(57)【要約】  哺乳動物である対象における異常細胞を特徴とする増殖性障害の薬物の発見、分析、及び治療のための方法及び組成物であって、細胞傷害性薬物、SETアゴニスト、及びSETリボソームアンタゴニストの組み合わせの医薬的有効量を投与することを含む方法及び組成物が、本発明の態様により提供される。本発明の態様による方法及び組成物には、癌細胞のような異常な増殖を特徴とする細胞における選択的翻訳を調節すること、及び/又はこれに影響を与えることにより、細胞の死滅を促進するのに有効な作用剤が組み込まれる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬組成物であって、
SETアゴニスト及びSETリボソームアンタゴニストを含む、医薬組成物。
【請求項２】
前記SETアゴニストがG2期進行の刺激因子である、請求項1記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記SETアゴニストは、ポリオキシル硬化ヒマシ油、ホルボールエステル、ブリオスタチン、その何れかの医薬的に許容可能な塩、及びその何れか2つ以上の組み合わせからなる群から選択される、請求項1又は2記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記ポリオキシル硬化ヒマシ油は、ポリオキシル30硬化ヒマシ油、ポリオキシル35硬化ヒマシ油、ポリオキシル40硬化ヒマシ油、ポリオキシル50硬化ヒマシ油、ポリオキシル60硬化ヒマシ油、及びその何れか2つ以上の組み合わせからなる群から選択される、請求項1乃至3の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記ポリオキシル硬化ヒマシ油は、ポリオキシル35硬化ヒマシ油、ポリオキシル40硬化ヒマシ油、及びその組み合わせからなる群から選択される、請求項1乃至4の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記ブリオスタチンは、ブリオスタチン1、ブリオスタチン2、その何れかの医薬的に許容可能な塩、及びその何れか2つ以上の組み合わせからなる群から選択される、請求項1乃至5の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記ホルボールエステルは、12-O-テトラデカノイルホルボール-13-アセタート又はその医薬的に許容可能な塩である、請求項1乃至6の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記SETリボソームアンタゴニストは、SETリボソームによるタンパク質合成を阻害する、請求項1乃至7の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記SETリボソームアンタゴニストは、アニソマイシン、エメチン、シクロヘキシミド、その医薬的に許容可能な塩、及びその何れか2つ以上の組合せからなる群から選択される、請求項1乃至8の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記SETアゴニストは、ポリオキシル35硬化ヒマシ油を含み、SETリボソームアンタゴニストは、アニソマイシン又はその医薬的に許容可能な塩を含む、請求項1乃至9の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記SETアゴニストは、ポリオキシル35硬化ヒマシ油を含み、SETリボソームアンタゴニストは、エメチン又はその医薬的に許容可能な塩を含む、請求項1乃至10の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項１２】
対象への経口投与用に製剤化された、請求項1乃至11の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項１３】
インビボでのG2期進行を促進又は阻害するのに有効な作用剤を同定する方法が提供され、TR第3階級外れ値SET応答を特徴とするTR第4階級細胞株の細胞であり、TRエレメント及びレポーターをコードし、前記細胞のゲノム内に安定的に組み込まれたTR核酸発現カセットを含む細胞を提供することと、前記細胞を非ヒト動物に投与して、前記非ヒト動物において異種移植腫瘍を発生させることと、試験物質を前記非ヒト動物に投与することと、前記SET応答に対する前記試験物質の効果を測定することとを含み、SET応答の増加により、前記作用剤は、インビボでのG2期進行を促進するのに有効なSETアゴニストとして同定される、本発明の態様による方法。
【請求項１４】
更に、インビボでのG2期進行を促進するためにSETアゴニストを前記非ヒト動物に投与することを含み、前記SET応答の減少により、前記作用剤は、インビボでのG2期進行を阻害するのに有効なSETアンタゴニストとして同定される、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
更に、前記異種移植腫瘍に対する前記試験物質の効果を測定することを含む、請求項13又は14記載の方法。
【請求項１６】
前記非ヒト動物は、ラット又はマウスである、請求項13乃至15の何れかに記載の方法。
【請求項１７】
増殖性疾患を治療するためのSET複合薬の成分として有効な作用剤を同定する方法であって、
TR第3階級SET応答又はTR第3階級SET外れ値応答を特徴とする細胞であり、前記細胞のゲノム内に安定的に組み込まれたTRエレメント及びレポーターをコードする発現コンストラクトを含む細胞を提供することと、
前記細胞を試験物質に接触させることと、
対照と比較したSETリボソームからのタンパク質合成に対する前記試験物質の効果を測定することと、を含み、前記試験物質によるSETリボソームからのタンパク質合成の阻害により、前記物質は、増殖性疾患治療用のSET複合薬の成分として有効な作用剤として同定される、方法。
【請求項１８】
前記細胞は、非接着性3D構造として懸濁培養において成長するインビトロでの能力と、切断しサブフラグメント化して二次性腫瘍として増殖させることが可能な原発性異種腫瘍をインビボで引き起こし、これに成長する能力とにより更に特徴付けられる、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
転移性癌細胞株モデルを生成する方法であって、
TRエレメント及びレポーターをコードする発現カセットを細胞に導入して、前記発現カセットが前記細胞のゲノム内に安定的に組み込まれた細胞の親集団を作成することと、
前記親集団のサブクローンを単離することと、
SETアゴニストを各サブクローンの細胞集団に投与して、各サブクローンの前記細胞集団においてSET TR応答を誘導することと、
前記レポーターの発現を検出することにより、各サブクローンの前記細胞集団におけるTR SET応答をアッセイすることと、
各サブクローンの前記TR SET応答を互いのサブクローンと比較して順位付けし、平均応答により特徴付けられるTR SET応答の範囲を確立することと、
前記平均応答よりも少なくとも2標準偏差だけ大きな、前記レポーターの発現の検出可能な増加を特徴とするサブクローンを選択することにより、前記選択されたサブクローンをTR第3階級TR SET応答サブクローンとして定義することと、
各TR第3階級TR SET応答サブクローンの細胞集団にSETアゴニストを投与して、各TR第3階級TR SET応答サブクローンの前記細胞集団においてSET TR応答を誘導することと、
前記レポーターの発現を検出することにより、各TR第3階級SET応答サブクローンの前記細胞集団における前記TR SET応答をアッセイすることと、
各TR第3階級SET応答サブクローンの前記TR SET応答を、互いのTR第3階級SET応答サブクローンと比較して順位付けし、平均応答により特徴付けられるTR SET応答の範囲を確立することと、
前記平均応答よりも少なくとも2標準偏差だけ大きな、レポーターの発現の検出可能な増加を特徴とするTR第3階級SET応答サブクローンを選択することにより、前記選択されたTR第3階級SET応答サブクローンをTR第3階級SET応答外れ値サブクローンとして定義することと、
TR第3階級SET応答外れ値サブクローンとして特徴付けられた1つ以上のサブクローンの細胞に1つ以上の毒素を投与することと、
前記サブクローンの細胞におけるSETリボソーム活性の上昇による薬剤及びストレス耐性を示す、TR第3階級SET応答外れ値サブクローンとして特徴付けられた前記1つ以上のサブクローンの細胞の応答を検出することにより、前記細胞がTR第4階級細胞であることを決定することと、これにより、転移性癌細胞株モデルを生成することと、を含む方法
【請求項２０】
更に、
前記TR第4階級細胞を低密度条件下で少なくとも50細胞周期に亘り培養して、低密度コロニー形成が可能なTR第4階級サブクローンを生成することと、
低密度コロニー形成が可能な前記TR第4階級サブクローンを選択することと、
低密度コロニー形成が可能な各TR第4階級サブクローンの細胞集団にSETアゴニストを投与して、TR SET応答を誘導することと、
前記レポーターの発現を検出することにより、TR SET応答を誘導する低密度コロニー形成が可能な各TR第4階級サブクローンの前記細胞集団における前記SET応答をアッセイすることと、
低密度コロニー形成が可能な各TR第4階級サブクローンの前記TR SET応答を、低密度コロニー形成が可能なTR第4階級サブクローンと互いに比較して順位付けし、平均応答により特徴付けられるSET応答の範囲を確立することと、
低密度コロニー形成が可能であり、前記平均応答よりも少なくとも2標準偏差だけ大きな前記レポーターの発現の検出可能な増加を特徴とする前記TR第4階級サブクローンを選択することと、を含む、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
更に、
前記TR第4階級細胞を非接着性の低密度培養条件下で培養することと、
懸濁凝集体として増殖する前記TR第4階級細胞のサブクローンを選択することにより、腫瘍様塊を引き起こす10個以下の細胞によるエクスビボ腫瘍様塊形成が可能なTR第4階級細胞のサブクローンを選択することと、
前記腫瘍様塊応答を引き起こす10個以下の細胞によるエクスビボ腫瘍様塊形成が可能な前記TR第4階級サブクローンの細胞に1つ以上の毒素を投与することと、
前記サブクローンの細胞におけるSETリボソーム活性の上昇による薬剤及びストレス耐性を示す、前記腫瘍様塊を引き起こす10個以下の細胞によるエクスビボ腫瘍様塊形成が可能な前記TR第4階級サブクローンの細胞の応答を検出することにより、前記TR第4階級サブクローンの細胞が、10個以下の細胞によるエクスビボ腫瘍様塊形成が可能であり、TR第4階級TR SET応答により特徴付けられることを決定することと、を含む、請求項19又は20記載の方法。
【請求項２２】
第3階級外れ値SET応答を特徴とする、単離された非天然型細胞であって、前記細胞のゲノム内に安定的に組み込まれたTRエレメント及びレポーターをコードする発現カセットを含む細胞。
【請求項２３】
非接着性3D構造として懸濁培養において成長するインビトロでの能力と、切断しサブフラグメント化して二次性腫瘍として増殖させることが可能な原発性異種腫瘍をインビボで引き起こし、これに成長する能力とにより更に特徴付けられる、請求項22記載の細胞。
【請求項２４】
哺乳動物である対象における異常細胞を特徴とする増殖性障害の治療方法であって、
細胞傷害性薬物、SETアゴニスト、及びSETリボソームアンタゴニストの組み合わせの医薬的有効量を投与することを含む、方法。
【請求項２５】
前記異常細胞には、有糸分裂異常細胞及び非有糸分裂異常細胞の両方が含まれ、異常細胞及び非有糸分裂異常の両方は、細胞傷害性薬物、SETアゴニスト、及びSETリボソームアンタゴニストの組み合わせの医薬的有効量を投与することにより、死滅させられる、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
細胞傷害性薬物、SETアゴニスト、及びSETリボソームアンタゴニストの前記組合せは、前記SETアゴニスト及び前記SETリボソームアンタゴニストを用いずに前記細胞傷害性薬物を投与することによる治療と比較して、前記異常細胞を死滅させるのに必要な細胞傷害性薬物の用量を低下させる効果を有する、請求項24又は25記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞傷害性薬物は、5-フルオロウラシル、ロイコボリン、カペシタビン、シクロホスファミド、イリノテカン、トポテカン、パクリタキセル、ドセタキセル、オキサリプラチン、その医薬的に許容可能な塩、及びその何れか2つ以上の組み合わせからなる群から選択される、請求項24乃至26の何れかに記載の方法。
【請求項２８】
前記SETアゴニストがG2期進行の刺激因子である、請求項24乃至27の何れかに記載の方法。
【請求項２９】
前記SETアゴニストは、ポリオキシル硬化ヒマシ油、ホルボールエステル、ブリオスタチン、その医薬的に許容可能な塩、及びその何れか2つ以上の組合せからなる群から選択される、請求項24乃至28の何れかに記載の方法。
【請求項３０】
前記ポリオキシル硬化ヒマシ油は、ポリオキシル30硬化ヒマシ油、ポリオキシル35硬化ヒマシ油、ポリオキシル40硬化ヒマシ油、ポリオキシル50硬化ヒマシ油、ポリオキシル60硬化ヒマシ油、及びその何れか2つ以上の組み合わせからなる群から選択される、請求項24乃至29の何れかに記載の方法。
【請求項３１】
前記ポリオキシル硬化ヒマシ油は、ポリオキシル35硬化ヒマシ油、ポリオキシル40硬化ヒマシ油、及びその組み合わせからなる群から選択される、請求項24乃至30の何れかに記載の方法。
【請求項３２】
前記ブリオスタチンは、ブリオスタチン1、ブリオスタチン2、その何れかの医薬的に許容可能な塩、及びその何れか2つ以上の組み合わせからなる群から選択される、請求項24乃至31の何れかに記載の方法。
【請求項３３】
前記ホルボールエステルは、12-O-テトラデカノイルホルボール-13-アセタート又はその医薬的に許容可能な塩である、請求項24乃至32の何れかに記載の方法。
【請求項３４】
前記SETリボソームアンタゴニストは、SETリボソームによるタンパク質合成を阻害する、請求項24乃至33の何れかに記載の方法。
【請求項３５】
前記SETリボソームアンタゴニストは、アニソマイシン、シクロヘキシミド、エメチン、その医薬的に許容可能な塩、及びその何れか2つ以上の組合せからなる群から選択される、請求項24乃至34の何れかに記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞傷害性薬物は、カペシタビン又はその医薬的に許容可能な塩を含み、前記SETアゴニストは、ポリオキシル35硬化ヒマシ油を含み、前記SETリボソームアンタゴニストは、アニソマイシン又はその医薬的に許容可能な塩を含む、請求項24乃至35の何れかに記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞傷害性薬物は、カペシタビン又はその医薬的に許容可能な塩を含み、前記SETアゴニストは、ポリオキシル35硬化ヒマシ油を含み、前記SETリボソームアンタゴニストは、エメチン又はその医薬的に許容可能な塩を含む、請求項24乃至36の何れかに記載の方法。
【請求項３８】
前記対象は、ヒトである、請求項24乃至37の何れかに記載の方法。
【請求項３９】
前記増殖性障害は、薬剤耐性癌及び/又は転移性癌である、請求項24乃至38の何れかに記載の方法。
【請求項４０】
前記細胞傷害性薬物、前記SETアゴニスト、及び前記SETリボソームアンタゴニストは、同時に投与される、請求項24乃至39の何れかに記載の方法。
【請求項４１】
前記細胞傷害性薬物、前記SETアゴニスト、及び前記SETリボソームアンタゴニストは、異なる時間に投与される、請求項24乃至40の何れかに記載の方法。
【請求項４２】
前記SETアゴニスト及び前記SETリボソームアンタゴニストは、医薬製剤中で一緒に投与される、請求項24乃至41の何れかに記載の方法。
【請求項４３】
前記SETアゴニスト及び前記SETリボソームアンタゴニストは、医薬製剤中で一緒に経口投与される、請求項24乃至42の何れかに記載の方法。
【請求項４４】
更に、補助治療処置を含む、請求項24乃至43の何れかに記載の方法。
【請求項４５】
前記補助治療処置は、前記対象の放射線治療を含む、請求項24乃至44の何れかに記載の方法。
【請求項４６】
前記補助治療処置は、1種類以上の追加細胞傷害性薬物の投与を含む、請求項24乃至45の何れかに記載の方法。
【請求項４７】
前記細胞傷害性薬物は、注射により投与される、請求項24乃至46の何れかに記載の方法。
【請求項４８】
前記細胞傷害性薬物は、静脈内投与される、請求項24乃至47の何れかに記載の方法。
【請求項４９】
異常細胞を特徴とする前記増殖性障害を有する前記対象の異常細胞を、前記SETアゴニスト又はSETリボソームアンタゴニストと接触させる前に、前記細胞傷害性薬物に接触させる、請求項24乃至48の何れかに記載の方法。
【請求項５０】
前記異常細胞は、癌細胞である、請求項24乃至49の何れかに記載の方法。
【請求項５１】
発現カセットは、ヒト及びマウスTRエレメントから選択されるTRエレメントをコードする、請求項13乃至23の何れかに記載の方法又は細胞。
【請求項５２】
発現カセットは、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、又はその何れかの変異体によりコードされたものから選択されたTRエレメントをコードし、前記コードされたTRレメントは、mRNA内で適切に作動可能に連結されたコード配列に選択的翻訳をもたらす、請求項13乃至23の何れかに記載の方法又は細胞。
【請求項５３】
前記発現カセットは、抗原エピトープ、生物発光タンパク質、酵素、蛍光タンパク質、受容体、及びトランスポーターから選択されたレポーターをコードする、請求項13乃至23及び52の何れかに記載の方法又は細胞。
【請求項５４】
前記発現カセットは、ルシフェラーゼ、GFP、EYFP、mRFP1、β-Gal、及びCATから選択されたレポーターをコードする、請求項13乃至23及び52乃至53の何れかに記載の方法又は細胞。
【請求項５５】
実質的に本明細書に記載の治療方法。
【請求項５６】
実質的に本明細書に記載の医薬組成物。
【請求項５７】
実質的に本明細書に記載の増殖性疾患を治療するためのSET複合薬の成分として有効な作用剤を同定する方法。
【請求項５８】
本明細書に記載の第3階級外れ値SET応答を特徴とする単離された非天然型細胞。
【請求項５９】
実質的に本明細書に記載の転移性癌細胞株モデルを生成する方法。
【請求項６０】
実質的に本明細書に記載のインビボでのG2期進行を促進又は阻害するのに有効な作用剤を同定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[関連出願の相互参照]
本願は、出典を明記することによりその開示内容全体を本願明細書の一部とした、2014年12月3日提出の米国仮特許出願第62/087,023号に基づく優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、異常に増殖する細胞を阻害するための方法及び組成物に関する。特定の態様によれば、本発明の方法及び組成物は、インビトロ及びインビボで、選択的翻訳を検出すること及びこれに影響を与えることに関する。
【背景技術】
【０００３】
癌は、離れた器官に広がり、患者の早期の死亡を引き起こす潜在力を獲得した上皮、結合組織、血液、及びリンパ細胞、並びに他の稀な細胞型(例えば、神経膠腫)の異常な加速的成長を特徴とする。2014年には、約170万件の新たな癌症例が診断され、米国では585,700人が死亡しており、1日当たり約1,600人に達する。今年、癌は、心臓病に次いで米国で2番目に多い死亡原因となり、死亡者の4人に1人近くを占めるであろう。癌を含む増殖性障害の治療に関連する組成物及び方法に対する必要性は、引き続き存在している。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、一態様において、患者における増殖性障害を治療する方法であって、治療有効量の選択的翻訳(SET)治療物質を患者に投与することを含む方法を提供する。本明細書で使用される「SET治療物質」という用語は、細胞傷害性薬物を選択的翻訳(SET)複合薬と組み合わせ、医薬的に許容可能な担体又は賦形剤により送達されるものを示す。SET治療物質は、癌、特に薬剤耐性癌及び/又は転移性癌等、多様な新生物性障害を予防及び/又は治療するために、本発明の態様により、必要とする患者に投与される。
【０００５】
SET複合薬には、SET応答のアゴニスト(SETアゴニスト)とSETリボソームのアンタゴニスト(SETリボソームアンタゴニスト)とが含まれる。
【０００６】
この合剤(drug combination)により治療及び/又は予防することが可能な、限定ではない代表的な癌には、薬剤耐性結腸直腸癌、乳癌、リンパ腫、白血病、メラノーマ、及び前立腺癌が含まれる。一対の組み合わせとして、又はCMC、FEC、FOLFIRI、CAPOXIRI、XELIRI、CAPOX、XELOX、CAPOXIRI等の複合薬の一部として、カペシタビン又は5-FU/ロイコボリンを含有するSET治療物質により治療可能な癌の非限定的なリストには、転移性乳癌、転移性結腸及び直腸癌、膵臓癌、肛門癌、胃及び食道癌、胆管及び胆嚢の癌、胆管細胞癌、肝細胞癌、神経膠腫、上衣腫、卵巣子宮内膜癌及び子宮頸癌、膀胱癌、転移性腎細胞癌、非小細胞肺癌、頭頸部癌、鼻咽頭癌、光線性(日光性)角化症、及び幾つかの種類の基底細胞癌(ボーエン病)が含まれる。一対の組み合わせとして、又はTCH、TC、AC、TIP、TPF等の複合薬の一部として、パクリタキセル又はドセタキセルを含有するSET治療物質により治療可能な癌の非限定的なリストには、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、頭頸部癌、カポジ肉腫、膵臓癌、胆道癌、膀胱癌、子宮内膜癌、及び胃癌が含まれる。一対の組み合わせとして、又はFOLFIRI、CAPOXIRI、及びXELIRI等の複合薬の一部として、イリノテカン又はトポテカンを含有するSET治療物質により治療可能な癌の非限定的なリストには、転移性結腸及び直腸癌、卵巣の転移性癌、IV-B期再発又は持続性子宮頸癌、小細胞肺癌、未分化星状細胞腫、混合悪性神経膠腫、乏突起膠腫、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、神経芽細胞腫、乳癌、白血病、及びリンパ腫が、単剤療法として又は他の薬物との組み合わせにおいて含まれる。一対の組み合わせとして、又はFOLFOX、CAPOX、XELOX、及びCAPOXIRI等の複合薬の一部として、オキサリプラチンを含有するSET治療物質により治療することが可能な癌の非限定的なリストには、膵臓の腺癌、乳頭及び乳頭部周囲癌、肛門の腺癌、虫垂癌、転移性結腸及び直腸癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、小腸癌、精巣癌、慢性リンパ球性白血病、非ホジキンリンパ腫、末梢T細胞リンパ腫、大型B細胞リンパ腫、及び胆嚢癌が含まれる。一対の組み合わせとして、又はAC、AP、CMF、及びFEC等の複合薬の一部として、シクロホスファミドを含有するSET治療物質により治療可能な癌の非限定的なリストには、乳癌、神経芽細胞腫(播種性疾患)、網膜芽細胞腫、卵巣の腺癌、悪性リンパ腫(Ann Arbor病期分類システムのIII及びIV期)、ホジキン病、リンパ球性リンパ腫(結節性又はびまん性)、混合細胞型リンパ腫、組織球性リンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、慢性リンパ球性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性骨髄性及び単球性白血病、小児における急性リンパ芽球性(幹細胞性)白血病が含まれる。
【０００７】
TCH: パクリタキセル、カルボプラチン、及びトラスツズマブ、TC: ドセタキセル及びシクロホスファミド、AC: ドキソルビシン及びシクロホスファミド、TAC: ドセタキセル及びドキソルビシン、AP: パクリタキセル及びドキソルビシン並びにシクロホスファミド(Cytoxan)500mg/m2 iv d1、TIP: パクリタキセル、イホスファミド、及びシスプラチン、TPF: ドセタキセル、シスプラチン、及びフルオロウラシル(5-FU)、GTX: ゲムシタビン、カペシタビン、及びドセタキセル、CMF: シクロホスファミド、メトトレキサート、及び5-FU、FEC: 5-FU、エピルビシン、及びシクロホスファミド、XELOX(CAPOXとも呼ばれる): カペシタビンのオキサリプラチンとの併用、XELIRI: カペシタビンのイリノテカンとの併用、CAPOXIRI: カペシタビン、オキサリプラチン、及びイリノテカン、FL(Mayoとしても知られる): 5-FU及びロイコボリン(フォリン酸)、FOLFOX: 5-FU/、ロイコボリン、及びオキサリプラチン、FOLFIRI: 5-FU、ロイコボリン、及びイリノテカン(FOLFIRIには、モノクローナル抗体等、幾つかの薬物が追加される場合がある)、GTX: ゲムシタビン、カペシタビン、及びドセタキセル、PEXG: 塩酸ゲムシタビン、シスプラチン、塩酸エピルビシン、及びカペシタビン、FOLFIRINOX: 5-FU、ロイコボリン、イリノテカン、及びオキサリプラチン、ECF: エピルビシン、シスプラチン、及び5-FU、TPF: ドセタキセル、シスプラチン、及び5-FU。
【０００８】
合剤TCH、TC、AC、TAC、AP、TIP、TPF、GTX、CMF、FEC、XELOX、XELIRI、CAPOXIRI、FL、FOLFOX、FOLFIRI、GTX、PEXG、FOLFIRINOX、ECF、TPFの投与として知られる治療レジメンは、対象へのSET治療物質の投与と併せて用いることが可能であり、又は対象の特性及び治療すべき疾患の臨床評価に応じて変化させることができる。
【０００９】
一態様において、SET治療物質には、患者の体内で5-フルオロウラシル(5-FU)に変換される化合物を含む細胞傷害性薬物が含まれる。カペシタビンは、患者の体内で5-FUに変換される細胞傷害性薬物の一例である。
【００１０】
本発明の態様によれば、細胞傷害性薬物は、カペシタビン、5-FU/ロイコボリン、パクリタキセル、ドセタキセル、シクロホスファミド、トポテカン、イリノテカン、及びオキサリプラチンのうち1つ以上を含む。
【００１１】
本発明の態様によれば、含まれるSETアゴニストは、ホルボールエステル、ホルボールエステルの誘導体、ブリオスタチン、及びポリオキシル硬化ヒマシ油(polyoxyl hydrogenated castor oil)のうち1つ以上である。
【００１２】
本発明の態様によれば、含まれるSETリボソームアンタゴニストは、アニソマイシン、シクロヘキシミド、及び/又はエメチンである。
【００１３】
細胞傷害性薬物により治療される対象において細胞傷害性薬物の有効性を強化する方法が、本発明の態様により提供される。この態様において、SET複合薬は、細胞周期の進行を刺激し、細胞毒性傷害後の薬剤耐性腫瘍の回復を阻止し、細胞死を促進する。
【００１４】
本発明の態様によれば、SET複合薬は、細胞傷害性薬物と同時に投与される。本発明の態様によれば、SET複合薬は、患者への細胞傷害性薬物の投与と異なる時間に患者に投与される。更に、SET複合薬のSETアゴニスト及びSETリボソームアンタゴニスト成分は、両方一緒に又は別々に、更に細胞傷害性薬物と一緒に又は別々に、随意に投与される。好適な態様において、細胞傷害性薬物は、SET複合薬の前に投与される。
【００１５】
患者への細胞傷害性薬物の投与と異なる時間にSET複合薬を患者に投与する本発明の態様によれば、SET複合薬は、好ましくは、細胞傷害性薬物の投与後10分、30分、1時間、2時間、3時間、4時間、8時間、12時間、24時間、48時間、72時間、4日、5日、6日、又は7日以内に投与される。SET複合薬のSETアゴニスト及びSETリボソームアンタゴニスト成分が互いに別々に投与される場合、は好ましくは、互いに10分、30分、1時間、2時間、3時間、4時間、8時間、12時間、24時間、48時間、72時間、4日、5日、6日、又は7日以内に投与される。
【００１６】
本発明の態様によれば、SET複合薬は、5-FU/ロイコボリン、カペシタビン、シクロホスファミド、トポテカン、イリノテカン、オキサリプラチン、ドセタキセル、及び/又はパクリタキセルと同時に患者に投与される。
【００１７】
本発明の態様によれば、SET複合薬は、5-FU/ロイコボリン、カペシタビン、シクロホスファミド、トポテカン、イリノテカン、オキサリプラチン、ドセタキセル、及び/又はパクリタキセルとは異なる時間に患者に投与される。
【００１８】
SET治療物質は、任意の医薬的に許容可能な経路により投与することができる。本発明の態様によれば、SET治療物質は、経口及び/又は非経口経路により患者に投与される。本発明の態様によれば、SET治療物質は、静脈内又は皮下経路により患者に投与される。
【００１９】
哺乳動物である対象における異常細胞を特徴とする増殖性障害の治療方法であって、細胞傷害性薬物、SETアゴニスト、及びSETリボソームアンタゴニストの組み合わせの医薬的有効量を投与することを含む方法が、本発明の態様により提供される。異常細胞には、有糸分裂異常細胞及び非有糸分裂異常細胞の両方が含まれ、異常細胞及び非有糸分裂異常細胞の両方は、細胞傷害性薬物、SETアゴニスト、及びSETリボソームアンタゴニストの組み合わせの医薬的有効量を投与することにより、死滅させられ、この組み合わせは、細胞傷害性薬物単独の投与と比較して、G2期における異常細胞死の増加を促進する。
【００２０】
哺乳動物である対象における異常細胞を特徴とする増殖性障害の治療方法であって、細胞傷害性薬物、SETアゴニスト、及びSETリボソームアンタゴニストの組合せは、SETアゴニスト及びSETリボソームアンタゴニストを用いずに細胞傷害性薬物を投与することによる治療と比較して、異常細胞を死滅させるのに必要な細胞傷害性薬物の用量を低下させる効果を有する方法が、本発明の態様により提供される。
【００２１】
細胞傷害性薬物は、カペシタビン、シクロホスファミド、トポテカン、パクリタキセル、5-FU/ロイコボリン、ドセタキセル、イリノテカン、及びオキサリプラチン、その医薬的に許容可能な塩、及びその何れか2つ以上の組み合わせからなる群から、本発明の治療方法の態様により選択される。
【００２２】
SETアゴニストがG2期進行の刺激因子である、哺乳動物である対象における異常細胞を特徴とする増殖性障害の治療方法が、本発明の態様により提供される。本発明の他の態様によれば、SETアゴニストは、ポリオキシル硬化ヒマシ油、ホルボールエステル、ブリオスタチン、その医薬的に許容可能な塩、及びその何れか2つ以上の組合せからなる群から選択される。
【００２３】
本発明の他の態様によれば、ポリオキシル硬化ヒマシ油は、ポリオキシル30硬化ヒマシ油、ポリオキシル35硬化ヒマシ油、ポリオキシル40硬化ヒマシ油、ポリオキシル50硬化ヒマシ油、ポリオキシル60硬化ヒマシ油、及びその任意の2つ以上の組み合わせからなる群から選択される。
【００２４】
本発明の他の態様によれば、ポリオキシル硬化ヒマシ油は、ポリオキシル35硬化ヒマシ油、ポリオキシル40硬化ヒマシ油、又はポリオキシル35硬化ヒマシ油及びポリオキシル40硬化ヒマシ油である。
【００２５】
本発明の他の態様によれば、ブリオスタチンは、ブリオスタチン1及び/又はブリオスタチン2であり、又はその医薬的に許容可能な塩である。
【００２６】
本発明の他の態様によれば、ホルボールエステルは、12-O-テトラデカノイルホルボール-13-アセタート又はその医薬的に許容可能な塩である。
【００２７】
本発明の態様により投与されるSETリボソームアンタゴニストは、SETリボソームによるタンパク質合成を阻害する。本発明の態様によれば、SETリボソームアンタゴニストは、アニソマイシン、シクロヘキシミド、エメチン、その医薬的に許容可能な塩、及びその組み合わせからなる群から選択される。
【００２８】
哺乳動物である対象における異常細胞を特徴とする増殖性障害の治療方法であって、1)5-フルオロウラシル/ロイコボリン、カペシタビン、シクロホスファミド、イリノテカン、トポテカン、パクリタキセル、ドセタキセル、オキサリプラチン、その医薬的に許容可能な塩、又はその何れか2つ以上の組み合わせと、2)ポリオキシル35硬化ヒマシ油、ポリオキシル40硬化ヒマシ油、又はその両方の組み合わせと、3)エメチン、シクロヘキシミド、アニソマイシン、その何れかの医薬的に許容可能な塩、又はその何れか2つ以上の組み合わせと、を組み合わせたものの医薬的有効量を投与することを含む方法が、本発明の態様により提供される。異常細胞には、有糸分裂異常細胞及び非有糸分裂異常細胞の両方が含まれ、異常細胞及び非有糸分裂異常細胞の両方は、医薬的有効量の1)、2)、及び3)の投与により、死滅させられる。
【００２９】
哺乳動物である対象における異常細胞を特徴とする増殖性障害の治療方法であって、1)5-フルオロウラシル/ロイコボリン、カペシタビン、シクロホスファミド、イリノテカン、トポテカン、パクリタキセル、ドセタキセル、オキサリプラチン、その医薬的に許容可能な塩、又はその何れか2つ以上の組み合わせと、2)ポリオキシル35硬化ヒマシ油、ポリオキシル40硬化ヒマシ油、又はその両方の組み合わせと、3)エメチン、シクロヘキシミド、アニソマイシン、その何れかの医薬的に許容可能な塩、又はその何れか2つ以上の組み合わせと、を組み合わせたものは、2)ポリオキシル35硬化ヒマシ油、ポリオキシル40硬化ヒマシ油、又はその両方の組み合わせと、3)エメチン、シクロヘキシミド、アニソマイシン、その何れかの医薬的に許容可能な塩、又はその何れか2つ以上の組み合わせと、を用いずに細胞傷害性薬物を投与することによる治療と比較して、異常細胞を死滅させるのに必要な、5-フルオロウラシル/ロイコボリン、カペシタビン、イリノテカン、トポテカン、パクリタキセル、ドセタキセル、オキサリプラチン、シクロホスファミド、その医薬的に許容可能な塩、又はその何れか2つ以上の組み合わせから選択された細胞傷害性薬物の用量を低下させる効果を有する方法が、本発明の態様により提供される。
【００３０】
哺乳動物である対象における異常細胞を特徴とする増殖性障害の治療方法であって、細胞傷害性薬物、SETアゴニスト、及びSETリボソームアンタゴニストの組み合わせは、表13に参照番号1乃至96として示した組み合わせの何れか1つであり、参照番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、又は96として示した細胞傷害性薬物、SETアゴニスト、及びSETリボソームアンタゴニストの組み合わせを含み、そのうちの1つ以上が特に検討される方法が、本発明の態様により提供される。
【００３１】
哺乳動物である対象における異常細胞を特徴とする増殖性障害の治療方法であって、対象は、ヒトである方法が、本発明の態様により提供される。
【００３２】
哺乳動物である対象における異常細胞を特徴とする増殖性障害の治療方法であって、増殖性障害は、薬剤耐性癌である方法が、本発明の態様により提供される。
【００３３】
哺乳動物である対象における異常細胞を特徴とする増殖性障害の治療方法であって、増殖性障害は、転移性癌である方法が、本発明の態様により提供される。
【００３４】
哺乳動物である対象における異常細胞を特徴とする増殖性障害の治療方法であって、増殖性障害は、乳癌、転移性乳癌、結腸癌、転移性結腸癌、転移性乳癌、肛門癌、転移性直腸癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、食道癌、胆管癌、胆嚢癌、胆管細胞癌、肝細胞癌、神経膠腫、上衣腫、転移性卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、子宮頸部の再発又は持続性癌、膀胱癌、腎細胞癌、転移性腎細胞癌、非小細胞肺癌、頭頸部癌、鼻咽頭癌、卵巣癌、網膜芽細胞腫、神経芽細胞腫、未分化星状細胞腫、混合悪性神経膠腫、乏突起膠腫、前立腺癌、膵臓の腺癌、乳頭及び乳頭部周囲癌、肛門の腺癌、卵巣の腺癌、虫垂癌、精巣癌、小細胞肺癌、小腸癌、白血病、慢性リンパ球性白血病、リンパ腫、混合細胞型リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、末梢T細胞リンパ腫、大型B細胞リンパ腫、カポジ肉腫、悪性リンパ腫(Ann Arbor病期分類システムのIII及びIV期)、ホジキン病、リンパ球性リンパ腫(結節性又はびまん性)、混合細胞型リンパ腫、組織球性リンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、慢性リンパ球性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性骨髄性及び単球性白血病、小児における急性リンパ芽球性(幹細胞性)白血病、胆道癌、基底細胞癌、再狭窄、瘢痕性及び光線性角化症からなる群から選択される方法が、本発明の態様により提供される。
【００３５】
哺乳動物である対象における異常細胞を特徴とする増殖性障害の治療方法であって、細胞傷害性薬物、SETアゴニスト、及びSETリボソームアンタゴニストは、同時に投与される方法が、本発明の態様により提供される。
【００３６】
哺乳動物である対象における異常細胞を特徴とする増殖性障害の治療方法であって、細胞傷害性薬物、SETアゴニスト、及びSETリボソームアンタゴニストは、異なる時間に投与される方法が、本発明の態様により提供される。
【００３７】
哺乳動物である対象における異常細胞を特徴とする増殖性障害の治療方法であって、SETアゴニスト及びSETリボソームアンタゴニストは、医薬製剤において一緒に投与される方法が、本発明の態様により提供される。
【００３８】
哺乳動物である対象における異常細胞を特徴とする増殖性障害の治療方法であって、SETアゴニスト及びSETリボソームアンタゴニストが、医薬製剤において一緒に経口投与される方法が、本発明の態様により提供される。
【００３９】
哺乳動物である対象における異常細胞を特徴とする増殖性障害の治療方法であって、補助治療処置を更に含む方法が、本発明の態様により提供される。
【００４０】
随意に、補助治療処置は、対象の放射線治療を含む。
【００４１】
他の選択肢として、補助治療処置は、1種類以上の追加化学療法薬の投与を含む。
【００４２】
哺乳動物である対象における異常細胞を特徴とする増殖性障害の治療方法であって、細胞傷害性薬物は、注射により投与される方法が、本発明の態様により提供される。
【００４３】
哺乳動物である対象における異常細胞を特徴とする増殖性障害の治療方法であって、細胞傷害性薬物は、静脈内投与される方法が、本発明の態様により提供される。
【００４４】
哺乳動物である対象における異常細胞を特徴とする増殖性障害の治療方法であって、異常細胞を特徴とする増殖性障害を有する対象の異常細胞を、SETアゴニスト又はSETリボソームアンタゴニストと接触させる前に、細胞傷害性薬物に接触させる方法が、本発明の態様により提供される。
【００４５】
哺乳動物である対象における異常細胞を特徴とする増殖性障害の治療方法であって、癌を有する対象の癌細胞を、SETアゴニスト又はSETリボソームアンタゴニストと接触させる前に、細胞傷害性薬物に接触させる方法が、本発明の態様により提供される。
【００４６】
哺乳動物である対象における異常細胞を特徴とする増殖性障害の治療方法であって、異常細胞を特徴とする増殖性障害を有する対象の異常細胞を、SETアゴニスト又はSETリボソームアンタゴニストと接触させる前に、細胞傷害性薬物に接触させる方法が、本発明の態様により提供される。
【００４７】
哺乳動物である対象における異常細胞を特徴とする増殖性障害の治療方法であって、細胞傷害性薬物、SETアゴニスト、及びSETリボソームアンタゴニストの組み合わせの医薬的有効量を投与することを含み、SETアゴニストの用量は、最大のSETリボソーム活性を発生させる濃度であり、SETリボソームアンタゴニストは、LD50の1/2500乃至1/5000の範囲でSETリボソーム活性のIC100を発生させる濃度である方法が、本発明の態様により提供される。異常細胞には、有糸分裂異常細胞及び非有糸分裂異常細胞の両方が含まれ、異常細胞及び非有糸分裂異常細胞の両方は、細胞傷害性薬物、SETアゴニスト、及びSETリボソームアンタゴニストの組み合わせの医薬的有効量の投与により、死滅させられ、SETアゴニストの用量は、最大のSETリボソーム活性を発生させる濃度であり、SETリボソームアンタゴニストは、LD50の1/2500乃至1/5000の範囲でSETリボソーム活性のIC100を発生させる濃度である。
【００４８】
医薬組成物であって、SETアゴニスト及びSETリボソームアンタゴニストを含む医薬組成物が、本発明の態様により提供される。
【００４９】
医薬組成物であって、SETアゴニスト及びSETリボソームアンタゴニストを含み、SETアゴニストがG2期進行の刺激因子である医薬組成物が、本発明の態様により提供される。
【００５０】
医薬組成物であって、SETアゴニスト及びSETリボソームアンタゴニストを含み、SETアゴニストは、ポリオキシル硬化ヒマシ油、ホルボールエステル、ブリオスタチン、その何れかの医薬的に許容可能な塩、及びその何れか2つ以上の組み合わせからなる群から選択される医薬組成物が、本発明の態様により提供される。
【００５１】
医薬組成物であって、SETアゴニスト及びSETリボソームアンタゴニストを含み、ポリオキシル硬化ヒマシ油は、ポリオキシル30硬化ヒマシ油、ポリオキシル35硬化ヒマシ油、ポリオキシル40硬化ヒマシ油、ポリオキシル50硬化ヒマシ油、ポリオキシル60硬化ヒマシ油、及びその何れか2つ以上の組み合わせからなる群から選択される医薬組成物が、本発明の態様により提供される。
【００５２】
医薬組成物であって、SETアゴニストは、ブリオスタチン1、ブリオスタチン2、その何れかの医薬的に許容可能な塩、及びその何れか2つ以上の組み合わせから選択される医薬組成物が、本発明の態様により提供される。
【００５３】
医薬組成物であって、SETアゴニストは、12-O-テトラデカノイルホルボール-13-アセタート又はその医薬的に許容可能な塩である医薬組成物が、本発明の態様により提供される。
【００５４】
SETリボソームアンタゴニストは、本明細書に記載の本発明の態様によるSETリボソームによるタンパク質合成を阻害する。
【００５５】
医薬組成物であって、アニソマイシン、シクロヘキシミド、エメチン、その医薬的に許容可能な塩、及びその何れか2つ以上の組合せからなる群から選択されるSETリボソームアンタゴニストを含む医薬組成物が、本発明の態様により提供される。
【００５６】
医薬組成物であって、ポリオキシル35硬化ヒマシ油及びアニソマイシン又はその医薬的に許容可能な塩を含む医薬組成物が、本発明の態様により提供される。
【００５７】
医薬組成物であって、ポリオキシル35硬化ヒマシ油及びエメチン又はその医薬的に許容可能な塩を含む医薬組成物が、本発明の態様により提供される。
【００５８】
医薬組成物であって、ポリオキシル35硬化ヒマシ油及びシクロヘキシミド又はその医薬的に許容可能な塩を含む医薬組成物が、本発明の態様により提供される。
【００５９】
医薬組成物であって、対象への経口投与用に製剤化された医薬組成物が、本発明の態様により提供される。
【００６０】
細胞傷害性薬物、SETアゴニスト、及び/又はSETリボソームアンタゴニストの誘導体は、本発明の態様による組成物及び方法において有用であり、それらに含めることが具体的に想到される。「誘導体」という用語は、未改変組成物との同定可能な構造的関係を保持し、未改変組成物の機能を保持するか、又は未改変組成物に対して機能性が向上した改変組成物を示す。
【００６１】
本発明の態様によれば、方法及び組成物は、TRエレメントをコードする発現カセットを含む。本発明の態様によれば、コードされたTRエレメントは、ヒト又はマウスTRエレメントから選択される。本発明の好適な態様によれば、TRエレメントは、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、又はその任意の変異体によりコードされたものから選択され、コードされたTRエレメントは、mRNA内で適切に作動可能に連結されたコード配列に選択的翻訳をもたらす。
【００６２】
本発明の態様による増殖性疾患治療用のSET複合薬の成分として有効な作用剤を同定する方法は、TR第3階級外れ値SET応答を特徴とする細胞であり、TRエレメント及びレポーターをコードし、細胞のゲノム内に安定的に組み込まれた発現カセットを含む細胞を提供することと、細胞を試験物質に接触させることと、対照と比較したSETリボソームからのタンパク質合成に対する試験物質の効果を測定することと、を含み、試験物質によるSETリボソームからのタンパク質合成の阻害により、その物質は、増殖性疾患治療用のSET複合薬の成分として有効な作用剤として同定される方法である。
【００６３】
本発明の態様による増殖性疾患治療用のSET複合薬の成分として有効な作用剤を同定する方法は、TR第3階級外れ値SET応答により特徴付けられる細胞を提供することを含むと共に、懸濁培養において非接着性3Dとして成長するインビトロでの能力、及び/又は切断しサブフラグメント化して二次性腫瘍として増殖させることが可能な原発性異種腫瘍をインビボで引き起こし、これに成長する能力により更に特徴付けられる細胞を提供することを含む。
【００６４】
単離された非天然型TR第4階級細胞であって、TR第3階級外れ値SET応答を特徴とする細胞が、本発明の態様により提供される。
【００６５】
単離された非天然型TR第4階級細胞であって、TR第3階級外れ値SET応答により特徴付けられると共に、懸濁培養において非接着性3D構造として成長するインビトロでの能力、及び/又はインビボで原発性異種腫瘍を引き起こし、これに成長する能力により更に特徴付けられ、原発性異種腫瘍は、切断してサブフラグメントとし、二次性腫瘍として繁殖させることが可能となる細胞が、本発明の態様により提供される。
【００６６】
転移性癌細胞株モデルを生成する方法であって、TRエレメント及びレポーターをコードする発現カセットを細胞に導入して、発現カセットが細胞のゲノム内に安定的に組み込まれた細胞の親集団を作成することと、親集団のサブクローンを単離することと、SETアゴニストを各サブクローンの細胞集団に投与して、各サブクローンの細胞集団においてSET TR応答を誘導することと、レポーターの発現を検出することにより、各サブクローンの細胞集団におけるTR SET応答をアッセイすることと、各サブクローンのTR SET応答を互いのサブクローンと比較して順位付けし、平均応答により特徴付けられるTR SET応答の範囲を確立することと、平均応答よりも少なくとも2標準偏差だけ大きな、レポーターの発現の検出可能な増加を特徴とするサブクローンを選択することにより、選択されたサブクローンをTR第3階級SET応答サブクローンとして定義することと、各TR第3階級SET応答サブクローンの細胞集団にSETアゴニストを投与して、各TR第3階級SET応答サブクローンの細胞集団においてSET TR応答を誘導することと、レポーターの発現を検出することにより、各TR第3階級SET応答サブクローンの細胞集団におけるTR SET応答をアッセイすることと、各TR第3階級SET応答サブクローンのTR SET応答を、互いのTR第3階級SET応答サブクローンと比較して順位付けし、平均応答により特徴付けられるTR SET応答の範囲を確立することと、平均応答よりも少なくとも2標準偏差だけ大きな、レポーターの発現の検出可能な増加を特徴とするTR第3階級SET応答サブクローンを選択することにより、選択されたTR第3階級SET応答サブクローンをTR第3階級SET応答外れ値サブクローンとして定義することと、TR第3階級SET応答外れ値サブクローンとして特徴付けられた1つ以上のサブクローンの細胞に1つ以上の毒素を投与することと、サブクローンの細胞におけるSETリボソーム活性の上昇による薬剤及びストレス耐性を示す、TR第3階級SET応答外れ値サブクローンとして特徴付けられた1つ以上のサブクローンの細胞の応答を検出することにより、細胞がTR第4階級細胞であることを決定することと、これにより、転移性癌細胞株モデルを生成することと、を含む方法が、本発明の態様により提供される。
【００６７】
転移性癌細胞株モデルを生成する方法であって、更に、TR第4階級細胞を低密度条件下で少なくとも50細胞周期に亘り培養して、低密度コロニー形成が可能なTR第4階級サブクローンを生成することと、低密度コロニー形成が可能なTR第4階級サブクローンを選択することと、低密度コロニー形成が可能な各TR第4階級サブクローンの細胞集団にSETアゴニストを投与して、TR SET応答を誘導することと、レポーターの発現を検出することにより、TR SET応答を誘導する低密度コロニー形成が可能な各TR第4階級サブクローンの細胞集団におけるSET応答をアッセイすることと、低密度コロニー形成が可能な各TR第4階級サブクローンのTR SET応答を、低密度コロニー形成が可能なTR第4階級サブクローンと互いに比較して順位付けし、平均応答により特徴付けられるSET応答の範囲を確立することと、低密度コロニー形成が可能であり、平均応答よりも少なくとも2標準偏差だけ大きなレポーターの発現の検出可能な増加を特徴とするTR第4階級サブクローンを選択することと、を含む方法が、本発明の態様により提供される。
【００６８】
転移性癌細胞株モデルを生成する方法であって、更に、TR第4階級細胞を非接着性の低密度培養条件下で培養すると共に、懸濁凝集体として増殖するTR第4階級細胞のサブクローンを選択することにより、腫瘍様塊を引き起こす10個以下の細胞によるエクスビボ腫瘍様塊形成が可能なTR第4階級細胞のサブクローンを選択することと、腫瘍様塊応答を引き起こす10個以下の細胞によるエクスビボ腫瘍様塊形成が可能なTR第4階級サブクローンの細胞に1つ以上の毒素を投与することと、サブクローンの細胞におけるSETリボソーム活性の上昇による薬剤及びストレス耐性を示す、腫瘍様塊を引き起こす10個以下の細胞によるエクスビボ腫瘍様塊形成が可能なTR第4階級サブクローンの細胞の応答を検出することにより、TR第4階級サブクローンの細胞が、10個以下の細胞によるエクスビボ腫瘍様塊形成が可能であり、TR第4階級TR SET応答により特徴付けられることを決定することと、を含む方法が、本発明の態様により提供される。
【００６９】
インビボでのG2期進行を促進又は阻害するのに有効な作用剤を同定する方法であって、TR第3階級外れ値SET応答により特徴付けられるTR第4階級細胞株の細胞であり、TRエレメント及びレポーターをコードするTR核酸発現カセットを含む細胞を提供することと、細胞を非ヒト動物に投与し、非ヒト動物において異種移植腫瘍を作成することと、試験物質を非ヒト動物に投与することと、SET応答に対する試験物質の効果を測定することと、を含み、SET応答の増加により、インビボでのG2期進行を促進するのに有効なSETアゴニストとして作用剤が同定される方法が、本発明の態様により提供される。
【００７０】
インビボでのG2期進行を促進又は阻害するのに有効な作用剤を同定する方法であって、更に、インビボでのG2期進行を促進するために非ヒト動物にSETアゴニストを投与することを含み、SET応答の減少により、インビボでのG2期進行を阻害するのに有効なSETアンタゴニストとして作用剤が同定される方法が、本発明の態様により提供される。
【００７１】
インビボでのG2期進行を促進又は阻害するのに有効な作用剤を同定する方法であって、更に、異種移植腫瘍に対する試験物質の効果を測定することを含む方法が、本発明の態様により提供される。
【００７２】
非ヒト動物は、任意の適切な動物である。本発明の態様によれば、非ヒト動物は、齧歯類、ウサギ、サル、又は他の非ヒト霊長類である。本発明の態様によれば、非ヒト動物は、ラット又はマウスである。
【００７３】
本発明の態様によるインビボでのG2期進行を促進又は阻害するのに有効な作用剤を同定する方法は、TR第3階級外れ値SET応答により特徴付けられるTR第4階級細胞株の細胞であり、TRエレメント及びレポーターをコードし、細胞のゲノム内に安定的に組み込まれたTR核酸発現カセットを含む細胞を提供することと、細胞を非ヒト動物に投与して、非ヒト動物において異種移植腫瘍を作成することと、試験物質を非ヒト動物に投与することと、異種移植腫瘍に対する試験物質の効果を測定することと、SET応答に対する試験物質の効果を測定することと、を含み、SET応答の増加により、インビボでのG2期進行を促進するのに有効なSETアゴニストとして作用剤が同定される。
【００７４】
本発明の態様によるインビボでのG2期進行を促進又は阻害するのに有効な作用剤を同定する方法は、TR第3階級外れ値SET応答により特徴付けられるTR第4階級細胞株の細胞であり、TRエレメント及びレポーターをコードし、細胞のゲノム内に安定的に組み込まれたTR核酸発現カセットを含む細胞を提供することと、細胞を非ヒト動物に投与して、非ヒト動物において異種移植腫瘍を作成することと、試験物質を非ヒト動物に投与することと、SETアゴニストを非ヒト動物に投与することと、細胞のSET応答に対する試験物質の効果を測定することと、を含み、SET応答の減少により、インビボでのG2期進行を阻害するのに有効なSETアンタゴニストとして作用剤が同定される。
【００７５】
本発明の態様によるインビボでのG2期進行を促進又は阻害するのに有効な作用剤を同定する方法は、更に、異種移植腫瘍に対する試験物質の効果を測定することを随意に含む。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】図1Aは、キャップ依存性翻訳を妨げ、SETリボソーム翻訳を調節するTR発現カセット内の配列要素を示す概略図である。TR発現カセットは、哺乳動物のプロテオリピド蛋白質(plp)遺伝子に由来している。カセットは、5'キャップ構造からレポーター遺伝子開始コドンまでのリボソームスキャニングを妨げる、複数の上流開始コドン、終止コドン(矢印として示す)、及び短いオープンリーディングフレーム(uORF1乃至9、ボックスとして示す)を含む。部位特異的変異誘発により、内部PIRP ORF(TR IRES、表1)の翻訳のためのリボソームローディング部位として機能するエクソン4におけるRNAセグメントを定めた。この部位は、Gtx IRESにおけるリボソームローディングを指示する配列との強い相同性を有する18S RNA相補的配列を含む(表1に示すアライメント)。エクソン5及び6内の配列は、内部翻訳開始に必須ではないと思われるが、遺伝子カセットの3'末端(エクソン7)は、IRES機能の主要制御因子を含む(TRレギュレーター、表1)。この領域における欠失及び点変異は、恐らくはRNA二次構造(表2に要約)の破壊により、開始コドン選択の忠実性及びTR IRES翻訳のストレス特異性に影響を与える。レギュレーター配列は、更に、カリシウイルス翻訳終結再開モチーフとの相同性が高い別個の18S RNA相補的配列を含み(表1に示すアライメント)、これは、レポーター遺伝子の翻訳が再開機構により生じることを意味する。図1Bは、100nMの12-O-テトラデカノイルホルボール-13-アセタート(TPA)により6時間連続処理したHEK293 hTRdm-gLUC#79細胞株から放出された分泌型ガウシアルシフェラーゼ(gLUC)レポータータンパク質を測定したSETの経時変化を示す。統計的分析(スチューデントの両側t検定)により、処置2時間後のキャップ依存性翻訳減少時(矢印)に、有意なSETの増加が見つかった。gLUCタンパク質合成のタイミングは、急速に複製する細胞が、細胞周期のG1/S期又はS期の初期にはTR発現カセットからのSETを示さないが、S期の後期(処置後2時間より後)にSETリボソームを活性化することを示している。細胞が細胞周期のG2期(3.5乃至6時間)に入り、gLUC合成、輸送、及び分泌がSETのTPA活性化により妨げられない状態が確立されると、SETリボソーム活性の増加が観察された。
【図２】図2は、キャップ依存性及びSETリボソーム特異的翻訳の熱ショック調節を示す。構成的に(CMV株)又はTR発現カセットの一部として(hTR及びmTR株)、ホタルルシフェラーゼ(fLuc)レポーターを発現するHEK293由来細胞株を、42℃で6時間(図2A)又は3時間(図2B)連続して加熱し、1時間間隔でfLuc活性についてアッセイした。予想通り、連続的な致死的熱処理により、CMV株におけるキャップ依存性fLuc発現がブロックされ、fLuc活性は、継続する代謝回転の結果として、アッセイ全体で低下し続ける。キャップ依存性翻訳阻害のタイミングは、致死温度(41℃)で処置したマウスの生存率の時間依存性の減少と密接に相関し、45分以内に統計的に有意となる。一方、TR株におけるSET依存性fLuc発現は、2時間以内に検出可能となり、アッセイ期間全体で増加し続ける。図2Bは、1乃至2時間の熱暴露の間にSET誘導が生じることを示している。処置後4時間までに、TR細胞株のSET応答は、固有の熱生存率(致命的な熱ショックに対する耐性)に基づいて定義済みのTR SETクラスに分かれる。TR第3階級細胞のサブセット(TR第4階級、hTRdm-fLUC#122と呼ぶ)は、第3階級の平均と比較して、熱誘導SET活性の統計的に有意な増加を示し、処置後8時間において細胞生存率の向上を示した(トリパンブルー染色により測定)。これらの結果は、エクスビボ及びインビボの熱生存率が、タンパク質合成の回復が可能なリボソームの別個の集団(SETリボソームと呼ぶ)の存在と相関することを示している。
【図３】図3は、キャップ依存性及びSETリボソーム翻訳の熱調節を示す。略語: TPA: 12-O-テトラデカノイルホルボール-13-アセタート、Tax: パクリタキセル、MG: MG132、Cal: カルシウムイオノフォアA23187、Topo: トポテカン。図3A及び3Bは、低周囲温度(23℃)及び高温(42℃)での、5つの参照標準試薬(表3)に対するTRクラス特異的SET応答を実証するトレンドプロットを示す。構成的に(CMV株)又はTR発現カセットの一部として(hTR及びmTR株)、fLucレポーターを発現するHEK293由来細胞株を、参照標準試薬(フルネーム及び用量は表3)により処理し、指定温度で6時間インキュベートし、fLuc活性についてアッセイした。fLucレポーターがキャップ依存性リボソームにより翻訳されるCMV細胞株において、全ての参照標準応答は、熱及び低温により抑制される。fLucレポーターがSETリボソームにより翻訳されるTR細胞株において、一部の参照標準応答は、TR SETクラスに応じて異なる、予測不能な変化を示す。TR第2階級のhTRdm-fLUC#8細胞は、熱に応じたSETリボソームの活性化が最も低い(図3A)。42℃の傾向線は、37℃と同じプロファイルを示しているが、TPA、TPA+Tax、及びTPA+Calのみが、未処理の試料と比較して、fLuc活性が向上している。Taxの応答は、ベースラインより上昇していないが、42℃でも、23℃と37℃と同様に低下しておらず、TR第3階級のトレンドプロットにおける42℃のTaxのピークと一致している。この細胞株における低温処理の影響は、それほど劇的ではなく、参照標準応答の性質ではなく、参照標準応答の大きさに影響している。hTRdm-fLUC#8細胞株とは対照的に、TR第3階級のmTRdm-fLUC#12及びhTRdm-fLUC#122細胞のSETリボソームは、23℃において、37℃及び42℃よりも活性が低い。熱は、TPA、TPA+Tax、TPA+Cal、Tax、Tax+Cal、及びCalの応答に対して刺激効果を有する。以前と同じく、2つのTR第3階級細胞株のうちの1つは、37℃及び42℃でSETリボソーム活性向上を示した。23℃においてのみ、TR第2階級乃至3の応答は、Tax、Tax+Cal、及びCalの応答での同様のSETの大きさ及び抑制を示す。図3Bに示すように、23℃のSETトレンドプロットは、hTR及びmTR細胞株において、TPAによるSETリボソーム活性化が23℃で保持される一方、Tax応答が、より高い温度を要するように思えることを示している。Calの応答は、高温及び低温での応答間の大きさの違いのため、検出は容易ではなかったが、観察可能であり、但し大幅に減少した形となっている。CMVの傾向線は、SETリボソームとは対照的に、キャップ依存性リボソームが周囲温度により完全に不活性化されることを示している。
【図４】図4は、ラパマイシンによるmTORC1の不活性化がSETリボソーム活性を刺激することを示す。略語: T/T: 12-O-テトラデカノイルホルボール-13-アセタート+タキソール、T/T/R: 12-O-テトラデカノイルホルボール-13-アセタート+タキソール+ラパマイシン。図4は、構成的に(CMV株)又はTR発現カセットの一部として(hTR及びmTR株)、fLucレポーターを発現するMCF7由来細胞株のラパマイシン用量反応チャートを示す。ラパマイシンは、mTORC1(栄養素/エネルギ/レドックスセンサーとして機能し、細胞周期G1期の細胞増殖を制御するタンパク質複合体)をブロックすることにより、増殖リボソーム活性を阻害する。更に、mTORC2(細胞周期G2期中のストレスシグナル伝達に関与する複合体)の活性にも影響を及ぼすが、但し高濃度で長期曝露後のみとなる。増殖応答とストレス応答とを分けるため、細胞を様々な用量のラパマイシンで処理し、37℃で6時間インキュベートし、fLuc活性についてアッセイした。驚くべきことに、fLucレポーターが増殖リボソームにより翻訳されるCMV細胞株は、タンパク質合成の中程度の阻害しか示さなかった。fLuc発現は、未処理の細胞と比較して僅かに上昇し、試験したラパマイシン用量の範囲全体で殆ど変化していない。対照的に、fLucレポーターがSETリボソームにより翻訳されるmTR及びhTR細胞は、TRクラス構造に従って応答する。第1階級のhTRdm-fLUC#6は、CMV細胞株と同様に応答する。第3階級細胞(mTRdm-fLUC#27、mTRdm-fLUC#45)のうち、mTRdm-fLUC#8株は、最も大きなfLuc発現の増加を示した(推定TR第4階級レスポンダ)。SET活性化の大きさは、ラパマイシン濃度1nM乃至20nMで安定しており、50nMのラパマイシン試料ではfLuc活性が急増し、その後、100nM乃至1μMの試料でSET活性が低下した。このfLuc活性の低下は、完全なmTORC1(mTORC2は異なる)の不活性化と相関しており、SETリボソームと、mTORC2ストレスシグナル伝達と、細胞周期G2期とを結び付けている。他の研究では、異なるラパマイシン濃度の影響を、構成的に(CMV株)又はTR発現カセットの一部として(hTR及びmTR株)、fLucレポーターを発現するMCF7由来細胞株において、TPA+タキソール参照標準応答と組み合わせて測定した。この参照合剤は、MCF7細胞におけるSET誘導が特に強力であることから選択した。細胞を、100nMのTPA、500nMのパクリタキセル、及び様々な濃度のラパマイシンで処理し、37℃で6時間インキュベートし、fLuc活性についてアッセイした。TPA+タキソール参照標準試薬によるSET誘導は、CMV株(増殖リボソーム応答のみを示す)では検出されず、TR第1階級hTRdm-fLUC#6株では無視できる程度であるため、最も有用な情報は、TR第3階級(mTRdm-fLUC#27及びmTRdm-fLUC#45)及びTR第4階級(mTRdm-fLUC#8)細胞に由来し、ここではラパマイシンにより、TPA+タキソールで処理した試料におけるSETの用量依存的超誘導が、ラパマイシン用量50nMまで発生しており、その後、SETの低下がラパマイシン濃度100nM以上で生じている。これらの結果は、図4に示したものと一致しており、SETリボソームとmTORC2との関連を裏付けている。
【図５】図5A及び5Bは、コバルトによるSETリボソームの選択的調節を検出するためのTR修飾因子アッセイの使用を示す。略語: TPA: 12-O-テトラデカノイルホルボール-13-アセタート、TopoL: 低用量トポテカン、TopoH: 高用量トポテカン、CoCl: 塩化コバルト。図5Aは、TR第3階級 HEK293 mTRdm-fLUC#12細胞株のコバルト(II)用量応答チャートを示し、タキソール、MG132、及びトポテカン(高及び低用量)参照標準応答に対する様々なコバルト(II)濃度の影響を示す。図5Bは、TPA参照標準試薬と組み合わせた様々なコバルト用量の同様のチャートを示す。可溶性コバルト(II)は、貧血症の治療のために、更に、癌、脳卒中、及び心虚血に関連する低酸素症を模倣する研究試薬として、広く使用されている。コバルト(II)への長時間の曝露は、DNA複製及び細胞周期の進行を妨げる重金属毒性を引き起こす。細胞を様々な濃度のCoCl2単独で、又は参照標準試薬(フルネーム及び用量を表3に示す)と組み合わせて、37℃で6時間インキュベートし、fLuc活性についてアッセイした。単独で利用した場合(図5A)、試験したコバルト用量の何れにおいても、SETリボソームは誘導されなかった。しかしながら、50μMより高い用量では、バックグラウンドSETリボソーム活性が用量依存的に抑制された。このSETリボソーム遮断効果は、SET(タキソール及びTPA)を活性化することが公知である参照標準試薬とコバルトを組み合わせた際に遙かに顕著となった。タキソール応答の阻害は、50μMのCoCl2で始まり、TPA活性化(図5B)の阻害は、200μMのCoCl2から始まった。利用可能な毒性データは、50μM乃至200μMのコバルト濃度が、長時間の暴露後に複数の臓器に影響を与えるヒトの慢性毒性と相関する一方、200μMを超える用量は、ミトコンドリアによる活性酸素種の産生及び細菌/動物の死滅(マウス及びラットLD50)に関連することを示している。したがって、SETリボソーム活性化を阻止する薬物又は化学物質の能力は、インビボの毒性及び副作用の良好な予測因子となり得る。
【図６】図6Aは、トポテカンによるクラス依存性のSETリボソーム制御を示す。この図では、構成的に(CMV株)又はTR発現カセットの一部として(hTR及びmTR株)、fLucレポーターを発現するMCF7由来細胞株に対して、トポテカン応答アッセイを行った。トポテカンは、トポイソメラーゼIタンパク質機能、DNA複製、及び細胞周期進行を撹乱する、成熟した第1選択経口治療物質であり、卵巣、子宮頸部、及び小細胞肺癌の治療に一般的に使用される。細胞を様々な用量のトポテカンで処理し、37℃で6時間インキュベートし、fLuc活性についてアッセイした。fLucレポーターが増殖リボソームにより翻訳されるCMV細胞株において、トポテカンは、500nM未満の用量ではタンパク質合成に殆ど影響しなかった。fLucレポーターがSETリボソームにより翻訳されるmTR及びhTR細胞は、TRクラス構造に従って応答する。第1階級のhTRdm-fLUC#6及びhTRdm-fLUC#15は、CMV対照株と同様に応答する。TR第3階級(mTRdm-fLUC#27及びmTRdm-fLUC#45)及びTR第4階級(mTRdm-fLUC#8)は、10nM乃至100nMのトポテカンでの最大SET値を示し、その後、SET最大値を下回る減少(100nM超乃至5μMのトポテカン用量で発生)と、SETタンパク質合成及びレポータータンパク質の代謝回転の6時間に亘る不在が示すSETリボソームの完全なブロック(5μM以上のトポテカン濃度)とが生じた。この高用量でのSET阻害は、キャップ依存性及びSETリボソーム活性を効果的にブロックする、S期内細胞周期チェックポイントにおけるDNA複製の公知の濃度依存性ブロックと相関する。図6Bは、構成的に(CMV3株)又はTR発現カセットの一部として(hTRdm-fLUC#13及びmTRdm-fLUC#45株)、fLucレポーターを発現するHEK293由来細胞株におけるTPA参照標準応答に対する様々なトポテカン濃度の影響を示す。細胞を100nMのTPA及び様々な濃度のトポテカンにより処理し、37℃で6時間インキュベートし、fLuc活性についてアッセイした。TPAもトポテカンも、CMV対照細胞のキャップ依存性リボソーム活性に顕著な影響を与えなかった。低用量のトポテカンは、TPA単独で生じるものと比較して、hTR及びmTR細胞株において軽度のSET超誘導しか発生させず、図6Aのように、100nM乃至5μMの用量ではSET活性化が低下し、5μM超では、SETリボソーム活性が完全にブロックされた。図6Cは、トポテカンにより誘導されたTR SETリボソーム活性がインビボ毒性とどのように相関するかを示す。図6Aの結果を、トポテカンに利用可能な考慮すべき前臨床及び臨床薬投薬及び毒性データと比較することで、トポテカン用量、SET応答、DNA複製損傷、及び慢性/急性毒性の間の強い相関が明らかとなった。急速なSETリボソーム誘導が生じる低用量(<10nM)は、細胞ストレスに関連するが、死滅には関連しない。最大のSETプラトーをもたらす用量(10nM乃至100nM)は、培養細胞の緩やかな死滅、ヒト臨床治療用量、及びヒト最大耐量(MTD)等の慢性的なエクスビボ及びインビボ毒性と相関する。SETの低下を引き起こす高用量(100nM乃至5μM)は、急性のエクスビボ及びインビボ毒性(培養細胞における即時のG2/Mでの細胞周期のブロック及びマウスLD50)と常に関連する。最後に、SETリボソーム誘導をブロックする最高用量範囲(5μM乃至25μM)は、S期内チェックポイントに関連する重大な細胞死を特徴とする。エクスビボの研究では、薬物が細胞と常に接触している場合、これらの用量は即時致死性(<24時間)を発生させることが分かっているが、しか��ながら、約6時間前に薬物を除去するプロトコルでは、遅延があるものの有意なアポトーシス細胞死(90乃至95％)が72時間以内に生じる。TR第4階級 mTRdm-fLUC#8細胞は、最大のSET誘導及び薬物毒性に対する耐性の向上を示し、これは標準的な細胞生存率アッセイ及びSETリボソーム活性を完全にブロックするのに必要な薬物濃度の上昇により定義される。
【図７】図7は、TR転移性癌細胞株モデルを同定するための重要なステップを示す。進行性の攻撃的な腫瘍には、自己再生のための能力、新規の幹細胞子孫に進化し、これを発生させる能力、細胞損傷に対する耐性向上、及び腫瘍開始能力といった幹細胞形質を示す特有の癌細胞集団が含まれると考えられている。癌幹細胞(CSC)は、任意の腫瘍のごく一部を占めているが、遠隔異種転移を形成するのに必要な集団を構成している。TRクラス数の高さ(及びSETリボソーム活性の上昇)は、G2/M損傷修復潜在力の増加、細胞生存率の向上、及び薬剤耐性と相関するため、複数のmTR及びhTR細胞株を用いて、SETリボソーム応答を、確立されたインビトロ及びインビボCSC特性と比較した。例えば、TR転移性癌細胞モデルは、一連の測定可能な形質を示し、これに含まれるものは、(1)親TR細胞株の小さな外れ値集団に由来すること(上位1乃至5％のSET誘導)、(2)細胞に基づくTRアッセイにおけるSETリボソーム活性の統計的上昇(第4階級応答と呼ぶ)と相関する薬剤及びストレス耐性を示したこと、(3)反復的な単細胞コロニー形成及び少数の細胞からの非接着性腫瘍様塊の生成といった低密度の選択的増殖の結果として、SETリボソーム活性の非常に有意な変化(新規のTR外れ値応答を形成する)をもたらすクローン進化を示したこと、(4)ヌードマウスへの連続異種移植後にインビボでの腫瘍開始活性を示したこと、(5)TR発現カセットからのSET特異的翻訳のインビボ調節を示した異種腫瘍を形成したこと、及び(6)増殖速度の上昇及び細胞毒性薬物処置に対する耐性を有する異種腫瘍を形成したことである。例えば、TR転移性結腸直腸癌(CRC)細胞モデルクローンは、親CRC細胞株(HCT116等)から単離され、これらの形質のそれぞれを示す。以降の項に示すように、TR転移性CRC細胞モデルの一例は、hTRdm-fLUC#32である。図7Aは、リボソーム活性の大きさが、転移性増殖のインビトロ培養モデルで増殖させた腫瘍細胞における遺伝的不安定性とどのように相関するかを示す。全てのヒト腫瘍は、特有の生物学的特性(腫瘍形成能、転移能、薬剤耐性等)を示す多くの明確な細胞亜集団により構成される。これらの集団は、遺伝的不安定性の結果として、腫瘍進行中に相互変換が可能であり、これにより腫瘍の一部は、抗悪性腫瘍薬により生じた複製損傷を修復し、治療サイクル完了時に再増殖することができる。現在の技術では、腫瘍細胞の変換を検出することができるが、プロセスは時間がかかり、高価であり、癌型の間の広範な相関を排除する細胞特異的バイオマーカーが利用される。TR SET応答と、転移性増殖のインビトロモデルに関連する腫瘍細胞変換事象との間の関係を調べるために、HEK293 TR細胞パネル株を、低密度でプレーティングし、コロニーを形成させ(約2ヶ月、50回の増殖サイクルにより細胞接着及びコロニー形成能力の上昇を選択)、その後、各株の娘サブクローン細胞パネルを生成するために使用した。新しいサブクローンを100nMのTPAで処理し、6時間インキュベートし、fLuc活性についてアッセイし、サブクローン細胞の応答を親細胞株と比較した。図7Aは、hTRdm-fLUC#122(TR第4階級)親株から生成された娘パネルにおけるTPA参照標準試薬に対するfLuc応答の順位プロットを示す。娘細胞における広範囲の応答は、腫瘍細胞の変換が遺伝性のSET活性を変化させたことを示しており、��れは、SETリボソームが選択プロセス中に適応し、クローン進化としても知られる遺伝的異質性を示すことができることを意味する。矢印は中央値応答を示し、サブクローン数が両側でほぼ等しいことを表している。しかしながら、TR第4階級 hTRdm-fLUC#122株が、外れ値SET誘導活性を有する娘細胞を生成することが特に重要である(中央値応答1788％と比較して、外れ値娘サブクローンでは6568％の応答、又はSET誘導の3.7倍の増加)。線の勾配は、異種性の度合いを反映しており、TR第2階級CMV#74及びTR第3階級mTRdm-fLUC#12が最大の不安定性を示している。これらの結果は、安定した細胞株において増殖させたSET応答が、腫瘍細胞変換のための単純且つ機能的なバイオマーカーを提供するという説得力のある証拠となる。高及び低TR SETクラスにおいて変換事象の頻度が低いことは、これらの細胞集団における細胞周期G2/M期の回復能の差により説明し得る。例えば、低TRクラス細胞は、最小限のSETリボソーム活性を示し、毒性治療中にS又はG2/Mチェックポイントで容易に死滅することになるが、高TRクラス細胞は、ストレス耐性、高い生存率、及び複製損傷から回復する能力と相関するSETリボソーム活性の上昇を示す。したがって、腫瘍細胞の変換は、生存能力の絶対的な基準ではなく、特定のストレッサに対する生存の頻度の尺度である。TR第4階級細胞株が、回復、生存率、及び薬剤耐性と相関した変換活性を示す能力は、腫瘍細胞の回復能を低下させるように設計された新しい治療物質の重要性を実証している。転移性増殖の第2のインビトロ細胞培養モデルにおいて、図7B及び7Cは、容易に腫瘍様塊を形成し、足場非依存性増殖を示したHCT116 TR第4階級 TR SET細胞株を示す。高いTR SET応答は、腫瘍様塊形成に絶対的に必要となるわけではないが(TR第1乃至3階級細胞は、この形質を示す場合が多い、表4参照)、真の転移性細胞候補は、付着性か非付着性かに関係無く、非被覆組織培養皿上での増殖として定義される非接着性増殖を示す必要がある(図7B及び7C)。図示したように、腫瘍様塊は数回の継代で形成され(浮遊細胞集団)、デノボクローン腫瘍様塊の活性を示す(単一細胞からの非接着性細胞増殖)。図7Cは、(DAPI核染色を用いて決定された)10個未満の核を含むクローン腫瘍様塊を矢印と共に示している。表4に示すように、HCT116細胞パネルを未処理組織培養皿において腫瘍様塊として32日間増殖させ、標準組織培養皿に14日間再プレーティングした後、TPA TR SET参照標準を用いてTR SETアッセイを行った。この研究では、3つの細胞株が外れ値TR SET応答と一致するSET誘導レベルの向上を示した(mTRdm-fLUC#25、#28、及び#75)。これらの推定TR転移性癌細胞モデルでは、TR SET応答は、未処理対照の19,413％乃至26,675％(15倍乃至79倍)に増加した。
【図８】図8A乃至8D及び表5では、発癌イニシエーション表現型について第4階級TR SET細胞株を試験する。ヌードマウス(nu/nu)において腫瘍を形成するTR第4階級 HCT116 hTRdm-fLUC#32細胞株の能力を調べるために、10匹の動物に、HCT116 hTRdm-fLUC#32又は親HCT116細胞(5×106細胞)を移植し、750mgまでの時間として定めた腫瘍増殖について試験した。親HCT116細胞は、1個の攻撃的腫瘍及び1個のノーテイクインプラント(no-take implant)を含む腫瘍増殖応答の範囲を示した(750mgまでの時間は8.6日)。対照的に、10個のTR細胞腫瘍の増殖は、有意な群変動を示さなかった(750mgまでの時間は8.8日)。これらの結果は、TR細胞が親HCT116からクローニングされたという事実と一致していた。第2の研究では、30乃至60mgの腫瘍断片を細胞由来の腫瘍から切り出し、6匹のヌードマウスの両側に移植し、12の腫瘍事象を発生させた(表5)。両側移植の最終的なサイズ(試験の21日目)は、様々であった。例えば、HCT116 3R移植は、2138mgにまで成長したが、3L移植は、僅か138mgとなった。更に、各試験アーム内の大きな腫瘍と小さな腫瘍との間には、有意なサイズの差が存在していた。2個の最大の親HCT116腫瘍は、残りの10個の腫瘍と有意に異なっていた(p=0.00034、両側t検定)。同様に、4個の最大のHCT116 hTRdm-fLUC#32腫瘍は、残りの8個の移植と有意に異なっていた(p=0.00001、両側t検定)。2アーム間で腫瘍の大きさに有意差は観察されなかったが、腫瘍サイズ分布は歪曲しており、HCT116 hTRdm-fLUC#32細胞がHCT116対照より大きかった(表5)。例えば、12個のTR移植のうち4個は、1.25gより大きい腫瘍を発生させたが、12個の対照試料では2個となった。同様に、12個のTR移植のうち6個は、550mgより大きかったが、HCT116の12個の腫瘍では4個となった。インビボでのHCT116 hTRdm-fLUC#32腫瘍増殖率の向上は、TR SET転移性腫瘍モデルとして適切な選択であることが立証された。図8A乃至8D及び表6は、TR転移性結腸直腸癌(CRC)細胞モデルとして、hTRdm-fLUC#32細胞株を更に支持している。この研究では、58匹のヌードマウスにHCT116 hTRdm-fLUC#32又は親HCT116細胞を注射し、腫瘍を約125mgまで成長させた(研究の8日目)。マウスを6アームに分け(アーム当たり6匹、即ちn=36)、残りの22匹を対照として選別した。最初の試みとして、TR SET動物(n=18)を、試験剤注入前のfLUCレポーター活性の非侵襲的生物発光画像化により、SETリボソーム活性についてアッセイした(図8A及び8C並びに表6の処置前動物)。動物を回復させ、アーム1にビヒクル(ポリオキシル35ヒマシ油又はクレモホールEL、0.5mg/kg又は75.8mg/平方m/日)、アーム3に120mg/kgシクロホスファミド(HCT116腫瘍に効果のない化学療法薬)、又は アーム2にクレモホールELに溶解したパクリタキセル(タキソール)20mg/kg/日を注射し、(細胞に基づくTR SETアッセイのタイミングを模倣するため)6時間後にfLUC活性について再試験した。図8A乃至8D及び表6は、小腫瘍(約125mg)における予想外の慢性G2細胞周期ストレスの例を示す。処置前生物発光レベルは、2つの異なる腫瘍タイプとして、図8Aに示す低ストレス群(18個の腫瘍のうち8個が示した低SETリボソーム活性)と、図8Cに示す高ストレス群(18個の腫瘍のうち10個が示した高SETリボソーム活性)とに分かれた。表6に示すように、処置の6時間後に動物を再撮像した際には、低ストレス腫瘍では、処置前発現レベルと比較してfLUC活性が有意に増加した(7192％乃至46600％の範囲)。驚くべきことに��これは、パクリタキセル/クレモホールELで処置したアームだけでなく、クレモホールEL及びシクロホスファミドの腫瘍においても生じた。対照的に、高ストレス腫瘍(図8C乃至8D)は、fLUC超誘導ができなかった(即ち、SETリボソームを活性化できなかった)。その後の研究により、処置前G2細胞周期ストレスの頻度が、腫瘍の大きさと相関していることが分かった。表6に示すように、HCT116 hTRdmfLUC-#32腫瘍を含む11匹の選別動物のうち9匹を3つの試験アームに割り当て、以前と同様に生物発光についてアッセイした。これらの動物の処理の遅延のため、腫瘍サイズは約500mgに増加し、9個の腫瘍のうち1個のみが低いSETリボソーム活性を示した。この腫瘍はパクリタキセル/クレモホールELで処置した際に有意なSET誘導(20500％)を示したため、SETリボソームの活性化は、腫瘍のサイズに影響されなかった。
【図９】図9A及び9Bは、TR転移性CRC細胞モデルhTRdm-fLUC#32がパクリタキセルに対するストレス依存性の薬剤耐性を示したことを表している。SETリボソームの活性化がインビボ腫瘍回復及び増殖をどのように調節するかをアッセイするために、腫瘍サイズを、各試験アームにおいて、合計63日間モニタした。動物は、腫瘍負荷に応じて(2g超)又は試験終了時(63日)に屠殺した。予想通り、ポリオキシル35ヒマシ油(クレモホールEL)は、腫瘍の増殖及び回復に影響を及ぼさなかった。シクロホスファミド処置は、クレモホールEL対照と比較して腫瘍増殖を遅らせたが、腫瘍退縮をもたらさなかった。タキソールアームでは、処置前G2細胞周期腫瘍ストレスとパクリタキセル/ポリオキシル35ヒマシ油の見かけの治療指数との間に強い相関が観察された(図9A及び表6)。3個の低ストレス腫瘍(動物#4、#5、及び#6)は、10日間のパクリタキセル処置期間中(図9A)、増殖停止及び軽度な腫瘍退縮を示したが(約33％サイズ減少)、処置中止から14乃至18日後に、各腫瘍のサイズが増加した。3匹の低ストレス動物のうち2匹は、50日目及び57日目に腫瘍負荷のため屠殺し、残りの腫瘍は600mgを超え、63日目に急速に増殖した。対照的に、高ストレス腫瘍の大きさの有意な減少が、パクリタキセル処置中に観察された(59％未満のサイズ減少)。この傾向は、29日目に、腫瘍が過小(50mg未満のサイズ)となるまで続いた。この群では、1匹のみが何らかの腫瘍の再増殖を示し、63日目に100mgの腫瘍となった。剖検では、試験期間の終わりに、2匹の残りの高ストレス動物において明らかな腫瘍は見られなかった。全ての腫瘍が同じ薬剤耐性TR転移性CRC細胞モデル(hTRdm-fLUC#32細胞株)に由来することを考えると、細胞周期G2期の翻訳により生じる、処置前のSETリボソーム活性化が、第1選択腫瘍薬パクリタキセルに対するインビボ腫瘍応答の調節において大きな役割を果たすことは明らかである。図9Bは、TR転移性CRC細胞モデルが、動物の生存減少と相関する細胞増殖の促進を示すことを表している。前臨床インビボ生存数は、動物の自然死、動物の消耗(体重減少合計が20％を超えた後の動物の屠殺)、及び最大許容腫瘍負荷(腫瘍サイズが2gを超えた後の動物の屠殺)の関数となる。この特定の試験では、全ての動物は、腫瘍負荷により屠殺した。このパネルは、動物数(生存％)が試験日(時間)に対してプロットされ、生存時間関数の推定値を処置アーム毎に提供するカプランマイヤグラフを示している。シクロホスファミド、クレモホールEL対照と比較して動物の生存に何らかの影響を与えたが、試験終了のかなり前に、腫瘍負荷のため全ての動物が屠殺された。パクリタキセル/クレモホールEL処置アームのみが、動物の生存の延長を示した(6匹中4匹が63日目まで生存)。TR転移性腫瘍細胞モデル由来腫瘍(Arm1乃至3)が、親HCT116由来腫瘍より攻撃的に増殖し、より早期に動物の屠殺が全ての処置アームで生じたことに留意することが重要である。腫瘍及び動物生存の結果を併せると、腫瘍応答の増強及び動物生存の長期化と相関する慢性G2チェックポイントを誘発するために、パクリタキセル及びクレモホールELに加えて、未定義の腫瘍ストレッサが必要であることを示している。
【図１０】図10Aは、SETリボソームを活性化するインビボSETアゴニストのインビトロ能力を調べるためのTR SETアッセイの使用を示す。表6のアーム1に示すように、0.5mg/kgのクレモホール(62.5mg/mlに相当する経口用量)は、静脈内(IV)送達の6時間後に、異種腫瘍においてSETを誘導する。細胞に基づくTRアッセイにおいて、このインビボ応答を調べるために、2.5mg/ml乃至100mg/mlの範囲のクレモホールEL用量を、HEK293 mTRdm-fLUC#12(潜在的TR転移性CRC細胞モデル)及びCMV-fLUC#73細胞に、6時間及び24時間に亘り連続して投与した。意外なことに、100nMのTPAにより生じる2000％超のSET増加とは対照的に、クレモホールELで処理したmTRdm-fLUC#12細胞は、24時間後に60％のSET増加しか示さなかった(2.5乃至10mg/ml)。更に、CMV応答は、クレモホールELがキャップ依存性リボソームの阻害剤であることを示している。これらの結果は、クレモホールELがインビボでSETリボソームを活性化することは可能だが、培養細胞への投与は、G2細胞周期チェックポイントを誘導しないことを意味する。疎水性薬物を可溶化するために界面活性剤が一般的に使用されるが、クレモホールELは、不活性ビヒクルではなく、インビボで多くの生物学的効果をもたらす。この研究は、細胞モデルが、インビトロでは観察し得ないインビボ薬物応答を示すことができるという証拠を提供している。表3に示すように、多数のSETアンタゴニストが同定されている。しかしながら、これらの作用剤の多くは、単にS期における細胞周期進行を妨げ、G2におけるSETリボソームの活性化を妨げるものである。図10Bは、準毒性用量でG2翻訳を選択的にブロックし、細胞周期進行を妨げるSETリボソームに直接結合可能なSETアンタゴニストを調べるインビトロTRアッセイの結果を示す。この効果は、内因性ストレスが腫瘍薬の見かけの治療指数に及ぼす影響を模倣するはずである。高TRクラスHEK293細胞を100nMのTPAと、様々な濃度の候補SETリボソームブロッカとにより処理し、37℃で6時間インキュベートし、fLuc活性についてアッセイするTPA参照標準応答修飾因子アッセイ(例えば、図5B)を用いて、SETリボソーム活性化をブロックする能力について複数の化合物を試験した。この研究のために、異なるリボソーム構造に結合する4つの化合物を選択した。アニソマイシンは、アミノアシルtRNA(P部位に入る最初のアミノアシルtRNAを除く)のエントリーポイントであるA部位において、60Sリボソームサブユニットに結合する。ピューロマイシンは、リボソームにおいてペプチジルtRNAが形成されるP部位の40S及び60Sサブユニットと相互作用する。シクロヘキシミドは、成長中のペプチド鎖にアミノ酸を放出した後の非荷電tRNAの出口部位であるE部位の60Sサブユニットに結合する。エメチンは、E部位に隣接するリボソーム棚構造に結合するが、シクロヘキシミドとは異なり、40Sサブユニットrps14リボソームタンパク質に結合する。これらの試験化合物のうち、エメチンのみが顕著な水溶性を示し、高用量アッセイのためにDMSO等の溶媒を必要とした。図10Bは、第3階級 HEK293 hTRdm-fLUC#13細胞株におけるTPA参照標準応答に対する様々な濃度の候補SETアンタゴニストの影響を示す。最も劇的な結果は、低用量のアニソマイシンによるSETの線形用量依存性の阻害の検出であった(SETリボソーム活性は、約35nMのIC50で10nM乃至250nMで着実に減少し、500nM以上で完全に���ロックされた)。同じ処置は、HEK293 CMV#3株のキャップ依存性翻訳に対しては最小限の影響しか及ぼさなかった。したがって、アニソマイシンは、PKCシグナル伝達系と相互作用するp38MAPKストレスキナーゼの活性化により、S/G2でDNA複製及び細胞周期進行を阻害する必要がある。エメチン及びシクロヘキシミドは、50nM乃至1μMの用量でSETを阻害し、その後、2.5μMを超える用量でSET遮断活性が生じた。アニソマイシンと同様に、エメチンはストレスキナーゼと相互作用することが知られている。ピューロマイシンは、SET阻害において最も効率が低く、ポリソーム構造の破壊のため毒性を有することが知られている1μM乃至2.5μMの用量で作用する。SETアンタゴニストに最適な生物学的有効用量を選択する際には、SETリボソーム活性の完全且つ即時の阻害をもたらす最低用量を決定した(IC100)。公知のfLUCタンパク質半減期を考慮すると、SETタンパク質合成を即時にブロックする任意の処置は、6時間以内(標準的なTR SETアッセイのタイミング)にfLuc活性の約15％の低下をもたらし、これは、85％を超えるfLUC活性を発生させるには継続的なタンパク質合成が必要であることを意味する。対照的に、fLUCタンパク質代謝回転を増加させる任意の処置は、6時間で85％未満のfLUC活性をもたらす。図10Bは、500nMのアニソマイシン処置が、未処理対照と比較して、98％のfLUC活性をもたらすことを示している。このアッセイ中にfLUCの15％が分解されていることを考えると、この値は、6時間に亘る約15％の残存翻訳又は翻訳ブロック前のタンパク質合成の短いバーストを表す。対照的に、1uMのアニソマイシンは即時ブロック又はIC100(87％fLUC活性)をもたらし、タンパク質分解の増強(予想されるfLUC代謝回転率の約2倍)を示すと思われる更に高い用量とは対照的である。したがって、500nMのアニソマイシンは、効果的な(但し不完全な)SET阻害剤であり、1uMのアニソマイシンは完全な又はIC100のSETアンタゴニスト応答を発生させる。更に用量を増加させると、SETアンタゴニスト活性だけでなく、タンパク質分解も促進し得る(正常な細胞回復に悪影響を及ぼし、予測不能な全身性の副作用を生じる恐れがある)。しかしながら、多くの細胞に基づく効果は、インビボで観察されない場合がある。したがって、第1の動物試験では、2種類のアニソマイシン用量を調べ、動物におけるサブIC100効果を試験した。表7に示すように、500nM相当用量(低用量=0.000027mg/kg/日)及び1μM相当用量(高用量=0.000054mg/kg/日)を選択した。その後の試験では、1μM相当用量を2.5μM相当量(超高アニソマイシン用量)及び2.5μM相当用量のエメチンと比較して、好適な投薬レジメンを試験した。
【図１１】図11A乃至11C、表8及び表9は、SET複合薬の最初の異種動物試験結果を示す。第1選択抗CRC腫瘍薬カペシタビンの効能を改善するSET遮断薬の能力を試験するために、HCT116 hTRdm-fLUC#32転移性CRC腫瘍細胞モデルをヌードマウス(胸腺欠損ヌード-Foxn1nu)に注射して腫瘍を形成させ、5つの処置アーム(表7)を用いて様々なSET成分の組み合わせで1日1回経口治療した。腫瘍が約125mgの大きさに達した時(研究7日目)に処置を開始し、18日間毎日行った後、動物を更に45日間モニタした。この研究の各アームの薬物濃度を表7に示す。全体重及び腫瘍重量は、標準的なサイジング手順を用いて測定した。動物は、消耗(体重減少合計が20％を超えた後)又は腫瘍負荷(2g超)により屠殺した。図11A、表8及び表9は、高用量カペシタビンと共に与えた場合にSET複合薬が有意な腫瘍退縮を誘導することを示している。アーム1のビヒクル(クレモホールEL)、及びアーム2のアニソマイシン/クレモホールEL処置は、何れも腫瘍増殖に全く影響しなかったが、アーム2の動物では10日目に統計的に有意な体重増加が観察された(表9)。この研究用に選択されたアーム3のカペシタビン(Cape)用量(500mg/kg/日、1500mg/sqm/日)は、細胞毒性範囲(標準ヒト用量の78％)であったが、生じた自然死は1件のみであった。しかしながら、表9に示したように、この毒性は、有意な動物の体重減少と、20％超の体重減少による屠殺とをもたらした(アーム#3では4匹、アーム#4では5匹、アーム#5では2匹)。このカペシタビン用量は、過剰な腫瘍退縮を発生させなかったが(平均サイズ減少56％、表8)、アーム#1及び#2と比較して腫瘍増殖を有意に遅延させた(10日目乃至35日目)。アーム#4における低用量のアニソマイシン及びクレモホールELの添加は、カペシタビン腫瘍応答を有意に改善しなかった。対照的に、アーム#5における高用量のアニソマイシン/クレモホールELの添加は、全ての動物において大きな腫瘍サイズの退縮をもたらした(図11A、平均サイズ縮退76.7％、表8)。アーム#3及びアーム#5における腫瘍応答を相関させると、処置期間中に最初に有意となり(15日目、p=0.0047)、アーム#3の屠殺(31日後)により更なる統計分析不能となるまで継続する統計的に有意な(両側t検定)サイズ差が検出された。アーム#5の腫瘍退縮は治療後も継続し、腫瘍は、38日目に最小サイズに達し、この時点で各腫瘍は、最小測定可能サイズよりも小さくなった(理論的治癒)。図11Bは、第1の動物研究におけるカペシタビン依存性異種腫瘍応答が、3つのタイプの遅延腫瘍増殖応答に分かれ(アーム3の動物#3、#5、及び#8により例示される)、低用量のアニソマイシン処置(アーム4)は、カペシタビン処置動物と比較した場合、新規の腫瘍応答を発生させなかったことを示す。明らかな相違は、動物C3(図11B)における特に攻撃的な腫瘍による。図11Cは、個々のアーム#3及びアーム#5の腫瘍の同様の比較を示す。図11Bに示す3つのカペシタビン依存性増殖遅延とは対照的に、アーム5の動物は、最も低い再増殖速度、又は腫瘍が有意な再増殖を示さない新しい腫瘍応答(動物#1、#3、#6、及び#7により例示される)に相関する、腫瘍再増殖パターンを示した。処置サイクルで生き残ったアーム#5の6匹は、全て70日目に生存していた(2gのサイズ限界に達した腫瘍が存在しなかったため)。3件の腫瘍再増殖事象のみが検出され、動物H5が最大の再増殖活性(70日目で1900mg未満)を示し、アーム#3の動物C5に非常に類似していた(最も好ましいカペシタビン応答)。動物H1、H3及びH7については、死亡後検査により、TR転移性腫瘍細胞が処置により完全に死滅したことが確認され(目に見える腫瘍はなく、細胞移植部位での僅かな瘢痕のみ)、38日目までに約450mgの最大腫瘍退縮(動物H3)を示し、アーム5の平均腫瘍退縮は76.7％となった(表8)。これらの結果は、カペシタビンと組み合わせたSET調節成分の補助的活性を実証しており、アニソマイシンについて0.000054mg/kg/日又は0.00016mg/平方m/日の前臨床生物学的有効用量(BED)を確立すると共に、第1選択腫瘍薬の有効性改善におけるSET複合薬の使用が更なる調査に値することを示すものとなった。
【図１２】図12A、12B及び表9は、SET複合薬に関連する用量依存性の可逆的な体重減少を示す。研究全体で記録された動物の全動物重量を、腫瘍重量の減算により基準化し、開始重量のパーセンテージとして表した(研究7日目)。用語及び略語: 対照薬物(Con): ビヒクル(クレモホールEL)、又はアーム#1。C又はCape: カペシタビン、又はアーム#3。C+L、L、又はC+LD: カペシタビン/低用量アニソマイシン/クレモホールEL、又はアーム#4。C+H、H、又はC+HD: カペシタビン/高用量アニソマイシン/クレモホールEL、又はアーム#5(表7)。図12Aは、低用量(アーム4)及び高用量(アーム5)SET複合薬により処置した個々の動物における体重変化を比較している。このチャートは、研究の38日目までのマウスの薬物治療及びその後の動物回復段階を通した動物体重動態を例示している。要約すると、動物の治療に対する反応は、体重減少(アーム4及び5の有意な体重減少、表9)及び31日後に統計的に有意な体重増加が生じるその後の回復期と、対照動物の体重パターンとの何れかを示し、二相性の体重反応が生じた。この体重減少は非中毒性と思われ、これらの動物は両方とも回復し、研究の終わりまでに他方に追いついた。この二相性反応は、アーム3のカペシタビン動物をアーム5の高用量アニソノマイシン動物と比較した場合には明らかではなく(図12B)、これは、動物が、体重に可逆的影響を及ぼし、その後の体重増加を促進することが可能な全身性SET複合薬応答を示すことを意味する。カペシタビン処置マウス(C8及びC5)は、2つのC+HD体重応答の丁度中間に位置するように見える一方、動物C3では体重が全く増加しなかった。表9は、アーム1ビヒクル(クレモホールEL)及びアーム3カペシタビン処置動物の体重が、処置期間を通して有意に変化しなかったことを示す。殆どの動物は、初期の処置段階では穏やかな平均体重変化を示したが、その後、腫瘍増殖により全般的な健康が低下したため体重がゆっくりと減少した。詳細な分析により、カペシタビン処置動物が2つのカテゴリに分類されることが分かった。動物C6、C5、C8、及びC3の体重変化は、ビヒクル対照に類似していたが、C1、C2、C4、及びC7は、処置期間中に体重が減少し、22日目乃至24日目に屠殺された。低用量のアニソマイシン/クレモホールELの添加は、体重減少効果を高め(10、13、及び15日目に観察される有意な体重減少、表9)、18日目に5匹の屠殺が生じたが(C+L 2、4、5、7、及び8)、腫瘍サイズの退縮には影響しなかった。生存した3匹(C+L 1、3、及び6)は、ビヒクル対照又は高用量応答と類似していた(図12A)。対照的に、高用量のアニソマイシン/クレモホールELの添加は、2匹のみであるため(C+H 2及び8が、22及び24日目に消耗により屠殺された)、保護効果を有すると思われた。したがって、低用量の体重減少は、薬物治療活性と殆ど関係ない予想外の臨床結果を有する可能性があるため、保護的な体重減少効果治療用量を最大にするSET複合薬成分の用量を選択する必要があると思われる。
【図１３】図13は、高用量カペシタビンと共に与えた場合、好適なSET複合薬(アーム5)が動物の生存を促進することを示している。前臨床インビボ生存数は、動物の自然死、動物の消耗(体重減少合計が20％を超えた後の動物の屠殺)、及び最大許容腫瘍負荷(腫瘍サイズが2gを超えた後の動物の屠殺)の関数となる。この図は、動物数(生存％)が試験日(時間)に対してプロットされ、全体的な生存時間関数の推定値を処置アーム毎に提供するカプランマイヤグラフを示している。ビヒクル(アーム#1)及びアニソマイシン/クレモホールEL(アーム#2)処置は生存に影響を与えず、全ての動物は、36日目までに屠殺された(腫瘍負荷の結果)。低用量アニソマイシンSET複合薬アーム#4では、15日目に5匹が早期に失われたが(体重減少による)、同様の生存数の減少がカペシタビンアーム#3で検出された(22及び24日目に合計5匹屠殺)。したがって、処置の終わり(24日目)まで、処置アーム#3及び#4における動物の消耗に差はなかった。腫瘍増殖の僅かな変動から、70日目にアーム#3の生存動物は1匹、アーム#4の生存動物は2匹となったが、動物L6の腫瘍は1.8gであり、71日目に屠殺されているため、この差は有意ではない。要約すると、全ての腫瘍及び動物の応答は、0.000027mg/kg/日又は0.00008mg/平方m/日のアニソマイシン用量が生物学的有効用量を下回っており、カペシタビンに対する補助薬物活性をもたらさないことを示している。対照的に、高用量アニソマイシンSET複合薬アーム#5では2匹のみがカペシタビン毒性を示し、処置期間中(22及び24日目)に屠殺にされた。この低い動物消耗の割合(カペシタビン対照の40％のみ)は、治療終了前の動物の体重増加と一致する(図12A参照)。予想外の体重増加のため、研究の残りの期間に体重減少による動物の損失は生じなかった(生存率100％)。アーム#5では、腫瘍再増殖の有意な遅延があったが(図11C参照)、生存関数は、この遅延がヒトの薬物応答の好適な測定基準(全体的な患者の生存増加)である動物生存数の向上と同等であることを明らかに示している。現在のところ、動物とヒトとの生存を相関させることは不可能だが、この前臨床試験により、0.5mg/kg/日のクレモホールEL及び0.000054mg/kg/日のアニソマイシンによる18日周期で処置した動物が、高用量カペシタビン(500mg/kg/日)療法の治療指数を改善する補助的又は同時的増感薬物応答を示すことが実証された。
【図１４】図14A、14B、表10及び11は、治療量未満のレベルの低用量カペシタビンと共に与えた場合、2つのSET複合薬が、腫瘍退縮を誘導し、腫瘍再増殖を遅延させることを立証する第2の異種動物試験を表している。第2の動物実験では、HCT116 hTRdm-fLUC#32転移性腫瘍細胞をヌードマウス(胸腺欠損ヌード-Foxn1nu)に注射して腫瘍を形成させ、5つの処置アームに分類した(表10)。腫瘍が約125mgの大きさに達した時(研究6日目)に処置を開始し、18日間毎日行った後、動物を更に56日間モニタした。この研究の各アームの薬物濃度を表10に示す。全体重及び腫瘍重量は、標準的なサイジング手順を用いて測定した。動物は、消耗(体重減少合計が20％を超えた後)又は腫瘍負荷(2g超)により屠殺した。用語及び略語: ビヒクル: クレモホール又はアーム#1。C又はCape: カペシタビン又はアーム#2。C+E: カペシタビン/エメチン/クレモホールEL又はアーム#3。 C+H: カペシタビン/高用量アニソマイシン/クレモホールEL(第1の動物試験と同じ)又はアーム#4。C+VH: カペシタビン/超高用量アニソマイシン/クレモホールEL又はアーム#5。図14Aは、試験期間中の平均腫瘍重量を示す。予想通り、アーム1のビヒクル対照(クレモホールEL)により処置した腫瘍は線形の増殖を示し、このアームの全ての動物は、25日目乃至40日目に腫瘍負荷のために屠殺された。体重減少による屠殺を減らす試みるために、この試験用に選択されたカペシタビン用量(400mg/kg/日又は1200mg/sqm/日)は、第1の研究の細胞毒性の範囲ではなく、細胞増殖抑制の範囲とした(標準ヒト用量の35％)。その結果、カペシタビンは、この試験で小さな腫瘍退縮のみを発生させ(表11、35.2％の平均腫瘍サイズ減少)、腫瘍増殖は、ほぼ処置の終了直後に再開した。アーム#2の動物(カペシタビン)における腫瘍退縮をアーム#3、アーム#4、及びアーム#5と相関させると、処置期間終了前(14日目)に最初に有意となり、屠殺により統計分析不能となるまで継続する統計的に有意な(両側t検定、p<0.05)腫瘍サイズ差が検出された。したがって、3つ全てのSET複合薬アームは、カペシタビン対照と比較して、腫瘍増殖の減少、広範な腫瘍退縮、及び腫瘍再増殖の遅延を示した。逆説的に言えば、図14A及び表11に示すように、アーム#4及びアーム#5の腫瘍応答は同等であったため、低用量アニソマイシンに対して、超高アニソマイシン用量を使用することに利点は無く、アニソマイシンの好適な前臨床生物学的有効用量(BED)が0.000054mg/kg/日であることが確認された。図14B及び表11に示すように、最大の腫瘍退縮及び最も遅い腫瘍再増殖は、低用量カペシタビンと、エメチンと、クレモホールELとの組み合わせ(アーム#3)により生じた。アーム5の8匹のうち7匹が有意な腫瘍効果(90％の最大腫瘍退縮)を示したが、「治癒」事象(腫瘍が検出可能サイズ未満に退縮し再増殖しないこと)は存在しなかった。しかしながら、両方の異種腫瘍動物実験により、複数のSET複合薬(固有の組成物及び用量)が、治療量未満の濃度で、毒性の高い第1選択腫瘍薬の治療指数を向上させることが可能な補助薬として機能したことが明らかとなった。
【図１５】図15は、SET複合薬が単相性の重量変化プロファイルを誘導することを示す。研究全体で記録された全動物重量を、腫瘍重量の減算により基準化し、開始重量のパーセンテージとして表した(研究6日目)。用語及び略語: ビヒクル: クレモホール又はアーム#1。C又はCape: カペシタビン又はアーム#2。C+E: カペシタビン/エメチン/クレモホールEL又はアーム#3。C+H: カペシタビン/高用量アニソマイシン/クレモホールEL(第1の研究と同じ)又はアーム#4。C+VH: カペシタビン/超高用量アニソマイシン/クレモホールEL又はアーム#5。C+H7: 第1の研究のC+HDアームからの動物7。C+H1: 第1の研究のC+HDアームからの動物1。C+L3: 第1の研究のC+LDアームからの動物3。図15は、研究36日目までの各アームの平均体重変化％を示す。第1の動物試験と同様に、アーム1のビヒクル(クレモホールEL)処置動物の体重は有意に変化しなかった。殆どの動物は、初期段階で成長を続けたが、その後、腫瘍増殖により全般的な健康が低下したため体重がゆっくりと減少した(即ち、悪液質)。しかしながら、破滅的な体重減少のため一部の動物が屠殺された第1の異種動物実験における高用量カペシタビン処置動物とは対称的に、アーム#2の低用量カペシタビン(400mg/kg/日)処置動物は、屠殺に至る十分な体重変化を示さなかった。以前と同様に、カペシタビン処置動物は、処置中に一致した体重減少を示し、その後、処置前の体重へのリバウンドを示した。第1の動物実験と同様に、アーム#3、#4、及び#5のSET複合薬は、この効果を増強する。体重減少は、アーム5のカペシタビン/超高用量アニソマイシン/クレモホールEL処置アームで最大となり、8匹中4匹が、11日目乃至20日目に体重減少のために屠殺された。対照的に、低いアニソマイシン用量のアーム#4の動物では、6匹中2匹のみが屠殺され、第1の研究と同じ動物数となった。カペシタビン/エメチン/クレモホールEL処置のアーム#3では、消耗のため失われた動物はいなかったが、処置期間中の平均体重減少は、アーム#2のカペシタビン処置マウスよりも有意に低かった(12乃至14日目、両側t検定、p=0.022)。図15に示すように、全てのSET複合薬処置動物は、29日目までに体重増加(開始体重レベルより上)を示したが、しかしながら、アーム#3の動物の体重増加は、26日目までに他の全てのアームを上回り、29日目までに統計的に有意となった(両側t検定、p=0.0006)。第1の動物試験と同様に、エメチン及びアニソマイシンは、保護効果を有し、治療停止後1週間以内に動物の体重の急速な増加をもたらす可逆的な体重変化を誘発すると思われる。第1及び第2の動物研究の平均開始重量変化％を比較すると(図12A及び15)、体重減少及び体重増加の傾向は著しく類似している。したがって、両研究において観察された可逆的な体重変化は、SET複合薬がカペシタビンと共に送達される際の共通の応答である可能性がある。この体重減少は、急速な可逆性を有し(動物の体重が17日で38.2％回復するため有毒な副作用により生じたものではない)、腫瘍の反応とは無関係であるため、体重の変化が重要な治療上の問題となるのを防ぐためにモニタリングが必要な治療の特徴であると思われる。
【図１６】図16は、低用量カペシタビンと共に与えた場合、SET複合薬が動物の生存を促進することを示す。前臨床インビボ生存数は、動物の自然死、動物の消耗(体重減少合計が20％を超えた後の動物の屠殺)、及び最大許容腫瘍負荷(腫瘍サイズが2gを超えた後の動物の屠殺)の関数となる。この図は、動物数(生存％)が試験日(時間)に対してプロットされ、全体的な生存時間関数の推定値を処置アーム毎に提供するカプランマイヤグラフを示している。ビヒクル(アーム#1、クレモホールEL)処置は生存に影響を与えず、全ての動物は、腫瘍負荷の結果として40日目までに屠殺された(屠殺の平均は26日)。カペシタビン処置動物(アーム#2)の損失は、43日目まで発生せず、その後、腫瘍負荷による損失が極めて急速に生じた(47日目までに5匹、50日目までに更に2匹、54日目に最後の動物)(屠殺の平均は47日)。殆どのアーム#2の動物は、治療期間中に体重が減少したが(図15)、屠殺に必要とされる20％超の体重減少閾値に達したものはなかった。対照的に、両方のアニソマイシン処置アームでは、体重減少による著しい動物の損失が生じた。超高アニソマイシン/カペシタビン/クレモホールELのアーム#5では、4匹が11日目乃至20日目に体重減少により屠殺され、残りは46及び57日目に腫瘍負荷のため屠殺された(屠殺の平均は47日)。したがって、(図14A及び表11に示す)腫瘍サイズに対する効果にもかかわらず、0.00013mg/kg/日のアニソマイシン用量を、低用量カフェシタビンと組み合わせたものは、カペシタビンの単独療法に対して、統計的に有意な利益を全生存にもたらさなかった。対照的に、体重減少により2匹が失われたものの(12乃至14日目)、アーム#4における0.000054mg/kg/日のアニソマイシン用量は、全生存に有意な利益をもたらした(屠殺の平均は57日でアーム2及び5に対して121％の増加)。このグループのマウスは、47乃至68日目に腫瘍負荷のために屠殺されており、0.000054mg/kg/日の処置が、カペシタビンと組み合わせた際に好適なアニソマイシン用量(BED)であることが確認された。しかしながら、全生存に最大の利益が見られたのはアーム#3であり、低用量カペシタビンを0.00013mg/kg/日のエメチン及び0.5mg/kg/日のクレモホールELと組み合わせている(屠殺の平均は68日でアーム2及び5に対して145％の増加)。アーム#3では処置期間中に有意な体重減少があったが、20％超の体重カットオフに達したものはなかった(図15)。更に、このアームの最初の動物が腫瘍負荷のために屠殺にされたのは57日目であり、アーム#1、#2、及び#5の屠殺の平均の後であり、アーム#4の屠殺の平均と同じである。図16に示すように、アーム#3の動物のうち2匹は、研究期間の終わりに生存していた。これらの前臨床試験は、0.5mg/kg/日のクレモホールEL及び0.000054mg/kg/日のアニソマイシン、又は0.5mg/kg/日のクレモホールEL及び0.00013mg/kg/日のエメチンにより処置された動物は、様々な用量でのカペシタビンの治療指数を改善する補助薬物応答を示すことを明らかに実証している。
【図１７】図17A乃至17J及び表12は、化学療法処置中の腫瘍及び免疫細胞応答を調べたhTRdm-fLUC#32腫瘍の免疫染色研究を示す。第1の動物実験(表7)由来の腫瘍を、体重減少のため屠殺した動物から切断した(アーム2の24日目の動物#1及び22日目の#7、アーム4の18日目の動物#5、アーム5の24日目の動物#2、22日目及び動物#8)。腫瘍を急速冷凍し、固定し、薄片化し、細胞及び組換えタンパク質のマルチエピトープ検出のために、蛍光標識及び非標識抗体の混合物を用いて、4つのマクロファージマーカータンパク質(ビオチン標識抗マウスMHCクラスII分子IA/IE、Alexa-647標識抗マウスCD11b/Mac-1、Alexa-488標識抗マウスF4/80、及びAlexa-647標識抗マウスCD68)及びTRレポータータンパク質(抗ホタルルシフェラーゼ)を検出した。非標識一次抗体を検出するために、Alexa-555標識二次抗体又はPE標識ストレプトアビジンを使用した。DAPI色素による核DNA染色を用いて、生存腫瘍細胞を検出した。外部の増殖/有糸分裂層、非有糸分裂細胞層、及び内部の壊死性コアを含む多層構造を主な原因として、ヒト固形腫瘍が非同期の非対数増殖を示すことは、150年以上前から知られている。増殖細胞層(細胞10個分超の厚さ)は、腫瘍微小環境に直接接触し、受動拡散により細胞に栄養分、酸素、成長刺激因子を注入する。有糸分裂層の内部には、血管新生/血流が減少し、受動拡散(即ち、腫瘍間質液圧)に対する自然耐性を有する圧縮細胞層がある。薬物拡散及び代謝活性の低下に加えて、この高い細胞密度は、G1/Sチェックポイントで細胞を停止させ、細胞周期進行を妨げる「接触阻害又はCI」表現型を発生させる。これらの非有糸分裂CI細胞は、DNA複製を開始することができないため、S期細胞毒性化学療法薬の作用に対して本質的に耐性を有する。しかしながら、腫瘍の再増殖では、CI腫瘍細胞が再び細胞周期に入り、薬剤損傷により死滅した有糸分裂細胞に置き換わる必要がある。これにより、TR発現系を用いることでのみ検出可能な腫瘍細胞における予想外のG2特異的SETが生じるはずである。更に、動物は、貪食免疫細胞を活性化することにより、退行性腫瘍のアポトーシス細胞破片に反応する(ヌードマウスでは、これらの免疫細胞は、自然免疫系のみが産生する)。免疫染色を用いて、腫瘍関連マクロファージ(TAM)のサブタイプ、それらの腫瘍分布、及び死滅する腫瘍細胞との関連性を定義する。略語: fLUC: ホタルルシフェラーゼ、DAPI: 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。図17Aの核染色を図17BのG2特異的fLUC発現(カペシタビンにより16日間処理したアーム2動物#1から単離した腫瘍、表7)に相関させることで、カペシタビンが辺縁の有糸分裂細胞の狭い区画においてG2/Mチェックポイントを誘導し、SETリボソーム翻訳(fLUC発現)を活性化することが確認される(図17Bの白矢印、Layer1)。腫瘍表面から延びる連続的な核の数を数えることにより、Layer1は、細胞3.4個分の平均厚さを有することが明らかとなった(表12)。驚くべきことに、Layer1細胞は、マクロファージエピトープの染色が最小限だったが、高濃度のF4/80染色マクロファージ(厚さ細胞6.4個分)を含む内部細胞層(Layer2)に接していた。一般に、この層のF4/80+マクロファージは、他の免疫又はfLUCタンパク質について染色されておらず、有糸分裂細胞層(厚さ細胞9.8個分)内に含有され、境界を構築しているように見えた。細胞16.6個分の平均深度���腫瘍に侵入した個々のF4/80+細胞が、腫瘍内部に延在していた(Layer3、表面からの全深さは細胞26.4個分)。Layer2/3の境界には、少数のfLUC陽性細胞体が含まれていたが、Layer3と壊死性コア(最小限の核DAPI染色を有する細胞残遺物)との間で最小限の染色が観察された。これらの結果は、カペシタビンの作用機序、固形腫瘍の予想される多層構造、及び死滅する細胞によるF4/80+自然免疫細胞の特定のサブクラスの活性化と一致する。同一の腫瘍及び免疫細胞応答は、14日目に処置したアーム2動物#7から処理された第2の腫瘍において観察された。図17C及び図17D(カペシタビン、低用量アニソマイシン、及びクレモホールELにより10日間処置したアーム4動物#5から単離した腫瘍、表7)により、SET複合薬が、Layer3から延在する腫瘍細胞において均一なG2特異的fLUC発現を活性化することが証明された(図17Dの白矢印)。図17Cにおいて、Layer2マクロファージは、fLUC抗原について染色されない明るい小さな核により例示される。カペシタビン腫瘍とは対照的に、Layer2免疫細胞の大部分は、CD68マーカータンパク質(CD68+F4/80-)に対する選択的な染色と、共染色又は薄く染色されたF4/80マクロファージの小部分とを示した。更に、CD68+F4/80-免疫細胞は、壊死性コアを含む腫瘍全体に侵入していた。アーム4の腫瘍は、有意な腫瘍応答又は動物生存の改善を示さなかったことから、SETアゴニストであるクレモホールELは、腫瘍全体でG2特異的SETを刺激し、別個のCD68+F4/80-マクロファージサブタイプを活性化した。低用量アニソマイシンにより生じた任意の腫瘍又は動物の効果(重量変化以外)については不明のままであるが、この研究は、Layer3から壊死性コアに位置するCI細胞がSET複合薬のために細胞周期に再び入ることになり、アーム2のカペシタビン単独療法の腫瘍では観察されなかったG2特異的fLUCレポータータンパク質の発現を開始することを示している。図17E乃至17F及び表12(カペシタビン、高用量アニソマイシン、及びクレモホールELにより16日間処置したアーム5動物#2から単離した腫瘍)は、腫瘍層構造の有意な変化を示す。図17Fでは、fLUCレポータータンパク質のG2特異的翻訳がLayer1に存在すること(白矢印)が確認されたが、しかしながら、平均厚さは、アーム2の腫瘍と比較して細胞7.8個分に増加していた(両側t検定、p=0.008、表12)。更に、この層は、崩壊が進んでおり、腫瘍辺縁に位置する小さな細胞内fLUC+体を含んでいた。意義深いことに、アーム4の腫瘍とは対照的に、内部腫瘍細胞は、壊死性コア内以外では有意なfLUC染色を示さなかった。同様のサイズの増加は、Layer2(平均厚さ細胞7.8個)及びLayer3(平均厚さ細胞18.6個)においても観察された。アーム2の腫瘍の有糸分裂細胞層とは対照的に、このアーム5の腫瘍では、Layer1/2の合計サイズは細胞15.6個分となった(50％超のサイズ増加)。以前と同様に、壊死性コアに浸入したCD68+F4/80-マクロファージが、Layer2及び3において豊富に観察された。これらの結果は、G2期腫瘍細胞数の増加及び死滅する有糸分裂細胞層(腫瘍退縮33.9％)内での小さなfLUC+体の出現と一致する。これは、SET複合薬が、カペシタビン誘発アポトーシス細胞死を増進すると共に、CI細胞層におけるG2特異的翻訳を減少させつつ、侵襲性CD68+F4/80-マクロファージ応答を促進する能力を裏付けている。図17G乃至17H(カペシタビン、高用量アニソマイシン、及びクレモホー��ELにより14日間処置したアーム5の動物#8から単離した腫瘍)は、CI及び壊死性コア細胞における予想外に高いレベルのfLUC発現及び細胞死を示す。図17Gは、近位CI/壊死層(検出可能なDAPI染色核)から壊死性コア(最小限のDAPI染色)に及ぶ腫瘍切片全体のDAPI染色を示す。図17Hは、この組織切片が、検出可能なDAPI染色を含まずに細胞に局在した高密度のfLUC+体を含有することを示している(図17G及び17Hの白矢印)。驚くべきことに、このデータは、SET複合薬が、死んでいるはずの細胞における予想外に高い代謝活動を活性化することを示している。更に、SET複合薬は、G2期への細胞周期進行を刺激し、処置した腫瘍の中心で細胞死を促進する。この腫瘍の大きさが59.8％縮退したことを考えると、これらの結果は、この薬物が腫瘍表面の有糸分裂細胞及び壊死性コア内の非有糸分裂細胞を死滅させるという考えを支持している。図17I乃至17J(アーム5の動物#8由来の腫瘍)は、ImageJソフトウェアを用いた、腫瘍内部を横切る蛍光fLUC+染色の定量化を示す。図17I上に15個のボックス(35×695ピクセル、0.64um/px)を描き、695個のピクセル毎に蛍光強度を測定することにより、蛍光密度マップを作成した。最も暗い壊死細胞層のピクセルを100％バックグラウンドに調整し、各ピクセルの全蛍光を、その値と比較した(図17J)。この密度マップは、隣接するDAPI+細胞と比較して、最小限のDAPI染色を示す細胞(壊死コア)において、fLUC染色強度が500％乃至600％増加したことを示す。この結果は、非有糸分裂で代謝的に不活性であると考えられる細胞におけるfLUCレポータータンパク質(及びG2特異的アポトーシス細胞死)のSETの非常に有意な選択的増加と一致する。
【発明を実施するための形態】
【００７７】
本明細書全体で、以下の段落で定義する幾つかの用語を使用する。
【００７８】
単数形の用語「a」、「an」、及び「the」は、特に明示されない限り、又は文脈から明らかとならない限り、限定的なものではなく、複数の指示対象を含む。
【００７９】
本明細書で使用される「comprising」、「comprises」及び「comprise」(含む、備える)という用語は、それぞれ「including」、「includes」、及び「include」(含む)と同義であり、追加要素を除外しない。
【００８０】
本明細書で使用される「増殖性障害」という用語は、癌を含む望ましくない細胞増殖を特徴とする病的状態及び良性状態を示す。
【００８１】
哺乳動物における「癌」という用語は、無制限増殖、不死性、転移能、急速な成長及び増殖、足場非依存性増殖、及び特定の明確な形態的特徴といった、癌細胞に特有の特徴を有する細胞の存在を特徴とする生理的状態を示す。往々にして、癌細胞の集合は、局在して「腫瘍」となるが、このような癌細胞は、動物内に単独で存在する場合、又は独立細胞として血液中を循環する場合がある。
【００８２】
「転移性癌」は、ある場所又は起源から体内の別の場所に広がった癌である。転移性細胞により形成される腫瘍は、「転移性」腫瘍又は「転移」と呼ばれる。癌細胞が体の他の部分へ広がる過程を「転移」という。
【００８３】
癌の例には、限定ではなく、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれる。より具体的には、こうした癌の例には、結腸直腸癌、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膵臓癌、多形神経膠芽腫、食道/口腔癌、子宮頸癌、卵巣癌、子宮内膜癌、前立腺癌、膀胱癌、頭頸部癌、肝癌、及び乳癌が含まれる。
【００８４】
「増殖性障害」という用語は、更に、細胞分裂の障害及び非癌性細胞の異常な又は望ましくない増殖を含み、このような状態は、本発明の組成物の投与により治療される。このような増殖性障害には、例えば、EBV誘発性リンパ増殖性疾患及びリンパ腫、新生内膜形成不全(例えば、アテローム性動脈硬化症の患者及びバルーン血管形成術を受けている患者におけるもの)、糖尿病、乾癬、良性腫瘍に続発する増殖効果(例えば、血管腫、線維腫、及び筋腫)及び骨髄増殖性障害(例えば、真性多血症)が含まれる。
【００８５】
「対象」、「個体」、及び「患者」という用語は、ヒト又は、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、ウマ、若しくは非ヒト霊長動物等、他の任意の哺乳動物を示すために相互に交換可能に用いられる。
【００８６】
「対象」、「個体」、及び「患者」という用語は、新生物性障害(例えば、癌)に罹患している可能性がある又は罹患しやすい個体を示すが、その疾患又は障害を有していても有していなくてもよい。例えば、「対象」、「個体」、及び「患者」という用語は、新生物性障害を示す1つ以上の症状を呈する個体、1つ以上の危険因子を有する個体、又は新生物性障害についてスクリーニングされた個体となり得る。この用語は、以前に増殖性障害の治療を受けていた個体に対しても使用される。好適な態様において、対象は、ヒトである。
【００８７】
本明細書で使用される「治療(処置)」、「プロトコル」、「治療方法」、「手順」、「療法」という用語、又はそれらの同義語は、以下を目的とする方法、組成物、又はプロセスを指す: (1)医学的状態、疾患、又は障害の発生又は再発の遅延又は予防、(2)状態の症状の進行、増悪、又は悪化の鈍化又は停止、(3)状態の症状の改善、及び/又は(4)状態の治癒。癌又は増殖性細胞疾患の治療は、必ずしも、全ての増殖性細胞を除去すること、増殖性細胞数を低減すること、又は状態の症状を緩和することを意味するものではない。往々にして、治療は、成功の可能性は低い場合でも、患者の病歴と推定生存予想から、有益となる可能性があると考えられる場合には実施される。治療は、予防活性のために、症状の発生前に行われる場合があり、又は治療作用のために、症状の開始又は発生後に行われる場合がある。
【００８８】
本明細書で使用される「物質」という用語は、定義された化学組成を有するものを示し、本明細書では「化合物」及び「薬物」という用語と相互に交換可能に用いられる。「細胞傷害性薬物」、「化学療法薬」、「抗悪性腫瘍薬」、「治療剤」、「細胞毒性腫瘍薬」、及び「抗癌剤」という用語は、様々な形態の増殖性障害、癌、及び増殖性細胞性疾患の治療を提供する物質、分子、化合物、組成物、作用剤、因子、プロセス、又は組成物を示すために相互に交換可能に用いられる。細胞毒性腫瘍薬は、従来、「細胞毒性抗悪性腫瘍薬」、例えば、トポイソメラーゼI阻害剤、アントラサイクリン、ポドフィロトキシン、タキサン、ビンカアルカロイド、アルキル化剤、白金化合物、及び他の化合物、又は「標的抗悪性腫瘍薬」、例えば、モノクローナル抗体、チロシンキナーゼ阻害剤、mTOR阻害剤、レチノイド、免疫調節剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、及び他の作用剤として分類される。細胞毒性腫瘍薬は、癌細胞の増殖を直接的又は間接的に阻害するか、癌細胞を死滅させる。
【００８９】
「治療標準」、「第1選択療法」、「導入療法」、「一次療法」、及び「一次治療」という用語は、本明細書において、臨床医が特定のタイプの患者、病気、又は臨床状況について従うべき第1の治療選択肢(群)を定義するために用いられる。疾患の治療は複雑であるため、特定の第1選択療法は、必ずしも治療標準の唯一の選択肢とはならない。「補助薬」及び「佐剤」という用語は、本明細書では相互に交換可能に用いられ、一次療法、治療、又は手順に追加され、一次療法、治療、又は手順の効能、安全性を高めたり、実施を促進したりする任意の追加的な物質、治療、又は処置を示す。機能的には、補助薬は、一次又は主要の物質、治療、又は手順無しで利用された場合に、治療又は治療活性を示しても示さなくてもよい。
【００９０】
本明細書で使用される「生物学的有効用量及び/又は量」、「治療有効用量/量」、及び「有効用量/量」は、組織、器官系、又は対象において、所望の生物学的、医薬的、又は治療的応答を引き起こす物質、組成物、又は治療プロセスの任意の量を示す。例えば、所望の応答には、治療パラダイムの1つ以上の好適な転帰が含まれる場合がある。
【００９１】
「汎耐性」、「極度薬剤耐性」、及び「交差薬剤耐性」という用語は、腫瘍治療薬及びプロセスに対する一般化された耐性を特徴とする細胞表現型を定義するために、本明細書において相互に交換可能に使用される。このプロセスは、薬物輸送体系の過剰発現を表すために用いられる多剤耐性とは区別される。
【００９２】
本明細書での使用において、「同時投与」及び「複合(組合せ)」という用語は、対象において生物学的に有効又は治療的な活性を示す2つ以上の薬物の投与を示す。同時投与又は複合薬は、同時に又は連続して送達することができる。2つ以上の生物学的に有効な又は治療的な活性を有する物質は、単一の組成物又は独立した複数の組成物として送達することができる。
【００９３】
「医薬組成物」は、本明細書において、一定量の薬物と少なくとも1つの「生理学的に許容可能な担体」又は「賦形剤」とを含むものとして定義される。医薬組成物は、バイオアベイラビリティ、薬物動態、又は薬力学等の処方活性を補助又は改善する様々な付加成分を、1つ以上の治療剤と共に含むことができる。本明細書での使用において、「生理学的に許容可能な担体」及び「賦形剤」は、任意の活性医薬成分の治療有効性又は生物学的プロセスに干渉せず、投与された濃度で対象に対する過度な毒性を有していない作用剤を示す。賦形剤という用語は、限定では無いが、希釈剤、増量剤、抗酸化剤又は他の安定剤、分散剤、溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤、等張剤、吸収遅延又は促進剤等により例示される。医薬活性物質の製剤化のために、こうした賦形剤を使用することは、当該技術分野において周知であり、例えば、出典を明記することによりその開示内容全体を本願明細書の一部とした"Remington's Pharmaceutical Sciences", E.W. Martin, 18th Ed., 1990, Mack Publishing Co.: Easton, PA.を参照されたい。
【００９４】
「キャップ依存性リボソーム」及び「増殖リボソーム」という用語は、mRNAの5'末端で選択的構造と相互作用し、成長又は増殖細胞内の好適な翻訳開始コドンに対する結合及びスキャニングを行うことにより真核生物翻訳(キャップ依存性翻訳)を開始する真核生物リボソーム及び関連開始因子を示す。「選択的翻訳」(SET)という用語は、キャップ依存性翻訳プロセスにより生じない全ての細胞翻訳活性、又はキャップ依存性翻訳の阻害により生じる翻訳を示す。「SETリボソーム」は、真核生物のリボソームであり、キャップ依存性翻訳プロセスにより生じない全ての細胞翻訳活性、又はキャップ依存性翻訳の阻害により生じる翻訳を生成するために必要な任意の関連タンパク質又は複合体である。SETリボソームは、細胞周期の後期S及びG2期中にタンパク質の選択的合成(SET)を指示する。SET中、SETリボソームは、「内部リボソーム進入配列」(IRES、40Sリボソームサブユニットの特異的mRNA配列との結合を指示する)と呼ばれる内部mRNA配列からの翻訳を開始し、TR発現カセット内の調節配列により例示されるmRNA「再開配列」を用いた翻訳を再開する能力を有する。翻訳調節(TR)手法は、TR発現カセット(哺乳動物プロテオリピドタンパク質遺伝子由来)内の特定のRNA配列及びmRNA二次構造に基づく。この特定のRNA配列及びmRNA二次構造は、40Sリボソームサブユニットに結合して方向付け(5'mRNAキャップ構造と全く相互作用せず)、適切に作動可能に連結されたレポーター遺伝子の翻訳開始コドンが翻訳開始のためにリボソーム暗号解読センタに位置するようにする。
【００９５】
「SETアゴニスト」という用語は、SETリボソームを活性化することによりTR mRNAのSETを増加させ、SETアゴニスト「応答」を発生させ、後期S/G2期への細胞周期進行を誘導すると同時に、キャップ依存性翻訳を阻害する作用剤又は治療薬を示す。SETアゴニスト「応答」は、全ての累積SET応答の平均に比べ2標準偏差より高い外れ値TRアッセイ結果(細胞計数15試薬アッセイ等の任意のTRアッセイ形式により検出される)として定義される。一例として、HCT116 mTRdm-fLUC細胞株を5つの参照標準(TPA、Tax、CaI、MG132、及びcAMP)により処理すると、このTRアッセイの平均値は、各5参照標準応答の平均に比べ3標準偏差より高かったため、TPA-TaxがSETアゴニストであることが確証された。
【００９６】
「SETリボソームアンタゴニスト」という用語は、SETアゴニストと組み合わせて送達した場合、齧歯類のLD50濃度の0.02％であるIC100用量で、SETアゴニスト活性及びSETリボソーム翻訳を完全にブロックする(SETリボソームに結合又は作用する)作用剤を示す。一例として、IC100用量又は100％阻害剤濃度は、公知のSETアゴニスト(TPA等)を不活性化する特異的SETアンタゴニスト用量を試験するTRアッセイ(細胞計数用量依存性修飾因子(Cell Count Dose-dependent Modifier)アッセイ)により検出される。
【００９７】
「遺伝子」という用語は、ポリペプチド又は前駆体又はRNA(例えば、tRNA、siRNA、rRNA等)の産生に必要なコード配列を含む核酸(例えば、DNA)配列を示す。ポリペプチドは、全長コード配列又はコード配列の任意の部分によりコードされ得るが、当該全長又は断片の、酵素活性、リガンド結合、シグナル伝達等の所望の活性又は機能的特性が保持されることを前提とする。この用語は、更に、構造遺伝子のコード領域及び5'及び3'末端の両方のコーディング領域に隣接して位置する配列で、その遺伝子が全長mRNAの長さに対応するようになるものを含む。コード領域の5'に位置し、mRNA上に存在する配列は、5'非翻訳配列と呼ばれる。コード領域の3'又はその下流に位置し、mRNA上に存在する配列は、3'非翻訳配列と呼ばれる。「遺伝子」という用語は、cDNA及び遺伝子のゲノム形態の両方を含む。遺伝子のゲノム形態又はクローンは、「イントロン」又は「介在領域」若しくは「介在配列」と呼ばれる非コード配列で中断される場合があるコード領域を含む。イントロンは、核転写物又は一次転写物から除去又は「切り出し」されるため、メッセンジャーRNA(mRNA)転写物には存在しない。mRNAは、翻訳中、新生ポリペプチド中のアミノ酸の配列又は順序を特定する働きをする。
【００９８】
「発現ベクター」という用語は、核酸発現カセットを含むウイルスベクター及び非ウイルスベクターの両方を示す。
【００９９】
「発現カセット」という用語は、細胞内のコード配列の転写及び翻訳をもたらすコード配列に適切に作動可能に連結された調節エレメントを含むヌクレオチド配列を定義するために使用される。
【０１００】
「哺乳類プロモーター」は、哺乳動物細胞において機能する、哺乳動物細胞に由来する、又はその両方である、転写プロモーターを示す。
【０１０１】
「哺乳動物最小プロモーター」は、RNAポリメラーゼ結合を介して転写を適切に開始するのに必要な「コア」DNA配列だが、適切に作動可能に連結された転写エフェクター配列の不在下でごく僅かな転写活性のみを示すものを示す。
【０１０２】
「オープンリーディングフレーム」又は「コード配列」という語句は、ポリペプチド又はタンパク質をコードするヌクレオチド配列を示す。コード領域は、真核生物において、5'側で、イニシエータメチオニンをコードするヌクレオチドトリプレット「ATG」、3'側で、終止コドンを特定する3つのトリプレット(即ち、TAA、TAG、及びTGA)の1つに結合している
【０１０３】
「適切に作動可能に連結された」とは、核酸が別の核酸配列との機能的な関係に置かれていることを意味すると定義される。例えば、プロモーター又はエンハンサーがコード配列に適切に作動可能に連結されるのは、それが配列の転写に影響を与える場合であり、リボソーム結合部位がコード配列に適切に作動可能に連結されるのは、それが翻訳を促進するように配置される場合である。一般に、「適切に作動可能に連結された」とは、連結されているDNA配列が連続していることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、連続している必要は無い。連結は、都合の良い制限部位でのライゲーションにより達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを、従来のように使用する。
【０１０４】
「組換え体」とは、核酸又は他の生体分子を酵素的、化学的、又は生物学的にエクスビボで切断、合成、結合、又は他の形で操作して、細胞又は他の生物系において所望の産物を産生する方法、試薬、又は実験室操作の結果を示す。「組換えDNA」という用語は、分子生物学的手法により共に連結したDNAのセグメントからなるDNA分子を示す。
【０１０５】
「トランスフェクション」は、外来性DNA等の外来物質の真核細胞への導入を表すために用いられる用語である。「形質転換」及び「形質導入」と相互に交換可能に用いられるが、後者は、より狭い意味では、キャリアとして機能するウイルスによりDNAを細胞に導入するプロセスを示す。したがって、トランスフェクションを受けた細胞は、「トランスフェクトされた」、「形質転換された」、又は「形質導入された」細胞と呼ばれる。
【０１０６】
本明細書で使用される「プラスミド」という用語は、独立して複製するDNA片を示す。一般に、環状2本鎖である。
【０１０７】
「レポーター遺伝子」は、その発現が当業者に公知の従来の手法を用いて検出又は測定可能な任意の遺伝子を示す。
【０１０８】
「調節エレメント」又は「エフェクターエレメント」という用語は、転写プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、又はターミネーターを示すと共に、リボソーム活性又はmRNAの成熟を調節する任意の翻訳調節エレメント、ポリアデニル化部位等を示す。調節及びエフェクターエレメントは、調節の対象となる成熟コード配列の選択的生成を可能にする、増強する、又は容易にするように配置し得る。
【０１０９】
「ベクター」という用語は、DNAの外来断片を挿入し得るDNA分子を示す。一般には、対象となる調節及びコード配列を含む。ベクターという用語は、限定では無いが、プラスミド、コスミド、ファージミド、ウイルスベクター、及びシャトルベクターを含む。
【０１１０】
「シャトル」ベクターは、原核細胞の複製は可能だが、真核細胞の複製配列を含まないプラスミドベクターである。この複製欠損シャトルベクター内に含まれるウイルスDNA配列は、真核宿主細胞内での組換えを指示し、感染性ウイルス粒子を産生する。
【０１１１】
「ストレス」及び「毒性」という用語は、細胞の自然な生化学的及び生物物理学的恒常性の撹乱を示すために使用される。ストレスは、一般に細胞恒常性の回復につながるが、毒性応答は、最終的に細胞死をもたらす。
【０１１２】
増殖性障害を治療するための本発明の態様による方法は、哺乳動物に、細胞毒性薬及びSET複合薬を含む選択的翻訳(SET)治療物質を投与することを含む。増殖性障害を治療するための本発明の態様による方法は、細胞毒性薬物及びSET複合薬を含むSET治療物質をヒトである対象に投与することを含む。
【０１１３】
本発明の態様による組成物は、細胞傷害性薬物及びSET複合薬を含む。
【０１１４】
本発明の態様による組成物は、カペシタビン及びSET複合薬を含む。
【０１１５】
SET複合薬は、SET応答の活性化因子及びSETリボソーム活性の阻害因子を含む。
【０１１６】
本発明の態様によれば、含まれるSET応答の活性化因子は、限定では無いが、ホルボールエステル等のプロテインキナーゼC活性化因子である。
【０１１７】
本発明の態様によれば、含まれるSETリボソームアンタゴニストは、翻訳調節因子エメチンである。
【０１１８】
随意に、1つ以上の追加の細胞毒性薬の投与、放射線療法、光線力学療法、外科手術、又は他の免疫療法等、1つ以上の追加の抗癌治療を、SET治療物質と組み合わせて、患者の増殖性障害を治療することができる。
【０１１９】
本発明の態様によれば、発現カセットは、遺伝子発現を調節する上流転写エフェクター配列を含む。一態様において、転写エフェクター配列は、哺乳類プロモーターである。加えて、転写エフェクターは、エンハンサー及びサイレンサー又はその組み合わせ等、他のプロモーター配列及び/又は転写調節因子を含むこともできる。これらの転写エフェクター配列は、任意の適切に作動可能に連結されたコード配列の転写を調節する、細胞成分に結合することが知られている部分を含むことができる。例えば、エンハンサー又はサイレンサー配列は、転写調節タンパク質等の公知の細胞成分に結合する配列を含むことができる。転写エフェクター配列は、ゲノムDNA、プラスミドDNA、ウイルスDNA、mRNA若しくはcDNA、又は任意の適切な生物(例えば、ウイルス、細菌、酵母、真菌、植物、昆虫、又は哺乳動物)等の任意の適切な核酸から選択することができる。利用される転写及び/又は翻訳系に基づいて、適切な転写エフェクター配列を選択することは、当該技術分野の技術の範囲内である。任意の個別の調節核酸配列は、野生型配置(天然のゲノムの順序で存在)、又は人工的配置で、転写エフェクターエレメント内に配置することができる。例えば、修飾エンハンサー又はプロモーター配列は、ベクターからの転写活性がこれらの変化により改変されるように、調節核酸配列の反復単位を含み得る。
【０１２０】
一態様において、TR核酸発現カセット又は対照核酸発現カセットに含まれるプロモーターは、構成的、組織特異的、及び腫瘍特異的プロモーターから選択される。
【０１２１】
TR核酸発現カセット又は対照核酸発現カセットに含まれる構成的プロモーターは、例えば、ラウス肉腫ウイルス(RSV)長末端反復(LTR)プロモーター、サイトメガロウイルス前初期遺伝子(CMV)プロモーター、シミアンウイルス40初期(SV40E)プロモーター、細胞質ベータアクチンプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター(adenovirus major late promoter)、及びホスホグリセロールキナーゼ(PGK)プロモーターから選択することができる。一態様によれば、TR核酸発現カセット又は対照核酸発現カセットに含まれる構成的プロモーターは、CMVプロモーターである。一態様によれば、TR核酸発現カセット又は対照核酸発現カセットに含まれる構成的プロモーターは、SV40Eプロモーターである。
【０１２２】
TR核酸発現カセット又は対照核酸発現カセットに含まれる組織特異的プロモーターは、例えば、トランスフェリン(TF)、チロシナーゼ(TYR)、アルブミン(ALB)、筋クレアチンキナーゼ(CKM)、ミエリン塩基性タンパク質(MBP)、グリア線維酸性タンパク質(GFAP)、神経特異的エノラーゼ(NSE)、及びシナプシンI(SYN1)プロモーターから選択することができる。一態様によれば、TR又は対照発現カセットに含まれる組織特異的プロモーターは、シナプシンI(SYN1)プロモーターである。他の好ましい態様において、TR又は対照発現カセットに含まれる組織特異的プロモーターは、ALBプロモーターである。
【０１２３】
TR核酸発現カセット又は対照核酸発現カセットに含まれる腫瘍特異的プロモーターは、例えば、血管内皮増殖因子(VEGF)、VEGF受容体(即ち、KDR、E-セレクチン、又はエンドグリン)、α-フェトプロテイン(AFP)、癌胎児性抗原(CEA)、erbB2(v-erb-b2赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ2)、オステオカルシン(骨γ-カルボキシグルタマートタンパク質、BGLAP)、SLP1(分泌性ロイコプロテイナーゼ阻害剤又は抗ロイコプロテイナーゼ1)、低酸素応答エレメント(HRE)、L-プラスチン(リンパ球細胞質タンパク質1)、及びヘキソキナーゼII(HK2)から選択することができる。好適な態様において、TR核酸発現カセット又は対照核酸発現カセットに含まれる腫瘍特異的プロモーターは、α-フェトプロテイン(AFP)プロモーターである。他の好ましい態様において、TR核酸発現カセット又は対照核酸発現カセットに含まれる腫瘍特異的プロモーターは、SLP1プロモーターである。
【０１２４】
本発明の態様によれば、特異的転写エフェクターエレメントは、単離された後、単一又は限定された細胞応答タイプ(例えば、熱ショック応答又は金属調節エレメント)に依存した転写活性を有する、TR核酸発現カセット又は対照核酸発現カセット内の最小プロモーターに適切に作動可能に連結される。
【０１２５】
本発明の態様によれば、TR核酸発現カセット又は対照核酸発現カセットは、種特異的転写調節配列を含むことができる。このようなDNA調節配列は、発現カセットが挿入される細胞型に基づいて選択可能であり、限定では無いが、細菌、酵母、植物、昆虫、哺乳動物細胞、又はウイルスを含む、原核又は真核細胞から単離することができる。このような例において、哺乳類プロモーターは、哺乳動物細胞において選択された核酸を発現するように選択される。
【０１２６】
レポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレーム核酸配列は、TR核酸発現カセット内のTRエレメントをコードする核酸に対して3'側に位置するか、又は対照核酸発現カセット内の構成的プロモーターに対して3'側に位置する。レポータータンパク質をコードする核酸配列は、完全なゲノム配列(例えば、イントロンを含む)、合成核酸、又はレポータータンパク質をコードする遺伝子のcDNAコピーの何れかにすることができる。好適な態様において、レポータータンパク質をコードするcDNA配列は、mRNAスプライス部位の除去がもたらすゲノムの複雑性の減少により、TR核酸発現カセット又は対照核酸発現カセットに含まれる。
【０１２７】
レポータータンパク質をコードする核酸配列及びTRエレメントをコードする核酸配列をTR核酸発現カセットに挿入する手法は、当該技術分野において公知であり、発現カセットに含まれる調節エレメントの制御下となるように、直接又はリンカーを介して配列を連結することを含む。制限エンドヌクレアーゼ部位を提供する1個以上のリンカーを、発現カセットに含まれるべき核酸配列の何れかに加えて、配列の正確な挿入を容易にすることができる。
【０１２８】
本明細書で説明したように、レポーター遺伝子は、自身が発現される細胞に検出可能な生化学的又は視覚的に観察できる(例えば、蛍光)表現型を与える、レポーターをコードしている。レポータータンパク質は、更に、他のポリペプチドがポリペプチド又はその断片のN末端又はC末端に融合された融合又はハイブリッドポリペプチドを含むこともできる。融合ポリペプチドは、あるポリペプチドをコードする核酸配列(又はその一部)をインフレームで別のポリペプチドをコードする核酸配列(又はその一部)と共にクローニングすることにより産生される。融合ポリペプチドを産生する手法は当該技術分野において公知であり、ポリペプチドをコードするコード配列をインフレームで、融合ポリペプチドの翻訳が発現カセットに含まれる調節エレメントの制御下となるように、連結することを含む。
【０１２９】
本明細書に記載の発現カセットにおいてコードされるレポーターの非限定的な例には、抗原エピトープ、生物発光タンパク質、酵素、蛍光タンパク質、受容体、及びトランスポーターであるタンパク質が含まれる。
【０１３０】
一般的に使用されるレポーター遺伝子のクラスの1つは、哺乳動物細胞で発現された場合に、細胞又は細胞環境において視認可能な変化を引き起こす酵素又は他の生化学マーカーをコードする。このような変化は、直接観察が可能であり、検出可能な産物に変換される適切な基質の添加、又は代謝トレーサの添加及び結合を伴う場合がある。これらのレポーター遺伝子の例には、β-ガラクトシダーゼ(β-gal)酵素をコードする細菌LacZ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)酵素、ホタルルシフェラーゼ(コウチュウ目の甲虫)、ウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼ(ウミシイタケ(Sea pansy))、ガウシアルシフェラーゼ、単純ヘルペス1チミジンキナーゼ(HSV1-TK)及び変異型単純ヘルペス1チミジンキナーゼ(HSV1-sr39tk)遺伝子が含まれる。β-galの場合、発現細胞をハロゲン誘導ガラクトースとインキュベートすることにより、組織化学的又は蛍光定量的に検出及び定量可能な着色又は蛍光産物が生じる。CATの場合、細胞溶解物を放射性標識したクロラムフェニコール又はアセチル-CoA等の他のアセチルドナー分子と共にインキュベートし、アセチル化クロラムフェニコール産物をクロマトグラフィーによりアッセイする。他の有用なレポーター遺伝子は、緑色蛍光タンパク質(GFP)、強化黄色蛍光タンパク質(EYFP)、又は単量体赤色蛍光タンパク質(mRFP1)を含む、自然蛍光を有するタンパク質をコードする。
【０１３１】
発現カセット内の核酸によりコードされるレポーターは、ルシフェラーゼ、GFP、EYFP、mRFP1、β-Gal、及びCATから選択することができるが、当該技術分野において公知の他の任意のレポーター遺伝子を使用することができる。好適な態様によれば、発現カセット内の核酸によりコードされるレポーターは、ホタルルシフェラーゼである。他の好適な態様において、発現カセット内の核酸によりコードされるレポーターは、ウミシイタケルシフェラーゼである。更に他の好適な態様において、発現カセット内の核酸によりコードされるレポーターは、ガウシアルシフェラーゼである。
【０１３２】
当業者は、任意のポリアデニル化(ポリA)シグナルを本明細書に記載のTR核酸発現カセット又は対照核酸発現カセットの3'非翻訳(3'UTR)エレメントに組み込むことができることを容易に認識するであろう。本発明に有用なポリA配列の例には、SV40初期及び後期遺伝子、HSV-TK、及びヒト成長ホルモン(hGH)配列が含まれる。好適な態様によれば、ポリA配列は、SV40初期遺伝子配列である。
【０１３３】
本発明の発現カセットの態様によれば、3'UTRは、mRNA安定性を変化させることにより遺伝子発現を調節する1つ以上のエレメントを含むことができる。通常、mRNA分解は、mRNAポリA末端の消失、脱アデニル化RNAのエキソソームへの動員、及びリボヌクレアーゼ(RNase)の分解により例示される。選択mRNAにおいて、このプロセスは、細胞分解系によるmRNAの選択的認識を促進する特異的RNA不安定性エレメントにより加速される。本発明において、発現カセットmRNAは、細胞応答/回復遺伝子をコードするmRNA種に由来する3'UTR AUリッチエレメント(「ARE」)配列等の要素を含むことができる。
【０１３４】
本発明の態様による発現カセットに随意に含まれるARE配列の例は、c-fos、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、c-jun、腫瘍壊死因子α(TNF-α)、及びIL-8 mRNA由来の3'UTR配列である。好適な態様によれば、c-fos遺伝子由来のARE配列が、TR核酸発現カセット又は対照核酸発現カセットに含まれる。
【０１３５】
TR核酸発現カセット又は対照核酸発現カセットは、更に、プロモーターの3'側、TR核酸発現カセット内でTRエレメントをコードする配列の5'側に位置する5'非翻訳領域(5'UTR)を含むことができる。発現カセットの一部の態様において、このような領域は、mRNA転写開始部位を含む。発現カセットの他の態様において、5'非翻訳領域は、イントロン配列を含み、これはmRNAスプライシングを指示し、インビボでの一部のmRNA種の効率的な処理に必要となる。真核細胞におけるmRNAスプライシングの一般的なメカニズムは、Sharp (Science 235: 736-771, 1987)において定義及び要約されている。mRNAスプライシングに必要な、次の4つの核酸配列が存在する: 5'スプライスドナー、分岐点、ポリピリミジントラクト、及び3'スプライスアクセプター。コンセンサス5'及び3' スプライスジャンクション(Mount, Nucl.Acids.Res. 10:459-472, 1992)及び分岐部位配列(Zhuang et al., PNAS 86:2752-2756, 1989)は、当該技術分野において公知である。
【０１３６】
TR核酸発現カセット又は対照核酸発現カセットは、更に、天然遺伝子配列又は人工イントロンに存在する1つ以上の天然イントロンを含む1つ以上の5'UTR配列、例えばpAAV-MCSベクター(Stratagene)に存在するヒトβグロビン免疫グロブリン配列等を含むことができる。
【０１３７】
TR核酸発現カセット又は対照核酸発現カセットは、プロモーターの5'側に位置し、かつ、発現カセットをプラスミド、シャトルベクター、又はウイルスベクターに挿入するための1つ以上の制限部位を含む約15乃至50ヌクレオチドの配列と、TRエレメント又は構成的プロモーターをコードする配列の3'側、かつ、レポーター配列の5'側に位置し、TRエレメント又は構成的プロモーターをコードする配列及びレポーターをコードする配列を挿入し適切に作動可能に連結するための1つ以上の制限部位を含む約15乃至50ヌクレオチドの配列と、レポーター配列の3'側、かつ、ポリアデニル化シグナルの5'側に位置し、ORF配列及びポリアデニル化配列を挿入し適切に作動可能に連結するための1つ以上の制限部位を含む約15乃至50ヌクレオチドの配列と、ポリアデニル化配列の3'側に位置し、核酸発現カセットをプラスミド、シャトルベクター、又はウイルスベクターに挿入するための1つ以上の制限部位を含む約15乃至50ヌクレオチドの配列と、の1つ以上を含むことができる。
【０１３８】
本明細書に記載のTR核酸発現カセット又は対照核酸発現カセットは、発現カセットを複製するために用いる宿主細胞に応じてプラスミド又はウイルス(「シャトル」)ベクターに挿入することができる。一般に、TR核酸発現カセット又は対照核酸発現カセットは、当該技術分野において公知の手法を用いてベクター内の適切な制限エンドヌクレアーゼ部位(群)に挿入される。この目的に有用な多数のベクターとしては、Miller, Human Gene Therapy 15-14, 1990、Friedman, Science 244:1275-1281, 1989、Eglitis and Anderson, BioTechniques 6:608-614, 1988、Tolstoshev and Anderson, Current Opinion in Biotechnology 1:55-61, 1990、Sharp, The Lancet 337:1277-1278, 1991、Cornetta et al., Nucleic Acid Research and Molecular Biology 36:311-322, 1987、Anderson, Science 226:401-409, 1984、Moen, Blood Cells 17:407-416, 1991、Miller et al., Biotechniques 7:980-990, 1989、及びLe Gal La Salle et al., Science 259:988-990, 1993、及びJohnson, Chest 107:77S-83S, 1995に記載のもの等が一般に知られている。
【０１３９】
プラスミドベクターは、プラスミドで形質転換されるべき宿主細胞に部分的に基づいて選択される。例えば、プラスミド内に存在する細菌又は哺乳動物の選択マーカーの存在、複製起点、プラスミドコピー数、染色体DNAとのランダム又は部位特異的な組換えを指示する能力等が、適切なベクターの選択に影響を与える場合がある。pBluescript II、pET14、pUC19、pCMV-MCS、及びpCMVneo等の細菌プラスミドは、細菌細胞において本発明の発現カセットを増やすために利用することができる。好適な態様において、プラスミドは、pCMVneoベクターである。他の好適な態様において、プラスミドは、pBluescript IIベクターである。
【０１４０】
他の態様において、TR核酸発現カセット又は対照核酸発現カセットは、哺乳動物又はウイルスシャトルベクターに挿入する。哺乳動物シャトルベクターは、哺乳動物選択マーカーを含み、安定したゲノム組み込み体を含む細胞の単離をもたらす一方、ウイルスシャトルベクターは、組換え又は遺伝的相補性を用いたウイルスゲノムの再構成をもたらす。一部の態様において、哺乳動物シャトルベクターは、pCMV、pEYFP-N1、pEGFP-N1、又はpEGFP-C1プラスミドから選択される。好適な態様において、哺乳動物シャトルベクターは、pEYFP-N1である。一部の態様において、ウイルスシャトルベクターは、pAAV-MCS(アデノ関連ウイルス血清型2又はAAV2ゲノム)又はpBac-1、pBacPAK8/9(Autographa californicaバキュロウイルスゲノム)プラスミドから選択される。好適な一態様において、ウイルスシャトルベクターは、pAAV-MCSである。他の好適な態様において、ウイルスシャトルベクターは、pBac-1プラスミドである。
【０１４１】
TR核酸発現カセット又はコントロール核酸発現カセットは、特定の細胞、組織、又は器官へ効率的に確実に送達するため、細胞標的化を促進する非ウイルス送達系に組み込むことができる。例えば、本発明のTR核酸発現カセット又は対照核酸発現カセットを含む哺乳動物シャトルプラスミドは、リポソームにカプセル化し得る。リポソームには、エマルション、フォーム、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散系、ラメラ層等が含まれる。リポソーム担体を用いたDNA配列の標的細胞への送達は、こうしたリポソームを調製する方法として、当該技術分野において周知である。
【０１４２】
本発明の実施に有用なウイルスには、好ましくはバキュロウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、及びアデノウイルス科のウイルスから選択される、組換え改変されたエンベロープ又は無エンベロープDNA及びRNAウイルスが含まれる。態様によれば、組換えウイルスは、バキュロウイルス科のウイルスである。好適な態様において、バキュロウイルスは、Autographa californica誘導体ウイルスである。他の実施形態において、ウイルスは、パルボウイルス科のウイルスである。好適な態様において、アデノ随伴ウイルス(「AAV」)は、AAV血清型2である。他の態様において、AAVは、AAV血清型1である。
【０１４３】
ウイルスゲノムは、好ましくは、本発明のTR核酸発現カセット又は対照核酸発現カセットを含むように組換えDNA手法により改変され、複製欠損、条件付き複製、又は複製可能となるように操作してもよい。例えば、条件付き複製ウイルスを用いて、ウイルスの複製を特定の調節された細胞培養条件に限定することが有用となり得る。
【０１４４】
2つ以上の「親」ウイルス特性の有利な要素を利用するキメラウイルスベクターは、本明細書に含まれる。ウイルスのバックボーンがウイルスベクターのパッケージングに必要な配列のみを含み、随意にTR核酸発現カセット又は対照核酸発現カセットを含む最小ベクター系も、本発明において作成及び使用し得る。ヒト細胞又はヒト細胞株の形質導入を行う際のヒトヘルペスウイルスのように、一般に、治療すべき種からのウイルスを利用することが好ましい。一部の例では、形質導入されるもの以外の種を起源とするウイルスを使用することができる。例えば、非ヒト供給源に由来する血清型のアデノ随伴ウイルス(AAV)は、天然又は既存のヒト抗体により非ヒト血清型が直ちに認識されないはずであるため、ヒトの治療に有用となり得る。ベクターに対する免疫応答を最小化することにより、ベクターの急速な全身クリアランスが回避され、ベクターのインビボでの有効性の持続時間が増加する。
【０１４５】
上述した哺乳動物シャトルベクターの何れかにおけるTR核酸発現カセット又は対照核酸発現カセットは、哺乳動物細胞に形質転換することができる。シャトルベクターは、当業者が利用可能な任意の手法により宿主細胞に導入することができる。これらに含まれるものには、限定では無いが、化学的トランスフェクション(例えば、塩化カルシウム法、リン酸カルシウム法)、リポフェクション、エレクトロポレーション、細胞融合、マイクロインジェクション、及びウイルス感染がある(Ridgway, A. “Mammalian Expression Vectors” Ch.24, pg. 470-472, Rodriguez and Denhardt, Eds., Butterworths, Boston MA 1988)。
【０１４６】
本発明の態様による発現カセットに含まれる及び/又は安定細胞株のゲノムに組み込まれるDNA配列によりコードされる翻訳調節又はTRエレメントは、内部リボソーム進入部位(IRES)であり、(a)その核酸配列の前後関係及び(b)翻訳を調節する細胞活性により、他のIRESから区別することができる(出典を明記することにより本願明細書の一部とした米国公開特許出願第2006/0173168号)。これら2つの特徴の組合せは、このIRES配列に適切に作動可能に連結された、ストレス下及び/又は瀕死の哺乳動物細胞における下流コード配列の選択的翻訳の基礎を成す。したがって、本発明では、ストレス下及び/又は瀕死の細胞において選択的に発現されるTRエレメントとして、任意の哺乳動物IRESを使用することが考えられる。
【０１４７】
一部実施形態において、本発明のIRESエレメントは、哺乳動物プロテオリピドタンパク質(PLP)遺伝子又はそのDM20スプライス変異体のORF内に局在するキャップ非依存性翻訳活性を有する。天然の関係性において、PLP IRES活性は、正常細胞において内部AUGコドンへのリボソームスキャニングを効果的にブロックする幾つかの上流ORF(「upstream ORF (uORF)」)を含むマルチシストロンRNA内に存在する。しかしながら、毒性剤への細胞の暴露により、リボソーム結合及び特定の内部RNA配列からの翻訳が生じ、内部アミノ酸配列がplp ORFの3'末端(例えば、PIRP-M及びPIRP-Lペプチド)から翻訳される。
【０１４８】
任意の哺乳動物種のプロテオリピドタンパク質(PLP)又はプロテオリピドタンパク質のDM20アイソフォームをコードする遺伝子に由来するTRエレメントをコードする核酸配列は、本発明の態様によるTR発現カセットに含まれる及び/又は安定細胞株のゲノムに組み込まれる。PLP及びDM20をコードする核酸配列は、哺乳動物種間での高度な同一性を特徴とする。TRエレメントをコードするヒト及びマウスPLP及びDM20 DNA配列を本明細書において詳細に説明する。
【０１４９】
マウスPLP及びヒトPLP DNA配列は、それぞれ配列番号6及び8であり、関連性が高く、96.5％の同一性を特徴とする。マウスDM20及びヒトDM20 DNA配列は、それぞれ配列番号5及び7であり、関連性が高く、96％の同一性を特徴とする。
【０１５０】
PLP DNA配列は、DM20 DNA配列と関連性が高いが、DM20は、PLP DNA配列と比較して104個のヌクレオチド欠失を特徴とする(代替mRNAスプライシング)。ヒトPLP DNA配列(配列番号8)を基準とすると、ヒトDM20 DNA配列は、87.5％の同一性、マウスDM20は、84.3％の同一性を有する。TRエレメントをコードする配列である配列番号1は、ヒトPLP DNA配列(配列番号8)に対して83.1％の同一性を有する。したがって、本発明の態様による発現カセットに含まれるTRエレメントをコードする配列の変異体は、エクソン3bが存在する場合、配列番号8と83％以上の同一性を有する。
【０１５１】
エクソン5は、随意に、本発明の態様による、発現カセット内のTRエレメントをコードするDNA配列から除外され、及び/又は、安定な細胞株のゲノムに組み込まれる。ヒトPLP DNA配列(配列番号8)を基準とすると、エクソン5を除くヒトDM20 DNA配列は、78.7％の同一性、エクソン5を除くマウスDM20は、75.4％の同一性を有する。TRエレメントをコードする配列である配列番号1からのエクソン5の欠失により、ヒトPLP DNA配列番号8に対して74.2％の同一性を有するDNA配列が生じる。したがって、本発明の態様による発現カセットに含まれるTRエレメントをコードする配列の変異体は、エクソン3b及び5が欠失した場合、配列番号8に対して74.2％以上の同一性を有する。
【０１５２】
TRエレメントをコードする、本発明の態様によるTRエレメント発現カセットに含まれる及び/又は安定細胞株のゲノムに組み込まれるDNA配列は、TRエレメントをコードする配列中の1つ以上のアミノ酸コドンを保存することがTRエレメントをコードするDNA配列の分析に関与しないように、任意の発現タンパク質又はペプチドをコードしない。
【０１５３】
配列番号17は、本発明の態様による組成物及び方法において有用なTRエレメントをコードするプロテオリピドタンパク質の変異コンセンサス配列である。配列番号17は、ヌクレオチド位置722のヌクレオチドTと、ヌクレオチド位置772のヌクレオチドAと、第1の18S rRNA結合部位はヌクレオチド位置503乃至526でコードされることと、第2の18S rRNA結合部位はヌクレオチド位置796乃至822でコードされることとを特徴とし、コードされたTRエレメントは、mRNA内で適切に作動可能に連結されたコード配列に選択的翻訳をもたらす。配列番号17の変異体は、これらの特徴を含み、全長の配列番号17に対して少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、又はそれ以上の同一性を有することを特徴とし、コードされたTRエレメントは、mRNA内で適切に作動可能に連結されたコード配列に選択的翻訳をもたらす。
【０１５４】
配列番号18は、本発明の態様による組成物及び方法において有用なTRエレメントをコードするDM20プロテオリピドタンパク質コンセンサス配列である。配列番号18は、ヌクレオチド位置617のヌクレオチドTと、ヌクレオチド位置667のヌクレオチドAとを特徴とし、更に、第1の18S rRNA結合部位はヌクレオチド位置398乃至422でコードされ、第2の18S rRNA結合部位はヌクレオチド位置691乃至716でコードされることを特徴とし、コードされたTRエレメントは、mRNA内で適切に作動可能に連結されたコード配列に選択的翻訳をもたらす。配列番号18の変異体は、これらの特徴を含み、全長の配列番号18に対して少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、又はそれ以上の同一性を有することを特徴とし、コードされたTRエレメントは、mRNA内で適切に作動可能に連結されたコード配列に選択的翻訳をもたらす。
【０１５５】
配列番号19は、本発明の態様による組成物及び方法において有用なTRエレメントをコードするプロテオリピドタンパク質コンセンサス配列である。配列番号19は、ヌクレオチド位置648のヌクレオチドTと、ヌクレオチド位置698のヌクレオチドAと、第1の18S rRNA結合部位はヌクレオチド位置503乃至526でコードされることと、第2の18S rRNA結合部位はヌクレオチド位置722乃至748でコードされることとを特徴とし、エクソン5は、欠失しており、コードされたTRエレメントは、mRNA内で適切に作動可能に連結されたコード配列に選択的翻訳をもたらす。配列番号19の変異体は、これらの特徴を含み、完全長の配列番号19に対して少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、又はそれ以上の同一性を有することを特徴とし、コードされたTRエレメントは、mRNA内で適切に作動可能に連結されたコード配列に選択的翻訳をもたらす。
【０１５６】
配列番号20は、本発明の態様による組成物及び方法において有用なTRエレメントをコードするDM20プロテオリピドタンパク質コンセンサス配列である。配列番号20は、ヌクレオチド位置543のヌクレオチドTと、ヌクレオチド位置593のヌクレオチドAとを特徴とし、更に、第1の18S rRNA結合部位はヌクレオチド位置398乃至422でコードされ、第2の18S rRNA結合部位はヌクレオチド位置617乃至642でコードされることを特徴とし、エクソン5は、欠失しており、コードされたTRエレメントは、mRNA内で適切に作動可能に連結されたコード配列に選択的翻訳をもたらす。配列番号20の変異体は、これらの特徴を含み、全長の配列番号20に対して少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、又はそれ以上の同一性を有することを特徴とし、コードされたTRエレメントは、mRNA内で適切に作動可能に連結されたコード配列に選択的翻訳をもたらす。
【０１５７】
配列番号1は、プロテオリピドタンパク質のDM20アイソフォームをコードするマウス遺伝子に由来するTRエレメント(mTRdm)をコードする。配列番号1は、ヌクレオチド位置617のヌクレオチドTと、ヌクレオチド位置667のヌクレオチドAと、ヌクレオチド1のAからTへの変異、ヌクレオチド4のGからAへの変異、ヌクレオチド6のCからTへの変異、ヌクレオチド7のTからGへの変異、ヌクレオチド8のTからAへの変異、ヌクレオチド17のGからAへの変異、ヌクレオチド18のTからGへの変異、ヌクレオチド21のTからAへの変異、ヌクレオチド27のAからTへの変異、ヌクレオチド511のAからTへの変異、及びヌクレオチド598のAからTへの変異であり、全てが配列番号5の野生型マウスDM20(mDM)DNA配列に対するものである変異を特徴とし、更に、ヌクレオチド位置398乃至422でコードされる第1の18S rRNA結合部位と、ヌクレオチド位置691乃至716でコードされる第2の18S rRNA結合部位と、を特徴とし、コードされたTRエレメントは、mRNA内で適切に作動可能に連結されたコード配列に選択的翻訳をもたらす。
【０１５８】
配列番号1によりコードされるTRエレメントの変異体は、726ヌクレオチドのDNA配列によりコードされ、この配列は、ヌクレオチド位置617のヌクレオチドTと、ヌクレオチド位置667のヌクレオチドAとを特徴とし、更に、ヌクレオチド1、2、及び3の何れか又は全ては、ヌクレオチド1、2、及び3がATGにならないように変異し、ヌクレオチド27、28、及び29の何れか又は全ては、ヌクレオチド27、28、及び29がATGにならないように変異し、ヌクレオチド511、512、及び513の何れか又は全ては、ヌクレオチド511、512、及び513がATGにならないように変異し、ヌクレオチド598、599、及び600の何れか又は全ては、ヌクレオチド598、599、及び600がATGにならないように変異し、ヌクレオチド2、3、及び4の何れか又は全ては、ヌクレオチド2、3、及び4が終止コドンになるように変異し、ヌクレオチド6、7、及び8の何れか又は全ては、ヌクレオチド6、7、及び8が終止コドンになるように変異し、ヌクレオチド16、17、及び18の何れか又は全ては、ヌクレオチド16、17、及び18が終止コドンになるように変異し、ヌクレオチド19、20、及び21の何れか又は全ては、ヌクレオチド19、20及び21が終止コドンになるように変異し、全ての変異が配列番号5に対するものであり、第1の18S rRNA結合部位はヌクレオチド位置398乃至422でコードされ、第2の18S rRNA結合部位はヌクレオチド位置691乃至716でコードされることを特徴とし、更に、少なくとも83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくはそれ以上の同一性を配列番号5に対して有するか、又は少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくはそれ以上の同一性を配列番号5に対して有することを特徴とし、コードされたTRエレメントは、mRNA内で適切に作動可能に連結されたコード配列に選択的翻訳をもたらす。
【０１５９】
配列番号1によりコードされるTRエレメントの変異体は、726ヌクレオチドのDNA配列によりコードされ、この配列は、ヌクレオチド位置617のヌクレオチドTと、ヌクレオチド位置667のヌクレオチドAとを特徴とし、更に、ヌクレオチド1はTであり、ヌクレオチド4はAであり、ヌクレオチド6はTであり、ヌクレオチド7はGであり、ヌクレオチド8はAであり、ヌクレオチド17はAであり、ヌクレオチド18はGであり、ヌクレオチド21はAであり、ヌクレオチド27はTであり、ヌクレオチド511はTであり、ヌクレオチド598はTであり、全ての変異は配列番号5に対するものであり、第1の18S rRNA結合部位はヌクレオチド位置398乃至422でコードされ、第2の18S rRNA結合部位はヌクレオチド位置691乃至716でコードされることを特徴とし、更に少なくとも83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくはそれ以上の同一性を配列番号5に対して有するか、又は少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくはそれ以上の同一性を配列番号5に対して有することを特徴とし、コードされたTRエレメントは、mRNA内で適切に作動可能に連結されたコード配列に選択的翻訳をもたらす。
【０１６０】
配列番号1によりコードされるTRエレメントの変異体は、652ヌクレオチドのDNA配列によりコードされ、この配列は、ヌクレオチド位置543のヌクレオチドTと、ヌクレオチド位置593のヌクレオチドAとを特徴とし、更に、ヌクレオチド1がTであり、ヌクレオチド4はAであり、ヌクレオチド6はTであり、ヌクレオチド7はGであり、ヌクレオチド8はAであり、ヌクレオチド17はAであり、ヌクレオチド18はGであり、ヌクレオチド21はAであり、ヌクレオチド27はTであり、ヌクレオチド511はTであり、ヌクレオチド524はTであり、エクソン5、ヌクレオチド518乃至591は欠失しており、全ての変異は配列番号5に対するものであり、最初の18S rRNA結合部位はヌクレオチド位置398乃至422でコードされ、第2の18S rRNA結合部位はヌクレオチド位置617乃至642でコードされることを特徴とし、更に、少なくとも83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくはそれ以上の同一性を配列番号5に対して有するか、又は少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくはそれ以上の同一性を配列番号5に対して有することを特徴とし、コードされたTRエレメントは、mRNA内で適切に作動可能に連結されたコード配列に選択的翻訳をもたらす。
【０１６１】
配列番号1によりコードされるTRエレメントの変異体は、652ヌクレオチドのDNA配列によりコードされ、この配列は、ヌクレオチド位置543のヌクレオチドTと、ヌクレオチド位置593のヌクレオチドAとを特徴とし、更に、ヌクレオチド1、2、及び3の何れか又は全ては、ヌクレオチド1、2、及び3がATGにならないように変異し、ヌクレオチド27、28、及び29の何れか又は全ては、ヌクレオチド27、28及び29がATGにならないように変異し、ヌクレオチド511、512、及び513の何れか又は全ては、ヌクレオチド511、512、及び513がATGにならないように変異し、ヌクレオチド524、525、及び526の何れか又は全ては、ヌクレオチド524、525、及び526がATGにならないように変異し、ヌクレオチド2、3、及び4の何れか又は全ては、ヌクレオチド2、3、及び4が終止コドンになるように変異し、ヌクレオチド6、7、及び8の何れか又は全ては、ヌクレオチド6、7、及び8が終止コドンになるように変異し、ヌクレオチド16、17、及び18の何れか又は全ては、ヌクレオチド16、17及び18が終止コドンになるように変異し、ヌクレオチド19、20、及び21の何れか又は全ては、ヌクレオチド19、20、及び21が終止コドンになるように変異し、エクソン5、ヌクレオチド518乃至591は欠失しており、全ての変異は配列番号5に対するものであり、第1の18S rRNA結合部位はヌクレオチド位置398乃至422でコードされ、第2の18S rRNA結合部位はヌクレオチド位置617乃至642でコードされることを特徴とし、更に、少なくとも83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくはそれ以上の同一性を配列番号5に対して有するか、又は少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくはそれ以上の同一性を配列番号5に対して有することを特徴とし、コードされたTRエレメントは、mRNA内で適切に作動可能に連結されたコード配列に選択的翻訳をもたらす。
【０１６２】
配列番号3は、プロテオリピドタンパク質のDM20アイソフォームをコードするヒト遺伝子に由来するTRエレメント(hTRdm)をコードする。配列番号3は、ヌクレオチド位置617のヌクレオチドTと、ヌクレオチド位置667のヌクレオチドAとを特徴とし、更に、ヌクレオチド1のAからTへの変異、ヌクレオチド4のGからAへの変異、ヌクレオチド6のCからTへの変異、ヌクレオチド7のTからGへの変異、ヌクレオチド8のTからAへの変異、ヌクレオチド17のGからAへの変異、ヌクレオチド18のTからGへの変異、ヌクレオチド21のTからAへの変異、ヌクレオチド27のAからTへの変異、ヌクレオチド511のAからTへの変異、 ヌクレオチド598のAからTへの変異であり、全てが配列番号7の野生型hDM DNA配列に対するものである変異を含み、第1の18S rRNA結合部位はヌクレオチド位置398乃至422でコードされ、第2の18S rRNA結合部位はヌクレオチド位置691乃至716にコードされ、コードされたTRエレメントは、mRNA内で適切に作動可能に連結されたコード配列に選択的翻訳をもたらす。
【０１６３】
配列番号3によりコードされるTRエレメントの変異体は、726ヌクレオチドのDNA配列によりコードされ、この配列は、ヌクレオチド位置617のヌクレオチドTと、ヌクレオチド位置667のヌクレオチドAとを特徴とし、更に、ヌクレオチド1はTであり、ヌクレオチド4はAであり、ヌクレオチド6はTであり、ヌクレオチド7はGであり、ヌクレオチド8はAであり、ヌクレオチド17はAであり、ヌクレオチド18はGであり、ヌクレオチド21はAであり、ヌクレオチド27はTであり、ヌクレオチド511はTであり、ヌクレオチド598はTであり、全ての変異は配列番号7に対するものであり、第1の18S rRNA結合部位はヌクレオチド位置398乃至422でコードされ、第2の18S rRNA結合部位はヌクレオチド位置691乃至716でコードされることを特徴とし、更に、少なくとも83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくはそれ以上の同一性を配列番号7に対して有するか、又は少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくはそれ以上の同一性を配列番号7に対して有することを特徴とし、コードされたTRエレメントは、mRNA内で適切に作動可能に連結されたコード配列に選択的翻訳をもたらす。
【０１６４】
配列番号3によりコードされるTRエレメントの変異体は、726ヌクレオチドのDNA配列によりコードされ、この配列は、ヌクレオチド位置617のヌクレオチドTと、ヌクレオチド位置667のヌクレオチドAとを特徴とし、更に、ヌクレオチド1、2、及び3の何れか又は全ては、ヌクレオチド1、2、及び3がATGにならないように変異し、ヌクレオチド27、28、及び29の何れか又は全ては、ヌクレオチド27、28、及び29がATGにならないように変異し、ヌクレオチド511、512、及び513の何れか又は全ては、ヌクレオチド511、512、及び513がATGにならないように変異し、ヌクレオチド598、599、及び600の何れか又は全ては、ヌクレオチド598、599、及び600がATGにならないように変異し、ヌクレオチド2、3、及び4の何れか又は全ては、ヌクレオチド2、3、及び4が終止コドンになるように変異し、ヌクレオチド6、7、及び8の何れか又は全ては、ヌクレオチド6、7、及び8が終止コドンになるように変異し、ヌクレオチド16、17、及び18の何れか又は全ては、ヌクレオチド16、17、及び18が終止コドンになるように変異し、ヌクレオチド19、20、及び21の何れか又は全ては、ヌクレオチド19、20、及び21になるように変異し、全ての変異は配列番号7に対するものであり、第1の18S rRNA結合部位はヌクレオチド位置398乃至422でコードされ、第2の18S rRNA結合部位は、ヌクレオチド位置691乃至716でコードされることを特徴とし、更に、少なくとも83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくはそれ以上の同一性を配列番号7に対して有するか、又は少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくはそれ以上の同一性を配列番号7に対して有することを特徴とし、コードされたTRエレメントは、mRNA内で適切に作動可能に連結されたコード配列に選択的翻訳をもたらす。
【０１６５】
配列番号3によりコードされるTRエレメントの変異体は、652ヌクレオチドのDNA配列によりコードされ、この配列は、ヌクレオチド位置543のヌクレオチドTと、ヌクレオチド位置593のヌクレオチドAとを特徴とし、更に、ヌクレオチド1はTであり、ヌクレオチド4はAであり、ヌクレオチド6はTであり、ヌクレオチド7はGであり、ヌクレオチド8はAであり、ヌクレオチド17はAであり、ヌクレオチド18はGであり、ヌクレオチド21はAであり、ヌクレオチド27はTであり、ヌクレオチド511はTであり、ヌクレオチド524はTであり、エクソン5、ヌクレオチド518乃至591は欠失しており、全ての変異は配列番号7に対するものであり、第1の18S rRNA結合部位はヌクレオチド位置398乃至422でコードされ、第2の18S rRNA結合部位はヌクレオチド位置617乃至642でコードされることを特徴とし、更に、少なくとも83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくはそれ以上の同一性を配列番号7に対して有するか、又は少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくはそれ以上の同一性を配列番号7に対して有することを特徴とし、コードされたTRエレメントは、mRNA内で適切に作動可能に連結されたコード配列に選択的翻訳をもたらす。
【０１６６】
配列番号3によりコードされるTRエレメントの変異体は、652ヌクレオチドのDNA配列によりコードされ、この配列は、ヌクレオチド位置543のヌクレオチドTと、ヌクレオチド位置593のヌクレオチドAとを特徴とし、更に、ヌクレオチド1、2、及び3の何れか又は全ては、ヌクレオチド1、2、及び3がATGにならないように変異し、ヌクレオチド27、28、及び29の何れか又は全ては、ヌクレオチド27、28、及び29がATGにならないように変異し、ヌクレオチド511、512、及び513の何れか又は全ては、ヌクレオチド511、512、及び513にならないように変異し、ヌクレオチド524、525、及び526の何れか又は全てが、ヌクレオチド524、525、及び526がATGにならないように変異し、ヌクレオチド2、3、及び4の何れか又は全ては、ヌクレオチド2、3、及び4が終止コドンになるように変異し、ヌクレオチド6、7、及び8の何れか又は全ては、ヌクレオチド6、7、及び8が終止コドンになるように変異し、ヌクレオチド16、17、及び18の何れか又は全ては、ヌクレオチド16、17、及び18が終止コドンになるように変異し、ヌクレオチド19、20、及び21の何れか又は全ては、ヌクレオチド19、20、及び21が終止コドンになるように変異し、エクソン5、ヌクレオチド518乃至591は欠失しており、全ての変異は配列番号7に対するものであり、第1の18S rRNA結合部位はヌクレオチド位置398乃至422でコードされ、第2の18S rRNA結合部位はヌクレオチド位置617乃至642でコードされることを特徴とし、更に、少なくとも83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくはそれ以上の同一性を配列番号7に対して有するか、又は少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくはそれ以上の同一性を配列番号7に対して有することを特徴とし、コードされたTRエレメントは、mRNA内で適切に作動可能に連結されたコード配列に選択的翻訳をもたらす。
【０１６７】
配列番号2は、プロテオリピドタンパク質をコードするマウス遺伝子由来のTRエレメント(mTRp)をコードする。配列番号2は、ヌクレオチド位置722のヌクレオチドTと、ヌクレオチド位置772のヌクレオチドAとを特徴とし、更に、ヌクレオチド1のAからTへの変異、ヌクレオチド4のGからAへの変異、ヌクレオチド6のCからTへの変異、ヌクレオチド7のTからGへの変異、ヌクレオチド8のTからAへの変異、ヌクレオチド17のGからAへの変異、ヌクレオチド18のTからGへの変異、ヌクレオチド21のTからAへの変異、ヌクレオチド27のAからTへの変異であり、全てが配列番号6の野生型mPLP DNA配列に対するものである変異を含み、第1の18S rRNA結合部位はヌクレオチド位置503乃至526にコードされ、第2の18S rRNA結合部位はヌクレオチド位置796乃至822でコードされ、コードされたTRエレメントは、mRNA内で適切に作動可能に連結されたコード配列に選択的翻訳をもたらす。
【０１６８】
配列番号2によりコードされるTRエレメントの変異体は、831ヌクレオチドのDNA配列によりコードされ、この配列は、ヌクレオチド位置722のヌクレオチドTと、ヌクレオチド位置772のヌクレオチドAとを特徴とし、更に、ヌクレオチド1はTであり、ヌクレオチド4はAであり、ヌクレオチド6はTであり、ヌクレオチド7はGであり、ヌクレオチド8はAであり、ヌクレオチド17はAであり、ヌクレオチド18はGであり、ヌクレオチド21はAであり、ヌクレオチド27はTであり、ヌクレオチド616はTであり、ヌクレオチド703はTであり、全ての変異は配列番号7に対するものであり、第1の18S rRNA結合部位はヌクレオチド位置503乃至526でコードされ、第2の18S rRNA結合部位はヌクレオチド位置796乃至822でコードされることを特徴とし、更に、少なくとも83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくはそれ以上の同一性を配列番号6に対して有するか、又は少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくはそれ以上の同一性を配列番号6に対して有することを特徴とし、コードされたTRエレメントは、mRNA内で適切に作動可能に連結されたコード配列に選択的翻訳をもたらす。
【０１６９】
配列番号2によりコードされるTRエレメントの変異体は、831ヌクレオチドのDNA配列によりコードされ、この配列は、ヌクレオチド位置722のヌクレオチドTと、ヌクレオチド位置772のヌクレオチドAとを特徴とし、更に、ヌクレオチド1、2、及び3の何れか又は全ては、ヌクレオチド1、2、及び3がATGにならないように変異し、ヌクレオチド27、28、及び29の何れか又は全ては、ヌクレオチド27、28、及び29がATGにならないように変異し、ヌクレオチド616、617、及び618の何れか又は全てが、ヌクレオチド616、617、及び618がATGにならないように変異し、ヌクレオチド703、704、及び705の何れか又は全ては、ヌクレオチド703、704、及び705がATGにならないように変異し、ヌクレオチド2、3、及び4の何れか又は全ては、ヌクレオチド2、3、及び4が終止コドンになるように変異し、ヌクレオチド6、7、及び8の何れか又は全ては、ヌクレオチド6、7、及び8が終止コドンになるように変異し、ヌクレオチド16、17、及び18の何れか又は全ては、ヌクレオチド16、17、及び18が終止コドンになるように変異し、ヌクレオチド19、20、及び21の何れか又は全ては、ヌクレオチド19、20、及び21が終止コドンになるように変異し、全ての変異は配列番号6に対するものであり、第1の18S rRNA結合部位はヌクレオチド位置503乃至526でコードされ、第2の18S rRNA結合部位はヌクレオチド位置796乃至822でコードされることを特徴とし、更に、少なくとも83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくはそれ以上の同一性を配列番号6に対して有するか、又は少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくはそれ以上の同一性を配列番号6に対して有することを特徴とし、コードされたTRエレメントは、mRNA内で適切に作動可能に連結されたコード配列に選択的翻訳をもたらす。
【０１７０】
配列番号2によりコードされるTRエレメントの変異体は、757ヌクレオチドのDNA配列によりコードされ、この配列は、ヌクレオチド位置648のヌクレオチドTと、ヌクレオチド位置698のヌクレオチドAとを特徴とし、更に、ヌクレオチド1はTであり、ヌクレオチド4はAであり、ヌクレオチド6はTであり、ヌクレオチド7はGであり、ヌクレオチド8はAであり、ヌクレオチド17はAであり、ヌクレオチド18はGであり、ヌクレオチド21はAであり、ヌクレオチド27はTであり、ヌクレオチド616はTであり、ヌクレオチド629はTであり、エクソン5、ヌクレオチド623乃至696は欠失しており、全ての変異は配列番号6に対するものであり、第1の18S rRNA結合部位はヌクレオチド位置503乃至526でコードされ、第2の18S rRNA結合部位はヌクレオチド位置722乃至748でコードされることを特徴とし、更に、少なくとも83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくはそれ以上の同一性を配列番号6に対して有するか、又は少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくはそれ以上の同一性を配列番号6に対して有することを特徴とし、コードされたTRエレメントは、mRNA内で適切に作動可能に連結されたコード配列に選択的翻訳をもたらす。
【０１７１】
配列番号2によりコードされるTRエレメントの変異体は、757ヌクレオチドのDNA配列によりコードされ、この配列は、ヌクレオチド位置648のヌクレオチドTと、ヌクレオチド位置698のヌクレオチドAとを特徴とし、更に、ヌクレオチド1、2、及び3の何れか又は全ては、ヌクレオチド1、2、及び3がATGにならないように変異し、ヌクレオチド27、28、及び29の何れか又は全ては、ヌクレオチド27、28、及び29がATGにならないように変異し、ヌクレオチド616、617、及び618の何れか又は全ては、ヌクレオチド616、617、及び618がATGにならないように変異し、ヌクレオチド629、630、及び631の何れか又は全ては、ヌクレオチド629、630、及び631がATGにならないように変異し、ヌクレオチド2、3、及び4の何れか又は全ては、ヌクレオチド2、3、及び4が終止コドンになるように変異し、ヌクレオチド6、7、及び8の何れか又は全ては、ヌクレオチド6、7、及び8が終止コドンになるように変異し、ヌクレオチド16、17、及び18の何れか又は全ては、ヌクレオチド16、17、及び18が終止コドンになるように変異し、ヌクレオチド19、20、及び21の何れか又は全ては、ヌクレオチド19、20、及び21が終止コドンになるように変異し、エクソン5、ヌクレオチド623乃至696は欠失しており、全ての変異は配列番号6に対するものであり、第1の18S rRNA結合部位はヌクレオチド位置503乃至526でコードされ、第2の18S rRNA結合部位はヌクレオチド位置722乃至748でコードされることを特徴とし、更に、少なくとも83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくはそれ以上の同一性を配列番号6に対して有するか、又は少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくはそれ以上の同一性を配列番号6に対して有することを特徴とし、コードされたTRエレメントは、mRNA内で適切に作動可能に連結されたコード配列に選択的翻訳をもたらす。
【０１７２】
配列番号4は、プロテオリピドタンパク質をコードするヒト遺伝子に由来するTRエレメント(hTRp)をコードする。配列番号4は、ヌクレオチド位置722のヌクレオチドTと、ヌクレオチド位置772のヌクレオチドAとを特徴とし、更に、ヌクレオチド1のAからTへの変異、ヌクレオチド4のGからAへの変異、ヌクレオチド6のCからTへの変異、ヌクレオチド7のTからGへの変異、ヌクレオチド8のTからAへの変異、ヌクレオチド17のGからAへの変異、ヌクレオチド18のTからGへの変異、ヌクレオチド21のTからAへの変異、ヌクレオチド27のAからTへの変異、ヌクレオチド616のAからTへの変異、ヌクレオチド703のAからTへの変異であり、全てが配列番号8の野生型hPLP DNA配列に対するものである変異を含み、第1の18S rRNA結合部位はヌクレオチド位置503乃至526でコードされ、第2の18S rRNA結合部位はヌクレオチド位置796乃至822でコードされ、コードされたTRエレメントは、mRNA内で適切に作動可能に連結されたコード配列に選択的翻訳をもたらす。
【０１７３】
配列番号4によりコードされるTRエレメントの変異体は、831ヌクレオチドのDNA配列によりコードされ、この配列は、ヌクレオチド位置722のヌクレオチドTと、ヌクレオチド位置772のヌクレオチドAとを特徴とし、更に、ヌクレオチド1はTであり、ヌクレオチド4はAであり、ヌクレオチド6はTであり、ヌクレオチド7はGであり、ヌクレオチド8はAであり、ヌクレオチド17はAであり、ヌクレオチド18はGであり、ヌクレオチド21はAであり、ヌクレオチド27はTであり、ヌクレオチド616はTであり、ヌクレオチド703はTであり、全ての変異は配列番号8に対するものであり、第1の18S rRNA結合部位はヌクレオチド位置503乃至526でコードされ、第2の18S rRNA結合部位はヌクレオチド位置796乃至822でコードされることを特徴とし、更に、少なくとも83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくはそれ以上の同一性を配列番号8に対して有するか、又は少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくはそれ以上の同一性を配列番号8に対して有することを特徴とし、コードされたTRエレメントは、mRNA内で適切に作動可能に連結されたコード配列に選択的翻訳をもたらす。
【０１７４】
配列番号4によりコードされるTRエレメントの変異体は、831ヌクレオチドのDNA配列によりコードされ、この配列は、ヌクレオチド位置722のヌクレオチドTと、ヌクレオチド位置772のヌクレオチドAとを特徴とし、更に、ヌクレオチド1、2、及び3の何れか又は全ては、ヌクレオチド1、2、及び3がATGにならないように変異し、ヌクレオチド27、28、及び29の何れか又は全ては、ヌクレオチド27、28、及び29がATGにならないように変異し、ヌクレオチド616、617、及び618の何れか又は全ては、ヌクレオチド616、617、及び618がATGにならないように変異し、ヌクレオチド703、704、及び705の何れか又は全ては、ヌクレオチド703、704、及び705がATGにならないように変異し、ヌクレオチド2、3、及び4の何れか又は全ては、ヌクレオチド2、3、及び4が終止コドンになるように変異し、ヌクレオチド6、7、及び8の何れか又は全ては、ヌクレオチド6、7、及び8が終止コドンになるように変異し、ヌクレオチド16、17、及び18の何れか又は全ては、ヌクレオチド16、17、及び18が終止コドンになるように変異し、ヌクレオチド19、20、及び21の何れか又は全ては、ヌクレオチド19、20、及び21が終止コドンになるように変異し、全ての変異は配列番号8に対するものであり、第1の18S rRNA結合部位はヌクレオチド位置503乃至526でコードされ、第2の18S rRNA結合部位はヌクレオチド位置796乃至822でコードされることを特徴とし、更に、少なくとも83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくはそれ以上の同一性を配列番号8に対して有するか、又は少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくはそれ以上の同一性を配列番号8に対して有することを特徴とし、コードされたTRエレメントは、mRNA内で適切に作動可能に連結されたコード配列に選択的翻訳をもたらす。
【０１７５】
配列番号4によりコードされるTRエレメントの変異体は、757ヌクレオチドのDNA配列によりコードされ、この配列は、ヌクレオチド位置648のヌクレオチドTと、ヌクレオチド位置698のヌクレオチドAとを特徴とし、更に、ヌクレオチド1がTであり、ヌクレオチド4はAであり、ヌクレオチド6はTであり、ヌクレオチド7はGであり、ヌクレオチド8はAであり、ヌクレオチド17はAであり、ヌクレオチド18はGであり、ヌクレオチド21はAであり、ヌクレオチド27はTであり、ヌクレオチド616はTであり、ヌクレオチド629はTであり、エクソン5、ヌクレオチド623乃至696は欠失しており、全ての変異は配列番号8に対するものであり、第1の18S rRNA結合部位はヌクレオチド位置503乃至526でコードされ、第2の18S rRNA結合部位はヌクレオチド位置722乃至748でコードされることを特徴とし、更に、少なくとも83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくはそれ以上の同一性を配列番号8に対して有するか、又は少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくはそれ以上の同一性を配列番号8に対して有することを特徴とし、コードされたTRエレメントは、mRNA内で適切に作動可能に連結されたコード配列に選択的翻訳をもたらす。
【０１７６】
配列番号4によりコードされるTRエレメントの変異体は、757ヌクレオチドのDNA配列によりコードされ、この配列は、ヌクレオチド位置648のヌクレオチドTと、ヌクレオチド位置698のヌクレオチドAとを特徴とし、更に、ヌクレオチド1、2、及び3の何れか又は全ては、ヌクレオチド1、2、及び3がATGにならないように変異し、ヌクレオチド27、28、及び29の何れか又は全ては、ヌクレオチド27、28、及び29がATGにならないように変異し、ヌクレオチド616、617、及び618の何れか又は全ては、ヌクレオチド616、617、及び618がATGにならないように変異し、ヌクレオチド629、630、及び631の何れか又は全ては、ヌクレオチド629、630、及び631がATGにならないように変異し、ヌクレオチド2、3、及び4の何れか又は全ては、ヌクレオチド2、3、及び4が終止コドンになるように変異し、ヌクレオチド6、7、及び8の何れか又は全ては、ヌクレオチド6、7、及び8が終止コドンになるように変異し、ヌクレオチド16、17、及び18の何れか又は全ては、ヌクレオチド16、17、及び18が終止コドンになるように変異し、ヌクレオチド19、20、及び21の何れか又は全ては、ヌクレオチド19、20、及び21が停止コドンになるように変異し、エクソン5、ヌクレオチド623乃至696は欠失しており、全ての変異は配列番号8に対するものであり、第1の18S rRNA結合部位はヌクレオチド位置503乃至526でコードされ、第2の18S rRNA結合部位はヌクレオチド位置722乃至748でコードされることを特徴とし、更に、少なくとも83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、若しくはそれ以上の同一性を配列番号8に対して有するか、又は少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくはそれ以上の同一性を配列番号8に対して有することを特徴とし、コードされたTRエレメントは、mRNA内で適切に作動可能に連結されたコード配列に選択的翻訳をもたらす。
【０１７７】
TRエレメントをコードし、本発明の態様による発現カセットに含まれるDNA配列は、PLP遺伝子及び/又はDM20遺伝子のエクソン1乃至7に由来する。特定の理論に縛られるものではないが、エクソン1乃至4は、変異解析データに基づく機能的IRES活性をコードするのに十分であると考えられる。更に、ストレス/死特異的翻訳において役割を果たすTR制御系は、エクソン6及び/又は7内に位置すると考えられる。
【０１７８】
以下の変異が、配列番号5乃至8として本明細書に示したPLP及びDM20をコードする野生型ヒト及びマウスDNA配列において行われ、変異配列が生じた:ヌクレオチド1をAからTに変異させ、全長PLP及びDM20の合成を指示するミエリンプロテオリピドタンパク質PLP及びDM20 cDNA内の野生型AUG開始コドンを取り除いて、そのような合成の発生を防止し、ヌクレオチド4をGからAへ変異させ、PLP及びDM20 cDNAの第2の可能なリーディングフレームに終止コドンを形成して、全長合成を防止し、ヌクレオチド6、7、及び8をCからT、TからG、及びTからAへそれぞれ変異させ、PLP及びDM20 cDNAの第3の可能なリーディングフレームに終止コドンを形成して、全長PLP及びDM20の合成を防止し、ヌクレオチド17及び18をGからA及びTからGへそれぞれ変異させ、PLP及びDM20 cDNAの主要(第1)オープンリーディングフレームに第1の終止コドンを作成して、その全長合成を防止し、ヌクレオチド21をTからAへ変異させ、PLP及びDM20 cDNAの主要(第1)オープンリーディングフレームに第2の終止コドンを作成して、その全長合成を防止し、ヌクレオチド27をAからTへ変異させ、PLP及びDM20 cDNAの第3の可能なリーディングフレームからAUGコドンを取り除いて、野生型AUGコドンの不在下でのフレーム外翻訳の開始を防止し、停止コドンをPLP及びDM20 cDNAから欠失させて、下流のオープンリーディングフレームの翻訳に対する干渉を減少させた。
【０１７９】
PLP又はDM20に由来する本発明の態様による発現カセットに含まれるDNA配列によりコードされるTRエレメントは、PIRP-M又はPIRP-Lペプチドを直接には翻訳しない。上述した変化に加えて、以下の変異を、cDNAのDM20変異体からのTRエレメントをコードする配列に導入した:ヌクレオチド511をAからTへ変異させ、PIRP-Mタンパク質の合成を指示するDM20変異体内の第1のインフレーム内部AUG開始コドンを取り除いて、そのような合成の発生を防止し、ヌクレオチド598をAからTへ変異させて、PIRP-Lタンパク質の合成を誘導するDM20変異体内の第2のインフレーム内部AUG開始コドンを取り除いて、そのような合成の発生を防止した。
【０１８０】
同様に、以下の変異をcDNAのマウスPLP変異体からのTRエレメントに導入した:ヌクレオチド616をAからTへ変異させ、PIRP-Mタンパク質の合成を指示するPLP変異体内の第1のインフレーム内部AUG開始コドンを取り除いて、そのような合成の発生を防止し、ヌクレオチド703をAからTへ変異させ、PIRP-Lタンパク質の合成を指示するPLP変異体内の第2のインフレーム内部AUG開始コドンを取り除いて、そのような合成の発生を防止した。
【０１８１】
本発明の態様によれば、TRエレメントは、ヒト又はマウスTRエレメントから選択される。より好ましくは、TRエレメントは、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、又はその何れかの変異体によりコードされるものから選択され、コードされたTRエレメントは、mRNA内で適切に作動可能に連結されたコード配列に選択的翻訳をもたらす。
【０１８２】
本発明の態様によれば、TRエレメントをコードするDNA配列は、A)参照配列である配列番号2又は配列番号4の少なくともヌクレオチド1乃至831に対応し、これに対して少なくとも62％の配列同一性を有するPLPヌクレオチド配列、又はB)参照配列である配列番号1又は配列番号3の少なくともヌクレオチド1乃至726に対応し、これに対して少なくとも62％の配列同一性を有するDM20ヌクレオチド配列を含み、TRエレメントをコードするDNA配列は、配列番号2又は配列番号4のPLPヌクレオチド位置41乃至48、50乃至56、75乃至81、150乃至156、200乃至205、227乃至244、251乃至257、270乃至274、299乃至303、490乃至494、563乃至570、578乃至582、597乃至601、626乃至632、642乃至648、669乃至674、707乃至712、755乃至761、767乃至771、及び800乃至804の1つ以上、又は配列番号1又は配列番号3における対応する1つ以上の位置に、ポリピリミジントラクトを含む。
【０１８３】
好適な一実施形態において、(A)又は(B)の配列同一性は、少なくとも約70％、より好ましくは少なくとも又は約80％である。
【０１８４】
本発明の態様によれば、TRエレメントをコードするDNA配列は、配列番号2又は配列番号4のPLPヌクレオチド位置130乃至133、142乃至145、190乃至193、220乃至223、305乃至308、329乃至332、343乃至346、572乃至575、635乃至638、650乃至653、及び683乃至686の1つ以上、又は配列番号1又は配列番号3における対応する1つ以上の位置に、GNRA配列を含む。
【０１８５】
PLP/DM20コード配列と、それによりコード又は構築されたTRエレメントとにおいては、TRエレメント機能に悪影響を与えることなく、配列番号2及び配列番号4/配列番号1及び配列番号3の以下のPLP/DM20ヌクレオチド位置に対応する1つ以上の位置で変異させることができる:1、2、3、4乃至21(このセグメントの全部又は一部の欠失を含む)、25、26、314、332、560/455、614/509、623/518乃至696/591(エクソン5の除去をもたらす、このセグメントの全部又は一部の欠失を含む)、616/511、703/598、806/701、811/706、817/712、818/713、及び827/722。様々な実施形態において、上記以外の核酸塩基は、PLP/DM20コード配列において保存することができる。
【０１８６】
PLP/DM20コード配列と、それによりコード又は構築されたTRエレメントとにおいては、TRエレメント機能に悪影響を与えることなく、配列番号2及び配列番号4/配列番号1及び配列番号3の以下のPLP/DM20ヌクレオチド位置に対応する1つ以上の位置で変異させることができる: 1、4、6、7、8、17、18、21、25、26、27、314、332、560/455、616/511、703/598、806/701、811/706、817/712、818/713、及び827/722。一部の実施形態において、これらの変異は、以下の何れかにすることができる: 1t、4a、6t、7g、8a、17a、18g、21a、25g、26c、27t、314g、332g、560/455c、616/511t、703/598t、806/701g、811/706t、817/712a、818/713a、及び827/722g。
【０１８７】
加えて、挿入、例えば、最大又は約5ヌクレオチドの挿入を、IRES機能に悪影響を与えることなく、PLP位置614/509で行うことができる。加えて、位置831/726との融合、例えば、この位置へのレポーター又は他の標的遺伝子コード配列のインフレーム融合は、TRエレメント機能に如何なる悪影響も与えない。
【０１８８】
他の実施形態において、本発明のTRエレメントは、ヒト又はマウス以外の脊椎動物のPLP又はDM20配列に由来する。一部の実施形態において、これは、霊長類、齧歯類、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、有袋類、鳥類、魚類、両生類、又は爬虫類の配列にすることができる。様々な実施形態において、脊椎動物の配列は、野生型でも変異体でも、天然配列にすることができ、一部の実施形態において、脊椎動物の配列は、野生型配列にすることができる。
【０１８９】
PLP/DM20配列に関して本明細書で使用される「哺乳動物コンセンサス配列」は、配列番号9のDNA配列を示す。「哺乳動物コンセンサス配列」は、Homo sapiens、Pongo pygmaeus(オランウータン)、Pan troglodytes(チンパンジー)、Macaca mulatta(アカゲザル)、Macaca fascicularis(カニクイザル)、Sus scrofa(ブタ)、Mus musculus(マウス)、Rattus norvegicus(ラット)、Monodelphis domestica(オポッサム)、Oryctolagus cuniculus(ウサギ)、Bos taurus(ウシ)、及びCanis familiaris(イヌ)種のPLP又はDM20配列を示す。コンセンサス配列では、ヌクレオチドに対して以下の標準的な略語が用いられる: mは、a又はcであり、rは、a又はgであり、wは、a又はtであり、sは、c又はgであり、yは、c又はtであり、kは、g又はtであり、 vは、a又はc又はgであり、hは、a又はc又はtであり、dは、a又はg又はtであり、bは、c又はg又はtであり、x/nは、a又はc又はg又はtである。
【０１９０】
一部の実施形態において、GenBankにおいてCAA43839(ニワトリ)、P47790(キンカチョウ)、AAW79015(ヤモリ)、CAA79582(カエル)、又はBAA84207(シーラカンス)として示されるもの等、非哺乳類脊椎動物のPLP及び/又はDM20配列を使用することができる。
【０１９１】
これらをコードするDNA配列は、httpワールドワイドウェブncbi.nlm.nih.gov/sites/entrezウェブサイトにおいてヌクレオチドメニューでNCBI Genbankを検索することにより、当業者に容易に利用可能である。例えば、有用なDNA配列には、以下のGenbankアクセッション番号で記載されるものが含まれる: AJ006976(ヒト)、CR860432(オランウータン)、XM_001140782(チンパンジー)、XM_001088537(アカゲザル)、AB083324(カニクイザル)、NM_213974(ブタ)、NM_011123(マウス)、NM_030990(ラット)、XM_001374446(オポッサム)、NM_001082328(ウサギ)、AJ009913(ウシ)、X55317(イヌ)、X61661(ニワトリ)、NM_001076703(残基113乃至946、キンカチョウ)、AY880400(ヤモリ)、Z19522(カエル)、及びAB025938(シーラカンス)。
【０１９２】
特定の例において、コードされたTRエレメントに適切に作動可能に連結された配列エレメントは、TRエレメントが示す選択的翻訳活性を破壊する恐れ、又は最適未満の翻訳活性を示す恐れがある。連結されたORFによるTR活性への任意の影響を緩和するために、本発明は、発現したポリペプチドのポリペプチド配列を変化させない(したがって生物活性に影響を与えない)代替コドンを利用する、開示ヌクレオチド配列のコドン使用変異体を提供する。これらの変異体は、遺伝コードの縮重に基づいており、これにより幾つかのアミノ酸は2個以上のコドントリプレットによりコードされる。例としては、コドンCGT、CGG、CGC、及びCGAがあり、これらは全てアミノ酸のアルギニン(R)をコードする。したがって、タンパク質は、正確な配列が異なるものの同一のアミノ酸配列によりポリペプチドをコードする異型核酸配列によりコードすることができる。コドンの利用/選択に基づいて、TR発現カセットからの調節された翻訳に影響を与えることなく、ORFの翻訳効率を最適化するようにコドンを選択することができる。
【０１９３】
部位特異的変異誘発は、1つ以上の所望の位置でヌクレオチド配列を変更することにより配列変異体を生成するための特に有用な一方法である。部位指向的(又は部位特異的)変異誘発では、所望の変異を有するDNA配列と、十分なサイズ及び複雑性を有する配列を提供するのに十分な数の隣接ヌクレオチドとを含むオリゴヌクレオチド配列を使用して、計画された変異の両側に安定した二重鎖を形成する。通常、長さ約20乃至25ヌクレオチドの合成プライマーが好ましく、計画された配列の変異の両側では約5乃至10個の残基が変更される。部位特異的変異誘発に有用となる代表的なベクターには、開示されたベクターの他、市販又は学術用のプラスミドベクターが含まれる。一般に、ヌクレオチド置換は、適切なDNAオリゴヌクレオチド配列を標的DNAによりアニーリングし、当該技術分野において公知のPCR手順により標的配列を増幅することにより導入される。
【０１９４】
本発明では、本発明により使用する所望のORF配列を産生するためのコード配列内の全ての可能なコドンを使用することが考えられる。
【０１９５】
定向進化手法を用いて、TR機能が改善された配列変異体を調製することができる。定向進化手法では、少なくとも1ラウンドの核酸変異又は核酸スプライシング又は相同組換えを、TR含有ポリヌクレオチドから開始して行うことができる。変異、スプライシング、及び相同組換えは、定向的に又はランダムに行うことができる。例えば、1つ以上のオリゴヌクレオチドを、上述したように、TRエレメントの部位特異的変異誘発のために設計することができ、又は1つ以上のランダムに生成されたオリゴヌクレオチドを、初期TR含有ポリヌクレオチドテンプレートに接触させることができる。代わりに、又は追加として、初期テンプレートのPCR増幅は、誤差が許容される条件下で、及び/又は変異の導入を可能にするエラープローンポリメラーゼにより、「スロッピー」PCRと呼ばれる手法で行うことができる。
【０１９６】
同様に、一組の相同TRエレメント含有ポリヌクレオチドを、定向的又はランダムにスプライシング又は組換えることができる。例えば、1つ以上の制限エンドヌクレアーゼを用いて、相同ポリヌクレオチドテンプレートを、ランダムに又は所定の形で消化し、その後、結果的に生じた断片を連結することができる。代わりに、又は追加として、一組のTRエレメント含有ポリヌクレオチドをプールし、試験管内又は細胞内で、それらの相同組換えに有利な条件下で処理することができる。特に、TR特異的翻訳効率にとって重要な調節配列は、複数のコピーを含む配列が発生するように、組み合わせること又は数を増やすことができる。この作業のために、変異及びスプライシング又は組換え手法の任意の組み合わせを用いることができる。これらの何れかを1ラウンド以上実行することができる。
【０１９７】
1ラウンド以上の突然変異、スプライシング、及び/又は組換えの後、結果的に生じたポリヌクレオチドを試験して、TR活性についてスクリーニングする。通常、これは、生成された1つ以上のTR変異体の適切に作動可能な制御下に、レポーター分子コード配列を置くことにより行うことができる。その後、結果的に生じた構築物(群)を、TR翻訳が起こり得るストレス状態等の条件下に置かれた細胞内で発現させる。この試験は、TRエレメント機能の所望の改善を検出するために用いることができる。例えば、ストレス状態に対するTRエレメント翻訳の特異性の改善、細胞ストレス応答(例えば、細胞ストレス及び/又は細胞死に先行する生化学的変化)に対するTRエレメント活性化の感受性、又はTRエレメント活性化時の翻訳開始の効率(即ち、規模)の何れか1つを、アッセイの焦点にすることができる。
【０１９８】
アッセイ結果に基づいて、1つ以上の改善されたTRエレメントを選択して、使用すること、又は更に開発することが可能であり、一部の実施形態において、選択された改良TRエレメント核酸は、定向進化の別のラウンド又は複数のラウンドの出発ポリヌクレオチドとして、又は一組の出発ポリヌクレオチドとして使用することができる。
【０１９９】
部位特異的変異誘発により、SET調節活性についてエクソン5乃至7配列を調べた。予想通り、エクソン5の欠失(マウスジンピー変異にも存在する)は、エクソン5及び6に関連する全てのORF(PIRP-M/PIRP-L ORF及びuORF7及び8)を破壊するが、SET調節に影響しなかった。これにより、全長TR発現カセットからのSETが、エクソン5欠失に影響されない単一のuORF(エクソン7内に位置するuORF9)に関連する可能性があるシス調節エレメントを必要とすることが示唆された。意外なことに、uORF9 AUGコドンを変更する単一の塩基変化(AUGからUUG)が、増殖細胞におけるSET調節を低下させ、ストレス無負荷細胞におけるレポーターORFの翻訳を可能にした。uORF9の翻訳がレポーターORFのSETに必要かを更に調べるために、アミノ酸配列を変更するがuORF9に終止コドンを導入しない特定のアミノ酸(単一及び対のコドン変化として発現)に変異を導入した。これらの突然変異体により、特定のヌクレオチド変化がSETの優性ネガティブ調節を示すことが確証された。RNA構造解析ソフトウェアM-foldを使用して、各uORF9変異をRNA構造変化について調べることにより、各優性ネガティブ変異が、インタクトなプロテオリピドmRNA構造を含め、複数の安定したRNA構造を変化させることが分かった。これらの研究は、uORF9に関連する野生型RNA構造が効率的なSET調節に必要であることの強力な証拠となる。
【０２００】
uORF9の比較配列分析を更に行うことで、第2の18S rRNA配列との高い相補性を有するが、plp IRES 18S rRNA配列との相同性が最小限である短いRNAセグメントを同定した。両配列は、18S rRNAの同じ露出ヘリックスの異なるセグメントに暫定的にハイブリダイズすることができたが、uORF9 18S rRNA配列は、感染細胞におけるdORFのキャップ非依存性翻訳の再開を指示する保存ウイルス配列(多くの哺乳動物ウイルスに存在する)との類似性が高い。IRES 18S rRNA配列と同様に、ウイルス翻訳の再開には、mRNAとの40Sサブユニット相互作用を制御するmRNA-18S rRNA相互作用が必要となる。しかしながら、IRES 18S rRNA相互作用とは対照的に、翻訳の再開には、mRNA出口トンネルにおいてmRNAを整列させるためにeIF3複合体と相互作用するRNA構造要素も必要となる。このmRNA-18S rRNA-eIF3複合体は、mRNA上に40Sサブユニットを保持しており、新たな三元複合体を結合させることが可能であると共に、翻訳再開のためにdORF AUGコドンを位置決めする。
【０２０１】
好適な態様において、TR mRNAは、2つの独立した機能的要素を用いてストレス細胞におけるレポータータンパク質のSETを指示する。第1の機能的配列(TR IRESと呼ばれる)は、増殖及びストレス細胞における80Sサブユニットに結合することが可能なエクソン4に位置する構成的IRESエレメントである。第2の機能的配列(エクソン7に位置するTRレギュレーターと呼ばれる)は、ストレス無負荷細胞における増殖リボソームとplp IRESとの間のTR mRNA相互作用を制御するが、しかしながら、毒素により処理された細胞において、TRレギュレーターは、TR mRNA、40Sサブユニット、及びeIF3複合体の間の相互作用を制御して、翻訳再開のためにレポーターdORFを位置決めする。下流のTRレギュレーターが上流の構成的IR IRESを制御する能力は、他の如何なるIRESエレメントにおいても検出されておらず、報告もされていない。この点において、TR発現系により検出されるSETプロセスは独特であり、ストレス細胞においてSETを指示する80Sリボソームが、増殖細胞においてキャップ依存性翻訳を発生させる80Sリボソームとは異なることを示している。
【０２０２】
本発明の一態様において、SET「参照標準」作用剤又はRefStanは、標準化された手順を用いて実行することが可能であり、TR「参照」又は「Ref」細胞株において予測可能なSET応答を一貫して生成する任意の薬物投与プロトコル、環境処理、又は細胞操作プロセスとなる。本発明の他の態様において、TR Ref細胞株は、SET RefStanの包括的なスクリーニングを受け、予測可能なSET応答を安定的に発生させるTR遺伝子カセットを安定して発現する任意の細胞株である。好適な態様において、本発明は、TR Ref細胞株を用いて、SETシグナル伝達経路を過剰発現することの生物学的影響を性質決定する方法を説明する。これらのRef細胞株は、主要なSETシグナル伝達エフェクター(SETリボソーム)を標的とする薬物のインビトロ及びインビボ有効性を定義するために必須となる。
【０２０３】
本発明の一部の態様において、哺乳動物細胞は、動物(即ち、初代細胞)又は哺乳動物腫瘍細胞株から単離された哺乳動物細胞にすることができる。動物からの細胞単離方法は、当該技術分野において周知である。一部の態様において、初代細胞は、マウスから単離される。他の態様において、初代細胞は、ヒトから単離される。更に他の態様において、哺乳動物腫瘍細胞株を用いることができる。細胞種の例には、HEK293(ヒト胎児腎臓)、HT1080(ヒト線維肉腫)、NTera2D(ヒト胎児性奇形腫)、HeLa(ヒト子宮頸部腺癌)、Caco2(ヒト結腸腺癌)、HepG2(ヒト肝臓肝細胞癌)、HCT116(ヒト結腸腫瘍)、MDA231(ヒト乳癌)、U2 OS(ヒト骨肉腫)、DU145(ヒト前立腺癌)、LNCaP(ヒト前立腺腺癌)、LoVo(ヒト結腸癌)、MiaPaCa2(ヒト膵臓癌)、AsPC1(ヒト膵臓腺癌)、MCF-7(ヒト乳癌)、PC3、Capan-2(ヒト膵臓腺癌)、COLO201(ヒト結腸癌)、COLO205(ヒト結腸腫瘍)、H4(ヒト脳神経膠腫)、HuTu80(ヒト十二指腸腺癌)、HT1080(ヒト結合組織線維肉腫)、及びSK-N-MC(ヒト脳神経上皮腫)が含まれる。哺乳動物腫瘍細胞株は、例えば、American Tissue Culture Collection(ATCC)又は任意の承認されたブダペスト条約に基づく施設又は他の生物寄託機関から入手可能である。
【０２０４】
本発明の一態様は、TR発現カセットにより安定的に形質転換された哺乳動物細胞を、「SET活性化」依存性タンパク質翻訳(以下参照)のレベルに基づいて3つの「TRクラス」に分けることができるという驚くべき発見であった。薬剤耐性を付与する導入遺伝子の少なくとも1つの組込み事象を各細胞が含む、安定的に形質転換された細胞の全集団は、「細胞プール」と呼ばれる。細胞プールに由来する個別の細胞コロニーのその後の単離は、「細胞株」と呼ばれる。多様なSET特異的発現レベルを有する細胞の混合集団を提供する第1のアプローチとは対照的に、第2のアプローチでは、固有のSET依存性タンパク質発現レベルを発現する選択コロニー群(即ち、TR Ref細胞株)を精製するために、数千の潜在的細胞コロニーから、個別のクローンを選択、単離、及び特徴付けする必要がある。
【０２０５】
複数のトランスフェクションプロトコルを用いて細胞プールを生成し、プレーティングして全ての薬剤耐性細胞を回収した。これらの初代細胞プール培養物(継代0培養物と呼ぶ)は、全ての潜在的トランスフェクタントの包括的なランダム集合を含む。しかしながら、当該技術分野において周知であるように、一般には、純粋な細胞単離物を得るために、細胞プールから細胞をサブクローニングすることが望ましい。細胞単離物は、細胞型特異的単離物を選択しない選択及び精製方法を用いて回収した(例えば、より大きなコロニーサイズ、プレーティング効率の向上、又はより速い単離物の増殖速度)。コロニーを複数のプレートから単離し、サイズバイアス無しで採取し、標準化された方法を用いて繁殖させ、コロニーの成長が定められたサイズ及び細胞数に達したときにアッセイした。このプロトコルを生き抜いた各クローン(即ち、全細胞株集団)を、SETアゴニストRefStanを用いてTRアッセイ応答についてスクリーニングした。
【０２０６】
標準SET応答を測定するために、処理した細胞においてTR発現カセットから翻訳されたレポータータンパク質の量をアッセイし、未処理の細胞標準により発現されたレポータータンパク質のレベルと比較する。試験試料応答の対照発現レベルに対する比は、未処理対照のパーセントとして表す。これらの研究の開始時に、SET又はSETシグナル伝達エフェクター(SETリボソーム)を直接的又は間接的に調節することが実験的に明らかになったRefStanは存在していなかった。したがって、候補RefStan剤には、細胞を損傷及び/又は死滅させること、細胞生存率に影響を与えずに細胞内の公知の代謝プロセスを選択的に変化させること、又は中立的なSET応答を発生させることが可能な任意の作用剤を含めるのが論理に適っていると思われた。候補RefStanの最初の試験濃度として、薬剤特異的標的酵素又はシグナル伝達系を絶対的に調節することが知られている濃度又は処理を、好適な試験処理として使用した。候補試験処理が特定の薬物用量を含む場合に、標準SET応答を定義するには、用量反応アッセイを使用する必要があることは、当業者に公知であろう。標準RefStanプロトコルが確立された後、そのプロトコルを、その後の全ての細胞に基づくアッセイに使用した。
【０２０７】
SET活性化の可能性を特徴とするTR細胞株は、集団分析を用いて特定のクラスに割り当てた。全ての治療応答には、ランキングプロットを用いて順位を割り当てた。傾向分析を用いて、腫瘍細胞の種類に関係しない、少なくとも3つのSET活性化傾向を定義した(全てのトランスフェクト腫瘍細胞は、同じ3つのSET活性化応答を含み、TR Ref細胞株を単離するために使用可能となる)。しかしながら、当業者が認識するように、最も正確なTRクラス分布では、SET活性化応答の全範囲を正確に表すために統計的に有意な数のサブクローンを調べる必要がある。好ましくは、3つのTRクラスからの細胞株の代表を得るためには、少なくとも約60の独立サブクローン、より好ましくは少なくとも約100の独立サブクローン、更により好ましくは少なくとも約250の独立サブクローンの単離が必要となった。細胞株は、同定後、増幅し、細胞培養で維持するか、貯蔵及び将来の使用のために凍結した。
【０２０８】
3つのTR細胞クラスは、任意に第1階級、第2階級、及び第3階級細胞と命名しており、次のように分類することができる。「SETアゴニスト」RefStanによる処理の際、第1階級細胞は、未処理細胞標準内のレポータータンパク質のレベルと比較して100％乃至500％高い範囲のレポータータンパク質のレベルを特徴とし、ここで、未処理細胞標準は、核酸発現カセットにより安定的に形質転換され、参照標準作用剤(群)により処理されていない哺乳動物細胞におけるレポータータンパク質のレベルを表す。同様に、第2階級細胞は、未処理細胞標準におけるレポータータンパク質のレベルと比較して500％より高く1400％以下であるレポータータンパク質のレベルを特徴とし、第3階級は、未処理細胞標準におけるレポータータンパク質のレベルと比較して1400％より高いレポータータンパク質のレベルを特徴とする。好適な一態様において、第3階級細胞は、未処理細胞標準におけるレポータータンパク質のレベルと比較して20,000％より高く75,000％以下であるレポータータンパク質のレベルを特徴とする。クラス指定は、隣接するクラスの集まりから2標準偏差だけ異なる推定クラスの平均に基づいて細胞株のグループに割り当てた。例えば、SETアゴニストによる処理後の全第1階級細胞株におけるレポータータンパク質発現の平均は、回収された全第2階級細胞株の平均よりも2標準偏差だけ低かった。
【０２０９】
好適な態様において、細胞株は、固定用量で、一定の時間に亘り、定められた体積で、特定の数の細胞上において37℃及び5％CO2で送達された1つのRefStanにより処理される(水不溶性RefStanは、全てDMSO中で溶解して細胞に送達する)。他の態様において、細胞は、複数のRefStanにより処理される。一例として、限定では無いが、SET RefStanは、cAMP、タプシガルジン、TPA、パクリタキセル(タキソール)、ノコダゾール、ビンブラスチン、コルヒチン、カルシウムイオノフォアA23167、MG132、ボルテゾミブ(ベルケイド)、ハイカムチン(トポテカン)、4-オキソキノリン-3-カルボン酸誘導体抗生物質、エタノール、及びメタノールからなる群から作成する。少なくとも2つのRefStanを使用する場合、RefStanの任意の組み合わせを使用することができる。どのRefStanの組み合わせが、その作用機序に基づいて特に有用であるかを、当業者は容易に判断することができる。2つのRefStanの組み合わせの例を以下に列挙する。一例として、2つのRefStanの組み合わせには、限定では無いが、cAMP及びTPAと、cAMP及びパクリタキセル、cAMP及びタプシガルジン、cAMP及びノコダゾール、cAMP及びビンブラスチン、cAMP及びコルヒチン、cAMP及びMG132、cAMP及びボルテゾミブ(ベルケイド)、cAMP及びカルシウムイオノフォアA23167、cAMP及び4-オキソキノリン-3-カルボン酸誘導体抗生物質、cAMP及びハイカムチンと、TPA及びパクリタキセル、TPA及びタプシガルジン、TPA及びノコダゾール、TPA及びビンブラスチンと、TPA及びコルヒチン、TPA及びMG132、TPA及びボルテゾミブ、TPA及びカルシウムイオノフォアA23167、TPA及び4-オキソキノリン-3-カルボン酸誘導体抗生物質、TPA及びハイカムチンと、パクリタキセル及びタプシガルジンと、パクリタキセル及びノコダゾールと、パクリタキセル及びビンブラスチンと、パクリタキセル及びコルヒチン、パクリタキセル及びMG132、パクリタキセル及びボルテゾミブ、パクリタキセル及びカルシウムイオノフォアA23167、パクリタキセル及び4-オキソキノリン-3-カルボン酸誘導体抗生物質、パクリタキセル及びハイカムチンと、MG132及びタプシガルジンと、MG132及びノコダゾールと、MG132及びビンブラスチンと、MG132及びコルヒチンと、MG132及びボルテゾミブ、MG132及びカルシウムイオノフォアA23167、MG132及び4-オキソキノリン-3-カルボン酸誘導体抗生物質、MG132及びハイカムチンと、タプシガルジン及びノコダゾール、タプシガルジン及びビンブラスチンと、タプシガルジン及びコルヒチン、タプシガルジン及びボルテゾミブ、タプシガルジン及びカルシウムイオノフォアA23167、タプシガルジン及び4-オキソキノリン-3-カルボン酸誘導体抗生物質、タプシガルジン及びハイカムチンと、ノコダゾール及びビンブラスチンと、ノコダゾール及びコルヒチン、ノコダゾール及びカルシウムイオノフォアA23167、ノコダゾール及び4-オキソキノリン-3-カルボン酸誘導体抗生物質、ノコダゾール及びハイカムチンと、ビンブラスチン及びコルヒチン、ビンブラスチン及びボルテゾミブ、ビンブラスチン及びカルシウムイオノフォアA23167、ビンブラスチン及び4-オキソキノリン-3-カルボン酸誘導体抗生物質、ビンブラスチン及びハイカムチンと、コルヒチン及びボルテゾミブ、コルヒチン及びカルシウムイオノフォアA23167と、コルヒチン及び4-オキソキノリン-3-カルボン酸誘導体抗生物質、コ��ヒチン及びハイカムチンと、ボルテゾミブ及びカルシウムイオノフォアA23167と、ボルテゾミブ及び4-オキソキノリン-3-カルボン酸誘導体抗生物質、ボルテゾミブ及びハイカムチンと、カルシウムイオノフォアA23167及び4-オキソキノリン-3-カルボン酸誘導体抗生物質、カルシウムイオノフォアA23167及びハイカムチンと、4-オキソキノリン-3-カルボン酸誘導体抗生物質及びハイカムチンとが含まれる。
【０２１０】
好適な態様では、全てのTR細胞株をSET活性化RefStanによりスクリーニングし、各単離物をTRクラスに割り当てる。他の態様において、SET活性化RefStanは、プロテインキナーゼC経路をアップレギュレートする。他の態様において、SETアゴニストRefStanの特定の例には、ポリオキシル硬化ヒマシ油ファミリー、ホルボールエステル化合物ファミリー、及びブリオスタチン類似体が含まれる。他の態様において、SET活性化RefStanの特定の例には、クレモホールEL、TPA、及びブリオスタチン1が含まれる。
【０２１１】
プロトタイプのPKCアイソザイムは、保存COOH末端キナーゼ配列及び可変NH末端調節ドメインを含有し、調節配列の差異により、活性化のモードの差異に基づいて3つの酵素クラスが機能的に定義される。例えば、従来のPKC[(cPKC)PKCα、PKCβI、PKCβII、及びPKCγ]は、ホスホリパーゼC(PLC)による膜結合性ホスファチジルイノシトール4,5-ビスリン酸(PIP2)の加水分解と、二次メッセンジャー分子であるジアシルグリセロール(DAG)及びイノシトール三リン酸(IP3)の放出とにより活性化される脂質感受性酵素として記述される。IP3は、サイトゾルに入り、ERからのカルシウムイオン放出を刺激するのに対して、疎水性DAG分子は、形質膜表面でcPKCに結合する。したがって、cPKCは、活性化のためにDAG結合(又はホルボールエステルTPAのようなDAG誘導体)とカルシウムイオンとを必要とする。対照的に、新規のPKC[(nPKC)PKCδ/θ及びPKCε/η]は、カルシウムイオン結合配列を欠いており、活性化のためにDAG(又はTPA)のみを必要とする。対照的に、非定型PKC [(aPKCs)PKCζ、PKC1/λ]は、カルシウムイオン結合配列を欠いているが、修飾された調節配列を含み、aPKC活性化は、ホスホイノシトール-3,4,5-三リン酸(PIP3)結合、様々なキナーゼによるリン酸化、及び自己リン酸化により調節されるようになる。aPKCアイソフォームは、更に、標的基質に近い細胞内位置に不活性及び活性キナーゼを方向付けて、受容体媒介シグナル変換及び細胞骨格/微小胞の再編成を容易にするタンパク質-タンパク質接触部位を含む。
【０２１２】
プロトタイプのPKCアイソフォームと同様に、脂質活性化PKC様キナーゼの第4の群(PKCμ/PKD1、PKCν/PKD2、PKD3)は、TPA依存性SET活性化を調節することができる。これらの酵素は、PKC調節ドメインに対して相同な配列を含むが、カルモジュリン依存性キナーゼ(細胞周期進行に必要な酵素活性)と同様のキナーゼドメインを含む。細胞刺激の際には、NH末端PKC様調節ドメインは、不活性キナーゼが脂質(又はTPA)に結合し、PKC依存性(例えば、nPKC酵素活性)又はPKC非依存性キナーゼによりリン酸化される特定の細胞内位置(例えば、細胞膜又はER膜)に、不活性PKDタンパク質を導く。自己リン酸化により、PKDキナーゼの活性化が完了し、PKDキナーゼは、PKC活性化の下流エフェクターとして機能し、細胞損傷後の細胞回復を調節する。
【０２１３】
アイソザイム特異的時空間運動の複雑なパターンは、PKCを細胞内基質の近くに局在化させるために必要となる。活性化後、PKCアイソザイムは、往々にして活性化部位から移動し、形質膜、核、ER/ゴルジ、及び/又はミトコンドリアに局在する。他の細胞キナーゼと同様に、活性化状態の維持、タンパク質の代謝回転、及び細胞内局在は、活性化キナーゼを固定する足場タンパク質により調節される。このようにして、足場タンパク質は、シグナル伝達分子を物理的にクラスター化することにより、多様なシグナル変換経路を統合し、異なるシグナル伝達カスケード間のクロストークを制御する。
【０２１４】
本発明にとって特に興味深いものは、PKCに対する選択的アンカータンパク質(好適なパートナーは、PKCβII、PKCε、PKCδ、及びPKCμアイソタイプ)であり、7個のWD40(Trp-Asp 40)反復を含む36kDaの細胞質タンパク質であるReceptor for Activated C Kinase 1(RACK1)タンパク質に関連するPKC活性である。RACK1は、細胞膜及び核膜で見ることができるが、本発明にとって特に興味深いのは、RACK1/プロテインキナーゼ複合体が真核細胞のリボソームに結合することである。この位置で、RACK1タンパク質は、40S Head構造に接続し、18S rRNA(mRNA出口チャネルの近く)及びeIF3複合体、並びに多数のシグナル伝達タンパク質、例えば、Srcキナーゼファミリー、インテグリンβサブユニット(CD104)、PDE4D5シグナル伝達兼転写活性化因子1(STAT1)、インスリン様増殖因子受容体、E3ユビキチンリガーゼ(VHL、エロンギンC等)、及びアンドロゲン受容体と接触する。これらのタンパク質を固定することにより、RACK1複合体は、細胞周期進行、抗アポトーシス/ストレス応答、接着性/運動性の変化、タンパク質代謝回転、細胞分化、転写、及び翻訳を制御する。RACK1タンパク質複合体は、mRNA IRESに対するSETリボソーム活性を指示し、翻訳再開の頻度を増加させる特異的mRNA配列上の機能的リボソームの集合を促進する可能性が高い。
【０２１５】
本発明の一態様において、SET応答を過剰発現するTR細胞株(即ち、全ての第3階級細胞の平均よりも3標準偏差だけ大きなSET応答を示すTR外れ値第3階級細胞)は、幹細胞様の転移性癌細胞と相関する増殖形質を示すことができる。以前に定義したTRクラス指定との一貫性を維持するため、実験的に定義されたインビトロ及びインビボ増殖形質を示す任意のTR第3階級細胞株を、TR第4階級細胞と呼ぶ。癌細胞は、無制限増殖と細胞死に対する抵抗性とを有するが、増殖支持基質の不在下で増殖する能力を有する細胞は、殆ど無い。本発明の一態様において、TR第4階級細胞は、第3階級外れ値SET応答と、懸濁培養において非接着性3D構造として成長するインビトロでの能力を示す必要がある。TR第4階級細胞株の球形成(即ち、腫瘍様塊)能力は、細胞凝集を反映しないが、少数の非接着性細胞から増殖する能力を表す。
【０２１６】
本発明の他の態様において、TR第4階級細胞株は、第3階級外れ値SET応答、腫瘍様塊を形成するインビトロでの能力、及びインビボでの腫瘍開始及び増殖活性を示す必要がある。定義によれば、ヌードマウスに移植された少数のTR第4階級細胞は、切断しサブフラグメント化して二次性腫瘍として増殖させることが可能な原発性異種腫瘍を引き起こして成長させるのに十分となる。
【０２１７】
本発明の一態様において、TR発現ベクターを発現する哺乳動物細胞は、SETシグナル伝達経路を「常用(addicted)」する安定した細胞株を単離するために用いることができる。定義によれば、腫瘍が癌遺伝子シグナル伝達経路を常用するようになるのは、その経路が腫瘍原性の増殖を開始及び/又は維持するために不可欠となる場合である。これらの細胞では、常用シグナル伝達経路を破壊することで、腫瘍増殖がブロックされ、生存能力が低下する。例えば、前臨床研究では、c-Mycを過剰発現する腫瘍(即ち、ヒト乳癌の5乃至15％がMyc遺伝子の増幅を示す)は、この経路を標的にすることにより治療可能であり、他の遺伝的及び後成的変化とは無関係に腫瘍の退縮をもたらすことが明らかとなっている。しかしながら、臨床研究は、転移性乳癌が既存の治療法では治療できないことを示している。殆どの場合、腫瘍の再増殖は、Myc活性の減少(シグナル伝達クロストーク)後に腫瘍細胞が効率的に増殖する後天的能力に関与する。又は、腫瘍は、構造的完全性にとって重要なシグナル伝達経路(例えば、VEGFRシグナル伝達)を常用する可能性がある。機能的脈管構造を形成する腫瘍の能力は、腫瘍全体での栄養素の受動的拡散を妨げるサイズを超える腫瘍増殖に必須のステップである。定義によれば、VEGFR依存性腫瘍内の細胞は、VEGFのサイズ依存性の存在を常用する。上述したように、腫瘍は、転移拡散を経て異常な血液又はリンパ組織に適応し、細胞の飢餓及びネクローシス死を制限する。
【０２１８】
本発明の好適な態様において、TR第4階級細胞におけるSET応答の過剰発現は、SETシグナル伝達の常用と同等であり、この経路の治療的介入により、薬物有効性を調節し得ることを意味する。TR第4階級細胞における主要なSETエフェクター(SETリボソーム)を標的とする薬物は、mTORC2により制御される細胞シグナル伝達経路を遮断する。したがって、SETリボソームからのタンパク質合成を阻害する薬物の開発は、細胞回復タンパク質の合成を減少させ、MAMリボソーム/mTORC2/ミトコンドリアシグナル伝達経路を変化させ、増殖の細胞周期チェックポイント制御を促進し、細胞回復を中断させ、ミトコンドリア特異的アポトーシス死を増加させる。実施例に示すように、SETリボソームを制御する薬物は、細胞毒性薬物のインビボ治療指数を向上させた。
【０２１９】
本発明は、腫瘍微小環境における細胞毒性薬物及び療法の細胞標的、生化学的標的、及び分子標的を評価すること、及び癌細胞による細胞毒性薬物に対する耐性に結び付く重要な細胞シグナル伝達系を破壊する標的化治療物質を活用することにより達成される。本発明は、細胞毒性薬物又は療法の有効性を増強する一方で、細胞毒性治療の安全性を高める方法及び組成物を提供する。殆どの細胞毒性薬物は、単独療法として投与される場合に毒性を有するが、他の作用剤と組み合わせて用いた場合、毒性が強化又は低減される可能性がある。同様に、放射線療法等の細胞傷害性療法は、正常細胞と癌細胞とに損傷を与える。本発明の態様によれば、治療の組合せは、個々の成分の毒性の合計よりも毒性が高くなる場合と低くなる場合とがある。本発明では、低(準毒性)用量の標的化治療物質を治療用量の細胞傷害性薬物と共に送達した際に、最良の組み合わせ治療効果が観察されることを示す、極めて意外且つ新規な結果を説明する。これらの実施例に基づいて、本発明では、最大治療効果(即ち、生物学的有効用量又はBED)を達成する方法、インビトロ及びインビボのプロトコル、及び希釈に基づく組成物を説明する。
【０２２０】
任意の癌治療レジメンに記載された細胞傷害性薬物又は他の化学療法剤の使用は、一般に癌治療の技術において十分に性質決定されており、本明細書におけるそれらの使用は、毒性、耐性、及び有効性をモニタすること、及び投与経路と投与量を制御することについて、何らかの調整と共に、同様の考慮の対象となる。例えば、患者に送達される細胞傷害性薬物の実際の用量は、化学療法に対する患者の耐性に依存する。当業者に公知であるように、任意の様々な生体外アッセイを使用して、臓器損傷を示す許容できない組織学的又は分子学的測定基準を定義することができる。毒性を示す患者の場合、細胞毒性薬物の投与量は、負の転帰がない場合に使用される量と比較して減少させる必要がある。本発明は、細胞傷害性薬物の患者依存性投薬の必要性を認識し、最適な投薬と、細胞毒性薬物を最適未満の治療濃度で投与しなければならない場合に細胞毒性性薬物の効能を最大限に高める好適な医薬組成物とを決定する方法を定める。
【０２２１】
本発明は、(a)特定の癌に対する細胞毒性薬物(例えば、承認された治療標準(群))を選択し、(b)腫瘍微小環境におけるインビトロ及びインビボの細胞応答、生化学応答、及び分子応答に対するこの薬剤の効果を評価し、(c)腫瘍微小環境において誘発される標的の酵素活性を遮断して阻害することにより、標的(群)が生成する薬剤耐性を遮断又は防止する組み合わせ化学療法を選択し、(d)インビトロ及びインビボ腫瘍モデルを用いた前臨床毒物学及び有効性研究における細胞毒性薬物(群)と標的化化学療法との様々な組合せの用量設定によりBEDを定義し、(e)そのヒト開始用量を確立するためのパラダイムを提供する。この新規の治療レジメンを開発するためのパラダイムは、細胞傷害性薬物と共に投与された際に標的化治療物質において最大の有効性を達成するように選択された2つ以上の薬物の組合せを用いた最適応答を目指している。
【０２２２】
カペシタビン及び5-フルオロウラシル: 本発明の態様による対象の増殖性障害を治療するための医薬組成物及び治療方法は、SET複合薬をカペシタビン(ペンチル[1-(3,4-ジヒドロキシ-5-メチルテトラヒドロフラン-2-イル)-5-フルオロ-2-オキソ-1H-ピリミジン-4-イル]カルバマート)又は5-フルオロウラシル(5-FU)/ロイコボリンと共に投与することを含む。
【０２２３】
本発明の態様によるSET複合薬をカペシタビン又は5-FU/ロイコボリンと共に含む組成物が提供される。
【０２２４】
カペシタビンは、広範な癌型(乳房、食道、喉頭、胃腸、及び泌尿生殖路を含む)を効果的に治療することが証明されているが、好中球減少症、口内炎、及び下痢により例示される重篤な毒性も示すフルオロウラシル又は5-FUの代謝拮抗プロドラッグである。カペシタビンは、腫瘍内薬物濃度を増加させつつ5-FUの副作用を減少させるために開発された(肝臓代謝産物を活性型5-FU薬物に変換するために腫瘍細胞酵素が必要)。
【０２２５】
投与後、経口カペシタビンは、胃腸管に容易に吸収され、肝臓に輸送されて、カルボキシルエステラーゼ酵素により処理され、5'-デオキシ-5-フルオロシチジン(5'DFCR)となる。肝臓シチジンデアミナーゼ酵素は、5'DFCRを、血液循環系に送達される5'-デオキシ-5-フルオロウリジン(5'DFUR)に変換する。5'DFURが腫瘍細胞内に拡散すると、過剰発現されたチミジンホスホリラーゼ酵素は、5'DFURを5-フルオロウラシル(5-FU)に変換する。この腫瘍細胞特異的変換工程は、チミジル酸シンテターゼ(TS)酵素を不可逆的に阻害し、デオキシウリジン1リン酸(dUMP)のデオキシチミジン1リン酸(TMP)への変換をブロックする高濃度の5-FUを提供する。TSを拮抗することにより、カペシタビン代謝物はチミジンヌクレオチドの合成を防止し、細胞増殖、DNA合成、及び複製を停止させる
【０２２６】
カペシタビンは、現在、転移性結腸直腸癌及び転移性乳癌の治療についてFDAに承認されている。他の国においても、低ステージの結腸直腸癌の治療について承認されている。単独療法としての標準投薬は、経口で1,250mg/m2を朝晩1日2回(BID)、連続14日間を3週間周期で行う。
【０２２７】
本発明の好適な態様では、腫瘍及び/又は腫瘍転移を、SET複合薬及びカペシタビンにより治療する。SET複合薬は、複製細胞の細胞死を増進するために、カペシタビンの前に、カペシタビンと組み合わせて、又はカペシタビンの後で投与する。別の態様において、SET複合薬は、複製細胞の細胞死を増進するために、カペシタビンの前に、カペシタビンと組み合わせて、又はカペシタビンの後で経口投与される。
【０２２８】
本発明では、腫瘍及び/又は腫瘍転移を、SET複合薬及び5-FUにより治療する。SET複合薬は、複製細胞の細胞死を増進するために、5-FUの前に、5-FUと組み合わせて、又は5-FUの後で投与する。別の態様において、SET複合薬は、複製細胞の細胞死を増進するために、5-FUの前に、5-FUと組み合わせて、又は5-FUの後で経口投与される。
【０２２９】
シクロホスファミド: 本発明の態様による対象における増殖性障害を治療する方法は、SET複合薬をシクロホスファミド(RS-N,N-ビス(2-クロロエチル)-1,3,2-オキサザホスフィナン-2-アミン2-オキシド)と共に投与することを含む。
【０２３０】
本発明の態様によるSET複合薬をシクロホスファミドと共に含む組成物が提供される。
【０２３１】
シクロホスファミドは、様々な癌(例えば、乳癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、リンパ腫、及び多発性骨髄腫)及び一部の自己免疫疾患を治療するために使用される、オキサゾホリン化学基由来のナイトロジェンマスタードアルキル化剤である。プロドラッグとして、シクロホスファミドは、肝臓において、シトクロムp450系(即ち、CYP3A5及びCYP2B6オキシダーゼ)により、活性代謝物(アルドホスファミドに互変異性化する4-ヒドロキシシクロホスファミド)に変換される。循環系への送達後、アルドホスファミドは、腫瘍細胞に輸送可能であり、そこで細胞内ホスファターゼにより脱リン酸化され、2つの細胞毒性活性代謝物ホスホラミドマスタード及びアクロレイン(全身性毒素)となる。ホスホラミドマスタードは、グアニンの7位の窒素を不可逆的にアルキル化し、ストランド内及びストランド間のDNA架橋を形成することによりDNA複製を妨げる。しかしながら、細胞DNAのシクロホスファミド修飾は、有糸分裂期とは無関係であり、複数の細胞周期チェックポイントにおいてDNA修復を活性化する。
【０２３２】
シクロホスファミドは、経口(コーティング錠)及び非経口製剤の両方で利用することができる。小児腫瘍薬の開発中に、粉末を水に溶解した後、経口的に摂取することが可能なシクロホスファミドの経口製剤が開発された。経口シクロホスファミドは、75％超のバイオアベイラビリティで急速に吸収され、排出半減期は3乃至12時間となる。主に代謝物として排出されるが、用量の5乃至25％が未変化体として尿中で排泄される。対照的に、静脈内カペシタビンは、注入速度は30分から24時間超まで変化し得るが、投与後2乃至3時間で血漿中の最大代謝産物濃度をもたらす。
【０２３３】
本発明の好適な態様では、腫瘍及び/又は腫瘍転移を、SET複合薬及びシクロホスファミドにより治療する。SET複合薬は、複製細胞の細胞死を増進するために、シクロホスファミドの前に、シクロホスファミドと組み合わせて、又はシクロホスファミドの後で投与する。他の態様において、SET複合薬は、複製細胞の細胞死を増進するために、シクロホスファミドの前に、シクロホスファミドと組み合わせて、又はシクロホスファミドの後で経口投与される。SET複合薬は、複製細胞の細胞死を増進するために、シクロホスファミドの注射又は点滴の前に、これと組み合わせて、又はこれの後に経口投与することができる。
【０２３４】
トポテカン及びイリノテカン: 本発明の態様による対象における増殖性障害を治療する方法は、SET複合薬をトポテカン[(S)-10-[(ジメチルアミノ)メチル]-4-エチル-4,9-ジヒドロ-1H-ピラノール[3',4',6,7]インドリジノール[1,2-b]キノリン-3,14(4H、12H)-ジオン一塩酸塩]又はイリノテカンと共に投与することを含む。カンプトテシンは、中国の木であるCamptotheca acuminataの抽出物から最初に単離され、DNA合成に必要なタンパク質トポイソメラーゼIの強力な毒である。カンプトテシン薬物類似体(カンプトテシン、イリノテカン、ルビテカン、及びトポテカン: CPT、IRT、RBT、及びTPT)は、2つの用量依存性の作用機序を示す。低用量(約20nM)では、カンプトテシン及びその誘導体は、PKCδ、ATRキナーゼ、CIP2/Kap1、p16Ink4a、Nek2、p21及びcdc2等のストレスタンパク質の活性化及び合成を含むストレス応答と一過性のG2/Mチェックポイントとを誘発する。対照的に、高用量(1μM超)では、不可逆的なTopoI薬物複合体、DNA鎖切断、細胞老化、及びアポトーシスの増加による恒久的なS期内停止をもたらす。
【０２３５】
トポテカンは、カンプトテシンの水溶性半合成誘導体である。トポイソメラーゼIの選択的阻害剤として、高用量のトポテカンは、一本鎖DNA切断の再連結を防止することでDNAスーパーコイルを除去することができるが、トポイソメラーゼIIに対しては効果がない。トポテカンは、許容し難い用量制限毒性、低い水溶性、及び望ましくない保存安定性を示すカンプトテシンの代替物として開発された。経口トポテカン(カプセル)は、水溶性塩酸塩として、ゼラチン、モノステアリン酸グリセリン、水添植物油、二酸化チタン(及び赤色酸化鉄)である賦形剤の残部と共に送達される。トポテカンの推奨用量では、癌患者において1.2乃至3.1mg/m2を5日間毎日投与する。トポテカンは、約40％の経口バイオアベイラビリティで急速に吸収され、ピーク血漿濃度は投与後1乃至2時間で生じる。
【０２３６】
イリノテカンは、カンプトテシンの水不溶性プロドラッグ誘導体であり、カルボキシルエステラーゼ変換酵素によりイリノテカンより1000倍強力な生物活性代謝物である7-エチル-10-ヒドロキシカンプトテシン(SN-38)に変換される。SN-38は、トポイソメラーゼI(topoI)活性をtopoIとDNAとの間の切断可能な複合体を安定化することにより阻害し、DNA複製、修復を阻害し、S期のアポトーシス細胞死を誘発するDNA二本鎖切断をもたらす。
【０２３７】
本発明の好適な態様では、腫瘍及び/又は腫瘍転移を、SET複合薬及びトポテカンにより治療する。SET複合薬は、複製細胞の細胞死を増進するために、トポテカンの前に、トポテカンと組み合わせて、又はトポテカンの後で投与する。他の態様において、SET複合薬は、複製細胞の細胞死を増進するために、トポテカンの前に、トポテカンと組み合わせて、又はトポテカンの後で経口投与される。
【０２３８】
本発明の好適な態様では、腫瘍及び/又は腫瘍転移を、SET複合薬及びイリノテカンにより治療する。SET複合薬は、複製細胞の細胞死を増進するために、イリノテカンの前に、イリノテカンと組み合わせて、又はイリノテカンの後で投与する。他の態様において、SET複合薬は、複製細胞の細胞死を増進するために、イリノテカンの前に、イリノテカンと組み合わせて、又はイリノテカンの後で経口投与される。
【０２３９】
パクリタキセル及びドセタキセル: 本発明の態様による対象における増殖性障害を治療する方法は、SET複合薬をパクリタキセル(5β,20-エポキシ-1,2α,4,7β,10β,13α-ヘキサヒドロキシタキサ-1-1-エン-9-14,10-ジアセタート2-ベンゾアート13-エステル及び(2R,3S)-N-ベンゾイル-3-フェニルイソセリン)又はドセタキセルと共に投与することを含む。パクリタキセルは、元々はタイヘイヨウイチイの木の樹皮に由来するジテルペン抗癌化合物である。樹皮の粗エキスは、米国国立癌研究所の大規模スクリーニングプログラムの一部として、前臨床腫瘍アッセイにおいて抗悪性腫瘍活性を示した。パクリタキセルは、チューブリン機能を標的とする幾つかの細胞骨格薬の1つである。微小管集合を破壊する他のチューブリン標的薬(即ち、コルヒチン、ビンクリスチン、ビンブラスチン)とは異なり、パクリタキセルは、中期における微小管の分解を防ぎ、紡錘体集合、染色体分離、及び細胞分裂を妨害する。M期チェックポイントの持続的活性化の結果、細胞は、老化してアポトーシスを起こすか、又は細胞分裂(即ち、多核細胞の形成)を伴うG1期に戻る。
【０２４０】
ドセタキセルは、ヨーロッパイチイTaxus baccataで発見された化合物に由来する半合成の第2世代タキサンである。パクリタキセルと同様に、ドセタキセルはチューブリンと結合して安定させ、微小管の分解を阻害し、G2/M後期に細胞周期を停止させ、細胞の老化及び死を促進する。しかしながら、パクリタキセルと比較すると、ドセタキセルは、チューブリン結合部位に対する親和性が高く、明確な微小管重合パターンを示し、細胞内保持が長く、標的細胞における細胞内濃度が高かった。このため、ドセタキセルは、強力且つ広範な抗癌剤であると共に、血管新生促進因子の発現を調節し、炎症応答メディエーターの発現を制御することにより免疫調節性及び炎症促進性の特性を示す。
【０２４１】
パクリタキセルは、水(0.01mg/ml未満)と、非経口薬投与に用いられる他の一般的なビヒクルとに対して難溶性である。有機溶媒によりパクリタキセルを部分的に溶解することができるが、パクリタキセルを飽和溶解度で含有する水混和性有機溶媒を水性注入液において希釈すると、薬物が沈殿する。界面活性剤により可溶化することで、安定して患者に送達可能なエマルションにすることができるため、パクリタキセルは、一般に、50％クレモホール、50％脱水アルコール(USP、米国薬局方)を用いて製剤化し、通常の生理食塩水又は5％デキストロースを含む水において希釈し、5％クレモホール及び5％脱水アルコール以下の最終濃度として、ヒトへの静脈内投与を行う。
【０２４２】
本発明の好適な態様では、腫瘍及び/又は腫瘍転移を、SET複合薬及びパクリタキセルにより治療する。SET複合薬は、複製細胞の細胞死を増進するために、パクリタキセルの前に、パクリタキセルと組み合わせて、又はパクリタキセルの後で投与する。SET複合薬は、複製細胞の細胞死を増進するために、パクリタキセルの前に、パクリタキセルと組み合わせて、又はパクリタキセル注射の後で経口投与することができる。
【０２４３】
本発明の好適な態様では、腫瘍及び/又は腫瘍転移を、SET複合薬及びドセタキセルにより治療する。SET複合薬は、複製細胞の細胞死を増進するために、ドセタキセルの前に、ドセタキセルと組み合わせて、又はドセタキセルの後で投与する。SET複合薬は、複製細胞の細胞死を増進するために、ドセタキセル注射又は注入の前に、ドセタキセル注射又は注入と組み合わせて、又はドセタキセル注射又は注入の後で経口投与することができる。
【０２４４】
オキサリプラチン: 本発明の態様による対象における増殖性障害を治療する方法は、SET複合薬をオキサリプラチン[オキサラト(トランス-L-1,2-ジアミノシクロヘキサン)プラチナ]と共に投与することを含む。先進世代のプラチナ(II)類似体であるオキサリプラチンは、複製損傷を発生させて細胞死を促進するPt-DNA付加物を形成することで機能する点において、シスプラチン及びカルボプラチンと類似している。しかしながら、オキサリプラチンプロドラッグは、明確な相乗相互作用、特有の薬物動態、毒性の減少、及び他の類似体と異なる活性免疫応答を示す。シュウ酸塩及び1,2-ジアミノシクロヘキサンのキャリヤリガンドを含むオキサリプラチンの構造のため、シュウ酸基の急速な非酵素的加水分解及び置換により、タンパク質、RNA、及びDNAを修飾する反応性中間体を生成することができる。
【０２４５】
本発明の好適な態様では、腫瘍及び/又は腫瘍転移を、SET複合薬及びオキサリプラチンにより治療する。SET複合薬は、複製細胞の細胞死を増進するために、オキサリプラチンの前に、オキサリプラチンと組み合わせて、又はオキサリプラチンの後で投与する。SET複合薬は、複製細胞の細胞死を増進するために、オキサリプラチン注射又は注入の前に、オキサリプラチン注射又は注入と組み合わせて、又はオキサリプラチン注射又は注入の後で経口投与することができる。
【０２４６】
補助治療処置-放射線療法
【０２４７】
放射線療法は、切除不能又は手術不可能な腫瘍及び腫瘍転移を制御するための標準的治療である。放射線療法を化学療法と組み合わせた際に改善された結果が見られてきた。放射線療法は、標的領域に送達された高線量放射線が複製細胞の死をもたらすという原理に基づいている。放射線量レジメンは、一般に放射線吸収線量(Gy)、時間、及び分割について定義される。患者が受ける放射線の量は、様々な要因に依存するが、最も重要な2つは、影響されていない重要な構造又は器官に関する腫瘍の位置、及び腫瘍転移の程度である。放射線療法を受ける患者の一般的な治療過程は、1乃至6週間に亘るスケジュールとなり、10乃至80Gyの総線量を、1.8乃至2.0Gyの分割線量で1日1回週5日照射する。
【０２４８】
本発明の好適な態様では、腫瘍及び/又は腫瘍転移を、SET複合薬及び放射線により治療する。好適な態様において、SET複合薬は、複製細胞の細胞死を増進するために、放射線治療前、放射線治療中、又は放射線治療後に投与される。他の態様において、SET複合薬は、複製細胞の細胞死を増進するために、放射線治療前、放射線治療中、又は放射線治療後に細胞傷害性薬物と共に投与する。
【０２４９】
放射線源は、治療される患者の外部又は内部に置くことができる。放射線源が患者の外部にある場合、治療法は、外部ビーム放射線療法として知られるものにすることができる。放射線源が患者の内部にある場合、治療は、近接照射療法と呼ばれる場合がある。本発明の文脈において用いられる放射性原子は、限定では無いが、ラジウム、セシウム137、イリジウム192、アメリシウム241、金198、コバルト57、銅67、テクネチウム99、ヨウ素123、ヨウ素131、及びインジウム111を含む群から選択することができる。
【０２５０】
本発明の一態様において、SET複合薬は、抗体を放射性同位体により標識して腫瘍細胞の標的死を増進するように、治療用抗体成分と共に投与することができる。好適な態様において、SET複合薬は、細胞傷害性薬物及び治療用抗体成分と共に投与され、抗体を放射性同位体により標識して腫瘍細胞の標的死を増進する。
【０２５１】
補助治療物質-化学療法薬
【０２５２】
特定の態様において、SET複合薬及び細胞傷害性薬物は、ラパチニブ、ドセタキセル、及びハーセプチン等の1つ以上の追加化学療法薬と同時投与される。ラパチニブ、ドセタキセル、及びハーセプチンの生産、製剤化、及び使用は周知である。
【０２５３】
本発明の態様による随意に投与される追加化学療法薬の例には、限定では無いが、アロプリノール、アルトレタミン、アミホスチン、アナストロゾール、三酸化ヒ素、ベキサロテン、ブレオマイシン、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、シスプラチン-エピネフリンゲル、セレコキシブ、クロラムブシル、クラドリビン、シタラビンリポソーム製剤、ダウノルビシンリポソーム製剤、ダウノルビシン、デクスラゾキサン、ドキソルビシン、クロラムブシル、クラドリビン、ダウノマイシン、デクスラゾラン、エピルビシン、エストラムスチン、リン酸エトポシド、エトポシド、エキセメスタン、酢酸ゴセレリン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イダマイシン、イホスファミド、メシル酸イマチニブ、レトロゾール、ロイコボリン、ロイコボリンレバミゾール、メルファラン、メスナ、メトトレキサート、メトキサレン、マイトマイシンC、ミトキサントロン、パクリタキセル、ペガデマーゼ、ペントスタチン、タルク、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、トポテカン、トレチノイン、バルルビシン、ビノレルビン、及びゾレドロネートが含まれる。
【０２５４】
SET治療物質と共に本発明の態様により随意に投与される化学療法薬は、小分子、ペプチド、糖類、ステロイド、抗体(その断片又は変異体を含む)、融合タンパク質、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、低分子干渉RNA、ペプチド模倣薬等から選択し得る。抗体の例には、限定では無いが、前立腺特異的膜抗原に対する抗体(MLN-591、MLN591RL、及びMLN2704等)、ベバシズマブ(又は他の抗VEGF抗体)、アレムツズマブ、MLN576(XR11576)、ゲムツズマブ・オゾガマイシン、リツキシマブ、及びトラスツズマブが含まれる。
【０２５５】
SET複合薬
【０２５６】
ラパマイシンの機構的標的(即ち、ラパマイシンの哺乳動物標的)又はmTORキナーゼは、細胞成長、細胞増殖、細胞運動性、細胞生存、タンパク質合成、及び転写活性化を調節する、ホスファチジルイノシトール3-キナーゼ関連キナーゼファミリーのメンバであるセリン/スレオニンキナーゼである。mTORタンパク質は、2つの構造的に異なる複合体、mTORC1及びmTORC2の触媒サブユニットであり、これらは別個のシグナル伝達プロセスを調節する。しかしながら、シグナル伝達プロセスは、mTORC1が増殖細胞においてmTORC2活性を抑制し、細胞が増殖を再開可能な場合にmTORC2がmTORC1を活性化するように、各複合クロストークにより制御される。
【０２５７】
本発明の一態様において、mTORC1キナーゼ活性は、40Sリボソームサブユニットを遺伝子ORFに近接して位置決めする一連の5'キャップ認識タンパク質を活性化することにより、間接的にキャップ依存性翻訳を調節する。キャップ依存性のラパマイシン感受性80Sリボソームは、細胞周期の進行に必要な全てのタンパク質の合成に関与している。この翻訳活性により調節される細胞機能のため、この80Sリボソームを本明細書において「増殖リボソーム」と呼ぶ。
【０２５８】
本発明の一態様において、mTORC2は、mTORC1が不活性である場合のみ活性化される。本発明の好適な態様において、mTORC2は、MAM膜構造に局在する80Sリボソームへの直接結合により活性化される。この細胞内位置では、80S/mTORC2複合体は、傷害回復タンパク質の合成を指示し、老化への進行を制限することにより細胞分裂停止を制御し、細胞死プロセスをブロックする。80S/mTORC2複合体がmRNA種のサブセットに対してのみ可能な配列特異的翻訳機構(即ち、IRES翻訳開始及びdORFの翻訳再開)を優先的に使用することから、80S/mTORC2リボソームを「選択的翻訳」又はSETリボソームと呼ぶ。
【０２５９】
含まれる実施例は、ラパマイシン耐性80S/mTORC2複合体が固有のストレス耐性活性を示すという証拠を提供する。例えば、80S/mTORC2は、耐熱性及び耐寒性である一方、キャップ依存性リボソームは、両方の処理により急速に不活性化される。好適な態様において、80S/mTORC2は、細胞生存率を増加させ、傷害修復を促進し、増殖の再開を促進する、細胞周期チェックポイント中の損傷細胞におけるタンパク質合成を指示する。
【０２６０】
本発明の好適な態様において、治療される腫瘍は、増殖性細胞及び非増殖細胞の混合物により構成され、増殖性細胞は、mTORC1活性により制御され、非増殖細胞は、mTORC2作用に応答する。mTORC1又はmTORC2を選択的に調節する作用剤は、mTOR触媒サブユニットによるシグナル伝達クロストークを防ぐことができない。したがって、腫瘍におけるmTOR活性をブロックする本発明の治療剤は、最初に、増殖性細胞中のSETアゴニストを介してSET活性を誘導することによりmTORC1を不活性化し、細胞分裂停止チェックポイントを生成し、第2の作用剤であるSETリボソームアンタゴニストが80S/mTORC2-特異的翻訳をブロックして、細胞の回復及び細胞周期進行を防止する。これら2つの薬物作用の組み合わせは、細胞分裂停止状態から老化状態への進行を強化することにより、DNA損傷化学療法薬の有効性を増加させ、細胞死を促進する。
【０２６１】
好適な態様において、腫瘍におけるmTOR活性を調節することが可能な合剤は、「SET複合薬」と呼ばれ、「SETアゴニスト」と「SETリボソームアンタゴニスト」とにより構成される。SET複合薬を細胞毒性化学療法物質と組み合わせると、薬剤耐性癌、転移、及び/又は再発癌を治療するのに特に適したレジメンとなる。
【０２６２】
一態様において、3つの成分のみが、レジメンにおける単独の抗癌成分となる。他の実施形態において、レジメンは、更に、非抗悪性腫瘍性である他の活性成分の送達を含む。本明細書での使用において、SET複合薬とは、一態様において、選択的翻訳プロセスにより例示される細胞ストレス応答プログラムを活性化する第1の化合物又はその誘導体若しくは医薬的に許容可能な塩と、選択的翻訳リボソームからのタンパク質合成をブロックする第2の化合物又はその誘導体若しくは医薬的に許容可能な塩とを示す。
【０２６３】
好適な実施形態において、SETアゴニストは、プロテインキナーゼC機能を活性化するために使用可能であるか、又は哺乳動物である対象において選択的翻訳を誘導するG2への細胞周期進行を刺激する本発明の化合物であり、ここで、SETアゴニストと呼ばれる本発明の化合物は、活性化に応答してSETシグナル伝達が調節される選択的翻訳の1つ以上の成分を増加させるのに十分な量で対象に投与される。本発明の好適な態様において、SET複合薬のSETアゴニストと呼ばれる活性医薬成分は、プロテインキナーゼC機能を活性化するか、又は癌治療中にSETプロセスを活性化するG2への細胞周期進行を刺激し、SETリボソームアンタゴニストと共に細胞毒性治療物質の有効性を向上させるように作用する。本発明の他の態様において、SET複合薬中のSETアゴニストと呼ばれる活性医薬成分は、プロテインキナーゼC機能を活性化するか、又はSETプロセスをインビボで全身的に誘導するG2への細胞周期進行を刺激し、細胞毒性死を防止して細胞毒性治療物質の安全性を高める、傷害後の細胞回復を改善する。
【０２６４】
SETアゴニスト-ポリオキシル硬化ヒマシ油
【０２６５】
本発明の態様によれば、ポリオキシル硬化ヒマシ油(PHCO、認可済みの市販賦形剤)が、SET複合薬製剤に含まれ、対象に投与される。
【０２６６】
本発明の実施例に示すように、SET複合薬に含まれるPHCO、ポリオキシル35ヒマシ油又はクレモホールELは、G2への細胞周期進行を刺激するSETアゴニストとして予想外に有効であった。
【０２６７】
SET治療物質の1つ以上の成分は、例えば、シクロデキストリンとの共溶媒、乳化、マイクロエマルション化、薬物複合体化、リポソーム及びナノ粒子を用いた担体媒介、並びに水可溶性誘導体又はプロドラッグを得るための化学修飾を例として含む方法により、材料の溶解性を高めるために随意に処理される。
【０２６８】
親油性薬物を含有する経口製剤は、水性媒体と混合することが可能なエマルション中に懸濁させることができる。効果的な経口送達のために、エマルションは、界面活性剤により安定化された2つの非混和性の液体からなる液滴を形成する必要がある。消化管の内腔に到着すると、これらの液滴は、疎水性薬物を液体状態に保つことが可能な微細な液滴に分散する。したがって、界面活性剤又は乳化剤は、場合によっては他の成分と共に、活性薬物又は医薬品を安定化及び可溶化する。製剤に使用される界面活性剤又は乳化剤は、単一の製品、又は2つ以上の製品の組み合わせにすることができる。界面活性剤及び乳化剤の例には、限定では無いが、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、ポリオキシエチレンステアラート、及び飽和ポリグリコール化グリセリドが含まれる。これらの医薬的に許容可能な界面活性剤は、当該技術分野において周知であり、商業的供給源から入手可能である。
【０２６９】
組成物中に含まれ、本発明の態様により投与されるPHCOは、ひまし油を水素化により硬質油に変換し、硬質油をエチレンオキシドと縮合させることにより調製される非イオン性界面活性剤である。PHCOは、添加したエチレンオキシドの平均モルにより分類され、添加したエチレンオキシドの平均モルは、好ましくは30、35、40、50、及び60である。例えば、ヒマシ油の各モルを平均35モルのエチレンオキシドと反応させた場合、結果的に生じる混合物は、ポリオキシル35ヒマシ油(又はクレモホールEL)と呼ばれる。同様に、40モルのエチレンオキシドを使用すると、ポリオキシル40硬化ヒマシ油(又はクレモホールRH)と呼ばれる生成物が生じる。何れの場合も、結果的に生じる生成物は、ポリエチレングリコールエーテル、リシノール酸のポリエチレングリコールエステル、ポリエチレングリコール、及びグリセロールのポリエチレングリコールエーテルの混合物である。クロマトグラフィーを用いて、(医薬品の分解を触媒する)PHCO中の水溶性イオン性、金属性、及び酸化性の不純物を減少させているが、分離不能な親油性混合物が、市販品には残っている。
【０２７０】
本発明の一態様において、PHCOは、癌治療中にSETプロセスを活性化し、SETリボソームアンタゴニストと共に作用して細胞毒性治療物質の有効性を向上させるSETアゴニストとして含まれる。加えて、PHCOは、親水性化合物の溶解性を改善する非イオン性洗剤様界面活性剤の役割、及びSETリボソームアンタゴニストと共に作用して細胞毒性治療物質の有効性を向上させるSETアゴニストの役割を果たす。
【０２７１】
好適な態様において、ポリオキシル35ヒマシ油(クレモホールEL)は、疎水性薬物に対する非イオン性界面活性剤の役割、及びSETアゴニストの役割を果たす。洗剤様ポリオキシル35ヒマシ油ミセル(cmcは0.0095 w/v％)は、細胞膜の流動性を高めることにより作用する。SETを活性化することに加え、ポリオキシル35ヒマシ油は、P糖タンパク質トランスポーター機能を阻害し(多剤耐性をブロックし、特定の疎水性作用剤の腸内吸収を促進し)、血液中のリポタンパク質複合体(HDL及びLDLの物理的特性)を破壊し得る。他の態様において、ポリオキシル40ヒマシ油(クレモホールRH)は、疎水性薬物に対する非イオン性界面活性剤の役割、及びSETアゴニストの役割を果たす。
【０２７２】
本発明の好適な態様は、細胞毒性死を防止して細胞毒性治療物質の安全性を高めることにより傷害後の細胞回復を改善する全身性のインビボSETプロセスを活性化するために、SET複合薬にPHCOを含めることである。本発明の一態様によれば、ポリオキシル35ヒマシ油は、SETアゴニストとしてSET複合薬に含まれ、インビボの細胞周期進行を改善するSETプロセスを活性化する。本発明の一態様によれば、ポリオキシル40ヒマシ油は、SETアゴニストとしてSET複合薬に含まれ、インビボの細胞周期進行を改善するSETプロセスを活性化する。
【０２７３】
SETアゴニスト-ホルボールエステル
【０２７４】
ホルボールは、ジアシルグリセロール(DAG)の分子模倣物として作用するジテルペンのチグリアンファミリーの天然植物由来有機化合物である。DAGと同様に、ホルボールエステルは、まとめてプロテインキナーゼC(PKC)ファミリーとして知られるセリン/スレオニンプロテインキナーゼのファミリーを直接的に活性化することにより、細胞シグナル伝達経路を調節する。
【０２７５】
本発明の実施例に示すように、SET活性化は、SETリボソームにより制御されるタンパク質合成を刺激し、マウス異種腫瘍モデルにおいて自然免疫応答を活性化する。これらの実施例と一致して、ホルボールエステルTPAは、皮膚炎症反応において観察されるものと同様の表皮における表現型の変化を誘導することが明らかとなっている。この系において、TPAは、IL-1αの放出及びデノボIL-1遺伝子発現(局在炎症)の両方の誘導を含む、傷害に対する皮膚の自然応答を直接的に模倣する。このインビボ応答は、病原体又は損傷シグナル結合により活性化されるNod様受容体ファミリーパイリンドメイン含有タンパク質(NLRP)に結合した際にMAM/ミトコンドリア/MAVS複合体により制御される細胞応答と一致する。複合体の形成により、病原性シグナルに対する自然免疫応答を発生させるインフラマソームへのシグナル伝達が生じる。
【０２７６】
本発明の態様によれば、SET複合薬のSETアゴニスト成分は、癌治療中にSETを活性化し、SETリボソームアンタゴニストと共に作用して細胞傷害性治療物質の有効性を向上させるホルボールエステルである。本発明の態様によれば、好適な化合物であるホルボール-12-ミリスタート-13-アセタート(PMA又はTPA)は、SET複合薬に含まれ、癌治療中にSETプロセスを活性化し、SETリボソームアンタゴニストと共に働き、細胞傷害性治療物質の有効性を向上させる。
【０２７７】
PKC活性化が多くの細胞毒性プロセスをブロック可能であることを考慮すると、本発明の好適な態様は、細胞毒性死を防止して細胞毒性治療物質の安全性を高めることにより傷害後の細胞回復を改善する全身性のインビボSETプロセスを活性化するためのSET複合薬におけるホルボールエステルの使用である。本発明の一態様は、インビボ細胞回復応答を改善するSETプロセスを活性化するために、ホルボール-12-ミリスタート-13-アセタート(PMA又はTPA)をSETアゴニストとしてSET複合薬に含めることである。
【０２７８】
SETアゴニスト-ブリオスタチン化合物
【０２７９】
ブリオスタチンは、コケムシであるBulula neritinaの抽出物から最初に単離されたマクロライドラクトン群である。ブリオスタチン化合物は、プロテインキナーゼC(PKC)活性の強力なモジュレーターである。現在までに、少なくとも20の異なるブリオスタチン類似体が同定されている。他のPKC活性化因子と同様に、ブリオスタチン1は、広範囲の条件付きインビトロ及びインビボ応答を示す。ブリオスタチン1は、短時間曝露で与えた場合には古典的及び新規のPKCの非典型的な活性化因子となるが、しかしながら、長時間曝露では、細胞増殖を阻害するアイソフォーム特異的PKC不活性化が生じる(分化及び/又はアポトーシス死をもたらす)。前臨床動物研究では、ブリオスタチンが癌を治療する可能性が示唆されたが、第II相ヒト臨床試験では、単独療法として、又は他の化学療法剤と併用した際に、ブリオスタチン1の治療活性は検出されなかった。これらの結果は、SETのブリオスタチン活性化が細胞傷害性薬物による傷害後の腫瘍回復を可能にするmTORC2キナーゼ機能をブロックするのに十分ではないという理論を支持している。
【０２８０】
細胞回復の増進におけるSET誘導の役割を更に支持するものとして、ブリオスタチン1は、アミロイド前駆体タンパク質(APP)を切断し、非毒性タンパク質断片を生成するα-セクレターゼ酵素を活性化することが明らかとなっている。この結果に基づいて、ブリオスタチン1は、APPプロセシングに関連する神経変性(即ち、アルツハイマー病又はAD)を予防する能力について試験された。ADトランスジェニック動物(ヒトADを引き起こす異なる突然変異を含む3つの齧歯類株)における前臨床試験では、ブリオスタチン1がアミロイド-βプラーク及び神経原線維変化を減少させ、神経シナプスを回復させ、記憶消失を防ぐことが明らかとなった。関連する臨床前研究において、ブリオスタチン1は、脳卒中、頭部外傷、又は老化により以前に破壊されたシナプスを再生することにより記憶を強化及び回復させた。これらの活性は、PKC媒介SET活性化が、細胞毒性を制限することにより細胞生存率を増加させる傷害回復プロセスを強化するという理論を支持している。
【０２８１】
ブリオスタチン2は、PKCのホルボールエステル結合部位に結合し、ブリオスタチン1の10倍の酵素結合定数を示す(PKCに対するブリオスタチン2のより大きな親和性を反映する)構造的に別個のブリオスタチン類似体である。前臨床研究は、ブリオスタチン2がDNA合成(及び細胞増殖)を阻害し、処置細胞からのアラキドン酸の放出を誘導し、B細胞刺激因子1と相乗的に作用して、ナイーブ休止リンパ節T細胞を細胞毒性Tリンパ球に分化させることを示している。
【０２８２】
本発明の一態様において、SET複合薬中のSETアゴニストは、癌治療中にSETを活性化し、SETリボソームアンタゴニストと共に作用して、細胞毒性治療物質の有効性を改善するブリオスタチン誘導体である。他の態様において、ブリオスタチン1は、癌治療中にSETプロセスを活性化するためにSET複合薬において用いられる好適な化合物であり、SETリボソームアンタゴニストと共に作用して、細胞毒性治療物質の有効性を改善する。他の態様では、ブリオスタチン2は、癌治療中にSETプロセスを活性化するためにSET複合薬において用いられる化合物であり、SETリボソームアンタゴニストと共に作用して、細胞毒性治療物質の有効性を改善する。
【０２８３】
本発明の一態様において、SETアゴニストは、SETプロセスを活性化することにより、細胞回復を促進し、副作用を低減し、薬物安全性を改善する。PKC活性化が多くの細胞毒性応答をブロック可能であることを考慮すると、本発明の好適な態様は、細胞毒性死を防止して細胞毒性治療物質の安全性を高めることにより傷害後の細胞回復を改善する全身性のインビボSETプロセスを活性化するためのSET複合薬におけるブリオスタチンの使用である。本発明の一態様は、インビボ細胞回復応答を改善するSETプロセスを活性化するためのSET複合薬におけるSETアゴニストとしてのブリオスタチン1の使用である。本発明の他の態様において、ブリオスタチン2は、インビボ細胞回復応答を改善するSETプロセスを活性化するために、SET複合薬においてSETアゴニストとして使用される。
【０２８４】
SETリボソームアンタゴニスト-アニソマイシン
【０２８５】
SETリボソームタンパク質合成を阻害するための候補分子は、新規に設計することが可能であり、又は既存のリボソーム阻害剤を用いる機能アッセイにより同定し得ると考えられる。デノボ分子を設計するために有用なアプローチの多くは、SETリボソーム上の機能的活性が実験的に決定された後で既存の分子を修飾するためにも有用であり得ると考えられる。80Sリボソームに結合し、タンパク質合成を妨げる作用剤には様々なものがあり、例えば、限定では無いが、クロラムフェニコール、マクロライド、リンコサミド、ストレプトグラミン、アルチオマイシン、オキサゾリジノン、ヌクレオチド類似体、チオストレプトン(例えば、ミクロコクシンファミリー)、ペプチド、グルタルイミド、トリコテセン、TAN-1057、プロイロムチリン、ハイグロマイシン、ベタシン(betacins)、エベミノマイシン(eveminomicins)、ボキサゾマイシン、及びフシダンが含まれる。
【０２８６】
アニソマイシン又は(2R,3S,4S)-4-ヒドロキシ-2-(4-メトキシベンジル)-ピロリジン-3-イルアセタート)は、真核細胞タンパク質合成を阻害するStreptomyces griseolusにより産生される抗生物質である。アニソマイシンのピロリジン環は、60Sリボソームサブユニットとの相互作用にとって重要であり、アミノアシル(A部位)及びペプチジル(P部位)の接合部において結合する。この部位において、アニソマイシンはペプチド結合形成をブロックし、ペプチジルトランスフェラーゼ反応を抑制する(伸長を妨げ、ポリソームの安定性を乱す)。
【０２８７】
アニソマイシンは、記憶の保持及び回復を調節する神経調節物質として広範囲に使用されてきた。翻訳を遮断する能力に加えて、アニソマイシンは、タンパク質合成に有意に影響しない用量で、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)シグナル伝達系、特にストレス活性化p38マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(p38MAPK)及びc-Jun NH2末端キナーゼ(JNK)のタンパク質活性化因子となることも明らかとなっている。
【０２８８】
本発明では、SETに影響する薬物の組み合わせが、mTORキナーゼ活性を不活性化し、細胞毒性治療物質の有効性を改善する、SETアゴニスト及びSETリボソームアンタゴニストからなるSET複合薬を説明する。本発明の一態様において、SETリボソームアンタゴニストは、「生物学的有効用量」(BED)が100％SETリボソーム阻害を生じるが動物における致死濃度を十分に下回るリボソーム活性の阻害剤である。
【０２８９】
実施例に示すように、アニソマイシンは、50nM未満の50％阻害濃度又はIC50及び1μMのIC100(100％SETリボソーム阻害)で、活性化80S/mTORC2リボソーム(SETリボソーム)からの翻訳を選択的にブロックする。この実施例において、1μM用量でのSETリボソームの絶対阻害は、マウスに対する35μM(筋肉内)及び500μM(経口)のLD50と、サルに対する200μM(筋肉内)及び1mM(経口)のLD50とを十分に下回っている。
【０２９０】
本発明の一態様において、SETリボソームアンタゴニストは、哺乳動物である対象におけるSETリボソームからのタンパク質合成をブロックするために使用可能な本発明の化合物であり、SETリボソームアンタゴニストと呼ばれる本発明の化合物は、全てのSETを除去するのに十分であり、その後SETリボソームの活性化により回復タンパク質合成が生じるようになる量で対象に投与される。好適な態様において、アニソマイシンは、癌治療中にSETリボソームからのタンパク質合成をブロックし、SETアゴニストと共に作用して、細胞毒性治療物質の有効性を改善するSET複合薬におけるSETリボソームアンタゴニストとして含まれる。
【０２９１】
SETリボソームアンタゴニスト-エメチン
【０２９２】
エメチン又は(2S,3R,11bS)-2-{{(1R)-6,7-ジメトキシ-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-1-イル〕メチル}-3-エチル-9,10-ジメトキシ-2,3,4,6,7,11b-ヘキサヒドロ-1H-ピリド[2,1-a]イソキノリン)は、Cephaelis ipecacuanhaの根から単離されたトコンの主要なアルカロイドである。エメチンは、最初期には催吐薬、去痰薬、抗寄生虫薬、及び抗菌/抗ウイルス剤として使用される場合もあった。しかしながら、生理的pHにおいて、エメチンは、40Sサブユニット内のrpS14タンパク質に結合することにより、濃度及び時間依存的に哺乳動物、酵母、及び植物のタンパク質合成を不可逆的に阻害する。
【０２９３】
rpS14タンパク質は、20S pre-rRNAの18S rRNAへのプロセッシングと、43Sプレリボソームの40Sへの成熟に関与する重要なリボソーム成熟因子である。80Sリボソームにおいて、rpS14は、18S rRNA内の保存ヘリックス構造と、mRNA配列エレメントとに結合することにより、40Sサブユニット上のmRNAアセンブリを促進する。40Sプラットフォーム構造では、mRNA出口トンネルの近くで、rpS14は、更に、40S暗号解読溝内の様々なウイルスIRES RNAエレメントを整列させるために必要な40Sサブユニットの立体構造変化を制御する。
【０２９４】
80Sリボソームに曝露すると、エメチンは、mRNAの40Sサブユニット結合をブロックする、露出した塩基性カルボキシ末端配列上のrpS14に結合する。抗寄生虫薬として、エメチンは、成長を阻害し、細胞毒性水準下の濃度でアポトーシスを誘導した。抗ウイルス薬として、エメチンは、キャップ非依存性ウイルスタンパク質の合成及び複製を妨げる40Sサブユニット上のデング熱ウイルスIRES RNA構造のアセンブリをブロックした。
【０２９５】
本発明では、SETに影響する薬物の組み合わせが、全てのmTORキナーゼ活性を不活性化し、細胞毒性治療物質の有効性を改善する、SETアゴニスト及びSETリボソームアンタゴニストからなるSET複合薬を説明する。本発明の一態様において、SETリボソームアンタゴニストは、「生物学的有効用量」(BED)が100％SETリボソーム阻害を生じるが動物における致死濃度を十分に下回るリボソーム活性の阻害剤である。実施例に示すように、エメチンは、175nMの50％阻害濃度又はIC50及び2.5μMのIC100(100％SETリボソーム阻害)で、活性化80S/mTORC2リボソーム(SETリボソーム)からの翻訳を選択的にブロックする。この実施例において、2.5μM用量でのSETリボソームの絶対阻害は、ウサギに対する5μM(筋肉内)及び35μM(経口)のLD50と、マウスに対する58μM(皮下)のLD50と、ラットに対する216μM(経口、120mg/kg)及び174μM(皮下、95mg/kg)のLD50とを十分に下回っている。
【０２９６】
本発明の一態様において、SETリボソームアンタゴニストは、哺乳動物である対象におけるSETリボソームからのタンパク質合成をブロックするために使用可能な本発明の化合物であり、SETリボソームアンタゴニストと呼ばれる本発明の化合物は、全てのSETを除去するのに十分であり、その後SETリボソームの活性化により回復タンパク質合成が生じるようになる量で対象に投与される。好適な態様において、エメチンは、癌治療中にSETリボソームからのタンパク質合成をブロックし、SETアゴニストと共に作用して、細胞毒性治療物質の有効性を改善するSET複合薬において、SETリボソームアンタゴニストと呼ばれる活性医薬成分である。
【０２９７】
作用剤の投与
【０２９８】
本発明の1つ以上の医薬組成物の有効量は、単一の丸薬、カプセル、予め測定した静脈内用量、又は注射用の充填済み注射器等の一態様に含まれ得る。又は、組成物は、丸薬等の1単位が最適未満の用量を含む個別投与形態で調製されるが、患者に対して、1治療当たり2単位用量以上を服用するように指示し得る。更に、エンドユーザが後で希釈するための濃縮物を、例えば、静脈内(IV)投与製剤及びマルチドーズ注射用製剤用に調製し得る。
【０２９９】
様々な投与経路を、ヒト又は動物の患者の治療で使用することができる。選択される特定の様式は、治療される特定の状態、治療効果に必要な用量、及び組み合わせ製剤の組成により決まる。本発明の方法は、医学的に許容可能な任意の投与様式(即ち、臨床的に許容できない副作用を増強することなく医薬活性化合物からの最適な治療活性を提供する様式)を用いて実施し得る。
【０３００】
好ましい投与経路には、経口投与、非経口投与(例えば、皮下、注射、静脈内、筋肉内、胸骨内、又は点滴)、吸入スプレによるもの、局所的投与、粘膜を介した吸収によるもの、又は直腸投与が含まれる。より好ましくは、本発明の化合物は、経口投与される。他の態様において、投与経路は、非経口(即ち、静脈内、腹腔内、点滴、又は注射)である。本発明の一態様において、化合物は、腫瘍注射により腫瘍に直接投与される。他の態様において、化合物は、全身投与される。
【０３０１】
懸濁液又は乳濁液としての経口投与用に、組成物は、医薬製剤の技術分野において周知の手法により調製することができる。組成物は、バルク用の微結晶セルロース、懸濁化剤としてのアルギン酸又はアルギン酸ナトリウム、粘度増強剤としてのメチルセルロース、甘味料、又は香味料を含むことができる。即放性錠剤として、組成物は、微結晶セルロース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ラクトース、又は当該技術分野で公知の他の賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、希釈剤、及び潤滑剤を含むことができる。
【０３０２】
注射溶液又は懸濁液としての非経口投与用に、組成物は、適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤を用いて、当該技術分野において周知の技術により製剤化することができる。溶液又は懸濁液は、水、等張食塩水(PBS)中で調製されるか、又は不活性界面活性剤(PCHO)と混合される。分散液も、グリセロール、液体ポリエチレン、グリコール、DNA、植物油、トリアセチン、及びその混合物において調製することができる。
【０３０３】
通常の保管及び使用条件下で、注射用調製物は、微生物の増殖を防ぐ不活性保存料を含む。保存料は、微生物の増殖又は望ましくない化学反応による分解を防ぐために、医薬組成物に添加又は付与される物質又はプロセスにすることができる。一般に、保存は、化学添加物又は物理的処理の何れかにより行われる。好適な態様では、mTOR特異的翻訳を刺激又は抑制することによりSETプロセスを調節しない保存料として使用することが可能な不活性化学添加物を同定するための方法及び組成物を説明している。
【０３０４】
免疫抑制による化学療法後の感染症を治療するための予防法として、抗菌治療(即ち、抗生物質)が化学療法後に用いられる。同様に、癌関連ウイルス及び細菌を標的とすることで、胃癌、子宮頸癌、造血器癌、肝臓癌、及び脳癌の開始を防止することができる。本発明の好適な態様では、抗菌剤及び抗ウイルス剤を投与して、mTOR調節翻訳を刺激又は抑制することにより対象におけるSETプロセスを制御する。他の態様では、mTOR調節翻訳を刺激又は抑制することによりSETプロセスを制御しない不活性抗生物質であり、微生物感染を防止するために本発明に記載の医薬品に安全に添加することが可能なものを同定するための方法及び組成物を説明している。
【０３０５】
様々な医薬品形態を採用することができる。したがって、固体担体が使用される場合、調製物は、錠剤化すること、硬ゼラチンカプセル内に配置すること、粉末、ペレット形態にすること、トローチ又はロゼンジの形態にすることができる。固体担体の量は、大きく変化するが、好ましくは、シロップ、エマルション、軟ゼラチンカプセル、滅菌注射溶液、又はアンプル、バイアル、若しくは非水液体懸濁液中の懸濁物の形態になる。安定した水溶性剤形を得るために、SET組成物及び細胞傷害性薬物の医薬的に許容可能な塩を、有機又は無機酸又は塩基の水溶液に溶解することができる。可溶性の塩の形態が利用できない場合、SET複合薬及び細胞傷害性薬物は、適切な共溶媒又はその組み合わせに溶解してよい。このような適切な共溶媒の例には、限定では無いが、全体積の0乃至60％の範囲の濃度であるアルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール300、ポリソルベート80、グリセリン等が含まれる。
【０３０６】
これらの組成物中での使用が考えられる賦形剤、希釈剤、又は担体は、医薬品処方の技術分野において一般に知られている。有用な材料については、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA等の周知の編集文献を参照することができる。組成物及び医薬賦形剤、希釈剤、又は担体の性質は、意図される投与経路、例えば、血管内及び筋肉内注射、非経口、局所、経口、又は吸入によるもの等に依存する。非経口投与用として、医薬組成物は、アンプル又は水性若しくは非水液体懸濁液等の滅菌注射液の形態となる。局所投与用として、組成物は、皮膚、眼、耳、鼻、又は生殖器への投与に適したクリーム、軟膏、ローション、ペースト、スプレ、又は液滴の形態となる。経口投与用として、医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉末、ペレット、トローチ、ロゼンジ、シロップ、液体、又はエマルションの形態となる。
【０３０７】
利用される医薬賦形剤、希釈剤、又は担体は、固体でも液体でもよい。医薬組成物が溶液又は懸濁液の形態で利用される場合、適切な担体又は希釈剤の例には、水性系での水と、非水性系でのエタノール、グリセリン、プロピレングリコール、オリーブ油、コーン油、綿実油、ピーナッツ油、ゴマ油、流動パラフィン、及び水の混合物と、固体系でのラクトース、白土、スクロース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アラビアゴム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、カオリン、及びマンニトールと、エアロゾルシ系でのジクロロジフルオロメタン、クロロトリフルオロエタン、及び圧縮二酸化炭素とが含まれる。医薬担体又は希釈剤に加えて、本組成物は、安定剤、抗酸化剤、防腐剤、潤滑剤、懸濁化剤、粘度調整剤等、他の成分を含んでもよいが、但し、追加成分は、本組成物の薬力学、薬物動態、又は治療作用に有害な影響を及ぼさないものとする。同様に、担体又は希釈剤は、モノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリル単独又はこれをワックスと併せたもの、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、及びメチルメタクリレート等、当該技術分野において周知の時間遅延材料を含み得る。
【０３０８】
本発明の化合物は、医薬的に許容可能な酸付加塩及び/又は塩基性塩の両方を形成することができる。塩基性塩は、アルカリ金属及びアルカリ土類金属又は有機アミン等の金属又はアミンにより形成される。カチオンとして使用される金属の例は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等である。更に、例えば、銀、亜鉛、コバルト、セリウム等の重金属塩も含まれる。適切なアミンの例は、N、N'-ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、N-メチルグルカミン、及びプロカインである。医薬的に許容可能な酸付加塩は、有機酸と無機酸により形成される。塩形成に適した酸の例は、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、クエン酸、シュウ酸、マロン酸、サリチル酸、リンゴ酸、グルコン酸、フマル酸、コハク酸、アスコルビン酸、マレイン酸、メタンスルホン酸等である。酸性塩は、遊離塩基形態を十分な量の所望の酸と接触させて、従来のようにモノ又はジ塩等の何れかを生成することにより調製される。遊離塩基形態は、塩形態を塩基で処理することにより、必要に応じて再生し得る。遊離塩基形態は、極性溶媒中での溶解性等、特定の物理特性において、それぞれの塩形態と異なっていてもよいが、医薬塩形態は、それ以外では、本発明を実施するそれぞれの遊離塩基形態と同等となるべきである。
【０３０９】
医薬活性化合物は、治療有効量で投与される。治療有効量とは、治療中の増殖性疾患の発症を遅らせる、進行を阻害する、又は発症又は進行を完全に停止させる等、所望の応答を達成するのに必要な量を意味する。このような治療的投与は、特に細胞傷害性薬物については、治療される特定の状態と、状態の重篤度(例えば、腫瘍の病期)と、年齢、健康状態、サイズ、体重、併用治療に応じて決まる。これらの要素は、当該技術分野において周知であり、日常的な臨床評価の範囲内で対処することができる。細胞傷害性薬物については、最大耐量、即ち、健全な医学的判断及び実証的なヒトでの試験による最高安全用量を用いることが好ましい。技術的、心理的理由、又は事実上任意の正当と認められる医学的理由から、より低い用量又は耐容用量を投与してもよいことは、当業者に理解されよう。
【０３１０】
本発明の組成物及び治療方法において使用されるSET複合薬及び細胞傷害性薬物の実際の好適な投与量は、使用される特定の成分、処方される特定の組成物、投与様式、治療される特定の部位、宿主、及び増殖状態により変化することは理解されよう。特定の患者における特定の病態に最適な投与量は、上記の実験データを考慮して従来の投与量決定試験を用いて、抗悪性腫瘍技術分野の当業者が確認し得る。例えば、非経口送達により投与される用量は、体表面積当たり1日2乃至50mg/m2の範囲で1乃至5日間としてよく、好ましくは3乃至4週間毎に4回の治療過程を繰り返す。連続的な静脈内投与では、用量は、約0.5mg/m2/日で5乃至21日間にしてよい。経口投与では、用量は、体表面積当たり20乃至150mg/m2の範囲で1乃至5日間としてよく、適切な間隔を空けて治療過程を繰り返す。
【０３１１】
本明細書で使用したような分子生物学的手法、生化学的手法、及び微生物手法は、当該技術分野において周知であり、一般に使用されており、例えば以下において説明されている: Sambrook J. et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor and its 3rd Ed. (2001)、Ausubel, F. M. (1987), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience、Ausubel, F. M. (1989), Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience、Innis, M. A. (1990), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press、Ausubel, F. M. (1992), Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates、Ausubel, F. M. (1995), Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates、Innis, M. A. et al. (1995), PCR Strategies, Academic Press、Ausubel, F. M. (1999), Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, and annual updates、Sninsky, J. J. et al. (1999), PCR Applications: Protocols for Functional Genomics, Academic Press、Special issue, Jikken Igaku [Experimental Medicine] "Idenshi Donyu & Hatsugenkaiseki Jikkenho [Experimental Method for Gene introduction & Expression Analysis]", Yodo-sha, 1997。これらの公表文献のそれぞれの関連する部分(又は場合によっては全体)は、出典を明記することにより本願明細書の一部とする。
【０３１２】
本発明のポリペプチドのアミノ酸又はヌクレオチドの欠失、置換、又は付加は、周知の手法である部位特異的変異誘発法により行うことができる。1つ又は幾つかのアミノ酸又はヌクレオチドの欠失、置換、又は付加は、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1 to 38, John Wiley & Sons (1987-1997)、Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6409 (1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 5662 (1984)、Science, 224, 1431 (1984)、PCT WO85/00817(1985)、Nature, 316, 601 (1985)等に記載の方法により行うことができる。
【０３１３】
本発明を詳細に説明してきたが、添付特許請求の範囲に定めた本発明の範囲を逸脱することなく、変形及び変更が可能であることは明らかであろう。更に、本開示における全ての例は、本発明を例示するものであり、非限定的な例として提供されており、したがって、このように例示された本発明の様々な態様を限定するものとして解釈されるべきではないことを理解されたい。
【実施例】
【０３１４】
以下の非限定的な実施例は、腫瘍においてSETリボソームの調節が、第一選択腫瘍薬の治療活性を増強する慢性ストレス状態を形成することを実証するものであり、本発明を更に説明するために提供される。
【０３１５】
実施例1
【０３１６】
1A. TR転移性癌細胞モデルの特性の定義
【０３１７】
進行性の攻撃的な腫瘍には、自己再生のための能力、新規の幹細胞子孫に進化し、これを発生させる能力、細胞損傷に対する耐性向上、及び腫瘍開始能力といった幹細胞形質を示す特有の癌細胞集団が含まれると考えられている。癌幹細胞(CSC)は、任意の腫瘍のごく一部を占めているが、遠隔異種転移を形成するのに必要な集団を構成している。TRクラス数の高さ(及びSETリボソーム活性の上昇)は、G2/M損傷修復潜在力の増加、細胞生存率の向上、及び薬剤耐性と相関するため、複数のmTR及びhTR細胞株を用いて、SETリボソーム応答を、確立されたインビトロ及びインビボCSC特性と比較した。例えば、TR転移性癌細胞モデルは、一連の測定可能な形質を示し、これに含まれるものは、(1)親TR細胞株の小さな外れ値集団に由来すること(上位1乃至5％のSET誘導)、(2)細胞に基づくTRアッセイにおけるSETリボソーム活性の統計的上昇(第4階級応答と呼ぶ)と相関する薬剤及びストレス耐性を示したこと、(3)反復的な単細胞コロニー形成及び少数の細胞からの非接着性腫瘍様塊の生成といった低密度の選択的増殖の結果として、SETリボソーム活性の非常に有意な変化(新規のTR外れ値応答を形成する)をもたらすクローン進化を示したこと、(4)ヌードマウスへの連続異種移植後にインビボでの腫瘍開始活性を示したこと、(5)TR発現カセットからのSET特異的翻訳のインビボ調節を示した異種腫瘍を形成したこと、及び(6)増殖速度の上昇及び細胞毒性薬物処置に対する耐性を有する異種腫瘍を形成したことである。例えば、TR転移性結腸直腸癌(CRC)細胞モデルクローンは、親CRC細胞株(HCT116等)から単離され、これらの形質のそれぞれを示す。以降の項に示すように、TR転移性CRC細胞モデルの一例は、hTRdm-fLUC#32である。
【０３１８】
1B. 外れ値小集団由来のTR細胞株の同定及び単離
【０３１９】
(a)細胞培養材料
【０３２０】
全ての哺乳動物細胞を、適切な完全増殖培地(各細胞株について以下に指定)において、37℃、5％CO2で維持した。
【０３２１】
DMEM: DMEM粉末1パケット/L(Invitrogen Life Technologies)、重炭酸ナトリウム3.7g/L、硫酸ゲンタマイシン30乃至50mg/L、10％ウシ胎仔血清(FBS)又はDMEM、高グルコース液(ThermoFisher Scientific)、硫酸ゲンタマイシン、10％FBS。
【０３２２】
MEM: アール塩を含むMEM粉末1パケット/L(Invitrogen Life Technologies)、重炭酸ナトリウム1.5g/L、100mMピルビン酸ナトリウム溶液10mL/L(Invitrogen Life Technologies)、10mM MEM非必須アミノ酸溶液10mL/L(Invitrogen Life Technologies)、硫酸ゲンタマイシン30乃至50mg/L、10％FBS又はMEM液(ThermoFisher Scientific)、硫酸ゲンタマイシン、ピルビン酸ナトリウム、MEM非必須アミノ酸、10％FBS。
【０３２３】
RPMI: RPMI1640粉末1パケット/L(Invitrogen Life Technologies)、100mMピルビン酸ナトリウム溶液10mL/L(Invitrogen Life Technologies)、硫酸ゲンタマイシン30乃至50mg/L、10％FBS又はRPMI液(ThermoFisher Scientific)、ピルビン酸ナトリウム、硫酸ゲンタマイシン、10％FBS。
【０３２４】
(b)哺乳動物細胞のトランスフェクション
【０３２５】
以下の発現プラスミドを用いて、哺乳動物細胞をトランスフェクトした: pCMV-fLUC、pmTRdm-fLUC、phTRdm-fLUC、pmTRdm-gLUC、及びphTRdm-gLUC。これらのプラスミドは、稀少翻訳制御系を用いたSETリボソームによるタンパク質合成を制御するTR発現カセット(図1A)を含有する。ポリソームプロファイリングは、哺乳動物mRNA(220乃至350種)の3％が、キャップ依存性翻訳の抑制後に活発に翻訳されることを示す。これらの転写物からの内部翻訳開始は、キャップ依存性及びキャップ非依存性プロセスにより同時に翻訳される導入遺伝子を用いて一般に検出される。これらの翻訳活性は、別個の細胞周期段階に位置しているため、既存の手法では、翻訳事象を定性的に測定することのみが可能となる。TR発現配列は、豊富な上流オープンリーディングフレーム(uORF)と、レポーター遺伝子の下流ORFへのキャップ依存性リボソームスキャニングを防止する翻訳終止コドンとを含む。これには、TR翻訳が内部開始プロセスにより生じることが必要となる。
【０３２６】
内部調節エレメントを定義するために、欠失マッピングにより、親遺伝子からのG2/M中の2つの内部ORFS(iORF)の翻訳を制御するエクソン4の内部リボソーム進入配列(TR IRES)を同定した(部位特異的変異誘発を用いて、これらのORFをTR配列において不活性化した)。このプロセスの特異性は、SETに影響を与えずに削除可能な非必須配列(エクソン3b及び5)にエクソン4のIRESが隣接しているという事実により説明される。しかしながら、エクソン5乃至7を欠失させるとSETが中断され、エクソン4からの構成的な翻訳開始が生じた。その後の配列解析により、GTX遺伝子内のIRESエレメントとの配列同一性及びIRES機能に必要な18S rRNAヘリックス26配列との相同性を有するエクソン4内の推定TR IRESエレメントが同定された(表1)。エクソン5乃至7は、哺乳動物発現ベクターにクローン化した際に転写活性又は翻訳活性を示さなかったため、これは、エクソン6乃至7がエクソン4 TR IRESの負の制御因子を含むはずであることを示している。
【０３２７】
エクソン7の配列分析により、複数のウイルスゲノムに存在する翻訳「再開」配列との同一性を有するセグメントを同定した(TRレギュレーター、図1及び表1)。ウイルスにおいて、この配列は、G2/M中に機能し、キャップ依存性翻訳中には通常ブロックされるORFからの翻訳を指示する。更に、この配列及び開始コドンを40Sリボソームサブユニットに位置させるためには、ウイルスRNA中のmRNA二次構造(最小限の異種間構造相同性を有する)が必要となる。TRエクソン7配列による翻訳調節を調べるために、部位特異的変異誘発を使用して、この再開エレメントを含むRNA構造に変異を導入すると、ネイティブエクソン7RNA構造に影響を与える任意の変異により、TR SETが調節不全となった(表2)。これにより、エクソン4の構成的TR IRESがエクソン7のTRレギュレーターにより制御され、TR発現カセットからのG2特異的SET及びレポータータンパク質発現(fLUC、gLUC)を生成することが証明された。他の哺乳動物のmRNAで、この二機能性制御系を含むことを知られているものは無い。
【０３２８】
哺乳動物のトランスフェクションは、非脂質Transfectolトランスフェクション試薬(Continental Lab Products)又はFuGENE6脂質ベーストランスフェクション試薬(Roche Applied Science)を使用して、ベンダの指示通りに行った。Transfectolトランスフェクションの前に、哺乳動物細胞を100mmディッシュで50％コンフルエントまで増殖させ、2.5乃至5％FBSを補充した適切な増殖培地を供給し、1乃至3時間後にDNA/トランスフェクション試薬混合物を添加した。混合物は、最初に1mLの希釈剤を15μgのプラスミドDNAと混合し、ボルテックスし、次に60μLのTransfectolを添加し、5秒間ボルテックスすることにより調製した。各DNA/トランスフェクション試薬混合物を室温で15分間インキュベートし、次に細胞に滴下した。細胞は、2乃至16時間、DNA/Transfectol混合物の存在下で2乃至16時間に亘り増殖させた。この時点で、培養培地を完全増殖培地、10％FBSに置き換え、細胞を更に24時間増殖させた後、G418選択培地を添加した。
【０３２９】
FuGENE6によるトランスフェクションの前に、哺乳動物細胞をT-25フラスコ内で50％コンフルエントまで増殖させ、適切な完全増殖培地、10％FBSを供給し、1乃至3時間後にDNA/トランスフェクション試薬混合物を添加した。3種類のDNA/トランスフェクション試薬混合物を、1:3、2:3、及び1:6のDNA: FuGENE6比を用いてプラスミドDNA毎に調製した。DNA/FuGENE6混合物を作成するために、FuGENE6は、次のように適切な無血清増殖培地において希釈した: 1:3混合: 242.5μL SFM+7.5μL FuGENE6、2:3混合: 242.5μL SFM+7.5μL FuGENE6、1:6混合: 235μL SFM+15μL FuGENE6。
【０３３０】
FuGENE6希釈液をボルテックスし、室温で5分間インキュベートした。次に、プラスミドDNAを次のように添加した: 1:3混合: 2.5μg、2:3混合: 5μg、1:6混合: 2.5μg。DNA/FuGENE6混合物をボルテックスし、室温で15分間インキュベートした後、細胞に添加した。細胞をDNA/FuGENE6混合物の存在下で一晩増殖させた。この時点で、培養培地を完全増殖培地、10％FBSに置き換え、細胞を更に24時間増殖させた後、G418選択培地を添加した。
【０３３１】
(c)安定して形質転換された細胞の選択
【０３３２】
安定したサブクローンを単離するために、発現プラスミドによりコードされるG418耐性因子についてトランスフェクタントを選択した。G418選択培地(500μg/mLのG418を補充した完全増殖培地)をトランスフェクションの約48時間後に利用した。選択培地は、非耐性細胞が脱離し、G418耐性「初代」コロニーが現れるまで、2乃至3週間に亘り2日毎に交換した。コロニーの数及び密度に応じて、プレートが50乃至60％コンフルエントになるまで、G418を含まない培地で増殖させた。選択プレート上の全ての「初代」コロニーを1つのサンプルに集め、100mmディッシュに移し、プレーティングの24時間後に栄養供給し、約80％コンフルエントまで増殖させた。このコロニーのコレクションを、細胞プール又は継代1(P1)プールと呼んだ。
【０３３３】
(d)安定して形質転換された哺乳動物細胞プールにおけるSETリボソーム活性の測定
【０３３４】
各P1プールは、1つ以上のTR SET参照標準試薬(表3)を用いてSETリボソーム活性について試験し、2つのアッセイ手順(例えば、細胞計数又はコンフルエンスアッセイ)の何れかを用いて測定した。
【０３３５】
全ての定量的TR SETアッセイは、細胞計数プロトコルを用いて行った。サブクローン分析のために、P1プールからの細胞を計数し、1ウェル当たり25,000個の密度で、白色透明底96ウェルマイクロタイタートレイに移した(3重のウェル)。残った細胞は、継代2(P2)ディッシュに入れ、ストック培養物を維持した。マイクロタイタープレート内の細胞は、約75％の細胞コンフルエンスに達するまで18乃至40時間増殖させた後、完全増殖培地において参照標準試薬とのインキュベーションを行い、fLUC活性についてアッセイした。対照的に、確立された細胞株の定量分析では、対数増殖(DNA複製した細胞又はS期細胞の割合が高くなる)が保証された培養条件(例えば、細胞数、頻繁な培地交換)を用いて、細胞を増殖させる必要がある。これらの培養物は、以前と同様に計数及び処理した。これらの培養系では、G2特異的SETリボソームバックグラウンドが低下し、未処理対処理細胞の応答比が改善した。
【０３３６】
コンフルエンスアッセイでは、コンフルエントなP1培養物の継代処理を行い、固定量の細胞懸濁液(全体の略1％又はウェル当たり約60,000細胞)を白色透明底96ウェルマイクロタイタトレイに移した。マイクロタイタプレート内の細胞は、全ての試料ウェルがコンフルエンス(即ち、平方センチメートル当たり最大の細胞数)に達するまで24乃至40時間増殖させた後、完全増殖培地において参照標準試薬とのインキュベーションを行い、fLUC活性についてアッセイした。
【０３３７】
6時間のインキュベーション後、細胞を、位相差顕微法により脱離の兆候について調べた。約10％以上の細胞が脱離した場合、96ウェルプレートを1200rpmで3分間遠心分離して、脱離細胞をペレット化した。培地を除去し、50μLの細胞溶解緩衝液(25mMリン酸トリス(pH7.8)、10％グリセロール、1％Triton X-100、1mg/ml BSA、2mM EGTA、及び2mM DTT)に置き換えた。細胞を細胞溶解緩衝液と共に室温で10分間インキュベートし、位相差顕微鏡を用いて細胞溶解を確認した。完全な溶解を確保するため、各試料ウェルを激しく攪拌した。気泡は、注射針により手作業で破壊した。発光させるために、反応緩衝液に溶解したD-ルシフェリン溶液(25mMグリシルグリシン(pH7.8)、15mM MgSO4、4mM EDTA、15mMリン酸カリウム、1mM DTT、1mMコエンザイムA、6.7mM ATP、及び3.35mM D-ルシフェリン)5μLをウェルに注入した。4秒間振盪後、発光値は、適切なレンズフィルタを備えたFLUOstar Optima(BMG Labtech)マイクロプレートリーダを用いて、2500乃至4000のゲインで測定した。
【０３３８】
光量値は、処理及び未処理細胞により生じた値の比を用いて誘導倍率に変換した。最初に、任意の特定の参照標準試薬により生じた最大SET値を用いて、最適参照標準アッセイ(即ち、最も高いTR SET応答を引き起こす参照標準の組成及び投与量)を細胞型毎に定義した(表3)。このアッセイは、その後、このプール由来のサブクローンをスクリーニングして、クラス指定を割り当てるために用いた。
【０３３９】
(e)別個のTR SETクラスを含むクローン細胞株の単離及びTR細胞パネルの構築
【０３４０】
細胞株プールに依存するが、構成的CMV-fLUCベクターにより形質転換した細胞は、ゲインが3500での合計相対発光単位(RLU)が毒素未処置ウェルにおける値である50,000以上であり、処置細胞における誘導が1.5乃至2.5倍である場合に応答性を有すると判断した。同様に、TR fLuc発現ベクターを含む細胞は、ゲイン3500での合計RLUが毒素未処置及び処置ウェルにおける値である1000以上であり、処置細胞の誘導が3乃至1000倍である場合に応答性を有すると判断した。
【０３４１】
応答性細胞プールからクローン単離体を調製するために、P3-P4培養物から細胞を回収し、希釈し、計数し、再プレーティングした。プレーティングの密度は、細胞型に応じて、100mmディッシュ当たり500乃至10,000個の範囲とした。増殖の遅い低密度感受性細胞型は、より高い細胞数でプレーティングし、増殖の速い密度非感受性細胞型は、より低い細胞数でプレーティングした。コロニーの形成には、細胞型に応じて1乃至4週間を要した。コロニーが裸眼で見えるようになった後、個々のコロニーにサブクローニング用のマークを付けた。火炎滅菌したクローニングリングを、高真空グリースのライトコーティングにより処理し、コロニーを囲むプレートに取り付けた。クローニングリングを1×トリプシン-EDTA(Invitrogen)で満たし、インキュベートしてP1コロニーとして継代した細胞を24ウェルトレイに放出した。プール毎に十分なコロニー(150乃至400の独立サブクローン)を処理して、全ての翻訳応答性単離体の75％超を回収した。各サブクローンがコンフルエンスに達すると、各単離体をT-25フラスコ(P2としてマーク)に移し、コンフルエンスまで増殖させ、コンフルエンスアッセイプロトコルにおいて細胞特異的最適参照標準試薬アッセイを用いて分析した。
【０３４２】
発光の読み出し値に基づいて、各サブクローンについて誘導倍率値を計算した。これらの値は、最低値から最高値まで順位付けし、順位対誘導倍率値の関数としてプロットした(即ち、ランキングプロット)。TRクラス指定を割り当てるために、統計分析を使用して、サブクローンを、より低いクラス応答群の平均から少なくとも2標準偏差だけ変化するサブセットにグループ化した。最も低い順位の系列(最も低い翻訳応答)に基づいて、細胞サブクローンをTR第1階級として分類した。類似の手順を用いて、TR第2及び3階級サブクローンを同定した。全てのクラス応答を編集して、第1、2、及び3階級の定義を確立し、細胞計数アッセイを用いて詳細な分析のためのサブクローンを同定した。
【０３４３】
定量的細胞計数アッセイの結果を用いて、以下を含むTR細胞パネルを構築するのに十分なサブクローンを同定した: 第1階級: 2乃至3個以上の代表及び全ての境界クローン(第1及び2階級の境界のクラス指定)、第2階級: 全ての境界クローンを含む3乃至4個以上の代表、第3階級: 全てのサブクローンを保持。第3階級の応答の定義に基づいて、「外れ値」は、第3階級サブクローン集団の平均値から3標準偏差より大きく外れたTR SET応答を示したサブクローンとなる。各TR細胞パネルサブクローンは、低温保存した。凍結保存ストックは、一般に、低継代サブクローンストックを100mmディッシュでコンフルエンスまで増殖させ、1×トリプシン-EDTAで少なくとも2回洗浄し(1分、室温)、100mmディッシュ当たり2mLの凍結培地(90％ウシ胎仔血清、10％DMSO)に回収し、クライオバイアルに移して調製した(バイアル当たり細胞1ml、バイアル当たり細胞1×10e7個)。クライオバイアルは、低速凍結容器内で-70/-80℃の冷凍庫に16乃至24時間入れ、その後、保存のために液体窒素に移した。
【０３４４】
(f)TR細胞パネルの特徴付け及び維持
【０３４５】
TR細胞パネルメンバ毎にSET発現パターンを定義するために、パネル内の全細胞は、参照標準試薬による細胞計数アッセイを用いて調べ、経時変化(6時間以下)、用量依存性(公知の生化学的又は酵素的特性により定義した用量)、及び様々な用量依存性修飾因子アッセイ(試験化合物又は処置が参照標準応答を改変する能力の試験)を施した。これらのアッセイは、単一又は組み合わせた処置(2つの試験作用剤/条件を含む)を用いて実施可能であり、アッセイにおける試薬/条件の総数に応じて、3試薬、15試薬、又は21試薬アッセイ形式と呼んだ。
【０３４６】
場合によって、TRクラス細胞株は、不適切なメンテナンス又は低温保存の不良により損傷する場合ある。特定の単離体を回収するには、クラス定義サブクローンの二次サブクローニング及び再精製が必要となる。二次サブクローンを精製するためには、細胞株の連続希釈(100乃至1000生存細胞/100mmディッシュのプレーティング)を行うことで、サブクローニングし、増殖させ、上述したように細胞計数アッセイを用いて再試験した個々のコロニーを回収することになる。TR第2及び3階級細胞では、この二次サブクローニング手順により、SET値が親クローンより低い及び高いサブクローンが生じる場合が多かった(例えば、図7A)。
【０３４７】
1C. 個別の外れ値集団に関連する特異的SETリボソーム応答の確立
【０３４８】
(a)S期におけるSETリボソームの一時的活性化の測定
【０３４９】
TRアッセイに使用される対数的又は指数関数的細胞増殖プロトコルでは、S期細胞の割合が高くなり、最小限のG1及びG2期細胞と、低いSETリボソームバックグラウンド活性とが生じる。様々なSETアゴニスト(表3)による翻訳誘導は、予想外に速い時間経過でSETリボソームを活性化することが明らかとなった。図1Bに示すように、SETリボソームの一時的な調節を測定するための優れたシステムは、TR gLUC発現ベクター(分泌型gLUCタンパク質)を含む。この研究において、TPAは、処置の2時間以内に統計学的に有意なSET増加を誘導した。S期細胞周期セグメントは6乃至8時間を対象とするので、これらの結果は、SETリボソームが後期S期細胞で活性化し、細胞がG2に入ると規模が増加することを示している。これは、SETリボソーム活性化がDNA複製と相関し、S期内チェックポイントを誘導することが可能な任意の作用剤が、SETリボソーム翻訳の即時ブロックを非選択的に発生させるはずであることを意味する(非選択的SETアンタゴニスト)。対照的に、DNA複製及びG2期進行を刺激することが可能な化合物又は処置は、SETリボソームを活性化し、SETアゴニスト活性を示すことになる。
【０３５０】
(b)SETリボソームの熱調節の検出及び定義
【０３５１】
DNA複製中に損傷した細胞は、S期内チェックポイントを活性化し、老化を誘導し、アポトーシス細胞死を増加させることができる。代わりに、耐性細胞は、細胞損傷を修復し、細胞周期進行を誘導するのに必要な材料を合成するのに十分な時間を提供するG2/M細胞周期チェックポイントを活性化することにより、DNA損傷に応答することができる。最もよく研究された細胞性ストレッサの1つである熱ストレスは、DNA合成を停止させ、DNA鎖切断を誘発し、mRNAをストレス顆粒に隔離し、熱ショックタンパク質のSETを増強する一方で、キャップ依存性リボソームを不活性化する、温度依存性の能力を示す。以前の研究では、低温(41℃)又は中程度(43℃)の温度への短期間の暴露(1乃至2時間)は、細胞死又はS期内チェックポイントは有意に増加させないが、G2/Mチェックポイントでの有糸分裂を停止しつつ、複製酵素(例えば、トポイソメラーゼ)及びキャップ依存性翻訳を不活性化することが明らかとなっている。
【０３５２】
図2A及び2Bに示すように、HEK293 TR細胞パネルに連続的な熱ショック(42℃)を与え、SETリボソーム応答についてアッセイした。各パネル株を、1ウェル当たり25,000個の細胞を使用する細胞計数プロトコルについて説明したように、一連の96ウェルマイクロタイタプレートにプレーティングし、約40時間増殖させた。各マイクロタイタプレートを42℃で加熱し、プレートを1時間毎に取り出し、試料を処理し、ホタルルシフェラーゼ活性について、説明したようにアッセイした。各時点は、3重のウェルの平均を表す。予想通り、キャップ依存性翻訳(CMV発現ベクターにより例示される)は、1時間以内に有意に減少し、6時間に亘り減少し続けた。しかしながら、fLUCレポータータンパク質のSETの直線的な増加が、2時間後(SETリボソーム活性化の初期のgLUC時間アッセイと一致する時間)から始まり、処置期間を通して継続した。予想外なことに、6時間後には、各TR細胞株におけるSETリボソーム応答の大きさは、以前に割り当てたTRクラス指定と相関した。これらの結果は、S期及びSET中のSETリボソームの活性化が共に耐熱性であることを示している。
【０３５３】
熱ショックと同様に、周囲温度(低温ショック)で細胞を処理することで、低温ショックタンパク質の急速なSETと、キャップ依存性リボソームの不活性化が生じる。SETリボソーム(図3A及び3B)の熱的特性を更に調べるために、15アッセイ研究を、HEK293 TR細胞パネルからの代表的な細胞株に対して42℃及び23℃で5つの参照標準を用いて行った(表3)。HEK293 TR細胞パネル株を96ウェルマイクロタイタプレートにプレーティングし、細胞計数プロトコルについて説明したように処理した。細胞は、単一又は一対の組合せとした参照標準試薬(表3に要約)により処置し、周囲温度(23℃)、生理的温度(37℃)、及び高温度(42℃)で6時間インキュベートした。細胞を処理し、ホタルルシフェラーゼ活性について、説明したようにアッセイした。
【０３５４】
予想どおり、CMV細胞株におけるキャップ依存性翻訳は、何れの温度においても全く応答を示さなかった。対照的に、高温及び低温の結果を比較すると、TR第3階級細胞は、好適なSETアゴニスト(TPA)を熱と共に付与した時に、相乗的SET活性化を示した。この増強されたSET活性は、初期のDNA合成を停止することが知られているプロテアソーム阻害剤及びトポイソメラーゼI毒により抑止された。対照的に、低温調節されたSETは、TRクラス非依存性の応答を示し、TPA SETアゴニストに対する全てのSET応答は、6時間後に同等となった。これらの結果は、熱がS期の進行及びG2/Mチェックポイントの開始を刺激する一方、低温がSETリボソームの活性化及び/又は細胞のG2への進行を遅らせることを示している。
【０３５５】
(c)キャップ依存性翻訳阻害剤により処理した細胞におけるSETリボソーム応答の検出及び定義
【０３５６】
間期の初期全体を通して、ラパマイシン(mTOR)キナーゼの哺乳動物標的は、多タンパク質mTOR複合体1の成分である。G0/G1キャップ依存性翻訳を開始する間に、mTORC1は、決してリボソームに直接結合しないが、5'mRNAキャップ構造上の40Sサブユニットアセンブリを促進し、隣接ORFへのリボソームスキャニングを誘導する調節タンパク質を酵素的に活性化する。対照的に、G2/M期中には、mTORキナーゼを活性化するために80Sリボソームに結合する必要がある別個のアクセサリタンパク質群を含むmTOR複合体2が形成される。この独特なタンパク質複合体は、80Sリボソーム機能を変更して、G2/Mリボソーム-mTORC2ハイブリッドがTR mRNAを選択的に翻訳することができるようにする(SETリボソーム)。
【０３５７】
翻訳調節経路は、mTORキナーゼ阻害に対するそれらの感受性によって区別することができる。低用量のラパマイシン、即ち、大環状ラクトン抗生物質は、mTORC1のFKBP12タンパク質に結合し、G1期のキャップ依存性リボソーム活性を下方制御し、G1/Sチェックポイントを誘導する。mTORC2では、アクセサリタンパク質の変化により、mTORキナーゼは、低用量のラパマイシンに対して感受性を失うが、しかしながら、このプロセスのSETリボソームに対する効果は、未確定のままとなっていた。MCF7 TR細胞パネルの選択メンバーを、96ウェルマイクロタイタープレートにプレーティングし、細胞計数用量依存性修飾因子(Cell Count Dose-dependent Modifier)プロトコルについて説明したように処理した。ラパマイシン濃度を、100nMのTPA/500nMのパクリタキセルの組み合わせにより生じた参照標準応答を変更する能力について試験した。ラパマイシンは、1nM乃至1μMの濃度範囲で利用した。全ての希釈溶液は、完全増殖培地で調製した。細胞を6時間インキュベートし、処理し、ルシフェラーゼ活性について、説明したようにアッセイした。
【０３５８】
図4に示すように、MCF7細胞は、SETリボソームを活性化することにより、低用量ラパマイシン(1nM乃至50nM)に応答する。mTORC2キナーゼを阻害する用量(50nM超)において、SETの規模は減少するが、排除はされない。これらの結果は、SETリボソームが標準的なG1翻訳阻害剤により制御されないことを示している。
【０３５９】
(d)DNA複製毒素により処置した細胞におけるSETリボソーム応答の確定
【０３６０】
MCF7及びHEK293 TR細胞パネルの選択メンバを96ウェルマイクロタイタプレートにプレーティングして、細胞計数用量依存性修飾因子プロトコル及び/又は用量依存性修飾因子プロトコルを、塩化コバルト及びトポテカンに対して実施した(100nM TPAにより生じたSETアゴニスト応答を変更する能力について試験された)。塩化コバルトの用量は、2μM乃至2mMの範囲とした。トポテカンの用量は、2nM乃至25μMの範囲とした。各試験用量を、完全増殖培地で調製し、適切な参照標準試薬と混合し、6時間に亘り細胞に与え、試料を処理し、ルシフェラーゼ活性について、説明したようにアッセイした。
【０３６１】
環境に遍在する金属は、鉱業、産業、医学、又は農業における長期の職業性暴露を伴う用途において、ヒトの健康上の危険として認識される。哺乳動物では、可溶性コバルト(II)塩等の金属は、依存性の急性毒性、DNA損傷、突然変異頻度の増加、及び染色体異常を引き起こす恐れがある。50μM乃至100μMの低用量では、培養細胞は、DNA鎖切断や巻き戻し等のS期の欠陥を示す場合がある。図5A及び5Bに示すように、固定用量のTR標準試薬(SETアゴニスト及び/又はアンタゴニスト)を、塩化コバルト(II)の濃度を増加させながら混合して、SETの組み合わせによる増加又は減少を試験した。低用量(2μM乃至50μM)において、コバルト(II)はSETに影響しなかったが、しかしながら、50μM超の用量では、パクリタキセルによるSETリボソーム活性化を阻害することができた(約200μMのIC50)。対照的に、TPAで処置した細胞は、SET活性を阻害するために200μM超を必要とした(約1mMのIC50)。これらの結果は、環境毒素により生じたDNA損傷がG2期進行を阻害することが可能であり、SETリボソーム活性化が薬物特異的調節を示し得ることを裏付けている。
【０３６２】
真核生物DNAトポイソメラーゼI(topoI)は、転写及び複製中に生成されるDNAスーパーコイルを緩和する酵素である。TopoIは、インタクトなDNA鎖の周りを回ることが可能な、一過性一本鎖切断の発生を刺激する共有結合酵素-DNA複合体を形成することにより、DNA緩和を調節する。DNA巻き戻しの後、topoI-DNA共有結合は逆転し、遊離DNA末端は、再連結される。様々な薬物(カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン等)は、酵素-DNA複合体を安定化させ、DNAライゲーションを防ぐことにより、このプロセスを妨害することが明らかとなっている。低用量において、これらの薬物はG2/Mチェックポイントへの細胞周期進行を刺激する一本鎖切断を誘導する。対照的に、より高い濃度では、複製フォークの衝突により二重鎖DNA切断、細胞老化、及び死滅が生じる十分な数の捕捉されたtopoI-DNA複合体が生じる。図6Aに示すように、トポテカンで処置したMCF7 TR細胞パネルの選択メンバは、より高い用量(100nM乃至10μM、IC100>5μM)でSETアンタゴニスト応答に推移する用量依存性SETアゴニスト活性(2乃至100nM、最大SET応答は10nM)を示した。同様に、図6Bは、HEK293第3階級細胞株を固定量のTPA及び異なるトポテカン用量で処置すると、同様の二相性SET応答プロファイルが生じることを示している。図6A乃至6Bにおいて、トポテカンはCMVキャップ依存性リボソームに対して検出可能な影響を与えなかった。図6Cでは、トポテカン特異的SET応答を公知の細胞/動物応答及び毒性と相関させている。特に重要なのは、SETアゴニストからアンタゴニスト活性へ推移する用量が、ヒトの臨床用量及び最大耐量と相関するという観察結果である。SETアンタゴニスト用量は、DNA損傷を誘導し、それだけでマウスを殺し、細胞周期を停止した。これらの結果は、TR細胞株が、SETリボソーム活性を急速に増加させることにより、軽度のDNA損傷(例えば、一本鎖切断)及び細胞周期G2期進行に応答することを示す。対照的に、重篤なDNA損傷(二本鎖切断)が可能な作用剤は、SETリボソームの活性化を妨げるS期初期のチェックポイントを促進する。
【０３６３】
(e)TR第3階級外れ値細胞株における特有の性質を定めるインビトロ増殖アッセイ
【０３６４】
明らかに、SETリボソーム応答の大きさは、細胞損傷を修復するため及び細胞周期進行に必要な後期S及びG2/M特異的タンパク質を合成する能力の増加と相関する。CSCモデルに基づくと、これらの特性は、薬物やストレス耐性の腫瘍細胞と一般に関連している。TR第3階級外れ値細胞株がTR転移性癌細胞モデルの候補である場合、これらの細胞は、転移能と一致する増殖特性を示さなければならない。この実施例では、接着性及び非接着性の成長アッセイを使用して、増強されたインビトロ増殖能と、分化の進んだ子孫を発生及び生産する能力とを試験する。
【０３６５】
最初のアッセイでは、反復コロニー形成プロトコルを利用して、単一細胞のプレーティング効率の向上を試験する。このアッセイでは、MCF7、HEK293、及びHCT116 TR細胞パネルからの推定第3階級外れ値細胞を、指数関数的に増殖する培養物と、2枚の100mm組織培養ディッシュ(Corning、細胞培養処理済み)にプレーティングした250乃至500個の細胞とにおいて確立した。G418選択培地におけるコロニー形成は、以前に説明したように実施した。コロニーを単一のプールに収穫し、ストック維持のために単一のT75フラスコに移し、サブクローニングを少なくとも3サイクル繰り返した。誘導倍率に基づいて、細胞応答を最低から最高までのランクに順位付け、順位対誘導倍率としてプロットした。
【０３６６】
第2のアッセイでは、MCF7、HEK293、及びHCT116 TR細胞パネルからの推定TR第3階級外れ値細胞を、指数関数的に増殖する培養物において確立し、10,000個の細胞を、細胞培養処理していない2枚の100mm組織培養ディッシュ(Fisherbrandポリスチレンペトリ皿)へ移した。細胞を凝集させ、完全培地で1週間継代することにより非接着性増殖に適応させた。細胞集合体を手作業で壊して単一の細胞とし、新鮮なペトリ皿に移した。初期の培養では細胞集合体に多数の死細胞が含まれていること珍しくなかった。これらの細胞は、新鮮な細胞集合体に付着しないので、生存細胞集塊を沈降させ、培地交換を繰り返して除去することができた。顕微鏡検査を用いて、細胞生存率、増殖率(集塊サイズ)を確認し、培養物に小さな細胞球が含まれているかを判定した。非接着性培養物として2週間経過後、トリパンブルーを用いて生存細胞数を決定し、完全培地を含む新鮮なペトリ皿に100乃至200個の生存細胞をプレーティングして、腫瘍様塊を形成する能力を測定した。本質的には、非接着性細胞コロニーを形成する能力について選択した。ディッシュを慎重にインキュベーターに移し、5日より長く増殖させた。顕微鏡検査を用いて、小さな腫瘍様塊を含む培養物を同定した(図7B)。この研究により、非接着性の増殖が、TRクラス応答ではなく、腫瘍細胞型と相関することが確証された。例えば、HCT116 TR細胞パネルにおける単離体の大部分は、非接着性の増殖を行う能力を示した(表4)。細胞プールを標準の組織培養ディッシュに移し、接着性の増殖に少なくとも2継代に亘り適応させた後、SET応答を測定した。
【０３６７】
図7Aに示すように、コロニー形成プロトコルを行ったHEK293 TR第3階級外れ値細胞株から単離したサブクローンは、この研究において、親TR細胞パネルクローンと比較してSET応答の減少又は増加により例示されるクローン進化(単細胞クローンが示す細胞増殖の変化)を示した。特に、コロニー形成により、他のサブクローンと比較してTRアッセイ応答が有意に高い新規の外れ値サブクローンを選択することができた。同様に、4週間の非接着性増殖後に多数のTR第3階級外れ値クローンを含むHCT116 TRクラスパネルにより生じたTRアッセイ応答を試験することにより、推定TR転移性癌細胞モデルのみが、SET応答の有意な増加を示すことが確証された(mTRdm-fLUC#25、#28、及び#75、表4)。これらの結果は、TR第3階級外れ値細胞株が、耐性及び生存性を高めるSETの規模を変えることにより、ストレスの大きい増殖条件に応答する能力と一致する。これらの形質は、転移性腫瘍細胞の期待される応答と一致し、TR第3階級外れ値サブクローンが増殖ストレスに適応し、SET活性が上昇した新たな外れ値細胞が生成されるように親のSET応答を変化させることができるという概念を支持している。我々は、これらの候補細胞を第4階級細胞と呼び、これらの細胞では、TR転移性癌細胞モデルとして認められるために、特異的なインビボ腫瘍形質のみが必要となる。
【０３６８】
実施例2
【０３６９】
2A. HCT116 TR転移性癌細胞モデルがヌードマウスにおける連続移植中に腫瘍開始活性を示すことの確証
【０３７０】
(a)TR転移性腫瘍細胞モデル及びHCT116親細胞由来の細胞及び腫瘍断片の移植
【０３７１】
Charles River Laboratoriesから入手した雌マウス(Cr1:NU-Foxn1nu)は、実験1日目に7週齢であった。マウスには、照射済み齧歯類飼料5053(LabDiet)及び水を自由に摂取させた。マウスを床敷Bed-O'Cobsを敷いた静止ケージに収容し、HEPA濾過空気を気泡環境に提供して完全な空気の入れ換えを1時間に100回行うBioBubble Clean Room内に置いた。環境は、温度範囲70±2°F、湿度範囲30乃至70％に制御した。
【０３７２】
HCT116親細胞及び第4階級 HCT116 hTRdm-fLUC#32細胞株を、L-グルタミンにより改変したRPMI 1640培地(Cell Gro)に10％ウシ胎仔血清、1％ペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミン、1％ピルビン酸ナトリウム、及び25mM Hepesを補充したもの使用して、5％CO2雰囲気中、37℃で増殖させた。移植前に、各細胞型を収集してプールし、トリパンブルー排除アッセイを用いて生存細胞数を決定した。細胞懸濁液を、1500rpm(300×g)で5分間、4℃で遠心分離した。
【０３７３】
25×106細胞/ml懸濁液(無血清RPMI)をHCT116及びHCT116 hTRdm-fLUC#32細胞について調製し、5×106細胞/マウス(0.2ml)を、20匹のマウス(各試験アームで10匹)に対して27ゲージの針を用いて0日目に皮下移植した。各細胞懸濁液を湿った氷上で維持して、細胞生存率の損失を最小化し、均一な細胞懸濁液を維持するために頻繁に反転させた。移植後21日目(腫瘍平均サイズ750mg)に、動物を安楽死させ、腫瘍を採取し、30乃至60mgの断片に切り分けた(平均サイズ45mg)。HCT116親及びhTRdm-fLUC#32腫瘍からの塊を、12ゲージのトロカール針を用いて12匹のヌードマウス(試験アーム当たり6匹)の皮下及び両側に移植した(0日目)。各アームにおいて1つの腫瘍が2g超に増殖した22日目に、動物を屠殺にした。
【０３７４】
全てのマウスの臨床徴候を、少なくとも1日1回観察した。体重及び腫瘍の測定値は、週に2回記録した。腫瘍負荷(mg)は、キャリパ測定値から、単位密度を仮定した長楕円体の体積の式を用いて、次のように推定した: 腫瘍負荷(mg)=(L×W2)/2、ここで、L及びWは、それぞれ直交する腫瘍の長さ及び幅の測定値(mm)である。全ての処置、体重測定、及び腫瘍測定は、気泡環境内で行った。
【０３７５】
(b)培養細胞及び腫瘍断片を移植したマウスにおける連続腫瘍増殖
【０３７６】
親HCT116細胞株を移植した10匹の試験動物のうち9匹で腫瘍が発生した。腫瘍は、17日で平均サイズ650mgに達した(腫瘍体積の倍加時間は5.8日)。hTRdm-fLUC#32細胞を移植した10匹の動物全てにおいて腫瘍が発生し、17.4日で平均サイズ650mgに達した(腫瘍体積倍加時間は6.5日)。両アームにおいて、マウスは、最小限の体重減少を示し、自然退縮は示さなかった。表5に示したように、腫瘍断片の増殖には大きなばらつきがあった。各腫瘍は、21日間に亘り正のサイズ増加を示したが(HCT116のサイズ増加は3.2倍乃至47.5倍であり、hTRdm-fLUC#32のサイズ増加は4倍乃至30倍)、腫瘍サイズの分布はランダムではなかった。両アームにおいて、上位4個の腫瘍サイズは、残りの8個の腫瘍よりも統計的に大きかったが、しかしながら、大きなサイズのランク分布は、hTRdm-fLUC#32腫瘍の方が多く、12個の腫瘍のうち6個が600mgを超えていたが、HCT116親腫瘍で12個のうち4個となった。これらの結果は、hTRdm-fLUC#32細胞株が、連続インビボ腫瘍開始活性を示すことを表しており、更に、腫瘍増殖速度の増加を裏付けている。
【０３７７】
2B.TR発現カセットからの調節翻訳を示す推定TR転移性癌細胞腫瘍の非侵襲的画像化
【０３７８】
(a)TR転移性腫瘍細胞モデル及びHCT116親細胞からの腫瘍の生成
【０３７９】
研究の1日目において6乃至7週齢である雌マウスを、Charles River Laboratorie(Crl:NU-Foxn1nu)又はHarlan Laboratories(Hsd:Athymic Nude-Fox1nu)から入手した。マウスには、照射済み齧歯類飼料5053(LabDiet)及び水を自由に摂取させ、床敷Bed-O'Cobsを敷いた静止ケージに収容し、HEPA濾過空気を気泡環境に提供して完全な空気の入れ換えを1時間に100回行うBioBubble Clean Room内に置いた。全ての処置、体重測定、及び腫瘍測定は、気泡環境内で行った。環境は、温度範囲70°±2°F、湿度範囲30乃至70％に制御した。全てのマウスの臨床徴候を、少なくとも1日1回観察した。マウスは、腫瘍が2gを超えた場合、腫瘍が潰瘍化した場合、苦痛が明らかな場合、又は瀕死状態の場合に安楽死させた。
【０３８０】
HCT116親株及びHCT116 hTRdm-fLUC#32細胞を、10％(熱失活)ウシ胎仔血清、1％ペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミン、25mM HEPES、及び1％ピルビン酸ナトリウムを補充したRPMI1640培地において、37℃の5％CO2雰囲気中で増殖させた。細胞を回収し、トリパンブルー排除アッセイにより細胞生存率を決定した後、移植のためにプールした。細胞懸濁液を遠心分離し、50×106細胞/ml懸濁液を、50％無血清RPMI及び50％マトリゲル中で調製した。合計29匹のマウスに、5×106細胞/マウスのHCT116 hTRdm-fLUC#32細胞(アーム1、2、及び3)を皮下移植し(0日目)、29匹のマウスにHCT116親細胞(アーム4、5、及び6)を移植した。処置は、全てのグループの平均推定腫瘍量が125mg(グループ別平均の範囲は、119乃至129mg)となった8日目に開始した(動物はそれぞれ6匹の3グループに分類した)。全てのマウスの体重は、処置開始時に19.2g以上であった。最初の処置時の平均グループ体重は、よく一致していた(グループ別平均の範囲は、22.4乃至23.5g)。全てのマウスには、処置日の個体の体重に応じた投与を行った(0.2ml/20g)。非侵襲的画像化研究を繰り返すために、残りのHCT116 hTRdm-fLUC#32動物を、3匹を含む3アームに配置した(平均腫瘍重量は約500mg)。
【０３８１】
(b)TR転移性腫瘍細胞モデルを含有する腫瘍の生物発光画像化結果
【０３８２】
図8A乃至8D及び表6に示したように、HCT116 hTRdm-fLUC#32腫瘍により発現されたTRレポータータンパク質(fLUC)活性の生物発光イメージを、処置前と処置6時間後に撮影した。アーム#1は、クレモホールEL(0.5mg/kg/日)により処置した。Arm#2は、クレモホールEL(0.5mg/kg/日)、パクリタキセル(20mg/kg/日)により処置した。アーム#3は、シクロホスファミド(120mg/kg/日)により処置した。fLUC酵素は、Molecular Imaging Products Company(MIP)から入手したD-ルシフェリン粉末を用いて検出した。生理食塩水をルシフェリン粉末に添加して15mg/mlの懸濁液を生成した。懸濁液を約1分間ボルテックスして、透明な黄色の溶液を生成した。D-ルシフェリンは、各生物発光画像化セッションの直前に調製し、使用中、濡れた氷上で保管した。インビボ生物発光画像化は、IVIS 50光学画像化システム(Xenogen、カリフォルニア州アラメダ)を用いて実施した。動物は、2％イソフルランガス麻酔下で(一度に3回)画像化した。各マウスにルシフェリン150mg/kgを腹腔内注射し、注射の10分後に腫瘍をカメラに向けて画像化した。CCDチップの大きなビニングを使用し、露光時間を調節して(5秒乃至5分)、腫瘍から少なくとも数百カウントを取得し、CCDチップの飽和を回避した。Living Image(Xenogen、カリフォルニア州アラメダ)ソフトウェアを使用して画像を分析し、特有のシグナルにそれぞれ手作業で丸を付け、グループ及びマウス番号でラベル付けした。
【０３８３】
図8A乃至8D及び表6は、未処置のHCT116 hTRdm-fLUC#32腫瘍により発現された生物発光レベルに大きなばらつきがあることを示している(0.2×106乃至60×106光子/秒の範囲)。しかしながら、腫瘍応答は、2つのクラスに分けることが可能であり、最も低い処置前発現レベルは、0.2×106乃至1.2×106光子/秒の範囲となり、最も高いものは、13.2×106乃至60.4×106光子/秒(最も大きな低処置前応答の10倍以上)の範囲となった。低処置前腫瘍は、処置後に非常に有意なSETの増加を示した一方(未処置腫瘍に対して処置腫瘍では10,540％乃至46,600％の増加)、高レベルを発現する腫瘍は、有意なSET活性を誘導できなかった(70.7％乃至381.8％)。これらの応答が処置前測定の6時間後に残留ルシフェリンにより生じたことを除外するために、担腫瘍動物の別のコホートを前処置の24時間後に画像化した(表6)。これらのより大きな腫瘍(約500mgの平均腫瘍サイズ)では、アーム#2内の1腫瘍のみが、低い内在性発現レベル(0.5×106光子/秒)を示したものの、予想されるSETの増加を発生させた(20,500％の誘導)。これらの結果は、インビトロTR第3階級外れ値活性と一致するインビボ応答を生成するパクリタキセル/クレモホールELにより、HCT116 hTRdm-fLUC#32腫瘍においてSETを活性化させることが可能であることを示している。第2に、処置前SET活性の存在は、小さな腫瘍形態が、腫瘍増殖中においてより一般的となる有糸分裂細胞において予想外のストレス応答(これまで知られていないG2関連細胞周期チェックポイント)を発生させることを示唆している。更に、各処置群における誘導性腫瘍応答の存在は、TR発現カセットからのSETが各薬物/ビヒクル処方中の一部の化合物に応答することを示している。特に注目すべきは、クレモホールEL(水溶液中でパクリタキセルを溶解させるために一般に用いられる賦形剤)により生じる大きなSET誘導であった。
【０３８４】
2C. TR転移性癌細胞モデルの腫瘍における予想外の腫瘍依存性及びSET依存性薬物耐性
【０３８５】
(a)薬物製剤及び動物処置
【０３８６】
試験アーム#1及び#4を、ビヒクル対照(クレモホールEL0.5mg/kg/日、 Q2Dx5)により処置し、アーム2及び5をパクリタキセル/クレモホールEL(20mg/kg/日及び0.5mg/kg/日、Q2Dx5)により処置し、アーム#3及び#6をシクロホスファミド(120mg/kg/日、Q4Dx3)により処置した。各薬物(0.2ml/匹)は、静脈内(IV)送達により送達した。ビヒクル対照は、12.5％のエタノール、12.5％のクレモホールEL、及び75％の生理食塩水を含有していた。試薬グレードのパクリタキセルは、Hauser Pharmaceutical Servicesから乾燥黄色粉末として入手し、室温で光から保護して保存した。各処置日に、化合物を無水エタノール(最終体積の12.5％)に溶解し、その後、クレモホールEL(最終体積の12.5％)及び生理食塩水(最終体積の75％)を連続して添加し、それぞれの添加後に完全に混合した。結果として無色透明の溶液が生じた。シクロホスファミドは、McKessen Specialty Productsから白色粉末として入手し、各処置前に生理食塩水に新たに溶解して、pH4.0の無色透明の溶液を生成した。
【０３８７】
全てのマウスの臨床徴候を、少なくとも1日1回観察した。マウスの体重は、各処置日に測定し、その後、少なくとも週2回測定した。腫瘍の測定値は、63日間、週2回記録した。腫瘍負荷(mg)は、前述の式を用いて、キャリパ測定から推定した。マウスは、腫瘍負荷が2gを超えた場合、腫瘍が潰瘍化した場合には、苦痛が明らかな場合又は瀕死状態の場合と同様に安楽死させた。各動物群について、個々の腫瘍重量を経時的にプロットした(図9A)。動物の生存率の評価は、動物数(生存％)が試験日(時間)に対してプロットされ、生存時間関数の推定値を処置アーム毎に提供するカプランマイヤグラフグラフを用いて行った(図9B)。
【０３８８】
(b)TR転移性腫瘍細胞モデルの腫瘍における予想外の薬剤耐性活性
【０３８９】
全ての処置は、平均腫瘍が125mg、平均動物体重が19.2g(22.4乃至23.5gの範囲)となった8日目に開始した。ビヒクルアーム#1及び#4の腫瘍サイズは、8日目には異なっていなかったが、hTRdm-fLUC#32の動物では、統計的に有意な腫瘍サイズの増加が早くも11日目に検出され(p=0.043)、22日目まで継続した(p=0.0093)。25日目の動物の屠殺のため(アーム#1では6匹中3匹を腫瘍負荷のために屠殺したがアーム#4では6匹中0匹であった)、以降の腫瘍の比較はできなかった。対照的に、アーム#2及び#6の腫瘍は、11日目に有意なサイズ差のみを示し(p=0.023)、これは、その後のシクロホスファミド処置が研究の残りの期間に腫瘍増殖を抑制したことを意味する。これらの結果は、hTRdm-fLUC#32腫瘍がインビボで増殖の亢進を示すことを表している。
【０３９０】
アーム#2及び#5では、各細胞株でのパクリタキセル/クレモホールELの有効性が確証されたが、個々の腫瘍には顕著なばらつきがあった。グループ単位では、hTRdm-fLUC#32腫瘍(アーム#2)は、750mgまでの平均時間が63日を超えたが(48.7日超の腫瘍成長遅延)、HCT116親腫瘍のでは50.4日だった(33.7日の増殖遅延)。しかしながら、図9Aに示したように、パクリタキセル/クレモホールELに感受性を有する3つの腫瘍も、低い処置前SET活性、処置後の有意なSET誘導、最小限の腫瘍退縮、及び化学療法に対する高い耐性(29乃至36日目の腫瘍再増殖をもたらした)を示した。対照的に、高い処置前SETの腫瘍は、パクリタキセル/クレモホールELに例外的な感受性を有し、最小の再増殖能を示した。
【０３９１】
hTRdm-fLUC#32腫瘍の増殖速度の増加は、図9Bの生存プロットにより更に裏付けられる。例えば、アーム#1の最後の動物は、29日目に腫瘍負荷のため屠殺され(生存平均24日)、一方、アーム#4では43日目となった(生存平均29日)。腫瘍サイズ及び生存平均は、アーム#3及び#6において有意に変化しなかったが、アーム#3の最後の動物は、39日目に腫瘍負荷のため屠殺され、他方では43日目となった。パクリタキセル/クレモホールELは、アーム#2及び#5において腫瘍の再増殖を減少させたため、腫瘍負荷による動物の屠殺は減少したが、しかしながら、2匹のhTRdm-fLUC#32の動物は、HCT116の動物より有意に早期に屠殺された(57及び62日目に対して50及び57日目)。この細胞株依存性の動物生存率の低下は、腫瘍増殖速度の向上と相俟って、hTRdm-fLUC#32腫瘍がHCT116親細胞より早く増殖することを証明している。更に、6個のhTRdm-fLUC#32腫瘍のうち4個が、パクリタキセル/クレモホールEL処置後に再増殖する能力は、これらの腫瘍がインビトロで観察されたTR第3階級応答と一致するインビボ薬剤耐性を示すことを表している。したがって、hTRdm-fLUC#32細胞株は、TR HCT116 CSCに関連する特性のそれぞれを示し、したがって、TR転移性癌細胞モデルの有効な例を表す。現在までに、15種類の候補第3階級外れ値細胞株が、第4階級の薬剤及びストレス耐性を示す6つの癌細胞型において同定されている(HCT116 mTRdm-fLUC#25、#28、#75及びhTRdm-fLUC#32、#69、#122、MCF-7 mTRplp-fLUC#118及びmTRdm-fLUC#111、#217、HepG2 hTRdm-fLUC#16、HEK293 hTRdm-fLUC#122及びhTRdm-gLUC#79、DU145 hTRdm-fLUC#27及びmTRdm-fLUC#194、HT1080 mTRdm-fLUC#99、#122)。このグループのうち、HCT116 mTRdm-fLUC#75及びhTRdm-fLUC#32では、全てのインビトロ研究が完了しており、hTRdm-fLUC#32細胞株を、この実施例に記載したインビボ腫瘍の検証のために選択した。
【０３９２】
実施例3
【０３９３】
3A. SETアゴニスト及びアンタゴニストにより生じるインビトロ翻訳活性の調査
【０３９４】
(a)インビボSETアゴニストにより生じた予想外の細胞に基づくSET応答
【０３９５】
表6のArm#1に示されるように、クレモホールEL(0.5mg/kg/日)の静脈内送達は、SET活性の低い処置前腫瘍において有意なSET活性化を発生させた。非イオン性界面活性剤として、クレモホールELは、疎水性薬物を可溶化するために一般に使用されるが、複数のインビボ副作用を発生させることも明らかとなっている。腫瘍SET応答の活性化パターン及び大きさが細胞に基づくSETアッセイと一致したことを考慮して、細胞計数用量応答アッセイにより、クレモホールELがインビトロSETを誘導する能力を調べた。図10Aに示すように、クレモホールEL(用量範囲2.5mg/ml乃至100mg/ml)は、CMV細胞株におけるfLUC発現を減少させ、クレモホールELがキャップ依存性翻訳を阻害することを実証した。意外なことに、HEK293 mTRdm-fLUC#12(TR第3階級)及びmTRdm-fLUC#122(TR第4階級)の6時間の治療は、如何なる用量でも有意なSETの増加を発生させなかった。24時間インキュベートした細胞のみが、10mg/mlで160％のSETの増加を示した。これらの結果は、クレモホールELが細胞型特異的有糸分裂効果を発生させることを示している。低用量のクレモホールELは、S期で細胞周期進行を止めることができるため、クレモホールELは、培養細胞においてG1のキャップ依存性翻訳を阻害するが、有糸分裂及びSET活性化は誘導しないと思われる。対照的に、腫瘍は、G2に入り、SETリボソームを活性化することによりクレモホールELに応答し、これは、細胞培養系がインビボ腫瘍応答を効果的にモデル化できないことを示している。
【０３９６】
(b)リボソーム結合翻訳阻害剤により生じるSETアンタゴニスト活性の調査
【０３９７】
表3に示すように、多数のSETアンタゴニストが同定されている。しかしながら、これらの作用剤の大部分は、単にS期において細胞周期進行を停止し、G2 SETリボソームの活性化を妨げるものである。薬剤感受性腫瘍により発現される処置前SETを再現するために、治療物質は、G2期進行を活性化するだけでなく、G2翻訳をブロックして、細胞回復を担うSET超誘導を防ぐ必要がある。図10Bは、SETリボソームに直接結合する一組の翻訳阻害剤に関連するSETアンタゴニスト活性を調べる、細胞計数用量依存性修飾因子(Cell Count Dose-dependent Modifier)アッセイの結果を示している。IC100用量(SETリボソーム活性の即時完全阻害を生じる薬物量)を決定するために、TR第3階級細胞HEK293 hTRdm-fLUC#13及びmTRdm-fLUC#45を、100nM TPA(SETアゴニスト)と様々な濃度の翻訳阻害剤であるアニソマイシン、エメチン、シクロヘキシミド、及びピューロマイシン(用量範囲10nM乃至25μM)との組み合わせにより処理した。報告されたホタルルシフェラーゼの半減期に基づいて、IC100処置は、全てのSETを完全に停止(SETアゴニスト応答をブロックし、fLuc活性を、未処置の対照試料の活性の約85％まで明らかに低下)させなければならない。したがって、SET遮断用量は、SETアゴニスト誘導を停止させるが、残存翻訳活性(95乃至150％ fLUC活性)を示し、IC100濃度はすべてのSET活性を停止し、85％未満の活性を生じる任意の処置は、タンパク質合成及び分解に影響を及ぼす可能性がある。
【０３９８】
図10Bに示すように、各薬物は、SETアゴニスト活性をブロックすることができたが、しかしながら、SET遮断及びIC100用量は、薬物特異的な変動を示した。例えば、SETアゴニスト誘導は、250nM乃至500nMのアニソマイシン、1μM乃至2.5μMのエメチン、2.5μM乃至5μMのシクロヘキシミド、及び10μM乃至25μMのピューロマイシンにより停止することができた。予想通り、各薬物のIC100用量は、アニソマイシンでは500nM乃至1μM、エメチンでは2.5乃至10μM、シクロヘキシミドでは10μM超、ピューロマイシンでは25μM超に増加した。したがって、アニソマイシンは、最も低いSET遮断及びIC100用量を示し、エメチン、シクロヘキシミド、及びピューロマイシンがそれぞれ続いた。
【０３９９】
B. 経口SET複合薬の安全性及び有効性の試験(動物研究1)
【０４００】
(a)TR転移性癌細胞モデル腫瘍を含むヌードマウスにおけるSET複合薬製剤の調製及び試験
【０４０１】
合計45匹のマウスにHCT116 mTRdm-fLUC#32細胞を移植し、5つのアーム(各8匹)に分類した。すべての処置は、平均腫瘍重量が125mg(グループ別平均の範囲は、152乃至169mg)となった7日目に開始した。全てのマウスの体重は、処置開始時に平均18.6g以上であった(グループ別平均の範囲は、20.5乃至22.4g)。全てのマウスで経口投与を行い、処置は、18日間毎日行った。全てのマウスの体重は、処置時、及び少なくとも週2回測定し、処置初日の開始体重の20％未満に体重が減少したマウスは、安楽死させた。腫瘍負荷(mg)は、上述したように推定し、腫瘍が2gを超えたマウスは、屠殺し、腫瘍を切除し、液体窒素で急速凍結し、組織病理学的分析及び免疫染色分析のために-80℃で保存した。体重及び腫瘍の測定値は、週2回、70日間記録した。
【０４０２】
グループ別平均腫瘍重量と、各グループ内の個々の腫瘍重量とを経時的にプロットし、腫瘍の増殖及び退縮に対する治療の効果を判定した。任意の日に測定した個々の動物の体重を、その日の腫瘍重量を差し引き、処置初日に測定した初期体重のパーセンテージに変換することで基準化した。基準化した重量を経時的にプロットし、治療の効果を評価した。動物の生存率の評価は、動物数(生存％)が試験日(時間)に対してプロットされ、生存時間関数の推定値を処置アーム毎に提供するカプランマイヤグラフグラフを用いて行った。
【０４０３】
(b)SET複合薬により生じた非常に有意なTR転移性癌細胞モデル腫瘍応答
【０４０４】
表7に示したように、それぞれ8匹の5つの試験アームに編成された合計40匹のマウス(HCT116 mTRdm-fLUC#32腫瘍を含む)に様々な薬物製剤を与えた。各SET複合薬は、SETアゴニスト、SETアンタゴニスト、及び細胞毒性S期毒素を含んでいた。この研究(第1の異種動物研究と呼ぶ)では、細胞毒性S期薬は、カペシタビン(転移性結腸癌の治療に用いられる第1選択治療物質)とした。500mg/kg/日のカペシタビン(18日間の処置)は、標準的なヒト用量の78％に相当するが、この高用量では、マウスに毒性が生じる。この研究ではSETアゴニストとして、インビボでSETを活性化することが証明済みの用量のクレモホールEL(0.5mg/kg/日)を選択した。魚及びラットでのクレモホールELのLD50が450乃至6400mg/kgであることを考えると、試験用量は、毒性濃度の900分の1より低い。この研究ではSETアンタゴニストとして、最小のSET遮断及びIC100用量を示したアニソマイシンを選択した。説明したように、250nM乃至500nM(等価経口用量は0.000027mg/kg/日)のアニソマイシンを用いた細胞に基づくアッセイにおいてSET遮断活性が観察され、IC100は、500nM乃至1μM(等価経口用量は0.000054mg/kg/日)となった。アニソマイシンのマウスLD50が75乃至200mg/kgであることを考えると、IC100用量は、毒性濃度の14,000分の1より低いことになる。アーム#1を10％エタノール、10％クレモホールEL(0.5mg/kg/日)、及び80％生理食塩水の溶液により処置し、アーム#2を500mg/kg/日のカペシタビンにより処置し、アーム#3を0.5mg/kg/日のクレモホールEL及び0.000054mg/kg/日のアニソマイシンにより処置し、アーム#4(低用量アニソマイシン)をクレモホールEL、カペシタビン、及び0.000027mg/kg/日のアニソマイシンにより処置し、アーム#5(高用量アニソマイシン)をクレモホールEL、カペシタビン、及び0.000054mg/kg/日のアニソマイシンにより処置した。
【０４０５】
図11A及び表8に示したように、IC100又は高用量アニソマイシンSET複合薬では、カペシタビン(アーム#2、53.2％退縮)又は低用量アニソマイシンSET複合薬(アーム#4、45.3％)により処置した動物と比較して、有意な腫瘍退縮が生じた(アーム#5、平均73.7％の腫瘍サイズの退縮)。図11Bに示したように、カペシタビン又は低用量アニソマイシンSET複合薬により処置した動物では、即座に腫瘍増殖が抑制されたが、処置を中止して2週間以内に、全ての腫瘍において再増殖が明らかとなった。対照的に、図11Cは、高用量アニソマイシンSET複合薬では、6個の腫瘍のうち4個に有意でない腫瘍の再増殖が生じ、6個の腫瘍のうち3個は、70日目に死後の腫瘍が存在しなかったことを示している。
【０４０６】
図13に詳細に示したように、唯一の有意な生存率増加は、高用量アニソマイシンSET複合薬により処置した動物において明らかとなった。アーム#1(28日)、#2(24日)、及び#3(28日)の生存期間の平均には、有意な差がなかった。対照的に、アーム#4では、体重減少のために屠殺された動物のため、Arm#5(70日超)と比較して生存期間の平均が低下した(15日)。全体として、これらの結果は、高用量カペシタビンとの組み合わせにおいて非常に有効であった高用量アニソマイシンSET複合薬と比較して、低用量SET複合薬が肯定的な腫瘍又は生存応答を発生させなかったことを示している。
【０４０７】
(c)SET複合薬により生じる可逆的な動物の体重減少
【０４０８】
図12A、12B及び表9に示したように、SET複合薬により、明確な動物体重減少パターンが生じた。驚くべきことに、アーム#3のSET薬物成分では、早期の薬物処置中(10日目)に僅かな体重増加が生じたが、その後の時点では明らかではなかった。予想通り、アーム#2における毒性カペシタビン処置により、24日目までに1匹の自然死と4匹の体重減少による屠殺が生じたが(20％超の体重減少)、生存動物の体重は試験全体を通して有意に増加又は減少しなかった(図12B)。図12Aに示すように、両方のSET複合薬で処置した動物は、2つの動物群に分かれ、一方の群は、有意な体重減少を示し、第2の群は、対照動物と有意に異ならなかった。有意な体重減少群の動物の多くは、体重減少が20％を超え、動物を屠殺した(表9、アーム#4では15日目までに8匹中5匹、アーム#5では24日までに8匹中2匹)。対照的に、処置終了(25日目)の前に、生存している動物は、急速に失った体重を回復し始め、統計的に有意な体重増加を31乃至38日目に示した(表9)。この体重増加は、最大の腫瘍退縮(図11C)と相関するが、アーム#5と比較したアーム#2及び#4における薬物処置終了前の体重増加及び体重依存性の動物屠殺の有意差は、驚くべきことである。この結果は、SET薬物成分が高カペシタビンの毒性を減少させる保護効果を提供することを示している。
【０４０９】
(d)SET複合薬による予想外の免疫応答
【０４１０】
図17A乃至17J及び表12は、SET複合薬で処置したhTRdm-fLUC#32腫瘍に関する免疫染色研究を示す。腫瘍は、体重減少のため屠殺した動物(アーム2の24日目の動物#1及び22日目の#7、アーム4の18日目の動物#5、アーム5の24日目の動物#2、22日目及び動物#8)から切断し、急速凍結し、PBS緩衝4％パラホルムアルデヒドで固定し、3μmの凍結切片に切断し、スライド上に載せ、蛍光標識抗体及び非標識抗体の混合物により染色して、マクロファージマーカータンパク質(ビオチン標識抗マウスMHCクラスII分子IA/IE、Alexa-647標識抗マウスCD11b/Mac-1、Alexa-488標識抗マウスF4/80、及びAlexa-647標識抗マウスCD68)及びTRレポータータンパク質(抗ホタルルシフェラーゼ)を検出した。非標識一次抗体を検出するために、Alexa-555標識二次抗体又はPE標識ストレプトアビジンを使用した。DAPI色素による核DNA染色を使用して、生存可能な腫瘍細胞を検出する。スライドを撮影し(Nikon 90i Eclipse)、NIS Elements 3.2又はImageJソフトウェアを使用して画像を解析した。
【０４１１】
図17Aの核染色を図17BのG2特異的fLUC発現(カペシタビンにより16日間処置したアーム#2動物#1の腫瘍)に相関させることで、カペシタビンが辺縁の有糸分裂細胞の狭い区画においてG2/Mチェックポイントを誘導し、SETリボソーム翻訳(fLUC発現)を活性化することが確認される(図17Bの白矢印、Layer1と呼ぶ)。腫瘍表面から延びる連続的な核の数を数えることにより、Layer1は、細胞3.4個分の平均厚さを有することが明らかとなった(表12)。驚くべきことに、Layer1細胞は、マクロファージエピトープの染色が最小限だったが、高濃度のF4/80染色マクロファージ(厚さ細胞6.4個分)を含む内部細胞層(Layer2と呼ぶ)に接していた。この層のF4/80+マクロファージは、他の免疫又はfLUCタンパク質について染色されておらず、腫瘍の有糸分裂細胞層(厚さ細胞9.8個分)内に含有され、境界を構築しているように見えた。個々のF4/80+細胞は、細胞16.6個分の平均深度で腫瘍に侵入していた(Layer3と呼ぶ)。免疫染色細胞は、細胞26.4個分の全深さで腫瘍内部に延在していた。Layer2/3の境界には、少数のfLUC陽性細胞体が含まれていたが、Layer3と壊死性コア(最小限の核DAPI染色を有する死滅細胞)との間で最小限の染色が観察された。同一の腫瘍及び免疫細胞応答は、14日目に処置したアーム2動物#7から処理された第2の腫瘍において観察された。これらの結果は、カペシタビンの作用機序、固形腫瘍の予想される多層構造、及び死滅する細胞によるF4/80+自然免疫細胞の特定のサブクラスの活性化と一致する。
【０４１２】
図17C及び17Dは、低用量アニソマイシンSET複合薬により10日間処置したアーム4動物#5由来の腫瘍を示す。この腫瘍において、SET複合薬は、Layer3から壊死性コアまで延在する腫瘍細胞において均一なG2特異的fLUC発現を活性化した(図17Dの白矢印)。図17Cにおいて、Layer2マクロファージは、fLUC抗原について染色されない明るい小さな核により例示された。カペシタビン腫瘍とは対照的に、Layer2免疫細胞の大部分は、CD68マーカータンパク質(CD68+F4/80-)に対する選択的な染色と、F4/80について共染色又は薄く染色されたマクロファージの小部分(CD68+F4/80+)とを示した。更に、CD68+F4/80-免疫細胞は、壊死性コアを含む腫瘍全体に侵入していた。アーム#4の腫瘍は、有意な腫瘍応答又は動物生存の改善を示さなかったことから、これらの結果は、SETアゴニストが腫瘍全体でG2特異的SETを刺激し(非有糸分裂細胞を再び細胞周期に入れ)、別個のCD68+F4/80-マクロファージサブタイプを活性化したことを示した。
【０４１３】
図17E乃至図17F及び表12は、高用量アニソマイシンSET複合薬により16日間処置したアーム#5動物#2から単離した腫瘍を示す。図17Fでは、fLUCレポータータンパク質のG2特異的翻訳がLayer1に存在すること(白矢印)が確認されたが、しかしながら、平均厚さは、Layer1の平均厚さは、細胞7.8個分に有意に増加した(Layer1厚さ、p=0.008、表12)。更に、この層は、崩壊が進んでおり、腫瘍辺縁に位置する小さな細胞内fLUC+体を含んでいた。意義深いことに、内部腫瘍細胞は、壊死性コア内以外では有意なfLUC染色を示さなかった。同様のサイズの増加は、Layer2(平均厚さ細胞7.8個)及びLayer3(平均厚さ細胞18.6個)においても観察された。アーム5の免疫反応細胞層の全深さは、細胞15.6個分となった(50％超のサイズ増加)。以前SET薬物腫瘍と同様に、マクロファージの大部分は、CD68+F4/80-であり、壊死性コアまで侵入していた。これらの結果は、高用量アニソマイシンSET複合薬が、アポトーシス細胞死(染色された有糸分裂細胞に隣接する小さなfLUC+体の出現)を増進すると共に、G2特異的翻訳を減少させつつ、侵襲性CD68+F4/80-マクロファージ応答を誘導する能力を裏付けている。
【０４１４】
図17G及び17Hは、高用量アニソマイシンSET複合薬により14日間処置したアーム#5の動物#8から単離した腫瘍を示す。図17Gは、近位壊死層(検出可能なDAPI染色核)から壊死性コア(最小限のDAPI染色)に及ぶ腫瘍切片により生じたDAPI染色を示す。図17Hは、この切片が、検出可能なDAPI染色を含まずに細胞に局在した高密度のfLUC+体を含有することを示している(図17G及び17Hの白矢印)。驚くべきことに、このデータは、高用量アニソマイシンSET複合薬が、細胞周期進行を刺激し、腫瘍の中心で細胞死を促進すること(死んでいるはずの細胞における予想外に高い代謝活動)を示している。
【０４１５】
図17I及び17Jは、Arm#5の動物#8由来の腫瘍と、ImageJソフトウェアを用いた、腫瘍内部を横切るfLUC+蛍光の定量化を示す。図17I上に15個のボックス(35×695ピクセル、0.64um/px)を描き、695個のピクセル毎に蛍光強度を測定することにより、蛍光密度マップを作成した。最も暗い壊死細胞層のピクセルを100％バックグラウンドに調整し、各ピクセルの全蛍光を、バックグラウンドと比較した(図17J)。この密度マップは、隣接するDAPI+細胞と比較して、最小限のDAPI染色を示す細胞において、fLUC染色強度が約600％増加したことを示している。この結果は、非有糸分裂で代謝的に不活性であると一般に考えられる細胞におけるG2特異的アポトーシス細胞死の非常に有意な選択的増加と一致する。
【０４１６】
3B. 経口SET複合薬の安全性及び有効性の試験(動物研究2)
【０４１７】
(a)TR転移性癌細胞モデル腫瘍を含むヌードマウスにおけるSET複合薬製剤の調製及び試験
【０４１８】
合計45匹のマウスにHCT116 mTRdm-fLUC#32細胞を移植し、5つのアーム(各8匹)に分類した。この研究(第2の異種動物研究と呼ぶ)では、カペシタビンの濃度は、標準的なヒト用量の35％に相当する400mg/kg/日のカペシタビン(10日間の処置)に低下させた。この低用量処置は、マウスの毒性を減少させるはずである。この研究ではSETアンタゴニストとして、アニソマイシン及びエメチンを選択した。説明したように、アニソマイシンIC100用量は、500nM乃至1μM(等価経口用量は0.000054mg/kg/日)となり、エメチンIC100用量は、2.5乃至10μM(等価経口用量は0.00013mg/kg/日)となった。エメチンのラットLD50が68mg/kgであることから、IC100用量は、最大試験用量の5,231分の1より低い。表10に示すように、アーム#1をビヒクルにより処置し、アーム#2を400mg/kg/日のカペシタビンにより処置し、Arm#3をクレモホールEL、カペシタビン、及びエメチンのIC100濃度(0.00013mg/kg/日)により処置し、Arm#4をクレモホールEL、カペシタビン、及び0.000054mg/kg/日のアニソマイシン(高用量)により処置し、Arm#5をクレモホールEL、カペシタビン、及び0.00013mg/kg/日のアニソマイシン(超高用量)により処置した。全ての治療は、実験の全グループの平均推定腫瘍量が125mg(グループ別平均の範囲は、152乃至172mg)となった6日目に開始した。全てのマウスの体重は、処置開始時に16.9g以上(平均の範囲は、19.9乃至21.2g)であった。全てのマウスには、処置日の個体の体重に応じた経口投与を行った。処置は、10日間毎日行い、その後、動物を合計72日間モニタした。全てのマウスの体重を測定し、腫瘍の測定値を以前に説明したように記録した。2gを超える腫瘍負荷のためにマウスを安楽死させた際には、腫瘍を切除し、PBS緩衝4％パラホルムアルデヒドで固定し、4℃で保存した。グループ別平均腫瘍重量と、各グループ内の個々の腫瘍重量とを経時的にプロットし、腫瘍の増殖及び退縮に対する治療の効果を判定した。任意の日に測定した個々の動物の体重を、その日の腫瘍重量を差し引き、処置初日に測定した初期体重のパーセンテージに変換することで基準化した。基準化した重量を経時的にプロットし、動物の健康全般に対する治療の効果を評価した。動物の生存率の評価は、動物数(生存％)が試験日(時間)に対してプロットされ、生存時間関数の推定値を処置アーム毎に提供するカプランマイヤグラフグラフを用いて行った。
【０４１９】
(b)SET複合薬により生じた非常に有意なTR転移性癌細胞モデル腫瘍応答
【０４２０】
図14A及び表11に示したように、IC100又は高用量エメチン(アーム#3、平均腫瘍退縮66.4％)、IC100又は高用量アニソマイシン(アーム#4、腫瘍退縮51.6％)及び超高用量アニソマイシン(アーム#5、腫瘍退縮46.2％)のSET複合薬では、カペシタビン(アーム#2、腫瘍退縮35.2％)により処置した動物と比較して非常に有意な腫瘍反応が生じた。図14Aに示したように、カペシタビン含有薬物は、腫瘍の増殖を即座に抑制したが、治療停止の2週間以内に、再増殖が全てのアームにおいて明らかとなった。アーム#3において観察された最大の腫瘍退縮の詳細な分析から、8匹中7匹において、個々の腫瘍が有意な腫瘍退縮を示したことが分かった(図14B)。
【０４２１】
図16に詳細に示したように、高用量エメチン(アーム#3、生存平均62日)及びアニソマイシンSET複合薬(アーム#5、生存平均54日)により処置した動物では、アーム#1(26日)、#2(47日)、及び#5(21日)と比較して、最も高い生存率の増加が明白となった。全体として、これらの結果は、高用量アニソマイシン及び高用量エメチンSET複合薬が、低用量カペシタビンと組み合わせた場合に非常に有効であったことを示している。
【０４２２】
(c)SET複合薬により生じる可逆的な動物の体重減少
【０４２３】
図15に示したように、400mg/kg/日のカペシタビンを含有する薬物では、明確な二相性の体重変化パターンを生じた。各薬物について、動物の体重は、治療中に減少し(6乃至16日)、治療停止後に急速に回復した。アニソマイシンSET複合薬では、腫瘍の再増殖ではなく20％の体重減少のため多数の動物が屠殺され、アーム#4(14日目までに8匹中2匹)及びアーム#5(21日目までに8匹中4匹)は、動物の屠殺が無かったアーム#2及び#3とは対照的となった。高用量エメチンSET複合薬により生じた平均体重変化は、カペシタビン処置動物より統計的に大きかったが(12乃至14日目、p=0.02)、動物の体重は、急速に回復し、29日目までに統計的に有意な体重増加を示した(p=0.0006)。動物研究1と同様に、この体重増加は、最大の腫瘍退縮と相関した(図14B)。これらの結果は、SET複合薬製剤がカペシタビン誘導性の動物体重減少を促進し、20％を超える体重減少による動物屠殺を減少させる上で、アニソマイシン含有薬物がエメチン含有薬物ほど有効ではない可能性があることを示した。しかしながら、動物の体重は、治療停止後10日以内に各SET複合薬で増加し、エメチンSET複合薬において統計的に有意となった。
【０４２４】
総合すると、実施例3により、アニソマイシン及びエメチンSET複合薬が、腫瘍表面の有糸分裂細胞と壊死性コア内の非有糸分裂細胞とを死滅させることにより、カペシタビン薬物作用を向上させ(図17A乃至17J)、広範な腫瘍退縮を生じさせ(表8及び11)、高用量及び低用量カペシタビンとの組み合わせにおいて腫瘍応答を有意に向上させ(図11A及び図14A)、動物の体重変化を減少/逆転させ(図12A及び15)、動物の生存を有意に増加させる(図13及び16)ことが証明される。
【０４２５】
【表１】
2017538698.tif 000002
【０４２６】
【表２】
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【０４２７】
【表３】
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【０４２８】
【表４】
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【０４２９】
【表５】
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【０４３０】
【表６】
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【０４３１】
【表７】
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【０４３２】
【表８】
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【０４３３】
【表９】
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【０４３４】
【表１０】
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【０４３５】
【表１１】
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【０４３６】
【表１２】
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【０４３７】
【表１３−１】
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【表１３−２】
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【表１３−３】
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【０４３８】
項目
【０４３９】
項目1. 医薬組成物であって、
SETアゴニスト及びSETリボソームアンタゴニストを含む、医薬組成物。
項目2. 前記SETアゴニストがG2期進行の刺激因子である、項目1記載の医薬組成物。
項目3. 前記SETアゴニストは、ポリオキシル硬化ヒマシ油、ホルボールエステル、ブリオスタチン、その何れかの医薬的に許容可能な塩、及びその何れか2つ以上の組み合わせからなる群から選択される、項目1又は2記載の医薬組成物。
項目4. 前記ポリオキシル硬化ヒマシ油は、ポリオキシル30硬化ヒマシ油、ポリオキシル35硬化ヒマシ油、ポリオキシル40硬化ヒマシ油、ポリオキシル50硬化ヒマシ油、ポリオキシル60硬化ヒマシ油、及びその何れか2つ以上の組み合わせからなる群から選択される、項目1乃至3の何れかに記載の医薬組成物。
項目5. 前記ポリオキシル硬化ヒマシ油は、ポリオキシル35硬化ヒマシ油、ポリオキシル40硬化ヒマシ油、及びその組み合わせからなる群から選択される、項目1乃至4の何れかに記載の医薬組成物。
項目6. 前記ブリオスタチンは、ブリオスタチン1、ブリオスタチン2、その何れかの医薬的に許容可能な塩、及びその何れか2つ以上の組み合わせからなる群から選択される、項目1乃至5の何れかに記載の医薬組成物。
項目7. 前記ホルボールエステルは、12-O-テトラデカノイルホルボール-13-アセタート又はその医薬的に許容可能な塩である、項目1乃至6の何れかに記載の医薬組成物。
項目8. 前記SETリボソームアンタゴニストは、SETリボソームによるタンパク質合成を阻害する、項目1乃至7の何れかに記載の医薬組成物。
項目9. 前記SETリボソームアンタゴニストは、アニソマイシン、エメチン、シクロヘキシミド、その医薬的に許容可能な塩、及びその何れか2つ以上の組合せからなる群から選択される、項目1乃至8の何れかに記載の医薬組成物。
項目10. 前記SETアゴニストは、ポリオキシル35硬化ヒマシ油を含み、SETリボソームアンタゴニストは、アニソマイシン又はその医薬的に許容可能な塩を含む、項目1乃至9の何れかに記載の医薬組成物。
項目11. 前記SETアゴニストは、ポリオキシル35硬化ヒマシ油を含み、SETリボソームアンタゴニストは、エメチン又はその医薬的に許容可能な塩を含む、項目1乃至10の何れかに記載の医薬組成物。
項目12. 対象への経口投与用に製剤化された、項目1乃至11の何れかに記載の医薬組成物。
項目13. インビボでのG2期進行を促進又は阻害するのに有効な作用剤を同定する方法が提供され、TR第3階級外れ値SET応答を特徴とするTR第4階級細胞株の細胞であり、TRエレメント及びレポーターをコードし、前記細胞のゲノム内に安定的に組み込まれたTR核酸発現カセットを含む細胞を提供することと、前記細胞を非ヒト動物に投与して、前記非ヒト動物において異種移植腫瘍を発生させることと、試験物質を前記非ヒト動物に投与することと、前記SET応答に対する前記試験物質の効果を測定することとを含み、SET応答の増加により、前記作用剤は、インビボでのG2期進行を促進するのに有効なSETアゴニストとして同定される、本発明の態様による方法。
項目14. 更に、インビボでのG2期進行を促進するためにSETアゴニストを前記非ヒト動物に投与することを含み、前記SET応答の減少により、前記作用剤は、インビボでのG2期進行を阻害するのに有効なSETアンタゴニストとして同定される、請求項13記載の方法。
項目15. 更に、前記異種移植腫瘍に対する前記試験物質の効果を測定することを含む、項目13又は14記載の方法。
項目16. 前記非ヒト動物は、ラット又はマウスである、項目13乃至15の何れかに記載の方法。
項目17. 増殖性疾患を治療するためのSET複合薬の成分として有効な作用剤を同定する方法であって、
TR第3階級SET応答又はTR第3階級SET外れ値応答を特徴とする細胞であり、前記細胞のゲノム内に安定的に組み込まれたTRエレメント及びレポーターをコードする発現コンストラクトを含む細胞を提供することと、
前記細胞を試験物質に接触させることと、
対照と比較したSETリボソームからのタンパク質合成に対する前記試験物質の効果を測定することと、を含み、前記試験物質によるSETリボソームからのタンパク質合成の阻害により、前記物質は、増殖性疾患治療用のSET複合薬の成分として有効な作用剤として同定される、方法。
項目18. 前記細胞は、非接着性3D構造として懸濁培養において成長するインビトロでの能力と、切断しサブフラグメント化して二次性腫瘍として増殖させることが可能な原発性異種腫瘍をインビボで引き起こし、これに成長する能力とにより更に特徴付けられる、請求項17に記載の方法。
項目19. 転移性癌細胞株モデルを生成する方法であって、
TRエレメント及びレポーターをコードする発現カセットを細胞に導入して、前記発現カセットが前記細胞のゲノム内に安定的に組み込まれた細胞の親集団を作成することと、
前記親集団のサブクローンを単離することと、
SETアゴニストを各サブクローンの細胞集団に投与して、各サブクローンの前記細胞集団においてSET TR応答を誘導することと、
前記レポーターの発現を検出することにより、各サブクローンの前記細胞集団におけるTR SET応答をアッセイすることと、
各サブクローンの前記TR SET応答を互いのサブクローンと比較して順位付けし、平均応答により特徴付けられるTR SET応答の範囲を確立することと、
前記平均応答よりも少なくとも2標準偏差だけ大きな、前記レポーターの発現の検出可能な増加を特徴とするサブクローンを選択することにより、前記選択されたサブクローンをTR第3階級SET応答サブクローンとして定義することと、
各TR第3階級TR SET応答サブクローンの細胞集団にSETアゴニストを投与して、各TR第3階級TR SET応答サブクローンの前記細胞集団においてSET TR応答を誘導することと、
前記レポーターの発現を検出することにより、各TR第3階級SET応答サブクローンの前記細胞集団における前記TR SET応答をアッセイすることと、
各TR第3階級SET応答サブクローンの前記TR SET応答を、互いのTR第3階級SET応答サブクローンと比較して順位付けし、平均応答により特徴付けられるTR SET応答の範囲を確立することと、
前記平均応答よりも少なくとも2標準偏差だけ大きな、レポーターの発現の検出可能な増加を特徴とするTR第3階級SET応答サブクローンを選択することにより、前記選択されたTR第3階級SET応答サブクローンをTR第3階級SET応答外れ値サブクローンとして定義することと、
TR第3階級SET応答外れ値サブクローンとして特徴付けられた1つ以上のサブクローンの細胞に1つ以上の毒素を投与することと、
前記サブクローンの細胞におけるSETリボソーム活性の上昇による薬剤及びストレス耐性を示す、TR第3階級SET応答外れ値サブクローンとして特徴付けられた前記1つ以上のサブクローンの細胞の応答を検出することにより、前記細胞がTR第4階級細胞であることを決定することと、これにより、転移性癌細胞株モデルを生成することと、を含む方法
項目20. 更に、
前記TR第4階級細胞を低密度条件下で少なくとも50細胞周期に亘り培養して、低密度コロニー形成が可能なTR第4階級サブクローンを生成することと、
低密度コロニー形成が可能な前記TR第4階級サブクローンを選択することと、
低密度コロニー形成が可能な各TR第4階級サブクローンの細胞集団にSETアゴニストを投与して、TR SET応答を誘導することと、
前記レポーターの発現を検出することにより、TR SET応答を誘導する低密度コロニー形成が可能な各TR第4階級サブクローンの前記細胞集団における前記SET応答をアッセイすることと、
低密度コロニー形成が可能な各TR第4階級サブクローンの前記TR SET応答を、低密度コロニー形成が可能なTR第4階級サブクローンと互いに比較して順位付けし、平均応答により特徴付けられるSET応答の範囲を確立することと、
低密度コロニー形成が可能であり、前記平均応答よりも少なくとも2標準偏差だけ大きな前記レポーターの発現の検出可能な増加を特徴とする前記TR第4階級サブクローンを選択することと、を含む、項目19記載の方法。
項目21. 更に、
前記TR第4階級細胞を非接着性の低密度培養条件下で培養することと、
懸濁凝集体として増殖する前記TR第4階級細胞のサブクローンを選択することにより、腫瘍様塊を引き起こす10個以下の細胞によるエクスビボ腫瘍様塊形成が可能なTR第4階級細胞のサブクローンを選択することと、
前記腫瘍様塊応答を引き起こす10個以下の細胞によるエクスビボ腫瘍様塊形成が可能な前記TR第4階級サブクローンの細胞に1つ以上の毒素を投与することと、
前記サブクローンの細胞におけるSETリボソーム活性の上昇による薬剤及びストレス耐性を示す、前記腫瘍様塊を引き起こす10個以下の細胞によるエクスビボ腫瘍様塊形成が可能な前記TR第4階級サブクローンの細胞の応答を検出することにより、前記TR第4階級サブクローンの細胞が、10個以下の細胞によるエクスビボ腫瘍様塊形成が可能であり、TR第4階級TR SET応答により特徴付けられることを決定することと、を含む、項目19又は20記載の方法。
項目22. 第3階級外れ値SET応答を特徴とする、単離された非天然型細胞であって、前記細胞のゲノム内に安定的に組み込まれたTRエレメント及びレポーターをコードする発現カセットを含む細胞。
項目23. 非接着性3D構造として懸濁培養において成長するインビトロでの能力と、切断しサブフラグメント化して二次性腫瘍として増殖させることが可能な原発性異種腫瘍をインビボで引き起こし、これに成長する能力とにより更に特徴付けられる、項目22記載の細胞。
項目24. 哺乳動物である対象における異常細胞を特徴とする増殖性障害の治療方法であって、
細胞傷害性薬物、SETアゴニスト、及びSETリボソームアンタゴニストの組み合わせの医薬的有効量を投与することを含む、方法。
項目25. 前記異常細胞には、有糸分裂異常細胞及び非有糸分裂異常細胞の両方が含まれ、異常細胞及び非有糸分裂異常の両方は、細胞傷害性薬物、SETアゴニスト、及びSETリボソームアンタゴニストの組み合わせの医薬的有効量を投与することにより、死滅させられる、項目24記載の方法。
項目26. 細胞傷害性薬物、SETアゴニスト、及びSETリボソームアンタゴニストの前記組合せは、前記SETアゴニスト及び前記SETリボソームアンタゴニストを用いずに前記細胞傷害性薬物を投与することによる治療と比較して、前記異常細胞を死滅させるのに必要な細胞傷害性薬物の用量を低下させる効果を有する、請求項24又は25記載の方法。
項目27. 前記細胞傷害性薬物は、5-フルオロウラシル、ロイコボリン、カペシタビン、シクロホスファミド、イリノテカン、トポテカン、パクリタキセル、ドセタキセル、オキサリプラチン、その医薬的に許容可能な塩、及びその何れか2つ以上の組み合わせからなる群から選択される、項目24乃至26の何れかに記載の方法。
項目28. 前記SETアゴニストがG2期進行の刺激因子である、項目24乃至27の何れかに記載の方法。
項目29. 前記SETアゴニストは、ポリオキシル硬化ヒマシ油、ホルボールエステル、ブリオスタチン、その医薬的に許容可能な塩、及びその何れか2つ以上の組合せからなる群から選択される、項目24乃至28の何れかに記載の方法。
項目30. 前記ポリオキシル硬化ヒマシ油は、ポリオキシル30硬化ヒマシ油、ポリオキシル35硬化ヒマシ油、ポリオキシル40硬化ヒマシ油、ポリオキシル50硬化ヒマシ油、ポリオキシル60硬化ヒマシ油、及びその何れか2つ以上の組み合わせからなる群から選択される、項目24乃至29の何れかに記載の方法。
項目31. 前記ポリオキシル硬化ヒマシ油は、ポリオキシル35硬化ヒマシ油、ポリオキシル40硬化ヒマシ油、及びその組み合わせからなる群から選択される、項目24乃至30の何れかに記載の方法。
項目32. 前記ブリオスタチンは、ブリオスタチン1、ブリオスタチン2、その何れかの医薬的に許容可能な塩、及びその何れか2つ以上の組み合わせからなる群から選択される、項目24乃至31の何れかに記載の方法。
項目33. 前記ホルボールエステルは、12-O-テトラデカノイルホルボール-13-アセタート又はその医薬的に許容可能な塩である、項目24乃至32の何れかに記載の方法。
項目34. 前記SETリボソームアンタゴニストは、SETリボソームによるタンパク質合成を阻害する、項目24乃至33の何れかに記載の方法。
項目35. 前記SETリボソームアンタゴニストは、アニソマイシン、シクロヘキシミド、エメチン、その医薬的に許容可能な塩、及びその何れか2つ以上の組合せからなる群から選択される、項目24乃至34の何れかに記載の方法。
項目36. 前記細胞傷害性薬物は、カペシタビン又はその医薬的に許容可能な塩を含み、前記SETアゴニストは、ポリオキシル35硬化ヒマシ油を含み、前記SETリボソームアンタゴニストは、アニソマイシン又はその医薬的に許容可能な塩を含む、項目24乃至35の何れかに記載の方法。
項目37. 前記細胞傷害性薬物は、カペシタビン又はその医薬的に許容可能な塩を含み、前記SETアゴニストは、ポリオキシル35硬化ヒマシ油を含み、前記SETリボソームアンタゴニストは、エメチン又はその医薬的に許容可能な塩を含む、項目24乃至36の何れかに記載の方法。
項目38. 前記対象は、ヒトである、項目24乃至37の何れかに記載の方法。
項目39. 前記増殖性障害は、薬剤耐性癌及び/又は転移性癌である、項目24乃至38の何れかに記載の方法。
項目40. 前記細胞傷害性薬物、前記SETアゴニスト、及び前記SETリボソームアンタゴニストは、同時に投与される、項目24乃至39の何れかに記載の方法。
項目41. 前記細胞傷害性薬物、前記SETアゴニスト、及び前記SETリボソームアンタゴニストは、異なる時間に投与される、請求項24乃至40の何れかに記載の方法。
項目42. 前記SETアゴニスト及び前記SETリボソームアンタゴニストは、医薬製剤中で一緒に投与される、請求項24乃至41の何れかに記載の方法。
項目43. 前記SETアゴニスト及び前記SETリボソームアンタゴニストは、医薬製剤中で一緒に経口投与される、項目24乃至42の何れかに記載の方法。
項目44. 更に、補助治療処置を含む、項目24乃至43の何れかに記載の方法。
項目45. 前記補助治療処置は、前記対象の放射線治療を含む、請求項24乃至44の何れかに記載の方法。
項目46. 前記補助治療処置は、1種類以上の追加細胞傷害性薬物の投与を含む、請求項24乃至45の何れかに記載の方法。
項目47. 前記細胞傷害性薬物は、注射により投与される、項目24乃至46の何れかに記載の方法。
項目48. 前記細胞傷害性薬物は、静脈内投与される、項目24乃至47の何れかに記載の方法。
項目49. 異常細胞を特徴とする前記増殖性障害を有する前記対象の異常細胞を、前記SETアゴニスト又はSETリボソームアンタゴニストと接触させる前に、前記細胞傷害性薬物に接触させる、項目24乃至48の何れかに記載の方法。
項目50. 前記異常細胞は、癌細胞である、項目24乃至49の何れかに記載の方法。
項目51. 発現カセットは、ヒト及びマウスTRエレメントから選択されるTRエレメントをコードする、項目13乃至23の何れかに記載の方法又は細胞。
項目52. 発現カセットは、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、又はその何れかの変異体によりコードされたものから選択されたTRエレメントをコードし、前記コードされたTRレメントは、mRNA内で適切に作動可能に連結されたコード配列に選択的翻訳をもたらす、項目13乃至23の何れかに記載の方法又は細胞。
項目53. 前記発現カセットは、抗原エピトープ、生物発光タンパク質、酵素、蛍光タンパク質、受容体、及びトランスポーターから選択されたレポーターをコードする、項目13乃至23及び52の何れかに記載の方法又は細胞。
項目54. 前記発現カセットは、ルシフェラーゼ、GFP、EYFP、mRFP1、β-Gal、及びCATから選択されたレポーターをコードする、項目13乃至23及び52乃至53の何れかに記載の方法又は細胞。
項目55. 実質的に本明細書に記載の治療方法。
項目56. 実質的に本明細書に記載の医薬組成物。
項目57. 実質的に本明細書に記載の増殖性疾患を治療するためのSET複合薬の成分として有効な作用剤を同定する方法。
項目58. 本明細書に記載の第3階級外れ値SET応答を特徴とする単離された非天然型細胞。
項目59. 実質的に本明細書に記載の転移性癌細胞株モデルを生成する方法。
項目60. 実質的に本明細書に記載のインビボでのG2期進行を促進又は阻害するのに有効な作用剤を同定する方法。
【０４４０】
配列
【０４４１】
配列番号1
マウスTRdm
ttgagtgagttagagtagtgagctagttgtctggtaggggccccctttgcttccctggtggccactggattgtgtttctttggagtggcactgttctgtggatgtggacatgaagctctcactggtacagaaaagctaattgagacctatttctccaaaaactaccaggactatgagtatctcattaatgtgattcatgctttccagtatgtcatctatggaactgcctctttcttcttcctttatggggccctcctgctggctgagggcttctacaccaccggcgctgtcaggcagatctttggcgactacaagaccaccatctgcggcaagggcctgagcgcaacgtttgtgggcatcacctatgccctgactgttgtatggctcctggtgtttgcctgctcggctgtacctgtgtacatttacttcaatacctggaccacctgtcagtctattgccttccctagcaagacctctgccagtataggcagtctctgcgctgatgccagattgtatggtgttctcccatggaatgctttccctggcaaggtttgtggctccaaccttctgtccatctgcaaaacagctgagttccaattgaccttccacctgtttattgctgcgtttgtgggtgctgcggccacactagtttccctgctcaccttcatgattgctgccacttacaacttcgccgtccttaaactcatgggccgaggcaccaagttc
【０４４２】
配列番号2
マウスTRplp
ttgagtgagttagagtagtgagctagttgtctggtaggggccccctttgcttccctggtggccactggattgtgtttctttggagtggcactgttctgtggatgtggacatgaagctctcactggtacagaaaagctaattgagacctatttctccaaaaactaccaggactatgagtatctcattaatgtgattcatgctttccagtatgtcatctatggaactgcctctttcttcttcctttatggggccctcctgctggctgagggcttctacaccaccggcgctgtcaggcagatctttggcgactacaagaccaccatctgcggcaagggcctgagcgcaacggtaacagggggccagaaggggaggggttccagaggccaacatcaagctcattctttggagcgggtgtgtcattgtttgggaaaatggctaggacatcccgacaagtttgtgggcatcacctatgccctgactgttgtatggctcctggtgtttgcctgctcggctgtacctgtgtacatttacttcaatacctggaccacctgtcagtctattgccttccctagcaagacctctgccagtataggcagtctctgcgctgatgccagattgtatggtgttctcccatggaatgctttccctggcaaggtttgtggctccaaccttctgtccatctgcaaaacagctgagttccaattgaccttccacctgtttattgctgcgtttgtgggtgctgcggccacactagtttccctgctcaccttcatgattgctgccacttacaacttcgccgtccttaaactcatgggccgaggcaccaagttc
【０４４３】
配列番号3
ヒトTRdm
ttgagtgagttagagtagtgagctagttgtctggtaggggccccctttgcttccctggtggccactggattgtgtttctttggggtggcactgttctgtggctgtggacatgaagccctcactggcacagaaaagctaattgagacctatttctccaaaaactaccaagactatgagtatctcatcaatgtgattcatgctttccagtatgtcatctatggaactgcctctttcttcttcctttatggggccctcctgctggctgagggcttctacaccaccggcgcagtcaggcagatctttggcgactacaagaccaccatctgcggcaagggcctgagcgcaacgtttgtgggcatcacctatgccctgaccgttgtgtggctcctggtgtttgcctgctctgctgtgcccgtgtacatttacttcaacacctggaccacctgcgactctattgccttccccagcaagacctctgccagtataggcagtctctgtgctgacgccagattgtatggtgttctcccatggaatgctttccctggcaaggtttgtggctccaaccttctgtccatctgcaaaacagctgagttccaattgaccttccacctgtttattgctgcatttgtgggggctgcagccacactggtttccctgctcaccttcatgattgctgccacttacaactttgccgtccttaaactcatgggccgaggcaccaagttc
【０４４４】
配列番号4
ヒトTRplp
ttgagtgagttagagtagtgagctagttgtctggtaggggccccctttgcttccctggtggccactggattgtgtttctttggggtggcactgttctgtggctgtggacatgaagccctcactggcacagaaaagctaattgagacctatttctccaaaaactaccaagactatgagtatctcatcaatgtgattcatgctttccagtatgtcatctatggaactgcctctttcttcttcctttatggggccctcctgctggctgagggcttctacaccaccggcgcagtcaggcagatctttggcgactacaagaccaccatctgcggcaagggcctgagcgcaacggtaacagggggccagaaggggaggggttccagaggccaacatcaagctcattctttggagcgggtgtgtcattgtttgggaaaatggctaggacatcccgacaagtttgtgggcatcacctatgccctgaccgttgtgtggctcctggtgtttgcctgctctgctgtgcccgtgtacatttacttcaacacctggaccacctgcgactctattgccttccccagcaagacctctgccagtataggcagtctctgtgctgacgccagattgtatggtgttctcccatggaatgctttccctggcaaggtttgtggctccaaccttctgtccatctgcaaaacagctgagttccaattgaccttccacctgtttattgctgcatttgtgggggctgcagccacactggtttccctgctcaccttcatgattgctgccacttacaactttgccgtccttaaactcatgggccgaggcaccaagttc
【０４４５】
配列番号5
ハツカネズミ
atgggcttgttagagtgttgtgctagatgtctggtaggggccccctttgcttccctggtggccactggattgtgtttctttggagtggcactgttctgtggatgtggacatgaagctctcactggtacagaaaagctaattgagacctatttctccaaaaactaccaggactatgagtatctcattaatgtgattcatgctttccagtatgtcatctatggaactgcctctttcttcttcctttatggggccctcctgctggctgagggcttctacaccaccggcgctgtcaggcagatctttggcgactacaagaccaccatctgcggcaagggcctgagcgcaacggtaacagggggccagaaggggaggggttccagaggccaacatcaagctcattctttggagcgggtgtgtcattgtttgggaaaatggctaggacatcccgacaagtttgtgggcatcacctatgccctgactgttgtatggctcctggtgtttgcctgctcggctgtacctgtgtacatttacttcaatacctggaccacctgtcagtctattgccttccctagcaagacctctgccagtataggcagtctctgcgctgatgccagaatgtatggtgttctcccatggaatgctttccctggcaaggtttgtggctccaaccttctgtccatctgcaaaacagctgagttccaaatgaccttccacctgtttattgctgcgtttgtgggtgctgcggccacactagtttccctgctcaccttcatgattgctgccacttacaacttcgccgtccttaaactcatgggccgaggcaccaagttctga
【０４４６】
配列番号6
ハツカネズミ
atgggcttgttagagtgttgtgctagatgtctggtaggggccccctttgcttccctggtggccactggattgtgtttctttggagtggcactgttctgtggatgtggacatgaagctctcactggtacagaaaagctaattgagacctatttctccaaaaactaccaggactatgagtatctcattaatgtgattcatgctttccagtatgtcatctatggaactgcctctttcttcttcctttatggggccctcctgctggctgagggcttctacaccaccggcgctgtcaggcagatctttggcgactacaagaccaccatctgcggcaagggcctgagcgcaacgtttgtgggcatcacctatgccctgactgttgtatggctcctggtgtttgcctgctcggctgtacctgtgtacatttacttcaatacctggaccacctgtcagtctattgccttccctagcaagacctctgccagtataggcagtctctgcgctgatgccagaatgtatggtgttctcccatggaatgctttccctggcaaggtttgtggctccaaccttctgtccatctgcaaaacagctgagttccaaatgaccttccacctgtttattgctgcgtttgtgggtgctgcggccacactagtttccctgctcaccttcatgattgctgccacttacaacttcgccgtccttaaactcatgggccgaggcaccaagttctga
【０４４７】
配列番号7
ホモ・サピエンス
atgggcttgttagagtgctgtgcaagatgtctggtaggggccccctttgcttccctggtggccactggattgtgtttctttggggtggcactgttctgtggctgtggacatgaagccctcactggcacagaaaagctaattgagacctatttctccaaaaactaccaagactatgagtatctcatcaatgtgatccatgccttccagtatgtcatctatggaactgcctctttcttcttcctttatggggccctcctgctggctgagggcttctacaccaccggcgcagtcaggcagatctttggcgactacaagaccaccatctgcggcaagggcctgagcgcaacgtttgtgggcatcacctatgccctgaccgttgtgtggctcctggtgtttgcctgctctgctgtgcccgtgtacatttacttcaacacctggaccacctgcgactctattgccttccccagcaagacctctgccagtataggcagtctctgtgctgacgccagaatgtatggtgttctcccatggaatgctttccctggcaaggtttgtggctccaaccttctgtccatctgcaaaacagctgagttccaaatgaccttccacctgtttattgctgcatttgtgggggctgcagctacactggtttccctgctcaccttcatgattgctgccacttacaactttgccgtccttaaactcatgggccgaggcaccaagttctga
【０４４８】
配列番号8
ホモ・サピエンス
atgggcttgttagagtgctgtgcaagatgtctggtaggggccccctttgcttccctggtggccactggattgtgtttctttggggtggcactgttctgtggctgtggacatgaagccctcactggcacagaaaagctaattgagacctatttctccaaaaactaccaagactatgagtatctcatcaatgtgatccatgccttccagtatgtcatctatggaactgcctctttcttcttcctttatggggccctcctgctggctgagggcttctacaccaccggcgcagtcaggcagatctttggcgactacaagaccaccatctgcggcaagggcctgagcgcaacggtaacagggggccagaaggggaggggttccagaggccaacatcaagctcattctttggagcgggtgtgtcattgtttgggaaaatggctaggacatcccgacaagtttgtgggcatcacctatgccctgaccgttgtgtggctcctggtgtttgcctgctctgctgtgcccgtgtacatttacttcaacacctggaccacctgcgactctattgccttccccagcaagacctctgccagtataggcagtctctgtgctgacgccagaatgtatggtgttctcccatggaatgctttccctggcaaggtttgtggctccaaccttctgtccatctgcaaaacagctgagttccaaatgaccttccacctgtttattgctgcatttgtgggggctgcagctacactggtttccctgctcaccttcatgattgctgccacttacaactttgccgtccttaaactcatgggccgaggcaccaagttctgatacactggtttccctg
【０４４９】
配列番号9
哺乳動物PLPコンセンサス配列
atgggcytgttagagtgytgygcnagatgyctsgtaggggccccctttgcttccytggtggccactggattntgtttctttggngtggcactsttctgtggmtgtggacatgaagchytmactggyacagaaaagytaattgagacmtatttctccaaaaaytaccaagactaygagtatctcatyaatgtgatycatgcyttccagtatgtcatctatggaactgcctctttcttcttcctttatggggccctcctgctggcygagggcttctacaccaccggygcwgtcaggcagatctttggcgactacaagaccaccatctgcggsaagggcctgagygcaacggtaacagggggccagaaggggaggggttccagaggccaacatcaagctcattctttggagcgggtgtgtcattgtttgggaaaatggctaggacatcccgacaagtttgtgggcatcacctatgccytgacygttgtntggctcctngtgtttgcctgctckgctgtncctgtgtacatttayttcaayacctggaccacytgycagtctattgcckycccyagcaagacytctgccagyataggcastctctgygctgatgccagaatgtatggtgttctcccatggaatgctttyccwggcaangtktgtggctccaaccttctgtccatctgcaaaacagctgagttccaaatgacsttccayctgtttattgctgcvttygtgggkgctgcngcyacactngtktccctgctcaccttcatgattgctgccacttacaacttygccgtcctkaaactcatgggccgaggcaccaagttctga
【０４５０】
エクソン5を含むPLP一般コンセンサス配列、配列番号17
btgagtgagttagagtagtgagcnagttgyctsgtaggggccccctttgcttccytggtggccactggattntgtttctttggngtggcactsttctgtggmtgtggacatgaagchytmactggyacagaaaagytaattgagacmtatttctccaaaaaytaccaagactaygagtatctcatyaatgtgatycatgcyttccagtatgtcatctatggaactgcctctttcttcttcctttatggggccctcctgctggcygagggcttctacaccaccggygcwgtcaggcagatctttggcgactacaagaccaccatctgcggsaagggcctgagygcaacggtaacagggggccagaaggggaggggttccagaggccaacatcaagctcattctttggagcgggtgtgtcattgtttgggaaaatggctaggacatcccgacaagtttgtgggcatcacctatgccytgacygttgtntggctcctngtgtttgcctgctckgctgtncctgtgtacatttayttcaayacctggaccacytgycagtctattgcckycccyagcaagacytctgccagyataggcastctctgygctgatgccagabtgtatggtgttctcccatggaatgctttyccwggcaangtktgtggctccaaccttctgtccatctgcaaaacagctgagttccaabtgacsttccayctgtttattgctgcvttygtgggkgctgcngcyacactngtktccctgctcaccttcatgattgctgccacttacaacttygccgtcctkaaactcatgggccgaggcaccaagttc
【０４５１】
エクソン5を含むDM20一般コンセンサス配列、配列番号18
btgagtgagttagagtagtgagcnagttgyctsgtaggggccccctttgcttccytggtggccactggattntgtttctttggngtggcactsttctgtggmtgtggacatgaagchytmactggyacagaaaagytaattgagacmtatttctccaaaaaytaccaagactaygagtatctcatyaatgtgatycatgcyttccagtatgtcatctatggaactgcctctttcttcttcctttatggggccctcctgctggcygagggcttctacaccaccggygcwgtcaggcagatctttggcgactacaagaccaccatctgcggsaagggcctgagygcaacgtttgtgggcatcacctatgccytgacygttgtntggctcctngtgtttgcctgctckgctgtncctgtgtacatttayttcaayacctggaccacytgycagtctattgcckycccyagcaagacytctgccagyataggcastctctgygctgatgccagabtgtatggtgttctcccatggaatgctttyccwggcaangtktgtggctccaaccttctgtccatctgcaaaacagctgagttccaabtgacsttccayctgtttattgctgcvttygtgggkgctgcngcyacactngtktccctgctcaccttcatgattgctgccacttacaacttygccgtcctkaaactcatgggccgaggcaccaagttc
【０４５２】
エクソン5が欠失したPLP一般コンセンサス配列、配列番号19
btgagtgagttagagtagtgagcnagttgyctsgtaggggccccctttgcttccytggtggccactggattntgtttctttggngtggcactsttctgtggmtgtggacatgaagchytmactggyacagaaaagytaattgagacmtatttctccaaaaaytaccaagactaygagtatctcatyaatgtgatycatgcyttccagtatgtcatctatggaactgcctctttcttcttcctttatggggccctcctgctggcygagggcttctacaccaccggygcwgtcaggcagatctttggcgactacaagaccaccatctgcggsaagggcctgagygcaacggtaacagggggccagaaggggaggggttccagaggccaacatcaagctcattctttggagcgggtgtgtcattgtttgggaaaatggctaggacatcccgacaagtttgtgggcatcacctatgccytgacygttgtntggctcctngtgtttgcctgctckgctgtncctgtgtacatttayttcaayacctggaccacytgycagtctattgcckycccyagcaagacytctgccagyataggcastctctgygctgatgccagabtgtatgttccaabtgacsttccayctgtttattgctgcvttygtgggkgctgcngcyacactngtktccctgctcaccttcatgattgctgccacttacaacttygccgtcctkaaactcatgggccgaggcaccaagttc
【０４５３】
エクソン5が欠失したDM20一般コンセンサス配列、配列番号20
btgagtgagttagagtagtgagcnagttgyctsgtaggggccccctttgcttccytggtggccactggattntgtttctttggngtggcactsttctgtggmtgtggacatgaagchytmactggyacagaaaagytaattgagacmtatttctccaaaaaytaccaagactaygagtatctcatyaatgtgatycatgcyttccagtatgtcatctatggaactgcctctttcttcttcctttatggggccctcctgctggcygagggcttctacaccaccggygcwgtcaggcagatctttggcgactacaagaccaccatctgcggsaagggcctgagygcaacgtttgtgggcatcacctatgccytgacygttgtntggctcctngtgtttgcctgctckgctgtncctgtgtacatttayttcaayacctggaccacytgycagtctattgcckycccyagcaagacytctgccagyataggcastctctgygctgatgccagabtgtatgttccaabtgacsttccayctgtttattgctgcvttygtgggkgctgcngcyacactngtktccctgctcaccttcatgattgctgccacttacaacttygccgtcctkaaactcatgggccgaggcaccaagttc
【０４５４】
本明細書にて言及した任意の特許又は公表文献は、各公表文献について明確且つ個別に出典を明記することにより本願明細書の一部とすることを示したものとして、出典を明記することにより本願明細書の一部とする。
【０４５５】
本明細書に記載の組成物及び方法は、好適な実施形態を例示的に現時点で表すものであり、本発明の範囲を限定するものではない。その変更及び他の用途は、当業者には想到されるであろう。こうした変更及び他の用途は、特許請求の範囲に記載の本発明の範囲を逸脱することなく実施することができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０４５６】
【非特許文献１】Mount, Nucl.Acids.Res. 10:459-472, 1992
【符号の説明】
【０４５７】
[図1A]
TR Transcript: TR転写物
Stop: 停止
Stop-Start: 停止-開始
PIRP-Start: PIRP-開始
Start-Stop: 開始-停止
PIRP Start-Stop: PIRP開始-停止
TR Start: TR開始
Reporter: レポーター
Mutation plpORF: 変異plpORF
Exon3A: エクソン3A
Exon 5: エクソン5
Unregulated IRES: 非調節IRES
Ribosome Scanning: リボソームスキャニング
Nonessential Sequence: 非必須配列
TR Regulator: TRレギュレーター
18S Helix26 Translation IRES Sequence: 18Sヘリックス26翻訳IRES配列
Met257 Mutation uORF9: Met257変異uORF9
18S Helix26 Translation Reinitiation Sequence: 18Sヘリックス26翻訳再開配列
Conservative Codon Mutations Altered RNA Structure: 保存的コドン変異変化RNA構造
[図1B]
Time (h): 時間(h)
Control: 対照
[図2A、2B]
Time (h): 時間(h)
min: 分
hr: 時間
[図3A、3B]
Drug Response: 薬物応答
[図4、5A、5B、6A、6B]
Dose: 用量
[図6C]
Stress No Deach: ストレス有り、死滅無し
Stress: ストレス有り
Max Tolerated Dose: 最大耐量
Clinical Doses: 臨床用量
Slow Death: 緩やかな死滅
DNA Damage: DNA損傷
ROS Damage: ROS損傷
LD50 Mouse: LD50マウス
Stop Cell Cycle G2/M: 細胞周期G2/M停止
Dose: 用量
[図7A]
Median: 中央値
Colony#: コロニー数
[図8A、8C]
Pre-treatment: 処置前
[図8B、8D]
6 Hr Post-treatment: 処置後6時間
Paclitaxel: パクリタキセル
[図9A、9B、11A、11B、11C、13、14A、14B、15]
Tumor Wgt: 腫瘍重量
Time (days): 時間(日)
Animal#: 動物数
Arm: アーム
[図10B]
Dose: 用量
Puromycin: ピューロマイシン
Emetine: エメチン
Cycloheximide: シクロヘキシミド
Anisomycin: アニソマイシン
[図12A、12B]
％Starting Wgt: 開始重量％
Time (days): 時間(日)
[図17A、17C、17E、17G]
DAPI Nuclei: DAPI核
[図17J]
％Background: バックグラウンド％
pixel#: ピクセル数
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2017538698.tif 000018
【図２Ａ】
2017538698.tif 000019
【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
2017538698.tif 000021
【図３Ｂ】
2017538698.tif 000022
【図４】
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【図５Ａ】
2017538698.tif 000024
【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
2017538698.tif 000026
【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
2017538698.tif 000029
【図７ＢＣ】
2017538698.tif 000030
【図８ＡＢＣＤ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
2017538698.tif 000033
【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７ＡＢ】
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【図１７ＣＤ】
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【図１７ＥＦ】
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【図１７ＧＨ】
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【図１７ＩＪ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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