(57)【要約】  本発明は、ロリンアルカロイド、有害生物防除組成物を含むロリンアルカロイドを含む組成物の調製方法、及び、生物学的防除剤としての使用を含むこの組成物の使用に関する。植物又は動物有害生物を含む有害生物の防除方法、及び、植物の成長又は繁殖の増強方法、並びに、例えば植物及び動物における昆虫の感染及び外寄生の処理及び予防もまた提供されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種又は複数種のロリンアルカロイドを含む組成物を生成する方法であって、
ａ）少なくとも１種の内生寄生菌に感染しているか感染したことがある植物に由来する植物材料を提供する工程、
ｂ）前記植物材料及び水溶液を混合する工程、
ｃ）前記混和物を少なくとも約５０℃の温度で少なくとも約１５分間の期間維持して、１種又は複数種のロリンアルカロイド化合物を含む抽出物を得る工程、
ｄ）前記抽出物を回収し、任意選択により前記抽出物をさらに精製して、１種又は複数種のロリンアルカロイドを含む組成物を形成する工程、
を含む方法。
【請求項２】
１種又は複数種のロリンアルカロイドを含む組成物を生成する方法であって、
ａ）少なくとも１種の内生寄生菌に感染しているか感染したことがある植物に由来する完全な種子を提供する工程、
ｂ）前記種子及び水溶液を混合する工程、
ｃ）前記混和物を少なくとも約５０℃の温度で維持して、１種又は複数種のロリンアルカロイドを含む抽出物を得る工程、
ｄ）前記抽出物／上澄みを回収し、及び、任意選択により前記抽出物をさらに精製して、１種又は複数種のロリンアルカロイドを含む組成物を得る工程、
を含む方法。
【請求項３】
少なくとも前記植物材料のいくらかが、粉末化される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記混和物が、約１時間〜約６時間維持される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ａ）少なくとも１種の内生寄生菌に感染しているか感染したことがある植物に由来する粉末化した植物材料を提供する工程、
ｂ）前記粉末化した植物材料及び水溶液を混合する工程、
ｃ）前記混和物を少なくとも約５０℃の温度で少なくとも約１５分間の期間維持して、１種又は複数種のロリンアルカロイド化合物を含む抽出物を得る工程、
ｄ）前記抽出物をろ過してろ液を得る工程、
ｅ）前記ろ液のｐＨを７超のｐＨに調節する工程、
ｆ）前記ｐＨ調節したろ液と、１種又は複数種のロリンアルカロイドに少なくとも７のｐＨで結合可能であるクロマトグラフィ固定相とを接触させる工程、
ｇ）前記クロマトグラフィ固定相と、前記１種又は複数種のロリンアルカロイドを溶出する有機溶剤とを接触させる工程、並びに
ｈ）１種又は複数種のロリンアルカロイドを含有する前記溶出液を回収して、１種又は複数種のロリンアルカロイドを含む組成物を得る工程、
を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記水溶液が、少なくとも７のｐＨを有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記粉末化した植物材料が、種子を含まない、請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記粉末化した植物材料が、粉末化した種子を含まない、請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記粉末化した植物材料が、粉末化した種子であるか粉末化した種子を含み、並びに
ａ）前記粉末化した植物材料が、少なくとも約９０℃の温度を有する水溶液もしくは水と混合され、又は
ｂ）前記混和物が、少なくとも約９０℃の温度で少なくとも約１５分間の期間維持され、又は
ｃ）上記のａ）及びｂ）の両方が行われる、
請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
前記粉末化した植物材料が、粉末化した種子であるか粉末化した種子を含み、並びに
ａ）前記粉末化した植物材料が、約９５℃〜約９８℃の温度を有する水溶液もしくは水と混合され、又は
ｂ）前記混和物が、約９５℃〜約９８℃の温度で少なくとも約１５分間の期間維持され、又は
ｃ）上記のａ）及びｂ）の両方が行われる、
請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
前記ロリンアルカロイドが、式［Ｉ］：
【化１】
2017538703.tif 000010
（式中：
Ｒ＝Ｈ又はＣＨ3、及び
Ｒ’＝Ｈ、ＣＨ3、ＣＨＯ、ＣＯＣＨ3）
の１種又は複数種のロリンアルカロイドを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記１種又は複数種のロリンアルカロイドが、ロリン、Ｎ−アセチルロリン（ＮＡＬ）、Ｎ−ホルミルロリン（ＮＦＬ）、Ｎ−アセチルノルロリン（ＮＡＮＬ）及びＮ−メチルロリン（ＮＭＬ）を含む群から選択される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記種子又は植物材料が、ウシノケグサ属（Ｆｅｓｔｕｃａ）に由来する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記水溶液が、水を含み、７超のｐＨを有する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記水溶液が、水を含み、少なくとも約７〜約９のｐＨを有する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記種子が、少なくとも約６５℃の温度を有する水溶液又は水と混合されるか、もしくは、前記混和物が、少なくとも約６５℃の温度で維持されるか、又は、この両方が行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
前記種子が、少なくとも約７０℃の温度を有する水溶液又は水と混合されるか、もしくは、前記混和物が、少なくとも約７０℃の温度で維持されるか、又は、この両方が行われる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記粉末化した植物材料が、少なくとも約６０℃の温度を有する水溶液又は水と混合されるか、もしくは、前記混和物が少なくとも約６０℃の温度で維持されるか、又は、この両方が行われる、請求項１〜８又は１１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記混和物が、少なくとも約６５℃、少なくとも約７０℃、少なくとも約８０℃又は少なくとも約９０℃の温度で維持される、請求項１〜８、１１〜１５又は１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記抽出物が、１つ又は複数の少なくとも部分的な精製工程に供される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記抽出物が、ろ過されて、１種又は複数種のロリンアルカロイドを含むろ液が得られる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記少なくとも部分的な精製が、前記抽出物又はろ液と１つもしくは複数のクロマトグラフィ固定相とを、前記固定相が１種もしくは複数種のロリンアルカロイドと結合するのに十分な時間の間接触させる工程、クロマトグラフィにより、１種もしくは複数種の汚染物を前記固定相に結合した１種もしくは複数種のロリンアルカロイドから分離する工程、又は、クロマトグラフィにより、前記固定相に結合した１種もしくは複数種のロリンアルカロイドを濃縮する工程、及び、前記１種又は複数種のロリンアルカロイドを回収する工程を含む、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記固定相が、逆相クロマトグラフィ固定相である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記固定相が、スチレン−ジビニルベンゼンポリマー樹脂を含む、請求項２２又は請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記１種又は複数種のロリンアルカロイドの前記回収が、有機溶剤による溶出によりなされる、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記抽出物又はろ液の前記ｐＨが、前記抽出物が前記固定相で接触される前に、少なくとも約ｐＨ９のｐＨに調節される、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記抽出物又はろ液と、前記１種又は複数種のクロマトグラフィ固定相とを接触させる前記工程が、７超のｐＨで行われる、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法により生成される１種又は複数種のロリンアルカロイドを含む、前記ロリンアルカロイドから本質的に構成される、又は、前記ロリンアルカロイドから構成される組成物又は抽出物。
【請求項２９】
有害生物個体群を防除する方法であって、前記個体群と、有害生物防除的に有効な量の請求項２８に記載の組成物又は抽出物とを接触させる工程を含む方法。
【請求項３０】
植物の成長又は繁殖を増強する方法であって、前記植物と、請求項２８に記載の組成物又は抽出物とを接触させる工程を含む方法。
【請求項３１】
有害生物、寄生生物又は昆虫感染又は外寄生を処置又は予防を必要とする対象における有害生物、寄生生物又は昆虫感染又は外寄生を処置又は予防する方法であって、前記対象が、ヒト又は非ヒト対象動物であり、前記対象に治療的有効量の請求項２８に記載の組成物を投与する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３２】
有害生物、寄生生物又は昆虫感染又は外寄生の処置又は予防のための組成物又は医薬品の製造における請求項２８に記載の組成物の使用。
【請求項３３】
請求項２８に記載の組成物、及び、１種又は複数種の薬学的に又は獣医学的に許容可能な賦形物、キャリア又は希釈剤を含むことを特徴とする薬学的もしくは獣医学的配合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に生物学の分野に関し、特に、ロリン(loline)アルカロイドの調製方法、有害生物防除（control）組成物を含むロリンアルカロイドを含む組成物、及び、生物学的防除剤としての使用を含むこの組成物の使用に関する。植物又は動物有害生物を含む有害生物の防除方法、及び、植物の成長又は繁殖の増強方法、並びに、例えば植物及び動物における昆虫の感染及び外寄生(infestation)の処理及び予防もまた提供されている。
【背景技術】
【０００２】
ロリンアルカロイドは、特にエピクロエ属（Ｅｐｉｃｈｌｏｅ）内生寄生菌(endophyte)（この語は、命名法の再分類に従い、現在では、以前は別分類とされていた無性世代のネオティホディウム属の一種（Ｎｅｏｔｙｐｈｏｄｉｕｍ  ｓｐｐ．）を含む）といった内生寄生菌に草が感染している間に共生的に産生される。これらの内生寄生菌は生体保護的であり、有害生物に対する保護、並びに、場合により干ばつ及び病害に対する保護を、一部を形成する共生生物に与えると考えられている。
【０００３】
しかしながら、牧畜農業において通例用いられる草の内生寄生菌感染にはまた、フェスクトキシコーシス、ライグラススタッガー及びエルゴトキシコーシス（ｅｒｇｏｔｏｘｉｃｏｓｉｓ）を含む動物に対する毒性も付随している。これらの中毒症は、種々の植物の成長条件下で内生寄生菌／草共生生物において産生される種々のアルカロイドに対する動物による複雑な反応によるものと考えられている。これらの動物中毒症は、家畜を失うことによる直接的な損失、及び、治療に関連する費用による間接的な損失の両方を含む顕著な経済的損失の要因である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
例えば、粉末化した(milled)牧草、又は、種子などの植物／内生寄生菌共生生物由来の植物材料からロリンアルカロイドを調製して、現在は入手できない病害虫の防除のための組成物を提供するための、ロバストで、及び／又は、スケーラブルな方法が必要とされている。
【０００５】
既存の方法は、典型的には実験規模で実施されており、すべてにおいて、ロリンの調製の原材料として粉末化、粉砕又は加工した植物又は種子材料が使用されているが、報告されている回収率は経済的ではない。
【０００６】
本出願人の知り得る範囲では、例えば完全な種子からロリンを一定の規模で生成又は抽出する成功例は報告されていない。
【０００７】
本発明は、植物材料から１種又は複数種のロリンアルカロイドを調製する方法、及び／又は、内生寄生菌／植物共生におけるロリンアルカロイドの存在に付随する１種又は複数種の生体保護効果を達成するための方法であって、上記の欠点のいくつかを克服もしくは少なくとも軽減するか、又は、少なくとも公衆に有用な選択肢を提供する方法、を提供することを目的とする。
【０００８】
本発明の他の目的は、単なる一例とされる以下の記載から明らかになり得る。
【０００９】
特許明細書及び他の書面を含む外部の情報源に対して参照がなされているこの明細書において、これは一般に、本発明の特性を考察するための文脈を提供することを目的とする。他に定めがある場合を除き、このような情報源に対する参照は、いかなる司法権においても、このような情報源が従来技術であるか、又は、技術分野における共通一般知識の一部を構成するものであるとの容認として解釈されるべきではない。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
第１の態様において、本発明は、１種又は複数種のロリンアルカロイドを含む組成物を生成する方法であって、
ａ）少なくとも１種の内生寄生菌に感染しているか感染したことがある植物に由来する植物材料を提供する工程、
ｂ）植物材料及び水溶液を混合する工程、
ｃ）混和物を少なくとも約５０℃の温度で維持して、１種又は複数種のロリンアルカロイド化合物を含む抽出物を得る工程、
ｄ）抽出物を回収し、任意選択により抽出物をさらに精製して、組成物を形成する工程
を含む方法を提供する。
【００１１】
一実施形態において、少なくとも植物材料のいくらかは粉末化される。例えば、植物材料のすべてが粉末化される。
【００１２】
一実施形態において、粉末化した植物材料は種子を含まない。
【００１３】
一実施形態において、本発明は、１種又は複数種のロリンアルカロイドを含む組成物を生成する方法であって、
ａ）少なくとも１種の内生寄生菌に感染しているか感染したことがある植物に由来する完全な種子を提供する工程、
ｂ）種子及び水溶液を混合する工程、
ｃ）混和物を少なくとも約５０℃の温度で維持して、１種又は複数種のロリンアルカロイドを含む抽出物を得る工程、
ｄ）抽出物／上澄みを回収し、及び、任意選択により抽出物をさらに精製して、１種又は複数種のロリンアルカロイドを含む組成物を得る工程
を含む方法を提供する。
【００１４】
従って、一実施形態において、本発明は、
ａ）少なくとも１種の内生寄生菌に感染しているか感染したことがある植物に由来する完全な種子を提供する工程、
ｂ）種子と少なくとも約６５℃の温度を有する水溶液とを混合する工程、
ｃ）混和物を、１種又は複数種のロリンアルカロイドを含む抽出物を得るのに十分な期間、約６５℃〜約１００℃の温度で維持する工程、
ｄ）抽出物を回収し、任意選択により抽出物をさらに精製して、１種又は複数種のロリンアルカロイドを含む組成物を得る工程
を含む１種又は複数種のロリンアルカロイドを含む組成物を生成する方法に関する。
【００１５】
他の実施形態において、本発明は、
ａ）少なくとも１種の内生寄生菌に感染しているか感染したことがある植物に由来する完全な種子を提供する工程、
ｂ）種子と少なくとも約８５℃の温度を有する水溶液とを混合する工程、
ｃ）混和物を、１種又は複数種のロリンアルカロイドを含む抽出物を得るのに十分な期間、約８５℃〜約１００℃の温度で維持する工程、
ｄ）抽出物を回収し、任意選択により抽出物をさらに精製して、１種又は複数種のロリンアルカロイドを含む組成物を得る工程
を含む１種又は複数種のロリンアルカロイドを含む組成物を生成する方法に関する。
【００１６】
一例において、混和物は、少なくとも約１５分間の期間の間維持される。例えば、混和物は、少なくとも約３０分間の期間、少なくとも約４５分間又は少なくとも約１時間の間維持される。
【００１７】
一例において、抽出物を得るために十分な期間は約１時間〜約６時間である。
【００１８】
第２の態様において、本発明は、１種又は複数種のロリンアルカロイドを種子から抽出する方法であって、
ａ）少なくとも１種の内生寄生菌に感染しているか感染したことがある植物に由来する完全な種子を提供する工程、
ｂ）種子及び水溶液を混合する工程、
ｃ）混和物を少なくとも約５０℃の温度で維持して、１種又は複数種のロリンアルカロイドを含む抽出物を得る工程、
ｄ）抽出物を回収し、及び、任意選択により抽出物をさらに精製する工程
を含む方法を提供する。
【００１９】
第３の態様において、本発明は、１種又は複数種のロリンアルカロイドを含む組成物を生成する方法であって、
ａ）少なくとも１種の内生寄生菌に感染しているか感染したことがある植物に由来する植物材料を提供する工程、
ｂ）植物材料及び水を混合する工程、
ｃ）混和物を少なくとも約６５℃の温度で維持して、１種又は複数種のロリンアルカロイド化合物を含む抽出物を得る工程、
ｄ）抽出物を回収し、任意選択により抽出物をさらに精製して組成物を形成する工程
を含む方法を提供し、ここで、植物材料は種子を含まない。
【００２０】
第４の態様において、本発明は、１種又は複数種のロリンアルカロイドを植物材料から抽出する方法であって、
ａ）少なくとも１種の内生寄生菌に感染しているか感染したことがある植物に由来する植物材料を提供する工程、
ｂ）植物材料及び水を混合する工程、
ｃ）混和物を少なくとも約６５℃の温度で維持して、１種又は複数種のロリンアルカロイド化合物を含む抽出物を得る工程、
ｄ）抽出物を回収し、任意選択により抽出物をさらに精製する工程
を含む方法を提供し、ここで、植物材料は種子を含まない。
【００２１】
第５の態様において、本発明は、１種又は複数種のロリンアルカロイドを含む組成物を生成する方法であって、
ａ）少なくとも１種の内生寄生菌に感染しているか感染したことがある植物に由来する粉末化した植物材料を提供する工程、
ｂ）植物材料及び水溶液を混合する工程、
ｃ）混和物を少なくとも約５０℃の温度で少なくとも約１５分間の期間維持して、１種又は複数種のロリンアルカロイド化合物を含む抽出物を得る工程、
ｄ）抽出物を回収し、任意選択により抽出物をさらに精製して、１種又は複数種のロリンアルカロイドを含む組成物を形成する工程
を含む方法を提供する。
【００２２】
第６の態様において、本発明は、本発明の方法により生成された１種又は複数種のロリンアルカロイドを含む、このロリンアルカロイドから本質的に構成される、又は、このロリンアルカロイドから構成される組成物又は抽出物を提供する。
【００２３】
第７の態様において、本発明は、１種又は複数種のロリンアルカロイドを含む組成物を生成する方法を提供するものであり、この方法は
本発明の方法により調製した抽出物を提供する工程
ａ）１種もしくは複数種のロリンアルカロイドとキャリアとを組み合わせる工程、又は
ｂ）上澄みもしくは抽出物、又は、その画分とキャリアとを組み合わせる工程、又は
ｃ）１種もしくは複数種のロリンアルカロイドを上澄みから分離し、及び、任意選択により、前記分離した１種もしくは複数種のロリンアルカロイドとキャリアとを組み合わせる工程、又は
ｄ）１種もしくは複数種のロリンアルカロイドを少なくとも部分的に精製し、又は、単離し、及び、任意選択により、前記精製もしくは単離した１種又は複数種のロリンアルカロイドとキャリアとを組み合わせる工程、又は
ｅ）（ａ）〜（ｅ）の２つ以上のいずれかの組み合わせ、
を含み、これにより組成物を提供する。
【００２４】
第８の態様において、本発明は、原材料から１種又は複数種のロリンアルカロイドを濃縮する方法を提供するものであり、原材料は１種又は複数種のロリンアルカロイドを含む水溶液を含み、この方法は
ａ）有機分子と結合可能であるクロマトグラフィ固定相を提供する工程、
ｂ）原材料と固定相とを、固定相が１種又は複数種のロリンアルカロイドと結合するのに十分な時間接触させる工程、
ｃ）固定相に結合した１種又は複数種のロリンアルカロイドをクロマトグラフィにより溶出し、これにより、溶出液を得る工程、及び
ｄ）１種又は複数種のロリンアルカロイドを含有する溶出液を回収する工程
を含む。
【００２５】
一実施形態において、濃縮する方法は溶剤体積に対して濃縮するものであり、１種又は複数種の他の化合物に対する１種又は複数種のロリンアルカロイドの相対濃度の増加を含んでいても、いなくてもよい。
【００２６】
以下の実施形態は本明細書における態様のいずれかに関し得る。
【００２７】
種々の実施形態において、ロリンアルカロイドは、式［Ｉ］：
【化１】
2017538703.tif 000002
（式中：
Ｒ＝Ｈ又はＣＨ3、及び
Ｒ’＝Ｈ、ＣＨ3、ＣＨＯ、ＣＯＣＨ3）
の１種又は複数種のロリンアルカロイドを含む。
【００２８】
より具体的には、式［Ｉ］は以下を含む：
ロリン（式中、Ｒ＝ＣＨ3及びＲ’＝Ｈ）；
ノルロリン（式中、Ｒ＝Ｈ及びＲ’＝Ｈ）；
Ｎ−メチルロリン（式中、Ｒ＝ＣＨ3及びＲ’＝ＣＨ3）；
Ｎ−ホルミルロリン（式中、Ｒ＝ＣＨ3及びＲ’＝ＣＨＯ）；
Ｎ−ホルミルノルロリン（式中、Ｒ＝Ｈ及びＲ’＝ＣＨＯ）；
Ｎ−アセチルロリン（式中、Ｒ＝ＣＨ3及びＲ’＝ＣＯＣＨ3）；
Ｎ−アセチルノルロリン（式中、Ｒ＝Ｈ及びＲ’＝ＣＯＣＨ3）。
【００２９】
種々の実施形態において、１種又は複数種のロリンアルカロイドは、ロリン、Ｎ−アセチルロリン（ＮＡＬ）、Ｎ−ホルミルロリン（ＮＦＬ）、Ｎ−アセチルノルロリン（ＮＡＮＬ）及びＮ−メチルロリン（ＮＭＬ）からなる群から選択される。
【００３０】
一実施形態において、内生寄生菌は、少なくとも１種のロリンアルカロイド化合物を生成することを特徴とする。より好ましくは、内生寄生菌は、エピクロエ属（Ｅｐｉｃｈｌｏｅ）（ネオティホディウム属（Ｎｅｏｔｙｐｈｏｄｉｕｍ）としても公知である）のものを含む。
【００３１】
１種又は複数種のネオティホディウム属（Ｎｅｏｔｙｐｈｏｄｉｕｍ）又はエピクロエ属（Ｅｐｉｃｈｌｏｅ）内生寄生菌は、植物／内生寄生菌共生者として存在する場合に１種又は複数種のロリンアルカロイドを生成することが可能である１種又は複数種の分離株であることが認識されるであろう。
【００３２】
種々の実施形態において、１種又は複数種のネオティホディウム属（Ｎｅｏｔｙｐｈｏｄｉｕｍ）又はエピクロエ属（Ｅｐｉｃｈｌｏｅ）内生寄生菌は、ネオティホディウムウンチナツム（Ｎｅｏｔｙｐｈｏｄｉｕｍ  ｕｎｃｉｎａｔｕｍ）分離株である。一実施形態において、ネオティホディウムウンチナツム（Ｎｅｏｔｙｐｈｏｄｉｕｍ  ｕｎｃｉｎａｔｕｍ）分離株は、本明細書に記載の分離株から選択される。
【００３３】
完全な種子は、実質的に無傷の種子であること、及び、粉末化、粉砕、又は、例えば表面積が増加するような他の方法、もしくは、例えば種子クチクラの除去、穿孔もしくは完全性の損失といった他の方法で物理的に改変されていない種子であることが認識されるであろう。一実施形態において、完全な種子は発芽可能な種子である。
【００３４】
一実施形態において、種子又は植物材料は、ウシノケグサ属（Ｆｅｓｔｕｃａ）に由来する。好ましくは、植物又はその一部は、ヒロハノウシノケグサ又はトールフェスク種の草である。
【００３５】
種々の実施形態において、植物材料は、植物全体、根、葉、花、茎、擬茎等を含む。一実施形態において、植物材料は植物の牧草を含む。
【００３６】
一実施形態において、植物材料は乾燥、例えば、凍結乾燥されている。一実施形態において、植物材料は粉末化されている。
【００３７】
一実施形態において、水溶液は水を含む。一実施形態において、水溶液は、酸又は塩基、例えば、水酸化アンモニウム又は酢酸を含む。他の実施形態において、水溶液は、有機溶剤、例えば、メタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリル、プロパノール又は２−プロパノールを含む。一実施形態において、水溶液は酢酸を含む。さらなる実施形態において、水溶液はアンモニアを含む。
【００３８】
一実施形態において、水溶液又は水は、種子又は植物材料と混合される前に抽出温度に加熱される。他の実施形態において、水溶液又は水は、種子又は植物材料と水又は水溶液とを混合した後に抽出温度に加熱される。
【００３９】
種々の実施形態において、種子又は植物材料は、少なくとも約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、９９、１００、１０５、１１０、１１５又は約１２０℃の温度を有する水溶液又は水と混合され、有用な範囲は、これらの値のいずれかの間から選択され得る（例えば、約５０〜約１２０、約５０〜約１１０、約５０〜約１００、約５０〜約９９、約５０〜約９５、約５０〜約９０、約５０〜８５、約５０〜約８０、約６０〜約１２０、約６０〜約１１０、約６０〜約１００、約６０〜約９９、約６０〜約９５、約６０〜約９０、約６０〜約８５、約６０〜約８０、約７０〜約１２０、約７０〜約１１０、約７０〜約１００、約７０〜約９９、約７０〜約９８、約７０〜約９５、約７０〜約９０、約７０〜約８５、約７０〜約８０、約７５〜約１２０、約７５〜約１１０、約７５〜約１００、約７５〜約９９、約７５〜約９８、約７５〜約９５、約７５〜約９０、約７５〜約８５、約７５〜約８０、約８０〜約１２０、約８０〜約１１０、約８０〜約１００、約８０〜約９９、約８０〜約９８、約８０〜約９５、約８０〜約９０、約８５〜約１２０、約８５〜約１１０、約８５〜約１００、約８５〜約９９、約８５〜約９８、約８５〜約９５、約９０〜約１２０、約９０〜約１１０、約９０〜約１００、約９０〜約９９、約９０〜約９８、約９５〜９８又は約９０〜約９５℃）。
【００４０】
特定の想定される実施形態において、粉末化した種子を含まない粉末化した植物材料は、少なくとも約５０℃の温度を有する水溶液又は水と混合される。
【００４１】
他の特定の想定される実施形態において、完全な種子は、少なくとも約５０℃、例えば、約５０℃〜約７５℃の温度を有する水溶液又は水と混合される。
【００４２】
粉末化した植物材料が粉末化した種子であるか粉末化した種子を含む他の特定の想定される実施形態において、植物材料又は粉末化した種子は、少なくとも約９０℃、例えば、約９０℃〜約９８℃又は約９５℃〜約９８℃の温度を有する水溶液もしくは水と混合される。
【００４３】
例えば、粉末化した植物材料が粉末化した種子であるか粉末化した種子を含む一実施形態においては、
ａ）粉末化した植物材料が少なくとも約９０℃の温度を有する水溶液もしくは水と混合され、又は
ｂ）混和物が少なくとも約９０℃の温度で少なくとも約１５分間の期間維持され、又は
ｃ）上記のａ）及びｂ）の両方が行われる。
【００４４】
粉末化した植物材料が粉末化した種子であるか粉末化した種子を含む他の実施形態においては、
ａ）粉末化した植物材料が約９５℃〜約９８℃の温度を有する水溶液もしくは水と混合され、又は
ｂ）混和物が約９５℃〜約９８℃の温度で少なくとも約１５分間の期間維持され、又は
ｃ）上記のａ）及びｂ）の両方が行われる。
【００４５】
種々の実施形態において、水溶液のｐＨは、約６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５のｐＨ又は約ｐＨ１０に調節されるか維持され、有用な範囲は、これらの値のいずれかの間から選択され得る（例えば、約６〜約１０、約６〜約９．５、約６〜約９、約７〜約１０、約７〜約９．５、約７〜約９、約８〜約１０、約８〜約９．５又は約８〜約９）。種々の実施形態において、水のｐＨは約７のｐＨで維持される。
【００４６】
一例において、水溶液は７超のｐＨを有する。一例において、水溶液は少なくとも７〜約９のｐＨを有する。他の例において、水溶液は、少なくとも約７．５〜約９のｐＨを有する。
【００４７】
一例において、水溶液は７未満のｐＨを有する。一例において、水溶液は約４．５〜約７のｐＨを有する。他の例において、水溶液は約４．５〜約６．５のｐＨを有する。
【００４８】
一実施形態において、水溶液又は水は約５０Ｌ超の体積を有する。一実施形態において、水溶液の体積は、約１００Ｌ超、約１５０Ｌ超、約２００Ｌ超、約３００Ｌ超、約４００Ｌ超、約５００Ｌ超又は約１０００Ｌ超である。
【００４９】
一実施形態において、水溶液又は水は、約１Ｌ／植物材料又は種子１ｋｇの体積を有する。一実施形態において、水溶液の体積は、約２Ｌ超／植物材料又は種子１ｋｇ、約３Ｌ超／植物材料又は種子１ｋｇ、約４Ｌ超／植物材料又は種子１ｋｇ、約５Ｌ超／植物材料又は種子１ｋｇ、約７．５Ｌ超／植物材料又は種子１ｋｇ、約１０Ｌ超／植物材料又は種子１ｋｇ、約１２．５Ｌ超／植物材料又は種子１ｋｇ、約１５Ｌ超／植物材料又は種子１ｋｇ、約１７．５Ｌ超／植物材料又は種子１ｋｇ、約２０Ｌ超／植物材料又は種子１ｋｇ、約２５Ｌ超／植物材料又は種子１ｋｇ又は約３０Ｌ超／植物材料又は種子１ｋｇである。
【００５０】
種々の実施形態において、混和物は、少なくとも約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、９９又は約１００℃の温度で維持され、有用な範囲は、これらの値のいずれかの間から選択され得る（例えば、約５０〜約９９、約５０〜約９５、約５０〜約９０、約５０〜８５、約５０〜約８０、約６０〜約１００、約６０〜約９９、約６０〜約９５、約６０〜約９０、約６０〜約８５、約６０〜約８０、約７０〜約１００、約７０〜約９９、約７０〜約９８、約７０〜約９５、約７０〜約９０、約７０〜約８５、約７０〜約８０、約７５〜約１００、約７５〜約９９、約７５〜約９８、約７５〜約９５、約７５〜約９０、約７５〜約８５、約７５〜約８０、約８０〜約１００、約８０〜約９９、約８０〜約９８、約８０〜約９５、約８０〜約９０、約８５〜約１００、約８５〜約９９、約８５〜約９８、約８５〜約９５、約９０〜約１００、約９０〜約９９、約９０〜約９８又は約９０〜約９５℃）。
【００５１】
特定の想定される実施形態において、種子を含まない粉末化した植物材料を含むかこれから構成される混和物は、少なくとも約５０℃の温度で維持される。
【００５２】
他の特定の想定される実施形態において、完全な種子を含むかこれから構成される混和物は、少なくとも約５０℃、例えば約５０℃〜約７５℃の温度で維持される。
【００５３】
粉末化した植物材料が粉末化した種子であるか粉末化した種子を含む他の特定の想定される実施形態において、混和物は、少なくとも約９０℃、例えば約９０℃〜約９８℃、又は、約９５℃〜約９８℃の温度で維持される。
【００５４】
一実施形態において、混和物は、約１気圧の圧力で維持される。他の実施形態において、混和物は１気圧超の圧力で維持される。種々の実施形態において、混和物は、約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５又は約２ｂａｒの圧力で維持され、有用な範囲は、これらの値のいずれかの間から選択され得る（例えば、約１．１ｂａｒ〜約１．５ｂａｒ又は約１．２ｂａｒ〜約１．５ｂａｒ又は約１．２ｂａｒ〜約１．４ｂａｒ）。他の実施形態において、混和物は、約２ｂａｒ又は２ｂａｒ超の圧力で維持される。
【００５５】
例えば完全な種子を用いる実施形態といった一実施形態において、混和物は、１種又は複数種のロリンアルカロイドが、少なくとも約０．０２５、０．０５、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．５、０．７５、１、１．２５、１．５、１．７５又は２ｍｇ／ｍＬの濃度で存在するまで維持される。例えば植物の牧草を用いる実施形態といった他の実施形態において、混和物は、ロリンアルカロイドの合計濃度が、少なくとも約０．０１、０．０１５、０．０２、０．０２５、０．０５、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．５、０．７５、１、１．２５、１．５、１．７５又は２ｍｇ／ｍＬとなるまで維持される。
【００５６】
一実施形態において、混和物は、１種又は複数種のロリンアルカロイドの抽出に十分な期間維持される。種々の実施形態において、混和物は、少なくとも約２、５、７、１０、１５、２０、２５、３０、４０、４５、５０もしくは６０分間、又は、約０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７．５、８、９、１０、１１、１２、１８又は約２４時間の期間維持され、有用な範囲は、これらの値のいずれかの間から選択され得る（例えば、約５〜６０、５〜４５、５〜３０、５〜２０、５〜１５、１０〜６０、１０〜４５、１０〜３０、１０〜２０、１５〜６０、１５〜４５、１５〜３０、２０〜６０、３０〜４５、又は、約２０〜３０分間、又は、約０．５〜１２、０．５〜６、０．５〜３、１〜１２、１〜６、１〜５、１〜３、２〜１２、２〜６、２〜５、２〜３、２．５〜１２、２．５〜６、２．５〜５、２．５〜４もしくは約２．５〜３時間）。
【００５７】
一実施形態において、混和物は、ＮＡＬの濃度が少なくとも約１０μｇ／ｍＬとなるまで維持される。例えば、混和物は、ＮＡＬの濃度が、少なくとも約２０μｇ／ｍＬ、少なくとも約２５μｇ／ｍＬ、少なくとも約３０μｇ／ｍＬ、少なくとも約３５μｇ／ｍＬ、少なくとも約４０μｇ／ｍＬ、少なくとも約４５μｇ／ｍＬ、少なくとも約５０μｇ／ｍＬ、少なくとも約６０μｇ／ｍＬ、少なくとも約７０μｇ／ｍＬ、少なくとも約７５μｇ／ｍＬ、少なくとも約１００μｇ／ｍＬ、少なくとも約２００μｇ／ｍＬ、少なくとも約３００μｇ／ｍＬ又は少なくとも約４００μｇ／ｍＬとなるまで維持される。
【００５８】
一実施形態において、混和物は、ＮＡＮＬの濃度が少なくとも約５μｇ／ｍＬとなるまで維持される。例えば、混和物は、ＮＡＮＬの濃度が、少なくとも約１０μｇ／ｍＬ、少なくとも約１５μｇ／ｍＬ、少なくとも約２０μｇ／ｍＬ、少なくとも約２５μｇ／ｍＬ、少なくとも約３０μｇ／ｍＬ、少なくとも約４０μｇ／ｍＬ、少なくとも約５０μｇ／ｍＬ、少なくとも約６０μｇ／ｍＬ、少なくとも約７０μｇ／ｍＬ、少なくとも約８０μｇ／ｍＬ、少なくとも約９０μｇ／ｍＬ、少なくとも約１００μｇ／ｍＬ、少なくとも約１１０μｇ／ｍＬ、少なくとも約１２０μｇ／ｍＬ、少なくとも約１３０μｇ／ｍＬ又は少なくとも約１４０μｇ／ｍＬ又は少なくとも約１５０μｇ／ｍＬとなるまで維持される。
【００５９】
一実施形態において、混和物は、ＮＦＬの濃度が少なくとも約１００μｇ／ｍＬになるまで維持される。例えば、混和物は、ＮＦＬの濃度が、少なくとも約１２５μｇ／ｍＬ、少なくとも約１５０μｇ／ｍＬ、少なくとも約１７５μｇ／ｍＬ、少なくとも約２００μｇ／ｍＬ、少なくとも約２２５μｇ／ｍＬ、少なくとも約２５０μｇ／ｍＬ、少なくとも約３００μｇ／ｍＬ、少なくとも約３５０μｇ／ｍＬ、少なくとも約４００μｇ／ｍＬ、少なくとも約４５０μｇ／ｍＬ、少なくとも約５００μｇ／ｍＬ、少なくとも約５５０μｇ／ｍＬ、少なくとも約６００μｇ／ｍＬ、少なくとも約６５０μｇ／ｍＬ、少なくとも約７００μｇ／ｍＬ又は、少なくとも約７５０μｇ／ｍＬとなるまで維持される。
【００６０】
一実施形態において、主なロリンアルカロイドはＮＦＬである。
【００６１】
種々の実施形態において、例えば完全な種子を用いる実施形態において、組成物又は抽出物における［ＮＡＬ］：［ＮＦＬ］の比は、約１：１０超、約１：８、約１：６、約１：５、約１：４、約１：３又は約１：２である。例示的な一実施形態において、［ＮＡＬ］：［ＮＦＬ］の比は約１：３である。
【００６２】
種々の実施形態であって、例えば牧草を用いる実施形態において、組成物又は抽出物における［ＮＡＬ］：［ＮＦＬ］の比は、約１：８超、約１：６、約１：４、約３：１１、約１：３又は約１：２である。例示的な一実施形態において、［ＮＡＬ］：［ＮＦＬ］の比は約３：１１である。
【００６３】
種々の実施形態において、例えば完全な種子を用いる実施形態において、組成物又は抽出物における［ＮＡＮＬ］：［ＮＦＬ］の比は、約１：１２超、約１：１０、約１：８．５、約１：８、約１：７．５、約１：７、約１：６又は約１：５である。例示的な一実施形態において、［ＮＡＬ］：［ＮＦＬ］の比は約１：７．５である。
【００６４】
種々の実施形態であって、例えば牧草を用いる実施形態において、組成物又は抽出物における［ＮＡＮＬ］：［ＮＦＬ］の比は、約３：４超、約２：３、約１：２、約６：１１又は約１：１である。例示的な一実施形態において、［ＮＡＬ］：［ＮＦＬ］の比は約６：１１である。
【００６５】
種々の実施形態において、例えば完全な種子を用いる実施形態において、組成物又は抽出物における［ＮＡＮＬ］：［ＮＡＬ］の比は、約１：５超、約１：４、約１：３、約１：２、約２：３、４：５又は約５：６である。例示的な一実施形態において、［ＮＡＬ］：［ＮＦＬ］の比は約２：３である。
【００６６】
種々の実施形態であって、例えば牧草を用いる実施形態において、組成物又は抽出物における［ＮＡＮＬ］：［ＮＡＬ］の比は、約６：５超、約５：４、約３：２、約２：１、約３：１又は約４：１である。例示的な一実施形態において、［ＮＡＬ］：［ＮＦＬ］の比は約２：１である。
【００６７】
一実施形態において、抽出物は、１つ又は複数の少なくとも部分的な精製工程に供される。
【００６８】
種々の実施形態において、抽出物のｐＨは、約６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５のｐＨ又は約ｐＨ１０に調節されるか維持され、有用な範囲は、これらの値のいずれかの間から選択され得る（例えば、約６〜約１０、約６〜約９．５、約６〜約９、約７〜約１０、約７〜約９．５、約７〜約９、約８〜約１０、約８〜約９．５又は約８〜約９）。
【００６９】
一実施形態において、少なくとも部分的な精製は、抽出物を冷却して、抽出物中に存在する固形分を析出させる工程、及び、析出した固形分を抽出物から分離する工程を含む。種々の実施形態において、抽出物は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１５、１６、１８又は約２０℃の温度に冷却され、有用な範囲は、これらの値のいずれかの間から選択され得る（例えば、約１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜９、１〜８、１〜６、１〜５、２〜２０、２〜１５、２〜１０、２〜９、２〜８、２〜６、２〜５、３〜２０、３〜１５、３〜１０、３〜８、３〜６、４〜２０、４〜１５、４〜１０、４〜９、４〜８、４〜６、５〜２０、５〜１５、５〜１０、５〜９又は約５〜８℃）。特に好ましい実施形態において、上澄みは約２〜約８℃の温度に冷却される。
【００７０】
種々の実施形態において、少なくとも部分的な精製は、例えばナノろ過、限外ろ過又は精密ろ過といったろ過による分離を含む。
【００７１】
一実施形態において、少なくとも部分的な精製は、抽出物を１種又は複数種のセディメントフィルタを用いてろ過して、ろ液を得る工程を含む。一実施形態において、抽出物はろ過前に約ｐＨ９に調節される。種々の実施形態において、セディメントフィルタは、約１、２．５、５、７．５、１０、１２．５、１５、２０、２５又は３０μｍの孔径を有する。種々の実施形態においては、孔径が異なる２種以上のセディメントフィルタが連続して用いられる。種々の実施形態において、フィルタは、流入側の孔径定格が大きく、流出側の小さい孔径定格に減少していく密度勾配型を有する。例えば、フィルタは、７５μｍ〜２５μｍの密度勾配型の孔径、又は、５０μｍ〜５μｍの密度勾配型の孔径、又は、２５μｍ〜１μｍの密度勾配型の孔径である。
【００７２】
一例において、少なくとも部分的な精製は２種以上のフィルタを用いてろ液をもたらす連続ろ過を含む。一例において、少なくとも部分的な精製は２種以上のフィルタを介する連続ろ過を含み、ここで、各フィルタは、直前のフィルタよりも孔径が小さいものである。一例において、少なくとも部分的な精製は、２種以上の密度勾配型フィルタを用いる連続ろ過を含む。
【００７３】
種々の実施形態において、少なくとも部分的な精製は、乾燥もしくは蒸発（噴霧乾燥など）又は析出を含む。
【００７４】
一実施形態において、少なくとも部分的な精製は、超臨界抽出による分離を含む。
【００７５】
一実施形態において、少なくとも部分的な精製は、液体−液体分割（液体−液体抽出又は溶剤抽出）による分離を含む。
【００７６】
一実施形態において、少なくとも部分的な精製は、クロマトグラフィによる分離を含む。
【００７７】
例えば、一実施形態において、少なくとも部分的な精製は、抽出物又はろ液と１つもしくは複数のクロマトグラフィ固定相とを、固定相が１種もしくは複数種のロリンアルカロイドと結合するのに十分な時間の間接触させる工程、クロマトグラフィにより、１種もしくは複数種の汚染物を固定相に結合した１種もしくは複数種のロリンアルカロイドから分離する工程、又は、クロマトグラフィにより、固定相に結合した１種もしくは複数種のロリンアルカロイドを濃縮する工程、及び、１種又は複数種のロリンアルカロイドを回収する工程を含む。
【００７８】
一実施形態において、固定相は、例えば疎水性マトリックスを含む逆相クロマトグラフィ固定相といった、逆相クロマトグラフィ固定相である。一実施形態において、固定相は、非選択的な吸着媒を含む。一実施形態において、固定相は、少なくとも中程度に極性の化合物に対する結合に好適な高分子吸着媒である。一実施形態において、固定相はカラム中に保持される。
【００７９】
一実施形態において、固定相は、スチレン−ジビニルベンゼンポリマー樹脂、例えば、Ｓｔｒａｔａ−Ｘ（商標）ＳＰＥ樹脂、Ｓｅｐａｂｅａｄｓ（登録商標）ＳＰ−２０７樹脂、Ｓｅｐａｂｅａｄｓ（登録商標）ＳＰ−７０樹脂又はＤｉａｉｏｎ（登録商標）ＨＰ−２０樹脂を含む。
【００８０】
一実施形態において、１種又は複数種のロリンアルカロイドは、極性有機溶剤、又は、例えばエタノールといった混合水性有機溶剤を用いて回収して、１種又は複数種のロリンアルカロイドを含む溶出液が得られる。一実施形態においては、１種又は複数種のロリンアルカロイドを含む２つ以上の画分が回収され、組み合わされて溶出液とされる。
【００８１】
例示的な一実施形態において、少なくとも部分的な精製は、極性溶剤中の抽出物又はろ液と、スチレン−ジビニルベンゼンポリマー樹脂とを固定相が１種又は複数種のロリンアルカロイドと結合するのに十分な時間接触させる工程、約５％〜約９９％エタノール、好ましくは約９６％エタノールを含む溶液を用いて１種又は複数種のロリンアルカロイドを溶出して溶出液を得る工程、及び、溶出液を収集する工程を含む。
【００８２】
一実施形態において、抽出物又はろ液のｐＨは、抽出物が固定相で濃縮される前に、少なくとも約ｐＨ９のｐＨに調節される。例えば、抽出物のｐＨは、抽出物をろ過する前に少なくとも約ｐＨ９のｐＨに調節される。
【００８３】
一実施形態において、抽出物又はろ液のｐＨは、抽出物又はろ液と固定相とを接触させる前に、約ｐＨ１０〜約ｐＨ１２のｐＨに調節される。
【００８４】
一実施形態においては、例えばロータリー蒸発、又は、ワイプ薄膜蒸発（ｗｉｐｅｄ  ｆｉｌｍ  ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）もしくは流下膜式蒸発によって溶剤を蒸発させることにより、１種又は複数種のロリンアルカロイドを含む溶出液から溶剤が除去され得る。
【００８５】
一実施形態において、１種又は複数種のロリンアルカロイドを含有する溶出液及び水溶液は、溶出液と、例えばアセトニトリル、エタノール又はメタノールといった溶剤とを混合して、溶出液中の１種又は複数種の不純物又は汚染物を析出させることによりさらに精製される。１種又は複数種のロリンアルカロイドを含む溶剤相は、傾瀉により析出物から分離され得る。
【００８６】
一実施形態において、少なくとも部分的な精製は、抽出物、ろ液又は溶出液と、例えば活性炭といった炭素供給源とを接触させる工程、及び、精製した画分を回収する工程を含む。
【００８７】
一実施形態においては、例えばロータリー蒸発によって溶剤を蒸発させることにより、抽出物、ろ液、溶出液又は精製した画分から溶剤が除去され、１種又は複数種のロリンアルカロイドを含む乾燥した生成物が回収される。
【００８８】
例示的な一実施形態において、本発明は、１種又は複数種のロリンアルカロイドを含む組成物を生成する方法、又は、１種又は複数種のロリンアルカロイドを種子から抽出する方法を提供するものであり、この方法は、
ａ）少なくとも１種の内生寄生菌に感染した植物に由来する完全な種子を提供する工程、
ｂ）種子と少なくとも約８５℃の温度を有する水溶液とを混合する工程、
ｃ）混和物を、約１〜約６時間の期間、約８５℃〜約１００℃の温度で維持して、１種又は複数種のロリンアルカロイドを含む抽出物を得る工程、
ｄ）抽出物を回収する工程、
ｅ）抽出物とクロマトグラフィ固定相とを接触させて、１種又は複数種のロリンアルカロイドを固定相に結合させる工程、
ｆ）溶剤を用いて１種又は複数種のロリンアルカロイドを固定相から溶出して、１種又は複数種のロリンアルカロイドを含有する溶出液を回収する工程、
ｇ）溶出液と溶剤とを混合して１種又は複数種の不純物を析出させ、析出した固形分を溶出液から分離して、溶剤精製した抽出物を得る工程、
ｈ）溶剤精製した抽出物をろ過し、精製した抽出物を回収する工程、並びに
ｉ）精製した抽出から溶剤を蒸発させ、乾燥させた精製した抽出を回収して、１種又は複数種のロリンアルカロイドを含む組成物を得る工程
を含む。
【００８９】
他の例示的な実施形態において、本発明は、１種又は複数種のロリンアルカロイドを含む組成物を生成する方法、又は、１種又は複数種のロリンアルカロイドを種子から抽出する方法を提供するものであり、この方法は、
ａ）少なくとも１種の内生寄生菌に感染した植物に由来する完全な種子を提供する工程、
ｂ）種子と少なくとも約８５℃の温度を有する水溶液とを混合する工程、
ｃ）混和物を、約１〜約６時間の期間、約８５℃〜約１００℃の温度で維持して、１種又は複数種のロリンアルカロイドを含む抽出物を得る工程、
ｄ）抽出物を回収する工程、
ｅ）抽出物を冷却して上澄み中に存在する固形分を析出させ、析出した固形分を抽出物から分離して冷却した抽出物を得る工程、
ｆ）冷却した抽出物を１種又は複数種のセディメントフィルタを用いてろ過して、ろ過した抽出物を得る工程、
ｇ）ろ過した抽出物とクロマトグラフィ固定相とを接触させて、１種又は複数種のロリンアルカロイドを固定相に結合させる工程、
ｈ）溶剤を用いて１種又は複数種のロリンアルカロイドを固定相から溶出して、１種又は複数種のロリンアルカロイドを含有する溶出液を回収する工程、
ｉ）溶剤を溶出液から蒸発させて、濃縮溶出液を得る工程、
ｊ）溶出液と水溶液及び溶剤（好ましくはアセトニトリル）とを混合して、１種又は複数種の不純物を析出させ、析出した固形分を溶出液から分離して溶剤精製した抽出物を得る工程、
ｋ）溶剤精製した抽出物と活性炭とを接触させ、精製した抽出物を回収する工程、並びに
ｌ）精製した抽出から溶剤を蒸発させ、乾燥させた精製した抽出を回収して、１種又は複数種のロリンアルカロイドを含む組成物を得る工程
を含む。
【００９０】
他の例示的な実施形態において、本発明は、１種又は複数種のロリンアルカロイドを含む組成物を生成する方法であって、
ａ）少なくとも１種の内生寄生菌に感染しているか感染したことがある植物に由来する植物材料を提供する工程、
ｂ）植物材料及び水を混合する工程、
ｃ）混和物を約１５〜約６０分間の期間、少なくとも約６５℃の温度で維持して、１種又は複数種のロリンアルカロイド化合物を含む抽出物を得る工程、
ｄ）抽出物を回収し、任意選択により抽出物をさらに精製して組成物を形成する工程
を含む方法を提供するものであり、ここで、植物材料は種子を含まない。
【００９１】
他の例示的な実施形態において、本発明は、１種又は複数種のロリンアルカロイドを含む組成物を生成する方法であって、
ａ）少なくとも１種の内生寄生菌に感染しているか感染したことがある植物に由来する粉末化した植物材料を提供する工程、
ｂ）粉末化した植物材料及び水溶液を混合する工程、
ｃ）混和物を少なくとも約５０℃の温度で少なくとも約１５分間の期間維持して、１種又は複数種のロリンアルカロイド化合物を含む抽出物を得る工程、
ｄ）抽出物を回収し、任意選択により抽出物をさらに精製して、１種又は複数種のロリンアルカロイドを含む組成物を形成する工程
を含む方法を提供する。
【００９２】
他の例示的な実施形態において、本発明は、１種又は複数種のロリンアルカロイドを含む組成物を生成する方法であって、
ａ）少なくとも１種の内生寄生菌に感染しているか感染したことがある植物に由来する粉末化した植物材料を提供する工程、
ｂ）粉末化した植物材料と少なくとも７のｐＨを有する水溶液とを混合する工程、
ｃ）混和物を少なくとも約５０℃の温度で少なくとも約１５分間の期間維持して、１種又は複数種のロリンアルカロイド化合物を含む抽出物を得る工程、
ｄ）抽出物をろ過してろ液を得る工程、
ｅ）ろ液のｐＨを７超、例えば、約８、約９、約１０又は約１１のｐＨに調節する工程、
ｆ）ｐＨ調節したろ液と、１種又は複数種のロリンアルカロイドに少なくとも７のｐＨで結合可能であるクロマトグラフィ固定相とを接触させる工程、
ｇ）クロマトグラフィ固定相と、１種又は複数種のロリンアルカロイドを溶出する有機溶剤とを接触させる工程、並びに
ｈ）１種又は複数種のロリンアルカロイドを含有する溶出液を回収して、１種又は複数種のロリンアルカロイドを含む組成物を得る工程
を含む方法を提供する。
【００９３】
一実施形態において、方法は、例えば２０ｍｍの有孔メッシュを通過可能なサイズに植物材料を粉末化する予備的な工程を含む。
【００９４】
一実施形態において、組成物又は抽出物は、１種又は複数種の昆虫の防除における使用に好適である。例えば、組成物又は抽出物は殺虫性組成物又は抽出物である。
【００９５】
一実施形態において、抽出物中における１種又は複数種のロリンアルカロイドの純度は、少なくとも約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８又は９９％である。
【００９６】
一実施形態において、抽出における種子又は植物材料からの１種又は複数種のロリンアルカロイドの収率は、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％である。
【００９７】
本発明はさらに、特に、植物及びヒト有害生物、又は、昆虫、線虫及び草食動物などの非ヒト動物有害生物といった有害生物の防除における組成物の使用方法に関する。
【００９８】
例えば、有害生物個体群の防除方法もまた本発明によって提供される。この方法は一般に、個体群と有害生物防除的に有効な量の本明細書に記載の組成物とを接触させる工程を含む。このような方法は、所与の領域における標的有害生物を死滅させるかその数を減少させるために用いられ得、又は、感受性を有する有害生物による外寄生を予防するために、環境的領域などの生息地に予防的に適用され得る。
【００９９】
本発明はさらに、例えば、１種もしくは複数種の植物病原性昆虫もしくは線虫、又は、１種もしくは複数種の動物種の１種もしくは複数種の昆虫もしくは線虫有害生物といった、１種又は複数種の病原性病害虫などの１種又は複数種の昆虫又は線虫有害生物を含む１種又は複数種の有害生物を防除するための本発明の組成物の使用に関する。
【０１００】
一実施形態において、本発明は、例えば、１種又は複数種の動物種の１種又は複数種の病害虫といった１種又は複数種の病原性昆虫を含む１種又は複数種の昆虫を防除する方法を提供し、この方法は、１種又は複数種の昆虫と本発明の組成物とを接触させる工程を含む。
【０１０１】
１種又は複数種の有害生物を防除するための組成物の生産における、本発明の方法により生成される混和物、抽出物、画分、溶出液の使用は、同様に想定される。
【０１０２】
対象における有害生物又は寄生性感染を処置又は予防するための医薬品の生産における、本発明の方法によって生成される混和物、抽出物、画分、溶出液、又は、本発明の組成物の使用は同様に想定される。
【０１０３】
本発明はさらに、１種もしくは複数種の寄生性もしくは病原性昆虫、又は、植物病原性昆虫を含む１種又は複数種の昆虫などの１種又は複数種の有害生物を防除する方法に関し、この方法は、植物又はその周囲などの生息地に本発明の組成物を適用する工程を含む。この方法はまた、本発明の組成物を寄生性又は病原性病害虫に感染している対象に投与する工程を含み得る。
【０１０４】
他の態様において、本発明は、１種もしくは複数種の有害生物防除剤又は１種もしくは複数種の病原性薬剤に対する有害生物の耐性を、完全に又は部分的に戻す方法を提供し、この方法は、昆虫と本発明の組成物とを接触させる工程を含む。
【０１０５】
任意選択により、方法は、有害生物と本発明の組成物とを、１種もしくは複数種の有害生物防除剤又は１種もしくは複数種の病原性薬剤(pathogenic agent)、又は、これらの組み合わせと一緒に接触させる工程を含む。
【０１０６】
種々の実施形態において、投与する１種もしくは複数種の有害生物防除剤、又は、１種もしくは複数種の病原性薬剤は、有害生物が耐性であるか、耐性になると想定されるものと同一である。
【０１０７】
さらなる態様において、本発明は、１種又は複数種の有害生物を防除する方法であって、前記１種又は複数種の有害生物の防除に効果的である有害生物防除剤又は病原性薬剤の量で本発明の組成物と接触させられた１種又は複数種の有害生物を防除する方法を提供する。
【０１０８】
１種もしくは複数種の有害生物防除剤、又は、１種もしくは複数種の病原性薬剤は、本発明の組成物の投与に先行して、同時に、又は、その後に投与され得る。従って、１種又は複数種の本発明の組成物及び１種もしくは複数種の有害生物防除剤又は１種もしくは複数種の病原性薬剤の投与は、同時、順次又は別個であり得る。
【０１０９】
他の態様において、本発明は植物の成長又は繁殖を増強する方法に関し、この方法は、植物と本発明の組成物とを接触させる工程を含む。
【０１１０】
一実施形態において、この方法は、顕著な殺草性、又は、殺草性の症状を伴うこと無く植物の成長又は繁殖を増強させる。
【０１１１】
一実施形態において、植物は、生物又は非生物ストレスの存在下にある。
【０１１２】
一実施形態において、非生物ストレスは、水の欠乏、栄養分の欠乏、熱ストレス、塩毒性、ミネラル又は金属毒性及び凍結温度からなる群から選択される。
【０１１３】
一実施形態において、生物ストレスは、昆虫外寄生、線虫外寄生及び草食動物の放牧からなる群から選択される。一実施形態において、生物ストレスは、昆虫、線虫及び草食動物からなる群から選択される少なくとも１種の生体により引き起こされるストレスである。
【０１１４】
一実施形態において、組成物は、本発明の方法を用いて調製された混和抽出物を含む。
【０１１５】
一実施形態において、組成物は、混和物、又は、上記の混和物もしくは抽出物からの溶出液、画分もしくは抽出物を含む。
【０１１６】
一実施形態において、組成物は、生存内生寄生菌を実質的に含まない。
【０１１７】
種々の実施形態において、本発明の組成物は、例えば植物などの生息地が、昆虫もしくは昆虫個体群などの有害生物個体群に感染するか、曝される前に予防的に適用される。他の実施形態において、組成物は、例えば植物などの生息地が昆虫に感染しているか曝されている場合、又は、昆虫が生息地中もしくは生息地上に存在している場合といった、感染が定着しているか、又は、病原体が存在している場合に適用される。
【０１１８】
一実施形態において、本発明の組成物は生息地に直接適用され、例えば植物又はその周囲に直接適用される。例えば、本発明の組成物は、溶剤と混合されるか乳化され、及び、本明細書に記載のとおり適用される。他の実施形態において、本発明の組成物は、例えばその後生息地に適用される基剤に適用されるなど、生息地に間接的に適用される。一実施形態において、組成物は、潅漑システム又は化学溶液潅漑システムを用いて生息地に適用される。
【０１１９】
一実施形態において、本明の組成物は、植え付け又は播種に先だって、例えば圃場又は牧草地といった生息地に適用される。
【０１２０】
一実施形態において、組成物は、適用に先立って、１００Ｌ当たり、約２ｇ、２．５ｇ、５ｇ、７．５ｇ、１０ｇ、１５ｇ、２０ｇ、２５ｇ、５０ｇ、７５ｇ、１００ｇ、１２５ｇ、１５０ｇ、１７５ｇ又は約２００ｇのロリンアルカロイド最終濃度となるよう、水と混合される。
【０１２１】
一実施形態においては、ノニオン性界面活性剤などの乾燥保護剤が、適用に先だって約１ｍＬ／Ｌの最終濃度に混合される。
【０１２２】
一実施形態において、組成物は適用に先立って水と混合される。一実施形態において、組成物は水と混合され、少なくとも約１００Ｌ水／Ｈａ、少なくとも約２００Ｌ／Ｈａ、少なくとも約２５０Ｌ／Ｈａ、少なくとも約３００Ｌ／Ｈａ、少なくとも約４００Ｌ／Ｈａ、少なくとも約５００Ｌ／Ｈａ、少なくとも約７５０Ｌ／Ｈａ、少なくとも約８００Ｌ／Ｈａ、少なくとも約８５０Ｌ／Ｈａ、少なくとも約９００Ｌ／Ｈａ、少なくとも約９５０Ｌ／Ｈａ、少なくとも約１０００Ｌ／Ｈａ、少なくとも約１２５０Ｌ／Ｈａ少なくとも約１５００Ｌ／Ｈａ、少なくとも約１７５０Ｌ／Ｈａ又は少なくとも約２０００Ｌ／Ｈａで適用される。
【０１２３】
種々の実施形態において、組成物は、少なくとも約２５ｇロリン／ヘクタール、少なくとも約５０ｇロリン／ヘクタール、少なくとも約１００ｇロリン／ヘクタール、少なくとも約１５０ｇロリン／ヘクタール、少なくとも約２００ｇロリン／ヘクタール、少なくとも約２５０ｇロリン／ヘクタール、少なくとも約３００ｇロリン／ヘクタール、少なくとも約３５０ｇロリン／ヘクタール、少なくとも約４００ｇロリン／ヘクタール、少なくとも約５００ｇロリン／ヘクタール、少なくとも約５５０ｇロリン／ヘクタール、少なくとも約６００ｇロリン／ヘクタール、少なくとも約６５０ｇロリン／ヘクタール、少なくとも約７００ｇロリン／ヘクタール又は少なくとも約７５０ｇロリン／ヘクタール又は少なくとも約１０００ｇロリン／ヘクタールの割合で適用される。一般に、約１００ｇ〜約５００ｇロリン／ヘクタールの施用量が目標とされる。
【０１２４】
一実施形態において、前記適用は、吹付けによる。他の実施形態において、適用は化学溶液潅漑による。
【０１２５】
他の実施形態において、組成物は種子粉衣で配合される。
【０１２６】
農業用途及び園芸用途において、本発明は、任意の植物又はその周囲に適用可能である。一定の実施形態において、例示的な植物は、アルファルファ、オオムギ、カノーラ、コーン、綿、亜麻、カポック、ピーナッツ、ジャガイモ、カラスムギ、イネ、ライ麦、モロコシ属（Ｓｏｒｇｈｕｍ）、ダイズ、サトウダイコン、サトウキビ、ヒマワリ、タバコ、トマト、コムギ、芝生の草、牧草地の草、液果、果実、マメ科植物、野菜、観賞用植物、潅木、サボテン、多肉植物及び高木などの単子葉又は双子葉植物である。
【０１２７】
さらなる例示的な実施形態において、植物は、以下の：ヒルガオ科（Ｃｏｎｖｏｌｖｕｌａｃｅａｅ）、セイロンハコベ科（Ｈｙｄｒｏｌｅａｃｅａｅ）、モンティニア科（Ｍｏｎｔｉｎｉａｃｅａｅ）、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）、及び、ナガボノウルシ科（Ｓｐｈｅｎｏｃｌｅａｃｅａｅ）からの植物を含むナス目（Ｓｏｌａｎａｌｅｓ）から選択される植物、並びに、以下の：ヒガンバナ科（Ａｍａｒｙｌｌｉｄａｃｅａｅ）、キジカクシ科（Ａｓｐａｒａｇａｃｅａｅ）、アステリア科（Ａｓｔｅｌｉａｃｅａｅ）、ブランドフォルディア科（Ｂｌａｎｄｆｏｒｄｉａｃｅａｅ）、ボリア科（Ｂｏｒｙａｃｅａｅ）、ドリアンテス科（Ｄｏｒｙａｎｔｈａｃｅａｅ）、キンバイザサ科（Ｈｙｐｏｘｉｄａｃｅａｅ）、アヤメ科（Ｉｒｉｄａｃｅａｅ）、イキシオリリオン科（Ｉｘｉｏｌｉｒｉａｃｅａｅ）、ラナリア科（Ｌａｎａｒｉａｃｅａｅ）、ラン科（Ｏｒｃｈｉｄａｃｅａｅ）、テコフィラエア科（Ｔｅｃｏｐｈｉｌａｅａｃｅａｅ）、ススキノキ科（Ｘａｎｔｈｏｒｒｈｏｅａｃｅａｅ）及びクセロネマ科（Ｘｅｒｏｎｅｍａｔａｃｅａｅ）からの植物を含むキジカクシ目（Ａｓｐａｒａｇａｌｅｓ）からの植物を含むいずれかの植物であり得る。
【０１２８】
他の態様において、本発明は、必要とされる対象における有害生物、寄生生物又は昆虫感染又は外寄生を処置又は予防する方法に関し、ここで、対象はヒト又は非ヒト対象動物であり、この方法は、対象に治療的有効量の本発明の組成物を投与する工程を含む。
【０１２９】
他の態様において、本発明は、例えば有害生物、寄生生物又は昆虫感染又は外寄生の処置又は予防における使用といった本明細書に記載の方法のいずれかにおける使用のための組成物又は医薬品の調製における、例えば抽出物又は溶出液といった本発明の組成物の使用に関する。
【０１３０】
他の態様において、組成物は、局部的に、経口的に、又は、非経口的に投与される。
【０１３１】
他の態様において、本発明は、本発明の組成物及び１種又は複数種の薬学的に又は獣医学的に許容可能な賦形物、キャリア又は希釈剤を含む薬学的もしくは獣医学的配合物を提供する。
【０１３２】
一実施形態において、この方法は、例えばトコジラミ、ノミ、ハエ、ブユ（ｇｎａｔ）、マダニ、アタマジラミなどのシラミ、又は、ダニによる感染又は外寄生といった、外寄生生物感染又は外寄生を処置又は予防するためのものである。
【０１３３】
一実施形態において、本発明は、例えば原生動物寄生虫、又は、蠕虫などの寄生蠕虫による感染又は外寄生といった内寄生生物感染又は外寄生を処置又は予防する方法を提供する。
【０１３４】
一実施形態において、組成物は、シャンプー、首輪、クリーム、ゲル、水薬、ポアオンもしくはスポットオン配合物、懸濁液、ローション、軟膏、スプレー、包帯、皮膚用パッチ、錠剤、カプセル、巨丸剤、エリキシル剤又は注射液の形態で投与される。
【０１３５】
種々の実施形態において、組成物は、皮膚１ｃｍ2当たり少なくとも約５μｇロリンアルカロイド、皮膚１ｃｍ2当たり、少なくとも約１０μｇ、少なくとも約２０μｇ、少なくとも約２５μｇ、少なくとも約３０μｇ、少なくとも約４０μｇ、少なくとも約４５μｇ、少なくとも約５０μｇ、少なくとも約５５μｇ、少なくとも約６０μｇ、少なくとも約７０μｇ、少なくとも約７５μｇ、少なくとも約８０μｇ、少なくとも約９０μｇ又は少なくとも約１００μｇのロリンアルカロイドを送達するのに十分な量で適用され、有用な範囲は、これらの値のいずれかの間から選択され得る（例えば、皮膚１ｃｍ2当たり約５μｇ〜約１００μｇのロリンアルカロイド、皮膚１ｃｍ2当たり、約２５μｇ〜約１００μｇ、約５０μｇ〜約１００μｇ、約２５μｇ〜約７５μｇ又は約５０μｇ〜約１００μｇのロリンアルカロイド）。
【０１３６】
種々の実施形態において、例えば局部投与用の薬学的もしくは獣医学的配合物中のロリンアルカロイドの濃度は、少なくとも約５μｇ／ｍＬ、１０μｇ、２０μｇ、２５μｇ、３０μｇ、４０μｇ、４５μｇ、５０μｇ、５５μｇ、６０μｇ、７０μｇ、７５μｇ、８０μｇ、９０μｇ、１００μｇ、１２５μｇ、１５０μｇ、１７５μｇ又は少なくとも約２００μｇ／ｍＬであり、有用な範囲は、これらの値のいずれかの間から選択され得る（例えば、約５０μｇ〜約２００μｇ／ｍＬ、約５０μｇ〜約１００μｇ、約７５μｇ〜約２００μｇ、約７５μｇ〜約１００μｇ又は約１００μｇ〜約２００μｇ／ｍＬ）。
【０１３７】
薬学又は獣医用途において、本発明は、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、シカ及びヤギなどの農業用動物；イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ及びテンジクネズミ、及び、ウマ並びにダチョウ、エミュー、雌鳥、ガチョウ、シチメンチョウ及びカモなどの鳥類などの伴侶動物；並びに、淡水魚又は海水魚といった、いずれかの非ヒト対象動物又はヒト対象に適用される。
【０１３８】
本発明の他の態様は、添付の図面を参照して、単なる一例とされている以下の記載から明らかになり得る。
【０１３９】
本明細書に開示されている数の範囲（例えば、１〜１０）に対する参照はまた、その範囲内のすべての有理数（例えば、１、１．１、２、３、３．９、４、５、６、６．５、７、８、９及び１０）、また、その範囲内の有理数のいずれかの範囲（例えば、２〜８、１．５〜５．５及び３．１〜４．７）に対する参照を引用することが意図されており、従って、本明細書に明示的に開示されているすべての範囲のすべての下位の範囲が本明細書により明示的に開示されている。これらは特異的に意図されているものの単なる例であり、列挙されている最小の値と最大の値との間の数値のすべての可能性のある組み合わせが、本出願中において同様に明示的に記載されていると考えられるべきである。
【０１４０】
特許明細書、他の外部書面又は他の情報源に対する参照がなされているこの明細書において、これは一般に、本発明の特性を考察するための文脈を提供することを目的とする。別段の記載がある場合を除き、このような外部の書面に対する参照は、このような書面又はこのような情報源が、いかなる司法権においても、従来技術であるか、又は、技術分野における共通一般知識の一部を構成するものであるとの容認として解釈されるべきではない。
【０１４１】
この明細書において用いられるところ、「〜を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「〜から少なくとも部分的に構成されている」を意味する。この用語を含むこの明細書中の記載を解釈する場合、各記載又は特許請求の範囲においてこの用語に続く特性は、すべて存在している必要があるか、他の特性もまた存在していることが可能である。「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「〜を含んでいた（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」などの関連する用語は同じく解釈されるべきである。
【０１４２】
本発明はまた、広義に、本出願の明細書において個別又は総括的に参照又は記載されている部分、要素及び特性、並びに、前記部分、要素又は特性のいずれか２つ以上の組み合わせのいずれか又はすべてに特徴を有すると表現され得、ここで、特定の整数が本明細書において記載されており、これらが本発明が関連する技術分野において公知の均等物を有する場合、このような公知の均等物は、個別に記載されているかのように本明細書において引用されているとみなされる。
【０１４３】
ここで本発明を、以下の図面を参照して、単なる一例として説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１４４】
【図１】図１は、粉末化したヒロハノウシノケグサ草から、種々の抽出温度で抽出されたＮＡＮＬ、ＮＦＬ、ＮＡＬ、ロリン及び全ロリンアルカロイドの量を示す。
【図２】図２は、粉末化したヒロハノウシノケグサ草から、４００分間にわたる経時変化において、得られた２回分の抽出物における合計ロリン濃度を示す。
【図３】図３は、７０℃の温度での浸漬又は充填床法により得た粉末化していないヒロハノウシノケグサ草からの抽出物中の合計ロリン濃度を示す。
【図４】図４は、７０℃の温度、４００分間における、粉末化したヒロハノウシノケグサ草及び粉末化していないヒロハノウシノケグサ草からの抽出物の合計ロリン濃度を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１４５】
本発明は、部分的に、ロリンアルカロイドを含む組成物を生成する方法、及び、内生寄生菌に感染した植物由来の植物材料からロリンアルカロイドを抽出又は精製する方法に関する。本発明はまた、有害生物及び有害生物個体群の防除、植物の成長又は繁殖の増強、並びに、有害生物、昆虫及び／もしくは寄生性感染症又はヒトもしくは非ヒト動物における外寄生の処置又は予防のための本発明の組成物の使用に関する。
【０１４６】
１．定義
「及び／又は」という用語は、「及び」又は「又は」を意味することが可能である。
【０１４７】
この明細書において用いられるところ、「を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「〜から少なくとも部分的に構成されている」を意味する。用語「を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を含むこの明細書における記載に係る各々の解釈に際しては、この用語に続くもの以外の特性もまた存在し得る。「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などの関連する用語は、同じく解釈されるべきである。
【０１４８】
本明細書において用いられるところ、「防除」又は「防除する」という用語は一般に、個体群［その１種又は複数種の構成要員］の増加を予防すること、減少させること、もしくは、根絶させることを包含し、又は、ヒトもしくは非ヒト動物に感染する１種もしくは複数種の植物病原体もしくは有害生物もしくは昆虫による感染などの１種もしくは複数種の有害生物もしくは病原体による感染もしくは外寄生を予防すること、減少させること、もしくは、根絶させることを包含し、又は、例えば植物中あるいはその上もしくはその周囲といった生息地における有害生物個体数を低減させるなど、このような感染の速度及び程度を阻害することを包含し、又は、ヒトもしくは非ヒト動物における有害生物もしくは昆虫感染もしくは外寄生を処置もしくは予防することを包含し、ここで、感染又は個体群に係るこのような予防又は低減は、未処理の感染又は個体群に対して統計的に有意である。治療的処理もまた想定される。好ましくは、このような防除は、有害生物又は病原体個体群における死亡率を高めることによって達成される。
【０１４９】
防除は、多数の形態を取り得る拮抗作用を介するものであり得ることが認識されるであろう。一形態において、本発明の組成物は、単に忌避剤として作用し得る。他の形態において、本発明の組成物は、病原体に対して好ましくない環境をもたらし得る。さらなる好ましい形態において、本発明の組成物は、有害生物又は病原体に対して、寄生し、無能力化し、不妊化し、成長を妨げ、拡散もしくは分布を妨げ、及び／又は、死滅させ得る。従って、拮抗メカニズムは、これらに限定されないが、抗生作用、寄生、固定化、不妊症及び毒性を含む。従って、１種又は複数種の有害生物のアンタゴニストとして作用する組成物は、有害生物防除活性を有すると言うことが可能である。例えば、１種又は複数種の昆虫のアンタゴニストとして作用する組成物は、殺虫効力を有すると言うことが可能である。さらに、有害生物のアンタゴニストであるかこれを含む薬剤又は組成物は有害生物防除剤又は有害生物防除組成物と言うことが可能であり、例えば、動物又は植物の病害虫を含む昆虫のアンタゴニストである薬剤は、殺虫薬であると言うことが可能である。同様に、動物又は植物の病害虫を含む昆虫のアンタゴニストであるかこれを含む組成物は、殺虫性組成物であると言うことが可能である。
【０１５０】
従って、本明細書において用いられるところ、「有害生物防除組成物」は、少なくとも１種の有害生物防除効力を有する薬剤を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）か、又は、含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）組成物である。
【０１５１】
種々の実施形態において、前記有害生物防除効力は、昆虫、線虫及び草食動物を含む１種又は複数種の有害生物を、昆虫と接触してから、好ましくは１４日間以内、より好ましくは７日間以内に忌避し、無能力化し、不妊化し、成長を妨げ、又は、死滅させることが可能であり、さらにより好ましくは、１種又は複数種の植物病原性昆虫を７日間以内に死滅させることが可能である。
【０１５２】
従って、本明細書において用いられるところ、「殺虫性組成物」は、殺虫効力を有する少なくとも１種の薬剤を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）か、又は、含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）組成物である。
【０１５３】
本明細書において用いられるところ、「抽出物」という用語は、原材料からの抽出により得られる１種又は複数種のロリンアルカロイドを含む組成物を含み、ここで、抽出物は、原材料中に存在する化合物のサブセットを含むか、又は、これから構成される。典型的には、抽出物は、例えば特徴的なクロマトグラフィプロファイル又は質量スペクトルプロファイルといった、決定可能であると共に同定可能な組成を有するであろう。
【０１５４】
本明細書において用いられるところ、「画分」という用語は、１種又は複数種のロリンアルカロイドを含む組成物を含み、ここで、画分は、分割されていない原材料中に存在する化合物のサブセットを含むか、又は、これから構成される。典型的には、画分は、例えば特徴的なクロマトグラフィプロファイル又は質量スペクトルプロファイルといった、決定可能であると共に同定可能な組成を有するであろう。
【０１５５】
本明細書において用いられるところ、「機能的変形例」という用語は、１種又は複数種のロリンアルカロイドに対する参照において、例えば本明細書において実施例において例示されている１種又は複数種のロリンアルカロイドに関して、特定的に同定されるエンティティとは異なり、例えば１つ又は複数の基が削除、置換又は付加されているが、特定的に同定されるロリンアルカロイドによって誘発される１種又は複数種の生物学的効果を誘発する能力などの特定的に同定されるエンティティの生物学的活性の１つ又は複数を少なくとも部分的に有するロリンアルカロイドを指す。
【０１５６】
本事例において、機能的変形例は、本発明の特定的に同定されるロリンアルカロイド又は組成物の有害生物防除効力又は活性の少なくとも一部分を保持することが好ましいであろう。
【０１５７】
殺虫効力などの本発明のロリンアルカロイドによって誘発される１種又は複数種の生物学的効果を判定するための方法及びアッセイは技術分野において周知であり、このような方法及びアッセイを用いて、１種又は複数種の本発明のロリンアルカロイドの機能的変形例の１種又は複数種を同定又は検証することが可能である。例えば、本発明の本発明のロリンアルカロイド又は組成物に係る、実施例において本明細書に記載のものなどの標的有害生物を死滅させるか、その成長に他の方法で拮抗する能力のアッセイは、本発明のロリンアルカロイド又は組成物の１種又は複数種の機能的変形例の同定に適用可能である。
【０１５８】
本明細書において用いられるところ、「植物」という用語は、植物全体を包含するのみならず、植物部位、挿木、並びに、根、葉、花、種子、茎、カルス組織、堅果及び果実、鱗茎、塊茎、球茎、子実、挿木、根ストック又は移植片を含む植物産物の植物産物に及び、植え付け前、栽培中、及び、収穫時もしくは収穫後に関わらずいずれかの植物材料を含む。本発明の適用により利益を享受し得る植物は広範囲の農業用及び園芸作物をカバーする。本発明の組成物はまた、有機生産システムにおける適用に特に好適である。
【０１５９】
本明細書において用いられるところ、「植物材料」という用語は、特に本明細書に記載の調製方法に対する参照について、植物全体を包含するのみならず、植物部位、挿木、並びに、根、葉、花、種子、茎、カルス組織、堅果及び果実、鱗茎、塊茎、球茎、子実、挿木、根ストック又は移植片を含む植物産物にも及ぶ。本明細書の解釈において、植物材料は、例えば水溶液との混合に先立って、例えば粉末化といった多数の方法で加工されることが可能であり、又は、例えば、植物材料が完全な種子からなる場合、加工をほとんど又は全く行うこと無く用いられ得ると認識されるべきである。従って、本明細書において用いられるところ、「粉末化した植物材料」という用語は、例えば切断、破砕、小断片化、造粒、粉砕等により植物材料片が小さくなるよう加工された植物材料を想定する。粉末化した植物材料の例は本明細書において提供されている。
【０１６０】
本発明の有害生物防除組成物などの有害生物防除剤に関して用いられる場合、「有害生物防除効力を保持している」という句、並びに、その文法的な均等物及び変形は、薬剤がいまだ有用な有害生物防除活性を有していることを意味することが意図されている。好ましくは、保持されている活性は、元の活性の少なくとも約３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９又は１００％であり、有用な範囲は、これらの値のいずれかの間から選択され得る（例えば、約３５〜約１００％、約５０〜約１００％、約６０〜約１００％、約７０〜約１００％、約８０〜約１００％及び約９０〜約１００％）。例えば、本明細書に記載のロリンアルカロイドの好ましい機能的変形例は、有害生物防除活性を保持しているべきであり、すなわち、特定の親ロリンアルカロイドの有害生物防除活性の少なくとも約３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９又は１００％を保持しているべきである。同様に、好ましい本発明の組成物は、これらが含む有害生物防除剤の有用な有害生物防除活性の維持を支持することが可能であり、理想的には、本明細書において想定される方法を用いて適用されるまで有害生物防除活性を保持する、と言うことが可能である。
【０１６１】
同様に、殺虫性組成物などの殺虫薬に関連して用いられる場合、「殺虫効力を保持」という句、並びに、その文法的な均等物及び変形は、薬剤がまだ有用な殺虫活性を有していることを意味することが意図されている。好ましくは、保持されている活性は、元の活性の少なくとも約３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９又は１００％であり、有用な範囲は、これらの値のいずれかの間から選択され得る（例えば、約３５〜約１００％、約５０〜約１００％、約６０〜約１００％、約７０〜約１００％、約８０〜約１００％及び約９０〜約１００％）。例えば、本発明の好ましい機能的変形例は、殺虫活性を保持しているべきであり、すなわち、特定の親ロリンアルカロイド又はこれを含む画分の殺虫活性の少なくとも約３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９又は１００％を保持しているべきである。同様に、好ましい本発明の組成物は、これらが含む殺虫薬の有用な殺虫活性の維持を支持することが可能であり、理想的には、本明細書において想定される方法を用いて適用されるまで殺虫活性を保持する、と言うことが可能である。
【０１６２】
「周囲」という用語は、本発明の方法及び組成物に対する植物対象への参照に用いられる場合、植物又はその根、塊茎等に隣接するかその周りの土壌、水、落ち葉及び／又は成長培地、隣接する植物、前記植物の挿木、支持、植物に投与される水、並びに、種子粉衣を含むコーティングを含む。これはさらに、保護コーティング、箱及び包装材などの保管、パッケージング又は加工材料、並びに、植え付け、維持管理又は収穫用器具を含む。
【０１６３】
「経口投与」という用語は、経口投与、口腔内投与、経腸投与及び胃内投与を含む。
【０１６４】
「非経口投与」という用語は、特に限定されないが、局部投与（経皮、表皮又は粘膜面いずれかへの投与を含む）、皮下投与、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与及び腫瘍内投与（腫瘍へのいずれかの直接投与を含む）が挙げられる。
【０１６５】
名詞に続く「（ｓ）」という用語は、単数形もしくは複数形、又は両方想定している。
【０１６６】
「対象」という用語は、動物、好ましくは哺乳類、より好ましくは哺乳類の伴侶動物又はヒトを指すことを意図している。好ましい伴侶動物としては、ネコ、イヌ及びウマが挙げられる。他の哺乳類対象としては、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、シカもしくはニワトリを含む農業用動物、又は、サル、ラット、マウス、ウサギもしくはテンジクネズミを含む実験動物が挙げられる。他の対象としては、ダチョウ、エミュー、メンドリ、ガチョウ、シチメンチョウ及びカモ中のトリ；並びに、淡水魚又は海水魚が挙げられる。
【０１６７】
「処置」という用語及びその変形は、可能な限り広い文脈で解釈されるべきである。この用語は、対象が完全に回復するまで処置されることを意味するとされるべきではない。従って、「処置」は広義に、対象の病害の進行又は症状の実質的に定常的なレベルでの維持、対象の回復速度の増加、症状の発症又は特定の状態の重症度の寛解及び／又は予防、又は、患者のクオリティオブライフの拡張を含む。「処置」という用語はまた、広義に、感受性の固体に係る良好な健康の維持及び病害、感染又は外寄生予防のためのスタミナの蓄積を含む。
【０１６８】
本明細書において用いられるところ、「寄生性感染」という用語は、対象中及び対象上における外部寄生虫（外寄生生物）又は内部寄生虫（内寄生生物）の感染又は外寄生を意味する。
【０１６９】
２．ロリンアルカロイドの生成、抽出及び／又は精製方法
一態様において、本発明は、１種又は複数種のロリンアルカロイドを含む組成物を生成する方法、又は、１種又は複数種のロリンアルカロイドを抽出する方法を提供するものであり、この方法は、
ａ）少なくとも１種の内生寄生菌に感染しているか感染したことがある植物に由来する完全な種子を提供する工程、
ｂ）種子及び水溶液を混合する工程、
ｃ）混和物を少なくとも約５０℃の温度で維持して、１種又は複数種のロリンアルカロイドを含む抽出物を得る工程、
ｄ）抽出物／上澄みを回収し、及び、任意選択により抽出物をさらに精製して、１種又は複数種のロリンアルカロイドを含む組成物を得る工程
を含む。
【０１７０】
本発明の例示的な方法は以下の工程を含む。
【０１７１】
内生寄生菌−感染草種子に由来する完全な種子を抽出容器に入れる。沸騰している水を加熱容器から抽出容器の上部に送り込む。循環システムを作動させて、水を抽出容器の底から排出すると共に加熱容器に戻す。抽出容器中の水のレベルは常に種子より上に維持する。
【０１７２】
種子床の温度をプロセスを通して監視する。いったん種子床が９０〜９５℃に達したら、再循環をこの温度で３時間継続する。
【０１７３】
代替的な実施形態においては、抽出はより低い温度でより長い期間行われる。
【０１７４】
抽出物を抽出容器から回収する。
【０１７５】
一実施形態において、水溶液は、酸性化又は塩基性化された水を含む。例えば、一実施形態において、水は、好適な量の酢酸、ギ酸、トリクロロ酢酸、フッ化水素酸、シアン化水素酸、硫化水素又は硫酸を水性溶剤又は水に加えることにより酸性化される。他の実施形態において、水は、好適な量のアンモニア、トリメチルアンモニア、ピリジン、水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムを水性溶剤又は水に加えることにより塩基性化される。
【０１７６】
一実施形態において、水溶液のｐＨは約ｐＨ６〜約ｐＨ９である。強酸性ｐＨ又は約９超のｐＨで抽出を行うと、抽出物中におけるＮＦＬの加水分解が生じ得る。
【０１７７】
抽出物はおよそ２〜８℃の温度に冷却して抽出物中において固形分を析出させる。抽出物のｐＨは、１０Ｍ水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムを用いてｐＨ９に調節する。抽出物を、直列につなげた２０及び５μｍのセディメントフィルタを通してろ過して、析出した固形分を除去する。代替的な実施形態において、析出した固形分は抽出物から遠心分離により除去される。
【０１７８】
ろ過した抽出物は１０Ｍ水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムを用いてｐＨ１１〜１２に調節される。代替的な実施形態において、ｐＨはろ過工程に先行してｐＨ１１〜１２に調節される。
【０１７９】
ｐＨ調節済みのろ過した抽出物を水中の逆相クロマトグラフィ樹脂を充填したカラムに適用する。特に好ましい実施形態において、逆相クロマトグラフィ樹脂はＳｕｐｅｌｃｏ（登録商標）Ｓｅｐａｂｅａｄｓ  ＳＰ−２０７樹脂を含む。
【０１８０】
抽出物中に存在するロリンアルカロイドがカラムと結合する。逆浸透（ＲＯ）水をポンプでカラムに通す。カラムに結合した分子は溶剤溶液を用いて溶出し、溶出液を画分で収集する。ロリンアルカロイドを含むすべての画分を組み合わせて溶出液を形成する。
【０１８１】
比較的小さい孔径を有する逆相クロマトグラフィ樹脂が用いられる場合、追加の前置ろ過が必要とされる可能性が高い。より大きな孔径を有する樹脂が用いられる場合、カラムへの投入は遅くなり、より長いカラムが必要とされる可能性が高い。種々の実施形態において、溶剤溶液は、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％又は約９６％エタノールを含む。特に好ましい実施形態において、カラムに結合した分子は９６％エタノールを用いて溶出する。他の有機溶剤が用いられ得るが、例えばメタノールといった水と混和性のものが好ましい。
【０１８２】
一実施形態において、溶剤溶液は酸性化される。酸性化した溶剤溶液が用いられる場合、より濃度が低い溶剤が、カラムからのロリンアルカロイドの溶出に用いられ得る。例えば、種々の実施形態において、酸性化した溶剤溶液は、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％又は約３０％エタノールを含む。
【０１８３】
ロータリー蒸発により溶出液からエタノールを除去して、濃色の油状の残渣をもたらす。この残渣を水に溶解させる。連続的に攪拌しながらアセトニトリルをゆっくりと添加して、不純物を析出させる。混合物を少なくとも１２〜１８時間の期間維持して、不純物を含む濃色の油状の残渣をロリンアルカロイドを含むアセトニトリルから分離する。傾瀉によりアセトニトリル相を残渣から分離する。
【０１８４】
代替的な実施形態において、不純物は、水／メタノール又は水／エタノール溶液を用いて析出される。
【０１８５】
アセトニトリル相を炭素カラムに適用する。ロリンアルカロイドは炭素に結合する。好ましい実施形態において、カラムは、水中の９０％アセトニトリルで前処理したＤａｒｃｏ（登録商標）活性炭（２０〜４０メッシュ、粒状）を含む。カラムを追加の水中の９０％アセトニトリルで洗浄する。カラムに結合したロリンアルカロイドは溶剤で溶出する。
【０１８６】
ロータリー蒸発によりチャコールで精製したロリン抽出物から溶剤を除去して、ロリンアルカロイドの乾燥した抽出物を得る。
【０１８７】
任意選択により、乾燥した抽出物にアセトニトリルを添加して一晩かけて−２０℃で微量の不純物を析出させる。アセトニトリルを傾瀉し、ロータリー蒸発により乾燥させて約９０％超の純度でロリンの乾燥した抽出物を得る。
【０１８８】
さらなる態様において、本発明は、１種又は複数種のロリンアルカロイドを含む組成物を生成する方法、又は、１種又は複数種のロリンアルカロイドを抽出する方法を提供するものであり、この方法は、
ａ）少なくとも１種の内生寄生菌に感染しているか感染したことがある植物に由来する植物材料を提供する工程、
ｂ）植物材料及び水を混合する工程、
ｃ）混和物を少なくとも約６５℃の温度で維持して、１種又は複数種のロリンアルカロイド化合物を含む抽出物を得る工程、
ｄ）抽出物を回収し、任意選択により抽出物をさらに精製して組成物を形成する工程
を含み、ここで、植物材料は種子を含まない。
【０１８９】
本発明のさらなる例示的な方法は以下の工程を含む。
【０１９０】
一実施形態において、植物材料は２０ｍｍスクリーンに通した機械的に切断した新鮮な草を含み、ここで、草は、内生寄生菌に感染しているか、感染していたものである。他の実施形態において、植物材料は粉末化されていない。
【０１９１】
ｐＨ１１の水を約７０℃の温度に加熱する。草を１：１０ｗ／ｖの比で加熱した水に加え、少なくとも約１６〜約２４時間の期間維持して抽出物を得る。抽出物を回収する。
【０１９２】
抽出物をろ過して、１種又は複数種のロリンアルカロイドを含むろ過した抽出物を得る。
【０１９３】
本発明の例示的な方法は以下の工程を含む。
【０１９４】
内生寄生菌に感染した草に由来する牧草を、フレイルミル（ｆｌａｉｌ  ｍｉｌｌ）及び２０ｍｍメッシュプレートを備える木材チッパーで粉末化する（例えば、ＰａｌｌｍａｎｎダブルストリームミルＰＳＫＭ又はＰＰＳＭ）。任意選択により、事前に、牧草を粗いカッターに通して必要に応じてサッチを砕いておく。
【０１９５】
粉末化した草を抽出容器に入れる。水（５０℃、１０：１ｗ／ｗ水：草）を加熱容器から抽出容器の上部に送り込む。循環システムを作動させて、水を抽出容器の底から排出すると共に加熱容器に戻す。抽出容器中の水のレベルは常に粉末化した草より上に維持する。
【０１９６】
水：草混和物の温度を５０℃に維持し、再循環をこの温度で少なくとも１時間継続する。
【０１９７】
抽出物を抽出容器から回収し、任意選択により、分析（例えば、有害生物防除剤、有害なアルカロイド、ロリン濃度）用にサンプルを採取する。
【０１９８】
抽出物を冷却し、抽出物のｐＨを１０Ｍ水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムを用いてｐＨ９に調節する。抽出物を、５０μｍ〜５μｍ、次いで、直列につなげた２５μｍ〜１μｍの密度勾配型セディメントフィルタを通してろ過して微粒子を除去する。
【０１９９】
ろ過した抽出物（ろ液）を、標準的な攪拌タンク中において、１０Ｍ水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムを用いてｐＨ１１に調節する。任意選択により、ｐＨを含む分析用にサンプルを再度採取する。
【０２００】
ｐＨ１１のろ過した抽出物を、Ｓｕｐｅｌｃｏ（登録商標）Ｓｅｐａｂｅａｄｓ  ＳＰ−２０７樹脂を充填したカラムに適用する。
【０２０１】
抽出物中に存在するロリンアルカロイドがカラムと結合する。逆浸透（ＲＯ）水をポンプでカラムに通す。カラムに結合した分子は共沸物エタノール（約９６％）を用いて溶出し、溶出液を画分で収集する。ロリンアルカロイドを含むすべての画分を組み合わせて溶出液を形成する。
【０２０２】
一実施形態において、溶剤溶液は酸性化される。酸性化した溶剤溶液が用いられる場合、より濃度が低い溶剤が、カラムからのロリンアルカロイドの溶出に用いられ得る。例えば、種々の実施形態において、酸性化した溶剤溶液は、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％又は約３０％エタノールを含む。
【０２０３】
ロータリー蒸発又は流下膜式蒸発により溶出液からエタノールを除去して、濃色の油状の残渣をもたらす。この残渣を水に溶解させる。
【０２０４】
任意選択により、連続的に攪拌しながらアセトニトリルをゆっくりと添加して、不純物を析出させる。混合物を少なくとも１２〜１８時間の期間維持して、不純物を含む濃色の油状の残渣をロリンアルカロイドを含むアセトニトリルから分離する。傾瀉によりアセトニトリル相を残渣から分離する。
【０２０５】
代替的な実施形態において、不純物は、水／メタノール又は水／エタノール溶液を用いて析出される。
【０２０６】
アセトニトリル相を炭素カラムに適用する。ロリンアルカロイドは炭素に結合する。好ましい実施形態において、カラムは、水中の９０％アセトニトリルで前処理したＤａｒｃｏ（登録商標）活性炭（２０〜４０メッシュ、粒状）を含む。カラムを追加の水中の９０％アセトニトリルで洗浄する。カラムに結合したロリンアルカロイドは．で溶出する。
【０２０７】
ロータリー蒸発によりチャコールで精製したロリン抽出物から溶剤を除去して、ロリンアルカロイドの乾燥した抽出物を得る。
【０２０８】
任意選択により、乾燥した抽出物にアセトニトリルを添加して一晩かけて−２０℃で微量の不純物を析出させる。アセトニトリルを傾瀉し、ロータリー蒸発により乾燥させて約９０％超の純度でロリンの乾燥した抽出物を得る。
【０２０９】
植物材料からの１種又は複数種のロリンアルカロイドの収率は、少なくとも約０．５、約０．６、約０．７、約０．７５、約０．８、約０．９、約１、約１．１、約１．２、約１．２５、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７５、約１．８、約１．９又は少なくとも約２ｍｇ／ｇである。
【０２１０】
本明細書における方法の一定の実施形態の特定の利点は、抽出に先立って種子を粉末化し、粉砕し、又は、他の方法で加工する必要性を伴うことなく、完全な種子からロリンアルカロイドを抽出し得ることである。特に出発材料として完全な（粉末化していない）種子を用いるものといった、本明細書に記載の方法の一定の実施形態のさらなる利点は、１種又は複数種のロリンの抽出における１種又は複数種の脂質汚染物、タンパク質汚染物又は多糖類汚染物の低減である。
【０２１１】
本発明の他の利点は、高純度で、不純物又は汚染物を比較的含まないロリンアルカロイドを含む組成物の生成が提供されることである。
【０２１２】
ロリンアルカロイドの分析方法
本明細書に記載の抽出物、画分、ろ液又は組成物におけるロリンアルカロイドの濃度を同定及び測定する方法は、技術分野において周知である。
【０２１３】
このような方法の一つは、液体クロマトグラフィタンデム型質量分光測定（ＬＣ  ＭＳ／ＭＳ）分析を利用する。このような方法の一例を本明細書において提供している実施例において利用したが、ここでは、サンプルは０．１％水酸化アンモニウム溶液中で適切な較正範囲に希釈されている。サンプルは、例えば、０．１％水酸化アンモニウムから１００％アセトニトリルへの勾配を用いるＡｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨフェニル１．０×５０ｍｍ、１．７μｍ樹脂を用いて、ＨＰＬＣによってに固定相に分離する。溶出した画分はＭＳ／ＭＳにより分析して存在するロリンアルカロイドを同定する。
【０２１４】
他の好適な技法は、本明細書を読むことにより当業者には明らかであろう。例えば、ガスクロマトグラフィなどの他のクロマトグラフィ技法も使用し得る。
【０２１５】
３．有害生物の防除
昆虫などの有害生物に対して効果的であり、かつ、本発明による使用に好適である本発明の組成物は、本発明の組成物と比較される対照処理剤と比して、標的有害生物種の個体群を統計的に有意な量で低減させる効果を有するものとして同定される。このような組成物は、有害生物防除効力を有するものとしてみなすことが可能である。本明細書に記載されているとおり、標的有害生物の個体群の低減は種々の拮抗メカニズムによるものであり得る。例えば、組成物は、有害生物の成長又は発達を無能力化し、不妊化し、阻害し得、及び／又は、好ましくは有害生物を死滅させ得、又は、成長と、本発明のロリンアルカロイドと一緒に組成物中に存在する殺菌・殺カビ剤（個別に、同時に、又は、順次にのいずれかで）などの同様に存在する１種又は複数種の他の有害生物防除剤の有害生物防除効力とを支持もしくは促進し得る。このように、本発明の組成物は、有害生物を、寄生し、無能力化し、不妊化し、及び／又は、好ましくは死滅させる有害生物防除剤の能力を実現可能とし、又は、支持し得る。本発明の組成物はまた、例えば組成物が適用される植物又はその周囲といった環境を、有害生物にとって好ましくないものとすることによって、標的有害生物の個体群を低減し得る。この実施形態において、組成物は、忌避剤として作用し、植物などの生息地の近傍もしくはその周囲における標的有害生物の有効個体群を低減させるとみなされ得る。
【０２１６】
種々の実施形態において、好適な本発明のロリンアルカロイド又は本発明の組成物は、対照処理剤と比した関連する昆虫種の個体群の低減割合としての表記で、約５％の有害生物防除効力、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、より好ましくは少なくとも約５０％の有害生物防除効力を示す。
【０２１７】
有害生物防除効力は、植物原材料由来のロリンアルカロイド含有抽出物などの本発明の組成物に係る主たる必要条件であるが、有害生物防除剤としての使用について好適であるとみなされるためには、組成物は、生物学的防除剤としての使用について好適であるために追加の特徴を有していてもよい。
【０２１８】
例えば、本発明の組成物は、究極的には、生物学的防除剤として効果的である形態及び濃度で、植物もしくはその周囲などの標的生息地への適用が可能であるよう、合理的な期間の間、効果的な形態で貯蔵が可能であるべきである。
【０２１９】
本明細書において例示されている１種又は複数種のロリンアルカロイドの１種又は複数種の機能的変形例を、本発明のロリンアルカロイド及び組成物は含み得、又は、本発明の方法がこの機能的変形例を使用し得ることを当業者は認識するであろう。ロリンアルカロイド及びその機能的変形例の組み合わせもまた本明細書において有用である。
【０２２０】
本明細書に開示の組成物は、広く多様な農業、園芸、医学又は獣医学における有害生物、昆虫及び／又は病原体に対する、並びに、広く多様な環境における局部的及び／又は浸透移行適用のための生物学的防除組成物として特定の実用性が見出されるであろうことを本発明者らは想定する。
【０２２１】
農業及び園芸用の使用
本発明では、例えば、米国、ニュージーランド及び欧州の国々のものを含む多くの国の農業及び園芸分野が植物有害生物における有害生物防除剤耐性の増大に関する問題に直面していることが認識されている。この問題は、いくつかの規制制度下において、規制上の障壁による新規の化学殺虫剤の入手可能性が低くなることによって複雑化している。
【０２２２】
本発明に利用可能となった有害生物防除性ロリンアルカロイドの使用により、この問題に対する解決法が提示されている。
【０２２３】
本明細書に開示の組成物は、農作物、草、果実及び野菜、芝、高木並びに／又は観賞用植物への適用などの園芸及び農業産業における局部的及び／又は浸透移行性適用のための生物学的防除組成物として特定の実用性が見いだされるであろうことを本発明者らは想定する。本明細書に開示の組成物は、有害生物を死滅させるか、又は、有害生物個体群を防除するスプレー、粉剤、粉末又は他の水性のもの、微粒化されたもの又はエアロゾルとして配合され得る。本明細書に開示の組成物は、予防的に用いられ得、又は、代替的に、処理されるべき特定の環境において標的有害生物が一度確認されてから環境に投与され得る。組成物は個別のロリンアルカロイドを含み得、又は、本明細書に開示のロリンアルカロイドの種々の組み合わせを含有し得る。
【０２２４】
適用方法に関わらず、活性なコンポーネントの量は有害生物防除的に有効な量で適用され、これは、例えば防除されるべき特定の標的有害生物、特定の環境又は場所、例えば処理されるべき植物、作物又は農業用の敷地、環境条件、並びに、方法、割合、濃度、安定性、及び、有害生物防除性活性組成物の適用量などの要因に応じて様々であろう。配合物はまた、気候条件、環境的事項、及び／又は、適用頻度及び／又は有害生物外寄生の重症度に関連して様々であり得る。
【０２２５】
記載の組成物は、１種又は複数種のロリンアルカロイド、抽出物、培養物又は培養培地等を、任意選択により１種又は複数種の他の薬剤と一緒に、所望される農学的に許容可能なキャリアと配合することにより形成され得る。組成物は、凍結乾燥、凍結乾燥、乾燥などの適切な手段で、又は、水性キャリア、媒体又は塩類溶液もしくは他の緩衝剤などの好適な希釈剤中において、投与前に配合され得る。配合した組成物は、粉剤もしくは粒状材料、又は、油中の懸濁液（植物性又は無機）、又は、水もしくは油／水エマルジョンの形態、又は、水和剤として、又は、農業用用途に好適ないずれかの他のキャリア材料との組み合わせであり得る。好適な農業用キャリアは固体又は液体であることが可能であり、技術分野において周知である。「農学的に許容可能なキャリア」という用語は、殺虫剤配合技術において通常用いられるすべての補助剤、不活性コンポーネント、分散剤、界面活性剤、粘着剤、バインダ等を包含し；これらは、殺虫剤配合物における当業者に周知である。配合物は、１種又は複数種の固体又は液体補助剤と混合され得、及び、例えば、従来の配合技術を用いて、殺虫性組成物を好適な補助剤と共に均質混合、ブレンド及び／又は粉砕することによって、種々の手段で調製され得る。
【０２２６】
水分散性顆粒
他の重要な例示的な実施形態において、本発明の組成物は、水分散性顆粒を含む。この顆粒は、１種又は複数種のロリンアルカロイドを、任意選択により、１種又は複数種の他の薬剤と共に含む。
【０２２７】
粉末、粉剤及び芽胞配合物
第３の重要な例示的な実施形態において、本発明の組成物は、水和剤、粉剤、芽胞配合物、細胞ペレット又はコロイド状濃縮物を含む。この粉末は、１種又は複数種の本発明のロリンアルカロイドを、任意選択により１種又は複数種の他の薬剤と共に含む。本発明の組成物のこのような乾燥形態は、湿らせた場合にすぐに溶解するよう、又は、代替的に、徐放性、持効性又は他の時間依存の様式で溶解するよう配合され得る。このような組成物は、標的有害生物に投与されるか、又は、標的有害生物により摂取され得、これにより、有害生物の数又は所与の環境におけるこのような有害生物の拡散の制御に用いられ得る。
【０２２８】
水性懸濁液及び培養ろ液又はライセート
第４の重要な例示的な実施形態において、本発明の組成物は、１種又は複数種の本発明のロリンアルカロイドの水性懸濁液を、任意選択により、１種又は複数種の溶解されているか、又は、そうでなければ死んでいる、又は、非生存内生寄生菌細胞（本明細書に開示の本発明のロリンアルカロイドの生成に用いられる１種又は複数種の内生寄生菌細胞を含む）と一緒に含み、これは、例えば培養ろ液、培養上澄み、培養培地、又は、これらから得られる抽出物もしくは画分を含む。このような水性懸濁液は、適用に先立って希釈される濃縮ストック溶液、又は、代替的に、すぐに適用可能な希釈液として提供され得る。
【０２２９】
本発明の組成物が完全な状態であるが死細胞を含む場合、このような組成物は、多様な方法で配合され得る。これらは無機ミネラル（フィロケイ酸塩、炭酸塩、硫酸塩、リン酸塩等）又は植物由来物質（粉末化した穂軸、もみ殻、クルミの殻等）などの種々の不活性材料と混合されることにより、水和剤、顆粒又は粉剤として採用され得る。これらの配合物は、拡展−展着補助剤、安定化剤、他の有害生物防除性添加剤又は界面活性剤を含み得る。液体配合物は、水性又は非水性であり得、フォーム、懸濁液、乳化性濃縮物等として採用され得る。処方成分は、レオロジー剤、界面活性剤、乳化剤、分散剤又はポリマーを含み得る。
【０２３０】
本明細書に記載されているとおり、一実施形態において、組成物は、ロリンアルカロイドを生成可能である培養物を含むと共に、このような組成物の溶液、懸濁液又はコロイド状調製物が活性組成物として用いられる。
【０２３１】
多官能性配合物
例えば複数の有害生物種の防除が所望される場合などといった一定の実施形態において、本明細書に記載の配合物はまた、１種もしくは複数種の化学的有害生物防除剤（化学的有害生物防除剤、抗線虫薬、殺菌・殺カビ剤、抗ウイルス薬、殺微生物剤、殺アメーバ薬、殺虫剤等など）などの１種もしくは複数種の他の薬剤、及び／又は、本明細書において同定されている殺虫性ロリンアルカロイドと同一又は異なる殺虫活性もしくは殺虫特異性を有する１種もしくは複数種のロリンアルカロイドをさらに含み得る。本発明の組成物はまた、配合物を一回投与した後における標的領域への長期の投薬を可能とする、肥料、除草剤、抗凍結剤、界面活性剤、洗剤、モノフルオロトリン、ドーマントオイル（ｄｏｒｍａｎｔ  ｏｉｌ）、ポリマー、及び／又は、持続放出性もしくは生分解性キャリア配合物などの他の処理剤と併せて用いられ得る。同様に、配合物は、可食性の「餌」に調製され得、又は、標的有害生物による組成物の給餌もしくは摂食が可能である有害生物「トラップ」とされ得る。
【０２３２】
本発明の組成物はまた、環境部位に単独で、又は、１種もしくは複数種の殺虫剤、有害生物防除剤、化学物質、肥料もしくは他の化合物を含む１種もしくは複数種の追加の薬剤と組み合わされて、連続投与又は同時投与に用いられ得る。
【０２３３】
同様に、必要とされる場合、本明細書に記載のとおり生成される１種又は複数種のロリンアルカロイドは、１つ又は複数の細胞−溶解工程と組み合わされているか（例えば細胞内ロリンアルカロイド）、又は、組み合わされていないか（例えば成長培地中に分泌されたロリンアルカロイド）に関わらず、例えば、分別、ろ過又は沈降技法（例えば遠心分離）といった技術分野において周知である方法により内生寄生菌から分離され得る。
【０２３４】
本発明の組成物はまた、１種又は複数種の農学的に許容可能なキャリアを含む１種又は複数種のキャリアを含み得る。一実施形態において、農学的に許容可能なキャリアなどのキャリアは、固体又は液体であることが可能である。本明細書において有用なキャリアとしては、農業用組成物の配合に典型的に用いられるいずれかの物質が挙げられる。
【０２３５】
一実施形態において、農学的に許容可能なキャリアは、充填材、溶剤、賦形物、界面活性剤、懸濁剤、拡展剤／展着剤（接着剤）、消泡剤、分散剤、湿潤剤、ドリフト低下剤（ｄｒｉｆｔ  ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、助剤、補助剤又はこれらの混合物を含む群から選択され得る。
【０２３６】
本発明の組成物は、十分に確立された手法により、例えば、濃縮物、溶液、スプレー、エアロゾル、浸漬浴、浸液、エマルジョン、水和剤、可溶性の粉末、懸濁液濃縮物、粉剤、顆粒、水分散性顆粒、マイクロカプセル、ペースト、ゲル及び他の配合物タイプとして配合され得る。
【０２３７】
これらの手法は、充填材、溶剤、賦形物、界面活性剤、懸濁剤、拡展剤／展着剤（接着剤）、消泡剤、分散剤、湿潤剤、ドリフト低下剤（ｄｒｉｆｔ  ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、助剤及び補助剤などの農学的に許容可能なキャリア物質を伴った、活性処方成分の混合及び／又は粉末化を含む。
【０２３８】
一実施形態において、固体キャリアとしては、これらに限定されないが、ケイ酸、シリカゲル、ケイ酸、タルク、カオリン、活性白土、石灰岩、生石灰、チョーク、油粘土、黄土、クレイ、苦灰石、珪藻土、アルミナ、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、酸化マグネシウムなどの無機質の土類、粉砕したプラスチック、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム及び尿素などの肥料、並びに、子実荒粉、樹皮荒粉、木材荒粉及び堅果殻荒粉などの植物性の産物、セルロース系粉末等が挙げられる。顆粒用の固体キャリアとしては、以下が好適である：方解石、大理石、軽石、セピオライト及び苦灰石などの破砕又は画分化した天然の岩石；無機又は有機荒粉の合成顆粒；おがくず、ココナツの殻、トウモロコシ穂軸、トウモロコシの包葉又はタバコの茎などの有機材料の顆粒；キースラガー、リン酸三カルシウム、コルク粉又は吸収剤カーボンブラック；水溶性ポリマー、樹脂、ワックス；又は、固体肥料。このような固体組成物は、所望の場合には、固体である場合に希釈剤ともされ得る、１種又は複数種の相溶性の湿潤剤、分散剤、乳化剤又は着色剤を含有し得る。
【０２３９】
一実施形態において、キャリアはまた、液体、例えば、水；アルコール、特にブタノール又はグリコール、並びに、そのエーテル又はエステル、特に、酢酸メチルグリコール；ケトン、特にアセトン、シクロヘキサノン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン又はイソホロン；パラフィン系炭化水素又は芳香族炭化水素などの石油留分、特にキシレン又はアルキルナフタレン；無機油又は植物油；脂肪族塩素化炭化水素、特にトリクロロエタン又は塩化メチレン；芳香族塩素化炭化水素、特にクロロベンゼン；ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド又はＮ−メチルピロリドンなどの水溶性又は強極性溶剤；液化ガス等、又は、これらの混合物であり得る。
【０２４０】
一実施形態において、界面活性剤としては、ノニオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤及び／又は両性界面活性剤が挙げられ、吹付けの最中における凝集物の溶液中への残留能を促進する。
【０２４１】
拡展剤／展着剤は、植物の表面に対する本発明の組成物の接着能を促進する。界面活性剤、拡展剤／展着剤の例としては、これらに限定されないが、Ｔｗｅｅｎ及びＴｒｉｔｏｎ（Ｒｈｏｍ  ａｎｄ  Ｈａｓｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、Ｄｅｅｐ  Ｆｒｉｅｄ（商標）、Ｆｏｒｔｕｎｅ（登録商標）、Ｐｕｌｓｅ、Ｃ．Ｄａｘｏｉｌ（商標）、Ｃｏｄａｃｉｄｅ  ｏｉｌ（登録商標）、Ｄ−Ｃ．Ｔａｔｅ（商標）、Ｓｕｐａｍｅｔ  Ｏｉｌ、Ｂｏｎｄ（登録商標）、Ｐｅｎｅｔｒａｎｔ、Ｇｌｏｗｅｌｔ（登録商標）及びＦｒｅｅｗａｙ、Ｃｉｔｏｗｅｔｔ（商標）、Ｆｏｒｔｕｎｅ  Ｐｌｕｓ（商標）、Ｆｏｒｔｕｎｅ  Ｐｌｕｓ  Ｌｉｔｅ、Ｆｒｕｉｍｅｃ、Ｆｒｕｉｍｅｃ  ｌｉｔｅ、アルカリ金属、アルカリ土類金属及び芳香族スルホン酸のアンモニウム塩、例えば、リグニンスルホン酸、フェノールスルホン酸、ナフタレンスルホン酸及びジブチルナフタレンスルホン酸、及び、脂肪酸のアンモニウム塩、アルキル及びアルキルアリールスルホン酸塩、及び、アルキル、ラウリルエーテル及び脂肪族アルコール硫酸塩、及び、硫酸化ヘキサデカノール、ヘプタデカノール及びオクタデカノールの塩、脂肪族アルコールグリコールエーテルの塩、スルホン化ナフタレン及びナフタレン誘導体とホルムアルデヒドとの縮合物、ナフタレン又はナフタレンスルホン酸とフェノール及びホルムアルデヒドとの縮合物、ポリオキシエチレンオクチルフェノールエーテル、エトキシル化イソオクチルフェノール、エトキシル化オクチルフェノール及びエトキシル化ノニルフェノール、アルキルフェノールポリグリコールエーテル、トリブチルフェニルポリグリコールエーテル、アルキルアリールポリエーテルアルコール、イソトリデシルアルコール、脂肪族アルコールエチレンオキシド縮合物、エトキシル化ヒマシ油、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、エトキシル化ポリオキシプロピレン、ラウリルアルコールポリグリコールエーテルアセタール、ソルビトールエステル、リグニン−亜硫酸廃液及びメチルセルロースが挙げられる。包含のために選択される場合、Ｔｗｅｅｎなどの１種又は複数種の農業用界面活性剤は、公知のプロトコルに従い組成物中に含まれることが望ましい。
【０２４２】
湿潤剤は、組成物中の水の表面張力を低減させ、それ故、所与の量の組成物が適用され得る表面積を増大させる。湿潤剤の例としては、これらに限定されないが、ポリアクリル酸の塩、リグノスルホン酸の塩、フェノールスルホン酸又はナフタレンスルホン酸の塩、エチレンオキシドと脂肪族アルコール又は脂肪酸又は脂肪族エステル又は脂肪族アミンとの重縮合物、置換フェノール（特にアルキルフェノール又はアリールフェノール）、スルホコハク酸エステルの塩、タウリン誘導体（特にアルキルタウレート）、アルコールのリン酸エステル、又は、エチレンオキシドとフェノールとの重縮合物のリン酸エステル、脂肪酸とポリオールとのエステル、又は、上記の化合物のスルフェート、スルホネートもしくはリン酸塩官能性誘導体が挙げられる。
【０２４３】
一実施形態において、本発明の組成物の好ましい適用方法は、ハンドガン又は市販のエアブラストによる希釈又は濃縮溶液のスプレーである。
【０２４４】
上記のとおり、本発明の組成物は、単独で、又は、有害生物防除剤、殺虫剤、殺ダニ剤、殺菌・殺カビ剤又は殺菌剤（ただし、このような殺菌・殺カビ剤又は殺菌剤が組成物中に存在するいずれかの真菌又はバクテリアに対して有害又は有毒性ではない場合）、除草剤、抗生物質、抗菌剤、殺線虫剤、殺鼠剤、昆虫病原物質、フェロモン、誘引剤、植物成長調節剤、植物ホルモン、昆虫成長調節剤、不妊化剤、有害微生物防除剤、忌避剤、ウイルス、摂食刺激物質、植物栄養分、植物肥料及び生物学的防除を含む１種又は複数種の他の農業用薬剤との組み合わせで用いられ得る。他の農業用薬剤との組み合わせで用いられる場合、２種の薬剤は、個別に、同時に、又は、順次に投与され得る。これらの農業用薬剤の特定の例は当業者に公知であり、多くが容易に購入可能である。
【０２４５】
植物栄養分の例としては、これらに限定されないが、窒素、マグネシウム、カルシウム、ホウ素、カリウム、銅、鉄、リン、マンガン、モリブデン、コバルト、ホウ素、銅、ケイ素、セレニウム、ニッケル、アルミニウム、クロム及び亜鉛が挙げられる。
【０２４６】
抗生物質の例としては、これらに限定されないが、オキシシリン及びストレプトマイシンが挙げられる。
【０２４７】
殺菌・殺カビ剤の例としては、これらに限定されないが、以下の殺菌・殺カビ剤の分類が挙げられる：カルボキサミド、ベンズイミダゾール、トリアゾール、ヒドロキシピリジン、ジカルボキサミド、フェニルアミド、チアジアゾール、カルバメート、シアノ−オキシム、桂皮酸誘導体、モルホリン、イミダゾール、β−メトキシアクリレート及びピリジン／ピリミジン。
【０２４８】
さらなる殺菌・殺カビ剤の例としては、これらに限定されないが、天然の殺菌・殺カビ剤、有機殺菌・殺カビ剤、硫黄系殺菌・殺カビ剤、銅／カルシウム殺菌・殺カビ剤及び植物生体防御の誘発物が挙げられる。
【０２４９】
天然の殺菌・殺カビ剤の例としては、これらに限定されないが、全乳、乳清、脂肪酸又はエステル化脂肪酸が挙げられる。
【０２５０】
有機殺菌・殺カビ剤の例としては、これらに限定されないが、生防除剤、天然生成物、誘発物（そのいくつかは天然生成物としても分類され得る）、並びに、硫黄及び銅殺菌・殺カビ剤（制限的な使用に限定される）などの有機認証基準（ｏｒｇａｎｉｃ  ｃｅｒｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｔａｎｄａｒｄ）に合格するいずれかの殺菌・殺カビ剤が挙げられる。
【０２５１】
硫黄系殺菌・殺カビ剤の例はＫｕｍｕｌｕｓ（商標）ＤＦ（ＢＡＳＦ，Ｇｅｒｍａｎｙ）である。
【０２５２】
銅殺菌・殺カビ剤の例は、Ｋｏｃｉｄｅ（商標）２０００ＤＦ（Ｇｒｉｆｆｉｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ）である。
【０２５３】
誘発物の例としては、これらに限定されないが、トサン、Ｂｉｏｎ（商標）、ＢＡＢＡ（ＤＬ−３−アミノ−ｎ−ブタン酸、β−アミノ酪酸）及びＭｉｌｓａｎａ（商標）（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｆａｒｍ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）が挙げられる。
【０２５４】
いくつかの実施形態においては、非有機殺菌・殺カビ剤が採用され得る。非有機殺菌・殺カビ剤の例としては、これらに限定されないが、Ｂｒａｖｏ（商標）（ウリ科植物におけるＰＭの防除用）；Ｓｕｐｅｒｓｈｉｅｌｄ（商標）（Ｙａｔｅｓ，ＮＺ）（バラにおけるボトリチス（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ）及びＰＭの防除用）；Ｔｏｐａｓ（商標）２００ＥＷ（ブドウ及びウリ科植物におけるＰＭの防除用）；ＦｌｉｎｔＴＭ（リンゴ及びウリ科植物におけるＰＭの防除用）；Ａｍｉｓｔａｒ（商標）ＷＧ（穀類におけるサビ病及びＰＭの防除用）；並びに、Ｃａｐｔａｎ（商標）、Ｄｉｔｈａｎｅ（商標）、Ｅｕｐａｒｅｎ（商標）、Ｒｏｖｒａｌ（商標）、Ｓｃａｌａ（商標）、Ｓｈｉｒｌａｎ（商標）、Ｓｗｉｔｃｈ（商標）及びＴｅｌｄｏｒ（商標）（ブドウにおけるボトリチス（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ）の防除用）が挙げられる。
【０２５５】
有害生物防除剤の例としては、これらに限定されないが、アゾキシストロビン、ビテルタノール、カルボキシン、Ｃｕ2Ｏ、シモキサニル、シプロコナゾール、シプロジニル、ジクロフルアニド、ジフェノコナゾール、ジニコナゾール、エポキシコナゾール、フェンピクロニル、フルジオキソニル、フルキコナゾール、フルシラゾール、フルトリアホール、フララキシル、グアザチン、ヘキサコナゾール、ヒメキサゾール、イマザリル、イミベンコナゾール、イプコナゾール、クレソキシム−メチル、マンコゼブ、メタラキシル、Ｒ−メタラキシル、メトコナゾール、オキサジキシル、ペフラゾエート、ペンコナゾール、ペンシクロン、プロクロラズ、プロピコナゾール、ピロキロン、ＳＳＦ−１０９、スピロキサミン、テブコナゾール、チアベンダゾール、トリフルアミド、トリアゾキシド、トリアジメホン、トリアジメノール、トリフルミゾール、トリチコナゾール及びウニコナゾールが挙げられる。
【０２５６】
本明細書に記載の真菌菌株以外の生物学的防除剤の例は、ウロクラディウムオウデマンシイ（Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ  ｏｕｄｅｍａｎｓｉｉ）を含むＢｏｔｒｙＺｅｎ（商標）生物学的防除剤である。
【０２５７】
本発明の組成物はまた、活性処方成分を増強するために用いられる安定化剤及び浸透剤などの幅広い範囲の添加剤を含み得る。添加剤はまた、長期の保管における安定性の維持を補助する組成物、例えば未精製のコーン油、並びに、連続相としての油及びワックスと分散相としての水、アルギン酸ナトリウム及び活性成分との混合物を含有する、いわゆるインバートエマルジョンを含み得る。
【０２５８】
当業者に認識されるであろうとおり、用いられるいずれかの添加剤は、生物学的防除剤の効力に干渉しない量で存在することが重要である。
【０２５９】
組成物は、多数の形態で調製され得る。１種の調製物は、植物もしくはその周囲に散布され得る本発明の組成物の粉末化形態を含む。さらなる形態において、組成物は、水などの希釈剤と混合されてスプレー、フォーム、ゲル又は浸液を形成し、公知のプロトコルを用いて適切に適用される。好ましい本実施形態において、上記のとおり配合される組成物は、加圧式スプレーヤを用いて、約５ｇ〜約３５０ｇのロリンアルカロイド／１００Ｌで、およそ３００〜約２０００Ｌ／ｈａで、水と混合される。一般に、組成物は、約５ｇ〜約１７０ｇのロリンアルカロイド／１００Ｌで配合される。
【０２６０】
実際にいずれかの公知の技術分野の方法であり得る、注射、なすりつけ、又は、はけ塗りなどの他の適用方法のために配合された組成物もまた用いられ得る。例えば土壌などの植物の周囲もしくは環境、水への組成物の間接的な適用、又は、例えば種子粉衣としての組成物の間接的な適用が想定される。
【０２６１】
上記において検討されているとおり、本発明の組成物が適用されるべき濃度は、最終用途、植物の生理的条件；タイプ（昆虫種を含む）、濃度及び有害生物の感染の程度；温度、季節、湿度、生育期におけるステージ及び植物の齢数；適用されている従来の殺虫剤又は他の処理剤（殺菌・殺カビ剤を含む）の数及びタイプ；並びに、植物処理（葉の摘採及び剪定など）に応じて様々であり得る。
【０２６２】
散粉、振りかけ、土壌液浸、土壌注入、種子粉衣、実生コーティング、葉吹付け、曝気、ミスティング、噴霧、燻蒸、エアロゾル適用等を含む他の適用技術もまた実施可能であり、例えば有害生物が根もしくは茎に外寄生しているなどの一定の状況下で必要とされ得、又は、繊細な植生もしくは観賞用植物に対する適用のために必要とされ得る。これらの適用手法もまた当業者に周知である。
【０２６３】
本発明の組成物はまた、ある領域への防止的又は予防的適用のために配合され得、また、一定の状況においては、ペット、家畜、動物敷料に、又は、農作業用器具、畜舎、住居又は農業用もしくは産業用設備等内及びその周囲に適用され得る。
【０２６４】
環境、浸透移行的、局部的又は葉面処理に用いられる組成物の濃度は、特定の配合物の性質、適用手段、環境条件及び活性の程度に応じて幅広く様々であろう。
【０２６５】
上記の殺虫性配合物は特定の植物又は標的領域に必要に応じて１回又は複数回の適用で投与され得、ここで、典型的な１ヘクタール当たりの圃場施用量はおよそ約２５ｇの活性薬剤／ヘクタール〜約５００ｇの活性薬剤／ヘクタールの範囲であり、又は、代替的に、約５００ｇの活性薬剤／ヘクタール〜約１０００ｇ活性薬剤／ヘクタールが利用され得る。約２５ｇの活性薬剤／ヘクタール〜約１，０００ｇの活性薬剤／ヘクタールの範囲内のすべての施用量が、このような殺虫性配合物を用いる標的病害虫の管理、防除及び駆除において有用であると想定される。従って、約１００ｇ／ヘクタール、約１２５ｇ／ヘクタール、約１５０ｇ／ヘクタール、約２００ｇ／ヘクタール、約２５０ｇ／ヘクタール、約３００ｇ／ヘクタール、約３５０ｇ／ヘクタール、約４００ｇ／ヘクタール、約４５０ｇ／ヘクタール、約５００ｇ／ヘクタール、約６００ｇ／ヘクタール、約７００ｇ／ヘクタール、約８００ｇ／ヘクタール、約９００ｇ／ヘクタールもしくは約１ｋｇ／ヘクタール、又は、これを超える量の活性薬剤が、本明細書において上記に記載の有害生物防除配合物の一定の農業用用途、産業用途及び家庭用用途に利用され得る。一般に、約１００ｇ〜約５００ｇの活性薬剤／ヘクタールの施用量が目標とされる。
【０２６６】
液体組成物の代表的な施用量は、約５０ｍＬの活性薬剤／ヘクタール〜約２０Ｌ／ヘクタールの範囲内の施用量を含み、想定される。従って、約１００ｍＬ／ヘクタール、約２００ｍＬ／ヘクタール、約３００ｍＬ／ヘクタール、約４００ｍＬ／ヘクタール、約５００ｍＬ／ヘクタール、約６００ｍＬ／ヘクタール、約７００ｍＬ／ヘクタール、約８００ｍＬ／ヘクタール、約９００ｍＬ／ヘクタール、約１Ｌ／ヘクタール、約１．１Ｌ／ヘクタール、約１．２Ｌ／ヘクタール、約１．３Ｌ／ヘクタール、約１．４Ｌ／ヘクタール、約１．５Ｌ／ヘクタール、約１．６Ｌ／ヘクタール、約１．７Ｌ／ヘクタール、約１．８Ｌ／ヘクタール、約１．９Ｌ／ヘクタール、約２．０Ｌ／ヘクタール、約２．５Ｌ／ヘクタール、約３．０Ｌ／ヘクタール、約３．５Ｌ／ヘクタール、約４．０Ｌ／ヘクタールもしくは約４．５Ｌ／ヘクタール、又は、これを超える量の活性薬剤が利用され得る。
【０２６７】
さらなる態様において、本発明は、１種又は複数種の有害生物を防除する方法を提供するものであり、この方法は、植物もしくはその周囲に本明細書に記載の本発明の組成物を適用する工程を含む。
【０２６８】
典型的には、稚苗が最も有害生物による損害を受けやすい。従って、発芽前の新たに植付けされた作物に対する本発明の組成物の適用が想定され、発芽してからの適用も想定される。
【０２６９】
作物の周期における同一又は異なる時期での反復的な適用もまた想定される。本発明の組成物は、季節の前期又は後期のいずれかにおいて適用され得る。これは、開花期にわたって、又は、結実期中であってもよい。本発明の組成物はまた、例えば有害生物のコロニー形成を予防するため、壊死又は老化している葉、果実、茎、機械収穫した茎等を迅速に移植するために、収穫直前又は収穫直後に適用され得る。本発明の組成物はまた、休眠状態の組織上の有害生物の成長を遅延化するため、及び、成長を増強するために冬季に休眠期の植物に適用され得る。
【０２７０】
適用は、発芽の前もしくはその後、及び、収穫の前後の時点であり得る。しかしながら、処理は、開花期と収穫の間に行われることが好ましい。効力を高めるために、本発明の組成物を複数回（例えば、開花期から結実期へのステージの最中に２〜６回の適用）適用することが好ましい。
【０２７１】
本発明の組成物の再適用はまた、雨後に検討されるべきである。有害生物感染予想モデル又は感染分析データを用いることで、ＢＣＡの適用もまた、有害生物の感染リスクがある時期を考慮して時期を調整することが可能である。
【０２７２】
種々の例示的な実施形態において、本発明のロリンアルカロイド及びこのようなロリンアルカロイドを含む組成物は、有害生物防除効力などの効力を達成可能である投与量でこれらが適用される植物又は植物の周囲に対して有害ではない。
【０２７３】
一定の実施形態において、本発明の組成物は、例えば上記のとおり、加圧式スプレーヤを用いて溶液で適用される。植物部位は、理想的には完全な被覆を確実なものとするために、流出する直前までそっとスプレーされるべきである。適用は、例えば、植物被全体花及び発育中の果実が密集している植物被中の領域、又は、植物の茎、及び／又は、根、塊茎等に隣接するもしくはその周囲の土壌、水もしくは成長培地といった、植物の任意の部分及び／又はその周囲に行われ得る。
【０２７４】
一定の態様において、本発明の組成物は植物病原性昆虫を防除するために用いられる。植物病原性昆虫は、植物部位に発病し、及び成長速度、開花期、結実期、生産量を低減させる収穫前及び収穫後の病害の多くの原因であり、罹病している植物を枯死させてしまう場合がある。本明細書において用いられるところ、植物病原性昆虫は、それら自体が植物病原体である昆虫、並びに、例えば植物病原性真菌及びバクテリアといった他の植物病原体のベクターとなり得る昆虫を含む。他の植物病原体のベクターとなる宿主昆虫を防除することにより、植物病害の発生率及び／又は重症度を最低限とすることが可能であることが認識されるであろう。
【０２７５】
ニュージーランドにおいて栽培されている多数の重要な園芸作物を罹病させる主な植物病原性昆虫の例が以下に示されている。
【０２７６】
【表１】
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【０２７７】
本発明の方法は、収穫前又は収穫後における植物及び植物産物に対する特定の適用を含む。例えば、本発明の組成物は、果実、野菜、切花及び種子を含む、上記に列挙した種類の貯蔵された産物に適用され得る。好適な適用技術は上記において明確にされているものであって、特に吹付けを含む。
【０２７８】
本発明の組成物は、植物への直接適用とは対照的に、場合によって、土壌又は種子の処理又は前処理に用いられることが可能である。本発明の組成物はまた、保護コーティング、箱及び包装材などの植物加工材料においても使用される。
【０２７９】
本発明はまた、本発明の組成物で直接処理された植物、植物産物、土壌及び種子を含む。
【０２８０】
薬学的及び獣医学的使用
本発明は、ヒト又は対象動物における有害生物、寄生生物又は昆虫感染の処置又は予防方法を提供するものであり、治療的有効量の本発明の組成物を投与する工程を含む。
【０２８１】
有害生物、寄生生物又は昆虫感染は、ヒト又は非ヒト動物内寄生生物又は外寄生生物のいずれかに感染又は外寄生し得る。
【０２８２】
外部寄生虫又は外寄生生物としては、これらに限定されないが、ヒツジハジラミ（Ｂｏｖｉｃｏｌａ  ｏｖｉｓ）（ヒツジシラミ）；ウシハジラミ（Ｂｏｖｉｃｏｌａ  ｂｏｖｉｓ）；ウシジラミ（Ｈａｅｍａｔｏｐｉｎｕｓ  ｅｕｒｙｓｔｅｒｎｕｓ）（ウシジラミ（ｓｈｏｒｔ−ｎｏｓｅｄ  ｃａｔｔｌｅ  ｌｏｕｓｅ））；ウシバエ属の一種（Ｈｙｐｏｄｅｒｍａ  ｓｐｐ．）；ヘマトビアイリタンスエクシグア（Ｈａｅｍａｔｏｂｉａ  ｉｒｒｉｔａｎｓ  ｅｘｉｇｕａ）；ネコノミ（Ｃｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ  ｆｅｌｉｓ）（ネコノミ）及びイヌノミ（Ｃｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ  ｃａｎｉｓ）（イヌノミ）、コクリオミイア属の一種（Ｃｏｃｈｌｉｏｍｙｉａ  ｓｐｐ．）などのイヌノミ属の一種（Ｃｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ  ｓｐｐ）；オビキンバエ属の一種（Ｃｈｒｙｓｏｍｙａ  ｓｐｐ．）；ウシホソジラミ（Ｌｉｎｏｇｎａｔｈｕｓ  ｖｉｔｕｌｉ）（ウシホソジラミ）；アタマジラミ（Ｐｅｄｉｃｕｌｕｓ  ｈｕｍａｎｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓ）（ヒトコモロジラミ）、コロモジラミ（Ｐｅｄｉｃｕｌｕｓ  ｈｕｍａｎｕｓ  ｈｕｍａｎｕｓ）（ヒトアタマジラミ）、ケジラミ（Ｐｔｈｉｒｕｓ  ｐｕｂｉｓ）（ケジラミ）、ヒトノミ（Ｐｕｌｅｘ  ｉｒｒｉｔａｎｓ）（ヒトノミ）、ケブカウシジラミ（Ｓｏｌｅｎｏｐｏｔｅｓ  ｃａｐｉｌｌａｔｕｓ）（ツベルクル−ベアリングシラウス（ｔｕｂｅｒｃｕｌｅ−ｂｅａｒｉｎｇ  ｌｏｕｓｅ））；サルコプテススカビエイカムス（Ｓａｒｃｏｐｔｅｓ  ｓｃａｂｉｅｉ  ｃａｍｓ）、サルコプテススカビエイスイス（Ｓａｒｃｏｐｔｅｓ  ｓｃａｂｉｅｉ  ｓｕｉｓ）、サルコプテススカビエイボビス（Ｓａｒｃｏｐｔｅｓ  ｓｃａｂｉｅｉ  ｂｏｖｉｓ）、サルコプテススカビエイｖａｒ．フマニ（Ｓａｒｃｏｐｔｅｓ  ｓｃａｂｉｅｉ  ｖａｒ．ｈｕｍａｎｉ）を含むヒゼンダニ属の一種（Ｓａｒｃｏｐｔｅｓ  ｓｐｐ．）（キュウセンヒゼンダニ）；ヒツジキュウセンヒゼンダニ（Ｐｓｏｒｏｐｔｅｓ  ｏｖｉｓ）及びデルマトフゴイデス属の一種（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈｇｏｉｄｅｓ  ｓｐｐ．）を含むキュウセンヒゼンダニ属の一種（Ｐｓｏｒｏｐｔｅｓ  ｓｐｐ．）；オウシマダニ（Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓ  ｍｉｃｒｏｐｌｕｓ）；並びに、ダマリニアボビス（Ｄａｍａｌｉｎｉａｂｏｖｉｓ）などのトコジラミ、ノミ、ハエ、ブユ（ｇｎａｔ）、マダニ、シラミ及びダニが挙げられる。
【０２８３】
内部寄生虫又は内寄生生物としては、これらに限定されないが、マラリア原虫属の一種（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｓｐｐ．）；トリパノソーマ属の一種（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｓｐｐ．）及びエイメリア属の一種（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｓｐｐ．）などの原生動物寄生虫、並びに、寄生蠕虫（蠕虫）が挙げられる。蠕虫としては、これらに限定されないが、捻転胃虫（Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ  ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ）を含む毛様線虫上科（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅａ）；毛様線虫属の一種（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ  ｓｐｐ．）；ディクチオカウルス属の一種（Ｄｉｃｔｙｏｃａｕｌｕｓ  ｓｐｐ．）；トキソカラ属の一種（Ｔｏｘｏｃａｒａ  ｓｐｐ．）を含む回虫上科（Ａｓｃａｒｉｄｏｉｄｅａ）；ストロンギルス属の一種（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ  ｓｐｐ．）；イヌ糸状虫（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａｉｍｍｉｔｉｓ）及びオンコセルカ属の一種（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ  ｓｐｐ）を含むフィラリア上科（Ｆｉｌａｒｉｏｉｄｅａ）：肝蛭（Ｆａｓｃｉｏｌａｈｅｐａｔｉｃａ）及び住血吸虫属の一種（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｓｐｐ．）を含む吸虫綱（Ｔｒｅｍａｔｏｄａ）；テニア属の一種（Ｔａｅｎｉａ  ｓｐｐ．）；並びに、モニエジア属の一種（Ｍｏｎｉｅｚｉａ  ｓｐｐ．）；オステルタジア属の一種（Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ  ｓｐｐ．）；ネマトジルス属の一種（Ｎｅｍａｔｏｄｉｒｕｓ  ｓｐｐ．）；クーペリア属の一種（Ｃｏｏｐｅｒｉａ  ｓｐｐ．）；ブノストムム属の一種（Ｂｕｎｏｓｔｏｍｕｍ  ｓｐｐ．）；腸結節虫属の一種（Ｏｅｓｏｐｈａｇｏｓｔｏｍｕｍ  ｓｐｐ．）；チャベルチア属の一種（Ｃｈａｂｅｒｔｉａ  ｓｐｐ）、鞭虫属の一種（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ  ｓｐｐ．）；トリコネマ属の一種（Ｔｒｉｃｈｏｎｅｍａ  ｓｐｐ．）；毛頭虫属の一種（Ｃａｐｉｌｌａｒｉａ  ｓｐｐ．）；ヘテラキス属の一種（Ｈｅｔｅｒａｋｉｓ  ｓｐｐ．）；トキソカラ属の一種（Ｔｏｘｏｃａｒａ  ｓｐｐ．）；、蟯虫属の一種（Ｏｘｙｕｒｉｓ  ｓｐｐ．）；鉤虫属の一種（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ  ｓｐｐ．）；ウンシナリア属の一種（Ｕｎｃｉｎａｒｉａ  ｓｐｐ．）；トキサスカリス属の一種（Ｔｏｘａｓｃａｒｉｓ  ｓｐｐ．）；並びに、パラスカリス属の一種（Ｐａｒａｓｃａｒｉｓ  ｓｐｐ）などの条虫（扁形動物）、線虫（回虫）及び吸虫（吸虫）が挙げられる。
【０２８４】
本発明の組成物は、意図される投与経路及び標準的な薬学的実践もしくは獣医による実践に関連して選択された１種もしくは複数種の薬学的にもしくは獣医学的に許容可能な賦形物、キャリアもしくは希釈剤との混和物で、又は、単独で投与され得る。
【０２８５】
「薬学的に又は獣医学的に許容可能なキャリア」という用語は、発明の組成物のコンポーネントとして対象に投与されることが可能である、特にこれらに限定されないが、賦形剤、希釈剤又は助剤を含むキャリアを指すことが意図されている。好ましいキャリアは、組成物の活性を低減させず、また、本発明の方法によって生成された組成物の有効量を送達するために十分な投与量で投与された場合、又は、他の有害生物防除剤の有効量を送達するために十分な投与量で投与された場合に有毒ではない。
【０２８６】
本発明の組成物は、局部的に、経口的に、又は、非経口的に投与され得る。
【０２８７】
例えば、組成物は、カプセル、錠剤、エリキシル剤、溶液、懸濁液、又は、例えば結腸もしくは十二指腸において溶解するよう配合された巨丸剤の形態で、経口投与（舌下投与を含む）され得る。配合物は、デンプン又はラクトース又は香味料又は着色剤などの賦形物を含み得る。
【０２８８】
組成物は、非経口注射（例えば静脈注射、筋肉注射又は皮下注射）され得る。非経口投与のために、組成物は、任意選択により塩又はグルコースなどの他の物質を含む無菌水溶液又は懸濁液中に配合され得る。
【０２８９】
組成物は、無菌クリーム、ゲル、ポアオン又はスポットオン配合物、懸濁液、ローション、軟膏剤、散粉粉末、スプレー、薬物が組み込まれた包帯、シャンプー、首輪又は皮膚用パッチの形態で、局部投与され得る。例えば、本発明の組成物は、ポリエチレングリコール又は液体パラフィンの水性又は油性エマルジョンを含むクリーム；白ろう軟パラフィン基材を含む軟膏；セルロース又はポリアクリレート誘導体又は他の好適な粘度変性剤を伴うヒドロゲル；乾燥粉末；液体スプレー；ブタン、プロパン、ＨＦＡ又はＣＦＣ噴射剤を伴うエアロゾル；チュール生地の包帯、白色ワセリン又はポリエチレングリコールに含浸したガーゼ包帯、又は、ヒドロゲル、親水コロイドもしくはアルギン酸塩フィルムを有する包帯などの包帯に組み込まれ得る。組成物はまた、適切な緩衝剤、粘度変性剤（例えば、セルロース誘導体）及び防腐剤（例えば、塩化ベンザルコニウム）を伴う点眼薬として眼内投与され得る。
【０２９０】
ポアオン又はスポットオン配合物は、ｂｕｔｙｌ  ｄｉｇｏｌ、液体パラフィン、又は、イソプロパノールなどの揮発性コンポーネントを含む、もしくは、含まない非揮発性のエステルなどの許容可能な液体キャリアビヒクル中に活性処方成分を溶解することにより調製され得る。配合物は、テルペン、脂肪酸エステル、トリグリセリド、グリセロールエステルなどの溶剤、又は、界面活性剤を含む透過増強剤を含み得る。配合物は、直接適用に好適な形態、又は、適用前に好適な量の水もしくは他の希釈剤による希釈が必要である濃縮物の形態であることが可能である。ポアオン、スポットオン又は、スプレー配合物は、動物の表面上に活性薬剤の残渣が残されるよう、カプセル化により調製されることが可能である。
【０２９１】
経口投与のために、カプセル、巨丸剤又は錠剤は、本発明の組成物と、崩壊剤、及び／又は、デンプン、ラクトース、タルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどのバインダを追加的に含有する好適な微粉希釈剤又はキャリアとを混合することにより調製され得る。水薬配合物は、活性処方成分を、分散剤又は湿潤剤と共に水溶液中に分散させることにより調製され得る。
【０２９２】
本発明の組成物は、例えば、組成物又は配合物を動物用飼料材料又は動物用飲料水中に溶解、懸濁又は分散させることにより、飼料材料又は水と一緒に投与され得る。
【０２９３】
非経口投与のために、注射液配合物は、無菌溶液又はエマルジョンの形態で調製され得る。
【０２９４】
組成物は、活性範囲を拡大するため、又は、耐性の増大を防止するために、他の抗寄生虫性薬剤と併用されてもよい。他の好適な抗寄生性薬剤の例としては、アバメクチン、シデクチン、ドラメクチン、エピリノメクチン、モキシデクチン、イベルメクチン及びミルベマイシンなどのアベルメクチン及びミルベマイシン；アルベンダゾール、カンベンダゾール、フェンベンダゾール、フルベンダゾール、メベンダゾール、オキシフェンダゾール、パルベンダゾール、及びオキシベンダゾールなどのベンズイミダゾール；フェバンテル、チオファネート及びネトビミンなどのプロベンズイミダゾール；クロサンテル及びニクロスアミドなどのサリチルアニリド；ブタミソールなどのイミダゾチアゾール、メトロニダゾール、チニダゾール、レバミゾール、ピランテルパモエート又はテトラミソール；モランテルなどのテトラヒドロピリジミン；並びに、プラジカンテルなどのヘキサヒドロピラジノイソキノリンを含む大環式ラクトンが挙げられる。組成物は、他の抗寄生虫性薬剤と個別に、同時に、又は、順次に投与され得る。
【０２９５】
当業者は、寄生性感染の動物の処置に際して適切な投与量及び投与の頻度を容易に判定することが可能であろう。
【０２９６】
正確な投与量は、投与の頻度及び投与形態、処置される動物の性別、歳、重量及び一般的な状態、処置される状態の性質及び重症度、並びに、処置されるべきいずれかの随伴する病害、及び、当業者に明らかである他の要因に応じることとなる。
【０２９７】
本発明は前述の内容からなり、また、以下において単に例が記載されており、その範囲は如何様にも限定はされない構成が想定される。
【実施例】
【０２９８】
実施例１
本実施例は、異なる溶剤の組み合わせを用いた植物材料からのロリンの抽出効率を検討するものである。
【０２９９】
１グラムの粉末化した草の種子粉末を、９ｍｌの異なる溶剤の組み合わせで１５分間抽出した。次いで、抽出したサンプルを遠心分離し、ＬＣ  ＭＳ／ＭＳによりロリン含有量について分析した。簡潔には、サンプルを０．１％水酸化アンモニウム溶液で適切な較正範囲に希釈し、０．１％水酸化アンモニウム溶液からアセトニトリルへの勾配を流して、Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨフェニル１．０×５０ｍｍ、１．７μｍカラムで分離した。溶出した画分をＭＳ／ＭＳにより分析して同定し、既知の標準と比較することによりロリン含有量を定量化する。
【０３００】
表１:異なる溶剤の組み合わせを用いて抽出されるロリンの量(μg)/種子1グラム
【表２】
2017538703.tif 000004
【０３０１】
表１に示すとおり、酢酸で酸性化した水による抽出で、１グラムの種子当たりロリンの最大の収率が得られた。有機溶剤を用いる抽出は、酸よりも塩基を添加した場合により効率的であることが見出された。
【０３０２】
この実施例は、本発明の方法における酸性化した水及び他の水性溶剤を用いた植物材料からのロリンアルカロイドの効果的な抽出を実証する。
【０３０３】
実施例２
本実施例は、異なる溶剤を用いた植物材料からのロリンの抽出を検討するものである。
【０３０４】
草の種子を微粉末に粉末化した。１グラムのサンプルを、９ｍｌの異なる溶剤（以下の表２を参照のこと）で１５分間、超音波処理しながら抽出した。次いで、抽出したサンプルを遠心分離し、ＬＣ  ＭＳ／ＭＳによりロリン含有量について分析した。簡潔には、サンプルを０．１％水酸化アンモニウム溶液で適切な較正範囲に希釈し、０．１％水酸化アンモニウム溶液からアセトニトリルへの勾配を流して、Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨフェニル１．０×５０ｍｍ、１．７μｍカラムで分離した。溶出した画分をＭＳ／ＭＳにより分析して同定し、既知の標準と比較することによりロリン含有量を定量化する。
【０３０５】
表２:異なる溶剤を用いて抽出されるロリンの量(μg)/種子1グラム
【表３】
2017538703.tif 000005
【０３０６】
この実施例では、表２に示すとおり、アルカリ性の水性溶剤（アンモニアを添加した水）による抽出で、１グラムの種子当たりの全ロリンの最大の収率が得られ、また、計測した各特定のロリンアルカロイドの最大の収率がもたらされた。有機溶剤を用いた抽出は、酸よりも塩基を添加した場合により効率的であることが見出された。
【０３０７】
この実施例は、アルカリ性溶剤、特にアルカリ性の水性溶剤（塩基性化した水など）を用いた植物材料からのロリンアルカロイドの効果的な抽出を実証する。
【０３０８】
実施例３
本実施例は、植物材料由来の抽出物からロリンアルカロイドを精製するためのクロマトグラフィ分離の使用を検討するものである。
【０３０９】
１００ｇのＪ２１９種子を粉末化し、９００ｍｌの水で１０分間煮た。冷却した後、混合物を遠心分離し、上澄みを傾瀉した。得られた液体抽出物の総体積は７５０ｍｌであり、これを、３．７ｍｌの濃縮アンモニアを添加することにより塩基性化した。
【０３１０】
２５ｇのＳｔｒａｔａ−Ｘ逆相クロマトグラフィカラムを、メタノール、続いて、水中の０．５％濃縮アンモニアで洗浄した。得られた７５０ｍｌの液体抽出物の３００ｍｌアリコートをカラムに投入した。一旦抽出物のすべてを投入したら、カラムを２００ｍｌの０．５％濃縮アンモニアで洗浄した。次いで、ロリンを、４×５０ｍｌのＭｅＯＨ／０．５％アンモニア（５０：５０ｖ／ｖ）で溶出した。
【０３１１】
抽出物及び溶出した画分のロリン含有量を実施例１について記載したとおり測定した。カラムに投入した抽出物は、合計で１９８ｍｇのロリンアルカロイドを含んでいた。投入及び洗浄画分でおよそ１ｍｇが損失されたと推定すると、合計で１９２ｍｇが溶出した画分が見出され、これは９７％の回収率を表す。
【０３１２】
この実施例は、逆相クロマトグラフィによる分離した種子抽出物からのロリンアルカロイドの効果的な回収を実証する。
【０３１３】
実施例４
本実施例は、抽出物中のロリンを精製するための、炭素供給源を用いる分離、及び、その後の溶剤抽出の効力を検討するものである。
【０３１４】
１リットルの粗抽出物当たり５ｍｌの濃縮アンモニアで実施例３に記載のとおり調製したものと同一の粗液体抽出物を用いて、小規模の試験を行った。炭素（Ｄａｒｃｏ（登録商標）活性炭１００メッシュ）を液体抽出物に加えた（１０／１の液体／炭素比）。抽出物中のロリンの９９％が炭素に吸収された。
【０３１５】
その後の試験において、１ｇ又は１．５ｇの炭素を５０ｍｌの抽出物に添加した。６０％及び９３％のロリン吸収率が、１ｇ及び１．５ｇのサンプルについてそれぞれ達成された。
【０３１６】
１．５ｇサンプルの懸濁液を遠心分離し、上澄みを傾瀉し、０．５％濃縮アンモニアをさらに添加し、混合し、遠心分離し、上澄みを傾瀉した。水画分を分析したところ、もともと存在していたロリンの３％が含有されているのみであった。
【０３１７】
この手法をさらに２回１．５ｇの炭素で繰り返し、炭素に投入した３つの同様のロリンサンプルを得た。ロリンを炭素に吸収させた後、炭素サンプルロリンを、メタノール、エタノール又はアセトニトリルを用いて抽出した。抽出物の乾燥重量に対して比較して、抽出収率及び純度を実施例１に記載の方法を用いて測定した。
【０３１８】
表３:液体種子抽出から得られるロリンの収率及び純度に対する抽出溶剤の影響
【表４】
2017538703.tif 000006
【０３１９】
アセトニトリルによる抽出で液体種子抽出物から得られたロリンの最高の収率及び純度がもたらされ、７７％のロリンが４５％の純度で抽出された（上記の表３を参照のこと）。
【０３２０】
この実施例は、炭素が効果的にロリンを吸収し、効果的な部分的な精製工程として用いられることが可能であることを実証する。この実施例はさらに、さらなる部分的な精製工程としての溶剤抽出の効力を実証する。
【０３２１】
実施例５
この実施例は、完全な種子の大規模抽出の実施可能性を評価し、このようなプロセスで単離されたロリンの純度を検討するものである。
【０３２２】
２００ｇの草の種子を１．８Ｌの水中で３０分間煮た。混合物を冷却し、粗いフィルタでろ過した。炭素（２％ｗ／ｖ）を液体抽出物と混合した。サンプルを遠心分離し、上澄みを傾瀉した。炭素ペレットをさらなる１Ｌの水で洗浄し、混合物を遠心分離した。次いで、上澄みを上記のとおり傾瀉した。
【０３２３】
炭素ペレットを１Ｌのアセトニトリルと混合し、混合物を遠心分離した。ロリンを含有する上澄みを傾瀉し、乾燥させた。この抽出手法は、２００ｇの草の種子２０バッチで行った。
【０３２４】
アセトニトリル抽出物から得た組み合わせた残渣を水中にとり、ろ過して炭素微細繊維を除去した。液体の総体積は約９０ｍｌであり、これに１０ｍｌのエタノールを添加して細菌の増殖を防止した。サンプルの分析は９．０％のロリンが含有されていることを示した。
【０３２５】
この実施例は、ロリンが効果的に抽出され、本発明の方法を用いて完全な種子から精製されることを実証する。
【０３２６】
実施例６
本実施例は、本明細書に記載の方法を用いた完全な種子からのロリンアルカロイドの抽出を検討するものである。
【０３２７】
１ｇの完全な草の種子を水溶液（水、０．５％アンモニア又は０．５％酢酸）中において１０、２０又は３０分間煮た。サンプルを遠心分離し、抽出物のロリン含有量を測定した。結果が表４に示されている。
【０３２８】
ロリンは、テストしたすべての水溶液中に完全な種子から抽出した。ロリンアルカロイドの収率は、すべての時点で、水又は０．５％酢酸で抽出したサンプルよりも０．５％アンモニアで抽出したサンプルにおいて顕著に高かった。
【０３２９】
この実施例は、完全な種子からのロリンアルカロイドの効率的で、高い収率での抽出を実証する。
【０３３０】
表４:異なる水溶液中に完全な種子から抽出されるロリンアルカロイドの収率。
【表５】
2017538703.tif 000007
【０３３１】
実施例７
本実施例は、本明細書に記載の方法を用いた植物材料からのロリンアルカロイドの抽出を検討するものである。
【０３３２】
ヒロハノウシノケグサの草を、切削面としてからざおを備え、粉末化した材料を通過させる２０ｍｍのメッシュプレートを備えるＲｏｖｅｒチッパー（モデル９８１１７；４．１ｋＷ）を用いて粉末化した。得られた粉末化した草をマットのように一緒に保持した。１ｋｇの牧草を、表５に記載の条件下で、１０ｋｇの水中において抽出した。抽出物のロリン含有量を実施例１について上記に記載したとおり測定した。
【０３３３】
５０℃〜９５℃の範囲の抽出温度を検討した（表５中のサンプル１〜６）。全ロリンの最大量が、図１及び表６に示されているとおり、７０℃の温度で抽出された。中性のｐＨ（サンプル１及び３）と比して、抽出をｐＨ１１で行った場合（サンプル２及び４）、ロリン収率における差異は観察されなかった。
【０３３４】
表５:抽出条件
【表６】
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【０３３５】
表６:粉末化した草から種々の抽出温度で抽出されるロリンアルカロイド総量
【表７】
2017538703.tif 000009
【０３３６】
経時的な７０℃の抽出温度でのロリン抽出（サンプル７〜１０）の効率のさらなる検討を行った。サンプリングは、種々の時点で１６又は２４時間にわたって行った。図２は、経時変化における最初のステージの最中にサンプル７及び８（表５）で得られたデータを表す。図２に示されているとおり、抽出物の全ロリン濃度は抽出期間にわたってわずかに低減した。経時変化に伴って、ＮＦＬ濃度は低下し、ロリン濃度は増加した（データは図示せず）。
【０３３７】
ロリン抽出の経時変化は粉末化していないヒロハノウシノケグサの草で２４時間かけて行い、差異的な抽出時間を特定するために種々の時点でサンプリングを行った。この抽出方法がヒロハノウシノケグサからのロリンの回収率を向上させたかを特定するために、バッチ（浸漬、サンプル９）及び充填床（循環、サンプル１０）の２種類の方法を粉末化していない草に実施した。図３に示されているとおり、粉末化していない草を用いる抽出方法間では、ロリン濃度に顕著な差異はなかった。
【０３３８】
粉末化していない草と比した粉末化した草からの浸漬法抽出を用いるロリン抽出を、直接的に比較した（サンプル１１及び１２）。図４に示されているとおり、粉末化した草からのロリン抽出は、粉末化していない草からのロリン抽出よりも迅速に生じた。より早期の時点（０〜１２０分間）では、全ロリンの顕著に高い濃度が粉末化した草抽出物中において観察された。
【０３３９】
この実施例は、本明細書に記載の方法を用いた植物材料からのロリンアルカロイドの抽出を実証する。この実施例は、本明細書に記載の方法を用いる効率的な抽出は、浸漬又は充填床抽出を用いて、及び、粉末化した草又は粉末化していない草を用いて達成され得ることをさらに実証する。
【産業上の利用可能性】
【０３４０】
上記の記載から明らかであろうとおり、本発明は、ロリンアルカロイドを含む組成物の調製方法、及び、このような組成物の使用を提供する。本明細書に記載の組成物及び方法は、園芸家に対する植物有害生物を防除する有用な手段の提供、及び、セラピストに対するヒト又は非ヒト動物における昆虫感染又は外寄生の処置又は予防の提供など、農業用用途、園芸用途、医学的用途及び獣医学用途といった広い範囲で実用性を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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