(57)【要約】  本発明は、安定した乾燥反応混合物、その調製方法、その使用方法、及びそれらを含むキットを提供する。安定した乾燥反応混合物は、多くの組換えＤＮＡ技術、特にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による核酸増幅において有効である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの核酸増幅関連酵素、ヌクレオチド三リン酸、及びサッカリドを含む乾燥反応混合物組成物であって、ここで、該組成物が凍結乾燥されていない、乾燥反応混合物組成物。
【請求項２】
（ｉ）凍結乾燥された；及び／又は（ｉｉ）サッカリドを欠いている反応混合物と比較して、改善された安定性を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記サッカリドが、スクロース、トレハロース、デキストロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、シクロデキストリン、マルトデキストリン及びデキストランから成る群から選択される、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
酢酸マンガン（Ｍｎ（ＯＡｃ）2）を更に含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物が、４５℃にて３カ月間又はそれと同等な条件下での保管によっても活性を維持する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
アプタマー、界面活性剤、緩衝剤、塩、及びオリゴヌクレオチドから成る群から選択される少なくとも１つの成分を更に含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記少なくとも１つの核酸増幅関連酵素が、サーマス・アクアティクスＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス属Ｚ０５ポリメラーゼ、サーマス・フラバスポリメラーゼ、サーモトガ・マリチマポリメラーゼ、サーモトガ・ネアポリタナポリメラーゼ、ＴＭＡ−２５ポリメラーゼ、ＴＭＡ−３０ポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、並びに修飾された熱安定性ポリメラーゼ、又は任意のそれらの組み合わせから成る群から選択される熱安定性ポリメラーゼである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物が水溶液の状態に再構成される場合、前記サッカリドが、約５０ｍＭ〜約１０００ｍＭのサッカリド濃度となるような量で存在する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記サッカリドがスクロースである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物が、周囲温度にて１２カ月間又はそれと同等な条件下での保管によっても活性を維持する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
乾燥反応混合物組成物を調製する方法であって、該方法は、凍結乾燥なしに水性形態の反応混合物を乾燥させることを含み、ここで、該水性形態の反応混合物が、少なくとも１つの核酸増幅関連酵素、ヌクレオチド三リン酸、及びサッカリドを含む方法。
【請求項１２】
前記サッカリドが、スクロース、トレハロース、デキストロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、シクロデキストリン、マルトデキストリン及びデキストランから成る群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記組成物が、４５℃にて３カ月間又はそれと同等な条件下での保管によっても活性を維持する、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
周囲温度にて実施される、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記サッカリドが、前記水性形態の反応混合物中に約５０ｍＭ〜約１０００ｍＭの濃度にて存在する、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記サッカリドがスクロースである、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記少なくとも１つの核酸増幅関連酵素が、サーマス・アクアティクスＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス属Ｚ０５ポリメラーゼ、サーマス・フラバスポリメラーゼ、サーモトガ・マリチマポリメラーゼ、サーモトガ・ネアポリタナポリメラーゼ、ＴＭＡ−２５ポリメラーゼ、ＴＭＡ−３０ポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、並びに修飾された熱安定性ポリメラーゼ、又は任意のそれらの組み合わせから成る群から選択される熱安定性ポリメラーゼである、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記乾燥組成物が、周囲温度にて１２カ月間又はそれと同等な条件下での保管によっても活性を維持する、請求項１１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、安定した反応混合物、それらの調製方法、それらの使用方法、及びそれらを含むキットを提供する。安定した反応混合物は、多くの組換えＤＮＡ技術、特にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による核酸増幅において有効である。
【背景技術】
【０００２】
安定したポリペプチド組成物を生産する難問に対処するために、満足のいく保存期限を提供するために、タンパク質は一般的に固体で調製される。固体形態のタンパク質組成物を調製するための標準的な方法は凍結乾燥（フリーズドライ）であるが、このプロセスは、いろいろな程度にタンパク質を変性させ得るストレスの原因となる（Wang, W. (2000) International Journal of Pharmaceutics 203; 1-60）。
【０００３】
生体反応化合物が、可溶化された形態で短時間でも安定していることはほとんどなく、このことは、室温にての保存の場合に特に当てはまる。その結果、乾燥状態の生体反応化合物の保存能力を強化する可能性を評価する多くの研究が実施されてきた。一般的に、例えばポリメラーゼの生体活性を再溶解の際に確保するために、少なくとも１つの安定化用添加物を使用することが必要であろうことを理解される。
【０００４】
ＷＯ２００８／３６５４４は、乾燥組成物を提供するためのいわゆる充填材の使用について記載しており、前記充填材とは、例えば、炭水化物、例えばＦＩＣＯＬＬ（登録商標）、スクロース、グルコース、トレハロース、メレジトース、ＤＥＸＴＲＡＮ（登録商標）又はマンニトール、タンパク質、例えばＢＳＡ、ゼラチン又はコラーゲン及びポリマー、例えばＰＥＧ又はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）である。生物学的な試薬を安定化するためのガラス形成充填材は、更に、米国特許第５，０９８，８９３号、同第５，２００，３９９号及び同第５，２４０，８４３号に記載されている。充填材であるＦＩＣＯＬＬ（登録商標）は、米国特許第３，３００，４７４号で開示されているコポリマーである。液体反応混合物を乾燥させる方法は、ほとんどの場合、実際には非常に複雑であり、そのため、乾燥させる手法は要求が厳しく、そして費用がかかる。
【０００５】
フリーズドライ（米国特許第５，５９３，８２４号）又は真空乾燥（米国特許第５，５６５，３１８号）を用いて炭水化物ポリマーマトリックス中の生体材料を乾燥している。凍結乾燥又はフリーズドライは、従来技術の水準を示す多くの文献で開示されている、タンパク質の保存について非常に確立された技術である（例えば、Passot, S., et al., Pharmaceutical Development and Technology 12 (2007) 543-553; Carpenter, J. F., et al., Pharmaceutical Research 14(8) (1997) 969-975; Schwegman, J. J., et al., Pharmaceutical Development and Technology 10 (2005) 151-173）。
【０００６】
Ｔａｑポリメラーゼの遺伝子組換えを含んで成るシークエンシングアプリケーションのための異なる反応混合物の乾燥条件の選択は、米国特許第７，４０７，７４７号に記載されている。使用した乾燥手順は、フリーズドライ、追加の乾燥を実施しないスピードバック、追加の乾燥を実施するスピードバック、及び室温にての風乾である。この特許における反応混合物は、種々の凍結保存物質、例えばトレハロース、スクロース、グルコース及びトリメチルアミン−Ｎ−オキシド（ＴＭＡＮＯ）について試験された。更に、凍結乾燥物質を全く用いないでの実験も実施したが、それらの反応混合物の経時的な安定性に関するデータは開示されなかった。８週間の間に限って良好な安定性が報告されたが、これはトレハロース及び牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含んで成る反応混合物についてのみであった。
【０００７】
更に、米国特許第７，４０７，７４７号は、それぞれのシークエンシング混合物は、緩衝液、ヌクレオチド三リン酸、並びに蛍光標識されたヌクレオチド及びプライマーの異なる組成物を含んで成る、異なるシークエンシング混合物中のポリメラーゼを用いた実験を開示している。しかしながら、リアルタイムＰＣＲ増幅のための混合物、すなわち緩衝液、ヌクレオチド三リン酸、プライマー及び検出プローブを含んで成る混合物中のポリメラーゼが、そのポリメラーゼ活性に影響を与えることなく乾燥され、そして保存される場合についての開示はない。
【０００８】
米国特許第８，６５２，８１１号は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼをリアルタイムＰＣＲ混合物中で乾燥させる方法を提供する。一方、得られた乾燥組成物は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼのＰＣＲ性能に影響を及ぼすことなく保存することができる。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、凍結乾燥又はフリーズドライの必要なしにドライダウンされた、サッカリド（例えば、スクロース）を含むＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素−ＰＣＲ）によって核酸増幅に使用される安定した反応混合物を提供する。本発明はまた、ドライダウン反応混合物の調製方法を提供する。
【００１０】
そのため、一態様において、本発明は、少なくとも１つの核酸増幅関連酵素、ヌクレオシドモノマー、及びサッカリドを含む乾燥反応混合物組成物に関係し、ここで、前記組成物は、凍結乾燥されていない。いくつかの実施形態において、組成物は、（ｉ）凍結乾燥された；及び／又は（ｉｉ）サッカリドを欠いている、反応混合物と比較して改善された安定性を有する。いくつかの実施形態において、サッカリドは、スクロース、トレハロース、デキストロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、シクロデキストリン、マルトデキストリン、及びデキストランから成る群から選択される。いくつかの実施形態において、組成物は、酢酸マンガン（Ｍｎ（ＯＡｃ）2）を更に含む。いくつかの実施形態において、組成物は、４５℃にて３カ月間又はそれと同等な条件下での保管によっても活性を維持する。いくつかの実施形態において、組成物は、アプタマー、界面活性剤、緩衝剤、塩、及びオリゴヌクレオチドから成る群から選択される少なくとも１つの成分を更に含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの核酸増幅関連酵素は、サーマス・アクアティクス（Thermus aquaticus）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス属（Thermus sp.）Ｚ０５ポリメラーゼ、サーマス・フラバス（Thermus flavus）ポリメラーゼ、サーモトガ・マリチマ（Thermotoga maritima）ポリメラーゼ、サーモトガ・ネアポリタナ（Thermotoga neapolitana）ポリメラーゼ、ＴＭＡ−２５ポリメラーゼ、ＴＭＡ−３０ポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、並びに修飾された熱安定性ポリメラーゼ、又は任意のそれらの組み合わせから成る群から選択される熱安定性ポリメラーゼである。いくつかの実施形態において、サッカリドは、組成物が水溶液の状態に再構成される場合、サッカリドの濃度が約５０ｍＭ〜約１０００ｍＭになるような量で存在する。いくつかの実施形態において、サッカリドはスクロースである。いくつかの実施形態において、組成物は、周囲温度にて１２カ月間又はそれと同等な条件下での保管によっても活性を維持する。
【００１１】
別の態様において、本発明は、乾燥反応混合物組成物を調製する方法に関係するものであって、該方法は、凍結乾燥なしに水性形態の反応混合物を乾燥させることを含み、ここで、水性形態の反応混合物は、少なくとも１つの核酸増幅関連酵素、ヌクレオシドモノマー、及びサッカリドを含む。いくつかの実施形態において、サッカリドは、スクロース、トレハロース、デキストロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、シクロデキストリン、マルトデキストリン、及びデキストランから成る群から選択される。いくつかの実施形態において、組成物は、４５℃にて３カ月間又はそれと同等な条件下での保管によっても活性を維持する。いくつかの実施形態において、方法は、周囲温度にて実施される。いくつかの実施形態において、サッカリドは、水性形態の反応混合物中に約５０ｍＭ〜約１０００ｍＭの濃度にて存在する。いくつかの実施形態において、サッカリドはスクロースである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの核酸増幅関連酵素は、サーマス・アクアティクスＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス属Ｚ０５ポリメラーゼ、サーマス・フラバスポリメラーゼ、サーモトガ・マリチマポリメラーゼ、サーモトガ・ネアポリタナポリメラーゼ、ＴＭＡ−２５ポリメラーゼ、ＴＭＡ−３０ポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、並びに修飾された熱安定性ポリメラーゼ、又は任意のそれらの組み合わせから成る群から選択される熱安定性ポリメラーゼである。いくつかの実施形態において、組成物は、周囲温度にて１２カ月間又はそれと同等な条件下での保管によっても活性を維持する。
本発明の実施形態及び利点が、発明の詳細な説明及び図面により詳細に記載されている。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、４２℃での保管１日目における凍結乾燥した（Ａ）及び凍結乾燥していない（Ｂ）乾燥反応マスターミックスによって作り出されたＲＴ−ＰＣＲ増加曲線を示す。
【図２】図２は、４２℃での保管１５日目における凍結乾燥した（Ａ）及び凍結乾燥していない（Ｂ）乾燥反応マスターミックスによって作り出されたＲＴ−ＰＣＲ増加曲線を示す。
【図３】図３は、４２℃での保管２９日目における凍結乾燥した（Ａ）及び凍結乾燥していない（Ｂ）乾燥反応マスターミックスによって作り出されたＲＴ−ＰＣＲ増加曲線を示す。
【図４】図４は、４２℃での保管４９日目における凍結乾燥した（Ａ）及び凍結乾燥していない（Ｂ）乾燥反応マスターミックスによって作り出されたＲＴ−ＰＣＲ増加曲線を示す。
【図５】図５は、４２℃での保管９０日目における凍結乾燥していない乾燥反応マスターミックスによって作り出されたＲＴ−ＰＣＲ増加曲線を示す。
【図６】図６は、周囲温度での保管２６日目における凍結乾燥していない乾燥反応マスターミックスによって作り出されたＲＴ−ＰＣＲ増加曲線を示す。
【図７】図７は、周囲温度での保管７１日目における凍結乾燥していない乾燥反応マスターミックスによって作り出されたＲＴ−ＰＣＲ増加曲線を示す。
【図８】図８は、周囲温度での保管２２２日目における凍結乾燥していない乾燥反応マスターミックスによって作り出されたＲＴ−ＰＣＲ増加曲線を示す。
【図９】図９は、周囲温度での保管２９９日目における凍結乾燥していない乾燥反応マスターミックスによって作り出されたＲＴ−ＰＣＲ増加曲線を示す。
【図１０】図１０は、周囲温度での保管３５３日目における凍結乾燥していない乾燥反応マスターミックスによって作り出されたＲＴ−ＰＣＲ増加曲線を示す。
【図１１】図１１は、周囲温度での保管３７９日目における凍結乾燥していない乾燥反応マスターミックスによって作り出されたＲＴ−ＰＣＲ増加曲線を示す。
【００１３】
本発明の詳細な説明
本発明は、安定した反応混合物、それらの調製方法、それらの使用方法、及びそれらを含むキットを提供する。安定した反応混合物は、多くの組換えＤＮＡ技術、特にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による核酸増幅において有効である。特に、本発明は、酵素（例えば核酸増幅に使用される酵素）及び糖を含む安定した非凍結乾燥反応混合物を提供する。斯かる酵素混合物は、凍結乾燥なしにドライダウンされるので、酵素活性の重大な損失なしに室温にて長期間保存され得る。
【００１４】
Ｉ．定義
他に断りがない限り、本明細書で用いる技術用語及び科学用語は全て、本発明が属する分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。実質的に本明細書に記載のものと同様の任意の方法及び材料を本発明の実施又は試験に用いることができるが、例示的な方法と材料のみを記載する。本発明の目的上、以下の用語は下記のとおり定義される。
【００１５】
用語「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈から明らかに別の意味を示さない限り、複数の指示対象を含む。
【００１６】
本発明との関連において「約」という用語は、指示値の＋／−１５％、＋／−１０％、＋／−５％、＋／−３％、＋／−２％又は＋／−１％の変動及び指示値自体を包含する。
「凍結乾燥」という用語は、急速冷凍すること、そして、高真空下での凍っている製品の脱水による生物学的物質の安定した調製物の作製を指し、一般的に「フリーズドライ」とも言われる。
【００１７】
「非凍結乾燥」、「ドライダウン」又は「乾燥」という用語は、凍結乾燥のプロセスを使用しないことによって生物学的物質をドライダウンするためのプロセスを指す。
「周囲温度」という用語は、周辺の温度を指し、そして、温度管理された屋内の温度に言及するときには、「室温」と同義である。一般的に、周囲温度とは、１５℃から２５℃の温度領域を指すが、それに加えて、わずかに涼しいか、又は暖かい温度も周囲温度の範囲内とみなされてもよい。
【００１８】
「アプタマー」という用語は、米国特許第５,６９３,５０２号に記載されているように、ＤＮＡポリメラーゼを認識して結合し、ポリメラーゼ活性を効率的に阻害する一本鎖ＤＮＡを指す。ＲＴ−ＰＣＲにおけるアプタマー及びｄＵＴＰ／ＵＮＧの使用はまた、Smith, E.S.ら（Amplification of RNA: High-temperature Reverse Transcription and DNA Amplification with a Magnesium-activated Thermostable DNA Polymerase, in PCR Primer: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Dieffenbach, C.W. and Dveksler, G.S., Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 21 1-219, (2003)）でも議論されている。
【００１９】
本明細書で使用する場合、「組換え体」とは、組換え法により意図的に修飾されたアミノ酸配列又はヌクレオチド配列のことを指す。本明細書では、「組換え核酸」という用語は、一般的には制限エンドヌクレアーゼによる核酸の操作により、天然には通常ない形で、元々はin vitroで生成された核酸を意味する。したがって、直鎖状の単離された変異ＤＮＡポリメラーゼ核酸、又は通常は結合しないＤＮＡ分子を結合させることによりin vitroで生成した発現ベクターは、どちらも本発明の目的の組換え体とみなす。一旦組換え核酸を生成し、宿主細胞中に再導入すれば、それは非組換え的に、すなわち、in vitroでの操作よりもむしろ宿主細胞のin vivoの細胞機構を使って複製するだろう；しかし、一旦組換えで生成されたそのような核酸は、その後は非組換え的に複製されるが、それでも本発明の目的の組換え体とみなされることが理解される。「組換えタンパク質」は、組み換え技術を使って、すなわち、上述した組換え核酸の発現を通して、生成されたタンパク質である。
【００２０】
核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれる時、「作動できるように連結される」。例えば、プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動できるように連結しており；又はリボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように配置される場合、コード配列に作動できるように連結している。
【００２１】
「宿主細胞」という用語は、細胞培養において増殖させる際の単細胞原核生物と真核生物の両方（例えば細菌、酵母及び放線菌類）、そしてより高等の植物又は動物由来の単細胞を指す。
【００２２】
「ベクター」という用語は、典型的には二本鎖のＤＮＡ断片を指し、外来ＤＮＡ断片がその中に挿入されていてもよい。又は、ベクターは例えば、プラスミド由来でもよい。ベクターは、宿主細胞内でベクターの自律複製を促進する「レプリコン」ポリヌクレオチド配列を含む。外来ＤＮＡは、宿主細胞中に本来存在しないＤＮＡである異種ＤＮＡとして定義され、それは例えば、ベクター分子を複製し、選択可能又はスクリーニング可能なマーカーをコードするか、又は導入遺伝子をコードする。ベクターは、外来又は異種ＤＮＡを適切な宿主細胞に輸送するために用いられる。一旦宿主細胞に入れば、ベクターは宿主の染色体ＤＮＡとは独立に又はそれと同時に複製することができ、ベクターとその挿入ＤＮＡの複数のコピーを生成することができる。その上、ベクターは挿入ＤＮＡからｍＲＮＡ分子への転写を可能にするか、又は挿入ＤＮＡからＲＮＡの複数のコピーを複製する、必要な因子も含むことができる。発現ベクターの中には、発現したｍＲＮＡの半減期を長くし、かつ／又はｍＲＮＡからのタンパク質分子への翻訳を可能にする、挿入ＤＮＡに隣接した配列因子を更に含むものもある。このように、挿入ＤＮＡによりコードされるｍＲＮＡとポリペプチドの多数の分子を、迅速に合成することができる。
【００２３】
「ヌクレオチド」という用語は、天然のリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのモノマーを指すのに加え、本明細書中では、文脈から明らかにそうでないと示されていない限り、ヌクレオチドが用いられている個々の状況（例えば、相補的塩基へのハイブリダイゼーション）に関して機能的に同等である、誘導体及び類似体を含む、関連するその構造的変異体も指すことが理解されるべきある。
【００２４】
「核酸」又は「ポリヌクレオチド」という用語は、リボース核酸（ＲＮＡ）若しくはデオキシリボース核酸（ＤＮＡ）ポリマー又はその類似体に相当しうるポリマーを指すと本明細書で理解される。これは、ＲＮＡやＤＮＡのようなヌクレオチドのポリマー、並びに合成型、その修飾（例えば化学的又は生化学的に修飾された）型、及び混合ポリマー（例えばＲＮＡサブユニットとＤＮＡサブユニットの両方を含む）を含む。修飾の例としては、メチル化、類似体での天然ヌクレオチドの１若しくは複数の置換、無電荷結合のようなヌクレオチド間修飾（例えばメチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミダート、カルバマート等）、懸垂部分（例えばポリペプチド）、挿入剤（例えばアクリジン、ソラーレン等）、キレート剤、アルキル化剤及び修飾結合（例えばアルファアノマー核酸等）が挙げられる。水素結合や他の化学的相互作用を介して指定配列に結合する能力において、ポリヌクレオチドを模倣する合成分子もまた含まれる。核酸の合成型は他の結合（例えばNielsen et al. (Science 254:1497-1500, 1991)に記載されるようなペプチド核酸）を含むことができるが、典型的には、ヌクレオチドモノマーはホスホジエステル結合を介して結合する。核酸には、例えば染色体又は染色体セグメント、ベクター（例えば発現ベクター）、発現カセット、裸のＤＮＡ又はＲＮＡポリマー、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物、オリゴヌクレオチド、プローブ及びプライマーがなりえる。又は核酸はそれらを含むことができる。核酸は例えば、一本鎖、二本鎖、又は三本鎖であることができ、特定の長さに限定されない。他に断りがない限り、特定の核酸配列は、明示された任意の配列に加え、相補的配列を任意に含んでなるか、又はコードする。
【００２５】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、少なくとも２つの核酸モノマー単位（例えばヌクレオチド）を含む核酸を指す。オリゴヌクレオチドは、典型的には約６〜約１７５の核酸モノマー単位、より典型的には約８〜約１００の核酸モノマー単位、更により典型的には約１０〜約５０の核酸モノマー単位（例えば約１５、約２０、約２５、約３０、約３５又はそれ以上の核酸モノマー単位）を含む。オリゴヌクレオチドの正確なサイズは、そのオリゴヌクレオチドの最終的な機能又は用途を含む多くの要因によって決まる。オリゴヌクレオチドは場合により、限定しないが、既存の又は天然の配列の単離、ＤＮＡ複製又は増幅、逆転写、適切な配列のクローニング及び制限消化、又はNarang et al. (Meth. Enzymol. 68:90-99, 1979)のホスホトリエステル法；Brown et al. (Meth. Enzymol. 68:109-151, 1979)のホスホジエステル法；Beaucage et al. (Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862, 1981)のジエチルホスホルアミダイト法；Matteucci et al. (J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191, 1981)のトリエステル法；自動合成法；若しくはCaruthers et al.の米国特許第４，４５８，０６６号の固相支持体法などの方法による直接化学合成、又は当業者に公知の他の方法を含む任意の適切な方法により調製される。
【００２６】
「プライマー」という用語は、本明細書で使用する場合、ポリヌクレオチド伸長が開始する条件下（例えば適切な緩衝液中及び適切な温度又は温度サイクル（例えばポリメラーゼ連鎖反応でのような）で、必要なヌクレオシド三リン酸（コピーされる鋳型により決まる）の存在とポリメラーゼを含んでなる条件下）に置かれた時に、鋳型依存（template−directed）の核酸合成の開始点として作用しうるポリヌクレオチドのことを指す。更に例示すると、プライマーは様々な他のオリゴヌクレオチド媒介合成方法において、例えばＲＮＡのde novo合成及びin vitro転写関連過程（例えば核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）等）の開始剤として、使用することもできる。プライマーは典型的には一本鎖オリゴヌクレオチド（例えば、オリゴデオキシリボヌクレオチド）である。プライマーの適切な長さは、プライマーの企図される用途により決まるが、典型的には６〜４０ヌクレオチド、より典型的には１５〜３５ヌクレオチドの範囲である。短いプライマー分子は一般に、鋳型と十分に安定なハイブリッド複合体を形成するためにより低い温度を必要とする。プライマーは鋳型の正確な配列を反映する必要はないが、プライマーを伸長させるために、鋳型とハイブリダイズするのに十分に相補的でなければならない。特定の実施形態においては、「プライマー対」という用語は、増幅させる核酸配列の５’末端の相補体とハイブリダイズする５’センスプライマー（「フォワード」と呼ばれる場合もある）と、増幅させる配列の３’末端とハイブリダイズする３’アンチセンスプライマー（「リバース」と呼ばれる場合もある）とを含むプライマーのセットを意味する（例えば、標的配列がＲＮＡとして発現されるか、又はＲＮＡである場合）。プライマーは、必要であれば、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的又は化学的手法により検出可能な標識を取り込むことにより、標識することができる。例えば、有用な標識としては、32Ｐ、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（ＥＬＩＳＡアッセイに汎用される）、ビオチン、又はそれに対する抗血清若しくはモノクローナル抗体が入手可能であるハプテン及びタンパク質が挙げられる。
【００２７】
核酸塩基、ヌクレオシド三リン酸又はヌクレオチドについて述べる場合、「従来の」又は「天然の」という用語は、記載されたポリヌクレオチド中に本来存在するもの（すなわち、ＤＮＡの場合にはｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ）を指す。加えて、シークエンシングのような、in vitroでのＤＮＡ合成反応においては、ｄＧＴＰの代わりにｄＩＴＰ及び７−デアザ−ｄＧＴＰが頻繁に用いられ、ｄＡＴＰの代わりに７−デアザ−ｄＡＴＰを用いることができる。それらをまとめて、ｄＮＴＰと呼んでもよい。
【００２８】
核酸塩基、ヌクレオシド又はヌクレオチドについて述べる場合、「特殊な」又は「修飾された」という用語は、特定のポリヌクレオチド中に本来存在する従来の塩基、ヌクレオシド又はヌクレオチドの修飾、誘導、類似体を含む。特定の特殊なヌクレオチドは、従来のｄＮＴＰと比較してリボース糖の２’位で修飾されている。したがって、ＲＮＡの場合は天然のヌクレオチドはリボヌクレオチド（すなわちＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、総称してｒＮＴＰ）だが、それらのヌクレオチドは、比較したらｄＮＴＰには存在しない、糖の２’位にヒドロキシル基を有するため、本明細書では、リボヌクレオチドはＤＮＡポリメラーゼの基質としては特殊なヌクレオチドである。本明細書では、特殊なヌクレオチドとしては、限定しないが、核酸シークエンシングにターミネーター（terminator）として用いられる化合物が挙げられる。ターミネーター化合物の例としては、限定しないが、２’，３’ジデオキシ構造を有し、ジデオキシヌクレオシド三リン酸と呼ばれる化合物が挙げられる。ジデオキシヌクレオシド三リン酸ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＣＴＰ及びｄｄＧＴＰは、まとめてｄｄＮＴＰと呼ばれる。ターミネーター化合物のその他の例としては、リボヌクレオチドの２’−ＰＯ4類似体（例えば、米国特許出願公開第２００５／００３７９９１号及び第２００５／００３７３９８号を参照のこと）が挙げられる。他の特殊ヌクレオチドとしては、ホスホロチオエートｄＮＴＰ（［α−Ｓ］ｄＮＴＰ）、５’−［α−ボラノ］−ｄＮＴＰ、［α］−メチルホスホネートｄＮＴＰ及びリボヌクレオシド三リン酸（ｒＮＴＰ）が挙げられる。特殊な塩基は、32Ｐ、33Ｐ又は35Ｓのような放射性同位体；蛍光標識；化学発光標識；生物発光標識；ビオチンのようなハプテン標識；又は、ストレプトアビジン若しくはアビジンのような酵素標識により標識してもよい。蛍光標識としては、フルオレセインファミリーの色素のような負に帯電した色素、又はローダミンファミリーの色素のような電荷が中性である色素、又はシアニンファミリーの色素のような正に帯電した色素を挙げることができる。フルオレセインファミリーの色素としては、例えば、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＮＡＮ及びＺＯＥが挙げられる。ローダミンファミリーの色素としては、テキサスレッド、ＲＯＸ、Ｒ１１０、Ｒ６Ｇ及びＴＡＭＲＡが挙げられる。ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＮＡＮ、ＺＯＥ、ＲＯＸ、Ｒ１１０、Ｒ６Ｇ、テキサスレッド及びＴＡＭＲＡにより標識した様々な色素又はヌクレオチドは、Perkin-Elmer (Boston, MA), Applied Biosystems (Foster City, CA)又はInvitrogen/Molecular Probes (Eugene, OR)より販売されている。シアニンファミリーの色素としてはＣｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５及びＣｙ７が挙げられ、それらはGE Healthcare UK Limited (Amersham Place, Little Chalfont, Buckinghamshire, England)により販売されている。
【００２９】
「Ｃｐ値」又は「クロッシングポイント」値という用語は、標的核酸の投入量の定量ができる値を指す。Ｃｐ値は、二次導関数最大値法（second−derivative maximum method）（Van Luu-The, et al., "Improved real-time RT-PCR method for high-throughput measurements using second derivative calculation and double correction," BioTechniques, Vol. 38, No. 2, February 2005, pp. 287-293）により求めることができる。二次導関数最大値法において、Ｃｐは二次導関数曲線の第１のピークに相当する。このピークは指数増大期の開始に相当する。二次導関数法により、リアルタイムの蛍光強度曲線の二次導関数値が算出され、１つの値のみが得られる。オリジナルのＣｐ法は、ある区間で定義された強度値の微分可能な近似、例えば、多項式関数によるものに基づく。その後三次導関数を算出する。Ｃｐ値は、三次導関数の最小根である。Ｃｐはまたフィットポイント法（fit point method）を用いて求めることもでき、ここでは、Ｃｐは指数増大範囲における補助線（threshold line）との平行線の交点から求める（Van Luu-The, et al., BioTechniques, Vol. 38, No. 2, February2005, pp. 287-293）。Roche製のＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ装置によって提供されたＣｐ値は、二次導関数最大法による計算によって決定された。
【００３０】
「ＰＣＲ効率」という用語は、サイクルからサイクルへの増幅効率の指標を指す。ＰＣＲ効率は式：ＰＣＲ効率（％）＝（１０(-傾き)−１）×１００を用いて、それぞれの条件で算出する。ここで、傾きは、ｙ軸にプロットされたコピー数の対数とｘ軸にプロットされたＣｐを用いた直線回帰により算出した。ＰＣＲ効率は、完全に合致したか又はミスマッチしたプライマー鋳型を使用することで計測できる。
【００３１】
「ＦＲＥＴ」又は「蛍光共鳴エネルギー転移」又は「フェルスター共鳴エネルギー転移」という用語は、少なくとも二つの発色分子、ドナー発色分子及びアクセプター発色分子（クエンチャーと呼ぶ）間のエネルギー転移を指す。ドナーは通常、適切な波長の光放射により励起された時、アクセプターにエネルギーを転移する。アクセプターは通常、異なる波長での光放射の形で転移されたエネルギーを再放出する。アクセプターが「ダーク」クエンチャーの場合、転移されたエネルギーは光以外の形で放出される。特定の蛍光色素分子がドナー又はアクセプターとして作用するか否かは、ＦＲＥＴ対の他の要素の性質による。通常用いられるドナー−アクセプター対としては、ＦＡＭ−ＴＡＭＲＡ対が挙げられる。通常用いられるクエンチャーはＤＡＢＣＹＬ及びＴＡＭＲＡである。通常用いられるダーククエンチャーとしては、ブラックホールクエンチャー（BlackHole Quencher）（登録商標）（ＢＨＱ）、（Biosearch Technologies, Inc., Novato, Cal.）、アイオワブラック（Iowa Black）（登録商標）（Integrated DNA Tech., Inc., Coralville, Iowa）、及びブラックベリー（登録商標）クエンチャー６５０（ＢＢＱ−６５０））（BlackBerry Quencher 650 (BBQ-650) (Berry & Assoc., Dexter, Mich.）が挙げられる。
【００３２】
「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養物」といった用語は、互換的に用いられることができ、このようなすべての表示は、子孫も含める。したがって、「形質転換体」又は「形質転換細胞」といった単語は、伝達の数に関わりなく、一次形質転換細胞及び該細胞に由来する培養物を含む。意図的な又は偶発的な変異のせいで、すべての子孫のＤＮＡ含量は、正確に同一ではなくてもよい。元の形質転換細胞において選別された同一の機能を有する変異体の子孫は、形質転換体の定義中に含まれる。前記細胞は原核細胞でもよく、真核細胞でもよい。
【００３３】
「制御配列」という用語は、特定の宿主生物において、作動可能に連結されているコード配列が発現するのに必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に適する制御配列には、例えば、プロモーター、必要に応じてオペレーター配列、リボゾーム結合部位、陽性レトロ制御要素（米国特許第４，６６６，８４８号を参照のこと）、及び他の可能な配列が含まれる。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
【００３４】
「作動できるように連結された」という用語は、制御配列が機能してコード配列によりコードされたタンパク質の発現を制御するようなコード配列の配置を指す。従って、コード配列が制御配列に「作動できるように連結された」とは、制御配列の方向にコード配列が発現できるという配置を指す。
【００３５】
「制限エンドヌクレアーゼ」及び「制限酵素」という用語は、特定のヌクレオチド配列の位置か又は近傍で二本鎖ＤＮＡを切断する、通常は細菌起源の酵素である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは本明細書で定義される。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アルパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アルパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、システイン、グリシン）、β−分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。
【００３６】
「試薬溶液」という用語は、ＰＣＲの目的に必要な又は使用される少なくとも１つの試薬を含有する任意の溶液である。最も典型的な成分は、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、プライマー、イオン、マグネシウム、塩、ｐＨ緩衝剤、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰｓ）又はデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、プローブ、蛍光色素（プローブに結合していてもい）、核酸結合剤、核酸鋳型である。試薬はまた、ポリメラーゼ反応又はそのモニタリングに影響を与える、他のポリメラーゼ反応添加剤でもよい。
【００３７】
「マスターミックス」という用語は、ＰＣＲが起きるのに必要なすべて又はほとんどの成分又は因子の混合物を指し、ある場合には、試料特異的な及びアンプリコン特異的な鋳型とプライマー以外のすべてを指す。市販のマスターミックスは通常、濃縮溶液である。マスターミックスは、多くの試料に共通したすべての試薬を含有することができるが、これはまた、１つの試料のみのために構築されてもよい。マスターミックスを使用することは、ピペッティングエラーを減らし、ピペッティング容量間の差による試料の変動を低減させるのに有用である。
【００３８】
「熱安定性ポリメラーゼ」は、熱に対して安定であり、耐熱であり、かつ、２本鎖核酸を変性するのに必要な時間高温に供された後でも、以後のプライマー伸長反応を進めるための充分な活性を維持する、酵素を指す。核酸変性に必要な加熱条件は当該分野で公知であり、米国特許第４，９６５，１８８号及び同第４，８８９，８１８号に例示されている。本明細書において熱安定性ポリメラーゼは、ＰＣＲなどの温度サイクリング反応で使用するのに適している。熱安定性核酸ポリメラーゼの例には、サーマス・アクアティクスＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、サーマス属Ｚ０５ポリメラーゼ、サーマス・フラバスポリメラーゼ、サーマス・マリチマポリメラーゼ、例えばＴＭＡ−２５及びＴＭＡ−３０ポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。
【００３９】
「修飾された」熱安定性ポリメラーゼは、未変性型又は野生型のポリメラーゼなどの基準配列又は他の修飾型のポリメラーゼとは少なくとも１つのモノマーが異なるポリメラーゼを指す。修飾の例は、モノマー挿入、欠失、及び置換が挙げられる。修飾ポリメラーゼはまた、２種以上の親に由来する同定可能な成分配列（例えば、構造又は機能ドメインなど）を有するキメラポリメラーゼを含む。また修飾ポリメラーゼの定義には、基準配列の化学的修飾を含むものがある。修飾された熱安定性ポリメラーゼの例には、Ｇ４６Ｅ Ｅ６７８Ｇ ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｇ４６Ｅ Ｌ３２９Ａ Ｅ６７８Ｇ ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｇ４６Ｅ Ｌ３２９Ａ Ｄ６４０Ｇ Ｓ６７１Ｆ ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｇ４６Ｅ Ｌ３２９Ａ Ｄ６４０Ｇ Ｓ６７１Ｆ Ｅ６７８Ｇ ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｇ４６Ｅ Ｅ６７８Ｇ ＣＳ６ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｚ０５ ＤＮＡポリメラーゼ、ΔＺ０５ポリメラーゼ、ΔＺ０５−Ｇｏｌｄポリメラーゼ、ΔＺ０５Ｒポリメラーゼ、Ｅ６１５Ｇ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ６７８Ｇ ＴＭＡ−２５ポリメラーゼ、Ｅ６７８Ｇ ＴＭＡ−３０ポリメラーゼなどが挙げられる。
【００４０】
「熱活性ポリメラーゼ」という用語は、特異的プライミングとプライマー伸長とを確保するに必要な高い温度（例えば、５５〜８０℃）で活性である酵素を指す。
【００４１】
「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、互換可能に用いられる。「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、互換可能に用いられる。別段の指示がない限り、アミノ酸配列は、アミノ末端からカルボキシ末端に向けて書かれる。別段の指示がない限り、一本鎖核酸配列は、５’から３’に向けて書かれる。別段の指示がない限り、二本鎖核酸配列の上側の鎖は、５’から３’に向けて書かれ、下側の鎖は、３’から５’に向けて書かれる。
【００４２】
ＩＩ．乾燥反応混合物組成物
本発明の乾燥反応混合物組成物は、少なくとも１つの核酸増幅関連酵素、ヌクレオチド三リン酸、及びサッカリドを含み、ここで、該組成物は、凍結乾燥されていない。本発明の乾燥反応混合物は、サッカリドを欠いているか、凍結乾燥されたか、又はサッカリドを欠き、かつ、凍結乾燥された乾燥反応混合物と比較して、改善された安定性を有する。乾燥反応混合物の一実施形態において、サッカリドは、スクロース、トレハロース、デキストロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、シクロデキストリン、マルトデキストリン、及びデキストランから選ばれる。別の実施形態において、乾燥反応混合物は、４５℃にて３カ月間又はそれと同等な条件下での保管によっても活性を維持する。別の実施形態において、乾燥反応混合物は、周囲温度にて１２カ月間又はそれと同等な条件下での保管によっても活性を維持する。更に別の実施形態において、乾燥反応混合物は、アプタマー、界面活性剤、緩衝剤、塩、及びオリゴヌクレオチドから成る群から選択される少なくとも１つの成分を含む。更に別の実施形態において、乾燥反応混合物は、酢酸マンガン（Ｍｎ（ＯＡｃ）2）を更に含む。それに加えて別の実施形態において、乾燥反応混合物は、増幅関連酵素、すなわち、サーマス・アクアティクスＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス属Ｚ０５ポリメラーゼ、サーマス・フラバスポリメラーゼ、ＴＭＡ−２５やＴＭＡ−３０ポリメラーゼなどのサーモトガ・マリチマポリメラーゼ、サーモトガ・ネアポリタナポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、並びに修飾された熱安定性ポリメラーゼ、又はそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される熱安定性ポリメラーゼを含む。それに加えて別の実施形態において、乾燥反応混合物組成物は、該組成物が水溶液の状態に再構成された場合に、サッカリド濃度が約５０ｍＭ〜約１０００ｍＭになるような量で存在するサッカリドを含む。更なる一実施形態において、サッカリドはスクロースである。
【００４３】
ＩＩＩ．乾燥反応混合物組成物を調製する方法
本発明の乾燥反応混合物組成物は、凍結乾燥なしに水性形態の反応混合物を乾燥させることによって調製され、ここで、水性形態の反応混合物は、少なくとも１つの核酸増幅関連酵素、ヌクレオチド三リン酸、及びサッカリドを含む。一実施形態において、乾燥は、周囲温度にて実施される。別の実施形態において、乾燥反応混合物中のサッカリドは、水性形態の反応混合物中に約５０ｍＭ〜約１０００ｍＭの濃度にて存在する。更なる一実施形態において、サッカリドはスクロースである。更に別の実施形態において、乾燥反応混合物は、酢酸マンガン（Ｍｎ（ＯＡｃ）2）を更に含む。それに加えて別の実施形態において、乾燥反応混合物は、増幅関連酵素、すなわち、サーマス・アクアティクスＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス属Ｚ０５ポリメラーゼ、サーマス・フラバスポリメラーゼ、ＴＭＡ−２５やＴＭＡ−３０ポリメラーゼなどのサーモトガ・マリチマポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、並びに修飾された熱安定性ポリメラーゼ、又は任意のそれらの組み合わせから成る群から選択される熱安定性ポリメラーゼを含む。更に別の実施形態において、本発明の方法を使用して調製された乾燥反応混合物組成物は、４５℃にて３カ月間又はそれと同等な条件下での保管によっても活性を維持する。更に別の実施形態において、本発明の方法を使用して調製された乾燥反応混合物組成物は、周囲温度にて１２カ月間又はそれと同等な条件下での保管によっても活性を維持する。
【００４４】
前述の発明について明確さと理解のためにある程度詳細に記載したが、この開示を読むことで当業者には、形態及び詳細について様々な変更が可能であることが明らかになる。例えば、先に記載したすべての組成物と方法は、様々な組み合わせで使用されてもよい。
以下の実施例は、現在実施することが好ましいという理由で、本発明の実施形態を例示するために提供される。実施例は説明的なものであり、そして、本発明は、添付した特許請求の範囲に示すもの以外を制限として考慮されるべきではないことは理解される。
【実施例】
【００４５】
実施例１：乾燥反応５×ＲＴ−ＰＣＲマスターミックスの調製
最初に、乾燥反応５×ＲＴ−ＰＣＲマスターミックスを、以下の組成：２５０ｍＭのトリシン（ｐＨ８．３）、５００ｍＭのＫＯＡｃ（ｐＨ７．５）、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、１．３２６μＭのＡｐｔａｍｅｒ（ホットスタートＰＣＲに使用される）、１０００μＭのｄＡＴＰ、１０００μＭのｄＣＴＰ、１０００μＭのｄＧＴＰ、１５００μＭのｄＵＴＰ、１５０μＭのｄＴＴＰ、０．０２９％のＮａＮ3、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．２Ｕ／μｌのウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）、２．２Ｕ／μｌのＺ０５−Ｄ ＤＮＡポリメラーゼを用いた水性溶液から調製した。１．５Ｍスクロースを、５×ＲＴ−ＰＣＲマスターミックスの半分［（＋）スクロース］に加え、そして、５×ＲＴ−ＰＣＲマスターミックスのもう半分［（−）スクロース］には加えなかった。一方のセットの（＋）スクロース及び（−）スクロースの５×ＲＴ−ＰＣＲマスターミックスを、凍結乾燥によってドライダウンし、そして、４５℃にてインキュベートした。もう片方のセットの（＋）スクロース及び（−）スクロース５×ＲＴ−ＰＣＲマスターミックスを、キャップなしのチューブ内で４５℃にて乾燥させ、そして、４５℃にてインキュベートした。乾燥反応５×ＲＴ−ＰＣＲマスターミックスの安定性を、３カ月間の期間にわたってＲＴ−ＰＣＲを実施することによって測定した。
【００４６】
実施例２：ＲＴ−ＰＣＲによる乾燥反応マスターミックスの分析
乾燥反応ＲＴ−ＰＣＲマスターミックスを、１×濃度に再構成し、ＲＴ−ＰＣＲ反応によって分析した。ＲＮＡ標的の逆転写過程及び増幅を、GeneAmp（登録商標）Gold RNA PCR Reagent Kit（P/N4308206、Applied Biosystems, Foster City, CA）のプロトコールに従って実施した。簡単に言えば、１×１０4投入コピーの対照ｐＡＷ１０９ＲＮＡ転写産物を、それぞれ０．２μＭのＤＭ１５１及びＤＭ１５２プライマー（ＩＬ−１α遺伝子から３０８塩基対の標的を生じる）に加えた。増幅産物を、０．１μＭ濃度のＴａｑＭａｎプローブＡＬ４２Ｆを使用して検出した。一部の反応では、酢酸マンガン（Ｍｎ（ＯＡｃ）2）を、１．５ｍＭの終濃度まで加えた。ＲＴ−ＰＣＲを、５５℃にて５分間、６０℃にて５分間、そして、６５℃にて５分間によって実施される逆転写相と、それに続く９２℃にて１５秒間、そして６０℃にて４０秒間を５５サイクルのＰＣＲを用いて、LightCycler（登録商標）480 Instrument（Roche Diagnostics）によって実施した。
【００４７】
実施例３：ＲＴ−ＰＣＲ反応の結果
ＲＴ−ＰＣＲ反応を、１日間、１５日間、２９日間、４９日間、及び９０日間保存した乾燥反応ＲＴ−ＰＣＲマスターミックスで実施し、そして、それぞれ日数について実施したＲＴ−ＰＣＲ反応の結果を、図１〜５の増加曲線で示す。１日後、凍結乾燥及びドライダウン（＋）スクロースマスターミックスは共に安定していたが、凍結乾燥（−）スクロースマスターミックスは完全に分解し、及びドライダウン（−）スクロースマスターミックスは分解を示し始めた（図１Ａ、Ｂ）。１５日後、凍結乾燥及びドライダウン（＋）スクロースマスターミックスは共に安定していて、類似した増加曲線を示した（図２Ａ、Ｂ）。２９日後、凍結乾燥（＋）マスターミックスは、酢酸マンガン（manganous acetate）を含まないマスターミックスでより多くの分解が観察される分解を示し始めた（図３Ａ）。対照的に、ドライダウン（＋）マスターミックスは、増加曲線が１５日目の増加曲線とわずかな違いを示して、まだ安定していた（図３Ｂ）。４９日後、凍結乾燥（＋）スクロースマスターミックスが完全に分解されたのに対して（図４Ａ）、Ｍｎ（ＯＡｃ）2含有ドライダウン（＋）スクロースマスターミックスはまだ安定していた。最終的に、９０日後、Ｍｎ（ＯＡｃ）2を含んでいないドライダウン（＋）スクロースマスターミックスは完全に分解され、Ｍｎ（ＯＡｃ）2を含んでいるマスターミックスは多少の分解を示したが、まだ、増加曲線を作り出すことができた（図５）。これらの結果は、スクロースと酢酸マンガンの安定化効果だけではなく、凍結乾燥マスターミックスと比較した非凍結乾燥マスターミックスの優れた性能も明確に示している。
【００４８】
実施例４：周囲温度における乾燥反応５×ＲＴ−ＰＣＲマスターミックスの調製及び分析
実施例１に記載の組成（マスターミックス中のスクロースの有無）を用いた乾燥反応５×ＲＴ−ＰＣＲマスターミックスを、２ｍｌのポリプロピレンチューブ内にピペットで移した。半分のチューブにはＭｎ（ＯＡｃ）2を加え、そして、もう片方の半分はＭｎ（ＯＡｃ）2なしのままにした。これらのサンプルを、キャップしない２ｍｌのポリプロピレンチューブ内で、４５℃及び大気圧にてドライダウンした。４５℃にて７日間の終わりの時点で、２ｍｌのチューブにキャップをし、そして、遮光して周囲の室温にて保存した。安定性時間ポイントを、１年間の期間にわたって測定した。これらのマスターミックスを、実施例２に記載の増幅試薬及び条件を使用したＲＴ−ＰＣＲ反応によって分析した。
【００４９】
ＲＴ−ＰＣＲ反応の結果を、図６〜１１の増加曲線で示す。図６は、周囲温度（室温）にて２６日後、スクロースを含んでいるドライダウンＲＴ−ＰＣＲマスターミックスは、安定していて、増加曲線を作り出したのに対して、スクロースを含んでいないドライダウンＲＴ−ＰＣＲマスターミックスは、完全に分解されていて、増加曲線を作り出せなかったことを示す。スクロースを含んでいるＲＴ−ＰＣＲマスターミックスは、７１日後（図７）、２２２日後（図８）、２９９日後（図９）、３５３日後（図１０）及び３７９日後（図１１）、周囲温度での保管においても安定性を示した。Ｍｎ（ＯＡｃ）2を添加したドライダウンＲＴ−ＰＣＲマスターミックスは、金属なしでドライダウンした同じ材料と同等か又はそれより高い安定性を示した。これらのＲＴ−ＰＣＲ結果は、周囲温度（室温）の暗所に置いて１２カ月間を超えても、スクロースを含んでいるＲＴ−ＰＣＲマスターミックス組成物を用いて効率的な増幅が達成されたことを示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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