(57)【要約】  本発明の目的は、グリコプロテインＳＣＯ−スポンジンから分離されるオリゴペプチドであって、以下の配列により特徴を有している：−Ｗ−Ｓ−Ｘ１−Ｗ−Ｓ−Ｘ２−Ｃ−Ｓ−Ｘ３−Ｘ４−Ｃ−Ｇ−（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）、ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４は、ヒト又は動物の血管形成に関連した病気の治療に、血管形成の医薬阻止因子として、特に医薬抗血管形成腫瘍として使用するための、１〜５のアミノ酸の配列を表している。オリゴペプチドは、特に脳腫瘍の治療に適応される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の配列：
Ｗ−Ｓ−Ｘ１−Ｗ−Ｓ−Ｘ２−Ｃ−Ｓ−Ｘ３−Ｘ４−Ｃ−Ｇ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）
を特徴とするオリゴペプチドであって、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４が、血管形成の医薬阻止因子としてヒト又は動物で使用するための、１〜５のアミノ酸からなるアミノ酸の配列を表すことを特徴とする、オリゴペプチド。
【請求項２】
少なくとも血管形成を伴った病気の治療において、血管形成が過度又は異常である、又は、血管内皮細胞が増殖することを特徴とする、請求項１に記載のオリゴペプチド。
【請求項３】
血管形成に関連した病気は、癌、関節炎、慢性関節リウマチ、アテローム性動脈硬化、角膜移植片の血管新生、肥大瘢痕又はケロイド、増殖的網膜症、糖尿病性網膜症、成体の黄斑変性、造粒、新生血管の緑内障及びブドウ膜炎から選択されることを特徴とする、請求項１又は２に記載のオリゴペプチド。
【請求項４】
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４はそれぞれアミノ酸を示し、前記アミノ酸は自然アミノ酸又は非自然アミノ酸であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載のオリゴペプチド。
【請求項５】
Ｘ１は、Ｇ、Ｖ、Ｓ、Ｐ及びＡから選択されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載のオリゴペプチド。
【請求項６】
Ｘ２は、Ｇ、Ｖ、Ｓ、Ｐ及びＡから選択されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載のオリゴペプチド。
【請求項７】
Ｘ３は、Ｒ、Ａ及びＶから選択されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載のオリゴペプチド。
【請求項８】
Ｘ４は、Ｓ及びＰから選択されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載のオリゴペプチド。
【請求項９】
アミド化、アシル化、ＰＥＧ化により補正されることを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載のオリゴペプチド。
【請求項１０】
以下の配列：
Ｗ−Ｓ−Ｇ−Ｗ−Ｓ−Ｓ−Ｃ−Ｓ−Ｒ−Ｓ−Ｃ−Ｇ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５）
を示すことを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載のオリゴペプチド。
【請求項１１】
ヒト又は動物の腫瘍の新血管形成の医薬阻止因子であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載のオリゴペプチド。
【請求項１２】
固形腫瘍の治療において、胸、肺、腎臓、腸、結腸、卵巣、前立腺の腫瘍から選択されることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれかに記載のオリゴペプチド。
【請求項１３】
ヒトまたは動物の脳腫瘍の治療であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載のオリゴペプチド。
【請求項１４】
神経膠芽腫の治療であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載のオリゴペプチド。
【請求項１５】
少なくとも１つの他の抗腫瘍有効成分に関連することを特徴とする、請求項１〜１４のいずれかに記載のオリゴペプチド。
【請求項１６】
抗腫瘍化学療法有効成分に関連することを特徴とする、請求項１〜１５のいずれかに記載のオリゴペプチド。
【請求項１７】
抗腫瘍照射療法に関連することを特徴とする、請求項１〜１６のいずれかに記載のオリゴペプチド。
【請求項１８】
クモ膜下腔内投与へのドラッグとして、クモ膜下、静脈、皮下、経蝶形骨洞又は局所用であることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれかに記載のオリゴペプチド。
【請求項１９】
医薬品組成物で処方されることを特徴とする、請求項１〜１８のいずれかに記載のオリゴペプチド。
【請求項２０】
溶液、エマルジョン、懸濁液、ゲル、バイオポリマー又は生体材料の形態で、医薬品組成物に処方されることを特徴とする、請求項１〜１９のいずれかに記載のオリゴペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト又は動物における血管形成に関連する病気の治療用ドラッグとしての、特有のオリゴペプチド及びその使用、特に抗腫瘍因子に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管形成は、既存の導管からの新しい血管の形成に貢献する機構である。これは、所定の生理的プロセス、特に胎児の維管束系の形成及び胎盤のインプランテーションのために不可欠であるが、慢性関節リウマチ、成体の黄斑変性、及び特に腫瘍の増殖及び転移の形成等の、病理学開発に貢献することも可能である。血管系腫瘍内部又は腫瘍周囲の成長が、腫瘍の増殖のための、及び血流による転移拡散のための鍵となる現象であることが、実際広く認められる。
【０００３】
それゆえ、数年来、腫瘍の治療に用いられると考えられる抗血管新生の効果を用いた研究が、分子に対して行われてきた。
【０００４】
現在の薬剤抗血管新生ターゲットの大部分が、主にＶＥＧＦ（＜＜血管内皮細胞増殖因子＞＞、血管内皮細胞増殖の因子）のカスケードであり、血管形成増殖及び腫瘍に関係した抗体ブロッキング又は受容体型チロシンキナーゼの阻止因子を用いることを含む、腫瘍細胞及びレセプターへの結合により、発生される。
【０００５】
しかしながら、ＶＥＧＦが、腫瘍増殖の因子重要な調節因子として認識され抗癌治療法のための特権的なターゲットを構成するものの、血管新生の新しい阻止因子を成長させることにより、治療の任意選択数を増やすことになってしまうという顕著な課題を示す。また、抗血管発生又は抗血管新生の追跡に作用するこの薬剤の同定は、血管新生患者の現象（例えば黄斑変性）等の多く病理に対応するための治療武器の開発を可能にすることが可能な、重要な進展を意味する。
【０００６】
現在開発されている血管新生阻止因子の一部が、従来の化学療法剤に関連した腫瘍の増殖の制御に対する効果を示すとしても、これらはしかしながら、特に一般的な方法での固形腫瘍及びとりわけ中枢神経系腫瘍の治療のためには、十分に効率的ではない。実際、抗体としてのこれらの分子の一部は、特に腫瘍質量において長距離での播種を予防する、又は血液‐脳関門を容易に移動するための、分子量の高い分子とすることが可能である。
【０００７】
また、抗血管新生分子は、複合であり且つ生産コストのかかる既存の合成タンパク質である。さらに、例えばアバスチン（商標）（ベバシズマブ）のように、ほとんどの場合、高濃度で用いる必要があり、且つ、副作用が大きくなる。時として致命的な予後を有する場合がある、ベバシズマブに遭遇されるこれらの副作用は、感染症の根源に白血球減少症と、出血のリスクとを含んでいる。ＶＥＧＦ（抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＶＥＧＦＲ、とりわけＰＩ３Ｋの小型分子遮断薬）の管をブロッキングする他のアプローチが、その反面開発されるものの、特異性及び副作用の能率に関して、効率に関する制限の場合の多数が示され、このうち後者は、心血管システムに影響する場合がある。そのため、動脈性高血圧症の突発は、その一部につき、異なる抗血管新生及び心筋毒性に広く観察される（Ｗｕ Ｓ ｅｔ ａｌ． Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ ２００８； ９： ４０７−１１；Ｎａｌｌｕｒｉ ＳＲ， ｅｔ ａｌ． ＪＡＭＡ ２００８ ； ３００（１９）： ２２７７−８５ ；Ｃｈｕ ＴＦ， ｅｔ ａｌ． Ｌａｎｃｅｔ ２００７； ３７０： ２０１１−１９）。
【０００８】
従って、このような不利益の多くを修復する抗血管新生薬剤が必要である。
【０００９】
本発明に応じる目的で、特有のオリゴペプチドを提案するものであり、その配列がＴＳＲ（＜＜トロンボスポンジン・タイプ１リピート＞＞）モチーフの一部から推論され、中枢神経系の特定のグリコプロテインをＳＣＯスポンジン内に示し、人への原索動物の全ての脊椎動物を示している。これは、第３の心室の頂部、交連下器官に位置する特有の本体により分泌される細胞外基材の分子である。ＳＣＯスポンジンは、４５００以上のアミノ酸から成り且つマルチモジュラー構造を示す、大型の分子であり、保持されたタンパク質の異なるモチーフから、この中では特に２６ＴＳＲモチーフから、成っている。神経細胞上で生物学的活性度を示すＴＳＲモチーフからのＳＣＯスポンジンから推論される所定のペプチド（国際特許出願ＷＯ９９／０３８９０の記載を含む）、並びに、特定の受容体を通して神経細胞に作用するこれらのペプチドが、知られている（Ｍ． Ｂａｍｂａｄ ｅｔ ａｌ．, Ｃｅｌｌ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ＶＯＬ． ３１５， １５−２５（２００４））。
【００１０】
モチーフＴＳＲは、保存されたアミノ酸システイン、トリプトファンとアルギニンの配列に基づくおよそ５５の残余のタンパク質領域である。これらのモチーフは、凝固に関係する分子であるＴＳＰ−１（トロンボスポンジン）内で最初に分離した。その後、これらは、細胞付着性、移動性、増殖性、細胞集合性、プロテアーゼの変調または血管新生の抑制のような生物学的機能を有する他の多くの分子で記載された。
【００１１】
ＴＳＰ−１は、ヘパリンとの結合、および血管新生要因、中でもＦＧＦ−２、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ及びＴＧＦ−β１へのいくつかとの反応で結合することが可能な３つのタイプの反復モチーフの領域を有する、その単量体の形態で分子量が約１２０ｋＤａの細胞外基質のグリコプロテインである（Ｌａｍｓｚｕｓ ｅｔ ａｌ．, １９９６; Ｍａｒｇｏｓｉｏ ｅｔ ａｌ．， ２００３ ）。この相互作用は、これらの因子の隔離を可能にすると共に、それらの相互作用に対するそれぞれのレセプターを制限する。ＴＳＰ−１の動作の第２の機構は、特に、プロテオグリカン、インテグリン、ＣＤ４７及びＣＤ３６を介した血管内皮細胞との結合によって行われる（Ａｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， １９８７；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．， １９９６；Ｐｒｉｍｏ ｅｔ ａｌ．，, ２００５；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．, ２００９ｂ）。
ＴＳＰ−１のＣＤ３６との相互作用があれば、ＮＲＰ−１及びＶＥＧＦＲ−２で錯体を形成する場合での血管新生誘導標識を妨げることができるものであり、これは、ＶＥＧＦにより誘導されるＶＥＧＦＲ−２の活性化を予防するだろう。更に、ＴＳＰ−１は、ＮＯＳに作用することができず、ＦＧＦ−２により誘導される血管内皮細胞の移動を禁止し、更に、血管内皮細胞のアポトーシスを誘発する。その上、ＴＳＰ１の抗血管形成特性が、生存の抑制、増殖の抑制、及び血管内皮細胞の移動の抑制が含まれることが、記載された（Ｊｉｍｅｎｅｚ Ｂ， Ｖｏｌｐｅｒｔ ＯＶ， Ｃｒａｗｆｏｒｄ ＳＥ， Ｆｅｂｂｒａｉｏ Ｍ， Ｓｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ ＲＬ， Ｂｏｕｃｋ Ｎ． Ｎａｔ Ｍｅｄ． ２０００ Ｊａｎ； ６（１）：４１−８）。
【００１２】
その構造がこれらのペプチドフラグメントのそれに同様である、合成ペプチドと同様のＴＳＰ−１のペプチドフラグメントの一部が、自生のトロンボスポンジン−１と同様の活性を示すことが、一般的に知られている。
【００１３】
例えば、米国特許第 ６，２３９，１１０号、米国特許第 ５，８４０，６９２号、米国特許第 ５，８４９，７０１号、米国特許第 ５，４９１，１３０及び米国特許第 ６，０５１，５４９号、米国特許第 ５，１９０，９１８及び米国特許第 ５，２００，３９７号、並びに、米国特許第 ６，３８４，１８９号が、ＴＳＰ−１及びその合成類似体から推論されるこれらのペプチド断片の構造及び生物学的影響を記載する。
【００１４】
また、ＴＳＰ−１のＴＳＰモチーフで示唆される抗血管新生分子が、開発された。ＴＳＰ−１の影響を模倣できることが示されるこのタイプのペプチド誘導体またはペプチドが数個存在し、特にＡＢＴ−５１０及びＡＢＴ−５２６である。アミノ酸の配列及びこの類似受容体のアフィニティにもかかわらず、可溶性と内皮細胞上の合成ペプチドの影響が、異なる場合がある（ＨＡＶＩＶら、２００５）。特にＡＢＴ−５１０は、ＣＤ３６を介してＣａｐｓａｓｅ−８のインビトロで作り出されるアポトーシスの誘因を明らかにし、ヌードマウス内での神経膠腫の異所的レジストリの臨床前モデルにおける腫瘍血管新生を縮小した（ＮＤＥＲＳＯＮら、２００７）。これはまた、異なる癌の臨床研究の対象、特に肉腫及び腎臓癌であった。しかし、その安全性が示されたものの、合成ＡＢＴ−５１０の単独療法の有効性は不十分であると考えられた（Ｂａｋｅｒ ら、２００８；Ｅｂｂｉｎｇｈａｕｓら、２００７)。
【００１５】
他のペプチド合成物が、例えば３ＴＳＲのようにＴＳＰ−１のＴＳＲモチーフから合成され（ｒｅｎら、２００９）、又は、例えばＴＳＲモチーフのタンパク質構造組み換え体を得るためのＡＤＡＭＴＳ５等、モチーフＴＳＲを有する他のタンパク質から研究された(Ｓｈａｒｇｈｉ・Ｎａｍｉｎｉら、２００８）。このタンパク質組み換え体動作のメカニズムは、しかしながらＶＥＧＦ依存的なままである。実際、組み換え型タンパク質は、ＶＥＧＦにより血管内皮細胞の刺激を抑制し、且つ、ＶＥＧＦの存在下でそれらのアポトーシスを誘発することを示した。更に、この組み換え型タンパク質を十分な量で得るためには、製薬品質に対して複雑な発現系に呼びかけることが必要であり、何故なら、コンタミネーションを招くこと、又は生産するタンパク質の形態（三次構造）を改めることになってしまうからである。
【００１６】
現在、これらの効果で知られるＴＳＲモチーフの配列は、以下の通りである：
−レセプターＣＤ３６又はｇｐｌＶ血小板に結合することが可能な配列Ｖ−Ｔ−Ｃ−Ｇ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）；
−配列Ｃ−Ｓ−Ｖ−Ｔ−Ｃ−Ｇ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）：Ｓ．Ｓ． Ｔｏｌｓｍａ ｅｔ ａｌ． (Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ． １２２ ｐ．４９７−５１１ （１９９３）)が、ＴＳＰ−１の抗血管形成活性が、異なる複数の合成ペプチド、特にＴＳＲ領域から導き出され且つ配列Ｃ−Ｓ−Ｖ−Ｔ−Ｃ−Ｇの中央位置にある２つの合成ペプチド配列を有する、インヴィトロで及びインヴィーヴォで再現されることが可能であることを示した（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）。さらに、ＴＳＰ−１による血管新生の活性が、配列Ｃ−Ｓ−Ｖ−Ｔ−Ｃ−Ｇを有する領域を含むＴＳＲの２つの異なる領域を有する２つの異なる機構により、展開することができたという、後の研究を明らかにした（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）（Ｍ．Ｌ． Ｉｒｕｅｌａ−Ａｒｉｓｐｅ， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，ｖｏｌ．１００ ｐ１４２６−３１(１９９９））；
−ヘパリンとプロテオグリカンとを結合させて、生物学的活性度を変化させ、且つ、ＴＳＰ−１によりＴＧＦＢの活性化のプロセスに介入することが可能である、配列Ｗ−Ｓ−Ｘ−Ｗ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４）。このモチーフＷ−Ｓ−Ｘ−Ｗ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４）の存在は、単独で十分ではないものの、その後異なる生体現象、例えば炎症、血管形成又は胚発育胚発生に介入することが可能なサイトカインの活性化のためには必要である（Ｇ． Ｄ． Ｙｏｕｎｇ ａｎｄ Ｊ． Ｅ． Ｍｕｒｐｈｙ−Ｕｌｌｒｉｃｈ， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ｖｏｌ． ２７９、ｐ．４７６３３−４７６４２ （２００４））。また、このモチーフは、血管内皮細胞の表面上に存在するプロテオグリカンへの接続の間に、所定の血管新生誘導増殖のライバルとなるように思われる（Ｔ． Ｖｏｇｅｌ ｅｔ ａｌ．, ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ｖｏｌ． ５３ ｐ．７４−８４(１９９３)）。また、これは、ＴＳＰ−１により血管新生の活性の原因となる機構に関係したＭ．Ｌ．Ｉｒｕｅｌａ−Ａｒｉｓｐｅに引用された（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ， ｖｏｌ． １００ ｐｌ４２３−３１（１９９９））ＴＳＲの第２の領域でもある。しかしながら、このモチーフの付加的な上流又は下流に位置されるアミノ酸変異形（Ｘ）又はアミノ酸の正確な構成が、ペプチドの活性には重要である。これは、特にヘパリンへの結合の効果、並びに、ペンタペプチドに対する増加が見出される細胞接着の誘導のケースであり、ここでＸはプロリンまたは塩基性のアミノ酸である（Ｎ．Ｈ． Ｇｕｏ， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ｖｏｌ． ２６７ ｐ．１９３４９−５５（１９９２））。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
現在のところ、十分効率的且つ適切に認容される抗血管形成製品が、開発されたわけではなく、また、前述の全ての要素に基づいて開発された製品が、抗血管形成の活性に対して試験されたわけではない。
【００１８】
すなわちこれは、本発明が、特定の効率的なオリゴペプチドを提案することの理由であると共に、現存する抗血管形成治療法の障害を除去することが適切に認容されることの理由である。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
特に本発明は、以下の配列：
−Ｗ−Ｓ−Ｘ１−Ｗ−Ｓ−Ｘ２−Ｃ−Ｓ−Ｘ３−Ｘ４−Ｃ−Ｇ−（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）
を示すオリゴペプチドを目的とし、その中でＸ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４は、血管形成の医療阻止因子として１〜５のアミノ酸からなるアミノ酸の配列を表す。これは、血管形成に関連した病気の治療に対して有効であり、すなわち、過剰な又は異常な血管形成により、又は血管内皮細胞の増殖により、特性化される病気に対して、有効である。このアミノ酸の配列は、形態−Ｗ−Ｓ−Ｇ−Ｗ−Ｓ−Ｓ−Ｃ−Ｓ−Ｒ−Ｓ−Ｃ−Ｇ−（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５）で記載されたものであり、これは国際特許出願ＷＯ９９０３８９０号及び国際特許出願ＷＯ２００９０２７３５０号に記載されているものの、抗血管形成活性に対してではない。
【００２０】
驚くべき且つ予想外なことに、本発明に従ったオリゴペプチドは、ＨＵＶＥＣまたはＨＢＭＥＣのアポトーシスの保護役割を行い、ＶＥＧＦを高用量（５０ｎｇ／ｍＬ）に相当させるとともに、自身の増殖に適用しない。インヴィトロでは、本発明に従った血管内皮細胞におけるオリゴペプチドの効果は、従って、ＴＳＰ−１のそれとは反対になると考えられる。さらに、本発明に従ったオリゴペプチドは、ＶＥＧＦ又はｂＦＧＦ等の血管形成因子の存在下で移動を促進する。しかしながら、これは、Ｕ８７−ＭＧ又はＨＢＭＥＣと接触する際、神経膠芽腫の腫瘍細胞により誘導されるＨＢＭＥＣの移動を抑制する。
【００２１】
また、本発明のオリゴペプチド物体の動作は、ＴＳＰ−１とは対照的に、レセプターＣＤ３６に携わっていないことを意味していた。
【００２２】
従って、それは、観察される抗腫瘍効果に関連する血管系のメカニズム及び抗血管形成の重要な効果に対して、抑制役割を提示する。そのサイズが小さいため、神経膠芽腫を含む中枢神経系疾患の腫瘍の治療に特に適切である。
【００２３】
抗血管形成として使用するための本発明に従ったオリゴペット糖は、本来のその効果及び作用機構に特異的である。実際には、そのオリジナルに最も近い抗血管形成分子であるＡＢＴ−５１０は、多くの細胞型に発現され血管形成を含む様々な生物学的プロセスに関与するタンパク質である、ＴＳＰ−１のＮ末端に位置する第２の反復トロンボスポンジンの１型の中心部を供給する一方、本発明に従ったオリゴペプチドは、ＴＳＲを有するタンパク質であるが具体的には特に成長中に介入するＣＮＳの水準で発現されるＳＣＯ−スポンジンの２７の反復標本ＴＳＲのＮ末端部分の共通配列を示している。
【００２４】
また、オリゴペプチドは、安全性の改良性を示しており、本発明に従ったオリゴペプチドは、２０ｍｇ／ｋｇの注入であっても毒性は示さない。
本発明の他の特徴及び利益は、添付図面を考慮して、後述の本発明の説明に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１Ａ〜１Ｄは、胎児の早発性徐脈9（ＥＤ９）への浸透移行性循環において、水性フルオレセインの投入の後に遂行されるマクロスコピックな観測（倍率ｘ２０）を表す図である。    図１Ａ：水（支配的）    図１Ｂ：ベバシズマブ（負の証拠）    図１Ｃ：１０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ（正の証拠）    図１Ｃ：発明に従ったオリゴペプチド、２５μｇ／ｍＬ。
【図２】図２Ａ〜２Ｃは、血管形成に関係する可溶性因子の解析の結果を表す図である。    本発明に従ったＴＳＰ−１及びオリゴペプチドの無菌水の存在下での、血管形成に関係するタンパク質の研究のために、細胞Ｕ８７−ＭＧの上澄みに対して、プロテオーム配列により検討を行った（図２Ａ及び図２Ｂ）。    本発明に従った無菌水、ＴＳＰ−１及びオリゴペプチドによる処理後の、Ｕ８７−ＭＧによるＶＥＧＦＡの分泌物が、ＥＬＩＳＡによって上澄みから配合された（図２Ｃ）。
【図３】図３Ａ〜３Ｃは、本発明に従ったオリゴペプチドの血管形成増殖上での効果及びＣＡＭモデルでの腫瘍の、解析の結果を示す図である。    ＣＡＭ上におけるＵ８７−ＭＧの移植から生じた腫瘍後、実験的な腫瘍の血管系を巨視的図（図３Ａのａ〜ｆ）で、また、４８時間の治療後を微視的図 （図３Ａのｇ〜ｉ）で、検討し、これらの中で、    Ｈ２Ｏ：ａ、ｄ、ｇ及びｊ、    ＴＳＰ−１：ｂ、ｅ、ｈ及びｋ、    本発明に従ったオリゴペプチド：ｃ、ｆ、ｉ及びｌ。  導管の顕鏡観察が、その標識の後、ＳＮＡ−１によって実行される。図３Ａの画像ｈ及びｉのスケールのバーは、１ｍｍを表し、図３Ａの画像ｊ、Ｋ及びｌはそれぞれ、図３Ａの画像ｇ、ｈ及びｉの倍率を有している（Ｘ２）。矢の先端は可視管を示し、矢印は処置表面及び管の無い星領域を示す。    腫瘍の構造は、実験的な腫瘍の部分のヘマトキシリン、エオシン及びサフランによるマーキングの後に視覚化され（図３Ｂのａ〜ｃ）、腫瘍細胞の増殖は、ヘマトキシリンによる対比染色法によるＫｉ−６７の免疫組織化学的なマーキングによって検討された（図３Ｂのｄ〜ｉ）。    腫瘍は、４８時間調査され、これらの中で、    水：ａ、ｄ及びｇ、    ＴＳＰ−１：ｂ、ｅ及びｈ、    発明に従ったオリゴペプチド：ｃ、ｆ及びｉであり、  図３Ｂの画像ｇ、ｈ及びｉは、それぞれ、図３Ｂの画像Ｄ、Ｅ及びＦの先端に対して倍率を有している（Ｘ４）。    矢は、Ｋｉ−６７をマーキングすることなく、処理表面及び星領域を示している。Ｋｉ−６７のマーキングは、ＩｍａｇｅＪソフトウェア、並びに、分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって実行された腫瘍の中心と端との間及び各状況の間の比較を使用して、異なる状況で定量化された（図３Ｃ）。ｐ ＜ ０．０５の値は、有意であると考えられる。＊ ｐ ＜ ０．０５；＊ ＊ ｐ ＜ ０．０１；＊ ＊ ＊ ｐ ＜０．００１、これらは同じ腫瘍の中心との比較で行われた。＄ ｐ ＜０．０５；＄ ＄ ｐ ＜ ０．０１；＄ ＄ ＄ ｐ ＜０．００１、これらは腫瘍支配との比較で行われた。
【図４】図４は、ＣＡＭからの試験的な腫瘍におけるＡＲＮｍの定量分析の結果を表し、管理腫瘍と比較しての相対的な表現により、異なる遺伝子を表す図である。
【図５】図５は、細胞Ｕ８７−ＭＧに対して本発明に従ったオリゴペプチドの有無にかかわらず、ビメンチンのタンパク質表現度の半定量分析の結果をウエスタンブロットによって表す図である。
【図６】図６は、インヴィトロでのＨＢＭＥＣのアポトーシスに対しての、本発明に従ったオリゴペプチドの機能的な影響の分析の結果を表す図である。これは、ＥＬＩＳＡ細胞死による分析の統合である：ＶＥＧＦ、ＴＳＰ−１及び本発明に従ったオリゴペプチド（ＮＸ）による処置は、単独で実行され、又は基本培地（ＢＭ）の組合せにより実行された。完全培地（ＣＭ）及び基本培地（ＭＢ）が、対照として用いられた。ｐ ＜ ０．０５の値は、有意であると考えられる。異なる処置の間の比較が、分散分析（分散分析試験）により行われた。＊ ｐ ＜ ０．０５；＊ ＊  ＢＭと比較して ｐ ＜ ０．０１；＄  ＢＭと比較して ｐ ＜０．０５；#  ＣＭと比較して ｐ ＜０．０５、
【図７Ａ】図７Ａ〜７Ｅは、ヌードマウスの増殖、血管新生及び腫瘍増大に対しての、本発明に従ったオリゴペプチドの活性の分析の結果を示す図である。    図７Ａの画像Ａ、Ｂ及びＣは、本発明に従ったＨ２Ｏ、ＴＳＰ−１又はオリゴペプチドによりそれぞれ扱われる腫瘍の部分上におけるＫｉ−６７の免疫染色を示す図である。    図７Ａの画像Ｄ、Ｅ及びＦは、画像Ａ、Ｂ及びＣに対して倍率（Ｘ２）を有している。    図７Ａの画像Ｇ、Ｈ及びＩは、それぞれ本発明に従ったＨ２Ｏ、ＴＳＰ−１またはオリゴペプチドにより処理される腫瘍のスライス上でのＣＤ３１の免疫染色を表す図である（スケールのバーは５００μｍに対応する）。    図７Ａの画像Ｊ、Ｋ及びＬは、画像Ｇ、Ｈ及びＩに対して倍率（Ｘ２）を有している。
【図７Ｂ】Ｋｉ−６７のマーキングは、ＩｍａｇｅＪソフトウェア、並びに、分散分析（ＡＮＯＶＡ試験）によって実行（図７Ｂ）された腫瘍の中心と端との間及び各状況の間の比較を使用して、異なる状況で定量化された。ｐ ＜ ０．０５の値は、有意であると考えられる。＊Ｐ＜０．０５は、同一腫瘍の中心と比較される；＄ｐ＜０．０５及び＄＄ｐ＜０．０１は、対照と比較される。
【図７Ｃ】ＣＤ３１のマーキングは、ＩｍａｇｅＪソフトウェア、並びに、分散分析（ＡＮＯＶＡ試験）によって実行（図７Ｃ）された腫瘍の中心と端との間及び各状況の間の比較を使用して、異なる状況で定量化された。＊Ｐ＜０．０５の値は、有意であると考えられる；＊Ｐ＜０．０５は、同じ腫瘍の中心と比較される；＄ｐ＜０．０５及び＄＄ｐ＜０．０１は、対照と比較される。
【図７Ｄ】図７Ｄの画像Ｍ及びＰは、ヒドロゲルのみによるマウス腫瘍の治療後を示す。    図７Ｄの画像Ｎ及びＱは、ヒドロゲルにおけるＴＳＰ−１によるマウス腫瘍の治療後を示す。    図７Ｄの画像Ｏ及びＲは、ヒドロゲル内での本発明に従ったオリゴペプチド（ＮＸ）によるマウス腫瘍の治療後を示す。
【図７Ｅ】図７Ｅは、癌細胞の投入の５日後、１２日後、１７日後、１９日後、２１日後及び２３日後の、本発明に従ったＨ２Ｏ、ＴＳＰ−１及びオリゴペプチドで処理される腫瘍増殖の計測を示す。治療薬（ヒドロゲルのみ、ＴＳＰ−１及び本発明に従ったオリゴペプチド（ＮＸ））の投入が、２１日後に遂行された（黒矢）。腫瘍サイズの対照との比較が、分散分析（ＡＮＯＶＡテスト）により遂行された。＊ ＊ ｐ ＜０．０１；＊ ＊ ＊ ｐ ＜０．００１。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
従って、本発明は、以下の配列：
−Ｗ−Ｓ−Ｘ１−Ｗ−Ｓ−Ｘ２−Ｃ−Ｓ−Ｘ３−Ｘ４−Ｃ−Ｇ−（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）
を示すオリゴペプチドを目的とし、その中でＸ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４は、血管形成の医療阻止因子として１〜５のアミノ酸からなるアミノ酸の配列を表す。これは、少なくとも血管形成に関連した病気の治療に対して有効であり、すなわち、過剰な又は異常な血管形成により、又は血管内皮細胞の増殖により、特性化される病気に対して、有効である。好ましくは、以下から選択される血管形成に関連した病気の治療に有効である：癌、関節炎、慢性関節リウマチ、アテローム性動脈硬化性プラーク、角膜移植片の血管新生、肥大した瘢痕又はケロイド、増殖網膜症、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性、肉芽組織、新生血管緑内障及びブドウ膜炎。
【００２７】
本発明の趣旨において、アミノ酸とは、天然アミノ酸及び非天然のアミノ酸を意味するものである。
【００２８】
「天然アミノ酸」とは、天然に存在するタンパク質に見出されるアミノ酸の形態Ｌを意味し、すなわち：アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（ｄ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）及びバリン（Ｖ）。
【００２９】
「非天然アミノ酸」とは、天然アミノ酸の形態Ｄであって、天然アミノ酸のヒト属の形態（例えば：アルギニン、リジン、フェニルアラニン及びセリン）を意味し、ロイシン及びバリンではない形態である。また、アルファ−アミノ酪酸（Ａｂｕ）、アグマチン（Ａｇｍ）、アルファーアミノイソブタン酸（Ａｉｂ）、Ｎ−ホルミル−Ｔｒｐ（Ｆ−ｔｒｐ）、サルコシン、スタチン、オルニチン、非アミノチロシン等の合成アミノ酸を含んでいる。非アミノチロシンは、Ｎ末端取り込まれる一方、アグマチン及びスタチンは、これらのペプチドのC末端に取り込まれる。
【００３０】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１では、少なくとも1つのアミノ酸を、その派生物又は類似物の１つと交換することが可能である。
【００３１】
好ましい具体化では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４はそれぞれ、アミノ酸を示している。
好ましくは、Ｘ１はＧ、Ｖ、Ｓ、Ｐ及びＡから選択され、Ｘ２はＧ、Ｖ、Ｓ、Ｐ及びＡから選択され、Ｘ３は、Ｒ、Ａ及びＶから選択され、Ｘ４は、Ｓ及びＰから選択される。類似のシーケンスとしては、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６：−Ｗ−Ｓ−Ｘ１−Ｗ−Ｓ−Ｘ２−Ｃ−Ｓ−Ｘ３−Ｘ４−Ｃ−Ｇ−、であり、そこではＧ、Ｖ、Ｓ、Ｐ及びＡから選択され、Ｘ２は、Ｇ、Ｖ、Ｓ、Ｐ及びＡから選択され、Ｘ３は、Ｒ、Ａ及びＶから選択され、Ｘ４は、Ｓ及びＰから選択される。
【００３２】
あるいは、Ｘ１及びＸ２は、Ｗ−Ｓ−Ｓ−、Ｗ−Ｓ−Ｇ−、Ｗ−Ｓ−Ｐ−、Ｗ−Ｓ−Ａ−、Ｗ−Ｓ−Ｒ−とすることも可能である。類似のシーケンスとしては、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７：−Ｗ−Ｓ−Ｘ１−Ｗ−Ｓ−Ｘ２−Ｃ−Ｓ−Ｘ３−Ｘ４−Ｃ−Ｇ−、であり、Ｘ１及びＸ２は、Ｗ−Ｓ−Ｓ−、Ｗ−Ｓ−Ｇ−、Ｗ−Ｓ−Ｐ−、Ｗ−Ｓ−Ａ−、Ｗ−Ｓ−Ｒ−から選択され、Ｘ３及びＸ４は、１〜５のアミノ酸からなるアミノ酸の配列を示す。
【００３３】
オリゴペプチドを修正する場合があり、これはアミド化、アシル化、ＰＥＧ化により、又はアミノ酸の追加により行わってもよいが、ステープルペプチドの修正により、又は特にアルブミン、又はＰＥＧとしてのポリマーにおける何らかの共役の手法により、又は、ゲル、ヒドロゲルとの組合せにより、行ってもよい。また、オリゴペプチドを環化することも可能である。
【００３４】
以下の異なる方法：液相内又は固体担持体（例えばＦｍｏｃ）上の化学合成により、本発明に従ったオリゴペプチドのペプチド配列を含む化合物のためのコード化が可能なＤＮＡの配列、又はフラグメントを含む遺伝子の構造物の、組み換え型技術を求めることにより、原核生物の真核生物発現システム又は発現産物を集めることにより、又は製品をインシチュウに表現する他の方法により、本発明に従ったオリゴペプチド得ることが可能である。本発明に従ったオリゴペプチドは、必要な場合は、脱グリコシルした形態又はグリコシル化された形態で存在してもよい。ある場合、そして製法の方法に従い、オリゴペプチドの第三級構造を再生することが必要と成る場合もある。
【００３５】
発明に従ったオリゴペプチドは：
−ＨＵＶＥＣ又はＨＢＭＥＣのアポトーシスの保護役割を行うものの、その増殖をモジュールしない、
−ＶＥＧＦ又はｂＦＧＦ等の血管形成因子の存在下での移動を促進する、
−Ｕ８７−ＭＧと接触する際に、神経膠芽腫の腫瘍細胞に誘起されるＨＢＭＥＣの移動を抑制する。
【００３６】
従って、本発明に従ったオリゴペプチドは、様々な病理学の治療における抗血管形成の有効成分治療又は医薬として用いることが可能であり、この様々な病理学には特に、癌、関節炎、慢性関節リウマチ、アテローム性動脈硬化、角膜移植片の血管新生、肥大瘢痕又はケロイド、増殖的網膜症、糖尿病性網膜症、成体の黄斑変性、造粒、新生血管の緑内障及びブドウ膜炎が含まれる。
【００３７】
好都合なことに、ヒト又は動物における腫瘍の新血管形成を妨げることが可能である。
【００３８】
他の具体例によれば、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１の小型のオリゴペプチドは、血液‐脳関門の通過、及び中枢神経系疾患の急速な生体分布を促進するとともに、腫瘍領域の対象化を促進する。その水溶液への溶解性により、医療との互換性が生じる。従って、ヒト又は動物の脳腫瘍の治療のための医薬、特に神経膠芽腫の治療のための医薬として、これを用いることができる。
【００３９】
さらに、これは身体に存在するタンパク質から誘導されるオリゴペプチドであるため、存在する多くの抗血管形成の場合のように、化学合成の結果の分子又は植物からの分子と比較して、本来は制限されるべき有害な副作用に対しての大きな寛容度及び特性を示す。さらに、これが溶解性であり、非毒性であり、かつ、天然アミノ酸から成る場合は、これは非免疫原性であり、簡単に体内から取り除かれる。
【００４０】
本発明に従ったオリゴペプチドの作用機構は、ＴＳＰ−１のそれとは異なり、ＣＤ３６とは無関係である。実際、ＣＤ３６がＴＳＰ−１により内皮細胞内で活性化すれば、これはＶＥＧＦ−Ｒ２（ＫＤＲ）の活性化に干渉するとともに、内皮細胞のアポトーシスをもたらすことになる。本発明に従ったオリゴペプチドは、２つのレセプター（ＣＤ３６及びＶＥＧＦＲ−２）との接近を促進するものの、ＣＤ３６との接触を増大することになる。
本発明に従ったオリゴペプチドは、内皮細胞との抑制の役割を直接演ずるのではなく、リガンドの存在下でのＶＥＧＦＲ−２の活性化を促進するため、ＶＥＧＦの管が、内皮細胞の存在及びその移動を残存しやすくすることが知られている。
【００４１】
更に、本発明によるオリゴペプチドは、２つの分子を調整することができる：血管形成の現象に関係するＣＤ３６及びＶＥＧＦ−Ｒ２である。
【００４２】
本発明に従ったオリゴペプチドは、任意の適合管理法により投与することが可能である。
これは中枢神経系に影響を及ぼす病気治療であるため、クモ膜下腔、心室内、実質内性、硬膜外により、優先して管理される。他のアプリケーションに対しては、これは、静脈管、腔内管、硝子体管、経蝶形骨洞又は局所管により優先して管理されるが、このような管理は、これらのモードにより制限されない。これは、液体若しくはゲル又は任意の他の支持を含む任意の形態で、医薬品組成物内に統合することが可能であり、特に徐放が可能である。
【００４３】
オリゴペプチドは、医薬品組成物、特に下記の状態の医薬品組成物において、優先的に処方されており：
−液体：特に、投入時に、溶液、懸濁液又はエマルション（点滴用の製剤）の形態で処方することができる。
−又は固体、特にゲル、バイオポリマー若しくは生体材料、又は例えば放出制御又は送達系を実現する移植片又は血液ポンプのような任意の医療器具を含んでいる。
【００４４】
腫瘍の治療の範囲において、本発明に従ったオリゴペプチドは、単独で用いられてもよく、又は１つ以上の他の有効成分抗腫瘍に関連して用いられてもよい。これは少なくとも、例えば、抗腫瘍化学療法有効成分で用いることが可能である。
【００４５】
従って、本発明はまた、以下の配列を示すオリゴペプチドを備えた医薬品組成物を目的とし：
−Ｗ−Ｓ−Ｘ１−Ｗ−Ｓ−Ｘ２−Ｃ−Ｓ−Ｘ３−Ｘ４−Ｃ−Ｇ−（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）
その中でＸ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４は、１〜５のアミノ酸からなるアミノ酸の配列を表し、血管形成の医薬阻止因子としてこれを使用する前述として、これらの組成物は、前述のように血管形成に関連する病気の治療に有効である。
【００４６】
本発明は、本発明に従ったオリゴペプチドの実施例により、及び、本発明に従ったオリゴペプチド、特に実施例１のオリゴペプチドの抗血管形成効果を示す試験の結果により、ここに示される。
【実施例１】
【００４７】
−Ｗ−Ｓ−Ｇ−Ｗ−Ｓ−Ｓ−Ｃ−Ｓ−Ｒ−Ｓ−Ｃ−Ｇ−（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５）
この本発明のオリゴペプチド物体は、ＳＣＯ−スポンジンの第４のＴＳＲ領域より最も保持される１２のアミノ酸に対応する。
試験
【００４８】
Ａ．本発明に従ったオリゴペプチドのインヴィトロによる血管形成上での効果の研究
アポトーシスのプロセスは、ＤＮＡの開裂を伴うとともに、それにより可溶ヌクレオソーム（断片化ＤＮＡを伴う細胞質ヒストン）を発生させ、この可溶ヌクレオソームは、供給元の推奨に従い、酵素結合免疫吸着検査法、細胞死検出ＥＬＩＳＡキット ＰＬＵＳ（酵素結合免疫吸着検査法）（Ｒｏｃｋ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｅｓ、フランス）によるアッセイが可能である。
ＨＢＭＥＣ細胞を２４ウェルプレートに、５ｘ１０３細胞／ウェルの密度で接種し、２４時間を静止する。細胞を、基礎培地で培養し、すなわち異なる治療に２４時間晒されるに先立ち変化する成育因子がない状況で培養する。その後これらを回収し、その後、５分間２００ｇ遠心分離する。その後細胞を計数し、その後、ＰＢＳ内で３ｘ１０４セル／ｍｌに適合する。新規な遠心を、２００ｇで１０分間実行する。上澄みを回収し、雰囲気温度での３０分の培養期間の前に、神経細胞を２００μＬの溶解バッファで取り戻す。１４００ｒｐｍで１０分間新たに遠心分離した後、２０μＬの上澄みが、ストレプトアビジンにコーティングされるウェルに分配され、それぞれの条件が複製され実行される。免疫反応性溶液が８０μＬ、それぞれのウェルに加えられる。この溶液は、インキュベーション緩衝剤ならびに２つの抗体：ビオチンに結合する抗体依存性ヒストン、及び、ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）に結合する抗体抗ＤＮＡを含んでいる。これら２つの抗体は、ストレプトアビジンを介してプレートに結合する。プレートは、撹拌及び暗所の下、室温で２時間インキュベーションされる。このステップの後、定着されない抗体の過剰を除去するため、２００μＬのインキュベーション緩衝剤による洗浄が３回行われる。その後、ＨＲＰの培地であるＡＢＴＳが１００μＬ、それぞれのウェルに追加される。ＡＢＴＳの溶液によるインキュベーションが、１５〜２０分の長さの間、暗闇で実行される。ＨＲＰによりＡＢＴＳを還元し、比色反応によりアポトーシスの視覚化が可能になる。その後、停止液ＡＢＴＳを１００μＬ加えて反応が停止され、そしてその後、４０５ｎｍまでプレートリーダーを通して結果が分析される。形成されるオリゴヌクレオゾームの量は、呈色の強度及びアポトーシス細胞に比例する。
【００４９】
図６及び表１に示される結果が、下記に示される：
【００５０】
【表１】
2017538683.tif 000002
【００５１】
表１：細胞ＨＢＭＥＣ上でのアポトーシスの誘導試験中に、治療のそれぞれの条件で測定される光学濃度に関する平均値
ＢＭ＝基礎培地
ＣＭ＝完全培地
ＮＸ＝本発明に従ったオリゴペプチド
【００５２】
これらの結果は、本発明に従ったオリゴペプチドがＶＥＧＦと同様のレベルで、ヒトのアポトーシスの血管内皮細胞ＨＢＭＥＣを保護することを示しており、この効果は、ＴＳＰ−１の存在下では観察されない。実際、ＴＳＰ−１が血管内皮細胞のアポトーシスを誘起することが知られている。さらに、本発明ＶＥＧＦに従った複合治療オリゴペプチドは、この防護効果を改良する。
【００５３】
Ｂ．鳥類モデルの絨毛尿膜（ＣＡＭ）からの血管形成に対する本発明に従ったペプチド効果の研究
血管形成は、胚発生の重要な機構の１つである。特定の生理的状況及び病的状況（特に癌）のもとで決定するプロセスでもある。このメカニズムは、潜在的抑制剤にせよ活性剤にせよ、多くの要因に依存している。インヴィーヴォでこれらの要因の主要な特性を評価する目的で、最も広範囲にわたるモデルは、鶏胚からの（絨毛尿膜の）ＣＡＭのモデルである（Ｒｉｂａｔｔｉら、２０００）。胚形成期４日と１０日の間での活発な血管形成段階の間に、血管新生促進又は抗血管新生の因子の試験を行うことが可能であるという長所がある。したがって、異なる分子の大きな効果を生体内で評価することが可能となる。ＣＡＭのモデルを、試験的な腫瘍の発育に用いることもできる。ヒト癌細胞系のＣＡＭ表面への移植が、胚形成期に９日間行われる。早発性徐脈１２日（ＥＤ１２）の移植３日後に、腫瘍の形成がカム表面に見出すことができる。次に、４８時間、局所的に治療が可能であり、この４８時間はそのステージに続き、そして、腫瘍は早発性徐脈１４日（ＥＤ１４ｊ）に繋がる。
【００５４】
詳細なプロトコル：
受精卵（ハースの家禽農場、ストラスブール、フランス）が、インキュベーションを開始する前に、１８℃に２４時間維持される。次いで、これらは育雛器内（マイノ、イタリア）において、含水量４５％で３８℃に加温される。胚形成期は、ＨＡＭＢＵＲＧＥＲ 及び Ｈａｍｉｌｔｏｎ（Ｈ及びＨ, １９５１）の表より決定される。ＨとＨのステージ１７に一致するステージ初期の２．５ｊ（ＥＤ２．５）まで４ｍＬのアルブミンが１０ｍＬの注射器を用いて除去され、各々の卵子の中身がその卵殻から引き抜かれ、六角形に秤量されるナセルに配置される（ＶＷＲ、ストラスブール、フランス）。続いて、これらはペトリ皿に配置され（ＶＷＲ、ストラスブール、フランス）、水を含有することにより適切な湿度測定法のメンテナンスを確実にするとともに、汚染の危険性を制限し、続いて、孵化するために箱を引き渡す。この発育の段階で、漿尿膜には血管の新生が開始される。ステージＥＤ９（Ｈ及びＨのステージ３５）では、直径およそ１ｃｍ、厚さ１ｍｍのシリコーンのリングが、複数の血管を管理する様式で配置される。２つの試験的なアプローチが行われる。
【００５５】
１）ＣＡＭ上での治療
異なる治療（本発明に従ったオリゴペプチド、無菌蒸留水、ＶＥＧＦ１６５、ベバシズマブ）が次に膜上に適用され、その後ＣＡＭ上に堆積されるウシゼラチンの塩基に吸収が可能となる（Ｂｌｏｘａｎｇ、Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ Ｃｈａｕｖｉｎ、フランス）。スポンジは、辺１ｍｍの立方体の無菌が割り当てられ、本発明に従ったオリゴペプチドが２５０μｇ／ｍＬの濃度で含浸される。認識される受精量は、スポンジに対して５０μＬである。スポンジに同じ滅菌蒸留水量を含浸させることにより、制御が実行される。さらに２つの血管形成の証がＣＡＭの上で堆積し、スポンジには、１０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ１６５が含浸し（積極的モデル）、２５０μｇ／ｍＬのベバシズマブが含浸される（否定的モデル）。結果が、図１Ａ〜１Ｄに示される。
【００５６】
２）Ｕ８７−ＭＧの移植からの腫瘍に対する治療
腫瘍を得るため、基礎培地の存在下で細胞Ｕ８７−ＭＧが、７５ｃｍ２のフランジ内に対して２００，０００個の細胞の割合で、接種される。４ｘ１０６個の細胞を含む体積が取得され、その後３１１ｇで５分間遠心された後、上澄みが除去され、細胞は２０μＬの中域で再懸濁され、これらは以前ＥＤ９に胎児のＣＡＭ上に当てはまったシリコーン環の中心に堆積される。移植が実行した後、培養のために胚が引き渡される。ＥＤ１１では、ＭＺＦＬ３カメラで腫瘍を観察することができる（ライカ、パリ、フランス）。この段階で、腫瘍は、２５０μｇ／ｍＬの本発明に従ったオリゴペプチド３０μＬにより、又は、ステージＥＤ１３までの無菌蒸留水３０μＬにより、局所的（腫瘍の先端部分）に処理される。その後、腫瘍が採取され、また凍結切片を作製することにより、免疫組織化学的な分析を可能にする。マイクロピペットを用いた卵黄動脈により１％（Ｃｈｕ、リモージュ）で水性フルオレセインの溶液を注射することにより、血管形成ネットワークが視覚化される。
腫瘍の巨視的観察ならびに管のフルオレセインの汎発が、蛍光の双眼鏡で遂行される（ＭＺＦＬ３、ライカ、フランス）。図１Ｄに示す結果は、２５０μｇ／ｍＬの本発明に従ったオリゴペプチドによる９時間の治療の後の血管系の抑制を示す。
【００５７】
アンジオグラフィー上、特により深い微小血管でのＣＡＭの血管系観察を促進するフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）の投入により、実験が行なれる。
【００５８】
ＶＥＧＦ（図１Ｃ）での処理では、微小血管新生は密度が高く、多くの脈管分枝を含んでいる血管新生誘導薬剤であることが言及される。対照的に、本発明（図１Ｄ）に従ったオリゴペプチドで抗血管形成効果は、微小血管新生に関してアバスチン（商標）（図１Ｂ）のベバシズマブのそれに相当する。その動作は、特に脈管樹状突起を構成する微小血管に顕著である一方、最も重要なこの管が変化するとは思われない。
【００５９】
Ｃ．腫瘍血管新生に関する本発明に従ったペプチドの効果の研究
腫瘍を得るため、基礎培地の存在下で細胞Ｕ８７−ＭＧが、７５ｃｍ２のフランジ内に対して２００，０００個の細胞の割合で、接種される。
【００６０】
４ｘ１０６個の細胞を含む体積が取得され、その後３００ｇで５分間遠心された後、上澄みが除去され、細胞は２０μＬの中域で再懸濁され、これらは以前ＥＤ９に胎児のＣＡＭ上に当てはまったシリコーン環の中心に堆積される。移植が実行した後、培養のために胚が引き渡される。
【００６１】
ＥＤ１１では、ＭＺＦＬ３カメラで腫瘍を観察することができ（ライカ、パリ、フランス）、腫瘍増殖の進化の追跡調査が、早発性徐脈１４日（ＥＤ１４）まで可能である。
【００６２】
結果が以下に示される：
ａ．モデルＣＡＭの腫瘍血管形成における本発明に従ったオリゴペプチドの効果の巨視的観察（図３Ａ〜３Ｃ）
ＣＡＭ上で開発される腫瘍は、双眼タイプＭＺＦＬ３（ライカ、フランス）を用いて、採取前に絨毛尿膜上で観察される。
【００６３】
腫瘍細胞の移植３日後に、腫瘍が発達し始め、血管新生が生成する。腫瘍表面への毛細管の存在によりピンクがかった色は、サイズが減少（直径１〜２ｍｍ）した腫瘍に関する本発明に従ったペプチドにより、治療の開始後２４時間で消失し、２４〜４８時間では、腫瘍の直径が２ｍｍよりも大きくなる。真珠状の白色が、恐らく腫瘍後退に至る壊死性プロセスの確立を暗示する腫瘍の表面に現れる（図３Ａ−ｃ）。腫瘍のサンプル及び環（本発明に従ったペプチド又は制御による処理領域）内に存在するＣＡＭにより、腫瘍内を通る血管を見ることができるようになる。
【００６４】
本発明に従ったオリゴペプチドで治療の後、腫瘍を潤す管の密度の顕著な減少が見出されるため、前記結果で暗示される抗血管形成活性が確かめられる（図３Ａ−ｉ）。
【００６５】
図３Ｃに示される結果に対応する値が、下記の表２に示される：
【００６６】
【表２】
2017538683.tif 000003
【００６７】
表2：この表は、測定された腫瘍領域（端部及び中心）に関して、治療（ＴＳＰ−１、本発明ＮＸに従ったオリゴペプチド及び治療コントロール（Ｃｔｒｌ）のない制御）のそれぞれの条件で得られるＫｉ−６７の標識の数量化値を示す。
【００６８】
ｂ．血管新生の研究、及び、本発明に従ったペプチドによる処置腫瘍上の免疫組織化学による腫瘍マーカーの発現（図５）
ニワトリの血管の脈管内皮は、レクチン、ＳＮＡ−１（西洋接骨木（セイヨウニワトコ）アグルチニン−１、ベクターラボラトリーズ社）、結合ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）を用いて顕著である。
【００６９】
雰囲気温度のＰＢＳ １Ｘ−ＰＦＡ ４％を２００μＬで１０分間実装した後、ＴＢＳ １Ｘ−トゥイーン０．０５％−トリプシン０．１％のｐＨ７．６の溶液で、スライスを１０分間培養する。これらはその後ＰＢＳ １Ｘで３回洗浄された後、ＴＢＳ １Ｘ−トゥイーン０．０５％の溶液内でレクチンＳＮＡ−１を１／２００希釈したｐＨ７．６の希釈剤１００μＬが、１時間適用される。（最後に蒸留水で）洗浄の後、前項に記載のように、その後、薄片が適合され、蛍光顕微鏡で観察される。管の計数が、拡大ｘ１００の写真から、及び６００μＬから広がる腫瘍の端部からの周縁帯から、作製された。観察された効果の関連性を確認するため、分散分析タイプの統計試験がその後実行された。ＳＮＡ−１レクチンは具体的に、血管壁を構成するニワトリの血管内皮細胞を示す。処理されない腫瘍のスライス上のＳＮＡ−１標識が、腫瘍の塩基に位置する大血管で豊富に血管新生化される構造を示す。本発明に従ったペプチドによる処理後、ＳＮＡ標識−１はより具体的には、腫瘍表面に近い領域で消失し、この領域での微小血管新生の消滅が示唆される。
【００７０】
標識が同じビメンチン／ＳＮＡ−１は、証拠の提供により前記観察が補完されるが、この証拠によれば、本発明に従ったペプチドにより誘導される腫瘍血管形成の抑制が腫瘍微小血管新生の退行に寄与するものの、ビメンチンを発現する分化腫瘍細胞の数が減少する。
腫瘍内でのビメンチンを示す細胞数は、腫瘍制御では非常に重要である（図５）。
【００７１】
ｃ．本発明に従ったオリゴペプチドによるＣＡＭモデルにおける腫瘍の細胞増殖処理後の研究（図７Ａ〜７Ｅ）
腫瘍は、ＰＢＳ １Ｘ−ＰＦＡ ４％に配置され（２４ｈ）、その後無水エタノールで脱水され、その後純度トルエンで脱水され、そしてその後、パラフィンブロック内に含まれ且つ保たれた。ミクロトームから４μｍのスライスがスーパーフロスト薄片に保管され、５０°Ｃのオーブンで１晩乾燥が行われた。
【００７２】
免疫標識を実現するため、スライスは脱パラフィンされ、その後エタノール濃度が減少する溶液で再水和された後、ＰＢＳ １Ｘで洗浄される。
【００７３】
抗原性部位を明らかにするため、薄片がｐＨ７でクエン酸塩バッファ内に培養され（クエン酸２００μＬ；クエン酸ナトリウム９．８ｍＭ）、その後加熱サイクルを経る（マイクロ波により７５０Ｗで５分を４回）。本来のペルオキシダーゼが阻害され、メタノール−５％Ｈ２Ｏ２による浴槽が１０分間実行される。３回の洗浄の後、３％ＰＢＳ−ＢＳＡで飽和を行った後、抗Ｋｉ６７抗体によるインキュベーションが遂行される。ＰＢＳ １Ｘでのリンスの後、二次抗体ＨＲＰ接合体が雰囲気温度で１時間加えられる。ＤＡＢ（３，３−ジアミノベンジジン）で、新しい事実が実行される。対比染色がヘマトキシリンで実行され、ライカＤＭＲＸ顕微鏡で観察される前に、スライスが水溶液内に供給される。
【００７４】
Ｋｉ−６７の標識が、腫瘍制御の全体上に均一に分配される（図７Ａ Ｄ）一方、腫瘍内では本発明に従ったペプチドにより処理され（図７Ａ Ｆ）、これら周囲の区域では、マーカーＫｉ６７を示さない。標識Ｋｉ６７が少量の領域が、以前に特徴を有していた地域に対応し、そこでは、ビメンチン発現が極めて低く、血管数が顕著に減少する。従って、この結果は、腫瘍細胞の増殖における本発明に従ったペプチドの電位効果を示唆し、対応領域において血管新生が顕著に減少し得るものである。
【００７５】
従って、腫瘍血管形成の抑制に対する本発明に従ったペプチドの作用により、腫瘍細胞（ビメンチン）のマーカーの発現が減少することになり、ＣＡＭ上で実験的に腫瘍が得られることが強調されるとともに、腫瘍細胞の増殖が顕著に減少することになる。
【００７６】
ｄ．ＣＡＭモデル上に得られる腫瘍に対して実行されるタンパク質解析及び転写学、並びに、血管形成に関係する可溶性因子の分泌変異の解析と共に、本発明に従ったオリゴペプチドによる処理の結果
細胞分泌の性質は、ＴＳＰ−１が処理する細胞の中央においてＩＬ−８の顕著な増加を示す一方、本発明に従ったオリゴペプチドは、ＭＣＰ−１の大きな増加（図２Ａおよび２Ｂ）及び、Ｕ８７−ＭＧの上澄みのＶＥＧＦ−Ａの減少（図２Ｃ）を、誘導する。
従って、ペプチドは、血管内皮細胞及び腫瘍細胞を含んだ状況で、抗血管形成効果を有している。
【００７７】
図２Ｂ及び図２Ｃに発現される結果に対応する値が、下記の表３及び表４に示される：
【００７８】
【表３】
2017538683.tif 000004
【００７９】
表３：図Ｂに示されるＨ２Ｏ（Ｈ２Ｏ）、ＳＰ−１（ＴＳＰ）、又は本発明に従ったオリゴペプチド（ＮＸ）による処理後の、Ｕ８７−ＭＧ上澄みの解析プロテオーム配列の結果に対する値
【００８０】
【表４】
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【００８１】
表４：ヒストグラムへの相対的な値であって、Ｈ２Ｏ（Ｈ２Ｏ）、ＴＳＰ−１（ＴＳＰ）又は図Ｃに示されるＥＬＩＳＡによる本発明に従ったオリゴペプチド（ＮＸ）による処理後、Ｕ８７−ＭＧの上澄みへのＶＥＧＦの投薬量を示す。
【００８２】
本発明に従ったオリゴペプチドの血管上の直接阻害作用に関し、ＣＡＭからの実験的腫瘍であるこのモデル上で、ＴＳＰ−１を、同一効果であるが小程度に、発生させることが示された（図２Ａ、２Ｂ及び２Ｃ）。従って、本発明に従ったオリゴペプチドは、腫瘍血管新生の抑制のＴＳＰ−１よりも効率性が高い。
【００８３】
ＣＡＭからの実験的な腫瘍における遺伝子発現の研究が、全体的に増加して明らかにされ、レセプター（ＩＴＧＢｌ、ＰＤＧＦＦβ、ＫＤＲ、ＴＨＩ−１、ＴＨＩ−２、ＣＤ３６）のための遺伝子コーディングの全ての制御に比較した４つの因子により、本発明に従ったオリゴペプチドにより処理される腫瘍内での検討が行われる。これらのレセプターは、ニワトリ種に属しており、従って、血管宿主上に見出される。遺伝子発現のこの増加は、ＴＳＰ−１から小さいスケールで受け取った腫瘍にも見出された（図４）。さらに、ＩＴＧＢｌの、ＣＤ３６のそれと同一時間の、過剰発現が、ＴＳＰ−１（ＴＳＰ）の本発明（ＮＸ）に従ったペプチドを区別する。さらに、実験的な腫瘍の血管内でＰＤＧＦＲＢ、ＴＩＥ１、ＴＥＫ及びＫＤＲに観察される発現のレベルは、それにもかかわらず、本発明に従ったオリゴペプチドが微小環境腫瘍のレベルに顕著な影響を与えることを示している（図４）。
【００８４】
図４に表される結果に対応する値が、下記の表５に示される：
【００８５】
【表５】
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【００８６】
表５：この表は、治療における異なる条件によりそれぞれの遺伝子のために得られるＲＱを表す。ＲＱ平均は、三重（さんじゅう）から得られる。動作＜＜ｃｏｎ＞＞、制御のため、＜＜ＴＳＰ＞＞トロンボスポンジン１によるＴＳＰ治療−１、及び本発明に従ったペプチドによるＮＸ治療
【００８７】
Ｄ．本発明に従ったペプチドのインヴィーヴォ抗血管形成の研究
マウスでの実験により、ＣＡＭモデルで得られる結果が確認される。この場合、腫瘍は、ヌードマウスの腿の高さにおける皮膚下でのヘテロタイプ移植からであった（図７Ｂ、７Ｃ及び７Ｅ）。
【００８８】
図７Ｂ、７Ｃ及び７Ｅに示される結果に対応する値が、下記の表６、表７及び表８に示される：
【００８９】
【表６】
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【００９０】
【表７】
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【００９１】
【表８】
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【００９２】
表６、表７及び表８：これらの表は、インヴィーヴォに処理される腫瘍に関して遂行される様々な解析の間に得られる総量に対応する。増殖の解析（ＫＩ６７標識数量化）（Ｆ）、血管新生の解析（ＣＤ３１標識数量化）（Ｇ）、及び時間の機能としての腫瘍増殖の解析（腫瘍の体積の程度）（Ｈ）。治療＜＜ｃｏｎ＞＞、＜＜Ｃｔｒｌ＞＞及び＜＜ヒドロゲル＞＞は、条件制御であり、＜＜ＴＳＰ＞＞及び＜＜ＴＳＰ１＞＞、トロンボスポンジン１（ＴＳＰ−１）及びＮＸによる治療は、本発明に従ったペプチドによる治療である。
【００９３】
本発明に従ったオリゴペプチドにより処理される腫瘍は、処理後４８時間で体積が減少して血管が小さくなり、腫瘍が制御されＴＳＰ−１により処理が行われることになる（図７Ｄ Ｒ）。組織学研究及び免疫組織化学では、制御による比較により、末梢のＣＤ３１標識の減少が示された（図７Ａ及び図７Ｃ）。この血管の量の減少は、細胞増殖の減少により伴われ、標識Ｋｉ−６７の低下が示された（図７Ｂ）。
【００９４】
本発明に従ったオリゴペプチドにより血管新生のメカニズムへの誘導に対する阻害は、壊死性領域の形成に至らしめると共に、腫瘍制御に記録することにより処理される腫瘍に対して未分化型とする、腫瘍細胞のマーカーの発現を減少させる。
【００９５】
従って、本発明に従ってオリゴペプチドは、特に神経膠芽腫の血管形成を伴った病気の治療に対して、特に複合ターゲティングの枠組みで、特に用いることが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【国際調査報告】
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