(57)【要約】  特定の態様において、従来技術の方法と比較して、細胞に対する代謝負荷を低減し得、GOI産生とマーカー産生の分離を低減し得る、目的の遺伝子(GOI)を産生するための方法および組成物が本明細書に記載される。該方法は、高GOI-産生細胞株、例えばCHO株を確立するための正の選択および負の選択のアプローチに関する。特定の態様において、該方法は、細胞を、(a)GOIおよびノンコーディングRNAを含むオリゴヌクレオチド、ならびに(b)選択タンパク質をコードするオリゴヌクレオチドによりトランスフェクションする工程を含み、該ノンコーディングRNAは、選択タンパク質の産生を促進または阻害する。該GOIを産生する細胞は、選択タンパク質の非存在もしくは存在の結果として、または選択タンパク質の非存在もしくは存在を検出することにより同定および/または選択され得る。
2017532065.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的の遺伝子(GOI)を産生する細胞を同定するための方法であって、該方法は、
(1)細胞を
(a)GOIおよび1つ以上のノンコーディングRNAを含むオリゴヌクレオチド、ならびに
(b)選択タンパク質をコードするオリゴヌクレオチド
によりトランスフェクションする工程、ここで該1つ以上のノンコーディングRNAは、選択タンパク質の産生を促進または阻害する；ならびに
(2)選択タンパク質の非存在もしくは存在の結果として、または選択タンパク質の非存在もしくは存在を検出することにより、GOIを産生する細胞を同定または選択する工程
を含む、方法。
【請求項２】
該1つ以上のノンコーディングRNAが、細胞生存および/または細胞当たりの産生されるGOIの量を促進する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該1つ以上のノンコーディングRNAが、ebv-miR-BART10-3pまたはmirR-7である。請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
選択タンパク質をコードする該オリゴヌクレオチドが、1つ以上のノンコーディングRNAにより安定化され、それにより選択タンパク質の翻訳を促進し得るsxRNAをさらに含む、請求項１〜３いずれか記載の方法。
【請求項５】
該方法が、該細胞を、第2の選択タンパク質によりトランスフェクションする工程をさらに含み、該第2の選択タンパク質が死遺伝子であり、該1つ以上のノンコーディングRNAが、死遺伝子の産生を阻害する、請求項４記載の方法。
【請求項６】
該1つ以上のノンコーディングRNAが、選択タンパク質をコードするオリゴヌクレオチドに結合して阻害し得るmiRNAまたはsiRNAである、請求項１〜５いずれか記載の方法。
【請求項７】
該細胞が、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞またはヒト胚性腎臓(HEK)細胞である、請求項１〜６いずれか記載の方法。
【請求項８】
該選択タンパク質が、抗生物質耐性遺伝子、蛍光マーカー、細胞表面マーカーまたは細胞死遺伝子である、請求項１〜７いずれか記載の方法。
【請求項９】
該1つ以上のノンコーディングRNAがGOIのイントロン中にコードされる、請求項１〜８いずれか記載の方法。
【請求項１０】
該方法が、該細胞を、第2のGOIおよび第2のノンコーディングRNAによりトランスフェクションする工程をさらに含み、該第2のGOIおよび第2のノンコーディングRNAが、同じオリゴヌクレオチド上に位置する、請求項１〜９いずれか記載の方法。
【請求項１１】
該第2のノンコーディングRNAが、第2のGOIのイントロン中にコードされる、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
該第1および第2のノンコーディングRNAが同じものである、請求項１０または１１記載の方法。
【請求項１３】
(1)該第1および第2のノンコーディングRNAが異なるものであり、
(2)該選択タンパク質をコードするオリゴヌクレオチドがさらに、第2の選択タンパク質をコードするか、または
該方法が、該細胞を、第2の選択タンパク質をコードする第2のオリゴヌクレオチドによりトランスフェクションする工程を含み、ここで
(2)該第2のノンコーディングRNAが、第2の選択タンパク質の翻訳を促進または阻害する、
請求項１０または１１記載の方法。
【請求項１４】
目的の遺伝子(GOI)を産生する細胞の生存を促進するための方法であって、該方法が、
細胞を、(a)GOIおよび1つ以上のsiRNAを含むオリゴヌクレオチド、ならびに(b)細胞に対して致死性のタンパク質をコードするオリゴヌクレオチドによりトランスフェクションする工程を含み、ここで該1つ以上のsiRNAが、該致死性のタンパク質の産生を阻害して、それによりGOIを産生する細胞の生存を促進し得る、方法。
【請求項１５】
(a)目的の遺伝子(GOI)および1つ以上のノンコーディングRNAを含むオリゴヌクレオチド、ならびに
(b)選択タンパク質をコードするオリゴヌクレオチド
を含むトランスジェニック細胞であって、
該ノンコーディングRNAが、選択タンパク質の翻訳を促進または阻害する、トランスジェニック細胞。
【請求項１６】
選択タンパク質をコードする該オリゴヌクレオチドがさらに、1つ以上のノンコーディングRNAにより安定化され、それにより選択タンパク質の翻訳を促進または阻害し得るsxRNAを含む、請求項１５記載の細胞。
【請求項１７】
該1つ以上のノンコーディングRNAが、sxRNAを安定化し、それによりsxRNAとRNA結合タンパク質(RBP)の結合を促進し得る、請求項１５または１６記載の細胞。
【請求項１８】
該1つ以上のノンコーディングRNAが、選択タンパク質をコードするオリゴヌクレオチドに結合して阻害し得るsiRNAである、請求項１５〜１７いずれか記載の細胞。
【請求項１９】
該細胞が、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞またはヒト胚性腎臓(HEK)である、請求項１５〜１８いずれか記載の細胞。
【請求項２０】
該1つ以上のノンコーディングRNAが、1つ以上のmiRNAまたは1つ以上のsiRNAである、請求項１５〜１９いずれか記載の細胞。
【請求項２１】
該1つ以上のノンコーディングRNAが、細胞生存および/または細胞当たりの産生されるGOIの量を促進する、請求項１５〜２０いずれか記載の細胞。
【請求項２２】
該1つ以上のノンコーディングRNAが、ebv-miR-BART10-3pまたはmirR-7である、請求項２１記載の細胞。
【請求項２３】
該選択タンパク質が、抗生物質耐性遺伝子、蛍光マーカー、細胞表面マーカーまたは細胞死遺伝子である、請求項１５〜２２いずれか記載の細胞。
【請求項２４】
該1つ以上のノンコーディングRNAが、GOIのイントロン中にコードされる、請求項１５〜２３いずれか記載の細胞。
【請求項２５】
該細胞が、第2のGOIをさらに含み、該第2のGOIおよび第2のノンコーディングRNAが、同じオリゴヌクレオチド上に位置する、請求項１５〜２３いずれか記載の細胞。
【請求項２６】
該第2のノンコーディングRNAが、第2のGOIのイントロン中にコードされる、請求項２５記載の細胞。
【請求項２７】
該第1および第2のノンコーディングRNAが同じものである、請求項２５記載の細胞。
【請求項２８】
(1)該第1および第2のノンコーディングRNAが異なるものであり、
(2)該選択タンパク質をコードするオリゴヌクレオチドがさらに、第2の選択タンパク質をコードするか、または
該細胞が第2の選択タンパク質をコードする第2のオリゴヌクレオチドを含み、
(2)該第2のノンコーディングRNAが、第2の選択タンパク質の翻訳を促進または阻害する、請求項２５記載の細胞。
【請求項２９】
目的の遺伝子(GOI)を含むオリゴヌクレオチドであって、該GOIが、1つ以上のノンコーディングRNAをコードするイントロンを含み、選択タンパク質をコードするオリゴヌクレオチドと共に細胞中で発現される場合、該1つ以上のノンコーディングRNAが、選択タンパク質の翻訳を促進または阻害し得る、オリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願についての相互参照
本願は、2014年10月3日に出願された米国仮特許出願62/059,573の利益および優先権を主張し、該仮特許出願の全内容は、参照により本明細書により援用される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
数十億ドルの価値のある抗体、ワクチンおよびタンパク質などの生物学的製品が、毎年チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞から作製される。CHO細胞における収量の小さな向上であっても、大きな経済的効果を有し得る。方法の開発は、活性産物、目的の遺伝子(Gene of Interest)(GOI)の最大量を達成することに焦点があてられている。GOIのより高い組み換えタンパク質収量を達成するための製造の最適化は、2つの主要な方法で達成され得る。第1のアプローチは、プロセスの細胞密度(すなわち体積当たりの細胞)を増大することである。これは、方法の開発(例えばバッチ、フェッドバッチ(fed-batch)、かん流など)および増殖培地の改善により達成され得る。1日当たりの体積当たりの細胞を増大することにより、より高いレベルの生成物が産生される。過去20年間の抗体についての生成物の力価の約0.1〜0.3g/1から今日の2〜10g/1までの増加は、ほとんどがプロセスおよび培地の改善により達成されたが、一方で一細胞の比生産性(specific productivity)は、同程度までは増大しなかった。細胞密度のさらなる増加は、固有のサイズ制限により制限されるので、将来の生産性の向上は、非常に高く効率的な生産性q(すなわち細胞当たりの産生されるGOIの量)を有する細胞の選択における向上に由来を達成する必要がある。
【０００３】
この第2のアプローチは、細胞株の開発により比生産性を増大するように努力している。細胞株の開発は、より高産生のクローンを選択するための細胞株のサブクローニング、および遺伝子増幅の使用の両方を含み得る。薬物耐性は、GOIと選択可能な遺伝子を組み合わせて遺伝子増幅を誘導して、産生レベルの増大を達成するための生物薬剤産業における選択ツールとなっている。CHO細胞において一般的に使用される2つの遺伝子増幅系は、メトトレキサート(MTX)耐性を使用するジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)系およびメチオニンスルホキサミン(MSX)耐性を使用するグルタミンシンテターゼ(GS)系である。遺伝子増幅は、細胞を、GOIと例えばDHFRについての遺伝子からなる組み換えDNAにより形質転換し、次いで該細胞を徐々に高くなるレベルのMTXで培養することにより達成される。DHFR酵素は、葉酸塩のテトラヒドロ葉酸塩への変換を触媒し、MTXは、細胞からヌクレオシド前駆体(ヒポキサンチンおよびチミジン)を奪う(deprive)テトラヒドロ葉酸塩の産生を阻害し、最終的に細胞を殺傷する。したがって、DHFR遺伝子のコピーが増加して、そのためにテトラヒドロ葉酸塩のレベルがより高いCHO細胞が選択される。細胞当たりの生産性のアプローチを使用して、科学者は、最初の非常に低いレベルから1000倍よりも高く発現レベルを増大させている。
【０００４】
図1に例示される細胞株開発プロセス自体には、(1)関連する非常に長い時間(現在では設定プラットフォーム技術を有する大きな会社での細胞株の開発は4〜9ヶ月である)、および(2)一般的に約5000クローンの開始試験を含む作業量が負担となる。ほとんどのcGMP方法は、トランスフェクション後のプールにおける作業から始まる。抗生物質の添加後の回収には2週間の遅延があり、その後プールの増幅工程が続く(同時にMTXまたはMSXの濃度の増加を伴う)。回収にはさらに2〜3週間が必要であり、良好なプールのサブクローニング(2週間)および2000〜5000の候補の開始試験が続く。これらの候補から、約300株を選択し、2週間後の次の試験ラウンドのために小さな振盪管(5〜10ml)に配置する。典型的に、次の段階のために60以上の候補を選択し、2週間のプロセスにわたり、別個の125ml振盪フラスコからそれぞれを個々に増殖して、分析しなければならない。次いでこれら60個を産生の品質特性について評価して、2〜6リットル容器中での安定性試験および小バイオプロセス試験のために10個を選択する。増殖およびバイオプロセスの試行には4週間が必要であり、安定性試験は容器を徐々に大きくして4ヶ月継続することがある。生産性のみにより最初に選択を実施して、その後より大きなスケールでより重要な産生の品質を評価する。
【０００５】
CHO方法の開発は、目的の遺伝子(GOI)と称される活性産物の可能な限り最良の質を保証しながら、該産物の量の最大化に焦点が当てられている。選択可能な代用としての薬剤耐性遺伝子の使用は、成功裡に形質転換されたCHO細胞の選択のための現在の標準であり、次いで該細胞をサブクローニングして、GOIの産生についてスクリーニングする。この基本的なアプローチは、20年にわたり実質的に変化していないが、2つの大きな欠点を有する。第1に、現在の方法は、制限された細胞供給源についてGOIと競合し得るさらなる抗生物質耐性遺伝子の産生を必要とし、細胞に更なる代謝的消耗が課される。第2に、同一ベクター中に頻度高く導入されるが、抗生物質耐性遺伝子または選択遺伝子の発現は、GOIの代用であり、直接は連結されておらず、最終的なGOI産生速度の誤解を生じる予測を生じ得、非生産的な細胞のコストのかかる維持をもたらし得る。実際に、現在の正の区分(positive section)技術は、選択可能マーカーの産生がGOIの産生に直接結び付かないために、50%〜90%効率がよいだけである(Fan, L., et al. (2012) BIOTECHNOL BIOENG 109(4): 1007-15およびKim, Y.G., et al. (2012) BMC Biotechnol 12:24参照)。増幅プロセスの際に、例えば、DNA複製エラーにより遺伝子コピー数が増加する場合、選択圧は、選択的マーカー遺伝子の増幅に対してであり、GOIは選択マーカーに近いために、従属的に増幅されるだけである。したがって、GOIを有さずに選択マーカー遺伝子を増幅する細胞は、一つの外来遺伝子のみを産生するために、実際には該細胞が選択的な利点を有する。
【０００６】
現在の転写系のアプローチ、すなわち異なる遺伝子を発現するかまたは代替的なDNAベクターを使用するアプローチは、これらの問題を改良することができない。したがって、CHOおよび他の細胞からのGOIの収量を向上するための改善が必要である。特に、(1)代謝負荷を低減する、および/または選択をGOIの転写、およびそのためにGOIの産生に直接結び付ける方法が、GOIの収量を向上させるために必要である。
【発明の概要】
【０００７】
発明の概要
特定の態様において、従来技術の方法と比較して、細胞に対する代謝負荷を低減し得、GOI産生とマーカー産生の分離(discoupling)を低減し得る目的の遺伝子(GOI)を産生するための方法および組成物が本明細書に記載される。該方法は、高GOI-産生細胞株、例えばCHO株を確立するための正の選択アプローチおよび負の選択アプローチに関する。特定の態様において、該方法は、細胞を、(a)GOIおよびノンコーディングRNAを含むオリゴヌクレオチド、ならびに(b)選択タンパク質をコードするオリゴヌクレオチドによりトランスフェクションする工程を含み、ここで該ノンコーディングRNAは、選択タンパク質(selection protein)の産生を促進または阻害する。該GOIを産生する細胞は、選択タンパク質の非存在もしくは存在の結果として、または選択タンパク質の非存在もしくは存在を検出することにより同定および/または選択され得る。
【０００８】
選択プロセスに使用されるGOI-発現細胞についてのマーカーは、ノンコーディングRNAであり、例えば翻訳についてGOIと競合する抗生物質耐性を有するタンパク質ではないので、細胞に対する代謝負荷は低減される。正の選択アプローチにおいても、選択プロセスは、細胞により長期間保持されない、人工的に転写されたmRNA分子またはDNA分子を使用して実施され得る。これは、GOIを回収する産生段階の間に、細胞が、GOIおよびマーカータンパク質よりもむしろ、GOI自体(または例えば抗体の場合には2つのGOI)のみを産生しなければならないことを意味する。
【０００９】
本明細書に記載される特定の態様のさらなる利点は、従来技術の方法と比較した、GOI産生とマーカー産生の分離の低減である。ノンコーディングRNAとGOI(例えばイントロンまたは非翻訳領域(UTR)中)を緊密に結合させることにより、従来技術の方法と比較して、ノンコーディングRNA、およびそのための選択タンパク質が、GOIの発現の非存在下で発現される可能性が低くなる。したがって、選択される細胞のほとんどがGOIを産生し、GOIの発現の効率の増大がもたらされる。
【００１０】
本明細書に記載される方法により、GOI-産生細胞の負の選択が可能になる。一例において、選択タンパク質は、細胞に対して致死性の遺伝子であり、ノンコーディングRNAは、致死性の遺伝子の産生を防ぐ。GOIおよびノンコーディングRNAの産生は結びついているので、ノンコーディングRNA(およびそれによりGOI)が産生される場合にのみ、細胞は生存する。負の選択法の特定の態様において、ノンコーディングRNAはsiRNAであり、このsiRNAは細胞に導入された人工的に転写されたmRNA上にコードされるプロアポトーシス遺伝子の発現をオフにするという細胞の本来のsiRNA経路を利用する。GOIが産生される場合に、siRNAは、プロアポトーシスタンパク質の産生を阻害し、細胞を生存させる。
【００１１】
負の選択アプローチの代替法として、または負の選択アプローチに加えて、正の選択アプローチを使用し得る。正の選択アプローチにおいて、miRNAなどのノンコーディングRNAは、sxRNAを安定化して、選択タンパク質、例えば抗生物質耐性遺伝子または蛍光マーカーを含むオリゴヌクレオチドの発現をオンにする。次いで、例えば抗生物質の添加により、または蛍光細胞分析分離装置(FACS)により、マーカーを発現する細胞を選択し得る。
【００１２】
一局面において、目的の遺伝子(GOI)を産生する細胞を同定するための方法が本明細書に記載され、該方法は、細胞を、(a)GOIおよび1つ以上のノンコーディングRNAを含むオリゴヌクレオチド、ならびに(b)選択タンパク質をコードするオリゴヌクレオチドによりトランスフェクションする工程を含み、該1つ以上のノンコーディングRNAは、選択タンパク質の産生を促進または阻害する。該方法はさらに、選択タンパク質の非存在または存在を検出することによりGOIを産生する細胞を同定する工程を含む。
【００１３】
特定の態様において、該1つ以上のノンコーディングRNAは1つのノンコーディングRNAである。他の態様において、該1つ以上のノンコーディングRNAは複数のノンコーディングRNAである。該複数のノンコーディングRNAは同じノンコーディングRNAの複数のコピーであり得るか、または該ノンコーディングRNAは異なり得る。
【００１４】
特定の態様において、該1つ以上のノンコーディングRNAは、細胞生存および/または細胞当たりの産生されるGOIの量を促進する。特定の態様において、該ノンコーディングRNAはebv-miR-BART 10-3pまたはmirR-7である。
【００１５】
特定の態様において、選択タンパク質をコードする該オリゴヌクレオチドはさらに、1つ以上のノンコーディングRNAにより安定化され、それにより選択タンパク質の翻訳を促進し得るsxRNAを含む。
【００１６】
特定の態様において、該方法はさらに、該細胞を、第2の選択タンパク質によりトランスフェクションする工程を含み、該第2の選択タンパク質は死遺伝子であり、該1つ以上のノンコーディングRNAは死遺伝子の産生を阻害する。
【００１７】
特定の態様において、該ノンコーディングRNAはmiRNAまたはsiRNAである。特定の態様において、該1つ以上のノンコーディングRNAは、選択タンパク質をコードするオリゴヌクレオチドに結合して阻害し得る1つ以上のmiRNAまたは1つ以上のsiRNAである。
【００１８】
特定の態様において、該細胞はチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞またはヒト胚性腎臓(HEK)細胞である。
【００１９】
特定の態様において、該選択タンパク質は、抗生物質耐性遺伝子、蛍光マーカー、細胞表面マーカーまたは細胞死遺伝子である。
【００２０】
特定の態様において、該1つ以上のノンコーディングRNAはイントロン中にコードされる。特定の態様において、該1つ以上のノンコーディングRNAはイントロンである。特定の態様において、該1つ以上のノンコーディングRNAはUTR中にある。
【００２１】
特定の態様において、該方法はさらに、該細胞を、第2のGOIおよび第2のノンコーディングRNAによりトランスフェクションする工程を含む。特定の態様において、該第1および第2のノンコーディングRNAは同じものである。
【００２２】
特定の態様において、該第1および第2のノンコーディングRNAは異なる。該選択タンパク質をコードするオリゴヌクレオチドはさらに、第2の選択タンパク質をコードするか、または該方法は、該細胞を、第2の選択タンパク質をコードする第2のオリゴヌクレオチドによりトランスフェクションする工程を含み得る。この態様において、該第2のノンコーディングRNAは第2の選択タンパク質の翻訳を促進または阻害する。
【００２３】
特定の態様において、該第2のノンコーディングRNAはイントロン中にコードされる。特定の態様において、該第2のノンコーディングRNAはイントロンである。特定の態様において、該1つ以上のノンコーディングRNAはUTR中にある。
【００２４】
別の局面において、該方法は、目的の遺伝子(GOI)を産生する細胞の生存の促進に関する。該方法は、細胞を、(a)GOIおよび1つ以上のsiRNAを含むオリゴヌクレオチド、ならびに(b)細胞に対して致死性であるタンパク質をコードするオリゴヌクレオチドによりトランスフェクションする工程を含み、該1つ以上のsiRNAは、目的の遺伝子と共に転写される場合、致死性のタンパク質の産生を阻害して、それによりGOIを産生する細胞の生存を促進し得る。
【００２５】
特定の態様において、該1つ以上のsiRNAは1つのsiRNAである。他の態様において、該1つ以上のsiRNAは複数のsiRNAである。該複数のsiRNAは、同じsiRNAの複数のコピーまたは異なるsiRNAの複数のコピーであり得る。
【００２６】
特定の態様において、該1つ以上のsiRNAは、細胞生存および/または細胞当たりの産生されるGOIの量を促進する。特定の態様において、該1つ以上のsiRNAはebv-miR-BART10-3pまたはmirR-7である。特定の態様において、該細胞はチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞またはヒト胚性腎臓(HEK)細胞である。特定の態様において、該1つ以上のsiRNAはイントロン中にコードされる。特定の態様において、該1つ以上のsiRNAはイントロンである。
【００２７】
さらに別の局面において、(a)目的の遺伝子(GOI)および1つ以上のノンコーディングRNAを含むオリゴヌクレオチド、ならびに(b)選択タンパク質をコードするオリゴヌクレオチドを含むトランスジェニック細胞が本明細書に開示され、該1つ以上のノンコーディングRNAは、選択タンパク質の翻訳を促進または阻害する。
【００２８】
特定の態様において、選択タンパク質をコードする該オリゴヌクレオチドはさらに、1つ以上のノンコーディングRNAにより安定化されて、それにより選択タンパク質の翻訳を促進または阻害し得るsxRNAを含む。
【００２９】
特定の態様において、該ノンコーディングRNAは、sxRNAを安定化して、それによりsxRNAとRNA-結合タンパク質(RBP)の結合を促進し得る。特定の態様において、該1つ以上のノンコーディングRNAは、選択タンパク質をコードするオリゴヌクレオチドに結合して阻害し得るsiRNAである。
【００３０】
特定の態様において、該細胞はチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞またはヒト胚性腎臓(HEK)細胞である。
【００３１】
特定の態様において、該1つ以上のノンコーディングRNAは1つ以上のmiRNAまたは1つ以上のsiRNAである。
【００３２】
特定の態様において、該1つ以上のノンコーディングRNAは細胞生存および/または細胞当たりの産生されるGOIの量を促進する。特定の態様において、該1つ以上のノンコーディングRNAはebv-miR-BART 10-3pまたはmirR-7である。
【００３３】
特定の態様において、該選択タンパク質は、抗生物質耐性遺伝子、蛍光マーカー、細胞表面マーカーまたは細胞死遺伝子である。
【００３４】
特定の態様において、該1つ以上のノンコーディングRNAはイントロン中にコードされる。特定の態様において、該1つ以上のノンコーディングRNAはイントロンである。特定の態様において、該1つ以上のノンコーディングRNAはUTR中にある。
【００３５】
特定の態様において、該細胞はさらに、第2のGOIおよび第2のノンコーディングRNAを含む。特定の態様において、該第2のノンコーディングRNAはイントロン中にコードされる。特定の態様において、該第2のノンコーディングRNAはイントロンである。該第2のノンコーディングRNAは1つ以上の第2のノンコーディングRNAであり得る。
【００３６】
特定の態様において、該第1および第2のノンコーディングRNAは同じものである。
【００３７】
特定の態様において、該第1および第2のノンコーディングRNAは異なり、該選択タンパク質をコードするオリゴヌクレオチドはさらに、第2の選択タンパク質をコードするか、または該細胞は、第2の選択タンパク質をコードする第2のオリゴヌクレオチドを含み、該第2のノンコーディングRNAは、第2の選択タンパク質の翻訳を促進または阻害する。
【００３８】
別の局面において、目的の遺伝子(GOI)およびノンコーディングRNAを含むオリゴヌクレオチドが本明細書に開示され、選択タンパク質をコードするオリゴヌクレオチドと共に細胞中で発現する場合、該ノンコーディングRNAは選択タンパク質の翻訳を促進または阻害し得る。
【００３９】
特定の態様において、該細胞はチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞またはヒト胚性腎臓(HEK)細胞である。
【００４０】
特定の態様において、該ノンコーディングRNAはmiRNAまたはsiRNAである。
【００４１】
特定の態様において、該ノンコーディングRNAは、細胞生存および/または細胞当たりの産生されるGOIの量を促進する。特定の態様において、該ノンコーディングRNAはebv-miR-BART10-3pまたはmirR-7である。
【００４２】
特定の態様において、該選択タンパク質は、抗生物質耐性遺伝子、蛍光マーカー、細胞表面マーカーまたは細胞死遺伝子である。
【００４３】
特定の態様において、該ノンコーディングRNAはイントロン中にコードされる。特定の態様において、該ノンコーディングRNAはイントロンである。特定の態様において、該1つ以上のノンコーディングRNAはUTR中にある。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図1は、例示的な従来技術のCHO cGMPプロセスを示す。該プロセスは、5000クローンで開始し、16週間かけて10個の高産生クローンまで減少する。該プロセスは、使用される選択プラットフォームに応じてより長くかかり得る。
【図２】図2は、本明細書に記載される負の選択および正の選択の方法の特定の態様の模式図を示す。2Aは、ノンコーディングRNAが、選択タンパク質のコーディング領域の下流のRBP結合部位(ステムループ)を除去して、その発現を防ぐmiRNAである、例示的な負の選択法を示す。2Bは、ノンコーディングRNAが、ステムループを安定化して、RBP結合部位の形成を促進するmiRNAであるという例示的な正の選択法を示す。RBPのステムループへの結合は、上流にコードされる選択タンパク質の発現を促進する。
【図３】図3は、本明細書に記載される負の選択および正の選択の方法の特定の態様の別の模式図を示す。工程1において、GOIを含みノンコーディングRNAをコードするプラスミドを細胞内にトランスフェクションする。工程2において、ノンコーディングRNAが発現されると、選択タンパク質をコードするオリゴヌクレオチドが細胞内にトランスフェクションされる。GOIを発現する細胞において、ノンコーディングRNAは、選択タンパク質の産生を促進するかまたは阻害するかのいずれかである。工程3において、正の選択について、ノンコーディングRNAは、ステムループを安定化して、RBPの結合を介して選択タンパク質遺伝子の産生を促進する。負の選択について、ノンコーディングRNAは、細胞に対して致死性の遺伝子の産生を阻害して、GOIを産生する細胞のみが生存する。
【図４】図4は、蛍光選択タンパク質(レポーター遺伝子)および下流のsxRNAを含む第2のオリゴヌクレオチドの設計を示す。sxRNAのステムループはBART 10 miRNAの結合により安定化されて、蛍光選択タンパク質(レポーター遺伝子)の発現を促進する。
【図５】図5は、図4に示すインビトロT7転写mRNAをヌクレオフェクションされた細胞から測定される発光を示す棒グラフを示す。1つの細胞株にBART10を発現するEBV系統を感染させ(HH514-16細胞)、一方、他の細胞株にBART 10遺伝子を欠くEBVバリアントを感染させた(LCL細胞)。示されるように、BART 10 miRNAは、蛍光の劇的な発現と統計的に有意な発現の変化を促進する。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
詳細な説明
1. 緒言
ノンコーディングRNA(例えばmiRNAまたはsiRNA)による遺伝子発現の制御と、高GOI産生CHO細胞の選択を可能にする選択タンパク質との組合せに関する方法および組成物が本明細書に記載される。本発明者らのアプローチの主な利点は、GOI産生の代用として機能するノンコーディングRNAがGOIと密接に結びついており(例えばGOI中から転写されるイントロンから共発現される)、いわゆるエスケープ変異の出現が最小化されることが確実になることである。次いで、正および/または負の選択は、ノンコーディングRNAおよびGOIを含むオリゴヌクレオチドと、sxRNAスイッチまたはsiRNA領域を含むmRNAをコードする第2のオリゴヌクレオチドを共トランスフェクションすることにより実施され得る。共発現されるmiRNAは、正または負のいずれかのmRNA-sxRNA-siRNA選択アプローチの誘発因子(trigger)として機能する。
【００４６】
sxRNA媒介の場合、正の選択は、抗生物質耐性タンパク質、FACSのための蛍光タンパク質または磁気細胞分離のための細胞表面タンパク質などの選択タンパク質トランスジーンの産生をオンにするノンコーディングRNA(例えばmiRNA)誘発因子に対して感受性の、遺伝子工学的に作り変えられたHSL構造の使用を必要とする。それに対する負の選択は、十分に文書化されたsiRNA応答により典型的に表され、代わりに、GOIを強く産生しない細胞の死をもたらすアポトーシス遺伝子または他の死遺伝子の発現をオフにするsiRNAの能力におけるノンコーディング誘発因子を使用する。時間経過に伴って連続してまたは同時に並行して正および負のsxRNA/siRNA技術を単独でまたは組み合わせて使用して、異なる時間間隔で異なる技術を繰り返して使用することにより、細胞選択は最適化され得る。
【００４７】
この全体的なアプローチに対していくつかの主要な利益がある。第1に、DHFRまたはGSの連続的な発現を本明細書に記載される正および負の選択アプローチに置き換えることで、本発明者らは、さらなるタンパク質の産生の必要性から、細胞に対する代謝的ストレスを有意に低減し、GOIの産生の増加をもたらす。具体的に、負の選択アプローチにおいて、GOIを産生する細胞において選択タンパク質は産生されない。正の選択アプローチにおいてさえ、選択タンパク質は、細胞により長期的に保持されない人工的に転写されたmRNAまたはDNA分子上に導入され得る。そのため、細胞は、短い選択段階の間に選択タンパク質についての代謝供給源のみに労力を費やすことのみを必要とし、産生サイクル中により多くの細胞機構がGOIを発現しないようになる。
【００４８】
第2に、特定の態様において、本発明者らの誘発因子miRNAの産生をGOI mRNAのリアルタイムの産生に直接結び付けることは、さらなる利益を有する。あらゆる選択方法の効率は、マーカーおよびGOIの分離された(dis-jointed)産生により引き起こされるエラー率を低減することにより、増大され得る。さらに、本明細書に記載される方法は、抗生物質の添加および抗生物質の添加後の回復に必要な時間の除外により高産生GOI細胞にかかるストレスを回避するために、有利である。
【００４９】
本明細書に記載される方法を使用して、q(細胞当たりの産生されるGOIの量)を増大し得る単数または複数のノンコーディングRNAの使用により、GOI産生をさらに増大し得る。いくつかの研究により、miRNAをCHO細胞に取り込むことで、産生の増大が引き起こされ得るということが示されている。選ばれたmiRNAは、アポトーシスの低減を含む種々の機能を有し得る。
【００５０】
本明細書に記載される方法および組成物は、バイオ製造(biomanufacturing)に特に有利であるが、タンパク質産生を必要とする任意の目的、例えば基礎研究にも使用され得る。
【００５１】
2. 方法
miRNAの共転写により利用可能になる正および負のこれらの2つの選択技術は、単独または組み合わせて使用されて、遺伝子増幅を最大化し得る。該技術はまた、任意の順序または組み合わせで繰り返し使用され得る。いずれかの戦略を使用するmRNAは、選択の1ラウンドとしてトランスフェクションされ得、または両方の戦略を使用するmRNAの混合物は、選択の単回ラウンドのために同時にトランスフェクションされ得る。特定の態様において、mRNAを培地に含ませる連続トランスフェクション技術が使用される。特定の態様において、該プロセスの開始の時点で負の選択が好ましく、その後の段階で正の選択が好ましい。
【００５２】
a. 正のsxRNA選択
本発明者らの正のsxRNA-mRNA選択アプローチは、ノンコーディングRNAを使用してマーカータンパク質の発現を「オン」にする最適なGOI産生細胞の選択を可能にする。正の選択アプローチにおいて、miRNAなどのノンコーディングRNAは、選択タンパク質、例えば抗生物質耐性遺伝子または蛍光マーカーの下流のsxRNAを安定化する。次いで、例えば抗生物質の添加または蛍光活性化細胞分離装置(FACS)により、マーカーを発現する細胞を選択し得る。
【００５３】
b. 負のsiRNA選択
負の選択のためには、ノンコーディングRNAは、正の選択およびsxRNAの場合のような選択タンパク質の増大よりもむしろ、選択タンパク質の発現を低減するsiRNAであり得る。特定の態様において、ノンコーディングRNA(例えばsiRNA)は、ジフテリア毒素A、ΔNBax、Bid、カスパーゼ9、BadまたはBimなどのプロアポトーシス死遺伝子の発現を抑制する。選択タンパク質をコードするオリゴヌクレオチド(例えばmRNA)は、BART10感受性siRNA分解標的である配列を含むように設計され得る。GOIおよびBART10 siRNAを共発現する細胞において、BART10 siRNAはプロアポトーシスmRNAを分解し、一方、共発現しない細胞は、プロアポトーシス遺伝子を発現して死に、miRNA保有細胞の能動的な選択がもたらされる。
【００５４】
選択タンパク質をコードするmRNAは、同起源の(cognate)siRNA標的部位(すなわち誘発因子miRNAに相補的な配列)をORFの5'または3'のいずれかに挿入することにより、事実上任意のsiRNA-媒介切断に対して感受性になり得る。多数のsiRNA標的部位を追加して効率を増大し得る。
【００５５】
代替的な負の選択方法は、以下により詳細に記載されるように、ステムループ配列を除去するsxRNAの使用を含む。
【００５６】
c. トランスフェクション方法
DNAおよびRNAを含むオリゴヌクレオチドをトランスフェクションする方法は当該技術分野で周知であり、本明細書に記載される方法における使用に適切であり得る。オリゴヌクレオチド例えばGOIおよびノンコーディングRNA(または選択タンパク質、sxRNAを有するかまたは有さない)を含むDNAプラスミドは、当該技術分野において現在知られている任意の数の方法を使用して細胞中にトランスフェクションされ得る。例示的な方法としては、リン酸カルシウム沈殿、塩化カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、ポリエチレンイミン、リポフェクションまたは任意の脂質系小胞技術、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ならびにレンチウイルスおよびレトロウイルス導入が挙げられる。
【００５７】
細胞にRNAをトランスフェクションするための方法は当該技術分野で周知であり、例えば細胞を、RNA、例えば選択タンパク質をコードするmRNA、および任意にsxRNAでトランスフェクションすることを含む、本明細書に記載される方法における使用に適し得る。例示的な方法としては、NEONエレクトロポレーター(Invitrogen)またはNucleofector(登録商標)IIデバイス(Lonza, MD)のいずれかを使用するヌクレオフェクションが挙げられる。DNAとmRNAの両方のトランスフェクションは、高い信頼性(viability)(90%より高い)で95%のトランスフェクション効率を達成するNEONを使用して実施され得る。mRNAを細胞質に到達させる任意の方法を使用したトランスフェクションも可能である。
【００５８】
3. 細胞
本明細書に開示される組成物は、(a)目的の遺伝子(GOI)およびノンコーディングRNAを含むオリゴヌクレオチド、ならびに(b)選択タンパク質をコードするオリゴヌクレオチドを含むトランスジェニック細胞に関し、ここで該ノンコーディングRNAは、選択タンパク質の翻訳を促進または阻害する。特定の態様において、該選択タンパク質は、死遺伝子であり、該ノンコーディングRNAは、死遺伝子の産生を阻害し得るsiRNAである。特定の態様において、死遺伝子の産生の阻害に加えて、該ノンコーディングRNAは独立して、細胞生存および/または細胞当たりの産生されるGOIの量を促進する。特定の態様において、該ノンコーディングRNAはebv-miR-BART10-3p (「BART10」)またはmirR-7である。特定の態様において、該ノンコーディングRNAはイントロン中にある。特定の態様において、該ノンコーディングRNAはUTRである。
【００５９】
特定の態様において、選択タンパク質をコードする該オリゴヌクレオチドはさらに、ノンコーディングRNA(例えばmiRNA)により安定化されて、それにより選択タンパク質の翻訳を促進または阻害し得るsxRNAを含む。該ノンコーディングRNAは、sxRNAを安定化して、それによりsxRNAとRBPの結合を促進し得る。特定の態様において、該ノンコーディングRNAは、選択タンパク質をコードするオリゴヌクレオチドに結合して阻害し得るsiRNAである。
【００６０】
特定の態様において、該細胞はさらに、第2のGOIおよび第2のノンコーディングRNAを含む。第1および第2のノンコーディングRNAは、同じであり得るかまたは異なり得る。異なる場合、該選択タンパク質をコードするオリゴヌクレオチドはさらに、第2の選択タンパク質をコードするか、または該細胞は、第2の選択タンパク質をコードする別の第2のオリゴヌクレオチドを含み、ここで該第2のノンコーディングRNAは、第2の選択タンパク質の翻訳を促進または阻害する。特定の態様において、該第2のノンコーディングRNAはイントロン中にコードされる。特定の態様において、該第2のノンコーディングRNAはUTR中にコードされるかまたはイントロンである。
【００６１】
本明細書に記載される方法および組成物のための開始系統(starting strain)としての使用に適切な細胞は、当該技術分野で公知であり、例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ヒト胚性腎臓(HEK)細胞、乳児ハムスター腎臓(BHK)細胞、ヒト線維肉腫細胞、PER.C6(登録商標)細胞(Crucell/Janssen Pharmaceuticals, Inc.)、EB66(登録商標)細胞(Vivalis)、NSO、バキュロウイルス細胞株Sf9、Sf-21、TN368およびBTI-TN-5B1-4、ならびに転写後調節にHSLモチーフを利用する任意の後生動物由来細胞株が挙げられる。
【００６２】
4. 目的の遺伝子(GOI)
CHO細胞または本明細書に記載される他の細胞中で発現され得る任意のGOIは、本明細書に記載される方法および組成物に関して使用され得る。例示的なGOIとしては、α-グルコシダーゼ、ラロニダーゼ(Laronidase)、Ig-CTLA4融合、N-アセチルガラクトサミン-4-スルファターゼ、黄体形成ホルモン、第VIII因子(Advate)、α-ガラクトシダーゼ、インターフェロン-β、第VIII因子、組織プラスミノゲンアクチベーター(テネクテプラーゼ、アクチバーゼ(Activase))、TNFα受容体融合(Enbrel)、第IX因子、卵胞刺激ホルモン、B-グルコセレブロシダーゼ、デオキシヌクレアーゼI、およびエリトロポイエチン(Epogen/Procrit, Aranesp)が挙げられる。
【００６３】
特定の態様において、2つのGOIが同じ細胞中で産生される。例えば、抗体産生について、軽鎖および重鎖の遺伝子の両方が、同じノンコーディングRNAを発現し得るか、それぞれが異なるノンコーディングRNAを発現し得る。2つの異なるノンコーディングRNAがある場合、選択は最初に、1つのmiRNAに対して実施され得、次いで他のmiRNAに対して実施され得る。正の選択または負の選択のいずれかは、任意の順序でいずれかのmiRNAに対して実施され得る。同じノンコーディングRNAの2つを使用する場合、正の選択または負の選択のいずれかは、miRNA誘発因子の過剰なレベルの発現(すなわち両方のGOIが発現されることを示す発現レベル)のみに応答して調整され得る。例示的な抗体(Ab)としては、例えば抗EGFR mAb、抗VEGF mAb、抗IgE mAb、抗CD11a mAb、抗TNFα mAb、抗CD52 mAb、抗HER2 mAb、抗PDl mAb、抗PD-Ll mAbおよび抗CD20 mAbなどのモノクローナルAbが挙げられる。
【００６４】
5. ノンコーディングRNA
本発明の特定の態様において、該ノンコーディングRNAは、sxRNAを安定化し得るか、または選択タンパク質を阻害(例えばサイレンシング)し得るRNA干渉配列(例えば、miRNA、shRNA、siRNA、piRNA、snoRNA、IncRNAまたはdsRNAヌクレオチド配列)である。本発明の薬剤における使用のためのRNAi配列はいずれかの市販のもの(例えばDharmacon, Ambion)であり得るか、または従事者は現実味のあるRNAi配列の構築のための公的に利用可能なソフトウェアツールのいくつかのうちの1つを使用し得る。
【００６５】
ノンコーディングRNAは、選択タンパク質の産生を促進または阻害する外来的に供給される任意のRNAであり得る。正の選択について、ノンコーディングRNAはsxRNAのフランク領域に結合し、sxRNAの構造を安定化し、RBPまたは他の翻訳促進タンパク質との相互作用を促進する。負の選択について、ノンコーディングRNAは、例えば選択タンパク質をコードするmRNAに結合して分解を引き起こすことにより選択タンパク質を阻害する。代替的に、該ノンコーディングRNAは、sxRNAに結合し、sxRNAの二次構造(例えばステムループ)の塩基対形成を破壊し、それにより近位にコードされる選択タンパク質の発現を防ぐ。
【００６６】
ノンコーディングRNA は、限定されないが、ウイルスポリヌクレオチド、細菌ポリヌクレオチド、新形成細胞中で発現されるポリヌクレオチドまたはタンパク質欠損を特徴とするポリヌクレオチドであり得る。ノンコーディングRNAは、例えば限定されないが、ウイルス-または細菌感染細胞、新形成細胞、疾患細胞、組織、細胞培養物またはポリヌクレオチドを含む試料(例えば血液試料)中に見られ得る。
【００６７】
正の選択について、ノンコーディングRNAの配列はまた、好ましいエネルギー最小化によりsxRNAが塩基対を形成し、優先的な結合を促進することを可能にするはずであり、すなわちノンコーディングRNAは、天然の標的と比較して、sxRNAと優先的に結合するはずである。例えば、計算されたMFE(最小自由エネルギー)構造は、(天然の標的と結合するノンコーディングRNA、またはそれ自身と折り畳まれるsxRNAおよびそれ自身と折り畳まれるノンコーディングRNA、または所望の様式以外の様式でハイブリダイズするsxRNAおよびノンコーディングRNAよりもむしろ)所望のようにノンコーディングRNAがsxRNAのフランク領域とハイブリダイズすることが予想されるようなものであるはずである。
【００６８】
本明細書に記載されるように、ノンコーディングRNAは、GOIと共にオリゴヌクレオチド上にコードされる。特定の態様において、該ノンコーディングRNAおよびGOIは同じオリゴヌクレオチド(例えばプラスミドベクター)上にあるが、異なるプロモーターを有する。特定の態様において、該ノンコーディングRNAおよびGOIは、GOIの発現とノンコーディングRNAの発現を物理的に結びつける同じ転写産物上にある。特定の態様において、ノンコーディングRNAは、GOIのイントロンまたは非翻訳領域(UTR)中で発現される。特定の態様において、該ノンコーディングRNAはイントロン(例えば国際特許公開公報WO 2010029303中の「mirtron」参照)またはUTRである。特定の態様において、複数のノンコーディングRNAがイントロンまたはUTR中にある。複数のノンコーディングRNAは同じであり得るかまたは異なり得る。イントロン中のノンコーディングRNAの発現は良好に理解される。miRNAおよびレポーターを共発現する市販のプラスミドは市販される(例えばCell Biolabs, Inc., San Diego, CA参照)。標準的な転写因子および開始配列を使用してノンコーディングRNAを発現し得る。GOIの発現とノンコーディングRNAの発現を密接に結び付ける任意の技術は十分である。
【００６９】
特定の態様において、miRNAなどのノンコーディングRNAは、アポトーシスを低減し、qを増大し、オートファジーを低減し、増殖を増大し、かつ細胞周期、シャペロニング(chaperoning)、分泌、タンパク質折り畳み、および代謝変化を向上して目的の遺伝子(gene of interes)産物の産生を向上するなどのいくつかの独立した利益を、細胞中のその過剰発現に提供する。例えば、ebv-miR-BART10-3pは、ヒト細胞においてアポトーシスの阻害に重要な役割を果たすことが示されている。エプスタインバールウイルス(EBV)は、BART10を使用して、細胞の天然の防御反応を低下させ、ウイルスが用意される(ready)まで細胞の完全性を維持しやすい。そのため、BART 10を本明細書に記載されるノンコーディングRNAとして使用し得るが、さらに独立してアポトーシスを阻害することにより細胞生存可能性を促進し得る。代替的なmiRNAとして、例えばmiR-7が、低い培養温度で下方制御されることが見出され、その過剰発現により、37℃でCHO細胞中のqが有意に増大され得る。細胞周期に影響し得る他のmRNAとしては、miR-21、miR-16およびlet-7bが挙げられる(Kim ei al. (2012) APPL MICROBIOL BIOTECHNOL 93:917-930)。より高い生産性および/または分泌を可能にするさらなる例示的なノンコーディングRNAとしては、miR-125a-3p、miR-149、miR-1271、miR-1275、miR-1285、miR-1287、miR-1293、miR-183、miR-185*、miR-193b*、miR-1978、miR-23b*、miR-299-3p、miR-557、miR-612、miR-644a、miR-885-3p、miR892aが挙げられる(WO2013/182553参照)。
【００７０】
a. siRNA
短い干渉RNA(siRNA)は、短く(通常約20〜25塩基対長)、二重鎖RNA分子であり、siRNAと相補的な配列を有する遺伝子の発現の妨害を含むいくつかの役割を果たす。siRNAおよびmRNAを分解するRISC複合体の機構は良く理解されており、これらの原理を使用して、本明細書に記載される方法および組成物におけるノンコーディングRNAとしての使用のためのsiRNAを設計し得る。一態様において、siRNA部位、すなわち該siRNAに完全に相補的な1つ以上のヌクレオチド配列を含むようにmRNAを設計する。特定の態様において、siRNAを使用して、80%のタンパク質発現の減少、すなわちmiRNAをサイレンシングしない発現レベルと比較して20%の予測されるタンパク質発現を達成する。選択mRNAの3'および5'UTR中の誘発因子miRNAに完全に相補的な配列を、本明細書に記載される方法および組成物と共に使用し得る。
【００７１】
b. miRNA
マイクロRNA(miRNA)は一本鎖RNAであり、通常約18〜25ヌクレオチド長であり、天然の設定では、mRNAの相補的な領域に結合し、mRNAを切断するかそうでなければmRNAの翻訳を抑制する。本明細書に記載される方法および組成物によると、miRNAは選択タンパク質mRNAに結合して切断するかそうでなければ、該mRNAの翻訳を抑制して、負の選択を容易にするように機能し得る。代替的に、正の選択アプローチに該miRNAを使用して、以下により詳細に記載されるようにsxRNAスイッチに結合して安定化し得る。
【００７２】
6. 選択タンパク質
1つまたは2つの部分において、細胞を区別する任意の方法を使用して、任意の選択タンパク質をこのプロセスに使用し得る。正の選択法のためには、当該技術分野で公知の任意のマーカーを使用し得る。選択タンパク質としては、抗生物質耐性遺伝子、蛍光タンパク質および細胞表面マーカーが挙げられる。抗生物質耐性遺伝子および関連のある系は、選択タンパク質として機能し得、例えばDHFRを発現してMTX耐性を選択し、GSを発現してMSX耐性を選択し、ピューロマイシンN-アセチル-トランスフェラーゼ(PAC)をコードするPac遺伝子を発現してピューロマイシン耐性を選択する。
【００７３】
mCherryまたは緑色蛍光タンパク質(GFP)などの蛍光マーカーを、蛍光細胞分析分離装置(FACS)を使用して実行される選択と共に使用し得る。FACS分離のための蛍光抗体または磁気細胞分離を使用する選択のための磁気抗体の添加により容易に染色され得る膜タンパク質CD4などの細胞表面マーカーを使用し得る。
【００７４】
負の選択方法のために、当該技術分野で公知の以下の例示的な選択系を使用し得る。発現したタンパク質と小分子の組合せにより細胞死が引き起こされる、ヘルペス単純ウイルスチミジンキナーゼ/ガンシクロビル(HSV-TK/GCV)またはシトシンデアミナーゼ/5-フルオロシトシン(CD/5-FU)などのプロドラッグ系を使用し得る。プロドラッグ/アクチベーター法は、プロドラッグ投与のレベルで精製(refined)され得るので、負の選択に有利であり得、すなわちアクチベーター発現が低い場合はより多くのプロドラッグを使用し得るか、またはアクチベーター発現が高い場合はより少ないプロドラッグが必要である。
【００７５】
アポトーシスの誘発および実行において中心的な役割を果たすカスパーゼ-9(C9)もしくはカスパーゼファミリーの任意の構成メンバー、カスパーゼアクチベーター、またはより大きなCARDスーパーファミリーのタンパク質などのアポトーシス遺伝子を使用し得る。さらなる適切な選択タンパク質としては、限定されないが、BCL-2およびBAGドメイン、ならびにBax、Bad、Bid、Bim、BIRCタンパク質、CARD、DEATHおよびTRAFドメイン含有タンパク質などのタンパク質のファミリーのプロアポトーシス構成メンバーが挙げられる。選択タンパク質としての使用に適切な他のタンパク質は、TNFおよび他のデスレセプターについてのリガンドとして機能するTRAILまたはTNFリガンドスーパーファミリーの他の構成メンバーなどの外部刺激に対して通常解明される経路を人工的に誘発するものである。他の適切なタンパク質は、細胞周期を停止し得るが、特定の状況でアポトーシスも誘発し、TP53、CHK2などのかなめの(lychpin)経路タンパク質により活性化される酸化的およびDNA損傷応答経路に影響するものであるが、多くの他のものでもある。ほとんどのプロアポトーシスタンパク質は阻害領域が除去されるまで不活性であり、ΔNBaxなどのこれらのタンパク質の活性な下部領域の発現も現実的である。ジフテリア毒素断片Aなどの病原菌由来プロアポトーシスタンパク質も使用し得る。
【００７６】
7. sxRNA
本明細書に記載される特定の態様において、miRNAの発現に応じて選択(choice)の正常でない位置にある遺伝子の発現を「オン」および「オフ」にする、構造的に相互作用するRNAまたは「sxRNA」と称されるトランス-RNA変換機構(trans-RNA switching mechanism)が使用される。2014年9月23日に発行され、その全体において参照により本明細書に援用される米国特許第8,841,438号参照。
【００７７】
図2に示されるように、sxRNA技術は、正常でない位置に送達されたmRNAの構造を「スイッチ」して細胞制御RBPと結合するようにその能力を改変するmiRNAの使用を含む。ほとんどのRBPは、mRNAの非翻訳領域(UTR)中に形成される特異的な構造的結合部位、しばしばステムループ構造と相互作用することにより、遺伝子発現を調節する。特定のRNA結合タンパク質(RBP)は、mRNAに結合すると、数倍の規模で翻訳を増大する。ノンコーディングRNA(例えばmiRNA)とのトランス相互作用によりRBP結合部位が除去または安定化され得るように、選択タンパク質をコードするオリゴヌクレオチド(例えば選択タンパク質をコードするmRNA)中に「スイッチ」を配置し得る。本明細書に記載される方法に従ったsxRNAスイッチの使用により、抗生物質耐性タンパク質の連続的な発現を必要とせずに、高いCHO生産性を有する細胞の選択が可能になる。
【００７８】
特定の態様において、ヒストンステムループ結合タンパク質(SLBP)と会合する(recruit)ヒストンステムループ(HSL)に基づいてsxRNAを設計する。mRNAの3' UTR中のHSLの存在または非存在は、SLBPを誘引するHSLの能力に応じたヒストンメッセージ(histone message)の発現レベルにおいて10〜25倍の差を生じ得る。ほとんどのヒストンメッセージは、ポリA尾部を有さず、HSLおよびSLBPが効率的に翻訳することを必要とする。
【００７９】
sxRNAスイッチは、正の選択または負の選択において機能するように設計され得る。一態様において、正のsxRNAスイッチは、HSLモチーフの構造的能力を弱めて、ヒストンSLBPがsxRNAに結合できないかまたは結合しにくくなるように安定なHSLモチーフを改変することにより設計される。ステムループの基部のフランク領域は、ノンコーディングRNAがsxRNA-mRNAと相互作用する際にステムループが再形成されるように、誘発因子ノンコーディング(trigger non-coding)と相補的になるように遺伝子工学的に作り変えられる。これは、モチーフの機能を修復し、SLBPの結合を可能にし、上流の選択タンパク質の活発な翻訳を誘導する。別の態様において、負の選択についてのスイッチは、ノンコーディングRNA(例えばmiRNA)に相補的なHSLまたはその一部を作製することにより設計される。2つの配列の相互作用は(例えばステムループの除去により)HSLを乱し、SLBPの結合が防がれる。
【００８０】
正の選択についてのsxRNAスイッチは、hsa-miR-122、Huh7細胞中で高度に発現される肝臓特異的miRNA、hsa-miR-302、人工多能性細胞(iPSC)特異的miRNA、およびebv-miR-BART10-3p、エプスタインバールウイルスにより産生されるmiRNAなどの誘発因子ノンコーディングRNAを使用して、選択タンパク質sxRNA-mRNAの翻訳をオンにする内因性miRNAを使用して設計された。ARGOおよびRISC複合体は、これらのsxRNA相互作用を阻害することが明らかではない。したがって、sxRNAスイッチの使用により、適切なノンコーディングRNA(例えばmiRNA)誘発因子を使用した場合、任意のGOIの発現を制御することが可能になる。
【００８１】
RBPと会合する二次構造を含む任意のRNAをsxRNAとして使用し得る。例えば、 IREBP、EIF4e、EIF4gまたはポリA結合タンパク質と会合するRNA配列を使用し得る。例えば、3' UTR中のIREは、IREBPを誘引して発現を増大し、5' UTR中のIREは、IREBPを誘引して発現を減少する。天然または改変されたヌクレオチドを使用して、生存およびmRNAの持続性を増大し得る。
【実施例】
【００８２】
実施例
実施例1：負の選択
負の選択について、GOIと共発現されるmiRNAは、一時的にトランスフェクションされたmRNAの発現をオフにし、そうでなければ翻訳される。トランスフェクションされたmRNAがプロアポトーシス性であるか他の細胞死エフェクター遺伝子である場合、これは誘発因子miRNAを有しそのためにGOIを有する細胞の生存を維持しながら、miRNAを発現していない細胞に死を生じ得る(図2A、図3)。
【００８３】
この実験において、GFP中のイントロンからBART10 miRNAを安定に発現するHEK293細胞株を作製し、これを、容易に測定可能な代用GOIとして使用した(GFP/BART10+細胞)。30日の継代後GFPシグナルの消失または希薄化を伴わない、安定なものとして細胞を分類した。BART 10産生は、野生型HEK293と比較したmiRNAについてのqRT-PCRを使用して検証した。T7プロモーターの下流にΔNBaxプロアポトーシスタンパク質およびΔNBaxの3'UTR中にBART10 siRNA標的部位の二本鎖の1または3コピーのいずれか(合計2または6部位)を有するプラスミドを設計した。標的部位自体は、予想されるBART10 siRNA配列と完全に相補的である。該プラスミドをインビトロ転写の鋳型として使用して、得られたmRNAを使用してGFP/BART10+ HEK293およびそれらの野生型対応物を試験した(challenge)。
【００８４】
最初のデータは、予想と一致する結果を示した。BART10 miRNAを有する細胞において、ΔNBax mRNAは迅速に分解されて、細胞は生存した。しかしながら、BART10を有さない細胞はΔNBaxを発現し、ミトコンドリア脱局在化およびアポトーシスを生じた。細胞のヘテロ接合体混合物において負の選択が機能することを示すために、本発明者らは、野生型とGFP/BART10+ HEK293細胞を種々の割合で混合して、該細胞をΔNBax mRNAによりトランスフェクションした。予想されるとおり、細胞死の量は、細胞混合物の全体的なBART10+ HEK293含有量に反比例し、より多くのBART10+細胞が混合集団を含んだ場合、死亡する細胞はより少なかった。蛍光顕微鏡検査はGFP/BART10+の富化を示し、結果は正確に、GFP/BART10細胞の成功裡の選択から予測された。
【００８５】
実施例2：正の選択
例示的な正の選択法において、ノンコーディングRNAとしてBART10 miRNAを使用した。BART10 miRNAは、CHOゲノムと交差反応性を有することは予想されていない。本発明者らは、BART10と相互作用して3つの経路の接合点を形成することが予想されるHSL系スイッチを設計し、このsxRNAスイッチを、図4に示されるようにルシフェラーゼレポーターmRNAの3' UTRに配置した。次いで本発明者らは、インビトロT7転写mRNAを2つの細胞株にヌクレオフェクションした(図5)。1つにBART10を発現するEBV系統を感染させ(HH514-16細胞)、他のものにBART10遺伝子を欠損するEBVバリアントを感染させた(LCL細胞)。図5は、得られた発現レベルを示し、劇的で統計的に有意な発現の変化を示す。
【００８６】
均等物
本発明は、その精神または本質的な特徴を逸脱することなく、他の具体的な形態において体現され得る。そのため、前述の態様は、全ての点において、本明細書に記載される発明の限定ではなく、例示的なものであると考えるべきである。したがって、本発明の範囲は、前述の記載よりもむしろ添付の特許請求の範囲により示され、特許請求の範囲の均等物の意味および範囲内にある全ての変更が、本発明に包含されることが意図される。
【００８７】
参照による援用
本明細書において先に開示される特許文献、科学的参考文献およびその他のデータベースのそれぞれの全開示は、全ての目的のために、参照により本明細書中に明白に援用される。
【図１】
2017532065.tif 000003
【図２】
2017532065.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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