(57)【要約】  線維化を検出及び定量化する方法であって、該方法は、少なくとも、固定済の非染色組織試料を支持体上に配置し、前記試料の各点を走査することにより、赤外線取得を行い、各取得点により生成された赤外スペクトルを、少なくとも１つのスペクトル画像に変換し、少なくとも生理的コラーゲンと線維化による病的コラーゲンとを区別し、スペクトルの類似度に従ってスペクトルを分類するアルゴリズムにより定義されるスペクトル分類を各点に付与し、スペクトルのデジタルモデルと統計的に比較することにより、状態を各分類に割り当てることによって、前記スペクトル画像のデジタル処理作業を行い、各状態の複数の点によって占められる相対表面積を定量化し、その結果を記録することを含む方法。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
線維化を検出及び定量化する方法であって、前記方法において、少なくとも、
固定済の非染色組織試料が、支持体上に配置され、
前記試料の各点を走査することにより、赤外線取得が行われ、
各取得点により生成された赤外スペクトルが、少なくとも１つのスペクトル画像に変換され、
スペクトルの類似性に従ってスペクトルを分類するアルゴリズムにより定義されるスペクトル分類を各点に付与することによって、少なくとも生理的コラーゲンと線維化による病的コラーゲンとを区別することにより、前記スペクトル画像のデジタル処理が行われ、
スペクトルの数値モデルと統計的に比較することにより、状態が各分類に割り当てられ、
各状態にある複数の点によって占められる相対表面積が定量化され、その結果が記録される方法。
【請求項２】
前記赤外線取得が、フーリエ変換赤外分光法により行われることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記処理は、支持体及び検出器からのバックグラウンドノイズをスペクトルから除去し、パラフィンの干渉を消す、事前の前処理工程を含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記分類は４種類であり、各分類の状態が、正常、線維化、非線維性コラーゲン、炎症と指定されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記区別することが、各点のスペクトルの値を、前記モデルのスペクトルの値の範囲と比較することにより行われることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
同一分類の複数の点が、前記試料の全表面積の表面百分率として統計的に定量化されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記結果が、別の試料を用いて前記方法を繰り返す前に、前記モデルと結び付けられることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
線維化を検出及び定量化する装置であって、少なくとも 
組織試料の支持体の受容手段と、 
前記受容手段と向かい合って配置された、フーリエ変換赤外分光法を用いる取得手段であって、各取得点により生成された赤外スペクトルを少なくとも１つのスペクトル画像に変換する取得手段と、
デジタル処理手段が備えているスペクトルの数値モデルと統計的に比較して、各点にスペクトル分類を付与することによって、少なくとも生理的コラーゲンと病的コラーゲンとを区別することによる、前記スペクトル画像のデジタル処理手段であって、同様のスペクトル分類を有する複数の点を定量化するデジタル処理手段と
前記デジタル処理手段の結果をデジタル的に記録する手段と
を備える装置。
【請求項９】
前記受容手段は電動式であり、前記装置は、前記赤外線取得手段によって前記支持体の相対走査を行うように、前記受容手段の移動を制御する手段を備えることを特徴とする、請求項８に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、組織の線維化を診断し、経時的変化を追跡調査するための医療分野に属する。
この目的のために、本発明は特に、組織の線維化を検出及び定量化するシステムに関する。
【０００２】
組織の線維化とは、結合組織内における細胞外マトリクスの蓄積を指す。線維化は、当該組織の炎症又は病変の後に生じる。後者の場合、当該組織が自然に正しく再生されることはない。
【０００３】
線維化とは、結合組織内の細胞により合成されるコラーゲンを蓄積するプロセスである。コラーゲンは、特に組織に対してその伸張時に機械的抵抗を付与するための、体内に生理的に存在するタンパク質ファミリーである。しかしながら、臓器実質内において、コラーゲンの過剰な蓄積、ひいてはその結果生じる結合組織の線維化は、段階的な、多くの場合避けがたい臓器の機能の喪失を引き起こす。
【０００４】
したがって、臓器の機能を変化させて様々な病状を生じさせる数種の線維化が存在する。
肺繊維化とは、肺の結合組織が変性し、肺胞がコラーゲン線維によって取り囲まれて厚く覆われることを言う。
【０００５】
肝臓繊維化とは、肝細胞が破壊された部分に生じる線維状の結合組織のことを言う。肝線維化が進展すると、肝硬変に至る場合がある。
また、腎実質内における細胞外マトリクスの過剰な蓄積に相当するものを腎線維化と言う。
【０００６】
換言すれば、臓器の線維化度とその機能との間には密接な相関関係がある。一般に、結合組織内におけるコラーゲンの蓄積が過剰になればなるほど、臓器の機能の喪失が大きくなる。
【０００７】
したがって、生命予後又は機能予後を定義し、現在存在する線維化について経時的変化を追跡するために、組織の線維化を具体的に定量化する必要がある。
公知の方法では、染色スライド上で組織の線維化の定量化が行われる。解剖病理学者は、生検組織における試料線維化部分により占められる相対的な表面積に応じて、スコアを確定する。
【０００８】
「生体組織検査」とは、診断を行うために、臓器又は組織のごく小さい部分を試料採取することを意味する。染色スライド上におけるこの解析手法は、人の目によって行われるため主観的であるという欠点を有する。したがって、この線維化の定量化は、利用者自身及び利用者間における再現性が低いことを意味し、よって、この定量化は非常に代表的なものとは言えず、信頼性に欠ける。
【０００９】
染色スライド上での主観的定量化のこうした制約を解消するために、半自動化された比色定量を行うことも知られている。この手法は、マッソン・トリクローム染色されたスライド上に存在する色の自動セグメンテーションに基づく、半自動化コンピュータ解析で構成される。この手法は、生検組織試料を固定して脱水した後、パラフィン包埋を行うことから成る。４〜１０マイクロメートル（μｍ）のパラフィン切片が、特にフーリエ変換赤外分光法（「ＦＴＩＲＳ」）に適合するスライドタイプの支持体上に広げられた後、マッソン・トリクローム染色を用いて染色される。マッソン・トリクローム染色は、コラーゲン線維を緑色に染色する。
【００１０】
マッソン・トリクローム染色の後、スライドが走査され、作業者は、得られた画像から緑色に見える不明瞭領域、すなわちコラーゲンが生理的に存在する領域を選択する。そして、選択後の画像は、色のセグメンテーションに基づくアルゴリズムに基づいてコンピュータ処理され、赤色、緑色、及び青色の３つのチャネルを特定し、緑色は、過剰なコラーゲンを有する結合組織、ひいては線維化に対応する。
【００１１】
しかしながら、この半自動化された比色定量には、不明瞭領域を取り出すための手作業の工程を必要とし、主観性の部分と追加の処理時間を生じさせるという欠点がある。
さらに、現在まで、この手法は腎組織においてのみ有効とされている。また、この手法は、体系的に、腎線維化を過大評価する。実際、腎管の基底膜はコラーゲンから成るため、緑色に染まり、線維化とみなされる。管が接続されており、間質性線維化が極小であるため、この欠点はとりわけ重大である。したがって、線維化が生じていない生検組織試料において、１５％から２０％の線維化が定量され、その定量が過大評価であることを表す。
【００１２】
半自動化された比色定量は、あらゆるコラーゲンを緑色の色素で染色することに基づくため、同一組織内の異なるタイプのコラーゲンを区別することができない。したがって、半自動化された比色定量は、腎組織線維化については再現可能であるが、代表性に欠ける。
【００１３】
同等の手法は、ラマン分光法を用いる。特に肝臓における線維化を定量化するために、組織内に存在するＩ型コラーゲンの半自動化された定量化を実現することを可能にする第ニ次高調波発生（ＳＨＧ）法も知られている。ＳＨＧ法は、２光子顕微鏡による励起後に、Ｉ型コラーゲンが特有の光を発することに基づいている。生検組織試料を固定し、脱水してパラフィン包埋した後、４〜６μｍの切片が作成され、染色することなく、ＦＴＩＲに適合した支持体上に広げられる。スライド上に存在する生検組織試料は、幾つかの部分にセグメント化された後、システムにより連結される。励起後に、Ｉ型コラーゲンがＳＨＧ信号を発する。各切片について、ＳＨＧ信号が検出される。組織のＳＨＧ信号は、半自動化デジタル処理作業により定量化される。作業者は、各画像又は画像群について、ＳＨＧ信号のノイズ閾値及び陽性閾値を定義する必要がある。このように、定量化アルゴリズムは各画像を処理する。アルゴリズムは、結果として、作業者により定義された閾値に基づき、各生検組織試料について、Ｉ型コラーゲンに特有のＳＨＧ信号により占められる相対表面積を算出する。その結果、この手法は、ＳＨＧ信号の陽性閾値を主観的に決定する必要がある使用者の介入という欠点を有する。
【００１４】
さらに、ＳＨＧイメージングは、専ら肝臓及び肺の線維化について説明されてきた。
さらに、ＳＨＧ法は、正常な結合組織と生理学的に似ているＩ型コラーゲンを含む、組織学的構造の線維化を識別しないという別の欠点を有する。したがって、このＳＨＧ法は、組織内に存在するＩ型コラーゲンの全てを検出することを可能にする。
【００１５】
本発明の目的は、作業者が介入せずに実施する自動的に再現可能かつ客観的な方法で組織の線維化を定量化し、その経時的変化を追跡することが可能な、線維化を検出するシステムを提案することにより、前述の複数の方法の欠点を解消することである。このシステムは、コラーゲンの異なる組織学的構造、すなわち病的な組織の線維化に関係する結合組織と生理学的に存在する結合組織との区別を可能にする。
【００１６】
このようなシステムは、まず、線維化を検出及び定量化する方法を含み、前記方法において、少なくとも、
−固定済の非染色組織試料が支持体上に配置され、
−前記試料の各点を走査することにより、赤外線取得が行われ、
−各取得点により生成される赤外スペクトルが、少なくとも１つのスペクトル画像に変換され、
−スペクトルの類似性に従ってスペクトルを分類するアルゴリズムによって定義されたスペクトル分類を各点に付与して、少なくとも生理的コラーゲンと線維化による病的コラーゲンとを区別することによる、スペクトル画像に対するデジタル処理作業が行われ、
−スペクトルの数値モデルとの統計的な比較により、状態が各分類に割り当てられ、
−各状態にある複数の点により占められる相対表面積が定量化され、その結果が記録される。
【００１７】
その他の追加的であって非限定的な特徴によれば、
−前記赤外線取得は、フーリエ変換赤外分光法により行われる。
−前記処理は、支持体及び検出器からのバックグラウンドノイズをスペクトルから除去し、パラフィンの干渉を消すことを含む、予備的な前処理工程を含む。
【００１８】
−前記の分類は４種類であり、各分類の状態は、正常、線維化、非線維性コラーゲン、炎症と指定される。
−前記区別は、各点のスペクトルの値を前記モデルのスペクトルの値の範囲と比較することにより行われ、
−同一分類の複数の点は、前記試料の全表面積の表面百分率として統計的に定量化される。
【００１９】
−前記結果は、別の試料を用いて前記方法を繰り返す前に、前記モデルと結び付けられる。
さらに、前記システムは、本発明による方法の適用を可能にする、線維化を検出及び定量化する装置も備える。こうした装置は、少なくとも以下を備える：
−組織試料の支持体の受容手段と、
−前記受容手段と向かい合って配置された、フーリエ変換赤外分光法を用いる取得手段であって、各取得点により生成された赤外スペクトルをスペクトル画像に変換する取得手段と、
−デジタル処理手段が備えているスペクトルの数値モデルと統計的に比較して、スペクトル分類を各点に付与することによって、少なくとも生理的コラーゲンと病的コラーゲンとを区別することによる、前記スペクトル画像のデジタル処理手段であって、同様のスペクトル分類を有する点を定量化するデジタル処理手段と、
−前記デジタル処理手段の結果のデジタル記録手段。
【００２０】
その他の追加的であって非限定的な特徴によれば、
−前記受容手段は電動式であり、前記装置は、前記赤外線取得手段によって前記支持体の相対走査を行うように、前記受容手段の移動を制御する手段を備える。
【００２１】
本発明のその他の特徴及び利点は、試料の線維化を検出及び定量化する本システムの構成を概略的に示す添付の図面を参照して、本発明の非限定的な実施形態に伴う詳細な説明から、明らかになるであろう。
【００２２】
本発明は、試料内の線維化を検出及び定量化する、図１に示されるシステムに関する。
試料１は、組織試料である。まず、試料１が、できる限り生体内での状態に近い状態を維持するように固定される。試料の固定は、例えばホルマリン、ＡＦＡ、もしくはブアン液を用いた化学的固定であってもよく、又は、例えば凍結もしくは凍結乾燥による物理的固定であってもよい。固定された試料１は、次に脱水される。脱水は、当業者に公知の方法により、例えば自動装置を用いて、あるいは例えば徐々に濃度を上げてアルコール槽に浸漬し、キシレン及びトルエンなど中間剤の有機溶媒を用いることにより、行われる。
【００２３】
試料１は、硬質のブロックを得るために、パラフィン又は樹脂に包埋する。包埋は、過冷却パラフィンに試料を浸漬し、低温重合することを含む。試料の包埋後、公知のミクロトーム法を用いて、包埋試料の切片が作成される。このような試料切片は、様々な厚さ、具体的には数十マイクロメートル（μｍ）、特に１０〜２０μｍの厚さを有していてもよい。
【００２４】
試料１を含むこの切片は、支持体２上に配置され、支持体２は、好ましくは電磁スペクトルの通常の赤外線放射に対して透過性のスライドである。試料１を含む切片は、支持体２上に広げられる。それ以外の準備は不要である。したがって、試料１は染色されていない。
【００２５】
この準備作業を除いて、前記システムは、試料１上における組織の線維化の検出を自動化し、人が介入することなく、試料１の他の組織と比較した組織の線維化の定量化を行い、それによって高い再現性と客観的な結果の提供を可能にする。
【００２６】
これを実現するために、本発明によるシステムは、試料１の赤外線取得、及び赤外線取得で得たスペクトル情報の特定のコンピュータ処理を含む。
赤外線取得については、試料１の各点を走査することにより行われる。
【００２７】
これを行うために、支持体２が電動式プレートなどの受容手段３に配置される。受容手段３は、取得作業中に支持体２を定位置に保つことを可能にする。
この取得は、受容手段３と向かい合って配置された、赤外分光法による取得手段４を用いて実現される。
【００２８】
好ましくは、本発明はフーリエ変換赤外分光法を含む。フーリエ変換赤外分光法では、試料１による平均赤外線吸収を検出するために、多色励起を赤外マイクロ分光計と結び付ける。補助的に、測定ノイズを抑えるために、検出器の連続的な冷却を検討してもよい。
【００２９】
なお、支持体２は、赤外分光法、具体的にはフーリエ変換を伴う赤外分光法に適合している。換言すれば、支持体２は、寄生赤外線信号のない材料で構成され、この材料は、例えば透過的な取得のためのフッ化カルシウム又はセレン化亜鉛である。銀蒸着により金属化されたスライドガラスが、反射を用いた取得のために用いられてもよい。
【００３０】
取得は、試料１の各点を走査することにより行われる。このような走査は、受容手段３に対して取得手段４が相対移動することにより生じてもよい。好ましくは、取得手段４が固定される一方で、受容手段３は移動可能に設けられる手段である。換言すれば、これは赤外線取得手段４による支持体２の相対的走査である。これを行うために、本発明は、受容手段３の移動を制御するための手段５を組み込んでいる。
【００３１】
さらに、制御手段５は、手段４の取得パラメータを自動的に処理することができる。
したがって、制御手段５は、試料１全体を取得するための工程を、自動化及び自己完結化することができる。
【００３２】
取得工程において、各点が赤外スペクトルを生成する。そして、各取得点により生成された赤外スペクトルは、少なくとも１つのスペクトル画像６に変換される。
取得手段４は、各取得点により生成された赤外スペクトルをスペクトル画像６に変換する手段である。
【００３３】
したがって、スペクトル画像は、全ての取得点のデジタル表示である。取得点は、２次元空間における座標により特定される。各点は、画像６の１ピクセルを形成する。
線維化を定量化するために、スペクトル画像６について数値処理作業が行われる。この処理は、好適な処理手段８により行われる。処理作業は、スペクトル７の数値モデルと比較して、各点にスペクトル分類を付与することによって、少なくとも生理的コラーゲンと病的コラーゲンとを区別することで構成される。
【００３４】
このようなモデルは、腎臓病理学における解剖病理学の専門家によって各分類の付与が行われた、様々な程度の線維化を有する腎生検組織の大きな、いわゆる「トレーニング」パネルを得た後に、このパネルが生検組織の第２のパネルについて内部検証されることで構成される。モデルの結果の確認が行われた後、このモデルのロバスト性を高めるために、盲検生検により得られた分析済組織の第３のパネルについて外部検証が行われる。
【００３５】
このようにして、試料の各点の測定されたスペクトル値から、線維化が生じている組織をその他の組織から区別することができる。
具体的には、前記の分類は少なくとも２つであればよいが、以下の４つであることが好ましい。すなわち、生理的コラーゲン、線維化から生じるコラーゲン、炎症、及び（非コラーゲン、非線維性及び非炎症性の）「正常な」実質及びである。その他の分類を任意選択的に追加してもよい。
【００３６】
まず、処理は、支持体２及び検出器からのバックグラウンドノイズをスペクトルから除去し、パラフィンのスペクトル干渉を消す、スペクトルの自動前処理工程を含む。したがって、この前処理は、信号対ノイズ比が不十分なスペクトルを除去することにより、画像６の品質を向上させることを含む。この前処理は、専用のアルゴリズムを用いて自動的に行われる。
【００３７】
次に、同様のスペクトル分類を有する複数の点が統計的に定量化され、結果１０が記録される。処理手段８は、分類毎にこれら統計的に多変数の（ｍｕｌｔｉｖａｒｉeｓ）群を自動的に確保する手段である。そして、デジタル記録手段９は、処理手段８から生じる結果１０を確実に保存する。
【００３８】
「同様」とは、同一の分類又はその他の同等の分類を付与された点のことを言う。同等の分類の場合、幾つかの分類が、より大きい単一で広範囲の同一分類にまとめられてもよい。
【００３９】
具体的には、同一分類の複数の点は、試料１の全表面積の表面百分率１１として統計的に定量化される。換言すれば、試料１の全表面積に対応する点の総数に対する各分類の点の数の百分率比が算出される。
【００４０】
ゆえに、他の健康な組織に対する病的線維化が生じている組織の割合を自動的に得ることができる。したがって、線維化の進行を示す値として直接入手可能な結果を専門的な作業者に解釈させることは、もはや必要がない。
【００４１】
補助的に、本発明は、データベース内の全ての結果を結び付けることにより、自動処理から得られる結果１０の関連性を向上させる。したがって、得られた結果は、他の試料の過去の分析時に先に確立された結果と結び付けられる。これを行うために、別の試料を用いて前記の方法を繰り返す前に、結果１０がモデル７と結び付けられる。このモデルの展開可能性は、所与の分類において画素を含めるか除去することによってモデルのロバスト性を更に向上させるために、具体的にはスペクトル分類を精緻化することを可能にする。
【００４２】
前述のように、本発明の目的は、線維化を検出及び定量化する方法であって、前記方法においては、少なくとも、
−固定済の非染色組織試料１が支持体２上に配置され、
−試料１の各点を走査することにより、赤外線取得が行われ、
−各取得点により生成された赤外スペクトルが、少なくとも１つのスペクトル画像６に変換され、
−スペクトルの数値モデルと統計的に比較して、各点にスペクトル分類を付与することによって、少なくとも生理的コラーゲンと線維化による病的コラーゲンとを区別することにより、スペクトル画像６のデジタル処理作業が行われ、
−同様のスペクトル分類を有する複数の点が定量化され、その結果が記録される。
【００４３】
本発明はまた、線維化を検出及び定量化する装置に関し、前記装置は、少なくとも、
−組織試料１の支持体２の受容手段３と、
−受容手段３と向かい合って配置された、フーリエ変換赤外分光法を用いる取得手段４であって、各取得点により生成された赤外スペクトルを少なくとも１つのスペクトル画像６に変換する取得手段４と、
−数値処理手段が備えているスペクトルの数値モデルと統計的に比較して、各点にスペクトル分類を付与することによって、少なくとも生理的コラーゲンと病的コラーゲンとを区別することによる、スペクトル画像６の数値処理手段であって、同様のスペクトル分類を有する複数の点を定量化する数値処理手段と、
−数値処理手段の結果をデジタル的に記録する手段と、を備える。
【００４４】
補助的に、すべての要素、態様、及びデジタル式演算手段、具体的にはアルゴリズム及び数値モデルは、専用のデジタル式コンピュータ端末、特にネットワーク及び好適な通信手段を用いて互いに接続された専用のデジタル式コンピュータ端末により実行される。
【図１】
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【国際調査報告】
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2017523423.tif 000005
2017523423.tif 000006
2017523423.tif 000007
2017523423.tif 000008
2017523423.tif 000009