(57)【要約】  本開示は、親株と比べてＲｅｃＡ活性が欠損しているアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株（例えば、ＬＢＡ４４０４）を製造および使用するための新規組成物および方法を提供する。アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のその他の遺伝子欠損株との組合せも開示される。具体的には、２種の例示的ｓ  ｒｅｃＡマイナス株である、クロラムフェニコール耐性遺伝子がｒｅｃＡ遺伝子を破壊しているＵＩＡ７７７およびカナマイシン耐性遺伝子がｒｅｃＡ遺伝子を破壊しているＵＩＡ７７０が提供される。
2017527292.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の修飾された株であって、その親株と比べて遺伝子組換え経路が欠損している、修飾された株。
【請求項２】
ＲｅｃＡ、ＲｅｃＢ、ＲｅｃＤ、ＲｅｃＦ、ＲｅｃＧ、ＲｅｃＪ、ＲｅｃＮ、ＲｅｃＯ、ＲｅｃＱ、ＲｅｃＲおよびＲｅｃＸからなる群から選択される少なくとも１つの組換え経路が欠損している、請求項１に記載の修飾された株。
【請求項３】
ＲｅｃＡ活性が欠損している、請求項２に記載の修飾された株。
【請求項４】
前記ｒｅｃＡ遺伝子が、配列番号１０または１１と少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、請求項２に記載の修飾された株。
【請求項５】
ＲｅｃＢ、ＲｅｃＤ、ＲｅｃＦ、ＲｅｃＧ、ＲｅｃＪ、ＲｅｃＮ、ＲｅｃＯ、ＲｅｃＱ、ＲｅｃＲおよびＲｅｃＸからなる群から選択される活性も欠損している、請求項３に記載の修飾された株。
【請求項６】
ゲノムｒｅｃＡ遺伝子が、前記ｒｅｃＡ遺伝子中の配列の欠失、再編成または挿入によって修飾されている、請求項３に記載の修飾された株。
【請求項７】
ゲノムｒｅｃＡ遺伝子が、前記ｒｅｃＡ遺伝子を含むゲノム配列を欠失することによって修飾されている、請求項３に記載の修飾された株。
【請求項８】
ゲノムｒｅｃＡ遺伝子が、前記ｒｅｃＡ遺伝子内に配列を挿入することによって修飾され、それによって、ＲｅｃＡタンパク質の発現を妨害する、請求項３に記載の修飾された株。
【請求項９】
前記挿入される配列が、選択マーカー遺伝子を含む、請求項８に記載の修飾された株。
【請求項１０】
前記選択マーカーが、クロラムフェニコール耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性またはそれらの組合せからなる群から選択される抗生物質耐性遺伝子を含む、請求項９に記載の修飾された株。
【請求項１１】
ＲｅｃＡ活性が、前記株から調製された抽出物において検出不能である、請求項３に記載の修飾された株。
【請求項１２】
ＲｅｃＡタンパク質が、ウエスタンブロット分析を使用して検出不能である、請求項３に記載の修飾された株。
【請求項１３】
ＲｅｃＡ  ｍＲＮＡが、ノーザンブロット分析を使用して検出不能である、請求項３に記載の修飾された株。
【請求項１４】
ｒｅｃＡ遺伝子が、サザンブロット分析を使用して検出不能である、請求項３に記載の修飾された株。
【請求項１５】
前記ｒｅｃＡ遺伝子が、配列番号のタンパク質をコードする、請求項４に記載の修飾された株。
【請求項１６】
Ｔｉプラスミドを含む、請求項１に記載の修飾された株。
【請求項１７】
前記Ｔｉプラスミドが、ｐＡＬ４４０４  Ｔｉプラスミドを含むか、またはｐＡＬ４４０４  Ｔｉプラスミドに由来する、請求項１６に記載の修飾された株。
【請求項１８】
バイナリープラスミドを含む、請求項１に記載の修飾された株。
【請求項１９】
前記バイナリープラスミドが、殺虫剤耐性形質、除草剤許容性形質、窒素使用効率形質、水使用効率形質、栄養価形質、ＤＮＡ結合形質、選択マーカー形質およびそれらの組合せからなる群から選択される農学的形質の遺伝子を含む、請求項１８に記載の修飾された株。
【請求項２０】
ターナリープラスミドを含む、請求項１に記載の修飾された株。
【請求項２１】
前記親株が、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）である、請求項１に記載の修飾された株。
【請求項２２】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）由来の修飾されたｒｅｃＡ遺伝子を含むプラスミドであって、前記ｒｅｃＡ遺伝子が、修飾前に、配列番号１０または１１に対して少なくとも８５％の配列同一性を有し、前記修飾されたｒｅｃＡ遺伝子が、ＲｅｃＡタンパク質の発現において欠損している、プラスミド。
【請求項２３】
前記修飾が、ｒｅｃＡ遺伝子または配列番号１０もしくは１１内へのドナー配列の挿入を含む、請求項２２に記載のプラスミド。
【請求項２４】
前記ドナー配列が、選択マーカー遺伝子を含む、請求項２３に記載のプラスミド。
【請求項２５】
前記選択マーカー遺伝子が、クロラムフェニコール耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性またはそれらの組合せから選択される抗生物質耐性遺伝子を含む、請求項２４に記載のプラスミド。
【請求項２６】
前記ドナー配列の少なくとも一方の末端が、配列番号１０または１１の少なくとも４３塩基対の断片と隣接している、請求項２３に記載のプラスミド。
【請求項２７】
その親株と比べて遺伝子組換え経路が欠損しているアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株を作製する方法であって、
（ａ）前記ｒｅｃＡ遺伝子を対象とするノックアウトプラスミドを準備するステップと、
（ｂ）アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株に前記ノックアウトプラスミドを導入するステップと、
（ｃ）ゲノム突然変異を含むコロニーを選択およびスクリーニングするステップと、
（ｄ）ｒｅｃＡのゲノム突然変異を有する少なくとも１種の突然変異されたアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を同定するステップと
を含む、方法。
【請求項２８】
前記ｒｅｃＡ遺伝子が、配列番号１０または１１に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ノックアウトプラスミドが、ゲノム欠失、ゲノム再編成、ゲノム挿入およびそれらの組合せからなる群から選択される突然変異を誘導する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記ゲノム挿入が、選択マーカーをコードする配列を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記選択マーカー遺伝子が、クロラムフェニコール耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性またはそれらの組合せから選択される抗生物質耐性遺伝子を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
（ａ）上流ゲノムＤＮＡ境界配列と隣接しているＴ鎖挿入部分および
（ｂ）下流ゲノムＤＮＡ境界配列
を含むトランスジェニック事象であって、その親株と比べて遺伝子組換え経路が欠損している、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の修飾された株由来のＴ鎖の組込みを含む、トランスジェニック事象。
【請求項３３】
前記アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の修飾された株由来のＴ鎖が、トランスジェニック事象を再生するために使用される、ターゲッティングされた植物細胞のゲノム内に組み込まれる、請求項３２に記載のトランスジェニック事象。
【請求項３４】
農学的形質をさらに含む、請求項３２に記載のトランスジェニック事象。
【請求項３５】
前記農学的形質が、殺虫剤耐性形質、除草剤許容性形質、窒素使用効率形質、水使用効率形質、栄養価形質、ＤＮＡ結合形質、選択マーカー形質およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項３４に記載のトランスジェニック事象。
【請求項３６】
双子葉植物または単子葉植物である、請求項３２に記載のトランスジェニック事象。
【請求項３７】
トランスジェニック植物を製造する方法であって、
（ａ）ターゲッティングされた植物細胞を、その親株と比べて遺伝子組換え経路が欠損している、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の修飾された株と接触させるステップと、
（ｂ）前記ターゲッティングされた植物細胞のゲノム中に組み込まれた前記アグロバクテリウム属（Agrobacterium）株由来のＤＮＡを含む植物細胞を選択およびスクリーニングするステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）において選択／スクリーニングされた植物細胞から、全トランスジェニック植物を再生するステップと
を含む、方法。
【請求項３８】
前記選択ステップが、クロラムフェニコール耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性またはそれらの組合せから選択される抗生物質耐性遺伝子を含む選択マーカーを使用して実施される、請求項３７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）のもと、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、２０１５年９月４日に出願された米国仮特許出願第６２／０４５，９４７号の利益を主張する。
【０００２】
電子的に提出された配列表への言及
配列表の認証謄本は、２０１５年９月２日に作製され、７３．９キロバイトの大きさを有し、本明細書と同時に出願された「７６０１８＿ＳＴ２５．ｔｘｔ”と名付けられたファイルとともにＡＳＣＩＩ形式配列表としてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。このＡＳＣＩＩ形式の文書中に含有される配列表は、本明細書の一部であり、その全文が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
植物のアグロバクテリウム媒介性形質転換は、植物細胞のゲノム内のＴ鎖の組込みをもたらす。Ｔ鎖は、プロモーターを対象の遺伝子および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）と連結するように正確に遺伝子操作されている遺伝子調節エレメントで構成されている遺伝子発現カセットを含有する。配列は、タンパク質を生成するように対象の遺伝子の発現を最適に駆動するように互いに正確に遺伝子操作される。遺伝子調節エレメントの安定性は、対象の遺伝子の最適発現にとって重大である。Ｔ鎖内に含有されるポリヌクレオチド配列のわずかな修飾は、対象の遺伝子の発現を低減またはさらには排除し得る。
【０００４】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）株は、植物細胞のゲノム内にＴ鎖を組み込むためによく使用される。Ooms, G., Hooykaas, P. J. J., Van Veen, R. J. M., Van Beelen, P., Regensburg-Tuienk, T. J. G., and R. A. Schilperoort (1982 “Octopine Ti-plasmid deletion mutants of Agrobacterium tumefaciens with emphasis on the right side of the T-region.” Plasmid 7: 15-29;Hoekema, A., Hirsch, P. R., Hooykaas, P. J. J., and R. A. Schilperoort (1983) “A binary plant vector strategy based on separation of vir- and T-region of the Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid.”Nature 303:179-180;およびde Frammond, A. J., Barton K. A., and M-D. Chilton (1983) “Mini-Ti: a new vector strategy for plant genetic engineering.” Biotechnology 1: 262-269を参照のこと。
【０００５】
過去３０年にわたってＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）が広く使用されてきたが、この株内で形質転換されたプラスミドは、株内での形質転換の際に不安定になると観察されている。遺伝子調節エレメント、特に、反復されるエレメントが、Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）株内で組み換わることが観察されている。この不安定性は、植物形質転換効率の低下および可能性あるトランスジェニック植物を変更されていないＴ鎖配列について徹底的にスクリーニングする必要性をもたらす。この株内で形質転換されたプラスミドの不安定性を考えると、組換え特性を有さず、プラスミド内に位置する遺伝エレメントの再編成を伴わずにプラスミドを安定に維持できるアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）株を開発する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、プラスミド安定性が改善されたアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の株が依然として必要である。特に、遺伝子組換え経路に欠損を有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の株の開発が望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は、親株と比べてＲｅｃＡ活性が欠損しているアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株（例えば、ＬＢＡ４４０４）を製造および使用するための新規組成物および方法を提供する。アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のその他の遺伝子欠損株との組合せも開示される。具体的には、２種の例示的ｓ  ｒｅｃＡマイナス株である、クロラムフェニコール耐性遺伝子がｒｅｃＡ遺伝子を破壊しているＵＩＡ７７７およびカナマイシン耐性遺伝子がｒｅｃＡ遺伝子を破壊しているＵＩＡ７７０が提供される。
【０００８】
一態様では、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の修飾された株が提供され、前記修飾された株は、その親株と比べて遺伝子組換え経路が欠損している。
【０００９】
一実施形態では、修飾された株は、ＲｅｃＡ、ＲｅｃＢ、ＲｅｃＤ、ＲｅｃＦ、ＲｅｃＧ、ＲｅｃＪ、ＲｅｃＮ、ＲｅｃＯ、ＲｅｃＱ、ＲｅｃＲおよびＲｅｃＸからなる群から選択される少なくとも１種の組換え経路が欠損している。別の実施形態では、修飾された株は、ＲｅｃＡ活性が欠損している。さらなる実施形態では、ｒｅｃＡ遺伝子は、配列番号１０または１１と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、修飾された株はまた、ＲｅｃＢ、ＲｅｃＤ、ＲｅｃＦ、ＲｅｃＧ、ＲｅｃＪ、ＲｅｃＮ、ＲｅｃＯ、ＲｅｃＱ、ＲｅｃＲおよびＲｅｃＸからなる群から選択される活性が欠損している。
【００１０】
ｒｅｃＡ遺伝子およびＲｅｃＡタンパク質配列は、それぞれ、配列番号１０および１２に示されている。ｒｅｃＢ遺伝子およびＲｅｃＢタンパク質配列は、それぞれ、配列番号１３および１４に示されている。ｒｅｃＤ遺伝子およびＲｅｃＤタンパク質配列は、それぞれ、配列番号１５および１６に示されている。ｒｅｃＦ遺伝子およびＲｅｃＦタンパク質配列は、それぞれ、配列番号１７および１８に示されている。ｒｅｃＧ遺伝子およびＲｅｃＧタンパク質配列は、それぞれ、配列番号１９および２０に示されている。ｒｅｃＪ遺伝子およびＲｅｃＪタンパク質配列は、それぞれ、配列番号２１および２２に示されている。ｒｅｃＮ遺伝子およびＲｅｃＮタンパク質配列は、それぞれ、配列番号２３および２４に示されている。ｒｅｃＯ遺伝子およびＲｅｃＯタンパク質配列は、それぞれ、配列番号２５および２６に示されている。ｒｅｃＱ遺伝子およびＲｅｃＱタンパク質配列は、それぞれ、配列番号２７および２８に示されている。ｒｅｃＲ遺伝子およびＲｅｃＲタンパク質配列は、それぞれ、配列番号２９および３０に示されている。ｒｅｃＸ遺伝子およびＲｅｃＸタンパク質配列は、それぞれ、配列番号３１および３２に示されている。
【００１１】
別の実施形態では、ゲノムｒｅｃＡ遺伝子は、ｒｅｃＡ遺伝子中の配列の欠失、再編成または挿入によって修飾される。別の実施形態では、ゲノムｒｅｃＡ遺伝子は、ｒｅｃＡ遺伝子内に配列を挿入することによって修飾され、それによって、ＲｅｃＡタンパク質の発現を妨害する。さらなる実施形態では、挿入される配列は、選択マーカー遺伝子を含む。別の実施形態では、選択マーカーは、クロラムフェニコール耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性またはそれらの組合せからなる群から選択される抗生物質耐性遺伝子を含む。さらなる実施形態では、抗生物質耐性遺伝子は、クロラムフェニコール耐性遺伝子またはカナマイシン耐性遺伝子を含む。
【００１２】
修飾された株の一実施形態では、ＲｅｃＡ活性は、前記株から調製された抽出物において検出不能である。別の実施形態では、ＲｅｃＡタンパク質は、ウエスタンブロット分析を使用して検出不能である。別の実施形態では、ＲｅｃＡ  ｍＲＮＡは、ノーザンブロット分析を使用して検出不能である。別の実施形態では、ｒｅｃＡ遺伝子は、サザンブロット分析を使用して検出不能である。
【００１３】
一実施形態では、ｒｅｃＡ遺伝子は、配列番号１２のタンパク質をコードする。別の実施形態では、株は、Ｔｉプラスミドを含む。さらなる実施形態では、Ｔｉプラスミドは、ｐＡＬ４４０４  Ｔｉプラスミドを含むか、またはｐＡＬ４４０４  Ｔｉプラスミドに由来する。
【００１４】
一実施形態では、株は、バイナリープラスミドを含む。さらなる実施形態では、殺虫剤耐性形質、除草剤許容性形質、窒素使用効率形質、水使用効率形質、栄養価形質、ＤＮＡ結合形質、選択マーカー形質およびそれらの組合せからなる群から選択される農学的形質の遺伝子を含むバイナリープラスミド。別の実施形態では、株は、ターナリープラスミドを含む。別の実施形態では、親株は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）である。
【００１５】
別の態様では、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）由来の修飾されたｒｅｃＡ遺伝子を含むプラスミドが提供され、ｒｅｃＡ遺伝子は、修飾前に、配列番号１０または１１に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％の配列同一性を有し、修飾されたｒｅｃＡ遺伝子は、ＲｅｃＡタンパク質の発現において欠損している。
【００１６】
一実施形態では、修飾は、ｒｅｃＡ遺伝子または配列番号１０もしくは１１内へのドナー配列の挿入を含む。さらなる実施形態では、ドナー配列は、選択マーカー遺伝子を含む。別の実施形態では、選択マーカー遺伝子は、クロラムフェニコール耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性またはそれらの組合せから選択される抗生物質耐性遺伝子を含む。さらなる実施形態では、抗生物質耐性遺伝子は、クロラムフェニコール耐性遺伝子またはカナマイシン耐性遺伝子を含む。別の実施形態では、ドナー配列の少なくとも一方の末端は、配列番号１０または１１の少なくとも４３塩基対の断片と隣接している。
【００１７】
別の態様では、その親株と比べて遺伝子組換え経路が欠損しているアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株を作製する方法が提供される。方法は、
（ａ）ｒｅｃＡ遺伝子を対象とするノックアウトプラスミドを準備するステップと、
（ｂ）アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株にノックアウトプラスミドを導入するステップと、
（ｃ）ゲノム突然変異を含むコロニーを選択およびスクリーニングするステップと、
（ｄ）ｒｅｃＡのゲノム突然変異を有する少なくとも１種の突然変異されたアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を同定するステップと
を含む。
【００１８】
一実施形態では、ｒｅｃＡ遺伝子は、配列番号１０または１１に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％の配列同一性を有する。別の実施形態では、ノックアウトプラスミドは、ゲノム欠失、ゲノム再編成、ゲノム挿入およびそれらの組合せからなる群から選択される突然変異を誘導する。さらなる実施形態では、ゲノム挿入は、選択マーカーをコードする配列を含む。別の実施形態では、選択マーカー遺伝子は、クロラムフェニコール耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性またはそれらの組合せから選択される抗生物質耐性遺伝子を含む。さらなる実施形態では、抗生物質耐性遺伝子は、クロラムフェニコール耐性遺伝子またはカナマイシン耐性遺伝子を含む。
【００１９】
別の態様では、（ａ）上流ゲノムＤＮＡ境界配列と隣接しているＴ鎖挿入部分および（ｂ）下流ゲノムＤＮＡ境界配列を含むトランスジェニック事象が提供され、トランスジェニック事象は、その親株と比べて遺伝子組換え経路が欠損している、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の修飾された株由来のＴ鎖の組込みを含む。
【００２０】
一実施形態では、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の修飾された株由来Ｔ鎖が、トランスジェニック事象を再生するために使用される、ターゲッティングされた植物細胞のゲノム内に組み込まれる。別の実施形態では、トランスジェニック事象は、農学的形質をさらに含む。さらなる実施形態では、農学的形質は、殺虫剤耐性形質、除草剤許容性形質、窒素使用効率形質、水使用効率形質、栄養価形質、ＤＮＡ結合形質、選択マーカー形質およびそれらの組合せからなる群から選択される。別の実施形態では、トランスジェニック事象は、双子葉植物または単子葉植物である。
【００２１】
別の実施形態では、双子葉植物または単子葉植物は、オオムギ、セイヨウアブラナ、コーヒー、トウモロコシ、ワタ、アマ、ブドウ、ホップ、カラシナ、ナッツ、カラスムギ、ポピー、ナタネ、イネ、ゴム植物、ライムギ、ヒマワリ、モロコシ、ダイズ、サトウキビ、茶、タバコおよびコムギからなる群から選択される。別の実施形態では、双子葉植物または単子葉植物は、トウモロコシ、コムギ、ワタ、イネ、ダイズおよびセイヨウアブラナからなる群から選択される。別の実施形態では、双子葉植物または単子葉植物は、バナナ、パイナップル、柑橘類、ブドウ、スイカ、カンタループ、マスクメロンおよびその他のメロン、リンゴ、モモ、セイヨウナシ、サクランボ、キウイ、マンゴー、ネクタリン、グアバ、パパイヤ、カキ、ザクロ、アボカド、イチジク、柑橘類および液果類からなる群から選択される。
【００２２】
別の態様では、トランスジェニック植物を製造する方法が提供される。方法は、
（ａ）ターゲッティングされた植物細胞を、その親株と比べて遺伝子組換え経路が欠損している、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の修飾された株と接触させるステップと、
（ｂ）ターゲッティングされた植物細胞のゲノム中に組み込まれた前記アグロバクテリウム属（Agrobacterium）株由来のＤＮＡを含む植物細胞を選択およびスクリーニングするステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）において選択／スクリーニングされた植物細胞から、全トランスジェニック植物を再生するステップと
を含む。
【００２３】
一実施形態では、選択ステップは、選択マーカーを使用して実施される。さらなる実施形態では、選択マーカー遺伝子は、クロラムフェニコール耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性またはそれらの組合せから選択される抗生物質耐性遺伝子を含む。別のさらなる実施形態では、抗生物質耐性遺伝子は、クロラムフェニコール耐性遺伝子またはカナマイシン耐性遺伝子を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ｒｅｃＡ突然変異誘発に使用されたプラスミドの挿入断片マップを示す図である。図１Ａは、ｐＷＭ−ＲｅｃＡｎｅｉ中のｒｅｃＡ遺伝子およびその隣接する配列を示す。Ｂは、ｐＣＰ−ＭＭＳＲ２中のＬＢＡ４４０４に由来するＤＮＡ断片のＸｈｏＩ  制限マップを示す。Ｃは、ｒｅｃＡの、抗生物質ＣｍまたはＫｍに対する耐性をコードするカセットでの置換を示す。
【図２】Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）由来のｒｅｃＡと、その他のアグロバクテリウム属（Agrobacterium）株由来のｒｅｃＡ遺伝子との関連性を示す図である。系統樹は、ｐｈｙＭＬ（ワールド・ワイド・ウェブphylogeny.fr.で入手可能）を使用して作製されている（Dereeper A, Guignon V, Blanc G, Audic S, Buffet S, Chevenet F, Dufayard JF, Guindon S, Lefort V, Lescot M, Claverie JM, Gascuel O. (2008) Phylogeny.fr: robust phylogenetic analysis for the non-specialist.  Nucleic Acids Research. 36 (Web Server Issue):W465-9）。このアラインメント分析を実施するために、ｒｅｃＡの内部の９６９ｂｐ断片（３４〜１００５ｂｐ）が使用される。その他の株は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属における代表的なｒｅｃＡ遺伝子型（genomovars）（Ｇ−）および示されるような関連分類群から選択される（Costechareyre et al., 2010）。
【図３】野生型および補完株と比較した、２種の例示的Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）突然変異ｒｅｃＡマイナス株であるＵＩＡ７７７およびＵＩＡ７７０の成長速度を示す図である。これらのアッセイには、ＭＧＬ培地が使用される。
【図４】構築物設計および構築物内のトウモロコシ（Zea mays）ユビキチン−１プロモーターの重複を示す、バイナリープラスミド、ｐＤＡＢ１０８７００のプラスミドマップを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
親株と比べてＲｅｃＡ活性が欠損している、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）株を製造および使用するための新規組成物および方法が本明細書において開示される。アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）のゲノム内のポリヌクレオチド断片の組込みのための染色体組込み部位がさらに記載される。開示される新規組成物および方法は、植物種を用いるトランスジェニック事象の製造にとって有用である。
【００２６】
別に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が関連する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。矛盾する場合には、定義を含む本願が支配する。文脈によって別に必要とされない限り、単数形の用語は、複数形を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。本明細書において言及されるすべての刊行物、特許およびその他の参考文献は、特許または特許公報の特定の節のみが、参照により組み込まれると示されない限り、個々の刊行物または特許出願が各々、具体的に、個別に、参照により組み込まれるよう示されるように、すべての目的のために参照によりその全文が組み込まれる。
【００２７】
この開示をさらに明らかにするために、以下の用語、略語および定義を提供する。
【００２８】
本明細書において使用される場合、用語「含む（comprises）」、「含んでいる（comprising）」、「含む（includes）」、「含んでいる（including）」、「有する（has）」、「有している（having）」、「含有する（contains）」または「含有している（containing）」またはその任意のその他の変形は、非排他的である、または制約がないものとする。例えば、要素のリストを含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品または装置は、必ずしもそれらの要素のみに限定されず、明確に列挙されていないか、またはこのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品または装置に特有ではないその他の要素を含み得る。さらに、逆の意味が明確に記載されない限り、「または」とは、包含的またはを指し、排他的またはを指さない。例えば、条件ＡまたはＢは、以下のいずれによっても満たされる：Ａが真であり（または存在し）、Ｂは偽である（または存在しない）、Ａが偽であり（または存在しない）、Ｂは真である（または存在する）、ならびにＡおよびＢの両方とも真である（または存在する）。
【００２９】
本明細書において、「内因性配列」は、生物における、または生物のゲノムにおけるその天然位置における、ポリヌクレオチド、遺伝子またはポリペプチドの天然形態を定義する。
【００３０】
本明細書において使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」は、同義的に使用され、単数形の核酸、複数形の核酸、核酸断片、その変異体または誘導体および核酸構築物（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）およびプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を包含し得る。ポリヌクレオチドまたは核酸は、非翻訳５’および／または３’配列およびコード配列を含む全長ｃＤＮＡ配列またはその断片のヌクレオチド配列を含有し得る。ポリヌクレオチドまたは核酸は、非修飾リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドまたは修飾リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドを含み得る、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドからなり得る。例えば、ポリヌクレオチドまたは核酸は、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡからなり得る。ＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子は、一本鎖、二本鎖または一本鎖および二本鎖領域の混合物であり得る。前記の用語はまた、ポリヌクレオチドまたは核酸の、化学的に、酵素によって、および代謝によって修飾された形態も包含する。
【００３１】
特定のＤＮＡは、配列がデオキシリボヌクレオチド塩基対合のルールに従って決定されるその補体も指すということは理解される。
【００３２】
本明細書において使用される場合、用語「遺伝子」とは、機能的生成物（ＲＮＡまたはポリペプチド／タンパク質）をコードする核酸を指す。遺伝子は、機能的生成物をコードする配列に先行する（５’非コード配列）および／またはそれに続く（３’非コード配列）を含み得る。
【００３３】
本明細書において使用される場合、用語「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列をコードする核酸配列を指す。「調節配列」とは、転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性または関連コード配列の翻訳に影響を及ぼす、コード配列の上流（例えば、５’非コード配列）、コード配列内またはコード配列の下流（例えば、３’非コード配列）に位置するヌクレオチド配列を指す。調節配列として、例えば、限定するものではないが、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステム−ループ構造が挙げられる。
【００３４】
本明細書において使用される場合、用語「ポリペプチド」は、単数形のポリペプチド、複数形のポリペプチドおよびその断片を含む。この用語は、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）によって直線的に連結しているモノマー（アミノ酸）からなる分子を指す。用語「ポリペプチド」とは、２個以上のアミノ酸の任意の鎖（単数または複数）を指し、特定の長さまたは大きさの生成物を指さない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、アミノ酸鎖または２個以上のアミノ酸の鎖（単数または複数）を指すために使用される任意のその他の用語は、「ポリペプチド」の定義内に含まれ、前記の用語は、本明細書における「ポリペプチド」と同義的に使用される。ポリペプチドは、自然の生物学的供給源から単離されてもよく、組換え技術によって製造されてもよいが、特定のポリペプチドは、必ずしも特定の核酸から翻訳されない。ポリペプチドは、例えば、限定するものではないが、化学合成によってを含め、任意の適当な方法で作製され得る。
【００３５】
対照的に、用語「異種」とは、参照（宿主）生物においてその位置に普通見られない、ポリヌクレオチド、遺伝子またはポリペプチドを指す。例えば、異種核酸は、異なるゲノム位置で参照生物中に普通見られる核酸であり得る。さらなる例によって、異種核酸は、参照生物において普通見られない核酸であり得る。異種ポリヌクレオチド、遺伝子またはポリペプチドを含む宿主生物は、異種ポリヌクレオチド、遺伝子またはポリペプチドを宿主生物中に導入することによって製造され得る。特定の例では、異種ポリヌクレオチドは、対応する天然ポリヌクレオチドとは異なる形態で供給源生物中に再導入される天然コード配列またはその一部を含む。特定の例では、異種遺伝子は、対応する天然遺伝子とは異なる形態で供給源生物中に再導入される天然コード配列またはその一部を含む。例えば、異種遺伝子は、天然宿主中に再導入される非天然調節領域を含むキメラ遺伝子の一部である天然コード配列を含み得る。特定の例では、異種ポリペプチドは、対応する天然ポリペプチドとは異なる形態で供給源生物中に再導入される天然ポリペプチドである。
【００３６】
異種遺伝子またはポリペプチドは、キメラもしくは融合ポリペプチドまたはそれをコードする遺伝子を製造するために、別の遺伝子またはポリペプチドと融合している、機能的ポリペプチドまたは機能的ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、遺伝子またはポリペプチドであり得る。特定の実施形態の遺伝子およびタンパク質は、具体的に例示される全長配列およびこれらの配列の部分、セグメント、断片（隣接する断片ならびに全長分子と比較した内部および／または末端欠失を含む）、変異体、突然変異体、キメラおよび融合物を含む。
【００３７】
本明細書において、用語「修飾」は、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの活性の低減、実質的な排除または排除をもたらす、本明細書において開示されるポリヌクレオチドの変化およびポリペプチドの活性の低減、実質的な排除または排除をもたらす本明細書において開示されるポリペプチドの変化を指し得る。あるいは、用語「修飾」は、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの活性の増大または増強をもたらす本明細書において開示されるポリヌクレオチドの変化およびポリペプチドの活性の増大または増強をもたらす本明細書において開示されるポリペプチドの変化を指し得る。このような変化は、限定するものではないが、欠失すること、突然変異すること（例えば、自然突然変異誘発、ランダム突然変異誘発、突然変異誘発遺伝子によって引き起こされる変異誘発またはトランスポゾン突然変異誘発）、置換すること、挿入すること、下方制御すること、細胞位置を変更すること、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの状態を変更すること（例えば、メチル化、リン酸化またはユビキチン化）、補因子を除去すること、アンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡを導入すること、干渉ＲＮＡ／ＤＮＡを導入すること、化学修飾、共有結合修飾、ＵＶまたはＸ線を用いる照射、相同組換え、有糸分裂組換え、プロモーター置換方法および／またはそれらの組合せを含めた当技術分野で周知の方法によって行われ得る。どのヌクレオチドまたはアミノ酸残基が修飾され得るかを決定する指針は、特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列を、例えば、酵母または細菌の、相同ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのものと比較することおよび高い相同性の領域（保存された領域）またはコンセンサス配列において行われる修飾の数を最大化することによって見い出され得る。
【００３８】
用語「誘導体」、本明細書において、本開示において示される配列の修飾を指す。このような修飾の例示は、作物種において本明細書において開示されるコード配列の機能を保存する、わずかに変更する、または増大する、本明細書において開示されるコード配列の核酸配列と関連する１個または複数の塩基の置換、挿入および／または欠失となる。このような誘導体は、当業者ならば、例えば、配列構造を予測および最適化するためにコンピュータモデリング技術を使用して容易に決定することができる。したがって、用語「誘導体」はまた、本明細書において開示されたコード配列と実質的な配列同一性を有し、その結果、本開示の製造実施形態において使用するための開示された機能を有することができる核酸配列を含む。
【００３９】
用語「プロモーター」とは、配列をコードする核酸の発現を制御可能なＤＮＡ配列または機能的ＲＮＡを指す。実施例において、制御されたコード配列は、プロモーター配列の３’に位置する。プロモーターは、全体として天然遺伝子に由来し得、プロモーターは、本来見られる異なるプロモーターに由来する異なる要素からなり得るか、またはプロモーターは、合理的に設計されたＤＮＡセグメントをさらに含み得る。異なるプロモーターは、異なる組織または細胞種における、または異なる発達段階での、または異なる環境条件もしくは生理学的条件に応じた遺伝子の発現に向けることができるということは当業者によって理解される。前記のプロモーターのすべての例は、公知であり、当技術分野において、異種核酸の発現を制御するために使用される。ほとんどの時点でのほとんどの細胞種において遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と呼ばれる。さらに、当業者は（多くの場合、不成功であるが）、調節配列の正確な境界を説明するよう試みたが、種々の長さのＤＮＡ断片が同一プロモーター活性を有し得ると理解されるようになった。特定の核酸のプロモーター活性は、当業者が精通する技術を使用してアッセイされ得る。
【００４０】
用語「作動可能に連結された」とは、単一核酸での核酸配列の結合を指し、ここで、一方の核酸配列の機能が、もう一方によって影響を受ける。例えば、プロモーターは、プロモーターが、そのコード配列の発現に影響を及ぼすことが可能である（例えば、コード配列が、プロモーターの転写制御下にある）場合にコード配列と作動可能に連結されている。コード配列は、センスまたはアンチセンス配向で調節配列と作動可能に連結され得る。
【００４１】
用語「発現」とは、本明細書において使用される場合、ＤＮＡに由来するセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を指し得る。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳も指し得る。本明細書において使用される場合、用語「過剰発現」とは、同一遺伝子または関連遺伝子の内因性発現よりも高い発現を指す。したがって、異種遺伝子は、その発現が、匹敵する内因性遺伝子のものよりも高い場合に「過剰発現される」。
【００４２】
本明細書において使用される場合、用語「形質転換」または「形質転換する」とは、遺伝的に安定な継承をもたらす、宿主生物への核酸またはその断片の転移および組込みを指す。形質転換核酸を含有する宿主生物は、「トランスジェニック」、「組換え」または「形質転換された」生物と呼ばれる。
【００４３】
本明細書において使用される場合、用語「結合」とは、高分子間（例えば、タンパク質および核酸間）の配列特異的、非共有結合相互作用を指す。全体としての相互作用が、配列特異的である限り、結合相互作用のすべての成分が、配列特異的である（例えば、ＤＮＡ骨格中のリン酸残基と接触する）必要はない。このような相互作用は、一般に、１０−６Ｍ−１以下の解離定数（Ｋｄ）を特徴とする。「親和性」とは、結合の強度を指し、結合親和性の増大は、より低いＫｄと相関している。
【００４４】
「結合タンパク質」は、別の分子と非共有結合によって結合できるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子と（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子と（ＲＮＡ結合タンパク質）および／またはタンパク質分子と（タンパク質結合タンパク質）結合できる。タンパク質結合タンパク質の場合には、それ自体と結合し得る（ホモ二量体、ホモ三量体などを形成する）および／または異なるタンパク質（単数または複数）の１個または複数の分子と結合し得る。結合タンパク質は、２種以上の結合活性を有し得る。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合、ＲＮＡ結合およびタンパク質結合活性を有する。
【００４５】
用語「プラスミド」および「ベクター」とは、本明細書において使用される場合、細胞の中央代謝の一部ではない１種または複数の遺伝子を保持し得る染色体外要素を指す。プラスミドおよびベクターは、通常、環状二本鎖ＤＮＡ分子である。しかし、プラスミドおよびベクターは、一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの線形または環状核酸であり得、いくつかのヌクレオチド配列が、プロモーター断片およびコーディングＤＮＡ配列を、任意の適当な３’非翻訳配列とともに細胞中に導入可能である独特の構築物に結合または組換えられている本質的に任意の供給源に由来するＤＮＡを保持し得る。例では、プラスミドおよびベクターは、細菌宿主における増殖のための自立複製配列を含み得る。
【００４６】
ポリペプチドおよび「タンパク質」は、本明細書において同義的に使用され、ペプチド結合によって連結された２個以上のアミノ酸の分子鎖を含む。この用語は、特定の長さの生成物を指さない。したがって、「ペプチド」および「オリゴペプチド」は、ポリペプチドの定義内に含まれる。この用語は、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などを含む。さらに、タンパク質断片、類似体、突然変異されたまたは変異体タンパク質、融合タンパク質などが、ポリペプチドの意味内に含まれる。この用語はまた、合成され得るまたは公知のタンパク質遺伝子操作技術を使用する組換えによって発現されるように、１個または複数のアミノ酸類似体または非カノニカルまたは非天然アミノ酸が含まれる分子を含む。さらに、発明の融合タンパク質は、周知の有機化学技術によって本明細書において記載されるように誘導体化され得る。
【００４７】
用語「融合タンパク質」は、タンパク質が、２種以上の親タンパク質またはポリペプチドに由来するポリペプチド成分を含むことを示す。通常、融合タンパク質は、１種のタンパク質に由来するポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列が、異なるタンパク質に由来するポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列とインフレームで付加され、任意選択で、異なるタンパク質に由来するポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列からリンカーによって離れている融合遺伝子から発現される。次いで、融合遺伝子は、単一タンパク質として組換え宿主細胞によって発現され得る。
【００４８】
発現「制御配列」とは、まとめて、宿主細胞においてコード配列の転写および翻訳を提供する、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写終結配列、上流調節ドメイン、エンハンサーなどをまとめて指す。所望の遺伝子が転写および翻訳され得る限り、これらの制御配列のすべてが、常に組換えベクター中に存在することを必要とするわけではない。
【００４９】
「組換え」とは、２種のＤＮＡまたはＲＮＡ分子間のＤＮＡまたはＲＮＡ配列の部分の再集合を指す。「相同組換え」は、各ＤＮＡ分子中に存在する相同または相補的ヌクレオチド配列によってハイブリダイズする２種のＤＮＡ分子間で起こる。
【００５０】
用語「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション」は、プローブが、その標的部分配列と優先的にハイブリダイズし、その他の配列とは、より少ない程度にハイブリダイズする、または全くハイブリダイズしない条件を指す。サザンおよびノーザンハイブリダイゼーションなどの核酸ハイブリダイゼーション実験の関連において「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」および「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は、配列依存的であり、異なる環境パラメータ下で異なる。核酸のハイブリダイゼーションの詳細な指針は、Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter 2 Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays, Elsevier, New Yorkに見られる。一般に、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、規定のイオン強度およびｐＨでの特定の配列の熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低いように選択される。Ｔｍは、標的配列の５０％が、完全に対応するプローブとハイブリダイズする温度である（規定のイオン強度およびｐＨ下）。極めてストリンジェントな条件は、特定のプローブのＴｍと等しいように選択される。
【００５１】
サザンまたはノーザンブロットにおけるフィルター上での、１００個を超える相補的残基を有する相補的核酸のハイブリダイゼーションのためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例として、４２℃で１ｍｇのヘパリンを有する５０％ホルムアミドがあり、ハイブリダイゼーションは、一晩実施される。高度にストリンジェントな洗浄条件の一例として、７２℃で約１５分間の０．１５Ｍ  ＮａＣｌがある。ストリンジェントな洗浄条件の一例として、６５℃で１５分間の０．２ｘＳＳＣ洗浄がある（ＳＳＣバッファーの説明については、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning--A Laboratory Manual (2nd ed.) Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NYを参照のこと）。バックグラウンドプローブシグナルを除去するために、高ストリンジェンシー洗浄に、低ストリンジェンシー洗浄が先行することが多い。例えば、１００を超えるヌクレオチドの二本鎖の中程度にストリンジェンシーな洗浄の一例として、４５℃で１５分間の１ｘＳＳＣがある。例えば、１００を超えるヌクレオチドの二本鎖の低ストリンジェンシー洗浄の一例として、４０℃で１５分間の４〜６ｘＳＳＣがある。一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいて、無関係プローブについて観察されたものの２ｘ（またはそれより高い）のシグナル対ノイズ比は、特異的ハイブリダイゼーションの検出を示す。ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一である場合には、依然として実質的に同一である。これは、例えば、核酸のコピーが、遺伝暗号によって可能にされる最大コドン縮重を使用して作製される場合に起こる。
【００５２】
本開示はまた、ストリンジェントな条件下で、好ましくは、高度にストリンジェントな条件下で、本開示のもののようなポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能な単離されたポリヌクレオチドに関する。
【００５３】
本明細書において、用語「ハイブリダイズする」とは、互いに少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、より好ましくは、少なくとも約８０％、さらにより好ましくは、少なくとも約８５％〜９０％、最も好ましくは、少なくとも９５％相同であるヌクレオチド配列が、通常、互いにハイブリダイズされたままであるハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を記載するよう意図される。
【００５４】
一実施形態では、本開示の核酸は、本願に示される核酸配列またはその相補体と、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上相同である。
【００５５】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の別の限定されない例として、約４５℃で６ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）におけるハイブリダイゼーションと、それに続く、５０℃での、好ましくは、５５℃での、より好ましくは、６０℃での、さらにより好ましくは、６５℃での１ｘＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳにおける１回または複数回の洗浄がある。
【００５６】
高度にストリンジェントな条件は、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識されたＤＮＡプローブなどの標識されたＤＮＡプローブを使用する２〜４日間などの数日間の４２℃でのインキュベーションと、それに続く、室温で２ｘＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳにおける１回または複数回の洗浄および６５〜６８℃で０．５ｘＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳまたは０．１ｘＳＳＣにおける１回または複数回の洗浄を含み得る。特に、高度にストリンジェントな条件は、例えば、２時間〜４日間の、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡを含むか、もしくは含まないＤｉｇＥａｓｙＨｙｂ溶液（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）または５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  クエン酸三ナトリウム）、０．０２％ドデシル硫酸ナトリウム、０．１％  Ｎ−ラウロイルサルコシンおよび２％ブロッキング試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）を含む溶液などの溶液における、ＤＩＧ標識されたＤＮＡプローブを使用する（例えば、ＤＩＧ標識系；Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ、６８２９８  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙを使用することによって調製された）４２℃でのインキュベーションと、それに続く、室温で２ｘＳＳＣおよび０．１％  ＳＤＳにおける５〜１５分間のフィルターの２回の洗浄、次いで、６５〜６８℃で０．５ｘＳＳＣおよび０．１％  ＳＤＳまたは０．１ｘＳＳＣおよび０．１％  ＳＤＳにおける１５〜３０分間の２回の洗浄を含む。
【００５７】
いくつかの実施形態では、高度にストリンジェントな条件下で本開示のヌクレオチド配列とハイブリダイズする本開示の単離された核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応し得る。本明細書において、「天然に存在する」核酸分子とは、天然に生じる（例えば、天然タンパク質をコードする）ヌクレオチド配列を有するＲＮＡまたはＤＮＡ分子を指す。
【００５８】
当業者ならば、どの条件が、ストリンジェントおよび高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件にあてはまるかを承知している。このような条件に関するさらなる指針は、例えば、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.およびAusubel et al. (eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, N.Y.)において当技術分野では容易に入手可能である。用語「相同性」または「同一性パーセント」は、本明細書において同義的に使用される。本開示の目的上、本明細書において、２種のアミノ酸配列の、または２種の核酸配列の同一性パーセントを決定するために、最適比較目的で配列がアラインされる（例えば、第２のアミノまたは核酸配列との最適アラインメントのために、第１のアミノ酸の配列または核酸配列中にギャップが導入され得る）と定義される。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められる場合には、その位置で分子は同一である。２種の配列間の同一性パーセントは、配列によって共有される同一位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一位置の数／位置の総数（すなわち、重複する位置ｘ１００）。好ましくは、２種の配列は、同一の長さである。
【００５９】
当業者ならば、２種の配列間の相同性を決定するためにいくつかの異なるコンピュータプログラムが利用可能であるという事実を承知する。例えば、２種の配列間の配列の比較および同一性パーセントの決定は、数学アルゴリズムを使用して達成され得る。好ましい実施形態では、２種のアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ａｃｃｅｌｒｙｓワールドワイドウェブａｃｃｅｌｒｙｓ．ｃｏｍでインターネットで入手可能）中のＧＡＰプログラム中に組み込まれている、Ｂｌｏｓｓｏｍ  ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれかおよび１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップ加重および１、２、３、４、５または６の長さ加重を使用するNeedlemanおよびWunsch（J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)）アルゴリズムを使用して決定される。当業者ならば、これらの異なるパラメータはすべて、わずかに異なる結果をもたらすが、異なるアルゴリズムを使用する場合にも、２種の配列の全体的な同一性パーセンテージは大きく変更されないと理解する。
【００６０】
さらに別の実施形態では、２種のヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ａｃｃｅｌｒｙｓワールドワイドウェブａｃｃｅｌｒｙｓ．ｃｏｍでインターネットで入手可能）中の、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスおよび４０、５０、６０、７０または８０のギャップ加重および１、２、３、４、５または６の長さ加重を使用するＧＡＰプログラムを使用して決定される。別の実施形態では、２種のアミノ酸またはヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）（ｖｅｇａウェブサイトでインターネットで入手可能、より詳しくは、ＡＬＩＧＮ−ＩＧＨ  Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ、またはより詳しくは、ｈｔｔｐ：／／ｖｅｇａ．ｉｇｈ．ｃｎｒｓ．ｆｒ／ｂｉｎ／ａｌｉｇｎ−ｇｕｅｓｓ．ｃｇｉで）に組み込まれている、ＰＡＭ１２０加重残基表、１２のギャップ長ペナルティーおよび４のギャップペナルティーを使用する、E. MeyersおよびW. Miller(CABIOS, 4: 11-17 (1989)のアルゴリズムを使用して決定される。
【００６１】
本開示の核酸およびタンパク質配列は、例えば、その他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定するために公開データベースに対する検索を実施するための「クエリー配列」としてさらに使用され得る。このような検索は、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸプログラム（バージョン２．０）を使用して実施され得る。本開示の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得るために、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索が、ＢＬＡＳＴＮプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて実施され得る。本開示のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るために、ＢＬＡＳＴタンパク質検索が、ＢＬＡＳＴＸプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実施され得る。比較目的でギャップありアラインメントを得るために、Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25 (17): 3389-3402に記載されるようなギャップありＢＬＡＳＴが利用され得る。ＢＬＡＳＴおよびギャップありＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合には、それぞれのプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴＸおよびＢＬＡＳＴＮ）のデフォルトパラメータが使用され得る。（ｎｃｂｉウェブサイト、例えば、ワールドワイドウェブｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖでインターネットで入手可能）
【００６２】
用語「キメラ」とは、本明細書において、「組み換えられている」配列からなることを意味する。例えば、配列は、「組み換えられており、天然には一緒に見られない。
【００６３】
用語「組み換える」とは、本明細書において、ポリヌクレオチドを結合する任意の方法を指すよう意味する。この用語は、末端と末端の結合、ある配列の別のものへの挿入を含む。この用語は、突出末端連結および平滑末端連結などの物理的結合技術を包含するものとする。このような配列は、組換えられた配列を含有するように人為的にまたは組換えによって合成され得る。
【００６４】
本発明に適した植物は、花、果実、野菜、苗床、芝生および観賞用作物からなる群から選択される。さらなる実施形態では、果実は、アーモンド、リンゴ、アボカド、バナナ、液果類（イチゴ、ブルーベリー、ラズベリー、ブラックベリー、スグリ（currents）およびその他の種類の液果類を含む）、カランボラ、サクランボ、柑橘類（オレンジ、レモン、ライム、マンダリン、グレープフルーツおよびその他の柑橘類を含む）、ココナッツ、イチジク、ブドウ、グアバ、キウイ、マンゴー、ネクタリン、メロン（カンタループ、マスクメロン、スイカおよびその他のメロンを含む）、オリーブ、パパイヤ、パッションフルーツ、モモ、セイヨウナシ、カキ、パイナップル、プラムおよびザクロからなる群から選択される。さらなる実施形態では、野菜は、アスパラガス、ビーツ（例えば、サトウダイコンおよび飼料用ビート）、マメ、ブロッコリー、キャベツ、ニンジン、キャッサバ、カリフラワー、セロリ、キュウリ、ナス、ニンニク、ガーキン、葉物野菜（レタス、ケール、ホウレンソウおよびその他の葉物野菜）、リーキ、レンティル、キノコ、タマネギ、エンドウ、パプリカ（例えば、スウィートペッパー（sweet pepper）、ベルペッパー（bell pepper）および唐辛子）、ジャガイモ、カボチャ（pumpkin）、サツマイモ、サヤマメ、カボチャ（squash）およびトマトからなる群から選択される。別の実施形態では、苗床植物また花または花部は、宿根カスミソウ、カーネーション、ダリア、ラッパズイセン、ゼラニウム、ガーベラ、ユリ、ラン、ボタン、ノラニンジン、バラ、キンギョソウまたはその他の切り花または装飾花、鉢植えの花、球根、低木、落葉樹または針葉樹からなる群から選択される。
【００６５】
Ｔｉプラスミド−いくつかの実施形態では、ＲｅｃＡ活性が欠損したアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）は、Ｔｉプラスミドを含む。Ｔｉプラスミド（ヘルパープラスミドとしても知られる）は、Ｔ−ＤＮＡ領域の製造および移動に必要なｖｉｒ領域を含む。Ｔｉプラスミド（例えば、ｐＡＬ４４０４、ｐＴｉＢｏ５４２、ｐＴｉＣ５８［および一般的な誘導体ｐＴｉ１５９５５］、ｐＴｉＡｃｈ５またはｐＴｉＣｈｒｙ５）は、その他の遺伝子特徴の中でも、オクトピン合成遺伝子、癌遺伝子、病原性遺伝子（本明細書において、以下ｖｉｒ遺伝子）およびＴ鎖と隣接する不完全な反復Ｔ−ＤＮＡ境界配列を含む。植物形質転換のためにアグロバクテリウム属（Agrobacterium）株において使用されるほとんどのＴｉプラスミドは、武装解除される。したがって、野生型、病原性アグロバクテリウム属（Agrobacterium）株のＴ鎖内に位置するｖｉｒおよびｏｎｃ遺伝子領域は除去されるか、または突然変異されている。しかし、Ｔ−ＤＮＡ境界はそのままであり、右および左Ｔ−ＤＮＡ境界間にポリヌクレオチド配列を含むように修飾される。武装解除されたＴｉプラスミドは、依然として、植物ゲノムＤＮＡ内のＴ鎖を形質転換可能であるが、Ｔ鎖は、野生型および病原性Ｔ鎖において見られる発癌特性を低減または除去するように修飾される。一実施形態では、ポリヌクレオチド配列を再編成、突然変異、欠失、付加、逆転または転位置するように修飾されている野生型および病原性Ｔｉプラスミドは、本明細書において、Ｔｉプラスミド誘導体と呼ばれる。一実施形態では、Ｔ−ＤＮＡ領域は、農学的形質を発現する少なくとも１つの遺伝子発現カセットを含有するように修飾されている。機能的ｖｉｒ遺伝子を有し、Ｔ領域のすべてまたは実質的にすべておよび関連エレメントを欠くこのようなＴｉ由来プラスミドが、本明細書において一実施形態として提供される。
【００６６】
その後の実施形態では、Ｔｉプラスミドは、ｐＴｉＢｏ５４２プラスミドである。一実施形態では、Ｔｉプラスミドは、ｐＴｉＢｏ５４２プラスミドの誘導体である（その全文が参照により本明細書に組み込まれる、Hood, E. E.; Helmer, G. C.; Fraley, R. T.; Chilton, M. D. The hypovirulence of Agrobacterium tumefaciens A281 is encoded in the region of PtiB0542 outside the T-DNA. J. Bacteriol. 168:1291-1301; 1986。その後の実施形態では、Ｔｉプラスミドは、ｐＴｉＣ５８プラスミドである（その全文が参照により本明細書に組み込まれる、Holsters et al., The Functional Organization of the Nopaline A. tumefaciens plasmid pTiC58. Plasmid 3(2); 212-230, 1980)。一実施形態では、Ｔｉプラスミドは、ｐＴｉＣ５８プラスミドの誘導体である。その後の実施形態では、Ｔｉプラスミドは、ｐＴｉＡｃｈ５プラスミド（その全文が参照により本明細書に組み込まれる、Gielen, J.; De Beuckeleer, M.; Seurinck, J.; Deboeck F.; De Greve H.; Lemmers, M.; Van Montagu M.; Schell J. The Complete Nucleotide Sequence of the TL-DNA of the Agrobacterium tumefaciens plasmid pTiAch5. The EMBO Journal. 3(4):835-846; 1984）。一実施形態では、Ｔｉプラスミドは、ｐＴｉＡｃｈ５プラスミドの誘導体である。その後の実施形態では、Ｔｉプラスミドは、ｐＴｉＣｈｒｙ５プラスミドである（その全文が参照により本明細書に組み込まれる、Kovacs L.G.; Pueppke S.G. Mapping and Genetic Organization of pTiChry5, a Novel Ti Plasmid from a Highly Virulent Agrobacterium tumefaciens Strain, Mol Gen Genet 242(3):327-336, 1994）。一実施形態では、Ｔｉプラスミドは、ｐＴｉＣｈｒｙ５プラスミドの誘導体である。その後の実施形態では、Ｔｉプラスミドは、ｐＴｉ１５９９５プラスミドである（その全文が参照により本明細書に組み込まれる、Barker, R.F., Idler, K.B., Thompson, D.V. and Kemp, J.D. Nucleotide sequence of the T-DNA region from the Agrobacterium tumefaciens octopine Ti plasmid pTi15955, Plant Mol. Biol. 2 (6), 335-350, 1983）。一実施形態では、Ｔｉプラスミドは、ｐＴｉ１５９９５プラスミドの誘導体である。さらなる実施形態では、Ｔｉプラスミドは、ｐＡＬ４４０４プラスミドの誘導体である（その全文が参照により本明細書に組み込まれる、van der Fits et al., (2000) Plant Molec. Biol. 43:495-502）。
【００６７】
バイナリーベクター−いくつかの実施形態では、ＲｅｃＡ活性が欠損しているアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）は、バイナリーベクターを含む。その他の実施形態では、第２のプラスミドは、バイナリーベクターである。バイナリーベクターの限定されない例として、ｐＢＩＮバイナリーベクター（その全文が参照により本明細書に組み込まれる、Bevan M (1984) Binary Agrobacterium vectors for plant transformation. Nucleic Acids Res 12: 8711-872）、ｐＧＡバイナリーベクター（その全文が参照により本明細書に組み込まれる、An G (1987) Binary Ti vectors for plant transformation and promoter analysis. Methods Enzymol 153: 292-305 An G, Watson BD, Stachel S, Gordon MP, Nester EW (1985) New cloning vehicles for transformation of higher plants. EMBO J 4: 277-284）、ＳＥＶバイナリーベクター（その全文が参照により本明細書に組み込まれる、Fraley RT, Rogers SG, Horsch RB, Eichholtz DA, Flick JS, Fink CL, Hoffmann NL, Sanders PR (1985) The SEV system: a new disarmed Ti plasmid vector system for plant transformation. Biotechnology (N Y) 3: 629-635）、ｐＥＮＤ４Ｋバイナリーベクター（その全文が参照により本明細書に組み込まれる、Klee HJ, Yanofsky MF, Nester EW (1985) Vectors for transformation of higher plants. Biotechnology (N Y) 3: 637-642）、ｐＢＩバイナリーベクター（その全文が参照により本明細書に組み込まれる、Jefferson RA, Kavanagh TA, BevanMW (1987) GUS fusions: b-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J 6:3901-3907）、ｐＣＩＢ１０バイナリーベクター（その全文が参照により本明細書に組み込まれる、Rothstein SJ, Lahners KN, Lotstein RJ, Carozzi NB, Jayne SM, Rice DA (1987) Promoter cassettes, antibiotic-resistance genes, and vectors for plant transformation. Gene 53: 153-161）、ｐＭＲＫ６３バイナリーベクター（その全文が参照により本明細書に組み込まれる、Vilaine F, Casse-Delbart F (1987) A new vector derived from Agrobacterium rhizogenes plasmids: a micro-Ri plasmid and its use to construct a mini-Ri plasmid. Gene 55: 105-114）、ｐＧＰＴＶバイナリーベクター（その全文が参照により本明細書に組み込まれる、Becker D (1990) Binary vectors which allow the exchange of plant selectable markers and reporter genes. Nucleic Acids Res 18: 203)、ｐＣＧＮ１５４７バイナリーベクター（その全文が参照により本明細書に組み込まれる、McBride KE, Summerfelt KR (1990) Improved binary vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant Mol Biol 14: 269-276）、ｐＡＲＴバイナリーベクター（その全文が参照により本明細書に組み込まれる、Gleave AP (1992) A versatile binary vector system with a T-DNA organizational structure conducive to efficient integration of cloned DNA into the plant genome. Plant Mol Biol 20: 1203-1207）、ｐＧＫＢ５バイナリーベクター（その全文が参照により本明細書に組み込まれる、Bouchez D, Camilleri C, Caboche M(1993) A binary vector based on Basta resistance for in planta transformation of Arabidopsis thaliana. C R Acad Sci Ser III Sci Vie 316: 1188-1193）、ｐＭＪＤ８０バイナリーベクター（その全文が参照により本明細書に組み込まれる、Day MJD, Ashurst JL, Dixon RA (1994) Plant expression cassettes forenhanced translational efficiency. Plant Mol Biol Rep 12: 347-357）、ｐＭＪＤ８１バイナリーベクター（その全文が参照により本明細書に組み込まれる、Day MJD, Ashurst JL, Dixon RA (1994) Plant expression cassettes forenhanced translational efficiency. Plant Mol Biol Rep 12: 347-357）、ｐＰＺＰバイナリーベクター（その全文が参照により本明細書に���み込まれる、Hajdukiewicz P, Svab Z, Maliga P (1994) The small, versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation. Plant Mol Biol 25: 989-994）、ｐＢＩＮＰＬＵＳバイナリーベクター（その全文が参照により本明細書に組み込まれる、van Engelen FA,Molthoff JW, Conner AJ, Nap JP, Pereira A, StiekemaWJ (1995) pBINPLUS: an improved plant transformation vector based on pBIN19. Transgenic Res 4: 288-290）、ｐＲＴ１００バイナリーベクター（その全文が参照により本明細書に組み込まれる、Uberlacker B, Werr W (1996) Vectors with rare-cutter restriction enzyme sites for expression of open reading frames in transgenic plants. Mol Breed 2: 293-295）、ｐＣＢバイナリーベクター（その全文が参照により本明細書に組み込まれる、Xiang C, Han P, Lutziger I, Wang K, Oliver DJ (1999) A mini binary vector series for plant transformation. Plant Mol Biol 40: 711-717）、ｐＧｒｅｅｎバイナリーベクター（その全文が参照により本明細書に組み込まれる、Hellens RP, Edwards EA, Leyland NR, Bean S, Mullineaux PM (2000) pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacteriummediated plant transformation. Plant Mol Biol 42: 819-832）、ｐＰＺＰ−ＲＣＳ２バイナリーベクター（その全文が参照により本明細書に組み込まれる、Goderis IJWM, De BolleMFC, Francois IEJA,Wouters PFJ, BroekaertWF, Cammue BPA (2002) A set of modular plant transformation vectors allowing flexible insertion of up to six expression units. Plant Mol Biol 50: 17-27）、ｐＭＤＣバイナリーベクター（その全文が参照により本明細書に組み込まれる、Curtis MD, Grossniklaus U (2003) A gateway cloning vector set for highthroughput functional analysis of genes in planta. Plant Physiol 133: 462-469）、ｐＲＣＳ２バイナリーベクター（その全文が参照により本明細書に組み込まれる、Chung SM, Frankman EL, Tzfira T (2005) A versatile vector system for multiple gene expression in plants. Trends Plant Sci 10: 357-361）、ｐＥａｒｌｅｙＧａｔｅバイナリーベクター（その全文が参照により本明細書に組み込まれる、Earley KW, Haag JR, Pontes O, Opper K, Juehne T, Song K, Pikaard CS (2006) Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics. Plant J 45: 616-629）、ｐＧＷＴＡＣバイナリーベクター（その全文が参照により本明細書に組み込まれる、Chen QJ, Zhou HM, Chen J, Wang XC (2006) A Gateway-based platform for multigene plant transformation. Plant Mol Biol 62: 927-936）、ｐＯＲＥバイナリーベクター（その全文が参照により本明細書に組み込まれる、Coutu C, Brandle J, Brown D, Brown K, Miki B, Simmonds J, Hegedus DD (2007) pORE: A modular binary vector series suited for both monocot and dicot plant transformation. Transgenic Res 16: 771-781）、ｐＳＩＴＥバイナリーベクター（その全文が参照により本明細書に組み込まれる、Chakrabarty R, Banerjee R, Chung SM, Farman M, Citovsky V, Hogenhout SA, Tzfira T, Goodin M (2007) pSITE vectors for stable integration or transient expression of autofluorescent protein fusions in plants: probing Nicotiana benthamiana-virus interactions. Mol Plant Microbe Interact 20: 740-750）、ｐＭＳＰバイナリーベクター（その全文が参照により本明細書に組み込まれる、Lee LY, Kononov ME, Bassuner B, Frame BR, Wang K, Gelvin SB (2007) Novel plant transformation vectors containing the superpromoter. Plant Physiol 145: 1294-1300）、ｐＣＡＭＢＩＡバイナリーベクター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｍｂｉａ．ｏｒｇ／ｄａｉｓｙ／ｃａｍｂｉａ／ｍａｔｅｒｉａｌｓ／ｖｅｃｔｏｒｓ）およびｐＧＤバイナリーベクター（その全文が参照により本明細書に組み込まれる、Goodin MM, Dietzgen RG, Schichnes D, Ruzin S, Jackson AO (2002) pGD vectors: versatile tools for the expression of green and red fluorescent protein fusions in agroinfiltrated plant leaves. Plant J 31: 375-383）が挙げられる。その全文が参照により本明細書に組み込まれるものを参照のこと。バイナリーベクターは、一般に、Ｔ−ＤＮＡ境界配列、大腸菌（Escherichia coli）およびアグロバクテリウム属（Agrobacterium）株の両方において機能的である複製起点、ｐＴｉ／ｐＲｉプラスミドおよび／またはアグロバクテリウム属（Agrobacterium）ゲノムが有するその他の抗生物質耐性と適合する抗生物質耐性遺伝子および植物形質転換効率を改善するその他の特徴（例えば、オーバードライブ配列）などのいくつかの重要な特徴を含有する。バイナリーベクターのさらなる特徴は、当業者に公知である。例えば、バイナリープラスミド／ベクターの上記の特徴の多数を開示するLee and Gelvin (2008) Plant Physiology, 146;325-332（参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
【００６８】
ターナリーベクター−いくつかの実施形態では、ＲｅｃＡ活性が欠損しているアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）は、ターナリーベクターを含む。ｐＴｉｌ５９５５由来の構成的突然変異株ｖｉｒＧＮ５４Ｄ遺伝子のコピーが、植物形質転換のための武装解除されたＴｉヘルパープラスミドｐＡＬ４４０４およびバイナリーベクターを有する遺伝子を含有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株ＬＢＡ４４０４においてｐＢＢＲｌ由来プラスミド上に共存している「ターナリー」（すなわち、３プラスミド）ベクターが記載されている。その全文が参照により本明細書に組み込まれる、van der Fits et al., (2000) Plant Molec. Biol. 43:495-502を参照のこと。ターナリーベクターのさらなる限定されない例が、その全文が参照により本明細書に組み込まれる、Ｔｉヘルパープラスミドを有するアグロバクテリウム属（Agrobacterium）細胞中に存在する場合に、ターナリープラスミド系のさらなる例を構成するコスミドバイナリーベクターおよび「追加免疫」プラスミドを記載する欧州特許出願第２０４２６０２Ａ１号明細書および米国特許出願第２０１０／０１３２０６８Ａ１号明細書にさらに詳細に記載されている。最後に、その全文が参照により本明細書に組み込まれる、国際特許出願第２０１２０１６２２２Ａ２号には、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）において使用するためのターナリープラスミド系が記載されている。
【００６９】
プラスミド−いくつかの実施形態では、ｒｅｃＡ遺伝子を含むプラスミドは、本開示の一実施形態である。プラスミドは、プラスミド中に含有される配列に基づいて不和合性群（遺伝子型指定：ｉｎｃ；群指定：Ｉｎｃ）に割り当てられる。ｉｎｃ決定因子は、通常、同一宿主中に共存するものに由来する同一または関連不和合性群のその他のプラスミドを妨げるように働き、細胞内のプラスミドの特定のコピー数を維持するよう役立つ。例えば、Fernandez-Lopez, et al. (2006) FEMS Microbiol. Rev. 30:942-66; and Adamczyk and Jagura-Burdzy (2003) Acta Biochim. Pol. 50:425-53を参照のこと。２つのプラスミドは、いずれかが、それ自身によるよりも、その他の存在下であまり安定でない場合には不和合である。同一細胞中に同一不和合性群の２種のプラスミドが見られる場合には、細胞資源についての競合が結果として起こり得る。どちらのプラスミドがより迅速に複製可能であるか、またはいくつかのその他の利点を提供するとしても、不和合性系によって可能にされるコピーの間で不相応な程度に表される。驚くべきことに、プラスミドはまた、両方とも、自身を娘細胞に分割するための同一機能を有する場合には不和合であり得る。
【００７０】
プラスミドは、通常、多数の既存の不和合性群のうち１つのみに入る。３０種を超える既知不和合性群がある。不和合性群ＩｎｃＰに属するプラスミドは、十分に研究されており、このＩｎｃＰ群に由来する多数のプラスミドが構築されている（Schmidhauser et al. (1988) Biotechnology 10:287-332）。ＩｎｃＰ不和合性群を含有する例示的プラスミドとして、ｐＭＰ９０ＲＫ、ｐＲＫ２０１３、ｐＲＫ２９０、ｐＲＫ４０４およびｐＲＫ４１５が挙げられる。これらのプラスミドは、大腸菌（E. coli）およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を含む多数の細菌種において維持され得る。その他の不和合性群の例として、限定するものではないが、例えば、相当な配列または機能的関係を示すそれらの変異体を含む、ＩｎｃＮ、ＩｎｃＷ、ＩｎｃＬ／Ｍ、ＩｎｃＴ、ＩｎｃＵ、ＩｎｃＷ、ＩｎｃＹ、ＩｎｃＢ／Ｏ、ＩｎｃＦＩＩ、ＩｎｃＩＩ、ＩｎｃＫ、ＩｎｃＣｏｍ９、ＩｎｃＦＩ、ＩｎｃＦＩＩ、ＩｎｃＦＩＩＩ、ＩｎｃＨＩｌ、ＩｎｃＨＩ２、ＩｎｃＸ、ＩｎｃＡ／Ｃ、ＩｎｃＤ、ＩｎｃＦＩＶ、ＩｎｃＦＶ／ＦＯ、ＩｎｃＦＶＩ、ＩｎｃＨｌ  ３、ＩｎｃＨＩＩ、Ｉｎｃ１２、ＩｎｃＩ、ＩｎｃＪ、ＩｎｃＶ、ＩｎｃＱなどが挙げられる。
【００７１】
さらに、本明細書において記載される方法を使用して植物細胞を形質転換するために使用される適したプラスミドは、抗生物質または除草剤に対する形質転換された植物細胞耐性を付与するタンパク質をコードする選択マーカー遺伝子を含有し得る。個別に使用される選択マーカー遺伝子は、その結果、形質転換された細胞の選択を可能にし得、一方で、挿入されたＤＮＡを含有しない細胞の成長が、選択化合物によって抑制され得る。使用される特定の選択マーカー遺伝子（複数可）は、実験設計または優先度に応じて変わり得るが、以下の選択マーカーのいずれも、および選択マーカーとして機能し得る本明細書において列挙されない任意のその他の遺伝子も使用され得る。選択マーカーの例として、限定するものではないが、カナマイシン、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、ブレオマイシンおよびメトトレキサートなどの抗生物質に対して、またはホスフィノトリシン（ビアラホス）、グリホサート、イミダゾリノン、スルホニル尿素、トリアゾロピリミジン、クロロスルフロン、ブロモキシニルおよびダラポン（Dalapon）などの除草剤に対して耐性または許容性を提供する遺伝子が挙げられる。
【００７２】
農学的形質をコードする遺伝子発現カセット−その後の実施形態では、前記細胞から植物を再生するために植物細胞が選択される。本開示のさらなる実施形態では、Ｔ−ＤＮＡは、農学的形質をコードする遺伝子発現カセットを含有する。さらなる実施形態では、農学的形質は、商品生産物を製造する。
【００７３】
一実施形態では、本開示は、植物ゲノム内に挿入される１種または複数の遺伝子発現カセットの導入に関する。いくつかの実施形態では、遺伝子発現カセットは、コード配列を含む。コード配列は、例えば、農学的形質を付与する遺伝子をコードし得る。さらなる実施形態では、農学的形質は、殺虫剤耐性形質、除草剤許容性形質、窒素使用効率形質、水使用効率形質、栄養価形質、ＤＮＡ結合形質および選択マーカー形質からなる群から選択される。さらなる実施形態では、農学的形質は、植物内で発現される。本開示の一実施形態は、１種または複数の農学的形質を含む植物を含む。
【００７４】
いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、遺伝子発現カセットを含む。本明細書において使用されるような遺伝子発現カセットの構築のための標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当技術分野で周知であり、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)によって；またSilhavy et al., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1984)によって；またAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, published by Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987)によって記載されている。
【００７５】
植物において遺伝子の発現を指示するいくつかのプロモーターが遺伝子発現カセットで使用され得る。このようなプロモーターは、構成的、化学調節性、誘導性、組織特異的および種子優先プロモーターから選択され得る。核酸の発現を指示するために使用されるプロモーターは、個々の適用に応じて変わる。例えば、宿主細胞に適している強力な構成的プロモーターが、発現したタンパク質の発現および精製のために通常使用される。
【００７６】
好ましい植物プロモーターの限定されない例として、シロイヌナズナ（A.thaliana）ユビキチン−１０（ubi-10）（Callis, et al., 1990, J. Biol. Chem., 265:12486-12493）；Ａ．ツメファシエンス（A.tumefaciens）マンノピンシンターゼ（Δmas）（Petolino et al.、米国特許第６，７３０，８２４号明細書）；および／またはキャッサバ葉脈モザイクウイルス（ＣｓＶＭＶ）（Verdaguer et al., 1996, Plant Molecular Biology 31:1129-1139）に由来するプロモーター配列が挙げられる。別の構成的プロモーターとして、例えば、コアカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（Odell et al. (1985) Nature 313:810-812)；イネアクチンプロモーター（McElroy et al. (1990) Plant Cell 2:163-171）；トウモロコシユビキチンプロモーター（米国特許第５，５１０，４７４号明細書;Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632およびChristensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689）；ｐＥＭＵプロモーター（Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588）；ＡＬＳプロモーター（米国特許第５，６５９，０２６号明細書）；トウモロコシヒストンプロモーター（Chaboute et al. Plant Molecular Biology, 8:179-191 (1987)）などが挙げられる。
【００７７】
有用な別の植物プロモーターは、組織特異的および誘導性プロモーターを含む。誘導性プロモーターは、誘導物質に応じて１種または複数のＤＮＡ配列または遺伝子の転写を直接的または間接的に活性化できるものである。誘導物質の不在下で、ＤＮＡ配列または遺伝子は転写されない。通常、誘導性調節エレメントと特異的に結合して転写を活性化するタンパク質因子は、不活性形態で存在し、これは、次いで、誘導物質によって、直接的または間接的に活性形態に変換される。誘導物質は、熱、冷温、塩または毒性要素によって直接的に、またはウイルスなどの病原体もしくは病因物質の作用によって間接的に課せられる、タンパク質、代謝生成物、成長調節物質、除草剤またはフェノール系化合物などの化学物質または生理学的ストレスであり得る。通常、誘導性調節エレメントと特異的に結合して、転写を活性化するタンパク質因子は、不活性形態で存在し、これは、次いで、誘導物質によって、直接的または間接的に活性形態に変換される。誘導性調節エレメントを含有する植物細胞は、噴霧、灌水、加熱または同様の方法によってなど、細胞または植物に誘導物質を外的に適用することによって誘導物質に曝露され得る。
【００７８】
本開示の実施形態では、任意の誘導プロモーターが使用され得る。Ward et al., Plant Mol. Biol. 22: 361-366 (1993)を参照のこと。例示的な誘導プロモーターとして、エクジソン受容体プロモーター（米国特許第６，５０４，０８２号明細書）；銅に反応するＡＣＥ１系に由来するプロモーター（Mett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 4567-4571 (1993)）；ベンゼンスルホンアミド除草剤解毒剤に反応するトウモロコシ由来のＩｎ２−１およびＩｎ２−２遺伝子（米国特許第５，３６４，７８０号明細書；Hershey et al., Mol. Gen. Genetics 227: 229-237 (1991)およびGatz et al., Mol. Gen. Genetics 243: 32-38 (1994)）；Ｔｎ１０由来のＴｅｔレプレッサー（Gatz et al., Mol. Gen. Genet. 227: 229-237 (1991)；転写活性が糖質コルチコステロイドホルモンによって誘導される、ステロイドホルモン遺伝子に由来するプロモーター、Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88: 10421 (1991)およびMcNellis et al., (1998) Plant J. 14(2):247-257；発芽前除草剤として使用される疎水性求電子性化合物によって活性化されるトウモロコシＧＳＴプロモーター（米国特許第５，９６５，３８７号明細書および国際特許出願公開第９３／００１２９４号パンフレット）；およびサリチル酸によって活性化されるタバコＰＲ−１ａプロモーター（Ono S, Kusama M, Ogura R, Hiratsuka K., "Evaluation of the Use of the Tobacco PR-1a Promoter to Monitor Defense Gene Expression by the Luciferase Bioluminescence Reporter System", Biosci Biotechnol Biochem. 2011 Sep 23;75(9):1796-800）が挙げられる。その他の化学物質によって調節される対象とするプロモーターとして、テトラサイクリン誘導性およびテトラサイクリン抑制性プロモーター（例えば、Gatz et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237および米国特許第５，８１４，６１８号明細書および同５，７８９，１５６号明細書を参照のこと）が挙げられる。
【００７９】
対象とするその他の調節可能なプロモーターとして、転写が、それぞれ、冷温または熱に対する曝露に応じて達成され得る、冷温反応性調節エレメントまたは熱ショック調節エレメント（Takahashi et al., Plant Physiol. 99:383-390, 1992）；嫌気性条件によって誘導可能な、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター（Gerlach et al., PNAS USA 79:2981-2985 (1982);Walker et al., PNAS 84(19):6624-6628 (1987)）；エンドウマメｒｂｃＳ遺伝子またはエンドウマメｐｓａＤｂ遺伝子に由来する光誘導性プロモーター（Yamamoto et al., (1997) Plant J. 12(2):255-265）；光誘導性調節エレメント（Feinbaum et al., Mol. Gen. Genet. 226:449, 1991;Lam and Chua, Science 248:471, 1990;Matsuoka et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590;Orozco et al. (1993) Plant Mol. Bio. 23(6):1129-1138）；植物ホルモン誘導性調節エレメント（Yamaguchi-Shinozaki et al., Plant Mol. Biol. 15:905, 1990; Kares et al., Plant Mol. Biol. 15:225, 1990）などが挙げられる。誘導性調節エレメントはまた、ベンゼンスルホンアミド除草剤解毒剤に応答するトウモロコシＩｎ２−１またはＩｎ２−２遺伝子のプロモーター（Hershey et al., Mol. Gen. Gene. 227:229-237, 1991; Gatz et al., Mol. Gen. Genet. 243:32-38, 1994）およびトランスポゾンＴｎ１０のＴｅｔレプレッサー（Gatz et al., Mol. Gen. Genet. 227:229-237, 1991）であり得る。ストレス誘導性プロモーターとして、Ｐ５ＣＳなどの塩／水ストレス誘導性プロモーター（Zang et al., (1997) Plant Sciences 129:81-89）；ｃｏｒ１５ａなどの冷温誘導性プロモーター（Hajela et al., (1990) Plant Physiol. 93:1246-1252）、ｃｏｒ１５ｂ（Wilhelm et al., (1993) Plant Mol Biol 23:1073-1077）、ｗｓｃ１（Ouellet et al., (1998) FEBS Lett. 423-324-328）、ｃｉ７（Kirch et al., (1997) Plant Mol Biol. 33:897-909）およびｃｉ２１Ａ（Schneider et al., (1997) Plant Physiol. 113:335-45）；Ｔｒｇ−３１（Chaudhary et al., (1996) Plant Mol. Biol. 30:1247-57）およびｒｄ２９（Kasuga et al., (1999) Nature Biotechnology 18:287-291）などの乾燥誘導性プロモーター；Ｒａｂ１７などの浸透圧誘導性プロモーター（Vilardell et al., (1991) Plant Mol. Biol. 17:985-93）およびオスモチン（Raghothama et al., (1993) Plant Mol Biol 23:1117-28）；熱ショックタンパク質などの熱誘導性プロモーター（Barros et al., (1992) Plant Mol. 19:665-75;Marrs et al., (1993) Dev. Genet. 14:27-41）、ｓｍＨＳＰ（Waters et al., (1996) J. Experimental Botany 47:325-338）；およびパセリユビキチンプロモーターに由来する熱ショック誘導性エレメント（国際公開第０３／１０２１９８号パンレット）が挙げられる。その他のストレス誘導性プロモーターとして、ｒｉｐ２（米国特許第５，３３２，８０８号明細書および米国特許公開第２００３／０２１７３９３号明細書）およびｒｄ２９ａ（Yamaguchi-Shinozaki et al., (1993) Mol. Gen. Genetics 236:331-340）が挙げられる。アグロバクテリウムｐＭＡＳプロモーター（Guevara-Garcia et al., (1993) Plant J. 4(3):495-505）およびアグロバクテリウムＯＲＦ１３プロモーター（Hansen et al., (1997) Mol. Gen. Genet. 254(3):337-343）を含めた特定のプロモーターは、創傷によって誘導可能である。
【００８０】
組織優先プロモーターは、特定の植物組織内での増強された転写および／または発現を標的とするために利用され得る。優先発現を指す場合には、意味されることは、特定の植物組織における、その他の植物組織においてよりも高レベルでの発現である。これらの種のプロモーターの例として、ファゼオリンプロモーターによって提供されるものなどの種子優先発現（Bustos et al., (1989) The Plant Cell Vol. 1, 839-853）およびトウモロコシグロブリン−１遺伝子、(Belanger, et al. (1991) Genetics 129:863-972）が挙げられる。双子葉植物について、種子優先プロモーターとして、それだけには限らないが、マメβ−ファゼオリン、ナピン（napin）、β−コングリシニン、ダイズレクチン、クルシフェリンなどが挙げられる。単子葉植物について、種子優先プロモーターとして、それだけには限らないが、トウモロコシ１５ｋＤａゼイン、２２ｋＤゼイン、２７ｋＤａゼイン、γ−ゼイン、ワキシー（waxy）、シュランケン（shrunken）１、シュランケン（shrunken）２、グロブリン１などが挙げられる。種子優先プロモーターとしてまた、例えば、γ−ゼインの胚乳優先プロモーターなどの種子内の特定の組織に遺伝子発現を主に向けるプロモーター、タバコ由来の隠れた（cryptic）プロモーター（Fobert et al., (1994) T-DNA tagging of a seed coat-specific cryptic promoter in tobacco. Plant J. 4: 567-577）、トウモロコシ由来のＰ遺伝子プロモーター（Chopra et al., (1996) Alleles of the maize P gene with distinct tissue specificities encode Myb-homologous proteinss with C-terminal replacements.Plant Cell 7:1149-1158, Erratum in Plant Cell.1997, 1:109）、トウモロコシ由来のグロブリン−１プロモーター（Belenger and Kriz (1991) Molecular basis for Allelic Polymorphism of the maize Globulin-1 gene. Genetics 129: 863-972）および種子皮またはトウモロコシ穀粒の殻に発現を向けるプロモーター、例えば、果皮特異的グルタミンシンセターゼプロモーター（Muhitch et al., (2002) Isolation of a Promoter Sequence From the Glutamine Synthetase1-2 Gene Capable of Conferring Tissue-Specific Gene Expression in Transgenic Maize. Plant Science 163:865-872）が挙げられる。
【００８１】
プロモーターに加えて、遺伝子発現カセット（例えば、ベクターにあってもよい）は、通常、原核生物または真核生物いずれかの宿主細胞における核酸の発現に必要なさらなる要素のすべてを含有する転写単位または発現カセットを含有する。したがって、通常の発現カセットは、遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする核酸配列と作動可能に連結されたプロモーターを含有する。遺伝子発現カセットはまた、当技術分野で公知の方法に従って作動可能に連結されているさらなる要素：転写物の効率的なポリアデニル化、転写終結、リボソーム結合部位または翻訳終結に必要なシグナルを含み得る。さらに、発現カセットは、エンハンサーおよび／または異種スプライシングシグナルを含み得る。
【００８２】
遺伝子発現カセットのその他の成分は、実施形態として提供される。例として、選択マーカー、ターゲッティングまたは調節配列、最適化された輸送ペプチド配列などの輸送ペプチド配列（米国特許第５，５１０，４７１号明細書を参照のこと）ＲＢ７  ＭＡＲなどの安定化配列（Thompson and Myatt, (1997) Plant Mol. Biol., 34: 687-692および国際特許公開第９７２７２０７号パンフレットを参照のこと）またはリーダー配列、イントロンなどが挙げられる。植物発現ベクターおよびリポーター遺伝子の一般的な説明および例は、Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick et al eds; CRC Press pp. 89-119 (1993)中のGruber, et al., "Vectors for Plant Transformation"に見出すことができる。適当な発現ベクターの選択は、宿主および発現ベクターを宿主に導入する方法に応じて変わる。遺伝子発現カセットはまた、対象とする異種ヌクレオチド配列の３’末端に、植物において機能的である転写および翻訳終結領域を含むこととなる。終結領域は、本開示の実施形態のプロモーターヌクレオチド配列に関して生来的である場合も、対象とするＤＮＡ配列に関して生来的である場合も、または別の供給源に由来する場合もある。オクトピンシンターゼおよびノパリンシンターゼ（nos）終結領域などの好都合な終結領域は、Ａ．ツメファシエンス（tumefaciens）のＴｉプラスミドから入手可能である（Depicker et al., Mol. and Appl. Genet. 1:561-573 (1982)およびShaw et al. (1984) Nucleic Acids Research vol. 12, No. 20 pp7831-7846(nos)）;Guerineau et al. Mol. Gen. Genet. 262:141-144 (1991);Proudfoot, Cell 64:671-674 (1991);Sanfacon et al. Genes Dev. 5:141-149 (1991);Mogen et al.Plant Cell 2:1261-1272 (1990);Munroe et al. Gene 91:151-158 (1990);Ballas et al., Nucleic Acids Res. 17:7891-7903 (1989); Joshi et al. Nucleic Acid Res. 15:9627-9639 (1987)も参照のこと。
【００８３】
遺伝子発現カセットは、５’リーダー配列をさらに含有し得る。このようなリーダー配列は、翻訳を増強するよう作用し得る。翻訳リーダーは、当技術分野で公知であり、例として、ピコルナウイルスリーダー、ＥＭＣＶリーダー（脳心筋炎５’非コーディング領域）、Elroy-Stein et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:6126-6130 (1989)；ポティウイルスリーダー、例えば、ＴＥＶリーダー（タバコエッチウイルス）Carrington and Freed Journal of Virology, 64:1590-1597 (1990)、ＭＤＭＶリーダー（トウモロコシ萎縮モザイクウイルス）、Allison et al., Virology 154:9-20 (1986)；ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）、Macejak et al., Nature 353:90-94 (1991)；アルファルファモザイクウイルスのコートタンパク質ｍＲＮＡ由来の非翻訳リーダー（ＡＭＶ  ＲＮＡ  ４）、Jobling et al., Nature 325:622-625 (1987)；タバコモザイクウイルスリーダー（TMV）、Gallie et al., (1989) Molecular Biology of RNA、237-256頁；およびトウモロコシ退緑斑紋ウイルスリーダー（Maize chlorotic mottle virus leader）（ＭＣＭＶ）Lommel et al., Virology 81:382-385 (1991)が挙げられる。Della-Cioppa et al., Plant Physiology 84:965-968 (1987)も参照のこと。
【００８４】
遺伝子発現カセット構築物はまた、イントロンなどの翻訳および／またはｍＲＮＡ安定性を増強する配列を含有し得る。１つのこのようなイントロンの例として、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のヒストンＨ３．ＩＩＩ変異体の遺伝子ＩＩの第１のイントロンがある。Chaubet et al., Journal of Molecular Biology, 225:569-574 (1992)。
【００８５】
発現カセットにとって、特定のオルガネラ、特に、プラスチド、アミロプラストに向けられた、または小胞体に向けられた、または細胞の表面でもしくは細胞外に分泌される遺伝子産物を発現することが望ましい場合には、発現カセットは、輸送ペプチドのコード配列をさらに含み得る。このような輸送ペプチドは、当技術分野で周知であり、それだけには限らないが、アシル担体タンパク質の輸送ペプチド、ＲＵＢＩＳＣＯ、植物ＥＰＳＰシンターゼおよびヒマワリ（Helianthus annuus）の小サブユニット（米国特許第５，５１０，４１７号明細書）、トウモロコシＢｒｉｔｔｌｅ−１葉緑体輸送ペプチド（Nelson et al., Plant Physiol 117(4):1235-1252 (1998); Sullivan et al., Plant Cell 3(12):1337-48; Sullivan et al., Planta (1995) 196(3):477-84; Sullivan et al., J. Biol. Chem. (1992) 267(26):18999-9004）などが挙げられる。さらに、最適化された輸送ペプチドなどのキメラ葉緑体輸送ペプチドは、当技術分野で公知である（米国特許第５，５１０，４７１号明細書）。さらなる葉緑体輸送ペプチドが、米国特許第５，７１７，０８４号明細書、および米国特許第５，７２８，９２５号明細書において、これまでに記載されている。当業者ならば、特定のオルガネラへ産物を発現させることにおいて利用可能な多数の選択肢を容易に理解する。例えば、オオムギアルファアミラーゼ配列は、発現を小胞体に向けるために使用されることが多い（Rogers, J. Biol. Chem. 260:3731-3738 (1985)）。
【００８６】
当業者には、組換えＤＮＡ技術は、例えば、宿主細胞内の核酸分子のコピー数、核酸分子が転写される効率、得られた転写物が翻訳される効率および翻訳後修飾の効率を操作することによって、形質転換された核酸分子の発現の制御を改善し得るということは理解される。さらに、プロモーター配列は、天然プロモーターと比較して、発現のレベルを改善するよう遺伝子操作され得る。核酸分子の発現の制御に有用な組換え技術として、それだけには限らないが、１種または複数の宿主細胞染色体中への核酸分子の安定な組込み、プラスミドへのベクター安定性配列の付加、転写制御シグナル（例えば、プロモーター、オペレーター、エンハンサー）の置換または修飾、翻訳制御シグナル（例えば、リボソーム結合部位、シャイン・ダルガーノ配列またはコザック配列）の置換または修飾、宿主細胞のコドン使用に対応するための核酸分子の修飾および転写物を不安定化する配列の欠失が挙げられる。
【００８７】
形質転換された細胞または組織または植物部分または植物の選択のためのリポーターまたはマーカー遺伝子が、形質転換ベクター中に含まれ得る。選択マーカーの例として、除草剤または抗生物質などの代謝拮抗剤に対する抵抗性を付与するもの、例えば、メトトレキサートに対する抵抗性を付与するジヒドロ葉酸レダクターゼ（Reiss, Plant Physiol. (Life Sci. Adv.) 13:143-149, 1994;Herrera Estrella et al., Nature 303:209-213, (1983);Meijer et al., Plant Mol. Biol. 16:807-820, (1991)）；アミノグリコシドネオマイシン、カナマイシンおよびパロマイシン（paromycin）に対する抵抗性を付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（Herrera-Estrella, EMBO J. 2:987-995, 1983およびFraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 80:4803 (1983)）およびハイグロマイシンに対する抵抗性を付与するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（Marsh, Gene 32:481-485, (1984);Waldron et al., Plant Mol. Biol. 5:103-108, (1985);Zhijian et al., Plant Science 108:219-227, (1995)も参照のこと）；細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にするｔｒｐＢ；細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にするｈｉｓＤ（Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85:8047, (1988)）；細胞がマンノースを利用することを可能にするマンノース−６−ホスフェートイソメラーゼ（国際特許出願第９４／２０６２７号パンフレット）；オルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤、２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチンに対する抵抗性を付与するオルニチンデカルボキシラーゼ（DFMO; McConlogue, 1987, In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.）；およびブラストサイジンＳに対する抵抗性を付与する、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）由来のデアミナーゼ（Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59:2336-2338, (1995)）が挙げられる。
【００８８】
さらなる選択マーカーとして、例えば、イミダゾリノンまたはスルホニル尿素抵抗性を付与する突然変異体アセト乳酸シンターゼ（Lee et al., EMBO J. 7:1241-1248, (1988)）、アトラジンに対する抵抗性を付与する突然変異体ｐｓｂＡ（Smeda et al., Plant Physiol. 103:911-917, (1993)）または突然変異体プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（米国特許第５，７６７，３７３号明細書を参照のこと）またはグルホシネートなどの除草剤に対する抵抗性を付与するその他のマーカーが挙げられる。適した選択マーカー遺伝子の例として、それだけには限らないが、クロラムフェニコール（Herrera Estrella et al., EMBO J. 2:987-992, (1983)）；ストレプトマイシン（Jones et al., Mol. Gen. Genet. 210:86-91, (1987)）；スペクチノマイシン（Bretagne-Sagnard et al., Transgenic Res. 5:131-137, (1996)）；ブレオマイシン（Hille et al., Plant Mol. Biol. 7:171-176, (1990)）；スルホンアミド（Guerineau et al., Plant Mol. Biol. 15:127-136, (1990)）；ブロモキシニル（Stalker et al., Science 242:419-423, (1988)）；グリホサート（Shaw et al., Science 233:478-481, (1986)）；ホスフィノトリシン（DeBlock et al., EMBO J. 6:2513-2518, (1987)）に対する抵抗性をコードする遺伝子などが挙げられる。
【００８９】
選択遺伝子の使用のための１つの選択肢は、グルホシネート抵抗性をコードするＤＮＡであり、一実施形態では、キャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーターの制御下の、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｐａｔ）、トウモロコシ最適化ｐａｔ遺伝子またはｂａｒ遺伝子である。これらの遺伝子は、ビアラホスに対する抵抗性を付与する（Wohlleben et al., (1988) Gene 70: 25-37);Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2:603; 1990; Uchimiya et al., Biotechnology 11:835, 1993;White et al., Nucl. Acids Res. 18:1062、1990; Spencer et al., Theor. Appl. Genet. 79:625-631, 1990；およびAnzai et al., Mol. Gen. Gen. 219:492、1989を参照のこと）を参照。ｐａｔ遺伝子の１つのバージョンとして、トウモロコシ最適化ｐａｔ遺伝子があり、米国特許第６，０９６，９４７号明細書に記載されている。
【００９０】
さらに、ポリヌクレオチドをコードするマーカーを含有する植物細胞の同定を容易にするマーカーが使用され得る。配列の存在が、測定可能な産物をもたらし、植物細胞の破壊を伴わずに産物をもたらし得る場合には、スコア化可能なまたはスクリーニング可能なマーカーは有用である。例として、種々の発色基質が公知である酵素をコードするβ−グルクロニダーゼまたはｕｉｄＡ遺伝子（ＧＵＳ）（例えば、米国特許第５，２６８，４６３号明細書および同５，５９９，６７０号明細書）；クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（Jefferson et al. The EMBO Journal vol. 6 No. 13 pp. 3901-3907）；およびアルカリホスファターゼが挙げられる。好ましい実施形態では、使用されるマーカーは、ベータ−カロテンまたはプロビタミンＡ（Ye et al., Science 287:303-305-(2000)）である。この遺伝子は、イネの栄養を増強するために使用されてきたが、この例では、代わりに、スクリーニング可能なマーカーとしてとして使用され、対象とする遺伝子と連結している遺伝子の存在は、提供される金色によって検出される。遺伝子が、植物へのその栄養的な貢献のために使用される状況とは異なり、マーキング目的には、少量のタンパク質で十分である。その他のスクリーニング可能なマーカーとして、例えば、中でも、植物組織におけるアントシアニン色素（赤色）の製造を調節する生成物をコードする、Ｒ−遺伝子座遺伝子（Dellaporta et al., in Chromosome Structure and Function, Kluwer Academic Publishers, Appels and Gustafson eds., pp. 263-282 (1988)）；トウモロコシＣ１遺伝子（Kao et al., Plant Cell (1996) 8: 1171-1179;Scheffler et al., Mol. Gen. Genet. (1994) 242:40-48）およびトウモロコシＣ２（Wienand et al., Mol. Gen. Genet. (1986) 203:202-207）などのフラボノイド色素の生合成を制御する遺伝子；Ｂ遺伝子（Chandler et al., Plant Cell(1989) 1:1175-1183）、ｐ１遺伝子（Grotewold et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA (1991) 88:4587-4591;Grotewold et al., Cell (1994) 76:543-553;Sidorenko et al., Plant Mol. Biol. (1999)39:11-19）；ｂｒｏｎｚｅ遺伝子座遺伝子（Ralston et al., Genetics (1988) 119:185-197;Nash et al., Plant Cell (1990) 2(11): 1039-1049）を含めた、全般的に、アントシアニン／フラボノイド遺伝子が挙げられる（Taylor and Briggs, The Plant Cell (1990)2:115-127での考察を参照のこと）。
【００９１】
適したマーカーのさらなる例として、シアン蛍光タンパク質（ＣＹＰ）遺伝子（Bolte et al., (2004) J. Cell Science 117: 943-54およびKato et al., (2002) Plant Physiol 129: 913-42）、黄色蛍光タンパク質遺伝子（Ｅｖｒｏｇｅｎ製のＰＨＩＹＦＰ（商標）；Bolte et al., (2004) J. Cell Science 117: 943-54を参照のこと）；ルシフェラーゼをコードし、例えば、Ｘ線フィルム、シンチレーション計数、蛍光分光光度測定、微光ビデオカメラ、光子計数カメラまたはマルチウェルルミノメトリーを使用してその存在が検出され得る、ｌｕｘ遺伝子（Teeri et al. (1989) EMBO J. 8:343）；緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子（Sheen et al., Plant J. (1995) 8(5):777-84）；およびマーカー遺伝子で形質転換された植物細胞が、赤色であり、したがって、視覚的に選択可能である、ＤｓＲｅｄ２（Dietrich et al., (2002) Biotechnologys 2(2):286-293）が挙げられる。さらなる例として、種々の発色基質（例えば、ＰＡＤＡＣ、発色性セファロスポリン）が公知である酵素をコードするβ−ラクタマーゼ遺伝子（Sutcliffe, Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. (1978) 75:3737）；発色性カテコールを変換できるカテコールジオキシゲナーゼをコードするｘｙｌＥ遺伝子（Zukowsky et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. (1983) 80:1101）；α−アミラーゼ遺伝子（Ikuta et al., Biotech. (1990) 8:241）およびチロシンをＤＯＰＡおよびドーパキノンに酸化でき、順に、これが縮合して、容易に検出可能な化合物メラニンを形成する酵素をコードするチロシナーゼ遺伝子（Katz et al., J. Gen. Microbiol. (1983) 129:2703）が挙げられる。明確に、多数のこのようなマーカーが利用可能であり、当業者に公知である。
【００９２】
特定の実施形態では、発現カセット中に遺伝子産物をコードする導入遺伝子のヌクレオチド配列は、任意選択で、カセットおよび／または植物中で対象の別のヌクレオチド配列と組み合わされ得る。例えば、特定の実施形態では、導入遺伝子は、グリホサートもしくは別の除草剤に対するさらなる抵抗性もしくは耐性、および／または選定された昆虫または疾患に対する抵抗性および／もしくは栄養強化および／もしくは改善された農学的特徴、および／またはタンパク質もしくは食餌、食物、工業的用途、医薬的用途もしくはその他の用途において有用なその他の生成物を提供する別の対象とするヌクレオチド配列と組み合わされ、または「積み重ねられ」得る。植物ゲノム内の対象とする２種以上の核酸配列の「スタッキング」は、例えば、２以上の事象、対象とする配列を含有する構築物を用いる植物の形質転換、トランスジェニック植物の再形質転換または相同組換えを介した組込みによる新規形質の付加を使用する従来の植物育種によって達成され得る。
【００９３】
対象のこのようなヌクレオチド配列として、それだけには限らないが、（１）有害生物または疾患に対する耐性、（２）除草剤に対する耐性および（３）以下に提供される付加価値のある形質を付与する遺伝子またはコード配列の例が挙げられる。
【００９４】
１．有害生物または疾患に対して抵抗性を付与する遺伝子またはコード配列（例えば、ｉＲＮＡ）
（Ａ）植物疾患抵抗性遺伝子。植物防御は、植物中の疾患抵抗性遺伝子（Ｒ）の生成物と、病原体中の対応する病原性（Ａｖｒ）遺伝子の生成物間の特定の相互作用によって活性化されることが多い。ある植物の種類が、クローニングされた抵抗性遺伝子を用いて形質転換され、特定の病原体株に対して抵抗性である植物に操作できる。このような遺伝子の例として、クラドスポリウム・フルブム（Cladosporium fulvu）に対する抵抗性のための、トマトＣｆ−９遺伝子（Jones et al., 1994 Science 266:789）、トマト斑葉細菌病に対する抵抗性のためのプロテインキナーゼをコードする、トマトＰｔｏ遺伝子（Martin et al., 1993 Science 262:1432）およびシュードモナス・シリンゲ（Pseudomonas syringae）に対する抵抗性のための、アラビドプシス属（Arabidopsis）ＲＳＳＰ２遺伝子（Mindrinos et al., 1994 Cell 78:1089）が挙げられる。
【００９５】
（Ｂ）Ｂｔ  δ−エンドトキシン遺伝子のヌクレオチド配列などの、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）タンパク質、その誘導体またはそれをモデルにした合成ポリペプチド（Geiser et al., 1986 Gene 48:109）および栄養型殺虫性（ＶＩＰ）遺伝子（例えば、Estruch et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93:5389-94を参照のこと）。さらに、δ−エンドトキシン遺伝子をコードするＤＮＡ分子は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．）からＡＴＣＣ受託番号４００９８、６７１３６、３１９９５および３１９９８の下で購入できる。
【００９６】
（Ｃ）いくつかのクンシラン（Clivia miniata）マンノース結合レクチン遺伝子のヌクレオチド配列などの、レクチン（Van Damme et al., 1994 Plant Molec. Biol. 24:825）。
【００９７】
（Ｄ）昆虫有害生物に対する殺うじ剤として有用であるアビジンおよびアビジン相同体などの、ビタミン結合タンパク質。米国特許第５，６５９，０２６号明細書を参照のこと。
【００９８】
（Ｅ）酵素阻害剤、例えば、プロテアーゼ阻害剤またはアミラーゼ阻害剤。
このような遺伝子の例として、イネシステインプロテイナーゼ阻害剤（Abe et al., 1987 J. Biol. Chem. 262:16793）、タバコプロテイナーゼ阻害剤Ｉ（Huub et al., 1993 Plant Molec. Biol. 21:985）およびα−アミラーゼ阻害剤（Sumitani et al., 1993 Biosci. Biotech. Biochem. 57:1243）が挙げられる。
【００９９】
（Ｆ）昆虫特異的ホルモンまたはフェロモン、例えば、エクジステロイドおよび幼若ホルモンその変異体、それをベースとしたミメティックまたはそのアンタゴニストもしくはアゴニスト、例えば、クローニングされた幼若ホルモンエステラーゼのバキュロウイルス発現、幼若ホルモンの不活化（Hammock et al., 1990 Nature 344:458）。
【０１００】
（Ｇ）発現すると、影響を受ける有害生物の生理学を撹乱する、昆虫特異的ペプチドまたはニューロペプチド（J. Biol. Chem. 269:9）。このような遺伝子の例として、昆虫利尿ホルモン受容体（Regan, 1994）、ディプロプテラ・プンクタータ（Diploptera punctata）において同定されたアロスタチン（allostatin）（Pratt,1989）および昆虫特異的、麻痺性神経毒（米国特許第５，２６６，３６１号明細書）が挙げられる。
【０１０１】
（Ｈ）蛇、スズメバチなどによって天然に産生される昆虫特異的毒液、例えば、サソリ昆虫毒ペプチド（Pang, (1992) Gene 116:165）。
【０１０２】
（Ｉ）モノテルペン、セスキテルペン、ステロイド、ヒドロキサム酸、フェニルプロパノイド誘導体または殺虫活性を有する別の非タンパク質分子の高度集積に関与している酵素
【０１０３】
（Ｊ）生物学的に活性な分子の翻訳後修飾を含めた、修飾に関与している酵素、例えば、天然または合成に関わらず、解糖酵素、タンパク質分解酵素、脂肪分解酵素、ヌクレアーゼ、シクラーゼ、トランスアミナーゼおよびエステラーゼ、ヒドロラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、ホスホリラーゼ、ポリメラーゼ、エラスターゼ、キチナーゼおよびグルカナーゼ。このような遺伝子の例として、ｃａｌｌａｓ遺伝子（ＰＣＴ公開出願第９３／０２１９７号パンフレット）、キチナーゼをコードする配列（例えば、ＡＴＣＣから受託番号３９９９６３７および６７１５２の下で入手できる）、タバコ鉤虫キチナーゼ（Kramer et al., (1993) Insect Molec. Biol. 23:691）およびパセリｕｂｉ４−２ポリユビキチン遺伝子（Kawalleck et al., (1993) Plant Molec. Biol. 21:673）が挙げられる。
【０１０４】
（Ｋ）シグナル変換をシミュレートする分子。このような分子の例として、リョクトウカルモジュリンｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列（Botella et al., (1994) Plant Molec. Biol. 24:757）およびトウモロコシカルモジュリンｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列（Griess et al., (1994) Plant Physiol. 104:1467）が挙げられる。
【０１０５】
（Ｌ）疎水性モーメントペプチド。米国特許第５，６５９，０２６号明細書および同５，６０７，９１４号明細書を参照のこと；後者は、疾患抵抗性を付与する合成抗菌ペプチドを教示している。
【０１０６】
（Ｍ）膜透過酵素、チャネル形成剤またはチャネル遮断剤、例えば、トランスジェニックタバコ植物をシュードモナス・ソラナセアラム（Pseudomonas solanacearum）に対して抵抗性にする、セクロピン−ベータ溶菌性ペプチド類似体（Jaynes et al., (1993) Plant Sci. 89:43）。
【０１０７】
（Ｎ）ウイルス侵襲性タンパク質またはそれに由来する複合毒素。例えば、形質転換植物細胞におけるウイルスコートタンパク質の蓄積は、ウイルス感染および／またはコートタンパク質遺伝子が由来するウイルスによって、ならびに関連ウイルスによって達成される疾患発生に対する抵抗性を与える。アルファルファモザイクウイルス、キュウリモザイクウイルス、タバコ条斑ウイルス、ジャガイモウイルスＸ、ジャガイモウイルスＹ、タバコエッチウイルス、タバコ茎えそウイルスおよびタバコモザイクウイルスに対して、コートタンパク質媒介性抵抗性が形質転換植物に付与されている。例えば、Beachy et al., (1990) Ann. Rev. Phytopathol. 28:451を参照のこと。
【０１０８】
（Ｏ）昆虫特異的抗体またはそれに由来する免疫毒素。したがって、昆虫腸において重大な代謝機能にターゲッティングされる抗体は、影響を受ける酵素を不活化し、昆虫を死滅させる。例えば、Taylor et al., (1994) Abstract #497、Seventh Intl. Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactionsは、一本鎖抗体断片の製造によるトランスジェニックタバコにおける酵素性不活性化を示す。
【０１０９】
（Ｐ）ウイルス特異的抗体。例えば、組換え抗体遺伝子を発現するトランスジェニック植物は、ウイルス攻撃から保護されるということを示すTavladoraki et al., (1993) Nature 266:469を参照のこと。
【０１１０】
（Ｑ）病原体または寄生生物によって天然に生成される発達遅延性タンパク質。したがって、真菌エンドα−１，４−Ｄポリガラクツロナーゼは、植物細胞壁ホモ−α−１，４−Ｄ−ガラクツロナーゼを可溶化することによって、真菌コロニー形成および植物栄養放出を促進する(Lamb et al., (1992) Biotechnology 10:1436)。マメエンドポリガラクツロナーゼ阻害性タンパク質をコードする遺伝子のクローニングおよび特性決定が、(Toubart et al., (1992) Plant J. 2:367)に記載されている。
【０１１１】
（Ｒ）植物によって天然に生成される発達遅延性タンパク質、例えば、真菌疾患に対する増大した抵抗性を提供するオオムギリボソーム不活化遺伝子(Longemann et al., (1992). Biotechnology 10:3305)。
【０１１２】
（Ｓ）ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡポリヌクレオチドが、標的遺伝子の発現を阻害するために使用される、ＲＮＡ干渉。一例では、ＲＮＡ分子は、部分的または完全に二本鎖であり、サイレンシング反応を引き起こし、ｄｓＲＮＡの低分子干渉ＲＮＡへの切断をもたらし、次いで、これが、相同ｍＲＮＡを破壊するターゲッティング複合体中に組み込まれる。例えば、Fire et al.、米国特許第６，５０６，５５９号明細書;Graham et al.、米国特許第６，５７３，０９９号明細書を参照のこと。
【０１１３】
２．除草剤に対する抵抗性を付与する遺伝子またはコード配列
（Ａ）成長点または分裂組織を阻害する除草剤、例えば、イミダゾリノン（imidazalinone）、スルホンアニリドまたはスルホニル尿素除草剤に対する抵抗性または耐性をコードする遺伝子。このカテゴリー中の例示的遺伝子は、突然変異体ＡＬＳ酵素をコードし（Lee et al., (1988) EMBOJ. 7:1241）、これは、ＡＨＡＳ酵素としても知られている（Miki et al., (1990) Theor. Appl. Genet. 80:449）。
【０１１４】
（Ｂ）突然変異体ＥＰＳＰシンターゼおよびａｒｏＡ遺伝子によって、またはＧＡＴ（グリホサートアセチルトランスフェラーゼ）もしくはＧＯＸ（グリホサートオキシダーゼ）などの遺伝子およびグルホシネート（ｐａｔおよびｂａｒ遺伝子；ＤＳＭ−２）などのその他のホスホノ化合物ならびにアリールオキシフェノキシプロピオン酸およびシクロヘキサンジオン（ＡＣＣアーゼ阻害剤をコードする遺伝子）による代謝不活性化によって与えられる、グリホサートに対する抵抗性または耐性をコードする１種または複数のさらなる遺伝子。例えば、グリホサート抵抗性を付与できるＥＰＳＰの形態のヌクレオチド配列を開示する米国特許第４，９４０，８３５号明細書を参照のこと。突然変異体ａｒｏＡ遺伝子をコードするＤＮＡ分子は、ＡＴＣＣ受託番号３９２５６の下で得ることができ、突然変異体遺伝子のヌクレオチド配列は、米国特許第４，７６９，０６１号明細書に開示されている。欧州特許出願第０３３３０３３号明細書および米国特許第４，９７５，３７４号明細書には、Ｌ−ホスフィノトリシンなどの除草剤に対する抵抗性を付与するグルタミンシンセターゼ遺伝子のヌクレオチド配列が開示されている。ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、欧州特許出願第０２４２２４６号明細書に提供されている。De Greef et al., (1989) Biotechnology 7:61には、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ活性のためにキメラｂａｒ遺伝子コーディングを発現するトランスジェニック植物の製造が記載されている。アリールオキシフェノキシプロピオン酸およびセトキシジムおよびハロキシホップなどのシクロヘキサンジオンに対する抵抗性を付与する遺伝子の例示的なものとして、Marshall et al., (1992) Theor. Appl. Genet. 83:435に記載される、Ａｃｃｌ−Ｓ１、Ａｃｃｌ−Ｓ２およびＡｃｃｌ−Ｓ３遺伝子がある。
【０１１５】
（Ｃ）光合成を阻害する除草剤、例えば、トリアジンに対する抵抗性または耐性をコードする遺伝子（ｐｓｂＡおよびｇｓ＋遺伝子）およびベンゾニトリル（ニトリラーゼ遺伝子）。Przibilla et al., (1991) Plant Cell 3:169には、クラミドモナス（Chlamydomonas）を形質転換するための突然変異体ｐｓｂＡ遺伝子をコードするプラスミドの使用が記載されている。米国特許第４，８１０，６４８号明細書におけるニトリラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列、およびこれらの遺伝子を含有するＤＮＡ分子は、ＡＴＣＣ受託番号５３４３５、６７４４１および６７４４２の下で入手可能である。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼのＤＮＡコーディングのクローニングおよび発現は、Hayes et al., (1992) Biochem. J. 285:173に記載されている。
【０１１６】
（Ｄ）ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）、パラ−ヒドロキシフェニルピルビン酸（ＨＰＰ）がホモゲンチジン酸に形質転換される反応を触媒する酵素と結合する除草剤に対する抵抗性または耐性をコードする遺伝子。これは、イソキサゾール（欧州特許第４１８１７５号明細書、欧州特許第４７０８５６号明細書、欧州特許第４８７３５２号明細書、欧州特許第５２７０３６号明細書、欧州特許第５６０４８２号明細書、欧州特許第６８２６５９号明細書、米国特許第５，４２４，２７６号明細書）、特に、トウモロコシの選択的除草剤であるイソキサフルトール、ジケトニトリル（欧州特許第４９６６３０号明細書、および欧州特許第４９６６３１号明細書）、特に、２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−ＳＯ２ＣＨ３−４−ＣＦ３フェニル）プロパン−１，３−ジオンおよび２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−ＳＯ２ＣＨ３−４−２，３Ｃｌ２フェニル）プロパン−１，３−ジオン、トリケトン（欧州特許第６２５５０５号明細書、欧州特許第６２５５０８号明細書、米国特許第５，５０６，１９５号明細書）、特に、スルコトリオンおよびピラゾリネートなどの除草剤を含む。例えば、米国特許第６，２６８，５４９号明細書および同６，２４５，９６８号明細書および米国特許公開第２００３００６６１０２号明細書に記載される遺伝子を含めた、植物において過剰量のＨＰＰＤを生成する遺伝子は、このような除草剤に対する耐性または抵抗性を提供し得る。
【０１１７】
（Ｅ）遺伝子。フェノキシオーキシン除草剤、例えば、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）に対する抵抗性または耐性をコードし、アリールオキシフェノキシプロピオネート（ＡＯＰＰ）除草剤に対する抵抗性または耐性も付与する遺伝子。このような遺伝子の例として、米国特許第７，８３８，７３３号明細書に記載される、α−ケトグルタレート依存性ジオキシゲナーゼ酵素（ａａｄ−１）遺伝子が挙げられる。
【０１１８】
（Ｆ）２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）などのフェノキシオーキシン除草剤に対する抵抗性または耐性をコードし、フルロキシピルまたはトリクロピルなどのピリジルオキシオーキシン除草剤に対する抵抗性または耐性も付与し得る遺伝子。このような遺伝子の例として、国際公開第２００７／０５３４８２  Ａ２号パンフレットに記載されるα−ケトグルタレート依存性ジオキシゲナーゼ酵素遺伝子（ａａｄ−１２）が挙げられる。
【０１１９】
（Ｇ）ジカンバに対する抵抗性または耐性をコードする遺伝子（例えば、米国特許公開第２００３０１３５８７９号明細書を参照のこと）。
【０１２０】
（Ｈ）プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＰＰＯ）を阻害する除草剤に対する抵抗性または耐性を提供する遺伝子（米国特許第５，７６７，３７３号明細書を参照のこと）。
【０１２１】
（Ｉ）光化学系ＩＩ反応中心（ＰＳ  ＩＩ）のコアタンパク質と結合する、トリアジン除草剤（アトラジンなど）および尿素誘導体（ジウロンなど）除草剤に対する抵抗性または耐性を提供する遺伝子(Brussian et al., (1989) EMBO J. 1989, 8(4): 1237-1245を参照のこと。
【０１２２】
３．価値が付加された形質を付与するか、またはそれに貢献する遺伝子
（Ａ）植物のステアリン酸含量を増大させるために、例えば、アンチセンス遺伝子またはステアロイル−ＡＣＰ不飽和化酵素を用いて、トウモロコシまたはアブラナ属（Brassica）を形質転換することによって修飾された脂肪酸代謝(Knultzon et al., (1992) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89:2624)。
【０１２３】
（Ｂ）減少したフィチン酸含量
（１）クロコウジカビ（Aspergillus niger）フィターゼ遺伝子などのフィターゼをコードする遺伝子の導入（Van Hartingsveldt et al., (1993) Gene 127:87）は、フィチン酸の分解を増強し、より多くの遊離リン酸を形質転換植物に付加する。
（２）フィチン酸含量を低下させる遺伝子は、導入され得る。トウモロコシでは、これは、例えば、クローニングすることおよび次いで、低レベルのフィチン酸を特徴とするトウモロコシ突然変異体と関連している単一の対立遺伝子と関連しているＤＮＡを再導入することによって達成され得る（Raboy et al., (1990） Maydica 35:383）。
【０１２４】
（Ｃ）例えば、植物を、デンプンの分岐パターンを変更する酵素の遺伝子コーディングを用いて形質転換することによって達成される修飾された炭水化物組成物。このような酵素の例として、ストレプトコッカス・ミューカス（Streptococcus mucus）フルクトース転移酵素遺伝子(Shiroza et al., (1988) J. Bacteriol. 170:810)、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）レバンスクラーゼ遺伝子（Steinmetz et al., (1985) Mol. Gen. Genel. 200:220）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）α−アミラーゼ（Pen et al., (1992) Biotechnology 10:292）、トマトインベルターゼ遺伝子（Elliot et al., (1993）、オオムギアミラーゼ遺伝子（Sogaard et al., (1993) J. Biol. Chem. 268:22480）およびトウモロコシ胚乳デンプン分岐酵素ＩＩ（Fisher et al., (1993) Plant Physiol. 102:10450）が挙げられる。
【０１２５】
商品生産物−本開示のさらなる実施形態では、トランスジェニック植物は、商品生産物を製造する。一実施形態では、商品生産物は、タンパク質濃縮物、タンパク質単離物、穀粒、粗びき粉、粉末、オイルまたは繊維からなる群から選択される。
【０１２６】
商品生産物とは、植物または植物種子に由来する材料からなり、消費者に販売される任意の生産物を指す。作物植物は、消費のためのタンパク質、炭水化物および植物油の最大の供給源である。トランスジェニック植物は、商品生産物を製造するために使用され得る。植物および／または植物種子は、粗びき粉、粉末またはオイルに加工され得、ならびに陸生および水生動物の両方のための動物飼料におけるタンパク質またはオイル供給源として使用され得る。ダイズおよびダイズオイルは、多数の異なる生産物、限定するものではないが、全種子または加工種子、動物飼料、植物油、粗びき粉、粉末、非毒性プラスチック、印刷用インク、滑沢剤、ワックス、油圧油、変圧器液、溶媒、化粧品、ヘアケア製品、納豆、テンペ、タンパク質濃縮物、タンパク質単離物、テクスチャードおよび加水分解タンパク質およびバイオディーゼルの製造において使用され得る。
【０１２７】
植物分類−さらなる実施形態では、本開示は、トランスジェニック植物に関し、トランスジェニック植物は、双子葉植物または単子葉植物からなる群から選択される。さらなる実施形態では、本開示は、作物植物およびそのオイル、タンパク質または炭水化物を求めて使用される植物を含む消費可能な植物に関する。したがって、任意の植物種または植物細胞は、以下にさらに記載されるように選択され得る。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、本開示に従って遺伝子修飾される植物（例えば、植物宿主細胞）として、限定するものではないが、双子葉および単子葉植物の両方、特に、作物植物を含む消費可能な植物を含む任意の高等植物が挙げられる。このような植物として、限定するものではないが、例えば、アルファルファ、ダイズ、ワタ、ナタネ（セイヨウアブラナとしても記載される）、アマの種子、トウモロコシ、イネ、ブラキアリア（brachiaria）、コムギ、ベニバナ、モロコシ、サトウダイコン、ヒマワリ、タバコおよび芝草を挙げることができる。したがって、任意の植物種または植物細胞が選択され得る。実施形態では、本明細書において使用される植物細胞およびそれから成長したまたはそれに由来する植物として、限定するものではないが、ナタネ（セイヨウアブラナ（Brassica napus））；カラシナ（セイヨウカラシナ（Brassica juncea））、エチオピアマスタード（Ethiopian mustard）（ブラシカ・カリナタ（Brassica carinata））、カブ（ブラシカ・ラパ（Brassica rapa））、キャベツ（ブラシカ・オレラセア（Brassica oleracea））、ダイズ（ダイズ（Glycine max））、アマの種子／アマ（リナム・ウシタチシマム（Linum usitatissimum））、トウモロコシ（maize）（トウモロコシ（corn）としても記載される）（ゼア・メイズ（Zea mays））、ベニバナ（ベニバナ（Carthamus tinctorius））、ヒマワリ（ヒマワリ（Helianthus annuus））、タバコ（タバコ（Nicotiana tabacum））、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、ブラジルナッツ（ベトレッチア・エクセルサ（Betholettia excelsa））、トウゴマ（トウゴマ（Ricinus communis））、ココナッツ（ココス・ヌシフェラ（Cocus nucifera））、コリアンダー（コリアンダー（Coriandrum sativum））、ワタ（ゴシピウム（Gossypium）種）、アメリカホドイモ（ピーナッツ（Arachis hypogaea））、ホホバ（シモンドシア・キネンシス（Simmondsia chinensis））、アブラヤシ（エラエイス・ギネイス（Elaeis guineeis））、オリーブ（オレア・ユールパエア（Olea eurpaea））、イネ（イネ（Oryza sativa））、カボチャ（squash）（セイヨウカボチャ（Cucurbita maxima））、オオムギ（オオムギ（Hordeum vulgare））、サトウキビ（サトウキビ（Saccharum officinarum））、イネ（イネ（Oryza sativa））、コムギ（デュラムコムギ（Triticum durum）およびコムギ（Triticum aestivum）を含むトリチカム（Triticum）種）およびウキクサ（レムナセアエ（Lemnaceae）種）から得ることができる細胞が挙げられる。いくつかの実施形態において、植物種内の遺伝的背景は、変わり得る。
【０１２９】
植物細胞中に導入される核酸は、本質的に任意の植物に所望の形質を付与するように使用され得る。さまざまな植物および植物細胞系が、本開示の遺伝子発現構築物および上記の種々の形質転換法を使用して、本明細書に記載される所望の生理学的および農学的特徴を求めて遺伝子操作され得る。実施形態では、遺伝子操作するための標的植物および植物細胞として、限定するものではないが、穀物作物（例えば、コムギ、トウモロコシ、イネ、雑穀、オオムギ）、果実作物（例えば、トマト、リンゴ、セイヨウナシ、イチゴ、オレンジ）、飼料作物（例えば、アルファルファ）、根菜作物（例えば、ニンジン、ジャガイモ、サトウダイコン、ヤムイモ）、葉物野菜作物（例えば、レタス、ホウレンソウ）、顕花植物（例えば、ペチュニア、バラ、キク）、コニファーおよびマツ（例えば、マツ、モミ、エゾマツ）、ファイトレメディエーションにおいて使用される植物（例えば、重金属蓄積植物）、油料作物（例えば、ヒマワリ、ナタネ）および実験目的のために使用される植物（例えば、アラビドプシス属（Arabidopsis））を含む作物などのそれらの単子葉および双子葉植物が挙げられる。したがって、開示される方法および組成物は、限定するものではないが、アスパラガス属（Asparagus）、アベナ属（Avena）、ブラシカ属（Brassica）、柑橘属（Citrus）、スイカ属（Citrullus）、トウガラシ属（Capsicum）、カボチャ属（Cucurbita）、ニンジン属（Daucus）、ムカシヨモギ属（Erigeron）、グリシン属（Glycine）、ワタ属（Gossypium）、オオムギ属（Hordeum）、アキノノゲシ属（Lactuca）、ドクムギ属（Lolium）、トマト属（Lycopersicon）、リンゴ属（Malus）、キャッサバ属（Manihot）、タバコ属（Nicotiana）、オオアラセイトウ属（Orychophragmus）、オリザ属（Oryza）、ワニナシ属（Persea）、インゲンマメ属（Phaseolus）、エンドウ属（Pisum）、ナシ属（Pyrus）、サクラ属（Prunus）、ダイコン属（Raphanus）、ライムギ属（Secale）、ナス属（Solanum）、モロコシ属（Sorghum）、コムギ属（Triticum）、ブドウ属（Vitis）、ササゲ属（Vigna）に由来する種およびトウモロコシ（Zea mays）を含む広範な植物にわたって使用する。
【０１３０】
本開示のさらなる態様では、本明細書において開示される系、組成物および方法は、トランスジェニック植物または植物細胞に関する。その他の実施形態では、トランスジェニック植物または植物細胞は、植物細胞を、ＲｅｃＡ活性が欠損しているＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）株と接触させることによって製造される。
【０１３１】
ｉｎ  Ｖｉｔｒｏアッセイ−一実施形態では、本開示は、Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）株内のＲｅｃＡ活性を評価するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイに関する。種々のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイが、当業者に公知である。いくつかの例示的方法を以下にさらに記載する。
【０１３２】
分子ビーコン（Molecular Beacons）は、配列検出における使用のために記載されている。手短には、それぞれの両端に位置するゲノムおよび挿入部分ＤＮＡ接合部分と重なるＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブが、設計される。ＦＲＥＴプローブの独特の構造が、蛍光および消光部分を極近接して維持する二次構造を含有するものをもたらす。ＦＲＥＴプローブおよびＰＣＲプライマー（挿入部分ＤＮＡ配列中の１種のプライマーおよびそれぞれの両端に位置するゲノム配列中の１種）が、熱安定性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下で循環される。成功したＰＣＲ増幅後、ＦＲＥＴプローブ（複数可）の標的配列とのハイブリダイゼーションは、プローブ二次構造の除去および蛍光および消光部分の空間的分離をもたらす。蛍光シグナルは、成功した増幅およびハイブリダイゼーションによって、それぞれの両端に位置するゲノム／導入遺伝子挿入部分配列の存在を示す。増幅反応の検出のためのこのような分子ビーコンアッセイは、本開示の実施形態である。
【０１３３】
加水分解プローブアッセイは、別に、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）（Life Technologies、Foster City、Calif.）としても知られる、ＤＮＡ配列の存在を検出および定量化する方法である。手短には、事象特異的検出のために導入遺伝子内に１つのオリゴおよびそれぞれの両端に位置するゲノム配列中に１つを有するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブが設計される。ＦＲＥＴプローブおよびＰＣＲプライマー（挿入部分ＤＮＡ配列中の１種のプライマーおよびそれぞれの両端に位置するゲノム配列中の１種）が、熱安定性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下で循環される。ＦＲＥＴプローブのハイブリダイゼーションが、ＦＲＥＴプローブ上の消光部分から蛍光部分の切断および放出をもたらす。蛍光シグナルは、成功した増幅およびハイブリダイゼーションによって、それぞれの両端に位置する／導入遺伝子挿入部分配列の存在を示す。増幅反応の検出のためのこのような加水分解プローブアッセイは、本開示の実施形態である。
【０１３４】
ＫＡＳＰａｒ（登録商標）アッセイは、ＤＮＡ配列の存在を検出および定量化する方法である。手短には、組み込まれた遺伝子発現カセットポリヌクレオチドを含むゲノムＤＮＡサンプルは、ＫＡＳＰａｒ（登録商標）アッセイ系として知られるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースのアッセイを使用してスクリーニングされる。本開示の実施において使用されるＫＡＳＰａｒ（登録商標）アッセイは、複数のプライマーを含有するＫＡＳＰａｒ（登録商標）ＰＣＲアッセイ混合物を使用し得る。ＰＣＲアッセイ混合物中で使用されるプライマーは、少なくとも１種のフォワードプライマーおよび少なくとも１種のリバースプライマーを含み得る。フォワードプライマーは、ＤＮＡポリヌクレオチドの特定の領域に対応する配列を含有し、リバースプライマーは、ゲノム配列の特定の領域に対応する配列を含有する。さらに、ＰＣＲアッセイ混合物中で使用されるプライマーは、少なくとも１種のフォワードプライマーおよび少なくとも１種のリバースプライマーを含み得る。例えば、ＫＡＳＰａｒ（登録商標）ＰＣＲアッセイ混合物は、２種の異なる対立遺伝子に対応する２種のフォワードプライマーおよび１種のリバースプライマーを使用し得る。フォワードプライマーのうち１種は、内因性ゲノム配列の特定の領域に対応する配列を含有する。第２のフォワードプライマーは、ＤＮＡポリヌクレオチドの特定の領域に対応する配列を含有する。リバースプライマーは、ゲノム配列の特定の領域に対応する配列を含有する。増幅反応の検出のためのこのようなＫＡＳＰａｒ（登録商標）アッセイは、本開示の実施形態である。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、蛍光シグナルまたは蛍光色素は、ＨＥＸ蛍光色素、ＦＡＭ蛍光色素、ＪＯＥ蛍光色素、ＴＥＴ蛍光色素、Ｃｙ３蛍光色素、Ｃｙ３．５蛍光色素、Ｃｙ５蛍光色素、Ｃｙ５．５蛍光色素、Ｃｙ７蛍光色素およびＲＯＸ蛍光色素からなる群から選択される。
【０１３６】
その他の実施形態では、増幅反応は、フローサイトメトリーによって検出可能な濃度範囲で細胞ＤＮＡを染色でき、リアルタイムサーモサイクラーによって検出可能である蛍光発光スペクトルを有する適した第２の蛍光ＤＮＡ色素を使用して実施される。その他の核酸色素は公知であり、継続的に同定されていることは、当業者によって理解されるべきである。ＹＯ−ＰＲＯ−１（登録商標）、ＳＹＴＯＸ緑色（登録商標）、ＳＹＢＲ緑色Ｉ（登録商標）、ＳＹＴＯ１１（登録商標）、ＳＹＴＯ１２（登録商標）、ＳＹＴＯ１３（登録商標）、ＢＯＢＯ（登録商標）、ＹＯＹＯ（登録商標）およびＴＯＴＯ（登録商標）などの適当な励起および発光スペクトルを有する任意の適した核酸色素が使用され得る。一実施形態では、第２の蛍光ＤＮＡ色素は、１０μＭ未満、４μＭ未満または２．７μＭ未満で使用されるＳＹＴＯ１３（登録商標）である。
【０１３７】
さらなる実施形態では、検出のために次世代配列決定（ＮＧＳ）が使用され得る。Brautigma et al., 2010によって記載されるように、単離され、増幅された断片のヌクレオチド配列を決定するために、ＤＮＡ配列分析が使用され得る。増幅された断片は、単離され、ベクター中にサブクローニングされ、鎖ターミネーター法（サンガー配列決定とも呼ばれる）または色素ターミネーター配列決定を使用して配列決定され得る。さらに、アンプリコンは、次世代配列決定を用いて配列決定され得る。ＮＧＳ技術は、サブクローニングステップを必要とせず、複数のシーケンシングリードが、単一反応において完了され得る。３種のＮＧＳプラットフォームが市販されている、４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｒｏｃｈｅ製のＧｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ＦＬＸ（商標）、Ｓｏｌｅｘａ製のＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｅｒ（商標）およびＡｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＳＯＬｉＤ（商標）（「Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  Ｏｌｉｇｏ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」のアクロニム）。さらに、現在開発中である２種の単一分子配列決定法がある。これらとして、Ｈｅｌｉｃｏｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）製のｔｒｕｅ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ｔＳＭＳ）およびＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＳｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ（商標）ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＳＭＲＴ）が挙げられる。
【０１３８】
４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｒｏｃｈｅによって市販されているＧｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ  ＦＬＸ（商標）は、ロングリードＮＧＳであり、これは、シーケンシングリードを作製するためにエマルジョンＰＣＲおよびピロシーケンシングを使用する。３００〜８００ｂｐのＤＮＡ断片または３〜２０ｋｂｐの断片を含有するライブラリーが使用され得る。反応は、２５０〜４００メガ塩基の総収量のために、実施あたり約２５０〜４００塩基の１００万個を超えるリードを生成し得る。この技術は、最長リードをもたらすが、実施あたりの総シーケンスアウトプットは、その他のＮＧＳ技術と比較して低い。
【０１３９】
Ｓｏｌｅｘａ（商標）によって市販されているＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｅｒ（商標）は、ショートリードＮＧＳであり、蛍光色素標識された可逆的ターミネーターヌクレオチドを用いる合成アプローチによるシーケンシングを使用し、固相架橋ＰＣＲに基づいている。最大１０ｋｂのＤＮＡ断片を含有するペアエンドシーケンシングライブラリーの構築が使用され得る。反応は、３５〜７６塩基の長さの１億を超えるショートリードを生成する。このデータは、実施あたり３〜６ギガ塩基を生成し得る。
【０１４０】
Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標）によって市販されているＯｌｉｇｏ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＳＯＬｉＤ）システムによるシーケンシングは、ショートリード技術である。このＮＧＳ技術は、最大１０ｋｂｐの長さの断片化された二本鎖ＤＮＡを使用する。このシステムは、色素標識されたオリゴヌクレオチドプライマーの連結によるシーケンシングおよび実施あたり最大３０ギガ塩基の全シーケンスアウトプットをもたらす１０億のショートリードを作製するエマルジョンＰＣＲを使用する。
【０１４１】
Ｈｅｌｉｃｏｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）のｔＳＭＳおよびＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標）のＳＭＲＴは、シーケンス反応のために単一ＤＮＡ分子を使用する異なるアプローチを適用する。ｔＳＭＳ  Ｈｅｌｉｃｏｓ（商標）システムは、最大８億のショートリードを生成し、これは、実施あたり２１ギガ塩基をもたらす。これらの反応は、「合成によるシーケンシング」アプローチとして記載されている蛍光色素標識されたバーチャルターミネーターヌクレオチドを使用して完了される。
【０１４２】
Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標）によって市販されているＳＭＲＴ次世代配列決定システムは、合成によってリアルタイムシーケンシングを使用する。この技術は、可逆的ターミネーターによって制限されていない結果として最大１，０００ｂｐの長さのリードを生成し得る。この技術を使用して、１日あたり、２倍体ヒトゲノムの１倍のカバー度に相当する生リードリードスループットが生成され得る。
【０１４３】
別の実施形態では、検出は、ウエスタンブロット、ノーザンブロットおよびサザンブロットを含めたブロッティングアッセイを使用して完了され得る。このようなブロッティングアッセイは、生物学的サンプルの同定および定量化のために生物学的研究においてよく使用される技術である。これらのアッセイは、まず、電気泳動手段によるゲルにおけるサンプル成分の分離と、それに続く、電気泳動によって分離された成分の、ニトロセルロース、ポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）またはナイロンなどの材料からできているトランスファーメンブランへの移動を含む。分析物はまた、これらの支持体上に直接的にスポッティングされるか、または真空、毛細血管作用または圧力を適用することによって支持体上の特定の領域に向けられる。次いで、トランスファーメンブランは、一般的に、分析物が互いに区別され、視覚的にまたは自動化リーダーによってのいずれかで検出される能力を増強するためにトランスファー後処理に付される。
【０１４４】
さらなる実施形態では、検出は、液体サンプルまたは湿潤サンプル中の物質、通常、抗原の存在を検出するために、固相酵素イムノアッセイを使用するＥＬＩＳＡアッセイを使用して完了され得る。サンプルに由来する抗原は、プレートの表面に結合される。次いで、さらなる特異的抗体が表面上に適用され、そのようにして抗原と結合し得る。この抗体は、酵素に連結され、最終ステップにおいて、酵素の基質を含有する物質が添加される。その後の反応は、検出可能なシグナル、最も一般的には、基質における色の変化をもたらす。
【０１４５】
形質転換−本明細書において開示されるベクター（複数可）を用いるＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）ＬＢＡ  （４４０４）宿主細胞の形質転換は、当技術分野で公知の任意の形質転換方法論を使用して実施され得、細菌宿主細胞は、無傷の細胞またはプロトプラスト（すなわち、細胞質体を含む）として形質転換され得る。例示的形質転換方法論として、「ポレーション方法論、例えば、エレクトロポレーション、プロトプラスト融合、細菌コンジュゲーションおよび二価カチオン処理（塩化カルシウムＣａＣｌ２処理またはＣａＣｌ２／Ｍｇ２＋処理）またはその他の当技術分野で周知の方法が挙げられる。例えば、Morrison, J. Bact., 132:349-351 (1977); Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology, 101:347-362 (Wu et al., eds, 1983)、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed. 1989)、Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990)、およびCurrent Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994))を参照のこと。その他の特異的な既知形質転換法は、Guerout-Fleury, A.M., Frandsen, N. and Stragier,P. (1996) Plasmids for ectopic integration in Bacillus subtilis. Gene 180 (1-2), 57-61によって記載されている。
【０１４６】
組込み部位−本開示の実施形態は、Ａ．ツメファシエンス（A tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）のゲノム遺伝子座内のポリヌクレオチド断片を同定し、組み込むための方法を含む。ｒｅｃＡゲノム遺伝子座内の、またはｒｅｃＡゲノム遺伝子座のすぐ上流または下流のポリヌクレオチド断片内の組込みが、本明細書において提供される。ポリヌクレオチド断片を組み込むためのゲノム遺伝子座は、配列番号１１として提供される。当業者ならば、Ａ．ツメファシエンス（A tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）の配列番号１１内で、開示されるゲノムポリヌクレオチド配列の対立遺伝子変異が観察され得ることを理解する。したがって、本開示は、配列番号１１と８０％、８２．５％、８５％、８７．５％、９０％、９２．５％、９５％、９７．５％、９９％、９９．５％または９９．９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列に関する。
【０１４７】
本開示のその他の実施形態は、ポリヌクレオチドを、ｒｅｃＡゲノム遺伝子座でＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）ゲノム中に組み込むこと、続いて、同一位置に第２のポリヌクレオチドを積み重ねることを含み得る。ここで、Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）ゲノム内のゲノム遺伝子座は、さらなるポリヌクレオチドを導入するための好ましい遺伝子座として利用される。一実施形態では、配列番号１１内の任意の位置が、Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）ゲノムへのポリヌクレオチドの組込みのための天然組込み部位として働く。
【０１４８】
本開示のその他の実施形態は、遺伝子発現カセットを含有するポリヌクレオチドを、ｒｅｃＡゲノム遺伝子座でＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）ゲノム中に組み込むこと、続いて、組み込まれたポリヌクレオチドから選択マーカー発現カセットを除去することを含み得る。ここで、選択マーカー発現カセットを除去するために使用された方法として、二重交差法、当技術分野で公知のその他の切り出し法に加えて、ＣＲＥ−ＬＯＸを使用する切り出し法、ＦＬＰ−ＦＲＴを使用する切り出し法またはＲＥＤ／ＥＴ  ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＴＩＯＮ（登録商標）キット（Ｇｅｎｅｂｒｉｄｇｅｓ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用する切り出し法がある。
【０１４９】
本開示のその他の実施形態は、外来複製プラスミドの使用の代替法としてポリヌクレオチドを、ｒｅｃＡゲノム遺伝子座でＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）ゲノム中に組み込むことを含み得る。ここで、１種または複数の外来複製プラスミドは、同様の複製起点、不和合性群、重複性選択マーカーまたはその他の遺伝子エレメントの存在によって不和合である。ここで、１種または複数の外来複製プラスミドは、Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）制限修飾系の特異性のために  Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）において機能的ではない。ここで、１種または複数の外来複製プラスミドは、Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）ゲノム内で利用可能ではなく、機能的ではなく、または容易に形質転換可能ではない。
【０１５０】
本開示のその他の実施形態は、原核細胞において相同組換えの効率を増大するための方法を含み得る。λ  ｒｅｄ「リコンビナーゼを使用した遺伝子組み換え」などの導入された酵素によって媒介される相同組換えに頼る方法および類似のアプローチは、制限された数の細菌クラス、特に、エシェリキア属（Escherichia）(Datsenko and Wanner (2000) Proc Natl Acad Sci U S A. 97: 6640-5）およびサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）において有用である。ファージインテグラーゼ、ＦＬＰ／ＦＲＴまたはＣｒｅ／ｌｏｘＰなどの導入された酵素によって媒介される部位特異的組換えに頼る方法も使用され得るが、標的ＤＮＡ内の既存の部位の存在に依存する（Wirth et al (2007) Current Opinions in Biotechnology 18, 411-419）。代替方法は、ウイルスまたは可動性エレメントまたはその成分（例えば、ファージ、トランスポゾンまたは可動性イントロン）を利用する。
【０１５１】
しかし、宿主媒介性相同組換えに頼る方法は、染色体ＤＮＡ修飾の、飛び抜けて最もよく使用される種類である。宿主媒介性相同組換えの通常の微生物適用では、染色体と配列同一性の単一領域を有するプラスミドが、「Ｃａｍｐｂｅｌｌ様組込み」と呼ばれることもある一重交差組込みによって染色体中に組み込まれる。このような事象の後、導入されたプラスミド上の遺伝子が、染色体の一部として複製され、これは、プラスミド複製よりもより迅速であり得る。したがって、プラスミド由来選択マーカー遺伝子について選択を有する培地における成長は、組込みの選択圧を提供し得る。Ｃａｍｐｂｅｌｌ様組込みは、対象の遺伝子の内部断片をプラスミド上に置き、その結果、組込み後に、染色体が遺伝子の全長コピーを含有しないことによって染色体遺伝子を不活性化するために使用され得る。Ｃａｍｐｂｅｌｌ様組込み体細胞の染色体は、組み込まれたプラスミドが、組込みを指示した相同配列と隣接しているので安定ではない。これらの配列間でのさらなる相同組換え事象は、プラスミドの切り出しおよび染色体の野生型への復帰につながる。このために、組込み体クローンを維持するためにプラスミド由来選択マーカー遺伝子の選択を維持することが必要であり得る。
【０１５２】
染色体修飾の基本的な一重交差組込み法の改良は、二重交差相同組換えであり、対立遺伝子交換とも呼ばれ、これは、２つの組換え事象が関与する。所望の修飾された対立遺伝子が、染色体中の標的対立遺伝子に隣接する領域に対して相同な領域（「相同性アーム」）が隣接しているプラスミド上に置かれる。第１の組込み事象は、相同性アームのいずれか対で起こり得、Ｃａｍｐｂｅｌｌ様組込みと同様に染色体中へのプラスミドの組込みにつながる。第１の交差事象後、染色体は、第２の組換え事象を指示し得る相同配列の２つの代替セットを含有する。第１の事象を指示した同一配列が、組み換わる場合には、プラスミドは切り出され、細胞は、野生型に復帰する。第２の組換え事象が、その他の相同性アームによって指示される場合には、プラスミドは切り出されるが、元の染色体対立遺伝子は、プラスミド上に導入された修飾された対立遺伝子と交換されており、所望の染色体修飾が達成される。Ｃａｍｐｂｅｌｌ様組込みと同様に、第１の組換え事象は、通常、検出され、プラスミド由来選択マーカー遺伝子の組込みによって与えられる選択利点を使用して組換え体が単離される。
【０１５３】
本開示の実施形態を、以下の実施例にさらに例示する。これらの実施例は、単に例示として与えられるということは理解されなくてはならない。
［実施例］
【実施例１】
【０１５４】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）ゲノムライブラリーの構築ならびにｒｅｃＡおよびコスミドクローンの単離
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）からこれまでに特性決定されていなかったｒｅｃＡ遺伝子を単離および同定するために、ゲノムＤＮＡライブラリーを構築する。Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）由来のゲノムＤＮＡを、制限酵素Ｓａｕ３Ａ１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を用いて部分消化し、バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０；１０ｍＭ  ＥＤＴＡ；および５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中、１０〜４０％不連続スクロース勾配での遠心分離によって分画する。約２０〜４０ｋｂの範囲にわたる大きさを有するゲノムＤＮＡ断片を含有する画分をプールし、広宿主域コスミドベクター、ｐＣＰ１３／Ｂ（テトラサイクリン耐性）中にライゲーションする（Dessaux Y, TempeJ, Farrand SK. 1987.  Genetic analysis of mannityl opine catabolism in octopine-type Agrobacterium tumefaciens strain 15955. Mol Gen Genet. 208(1-2):301-8）。このコスミドベクターを、ＢａｍＨＩおよびアルカリホスファターゼを用いて処理し、その後、連結反応において使用する。連結混合物をＰｒｏｍｅｇａのＰａｃｋａｇｅｎｅ（登録商標）λＤＮＡパッケージング系（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して処理し、大腸菌（Escherichia coli）（ＨＢ１０１）中にトランスフェクトする。得られたライブラリーバンクは、Ａ．ツメファシエンス（tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）ゲノムの適用範囲の約２０倍に相当する約５，０００のテトラサイクリン耐性コスミド形質導入体を含有する。
【０１５５】
Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）のｒｅｃＡ遺伝子を有するコスミドクローンを単離するために、ライブラリーから大腸菌（E. coli）（ＨＢ１０１）細菌株を単離し、０．０１％メタンスルホン酸メチルエステル（ＭＭＳ）を含有するＬｕｒｉａ培養液プレート上に広げる。大腸菌（E. coli）（ＨＢ１０１）は、ｒｅｃＡ突然変異株であり、したがって、ＭＭＳに対して感受性であるので、培地上で成長したＭＭＳ耐性コロニーを、Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）のｒｅｃＡ遺伝子をコードするコスミドを含有すると仮定する（Farrand SK, O'Morchoe SP, McCutchan J. 1989. Construction of an Agrobacterium tumefaciens C58 recA mutant.  J Bacteriol. 171(10):5314-21）。数百のＭＭＳ耐性コスミドクローンが得られ、そのうちの２４を、ＸｈｏＩを用いる制限酵素消化によってさらに精製し、分析する。ＸｈｏＩ断片の共通のサブセットを共有していたコロニーのうち９つを、プライマー；ｐＣＰ１３／Ｂ左およびｐＣＰ１３／Ｂ右（表１）を使用する末端配列決定に付す。Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）の染色体と、Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（Ｃ５８）の配列決定された株の間のシンテニーを仮定することによって、ｒｅｃＡが、挿入部分の中央に配置されると予測した接合配列について、コスミドを検索する。１つのこのようなコスミド、ｐＣＰ−ＭＭＳＲ２を、さらなる配列決定に付して、表１にさらに記載されるようなプライマーを使用して推定的に同定されたｒｅｃＡ遺伝子の存在を確認する。
【０１５６】
【表１】
2017527292.tif 000003
【実施例２】
【０１５７】
Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）からのｒｅｃＡ遺伝子のクローニング、特性決定および配列分析
Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）のｒｅｃＡ遺伝子ノックアウト株を構築するために、ｒｅｃＡ遺伝子の位置を評価して、ｒｅｃＡ遺伝子の位置が、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）およびリゾビウム属（Rhizobium）種に由来するその他のｒｅｃＡ遺伝子単離物と同一のゲノム状況に存在するか否かを決定する（Goodner B et al., 2001. Genome sequence of the plant pathogen and biotechnology agent Agrobacterium tumefaciens C58. Science 2942323-2328;およびSlater SC et al., 2009. Genome sequences of three Agrobacterium biovars help elucidate the evolution of multi-chromosome genomes in bacteria. J Bacteriol. 191(8):2501-11）。したがって、プライマーを設計するために、Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（Ｃ５８）、Ａ．ビチス（A. vitis）（Ｓ４）、Ａ．ラジオバクター（A. radiobactor）（Ｋ８４）、リゾビウム・レグミノサルム（Rhizobium leguminosarum）およびリゾビウム属（Rhizobium）の種ＮＧＲ２３４に由来するｒｅｃＡの上流および下流に位置する隣接する配列を、高度に保存された配列について検索する（表１中、Ｆ−ｒｅｃＡｎｅｉおよびＲ−ＲｅｃＡｎｅｉ）。これらの配列は、ｒｅｃＡ遺伝子から約１．５ｋｂ上流および下流に位置する。これらの配列を、Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）に由来するｒｅｃＡ遺伝子を含有する領域と結合したプライマーを使用するＰＣＲによって増幅する。得られた３．７ｋｂのＰＣＲ断片を、ｐＷＭ９１プラスミド中にクローニングして、ｐＷＭ−ｒｅｃＡｎｅｉとして表示される新規プラスミドを作製する（図１を参照のこと）（Metcalf WW, Jiang W, Daniels LL, Kim SK, Haldimann A, Wanner BL. 1996. Conditionally replicative and conjugative plasmids carrying lacZ alpha for cloning, mutagenesis, and allele replacement in bacteria. Plasmid. 35(1):1-13）。ＰＣＲ増幅されたｒｅｃＡ遺伝子断片を、表１に列挙されるようなｒｅｃＡｎｅｉプライマーを使用する配列決定に付す。配列決定データによって、配列番号１０として提示されるＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）由来のｒｅｃＡ遺伝子が同定された。さらに、配列決定データは、Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）由来のｒｅｃＡ遺伝子が、その他の関連株と同一のゲノム状況を含有することを示し、それは、下流方向でａｌａＳと、上流方向でＡｔｕ１８７５、炭水化物キナーゼと隣接している（ｒｅｃＡ遺伝子ならびに上流および下流隣接配列を含有するゲノム配列はまた、配列番号１１として提供される）。
【０１５８】
Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）のｒｅｃＡ遺伝子は、Ｓ  ３７７、ＴＴ１１１およびＡＴＣＣ４７２０などの次亜種１アグロバクテリウム属（Agrobacterium）株の遺伝子型（genomovar）−１単離物由来のｒｅｃＡ遺伝子と配列においてほとんど同一である。さらに、Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）のｒｅｃＡ遺伝子は、遺伝子型（genomovar）−８株、すなわち、Ｃ５８のｒｅｃＡ遺伝子と核酸（nucleic）配列において９２％の同一性を共有する（Costechareyre et al., 2010）。その他のアグロバクテリウム属（Agrobacterium）株および関連分類群由来のｒｅｃＡ遺伝子と比較した、Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）のｒｅｃＡ遺伝子の全体的な関連性を比較することができ、この比較の系統樹が図２に示されている。Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）のｒｅｃＡ遺伝子の配列比較結果は、Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）ゲノムのかなりの数の領域が、Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（Ｃ５８）のものと無関係のゲノムＤＮＡ配列を含有していたということを示唆する。さらなる配列比較は、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）種の密接に関連した次亜種１単離物の間でさえ染色体多型が存在することを示した。
【実施例３】
【０１５９】
カナマイシンまたはクロラムフェニコール耐性カセットを用いる、ＭＭＳ耐性コスミドにおけるｒｅｃＡ遺伝子の置換および破壊
バクテリオファージλベースのｒｅｄ組換えを使用して、ｐＣＰ−ＭＭＳＲ２上に保持されるＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）ｒｅｃＡ遺伝子中に抗生物質耐性カセットを導入する（Datsenko KA, Wanner BL. 2000. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.  Proc Natl Acad Sci U S A. 97(12):6640-5）。手短には、表１に列挙されるプライマーＦ−ｒｅｃＡ−ｆｒｔおよびＲ−ＲｅｃＡ−ｆｒｔを使用して、クロラムフェニコールおよびカナマイシン抗生物質耐性遺伝子をコードするＤＮＡ断片を、それぞれ、ｐＫＤ３およびｐＫＤ４から増幅する。抗生物質カセットをコードする、これらの増幅されたＰＣＲ断片は、ｒｅｃＡ遺伝子の上流および下流に位置する４３ｂｐ配列と隣接している。配列は、ｒｅｃＡ遺伝子の各末端に由来する９ｂｐをさらに含んでいた。得られた線形ＰＣＲ増幅産物を、ｒｅｄ媒介性組換えのためにＭＭＳ耐性コスミド、ｐＣＰ−ＭＭＳＲ２およびｐＫＤ２０を有する大腸菌（E. coli）（ＨＢ１０１）株中にエレクトロポレーションする。プラスミドｐＫＤ２０は、ｒｅｄリコンビナーゼを提供し、４２℃での形質転換された株の成長によって組換え後に治癒され得る。次いで、大腸菌（E. coli）（ＨＢ１０１）のＭＭＳ耐性を回復させることができないことを試験することによって、およびプライマーＦ３−ｒｅｃＡｎｅｉおよびＲ２−ＲｅｃＡｎｅｉ（表１）を使用する配列分析によって、コスミド内でのｒｅｃＡ遺伝子の破壊が確認される。いくつかのこのような構築物が、大腸菌（E. coli）（ＨＢ１０１）においてｒｅｃＡ突然変異を補完できないという必要条件を満たした。各抗生物質耐性クラス、ｐＣＰ−ＭＭＳＲΔｒｅｃＡｋａｎおよびｐＣＰ−ＭＭＳＲΔｒｅｃＡＣｍの１種を、Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）のｒｅｃＡノックアウト株を構築するために保持する。
【実施例４】
【０１６０】
カナマイシンまたはクロラムフェニコール耐性カセットを用いる、Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）の染色体におけるｒｅｃＡ遺伝子の置換および破壊
コスミドの破壊されたｒｅｃＡ遺伝子の、Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）染色体ｒｅｃＡ遺伝子へのマーカー交換のために、上記の、２種のｒｅｃＡが破壊されたコスミドクローンを、Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）中に形質転換する。手短には、ｒｅｃＡが破壊されたコスミドの、Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）へのエレクトロポレーション後、テトラサイクリンおよびカナマイシンまたはクロラムフェニコールを含有する栄養寒天プレート上で形質転換体を選択し、精製する。次いで、形質転換体を、カナマイシンまたはクロラムフェニコールのみを含有する液体培養物に播種する。これらの培養物を３回継代培養して、二重交差事象およびコスミドクローンの喪失の可能性を増大する。５０マイクロリットル容積の１０００倍希釈された培養物を、適当な抗生物質を含有するプレート上に広げ、約１００〜２００個のコロニーを選び、カナマイシンまたはクロラムフェニコールに対する耐性およびテトラサイクリンおよびＭＭＳ両方に対する感受性を試験することによって二重交差についてスクリーニングする。得られた候補ｒｅｃＡノックアウトアグロバクテリウム属（Agrobacterium）株を単離し、ＵＩＡ７７７（Ｃｍ）およびＵＩＡ７７０（Ｋａｎ）として表示する。単離されたｒｅｃＡノックアウト株を、表１に列挙されたプライマーを使用するＰＣＲおよび配列分析によってさらに確認する。Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）においてｒｅｃＡ遺伝子ノックアウトを構築する全プロセスは、図１に例示されている。
【実施例５】
【０１６１】
Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）株のｒｅｃＡノックアウト株の成長特性の特性決定
２種のＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）ノックアウトｒｅｃＡ株、ＵＩＡ７７７およびＵＩＡ７７０を、細菌成長速度について観察する。ｒｅｃＡノックアウト株は、ＭＧＬ液体培地に播種された場合に、野生型株と比較して１時間の成長遅延を示したことが観察される（図３を参照のこと）。さらなる観察は、両方のｒｅｃＡノックアウト株とも、固体栄養寒天プレート上でさらに遅く成長したことを示す。例えば、ｒｅｃＡノックアウト株は、コロニーが、直径約１〜２ｍｍに到達するのに３日超を必要としたが、野生型株は、同じ直径１〜２ｍｍの大きさへ約２日で成長したことが観察される。
【０１６２】
２種のＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）ノックアウトｒｅｃＡ株、ＵＩＡ７７７およびＵＩＡ７７０を、メチルメタンスルホン酸塩（ＭＭＳ）および紫外線（ＵＶ）照射に対する感受性について観察する。ＭＭＳおよびＵＶ照射に対する感受性は、細菌ｒｅｃＡノックアウト株の共通の特徴である（Farrand SK, O'Morchoe SP, McCutchan J. 1989. Construction of an Agrobacterium tumefaciens C58 recA mutant.  J Bacteriol. 171(10):5314-21）。Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）ｒｅｃＡノックアウト株の一晩培養物を、３ｍｌのＭＧＬ培地中に１００倍希釈し、振盪しながら初期静止期まで成長させる。次いで、得られた培養物を、０．９％  ＮａＣｌで１０倍段階希釈し、５μｌのサンプルを、栄養寒天プレートの表面上にスポッティングする。ＭＭＳ処理のために、培地中に０．０１％  ＭＭＳが含まれる。ＵＶ照射のために、プレートをＵＶ光供給源（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）に曝露して、内部ＵＶ線量計によって測定されるようなＵＶの正確な線量を送達する。曝露の直後に、プレートを覆い、２８℃で遮光性ブラックボックス中で２４時間インキュベートする。ゼロ希釈での培養物の力価を使用して、ＭＭＳの存在下での、または種々の線量のＵＶ照射に対する曝露後の細胞の生存を調べる。表２に示されるように、２種のＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）ｒｅｃＡノックアウト株、ＵＩＡ７７７およびＵＩＡ７７０は、野生型Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）と比較して、ＭＭＳおよびＵＶ照射の両方に対して感受性である。
【０１６３】
【表２】
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【実施例６】
【０１６４】
ｒｅｃＡノックアウトＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）株の補完
プラスミドｐＳＯＭ３０１、Ｃ５８由来のｒｅｃＡ遺伝子を含有するｐＣＰ１３／Ｂの誘導体（Farrand SK, O'Morchoe SP, McCutchan J. 1989. Construction of an Agrobacterium tumefaciens C58 recA mutant.  J Bacteriol. 171(10):5314-21)を、Ａ．ツメファシエンス(A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）ｒｅｃＡノックアウト株、ＵＩＡ７７０の遅い成長、ＭＭＳおよびＵＶ感受性を補完するその能力について試験する。ｐＳＯＭ３０１プラスミドは、ＵＩＡ７７０の成長遅延および小さいコロニー表現型を回復させた（図３）。また、ＵＩＡ７７０の、ＭＭＳおよびＵＶ照射に対する耐性も、野生型Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）によって示されるものと同様のレベルに回復させ得る（表２）。
【実施例７】
【０１６５】
ノックアウトＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）株由来の単離されたプラスミドの特性決定
野生型、Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）株は、ｖｉｒヘルパープラスミドｐＡＬ４４０４を有する（Hoekema A, Hirsch PR, Hooykaas PJJJ, Schilperoort, 1983. A binary plant vector strategy based on separation of vir and T-region of the Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid. Nature 303:179-180）。ｐＡＬ４４０４ヘルパープラスミド（すなわち、Ｔｉプラスミド）は、ｒｅｃＡノックアウト株から単離される。次いで、へルパープラスミドをゲル電気泳動分析に付す。得られたゲル分析は、Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）ＵＩＡ７７７およびＵＩＡ７７０株から単離されたプラスミドは、両方ともｐＡＬ４４０４と同一の移動度で移動する単一プラスミドを有していることを示した。
【実施例８】
【０１６６】
ｒｅｃＡノックアウトＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）株由来のターナリープラスミドの導入
参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０４６０２８にこれまでに記載されたようなターナリープラスミド（ｐＤＡＢ９２９２）を、２種のＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）ｒｅｃＡノックアウト株、ＵＩＡ７７７およびＵＩＡ７７０中に形質転換する。アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株へのターナリープラスミドの導入を、分子確認アッセイ（すなわち、制限酵素消化および配列決定）によって確認する。
【実施例９】
【０１６７】
ｒｅｃＡノックアウトＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）株における関連遺伝子エレメントを含有するバイナリープラスミドの安定性
Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）ｒｅｃＡノックアウト株を試験して、反復遺伝子エレメントを含有するバイナリープラスミドの安定性を評価する。これまでの実施形態では、バイナリープラスミドが、Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）中にクローニングされる場合に、バイナリープラスミド内の反復遺伝子エレメントの使用は、再編成すると観察される。バイナリープラスミド、ｐＤＡＢ１０８７００（配列番号１２）は、図４に示されている。示されるように、ｐＤＡＢ１０８７００は、両方とも同一プロモーターによって駆動される２種の遺伝子発現カセットを含有する。第１の遺伝子発現カセットは、ｐｈｉ黄色蛍光タンパク質（ＰｈｉＹＰＦ  ｖ３）遺伝子配列と連結しており、トウモロコシ（Zea mays）ペルオキシダーゼ５３’ＵＴＲ（ＺｍＰｅｒ５  ３’ＵＴＲ  ｖ２）で終結するトウモロコシ（Zea mays）ユビキチン−１プロモーター（Ｚｍ  Ｕｂｉ１プロモーターｖ２）を含有する。第２の遺伝子発現カセットは、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ  ｖ９）遺伝子配列と連結しており、トウモロコシ（Zea mays）リパーゼ３’ＵＴＲ（ＺｍＬｉｐ  ３’ＵＴＲ  ｖ１）で終結するトウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）ユビキチン−１プロモーター（Ｚｍ  Ｕｂｉ１プロモーターｖ２）を含有する。
【０１６８】
【表３】
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【０１６９】
バイナリープラスミド、ｐＤＡＢ１０８７００を、表３のＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）株中に形質転換する。形質転換後、２種の細菌コロニーを各細菌株の形質転換から単離する。各コロニーを成長させ、一連の制限酵素消化（すなわち、ＮｏｔＩ、ＥｃｏＲＩ、ＦｓｏＩおよびＰｓｔＩ消化）を用いる検証のためにバイナリープラスミドＤＮＡを単離する。次いで、第１の実験から得られた１つの特異的コロニーを選択し、固体培地上に画線する。固体培地上で成長したコロニーのうち１０を選び、成長させる。一連の制限酵素消化（すなわち、ＮｏｔＩ、ＥｃｏＲＩ、ＦｓｏＩおよびＰｓｔＩ消化）を用いる別のラウンドの検証のために、バイナリープラスミドＤＮＡを単離する。制限酵素消化のバンド形成パターンを予想された大きさのプラスミドＤＮＡ断片の生成について観察する。異常な、予想しない大きさのプラスミドＤＮＡ断片を有するバンド形成パターンを生成したコロニーを不安定と同定する。予想した大きさのプラスミドＤＮＡ断片を有するバンド形成パターンを生成したコロニーを安定と同定する。各異なる株について、再編成を全く示さなかったプラスミドの総パーセンテージを算出し、結果は、表３に提示されている。
【実施例１０】
【０１７０】
Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）ｒｅｃＡノックアウト株を用いる植物媒介性形質転換
植物種を、当技術分野で公知の技術を使用して本開示の実施形態に従って形質転換する。植物媒介性形質転換のために、バイナリープラスミドを含有する２種のＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）ｒｅｃＡノックアウト株、ＵＩＡ７７７およびＵＩＡ７７０を使用する。形質転換の結果として、選択マーカーを含有する遺伝子発現カセットを、Ｔ鎖として、植物染色体内のゲノム遺伝子座中に組み込む。上流および下流ゲノム隣接配列内へのＴ鎖の組込みは、トランスジェニック植物のゲノム内に安定に組み込まれたトランスジェニック事象をもたらす。
【０１７１】
トウモロコシ植物は、国際公開第２００７／０５３４８２号パンフレットの実施例８にこれまでに記載される同一技術を利用することによって、バイナリープラスミドを含有する、２種のＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）ｒｅｃＡノックアウト株、ＵＩＡ７７７およびＵＩＡ７７０のいずれかを用いて形質転換され得る。得られた形質転換は、植物染色体内のゲノム遺伝子座中へＴ鎖として組み込まれる農学的形質を含有する遺伝子発現カセットを組み込む。
【０１７２】
ダイズ植物は、国際公開第２００７／０５３４８２号パンフレットの実施例１１または実施例１３にこれまでに記載される同一技術を利用することによって、バイナリープラスミドを含有する、２種のＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）ｒｅｃＡノックアウト株、ＵＩＡ７７７およびＵＩＡ７７０のいずれかを用いて形質転換され得る。得られた形質転換は、植物染色体内のゲノム遺伝子座中へＴ鎖として組み込まれる農学的形質を含有する遺伝子発現カセットを組み込む。
【０１７３】
ワタ植物は、特許出願米国特許第７，８３８，７３３号明細書の実施例１４または国際公開第２００７／０５３４８２号パンフレット（Wright et al.）の実施例１２にこれまでに記載される同一技術を利用することによって、バイナリープラスミドを含有する、２種のＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）ｒｅｃＡノックアウト株、ＵＩＡ７７７およびＵＩＡ７７０のいずれかを用いて形質転換され得る。得られた形質転換は、植物染色体内のゲノム遺伝子座中へＴ鎖として組み込まれる農学的形質を含有する遺伝子発現カセットを組み込む。
【０１７４】
セイヨウアブラナ植物は、特許出願米国特許第７，８３８，７３３号明細書の実施例２６または国際公開第２００７／０５３４８２号パンフレット（Wright et al.）の実施例２２にこれまでに記載される同一技術を利用することによって、バイナリープラスミドを含有する、２種のＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）ｒｅｃＡノックアウト株、ＵＩＡ７７７およびＵＩＡ７７０のいずれかを用いて形質転換され得る。得られた形質転換は、植物染色体内のゲノム遺伝子座中へＴ鎖として組み込まれる農学的形質を含有する遺伝子発現カセットを組み込む。
【０１７５】
ライムギのアグロバクテリウム媒介性形質転換については、例えば、Popelka JC, Xu J, Altpeter F., “Generation of rye with low transgene copy number after biolistic gene transfer and production of (Secale cereale L.) plants instantly marker-free transgenic rye”, Transgenic Res. 2003 Oct;12(5):587-96を参照のこと。モロコシのアグロバクテリウム媒介性形質転換については、例えば、Zhao et al., “Agrobacterium-mediated sorghum transformation”, Plant Mol Biol. 2000 Dec;44(6):789-98を参照のこと。オオムギのアグロバクテリウム媒介性形質転換については、例えば、Tingay et al., “Agrobacterium tumefaciens-mediated barley transformation”, The Plant Journal, (1997) 11:1369-1376を参照のこと。コムギのアグロバクテリウム媒介性形質転換については、例えば、Cheng et al., “Genetic Transformation of Wheat Mediated by Agrobacterium tumefaciens”, Plant Physiol. 1997 Nov;115(3):971-980を参照のこと。イネのアグロバクテリウム媒介性形質転換については、例えば、Hiei et al., “Transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens”, Plant Mol. Biol. 1997 Sep;35(1-2):205-18を参照のこと。
【０１７６】
これらのおよびその他の植物のラテン名を以下に示す。植物は、バイナリープラスミドを含有する、２種のＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）ｒｅｃＡノックアウト株、ＵＩＡ７７７およびＵＩＡ７７０のいずれかを用いて形質転換され得ることは明確でなくてはならない。結果として、２種のＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）ｒｅｃＡノックアウト株、ＵＩＡ７７７およびＵＩＡ７７０のいずれかを使用して、農学的形質をこれらおよびその他の植物中に形質転換できる。例として、限定するものではないが、トウモロコシ（ゼア・メイズ（Zea mays））、コムギ（トリチカム属（Triticum）の種）、イネ（オリザ属（Oryza）の種およびジザニア属（Zizania）の種）、オオムギ（ホルデウム属（Hordeum）の種）、ワタ（アブロマ・オーグスタ（Abroma augusta）およびゴシッピウム属（Gossypium）の種）、ダイズ（ダイズ（Glycine max））、サトウダイコンおよびテーブルビート（ベータ属（Beta）の種）、サトウキビ（アレンガ・ピンナタ（Arenga pinnata））、トマト（トマト（Lycopersicon esculentum）およびその他の種、フィサリス・イクソカルパ（Physalis ixocarpa）、ソラナム・インカナム（Solanum incanum）およびその他の種ならびにシフォマンドラ・ベタセア（Cyphomandra betacea））、ジャガイモ（ジャガイモ（Solanum tuberosum））、サツマイモ（サツマイモ（Ipomoea batatas））、ライムギ（セカレ属（Secale）の種）、ピーマン（トウガラシ（Capsicum annuum）、チネンセ（chinense）およびフルテセンス（frutescens））、レタス（レタス（Lactuca sativa）、ペレニス（perennis）およびプルケラ（pulchella））、キャベツ（ブラシカ属（Brassica）の種）、セロリ（アピウム・グラベオレンス（Apium graveolens））、ナス（ナス（Solanum melongena））、ピーナッツ（アラキス・ヒポゲア（Arachis hypogea））、モロコシ（ソルガム属（Sorghum）の種）、アルファルファ（アルファルファ（Medicago sativa））、ニンジン（ニンジン（Daucus carota））、マメ（ファセオラス属（Phaseolus）の種およびその他の属）、カラスムギ（エンバク（Avena sativa）およびストリゴサ（strigosa））、エンドウ（ピスム属（Pisum）、ササゲ属（Vigna）およびシカクマメ属（Tetragonolobus）の種）、ヒマワリ（ヒマワリ（Helianthus annuus））、カボチャ（ククルビタ属（Cucurbita）の種）、キュウリ（ククミス・サティバ（Cucumis sativa））、タバコ（ニコチアナ属（Nicotiana）の種）、シロイヌナズナ（シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））、芝草（ロリウム属（Lolium）、アグロスティス属（Agrostis）、ポア属（Poa）、ギョウギシバ属（Cynodon）およびその他の属）、クローバー（トリフォリウム属（Trifolium））、カラスノエンドウ（ビキア属（Vicia））が挙げられる。バイナリープラスミドを含有する、２種のＡ．ツメファシエンス（tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）ｒｅｃＡノックアウト株、ＵＩＡ７７７およびＵＩＡ７７０のいずれかを用いるこのような植物の形質転換は、例えば、本開示の一実施形態として考慮される。
【０１７７】
バイナリープラスミドを含有する２種のＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）ｒｅｃＡノックアウト株、ＵＩＡ７７７およびＵＩＡ７７０は、多数の落葉および常緑木材植物作付体系の形質転換のために使用され得る。トランスジェニック木材植物種は、傷害を気に掛けることなく、これらの除草剤の過度の使用の適応性を増大する。これらの種として、限定するものではないが、ハンノキ（アルヌス（Alnus）種）、セイヨウトネリコ（トネリコ属（Fraxinus）の種）、アスペンおよびポプラ種（ポプラ属（Populus）の種）、ブナノキ（ブナ属（Fagus）の種）、カバノキ（カバノキ属（Betula）の種）、サクラ（サクラ属（Prunus）の種）、ユーカリ（ユーカリ属（Eucalyptus）の種）、ヒッコリー（ペカン属（Carya）の種）、カエデ（カエデ属（Acer）の種）、オーク（カシ属（Quercus）の種）およびマツ（マツ属（Pinus）の種）が挙げられる。
【０１７８】
観賞植物および果実を有する種の形質転換のためのバイナリープラスミドを含有する、２種のＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）ｒｅｃＡノックアウト株、ＵＩＡ７７７およびＵＩＡ７７０のいずれかの使用もまた、本開示の実施形態の範囲内である。例として、限定するものではないが、バラ（バラ属（Rosa）の種）、ホウキグサ（ニシキギ属（Euonymus）の種）、ペチュニア（ペチュニア属（Petunia）の種）、ベゴニア（ベゴニア属（Begonia）の種）、ロドデンドロン（ロドデンドロン属（Rhododendron）の種）、小さくて酸っぱいリンゴまたはリンゴ（リンゴ属（Malus）の種）、セイヨウナシ（ナシ属（Pyrus）種）、モモ（サクラ属（Prunus）の種）およびマリーゴールド（タゲテス属（Tagetes）の種）が挙げられる。本発明の態様は、特定の実施形態において記載されているが、それらは本開示の種子および範囲内でさらに修飾され得る。
【０１７９】
したがって、本願は、その一般原則を使用する本発明の実施形態の任意の変法、使用または適応を対象とするものである。さらに、本願は、これらの実施形態が属する技術分野における公知のまたは通例の実施内にあるような、また添付の特許請求の範囲の制限内に入る本願からのこのような逸脱を対象とするものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2017527292.tif 000012
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