(57)【要約】本出願は、組織の直接的な免疫組織化学アッセイにおいて使用するための、多酵素（複数の酵素）、具体的にはポリペルオキシダーゼで標識された抗体を対象とする。診断に使用される抗体は、治療に使用される抗体であってもよい。一局面において、組織内の標的分析物を検出するための方法が提供され、この方法は、（ａ）上記標的分析物を含む上記組織を、複数の酵素分子、および上記標的分析物を認識する抗体を含む１つのポリマー酵素／抗体コンジュゲートを含むポリマー酵素／抗体コンジュゲートと接触させて、上記標的分析物および上記ポリマー酵素／抗体コンジュゲートを含む複合体を形成するステップと、（ｂ）上記複合体を形成しない上記ポリマー酵素／抗体コンジュゲートを実質的に除去するステップと、（ｃ）上記組織を上記複数の酵素分子の基質と接触させて、それにより、上記標的分析物を検出するステップとを含む。
2017515121.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織内の標的分析物を検出するための方法であって、
（ａ）前記標的分析物を含む前記組織を、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートであって、複数の酵素分子、および前記標的分析物を認識する抗体を含む１つのポリマー酵素／抗体コンジュゲートを含む、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートと接触させて、前記標的分析物および前記ポリマー酵素／抗体コンジュゲートを含む複合体を形成するステップと、
（ｂ）前記複合体を形成しない前記ポリマー酵素／抗体コンジュゲートを実質的に除去するステップと、
（ｃ）前記組織を前記複数の酵素分子の基質と接触させて、それにより、前記標的分析物を検出するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
ステップ（ａ）の前にブロッキングステップをさらに含み、前記ブロッキングステップが、前記組織をブロッキング剤と接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組織が、アルデヒドを含む固定液中に固定される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記固定液がホルマリンを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記組織がパラフィン包埋される、請求項１から４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記組織が凍結組織である、請求項１から２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記組織が、組織切片、臨床塗抹標本、または培養細胞もしくは組織である、請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記組織切片が、哺乳動物の脳、副腎、結腸、小腸、胃、心臓、肝臓、皮膚、腎臓、肺、膵臓、精巣、卵巣、前立腺、子宮、甲状腺、および脾臓の組織切片からなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記酵素分子が、ベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ラクタマーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ウリカーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、ルシフェラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、エンテロキナーゼ、チロシナーゼ、およびキサンチンオキシダーゼからなる群より選択される、請求項１から８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリマー酵素／抗体コンジュゲートが、ポリマー酵素／抗体コンジュゲート当たり少なくとも６個の酵素分子を含む、請求項１から９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ポリマー酵素／抗体コンジュゲートが、ポリマー酵素／抗体コンジュゲート当たり約６個から約８０個の間の酵素分子を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ａ）を約１５℃から約３７℃の間のインキュベーション温度で実施する、請求項１から１１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ａ）を約３分間から約３０分間の間のインキュベーション期間で実施する、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記インキュベーション期間が約５分間から約１５分間の間である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ブロッキング剤が、脱脂乳、ＢＳＡ、冷水魚皮膚ゼラチン、カゼイン、または動物血清を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
ポリマー酵素／抗体コンジュゲートを作製する方法であって、
（ａ）複数の酵素分子を含むポリマー酵素と抗体をコンジュゲートするステップ
を含む、方法。
【請求項１７】
前記抗体が治療用抗体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
疾患を有する個体を、薬剤を用いて治療する方法であって、ａ）請求項１から１７までのいずれか一項に記載の方法に従って、標的分析物の存在を、前記標的分析物を認識する抗体とコンジュゲートした複数の酵素分子を含むポリマー酵素／抗体コンジュゲートを使用して検出するステップを含む、方法。
【請求項１９】
前記薬剤が治療用抗体である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記標的分析物に特異的に結合する前記抗体と前記治療用抗体とが同じものである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
複数の酵素分子および治療用抗体を含むポリマー酵素／抗体コンジュゲート。
【請求項２２】
（ａ）請求項２１に記載のポリマー酵素／抗体コンジュゲート
を含むキット。
【請求項２３】
前記複数の酵素分子の基質をさらに含む、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
請求項１から２０までのいずれか一項に従った使用のための説明書をさらに含む、請求項２２または２３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、ＲＡＰＩＤ  ＩＭＭＵＮＯＨＩＳＴＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＡＳＳＡＹとの表題の、２０１４年５月８日に出願された米国仮第６１／９９０，１１１号（これは、全ての目的のために、その全体が参考として本明細書に援用される）からの優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、組織を直接免疫組織化学的染色するための組成物、方法、およびキットならびにその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
外科手術中には頻繁に、例えば凍結組織切片診断による分析のために、組織生検試料が患者から取り出され、手術室から病理検査室に送付される可能性がある。凍結組織切片診断のための方法体系は、病理検査室において組織を凍結させるステップと、凍結組織の切片作製を行うステップと、標準のヘマトキシリン・エオシン（Ｈ／Ｅ）染色を実施するステップとからなることがある。Ｈ／Ｅ染色は、医療病理学者が組織病理を診断するのを補助するために使用される汎用技法である。しかし、Ｈ／Ｅ染色には、例えば、組織の染色が非特異的であり、また、組織内の特定のタンパク質が同定されない可能性もあることを含めたいくつもの限界がある。例えば、時には免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）と称される手順を使用することによる組織内の特定のタンパク質の同定が、病理学者が手術中に多数の組織病理を診断する助けになり得る。例としては、センチネルリンパ節生検（潜在的な転移性癌腫および黒色腫に関するもの）、未分化腫瘍（潜在的な癌腫、リンパ腫、および黒色腫）、ならびに周縁部の生検（切り取られた組織の縁について調べて腫瘍全体が除去されたかどうか確かめる）を挙げることができる。
【０００４】
組織切片の免疫組織化学的染色は、不均一な組織におけるタンパク質の存在、またはその欠如、および変更を評価する信頼できる方法である。一般に、ＩＨＣ技法では、細胞抗原をｉｎ  ｓｉｔｕでプローブし、可視化するために抗体を利用する。多くの場合、組織内のタンパク質が拡散して分布しているため、細胞抗原を可視化するためにはシグナル増幅が必要である。シグナル増幅のための技法としては、例えば、細胞抗原に特異的な一次抗体に結合する二次抗体およびビオチン−アビジン系の使用が挙げられる。二次抗体上の発色部分もしくは蛍光部分またはビオチン−アビジンシグナル増幅系を使用して細胞抗原の存在を検出する。ＩＨＣ技法によって、望ましくない離解の影響が回避され、形態に関して個々の細胞を評価することが可能になるので、この技法は優れている。さらに、凍結プロセスによって標的タンパク質が変化することもないので、ＩＨＣには、切除組織を手術中に病理学的に分析するためのツールとしての潜在性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、現行のＩＨＣ技法では、結果を得るまでに６０〜１２０分必要になる場合がある。Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｓｔｓによって提供されるものなどの手術中ガイドラインでは、一般には、病理データをおよそ２０分以内に外科医に報告することが推奨されている。したがって、現行のＩＨＣ技法は、時間がかかりすぎて手術中のツールとして有用でない。さらに、現行のＩＨＣ技法には、例えば、二次抗体の非特異的な結合、または内在性ビオチンの存在など、使用するシグナル増幅技法によって引き起こされるアーチファクトが生じ得る。したがって、改善されたＩＨＣ技法が必要とされている。
【０００６】
ＩＨＣ技法は、組織の遡及的分析のためにも有用である。大多数の病理学的試料は、保存記録用貯蔵および後の時点での組織学的分析を可能にするために、凍結組織として調製されず、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）される。パラフィン包埋試料は遡及的試験のために広範に利用可能であるので、そのような試料からタンパク質を定量的に検出するための迅速かつ信頼できる方法が必要である。
【０００７】
凍結組織およびパラフィン包埋組織からタンパク質を定量するための組成物および方法は、腫瘍組織におけるタンパク質の発現の試験のために特に必要である。例えば、ある特定の受容体または酵素の発現レベルにより、特定の治療が成功する可能性が示され得る。したがって、当技術分野では、腫瘍抗原などの抗原を迅速に検出することが可能な高感度の定量的ＩＨＣ方法も必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本明細書では、組織試料中の標的分析物の存在または非存在を検出するための方法、組成物、およびキットが提供される。
【０００９】
本明細書では、組織内の標的分析物を検出するための方法であって、
【００１０】
標的分析物を含む組織を、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートであって、複数の酵素分子、および標的分析物を認識する抗体を含む１つのポリマー酵素／抗体コンジュゲートを含む、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートと接触させて、標的分析物およびポリマー酵素／抗体コンジュゲートを含む複合体を形成するステップと、複合体を形成しないポリマー酵素／抗体コンジュゲートを実質的に除去するステップと、組織を複数の酵素分子の基質と接触させて、それにより、標的分析物を検出するステップとを含む方法が提供される。一部の実施形態では、組織は凍結組織である。
【００１１】
上記の実施形態のいずれかによる（またはそれが適用される）一部の実施形態では、本方法は、標的分析物を含む組織を、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートであって、複数の酵素分子、および標的分析物を認識する抗体を含む１つのポリマー酵素／抗体コンジュゲートを含む、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートと接触させて、標的分析物およびポリマー酵素／抗体コンジュゲートを含む複合体を形成するステップの前にブロッキングステップをさらに含み、ブロッキングステップは、組織をブロッキング剤と接触させることを含む。一部の実施形態では、組織は凍結組織である。一部の実施形態では、ブロッキング剤は、脱脂乳、ＢＳＡ、冷水魚皮膚ゼラチン（ｃｏｌｄ  ｆｉｓｈ  ｓｋｉｎ  ｇｅｌａｔｉｎ）、カゼイン、または動物血清を含む。
【００１２】
上記の実施形態のいずれかによる（またはそれが適用される）一部の実施形態では、組織は、アルデヒドを含む固定液中に固定されている。
【００１３】
上記の実施形態のいずれかによる（またはそれが適用される）一部の実施形態では、固定液はホルマリンを含む。
【００１４】
上記の実施形態のいずれかによる（またはそれが適用される）一部の実施形態では、組織はパラフィン包埋される。
【００１５】
上記の実施形態のいずれかによる（またはそれが適用される）一部の実施形態では、組織は、組織切片、臨床塗抹標本、または培養細胞もしくは組織である。一部の実施形態では、組織切片は、哺乳動物の脳、副腎、結腸、小腸、胃、心臓、肝臓、皮膚、腎臓、肺、膵臓、精巣、卵巣、前立腺、子宮、甲状腺、および脾臓の組織切片からなる群より選択される。
【００１６】
上記の実施形態のいずれかによる（またはそれが適用される）一部の実施形態では、酵素分子は、ベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ラクタマーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ウリカーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、ルシフェラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、エンテロキナーゼ、チロシナーゼ、およびキサンチンオキシダーゼからなる群より選択される。
【００１７】
上記の実施形態のいずれかによる（またはそれが適用される）一部の実施形態では、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートは、ポリマー酵素／抗体コンジュゲート当たり少なくとも６個の酵素分子を含む。一部の実施形態では、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートは、ポリマー酵素／抗体コンジュゲート当たり約６個から約８０個の間の酵素分子を含む。
【００１８】
上記の実施形態のいずれかによる（またはそれが適用される）一部の実施形態では、標的分析物を含む組織を、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートであって、複数の酵素分子、および標的分析物を認識する抗体を含む１つのポリマー酵素／抗体コンジュゲートを含む、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートと接触させて、標的分析物およびポリマー酵素／抗体コンジュゲートを含む複合体を形成するステップを、約１５℃から約３７℃の間のインキュベーション温度で実施する。
【００１９】
上記の実施形態のいずれかによる（またはそれが適用される）一部の実施形態では、標的分析物を含む組織を、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートであって、複数の酵素分子、および標的分析物を認識する抗体を含む１つのポリマー酵素／抗体コンジュゲートを含む、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートと接触させて、標的分析物およびポリマー酵素／抗体コンジュゲートを含む複合体を形成するステップを、約３分間から約３０分間の間のインキュベーション期間で実施する。一部の実施形態では、インキュベーション期間は、約５分間から約１５分間の間である。
【００２０】
本明細書では、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートを作製する方法であって、複数の酵素分子を含むポリマー酵素と抗体をコンジュゲートするステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、抗体は治療用抗体である。
【００２１】
本明細書では、疾患を有する個体を、薬剤を用いて治療する方法であって、上記の実施形態のいずれかに従って（またはそれを適用して）、標的分析物の存在を、当該標的分析物を認識する抗体とコンジュゲートした複数の酵素分子を含むポリマー酵素／抗体コンジュゲートを使用して検出するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、薬剤は、治療用抗体である。一部の実施形態では、標的分析物に特異的に結合する抗体と治療用抗体は同じものである。
【００２２】
本明細書では、複数の酵素分子および治療用抗体を含むポリマー酵素／抗体コンジュゲートが提供される。上記の実施形態のいずれかによるポリマー酵素／抗体コンジュゲートを含むキットも提供される。一部の実施形態では、キットは、複数の酵素分子の基質をさらに含む。一部の実施形態では、キットは、上記の実施形態のいずれかに従った使用説明書をさらに含む。
【００２３】
参照による組み込み
本明細書において言及されている全ての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が、具体的にかつ個別に参照により組み込まれることが示されたのと同じ程度に参照により本明細書に組み込まれる。
【００２４】
本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲において詳細に記載されている。本発明の原理が利用されている例示的な実施形態が記載されている以下の発明の詳細な説明および添付の図面を参照することにより、本発明の特徴および利点がよりよく理解される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、ポリＨＲＰ抗Ｃｋ８／１８抗体コンジュゲートを使用した凍結ヒトリンパ節組織の直接ＩＨＣ染色の代表的な画像を示す。図１Ａは、凍結ヒトリンパ節組織の直接的な免疫組織化学染色の結果（１００×）を示す。このリンパ節は、転移性乳管癌を含有している。転移性癌腫細胞をＨＲＰポリマーで標識したマウス抗ヒト低分子量ケラチンモノクローナル抗体（ＣＫ８／１８、クローンＣ９４）により直接染色し、直接的な免疫組織化学染色のためのインキュベーション時間は室温で３分であった。図１Ｂは、２００×倍率の組織を示す。例示的な染色された領域が矢印で示されている。
【００２６】
【図２】図２は、ポリＨＲＰ抗Ｃｋ８／１８抗体コンジュゲートを使用した凍結ヒトリンパ節組織の直接ＩＨＣ染色の代表的な画像を示す。図２Ａは、凍結ヒトリンパ節組織の直接的な免疫組織化学染色の結果（１００×）を示す。このリンパ節は、転移性乳管癌を含有している。転移性癌腫細胞をＮｏｖｏｄｉａｘ  ＨＲＰポリマーで標識したマウス抗ヒト低分子量ケラチンモノクローナル抗体（ＣＫ８／１８、クローンＣ９４）により直接染色し、直接的な免疫組織化学染色のためのインキュベーション時間は室温で５分であった。図２Ｂは２００×倍率の組織を示す。例示的な染色された領域が矢印で示されている。
【００２７】
【図３】図３は、ポリＨＲＰ抗Ｃｋ８／１８抗体コンジュゲートを使用した凍結ヒトリンパ節組織の直接ＩＨＣ染色の代表的な画像を示す。図３Ａは、凍結ヒトリンパ節組織の直接的な免疫組織化学染色の結果（１００×）を示す。このリンパ節は、転移性乳管癌を含有している。転移性癌腫細胞をＨＲＰポリマーで標識したマウス抗ヒト低分子量ケラチンモノクローナル抗体（ＣＫ８／１８、クローンＣ９４）により直接染色し、直接的な免疫組織化学染色のためのインキュベーション時間は室温で８分であった。図３Ｂは２００×倍率の組織を示す。例示的な染色された領域が矢印で示されている。
【００２８】
【図４】図４は、Ｈ／Ｅ染色の代表的な画像を示す。図４Ａは、凍結切片組織のＨ／Ｅ染色スライド、１０×倍率を示す。この組織は、転移性乳管癌を含有する腋窩リンパ節である。大多数のリンパ組織が腫瘍で置き換えられている。図４Ｂは、凍結切片組織のＨ／Ｅ染色スライド、１０×倍率を示す。この組織は、転移性乳管癌を含有する腋窩リンパ節である。大多数のリンパ組織が腫瘍で置き換えられている。
【００２９】
【図５】図５は、マウス抗ヒトサイトケラチン８／１８抗体とコンジュゲートしたＮｏｖｏｄｉａｘ  Ｐｏｌｙ−ＨＲＰポリマーを使用したホルマリン固定組織スライドの直接ＩＨＣ染色を１００×顕微鏡倍率でデジタル撮影した代表的な画像を示す。検査した組織は正常な前立腺である。例示的な染色された領域が矢印で示されている。
【００３０】
【図６】図６は、正常な前立腺組織に対する、マウス抗ヒト前立腺特異的抗体（ＰＳＡ）とコンジュゲートしたＮｏｖｏｄｉａｘ  Ｐｏｌｙ−ＨＲＰポリマーを使用した直接ＩＨＣ染色の代表的なデジタル顕微鏡写真（１００×倍率）を示す。例示的な染色された領域が矢印で示されている。
【００３１】
【図７】図７は、ヒトリンパ組織に対する、マウス抗ヒトＩｇＧ抗体とコンジュゲートしたＮｏｖｏｄｉａｘ  Ｐｏｌｙ−ＨＲＰポリマーを使用した直接ＩＨＣ染色の代表的な結果を示す。顕微鏡倍率は４００×である。例示的な染色された領域が矢印で示されている。
【００３２】
【図８】図８は、ポリＨＲＰ抗Ｃｋ８／１８抗体コンジュゲートを使用した凍結ヒトリンパ節組織の直接ＩＨＣ染色の代表的な画像を示す。図８Ａは、ホルマリン固定ヒト前立腺組織の直接的な免疫組織化学染色の結果（２０×）を示す。前立腺上皮細胞をＮｏｖｏｄｉａｘ  ＨＲＰポリマーで標識したマウス抗ヒト低分子量ケラチンモノクローナル抗体（ＣＫ８／１８、クローンＣ９４）により直接染色し、直接的な免疫組織化学染色のためのインキュベーション時間は３７℃で３分であった。図８Ｂは、ホルマリン固定ヒト前立腺組織の直接的な免疫組織化学染色の結果（４０×）を示す。前立腺上皮細胞をＮｏｖｏｄｉａｘ  ＨＲＰポリマーで標識したマウス抗ヒト低分子量ケラチンモノクローナル抗体（ＣＫ８／１８、クローンＣ９４）により直接染色し、直接的な免疫組織化学染色のためのインキュベーション時間は３７℃で３分であった。
【００３３】
【図９】図９は、ポリマーＨＲＰ抗Ｃｋ８／１８抗体コンジュゲートを使用した、組織切片の直接ＩＨＣ染色の代表的な画像を示す。ＦＦＰＥ前立腺組織切片（図９Ａ）および凍結ヒトリンパ節組織切片（図９Ｂ）が例示されている。例示的な染色された領域が矢印で示されている。
【００３４】
【図１０】図１０は、ポリマーＨＲＰ抗Ｋｉ−６７抗体コンジュゲートを使用した、ヒト扁桃組織切片の直接ＩＨＣ染色の代表的な画像を示す。例示的な染色された領域が矢印で示されている。
【００３５】
【図１１】図１１は、ポリマーＨＲＰ抗Ｃｋ５抗体コンジュゲートを使用した、ヒト凍結扁桃組織切片の直接ＩＨＣ染色の代表的な画像を示す。例示的な染色された領域が矢印で示されている。
【００３６】
【図１２】図１２は、ポリマーＨＲＰ抗Ｍａｒｔ−１抗体クローンＡ１０３コンジュゲートを使用した、黒色腫組織切片の直接ＩＨＣ染色の代表的な画像を示す。例示的な染色された領域が矢印で示されている。
【００３７】
【図１３】図１３は、ポリマーＨＲＰ抗ＣＤ４５抗体クローン３Ａ４コンジュゲートを使用した、扁桃組織切片の直接ＩＨＣ染色の代表的な画像を示す。例示的な染色された領域が矢印で示されている。
【００３８】
【図１４】図１４は、ポリマーＨＲＰとコンジュゲートした治療用抗体を使用した、組織切片の直接ＩＨＣ染色の代表的な画像を示す。扁桃組織試料（図１４Ａ）、前立腺組織試料（図１４Ｂ）、胃組織試料（図１４Ｃ）、および腎臓組織試料（図１４Ｄ）が例示されている。例示的な染色された領域が矢印で示されている。
【００３９】
【図１５】図１５は、ポリマーＨＲＰ抗ＲＯＲ２抗体コンジュゲートを使用した、組織試料の直接ＩＨＣ染色の代表的な画像を示す。黒色腫組織切片（図１５Ａおよび１５Ｂ）、肝細胞癌組織切片（図１５Ｃおよび１５Ｄ）、神経内分泌腫瘍組織切片（図１５Ｅおよび１５Ｆ）、肺癌組織切片（図１５Ｇ）、および腎明細胞癌（ｒｅｎａｌ  ｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）組織切片（図１５Ｈ）が例示されている。例示的な染色された領域が矢印で示されている。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本発明のいくつかの態様が例示のための適用例を参照して下に記載されている。本発明の完全な理解をもたらすために多数の特定の詳細、関係、および方法が記載されていることが理解されるべきである。しかし、本発明は、特定の詳細の１つまたは複数を用いずに、または他の方法を用いて実施することができることが当業者には容易に認識されよう。本発明は、いくつかの行為は異なる順序で、および／または他の行為または事象と同時に起こり得るので、例示された行為または事象の順序に限定されない。
【００４１】
さらに、例示された行為または事象の全てが本発明による方法体系を実行するために必要であるとは限らない。
【００４２】
本明細書において使用される用語法は、特定の実施形態を記載するためだけのものであり、本発明を限定するものではない。本明細書で使用される場合、単数形「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」、および「ｔｈｅ（その）」は、文脈によりそうでないことが明白に示されない限り、複数の形態も含むものとする。さらに、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｗｉｔｈ）」という用語、またはその変形が発明の詳細な説明および／または特許請求の範囲のいずれかにおいて使用される限りでは、そのような用語は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語と同様に包括的なものとする。
【００４３】
「約」または「およそ」という用語は、値がどのように測定または決定されるか、すなわち、測定システムの限定に一部依存する、当業者によって決定される特定の値の許容される誤差範囲内であることを意味する。例えば、「約」とは、当技術分野の慣習に従って、１または１超の標準偏差以内に入ることを意味し得る。あるいは、「約」とは、所与の値の２０％まで、好ましくは１０％まで、より好ましくは５％まで、より好ましくはさらに１％までの範囲を意味し得る。あるいは、特に、生物システムまたはプロセスに関しては、「約」という用語は、値の１桁分以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味し得る。特定の値が本出願および特許請求の範囲に記載されている場合、別段の指定のない限り、特定の値の許容される誤差範囲内を意味する「約」という用語が想定されるべきである。
【００４４】
Ｉ．免疫組織化学アッセイ
一般に、本発明は、組織試料中の標的分析物の存在または非存在を検出するための組成物、方法、およびキットを提供する。一般に、本方法は、（ａ）約１５℃から約４５℃の間のインキュベーション温度で約３分から約１時間の間のインキュベーション期間にわたって、標的分析物を含有する組織試料をポリマー酵素／抗体コンジュゲートと接触させて、標的分析物、およびポリマー酵素／抗体コンジュゲートの少なくとも１つを含む複合体を形成するステップであって、抗体が、標的分析物に特異的に結合することが可能なものであるステップと、（ｂ）複合体を形成しないポリマー酵素／抗体コンジュゲートを除去するステップと、（ｃ）組織試料を酵素の基質と接触させて、それにより、標的分析物を検出するステップとを含む。
【００４５】
一態様では、提供される組成物、方法、およびキットを、ＦＦＰＥ組織切片または凍結組織切片などの組織試料中の抗原などの標的分析物を迅速に検出するために使用する。一態様では、提供される組成物、方法、およびキットを、ＦＦＰＥ組織切片または凍結組織切片などの組織試料中の抗原などの標的分析物を感度よく検出するために使用する。一部の実施形態では、疾患を有する個体を治療のために選択し、ここで、本明細書に開示されている方法による標的分析物の検出を、個体を治療のために選択するための基礎として使用する。
【００４６】
Ａ．組織試料
一般には、本発明で提供される組成物および方法を、被験体に由来する組織試料中の標的分析物を検出するために使用する。一部の実施形態では、本発明で提供される組成物および方法を、被験体に由来する組織内の標的分析物を検出するために使用し、ここで、標的分析物は腫瘍抗原である。
【００４７】
「被験体」または「患者」とは、本明細書では、ヒト、ウシ、イヌ、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ニワトリ、昆虫などを含めた、療法が望まれる任意の単一の被験体を意味する。疾患のいかなる臨床徴候も示していない、臨床試験に関与しているあらゆる被験体、または疫学試験に関与している被験体、または対照として使用される被験体も、被験体に含まれるものとする。
【００４８】
「組織試料」とは、本明細書では、好ましくは染色体性物質を有する有核細胞を含有する被験体または患者の組織から得られる類似した細胞の集合を意味する。４つの主要なヒト組織は、（１）上皮；（２）血管、骨および軟骨などの結合組織；（３）筋組織；および（４）神経組織である。組織試料の供給源は、新鮮な、凍結した、および／もしくは保存された臓器もしくは組織試料、または生検材料、または吸引物、または血液または任意の血液構成成分、または、脳脊髄液、羊水、腹腔液（ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｆｌｕｉｄ）、もしくは間質液などの体液、または被験体の妊娠または発生の任意の時点での細胞に由来する固形組織であってよい。組織試料は、初代もしくは培養した細胞もしくは細胞株、または培養組織であってもよい。組織試料は、天然の組織と天然には混合しない化合物、例えば、防腐剤、抗凝固薬、緩衝液、固定剤、栄養分、抗生物質などを含有してよい。本発明の一部の実施形態では、組織試料は、「非血液組織」である（すなわち、血液でも骨髄組織でもない）。
【００４９】
本発明の方法は、例えば、がん組織を含めた任意の型の組織に適用することができる。凍結腫瘍組織は広範に入手可能ではないが、パラフィンブロックは、外科手術後に腫瘍から慣例的に調製され、例えば、チミジル酸シンターゼ発現および化学療法応答の大規模遡及的調査を実施することが可能になる。さらに、当該技法は、広範囲の腫瘍型および無制限の範囲の遺伝子産物のいずれにも適用することができる。本発明の方法は、個々の腫瘍「遺伝子発現プロファイル」を調製するために使用することができ、それにより、個々の患者試料において、１つまたは複数の遺伝子産物について、例えば、臨床転帰および種々の化学療法剤に対する応答に影響を及ぼすことが公知である一連の遺伝子産物などについて発現レベルを決定することができる。
【００５０】
一部の実施形態では、組織は、がん細胞を含む。一部の実施形態では、組織は、がん細胞に対して空間的近傍にある細胞を含む。一部の実施形態では、組織は、がん細胞およびがん細胞に対して空間的近傍にある細胞を含む。一部の実施形態では、組織は、がん細胞に対して密接に空間的近傍にある細胞を含む。一部の実施形態では、組織は、がん細胞に対して密接に空間的近傍にある正常細胞を含む。一部の実施形態では、組織は、がん細胞とがん細胞に対して空間的近傍にある正常細胞の混合物を含む。一部の実施形態では、混合物は、低百分率のがん細胞を含む。一部の実施形態では、混合物は、がん細胞を３０％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、または５％未満含む。一部の実施形態では、混合物は、約５％から約３０％の間のがん細胞を含む。
【００５１】
一部の実施形態では、組織試料は組織切片を含む。
【００５２】
組織試料の「切片」とは、本明細書では、組織試料の単一の部分または小片、例えば、組織試料から切り出された組織または細胞の薄いスライスを意味する。組織試料の複数の切片を取得し、本発明に従って分析に供することができることが理解される。一部の実施形態では、組織の選択された部分または切片は、均一な細胞の集団を含む。一部の実施形態では、組織の選択された部分または切片は、不均一な細胞の集団を含む。一部の実施形態では、選択された部分は、組織の領域、例えば、非限定的な例として内腔を含む。選択された部分は、例えば、１つの細胞または２つの細胞ほど小さくてもよく、何千もの細胞であってもよい。ほとんどの場合、細胞の集合が重要であり、また、本発明は細胞成分の検出における使用に関して記載されているが、本方法は、生物体の非細胞成分（例えば、非限定的な例として血液中の可溶性成分）を検出するためにも使用することができる。
【００５３】
被験体由来の任意の組織試料を使用することができる。使用することができる組織試料の例としては、これだけに限定されないが、乳房、前立腺、卵巣、結腸、肺、子宮内膜、胃、唾液腺、または膵臓が挙げられる。組織試料は、これだけに限定されないが、外科的切除、吸引、または生検を含めた種々の手順によって得ることができる。組織は新鮮なものであっても凍結したものであってもよい。
【００５４】
一部の実施形態では、組織は、時間を経たものである。「時間を経たもの」とは、本明細書では、ある期間、例えば、凍結またはＦＦＰＥが貯蔵される期間にわたって貯蔵されている組織を意味する。一部の実施形態では、組織試料は、凍結組織試料である。一部の実施形態では、組織は凍結組織である。一部の実施形態では、組織はパラフィン包埋組織である。一部の実施形態では、組織はホルマリン固定パラフィン包埋組織である。
【００５５】
一部の実施形態では、組織試料は、組織切片、臨床塗抹標本、または培養細胞もしくは組織である。一部の実施形態では、組織は、厚さ約５μｍ超の組織切片である。一部の実施形態では、組織は、厚さ約５μｍの組織切片である。一部の実施形態では、組織は、厚さ約５μｍ未満の組織切片である。一部の実施形態では、組織は、厚さ約１．５μｍ〜厚さ約５．５μｍの組織切片である。一部の実施形態では、組織は、厚さ約４．５μｍ〜厚さ約７．５μｍの組織切片である。
【００５６】
一部の実施形態では、組織切片は、哺乳動物の脳、副腎、結腸、小腸、胃、心臓、肝臓、皮膚、腎臓、肺、膵臓、精巣、卵巣、前立腺、子宮、甲状腺、および脾臓の組織切片からなる群より選択される。一部の実施形態では、組織切片は固形腫瘍に由来するものである。
【００５７】
組織試料の調製
これらの粒子状検体から組織ブロックを調製する方法は、種々の予後因子に関する以前のＩＨＣ試験において首尾よく使用されており、かつ／または当業者には周知である。
【００５８】
簡単に述べると、任意のインタクトな臓器または組織を切断してかなり小さな片にし、種々の固定剤（例えば、ホルマリン、アルコールなど）中、組織が「固定」されるまで様々な期間にわたってインキュベートすることができる。試料は、事実上、身体から外科的に除去されたインタクトな任意の組織であってよい。試料は、病理組織検査室において慣例的に使用される設備に適合する合理的に小さな片（複数可）に切断することができる。切断される小片のサイズは、一般には、数ミリメートルから数センチメートルにわたる。
【００５９】
一部の実施形態では、凍結切片は、凍結「粉末化」組織５０ｍｇを、室温、小さなプラスチックカプセルに入ったリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で再湿潤化し（ｒｅｈｙｄｒａｔｅ）；粒子を遠心分離によってペレット化し；粒子を粘性包埋媒体（ＯＣＴ）中に再懸濁させ；カプセルを反転させ、かつ／または遠心分離によって再度ペレット化し；−７０℃イソペンタン中でスナップ凍結させ；プラスチックカプセルを切断し、かつ／または凍結した組織の円柱を取り出し；組織円柱を低温保持装置ミクロトームチャック上に固定し；かつ／または２５〜５０の連続切片に切断することによって調製することができる。
【００６０】
恒久的切片は、プラスチック微量遠心チューブ中、試料５０ｍｇを再湿潤化すること；ペレット化すること；１０％ホルマリン中に再懸濁させ４時間にわたって固定すること；洗浄／ペレット化すること；温かい２．５％寒天中に再懸濁させること；ペレット化すること；氷水中で冷却して寒天を硬化させること；チューブから組織／寒天ブロックを取り出すこと；ブロックをパラフィン中に浸潤および／もしくは包埋させること；ならびに／または５０個までの連続的な恒久的切片に切断することを伴う同様の方法によって調製することができる。
【００６１】
一部の実施形態では、本発明では、例えば、標準の凍結切片（Ｆｒｏｚｅｎ  Ｓｅｃｔｉｏｎ）病院検査室において使用されるものを含めた、ＯＣＴに包埋されたもの、および粉末化されていないものなどの標準の凍結試料を利用することができる。
【００６２】
組織試料は、多くの場合、固定剤を用いて固定する。一般には、ホルマリン（ホルムアルデヒド）およびグルタルアルデヒドなどのアルデヒド固定剤が使用される。アルコール浸漬などの他の固定技法を使用して固定された組織試料も同様に適切である。ＢａｔｔｉｆｏｒａおよびＫｏｐｉｎｓｋｉ，  Ｊ．、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．、３４巻：１０９５頁（１９８６年）を参照されたい。使用する試料は、パラフィンに包埋され得る。
【００６３】
一部の実施形態では、組織試料は、アルデヒドを含有する溶液中に固定される。
【００６４】
一部の実施形態では、組織試料は、ホルマリンを含有する溶液中に固定される。
【００６５】
一部の実施形態では、組織試料は、パラフィン包埋される。
【００６６】
一部の実施形態では、組織試料は、固定され、かつパラフィンなどに包埋される。
【００６７】
一部の実施形態では、試料は、ホルマリン固定され、かつパラフィン包埋される。
【００６８】
一部の実施形態では、ホルマリン固定パラフィン包埋組織（ＦＦＰＥＴ）ブロックを、ＦＦＰＥＴコア試料のための特異的な領域（複数可）を選択するために、分析用に１つまたは複数の部分を選択する前にヘマトキシリン・エオシン染色する。
【００６９】
組織試料は、従来の方法体系によって固定（すなわち、保存）することができる。例えば、「Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｒｍｅｄ  Ｆｏｒｃｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ」、第３版（１９６０年）、Ｌｅｅ  Ｇ．  Ｌｕｎａ、ＨＴ（ＡＳＣＰ）編、Ｔｈｅ  Ｂｌａｋｓｔｏｎ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｂｏｏｋ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｔｈｅ  Ａｒｍｅｄ  Ｆｏｒｃｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ（１９９４年）Ｕｌｒｅｋａ  Ｖ．  Ｍｉｋｅｌ編、Ａｒｍｅｄ  Ｆｏｒｃｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃを参照されたい。固定剤の選択は、組織を組織学的に染色するまたは他の方法で分析する目的によって決定されることが当業者には理解されよう。当業者には、固定の長さが組織試料のサイズおよび使用する固定剤に依存することも理解されよう。例として、中性緩衝ホルマリン、ブアン、またはパラホルムアルデヒドを組織試料の固定に使用することができる。
【００７０】
一般に、組織試料を、まず固定し、次いで、増加系列（ａｓｃｅｎｄｉｎｇ  ｓｅｒｉｅｓ）のアルコールによって脱水し、浸潤させ、パラフィンまたは他の切片作製媒体を用いて包埋し、したがって、組織試料の切片作製を行うことができる。あるいは、組織の切片作製を行い、得られた切片を固定することができる。例として、従来の方法体系によって組織試料をパラフィン中で包埋し、そして加工することができる。例えば、「Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｒｍｅｄ  Ｆｏｒｃｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ」、上記を参照されたい。使用することができるパラフィンの例としては、これだけに限定されないが、Ｐａｒａｐｌａｓｔ、Ｂｒｏｌｏｉｄ、およびＴｉｓｓｕｅｍａｙが挙げられる。組織試料を包埋したら、ミクロトームなどによって試料の切片作製を行うことができる。例えば、「Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｒｍｅｄ  Ｆｏｒｃｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ」、上記を参照されたい。この手順の例として、切片の厚さは約３ミクロン〜約５ミクロンにわたってよい。切片作製したら、いくつかの標準の方法によって切片をスライドに付着させることができる。スライド接着剤の例としては、これだけに限定されないが、シラン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リシンなどが挙げられる。例として、パラフィン包埋した切片を、正に荷電したスライドおよび／またはポリ−Ｌ−リシンでコーティングしたスライドに付着させることができる。
【００７１】
試料の脱パラフィン
パラフィンを包埋材料として使用した場合、一般に、組織切片を脱パラフィンし、水で再湿潤化する。一部の実施形態では、組織をＩＨＣ前に脱パラフィンする。
【００７２】
脱パラフィンにより、パラフィン包埋試料からパラフィンの大半が除去される。脱パラフィンのためのいくつもの技法が公知であり、任意の適切な技法を本発明と共に使用することができる。本発明の好ましい方法では、パラフィンを溶解するために有機溶媒を用いた洗浄を利用する。そのような溶媒は、組織内のリガンドに悪影響を及ぼすことなく、組織試料からパラフィンを有効に除去することができるものである。適切な溶媒は、ベンゼン、トルエン、エチルベンゼン、キシレン、ならびにそれらの混合物などの例示的な溶媒から選択することができる。本発明の方法において使用することが好ましい溶媒はキシレンである。本発明の方法における溶媒単独または溶媒の組合せは、高純度、通常は約９９％超のものであることが好ましい。
【００７３】
パラフィンは、一般には、激しく混合しながら有機溶媒を用いて洗浄し、その後、遠心分離することによって除去する。試料を、チューブ内の組織のペレット化を引き起こすために十分なスピード、通常は約１０，０００〜約２０，０００×ｇで遠心分離する。遠心分離した後、有機溶媒上清を廃棄する。使用する有機溶媒の体積および必要な洗浄の回数は、試料のサイズおよび除去するパラフィンの量に依存することは組織学的検査の当業者には認識されよう。除去するパラフィンの量が多いほど、より多くの洗浄が必要になる。一般には、試料を１回から約１０回の間、好ましくは、約２回から約４回の間洗浄する。有機溶媒の典型的な体積は、組織検体１０μｍに対して約５００μＬである。
【００７４】
例えば直接融解を含めた、当業者に公知の脱パラフィンの他の方法も本発明の方法において使用することができる。
【００７５】
追加的な実施形態では、例えば、脱パラフィンのために使用される、独占所有権のある他の例示的な製剤（例えば、ＨＥＭＯ−ＤＥ（登録商標）（ＰＭＰ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｉｒｖｉｎｇ、ＴＸ）；ＣＬＥＡＲ−ＲＩＴＥ（登録商標）（Ｍｉｃｒｏｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｗａｌｌｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）；ＥＺ−ＤＥＷＡＸ（商標）（ＢｉｏＧｅｎｅｘ、Ｓａｎ  Ｒａｍｏｎ、ＣＡ））を含む柑橘類に基づく脂肪族炭化水素（例えばＤ−リモネン（Ｄ−Ｌｉｍｏｌｅｎｅ）に基づくもの）を使用することができる。ＥＺ−ＤＥＷＡＸ（商標）は、脱蝋および再湿潤化剤として公知である。
【００７６】
組織切片は、いくつかの従来の標準の方法体系によって脱パラフィンすることができる。例えば、キシレンおよび徐々に低下する系列のアルコールを使用することができる。例えば、「Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｒｍｅｄ  Ｆｏｒｃｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ」、上記を参照されたい。あるいは、Ｈｅｍｏ−Ｄｅ（登録商標）（ＣＭＳ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、Ｔｅｘａｓ）などの市販の脱パラフィン非有機薬剤を使用することができる。
【００７７】
再湿潤化
試料を脱パラフィン後に再湿潤化することができる。再湿潤化するための好ましい方法は、漸減濃度の水性低級アルコール性溶液を用いた段階的な洗浄である。再湿潤化のために好ましい低級アルコールはエタノールである。メタノール、イソプロパノールおよびＣ１〜Ｃ５範囲の他の同様のアルコールを含めた他のアルコールも本発明と共に使用するのに適し得る。あるいは、試料をアルコール性溶液と激しく混合し、遠心分離する。好ましい実施形態では、アルコールの濃度範囲を約３〜５の増分ステップにわたって水中約１００％から約７０％まで段階的に低下させ、各ステップにおける溶液濃度の変化は通常、約１０％未満である（例えば、例示的なシークエンス：１００％、９５％、９０％、８０％、７０％）。一部の実施形態では、例えばＥＺ−ＤＥＷＡＸ（商標）（ＢｉｏＧｅｎｅｘ、Ｓａｎ  Ｒａｍｏｎ、ＣＡ）などの試薬を使用して脱パラフィンおよび再湿潤化を同時に行う。
【００７８】
前処理
本発明の一部の実施形態では、例えば、本発明の方法を直接または間接的に容易にするなどのために、試料を前処理することができる。一部の実施形態では、組織の前処理により、標的分析物の抗体結合に対する利用可能性が増大する。標的を利用可能にするための前処理（熱により誘導されるエピトープ回復（ｅｐｉｔｏｐｅ  ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）、またはタンパク質分解酵素により媒介される）を利用することができる。クエン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ、およびＥＤＴＡ塩基を例示的な熱誘導性試薬として使用することができる。本発明のある特定の態様では、ペプシン、プロテイナーゼＫ、トリプシン、プロテアーゼ、およびサブタイプの全ても、例えば、独占所有権のある利用可能な多くの製剤を利用することによってなどで使用することができる。
【００７９】
Ｂ．標的分析物
提供される組成物および方法を、組織試料中の１つまたは複数の標的分析物を検出するために使用する。
【００８０】
「標的分析物」または「分析物」または「標的」または文法上の等価物は、本明細書では、検出される任意の分子、化合物、または粒子を意味する。
【００８１】
一部の実施形態では、標的分析物は、未分化新生物／未知の原発性（ｐｒｉｍａｒｙ）の診断におけるバイオマーカー、例えば、上皮マーカー（サイトケラチンおよびＥＭＡ）、筋上皮マーカー（ｐ６３、Ｓ１００、カルポニン、ＳＭＡ、ＳＭＭＨ−１、ＣＫ１４、マスピン）、間葉系マーカー（ビメンチン、ＳＭＡ、ＭＳＡ、デスミン、ＭｙｏＤ１、ミオゲニン、ＮＦ、Ｓ１００、Ｐ６３、ＣＤ１０、カルポニン、ミオグロビン、ＭＤＭ２、ＣＤＫ４、ＦＬＩ−１、ＣＤ１１７、ＤＯＧ１、ＣＤ３１、ＣＤ３４、第ＸＩＩＩａ因子、ＣＤ９９）、メラニン細胞マーカー（Ｓ１００、ＨＭＢ−４５、ＭＡＲＴ−１、チロシナーゼ、ＭｉＴＦ）、中皮マーカー（カルレチニン、ＣＫ５／６、ＷＴ１、Ｄ２−４０、ＨＢＭＥ−１、メソテリン、トロンボモジュリン）、神経内分泌マーカー（クロモグラニン、シナプトフィジン、ＣＤ５６、ＰＧＰ９．５、ＮＳＥ、インスリン、ＰＴＨ、カルシトニン、サイログロブリン、プロラクチン）、生殖細胞腫瘍マーカー（ＰＬＡＰ、ＯＣＴ４、ＣＤ１１７またはｃ−ｋｉｔ、ＳＡＬＬ４、ＣＤ３０、アルファ−フェトプロテイン、ベータ−ｈＣＧ、グリピカン−３、インヒビン−アルファ、カルレチニン、ＥＭＡ、ＣＡＭ５．２）、Ｂ細胞マーカー（ＣＤ７９ａおよびＰＡＸ５）、および造血マーカー（ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ１０、ＣＤ３８、ＣＤ２１、ＣＤ３５、ＣＤ１５、ＣＤ３０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ４３、ＣＤ１３８、ＣＤ６８、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−６、サイクリンＤ１、ＭＵＭ１、Ｓ１００、ＭＰＯ）などである。
【００８２】
一部の実施形態では、標的分析物は、腫瘍起源を同定するためのバイオマーカー、例えば、甲状腺髄様癌に関するカルシトニンおよびＣＥＡ；膵臓内分泌新生物に関するインスリン、グルカゴンおよびソマトスタチン；メルケル細胞癌に関するＣＫ２０；血管筋脂肪腫に関するＨＭＢ−４５、ＭＡＲＴ−１およびＳＭＡ；黒色腫に関するＳ１００、ＨＭＢ−４５、ＭＡＲＴ−１、ＳＯＸ１０、およびビメンチン；ＧＩおよびＧＩ外間質腫瘍に関するＣＤ１１７およびＤＯＧ−１；胸腺癌に関するＣＤ５およびｐ６３；結腸直腸癌に関するＣＫ２０、ＣＤＸ−２、ベータカテニンおよびビリン；唾液腺管癌に関するアンドロゲン受容体およびＧＣＤＦＰ−１５；乳癌に関するＧＣＤＦＰ−１５、ＥＲ、ＰＲ、マンマグロビン；肺腺癌に関するＴＴＦ１、ナプシンＡおよびサーファクタントＡ；甲状腺乳頭状癌（ｔｈｙｒｏｉｄ  ｐａｏｉｌｌａｒｙ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）および濾胞状癌に関するＴＴＦ１、サイログロブリン、ＰＡＸ８；ランゲルハンス細胞組織球増殖症（ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ  ｃｅｌｌ  ｈｉｓｔｉｃｙｔｏｓｉｓ）に関するＣＤ１ａおよびＳ１００；前立腺腺癌に関するＰＳＡ、ＰＳＡＰおよびＰ５０４Ｓ；脊索腫に関するＣＫ、ＥＭＡ、Ｓ１００；乳頭状ＲＣＣに関するＰ５０４Ｓ／ＫＩＭ−１／ＲＣＣＭａ；明細胞ＲＣＣに関するＲＣＣＭａ、ＫＩＭ−１、ＰＡＸ８、ｐＶＨＬ；甲状腺のヒアリン化小柱状腺腫（ｈｙａｌｉｎｉｚｉｎｇ  ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ  ａｄｅｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｈｙｒｏｉｄ）に関するＭＩＢ１（Ｋｉ−６７）；セミノーマに関するＯＣＴ４／ＣＤ１１７／ＰＬＡＰ／Ｄ２−４０；線維形成性小円形細胞腫瘍（ＤＰＳＲＣＴ）に関するＣＫ、デスミン；肝細胞癌に関するグリピカン−３、Ｈｅｐ  Ｐａｒ１；悪性胚細胞性腫瘍に関するアルファ−フェトプロテイン／グリピカン−３／ＰＬＡＰ／ＳＡＬＬ４；胎生期癌に関するＯＣＴ４／ＣＤ３０／ＳＯＸ２／ＳＡＬＬ４／ＰＬＡＰ；脂肪組織／脂肪肉腫に関するＤＭ２、ＣＤＫ４；横紋筋肉腫に関するミオゲニン、デスミン、ｍｙｏＤ１；平滑筋肉腫／平滑筋腫瘍に関するＳＡＭ、ＭＳＡ、デスミン；子宮頸癌（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）および頚管内癌（ｅｎｄｏｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）に関するｐ１６、ＨＰＶ  ｉｎ  ｓｉｔｕ；漿液性卵巣癌に関するＥＲ、ＷＴ１、ＰＡＸ８；子宮内膜間質部肉腫に関するＣＤ１０、ＥＲ；膵管腺癌（ＰＤＡ）に関するマスピン、ＶＨＬ；Ｔ細胞に関するＣＤ２、ＣＤ３；Ｂ細胞に関するＣＤ２０、ＰＡＸ５、ＣＤ６９ａ；骨髄性細胞に関するＣＤ４３、ＣＤ３４、ＣＤ３３、ＭＰＯ；肥満細胞に関するＣＤ１１７、トリプターゼ；ならびに濾胞樹状細胞に関するＣＤ２１、ＣＤ３５などである。
【００８３】
一部の実施形態では、標的分析物は、疾患カテゴリー内での詳細な分類に関するバイオマーカー、例えば、リンパ腫／白血病に関するＣＤ３、ＣＤ２０、ＣＤ７９ａ、ＰＡＸ５、ＣＤ４５ｒｂ、ＣＤ１５、ＣＤ３０、ＡＬＫ−１、ＣＤ１３８、ＣＤ５６、免疫グロブリン、ＨＨＶ８、ＥＭＡ、ＴｄＴ、ＣＤ３４、ＣＤ１１７、およびＭＰＯなどである。
【００８４】
一部の実施形態では、標的分析物は、コンパニオン診断のためのバイオマーカー、例えば、ＥＲ、ＰＲ、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、およびＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）などである。
【００８５】
一部の実施形態では、標的は、タンパク質、炭水化物、脂質、および／または核酸を含む。一部の実施形態では、標的は、タンパク質および／またはその特徴的な部分、例えば、腫瘍マーカー、インテグリン、細胞表面受容体、膜貫通タンパク質、細胞間タンパク質、イオンチャネル、膜輸送体タンパク質、酵素、抗体、キメラタンパク質、糖タンパク質などを含む。一部の実施形態では、標的は、例えば、糖タンパク質、糖（例えば、単糖、二糖、多糖）、グリコカリックス（すなわち、大多数の真核細胞の外側表面上の炭水化物に富む辺縁ゾーン）などの炭水化物および／またはその特徴的な部分を含む。一部の実施形態では、標的は、例えば、油、脂肪酸、グリセリド、ホルモン、ステロイド（例えば、コレステロール、胆汁酸）、ビタミン（例えば、ビタミンＥ）、リン脂質、スフィンゴ脂質、リポタンパク質などの脂質および／またはその特徴的な部分を含む。
【００８６】
多数のマーカーが当技術分野で公知である。典型的なマーカーとしては、細胞表面タンパク質、例えば、受容体が挙げられる。例示的な受容体としては、これだけに限定されないが、トランスフェリン受容体；ＬＤＬ受容体；増殖因子受容体、例えば、上皮増殖因子受容体ファミリーメンバー（例えば、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、Ｈｅｒ４）または血管内皮増殖因子受容体、サイトカイン受容体、細胞接着分子、インテグリン、セレクチン、およびＣＤ分子が挙げられる。マーカーは、悪性細胞において排他的にまたは多量に存在する分子、例えば腫瘍抗原であってよい。一部の実施形態では、マーカーまたは標的分析物は、対照におけるマーカーまたは標的分析物よりも多量に存在する。
【００８７】
一部の実施形態では、標的分析物は、上皮マーカー（サイトケラチン（ｃｙｔｏｋｅｒｔｉｎ）およびＥＭＡ）、筋上皮マーカー（ｐ６３、Ｓ１００、カルポニン、ＳＭＡ、ＳＭＭＨ−１、ＣＫ１４、マスピン）、間葉系マーカー（ビメンチン、ＳＭＡ、ＭＳＡ、デスミン、ＭｙｏＤ１、ミオゲニン、ＮＦ、Ｓ１００、Ｐ６３、ＣＤ１０、カルポニン、ミオグロビン、ＭＤＭ２、ＣＤＫ４、ＦＬＩ−１、ＣＤ１１７、ＤＯＧ１、ＣＤ３１、ＣＤ３４、第ＸＩＩＩａ因子、ＣＤ９９）、メラニン細胞マーカー（Ｓ１００、ＨＭＢ−４５、ＭＡＲＴ−１、チロシナーゼ、ＭｉＴＦ）、中皮マーカー（カルレチニン、ＣＫ５／６、ＷＴ１、Ｄ２−４０、ヘム−１、メソテリン、トロンボモジュリン）、神経内分泌マーカー（クロモグラニン、シナプトフィジン、ＣＤ５６、ＰＧＰ９．５、ＮＳＥ、インスリン、ＰＴＨ、カルシトニン、サイログロブリン、プロラクチン）、生殖細胞腫瘍マーカー（ＰＬＡＰ、ＯＣＴ４、ＣＤ１１７またはｃ−ｋｉｔ、ＳＡＬＬ４、ＣＤ３０、アルファフェトプロテイン、ベータ−ｈＣＧ、グリピカン−３、インヒビン−アルファ、カルレチニン、ＥＭＡ、ＣＡＭ５．２）、ならびに造血マーカー（ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ１０、ＣＤ３８、ＣＤ２１、ＣＤ３５、ＣＤ１５、ＣＤ３０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ４３、ＣＤ１３８、ＣＤ６８、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−６、サイクリンＤ１、ＭＵＭＩ、Ｓ１００、ＭＰＯ）から選択される、未分化新生物および／または未知の原発腫瘍の診断のためのバイオマーカー；以下から選択される腫瘍起源を同定するためのバイオマーカー：甲状腺髄様癌に関するカルシトニンおよびＣＥＡ；膵臓内分泌新生物に関するインスリン、グルカゴンおよびソマトスタチン；メルケル細胞癌に関するＣＫ２０；血管筋脂肪腫に関するＨＭＢ−４Ｓ、ＭＡＲＴ−１およびＳＭＡ；黒色腫に関するＳ１００、ＨＭＢ−４５、ＭＡＲＴ−１、ＳＯＸ１０、およびビメンチン；ＧＩおよびＧＩ外間質腫瘍に関するＣＤ１１７およびＤＯＧ−１；胸腺癌に関するＣＤ５およびｐ６３；結腸直腸癌に関するＣＫ２０、ＣＤＸ−２、ベータカテニンおよびビリン；唾液腺管癌に関するアンドロゲン受容体およびＧＣＤＦＰ−１５；乳癌に関するＧＣＤＦＰ−１５、ＥＲ、ＰＲ、マンマグロビン；肺腺癌に関するＴＴＦ１、ナプシンＡおよびサーファクタントＡ；甲状腺乳頭状癌および濾胞状癌に関するＴＴＦ１、サイログロブリン、ＰＡＸ８；ランゲルハンス細胞組織球増殖症に関するＣＤ１ａおよびＳ１００；前立腺腺癌に関するＰＳＡ、ＰＳＡＰおよびＰ５０４Ｓ；脊索腫に関するＣＫ、ＥＭＡ、Ｓ１００；乳頭状ＲＣＣに関するＰ５０４Ｓ／ＫＩＭ−１／ＲＣＣＭａ；明細胞ＲＣＣに関するＲＣＣＭａ、ＫＩＭ−１、ＰＡＸ８、ｐＶＨＬ；甲状腺のヒアリン化小柱状腺腫に関するＭＩＢＩ（Ｋｉ−６７）；セミノーマに関するＯＣＴ４／ＣＤ１１７／ＰＬＡＰ／Ｄ２−４０；線維形成性小円形細胞腫瘍（ＤＰＳＲＣＴ）に関するＣＫ、デスミン；肝細胞癌に関するグリピカン−３、Ｈｅｐ  Ｐａｒｌ；悪性胚細胞性腫瘍に関するアルファ−フェトプロテイン／グリピカン−  ３／ＰＬＡＰ／ＳＡＬＬ４；胎生期癌に関するＯＣＴ４／ＣＤ３０／ＳＯＸ２／ＳＡＬＬ４／ＰＬＡＰ；��肪組織／脂肪肉腫に関するＤＭ２、ＣＤＫ４；横紋筋肉腫に関するミオゲニン、デスミン、ｍｙｏＤＩ；平滑筋肉腫／平滑筋腫瘍に関するＳＡＭ、ＭＳＡ、デスミン；子宮頸癌および頚管内癌に関するｐ１６、ＨＰＶ  ｉｎ  ｓｉｔｕ；漿液性卵巣癌に関するＥＲ、ＷＴ１、ＰＡＸ８；子宮内膜間質部肉腫に関するＣＤ１０、ＥＲ；膵管腺癌（ＰＤＡ）に関するマスピン、ＶＨＬ；Ｔ細胞に関するＣＤ２、ＣＤ３；Ｂ細胞に関するＣＤ２０、ＰＡＸ５、ＣＤ６９ａ；骨髄性細胞に関するＣＤ４３、ＣＤ３４、ＣＤ３３、ＭＰＯ；肥満細胞に関するＣＤ１１７、トリプターゼ；もしくは濾胞樹状細胞に関するＣＤ２１、ＣＤ３５；ＣＤ３、ＣＤ２０、ＣＤ７９ａ、ＰＡＸ５、ＣＤ４５ｒｂ、ＣＤ１５、ＣＤ３０、ＡＬＫ−１、ＣＤ１３８、ＣＤ５６、免疫グロブリン、ＨＨＶ８、ＥＭＡ、ＴｄＴ、ＣＤ３４、ＣＤ１１７、およびＭＰＯから選択される疾患カテゴリー内での詳細な分類に関するバイオマーカー；または、ＥＲ、ＰＲ、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、およびＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）から選択されるコンパニオン診断のためのバイオマーカーから選択される。
【００８８】
腫瘍抗原
ある特定の実施形態では、標的は、腫瘍マーカーである。一部の実施形態では、腫瘍マーカーは、腫瘍に存在し、正常な器官、組織、および／または細胞には存在しない抗原である。一部の実施形態では、腫瘍マーカーは、腫瘍に関連し、正常な器官、組織、および／または細胞には関連しない抗原である。一部の実施形態では、腫瘍マーカーは、腫瘍の細胞表面上にあり、正常な器官、組織、および／または細胞の細胞表面上にはない抗原である。一部の実施形態では、腫瘍マーカーは、腫瘍において正常な器官、組織、および／または細胞よりもより広く行き渡っている抗原である。一部の実施形態では、腫瘍マーカーは、腫瘍に、正常な器官、組織、および／または細胞よりもより広く行き渡って関連する抗原である。一部の実施形態では、腫瘍マーカーは、悪性がん細胞において正常細胞よりも広く行き渡っている抗原である。一部の実施形態では、腫瘍マーカーは、悪性がん細胞に、正常細胞よりも広く行き渡って関連する抗原である。一部の実施形態では、腫瘍マーカーは、腫瘍マーカーが対照において見いだされるよりも高レベルで存在する。一部の実施形態では、腫瘍マーカーは、腫瘍マーカーが非がん性組織において見いだされるよりも高レベルで存在する。
【００８９】
一部の実施形態では、標的分析物は腫瘍抗原を含む。
【００９０】
「腫瘍抗原」とは、本明細書では、腫瘍細胞において産生される抗原性物質を意味する、すなわち、腫瘍抗原とは、宿主における免疫応答を誘発するものである。身体内の正常なタンパク質は、自己反応性細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）および自己抗体産生Ｂリンパ球が、一次リンパ組織（ＢＭ）に「中心的に」、および二次リンパ組織に「末梢性に」選別される（大部分は、Ｔ細胞について胸腺およびＢ細胞について脾臓／リンパ節）プロセスである自己寛容に起因して、抗原性ではない。したがって、免疫系に曝露されないあらゆるタンパク質が免疫応答を誘発する。これは、免疫系から十分に隔離された正常なタンパク質、通常は極めて少量しか産生されないタンパク質、通常はある特定の発生段階でのみ産生されるタンパク質、または変異に起因して構造が改変されたタンパク質を含み得る。
【００９１】
一部の実施形態では、標的は、腫瘍組織および／または細胞において正常組織および／または細胞よりも優先的に発現する。一部の実施形態では、標的は、腫瘍組織において正常組織よりも高レベルで発現する。一部の実施形態では、標的は、対照よりも高レベルで発現する。
【００９２】
本発明の一部の実施形態では、マーカーは腫瘍マーカーである。マーカーは、分裂細胞において非分裂細胞よりも高レベルで発現するポリペプチドであってよい。例えば、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ（ＥｒｂＢ−２としても公知）はＥＧＦ受容体ファミリーのメンバーであり、乳がんに関連する腫瘍の細胞表面上に発現する。別の例は、ナノ粒子をヌクレオリンに誘導するために適した標的化薬剤であるＦ３として公知のペプチドである。Ｐｏｒｋｋａら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、９９巻：７４４４頁（２００２年）；およびＣｈｒｉｓｔｉａｎら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１６３巻：８７１頁（２００３年）を参照されたい。ナノ粒子およびＡ１０アプタマー（ＰＳＭＡに特異的に結合する）を含む標的化された粒子により、ドセタキセルを前立腺がん腫瘍に特異的かつ有効に送達できたことが示されている。
【００９３】
腫瘍細胞の生物学的挙動のシグナル伝達経路に特異的に干渉し、それを調節するこれらの腫瘍標的を特異的に標的化する抗体または他の薬物は、シグナル伝達経路を直接調節または遮断して腫瘍細胞の成長を阻害するまたはアポトーシスを誘導する。現在まで、固形腫瘍または血液悪性疾患の臨床研究および治療に関して多数の標的薬物が承認されており、血液悪性疾患に対して標的化された薬物がいくつも存在する。
【００９４】
一部の実施形態では、腫瘍抗原（または腫瘍標的）は、ＣＤ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７９、およびＣＤ１３７からなる群より選択される。
【００９５】
一部の実施形態では、腫瘍抗原（または腫瘍標的）は、４−１ＢＢ、５Ｔ４、ＡＧＳ−５、ＡＧＳ−１６、アンジオポエチン２、Ｂ７．１、Ｂ７．２、Ｂ７ＤＣ、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７Ｈ２、Ｂ７Ｈ３、ＢＴ−０６２、ＢＴＬＡ、ＣＡＩＸ、がん胎児性抗原、ＣＴＬＡ４、クリプト（Ｃｒｉｐｔｏ）、ＥＤ−Ｂ、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＥＧＦＬ７、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＢ２、ＦＡＰ、フィブロネクチン、葉酸受容体、ガングリオシドＧＭ３、ＧＤ２、グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）、ｇｐ１００、ｇｐＡ３３、ＧＰＮＭＢ、ＩＣＯＳ、ＩＧＦ１Ｒ、インテグリンαν、インテグリンανβ、ＫＩＲ、ＬＡＧ−３、ルイスＹ抗原、メソテリン、ｃ−ＭＥＴ、ＭＮ炭酸脱水酵素ＩＸ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、Ｎｅｃｔｉｎ−４、ＮＫＧＤ２、ＮＯＴＣＨ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＰＤ−１、ＰＤＬ１、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＡＮＫＬ、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＳＬＣ４４Ａ４、シンデカン−１、ＴＡＣＩ、ＴＡＧ−７２、テネイシン、ＴＩＭ３、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、およびそのバリアントからなる群より選択される。腫瘍抗原のバリアントは、当技術分野で公知であり、かつ／または天然に存在する種々の変異体または多型を包含する。
【００９６】
一部の実施形態では、標的分析物は、低レベルで発現する。一部の実施形態では、例えばＲＯＲ１およびＲＯＲ２など、標的分析物のコピー数は細胞当たり約１×１０３〜１×１０４個である。Ｓ．  Ｂａｓｋａｒら、Ｕｎｉｑｕｅ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ＲＯＲ１  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００８年：１４巻（２号）３９６頁、Ｖ．  Ｗａｌｋａｍｍら、Ｌｉｖｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  Ｘｗｎｔ５Ａ−ＲＯＲ２  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ、ＰＬＯＳ  ＯＮＥ  ２０１４年、９巻（１０号）１〜９頁を参照されたい。
【００９７】
Ｃ．ポリマー酵素／抗体コンジュゲート
別の態様では、本発明は、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートであって、抗体が、標的分析物に特異的に結合することが可能なものであるポリマー酵素／抗体コンジュゲートを提供する。
【００９８】
抗体
一般に、コンジュゲートは、抗体またはその機能性断片を含む。
【００９９】
「免疫グロブリン」または「抗体」とは、本明細書では、全長（すなわち、天然に存在するもしくは正常な免疫グロブリン遺伝子断片組換えプロセスによって形成される）免疫グロブリン分子（例えば、ＩｇＧ抗体）、または、抗体断片のような、免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な（すなわち、特異的に結合する）部分を意味する。抗体または抗体断片は、特許請求された主題の範囲内でコンジュゲートまたは他のやり方で誘導体化することができる。そのような抗体としては、ＩｇＧ１、ｌｇＧ２ａ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４（およびＩｇＧ４サブフォーム）、ならびにＩｇＡアイソタイプが挙げられる。
【０１００】
「抗体」という用語は、本明細書では、最も広範な意味で使用され、所望の抗原結合活性を示し、免疫グロブリンのＦｃ領域またはＦｃ領域と同等の領域を含む限りは、それだけに限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば二特異性抗体）、および抗体断片を含めた種々の抗体構造を包含する。「全長の抗体」、「インタクトな抗体」および「全抗体」という用語は、本明細書では互換的に使用され、ネイティブな抗体構造と実質的に類似した構造を有するまたは本明細書で定義されているＦｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指す。
【０１０１】
「ネイティブな抗体」とは、本明細書では、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を意味する。例えば、ネイティブなＩｇＧ抗体は、約１５０，０００ダルトンの、ジスルフィド結合した２つの同一の軽鎖と２つの同一の重鎖で構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端まで、各重鎖は、可変重ドメインまたは重鎖可変ドメインとも称される可変領域（ＶＨ）、その後に、重鎖定常領域とも称される３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、各軽鎖は、可変軽ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも称される可変領域（ＶＬ）、その後に、軽鎖定常領域とも称される定常軽（ＣＬ）ドメインを有する。抗体の軽鎖は、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と称される２つの型のうちの１つ割り当てることができる。
【０１０２】
「抗体断片」とは、本明細書では、インタクトな抗体が結合する抗原に結合する、インタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を意味する。抗体断片の例としては、これだけに限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、直鎖状抗体、単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、および抗体断片から形成される多特異性抗体が挙げられる。ある特定の抗体断片の概説については、Ｈｕｄｓｏｎら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９巻、１２９〜１３４頁（２００３年）を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の概説については、例えば、Ｐｌｉｉｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、１１３巻、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２６９〜３１５頁（１９９４年）を参照されたい；ＷＯ９３／１６１８５；ならびに米国特許第５，５７１，８９４号および同第５，５８７，４５８号も参照されたい。サルベージ受容体結合性エピトープ残基を含み、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期が増大したＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片に関する考察については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照されたい。ダイアボディは、二価または二特異性であり得る２つの抗原結合性部位を有する抗体断片である。例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ１９９３／０１１６１；Ｈｕｄｓｏｎら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ、９巻、１２９〜１３４頁（２００３年）；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、９０巻、６４４４〜６４４８頁（１９９３年）を参照されたい。トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）およびテトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）もＨｕｄｓｏｎら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ、９巻、１２９〜１３４頁（２００３年）に記載されている。単一ドメイン抗体とは、抗体の重鎖可変ドメインの全部もしくは一部または軽鎖可変ドメインの全部もしくは一部を含む抗体断片である。ある特定の実施形態では、単一ドメイン抗体とはヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，  Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ，  ＭＡ；例えば、米国特許第６，２４８，５１６Ｂ１号を参照されたい）。抗体断片は、これだけに限定されないが、本明細書に記載の通り、インタクトな抗体のタンパク質分解性消化ならびに組換え宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはファージ）による産生を含めた種々の技法によって作製することができる。
【０１０３】
「抗原結合性ドメイン」とは、本明細書では、抗原の一部または全部に特異的に結合し、それと相補的である領域を含む抗体の部分を意味する。抗原結合性ドメインは、例えば、１つまたは複数の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも称される）からもたらすことができる。特に、抗原結合性ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）および抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
【０１０４】
「可変領域」または「可変ドメイン」とは、本明細書では、抗体の抗原への結合に関与する抗体重鎖または軽鎖のドメインを意味する。ネイティブな抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨおよびＶＬ）は、一般に、同様の構造を有し、各ドメインが４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む。例えば、Ｋｉｎｄｔら、Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第６版、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、９１頁（２００７）を参照されたい。単一のＶＨドメインまたはＶＬドメインが、抗原結合特異性を付与するために十分であり得る。
【０１０５】
「超可変領域」または「ＨＶＲ」とは、本明細書では、配列が超可変性であり、かつ／または構造的に定義されたループである「超可変ループ」を形成する抗体可変ドメインの領域のそれぞれを意味する。一般に、ネイティブな４鎖抗体は、６つのＨＶＲ；ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、およびＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）を含む。ＨＶＲは、一般に、超可変ループからのアミノ酸残基および／または相補性決定領域（ＣＤＲ）からのアミノ酸残基を含み、後者は配列可変性が最も高く、かつ／または抗原認識に関与する。ＶＨのＣＤＲ１は例外として、ＣＤＲは、一般に、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。超可変領域（ＨＶＲ）は、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）とも称され、これらの用語は、抗原結合性領域を形成する可変領域の部分に関して、本明細書では互換的に使用される。この特定の領域は、Ｋａｂａｔら、Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐｔ．  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（１９８３年）およびＣｈｏｔｈｉａら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９６巻：９０１〜９１７頁（１９８７年）により記載されており、そこでは、互いと比較した際のアミノ酸残基の重複またはサブセットが定義に含まれる。それにもかかわらず、抗体のＣＤＲまたはそのバリアントを指すいずれの定義の適用も、本明細書で定義され、使用されるこの用語の範囲内であるものとする。特定のＣＤＲを包含する正確な残基数は、ＣＤＲの配列およびサイズに応じて変動する。当業者は、どの残基が特定のＣＤＲを含むかを、抗体の可変領域アミノ酸配列を考慮して慣例的に決定することができる。
【０１０６】
本発明の抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、または抗体融合タンパク質であってよい。
【０１０７】
「キメラ抗体」とは、本明細書では、１つの種に由来する抗体、好ましくはげっ歯類抗体、より好ましくはマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、抗体重鎖および軽鎖の両方の可変ドメインを含有するが、抗体分子の定常ドメインはヒト抗体の定常ドメインに由来する組換えタンパク質を意味する。獣医学的適用に関しては、キメラ抗体の定常ドメインは、類人霊長類、ネコまたはイヌなどの他の種の定常ドメインに由来するものであり得る。
【０１０８】
「ヒト化抗体」とは、本明細書では、１つの種に由来する抗体、例えば、げっ歯類抗体からのＣＤＲが、げっ歯類抗体の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインからヒト重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインに移入されたものである、組換えタンパク質を意味する。当該抗体分子の定常ドメインはヒト抗体の定常ドメインに由来するものである。一部の実施形態では、ヒト化抗体のフレームワーク領域の特定の残基、特にＣＤＲ配列と接触しているまたはその近くにある残基を改変すること、例えば、元のげっ歯類、類人霊長類、または他の抗体からの対応する残基で置き換えることができる。
【０１０９】
「ヒト抗体」とは、本明細書では、例えば、抗原性攻撃に応答して特定のヒト抗体を産生するように「操作された」トランスジェニックマウスから得られる抗体を意味する。この技法では、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子座の構成要素を、内在性の重鎖および軽鎖遺伝子座の標的化破壊を含む胚性幹細胞株に由来するマウスの系統に導入する。トランスジェニックマウスは、ヒト抗原に特異的なヒト抗体を合成することが可能であり、当該マウスを使用して、ヒト抗体を分泌するハイブリドーマを産生することができる。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得るための方法は、Ｇｒｅｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ  ７巻：１３頁（１９９４年）、Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８巻：８５６頁（１９９４年）、およびＴａｙｌｏｒら、Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎ．  ６巻：５７９頁（１９９４年）に記載されている。完全ヒト抗体は、全て当技術分野で公知である、遺伝子または染色体トランスフェクション方法ならびにファージディスプレイ技術によって構築することもできる。例えば、免疫化していないドナー由来の免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子レパートリーからのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるヒト抗体およびその断片の産生に関しては、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８巻：５５２〜５５３頁（１９９０年）を参照されたい。この技法では、抗体可変ドメイン遺伝子を糸状バクテリオファージの主要または副コートタンパク質遺伝子のいずれかにインフレームでクローニングし、ファージ粒子の表面上に機能性抗体断片としてディスプレイさせる。糸状粒子は、ファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含有するので、抗体の機能的性質に基づく選択により、それらの性質を示す抗体をコードする遺伝子の選択ももたらされる。このように、ファージは、Ｂ細胞の性質のいくつかを模倣する。ファージディスプレイは様々な形式で実施することができ、それらの総説については、例えば、ＪｏｈｎｓｏｎおよびＣｈｉｓｗｅｌｌ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３巻：５５６４〜５７１頁（１９９３年）を参照されたい。ヒト抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化したＢ細胞によって生成させることもできる。その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５６７，６１０号および同第５，２２９，２７５号を参照されたい。
【０１１０】
「抗体融合タンパク質」とは、本明細書では、同じまたは異なる特異性を有する同じまたは異なる天然の抗体、単鎖抗体または抗体断片セグメントのうちの２つまたはそれ超が連結した、組換え産生された抗原結合性分子を意味する。融合タンパク質は、特異的な結合部位を少なくとも１つ含む。融合タンパク質の価数は、融合タンパク質が抗原（複数可）またはエピトープ（複数可）に対して有する結合アームまたは部位の総数、すなわち、一価、二価、三価、または多価を示す。抗体融合タンパク質の多価とは、抗体融合タンパク質が、抗原への結合に複数の相互作用を活用することができ、したがって、抗原への、または異なる抗原への結合のアビディティが増大することを意味する。特異性とは、抗体融合タンパク質がどれほど多くの異なる型の抗原またはエピトープに結合することができるか、すなわち、単一特異性、二特異性、三重特異性、多特異性を示す。これらの定義を使用すると、天然の抗体、例えばＩｇＧは、結合アームを２つ有するので二価であるが、１つの型の抗原またはエピトープに結合するので、単一特異性である。単一特異性多価融合タンパク質は、同じ抗原またはエピトープに対する結合部位を１つ超有する。例えば、単一特異性ダイアボディは、同じ抗原に反応する結合部位を２つ有する融合タンパク質である。融合タンパク質は、異なる抗体成分の多価または多特異性の組合せを含んでもよく、同じ抗体成分の複数のコピーを含んでもよい。融合タンパク質は、治療剤をさらに含んでよい。
【０１１１】
一部の実施形態では、抗体を、組織試料中の目的の標的細胞上または標的部位において発現する抗原に対する特異性に基づいて選択する。多種多様な、腫瘍に特異的な抗原または他の疾患に特異的な抗原が同定されており、これらの抗原に対する抗体は、そのような腫瘍または他の疾患の治療において使用されているまたは使用が提唱されている。当技術分野で公知の抗体を、特に、標的抗原が関連する疾患を治療するための本発明の化合物に使用することができる。本発明の抗体−リンカー−薬物コンジュゲートにより標的化することが可能な標的抗原（およびそれらの関連する疾患）の例としては、ＣＤ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７９、ＣＤ１３７、４−１ＢＢ、５Ｔ４，ＡＧＳ−５，ＡＧＳ−１６、アンジオポエチン２、Ｂ７．１、Ｂ７．２、Ｂ７ＤＣ、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７Ｈ２、Ｂ７Ｈ３、ＢＴ−０６２、ＢＴＬＡ、ＣＡＩＸ、がん胎児性抗原、ＣＴＬＡ４、クリプト、ＥＤ−Ｂ、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＥＧＦＬ７、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＢ２、ＦＡＰ、フィブロネクチン、葉酸受容体、ガングリオシドＧＭ３、ＧＤ２、グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）、ｇｐ１００、ｇｐＡ３３、ＧＰＮＭＢ、ＩＣＯＳ、ＩＧＦ１Ｒ、インテグリンαν、インテグリンανβ、ＫＩＲ、ＬＡＧ−３、ルイスＹ、メソテリン、ｃ−ＭＥＴ、ＭＮ炭酸脱水酵素ＩＸ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、Ｎｅｃｔｉｎ−４、ＮＫＧＤ２、ＮＯＴＣＨ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＰＤ−１、ＰＤＬ１、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＡＮＫＬ、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＳＬＣ４４Ａ４、シンデカン−１、ＴＡＣＩ、ＴＡＧ−７２、テネイシン、ＴＩＭ３、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、およびＶＥＧＦＲ−３。
【０１１２】
一部の実施形態では、抗体は、抗ＲＯＲ２抗体、抗Ｃｋ８／１８抗体、抗Ｋｉ−６７抗体、抗Ｃｋ５抗体、抗Ｍａｒｔ−１抗体、抗Ｓ１００抗体、または抗ＣＤ４５抗体である。
【０１１３】
一部の実施形態では、コンジュゲートは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン抗体、ＴおよびＡｂｓ二量体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、Ｆｄ、直鎖状抗体、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ダイアボディ、二特異性抗体断片、バイボディ（ｂｉｂｏｄｙ）、トリボディ、ｓｃ−ダイアボディ、カッパ（ラムダ）ボディ、ＢｉＴＥ、ＤＶＤ−Ｉｇ、ＳＩＰ、ＳＭＩＰ、ＤＡＲＴ、または１つもしくは複数のＣＤＲを含む抗体類似体を含む。
【０１１４】
一部の実施形態では、コンジュゲートは一次抗体を含む。
【０１１５】
「一次抗体」とは、本明細書では、組織試料中の標的タンパク質抗原に特異的に結合する抗体を意味する。一次抗体とは、一般に、免疫組織化学的（ＩＨＣ）手順において使用される第１の抗体である。一部の実施形態では、一次抗体は、ＩＨＣ手順において使用される唯一の抗体である。
【０１１６】
一部の実施形態では、コンジュゲートは、二次抗体を含む。
【０１１７】
「二次抗体」とは、本明細書では、もしあれば、一次抗体に特異的に結合し、それにより、一次抗体とその後の試薬の間に橋を形成する抗体を意味する。二次抗体は、一般に、免疫組織化学的手順において使用される第２の抗体である。
【０１１８】
一部の実施形態では、標的分析物を認識する抗体は、直接結合によるものである。一部の実施形態では、標的分析物を認識する抗体は、間接的な結合によるものである。一部の実施形態では、標的分析物への特異的な抗体結合は、直接結合によるものである。一部の実施形態では、標的分析物への特異的な抗体結合は、間接的な結合によるものである。
【０１１９】
一部の実施形態では、抗体の結合親和性は、約１０−７〜１０−１３（Ｋｄ）である。
【０１２０】
酵素
一般に、抗体コンジュゲートは、複数の酵素分子を含む。一部の実施形態では、抗体コンジュゲートは、複数の酵素分子を含み、複数の酵素分子は、同じ酵素型を含む（例えば、抗体コンジュゲートの酵素分子は全て西洋ワサビペルオキシダーゼである）。
【０１２１】
酵素は、一般に、種々の技法を使用して測定することができる発色基質の化学的変質を触媒する。例えば、酵素は、分光光度的に測定することができる基質の色の変化を触媒し得る。あるいは、酵素は、基質の蛍光または化学発光を変更し得る。化学発光基質は、化学反応によって電子的に励起され、次いで、（例えばケミルミノメーターを使用して）測定することができる光を放出し得るまたは蛍光アクセプターにエネルギーを供与し得る。酵素標識の例としては、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ；米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖類オキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環オキシダーゼ（例えば、ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼなど）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどが挙げられる。酵素を抗体にコンジュゲートするための技法は、Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍ（Ｊ．  ＬａｎｇｏｎｅおよびＨ．  Ｖａｎ  Ｖｕｎａｋｉｓ編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、７３巻：１４７〜１６６頁（１９８１年）に記載されている。酵素−基質の組合せの例としては、例えば、（ｉ）西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と、基質として水素ペルオキシダーゼ、ここで、水素ペルオキシダーゼにより色素前駆体［例えば、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）または３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン塩酸塩（ＴＭＢ）］が酸化される；（ｉｉ）アルカリホスファターゼ（ＡＰ）と、発色基質としてパラ−ニトロフェニルホスフェート；および（ｉｉｉ）β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（β−Ｄ−Ｇａｌ）と発色基質（例えば、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ）または蛍光原基質（例えば、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ）が挙げられる。
【０１２２】
一部の実施形態では、酵素は、ベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ラクタマーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ウリカーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、ルシフェラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、エンテロキナーゼ、チロシナーゼ、およびキサンチンオキシダーゼからなる群より選択される。
【０１２３】
ポリマー酵素
一般に、抗体コンジュゲートは、複数の酵素分子を含むポリマー酵素を含む。
【０１２４】
一部の実施形態では、ポリマー酵素の複数の酵素分子は、共有結合によって連結している。一部の実施形態では、ポリマー酵素の複数の酵素分子は、架橋試薬を介して共有結合によって連結している。一部の実施形態では、酵素は、タンパク質成分を含む。一部の実施形態では、ポリマー酵素の複数の酵素分子は、タンパク質成分を介して共有結合によって連結している。一部の実施形態では、酵素分子は、多糖成分を含む。一部の実施形態では、ポリマー酵素の複数の酵素分子は、多糖成分を介して共有結合によって連結している。一部の実施形態では、ポリマー酵素の複数の酵素分子は、多糖成分およびタンパク質成分を介して共有結合によって連結している。一部の実施形態では、ポリマー酵素の複数の酵素分子は、非共有結合によって連結している。一部の実施形態では、複数の酵素分子は、多量体酵素を含む。一部の実施形態では、複数の酵素分子は、酵素凝集体を含む。
【０１２５】
一般に、重合手順は、事前に選択されたサイズのポリマー酵素の制御された再現性のある形成が可能になる条件下で行う。酵素の濃度、緩衝液のｐＨ、架橋試薬に対する遊離の官能基の化学量論、温度、および反応時間は全て、この制御可能なプロセスの達成における重要な因子である。
【０１２６】
一部の実施形態では、ポリマー酵素は、約５〜約５００個の酵素分子を含む。一部の実施形態では、ポリマー酵素は、少なくとも約５個、約１０個、約１５個、約２０個、約２５個、約５０個、約７５個、約１００個、約１５０個、約２００個、または約２５０個の酵素分子を含む。一部の実施形態では、ポリマー酵素は、約２５０個未満、約２００個未満、約１５０個未満、約１００個未満、約７５個未満、約５０個未満、約２５個未満、約２０個未満、約１５個未満、約１０個未満、または約５個未満の酵素分子を含む。
【０１２７】
一部の実施形態では、ポリマー酵素の酵素分子は架橋試薬を介して共有結合によって連結している。一部の実施形態では、ポリマー酵素の酵素分子は、長さゼロの架橋試薬を介して共有結合によって連結している。一部の実施形態では、ポリマー酵素の酵素分子は直鎖様式で共有結合によって連結している。一部の実施形態では、ポリマー酵素の酵素分子は、分枝様式で共有結合によって連結している。一部の実施形態では、ポリマー酵素の酵素分子は、直鎖と分枝が混在する様式で共有結合によって連結している。一部の実施形態では、ポリマー酵素の酵素分子は、直鎖構造が形成されるように共有結合によって連結している。一部の実施形態では、ポリマー酵素の酵素分子は共有結合によって連結され、球状構造を形成している。
【０１２８】
一部の実施形態では、複数のポリマー酵素を含むポリマー酵素の集団は、ポリマー酵素当たりの酵素分子の数によって特徴付けられるポリマー酵素のサイズ分布を含む。一部の実施形態では、複数のポリマー酵素を含むポリマー酵素の集団は、ポリマー酵素の構造によって特徴付けられるポリマー酵素の形状分布（ｓｈａｐｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を含む。
【０１２９】
一部の実施形態では、ポリマー酵素の分子量は約５００ｋＤａ〜約５メガダルトン（ＭＤａ）である。一部の実施形態では、ポリマー酵素の分子量は少なくとも約５００ｋＤａである。一部の実施形態では、ポリマー酵素の分子量は５ＭＤａ未満または約５ＭＤａである。一部の実施形態では、ポリマー酵素の分子量は少なくとも約７５０ｋＤａである。一部の実施形態では、ポリマー酵素の分子量は少なくとも約１ＭＤａ、約２ＭＤａ、約３ＭＤａ、または約４ＭＤａである。
【０１３０】
一部の実施形態では、抗体とコンジュゲートする前にまずポリマー酵素を形成する。
【０１３１】
酵素／抗体コンジュゲート
一般に、酵素を抗体とコンジュゲートする。一部の実施形態では、１つ超の酵素分子を１つの（ａｎ）抗体とコンジュゲートする。一部の実施形態では、酵素分子を１つ超の抗体とコンジュゲートする。一部の実施形態では、１つ超の抗体を１つの（ａｎ）酵素分子とコンジュゲートする。一部の実施形態では、１つ超の酵素分子を１つ超の抗体とコンジュゲートする。一部の実施形態では、１つ超の抗体を１つ超の酵素とコンジュゲートする。
【０１３２】
「コンジュゲートされる」または「付着される」または「連結される」とは、本明細書では、結合性作用物質（例えば抗体）とポリマー（例えば酵素ポリマー）または酵素分子の、共有結合性または非共有結合性の、ならびに直接または間接的な関連を意味する。
【０１３３】
本発明で企図されている抗体コンジュゲートとしては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて使用するためのものが挙げられ、その場合、抗体は、発色基質と接触すると呈色した生成物を生成する二次結合性リガンドおよび／または酵素（酵素タグ）に連結している。適切な酵素の例としては、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ、（西洋ワサビ）水素ペルオキシダーゼおよび／またはグルコースオキシダーゼが挙げられる。好ましい二次結合性リガンドは、ビオチンおよび／またはアビジンおよびストレプトアビジン化合物である。そのような標識の使用は当業者には周知であり、例えば、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第３，８１７，８３７号；同第３，８５０，７５２号；同第３，９３９，３５０号；同第３，９９６，３４５号；同第４，２７７，４３７号；同第４，２７５，１４９号；および同第４，３６６，２４１号に記載されている。
【０１３４】
アジド基を含有する分子を使用して、低強度の紫外線によって生成される反応性ニトレン中間体を通じてタンパク質との共有結合を形成することもできる（ＰｏｔｔｅｒおよびＨａｌｅｙ、１９８３年）。具体的には、プリンヌクレオチドの２−アジド類似体および８−アジド類似体が、粗製細胞抽出物中のヌクレオチド結合性タンパク質を同定するための部位特異的光プローブ（ｐｈｏｔｏｐｒｏｂｅ）として使用されている（ＯｗｅｎｓおよびＨａｌｅｙ、１９８７年；Ａｔｈｅｒｔｏｎら、１９８５年）。２−アジドヌクレオチドおよび８−アジドヌクレオチドは、精製されたタンパク質のヌクレオチド結合性ドメインをマッピングするためにも使用されており（Ｋｈａｔｏｏｎら、１９８９年；Ｋｉｎｇら、１９８９年；およびＤｈｏｌａｋｉａら、１９８９年）、また、抗体結合性作用物質としても使用することができる。
【０１３５】
抗体とそのコンジュゲート部分を付着またはコンジュゲートさせるためのいくつかの方法が当技術分野で公知である。いくつかの付着方法は、例えば、抗体に付着させたジエチレントリアミン五酢酸無水物（ＤＴＰＡ）；エチレントリアミン四酢酸；Ｎ−クロロ−ｐ−トルエンスルホンアミド；および／またはテトラクロロ−３α−６α−ジフェニルグルコウリル−３（ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏ−３α−６α−ｄｉｐｈｅｎｙｌｇｌｙｃｏｕｒｉｌ−３）のような有機キレート化剤を利用する金属キレート複合体の使用を伴う（米国特許第４，４７２，５０９号および同第４，９３８，９４８号、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる）。モノクローナル抗体をグルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸塩などのカップリング剤の存在下で酵素と反応させることもできる。フルオレセインマーカーとのコンジュゲートは、これらのカップリング剤の存在下でまたはイソチオシアネートとの反応によって調製する。米国特許第４，９３８，９４８号では、例えば、乳腺腫瘍のイメージングは、モノクローナル抗体を使用して達成され、検出可能なイメージング部分をメチル−ｐ−ヒドロキシベンズイミデートまたはＮ−スクシンイミジル−３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオネートなどのリンカーを使用して抗体に結合する。
【０１３６】
他の実施形態では、抗体結合部位を変更することのない反応条件を使用してスルフヒドリル基を免疫グロブリンのＦｃ領域に選択的に導入することによる免疫グロブリンの誘導体化が企図されている。この方法体系に従って作出された抗体コンジュゲートは、改善された寿命、特異性および感受性を示すことが開示されている（米国特許第５，１９６，０６６号、参照により本明細書に組み込まれる）。Ｆｃ領域内の炭水化物残基とコンジュゲートしたエフェクターまたはレポーター分子の部位特異的付着も文献（Ｏ’Ｓｈａｎｎｅｓｓｙら、１９８７年）に開示されている。
【０１３７】
ポリマー酵素／抗体コンジュゲート
一般に、複数の酵素分子を含むポリマー酵素を抗体とコンジュゲートする。一部の実施形態では、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートを、その全体が参照によって組み込まれる米国特許第４，６５７，８５３号に開示されているものなどの方法に従って生成する。一部の実施形態では、本方法は、（ａ）少なくとも２つの酵素分子を共有結合によってカップリングしてポリマー酵素を作出するステップ、および（ｂ）ポリマー酵素と抗体またはその断片を共有結合によってカップリングするステップの逐次的なステップを含む。
【０１３８】
一部の実施形態では、ポリマー酵素を、抗体またはその断片上の特異的な部位とコンジュゲートする。一部の実施形態では、ポリマー酵素を、抗体またはその断片上の１つまたは複数の特異的な部位とコンジュゲートする。一部の実施形態では、ポリマー酵素を、抗体またはその断片上のランダムな部位とコンジュゲートする。一部の実施形態では、ポリマー酵素を、抗体またはその断片上の１つまたは複数のランダムな部位とコンジュゲートする。一部の実施形態では、ポリマー酵素を、抗体またはその断片と、アミノ酸の固有のまたは外因性の化学的特性を介してコンジュゲートする。一部の実施形態では、ポリマー酵素を、抗体またはその断片と、アミノ酸残基の固有のまたは外因性の化学的特性を介してコンジュゲートする。
【０１３９】
一部の実施形態では、抗体コンジュゲートは、１つまたは複数のポリマー酵素を含む。一部の実施形態では、抗体コンジュゲートは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０のポリマー酵素を含む。一部の実施形態では、抗体コンジュゲートは、１から２０の間のポリマー酵素を含む。
【０１４０】
一部の実施形態では、抗体コンジュゲートは、コンジュゲート当たり約６個から約１６個、約１８個、約２０個、約２２個、約２４個、約２６個、約２８個、約３０個、約４０個、約５０個、約６０個、約８０個、約９０個、約１００個、約１１０個、約１２０個、約１３０個、約１４０個、約１５０個、約１６０個、約１７０個、約１８０個、約１９０個、または約２００個、またはそれ超の間の酵素分子を含む。
【０１４１】
一部の実施形態では、抗体コンジュゲートは、コンジュゲート当たり少なくとも６個から２４個の間、６個から２６個の間、６個から２８個の間、６個から３０個の間、６個から４０個の間、６個から５０個の間、６個から６０個の間、６個から７０個の間、６個から８０個の間、６個から９０個の間、または６個から１００個の間の酵素分子を含む。
【０１４２】
一部の実施形態では、抗体コンジュゲートは、コンジュゲート当たり少なくとも６個、８個、１０個、１２個、１４個、１６個、１８個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１１０個、１２０個、１３０個、１４０個、１５０個、１６０個、１７０個、１８０個、１９０個、または２００個、しかし２５０個以下、３００個以下、３５０個以下、４００個以下、または５００個以下の酵素分子を含む。
【０１４３】
一部の実施形態では、抗体コンジュゲートの分子量は、約４００ｋＤａから約５００ｋＤａ、約６００ｋＤａ、約７００ｋＤａ、約８００ｋＤａ、約９００ｋＤａ、約１０００ｋＤａ、約２０００ｋＤａ、約３０００ｋＤａ、約４０００ｋＤａ、約５０００ｋＤａ、約６０００ｋＤａ、約７０００ｋＤａ、約８０００ｋＤａ、約９０００ｋＤａ、または約１００００ｋＤａの間である。
【０１４４】
一部の実施形態では、抗体コンジュゲートの分子量は、約４７０ｋＤａから約４．７メガＤａの間である。
【０１４５】
一部の実施形態では、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートは、１つ超の抗体を含む。一部の実施形態では、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートは、複数のポリマー酵素を含む。一部の実施形態では、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートは複数のポリマー酵素を含み、ポリマー酵素のそれぞれがほぼ同じ数の酵素分子を含む。一部の実施形態では、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートは複数のポリマー酵素を含み、複数のポリマー酵素はポリマー酵素それぞれの酵素分子の数の分布を示す。一部の実施形態では、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートは複数のポリマー酵素を含み、複数のポリマー酵素は、ポリマー酵素の形状に差異を示す。
【０１４６】
一部の実施形態では、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートの比（抗体：酵素）は１：８超である。一部の実施形態では、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートの比（抗体：酵素）は１：６超である。一部の実施形態では、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートの比（抗体：酵素）は約１：６、約１：８、約１：１５、約１：２０、約１：３０、約１：４０、約１：５０、約１：６０、約１：７５、約１：１００、約１：１２５、約１：１５０、約１：２００である。
【０１４７】
一部の実施形態では、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートにコンジュゲートするポリマー酵素の数を、組織透過および標的分析物検出の増加が可能になるように調整する。一部の実施形態では、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートの重量比を、組織透過および標的分析物検出の増加が可能になるように調整する。一部の実施形態では、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートにコンジュゲートするポリマー酵素当たりの酵素の数により、組織透過および標的分析物検出の増加を可能にする。一部の実施形態では、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートにコンジュゲートするポリマー酵素のサイズにより、組織透過および標的分析物検出の増加を可能にする。
【０１４８】
一部の実施形態では、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートは、Ｎｏｖｏｄｉａｘ，Ｉｎｃ．（Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）、カタログ番号Ｋ２９３０１−１／８、Ｑ３１００１、Ｑ３１００２、Ｑ３１００３、Ｑ３１００４、Ｑ３１００５、Ｄ２８００１、Ｄ２８００２、Ｄ２８００３、Ｄ２８００４、Ｄ２８００５、またはＤ２８００６から入手可能なコンジュゲートである。
【０１４９】
酵素基質
一般に、検出を可能にするために、酵素に特異的な基質を含む溶液をポリマー酵素／抗体コンジュゲートと一緒にインキュベートする。一部の実施形態では、酵素に特異的な基質を含む溶液は、前記酵素に特異的な基質のストック溶液から調製する。
【０１５０】
一部の実施形態では、酵素に特異的な基質を含む溶液、および／または酵素に特異的な基質のストック溶液は不純物を含まない。一部の実施形態では、酵素に特異的な基質を含む溶液を調製するために使用する溶液（例えば、緩衝液）、および／または酵素に特異的な基質のストック溶液は不純物を含まない。一部の実施形態では、不純物により、酵素の触媒反応が阻害される。
【０１５１】
一部の実施形態では、酵素に特異的な基質は実質的に純粋である。一部の実施形態では、酵素に特異的な基質の純度は、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、９９．５％、または９９．９％純粋である。
【０１５２】
一部の実施形態では、酵素に特異的な基質を含む溶液は、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートと一緒にインキュベートする直前に調製する。
【０１５３】
一部の実施形態では、ポリマー酵素の酵素分子は、１つ超の基質型を触媒するものである。
【０１５４】
一部の実施形態では、酵素は西洋ワサビペルオキシダーゼであり、基質はＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンジジン色素原）である。一部の実施形態では、酵素は西洋ワサビペルオキシダーゼであり、基質はＡＥＣ（３−アミノ−９−エチルカルバゾール）である。一部の実施形態では、酵素は西洋ワサビペルオキシダーゼであり、基質はＡＭＥＣ  Ｒｅｄである。一部の実施形態では、酵素は西洋ワサビペルオキシダーゼであり、基質はＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）である。一部の実施形態では、酵素はアルカリホスファターゼであり、基質はＦａｓｔ  Ｒｅｄ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＳＴ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）である。一部の実施形態では、酵素はアルカリホスファターゼであり、基質はＢＣＩＰ／ＮＢＴ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム）である。
【０１５５】
Ｅ．免疫検出方法
２種の一般的なＩＨＣ方法：間接アッセイなおよび直接アッセイが利用可能である。
【０１５６】
典型的な間接アッセイでは、コンジュゲートしていない一次抗体を抗原に結合させ、次いで、標識した二次抗体を一次抗体に結合させる。抗原の可視化を可能にするために、二次抗体を酵素標識、発色または蛍光原基質とコンジュゲートする。いくつかの二次抗体は一次抗体上の異なるエピトープと反応し得るので、シグナル増幅を行う。
【０１５７】
典型的な直接アッセイでは、抗体と標的抗原の結合を直接決定する。この直接アッセイでは、さらなる抗体相互作用を用いずに可視化することができる蛍光タグまたは酵素で標識した一次抗体などの標識された試薬を使用する。
【０１５８】
直接アッセイ
一態様では、本発明は、直接ＩＨＣアッセイのための組成物および方法を提供する。この直接アッセイでは、一次抗体を含むポリマー酵素／抗体コンジュゲートを使用する。
【０１５９】
一部の実施形態では、組織内の標的分析物を検出するために直接アッセイを使用する。一部の実施形態では、組織内の標的分析物を直接検出するためにポリマー酵素／抗体コンジュゲートを使用する。一部の実施形態では、組織内の標的分析物を検出するために直接ＩＨＣ方法を使用し、この方法は、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートの使用を含む。一部の実施形態では、組織内の標的分析物のレベルを決定するために直接ＩＨＣ方法を使用し、この方法は、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートの使用を含む。一部の実施形態では、組織内の標的分析物の存在を決定するために直接ＩＨＣ方法を使用し、この方法は、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートの使用を含む。一部の実施形態では、組織内に標的分析物が検出可能には存在しないことを決定するために直接ＩＨＣ方法を使用し、この方法は、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートの使用を含む。一部の実施形態では、組織試料（例えば、組織切片）、好ましくはＦＦＰＥ切片または凍結組織切片における標的分析物を検出するために直接アッセイを使用する。
【０１６０】
上記で検討された試料の調製手順に加えて、ＩＨＣの前、その間、またはその後に組織切片をさらに処理することが望ましい場合がある。例えば、組織試料をクエン酸緩衝液中で加熱するなど、エピトープ回復方法を行うことができる。例えば、Ｌｅｏｎｇら、Ａｐｐｌ  Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  ４巻（３号）：２０１頁（１９９６年）を参照されたい。任意選択のブロッキングステップの後、組織切片を一次抗体（例えば、ポリマー酵素／抗体コンジュゲート）に、一次抗体が組織試料中の標的タンパク質抗原に結合するのに適した条件下、十分な期間（「インキュベーション時間」）にわたって曝露する。一部の実施形態では、組織を、一次ポリマー酵素／抗体コンジュゲートと一緒に、一次ポリマー酵素／抗体コンジュゲートが組織内の標的タンパク質抗原に結合するのに適切な条件下、十分な期間にわたってインキュベートする。一部の実施形態では、組織を、一次ポリマー酵素／抗体コンジュゲート（例えば、１つ超）のセットであって、セット内の別のポリマー酵素／抗体コンジュゲートとは標的分析物に対する結合特異性が異なるポリマー酵素／抗体コンジュゲートを少なくとも１つ含むポリマー酵素／抗体コンジュゲートのセットと一緒に、一次ポリマー酵素／抗体コンジュゲートが組織内の標的タンパク質抗原に結合するのに適切な条件下、十分な期間にわたってインキュベートする。これを達成するために適した条件は、慣例的な実験によって決定することができる。抗体と試料の結合の程度は、上記で検討された検出可能な標識のいずれか１つを使用することによって決定する。好ましくは、標識は、３，３’−ジアミノベンジジン色素原などの発色基質の化学的変質を触媒する酵素標識（例えば、ＨＲＰ）である。標識は、３，３’−ジアミノベンジジン色素原などの発色基質の化学的変質を触媒するポリマー酵素（例えば、ポリＨＲＰまたはポリマーＨＲＰ）であることがより好ましい。
【０１６１】
一部の実施形態では、本明細書に記載のＩＨＣ方法をハイスループットな様式で実施する。一部の実施形態では、本明細書に記載のポリマー酵素／抗体コンジュゲートを使用するＩＨＣ方法をハイスループットな様式で実施する。一部の実施形態では、本明細書に記載の直接ＩＨＣ方法をハイスループットな様式で実施する。一部の実施形態では、本明細書に記載のポリマー酵素／抗体コンジュゲートを使用する直接ＩＨＣ方法をハイスループットな様式で実施する。
【０１６２】
標的分析物／抗体複合体の形成
一般に、約１５℃から約５０℃の間のインキュベーション温度で約３分から約１時間の間のインキュベーション期間にわたって、標的分析物を含有する組織試料（例えば、組織切片）をポリマー酵素／抗体コンジュゲートと接触させて、標的分析物と抗体コンジュゲートのうちの少なくとも１つとを含む複合体を形成し、抗体コンジュゲートは、標的分析物に特異的に結合することが可能な一次抗体である。
【０１６３】
一部の実施形態では、約１５℃から約５０℃の間のインキュベーション温度で約３分から約１時間の間のインキュベーション期間にわたって、一連の標的分析物（例えば、分析物Ａおよび分析物Ｂ）を含む組織をポリマー酵素／抗体コンジュゲートのセット（例えば、分析物Ａに特異的に結合するポリマー酵素／抗体複合体、および分析物Ｂに特異的に結合するポリマー酵素／抗体複合体）と接触させて、標的分析物と抗体コンジュゲートのうちの少なくとも１つとを含む一連の複合体を形成し、抗体コンジュゲートは、それらのそれぞれの標的分析物に特異的に結合することが可能な一次抗体である。
【０１６４】
一部の実施形態では、リン酸塩、トリス、ＭＯＰＳ、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ、または炭酸水素塩（ｏｒｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ）を含み、任意選択で、チオメルサール、ｐｒｏｃｌｉｎ  ３００、マンガン、カルシウム、鉄、マグネシウム、亜鉛、分子量が４００Ｄａから４０，０００Ｄａまでのポリエチレングリコール、エチレングリコール、グリセロール、ウシ血清アルブミン、ウマ血清アルブミン、ヤギ血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、トレハロース、スクロース、ゼラチン、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ３０、分子量が３００〜３０，０００Ｄａの硫酸デキストラン、または分子量が５００〜２５，０００ＤａのＤＥＡＥデキストランから選択される１つまたは複数の成分を含む緩衝液を用いてＩＨＣ染色を行う。含まれる場合の各成分の量は、一般に、当技術分野において使用される量である。標的抗原への抗体結合を増加させるための緩衝液の最適化、およびその使用方法は当技術分野において周知である。
【０１６５】
一部の実施形態では、任意選択でウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および／またはポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、例えば、分子量が２００、３００、４００、６００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５００００、６０００、１００００、または２００００のＰＥＧ、好ましくはＰＥＧ４００、１５００、または６０００などを伴うＰＢＳ緩衝液またはＴＢＳ緩衝液などの緩衝液を用いてＩＨＣ染色を行う。一部の実施形態では、緩衝液は、Ｎｏｖｏｄｉａｘ，Ｉｎｃ．（Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）から市販されている緩衝液、例えば、製品カタログ番号Ｃ３０００１である。
【０１６６】
一部の実施形態では、インキュベーション温度は、約１５℃から約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、約４４℃、約４５℃、約４６℃、約４７℃、約４８℃、約４９℃、もしくは約５０℃の間、約２０℃から約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、約４４℃、約４５℃、約４６℃、約４７℃、約４８℃、約４９℃、もしくは約５０℃の間、約２５℃から約３０℃の間、または約２５℃から約３７℃の間である。
【０１６７】
一部の実施形態では、インキュベーション温度は、約１４℃、約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、約４４℃、約４５℃、約４６℃、約４７℃、約４８℃、約４９℃、または約５０℃である。
【０１６８】
一部の実施形態では、インキュベーション温度は、約１４℃未満、約１５℃未満、約１６℃未満、約１７℃未満、約１８℃未満、約１９℃未満、約２０℃未満、約２１℃未満、約２２℃未満、約２３℃未満、約２４℃未満、約２５℃未満、約２６℃未満、約２７℃未満、約２８℃未満、約２９℃未満、約３０℃未満、約３１℃未満、約３２℃未満、約３３℃未満、約３４℃未満、約３５℃未満、約３６℃未満、約３７℃未満、約３８℃未満、約３９℃未満、約４０℃未満、約４１℃未満、約４２℃未満、約４３℃未満、約４４℃未満、約４５℃未満、約４６℃未満、約４７℃未満、約４８℃未満、約４９℃未満、または約５０℃未満である。
【０１６９】
一部の実施形態では、インキュベーション温度は、約１４℃超、約１５℃超、約１６℃超、約１７℃超、約１８℃超、約１９℃超、約２０℃超、約２１℃超、約２２℃超、約２３℃超、約２４℃超、約２５℃超、約２６℃超、約２７℃超、約２８℃超、約２９℃超、約３０℃超、約３１℃超、約３２℃超、約３３℃超、約３４℃超、約３５℃超、約３６℃超、約３７℃超、約３８℃超、約３９℃超、約４０℃超、約４１℃超、約４２℃超、約４３℃超、約４４℃超、約４５℃超、約４６℃超、約４７℃超、約４８℃超、約４９℃超、または約５０℃超である。
【０１７０】
一部の実施形態では、インキュベーション期間は、約３分間から約５分間、約１０分間、約１５分間、約２０分間、約２５分間、約３０分間、約３５分間、約４０分間、約４５分間、約５０分間、約５５分間、または約６０分間の間、５分間から約１０分間、約１５分間、約２０分間、約２５分間、約３０分間、約３５分間、約４０分間、約４５分間、約５０分間、約５５分間、または約６０分間の間、１０分間から約１５分間、約２０分間、約２５分間、約３０分間、約３５分間、約４０分間、約４５分間、約５０分間、約５５分間、または約６０分間の間、約１５分間から約２０分間、約２５分間、約３０分間、約３５分間、約４０分間、約４５分間、約５０分間、約５５分間、または約６０分間の間、約２０分間から約２５分間、約３０分間、約３５分間、約４０分間、約４５分間、約５０分間、約５５分間、または約６０分間の間、約２５分間から約３０分間、約３５分間、約４０分間、約４５分間、約５０分間、約５５分間、または約６０分間の間、約３０分間から約３５分間、約４０分間、約４５分間、約５０分間、約５５分間、または約６０分間の間である。
【０１７１】
一部の実施形態では、インキュベーション期間は、約３分間、約４分間、約５分間、約６分間、約７分間、約８分間、約９分間、約１０分間、約１１分間、約１２分間、約１３分間、約１４分間、約１５分間、約１６分間、約１７分間、約１８分間、約１９分間、約２０分間、約２５分間、約３０分間、約３５分間、約４０分間、約４５分間、約５０分間、約５５分間、または約６０分間である。
【０１７２】
一部の実施形態では、インキュベーション期間は、約３分間未満、約４分間未満、約５分間未満、約６分間未満、約７分間未満、約８分間未満、約９分間未満、約１０分間未満、約１１分間未満、約１２分間未満、約１３分間未満、約１４分間未満、約１５分間未満、約１６分間未満、約１７分間未満、約１８分間未満、約１９分間未満、約２０分間未満、約２５分間未満、約３０分間未満、約３５分間未満、約４０分間未満、約４５分間未満、約５０分間未満、約５５分間未満、または約６０分間未満である。
【０１７３】
一部の実施形態では、インキュベーション期間は、約３分間超、約４分間超、約５分間超、約６分間超、約７分間超、約８分間超、約９分間超、約１０分間超、約１１分間超、約１２分間超、約１３分間超、約１４分間超、約１５分間超、約１６分間超、約１７分間超、約１８分間超、約１９分間超、約２０分間超、約２５分間超、約３０分間超、約３５分間超、約４０分間超、約４５分間超、約５０分間超、約５５分間超、または約６０分間超である。
【０１７４】
洗浄ステップ
インキュベート後、一般に、組織試料を、任意選択でＴｗｅｅｎ（例えば、０．０１〜０．２％）などの界面活性剤を含むＰＢＳ、ＴＢＳ、ＭＯＰＳ、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ、または炭酸水素塩緩衝液などの洗浄緩衝液を用いて洗浄する。例示的な緩衝液の１つは、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を伴う１０ｍＭのＰＢＳである。
【０１７５】
洗浄ステップは、２回〜６回、好ましくは３回、４回、または５回、洗浄ステップ当たり１分間、２分間、３分間、４分間、５分間、６分間、７分間、８分間、９分間、または１０分間またはそれ超の期間にわたり行う。
【０１７６】
一部の実施形態では、洗浄温度は、約１５℃から約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、約４４℃、約４５℃、約４６℃、約４７℃、約４８℃、約４９℃、もしくは約５０℃の間、約２０℃から約２１℃、約２２℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、約４４℃、約４５℃、約４６℃、約４７℃、約４８℃、約４９℃、もしくは約５０℃の間、約２５℃から約３０℃の間、または約２５℃から約３７℃の間である。
【０１７７】
一部の実施形態では、洗浄温度は、約１４℃、約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、約４４℃、約４５℃、約４６℃、約４７℃、約４８℃、約４９℃、または約５０℃である。
【０１７８】
一部の実施形態では、洗浄温度は、約１４℃未満、約１５℃未満、約１６℃未満、約１７℃未満、約１８℃未満、約１９℃未満、約２０℃未満、約２１℃未満、約２２℃未満、約２３℃未満、約２４℃未満、約２５℃未満、約２６℃未満、約２７℃未満、約２８℃未満、約２９℃未満、約３０℃未満、約３１℃未満、約３２℃未満、約３３℃未満、約３４℃未満、約３５℃未満、約３６℃未満、約３７℃未満、約３８℃未満、約３９℃未満、約４０℃未満、約４１℃未満、約４２℃未満、約４３℃未満、約４４℃未満、約４５℃未満、約４６℃未満、約４７℃未満、約４８℃未満、約４９℃未満、または約５０℃未満である。
【０１７９】
一部の実施形態では、洗浄温度は、約１４℃超、約１５℃超、約１６℃超、約１７℃超、約１８℃超、約１９℃超、約２０℃超、約２１℃超、約２２℃超、約２３℃超、約２４℃超、約２５℃超、約２６℃超、約２７℃超、約２８℃超、約２９℃超、約３０℃超、約３１℃超、約３２℃超、約３３℃超、約３４℃超、約３５℃超、約３６℃超、約３７℃超、約３８℃超、約３９℃超、約４０℃超、約４１℃超、約４２℃超、約４３℃超、約４４℃超、約４５℃超、約４６℃超、約４７℃超、約４８℃超、約４９℃超、または約５０℃超である。
【０１８０】
一部の実施形態では、洗浄期間は、約３分間から約５分間、約１０分間、約１５分間、約２０分間、約２５分間、約３０分間、約３５分間、約４０分間、約４５分間、約５０分間、約５５分間、もしくは約６０分間の間、５分間から約１０分間、約１５分間、約２０分間、約２５分間、約３０分間、約３５分間、約４０分間、約４５分間、約５０分間、約５５分間、もしくは約６０分間の間、１０分間から約１５分間、約２０分間、約２５分間、約３０分間、約３５分間、約４０分間、約４５分間、約５０分間、約５５分間、もしくは約６０分間の間、約１５分間から約２０分間、約２５分間、約３０分間、約３５分間、約４０分間、約４５分間、約５０分間、約５５分間、もしくは約６０分間の間、約２０分間から約２５分間、約３０分間、約３５分間、約４０分間、約４５分間、約５０分間、約５５分間、もしくは約６０分間の間、約２５分間から約３０分間、約３５分間、約４０分間、約４５分間、約５０分間、約５５分間、もしくは約６０分間の間、または約３０分間から約３５分間、約４０分間、約４５分間、約５０分間、約５５分間、もしくは約６０分間の間である。
【０１８１】
一部の実施形態では、洗浄期間は、約３分間、約４分間、約５分間、約６分間、約７分間、約８分間、約９分間、約１０分間、約１１分間、約１２分間、約１３分間、約１４分間、約１５分間、約１６分間、約１７分間、約１８分間、約１９分間、約２０分間、約２５分間、約３０分間、約３５分間、約４０分間、約４５分間、約５０分間、約５５分間、または約６０分間である。
【０１８２】
一部の実施形態では、洗浄期間は、約３分間未満、約４分間未満、約５分間未満、約６分間未満、約７分間未満、約８分間未満、約９分間未満、約１０分間未満、約１１分間未満、約１２分間未満、約１３分間未満、約１４分間未満、約１５分間未満、約１６分間未満、約１７分間未満、約１８分間未満、約１９分間未満、約２０分間未満、約２５分間未満、約３０分間未満、約３５分間未満、約４０分間未満、約４５分間未満、約５０分間未満、約５５分間未満、または約６０分間未満である。
【０１８３】
一部の実施形態では、洗浄期間は、約３分間超、約４分間超、約５分間超、約６分間超、約７分間超、約８分間超、約９分間超、約１０分間超、約１１分間超、約１２分間超、約１３分間超、約１４分間超、約１５分間超、約１６分間超、約１７分間超、約１８分間超、約１９分間超、約２０分間超、約２５分間超、約３０分間超、約３５分間超、約４０分間超、約４５分間超、約５０分間超、約５５分間超、または約６０分間超である。
【０１８４】
一部の実施形態では、洗浄ステップは、２回〜６回、洗浄ステップ当たり約１分間、約２分間、約３分間、約４分間、約５分間、約６分間、約７分間、約８分間、約９分間、または約１０分間またはそれ超の期間にわたり行い、洗浄温度は、約１４℃未満、約１５℃未満、約１６℃未満、約１７℃未満、約１８℃未満、約１９℃未満、約２０℃未満、約２１℃未満、約２２℃未満、約２３℃未満、約２４℃未満、約２５℃未満、約２６℃未満、約２７℃未満、約２８℃未満、約２９℃未満、約３０℃未満、約３１℃未満、約３２℃未満、約３３℃未満、約３４℃未満、約３５℃未満、約３６℃未満、約３７℃未満、約３８℃未満、約３９℃未満、約４０℃未満、約４１℃未満、約４２℃未満、約４３℃未満、約４４℃未満、約４５℃未満、約４６℃未満、約４７℃未満、約４８℃未満、約４９℃未満、または約５０℃未満である。
【０１８５】
一部の実施形態では、洗浄ステップは、２回〜６回、洗浄ステップ当たり約１分間、約２分間、約３分間、約４分間、約５分間、約６分間、約７分間、約８分間、約９分間、または約１０分間またはそれ超の期間にわたり行い、洗浄温度は、約１４℃超、約１５℃超、約１６℃超、約１７℃超、約１８℃超、約１９℃超、約２０℃超、約２１℃超、約２２℃超、約２３℃超、約２４℃超、約２５℃超、約２６℃超、約２７℃超、約２８℃超、約２９℃超、約３０℃超、約３１℃超、約３２℃超、約３３℃超、約３４℃超、約３５℃超、約３６℃超、約３７℃超、約３８℃超、約３９℃超、約４０℃超、約４１℃超、約４２℃超、約４３℃超、約４４℃超、約４５℃超、約４６℃超、約４７℃超、約４８℃超、約４９℃超、または約５０℃超である。
【０１８６】
一部の実施形態では、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートの使用を含む方法の洗浄ステップの数は、単一の酵素分子とコンジュゲートした抗体を使用する方法と比較して減少する。一部の実施形態では、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートの使用を含む方法の洗浄ステップの長さは、単一の酵素分子とコンジュゲートした抗体を使用する方法と比較して短縮される。一部の実施形態では、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートの使用を含む方法の洗浄ステップの数および洗浄ステップの長さは、単一の酵素分子とコンジュゲートした抗体を使用する方法と比較して減少する。一部の実施形態では、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートの使用を含む方法の洗浄溶液のストリンジェンシーは、単一の酵素分子とコンジュゲートした抗体を使用する方法において使用される洗浄溶液のストリンジェンシーよりも高い。一部の実施形態では、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートの使用を含む方法の洗浄溶液のストリンジェンシーは、単一の酵素分子とコンジュゲートした抗体を使用する方法において使用される洗浄溶液のストリンジェンシーよりも低い。
【０１８７】
ブロッキングステップ
一部の実施形態では、ＩＨＣ染色プロセスは、抗体コンジュゲートを組織と一緒にインキュベートするステップの前にブロッキングステップをさらに含み、前記ブロッキングステップは、前記組織をブロッキング剤と接触させることを含む。
【０１８８】
一部の実施形態では、ブロッキング剤は、脱脂乳、ＢＳＡ、冷水魚皮膚ゼラチン、カゼイン、または動物血清を含む。
【０１８９】
一部の実施形態では、ブロッキング剤は、ＢＳＡを伴うＴＢＳまたはＰＢＳなどの緩衝液を含む。
【０１９０】
一部の実施形態では、ブロッキング剤は、任意選択で０．５〜６％のウシ血清アルブミン、ウマ血清アルブミン、ヤギ血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、またはゼラチン、および０．００１〜０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を伴うＰＢＳ、ＴＢＳ、ＭＯＰＳ、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ、および炭酸水素塩から選択される緩衝系を含む。
【０１９１】
一部の実施形態では、ブロッキング剤は、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％または約１０％の脱脂乳を含む。
【０１９２】
一部の実施形態では、ブロッキング剤は、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、または約１５％のＢＳＡを含む。
【０１９３】
一部の実施形態では、ブロッキング温度は、約１５℃から約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、約４４℃、約４５℃、約４６℃、約４７℃、約４８℃、約４９℃、もしくは約５０℃の間、約２０℃から約２１℃、約２２℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、約４４℃、約４５℃、約４６℃、約４７℃、約４８℃、約４９℃、もしくは約５０℃の間、約２５℃から約３０℃の間、または約２５℃から約３７℃の間である。
【０１９４】
一部の実施形態では、ブロッキング温度は、約１４℃、約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、約４４℃、約４５℃、約４６℃、約４７℃、約４８℃、約４９℃、または約５０℃である。
【０１９５】
一部の実施形態では、ブロッキング温度は、約１４℃未満、約１５℃未満、約１６℃未満、約１７℃未満、約１８℃未満、約１９℃未満、約２０℃未満、約２１℃未満、約２２℃未満、約２３℃未満、約２４℃未満、約２５℃未満、約２６℃未満、約２７℃未満、約２８℃未満、約２９℃未満、約３０℃未満、約３１℃未満、約３２℃未満、約３３℃未満、約３４℃未満、約３５℃未満、約３６℃未満、約３７℃未満、約３８℃未満、約３９℃未満、約４０℃未満、約４１℃未満、約４２℃未満、約４３℃未満、約４４℃未満、約４５℃未満、約４６℃未満、約４７℃未満、約４８℃未満、約４９℃未満、または約５０℃未満である。
【０１９６】
一部の実施形態では、ブロッキング温度は、約１４℃超、約１５℃超、約１６℃超、約１７℃超、約１８℃超、約１９℃超、約２０℃超、約２１℃超、約２２℃超、約２３℃超、約２４℃超、約２５℃超、約２６℃超、約２７℃超、約２８℃超、約２９℃超、約３０℃超、約３１℃超、約３２℃超、約３３℃超、約３４℃超、約３５℃超、約３６℃超、約３７℃超、約３８℃超、約３９℃超、約４０℃超、約４１℃超、約４２℃超、約４３℃超、約４４℃超、約４５℃超、約４６℃超、約４７℃超、約４８℃超、約４９℃超、または約５０℃超である。
【０１９７】
一部の実施形態では、ブロッキング期間は、約３分間から約５分間、約１０分間、約１５分間、約２０分間、約２５分間、約３０分間、約３５分間、約４０分間、約４５分間、約５０分間、約５５分間、もしくは約６０分間の間、５分間から約１０分間、約１５分間、約２０分間、約２５分間、約３０分間、約３５分間、約４０分間、約４５分間、約５０分間、約５５分間、もしくは約６０分間の間、１０分間から約１５分間、約２０分間、約２５分間、約３０分間、約３５分間、約４０分間、約４５分間、約５０分間、約５５分間、もしくは約６０分間の間、約１５分間から約２０分間、約２５分間、約３０分間、約３５分間、約４０分間、約４５分間、約５０分間、約５５分間、もしくは約６０分間の間、約２０分間から約２５分間、約３０分間、約３５分間、約４０分間、約４５分間、約５０分間、約５５分間、もしくは約６０分間の間、約２５分間から約３０分間、約３５分間、約４０分間、約４５分間、約５０分間、約５５分間、もしくは約６０分間の間、または約３０分間から約３５分間、約４０分間、約４５分間、約５０分間、約５５分間、もしくは約６０分間の間である。
【０１９８】
一部の実施形態では、ブロッキング期間は、約３分間、約４分間、約５分間、約６分間、約７分間、約８分間、約９分間、約１０分間、約１１分間、約１２分間、約１３分間、約１４分間、約１５分間、約１６分間、約１７分間、約１８分間、約１９分間、約２０分間、約２５分間、約３０分間、約３５分間、約４０分間、約４５分間、約５０分間、約５５分間、または約６０分間である。
【０１９９】
一部の実施形態では、ブロッキング期間は、約３分間未満、約４分間未満、約５分間未満、約６分間未満、約７分間未満、約８分間未満、約９分間未満、約１０分間未満、約１１分間未満、約１２分間未満、約１３分間未満、約１４分間未満、約１５分間未満、約１６分間未満、約１７分間未満、約１８分間未満、約１９分間未満、約２０分間未満、約２５分間未満、約３０分間未満、約３５分間未満、約４０分間未満、約４５分間未満、約５０分間未満、約５５分間未満、または約６０分間未満である。
【０２００】
一部の実施形態では、ブロッキング期間は、約３分間超、約４分間超、約５分間超、約６分間超、約７分間超、約８分間超、約９分間超、約１０分間超、約１１分間超、約１２分間超、約１３分間超、約１４分間超、約１５分間超、約１６分間超、約１７分間超、約１８分間超、約１９分間超、約２０分間超、約２５分間超、約３０分間超、約３５分間超、約４０分間超、約４５分間超、約５０分間超、約５５分間超、または約６０分間超である。
【０２０１】
一部の実施形態では、ブロッキングステップを１回、２回、３回、４回、または５回実施する。
【０２０２】
一部の実施形態では、ブロッキングステップを１回、２回、または３回実施し、ブロッキング剤は約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、または約７％の脱脂乳を含み、ブロッキング期間は、約３分間未満、約４分間未満、約５分間未満、約６分間未満、約７分間未満、約８分間未満、約９分間未満、約１０分間未満、約１１分間未満、約１２分間未満、約１３分間未満、約１４分間未満、約１５分間未満、約１６分間未満、約１７分間未満、約１８分間未満、約１９分間未満、約２０分間未満、約２５分間未満、約３０分間未満、約３５分間未満、約４０分間未満、約４５分間未満、約５０分間未満、約５５分間未満、または約６０分間未満である。
【０２０３】
一部の実施形態では、ブロッキングステップを１回、２回、または３回実施し、ブロッキング剤は約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、または約７％の脱脂乳を含み、ブロッキング期間は、約３分間超、約４分間超、約５分間超、約６分間超、約７分間超、約８分間超、約９分間超、約１０分間超、約１１分間超、約１２分間超、約１３分間超、約１４分間超、約１５分間超、約１６分間超、約１７分間超、約１８分間超、約１９分間超、約２０分間超、約２５分間超、約３０分間超、約３５分間超、約４０分間超、約４５分間超、約５０分間超、約５５分間超、または約６０分間超である。
【０２０４】
一部の実施形態では、ブロッキングステップを１回、２回、または３回実施し、ブロッキング剤は、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、または約７％のＢＳＡを含み、ブロッキング期間は、約３分間未満、約４分間未満、約５分間未満、約６分間未満、約７分間未満、約８分間未満、約９分間未満、約１０分間未満、約１１分間未満、約１２分間未満、約１３分間未満、約１４分間未満、約１５分間未満、約１６分間未満、約１７分間未満、約１８分間未満、約１９分間未満、約２０分間未満、約２５分間未満、約３０分間未満、約３５分間未満、約４０分間未満、約４５分間未満、約５０分間未満、約５５分間未満、または約６０分間未満である。
【０２０５】
一部の実施形態では、ブロッキングステップを１回、２回、または３回実施し、ブロッキング剤は、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、または約７％のＢＳＡを含み、ブロッキング期間は、約３分間超、約４分間超、約５分間超、約６分間超、約７分間超、約８分間超、約９分間超、約１０分間超、約１１分間超、約１２分間超、約１３分間超、約１４分間超、約１５分間超、約１６分間超、約１７分間超、約１８分間超、約１９分間超、約２０分間超、約２５分間超、約３０分間超、約３５分間超、約４０分間超、約４５分間超、約５０分間超、約５５分間超、または約６０分間超である。
【０２０６】
一部の実施形態では、組織を形態学的に染色することができる。一部の実施形態では、組織を対比染色して細胞または細胞成分の同定を可能にすることができる。
【０２０７】
一部の実施形態では、組織試料を、ヘマトキシリンを用いて対比染色し、当技術分野で公知の方法を使用して長期貯蔵のために脱水する。一部の実施形態では、組織試料を、Ｈ／Ｅを用いて染色することができる。
【０２０８】
検出ステップ
洗浄ステップの後、酵素の基質、例えば、ＨＲＰに対するＤＡＢ、またはＡＰに対するＦａｓｔ  Ｒｅｄなどを含む検出剤を組織試料に添加する。
【０２０９】
一部の実施形態では、検出試薬は、任意選択でＢＳＡおよび／またはポリエチレングリコールを伴うＰＢＳ緩衝液またはＴＢＳ緩衝液などの緩衝液を含む。
【０２１０】
一部の実施形態では、リン酸塩、トリス、ＭＯＰＳ、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ、または炭酸水素塩を含み、任意選択でチオメルサール（ｈｉｏｍｅｒｓａｌ）、ｐｒｏｃｌｉｎ  ３００、マンガン、カルシウム、鉄、マグネシウム、亜鉛、分子量が４００Ｄａから４０，０００Ｄａまでのポリエチレングリコール、エチレングリコール、グリセロール、ウシ血清アルブミン、ウマ血清アルブミン、ヤギ血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、トレハロース、スクロース、ゼラチン、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ３０、分子量が３００〜３０，０００Ｄａの硫酸デキストラン、または分子量が５００〜２５，０００のＤＥＡＥデキストランを含む緩衝液を用いて染色を行う。
【０２１１】
一部の実施形態では、検出温度は、約１５℃から約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、約４４℃、約４５℃、約４６℃、約４７℃、約４８℃、約４９℃、もしくは約５０℃の間、約２０℃から約２１℃、約２２℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、約４４℃、約４５℃、約４６℃、約４７℃、約４８℃、約４９℃、もしくは約５０℃の間、約２５℃から約３０℃の間、または約２５℃から約３７℃の間である。
【０２１２】
一部の実施形態では、検出温度は、約１４℃、約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、約４４℃、約４５℃、約４６℃、約４７℃、約４８℃、約４９℃、または約５０℃である。
【０２１３】
一部の実施形態では、検出温度は、約１４℃未満、約１５℃未満、約１６℃未満、約１７℃未満、約１８℃未満、約１９℃未満、約２０℃未満、約２１℃未満、約２２℃未満、約２３℃未満、約２４℃未満、約２５℃未満、約２６℃未満、約２７℃未満、約２８℃未満、約２９℃未満、約３０℃未満、約３１℃未満、約３２℃未満、約３３℃未満、約３４℃未満、約３５℃未満、約３６℃未満、約３７℃未満、約３８℃未満、約３９℃未満、約４０℃未満、約４１℃未満、約４２℃未満、約４３℃未満、約４４℃未満、約４５℃未満、約４６℃未満、約４７℃未満、約４８℃未満、約４９℃未満、または約５０℃未満である。
【０２１４】
一部の実施形態では、検出温度は、約１４℃超、約１５℃超、約１６℃超、約１７℃超、約１８℃超、約１９℃超、約２０℃超、約２１℃超、約２２℃超、約２３℃超、約２４℃超、約２５℃超、約２６℃超、約２７℃超、約２８℃超、約２９℃超、約３０℃超、約３１℃超、約３２℃超、約３３℃超、約３４℃超、約３５℃超、約３６℃超、約３７℃超、約３８℃超、約３９℃超、約４０℃超、約４１℃超、約４２℃超、約４３℃超、約４４℃超、約４５℃超、約４６℃超、約４７℃超、約４８℃超、約４９℃超、または約５０℃超である。
【０２１５】
一部の実施形態では、インキュベーション期間は、約３分間から約３０分間の間、約５分間から約１５分間の間、または約３分間から約５分間の間である。
【０２１６】
一部の実施形態では、インキュベーション期間は、約１分間、約２分間、約３分間、約５分間、約７分間、約９分間、約１０分間、約１２分間、約１５分間、約２０分間、約２５分間、約３０分間、約３５分間、約４０分間、約４５分間、約５０分間、約５５分間、または約６０分間である。
【０２１７】
一部の実施形態では、インキュベーション期間は、約１分間未満、約２分間未満、約３分間未満、約５分間未満、約７分間未満、約９分間未満、約１０分間未満、約１２分間未満、約１５分間未満、約２０分間未満、約２５分間未満、約３０分間未満、約３５分間未満、約４０分間未満、約４５分間未満、約５０分間未満、約５５分間未満、または約６０分間未満である。
【０２１８】
一部の実施形態では、インキュベーション期間は、約１分間超、約２分間超、約３分間超、約５分間超、約７分間超、約９分間超、約１０分間超、約１２分間超、約１５分間超、約２０分間超、約２５分間超、約３０分間超、約３５分間超、約４０分間超、約４５分間超、約５０分間超、約５５分間超、または約６０分間超である。
【０２１９】
一部の実施形態では、検出温度は、約１４℃、約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、約４４℃、約４５℃、約４６℃、約４７℃、約４８℃、約４９℃、または約５０℃であり、インキュベーション期間は、約１分間、約２分間、約３分間、約５分間、約７分間、約９分間、約１０分間、約１２分間、約１５分間、約２０分間、約２５分間、約３０分間、約３５分間、約４０分間、約４５分間、約５０分間、約５５分間、または約６０分間である。
【０２２０】
一部の実施形態では、検出温度は、約１４℃未満、約１５℃未満、約１６℃未満、約１７℃未満、約１８℃未満、約１９℃未満、約２０℃未満、約２１℃未満、約２２℃未満、約２３℃未満、約２４℃未満、約２５℃未満、約２６℃未満、約２７℃未満、約２８℃未満、約２９℃未満、約３０℃未満、約３１℃未満、約３２℃未満、約３３℃未満、約３４℃未満、約３５℃未満、約３６℃未満、約３７℃未満、約３８℃未満、約３９℃未満、約４０℃未満、約４１℃未満、約４２℃未満、約４３℃未満、約４４℃未満、約４５℃未満、約４６℃未満、約４７℃未満、約４８℃未満、約４９℃未満、または約５０℃未満であり、インキュベーション期間は、約１分間未満、約２分間未満、約３分間未満、約５分間未満、約７分間未満、約９分間未満、約１０分間未満、約１２分間未満、約１５分間未満、約２０分間未満、約２５分間未満、約３０分間未満、約３５分間未満、約４０分間未満、約４５分間未満、約５０分間未満、約５５分間未満、または約６０分間未満である。
【０２２１】
一部の実施形態では、検出温度は、約１４℃超、約１５℃超、約１６℃超、約１７℃超、約１８℃超、約１９℃超、約２０℃超、約２１℃超、約２２℃超、約２３℃超、約２４℃超、約２５℃超、約２６℃超、約２７℃超、約２８℃超、約２９℃超、約３０℃超、約３１℃超、約３２℃超、約３３℃超、約３４℃超、約３５℃超、約３６℃超、約３７℃超、約３８℃超、約３９℃超、約４０℃超、約４１℃超、約４２℃超、約４３℃超、約４４℃超、約４５℃超、約４６℃超、約４７℃超、約４８℃超、約４９℃超、または約５０℃超であり、インキュベーション期間は、約１分間未満、約２分間未満、約３分間未満、約５分間未満、約７分間未満、約９分間未満、約１０分間未満、約１２分間未満、約１５分間未満、約２０分間未満、約２５分間未満、約３０分間未満、約３５分間未満、約４０分間未満、約４５分間未満、約５０分間未満、約５５分間未満、または約６０分間未満である。
【０２２２】
一部の実施形態では、検出温度は、約１４℃未満、約１５℃未満、約１６℃未満、約１７℃未満、約１８℃未満、約１９℃未満、約２０℃未満、約２１℃未満、約２２℃未満、約２３℃未満、約２４℃未満、約２５℃未満、約２６℃未満、約２７℃未満、約２８℃未満、約２９℃未満、約３０℃未満、約３１℃未満、約３２℃未満、約３３℃未満、約３４℃未満、約３５℃未満、約３６℃未満、約３７℃未満、約３８℃未満、約３９℃未満、約４０℃未満、約４１℃未満、約４２℃未満、約４３℃未満、約４４℃未満、約４５℃未満、約４６℃未満、約４７℃未満、約４８℃未満、約４９℃未満、または約５０℃未満であり、インキュベーション期間は、約１分間超、約２分間超、約３分間超、約５分間超、約７分間超、約９分間超、約１０分間超、約１２分間超、約１５分間超、約２０分間超、約２５分間超、約３０分間超、約３５分間超、約４０分間超、約４５分間超、約５０分間超、約５５分間超、または約６０分間超である。
【０２２３】
一部の実施形態では、検出温度は、約１４℃超、約１５℃超、約１６℃超、約１７℃超、約１８℃超、約１９℃超、約２０℃超、約２１℃超、約２２℃超、約２３℃超、約２４℃超、約２５℃超、約２６℃超、約２７℃超、約２８℃超、約２９℃超、約３０℃超、約３１℃超、約３２℃超、約３３℃超、約３４℃超、約３５℃超、約３６℃超、約３７℃超、約３８℃超、約３９℃超、約４０℃超、約４１℃超、約４２℃超、約４３℃超、約４４℃超、約４５℃超、約４６℃超、約４７℃超、約４８℃超、約４９℃超、または約５０℃超であり、インキュベーション期間は、約１分間超、約２分間超、約３分間超、約５分間超、約７分間超、約９分間超、約１０分間超、約１２分間超、約１５分間超、約２０分間超、約２５分間超、約３０分間超、約３５分間超、約４０分間超、約４５分間超、約５０分間超、約５５分間超、または約６０分間超である。
【０２２４】
インキュベーション後、組織試料を、水道水などの水を用いて１回または複数回すすぐ。
【０２２５】
一部の実施形態では、分光光度計を使用して酵素反応を検出する。一部の実施形態では、ケミルミノメーターを使用して酵素反応を検出する。一部の実施形態では、蛍光検出器を使用して酵素反応を検出する。一部の実施形態では、比色定量シグナル検出器を使用して酵素反応を検出する。一部の実施形態では、光学顕微鏡または蛍光顕微鏡を使用して酵素反応を検出する。
【０２２６】
一部の実施形態では、標的分析物を定量する。一部の実施形態では、標的分析物を相対的に定量する。一部の実施形態では、標的分析物を標準物質と比べて定量する。一部の実施形態では、標的分析物を標準曲線と比べて定量する。
【０２２７】
Ｄ．形態学的染色
組織切片を調製した後、スライド上にマウントした切片を、評価のために形態学的染色を用いて染色することができる。一般に、それぞれが異なる細胞成分を明瞭に染色する１つまたは複数の色素を用いて切片を染色する。一部の実施形態では、キサンチン色素もしくはその機能的等価物および／またはチアジン色素もしくはその機能的等価物を使用して各組織切片内の核、細胞質、および「顆粒状の」構造を増強し、区別可能にする。そのような色素は市販されており、多くの場合、セットで販売されている。例として、ＨＥＭＡ３（登録商標）（ＣＭＳ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、Ｔｅｘａｓ）染色セットは、キサンチン色素およびチアジン色素を含む。一部の実施形態では、メチレンブルーも使用することができる。本方法に使用することができる他の形態学的染色の例としては、これだけに限定されないが、別の蛍光標識と同じ波長では有意に自己蛍光しない色素が挙げられる。染色は、スライドを色素にとどめておく時間の長さを延ばすまたは短縮することによって所与の組織に対して最適化することができることが当業者には理解されよう。
【０２２８】
染色後、組織切片を顕微鏡法の標準の技法によって分析することができる。一般に、病理学者などが、組織を異常細胞または正常細胞または特定の細胞型の存在について評価し、目的の細胞型の遺伝子座をもたらす。したがって、例えば、乳がんにおけるＨＥＲ２／ｎｅｕ増幅を相関付ける試験では、病理学者などがスライドを精査し、正常な乳房細胞および異常な乳房細胞を同定する。
【０２２９】
一部の実施形態では、形態学的染色およびポリマー酵素／抗体コンジュゲート染色を組織に対して実施する。
【０２３０】
ＩＩ．診断方法
本出願は、一態様において、診断（例えば、コンパニオン診断）のための組成物、方法、およびキットを提供する。一般に、診断方法は、個体における標的分析物の存在または非存在（すなわち、測定可能なレベルの欠如）を、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートの使用を含む方法によって検出することを含む。一部の実施形態では、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートは、治療用抗体を含む。当該方法は、個体における治療用抗体の標的分析物への結合を検出することにより、その治療用抗体を使用する治療に特に適する個体を選択することを可能にする。
【０２３１】
したがって、例えば、一部の実施形態では、異常なレベルの標的分析物を特徴とする疾患（例えばがんなど）を有する個体を治療する方法であって、１）標的分析物を認識する抗体とコンジュゲートした複数の酵素分子を含むポリマー酵素／抗体コンジュゲートを使用して標的分析物のレベルまたは存在を検出するステップと、２）標的分析物を標的化する薬剤を有効量で個体に投与するステップとを含む方法が提供される。一部の実施形態では、薬剤は、標的分析物に特異的に結合する抗体である。一部の実施形態では、薬剤は、ポリマー酵素抗体コンジュゲートに含まれるものと同じ抗体である。一部の実施形態では、疾患はがんであり、標的分析物は腫瘍抗原である。
【０２３２】
一部の実施形態では、異常なレベルの標的分析物を特徴とする疾患（例えばがんなど）を有する個体の、標的分析物を標的化する薬剤を用いた治療に対する適合性を評価する方法であって、標的分析物を認識する抗体とコンジュゲートした複数の酵素分子を含むポリマー酵素／抗体コンジュゲートを使用して標的分析物のレベルまたは存在を検出するステップを含み、標的分析物のレベルまたは存在を、治療の適合性を評価するための基礎として使用する方法が提供される。一部の実施形態では、薬剤は、標的分析物に特異的に結合する抗体である。一部の実施形態では、薬剤は、ポリマー酵素抗体コンジュゲートに含まれるものと同じ抗体である。一部の実施形態では、本方法は、治療を臨床医に推奨するステップをさらに含む。一部の実施形態では、疾患はがんであり、標的分析物は腫瘍抗原である。
【０２３３】
一部の実施形態では、異常なレベルの標的分析物を特徴とする疾患（例えばがんなど）を有する個体を、標的分析物を標的化する薬剤を用いた治療のために選択する（同定を含む）方法であって、標的分析物を認識する抗体とコンジュゲートした複数の酵素分子を含むポリマー酵素／抗体コンジュゲートを使用して標的分析物のレベルまたは存在を検出するステップを含み、標的分析物のレベルまたは存在を、個体を治療のために選択（同定を含む）するための基礎として使用する方法が提供される。一部の実施形態では、薬剤は、標的分析物に特異的に結合する抗体である。一部の実施形態では、薬剤は、ポリマー酵素抗体コンジュゲートに含まれるものと同じ抗体である。一部の実施形態では、本方法は、治療を臨床医に推奨するステップをさらに含む。一部の実施形態では、疾患はがんであり、標的分析物は腫瘍抗原である。
【０２３４】
一部の実施形態では、標的抗原の検出をＩＨＣによって実施する。一部の実施形態では、標的抗原の検出を直接ＩＨＣによって実施する。一部の実施形態では、薬剤を標的分析物に直接結合する。一部の実施形態では、薬剤を標的分析物に間接的に結合する。一部の実施形態では、薬剤は、小分子に基づく薬剤、ヌクレオチドに基づく薬剤、またはアミノ酸に基づく薬剤である。一部の実施形態では、薬剤は、抗体またはその断片である。一部の実施形態では、抗体は、標的分析物を検出するために使用するポリマー酵素／抗体コンジュゲートの抗体と同じ標的分析物のエピトープに結合する。一部の実施形態では、抗体は、標的分析物を検出するために使用するポリマー酵素／抗体コンジュゲートの抗体と同じ標的分析物のエピトープに、同じ結合親和性で結合する。一部の実施形態では、抗体は、標的分析物を検出するために使用するポリマー酵素／抗体コンジュゲートの抗体と異なるエピトープに結合し得る。一部の実施形態では、標的組織において標的分析物の存在を検出する。一部の実施形態では、疾患は、がんである。一部の実施形態では、個体はヒトである。
【０２３５】
一部の実施形態では、個体はヒトである。
【０２３６】
一部の実施形態では、標的分析物は、ＥＲ、ＰＲ、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）などのコンパニオン診断のためのバイオマーカーである。
【０２３７】
一部の実施形態では、治療用抗体は、Ｇタンパク質共役受容体またはイオンチャネルに特異的である。一部の実施形態では、治療用抗体は、１−４０−β−アミロイド、４−１ＢＢ、５ＡＣ、５Ｔ４、ＡＣＶＲ２Ｂ、腺癌抗原、ＡＧＳ−２２Ｍ６、アルファ−フェトプロテイン、アンジオポエチン２、アンジオポエチン３、ＡＯＣ３（ＶＡＰ−１）、Ｂ７−Ｈ３、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ（炭疽菌）、ＢＡＦＦ、ベータ−アミロイド、Ｂ−リンパ腫細胞、Ｃ２４２抗原、Ｃ５、ＣＡ−１２５、炭酸脱水酵素９（ＣＡ−ＩＸ）、心臓ミオシン、ＣＣＬ１１（エオタキシン−１）、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＤ１１、ＣＤ１８、ＣＤ１２５、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４７（ベイシジン）、ＣＤ１５、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ１９、ＣＤ２、ＣＤ２０、ＣＤ２００、ＣＤ２２、ＣＤ２２１、ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ２５（ＩＬ−２受容体のα鎖）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８（サイクリックＡＤＰリボースヒドロラーゼ）、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４１（インテグリンアルファ−ＩＩｂ）、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ５、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ８０、ＣＥＡ、ＣＥＡ関連抗原、ＣＦＤ、ｃｈ４Ｄ５、ＣＬＤＮ１８．２、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、クランピング因子（ｃｌｕｍｐｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）Ａ、ＣＳＦ２、ＣＴＬＡ−４、ＤＬＬ４、ＤＲ５、ＥＧＦＬ７、ＥＧＦＲ、内毒素、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３、エピシアリン（ｅｐｉｓｉａｌｉｎ）、ＥＲＢＢ３、ＦＡＰ、フィブリンＩＩ、ベータ鎖、フィブロネクチンエクストラドメイン−Ｂ、葉酸受容体１、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体、ガングリオシドＧＤ２、ガングリオシドＧＤ３、ＧＭＣＳＦ受容体α鎖、ＧＰＮＭＢ、赤血球凝集素、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＧＦ、ＨＨＧＦＲ、ＨＮＧＦ、Ｈｓｐ９０、ヒト散乱因子受容体キナーゼ（Ｈｕｍａｎ  ｓｃａｔｔｅｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｋｉｎａｓｅ）、ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＧＦ−１受容体、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＨＥ、ＩＬ２０、ＩＬ−１、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１β、ＩＬ−２２、ＩＬ２３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−６受容体、ＩＬ９、ＩＬＧＦ２、インテグリンα４β７、インテグリンα５β１、インテグリンα７β７、インテグリンαＩＩｂβ３、インテグリンαｖβ３、インターフェロン受容体、インターフェロンα／β受容体、インターフェロンガンマ誘導性タンパク質、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＢ２（ＣＤ１８）、ＫＩＲ２Ｄ、ルイスＹ抗原、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ）、リポテイコ酸、ＬＯＸＬ２、Ｌ−セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）、ＬＴＡ、ＭＣＰ−１、メソテリン、ＭＳ４Ａ１、ＭＵＣ１、ムチン  ＣａｎＡｇ、ミオスタチン、ＮＡＲＰ−１、ＮＣＡ−９０（顆粒球抗原）、ＮＧＦ、Ｎ−グリコリルノイラミン酸、ＮＯＧＯ−Ａ、Ｎｏｔｃｈ受容体、ＮＲＰ１、ＯＸ−４０、ＯＸＬＤＬ、ＰＣＳＫ９、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤＣＤ１、ＰＤＣＤ１、ＰＤＧＦ−Ｒα、リン酸ナトリウム共輸送体、ホスファチジルセリン、ＲＡＮＫＬ、ＲＨＤ、Ｒｈ因子、ＲＯＮ、ＲＴＮ４、スクレロスチン、ＳＤＣ１、セレクチンＰ、ＳＬＡＭＦ７、ＳＯＳＴ、スフィンゴシン−１−リン酸、ＴＡＧ−７２、Ｔ細胞受容体、ＴＥＭ１、テネイシンＣ、ＴＦＰＩ、ＴＧＦベータ１、ＴＧＦベータ２、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、腫瘍抗原ＣＴＡＡ１６．８８、ＭＵＣ１の腫瘍特異的グリコシル化、ＴＷＥＡＫ受容体、ＴＹＲＰ１（糖タンパク質７５）、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ２、ビメンチン、またはＶＷＦに特異的である。
【０２３８】
本明細書では、疾患を有する個体が治療に応答する可能性があるかどうかを評価する方法であって、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートを使用して標的分析物の存在を決定するステップを含む方法も提供される。
【０２３９】
さらに、本明細書では、治療に応答する可能性がある、疾患を有する個体を選択（同定を含む）するための方法であって、（ａ）ポリマー酵素／抗体コンジュゲートを使用して標的分析物の存在を検出するステップと、（ｂ）標的分析物を標的化する薬剤を有効量で投与するステップとを含む方法が提供される。
【０２４０】
本明細書では、標的分析物を標的化する薬剤を有効量で受けている、疾患を有する個体の療法治療を調整する方法であって、個体から単離した試料においてポリマー酵素／抗体コンジュゲートを使用して標的分析物の存在を検出するステップと、評価に基づいて療法治療を調整するステップとを含む方法も提供される。一部の実施形態では、薬剤の量を調整する。一部の実施形態では、疾患は、がんである。
【０２４１】
本明細書におけるいずれかの方法の一部の実施形態では、本方法により、腫瘍サイズまたは疾患もしくは疾患の進行の証拠の測定可能な減少、完全奏効、部分奏効、安定病態、無増悪生存の増加もしくは延長、または全生存の増加もしくは延長が予測され、かつ／またはそれがもたらされる。上記のいずれかの方法の一部の実施形態では、個体において、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートによって測定される検出可能な標的分析物が存在する場合、その個体は、標的分析物を標的化する薬剤に応答する可能性があり、この応答は、腫瘍サイズまたは疾患もしくは疾患の進行の証拠の測定可能な縮小、完全奏効、部分奏効、安定病態、無増悪生存の増加もしくは延長、全生存の増加もしくは延長によって明らかである。
【０２４２】
本方法の一部の実施形態では、個体におけるがんの無増悪生存を延ばす方法であって、個体を、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートによって測定される標的分析物の存在に基づいて治療のために選択するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、本方法により、疾患の進行までの時間が少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、または１２週間のいずれかだけ延ばされる。
【０２４３】
本方法の一部の実施形態では、がんを有する個体の生存を延ばす方法であって、個体を、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートによって測定される標的分析物の存在に基づいて治療のために選択するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、本方法により、個体の生存が、少なくとも１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１２カ月、１８カ月、または２４カ月のいずれかだけ延ばされる。
【０２４４】
本方法の一部の実施形態では、がんを有する個体におけるＡＥおよびＳＡＥを減少させる方法であって、個体を、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートによって測定される標的分析物の存在に基づいて治療のために選択するステップを含む方法が提供される。本明細書に記載のいずれかの方法の一部の実施形態では、本方法により、客観的な応答（例えば、部分奏効または完全奏効など）が予測され、かつ／またはそれがもたらされる。
【０２４５】
本明細書に記載のいずれかの方法の一部の実施形態では、本方法により、生活の質の改善が予測され、かつ／またはそれがもたらされる。
【０２４６】
一部の実施形態では、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートを使用して、測定可能な標的分析物の存在を有する個体の、集団内での百分率を決定するための方法が提供される。一部の実施形態では、ＩＨＣを使用して標的分析物の発現を決定する。一部の実施形態では、直接ＩＨＣを使用して標的分析物の発現を決定する。一部の実施形態では、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートを使用して標的分析物の発現を決定する。一部の実施形態では、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートを使用した直接ＩＨＣを使用して標的分析物の発現を決定する。一部の実施形態では、標的分析物は腫瘍抗原である。一部の実施形態では、個体はヒトである。
【０２４７】
一部の実施形態では、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートを使用して個体における標的分析物の組織分布を決定するための方法が提供される。一部の実施形態では、個体における１つ超の組織型について標的分析物の組織分布を決定する。一部の実施形態では、１または複数の個体に由来する組織型について標的分析物の組織分布を決定する。一部の実施形態では、１または複数の個体に由来する１つ超の組織型について標的分析物の組織分布を決定する。一部の実施形態では、ＩＨＣを使用して標的分析物の組織分布を決定する。一部の実施形態では、直接ＩＨＣを使用して標的分析物の組織分布を決定する。一部の実施形態では、組織は、がんである。一部の実施形態では、個体はヒトである。
【０２４８】
一部の実施形態では、組織における標的分析物の存在を決定するための、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートの使用を含む方法により、組織における標的分析物の存在を層別化することもできる。一部の実施形態では、組織は標的分析物について陽性である。一部の実施形態では、組織は標的分析物について弱く陽性である。一部の実施形態では、組織は標的分析物について陰性である。
【０２４９】
一部の実施形態では、標的抗原の存在を決定するための、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートの使用を含む方法により、標的抗原のレベルを検出することもできる。一部の実施形態では、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートを使用して決定される、個体における標的分析物のレベルを、同じくポリマー酵素／抗体コンジュゲートを使用して決定される対照試料中の標的分析物のレベルと比較する。一部の実施形態では、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートを使用して決定される個体における標的分析物のレベルを、それぞれポリマー酵素／抗体コンジュゲートを使用して決定される複数の対照試料中の標的分析物のレベルと比較する。一部の実施形態では、複数の対照試料を使用して、がんを有する個体における標的分析物のレベルを分類するために使用する統計量を生成する。
【０２５０】
ポリマー酵素／抗体コンジュゲートを使用して決定される標的分析物のレベルは、以下のいずれかを決定するためにも有用であり得る：（ａ）個体が最初に受ける治療（複数可）に適合する可能性が高いまたは可能性があること；（ｂ）個体が最初に受ける治療（複数可）に適合しない可能性が高いまたは可能性があること；（ｃ）治療への応答性；（ｄ）個体が治療（複数可）を受け続けることに適合する可能性が高いまたは可能性があること；（ｅ）個体が治療（複数可）を受け続けることに適合しない可能性が高いまたは可能性があること；（ｆ）投与量の調整；（ｇ）臨床的利益の可能性の予測。一部の実施形態では、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートを使用して決定される標的分析物のレベルは、以下のいずれかの評価を補助するためにも有用であり得る：（ａ）個体が最初に受ける治療（複数可）に適合する可能性が高いまたは可能性があること；（ｂ）個体が最初に受ける治療（複数可）に適合しない可能性が高いまたは可能性があること；（ｃ）治療への応答性；（ｄ）個体が治療（複数可）を受け続けることに適合する可能性が高いまたは可能性があること；（ｅ）個体が治療（複数可）を受け続けることに適合しない可能性が高いまたは可能性があること；（ｆ）投与量の調整；（ｇ）臨床的利益の可能性の予測。
【０２５１】
本明細書で使用される場合、「に基づいて（ｂａｓｅｄ  ｕｐｏｎ）」または「に基づいて（ｂａｓｅｄ  ｏｎ）」とは、本明細書に記載の通り個体の特性を評価、決定、または測定すること（および好ましくは治療を受けるのに適した個体を選択すること）を含む。ポリマー酵素／抗体コンジュゲートを使用して決定される標的分析物の存在またはレベルを、本明細書に記載の治療方法を選択するため、評価（または評価を補助）するため、測定するため、または決定するための基礎として使用する場合、標的分析物のレベルを治療前および／または治療中に測定し、得られた値を臨床医が以下のいずれかの評価において使用することができる：（ａ）個体が最初に受ける治療（複数可）に適合する可能性が高いまたは可能性があること；（ｂ）個体が最初に受ける治療（複数可）に適合しない可能性が高いまたは可能性があること；（ｃ）治療への応答性；（ｄ）個体が治療（複数可）を受け続けることに適合する可能性が高いまたは可能性があること；（ｅ）個体が治療（複数可）を受け続けることに適合しない可能性が高いまたは可能性があること；（ｆ）投与量の調整；または（ｇ）臨床的利益の可能性の予測。
【０２５２】
一部の実施形態では、個体はヒトである。一部の実施形態では、個体は女性である。一部の実施形態では、個体は男性である。一部の実施形態では、個体は約６５歳未満である。一部の実施形態では、個体は、少なくとも約６５歳、少なくとも約７０歳、または少なくとも約７５歳である。一部の実施形態では、個体は、がんに付随する身体的ストレスおよび心理学的ストレスを含めた慢性ストレス、例えば、不安、うつ病、頭痛、疼痛、疲労、不眠症、食欲不振、悪心、栄養不良、またはそれらの任意の組合せなどの１つまたは複数の症状を有する。一部の実施形態では、個体は、進行期のがん、例えば、ＴＮＭ病期分類系に基づくステージＴ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３またはＭ１のがんのいずれかなどを有する。一部の実施形態では、個体は、高腫瘍量、例えば、大きな腫瘍サイズおよび／または腫瘍床（ｔｕｍｏｒ  ｂｅｄ）内の多数のがん細胞などを有する。一部の実施形態では、個体は、リンパ節が触知できる、または、近くのリンパ節にがん細胞が拡散している。一部の実施形態では、個体は、遠隔腫瘍転移を有する。
【０２５３】
いずれかの方法の一部の実施形態では、がんは、肺がん、子宮がん、腎がん、卵巣がん、乳がん、子宮体がん、頭頸部がん、膵がん、および黒色腫からなる群より選択される。一部の実施形態では、がんは、乳がん、肺がん、および膵がんからなる群より選択される。一部の実施形態では、がんは、トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）である。一部の実施形態では、がんは非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である。一部の実施形態では、がんは膵管腺癌（ＰＤＡＣ）である。一部の実施形態では、がんは、副腎皮質がん、胆管がん、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、結腸がん、子宮内膜がん（ｅｎｄｏｍｅｔｒｏｉｄ  ｃａｎｃｅｒ）、食道がん、神経膠芽腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｏｍａ）、頭頸部がん、腎嫌色素性がん（ｋｉｄｎｅｙ  ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｂｅ  ｃａｎｃｅｒ）、腎明細胞癌（ｋｉｄｎｅｙ  ｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、乳頭状腎細胞癌（ｋｉｄｎｅｙ  ｐａｐｉｌｌａｒｙ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肝がん、低グレード神経膠腫、肺腺癌、肺扁平上皮癌、黒色腫、中皮腫、眼の黒色腫、卵巣がん、膵がん、褐色細胞腫および傍神経節腫、前立腺がん、肉腫、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、精巣がん、甲状腺がん、および子宮癌肉腫からなる群より選択される。
【０２５４】
一部の実施形態では、がんは、固形上皮腫瘍または肉腫である。一部の実施形態では、がんは、副腎皮質癌、カポジ肉腫、肛門がん、消化管カルチノイド腫瘍、基底細胞癌、胆管がん、膀胱がん（例えば、膀胱移行上皮癌、膀胱扁平上皮癌、および膀胱腺癌など）、骨がん（例えば、ユーイング肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、および悪性線維性組織球腫など）、乳がん（例えば、腺管癌、小葉癌、線維腺腫など）、気管支腫瘍、原発不明の癌、子宮頸がん、脊索腫、結腸がん、直腸がん、子宮体がん、食道がん（食道扁平上皮癌および食道腺癌を含む）、眼内黒色腫、卵巣がん（例えば、卵巣上皮がん、卵管がん、および腹膜がんなど）、胆嚢がん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、頭頸部がん（例えば、下咽頭がん、喉頭がん、口唇・口腔がん、原発不明転移性扁平上皮性頸部がん治療（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｎｅｃｋ  ｃａｎｃｅｒ  ｗｉｔｈ  ｏｃｃｕｌｔ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）、鼻咽頭がん、中咽頭がん、副鼻腔および鼻腔がん、唾液腺がん、および化学療法および頭部／頸部放射線の口腔合併症など）、心臓腫瘍（例えば、横紋筋腫、粘液腫、線維腫、線維肉腫、および血管肉腫など）、肝細胞（肝）がん、腎がん（例えば、腎細胞がん、腎盤および尿管の移行上皮がん、およびウィルムス腫瘍）、肺がん（例えば、非小細胞肺がん、および小細胞肺がんなど）、皮膚がん（例えば、基底細胞癌、扁平上皮癌、皮膚神経内分泌癌、黒色腫、およびメルケル細胞癌など）、膵がん、褐色細胞腫、副甲状腺がん、陰茎がん、下垂体腫瘍、前立腺がん、子宮肉腫（例えば、平滑筋肉腫および子宮内膜間質部肉腫など）、小腸がん（例えば、小腸腺癌および小腸肉腫、および消化管間質腫瘍など）、軟部組織肉腫（例えば、成人軟部組織肉腫、および小児期軟部組織肉腫など）、甲状腺がん（例えば、甲状腺乳頭状がん、甲状腺濾胞状がん、甲状腺髄様がんおよび甲状腺未分化がんなど）、尿道がん（尿道移行上皮癌、尿道扁平上皮癌、および尿道腺癌を含む）、膣がん（例えば、膣扁平上皮癌および膣腺癌など）、ならびに外陰がんからなる群より選択される。
【０２５５】
本方法の一部の実施形態では、本方法は、第一選択療法である。
【０２５６】
一部の実施形態では、がんは、進行期（例えば、ＩＩＩ期またはＩＶ期など）にある。一部の実施形態では、がんは転移性がんである。
【０２５７】
ポリマー酵素／抗体コンジュゲートを使用して決定される標的分析物レベルの分類または順位付け（すなわち、高いか低いか）は、対照レベルの統計学的分布と比べて決定することができる。一部の実施形態では、分類または順位付けは、正常組織などの対照試料と相対的なものである。一部の実施形態では、標的分析物のレベルを対照レベルの統計学的分布と比べて分類するまたは順位付ける。一部の実施形態では、標的分析物のレベルを個体から得た対照試料からのレベルと比べて分類するまたは順位付ける。
【０２５８】
対照試料は、非対照試料と同じ供給源および方法を使用して得ることができる。一部の実施形態では、対照試料は、異なる個体（例えば、がんを有さない個体、がんに対応する疾患の良性形態またはより進行していない形態を有する個体、および／または同様の民族、年齢、および性別同一性を共有する患者）から得られる。一部の実施形態では、試料が腫瘍組織試料である場合、対照試料は、同じ個体に由来する非がん性試料であってよい。一部の実施形態では、複数の対照試料（例えば、異なる個体に由来するもの）を使用して、特定の組織、器官、または細胞集団における標的分析物のレベルの範囲を決定する。
【０２５９】
一部の実施形態では、標的分析物のレベルの決定および分類のために、バイオインフォマティクス方法を使用する。
【０２６０】
一部の実施形態では、標的分析物レベルを、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートを使用して、例えば、直接的な免疫組織化学的検査によって決定する。例えば、低レベルまたは高レベルの判定基準は、例えば標的分析物を特異的に認識する抗体を使用することにより、陽性染色細胞の数および／または染色の強度に基づいて作成することができる。一部の実施形態では、陽性染色の細胞が約１％未満、約５％未満、約１０％未満、約１５％未満、約２０％未満、約２５％未満、約３０％未満、約３５％未満、約４０％未満、約４５％未満、または約５０％未満であれば、レベルが低い。一部の実施形態では、染色の強度が陽性対照染色よりも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％低ければ、レベルが低い。一部の実施形態では、約４０％超、約４５％超、約５０％超、約５５％超、約６０％超、約６５％超、約７０％超、約７５％超、約８０％超、約８５％超、または約９０％超の細胞が陽性染色される場合、レベルが高い。
【０２６１】
一部の実施形態では、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートの染色の強度が陽性対照染色と同程度であれば、レベルが高い。一部の実施形態では、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートの染色の強度が、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートの陽性対照染色の８０％、８５％、または９０％であれば、レベルが高い。
【０２６２】
一部の実施形態では、強力な染色、中程度の染色、および弱い染色は、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートの染色の較正されたレベルであり、範囲が確立されており、染色の強度はその範囲内においてビンに分ける（ｂｉｎ）。一部の実施形態では、強力な染色とは、強度範囲の７５パーセンタイルを超えるポリマー酵素／抗体コンジュゲートの染色であり、中程度の染色とは、強度範囲の２５パーセンタイルから７５パーセンタイルまでのポリマー酵素／抗体コンジュゲートの染色であり、弱い染色とは、強度範囲の２５パーセンタイルを下回るポリマー酵素／抗体コンジュゲートの染色である。一部の態様では、特定の染色技法に詳しい当業者により、ビンサイズが調整され、染色カテゴリーが定義される。
【０２６３】
一部の実施形態では、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートによって決定される、試料、患者などにおける標的分析物レベルの評価およびスコア化は、１人または複数人の経験のある臨床医、すなわち、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートを使用した標的分析物発現および標的分析物染色パターンの経験がある臨床医により実施される。例えば、一部の実施形態では、臨床医（複数可）は、評価およびスコア化される試料、患者などの臨床的特性および転帰に関して盲検にされる。
【０２６４】
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法を診療所で実施する。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法を診療所の外部で実施する。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法を診断検査室で実施する。
【０２６５】
ＩＩＩ．キット
さらなる態様では、本発明は、本発明の組成物の１つまたは複数、および組成物を使用し、かつ／または開示されている方法を行うための指示を含有するキットを提供する。
【０２６６】
一部の実施形態では、本発明は、上記の免疫検出方法と共に使用する免疫検出キットを提供する。一般に、野生型および／または変異体タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドを検出するために抗体が使用されるので、抗体がキットに含まれることが好ましい。したがって、免疫検出キットは、適切な容器手段中に、野生型および／もしくは変異体タンパク質、ポリペプチドおよび／もしくはペプチドに結合する一次抗体、ならびに／または、任意選択で、免疫検出用試薬、ならびに／または、さらに、任意選択で、野生型および／もしくは変異体タンパク質、ポリペプチドおよび／もしくはペプチドを含む。
【０２６７】
キットの免疫検出用試薬は、所与の一次抗体に付随し、かつ／または連結した、検出可能な標識を含めた、好ましくは、ポリマー酵素／抗体コンジュゲートとして、種々の形態のうちの任意の１つを取ってよい。
【０２６８】
キットは、標識されていようとおよび／または標識されていまいと、検出アッセイ用の標準曲線を調製するために使用することができる、野生型および／または変異体タンパク質、ポリペプチドおよび／またはポリペプチドの適切に分注した組成物をさらに含んでよい。キットは、抗体−標識コンジュゲートを完全にコンジュゲートした形態で、中間体の形態で、および／またはキットの使用者によってコンジュゲートされる別々の部分として、含有してよい。キットの成分は、水性媒体中に、および／または凍結乾燥した形態で包装されていてよい。
【０２６９】
キットの容器手段は、一般に、抗体を入れ、および／または好ましくは適切に分注することが可能な少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ビン、シリンジおよび／または他の容器手段を含む。本発明のキットは、一般には、抗体、抗原、および／または任意の他の試薬容器を販売用に密封するための手段も含む。そのような容器は、所望のバイアルを保持する射出成型および／またはブロー成形されたプラスチック容器を含む。
【０２７０】
本発明のキットは、適切に包装中にある。適切な包装としては、これだけに限定されないが、バイアル、ビン、ジャー、柔軟な包装（例えば、Ｍｙｌａｒまたはプラスチックの袋）などが挙げられる。任意選択で、キットにより、緩衝液および説明的情報などの追加的な成分を提供することができる。したがって、本出願は、バイアル（例えば、密閉バイアルなど）、ビン、ジャー、柔軟な包装などを含む製造品も提供する。
【０２７１】
例えば、本発明の一実施形態では、キットにより、広範な臨床の場および研究の場において分子（例えば、がんにおいて臨床的に関連のある予後因子および予測因子）の包括的なパネルを評価する。
【０２７２】
一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載の方法のいずれかに従った使用のための説明書をさらに含む。キットは、治療に適した個体の選択に関する説明を含んでよい。本発明のキットで供給される説明書は、一般には、ラベルまたは添付文書（例えば、キットに含まれる紙シート）上の書面での説明書であるが、機械可読説明書（例えば、磁気または光学保存ディスクに保持された説明書）も許容される。
【０２７３】
例えば、一部の実施形態では、キットは、ａ）ポリマー酵素／抗体コンジュゲートを含む。一部の実施形態では、キットは、ａ）ポリマー酵素／抗体コンジュゲート、およびｂ）使用説明書を含む。一部の実施形態では、キットは、ａ）ポリマー酵素／抗体コンジュゲート、およびｂ）ポリマー酵素の基質を含む。一部の実施形態では、キットは、ａ）ポリマー酵素／抗体コンジュゲート、ｂ）ポリマー酵素の基質、およびｃ）使用説明書を含む。一部の実施形態では、ポリマー酵素はポリマーＨＲＰである。一部の実施形態では、抗体は治療用抗体である。
【０２７４】
本発明の好ましい実施形態が本明細書において示され、記載されているが、そのような実施形態が単に例として提供されていることは当業者には明白であろう。当業者は、本発明から逸脱することなく多数の変形、変化および置換をすぐに思いつくであろう。本明細書に記載の本発明の実施形態に対する種々の代替物を本発明の実施において使用することができることが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲により本発明の範囲が定義されること、ならびにこれらの特許請求の範囲内の方法および構造およびそれらの等価物がそれに包含されることが意図されている。
【実施例】
【０２７５】
本発明を、本発明の化合物の調製を例示する以下の実施例によりさらに例示するが、本発明はそれにより限定されない。
【０２７６】
（実施例１  凍結組織スライドに対する直接ＩＨＣのプロトコール）
本実施例では、凍結組織試料から得た組織切片に対する直接ＩＨＣを実施するためのプロトコールを実証する。
【０２７７】
組織切片を以下の例示的な方法に記載の通り調製する。新鮮に切開した組織ブロック（厚さ＜５ｍｍ）を、予め標識した組織基礎型に入れる。組織ブロック全体を低温包埋媒体（ｃｒｙｏ−ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ  ｍｅｄｉａ）（例えば、ＯＣＴ）で覆う。組織ブロックを含有する基礎型をゆっくりと液体窒素に入れ、組織ブロック全体を液体窒素に浸して確実に組織ブロックを完全に凍結させる。凍結組織ブロックをクライオトーム低温保持装置（例えば、−２０℃）に移す。クライオトームを使用して凍結組織ブロックの切片作製を行って所望の厚さ（一般には、５〜１０μｍ）にする。組織切片を免疫組織化学的検査に適したガラススライド（例えば、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ（登録商標）Ｐｌｕｓ、ＶＷＲ）に置く。
【０２７８】
組織切片を以下の典型的な方法に記載の通り免疫染色する。組織切片を、７５％のメタノール、５％の氷酢酸（ｇｌａｃｉａｌ  ａｃｉｄｉｃ  ａｃｉｄ）、および２０％の３７％ホルムアルデヒドを含有する固定剤を用いて１〜２分間固定する。次に、組織切片を伴うスライドを、ブロッキング緩衝液、例えば、５％脱脂乳または２％ＢＳＡを用いて２分間ブロッキングする。ブロッキング後、スライドを中性ｐＨ、１０ｍＭのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で１０秒間すすぐ；スライドを３回すすぐ。１％ＢＳＡで希釈したポリマーＨＲＰ／抗体コンジュゲートをスライドに適用して組織切片の全面積を覆い、室温で３〜５分間インキュベートする。インキュベート後、スライドをＰＢＳ緩衝液で３回、毎回１０秒間洗浄する。ＤＡＢ溶液をスライドに適用して組織切片の全面積を覆い、１〜３分間インキュベートする。水道水で洗浄することによって反応を停止させる。スライドを、ヘマトキシリンを用いて１０秒にわたって対比染色し、次いで水で洗浄する。その後、スライドを酸アルコール（濃縮塩酸１１ｍＬと８０％エタノール４４００ｍＬを組み合わせることによる０．２５％酸アルコール溶液）に短時間浸漬する；スライドを１〜３回浸漬する。次に、スライドを炭酸リチウム（炭酸リチウム２．３ｇと８０％エタノール２００ｍＬを組み合わせることによる炭酸リチウム溶液）に１５秒にわたって短時間浸漬し、次いで、水道水で１０秒間すすぐ。次いで、スライドを１００％エタノールに３回、それぞれ１０秒間浸漬して組織切片を脱水する。脱水後、キシレンに３回、それぞれ１０秒間浸漬することによってスライドをきれいにする。
【０２７９】
（実施例２  組織スライドの脱パラフィンおよび再湿潤化）
本実施例では、組織切片の脱パラフィン、再湿潤化、およびエピトープ回復後の組織切片に対する直接ＩＨＣを実施するためのプロトコールを実証する。
【０２８０】
組織切片を伴うスライドをキシレンに５分間浸漬する。キシレンへの浸漬を、きれいなキシレンを用いてさらに２回、それぞれ５分間、繰り返す。次に、スライドを以下の一連のエタノール溶液に浸漬する：１００％エタノールに３分；１００％エタノールに３分；９５％エタノールに３分；および７５％エタノールに３分。その後、スライドをきれいな水道水に３分間浸漬することによってスライドを水道水ですすぐ；さらに２回繰り返す。
【０２８１】
組織切片の再湿潤化後、トリプシンを使用してタンパク質エピトープを露出させる。まず、０．１％トリプシン溶液を、蒸留水を使用して０．１％塩化カルシウムに調製する。トリプシン溶液のｐＨを、１Ｍの水酸化ナトリウムを使用して７．２に調整する。加湿チャンバー、０．１％トリプシン溶液、および蒸留水中の組織切片を伴うスライドを３７℃で予め温める。その後、組織切片を伴うスライドを０．１％トリプシン溶液中、２０分間インキュベートする。次に、スライドを室温で１０分間冷ます。１０分後、スライドをきれいな水道水に２分間浸漬することによってスライドを水道水ですすぐ；さらに１回繰り返す。次いで、スライドを、３％過酸化水素溶液で２分間ブロッキングする。次いで、スライドを０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を伴うＰＢＳ中、スライドを２分間浸漬することによってすすぐ；さらに１回繰り返す。その後、スライドを１％ＢＳＡで３０分間ブロッキングする。
【０２８２】
ブロッキング後、組織切片を、ポリマーＨＲＰ／抗体コンジュゲートを用いて免疫染色する。ポリマーＨＲＰ／抗体コンジュゲートを含む溶液をスライドに適用して組織切片の全面積を覆い、室温で５〜３０分間インキュベートする。インキュベート後、スライドを、ＰＢＳ  Ｔｗｅｅｎ２０緩衝液を用いて３回、毎回２分間洗浄する。
【０２８３】
希釈剤１ｍＬ当たり色素原３０μｌを含有するＤＡＢ溶液をスライドに適用して組織切片の全面積を覆い、室温で５分間インキュベートする。水道水で洗浄することによって反応を停止させる。スライドを、ヘマトキシリンを用いて１０秒にわたって対比染色し、次いで水で洗浄する。次いで、スライドを０．１％炭酸ナトリウム、ｐＨ８（青み付け溶液（ｂｌｕｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ））に１５秒間浸漬する。その後、スライド上の組織切片を、スライドを以下の溶液に浸漬することによって脱水する：９５％エタノールに３分；１００％エタノールに３分；および１００％エタノールに３分。この後、キシレンによる５分間の洗浄を２回行う。その後、スライドをキシレンに２回、毎回１０秒間浸漬することによってスライドをきれいにする。
【０２８４】
（実施例３  ポリマーＨＲＰ抗Ｃｋ８／１８抗体コンジュゲートを使用した直接ＩＨＣ）
本実施例では、ポリマーＨＲＰ抗Ｃｋ８／１８抗体コンジュゲートを用いた直接ＩＨＣ染色を使用した、組織試料中のＣｋ８／１８の検出を実証する。
【０２８５】
ＦＦＰＥ前立腺組織切片および凍結ヒトリンパ節組織切片を調製し、実施例１および２に記載の技法を使用して免疫染色した。ＦＦＰＥ前立腺組織切片を、トリプシンを使用して処理してタンパク質エピトープを回復させ、ポリマーＨＲＰとコンジュゲートした抗Ｃｋ８／１８マウスモノクローナル抗体を組織試料と一緒に３７℃で５分間インキュベートした。凍結ヒトリンパ節組織切片を、ポリマーＨＲＰとコンジュゲートした抗Ｃｋ８／１８マウスモノクローナル抗体と一緒に室温で３分間インキュベートした。
【０２８６】
ＦＦＰＥ前立腺組織切片（図９Ａ）および凍結ヒトリンパ節組織切片（図９Ｂ）についての染色されたがん組織の代表的な画像を提供する。
【０２８７】
（実施例４  ポリマーＨＲＰ抗Ｋｉ−６７抗体コンジュゲートを使用した直接ＩＨＣ）
本実施例では、ポリマーＨＲＰ抗Ｋｉ−６７抗体コンジュゲートを用いた直接ＩＨＣ染色を使用した、組織試料中のＫｉ−６７の検出を実証する。
【０２８８】
ヒト扁桃組織切片を調製し、実施例１および２に記載の技法を使用して免疫染色した。さらに、組織切片をＱ−染色を用いて染色した。
【０２８９】
ヒト扁桃組織切片について抗Ｋｉ−６７により染色された組織の代表的な画像を提供する（図１０）。
【０２９０】
（実施例５  ポリマーＨＲＰ抗Ｃｋ５抗体コンジュゲートを使用した直接ＩＨＣ）
本実施例では、ポリマーＨＲＰ抗Ｃｋ５抗体コンジュゲートを用いた直接ＩＨＣ染色を使用した、ヒト扁桃組織試料中のＣｋ５の検出を実証する。
【０２９１】
凍結ヒト扁桃組織切片を調製し、実施例１および２に記載の技法を使用して免疫染色した。凍結ヒト扁桃組織切片をポリマーＨＲＰ抗Ｃｋ５抗体コンジュゲートと一緒に室温で１０分間インキュベートした。
【０２９２】
ヒト扁桃組織切片について抗Ｃｋ５により染色された組織の代表的な画像を提供する（図１１）。
【０２９３】
（実施例６  ポリマーＨＲＰ抗Ｍａｒｔ−１抗体コンジュゲートを使用した直接ＩＨＣ）
本実施例では、ポリマーＨＲＰ抗Ｍａｒｔ−１抗体クローンＡ１０３コンジュゲートを用いた直接ＩＨＣ染色を使用した、黒色腫組織試料中のＭａｒｔ−１の検出を実証する。
【０２９４】
黒色腫組織切片を調製し、実施例１および２に記載の技法を使用して免疫染色した。
【０２９５】
黒色腫組織切片について抗Ｍａｒｔ−１により染色された組織の代表的な画像を提供する（図１２）。
【０２９６】
（実施例７  ポリマーＨＲＰ抗ＣＤ４５抗体コンジュゲートを使用した直接ＩＨＣ）
本実施例では、ポリマーＨＲＰ抗ＣＤ４５抗体クローン３Ａ４コンジュゲートを用いた直接ＩＨＣ染色を使用した、扁桃組織試料中のＣＤ４５の検出を実証する。
【０２９７】
扁桃組織切片を調製し、実施例１および２に記載の技法を使用して免疫染色した。
【０２９８】
扁桃組織切片について抗ＣＤ４５により染色された組織の代表的な画像を提供する（図１３）。
【０２９９】
（実施例８  治療用抗体を使用した直接ＩＨＣの方法および結果）
本実施例では、ポリマーＨＲＰとコンジュゲートした治療用抗体を使用した、種々の組織試料の直接ＩＨＣ染色の方法を実証する。
【０３００】
ＲＯＲ２に特異的に結合するヒト治療用抗体を得た。治療用抗体をポリマーＨＲＰで標識して治療用抗体のポリマーＨＲＰコンジュゲートを作出した。
【０３０１】
組織切片を調製し、実施例１および２に記載されているものなどの、本明細書に記載の技法を使用して免疫染色した。
【０３０２】
免疫染色画像を、「０〜４」にスコア化し、４を最も強力とし、「３〜４」を陽性とし、「１〜２」を弱い陽性とし、０を陰性とした。
【０３０３】
ポリマーＨＲＰ抗ＲＯＲ２抗体コンジュゲートの作業条件を、ＲＯＲ２を発現することまたはＲＯＲ２の発現を欠くことが既知である組織切片に基づいて最適化した。既知の陽性組織切片および陰性組織切片の染色分類結果を表１に報告する。本方法を用いたＲＯＲ２を発現する組織の同定は、組織試料中のＲＯＲ２の既知の発現と相関した。
【表１】
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【０３０４】
以下の染色された組織の代表的な画像を提供する：扁桃（図１４Ａ）、前立腺（図１４Ｂ）、胃（図１４Ｃ）、および腎臓（図１４Ｄ）。
【０３０５】
その後、ポリマーＨＲＰ抗ＲＯＲ２抗体コンジュゲートを使用する最適化した直接ＩＨＣ方法を使用して、一連のがん組織試料を分類した。染色分類結果を表２に報告する。
【表２】
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【０３０６】
以下の直接ＩＨＣ染色された組織の代表的な画像を提供する：黒色腫（図１５Ａおよび１５Ｂ）、肝細胞癌（図１５Ｃおよび１５Ｄ）、神経内分泌腫瘍（図１５Ｅおよび１５Ｆ）、肺癌（図１５Ｇ）、および腎明細胞癌（図１５Ｈ）。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５Ａ】
2017515121.tif 000028
【図１５Ｂ】
2017515121.tif 000029
【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
2017515121.tif 000032
【図１５Ｆ】
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【図１５Ｇ】
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【図１５Ｈ】
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【国際調査報告】
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