(57)【要約】  バイオマーカーパネルを使用して、糖尿病における腎機能の急速な低下を予測する方法。方法は、個々の患者の腎機能の低下リスクの予測に有用であり、また、臨床試験の患者の選択にも有用である。
2017516113.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の腎機能低下リスクの決定方法であって、（ａ）前記患者から得られた１つ以上のサンプルについて、複数のバイオマーカーのそれぞれのレベルを解析する工程、（ｂ）前記複数のバイオマーカーの各測定レベルを各複数の対照レベルと比較する工程、および（ｃ）前記比較から前記患者の腎機能低下リスクを決定する工程を含み、前記複数のバイオマーカーが、（ｉ）アドレノメデュリン、（ｉｉ）アルファ−１アンチトリプシン、（ｉｉｉ）ベータ−２−ミクログロブリンまたはシスタチン−Ｃ、（ｉｖ）ｃ１６−アシルカルニチン、（ｖ）クレアチン、（ｖｉ）クレアチニン、（ｖｉｉ）心臓型脂肪酸結合タンパク質、（ｖｉｉｉ）線維芽細胞増殖因子２１、（ｉｘ）ヒドロキシプロリン、（ｘ）腎障害分子−１、（ｘｉ）脳性ナトリウム利尿ペプチドのＮ−末端プロホルモン、（ｘｉｉ）シンメトリックジメチルアルギニンとアシンメトリックジメチルアルギニンとの比、（ｘｉｉｉ）シンメトリックジメチルアルギニンおよび（ｘｉｖ）ウラシルからなる群のうちの少なくとも７つを含む方法。
【請求項２】
工程（ｃ）がまた、前記患者に関する複数の臨床共変量のそれぞれを考慮する工程を含み、前記臨床共変量が、（ａ）前記患者の年齢、（ｂ）前記患者の性別、（ｃ）前記患者の推算糸球体濾過量（ｅＧＲＦ）、（ｄ）前記患者の尿中のアルブミンレベル、（ｅ）前記患者から得られた１つ以上のサンプル中のＨｂＡ１ｃレベル、（ｆ）前記患者によるＡＣＥ阻害薬の一定の使用および（ｇ）前記患者によるアンジオテンシン受容体遮断薬の一定の使用からなる群のうちの少なくとも５つを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
患者を、腎機能に対する治療方法の有効性、または腎機能低下の進行に関する研究の対象患者として選択する方法であって、請求項１または請求項２の方法を実行する工程、および前記比較に応じて、前記患者を前記研究の対象患者として選択するか否かを決定する工程を含む方法。
【請求項４】
腎機能低下の維持、改善、阻止または遅延のため、治療介入によって治療を行う患者を選択する方法であって、請求項１または請求項２の方法を実行する工程、および前記比較に応じて、前記患者を前記研究の対象患者として選択するか否かを決定する工程を含む方法。
【請求項５】
患者に対する治療介入の有効性を監視する方法であって、（ａ）前記患者から得られる１つ以上のサンプルについて、複数のバイオマーカーのそれぞれのレベルを解析する工程、（ｂ）前記複数のバイオマーカーの各測定レベルを各複数の対照レベルと比較する工程、および（ｃ）前記比較から前記患者の腎機能低下のリスクを決定する工程、（ｄ）前記患者に前記治療介入を行い、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の工程を繰り返し、その後（ｅ）前記治療介入を前記患者に行う前記工程の前の前記測定レベルの比較から決定されたリスクを、前記治療介入工程後の前記測定レベルの比較から決定されたリスクと比較する工程、および（ｆ）前記決定されたリスクの前記比較に基づいて、前記治療介入の有効性を評価する工程を含み、前記複数のバイオマーカーが、（ｉ）アドレノメデュリン、（ｉｉ）アルファ−１アンチトリプシン、（ｉｉｉ）ベータ−２−ミクログロブリン、（ｉｖ）ｃ１６−アシルカルニチン、（ｖ）クレアチン、（ｖｉ）クレアチニン、（ＸＶ）シスタチン−Ｃ、（ｖｉｉ）心臓型脂肪酸結合タンパク質、（ｖｉｉｉ）線維芽細胞増殖因子２１、（ｉｘ）ヒドロキシプロリン、（ｘ）腎障害分子−１、（ｘｉ）脳性ナトリウム利尿ペプチドのＮ−末端プロホルモン、（ｘｉｉ）シンメトリックジメチルアルギニンとアシンメトリックジメチルアルギニンとの比、（ｘｉｉｉ）シンメトリックジメチルアルギニンおよび（ｘｉｖ）ウラシルからなる群のうちの少なくとも７つを含む方法。
【請求項６】
工程（ｃ）がまた、前記患者に関する複数の臨床共変量のそれぞれを考慮する工程を含み、前記臨床共変量が、（ａ）前記患者の年齢、（ｂ）前記患者の性別、（ｃ）前記患者の推算糸球体濾過量（ｅＧＲＦ）、（ｄ）前記患者の尿中のアルブミンレベル、（ｅ）前記患者から得られた１つ以上のサンプル中のＨｂＡ１ｃレベル、（ｆ）前記患者によるＡＣＥ阻害薬の一定の使用および（ｇ）前記患者によるアンジオテンシン受容体遮断薬の一定の使用からなる群のうちの少なくとも５つを含む請求項５に記載の方法。
【請求項７】
コンピューターの１つ以上のプロセッサーによって実行される、患者から得られる１つ以上のサンプルの解析によって得られる複数のバイオマーカーのレベルと、前記複数のバイオマーカーのレベルと前記患者の腎機能低下のリスクとの間の統計的関係に関するデータとを処理して、前記患者の腎機能低下のリスクを推定する方法であって、前記複数のバイオマーカーが、（ｉ）アドレノメデュリン、（ｉｉ）アルファ−１アンチトリプシン、（ｉｉｉ）ベータ−２−ミクログロブリン、（ｉｖ）ｃ１６−アシルカルニチン、（ｖ）クレアチン、（ｖｉ）クレアチニン、（ｖｉｉ）心臓型脂肪酸結合タンパク質、（ｖｉｉｉ）線維芽細胞増殖因子２１、（ｉｘ）ヒドロキシプロリン、（ｘ）腎障害分子−１、（ｘｉ）脳性ナトリウム利尿ペプチドのＮ−末端プロホルモン、（ｘｉｉ）シンメトリックジメチルアルギニンとアシンメトリックジメチルアルギニンとの比、（ｘｉｉｉ）シンメトリックジメチルアルギニンおよび（ｘｉｖ）ウラシルからなる群のうちの少なくとも７つを含む方法。
【請求項８】
前記同じ患者に関する複数の臨床共変量と、前記複数のバイオマーカーのレベルと前記複数の臨床共変量との間の統計的関係に関する前記データとを処理する工程をさらに含み、前記臨床共変量が、（ａ）前記患者の年齢、（ｂ）前記患者の性別、（ｃ）前記患者の推算糸球体濾過量（ｅＧＲＦ）、（ｄ）前記患者の尿中のアルブミンレベル、（ｅ）前記患者から得られた１つ以上のサンプル中のＨｂＡ１ｃレベル、（ｆ）前記患者によるＡＣＥ阻害薬の一定の使用および（ｇ）前記患者によるアンジオテンシン受容体遮断薬の一定の使用からなる群のうちの少なくとも５つを含む請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記複数のバイオメーカーは、（ｉ）アドレノメデュリン、（ｉｉ）アルファ−１アンチトリプシン、（ｉｉｉ）ベータ−２−ミクログロブリン、（ｉｖ）ｃ１６−アシルカルニチン、（ｖ）クレアチン、（ｖｉ）クレアチニン、（ｖｉｉ）心臓型脂肪酸結合タンパク質、（ｖｉｉｉ）線維芽細胞増殖因子２１、（ｉｘ）ヒドロキシプロリン、（ｘ）腎障害分子−１、（ｘｉ）脳性ナトリウム利尿ペプチドのＮ−末端プロホルモン、（ｘｉｉ）シンメトリックジメチルアルギニンとアシンメトリックジメチルアルギニンとの比、（ｘｉｉｉ）シンメトリックジメチルアルギニンおよび（ｘｉｖ）ウラシルからなる群のうちの少なくとも１２を含む請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記複数のバイオメーカーは、（ｉ）アドレノメデュリン、（ｉｉ）アルファ−１アンチトリプシン、（ｉｉｉ）ベータ−２−ミクログロブリン、（ｉｖ）ｃ１６−アシルカルニチン、（ｖ）クレアチン、（ｖｉ）クレアチニン、（ｖｉｉ）心臓型脂肪酸結合タンパク質、（ｖｉｉｉ）線維芽細胞増殖因子２１、（ｉｘ）ヒドロキシプロリン、（ｘ）腎障害分子−１、（ｘｉ）脳性ナトリウム利尿ペプチドのＮ−末端プロホルモン、（ｘｉｉ）シンメトリックジメチルアルギニンとアシンメトリックジメチルアルギニンとの比、（ｘｉｉｉ）シンメトリックジメチルアルギニンおよび（ｘｉｖ）ウラシルからなる群を含むか、またはその群から構成される請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記複数のバイオメーカーは、（ｘｖ）シスタチン−Ｃをさらに含む請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記複数のバイオメーカーは、（ｖｉ）クレアチニンを含むが、（ｃ）糸球体濾過量の前記推定もまた、前記患者から得られたサンプル中のクレアチニンの測定値に基づく請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記複数のバイオメーカーは、アドレノメデュリンを含まず、かつ／またはベータ−２−ミクログロブリンを含まない請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記複数のバイオメーカーは、（ｖｉｉｉ）線維芽細胞増殖因子２１を含む請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記複数のバイオメーカーは、（ｉｖ）ｃ１６−アシルカルニチンを含む請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記複数のバイオメーカーは、（ｉｘ）ヒドロキシプロリンを含む請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記複数のバイオメーカーは、（ｖｉｉ）心臓型脂肪酸結合タンパク質を含む請求項１〜１６いずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記複数のバイオメーカーは、（ｖ）クレアチンを含む請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記複数のバイオメーカーは、（ｘ）腎障害分子−１、（ｘｉｉ）シンメトリックジメチルアルギニンとアシンメトリックジメチルアルギニンとの比、（ｉｉｉ）ベータ２−ミクログロブリン、（ｉｉ）アルファ−１アンチトリプシン、（ｉｖ）Ｃ−１６アシルカルニチン、（ｖｉｉｉ）線維芽細胞増殖因子−２１（ＦＧＦ−２１）および（ｘｉｖ）ウラシルからなる群を含むか、またはその群から構成される請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
工程（ｃ）がまた、前記患者に関する複数の臨床共変量のそれぞれを考慮する工程を含み、前記臨床共変量が、（ａ）前記患者の年齢、（ｂ）前記患者の性別、（ｃ）前記患者の推算糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）、（ｄ）前記患者の尿中のアルブミンレベル、（ｅ）前記患者から得られた１つ以上のサンプル中のＨｂＡ１ｃレベル、（ｆ）前記患者によるＡＣＥ阻害薬の一定の使用、（ｇ）前記患者によるアンジオテンシン受容体遮断薬の一定の使用、（ｈ）前記患者の体格指数、（ｉ）前記患者の糖尿病の病状の期間、（ｊ）前記患者の収縮期血圧、および（ｋ）前記患者の拡張期血圧からなる群のうちの少なくとも８つ、少なくとも１０を含むか、あるいはその全てを含むか、またはその全てから構成される請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記複数のバイオメーカーは、（ｉｉ）アルファ−１アンチトリプシン、（ｉｖ）ｃ１６−アシルカルニチン、（ｖ）クレアチン、（ｖｉ）クレアチニン、（ｖｉｉ）心臓型脂肪酸結合タンパク質、（ｖｉｉｉ）線維芽細胞増殖因子２１、（ｉｘ）ヒドロキシプロリン、（ｘ）腎障害分子−１、（ｘｉ）脳性ナトリウム利尿ペプチドのＮ−末端プロホルモン、（ｘｉｉ）シンメトリックジメチルアルギニンとアシンメトリックジメチルアルギニンとの比、（ｘｉｉｉ）シンメトリックジメチルアルギニン、（ｘｉｖ）ウラシル、（ｘｖ）シスタチン−Ｃ、（ｘｖｉ）アポリポタンパク質Ｄまたはｅセレクチン、（ｘｖｉｉ）線維芽細胞増殖因子２３、（ｘｖｉｉｉ）グルタミン酸、（ｘｉｘ）ハプトグロビンベータ鎖、（ｘｘ）トロポニン、（ｘｘｉ）ヒポキサンチン、（ｘｘｉｉｉ）インターロイキン−２受容体アルファ、（ｘｘｉｖ）形質転換成長因子ベータ１の潜在関連ペプチド、（ｘｘｖ）ロイシン−リッチアルファ−２−グリコプロテイン、（ｘｘｖｉ）リシン、（ｘｘｖｉｉ）ガンマインターフェロンで誘導されたモノカイン、（ｘｘｖｉｉｉ）メチルマロン酸、（ｘｘｉｘ）Ｎ−アセチルアスパラギン酸、（ｘｘｘ）好中球ゲラチナーゼ結合性リポカリン、（ｘｘｘｉ）オステオポンチン、（ｘｘｘｉｉ）タム・ホルスフォール尿グリコプロテイン、（ｘｘｘｉｉｉ）チミン、（ｘｘｘｉｖ）組織メタロプロテアーゼ１阻害物質、（ｘｘｘｖｉ）トリプトファン、（ｘｘｘｖｉｉ）腫瘍壊死因子受容体１、（ｘｘｘｖｉｉｉ）フォン・ヴィレブランド因子からなる群のうちの少なくとも２０を含む請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記複数のバイオメーカーは、（ｉｉ）アルファ−１アンチトリプシン、（ｉｖ）ｃ１６−アシルカルニチン、（ｖ）クレアチン、（ｖｉ）クレアチニン、（ｖｉｉ）心臓型脂肪酸結合タンパク質、（ｖｉｉｉ）線維芽細胞増殖因子２１、（ｉｘ）ヒドロキシプロリン、（ｘ）腎障害分子−１、（ｘｉ）脳性ナトリウム利尿ペプチドのＮ−末端プロホルモン、（ｘｉｉ）シンメトリックジメチルアルギニンとアシンメトリックジメチルアルギニンとの比、（ｘｉｉｉ）シンメトリックジメチルアルギニン、（ｘｉｖ）ウラシル、（ｘｖ）シスタチン−Ｃ、（ｘｖｉ）アポリポタンパク質Ｄまたはｅ−セレクチン、（ｘｖｉｉ）線維芽細胞増殖因子２３、（ｘｖｉｉｉ）グルタミン酸、（ｘｉｘ）ハプトグロビンベータ鎖、（ｘｘ）トロポニン、（ｘｘｉ）ヒポキサンチン、（ｘｘｉｉｉ）インターロイキン−２受容体アルファ、（ｘｘｉｖ）形質転換成長因子ベータ１の潜在関連ペプチド、（ｘｘｖ）ロイシン−リッチアルファ−２−グリコプロテイン、（ｘｘｖｉ）リシン、（ｘｘｖｉｉ）ガンマインターフェロンで誘導されたモノカイン、（ｘｘｖｉｉｉ）メチルマロン酸またはモノメチルアルソン酸、（ｘｘｉｘ）Ｎ−アセチルアスパラギン酸、（ｘｘｘ）好中球ゲラチナーゼ結合性リポカリン、（ｘｘｘｉ）オステオポンチン、（ｘｘｘｉｉ）タム・ホルスフォール尿グリコプロテイン、（ｘｘｘｉｉｉ）チミン、（ｘｘｘｉｖ）組織メタロプロテアーゼ１阻害物質、（ｘｘｘｖｉ）トリプトファン、（ｘｘｘｖｉｉ）腫瘍壊死因子受容体１、（ｘｘｘｖｉｉｉ）フォン・ヴィレブランド因子からなる前記群の全てを含むか、またはその全てから構成される請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記シンメトリックジメチルアルギニンとアシンメトリックジメチルアルギニンとの比のレベルは、任意の適切な単位の前記シンメトリックジメチルアルギニンのレベル測定値と前記アシンメトリックジメチルアルギニンのレベル測定値との比として表される請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記複数のバイオメーカーは、（ｘｉｉｉ）シンメトリックジメチルアルギニンと、（ｘｉｉ）シンメトリックジメチルアルギニンとアシンメトリックジメチルアルギニンとの比を共に含み、シンメトリックジメチルアルギニンのレベルの上昇が、腎機能低下のリスクの低下を示し、かつシンメトリックジメチルアルギニンとアシンメトリックジメチルアルギニンとの比の上昇が、腎機能低下のリスクの上昇を示す請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記決定されたリスクは、リスクレベルを示す数値、リスクレベルの有限群の１つ、または２進値である請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
少なくとも１つのバイオマーカーのレベルが、前記バイオマーカーから生成された生成物を測定することによって測定される請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
患者の腎機能低下リスクの決定方法であって、（ａ）前記患者から得られた１つ以上のサンプルについて、線維芽細胞増殖因子２１を含む１つ以上のバイオマーカーのレベルを解析する工程、（ｂ）前記１つ以上のバイオマーカーの各測定レベルを各１つ以上の対照レベルと比較する工程、および（ｃ）前記比較から前記患者の腎機能低下リスクを決定する工程を含み、線維芽細胞増殖因子２１のレベルの上昇が、腎機能低下リスクの上昇と相関し得る方法。
【請求項２８】
患者の腎機能低下リスクの決定方法であって、（ａ）前記患者から得られた１つ以上のサンプルについて、ｃ１６−アシルカルニチンを含む１つ以上のバイオマーカーのレベルを解析する工程、（ｂ）前記１つ以上のバイオマーカーの各測定レベルを各１つ以上の対照レベルと比較する工程、および（ｃ）前記比較から前記患者の腎機能低下リスクを決定する工程を含み、ｃ１６−アシルカルニチンのレベルの上昇が、腎機能低下リスクの上昇と相関する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病に羅患している患者の腎機能の急速な低下の予測、および、そのような予測の、例えば、糖尿病に起因する腎機能低下の臨床試験の対象者の選択に対する利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
腎臓病は、糖尿病の重要な合併症であり、有意の罹患率および死亡率をもたらす。英国では、糖尿病による末期の腎臓病（ＥＳＲＤ）の有病率が、過去１０年で２倍を超え（Ｈｉｌｌ  ＣＪ，Ｆｏｇａｒｔｙ  ＤＧ．Ｃｈａｎｇｉｎｇ  ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｅｎｄ−ｓｔａｇｅ  ｒｅｎａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｄｕｅ  ｔｏ  ｄｉａｅｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ．Ｊ  Ｒｅｎ  Ｃａｒｅ．２０１２；３８  Ｓｕｐｐｌ  １：１２−２２）、そして、いくつかの研究で、今日、糖尿病によるインシデントＥＳＲＤの増加速度が遅く、または減りつつさえある証拠がある一方、医療サービスにかかる費用とともに、依然として糖尿病患者の主要な健康問題となっている（Ｃｏｕｃｈｏｕｄ  Ｃ，Ｖｉｌｌａｒ  Ｅ．Ｅｎｄ−ｓｔａｇｅ  ｒｅｎａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｅｐｉｄｅｍｉｃ  ｉｎ  ｄｉａｂｅｔｉｃｓ：ｉｓ  ｔｈｅｒｅ  ｌｉｇｈｔ  ａｔ  ｔｈｅ  ｅｎｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｕｎｎｅｌ？  Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｄｉａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２０１３；２８（５）：１０７３−６）。
【０００３】
アルブミン尿は、糖尿病性腎症進行のカギとなる測定であるが、腎機能喪失が常にタンパク尿を伴うとは限らず、ＵＫ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｓｔｕｄｙ（ＵＫＰＤＳ）では、慢性腎臓病ステージ３（Ｋｅｙ  Ｆａｃｔｓ  ａｎｄ  Ｆｉｇｕｒｅｓ．２０１０；ｗｗｗ．ｋｉｄｎｅｙｃａｒｅ．ｎｈｓ．ｕｋ／ｄｏｃｕｍｅｎｔ．ｐｈｐ？ｏ＝４７６から入手可能）（ＣＫＤ３）もしくはそれより悪いステージにある人々の５１％に、アルブミン尿の病歴がなかった（Ｒｅｔｎａｋａｒａｎ  Ｒ，Ｃｕｌｌ  ＣＡ，Ｔｈｏｒｎｅ  ＫＩ，Ａｄｌｅｒ  ＡＩ，Ｈｏｌｍａｎ  ＲＲ．Ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｒｅｎａｌ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｙｐｅ  ２  ｄｉａｂｅｔｅｓ：Ｕ．Ｋ．Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｓｔｕｄｙ  ７４．Ｄｉａｂｅｔｅｓ．２００６；５５（６）：１８３２−９）。したがって、我々は、アルブミン尿の進行よりむしろ推算糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）により評価される腎機能の低下それ自身に焦点を合わせた。
【０００４】
腎機能進行のリスクの高い患者を特定することは、臨床的に重要であるが、腎疾患の進行を遅らせることを目指す治療のための臨床試験を実施する製薬会社にとってもそれは重要である。これらの臨床試験は、腎臓の機能不全が急速に進行する患者の数によって強化されるが、現在、これは容易には推測されないため、臨床試験は、多数の人々を集め、彼らを何年間も追跡する必要がある。それらはいずれもこれらの臨床試験の費用に加算される。糖尿病における慢性腎臓病（ＣＫＤ）の進行（所与のｅＧＦＲの終点またはＥＳＲＤのいずれかへ）を妨げる薬剤の臨床試験の重要な課題は、たとえｅＧＦＲが低くとも、多くの人は相当長い期間安定しているが、他のいくらかの人は、ＥＳＲＤに進行するか、または極めて急速にｅＧＦＲが低下するであろうことである。したがって、重要な目標は、球速に進行する人々の一部を特定することができることである。本発明は、バイオマーカーのレベルと臨床共変量を考慮することによって、これに取り組み、そして、我々は、糖尿病に罹患している人々における腎臓機能不全のリスクの予測を改善するために使用することができるバイオマーカーのパネルを特定した。
【０００５】
ｅＧＦＲおよびアルブミン排泄量の測定は、臨床診療において、糖尿病性腎症状態を評価するために日常的に行われているものであるが、急速な進行リスクが非常に高い人々を示す新しいバイオマーカーにより、治療を改善することができた。さらに、腎臓の機能不全の進行リスクが高い患者を特定することもまた、腎疾患の進行を遅らせることを目指す治療のための臨床試験を実施する製薬会社にとって必須である。これらの臨床試験は、腎臓の機能不全が急速に進行する患者の数によって強化されるが、現在、これは容易には予測されないため、臨床試験は、多数の人々を集め、彼らを何年間も追跡する必要がある。それらはいずれもこれらの臨床試験の費用に加えられる。したがって、比較的短期間（３〜４年）で、進行リスクの高い患者を予測するより良好な方法は、そのような臨床試験に必要な費用を大きく削減するであろう。そして本発明のいくつかの態様は、進行が急速な人々の集団を、彼らが臨床試験の参加者として選択されるように特定することを目的としている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の第１の態様においては、（ヒト）患者の腎機能低下リスクを決定する方法であって、（ａ）患者から得られた１つ以上のサンプルについて、複数のバイオマーカーのそれぞれのレベルを解析する工程、（ｂ）複数のバイオマーカーの各測定レベルを各複数の対照レベルと比較する工程、および（ｃ）その比較から患者の腎機能低下リスクを決定する工程を含み、前記複数のバイオマーカーが、（ｉ）アドレノメデュリン、（ｉｉ）アルファ−１アンチトリプシン、（ｉｉｉ）ベータ−２−ミクログロブリン、（ｉｖ）ｃ１６−アシルカルニチン、（ｖ）クレアチン、（ｖｉ）クレアチニン、（ｖｉｉ）心臓型脂肪酸結合タンパク質、（ｖｉｉｉ）線維芽細胞増殖因子２１、（ｉｘ）ヒドロキシプロリン、（ｘ）腎障害分子−１、（ｘｉ）脳性ナトリウム利尿ペプチドのＮ−末端プロホルモン、（ｘｉｉ）シンメトリックジメチルアルギニンとアシンメトリックジメチルアルギニンとの比、（ｘｉｉｉ）シンメトリックジメチルアルギニンおよび（ｘｉｖ）ウラシルからなる群のうちの少なくとも７つを含む方法が提供される。
【０００７】
工程（ｃ）はまた、患者に関する複数の臨床共変量のそれぞれを考慮する工程を含み、その臨床共変量が、（ａ）患者の年齢、（ｂ）患者の性別、（ｃ）患者の推算糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）、（ｄ）患者の尿中のアルブミンレベル、（ｅ）患者から得られた１つ以上のサンプル中のＨｂＡ１ｃレベル、（ｆ）患者によるＡＣＥ阻害薬の一定の使用および（ｇ）患者によるアンジオテンシン受容体遮断薬の一定の使用からなる群のうちの少なくとも５つを含み得る。
【０００８】
本発明の第２の態様においては、（ヒト）患者を、腎機能に対する治療方法の有効性、または腎機能低下の進行に関する研究の対象患者として選択する方法であって、（ａ）患者から得られる１つ以上のサンプルについて、複数のバイオマーカーのそれぞれのレベルを解析する工程、（ｂ）複数のバイオマーカーの各測定レベルを各複数の対照レベルと比較する工程、および（ｃ）比較に基づいて、研究の対象患者としてその患者を選択するか否かを決定する工程を含み、前記複数のバイオマーカーが、（ｉ）アドレノメデュリン、（ｉｉ）アルファ−１アンチトリプシン、（ｉｉｉ）ベータ−２−ミクログロブリン、（ｉｖ）ｃ１６−アシルカルニチン、（ｖ）クレアチン、（ｖｉ）クレアチニン、（ｖｉｉ）心臓型脂肪酸結合タンパク質、（ｖｉｉｉ）線維芽細胞増殖因子２１、（ｉｘ）ヒドロキシプロリン、（ｘ）腎障害分子−１、（ｘｉ）脳性ナトリウム利尿ペプチドのＮ−末端プロホルモン、（ｘｉｉ）シンメトリックジメチルアルギニンとアシンメトリックジメチルアルギニンとの比、（ｘｉｉｉ）シンメトリックジメチルアルギニンおよび（ｘｉｖ）ウラシルからなる群のうちの少なくとも７つを含む方法が提供される。
【０００９】
工程（ｃ）はまた、患者に関する複数の臨床共変量のそれぞれを考慮する工程を含み、臨床共変量が、（ａ）患者の年齢、（ｂ）患者の性別、（ｃ）患者の推算糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）、（ｄ）患者の尿中のアルブミンレベル、（ｅ）患者から得られた１つ以上のサンプル中のＨｂＡ１ｃレベル、（ｆ）患者によるＡＣＥ阻害薬の一定の使用および（ｇ）患者によるアンジオテンシン受容体遮断薬の一定の使用からなる群のうちの少なくとも５つを含み得る。
【００１０】
通常、前記比較から、閾値を超える腎機能低下リスクを有すると判定された患者が、対象患者として選択される。大人数の対象患者を得るためには、より低い閾値が使用され、リスクが最大の少人数の対象患者を得るためには、高い閾値が使用されよう。閾値のレベルは、例えば、一群の患者の上位２５％、上位１０％または上位５％に入る人々を得るなど、対象患者の所望のリスクレベルに応じて設定され得る。対象患者は、特定の治療介入を受ける患者として選択され得る。しかしながら、しかしながら、患者は、対照群の一部とするために選択され得る。
【００１１】
本発明の第３の態様においては、腎機能低下の維持、改善、阻止または遅延のため、治療介入によって治療を行う（ヒト）患者を選択する方法であって、（ａ）患者から得られる１つ以上のサンプルについて、複数のバイオマーカーのそれぞれのレベルを解析する工程、（ｂ）複数のバイオマーカーの各測定レベルを各複数の対照レベルと比較する工程、および（ｃ）比較に基づいて、治療介入により患者を治療するか否かを決定する工程を含み、前記複数のバイオマーカーが、（ｉ）アドレノメデュリン、（ｉｉ）アルファ−１アンチトリプシン、（ｉｉｉ）ベータ−２−ミクログロブリン、（ｉｖ）ｃ１６−アシルカルニチン、（ｖ）クレアチン、（ｖｉ）クレアチニン、（ｖｉｉ）心臓型脂肪酸結合タンパク質、（ｖｉｉｉ）線維芽細胞増殖因子２１、（ｉｘ）ヒドロキシプロリン、（ｘ）腎障害分子−１、（ｘｉ）脳性ナトリウム利尿ペプチドのＮ−末端プロホルモン、（ｘｉｉ）シンメトリックジメチルアルギニンとアシンメトリックジメチルアルギニンとの比、（ｘｉｉｉ）シンメトリックジメチルアルギニンおよび（ｘｉｖ）ウラシルからなる群のうちの少なくとも７つを含む方法が提供される。工程（ｃ）はまた、患者に関する複数の臨床共変量のそれぞれを考慮する工程を含み、臨床共変量が、（ａ）患者の年齢、（ｂ）患者の性別、（ｃ）患者の推算糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）、（ｄ）患者の尿中のアルブミンレベル、（ｅ）患者から得られた１つ以上のサンプル中のＨｂＡ１ｃレベル、（ｆ）患者によるＡＣＥ阻害薬の一定の使用および（ｇ）患者によるアンジオテンシン受容体遮断薬の一定の使用からなる群のうちの少なくとも５つを含み得る。
【００１２】
治療介入は、治療実体、例えば化学的または生物学的治療実体の投与プログラムを含み得る。
【００１３】
本発明の第４の態様においては、（ヒト）患者に対する治療介入の有効性を監視する方法であって、（ａ）患者から得られる１つ以上のサンプルについて、複数のバイオマーカーのそれぞれのレベルを解析する工程、（ｂ）複数のバイオマーカーの各測定レベルを各複数の対照レベルと比較する工程、（ｃ）比較から患者の腎機能低下のリスクを決定する工程、（ｄ）患者に治療介入を行い、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の工程を繰り返し、その後（ｅ）治療介入を患者に行う工程の前の測定レベルの比較から決定されたリスクを、治療介入工程後の測定レべルの比較から決定されたリスクと比較する工程、および（ｆ）決定されたリスクの前記比較に基づいて、治療介入の有効性を評価する工程を含み、前記複数のバイオマーカーが、（ｉ）アドレノメデュリン、（ｉｉ）アルファ−１アンチトリプシン、（ｉｉｉ）ベータ−２−ミクログロブリン、（ｉｖ）ｃ１６−アシルカルニチン、（ｖ）クレアチン、（ｖｉ）クレアチニン、（ｘｖ）シスタチン−Ｃ、（ｖｉｉ）心臓型脂肪酸結合タンパク質、（ｖｉｉｉ）線維芽細胞増殖因子２１、（ｉｘ）ヒドロキシプロリン、（ｘ）腎障害分子−１、（ｘｉ）脳性ナトリウム利尿ペプチドのＮ−末端プロホルモン、（ｘｉｉ）シンメトリックジメチルアルギニンとアシンメトリックジメチルアルギニンとの比、（ｘｉｉｉ）シンメトリックジメチルアルギニンおよび（ｘｉｖ）ウラシルからなる群のうちの少なくとも７つを含む方法が提供される。工程（ｃ）はまた、患者に関する複数の臨床共変量のそれぞれを考慮する工程を含み、臨床共変量が、（ａ）患者の年齢、（ｂ）患者の性別、（ｃ）患者の推算糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）、（ｄ）患者の尿中のアルブミンレベル、（ｅ）患者から得られた１つ以上のサンプル中のＨｂＡ１ｃレベル、（ｆ）患者によるＡＣＥ阻害薬の一定の使用および（ｇ）患者によるアンジオテンシン受容体遮断薬の一定の使用からなる群のうちの少なくとも５つを含み得る。
【００１４】
治療介入は、例えば、血圧降下（例えば、降圧剤の投与、ＡＣＥ阻害薬の投与）、ＨｂＡ１ｃレベルを低下させるための介入、または腎臓病の進行を止めるための介入であり得る。
【００１５】
研究は臨床治験であり得る。臨床試験は、治療方法、例えば、化学的実体または生物学的実体などの治療実体の実施の臨床試験であり得る。
【００１６】
本発明の第５の態様においては、コンピューターの１つ以上のプロセッサーによって実行される、患者から得られる１つ以上のサンプルの解析によって得られる複数のバイオマーカーのレベルと、前記複数のバイオマーカーのレベルと患者の腎機能低下のリスクとの間の統計的関係に関するデータとを処理して、患者の腎機能低下のリスクを推定する方法であって、前記複数のバイオマーカーが、（ｉ）アドレノメデュリン、（ｉｉ）アルファ−１アンチトリプシン、（ｉｉｉ）ベータ−２−ミクログロブリン、（ｉｖ）ｃ１６−アシルカルニチン、（ｖ）クレアチン、（ｖｉ）クレアチニン、（ｖｉｉ）心臓型脂肪酸結合タンパク質、（ｖｉｉｉ）線維芽細胞増殖因子２１、（ｉｘ）ヒドロキシプロリン、（ｘ）腎障害分子−１、（ｘｉ）脳性ナトリウム利尿ペプチドのＮ−末端プロホルモン、（ｘｉｉ）シンメトリックジメチルアルギニンとアシンメトリックジメチルアルギニンとの比、（ｘｉｉｉ）シンメトリックジメチルアルギニンおよび（ｘｉｖ）ウラシルからなる群のうちの少なくとも７つを含む方法が提供される。
【００１７】
この方法はまた、同じ患者に関する複数の臨床共変量と、前記複数のバイオマーカーのレベルと前記複数の臨床共変量との間の統計的関係に関する前記データとを処理する工程をさらに含み得る。ここで、臨床共変量は、（ａ）患者の年齢、（ｂ）患者の性別、（ｃ）患者の推算糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）、（ｄ）患者の尿中のアルブミンレベル、（ｅ）患者から得られた１つ以上のサンプル中のＨｂＡ１ｃレベル、（ｆ）患者によるＡＣＥ阻害薬の一定の使用および（ｇ）患者によるアンジオテンシン受容体遮断薬の一定の使用からなる群のうちの少なくとも５つを含む。
【００１８】
統計的関係に関するデータは、通常、１つ以上のプロセッサーを備えた電子通信の有形のコンピューターの読み出し可能なデータ記憶媒体に保存される。データは、前記複数のバイオマーカーのそれぞれの対照レベルを含み得る。データは、前記複数のバイオマーカーのレベル、前記複数の臨床共変量、および患者の腎機能低下のリスクを、患者の腎機能低下のリスクに関連付けるアルゴリズムを特定するデータを含み得る。
【００１９】
本発明はまた、第６の態様において、コンピューターの１つ以上のプロセッサーで実行されるとき、本発明の第５の態様の方法を実行させるプログラムコード命令およびデータを記憶する有形のコンピューターの読み出し可能な記憶媒体に及ぶ。
【００２０】
前記有形のコンピューターの読み出し可能な記憶媒体は、通常、集積回路の形態のソリッドステートメモリーを１つ以上含み得る。
【００２１】
以下の特徴は、本発明の各態様の任意選択の特徴である。
前記複数のバイオメーカーは、（ｉ）アドレノメデュリン、（ｉｉ）アルファ−１アンチトリプシン、（ｉｉｉ）ベータ−２−ミクログロブリン、（ｉｖ）ｃ１６−アシルカルニチン、（ｖ）クレアチン、（ｖｉ）クレアチニン、（ｖｉｉ）心臓型脂肪酸結合タンパク質、（ｖｉｉｉ）線維芽細胞増殖因子２１、（ｉｘ）ヒドロキシプロリン、（ｘ）腎障害分子−１、（ｘｉ）脳性ナトリウム利尿ペプチドのＮ−末端プロホルモン、（ｘｉｉ）シンメトリックジメチルアルギニンとアシンメトリックジメチルアルギニンとの比、（ｘｉｉｉ）シンメトリックジメチルアルギニンおよび（ｘｉｖ）ウラシルからなる群のうちの少なくとも８つ、少なくとも１０、少なくとも１２または少なくとも１３を含むか、あるいはその全てを含むか、またはその全てから構成され得る。臨床共変量は、（ａ）患者の年齢、（ｂ）患者の性別、（ｃ）患者の推算糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）、（ｄ）患者の尿中のアルブミンレベル、（ｅ）患者から得られた１つ以上のサンプル中のＨｂＡ１ｃレベル、（ｆ）患者によるＡＣＥ阻害薬の一定の使用および（ｇ）患者によるアンジオテンシン受容体遮断薬の一定の使用からなる群のうちの少なくとも５つを含み得る。
【００２２】
前記複数のバイオメーカーは、（ｘ）腎障害分子−１、（ｘｉｉ）シンメトリックジメチルアルギニンとアシンメトリックジメチルアルギニンとの比、（ｉｉｉ）ベータ２−ミクログロブリン、（ｉｉ）アルファ−１アンチトリプシン、（ｉｖ）Ｃ−１６アシルカルニチン、（ｖｉｉｉ）線維芽細胞増殖因子−２１（ＦＧＦ−２１）および（ｘｉｖ）ウラシルからなる群を含むか、またはその群から構成され得る。複数の臨床共変量は、（ａ）患者の年齢、（ｂ）患者の性別、（ｃ）患者の推算糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）、（ｄ）患者の尿中のアルブミンレベル、（ｅ）患者から得られた１つ以上のサンプル中のＨｂＡ１ｃレベル、（ｆ）患者によるＡＣＥ阻害薬の一定の使用、（ｇ）患者によるアンジオテンシン受容体遮断薬の一定の使用、（ｈ）患者の体格指数、（ｉ）患者の糖尿病の病状の期間、（ｊ）患者の収縮期血圧、および（ｋ）患者の拡張期血圧からなる群のうちの少なくとも８つ、少なくとも１０を含むか、あるいはその全てを含むか、またはその全てから構成され得る。（ｃ）推算糸球体濾過量は、患者のベースラインの推算糸球体濾過量と、患者のある期間にわたる糸球体濾過量の平均（例えば、重量平均）の両方を含み得る。このように、広範な臨床共変量データが存在する場合、これらのバイオマーカーは予測を十分に改善し得る。
【００２３】
前記複数のバイオマーカーは、さらに、（ｘｖ）シスタチン−Ｃ（測定オッズ比６．３４、９５％ＣＩ  ３．８８，１０．９７）。複数のバイオマーカーは、シスタチン−Ｃおよびベータ−２ミクログロブリン（測定オッズ比６．１１、９５％ＣＩ  ３．９０，１０．０５）の１つのみを、これらのバイオマーカーのレベルに強固な相関性があるため（ｒｈｏ＝０．８６）、含み得る。
【００２４】
前記複数のバイオマーカーは、（ｖｉ）クレアチニン（測定オッズ比３．４３、９５％ＣＩ  １．９７，６．３６）を含むが、（ｃ）糸球体濾過量の推定値がまた、患者から得られるサンプルのクレアチニンの測定値に基づくことがあり得る。驚いたことに、我々は、この測定が重複ではなく、リスク予測の精度を高めることを見出した。
【００２５】
複数のバイオマーカーは、アドレノメデュリン（測定オッズ比２．９４、９５％ＣＩ  ２．１０，４．２２）を含まない場合があり得る。複数のバイオマーカーは、ベータ−２−ミクログロブリンを含まない場合があり得る。我々は、これらのバイオマーカーを含まない、腎機能の急速な低下のリスクを強く予測する３４のバイオマーカーのパネルを作り得ることを見出した。
【００２６】
ベータ−２−ミクログロブリンまたはシスタチン−Ｃが、これらのバイオマーカーのレベル間に大きい相関性があることから、使用可能である。
【００２７】
複数のバイオマーカーは、（ｖｉｉｉ）線維芽細胞増殖因子−２１（測定オッズ比２．０６、９５％ＣＩ  １．５６，２．８０）を含み得る。これは、腎機能低下のバイオマーカーとしてこれまで特定されていなかった。したがって、本発明は、（ヒト）患者の腎機能低下リスクを決定する方法であって、（ａ）患者から得られた１つ以上のサンプルについて、線維芽細胞増殖因子−２１を含む１つ以上のバイオマーカーのレベルを解析する工程、（ｂ）１つ以上のバイオマーカーの各測定レベルを各１つ以上の対照レベルと比較する工程、および（ｃ）その比較から患者の腎機能低下リスクを決定する工程を含む。線維芽細胞増殖因子−２１のレベルの上昇は、腎機能低下リスクの上昇と相関関係があり得る。（ａ）患者の年齢、（ｂ）患者の性別、（ｃ）患者の推算糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）、（ｄ）患者の尿中のアルブミンレベル、（ｅ）患者から得られた１つ以上のサンプル中のＨｂＡ１ｃレベル、（ｆ）患者によるＡＣＥ阻害薬の一定の使用、（ｇ）患者によるアンジオテンシン受容体遮断薬の一定の使用からなる臨床共変量の群の少なくとも５つ、少なくとも６つ、または全てもまた考慮され得る。
【００２８】
複数のバイオマーカーは、（ｉｖ）ｃ１６−アシルカルニチン、（測定オッズ比１．６８、９５％ＣＩ  １．２９，２．２１）を含み得る。これは、腎機能低下のバイオマーカーとしてこれまで特定されていなかった。したがって、本発明は、（ヒト）患者の腎機能低下リスクを決定する方法であって、（ａ）患者から得られた１つ以上のサンプルについて、ｃ１６−アシルカルニチンを含む１つ以上のバイオマーカーのレベルを解析する工程、（ｂ）１つ以上のバイオマーカーの各測定レベルを各１つ以上の対照レベルと比較する工程、および（ｃ）その比較から患者の腎機能低下リスクを決定する工程を含む。線維芽細胞増殖因子−２１のレベルの上昇は、腎機能低下リスクの上昇と相関し得る。（ａ）患者の年齢、（ｂ）患者の性別、（ｃ）患者の推算糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）、（ｄ）患者の尿中のアルブミンレベル、（ｅ）患者から得られた１つ以上のサンプル中のＨｂＡ１ｃレベル、（ｆ）患者によるＡＣＥ阻害薬の一定の使用、（ｇ）患者によるアンジオテンシン受容体遮断薬の一定の使用からなる臨床共変量の群の少なくとも５つ、少なくとも６つ、または全てもまた考慮され得る。
【００２９】
複数のバイオマーカーは、（ｉｘ）ヒドロキシプロリンを含み得る。単変量解析では、これは統計的に有意ではないため（測定オッズ比１．０５、９５％ＣＩ  ０．７５，１．４６）、腎機能低下の有用なバイオマーカーであることは驚くべきことである。
【００３０】
複数のバイオマーカーは、（ｖｉｉ）心臓型脂肪酸結合タンパク質を含み得る。単変量解析では、これは統計的に有意ではないため（測定オッズ比１．２６、９５％ＣＩ  ０．８８，１．８３）、腎機能低下の有用なバイオマーカーであることは驚くべきことである。
【００３１】
複数のバイオマーカーは、（ｖ）クレアチンを含み得る。単変量解析では、これは統計的に有意ではないため（測定オッズ比０．６３、９５％ＣＩ  ０．４４，０．８９）、腎機能低下の有用なバイオマーカーであることは驚くべきことである。
【００３２】
複数のバイオマーカーは、（ｖｉｉ）クレアチニンを含まないことがあり得る。したがって、前記複数のバイオマーカーは、（ｉ）アドレノメデュリン、（ｉｉ）アルファ−１アンチトリプシン、（ｉｉｉ）ベータ−２−ミクログロブリンもしくはシスタチン−Ｃ、（ｉｖ）ｃ１６−アシルカルニチン、（ｖ）クレアチン、（ｖｉｉ）心臓型脂肪酸結合タンパク質、（ｖｉｉｉ）線維芽細胞増殖因子２１、（ｉｘ）ヒドロキシプロリン、（ｘ）腎障害分子−１、（ｘｉ）脳性ナトリウム利尿ペプチドのＮ−末端プロホルモン、（ｘｉｉ）シンメトリックジメチルアルギニンとアシンメトリックジメチルアルギニンとの比、（ｘｉｉｉ）シンメトリックジメチルアルギニンおよび（ｘｉｖ）ウラシルからなる群のうちの少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも１０または少なくとも１２を含むか、あるいはその全てを含むか、またはその全てから構成され得る。
【００３３】
前記複数のバイオマーカーは、（ｉｉ）アルファ−１アンチトリプシン、（ｉｖ）ｃ１６−アシルカルニチン、（ｖ）クレアチン、（ｖｉ）クレアチニン、（ｖｉｉ）心臓型脂肪酸結合タンパク質、（ｖｉｉｉ）線維芽細胞増殖因子２１、（ｉｘ）ヒドロキシプロリン、（ｘ）腎障害分子−１、（ｘｉ）脳性ナトリウム利尿ペプチドのＮ−末端プロホルモン、（ｘｉｉ）シンメトリックジメチルアルギニンとアシンメトリックジメチルアルギニンとの比、（ｘｉｉｉ）シンメトリックジメチルアルギニン、（ｘｉｖ）ウラシル、（ｘｖ）シスタチン−Ｃ、（ｘｖｉ）アポリポタンパク質Ｄまたはｅセレクチン、（ｘｖｉｉ）線維芽細胞増殖因子２３、（ｘｖｉｉｉ）グルタミン酸、（ｘｉｘ）ハプトグロビンベータ鎖、（ｘｘ）トロポニン、（ｘｘｉ）ヒポキサンチン、（ｘｘｉｉｉ）インターロイキン−２受容体アルファ、（ｘｘｉｖ）形質転換成長因子ベータ１の潜在関連ペプチド、（ｘｘｖ）ロイシン−リッチアルファ−２−グリコプロテイン、（ｘｘｖｉ）リシン、（ｘｘｖｉｉ）ガンマインターフェロンで誘導されたモノカイン、（ｘｘｖｉｉｉ）メチルマロン酸、（ｘｘｉｘ）Ｎ−アセチルアスパラギン酸、（ｘｘｘ）好中球ゲラチナーゼ結合性リポカリン、（ｘｘｘｉ）オステオポンチン、（ｘｘｘｉｉ）タム・ホルスフォール尿グリコプロテイン、（ｘｘｘｉｉｉ）チミン、（ｘｘｘｉｖ）組織メタロプロテアーゼ１阻害物質、（ｘｘｘｖｉ）トリプトファン、（ｘｘｘｖｉｉ）腫瘍壊死因子受容体１、（ｘｘｘｖｉｉｉ）フォン・ヴィレブランド因子からなる群（以下、「拡大群」）のうちの少なくとも２０を含み得る。
【００３４】
アポリポタンパク質Ｄまたはｅ−セレクチンが、これらの２つのレベルに高い相関性があることから（＞０．９）、使用可能である。
【００３５】
（ｘｘ）トロポニンのレベルは、高感度トロポニン検定により測定されるべきである。旧トロポニン検定は、十分には正確ではない。しかしながら、感度が十分に高い検定が種々商業的に入手可能であり、例えば、Ｅｌｅｃｓｙｓ（商標）Ｔｒｏｐｏｎｉｎ  Ｔ  ｈｉｇｈ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ（ＴｎＴ−ｈｓ）ｔｅｓｔがＲｏｃｈｅから入手可能である。
【００３６】
前記複数のバイオマーカーは、（ｉｉ）アルファ−１アンチトリプシン、（ｉｖ）ｃ１６−アシルカルニチン、（ｖ）クレアチン、（ｖｉ）クレアチニン、ｖｉｉ）心臓型脂肪酸結合タンパク質、（ｖｉｉｉ）線維芽細胞増殖因子２１、（ｉｘ）ヒドロキシプロリン、（ｘ）腎障害分子−１、（ｘｉ）脳性ナトリウム利尿ペプチドのＮ−末端プロホルモン、（ｘｉｉ）シンメトリックジメチルアルギニンとアシンメトリックジメチルアルギニンとの比、（ｘｉｉｉ）シンメトリックジメチルアルギニン、（ｘｉｖ）ウラシル、（ｘｖ）シスタチン−Ｃ、（ｘｖｉ）アポリポタンパク質Ｄまたはｅ−セレクチン、（ｘｖｉｉ）線維芽細胞増殖因子２３、（ｘｖｉｉｉ）グルタミン酸、（ｘｉｘ）ハプトグロビンベータ鎖、（ｘｘ）トロポニン、（ｘｘｉ）ヒポキサンチン、（ｘｘｉｉｉ）インターロイキン−２受容体アルファ、（ｘｘｉｖ）形質転換成長因子ベータ１の潜在関連ペプチド、（ｘｘｖ）ロイシン−リッチアルファ−２−グリコプロテイン、（ｘｘｖｉ）リシン、（ｘｘｖｉｉ）ガンマインターフェロンで誘導されたモノカイン、（ｘｘｖｉｉｉ）メチルマロン酸、（ｘｘｉｘ）Ｎ−アセチルアスパラギン酸、（ｘｘｘ）好中球ゲラチナーゼ結合性リポカリン、（ｘｘｘｉ）オステオポンチン、（ｘｘｘｉｉ）タム・ホルスフォール尿グリコプロテイン、（ｘｘｘｉｉｉ）チミン、（ｘｘｘｉｖ）組織メタロプロテアーゼ１阻害物質、（ｘｘｘｖｉ）トリプトファン、（ｘｘｘｖｉｉ）腫瘍壊死因子受容体１、（ｘｘｘｖｉｉｉ）フォン・ヴィレブランド因子からなる前記群の少なくとも２２、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２８、少なくとも３０、少なくとも３２、または少なくとも３３を含むか、あるいはその全てを含むか、またはその全てから構成され得る。
【００３７】
複数のバイオマーカーは、（ｖｉｉｉ）線維芽細胞増殖因子２１を含み得る。これは、腎機能低下のバイオマーカーとして、これまで特定されていなかった。
【００３８】
シンメトリックジメチルアルギニンとアシンメトリックジメチルアルギニンとの比のレベルは、任意の適切な単位のシンメトリックジメチルアルギニンのレベル測定値とアシンメトリックジメチルアルギニンのレベル測定値との比として表され得る。（ｘｉｉ）シンメトリックジメチルアルギニンとアシンメトリックジメチルアルギニンとの比のレベルと、（ｘｉｉｉ）シンメトリックジメチルアルギニンのレベルは、シンメトリックジメチルアルギニンのレベルとアシンメトリックジメチルアルギニンのレベルを測定することによって測定され得る。
【００３９】
リスクは、腎機能の急速な低下のリスクであり得る。腎機能の急速な低下は、所定の期間に亘ってベースラインＧＦＲの少なくとも所定の割合が低下すること、または所定の速度で低下すること、例えば、３．５年の最大期間に亘って、ベースラインｅＧＦＲの４０％が低下（１年当たり、ベースラインｅＧＦＲの少なくとも１１．４％の低下に相当）することが特徴であり得る。
【００４０】
測定されるリスクは、リスクレベル、例えば、適切な尺度（例えば、０〜１または０〜１００％）によるリスクレベルを示す数値であり得る。測定されるリスクは、リスクレベルの有限群の１つであり得る。測定されるリスクは、２進値（「リスクあり」または「リスクなし」を示す２つの値の１つをとる）であり得る。
【００４１】
バイオマーカーのレベルは、任意の適当な単位で測定し得、例えば、絶対値、または、例えば、モル濃度、１ミリリットル当たりの質量または１０億当たりの部に比例する単位で表される濃度であり得る。しかしながら、単位は、解析のアウトプット単位、例えば、バイオマーカーのラベルの量を示す値、または、適当な単位によるクロマトグラフのピークの大きさを示す値であり得る。バイオマーカーのレベルは、さらに、バイオマーカーのレベルが測定されるサンプルの他の成分に対するレベル、例えば、そのバイオマーカーのレベルとアルブミンＴ６の安定な同位体のレベルとの比であり得る。
【００４２】
レベルは、単純に存在または非存在、例えば、検出限界を超える量または濃度が検出されたか否かであり得る。
【００４３】
バイオマーカーレベルは、患者からの同じサンプルで測定され得るが、患者からの異なる複数のサンプルで同様に測定され得る。一般に、１つ以上のサンプルは血液サンプルである。通常、バイオマーカーレベルは、インビトロおよび／またはエクスビボで測定される。
【００４４】
バイオマーカーレベルは、バイオマーカーから生成された生成物、例えば、バイオマーカーの分解生成物、例えば、トリプシン消化物などを測定することによって測定され得る。この方法は、特に、液体クロマトグラフィに基づく測定に適している。
【００４５】
対照レベルは、値または値の範囲であり得る。値の範囲は、統計的分布として、例えば、平均（例えば、算術平均）および標準偏差として表すことができる。レベルは、例えば算術平均レベルからの標準偏差として表すことができる。
【００４６】
リスクは、通常、糖尿病（例えば、２型糖尿病、およびいくつかの実施形態では、１型糖尿病）に起因する、腎機能の急速な低下のリスクであり得る。腎機能の急速な低下は、所定の期間に亘ってベースラインＧＦＲの少なくとも所定の割合が低下すること、または所定の速度で低下すること、例えば、３．５年の最大期間に亘って、ベースラインｅＧＦＲの４０％が低下（１年当たり、ベースラインｅＧＦＲの少なくとも１１．４％の低下に相当）することが特徴であり得る。
【００４７】
アルブミンレベルは、一定の期間、例えば、それまでの５年間に亘って、患者の尿で測定された最高値であり得る。
【００４８】
方法は、データが欠測しているか、レベルが検出レベル未満である複数のバイオメーカーの１つ以上のレベルを補完し、比較時に、補完したレベルを考慮する工程を含み得る。
【００４９】
以下の各バイオマーカーでは、複数のバイオマーカーが各バイオマーカーを含むなら、各バイオマーカーのレベルの上昇は、腎機能低下のリスクの上昇を示し得る：
（ｉ）アドレノメデュリン、
（ｉｉ）アルファ−１アンチトリプシン、
（ｉｉｉ）ベータ−２−ミクログロブリン、
（ｉｖ）ｃ１６−アシルカルニチン、
（ｖｉ）クレアチニン、
（ｖｉｉｉ）線維芽細胞増殖因子２１、
（ｉｘ）ヒドロキシプロリン、
（ｘ）腎障害分子−１、
（ｘｉ）脳性ナトリウム利尿ペプチドのＮ−末端プロホルモン、
（ｘｉｉ）シンメトリックジメチルアルギニンとアシンメトリックジメチルアルギニンとの比、
（ｘｉｖ）ウラシル、
（ｘｖ）シスタチン−Ｃ、
（ｘｖｉ）アポリポタンパク質Ｄ、
（ｘｖｉｉｉ）グルタミン酸、
（ｘｘ）トロポニン、
（ｘｘｉ）ヒポキサンチン、
（ｘｘｉｉｉ）インターロイキン−２受容体アルファ、
（ｘｘｖｉｉｉ）メチルマロン酸、
（ｘｘｉｖ）Ｎ−アセチルアスパラギン酸、
（ｘｘｖｉ）オステオポンチン、
（ｘｘｖｉｉｉ）チミン、
（ｘｘｉｘ）組織メタロプロテアーゼ１阻害物質、
（ｘｘｘｉ）腫瘍壊死因子受容体１、
（ｘｘｘｉｉ）フォン・ヴィレブランド因子。
【００５０】
以下の各バイオマーカーでは、複数のバイオマーカーが各バイオマーカーを含むなら、各バイオマーカーのレベルの上昇は、腎機能低下のリスクの減少を示し得る：
（ｖ）クレアチン、
（ｘｉｘ）ハプトグロビンベータ鎖、
（ｘｘｉｖ）形質転換成長因子ベータ１の潜在関連ペプチド、
（ｘｘｖｉ）リシン、
（ｘｘｖｉｉ）ガンマインターフェロンで誘導されたモノカイン、
（ｘｘｖｉｉ）タム・ホルスフォール尿グリコプロテイン、
（ｘｘｘ）トリプトファン、
（ｘｘｘｉ）Ｅ−セレクチン
以下の各バイオマーカーでは、複数のバイオマーカーが各バイオマーカーを含むなら、各バイオマーカーのレベルの上昇は、腎機能低下のリスクの減少を示し得る。但し、それは前記臨床共変量が考慮されるときのみである。前記臨床共変量なしで個々に考えられたときには、それらは腎機能低下のリスクの上昇を示すであろう。
（ｖｉｉ）心臓型脂肪酸結合タンパク質、
（ｘｖｉｉ）線維芽細胞増殖因子２３、
（ｘｘｖ）ロイシン−リッチアルファ−２−グリコプロテイン、
（ｘｘｖ）好中球ゲラチナーゼ結合性リポカリン。
【００５１】
したがって、複数のバイオマーカーが（ｖｉｉ）心臓型脂肪酸結合タンパク質を含み、（ｖｉｉ）心臓型脂肪酸結合タンパク質のレベルが上昇すると、それは腎機能低下のリスクの減少を示し得る。単変量解析ではその反対となるため、これは驚くべきことである。
【００５２】
したがって、複数のバイオマーカーが（ｘｖｉｉ）線維芽細胞増殖因子２３を含み、（ｘｖｉｉ）線維芽細胞増殖因子２３のレベルが上昇すると、それは腎機能低下のリスクの減少を示し得る。単変量解析ではその反対となるため、これは驚くべきことである。
【００５３】
したがって、複数のバイオマーカーが（ｘｘｖ）ロイシン−リッチアルファ−２−グリコプロテインを含み、（ｘｘｖ）ロイシン−リッチアルファ−２−グリコプロテインのレベルが上昇すると、それは腎機能低下のリスクの減少を示し得る。単変量解析ではその反対となるため、これは驚くべきことである。
【００５４】
したがって、複数のバイオマーカーが（ｘｘｖ）好中球ゲラチナーゼ結合性リポカリンを含み、（ｘｘｖ）好中球ゲラチナーゼ結合性リポカリンのレベルが上昇すると、腎機能低下のリスクの減少を示し得る。単変量解析ではその反対となるため、これは驚くべきことである。
【００５５】
（ｘｉｉｉ）シンメトリックジメチルアルギニンでは、シンメトリックジメチルアルギニンのレベルの上昇が、腎機能低下のリスクの減少を示すが、（ｘｉｉ）シンメトリックジメチルアルギニンとアシンメトリックジメチルアルギニンとの比が、前記複数のバイオマーカーの１つでない場合には、これは当てはまらないであろう。
【００５６】
したがって、複数のバイオマーカーは、（ｘｉｉｉ）シンメトリックジメチルアルギニンと（ｘｉｉ）シンメトリックジメチルアルギニンとアシンメトリックジメチルアルギニンとの比を共に含み、シンメトリックジメチルアルギニンのレベルが上昇すると、それは腎機能低下のリスクの減少を示し、シンメトリックジメチルアルギニンとアシンメトリックジメチルアルギニンとの比が上昇すると、腎機能低下のリスクの上昇を示す。シンメトリックジメチルアルギニンのレベルと、シンメトリックジメチルアルギニンとアシンメトリックジメチルアルギニンとの比の両方を考慮することによって良好な結果が得られることは驚くべきことである。
【００５７】
アドレノメデュリンは、１８５個のアミノ酸からなる前駆体ペプチド（プレプロアドレノメデュリン）の活性化によって生成される、５２個のアミノ酸からなるペプチドである。血中アドレノメデュリンは、活性な形態と、糖化された不活性な形態の両者からなる。アドレノメデュリンは、血管拡張性ペプチドであり、また、血管の形成を上方制御し、酸化ストレスから細胞を保護する作用を有する。
【００５８】
アルファ−１アンチトリプシンは、肝臓で生成され、特定の酵素の効果を遮断する５２ｋＤａのセルピンタンパク質である。我々は、このバイオマーカーを、トリプシン消化物と、６３１．３のペプチドトランジションＱ１  ＭＳ１および８８９．５のペプチドトランジションＱ３  ＭＳ２を有する腎臓の進行と最も強い関連を示したフラグメントを有するＭＳＭＳを使用して測定した。
【００５９】
アルファ−１−ミクログロブリンは、体内細胞の多くで合成されるアミノ酸１８３個の小さな球状タンパク質であるが、肝臓が主な供給源である。その主要な機能は、ヘムの分解および遊離基の除去である。
【００６０】
アポリポタンパク質Ｄは、リポカリンファミリーのメンバーである。それはホモダイマーとして存在し、レシチン・コレストロール・アシル転移酵素との高分子複合体において生じる。血漿中では、アポリポタンパク質Ｄはまた、アポリポタンパク質Ａ２とのジスルフィド結合ヘテロダイマーとして存在する。アポリポタンパク質Ｄは多くの組織で発現するが、主に、脳および精巣で生成される。アポリポタンパク質Ｄは主にＨＤＬで局在し（６０〜６５％）、残りの多くはＶＨＤＬであり、ＶＬＤＬおよびＬＤＬは微量にすぎない。
【００６１】
アスパラ酸は、化学式ＨＯＯＣＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ２ＣＯＯＨで表される酸性α−アミノ酸である。
【００６２】
アシンメトリックジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）およびシンメトリックジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）と、それらの比：タンパク質の代謝回転の過程で、３種のアルギニンメチル化誘導体が放出される：Ｎ（Ｇ）−モノメチル−Ｌ−アルギニン（Ｌ−ＮＭＭＡ）、アシンメトリックジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）およびシンメトリックジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）。ＳＤＭＡは多くが腎臓で除去され、いくつかの研究が、それが腎機能に大きく関与していることを見出した。ＳＤＭＡはＮＯシンターゼを直接阻害しないが、Ｌ−アルギニンの細胞内の取り込みを阻害する証拠がある。また、ＳＤＭＡを合成するタンパク質メチル基転移酵素ＰＲＭＴ５がインターロイキン−２−遺伝子の発現を制御する証拠がある。それは、ＳＤＭＡのレベルの高さが炎症を反映するであろうことを示している。他は、ＳＤＭＡのレベルが、高タンパク質の代謝回転の状態においては、ＡＤＭＡより上方制御され得ることを示した。
【００６３】
ベータ−２−ミクログロブリンは、有核細胞の全てに存在し、血液中に、特にリンパ球によって出されるＭＨＣクラスＩ分子の構成要素である。大きさが小さいため、腎臓の糸球体膜を通過するが、近位尿細管での再吸収により、尿中に排出されるのは１％未満である。したがって、高血漿レベルは、腎不全、炎症、およびいくつかの癌、特にＢリンパ球に関連するもので生じる。
【００６４】
Ｃ１６アシルカルニチン、Ｃ１８アシルカルニチンおよびＣ２アシルカルニチン。アシルカルニチンは、脂肪酸代謝で重要な役割を持つカルニチンエステルである。鎖長プロファイルによって、異なる形態が決定されている。
【００６５】
クレアチンは、分子式Ｃ４Ｈ９Ｎ３Ｏ２で表される窒素含有有機酸であり、グリシンおよびアルギニンから生成される。それは主に腎臓および肝臓で生成され、その後、筋肉に運ばれる。そこでは、それはエネルギーの生成に関与する。少ないクレアチンの貯蔵は菜食の証拠であり得る。
【００６６】
クレアチニンは、クレアチンリン酸の分解生成物である。生成速度は一定で、クリアランスは腎臓、主に、活性再吸収のない糸球体での濾過による。血清クレアチニンは、その濃度変化が主に腎臓の濾過作用の変化を反映するため、腎機能の日常的な測定として使用されている。血清クレアチニンは、ＭＤＲＤ４方程式（本研究で使用）およびＣＫＤ−ＥＰＩ方程式などのｅＧＦＲの算出に確立された方程式の多くで使用されている。
【００６７】
シスタチン−Ｃは、システインプロテアーゼのＣ１ファミリーの強力阻害剤である１３ｋＤａのタンパク質である。通常、それは血管壁平滑筋細胞で発現する。それは、腎臓糸球体での濾過によって除去され、糸球体濾過のマーカーとして確立されている。
【００６８】
Ｅ−セレクチンは、細胞接着分子のファミリーの１つである。Ｅ−セレクチンは、サイトカインで活性化された内皮細胞上でのみ発現する。可溶性Ｅ−セレクチンは、表面発現分子のタンパク分解的切断から生ずる。それは損傷領域へ白血球を補充するなど、炎症において重要な役割を担っている。
【００６９】
心臓型脂肪酸結合タンパク質は、脂肪酸結合型タンパク質ファミリーのメンバーであり、脂肪酸のミトコンドリアへの輸送体として作用する脂肪酸代謝に関与している。心臓型脂肪酸結合タンパク質は、主にミトコンドリア細胞に含まれる１５ｋＤａの細胞質タンパク質である。それは、急性心筋梗塞のマーカーであり、心血管系リスクの有用なマーカーでもあり得る。
【００７０】
線維芽細胞増殖因子２１は、線維芽細胞増殖因子ファミリーのメンバーである。それは、肝臓および脂肪組織によって主に分泌される１８１個のアミノ酸からなるポリペプチドである。線維芽細胞増殖因子２１は、脂質およびエネルギー代謝で重要な役割を担っていることが知られている。線維芽細胞増殖因子２１は、グルコース輸送体ＳＬＣ２Ａ１／ＧＬＵＴ１の発現を誘導することによって、分化脂肪細胞におけるグルコースの取り込みを刺激する。これまでのいくつかの研究で、ＦＧＦ  ２１とｅＧＦＲとの、またＦＧＦ  ２１とアルブミン尿との横断的関連性が報告されている。
【００７１】
線維芽細胞増殖因子２３は、線維芽細胞増殖因子ファミリーのメンバーである。それは、高い血中リン酸塩レベル、または高い血中上皮小体ホルモンに応答して、骨細胞および骨芽細胞によって生成される。それは、リン酸塩輸送体を下方制御し、ビタミンＤの生成を抑制することによって、リン酸塩の腎臓による吸収の減少を促進する。それはまた、リン酸塩の腸管吸収を減少させる。人の慢性腎疾患において、血漿中の線維芽細胞増殖因子２３のレベルは、腎不全の初期段階で上昇する。
【００７２】
グルタミン酸は、タンパク質を構成する非必須アミノ酸である。それは良好なサンプル保存マーカーとして、グルタミンと共に使用され得る。これは、適切な凍結を行わずに保存したサンプルは、グルタミン酸塩からグルタミン酸への転換率が上昇するからである。
【００７３】
増殖分化因子１５は、形質転換成長因子ベータスーパーファミリーに属するタンパク質であり、損傷組織や病気の進行過程において、炎症経路およびアポトーシス経路を調節する役割を有している。
【００７４】
ハプトグロビンベータ鎖は、ハプトグロビンアルファ鎖と組み合わされて、赤血球から放出される遊離ヘモグロビンと結合するタンパク質ハプトグロビンを作るタンパク質鎖である。
【００７５】
ヒドロキシプロリンは、小胞体でプロリンのヒドロキシル化によって生成されるアミノ酸である。それは、タンパク質コラーゲンの主要な構成要素であり、プロリンと共に、コラーゲンの安定性に重要な役割を担っている。
【００７６】
ヒポキサンチンは、分子式Ｃ５Ｈ４Ｎ４Ｏを有するプリン誘導体である。ヒポキサンチンは、ＡＴＰ消費後、筋から循環へ放出され、したがって、運動または虚血後、血清レベルが上昇することが知られている。インターロイキン−２受容体アルファは、インターロイキン−２受容体を作る３つのタンパク質鎖の１つで、他は、インターロイキン−２ベータ、インターロイキン−２ガンマである。可溶性の形態は、細胞外タンパク質分解から生じ、血液レベルは、Ｔ細胞よびＢ細胞の活性化と免疫系の活性化の上昇と相関する。
【００７７】
腎障害分子−１は、近位尿細管細胞の頂端膜上で発現する免疫グロブリンのスーパーファミリーの細胞表面タンパク質であり、損傷した腎臓の上皮細胞の表面で大きく上方制御される。腎障害分子−１の尿中濃度は、急性腎障害に応えて上昇することが知られている。尿中ＫＩＭ−１は、糖尿病性腎疾患の予後マーカーとして評価されているが、進行の強力な予知因子であると一貫しては認められていない。本研究では、我々は血清中の腎障害分子−１を測定した。
【００７８】
形質転換成長因子ベータ１の潜在関連ペプチドは、形質転換成長因子１ベータ遺伝子によってコードされ、形質転換成長因子１ベータと共に共分泌される。２つのタンパク質の切断は形質転換成長因子１ベータの潜在関連ペプチドと成熟形質転換成長因子１ベータ自身の両方を生じさせる。
【００７９】
ロイシン−リッチアルファ−２−グリコプロテインは、タンパク質間相互作用、シグナル伝達、細胞接着および細胞発生に関与することが知られているロイシン−リッチリピートファミリーのタンパク質に属する分泌型急性期タンパク質である。ロイシン−リッチアルファ−２−グリコプロテインは、顆粒球分化の過程で発現する。それはシトクロムＣに強く結合するが、これはアポトーシスに関与し得ることを示すものである。
【００８０】
リシンは、化学式ＨＯ２ＣＣＨ（ＮＨ２）（ＣＨ２）４ＮＨ２で表される必須アミノ酸である。
【００８１】
メチルマロン酸（ＭＭＡ）は、マロン酸塩のＣ−メチル化誘導体のジカルボン酸である。ビタミンＢ１２が欠損すると高レベルになる。
【００８２】
ガンマインターフェロンで誘導されたモノカインは、ＣＸＣケモカインのファミリーに属する小さなサイトカインである。それはインターフェロンガンマによって発現が誘発されるＴ細胞走化性因子である。それは、免疫と炎症の両方の応答において役割を果たしており、活性化Ｔ細胞に向けて走化性を有する。
【００８３】
Ｎ−アセチルアスパラギン酸は、主に、ニューロンのミトコンドリアにより、アミノ酸のアスパラギン酸とアセチル補酵素Ａから、酵素アスパラギン酸−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼにより合成される、化学式Ｃ６Ｈ９ＮＯ５で表される小さなアミノ酸である。それは、脳卒中や他のニューロン疾患などのニューロン損傷後に血液循環に放出されることが明らかとなっている。
【００８４】
脳性ナトリウム利尿ペプチドのＮ−末端プロホルモン（ＮＴ−ＰｒｏＢＮＰ）は、ＰｒｏＢＮＰから切断されて脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）を放出する、７６個のアミノ酸からなるＮ−末端不活性タンパク質である。ＮＴ−ＰｒｏＢＮＰと活性ペプチドＢＮＰの血中レベルは、急性鬱血性心不全のスクリーニングおよび診断に使用されている。ＢＮＰおよびＮＴ−ＰｒｏＢＮＰの両方の血中濃度はまた、通常、症候性または無症候性左室収縮不全患者で上昇する。
【００８５】
好中球ゲラチナーゼ結合性リポカリン（ＮＧＡＬ）は、リポカリンファミリーのタンパク質である。それは、ＭＭＰ−９とジスルフィド結合で連結されたヘテロダイマーを形成する。それは、鉄を隔離することによって、細菌感染に対する生来の免疫応答を仲介する。それは主に好中球で発現するが、他の組織と共に腎臓でも低レベルで発現する。ＮＧＡＬレベルは、腎臓の損傷後２時間以内に尿および血液で上昇し、そのため、ＮＧＡＬは急性腎不全のバイオマーカーとなる。
【００８６】
オステオポンチンは、３１４個のアミノ酸からなり、腎臓で合成されるサイトカインとして作用し、インターフェロン−ガンマおよびＩＬ−１２の生成を増大させ、ＩＬ−１０の生成を減少させる。オステオポンチンは、タイプ１免疫に導く経路において必須である。それは無機化マトリックスの不可欠な部分を形成するようである。シアル酸は、単糖ノイラミン酸の一群の誘導体に対する用語であり、人で最も多いのは、それらの中で、Ｎ−アセチルノイラミン酸である。腎疾患があると、血清中の全シアル酸が上昇することがわかった。
【００８７】
ウロモデュリンとしても知られるタム・ホルスフォール尿グリコプロテインは、約８５ｋＤａで、多くがグリコシル化されている炭水化物部分を約３０％含む単量体グリコプロテインである。それは健康な人の尿に最も多く含まれるタンパク質である。それは腎臓で生成され、ヘンレループの細い上行脚により尿中に分泌される。最近の研究で、タム・ホルスフォールプロテインは血清中に含まれ、腎疾患の存在に関与していることがわかった。
【００８８】
ＣＤ１４１としても知られるトロンボモデュリンは、内皮細胞の表面で発現する内在性膜タンパク質である。それは、トロンビンと１：１の複合体を形成することによる、トロンビン誘導のタンパク質Ｃの活性化において、補因子として機能する。この複合体はその後、繊維素溶解を刺激する。
【００８９】
チミンは、分子式Ｃ５Ｈ６Ｎ２Ｏ２で表される核酸である。それはＤＮＡ中に存在し、ウラシルのメチル化によって生成され得る。
【００９０】
組織メタロプロテアーゼ１阻害物質（ＴＩＭＰ−１）は、分泌型タンパク質分解酵素ファミリーのメンバーであり、マトリックスメタロプロテアーゼの作用を阻害することによって、結合組織の生合成に関与している。ＴＩＭＰ−１はグリコプロテインであり、細胞外マトリックスの合成および分解の主要な調節因子である。
【００９１】
腸トレフォイル因子としても知られるトレフォイル因子３は、他のトレフォイル因子ペプチドと同様、粘液産生細胞を含む組織で高発現する。それは、６０個のアミノ酸からなる単量体と１１８個のアミノ酸からなるニ量体の形態の両方で存在する。それは上皮の修復に役割を有すると考えられる。ごく最近になって、それが腎髄質、特に腎皮質の尿細管細胞で発現することが示された。ＴＦＦ３は、一般集団において、ｅＧＦＲの低い人々の血清および尿中で高レベルであることが示された。
【００９２】
トロポニンＴは、トロポニンＩおよびトロポニンＣと共に、筋収縮性の重要な構成要素であるトロポニン複合体を作る筋原線維タンパク質である。心筋トロポニンＴは、急性心外傷のバイオマーカーとして認められているが、ごく最近の高感度アッセイで、血漿および血清のトロポニンＴの測定値もまた心血管系リスクのバイオマーカーとなることが示された。
【００９３】
トリプトファンは、分子式Ｃ１１Ｈ１２Ｎ２Ｏ２で表される必須アミノ酸である。それは、セロトニンおよびナイアシンの生成に必要である。
【００９４】
腫瘍壊死因子受容体１および腫瘍壊死因子受容体２は、ＴＮＦ受容体の可溶性の形態である。ＴＮＦ−アルファとＴＮＦ−ベータの生物学的活性を失活させる２つのタイプの可溶性ＴＮＦ受容体が、ヒトの血清および尿で特定されている。これらの結合タンパク質は、ＴＮＦに対する２つのタイプの高親和性細胞表面受容体の切断型（ＴＮＦＲ  ｐ６０タイプＢおよびＴＮＦＲ  ｐ８０タイプＡ）を示す。可溶性腫瘍壊死因子受容体１はＴＮＦＲ  ｐ６０タイプＢに相当する。可溶性腫瘍壊死因子受容体２はＴＮＦＲ  ｐ８０タイプＡに相当する。ＴＮＦスーパーファミリーの命名法では、ＴＮＦＲ１とＴＮＦＲ２は、それぞれＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂと称する。これらの可溶型の受容体は、膜結合型受容体の細胞外領域の脱落の結果、生じるようである。
【００９５】
ウラシルは、分子式Ｃ４Ｈ４Ｎ２Ｏ２で表されるピリミジン誘導体である。それはＲＮＡ中の核酸の１つである。それは、多くの酵素生成の補因子として作用する。
【００９６】
血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）は、多くの免疫グロブリン領域で構成され、サイカインの刺激によって大小の血管で発現する。それは、リンパ球、単球、ナチュラルキラー細胞、好酸球および好塩基球の接着を、白血球超後期抗原（ＶＬＡ−４）との相互作用によってサポートする。ＶＣＡＭ−１／ＶＬＡ４相互作用は、循環非好中球の内皮への強い付着を仲介し、免疫応答および白血球の炎症サイトへの移動に病態生理学的役割を果たし得る。
【００９７】
フォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）は、止血の維持に関与する大きな多量体グリコプロテインである。ｖＷＦの基本の単量体は、２０５０個のアミノ酸からなるタンパク質である。血漿中で、ｖＷＦは、血液凝固第ＶＩＩＩ因子が非共有結合によって複合体を形成するポリマーの異種集団として存在する。それは、内皮下コラーゲンマトリックスと血小板表面受容体複合体ＧＰＩｂ−ＩＸ−Ｖ間の分子ブリッジを形成することによって、血小板の損傷サイトとの接着を促進する。それはまた、血液凝固第ＶＩＩＩ因子のシャペロンとして作用し、血液凝固第ＶＩＩＩ因子を損傷サイトへ送り、そのヘテロニ量体構造を安定化し、血漿からの早期クリアランスからそれを保護する。ｖＷＦは、内皮細胞および巨核球において、重合し、第ＶＩＩＩ因子と結合して大きな複合体を形成する多くのサブユニットとして合成される。それは急性期反応物質である。
【００９８】
次に、発明の実施形態を、以下の図面を参照して記載する。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】図１は、本発明の腎機能の急速な低下リスクを算出する方法を示すフローチャートである。
【図２】図２は、本発明の腎機能の急速な低下リスクを算出するためにプログラムされたコンピューターの模式図である。
【図３】図３は、バイオマーカーの数に基づいたモデルの受信者動作特性曲線下面積（ＡＵＲＯＣ）のグラフである。
【図４】図４は、臨床共変量に基づいたモデル、ならびに、スパースバイオマーカーパネルおよび拡張バイオマーカーパネルを使用したモデルの受信者動作特性曲線下面積（ＡＵＲＯＣ）のグラフである。
【図５】図５は、単独での試験で臨床共変量で調整されたｅＧＦＲの急速な進行と関連するオッズ比によって、個々のバイオマーカーと臨床共変量の関連を示すボルケーノプロット（ｖｏｌｃａｎｏ  ｐｌｏｔ）である。ラベルポイントは、有意水準が−ｌｏｇ１０（ｐ値）＞９、または、フォールドチェンジ（ｆｏｌｄ−ｃｈａｎｇｅ）が＋／−＞０．６より大きいところである。
【図６】図６は、残ったバイオマーカー数と選択方法によるモデルの性能メトリックを示す。３５のバイオマーカーまで変化することが認められたトップダウン選択の残留バイオマーカーの数と共に、前進選択パネルで達成されたＡＵＲＯＣ（黒塗りの四角で示す）を、トップダウン選択パネルの性能（白抜きのひし形で示す）と比較して示すモデル性能プロット（図６Ａ）。年齢、性別、ＨｂＡ１ｃ、アルブミン尿、ｅＧＦＲ、ＡＣＥ阻害剤およびアンジオテンシン受容体遮断薬によっての単独使用によって達成されたＡＵＲＯＣの上部に（図６Ｂ）。長期ｅＧＦＲを含む拡張臨床共変量により達成されたＡＵＲＯＣの上部に（全リストの方法を参照）。
【図７】図７は、臨床データ単独と比べた前進選択およびトップダウン選択により選択されたバイオメーカーパネルの性能を示す。臨床共変量（年齢、性別、ＨｂＡ１ｃ、アルブミン尿、ｅＧＦＲ、ならびにＡＣＥ阻害剤およびアンジオテンシン受容体遮断薬の使用）（ライン２００）、臨床共変量および前進選択バイオマーカー（ライン２０１）、ならびに、臨床共変量および３５バイオマーカーパネル（ライン２０２）を含む最良の全バイオマーカーモデルおよびスパースバイオマーカーモデルの性能プロット（図７Ａ）。ＲＯＣ曲線下面積（図７Ｂ）陽性予測値プロット。
【発明を実施するための形態】
【０１００】
第１実施例
図１を参照して、将来、例えば、２型糖尿病に起因する腎機能の急速な低下に苦しむ患者のリスクを判定するため、血液サンプルをその患者から採取し、下の表１に記載のバイオマーカーの存在を検査する１０。
【０１０１】
【表１】
2017516113.tif 000003
【０１０２】
バイオマーカーのレベルは、当業者に知られた様々な異なる方法で測定することができる。
【０１０３】
一般に、個々のバイオマーカーは、バイオマーカーに特異的に結合する特定の認識要素、例えば抗体、抗体フラグメント、化学物質など、および標識により、または他の検出技術により測定することができる。例えば、個々のバイオマーカーのレベルは、抗体（あるいは抗体フラグメント、またはその類似体もしくは誘導体）をそれぞれのバイオマーカーの特定認識要素として、および検出を促進する標識を組み込む酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）または他の免疫測定法（例えば、ＥＣＬＩＡ、電界発光免疫測定法）を使用して測定し得る。バイオマーカーレベルは、Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘａｓ、ＵＫ）から入手可能なｘＭＡＰ多重分析技術（ｘＭＡＰは、Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの商標である）を用いる、ミクロスフェアに基づく多重化検出アッセイにより、多数のバイオマーカーを並行して測定することができる。表１中、これを「ミクロスフェアアッセイ」と称する。バイオマーカーはまた、クロマトグラフ法、例えば、液体クロマトグラフィ質量分析（ＬＳ−ＭＳ）技術、例えば、バイオマーカーを適切に構成された液体クロマトグラフ装置により分離し、質量分析により検出する液体クロマトグラフィ−エレクトロスプレーイオン化−タンデム質量分析（表１中、ＥＳＩ−ＭＳＭＳ）により測定することができる。これらの方法は、下記の実験の項でさらに記載する。いくつかのバイオマーカーは、解析前に、トリプシンによる消化などの前処理がなされ得、本実施例では、この方法は、アルファ−１  アンチトリプシンに適用される。これは、ＬＳ−ＭＳなどのクロマトグラフィに基づいた技術で特に有用であり、一般に、多数のピークが検出される。そのうちのいくつかまたは全てが対応するバイオマーカーのレベルの決定に測定され得る。このような方法でトリプシン消化物により特定されるバイオマーカーでは、絶対濃度の測定よりむしろ半定量的測定を、バイオマーカー濃度とサンプルの調製過程で加えられるアルブミンＴ６の安定な同位体との比により得る。
【０１０４】
さらに、次の臨床共変量を、各患者について記録する２０：患者の年齢、患者の性別、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｔｒｉａｌ（ＤＣＣＴ）でアラインされたアッセイによる血液サンプル中の糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）のレベル、微量アルブミン尿陰性（すなわち、微量アルブミン濃度、２４時間タンパク質濃度、尿中アルブミン：クレアチニン比などの、使用アッセイに関連する微量アルブミン尿の閾値未満）、または、微量アルブミン尿もしくは顕性アルブミン尿などのアルブミン尿（再び、適当なアッセイで定義されている通りの）に分類される患者の尿中のアルブミンレベル、クレアチニンの血液検査から、Ｍｏｄｉｆｉｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｉｅｔ  ｉｎ  Ｒｅｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ４（ＭＤＲＤ４）式：ｅＧＦＲ＝１８６×（クレアチニン（ｍｍｏｌ／ｌ／８８．４））−１．１５４×（年齢−０．２０３）×０．７４２（女性なら）×（１．２１０（黒人なら））を使用して求められた患者の推算糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）、ならびに患者のＡＣＥ（アンジオテンシン変換酵素）阻害剤およびアンジオテンシン受容体遮断薬の使用の有無（および、任意選択的に、どの程度）。
【０１０５】
図２を参照して、このデータを、キーボード１０４、マウス１０６もしくはタッチインターフェースなどのデータ入力ペリフェラを使用して手動により、またはネットワークインターフェース１１０（イーサネット(登録商標）インターフェースなど）により測定装置から直接、自動的にコンピューター１００に入力する。コンピューターは、腎機能の急速な低下リスクを計算するコンピュータープログラム１１６と、コンピュータープログラムに必要な複数のバイオマーカー１２０Ａ、１２０Ｂ、１２０Ｃのそれぞれに関連するパラメータを含むパラメータ１１８と、患者に関する受信データ１２２とを保存するメモリー１１４と電子通信を行う１つ以上のマイクロプロセッサー１０２を有する。コンピューターは、以下の手順によって、腎機能の急速な低下に苦しむ個々の患者のリスクを算出する４０。
【０１０６】
判定された人全員のデータをガウシアン化し、モデルの予測と、臨床共変量およびバイオマーカーの全データを最大化する。後述するように、臨床共変量およびバイオマーカーの全データを含む線形回帰モデルからの連続測定として推定された転帰（患者のｅＧＦＲの変化速度を反映する）。スコアの高い患者はスコアの低い患者より高リスクの患者であることから、一般化された転帰は、ｅＧＦＲの減少速度の指標となる。我々の症例−対照モデルから一般化された係数を使用することも可能であるが、他の集団から作られたモデルは、係数がその集団自身のデータから得られるなら、より有効であろう。選択の閾値は、特定される必要のある患者の数または所定のカットポイントによる。
【０１０７】
転帰を推定するために、欠測しているバイオマーカーの測定値と環境および臨床共変量を、次に、下記のトレーニングデータについて事前にトレーニングされた補完モデルを使用して補完する（「統計方法」を参照）。
【０１０８】
定量的リスクスコアが、ロジスティック回帰モデルｐ（ｙｉ＝１｜ｘｉ）＝１／１＋ｅｘｐ（−ｗ０−ｗＴｘｉ））に使用によって補完されたバイオマーカーならびに環境および／または臨床共変量ｘｉを考慮して、腎機能の急速な低下の症例であるサンプルｉの条件付き確率ｐ（ｙｉ＝１｜ｘｉ）により推定される。モデルのパラメータｗ０、ｗは、トレーニングデータから、前進選択法またはＬＡＳＳＯ法の新規な改良法を使用して推定される（「統計方法」を参照）。改良法は、欠測のランダム要因と系統的要因の混合からなる新規な補完方法（「データの洗浄および補完）と、極端な症例（糖尿病性腎症の症例／対照状態とは対照的な急速なプログレッサー）の高次元予測の過縮小および冗長性からなる入れ子フィルタリング手順の使用を含む−下記の「バイオマーカー特定におけるボトルネックの対処方法」を参照。
【０１０９】
共変量の重みづけベクトルｗの長さ（モデルパラメータ）は、バイオマーカーと臨床／環境共変量の数（共変量１つ当たり１個の係数）に等しい。ベクトルはわずか、すなわち、要素の多くはゼロに等しい。ゼロは、得られるバイオマーカーパネルに含まれない廃棄された共変量に相当し、ベクトルｗの非ゼロ値は、得られるバイオマーカーパネルに残るバイオマーカーに相当する。重みのしるしおよび大きさは、得られる、腎機能低下の急速な進行のリスクに関するパネルの対応するバイオマーカーと臨床共変量の効果の方向および大きさを示す。
【０１１０】
（２）により推定された確率は、患者の個々のレベルの定量的リスクスコアを構成し、熟練した医師または臨床試験の被験者によって、予防介入の決定、臨床試験の分割、または継続中の治療の効果の評価のために使用される。
【０１１１】
各バイオマーカーについて、以下のデータが使用される。
【０１１２】
【表２】
2017516113.tif 000004
【０１１３】
コンピューターは、患者のリスクを出力する。いくつかの実施形態では、コンピューターは、腎機能の急速な低下リスクを有する患者のリスクを計算する。他の実施形態では、コンピューターは、１つまたは１群のリスクカテゴリーに患者を分ける。それは、「リスクが上昇している」または「リスクが上昇していない」という単純なものであり得る。
【０１１４】
得られるデータは、多くの方法で使用することができる。例えば、データは、臨床試験の患者を選択する手順の一部として使用することができる。この場合、リスクが上昇していると判定された患者は、薬剤の投与などの治療介入の有効性を評価する臨床試験の対象として選ばれる。対象となった患者は、通常、その後、付加的基準に対してスクリーニングされ、次いで、対照と実験群との間でランダムに分けられる。臨床試験の一部として、選ばれた患者は、繰り返し測定されるアルブミン尿またはｅＧＦＲなどの腎機能の１つ以上の測定値を有し得る。彼らは、腎疾患の異なるステージに分類され得る。臨床試験によるこれらの測定値またはステージの変化が監視され得る。
【０１１５】
本発明の方法で、リスクが上昇していると判定された患者を選択することによって、臨床試験で採用する患者の数を減らし得るか、またはそうでない場合より臨床試験を迅速に終えることができる。
【０１１６】
本発明は、その後、患者の治療過程の進展を評価するために使用することができる。腎機能の急速な低下を患う患者のリスクは、上記手順によって、治療前、治療中または治療後の様々な時間に決定され得、一連の治療が有効に働いているか否かを、算出したリスクから決定することができる。
【０１１７】
本発明はまた、患者が一連の治療を受けるべきか否かを判断するのに有用である。腎機能が急速に低下するリスクが閾値を超えるとの計算結果が出るか、または腎機能の急速な低下リスクが上昇していることを示すリスクカテゴリーに分類されるなら、彼らは一連の治療を受け得る。
【０１１８】
第２実施例
第２実施例においては、表３に示すバイオマーカーの拡大パネルが、代わりに使用される。
【０１１９】
【表３−１】
2017516113.tif 000005
【０１２０】
【表３−２】
2017516113.tif 000006
【０１２１】
【表３−３】
2017516113.tif 000007
【０１２２】
測定レベルと、アルブミンＴ６の安定な同位体の測定レベルとの比は、同じサンプル中のバイオマーカーのレベルと、添加されたアルブミンＴ６の安定な同位体のレベルを測定し、存在する量の比を計算することによって確立することができる。
【０１２３】
下の表に含まれる各バイオマーカー測定値を組み込むことを除いて、前述のような計算を繰り返す。
【０１２４】
【表４−１】
2017516113.tif 000008
【０１２５】
【表４−２】
2017516113.tif 000009
【０１２６】
【表４−３】
2017516113.tif 000010
【０１２７】
本発明は、腎機能の急速な低下リスクの高い患者を検出する精度の向上を提供する。有利なことに、バイオマーカーのほぼ全て、または全てを、わずか２つの分析法、１つはクロマトグラフィ分析法（複数のバイオマーカー間を区別することができる）、そして１つは、種々のバイオマーカーに対し、異なる標識を付けた特定の認識要素（抗体、抗体フラグメントまたはそれらの類似体）を使用する多重免疫測定法により測定することができる。上に列挙したバイオマーカーの１つのトロポニンＴは、これらのいずれの方法によっても測定せず、代わりに、表５に詳述したＥＬＩＳＡによって測定した。
【０１２８】
実験方法
バイオマーカーパネルを選択し、それらと腎機能の急速な低下との相関を以下方法により決定した。
【０１２９】
ＳｃｏｔｌａｎｄのＧｏ−ＤＡＲＴＳコーホートから、腎疾患が急速に進行している１５３の症例を、１５４の対照例とともに認定した。２０７のバイオマーカーのパネルをベースラインサンプルにおいて測定し、腎機能の低下の予測を改善し得るであろうバイオマーカーを特定した。
【０１３０】
Ｇｏ−ＤＡＲＴＳ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ａｕｄｉｔ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔａｙｓｉｄｅ  Ｓｔｕｄｙ）は、２型糖尿病で登録された患者のコーホートであり、そこでは、患者は、登録時に集められた生体サンプルと臨床データの両方を、日常的な臨床測定の過去および将来のデータと処方に関するデータとを提供する患者の電子カルテに連鎖するデータにより集められた糖尿病に関連する縦断的測定値とともに有する。患者はこの研究に、１９９８年１２月から２００９年５月の間に登録し、今日まで継続して追跡されている。参加医院（ＳｃｏｔｌａｎｄのＴａｙｓｉｄｅの健康局の領域を全てカバーしている）に通院している人は全員、参加するように招かれた。最終サンプルは、そのエリアに住む２型糖尿病の全患者の約７５％を含む。糖尿病の状態は、糖尿病の診断の臨床記録に基づいており、臨床記録データと、現在行われている投薬と、生化学検査データで検証されている。患者は、臨床試験登録時、血液サンプルを提出し、予め確認された、彼らの日常と、糖尿病に特有の臨床および死亡率記録を持つことに同意した。投薬情報、血圧、人体測定および生化学検査の結果などの共変量データは、進行中のプライマリーケア記録と病院の糖尿病電子記録（ＳＣＩ−ＤＣ）から抽出することによって得られる。
【０１３１】
この研究の表現型は、腎臓保護薬を評価する通常の登録基準に則って設計された。サンプルは、研究登録日にＣＫＤ３（すなわち、ｅＧＦＲが３０〜６０ｍｌ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２）の患者から選択した。ｅＧＦＲは、Ｇｏ−Ｄａｒｔｓに登録した日に、臨床検査室で測定された単独の血清クレアチニンから、ＭＤＲＤ４式により算出した（Ｌｅｖｅｙ  ＡＳ，Ｃｏｒｅｓｈ  Ｊ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｔ，Ｓｔｅｖｅｎｓ  ＬＡ，Ｚｈａｎｇ  ＹＬ，Ｈｅｎｄｒｉｋｓｅｎ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．  Ｕｓｉｎｇ  ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄ  ｓｅｒｕｍ  ｃｒｅｔｉｎｉｎｅ  ｖａｌｕｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｅｔ  ｉｎ  ｒｅｎａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｓｔｕｄｙ  ｅｑｕａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ  ｇｌｏｍｅｒｕｌｅｒ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｒａｔｅ．Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ．２００６；１４５（４）：２４７−５４）。全ての症例が、臨床記録に、最大３．５年の経過観察期間内にベースラインｅＧＦＲの＜６０％となる、少なくとも１回の、その後に算出されたｅＧＦＲを有した。対照的に、全ての対照を＞３．５年間追跡したが、ｅＧＦＲが彼らのベースライン値の＜８０％となることはなく、もっとも最近の追跡では、ベースライン値の＞９５％であった。ベースラインｅＧＦＲ測定の１年以内に、抗高血圧治療を受けなかった患者は全て除外した。症例では、この研究に登録後、急性腎不全のために病院に入院した患者も除外された。研究は、１５３の症例と１５４の対照からの３０７のサンプルを含んだ。
【０１３２】
本研究では、３つの主要な因子：１）腎症との関連性を示す事前の証拠、２）少量の血清サンプルで使用可能な信頼性のあるアッセイの存在、および３）利用可能な全サンプル量、に基づく一組のバイオマーカーが測定のために選択された。我々は腎機能障害に関連するものをいくつか既に知っている。我々は、２００８年〜２０１２年に発行された研究に特に焦点を合わせた文献レビューに着手し、要約が一般的な、または付随的な腎症との関連を示した入手可能な論文をレビューした。その後、我々は、一連の最終選考に取り掛かり、潜在的機序が広範囲にわたるマーカー（例えば、炎症マーカー、グリコカリックスに関連するマーカーなど）を含むことを目標とし、重要なマーカーを特定した。このフィードバックと、入手可能な少量の血清で測定できるマーカーの最良の組み合わせの実用性に基づいて、最終的に３０のバイオマーカーを選択した。
【０１３３】
バイオマーカーを３つの異なる方法により測定した：５種のバイオマーカーのレベルを、シングルＥＬＩＳＡ法、および商業的に入手可能なキットにより測定した。１４４の特定された実体を含むバイオマーカーの拡大パネルを、ＬＳ／ＭＳを使用して測定した。５８のバイオマーカーを、Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘａｓ、ＵＫ）から入手可能なｘＭＡＰ多重分析技術（ｘＭＡＰは、Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの商標である）を用いて行われる、ミクロスフェアに基づく多重化アッセイにより測定した。
【０１３４】
このように、低レベルおよび高レベルの代謝産物を含む多数のバイオマーカーを測定した。多重反応モニタリング（ＭＲＭ）モードのトリプシン消化物プロテオミクスを使用して、一連の標的ペプチドの半定量的測定を行った。いまだ正式には特性が明らかにされていないさらに１３７のバイオマーカーについては、ＬＳ／ＭＳ法により特定した。測定された２０７のバイオマーカーと、使用した検査方法の全リストを示表に示す。症例および対照を決めるために使用したｅＧＦＲは、臨床的に測定した血清クレアチニンに基づいて算出しており、また、ベースラインのクレアチニンを再測定することによって、全てのサンプルのクレアチニンの統一された測定値を有するため、我々は血清クレアチニンをパネルに含めた。
【０１３５】
【表５−１】
2017516113.tif 000011
【０１３６】
【表５−２】
2017516113.tif 000012
【０１３７】
【表５−３】
2017516113.tif 000013
【０１３８】
【表５−４】
2017516113.tif 000014
【０１３９】
【表５−５】
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【０１４０】
【表５−６】
2017516113.tif 000016
【０１４１】
【表５−７】
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【０１４２】
【表５−８】
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【０１４３】
【表５−９】
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【０１４４】
【表５−１０】
2017516113.tif 000020
【０１４５】
【表５−１１】
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【０１４６】
【表５−１２】
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【０１４７】
【表５−１３】
2017516113.tif 000023
【０１４８】
表５はまた、ＥＬＩＳＡによって測定された、さらなる少数のバイオマーカー（増殖分化因子１５、トロポニンＴ、ヒアルロン酸、糖化最終産物の可溶性受容体および形質転換成長因子ベータ３）を含む。
【０１４９】
バイオマーカーの選択に、２つの相補的な方法：ロジスティック回帰を用いる前進選択、およびＬ１（ＬＡＳＳＯ）正則化ペナルティによるスパースロジスティック回帰を使用した（Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ  Ｒ．ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｈｒｉｎｋａｇｅ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ＬＡＳＳＯ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｂ−Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｃａｌ．１９９６，５８（１）：２６７−８８）。ベースラインモデルでは、我々は、臨床試験のランダム化ステージで利用可能でありそうな臨床共変量：年齢、性別、アルブミン尿、ＨｂＡ１ｃ、ｅＧＦＲ、ＡＣＥ阻害剤の使用、およびＡＲＢの使用を用いた。受信者操作特性曲線下面積（ＡＵＲＯＣ）を性能メトリックとして使用した。全モデルが、最終モデルを交差検証した入れ子交差検証により開発した。
【０１５０】
ＬＣ−ＭＳＭＳ手順の詳細
ＬＣ−ＭＳＭＳにより、１４４の代謝産物、ペプチドおよびタンパク質の定量的および半定量的情報を得るため、２つのプロトコルを使用した。方法を、定量化されたと報告された実体の既知の基準に照らして検証した（未だ特定されておらず検証されていない実体は別として、そのうちのいくつかはｅＧＦＲと明らかに関連している他のシグナルが報告されている）。高感度血清代謝産物の推定では、３０μＬの水性標準液、対照およびサンプルを、１．８ｍＬのポリプロピレン製のスナップトップ式のＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  ｔｕｂｅに分注した。各チューブに、７５μＬの安定なメタノール／水同位体混合液１、次いで７５μＬの純メタノールを加え、チューブに蓋をし、ボルテックスミキサーで２〜５秒間攪拌し、２１，０００ｇ、４℃で６分間、遠心分離した。上清１２０μＬを９６ディープウェル（２ｍＬ）ポリプロピレンサンプルブロックに移し、密封し、８℃のオートサンプラーに入れ、ＡＰＩ５５００、Ａｎａｌｙｓｔ  １．５．２  ｃｏｎｔｒｏｌ（Ａｎａｌｙｓｔソフトウエアは、Ａｂ  Ｓｃｉｅｘ、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＵＳＡから入手可能である。ＡｎａｌｙｓｔはＳｃｉｅｘの商標である）を用いるＬＣエレクトロスプレーＭＳＭＳによる分析の準備をした。サンプルの上清（３μＬ）を自動的に注入し、クロマトグラフィを、２ｃｍ×４．０ｍｍ、５μｍのガードカラムを備えたｓｔｅｃ  Ｃｈｉｒｏｂｉｏｔｉｃ  Ｔ  ＨＰＬＣ、カラム２５ｃｍ×２．１ｍｍ、５μｍ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、ＵＳＡから入手可能）により、アイソクラチックランニング溶媒（アセトニトリル：水、１：１、ギ酸０．０２５％含有）を用い、流量２５０μｌ／ｍｉｎで行った（Ｃｈｉｒｏｂｉｏｔｉｃは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈの商標である）。ポジティブイオンＭＲＭ（多重反応モニタリング）モード、１５分間でデータを得、この後、再注入して、ネガティブイオンＭＲＭモード、９分間でデータを得た。血清トリプシンペプチドを標的としたプロテオーム解析では、１０μＬの血漿コントロールおよびサンプルを上記のように分注した。各チューブに、４０μＬの水、５０μＬの希釈した安定同位体標識アルブミンＴ６水性内部標準液、１０μＬのアセトニトリル、および１０μＬの１％ギ酸を加え、室温で５分間、オービタルシェーカーで混合した。その後、６μｍの１ＭＮＨ４ＣＯ３を各チューブに加え、ボルテックスミキサーで５秒間攪拌し、２５μＬのトリプシンを加え、ボルテックスミキサーで攪拌し、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベート後、２００μＬのランニングバッファー（アセトニトリル：水、１：１、ギ酸０．０２５％含有）を各チューブに加え、ボルテックスミキサーで２〜５秒間攪拌し、２１，０００ｇ、４℃で５分間、遠心分離した。上清２００μＬを、上記のように、９６ディープウェル（２ｍＬ）ポリプロピレンサンプルブロックに移した。上清（５μＬ）を自動的に注入し、クロマトグラフィを、直列に配置された２本の、２ｃｍ×４．０ｍｍ、５μｍのＡｓｔｅｃ  Ｃｈｉｒｏｂｉｏｔｉｃ  Ｔ  ＨＰＬＣ  ガードカラム、カラム２ｃｍ×４．０ｍｍ、５μｍ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、ＵＳＡから入手可能）により、��イソクラチックランニング溶媒（アセトニトリル：水、１：１、ギ酸０．０２５％含有）を用い、流量３２０μｌ／ｍｉｎで行った。データを、Ａｎａｌｙｓｔ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １．５．２およびＭｕｌｔｉＱｕａｎｔ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．１で解析した（Ｍｕｌｔｉ−ＱｕａｎｔはＡｂ  Ｓｃｉｅｘ、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＵＳＡから入手可能であって、その商標である）。
【０１５１】
Ｍｙｒｉａｄ  ＲＢＭ（ＭＲＢＭ）プラットフォームの詳細：
ｘＭＡＰ多重アッセイ技術（Ｌｕｍｉｎｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘａｓ）に基づく、多重ミクロスフェアに基づくアッセイ、およびシングルチップ上のバイオマーカー群（Ｍｙｒｉａｄ  ＲＢＭ、Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘａｓ）の組み合わせアッセイを、光学分類スキーム、生化学的アッセイ、フローサイトメトリー、ならびにデジタル信号処理のハードウエアおよびソフトウエアを組み合わせることによって、単一反応容器において行った。（多重化は、各分析物特異的アッセイに、固有の蛍光サインで標識したミクロスフェアセットを与えることによって行う。明らかなミクロスフェアサインを得るために、２種の蛍光染料、赤色および遠赤色の染料を、それぞれ様々な強度レベルによる様々な組み合わせで混合する。各バッチまたはミクロスフェア群を、ミクロスフェアにこれらの染料の組み合わせの１つを含浸させることによって、蛍光サインでコードする。コード化後、アッセイに固有の捕捉剤（すなわち、抗原、抗体、受容体、ペプチド、酵素基質など）を、それぞれ固有のミクロスフェア群の共有結合的に接合する。ミクロスフェアへの捕捉剤の共有結合は、標準的なカルボジイミド化学で行う。各アッセイのパラメータを個々に最適化した後、マルチアナライトプロファイルを、９６または３８４ウェルのフォーマットマイクロタイタープレートの単一ウェル内で、異なるミクロスフェア群を混合することによって行う。少容量のサンプルをウェルに加え、ミクロスフェアと反応させた。各個々のミクロスフェア上のアッセイに固有の捕捉剤が対象の被検物質と結合する。アッセイに固有のビオチン化検出剤（例えば、抗原、抗体、リガンドなど）の混合物を、ミクロスフェア混合物と反応させ、次いで、蛍光「レポーター」分子（通常、フィコエリトリン）標識ストレプトアビジンと反応させた。ミクロスフェアは懸濁しているため、アッセイ動態は溶液相に近い。最後に、マルチプレックスを洗浄して、結合していない検出剤を除く。洗浄後、ミクロスフェア混合物をＬｕｍｉｎｅｘ  １００／２００ＴＭ装置により解析した。フローサイトメトリーと同様、装置は、２条のレーザービームにミクロスフェアを一列で通過させることに焦点を置く流体力学を使用する。各個々のミクロスフェアは、励起ビームを通過するので、サイズ、コードされた蛍光サイン、および被検物質に比例して生ずる蛍光量が解析される。得られたデータ流を、Ｍｙｒｉａｄ  ＲＢＭ（Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘａｓ、ＵＳＡ）で開発された、独占所有権のあるデータ解析ソフトウエアを使用して翻訳する。高比重多重パネルでアッセイを行い、最小可検量（ＬＤＤ）を、２０のブランク読取りの平均値＋３標準偏差として求めた。ＬＬＯＱを、被検物質の濃度によって決定した。被検物質の測定値は３０％の変動係数（ＣＶ）を示す。それは、３０％またはそれより良好な精度で測定され得る被検物質の最小濃度を示す。アッセイの限界内での定量的測定を保証するために、適当な希釈を行った。各サンプルの定量的測定値を得るために、８（ｎ＝８）点標準曲線（Ｓ１〜Ｓ８）を使用した。各被検物質の精度および正確さを確保するために、物質管理（ＱＣ）を、曲線の異なる点で繰り返し行う。
【０１５２】
臨床共変量
ＨｂＡ１ｃおよび血清クレアチニンを、サンプル採取日に、ルーチンの臨床試験の一部として、標準臨床検査法により測定した。アルブミン尿は、サンプル採取前５年間のカルテに記録された微量アルブミン尿の最も高い測定値に基づいた。微量アルブミン尿陰性で標準カットポイント＜２０ｍｇ／ｍｌ、微量アルブミン尿で２０〜２００ｍｇ／ｍｌ、顕性アルブミン尿で＞２００ｍｇ／ｍｌを使用した。微量アルブミンが測定されなかった場合、状態は微量アルブミン尿陰性とした。ＡＣＥ阻害剤またはアンジオテンシン受容体遮断薬（ＡＲＢ）の使用が、プライマリーケアの処方箋データを使用して決定した。
【０１５３】
統計的方法
データのクリーニングおよびインピュテーション
バイオマーカーアッセイのデータのクリーニングおよびインピュテーションを解析前に行った。２８のバイオマーカーが、測定値の＞８０％が検出閾値未満であるか、または全欠損が＞８０％であり、したがって、これらのバイオマーカーは全ての解析から除外した。アデノシンは、アッセイの検出レベルを超える測定値のサンプルが＜１００未満であり、それで、検出限界未満、検出限界を超えるが中央値未満、および中央値超のレベルからなる、秩序だったカテゴリー変数として示す。新規のこれまでに報告されていないスパース反復回帰モデルが、検出閾値であるか、またはランダムに欠損しているため、バイオマーカー測定値欠損のインピュテーションのために使用した。各欠損測定値を、観察され、かつ補完された値から、Ｌ１正則化線形モデルおよび一般化線形モデル、測定値の事前分布の補正によりくり返し予測した。フラットな事前分布を、ランダムに欠損する値を補完するために使用し、連続する途中打ち切り値（これは、検出限界での外部からのスパイクを回避するのを助けた）を補完するために、有界パレート事前分布に使用した。一組の臨床共変量（サンプル中のクレアチニンおよびシスタチンＣを含む）をまず補完した。残りのバイオマーカーは、欠損値の再構成、ならびに欠損タイプおよびバイオマーカーアッセイで提供された低検出限界と高検出限界に関する情報において入手可能な全てのデータ（補完臨床共変量を含む）を用いて補完した。この方法は、ハードウエアおよび／またはランダムな欠損により打ち切られるバイオオマーカーの同時補完を可能にし、特徴選択法によるバイオマーカーのパネルの特定のために必要な要件である。
【０１５４】
データ解析
バイオマーカーの選択に２つの相補的な方法：ロジスティック回帰を用いる前進選択、およびＬ１（ＬＡＳＳＯ）正則化ペナルティによるスパースロジスティック回帰を使用した（Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ  Ｒ．Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｈｒｉｎｋａｇｅ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ＬＡＳＳＯ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｂ−Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｃａｌ．１９９６，５８（１）：２６７−８８）。両方法は、臨床共変量（年齢、性別、ＨｂＡ１ｃ、腎疾患における食事の４つの可変改善（ＭＤＲＤ４）方程式により算出されたｅＧＦＲ、アルブミン尿、およびＡＣＥ阻害剤またはＡＲＢの使用）の調整を用いた。
【０１５５】
モデルの選択前に、我々は２つのフィルタリング工程を含めた。工程１では、＞０．９の相関関係を有するバイオマーカー全てを特定し、各対で単一のバイオマーカーを残した。第２の工程は、トレーニングセットデータを使用し、転帰と単変量の関連を有するバイオマーカーを特定し、最も強い関連性を有する５０のバイオマーカーを選択した。この第２のフィルタリング工程を含めるかまたは除く場合の予測をモデルで評価し、最も良い性能がフィルタリングを行ったモデルで見られることがわかった。
【０１５６】
前進選択法は、まず上述の臨床共変量を含む予測材料の初期パネルから始め、バイオマーカーを１つずつ、予測性能における相対的な改善の大きさによりランク付けを行うことによって、パネルに加えた。選択の基準は、検証データセットに対するロジスティック回帰の条件付き尤度の増加の有意性に基づき、各反復において、３０−インナー分割交差検証を使用した。バイオ−マーカーによる改善の有意性は、対サンプルが、固定検証ホールドのバイオマーカーの有り無しの両方のモデルの検証尤度である対片側ｔ検定により評価した。選択プロセスは、検証対数尤度の０．５またはそれ以上のさらなる増加がなくなったとき、終了した。
【０１５７】
使用した他の方法は、全共変量を同時に使用するスパースロジスティック回帰に基づいた。この代替方法では、分類／回帰モデルのパラメータにスパーシティインデューシングプライアーを課すことによって、マーカーのサブセットを特定した。Ｌ１（ＬＡＳＳＯ）正則化を使用した。この方法は、高次元統計および機械学習において検証が最も進んだ方法の一つである（Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ  Ｒ．Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｈｒｉｎｋａｇｅ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ＬＡＳＳＯ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｂ−Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｃａｌ．１９９６，５８（１）：２６７−８８）。スパーシティハイパーパラメータは、３０−分割交差検証により得た。臨床因子とは無関係に、腎機能低下の急速な進行を予測する非冗長タンパク質マーカーのサブセットを特定するために、臨床因子が罰せられない、すなわち、それらは常に、結果として生ずる共変量の集団に残ると仮定した。これはまた、前進選択によって得られるバイオマーカーパネルとの比較を容易にする。
【０１５８】
前進選択とスパースロジスティック回帰をガウシアン化データに適用した。ガウシアン化は、連続確率変数を、正常に分布した周辺分布を有するように変換する。それは、多くのデータセットにおいて、統一モデルより、より良好な密度推定に導き（Ｃｈｅｎ  ＳＳＢ，Ｇｏｐｉｎａｔｈ  ＲＡ．Ｇａｕｓｓｉａｎｉｚａｔｉｏｎ．Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  １３．２００１；１３：４２３−９）、統一パラメータモデルを極値によって引き起こされるエラーに対しより安定化させ得る。
【０１５９】
前進選択およびスパースロジスティック回帰によって作成されたバイオマーカーパネルの性能を評価するため、入れ子交差検証を５０アウターホールドで使用した。アウターホールドによるテストデータを、結果として生ずるバイオマーカーパネルの予測品質を評価するために純粋に使用し、モデルパラメータ／ハイパーパラメータを得るか、パネルを特定するために触れなかった。テストデータのＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＲＯＣ）を性能基準として使用した。最高スコアリング法を、完全なデータセットを用いる最終バイオマーカーパネルの選択に再び適用し、得られるバイオマーカーの要約統計量を報告した。
【０１６０】
全データの作成と解析を、Ｒ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．１５．２を用いて行った（Ｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｅ  Ｔｅａｍ：Ａ  ｌａｎｇｕａｇｅ  ａｎｄ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ：Ｒ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ；２０１３）。
【０１６１】
バイオマーカーの特定におけるボトルネックの対処方法
高次元の予測に最も有用な方法は、スパーシティの考えを使用することであり、そこでは、対象予測材料は、それらが予測を改善するとデータにより確認されなければ、自動的に除かれる。しかしながら、これらの方法をバイオマーカーの特定およびリスク評価に適用するのは、以下の理由から限られる。重要でない共変量を除くことを学ぶことによって、（ａ）方法は、有用なバイオマーカーの効果を過小評価（「オーバー収縮」）する傾向があり、これは予測の品質を低下させる；（ｂ）バイオマーカーの測定が、多くのランダムかつ体系立てられた原因のために欠測し得るとき（これは、高次元バイオマーカー予測では、ほぼ全ての場合である）その方法を適用することができない；（ｃ）方法は単純な終点（すなわち、症例および対照が一般化線形モデルによって良好に分離される状況において）の予測にほぼ適用可能である。
【０１６２】
我々は、複雑な終点を予測するためのスパース予測法の３つの実際的なボトルネックを全て克服した。我々は、オーバー収縮問題（ａ）が、重要でないマーカーをパネルから除き、同時に残ったマーカーを組み合わせようとすることによって引き起こされると仮定する。我々は、選択法を、この分野で熟練した研究者により選択され、必要に応じて、プレフィルタリング法と組み合わせた少数の対象マーカー群に重点を置くことによってそれを解決した。この２層の特徴選択手順は仮設空間を減じ、個々の予測バイオマーカーの選択を非冗長バイオマーカーの組み合わせを特定することから切り離す。手順は従来の知識を使用するので、試料サイズが、仮設空間のサイズより小さいときでも、提案された研究の場合のように、適用することができる。我々は、この手順が、予測の質の冗長性の実質的減少および／または改善をもたらすことを示した。
【０１６３】
我々は、問題（ｂ）を、異種の原因の混合によるバイオメーカー測定の欠測（例えば、ランダムな欠測、または濃度が測定ハードウエアにより検出できないことによる欠測）を補完する新規な方法を提案することによって解決した。この方法は、最もエラーを起こす可能性の高い検出閾値（例えば、商業的に入手可能なパッケージのいくつかによって作成される）の外部モードを回避し、完全な症例解析の限られたサンプルサイズの問題を克服するのを助ける。
【０１６４】
我々は、既存のデータセットにより、予測により適している可能性の高い臨床的に関連のある終点を特定することによって問題（ｃ）に対処した。特に、解析を、症例／対照の状態よりむしろ、糖尿病性腎症の急速な進行の予測に重点を置くことにより、極端な症例のほぼ線形の分離をもたらした。したがって我々の方法は、バイオマーカー特定のための一般的な方法の実用上のボトルネックを克服する。
【０１６５】
結果および結論
測定された２０７のバイオマーカー中の３６が、単変量交差検証ロジスティック回帰モデルにおいて、腎機能低下の進行と大きな関連性があった。入れ子５０分割交差検証を使用して、前進選択およびトップダウンアプローチにより特定された一連のバイオマーカーパネルの予測性能を評価した。予測を改善する最良の「スパース」バイオマーカーパネル（＜１５のバイオマーカーを含む）は、前進選択により特定されたパネルであった。しかし一方、トップダウンアプローチにより特定された３４のバイオマーカーからなるより拡大されたパネルを使用することによって、予測は最大となった。
【０１６６】
臨床共変量単独の場合と比較した、２つのパネルの予測における改善を図４に示す。臨床共変量（２００）単独では、ＡＵＲＯＣは０．７０６であったが、スパースパネル（２０１）を加えると、これが０．８７２に上昇し、拡大パネル（２０２）を加えると、ＡＵＲＯＣは０．８８５とさらに上昇した。これは、バイオマーカーパネルが、臨床共変量単独の場合と比べて、急速な腎不全のリスクの予測を大きく改善できること示している。
【０１６７】
２つのパネルに含まれるバイオマーカーを上の表１および表３に示す。前進選択により選択された１４のバイオマーカーと、ロジスティック回帰モデルにおいて相互にかつ臨床共変量によって補正した、それらの急速な進行との関連性を表１および表２に示す。パネル中のバイオマーカーの全てではないが、ロジスティック回帰モデルにおいて大きなオッズ比（ＯＲ）を有するが、各バイオマーカーの存在は、モデル全体の予測力を増大させる。
【０１６８】
これらのバイオマーカーは、シスタチン−Ｃがトップダウンで選択されるが、ベータ−２−ミクログロブリンが、それに代えて前進選択において選択されることを除いて、大部分がトップダウン回帰により選択された、予測が最大の３５のバイオマーカーからなるパネルの一部であり、表３および表４に示す。これらのバイオマーカー間の非常に高い相関性は、それらが完全に交換可能であることを意味する。また、アドレノメデュリンは、他のバイオマーカーで補正したとき、進行と弱い関連性を示し、トップダウン選択では選択されなかった。
【０１６９】
拡大臨床共変量に加えて前進選択パネルで選択された７つのバイオマーカーは、１４のバイオマーカーからなるパネルの一部−ＫＩＭ−１、ＳＤＭＡ：ＡＤＭＡ比、ベータ２−ミクログロブリン、アルファ−１アンチトリプシン（２）、Ｃ−１６アシルカルニチン、繊維芽細胞増殖因子−２１（ＦＧＦ−２１）およびウラシルである。このように、より広範囲の臨床共変量データが存在した場合に、これらのバイオマーカーは予測を十分に改善し得る。
【０１７０】
したがって、臨床共変量に加え、性能の特性が明らかにされ、腎機能低下の急速な進行の予測を大きく改善する２通りの新規な非冗長バイオマーカーのパネルが作成された。これは、急速な腎機能低下の高いリスクを持った人々を適正に識別できることが、そのような人々による臨床試験を強化し、それ故、これらの試験の効率および費用を節約できることから、有用である。
【０１７１】
バイオマーカーの新規な組み合わせは、糖尿病患者の腎機能低下の急速な進展の予測を改善する。これは、急速な低下リスクが非常に大きい患者の特定が、臨床の場で有効であるだけでなく、集める必要のある人数および要求される追跡期間の減少において、臨床試験の力を大きく改善しうることから、興味深いことである。現在の臨床試験は、既存の腎機能およびやアルブミン尿などの知られたリスク要因に基づいて人が集められているが、２、３年の間に進行する患者で強化することができれば、研究に参加する必要のある患者数を減らし、臨床試験を実施する費用を大きく削減することができるであろう。
【０１７２】
重要なことは、バイオマーカーの使用が、ｅＧＦＲを含むベースライン臨床共変量を含むモデルによる腎機能の急速な進行の予測を改善することである。これは、これらのバイオマーカーの一部または全てが、腎機能の急速な低下リスクが非常に大きい患者を特定する上で有用である可能性を示している。
【０１７３】
以前の臨床測定、特に旧アッセイに基づく測定による均一にアッセイされたな測定の恩恵を示す共変量として、ＧＦＲ（一般に、血清クレアチニンの測定値に基づく）を含むにもかかわらず、拡大パネルに血清クレアチニンが含まれることは、注目すべきことである。我々のベースラインサンプルの大半はＩＤＭＳ法に準拠したクレアチニンアッセイを採用する前に集められた。しかしながら、いくつかは、アッセイのスイッチは、追跡期間中に生じたであろう。ＩＤＭＳ法に準拠したクレアチニン値は、旧アッセイ１０より低い値になる傾向があり、これは、むしろ、我々が、人為的に事例性の基準を満たす人をもたらすよりむしろ、症例を失ったことを意味することになろう。
【０１７４】
２つのパネルに含まれるバイオマーカーには、シスタチンＣなどの腎機能に関連するものとして既に十分に確立されているものを含まれるが、Ｃ−１６アシルカルニチンおよび線維芽細胞増殖因子２１などの新規な関連物質も含まれる。
【０１７５】
追加情報
３０７人の患者（１５３人の症例、１５４人の対照）で１７９のバイオマーカーの測定が、２つのバイオマーカーの比（シンメトリックジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）：アシンメトリックジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ））と共に含まれた。症例では、ｅＧＦＲの中央値の変化が、１．９年の平均追跡期間（ＩＱＲ１．２，２．６）で−４５．２％（ＩＱＲ−５０．５，−４２．０）であった。対照では、追跡終了時のｅＧＦＲの中央値の変化が、５．８年の平均追跡期間（ＩＱＲ５．５，６．２）で＋１６．５％（ＩＱＲ＋４．９，＋３２．４％）であった。症例および対照の全てがベースライン（すなわち、ｅＧＦＲが３０〜６０ｍｌ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２）のＣＫＤ３を有するにもかかわらず、症例のベースラインのｅＧＦＲの中央値はより低い値であった。（すなわち、４８．２１ｍｌ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２対５１．３４ｍｌ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２）。さらに、症例は、平均して、対照より年齢が高く、糖尿病罹患期間が長く、かつ、男性、元喫煙者、網膜症の病歴を有する者、および過去５年間に微量または顕性アルブミン尿の症状を発現した者である可能性が高かった（表７）。
【０１７６】
血清クレアチニンの新しい測定値が、サンプル採取時に測定され記録されたクレアチニン値と強い相関があった（ｒ＝０．８９）。しかしながら、ベースラインｅＧＦＲで補正後でも、それは事例性と依然として大きな関連があった。ｅＧＦＲの測定は、サンプル採取時に、その時の標準の臨床アッセイ（研究採用時、主に、真のクレアチニン値より過大に推定されることが知られているアルカリ性ピクリン酸法（ＰＡＲＴ  ５．ＥＶＡＬＵＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＥＡＳＵＲＥＭＥＮＴＳ  ＦＯＲ  ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＡＳＳＥＳＳＭＥＮＴ  ＯＦ  ＫＩＤＮＥＹ  ＤＩＳＥＡＳＥ．ＫＤＯＱＩ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｓｔｒａｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ２００２，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋｉｄｎｅｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌｓ／ｋｄｏｑｉ／ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓｃｋｄ／ｐ５１ａｂｇ４．ｈｔｍから入手可能）により測定された血清クレアチニンを使用して算出されていることから、これは驚くことではない。
【０１７７】
含まれる多くのマーカー間で高レベルの相関がある（データは示されていない）。２つのマーカーが強い相関（＞０．９）を示した場合、我々は、その対から単一のバイオマーカー選択し、モデルに含めた（データは示されていない）。症例および対照の両方で、測定されたバイオマーカーの濃度の中央値を、上の表５に示し、各マーカー単独の関連性を、全臨床共変量で補正した一連のロジスティック回帰モデルで評価した（表５）。多くのバイオマーカーが、腎機能低下の急速な進行と関連性がある証拠を示した（４６のバイオマーカーが、＜０．０１のｐ値を有した）。
【０１７８】
バイオマーカー選択パネル
フィルタリング工程が解析するバイオマーカーの数を減らすために使用された。これは、急速に進行するリスクと関連する上位５０のバイオマーカーを選択するフィルタリング工程で行われた。これは、前進選択またはトップダウンモデルのフィッティングの前のトレーニングホールドにおいてなされた。下の表６に、フィルタリング工程後に残った５０のバイオマーカーと、それらの急速に進行するリスクとの関連性を示す。表は、全試験ホールドにわたる各マーカーの対数尤度検定の差の中央値によって並べられている。再度、ｐ値＜０．０５に相当する、対数尤度検定の差の中央値が＞２の４６を含む、腎機能低下の進行との単変量関連性を示す多くのマーカーがある。
【０１７９】
【表６−１】
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【０１８０】
【表６−２】
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【０１８１】
【表６−３】
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【０１８２】
選択バイオマーカー
各モデルの性能が、入れ子交差検証されたモデルを用いたＡＵＲＯＣを計算することによって評価された。交差検証は、新しいデータセットで見られた結果を反映する可能性がより高いＡＵＲＯＣによる、より安定な推定を可能にする。図３に、モデルタイプ（前進選択またはトップダウン）によるＡＵＲＯＣにおける差、および、トップダウンモデルでは、各モデルに認められたバイオマーカーの数によるＡＵＲＯＣにおける差を示した。概して、最大のＡＵＲＯＣを有するモデルは、３５のバイオマーカーの最大値（ＡＵＲＯＣ＝０．８８５）に限られたトップダウン限定臨床共変量モデルであった。「スパースバイオマーカーパネル（＜１５のマーカー）の最良のＡＵＲＯＣは、１４のバイオマーカーを含む前進選択モデルによって達成される。一方、全体の最良モデルは、３５のバイオマーカーの最大値（ＡＵＲＯＣ＝０．８８５）に限られたトップダウン限定臨床共変量モデルである。図６は、ベースライン共変量モデルで予測されたスパースおよび拡大バイオマーカーセットのＡＵＲＯＣ曲線を示す。
【０１８３】
表２は、バイオマーカーのスパースパネルのオッズ比を示し、表４は、バイオマーカーの拡大パネルのオッズ比を示す。スパースパネルの２つのバイオマーカー（アドレノメデュリンおよびベータ−２ミクログロブリン）以外は全て、拡大パネルにある。両パネルで個々のバイオマーカーが、ｐ値を基準として使用する進行と大きく関連しているとは限らないものの、パネルの予測に寄与していることに留意することは重要である。また、拡大パネルでは、マーカー間の強い相関関係と共直線性が、正確なオッズ比の推定を困難にしている。
【０１８４】
さらなる結果
概して、ベースラインでＣＫＤ３のＧｏ−ＤＡＲＴＳ集団の１２．５％が、３．５年以内にベースラインｅＧＦＲの＞４０％を損失し、したがって、症例と定義された。研究集団のベースラインのデモグラフィックが、下記の表７に示されている。症例は、追跡期間の間、ｅＧＦＲが安定している対照に比べ、糖尿病期間がより長く、アルブミン尿および網膜症の罹患率がより高く、そしてベースラインのｅＧＦＲ中央値がわずかに低かった。
【０１８５】
【表７】
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【０１８６】
データ整理工程
測定した２０７のバイオマーカーを全て、表５に示す。この初期パネルから、我々は、４２のバイオマーカーを、そのバイオマーカーの検出可能なレベルの患者がほとんどいないか（ｎ＝２２）、そのバイオマーカーが他のバイオマーカーと高い相関がある（ｒ＞０．９）か（ｎ＝１５）、またはサンプル容量が適切ではない解析のために得られる結果が少な過ぎる（ｎ＝５）ために、有用な情報が得られないとして、さらなる解析から除外した。これにより１６５のバイオマーカーが残り、さらに、１６６の測定を与えるシンメトリックジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）とアシンメトリックジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）との比を評価した。これらのバイオマーカーと連続する臨床共変量の相関行列を計算した。測定したバイオマーカーの多くは、互いに強い相関関係があった。注目すべきことに、シスタチンＣとベータ２−ミクログロブリンは、高い相関性を示した（ｒｈｏ＝０．８６）。
【０１８７】
単変量関連性
図３のボルケーノプロットは、単独で評価され、ベースラインの年齢、性別、ｅＧＦＲ、アルブミン尿、ＨｂＡ１ｃ、ならびにＡＣＥ阻害剤およびアンジオテンシン受容体遮断薬の使用で補正した１６６バイオマーカー全ての急速な進行との関連性を示す。シスタチンＣとベータ２−ミクログロブリンは、非常に大きい相関関係があり、標準偏差当たりの効果量が類似している。我々は、さらなる評価のために６３のバイオマーカーを、単独で評価された各バイオマーカーの初期交差検証ロジスティック回帰において、少なくとも関連性の示唆的証拠を有するとして、残した。下の表８は、単独で試験された臨床共変量の調整で、フェローニ補正された有意水準（ｐ＜０．０００８）に達した、この６３のセットのバイオマーカーを示す。
【０１８８】
【表８−１】
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【０１８９】
【表８−２】
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【０１９０】
【表８−３】
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【０１９１】
【表８−４】
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【０１９２】
バイオマーカーパネル性能
図６Ａは、終了基準を固定した前進選択プロセスによって選択されたバイオマーカーパネルの性能、および、スパーシティコンストレイントを変えて行う、すなわち、種々の数の残されたバイオマーカーで終了するように設定されたトップダウン選択プロセスによって選択されたバイオマーカーパネルの性能を示す。臨床共変量のみを含むモデルのＡＵＲＯＣは０．７０６であった。前進選択プロセスは、残された６３のバイオマーカーのうちの１４を、臨床共変量より予測の改善に貢献することから選択された。これは、ＡＵＲＯＣを０．８６８に実質的に増加させた。図に示すように、トップダウン法により、選択したバイオマーカーの数に応じて、最大０．８９２のＡＵＲＯＣに達する様々な程度に、性能を改善することができた。しかし、これを達成するのに３５のバイオマーカーという大きなセットが必要であった。
【０１９３】
ＧＯ−ＤＡＲＴＳデータセットは、プレベースラインの数年間の既往の臨床データを含み、それで、我々はさらに、長期ｅＧＦＲ（フルリストの方法を参照）プレベースラインを含む臨床共変量データの拡大セットを使用することによってなされたそれを超える予測に対するバイオマーカーの寄与を調べた。この拡大臨床データセットは、基本の臨床共変量モデルより、実質的に高い予測を示した（それぞれ、ＡＵＲＯＣ＝０．７９３対０．７０６）。図６Ｂに示すように、選択バイオマーカーの追加は、前進選択によって選択された７のバイオメーカーからなるパネルで、ＡＵＲＯＣが０．７９３から０．８５９へとさらに増加し、２５バイオマーカーを残すトップダウン選択で、０．８６８の最大ＡＵＲＯＣが達成された。少なくとも８のバイオマーカーの使用は、臨床共変量なしでＡＵＲＯＣを大きく改善し、少なくとも１０で特に大きく増加した。
【０１９４】
図７Ａは、１４のバイオマーカーからなる前進選択パネルのＡＵＲＯＣ曲線と、３５のバイオマーカーのトップダウン選択のＡＵＲＯＣ曲線を示す。しかしながら、臨床試験の患者の選択におけるバイオマーカーの潜在的価値を要約する有用な測定基準は、所与の潜在的な臨床試験集団においてバイオマーカーパネルを使用することによってなされる「予測される事象率の向上」である（図７Ｂ）。例えば、Ｇｏ−ＤＡＲＴＳコーホートでは、３０〜６０ｍｌ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２のｅＧＦＲベースライン登録基準を満たす人のちょうど１２．５％が、３．５年以内に症例になった。このように、リスク分類によるいかなる選択もしない場合（図７Ｂのｙ軸＝１）の、進行の予想される累積発生率は１２．５％（ｘ軸）である。プロットは、選択により、臨床共変量と選択されたバイオマーカーを組み合わせるモデルのスコアに基づく患者の上位２０％（ｙ軸＝０．２）が、急速な進行の累積発生率を＞６０％まで高めることができたことを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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