(57)【要約】【解決手段】  本発明は、一般に、目的タンパク質の発現を増大させる遺伝子変異を有する細菌細胞、ならびに、そのような細胞を作製する方法および使用する方法に関する。本発明の態様は、ｓｉｎオペロン中の遺伝子の発現を減少させ、それによって１種以上の目的タンパク質の発現を増強させる、１つ以上の遺伝子変異を有する変異グラム陽性微生物を含む。【選択図】図５Ｂ
2017538426.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グラム陽性菌細胞における目的タンパク質（ＰＯＩ）の発現を増大させる方法であって、
（ａ）目的タンパク質を産生する変異グラム陽性菌細胞を得る工程であって、前記変異グラム陽性菌細胞は、ｓｉｎオペロン中の１つ以上の遺伝子の発現を減少させる少なくとも１つの遺伝子変異を含む工程と、
（ｂ）前記ＰＯＩを発現するような条件下で前記変異グラム陽性菌細胞を培養する工程と
を含み、
前記ＰＯＩ量の増大は、非変異グラム陽性菌細胞における同ＰＯＩの発現に対するものである方法。
【請求項２】
前記変異グラム陽性菌細胞は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属のメンバーである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細胞は、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・ソノレンシス（Ｂ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、バチルス・ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、バチルス・プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ラウツス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・パブリ（Ｂ．ｐａｂｕｌｉ）、バチルス・セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・アガラドハエレンス（Ｂ．ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）、バチルス・アキバイ（Ｂ．ａｋｉｂａｉ）、バチルス・クラーキイ（Ｂ．ｃｌａｒｋｉｉ）、バチルス・シュードファーマス（Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・レヘンシス（Ｂ．ｌｅｈｅｎｓｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サークランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）、およびバチルス・チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）からなる群から選択される請求項２に記載の方法。
【請求項４】
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）またはバチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記変異細菌細胞は、前記ｓｉｎオペロンのｓｉｎＲ遺伝子の発現を減少させる遺伝子変異を含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記遺伝子変異は、さらに、前記ｓｉｎオペロンに由来するｍＲＮＡ転写レベルの減少と定義される請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ｍＲＮＡ転写レベルの減少は、ｓｉｎＲ  ｍＲＮＡ転写である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ｓｉｎＲ  ｍＲＮＡ転写レベルの減少は、前記非変異細菌対照細胞に対して少なくとも１０％である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ｓｉｎＲ遺伝子の核酸配列は、配列番号１と少なくとも６０％同一である請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記遺伝子変異は、前記ｓｉｎＲ遺伝子における変異である請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記ｓｉｎＲ遺伝子における変異は、サイレント変異である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記サイレント変異は、配列番号１の３３０番目のヌクレオチドに対応するヌクレオチド位置にある請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記サイレント変異は、配列番号１の３３０番目のヌクレオチドに対応するヌクレオチド位置におけるＧからＡへの変異である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記サイレント変異は、配列番号１の７２９番目のヌクレオチドに対応するヌクレオチド位置にある請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記サイレント変異は、配列番号１の７２９番目のヌクレオチドに対応するヌクレオチド位置におけるＣからＴへの変異である請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記変異は、前記ｓｉｎＲ遺伝子の全部または一部の欠失である請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＰＯＩは、前記変異細菌細胞に対し外来性の遺伝子、または前記変異細菌細胞に対し内在性の遺伝子によってコードされる請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＰＯＩは酵素である請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記酵素は、アセチルエステラーゼ、アミノぺプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシナーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルカナーゼ、グルカンリアーゼ、エンド−β−グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルヒドロラーゼ、ポリオールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＰＯＩを回収する工程をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
ＰＯＩの発現増加量は、前記非変異グラム陽性対照細胞に対して少なくとも１０％である請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
目的タンパク質を、非変異グラム陽性菌対照細胞の同ＰＯＩの発現に比べてより多く発現する変異グラム陽性菌細胞であって、ｓｉｎオペロン中の１つ以上の発現を減少させる少なくとも１つの遺伝子変異を含む変異細胞。
【請求項２３】
バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属のメンバーである請求項２２に記載の変異細胞。
【請求項２４】
前記バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細胞は、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・ソノレンシス（Ｂ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、バチルス・ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、バチルス・プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ラウツス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・パブリ（Ｂ．ｐａｂｕｌｉ）、バチルス・セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・アガラドハエレンス（Ｂ．ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）、バチルス・アキバイ（Ｂ．ａｋｉｂａｉ）、バチルス・クラーキイ（Ｂ．ｃｌａｒｋｉｉ）、バチルス・シュードファーマス（Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・レヘンシス（Ｂ．ｌｅｈｅｎｓｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サークランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）、およびバチルス・チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）からなる群から選択される請求項２３に記載の変異細胞。
【請求項２５】
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）またはバチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）である請求項２４に記載の変異細胞。
【請求項２６】
前記ｓｉｎオペロンのｓｉｎＲ遺伝子の発現を減少させる遺伝子変異を含む請求項２２に記載の変異細胞。
【請求項２７】
前記遺伝子変異は、さらに、前記ｓｉｎオペロンに由来するｍＲＮＡ転写レベルの減少と定義される請求項２２に記載の変異細胞。
【請求項２８】
前記ｍＲＮＡ転写レベルの減少は、ｓｉｎＲ  ｍＲＮＡ転写である請求項２７に記載の変異細胞。
【請求項２９】
前記ｓｉｎＲ  ｍＲＮＡ転写レベルの減少は、前記非変異細菌対照細胞に対して少なくとも１０％である請求項２８に記載の変異細胞。
【請求項３０】
前記ｓｉｎＲ遺伝子の核酸配列は、配列番号１と少なくとも６０％同一である請求項２２に記載の変異細胞。
【請求項３１】
前記遺伝子変異は、前記ｓｉｎＲ遺伝子における変異である請求項２２に記載の変異細胞。
【請求項３２】
前記ｓｉｎＲ遺伝子における変異は、サイレント変異である請求項３１に記載の変異細胞。
【請求項３３】
前記サイレント変異は、配列番号１の３３０番目のヌクレオチドに対応するヌクレオチド位置にある請求項３２に記載の変異細胞。
【請求項３４】
前記サイレント変異は、配列番号１の３３０番目のヌクレオチドに対応するヌクレオチド位置におけるＧからＡへの変異である請求項３３に記載の変異細胞。
【請求項３５】
前記サイレント変異は、配列番号１の７２９番目のヌクレオチドに対応するヌクレオチド位置にある請求項３２に記載の変異細胞。
【請求項３６】
前記サイレント変異は、配列番号１の７２９番目のヌクレオチドに対応するヌクレオチド位置におけるＣからＴへの変異である請求項３５に記載の変異細胞。
【請求項３７】
前記変異は、前記ｓｉｎＲ遺伝子の全部または一部の欠失である請求項３１に記載の変異細胞。
【請求項３８】
前記ＰＯＩは、前記変異細菌細胞に対し外来性の遺伝子、または前記変異細菌細胞に対し内在性の遺伝子によってコードされる請求項２２に記載の変異細胞。
【請求項３９】
前記ＰＯＩは酵素である請求項２２に記載の変異細胞。
【請求項４０】
前記酵素は、アセチルエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシナーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルカナーゼ、グルカンリアーゼ、エンド−β−グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルヒドロラーゼ、ポリオールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される請求項３９に記載の変異細胞。
【請求項４１】
ＰＯＩの発現増加量は、前記非変異グラム陽性対照細胞に対して少なくとも１０％である請求項２２に記載の変異細胞。
【請求項４２】
請求項２２に記載の変異細胞で産生され単離された目的タンパク質。
【請求項４３】
配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を有する野生型ｓｉｎＲ遺伝子由来のポリヌクレオチド変異体であって、ミスセンス変異、フレームシフト変異、ナンセンス変異、挿入および／または欠失を含むポリヌクレオチド変異体。
【請求項４４】
配列番号１の３３０番目のヌクレオチドに対応するヌクレオチド位置にサイレント変異を含む請求項４３に記載のポリヌクレオチド変異体。
【請求項４５】
前記配列番号１の３３０番目のヌクレオチドに対応する位置におけるサイレント変異は、ＧからＡへのヌクレオチド置換である請求項４４に記載のポリヌクレオチド変異体。
【請求項４６】
前記サイレント変異は、配列番号１の７２９番目のヌクレオチドに対応するヌクレオチド位置にある請求項４４に記載のポリヌクレオチド変異体。
【請求項４７】
前記サイレント変異は、配列番号１の７２９番目のヌクレオチドに対応するヌクレオチド位置におけるＣからＴへの変異である請求項４６に記載のポリヌクレオチド変異体。
【請求項４８】
請求項４３に記載のポリヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項４９】
相同組み換えによって内在性染色体ｓｉｎＲ遺伝子を置換するターゲティングベクターである請求項４８に記載のベクター。
【請求項５０】
グラム陽性菌細胞における目的タンパク質（ＰＯＩ）の発現を増大させる方法であって、
（ａ）請求項３９に記載のベクターで親グラム陽性菌細胞を形質転換する工程であって、前記ベクターと親ｓｉｎＲ遺伝子の対応する領域との間の相同組み換えによって変異グラム陽性菌細胞が生成される工程と、
（ｂ）前記ＰＯＩを発現に適した条件下で前記変異細胞を培養する工程と
を含み、
前記ＰＯＩの発現の増大は、非変異グラム陽性菌対照細胞における同ＰＯＩの発現に対するものである方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、米国特許法第１１９条の下、２０１４年１２月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／０９２，４６１号の優先権を主張するものであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、一般に、分子生物学、細胞生物学、微生物学、遺伝学およびタンパク質生成の分野に関する。さらに詳しくは、本明細書に開示する種々の実施形態において、発明は、目的のタンパク質の発現を増大させる遺伝子変異を有するグラム陽性菌細胞、ならびに、そのような細胞を作製する方法および使用する方法に関する。
【０００３】
配列表の参照
電子的手段により提出された、２０１５年１０月２９日作成の１１キロバイトのサイズを有するＮＢ４０７７２−ＷＯ−ＰＣＴ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名の配列表テキストファイルの内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
遺伝子工学によって、工業用バイオ反応器として、細胞工場として、また食品発酵において使用する微生物が改善されてきた。多くのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種の菌を含むグラム陽性微生物が、多くの有用なタンパク質および代謝物の製造に使用されている（例えば、Ｚｕｋｏｗｓｋｉ，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｌｙ  ｖａｌｕａｂｌｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ，”：Ｄｏｉ  ａｎｄ  ＭｃＧｌｏｕｇｌｉｎ（編）Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｉ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｔｏ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，Ｓｔｏｎｅｈａｍ．Ｍａｓｓ  ｐａｇｅｓ  ３１１−３３７，１９９２を参照）。工業で汎用されているバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種の菌としては、バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、およびバチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が挙げられる。それらはＧＲＡＳ（一般に安全と認められる）のステータスが与えられているため、これらのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種の菌種は、食品および医薬品工業で使用するタンパク質を製造するための天然の候補である。グラム陽性微生物で産生されるタンパク質の例としては、α−アミラーゼ、中性プロテアーゼ、アルカリ（または、セリン）プロテアーゼなどが挙げられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
細菌宿主細胞でのタンパク質産生の理解が進んでいるとはいえ、目的タンパク質を高レベルで発現する新しい組み換え菌株の開発が要望されている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明のある実施形態は、目的のタンパク質を高レベルで発現させる組み換えグラム陽性細胞、ならびに、その作製方法および使用方法に関する。特に、ある実施形態は、遺伝子変異を有しない細菌細胞に比べ、目的タンパク質をより多く発現する、遺伝子変異を有する細菌細胞に関する。
【０００７】
したがって、本明細書に開示するある実施形態は、グラム陽性菌細胞における目的タンパク質（以下、「ＰＯＩ」）の発現を増大させる方法に関する。より特には、ある実施形態は、グラム陽性菌細胞におけるＰＯＩ発現を増大させる方法であって、（ａ）ＰＯＩを産生する変異グラム陽性菌細胞を得る工程であって、その変異グラム陽性菌細胞は、ｓｉｎオペロン中の１つ以上の遺伝子の発現を減少させる少なくとも１つの遺伝子変異を含む工程と、（ｂ）ＰＯＩを発現するような条件下で変異グラム陽性菌細胞を培養する工程とを含み、ＰＯＩの量が、非変異グラム陽性菌細胞における同ＰＯＩの発現と比べて増大する方法に関する。
【０００８】
他の実施形態において、発明は変異グラム陽性菌細胞を含む組成物に関する。ある実施形態では、発明は、ＰＯＩを、非変異グラム陽性菌細胞における同ＰＯＩの発現と比べて、より多く発現する変異グラム陽性菌細胞であって、ｓｉｎオペロン中の１つ以上の遺伝子の発現を減少させる少なくとも１つの遺伝子変異を含む細胞を提供する。
【０００９】
本開示の変異グラム陽性菌細胞は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属のメンバーであり得る。ある実施形態では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の細胞は、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・ソノレンシス（Ｂ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、バチルス・ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、バチルス・プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ラウツス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・パブリ（Ｂ．ｐａｂｕｌｉ）、バチルス・セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・アガラドハエレンス（Ｂ．ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）、バチルス・アキバイ（Ｂ．ａｋｉｂａｉ）、バチルス・クラーキイ（Ｂ．ｃｌａｒｋｉｉ）、バチルス・シュードファーマス（Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・レヘンシス（Ｂ．ｌｅｈｅｎｓｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サークランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）、およびバチルス・チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）からなる群から選択される。ある他の実施形態では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）またはバチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）である。
【００１０】
ある実施形態では、ＰＯＩは、変異細菌細胞に対し外来性の遺伝子、または変異細菌細胞に対し内在性の遺伝子によってコードされる。ある実施形態では、ＰＯＩは酵素である。他の実施形態では、ＰＯＩは、アセチルエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシナーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルカナーゼ、グルカンリアーゼ、エンド−β−グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルヒドロラーゼ、ポリオールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される酵素である。
【００１１】
ある実施形態では、ＰＯＩはプロテアーゼである。ある実施形態では、プロテアーゼはサブチリシンである。ある他の実施形態では、サブチリシンは、サブチリシン１６８、サブチリシンＢＰＮ’、サブチリシンカールスバーグ、サブチリシンＤＹ，サブチリシン１４７、サブチリシン３０９、およびこれらの変異体からなる群から選択される。
【００１２】
他の実施形態では、そのような変異グラム陽性菌細胞およびその方法は、さらに、ＰＯＩを回収する工程を含む。特定の実施形態では、非変異グラム陽性対象細胞に比べて増加するＰＯＩの発現量は少なくとも１０％である。
【００１３】
ある他の実施形態では、変異グラム陽性菌細胞（およびその方法）は、さらに、ｄｅｇＵ、ｄｅｇＱ、ｄｅｇＳ、ｓｃｏＣ４、およびｏｐｐＡからなる群から選択される遺伝子の変異を含む。ある実施形態では、変異は、ｄｅｇＵ（Ｈｙ）３２である。
【００１４】
ある他の実施形態は、配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を有する野生型ｓｉｎＲ遺伝子由来のポリヌクレオチド変異体であって、ミスセンス変異、フレームシフト変異、ナンセンス変異、挿入および／または欠失を含むポリヌクレオチド変異体に関する。ある実施形態では、ポリヌクレオチド変異体は、配列番号１の３３０番目のヌクレオチドに対応するヌクレオチドの位置にサイレント変異を含む。特定の実施形態においては、サイレント変異は、配列番号１の３３０番目のヌクレオチドに対応する位置にあり、そのサイレント変異は、ＧヌクレオチドのＡヌクレオチドへの置換である。
【００１５】
ある他の実施形態では、この発明の１つ以上の変異体を含むベクターに関する。他の実施形態では、ベクターは、相同組み換えによって、内在性の染色体のｓｉｎＲ遺伝子を置換するターゲティングベクターである。
【００１６】
ある他の実施形態では、グラム陽性菌細胞における目的タンパク質（ＰＯＩ）の発現を増大させる方法であって、（ａ）親グラム陽性菌細胞を、ポリヌクレオチド変異体を含むベクターで形質転換する工程であって、ベクターと、親ｓｉｎＲ遺伝子の対応する領域との間の相同組み換えによって変異グラム陽性菌細胞を形成する工程と、（ｂ）ＰＯＩの発現に適した条件下で変異細胞を培養する工程であって、ＰＯＩの発現は、非変異グラム陽性菌細胞における同じＰＯＩの発現と比べて増大する工程とを含む方法に関する。
【００１７】
ある実施形態では、変異グラム陽性菌細胞は目的タンパク質を発現するが、ここでは、そのＰＯＩをコードする発現カセットが親グラム陽性菌細胞に導入される。
【００１８】
他の実施形態では、方法（および、その組成物）は、さらに、変異グラム陽性菌細胞が目的タンパク質を発現するような条件下で、変異グラム陽性菌細胞を培養する工程を含む。特定の実施形態においては、その組成物と方法は、さらに、ＰＯＩを回収する工程を含む。
【００１９】
ある実施形態では、少なくとも１つの変異は、配列番号１の７２９番目のヌクレオチドに対応するヌクレオチドの位置のサイレント変異を含む。ある実施形態では、変異は、配列番号１の７２９番目のヌクレオチドに対応するヌクレオチドの位置のＣからＴへの変異を含む。ある実施形態では、ポリヌクレオチド変異体配列は、配列番号３の全てまたは一部と少なくとも９０％相同である。ある実施形態では、変異体配列は、配列番号３の全てまたは一部と同一である。ある実施形態では、変異体配列は長さが少なくとも２０ヌクレオチドである。ある実施形態では、変異体配列は長さが少なくとも５０ヌクレオチドである。ある実施形態では、変異体配列は長さが少なくとも２００ヌクレオチドである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、ｐＫＳＶ７−ｓｉｎＲのプラスミドマップ図を示す。
【図２】図２は、ｓｉｎＲ欠失（ΔｓｉｎＲ）の遺伝子マップ図を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、ＦＮＡプロテアーゼを発現するバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞の細胞密度のグラフを示す。ＷＴは「非変異」（親）バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（対照）細胞であり、ｓｉｎＲ＊は、ｓｉｎＲ遺伝子の３３０番目のヌクレオチドに対応するサイレント変異を含む「変異」（娘）バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞であり、そして、ΔｓｉｎＲは、ｓｉｎＲ欠失遺伝子を含む「変異」（娘）バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞である（例えば、図２参照）。
【図３Ｂ】図３Ｂは、図３Ａに示すＷＴ細胞および変異バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞におけるＦＮＡプロテアーゼ発現のグラフを示す。ＷＴは「非変異」（親）バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（対照）細胞であり、ｓｉｎＲ＊は、ｓｉｎＲ遺伝子の３３０番目のヌクレオチドに対応するサイレント変異を含む「変異」（娘）バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞であり、そして、ΔｓｉｎＲは、ｓｉｎＲ欠失遺伝子を含む「変異」（娘）バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞である。
【図４Ａ】図４Ａは、ＷＴ細胞および変異バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞におけるＡｍｙＥ発現の細胞密度のグラフを示す。ＷＴは「非変異」（親）バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（対照）細胞であり、ｓｉｎＲ＊は、ｓｉｎＲ遺伝子の３３０番目のヌクレオチドに対応するサイレント変異を含む「変異」（娘）バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞であり、そして、ΔｓｉｎＲは、ｓｉｎＲ欠失遺伝子を含む「変異」（娘）バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＷＴ細胞および変異バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞におけるＡｍｙＥアミラーゼ発現のグラフを示す。ＷＴは「非変異」（親）バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（対照）細胞であり、ｓｉｎＲ＊は、ｓｉｎＲ遺伝子の３３０番目のヌクレオチドに対応するサイレント変異を含む「変異」（娘）バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞であり、そして、ΔｓｉｎＲは、ｓｉｎＲ欠失遺伝子を含む「変異」（娘）バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞である。
【図５Ａ】図５Ａは、ＷＴ細胞および変異バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞の細胞密度のグラフを示す。ＷＴは「非変異」（親）バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（対照）細胞であり、ｓｉｎＲ＊は、ｓｉｎＲ遺伝子の３３０番目のヌクレオチドに対応するサイレント変異を含む「変異」（娘）バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞であり、そして、ΔｓｉｎＲは、ｓｉｎＲ欠失遺伝子を含む「変異」（娘）バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＷＴ細胞および変異バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞のｐｅｌＣ発現のグラフを示す。ＷＴは「非変異」（親）バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（対照）細胞であり、ｓｉｎＲ＊は、ｓｉｎＲ遺伝子の３３０番目のヌクレオチドに対応するサイレント変異を含む「変異」（娘）バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞であり、そして、ΔｓｉｎＲは、ｓｉｎＲ欠失遺伝子を含む「変異」（娘）バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、一般に、目的タンパク質（以下、「ＰＯＩ」）の発現を増大させる１つ以上の遺伝子変異を有する細菌細胞、ならびに、そのような細胞を作製する方法および使用する方法に関する。
【００２２】
本組成物および本方法をより詳細に記載する前に、本組成物および本方法が記載されている特定の実施形態に限定されず、したがって、当然変わり得ることは理解されるべきである。また、本組成物および本方法の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書中で使用されている用語が、特定の実施形態を記載する目的でのみ使用され、それらの範囲を限定することを意図していないこともまた理解されるべきである。
【００２３】
ある数値範囲が示された場合、文脈中に明らかな別段の記載がない限り、その範囲の上限から下限の間に介在する値は、下限の単位の十分の一まで、またその記載範囲に記載された、または介在するいかなる他の値も本組成物および本方法に包含されると理解される。これらのより狭い範囲の上限および下限は、その狭い範囲に独立して含まれてよく、また、記載の範囲で明示的に排除された境界の支配下にある、本組成物および本方法に含まれる。記載の範囲が、その範囲の一端または両端を含む場合、それらの含まれる境界の一方または両方を排除する範囲もまた、本組成物および本方法に含まれる。
【００２４】
本明細書において、いくつかの範囲は、「約」という用語が先行する数値で示される。本明細書においては、「約」という用語は、これが先行する正確な数、および、この用語が先行する数に近い数または近似する数に対するリテラルサポートを提供するために使用される。ある数が明示的に記載された数に近いかまたは近似しているかの決定においては、記載されていない近いかまたは近似している数は、提示されている文脈中で、明示的に記載されている数と実質的に同等な数を提供する数であり得る。例えば、数値に関連して、「約」という用語は、文脈中に別段の定義がなされていない限り、その数値の−１０％〜＋１０％の範囲を指す。他の例では、「約６のｐＨ値」という句は、別段の定義がなされていない限り、５．４〜６．６のｐＨ値を指す。
【００２５】
本明細書に記載される見出しは、本明細書全体を参照することにより得られる、本組成物および本方法の各種態様または実施形態の限定となるものではない。したがって、すぐ下で定義される用語は、本明細書全体を参照することにより、より完全に定義される。
【００２６】
本明細書は、読みやすくするために多くのセクションで編成されている。しかしながら、１つのセクションでなされた記載が他のセクションに適用され得ることは、読者は理解するであろう。このように、本開示の異なるセクションに使用される見出しを、限定のためのものと解釈すべきではない。
【００２７】
別段の定義がなされていない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語は全て、本組成物および本方法が属する技術分野において、通常の知識を有する者が一般に理解しているものと同じ意味を有する。本組成物および本方法を実施または試験する際に、本明細書に記載のものに類似した、または同等の方法および材料を使用することができるが、ここで、代表的な、説明に役立つ方法および材料を記載する。
【００２８】
本明細書中に引用する刊行物および特許は全て、あたかもそれぞれ個々の刊行物または特許が参照により組み込まれると具体的かつ個別に述べられているかのごとく、参照により本明細書に組み込まれ、また、刊行物がそれと関連して引用される方法および／または組成物を開示し記述するために、参照により本明細書に組み込まれる。いかなる刊行物の引用も出願日前の開示に対するものであり、先行発明であるとの理由で、本組成物および本方法が、そのような刊行物に先行する資格がないということを承認していると解釈されるべきではない。さらに、示された刊行日は、実際の刊行日と異なっている可能性があり、独立して確認する必要があり得る。
【００２９】
この発明の詳細な説明に基づき、以下の略語および定義が使用される。文脈中に明らかな別段の記載がない限り、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」には複数の参照対象が含まれることに注意すべきである。したがって、例えば、「１つの酵素（ａｎ  ｅｎｚｙｍｅ）」と言った場合は、複数のそのような酵素を含み、「その用量（ｔｈｅ  ｄｏｓａｇｅ）」といった場合は、１以上の用量および当業者に知られたそれに等価なものを含む、などである。
【００３０】
さらに、特許請求の範囲が任意選択要素を排除するように記載されている可能性があることにも留意すべきである。したがって、ここで述べることは、特許請求範囲の構成要件の記載に関連して「単に（ｓｏｌｅｌｙ）」、「唯一の（ｏｎｌｙ）」などの排他的な用語を使用する場合、または「負の」の限定を使用する場合の優先的基準となることを意図している。
【００３１】
さらに、「実質的に〜から構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」との用語は、本明細書で使用されるとき、その用語の後に記載されている成分が、全量が全組成物の３０重量％未満であって、その成分の作用または活性に貢献も阻害もしない他の知られた成分の存在下にある組成物を指すことに留意すべきである。
【００３２】
さらに、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、本明細書で使用されるとき、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の後に記載の成分を含むが、それに限定されないことを意味することに留意すべきである。「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語の後に記載の成分は必要または必須であるが、その成分を含む組成物は、他の必須でないかまたは任意選択による成分をさらに含み得る。
【００３３】
また、「〜から構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語は、本明細書で使用されるとき、「〜から構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語の後に記載の成分を含み、かつ、それに限定されることを意味することに留意すべきである。「〜から構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語の後に記載される成分は、したがって、必要または必須であり、そして、その組成物には他の成分は含まれない。
【００３４】
この開示を読めば当業者には明らかなように、本明細書に記載され、説明された個々の実施形態のそれぞれは、本明細書に記載された本組成物および本方法の範囲または精神から逸脱せずに、他のいくつかの実施形態の特徴から容易に分離され、または容易に統合することができる個別の成分および特徴を有する。記載された方法はいずれも、記載された事象の順序で、または論理的に可能な他の任意の順序で実施することができる。
【００３５】
定義
本発明は、一般に、１種以上の目的タンパク質を発現および／または産生する能力が増大するよう変異（または改変）させたグラム陽性菌細胞（ならびに、その作製方法および使用方法）に関する。
【００３６】
本明細書で定義されるように、「改変細胞」、「変異細胞」、「改変細菌細胞」、「変異細菌細胞」、「改変宿主細胞」または「変異宿主細胞」は、互換的に使用され、ｓｉｎオペロンの１つ以上の遺伝子の発現を変化もしくは変更させる（すなわち、発現の増大または発現の減少）少なくとも１つの遺伝子変異を含む組み換えグラム陽性菌細胞を指し得る。例えば、本開示の「変異」グラム陽性菌細胞は、さらに、親細菌細胞から誘導される「変異細胞」と定義され得、その変異（娘）細胞は、ｓｉｎオペロン中の１つ以上の遺伝子の発現を減少させる、少なくとも１つの遺伝子変異を含む。
【００３７】
本明細書で定義されるように、「非改変細胞」、「非変異細胞」、「非改変細菌細胞」、「非変異細菌細胞」、「非改変宿主細胞」または「非変異宿主細胞」は、互換的に使用され、ｓｉｎオペロンの１つ以上の遺伝子の発現を減少させる少なくとも１つの遺伝子変異を含まない「非変異」「親」グラム陽性菌細胞を指し得る。ある実施形態では、非変異グラム陽性菌細胞は、「対照細胞」または「非変異グラム陽性菌「対照」細胞」と呼ばれる。
【００３８】
例えば、本開示のある実施形態は、ＰＯＩを多量に発現する「変異」グラム陽性菌細胞であって、その多量に発現するＰＯＩの量は、「非変異」グラム陽性菌細胞（すなわち、非変異グラム陽性菌「対照」細胞）における同じＰＯＩの発現と比較したものである細胞に関する。
【００３９】
したがって、本明細書で定義されるように、「非変異細菌細胞」、「非変異グラム陽性菌細胞」、「非変異陽性菌「対照」細胞」などの用語または句が、本開示の１種以上の「変異細菌細胞」と比較する中で使用される場合、変異（娘）細胞も非変異親（対照）細胞も実質的に同じ条件および培地で増殖／培養されると理解される。
【００４０】
本明細書で定義されるように、ｓｉｎ（胞子形成抑制）オペロンは、少なくともｓｉｎＩ（ｓｉｎＲのインヒビター）タンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびｓｉｎＲ（リプレッサー）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、さらに、ｓｉｎＲおよび／もしくはｓｉｎＩ遺伝子、またはそのポリヌクレオチド配列と機能可能に結合または挿入された５’および３’制御ヌクレオチド配列を含み得る（例えば、Ｇａｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １６８：８６０−８６９，１９８６を参照）。ある実施形態では、ｓｉｎオペロンのｓｉｎＲ遺伝子（またはｓｉｎＲ遺伝子から誘導されたｓｉｎＲポリヌクレオチド）は、配列番号１のｓｉｎＲポリヌクレオチドと少なくとも６０％の核酸配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００４１】
「オペロン」は、本明細書で使用されるとき、共通のプロモーターから単一の転写単位として転写され、それによって同時制御される、連続する一群の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、オペロンは、複数の異なるｍＲＮＡの転写を駆動する複数のプロモーターを含み得る（例えば、図１に示すｐｈｄオペロンのプロモーターを参照）。
【００４２】
本明細書で定義されるように、「発現の増大」、［ＰＯＩ発現の増大］、「産生の増大」、「ＰＯＩ産生の増大」などの用語は、ｓｉｎオペロンの１つ以上の遺伝子の発現を減少させる少なくとも１つの遺伝子変異を含む「変異」（娘）細菌細胞）を指す。ここで、「増大させる」は常に、同じＰＯＩを発現する「非変異」（親）細菌（対照）細胞と比較した（に対する（ｖｉｓ−ａ−ｖｉｓ））ものである。
【００４３】
本明細書で定義されるように、少なくとも１つのポリヌクレオチドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、その遺伝子、またはそのベクターを「細菌細胞へ導入する」などの句で使用される「導入する」という用語は
【００４４】
本明細書で定義されるように、「オープンリーディングフレーム」（以下「ＯＲＦ」）という用語は、（ｉ）開始コドン、（ｉｉ）アミノ酸を示す一連の２以上のコドン、および（ｉｉｉ）終止コドンからなる連続するリーディングフレームを含む核酸または核酸配列（天然由来であるか、天然由来でないか、また合成であるかにかかわらず）を意味し、ＯＲＦは、５’から３’の方向に読まれる（または、翻訳される）。
【００４５】
本明細書に記載されるポリヌクレオチドには、「遺伝子」が含まれ、本明細書に記載される核酸分子には、「ベクター」または「プラスミド」が含まれると理解される。したがって、「遺伝子」という用語は、あるタンパク質の全てまたは一部を構成する特定のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを指し、例えば、遺伝子が発現する条件を決定するプロモーター配列などの調節（非転写）ＤＮＡ配列を含み得る。遺伝子の転写領域は、イントロン、５’−非翻訳領域  （ＵＴＲ）および３’−ＵＴＲを含む非翻訳領域（ＵＴＲ）、ならびにコード配列を含み得る。
【００４６】
本明細書で使用されるとき、「プロモーター」という用語は、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を調節することができる核酸配列を指す。一般に、コード配列は、プロモーター配列の３’（下流）に位置する。プロモーターはその全体が天然遺伝子に由来してもよく、また、天然に存在する異なるプロモーターに由来する異なるエレメントで構成されていてもよく、さらに、合成された核酸フラグメントを含んでもよい。種々のプロモーターが、種々の細胞型で、種々の生育段階で、または種々の環境もしくは生理的条件に応じて遺伝子の発現を指示することは、当業者には理解されている。殆どの細胞型で最も多く遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは、一般に、「構成的プロモーター」と呼ばれている。殆どの場合、調節配列の正確な境界は完全には明らかになっていないため、種々の長さのＤＮＡフラグメントが同じ活性を有し得ることがさらに確認されている。
【００４７】
本明細書で使用されるとき、「機能可能に結合される」という用語は、一方の機能が他方により影響されるような、単一の核酸フラグメント上の核酸配列の結合を指す。例えば、プロモーターがコード配列の発現に影響を及ぼすことができる（すなわち、コード配列がプロモーターの転写調節下にある）とき、それはコード配列に機能可能に結合している。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向に調節配列に機能可能に結合することができる。
【００４８】
ベクターはまた、本来エピソームでない、裸のＲＮＡポリヌクレオチド、裸のＤＮＡポリヌクレオチド、同じ鎖内にＤＮＡとＲＮＡの両方を含むポリヌクレオチド、ポリリシン結合ＤＮＡまたはＲＮＡ、ペプチド結合ＤＮＡまたはＲＮＡ、リポソーム結合ＤＮＡなどであり得、または、アグロバクテリウム属（ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）またはバクテリウム属（ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）などの、１つ以上の上記ポリヌクレオチドコンストラクトを含む有機体であり得る。
【００４９】
本明細書で定義されるように、遺伝子配列、ＯＲＦ配列またはポリヌクレオチド配列に関する「発現」または「発現した」という用語は、遺伝子、ＯＲＦまたはポリヌクレオチドの転写、および、場合により、その結果得られたｍＲＮＡ転写産物のタンパク質への翻訳を指す。したがって、この文脈から明らかなように、タンパク質の発現は、オープンリードフレーム配列の転写および翻訳により生じる。宿主微生物における目的生成物の発現レベルは、宿主内に含まれる対応するｍＲＮＡ量、または選択された配列によってコードされた目的生成物の量に基づいて決まり得る。例えば、選択された配列から転写されたｍＲＮＡは、ＰＣＲまたはノーザンハイブリダイゼーションにより定量化し得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９を参照）。選択された配列によってコードされたタンパク質は、種々の方法により（例えば、ＥＬＩＳＡ、タンパク質の生物活性の測定、または、ウエスタンブロット法もしくは放射免疫測定法などの、そのような活性とは無関係の、タンパク質を認識し結合反応する抗体を用いる測定法により）定量化し得る。遺伝子（または、そのポリヌクレオチド）と関連する「発現」という用語は、遺伝子（または、そのポリヌクレオチド）の核酸配列に基づいてタンパク質を産生するプロセスをいい、したがって、転写および翻訳の両方を含む。
【００５０】
本明細書で定義されるように、ｓｉｎオペロンから誘導されるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写体は、少なくとも、ｓｉｎＲタンパク質の全てまたは一部をコードするｍＲＮＡ転写体を含む。
【００５１】
本明細書で定義されるように、ｓｉｎオペロンの１つ以上の遺伝子の発現を減少させる「遺伝子変異」としては、限定はされないが、ミスセンス変異、フレームシフト変異、ナンセンス変異、挿入変異、および欠失変異などが挙げられる。
【００５２】
「変異」という用語は、本明細書で使用されるとき、核酸またはコードされたポリペプチドの変化をもたらす（すなわち、野生型の核酸またはポリペプチド配列に対する）核酸の修飾を示す。変異には、遺伝子のタンパク質コード領域内で起こる変化、およびタンパク質コード配列外の領域（限定はされないが、例えば、調節配列またはプロモーター配列）で起こる変化が含まれる。したがって、遺伝子変異は、任意の型の変異であり得る。
【００５３】
ある実施形態では、遺伝子が変異（修飾）された微生物のゲノムの一部が、１つ以上の異種（外来性の）ポリヌクレオチドで置き換えられ得る。
【００５４】
本明細書で使用されるとき、「バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属」または「バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属のメンバー」は、当該技術分野で知られる「バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）」属の全ての種、例えば、限定はされないが、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・ソノレンシス（Ｂ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、バチルス・ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、バチルス・プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ラウツス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・パブリ（Ｂ．ｐａｂｕｌｉ）、バチルス・セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・アガラドハエレンス（Ｂ．ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）、バチルス・アキバイ（Ｂ．ａｋｉｂａｉ）、バチルス・クラーキイ（Ｂ．ｃｌａｒｋｉｉ）、バチルス・シュードファーマス（Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・レヘンシス（Ｂ．ｌｅｈｅｎｓｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サークランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）、およびバチルス・チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）を含む。
【００５５】
「バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属」について、分類学的な再編成が継続的に行われていることは認識されている。したがって、この属が、再分類された種、例えば、限定はされないが、今日、「ゲオバチルス・ステアロテルモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）」という名前が付されているバチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などの生物を含むことが意図されている。酸素の存在下で耐性内生胞子を生成することが、「バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属」の重要な特徴であると考えられているが、この特徴はまた、最近、名付けられたアリサイクロバチルス属（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アンフィバチルス属（Ａｍｐｈｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アネウリニバチルス（Ａｎｅｕｒｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アノキシバチルス（Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、フィロバチルス（Ｆｉｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、グラシリバチルス（Ｇｒａｃｉｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、ハロバチルス（Ｈａｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、サリバチルス（Ｓａｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、テルモバチルス（Ｔｈｅｒｍｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ウレイバチルス（Ｕｒｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ）およびバルジバチルス（Ｖｉｒｇｉｂａｃｉｌｌｕｓ）にも当てはまる。
【００５６】
本明細書で使用されるとき、「核酸」は、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列、およびそのフラグメントまたは一部、ならびに、センス鎖であるかアンチセンス鎖であるかにかかわらず、二本鎖であっても一本鎖であってもよいゲノムまたは合成起源のＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびＲＮＡを指す。遺伝子コードの縮退の結果として、多くのヌクレオチド配列が所与のタンパク質をコードし得ることは理解されよう。
【００５７】
本明細書で使用されるとき、「ベクター」という用語は、核酸を、生物間、細胞間または細胞構成要素間で伝搬および／または移行させる手段をいう。ベクターとしては、ウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、プラスミド、ファージミド、トランスポゾン、ならびに、ＹＡＣ（酵母人工染色体）、ＢＡＣ（細菌人工染色体）およびＰＬＡＣ（植物人工染色体）などの人工染色体が挙げられる。これらは、「エピソーム」、すなわち、自律的に複製するか、または宿主微生物の染色体に組み込むことができる。「発現ベクター」は、異質細胞に異種ＤＮＡを組み込み、発現させる能力を有するベクターである。多くの原核細胞発現ベクターおよび真核細胞発現ベクターが商業的に入手可能である。「ターゲティングベクター」は、形質転換する宿主細胞の染色体の領域に相同のポリヌクレオチド配列を含み、その領域で相同組み換えを行わせるベクターである。ターゲティングベクターは、相同組み換えによって細胞の染色体に変異を導入するのに使用される。いくつかの実施形態では、ターゲティングベクターは、他の非相同配列、例えば、末端に加えられた配列（すなわち、スタッファー配列またはフランキング配列を含む。末端は、例えば、ベクターへの挿入など、ターゲティングベクターが閉環するように閉じることができる。適切なベクターの選択および／または構成は、当業者の知識の範囲内である。
【００５８】
本明細書で使用されるとき、「プラスミド」という用語は、クローニングベクターとして使用され、多くの細菌や真核生物において染色体外の自己複製遺伝因子を形成する、環状の二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡコンストラクを指す。いくつかの実施形態では、プラスミドは宿主細胞のゲノムに組み込まれる。
【００５９】
「精製」、「単離」または「富化」は、生体分子（例えば、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド）が、本来結合している、天然に存在するいくつかの構成要素または全ての構成要素から分離することによって、その天然状態から改変されることを意味する。そのような単離または精製は、イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、疎水性分離、透析、プロテアーゼ処理、硫安沈澱または他のタンパク質塩析、遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィ、濾過、精密濾過、ゲル電気泳動、または勾配による分離など、最終組成物中に望ましくない全細胞、細胞残屑、不純物、外来タンパク質、もしくは酵素を除く、当該技術分野で知られた分離技術によって行うことができる。精製または単離した生体分子組成物には、その後さらに、追加の便益を付与する構成要素、例えば、活性化剤、抗阻害剤、望ましいイオン、ｐＨ調節化合物、または他の酵素もしくは化学物質を添加することができる。
【００６０】
本明細書で使用されるとき、「選択可能マーカー」または「選択マーカー」という用語は、宿主細胞で発現することができる核酸（例えば、遺伝子）を指し、その核酸を含む宿主の選択を容易にする。そのような選択可能マーカーの例としては、限定はされないが、抗微生物剤が挙げられる。したがって、「選択可能マーカー」という用語は、宿主細胞が導入ＤＮＡを取りいれたか、または何らかの他の反応が起こったことを示す遺伝子を指す。通常、選択可能マーカーは、形質転換中に外来性の配列を受け取っていない細胞から外来性ＤＮＡを含む細胞を区別することを可能にする抗微生物剤耐性または代謝有利性を宿主細胞に付与する遺伝子である。本発明に有用な他のマーカーとしては、限定はされないが、トリプトファンなどの栄養要求性マーカー、およびβ−ガラクトシダーゼなどの検出マーカーが挙げられる。
【００６１】
遺伝子の「不活化」は、遺伝子の発現、またはそのコードされた生体分子の活性が遮断されるか、またはその既知の機能を働かせることができないことを意味する。不活化は、任意の適切な手段、例えば、上記のような遺伝子変異により発生し得る。一実施形態においては、不活化遺伝子の発現産物は、タンパク質の生物活性に対応する変化を有するトランケートタンパク質である。いくつかの実施形態では、変異グラム陽性菌株は、好ましくは、安定で非可逆的な不活化をもたらす１つ以上の遺伝子をの不活化を含む。
【００６２】
いくつかの実施形態では、不活化は、欠失によって行われる。いくつかの実施形態では、欠失の標的とされた領域（例えば、遺伝子）は、相同組み換えによって欠失される。例えば、欠失の標的とされた領域に相同な配列が各側に存在する選択マーカーを有する入来（ｉｎｃｏｍｉｎｇ）配列を含むＤＮＡコンストラクトが使用される（ここで、これらの配列は、本明細書において、「相同ボックス」と呼ばれ得る）。ＤＮＡコンストラクトが宿主染色体の相同配列と並び、ダブルクロスオーバー事象で、欠失の標的とされた領域が宿主染色体から切り出される。
【００６３】
「挿入」または「付加」は、天然に存在する配列、または親配列と比較して、それぞれ１つ以上のヌクレオチド残基またはアミノ酸残基が付加されるヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の変化である。
【００６４】
本明細書で使用されるとき、「置換」は、それぞれ異なるヌクレオチドまたはアミノ酸による一つ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の置き換えによって生じる。
【００６５】
遺伝子を変異させる方法は、当該技術分野ではよく知られており、例えば、限定はされないが、部位特異的変異、ランダム変異の生成、およびギャップ二本鎖法が挙げられる（例えば、米国特許第４，７６０，０２５号明細書；Ｍｏｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．２：６４６，１９８４；およびＫｒａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２：９４４１，１９８４を参照）。
【００６６】
本明細書で使用されるとき、「相同遺伝子」は、異なるものの、通常、関連する種の１対の遺伝子を指し、それらは、互いに対応し、かつ同一であるか、または非常に類似している。この用語は、種分化（すなわち、新しい種の開発）によって分離される遺伝子（例えば、オルソロガス遺伝子）、および遺伝子複製によって分離された遺伝子（例えば、パラロガス遺伝子）を包含する。
【００６７】
本明細書で使用されるとき、「オルソログ」および「オルソロガス遺伝子」は、種分化によって共通の先祖遺伝子（すなわち、相同遺伝子）から生じた、異なる種の遺伝子を指す。通常、オルソログは、進化の過程で同じ機能を保持している。オルソログの同定は、新しく配列が決定されたゲノムにおける遺伝子機能の信頼性の高い予測に使用される。
【００６８】
本明細書で使用されるとき、「パラログ」および「パラロガス遺伝子」は、ゲノム内での複製に関係する遺伝子を指す。オルソログが進化の過程を通して同じ機能を保持し、一方、パラログは、いくつかの機能は多くは元の機能に関連するものの、新しい機能を生じる。パラログ遺伝子の例としては、限定はされないが、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼおよびトロンビン（これらはいずれも、セリンプロテイナーゼであり、同じ種において同時に発生する）をコードする遺伝子が挙げられる。
【００６９】
本明細書で使用されるとき、「相同性」は、配列の類似性または同一性を指し、好ましくは同一性である。この相同性は、当該技術分野で知られた標準的な手法によって決定される（例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２：４８２［１９８１］；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３［１９７０］；Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４［１９８８］；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡなどのプログラム；ならびにＤｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１２：３８７−３９５［１９８４］を参照）。
【００７０】
本明細書で使用されるとき、「アナログ配列」は、遺伝子の機能が、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株１６８から示される遺伝子と実質的に同じ配列である。さらに、アナログ遺伝子は、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株１６８遺伝子の配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を含む。あるいは、アナログ配列は、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８の領域で見られる７０〜１００％の遺伝子のアライメントを有し、かつ／またはバチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８の染色体の遺伝子と一致する領域で見られる少なくとも５〜１０の遺伝子を有する。さらなる実施形態では、上記特性の２つ以上が配列に当てはまる。アナログ配列は、既知のシーケンスアライメント法で決定される。一般に使用されるアライメント法はＢＬＡＳＴであるが、上記および下記に示すように、他の方法も配列の決定に使用される。
【００７１】
有用なアルゴリズムの一例がＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、プログレッシブ、ペアワイズアライメントを用いて、関連する一群の配列からマルチプルシーケンスアライメントを作成する。それはまた、アライメントの作成に使用するクラスタリング関係を示すツリーをプロットすることができる。ＰＩＬＥＵＰは、ＦｅｎｇおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅのプログレッシブアライメント法の簡略化を用いる（Ｆｅｎｇ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．，３５：３５１−３６０［１９８７］）。この方法はＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐが記載したものと類似している（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３［１９８９］）。有用なＰＩＬＥＵＰパラメータは、初期設定ギャップウエイト３．００、初期設定ギャップ長ウエイト０．１０、および加重エンドギャップを含む。
【００７２】
有用なアルゴリズムの他の例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、Ａｌｔｓｃｈｕｌらにより説明されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０，［１９９０］；およびＫａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７［１９９３］）。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２６６：４６０−４８０［１９９６］を参照）。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２はいくつかのサーチパラメータを使用し、その殆どは初期値に設定されている。調節可能なパラメータは以下の値に設定する：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、言語閾値（Ｔ）＝１１。ＨＳＰ  ＳおよびＨＳＰ  Ｓ２パラメータは動的値であり、特定配列の組成物、および目的配列がサーチされる特定のデータベースの組成物に応じて、プログラム自体により設定される。しかしながら、これらの値は感度を増大させるために調節することができる。Ａ％のアミノ酸配列同一性値は、適合同一残基の数をアライメント領域の「より長い」配列の残基の合計数で割ることにより決定する。「より長い」配列は、アライメント領域において実際に存在している残基を最も有する配列である（アライメントスコアを最大化するためにＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２により導入されたギャップは無視する）。
【００７３】
本明細書で使用されるとき、本明細書において同定されているアミノ酸またはヌクレオチド配列に関する「配列同一性パーセント（％）」は、配列をアライメントし、最大パーセントの配列同一性を達成するために必要に応じてギャップを導入した後の、目的配列のアミノ酸残基またはヌクレオチドと同一である、候補配列におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドの割合として定義され、いかなる同類置換も配列同一性の一部として考慮しない。
【００７４】
「ホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）」（または「ホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」は、対象アミノ酸配列および対象ヌクレオチド配列と特定の同一性を有する実在物を意味するであろう。相同配列は、従来の配列アライメントツール（例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ、ＢＬＡＳＴなど）を使用して、対象配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含み得る。別段の規定がなければ、ホモログは、通常、対象アミノ酸配列と同じ活性部位残基を含むであろう。
【００７５】
配列アライメントを行い、配列の同一性を決定する方法は、当業者には知られており、過度の実験をせずとも行うことができ、同一性の値を明確に算出することができる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １９（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；およびＡＬＩＧＮ  ｐｒｏｇｒａｍ（Ｄａｙｈｏｆｆ（１９７８）  ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５：Ｓｕｐｐｌ．３（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）を参照されたい。配列のアライメントおよび配列同一性の決定に多くのアルゴリズムを利用することができ、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アライメントアルゴリズム；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所相同性アルゴリズム；Ｐｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４の類似性探索法；Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７０：１７３−１８７（１９９７））；ならびに、ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０を参照）が挙げられる。
【００７６】
これらのアルゴリズムを使用したコンピュータプログラムも利用可能であり、限定はされないが、ＡＬＩＧＮもしくはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア、またはＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．，２６６：４６０−４８０（１９９６））；あるいはＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）パッケージ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）で利用可能なＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ；ならびにＩｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によるＰＣ／ＧｅｎｅプログラムのＣＬＵＳＴＡＬが挙げられる。当業者は、アライメントを測定するために、比較する配列の長さ全体で最大限のアライメントを達成するのに必要なアルゴリズムも含めて、適切なパラメータを決定することができる。配列同一性は、プログラムで決められている既定のパラメータを使用して決定することが好ましい。具体的には、配列同一性は、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０）を、既定のパラメータ、すなわち、
Ｇａｐ  ｏｐｅｎｉｎｇ  ｐｅｎａｌｔｙ：１０．０
Ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ：０．０５
Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＳＵＭ  ｓｅｒｉｅｓ
ＤＮＡ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍａｔｒｉｘ：ＩＵＢ
Ｄｅｌａｙ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ％：４０
Ｇａｐ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｄｉｓｔａｎｃｅ：８
ＤＮＡ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ  ｗｅｉｇｈｔ：０．５０
Ｌｉｓｔ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ：ＧＰＳＮＤＱＥＫＲ
Ｕｓｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｍａｔｒｉｘ：ＯＦＦ
Ｔｏｇｇｌｅ  Ｒｅｓｉｄｕｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｅｎａｌｔｉｅｓ：ＯＮ
Ｔｏｇｇｌｅ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｐｅｎａｌｔｉｅｓ：ＯＮ
Ｔｏｇｇｌｅ  ｅｎｄ  ｇａｐ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙＯＦＦ
で使用して決定することができる。
【００７７】
本明細書で使用されるとき、「ハイブリダイゼーション」という用語は、当該技術分野で知られた塩基対合により、核酸鎖を相補鎖と接合させるプロセスを指す。
【００７８】
核酸配列は、２つの配列が中〜高ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件および洗浄条件下でお互いに特異的にハイブリダイズする場合、対照核酸配列に「選択的にハイブリダイズ可能」であると考えられる。ハイブリダイゼーション条件は核酸結合複合体またはプローブの融解温度（Ｔｍ）に基づいている。例えば、「最大ストリンジェンシーは、通常、約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍより５℃低い）で起こり、「高ストリンジェンシー」は、Ｔｍより約５〜１０℃低い温度で起こり；「中間ストリンジェンシー」は、プローブのＴｍより約１０〜２０℃低い温度で起こり；そして「低ストリンジェンシー」はＴｍより約２０〜２５℃低い温度で起こる。機能上、最大ストリンジェンシー条件はハイブリダイゼーションプローブと厳密な同一性、またはほぼ厳密な同一性を有する配列を同定するために用いることができ、一方、中間または低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションはポリヌクレオチド配列ホモログを同定または検出するために用いることができる。
【００７９】
中〜高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は当該技術分野ではよく知られている。高ストリンジェンシー条件の例としては、５０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ、５ＸＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌ変性キャリアＤＮＡ中、約４２℃でハイブリダイゼーションし、続いて２ＸＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ中、室温で２回洗浄し、さらに、０．１ＸＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳ中、４２℃で２回洗浄することが挙げられる。中ストリンジェント条件の例としては、２０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸３ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５Ｘデンハルト溶液、１０％硫酸デキストランおよび２０ｍｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中、３７℃で終夜インキュベートし、続いて１ＸＳＳＣ中、約３７〜５０℃でフィルターを洗浄することが挙げられる。プローブ長などの因子を適合させるために必要な温度、イオン強度などの調節の仕方は、当業者であれば知っている。
【００８０】
「組み換え体」という用語は、生物学的構成要素または組成物（例えば、細胞、核酸、ポリペプチド／酵素、ベクターなど）に関連して使用されるとき、それらの生物学的構成要素または組成物が天然では見られない状態のものであることを示す。言い換えれば、生物学的構成要素または組成物は、人の介入によって天然状態が変えられている。例えば、組み換え細胞は、天然の親（すなわち、非組み換え）細胞中には存在しない１つ以上の遺伝子を発現する細胞、１つ以上の天然遺伝子を天然親細胞とは異なる量で発現する細胞、および／または１つ以上の天然遺伝子を天然親細胞とは異なる条件下で発現する細胞を包含する。組み換え核酸は、天然配列と１つ以上のヌクレオチドが異なっている、異種配列（例えば、異種プロモーター、非天然または変異シグナル配列をコードする配列など）に機能可能に結合している、イントロンを欠いている、および／または単離された形態にあり得る。組み換えポリペプチド／酵素は、天然配列と１つ以上のアミノ酸が異なっている、トランケートされるか、もしくはアミノ酸の内部欠失を有する、天然細胞に見られない態様で（例えば、ポリペプチドをコードする発現ベクターが細胞中に存在することにより、ポリペプチドを過剰発現する組み換え細胞から）発現する、および／または単離された形態にあり得る。いくつかの実施形態では、組み換えポリヌクレオチド、またはポリペプチド／酵素が、その野生型の相手と同一の配列を有するが、非天然形態（例えば、単離、または富化された形態）であることが強調されている。
【００８１】
本明細書で使用されるとき、「標的配列」という用語は、入来配列が宿主細胞ゲノム内に挿入されることが望ましい配列をコードする宿主細胞中のＤＮＡ配列を指す。いくつかの実施形態においては、標的配列は野生型機能遺伝子またはオペロンをコードし、一方、他の実施形態においては、標的配列は変異機能遺伝子またはオペロンまたは非機能遺伝子またはオペロンをコードする。
【００８２】
本明細書で使用されるとき、「フランキング配列」は、対象配列の上流または下流にある配列を指す（例えば、遺伝子Ａ−Ｂ−Ｃでは、遺伝子ＢがＡおよびＣ遺伝子配列にフランキングされている）。一実施形態においては、入来配列の両側に相同ボックスがフランキングしている。他の実施形態においては、入来配列および相同ボックスは両側にスタッファー配列がフランキングしている単位を含む。いくつかの実施形態では、フランキング配列は一方の側（３’または５’）にのみ存在するが、ある実施形態では、フランキングされている配列の両側に存在する。各相同ボックスの配列は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）染色体の配列に相同である。これらの配列は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）染色体に新しいコンストラクトが組み込まれ、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）染色体の一部が入来配列により置換されることを目的とする。一実施形態において、選択マーカーの５’および３’末端は、不活化染色体断片の一部を含むポリヌクレオチド配列によってフランキングされている。いくつかの実施形態では、フランキング配列は一方の側（３’または５’）にのみ存在するが、ある実施形態では、フランキングされている配列の両側に存在する。
【００８３】
本明細書で使用されるとき、「増幅性マーカー」、「増幅性遺伝子」および「増幅ベクター」という用語は、適当な増殖条件下で遺伝子の増幅を可能にする遺伝子をコードする遺伝子またはベクターを指す。
【００８４】
「鋳型特異性」は、酵素を選択することにより、殆どの増幅技術において達成される。増幅酵素は、その使用条件下で、核酸の異種混合物中、核酸の特定の配列のみを処理する酵素である。例えば、Ｑβレプリカーゼの場合、ＭＤＶ−１  ＲＮＡがレプリカーゼの特異的鋳型である（例えば、Ｋａｃｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９：３０３８［１９７２］を参照）。その他の核酸は、この増幅酵素によっては複製されない。同様に、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの場合、この増幅酵素はそれ自身のプロモーターにストリンジェントな特異性を有する（Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２２８：２２７［１９７０］を参照）。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの場合、連結接合部分にオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド基質とテンプレートとの間に不整合が存在すると、この酵素は２つのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを連結しない（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：５６０［１９８９］を参照）。最後に、ＴａｑおよびＰｆｕポリメラーゼは、高温で機能する能力を有するため、結合する配列に高い特異性を示すことが分かっており、それゆえ、プライマーにより確定され、高温が、標的配列とのプライマーハイブリダイゼーションに有利に働き、非標的配列とのハイブリダイゼーションには有利でない熱力学的条件を生じさせる。
【００８５】
本明細書で使用されるとき、「増幅性核酸」という用語は、任意の増幅方法により増幅され得る核酸を指す。「増幅性核酸」は、通常、「サンプルテンプレート」を含むと考えられる。
【００８６】
本明細書で使用されるとき、「サンプルテンプレート」という用語は、「標的」（下記に定義）の存在を分析するサンプルから生じる核酸を指す。一方、「バックグラウンドテンプレート」は、サンプルテンプレート以外の核酸に関して用いられ、サンプル内に存在していてもいなくてもよい。バックグラウンドテンプレートは、殆どの場合、故意のものではない。それは、キャリーオーバーの結果、またはサンプルから精製すべき核酸汚染物質の存在によるものであり得る。例えば、検出すべき生物以外の生物由来の核酸は試験サンプル内のバックグラウンドとして存在し得る。
【００８７】
本明細書で使用されるとき、「プライマー」という用語は、精製制限消化などにおいて自然に生成されるか、合成的に生成されるかにかかわらず、核酸鎖に相補的なプライマー伸長生成物の合成が誘導される条件下に置かれた場合（すなわち、ヌクレオチド、およびＤＮＡポリメラーゼなどの誘発剤の存在下、適切な温度およびｐＨで）、合成開始点として作用し得るオリゴヌクレオチドを指す。増幅効率を最大にするためには、プライマーは一本鎖であることが好ましいが、あるいは二本鎖であってもよい。二本鎖の場合、プライマーは、伸長生成物の生成に使用する前にまず、その鎖を分離する処理を行う。プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドであることが好ましい。プライマーは、誘発剤の存在下、伸長生成物の合成を開始するため、十分に長くなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマー源、および使用方法などの多くの因子に左右される。
【００８８】
本明細書で使用されるとき、「プローブ」という用語は、精製制限消化などにおいて自然に生成されるか、合成、組み換え、またはＰＣＲ増幅により生成されるかにかかわらず、他の目的のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド（すなわちヌクレオチド配列）を指す。プローブは一本鎖であっても二本鎖であってもよい。プローブは、特定の遺伝子配列の検出、同定および単離に有用である。本発明で使用されるプローブはいずれも任意の「レポーター分子」で標識されるため、任意の検出システム、例えば、限定はされないが、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡ、および酵素をベースとした組織化学的分析）、蛍光、放射性および発光性システムなどにおいて検出されると考えられる。本発明を特定の検出システムまたは標識に限定することは意図されていない。
【００８９】
本明細書で使用されるとき、「標的」という用語は、ポリメラーゼ連鎖反応に関して用いる場合、ポリメラーゼ連鎖反応に用いるプライマーによって結合される核酸領域を指す。したがって、「標的」は、他の核酸配列から選別されようとするものである。「断片」は、標的配列内の核酸領域と定義される。
【００９０】
本明細書で使用されるとき、「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）という用語は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，６８３，１９５号明細書、同第４，６８３，２０２号明細書および同第４，９６５，１８８号明細書に記載の方法を指し、例えば、クローニングまたは精製することなくゲノムＤＮＡの混合物において標的配列の断片濃度を増加させる方法が挙げられる。標的配列を増幅させるこのプロセスは、所望の標的配列を含むＤＮＡ混合物に過剰な２つのオリゴヌクレオチドプライマーを導入し、続いて、ＤＮＡポリメラーゼの存在下、熱サイクルの正確な配列を行うことからなる。２つのプライマーは、二本鎖標的配列のそれぞれの鎖に相補的である。増幅させるために、混合物を変性させ、その後、プライマーを標的分子内のそれらの相補配列にアニールする。アニーリングに続いて、プライマーを新しい相補鎖ペアを形成するためにポリメラーゼを用いて伸長する。変性、プライマーアニーリングおよびポリメラーゼ伸長の工程は何回も繰り返すことができ（すなわち、変性、アニーリングおよび伸長が１「サイクル」を構成し、多数の「サイクル」を行うことができる）、所望の標的配列の増幅断片を高濃度で得ることができる。所望の標的配列の増幅断片の長さは、互いのプライマーの相対位置により決定され、したがって、この長さは制御可能なパラメータである。このプロセスが繰り返されることから、この方法は、「ポリメラーゼ連鎖反応」（以下、「ＰＣＲ」と記す）と呼ばれる。標的配列の所望の増幅断片は混合物中で主要な配列（濃度に関して）となるので、それらは「ＰＣＲ増幅された」という。
【００９１】
本明細書で使用されるとき、「増幅試薬」という用語は、プライマー、核酸テンプレートおよび増幅酵素以外の増幅に必要な試薬（デオキシリボヌクレオチド３リン酸、バッファなど）を指す。通常、増幅試薬は、その他の反応成分とともに、反応容器（試験管、マイクロウェルなど）内に加え、含有される。
【００９２】
ＰＣＲを用いて、ゲノムＤＮＡ中の特定の標的配列の１つのコピーを、いくつかの異なる方法（例えば、標識プローブを用いるハイブリダイゼーション；ビオチン化プライマー組み込み後のアビジン−酵素結合の検出；ｄＣＴＰまたはｄＡＴＰなどの３２Ｐ標識デオキシヌクレオチド３リン酸の増幅断片への組み込み）で検出可能なレベルにまで増幅することができる。ゲノムＤＮＡに加えて、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列を、適当なプライマー分子のセットを用いて増幅することができる。特に、ＰＣＲプロセスにより作成された増幅断片はそれ自身、続くＰＣＲ増幅の効率的な鋳型となる。
【００９３】
本明細書で使用されるとき、「ＰＣＲ産物」、「ＰＣＲフラグメント」および「増幅生成物」という用語は、変性、アニーリングおよび伸長のＰＣＲ工程の２以上のサイクル完了後に得られる化合物の混合物を指す。これらの用語は、１つ以上の標的配列の１つ以上の断片の増幅が行われた場合を包含する。
【００９４】
本明細書で使用されるとき、「ＲＴ−ＰＣＲ」という用語は、ＲＮＡ配列の複製および増幅を指す。この方法では、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，３２２，７７０号明細書に記載されているように、殆どの場合、熱安定性ポリメラーゼを用いる１つの酵素手順を用いて、逆転写をＰＣＲと組み合わせる。ＲＴ−ＰＣＲにおいては、ＲＮＡテンプレートが、ポリメラーゼの逆転写酵素活性によりｃＤＮＡに転換され、その後、ポリメラーゼの重合活性により増幅される（すなわち、他のＰＣＲ法と同様）。
【００９５】
本明細書で使用されるとき、「遺伝子変異宿主株」（例えば、遺伝子変異バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株）は、遺伝子組み換えが行われた宿主細胞を指し、組み換え宿主細胞とも呼ばれる。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え宿主細胞は、目的タンパク質の発現が、実質的に同じ条件で増殖させた、対応する非変異宿主株における同じタンパク質の発現および／または産生と比べて増強（増大）している。いくつかの実施形態では、発現レベルの増強は、ｓｉｎオペロンの１つ以上の遺伝子、例えば、ｓｉｎＲ遺伝子の発現の減少によりもたらされる。いくつかの実施形態では、変異株は、内在性の染色体領域またはそのフラグメントの１つ以上を欠失させた遺伝子組み換えバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種であり、そこでは、目的タンパク質の発現または産生レベルが、実質的に同じ条件で増殖させた、対応する非変異バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主株と比べて増強されている。
【００９６】
本明細書で使用されるとき、「染色体の組み込み」という用語は、入来配列が宿主細胞（例えば、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ））の染色体内に導入されるプロセスを指す。形質転換ＤＮＡのホモログ領域が、染色体の相同領域と整列する。続いて、相同ボックス間の配列がダブルクロスオーバーで入来配列により置換される（すなわち、相同組み換え）。いくつかの実施形態では、ＤＮＡコンストラクトの不活化染色体断片の相同部分が、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）染色体の固有染色体領域のフランキング相同領域と整列する。続いて、固有染色体領域が、ダブルクロスオーバーでＤＮＡ構築体により欠失される（すなわち、相同組換え）。
【００９７】
「相同組み換え」は、同一、またはほぼ同一のヌクレオチド配列部位における、２つのＤＮＡ分子間、または対の染色体間のＤＮＡフラグメントの交換を意味する。一実施形態では、染色体組み込みは、相同組み換えである。
【００９８】
本明細書で使用されるとき、「相同配列」は、比較のために最適に整列させた場合に、他の核酸またはポリペプチド配列に対して１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８８％、８５％、８０％、７５％または７０％の配列同一性を有する核酸またはポリペプチド配列を意味する。いくつかの実施形態では、相同配列は８５％〜１００％の配列同一性を有し、一方、他の実施形態では、９０％〜１００％の配列同一性を有し、また、より多くの実施形態では、９５％〜１００％の配列同一性を有する。
【００９９】
本明細書で使用されるとき、「アミノ酸」は、ペプチドまたはタンパク質配列、またはそれらの一部を指す。「タンパク質」、「ぺプチド」および「ポリペプチド」という用語は、互換的に使用される。
【０１００】
本明細書で使用されるとき、「目的タンパク質」および「目的ポリペプチド」は、所望の、および／または評価対象のタンパク質／ポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、目的タンパク質は細胞内にあり、さらに、他の実施形態では、それは分泌ポリペプチドである。特に好ましいポリペプチドとしては、酵素が挙げられ、酵素としては、限定はされないが、デンプン分解酵素、タンパク質分解酵素、セルロース分解酵素、酸化還元酵素および植物細胞壁分解酵素から選択される酵素が挙げられる。より具体的には、これらの酵素としては、限定はされないが、アミラーゼ、プロテアーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ラッカーゼ、フェノールオキシダーゼ、オキシダーゼ、クチナーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、エステラーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、フィターゼ、ペクチナーゼ、ペルヒドロラーゼ、ポリオールオキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、グルコシダーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、ガラクトシダーゼおよびキチナーゼが挙げられる。本発明の特定の実施形態では、目的ポリペプチドは、プロテアーゼである。いくつかの実施形態では、目的タンパク質は、シグナルペプチドに融合される分泌ポリペプチドである（すなわち、分泌されるタンパク質上でのアミノ末端伸長）。分泌タンパク質は大半が、膜透過の前駆体タンパク質のターゲッティングおよび翻訳に重要な役割を果たすアミノ末端タンパク質伸長を用いる。この伸長は、膜移動の間、またはそのすぐ後に、シグナルペプチダーゼによるタンパク質分解によって除去される。
【０１０１】
本発明のいくつかの実施形態においては、目的ポリペプチドは、ホルモン、抗体、成長因子、受容体などから選択される。本発明に包含されるホルモンとしては、限定はされないが、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、ソマトスタチン、ゴナドトロピンホルモン、バソプレシン、オキシトシン、エリスロポエチン、インスリンなどが挙げられる。成長因子としては、限定はされないが、血小板由来成長因子、インスリン様成長因子、上皮成長因子、神経成長因子、線維芽細胞成長因子、形質転換成長因子、サイトカイン、例えばインターロイキン（例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−１３）、インターフェロン、コロニー刺激因子などが挙げられる。抗体としては、限定はされないが、抗体を生成するのが望ましい任意の種から直接得られる免疫グロブリンが挙げられる。さらに、本発明は、修飾抗体を包含する。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体もまた、本発明に包含される。特に好ましい実施形態においては、抗体はヒト抗体である。
【０１０２】
本明細書で使用されるとき、ポリペプチドの「誘導体」または「変異体」は、１つ以上のアミノ酸のＣ末端およびＮ末端の一方または両方への付加、アミノ酸配列における１つまたは多くの異なる部位での１つ以上のアミノ酸の置換、ポリペプチドの一端もしくは両端での、またはアミノ酸配列の１つ以上の部位での１つ以上のアミノ酸の欠失、アミノ酸配列の１つ以上の部位での１つ以上のアミノ酸の挿入、およびこれらの任意の組み合わせによって、前駆体ポリペプチド（例えば、天然ポリペプチド）から誘導されるポリペプチドを意味する。ポリペプチドの誘導体または変異体の作製は、任意の都合の良い方法で、例えば、天然ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を変更して誘導／変異ポリペプチドを生成することにより、そのようなＤＮＡ配列を適切な宿主へ形質転換して誘導／変異ポリペプチドを生成することにより、および改変ＤＮＡ配列を発現させて誘導／変異ポリペプチドを生成することにより、行うことができる。誘導体または変異体としては、さらに、化学的に改変したポリペプチドが挙げられる。
【０１０３】
本明細書で使用されるとき、「異種タンパク質」という用語は、宿主細胞で天然には生じないタンパク質またはポリペプチドを指す。異種タンパク質の例としては、ヒドロラーゼ、例えば、プロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼおよびリパーゼ；イソメラーゼ、例えば、ラセマーゼ、エピメラーゼ、トートメラーゼまたはムターゼ；トランスフェラーゼ；キナーゼおよびホスファターゼなどの酵素が挙げられる。いくつかの実施形態においては、タンパク質は治療的に重要なタンパク質またはペプチドであり、例えば、限定はされないが、成長因子、サイトカイン、リガンド、受容体およびインヒビター、ならびにワクチンおよび抗体が挙げられる。さらなる実施形態では、タンパク質は商業的に重要な工業タンパク質／ぺプチド（例えば、プロテアーゼ、アミラーゼおよびグルコアミラーゼなどのカルボヒドラーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼおよびリパーゼ）である。いくつかの実施形態では、タンパク質をコードする遺伝子は天然に存在する遺伝子であり、一方、他の実施形態では、変異および／または合成遺伝子が使用される。
【０１０４】
本明細書で使用されるとき、「相同タンパク質」は、細胞内の天然の、すなわち、細胞内に天然に存在するタンパク質またはポリペプチドを指す。実施形態において、当該細胞はグラム陽性細胞であり、一方、特に好ましい実施形態においては、細胞はバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞である。代替の実施形態において、相同タンパク質は、他の生物、例えば、限定はされないが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などにより生成された天然タンパク質である。本発明は、組み換えＤＮＡ技術により相同タンパク質を産生する宿主細胞を包含する。
【０１０５】
本発明は、一般に、目的タンパク質の発現を増大させる遺伝子変異を有する細菌細胞、ならびに、そのような細胞を作製する方法および使用する方法に関する。本発明の態様は、ｓｉｎオペロンの遺伝子の発現を減少させ、それにより、目的タンパク質の発現を増強させる（例えば、ｓｉｎＲ遺伝子の発現の減少）遺伝子変異を有する、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種などのグラム−陽性微生物を含む。
【０１０６】
上で要約したように、本発明の態様は、グラム陽性菌細胞からの目的タンパク質の発現を増大させる方法を含み、ｓｉｎオペロン中の１つ以上の遺伝子の発現が減少するように遺伝子変異したグラム陽性細胞においては、目的タンパク質の生成が、対応する、遺伝子変換していないグラム陽性細胞（例えば、野生型および／または親細胞）における、同じ目的タンパク質の発現レベルと比較して増大するという観察に基づいている。遺伝子変異は、例えば、エピソームへの付加および／または染色体への挿入、欠失、逆位、塩基の変化などによって、宿主細胞の遺伝子構造を変化させる、宿主細胞における変化を意味する。この点において、いかなる限定も意図するものではない。
【０１０７】
ある実施形態では、方法は、ｓｉｎオペロン中の１つ以上の遺伝子の発現を減少させる少なくとも１つの遺伝子変異を含み、かつ目的タンパク質を産生することができる変異グラム陽性菌細胞を作製または得る工程と、目的タンパク質が変異グラム陽性菌細胞によって発現されるような条件下で、変異グラム陽性菌細胞を培養する工程とを含む。それによって、目的タンパク質の発現が、実質的に同じ培養条件下で増殖させた対応する非変異グラム陽性菌細胞における目的タンパク質の発現に比べて増大する。
【０１０８】
ある実施形態においては、遺伝子を変化させたグラム陽性菌細胞（または、遺伝子を変化させたグラム陽性菌細胞が由来する親細菌細胞）は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株であり得る。いくつかの実施形態では、目的バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株は、好アルカリ性である。多くの好アルカリ性バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株が知られている（例えば、米国特許第５，２１７，８７８号明細書、およびＡｕｎｓｔｒｕｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  ＩＶ  ＩＦＳ：Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，２９９−３０５［１９７２］を参照）。いくつかの実施形態では、目的バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株は、工業用バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株である。工業用バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株の例としては、限定はされないが、バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびバチルス・アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）が挙げられる。さらなる実施形態では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主菌株は、バチルス・レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サークランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）およびバチルス・メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、ならびに、上記したようなバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する他の生物からなる群から選択される。特定の実施形態では、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が使用される。例えば、米国特許第５，２６４，３６６号明細書および同第４，７６０，０２５（ＲＥ  ３４，６０６）号明細書には、本発明において使用される種々のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主菌株が記載されているが、本発明では、他の適切な菌株の使用も検討される。
【０１０９】
本明細書中に記載される遺伝子変異した細胞の親菌株（例えば、親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株）は、工業用菌種であり得、例えば、非組み換え株、天然に存在する菌株の変異株、組み換え株が挙げられる。ある実施形態では、親菌株は、組み換え宿主菌株であり、目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、その宿主に導入されている。目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの導入が親菌株で行われるが、この工程はまた、本明細書中に詳述するようなポリペプチドの産生を増大させるために既に遺伝子を変化させた菌株でも行われ得る。いくつかの実施形態では、宿主菌株は、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主菌株、例えば、組み換えバチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主菌株である。
【０１１０】
本発明の態様で使用される多くのバチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株が知られており、限定はされないが、例えば、１Ａ６（ＡＴＣＣ  ３９０８５）、１６８（１Ａ０１）、ＳＢ１９、Ｗ２３、Ｔｓ８５、Ｂ６３７、ＰＢ１７５３〜ＰＢ１７５８、ＰＢ３３６０、ＪＨ６４２、１Ａ２４３（ＡＴＣＣ  ３９，０８７）、ＡＴＣＣ  ２１３３２、ＡＴＣＣ  ６０５１、ＭＩ１１３、ＤＥ１００（ＡＴＣＣ  ３９，０９４）、ＧＸ４９３１、ＰＢＴ  １１０およびＰＥＰ  ２１１株が挙げられる（例えば、Ｈｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，７３：２１５−２２８［１９７３］；米国特許第４，４５０，２３５号明細書；同第４，３０２，５４４号明細書および欧州特許第０１３４０４８号明細書を参照）。バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）を発現宿主として使用することは、さらに、Ｐａｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．およびその他にも記載されている（Ｐａｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １９：８１−８７［１９８２］を参照；またＦａｈｎｅｓｔｏｃｋ  ａｎｄ  Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６５：７９６−８０４［１９８６］；およびＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ６９：３９−４７［１９８８］を参照）。
【０１１１】
ある実施形態では、プロテアーゼを産生する工業用バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株は、親発現宿主として働くことができる。いくつかの実施形態では、本発明でのこれらの菌株の使用は、プロテアーゼの産生効率をさらに増大させる。プロテアーゼの２種類の一般型、すなわち、中性プロテアーゼ（または「金属プロテアーゼ」）およびアルカリ性（または「セリン」）プロテアーゼは、通常、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種により分泌される。セリンプロテアーゼは、活性部位に必須のセリン残基があるペプチド結合の加水分解を触媒する酵素である。セリンプロテアーゼは、２５，０００〜３０，０００の範囲の分子量を有する（Ｐｒｉｅｓｔ，Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｒｅｖ．，４１：７１１−７５３［１９７７］を参照）。サブチリシンは、本発明で使用するセリンプロテアーゼである。様々なバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来のサブチリシン、例えば、サブチリシン１６８、サブチリシンＢＰＮ’、サブチリシンカールスバーグ、サブチリシンＤＹ、サブチリシン１４７およびサブチリシン３０９が同定され、その配列が決定されている（例えば、欧州特許４１４２７９Ｂ号明細書；国際公開第８９／０６２７９号パンフレット；およびＳｔａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５９：８１１−８１８［１９８４］を参照）。本発明のいくつかの実施形態では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主菌株は変異（ｍｕｔａｎｔ）（例えば、変異（ｖａｒｉａｎｔ））プロテアーゼを産生する。多くの参考文献が、変異プロテアーゼおよび参考文献を提示している（例えば、国際公開第９９／２０７７０号パンフレット；国際公開第９９／２０７２６号パンフレット；国際公開第９９／２０７６９号パンフレット；国際公開第８９／０６２７９号パンフレット；ＲＥ３４，６０６；米国特許第４，９１４，０３１号明細書；米国特許第４，９８０，２８８号明細書；米国特許第５，２０８，１５８号明細書；米国特許第５，３１０，６７５号明細書；米国特許第５，３３６，６１１号明細書；米国特許第５，３９９，２８３号明細書；米国特許第５，４４１，８８２号明細書；米国特許第５，４８２，８４９号明細書；米国特許第５，６３１，２１７号明細書；米国特許第５，６６５，５８７号明細書；米国特許第５，７００，６７６号明細書；米国特許第  ５，７４１，６９４号明細書；米国特許第５，８５８，７５７号明細書；米国特許第５，８８０，０８０号明細書；米国特許第６，１９７，５６７および米国特許第６，２１８，１６５号明細書を参照）。
【０１１２】
本発明においては、目的タンパク質がプロテアーゼに限定されないことに留意されたい。実際、本発明は、グラム陽性細胞において発現の増大が望まれる様々な目的タンパク質を包含する（下記に詳述する）。
【０１１３】
他の実施形態においては、本発明の態様で使用される菌株は、有用な表現型を提供する他の遺伝子におけるさらなる遺伝子変異を有し得る。例えば、次の遺伝子、ｄｅｇＵ、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＲおよびｄｅｇＱの少なくとも１つに、変異または欠失を含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種を使用することができる。いくつかの実施形態においては、変異は、ｄｅｇＵ遺伝子にある（例えば、ｄｅｇＵ（Ｈｙ）３２変異）。（Ｍｓａｄｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２：８２４−８３４［１９９０］；およびＯｌｍｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２５３：５６２−５６７［１９９７］を参照）。したがって、本発明の態様で使用される、親／遺伝子変異したグラム陽性菌株の一例は、ｄｅｇＵ３２（Ｈｙ）変異を有するバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞である。さらなる実施形態では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主は、ｓｃｏＣ４（Ｃａｌｄｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８３：７３２９−７３４０［２００１］を参照）；ｏｐｐＡまたはｏｐｐオペロンの他の遺伝子（Ｐｅｒｅｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５：１７３−１８５［１９９１］を参照）に変異または欠失を有し得る。実際、ｏｐｐＡと同じ表現型を生じさせるｏｐｐオペロンの変異はいずれも、本発明の変異バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株のいくつかの実施形態で使用されると考えられる。いくつかの実施形態では、これらの変異は単独で起こるが、一方、他の実施形態では、変異の組み合わせが存在する。いくつかの実施形態では、本発明の変異バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）は、上記遺伝子の１つ以上に対する変異を既に含む親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主菌株から得られる。代替の実施形態においては、既に遺伝子変異している本発明のバチル属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）は、上記遺伝子の１つ以上の変異を含むようさらに遺伝子操作される。
【０１１４】
上述したように、ｓｉｎオペロンの少なくとも１つの遺伝子の発現は、遺伝子変異したグラム陽性細胞においては、（実質的に同じ条件で増殖させた）野生型および／または親細胞と比較して減少する。この発現の減少は、任意の便宜の良いやり方で行うことができ、そして、それは、転写、ｍＲＮＡの安定性、翻訳のレベルに依るか、または、その活性を低下させるｓｉｎオペロンから生成される１種以上のポリペプチドの変異の存在によってであり得る（すなわち、それは、ポリペプチドの活性に基づく発現の「機能的」減少である）。したがって、遺伝子変異の種類、または、ｓｉｎオペロン中の少なくとも１つの遺伝子の発現を減少させる方法を限定することは意図されていない。例えば、いくつかの実施形態では、グラム陽性細胞の遺伝子変異は、転写活性を低下させるｓｉｎオペロン中の１つ以上のプロモーターを変化させるものである。ある実施形態では、変化は、ｍＲＮＡの転写レベルを減少させるｓｉｎオペロン（例えば、ｓｉｎＲ遺伝子）におけるサイレント変異である（例えば、実施例で示す通り）。あるいは、グラム陽性細胞の遺伝子変異は、細胞において安定性の減少した転写をもたらすｓｉｎオペロン中のヌクレオチドを変化させるものであり得る。ある実施形態では、ｓｉｎオペロンにおける１つ以上の遺伝子の発現を減少させる２以上の遺伝子変異が、遺伝子変異したグラム陽性細胞に存在する。
【０１１５】
ある実施形態では、遺伝子変異グラム陽性細胞におけるｓｉｎオペロン中の１つ以上の遺伝子の発現は、実質的に同じ培養条件で培養した野生型および／または親細胞の発現レベルの約３％、例えば、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％または約８０％にまで減少する。したがって、ｓｉｎオペロン中の１つ以上の遺伝子の発現の減少範囲は、約３％〜約８０％、約４％〜約７５％、約５％〜約７０％、約６％〜約６５％、約７％〜約６０％、約８％〜約５０％、約９％〜約４５％、約１０％〜約４０％、約１１％〜約３５％、約１２％〜約３０％、約１３％〜約２５％、約１４％〜約２０％などであり得る。上記範囲における任意の部分的範囲の発現が考えられる。
【０１１６】
ある実施形態では、変異グラム陽性菌細胞は、ｓｉｎＲ遺伝子の発現を、実質的に同じ培養条件で増殖させた対応する非変異グラム陽性菌細胞におけるこれらの遺伝子の発現と比べ、減少させた。特定の実施形態では、遺伝子変異は、変異グラム陽性菌細胞におけるｓｉｎＲ由来のｍＲＮＡの転写レベルを、実質的に同じ培養条件で増殖させた、対応する非変異グラム陽性菌細胞より低下させる。
【０１１７】
ある実施形態では、遺伝子変異（または、変異）は、ｓｉｎオペロン中のｓｉｎＲ遺伝子の減少させるものである。これらの実施形態のいくつかでは、遺伝子変異、ｓｉｎオペロンのｓｉｎＲ遺伝子に存在する。親グラム陽性細胞（すなわち、本明細書に記載されるような遺伝子変異をさせる前の細胞）中のｓｉｎＲ遺伝子は、配列番号１と少なくとも６０％同一である（例えば、配列番号１と少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一である）遺伝子である。ある実施形態では、遺伝子変異はｓｉｎＲ遺伝子の全部または一部の欠失である。ある実施形態では、遺伝子変異はサイレント変異である。ここで、サイレント変異とは、翻訳の際、コードされたポリペプチドにアミノ酸変化を生じさせない、遺伝子のコード領域の核酸配列の変異を意味する（当該技術分野でよく理解されている用語）。ある実施形態では、変異配列におけるサイレント変異は、配列番号１の３３０番目のヌクレオチドに対応するヌクレオチドの位置にある。ある実施形態では、ｓｉｎＲサイレント変異は、野生型ｓｉｎＲ遺伝子のコード配列のセンス鎖の３３０番目のヌクレオチドにおけるグアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）への単一のヌクレオチドの変化である（配列番号１はｓｉｎＲ野生型ヌクレオチド配列を示し、配列番号２はＳｉｎＲアミノ酸配列を示し、配列番号３は、Ｇ３３０Ａサイレント変異を有する、変異ｓｉｎＲヌクレオチド配列を示す）。
【０１１８】
上述したように、多くの種々のタンパク質が、グラム陽性細胞における目的タンパク質（すなわち、遺伝子変異細胞において発現が増大するタンパク質）として使用される。目的タンパク質は、相同タンパク質または異種タンパク質であり得、また、野生型タンパク質、または天然もしくは組み換え変異体であり得る。ある実施形態では、目的タンパク質は酵素であり、この酵素は、いくつかの例では、プロテアーゼ、セルラーゼ、プルラナーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、リパーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼおよびホスファターゼから選択される。ある実施形態では、目的タンパク質はプロテアーゼであり、このプロテアーゼは、サブチリシン、例えば、サブチリシン１６８、サブチリシンＢＰＮ’、サブチリシンカールスバーグ、サブチリシンＤＹ、サブチリシン１４７、サブチリシン３０９、およびこれらの変異体であり得る。ある実施形態では、目的タンパク質は蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質である（ＧＦＰ）。
【０１１９】
ある実施形態では、方法は目的タンパク質を回収する工程をさらに含む。目的タンパク質の発現／産生レベルは、遺伝子変異グラム陽性細胞ｄでは増大する（野生型／親細胞と比較して）ので、回収される目的タンパク質の量は、実質的に同じ培養条件（および、同じ規模）で培養される、対応する野生型／親細胞と比較して増大する。細胞内、または細胞外で発現したポリペプチドの発現レベル／産生を検出し測定する様々な方法が当業者に知られている。そのような方法は、本発明の使用者によって決定されるであろう。そして、それは、目的タンパク質の特性および／または活性に依るであろう。例えば、プロテアーゼでは、フォーリン法を用い、２８０ｎｍにおける吸光度を測定するか、または比色分析して測定される、カゼインまたはヘモグロビンから放出される酸可溶性ペプチドに基づく方法がある（例えば、Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ”ｖｏｌ．５，Ｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，Ｖｅｒｌａｇ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ［１９８４］を参照）。他の方法としては、発色性基質の可溶化がある（例えば、Ｗａｒｄ，“Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ，”ｉｎ  Ｆｏｇａｒｔｙ（ｅｄ．）．，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，［１９８３］，ｐｐ２５１−３１７を参照）。測定法の他の例としては、スクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−パラニトロアニリド法（ＳＡＡＰＦｐＮＡ）および２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム塩法（ＴＮＢＳ法）が挙げられる。当業者に知られた数多くのさらなる参考文献が、適切な方法を提示している（例えば、Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１：７９１１−７９２５［１９８３］；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２３：１１９−１２９［１９９４］；およびＨｓｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２４２：２２１−２２７［１９９９］を参照）。
【０１２０】
また、上述したように、目的タンパク質の分泌レベルを測定する手段として、目的タンパク質に特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を用いる免疫測定法が挙げられる。その例としては、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、および蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）は挙げられる。しかしながら、他の方法が当業者に知られており、目的タンパク質の評価に使用される（例えば、Ｈａｍｐｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＡＰＳ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ［１９９０］；およびＭａｄｄｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１５８：１２１１［１９８３］を参照）。当該技術分野で知られているように、本発明により作製される変異バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、細胞培養物からの目的タンパク質の発現および回収に適した条件下で維持され、増殖される（例えば、Ｈａｒｄｗｏｏｄ  ａｎｄ  Ｃｕｔｔｉｎｇ（ｅｄｓ．）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ［１９９０］を参照）。なお、さらに、本明細書に記載の遺伝子変異細胞は、２種以上の目的タンパク質、例えば、２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、７種以上、８種以上、９種以上、１０種以上などの目的タンパク質を発現し得る。いくつかの実施形態では、細胞から分泌される多くの様々なタンパク質を含む細菌セクレトームにおけるタンパク質の発現の増加が望まれる。
【０１２１】
本発明の態様は、タンパク質産生能の向上した変異グラム陽性菌細胞を得る方法を含む。一般に、この方法は、親グラム陽性細胞を遺伝子変異させて、ｓｉｎオペロン中の１つ以上の遺伝子の発現が減少した遺伝子変異菌株を生成する工程を含む（上記の通り）。
【０１２２】
ある実施形態では、方法は、染色体に組み込まれるか、またはエピソーム遺伝因子として保持されると、ｓｉｎオペロン中の１つ以上の遺伝子の発現が減少した遺伝子変異グラム陽性細胞を生成するポリヌクレオチド配列を親グラム陽性菌細胞に導入する工程を含む。
【０１２３】
ポリヌクレオチドベクター（例えば、プラスミドコンストラクト）を用いて、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種を形質転換して、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の染色体を変異させるか、またはエピソーム遺伝因子を維持する方法はよく知られている。ポリヌクレオチド配列をバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞に導入するのに好適な方法は、例えば、Ｆｅｒｒａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｇｅｎｅｔｉｃｓ”Ｈａｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．），Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．［１９８９］，ｐａｇｅｓ５７−７２に記載されている。Ｓａｕｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５７：７１８−７２６［１９８４］；Ｈｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，９３：１９２５−１９３７［１９６７］；Ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３：１３１−１３５［１９８６］；およびＨｏｌｕｂｏｖａ，Ｆｏｌｉａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３０：９７［１９８５］；バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）については、Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８：１１−１１５  ［１９７９］；バチルス・メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）については、Ｖｏｒｏｂｊｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，７：２６１−２６３［１９８０］；バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）については、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５１：６３４（１９８６）；バチルス・チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）については、Ｆｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３９：２１３−２１７［１９８１］；そして、バチルス・スファエリカス（Ｂ．ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）については、ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３０：２０３［１９８４］も参照されたい。実際、形質転換といった方法（プロトプラスト形質変換およびコングレッション（ｃｏｎｇｒｅｓｓｉｏｎ）、形質導入、ならびにプロトプラスト融合を含む）はよく知られており、本発明での使用に適している。形質転換の方法は、特に、本発明によって提供されるＤＮＡコンストラクトを宿主細胞に導入するためである。
【０１２４】
さらに、ＤＮＡコンストラクトを宿主細胞に導入する方法として、ターゲティングＤＮＡコンストラクトをプラスミドまたはベクターに挿入せずに物理的または化学的にＤＮＡを宿主細胞に導入する、当該技術分野で知られた方法が挙げられる。そのような方法としては、限定はされないが、塩化カルシウム沈澱、エレクトロポレーション、裸ＤＮＡ、リポソームなどが挙げられる。さらなる実施形態では、ＤＮＡコンストラクトをプラスミドに挿入せずに、プラスミドと共に同時形質転換することができる。
【０１２５】
選択可能マーカー遺伝子が安定な形質転換のための選択に使用される実施形態では、任意の便宜の良い方法を用いて、遺伝子変異グラム陽性菌株から選択マーカーを欠失させることが望ましく、多くの方法が当該技術分野で知られている（Ｓｔａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５８：４１１−４１８［１９８４］；およびＰａｌｍｅｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ２４７：２５５−２６４［２０００］を参照）。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、２以上のＤＮＡコンストラクト（すなわち、それぞれ宿主細胞の遺伝子を変異させるように設計されているＤＮＡコンストラクト）が、親グラム陽性細胞に導入され、細胞において２以上の遺伝子変異、例えば、２以上の染色体領域での変異の導入を生じる。いくつかの実施形態では、これらの領域は隣接しており（例えば、ｓｉｎオペロン内の２つの領域、またはｓｉｎオペロンおよび隣接する遺伝子もしくはオペロン内の２つの領域）、一方、他の実施形態では、領域は離れている。いくつかの実施形態では、遺伝子変異の１つ以上は、エピソーム遺伝因子の付加による。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は本発明の１つ以上のＤＮＡコンストラクトで形質転換され、変異バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株が生成される。そこでは、宿主細胞の２つ以上の遺伝子が不活化されている。いくつかの実施形態では、２つ以上の遺伝子が宿主細胞染色体から欠失される。代替の実施形態では、２つ以上の遺伝子がＤＮＡコンストラクトの挿入により不活化される。いくつかの実施形態では、不活化遺伝子は隣接しており（欠失および／または挿入による不活化であるかに関わりなく）、一方、他の実施形態では、それらは隣接した遺伝子ではない。
【０１２８】
遺伝子変異宿主細胞が生成されたなら、目的タンパク質が発現する条件下で培養することができ、ある実施形態では、目的タンパク質が回収される。
【０１２９】
本発明の態様は、変異グラム陽性菌細胞を含み、その変異グラム陽性菌細胞は、ｓｉｎオペロンにおける１つ以上の遺伝子の発現を、実質的に同じ条件下で増殖された、対応する非変異グラム陽性菌細胞に比べて減少させる少なくとも１つの遺伝子変異を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子変異グラム陽性細胞は上記のように生成される。さらに上記したように、変異グラム陽性菌細胞は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種の菌株、例えば、バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サークランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ラウツス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）またはバチルス・チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）株であり得る。ある実施形態では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種の菌株は、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。いくつかの態様では、変異グラム陽性菌細胞は、さらに、細胞の表現型を改善するさらなる変異、例えば、ｅｇＵ、ｄｅｇＱ、ｄｅｇＳ、ｓｃｏＣ４およびｏｐｐＡからなる群から選択される遺伝子の変異を含む。ある実施形態では、変異は、ｄｅｇＵ（Ｈｙ）３２である。
【０１３０】
ある実施形態では、ｓｉｎオペロンの少なくとも１つの遺伝子の発現が、遺伝子変異グラム陽性細胞において、（実質的に同じ条件で増殖させた）野生型および／または親細胞と比較して減少する。この発現の減少は、任意の便宜の良いやり方で行うことができ、そして、それは、転写、ｍＲＮＡの安定性、翻訳のレベルに依るか、または、その活性を低下させるｓｉｎオペロンから生成される１種以上のポリペプチドの変異の存在によってであり得る（すなわち、それは、ポリペプチドの活性に基づく発現の「機能的」減少である）。したがって、遺伝子変異の種類、または、ｓｉｎオペロン中の少なくとも１つの遺伝子の発現を減少させる方法を限定することは意図されていない。例えば、いくつかの実施形態では、グラム陽性細胞の遺伝子変異は、転写活性を低下させるｓｉｎオペロン中の１つ以上のプロモーターを変異させるものである。ある実施例では、変異は、ｍＲＮＡ転写レベルの低下をもたらす、ｓｉｎオペロンにおけるサイレント変異である（例えば、実施例に示すような）。あるいは、グラム陽性細胞の遺伝子変異は、ｓｉｎオペロンのヌクレオチドを変化させ、細胞中での転写の安定性を低下させるものであり得る。ある実施形態では、遺伝子変異グラム陽性細胞に、ｓｉｎオペロンの１つ以上の遺伝子の発現を減少させる２以上の遺伝子変異が存在し得る。ある実施形態では、遺伝子変異は、実質的に同一の培養条件下で増殖させた対応する非変異グラム陽性菌細胞と比較して、変異グラム陽性菌細胞におけるｓｉｎオペロン由来のｍＲＮＡ転写レベルの減少をもたらす。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、本発明は、一般に、宿主細胞に安定に組み込まれると、（上で詳細に記載したように）ｓｉｎオペロン中の１つ以上の遺伝子の発現が減少するように細胞を変異させる入来配列を含むＤＮＡコンストラクトを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡコンストラクトはインビトロで組み立てられ、続いて、ＤＮＡコンストラクトが宿主細胞染色体に組み込まれるよう、コンストラクトをコンピテントグラム陽性（例えばバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主に直接クローニングする。例えば、インビトロでＤＮＡコンストラクトを構築するには、ＰＣＲ融合および／またはＰＣＲライゲーションを用いることができる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡコンストラクトは非プラスミドコンストラクトであるが、他の実施形態では、ベクター（例えば、プラスミド）に組み込まれる。いくつかの実施形態では、環状プラスミドが使用される。実施形態では、環状プラスミドは適切な制限酵素（すなわち、ＤＮＡコンストラクトを破壊しないもの）を使用するように設計される。したがって、線状プラスミドは本発明において使用される。しかしながら、当業者に知られているように、本発明で使用するには他の方法が適している（例えば、Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｇｒａｍ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ［１９９３］中のＰｅｒｅｇｏ，“Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ”を参照）。
【０１３２】
ある実施形態では、ＤＮＡターゲティングベクターは、ｓｉｎＲ遺伝子の全部または一部を欠失させる（または欠失を可能にする）ように設計される。例えば、ＤＮＡターゲティングベクターは、ｓｉｎＲ遺伝子の全部または一部を（例えば、当業者に知られているようにｃｒｅ−ｌｏｘ系を用いて）除去することを可能にするエレメントを含むことができる。ある実施形態では、ＤＮＡターゲティングベクターの入来配列は、ｓｉｎＲ遺伝子由来の変異配列を含むポリヌクレオチドを含む。これらの実施形態のいくつかでは、変異配列は、少なくとも約１５ヌクレオチドの長さがあり、配列番号１の全体または一部と少なくとも６０％の同一性があり、かつ、グラム陽性菌細胞の内在性ｓｉｎＲ遺伝子中に変異があるとき、ｓｉｎＲ遺伝子のヌクレオチド部位にｓｉｎオペロン中の遺伝子の発現を減少させる、少なくとも１つの変異を有する。変異配列は、少なくとも約２０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約９０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド、約７００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド、約９００ヌクレオチド、約１０００ヌクレオチド、約１１００ヌクレオチド、約１２００ヌクレオチド、約１３００ヌクレオチド、約１４００以上のヌクレオチドであり得る。さらに上述したように、変異配列は、配列番号１と少なくとも６０％の同一性を有することができ、これは、配列番号１に対して、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％の同一性を含む。ある実施形態では、変異配列の遺伝子変異は、サイレント変異であり、このサイレント変異は、翻訳の際、コードされたＳｉｎＲポリペプチドにアミノ酸の変化をもたらさない、ｓｉｎＲ遺伝子のコード領域における変異配列の変異を意味する（当該技術分野でよく理解されている用語）。ある実施形態では、変異配列のサイレント変異は、配列番号１の３３０番目のヌクレオチドに対応するヌクレオチド部位に生じる。ある実施形態では、ｓｉｎＲサイレント変異は、野生型ｓｉｎＲ遺伝子のコード配列のセンス鎖のヌクレオチド位３３０における、グアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）への単一のヌクレオチド変化である（配列番号１はｓｉｎＲ野生型ヌクレオチド配列を示し；配列番号２はＳｉｎＲアミノ酸配列を示し；配列番号３はＧ３３０Ａサイレント変異を有する変異ｓｉｎＲヌクレオチド配列を示す）。
【０１３３】
本発明の態様は、上述したようなポリヌクレオチド配列を含むベクターを含む。ある実施形態では、ベクターは、グラム陽性菌細胞に形質転換されるとき、相同組み換えによって、ポリヌクレオチド配列の少なくとも１つの変異を、グラム陽性菌細胞のｓｉｎオペロンの対応する位置に導入するように設計されたターゲティングベクターである。いくつかの実施形態では、入来配列／ベクターは選択マーカーを含む。いくつかの実施形態では、選択マーカーは２つのｌｏｘＰ部位の間に位置し（Ｋｕｈｎ  ａｎｄ  Ｔｏｒｒｅｓ，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１８０：１７５−２０４［２００２］を参照）、抗微生物遺伝子は、その後、Ｃｒｅタンパク質の作用により欠失される。
【０１３４】
本発明の態様は、親グラム陽性菌細胞を上述したＤＮＡコンストラクトまたはベクターにより形質転換し（すなわち、宿主細胞に安定に組み込まれたとき、ｓｉｎオペロンの１種以上の遺伝子の発現を減少させるよう細胞を遺伝的に改変する組み込み配列を含むもの、例えば、上で説明したようにｓｉｎＲ遺伝子に変異を含むもの）、ベクターおよび親グラム陽性菌細胞のｓｉｎオペロン中の対応する領域の相同組み換えを行って、変異グラム陽性菌細胞を産生し、そして、目的タンパク質の発現に適した条件、すなわち形質転換工程前のグラム陽性菌細胞と比べ、変異グラム陽性菌細胞内で目的タンパク質の産生が増加する条件下で、変異グラム陽性菌細胞を増殖させることを含む、グラム陽性菌細胞内での目的タンパク質の発現を増強させる方法を含む。本発明のこの態様で使用される、グラム陽性菌株、変異および他の特徴の例は、上で詳しく説明されている。
【０１３５】
ＤＮＡコンストラクトがベクターに組み込まれようと、あるいはプラスミドＤＮＡの非存在下に使用されようと、それは微生物を形質転換させるために使用される。適切ないかなる形質転換方法も、本発明で使用されると考えられる。実施形態では、ＤＮＡコンストラクトの少なくとも１つのコピーは、宿主バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の染色体に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本発明の１種以上のＤＮＡコンストラクトが、宿主細胞の形質転換に使用される。
【０１３６】
本発明を実施する仕方および方法は、以下の実施例を参照することにより当業者により深く理解され得る。これらの実施例は、いかなる方法によっても、本発明の範囲またはそれに係る特許請求の範囲を限定することを意図されていない。
【実施例】
【０１３７】
以下の実施例は、本発明の特定の実施例および態様を実証し、かつさらに詳しく説明するために提供されるものであり、その範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【０１３８】
以下の実験の開示において、次の略語のいくつかが用いられる：℃（摂氏温度）；ｒｐｍ（毎分の回転数）；μｇ（マイクログラム）；ｍｇ（ミリグラム）；μｌ（マイクロリットル）；ｍｌ（ミリリットル）；ｍＭ（ミリモル）；μＭ（マイクロモル）；ｓｅｃ（秒）；ｍｉｎ（分）；ｈｒ（時間）；ＯＤ２８０（２８０ｎｍにおける光学濃度）；ＯＤ６００（６００ｎｍにおける光学濃度）；ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）；ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）；ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）；Ａｂｓ（吸光度）。
【０１３９】
実施例１
ｓｉｎＲ遺伝子の変異によるバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）のタンパク質発現の増加
Ａ．バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｓｉｎＲ遺伝子の変異
Ｊａｎｅｓ  ａｎｄ  Ｓｔｉｂｉｔｚ（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，７４（３）：１９４９，２００６）に記載されたマーカーレス遺伝子置換法を用いて、親バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株（ｏｐｐＡ：：ｔｅｔＲ、ΔａｐｒＥ、ΔｎｐｒＥ、ｄｅｇＵＨｙ３２；本明細書では「親株」と呼ぶ）のｓｉｎＲ遺伝子にサイレント変異を導入した。ｓｉｎＲサイレント変異は、野生型ｓｉｎＲのコード領域のセンス鎖のヌクレオチド位３３０における、グアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）への単一のヌクレオチド変化である（配列番号１は野生型配列を示し、配列番号２はＳｉｎＲアミノ酸配列を示し、そして配列番号３はＧ３３０Ａサイレント変異を示す）（サイレント変異は、遺伝子のコード領域の部位の核酸配列を変化させるが、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列は変化させない）。
【０１４０】
ｓｉｎＲ遺伝子の３３０位にｓｉｎＲ  Ｇ＞Ａ同義変異を含むゲノム領域を、次のプライマーを使用してＦＣＭ１０２株から増幅させた。
ＥｃｏＲＩ  ｓｉｎＲ  ＦＷ：５’−ｃａｇｇａａｔｔｃｃｔｇａｃｇｔｃｔｃａａａｔａｔｇｔｇａｃｔａｔｔｇ−３’  配列番号４
ＢａｍＨＩ  ｓｉｎＲ  ＲＶ：５’−ｃｔｃｇｇａｔｃｃｇａｇａａａｔｔｇａａａｇａａａｇａｃａａａａｇｃ−３’  配列番号５
【０１４１】
増幅したフラグメントをｐＫＳＶ７−Ｉ−Ｓｃｅ−Ｋｍｖｅｃｔｏｒ（図１）にクローン化し、このプラスミドをｐＫＳＶ７（Ｓｍｉｔｈ  Ｋ．ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇｍａｎ  Ｐ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ（１９９２）７４，７０５−７１１）から得、クロラムフェニコール耐性マーカーをカナマイシン耐性マーカーで置換し、プラスミドポリリンカーにＩ−Ｓｃｅ制限酵素認識部位を付加した。Ｊａｎｅｓ  ａｎｄ  Ｓｔｉｂｉｔｚ法を使用して、ｓｉｎＲ遺伝子に単一のヌクレオチド多型を導入した。得られたＣＢ１５−１４  ｓｉｎＲ株を、本明細書では、「ｓｉｎＲ変異株」、「ｓｉｎＲ＊」、「変異株」、またはこれらと同等の用語で呼ぶことがある。非変異株（ＣＢ１５−１４）は、本明細書では、「親株」またはこれと同等の用語で呼ぶことがある。
【０１４２】
Ｂ．バチルス・サブチリス株のｓｉｎＲ遺伝子の削除
バチルス・サブチリス１６８（ＢＫＥ２４６１０）由来のｓｉｎＲ欠失株を、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｇｓｃ．ｏｒｇ／）から入手した。ＢＫＥ２４６１０の染色体ＤＮＡを抽出し、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）「親株」を形質転換した。欠失は、ＰＣＲおよびｓｉｎＲ遺伝子座の配列決定により確認した。得られた株を、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓΔｓｉｎＲまたはｓｉｎＲ：：ｅｒｍＲと表示する。図２にｓｉｎＲ欠失の遺伝子マップを示す。エリスロマイシン耐性マーカーの除去を容易にするために、プラスミドにコードされたｃｒｅリコンビナーゼを使用して、ｓｉｎＲ遺伝子のＯＲＦを欠失させ、ｌｏｘＰ部位（ｌｏｘ７１およびｌｏｘ６６）隣接のエリスロマイシン耐性カセットで置換した。隣接するｓｉｎＩおよびｔａｓＡ遺伝子のＯＲＦは、ｓｉｎＲ遺伝子がノックアウトされても不変であった。
【０１４３】
Ｃ．ｓｉｎＲ変異またはｓｉｎＲ欠失バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株におけるプロテアーゼの発現
ＦＮＡプロテアーゼ（Ｙ２１７Ｌ置換を含むサブチリシンＢＰＮ’；配列番号６）の発現に対するｓｉｎＲ変異および欠失の影響を試験するために、親株ならびにｓｉｎＲ＊およびΔｓｉｎＲ株のｎｐｒＥ遺伝子座に、コンストラクトｎｐｒＥ：：ＰｒｒｎＥ２／３−ＦＮＡ−ｃａｔＲ（バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｒｒｎＥ２／３リボソームプロモーターからＦＮＡを発現し、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ耐性（ｃａｔＲ）マーカー遺伝子を含む）を導入した。形質転換細胞を、５ｐｐｍのクロラモフェニコールを含むルリア寒天プレート上で選択した。ＬＢ培地により３０℃で終夜、野生型／親株および変異株（ｓｉｎＲ＊およびｓｉｎＲ：：ｅｒｍＲ）を培養した。１０マイクロリットルの前培養を使用して、１６５マイクロリットルのブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）培地に播種した。３７℃で菌株を培養し、３時間培養したものから試料を採取した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ，ＵＳＡ）を使用し、２０倍に希釈した培養液全体の細胞密度を６００ｎｍで１時間間隔で測定した。６００ｎｍの吸光度を時間の関数としてプロットし、結果を図３Ａに示す。図３Ａは、ＦＮＡ発現親株（ＷＴ）ならびにｓｉｎＲ＊株およびΔｓｉｎＲ株の細胞増殖が、７時間の培養で同等であったことを示す。
【０１４４】
国際公開第２０１０／１４４２８３号パンフレットに記載されているように、Ｎ−ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ基質（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．より）を使用して、プロテアーゼの発現をモニターした。簡単に説明すると、アッセイバッファー（１００ｍＭ  トリス、０．００５％  Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ８．６）中で培養液全体を４０倍に希釈し、希釈試料１０μｌをマイクロタイタープレートに配置した。ＡＡＰＦ原液を希釈し、アッセイバッファー（ＤＭＳＯ中、１００ｍｇ／ｍｌのＡＡＰＦストックを１００倍に希釈）と、この溶液１９０μｌとをマイクロタイタープレートに加え、この溶液の吸光度を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ，ＵＳＡ）を使用して４０５ｎｍで測定した。４０５ｎｍの吸光度を時間の関数としてプロットし、結果を図３Ｂに示す。図３Ｂに示すように、ＦＮＡの産生は、変異株（ｓｉｎＲ＊およびΔｓｉｎＲ）で、野生型の株（ＷＴ）と比較して増加する。
【０１４５】
Ｄ．ｓｉｎＲ変異またはｓｉｎＲ欠失バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株におけるアミラーゼの発現
アミラーゼ（配列番号７）発現に対するｓｉｎＲ変異および欠失株の影響を決定するために、ｓｉｎＲ遺伝子が欠失した、またはｓｉｎＲ変異を含むパチリス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）親株に、コンストラクトＰａｐｒＥ−ａｍｙＥ  ｃａｔＲを導入した。５ｐｐｍのクロラムフェニコールを含むＬＡプレート上で、形質転換体を選択した。ルリア培地中で終夜、ＷＴ株（ＣＢ１５−１４）および変異株（ｓｉｎＲ＊およびｓｉｎＲ：：ｅｒｍＲ）を培養した。１０マイクロリットルの前培養を使用して、１６５マイクロリットルのトリプチックソイブロス（Ｂａｃｔｏ  Ｔｒｙｐｔｏｎｅ  １７ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ  Ｓｏｙｔｏｎｅ  ３ｇ／Ｌ、グルコース２．５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム２．５ｇ／Ｌ  ｐＨ７．３）に播種し、３０℃で菌株を培養してａｍｙＥアミラーゼの発現を試験した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ，ＵＳＡ）を使用し、細胞密度を６００ｎｍで１時間間隔で測定した。６００ｎｍの吸光度を時間の関数としてプロットし、結果を図４Ａに示す。図４Ａは、ＡｍｙＥ発現親株と、ＡｍｙＥ発現ｓｉｎＲ＊およびΔｓｉｎＲ株の細胞増殖は同等であり、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株のｓｉｎＲ遺伝子の変異または欠失が、細胞増殖に影響を及ぼさないことを示す。
【０１４６】
Ｃｅｒａｌｐｈａ試薬（Ｍｅｇａｚｙｍｅ、Ｗｉｃｋｌｏｗ，Ｉｒｅｌａｎｄ）を使用して、培養液全体についてＡｍｙＥのアミラーゼ活性を測定した。Ｃｅｒａｌｐｈａ  ＨＲキットのＣｅｒａｌｐｈａ試薬混合物を、まず１０ｍｌのＭｉｌｌｉＱ水に溶解し、次いで、５０ｍＭのリンゴ酸塩バッファ、ｐＨ５．６を３０ｍｌ加えた。培養物の上澄みをＭｉｌｌｉＱ水で４０倍に希釈し、５μｌの希釈試料を５５μｌの希釈作用性基質溶液に加えた。ＭＴＰプレートを振盪後、室温で４分間、インキュベートした。７０μｌの２００ｍＭホウ酸塩バッファ、ｐＨ１０．２（停止溶液）を加え、反応を停止させた。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ，ＵＳＡ）を使用し、４００ｎｍで溶液の吸光度を測定した。４００ｎｍの吸光度を時間の関数としてプロットし、結果を図４Ｂに示す。図４Ｂのグラフは、野生型株（ＷＴ）と比べて、ｓｉｎＲ＊およびΔｓｉｎＲ株でＡｍｙＥの発現が増加したことを示している。
【０１４７】
Ｅ．ｓｉｎＲ変異またはｓｉｎＲ欠失バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株における内在性遺伝子の発現
内在性遺伝子の発現に対するｓｉｎＲ変異またはｓｉｎＲ欠失の影響を試験するために、前述したように、ｓｉｎＲ変異またはｓｉｎＲ欠失を親株に導入した。振盪フラスコ中、ＢＨＩ培地で、ペクチン酸リアーゼ（配列番号８）タンパク質の活性を評価した。ＬＢ培地により３０℃で終夜、野生型／親株および変異株（ｓｉｎＲ＊およびｓｉｎＲ：：ｅｒｍＲ）を培養した。１ミリリットルの前培養を使用して、振盪フラスコ中の２０ｍｌのＢＨＩ培地に播種した。３７℃で株を培養し、ペクチン酸リアーゼ酵素の発現を試験した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ，ＵＳＡ）を使用し、細胞密度を６００ｎｍで１時間間隔で測定した。６００ｎｍの吸光度を時間の関数としてプロットし、結果を図５Ａに示す。図５Ａは、親株と、ｓｉｎＲ＊およびΔｓｉｎＲ株との細胞増殖は同等であり、菌株のｓｉｎＲ遺伝子の変異または欠失が、細胞増殖に影響を及ぼさないことを示す。
【０１４８】
ポリガラクツロン酸のカリウム塩（Ｓｉｇｍａ  Ｐ０８５３）基質を使用してペクチン酸リアーゼの活性をモニターした。基質溶液は、０．６％ｗ／ｖポリガラクツロン酸カリウム塩をトリスアッセイバッファ（０．１Ｍ  トリス、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１％  ＰＥＧ−８０００  ｐＨ７．７３）に溶解して調製した。１００マイクロリットルの基質溶液を、２０マイクロリットルの試料上澄みに加えた。この反応液を３７℃で１０分間インキュベートした。インキュベート後、試料に２００マイクロリットルの停止溶液（０．０５Ｍリン酸）を加え、石英製の９６ウェルマイクロタイタープレートを使用して２３５ｎｍで溶液の吸光度を測定した。２３５ｎｍの吸光度を時間の関数としてプロットし、結果を図５Ｂに示す。図５Ｂのグラフは、野生型株（ＷＴ）と比べてｓｉｎＲ＊およびΔｓｉｎＲ株でのペクチン酸リアーゼの発現が増加したことを示している。
【０１４９】
上述の組成物および方法は、明瞭な理解のために図面および実施例を通していくらか詳細に記載してきたが、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく、一定の変更と修正を行い得ることは、本明細書に記載の教示に照らせば、当業者には容易に明らかである。
【０１５０】
したがって、先の記述は単に本組成物および方法の原理を説明したものである。本明細書に明示的に記載または示されていないが、本発明の組成物および方法の原理を具体化し、かつ本発明の精神と範囲に含まれる各種配置を当業者が考案できるであろうことは認識されよう。さらに、本明細書に記載の実施例および条件付き文言は全て、本組成物および本方法の原理、ならびに発明者らによって技術の進展に寄与する概念について読者の理解を助けることを主に意図しており、またそのような具体的に記載された実施例および条件に限定されないと解されるべきである。さらに、本組成物および本方法の原理、態様および実施形態、ならびにそれらの具体的実施例を述べている本明細書中の全ての記述は、それらの構造的等価物および機能的等価物の両方を包含するものとする。さらに、そのような透過物には、現在知られている等価物、および将来開発される等価物、すなわち、構造に関わりなく同じ機能を有するように開発されるあらゆる要素がいずれも含まれるものとする。したがって、本組成物および本方法の範囲は、本明細書に示され、記載されている例示の実施形態に限定されるものではない。
【０１５１】
配列
配列番号１−ｓｉｎＲ野生型コード配列、センス鎖（停止コドンを有する）
【化１】
2017538426.tif 000003
【０１５２】
配列番号２−ｓｉｎＲタンパク質配列
【化２】
2017538426.tif 000004
【０１５３】
配列番号３−ｓｉｎＲ変異コード配列、センス鎖（太字下線部分にＧ３３０Ａサイレント変異を有する；停止コドンを有する）
【化３】
2017538426.tif 000005
【０１５４】
配列番号４  ｓｉｎＲ遺伝子増幅用順方向プライマー
５’−ｃａｇｇａａｔｔｃｃｔｇａｃｇｔｃｔｃａａａｔａｔｇｔｇａｃｔａｔｔｇ−３’
【０１５５】
配列番号５  ｓｉｎＲ遺伝子増幅用逆方向プライマー
５’−ｃｔｃｇｇａｔｃｃｇａｇａａａｔｔｇａａａｇａａａｇａｃａａａａｇｃ−３’
【０１５６】
配列番号６  ＦＮＡタンパク質配列（プロドメインを有する）
【化４】
2017538426.tif 000006
【０１５７】
配列番号７  ＡｍｙＥタンパク質配列
【化５】
2017538426.tif 000007
【０１５８】
配列番号８  ペクチン酸リアーゼＣタンパク質配列
【化６】
2017538426.tif 000008
【図１】
2017538426.tif 000009
【図２】
2017538426.tif 000010
【図３Ａ】
2017538426.tif 000011
【図３Ｂ】
2017538426.tif 000012
【図４Ａ】
2017538426.tif 000013
【図４Ｂ】
2017538426.tif 000014
【図５Ａ】
2017538426.tif 000015
【図５Ｂ】
2017538426.tif 000016
【配列表】
2017538426000001.app
【国際調査報告】
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