(57)【要約】  一態様において、本開示は、ヘパリンを製造するための方法、細胞およびトランスジェニック非ヒト哺乳動物、細胞およびそのトランスジェニック非ヒト哺乳動物、ならびに、これらの細胞またはトランスジェニック非ヒト哺乳動物から得られるヘパリンを提供する。
2017503490.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳中にヘパリンを産生する非ヒトトランスジェニック哺乳動物を用意する工程、および
前記トランスジェニック哺乳動物の乳腺で生成された乳からヘパリンを採取する工程
を含む、ヘパリンの製造方法。
【請求項２】
乳腺中に１種以上のへパリン生合成酵素を発現するように改変された非ヒトトランスジェニック哺乳動物を用意する工程、および
前記トランスジェニック哺乳動物の乳腺で生成された乳からヘパリンを採取する工程
を含む、ヘパリンの製造方法。
【請求項３】
乳腺中に１種以上のへパリン生合成酵素とコアタンパク質とを発現するように改変された非ヒトトランスジェニック哺乳動物を用意する工程、および
前記トランスジェニック哺乳動物の乳腺で生成された乳からヘパリンを採取する工程
を含む、ヘパリンの製造方法。
【請求項４】
前記トランスジェニック哺乳動物が有蹄動物である、請求項１〜３いずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記有蹄動物がヤギである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記有蹄動物がウシである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
１種以上のへパリン生合成酵素を発現するように改変された乳腺上皮細胞を用意する工程、および
前記乳腺上皮細胞からヘパリンを採取する工程
を含む、ヘパリンの製造方法。
【請求項８】
１種以上のへパリン生合成酵素とコアタンパク質とを発現するように改変された乳腺上皮細胞を用意する工程、および
前記乳腺上皮細胞からヘパリンを採取する工程
を含む、ヘパリンの製造方法。
【請求項９】
乳中にヘパリンを産生するトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項１０】
乳腺中に１種以上のヘパリン生合成酵素を発現するように改変されている、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項１１】
乳腺中に１種以上のヘパリン生合成酵素とコアタンパク質とを発現するように改変されている、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項１２】
請求項９〜１１いずれか１項記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項１３】
１種以上のヘパリン生合成酵素を発現するように改変されている、乳腺上皮細胞。
【請求項１４】
１種以上のヘパリン生合成酵素とコアタンパク質とを発現するように改変されている、乳腺上皮細胞。
【請求項１５】
１種以上のヘパリン生合成酵素が乳プロモータの制御下にある、請求項１〜８いずれか１項記載の方法、請求項９〜１２何れか１項記載の哺乳動物、あるいは請求項１３または１４記載の細胞。
【請求項１６】
前記乳プロモータがヤギβ−カゼインプロモータである、請求項１５記載の方法、哺乳動物または細胞。
【請求項１７】
請求項１〜８、１５および１６いずれか１項記載の方法により製造されたヘパリン。
【請求項１８】
請求項１７記載のヘパリンを含む組成物。
【請求項１９】
乳をさらに含む、請求項１８記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｐａｒｉｎ」という名称で２０１３年１２月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／９２０，５０５号の米国特許法第１１９条（ｅ）項の下での利益を主張し、この仮特許出願はその全体が参照により本願明細書に組み込まれる。
【技術分野】
【０００２】
本開示は、生物学的化合物の遺伝子導入による製造(transgenic production)の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
ヘパリンは、抗凝血剤として広く使用されている複合グリコサミノグリカンである。ヘパリンは、一般に、動物の腸またはウシの肺から採取されている。しかしながら、ヘパリンの汚染という問題がある。したがって、ヘパリンの新規な製造方法が求められている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
一態様において、本開示は、ヘパリンを製造するための方法、細胞およびトランスジェニック哺乳動物(transgenic mammals)を提供する。一実施形態において、乳中にヘパリンを生成するトランスジェニック非ヒト哺乳動物が提供される。一実施形態において、乳腺中に１種以上のへパリン生合成酵素を発現するように改変されたトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用意する工程と、そのトランスジェニック哺乳動物の乳腺で生成された乳からヘパリンを採取(harvest)する工程とを含む、ヘパリンの製造方法が提供される。一実施形態において、乳腺中に１種以上のへパリン生合成酵素とコアタンパク質とを発現するように改変されたトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用意する工程と、そのトランスジェニック哺乳動物の乳腺で生成された乳からヘパリンを採取する工程とを含む、ヘパリンの製造方法が提供される。
【０００５】
他の態様において、１種以上のへパリン生合成酵素を発現するように改変された乳房上皮細胞を用意する工程と、その乳房上皮細胞からヘパリンを採取する工程とを含む、ヘパリンの製造方法が提供される。一実施形態において、１種以上のへパリン生合成酵素とコアタンパク質とを発現するように改変された乳房上皮細胞を用意する工程と、その乳房上皮細胞からヘパリンを採取する工程とを含む、ヘパリンの製造方法が提供される。
【０００６】
他の態様において、乳腺中に１種以上のへパリン生合成酵素を発現するように改変されたトランスジェニック非ヒト哺乳動物が提供される。一実施形態において、乳腺中に１種以上のへパリン生合成酵素とコアタンパク質とを発現するように改変されたトランスジェニック非ヒト哺乳動物が提供される。
【０００７】
他の態様において、１種以上のへパリン生合成酵素を発現するように改変された乳房上皮細胞が提供される。一実施形態において、１種以上のへパリン生合成酵素とコアタンパク質とを発現するように改変された乳房上皮細胞が提供される。
【０００８】
一実施形態において、トランスジェニック哺乳動物は有蹄動物である。他の実施形態において、有蹄動物はヤギである。他の実施形態において、有蹄動物はウシである。
【０００９】
提供される方法、細胞または哺乳動物の１つの実施形態において、ヘパリン生合成酵素は、四糖プロデューサ(tetrasaccharide producers)、繰り返し単位プロデューサ(repeating unit producers)、繰り返し単位モディファイア(repeating unit modifiers)、エピメライザー(epimerizers)、硫酸化酵素(sulfation enzymes)および補助的酵素（supporting enzymes）からなる群から選択される。他の実施形態では、四糖プロデューサは、ＸＴＩＩ、ＧａｌＴ−１またはＧｌｃＡＴ−１である。他の実施形態では、繰り返し単位プロデューサは、ＥＸＴ１ポリメラーゼおよびＥＸＴ２ポリメラーゼである。他の実施形態では、繰り返し単位モディファイアは、ＮＤＳＴＩおよびＮＤＳＴＩＩである。他の実施形態では、エピメライザーは、Ｃ５エピメラーゼである。他の実施形態では、硫酸化酵素は、３−ＯＳＴ、６−ＯＳＴまたは２−ＯＳＴである。他の実施形態では、補助的酵素は、ＵＤＰＧＤＨである。
【００１０】
提供される方法、細胞または哺乳動物の１つの実施形態において、１種以上のへパリン生合成酵素およびコアタンパク質は、ＧＰＩ（グリコシルホスファチジルイノシトール）アンカーが操作されるように改変されている。一実施形態において、ＧＰＩアンカーは、膜を標的にするため、コアタンパク質に付加される。他の実施形態において、ＧＰＩアンカーは、乳中に分泌物を放出させるために除去される。他の実施形態において、へパリン生合成酵素およびコアタンパク質は、へパリンおよび生合成酵素が脂肪球皮膜で産生されるように改変されている。他の実施形態において、１種以上のへパリン生合成酵素は乳プロモータの制御下にある。他の実施形態では、乳プロモータは、ヤギβ−カゼインプロモータである。
【００１１】
一態様において、提供される方法で製造されるヘパリンが提供される。
【００１２】
本発明の各限定は、本発明の様々な実施形態を包含し得る。したがって、任意の一構成要素または構成要素の組合せを含む本発明の各限定が、本発明の各態様に含まれ得ることが予想される。本発明は、その適用において、以下の説明に記載された、または図面に示された構成の詳細や構成要素の配置に限定されない。本発明は他の実施形態が可能であり、様々な方法で実施または実行することができる。また、本明細書中で使用されている句や用語は説明を目的としたものであって、限定するものとして見なされるべきものではない。
【００１３】
図面は単に説明するためのものであって、開示の可能性に必要なものではない。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、ヘパリンの生合成経路の概略図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
一態様において、本開示は、ヘパリンを製造するための方法、細胞、およびトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。ヘパリンの投与が、時に非常に重篤になり得る、出血、点状出血、紫斑病または斑状出血などの副作用を引き起こし得ることがこれまでに報告されているが、驚いたことに、低用量および中用量の全身および乳腺注入されたヘパリンは、哺乳動物の健康や乳生産に最小限の影響しか与えず、トランスジェニック哺乳動物におけるヘパリンの産生を可能にすることが、本明細書中に示されている。
【００１６】
ヘパリンは、二糖単位の繰り返しで構成される多価陰イオン性で多様な直鎖多糖類からなるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）ファミリーの一員である。ヘパリンの主な二糖は、Ｌ−イズロン酸（ＩｄｏＡ）およびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、またはＤ−グルクロン酸（ＧｌｃＡ）およびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）である。しかしながら、これらの二糖のさらなる修飾により、ヘパリンのポリマー鎖には大きな多様性がある（以下の生合成の記載を参照）。ヘパリンは、通常、約１０〜２００の二糖からなり、一般に、３ｋＤａ〜４０ｋＤａの分子量を有する（Ｓａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ４：６２６−６３１（２０００））。ヘパリンなどのＧＡＧは、糖合成が行われるアンカーとして使用されるコアタンパク質のセリン残基に共有結合することができ、プロテオグリカンと呼ばれる複合糖質を形成する。
【００１７】
ヘパリンは、一般に、細胞の外膜、および細胞を取り囲む細胞外マトリクスに存在する。ヘパリンは多くのヘパリン結合分子と相互に作用し、例えば、細胞の増殖、細胞の分化、免疫、代謝、細胞の情報伝達、炎症、血液の凝固および癌など、多くの生物学的プロセスを制御する。ヘパリンとヘパリン様分子が、無脊椎動物および脊椎動物の両方で特定されており、多くの種から単離された分子が、抗凝血などの生物学的プロセスの少なくともいくつかを誘導し得るようである（例えば、Ｍｅｄｅｉｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １４７５（３）：２８７−２９４（２０００）およびＰｅｊｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６２（２４）：１１４１３−２１（１９８７）を参照）。
【００１８】
重要な生物学的プロセスにおけるヘパリンの関与、特に血液の凝固、炎症および癌における関与は、ヘパリンの薬としての使用に繋がった。血液凝固におけるヘパリンの役割は広く研究されている。ヘパリンは、好塩基性細胞および肥満細胞で生成される天然に存在する抗凝血性物質である。ヘパリンは、血管系内の血栓の形成や、存在する血栓の拡大を妨げることにより、抗凝血性物質として作用する。これは、ヘパリンがアンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ）に結合して立体構造の変化を引き起こし、それによってＡＴが活性化されることによるものである。活性ＡＴは、その後、血液の凝固、初期凝固の遮断またはさらなる凝固に関係するトロンビンおよび他のプロテアーゼを不活性化する。ヘパリンは、今日、抗凝血薬として広く使用されており、年間、１００トンを超える量が使用されている（例えば、Ｌａｒｅｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  １３（５−６）：６３３−６４０（２００９）を参照）。ヘパリンは、例えば、深部静脈血栓症および肺塞栓、急性冠症候群、心房細動、心肺バイパス、血液ろ過、ならびに、中心静脈または抹消静脈の留置カテーテルなどに多く適応されている。ヘパリンは、血液凝固以外にも他のプロセスを制御する多くのヘパリン結合タンパク質と相互作用するため、例えば、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー性鼻炎、喘息及び炎症性腸疾患などの、他の多くの病気に対し、ヘパリン治療を含む臨床試験が行われている。さらに、ヘパリンは動物モデルで抗転移特性を有しており、癌の治療にも役立つ可能性があることも示されている（Ｂｏｒｓｉｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８（６）：３３５２−３３５７（２０００））。
【００１９】
ヒトのヘパリンは構造的かつ機能的に他の哺乳動物のヘパリンを類似しているため、患者に使用するヘパリンは、一般に、屠殺動物(slaughter animals)に天然に存在するヘパリンを単離することによって製造されている（例えば、Ｌｉｎｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１（４９）：１２４４１−５（１９９２）を参照）。しかしながら、２００８年に、過硫酸化コンドロイチン硫酸によるヘパリン供給の汚染により、いく人かの患者が死亡した（例えば、Ｓａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  １０２：８５４−８５８（２００９）を参照）。その結果、特定されかつ制御された供給源からヘパリンを製造する代替の方法が求められてきている。屠殺動物からのヘパリンの単離に変わる方法として試験された今日の方法には、化学的合成法、化学酵素合成法、および生体外での細胞ベースの合成法が含まれる。しかしながら、これらの方法は、コストがかかる、技術的に難しい、および／または生体内（in vivo）で見られる多様なヘパリンを再現できないという欠点を有している（例えば、Ｌａｒｅｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  １３（５−６）：６３３−６４０（２００９）を参照）。ヘパリンを製造する代替方法の開発が求められている。
【００２０】
したがって、本発明は、乳中にヘパリンを発現するように改変されたトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用意する工程を含む、ヘパリンの製造方法が提供される。一態様において、本発明は、乳腺中に１種以上のへパリン生合成酵素を発現するように改変されたトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用意する工程と、そのトランスジェニック哺乳動物の乳腺で生成された乳からヘパリンを採取する工程とを含む方法を提供する。
【００２１】
本発明の他の態様は、乳腺中に１種以上のへパリン生合成酵素とコアタンパク質とを発現するように改変されたトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用意する工程と、そのトランスジェニック哺乳動物の乳腺で生成された乳からヘパリンを採取する工程とを含む、ヘパリンの製造方法を提供する。
【００２２】
一態様において、トランスジェニック哺乳動物におけるヘパリンの生成は、その哺乳動物に既に存在するレベルを超えてヘパリンの発現を増加させることを称する（例えば、トランスジェニックヤギにおける高レベルのヤギヘパリンの生成）。他の態様において、トランスジェニック哺乳動物におけるヘパリンの生成は、その哺乳動物において天然には生じないヘパリンのオルソログ（ortholog）の生成を称する（例えば、トランスジェニックヤギまたは雌牛で生成されるヒトヘパリン）。他の態様において、トランスジェニック哺乳動物におけるヘパリンの生成は、その哺乳動物において天然には生じないハイブリッドヘパリンの生成を称する（例えば、トランスジェニックヤギにおいて、ヤギ酵素およびヒト酵素を併用して生成されるヘパリン）。ヘパリンおよびヘパリン様分子は類似の生物学的応答をすることが示されているので（例えば、ヒト疾患の治療に使用される動物ヘパリン、および無脊椎動物のヘパリン様分子の抗凝血特性など）、トランスジェニック哺乳動物から得られたヘパリンが、ヒトまたは非ヒト哺乳動物ヘパリンに限定されず、ヘパリン変異体およびヘパリン様分子を包含することは理解されよう。
【００２３】
一態様において、発明は、１種以上のへパリン生合成酵素を発現するように改変された哺乳動物上皮細胞を用意する工程と、その哺乳動物上皮細胞からヘパリンを採取する工程とを含む、ヘパリンの製造方法を提供する。
【００２４】
他の態様において、本発明は、１種以上のへパリン生合成酵素とコアタンパク質とを発現するように改変された哺乳動物上皮細胞を用意する工程と、その哺乳動物上皮細胞からヘパリンを採取する工程とを含む、ヘパリンの製造方法を提供する。
【００２５】
ヘパリンの生合成に関与する主要な酵素（「ヘパリン生合成酵素」）は当該技術分野で知られている（例えば、Ｂａｉｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １４：８１−９０（２０１２）を参照）。生合成経路は少なくとも１２の酵素工程を含むと考えられており、図１に概説する。そこで糖合成が行われるアンカーとして使用されるコアタンパク質がある。このコアタンパク質は、糖酵素が存在するゴルジ体に運ばれる。まず、コアタンパク質のＳｅｒ残基に四糖結合が付加される。これは、キシロース、次いで、２つのｇａｌ残基、その後、グルクロン酸を順に付加する４種の異なる酵素による逐次付加によってなされる。四糖を生成する酵素は、コアタンパク質のＳｅｒにキシロースを付加するためのＸＴＩおよびＸＴＩＩ、ｇａｌ残基を付加するＢ４ＧａｌＴ７（β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ）およびＢ３ＧＡＬＴ６（β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ）、ならびに、グルクロン酸を付加するＢ３ＧＡＴ３（ＧｌｃＡ  β１，３−グルクロニルトランスフェラーゼ）である。四糖を生成する酵素は、本明細書において、四糖プロデューサと称され、表１に示す遺伝子が挙げられる。
【００２６】
次の工程は、タンパク質上でヘパリンまたはヘパリン硫酸が合成されることを確立するＧｌｃＮＡＣの付加である。酵素ＥＸＴＩおよびＥＸＴ２が、ＧｌｃＮＡＣおよびＧｌｃＡの繰返し単位を交互に付加し、ヘパリンの重合をもたらす。分子鎖を重合させる酵素は、本明細書において、「繰返し単位プロデューサ」と称され、表２に示す遺伝子が挙げられる。
【００２７】
繰り返し単位は、ＧｌｃＮＡＣ  Ｎ−デアセチラーゼおよびＮ−スルホトランスフェラーゼ（例えば、ＮＤＳＴ  ＩおよびＮＤＳＴ  ＩＩ）により修飾される。ＮＤＳＴは、選択されたＧｌｃＮＡＣ残基を脱アセチル化し、かつ硫酸化して、ＧｌｃＮＳを生成する（ＮＤＳＴ  ＩＩは、ＰＡＰＳ硫酸ドナーとともに働くことがある）。この工程で使用される酵素は、本明細書では、繰返し単位モディファイアと称され、表３に示す遺伝子が挙げられる。
【００２８】
繰返し単位モディファイアによる修飾の前、その間またはその後に起こり得る次の工程では、Ｃ５エピメラーゼ（「エピメライザー」）の作用により、グルクロン酸（ＧｌｃＡ）の一部がイズロン酸（ＩｄｏＡ）に変わる。エピメライザーとしては表４に示す遺伝子が挙げられる。
【００２９】
この後、一連のスルホトランスフェラーゼの作用によって繰返し単位を修飾し、繰返し単位の一部に硫酸を付加する。この工程で使用されるこれらの酵素は「硫酸化酵素」と称され、３−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ、６−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ、および２−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ（それぞれ、３−ＯＳＴ、６−ＯＳＴおよび２−ＯＳＴ）が挙げられ、関連遺伝子が表５に示される。
【００３０】
これらの修飾の後にヘパリン内に存在する主な修飾および非修飾二糖としては、これらに限定はされないが、ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＳ、ＩｄｏＡ−ＧｌｃＮＳ、ＩｄｏＡ（２Ｓ）−ＧｌｃＮＳ、ＩｄｏＡ−ＧｌｃＮＳ（６Ｓ）、およびＩｄｏＡ（２Ｓ）−ＧｌｃＮＳ（６Ｓ）が挙げられる。
【００３１】
好適な四糖プロデューサの例としては、これらに限定はされないが、表１の遺伝子が挙げられる。
【００３２】
【表１】
2017503490.tif 000003
【００３３】
好適な繰返し単位プロデューサの例としては、これらに限定はされないが、表２の遺伝子が挙げられる。
【００３４】
【表２】
2017503490.tif 000004
【００３５】
好適な四糖モディファイアの例としては、これらに限定はされないが、表３の遺伝子が挙げられる。
【００３６】
【表３】
2017503490.tif 000005
【００３７】
好適なエピメライザーの例としては、これらに限定はされないが、表４の遺伝子が挙げられる。
【００３８】
【表４】
2017503490.tif 000006
【００３９】
好適な硫酸化酵素の例としては、これらに限定はされないが、表５の遺伝子が挙げられる。
【００４０】
【表５−１】
2017503490.tif 000007
【００４１】
【表５−２】
2017503490.tif 000008
【００４２】
ヘパリンの合成に使用されるコアタンパク質の例としては、これらに限定はされないが、表６に示すものが挙げられる。
【００４３】
【表６】
2017503490.tif 000009
【００４４】
酵素が、種により配列が異なり得ることは理解されよう。したがって、例えば、ウシＮＤＳＴ  Ｉは、ヒトＮＤＳＴ  Ｉと異なる配列を有し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法において種に特異的な酵素が使用される。したがって、例えば、ヤギヘパリン生合成酵素はトランスジェニックヤギにおいて使用される。しかしながら、いくつかの実施形態では、１つの種のヘパリン生合成酵素が異なる種で使用され得る。したがって、例えば、ヒトヘパリン生合成酵素が、トランスジェニック哺乳動物（例えば、トランスジェニックヤギ）で使用される（すなわち、発現される）。さらに、異なる種からの酵素が「混合され、かつ適合され」得ることもまた理解されよう。したがって、いくつかの実施形態では、トランスジェニックヤギなどのトランスジェニック哺乳動物は、ヒトヘパリン生合成酵素と他の哺乳動物のヘパリン生合成酵素の両方を導入遺伝子(transgenes)として有し得る。
【００４５】
トランスジェニック動物からのヘパリンの精製
いくつかの実施形態では、ヘパリンは、ヘパリンを生成するトランスジェニック動物の乳から精製される。いくつかの実施形態では、ヘパリンは、ヘパリンを生成するトランスジェニック動物の乳から、ヘパリンが実質的に純粋になるように精製される。いくつかの実施形態では、実質的に純粋とは、汚染物質を実質的に含有しないことを含む。いくつかの実施形態では、汚染物質は過硫酸化コンドロイチン硫酸を含む。
【００４６】
いくつかの実施形態では、ヘパリンはカラムクロマトグラフィにより精製される。カラムクロマトグラフィはこの分野ではよく知られている（一般的なカラムクロマトグラフィはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｕｎｉｔ  ６．２（２００８）を、ヘパリンの精製については米国特許第４，１１９，７７４号明細書を参照）。いくつかの実施形態では、ヘパリンは、免疫沈降法によって精製される（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｕｎｉｔ  ７．２（２００１）を参照）。いくつかの実施形態では、ヘパリンは、ヘパリン結合抗体またはそのフラグメントを用いて精製される。
【００４７】
乳中にヘパリンを発現するトランスジェニック動物を作製するための構築物
いくつかの実施形態では、核移植によりトランスジェニック動物（例えば、ヤギ）を作成するのに使用するための構築物(constructs)（例えば、１種以上のヘパリン生合成酵素、または１種以上のヘパリン生合成酵素およびコアタンパク質をコードする）を含む初代細胞株を生成するために、その構築物を、初代動物皮膚上皮細胞、例えば、ヤギの皮膚上皮細胞にトランスフェクトすることができ、それはクローン拡大され、導入遺伝子コピー数、導入遺伝子の構造的完全性および染色体への組み込み部位の評価のために十分に特徴付けられる。本明細書で使用されるとき、「核移植」はドナー細胞からの核を除核卵母細胞に移植するクローニング法を称する。
【００４８】
対象とするタンパク質（例えば、ヘパリン生合成酵素、またはヘパリン生合成酵素およびコアタンパク質）のコード配列は、ＮＣＢＩ、Ｇｅｎｂａｎｋなどの配列データベースから得られた、選択動物（例えば、有蹄動物など）由来のゲノム材料または逆翻訳メッセンジャーＲＮＡ(reverse-translated messenger RNA)のライブラリーをスクリーニングすることによって、あるいは、ヘパリン生合成酵素の配列を得ることなどによって、得ることができる。配列を適当なプラスミドベクターにクローニングし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ．）などの適切な宿主生物中で増幅させることができる。
【００４９】
ベクターの増幅後、遺伝子をコードするＤＮＡを切り出し、ベクターの残部から精製し、トランスジェニック動物の生産に使用できる発現ベクターに導入することができる。また、ベクターの増幅後、ＤＮＡ構築物を、適切な５’および３’調節配列と共に切り出し、ベクター残部から精製し、所望の発現構築物をゲノムに取り込んだトランスジェニック動物を生産するために使用することができる。逆に、酵母人工染色体（ＹＡＣ）のようないくつかのベクターを用いると、組み立てられた構築物(assembled construct)をベクターから除去する必要がなく、そのような場合には、増幅ベクターを、トランスジェニック動物の生産に直接使用することができる。コード配列を調節配列に動作可能に結合させることができ、これにより、コード配列をトランスジェニック非ヒト哺乳動物の乳腺で発現させることができる。
【００５０】
ヘパリン生合成酵素をトランスジェニック動物の乳中に直接産生するのに適したＤＮＡ配列は、天然に存在する乳タンパク質由来の５’−プロモータ領域を有し得る。それ故、このプロモータは、ホルモンおよび組織特異的因子の制御下にあり、乳汁分泌乳房組織において最も活性が高い。いくつかの実施形態では、プロモータは、ヤギβ−カゼインプロモータ(caprine beta casein promoter)である。このプロモータは、トランスジェニックタンパク質(transgenic protein)を乳腺上皮から乳へ分泌させるタンパク質リーダー配列の生成を指向するＤＮＡ配列に作動的に結合することができる。いくつかの実施形態では、天然に分泌される乳タンパク質から生成され得る３’−配列が、ｍＲＮＡの安定性を高めるために加えられ得る。
【００５１】
本明細書で使用されるとき、「リーダー配列」または「シグナル配列」はタンパク質分泌シグナルをコードする核酸配列であり、トランスジェニックタンパク質をコードする下流の核酸分子に作動的に連結すると、分泌を導く。リーダー配列は、天然のリーダー配列、人工的に生成されたリーダー配列であり得、あるいは、導入遺伝子コード配列の転写を導くのに使用されるプロモータと同じ遺伝子から、または哺乳動物の乳腺上皮細胞などの細胞から通常分泌される他のタンパク質から得てもよい。
【００５２】
いくつかの実施形態では、プロモータは、乳特異的プロモータである。本明細書で使用されるとき、「乳特異的プロモータ」は、タンパク質を乳中に分泌する細胞（例えば、乳腺上皮細胞など）における遺伝子の発現を天然に導くプロモータであり、例えば、カゼインプロモータ、例えば、α−カゼインプロモータ（例えば、アルファＳ−１カゼインプロモータ、アルファＳ２カゼインプロモータなど）、β−カゼインプロモータ（例えば、ヤギβ−カゼイン遺伝子プロモータ（ＤｉＴｕｌｌｉｏ  ｅｔ  ａｌ．ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ  １０：７４−７７（１９９２）など）、γ−カゼインプロモータ、κ−カゼインプロモータ、ホエー酸性タンパク質（ＷＡＰ）プロモータ（Ｇｏｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ  ５：１１８３−１１８７（１９８７））、β−ラクトグロブリンプロモータ（Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ  ７：４８７−４９２（１９８９））、およびα−ラクトグロブリンプロモータ（Ｓｏｕｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ＦＥＢＳ  ＬＥＴＴＳ．２９７：１３（１９９２））などを含む。この定義にはまた、乳房組織で特異的に活性化されるプロモータ、例えば、マウス乳癌ウィルス（ＭＭＴＶ）の長い末端反復(long terminal repeat)（ＬＴＲ）プロモータが含まれる。
【００５３】
本明細書で使用されるとき、コード配列および調節配列は、それらが調節配列の影響下または制御下でコード配列を発現または転写するように共有結合している場合、「作動的に結合している」という。コード配列が機能性タンパク質に翻訳されるように、コード配列は調節配列に作動的に結合される。５’調節配列におけるプロモータの誘導がコード配列の転写をもたらし、２つのＤＮＡ配列間の結合が、（１）フレームシフト変異の導入をもたらさないか、（２）コード配列の転写を誘導するプロモータ領域の機能を妨げないか、または（３）タンパク質に翻訳される対応するＲＮＡ転写機能を妨げない場合、その２つのＤＮＡ配列は作動的に結合しているという。したがって、プロモータ領域が、得られる転写が所望のタンパク質またはポリペプチドに翻訳され得るように、そのＤＮＡ配列を転写させることができる場合、そのプロモータ領域はコード配列に作動的に結合している。
【００５４】
本明細書で使用されるとき、「ベクター」は、異なる遺伝子環境間における輸送、または宿主細胞における発現のために、制限およびライゲーションによって、所望の配列が挿入され得る多数の核酸のいずれであってもよい。ＲＮＡベクターも使用できるが、通常、ベクターはＤＮＡからなる。ベクターとしては、プラスミドおよびファージミドが挙げられるが、これらに限定されない。クローニングベクターは、宿主細胞で複製し得るものであり、および１つ以上のエンドヌクレアーゼ制限部位によってさらに特徴づけられ、その制限部位においてベクターが特定可能な態様で切断され、新しい組換えベクターが宿主細胞で複製する能力を保持するようにその部位に所望のＤＮＡ配列が連結され得る。プラスミドの場合、プラスミドは宿主細菌内でコピー数が増加するので、所望の配列の複製が何回も起こるか、あるいは、宿主が有糸分裂で再生されるので、一宿主につき１回のみ起こり得る。ファージの場合、複製は溶菌相の過程で能動的に、または溶原相の過程で受動的に起こり得る。発現ベクターは、その中に、所望のＤＮＡ配列が、調節配列に作動的に結合されるように、制限およびライゲーションによって挿入され得るもので、ＲＮＡ転写物として発現され得る。ベクターは、そのベクターで形質転換またはトランスフェクトされたまたはされていない細胞の同定に使用するのに適した１つ以上のマーカー配列をさらに含み得る。マーカーとしては、例えば、抗生物質または他の化合物に対する耐性または感受性を増大または減少させるタンパク質をコードする遺伝子、当業界で知られた標準アッセイによって活性を検出し得る酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼ、またはアルカリホスファターゼ）をコードする遺伝子、および形質転換またはトランスフェクトされた細胞、宿主、コロニーまたはプラークの表現型に目に見えて影響する遺伝子が挙げられる。好適なベクターは、自己複製が可能で、かつそれらが作動的に結合しているＤＮＡセグメントに存在する構造遺伝子産物を発現できるものである。
【００５５】
トランスジェニック動物および乳腺上皮細胞
一態様において、本開示は乳中にヘパリンを生成するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。特に、本開示は乳腺中に１種以上のヘパリン生合成酵素を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。乳腺中に１種以上のヘパリン生合成酵素とコアタンパク質とを発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物もまた提供される。
【００５６】
他の態様において、１種以上のヘパリン生合成酵素を発現する乳腺上皮細胞が提供される。１種以上のヘパリン生合成酵素とコアタンパク質とを発現する乳腺上皮細胞もまた提供される。
【００５７】
トランスジェニック動物は、この分野で知られた方法で作製することができる。一実施形態において、別個の構築物を初代細胞(primary cells)に同時トランスフェクションすることによって動物を作製する。これらの細胞はその後、核移植に使用され得る。あるいは、マイクロインジェクション法を使用してトランスジェニック動物を作ることができ、構築物が注入され得る。
【００５８】
トランスジェニック発現に適した動物としては、ヤギ、ヒツジ、バイソン、ラクダ、雌牛、ウサギ、スイギュウ、ウマおよびラマが挙げられるが、これらに限定されない。また、好適な動物として、雌牛、ヤギおよびヒツジの変異種である、ウシ（ｂｏｖｉｎｅ）、ヤギ（ｃａｐｒｉｎｅ）およびヒツジ（ｏｖｉｎｅ）も挙げられる。好適な動物としては、また、有蹄動物が挙げられる。本明細書で使用されるとき、「有蹄動物」は、通常、草食性で四肢の有蹄哺乳動物であるか、またはそれに関し、限定はされないが、例えば、ヒツジ、ヤギ、畜牛およびウマが挙げられる。
【００５９】
クローニングは、それぞれヘパリン生合成酵素または他の関心遺伝子構築物を産生することができる、多様なトランスジェニック動物をもたらすであろう。生産方法としては、クローン動物およびそれら動物の子孫の使用が挙げられる。いくつかの実施形態では、クローン動物は、ヤギ（ｃａｐｒｉｎｅ）またはウシ（ｂｏｖｉｎｅ）である。クローニングは、胎児の核移植、核移植、組織および臓器移植、ならびにキメラ子孫の作出も包含する。
【００６０】
クローニングプロセスの一工程は、１種以上のヘパリン生合成酵素、または１種以上のヘパリン生合成酵素およびコアタンパク質を、コードする導入遺伝子を含む細胞のゲノムを脱核卵母細胞に導入することを含む。本明細書で使用されるとき、「導入遺伝子(transgene)」は、技術を用いて細胞、またはその原細胞に挿入される核酸分子片を称し、その細胞から発生する動物のゲノムの一部になる。そのような導入遺伝子は、トランスジェニック動物に対して、部分的にまたは全体的に外生的な（すなわち、外来の）遺伝子を含むか、或いは、その動物の内在性遺伝子と同一性を有する遺伝子を表わし得る。
【００６１】
卵母細胞に好適な哺乳動物源としては、ヤギ、ヒツジ、雌牛、ウサギ、非ヒト霊長類などが挙げられる。卵母細胞は有蹄動物から得ることが好ましく、ヤギまたは雌牛から得ることが最も好ましい。卵母細胞を単離する方法は、この分野ではよく知られている。実質的に、その方法は、哺乳動物、例えば、ヤギの卵巣または生殖器官から卵母細胞を単離することを含む。容易に入手可能な有蹄動物の卵母細胞源は、ホルモン誘発した雌動物からのものである。遺伝子工学、核移植およびクローニングなどの技術を上手く使用するには、卵母細胞を、それらが核移植のレシピエント細胞として使用される前に、そして、それらが精子細胞によって受精されて胚になる前に、生体内で十分に成熟させることが好ましい。生体内で成熟した減数第二分裂中期の卵母細胞は、核移植技術で上首尾に使用された。実質的に、減数第二分裂中期の卵母細胞は、発情開始後またはヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）または類似のホルモンの注射後、数時間の過排卵または非過排卵の動物から外科的に採取される。
【００６２】
乳腺で発現する組換え分子の量および質を予測するために使用される手段の１つは、泌乳の誘発による（Ｃａｍｍｕｓｏ，Ｇａｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｉｍａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１（１）：１−１７（１９９９））。誘発された泌乳は、妊娠により生ずる最初の自然の泌乳（これは１年後になるであろう）からよりむしろ、トランスジェニック製造の初期の段階からのタンパク質の発現および分析を可能にする。泌乳の誘発は、ホルモンまたは手によりなされ得る。
【００６３】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法により生成されるヘパリン組成物は、乳、または一部精製された乳をさらに含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、トランスジェニック動物の乳からヘパリンを単離する工程を含む（例えば、Ｐｏｌｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２３１（１−２）：１４７−１５７（１９９９）を参照）。
【００６４】
以下の実施例により本発明をさらに説明するが、それらは決してさらなる限定を加えるものであると解釈されるべきではない。本願全体を通して引用されている全参照文献（参考文献、登録特許、公開特許出願および同時継続出願を含む）の全内容が参照により、特に、ここまでに参照されている教示において、本願明細書に明示的に組み込まれる。しかしながら、いかなる参照文献も、それが従来技術であると認めることを意図するものではない。
【実施例】
【００６５】
１．安全性試験
１．１  乳腺に対するヘパリンの効果を試験する
泌乳乳腺に対するヘパリンの効果を評価した。乳腺におけるヤギアンチトロンビン（ＡＴ）の濃度は約２μｇ／ｍｌで、血流中に存在する量の１％である。ヘパリンを泌乳ヤギの乳腺に、１ｍｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌの生成量に相当する濃度で注入することができる。ヤギ乳腺は１リットルの乳を保持し得るため、乳を搾った後、ヘパリンを注入し、翌日、乳を取ることができる（高分子量ヘパリンを１ｇ、２００ｍｇおよび５０ｍｇ注入）。注入は１週間、または乳腺もしくは血液に毒性が観察されるまで毎日行うことができる。
【００６６】
試験動物の乳および血流中のヘパリンの濃度を測定することができる。過去の研究は、乳腺で生成されたいくつかのタンパク質が、乳中にみられる濃度の１％まで血液循環中に漏出し得ることを示している。乳の体積も、ヘパリンが泌乳に影響するか否かを決定するため、試験期間を通じて監視することができる。乳体積に及ぼす長期効果を試験するため、動物に対してさらに１週間搾乳を続けることができる。血液試料は毎日得ることができ、ヘパリン濃度、およびａＰＴＴ（活性化部分トロンボプラスチン時間）を試験することによって監視される凝固特性を、様々なヘパリン濃度を有するヤギ血液で試験することができる。
【００６７】
対照実験は、ヘパリンを静注投与したヤギで行うことができる。出血の問題を引き起こす血液中のヘパリン濃度も特定することができる。
【００６８】
１．２  泌乳ヤギにおけるヘパリンの毒性試験
乳腺におけるヘパリンの生成も産生動物に有意な影響を及ぼすか否かを調べるために試験が行われた。導入遺伝子によって産生されたタンパク質は乳腺に直接影響する可能性がある。さらに、全身系にタンパク質が漏出する可能性があることは知られている。ヤギへの全身性および注入ヘパリンの潜在的影響を評価するために、以下に概説する研究がなされた。血液を採取し、２つの実験期間、各搾乳動物から少なくとも１日に１回、乳を集め、全身性および乳房注入経路に対するヘパリン投与の影響を調べた。ヘパリン濃度、およびａＰＴＴによって示される凝固時間を血清から算出した。乳体積を測定し、乳中のヘパリン濃度を求めた。さらに、乳の質（色、一貫性、凝集の痕跡、血液、または乳腺炎）を記録した。直腸温を含む各動物の全身状態を毎日評価した。ヘパリンは抗凝血性物質であるため、動物はまた、異常な痣または点状出血など、肉眼で観察されるような出血の兆候が毎日調べられた。
【００６９】
方法
動物
６匹の正常な非トランスジェニック泌乳ヤギに、１日当たり、特別に調合したヤギ用野菜食を約４ポンド（約１．８ｋｇ）与え、またティモシーおよびアルファルファを組み合わせた干し草を与えるとともに、水と、プレーンおよびミネラル塩ブロックとを自由摂取とした。これらは泌乳動物であるため、到着した日から毎日搾乳した。毎日、乳体積を測定し、直腸温を記録した。第１または第２の実験前の乳体積および直腸温は下記の表７で見ることができる。
【００７０】
血液の採取
頸静脈を特定できるように、動物を手で押さえた。２１ゲージ（約０．８０ｍｍ）３／４インチ（約１９ｍｍ）翼状針（ＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｓｅｔ  Ｒｅｆ  ３６７２５１，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ  ＵＳＡ）を血管に挿入し、血液を、２〜１．８ｍｌのクエン酸ナトリウム入りのバキュテナーチューブ（ＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ，  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｎａ  Ｃｉｔｒａｔｅ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ  ＵＳＡ）に採取した。採取後（または、血液採取およびヘパリン投与後−下記を参照）、針を除き、採取部位に圧力をかけて、出血を止めた。各処置の後、動物は陽性強化（一粒の褒美）を受けた。
【００７１】
ヘパリンの静脈内投与
上記のように動物を抑えた。上記の血液採取で使用した翼状針は、バキュテナー採血チューブにより血液を採取するか、または注射器が接続できるように設計されている。したがって、血液採取後、血液採取チューブに接続している針の一部を取り除き、ヘパリンの入った注射器を接続し、ヘパリンをゆっくりと注入した。全ヘパリンが確実に注入されるように、針に無菌の生理食塩水０．４ｍｌを通した。このように、血液の採取とヘパリンの注入に、１本の針を使用し、第２の静脈穿刺を行う場合と比較してストレスが加わるのを回避した。
【００７２】
表７：第１または第２の実験前の全動物の乳体積（リットル）、および体温（華氏度）。
【００７３】
【表７】
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【００７４】
採乳
全ヤギに対し、その到着日から毎日１回、携帯型搾乳機を用いて搾乳を行った。この行為は、搾乳台に動物を載せて行った。搾乳の一般的な手順は以下の通りであった。搾乳をする人は手を十分に洗い、実験用ゴム手袋をはめた。ペーパータオルおよび水を用いて乳房を洗浄した。その後、乳房を清浄なペーパータオルで乾燥させた。乳首を再び、アルコールワイプで洗浄し、プリディップ（ＦＳ−１０６  Ｓａｎｉｔｉｚｉｎｇ  Ｔｅａｔ  Ｄｉｐ，ＩＢＡ  Ｉｎｃ．，Ｍｉｌｌｂｕｒｙ，ＭＡ  ＵＳＡ）を塗布し、乾燥させた。手で小試料を乳首から出させ、乳の質を評価し、ストリークテスト(streak test)を行い、さらなる分析のために凍結した。その後、搾乳機を乳房に取り付けた。搾乳後、乳首をアルコールで洗浄し、搾乳後消毒剤を塗布した（Ｕｌｔｒａ  Ｓｈｉｅｌｄ  Ｓａｎｉｔｉｚｉｎｇ  Ｂａｒｒｉｅｒ  Ｔｅａｔ  Ｄｉｐ，ＩＢＡ  Ｉｎｃ．，Ｍｉｌｌｂｕｒｙ，ＭＡ  ＵＳＡ）。乳体積を測定し、小試料を凍結させ、その後の試験のために−８０℃の冷凍庫に保存した。
【００７５】
実験１：ヘパリンの全身投与の効果の研究
２頭のヤギが、６日間に亘って、１日に３回、午前８時、正午１２時、および午後４時に、静脈（ＩＶ）注射を受けた。スケジュールは次の通りであった：低用量のヘパリン、１，５００単位（０．１５ｍｌ［１０，０００単位／ｍｌ］ＩＶ、ＴＩＤ［１日３回］）２日間、次いで、中用量のヘパリン、６，０００単位（０．６ｍｌ［１０，０００単位／ｍｌ］ＩＶ、ＴＩＤ）２日間、最後に、高用量のヘパリン、３１，０００単位（３．１ｍｌ［１０，０００単位／ｍｌ］ＩＶ、ＴＩＤ）２日間。これらの用量は、生成されるファウンダートランスジェニック動物の乳／乳腺の目標とする発現濃度の１％に相当する。ヘパリン注入前に、その都度、血液を頸静脈から採取した。さらに、１日に１回、ヤギに対し搾乳を行い、試料を集めた。全身性ヘパリンを受けた２頭のヤギは、この実験後、第２の実験に含まれる前に、１日間搾乳された。
【００７６】
実験２：ヘパリンの乳房注入
６頭の乳用ヤギを２頭ずつ３グループに分けた。全てのヤギに対し、搾乳機を用いて毎日搾乳を行い、血液試料を採取した。搾乳および採血後、乳首注入カニューレ（Ｕｄｄｅｒ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  Ｃａｎｎｕｌａ，ＩＢＡ  Ｉｎｃ．，Ｍｉｌｌｂｕｒｙ，ＭＡ  ＵＳＡ）を用いて、ヤギの乳房にヘパリンを注入した。各グループには、ベースの乳１リットル当たりで調べられた３通りの発現レベルに相当する、低用量（２５，０００単位）、中用量（１００，０００単位）、または高用量（５００，０００単位）のヘパリンが注入された。乳房当たりの注入体積は５０ｍｌ未満であった。この手順を計７日間行った。乳房注入後、さらに８日間搾乳し、その間、血液試料および乳試料を採取した。
【００７７】
１．３結果
実験１
低用量および中用量のヘパリンがＩＶ投与されている間は、ａＰＴＴは緩やかに上昇した。高用量のヘパリン投与後、ａＰＴＴは劇的に上昇した。高用量の期間、正午および４ＰＭにおける４試料のうちの３つの試料で、血液凝固器具で算出され得る最大ａＰＴＴを超えた（＞１２４秒）。第２の高用量のＡＭ試料（ヘパリンのＡＭ投与前）のａＰＴＴ時間は、前夜に、より通常のレベルにまで低下していた。乳体積と体温はどの用量でも影響しなかった。いかなる時も、点状出血または異常出血の兆候は見られなかった。唯一の身体所見は、１頭の、高用量投与の第２日の正午と４ＰＭの検査での肺音の上昇であった。これらの肺音は、高用量の全身投与が終わると直ぐに消失した。
【００７８】
実験２
乳生成体積についての注入ヘパリンの結果は、以下のように分析することができる。全ての例で、乳房へのヘパリンの注入期間において、乳体積の初期落ち込みがあるが、ヘパリンの注入後にいくらか回復するようである。最大量のヘパリン注入を受けた１頭の動物で、最大の落ち込みが起こった（ヘパリン注入量は、注入前に生成された乳体積に基づいて計算した）（下記の表８に示すように）。表８はまた、ヘパリン注入量のａＰＴＴとの関係を示す。ａＰＴＴは、ヘパリン注入量と関係し、投与して最初の３日間で最大となり、その後、減少するようであった。ａＰＴＴは、ヘパリン乳房注入後、「洗い出し」期間に、より通常のレベル（２０〜４０秒）に戻った。ヘパリン注入レベルは、ヘパリン後のａＰＴＴレベルと直接的な相関関係はないようであった。
【００７９】
表８：乳体積、ヘパリン単位、およびａＰＴＴ時間に対する３つの注入レベルの１日当たりの乳房ごとの注入ｍＬ。アスタリスク（＊）は、１０，０００単位／ｍＬ、さもなければ２０，０００単位／ｍＬを示す。乳体積はリットル単位である。ｍＬは、乳房あたり注入されたヘパリンのｍＬである。ａＰＴＴ時間は秒単位である。
【００８０】
【表８】
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【００８１】
１．４結論
実験１
ここでは、ヘパリンの全身投与の体温または乳生成量に対する影響が（たとえあったとしても）ほとんどないことを示している。低および中レベルの全身性ヘパリンは、ａＰＴＴを４０〜５０秒まで徐々に上昇させるようである（正常範囲２０〜４０）。高レベルの全身性ヘパリンは、注入後、ａＰＴＴに大きく影響し、機器で測定し得る時間（＞１２４秒）より長い凝固時間までしばしば増大させる。しかし、夜の間（２回の高用量投与の間）にａＰＴＴは、低および中レベルの全身性ヘパリンで見られる時間に近い、４０秒台まで低下した。肉眼で明らかに観察されるような出血、例えば、口腔粘膜、外陰、乳房における点状出血などの兆候はなかった。高レベルのヘパリンの投与期間中、１頭のヤギで、上昇した「パチパチ」という肺音が聞こえた。しかしながら、この期間、鼻からの血液を含んだ滲出液の兆候は見られなかった。
【００８２】
これらの結果から、驚くべきことに、６日に亘って投与された全身性ヘパリンは、ヘパリンの副作用として報告されている点状出血、紫斑病、または斑状出血を引き起こすことはなく、トランスジェニック哺乳動物からヘパリンを生成するのを妨げることがないと結論づけることができる。
【００８３】
実験２
低用量および中用量のヘパリンを乳房に１日１回、１週間注入した場合、体温にはほとんど影響せず、出血のいかなる兆候もなく、かつａＰＴＴが５５秒を超えて増加することはなかった。高レベルのヘパリンの注入では、ａＰＴＴが劇的に増大し、最大レベルの注入では、体温の上昇および呼吸音の上昇など全身的な影響をもたらすようであった。最大レベルで注入されたヤギの乳房は炎症反応が起こり、乳の生成は著しく減少した。しかしながら、この実験では、ヤギに対し搾乳を行い、純粋なヘパリンを乳房に直接、希釈せずに注入した。ヘパリンを生成するトランスジェニックヤギでは、タンパク質が乳とともに生成され、したがって希釈される。さらに、ヤギ自身によって生成されたヘパリンは、注入された外生的ヘパリンと同じではない可能性がある。
【００８４】
これらの研究から、低用量および中用量の全身性の注入ヘパリンは、ヤギの健康および乳の生成に及ぼす影響が最小で、トランスジェニック哺乳動物からヘパリンを生成するのを妨げることはないと結論づけることができる。
【００８５】
２．ヘパリン生成トランスジェニック動物の作製
各種修飾酵素を有する構築物を、既にコアタンパク質を産生する動物由来の系統のゲノムに導入することができる。構築物は、四糖の合成から始まり、スルホトランスフェラーゼで終わる、その経路で生じると推定される順序で導入することができる。各時点で（例えば、新しい酵素の添加後）、ヘパリンをトランスジェニック雌動物の乳から単離することができる。
【００８６】
２．１四糖の合成、ＥＸＴ  ＩおよびＥＸＴ  ＩＩ、ＮＤＳＴ  ＩおよびＮＤＳＴ  ＩＩ、スルホトランスフェラーゼ
四糖の合成に関連する酵素、ＥＸＴ  ＩおよびＥＸＴ  ＩＩ、ＮＤＳＴ  ＩおよびＮＤＳＴ  ＩＩ、ならびにスルホトランスフェラーゼのための酵素をコードするＤＮＡを、β−カゼインベクターに結合することができ、その構築物を、既にコアプロテインを有する動物の胚に顕微注入することができる。その新しい構築物を有する子孫を、成熟させて、コアタンパク質に四糖を付加する能力について調べることができる。ＥＸＴ  ＩおよびＥＸＴ  ＩＩをコードする遺伝子もまた、カゼインベクターに結合させることができ、構築物を、既にコアプロテインを有する動物の胚に顕微注入することができる。同様に、この方法は、ＮＤＳＴ  ＩおよびＮＤＳＴ  ＩＩ、ならびにスルホトランスフェラーゼをコードする遺伝子で行うことができる。
【００８７】
２．２  複数のヘパリン合成経路遺伝子を有するトランスジェニック動物の作製
一群の酵素（例えば、ＮＤＳＴＩ、ＮＤＳＴＩＩおよびＣ５エピメラーゼ）を有するトランスジェニック系統を、第二の群（例えば、コアタンパク質、四糖合成、ならびにＥＸＴ  ＩおよびＥＸＴ  ＩＩ）を有するトランスジェニック動物の異なる系統と交配させることができる。乳腺の既存のヘパリン合成活性を補完するのに必要な酵素群は、その後、繁殖プログラムから特定することができる。
【００８８】
別個の並行プログラムにおいて、その経路に必要な遺伝子全てを有する大きな構築物（ＢＡＣまたはＹＡＣを使用）を組み立てることができる。この大きな構築物は、その後、動物のゲノムに導入することができる。この方法を使用して、大きな多遺伝子アレイ（例えば、免疫グロブリン座）を有するトランスジェニック動物をうまく構築することができた。
【００８９】
２．３  分泌プロセス
グリコサミノグリカンタンパク質のほとんどは、膜に結合しているか、細胞内に存在する。
【００９０】
可溶型もまた、分泌を助けるように遺伝子操作で生成することができる。例えば、あるＧＡＧタンパク質（グリピカン）はＧＰＩアンカーにより細胞の表面に結合している可溶型が生成されるようにアンカー部位を取り除くことができる。
【００９１】
脂肪球の分泌：膜タンパク質は脂肪球皮膜で産生させることができる。             
【００９２】
２．４ヘパリンを産生する大型トランスジェニック動物の作製
体細胞核移植（クローニング）によって、ヤギゲノムまたは雌牛ゲノムに構築物を導入することができる。トランスジェニックヤギは、雌牛に比べ世代期間が短いという利点を有する。しかしながら、トランスジェニック雌牛は、１頭当たり、およそ１０倍の乳を生成し、高いスケーラビリティーを示す。さらに、雌牛はヤギより世代期間が長いが、若い牛のホルモン誘発によって、大量の乳を得ることができ、開発タイムライン(development timelines)に対する、世代期間の影響をいくらか減らすことができる。
【００９３】
大きな発現構築物を、繊維芽細胞などの細胞に導入することができ、良好なクローンを選択することができる。これらのクローン細胞について、その後、関連するヘパリン生合成遺伝子の全てをうまく取り込んでいるかについてスクリーニングを行うことができる。クローニング手段は、ヘパリン経路を有する多くのファウンダーをもたらすことができる。ヤギについては２か月（または、ウシは６か月）で誘発を実施して、大型動物の乳腺中にヘパリンを生成するようにコアタンパク質がうまく修飾されているか否かを特定することができる。
【００９４】
均等物
以上記載した明細は、当業者が発明を実施するのに十分であると考える。提示した実施例は本発明のある態様および実施形態の例とすることを意図したものであるから、本発明はそれらの実施例によってその範囲が限定されるものではない。他の機能的に均等な実施形態は本発明の範囲内である。本明細書に示され記載されたものに加えられる本発明の様々な変更は、当業者であれば前述の記載から明らかであり、添付の請求の範囲に含まれるであろう。本発明の利点と目的は、本発明の各実施形態に必ずしも包含されていない。
【図１】
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【国際調査報告】
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