(57)【要約】ヒト起源の新規なインターロイキン−２０（ＩＬ−２０）結合分子、具体的にはヒト由来抗ヒトＩＬ−２０抗体、ＩＬ−２０結合断片、それらの誘導体および生物工学的変異体が提供される。加えて、診断および治療において使用されるための医薬組成物、キットおよび方法が記載される。加えて、細胞型の酵素連結リガンド結合アッセイが、薬学的使用のための抗体およびその生物工学的誘導体を単離するために、具体的には組換え型のヒト由来抗ヒトサイトカイン抗体を単離するために記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
好ましくはその可変領域に、
（ａ）下記に示されるＶＨ可変領域アミノ酸配列および／またはＶＬ可変領域アミノ酸配列の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、
（ｉ）図１（ＶＨ）（配列番号２、配列番号１０、配列番号１８および配列番号２６）、および
（ｉｉ）図１（ＶＬ）（配列番号４、配列番号１２、配列番号２０および配列番号２８）
（ｂ）図１に示されるようなＶＨ領域および／またはＶＬ領域のアミノ酸配列、
（ｃ）（ａ）の前記アミノ酸配列のいずれか１つの部分的変化から生じるアミノ酸配列からなる少なくとも１つのＣＤＲ、あるいは
（ｄ）（ｂ）のアミノ酸配列の部分的変化から生じるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域、
を含む、ヒト由来モノクローナル抗ヒトインターロイキン−２０（ＩＬ−２０）抗体またはそのＩＬ−２０結合断片、あるいはそれらの合成または生物工学的誘導体。
【請求項２】
ＩＬ−２０の生物学的活性を低下または中和することができる、請求項１に記載の抗体またはＩＬ−２０結合断片。
【請求項３】
アミノ酸配列１０１−ＰＤＨＹＴＬＲＫＩＳＳＬＡＮＳＦＬＴ−１１８（配列番号６９）、アミノ酸配列１０２−ＤＨＹＴＬＲＫＩＳＳＬＡＮＳＦ−１１６（配列番号７０）またはアミノ酸配列１０１−ＰＤＨＹＴＬＲＫＩＳＳＬＡＮＳＦＬ−１１７（配列番号７２）からなるＩＬ−２０由来ペプチドを認識し（ただし、前記配列において、Ｐ１０１、Ｉ１０９、Ｓ１１０および／またはＬ１１７のみが別のアミノ酸によって置換されることがあり、好ましくはアラニンによって置換されることがある）、かつ、アミノ酸配列９７−ＮＹＱＴＰＤＨＹＴＬＲＫＩＳＳＬＡＮ−１１４（配列番号７１）からなるペプチドを認識しない、または実質的に認識しない、請求項１または２に記載の抗体あるいはＩＬ−２０結合断片、合成または生物工学的誘導体。
【請求項４】
マウスＩＬ−２０と実質的に結合しない、かつ／またはマウスＩＬ−２０を実質的に中和しない、請求項１または２に記載の抗体またはＩＬ−２０結合断片。
【請求項５】
前記生物活性が、
（ａ）細胞ベースのＳＴＡＴ（シグナル伝達・転写活性化因子）活性化アッセイにおけるヒトＩＬ−２０シグナル伝達、
（ｂ）ＩＬ−２０サイトカイン細胞表面受容体結合の阻害、
（ｃ）ヒトＩＬ２０ＲのＩ型／ＩＩ型の受容体複合体のヒトＩＬ−２０媒介活性化、および／または
（ｄ）ヒトＩＬ−２０の前炎症性活性
である、請求項２〜４のいずれか一項に記載の抗体またはＩＬ−２０結合断片。
【請求項６】
少なくとも前記ＣＤＲが、図１に示される対応するＣＤＲに対して少なくとも７０％の同一性、好ましくは８０％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性を有し、ならびに／あるいは、前記ＶＨ可変領域および／またはＶＬ可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸配列が、図１に示される対応するフレームワーク領域に対して少なくとも７０％の同一性、好ましくは８０％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体またはＩＬ−２０結合断片。
【請求項７】
Ｉｇ１またはＩｇＧ４である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体またはＩＬ−２０結合断片。
【請求項８】
表１において示されるＣＨアミノ酸配列およびＣＬアミノ酸配列（配列番号６、配列番号１４、配列番号２２および配列番号３０）から選択されるアミノ酸配列または少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＨ定常領域および／またはＣＬ定常領域を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体またはＩＬ−２０結合断片。 
【請求項９】
ヒトＩＬ−２０に対する結合について、請求項１〜８のいずれか一項に記載される抗体と競合する抗体または抗原結合分子。
【請求項１０】
単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆ（ａｂ）断片およびＦ（ａｂ’）２断片からなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載される抗体または抗原結合断片の１つの免疫グロブリン鎖の可変領域を少なくともコードするポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１１に記載されるポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１３】
請求項１１に記載されるポリヌクレオチドまたは請求項１２に記載されるベクターを含む宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１２に記載されるポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはその免疫グロブリン鎖。
【請求項１５】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載される抗ＩＬ−２０抗体またはＩＬ−２０結合断片、あるいは、請求項１３に記載される細胞を培養することによって得られる抗ＩＬ−２０抗体またはＩＬ−２０結合断片を含む免疫コンジュゲートであって、好ましくは、放射性核種、酵素、基質、補因子、蛍光性マーカー、化学発光マーカー、ペプチドタグ、重金属、磁気粒子、薬物または毒素を含む免疫コンジュゲート。
【請求項１６】
請求項１〜１０または１４のいずれか一項に記載される抗ＩＬ−２０抗体またはＩＬ−２０結合断片、請求項１５に記載される免疫コンジュゲート、請求項１１に記載されるポリヌクレオチド、請求項１２に記載されるベクター、あるいは請求項１３に記載される細胞を含む組成物であって、好ましくは、
（ａ）医薬組成物であり、かつ、薬学的に許容され得る担体をさらに含み、かつ、必要な場合には、炎症性疾患を処置するために有用であるさらなる薬剤をさらに含む、組成物、あるいは、
（ｂ）診断組成物またはキットであり、かつ、免疫または核酸ベースの診断方法において従来から使用される試薬をさらに含む、組成物。
【請求項１７】
目的とするリガンドのリガンド結合ドメインへの結合を評価するための方法であって、
（ａ）細胞内機能的領域（２）を必要に応じて含む前記リガンド結合ドメインを発現する標的細胞（１）を、レポーター（４）により標識される目的とする前記リガンドを含むサンプル（３）と接触させること、および
（ｂ）レポーター活性（６）を測定すること
を含み、
コントロールと比較した場合のレポーター活性の増大が、目的とする前記リガンドが前記リガンド結合ドメインに結合することの指標となる、方法。
【請求項１８】
前記結合ドメインが受容体または抗リガンド抗体に由来し、かつ／あるいは、前記リガンドがサイトカインであり、好ましくはインターフェロンまたはインターロイキンである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記リガンド結合ドメインおよび／または前記リガンドが生物学的に活性である、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞、リガンドおよび／またはリガンド結合ドメインが哺乳動物起源のものであり、好ましくはヒト起源のものである、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記レポーターが、検出可能な酵素であり、好ましくは、ルシフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼからなる群から選択され、最も好ましくはＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼまたはＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼである、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記標識されたリガンドが組換え融合タンパク質であり、好ましくは、宿主細胞によって発現され、かつ、分泌される組換え融合タンパク質である、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記標的細胞が前記リガンド結合ドメインを内在性に、一過性に、または安定的に発現する、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の方法、ならびに／あるいは、前記宿主細胞が前記融合タンパク質を一過性に発現する、請求項６に記載の方法。
【請求項２４】
前記サンプルが前記宿主細胞の培養物の上清を含み、好ましくは、前記コントロールが、前記上清を伴わない培養培地、または、前記融合タンパク質の発現および分泌を伴わない同じ種類の細胞の培養物の上清である、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記標的細胞および／または宿主細胞が、ＨＥＫ２９３Ｔ  ＭＳＲ細胞またはＣＯＬＯ２０５結腸直腸ガン細胞であり、好ましくは、（ｉ）前記標的細胞が、Ｉ型およびＩＩ型のＩＬ−２０受容体を一過性に発現するＨＥＫ２９３Ｔ  ＭＳＲ細胞であり、かつ、前記サンプルが、ＩＬ−２０−ルシフェラーゼ融合タンパク質を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞の上清を含むか、または、（ｉｉ）前記標的細胞が、膜貫通型の抗インターフェロンオメガ（ＩＦＮＷ）抗体を一過性に発現するＨＥＫ２９３Ｔ  ＭＳＲ細胞であり、かつ、前記サンプルが、ＩＦＮＷ−ルシフェラーゼ融合タンパク質を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞の上清を含む、請求項１７〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
試験サンプルが、目的とするリガンドのそのコグネイトリガンド結合ドメインへの結合のアゴニストまたはアンタゴニストを含むかどうかを明らかにするためのアッセイであって、請求項１７〜２５のいずれか一項に記載される方法の前記工程を含み、ただし、工程（ａ）の前または期間中において、前記リガンドおよび／または前記標的細胞が前記試験サンプル（７）に供され、かつ、工程（ｂ）において、前記試験サンプルの非存在下またはコントロールの存在下における前記レポーター活性と比較と比較した場合の、
（ｉ）レポーター活性の増大がアゴニストの指標となり、かつ
（ｉｉ）レポーター活性の低下がアンタゴニストの指標となる、
アッセイ。
【請求項２７】
前記試験サンプルが、（ｉ）抗リガンド抗体、そのリガンド結合断片、またはそれらの合成または生物工学的誘導体、あるいは、（ｉｉ）抗リガンド受容体（ＬＲ）抗体、そのＬＲ結合断片、またはそれらの合成または生物工学的誘導体を含み、好ましくは、前記抗体がヒト由来抗体であり、かつ、必要な場合には、前記コントロールが非リガンド結合抗体または非ＬＲ結合抗体である、請求項２６に記載のアッセイ。
【請求項２８】
前記サンプルが体液に由来し、好ましくは、抗リガンド抗体または抗ＬＲ抗体を含有することが疑われる被験体から得られる血清であり、好ましくは、前記被験体が、自己免疫障害もしくは炎症性障害、病原体感染、またはガンに罹患する、請求項２６または２７に記載のアッセイ。
【請求項２９】
前記リガンドが前記試験サンプルとプレインキュベーションされ、あるいは、コントロールとして、非リガンド結合分子もしくは非ＬＲ結合分子または過剰濃度の標識されていないリガンドとプレインキュベーションされる、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項３０】
ヒト由来モノクローナル抗リガンド抗体またはそのリガンド結合断片、あるいはそれらの合成または生物工学的誘導体を調製する方法であって、前記モノクローナル抗体を発現するＢ細胞が、哺乳動物から得られるサンプルから単離され、好ましくは、前記哺乳動物が、損なわれた中枢性寛容および／または末梢性寛容あるいは自己寛容の喪失、例えば、自己免疫性多腺性内分泌不全症・カンジダ症・外胚葉ジストロフィー（ＡＰＥＣＥＤ）に冒されており、
（ａ）前記サンプルを抗リガンド抗体の存在についてアッセイすること、
（ｂ）Ｂ細胞（好ましくはメモリーＢ細胞）を、抗リガンド抗体を含有することが特定されているサンプルから精製すること、
（ｃ）前記Ｂ細胞を培養し、必要な場合には、前記Ｂ細胞のサンプルを前記抗体の生物学的活性についてアッセイし、かつ
（ｉ）前記モノクローナル抗体を単離すること、または
（ｉｉ）前記抗体の少なくとも可変領域についての免疫グロブリン遺伝子レパートリーを前記Ｂ細胞またはメモリーＢ細胞から得ること、および
（ｄ）前記レパートリーを使用して、前記抗体またはそのリガンド結合断片、あるいはそれらの合成または生物工学的誘導体を宿主細胞において発現させ、前記抗体またはそのリガンド結合断片、あるいはそれらの合成または生物工学的誘導体を単離すること、
（ｅ）前記抗体またはそのリガンド結合断片、あるいはそれらの合成または生物工学的誘導体のサンプルの生物学的活性をアッセイすること
を含み、必要な場合にはさらに下記の工程
（ｆ）前記単離された抗体またはそのリガンド結合断片、あるいはそれらの合成または生物工学的誘導体を薬学的に許容される担体と混合する工程
を含み、
前記リガンドが、前記請求項のいずれか一項で定義されるようなリガンドであり、かつ、前記サンプルを、工程（ａ）、工程（ｃ）および／または工程（ｅ）においてアッセイすることが、請求項２６〜２９のいずれか一項に記載されるアッセイに従って行われることを特徴とする、方法。
【請求項３１】
自己免疫障害、炎症性障害、がん、または、受容体に対するリガンド結合によって媒介される障害を処置する際に使用されるための、抗リガンド抗体またはそのリガンド結合断片、あるいはそれらの合成または生物工学的誘導体を含む医薬組成物を調製するための方法であって、
（ａ）抗リガンド抗体を提供すること、
（ｂ）前記抗体を請求項２６〜２９のいずれか一項に記載されるアッセイに供すること、および
（ｃ）前記抗体がアンタゴニストまたはアゴニストであることが明らかにされる場合にだけ、前記抗体またはその誘導体を医薬組成物に製剤すること
を含む、方法。
【請求項３２】
請求項１７〜２５、３０または３１のいずれか一項に記載される方法あるいは請求項２６〜２９のいずれか一項に記載されるアッセイを行うために有用であるキットであって、
（ａ）レポーター（４）により標識される目的とするリガンドを含有するサンプル（３）、または、その調製のための手段、
（ｂ）細胞内機能的領域（２）を必要な場合には含む前記リガンド結合ドメインを発現する標的細胞（１）、または、その調製のための手段、
（ｃ）必要な場合にはレポーター活性（６）を明らかにするための手段（５）
を含み、
好ましくはさらに、請求項１７〜２５、３０または３１のいずれか一項に記載される方法あるいは請求項２６〜２９のいずれか一項に記載されるアッセイを行うための説明書を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は概して、哺乳動物起源の、好ましくはヒト起源のインターロイキン−２０（ＩＬ−２０）と結合する新規な分子、具体的にはヒトモノクローナル抗体、ならびに、その断片、誘導体および変異体に関連する。具体的には、本発明は、組換えによるヒト患者由来の抗ＩＬ−２０抗体、ならびに、ＩＬ−２０を認識するその断片、誘導体および合成または生物工学的変異体に関連する。加えて、様々な障害の処置および診断において有用であるそのような結合分子、抗体およびその模倣体を含む組成物が記載される。さらには、本発明は、自己免疫障害および自己炎症性障害、ならびに、悪性腫瘍、例えば、様々な形態の関節炎、血管炎症、アテローム性動脈硬化、乾癬、アトピー性皮膚炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）およびガンなどの免疫療法において使用されるための抗ＩＬ−２０抗体およびその言及された等価物、ならびに、それらの治療的介入における標的に関連する。より具体的には、本発明は、免疫調節に関与する遺伝子における変異に典型的には起因する損なわれた中枢性寛容および／または末梢性寛容あるいは自己寛容の喪失に冒された被験体に由来するＢ細胞から単離されているモノクローナル自己抗体に関連する。
【０００２】
さらなる局面において、本発明は、目的とするリガンドのリガンド結合ドメインへの結合を評価し、試験サンプルに存在する化合物（具体的には、前記リガンド結合を妨げることができる抗体）を特定するための方法に関連する。より具体的には、本発明は、目的とするリガンドの、前記リガンドに対する関連性のある受容体を発現する細胞への結合を評価するための新規な細胞アッセイ、および、候補化合物（例えば、抗体）が、前記リガンドが細胞表面のそのコグネイト受容体に結合することを妨げるかどうか、または補助するかどうか、したがって、アンタゴニスト活性またはアゴニスト活性を有するかどうかを評価するためのこのアッセイの使用に関連する。さらに下記で記載され、また、実施例および図において例示されるこのアッセイの最も好ましい実施形態によれば、本発明のアッセイはまた、本明細書中では発光法細胞結合アッセイ（ＬＣＢＡ）と呼ばれることがある。
【背景技術】
【０００３】
インターロイキン−２０（ＩＬ−２０、インターロイキン−１０ＤまたはＺＣＹＴＯ１０としても知られている）は、細胞成長に影響を及ぼす炎症性機能および免疫調節機能を有する多面発現性サイトカインである（非特許文献１）。ヒトＩＬ−２０遺伝子（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０１８７２４）が染色体１ｑ３２．１に位置しており、この遺伝子には、１７６個のアミノ酸（ａａ）を含むタンパク質がコードされる（ＵｎｉＰｏｒｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ識別子：Ｑ９ＮＹＹ１）。ＩＬ−２０は、下記の９つのメンバーからなるＩＬ−１０ファミリーに属する：ＩＬ−１０、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２２、ＩＬ−２４、ＩＬ−２６、ならびに、より遠縁のＩＬ−２８Ａ、ＩＬ−２８ＢおよびＩＬ−２９（非特許文献２）。ＩＬ−１０ファミリーのサイトカインは、組織上皮層の完全性および恒常性を維持するために不可欠である。このファミリーのメンバーは、組織上皮からの自然免疫応答を、ウイルス感染および細菌感染によって引き起こされる損傷を制限するために促進させることができる。状況に依存して、ＩＬ−２０は、強力な炎症性特性（非特許文献３）、血管形成特性（非特許文献４）および化学誘引特性（非特許文献５）を有する。しかしながら、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌による感染の期間中におけるＩＬ−１９およびＩＬ−２４と協働したＩＬ−２０についての免疫抑制的役割もまた確認されている（非特許文献６）。ＩＬ−２０が下記の５つの主要な細胞タイプにおいて優先的に発現される：上皮細胞、筋上皮細胞、内皮細胞、単球および骨格筋細胞（非特許文献７）。
【０００４】
ＩＬ−２０が低酸素刺激および炎症性刺激（例えば、ＩＬ−１βおよびリポ多糖（ＬＰＳ）など）によって調節される（非特許文献８、非特許文献９）。ＩＬ−２０により、シグナル伝達・転写活性化因子（ＳＴＡＴ）１および３の活性化が、ＩＬ−２０受容体（Ｒ）複合体のＩＬ−２０ＲＡ／ＩＬ−２０ＲＢ（Ｉ型）を介して、または、ＩＬ−２０受容体複合体ＩＬ−２２ＲＡ／ＩＬ−２０ＲＢ（ＩＩ型）を介してそのどちらでも誘導される（非特許文献１０、非特許文献１１）。両方の受容体複合体が皮膚において発現され、乾癬性皮膚およびアトピー性皮膚炎において劇的にアップレギュレーションされている（非特許文献１、非特許文献１２）。トランスジェニックマウスにおけるＩＬ−２０の過剰発現では、異常な表皮分化を含む皮膚異常を伴う新生児の致死が生じている（非特許文献１、非特許文献１３）。ＩＬ−２０は、ケラチノサイト、内皮細胞および滑膜細胞を標的とし、乾癬に関連する（非特許文献１４、非特許文献１５）。
【０００５】
さらには、ＩＬ−２０およびその受容体が関節リウマチ（ＲＡ）滑膜組織生検物および強直性脊椎炎（ＡＳ）において過剰発現されることが認められており（非特許文献１６）、この場合、ＩＬ−２０およびその受容体の発現レベルが炎症の重篤度との正の相関を有した（非特許文献５）。ＩＬ−２０は、単球走化性タンパク質（ＭＣＰ）−１、ＩＬ−６およびＩＬ−８を分泌するようにＲＡ滑膜線維芽細胞（ＲＡＳＦ）を誘導し、また、好中球走化性、ＲＡＳＦ遊走および内皮細胞増殖を促進させた。コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）ラットモデルにより、可溶性のＩＬ−２０ＲＡがＣＩＡのラットにおいて有意に減少したので、ＩＬ−２０が関節炎の病理発生に関与していることが明らかにされた（非特許文献５）。
【０００６】
関節リウマチ（ＲＡ）および乾癬の進行時におけるその促進役割のほかに、ＩＬ−２０は、下記のいくつかの他の障害と機能的に関連することが見出された：例えば、アテローム性動脈硬化（非特許文献４）、急性腎不全（非特許文献１７）、潰瘍性大腸炎（非特許文献１８）、虚血性発作（非特許文献９）、ならびに、骨減少症および骨粗鬆症（非特許文献１９）。さらに、ＩＬ−２０は造血細胞の発達において役割を果たしている（非特許文献１３）。
【０００７】
ＩＬ−２０遺伝子の調節不全の発現が、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）ガンにおいて（非特許文献２０）、また、筋浸潤性膀胱ガンにおいて認められている（非特許文献２１）。ＩＬ−２０は、膀胱ガン細胞の遊走を、ｐ２１（ＷＡＦ１）タンパク質発現のアップレギュレーションを誘導することにより核因子（ＮＦ−κＢ）の活性化を引き起こす細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）媒介のＭＭＰ−９タンパク質発現を介して促進させている（非特許文献２２）。ＩＬ−２０およびその受容体サブユニットの発現が、臨床口腔腫瘍組織では乳ガン組織と同様に、非腫瘍組織の場合よりも大きかった（非特許文献２３、非特許文献２４）。インビトロでは、ＩＬ−２０は、活性化されたＳＴＡＴ３シグナルおよびＡＫＴ／ＪＮＫ／ＥＲＫシグナルを介して、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、ＩＬ−１β、ＭＣＰ−１、ＣＣＲ４およびＣＸＣＲ４を増進させ、また、口腔ガン細胞の増殖、遊走、活性酸素種（ＲＯＳ）産生およびコロニー形成を増大させた。インビボでは、ＩＬ−２０を、マウス抗ヒトＩＬ−２０モノクローナル抗体７Ｅを使用して中和することにより、口腔ガン細胞における腫瘍成長および炎症が軽減された（非特許文献２３）。
【０００８】
まとめると、ＩＬ−２０は、非常に異なる疾患状況において、異常な細胞成長、細胞遊走を促進させる可能性があり、炎症の局所的部位において作用する。したがって、ＩＬ−２０は、未だ十分には理解されていないが、重要な新しい治療標的を表しており、ＩＬ−２０の生物学的な活性および機能を中和することができるＩＬ−２０特異的な結合分子であって、有害なＩＬ−２０活性に伴う障害または状態の処置および診断において有用であり、かつ、ヒトに対して寛容なＩＬ−２０特異的な結合分子が求められている。
【０００９】
この問題に対する解決策が、請求項において特徴づけられ、かつ、さらには下記における説明において開示され、また、実施例および図において例示されるような本発明の実施形態によって提供される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｂｌｕｍｂｅｒｇ他、Ｃｅｌｌ  １０４（２００１）、９〜１９
【非特許文献２】Ｏｕｙａｎｇ他、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（２０１１）、７１〜１０９
【非特許文献３】Ｈｓｉｅｈ他、Ｇｅｎｅｓ  Ｉｍｍｕｎ．７（２００６）、２４３４〜２４２
【非特許文献４】Ｃｈｅｎ他、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２６（２００６）、２０９０〜２０９５
【非特許文献５】Ｈｓｕ他、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．５４（２００６）、２７２２〜２７３３
【非特許文献６】Ｍｙｌｅｓ他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４（２０１３）、８０４〜８１１
【非特許文献７】Ｈｓｉｎｇ他、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ３５（２００６）、４４〜５２
【非特許文献８】Ｏｔｋｊａｅｒ他、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１２７（２００７）、１３２６〜１３３６
【非特許文献９】ＣｈｅｎおよびＣｈａｎｇ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８２（２００９）、５００３〜１２
【非特許文献１０】Ｐａｒｉｓｈ−Ｎｏｖａｋ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（２００２）、４７５１７〜４７５２３
【非特許文献１１】Ｌｏｇｓｄｏｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０９（２０１２）、１２７０４〜９
【非特許文献１２】Ｔｏｙｈａｍａ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３９（２００９）、２７７９〜８８
【非特許文献１３】Ｌｉｕ他、Ｂｌｏｏｄ  １０２（２００３）、３２０６〜３２０９
【非特許文献１４】Ｗｅｉ他、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７（２００５）、６５〜７２
【非特許文献１５】Ｓａ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７８（２００７）、２２２９〜２２４０
【非特許文献１６】Ｋｒａｇｓｔｒｕｐ他、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ４１（２００８）、１６〜２３
【非特許文献１７】Ｌｉ他、Ｇｅｎｅｓ  Ｉｍｍｕｎ．９（２００８）、３９５〜４０４
【非特許文献１８】Ｆｏｎｓｅｃａ−Ｃａｍａｒｉｌｌｏ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３（２０１３）、６４０〜８
【非特許文献１９】Ｈｓｕ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０８（２０１１）、１８４９〜１８６１
【非特許文献２０】Ｂａｉｒｄ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４７（２０１１）、１９０８〜１８
【非特許文献２１】Ｌｅｅ他、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ７（２０１２）、ｅ４０２６７
【非特許文献２２】Ｌｅｅ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８８（２０１３）、５５３９〜５２
【非特許文献２３】Ｈｓｕ他、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１０（２０１２）、１４０３〜９
【非特許文献２４】Ｈｓｕ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８８（２０１２）、１９８１〜９１
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、ＩＬ−２０特異的なヒト由来モノクローナル抗体、ならびに、ＩＬ−２０を認識するその断片、誘導体および合成または生物工学的変異体に関連する。具体的には、ＩＬ−２０に対する選択的結合プロファイルを有し、かつ、添付された実施例および図において示されるような結合活性および中和活性を示す様々なヒトモノクローナル抗ＩＬ−２０抗体が提供される。それらの中和特性のために、本発明の抗体は、治療、予後判定および診断での有用性を有しており、これらの有用性により、本発明の抗体は、望まれない免疫応答の開始および／または維持におけるＩＬ−２０活性に伴う／を伴う自己免疫性および炎症性の多種多様な障害および状態との関連性での様々な適用について、例えば、様々な形態の関節炎（例えば、関節リウマチ（ＲＡ）または脊椎関節炎など）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、乾癬、血管炎症およびアテローム性動脈硬化、アトピー性皮膚炎およびガンなどとの関連性での様々な適用について特に有益になっている。治療および診断でのこれらおよびさらなる可能な抗ＩＬ−２０適応については上記の背景技術の節もまた参照のこと。
【００１２】
本発明の抗体は、ＡＩＲＥ（自己免疫調節因子）遺伝子における変異に起因する自己免疫性多腺性内分泌不全症症候群タイプ１（ＡＰＳ１）に冒されたヒトから単離されている（総説については、Ｐｅｔｅｒｓｏｎ他、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｌ．８（２００８）、９４８〜９５７、および、国際出願公開ＷＯ２０１３／０９８４１９を参照のこと）。
【００１３】
これに関連して、本発明に従って行われた実験の範囲内において、最も強力な中和候補抗体を特定し、単離し、かつ特徴づけし、これにより、特に選択するための最初の試みは、面倒であるようであった。例えば、今日まで、ならびに、本発明に従って行われた最初の実験では、ルシフェラーゼ免疫沈殿システム（ＬＩＰＳ）アッセイが、所望された抗原ＩＬ−２０に対抗するＩｇＧ抗体を検出するために使用されており、このアッセイは、ＥＬＩＳＡによって見逃されるが、可能性のある立体配座エピトープに対する抗体を、中和活性を評価するためにモニターすることができるという潜在的可能性を有することが報告された。Ｂｕｒｂｅｌｏ他、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ９（２０１０）、５６７〜５７８（著者原稿；ＰＭＣ（２０１２年８月１３日）において入手可能）を参照のこと。しかしながら、本発明に従って行われた実験において、ＬＩＰＳアッセイは中和抗体と非中和抗体とを識別しなかったので、抗体をこの方法に従って特定し、選択することでは、その中和活性に関しての実際の最も強力な抗体は得られていないかもしれない。
【００１４】
したがって、図７に例示され、また、実施例５に記載されるように、本発明によれば、目的とするリガンドの、関連性のある受容体を発現するように誘導される細胞への結合を評価するための新規なアッセイが、このリガンドに対する候補抗体により、このリガンドが細胞表面のそれぞれの受容体に結合することができることが妨げられるかどうかを明らかにする際に使用するために開発されている。例として、目的とするリガンドがレポーターとして、すなわち、ルシフェラーゼ融合タンパク質として使用されるので、リガンドの細胞結合が細胞会合レポーターによって、すなわち、ルシフェラーゼ活性によって測定される。このアッセイは、リガンドに対する抗体により、このリガンドが細胞表面のそれぞれの受容体に結合することができることが妨げられるかどうかを、レポーター活性における変化を観測することによって、すなわち、ルシフェラーゼによる低下した光放射を観測することによって評価することを可能にする。したがって、本発明によれば、新規な発光法細胞結合アッセイ（ＬＣＢＡ）が確立された。この新規なアッセイのおかげで、強力なＩＬ−２０中和抗体を特定することが可能であった。
【００１５】
よって、実施例において例示される主題抗体を、（ｉ）患者（これはＡＰＳ１−９と呼ばれる）が抗ＩＬ−２０抗体の高産生体であること、および（ｉｉ）新規な細胞リガンド結合レポータアッセイの使用のおかげで単離し、特定することができた。
【００１６】
詳しくは、本発明は下記のものに関する。
［１］その可変領域に、
（ａ）下記に示されるＶＨ可変領域アミノ酸配列および／またはＶＬ可変領域アミノ酸配列の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、
（ｉ）図１（ＶＨ）（配列番号２、配列番号１０、配列番号１８および配列番号２６）、および
（ｉｉ）図１（ＶＬ）（配列番号４、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２８）、
（ｂ）図１に示されるようなＶＨ領域および／またはＶＬ領域のアミノ酸配列、
（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列のいずれか１つの部分的変化から生じるアミノ酸配列からなる少なくとも１つのＣＤＲ、あるいは
（ｄ）（ｂ）のアミノ酸配列の部分的変化から生じるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域、
を含み、好ましくは、前記抗体はＩＬ−２０の生物学的活性を低下または中和することができる、ヒト由来モノクローナル抗ヒトインターロイキン−２０（ＩＬ−２０）抗体またはそのＩＬ−２０結合断片、あるいはそれらの合成または生物工学的誘導体。
［２］（１）アミノ酸配列１０１−ＰＤＨＹＴＬＲＫＩＳＳＬＡＮＳＦＬＴ−１１８（配列番号６９）、アミノ酸配列１０２−ＤＨＹＴＬＲＫＩＳＳＬＡＮＳＦ−１１６（配列番号７０）および／またはアミノ酸配列１０１−ＰＤＨＹＴＬＲＫＩＳＳＬＡＮＳＦＬ−１１７（配列番号７２）からなるＩＬ−２０由来ペプチドを認識し（ただし、前記配列において、Ｐ１０１、Ｉ１０９、Ｓ１１０および／またはＬ１１７のみが別のアミノ酸によって置換されることがあり、好ましくはアラニンによって置換されることがある）、かつ、（２）アミノ酸配列９７−ＮＹＱＴＰＤＨＹＴＬＲＫＩＳＳＬＡＮ−１１４（配列番号７１）からなるペプチドを認識しない、または実質的に認識しない、［１］に記載の抗体またはＩＬ−２０結合断片。
［３］マウスＩＬ−２０と結合することおよび／またはマウスＩＬ−２０を中和することが可能である、［１］または［２］に記載の抗体またはＩＬ−２０結合断片。
［４］前記生物活性が、
（ａ）細胞ベースのＳＴＡＴ（シグナル伝達・転写活性化因子）活性化アッセイにおけるヒトＩＬ−２０シグナル伝達、
（ａ）ＩＬ−２０サイトカイン細胞表面受容体結合の阻害、
（ｃ）ヒトＩＬ２０Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２受容体複合体のヒトＩＬ−２０媒介活性化、および／または
（ｄ）ヒトＩＬ−２０の前炎症性活性
である、［２］または［３］に記載の抗体またはＩＬ−２０結合断片。
［５］少なくとも前記ＣＤＲが、図１に示される対応するＣＤＲに対して少なくとも７０％の同一性、好ましくは８０％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性を有し、ならびに／あるいは、前記ＶＨ可変領域および／またはＶＬ可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸配列が、図１に示される対応するフレームワーク領域に対して少なくとも７０％の同一性、好ましくは８０％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性を有する、請求項１〜４のいずれか１つに記載の抗体またはＩＬ−２０結合断片。
［６］Ｉｇ１またはＩｇＧ４である、［１］〜［５］のいずれか１つに記載の抗体またはＩＬ−２０結合断片。
［７］表１に示されるＣＨアミノ酸配列およびＣＬアミノ酸配列（配列番号６、配列番号１４、配列番号２２および配列番号３０）から選択されるアミノ酸配列または少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＨ定常領域および／またはＣＬ定常領域を含む、［１］〜［６］のいずれか１つに記載の抗体またはＩＬ−２０結合断片。 
［８］ヒトＩＬ−２０に対する結合について（例えば、実施例２に従って求められることになる）［１］〜［７］のいずれか１つに記載される抗体と競合するヒト抗体またはその抗原結合分子。
［９］単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆ（ａｂ）断片およびＦ（ａｂ’）２断片からなる群から選択される、［１］〜［８］のいずれか１つに記載の抗体。
［１０］［１］〜［９］のいずれか１つに記載される抗体または抗原結合断片の１つの免疫グロブリン鎖の可変領域を少なくともコードするポリヌクレオチドであって、好ましくは、前記可変領域と、前記定常ドメインの少なくとも一部とをコードするｃＤＮＡである、ポリヌクレオチド。
［１１］［１０］に記載されるポリヌクレオチドを含むベクター。
［１２］［１０］に記載されるポリヌクレオチドまたは［１１］に記載されるベクターを含む宿主細胞。
［１３］抗ＩＬ−２０抗体またはその免疫グロブリン鎖を調製するための方法であって、
（ａ）［１２］に記載される細胞を培養すること、および
（ｂ）抗体またはその免疫グロブリン鎖を培養物から単離すること
を含み、好ましくは、前記抗ＩＬ−２０抗体が、上記でそれぞれ定義されるような、また、説明における下記の実施形態においてそれぞれ記載されるような抗ヒトＩＬ−２０抗体またはそのＩＬ−２０結合断片、あるいはそれらの合成または生物工学的誘導体である、方法。
［１４］［１１］に記載されるポリヌクレオチドによってコードされるか、または、［１３］に記載される方法によって得ることができる抗体またはその免疫グロブリン鎖。
［１５］［１］〜［９］または［１４］のいずれか１つに記載される抗ＩＬ−２０抗体またはＩＬ−２０結合断片、あるいは、［１２］に記載される細胞を培養することによって得られる抗ＩＬ−２０抗体またはＩＬ−２０結合断片を含む免疫コンジュゲートであって、好ましくは、放射性核種、酵素、基質、補因子、蛍光性マーカー、化学発光マーカー、ペプチドタグ、重金属、磁気粒子、薬物または毒素を含む免疫コンジュゲート。
［１６］［１］〜［９］または［１４］のいずれか１つに記載される抗ＩＬ−２０抗体またはＩＬ−２０結合断片、［１５］に記載される免疫コンジュゲート、［１０］に記載されるポリヌクレオチド、［１１］に記載されるベクター、あるいは［１２］に記載される細胞を含む組成物であって、好ましくは、
（ａ）医薬組成物であり、かつ、薬学的に許容され得る担体をさらに含み、かつ、必要な場合には、炎症性疾患を処置するために有用であるさらなる薬剤をさらに含む、組成物、あるいは、
（ｂ）診断組成物またはキットであり、かつ、免疫または核酸ベースの診断方法において従来から使用される試薬をさらに含む、組成物。
［１７］下記の方法において使用されるための［１］〜［９］または［１４］のいずれか１つに記載される抗ＩＬ−２０抗体またはＩＬ−２０結合断片、［１５］に記載される免疫コンジュゲート、あるいは、［１６］に記載される組成物。
（ａ）免疫媒介もしくは自己免疫性の疾患もしくは状態を処置するか、または、免疫媒介もしくは自己免疫性の疾患もしくは状態の進行を妨げる方法、
（ｂ）免疫媒介もしくは自己免疫性の疾患もしくは状態に伴う症状を改善する方法、ならびに／あるいは
（ｃ）患者におけるＩＬ−２０の発現および活性に伴う免疫媒介もしくは自己免疫性の疾患もしくは状態の存在について、または、該疾患もしくは状態を発症する被験体の危険性を明らかにするために、被験体を診断するか、またはスクリーニングする方法、
ただし、これらの方法において、好ましくは、前記疾患が、炎症性腸疾患（ＩＢＤ；クローン病、潰瘍性大腸炎およびセリアック病を含む）、強直性脊椎炎および他の形態の脊椎関節炎、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、骨粗鬆症、シェルグン（Ｓｊｏｒｇｅｎ’ｓ）症候群、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎またはこれらの組合せ、がん（皮膚、舌、食道または肺の扁平上皮ガンを含む）および血管炎症からなる群から選択される。
［１８］ＩＬ−２０の発現および活性に伴う障害を処置することにおいて使用されるための医薬組成物を調製する方法であって、
（ａ）［１２］に記載される細胞を培養すること、
（ｂ）抗体、その生物工学的誘導体、またはそれらの免疫グロブリン鎖を培養物から医薬品グレードにまで精製すること、および
（ｃ）前記抗体またはその生物工学的誘導体を薬学的に許容される担体と混合すること
を含む、方法。
［１９］ＩＬ−２０の発現に伴う被験体における免疫媒介または自己免疫性の疾患または状態を診断するための方法であって、被験体細胞の生物学的サンプルを、［１］〜［９］、［１４］または［１５］のいずれかに記載される抗ＩＬ−２０抗体またはＩＬ−２０結合断片と接触させること、および、ＩＬ−２０の存在を検出することを含む、方法。
［２０］単離された生物学的サンプルにおいてＩＬ−２０を検出するか、または測定する方法であって、前記サンプルを、［１］〜［９］、［１４］または［１５］のいずれか１つに記載される抗体と混合すること、前記抗体が、混合物に存在するＩＬ−２０との複合体を形成することを可能にすること、および、前記混合物に存在する前記複合体を検出することを含む、方法。
【００１７】
本発明ではまた、本明細書中に開示されるヒト由来モノクローナル抗ヒトＩＬ−２０抗体またはそのＩＬ−２０結合断片、あるいはそれらの合成または生物工学的変異体を使用することにより本発明に従って適合化されるＩＬ−２０アンタゴニスト（例えば、先行技術において記載される抗ＩＬ−２０抗体）の様々な実施形態が使用され、また、その様々な実施形態に関連する。例えば、ＩＬ−２０活性を、とりわけ抗ＩＬ−２０モノクローナル抗体を使用して打ち消すことが、様々な炎症状態を処置するための有望な取り組みとして記載されている。例えば、国際出願公開ＷＯ９９／２７１０３、同ＷＯ０１／４６２６１、同ＷＯ０３／０５１３８４、同ＷＯ２００４／０８５４７５および同ＷＯ２００６／０８６３９６を参照のこと。ヒトＩＬ−２０と結合するラットまたはマウスのモノクローナル抗体もまた記載されている。例えば、国際出願公開ＷＯ２００５／０５２０００、同ＷＯ２００７／０８１４６５および同ＷＯ２０１０／０００７２１を参照のこと。しかしながら、患者処置のために好適であるヒト由来抗体は今までのところ何ら提供されていない。本発明は、この技術分野におけるこれらの要求および他の要求に対処するものである。
【００１８】
さらに、図に例示されるように、また、実施例に記載されるように、本発明はまた、目的とするリガンドのそのコグネイト受容体への結合を評価するための新規なアッセイを、試験物質（例えば、候補化合物、例えば、リガンドに対する抗体など）により、この試験物質がそのそれぞれの受容体に結合することができることが妨げられるかどうかを明らかにすることにおいて使用するために、ならびに、候補の抗リガンド抗体のための競合アッセイおよび交差競合アッセイとして使用するために提供する。
【００１９】
この新規なアッセイでは、関連性のある受容体または抗体が細胞において発現させられ、ただし、この場合、好ましくは少なくともリガンド結合ドメインが細胞表面に露出させられ、かつ、リガンドが融合分子として、すなわち、レポーターに連結されて、またはレポーターにより標識されて提供される。明白ではあるが、この新規なアッセイは、候補化合物（例えば、抗体）により、リガンドが細胞表面のそのコグネイト受容体に結合することが妨げられるかどうか、したがって、候補化合物（例えば、抗体）がアンタゴニスト活性を有するかどうかの評価を可能にするだけではなく、候補化合物が、例えば、リガンド−受容体の結合を安定化させることによってリガンド結合を高め得るかどうか、したがって、レポーター活性を高め得るかどうかの評価もまた可能にし、それにより、リガンド結合のアゴニストを特定することを可能にする。これに関連して、当業者は、本発明のこの新規なアッセイが、抗リガンド結合分子のスクリーニングのために有用であるだけではなく、コグネイト結合ドメイン（すなわち、リガンドの受容体）と結合し、リガンド結合を妨害する物質のスクリーニングのためにもまた有用であることを理解するであろう。したがって、抗リガンド抗体を試験するために本明細書中に記載される実施形態と、実施例とは、抗リガンド結合ドメイン（具体的には受容体、好ましくは、細胞外のリガンド結合部分を有する受容体）に同等に適用され得るであろう。
【００２０】
例として、目的とするリガンドがレポーターとして、すなわち、ルシフェラーゼ融合タンパク質として使用されるので、リガンドの細胞結合が細胞会合レポーターによって、すなわち、ルシフェラーゼ活性によって測定される。このアッセイは、リガンドに対する抗体により、このリガンドが細胞表面のそれぞれの受容体に結合することができることが妨げられるか、または強化されるかどうかを、レポーター活性における変化を観測することによって、すなわち、ルシフェラーゼによる低下した光放射または増大した光放射を観測することによって評価することを可能にする。
【００２１】
従来、Ｌｕｋｅｒ他（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４７（２００９）、６２５〜６３２）は、ケモカイン−ケモカイン受容体の結合についてのルミネセンスベースのアッセイを記載し、そして、ケモカイン受容体をプローブ探査するために、また、ケモカイン−ケモカイン受容体の結合の小分子調節因子を特定するために、生物発光レポーターを使用することを示唆した。このアッセイはさらに、共培養後の生細胞および動物におけるインビボでのリガンド受容体相補アッセイにまで進展させられた。Ｌｕｋｅｒ他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １８（２０１２）、１７２〜１７７を参照のこと。
【００２２】
しかしながら、添付された実施例において例示されるようなロバストな生物発光法細胞型インビトロアッセイ、ならびに、標的タンパク質中和抗体（具体的にはインターフェロンまたはインターロイキンのアンタゴニスト）の特定、単離および／または検証のためのその使用は記載も、示唆もされていない。したがって、この局面において、本発明は、目的とするリガンドの、このリガンドに対する関連性のある受容体を発現する細胞への結合を評価するための新規な細胞アッセイに関連する。その最も広い局面において、本発明は下記の方法に関する。
【００２３】
［２１］目的とするリガンドのリガンド結合ドメインへの結合を評価するための方法であって、
（ａ）細胞内機能的領域（２）を必要に応じて含む前記リガンド結合ドメインを発現する標的細胞（１）を、好ましくは検出可能な酵素であるレポーター（４）により標識される目的とする前記リガンドを含むサンプル（３）と接触させること、および
（ｂ）レポーター活性（５）、好ましくは化学発光を測定すること
を含み、
コントロールと比較した場合のレポーター活性の増大が、目的とする前記リガンドが前記リガンド結合ドメインに結合することの指標となり、かつ前記リガンド結合ドメインが受容体または抗リガンド抗体に由来し、好ましくは前記リガンドがインターフェロンまたはインターロイキンである、方法。
【００２４】
用語「リガンド」は、本明細書中で使用される場合、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９７年、２０００年改訂および２００３年再版、ＩＳＢＮ  ０１９８５０６７３２）において提供されるような定義で示される。リガンドには、目的とするどのような小分子、核酸、タンパク質または抗原も含まれ、例えば、限定されないが、ＣＤマーカーリガンド（例えば、ＣＤ４８、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ１２２など）、サイトカインおよびケモカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−６、ＴＮＦ−ａ、ＩＬβ、ＩＬ−１０、ＩＰ−１０など）、増殖因子（例えば、ＩＴＡＣ、ＭＩＧ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦなど）、共刺激リガンド（例えば、ＩＣＯＳ−Ｌ、ＯＸ−４０−２５Ｌ、ＣＤ１３７−Ｌなど）、シグナル伝達経路の成分、および、実際には、どのような抗原であれ、目的とする抗原が含まれる。リガンドにまた、抗体が含まれる。本発明の方法において、リガンドは最も好ましくは可溶性リガンドである。
【００２５】
レポーターは検出可能部分（ｍｏｉｅｔｙ）であり、直接的または間接的のどちらであれ、追跡することができるどのような種類のものであってもよい。多くのそのような部分がこの技術分野では広く知られており、これらには、生化学、細胞生物学および医学的診断用途において日常的に使用される標準的な標識、例えば、放射能、蛍光、化学発光、コロイド状金属のプラズモン共鳴、または、酵素比色検出に基づく標識などが含まれる。
【００２６】
「リガンド結合ドメイン」はどのような分子であってもよく、ただし、この分子は、所与のリガンド（例えば、本明細書中上記で定義されるリガンドなど）と結合することができるものである。典型的には、リガンド結合ドメインは、タンパク質またはポリペプチド（例えば、受容体分子）に由来する場合がある。しかしながら、原理的にはまた、非タンパク質性の結合分子も、本発明によるリガンド結合ドメインを提供する場合がある。例えば、合成による結合分子、例えば、Ｚｅｎｇ他、ＡＣＳ  Ｎａｎｏ、４（２０１０）、１９９〜２０４を参照のこと（これは、親水性ペプチドに対する抗体様親和性を有する合成ポリマーナノ粒子を記載する）。それにもかかわらず、好ましい実施形態において、リガンド結合ドメインは受容体または抗体（典型的には抗リガンド抗体）に由来するであろう。リガンド結合ドメインはどのようなポリペプチドまたはその一部分であってもよく、ただし、それらは、所与のリガンド（例えば、本明細書中上記で定義されるリガンドなど）と結合することができるものである。受容体は、遺伝子発現を含むシグナル伝達経路を調節する、リガンドにより活性化される結合タンパク質である。これらの受容体についての作用機構は、リガンドが結合することを介した第一段階の活性化として、また、遺伝子発現の調節を結果的にはもたらす下流側のシグナル伝達カスケードを受容体が誘発するか、または阻害することによって伝達される第二段階のシグナルとして関わる。リガンド結合を担うドメインがリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）である。このドメインは、リガンド結合ならびにホモ二量体化および／またはヘテロ二量体化を含むいくつかの活性に関与する。受容体のリガンド結合型形態とリガンド非結合型形態との間における移行に付随して生じる立体配座変化により、他のタンパク質に対するそれらの親和性が劇的な影響を受ける（Ｅｄｗａｒｄｓ、Ｊ．Ｍａｍｍａｒｙ．Ｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌ．Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ５（２０００）、３０７〜２４；Ｔｈｏｍａｓ−Ｃｈｏｌｌｉｅｒ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １１０（２０１３）、１７８２６〜３１）。
【００２７】
しかしながら、本発明の方法およびアッセイの目的のためには、細胞膜において細胞外に存在するリガンド結合ドメインの存在は十分であり、これは、先行技術分野におけるほとんどのアッセイとは対照的に、本発明の方法およびアッセイは、レポーター活性を記録するために細胞内のシグナル伝達に依存していないからである。それにもかかわらず、リガンド結合ドメインは、１つまたは複数の機能的領域への融合または結合が行われる場合があり、例えば、膜貫通領域への融合または結合が行われる場合がある。
【００２８】
膜貫通領域は概して、受容体を細胞膜に固定するために役立つものであり（したがって、細胞外のリガンド結合ドメインは膜結合型であり）、膜貫通領域には、どのようなタンパク質であれ、そのようなことが可能であるタンパク質（または、どのような核酸であれ、そのようなタンパク質をコードする核酸）が含まれる。そのような領域は広範囲の様々な供給源に由来することができ、例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤＳ、ＣＤ８、ＣＤ３ａ、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ６４、ＣＤ９、ＣＤ３７、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７またはＣＤ１５４、サイトカイン受容体（例えば、インターロイキン受容体、ＴＮＦ−Ｒなど）、チロシンキナーゼ受容体またはインターフェロン受容体あるいはコロニー刺激因子受容体のアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖の全体または一部などに由来することができる。代替において、膜貫通領域は、合成されたものである場合がある。好適な合成された膜貫通領域は、主に疎水性アミノ酸（例えば、ロイシンおよびバリンなど）を含むであろう。
【００２９】
用語「標的細胞」には、本発明との関連で使用される場合、どのような細胞も含まれ、ただし、この場合、この細胞は、目的とする１つまたは複数のリガンド結合ドメインを発現することができるものである。具体的には、目的とするリガンドに結合することができる１つまたは複数の受容体を内在性に発現するか、あるいは、１つまたは複数の前記受容体を発現するようにトランスフェクションまたは形質転換を行うことができる哺乳動物細胞および哺乳動物細胞株が使用される場合がある。しかしながら、一方では、リガンド結合を研究するために受容体を挿入することができる人工的な細胞および細胞膜が開発されている。例えば、総説については、ＨａｍｍｅｒおよびＫａｍａｔ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、５８６（２０１２）、２８８２〜２８９０、ならびに、Ｍａｙ他、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ５２（２０１３）、７４９  ＤＯＩ：１０．１００２／ａｎｉｅ．２０１２０４６４５を参照のこと。
【００３０】
本発明の方法およびアッセイは、細胞内機能的領域（２）を必要に応じて含むリガンド結合ドメインを発現する標的細胞（１）を、レポーター（４）により標識される目的とするリガンドを含むサンプル（３）と接触させることによって行われる場合がある。コグネイトリガンドが存在するならば、複合体が２つの結合性試薬の間で形成され、リガンドが標的細胞に結合する。結合していない目的とするリガンドが、例えば、洗浄によって、反応混合物から分離され、そして、標的細胞に結合したリガンドの存在が、レポーター部分（６）を介して、例えば、基質（５）に対するその酵素活性のために検出される。標的細胞−リガンド複合体におけるレポーター活性の存在（または大きさ）は、リガンドの存在（または濃度）を示すものである。本発明の方法およびアッセイは、どのような容器、バイアル、培養ディッシュ、マルチプルウエルプレート、液体毛管システムおよび同様なものであれ、好適なものにおいて行うことができる。代替において、本発明の方法およびアッセイは、リガンド−レポーターがリガンド結合ドメインに結合している細胞が、例えば、蛍光部分をレポーターとして使用するときには蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって選択的に検出されるように行われる場合がある。
【００３１】
実施例において例示されるように、本発明の方法およびアッセイは、受容体のリガンド結合をアッセイするために、具体的には、サイトカイン（最も好ましくはインターフェロンまたはインターロイキン）のそのコグネイト受容体との相互作用をアッセイするために特に好適である。
【００３２】
サイトカインは、小さい糖タンパク質メッセンジャーであり、これらは、統一された分類システムがない場合には、発見順の数字、所与の機能的活性、炎症応答における速度論的または機能的な役割、起源となる最初の細胞、あるいは、関連した分子と共有される構造的ホモログによって様々に特定されていた。例えば、ＭｃＩｎｎｅｓ、Ｋｅｌｌｅｙ’ｓ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ第９版、第１巻（Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ他（２０１２）、パート３、２３章、３６７〜３７７）を参照のこと。本発明に従って使用されるサイトカインおよび受容体が下記のものに記載されるが、本発明に従って使用されるサイトカインおよび受容体は、下記のものに記載されるサイトカインおよび受容体に限定されない。ＭｃＩｎｎｅｓ（２０１２）（パート３、２３章、３６７〜３７７）（表２３−１〜表２３−８に示されるものが、その開示内容は参照によって本明細書中に組み込まれる）、ならびに、国際出願公開ＷＯ２０１３／０９８４１９および出願人の同時係属中の国際出願公開ＷＯ２０１５／００１０４７に開示されるサイトカイン列挙を参照のこと。好ましくは、サイトカインはヒトのサイトカインである。好ましい実施形態において、サイトカインは、ロイコトリエン、リンホカイン、インターロイキン、インターフェロン、ケモカイン、および、ＴＮＦファミリーのメンバーからなる群から選択される。しかしながら、原理的には、リガンドは、ホルモンおよび増殖因子、しかし、同様に、小分子（例えば、コグネイト結合ドメイン（例えば、受容体または抗体など）との相互作用が可能である炭水化物など）を含めて、事実上どのような可溶性分子であってもよい。
【００３３】
したがって、本発明に従って行われた実験により、驚くべきことに、ＬＢＣＡアッセイが、候補の抗リガンド抗体を試験するために特に適していることが明らかにされた。この場合、その膜貫通型の発現として、抗リガンド抗体が抗リガンド結合ドメインとして働いている。ＩＦＮ−アルファおよびＩＦＮ−ωに対する抗体２６Ｂ９の、２９３Ｔ  ＭＳＲ細胞における発現と、この抗体が、ルシフェラーゼによりタグ化されたＩＦＮ−ωに効率的に結合することを記載する実施例９および図１７を参照のこと。したがって、本発明の方法およびアッセイはまた、抗体−リガンド結合をアッセイするために特に好適である。したがって、さらなる好ましい実施形態において、本発明は下記の方法に関連する。
［２２］前記リガンド結合ドメインが抗体またはそのリガンド／抗原結合断片、あるいはそれらの誘導体である、［２１］に記載の方法。
【００３４】
この実施形態ではまた、リガンド／抗原は好ましくはサイトカインである場合があり、しかしながら、一方で、明らかに、どのような他のリガンド／抗原相互作用であっても同様にアッセイされる場合がある。
【００３５】
背景の節で議論されるように、また、実施例において例示されるように、所望される特異性を有する抗体の最初のスクリーニングでは、例えば、リガンドに対する抗体の特異的な結合を明らかにするために通常の場合には十分である様々な生化学的アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイおよびＬＩＰＳアッセイなど）が使用される。しかしながら、それらのアッセイはほとんど常に、非細胞性の条件のもとで、すなわち、非生理学的な条件のもとで行われるので、そのような生化学的アッセイでは、所与の抗体がまた、インビボにおいてリガンドに結合し、その生物学的活性を妨げることが可能であり得るかどうか、例えば、シグナル伝達経路がそれによりトリガーされる、受容体へのリガンドの結合を阻害することが可能であり得るかどうかが確実に予測されない場合がある。
【００３６】
対照的に、実施例５において明らかにされるように、本発明の細胞型アッセイでは、リガンド結合が細胞状況でアッセイされるので、本発明の細胞型アッセイは、実施例５に記載される機能的ＳＴＡＴ３アッセイによって確認されるような抗リガンド分子の中和活性を明らかにすることにおいて信頼性がある。したがって、本発明の細胞型リガンド結合アッセイでは、そのような機能的アッセイを行う必要性がなくなり、それにより、実験室設備、時間および費用が軽減される。したがって、１つの実施形態において、本発明は下記の方法に関連する。
［２３］前記リガンド結合ドメインおよび／または前記リガンドが生物学的に活性である、［２１］または［２２］に記載の方法。
【００３７】
原理的には、どのような細胞、リガンドおよびリガンド結合ドメインであっても調べられるかもしれないが、本発明のアッセイは、哺乳動物、具体的にはヒトのリガンドおよびリガンド結合ドメインを評価するために特に好適であり、そのため、同様に、哺乳動物の標的細胞、具体的にはヒトの標的細胞の使用も好ましい。したがって、さらなる好ましい実施形態において、本発明は下記の方法に関連する。
［２４］前記標的細胞、リガンドおよび／またはリガンド結合ドメインが哺乳動物起源のものであり、好ましくはヒト起源のものである、［２１］〜［２３］のいずれか１つに記載の方法。しかしながら、標的細胞は、必ずしも哺乳動物起源のものである必要はなく、原核生物を含めて、どのような細胞であっても可能であるかもしれない。リガンド結合ドメインはまた、非生細胞様の粒子の一部であることも可能であり、これには、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、合成細胞または他の細胞様粒子が含まれるが、これらに限定されない。
【００３８】
細胞外のリガンド結合ドメインは、タンパク質リガンドと結合することができるどのようなタンパク質（または、そのようなタンパク質をコードする核酸）であっても含む。最も好ましくは、リガンドは可溶性リガンドである。膜に結合した細胞外のリガンド結合ドメインは、例えば、表面の膜受容体、例えば、キナーゼ受容体、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、増殖因子受容体、サイトカイン受容体、例えば、インターロイキン受容体（例えば、ＩＬ−ＩＲ（Ｉ型およびＩＩ型）、ＩＬ−２Ｒ（αサブユニット、βサブユニットおよびγサブユニット）、ＩＬ−３Ｒ、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−５Ｒ、ＩＬ−６Ｒ；ｇｐ１３０、ＩＬ−８Ｒ、ＩＬ−１３ＲａＩ、ＩＬ−４Ｒａ、ＩＬ−３０Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ（αサブユニット、βサブユニットおよびγサブユニット）、ＩＬ−１７Ｒ；ＴＮＦ受容体（ＴＮＦ−ＲＩおよびＴＮＦ−ＲＩＩ）；ＩＬ−β、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−１、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＨＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ−β、ＩＰ−１０、ＩＴＡＣ、ＭＩＧおよびＶＥＧＦに対する受容体；ＣＤマーカー（例えば、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤＳ、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４８、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ１２２およびＣＤ２４４など）；ならびに、ＩＣＯＳ−Ｌ、ＯＸ−４０−Ｌ、ＣＤ４０ＬおよびＣＤ１３７−Ｌに対する受容体を含むか、または、それらに由来する。本発明の方法およびアッセイにおいて使用されるための、膜に結合した細胞外のリガンド結合ドメインはまた、細胞膜の表面または内部に通常の場合には見出されない分子を結合ドメインとして含むことができ、例えば、細胞質性のタンパク質または可溶性のタンパク質、例えば、限定されないが、通常の場合には分泌されるタンパク質を含むことができる。したがって、細胞外のリガンド結合ドメインはまた、膜貫通領域（下記を参照のこと）のために細胞外に呈示されるＳＯＳＴおよびＬＤＬ関連タンパク質（例えば、ＬＲＰＳおよびＬＲＰ６など）、サイトカインおよび増殖因子を含むことができる。好ましくは、細胞外のリガンド結合ドメインを細胞表面に標的化するシグナル配列が、リガンド結合ドメインおよび受容体をそれぞれコードするベクターのＤＮＡ配列に含まれることが、当業者によって理解されるであろう。様々なそのようなシグナル配列がこの技術分野では知られており、これらには、細胞外のリガンド結合ドメインと生来的に会合する配列（シグナル配列／リーダー配列）が含まれる。シグナル配列は概して、細胞外のリガンド結合ドメインが細胞表面にトラフィッキングされる期間中にプロセシングされ、除かれるであろう。
【００３９】
１つの実施形態において、細胞外のリガンド結合ドメインは、このリガンド結合ドメインが１つまたは複数の他の細胞外のリガンド結合ドメインと相互作用して、リガンドを認識することができる（リガンドに結合することができる）多重に会合した細胞外のリガンド結合ドメインを達成するように選ぶことができる。したがって、１つの実施形態において、本発明の方法およびアッセイにおける標的細胞は、２つ以上の膜結合した細胞外のリガンド結合ドメインを含む。より好ましくは、２つまたはそれ以上の異なるリガンド結合ドメインが、リガンドを認識することができる（リガンドに結合することができる）多重に会合した細胞外のリガンド結合ドメインを達成するために標的細胞において発現させられる場合がある。
【００４０】
図７Ａの説明文において説明されるように、レポーターはどのような検出可能部分であってもよい。レポーター部分には、測定可能（検出可能）なシグナルを生成することができる化合物が含まれ、例えば、また、限定されないが、ルシフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、緑色蛍光タンパク質または赤色蛍光タンパク質などが含まれる。したがって、レポーターシグナルの測定には、光放射、蛍光生成またはアルカリホスファターゼ産生の測定が含まれる。適切なレポーター分子の総説については、例えば、Ｌｅｓｎｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４（２０１２）、１〜２；ＫａｉｎおよびＧａｎｇｕｌｙ、Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００１）、９章、ユニット９．６を参照のこと。したがって、１つの実施形態において、本発明は下記の方法に関連する。
［２５］前記レポーターが、検出可能な酵素であり、好ましくは、ルシフェラーゼ、ＳＥＡＰ、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼからなる群から選択され、好ましくは、前記検出可能なレポーターの活性が光放射（ルミネセンス、化学ルミネセンス）である、［２１］〜［２４］のいずれか１つに記載の方法。
【００４１】
ウミシイタケルシフェラーゼ（本明細書中では「Ｒｕｃ」と略記される）が特に好ましい。最も好ましくは、実施例において例示されるように、レポーターは、高感度であり、生来的に分泌され、かつ、培養における細胞の馴化培地において、同様に、エクスビボでの動物の血液において検出することができ、これにより、細胞変数のリアルタイムでのモニタリングを可能にするＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼである（Ｔａｎｎｕｓ他、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、１１（２００５）、４３５〜４３；Ｗｕｒｄｉｎｇｅｒ他、Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５（２００８）、１７１〜３）。代替において、レポーターはまた、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼであることが可能である。例えば、Ｈａｌｌ他、ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．７（２０１２）、１８４８〜１８５７を参照のこと。別の実施形態において、検出可能部分は、検出可能な酵素の多数コピーを含む。そのようなことが、例えば、そのような酵素の多数コピー（これらは直列に連結されてもよく、または結合ドメインのどちらの側に位置してもよい）をコードするクローニングベクターの使用によって達成される場合がある。他の検出可能部分として、例えば、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質など）、および、様々な他の着色タンパク質、例えば、ＣｌｏｎｔｅｃｈによってそれらのＬｉｖｉｎｇ  Ｃｏｌｏｒｓ（商標）製品ラインで販売される着色タンパク質が含まれる。
【００４２】
しかしながら、言及されたように、ルシフェラーゼおよび同等な発光酵素が特に好ましい。例えば、蛍光標識されたリガンドを用いるアッセイでは、細胞、プラスチック容器および緩衝液のバックグランド自己蛍光に悩まされる。対照的に、本発明のＬＣＢＡアッセイでは、バックグランドでの光放射が何ら認められず、これは、ルシフェラーゼが少数の非常に特殊化された動物において見出されるだけであり、哺乳動物では見出されないからである。さらなる利点として、ＬＣＢＡアッセイはまた、応答性の細胞株が存在する限り、細胞受容体が不明であるときにも機能する。最後に、本発明の細胞結合アッセイの１つの大きな利点が、このアッセイは、例えば、抗体の機能を、最大限に上流側にあるシグナル伝達カスケード内の所与の地点において評価することを可能にするという事実である。したがって、このアッセイは、例えば、反応混合物に存在する他のシグナル伝達分子（これは、下流側のシグナル伝達事象を妨害することを誘発するかもしれない）によって影響されない。したがって、非常に複雑な混合物（例えば、血清など）を中和抗体の存在についてアッセイすることができる。
【００４３】
先行技術分野において記載されるいくつかのアッセイでは、レポーター−抗原融合タンパク質が分泌されるのではなく、細胞内に発現させられ、このため、細胞を溶解して、融合タンパク質を集めることが要求される。このことは、かなり時間がかかることであるので、本発明のアッセイの好ましい実施形態では、標識されたリガンドは、好ましくは分泌される組換え融合体である。したがって、１つの実施形態において、本発明は下記の方法に関連する。
［２６］前記標識されたリガンドが組換え融合タンパク質であり、好ましくは、宿主細胞によって発現され、かつ分泌される組換え融合タンパク質である、［２１］〜［２５］のいずれか１つに記載の方法。
【００４４】
本発明の方法において使用される標的細胞は、１つまたは複数のリガンド結合ドメインを生来的に、または遺伝子操作されて発現するどのような細胞であってもよい。例えば、目的とするリガンド結合ドメインを構成的に、または誘導時のどちらかで発現する遺伝子操作された細胞株（具体的には哺乳動物細胞株）が確立される場合がある。様々な好適な誘導体系（例えば、ＴＥＴリプレッサー系など）が当業者には広く知られている。代替において、数種類のリガンド結合相互作用を調べるという観点では特に、標的細胞は、リガンド結合ドメインを発現させるときに遺伝子操作される場合があり、例えば、本発明の方法を実施することを始めるとき、リガンド結合ドメインをコードする適切な発現ベクターのトランスフェクションによって遺伝子操作される場合がある。同様に、リガンド−レポーター融合分子はまた、要求されるときに、例えば、融合型のリガンド−レポータータンパク質の場合には、融合タンパク質を宿主細胞において一過性に発現させることによって調製される場合がある。添付された実施例５もまた参照のこと。
【００４５】
哺乳動物の標的細胞および宿主細胞は、任意の好適な技術を使用して、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング（ｓｃｒａｐｅ  ｌｏａｄｉｎｇ）、弾道学的導入または感染などを使用して発現ベクターによりトランスフェクションされる場合がある（例えば、Ｄａｖｉｓ他、Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）、および、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ、ＮＹ、１９８９）を参照のこと）。ベクター発現を宿主細胞内において誘導するための様々な好適な条件がこの技術分野では広く知られている。トランスフェクションは一過性である場合があり、または、代替において、リガンド結合ドメインを安定的に発現する細胞株が、この技術分野では知られているように作製される場合がある。具体的には、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７．Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（編者：Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ、１９９１年）を参照のこと。他方で、目的とするリガンド結合ドメインを内因的に発現する標的細胞もまた使用される場合がある。例えば、実施例５で使用されるＨＥＫ２９３Ｔ  ＭＳＲ細胞およびＣＯＬＯ２０５結腸直腸ガン細胞を参照のこと。例えば、増殖因子受容体またはサイトカイン受容体を発現する細胞および細胞株をそれぞれ使用することができる（例えば、インターロイキン依存性細胞株など）。さらには、リガンド結合ドメインとしての膜結合型抗体に関する実施例９に記載される実験を考慮すると、抗原結合ドメインを発現する細胞が、膜結合型抗体およびＴ細胞受容体をそれぞれ発現するＢ細胞およびＴ細胞を含む標的細胞として使用される場合がある。
【００４６】
したがって、さらなる好ましい実施形態において、本発明は下記の方法に関連する。
［２７］前記標的細胞が前記リガンド結合ドメインを内在性にに、一過性に、または安定的に発現する、［２１］〜［２６］のいずれか１つに記載の方法、ならびに／あるいは、前記宿主細胞が前記融合タンパク質を一過性に発現する、［２６］に記載の方法。
【００４７】
原理的には、リガンド−レポーター融合体は、例えば、目的とするリガンドをレポーター部分とともにインビトロ翻訳することにより、または、目的とするリガンドをレポーター部分と化学的に連結することによって、別個に、また、生化学的手段によりそれぞれ作製される場合がある。代替において、レポーター部分を、物理的相互作用を介して、例えば、高親和性の系（例えば、ストレプトアビジン／ビオチン、または、金属（例えば、好ましくはコロイド状金など）による直接的な標識化など）を介して間接的に目的とするリガンドに連結することもまた可能である。原理的には、このことはまた、融合タンパク質についても、例えば、単離された固体形態で提供することができるサイトカインおよびルシフェラーゼの融合体などについても可能であろう。
【００４８】
しかしながら、化学的に作製された融合タンパク質および／または単離された融合タンパク質を使用することの短所が、それらの調製のために、ならびに／あるいは、例えば、単離プロセス、乾燥および／または凍結乾燥の期間中において、リガンド成分が、当該リガンドがその結合ドメインにインビボで結合することを反映するために必要なネイティブな立体配座をもはや有しないということ、そして、ネイティブな構造がまた、液体サンプルにおいて復元されないということであるかもしれない。このことは、システイン残基およびジスルフィド架橋を有するサイトカインおよびホルモン（例えば、Ｇ−ＣＳＦなど）についてはそれぞれ、特に当てはまる。これは、これらのサイトカインおよびホルモンは、それらの調製の期間中において変性する傾向があり、また、再折り畳みが過酷な条件のもとでのみ可能であるからである。
【００４９】
対照的に、実施例において例示されるように、本発明によれば、リガンド−レポーター融合タンパク質を宿主細胞において一過性に発現させ、培養培地に分泌させることができる。目的とするリガンドをそのネイティブ形態で含むと考えられる融合タンパク質を含有する培養培地および培養物の上清はそれぞれ、すみやかな精製工程を何ら伴うことなく、本発明の方法においてそのまま使用することができる。実施例５を参照のこと。この実施形態では、融合タンパク質の発現および分泌を行わない宿主細胞、または、異なるリガンドとの融合タンパク質を発現し、分泌する宿主細胞から得られる培養培地および上清をそれぞれコントロールとして使用することが最も適している。したがって、特に好ましい実施形態において、本発明は下記の方法に関連する。
［２８］前記サンプルが前記宿主細胞の培養物の上清を含み、好ましくは、前記コントロールが、前記上清を伴わない培養培地、または、前記融合タンパク質の発現および分泌を伴わない同じ種類の細胞の培養物の上清である、［２６］または［２７］に記載の方法。
【００５０】
原理的には、どのような種類の細胞であれ、リガンド結合ドメインを発現すること、および、融合タンパク質を分泌することがそれぞれ可能である細胞が本発明の方法において使用される場合があり、ただし、この場合、哺乳動物細胞が標的細胞および宿主細胞としての使用のために好適である。Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＮＳＯ細胞、Ｃｏｓ−７細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＭＣＦ−７細胞、ＨＬ−６０細胞、ＥＬ４細胞、Ａ５４９細胞およびＫ５６２細胞を含む哺乳動物宿主細胞、ならびに、リガンド結合ドメインをコードするＤＮＡ、すなわち、リガンドに結合することができる細胞外のリガンド結合ドメインと、膜貫通領域とを有するバイオアッセイ受容体をコードするＤＮＡを含有し、かつ発現するように構成される適切な発現ベクターが、例えば、国際出願公開ＷＯ２００７／０６０４０６に記載される（その開示内容は参照によって本明細書中に組み込まれる）。しかしながら、国際出願公開ＷＯ２００７／０６０４０に開示されるバイオアッセイとは対照的に、本発明の方法に従って使用されるための受容体は、レポーター領域と、シグナルを伝えることができる１つまたは複数の細胞内のシグナル伝達領域とを含有する必要がない。むしろ、細胞外のリガンド結合ドメインと、必要な場合には膜貫通領域または別の膜固定ポリペプチド（これらのどちらかまたは両方が細胞外のリガンド結合ドメインに対して同種または異種であってもよい）との発現が、本発明の方法の目的のためには十分である。
【００５１】
好ましくは、宿主細胞および標的細胞はそれぞれ、添付された実施例において使用される細胞であり、すなわち、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３Ｔ  ＭＳＲ細胞、または、ＣＯＬＯ２０５結腸直腸ガン細胞である。したがって、別の好ましい実施形態において、本発明は下記の方法に関連する。
［２９］前記標的細胞および／または宿主細胞が、ＨＥＫ２９３Ｔ  ＭＳＲ細胞、または、ＣＯＬＯ２０５結腸直腸ガン細胞である、［２１］〜［２８］のいずれか１つに記載の方法。好ましくは、標的細胞は、Ｉ型およびＩＩ型のＩＬ−２０受容体を一過性に発現するＨＥＫ２９３Ｔ  ＭＳＲ細胞であり、かつ、サンプルは、ＩＬ−２０−ルシフェラーゼ融合タンパク質を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞の上清を含む、または、標的細胞は、膜貫通型の抗インターフェロンオメガ（ＩＦＮＷ）抗体を一過性に発現するＨＥＫ２９３Ｔ  ＭＳＲ細胞であり、かつ、サンプルは、ＩＦＮＷ−ルシフェラーゼ融合タンパク質を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞の上清を含む。
【００５２】
実施例において示されるように、本発明の方法では、類似する結果が、標的細胞が工程（ｂ）に先立って溶解されるか、または溶解されないかどうかにかかわらず得られる。このことは好都合であり、これは、標的細胞を、レポーターと連結される目的とするリガンドと接触させるための工程（ａ）においては、標的細胞は生存可能であること、そして、細胞膜は非変性状態であることがそれぞれ必要なだけであるからである。この工程の後、本発明の方法は、比較的ロバストな条件のもとでの生化学的アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡまたはＬＩＰＳアッセイなど）と類似する様式で行うことができる。したがって、代替において、本発明は下記の方法に関連する。
［３０］前記標的細胞が工程（ｂ）に先立って溶解されるか、または溶解されない、［２１］〜［２９］のいずれか１つに記載の方法。
【００５３】
図７に例示され、また、本明細書中前記で議論されるように、インビボでのリガンド結合を反映すること、そして、その感度を考慮すると、本発明の方法はまた、試験物質がリガンド結合に干渉することができること、すなわち、肯定的または否定的に干渉することができ、したがって、目的とするリガンドのそのコグネイトリガンド結合ドメインへの結合のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用するかどうかを明らかにするために特に適している。したがって、さらなる重要な局面において、本発明は下記のアッセイに関連する。
［３１］試験サンプルが、目的とするリガンドのそのコグネイトリガンド結合ドメインへの結合のアゴニストまたはアンタゴニストを含むかどうかを明らかにするためのアッセイであって、［２１］〜［３０］のいずれか１つに記載される方法の工程を含み、ただし、工程（ａ）の前または期間中において、前記リガンドおよび／または前記標的細胞が前記試験サンプル（７）に供され、かつ、工程（ｂ）において、前記試験サンプルの非存在下またはコントロールの存在下におけるレポーター活性と比較した場合の、
（ｉ）レポーター活性の増大がアゴニストの指標となり、かつ
（ｉｉ）レポーター活性の低下がアンタゴニストの指標となる、アッセイ。
【００５４】
本発明のアッセイが図７に例示され、実施例５においてさらに記載される。簡単に記載すると、本発明の上記方法では、試験物質、または、例えば、目的とするリガンドに対する抗体により、前記リガンドが標的細胞表面のそれぞれのリガンド結合ドメイン（例えば、前記リガンドのコグネイト受容体など）に結合できることが妨げられるかどうかが評価される。したがって、目的とするリガンドが工程（ａ）の前に、試験サンプルおよび試験物質とそれぞれ接触させられる場合があり、ただし、この場合、試験物質が目的とするリガンドに結合したときには、リガンド結合ドメインへのその結合が阻止される。その結果、リガンド−レポーター融合分子が結合したときには通常、観測可能であろうレポーター活性が、すべて一緒になって低下するか、または消失しており、したがって、このことはリガンド結合のアンタゴニストの存在を示している。代替において、標的細胞が工程（ａ）の前に、試験サンプルおよび試験物質とそれぞれ接触させられる場合があり、ただし、この場合、試験物質がリガンド結合ドメインに結合したとき、目的とするリガンドと結合するその能力が阻止されるであろうし、このことは結果的にはレポーター活性の低下または消失さえも再び引き起こし、したがって、アンタゴニストの存在を示している。さらに、特にリガンド結合のアゴニストを明らかにするためには、試験サンプルおよび試験物質がそれぞれ、工程（ａ）の期間中に試験細胞および目的とするリガンドと接触させられ、ただし、この場合には、例えば、目的とするリガンドのそのコグネイトリガンド結合ドメインとの複合体に試験物質が結合したとき、目的とするリガンドの結合ドメインへの結合が安定化される場合があり、結果として、リガンドの定量的なより大きい結合をもたらし、したがって、アゴニストの存在を示すレポーター活性の増大をもたらす。まとめると、当業者は、目的とするリガンドのそのコグネイトリガンド結合ドメインへの結合のアゴニストまたはアンタゴニストを明らかにするために本発明のアッセイを使用することの様々な可能性を十分に認識するであろう。
【００５５】
用語「アゴニスト」および用語「アンタゴニスト」はそれぞれ、本発明に関連して使用される場合、抗体およびその生物工学的誘導体により例示されるが、目的とするリガンドに対する結合、そのコグネイトリガンド結合ドメインに対する結合、または両者の複合体に対する結合が可能であり、それにより、リガンド−受容体の結合を刺激する（例えば、補助する）こと、または、リガンドのその結合ドメインとの相互作用を打ち消す（例えば、妨げる）ことが可能である他の非抗体分子もまた包含する。したがって、試験サンプルにおける化合物には、抗体、小分子（例えば、ＮＣＥなど）および他の薬物、タンパク質、ポリペプチドおよびペプチド、ペプチド模倣体、脂質、炭水化物および核酸、アンキリン、受容体、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子、シャペロン（例えば、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）など）、ならびに、細胞−細胞接着分子（例えば、カドヘリンスーパーファミリー、インテグリンスーパーファミリー、Ｃ型レクチンスーパーファミリーおよび免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのメンバーなど）が含まれる。それにもかかわらず、明瞭性だけのために、また、本発明の範囲を限定することなく、下記の実施形態のほとんどが、治療剤および診断剤を開発するための好ましい「アゴニスト」および「アンタゴニスト」を代表する抗体および抗体様分子に関して議論される。最も好ましくは、試験サンプルに存在する目的とする化合物は抗体である。
【００５６】
加えて、実施例９を参照して上記で説明されるように、本発明のアッセイはまた、例えば、候補の抗リガンド抗体が所与のリガンドの同じエピトープまたは異なったエピトープに結合するかどうかを調べるために競合アッセイおよび交差競合アッセイとしてそれぞれ適用される場合がある。本発明による交差競合アッセイを例示する実施例９および図１８を参照のこと（この場合、２つの抗インターフェロン抗体（８Ｈ１および２６Ｂ９）がインターフェロン−ωの異なったエピトープに結合することが示される）。その結果、本発明のアッセイの１つの実施形態において、標的細胞は膜結合型抗体またはそのリガンド結合ドメインを発現し、かつ、目的とするリガンドの結合のアゴニストおよびアンタゴニストはそれぞれ、同じ種類の抗リガンド抗体または似ている候補の抗リガンド抗体である場合がある。したがって、この実施形態において、本発明のアッセイは競合アッセイおよび交差競合アッセイとしてそれぞれ使用され、ただし、この場合、リガンド結合ドメインおよびアゴニスト／アンタゴニストは、同じリガンド結合分子に由来する。
【００５７】
実施例および図において、本発明のアッセイが抗リガンド抗体の特定および単離に関して例示される。しかしながら、当業者によって理解されるであろうように、本発明のアッセイはまた、リガンド結合ドメインと相互作用する化合物、例えば、リガンドの受容体と相互作用する化合物を特定し、単離することが可能である。例えば、受容体のリガンド結合ドメインを認識する抗体は、リガンドが受容体に結合することを妨げる場合があり、それにより、このことは、分析されるサンプルからレポータータグ化リガンドが失われるためにレポーター活性の低下を生じさせ、したがって、アンタゴニスト抗体の存在を示している。
【００５８】
別途示される場合を除き、用語「試験サンプル」は、用語「試験物質」または用語「試験化合物」と本明細書中では交換可能に使用される場合があり、通常の場合には、試験物質が典型的にはサンプルとして提供されること、例えば、溶媒中に存在し、かつ／または、試験物質の所与の回分物から採取されることを示している。同様に、本発明のアッセイは、例えば、薬物開発のどの段階においても使用することができるので、試験サンプルは、例えば、化学合成からの反応混合物、天然供給源のサンプル（例えば、土壌サンプル、水サンプル、微生物の調製物、体液およびその他）、食品製造および薬物製造の中間段階から採取されるサンプル、ならびに、薬学的使用前の薬物の前臨床回分物からのサンプルであることが可能である。したがって、「試験サンプル」は、推定されるアゴニストまたはアンタゴニストを単独で、または他の成分との関連でのどちらであっても含有するどのような種類のものでもあり得る。実施例において例示されるように、試験サンプルは好ましくは、目的とするリガンド、リガンド結合ドメインおよび／またはこれらの複合体と結合することができる抗体または同等な分子を含有する体液（例えば、血漿など）である場合がある。
【００５９】
したがって、特定の好ましい実施形態において、本発明は下記のアッセイに関連する。
［３２］前記試験サンプルが、（ｉ）抗リガンド抗体、そのリガンド結合断片、またはそれらの合成または生物工学的誘導体、あるいは、（ｉｉ）抗リガンド受容体（ＬＲ）抗体、そのＬＲ結合断片、またはそれらの合成または生物工学的誘導体を含み、好ましくは、前記抗体がヒト由来抗体であり、かつ、必要な場合には、前記コントロールが非リガンド結合抗体または非ＬＲ結合抗体である、［３１］に記載のアッセイ。
【００６０】
下記でさらに説明されるように、本発明のアッセイは、所望される特異性を有する抗体または同等な結合分子が、被験体（例えば、抗原（例えば、目的とするリガンド）により免疫化されている哺乳動物、あるいは、他の場合には、例えば、内部刺激または外部刺激（例えば、障害または病原体感染、ストレスおよび中毒など）によって惹起される哺乳動物における免疫応答のために、抗リガンド抗体を産生することが予想されるかもしれない哺乳動物）に由来するサンプルに存在することを明らかにするために特に適している。他方で、あるレベルの運動または効果的ストレスは免疫系を活性化し、そして、一般的な疾患（例えば、風邪、流感およびガンなど）からの保護をもたらす場合があることが知られているので、被験体は、対応する経験をサンプル採取前に十分に行っていたかもしれない。したがって、好ましい実施形態において、本発明は下記のアッセイに関連する。
［３３］前記サンプルが体液に由来し、好ましくは、抗リガンド抗体または抗ＬＲ抗体を含有することが疑われる被験体から得られる血清であり、好ましくは、前記被験体が、自己免疫障害もしくは炎症性障害、病原体感染、またはガンに罹患する、［３１］または［３２］に記載のアッセイ、ただし、この場合、顕著な疾患経過を有する被験体、すなわち、安定な疾患を有する被験体は、疾患と闘う抗体の存在が示されることがあるように、あるいは、前記被験体は運動を行っているか、または効果的ストレスを経験しているように、寛解状態にあるか、または、疾患を克服している。
【００６１】
実施例５に例示され、また、図７、図８および図１４に示されるように、本発明の方法およびアッセイを行うための異なる様々な方法が存在する。例えば、リガンド結合の特異性を明らかにするために、また、競合性阻害剤を特定するためにそれぞれ、細胞でのリガンド結合レポータアッセイが競合剤（例えば、リガンドまたは阻害剤）の存在下で行われる場合があり、例えば、異なるが、目的とするリガンドに対して近縁であり、かつ、非標識であり得るか、または、目的とするリガンドに連結されるレポーターとは異なるレポーターにより標識され得るかのどちらかであるレポーターまたはリガンドを有しないことを除いて同じリガンドの存在下で行われる場合がある。下記で、具体的には二重ルシフェラーゼアッセイに関して記載される実施形態もまた参照のこと。例えば、目的とするリガンドの親和性または競合性リガンドの生物学的活性に関する情報を得るために、例えば、競合性リガンドがリガンド結合の後で目的とするリガンドに取って代わることができるかどうかに関する情報を得るために、試験細胞が目的とするレポータータグ化リガンドに供される前に、または供されるのと同時に、または供された後で、（推定される）競合性リガンドが加えられる場合がある。同様に、代替において、または加えて、試験物質を有する試験サンプルは、標的細胞をリガンドと接触させる前に、または標的細胞をリガンドと接触させるのと同時に、または標的細胞をリガンドと接触させた後で加えられる場合がある。試験物質が、目的とするリガンドに結合すること、または、標的細胞表面に存在するリガンド結合ドメインに結合すること、または両方が疑われるかどうかに依存して、目的とするリガンドまたは標的細胞のどちらかが試験物質とプレインキュベーションされる場合がある。これに関連して、リガンドおよびリガンド結合ドメインとそれぞれ結合しない分子が、目的とするリガンドおよび標的細胞を試験サンプルとインキュベーションする前に、またはインキュベーションしている期間中に、またはインキュベーションした後で、好ましくは過剰に加えられる場合がある。したがって、１つの実施形態において、本発明は下記のアッセイに関連する。
［３４］前記リガンドまたは前記標的細胞が試験サンプルとプレインキュベーションされ、あるいは、コントロールとして、非リガンド結合分子もしくは非ＬＲ結合分子または過剰濃度の非標識リガンド、および／または、異なり、かつ、非標識であるか、もしくは異なるレポーターにより標識されるリガンドとプレインキュベーションされる、［３１］〜［３３］のいずれか１つに記載のアッセイ。好ましくは、コントロールのリガンドは、目的とするリガンドに対して近縁のものであり、かつ／あるいは、コントロールの非リガンド結合分子または非ＬＲ結合分子は試験物質に対して近縁のものである。
【００６２】
これに関連して、本発明のアッセイではまた、試験サンプルおよび試験物質がそれぞれ、例えば、類似するが、異なるサイトカインに対する結合、ならびに／あるいは、例えば、１つまたは複数のサイトカイン受容体におけるリガンド結合ドメインの異なる部位に対するそれらの結合を識別することができることを明らかにすることができる。そのようなことを行うために、好ましい実施形態において、目的とする１つまたは複数の異なる抗原（例えば、サイトカイン）が使用され、そして、例えば、異なるルシフェラーゼまたは蛍光タンパク質がレポーターとして使用される場合には異なる波長の光が放射されるために、連続的または同時に好ましくは評価することができる異なるシグナルを生じさせるレポーター部分により標識される。この実施形態では、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（２８００  Ｗｏｏｄｓ  Ｈｏｌｌｏｗ  Ｒｏａｄ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ  ５３７１１、米国）によって提供されるルシフェラーゼレポータアッセイ系（Ｔｈｅ  Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（登録商標）Ｒｅｐｏｒｔｅｒ（ＤＬＲ（商標））Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ）が本発明に従って適合化され、使用されることが可能であり、ただし、この場合、１つのサイトカインがホタルルシフェラーゼにタグ化され、第２のサイトカインがウミシイタケルシフェラーゼにタグ化される。本発明のアッセイに従って、目的とする第１のリガンドに融合されるホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼの活性と、目的とする第２のリガンドに融合されるウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、または、ｓｅａ  ｐａｎｓｙ）ルシフェラーゼの活性とが、１個のサンプルから連続して測定される。ホタルルシフェラーゼレポーターが、ルシフェラーゼの基質（例えば、ルシフェラーゼアッセイ試薬ＩＩ（ＬＡＲ  ＩＩ））を加えて、少なくとも１分間持続するルミネセンスシグナルを生じさせることによって最初に測定される。ホタルルミネセンスを定量した後、この反応は停止させられ、ウミシイタケルシフェラーゼの反応が、Ｓｔｏｐ＆Ｇｌｏ（登録商標）試薬を反応液に加えることによって同時に開始される。
【００６３】
したがって、この実施形態では、所与の試験物質（例えば、抗サイトカイン抗体）が、１つのサイトカインに対する、別のサイトカインよりも優先的な結合、または、１つのサイトカインについての受容体のリガンド結合部位に対する優先的な結合を示し、その一方で、存在するならば、別のリガンド結合ドメインを本質的には影響されないままにするかどうかを容易に明らかにすることが可能である。
【００６４】
原理的には、候補抗体または同等なヒトサイトカイン結合剤が、どのような供給源であれ、古典的なハイブリドーマ法、ならびに、コンビナトリアルライブラリーを含めて、合成抗体および抗体様のサイトカイン結合分子を製造するための可能な供給源によって提供され得るかもしれない。したがって、抗体工学は、十分に発達した領域となっており、天然型および非天然型のヒト抗体レパートリーのための発見法、作製戦略および改変技術、ならびに、非コンビナトリアル戦略およびコンビナトリアル戦略によるそれらのマイニングを包含する。これにはまた、ハイブリドーマ技術、末梢Ｂ細胞のクローン増殖、単細胞ＰＣＲ、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、哺乳動物細胞ディスプレイおよびインシリコ設計に基づく方法を使用する、ナイーブなヒト抗体レパートリー、免疫性のヒト抗体レパートリー、遺伝子組換えヒト抗体レパートリーおよび合成ヒト抗体レパートリーからのヒト抗体（ｍＡｂ）の製造および選択が含まれる。天然型および非天然型のヒト抗体レパートリーの特徴、ならびに、非コンビナトリアル戦略およびコンビナトリアル戦略によるそれらのマイニングの総説については、例えば、ＢｅｅｒｌｉおよびＲａｄｅｒ、Ｍｉｎｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ、ｍＡｂｓ  ２（２０１０）、３６５〜３７８、ならびに、Ｃａｍｐｂｅｌｌ他、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １６２（２０１１）、１４７０〜１４８４を参照のこと（それらの開示内容は参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【００６５】
しかしながら、以前に言及されたように、本発明の方法の好ましい実施形態において、候補の抗ヒトサイトカイン抗体またはそのサイトカイン結合断片は、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を単離することを含み、前記モノクローナル抗体を発現するＢ細胞が、被験体哺乳動物から得られるサンプルから単離される方法によって提供されるヒト抗体に由来する。過去数十年間において、いくつかの技術が、モノクローナル抗体を単離するために、また、ヒト化抗体または完全にヒト抗体を作製するために開発されている。例えば、欧州特許ＥＰ１９７４０２０Ｂ１としてもまた特許付与される国際出願公開ＷＯ２００７／０６８７５８において、特に［０００２］節〜［００２７］節において引用される参考文献を参照のこと（それらの開示内容は参照によって本明細書中に組み込まれる）。典型的には、抗体の単離、例えば、モノクローナル抗体をＢ細胞から単離することは、免疫グロブリン遺伝子のクローニングおよび発現に依拠している。このことを、Ｂ細胞から得られるスクランブル化されたＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子のファージディスプレイライブラリーを使用することによって、あるいは、単細胞ＰＣＲを使用してただ１個のＢ細胞から得られる、または、不死化されたＢ細胞クローンから得られる対形成させたＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子の単離によって行うことができる。
【００６６】
本発明によれば、自己免疫疾患および／または炎症性疾患に罹患する患者のＢ細胞に起源を有した候補の抗ヒトサイトカイン抗体を使用することは特に有益であること、すなわち、特にヒト抗体を提供するために特に有益であることが判明した。したがって、１つの実施形態において、本発明は下記の方法に関連する。
［３５］ヒト由来モノクローナル抗リガンド抗体またはそのリガンド結合断片、あるいはそれらの合成または生物工学的誘導体を調製する方法であって、前記モノクローナル抗体を発現するＢ細胞が、哺乳動物から得られるサンプルから単離され、好ましくは、前記哺乳動物が、損なわれた中枢性寛容および／または末梢性寛容あるいは自己寛容の喪失、例えば、自己免疫性多腺性内分泌不全症・カンジダ症・外胚葉ジストロフィー（ＡＰＥＣＥＤ）に冒されており、
（ａ）前記サンプルを抗リガンド抗体の存在についてアッセイすること、
（ｂ）Ｂ細胞（好ましくはメモリーＢ細胞）を、抗リガンド抗体を含有することが特定されているサンプルから精製すること、
（ｃ）前記Ｂ細胞を培養し、必要な場合には、前記Ｂ細胞のサンプルを前記抗体の生物学的活性についてアッセイし、かつ
（ｉ）前記モノクローナル抗体を単離すること、または
（ｉｉ）前記抗体の少なくとも可変領域についての免疫グロブリン遺伝子レパートリーを前記Ｂ細胞またはメモリーＢ細胞から得ること、および
（ｄ）前記レパートリーを使用して、前記抗体またはそのリガンド結合断片、あるいはそれらの合成または生物工学的誘導体を宿主細胞において発現させ、前記抗体またはそのリガンド結合断片、あるいはそれらの合成または生物工学的誘導体を単離すること、
（ｅ）前記抗体またはそのリガンド結合断片、あるいはそれらの合成または生物工学的誘導体のサンプルの生物学的活性をアッセイすること
を含み、必要な場合にはさらに下記の工程、
（ｆ）前記単離された抗体またはそのリガンド結合断片、あるいはそれらの合成または生物工学的誘導体を薬学的に許容される担体と混合する工程
を含み、
前記リガンドが、前記項［２１］〜項［３４］のいずれか一項で定義されるようなリガンドであり、かつ、前記サンプルおよび抗体を、工程（ａ）、工程（ｃ）および／または工程（ｅ）においてそれぞれアッセイすることが、［３１］〜［３４］のいずれか１つに記載されるアッセイに従って行われることを特徴とする、方法。
【００６７】
抗体またはそのリガンド結合断片、あるいはそれらの合成または生物工学的誘導体の組換え製造を、この技術分野では広く知られている方法によって行うことができる。必要な場合には、免疫グロブリン遺伝子レパートリー、すなわち、前記抗リガンド抗体の少なくとも可変領域をコードするＤＮＡが、制限部位を導入するために、コドン使用頻度を変更するために、機能的領域またはペプチドリンカーのためのコード配列を導入するために、かつ／あるいは、転写調節配列および／または翻訳調節配列を加え、または最適化するために操作される。ただ１個の選別された細胞のＲＴ−ＰＣＲが好ましくは、前記抗体のための免疫グロブリン遺伝子レパートリーを得るために用いられる。とりわけ単細胞ＲＴ−ＰＣＲを使用してヒト抗体を得る方法が、例えば、国際出願公開ＷＯ２００８／１１０３７２に記載され（その開示内容は参照によって本明細書中に組み込まれる）、具体的には補足方法の節および実施例２に記載される。本明細書中で使用される場合、用語「ｃＤＮＡ」および用語「ｍＲＮＡ」はすべての形態の核酸を包含し、これには、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびｍＲＮＡが含まれるが、これらに限定されない。抗体または抗体断片のクローニングおよび異種発現を、当業者の範囲内にある分子生物学および組換えＤＮＡの従来技術を使用して行うことができる（Ｗｒａｍｍｅｒｔ他、Ｎａｔｕｒｅ、４５３（２００８）、６６７〜６７１、および、Ｍｅｉｊｅｒ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．３５８（２００６）、７６４〜７７２）。そのような様々な技術が、文献において、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、１９８９  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ第２版において詳しく説明されている。ＶＨ／ＶＬ配列の回収および発現については、Ｔｉｌｌｅｒ他の方法（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、３２９（２００８）、１１２〜１２４）を使用することができる。組換えヒト抗体を発現させるための適切な宿主細胞はどれも使用されてよく、例えば、酵母、植物細胞または動物細胞が使用されてよい。好ましくは、哺乳動物宿主細胞、例えば、ＣＨＯ細胞およびＨＥＫ細胞などが使用される；例えば、欧州特許ＥＰ１９７４０２０Ｂ１もまた［０１６４］節〜［０１７１］節において参照のこと（その開示内容は参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【００６８】
１つの実施形態において、本発明の抗体の定常領域またはその一部（具体的にはＣＨ２ドメインおよび／またはＣＨ３ドメイン、しかし、必要な場合にはＣＨ１ドメインもまた）は、本発明の方法に従って単離されるネイティブのヒトモノクローナル抗体の可変領域に対して異種である。これに関連して、異種の定常領域は、本発明の抗体の治療適用の場合には好ましくはヒト起源であり、しかし、動物研究の場合には、例えば、齧歯類起源であり得る。
【００６９】
被験体哺乳動物の使用に関して、特に、自己免疫障害および／または炎症性障害に罹患するヒト患者の使用に関して、候補抗体は好ましくは、自己寛容の乱された発生または脱調節された発生（好ましくは、一遺伝子性の自己免疫障害によって引き起こされるもの）に起因することがある、あるいは伴うことがある損なわれた中枢性寛容および／または末梢性寛容あるいは自己寛容の喪失に冒される哺乳動物（具体的にはヒト）から単離される。本発明による自己抗体のための特に好適な供給源を提供する動物の例が哺乳動物であり、例えば、ＡＩＲＥ（自己免疫調節因子）遺伝子における変異に伴う障害を有するヒト、例えば、自己免疫性多腺性内分泌不全症症候群タイプ１（ＡＰＳ１）および自己免疫性多腺性内分泌不全症・カンジダ症・外胚葉ジストロフィー（ＡＰＥＣＥＤ）をそれぞれ有するヒト（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ他、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８（２００８）、９４８〜９５７）、自己免疫性多腺性内分泌不全症症候群タイプ２（ＡＰＳ２）を有するヒト（Ｂａｋｅｒ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．９５（２０１０）、Ｅ２６３〜Ｅ２７０）、ならびに、Ｘ連鎖免疫調節異常・多発性内分泌障害腸症候群（ＩＰＥＸ）を有するヒト（Ｐｏｗｅｌｌ他、Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．１００（１９８２）、７３１〜７３７；Ｏｃｈｓ他、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２０３（２００５）、１５６〜１６４）などである。好ましくは、候補抗体が単離される被験体哺乳動物は、所定のヒトサイトカインに対する血清反応性を呈示し続けている。ＡＰＥＣＥＤ／ＡＳＰ１患者およびそれらのオートイムノソームのスクリーニングに関するさらなる詳細については、本出願人の国際出願公開ＷＯ２０１３／０９８４１９の記載（その開示内容はその全体が参照によって本明細書中に組み込まれる）、そして、それに記載される実施例、特に、１１２頁〜１１７頁における「材料および方法」の節、１１７頁〜１１８頁における実施例１、ならびに、１２８頁における実施例７および続く表１〜表１４、ならびに、１６８頁〜１７１頁における実施例１７を参照のこと（それらの開示内容は参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【００７０】
これに関連して、原理的には言及されるように、ヒト抗体の生成がいくつかの抗原クラス（例えば、アミロイド−ベータ抗原およびウイルス抗原など）について報告されているにもかかわらず、ヒト生体において成熟化した、単離されたおよび組換えのヒト抗サイトカイン抗体の提供は未だ報告されていないようであることは注目される。したがって、本発明によれば、ヒトの候補抗ヒトサイトカイン抗体が好ましくは、ヒト抗体を単離する新規かつ独占権下の方法によってクローン化される；なお、この方法は本出願人の国際出願公開ＷＯ２０１３／０９８４２０に開示されており、その開示内容はその全体が参照によって本明細書中に組み込まれる。簡単に記載すると、目的とする抗体を単離するためのサンプルは、生じ得る可能な抗体反応性を検出するために、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と、血清とを含むか、または、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と、血清とからなる。被験体に由来するサンプルは、例えば、所望される抗原（１つまたは複数）の１つまたは複数に対する血清反応性を試験するためにそのまま使用される場合があり、あるいは、さらに処理される場合があり、例えば、Ｂリンパ球について富化される場合がある。具体的には、サンプルは、目的とする抗体を産生するＢ細胞を含むこと、最も好ましくはメモリーＢ細胞を含むこと、または、そのようなＢ細胞に由来すること、最も好ましくはメモリーＢ細胞に由来することが好ましい。メモリーＢ細胞は、Ｂ細胞の一定の寿命のみを可能にする条件のもと、典型的にはわずか１週間〜２週間、所望される抗原に対して反応性である細胞をＢ細胞培養物から選抜するまで培養され、その後、続いて、単一の選別された細胞のＲＴ−ＰＣＲが、免疫グロブリン遺伝子レパートリーを得るために行われる；詳細な記載については、国際出願公開ＷＯ２０１３／０９８４１９の１１８頁〜１２０頁における実施例１および実施例２、ならびに、特に、国際出願公開ＷＯ２０１３／０９８４２０の２７頁〜３１頁における実施例１〜実施例４、ならびに、図１および図６を参照のこと（それらの開示内容は参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【００７１】
実際、自己免疫障害および／または炎症性障害（例えば、ＡＰＥＣＥＤなど）に罹患する患者の使用に関して、本出願人の国際出願公開ＷＯ２０１３／０９８４１９および同ＷＯ２０１３／０９８４２０に開示される方法は、抗ヒトサイトカイン抗体を単離するために特に好適であることが判明した。
【００７２】
本発明の単離された抗体は、当然のことながら、そのままの状態で、患者に適用され得るのではなく、通常の場合には、例えば、患者におけるその安定性、受容性および生物学的利用能を保証するために薬学的に製剤されなければならない。したがって、１つの実施形態において、本発明の方法はさらに、単離され、かつ検証された候補抗体またはそのサイトカイン結合断片を薬学的に許容され得る担体と混合する工程を含む。薬学的に許容され得る担体の綿密な議論が、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．１９９１）、および、Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（第２０版、ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２）において得ることができる。投与のための好ましい形態には、非経口投与のために好適である形態が含まれ、例えば、注射または注入による非経口投与、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与のために好適である形態が含まれる。製造物が注射または注入のためのものである場合、製造物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクルにおける懸濁物、溶液またはエマルションの形態を取る場合があり、また、医薬配合物において一般に使用される薬剤（例えば、懸濁化剤、保存剤、安定化剤および／または分散化剤など）を含有する場合がある。代替において、抗体分子は、適切な無菌液体により使用前に再構成されるために乾燥形態である場合がある。製剤されると、組成物は被験体に直接に投与することができる。組成物は、ヒト被験体への投与のために適合化されることが好ましい。医薬組成物は、経口経路、静脈内経路、筋肉内経路、動脈内経路、髄内経路、腹腔内経路、クモ膜下腔内経路、脳室内経路、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）経路、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）経路、局所的経路、皮下経路、鼻腔内経路、経腸経路、舌下経路、膣内経路または直腸経路（これらに限定されない）を含めて、いくつかの経路によって投与される場合がある。
【００７３】
本発明の抗体またはその断片は治療剤として直接に使用される場合がある。しかしながら、１つの実施形態において、本発明によって提供されるヒト抗ヒトサイトカイン抗体またはそのサイトカイン結合断片は検出可能に標識され、または薬物に結合させられ、ただし、この場合、例えば、検出可能な標識が、酵素、放射性同位体、蛍光団および重金属からなる群から選択される。本発明の標識されたヒト抗ヒトサイトカイン抗体またはサイトカイン結合断片は、特異的な標的を、インビトロでのアッセイのような「免疫化学／免疫標識化」を含めてインビボまたはインビトロで検出するために使用される場合がある。インビボにおいて、本発明の標識されたヒト抗ヒトサイトカイン抗体またはサイトカイン結合断片は、目的とする抗原を発現する組織、細胞または他の材料を検出するために、核医学画像化技術と類似するような様式で使用される場合がある。様々な標識、診断学におけるそれらの使用、および、本発明のヒトサイトカイン結合分子へのそれらのカップリングが、当業者には知られている。これに関連して、１つの実施形態において、薬学的使用の用語には、インビボでの診断使用、具体的にはヒトにおけるインビボ画像化が含まれる。
【００７４】
したがって、本発明はまた、ヒト抗ヒトサイトカイン抗体またはそのサイトカイン結合断片を、上記で特定された自己免疫性および／または炎症性の障害および疾患のいずれか１つの処置における薬学的使用のために、または治療的介入のための標的として調製する方法であって、本発明の上記方法のいずれかのその工程を含み、必要な場合には、前記ヒト抗ヒトサイトカイン抗体またはそのサイトカイン結合断片が検出可能に標識され、あるいは機能的領域または薬物に結合させられ、好ましくは、前記検出可能な標識が、酵素、放射性同位体、蛍光団および重金属からなる群から選択される、方法に関連する。
【００７５】
当然のことながら、当業者は、本明細書中先におよび実施例において記載されるような本発明の方法およびアッセイが概して、リガンド結合を妨げる薬物の所与の回分物（ｂａｔｃｈ）を、例えば、品質検査のために検証し、薬学的使用のためのそのような回分物を選択すること、例えば、本発明のアッセイにおいて十分に活性であること、すなわち、リガンド結合を効果的に打ち消すことまたは刺激することにおいて十分に活性であることが判明するそのような回分物を選択することのために適用され得ることを理解するであろう。したがって、さらなる実施形態において、本発明は下記の方法に関連する。
［３６］自己免疫障害、炎症性障害、がん、または、受容体に対するリガンド結合によって媒介される障害を処置する際に使用されるための、抗リガンド抗体またはそのリガンド結合断片、あるいはそれらの合成または生物工学的誘導体を含む医薬組成物を調製するための方法であって、
（ａ）抗リガンド抗体を提供すること、
（ｂ）前記抗体を［３１］〜［３４］のいずれか１つに記載されるアッセイに供すること、および
（ｃ）前記抗体がアンタゴニストまたはアゴニストであることが明らかにされる場合にだけ、前記抗体またはその誘導体を医薬組成物に製剤すること
を含む、方法。
【００７６】
本発明ではまた、本明細書中に記載される方法およびアッセイにおいて使用されるための試薬がキットの形態で含有されることが意図される。そのようなキットは、好適な包装材に含有されて、第１の結合試薬およびレポーター（これらは別々であっても、または連結されていてもどちらであってもよい）と、第２の結合試薬とを含むであろう（両者は上記で記載される通りである）。キットは必要な場合にはさらに、他の構成要素、例えば、キットの使用のための説明資料、第１の結合試薬のレポーターを検出するための試薬（例えば、緩衝液、検出可能な酵素と接触させられたときに光を生じさせる化合物など）、比較目的または較正目的のための陽性コントロールなどを含む場合がある。
したがって、さらなる実施形態において、本発明は下記のキットに関連する。
［３７］［２１］〜［３０］のいずれか１つに記載される方法または［３１］〜［３４］のいずれか１つに記載されるアッセイを行うために有用であるキットであって、
（ａ）レポーター（４）により標識される目的とするリガンドを含有するサンプル（３）、および／または、リガンド−レポーター融合タンパク質を発現し、かつ、好ましくは分泌することができる宿主（レポーター）細胞、または、そのための調製のための手段、
（ｂ）細胞内機能的領域（２）を必要な場合には含む前記リガンド結合ドメインを発現する標的細胞（１）、または、その調製のための手段、
（ｃ）レポーター活性（５）を明らかにするための手段（６）
を含み、
好ましくは、前記方法およびアッセイをそれぞれ行うための説明書を含む、キット。
【００７７】
適切な標的細胞および宿主細胞、ベクター、リガンド、受容体ならびにレポーターが、本明細書中前記および実施例において記載されている。ウミシイタケルシフェラーゼ融合体のためのプラスミドが、以前に、例えば、Ｂｕｒｂｅｌｌｏ他、ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、５（２００５）、２２、および、国際出願公開ＷＯ２００６／０７１９７０に記載されている。Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（２８００  Ｗｏｏｄｓ  Ｈｏｌｌｏｗ  Ｒｏａｄ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ  ５３７１１、米国）によって提供されるｐＲＬウミシイタケルシフェラーゼレポーターベクター、および、そのようなレポーターベクターを使用するための対応する技術冊子もまた参照のこと。
【００７８】
さらに、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（５、ｒｕｅ  Ｊｅａｎ  Ｒｏｄｉｅｒ、Ｆ−３１４００  Ｔｏｕｌｏｕｓｅ、フランス）によって提供されるレポーター検出キット、すなわち、その分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子系（この場合、ＳＥＡＰが、比色アッセイのＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ（商標）ＤｅｔｅｃｔｉｏｎおよびＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎを使用して（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎレポーター細胞のような）培養細胞の上清における酵素活性を測定することによって容易に定量される）；分泌型の合成セレンテラジンルシフェラーゼＬｕｃｉａレポーター遺伝子系（この場合、Ｌｕｃｉａルシフェラーゼを、すぐに使用できる生物発光アッセイ試薬ＱＵＡＮＴＩ−Ｌｕｃ（商標）およびβ−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）レポーター遺伝子系を使用して細胞培養上清において直接に測定することができる）が、本発明に従って適合化され、使用される場合がある：例えば、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎレポーター細胞とは対照的に、本発明によるレポーター（上記で定義されるような宿主細胞）細胞株はリガンド−レポーター融合タンパク質（例えば、ＳＥＡＰまたはＬｕｃｉａルシフェラーゼに融合されるサイトカイン）を発現し、好ましくは分泌する。第２の、すなわち、標的細胞株は、１つまたは複数のリガンド結合ドメインを発現し、例えば、膜固定ポリペプチドに好ましくは連結される１つまたは複数のサイトカイン受容体または少なくともそれらのリガンド結合ドメインを発現する。加えて、または代替において、本発明のキットは、レポーター（宿主）細胞および標的細胞の一方または両方のために、適切な細胞にトランスフェクションされたとき、所望されるレポーター細胞および標的細胞をそれぞれ生じさせる対応する発現ベクターを含む。
【００７９】
したがって、好ましい実施形態において、本発明は下記のキットに関連する。
［３８］方法およびアッセイを［２１］〜［３７］のいずれか１つに従ってそれぞれ行うために有用であるキットであって、
（ａ）［６］に記載される組換え融合タンパク質をコードするＤＮＡ、または、前記レポーターをコードするＤＮＡ配列、および、目的とするリガンドをコードするＤＮＡまたはその断片のための挿入部位を含む少なくとも１つの第１の発現ベクター、ならびに／あるいは
（ｂ）必要な場合には、目的とする前記リガンドの１つまたは複数のリガンド結合ドメインをコードするＤＮＡを含む少なくとも１つの第２の発現ベクター、
（ｃ）陽性コントロールとして使用される前記レポーターを単独でコードするＤＮＡを含む少なくとも１つの第３の発現ベクター、
（ｄ）工程（ｃ）の前記レポーターを中和する少なくとも１つのコントロール抗体、または、代替において、レポーター結合の競合性阻害剤としての非標識の組換えリガンド、
（ｅ）少なくとも１つの希釈緩衝液、
（ｆ）少なくとも１つのアッセイ緩衝液、
（ｇ）前記レポーターの基質を含む少なくとも１つの染色溶液、
（ｈ）必要な場合には、バイオルミネセンス生成系によって生じる光のスペクトルを変化させるスペクトルシフト剤である化合物、および、必要な場合には、前記レポーターの存在または活性を検出するための手段
を含み、
好ましくは、前記方法およびアッセイをそれぞれ行うための説明書を含む、キット。
【００８０】
本発明のキットには、例えば、キットを含む容器の内部に、医薬品または生物学的製造物の製造、使用または販売を規制する政府当局によって定められる形式での通知が伴い得る（ただし、そのような通知は、ヒト投与のための製造、使用または販売の当局による承認を反映する）。加えて、または、代替において、キットは、適切な診断アッセイにおいて使用されるための試薬および／または説明書を含む。本発明の組成物、すなわち、キットは、当然のことながら、本発明による方法およびアッセイを行うために特に好適であり、具体的には、目的とするリガンドの上記で述べられるようなリガンド結合ドメインへの結合を評価するために適用可能である。
【００８１】
診断目的のために有用である分子生化学および細胞生化学における様々な一般的方法を下記のような標準的な教本において見出すことができる：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ第３版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００１）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ第４版（Ａｕｓｕｂｅｌ他編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９９）；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｂｏｌｌａｇ他、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９６）。診断目的のための様々な試薬、検出手段およびキットが、様々な商業的販売者から、例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎおよびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈなどから、ならびに、本明細書中に引用される参考文献（特に特許文献）のいずれか１つに与えられる供給源から入手可能である。
【００８２】
本発明の方法およびアッセイ、ならびに、キットの構成成分が、下記の図および実施例において例示される。
【００８３】
図、図の説明文および実施例において開示される特徴のどれもが個々に、または組合せで、請求項および上記で記載される実施形態［２１］〜［３８］における特徴を例示していることを理解しなければならない。したがって、請求項および対応する上記の実施形態における特徴のどれもが、図、図の説明文および実施例において使用される対応する特徴の具体的な実施形態の１つまたは複数によって置き換えられる場合がある。このことは、リガンド結合ドメイン（例えば、サイトカイン受容体）およびリガンド−レポーター（例えば、サイトカイン−ルシフェラーゼ）融合タンパク質を発現させるための標的細胞および宿主細胞、ならびに、それらを使用するための発現ベクターに関して特に当てはまる。加えて、本発明はまた、本発明の方法およびアッセイの実施形態のいずれか１つで使用されるための、図、図の説明文および実施例に記載される材料および方法のいずれにも関連することを理解しなければならない。完全性のために、当業者は、説明、実施例および図が、本出願において開示されるのと同じ発明に関連し、かつ、本出願が優先権を主張する欧州特許出願ＥＰ１４１７５５８５．０および同ＥＰ１４１７５６７３．４の開示内容（特に実施例および図）により補足され得ることを理解するであろう。
本発明のさらなる実施形態が下記の説明および実施例から明らかであろう。交換可能に使用されるとき、また、別途示されないならば、「モノクローナル抗体」、「ｍＡｂ」、「ＭＡＢ」および「ＭＡｂ」の用語は本明細書中では交換可能に使用される。そのうえ、本発明は、最初は本発明に従って行われる、実施例に記載される実験において得られるヒト由来抗体に言及することによって例示され、また、記載されるが、本発明の抗体または抗体断片には、主題抗体の機能的性質の１つまたは複数を保持する、具体的にはＩＬ−２０に対するその中和活性を保持する操作された抗体または抗体様のＩＬ−２０結合分子（これらは化学的技術または組換え技術によって合成される）をどのようなものであっても意味する抗体の合成および生物工学的誘導体が含まれることを理解しなければならない。したがって、本発明は、簡潔さのために、抗体に言及することによって記載されることがあるが、別途述べられる場合を除き、その合成および生物工学的誘導体、ならびに、同等なＩＬ−２０結合分子が同様に意味され、抗体の用語の意味で含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】本発明のＩＬ−２０特異的ヒト抗体の可変領域、すなわち、重鎖およびカッパ／ラムダ軽鎖（ＶＨ、ＶＬ）のアミノ酸配列。Ａ：抗体２０Ａ１０（ＩｇＧ４、カッパ）；Ｂ：抗体２Ａ１１（ＩｇＧ１、ラムダ）；Ｃ：抗体７Ｄ１（ＩｇＧ１、ラムダ）；Ｄ：抗体６Ｅ１１（ＩｇＧ１、ラムダ）。フレームワーク領域（ＦＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）が示され、ＣＤＲには下線が引かれる。斜体字のアミノ酸は、配列決定がなされていないが、データベースから得られている配列を示している。
【図２】ＡＰＳ１患者から単離される血清におけるＩＬ−２０のＬＩＰＳ血清反応性の比較。個々の患者がＸ軸に示され、ＭＡＢ結合のＲＬＵ測定値がＹ軸に示される。患者ＡＰＳ１−２および患者ＡＰＳ１−９の血清により、高まったＩＬ−２０反応性が示される。
【図３】ＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼにＮ末端またはＣ末端のどちらかで融合されるＩＬ−２０構築物（Ｎ末端：ｇ１  ＩＬ−２０、Ｃ末端：ｇ２  ＩＬ−２０）に対する例示的な抗ＩＬ−２０抗体の結合のＥＣ５０のＥＬＩＳＡ決定。Ａ：２Ａ１１；Ｂ：６Ｅ１１；Ｃ：６Ｈ２；Ｄ：７Ｄ１；Ｅ：２０Ａ１０；Ｆ：ＩＬ−２０非特異的モノクローナル抗体が非特異的結合のためのコントロールとして使用される。２Ａ１１、６Ｅ１１および２０Ａ１０の各抗体が両方のＩＬ−２０構築物に対して大きい親和性で結合し、対照的に、残る抗体６Ｈ２および抗体７Ｄ１は、ｇ２  ＩＬ−２０に対してより低い親和性で結合する。
【図４】ヒト由来抗ＩＬ−２０モノクローナル抗体により、組換えＩＬ−２０媒介のＳＴＡＴ３活性化が、Ｉ型およびＩＩ型のＩＬ−２０受容体を一過性に発現するＨＥＫ２９３Ｔ  ＭＳＲ細胞において中和される。どちらの細胞も非処置のままにしたか、あるいは、示されるように抗体の非存在下またはヒト由来ＩＬ−２０モノクローナル抗体もしくはヒトコントロールＩｇＧ（ｈｕＩｇＧ）の存在下、組換えヒトＩＬ−２０または組換えマウスＩＬ−２０により刺激した。細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ｐＳＴＡＴ３レベルをウエスタンブロットで可視化した。ＳＴＡＴ３、アルファ−チューブリンおよびＩＬ−２０ＲＢの総レベルが負荷コントロールとなる。抗体濃度：５μｇ／ｍｌ。Ａ：コントロール：ｒｈＩＬ−２０およびｒｍＩＬ−２０により、ＳＴＡＴ３の用量依存的なリン酸化が、Ｉ型またはＩＩ型のＩＬ−２０受容体を一過性に発現するＨＥＫ２９３Ｔ  ＭＳＲ細胞において誘導される。ＳＴＡＴ３およびＩＬ−２０ＲＢ−Ｍｙｃ−ＤＤＫの総レベルおよびリン酸化体レベルの検出。Ｂ：ｒｈＩＬ−２０（１０ｎｇ／ｍｌ）またはｒｍＩＬ−２０（２５ｎｇ／ｍｌ）による刺激。例示的抗体の２Ａ１１、２０Ａ１０および７Ｄ１により、ｒｈＩＬ−２０が中和され、これに対して、２０Ａ１０でも、ｒｍＩＬ−２０が強力に中和される。
【図５】ヒト由来抗ＩＬ−２０モノクローナル抗体により、ＫＺ１３６−ＮＬｕｃレポーター構築物のｒｈＩＬ−２０媒介の誘導が、ＩＬ−２０受容体およびＫＺ１３６−ＮＬｕｃにより一過性にトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｔ  ＭＳＲ細胞において中和される。細胞を、示されるようにヒト由来ＩＬ−２０モノクローナル抗体またはコントロールのヒトＩｇＧ（ｈｕＩｇＧ）の存在下、１２０ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ−２０または２００ｎｇ／ｍｌのｒｍＩＬ−２０により刺激した。Ａ：ＫＺ１３６−ＮＬｕｃレポーター構築物の概略図。Ｂ：コントロール：ｒｈＩＬ−２０およびｒｍＩＬ−２０により、ＫＺ１３６−ＮＬｕｃレポーター構築物が、Ｉ型ＩＬ−２０受容体およびＫＺ１３６−ＮＬｕｃにより一過性にトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｔ  ＭＳＲ細胞において誘導される。Ｃ、Ｄ：２０Ａ１０、７Ｄ１および２Ａ１１の各例示的抗体のｒｈＩＬ−２０  ＩＣ５０分析。Ｅ：例示的抗体２０Ａ１０およびコントロールのヒトＩｇＧのｒｍＩＬ−２０  ＩＣ５０分析。Ｆ：２０Ａ１０、７Ｄ１および２Ａ１１の各例示的抗体のＩＣ５０値。
【図６】ｐＳＴＡＴ３ウエスタンブロットアッセイにおける、ｒｍＩＬ−２０に対抗するヒト由来抗ＩＬ−２０モノクローナル抗体２０Ａ１０のＩＣ５０分析。Ａ：Ｉ型ＩＬ−２０受容体を一過性に発現するＨＥＫ２９３Ｔ  ＭＳＲ細胞を非処置のままにしたか、あるいは、示されるように抗体の非存在下（−）または例示的抗体２０Ａ１０の存在下（＋）、２５ｎｇ／ｍｌのｒｍＩＬ−２０により刺激した。細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ｐＳＴＡＴ３レベルをウエスタンブロットで可視化した。総ＳＴＡＴ３レベルが負荷コントロールとなる。Ｂ：ｐＳＴＡＴ３ウエスタンブロットアッセイにおける、ｒｍＩＬ−２０に対抗する例示的抗体２０Ａ１０のＩＣ５０値。
【図７】目的とするリガンドの、このリガンドに対する関連性のある受容体を発現する細胞への結合を評価するための新しいアッセイ。目的とするリガンドがルシフェラーゼ融合タンパク質として使用されるので、リガンドの細胞結合が細胞会合のルシフェラーゼ活性によって測定される。このアッセイはまた、リガンドに対する抗体により、このリガンドが細胞表面のそれぞれの受容体に結合することができることが妨げられるかの評価を可能にする。ヒト由来抗ＩＬ−２０モノクローナル抗体により、ＩＬ−２０−Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ融合タンパク質が、Ｉ型およびＩＩ型のＩＬ−２０受容体を一過性に発現するＨＥＫ２９３Ｔ  ＭＳＲ細胞に結合することが中和される。細胞を、ＩＬ−２０−Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ融合タンパク質を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞の上清とともに、示されるように抗体の非存在下（−）、あるいは、ヒト由来ＩＬ−２０モノクローナル抗体、ヒトのコントロールＩｇＧ（ｈｕＩｇＧ）または１μｇ／ｍｌのｒｈＩＬ−２０の存在下でインキュベーションした。抗体濃度：５μｇ／ｍｌ。Ａ：目的とするリガンドの、このリガンドに対する関連性のある受容体を発現する細胞への結合を評価するための新しいアッセイを記載する概略図。目的とするリガンドがレポーターとして、すなわち、ルシフェラーゼ融合タンパク質として使用されるので、リガンドの細胞結合が細胞会合レポーターによって、例えば、ルシフェラーゼ活性によって測定される。結合していない融合タンパク質を除いた後、ルシフェラーゼの基質が加えられ、光の放射が記録される。出力された光が、結合した融合タンパク質の量に比例している。Ｂ：ルシフェラーゼに基づくこの化学発光法細胞結合アッセイはまた、試験物質、例えば、リガンドに対する抗体などにより、リガンドが細胞表面のそれぞれの受容体に結合することができることが妨げられるかの評価を可能にする。参照符号１：リガンド結合ドメインを発現する標的細胞２：リガンド結合ドメイン（例えば、サイトカイン受容体など、例えば、Ｉ型またはＩＩ型のＩＬ−２０受容体）３：リガンド（例えば、サイトカインなど、例えば、ＩＬ−２０）４：レポーター（例えば、酵素など、例えば、ヒトＩＬ−２０−Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ融合タンパク質）５：必要な場合にはレポーターのための基質（例えば、ルシフェラーゼのための基質など）６：検出可能なレポーター活性（例えば、光放射など）７：試験物質（例えば、抗体など、例えば、ＩＬ−２０抗体）  レポーターのための基質は、例えば、レポーターが酵素ではなく、それ自体が検出可能である分子、例えば、重金属（例えば、金）、放射性同位体または蛍光タンパク質などであって、リガンドがリガンド結合ドメインに結合したときのレポーター活性における変化が、例えば、放射の消滅、波長の変化および遮蔽などであり得る場合には必須でなくてもよい。Ｃ：コントロール：ＩＬ−２０−Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ融合タンパク質（ｇ１  ＩＬ−２０）が機能的に活性である。ＩＬ−２０−Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ融合タンパク質を含有するＨＥＫ２９３Ｔの上清により、ＳＴＡＴ３が、Ｉ型およびＩＩ型のＩＬ−２０受容体を一過性に発現するＨＥＫ��９３Ｔ  ＭＳＲ細胞において活性化される。細胞を、ｇ１  ＩＬ−２０の上清の連続希釈物と、またはコントロール培地（ＮＣ）とインキュベーションした。ＳＴＡＴ３、ＩＬ−２０ＲＢ−Ｍｙｃ−ＤＤＫ、ＩＬ−２０ＲＡ−Ｍｙｃ−ＤＤＫおよびＩＬ−２２ＲＡ（ＲＡサブユニット）の総量およびリン酸化体のウエスタンブロットでの検出。Ｄ：コントロール：ｇ１  ＩＬ−２０融合タンパク質が、Ｉｌ−２０受容体Ｉ型の両方のサブユニットを発現するＨＥＫ２９３Ｔ  ＭＳＲ細胞に特異的に結合する。結合が非標識のｒｈＩＬ−２０（３μｇ／ｍｌ）によって取り消される。Ｅ：コントロール：ｇ１  ＩＬ−２０が、Ｉ型ＩＬ−２０受容体を発現するＨＥＫ２９３Ｔ  ＭＳＲ細胞に結合することが、ｒｈＩＬ−２０、ｒｍＩＬ−２０および例示的なヒト由来ＩＬ−２０モノクローナル抗体２０Ａ１０によって用量依存的様式で阻害される。結合が、無関係のｒｈＩＬ−３２γおよびコントロールのヒトＩｇＧ（ｈｕＩｇＧ）によって影響されない。Ｆ：例示的抗体の２Ａ１１、２０Ａ１０および７Ｄ１により、ｇ１  ＩＬ−２０が、Ｉ型およびＩＩ型のＩＬ−２０受容体を一過性に発現するＨＥＫ２９３Ｔ  ＭＳＲ細胞に結合することが中和される。非標識のｒｈＩＬ−２０（１μｇ／ｍｌ）が陽性コントロールとして役立つ。抗体濃度：５μｇ／ｍｌ。Ｇ：ＩＦＮＡ５−Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ融合タンパク質（ｇ１  ＩＦＮＡ５）の、ＨＥＫ２９３Ｔ  ＭＳＲ細胞への結合が、非標識のｒｈＩＦＮＡ２（３μｇ／ｍｌ）によって、また、例示的なヒト由来モノクローナルＩＦＮ抗体１９Ｄ１１（１．７μｇ／ｍｌ）によって阻害される。ヒトコントロール抗体（ｈｕＩｇＧ、１５μｇ／ｍｌ）は影響を何ら示さない。Ｈ：ｇ１  ＩＦＮＡ２、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ１０、Ａ１４、Ａ１６、Ａ１７およびＡ２１の各融合タンパク質の、ＨＥＫ２９３Ｔ  ＭＳＲ細胞への結合が、例示的なヒト由来モノクローナルＩＦＮ抗体１９Ｄ１１によって阻害される。ｇ１  ＩＦＮＢおよびＷの結合は１９Ｄ１１によって影響されない。すべてのｇ１  ＩＦＮの結合が、コントロールのヒト抗体（ｈｕＩｇＧ）によって影響されない。抗体濃度：５μｇ／ｍｌ。
【図８】化学発光法細胞結合アッセイにおけるヒト由来抗ＩＬ−２０モノクローナル抗体のＩＣ５０分析。Ｉ型またはＩＩ型のＩＬ−２０受容体を一過性に発現するＨＥＫ２９３Ｔ  ＭＳＲ細胞を、ヒト由来ＩＬ−２０モノクローナル抗体の存在下（Ａ：２０Ａ１０、Ｂ：７Ｄ１、および、Ｃ：２Ａ１１）、ｇ１  ＩＬ−２０の上清とインキュベーションした。Ｄ：例示的抗体の２０Ａ１０、７Ｄ１および２Ａ１１のＩＣ５０値。
【図９】交差競合。Ａ：実験構成：９６ウェルマイクロプレート（Ｃｏｓｔａｒ、米国）を、ＰＢＳにおいて１／２５０で希釈されるウサギ抗ＧＬｕｃ特異的抗体（ＮＥＢ、Ｅ８０２３Ｓ）により被覆した（Ｏ／Ｎ、４℃）。プレートをＰＢＳ−Ｔにより洗浄し、２％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ、Ｂｕｃｈｓ、スイス）を含有するＰＢＳによる室温での１時間のブロッキング処理に供した。３０μｌのＧＬｕｃ−ＩＬ−２０を２ｘ１０６ＬＵ／ウエルの最終濃度で加え、室温で２時間インキュベーションした。キメラ抗体が、ヒト競合剤抗体と、３０μｌのＰＢＳにおいて０．５μｇ／ｍｌ対３μｇ／ｍｌの最終濃度で事前に混合され、プレートに加えられる。室温での２時間のインキュベーションを行ったとき、プレートをＰＢＳ−Ｔにより洗浄し、ヒト−マウスキメラ抗体の結合を、西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲート化されたヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ−γ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、０．５％ＢＳＡ−ＰＢＳでの１：５００）を使用して求め、その後、ＨＲＰ活性の測定を、ＴＭＢ基質溶液（Ｓｉｇｍａ、Ｂｕｃｈｓ、スイス）を使用して行った。本発明の例示的なヒト由来抗ＩＬ−２０モノクローナル抗体の、異なった結合部位に対するヒト−マウス（ｈｍ）キメラ構築物による示差的な結合を、Ｂ：２０Ａ１０ｈｍ、Ｃ：２Ａ１１ｈｍ、Ｄ：７Ｄ１ｈｍ、および、Ｅ：６Ｅ１１ｈｍを用いた交差競合実験で調べた。Ｆ：ＩＬ−２０非結合コントロールとして、無関係の抗原に結合するヒト抗体を使用した。ヒト由来の抗ＩＬ−２０  ＭＡｂの２０Ａ１０、２Ａ１１および６Ｅ１１は、他のヒト−マウスキメラ抗ＩＬ−２０  ＭＡｂのいずれとも競合せず、しかし、ヒト６Ｈ２はヒトキメラ型７Ｄ１の結合と競合した。
【図１０】交差反応性−本発明の例示的なヒト由来抗ＩＬ−２０モノクローナル抗体の６Ｅ１１、２Ａ１１および２０Ａ１０の、マウスＩＬ−２０およびヒトＩＬ−２０への結合のＧＬｕｃサンドイッチＥＬＩＳＡによる決定および比較。Ａ：交差反応性を試験するための実験構成：９６ウェルマイクロプレート（Ｃｏｓｔａｒ、米国）を、ＰＢＳにおいて１／２５０で希釈されるウサギ抗ＧＬｕｃ抗体（ＮＥＢ、Ｅ８０２３Ｓ）により被覆した（Ｏ／Ｎ、４℃）。プレートをＰＢＳ−Ｔにより洗浄し、２％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ、Ｂｕｃｈｓ、スイス）を含有するＰＢＳによる室温での１時間のブロッキング処理に供した。３０μｌのＧＬｕｃ−ＩＬ−２０を２ｘ１０６ＬＵ／ウエルの最終濃度で加え、室温で２時間インキュベーションした。競合剤抗原の組換えｈＩＬ−２０および組換えマウスＩＬ−２０を、試験される抗体（１μｇ／ｍｌの固定された濃度）に対して、１０μｇ／ｍｌから４．６ｎｇ／ｍｌにまで及ぶ連続希釈で力価測定した。混合物のウエルあたり３０μｌをウエルにおいて室温で１．５時間インキュベーションした。プレートをＰＢＳ−Ｔにより洗浄し、競合剤の存在下における目的とする抗原へのヒトＩｇＧの結合を、西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲート化されたヤギ抗ヒトＦｃガンマ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｅｕｒｏｐｅ  Ｌｔｄ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅｓｈｉｒｅ、英国）を使用して明らかにし、その後、ＨＲＰ活性の測定を、ＴＭＢ基質溶液（ＴＭＢ、Ｓｉｇｍａ、Ｂｕｃｈｓ、スイス）を使用して行った。Ｂ、Ｃ、Ｄ：ヒトＩＬ−２０により、ｇ２  ＩＬ−２０に対するすべての試験された抗ＩＬ−２０抗体の結合が阻害される。マウスＩＬ−２０は、ｇ２  ＩＬ−２０に対する、６Ｅ１１を除くすべての試験された抗体の結合を阻害することができる。
【図１１】ＩＬ−２０の耳炎症アッセイＣｙｔｏＥａｒ。本発明の異なるＩＬ−２０阻止抗体の影響をｈＩＬ−２０誘導炎症の後で試験する。炎症を誘導するために、ＩＬ−２０を、１２５ｎｇ、２５０ｎｇ、５００ｎｇおよび１０００ｎｇの異なる濃度を滴定した後で最適な実験結果を与えた２０μｌの容量での１０００ｎｇの濃度で注入した。Ａ：例示的な１０日間の実験予定表。Ｂ：実験動物群（Ａ〜Ｍ）の実験的処置の概観。それぞれのコホートについて、関連性のあるＰＢＳコントロールに対して正規化される０日目の測定に対する変化倍数として計算されるＣｙｔｏＥａｒ耳厚さ測定。Ｃ：すべての正規化された測定の影響の概略。Ｄ：すべての正規化された測定の影響の概略。Ｅ：ＩＬ−２０の結果を明瞭性のためだけに示す、すべての正規化された測定の影響の概略。本発明の抗体２０Ａ１０および抗体７Ｄ１による処置（それぞれ６日目〜１０日目における、２Ａ１１については８日目〜１０日目における耳厚さの有意な減少）は、（結合特異性がＩＬ−２０に関連づけられない）ＩｇＧによるコントロール処置と比較して、ＩＬ−２０注入から生じる耳厚さの顕著な減少を引き起こす。平均＋／−ＳＥＭ、ＩＤ＝皮内へのサイトカイン注入、Ｍ＝測定−耳厚さ、Ｓ＝動物の屠殺；ＩＤ−サイトカイン注入；試験抗体（２Ａ１１、２０Ａ１０、７Ｄ１）およびコントロールＩｇＧを０日目および６日目に注入した（ＩＰ）。ＩＰ＝腹腔内への抗体注入、ＩＤ＝皮内耳注入。
【図１２】ＳＰＲ分析。Ａ：本発明の例示的抗体に対するヒトＩＬ−２０およびマウスＩＬ−２０の結合に関するセンソグラム（ｓｅｎｓｏｇｒａｍ）の詳細な分析。１：１の結合速度論が認められた。抗原を、１．５ｎＭ、３．１２５ｎＭ、６．２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭおよび１００ｎＭの濃度で注入した。計算された親和性（ＫＤ値［Ｍ］）が図中に示される。Ｂ：プロットは、すべての試験された抗体の会合（オン速度ｋａ）および解離（オフ速度ｋｄ）についての適合化曲線から導かれる速度論パラメーターを示す。点線の対角線により、親和性（ＫＤ）が示される。Ｃ：ビオチン−ストレプトアビジン結合のＳＰＲ文献値との比較での本発明の例示的抗体のＫＤ値。２０Ａ０および２Ａ１１のヒトＩＬ−２０に対する親和性が、マウスＩＬ−２０についてそれぞれ、サブピコモル濃度範囲およびサブナノモル濃度範囲にある。
【図１３】本発明のヒト抗ＩＬ−２０抗体のエピトープのマッピング。Ａ：マイクロアレイに結合させた全長型抗原に対する本発明の抗体の結合。Ｙ軸は、Ｃｙ５コンジュゲート化二次抗体により検出されたときの蛍光強度（ＲＦＵ）を示した。Ｂ：本発明のすべての抗体に対するヒトＩＬ−２０の１８ｍｅｒペプチドの一次ペプチドアレイ。Ｃ：本発明のすべての抗体に対するマウスＩＬ−２０の１８ｍｅｒペプチドの一次ペプチドアレイ。Ｄ：２０Ａ１０に対するヒトＩＬ−２０の一次ペプチドアレイ。下段パネルには、リシン８９からメチオニン１２９までの配列を網羅するペプチドが示される。例示的抗体２０Ａ１０はペプチド２０に特異的に結合する。Ｅ：残基Ｐ１０１〜残基Ｌ１２９を含む例示的抗体２０Ａ１０のエピトープのアラニンスキャン。Ｄ１０２、Ｈ１０３、Ｙ１０４、Ｔ１０５、Ｌ１０６、Ｒ１０７、Ｋ１０８、Ｓ１１１、Ｎ１１４、Ｓ１１５およびＦ１１６の位置におけるアラニン置換により、ｍＡＢ結合の破壊がもたらされた。
【図１４】ヒトＩＬ−２２−Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ融合タンパク質はＣＯＬＯ２０５細胞に特異的に結合する。細胞を、ＩＬ−２２−Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ融合タンパク質（ｇ２  ＩＬ−２２）を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞の上清とともに、示されるように阻害剤の非存在下（−）または競合性阻害剤の存在下でインキュベーションした。Ａ：ｇ２  ＩＬ−２２のＣＯＬＯ２０５細胞への結合が非標識のｒｈＩＬ−２２によって阻害され、無関係のｒｈＩＦＮＡ２によって阻害されない。ＣＯＬＯ２０５細胞を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のｇ２  ＩＬ−２２含有上清とともに、示されるように阻害剤の非存在下あるいは非標識のｒｈＩＬ−２２またはｒｈＩＦＮＡ２（それぞれ１μｇ／ｍｌ）の存在下でインキュベーションした。細胞を、光出力が記録される前に溶解したか、または溶解しなかった。Ｂ：ｇ２  ＩＬ−２２のＣＯＬＯ２０５細胞への結合が、例示的なヒト由来ＩＬ−２２モノクローナル抗体３０Ｇ１によって用量依存的様式で阻害される。結合がコントロールのヒト抗体（ｈｕＩｇＧ）によって影響されない。
【図１５】抗体２６Ｂ９の膜貫通（２６Ｂ９−ＴＭ）構築物の設計。ｍｙｃエピトープと、ヒト血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）ベータの膜貫通ドメイン（データベースアクセション番号ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０９６１９、アミノ酸５１３〜５６１）とを含む断片が、重鎖定常ドメインのＣ末端部分に融合される（Ａ）。カッパ軽鎖の定常領域は変更されないままである（Ｂ）。ＨＥＫ２９３Ｔ  ＭＳＲ細胞の共トランスフェクションが行われたとき、適正に組み立てられたＩｇＧが、抗ヒトＩｇＧ−ＨＣ−ＦＩＴＣ標識の検出抗体および抗ヒトＩｇカッパ−ＡＰＣ標識の検出抗体を使用するＦＡＣＳ分析によって細胞表面に検出される。
【図１６】２６Ｂ９−ＴＭ膜貫通領域の配列（配列番号６７）。ＤＮＡ塩基１〜３０に由来するｍｙｃエピトープと、ＤＮＡ塩基３４〜１８３に由来するＰＤＧＦＲ膜貫通ドメインとを含む２６Ｂ９−ＴＭ膜貫通領域のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列。
【図１７】ヒトＩＦＮＷ−Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ融合タンパク質は、膜貫通型の抗ＩＦＮＷ  ｍＡｂを発現するＨＥＫ２９３Ｔ  ＭＳＲ細胞に特異的に結合する。ＨＥＫ２９３Ｔ  ＭＳＲ細胞を、示された量の抗ＩＦＮＷ  ｍＡｂの２６Ｂ９の膜結合型（２６Ｂ９−ＴＭ）をコードするｃＤＮＡ、または、空ベクター（モック）によりリバーストランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後、ＩＦＮＷ−Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼを加え（ｇ１  ＩＦＮＷ）、結合を化学発光法細胞結合アッセイで分析した。Ａ：コントロール：２６Ｂ９−ＴＭが、トランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｔ  ＭＳＲ細胞の細胞表面で発現される。表面の抗体発現をトランスフェクションの４８時間後、細胞に基づくＥＬＩＳＡで分析した。Ｂ：ｇ１  ＩＦＮＷは、発光法細胞結合アッセイにおいて、２６Ｂ９−ＴＭを発現する細胞に特異的に結合する。
【図１８】抗ＩＦＮＷ抗体の交差競合アッセイ。ｇ１  ＩＦＮＷの２６Ｂ９−ＴＭへの結合が、可溶性の２６Ｂ９によって、また、クローン的に関連した３１Ｂ４抗体によって用量依存的な競合を受ける。対照的に、結合が、コントロールＩｇＧによっても、例示的な抗ＩＦＮＷ抗体８Ｈ１によっても影響されない。
【発明を実施するための形態】
【００８５】
第１の局面において、本発明は概して、哺乳動物起源（好ましくはヒト起源）のＩＬ−２０と結合する新規な分子に関連する。したがって、本発明は、組換えによるヒト由来モノクローナル抗インターロイキン−２０（ＩＬ−２０）抗体、ＩＬ−２０結合断片、それらの合成および生物工学的変異体、ならびに、添付された実施例および図において例示される抗ＩＬ−２０抗体の２０Ａ１０、２Ａ１１、７Ｄ１または６Ｅ１１のいずれか１つの免疫学的特徴（例えば、ＩＬ−２０結合特徴）および／またはそのような抗体のいずれか１つの生物学的活性の１つもしくは複数を示す同等なＩＬ−２０結合分子に関連する。本発明の特に好ましい実施形態において、述べられた抗ＩＬ−２０結合分子はヒトにおいて実質的に非免疫原性である。
【００８６】
実施例２および実施例６に記載されるように、同様にまた、図３および図１０において例示されるように、本発明は、ヒトＩＬ−２０と選択的または優先的に結合する抗ＩＬ−２０抗体（例えば、抗体２０Ａ１１および抗体７Ｄ１）、ならびに、ヒトＩＬ−２０およびマウスＩＬ−２０とは同程度に結合する抗ＩＬ−２０抗体（すなわち、抗体２０Ａ１０）を提供する。したがって、１つの実施形態において、本発明のヒトモノクローナル抗ＩＬ−２０抗体、ＩＬ−２０結合断片、それらの合成または生物工学的変異体は、組換え型マウスＩＬ−２０と結合することができ、その一方で、別の実施形態において、マウスＩＬ−２０とは実質的に結合しない。両方の実施形態は様々な利点を有している。例えば、治療用抗体の開発のために、リード抗体は、特定の疾患に対する治療活性について、また、毒性学研究を行うために動物モデルにおいて試験されなければならないことが一般に知られている。この場合、マウスが、疾患モデルのための最も一般に使用されている動物であり、そして、マウスはまた、予備的なスクリーニングを毒性学研究および長期間の生殖毒性学研究のために行うための最も一般に使用されている動物である。したがって、マウスＩＬ−２０とのそれらの交差反応性のため、抗体２０Ａ１０に由来するＩＬ−２０抗体および類似したＩＬ−２０結合分子により、代用マウス抗体が必要なくなる。
【００８７】
他方で、抗体２０Ａ１１または抗体７Ｄ１に由来する抗ＩＬ−２０抗体および類似したＩＬ−２０結合分子は、ヒトＩＬ−２０と選択的に結合するという利点を有しており、そのため、所与の状態が組換え型ヒトＩＬ−２０によって誘導される動物モデルにおいては、例えば、本出願人の同時係属中の国際出願公開ＷＯ２０１５／００１０４７に記載されるＨｕＣｙｔｏＭａｂ−Ａｓｓａｙ（それにおける実施例２および実施例３もまた参照のこと）などでは、結果が動物の内因性ＩＬ−２０によって影響されない。そのうえ、ヒトＩＬ−２０および対応する動物種を識別する抗ＩＬ−２０抗体および類似したＩＬ−２０結合分子は診断使用のために好都合である。したがって、本発明のヒトモノクローナル抗ＩＬ−２０抗体、ＩＬ−２０結合断片、それらの合成または生物工学的変異体の両実施形態はそれらの長所を有している。
【００８８】
好ましい実施形態において、上記ヒトモノクローナル抗ＩＬ−２０抗体またはそのＩＬ−２０結合断片はＩＬ−２０の生物学的活性を中和することができ、ただし、この場合、好ましくは、前記生物学活性は下記のものである。
（ａ）細胞ベースのＳＴＡＴ（シグナル伝達・転写活性化因子）活性化アッセイにおけるＩＬ−２０シグナル伝達（例えば、実施例３に従って求められることになるＩＬ−２０シグナル伝達）、
（ｂ）ＩＬ−２０サイトカイン細胞表面受容体結合の阻害（例えば、実施例４に従って求められることになる阻害）、
（ｃ）ヒトＩＬ２０Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２受容体複合体のヒトＩＬ−２０媒介の活性化（例えば、実施例５に従って求められることになる活性化）、および／または
（ｄ）ヒトＩＬ−２０の前炎症性活性（例えば、実施例７に従って求められることになる前炎症性活性）。
【００８９】
好ましくは、本発明の抗ヒトインターロイキン−２０（ＩＬ−２０）抗体、ＩＬ−２０結合断片、それらの合成または生物工学的変異体は、その可変領域において、
（ａ）下記に示されるＶＨ可変領域アミノ酸配列および／またはＶＬ可変領域アミノ酸配列の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、
（ｉ）図１（ＶＨ）（配列番号２、配列番号１０、配列番号１８および配列番号２６）、および
（ｉｉ）図１（ＶＬ）（配列番号４、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２８）、
（ｂ）図１に示されるようなＶＨ領域および／またはＶＬ領域のアミノ酸配列、
（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列のいずれか１つの部分的変化から生じるアミノ酸配列からなる少なくとも１つのＣＤＲ、ならびに
（ｄ）（ｂ）のアミノ酸配列の部分的変化から生じるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域
を含む。
【００９０】
本明細書中下記においてより詳しく記載されるように、本発明の抗ＩＬ−２０抗体、ＩＬ−２０結合断片、それらの合成または生物工学的変異体は、免疫グロブリン分子のどのようなタイプ、クラスまたはサブクラスのものでも可能であり、あるいは、免疫グロブリン分子のどのようなタイプ、クラスまたはサブクラスにも由来することができる。しかしながら、好ましい実施形態において、本発明の抗体はＩｇＧイソタイプのものであり、最も好ましくはＩｇＧ１サブクラスまたはＩｇＧ４サブクラスのものである。
【００９１】
これに関連して、本発明の抗ＩＬ−２０抗体、ＩＬ−２０結合断片、それらの合成または生物工学的変異体は好ましくは、表１に示されるＣＨアミノ酸配列およびＣＬアミノ酸配列（配列番号６、配列番号８、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２２、配列番号２４、配列番号３０および配列番号３２）から選択されるアミノ酸配列、あるいは、言及された参照配列に対する少なくとも６０％の同一性、好ましくは７０％の同一性、より好ましくは８０％の同一性、なお一層より好ましくは９０％の同一性、特に好ましくは少なくとも９１％の同一性、９２％の同一性、９３％の同一性、９４％の同一性、９５％の同一性、９６％の同一性、９７％の同一性、９８％の同一性または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＨ定常領域および／またはＣＬ定常領域を含む。
【００９２】
上記で記載されるように、ＩＬ−２０は、ＳＴＡＴ３の活性化を、ＩＬ−２０受容体（Ｒ）複合体ＩＬ−２０ＲＡ／ＩＬ−２０ＲＢ（Ｉ型）の結合を介して、または、ＩＬ−２０受容体複合体ＩＬ−２２ＲＡ／ＩＬ−２０ＲＢ（ＩＩ型）の結合を介してそのどちらでも誘導することが見出されている（Ｐａｒｉｓｈ−Ｎｏｖａｋ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（２００２）、４７５１７〜４７５２３；Ｌｏｇｓｄｏｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０９（２０１２）、１２７０４〜９）。そのうえ、ＩＬ−２０は様々な前炎症性サイトカイン（例えば、単球走化性タンパク質（ＭＣＰ）−１、ＩＬ−６およびＩＬ−８など）を誘導することができる（Ｈｓｉｅｈ他、Ｇｅｎｅｓ  Ｉｍｍｕｎ．７（２００６）、２４３４〜２４２；Ｈｓｕ他、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．５４（２００６）、２７２２〜２７３３（上掲）を参照のこと）。この活性化機構が、ＩＬ−２０活性を明らかにするためのインビトロアッセイおよびインビボアッセイ（実施例３および実施例４を参照のこと）を設計するために、同様にまた、実施例５に記載される新規な細胞リガンド受容体結合アッセイにおいて、ならびに、実施例７、ならびに、図４、図５、図６、図７Ｅ、図７Ｆおよび図８に記載されるような耳炎症アッセイをモニターして、本発明の抗体の中和特性をモニターするために本発明において使用されている。それらにおいて詳しく記載されるように、本発明の抗体は、ＩＬ−２０、ＩＬ−２０媒介のＳＴＡＴ３活性化、および、Ｉ型ＩＬ−２０受容体に対する、ならびに、ＩＩ型ＩＬ−２０受容体に対する強力な中和活性を有することが見出されている。したがって、１つの実施形態において、本発明のＩＬ−２０抗体またはそのＩＬ−２０結合断片はヒトＩＬ−２０の生物学的活性を低下させることができる。好ましい実施形態において、生物学的活性は、ヒトＩＬ−２０により誘導される炎症である。そのうえ、本発明の１つの実施形態において、生物学的活性がＳＴＡＴレポータアッセイおよび／または耳炎症アッセイにおいて明らかにされる。そのうえ、本発明の抗体の結合親和性が、本明細書中（例えば、実施例２）に記載されるように、また、図３および図１０に示されるようにＥＬＩＳＡおよびヒトＩＬ−２０−Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ融合タンパク質によって試験されている。これらの実験の結果に従って、本発明は、ＩＬ−２０に対する示差的な結合親和性を示すいくつかの例示的な抗ＩＬ−２０抗体およびそのＩＬ−２０結合断片を提供する。なお、これらの抗ＩＬ−２０抗体およびそのＩＬ−２０結合断片により、本明細書中に提供されるＩＬ−２０結合分子の結合特性および中和特性が例示される。そのうえ、実施例１０に記載され、また、図１３に示されるように、本発明の例示的抗体２０Ａ１０は大きいエピトープビン（ｅｐｉｔｏｐｅ  ｂｉｎ）を有しており、このことは、１８ｍｅｒのＩＬ−２０ペプチドのアミノ酸配列における多数のアミノ酸が抗体の結合のために必須であり、かつ要求されることを意味している。
【００９３】
したがって、本発明の１つの実施形態において、本発明の抗体またはＩＬ−２０結合断片、あるいはそれらの合成または生物工学的誘導体であって、アミノ酸配列１０１−ＰＤＨＹＴＬＲＫＩＳＳＬＡＮＳＦＬＴ−１１８（配列番号６９）、アミノ酸配列１０２−ＤＨＹＴＬＲＫＩＳＳＬＡＮＳＦ−１１６（配列番号７０）および／またはアミノ酸配列１０１−ＰＤＨＹＴＬＲＫＩＳＳＬＡＮＳＦＬ−１１７（配列番号７２）からなるＩＬ−２０由来ペプチドを認識する抗体またはＩＬ−２０結合断片、あるいはそれらの合成または生物工学的誘導体が提供され、ただし、前記配列において、Ｐ１０１、Ｉ１０９、Ｓ１１０および／またはＬ１１７のみがアラニンによって置換されることがあり、かつ、前記抗体は、アミノ酸配列９７−ＮＹＱＴＰＤＨＹＴＬＲＫＩＳＳＬＡＮ−１１４（配列番号７１）からなるペプチドを認識しない、または実質的に認識しない。
【００９４】
興味深いことに、抗体２０Ａ１０は、そのアミノ酸配列においてヒトＩＬ−２０の１０１−１１８−ペプチドとはＹ１０４ＨおよびＴ１１８Ｉの位置（後者は２０Ａ１０結合のために必須でない）でのみ異なるマウスＩＬ−２０に由来する対応したペプチドには結合せず、また、この抗体は全長型マウスＩｌ−２０に結合することができるにもかかわらず、どのような他のマウスＩＬ−２０由来１８ｍｅｒペプチドに対しても結合しない。例えば、図１３を参照のこと。したがって、２０Ａ１０抗体により、ヒトＩＬ−２０およびマウスＩＬ−２０の立体配座エピトープ（これはまた、ヒトＩＬ−２０由来ペプチドの１０１−ＰＤＨＹＴＬＲＫＩＳＳＬＡＮＳＦＬＴ−１１８（配列番号６９）および１０１−ＰＤＨＹＴＬＲＫＩＳＳＬＡＮＳＦＬ−１１７（配列番号７２）によって形成または模倣され得る）が認識されると仮定することは、興味をそそるものである。
【００９５】
実施例において明らかにされ、また、図に示されるように、本発明を例示する抗ＩＬ−２０抗体は、１０ｎｇ未満にまで達するμＭ範囲におけるＥＣおよびＩＣによってそれぞれ特徴づけられる（抗ＩＬ−２０抗体２Ａ１１）。したがって、好ましくは、本発明の抗ＩＬ−２０抗体、ＩＬ−２０結合断片、あるいはそれらの合成または生物工学的変異体は、ＥＬＩＳＡアッセイによって求められるようなＥＣ５０が、ｇ１  ＩＬ−２０および／またはｇ２  ＩＬ−２０については約１００ｎｇ／ｍｌ未満であり、好ましくは５０ｎｇ／ｍｌ未満であり、最も好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ未満である。実施例２および図３を参照のこと。加えて、または、代替において、本発明の抗ＩＬ−２０抗体、ＩＬ−２０結合断片、あるいはそれらの合成または生物工学的変異体は、ＫＺ１３６−ＮＬｕｃレポータアッセイによって求められるようなＩＣ５０が、ｒｈＩＬ−２０については約１０００ｎｇ／ｍｌ未満であり、好ましくは５００ｎｇ／ｍｌ未満である。実施例３および実施例４を参照のこと、また、図５Ｆに示される。本発明の抗体の結合親和性に関してより詳しくは、例えば、さらには下記の節「結合特徴」を参照のこと。
【００９６】
治療的適用のために特に有用である抗体を提供するために、すなわち、外来抗体（例えば、ヒトにおけるマウス抗体など）について認められるような本発明の抗体に対する免疫学的応答（ＨＡＭＭ応答）を回避するために、本発明は好ましくは、完全なヒト抗体またはヒト由来の抗体に関連する。なぜならば、例示的な抗ＩＬ−２０抗体が、本発明を例示する実施例において記載されるが、これらは、ヒト患者に由来するものであるからである。
【００９７】
これに関連して、ヒト化抗体および他の場合にはヒト様抗体に反して、下記の議論もまた参照のこと。本発明のヒト由来抗体は、ヒト身体によって認められているＣＤＲを含むことによって特徴づけられ、したがって、免疫原性である危険性を実質的に有していない。したがって、本発明の抗体は、抗体の可変軽鎖および可変重鎖の一方または両方の少なくとも１つのＣＤＲ、好ましくは２つのＣＤＲ、最も好ましくは３つすべてのＣＤＲが、本明細書中に例示されるヒト抗体に由来するならば、依然として、ヒト由来であると示される場合がある。
【００９８】
本発明のヒト由来抗体はまた、そのような抗体が、実際に被験体によって最初に発現されたものであり、例えば、ヒト免疫グロブリンを発現するファージライブラリによって生じるインビトロ選択された構築物、または、ヒト免疫グロブリンレパートリーの一部を発現するトランスジェニック動物において生じる異種抗体でないことを強調するために、「ヒト自己抗体」と呼ばれる場合がある（なお、それらはこれまで、ヒト様抗体を提供するために試みるための最も一般的な方法を表していた）。他方で、本発明のヒト由来抗体は、プロテインＡカラムまたは親和性カラムによって精製される場合があるヒト血清抗体そのものから区別するために、合成（的）、組換え（型）および／または生物工学的（的）であると示される場合がある。
【００９９】
しかしながら、本発明では、本発明の抗体のさらなる研究が動物モデルにおいて、例えば、ヒトＩＬ−２０を発現するトランスジェニックマウスにおいて使用され、また、想定される。ヒトにおけるＨＡＭＡ応答と類似した実験動物における免疫原性影響を避けるために、１つの局面において、本発明の抗体は、ヒト化抗体、異種抗体またはヒト−マウスのキメラ抗体、好ましくは齧歯類−ヒトのキメラ抗体または齧歯類化抗体、最も好ましくはマウス−ヒトのキメラ抗体またはマウス化抗体である場合がある。
【０１００】
１つの実施形態において、本発明の抗ＩＬ−２０抗体またはＩＬ−２０結合分子は、図１に示されるようなＶＨ領域および／またはＶＬ領域のアミノ酸配列、あるいは、表１に示されるような対応する核酸によってコードされるようなＶＨ領域および／またはＶＬ領域のアミノ酸配列を含む。加えて、別の実施形態において、本発明は、ヒトＩＬ−２０に対する特異的結合について、本明細書中上記で定義されるような本発明の抗体と競合する抗ＩＬ−２０抗体またはＩＬ−２０結合分子に関連する。実施例６および実施例７、ならびに、図９〜図１０を参照のこと。具体的には、実施例および図において例示される抗体について概説されるような免疫学的結合特徴および／または生物学的性質を明らかにする抗ＩＬ−２０抗体が提供される。存在する場合、抗原との抗体の用語「免疫学的結合特徴」または他の結合特徴はその文法的形態のすべてで、抗体の特異性、親和性、交差反応性および他の結合特徴を示す。
【０１０１】
さらなる実施形態において、本発明の抗ＩＬ−２０抗体は抗体断片である。例えば、本発明の抗体または抗体断片は、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆ（ａｂ）断片、Ｆ（ａｂ’）２断片および単一ドメイン抗体断片（ｓｄＡＢ）からなる群から選ばれる場合がある。
【０１０２】
本発明の抗体のさらなる利点が、体液性免疫応答がその生理学的環境および細胞環境においてネイティブ抗原に対して誘発されているという事実のために、典型的には、当該抗原の立体配座エピトープを、例えば、他の細胞成分を伴う状況でのその提示、細胞表面膜におけるその提示、および／または、受容体に対するその結合に起因して認識する自己抗体が産生され、かつ、この自己抗体を単離することができることである。対照的に、モノクローナル抗体（例えば、マウスのモノクローナル体など）、そのヒト化型、または、ファージディスプレイから得られる抗体を作製する従来の方法では典型的に、標的タンパク質の抗原性断片が、非ヒト哺乳動物を免疫化することおよび検出のためにそれぞれ用いられ、このときには通常、ネイティブタンパク質の存在をその生理学的状況および細胞状況において認識するのではなく、むしろ、免疫原の二次元構造に限定される線状エピトープまたは立体配座エピトープを認識する抗体が得られる。それによれば、本発明の自己抗体がそのエピトープ特異性の面で独特であると予想することは慎重なことである。したがって、本発明はまた、本発明の方法に従って単離される自己抗体と実質的に同じ結合特異性を示す抗体および同様な結合分子に関連する。そのような抗体は、例えば、競合的ＥＬＩＳＡによって、または、より適切には、細胞に基づいた中和アッセイによって、本発明の自己抗体およびそのモノクローナル誘導体を参照抗体としてそれぞれ使用して容易に試験することができ、また、実施例に記載されるか、または、そうでない場合には当業者に知られている免疫学的試験によって容易に試験することができる。
【０１０３】
本発明では、その可変領域において、すなわち、結合ドメインにおいて、（ＶＨ）（配列番号２、配列番号１０、配列番号１８および配列番号２６）および（ＶＬ）（配列番号４、配列番号１２、配列番号２０および配列番号２８）の図１に示されるアミノ酸配列を含む可変領域のＶＨおよび／またはＶＬの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むことによって概して特徴づけられることがあるＩＬ−２０結合分子、すなわち、抗体およびその結合断片が例示される−図１において下線が引かれ、表１において特定される例示的なＣＤＲ配列を参照のこと。しかしながら、下記で議論されるように、当業者は、加えて、または、代替として、図１に示されるアミノ酸配列から、特にＣＤＲ２およびＣＤＲ３の場合には１つ、２つ、３つ、または、それどころか、それ以上のアミノ酸置換によってそれらのアミノ酸配列が異なる様々なＣＤＲが使用されてもよいという事実を十分に承知している。
【０１０４】
本発明の抗体についてさらに明らかにされているように、本発明の様々な抗体はそれらの標的タンパク質の生物学的活性を中和することができる。例えば、実施例３および図４、図５、図６、図７Ｅ、図７Ｆ、ならびに、実施例７および図１１において記載されるＳＴＡＴ３阻害アッセイおよび耳炎症アッセイの結果を参照のこと。これに関連して、用語「中和（する）」は、本発明の抗ＩＬ−２０抗体またはそのＩＬ−２０結合断片が、生化学的な細胞型アッセイまたはインビボアッセイにおけるその標的タンパク質の生物学的活性を、それぞれのアッセイを本発明の主題抗体の存在下で行うことによって評価され得るように妨害することができることを意味し、ただし、この場合、本発明の抗体が存在しないときの当該タンパク質の生物学的活性と比較して、また、標的タンパク質の生物学的活性を本質的に影響されないままにしておくことが知られている化合物（例えば、コントロール抗体）の存在下での当該タンパク質の生物学的活性と比較して、標的タンパク質の生物学的活性は、アッセイに供される本発明の抗体のレベルを増大させるのと同時に低下する。そのような生化学的なインビトロ型アッセイおよびインビボ型アッセイはまた、例えば、本発明の抗ＩＬ−２０抗体について示されているような標的タンパク質の生化学的活性を中和できることが知られている参照抗体を使用して、また、候補抗体を試験サンプルに供して行うことができ、ただし、この場合、参照抗体および候補抗体の組み合わされた活性から生じる付加的な中和活性が認められる場合があり、または、どちらかの抗体を標識することによって明らかにされることがある候補抗体および参照抗体の競合が認められる。したがって、本発明の好ましい実施形態において、本発明の抗ＩＬ−２０抗体、ＩＬ−２０結合断片、あるいはそれらの合成または生物工学的変異体は、その抗原の生物学的活性を中和することができる。中和作用は、例えば、ＩＬ−２０活性を低下させる量の観点から、または、そのような低下を本発明のＩＬ−２０結合分子の導入の後で認めることができる時間によって、または、当然のことではあるが、両者の組み合わされた観点から評価される場合がある。
【０１０５】
本発明の抗ＩＬ−２０抗体、ＩＬ−２０結合断片、それらの合成または生物工学的変異体、ならびに以下で更に説明される免疫複合体が、以下で詳述するように、例えば、宿主細胞における発現またはインビトロ無細胞翻訳系における発現によって提供される場合がある。ペプチド、ポリペプチドまたは融合タンパク質を宿主細胞において発現させるために、前記抗ＩＬ−２０抗体、ＩＬ−２０結合断片、その合成または生物工学的変異体、免疫複合体をコードする核酸分子が、適切な発現ベクターに、すなわち、挿入されたコード配列の転写および翻訳のための必要なエレメントを含有するベクターに挿入される場合がある。当業者によく知られている様々な方法が、目的とするポリペプチドをコードする配列ならびに適切な転写制御エレメントおよび翻訳制御エレメントを含有する発現ベクターを構築するために使用される場合がある。これらの方法には、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術およびインビボ遺伝子組換えが含まれる。そのような技術が、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８９）、および、Ａｕｓｕｂｅｌ他、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８９）に記載される；さらには下記の「ポリヌクレオチド」および「発現」のセクション、ならびに、この点についてのさらなる詳細については実施例のセクションで引用される参考文献を参照のこと。
【０１０６】
生成物の発現のための好適な宿主細胞は、どのような原核生物細胞または真核生物細胞であってもよい；例えば、細菌細胞（例えば、大腸菌または枯草菌など）、昆虫細胞（バキュロウイルス）、酵母細胞、植物細胞または動物細胞。しかしながら、効率的なプロセッシングのためには、哺乳動物細胞が好ましい。この目的のために有用である典型的な哺乳動物細胞株には、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞およびＮＳＯ細胞が含まれる。
【０１０７】
本発明の単離された抗体は、当然のことながら、そのようなものとして、患者に適用され得るのではなく、通常の場合には、例えば、患者におけるその安定性、受容性および生物学的利用能を保証するために薬学的に配合されなければならない。したがって、１つの実施形態において、前記抗ＩＬ−２０抗体、ＩＬ−２０結合断片、その合成または生物工学的変異体、ならびに免疫複合体を薬学的に許容され得る担体と混合する工程をさらに含む本発明の方法が提供される。薬学的に許容され得る担体がさらに下記において詳しく記載される。
【０１０８】
本発明はまた、本発明の抗体または抗原結合断片の免疫グロブリン鎖の可変領域を少なくともコードするポリヌクレオチドに関連する。好ましくは、前記可変領域は、図１に示されるような可変領域のＶＨおよび／またはＶＬの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【０１０９】
導出されたまたは同等の配列の場合、前記配列は、少なくとも６０％の同一性、より好ましくは（次の順で）少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、最も好ましくは９５％、少なくとも９６％〜９９％、または、さらには、１００％の同一性を、上記で言及され、また、配列表において特定されるそのような配列からなる群の配列に対して示す。２つの配列の間におけるパーセント同一性は、ギャップの数を考慮に入れた場合のこれらの配列によって共有される同一位置の数、および、それぞれのギャップの長さの関数であり、この場合、ギャップは、２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要がある。配列の比較および２つの配列の間におけるパーセント同一性の決定を、当業者にはよく知られている数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。本明細書中で言及される同一性は、本明細書中下記でさらに言及されるようなＢＬＡＳＴプログラムを使用して決定されなければならない。
【０１１０】
上記で述べられるように、好ましい実施形態において、本発明は、実質的に完全なヒト抗体に関連し、好ましくは、定常重鎖Ｉ（ＣＨ１）と定常領域の対応する軽鎖とを少なくとも含むＩｇＧ、すなわち、γ−１、γ−２、γ−３またはγ−４をラムダまたはカッパとの組合せで含むＩｇＧに関連する。特に好ましい実施形態において、実施例において例示される本件抗体について単離されるそのような定常領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列が、下記の表１において、また、ヌクレオチド配列に関しては配列番号５、配列番号７、配列番号１３、配列番号１５、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２９、および配列番号３１において、ならびに／あるいは、アミノ酸配列に関しては配列番号６、配列番号８、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２２、配列番号２４、配列番号３０および配列番号３２において、または、前記で示されるこれらに対して少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列において示されるように使用される。
【０１１１】
上記によれば、１つの実施形態において、本発明はまた、本発明の抗体または抗原結合断片の１つの免疫グロブリン鎖の可変領域を少なくともコードするポリヌクレオチドを提供する。典型的には、このポリヌクレオチドによってコードされる前記可変領域は、前記抗体の可変領域のＶＨおよび／またはＶＬの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。抗体の可変領域および定常領域が下記の節「ＩｇＧ構造」においてより詳しく記載される。本発明の好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは、下記の表１に示されるような本発明の抗体のＶＨ領域またはＶＬ領域をコードするポリヌクレオチド配列を有する核酸を含むか、あるいは、そのような核酸から本質的になるか、あるいは、そのような核酸からなる。この点に関して、当業者は、軽鎖および／または重鎖の可変ドメインを少なくともコードするポリヌクレオチドが様々な免疫グロブリン鎖またはそれらの１つのみのどちらかの可変ドメインをコードし得ることを容易に理解するであろう。好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは、本明細書中上記で定義されるような抗ＩＬ−２０抗体またはそのＩＬ−２０結合断片をコードする。
【０１１２】
表１：本発明のＩｇＧ４型かつラムダ型のＩＬ−２０特異的な２０Ａ１０抗体、本発明のＩｇＧ１型かつラムダ型のＩＬ−２０特異的な２Ａ１１抗体、７Ｄ１抗体および  ６Ｅ１１抗体の可変領域および定常領域（ＶＨ、ＶＬ、ＣＨ、ＣＬ）領域のヌクレオチド配列、ならびに本発明において用いられるＩｇＧ１型かつカッパ型のＩＦＮ−α／ω特異的な２６Ｂ９抗体、３１Ｂ４抗体、８Ｈ１抗体および１９Ｄ１１抗体の可変領域および定常領域（ＶＨ、ＶＬ、ＣＨ、ＣＬ）領域のヌクレオチド配列。下線が引かれた太字のヌクレオチドまたはアミノ酸により、可変鎖配列におけるＣＤＲコード領域が示される。下線が引かれた斜体字のヌクレオチドまたはアミノ酸により、配列決定がなされていないが、データベースから得られている配列が示される。定常鎖において、そのような１５領域がデータベースにおける該当するヒト生殖系列可変領域配列とアライメントされ、それらと一致させられる；例えば、ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国）によって管理されるＶｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ）を参照のこと。
【表１−１】
2017527262.tif 000002
【表１−２】
2017527262.tif 000003
【表１−３】
2017527262.tif 000004
【表１−４】
2017527262.tif 000005
【表１−５】
2017527262.tif 000006
【表１−６】
2017527262.tif 000007
【表１−７】
2017527262.tif 000008
【表１−８】
2017527262.tif 000009
【０１１３】
当業者は、上記可変ドメインを有する抗体の可変ドメインが、所望される特異性および生物学的機能の他のポリペプチドまたは抗体を構築するために使用され得ることを容易に理解するであろう。したがって、本発明はまた、上記で記載された可変ドメインの少なくとも１つのＣＤＲを含み、かつ、好都合には、添付された実施例において記載される抗ＩＬ−２０抗体のいずれかと実質的に同じ結合特性または類似する結合特性を有するポリペプチドおよび抗体を包含する。当業者は、本明細書中に記載される可変ドメインまたはＣＤＲを使用して、様々な抗体が、この技術分野において知られている方法に従って、例えば、欧州特許出願ＥＰ０４５１２１６Ａ１および同ＥＰ０５４９５８１Ａ１に記載されるように構築され得ることを容易に理解するであろう。
【０１１４】
さらに、当業者は、結合親和性が、アミノ酸置換をＣＤＲ内において、または、Ｋａｂａｔによって定義されるようなＣＤＲと部分的に重なる超可変ループ（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６（１９８７）、９０１〜９１７）の内部において行うことによって強化されることがあることを知っている。したがって、本発明はまた、述べられたＣＤＲの１つまたは複数が１つまたは複数のアミノ酸置換を含み、好ましくは２つ以下のアミノ酸置換を含む抗体に関連する。好ましくは、本発明の抗体は、その免疫グロブリン鎖の一方または両方において、ＶＨ領域については配列番号２、配列番号１０および配列番号２６に示されるような可変領域、ならびに、ＶＬ領域については配列番号４、配列番号１２、配列番号２０および配列番号２８に示されるような可変領域、あるいは、図１に示されるような可変領域の２つのＣＤＲまたは３つすべてのＣＤＲを含む。
【０１１５】
好ましくは、１つまたは複数のアミノ酸変化（例えば、置換）を有する述べられたＣＤＲのいずれか１つを含む抗体またはそのＩＬ−２０結合断片、あるいはそれらの生物工学的誘導体は、実施例において例示される抗体のいずれか１つの結合特徴を示す。特に好ましい実施形態において、そのような抗体またはそのＩＬ−２０結合断片あるいはそれらの生物工学的誘導体は、アミノ酸配列１０１−ＰＤＨＹＴＬＲＫＩＳＳＬＡＮＳＦＬＴ−１１８（配列番号６９）またはアミノ酸配列１０２−ＤＨＹＴＬＲＫＩＳＳＬＡＮＳＦ−１１６（配列番号７０）および／またはアミノ酸配列１０１−ＰＤＨＹＴＬＲＫＩＳＳＬＡＮＳＦＬ−１１７（配列番号７２）からなるＩＬ−２０由来ペプチドを認識し、ただし、前記配列において、Ｐ１０１、Ｉ１０９、Ｓ１１０および／またはＬ１１７のみが別のアミノ酸によって置換されることがあり、好ましくはアラニンによって置換されることがあり、その一方で、Ｔ１１８を除く他のアミノ酸位置は変わらない。実施例１０ならびに図１３Ｄおよび図１３Ｅもまた参照のこと。したがって、この実施形態では、抗体はまた、欠けているＳ１１５およびＦ１１６を考慮すると、アミノ酸配列９７−ＮＹＱＴＰＤＨＹＴＬＲＫＩＳＳＬＡＮ−１１４（配列番号７１）からなるペプチドを認識しない、または実質的に認識しない。加えて、実施例１０および図１３Ｃにおいて例示されるように、そのような抗体またはそのＩＬ−２０結合断片、あるいはそれらの生物工学的誘導体は好ましくは、マウスＩＬ−２０に由来する対応した１８ｍｅｒペプチドとは結合せず、好ましくは、その一方で、全長型のヒトＩＬ−２０およびマウスＩＬ−２０とは結合することができる。これに関連して、本発明の抗体またはそのＩＬ−２０結合断片、あるいはそれらの生物工学的誘導体の述べられた結合特徴を明らかにすることが好ましくは、添付された実施例に記載されるように行われること、例えば、実施例１０に記載され、また、図１０に示されるようなマイクロアレイで行われることが理解される。
【０１１６】
上記抗体をコードする本発明のポリヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡまたは合成的に生産されたＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはそれらのポリヌクレオチドのいずれかを単独でまたは組み合わせて含む組換え的に生産されたキメラ核酸分子であり得る。好ましい実施形態では、場合により、前記抗体の他方の免疫グロブリン鎖の可変領域をコードする前記ポリヌクレオチドと組み合わせて、上記ポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。このようなベクターは、適切な宿主細胞中、適切な条件下で前記ベクターの選択を可能にするマーカー遺伝子などのさらなる遺伝子を含み得る。
【０１１７】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、原核細胞または真核細胞における発現を可能にする発現制御配列に機能的に連結される。前記ポリヌクレオチドの発現は、翻訳可能なｍＲＮＡへのポリヌクレオチドの転写を含む。真核細胞、好ましくは、哺乳動物細胞における発現を確実にする調節要素は、当業者に周知である。それらは、通常、転写開始を確実にする調節配列と、場合により、転写終止および転写産物の安定化を確実にするポリＡシグナルとを含む。さらなる調節要素は、転写および翻訳エンハンサ、ならびに／または本来的に結合しているプロモータ領域もしくは異種プロモータ領域を含み得る。
【０１１８】
これに関して、当業者であれば、軽鎖および／または重鎖の少なくとも可変ドメインをコードするポリヌクレオチドは、両方の免疫グロブリン鎖または一方の鎖のみの可変ドメインをコードし得ることを容易に認識するであろう。
【０１１９】
同様に、前記ポリヌクレオチドは同じプロモータの制御下にあってもよいし、または別個に発現制御されてもよい。原核生物宿主細胞における発現を可能にする有望な調節要素は、例えば、大腸菌の場合にはＰＬ、ｌａｃ、ｔｒｐまたはｔａｃプロモータを含み、真核生物宿主細胞における発現を可能にする調節要素の例は、酵母の場合にはＡＯＸ１またはＧＡＬ１プロモータ、または哺乳動物および他の動物細胞の場合にはＣＭＶ−、ＳＶ４０−、ＲＳＶ−プロモータ、ＣＭＶ−エンハンサ、ＳＶ４０−エンハンサまたはグロビンイントロンである。
【０１２０】
転写開始に関与する要素に加えて、このような調節要素は、ポリヌクレオチドの下流に、ＳＶ４０−ポリＡ部位またはｔｋ−ポリＡ部位などの転写終止シグナルも含み得る。さらに、使用される発現系に応じて、ポリペプチドを細胞区画に方向付けるかまたはそれを培地に分泌させることができるリーダ配列を本発明のポリヌクレオチドのコード配列に付加することができ、当技術分野において周知である。リーダ配列は、翻訳、開始および終止配列と適切な段階で会合し、好ましくは、リーダ配列は、翻訳されたタンパク質またはその一部を周辺腔または細胞外培地に分泌させることができる。場合により、異種配列は、所望の特徴、例えば、発現された組換え産物の安定化または簡単な精製を付与するＣ末端またはＮ末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードし得る。本文脈では、Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ  ｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＶ１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＣＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはｐＳＰＯＲＴ１（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）などの適切な発現ベクターが当技術分野において公知である。
【０１２１】
好ましくは、発現制御配列は、真核生物宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトすることができるベクター中の真核生物プロモータ系であるが、原核生物宿主用の制御配列も使用し得る。ベクターが適切な宿主に組み込まれたら、ヌクレオチド配列の高レベルの発現に適切な条件下で宿主を維持し、所望により、免疫グロブリン軽鎖、重鎖、軽鎖／重鎖二量体またはインタクトな抗体、結合断片または他の免疫グロブリン形態を回収および精製する；Ｂｅｙｃｈｏｋ，Ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，（１９７９）を参照のこと。
【０１２２】
さらに、本発明は、場合により、本発明の抗体の他方の免疫グロブリン鎖の可変ドメインをコードする本発明のポリヌクレオチドと組み合わせて、抗原または好ましくは本発明の抗体の免疫グロブリン鎖の可変ドメインをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子工学で通常使用されるベクター、特にプラスミド、コスミド、ウイルスおよびバクテリオファージに関する。好ましくは、前記ベクターは、発現ベクターおよび／または遺伝子導入もしくは標的化ベクターである。
【０１２３】
レトルウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルスまたはウシ乳頭腫ウイルスなどのウイルス由来の発現ベクターを、標的細胞集団への本発明のポリヌクレオチドまたはベクターの送達に使用することができる。組換えウイルスベクターを構築するために、当業者に周知の方法を使用することができる；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）Ｎ．Ｙ．およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９９４）に記載されている技術を参照のこと。あるいは、標的細胞への送達のために、本発明のポリヌクレオチドおよびベクターをリポソームに再構成することができる。本発明のポリヌクレオチドを含有するベクター（例えば、免疫グロブリン鎖の重および／または軽可変ドメインをコードする配列および発現制御配列）を、周知方法（これは、細胞宿主の種類に応じて変化する）によって宿主細胞に導入することができる。例えば、原核細胞の場合には塩化カルシウムトランスフェクションが一般的に用いられるのに対して、他の細胞宿主の形質転換の場合にはリン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションが使用され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記を参照のこと）。
【０１２４】
上記に関して、本発明はさらに、前記ポリヌクレオチドまたはベクターを含む宿主細胞に関する。前記宿主細胞は、原核細胞または真核細胞であり得る。宿主細胞中に存在する本発明のポリヌクレオチドまたはベクターは、宿主細胞のゲノムに組み込まれ得るか、または染色体外で維持され得る。宿主細胞は、細菌、昆虫、真菌、植物、動物またはヒト細胞などの任意の原核細胞または真核細胞であり得る；本発明の抗体を生産するのに適切な宿主細胞および方法は、以下のセクション「宿主細胞」により詳細に記載されている。
【０１２５】
上述の宿主細胞を使用して、本発明の抗体を、例えば、薬学的使用のために、または、治療的介入のための標的として産生させ、また調製することが可能である。したがって、１つの実施形態において、抗ＩＬ−２０抗体またはそのＩＬ−２０結合断片を調製するための方法であって、下記の工程を含む方法を提供することもまた、本発明の目的である：
（ａ）本明細書中上記で定義されるような細胞を培養する工程；および
（ｂ）前記抗体またはそのＩＬ−２０結合断片を培養物から単離する工程。
【０１２６】
したがって、本発明は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる、あるいは、抗ＩＬ−２０抗体またはその免疫グロブリン鎖を調製するための上述の方法によって得ることができる組換え抗体、好ましくはヒト由来抗ＩＬ−２０抗体およびそのＩＬ−２０結合断片、その免疫グロブリン鎖に関連する。
【０１２７】
抗体およびその模倣体の組換え産生のための様々な手段および方法、ならびに、競合する結合分子（これは抗体である場合があり、または、抗体でない場合がある）についてスクリーニングする様々な方法がこの技術分野において知られている。しかしながら、本明細書中に記載されるように、特にヒトにおける治療的適用に関しては、本発明の抗体は、前記抗体の適用が、キメラ抗体について、また、さらには、ヒト化抗体について他の場合には認められるそのような抗体に対する免疫応答を実質的に有していないという意味で、ヒト抗体である。
【０１２８】
抗ＩＬ−２０抗体、ＩＬ−２０結合断片、あるいはそれらの合成または生物工学的変異体は、治療剤として直接に使用される場合がある。しかしながら、１つの実施形態において、本発明によって提供される抗ＩＬ−２０抗体、ＩＬ−２０結合断片、あるいはそれらの合成または生物工学的変異体は、検出可能に標識され、または薬物に結合させられ、ただし、この場合、好ましくは、検出可能な標識が、例えば、酵素、放射性同位体、蛍光団、ペプチドおよび重金属からなる群から選択される。治療剤または検出可能な標識をそれぞれ含む抗体または他の場合には免疫グロブリン成分、および、治療剤または検出可能な標識にそれぞれコンジュゲート化される抗体または他の場合には免疫グロブリン成分はまた、「免疫コンジュゲート」と呼ばれる。
【０１２９】
したがって、さらなる実施形態において、本発明は、本発明のヒト由来モノクローナル抗ヒトＩＬ−２０抗体またはその述べられた誘導体を含む免疫コンジュゲートであって、好ましくは、機能的部分（例えば、放射性核種、酵素、基質、補因子、蛍光性マーカー、化学発光マーカー、ペプチドタグ、重金属、磁気粒子、薬物または毒素など）を含む免疫コンジュゲートに関連する。１つの実施形態において、本発明の免疫コンジュゲートは、例えば、ヒト身体における抗体の半減期および生物学的利用能を改善するためにペグ化される。免疫コンジュゲートの調製、ならびに、適切な検出可能な標識、薬物および毒素がこの技術分野では知られており、例えば、国際出願公開ＷＯ２００５／０５２０００に記載される。
【０１３０】
標識された本発明の抗体または抗原結合断片は、「免疫化学／免疫標識」のようなインビトロアッセイを含め、インビボまたはインビトロで特定の標的を検出するのに使用することができる。インビボにおいて、それらは、目的の抗原を発現する組織、細胞または他の物質を検出するために、核医学イメージング技術と同様の方法で使用することができる。標識、それらの診断での使用、およびそれらと本発明の結合分子とのカップリングは、さらに以下のセクション「標識および診断」により詳細に記載されている。
【０１３１】
本発明において特定されるＩＬ−２０特異的抗体は、罹患個体の免疫系（例えば、ＡＰＥＣＥＤ患者において認められる症状に関連する免疫系）を重度に損なうことに関与する場合がある。したがって、自己免疫性障害に罹患する被験体の病理学的反応を、自己抗体の数および／またはその影響を罹患したヒト患者または動物において最小限に抑えるための手段および対策を提供することによって消滅させること、または少なくとも緩和することが、本発明のさらなる局面である。したがって、１つの実施形態において、本発明はまた、本発明の自己抗体によって特異的に認識されるエピトープを含むペプチドまたはペプチド型化合物に関連する。競合的抗原の適用による場合と同様な効果で、それにより、様々な自己抗体がそれらのそれぞれの標的に結合しないようにすること、また、様々な自己抗体がそれらのそれぞれの標的に結合することを妨げることが、さらに下記で詳しく記載されるように抗イディオタイプ抗体によって得られる場合がある。したがって、１つの実施形態において、本発明はまた、本発明の自己抗体の抗イディオタイプ抗体を提供する。
【０１３２】
既に上述したように、本発明はまた、上記に定義された障害（すなわち、自己寛容の発生障害または無秩序な発生に関連する障害）の処置に使用するための、本発明の抗イディオタイプ抗体またはペプチドもしくはペプチド系化合物に関する。これらの単離された本発明の抗体またはその断片は、モノクローナル抗イディオタイプのパネルを作製するために免疫原として使用することができる。抗イディオタイプ抗体を作製するのに適切な方法については、Ｒａｙｃｈａｄｈｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７（１９８６），１７４３を参照し、Ｔ細胞については、Ｅｒｔｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５９（１９８５），１７７６を参照のこと。Ｒａｙｃｈａｕｄｈｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７（１９８６），１７４３によって詳細に記載されているように、当技術分野においてルーチンに実施される標準的なアッセイを使用すれば、抗イディオタイプ抗体は、内部イメージおよび非内部イメージイディオトープの表示を特徴とするであろう。抗イディオタイプ抗体が、それが結合するかまたは結合される抗体の抗原を構造的に模倣する場合、その抗原の「内部イメージ」と称される。
【０１３３】
自己免疫性疾患関連自己抗体（複数の自己抗体）のイディオタイプを模倣する分子を提供する方法は、当技術分野において説明されている；例えば、国際公開第０３／０９９８６８号（この開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。例えば、このような方法は、以下の工程：（ａ）本発明の方法にしたがって自己抗体を提供すること；（ｂ）該自己抗体を固相に結合してアフィニティマトリックスを形成すること；（ｃ）免疫グロブリンを含むプールした血漿もしくはＢ細胞を該アフィニティマトリックスと接触させ、次いで未結合の血漿成分を除去すること；（ｄ）自己抗体に対する抗イディオタイプ抗体（抗Ｉｄ）である結合した免疫グロブリンをマトリックスから溶出すること；（ｅ）複数の分子メンバーを含む分子ライブラリを提供すること；ならびに（ｅ）該抗Ｉｄを該分子ライブラリと接触させ、該抗Ｉｄが結合した結合分子を単離すること（該結合分子は、自己抗体のイディオタイプを模倣する分子である）を含み得る。自己抗体を単離する方法は、国際公開第２０１０／１３６１９６号（この開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる）に開示されており、自己免疫性疾患および免疫系障害を処置するための、正常ヒト血清（ＮＨＳ）から単離された天然ポリクローナルＩｇＧ反応性抗体（Ａｂ）を含有する免疫グロブリン調製物が記載されている。ＩｇＧ反応性Ａｂは、抗原結合部位内またはその付近（例えば、オーバーラップしている）のいずれかに位置するそれらの抗原決定基に結合することよって、自己免疫性疾患を患っている患者の血清中に存在する疾患関連または病原性自己抗体を強力に中和する。
【０１３４】
本発明はまた、上述の抗ＩＬ−２０抗体、ＩＬ−２０結合断片、それらの合成または生物工学的変異体、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、細胞、ペプチドまたはペプチド型化合物、ならびに／あるいは、組合せで本発明の抗ＩＬ−２０抗体またはそのＩＬ−２０結合断片の特徴を示す抗ＩＬ−２０抗体またはそのＩＬ−２０結合断片のカクテルのうちのいずれか１つを含む組成物に関連する。加えて、または、代替として、１つの実施形態において、本発明の組成物またはキットは本発明の抗イディオタイプ抗体を含む。１つの実施形態において、組成物は医薬組成物であり、かつ、薬学的に許容され得る担体をさらに含む。薬学的に許容され得る担体、投与経路および投薬計画は、当業者に知られている対応する文献から採用することができ、さらには下記の「薬学的担体」および「投薬計画」のセクションにおいてもより詳しく記載される。
【０１３５】
加えて、本発明は、抗ＩＬ−２０モノクローナル抗体、ＩＬ−２０結合断片、あるいはそれらの生物工学的誘導体を含む組成物を製造するためのプロセスに関連し、ただし、この場合、その製造は、当該抗体、ＩＬ−２０結合断片、あるいはそれらの生物工学的誘導体を、当該抗体、ＩＬ−２０結合断片、あるいはそれらの生物工学的誘導体をコードする形質転換用ＤＮＡの組換え宿主生物における発現によって調製する工程を含む。１つの実施形態において、組成物は医薬組成物であり、ただし、この場合、抗体、ＩＬ−２０結合断片、あるいはそれらの生物工学的誘導体を調製する工程の後には、必要な場合には間における１つまたは複数の工程の後で、抗体、ＩＬ−２０結合断片、あるいはそれらの生物工学的誘導体を医薬組成物の製造において薬学的に許容され得る担体と混合することが続く。例えば、医薬組成物に製剤する前に、抗体またはそのＩＬ−２０結合断片が細胞培養物から医薬用グレードに精製される場合があり、かつ／または、誘導体化され、例えば、ペグ化され、または、診断用標識もしくは薬物にコンジュゲート化され、その結果、医薬組成物を得るようにされる場合がある。
【０１３６】
生化学的アッセイおよび細胞型インビトロアッセイのほかに、本発明の抗体の治療的有用性は、適切な動物モデルにおいて、例えば、ＲＡ、乾癬、ＳＬＥまたはＴ１ＤＭなどについての動物モデルにおいて確認することができる。下記の実施例において詳しく説明される。
【０１３７】
一実施形態では、医薬組成物は、好ましくは、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、コルチコステロイド、抗ヒスタミンおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される、炎症または自己免疫性障害を処置するのに有用なさらなる薬剤をさらに含む。加えてまたはあるいは、さらなる実施形態では、医薬組成物は、免疫抑制薬および抗炎症または「抗リウマチ」薬からなる群より選択される、炎症関連疾患を処置するのに有用なさらなる薬剤をさらに含む。
【０１３８】
別の実施形態では、組成物は診断組成物又はキットであり、免疫診断法または核酸ベースの診断法に通常使用される試薬をさらに含む。
【０１３９】
さらに、本発明は、下記の方法において使用されるための上述の抗ＩＬ−２０抗体、ＩＬ−２０結合断片、それらの合成または生物工学的変異体、あるいは、上記で定義されるような組成物を提供する：
（ａ）免疫媒介もしくは自己免疫性の疾患もしくは状態を処置するか、または、免疫媒介もしくは自己免疫性の疾患もしくは状態の進行を妨げる方法；
（ｂ）免疫媒介もしくは自己免疫性の疾患もしくは状態に伴う症状を改善する方法；ならびに／あるいは
（ｃ）免疫媒介もしくは自己免疫性の疾患もしくは状態の存在について、または、該疾患もしくは状態を発症する被験体の危険性を明らかにするため、に被験体を診断するか、またはスクリーニングする方法；ただし、前記疾患または状態は患者におけるＩＬ−２０の発現、ＩＬ−２０の上昇したおよび／または有害な活性、に伴うおよび／または引き起こされる。
【０１４０】
上記で示されるように、それらの結合特異性のために、本発明のＩＬ−２０結合分子（例えば、抗体およびその断片など）は好ましくは、ＩＬ−２０の発現、ＩＬ−２０の上昇したおよび／または有害な活性、に伴うおよび／または引き起こされる免疫媒介または自己免疫性の障害または状態の処置、改善、診断および／またはスクリーニングの上記で規定される方法において使用される場合がある。
【０１４１】
例えば、発現、上昇したＩＬ−２０活性および／または有害なＩＬ−２０活性が、関節リウマチ（ＲＡ）滑膜組織生検物、乾癬皮膚病変部および強直性脊椎炎（ＡＳ）において認められており、この場合、ＩＬ−２０発現のレベルが炎症の重篤度との正の相関関係を有していた（Ｋｒａｇｓｔｒｕｐ他、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ４１（２００８）、１６〜２３；Ｂｌｕｍｂｅｒｇ他、Ｃｅｌｌ  １０４（２００１）、９〜１９；Ｔｏｙｈａｍａ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３９（２００９）、２７７９〜８８、上掲）。関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬および強直性脊椎炎（ＡＳ）のほかに、ＩＬ−２０が、例えば、下記のいくつかの他の障害と機能的に関連することが見出された：アテローム性動脈硬化（Ｃｈｅｎ他、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２６（２００６）、２０９０〜２０９５、上掲）、急性腎不全（Ｌｉ他、Ｇｅｎｅｓ  Ｉｍｍｕｎ．９（２００８）、３９５〜４０４、上掲）、潰瘍性大腸炎（Ｆｏｎｓｅｃａ−Ｃａｍａｒｉｌｌｏ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３（２０１３）、６４０〜８、上掲）、虚血性発作（ＣｈｅｎおよびＣｈａｎｇ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８２（２００９）、５００３〜１２、上掲）、ならびに、骨減少症および骨粗鬆症（Ｈｓｕ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０８（２０１１）、１８４９〜１８６１、上掲）。
【０１４２】
また、ＩＬ−２０の増大した転写が、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）ガンにおいて（Ｂａｉｒｄ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４７（２０１１）、１９０８〜１８、上掲）、また、筋浸潤性膀胱ガンにおいて認められている（Ｌｅｅ他、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ７（２０１２）、ｅ４０２６７、上掲）。ＩＬ−２０およびその受容体サブユニットの発現が、臨床口腔腫瘍組織では乳ガン組織と同様に、非腫瘍組織よりも大きかった（Ｈｓｕ他、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１０（２０１２）、１４０３〜９；Ｈｓｕ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８８（２０１２）、１９８１〜９１、すべて上掲）。
【０１４３】
したがって、１つの実施形態において、上述の方法において使用されるための本明細書中上記で定義されるような抗ＩＬ−２０抗体またはＩＬ−２０結合断片、あるいはそれらの合成もしくは生物工学的変異体あるいは組成物が提供され、ただし、この場合、前記疾患は、自己免疫疾患、好ましくは、関節リウマチ（ＲＡ）、強直性脊椎炎および他の形態の脊椎関節炎（乾癬性関節炎を含むが、これに限定されない）、乾癬、血管炎症およびアテローム性動脈硬化、アトピー性皮膚炎およびガン（非小細胞肺ガン（ＮＳＣＬ）を含む）、筋浸潤性膀胱がん、口腔腫瘍および乳ガンからなる群から選択される自己免疫疾患である。
【０１４４】
処置において好適である分子、例えば、本明細書中に示される炎症に伴う障害の処置において好適である分子の多さのために、本発明はまた、そのような障害（好ましくは、自己免疫性の疾患または状態は、ＩＬ−２０の発現、ＩＬ−２０の上昇したおよび／または有害な活性に伴う）の処置、そのような障害の診断、ならびに／あるいは、そのような障害の起こりそうな経過および結果を予後判定する方法に関連し、また、本発明の分子の使用に関連する。１つの実施形態において、そのような障害を処置するための方法が提供され、この方法は、その必要性のある被験体に、治療有効量の上述の抗ＩＬ−２０抗体、ＩＬ−２０結合断片、その合成または生物工学的変異体、組合せで本発明の抗体の特徴を示す抗体のカクテル、抗イディオタイプ抗体またはペプチドもしくはペプチド型化合物を投与することを含む。
【０１４５】
さらに、１つの実施形態において、本発明は、ＩＬ−２０の発現、ＩＬ−２０の上昇したおよび／または有害な活性に伴う免疫媒介または自己免疫性の疾患または状態を処置する方法であって、被験体に、
（ａ）本発明の抗ＩＬ−２０抗体またはＩＬ−２０結合断片の少なくとも１つのＣＤＲ
；あるいは
（ｂ）本明細書中上記で定義されるような少なくとも１つの抗イディオタイプ抗体および／またはペプチドもしくはペプチド型化合物
を含むリガンド結合分子の治療有効量を投与することを含む方法に関連する。
【０１４６】
疾患に関連づけられるか、または疾患を引き起こす特定の抗原のエピトープについて特異的であるただ１つのモノクローナル抗体を使用することに基づく処置方法は、いくつかの欠点に悩まされる場合がある。例えば、処置の困難さおよびおそらくは非効率性が、いくつかの抗原を同時に標的とすることを必要とする特定の障害を引き起こす病原性機構の多さから生じる場合がある。そのうえ、患者集団の本来的な多様性を、少なくとも使用されるモノクローナル抗体の低下した結合効率を引き起こすことがある異なる患者または一人の患者のどちらにおいてでも、例えば、所与抗原の多型、グリコシル化の不均一性またはわずかな変性に関して考慮に入れなければならない。これらの欠点のいくつかは、例えば、抗原が、処置されることが意図される患者に免疫学的に関連しているかどうかを、また、どのようなエピトープ変化であれ、エピトープ変化が特定の患者において存在するかどうかを判定するための処置前のスクリーニングによって回避される場合がある。しかしながら、そのようなスクリーニングは多くの場合、処置の緊急性のために、または、費用抑制のために省かれる。したがって、本発明はさらに、２つ以上のタイプの結合分子を一度に患者に適用することに基づく方法、すなわち、結合分子のカクテルを適用することに基づく方法に関連する。これらの結合分子は、異なるエピトープにおいてＩＬ−２０に特異的に結合する場合があり、この場合、適用される結合分子のそれぞれがＩＬ−２０と特異的に結合する場合があり、または、ＩＬ−２０のいくつかのエピトープに結合するいくつかの結合分子が使用される。本発明の様々な結合分子が抗原としてのＩＬ−２０に向けられる（特異的に結合する）場合、それらの結合特異性は前記抗原の異なったエピトープに向けられる。そのようなカクテルの使用が、自己免疫性障害（例えば、ＡＰＳ１など）に罹患する患者を処置するために特に想定される。これは、そのような患者は、約３０００の内因性抗原に対する自己抗体の存在を考慮すると、１つの特定の抗体による単独療法を受け入れないことが多いからである。そのような場合には、同じ抗原特異性または異なる抗原特異性を有する本発明の２つ以上のモノクローナル抗体および／またはペプチドおよびペプチド型化合物による併用療法は、症状の少なくとも何らかの軽減を達成することが予想される。
【０１４７】
したがって、１つの実施形態において、障害を処置するさらなる方法であって、
（ａ）上記で定義されるようなＩＬ−２０抗体、ＩＬ−２０結合断片、それらの合成または生物工学的変異体；ならびに／あるいは
（ｂ）本発明の抗イディオタイプ抗体および／または本発明のペプチドもしくはペプチド型化合物（ただし、そのようなペプチドもしくはペプチド型化合物は、本発明の抗体および抗原結合断片によって特異的に認識されるエピトープを含む）
からなる群から選択される少なくとも２つ、３つ、４つ、５つおよびそれ以上の成分から本質的になるカクテルの治療有効量を被験体に投与することを含む方法が提供される。
【０１４８】
本発明は当然のことながら、ＩＬ−２０の発現、ＩＬ−２０の上昇したおよび／または有害な活性に伴う免疫媒介または自己免疫性の状態および障害を診断することに向けられる診断方法および予後方法、ならびに／あるいは、そのような疾患の発症の予後、すなわち、その進行、処置に対する応答または回復にもまた及ぶ。したがって、１つの実施形態において、本発明は、ＩＬ−２０の発現、ＩＬ−２０の上昇したおよび／または有害な活性に伴う被験体における免疫媒介または自己免疫性の疾患または状態を診断するための方法であって、被験体の生物学的サンプルを本発明の抗ＩＬ−２０抗体またはそのＩＬ−２０結合断片と接触させること、ならびに、ＩＬ−２０の存在を検出することを含む方法に関連する。さらに、１つの実施形態において、本発明は、単離された生物学的サンプルにおいてＩＬ−２０を検出するか、または測定する方法であって、該サンプルを本発明の抗ＩＬ−２０抗体と混合すること、当該抗体により、混合物に存在するＩＬ−２０との複合体を形成させること、ならびに、該混合物に存在する該複合体を検出することを含む方法に関連する。
【０１４９】
既に上記で述べられたように、１つの実施形態において、本発明は、ＩＬ−２０の発現に伴う免疫媒介または自己免疫性の疾患または状態を診断するためのキットであって、上述の抗ＩＬ−２０抗体、ＩＬ−２０結合断片、それらの合成または生物工学的変異体、抗イディオタイプ抗体またはペプチドもしくはペプチド型化合物、ポリヌクレオチド、ベクターまたは細胞を、必要な場合には使用のための試薬および／または説明書と一緒に含むキットに関連する。
【０１５０】
本発明のキットには、例えば、キットを含む容器の内部に、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府当局によって定められる形式での通知が伴い得る（そのような通知は、ヒト投与のための製造、使用または販売の当局による承認を反映する）。加えて、または、代替において、キットは、適切な診断アッセイにおいて使用されるための試薬および／または説明書を含む。本発明の組成物、すなわち、キットは、当然のことではあるが、上記で述べられるような疾患を処置するために特に適用可能である、ＩＬ−２０の発現に伴う障害の診断、防止および処置のために特に適している。特に好ましい実施形態において、障害はＩＬ−２０の発現に伴う。
【０１５１】
別の実施形態では、本発明は、上記本発明のＩＬ−２０結合分子、抗体、抗原結合断片、ペプチドもしくはペプチド系化合物、ポリヌクレオチド、ベクターまたは細胞のうちのいずれか１つ、および場合により、免疫診断法または核酸ベースの診断法で通常使用される試薬などの検出に適切な手段を含む診断組成物に関する。本発明の抗体は、例えば、それらを液相でまたは固相担体に結合して利用することができるイムノアッセイで使用するのに適切である。本発明の抗体を利用することができるイムノアッセイの例は、直接または間接フォーマットのいずれかの競合および非競合イムノアッセイである。このようなイムノアッセイの例は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、サンドイッチ（イムノメトリックアッセイ）、フローサイトメトリおよびウェスタンブロットアッセイである。本発明の抗原および抗体を多くの異なる担体に結合させ、それらに特異的に結合した細胞を単離するのに使用することができる。周知の担体の例としては、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然および改変セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースおよびマグネタイトが挙げられる。担体の性質は、本発明の目的のために、可溶性または不溶性のいずれかであり得る。当業者に公知の多くの異なる標識および標識方法がある。本発明に使用することができる標識の種類の例としては、酵素、放射性同位体、コロイド状金属、蛍光化合物、化学発光化合物および生物発光化合物が挙げられる（上記実施形態も参照のこと）。
【０１５２】
これに関連して、本発明はまた、この目的のために特に設計される手段に関連する。例えば、タンパク質または抗体に基づくアレイであって、例えば、自己免疫疾患に罹患する患者に存在するかもしれない自己抗体を検出するために、ＩＬ−２０に由来する抗原および疾患関連抗原を含有する抗原のどちらでも装荷されるアレイが使用される場合がある。マイクロアレイでの免疫アッセイの設計が、Ｋｕｓｎｅｚｏｗ他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ５（２００６）、１６８１〜１６９６において要約されている。したがって、本発明はまた、本発明に従って特定される結合分子または抗原が装荷されるマイクロアレイに関連する。
【０１５３】
本発明はまた、本発明のヒト由来モノクローナル抗ヒトＩＬ−２０抗体またはそのＩＬ−２０結合断片、あるいはそれらの合成または生物工学的変異体のために適用可能であり、また有用であるＩＬ−２０アンタゴニスト（例えば、先行技術において記載される抗ＩＬ−２０抗体）の様々な実施形態の使用をもたらし、これらの実施形態に関連する。例えば、国際出願公開ＷＯ２００５／０５２０００にはとりわけ、ラットの抗ヒトＩＬ−２０モノクローナル抗体、ならびに、抗ＩＬ−２０ＲＡモノクローナル抗体および抗ＩＬ−２０ＲＢモノクローナル抗体が、インビトロおよびインビボにおけるそれらの特徴づけのための手段および方法、ならびに、その使用を含めて記載されており、これらもまた、本発明のヒト由来モノクローナル抗ヒトＩＬ−２０抗体および述べられたその誘導体に従って適用することができる。
【０１５４】
したがって、さらなる実施形態において、本発明は、造血細胞および造血細胞前駆体のＩＬ−２０誘導の増殖または分化を低下させ、または阻害するためのインビトロ方法であって、骨髄細胞または末梢血細胞を、本発明のヒト由来モノクローナル抗ヒトＩＬ−２０抗体および述べられたその誘導体を含む組成物、免疫コンジュゲートまたは医薬組成物（これらは本明細書中に開示される通りである）と一緒に培養することを含み、前記低下または阻害が、可溶性サイトカインの非存在下で培養される骨髄細胞または末梢血細胞と比較して、前記骨髄細胞または末梢血細胞における前記造血細胞の増殖または分化として測定される、インビトロ方法に関連する。造血細胞および造血前駆体細胞はリンパ系細胞である場合があり、好ましくは、前記リンパ系細胞はマクロファージまたはＴ細胞である。
【０１５５】
したがって、原理的には、本明細書中に開示されるような本発明のヒト由来モノクローナル抗ヒトＩＬ−２０抗体および述べられたその誘導体、免疫コンジュゲートおよび医薬組成物は、特に国際出願公開ＷＯ２００５／０５２０００に記載されるようなＩＬ−２０アンタゴニストおよび抗ＩＬ−２０抗体の様々な治療的使用法のいずれかに従って適用することができる。
【０１５６】
定義および実施形態
別途記載される場合を除き、本明細書中で使用されるような用語および実施形態には、国際出願公開ＷＯ２０１３／０９８４１９および国際出願公開ＷＯ２０１３／０９８４２０において提供されるような、また、使用されるような定義が与えられる。補充として、本明細書中で使用されるような一般的な用語には、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９７年、２０００年改訂および２００３年再版、ＩＳＢＮ  ０１９８５０６７３２）において提供されるような定義が与えられる。
【０１５７】
用語「ａ」または「ａｎ」の実体は、その実体の１つ以上を指すことに留意する；例えば、「抗体」は、１つ以上の抗体を表すと理解される。したがって、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上」および「少なくとも１つ」は、本明細書で互換的に使用され得る。
【０１５８】
用語「中和する」および用語「中和抗体」はそれぞれ、抗原または生きている微生物の少なくとも何らかの生物学的活性を低下させるか、または無効にする抗体が意味されるという点でこの技術分野において一般的であるように使用される。例えば、本発明の抗ＩＬ−２０抗体は、十分な量で、ＩＬ−２０の活性を、例えば、実施例に記載されるようなアッセイにおいて無効にするか、または低下させるならば、中和抗体である。中和は５０％阻害濃度（ＩＣ５０）によって一般に定義され、中和滴定曲線下面積（ＡＵＣ）に基づいて統計学的に評価することができる。本発明の例示的な抗ＩＬ−２０抗体のＩＣ５０値が示される。例えば、例示的な２０Ａ１０抗体のヒトＩＬ−２０のＩＣ５０値はＫＺ１３６−ＮＬｕｃレポータアッセイにおいて３２９．７ｎｇ／ｍｌ、化学発光細胞結合アッセイにおいて４．０３ｎｇ／ｍｌである（それぞれ、図５Ｆの左柱、及び図８Ｄ）。
【０１５９】
ペプチドおよびポリペプチド：
用語「ペプチド」は、用語「ポリペプチド」および「タンパク質」（これは、本明細書では時には互換的に使用され得る）、ならびにその意味の範囲内で、任意のアミノ酸配列、例えば、本発明の重鎖および軽鎖可変領域ならびに定常領域のアミノ酸配列を含むと理解される。同様に、タンパク質およびポリペプチドの断片も意図され、本明細書では「ペプチド」と称され得る。それにもかかわらず、用語「ペプチド」は、好ましくは、少なくとも５個の連続するアミノ酸、好ましくは少なくとも１０個の連続するアミノ酸、より好ましくは少なくとも１５個の連続するアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも２０個の連続するアミノ酸、特に好ましくは少なくとも２５個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸ポリマーを意味する。加えて、本発明によるペプチドは、典型的には、１００個以下の連続するアミノ酸、好ましくは８０個未満の連続するアミノ酸、より好ましくは５０個未満の連続するアミノ酸を有する。
【０１６０】
本明細書で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、単数の「ポリペプチド」および複数の「ポリペプチド」、例えば、本発明の抗体を包含することを意図し、（ペプチド結合としても公知である）アミド結合によって直線的に連結したモノマー（アミノ酸）から構成される分子を指す。用語「ポリペプチド」は、２個以上のアミノ酸からなる任意の１つまたは複数の鎖を指し、特定の長さの産物を指さない。したがって、「ペプチド」、「ジペプチド」、「トリペプチド」、「オリゴペプチド」、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」または２個以上のアミノ酸からなる１つまたは複数の鎖を指すのに使用される他の任意の用語が「ポリペプチド」の定義内に含まれ、用語「ポリペプチド」は、これらの用語のいずれかに代えてまたはこれと互換的に使用され得る。
【０１６１】
用語「ポリペプチド」はまた、限定されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解による切断、または天然に存在しないアミノ酸による改変を含むポリペプチドの発現後修飾産物を指すことを意図する。ポリペプチドは天然の生物学的供給源に由来するものでもよいし、または組換え技術によって生産されるものでもよいが、必ずしも指定の核酸配列から翻訳されるものではない。それは、化学合成を含む任意の方法で作製され得る。
【０１６２】
本発明のポリペプチドは、約３個以上、５個以上、１０個以上、２０個以上、２５個以上、５０個以上、７５個以上、１００個以上、２００個以上、５００個以上、１，０００個以上または２，０００個以上のアミノ酸のサイズであり得る。それにもかかわらず、用語「ポリペプチド」は、好ましくは、少なくとも１００個のアミノ酸を含むアミノ酸ポリマーを意味する。ポリペプチドは一定の三次元構造を有し得るが、それらは必ずしもこのような構造を有するものではない。一定の三次元構造を有するポリペプチドは折り畳まれていると称され、一定の三次元構造を持たず、むしろ多数の異なる立体構造をとり得るポリペプチドは折り畳まれていないと称される。本明細書で使用される場合、糖タンパク質という用語は、アミノ酸残基、例えば、セリン残基またはアスパラギン残基の酸素含有側鎖または窒素含有側鎖を介してタンパク質に結合する少なくとも１つの炭水化物部分に結合したタンパク質を指す。
【０１６３】
「単離された」ポリペプチドまたはその断片、変異体もしくは誘導体は、その自然環境下にないポリペプチドを意図する。特定の精製レベルは必要とされない。例えば、単離されたポリペプチドは、その天然または自然の環境から取り出され得る。宿主細胞で発現された組換的に生産されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって分離、分画または部分的もしくは実質的に精製された天然ポリペプチドまたは組換えポリペプチドがそうであるように、本発明の目的のために単離されたとみなされる。
【０１６４】
「組換えペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質」は、組換えＤＮＡ技術によって生産された（すなわち、所望のペプチドを含む融合タンパク質をコードする外因性の組換えＤＮＡ発現構築物によって形質転換された細胞、微生物または哺乳動物から産生された）ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を指す。ほとんどの細菌培養物で発現されたタンパク質またはペプチドは、典型的には、グリカンを含まないであろう。酵母で発現されたタンパク質またはポリペプチドは、哺乳動物細胞で発現されたものとは異なるグリコシル化パターンを有し得る。
【０１６５】
本発明のポリペプチドには、上記ポリペプチドの断片、誘導体、類似体および変異体ならびにそれらの任意の組み合わせも含まれる。用語「断片」、「変異体」、「誘導体」および「類似体」は、天然ペプチドのアミノ酸配列と十分に類似のアミノ酸配列を有するペプチドおよびポリペプチドを含む。用語「十分に類似の」は、第１および第２のアミノ酸配列が共通の構造ドメインおよび／または共通の機能活性を有するように、第１のアミノ酸配列が、第２のアミノ酸配列と同一または同等のアミノ酸残基の十分数または最小数を含有することを意味する。例えば、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％同一の共通の構造ドメインを含むアミノ酸配列が、本明細書では十分に類似のものと定義される。好ましくは、変異体は、本発明の好ましいペプチドのアミノ酸配列と、特に抗体もしくは抗体断片と、または本発明の抗体もしくはそれらのいずれかの断片、変異体、誘導体もしくは類似体よって認識されるエピトープを含む合成ペプチドもしくはペプチド系化合物と十分に類似である。このような変異体は、一般に、本発明のペプチドの機能活性を保持する（すなわち、本発明の抗体によって結合される）。変異体は、１個以上のアミノ酸の欠失、付加、および／または置換によって、アミノ酸配列がそれぞれ天然および野生型（ｗｔ）ペプチドとは異なるペプチドを含む。これらは、天然に存在する変異体および人工的に設計されたものであり得る。
【０１６６】
用語「断片」、「変異体」、「誘導体」および「類似体」は、本発明の抗体または抗体ポリペプチドに言及する場合、対応する天然結合分子、抗体またはポリペプチドの抗原結合特性の少なくとも一部を保持する任意のポリペプチドを含む。本発明のポリペプチド断片は、本明細書の他の箇所で議論される特定の抗体断片に加えて、タンパク質分解断片および欠失断片を含む。本発明の抗体および抗体ポリペプチドの変異体は、上記断片、およびさらにアミノ酸の置換、欠失または挿入によりアミノ酸配列を改変したポリペプチドを含む。変異体は天然に存在するものでもよいし、または天然に存在しないものでもよい。天然に存在しない変異体は、当技術分野において公知の突然変異誘発技術を使用して生産され得る。変異体ポリペプチドは、保存的または非保存的なアミノ酸置換、欠失または付加を含むことができる。本発明の結合分子、例えば、本発明の抗体および抗体ポリペプチドの誘導体は、天然ポリペプチドでは見られないさらなる特徴を示すように改変されたポリペプチドである。例としては、融合タンパク質が挙げられる。変異体ポリペプチドは、本明細書では「ポリペプチド類似体」とも称され得る。本明細書で使用される場合、結合分子もしくはその断片、抗体または抗体ポリペプチドの「誘導体」は、官能側基の反応によって化学的に誘導体化された１つ以上の残基を有する主題ポリペプチドを指す。「誘導体」としては、２０種の標準的アミノ酸の１個以上の天然に存在するアミノ酸誘導体を含有するペプチドも挙げられる。例えば、プロリンを４−ヒドロキシプロリンに置換することができる；リシンを５−ヒドロキシリシンに置換することができる；ヒスチジンを３−メチルヒスチジンに置換することができる；セリンをホモセリンに置換することができる；そして、リシンをオルニチンに置換することができる。
【０１６７】
抗イディオタイプ抗体：
用語「抗イディオタイプ抗体」は、抗体または他の結合分子に言及する場合、抗原結合部位付近におけるまたは抗原結合部位における抗体の可変領域上に位置する固有の抗原性ペプチド配列に結合して、これによって、所定の自己抗体により別の方法で引き起こされる特異的免疫反応を阻害する分子を含む。同様に、本発明の抗体によって特異的に認識されるエピトープを含む合成ペプチドまたはペプチド系化合物を使用することができる。
【０１６８】
抗イディオタイプ抗体は、他の抗体と同様の方法で得ることができる。特定の抗イディオタイプ抗体は、凝集（比濁法アッセイまたは比濁分析アッセイ）、沈殿（放射免疫拡散）、またはサンドイッチイムノアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡによって、任意の種類の架橋により検出される。米国特許出願公開第２００２０１４２３５６号明細書は、高濃度高分子量の標的抗原に対して特異的な抗体に対する抗イディオタイプモノクローナル抗体集団を得るための方法であって、前記抗イディオタイプ抗体集団が、前記標的抗原に対して特異的な選択抗体に対して多種多様な結合親和性を有し、特定の用途に必要な親和性を有する前記抗イディオタイプ抗体集団のサブセットが選択され得る方法を提供する。
【０１６９】
米国特許出願公開第２００２０１４２３５６号明細書には、抗体をコートとしておよび抗イディオタイプ抗体を検出として使用した（その逆もまた同様である）抗原の競合イムノアッセイが記載されている。抗イディオタイプ抗体を代理抗原として使用することが開示されている他の参考文献としては、Ｌｏｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５５（１９９５）（２３  ｓｕｐｐｌ．Ｓ）：Ｓ５９７８−Ｓ５９８２；Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９２（１９９６），７３−８５；Ｂａｒａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊ．ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，９２（２００１），８８−９５；およびＫｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２（２０００），１９３−２０１が挙げられる。疾患の処置においてまたは寄生虫に対して抗イディオタイプ抗体を使用することは、当技術分野において公知である；例えば、Ｓａｃｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐｅｒ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１５５（１９８２），１１０８−１１１９を参照のこと。
【０１７０】
分子の類似性および／または同一性の決定：
２つのペプチド間の「類似性」は、第１のペプチドのアミノ酸配列を第２のペプチドの配列と比較することによって決定される。第１のペプチドのアミノ酸は、それが同一または保存的アミノ酸置換である場合、第２のペプチドの対応するアミノ酸と類似する。保存的置換としては、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．，ｅｄ．，Ｔｈｅ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９７８）、およびＡｒｇｏｓ，ＥＭＢＯ  Ｊ．８（１９８９），７７９−７８５に記載されているものが挙げられる。例えば、以下の群の１つに属するアミノ酸は、保存的変化または置換を表す：−Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；−Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ；−Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ；−Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；−Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ；および−Ａｓｐ、Ｇｌｕ。
【０１７１】
２つの配列間の％同一性または類似性の決定は、好ましくは、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７の数学的アルゴリズムを使用して達成される。このようなアルゴリズムは、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｅ）で利用可能なＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０のＢＬＡＳＴｎおよびＢＬＡＳＴｐプログラム中に組み込まれている。
【０１７２】
％同一性または類似性の決定は、ＢＬＡＳＴｎおよびＢＬＡＳＴｐプログラムの標準的パラメータを用いて実施される。
【０１７３】
ＢＬＡＳＴポリヌクレオチド検索は、ＢＬＡＳＴｎプログラムを用いて実施される。一般的パラメータについて、「最大標的配列」のボックスを１００に設定し得、「ショートクエリ」のボックスにチェックマークを付け得、「予測閾値」のボックスを１０に設定し得、「ワードサイズ」のボックスを２８に設定し得る。スコアリングパラメータについて、「一致／不一致スコア」を１，−２に設定し得、「ギャップコスト」のボックスを線形に設定し得る。フィルタおよびマスキングパラメータについて、「低複雑度領域」のボックスにチェックマークを付け得、「種特異的反復」のボックスにはチェックマークを付けなくてもよく、「ルックアップテーブルのみについてマスク」のボックスにチェックマークを付け得、「小文字をマスク」のボックスにはチェックマークを付けなくてもよい。
【０１７４】
ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＢＬＡＳＴｐプログラムを用いて実施される。一般的パラメータについて、「最大標的配列」のボックスを１００に設定し得、「ショートクエリ」のボックスにチェックマークを付け得、「予測閾値」のボックスを１０に設定し得、「ワードサイズ」のボックスを「３」に設定し得る。スコアリングパラメータについて、「マトリックス」のボックスを「ＢＬＯＳＵＭ６２」に設定し得、「ギャップコスト」のボックスを「存在：１１  伸長：１」に設定し得、「組成調整」のボックスを「条件的組成スコアマトリックス調整」に設定し得る。フィルタおよびマスキングパラメータについて、「低複雑度領域」のボックスにはチェックマークを付けなくてもよく、「ルックアップテーブルのみについてマスク」のボックスにはチェックマークを付けなくてもよく、「小文字をマスク」のボックスにはチェックマークを付けなくてもよい。
【０１７５】
ポリヌクレオチド：
用語「ポリヌクレオチド」は、単数の核酸および複数の核酸を包含することを意図し、単離された核酸分子または構築物、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、通常のホスフォジエステル結合または非通常型結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなアミド結合）を含むことができる。用語「核酸」は、ポリヌクレオチド中に存在する任意の１つ以上の核酸セグメント、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ断片を指す。「単離された」核酸またはポリヌクレオチドは、その天然環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを意図する。例えば、ベクターに含まれる抗体をコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的のために単離されたとみなされる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例としては、異種宿主細胞で維持される組換えポリヌクレオチドまたは溶液中の（部分的または実質的に）精製されたポリヌクレオチドが挙げられる。単離されたＲＮＡ分子としては、本発明のポリヌクレオチドのインビボまたはインビトロＲＮＡ転写産物が挙げられる。本発明にしたがって単離されたポリヌクレオチドまたは核酸としてはさらに、合成的に生産されたこのような分子が挙げられる。加えて、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモータ、リボソーム結合部位または転写ターミネータなどの調節要素でもよいし、またはこれらを含んでもよい。
【０１７６】
本明細書で使用される場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の部分である。「停止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡまたはＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないがコード領域の一部とみなされ得るが、例えば、プロモータ、リボソーム結合部位、転写ターミネータ、イントロンなどの任意の隣接配列はコード領域の一部ではない。本発明の２つ以上のコード領域が単一のポリヌクレオチド構築物内に、例えば、単一のベクター上に、または別々のポリヌクレオチド構築物内に、例えば、別々の（異なる）ベクター上に存在することができる。また、任意のベクターは、単一のコード領域を含有することもできるし、または２つ以上のコード領域を含むことができ、例えば、単一のベクターは、免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を別々にコードすることができる。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチドまたは核酸は、結合分子、抗体またはそれらの断片、変異体もしくは誘導体をコードする核酸に融合しているかまたは融合していない異種コード領域をコードすることができる。異種コード領域は、限定されないが、分泌シグナルペプチドまたは異種機能性ドメインなどの特別な要素またはモチーフを含む。
【０１７７】
ある実施形態では、ポリヌクレオチドまたは核酸は、ＤＮＡである。ＤＮＡの場合では、ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは、通常、１つ以上のコード領域と機能的に結合されたプロモータおよび／または他の転写もしくは翻訳制御要素を含むことができる。機能的な結合は、遺伝子産物（例えば、ポリペプチド）のコード領域が、遺伝子産物の発現を調節配列の影響下または制御下に置くような方法で１つ以上の調節配列と結合している場合である。プロモータ機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合、および２つのＤＮＡ断片間の結合の性質が遺伝子産物の発現を指令する発現調節配列の能力を妨害しないか、または鋳型ＤＮＡの転写される能力を妨害しない場合、２つのＤＮＡ断片（例えば、ポリペプチドコード領域およびそれと結合するプロモータ）は、「機能的に結合されている」かまたは「機能的に連結されている」。したがって、プロモータがポリペプチドをコードする核酸の転写をもたらすことができる場合、プロモータ領域はその核酸と機能的に結合されているであろう。プロモータは、所定の細胞でのみＤＮＡの実質的な転写を指令する細胞特異的プロモータであり得る。プロモータの他に、例えば、エンハンサ、オペレータ、リプレッサおよび転写終結シグナルなどの他の転写制御要素が、細胞特異的転写を指令するためにポリヌクレオチドと機能的に結合され得る。適切なプロモータおよび他の転写制御領域は、本明細書で開示される。
【０１７８】
様々な転写制御領域が当業者に公知である。これらとしては、限定されないが、脊椎動物細胞で機能する転写制御領域、例えば限定されないが、サイトメガロウイルス（イントロン−Ａを含む前初期プロモータ）、シミアンウイルス４０（初期プロモータ）および（ラウス肉腫ウイルスなどの）レトロウイルス由来のプロモータおよびエンハンサセグメントが挙げられる。他の転写制御領域としては、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモンおよびウサギβグロビンなどの脊椎動物遺伝子由来のもの、ならびに真核細胞での遺伝子発現を制御することができる他の配列が挙げられる。他の適切な転写制御領域としては、組織特異的プロモータおよびエンハンサ、ならびにリンホカイン誘導性プロモータ（例えば、インターフェロンまたはインターロイキンによって誘導可能なプロモータ）が挙げられる。
【０１７９】
同様に、様々な翻訳制御要素が当業者に公知である。これらとしては、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始および停止コドン、ならびにピコルナウイルス由来の要素（特に、ＣＩＴＥ配列とも称される内部リボソーム侵入部位またはＩＲＥＳ）が挙げられる。
【０１８０】
他の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ：ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または任意の他のＲＮＡ産物の形態のＲＮＡである。
【０１８１】
本発明のポリヌクレオチドコード領域および核酸コード領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指令する分泌またはシグナルペプチドをコードするさらなるコード領域と結合することができる。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞によって分泌されたタンパク質は、成長中のタンパク質鎖が粗面小胞体通って輸送され始めると成熟タンパク質から切断されるシグナルペプチドまたは分泌リーダ配列を有する。当業者であれば、脊椎動物細胞によって分泌されたポリペプチドは、一般に、前記ポリペプチドのＮ末端に融合したシグナルペプチドを有し、これが完全または「全長」ポリペプチドから切断されて分泌型または「成熟」型ポリペプチドが産生されることを理解している。ある実施形態では、天然のシグナルペプチド、例えば、免疫グロブリン重鎖もしくは軽鎖のシグナルペプチド、またはその配列の機能性誘導体であって、それと機能的に結合されたポリペプチドの分泌を指令する能力を保持している機能性誘導体が使用される。あるいは、異種哺乳動物シグナルペプチドまたはその機能性誘導体を使用することができる。例えば、野生型リーダ配列をヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）またはマウスβ−グルクロニダーゼのリーダ配列で置換することができる。しかしながら、ポリペプチド、特に本発明の免疫グロブリン及びその断片の細胞内生産もまた可能である。
【０１８２】
発現：
用語「発現」は、本明細書で使用される場合、遺伝子が生化学物質、例えば、ＲＮＡまたはポリペプチドを生成する過程を指す。この過程は、限定されないが、遺伝子ノックダウンならびに一過性発現および安定発現の両方を含む、細胞内における遺伝子の機能的存在の任意の顕在化を含む。それとしては、限定されないが、遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または任意の他のＲＮＡ産物への転写、およびこのようなｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳が挙げられる。所望の最終産物が生化学物質である場合、発現は、その生化学物質および任意の前駆体の作製を含む。遺伝子の発現は、「遺伝子産物」を生成する。本明細書で使用される場合、遺伝子産物は、核酸、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、遺伝子の転写によって生成されるメッセンジャーＲＮＡ、または転写産物から翻訳されるポリペプチドのいずれかであり得る。本明細書に記載される遺伝子産物としてはさらに、転写後修飾、例えば、ポリアデニル化を受けた核酸、または翻訳後修飾、例えば、メチル化、グリコシル化、脂質付加、他のタンパク質サブユニットとの会合、タンパク質分解切断などを受けたポリペプチドが挙げられる。
【０１８３】
様々な発現ベクター／宿主系を用いて、ポリヌクレオチド配列を含有および発現させることができる。これらとしては、限定されないが、組換えバクテリオファージ、プラスミドもしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌などの微生物；酵母発現ベクターで形質転換された酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ：）もしくは細菌発現ベクター（例えば、ＴｉもしくはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換された植物細胞系；または動物細胞系が挙げられる。
【０１８４】
ペプチド、ポリペプチドまたは融合タンパク質（以下、「産物」と称される）を宿主細胞中で発現させるために、以下のような手順を使用することができる。前記産物をコードするＤＮＡ配列を含有する制限断片を、宿主細胞で機能する複製起点および適切な選択可能マーカを含有する適切な組換えプラスミドにクローニングすることができる。プラスミドは、産物の誘導性発現用のプロモータ（例えば、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  ６９（１９８８），３０１  ３１５）およびｐＥＴｌ  Ｉｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０），６０  ８９）を含むことができる。組換えプラスミドを、例えば、エレクトロポレーションによって宿主細胞に導入することができ、組換えプラスミドを含有する細胞を、プラスミド上のマーカについて選択することによって特定することができる。産物に対して特異的なアッセイを使用して、産物の発現を宿主細胞で誘導および検出することができる。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、産物／ペプチドをコードするＤＮＡを宿主細胞での発現のために最適化することができる。例えば、ＤＮＡは、１つ以上のアミノ酸に対するコドンであって、この同じアミノ酸に対する他のコドンと比べて宿主細胞において優勢なコドンを含むことができる。
【０１８６】
あるいは、産物の発現は、無細胞抽出物中でのインビトロタンパク質合成によって実施することができ、これは、機能的研究のための改変または非天然アミノ酸の導入にも特に適している（下記も参照のこと）。過剰発現産物が宿主細胞に対して毒性である場合、産物が不溶性であるかまたは封入体を形成する場合、またはタンパク質が細胞内プロテアーゼによって急速なタンパク質分解を受ける場合、インビトロ翻訳系の使用は、インビボ遺伝子発現よりも利点を有し得る。最も頻繁に使用される無細胞翻訳系は、ウサギ網状赤血球、コムギ胚芽および大腸菌由来の抽出物からなる。すべてが、外因性ＲＮＡの翻訳に必要なすべての高分子成分（７０Ｓまたは８０Ｓリボソーム、ｔＲＮＡ、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、開始、伸長および終結因子など）を含む粗抽出物として調製される。効率的な翻訳を確実にするためには、アミノ酸、エネルギー源（ＡＴＰ、ＧＴＰ）、エネルギー再生系（真核生物系の場合にはクレアチンリン酸およびクレアチンホスホキナーゼ、ならびに大腸菌溶解物の場合にはホスホエノールピルビン酸およびピルビン酸キナーゼ）、および当技術分野において公知の他の補因子（Ｍｇ２＋、Ｋ＋など）を各抽出物に補充しなければならない。適切な転写／翻訳系は、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、およびＡｍｂｉｏｎ、すなわち、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販されている（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１（１９８３），６３５−６４４；Ａｒｄｕｅｎｇｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００７），Ｔｈｅ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ  Ｒａｂｂｉｔ  Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｉｎ，Ｋｕｄｌｉｃｋｉ，Ｋａｔｚｅｎ  ａｎｄ  Ｂｅｎｎｅｔｔ  ｅｄｓ．，Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｏｌ．２００７．Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｘ：Ｌａｎｄｅｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ｐｐ．１−１８；Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｚｕｂａｙ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１（１９８３），６７４−９０；Ｅｚｕｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２２（２００６），１５７０−１５７７）。
【０１８７】
宿主細胞：
本発明に関して、宿主細胞は、細菌、昆虫、真菌、植物、動物またはヒト細胞などの原核細胞または真核細胞であり得る。好ましい真菌細胞は、例えば、サッカロマイセス属のもの、特に、Ｓ．セレビシエ種のものである。用語「原核生物の」は、本発明の抗体または対応する免疫グロブリン鎖の発現のためのＤＮＡまたはＲＮＡ分子で形質転換またはトランスフェクトされ得るすべての細菌を含むことを意味する。原核生物宿主としては、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ネズミチフス菌、セラチア・マルセッセンスおよび枯草菌などのグラム陰性ならびにグラム陽性細菌が挙げられ得る。用語「真核生物の」は、酵母、高等植物、昆虫および好ましくは哺乳動物細胞、最も好ましくはＨＥＫ２９３、ＮＳＯ、ＣＳＯおよびＣＨＯ細胞を含むことを意味する。組換え生産手順で用いられる宿主に応じて、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる抗体または免疫グロブリン鎖は、グリコシル化され得るか、または非グリコシル化され得る。本発明の抗体、または対応する免疫グロブリン鎖も、最初のメチオニンアミノ酸残基を含み得る。本発明のポリヌクレオチドは、当業者に一般に公知の技術のいずれかを使用して、宿主を形質転換またはトランスフェクトするのに使用され得る。さらに、機能的に連結された融合遺伝子を調製し、それらを、例えば、哺乳動物細胞および細菌で発現させるための方法は、当技術分野において周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）。そこに記載されている遺伝子構築物および方法は、真核生物または原核生物の宿主における本発明の抗体または対応する免疫グロブリン鎖の発現に用いられ得る。一般に、挿入されたポリヌクレオチドの効率的な転写を促進するプロモータ配列を含有する発現ベクターが、宿主と併せて使用される。発現ベクターは、典型的には、複製起点、プロモータ、およびターミネータ、ならびに形質転換細胞の表現型選択を提供することができる特定の遺伝子を含む。ＤＮＡ配列に適切な細胞源ならびに免疫グロブリンの発現および分泌用の宿主細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ」，Ｆｉｆｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８５）Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，Ｕ．Ｓ．Ａ．（これは、参照により本明細書に組み込まれる））などの多数の供給源から得ることができる。さらに、本発明の細胞を含むトランスジェニック動物、好ましくは哺乳動物は、本発明の抗体の大規模生産に使用され得る。
【０１８８】
発酵槽で形質転換宿主を成長させ、当技術分野において公知の技術にしたがって培養して、最適な細胞成長を達成し得る。発現されたら、本発明の全抗体、それらの二量体、個々の軽鎖および重鎖、または他の免疫グロブリン形態を、硫酸アンモニウム沈降法、アフィニティカラム、カラムクロマトグラフィ、ゲル電気泳動などを含む当技術分野の標準手順にしたがって精製し得る；Ｓｃｏｐｅｓ，「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９８２）を参照のこと。次いで、本発明の抗体またはその対応する免疫グロブリン鎖を、成長培地、細胞溶解物、または細胞膜画分から単離し得る。例えば、本発明の組換え発現された抗体または免疫グロブリン鎖の単離および精製は、任意の従来の手段、例えば、本発明の抗体の定常領域に対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体の使用を含むものなどの分取クロマトグラフィ分離および免疫学的分離によるものであり得る。例えば、薬物標的化およびイメージング用途のために、本発明の抗体を他の部分にさらにカップリングし得ることは、当業者に明らかである。結合部位に対する抗体または抗原の発現後にこのようなカップリングを化学的に行ってもよいし、またはカップリング産物をＤＮＡレベルで本発明の抗体または抗原に人為操作してもよい。次いで、ＤＮＡを適切な宿主系で発現させ、必要な場合、発現タンパク質を収集および変性させる。
【０１８９】
医薬用途の場合、少なくとも約９０〜９５％の同質性の実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、９８〜９９％またはそれ以上の同質性が最も好ましい。部分的にまたは所望により同質性まで精製したら、次いで、抗体を治療的（体外的を含む）に使用してもよいし、またはアッセイ手順の開発および実施に使用してもよい。
【０１９０】
本発明はまた、本発明の抗体またはその対応する免疫グロブリン鎖を発現することができる細胞を生産するための方法であって、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを用いて、細胞を遺伝子操作することを含む方法に関する。本発明の方法によって得ることができる細胞は、例えば、本発明の抗体とその抗原との相互作用を試験するのに使用され得る。
【０１９１】
ＥＬＩＳＡアッセイ：
様々な抗原のための酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）としては、比色分析、化学発光および蛍光測定ベースのものが挙げられる。ＥＬＩＳＡは、薬物、ならびに血漿および尿試料中の他の抗原性成分が低量の検出に上手く適用されており、抽出工程を伴わず、実施が簡単である。タンパク質抗原に対する抗体の検出のためのＥＬＩＳＡでは、短い合成ペプチドをマイクロタイタープレートのプラスチック表面に直接結合する使用が多い。ペプチドは、一般に、それらの合成的性質および高速液体クロマトグラフィを使用した効率的な精製方法により非常に純粋である。短いペプチドの欠点は、それらが通常は、立体構造または不連続エピトープではなく直鎖状エピトープを表すことである。立体構造エピトープを提示するためには、長いペプチドまたは完全な天然タンパク質のいずれかを使用する。タンパク質抗原をプレートの疎水性ポリスチレン支持体に直接結合すると、結合したタンパク質が部分的または完全に変性し、立体構造エピトープが失われ得る。抗原の固定化（捕捉ＥＬＩＳＡ）を媒介する抗体でプレートをコーティングすることにより、この影響を回避することができる。
【０１９２】
しかしながら、多くの場合、過剰発現された組換えタンパク質は不溶性であり、立体構造エピトープに対する抗体を分析しようとする場合には変性条件下での精製および復元を必要とする。例えば、コートタンパク質として組換え融合タンパク質を使用した一般的なＥＬＩＳＡについては、米国特許出願公開第２００３００４４８７０号明細書を参照のこと。
【０１９３】
結合分子：
「結合分子」は、本発明との関連で使用される際には、主に抗体およびその断片に関連し、しかし、本発明の「目的とする分子」に結合する他の非抗体分子もまた指すことがあり、この場合、目的とする分子は、サイトカインとして知られている糖タンパク質のクラスのタンパク質であり、特に、ＩＬ−２０である。本発明の目的とする分子は、上記および下記における本発明の特定の実施形態の記載の範囲内においてさらに詳しく定義される。本発明の結合分子には、ホルモン、受容体、リガンド、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子、シャペロン（例えば、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）など）、ならびに、細胞間接着分子（例えば、カドヘリンスーパーファミリー、インテグリンスーパーファミリー、Ｃ型レクチンスーパーファミリーおよび免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのメンバーなど）が含まれるが、これらに限定されない。したがって、明瞭性だけのために、また、本発明の範囲を限定することなく、下記の実施形態のほとんどが、治療剤および診断剤を開発するための好ましい結合分子を代表する抗体および抗体様分子に関して議論される。
【０１９４】
抗体：
用語「抗体」および「免疫グロブリン」は、本明細書では互換的に使用される。抗体または免疫グロブリンは、上記および下記に定義される本発明の目的の分子に結合する分子であって、少なくとも重鎖の可変ドメインを含み、通常、少なくとも重鎖および軽鎖の可変ドメインを含む分子である。脊椎動物系における基本的な免疫グロブリンの構造は、比較的よく理解されている；例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）を参照のこと。用語「結合する」および「認識する」は、本発明の結合分子（例えば、抗体）の結合親和性に関して互換的に使用される。
【０１９５】
上記および下記に定義されているように、目的の分子に特異的に結合するのに十分な構造を含む任意の抗体または免疫グロブリン断片は、本明細書では、「結合分子」、「結合断片」または「免疫特異的断片」と互換的に表される。
【０１９６】
本発明の抗体または抗原結合断片、免疫特異的な断片、あるいはそれらの変異体または誘導体には、ポリクローナル性、モノクローナル性、多特異性、ヒト型、ヒト化型、霊長類化型、マウス化型またはキメラ型の抗体、単鎖抗体、エピトープ結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２）、Ｆｄ、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＬドメインまたはＶＨドメインのどちらかを含む断片、Ｆａｂ発現ライブラリーによって作製される断片、ならびに、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本明細書中に開示される抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）が含まれるが、これらに限定されない。様々なｓｃＦｖ分子がこの技術分野では知られており、例えば、米国特許第５，８９２，０１９号に記載される。この点において、抗体の抗原結合断片もまた、単一ドメイン抗体（ｓｄＡＢ）またはナノボディー（商標）（Ａｂｌｙｎｘ、Ｇｅｎｔ、ベルギー）としてもまた知られているドメイン抗体（ｄＡｂ）であることが可能である。例えば、Ｄｅ  Ｈａａｒｄ他、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８７（２００５）、４５３１〜４５４１；Ｈｏｌｔ他、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１（２００３）、４８４〜４９０を参照のこと。より詳しくは下記で議論されるように、用語「免疫グロブリン」は、生化学的に識別することができる様々な幅広いクラスのポリペプチドを含む。当業者は、重鎖が、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）として、それらの中のいくつかのサブクラス（例えば、γ１〜γ４）で分類されることを理解するであろう。抗体の「クラス」を、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹとしてそれぞれ決定するのが、この鎖の性質である。免疫グロブリンのサブクラス（イソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１などが十分に特徴づけられており、これらは、機能的な特殊化を与えることが知られている。本発明の免疫グロブリン分子または抗体分子は、免疫グロブリン分子のどのようなタイプのものも（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、どのようなクラスのものも（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２など）またはどのようなサブクラスのものも可能である。これらのクラスおよびイソタイプのそれぞれの様々な改変された型が、本開示を考慮して当業者には容易に認識可能であり、従って、本発明の範囲の範囲内である。すべての免疫グロブリンクラスが明らかに本発明の範囲内であるが、下記の議論は概して、免疫グロブリン分子のＩｇＧクラスに関するものになる。ＩｇＧに関して、標準的な免疫グロブリン分子は、分子量がおよそ２３，０００ダルトンである２つの同一の軽鎖ポリペプチドと、分子量が５３，０００〜７０，０００である２つの同一の重鎖ポリペプチドとを含む。これら４つの鎖は典型的には、軽鎖が、“Ｙ”の口部から始まり、可変領域の終わりまで続く重鎖を腕木として支える“Ｙ”字型の立体配置でジスルフィド結合によってつながれる。
【０１９７】
上記の表１に列記される本発明の例示的な抗ＩＬ−２０抗体の分類から明白であるように、本発明の例示的抗体はＩｇＧ４またはＩｇＧ１クラスのものであり、このことから、調節性Ｔ細胞応答および／または上皮が場合によっては、これらのＡＩＲＥ欠乏状態におけるそれらの開始において暗示される。これらの知見が、Ｋａｒｎｅｒ他によってＣｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１２）（ｄｏｉ：１０．１１１１／ｃｅｉ．１２０２４）に記載されるＡＩＲＥ欠損マウスにおいて見出される対応する自己抗体の分類によって確認される（その開示内容は参照によって本明細書中に組み込まれる）。したがって、本発明の好ましい実施形態において、本発明の抗体はＩｇＧタイプのものであり、一層より好ましくはＩｇＧ４またはＩｇＧ１である。
【０１９８】
ＩｇＧの構造：
軽鎖は、カッパまたはラムダ（κ、λ）のいずれかに分類される。各重鎖クラスは、カッパまたはラムダ軽鎖のいずれかと結合することができる。一般に、ハイブリドーマ、Ｂ細胞または遺伝子操作した宿主細胞のいずれかによって免疫グロブリンが産生される場合、軽鎖および重鎖は互いに共有結合し、２本の重鎖の「テール」部分は共有結合性ジスルフィド結合または非共有結合によって互いに結合する。重鎖では、アミノ酸配列は、Ｙ構造のフォークヘッド末端にあるＮ末端から各鎖の下部にあるＣ末端へと延びている。軽鎖および重鎖の両方が、構造的および機能的相同性の領域に分けられる。用語「定常」および「可変」は、機能的に使用される。これに関して、軽鎖部分および重鎖部分の両方の可変ドメイン（ＶＬおよびＶＨ）は、抗原認識および抗原特異性を決定することが認識されよう。反対に、軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）および重鎖の定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３）は、分泌、経胎盤移動性、Ｆｃ受容体結合、補体結合などの重要な生物学的特性を付与する。慣例では、定常領域ドメインが抗体の抗原結合部位またはアミノ末端から遠ざかるにつれて、定常領域ドメインのナンバリングが増加する。Ｎ末端部分は可変領域であり、定常領域はＣ末端部分にある；ＣＨ３およびＣＬドメインは、実際には、それぞれ重鎖および軽鎖のカルボキシ末端を含む。
【０１９９】
上記のように、可変領域は、抗体が抗原上のエピトープを選択的に認識し、特異的に結合することを可能にする。すなわち、抗体のＶＬドメインおよびＶＨドメインまたは相補性決定領域（ＣＤＲ）のサブセットが組み合わさって、三次元の抗原結合部位を規定する可変領域を形成する。この四要素の抗体構造が、Ｙの各アームの末端に存在する抗原結合部位を形成する。より具体的には、抗原結合部位は、ＶＨ鎖およびＶＬ鎖それぞれの３つのＣＤＲによって規定される。本発明の目的の分子に特異的に結合するのに十分な構造を含有する任意の抗体または免疫グロブリン断片は、本明細書では「結合断片」または「免疫特異的断片」と互換的に表される。
【０２００】
天然に存在する抗体では、抗体は、各抗原結合ドメイン中に存在する「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも称される６つの超可変領域を含み、それらは、水性環境での抗体の三次元構造を想定して、抗原結合ドメインを形成するように特別に配置されている短い非連続的なアミノ酸配列である。「ＣＤＲ」は、より少ない分子間の多様性を示す４つの比較的保存された「フレームワーク」領域または「ＦＲ」に隣接する。フレームワーク領域は主としてβシート立体構造をとり、ＣＤＲは、βシート構造と連結し、いくつかの場合では、その一部を形成するループを形成する。したがって、フレームワーク領域は、鎖間非共有結合性相互作用によってＣＤＲの正しい方向での配置を提供する足場を形成するように作用する。配置されたＣＤＲによって形成された抗原結合ドメインは、免疫反応性抗原上のエピトープに対して相補的な表面を規定する。この相補性表面は、抗体のその同種エピトープへの非共有結合を促進する。それぞれＣＤＲおよびフレームワーク領域を含むアミノ酸は、正確に定義されているので、当業者であれば、任意の所定の重鎖または軽鎖可変領域についてそれらを容易に同定することができる；「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」，Ｋａｂａｔ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，（１９８３）；およびＣｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６（１９８７），９０１−９１７（これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
【０２０１】
当技術分野において使用されており、および／または認められている用語の定義が２つ以上ある場合、本明細書で使用される用語の定義は、特に明確な反対の指定がない限り、すべてのこのような意味を含むことを意図する。具体例は、重鎖および軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に見られる非連続的な抗原結合部位を説明する用語「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）の使用である。この特定の領域は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）およびＣｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６（１９８７），９０１−９１７（これらは、参照により本明細書に組み込まれる）によって記載されており、ここで、これらの定義は、互いに比較するとアミノ酸残基のオーバーラップまたはサブセットを含む。それにもかかわらず、抗体またはその変異体のＣＤＲを指すいずれかの定義の適用は、本明細書で定義および使用される用語の範囲内にあることを意図する。上記で引用した各参考文献によって定義されるＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基を、比較として以下の表２に示す。特定のＣＤＲを包含する正確な残基数は、ＣＤＲの配列およびサイズに応じて変化する。当業者であれば、どの残基がヒトＩｇＧサブタイプの抗体の特定の超可変領域またはＣＤＲを含むかを、その抗体の可変領域のアミノ酸配列を考慮してルーチンに決定することができる。
【０２０２】
表２：ＣＤＲの定義１
【表２】
2017527262.tif 000010
１表２におけるすべてのＣＤＲ定義の番号表記は、Ｋａｂａｔ他によって示される番号表記慣例に従う（下記を参照のこと）。
【０２０３】
Ｋａｂａｔらはまた、任意の抗体に適用可能な可変ドメイン配列のナンバリングシステムを定義した。当業者であれば、配列それ自体以外のいかなる実験データにも頼ることなく、任意の可変ドメイン配列にこの「Ｋａｂａｔナンバリング」システムを明確に割り当てることができる。本明細書で使用される場合、「Ｋａｂａｔナンバリング」は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）によって示されるナンバリングシステムを指す。特に明記されない限り、本発明の抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体における特定のアミノ酸残基の位置のナンバリングについての言及は、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従うものであるが、それは理論上のものであり、本発明のあらゆる抗体に等しく適用することはできない。例えば、最初のＣＤＲの位置に応じて、以降のＣＤＲがいずれかの方向にシフトする場合がある。
【０２０４】
一実施形態では、本発明の抗体は、ＩｇＭまたは５価構造を有するその誘導体ではない。特に、本発明の特定の用途、特に治療用途では、ＩｇＭは、その５価構造および親和性成熟の欠如のために非特異的な交差反応性および非常に低い親和性を示すことが多いので、ＩｇＭは、ＩｇＧおよび他の２価抗体または対応する結合分子よりも有用ではない。
【０２０５】
特に好ましい実施形態では、本発明の抗体は、ポリクローナル抗体ではない。すなわち、それは、血漿免疫グロブリン試料から得られる混合物ではなく１つの特定の抗体種から実質的になる。
【０２０６】
抗体断片、動物化：
単鎖抗体を含む抗体断片は、可変領域を単独で、または以下のものの全部もしくは一部と組み合わせて含むことができる：ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン。本発明の目的の分子に結合する断片であって、可変領域と、ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインとの任意の組み合わせをまた含む断片も本発明に含まれる。本発明の方法にしたがって単離されたモノクローナル抗体、特にヒトモノクローナル抗体と同等の本発明の抗体またはその免疫特異的断片は、鳥類および哺乳動物を含む任意の動物起源であり得る。好ましくは、抗体は、ヒト、マウス、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、リャマ、ウマまたはニワトリ抗体である。別の実施形態では、可変領域は、起源がコンドリクトイド（例えば、サメ由来）であり得る。
【０２０７】
本発明の特に好ましい実施形態において、抗体は、ヒト被験体からクローン化される天然に産出するヒトモノクローナル抗体またはその結合断片、誘導体および変異体であり、ただし、これらは、上記および下記において、例えば、表１、図（具体的には図３〜図１０）および実施例（例えば、実施例２および実施例５）において詳しく定義されるように本発明のＩＬ−２０に特異的に結合するものである。
【０２０８】
場合により、ヒト抗体のフレームワーク領域がデータベースにおける該当するヒト生殖系列可変領域配列に従ってアライメントされ、また、取り入れられる；例えば、ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国）によって提供されるＶｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）を参照のこと。例えば、真の生殖系列配列から潜在的に逸脱すると見なされるアミノ酸は、クローニング過程の期間中に組み込まれるＰＣＲプライマー配列に起因し得ると思われる。人為的に作製されたヒト様抗体、例えば、ファージディスプレイされた抗体ライブラリまたは異種マウスに由来する単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）などと比較した場合、本発明のヒトモノクローナル抗体は、（ｉ）代理動物の免疫応答ではなく、むしろ、ヒトの免疫応答を使用して得られること、すなわち、抗体が、ヒト体内におけるその関連する立体配座における天然型ＩＬ−２０に対する応答で作製されていること、（ｉｉ）個体を疾患（例えば、ＳＬＥ）の症状の存在から保護しているか、または、疾患（例えば、ＳＬＥ）の症状の存在を少なくとも有意に最小限に抑えていること、そして、（ｉｉｉ）抗体がヒト起源であるので、自己抗原に対する交差反応性の危険性が最小限に抑えられることによって特徴づけられる。したがって、本発明によれば、用語「ヒトモノクローナル抗体」、用語「ヒトモノクローナル自己抗体」および用語「ヒト抗体」などは、ヒト起源のものであるＩＬ−２０結合分子を示すために、すなわち、ヒト細胞（例えば、Ｂ細胞またはそのハイブリドーマなど）から単離されているか、あるいは、ｃＤＮＡがヒト細胞（例えば、ヒトメモリーＢ細胞）のｍＲＮＡから直接にクローン化されているＩＬ−２０結合分子を示すために使用される。ヒト抗体は、アミノ酸置換がたとえ、例えば、その結合特徴を改善するために、当該抗体において行われるにしても、依然として「ヒト」であると見なされる。
【０２０９】
下記の、および例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによる米国特許第５，９３９，５９８号明細書に記載されているように、ヒト免疫グロブリンライブラリ由来の抗体、または内在性免疫グロブリンを発現しない１つ以上のヒト免疫グロブリンについてトランスジェニックな動物由来の抗体は、それらを本発明の真のヒト抗体から区別するためにヒト様抗体と表される。
【０２１０】
例えば、典型的にはファージディスプレイから単離された合成および半合成抗体などのヒト様抗体の重鎖および軽鎖の対合は、それらが元のヒトＢ細胞で生じたような元の対合を必ずしも反映しない。したがって、従来技術で一般的に使用されている組換え発現ライブラリから得られたＦａｂおよびｓｃＦｖ断片は、免疫原性および安定性に対するすべての可能な関連効果に関して人工的であるとみなされ得る。
【０２１１】
対照的に、本発明は、ヒトにおけるその治療有用性を特徴とする、選択されたヒト被験体から単離された親和性成熟抗体を提供する。
【０２１２】
移植抗体（等価物）
本発明はまた、それぞれ抗ＩＬ−２０抗体などの本発明の抗体由来のＣＤＲを含む移植抗体（互換的に、等価物と称される）を提供する。このような移植ＣＤＲとしては、本発明の抗体のＣＤＲが移植されたか、または１つ以上のアミノ酸置換を含むＣＤＲが移植される動物化抗体が挙げられる。ＣＤＲは、上記のように、ヒトフレームワークまたは動物起源由来の抗体フレームワークに直接移植され得る。所望により、フレームワークライブラリを作製することによって、フレームワーク変化も組み込まれ得る。以下により詳細に記載されるように、ＣＤＲおよび／またはフレームワーク配列の最適化を独立しておよび連続的に組み合わせて実施することもできるし、または同時に実施することもできる。
【０２１３】
移植抗体を作製するために、本発明の抗体のドナーＣＤＲを、抗体アクセプタ可変領域フレームワークに移植する。活性を最適化するために抗体を移植してＣＤＲ変異体作製するための方法は、以前に記載されている（例えば、国際公開第９８／３３９１９号；国際公開第００／７８８１５号；国際公開第０１／２７１６０号を参照のこと）。この手順を実施して、ドナーＣＤＲの移植および親和性の再獲得を同時プロセスで達成し得る。可変領域の結合親和性を改変または最適化するために、この方法を単独でまたはＣＤＲ移植と組み合わせて同様に使用することができる。ドナーＣＤＲの結合親和性をアクセプタ可変領域に付与するための方法は、重鎖および軽鎖可変領域の両方に適用可能であり、それ自体を使用して抗体可変領域を移植し、それと同時に抗体可変領域の結合親和性を最適化することができる。
【０２１４】
ドナーＣＤＲ内の全位置または選択位置に複数の異なるアミノ酸残基変化を含むように、ドナーＣＤＲを改変することができる。ＣＤＲ種の様々な集団を生産するために、例えば、２０種の天然に存在するアミノ酸残基または予め選択されたサブセットのランダムな組み込みまたは偏った組み込みをドナーＣＤＲに導入することができる。ＣＤＲ変異体種を可変領域の様々な集団に含めることにより、所定の抗原に対して最適化された結合親和性を示す変異体種の作製が可能になる。一定範囲の可能な変化をドナーＣＤＲの位置で行うことができる。変化のために選択され得る可能な変化の一部または全部を、移植ドナーＣＤＲの集団に導入することができる。変化を導入するためにＣＤＲ内の単一位置を選択することもできるし、またはアミノ酸を改変した様々な位置が組み合わせて活性についてスクリーニングすることもできる。
【０２１５】
１つのアプローチは、例えば、全２０種の天然に存在するアミノ酸を各位置で置換することによって、ＣＤＲに沿ってすべてのアミノ酸位置を変化させることである。ＣＤＲの大部分が基準のドナーＣＤＲ配列を維持し、したがってドナーＣＤＲの結合親和性を維持するように、他のドナーＣＤＲアミノ酸位置との関連で各位置の置換を行うことができる。例えば、アクセプタ可変領域フレームワーク（天然または改変フレームワークのいずれか）に、ＣＤＲ内の各位置に単一位置の置換を含むＣＤＲの集団を移植することができる。同様に、全２０種のアミノ酸残基またはアミノ酸のサブセットを組み込むように変化させた２個以上の位置を含むＣＤＲの集団による移植のために、アクセプタ可変領域フレームワークを標的とすることができる。移植するべきＣＤＲ内またはＣＤＲ群内の１つ以上のアミノ酸位置を改変し、アクセプタ可変領域フレームワークに移植して移植抗体の集団を作製することができる。１つ以上の改変位置を有するＣＤＲは、所望により、１つ以上の改変位置を有する１つ以上の他のＣＤＲと組み合わせることができると理解される。
【０２１６】
１つ以上の改変位置を有するＣＤＲ変異体種の集団を、可変領域の結合ポケットを構成するＣＤＲのいずれかまたはすべてと組み合わせることができる。したがって、重鎖または軽鎖における１つ、２つまたは全３つのレシピエントＣＤＲ位置にドナーＣＤＲ変異体集団を同時に組み込むために、アクセプタ可変領域フレームワークを標的とすることができる。アミノ酸位置変化で標的とするためのＣＤＲまたはＣＤＲの数の選択は、例えば、アクセプタへの完全なＣＤＲ移植が望ましいか、または結合親和性の最適化のためにこの方法が実施されるかに依存するであろう。
【０２１７】
ドナーＣＤＲの結合親和性を抗体アクセプタ可変領域フレームワークに付与するために変化のためのドナーＣＤＲアミノ酸を選択するための別のアプローチは、公知のまたは容易に同定可能なＣＤＲ位置であって非常に変わりやすいものを選択することである。例えば、可変領域ＣＤＲ３は、一般に、非常に変わりやすい。したがって、結合親和性の再獲得もしくは増強を単独でまたは関連アクセプタ可変フレームワーク変化と一緒に確実にする移植手順では、この領域をアミノ酸位置変化の選択的な標的とすることができる。
【０２１８】
マウス化抗体：
上記のように、移植によって作製される抗体の例は、マウス化抗体である。本明細書で使用される場合、用語「マウス化抗体」または「マウス化免疫グロブリン」は、本発明のヒト抗体由来の１つ以上のＣＤＲ、およびマウス抗体配列に基づくアミノ酸置換および／または欠失および／または挿入を含有するヒトフレームワーク領域を含む抗体を指す。ＣＤＲを提供するヒト免疫グロブリンは「親」または「アクセプタ」と称され、フレームワーク変化をもたらすマウス抗体は「ドナー」と称される。定常領域は存在する必要がないが、存在する場合、それらは、通常、マウス抗体の定常領域と実質的に同一、すなわち、少なくとも約８５〜９０％、好ましくは約９５％またはそれ以上同一である。したがって、いくつかの実施形態では、全長マウス化ヒト重鎖免疫グロブリンまたは軽鎖免疫グロブリンは、マウス定常領域、ヒトＣＤＲ、および多数の「マウス化」アミノ酸置換を有する実質的にヒトのフレームワークを含有する。典型的には、「マウス化抗体」は、マウス化可変軽鎖および／またはマウス化可変重鎖を含む抗体である。例えば、キメラ抗体の可変領域全体は非マウスであるため、マウス化抗体は典型的なキメラ抗体を包含しないであろう。「マウス化」の工程によって「マウス化」された改変抗体は、ＣＤＲを提供する親抗体と同じ抗原に結合し、マウスでは親抗体と比較して免疫原性が通常低い。
【０２１９】
抗体断片：
本明細書で使用される場合、用語「重鎖部分」は、免疫グロブリン重鎖に由来するアミノ酸配列を含む。重鎖部分を含むポリペプチドは、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ（例えば、上部、中部および／または下部ヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインまたはその変異体もしくは断片の少なくとも１つを含む。例えば、本発明に使用される結合ポリペプチドは、ＣＨ１ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部およびＣＨ２ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部およびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖、またはＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含むことができる。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含む。さらに、本発明に使用される結合ポリペプチドは、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部（例えば、ＣＨ２ドメインの全部または一部）を欠くことができる。上記のように、当業者であれば、これらのドメイン（例えば、重鎖部分）のアミノ酸配列が天然に存在する免疫グロブリン分子と異なるように、これらのドメインを改変することができると理解するであろう。
【０２２０】
本明細書で開示される特定の抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体では、多量体の１つのポリペプチド鎖の重鎖部分は、多量体の第２のポリペプチド鎖上の重鎖部分と同一である。あるいは、本発明の重鎖部分含有単量体は同一ではない。例えば、各単量体は、異なる標的結合部位を含むことができ、例えば、二重特異性抗体または二特異性抗体を形成する。
【０２２１】
別の実施形態では、本明細書で開示される抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体は、ｓｃＦｖなどの単一ポリペプチド鎖から構成され、潜在的なインビボ治療用途および診断用途のために細胞内に発現され得る（細胞内抗体）。
【０２２２】
本明細書で開示される診断方法および治療方法に使用される結合ポリペプチドの重鎖部分は、様々な免疫グロブリン分子に由来し得る。例えば、ポリペプチドの重鎖部分は、ＩｇＧ１分子に由来するＣＨ１ドメイン、およびＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域を含むことができる。別の例では、重鎖部分は、ＩｇＧ１分子に部分的に由来するヒンジ領域、およびＩｇＧ３分子に部分的に由来するヒンジ領域を含むことができる。別の例では、重鎖部分は、ＩｇＧ１分子に部分的に由来するキメラヒンジ、およびＩｇＧ４分子に部分的に由来するキメラヒンジを含むことができる。
【０２２３】
したがって、実施例にも例示されているように、一実施形態では、本発明の抗体の定常領域またはその一部、特にＣＨ２および／またはＣＨ３ドメイン、しかし場合によりＣＨ１ドメインは、本発明の方法にしたがって単離されたネイティブなヒトモノクローナル抗体の可変領域に対して異種性である。本文脈では、異種定常領域は、本発明の抗体の治療用途の場合には、好ましくはヒト起源のものであるが、動物研究の場合には、例えば齧歯類起源のものであり得る（実施例も参照のこと）。
【０２２４】
本明細書で使用される場合、用語「軽鎖部分」は、免疫グロブリン軽鎖由来のアミノ酸配列を含む。好ましくは、軽鎖部分は、ＶＬまたはＣＬドメインの少なくとも１つを含む。
【０２２５】
先に示したように、様々な免疫グロブリンクラスの定常領域のサブユニット構造および三次元構造が周知である。本明細書で使用される場合、用語「ＶＨドメイン」は免疫グロブリン重鎖のアミノ末端可変ドメインを含み、用語「ＣＨ１ドメイン」は免疫グロブリン重鎖の第１の（最もアミノ末端の）定常領域ドメインを含む。ＣＨ１ドメインはＶＨドメインに隣接し、免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域に対してアミノ末端側にある。
【０２２６】
本明細書で使用される場合、用語「ＣＨ２ドメイン」は、例えば、従来のナンバリングスキームを使用すれば抗体の約残基２４４〜残基３６０（Ｋａｂａｔナンバリングシステムでは残基２４４〜３６０；およびＥＵナンバリングシステムでは残基２３１〜３４０、Ｋａｂａｔ  ＥＡ  ｅｔ  ａｌ．上掲を参照のこと）に及ぶ重鎖分子の部分を含む。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと密接に対合していないという点が固有である。どちらかといえば、２つのＮ−結合分岐状炭水化物鎖が、インタクトな天然ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメイン間に挿入される。ＣＨ３ドメインはＣＨ２ドメインからＩｇＧ分子のＣ末端に及び、約１０８個の残基を含むこともまた詳細に記載されている。
【０２２７】
本明細書で使用される場合、用語「ヒンジ領域」は、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインに結合する重鎖分子の部分を含む。このヒンジ領域は約２５個の残基を含み、柔軟であり、したがって２つのＮ末端抗原結合領域が独立して動くことを可能にする。ヒンジ領域を３つの異なるドメイン：上部、中部および下部ヒンジドメインに細分化することができる；Ｒｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（１９９８），４０８３を参照のこと。
【０２２８】
本明細書で使用される場合、用語「ジスルフィド結合」は、２個の硫黄原子間に形成される共有結合を含む。アミノ酸システインは、ジスルフィド結合を形成することができるか、または第２のチオール基と架橋することができるチオール基を含む。天然に存在するＩｇＧ分子の大部分では、ＣＨ１およびＣＬ領域はジスルフィド結合によって連結され、２本の重鎖は、Ｋａｂａｔナンバリングシステムを使用すれば２３９位および２４２位に対応する位置で（ＥＵナンバリングシステムでは、２２６位または２２９位）２つのジスルフィド結合によって連結される。
【０２２９】
本明細書中で使用される場合、用語「連結される」、「融合される」または「融合」は交換可能に使用される。これらの用語は、化学的コンジュゲート化または組換え手段を含むどのような手段によってでも、２つ以上の要素または成分を一緒につなぐことを示す。「読み枠を合わせた融合」は、２つ以上のポリヌクレオチドのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、これらの元々のＯＲＦの正しい翻訳読み枠を維持する様式で、連続したより長いＯＲＦを形成するためにつなぐことを示す。したがって、組換え融合タンパク質は、元々のＯＲＦによってコードされるポリペプチドに対応する２つ以上のセグメントを含有する単一タンパク質である（そのようなセグメントは通常、自然界ではそのようにつながれない）。したがって、読み枠が、融合されたセグメントの全体にわたって連続にされるにもかかわらず、これらのセグメントは、例えば、読み枠を合わせたリンカー配列によって物理的または空間的に隔てられる場合がある。例えば、免疫グロブリン可変領域のＣＤＲをコードするポリヌクレオチドが、読み枠を合わせて融合される場合があり、しかし、「融合された」ＣＤＲが、連続したポリペプチドの一部として共翻訳される限り、少なくとも１つの免疫グロブリンフレームワーク領域またはさらなるＣＤＲ領域をコードするポリヌクレオチドによって隔てられる場合がある。
【０２３０】
エピトープ：
抗体のためのペプチドまたはポリペプチドのエピトープの最小サイズは約４〜５個のアミノ酸であると考えられる。ペプチドまたはポリペプチドのエピトープは好ましくは、少なくとも７個のアミノ酸を含有し、より好ましくは少なくとも９個のアミノ酸を含有し、最も好ましくは少なくとも約１５〜約３０個の間のアミノ酸を含有する。ＣＤＲは抗原性のペプチドまたはポリペプチドをその三次形態で認識することができるので、エピトープを構成するアミノ酸は連続している必要はなく、いくつかの場合には、同じペプチド鎖に存在していないことさえある。本発明において、本発明の抗体によって認識されるペプチドまたはポリペプチドのエピトープは、抗体が２つ以上のサブタイプを認識する場合には、本発明の目的とする分子、すなわち、ＩＬ−２０の相同的配列の少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、より好ましくは少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、約１５〜約３０個の間または約３０〜約５０個の間の連続したアミノ酸または不連続なアミノ酸からなる配列を含有する。好ましくは、本発明の抗体によって認識されるペプチドは１５〜１８個のアミノ酸を含む。好ましい実施形態では、前記ペプチドは、ヒトＩＬ−２０由来の連続した１８個のアミノ酸からなる配列ＰＤＨＹＴＬＲＫＩＳＳＬＡＮＳＦＬＴ（配列番号６９）を含む。好ましい別の実施形態では、前記ペプチドエピトープは、配列ＤＨＹＴＬＲＫＩＳＳＬＡＮＳＦ（配列番号７０）からなる１５個アミノ酸を含む。
【０２３１】
結合特性：
本明細書で互換的に使用される「結合する」または「認識する」は、一般に、結合分子、例えば、抗体がその抗原結合ドメインを介して所定のエピトープに結合すること、およびその結合が抗原結合ドメインとエピトープとの間のある程度の相補性を必要とすることを意味する。この定義によれば、抗体がランダムな無関係のエピトープに結合するよりも容易に、その抗原結合ドメインを介してエピトープに結合する場合、その抗体はそのエピトープに「特異的に結合する」と言われる。用語「特異性」は、本明細書では、ある特定の抗体がある特定のエピトープに結合する相対的親和性を特定するのに使用される。例えば、抗体「Ａ」が抗体「Ｂ」よりも所定のエピトープに対して高い特異性を有するとみなしてもよいし、または抗体「Ａ」が、関連エピトープ「Ｄ」に対して有するよりも高い特異性でエピトープ「Ｃ」に結合すると言うこともできる。無関係のエピトープは、通常、所定の結合分子の結合特異性の評価に使用され得る非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼインまたは任意の他の特定のポリペプチド）の一部である。これに関して、用語「特異的結合」は、抗体が、非特異的抗原に対する結合のそのＫＤよりも少なくとも２倍低いＫＤで、所定の抗原に結合することを指す。本明細書で使用される場合、用語「高特異的」結合は、特定の標的エピトープに対する抗体の相対ＫＤが、他のリガンドに対するその抗体の結合のＫＤよりも少なくとも１０倍低いことを意味する。
【０２３２】
存在する場合、抗体の抗原との「免疫学的結合特性」または他の結合特性という用語は、そのすべての文法の形式で、抗体の特異性、親和性、交差反応性および他の結合特性を指す。
【０２３３】
「優先的に結合する」によって、結合分子、例えば、抗体が、関連したエピトープ、類似したエピトープ、相同的なエピトープまたは相似的なエピトープに結合するであろうよりも容易に、ある１つのエピトープに特異的に結合することが意味される。したがって、所与のエピトープに「優先的に結合する」抗体は、そのような抗体が関連のエピトープと交差反応することがあるとしても、そのエピトープに結合する可能性が、関連したエピトープに結合することができる場合よりも大きいであろう。
【０２３４】
非限定的な例として、結合分子、例えば、抗体が、その抗体の第２のエピトープに対する解離定数（ＫＤ）よりも低いＫＤで第１のエピトープに結合する場合、それは第１のエピトープに選択的に結合するとみなされ得る。別の非限定的な例では、抗体が、その抗体の第２のエピトープに対するＫＤよりも少なくとも１桁低い親和性で第１のエピトープに結合する場合、抗体は前記第１の抗原に選択的に結合するとみなされ得る。別の非限定的な例では、抗体が、その抗体の第２のエピトープに対するＫＤよりも少なくとも２桁低い親和性で第１のエピトープに結合する場合、抗体は前記第１のエピトープに選択的に結合するとみなされ得る。
【０２３５】
別の非限定的な例では、結合分子、例えば、抗体が、その抗体の第２のエピトープに対する解離速度（ｋ（ｏｆｆ））よりも低いｋ（ｏｆｆ）で第１のエピトープに結合する場合、それは第１のエピトープに選択的に結合するとみなされ得る。別の非限定的な例では、抗体が、その抗体の第２のエピトープに対するｋ（ｏｆｆ）よりも少なくとも１桁低い親和性で第１のエピトープに結合する場合、抗体は第１のエピトープに選択的に結合するとみなされ得る。別の非限定的な例では、抗体が、その抗体の第２のエピトープに対するｋ（ｏｆｆ）よりも少なくとも２桁低い親和性で第１のエピトープに結合する場合、抗体は第１のエピトープに選択的に結合するとみなされ得る。
【０２３６】
本明細書で開示される結合分子、例えば、抗体または抗原結合断片、変異体または誘導体は、５×１０−２秒−１、１０−２秒−１、５×ｌ０−３秒−１またはｌ０−３秒−１以下の解離速度（ｋ（ｏｆｆ））で、本発明の目的の分子またはその断片もしくは変異体と結合すると言うことができる。より好ましくは、本発明の抗体は、５×１０−４秒−１、１０−４秒−１、５×１０−５秒−１、または１０−５秒−１５×１０−６秒−１、１０−６秒−１、５×１０−７秒−１または１０−７秒−１以下の解離速度（ｋ（ｏｆｆ））で、本発明の目的の分子またはその断片もしくは変異体と結合すると言うことができる。
【０２３７】
本明細書で開示される結合分子、例えば、抗体または抗原結合断片、変異体または誘導体は、１０３Ｍ−１秒−１、５×１０３Ｍ−１秒−１、１０４Ｍ−１秒−１または５×１０４Ｍ−１秒−１以上の結合速度（ｋ（ｏｎ））で、本発明の目的の分子またはその断片もしくは変異体と結合すると言うことができる。より好ましくは、本発明の抗体は、１０５Ｍ−１秒−１、５×１０５Ｍ−１秒−１、１０６Ｍ−１秒−１、または５×１０６Ｍ−１秒−１または１０７Ｍ−１秒−１以上の結合速度（ｋ（ｏｎ））で、本発明の目的の分子またはその断片もしくは変異体と結合すると言うことができる。
【０２３８】
結合分子、例えば、抗体が、所定のエピトープに対する基準抗体の結合をいくらか遮断する程度にそのエピトープに選択的に結合する場合、所定のエピトープに対する基準抗体の結合を競合的に阻害すると言われる。当技術分野において公知の任意の方法、例えば、競合ＥＬＩＳＡアッセイによって競合的阻害を判定することができる。抗体は、所定のエピトープに対する基準抗体の結合を少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％競合的に阻害すると言うことができる。
【０２３９】
本明細書で使用される場合、用語「親和性」は、結合分子、例えば、個々のエピトープと、免疫グロブリン分子のＣＤＲとの結合強度の程度を指す。例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．（１９８８）の第２７頁〜第２８頁を参照のこと。本明細書で使用される場合、用語「結合活性」は、免疫グロブリンの集団と抗原との間の複合体の総合的な安定性、すなわち、免疫グロブリン混合物と抗原との機能的結合強度を指す。例えば、Ｈａｒｌｏｗの第２９頁〜第３４頁を参照のこと。結合活性は、集団中の個々の免疫グロブリン分子と特異的エピトープとの親和性、およびさらに免疫グロブリンおよび抗原の結合価の両方に関連する。例えば、２価のモノクローナル抗体と、ポリマーなどの高頻度反復エピトープ構造を有する抗原との間の相互作用は、高い結合活性の１つであろう。任意の適切な方法を使用して抗原に対する抗体の親和性または結合活性を実験的に決定することができる。例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，「Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」Ｉｎ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８４）、Ｋｕｂｙ，Ｊａｎｉｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９２）、および本明細書に記載される方法を参照のこと。抗原に対する抗体の親和性を測定するための一般的な技術としては、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡおよび表面プラズモン共鳴が挙げられる。異なる条件下（例えば、塩濃度、ｐＨ）で測定する場合、特定の抗体抗原間相互作用の測定された親和性は変化し得る。したがって、標準化した抗体抗原溶液および標準化した緩衝液を用いて、親和性および他の抗原結合パラメータ、例えば、ＫＤ、ＩＣ５０を測定することが好ましい。
【０２４０】
本発明の結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体はまた、それらの交差反応性に関して記載または明示され得る。本明細書で使用される場合、用語「交差反応性」は、第１の抗原に対して特異的な抗体の第２の抗原と反応する能力；２つの異なる抗原性物質間の関連性の程度を指す。したがって、抗体が、その抗体の形成を誘導したエピトープと異なるエピトープに結合する場合、その抗体は交差反応性である。交差反応性エピトープは、一般に、抗体を誘導したエピトープと同じ相補的な構造的特徴の多くを含み、いくつかの場合では、実際には元のエピトープよりも適合する可能性がある。
【０２４１】
例えば、ある特定の抗体が、関連するが同一ではないエピトープ、例えば、基準エピトープに対して少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、および少なくとも５０％の（当技術分野において公知の、および本明細書に記載される方法を使用して計算されるような）同一性を有するエピトープに結合するという点で、それらはある程度の交差反応性を有する。抗体が基準エピトープに対して９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、および５０％未満の（当技術分野において公知の、および本明細書に記載される方法を使用して計算されるような）同一性を有するエピトープに結合しない場合、それは交差反応性をほとんど、または全く持たないと言うことができる。抗体があるエピトープの他の任意の類似体、オーソログまたは相同体に結合しない場合、それはそのエピトープに対して「非常に特異的である」とみなすことができる。
【０２４２】
本発明の結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体はまた、本発明の目的の分子に対する結合親和性に関して記載または明示され得る。好ましい結合親和性には５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、または１０−１５Ｍ未満の解離定数またはＫＤを有するものが含まれる。典型的には、抗体は、１０−７Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）で、その所定の抗原に結合する。好ましくは、抗体は、１０−９Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）で、さらにより好ましくは１０−１１Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）で、その同種抗原に結合する。
【０２４３】
抗体の改変：
免疫グロブリンまたはそれをコードするｃＤＮＡをさらに改変することができる。したがって、さらなる実施形態では、本発明の方法は、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、二重特異性抗体、融合抗体、標識抗体またはこれらのいずれか１つの類似体を生産する工程のいずれか１つを含む。対応する方法が当業者に公知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８８に記載されている。ファージディスプレイ技術によって前記抗体の誘導体を得る場合、本発明に提供される抗体のいずれか１つのものと同じエピトープに結合するファージ抗体の効率性を上昇させるために、ＢＩＡｃｏｒｅシステムにおいて用いられるように、表面プラズモン共鳴を使用することができる（Ｓｃｈｉｅｒ，Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ７（１９９６），９７−１０５；Ｍａｌｍｂｏｒｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８３（１９９５），７−１３）。例えば、国際公開第８９／０９６２２号には、キメラ抗体の生産が記載されている。欧州特許出願公開第０２３９４００号明細書および国際公開第９０／０７８６１号には、ヒト化抗体の生産方法が記載されている。本発明にしたがって用いられる抗体のさらなる供給源は、いわゆるゼノジニック抗体である。例えば、国際公開第９１／１０７４１号、国際公開第９４／０２６０２号、国際公開第９６／３４０９６号および国際公開第９６／３３７３５号には、マウスにおけるヒト抗体などのゼノジニック抗体の生産についての一般的原理が記載されている。上記のように、本発明の抗体は、完全抗体の他に、例えば、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２を含む様々な形態で、ならびに単鎖形態で存在し得る。例えば、国際公開第８８／０９３４４号を参照のこと。
【０２４４】
当技術分野において公知の従来の技術を使用して、例えば、アミノ酸の欠失、挿入、置換、付加、および／または組換えおよび／または当技術分野において公知の任意の他の改変を単独でまたは組み合わせて使用することによって、本発明の抗体またはそれらの対応する免疫グロブリン鎖をさらに改変することができる。免疫グロブリン鎖アミノ酸配列の基礎となるＤＮＡ配列にこのような改変を導入する方法は当業者に周知である；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）Ｎ．Ｙ．およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９９４）を参照のこと。本発明の抗体の改変としては、アセチル化、ヒドロキシル化、メチル化、アミド化、および炭水化物もしくは脂質部分、補因子などの結合を含む、側鎖改変、骨格改変、ならびにＮ末端およびＣ末端改変を含む、１つ以上の構成アミノ酸における化学的および／または酵素的誘導体化が挙げられる。同様に、本発明は、標識または薬物などの異種性分子がアミノ末端に融合された記載される抗体またはそのいくつかの断片を含むキメラタンパク質の生産を包含する。このようにして作製された抗原結合分子は、それぞれ罹患細胞および組織の適切な表面構造を発現する細胞への薬物局在化に使用することができる。この標的化および細胞への結合は、治療的または診断的に活性な薬剤の送達および遺伝子治療／遺伝子送達に有用であり得る。本発明の抗体を有する分子／粒子は、目的の特定の抗原を発現する細胞／組織に特異的に結合するので、診断用途および治療用途を有し得る。
【０２４５】
試料：
本明細書で使用される場合、用語「試料」又は「生物学的試料」は、被験体または患者から得られる任意の生物学的物質を指す。一態様では、試料は、血液、脳脊髄液（「ＣＳＦ」）または尿を含み得る。他の態様では、試料は、全血、血漿、末梢血から濃縮された単核細胞（ＰＢＭＣ）、例えば、リンパ球（すなわち、Ｔ細胞、ＮＫ細胞またはＢ細胞）、単球、マクロファージ、樹状細胞および好塩基球；および培養細胞（例えば、被験体由来のＢ細胞）を含み得る。試料はまた、腫瘍組織を含む生検または組織試料を含み得る。さらに他の態様では、試料は、全細胞および／または細胞溶解物を含み得る。一実施形態では、試料は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む。当技術分野において公知の方法によって試料を採取することができる。
【０２４６】
疾患および障害：
特に指定がない限り、用語「障害」および「疾患」は、本明細書では互換的に使用される。本明細書で使用される場合、用語「自己免疫性障害」は、個体自身の組織または器官またはその同時分離体または徴候またはそれらから生じる症状から生じるかまたそれらに対する疾患または障害である。自己免疫性疾患は適応免疫反応の脱調節によって主に引き起こされ、自己構造に対する自己抗体または自己反応性Ｔ細胞が形成される。ほぼすべての自己免疫性疾患は、炎症性成分を有する。自己炎症性疾患は主に炎症性であり、いくつかの古典的な自己炎症性疾患は、先天性炎症経路の遺伝的欠陥によって引き起こされる。自己炎症性疾患では、自己反応性Ｔ細胞または自己抗体は見られない。これらの自己免疫性および自己炎症性障害の多くにおいて、限定されないが、高ガンマグロブリン血症、高レベルの自己抗体、組織中の抗原抗体複合体沈着、副腎皮質ステロイドまたは免疫抑制性処置から恩恵を受けるもの、および罹患組織中のリンパ系細胞凝集塊を含む多くの臨床用および研究用のマーカが存在し得る。Ｂ細胞媒介性自己免疫性障害に関する理論に限定されないが、Ｂ細胞は、自己抗体産生、免疫複合体形成、樹状およびＴ細胞活性化、サイトカイン合成、ケモカインの直接放出、および異所性新リンパ形成に対しての病巣の提供を含む、多くの機構的な経路によりヒト自己免疫性疾患において病原性効果を示すことが考えられる。これらの経路のそれぞれが、自己免疫性疾患の病状に異なった度合いで寄与し得る。
【０２４７】
本明細書中で使用される場合、「自己免疫障害」は、器官特異的疾患であること（すなわち、免疫応答が、器官系に対して、例えば、内分泌系、造血系、皮膚、心肺系、胃腸系および肝臓系、腎臓系、甲状腺、耳、神経筋系、中枢神経系などに対して特異的に向けられる）、または、多数の器官系を冒し得る全身性疾患（これには、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性筋炎、自己免疫性多腺性内分泌不全症症候群１型（ＡＰＳ１）／自己免疫性多腺性内分泌不全症・カンジダ症・外胚葉ジストロフィー（ＡＰＥＣＥＤ）などが含まれるが、これらに限定されない）であることが可能である。好ましいそのような疾患には、多発性硬化症（ＭＳ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、様々な形態の自己免疫性のリウマチ学的障害（関節リウマチ、若年性関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、脊椎関節炎、乾癬性関節炎、シェーグレン症候群、強皮症、狼瘡（ＳＬＥおよびループス腎炎を含むが、これらに限定されない）、多発性筋炎／皮膚筋炎および乾癬性関節炎を含むが、これらに限定されない）を含むが、これらに限定されない）、自己免疫性の皮膚科学的障害（乾癬、天疱瘡群疾患、水疱性類天疱瘡疾患および皮膚エリテマトーデスを含むが、これらに限定されない）、および、自己免疫性の内分泌障害（糖尿病関連の自己免疫疾患（例えば、１型糖尿病またはインスリン依存性糖尿病（Ｔ１ＤＭまたはＩＤＤＭ）など）、自己免疫性の甲状腺疾患（グレーブス病および甲状腺炎を含むが、これらに限定されない）、および、自己免疫の生成に影響を及ぼす疾患（自己免疫性多腺性内分泌不全症症候群１型（ＡＰＳ１）／自己免疫性多腺性内分泌不全症・カンジダ症・外胚葉ジストロフィー（ＡＰＥＣＥＤ）および重症筋無力症（ＭＧ／胸腺腫）を含むが、これらに限定されない）を含むが、これらに限定されない。好ましい疾患には、例えば、ＳＬＥ、ＲＡ、脊椎関節炎、乾癬性関節炎、乾癬、シェーグレン症候群、グレーブス病、甲状腺炎、糸球体腎炎およびＡＰＳ１が含まれる。一層より好ましいものが、ＲＡおよびＳＬＥであり、最も好ましいものがＳＬＥである。
【０２４８】
ＩＬ−２０アンタゴニスト（例えば、抗ＩＬ−２０抗体など）のさらなる医学的使用が近年には、例えば、関節リウマチおよび骨粗鬆症を防止または処置するために国際出願公開ＷＯ２０１０／０４２６３４において、肝線維症を軽減させるために国際出願公開ＷＯ２０１４／０２５７６７において、アレルギー性気道障害（例えば、喘息または気管支気道閉塞など）を処置するために国際出願公開ＷＯ２０１４／０２５７７５において、また、骨折を有する被験体において骨折治癒を促進させるために国際出願公開ＷＯ２０１４／０３６３８４において記載されている。
【０２４９】
標識および診断：
標識剤は、例えば、免疫複合体を調製するために、本発明の抗体または抗原に直接的または間接的のいずれかでカップリングされ得る。間接的カップリングの一例は、スペーサ部分の使用によるものである。さらに、本発明の抗体は、共有結合または非共有結合によって連結されているさらなるドメインを含み得る。この連結は、当技術分野において公知の上記方法による遺伝的融合に基づくものでもよいし、または例えば国際公開第９４／０４６８６号に記載されている化学的架橋によって実施することもできる。本発明の抗体を含む融合タンパク質中に存在するさらなるドメインは、好ましくは、可撓性リンカー、有利にはポリペプチドリンカーによって連結され得、前記ポリペプチドリンカーは、前記さらなるドメインのＣ末端と本発明の抗体のＮ末端との間（またはその逆も同様である）の距離に及ぶのに十分な長さの、複数の親水性ペプチド結合アミノ酸を含む。治療的または診断的に活性な薬剤が、様々な方法によって、本発明の抗体またはその抗原結合断片にカップリングされ得る。これとしては、例えば、共有的な方法、例えばペプチド結合によって、治療的または診断的に活性な薬剤にカップリングされた、本発明の抗体の可変領域を含む単鎖融合タンパク質が挙げられる。さらなる例としては、さらなる分子に共有結合または非共有結合によってカップリングされた抗原結合断片を少なくとも含む分子が挙げられ、以下の非限定的な例示的リスト中のものが挙げられる。Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｒｐ．ＳｕＤＰ  ７（１９９２），５１−５２には、ＣＤ３に対するＦｖ領域が、可溶性ＣＤ４または他のリガンド、例えばＯＶＣＡおよびＩＬ−７にカップリングされている、二重特異性試薬ヤヌシンが記載されている。同様に、本発明の抗体の可変領域をＦｖ分子に構築して、引用文献に示されている代替的リガンドにカップリングすることができる。Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓｅａｓｅ  １６６（１９９２），１９８−２０２には、ＧＰ１２０のＶ３領域中の特定の配列に対する抗体に架橋されたＯＫＴ３からなるヘテロコンジュゲート抗体が記載されている。このようなヘテロコンジュゲート抗体はまた、本発明の方法の抗体中に含まれる少なくとも可変領域を使用して構築され得る。特異的抗体のさらなる例としては、Ｆａｎｇｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｓ．６８（１９９３），１８１−１９４およびＦａｎｇｅｒ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２（１９９２），１０１−１２４に記載されている抗体が挙げられる。従来の抗体を含む免疫毒素であるコンジュゲートは、当技術分野において広く記載されている。従来のカップリング技術によって毒素を抗体にカップリングしてもよいし、またはタンパク質毒素部分を含む免疫毒素を融合タンパク質として生産してもよい。本発明の抗体は、このような免疫毒素を得るための対応する方法で使用され得る。このような免疫毒素の例示は、Ｂｙｅｒｓ，Ｓｅｍｉｎａｒｓ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２（１９９１），５９−７０およびＦａｎｇｅｒ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １２（１９９１），５１−５４によって記載されているものである。
【０２５０】
上記融合タンパク質は、プロテアーゼにより切断可能なリンカーまたは切断部位をさらに含み得る。これらのスペーサ部分は順に不溶性でもよいしまたは可溶性でもよく（Ｄｉｅｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３１（１９８６），１４８）、標的部位における抗原からの薬物放出を可能にするように選択され得る。免疫療法のための本発明の抗体および抗原にカップリングされ得る治療剤の例は、ケモカイン、ホーミング分子、薬物、放射性同位体、レクチンおよび毒素である。本発明の抗体および抗原にコンジュゲートされ得る薬物は、コンジュゲート分子を使用しようとする疾患状況に依存する。例えば、腫瘍疾患の処置に有用な標的に対して特異的な抗体を、古典的には抗腫瘍薬物と称される化合物、例えば、マイトマイシンＣ、ダウノルビシンおよびビンブラスチンにコンジュゲートすることができる。例えば、腫瘍免疫療法のために、放射性同位体とコンジュゲートした本発明の抗体または抗原を使用する際には、特定の同位体が、白血球分布ならびに安定性および放射などの因子に応じて、他の同位体よりも好ましい場合がある。自己免疫反応に応じて、いくつかの放射体が、他の放射体よりも好ましい場合がある。一般に、α粒子およびβ粒子を放射する放射性同位体が、免疫療法では好ましい。ショートレンジの高エネルギー放射体、例えば２１２Ｂｉが好ましい。治療目的では、本発明の抗体または抗原に結合され得る放射性同位体の例は、１２５Ｉ、１３１Ｉ、９０Ｙ、６７Ｃｕ、２１２Ｂｉ、２１２Ａｔ、２１１Ｐｂ、４７Ｓｃ、１０９Ｐｄおよび１８８Ｒｅである。本発明の抗体または抗原にカップリングされ得る他の治療剤、ならびにエクスビボおよびインビボの治療プロトコールは公知であるか、または当業者であれば容易に確認することができる。標識するのに適切な放射性核種の非限定的な例は、１９８Ａｕ、２１２Ｂｉ、１１Ｃ、１４Ｃ、５７Ｃｏ、６７Ｃｕ、１８Ｆ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、３Ｈ、１９７Ｈｇ、１６６Ｈｏ、１１１Ｉｎ、１１３ｍＩｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１２７Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、１５Ｏ、１３Ｎ、３２Ｐ、３３Ｐ、２０３Ｐｂ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、３５Ｓ、１５３Ｓｍおよび９９ｍＴｃである。標識するのに適切な他の分子は、蛍光色素または発光色素、磁気粒子、金属、および二次的な酵素または結合工程によって検出可能な分子、例えば、酵素またはペプチドタグである。本発明で標識として使用するのに適切な市販の蛍光プローブは、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（この開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる）に列挙されている。磁気粒子ベースのアッセイ（ＭＰＡ）に使用するのに適切な磁気粒子は、常磁性物質、反磁性物質、強磁性物質、強磁性物質および超常磁性物質から選択され得る。
【０２５１】
診断目的に有用な分子および細胞生化学の一般的な方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００１）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  Ｅｄ．（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  １９９９）；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｂｏｌｌａｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  １９９６）などの標準的な教科書に見られ得る。診断目的用の試薬、検出手段およびキットは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、およびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈなどの商業ベンダー、ならびに本明細書で引用されている参考文献、特に特許文献のいずれか１つに示されている供給源から市販されている。
【０２５２】
処置および薬物：
本明細書で使用される場合、用語「処置する」または「処置」は、自己免疫性疾患および／または自己炎症性疾患の発症などの望ましくない生理的変化または障害を防止するか、または遅延（減少）させることを目的とする治療的処置および予防的または防止的手段の両方を指す。有益なまたは所望の臨床結果としては、限定されないが、検出可能であるかまたは検出不可能であるかにかかわらず、症候の軽減、疾患の程度の縮小、安定化した（すなわち、悪化していない）疾患状態、疾患進行の遅延または緩慢化、疾患状態の寛解または緩和、および（部分的であるかまたは完全であるかにかかわらず）寛解が挙げられる。「処置」はまた、処置を受けない場合に予想される生存期間と比較して生存期間を延長させることを意味し得る。処置を必要とする者としては、症状または障害を既に有する者、ならびに症状または障害を有する傾向がある者、または症状または障害の徴候を防止するべき者が挙げられる。
【０２５３】
特に指定がなければ、用語「薬物」、「医薬」または「医薬品」は、本明細書では互換的に使用され、限定されないが、（Ａ）内用または外用の物品、医薬および調製物、ならびにヒトまたは他の動物のいずれかの疾患の診断、治癒、緩和、処置または予防に使用することを目的とする任意の物質または物質の混合物；ならびに（Ｂ）ヒトまたは他の動物の体の構造または任意の機能に影響を与えることを目的とする物品、医薬および調製物（食品を除く）；ならびに（Ｃ）項目（Ａ）および（Ｂ）で指定された任意の物品の成分として使用することを目的とする製品を含むものである。用語「薬物」、「医薬」または「医薬品」は、１つ以上の「薬剤」、「化合物」、「物質」または「（化学）組成物」、ならびにいくつかの他の文脈ではさらに充填剤、崩壊剤、潤滑剤、流動促進剤、結合剤のような他の薬学的に不活性な賦形剤、またはヒトもしくは他の動物の体内の目的の標的部位（例えば、皮膚、胃または腸内）における「薬物」、「医薬」もしくは「医薬品」の容易な運搬、崩壊、分解、溶解および生物学的アベイラビリティを確保するものを含有する、ヒトまたは他の動物のいずれかで使用することを目的とする調製物の製剤一式を含むものである。用語「薬剤」、「化合物」または「物質」は、本明細書では互換的に使用され、より具体的な文脈では、限定されないが、すべての薬理学的に活性な薬剤（すなわち、所望の生物学的または薬理学的効果を誘導するか、または本発明の方法によってこのような可能な薬理学的効果を誘導する能力について調査または試験される薬剤）を含むものである。
【０２５４】
「抗リウマチ薬」および免疫抑制薬の例としては、クロロキン、ヒドロキシクロロキノン、ミオクリシン、オーラノフィン、スルファサラジン、メトトレキセート、レフルノミド、エタネルセプト、インフリキシマブ（プラス経口および皮下用メトトレキセート）、アダリムマブなど、アザチオプリン、Ｄ−ペニシラミン、ゴールド塩類（経口）、ゴールド塩類（筋肉内）、ミノサイクリン、シクロスポリンＡおよび局所性シクロスポリンを含むシクロスポリン、タクロリムス、ミコフェノール酸モフェチル、シクロホスファミド、ブドウ球菌プロテインＡ（Ｇｏｏｄｙｅａｒ  ａｎｄ  Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９７（２００３），１２５−３９）が挙げられ、これらの塩および誘導体などを含む。
【０２５５】
「非ステロイド系抗炎症薬」または「ＮＳＡＩＤ」の例としては、アスピリン、アセチルサリチル酸、イブプロフェンおよびイブプロフェン遅延剤、フェノプロフェン、ピロキシカム、フルルビプロフェン、ナプロキセン、ケトプロフェン、ナプロキセン、テノキシカム、ベノリレート、ジクロフェナク、ナプロキセン、ナブメトン、インドメタシン、ケトプロフェン、メフェナム酸、ジクロフェナク、フェンブフェン、アザプロパゾン、アセメタシン、チアプロフェン酸、インドメタシン、スリンダク、トルメチン、フェニルブタゾン、ジクロフェナクおよびジクロフェナク遅延剤、ＧＲ２５３０３５などのシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）−２インヒビター、ＭＫ９６６、セレコキシブ（ＣＥＬＥＢＲＥＸ（登録商標）；４−（５−（４−メチルフェニル）−３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾロ−１−イル）ベンゼンスルホンアミドおよびバルデコキシブ（ＢＥＸＴＲＡ（登録商標））、およびメロキシカム（ＭＯＢＩＣ（登録商標））が挙げられ、これらの塩および誘導体などを含む。好ましくは、これらは、アスピリン、ナプロキセン、イブプロフェン、インドメタシンまたはトルメチンである。このようなＮＳＡＩＤは、場合により、鎮痛剤、例えば、コデイン、トラマドール、および／またはジヒドロコデインまたは麻酔剤、例えば、モルヒネと共に使用される。
【０２５６】
「被験体」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」は、診断、予後予測、予防または治療に望ましい任意の被験体、特に哺乳動物被験体、例えば、ヒト患者を意味する。
【０２５７】
医薬担体：
薬学的に許容し得る担体および投与経路は、当業者に公知の対応文献から採用することができる。当技術分野において周知の方法にしたがって本発明の医薬組成物を製剤化することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０００）ｂｙ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＩＳＢＮ  ０−６８３−３０６４７２，Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ，２００３；Ｂａｎｇａ，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，ａｎｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ．２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｃｉｓ．（２００６），ＩＳＢＮ：０−８４９３−１６３０−８を参照のこと。適切な医薬担体の例は当技術分野において周知であり、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、様々な種類の湿潤剤、滅菌溶液などが挙げられる。周知の従来の方法によってこのような担体を含む組成物を製剤化することができる。適切な用量で被験体にこれらの医薬組成物を投与することができる。様々な方法で、適切な組成物の投与をもたらすことができる。例としては、薬学的に許容し得る担体を含有する組成物を、経口、鼻腔内、直腸、局所、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下、皮下、経皮、くも膜下および頭蓋内の方法により投与することが挙げられる。点鼻薬製剤などのエアロゾル製剤は、保存剤および等張剤を有する、活性薬剤の精製した水溶液または他の溶液を含む。このような製剤は、好ましくは、鼻粘膜に適合するｐＨおよび等張状態に調節される。経口投与用医薬組成物、例えば、単一ドメイン抗体分子（例えば、「ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）」なども本発明で想定される。このような経口製剤は、錠剤、カプセル剤、粉末、液体または半固体形態であり得る。錠剤は、ゼラチンまたはアジュバントなどの固体担体を含むことができる。直腸投与用または経膣投与用の製剤は、適切な担体を有する坐剤として提供され得る；Ｏ’Ｈａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ２（９）（２００３），７２７−７３５も参照のこと。様々な種類の投与に適切な製剤に関するさらなる指針は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，１７ｔｈ  ｅｄ．（１９８５）および対応する最新版に見ることができる。薬物送達方法の簡単な総説については、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９（１９９０），１５２７−１５３３を参照のこと。
【０２５８】
投薬計画：
投薬計画は、主治医および様々な臨床上の要因によって決定されるであろう。医療技術分野では広く知られているように、どのような患者であれ、一人の患者のための投薬量は、患者の大きさ、体表面積、年齢、投与されるべき具体的な化合物、性別、投与時間および投与経路、全身の健康状態、ならびに、他の薬物が同時に投与されることを含めて、多くの要因に依存する。典型的な用量が、例えば、０．００１μｇ〜１０００μｇの範囲（あるいは、この範囲における発現または発現阻害のための核酸の範囲）であることが可能である。しかしながら、この例示的な範囲よりも少ない用量または大きい用量が、とりわけ上述の要因を考慮して想定される。一般に、医薬組成物の定期的な投与としての投与計画は１日あたり１μｇ単位〜１０ｍｇ単位の範囲でなければならない。投与計画が連続注入であるならば、投与計画はまた、体重１キログラムあたり１分につきそれぞれ、１μｇ単位〜１０ｍｇ単位の範囲でなければならない。進行を定期的な評価によってモニターすることができる。非経口投与のための調製物には、無菌の水性または非水性の溶液、懸濁物およびエマルションが含まれる。非水性溶媒の例として、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油など）および注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチルなど）が挙げられる。水性キャリアには、生理的食塩水および緩衝化媒体を含めて、水、アルコール性／水性の溶液、エマルションまたは懸濁物が含まれる。非経口用ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルブドウ糖、ブドウ糖および塩化ナトリウム、乳酸加リンゲルまたは固定油が含まれる。静脈内用ビヒクルには、流体および栄養補充液、電解質補充液（例えば、リンゲルブドウ糖に基づくものなど）などが含まれる。保存剤および他の添加剤もまた存在する場合がある（例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤および不活性ガスなど）。さらには、本発明の医薬組成物は、医薬組成物の意図された使用に依存して、さらなる薬剤（例えば、抗腫瘍剤および細胞傷害性薬物など）を含んでもよい。
【０２５９】
加えて、他の薬剤の共投与または逐次投与が望ましい場合がある。治療効果的な用量または量は、症状または状態を改善するために十分である有効成分のそのような量を示す。そのような化合物の治療効力および毒性を細胞培養物または実験動物における標準的な薬学手順によって求めることができ、例えば、ＥＤ５０（集団の５０％において治療効果的な用量）およびＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）によって求めることができる。治療効果と毒性影響との間における用量比が治療指数であり、これはＬＤ５０／ＥＤ５０の比率として表すことができる。好ましくは、組成物における治療剤は、炎症を防止するために、または免疫応答を抑制するために十分である量で存在する。
【０２６０】
これらの実施形態および他の実施形態が本発明の記載および実施例によって開示され、また、包含される。本発明に従って用いられるための材料、方法、使用法および化合物のいずれか１つに関するさらなる文献が、公開されている図書館およびデータベースから、例えば、電子デバイスを使用して検索される場合がある。例えば、公開されているデータベースの「ＰｕｂＭｅｄ」が利用される場合がある（このデータベースは国立バイオテクノロジー情報センターおよび／または国立衛生研究所の国立医学図書館によって提供される）。さらなるデータベースおよびウエブアドレスが、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（ＥＢＩ）（これは欧州分子生物学研究所（ＥＭＢＬ）の一部である）のデータベースなどが当業者には知られており、これらもまた、インターネット検索エンジンを使用して得ることができる。バイオテクノロジーにおける特許情報、ならびに、遡及的検索および現在の認識のために有用な特許情報の関連原典の調査の概略が、Ｂｅｒｋｓ、ＴＩＢＴＥＣＨ  １２（１９９４）、３５２〜３６４に示される。
【０２６１】
上記開示により、本発明が概して記載される。いくつかの文書が本明細書の本文を通して引用される。完全な書誌的引用が請求項の直前において明細書の最後に見出される場合がある。すべての引用された参考文献（背景の節における開示を含めて本出願明細書を通して引用されるような文献参照物、発行された特許、公開された特許出願、および、製造者の仕様書、説明書などを含む）の内容が、本明細書により明示的に、参照によって組み込まれる。しかしながら、どのような文書であれ、引用される文書は実際に本発明に関して先行技術であることを何ら認めるものではない。
【０２６２】
より完全な理解を、例示のみの目的のために本明細書中に提供される下記の具体的な実施例を参照することによって得ることができる。
【実施例】
【０２６３】
以下の実施例１〜１０および対応する図１〜１８は本発明をさらに例証するが、本発明の範囲を何ら限定するものと解釈するべきではない。本明細書で用いられるものなどの従来の方法についての詳細な説明は、引用されている文献に見出すことができる；「Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ」Ｓｅｖｅｎｔｅｅｎｔｈ  Ｅｄ．ｅｄ．ｂｙ  Ｂｅｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｅｒｋｏｗ（Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，２００３）も参照のこと。本発明の実施は、特に指示がない限り、当技術分野の技術の範囲内である細胞生物学、細胞培養、分子生物学、遺伝子導入生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来の技術を用いる。
【０２６４】
分子遺伝学および遺伝子工学の方法は、一般に、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ．，１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｇａｉｔ  ｅｄ．，１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ  ａｎｄ  Ａｌａｎ，Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．）；およびＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ（Ｗｕ，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）．Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４  ａｎｄ  １５５（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ（Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）の最新版に記載されている。この開示で言及されている遺伝子操作のための試薬、クローニングベクターおよびキットは、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎおよびＣｌｏｎｔｅｃｈなどの商業ベンダーから入手可能である。細胞培養および培地回収の一般的な技術は、Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８（１９９７），１４８）；Ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  Ｍｅｄｉａ（Ｋｉｔａｎｏ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ��７（１９９１），７３）；Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２（１９９１），３７５）；およびＳｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｂｉｒｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９（１９９０），２５１に概説されている。
【０２６５】
実施例１：ＬＩＰＳアッセイによる患者の血清におけるヒトサイトカイン特異的抗体の検出、候補抗ＩＬ−２０抗体のクローニングおよび組換え発現
ＬＩＰＳアッセイを、ＡＰＥＣＥＤ（自己免疫性多腺性内分泌不全症・カンジダ症・表皮異形成、これは自己免疫性多腺性内分泌不全症１型（ＡＰＳ１）とも呼ばれる）の遺伝子状態に罹患する患者の血清におけるＩＬ−２０抗体の示差的分析のために使用した。ＩＬ−２０を、本出願人の国際出願公開ＷＯ２０１３／０９８４１９における１５８頁の実施例１０および１６５頁〜１６７頁の実施例１５に記載されるように（それらの開示内容は参照によって本明細書中に組み込まれる）、下記の表３に示されるプライマーを使用してＮ末端においてＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼと融合し、ＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクションによって発現させた。
【０２６６】
このプロトコルには、抗体をルシフェラーゼ免疫沈殿システム（ＬＩＰＳ）技術によって検出するための実験手順が記載される。
【０２６７】
材料：
・ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ  ＨＴＳフィルタープレート、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、＃ＭＳＢＶＮ１Ｂ５０
・組換えプロテインＧアガロースビーズ、Ｅｘａｌｐｈａ、＃Ｘ１１９７
・緩衝液Ａ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）
・ルシフェラーゼアッセイシステム、Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｅ１５０１
・Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼアッセイ試薬、標的化システムＧＡＲ−２Ｂ
・Ｌｕｃ抗原（−８０℃での貯蔵、濃度（ＬＵ／ｍｌ））
・ＰＢＳ
【０２６８】
ハードウエア：
・回転式振とう機
・ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎＨＴＳ真空マニホールド、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、＃ＭＳＶＭＨＴＳ００
・１４５０  ＭｉｃｒｏＢｅｔａ  ＴｒｉＬｕｘ液体シンチレーションカウンター＆ルミノメーター、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ
・Ｖｉｃｔｏｒ  Ｘ５マルチラベルプレートリーダー、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ
・マルチチャネルピペット：Ｂｉｏｈｉｔ  ３０〜３００μｌ
・Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機５４１５Ｄ
【０２６９】
方法：
・プロテインＧアガロースを注意深く再懸濁し、必要量を取る（１枚のプレートあたり、１００μｌの排液媒体を作製するおよそ２００μｌの懸濁物）。遠心分離し（３００ｇ、５分間）、排液体積を調べ、緩衝液Ａ（３倍体積）により１回洗浄する（３００ｇ、５分）。２５μｌの懸濁物により、１μｌの排液プロテインＧアガロースが含有されるであろうことを考慮して、緩衝液Ａに再懸濁する。（プロテインＧアガロースを、通常の場合には必要とされる量でチューブに小分けすることは有用であろう。）
・２５μｌ／ウエルの患者血清の１：１００希釈物（緩衝液Ａで希釈される）を加える。
・２５μｌ／ウエルのプロテインＧアガロース懸濁物を加える。
・プレートを回転式振とう機において室温で１時間インキュベーションする。
・Ｌｕｃ抗原を希釈し、１０６（５＊１０５）の光ユニット（ＬＵ）が５０μｌの緩衝液Ａにおいて加えられるであろうようにする。５０μｌ／ウエルのＬｕｃ抗原希釈物を加える。
・プレートを回転式振とう機において室温で１時間インキュベーションする。
・プレートを真空マニホールドで洗浄する。それぞれのウエルを２００μｌの緩衝液Ａにより５回洗浄し、その後、２００μｌのＰＢＳにより２回洗浄する。プレートの上部および底部の水分を確実に除く積み重ねたペーパータオルまたはろ紙を使用してプレートから水分を拭き取る。
・Ｇａｕｓｓｉａ構築物を使用する場合、Ｇａｕｓｓｉａ基質を加え（１０μｌ／ウエル）、２秒間振とうする。ルミネセンスを装置のマニュアルにおける説明に従って直ちに５秒の間読み取る。ホタルの構築物を使用する場合、ルシフェラーゼ基質を加え（２０μｌ／ウエル）、２秒間振とうする。ルミネセンスを装置のマニュアルにおける説明に従って直ちに５秒の間読み取る。
【０２７０】
【表３】
2017527262.tif 000011
表３：ＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼをそのＮ末端に有するＩＬ−２０。 シグナル配列を有しない全長型ＩＬ−２０（２５〜１７６ａａ）を、ｐＧａｕｓｓｉａ１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、Ｔａｒｔｕ大学、エストニア）哺乳動物発現ベクターを使用して（ＥｃｏＲＩ部位およびＮｏｔＩ部位に）ＩＬ−２０のＮ末端においてＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼ遺伝子との融合体にクローン化した。ＨＥＫ２９３細胞へのトランスフェクションの後、細胞培養上清をルシフェラーゼに基づく免疫沈殿アッセイにおいて抗原として使用した。
【０２７１】
合計で３０名の患者から得られる血清（これらはＡＰＳ１−１からＡＰＳ１−３０までの符号によって示される）をアッセイにおいて使用した。図２に示されるように、患者ＡＰＳ１−９から得られる血清により、抗ＩＬ−２０抗体の最も大きい力価が明らかにされた。したがって、患者ＡＰＳ１−９を、候補の抗ＩＬ−２０抗体をクローニングするためのメモリーＢ細胞の供給源として使用した。メモリーＢ細胞単離、培養および抗体単離を、国際出願公開ＷＯ２０１３／０９８４１９および同ＷＯ２０１３／０９８４２０に記載されるように、そして、単離および分析された抗体の特異性が、これらの述べられた国際出願において具体的に使用されたＩＬ−１７およびＩＬ−２２の代わりに本明細書中上記および下記で定義されるようなＩＬ−２０に対してであったという違いを伴って行った。それらにおける実施例の節を参照のこと、具体的には、国際公開ＷＯ２０１３／０９８４１９の１１７頁〜１２０頁における実施例１および実施例２ならびに１６８頁〜１７１頁における実施例１７、そして、国際公開ＷＯ２０１３／０９８４２０の２７頁〜３１頁における実施例１〜実施例４を参照のこと（それらの開示内容は参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【０２７２】
実施例２：候補の抗ＩＬ−２０抗体のＥＬＩＳＡでのＥＣ５０決定
本発明のヒト抗体の分子クローニングならびにその後の抗体産生および抗体精製を国際出願公開ＷＯ２０１３／０９８４１９に記載されるように行った。その出願明細書の実施例の節を参照のこと、具体的には、その１１７頁〜１２０頁における実施例１〜実施例３を参照のこと（それらの開示内容は参照によって本明細書中に組み込まれる）。ヒトＩＬ−２０のＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼとの融合タンパク質（ｇ１  ＩＬ−２０およびｇ２  ＩＬ−２０）に対する本発明の例示的な抗ＩＬ−２０抗体のＥＣ５０結合をＧＬｕｃサンドイッチＥＬＩＳＡによって求めた。プレートを抗Ｇｌｕｃ  Ａｂ（１μｇ／ｍｌ）により被覆し、Ｇｌｕｃ抗原を結合させ、そして、様々なＭＡＢの連続希釈物を２時間結合させた。プレートを続いて洗浄し、ＭＡＢの結合を、抗ヒトＨＲＰコンジュゲート化二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｅｕｒｏｐｅ  Ｌｔｄ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅｓｈｉｒｅ、英国）を用いて検出した。それぞれの抗原に対する最大結合の半分をもたらすＭＡＢの濃度（ＥＣ５０、ｎｇ／ｍｌ）を、濃度の対数をＯＤの４５０ｎｍでの測定値に対してプロットすることによって得られるＳ字形の用量応答曲線（可変スロープ、４パラメーター）において、Ｐｒｉｓｍ  ４  ＧｒａｐｈＰａｄソフトウエアを使用して計算した。結果については図３および下記の表４を参照のこと。
【０２７３】
【表４】
2017527262.tif 000012
表４：ｇ１  ＩＬ−２０およびｇ２  ＩＬ−２０に対するＭＡＢの結合のＥＣ５０値のまとめ。２Ａ１１、６Ｅ１１、６Ｈ２、７Ｄ１および２０Ａ１０の各ＭＡＢは、ｇ１  ＩＬ−２０およびｇ２  ＩＬ−２０に結合しなかった。７Ｄ１のＭＡＢは、ＥＣ５０結合が５μｇ／ｍｌよりも大きいことを示す非常に高い濃度でのみ、ｇ１  ＩＬ−２０に結合した。
【０２７４】
実施例３：ヒト由来抗ＩＬ−２０モノクローナル抗体は組換えＩＬ−２０および組換えＩＬ−２０受容体媒介ＳＴＡＴ３活性化を中和する
中和アッセイが、研究されたサイトカインに応答する細胞株を用いて行われる。受容体に対するリガンド結合は一般に、対応するシグナル伝達経路、核への転写因子の移行を活性化し、応答因子遺伝子の転写、翻訳、および、適用可能であるならば、生成物分泌をアップレギュレーションする。使用されるサイトカイン濃度が、アッセイの感度を最大にするために用量応答曲線の直線部分の開始部から選択される。抗体の中和能を試験するために、標的サイトカインの最適な濃度が、血清、上清または精製抗体のサンプルの連続希釈物とプレインキュベーションされる。結果が、陽性コントロールと陰性コントロールとの間において中間の値を示す抗体の力価または濃度として表される。
【０２７５】
最初の一組の実験において、ヒト由来抗ＩＬ−２０モノクローナル抗体を、Ｉ型およびＩＩ型のＩＬ−２０受容体を一過性に発現するＨＥＫ２９３Ｔ  ＭＳＲ細胞における組換えＩＬ−２０媒介ＳＴＡＴ３活性化に対するその中和活性を評価するためにホスホ−ＳＴＡＴ３アッセイに供した（図４）。
【０２７６】
ホスホ−ＳＴＡＴ３アッセイ
２０，０００個のＨＥＫ２９３Ｔ  ＭＳＲ細胞（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｒ７９５０７、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｓｌｂａｄ、ＣＡ、米国）を９６ウエル組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、米国）に播種した。翌日、細胞を、ＩＬ２０ＲＡ−Ｍｙｃ−ＤＤＫおよびＩＬ２０ＲＢ−Ｍｙｃ−ＤＤＫの発現プラスミド（Ｉ型ＩＬ−２０受容体；Ｃａｔ．Ｎｏ．ＲＣ２１２５４６および同ＲＣ２１３１９７、ＯｒｉＧｅｎｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、米国）またはＩＬ２２ＲＡ発現プラスミド（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＣ３２２５６６、ＯｒｉＧｅｎｅ）およびＩＬ２０ＲＢ−Ｍｙｃ−ＤＤＫ発現プラスミド（ＩＩ型ＩＬ−２０受容体）のどちらかと共トランスフェクションした。トランスフェクションの翌日、組換えＩＬ−２０を抗ＩＬ−２０ｍＡｂまたはコントロールＩｇＧと混合し、３７℃で１時間プレインキュベーションした。プレインキュベーション後、混合物を使用して、ＩＬ−２０受容体を一過性に発現するＨＥＫ２９３Ｔ  ＭＳＲ細胞を３７℃で４０分間刺激した。刺激後、細胞を、プロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｃ２９７８、同Ｐ５７２６、同Ｐ００４４、同Ｐ８３４０、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）が補充されるＣｅｌＬｙｔｉｃ（商標）Ｍ溶解緩衝液を用いて溶解し、回収された溶解物を卓上型遠心分離機において１３，０００ＲＰＭで、４℃で清澄化した。溶解物を還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ニトロセルロースメンブラン上にブロットした。メンブランを、０．２５％ウシゼラチン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．０５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有する緩衝液による室温での１時間のブロッキング処理に供し、その後、リン酸化ＳＴＡＴ３に対するウサギモノクローナル抗体（Ｔｙｒ７０５、ブロッキング緩衝液で１：２０００希釈、Ｃａｔ．Ｎｏ．９１４５、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ、米国）、または、アルファ−チューブリン（１：２５００希釈、Ｃａｔ．Ｎｏ．２１２５、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とのインキュベーションを４℃で一晩行った。翌日、ブロットをブロッキング緩衝液により３回洗浄し、その後、ウサギＩｇＧに対する西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体（ブロッキング緩衝液で１：２０，０００希釈、Ｃａｔ．Ｎｏ．１１１−０３５−１４４、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ、米国）とのインキュベーションを行った。３回のさらなる洗浄工程の後、ＥＣＬ基質を加え（Ｃａｔ．Ｎｏ．３４０８７、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、米国）、反応性のバンドをオートラジオグラフィーにより可視化した。結合した抗体を、Ｒｅｓｔｏｒｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ  Ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ緩衝液（Ｃａｔ．Ｎｏ．２１０５９、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）におけるインキュベーションによって除き、ウサギモノクローナル抗ＳＴＡＴ３血清を使用して、総ＳＴＡＴ３レベルを可視化した（１：１０００希釈、Ｃａｔ．Ｎｏ．１２６４０、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。ＩＬ−２０受容体サブユニットの発現を、マウスモノクローナル抗ＤＤＫ血清（１：１０００希釈、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＴＡ５００１１、ＯｒｉＧｅｎｅ）、ならびに、ＩＬ−２０ＲＡおよびＩＬ−２２ＲＡに対するウサギポリクローナル血清（それぞれ、１：５００希釈および１：１０００希釈、Ｃａｔ．Ｎｏ．０６−１０７３および同０６−１０７７、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、米国）により可視化した。
【０２７７】
【表５】
2017527262.tif 000013
表５：中和アッセイで使用される組換えタンパク質（インターロイキン）のリスト
【０２７８】
コントロールとして、ｒｈＩＬ−２０およびｒｍＩＬ−２０により、ＳＴＡＴ３の用量依存的なリン酸化が、Ｉ型またはＩＩ型のＩＬ−２０受容体を一過性に発現するＨＥＫ２９３Ｔ  ＭＳＲ細胞において誘導される。ＳＴＡＴ３およびＩＬ−２０ＲＢ−Ｍｙｃ−ＤＤＫの総レベルおよびリン酸化体レベルの検出（図４Ａ）。
【０２７９】
図４Ｂに示されるように、抗体２０Ａ１０および抗体７Ｄ１ならびに抗体２Ａ１１が同様に、最も強力な中和抗体である。しかしながら、このことは、実施例２において得られ、図３に示される結果（図３では、例えば、抗体６Ｅ１１が抗体７Ｄ１よりも大きい結合親和性を示し、抗体２Ａ１１が抗体７Ｄ１よりも実質的に良好な成績をもたらした）から予想されていたかもしれないことと部分的には対照的である。
【０２８０】
次に、ｐＳＴＡＴ３ウエスタンブロットアッセイにおけるｒｍＩＬ−２０に対抗する２０Ａ１０の力価測定を行った。Ｉ型ＩＬ−２０受容体を一過性に発現するＨＥＫ２９３Ｔ  ＭＳＲ細胞を非処置のままにしたか、あるいは、示されるように抗体の非存在下（−）または例示的抗体２０Ａ１０の存在下（＋）、２５ｎｇ／ｍｌのｒｍＩＬ−２０により刺激した（図６Ａ）。細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ｐＳＴＡＴ３レベルをウエスタンブロットで可視化した。総ＳＴＡＴ３レベルが負荷コントロールとして役立つ。用量応答曲線をプロットし、ＩＬ−２０活性を取り消すことに対するＩＬ−２０抗体２０Ａ１０の力価測定を調べることによって、１，８６７ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０が計算され、このＩＣ５０は、Ｉ型ＩＬ−２０受容体へのｒｍＩＬ−２０結合に対抗するＭＡｂ  ２０Ａ１０の大きい中和活性を裏づけている（図６Ｂ）。
【０２８１】
実施例４：ヒト由来抗ＩＬ−２０モノクローナル抗体はｒｈＩＬ−２０およびＫＺ１３６−ＮＬｕｃ受容体遺伝子のＩＬ−２０受容体媒介誘導を中和する
実施例２において得られ、図３に示される候補抗ＩＬ−２０抗体のＥＬＩＳＡでのＥＣ５０決定の結果と、実施例３において得られ、図４Ｂに示されるホスホ−ＳＴＡＴ３アッセイの結果との不一致（上記）を考慮して、また、ＩＬ−２０受容体のＩＬ−２０媒介誘導を中和することにおける、候補抗ＩＬ−２０抗体の７Ｄ１、２０Ａ１０および２Ａ１１の効力を検証するために、ＫＺ１３６−ＮＬｕｃレポーター中和アッセイを確立した。
【０２８２】
ＫＺ１３６−ＮＬｕｃレポータアッセイ
ＫＺ１３６−ＮＬｕｃレポーター構築物の作製
Ｐｏｕｌｓｅｎおよび共同研究者（Ｐｏｕｌｓｅｎ他、Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｖｉａ  ｔｈｅ  Ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩａ  ｔｏ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｆａｃｔｏｒ、ＪＢＣ、１９９８）によって最初に記載されるようなＫＺ１３６レポーター構築物には、誘導可能なホタルルシフェラーゼがコードされ、その上流には、ｃ−ｆｏｓプロモーターの断片（ヌクレオチド６４９〜７４７、ＧｅｎＢａｎｋＴＭアクセション番号Ｋ００６５０）が存在する。すぐ上流側において、この構築物は、血清応答エレメントと一緒に、ｃ−ｆｏｓの４つのＳＴＡＴ結合エレメント、ｐ２１ＷＡＦ１、β−カゼインおよびＦｃｇ  ＲＩの遺伝子を特徴とする。この最初のＫＺ１３６構築物は主として、安定な細胞株を作製するために使用された。本明細書中に記載されるＫＺ１３６−ＮＬｕｃレポーターは、かなりより明るいＮａｎｏルシフェラーゼをコードしており、一過性の共トランスフェクション実験のために好適である。ＮｈｅＩ制限部位およびＸｈｏＩ制限部位が隣接するＫＺ１３６プロモーター配列を含有する構築物を遺伝子合成により作製した。ＫＺ１３６プロモーター配列を、ＮｈｅＩおよびＸｈｏＩの二重制限を使用して切り出し、その後、同じ制限酵素により消化されるＮａｎｏルシフェラーゼをコードするｐＮＬ２．１標的ベクター（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｎ１０６１、Ｐｒｏｍｅｇａ）に連結した（図５Ａにおける構築物のスキームを参照のこと）。
【０２８３】
ＫＺ１３６−ＮＬｕｃレポーター中和アッセイ
１０，０００個のＨＥＫ２９３Ｔ  ＭＳＲ細胞を、半分の領域が白色である９６ウエル組織培養プレート（Ｃａｔ．Ｎｏ．３６８８、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．）に播種した。翌日、細胞を、Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｅ２３１１、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、米国）を使用して２０ｎｇのＫＺ１３６−Ｎａｎｏルシフェラーゼレポーター構築物および８０ｎｇのＩＬ−２０レポーター構築物により共トランスフェクションした。トランスフェクションの翌日、細胞を、抗ＩＬ−２０  ｍＡｂまたはコントロールのヒトＩｇＧ（ｈｕＩｇＧ）を伴う、または伴わない１２０ｎｇ／ｍｌの組換えヒト（ｒｈ）ＩＬ−２０（図５Ｃ、図５Ｄ）または２００ｎｇ／ｍｌの組換えマウス（ｒｍ）ＩＬ−２０（図５Ｅ）の混合物を含有し、３７℃での１時間のプレインキュベーションが行われた培地により２４時間刺激した。２４時間の刺激の後、ルシフェラーゼアッセイを製造者の説明書（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｎ１１３０、Ｐｒｏｍｅｇａ）に従って展開させた。
【０２８４】
コントロールとして、ｒｈＩＬ−２０およびｒｍＩＬ−２０により、ＫＺ１３６−ＮＬｕｃレポーター構築物が、Ｉ型ＩＬ−２０受容体およびＫＺ１３６−ＮＬｕｃにより一過性にトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｔ  ＭＳＲ細胞において誘導される（図５Ｂ）。ｒｈＩＬ−２０（図５Ｃ、図５Ｄ）またはｒｍＩＬ−２０（図５Ｅ）を使用するＫＺ１３６−ＮＬｕｃレポータアッセイによる例示的なヒト由来のＩＬ−２０  ｍＡｂの２０Ａ１０、７Ｄ１および２Ａ１１のＩＣ５０分析。結果が図５Ｆにまとめられており、２０Ａ１０のＩＬ−２０中和能が明らかにされている。ホスホ−ＳＴＡＴ３アッセイ（図４Ｂ）で既に認められるように、抗体２０Ａ１０は、抗体７Ｄ１および抗体２Ａ１１と比較して、最も大きい中和能を示し、Ｉ型ＩＬ−２０受容体へのｒｈＩＬ−２０結合に対するより大きい効力を伴っていた（図５Ｆ、左欄）。
【０２８５】
実施例５：ヒト由来抗ＩＬ−２０モノクローナル抗体は、ＩＬ−２０がＩＬ−２０受容体に結合することを化学発光法細胞結合アッセイにおいて中和する
ＬＩＰＳアッセイは、候補抗体の拮抗活性、すなわち、候補抗体の中和活性について予測的ではなかったので、目的とするリガンドの、関連性のある受容体を発現する細胞への結合を評価するための新しいアッセイが、リガンドに対する候補抗体により、このリガンドが細胞表面のそれぞれの受容体に結合することができることが妨げられるかどうかを明らかにする際における使用のために本発明に従って開発されている。
【０２８６】
図７Ａにおいて例示されるように、本発明の新規な方法によれば、目的とするリガンドが標識され、レポーターを含む融合タンパク質として、すなわち、ルシフェラーゼ融合タンパク質（例えば、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼなど）として提供される。リガンドの細胞結合が細胞会合レポーターによって、すなわち、ルシフェラーゼ活性によって測定される。このアッセイは、リガンドに対する抗体により、このリガンドが細胞表面のそれぞれの受容体に結合することができることが妨げられるかどうかの評価を可能にする（図７Ｇおよび図７Ｈ）。
【０２８７】
【表６】
2017527262.tif 000014
表６：中和アッセイで使用される組換えタンパク質（すべてのタンパク質）のリスト
【０２８８】
最初に、ヒト由来抗ＩＦＮ−アルファモノクローナル抗体が単離され、これらは、受容体結合において、また、様々なヒトＩＦＮのＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼとの融合タンパク質を中和することにおいて好適であることが発光法細胞結合アッセイ（ＬＣＢＡ）で証明された。例示的な抗ＩＦＮ−アルファ抗体ならびにＩＦＮＡサブタイプおよびＩＦＮＡ分子の詳細な記載については、本出願人の同時係属中の国際出願公開ＷＯ２０１５／００１０１３（その開示内容は参照によって本明細書中に組み込まれる）、具体的には、ＩｇＧ１、カッパ、ＩＦＮＡ（例えば、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４およびＩＦＮＡ１４）認識抗体の５Ｄ１、１３Ｂ１１、１９Ｄ１１、２５Ｃ３および３１Ｂ４、同様に、ＩＦＮＡサブタイプのほかに、ＩＦＮＷ（インターフェロンオメガ）を効果的に認識する抗体２６Ｂ９および抗体８Ｈ１の可変領域および定常領域（ＶＨ、ＶＬ、ＣＨ、ＣＬ領域）のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列、ならびに、ＩＦＮＡサブタイプ分子の供給源を含めてそれらの機能的な特徴づけを開示する実施例１〜実施例９、表１および図１を参照のこと。Ｇａｕｓｓｉａ−ルシフェラーゼ−ＩＦＮ融合構築物およびＧａｕｓｓｉａ−ルシフェラーゼ−ＩＬ−２２融合構築物をクローニングするために使用されるプライマー配列については、本出願人の国際出願公開ＷＯ２０１３／０９８４１９（２０１３年７月０４日公開）を参照のこと（その開示内容は参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【０２８９】
インターフェロン−Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ
３０，０００個のＨＥＫ２９３Ｔ  ＭＳＲ細胞を、半分の領域が白色である９６ウエル組織培養プレート（Ｃａｔ．Ｎｏ．３６８８、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．）に播種した。翌日、ヒトＩＦＮ−Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ融合タンパク質を一過性に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞の上清を、抗ＩＦＮＡ  ｍＡｂ、コントロールＩｇＧまたは過剰濃度の標識されていない組換えＩＦＮＡ２と混合し、３７℃で１時間プレインキュベーションした。プレインキュベーション後、混合物を使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ  ＭＳＲ細胞を３７℃で４０分間刺激した。結合すると、細胞をＰＢＳにより３回洗浄し、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼアッセイを、Ｇａｕｓｓｉａ  Ｆｌａｓｈ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔを製造者の説明書に従って使用して展開させた（Ｃａｔ．Ｎｏ．１６１５９、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。
【０２９０】
図７Ｇに示されるこの実験の結果は、ＩＦＮＡ５−Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ融合タンパク質（ｇ１  ＩＦＮＡ５）の、ＨＥＫ２９３Ｔ  ＭＳＲ細胞への結合が、非標識の組換えヒト（ｒｈ）ＩＦＮＡ２（３μｇ／ｍｌ）によって、また、例示的なヒト由来モノクローナルＩＦＮ抗体１９Ｄ１１（１．７μｇ／ｍｌ）によって阻害されることを明らかにする。そのうえ、ｇ１  ＩＦＮＡ２、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ１０、Ａ１４、Ａ１６、Ａ１７およびＡ２１の各融合タンパク質の、ＨＥＫ２９３Ｔ  ＭＳＲ細胞への結合が、例示的なヒト由来モノクローナルＩＦＮ抗体１９Ｄ１１によって阻害される。対照的に、ｇ１  ＩＦＮＢおよびＷの結合は１９Ｄ１１によって影響されず、また、すべてのｇ１  ＩＦＮの結合がコントロールのヒト抗体（ｈｕＩｇＧ）によって影響されない（図７Ｈ）。抗体濃度：５μｇ／ｍｌ。
【０２９１】
次に、ヒト由来ＩＬ−２２モノクローナル抗体が単離され、これらは、受容体結合において、また、ヒトＩＬ−２２のＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼとの融合タンパク質を中和することにおいて好適であることが発光法細胞結合アッセイ（ＬＣＢＡ）で証明された。例示的な抗ＩＬ−２２抗体および抗ＩＬ−２２分子の詳細な記載については、本出願人の国際出願公開ＷＯ２０１３／０９８４１９を参照のこと（その開示内容は参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【０２９２】
ＩＬ−２２−Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ
ＣＯＬＯ２０５結腸直腸ガン細胞を製造者の説明書に従ってＶｅｒｓｅｎｅにより剥離させ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１５０４０−０６６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＰＢＳにより２回洗浄した。８ｘ１０５個の細胞を、ウエルあたり２００μｌのＣＯＬＯ２０５完全培養培地（ＲＰＭＩ１６４０  ＧｌｕｔａＭＡＸ、１０％ウシ胎児血清、Ｃａｔ．Ｎｏ．６１８７０−０４４および同１０１０９１５５、それぞれＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）による１時間のブロッキング処理が施されたＶ底の９６ウエルプレート（Ｃａｔ．Ｎｏ．２４９５７、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に移した。ヒトＩＬ−２２−Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ融合タンパク質を一過性に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞の上清を、抗ＩＬ−２２  ｍＡｂ、コントロールＩｇＧまたは過剰濃度の標識されていない組換えＩＬ−２２と混合し、３７℃で１時間プレインキュベーションした。プレインキュベーション後、混合物を使用して、ＣＯＬＯ２０５細胞をＶ底の９６ウエルプレートにおいて３７℃で１時間刺激した。結合すると、細胞をＰＢＳにより３回洗浄し、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼアッセイを、Ｇａｕｓｓｉａ  Ｆｌａｓｈ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔを製造者の説明書に従って使用して展開させた（Ｃａｔ．Ｎｏ．１６１５９、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。細胞はルシフェラーゼ基板の添加の前に溶解されたか、または溶解されなかった。
【０２９３】
ヒトＩＬ−２２−Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ融合タンパク質はＣＯＬＯ２０５細胞に特異的に結合する。細胞を、ＩＬ−２２−Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ融合タンパク質（ｇ２  ＩＬ−２２）を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞の上清とともに、示されるように阻害剤の非存在下（−）または競合性阻害剤の存在下でインキュベーションした。図１４Ａに示されるこの実験の結果は、ｇ２  ＩＬ−２２のＣＯＬＯ２０５細胞への結合が、非標識のｒｈＩＬ−２２によって阻害され、無関係のｒｈＩＦＮＡ２によって阻害されないことを明らかにする。ＣＯＬＯ２０５細胞を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のｇ２  ＩＬ−２２含有上清とともに、示されるように阻害剤の非存在下あるいは非標識のｒｈＩＬ−２２またはｒｈＩＦＮＡ２（それぞれ１μｇ／ｍｌ）の存在下でインキュベーションした。細胞を、光出力が記録される前に溶解したか、または溶解しなかった。図１４Ｂは、ｇ２  ＩＬ−２２のＣＯＬＯ２０５細胞への結合が例示的なヒト由来ＩＬ−２２モノクローナル抗体３０Ｇ１によって用量依存的様式で阻害されることを明らかにする。結合は、コントロールのヒト抗体（ｈｕＩｇＧ）によって影響されない。
【０２９４】
次に、ＬＩＰＳアッセイは、候補抗体の拮抗活性、すなわち、候補抗体の中和活性について予測的ではなかったので、目的とするリガンドの、関連性のある受容体を発現する細胞への結合を評価するための新しいアッセイが、リガンドに対する候補抗体により、このリガンドが細胞表面のそれぞれの受容体に結合することができることが妨げられるかどうかを明らかにする際における使用のために本発明に従って開発されている。
【０２９５】
このため、最初に、実施例３に記載されるホスホ−ＳＴＡＴ３アッセイが、両方の受容体、すなわち、Ｉ型およびＩＩ型のＩＬ−２０受容体、ならびに、レポーターにより標識されるリガンド、すなわち、ＩＬ−２０−Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ融合タンパク質がアッセイにおいて生化学的に活性であるかどうかを調べるために適用されている。図７Ｃおよび図７Ｄに示されるように、ＩＬ−２０−Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ融合タンパク質（ｇ１  ＩＬ−２０）は機能的に活性である。細胞を、ｇ１  ＩＬ−２０の上清の連続希釈物と、またはコントロール培地（ＮＣ）とインキュベーションした。ＳＴＡＴ３、ＩＬ−２０ＲＢ−Ｍｙｃ−ＤＤＫ、ＩＬ−２０ＲＡ−Ｍｙｃ−ＤＤＫおよびＩＬ−２２ＲＡ（ＲＡサブユニット）の総量およびリン酸化体のウエスタンブロットでの検出（図７Ａ）。コントロールとして、ＩＬ−２０融合タンパク質は、Ｉｌ−２０受容体Ｉ型の両方のサブユニットを発現するＨＥＫ２９３Ｔ  ＭＳＲ細胞に特異的に結合することが示されている（図７Ｄ）。結合が、非標識のｒｈＩＬ−２０（３μｇ／ｍｌ）によって取り消される。したがって、ＩＬ−２０−Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ融合タンパク質を含有するＨＥＫ２９３Ｔの上清により、ＳＴＡＴ３が、Ｉ型およびＩＩ型のＩＬ−２０受容体を一過性に発現するＨＥＫ２９３Ｔ  ＭＳＲ細胞において活性化される。
【０２９６】
したがって、リガンドおよびリガンド結合ドメインの結合特徴は、インビボでのそれらの結合特徴に実質的に類似しているにちがいない。そのため、本発明のアッセイを用いて特定され、また得られる活性化因子およびアンタゴニストもまた、インビボにおいて生物学的に活性であると予想することは、控え目なことである。
【０２９７】
次の段階として、候補抗体を、その中和活性を評価するために化学発光法細胞結合アッセイに供した。
【０２９８】
化学発光法細胞結合アッセイ
ＩＬ−２０の化学発光法細胞結合アッセイのために、１０，０００個のＨＥＫ２９３Ｔ  ＭＳＲ細胞を、半分の領域が白色である９６ウエル組織培養プレート（Ｃａｔ．Ｎｏ．３６８８、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．）に播種した。翌日、細胞を、ＩＬ２０ＲＡ−Ｍｙｃ−ＤＤＫおよびＩＬ２０ＲＢ−Ｍｙｃ−ＤＤＫの発現プラスミド（Ｉ型ＩＬ−２０受容体；Ｃａｔ．Ｎｏ．ＲＣ２１２５４６および同ＲＣ２１３１９７、ＯｒｉＧｅｎｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、米国）またはＩＬ２２ＲＡ発現プラスミド（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＣ３２２５６６、ＯｒｉＧｅｎｅ）およびＩＬ２０ＲＢ−Ｍｙｃ−ＤＤＫ発現プラスミド（ＩＩ型ＩＬ−２０受容体）のどちらかと共トランスフェクションした。トランスフェクションの翌日、ヒトＩＬ−２０−Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ融合タンパク質を一過性に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞の上清を、抗ＩＬ−２０  ｍＡｂ、コントロールＩｇＧまたは過剰濃度の標識されていない組換えＩＬ−２０と混合し、３７℃で１時間プレインキュベーションした。プレインキュベーション後、混合物を使用して、ＩＬ−２０受容体を一過性に発現するＨＥＫ２９３Ｔ  ＭＳＲ細胞を３７℃で３０分間刺激した。結合すると、細胞をＰＢＳにより３回洗浄し、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼアッセイを、Ｇａｕｓｓｉａ  Ｆｌａｓｈ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔを製造者の説明書に従って使用して展開させた（Ｃａｔ．Ｎｏ．１６１５９、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。
【０２９９】
図７Ｅおよび図７Ｆに示されるように、細胞結合アッセイにおける認められた影響は、実施例３および実施例４、ならびに、図４〜図６において候補抗体について認められる中和活性のレベルを密接に反映する。コントロールとして、ｇ１  ＩＬ−２０が、Ｉ型ＩＬ−２０受容体を発現するＨＥＫ２９３Ｔ  ＭＳＲ細胞に結合することが、ｒｈＩＬ−２０、ｒｍＩＬ−２０および例示的なヒト由来ＩＬ−２０モノクローナル抗体２０Ａ１０によって用量依存的様式で阻害される（図７Ｅ）。結合は、無関係のｒｈＩＬ−３２γおよびコントロールのヒトＩｇＧ（ｈｕＩｇＧ）によって影響されない。例示的な抗ＩＬ−２０抗体の２Ａ１１、２０Ａ１０および７Ｄ１により、ｇ１  ＩＬ−２０が、Ｉ型およびＩＩ型のＩＬ−２０受容体を一過性に発現するＨＥＫ２９３Ｔ  ＭＳＲ細胞に結合することが中和される。非標識のｒｈＩＬ−２０（１μｇ／ｍｌ）が陽性コントロールとして役立つ。抗体濃度：５μｇ／ｍｌ（図７Ｆ）。ホスホ−ＳＴＡＴ３アッセイの結果（実施例３）およびＫＺ１３６−ＮＬｕｃレポーター中和アッセイの結果（実施例４）と一致して、抗ＩＬ−２０抗体２０Ａ１０は最も大きい阻害活性（すなわち、中和活性）を示し、これに対して、２Ａ１１および７Ｄ１のＭＡｂは、Ｉ型およびＩＩ型の両方のＩＬ−２０受容体に対するｇ１  ＩＬ−２０結合のわずかにより弱い中和能を示しただけであった。対照的に、抗ＩＬ−２０抗体６Ｅ１１では、Ｉ型ＩＬ−２０受容体に対するｇ１  ＩＬ−２０結合のそれほど大きくない中和能が明らかにされ、しかし、ＩＩ型ＩＬ−２０受容体に対する中和能の喪失が明らかにされた。中和能がないことまたははるかに低下した中和能が、ＭＡｂ  ６Ｈ２に関して認められ得るであろう。
【０３００】
したがって、本発明のこの新規な細胞リガンド受容体結合アッセイは、候補化合物の生物学的活性（すなわち、中和活性）、具体的には抗リガンド抗体の生物学的活性（すなわち、中和活性）を予測するための信頼できる手段であって、他の場合にはまず最初に求められていなかったかもしれない、または特定されていなかったかもしれない治療的に有用な抗体を特定し、得ることを著しく簡略化する信頼できる手段を提供する。
【０３０１】
実際、化学発光法細胞結合アッセイにおけるヒト由来抗ＩＬ−２０モノクローナル抗体のさらなるＩＣ５０（半最小（５０％）阻害濃度）分析では、例示的なＩＬ−２０抗体の２０Ａ１０、７Ｄ１および２Ａ１１によるＩＬ−２０の効果的な中和能が明らかにされた（図８）。この目的を達成するために、Ｉ型またはＩＩ型のＩＬ−２０受容体を一過性に発現するＨＥＫ２９３Ｔ  ＭＳＲ細胞を、示されるようなヒト由来ＩＬ−２０モノクローナル抗体の存在下、ｇ１  ＩＬ−２０の上清とインキュベーションした。図８、Ａ：２０Ａ１０、Ｂ：７Ｄ１、および、Ｃ：２Ａ１１。図８Ｄには、２０Ａ１０、７Ｄ１および２Ａ１１の例示的抗体のＩＣ５０値がまとめられており、これは、抗ＩＬ−２０抗体２０Ａ１０が最も大きい中和活性を示したホスホ−ＳＴＡＴ３アッセイ（実施例３）およびＫＺ１３６−ＮＬｕｃレポーター中和アッセイ（実施例４）によって得られるデータを裏づけている。ＭＡｂ  ２Ａ１１は、２０Ａ１０よりもわずかに弱い中和能を示しただけであった。対照的に、ＭＡｂ  ７Ｄ１は、Ｉ型ＩＬ−２０受容体またはＩＩ型ＩＬ−２０受容体への、ｇ１  ＩＬ−２０の結合を阻害するために、最も大きいＩＣ５０を必要とするように思われる。
【０３０２】
実施例６：抗ＩＬ−２０抗体（２０Ａ１０、２Ａ１１、７Ｄ１および６Ｅ１１）のヒト−マウスキメラ構築物との交差競合および交差反応性
異なる結合部位の数を求めるために、異なった抗原結合部位に対する様々な抗ＩＬ−２０  ＭＡＢの示差的結合が調べられる。この目的のために、ＭＡＢがヒト（ｈＭＡＢ）Ｆｃまたはマウス（ｈｍＭＡＢ）Ｆｃのどちらかとともに発現させられ、交差競合実験がＧＬｕｃサンドイッチＥＬＩＳＡによって行われる。ＧＬｕｃ−Ｉｌ２０が、事前に被覆されたウサギ抗ＧＬｕｃ抗体によって捕獲される。大過剰のヒトＭＡＢの存在下におけるｈｍＭＡＢの結合が、一次抗体のＦｃ部分に対するＨＲＰコンジュゲート化二次抗体によって検出される（図９Ａにおける実験構成のスキームを参照のこと）。
【０３０３】
方法：
９６ウェルマイクロプレート（Ｃｏｓｔａｒ、米国）を、ＰＢＳにおいて１／２５０で希釈されるウサギ抗ＧＬｕｃ抗体（ＮＥＢ、Ｅ８０２３Ｓ）により被覆した（３０μｌ／ウエル、一晩、４℃）。プレートをＰＢＳ−Ｔにより洗浄し、２％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ、Ｂｕｃｈｓ、スイス）を含有するＰＢＳによる室温での１時間のブロッキング処理に供した。３０μｌのＧＬｕｃ−ＩＬ−２０を２ｘ１０６ＬＵ／ウエルの最終濃度で加え、室温で２時間インキュベーションした。キメラ抗体を３０μｌのＰＢＳにおいて０．５μｇ／ｍｌ対３μｇ／ｍｌの最終濃度でヒト競合剤抗体と事前に混合し、プレートに加えた。室温での２時間のインキュベーションを行ったとき、プレートをＰＢＳ−Ｔにより洗浄し、ヒト−マウスキメラ抗体の結合を、西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲート化されたヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ−ガンマ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、０．５％ＢＳＡ−ＰＢＳでの１：５００）を使用して求め、その後、ＨＲＰ活性の測定を、ＴＭＢ基質溶液（Ｓｉｇｍａ、Ｂｕｃｈｓ、スイス）を使用して行った。
【０３０４】
図９Ｂ〜図９Ｆおよび下記の表７から認められ得るように、キメラな抗ＩＬ−２０抗体の２０Ａ１０（ｈｍ）、２Ａ１１（ｈｍ）および６Ｅ１１（ｈｍ）は、それらのコグネイトヒト対応体のみと競合しており、このことは、これらのヒト由来抗ＩＬ−２０抗体（２０Ａ１０、２Ａ１１および６Ｅ１１）のそれぞれがＩＬ−２０の異なる結合部位を認識することを示している。対照的に、キメラな抗ＩＬ−２０抗体の７Ｄ１（ｈｍ）はそのヒト対応体と競合するだけでなく、ヒト由来ＩＬ−２０抗体６Ｈ２とも競合しており、このことは、これらの抗体の部分的に重なり得るエピトープを示している。
【０３０５】
しかしながら、実施例３〜実施例５における機能的アッセイ、ならびに、図４Ｂ、図７Ｆおよび図８Ｄに示される機能的アッセイを考慮すると、抗体７Ｄ１は、ＩＬ−２０活性を効果的に中和するように思われる。したがって、抗体７Ｄ１および抗体６Ｈ２のエピトープは同一ではなく、重複すること、または、これらの抗体では、ＩＬ−２０への結合が立体障害のために妨げられることが推測される。
【０３０６】
本発明に従って行われた実験を考慮して、とりわけ、結合親和性／特異性と中和活性との間には関係性がないことを明らかにする実験を考慮すると、本発明の新規な細胞リガンド結合アッセイは、抗ＩＬ−２０抗体を治療的使用のために選択し、提供することにおいて有用かつ必須であることが明らかである。それにもかかわらず、ＩＬ−２０活性を効果的に中和するようには思われない本発明のＩＬ−２０抗体はまた、例えば、診断適用において有用である。
【０３０７】
【表７】
2017527262.tif 000015
表７：本発明の例示的抗体の交差競合実験の結果。ヒトＭＡＢ（ｈＭＡＢ）を、マウスＦｃを有するＭＡＢ（ｈｍＭＡＢ）を加える前に、それぞれの抗原により被覆されるプレートに大過剰で加えた。
【０３０８】
加えて、本発明の例示的なヒト由来抗ＩＬ−２０モノクローナル抗体の６Ｅ１１、２Ａ１１および２０Ａ１０の、マウスＩＬ−２０およびヒトＩＬ−２０への結合を、マウスＩＬ−２０およびヒトＩＬ−２０のエピトープに対する交差反応性を明らかにし、比較するためにＧＬｕｃサンドイッチＥＬＩＳＡによって調べた（図１０Ａにおける実験構成のスキームを参照のこと）。
【０３０９】
方法：
９６ウェルマイクロプレート（Ｃｏｓｔａｒ、米国）を、ＰＢＳにおいて１／２５０で希釈されるウサギ抗ＧＬｕｃ抗体（ＮＥＢ、Ｅ８０２３Ｓ）により被覆した（３０μｌ／ウエル、一晩、４℃）。プレートをＰＢＳ−Ｔにより洗浄し、２％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ、Ｂｕｃｈｓ、スイス）を含有するＰＢＳによる室温での１時間のブロッキング処理に供した。３０μｌのＧＬｕｃ−ＩＬ−２０を２ｘ１０６ＬＵ／ウエルの最終濃度で加え、室温で２時間インキュベーションした。競合剤抗原の組換えヒトＩＬ−２０および組換えマウスＩＬ−２０を、試験される抗体（１μｇ／ｍｌの固定された濃度）に対して、１０μｇ／ｍｌから４．６ｎｇ／ｍｌにまで及ぶ連続希釈で力価測定した。混合物のウエルあたり３０μｌをウエルにおいて室温で１．５時間インキュベーションした。プレートをＰＢＳ−Ｔにより洗浄し、競合剤の存在下における目的とする抗原へのヒトＩｇＧの結合を、西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲート化されたヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃガンマ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｅｕｒｏｐｅ  Ｌｔｄ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅｓｈｉｒｅ、英国）を使用して明らかにし、その後、ＨＲＰ活性の測定を、ＴＭＢ基質溶液（ＴＭＢ、Ｓｉｇｍａ、Ｂｕｃｈｓ、スイス）を使用して行った。
【０３１０】
図１０Ｂ〜図１０Ｄに示されるように、ヒトＩＬ−２０は、ｇ２  ＩＬ−２０に対するすべての試験された抗ＩＬ−２０抗体の結合を阻害することができる。マウスＩＬ−２０は、ｇ２  ＩＬ−２０に対する、６Ｅ１１を除くすべての試験された抗ＩＬ−２０抗体の結合を阻害することができる。したがって、例示的な抗ＩＬ−２０抗体の２Ａ１１および２０Ａ１０は種交差反応性を示し、これに対して、ＭＡｂ  ６Ｅ１１はｈＩＬ−２０を認識するだけである。しかしながら、実施例３〜実施例５における機能的アッセイおよび図４Ｂに示される機能的アッセイを考慮すると、抗体２Ａ１１は、ｍＩＬ−２０を中和することにおいて、ＭＡｂ  ２０Ａ１０ほどには効果的でない。２Ａ１１は強力な結合剤であるが、明らかに、ＩＬ−２０とその受容体との間における相互作用に関与しないＩＬ−２０の領域を認識している。２Ａ１１および７Ｄ１はｒｈＩＬ−２０を弱く中和するが、ＧＬｕｃ  ＩＬ−２０のより良好な中和を示す。この結果はさらに、とりわけ、結合親和性／特異性と中和活性との間には関係性がないことを明らかにする。本発明の新規な細胞リガンド結合アッセイは、抗ＩＬ−２０抗体を治療的使用のために選択し、提供することにおいて有用かつ必須であることが明らかである。それにもかかわらず、ＩＬ−２０活性を効果的に中和するようには思われない本発明のＩＬ−２０抗体はまた、例えば、診断適用において有用である。
【０３１１】
実施例７：主題抗体の検証
本発明によって提供される様々な抗体が、動物疾患モデルにおいてヒトＩＬ−２０に対するそれらの中和活性に関して試験される。そのような実験を行うときには、ヒトＩＬ−２０が病的表現型をマウスにおいて誘導すること、および、交差反応が本発明の試験されたＩＬ−２０抗体とマウスＩＬ−２０ホモログとの間において生じないことが保証されなければならない。ＩＬ−２０についての適切なモデル系が先行技術では利用可能でなかったので、本実施例では、マウスＩＬ−２０と交差反応しないＩＬ−２０中和抗体を試験するためのそのような系が記載され、提供される。
【０３１２】
耳炎症アッセイ
耳炎症の表現型を、それぞれの耳へのヒトサイトカインＩＬ−２０またはＰＢＳコントロールの皮内注入が、３０ゲージのニードルを使用して、１日目、３日目、６日目および８日目での１日おきに与えられること（２０μｌ／耳、１０００ｎｇ／耳、２０００ｎｇ／マウス／日）によって８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ（ＷＴ）マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから得られる）において誘導した。本発明の例示的な抗ＩＬ−２０抗体の２Ａ１１、７Ｄ１および２０Ａ１０による処置を、誘導された耳炎症表現型を軽減させるそれらの中和能に関してこれらの動物について試験した。２Ａ１１、７Ｄ１および２０Ａ１０またはコントロールのヒトＩｇＧ［２００μｇ］の２回のＩＰ注入を０日目および６日目に動物に施した。マウスを１０日目に屠殺した。
【０３１３】
本発明の抗体の潜在的な治療効果を試験するために、動物の耳厚さ測定を、ＩＬ−２０注入前における毎日の測定によってＩＬ−２０投与の期間中、Ｍｉｔｕｔｏｙｏデジタルマイクロメーターにより行った。そのうえ、体重が処置期間中にモニターされており、しかしながら、有意な体重変化が、加えられた処置に起因して動物群のいずれにおいても認められていない。加えて、動物の屠殺の後、耳のＨ＆Ｅ（ヘマトキシリンおよびエオシン）組織学染色（Ｈａｒｒｉｓ，Ｈ．Ｆ．、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ＩＩＩ（１９００）、７７７〜７８１、および、Ｍａｌｌｏｒｙ，Ｆ．Ｂ．、Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｓａｕｎｄｅｒｓ（１９３８）を参照のこと）が行われる。 これらの実験は、ヒトＩＬ−２０の皮内注入による耳腫大の誘導が、２Ａ１１、７Ｄ１および２０Ａ１０の各中和抗体の存在下で軽減されることを示す。図１１を参照のこと。このことは、様々な程度の統計学的有意性で６日目以降は顕著である。例示的な抗ＩＬ−２０抗体の２Ａ１１、７Ｄ１および２０Ａ１０は、注射されたＩＬ−２０をマウスモデルにおいて中和することができる。したがって、本明細書中に示されるデータは、本発明の抗ＩＬ−２０抗体がサイトカイン誘導の耳炎症実験においてＩＬ−２０に対抗して効果的であることを示しており、このことは、本発明のＩＬ−２０特異的な結合分子の治療的価値を明らかにしている。
【０３１４】
実施例８：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を使用する抗体親和性測定
本発明の抗体の親和性決定のために、表面プラズモン共鳴ＳＰＲ測定を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  ＳＰＲ装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を製造者の説明書に従って使用して行った。ＣＭ５チップを、抗ｈｕＩｇＧ  ＦｃマウスＩｇＧ１  ｍＡｂ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）とカップリングし、抗ＩＬ−２０抗体を飽和するまで捕獲させた。分析物として、ヒトＩＬ２０およびマウスＩＬ２０を１．５ｎＭ〜１００ｎＭの濃度で反復操作で加えた。オン速度およびオフ速度ならびに得られるＫＤを、１：１の結合での適合を使用して装置の分析ソフトウエアによって求めた（図１２）。
【０３１５】
実施例９：主題抗体の膜貫通型をリガンド結合ドメインとして使用するＬＣＢＡアッセイ
主題抗体２６Ｂ９の構築物、配列情報、および、その血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）−膜貫通（ＴＭ）媒介表面発現に対する参照が図１５および図１６に示される。さらなる詳細については、それらの図の説明文（上掲）もまた参照のこと。
【０３１６】
膜貫通抗体に対するリガンド結合
３０，０００個のＨＥＫ２９３Ｔ  ＭＳＲ細胞を、半分の領域が白色である９６ウエル組織培養プレート（Ｃａｔ．Ｎｏ．３６８８、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．）に播種した。播種期間中に、細胞を、Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｅ２３１１、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、米国）を使用して、抗ＩＦＮ  ｍＡｂの２６Ｂ９の膜貫通型（２６Ｂ９−ＴＭ）（配列番号６７、Ｈｏ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１０３（２００６）、９６３７〜９６４２；Ｚｈｏｕ他、Ｍａｂｓ、２（２０１０）、５０８〜５１８）をコードする１００ｎｇのｃＤＮＡによりトランスフェクションした（図１７、図１８）。表面の抗体（２６Ｂ９−ＴＭ）発現をトランスフェクションの４８時間後、細胞に基づくＥＬＩＳＡで分析した（図１７Ａ）。トランスフェクション後４８時間で、ヒトＩＦＮＷ−Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ融合タンパク質（ｇ１  ＩＦＮＷ）を一過性に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞の上清を使用して、事前にトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｔ  ＭＳＲ細胞を３７℃で４０分間刺激した。代替として、ｇ１  ＩＦＮＷの上清を抗ＩＦＮ  ｍＡｂまたはコントロールＩｇＧと混合し、３７℃で１時間プレインキュベーションした。プレインキュベーション後、混合物を使用して、２６Ｂ９−ＴＭを一過性に発現するＨＥＫ２９３Ｔ  ＭＳＲ細胞を３７℃で４０分間刺激した。結合すると、細胞をＰＢＳにより３回洗浄し、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼアッセイを、Ｇａｕｓｓｉａ  Ｆｌａｓｈ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔを製造者の説明書に従って使用して展開させ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１６１５９、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、これにより、ｇ１  ＩＦＮＷが、２６Ｂ９−ＴＭを発現する細胞に特異的に結合することが示された（図１７Ｂ）。モノマーＦｖのＰＤＧＦＲ媒介の表面発現、および、ＰＤＧＦＲドメインのさらなる参考文献が、Ｈｏ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１０３（２００６）、９６３７〜９６４２に記載される。完全なＩｇＧのＰＤＧＦＲ媒介の表面発現が、Ｚｈｏｕ他、Ｍａｂｓ、２（２０１０）、５０８〜５１８に記載される。
【０３１７】
抗ＩＦＮＷ抗体の交差競合アッセイ。
上記実験構成はまた、本発明の例示的抗体の２６Ｂ９、３１Ｂ４および８Ｈ１との間での交差競合を試験するために使用されている（図１８を参照のこと）。ＨＥＫ２９３Ｔ  ＭＳＲ細胞を、２６Ｂ９−ＴＭをコードするｃＤＮＡによりリバーストランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後、ｇ１  ＩＦＮＷを可溶性抗ＩＦＮＷ抗体（２６Ｂ９、３１Ｂ４、８Ｈ１）またはコントロールＩｇＧ（ｈｕＩｇＧ）と混合し、１時間プレインキュベーションした。インキュベーション後、混合物を、トランスフェクションされた細胞に加え、結合を化学発光法細胞結合アッセイで分析した。図１８に示されるように、ｇ１  ＩＦＮＷの２６Ｂ９−ＴＭへの結合が、可溶性の２６Ｂ９によって、また、クローン的に関連した３１Ｂ４抗体によって用量依存的な競合を受ける。対照的に、結合が、コントロールＩｇＧによっても、例示的な抗ＩＦＮＷ抗体８Ｈ１によっても影響されない。これらの結果は、例示的抗体の２６Ｂ９および３１Ｂ４が、類似するエピトープを共有し、一方、８Ｈ１は、異なったエピトープに結合するようであることを示している。
【０３１８】
実施例１０：抗ＩＬ−２０モノクローナル抗体の抗原マッピング
それらのそれぞれの抗原に対するＭＡＢの結合領域を、例えば、ＰｅｐＳｔａｒ（商標）分析によってマッピングすることができる。したがって、重複する１８ｍｅｒペプチド（１４アミノ酸の重複）を、すべての知られている変異体を含めて、ヒトＩＬ−２０およびマウスＩＬ−２０をそれぞれ覆うために設計した。これらのペプチド（図１３Ｂ−ヒトＩＬ−２１および図１３Ｃ−マウスＩＬ−２０）および（陽性コントロールとしての）全長型抗原（図１３Ａ）をマイクロアレイにスポットし、このペプチドマイクロアレイを一次抗体とインキュベーションし、その後、一次抗体のＦｃ部分に対して向けられる蛍光標識された二次抗体とインキュベーションする。立体障害によって引き起こされる偽陰性を避けるために、最適化された親水性リンカー部分がガラス表面と抗原由来ペプチド配列との間に挿入される。
【０３１９】
そのうえ、ヒトＩＬ−２０の配列１０１−ＰＤＨＹＴＬＲＫＩＳＳＬＡＮＳＦＬ−１１７（配列番号７２）を含む１７個のペプチドの一組を、アラニンスキャンによるエピトープ特徴づけのために合成した。この場合、それぞれの個々のアミノ酸が、抗体結合に対するその寄与を評価するためにアラニンによって別々に置換される。
【０３２０】
サンプルを１μｇ／ｍｌの濃度によりマイクロアレイスライド上に印刷した。続いて、マイクロアレイを本発明の抗体とブロッキング処理緩衝液において３０℃で６０分間インキュベーションした。検出のために、Ｃｙ５−抗ヒトＩｇＧ二次抗体（ＪＩＲ  ２０９−１７５−０８２）を、ブロッキング緩衝液で希釈される１μｇ／ｍｌの濃度で使用し、３０℃で６０分間インキュベーションした。加えて、蛍光標識された二次抗体のみとのインキュベーションを、潜在的に偽陽性のシグナルを検出するためのコントロール実験として行った。それぞれの工程の前に、マイクロアレイを洗浄緩衝液により洗浄した。分析のために、シグナル強度を、線状エピトープの特定を可能にするためにタンパク質配列の上にマッピングした。
【０３２１】
緩衝液および溶液
５０ｍＭ  ＴＢＳ緩衝液（０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含む）（ＪＰＴ）、ｐＨ７．２
３ｍＭ  ＳＳＣ緩衝液（ＪＰＴ）、ｐＨ７．０
ブロッキング緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ  ＴＢＳ  Ｔ２０、オーダー＃３７５３６）
【０３２２】
ハードウエアおよびソフトウエア
ペプチドマイクロアレイ（ＪＰＴ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＧｍｂＨ、Ｂｅｒｌｉｎ、ドイツ；バッチ＃２６１１）
Ａｘｏｎ  Ｇｅｎｅｐｉｘ  Ｓｃａｎｎｅｒ  ４２００ＡＬ
スポット認識ソフトウエアＧｅｎｅＰｉｘ
【０３２３】
そのようなペプチドマッピングが、本発明の例示的抗体の２０Ａ１０、２Ａ１１、６Ｅ１１および７Ｄ１について、ヒトＩＬ−２０およびマウスＩＬ−２０のそれぞれ１８ｍｅｒペプチドのペプチドアレイで行われている。アッセイの結果が図１３に示される。例示的抗体２０Ａ１０はＩＬ−２０のペプチド２０（ＰＤＨＹＴＬＲＫＩＳＳＬＡＮＳＦＬＴ、配列番号６９）に対して特異的に結合し（図１３Ｄ）、しかしながら、アミノ酸配列ＮＹＱＴＰＤＨＹＴＬＲＫＩＳＳＬＡＮ（配列番号７１）からなるペプチド１９には結合しない。したがって、抗体２０Ａ１０の結合特異性は、国際出願公開ＷＯ２０１０／０００７２１に記載される抗ＩＬ−２０抗体の１５Ｄ２および５Ｂ７の結合特異性とは異なる。なお、抗体１５Ｄ２および抗体５Ｂ７はともに、ＩＬ−２０のペプチド１９およびペプチド２０に結合する（これらのペプチドは本出願では、抗体５Ｂ７についてはペプチド２５およびペプチド２６と称され、抗体１５Ｄ２についてはペプチド８６およびペプチド８７と称される。ＷＯ２０１０／０００７２１（図６Ａ、図６Ｂ、図７Ａおよび図７Ｂ）を参照のこと）。
【０３２４】
例示的抗体２Ａ１１は交差競合アッセイにおいてマウスＩＬ−２０に結合する（図１０Ｃ）が、マイクロアレイでは結合せず（図１３Ａ）、一方、本発明の例示的な抗ＩＬ−２０抗体２０Ａ１０は両方の場合においてマウスＩＬ−２０およびヒトＩＬ−２０に結合する（図１０Ｄおよび図１３Ａ）。アラニンスキャン（図１３Ｇ）によって示されるように、ペプチド２０の配列の内部における数残基が、例示的抗体２０Ａ１０と相互作用するために非常に重要であり、しかし、これらの重要なアミノ酸が置換されるならば、例示的抗体２０Ａ１０の結合が取り消されるか、少なくとも大幅に低下する。
【０３２５】
これらの特定のアミノ酸が例示的抗体２０Ａ１０の結合のために重要であることが、１５ａａのエピトープビンの下記の記載でまとめられる：１０１−ＰＤＨＹＴＬＲＫＩＳＳＬＡＮＳＦＬＴ−１１８、式中、例示的抗体２０Ａ１０による結合のために非常に重要であるアミノ酸が太字かつ斜体字で示され、かつ、これらには下線が引かれ、相互作用するが、それほど重要でないアミノ酸が下線によって示される。対照的に、末端欠失およびアラニンスキャンでのエピトープマッピングにおいて、ＷＯ２０１０／０００７２１に記載される抗体５Ｂ７および抗体１５Ｄ２については、Ｈ１０３からＮ１１４までの１２アミノ酸のより小さい線状エピトープが示唆され、しかしながら、これらのアミノ酸において、３つのアミノ酸位置（Ｈ１０３、Ｓ１１１およびＮ１１４）のみが、抗体５Ｂ７および抗体１５Ｄ２による結合のために不変であり、かつ、非常に重要であることが見出だされた。ＷＯ２０１０／０００７２１において実施例７および実施例８、ならびに、図７および図８におけるアラニンスキャンのデータを参照のこと。
【０３２６】
さらなる興味深い発見が、抗体２０Ａ１０は全長型のヒトＩＬ−２０およびマウスＩＬ−２０に結合する（図１０Ｄ、図１２Ｃ、および、マイクロアレイの関連では図１３Ａ）が、アレイでの抗原マッピングアッセイでは、マウスＩＬ−２０に由来する対応したペプチド（これはそのアミノ酸配列においてヒトＩＬ−２０の１０１−１１８−ペプチドとはＹ１０４ＨおよびＴ１１８Ｉの位置でのみ異なり、この場合、後者は、２０Ａ１０結合のために必須であるように思わる）には結合せず、また、どのような他のマウスＩＬ−２０由来１８ｍｅｒペプチドにも結合しないということである（図１３Ｃ）。したがって、抗体２０Ａ１０は、ヒトＩＬ−２０およびマウスＩＬ−２０の立体配座エピトープで、ヒトＩＬ−２０由来ペプチドの１０１−ＰＤＨＹＴＬＲＫＩＳＳＬＡＮＳＦＬＴ−１１８（配列番号６９）によってもまた形成され得るか、または模倣され得る立体配座エピトープ、あるいは、このペプチドのアミノ酸配列がこの立体配座エピトープの主要な構成要素を表す立体配座エピトープを認識するかもしれない。したがって、抗体２０Ａ１０の大きいエピトープビン、および、マウスＩＬ−２０に由来するペプチドに対する結合を抗体２０Ａ１０は有していないことは、この抗体をＩＬ−２０に対して非常に特異的にしており、そのため、他のサイトカインとの交差反応、例えば、ＩＬ−１０およびＩＬ−１０様サイトカインなどとの交差反応は起こりそうにない。
【図１−１】
2017527262.tif 000016
【図１−２】
2017527262.tif 000017
【図１−３】
2017527262.tif 000018
【図１−４】
2017527262.tif 000019
【図２】
2017527262.tif 000020
【図３】
2017527262.tif 000021
【図４】
2017527262.tif 000022
【図５−１】
2017527262.tif 000023
【図５−２】
2017527262.tif 000024
【図５−３】
2017527262.tif 000025
【図６】
2017527262.tif 000026
【図７−１】
2017527262.tif 000027
【図７−２】
2017527262.tif 000028
【図７−３】
2017527262.tif 000029
【図８】
2017527262.tif 000030
【図９−１】
2017527262.tif 000031
【図９−２】
2017527262.tif 000032
【図１０−１】
2017527262.tif 000033
【図１０−２】
2017527262.tif 000034
【図１１−１】
2017527262.tif 000035
【図１１−２】
2017527262.tif 000036
【図１２−１】
2017527262.tif 000037
【図１２−２】
2017527262.tif 000038
【図１３−１】
2017527262.tif 000039
【図１３−２】
2017527262.tif 000040
【図１３−３】
2017527262.tif 000041
【図１４】
2017527262.tif 000042
【図１５】
2017527262.tif 000043
【図１６】
2017527262.tif 000044
【図１７】
2017527262.tif 000045
【図１８】
2017527262.tif 000046
【配列表】
2017527262000001.app
【国際調査報告】
2017527262.tif 000047
2017527262.tif 000048
2017527262.tif 000049
2017527262.tif 000050
2017527262.tif 000051
2017527262.tif 000052