(57)【要約】ハンチントン病（ＨＤ）を処置または予防するための方法および組成物が開示される。具体的には、ハンチンチン（Ｈｔｔ）凝集体を低減および／もしくは排除する、運動障害を緩和する、細胞活性（例えば、ＡＴＰ活性）を増加させる、ならびに／またはＨＤを有する被験体においてアポトーシスを低減させるための方法および組成物が提供され、本方法は、被験体に変異体Ｈｔｔ（ｍＨｔｔ）対立遺伝子の抑制因子を投与することを含む。被験体においてｍＨｔｔを検出することを含む、ＨＤを診断するおよび／または該疾患進行を監視する方法がさらに開示される。
2017515819.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハンチントン病（ＨＤ）を有する被験体においてニューロンを改変する方法であって、該ニューロンが改変されるように、該被験体に変異体Ｈｔｔ（ｍＨｔｔ）対立遺伝子の抑制因子を投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記ニューロンは、ＨＤニューロンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記改変は、前記ニューロンにおけるＨｔｔの凝集を低減すること；該ニューロンにおけるエネルギー代謝を増加させること；該ニューロンにおけるアポトーシスに対する感受性を低減すること、およびそれらの組合せを含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
細胞内のＡＴＰレベルが増加する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＨＤニューロンにおけるＨｔｔ凝集体の形成を防止または低減する方法であって、請求項３に記載の方法に従って該ＨＤニューロンを改変することを含む、方法。
【請求項６】
ＨＤニューロンにおける細胞活性を増加させる方法であって、請求項３に記載の方法に従って該ＨＤニューロンを改変することを含む、方法。
【請求項７】
ＨＤニューロンにおけるアポトーシスを低減する方法であって、請求項３に記載の方法に従って該ＨＤニューロンを改変することを含む、方法。
【請求項８】
運動障害を低減することを必要とするＨＤ被験体において運動障害を低減するための方法であって、請求項２に記載の方法に従って該被験体におけるＨＤニューロンを改変することを含む、方法。
【請求項９】
前記運動障害は、クラスピングを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記被験体におけるｍＨｔｔレベルを検出することをさらに含む、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記ｍＨｔｔレベルは、脳脊髄液（ＣＳＦ）中で検出される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記抑制因子は、ジンクフィンガータンパク質転写因子（ＺＦ）−ＴＦ）、ＴＡＬ−エフェクタードメイン転写因子（ＴＡＬＥ−ＴＦ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−転写因子、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬ−エフェクタードメインヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系を含む、請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記抑制因子は、タンパク質として、またはポリヌクレオチドとして前記ニューロンに送達される、請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ、またはプラスミドおよびウイルスベクターからなる群より選択される発現構築物を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記抑制因子は、ｍＨｔｔ発現を少なくとも８５％低減させる、請求項１から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
Ｈｔｔ抑制因子、およびｍＨｔｔタンパク質のレベルを検出および／または定量するための試薬を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年５月８日に出願された米国仮出願第６１／９９０，５２１号および２０１４年９月１７日に出願された米国仮出願第６２／０５１，７２４号の利益を主張し、それらの開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
技術分野
本開示は、ハンチントン病のための診断および治療の分野のものである。
【背景技術】
【０００３】
背景
ハンチントン舞踏病としても知られる、ハンチントン病（ＨＤ）は、進行性の運動、認知、および精神的混乱障害である。この疾患の平均発症年齢は、３５〜４４歳であるが、症例の約１０％においては、２１歳より前に発症し、この疾患の診断後の平均寿命は、１５〜１８年である。有病率は、西ヨーロッパ家系で１００，０００人中約３〜７人である。
【０００４】
ハンチントン病は、１９９０年代初期に最初に特徴付けられたトリヌクレオチド反復伸長障害の一例である（Ｄｉ  Ｐｒｏｓｐｅｒｏ  ａｎｄ  Ｆｉｓｃｈｂｅｃｋ（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６：７５６−７６５を参照されたい）。これらの障害は、３つのヌクレオチドの組の不安定な反復の局所的伸長を伴い、その伸長した反復が存在する遺伝子の機能喪失、毒性機能獲得、またはそれらの両方をもたらし得る。トリヌクレオチド反復は、非コードおよびコード遺伝子領域を含む、遺伝子のいずれの部分にも位置し得る。コード領域内に位置する反復は、典型的に、反復したグルタミンコードトリプレット（ＣＡＧ）またはアラニンコードトリプレット（ＣＧＡ）のいずれかを伴う。非コード配列内の伸長した反復領域は、遺伝子の異常な発現につながり得る一方で、コード領域内の伸長した反復（コドン反復障害としても知られる）は、ミスフォールディングおよびタンパク質凝集を引き起こすことがある。異常なタンパク質に関連する病態生理学の正確な原因は、知られていないことが多い。典型的に、トリヌクレオチド伸長の対象となる野生型遺伝子において、これらの領域は、正常な集団において可変数の反復配列を含有するが、罹患した集団においては、反復の回数は、反復の回数の倍加から対数桁の増加まで増加し得る。ＨＤにおいて、反復は、巨大細胞質タンパク質ハンチンチン（Ｈｔｔ）のＮ末端コード領域内に挿入される。正常なＨｔｔ対立遺伝子は、１５〜２０回ＣＡＧ反復を含有する一方で、３５回以上の反復を含有する対立遺伝子は、ＨＤを引き起こす可能性がある対立遺伝子と見なされ、疾患を発症する危険性を付与し得る。３６〜３９回反復を含有する対立遺伝子は、不完全に浸透性であると見なされ、それらの対立遺伝子を内部に持つそれらの個人は、疾患を発症することもしないこともある（または後年に症状を発症することがある）一方で、４０回以上の反復を含有する対立遺伝子は、完全に浸透性であると見なされる。実際、これほど多くの反復を有するＨＤ対立遺伝子を持つ無症候性の人物は、何ら報告されてこなかった。若年発症型ＨＤ（２１歳未満）を有する個人はしばしば、６０回以上のＣＡＧ反復を有することが見出されている。ＣＡＧ反復の増加に加えて、ＨＤが反復配列内で＋１および＋２フレームシフトを伴い得、その結果、その領域が、ポリ−グルタミンではなくポリ−セリンポリペプチド（＋１フレームシフトの場合にはＡＧＣ反復によってコードされる）トラックをコードすることになることもまた示されてきた（Ｄａｖｉｅｓ  ａｎｄ  Ｒｕｂｉｎｓｚｔｅｉｎ（２００６）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４３：８９３−８９６）。
【０００５】
ＨＤにおいて、変異体Ｈｔｔ対立遺伝子は、通常、優性形質として一方の親から遺伝する。ＨＤ患者から生まれた子供は、他方の親がその障害に罹患していなかった場合、疾患を発症する５０％の可能性を有する。場合によっては、親は、中間のＨＤ対立遺伝子を有し、無症候性であり得るが、反復伸長に起因して、その子供は疾患を呈する。加えて、ＨＤ対立遺伝子はまた、精子形成中の反復領域の不安定な性質に起因して重症度の増加または発症年齢の低下が数世代にわたって観察される、表現促進として知られる現象も表示し得る。
【０００６】
さらに、Ｈｔｔにおけるトリヌクレオチド伸長は、線条体における中型有棘細胞のγアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）投射ニューロンのニューロン欠損につながり、このニューロン欠損は、新皮質においても生じる。エンケファリンを含有し、かつ淡蒼球外節に投射する中型有棘ニューロンは、Ｐ物質を含有し、かつ淡蒼球内節に投射するニューロンよりも影響を受ける。ハンチントン病を有する人々において侵される他の脳領域には、黒質、皮層３、５、および６、海馬のＣＡ１領域、頭頂葉における角回、小脳のプルキンエ細胞、視床下部の外側隆起核、ならびに視床の正中中心核−束傍核複合体（ｃｅｎｔｒｏｍｅｄｉａｌｐａｒａｆａｓｃｉｃｕｌａｒ）（Ｗａｌｋｅｒ（２００７）Ｌａｎｃｅｔ  ３６９：２１８−２２８）が含まれる。
【０００７】
正常なＨｔｔタンパク質の役割は、十分に理解されていないが、それはニューロン形成、アポトーシス細胞死、および小胞輸送に関与し得る。加えて、野生型Ｈｔｔが、線条体ニューロンの生存促進因子である、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の産生を刺激するという証拠が存在する。ＨＤの進行がＨＤのマウスモデルにおいてＢＤＮＦ発現の減少と相関すること（Ｚｕｃｃａｔｏ  ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２（２）：１３３−１３９）、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター媒介性遺伝子送達を介したＢＤＮＦまたはグリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）のいずれかの送達がＨＤのマウスモデルにおいて線条体（ｓｔｒａｉｔａｌ）ニューロンを保護し得ることが示されてきた（Ｋｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ，（２００４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ９（５）：６８２−６８８）。
【０００８】
ＨＤに対する診断および処置の選択肢は、現在のところ非常に限定されている。診断に関して、変更された（変異体）Ｈｔｔ（ｍＨＴＴ）レベルは、疾患負荷スコアおよび疾患進行に伴う可溶性ｍＨＴＴ種の濃度増加と有意に関連している。しかしながら、ｍＨＴＴはその存在量が少ないことにより、患者のＣＮＳでの定量が難しく、そのためインビボのＨＤの神経病理生物学（ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ）における役割の研究が制限され、ＨＴＴ低下薬による標的への関与の実証も不可能になっている。例えば、Wildら（２０１４年）J  Neurol  Neurosurg  Psychiatry  ８５巻：ｅ４を参照されたい。
処置に関して、化合物ゲルダナマイシンによるシャペロニンの過剰発現または熱ショック応答の誘導等の、伸長したポリ−グルタミントラクトを通じて生じるタンパク質凝集に関連する毒性を予防するように設計された、いくつかの可能性のある手法は、インビトロモデルにおいてこれらの毒性の低減を示してきた。他の治療は、疾患の臨床徴候におけるアポトーシスの役割を標的とする。例えば、一方の親がＨＤ対立遺伝子を含有し、他方の親がカスパーゼ１の優性阻害の対立遺伝子を有した場合のマウスの対合の子孫における動物モデルで、カスパーゼ活性の遮断を介した疾患症状の緩徐化が示されてきた。さらに、カスパーゼによる変異ＨＤ  Ｈｔｔの切断は、疾患の病原性において役割を果たし得る。カスパーゼ−６耐性変異体Ｈｔｔを担持するトランスジェニックマウスは、カスパーゼ非耐性変異体Ｈｔｔ対立遺伝子を担持するマウスと比較して、正常なニューロン機能を維持することが見出され、線条体神経変性を発症しなかった（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｃｅｌｌ  １２５：１１７９−１１９１を参照されたい）。アポトーシス経路のメンバーを標的とする分子もまた、総体症状に対する緩徐化効果を有することが示されてきた。例えば、両方ともカスパーゼ活性を阻害する、化合物ｚＶＡＤ−ｆｍｋおよびミノサイクリンは、マウスにおいて疾患徴候を緩徐化することが示されてきた。薬物レマセミドもまた、この化合物がＮＤＭＡ受容体への変異体Ｈｔｔの結合を阻止して、神経細胞への毒性作用の行使を阻止すると考えられたため、ヒトの小規模なＨＤ治験において使用されてきた。しかしながら、これらの治験において、ニューロン機能の統計的に有意な改善は、何ら観察されなかった。加えて、ハンチントン研究グループは、補酵素Ｑを使用して無作為二重盲検試験を行った。補酵素Ｑ１０で治療された患者の間でより緩徐な疾患進行の傾向が観察されたものの、総計の機能的能力の低下速度における有意な変化は何ら存在しなかった。（Ｄｉ  Ｐｒｏｓｐｅｒｏ  ａｎｄ  Ｆｉｓｃｈｂｅｃｋ（同書））。
ジンクフィンガータンパク質（「ＺＦＰ」）由来のＤＮＡ結合ドメイン、ＴＡＬ−エフェクタードメイン（「ＴＡＬＥ」）を含む組換え転写因子およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ転写因子系は、内因性遺伝子の遺伝子発現を制御する能力を有する（例えば、米国特許第８,５８６,５２６号；同第６,５３４,２６１号；同第６,５９９,６９２号；同第６,５０３,７１７号；同第６,６８９,５５８号；同第７,０６７,３１７号；同第７,２６２,０５４号；Perez-Pineraら（２０１３年）Nature  Methods  １０巻：９７３〜９７６頁；Platekら（２０１４年）Plant  Biotechnology  J.  doi：１０．１１１１／ｐｂｉ．１２２８４を参照されたい）。ジンクフィンガータンパク質を含有するこれらの操作された転写因子を使用した臨床試験は、これらの新規の転写因子が様々な状態を処置できることを示してきた。（例えば、Yuら（２００６年）FASEB  J.  ２０巻：４７９〜４８１頁を参照されたい）。加えて、ジンクフィンガータンパク質（「ＺＦＰ」）由来のＤＮＡ結合ドメイン、ＴＡＬ−エフェクタードメイン（「ＴＡＬＥ」）を含む人工ヌクレアーゼ、ＴｔａｇｏおよびＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓまたはＴｔａｇｏヌクレアーゼ系は非相同末端結合（ＮＨＥＪ：ｎｏｎ−ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｎｄ  ｊｏｉｎｉｎｇ）の後の相同組換え修復（ＨＤＲ：ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒｅｐａｉｒ）、および／または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって駆動するプロセスにおける末端捕捉による相同組換え修復のいずれかを含む、ヌクレアーゼが媒介する遺伝子修飾を介して内因性遺伝子の遺伝子発現を修飾する能力を有する。例えば、８，６２３，６１８；８，０３４，５９８；８，５８６，５２６；６，５３４，２６１；６，５９９，６９２；６，５０３，７１７；６，６８９，５５８；７，０６７，３１７；７，２６２，０５４；７，８８８，１２１；７，９７２，８５４；７，９１４，７９６；７，９５１，９２５；８，１１０，３７９；８，４０９，８６１；米国特許公開第２００３０２３２４１０号；同第２００５０２０８４８９号；同第２００５００２６１５７号；同第２００６００６３２３１号；同第２００８０１５９９９６号；同第２０１０００２１８２６４号；同第２０１２００１７２９０号；同第２０１１０２６５１９８号；同第２０１３０１３７１０４号；同第２０１３０１２２５９１号；同第２０１３０１７７９８３号；同第２０１３０１７７９６０号および同第２０１５００５６７０５号（それらの開示は、すべての目的でそれらの全体が参考として組み込まれる）を参照されたい。したがってこれらの方法は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）等のエラーを生じるプロセスによる切断の修復または修復鋳型を使用した修復（相同組換え修復またはＨＤＲ）が遺伝子のノックアウトまたは目的の配列の挿入（標的化組み込み）を引き起こし得るように、標的ＤＮＡ配列中で二本鎖切断（ＤＳＢ）またはニックを誘導するために操作された切断系の使用を伴うことが多い。外部から供給された修復鋳型（例えば「ドナー」または「導入遺伝子」）の非存在下における二本鎖切断の導入は、細胞のＮＨＥＪ経路によって導入された変異（「インデル」として公知の挿入および／または欠失）を介した標的化遺伝子の不活性化のために一般的に使用されている。例えば、米国特許公開第２０１１００８２０９３号は、Ｈｔｔに標的化された特異的なジンクフィンガータンパク質を開示しており、米国特許公開第２０１３０２５３０４０号は、Ｈｔｔ等のＨＤ対立遺伝子の発現を調節するＤＮＡ結合タンパク質に関する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第８，５８６，５２６号明細書
【特許文献２】米国特許第６，５３４，２６１号明細書
【特許文献３】米国特許第６，５９９，６９２号明細書
【特許文献４】米国特許第６，５０３，７１７号明細書
【特許文献５】米国特許第６，６８９，５５８号明細書
【特許文献６】米国特許第７，０６７，３１７号明細書
【特許文献７】米国特許第７，２６２，０５４号明細書
【特許文献８】米国特許出願公開第２００３／０２３２４１０号明細書
【特許文献９】米国特許出願公開第２００５／０２０８４８９号明細書
【特許文献１０】米国特許出願公開第２００５／００２６１５７号明細書
【特許文献１１】米国特許出願公開第２００６／００６３２３１号明細書
【特許文献１２】米国特許出願公開第２００８／０１５９９９６号明細書
【特許文献１３】米国特許出願公開第２０１０／００２１８２６４号明細書
【特許文献１４】米国特許出願公開第２０１２／００１７２９０号明細書
【特許文献１５】米国特許出願公開第２０１１／０２６５１９８号明細書
【特許文献１６】米国特許出願公開第２０１３／０１３７１０４号明細書
【特許文献１７】米国特許出願公開第２０１３／０１２２５９１号明細書
【特許文献１８】米国特許出願公開第２０１３／０１７７９８３号明細書
【特許文献１９】米国特許出願公開第２０１３／０１７７９６０号明細書
【特許文献２０】米国特許出願公開第２０１５／００５６７０５号明細書
【特許文献２１】米国特許出願公開第２０１１／００８２０９３号明細書
【特許文献２２】米国特許出願公開第２０１３／０２５３０４０号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｄｉ  Ｐｒｏｓｐｅｒｏ  ａｎｄ  Ｆｉｓｃｈｂｅｃｋ（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６：７５６−７６５
【非特許文献２】Ｄａｖｉｅｓ  ａｎｄ  Ｒｕｂｉｎｓｚｔｅｉｎ（２００６）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４３：８９３−８９６
【非特許文献３】Ｗａｌｋｅｒ（２００７）Ｌａｎｃｅｔ  ３６９：２１８−２２８
【非特許文献４】Ｚｕｃｃａｔｏ  ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２（２）：１３３−１３９
【非特許文献５】Ｋｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ，（２００４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ９（５）：６８２−６８８）。
【非特許文献６】Ｗｉｌｄら（２０１４年）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ８５巻：ｅ４
【非特許文献７】Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｃｅｌｌ  １２５：１１７９−１１９１
【非特許文献８】Ｐｅｒｅｚ−Ｐｉｎｅｒａら（２０１３年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０巻：９７３〜９７６頁
【非特許文献９】Ｐｌａｔｅｋら（２０１４年）Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｊ．  ｄｏｉ：１０．１１１１／ｐｂｉ．１２２８４
【非特許文献１０】Ｙｕら（２００６年）ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  ２０巻：４７９〜４８１頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、疾患進行を監視するための、ＨＤの神経病理生物学の理解を増すための、および疾患を改変するＨＤ療法を評価するための、ｍＨＴＴの検出を含むハンチントン病の診断、研究、処置および／または予防のための方法が未だ求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
ハンチントン病を診断および／または処置するための方法および組成物が本明細書で開示される。特に、Ｈｔｔ凝集体を検出する、低減する、および／もしくは排除する、運動障害を緩和する、細胞活性（例えば、ＡＴＰ活性）を増加させる、ならびに／またはＨＤを有する被験体においてアポトーシスを低減させるための方法および組成物が本明細書で提供される。
【００１３】
したがって、一態様において、ＨＤを有する被験体においてニューロンを改変する方法であって、ニューロンが改変されるように、被験体に変異体Ｈｔｔ対立遺伝子の抑制因子を投与することを含む、方法が本明細書に記載される。ある特定の実施形態において、ニューロンは、変異体Ｈｔｔ対立遺伝子を含むニューロン、および／または増加した量の細胞内で凝集したＨｔｔを含むニューロン（「ＨＤニューロン」）である。ある特定の実施形態において、改変は、ニューロン（例えば、ＨＤニューロン）におけるＨｔｔの凝集を低減すること；例えば細胞内のＡＴＰレベルを増加させることによって、ニューロン（例えば、ＨＤニューロン）のエネルギー代謝を増加させること；および／またはニューロン（例えば、ＨＤニューロン）におけるアポトーシスに対する感受性を低減することを含む。ある特定の実施形態において、被験体は、哺乳類である。
【００１４】
したがって、他の態様において、ＨＤを有する被験体のＨＤニューロンにおいてＨｔｔ凝集体の形成を防止および／または低減する方法であって、被験体に変異体Ｈｔｔ対立遺伝子の抑制因子を投与することを含む、方法が本明細書に記載される。
【００１５】
他の態様において、ニューロン（例えば、ＨＤニューロン）における細胞活性（例えば、ＡＴＰ活性）を増加させる方法であって、ニューロンに変異体Ｈｔｔ対立遺伝子の抑制因子を投与することを含む、方法が本明細書に記載される。
【００１６】
他の態様において、ニューロン（例えば、ＨＤニューロン）におけるアポトーシスを低減する方法であって、ニューロンに変異体Ｈｔｔ対立遺伝子の抑制因子を投与することを含む、方法が本明細書に記載される。
【００１７】
別の態様において、運動障害（例えば、クラスピング（ｃｌａｓｐｉｎｇ））の低減を必要とするＨＤ被験体に変異体Ｈｔｔ対立遺伝子の抑制因子を投与することによって、それを必要とする該被験体において運動障害（例えば、クラスピング）を低減するための方法が本明細書に記載される。
【００１８】
さらに別の態様において、治療に応答して（例えば、本明細書に記載されるＨｔｔ抑制因子の投与に応答して）ｍＨｔｔを検出することを含む、被験体においてｍＨｔｔを（例えば、ＣＳＦ中で）検出するための方法が本明細書に記載される。ある特定の実施形態において、検出することは、被験体におけるｍＨｔｔの量を定量することを含む。本明細書に記載される検出方法のいずれも、ＨＤの診断のために使用することができ、および／またはｍＨＴＴレベルが疾患負荷スコアと有意に関連しており、疾患が進行するにつれてｍＨＴＴの濃度レベルが増加するため、疾患進行を監視するために使用することができる。さらに、被験体においてｍＨｔｔを検出する（例えば、定量する）方法のいずれも、ＨＤの神経病理生物学を評価する方法、および／または疾患を改変するＨＤ療法の有効性を評価するための方法で使用することができる。
【００１９】
本明細書に記載される方法のいずれにおいても、変異体Ｈｔｔ対立遺伝子の抑制因子は、ＺＦＰ−ＴＦ、例えば、変異体Ｈｔｔ対立遺伝子に特異的に結合するＺＦＰと転写抑制ドメイン（例えば、ＫＯＸ、ＫＲＡＢ等）とを含む融合タンパク質であり得る。他の実施形態において、変異体Ｈｔｔ対立遺伝子の抑制因子は、ＴＡＬＥ−ＴＦ、例えば変異体Ｈｔｔ対立遺伝子に特異的に結合するＴＡＬＥポリペプチドと転写抑制ドメイン（例えば、ＫＯＸ、ＫＲＡＢ等）とを含む融合タンパク質であり得る。一部の実施形態において、変異体Ｈｔｔ対立遺伝子抑制因子は、Ｃａｓタンパク質がＤＮＡを切断しないようにＣａｓタンパク質中のヌクレアーゼドメインが不活性化されているＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−ＴＦである。結果生じるＣａｓ  ＲＮＡガイドＤＮＡ結合ドメインは転写抑制因子（例えばＫＯＸ、ＫＲＡＢ等）と融合して、変異体Ｈｔｔ対立遺伝子を抑制する。依然としてさらなる実施形態において、抑制因子は、変異体Ｈｔｔ対立遺伝子を切断してそれを不活性化することにより変異体Ｈｔｔ対立遺伝子を抑制するヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮおよび／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）を含んでもよい。ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼによる切断の後の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を介して、挿入および／または欠失（「インデル」）を導入する。他の実施形態において、ヌクレアーゼは、ドナー配列を導入し（相同または非相同組換え方法（ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｏｒ  ｎｏｎ−ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ）によって）、そこでドナーの組み込みが、変異体Ｈｔｔ対立遺伝子を不活性化する。
【００２０】
本明細書に記載される方法のいずれにおいても、抑制因子は、タンパク質、ポリヌクレオチド、またはタンパク質およびポリヌクレオチドの任意の組合せとして、ニューロン（例えば、ＨＤニューロン）に送達されてもよい。ある特定の実施形態において、抑制因子（複数可）は、発現構築物、例えばプラスミド、またはウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター、アデノウイルス（Ａｄ）ベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター等）を使用して送達される。他の実施形態において、抑制因子は、ｍＲＮＡとして送達される。他の実施形態において、抑制因子（複数可）は、本明細書に記載される発現構築物のいずれか、例えばある発現構築物上の１つの抑制因子（またはその部分）と別の発現構築物上の１つの抑制因子（またはその部分）との組合せを使用して送達される。
【００２１】
さらに、本明細書に記載される方法のいずれにおいても、抑制因子は、所望の作用を提供する任意の濃度（用量）で送達され得る。ある特定の実施形態において、抑制因子は、レンチウイルスベクターを使用して、２５０から１，０００の間（またはその間の任意の値）のＭＯＩで送達される。他の実施形態において、抑制因子は、プラスミドベクターを使用して、細胞１００，０００個当たり１５０〜１，５００ｎｇ（またはその間の任意の値）で送達される。依然としてさらなる実施形態において、抑制因子は、アデノ随伴ウイルスベクターを使用して、細胞１個当たり１０，０００〜５００，０００個のベクターゲノム（またはその間の任意の値）で送達される。他の実施形態において、抑制因子は、ｍＲＮＡとして、細胞１００，０００個当たり１５０〜１，５００ｎｇ（またはその間の任意の値）で送達される。
【００２２】
本明細書に記載される方法のいずれにおいても、本方法は、被験体の１つまたは複数のＨＤニューロンにおいて、約８５％またはそれよりも多く、約９０％またはそれよりも多く、約９２％またはそれよりも多く、または約９５％またはそれよりも多くの変異体Ｈｔｔ対立遺伝子の抑制をもたらすことができる。
【００２３】
さらなる態様において、本明細書に記載される発明は、１種または複数のＨｔｔ調節転写因子、例えば、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ  ＴＦ）、ＴＡＬＥ（ＴＡＬＥ−ＴＦ）、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−ＴＦの１種または複数を含むＨｔｔ調節転写因子、例えば、ＺＦＰ−ＴＦ、ＴＡＬＥ−ＴＦまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−ＴＦを含む。ある特定の実施形態において、Ｈｔｔ調節転写因子は、被験体の１つまたは複数のＨＤニューロンにおいて変異体Ｈｔｔ対立遺伝子の発現を抑制することができる。抑制は、被験体の１つまたは複数のＨＤニューロンにおける、被験体の未処置（野生型）ニューロンと比較した場合の、約８５％またはそれよりも多く、約９０％またはそれよりも多く、約９２％またはそれよりも多く、または約９５％またはそれよりも多くの変異体Ｈｔｔ対立遺伝子の抑制であり得る。ある特定の実施形態において、Ｈｔｔ調節転写因子は、本明細書に記載される方法の１つまたは複数を達成するのに使用することができる。
【００２４】
また、Ｈｔｔ調節因子（例えば、抑制因子）、ならびに／または本明細書に記載されるＨｔｔ調節因子の構成要素を含むおよび／もしくは本明細書に記載されるＨｔｔ調節因子（またはその構成要素）をコードするポリヌクレオチドの１つまたは複数を含むキットも提供される。キットは、細胞（例えば、ニューロン）、試薬（例えば、例えばＣＳＦ中のｍＨｔｔタンパク質を検出および／または定量するための）、および／または本明細書に記載される方法を含む使用のための指示をさらに含んでもよい。
【００２５】
これらのおよび他の態様は、本開示を全体として考慮すると、当業者に容易に明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、ＨＤニューロン（示された通り３つの左側のバー）および非ＨＤニューロン（示された通り３つの右側のバー）における、示された構築物を該ニューロンに投与した後の、相対的な細胞内のＡＴＰレベルを描写するグラフである。「３３０７４」は、転写抑制ドメイン（ＫＯＸ）に融合したＺＦＰ３３０７４（表１Ａ、変異体Ｈｔｔに特異的である）、加えてＧＦＰコード配列を含むＺＦＰ−ＴＦ抑制因子を指し、「ＧＦＰ」は、ＧＦＰのみをコードする（ＺＦＰ−ＴＦはコードしない）構築物を指し、「ｍｏｃｋ」は、コード配列を有さない構築物を指す。
【００２７】
【図２】図２は、ＴＵＮＥＬアッセイによって決定された、ＨＤニューロン（示された通り３つの左側のバー）および非ＨＤニューロン（示された通り３つの右側のバー）における、示された構築物を該ニューロンに投与した後（図１を参照）の、アポトーシス細胞の百分率を描写するグラフである。
【００２８】
【図３Ａ−Ｈ】図３Ａ〜３Ｋは、Ｈｔｔ変異体対立遺伝子のＺＦＰ−ＴＦ抑制因子で処置した後のＱ１７５マウスにおける変異体Ｈｔｔ凝集の防止を描写する。図３Ａ〜３Ｈは、ＺＦＰ−ＴＦ発現構築物で処置したマウスから得られた脳薄片の免疫組織化学的分析の代表的な画像を示す。図３Ａ〜３Ｄは、核のＤＮＡと、ＦＬＡＧエピトープタグ（これは、ＺＦＰ−ＴＦの存在を示す）のための抗体とを標識する４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色された画像を示す。ＺＦＰ−ＴＦは、それが投与される側（同側）にのみ存在する。図３Ｅ〜３Ｈは、変異体Ｈｔｔ凝集体に向けられた抗体（ｍＥＭ４８）で染色した後の代表的な画像を示す。注射を受けなかった反対側の線条体では、変異体Ｈｔｔ凝集がｍＥＭ４８抗体によって容易に検出されたが、それと比較して、注射を介してＺＦＰ−ＴＦ発現構築物を受けた同側の線条体では、非常に低いレベルの変異体Ｈｔｔ凝集が観察された。図３Ｉは、示された構築物を有する注射されていない反対側の線条体における細胞１個当たりの凝集体数に正規化した、同側の線条体における細胞１個当たりの核のＨｔｔ凝集体数（ＦＬＡＧ（＋）およびＧＦＰ（＋）細胞に関して定量した場合）を示すグラフである。図３Ｊは、反対側の線条体からのニューロンの強度に正規化した、示された構築物を受け入れている細胞におけるＨｔｔ凝集体に関する核のｍＥＭ４８染色の強度を示すグラフである。図３Ｋは、反対側の線条体のニューロンにおける密度に正規化した、ＺＦＰ−ＴＦ抑制因子またはＧＦＰを発現する細胞における核周囲の変異体Ｈｔｔ凝集体の密度を示すグラフである。図３Ｉ〜３Ｋにおいて、「ＧＦＰ」は、ＧＦＰをコードするが、ＺＦＰ−ＴＦ  Ｈｔｔ抑制因子をコードする構築物を指し、「３０６４０」および「３０６４５」は、注射された構築物で使用された具体的なＺＦＰ設計物を指す（表１）。クラスカル−ウォリス検定およびダンの多重比較（Ｄｕｎｎ’ｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）によって統計的分析を行った；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１；データは、平均値＋ＳＥＭを伴う棒グラフとして表示される。
【図３Ｉ−Ｋ】図３Ａ〜３Ｋは、Ｈｔｔ変異体対立遺伝子のＺＦＰ−ＴＦ抑制因子で処置した後のＱ１７５マウスにおける変異体Ｈｔｔ凝集の防止を描写する。図３Ａ〜３Ｈは、ＺＦＰ−ＴＦ発現構築物で処置したマウスから得られた脳薄片の免疫組織化学的分析の代表的な画像を示す。図３Ａ〜３Ｄは、核のＤＮＡと、ＦＬＡＧエピトープタグ（これは、ＺＦＰ−ＴＦの存在を示す）のための抗体とを標識する４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色された画像を示す。ＺＦＰ−ＴＦは、それが投与される側（同側）にのみ存在する。図３Ｅ〜３Ｈは、変異体Ｈｔｔ凝集体に向けられた抗体（ｍＥＭ４８）で染色した後の代表的な画像を示す。注射を受けなかった反対側の線条体では、変異体Ｈｔｔ凝集がｍＥＭ４８抗体によって容易に検出されたが、それと比較して、注射を介してＺＦＰ−ＴＦ発現構築物を受けた同側の線条体では、非常に低いレベルの変異体Ｈｔｔ凝集が観察された。図３Ｉは、示された構築物を有する注射されていない反対側の線条体における細胞１個当たりの凝集体数に正規化した、同側の線条体における細胞１個当たりの核のＨｔｔ凝集体数（ＦＬＡＧ（＋）およびＧＦＰ（＋）細胞に関して定量した場合）を示すグラフである。図３Ｊは、反対側の線条体からのニューロンの強度に正規化した、示された構築物を受け入れている細胞におけるＨｔｔ凝集体に関する核のｍＥＭ４８染色の強度を示すグラフである。図３Ｋは、反対側の線条体のニューロンにおける密度に正規化した、ＺＦＰ−ＴＦ抑制因子またはＧＦＰを発現する細胞における核周囲の変異体Ｈｔｔ凝集体の密度を示すグラフである。図３Ｉ〜３Ｋにおいて、「ＧＦＰ」は、ＧＦＰをコードするが、ＺＦＰ−ＴＦ  Ｈｔｔ抑制因子をコードする構築物を指し、「３０６４０」および「３０６４５」は、注射された構築物で使用された具体的なＺＦＰ設計物を指す（表１）。クラスカル−ウォリス検定およびダンの多重比較（Ｄｕｎｎ’ｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）によって統計的分析を行った；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１；データは、平均値＋ＳＥＭを伴う棒グラフとして表示される。
【００２９】
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｄは、Ｈｔｔ変異体対立遺伝子のＺＦＰ−ＴＦ抑制因子で処置した後のＱ１７５マウスにおける変異体Ｈｔｔ凝集の逆転を描写する。図４Ａは、反対側および同側の線条体においてＤＡＲＰＰ−３２（線条体特異的なタンパク質）および抗Ｈｔｔ凝集体抗体であるｍＥＭ４８で染色されたＺＦＰ−ＴＦおよび対照動物の脳切片の代表的な画像を示す。図４Ｂは、示された構築物を有する注射されていない反対側の線条体における細胞１個当たりの凝集体の数に正規化した、同側の線条体における細胞１個当たりの核のＨｔｔ凝集体数（ＦＬＡＧ（＋）およびＧＦＰ（＋）細胞に関して定量した場合）を示すグラフである。図４Ｃは、反対側の線条体からのニューロンの強度に正規化した、示された構築物を受け入れている細胞におけるＨｔｔ凝集体に関する核のｍＥＭ４８染色の強度を示すグラフである。図４Ｄは、反対側の線条体のニューロンにおける密度に正規化した、ＺＦＰ−ＴＦ抑制因子またはＧＦＰを発現する細胞における核周囲の変異体Ｈｔｔ凝集体の密度を示すグラフである。図４Ｂ〜４Ｄにおいて、「ＧＦＰ」は、ＧＦＰをコードするが、ＺＦＰ−ＴＦ  Ｈｔｔ抑制因子をコードする構築物を指し、「ＧＦＰ−２Ａ−３０６４０」および「ＧＦＰ−２Ａ−３０６４５」は、ＧＦＰおよび注射された構築物で使用された具体的なＺＦＰ設計物（表１）をコードする構築物を指す。クラスカル−ウォリス検定およびダンの多重比較によって統計的分析を行った；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１；データは、平均値＋ＳＥＭを伴う棒グラフとして表示される。
【図４Ｂ−Ｄ】図４Ａ〜４Ｄは、Ｈｔｔ変異体対立遺伝子のＺＦＰ−ＴＦ抑制因子で処置した後のＱ１７５マウスにおける変異体Ｈｔｔ凝集の逆転を描写する。図４Ａは、反対側および同側の線条体においてＤＡＲＰＰ−３２（線条体特異的なタンパク質）および抗Ｈｔｔ凝集体抗体であるｍＥＭ４８で染色されたＺＦＰ−ＴＦおよび対照動物の脳切片の代表的な画像を示す。図４Ｂは、示された構築物を有する注射されていない反対側の線条体における細胞１個当たりの凝集体の数に正規化した、同側の線条体における細胞１個当たりの核のＨｔｔ凝集体数（ＦＬＡＧ（＋）およびＧＦＰ（＋）細胞に関して定量した場合）を示すグラフである。図４Ｃは、反対側の線条体からのニューロンの強度に正規化した、示された構築物を受け入れている細胞におけるＨｔｔ凝集体に関する核のｍＥＭ４８染色の強度を示すグラフである。図４Ｄは、反対側の線条体のニューロンにおける密度に正規化した、ＺＦＰ−ＴＦ抑制因子またはＧＦＰを発現する細胞における核周囲の変異体Ｈｔｔ凝集体の密度を示すグラフである。図４Ｂ〜４Ｄにおいて、「ＧＦＰ」は、ＧＦＰをコードするが、ＺＦＰ−ＴＦ  Ｈｔｔ抑制因子をコードする構築物を指し、「ＧＦＰ−２Ａ−３０６４０」および「ＧＦＰ−２Ａ−３０６４５」は、ＧＦＰおよび注射された構築物で使用された具体的なＺＦＰ設計物（表１）をコードする構築物を指す。クラスカル−ウォリス検定およびダンの多重比較によって統計的分析を行った；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１；データは、平均値＋ＳＥＭを伴う棒グラフとして表示される。
【００３０】
【図５Ａ−Ｃ】図５Ａ〜５Ｃは、ＡＡＶ−ＺＦＰ−３３０７４を注射した後のＱ１７５マウスの線条体における変異体Ｈｔｔ凝集の防止を描写する。ＡＡＶベクターを２カ月の月齢で線条体に送達し、４カ月の月齢で分析を行った。図５Ａは、ＡＡＶを形質導入した（ＧＦＰで標識された）中型有棘ニューロン（ＭＳＮ、ＤＡＲＰＰ３２抗体で標識された）における核のＨｔｔ凝集体数を示すグラフである。図５Ｂは、ＡＡＶを形質導入したＭＳＮにおける核外の変異体Ｈｔｔ凝集体の密度を示すグラフである。図５Ｃは、ＡＡＶを形質導入したＭＳＮにおけるＨｔｔ凝集体を染色した核のｍＥＭ４８抗体の強度を示すグラフである。「対照ＡＡＶ」は、ＧＦＰを発現するＡＡＶベクターを指し、「ＺＦＰ３３０７４」は、自己切断２Ａペプチドで連結された、ＺＦＰ３３０７４とＧＦＰの両方を発現するＡＡＶベクターを指す。データは、平均値＋／−ＳＥＭを伴うドットプロットとして表示される。対照に対するダンの事後検定によるクラスカル−ウォリスの検定を使用して統計的分析を行った；＊＊＊＝ｐ＜０．００１。それぞれの群について、ｎ＝４匹の動物を動物１匹当たり６つの切片を用いて定量に使用した。
【００３１】
【図６Ａ−Ｃ】図６Ａ〜６Ｃは、ＡＡＶ−ＺＦＰ−３３０７４を注射した後のＱ１７５マウスの線条体における変異体Ｈｔｔ凝集の低減を描写する。ＡＡＶベクターを６カ月の月齢で線条体に送達し、１０カ月の月齢で分析を行った。図６Ａは、ＡＡＶを形質導入した（ＧＦＰで標識された）中型有棘ニューロン（ＭＳＮ、ＤＡＲＰＰ３２抗体で標識された）における核のＨｔｔ凝集体数を示すグラフである。図６Ｂは、ＡＡＶを形質導入したＭＳＮにおける核外の変異体Ｈｔｔ凝集体の密度を示すグラフである。図６Ｃは、ＡＡＶを形質導入したＭＳＮにおけるＨｔｔ凝集体を染色した核のｍＥＭ４８抗体の強度を示すグラフである。「対照ＡＡＶ」は、ＧＦＰを発現するＡＡＶベクターを指し、「ＺＦＰ３３０７４」は、自己切断２Ａペプチドで連結された、ＺＦＰ３３０７４とＧＦＰの両方を発現するＡＡＶベクターを指す。「ＺＦＰΔＤＢＤ」は、ジンクフィンガーのＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を欠失していることを除いて「ＺＦＰ３３０７４」に類似した対照ＡＡＶベクターを指す。データは、平均値＋／−ＳＥＭを伴うドットプロットとして表示される。対照に対するダンの事後検定によるクラスカル−ウォリスの検定を使用して統計的分析を行った；＊＊＊＝ｐ＜０．００１；ｎ．ｓ．＝有意ではない。それぞれの群で、ｎ＝４匹の動物を動物１匹当たり６つの切片で定量に使用した。
【００３２】
【図７Ａ−Ｂ】図７Ａおよび７Ｂは、ＡＡＶ−ＺＦＰ−３３０７４を注射した後のＱ１７５マウスの線条体における免疫染色によるＤＡＲＰＰ３２発現の増加を描写する。ＡＡＶベクターを６カ月の月齢で線条体に送達し、１０カ月の月齢で分析を行った。図７Ａは、ＤＡＲＰＰ３２発現が、１０月齢のＱ１７５マウスにおいて、同じ月齢の野生型マウスと比較して低減することを示す。図７Ｂは、ＺＦＰ３３０７４のためのＡＡＶベクターまたは対照ＡＡＶベクターで処置されたＱ１７５の線条体におけるＤＡＲＰＰ３２レベルを示す。「対照ＡＡＶ」は、ＧＦＰを発現するＡＡＶベクターを指し、「ＺＦＰ３３０７４」は、自己切断２Ａペプチドで連結された、ＺＦＰ３３０７４とＧＦＰの両方を発現するＡＡＶベクターを指す。「ＺＦＰΔＤＢＤ」は、ジンクフィンガーのＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を欠失していることを除いて「ＺＦＰ３３０７４」に類似した対照ＡＡＶベクターを指す。データは、平均値＋／−ＳＥＭを伴うドットプロットとして表示される。対照に対するダンの事後検定によるクラスカル−ウォリスの検定を使用して統計的分析を行った；＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＊＝ｐ＜０．００１；ｎ．ｓ．＝有意ではない。それぞれの群について、ｎ＝４匹の動物を動物１匹当たり６つの切片を用いて定量に使用した。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
詳細な説明
ハンチントン病（ＨＤ）を検出する、疾患進行を監視する、ハンチントン病を処置および／または予防するための組成物および方法が本明細書で開示される。特に、本明細書に記載される方法は、ＨＤを有する被験体における脳（例えば、ＨＤニューロン）を変更すること、それによってＨＤのための治療を提供することを可能にする。Ｈｔｔ調節転写因子、例えば、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ  ＴＦ）、ＴＡＬＥ（ＴＡＬＥ−ＴＦ）、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−ＴＦを含むＨｔｔ調節転写因子、例えば、変異体Ｈｔｔ対立遺伝子の発現を抑制するＺＦＰ−ＴＦ、ＴＡＬＥ−ＴＦまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−ＴＦを使用して、ＨＤ被験体におけるＨＤニューロンは、例えば、ＨＤニューロンにおけるＨｔｔの凝集を低減することによって、ＨＤニューロンのエネルギーを増加させることによって（例えば、ＡＴＰレベルを増加させることによって）、ＨＤニューロンにおけるアポトーシスを低減することによって、および／またはＨＤ被験体における運動障害を低減することによってＨＤの作用および／または症状が低減または排除されるように改変することができる。加えて、本明細書に記載される組成物および方法は、患者試料（例えば、ＣＳＦ）でのＨＤの検出を可能にする。患者試料でｍＨｔｔレベルを検出することは、ＨＤの診断；ｍＨｔｔレベルに基づく疾患進行の監視；加えてＨＤ治療の評価を可能にする。
【００３４】
概要
本明細書に開示される方法の実践ならびに組成物の調製および使用は、別途指定されない限り、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算化学、細胞培養、組換えＤＮＡ、ならびに当該分野の技術の範囲内である関連分野における従来の技術を用いる。これらの技術は、文献に完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９および第３版２００１、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７および定期改訂版、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹシリーズ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｗｏｌｆｆｅ，ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ  ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＦＵＮＣＴＩＯＮ，Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９８、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．３０４，“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ”（Ｐ．Ｍ．Ｗａｓｓａｒｍａｎ  ａｎｄ  Ａ．Ｐ．Ｗｏｌｆｆｅ，ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９９、ならびにＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１１９，“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”（Ｐ．Ｂ．Ｂｅｃｋｅｒ，ｅｄ．）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，１９９９を参照されたい。
【００３５】
定義
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、交換可能に使用され、線状または環状立体配座であり、かつ１本鎖または２本鎖形態のいずれかである、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド重合体を指す。本開示の目的のために、これらの用語は、重合体の長さに関して限定的であると解釈されるべきではない。この用語は、天然ヌクレオチドの既知の類似体、ならびに塩基部分、糖部分および／またはリン酸部分において修飾されるヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート骨格）を包含することができる。一般に、特定のヌクレオチドの類似体は、同じ塩基対形成特異性を有し、すなわち、Ａの類似体は、Ｔと塩基対形成する。
【００３６】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基の重合体を指すために交換可能に使用される。この用語はまた、１つ以上のアミノ酸が、対応する天然に存在するアミノ酸の化学的類似体または修飾誘導体である、アミノ酸重合体にも適用される。
【００３７】
「結合」は、高分子間（例えば、タンパク質と核酸との間）の配列特異的で非共有結合的な相互作用を指す。相互作用が全体として配列特異的である限り、結合相互作用の全ての構成要素が配列特異的である必要はない（例えば、ＤＮＡ骨格内のリン酸残基との接触）。かかる相互作用は、一般に、１０−６Ｍ−１以下の解離定数（Ｋｄ）によって特徴付けられる。「親和性」は、結合の強度を指し、すなわち、結合親和性の増加は、Ｋｄの低下と相関している。
【００３８】
「結合タンパク質」は、別の分子に非共有結合的に結合することができるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）、および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合することができる。タンパク質結合タンパク質の場合、それは、それ自体に結合する（そしてホモ二量体、ホモ三量体等を形成する）ことができ、かつ／または、それは、異なるタンパク質（単数または複数）の１つ以上の分子に結合することができる。結合タンパク質は、１つより多くの種類の結合活性を有することができる。例えば、ジンクフィ
ンガータンパク質は、ＤＮＡ結合活性、ＲＮＡ結合活性、およびタンパク質結合活性を有する。
【００３９】
「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、亜鉛イオンの配位によってその構造が安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である１つ以上のジンクフィンガーを通じて配列特異的な様態でＤＮＡに結合する、タンパク質またはより大きなタンパク質内のドメインである。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は、しばしば、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと省略される。
【００４０】
「ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１つ以上のＴＡＬＥ反復ドメイン／単位を含むポリペプチドである。反復ドメインは、ＴＡＬＥの、その同族の標的ＤＮＡ配列への結合に関与する。単一の「反復単位」（「反復」とも称される）は、典型的には３３〜３５アミノ酸長であり、天然型ＴＡＬＥタンパク質内の他のＴＡＬＥ反復配列との少なくともある程度の配列相同性を示す。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号を参照されたい。
【００４１】
「ＴｔＡｇｏ」は、遺伝子サイレンシングに関与すると考えられる原核アルゴノートタンパク質である。ＴｔＡｇｏは、細菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来である。例えば、Swartsら（２０１４年）Nature  ５０７巻（７４９１号）：２５８〜２６１頁、G.  Shengら、（２０１３年）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.  １１１巻、６５２頁）を参照されたい。「ＴｔＡｇｏ系」は全て必要な構成要素であり、例えばＴｔＡｇｏ酵素による切断のためのガイドＤＮＡを含む。「組換え」は、２つのポリヌクレオチド間で遺伝情報を交換するプロセスを指し、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および相同組換えによるドナー捕獲を含むが、これらに限定されない。本開示の目的のために、「相同組換え（ＨＲ）」は、例えば、相同性指向性の修復機構を介して細胞内の２本鎖切断の修復中に起こる、かかる交換の特殊な形態を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「標的」分子（すなわち、２本鎖切断を経験した分子）の鋳型修復のために「ドナー」分子を使用し、ドナーから標的への遺伝子情報の伝達をもたらすため、「非交差遺伝子変換」または「ショートトラクト遺伝子変換」として様々に知られている。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、かかる伝達は、切断された標的とドナーとの間に形成するヘテロ二重鎖ＤＮＡのミスマッチ修正、および／または、標的の一部になる遺伝子情報を再合成するためにドナーが使用される「合成依存鎖アニーリング」、および／または関連プロセスに関与し得る。かかる特殊なＨＲは、しばしば、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全てが標的ポリヌクレオチドに組み込まれるように、標的分子の配列の改変をもたらす。
【００４２】
ジンクフィンガー結合ドメインまたはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインは、例えば、天然型ジンクフィンガータンパク質の認識へリックス領域の操作（１つ以上のアミノ酸の改変）を介して、またはＴＡＬＥタンパク質のＲＶＤの操作によって、所定のヌクレオチド配列に結合するように「操作」（engineer）することができる。したがって、操作されたジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、非天然型であるタンパク質である。ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥを操作するための方法の非限定的な例は、設計および選択である。「設計」されたジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、その設計／組成が、主として合理的基準によってもたらされる、天然には生じないタンパク質である。設計のための合理的基準は、置換規則の適用、ならびに既存のＺＦＰ設計および結合データの情報を格納するデータベース内で情報を処理するためのコンピュータアルゴリズムの適用を含む。「選択された」ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、その産生が、主としてファージディスプレイ、相互作用トラップ、またはハイブリッド選択等の実験プロセスからもたらされる、天然には見出されないタンパク質である。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号；同第６，１４０，０８１号；同第６，４５３，２４２号；同第６，７４６，８３８号；同第７，２４１，５７３号；同第６，８６６，９９７号；同第７，２４１，５７４号および同第６，５３４，２６１号を参照されたい。また、ＷＯ０３／０１６４９６も参照されたい。
【００４３】
「配列」という用語は、任意の長さのヌクレオチド配列を指し、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、線状、環状、または分岐状であり得、１本鎖または２本鎖のいずれでもあり得る。「ドナー配列」という用語は、ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を指す。ドナー配列は、任意の長さ、例えば、２〜１０，０００ヌクレオチド長（またはその間もしくはそれ以上の任意の整数値）、好ましくは、約１００〜１，０００ヌクレオチド長（またはその間の任意の整数）、より好ましくは、約２００〜５００ヌクレオチド長であり得る。
【００４４】
「標的部位」または「標的配列」は、結合のための十分な条件が存在する場合に結合分子が結合する核酸の一部分を定義する核酸配列である。
【００４５】
「外因性」分子は、通常は細胞内に存在しないが、１つ以上の遺伝学的方法、生化学的方法、または他の方法によって細胞内に導入することができる分子である。「通常は細胞内に存在する」は、細胞の特定の発達段階および環境条件に対して決定される。したがって、例えば、筋肉の胚発生の間だけ存在する分子は、成体筋細胞に対する外因性分子である。同様に、熱ショックによって誘導される分子は、非熱ショック細胞に対する外因性分子である。外因性分子は、例えば、機能不全型内因性分子の機能型、または正常機能型内因性分子の機能不全型を含むことができる。
【００４６】
外因性分子は、とりわけ、小分子（コンビナトリアル化学プロセスによって生成されるもの等）、または高分子（タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上記分子の任意の修飾誘導体）、または上記分子のうちの１つ以上を含む任意の複合体等であってもよい。核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含み、１本鎖または２本鎖であり得、線状、分岐状、または環状であり得、任意の長さであり得る。核酸は、二重鎖を形成することができるもの、ならびに三重鎖形成核酸を含む。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および同第５，４２２，２５１号を参照されたい。タンパク質には、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチン再構成因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレース、およびヘリカーゼが含まれるが、これらに限定されない。
【００４７】
外因性分子は、内因性分子と同じ種類の分子、例えば、外因性タンパク質または核酸であり得る。例えば、外因性核酸は、感染ウイルスゲノム、細胞内に導入されたプラスミドもしくはエピソーム、または通常は細胞内に存在しない染色体を含むことができる。細胞内に外因性分子を導入するための方法は、当業者に既知であり、脂質介在性導入（すなわち、中性脂質および陽イオン性脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接注入、細胞融合、粒子衝突、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン介在性導入、およびウイルスベクター媒介性導入を含むが、これらに限定されない。外因性分子はまた、内因性分子と同じ種類の分子であり得るが、細胞が由来するものとは異なる種に由来し得る。例えば、ヒト核酸配列が、もともとマウスまたはハムスターに由来する細胞株に導入されてよい。
【００４８】
対照的に、「内因性」分子は、特定の環境条件下で特定の発達段階にある特定の細胞内に通常存在する分子である。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリア、クロロプラスト、もしくは他の細胞小器官のゲノム、または天然型エピソーム核酸を含むことができる。さらなる内因性分子には、タンパク質、例えば、転写因子および酵素が含まれ得る。
【００４９】
「融合」分子は、好ましくは共有結合的に、２つ以上のサブユニット分子が連結した分子である。サブユニット分子は、同じ化学型の分子であり得るか、または異なる化学型の分子であり得る。第１の型の融合分子の例としては、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインと１つ以上の活性化ドメインとの間の融合物）および融合核酸（例えば、上記の融合タンパク質をコードする核酸）が挙げられるが、これらに限定されない。第２の型の融合分子の例としては、三重鎖形成核酸とポリペプチドとの間の融合物、および副溝結合剤と核酸との間の融合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
細胞内の融合タンパク質の発現は、融合タンパク質の細胞への送達からもたらされ得るか、または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが細胞に送達され、そのポリヌクレオチドが転写され、その転写物が翻訳されて、融合タンパク質を生成することによってもたらされ得る。トランススプライシング、ポリペプチド切断、およびポリペプチド連結もまた、細胞内のタンパク質の発現に関与する可能性がある。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの細胞への送達方法は、本開示の他の箇所に提示される。
【００５１】
「多量体化ドメイン」（「二量体化ドメイン」または「タンパク質相互作用ドメイン」とも称される）は、ＺＦＰ  ＴＦまたはＴＡＬＥ  ＴＦのアミノ末端領域、カルボキシ末端領域、またはアミノおよびカルボキシ末端領域で組み込まれるドメインである。これらのドメインは、複数のＺＦＰ  ＴＦまたはＴＡＬＥ  ＴＦ単位の多量体化を可能にし、その結果、トリヌクレオチド反復ドメインのより大きなトラクトが、野生型の数の長さを有するより短いトラクトと比べて、多量体化ＺＦＰ  ＴＦまたはＴＡＬＥ  ＴＦによって優先的に結合されるようになる。多量体化ドメインの例としては、ロイシンジッパーが挙げられる。多量体化ドメインはまた、小分子によって制御されてもよく、その多量体化ドメインは、小分子または外部リガンドの存在下でのみ別の多量体化ドメインとの相互作用を可能にするために適正な立体配座をとる。このようにして、外因性リガンドを使用して、これらのドメインの活性を制御することができる。
【００５２】
本開示の目的のために、「遺伝子」は、遺伝子産物（下記を参照されたい）をコードするＤＮＡ領域、および遺伝子産物の産生を制御する全てのＤＮＡ領域（かかる制御配列がコード配列および／または転写される配列に隣接しているか否かに関わらず）を含む。したがって、遺伝子には、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳制御配列（リボソーム結合部位および内部リボソーム進入部位等）、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界要素、複製起点、マトリックス付着部位、および遺伝子座調節領域が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。
【００５３】
「遺伝子発現」は、遺伝子内に含まれる情報の遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡ、もしくは任意の他の種類のＲＮＡ）、またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質であり得る。遺伝子産物にはまた、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、および編集等のプロセスによって修飾されたＲＮＡ、ならびに、例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、ミリスチン化、およびグリコシル化によって修飾されたタンパク質も含まれる。
【００５４】
遺伝子発現の「調節」は、遺伝子の活性における変化を指す。発現の調節には、遺伝子の活性化および遺伝子の抑制が含まれ得るが、これらに限定されない。ゲノム編集（例えば、切断、改変、不活性化、ランダム変異）を使用して発現を調節することができる。遺伝子の不活性化は、本明細書に記載されるＺＦＰもＴＡＬＥタンパク質も含まない細胞と比較した、遺伝子発現におけるいずれの低減も指す。故に、遺伝子の不活性化は、部分的または完全であり得る。
【００５５】
「目的領域」は、細胞クロマチンの任意の領域であり、例えば、外因性分子に結合することが望ましい、遺伝子、または遺伝子内のもしくは遺伝子に隣接する非コード配列等である。結合は、標的ＤＮＡ切断および／または標的組換えの目的のためであり得る。目的領域は、例えば、染色体、エピソーム、細胞小器官のゲノム（例えば、ミトコンドリア、クロロプラスト）、または感染ウイルスゲノム内に存在し得る。目的領域は、遺伝子のコード領域内、転写される非コード領域（例えば、リーダー配列、トレーラー配列、もしくはイントロン等）内、またはコード領域の上流もしくは下流のいずれかの非転写領域内にあり得る。目的領域は、単一のヌクレオチド対ほど小さいか、または最大２，０００ヌクレオチド対長であるか、またはヌクレオチド対の任意の整数値であり得る。
【００５６】
「真核」細胞には、真菌細胞（酵母等）、植物細胞、動物細胞、哺乳類細胞、およびヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）が含まれるが、これらに限定されない。
【００５７】
「作動的な連結」および「作動的に連結された」（または「作動可能に連結された」）という用語は、両方の構成要素が正常に機能し、構成要素のうちの少なくとも１つが、他の構成要素のうちの少なくとも１つに対して発揮される機能を媒介できる可能性を許容するように構成要素が配置された、２つ以上の構成要素（配列要素等）の並置を指して交換可能に使用される。例示説明として、転写制御配列が、１つ以上の転写制御因子の有無に応じてコード配列の転写レベルを調節する場合、プロモーター等の転写制御配列がコード配列に作動的に連結される。転写制御配列は、一般に、コード配列と共にシスに作動的に連結されるが、それに直接隣接する必要はない。例えば、エンハンサーは、たとえそれらが近接していない場合でも、コード配列に作動的に連結された転写制御配列である。
【００５８】
融合ポリペプチドに関して、「作動的に連結された」という用語は、構成要素の各々が、そのように連結されていない場合に実行したであろう機能と同じ機能を、他の構成要素との連結において実行するという事実を指すことができる。例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインが活性化ドメインに融合された融合ポリペプチドに関して、融合ポリペプチドにおいて、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン部分が、その標的部位および／またはその結合部位に結合することができる一方で、活性化ドメインが遺伝子発現を上方制御することが可能である場合、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインとは作動的に連結している。遺伝子発現を制御することが可能なドメインに融合されたＺＦＰは、集合的に「ＺＦＰ−ＴＦ」または「ジンクフィンガー転写因子」と称される一方で、遺伝子発現を制御することが可能なドメインに融合されたＴＡＬＥは、集合的に「ＴＡＬＥ−ＴＦ」または「ＴＡＬＥ転写因子」と称される。ＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインが切断ドメインに融合された融合ポリペプチド（「ＺＦＮ」または「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」）の場合、融合ポリペプチドにおいて、ＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメイン部分が、その標的部位および／またはその結合部位に結合可能である一方で、切断ドメインが、標的部位の近傍でＤＮＡを切断可能である場合、ＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインとは作動的に連結している。ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインが切断ドメインに融合された融合ポリペプチド（「ＴＡＬＥＮ」または「ＴＡＬＥヌクレアーゼ」）の場合、融合ポリペプチドにおいて、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン部分が、その標的部位および／またはその結合部位に結合可能である一方で、切断ドメインが、標的部位の近傍でＤＮＡを切断可能である場合、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインとは作動的に連結している。Ｃａｓ  ＤＮＡ結合ドメインが活性化ドメインに融合されている融合ポリペプチドに関して、融合ポリペプチドにおいて、Ｃａｓ  ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位と結合することができる一方で、活性化ドメインが遺伝子発現を上方制御することが可能である場合、Ｃａｓ  ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインは作動的に連結している。Ｃａｓ  ＤＮＡ結合ドメインが切断ドメインに融合されている融合ポリペプチドに関して、融合ポリペプチドにおいて、Ｃａｓ  ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位と結合することができる一方で、切断ドメインが標的部位の近くでＤＮＡを切断することが可能である場合、Ｃａｓ  ＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメインは作動的に連結している。
【００５９】
タンパク質、ポリペプチド、または核酸の「機能的断片」は、その配列が、完全長のタンパク質、ポリペプチド、または核酸と同一ではないが、完全長のタンパク質、ポリペプチド、または核酸と同じ機能を保持するタンパク質、ポリペプチド、または核酸である。機能的断片は、対応する天然の分子よりも多いか、少ないか、もしくは同じ数の残基を有することができ、かつ／または、１つ以上のアミノ酸もしくはヌクレオチド置換を含有することができる。核酸の機能（例えば、コード機能、別の核酸にハイブリダイズする能力）を決定するための方法は、当該技術分野において周知である。同様に、タンパク質の機能を決定するための方法も周知である。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能は、例えば、フィルター結合アッセイ、電気泳動移動度シフトアッセイ、または免疫沈降アッセイによって決定することができる。ＤＮＡ切断は、ゲル電気泳動によって評価することができる。上記のＡｕｓｕｂｅｌらを参照されたい。タンパク質が別のタンパク質と相互作用する能力は、例えば、免疫共沈降、ツーハイブリッドアッセイ、または相補性（遺伝子的相補性もしくは生化学的相補性の両方）によって決定することができる。例えば、Ｆｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：２４５−２４６、米国特許第５，５８５，２４５号、およびＰＣＴ国際公開第ＷＯ９８／４４３５０号を参照されたい。
【００６０】
「ベクター」は、遺伝子配列を標的細胞に導入することが可能である。典型的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、および「遺伝子導入ベクター」は、目的遺伝子の発現を誘導することが可能であり、かつ、遺伝子配列を標的細胞に導入することができる、任意の核酸構築物を意味する。故に、この用語は、クローニング、および発現ビヒクル、ならびに組み込みベクターを包含する。
【００６１】
「レポーター遺伝子」または「レポーター配列」は、必ずしも必要でないが好ましくは通例のアッセイにおいて、容易に測定される、タンパク質産物を産生する任意の配列を指す。好適なレポーター遺伝子には、抗体の耐性（例えばアンピシリン耐性、ネオマイシン耐性、Ｇ４１８耐性、ピューロマイシン耐性）を媒介するタンパク質をコードする配列、着色したタンパク質または蛍光タンパク質または発光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、高感度緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ）をコードする配列、ならびに向上した細胞成長および／または遺伝子増幅を媒介するタンパク質（例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ）が含まれるが、これらに限定されない。エピトープタグには、例えば、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｔａｐ、ＨＡ、または任意の検出可能なアミノ酸配列の１つ以上のコピーが含まれる。「発現タグ」には、目的遺伝子の発現を監視するために所望の遺伝子配列に作動可能に連結され得るレポーターをコードする配列が含まれる。
【００６２】
ＤＮＡ結合ドメイン
本明細書に記載される方法は、組成物、例えば、Ｈｔｔ遺伝子中の標的配列に特異的に結合する、特に複数のトリヌクレオチド反復を含む変異体Ｈｔｔ対立遺伝子に結合するＤＮＡ結合ドメインを含むＨｔｔ調節転写因子を利用する。任意のＤＮＡ結合ドメインが、本明細書で開示された組成物および方法で使用することができる。
【００６３】
ある特定の実施形態において、Ｈｔｔ調節転写因子、またはその中のＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガータンパク質を含む。標的部位の選択、ＺＦＰ、ならびに融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のための方法は、当業者に知られており、米国特許第６，１４０，０８１号、同第５，７８９，５３８号、同第６，４５３，２４２号、同第６，５３４，２６１号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，２００，７５９号、国際公開第ＷＯ９５／１９４３１号、同第ＷＯ９６／０６１６６号、同第ＷＯ９８／５３０５７号、同第ＷＯ９８／５４３１１号、同第ＷＯ００／２７８７８号、同第ＷＯ０１／６０９７０号、同第ＷＯ０１／８８１９７号、同第ＷＯ０２／０９９０８４号、同第ＷＯ９８／５３０５８号、同第ＷＯ９８／５３０５９号、同第ＷＯ９８／５３０６０号、同第ＷＯ０２／０１６５３６号、および同第ＷＯ０３／０１６４９６号に詳述される。
【００６４】
ある特定の実施形態において、ＺＦＰは、変異体Ｈｔｔ対立遺伝子または野生型Ｈｔｔ配列のいずれかに選択的に結合することができる。Ｈｔｔ標的部位は、典型的に、少なくとも１つのジンクフィンガーを含むが、複数のジンクフィンガー（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれよりも多いフィンガー）を含む可能性がある。通常、ＺＦＰは、少なくとも３つのフィンガーを含む。ＺＦＰのある特定のものは、４、５、または６個のフィンガーを含む一方で、いくつかのＺＦＰは、８、９、１０、１１、または１２個のフィンガーを含む。３つのフィンガーを含むＺＦＰは、典型的に、９または１０ヌクレオチドを含む標的部位を認識し、４つのフィンガーを含むＺＦＰは、典型的に、１２〜１４ヌクレオチドを含む標的部位を認識する一方で、６つのフィンガーを含むＺＦＰは、１８〜２１ヌクレオチドを含む標的部位を認識し得る。ＺＦＰはまた、１つ以上の制御ドメインを含む融合タンパク質であり得、そのドメインは、転写活性化または抑制ドメインであり得る。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、一緒に連結された２つのＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインを含む。これらのジンクフィンガータンパク質はゆえに、８、９、１０、１１、１２個、またはそれよりも多いフィンガーを含むことができる。いくつかの実施形態において、２つのＤＮＡ結合ドメインは、１つのＤＮＡ結合ドメインが４つ、５つ、または６つのジンクフィンガーを含み、第２のＤＮＡ結合ドメインがさらなる４つ、５つ、または５つのジンクフィンガーを含むように、伸長可能な柔軟なリンカーを介して連結される。いくつかの実施形態において、リンカーは、フィンガーアレイが、８、９、１０、１１、もしくは１２個、またはそれよりも多いフィンガーを含む１つのＤＮＡ結合ドメインを含むような、標準的なフィンガー間リンカーである。他の実施形態において、リンカーは、柔軟なリンカー等の不定型のリンカーである。ＤＮＡ結合ドメインは、少なくとも１つの制御ドメインに融合され、「ＺＦＰ−ＺＦＰ−ＴＦ」構造と考えることができる。これらの実施形態の具体的な例は、柔軟なリンカーで連結され、ＫＯＸ抑制因子に融合された２つのＤＮＡ結合ドメインを含む「ＺＦＰ−ＺＦＰ−ＫＯＸ」、および２つのＺＦＰ−ＫＯＸ融合タンパク質がリンカーを介して一緒に融合された「ＺＦＰ−ＫＯＸ−ＺＦＰ−ＫＯＸ」と称され得る。
【００６５】
代替的に、ＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼに由来してもよい。例えば、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、およびＩ−ＴｅｖＩＩＩ等のホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼの認識配列が知られている。また、米国特許第５，４２０，０３２号、米国特許第６，８３３，２５２号、Ｂｅｌｆｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３７９−３３８８、Ｄｕｊｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｇｅｎｅ  ８２：１１５−１１８、Ｐｅｒｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２，１１２５−１１２７、Ｊａｓｉｎ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１２：２２４−２２８、Ｇｉｍｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：１６３−１８０、Ａｒｇａｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８０：３４５−３５３、およびＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ｃａｔａｌｏｇｕｅを参照されたい。加えて、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性は、非天然の標的部位に結合するように操作することができる。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ  １０：８９５−９０５、Ｅｐｉｎａｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：２９５２−２９６２、Ａｓｈｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  ４４１：６５６−６５９、Ｐａｑｕｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：４９−６６、米国特許公開第２００７０１１７１２８号を参照されたい。
【００６６】
「２本の手を持つ」ジンクフィンガータンパク質は、２つのジンクフィンガードメインが２つの不連続の標的部位に結合するように、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインの２つのクラスタが介在するアミノ酸によって分離される、タンパク質である。２本の手を持つ種類のジンクフィンガー結合タンパク質の例は、４つのジンクフィンガーのクラスタが、タンパク質のアミノ末端に位置し、３つのフィンガーのクラスタが、カルボキシル末端に位置する、ＳＩＰ１である（Ｒｅｍａｃｌｅ  ｅｔ  ａｌ，（１９９９）ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １８（１８）：５０７３−５０８４を参照されたい）。これらのタンパク質におけるジンクフィンガーの各クラスタは、固有の標的配列に結合可能であり、２つの標的配列の間の間隔は、多くのヌクレオチドを含むことができる。２本の手を持つＺＦＰは、例えば、ＺＦＰの一方または両方に融合された、機能的ドメインを含んでもよい。故に、機能的ドメインは、ＺＦＰの一方もしくは両方の外部に結合されてもよく（図１Ｃを参照されたい）、またはそれらのＺＦＰの間に位置付けられ（両方のＺＦＰに結合され）てもよい（図４を参照されたい）ことが明らかとなろう。
【００６７】
Ｈｔｔ標的化ＺＦＰの具体的な例は、参照によりその全体が任意の目的で本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０１３０２５３０４０号、加えて以下の表１に開示される。この表の第１列は、ＺＦＰの内部基準の名称（番号）であり、表２の列１における同じ名称に対応する。「Ｆ」は、フィンガーを指し、「Ｆ」の後に続く番号は、どのジンクフィンガーかを指す（例えば、「Ｆ１」はフィンガー１を指す）。
【表１−１】
2017515819.tif 000003
【表１−２】
2017515819.tif 000004
【表１−３】
2017515819.tif 000005
【表１−４】
2017515819.tif 000006
【００６８】
これらのタンパク質の標的部位についての配列および箇所は、表２に開示される。ＺＦＰ認識ヘリックスが接触している標的部位におけるヌクレオチドは、大文字で示され、接触していないヌクレオチドは、小文字で示される。
【表２−１】
2017515819.tif 000007
【表２−２】
2017515819.tif 000008
【００６９】
ある特定の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、天然型または操作された（非天然型）ＴＡＬエフェクター（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメインを含む。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号を参照されたく、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００７０】
キサントモナス属の植物病原性細菌は、重要な作物に多くの病害を引き起こすことが知られている。キサントモナスの病原性は、植物細胞内に２５を超える異なるエフェクタータンパク質を注入する保存された３型分泌（Ｔ３Ｓ）系に依存する。これらの注入されるタンパク質の中には、植物の転写活性化因子を模倣し、植物のトランスクリプトームを操作する転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）がある（Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８：６４８−６５１を参照されたい）。これらのタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含有する。最もよく特徴付けされたＴＡＬＥの１つは、キサントモナス・カンペストリス病原型ベシカトリアに由来するＡｖｒＢｓ３である（Ｂｏｎａｓ  ｅｔ  ａｌ（１９８９）Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２１８：１２７−１３６および国際公開第ＷＯ２０１００７９４３０号を参照されたい）。ＴＡＬＥは、縦列反復の集中ドメインを含有し、各反復が、これらのタンパク質のＤＮＡ結合特異性の要である約３４個のアミノ酸を含有する。加えて、これらは、核局在化配列および酸性転写活性化ドメインを含有する（概説についてはＳｃｈｏｒｎａｃｋ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｊ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １６３（３）：２５６−２７２を参照されたい）。加えて、植物病原性細菌である青枯病菌において、ｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７と表記される２つの遺伝子が、青枯病菌の次亜種１系統ＧＭＩ１０００および次亜種４系統ＲＳ１０００において、キサントモナスのＡｖｒＢｓ３ファミリーと相同であることが見出されている（Ｈｅｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２００７）Ａｐｐｌ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒ  Ｍｉｃｒｏ  ７３（１３）：４３７９−４３８４を参照されたい）。これらの遺伝子は、ヌクレオチド配列において互いに９８．９％同一であるが、ｈｐｘ１７の反復ドメインにおいて１，５７５ｂｐの欠失分だけ異なる。しかしながら、両方の遺伝子産物が、キサントモナスのＡｖｒＢｓ３ファミリータンパク質と４０％未満の配列同一性を有する。
【００７１】
これらのＴＡＬＥの特異性は、縦列反復に見出される配列に依存する。反復した配列は、およそ１０２ｂｐを含み、反復は、典型的に互いに９１〜１００％相同である（Ｂｏｎａｓ  ｅｔ  ａｌ，（同書））。反復の多型性は、通常、１２および１３位に位置し、１２および１３位の超可変二残基（ｄｉｒｅｓｉｄｕｅｓ）の正体と、ＴＡＬＥの標的配列における連続したヌクレオチドの正体との間に１対１の対応関係が存在するようである（Ｍｏｓｃｏｕ  ａｎｄ  Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ，（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６：１５０１およびＢｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６：１５０９−１５１２を参照されたい）。実験的に、１２および１３位のＨＤ配列がシトシン（Ｃ）への結合をもたらし、ＮＧがＴに、ＮＩがＡ、Ｃ、ＧまたはＴに結合し、ＮＮがＡまたはＧに結合し、ＮＧがＴに結合するように、これらのＴＡＬＥのＤＮＡ認識のためのコードが決定されている。これらのＤＮＡ結合反復を、新たな反復の組み合わせおよび数を用いてタンパク質へと組み立てて、新たな配列と相互作用することが可能である人工転写因子を作製した）。加えて、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，５８６，５２６号および米国特許公開第２０１３０１９６３７３号は、Ｎ−ｃａｐポリペプチド、Ｃ−ｃａｐポリペプチド（例えば、＋６３、＋２３１または＋２７８）および／または新規の（非定型）ＲＶＤを含むＴＡＬＥを記載している。
【００７２】
例示的なＴＡＬＥは、その全体が参照により組み込まれる米国特許公開第２０１３０２５３０４０号、および以下の表３に記載されている。
【００７３】
以下の表３に、試験されたＴＡＬＥ  ＴＦの標的および数字の識別子を示す。数値識別子は、「ＳＢＳ番号」とラベルされ、センス（Ｓｅｎｓｅ）またはアンチセンス（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）鎖に対する特異性は、（「Ｓ／Ａ」）と示され、標的、反復単位またはＲＶＤの数、およびＣ末端の種類も同様に示される。
【表３】
2017515819.tif 000009
【００７４】
ある特定の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、二量体化および／または多量体化ドメイン、例えばコイルドコイル（ＣＣ）および二量体化ジンクフィンガー（ＤＺ）を含む。米国特許公開第２０１３０２５３０４０号を参照されたい。
【００７５】
近年、真核ＲＮＡｉ経路と類似すると仮定されてきた古細菌および多くの細菌におけるＲＮＡ媒介性ゲノム防御経路の存在に関して、注目すべき証拠が出現してきた（概説に関しては、GoddeおよびBickerton、２００６年.  J.  Mol.  Evol.  ６２巻：７１８〜７２９頁；Lillestolら、２００６年.  Archaea  ２巻：５９〜７２頁；Makarovaら、２００６年.  Biol.  Direct  １巻：７号；Sorekら、２００８年.  Nat.  Rev.  Microbiol.  ６巻：１８１〜１８６頁を参照されたい）。このような経路は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系または原核ＲＮＡｉ（ｐＲＮＡｉ）として公知であり、２つの進化的に、しばしば物理的に関連する遺伝子座、すなわち系のＲＮＡ構成要素をコードするＣＲＩＳＰＲ（規則的な間隔でクラスター化された短鎖反復回文配列）遺伝子座、およびタンパク質をコードするｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子座から生じると提唱されている（Jansenら、２００２年.  Mol.  Microbiol.  ４３巻：１５６５〜１５７５頁；Makarovaら、２００２年.  Nucleic  Acids  Res.  ３０巻：４８２〜４９６頁；Makarovaら、２００６年.  Biol.  Direct  １巻：７号；Haftら、２００５年.  PLoS  Comput.  Biol.  １巻：e６０）。微生物宿主におけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子、加えてＣＲＩＳＰＲ媒介性核酸切断の特異性をプログラミングすることが可能な非コードＲＮＡエレメントの組合せを含有する。個々のＣａｓタンパク質は、真核ＲＮＡｉ機構のタンパク質構成要素と有意な配列類似性を有していないが、類似した予測機能（例えば、ＲＮＡ結合、ヌクレアーゼ、ヘリカーゼ等）を有する（Makarovaら、２００６年.  Biol.  Direct  １巻：７号）。ＣＲＩＳＰＲ関連（ｃａｓ）遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲ反復−スペーサーのアレイに結合されていることが多い。４０種より多くの様々なＣａｓタンパク質ファミリーが記載されている。これらのタンパク質ファミリーのなかでも、Ｃａｓ１は、様々なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の間で偏在的なようである。ｃａｓ遺伝子および反復構造の特定の組合せを使用して、８種のＣＲＩＳＰＲサブタイプ（Ｅｃｏｌｉ、Ｙｐｅｓｔ、Ｎｍｅｎｉ、Ｄｖｕｌｇ、Ｔｎｅａｐ、Ｈｍａｒｉ、Ａｐｅｒｎ、およびＭｔｕｂｅ）が定義されているが、これらのうちいくつかは、反復関連ミステリアスタンパク質（ＲＡＭＰ：ｒｅｐｅａｔ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｙｓｔｅｒｉｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードする追加の遺伝子モジュールと結合している。単一のゲノム中に、１つより多くのＣＲＩＳＰＲサブタイプが生じる可能性がある。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓサブタイプの散発的な分布から、系が、微生物の進化中に遺伝子水平伝播を受けていることが示唆される。
【００７６】
タイプＩＩのＣＲＩＳＰＲは、最初にＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓで記載され、最もよく特徴付けられた系の１つであり、４つの逐次ステップで標的化されたＤＮＡ二本鎖切断を行う。第１に、２つの非コードＲＮＡ、プレ−ｃｒＲＮＡアレイおよびｔｒａｃｒＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡが、プレ−ｃｒＲＮＡの反復領域にハイブリダイズし、個々のスペーサー配列を含有する成熟ｃｒＲＮＡへのプレ−ｃｒＲＮＡのプロセシングを媒介し、そのスペーサー配列でＣａｓ９タンパク質の存在下で二本鎖特異的なＲＮアーゼＩＩＩによるプロセシングが起こる。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体は、標的認識の追加の必要条件である、ｃｒＲＮＡにおけるスペーサーとプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣にある標的ＤＮＡにおけるプロトスペーサーとの間でワトソン−クリック塩基対を形成することによって、Ｃａｓ９を標的ＤＮＡに向かわせる。加えて、ｔｒａｃｒＲＮＡがその３’末端でｃｒＲＮＡと塩基対形成して、この結合がＣａｓ９活性を開始させることから、ｔｒａｃｒＲＮＡも存在していなければならない。最終的に、Ｃａｓ９は標的ＤＮＡの切断を媒介して、プロトスペーサー内で二本鎖切断を発生させる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の活性は、３つのステップ、すなわち（ｉ）外来のＤＮＡ配列をＣＲＩＳＰＲアレイに挿入して、「適合」と呼ばれるプロセスにおける将来的な攻撃を防止すること、（ｉｉ）関連タンパク質の発現、加えてアレイの発現およびプロセシング、続いて（ｉｉｉ）外来の核酸でのＲＮＡ媒介干渉で構成される。したがって、細菌細胞において、いわゆる「Ｃａｓ」タンパク質のいくつかは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の天然の機能と関連する。
【００７７】
多くの様々な細菌で、タイプＩＩのＣＲＩＳＰＲ系が見出されている。Fonfaraらによる公的に利用可能なゲノムにおけるＢＬＡＳＴ検索（（２０１３年）Nuc  Acid  Res  ４２巻（４号）：２３７７〜２５９０頁）は、３４７の細菌種でＣａｓ９オーソログを見出した。加えてこのグループは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ、Ｓ．ｔｈｅｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａおよびＦ．ｎｏｖｉｃｉｄａ由来のＣａｓ９オーソログを使用した、インビトロでのＤＮＡ標的のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ切断を実証した。したがって、用語「Ｃａｓ９」は、ＤＮＡ結合ドメインと２つのヌクレアーゼドメインとを含むＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼを指し、ここでＣａｓ９をコードする遺伝子は、任意の好適な細菌に由来していてもよい。
【００７８】
Ｃａｓ９タンパク質は、少なくとも２つのヌクレアーゼドメインを有し、一方のヌクレアーゼドメインはＨＮＨエンドヌクレアーゼに類似しており、他方はＲｕｖエンドヌクレアーゼドメインに似ている。ＨＮＨタイプのドメインは、ｃｒＲＮＡに相補的なＤＮＡ鎖の切断に関与するようであり、一方でＲｕｖドメインは、非相補鎖を切断する。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼドメインの一方のみが機能的であり、Ｃａｓニッカーゼが生じるように操作されてもよい（Jinekら（同書）を参照されたい）。ニッカーゼは、酵素の触媒ドメインにおけるアミノ酸の特異的な変異によって、またはドメインがもはや機能的でなくなるようなドメインの一部または全部の切断によって生成され得る。Ｃａｓ９は２つのヌクレアーゼドメインを含むため、このアプローチは、どちらのドメインでも起こり得る。二本鎖切断は、標的ＤＮＡにおいて、２つのこのようなＣａｓ９ニッカーゼの使用により達成することができる。ニッカーゼはそれぞれ、ＤＮＡの一方の鎖を切断し、２つの使用は、二本鎖切断を引き起こす。
【００７９】
ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体の必要性は、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとのアニーリングによって正常に形成されたヘアピンを含む操作された「シングルガイドＲＮＡ」（ｓｇＲＮＡ）の使用によって回避することができる（Jinekら（２０１２年）Science  ３３７巻：８１６頁およびCongら（２０１３年）Sciencexpress／１０．１１２６／science．１２３１１４３を参照されたい）。Ｓ．ｐｙｒｏｇｅｎｅｓにおいて、操作されたｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ融合物、またはｓｇＲＮＡは、Ｃａｓが結合したＲＮＡと標的ＤＮＡとの間に二本鎖ＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二量体が形成されたときに標的ＤＮＡを切断するようにＣａｓ９をガイドする。Ｃａｓ９タンパク質およびＰＡＭ配列を含有する操作されたｓｇＲＮＡを含むこの系は、ＲＮＡガイドゲノム編集に使用されており（Ramalingam（同書）を参照されたい）、インビボにおけるゼブラフィッシュ胚のゲノム編集（Hwangら（２０１３年）Nature  Biotechnology  ３１巻（３号）：２２７頁を参照されたい）に有用であり、編集効率はＺＦＮおよびＴＡＬＥＮに類似していた。
【００８０】
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の一次生成物は、インベーダー標的配列を含有する短いＲＮＡであるようであり、経路におけるそれらの仮定の役割に基づいてガイドＲＮＡまたは原核生物サイレンシングＲＮＡ（ｐｓｉＲＮＡ）と称される（Makarovaら、２００６年.  Biol.  Direct  １巻：７号；Haleら、２００８年.  RNA、１４巻：２５７２〜２５７９頁）。ＲＮＡ分析から、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の転写物は反復配列内で切断されて、個々のインベーダー標的配列と隣接する反復断片とを含有する約６０から７０ｎｔのＲＮＡ中間体を放出することが示される（Tangら、２００２年.  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  ９９巻：７５３６〜７５４１頁；Tangら、２００５年.  Mol.  Microbiol.  ５５巻：４６９〜４８１頁；Lillestolら２００６年.  Archaea  ２巻：５９〜７２頁；Brounsら、２００８年.  Science  ３２１巻：９６０〜９６４頁；Haleら、２００８年.RNA、１４巻：２５７２〜２５７９頁）。古細菌のＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓにおいて、これらの中間体ＲＮＡはさらに、豊富で安定な約３５から４５ｎｔの成熟ｐｓｉＲＮＡにプロセシングされる（Haleら、２００８年.  RNA、１４巻：２５７２〜２５７９頁）。
【００８１】
ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体の必要性は、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとのアニーリングによって正常に形成されたヘアピンを含む操作された「シングルガイドＲＮＡ」（ｓｇＲＮＡ）の使用によって回避することができる（Jinekら（２０１２年）Science  ３３７巻：８１６頁およびCongら（２０１３年）Sciencexpress／１０．１１２６／science．１２３１１４３を参照されたい）。Ｓ．ｐｙｒｏｇｅｎｅｓにおいて、操作されたｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ融合物、またはｓｇＲＮＡは、Ｃａｓが結合したＲＮＡと標的ＤＮＡとの間に二本鎖ＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二量体が形成されたときに標的ＤＮＡを切断するようにＣａｓ９をガイドする。Ｃａｓ９タンパク質およびＰＡＭ配列を含有する操作されたｓｇＲＮＡを含むこの系は、ＲＮＡガイドゲノム編集に使用されており（Ramalingam（同書）を参照されたい）、インビボにおけるゼブラフィッシュ胚のゲノム編集（Hwangら（２０１３年）Nature  Biotechnology  ３１巻（３号）：２２７頁を参照されたい）に有用であり、編集効率はＺＦＮおよびＴＡＬＥＮに類似していた。
【００８２】
キメラまたはｓｇＲＮＡは、任意の所望の標的に相補的な配列を含むように操作されてもよい。一部の実施形態において、ガイド配列は、約５またはそれ超、約１０またはそれ超、約１１またはそれ超、約１２またはそれ超、約１３またはそれ超、約１４またはそれ超、約１５またはそれ超、約１６またはそれ超、約１７またはそれ超、約１８またはそれ超、約１９またはそれ超、約２０またはそれ超、約２１またはそれ超、約２２またはそれ超、約２３またはそれ超、約２４またはそれ超、約２５またはそれ超、約２６またはそれ超、約２７またはそれ超、約２８またはそれ超、約２９またはそれ超、約３０またはそれ超、約３５またはそれ超、約４０またはそれ超、約４５またはそれ超、約５０またはそれ超、約７５またはそれ超、またはそれよりも多くのヌクレオチド長である。一部の実施形態において、ガイド配列は、約７５未満、約５０未満、約４５未満、約４０未満、約３５未満、約３０未満、約２５未満、約２０未満、約１５未満、約１２未満、またはそれより少ないヌクレオチド長である。一部の実施形態において、ＲＮＡは、標的への相補性とＧ［ｎ１９］型を有する２２塩基、続いてＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系と共に使用するためのＮＧＧまたはＮＡＧ型のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む。したがって、１つの方法において、目的の遺伝子中の公知のＺＦＮ標的の利用によって、（ｉ）ＺＦＮヘテロ二量体の認識配列を、関連ゲノム（ヒト、マウス、または特定の植物種由来）の参照配列とアラインすること；（ｉｉ）ＺＦＮの半分の部位の間のスペーサー領域を同定すること；（ｉｉｉ）スペーサー領域に最も近いモチーフＧ［Ｎ２０］ＧＧの配置を同定すること（１個より多くのこのようなモチーフがスペーサーとオーバーラップするとき、スペーサーに対して中心側のモチーフが選択される）；（ｉｖ）ｓｇＲＮＡのコアとしてそのモチーフを使用することによって、ｓｇＲＮＡを設計することができる。この方法は、証明されたヌクレアーゼ標的に頼ることが有利である。代替的に、ｓｇＲＮＡは、単に好適な標的配列がＧ［ｎ２０］ＧＧ式に従っていることを同定することによって、任意の関心領域を標的化するように設計することができる。相補性領域と共に、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ部分のテール領域まで伸長する追加のヌクレオチドを含んでもよい（Hsuら（２０１３年）Nature  Biotech  doi：１０．１０３８／ｎｂｔ．２６４７を参照されたい）。テールは、＋６７から＋８５ヌクレオチド、またはその間の任意の数のヌクレオチドを有していてよく、好ましい長さは＋８５ヌクレオチドである。端を切りとったｓｇＲＮＡ、「ｔｒｕ−ｇＲＮＡ」も使用が可能である（Fuら、（２０１４年）Nature  Biotech  ３２巻（３号）：２７９頁を参照されたい）。ｔｒｕ−ｇＲＮＡにおいて、相補性領域は、１７または１８ヌクレオチド長に減少する。
【００８３】
さらに、代替のＰＡＭ配列も利用することができ、その場合、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９を使用して、ＰＡＭ配列がＮＧＧの代替物としてＮＡＧであってもよい（Hsu  ２０１４年（同書））。また追加のＰＡＭ配列としては、最初のＧが欠失したものも挙げることができる（SanderおよびJoung（２０１４年）Nature  Biotech  ３２巻（４号）：３４７頁）。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのコードされたＣａｓ９  ＰＡＭ配列に加えて、他の細菌源からのＣａｓ９タンパク質に特異的な他のＰＡＭ配列を使用することができる。例えば、以下に示すＰＡＭ配列（SanderおよびJoung（同書）、およびEsveltら、（２０１３年）Nat  Meth  １０巻（１１号）：１１１６頁から適合させた）は、これらのＣａｓ９タンパク質に特異的である：
【表４】
2017515819.tif 000010
【００８４】
したがって、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系との使用に好適な標的配列は、以下のガイドライン：［ｎ１７、ｎ１８、ｎ１９、またはｎ２０］（Ｇ／Ａ）Ｇに従って選択されてもよい。代替的に、ＰＡＭ配列は、ガイドラインＧ［ｎ１７、ｎ１８、ｎ１９、ｎ２０］（Ｇ／Ａ）Ｇに従っていてもよい。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓではない細菌由来のＣａｓ９タンパク質の場合、同じガイドラインが使用される可能性があるが、代替のＰＡＭがＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＰＡＭ配列の代わりに用いられる。
【００８５】
可能性のあるオフターゲット配列を回避する特異性の最高尤度を有する標的配列を選択することが最も好ましい。これらの望ましくないオフターゲット配列は、以下の特性を考慮するとによって同定することができる：ｉ）利用されているＣａｓ９タンパク質と共に機能することが公知のＰＡＭ配列が後に続く標的配列における類似性；ｉｉ）所望の標的配列からのミスマッチが３つより少ない類似の標的配列；ｉｉｉ）ｉｉ）の場合と類似の標的配列であって、ミスマッチが全てＰＡＭの近位領域というよりＰＡＭの遠位領域に配置されている配列（時には「シード」領域と称される、ＰＡＭに直接隣接しているかまたはその近位にあるヌクレオチド１〜５（Ｗｕら（２０１４年）Nature  Biotech  doi：１０．１０３８／ｎｂｔ２８８９）が認識にとって最も重要であるといういくつかの証拠があることから、ミスマッチがシード領域中に配置された推定上のオフターゲット部位は、ｓｇＲＮＡによって認識される可能性が最も低い可能性がある）；およびｉｖ）ミスマッチが連続して間隔をあけていないか、４ヌクレオチドより多く離れて間隔をあけている、類似の標的配列（Hsu  ２０１４年（同書））。したがって、上記のこれらの基準を使用して、どのＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ系が採用されることになってもゲノム中の可能性のあるオフターゲット部位の数の分析を行うことによって、ｓｇＲＮＡにとって好適な標的配列を同定することができる。
【００８６】
ある特定の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、天然型Ｃａｓタンパク質の「機能的な誘導体」であり得る。天然配列ポリペプチドの「機能的な誘導体」は、天然配列ポリペプチドに共通する定性的な生物学的特性を有する化合物である。「機能的な誘導体」は、対応する天然配列ポリペプチドに共通する生物活性を有するという条件で、天然配列の断片ならびに天然配列ポリペプチドの誘導体およびその断片を含むが、これらに限定されない。本明細書で企図される生物活性は、ＤＮＡ基質を加水分解して断片にする、機能的な誘導体の能力である。用語「誘導体」は、ポリペプチドのアミノ酸配列バリアント、共有結合による改変体、およびそれらの融合体の両方を包含する。いくつかの態様において、機能的な誘導体は、天然型Ｃａｓタンパク質の単一の生物学的特性を含んでもよい。他の態様において、機能的な誘導体は、天然型Ｃａｓタンパク質の生物学的特性の部分集合を含んでもよい。Ｃａｓポリペプチドまたはそれらの断片の好適な誘導体は、Ｃａｓタンパク質またはそれらの断片の変異体、融合体、共有結合による改変体を含むが、これらに限定されない。Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質またはそれらの断片、加えてＣａｓタンパク質またはそれらの断片の誘導体を含み、これらは、細胞から得てもよいし、または化学合成から得てもよいし、またはこれらの２つの手順の組合せによって得てもよい。細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然に産生する細胞であってもよいし、またはＣａｓタンパク質を天然に産生し、内因性Ｃａｓタンパク質をより高い発現レベルで産生するように、または内因性Ｃａｓと同一または異なるＣａｓをコードする外因的に導入された核酸からＣａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作されている細胞であってもよい。いくつかのケースにおいて、細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然に産生せず、Ｃａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作されている。
【００８７】
例えば米国仮出願第６１／８２３，６８９号では、特異的な遺伝子に標的化した例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系が開示されている。
【００８８】
したがって、ヌクレアーゼは、ＤＮＡを切断するヌクレアーゼドメインと組み合わせてドナー（導入遺伝子）を挿入することが望ましい任意の遺伝子における標的部位に特異的に結合するＤＮＡ結合ドメインを含む。
【００８９】
融合分子
ＤＮＡ結合ドメインは、本明細書に記載される方法での使用のために任意の追加の分子（例えば、ポリペプチド）に融合していてもよい。ある特定の実施形態において、本方法は、少なくとも１つのＤＮＡ結合分子（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはシングルガイドＲＮＡ）および異種調節（機能的）ドメイン（またはそれらの機能的な断片）を含む融合分子を採用する。
【００９０】
ある特定の実施形態において、機能的ドメインは、転写調節ドメインを含む。一般的なドメインには、例えば、転写因子ドメイン（活性化因子、抑制因子、共活性化因子、共抑制因子）、サイレンサー、癌遺伝子（例えば、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍｙｂ、ｍａｘ、ｍａｄ、ｒｅｌ、ｅｔｓ、ｂｃｌ、ｍｙｂ、ｍｏｓファミリーメンバー等）；ＤＮＡ修復酵素およびそれらの関連因子と修飾因子；ＤＮＡ再配列酵素およびそれらの関連因子と修飾因子；クロマチン関連タンパク質およびそれらの修飾因子（例えば、キナーゼ、アセチラーゼ、およびデアセチラーゼ）；ならびにＤＮＡ修飾酵素（例えば、メチルトランスフェラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ）およびそれらの関連因子と修飾因子が含まれる。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０１３０２５３０４０号を参照されたい。
【００９１】
活性化を達成するのに好適なドメインには、ＨＳＶ  ＶＰ１６活性化ドメイン（例えば、Ｈａｇｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１，５９５２−５９６２（１９９７））、核内ホルモン受容体（例えば、Ｔｏｒｃｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：３７３−３８３（１９９８）を参照されたい）；核内因子カッパＢのｐ６５サブユニット（Ｂｉｔｋｏ＆Ｂａｒｉｋ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：５６１０−５６１８（１９９８）およびＤｏｙｌｅ＆Ｈｕｎｔ，Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ  ８：２９３７−２９４２（１９９７））、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：３−２８（１９９８））、またはＶＰ６４等の人工キメラ機能的ドメイン（Ｂｅｅｒｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１４６２３−３３）、およびデグロン（Ｍｏｌｉｎａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）ＥＭＢＯ  Ｊ．１８、６４３９−６４４７）が含まれる。さらなる例となる活性化ドメインには、Ｏｃｔ  １、Ｏｃｔ−２Ａ、Ｓｐ１、ＡＰ−２、およびＣＴＦ１（Ｓｅｉｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１１，４９６１−４９６８（１９９２）ならびにｐ３００、ＣＢＰ、ＰＣＡＦ、ＳＲＣ１  ＰｖＡＬＦ、ＡｔＨＤ２Ａ、およびＥＲＦ−２が含まれる。例えば、Ｒｏｂｙｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４：３２９−３４７、Ｃｏｌｌｉｎｇｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２３：２５５−２７５、Ｌｅｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｇｅｎｅ  ２４５：１−１１、Ｍａｎｔｅｕｆｆｅｌ−Ｃｙｍｂｏｒｏｗｓｋａ（１９９９）Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｐｏｌ．４６：７７−８９、ＭｃＫｅｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６９：３−１２、Ｍａｌｉｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２５：２７７−２８３、およびＬｅｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．９：４９９−５０４を参照されたい。さらなる例となる活性化ドメインには、ＯｓＧＡＩ、ＨＡＬＦ−１、Ｃ１、ＡＰ１、ＡＲＦ−５、−６、−７、および−８、ＣＰＲＦ１、ＣＰＲＦ４、ＭＹＣ−ＲＰ／ＧＰ、ならびにＴＲＡＢ１が含まれるが、これらに限定されない。例えば、Ｏｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｇｅｎｅ  ２４５：２１−２９；Ｏｋａｎａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １：８７−９９、Ｇｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．５：２９８−３０９、Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０：４１９−４２９、Ｕｌｍａｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：５８４４−５８４９、Ｓｐｒｅｎｇｅｒ−Ｈａｕｓｓｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２２：１−８、Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４１：３３−４４、およびＨｏｂｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：１５，３４８−１５，３５３を参照された��。
【００９２】
例となる抑制ドメインには、ＫＲＡＢ  Ａ／Ｂ、ＫＯＸ、ＴＧＦ−β誘導性初期遺伝子（ＴＩＥＧ）、ｖ−ｅｒｂＡ、ＳＩＤ、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＤＮＭＴファミリーのメンバー（例えば、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ）、Ｒｂ、およびＭｅＣＰ２が含まれるが、これらに限定されない。例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃｅｌｌ  ９９：４５１−４５４、Ｔｙｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃｅｌｌ  ９９：４４３−４４６、Ｋｎｏｅｐｆｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃｅｌｌ  ９９：４４７−４５０、およびＲｏｂｅｒｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．２５：３３８−３４２が含まれるが、これらに限定されない。さらなる例となる抑制ドメインには、ＲＯＭ２およびＡｔＨＤ２Ａが含まれるが、これらに限定されない。例えば、Ｃｈｅｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ８：３０５−３２１、およびＷｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２２：１９−２７を参照されたい。
【００９３】
融合分子は、当業者に周知であるクローニングおよび生化学的共役方法によって構築される。融合分子は、ＤＮＡ結合ドメインおよび機能的ドメイン（例えば、転写活性化または抑制ドメイン）を含む。融合分子はまた任意に、核局在化シグナル（例えば、ＳＶ４０中型Ｔ抗原からのもの等）およびエピトープタグ（例えば、ＦＬＡＧおよびヘマグルチニン等）を含む。融合タンパク質（およびそれらをコードする核酸）は、融合物の構成要素の中でも翻訳リーディングフレームが保存されるように設計される。
【００９４】
一方の機能的ドメイン（またはその機能的断片）のポリペプチド構成要素と、他方の非タンパク質ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、抗生物質、インターカレーター、副溝結合剤、核酸）との間の融合物は、当業者に既知の生化学的共役方法によって構築される。例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）Ｃａｔａｌｏｇｕｅを参照されたい。副溝結合剤とポリペプチドとの間の融合物を作製するための方法および組成物が記載されている。Ｍａｐｐ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：３９３０−３９３５。
【００９５】
当業者に既知であるが、融合分子は、薬学的に許容される担体と共に製剤化されてもよい。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ  ｅｄ．，１９８５、および譲受人共通の国際公開第ＷＯ００／４２２１９号を参照されたい。
【００９６】
融合分子の機能的構成要素／ドメインは、一旦、融合分子がそのＤＮＡ結合ドメインを介して標的配列に結合すると遺伝子の転写に影響を及ぼすことが可能な、多様な異なる構成要素のうちのいずれからも選択することができる。よって、機能的構成要素には、活性化因子、抑制因子、共活性化因子、共抑制因子、およびサイレンサー等の種々の転写因子ドメインが含まれ得るが、これらに限定されない。
【００９７】
ある特定の実施形態において、融合タンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインとヌクレアーゼドメインとを含むことにより、それらの操作された（ＺＦＰまたはＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメインを介してそれらの意図した核酸標的を認識することができる機能的な実体をもたらし、さらに、ヌクレアーゼ活性を介してＤＮＡ結合部位の近くでＤＮＡを切断するヌクレアーゼ（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥヌクレアーゼ）をもたらすことができる。
【００９８】
故に、本明細書に記載される方法および組成物は、広く適用可能であり、任意の目的ヌクレアーゼを伴ってもよい。ヌクレアーゼの非限定的な例としては、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、およびジンクフィンガーヌクレアーゼが挙げられる。ヌクレアーゼは、異種のＤＮＡ結合および切断ドメイン（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、異種の切断ドメインを有するメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン）を含んでもよく、または代替的に、天然型ヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインが、選択された標的部位に結合するように改変されてもよい（例えば、同族の結合部位とは異なる部位に結合するように遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ）。
【００９９】
ヌクレアーゼドメインは、任意のヌクレアーゼ、例えば任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ由来でもよい。本明細書に記載されるＨｔｔのＤＮＡ結合ドメインに融合され得る好適なヌクレアーゼ（切断）ドメインの非限定的な例としては、任意の制限酵素からのドメイン、例えばタイプＩＩＳ制限酵素（例えば、ＦｏｋＩ）が挙げられる。ある特定の実施形態において、切断ドメインは、切断活性のために二量体化を必要とする半分の切断ドメインである。例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，５８６，５２６号；同第８，４０９，８６１号および同第７，８８８，１２１号を参照されたい。一般に、融合タンパク質が切断ハーフドメインを含む場合、切断のために２つの融合タンパク質が必要である。代替的に、２つの切断ハーフドメインを含む単一のタンパク質を使用することができる。２つ切断ハーフドメインは、同じエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来し得るか、または各切断ハーフドメインは、異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来し得る。加えて、２つの融合タンパク質のそれぞれの標的部位への結合が、例えば、二量体化によって、切断ハーフドメインが機能的切断ドメインを形成することを可能にする互いの空間的定位に切断ハーフドメインを配置するように、２つの融合タンパク質のための標的部位は互いに対して好ましく配置される。
【０１００】
またヌクレアーゼドメインは、切断活性を有し、本明細書に記載されるヌクレアーゼとともに使用することも可能な任意のメガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼ）ドメイン由来であってもよく、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩおよびＩ−ＴｅｖＩＩＩを含むが、これらに限定されない。
【０１０１】
ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼは、コンパクトＴＡＬＥＮ（ｃＴＡＬＥＮ）を含む。これらは、ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインをＴｅｖＩヌクレアーゼドメインに連結する単一鎖の融合タンパク質である。融合タンパク質は、ＴＡＬＥ領域によって局在化されたニッカーゼとして作用することもできるし、またはＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインが、メガヌクレアーゼ（例えば、ＴｅｖＩ）ヌクレアーゼドメインに対してどこに配置されているかに応じて、二本鎖切断を行うことができる（Beurdeleyら（２０１３年）Nat  Comm：１〜８ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ２７８２を参照されたい）。
【０１０２】
他の実施形態において、ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼは、メガＴＡＬである。これらのメガＴＡＬヌクレアーゼは、ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインおよびメガヌクレアーゼの切断ドメインを含む融合タンパク質である。メガヌクレアーゼ切断ドメインは、単量体として活性であり、活性のために二量体化を必要としない。（Boisselら、（２０１３年）Nucl  Acid  Res：１〜１３巻、doi：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｔ１２２４を参照されたい）。
【０１０３】
加えて、メガヌクレアーゼのヌクレアーゼドメインはまた、ＤＮＡ結合機能を示す場合もある。任意のＴＡＬＥＮは、追加のＴＡＬＥＮ（例えば、１つもしくは複数のメガＴＡＬを有する１つもしくは複数のＴＡＬＥＮ（ｃＴＡＬＥＮもしくはＦｏｋＩ−ＴＡＬＥＮ）ならびに／またはＺＦＮと組み合わせて使用してもよい。
【０１０４】
加えて、切断ドメインは、例えばオフターゲットの切断作用を低減または排除する絶対ヘテロ二量体の形成のために、野生型と比較して１つまたは複数の変更を含んでいてもよい。例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，９１４，７９６号；同第８，０３４，５９８号；および同第８，６２３，６１８号を参照されたい。
【０１０５】
本明細書に記載されるヌクレアーゼは、二本鎖標的（例えば、遺伝子）において二本鎖または一本鎖切断を起こすことができる。一本鎖切断（「ニック」）の発生は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，７０３，４８９号で記載されており、これは、ヌクレアーゼドメインの１つにおける触媒ドメインの変異がどのようにニッカーゼをもたらすのかを記載している。
【０１０６】
したがって、ヌクレアーゼ（切断）ドメインまたは半分の切断ドメインは、切断活性を保持するか、または多量体化（例えば、二量体化）して機能的な切断ドメインを形成する能力を保持するタンパク質の任意の部分であってもよい。
【０１０７】
代替的に、ヌクレアーゼは、いわゆる「スプリット酵素」技術を使用して、核酸標的部位においてインビボで組み立てられてもよい（例えば、米国特許公開第２００９００６８１６４号を参照されたい）。かかるスプリット酵素の構成要素は、別個の発現構築物上で発現されてもよく、または、１つのオープンリーディングフレーム内に連結させることができ、個々の構成要素は、例えば、自己切断２ＡペプチドまたはＩＲＥＳ配列によって分離される。構成要素は、個々のジンクフィンガー結合ドメイン、またはメガヌクレアーゼ核酸結合ドメインのドメインであってもよい。
【０１０８】
ヌクレアーゼは、使用前に、例えば米国特許公開第２００９０１１１１１９号で記載されるような酵母ベースの染色体系で、活性に関してスクリーニングすることができる。ヌクレアーゼ発現構築物は、当技術分野において公知の方法を使用して容易に設計することができる。
【０１０９】
融合タンパク質の発現は、構成的プロモーターまたは誘導的プロモーター、例えば、ラフィノースおよび／またはガラクトースの存在下で活性化（抑制解除）され、グルコースの存在下で抑制されるガラクトキナーゼプロモーターの調節下にあってもよい。ある特定の実施形態において、プロモーターは、例えば高親和性結合部位の包含により、融合タンパク質の発現を自己制御する。例えば、２０１４年３月１８日に出願された米国特許出願第６１，９５５，００２号を参照されたい。
【０１１０】
送達
本明細書に記載されるタンパク質および／またはポリヌクレオチド（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）、ならびにタンパク質および／またはポリヌクレオチドを含む組成物は、例えば、ｍＲＮＡを介したタンパク質の注入、および／または発現構築物（例えば、プラスミド、レンチウイルスベクター、ＡＡＶベクター、Ａｄベクターなど）の使用を含む任意の好適な手段で標的細胞に送達されてもよい。
【０１１１】
本明細書に記載されるジンクフィンガータンパク質を含むタンパク質を送達する方法は、例えば、米国特許第６，４５３，２４２号、同第６，５０３，７１７号、同第６，５３４，２６１号、同第６，５９９，６９２号、同第６，６０７，８８２号、同第６，６８９，５５８号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号、および同第７，１６３，８２４号に記載され、それらの全ての開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０１１２】
プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクター等を含むが、これらに限定されない、任意のベクター系が使用されてもよい。また、米国特許第８，５８６，５２６号、第６，５３４，２６１号、同第６，６０７，８８２号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号、および同第７，１６３，８２４号も参照されたく、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。さらに、これらのベクターのいずれも、１つ以上のＤＮＡ結合タンパク質コード配列を含み得ることが明らかとなろう。故に、１つ以上のＺＦＰ、ＴＡＬＥ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質が細胞に導入されるとき、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質をコードする配列は、同じベクター上または異なるベクター上に担持されてもよい。複数のベクターが使用されるとき、各ベクターは、１つまたは複数のＺＦＰ、ＴＡＬＥ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードする配列を含んでもよい。
【０１１３】
従来のウイルスおよび非ウイルスベースの遺伝子導入方法を使用して、操作されたＺＦＰ、ＴＡＬＥ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードする核酸を細胞（例えば、哺乳類細胞）および標的組織に導入することができる。かかる方法をまた使用して、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードする核酸を細胞にインビトロで投与することもできる。ある特定の実施形態において、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードする核酸は、インビボまたはエクスビボ遺伝子治療用途のために投与される。非ウイルスベクター送達系は、ＤＮＡプラスミド、裸の核酸、およびリポソームまたはポロキサマー等の送達ビヒクルと複合体化された核酸を含む。ウイルスベクター送達系は、細胞への送達後にエピソームのゲノムまたは組み込まれたゲノムのいずれかを有するＤＮＡおよびＲＮＡウイルスを含む。遺伝子治療手順の概説については、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：８０８−８１３（１９９２）、Ｎａｂｅｌ＆Ｆｅｌｇｎｅｒ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：２１１−２１７（１９９３）、Ｍｉｔａｎｉ＆Ｃａｓｋｅｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：１６２−１６６（１９９３）、Ｄｉｌｌｏｎ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：１６７−１７５（１９９３）、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３５７：４５５−４６０（１９９２）、Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６（１０）：１１４９−１１５４（１９８８）、Ｖｉｇｎｅ，Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ８：３５−３６（１９９５）、Ｋｒｅｍｅｒ＆Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ５１（１）：３１−４４（１９９５）、Ｈａｄｄａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｄｏｅｒｆｌｅｒ  ａｎｄ  Ｂｏｅｈｍ（ｅｄｓ．）（１９９５）、およびＹｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：１３−２６（１９９４）を参照されたい。
【０１１４】
核酸の非ウイルス性送達の方法には、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン、または脂質：核酸複合体、裸のＤＮＡ、裸のＲＮＡ、人工ビリオン、および薬剤によって強化されたＤＮＡの取り込みを含む。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ  ２０００システム（Ｒｉｃｈ−Ｍａｒ）を使用したソノポレーションも、核酸の送達のために使用することができる。好ましい実施形態において、１つ以上の核酸は、ｍＲＮＡとして送達される。また、キャップ付加されたｍＲＮＡの使用により翻訳効率および／またはｍＲＮＡ安定性を増加させることも好ましい。特に、ＡＲＣＡ（抗逆方向キャップ類似体（ａｎｔｉ−ｒｅｖｅｒｓｅ  ｃａｐ  ａｎａｌｏｇ））キャップまたはその変異体が好ましい。米国特許ＵＳ７０７４５９６およびＵＳ８１５３７７３を参照されたく、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１５】
さらなる例となる核酸送達系には、Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ），Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）、ＢＴＸ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）、およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃによって提供されるものが含まれる（例えば、米国公開特許第６００８３３６号を参照されたい）。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、同第４，９４６，７８７号、および同第４，８９７，３５５号）に記載されており、リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ）。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適である、陽イオン性脂質および中性脂質は、Ｆｅｌｇｎｅｒ、国際公開第ＷＯ９１／１７４２４号、同第ＷＯ９１／１６０２４号のものを含む。送達は、細胞（エクスビボ投与）または標的組織（インビボ投与）へのものであり得る。
【０１１６】
免疫脂質複合体等の標的化リポソームを含む脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知である（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４０４−４１０（１９９５）、Ｂｌａｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：２９１−２９７（１９９５）、Ｂｅｈｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：３８２−３８９（１９９４）、Ｒｅｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：６４７−６５４（１９９４）、Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２：７１０−７２２（１９９５）、Ａｈｍａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：４８１７−４８２０（１９９２）、米国特許第４，１８６，１８３号、同第４，２１７，３４４号、同第４，２３５，８７１号、同第４，２６１，９７５号、同第４，４８５，０５４号、同第４，５０１，７２８号、同第４，７７４，０８５号、同第４，８３７，０２８号、および同第４，９４６，７８７号を参照されたい）。
【０１１７】
さらなる送達方法は、送達対象の核酸をＥｎＧｅｎｅＩＣ送達ビヒクル（ＥＤＶ）にパッケージングする使用法を含む。これらのＥＤＶは、二重特異性抗体を用いて標的組織に特異的に送達され、その抗体の一方のアームは、標的組織に対する特異性を有し、他方のアームは、ＥＤＶに対する特異性を有する。抗体は、ＥＤＶを標的細胞表面に運び、次いで、エンドサイトーシスによりＥＤＶが細胞内に取り込まれる。一旦、細胞内に取り込まれると、その内容物が放出される（ＭａｃＤｉａｒｍｉｄ  ｅｔ  ａｌ（２００９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２７（７）：６４３を参照されたい）。
【０１１８】
操作されたＺＦＰ、ＴＡＬＥ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードする核酸を送達するためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベースの系の使用は、ウイルスの標的を体内の特定の細胞に定め、ウイルスのペイロードを核に輸送するための高度に進化したプロセスを活用する。ウイルスベクターは、患者に直接投与することができるか（インビボ）、またはそれらは、インビトロで細胞を治療するために使用することができ、修飾細胞が患者に投与される（エクスビボ）。ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を送達するための従来のウイルスベースの系には、遺伝子導入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、および単純ヘルペスウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。宿主ゲノムへの組み込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルスによる遺伝子導入方法を用いて可能であり、挿入された導入遺伝子の長期発現をもたらすことが多い。さらに、多くの異なる細胞型および標的組織において、高い導入効率が観察されている。
【０１１９】
レトロウイルスの指向性は、外来性エンベロープタンパク質を組み込むことによって改変することができ、標的細胞の可能性のある標的集団を拡張する。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導入するかまたは感染させることが可能であり、かつ典型的には高いウイルス力価を生じるレトロウイルスベクターである。レトロウイルス遺伝子導入系の選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、最大６〜１０ｋｂの外来性配列のパッケージング能力を有する、シス作用性の長い末端反復からなる。ベクターの複製およびパッケージングには、最小限のシス作用性ＬＴＲが十分であり、次いでそれらを使用して、治療用遺伝子を標的細胞に組み込んで恒久的な導入遺伝子の発現を提供する。広く使用されているレトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびそれらの組み合わせに基づくものが含まれる（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１−２７３９（１９９２）、Ｊｏｈａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５−１６４０（１９９２）、Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８−５９（１９９０）、Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４−２３７８（１９８９）、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０−２２２４（１９９１）、ＰＣＴ／米国公開第９４／０５７００号を参照されたい）。
【０１２０】
一過性の発現が好ましい用途では、アデノウイルスベースの系を使用することができる。アデノウイルスベースのベクターは、多くの細胞型において非常に高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を必要としない。かかるベクターを用いて、高力価かつ高レベルの発現が得られている。このベクターは、比較的単純な系において大量に産生することができる。アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターもまた、例えば、核酸およびペプチドのインビトロ産生において、ならびにインビボおよびエクスビボの遺伝子治療手順のために、標的核酸を用いて細胞に形質導入するために使用される（例えば、Ｗｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６０：３８−４７（１９８７）、米国特許第４，７９７，３６８号、国際公開第ＷＯ９３／２４６４１号、Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：７９３−８０１（１９９４）、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３５１（１９９４）を参照されたい）。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１−３２６０（１９８５）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ＆Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＰＮＡＳ  ８１：６４６６−６４７０（１９８４）、およびＳａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２−３８２８（１９８９）を含む、いくつかの刊行物に記載される。
【０１２１】
現在のところ、少なくとも６つのウイルスベクターのアプローチが、臨床治験における遺伝子導入に利用可能であり、それらは、ヘルパー細胞株に挿入される遺伝子による欠陥ベクターの補完を伴うアプローチを利用して、形質導入剤を生成する。
【０１２２】
ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ−Ｓは、臨床治験に使用されてきたレトロウイルスベクターの例である（Ｄｕｎｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８５：３０４８−３０５（１９９５）、Ｋｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１：１０１７−１０２（１９９５）、Ｍａｌｅｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９４：２２  １２１３３−１２１３８（１９９７））。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子治療治験で使用された最初の治療用ベクターであった。（Ｂｌａｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４７５−４８０（１９９５））。ＭＦＧ−Ｓをパッケージしたベクターについて５０％以上の形質導入効率が観察されている。（Ｅｌｌｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４４（１）：１０−２０（１９９７）、Ｄｒａｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１：１１１−２（１９９７）。
【０１２３】
組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠損型および非病原性のパルボウイルスアデノ随伴２型ウイルスに基づく、有望な代替の遺伝子送達系である。全てのベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接するＡＡＶの１４５ｂｐの逆方向末端反復のみを保持するプラスミドに由来する。形質導入された細胞のゲノムへの組み込みに起因する効率的な遺伝子導入および安定した導入遺伝子送達が、このベクター系の主要な特長である。（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ３５１：９１１７  １７０２−３（１９９８）、Ｋｅａｒｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９：７４８−５５（１９９６））。ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８ＡＡＶ  ８．２、ＡＡＶ９、およびＡＡＶ  ｒｈ１０を含む他のＡＡＶ血清型、ならびにＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５、およびＡＡＶ２／６等のシュードタイピングされたＡＡＶもまた、本発明において使用することができる。
【０１２４】
複製欠損型組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）は、高力価で産生することができ、いくつかの異なる細胞型に容易に感染する。ほとんどのアデノウイルスベクターは、導入遺伝子がＡｄＥ１ａ、Ｅ１ｂ、および／またはＥ３遺伝子を置換するように操作され、その後、複製欠損型ベクターは、欠失した遺伝子機能をトランスで供給するヒト２９３細胞内で伝播させられる。Ａｄベクターは、例えば、肝臓、腎臓、および筋肉中に見出されるもの等の非分裂の分化細胞を含む、複数の種類の組織にインビボで形質導入することができる。従来のＡｄベクターは、高い輸送能力を有する。臨床治験におけるＡｄベクターの使用の例は、筋肉内注射を用いた抗腫瘍免疫のためのポリヌクレオチド治療を伴った（Ｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１０８３−９（１９９８））。臨床治験における遺伝子導入のためのアデノウイルスベクターの使用のさらなる例としては、Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ２４：１  ５−１０（１９９６）、Ｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９：７  １０８３−１０８９（１９９８）、Ｗｅｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：２０５−１８（１９９５）、Ａｌｖａｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：５９７−６１３（１９９７）、Ｔｏｐｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：５０７−５１３（１９９８）、Ｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１０８３−１０８９（１９９８）が挙げられる。
【０１２５】
パッケージング細胞を使用して、宿主細胞を感染させることが可能であるウイルス粒子が形成される。かかる細胞には、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングするψ２細胞またはＰＡ３１７細胞が含まれる。遺伝子治療に使用されるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子中にパッケージングする産生細胞株によって生成される。ベクターは、典型的には、パッケージングおよびその後の宿主への組込みに必要な最小限のウイルス配列を含有し（該当する場合）、他のウイルス配列が、発現対象のタンパク質をコードする発現カセットによって置換される。欠落したウイルス機能は、パッケージング細胞株によってトランスで供給される。例えば、遺伝子治療に使用されるＡＡＶベクターは、典型的には、宿主ゲノムへのパッケージングおよび組込みに必要とされる、ＡＡＶゲノムからの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列のみを有する。ウイルスＤＮＡが細胞株にパッケージングされ、それは他のＡＡＶ遺伝子、つまりｒｅｐおよびｃａｐをコードするが、ＩＴＲ配列が欠如しているヘルパープラスミドを含有する。細胞株はまた、ヘルパーとしてのアデノウイルスにも感染させられる。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。このヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠如に起因して、相当な量ではパッケージングされない。アデノウイルスによる汚染は、例えば、ＡＡＶよりもアデノウイルスのほうがより感受性の高い熱処理によって、低減することができる。
【０１２６】
多くの遺伝子治療の用途において、遺伝子治療ベクターが、特定の組織型に対する高度の特異性をもって送達されることが望ましい。したがって、ウイルスベクターは、ウイルスの外表面上のウイルスコートタンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現させることによって、所与の細胞型に対する特異性を有するように修飾することができる。リガンドは、目的の細胞型上に存在することが知られている受容体に対する親和性を有するように選定される。例えば、Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：９７４７−９７５１（１９９５）は、モロニーマウス白血病ウイルスを、ｇｐ７０に融合されたヒトヘレグリンを発現するように修飾することができ、その組換えウイルスが、ヒト上皮成長因子受容体を発現するある特定のヒト乳癌細胞に感染することを報告した。この原理は、標的細胞が受容体を発現し、ウイルスが細胞表面受容体に対するリガンドを含む融合タンパク質を発現する、他のウイルス標的細胞対にまで拡張することができる。例えば、繊維状ファージは、実質的にいかなる選定された細胞受容体に対しても特異的結合親和性を有する抗体断片（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）を提示するように、操作することができる。上記の説明は、主としてウイルスベクターに適用されるが、同じ原理を非ウイルスベクターに適用することができる。かかるベクターは、特異的な標的細胞による取り込みを選好する特異的な取り込み配列を含有するように操作することができる。
【０１２７】
遺伝子治療ベクターは、下に記載されるように、典型的には、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、もしくは頭蓋内注入）または局所適用による個々の患者への投与によって、インビボで送達することができる。代替的に、ベクターは、個々の患者から外植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検）または万能ドナー造血幹細胞等の細胞にエクスビボで送達することができ、続いて、通常はベクターを組み込んだ細胞の選択後に、細胞が患者に再移植される。
【０１２８】
ある特定の実施形態において、本明細書に記載される組成物（例えば、ポリヌクレオチドおよび／またはタンパク質）は、インビボで直接送達される。組成物（細胞、ポリヌクレオチドおよび／またはタンパク質）は、これらに限定されないが、脳または脊髄への直接注射を含む中枢神経系（ＣＮＳ）への直接投与であってもよい。これらに限定されないが、海馬、黒質、マイネルト基底核（ＮＢＭ）、線条体および／または皮質を含む脳の１つまたは複数の領域が、標的化されてもよい。ＣＮＳ送達の代りに、またはそれに加えて、組成物は、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、心臓内、筋肉内、髄腔内、真皮下、および／または頭蓋内注入）されてもよい。本明細書に記載される組成物を被験体に直接送達するための（ＣＮＳへの直接送達を含む）方法および組成物は、ニードルアセンブリを介した直接注射（例えば、定位的注射）を含むが、これらに限定されない。このような方法は、例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、脳への組成物（発現ベクターを含む）の送達に関する米国特許第７，８３７，６６８号；同第８，０９２，４２９号、および米国特許公開第２００６０２３９９６６号に記載される。
【０１２９】
診断、研究のため、または遺伝子治療のための（例えば、宿主生物へのトランスフェクトされた細胞の再注入を介した）エクスビボ細胞トランスフェクションは、当業者に周知である。好ましい実施形態において、細胞は、対象生物から単離され、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系核酸でトランスフェクトされ（遺伝子．ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ）、対象生物（例えば、患者）に再注入される。好ましい実施形態において、１つ以上の核酸は、ｍＲＮＡとして送達される。また、キャップ付加されたｍＲＮＡの使用により翻訳効率および／またはｍＲＮＡ安定性を増加させることも好ましい。特に、ＡＲＣＡ（抗逆方向キャップ類似体（ａｎｔｉ−ｒｅｖｅｒｓｅ  ｃａｐ  ａｎａｌｏｇ））キャップまたはその変異体が好ましい。米国特許第７，０７４，５９６号および同第８，１５３，７７３号を参照されたく、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。エクスビボトランスフェクションに好適な種々の細胞型は、当業者に周知である（例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（３ｒｄ  ｅｄ．１９９４））、ならびに患者からの細胞の単離および培養方法の考察についてはその中で引用される参考文献を参照されたい）。
【０１３０】
一実施形態において、細胞トランスフェクションおよび遺伝子治療のために幹細胞がエクスビボ手順で使用される。幹細胞を使用することの利点は、それらがインビトロで他の細胞型に分化し得るか、または哺乳動物（細胞のドナー等）に導入され得、それらがその骨髄中で生着することである。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−α等のサイトカインを使用して、ＣＤ３４＋細胞を臨床的に重要な免疫細胞型へとインビトロで分化させるための方法が知られている（Ｉｎａｂａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１６９３−１７０２（１９９２）を参照されたい）。
【０１３１】
幹細胞は、形質導入および分化のために、既知の方法を使用して単離される。例えば、幹細胞は、骨髄細胞を、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋（Ｔ細胞）、ＣＤ４５＋（汎Ｂ細胞）、ＧＲ−１（顆粒球）、およびＩａｄ（分化抗原提示細胞）等の、所望されない細胞に結合する抗体でパンニングすることによって、骨髄細胞から単離される（Ｉｎａｂａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１６９３−１７０２（１９９２）を参照されたい）。
【０１３２】
修飾された幹細胞もまた、いくつかの実施形態において使用され得る。例えば、アポトーシスへの耐性を与えられたニューロン幹細胞が治療用組成物として使用されてもよく、その幹細胞はまた、本発明のＺＦＰ  ＴＦも含有する。アポトーシスへの耐性は、幹細胞内でＢＡＸまたはＢＡＫ特異的ＴＡＬＥＮまたはＺＦＮを使用してＢＡＸおよび／またはＢＡＫをノックアウトすることによって（米国特許第８，５９７，９１２号を参照されたい）、または例えばカスパーゼ−６特異的ＺＦＮを再び使用してカスパーゼにおいて妨害されるものによって、生じ得る。これらの細胞は、変異または野生型Ｈｔｔを制御することが知られているＺＦＰ  ＴＦまたはＴＡＬＥ  ＴＦでトランスフェクトすることができる。
【０１３３】
治療用ＺＦＰ核酸を含有するベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソーム等）はまた、インビボでの細胞の形質導入のために生物に直接投与することもできる。代替的に、裸のＤＮＡを投与することができる。投与は、注射、注入、局所適用、およびエレクトロポレーションを含むが、これらに限定されない、血液または組織細胞との最終的な接触に分子を導入するために通常使用される経路のうちのいずれかによる。かかる核酸を投与する好適な方法は、利用可能かつ当業者に周知であり、特定の組成物を投与するために１つを超える経路が使用されてもよいが、特定の経路が、別の経路より即時的かつより効果的な反応を提供できる場合が多い。
【０１３４】
造血幹細胞へのＤＮＡの導入のための方法は、例えば、米国特許第５，９２８，６３８号に開示される。造血幹細胞、例えば、ＣＤ３４＋細胞への導入遺伝子の導入に有用なベクターには、アデノウイルス３５型が含まれる。
【０１３５】
免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）への導入遺伝子の導入に好適なベクターには、非組み込み型レンチウイルスベクターが含まれる。例えば、Ｏｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：１１３８２−１１３８８、Ｄｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８４６３−８４７１、Ｚｕｆｆｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９８７３−９８８０、Ｆｏｌｌｅｎｚｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ２５：２１７−２２２を参照されたい。
【０１３６】
薬学的に許容される担体は、部分的に、投与されている特定の組成物によって、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法によって、決定される。したがって、下に記載されるように、多種多様な好適な医薬組成物の製剤が利用可能である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ  ｅｄ．，１９８９を参照されたい）。
【０１３７】
上述のように、開示される方法および組成物は、原核細胞、真菌細胞、古細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞、脊椎動物細胞、哺乳類細胞、およびヒト細胞を含むが、これらに限定されない、任意の種類の細胞内で使用することができる。タンパク質発現に好適な細胞株は、当業者に知られており、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ）、ｐｅｒＣ６、ヨトウガ（Ｓｆ）等の昆虫細胞、ならびにサッカロミセス属、ピチア属、およびシゾサッカロミセス属等の真菌細胞を含むが、これらに限定されない。これらの細胞株の子孫、変異体、および誘導体もまた使用することができる。
【０１３８】
投与される有効量は、患者間で、ならびに投与様式および投与部位に従って異なる。したがって、有効量は、組成物を投与する医師によって最もよく決定され、適切な投与量は、当業者により容易に決定することができる。組み込みおよび発現に十分な時間（典型的には、例えば４〜１５日）を与えた後、治療用ポリペプチドの血清または他の組織レベルを分析し、投与前の最初のレベルと比較することによって、投与される量が低すぎるか、正しい範囲内であるか、または高すぎるかを決定する。また最初の投与および後続の投与にとって好適なレジメンも変更可能であるが、最初の投与、その後に必要に応じて後続の投与が典型的である。後続の投与は、毎日から、毎年〜数年毎までの範囲の多様な間隔で投与されてもよい。ある特定の実施形態において。
【０１３９】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを使用してＺＦＰをヒト脳に直接送達するために、線条体１つ当たりベクターゲノム１×１０１０〜５×１０１２個（またはその間の任意の値）の用量範囲を適用することができる。述べたように、投与量は、他の脳構造の場合、および異なる送達プロトコールの場合、異なっていてもよい。
【０１４０】
用途
本明細書に記載されるＨｔｔ結合分子（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、Ｔｔａｇｏなど）、およびそれらをコードする核酸は、様々な用途に使用することができる。これらの用途としては、Ｈｔｔ結合分子（ＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸を含む）を被験体に投与して、被験体内の標的遺伝子の発現を調節するのに使用する治療方法が挙げられる。調節は、抑制、例えば、ＨＤの病状に寄与するｍＨｔｔの抑制の形態であってもよい。代替的に、内因性の細胞遺伝子の発現の活性化または発現の増加が病状を緩和することができる場合、調節は、活性化の形態であってもよい。依然としてさらなる実施形態において、調節は、例えば変異体Ｈｔｔ遺伝子の不活性化のための、切断（例えば、１種または複数のヌクレアーゼによる）であってもよい。上記のように、このような用途のために、Ｈｔｔ結合分子、またはより典型的には、それらをコードする核酸は、薬学的に許容される担体と共に医薬組成物として製剤化される。
【０１４１】
Ｈｔｔ結合分子、またはそれらをコードするベクターは、単独で、または他の好適な構成要素（例えばリポソーム、ナノ粒子または当技術分野において公知の他の構成要素）と組み合わせて、吸入によって投与されるエアロゾル製剤にすることができる（すなわち、それらは「霧状」にすることができる）。エアロゾル製剤は、例えばジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの加圧された許容できる噴射剤に入れられていてもよい。例えば静脈内、筋肉内、皮内、および皮下経路などによる、非経口投与に好適な製剤としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を対象となる受容者の血液と等張にする溶質を含有し得る水性および非水性の等張滅菌注射液、ならびに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および保存剤を含み得る水性および非水性の滅菌懸濁液が挙げられる。組成物は、例えば、静脈内注入、経口、局所、腹腔内、膀胱内または髄腔内に投与することができる。化合物の製剤は、単回投与または複数回投与用の密封容器、例えばアンプルおよびバイアル中で提供されてもよい。注射液および懸濁液は、既述の種類の滅菌された粉末、顆粒、および錠剤から調製することができる。
【０１４２】
患者に投与される用量は、時間の経過とともに患者に有益な治療応答をもたらすのに十分な用量であるべきである。用量は、採用される特定のＨｔｔ結合分子の有効性およびＫｄ、標的細胞、ならびに患者の状態、加えて処置される患者の体重または体表面積によって決定される。また用量の規模は、特定の患者における特定の化合物またはベクターの投与に付随する任意の有害な副作用の存在、性質、および程度によっても決定される。
【０１４３】
他の用途において、本明細書に記載される分子の有効性は、患者における、例えば脳脊髄液（ＣＳＦ）などの試料におけるｍＨＴＴタンパク質の量を測定するように設計された検出方法を使用して分析される。例えば、Wildら（２０１４年）J.  Neurol  Neurosurg  Psychiatry  ８５巻：１０号に記載されるような超高感度イムノアッセイを使用して、患者試料におけるＨＤに関連する変異体Ｈｔｔタンパク質の存在を検出（および／または定量）することができる。ある特定の実施形態において、ＣＳＦ中のｍＨｔｔレベルにおける変化の検出は、本明細書に記載されるＨＤ治療（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥなど）に応答して被験体におけるＨＤの進行を決定するための診断を提供する。
【０１４４】
イムノアッセイを含む診断アッセイを行うための任意の好適な様式を使用することができる。例えば、ＥＬＩＳＡプレート上に、捕獲試薬（例えば抗体、受容体など）を固定することができる。代替的に、磁気粒子スキャニングなどの当技術分野において公知の方法による定量のために、チップ上での超高感度免疫検出で検出試薬が使用される（例えばCornagliaら（２０１４年）Anal  Chem  ８６巻（１６号）：８２１３〜２３頁を参照されたい）。検出試薬は、結合が起こり得る条件下で、変異体Ｈｔｔタンパク質を含有する疑いのある試料と接触させ、定量は、当技術分野において公知の方法で行われる。
【０１４５】
それゆえに、ｍＨＴＴレベルは疾患負荷スコアおよび疾患進行に伴う濃度レベルの増加と関連することから、ＣＳＦまたは他の患者試料におけるｍＨｔｔの検出は、ＨＤにおけるＨｔｔ結合分子治療の有効性を監視することを可能にし、同様にＨＤの神経病理生物学に対する処置の作用を研究する能力を助け、さらに本明細書に記載される疾患を改変するＨＤ療法の臨床試験をサポートするのに使用することができる。
【０１４６】
以下の実施例は、Ｈｔｔ調節因子がジンクフィンガータンパク質またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含む本開示の例示的な実施形態に関する。これは単なる例証の目的であることと、操作されたＤＮＡ結合ドメインと共に、これらに限定されないが、ＴＡＬＥ−ＴＦ、追加のＺＦＰ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、追加のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、ホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）を含む他のＨｔｔ調節物を使用することができることが理解されよう。
【実施例】
【０１４７】
（実施例１）
ＺＦＰ−ＴＦは、培養されたＨＤニューロンの表現型を救済する
様々な研究から、ＨＤ患者由来の細胞における拡張したＣＡＧ反復に関連する表現型の変化、例えば、細胞内のＡＴＰレベルの低減および増殖因子の離脱に対する脆弱性の増加が示されてきた。例えば、Jung-Ilら（２０１２年）Biochemical  Journal  ４４６巻（３号）：３５９〜３７１頁；HD  IPSC  Consortium（２０１２年）Cell  Stem  Cell  １１巻（２号）：２６４〜２７８頁；Anら（２０１２年）Cell  Stem  Cell  １１巻（２号）：２５３〜２６３頁を参照されたい。
【０１４８】
したがって、本発明者らは、患者由来のニューロンにおいて、Ｈｔｔの対立遺伝子特異的なＺＦＰ抑制因子の発現がこのような表現型を救済するのかどうかを評価した。簡単に言えば、Ｖｅｎｕｓ（ＧＦＰ）およびＺＦＰ−ＴＦ  ３３０７４−ＫＯＸ−２Ａ−Ｖｅｎｕｓのためのレンチウイルスベクターを、本明細書および米国特許公開第２０１３０２５３０４０号に記載された通りに生成した。切断可能な２Ａペプチドは、Ｖｅｎｕｓ（ＧＦＰ）およびＺＦＰを同じベクターから発現させることができ、ＺＦＰを発現する細胞は、ＧＦＰ発現によって同定することができる。レンチウイルスの発現構築物は、第３世代の自己不活性化ＨＩＶベースＬＶであった。ＣＭＶプロモーターの下流に２ＡリンカーおよびＧＦＰ−Ｖｅｎｕｓと共にＺＦＰ−ＴＦを挿入することによって、３３０７４発現ベクターを構築した。ＧＦＰ発現構築物は、ＣＭＶプロモーターの下流にＧＦＰ−Ｖｅｎｕｓのみを含有する。リポフェクトアミン２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによって組換えＬＶを調製した。トランスフェクション後の４８および７２時間にウイルス上清を回収し、０．４５μｍフィルターを通過させて濾過し、その後、４℃、５０，０００×ｇで９０分の超遠心分離によって（Ｏｐｔｉｍａ  Ｌ−８０Ｋ分取超遠心分離機、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）３００倍に濃縮した。次いでウイルスのペレットをハンクス緩衝化塩溶液（Ｌｏｎｚａ）に再懸濁し、−８０Ｃで貯蔵した。ウイルスタイターを２９３Ｔ細胞の感染によって決定し、ＧＦＰ−ＶＥＮＵＳ発現のフローサイトメトリー分析によって測定した。
【０１４９】
ＨＤ−ＥＳＣを、アキュターゼを用いて継代し、Ｅ８培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中のマトリゲルでコーティングしたプレート上で培養した。ＳｔｅｍＰｒｏ神経誘導培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して神経幹細胞を誘導した。簡単に言えば、ｇｅｌｔｒｅｘでコーティングした６ウェルのディッシュにＥＳＣを細胞２００，０００個／ウェルで植え付け、１０〜２０％の密集度になったら培地をＳｔｅｍＰｒｏ神経誘導培地に変更した。２日毎に培地を変更し、７日目にＮＳＣを回収して増やした。ＳｔｅｍＰｒｏ  ＮＳＣ  ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＨＤ−ＮＳＣおよび非ＨＤ  ＮＳＣを培養した（ＨＩＰ（商標）Ｇｌｏｂａｌｓｔｅｍ）。ＮＳＣを、ｇｅｌｔｒｅｘでコーティングしたプレート上でアキュターゼを用いて継代した。Ｂ−２７無血清サプリメントおよびＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むNeurobasal培地を含有する神経分化培地に培地を変更することにより、ニューロンの分化を誘導した。３〜４日毎に培地を交換した。
【０１５０】
Ｖｅｎｕｓ（ＧＦＰ）およびＺＦＰ−ＴＦ  ３３０７４−ＫＯＸ−２Ａ−Ｖｅｎｕｓのためのレンチウイルスベクターを用い、５００のＭＯＩで、分化したニューロンに形質導入した。その後、上清を新しい神経分化培地で置き換え、培養物を最大２１日間維持した。
【０１５１】
ＨＤ患者（ＣＡＧ１７／４８）または正常な被験体由来の培養したニューロンの細胞内のＡＴＰレベルを、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）発光アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して測定し、各試料中の細胞数を、ＡｐｏＬｉｖｅ−Ｇｌｏ（登録商標）アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して決定した。簡単に言えば、ニューロン中の細胞内のＡＴＰレベルを、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ発光アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造業者の指示に従って使用して測定した。３０分後に、Ｐｅｒｋｉｎ  ＥｌｍｅｒのＷａｌｌａｃ  １４２０  Ｖｉｃｔｏｒ２マイクロプレートリーダーで発光（ＲＬＵ）を測定し、ＡｐｏＬｉｖｅ−Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して蛍光（Ａ．Ｕ．）を測定することによって値をウェル中の細胞数に正規化した。次いで、異なる細胞／処置からの細胞１個当たりのＡＴＰレベルの値を、ｍｏｃｋ感染ＨＤニューロンの値に正規化した。
【０１５２】
図１で示すように、ｍｏｃｋ感染またはレンチ−ＧＦＰ感染ＨＤニューロンは、非ＨＤ（正常）ニューロンと比べてＡＴＰの細胞内レベルを有意に低減させた。対照的に、レンチ−３３０７４−ＫＯＸ−２Ａ−ＧＦＰ感染は、ＨＤニューロンにおける細胞内のＡＴＰレベルの約６０％の増加をもたらしたことから、変異体Ｈｔｔ対立遺伝子のＺＦＰによって引き起こされる抑制が、これらの細胞のエネルギー代謝の低下を正常化することが示される。
【０１５３】
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによるｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイを使用して、増殖因子の離脱により誘導されたＨＤおよび非ＨＤニューロンの細胞死を測定した。簡単に言えば、ＡＴＰアッセイに関して上記のように、３連でニューロンにＬＶを感染させた。細胞を１２日間培養し、次いで培地を、いかなる添加剤（増殖因子）も含まない新しいNeurobasal培地に交換した。細胞を、この増殖因子離脱培地中で４８時間維持した。ＡｐｏＢｒｄＵ  Ｒｅｄ  ＤＮＡ断片化キット（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）を使用してＴＵＮＥＬアッセイを行った。ニューロンを、４％パラホルムアルデヒドを用いて氷上で１５分固定した。製造業者の推奨に従って（ＡｐｏＢｒｄＵ  Ｒｅｄ  ＤＮＡ断片化キット、ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）、ＴＵＮＥＬ陽性細胞を定量することによってアポトーシスを評価した。フローサイトメトリーを使用して、抗ＢｒｄＵ−Ｒｅｄ染色によるアポトーシスの測定およびＧＦＰによるＬＶ形質導入の測定の両方を行った。
【０１５４】
図２で示すように、増殖因子離脱の４８時間後、ＨＤニューロン（ｍｏｃｋ感染）は、非ＨＤニューロン（約２０％）より高い割合の細胞死（約５０％）を示した。レンチ−ＧＦＰ感染は、ＨＤニューロンにおける細胞死のレベルに影響を与えなかった一方で、レンチ−３３０７４−ＫＯＸ−２Ａ−ＧＦＰ感染は、アポトーシス細胞の百分率で（約５０％から２０％への）有意なニューロンの減少を引き起こす。
【０１５５】
したがって、変異体ＨｔｔのＺＦＰによって引き起こされる抑制は、増殖因子離脱に対するＨＤニューロンの脆弱性を低減させる。
【０１５６】
（実施例２）
ＺＦＰ−ＴＦはＱ１７５マウスにおいて変異体Ｈｔｔ凝集を防止および逆転する
対立遺伝子特異的な変異体Ｈｔｔ抑制因子であるＺＦＰ−ＴＦ（ＺＦＰ−３０６４０および３０６４５）のインビボにおける有効性を、マウスＨｔｔ対立遺伝子の１つのエクソン１が、拡張されたＣＡＧ反復（約１７９のＣＡＧ）を含有するヒトＨｔｔエクソン１配列で置き換えられたＱ１７５ノックインマウスモデル（Menalledら（２０１２年）PLoS  One  ７巻（１２号）：ｅ４９８３８）で試験した。変異体Ｈｔｔの病的な凝集を、Ｑ１７５マウスの線条体で２カ月の月齢までに検出し始めることができ、それは加齢に伴って増加し続け、６カ月の月齢までに凝集が十分に確立されるようになる。
【０１５７】
ＺＦＰが線条体における変異体Ｈｔｔの累積を防止できるかどうかを試験するために、片側の線条体内へのＡＡＶ−ＺＦＰ、または陰性対照としてＡＡＶ−ＧＦＰ注射（ベクターゲノム２×１０１０個／線条体を、２月齢のＱ１７５マウスに行い、ヒトシナプシン１プロモーターによってＺＦＰおよびＧＦＰ発現を引き起こした。
【０１５８】
注射（４カ月の月齢）から２カ月後に、脳を回収し、薄片を作り、免疫組織化学分析に供して、ＺＦＰおよびＨｔｔ発現を評価した。ＺＦＰ発現をＦＬＡＧエピトープタグに対する抗体によって検出し、変異体Ｈｔｔ凝集を抗Ｈｔｔ抗体（ｍＥＭ４８）によって検出した。図３Ａ〜３Ｈに、ＡＡＶ−３０６４５が注射されたマウスからの代表的な画像を示す。注射を受けなかった反対側の線条体において、変異体Ｈｔｔ（ｍＥＭ４８）凝集が容易に検出されたが、ＡＡＶ−３０６４５が注射された同側の線条体では、ＺＦＰを発現する細胞で非常に低レベルの変異体Ｈｔｔ凝集しか観察されなかった（陽性ＦＬＡＧ染色によって示された）。
【０１５９】
図３Ｉで示すように、細胞１個当たりの核のＨｔｔ凝集体数を、ＡＡＶ−ＺＦＰおよびＡＡＶ−ＧＦＰが注射されたマウスの同側の線条体におけるＦＬＡＧ（＋）およびＧＦＰ（＋）細胞に関してそれぞれ定量し、次いで注射されていない反対側の線条体における細胞１個当たりの凝集体の数に正規化したところ、ＺＦＰ−３０６４０および３０６４５はどちらも、核のＨｔｔ凝集体数を有意に低減させた（＞９０％）（Ｐ＜０．００１、クラスカル−ウォリス検定およびダンの多重比較）。
【０１６０】
図３Ｊで示すように、ＺＦＰまたはＧＦＰを発現する細胞における核のｍＥＭ４８染色の強度を反対側の線条体からのニューロンの強度に正規化したところ、核のｍＥＭ４８強度における５０〜６０％の低減が、ＺＦＰが注射された線条体で観察された（Ｐ＜０．００１）。図３Ｋで示すように、ＺＦＰまたはＧＦＰを発現する細胞における核周囲の変異体Ｈｔｔ凝集体の密度を、反対側の線条体のニューロンにおける密度に正規化したところ、核周囲のＨｔｔ凝集体密度における４５〜７０％の低減が、ＺＦＰが注射された線条体で観察された（Ｐ＜０．０１）。
【０１６１】
これらの結果は、Ｑ１７５マウスの線条体において、ＺＦＰ−ＴＦは、２カ月の月齢で注射される場合、４カ月の月齢で変異体Ｈｔｔ凝集を防止したことを示す。
【０１６２】
ＺＦＰが十分に確立されたＨｔｔ凝集を逆転することができるかどうかを試験するために、６月齢のＱ１７５マウスに、片側の線条体内へのＡＡＶ−ＧＦＰ−２Ａ−ＺＦＰ注射を行った。切断可能な２Ａペプチドは、同じベクターからＧＦＰおよびＺＦＰを発現させることができ、ＺＦＰを発現する細胞は、ＧＦＰ発現によって同定することができる。８カ月の月齢で、脳を回収し、薄片を作り、免疫組織化学分析に供して、Ｈｔｔ凝集を評価した。図４Ａに、ＡＡＶ−ＧＦＰ−２Ａ−３０６４５が注射されたマウスからの代表的な画像を示す。線条体特異的なタンパク質であるＤＡＲＰＰ−３２に対する抗体を使用して線条体を標識した。注射を受けなかった反対側の線条体では、高いレベルの変異体Ｈｔｔ凝集（ｍＥＭ４８抗体によって検出された）が観察されたが、ＡＡＶ−ＧＦＰ−２Ａ−３０６４５が注射された同側の線条体では、変異体Ｈｔｔ凝集の低減が観察された。
【０１６３】
さらに、細胞１個当たりの核のＨｔｔ凝集体数を、ＡＡＶ−ＧＦＰ−２Ａ−ＺＦＰおよびＡＡＶ−ＧＦＰが注射されたマウスの同側の線条体におけるＧＦＰ（＋）細胞に関して定量し、次いで注射されていない反対側の線条体における細胞１個当たりの凝集体の数に正規化した。図４Ｂで示すように、ＧＦＰ−２Ａ−３０６４０の送達は、Ｈｔｔの核の凝集体数において約２０％の低減をもたらし（Ｐ＜０．００１、クラスカル−ウォリス検定およびダンの多重比較）、ＧＦＰ−２Ａ−３０６４５の送達も、細胞１個当たりのＨｔｔの核の凝集体数においてわずかな低減を引き起こした。
【０１６４】
ＡＡＶ−ＧＦＰ−２Ａ−ＺＦＰおよびＡＡＶ−ＧＦＰが注射されたマウスの同側の線条体からのＧＦＰ（＋）細胞における核のｍＥＭ４８染色の強度も、反対側の線条体からのニューロンにおける強度に正規化した。図４Ｃで示すように、核のｍＥＭ４８強度におけるおよそ２０％の低減（Ｐ＜０．００１）が、ＧＦＰ−２Ａ−３０６４５が注射された線条体で観察された。核のｍＥＭ４８強度におけるおよそ１０％の低減も、ＧＦＰ−２Ａ−３０６４０が注射された線条体で観察された。
【０１６５】
ＡＡＶ−ＧＦＰ−２Ａ−ＺＦＰおよびＡＡＶ−ＧＦＰが注射されたマウスの同側の線条体におけるＧＦＰ（＋）細胞における核周囲の変異体Ｈｔｔ凝集体の密度を測定して、反対側の線条体のニューロンにおける密度に正規化した。図４Ｄで示すように、核周囲のＨｔｔ凝集体の密度における３０〜５０％の低減（Ｐ＜０．００１）が、ＺＦＰが注射された線条体で観察された。
【０１６６】
これらの結果は、ＺＦＰ−ＴＦは、６カ月の月齢で注射される場合、わずか２カ月後にＱ１７５マウスの線条体における既存の変異体Ｈｔｔ凝集を逆転したことを示す。マウスの脳が分析される前にＺＦＰの発現が２カ月より長く継続できる場合、変異体Ｈｔｔ凝集のより実質的な排除が期待される。
【０１６７】
総合すると、データから、ＨＤ被験体の脳に送達された変異体Ｈｔｔ−対立遺伝子の抑制因子は、ＨＤニューロンにおける細胞内のＡＴＰ濃度のレベル増加、ＨＤニューロンにおけるアポトーシスの低減、ならびに既存のＨｔｔ凝集体の防止および排除をもたらしたことが実証される。
【０１６８】
（実施例３）
ＺＦＰ−ＴＦ処置の有効性
診断試験は、変異体Ｈｔｔ対立遺伝子に特異的なＨｔｔ結合分子（例えば、ＺＦＰ−ＴＦ、ＴＡＬＥ−ＴＦなど）で処置された被験体に行われる。ＨＤ被験体は、本明細書に記載されるＨｔｔ結合分子で処置される。ＣＳＦは、標準的な方法（例えば腰椎穿刺）によって被験体から抽出され、次いでｍＨｔｔタンパク質を検出および定量するための当技術分野において公知の方法に供される（Wildら（同書）を参照されたい）。本明細書に記載される治療後のＣＳＦにおいて、ｍＨｔｔタンパク質のレベルは減少する。
【０１６９】
（実施例４）
ＺＦＰ−ＴＦは、Ｑ１７５マウスにおいて変異体Ｈｔｔ凝集を防止および低減し、ＤＡＲＰＰ３２遺伝子の発現を増加させる。
変異体Ｈｔｔの別の対立遺伝子特異的な抑制因子ＺＦＰ−ＴＦ（ＺＦＰ−３３０７４）のインビボにおける有効性を、マウスＨｔｔ対立遺伝子の１つのエクソン１が、拡張されたＣＡＧ反復（約１７９のＣＡＧ）を含有するヒトＨｔｔエクソン１配列で置き換えられたＱ１７５ノックインマウスモデル（Menalledら（２０１２年）PLoS  One  ７巻（１２号）：ｅ４９８３８）で試験した。変異体Ｈｔｔの病的な凝集を、Ｑ１７５マウスの線条体で２カ月の月齢までに検出し始めることができ、それは加齢に伴って増加し続け、６カ月の月齢までに凝集が十分に確立されるようになる。
【０１７０】
ＺＦＰが線条体における変異体Ｈｔｔの累積を防止できるかどうかを試験するために、片側の線条体内へのＡＡＶ−ＺＦＰ−２Ａ−ＧＦＰ、または陰性対照としてＡＡＶ−ＧＦＰの注射（ベクターゲノム２×１０１０個／線条体）を、２月齢のＱ１７５マウスに行い、ヒトシナプシン１プロモーターによってＺＦＰおよびＧＦＰ発現を引き起こした。自己切断可能な２Ａペプチドは、同じベクターからＧＦＰおよびＺＦＰを発現させることができ、ＺＦＰを発現する細胞は、ＧＦＰ発現によって同定することができる。
【０１７１】
注射から２カ月後（４カ月の月齢）、脳を回収し、薄片を作り、免疫組織化学分析に供して、Ｈｔｔ発現を評価した。形質導入された細胞をＧＦＰによってマークし、中型有棘ニューロン（ＭＳＮ）をＤＡＲＰＰ３２抗体で標識し、変異体Ｈｔｔ凝集を抗Ｈｔｔ抗体（ｍＥＭ４８）によって検出した。
【０１７２】
図５Ａで示すように、ＡＡＶを形質導入したＭＳＮ（ＧＦＰおよびＤＡＲＰＰ３２抗体で標識された）において、細胞１個当たりの核のＨｔｔ凝集体数または封入体数は、ＺＦＰ３３０７４によって有意に低減した（Ｐ＜０．００１）。図５Ｂは、ＡＡＶを形質導入した細胞における核外の変異体Ｈｔｔ凝集体の密度が、ＺＦＰ処置線条体において有意に低減したことを示す。（Ｐ＜０．０００１）。図５Ｃは、核のｍＥＭ４８染色（変異体Ｈｔｔ）の強度が、ＺＦＰ処置マウスにおいて有意に低減したことを示す（Ｐ＜０．００１）。
【０１７３】
これらの結果は、Ｑ１７５マウスの線条体において、ＺＦＰ３３０７４は、２カ月の月齢で注射される場合、変異体Ｈｔｔ凝集を防止することを示す。
【０１７４】
Ｑ１７５の線条体においてＨｔｔ凝集が十分に確立された後にＺＦＰがＨｔｔ凝集を低減できるかどうかを試験するために、ＡＡＶ−ＧＦＰ−２Ａ−ＺＦＰまたはＡＡＶ−ＧＦＰの片側の線条体内への注射を、６月齢のＱ１７５マウスに行った。１０カ月の月齢で、脳を回収し、薄片を作り、免疫組織化学検査に供した。
【０１７５】
図６Ａは、ＡＡＶを形質導入したＭＳＮ（ＧＦＰおよびＤＡＲＰＰ３２抗体で標識された）において、細胞１個当たりの核のＨｔｔ凝集体数／封入体数が、ＺＦＰ３３０７４によって有意に低減したことを示す（Ｐ＜０．００１）。図６Ｂは、ＡＡＶを形質導入した細胞における核外の変異体Ｈｔｔ凝集体の密度が、ＺＦＰ処置線条体において有意に低減したことを示す。（Ｐ＜０．０００１）。図６Ｃは、核のｍＥＭ４８染色（変異体Ｈｔｔ）の強度が、ＺＦＰ処置マウスにおいて有意に低減したことを示す（Ｐ＜０．００１）。
【０１７６】
図７Ａは、１０カ月齢のＱ１７５マウスにおいて、ＭＳＮマーカーであるＤＡＲＰＰ３２の発現は、年齢を適合させた野生型マウスと比較して低減することを示し（Ｐ＜０．０５）、これらのマウスにおけるＭＳＮの変性が示唆される。図７Ｂは、Ｑ１７５マウスに６カ月の月齢でＡＡＶ−ＺＦＰ−２Ａ−ＧＦＰを注射し、１０カ月の月齢でＤＡＲＰＰ３２発現に関して分析したところ、対照処置マウスと比較して、ＺＦＰ３３０７４処置マウスにおいてＤＡＲＰＰ３２発現における有意な増加が見出されたことを示す。
【０１７７】
総合すると、これらの結果は、ＺＦＰ３３０７４は、６カ月の月齢で注射される場合、既存の凝集体の存在下で変異体Ｈｔｔの発現および凝集を低減できることを実証する。さらに、ＺＦＰ３３０７４は、ＤＡＲＰＰ３２の発現を救済することができ、これは、ＭＳＮの保護を示唆している。ＤＢＤを欠失した対照ベクター（ＺＦＰΔＤＢＤ）は、変異体Ｈｔｔ凝集またはＤＡＲＰＰ３２発現に対して効果を有さないので、拡張されたＣＡＧ反復に対して、ＺＦＰを補充する（recruit）ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）が必要である。
【０１７８】
（実施例５）
ＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ−ＴＦは、ＨＤニューロンにおいて変異体Ｈｔｔ凝集を防止および低減する
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系で使用するためのｓｇＲＮＡは、当技術分野において公知の方法で合成的に作製される（Hsuら（２０１３年）Nature  Biotech  doi：１０．１０３８／ｎｂｔ．２６４７またはSternbergら、（２０１４年）Nature  ５０７巻：６２頁を参照されたい）。ｓｇＲＮＡは、上記のように操作されており、ｍＨｔｔ中の配列を標的化するように設計されている。例えば、ｓｇＲＮＡは、以下の配列の１つを有していてもよく、ここでＰＡＭ配列は下線で示される：
【表５】
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【０１７９】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ転写因子は、当技術分野において公知の方法に従って作製される（例えばPerez-Pinera（２０１３年）Nature  １０巻（１０号）：９７３頁ならびにQiおよびArkin（２０１４年）Nature  Reviews  Microbiology  １２巻：３４１頁を参照されたい）。簡単に言えば、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質を使用して、抑制ドメイン（すなわちＫＲＡＢ）に融合させる。
【０１８０】
培養されたＨＤニューロンに、Ｃａｓ９（ヌクレアーゼ−）−ＫＲＡＢ融合タンパク質をコードするｍＲＮＡ（２０μｇ／ｍＬ）および上記のようなｓｇＲＮＡをトランスフェクトし、ここでｓｇＲＮＡは、ＢＴＸ  ＥＣＭ８３０を使用したエレクトロポレーションによって、ｍＲＮＡ（例えば２〜４μｇ）またはＤＮＡ発現ベクター（例えば４００ｎｇ〜８００ｎｇ）を介して導入される。定量的なＴａｑｍａｎ分析の５日後に細胞を収集して、ｍＨｔｔ発現を測定する。加えて、細胞を上記の実験に供し、細胞間のＡＴＰレベルを測定して、アポトーシスを分析する。データから、ｓｇＲＮＡを使用したｍＨｔｔ−特異的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ転写因子は、ｍＨｔｔの発現を抑制し、ｍＨｔｔタンパク質凝集によって引き起こされる表現型の特徴を低減させることができることが示される。
【０１８１】
（実施例６）
運動障害の低減
本明細書に記載されるＨｔｔ抑制因子を動物（例えば、マウス）に投与して、これらの動物によって示される十分に確立された運動欠陥であるクラスピング動作に関して定期的に試験する（Mangiariniら、１９９６年  Cell  ８７巻、４９３〜５０６頁）。簡単に言えば、各動物をそのホームケージから取り出し、ケージのふたの上に置く。次いで観察者は、表面から約１２インチ上に動物が吊り上げられるまで動物を穏やかに後ろおよび前に滑らかな動きで引っ張る。次いで動物を３０秒間スコア付けする。前肢のクラスピングのみが観察される場合、動物は１のスコアが与えられる。後肢のクラスピングのみが観察される場合、動物は２のスコアが与えられる。後肢と前肢のクラスピングの両方が観察されるが同時ではない場合、動物は３のスコアが与えられる。中心部へきつく引き戻される後肢と前肢の同時のクラスピングと定義される完全なクラスピングは、４のスコアが与えられる。３０秒の吊り上げ後、動物をそのホームケージに戻す。各処置群、加えて年齢を適合させた野生型の同腹子につき、毎週の観察それぞれにおいて完全なクラスピング（４のスコア）を表示する動物の比率を決定する。
【０１８２】
本明細書に記載されるＨｔｔ抑制因子は、対照（Ｈｔｔ抑制因子なし）と比較して、よく特徴付けられた運動欠陥であるクラスピング動作を改善する。
【０１８３】
本明細書において言及された全ての特許、特許出願、および刊行物は、参照によりそれらの全体がすべての目的のために本明細書に組み込まれる。
【０１８４】
理解の明確さを目的として、例示説明および実施例を用いてある程度詳細に開示を提供してきたが、当業者には、本開示の趣旨または範囲から逸脱することなく、種々の変更および修正が実施され得ることは明白であろう。したがって、前述の説明および実施例は、限定的であると解釈されるべきではない。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ−Ｈ】
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【図３Ｉ−Ｋ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ−Ｄ】
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【図５Ａ−Ｃ】
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【図６Ａ−Ｃ】
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【図７Ａ−Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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