(57)【要約】  本発明は、腫瘍を発症した患者の、カスパーゼ９とＰＰ２Ａとの相互作用を阻害することができるアポトーシス促進ペプチドによる治療に対する、応答の可能性を測定するインビトロの方法を提供する。本方法は、前記患者の生体試料において、少なくとも、ＶＩＭ、ＭＫ１６７、ＴＣＦ７Ｌ２、ＮＥＫ２、ＢＩＲＣ５、ＭＣＬ１、およびＰＬＫ１の各遺伝子の発現レベルを測定することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍を発症した患者の、カスパーゼ９とＰＰ２Ａとの相互作用を阻害することができるアポトーシス促進ペプチドによる治療に対する、応答の可能性を測定するインビトロの方法であって、前記患者の生体試料において、少なくとも、ＶＩＭ、ＭＫ１６７、ＴＣＦ７Ｌ２、ＮＥＫ２、ＢＩＲＣ５、ＭＣＬ１、およびＰＬＫ１の各遺伝子の発現レベルを測定することを含む、方法。
【請求項２】
さらに、前記遺伝子の発現レベルを、少なくとも一つの対照値と比較することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生体試料が、腫瘍のＤＮＡまたはＲＮＡを含む試料、好ましくは腫瘍組織生検である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
アポトーシス促進ペプチドがＰＰ２Ａへの結合ドメインを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
アポトーシス促進ペプチドが、
配列Y-X4a-ETLD-X4b-I-X5-EQWA-X6-S-X7（配列番号３）
（ここで、
X4aはバリンまたはイソロイシンであり；
X4bはアスパラギン酸またはグリシンであり；
X5はフェニルアラニンまたはロイシンであり；
X6はアルギニンまたはヒスチジンであり；
X7はアミノ酸なしであり、またはグルタミン酸、グルタミン酸−アスパラギン酸、またはグルタミン酸−アスパラギン酸−ロイシンであり；好ましくは、X4aはバリンであり；X4bはアスパラギン酸であり；X5はフェニルアラニンであり；およびX6はヒスチジンである）を含む；
または、一つ以上の化学修飾によって前記アポトーシス促進ペプチドから生じるタンパク質分解耐性ペプチドである、もしくは実質的な相同ペプチド、好ましくは一つ以上の保存的置換によって配列番号３から生じるペプチドである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
アポトーシス促進ペプチドがカスパーゼ９への結合ドメインを含む、好ましくはアポトーシス促進ペプチドがアミノ酸配列DTLDHIRALDRLQEVPHEGP（配列番号５）を含む、または、一つ以上の化学修飾によって前記アポトーシス促進ペプチドから生じるタンパク質分解耐性ペプチドである、もしくは実質的な相同ペプチド、好ましくは一つ以上の保存的置換によって配列番号５から生じるペプチドである、請求項１〜３に記載の方法。
【請求項７】
アポトーシス促進ペプチドが細胞透過性ペプチドと融合し、それによってキメラペプチドを形成している、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞透過性ペプチドが以下から選択される、請求項７に記載の方法。
ａ）X1-KKKIK-Ψ-EI-X2-X3（配列番号１８）
（ここで、X1はアミノ酸なし、リジン残基、またはバリン−リジンであり；
X2はアミノ酸なし、リジン残基、またはリジン−イソロイシンであり；
X3はアミノ酸なし、または１〜４つのアミノ酸から成るアミノ酸配列であり；
Ψは任意のアミノ酸である）；
または、一つ以上の化学修飾によって配列番号１８から生じるタンパク質分解耐性ペプチドである、もしくは一つ以上の保存的置換によって配列番号１８から生じる実質的な相同ペプチドである；
ｂ）(RQKRLI)3（配列番号１９）、(RHSRIG)3（配列番号２０）、RHSRIGIIQQRRTRNG（配列番号２１）、RHSRIGVTRQRRARNG（配列番号２２）、RRRRRRRSRGRRRTY（配列番号２３）；または
ｃ）Ｔａｔペプチド、ポリアルギニンペプチド、ＨＡ２−Ｒ９ペプチド、ペネトラチンペプチド、トランスポータンペプチド、Vectocellペプチド、マウロカルシンペプチド、デカリジンペプチド、ＨＩＶ−Ｔａｔ由来ＰＴＤ４ペプチド、Ｂ型肝炎ウイルス転位モチーフ（ＰＴＭ）ペプチド、ｍＰｒＰ１−２８ペプチド、ＰＯＤ、ｐＶＥＣ、ＥＢ１、Ｒａｔｈ、ＣＡＤＹ、ヒスタチン５、Ａｎｔｐペプチド、またはＣｙｔ86-101ペプチド。
【請求項９】
前記細胞透過性ペプチドがX1-KKKIK-Ψ-EI-X2-X3（配列番号１８）であって、Ψがアルギニン、アラニン、リジン、またはアスパラギンであり、好ましくはΨがアルギニン、アラニン、リジン、またはアスパラギンであり、X1がバリン−リジン；X2がリジン−イソロイシン；およびX3がアミノ酸なしであり、さらに好ましくは、前記細胞透過性ペプチドがVKKKKIKREIKI（配列番号２６）、VKKKKIKAEIKI（配列番号２７）、VKKKKIKKEIKI（配列番号２８）またはVKKKKIKNEIKI（配列番号２９）である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
キメラペプチドが、
VKKKKIKREIKI-YVETLDGIFEQWAHSEDL（配列番号４９）
VKKKKIKREIKI-YIETLDGILEQWARSEDL（配列番号５０）
VKKKKIKAEIKI-YVETLDGIFEQWAHSEDL（配列番号５１）
VKKKKIKAEIKI-YIETLDGILEQWARSEDL（配列番号５２）
VKKKKIKKEIKI-YVETLDGIFEQWAHSEDL（配列番号５３）
VKKKKIKKEIKI-YIETLDGILEQWARSEDL（配列番号５４）
VKKKKIKNEIKI-YVETLDGIFEQWAHSEDL（配列番号５５）
VKKKKIKNEIKI-YIETLDGILEQWARSEDL（配列番号５６）
VKKKKIKREIKI-DTLDHIRALDRLQEVPHEGP（配列番号５７）
(RQKRLI)3-DTLDHIRALDRLQEVPHEGP（配列番号５８）、
(RHSRIG)3-DTLDHIRALDRLQEVPHEGP（配列番号５９）、
RHSRIGIIQQRRTRNG-DTLDHIRALDRLQEVPHEGP（配列番号６０）、
RHSRIGVTRQRRARNG-DTLDHIRALDRLQEVPHEGP（配列番号６１）、
RRRRRRRSRGRRRTY-DTLDHIRALDRLQEVPHEGP（配列番号６２）、
から成る群から選択される配列を含むか、前記配列から成る、または、前記キメラペプチドから一つ以上の化学修飾によって生じるタンパク質分解ペプチドである、もしくは実質的な相同ペプチド、好ましくは配列番号４９〜６２のアミノ酸配列から一つ以上の保存的置換によって生じるペプチドである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
腫瘍が、乳房腫瘍、卵巣腫瘍、肺腫瘍、結腸腫瘍または前立腺腫瘍から成る群から選択される腫瘍である、または、腫瘍が、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、多発性骨髄腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、脳癌、頭頸部癌、膀胱癌、胃癌、膵癌、頭部癌、頸部癌、腎癌、前立腺癌、結腸直腸癌、食道癌、甲状腺癌、ぶどう膜黒色腫および黒色腫から成る群から選択される腫瘍である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記遺伝子の発現レベルをＲＴ−ＰＣＲ増幅によって測定することを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
さらに、少なくとも一つの他の遺伝子、好ましくはＶＣＡＭ、ＶＥＧＦＡ、ＴＮＦＡＩＰ３、およびＢＢＣ３から成る群より選択される遺伝子の発現レベルを測定することを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ＶＩＭ、ＭＫ１６７、ＴＣＦ７Ｌ２、ＮＥＫ２、ＢＩＲＣ５、ＭＣＬ１、およびＰＬＫ１の各遺伝子に特異的なプライマーおよび／またはプローブを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法に使用するキット。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載される方法によって応答の可能性があると分類された患者の腫瘍を治療するために使用される、請求項１〜１３のいずれか一項に規定される、カスパーゼ９とＰＰ２Ａとの相互作用を阻害することができるアポトーシス促進ペプチド、あるいは前記アポトーシス促進ペプチドを含むキメラペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗腫瘍治療に対する応答を予測する方法、特に特定のアポトーシス促進ペプチドが患者の腫瘍の治療に有効であるかどうかを予測するためのマーカーの同定に関連する。
【背景技術】
【０００２】
アポトーシスは遺伝的なプログラム細胞死であり、その調節解除は、数ある病的状態の中でも特に、癌と関係している。アポトーシスは、Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーおよびカスパーゼに依存することが知られているが、データは、セリン・スレオニンフォスファターゼの二つの主要なファミリー、ＰＰ１およびＰＰ２Ａが、細胞の生または死の決定に関わる主要な動作主体であることを示している。セリン・スレオニンフォスファターゼＰＰ２Ａは、アポトーシスの誘導および阻害の両方と関連づけられており、フォスファターゼ作用の複雑な相互作用を示している。ＰＰ２Ａは、カスパーゼ９のＣ末端部の特定の配列によってカスパーゼ９と相互作用することが示された。この配列は、ヒトカスパーゼ９ではYVETLDGIFEQWAHSEDL（配列番号１）であると同定された。ＰＰ２Ａｃへの当該結合ドメインは、ヒトカスパーゼ９（NCBI アクセッション番号 NP 001 220）のアミノ酸３６３−３８０の位置に相当し、特許文献１に記載されている。パートナーであるカスパーゼ９と相互作用するヒトＰＰ２Ａｃサブユニットの対応する配列は、DTLDHIRALDRLQEVPHEGP（配列番号２）で、ヒトＰＰＡ２ｃ配列の１７５−１９４の位置（Swiss-Prot アクセッション番号 P67775-1）であると同定され、特許文献２に記載されている。カスパーゼ９とＰＰ２Ａとの間のこれらの相互作用モチーフは、アポトーシス促進ペプチドとして提唱されており、特に細胞透過性ペプチドと融合した際に非常に有望であることが明らかになってきている。
【０００３】
癌治療の選択肢の広がりにつれて、個々の腫瘍にあわせた治療方針を立てるための予測バイオマーカーの同定が必要になってきている。かかる治療方針は、毒性を最小化して臨床的有用性を向上させながら、抗腫瘍効果を最大にする可能性を有している。過去数十年間の分子治療学の発展により、個別化療法で癌患者を治療する可能性が開拓されてきた。
【０００４】
日々の臨床腫瘍学診療において用いられている予測バイオマーカーのいくつかの例には、乳癌での内分泌療法に対する感受性を予測するエストロゲンおよびプロゲステロン受容体、ハーセプチン治療に対する感受性を予測するＨＥＲ２、およびＥＧＦＲ抗体療法に対する耐性を予測するＫＲＡＳ変異がある。治療の前または初期に抗癌療法の応答を予測する当該サインにより、利用可能な治療の選択肢から根拠に基づいて決定できるようになる。
【０００５】
同様に、患者がアポトーシス促進ペプチドによる治療に対して応答するか否かを予測する方法が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際特許出願  ＷＯ２０１０／１１２４７１
【特許文献２】国際特許出願  ＷＯ２０１２／０４２０３８
【発明の概要】
【０００７】
腫瘍を発症した患者が、カスパーゼ９とＰＰ２Ａとの相互作用を阻害することができるアポトーシス促進ペプチドによる治療に応答する可能性を測定するインビトロの方法が、提供される。本発明によると、本方法は、前記患者の生体試料において、少なくともＶＩＭ、ＭＫ１６７、ＴＣＦ７Ｌ２、ＮＥＫ２、ＢＩＲＣ５、ＭＣＬ１、およびＰＬＫ１遺伝子の発現レベルを測定することを含む。
【０００８】
以下にさらに詳細に記載されている通り、アポトーシス促進ペプチドは、ＰＰ２Ａに対する結合ドメイン、またはカスパーゼ９に対する結合ドメインを含んでもよい。
【０００９】
好ましくは、アポトーシス促進ペプチドは細胞透過性ペプチドと融合し、それによってキメラペプチドを形成している。
【００１０】
特定の実施形態において、キメラペプチドはVKKKKIKREIKI-YVETLDGIFEQWAHSEDL（配列番号４９）であり、ＤＰＴ−Ｃ９ｈとも命名されている。
【００１１】
腫瘍は、任意の腫瘍または癌であってよく、例えば、乳房腫瘍、卵巣腫瘍、肺腫瘍または前立腺腫瘍であってよい。
【００１２】
本発明はさらに、当該治療に対する患者の応答をモニターする方法を提供する。
【００１３】
最後に、ＶＩＭ、ＭＫ１６７、ＴＣＦ７Ｌ２、ＮＥＫ２、ＢＩＲＣ５、ＭＣＬ１、およびＰＬＫ１の各遺伝子に特異的なプライマーおよび／またはプローブを含む、当該方法において用いられるキットが提供される。
【００１４】
さらに、腫瘍を発症した患者を治療する方法が提供される。本方法は、本明細書に記載のアポトーシス促進ペプチドまたはキメラペプチドを、所望により化学療法薬のような抗腫瘍薬と組み合わせて、前記患者に投与することを含み、前記患者は、治療過程の前または途中に、少なくともＶＩＭ、ＭＫ１６７、ＴＣＦ７Ｌ２、ＮＥＫ２、ＢＩＲＣ５、ＭＣＬ１、およびＰＬＫ１の各遺伝子の発現レベルをその生体試料において測定することを含む本明細書に記載の方法によって、事前に「応答者」として分類されている。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の詳細な説明
定義
「患者」という用語は、ヒトまたは非ヒト動物を指し、好ましくは哺乳類を指し、アポトーシス促進効果が期待される治療を必要とする男性、女性、成人および子供を含む。
【００１６】
本明細書で用いられる場合、「治療」または「療法」という用語は、治癒的および／または予防的治療を含む。さらに詳細には、治癒的治療（curative treatment）とは、特定の疾患の症状の軽減、寛解および／または消失、減少および／または安定化（例えば、さらに進行した段階に進まないこと）、および症状の進行の遅延のいずれをも指す。予防的治療とは、特定の疾患の症状の発現を止めること、発症のリスクを減らすこと、発症率を低下させること、発現を遅らせること、発症を減らすこと、および発現までの時間を延ばすことのいずれをも指す。
【００１７】
「治療に対する応答者、または治療に応答性の」という用語は、治療中または治療後に少なくとも一つの症状の発現が遅れているまたは阻止されている対象者、あるいはその症状またはその少なくとも一つが安定化、減少または消失している対象者、あるいは腫瘍の成長、体積、または拡散が停止または減少している、例えば病変直径の合計が少なくとも３０％減少している対象者（固形癌効果判定基準（RECIST criteria））を指す。
【００１８】
「治療に抵抗性の」または「治療に非応答性の」という用語は、治療中または治療後に症状の発現が遅れていないまたは阻止されていない対象者、およびいずれの症状も安定化も、減少も、消失もしていない対象者、および腫瘍の成長、体積および拡散が停止も減少もしていない、特に病変直径の合計が３０％を超えて減少していない対象者（固形癌効果判定基準）を指す。
【００１９】
互換的に用いられる「透過性ペプチド」または「細胞透過性ペプチド」（つまり「ＣＰＰ」）または「シャトルペプチド」という用語は、ペプチドが実質的な細胞膜の損傷を引き起こすことなく細胞内に移動できること、および他の分子と結合して、それらのベクターとして使用できることを意味する。当該用語は、陽イオン性の細胞透過性ペプチドのことを指し、輸送ペプチド、キャリアペプチド、またはペプチド伝達ドメインとも呼ばれている。ＣＰＰは、本明細書に示した通り、所与の細胞培養集団のうち３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％（これらの間の整数の％は全て含む）の細胞に対し、ＣＰＰと融合したペプチドの細胞透過を誘導する能力があり、また全身投与においてインビボでの様々な組織内での高分子の転移を可能にする。また、細胞透過性ペプチドは、適切な条件下で細胞と接触した際、外部環境から、細胞の細胞質、ミトコンドリアのようなオルガネラ、または核を含む細胞内環境へ、受動拡散よりも顕著に多い状態で通過するペプチドのことも意味しうる。本特性は、当業者に知られる様々な方法によって評価することができる。
【００２０】
一つ以上のアミノ酸残基が生物学的に類似する残基で置換される場合、あるいは８０％を超えるアミノ酸が同一である場合、あるいは約９０％を超えるアミノ酸、好ましくは約９５％を超えるアミノ酸が類似する（機能的に同一である）場合に、二つのアミノ酸配列は「相同」、「実質的に相同」、あるいは「実質的に類似」である。好ましくは、類似の配列または相同の配列は、例えばＧＣＧ（Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin）パイルアップ（pileup）プログラム、あるいは当業界で知られた任意のプログラム（ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなど）を用いたアライメントによって同定される。好ましくは、相同ペプチドは、環化を避けるために、二つのシステイン残基を含まない。
【００２１】
本明細書で使用されている「保存的置換」という用語は、ペプチドの全体のコンフォメーションおよび機能を変えることなく、あるアミノ酸を別のアミノ酸に置換することを意味する。限定されないが、あるアミノ酸を、類似の特性（例えば、極性、水素結合能、酸性、塩基性、形状、疎水性、芳香族性など）を持つアミノ酸に置換することを含む。類似の特性を持つアミノ酸は当業界ではよく知られている。例えば、アルギニン、ヒスチジン、およびリジンは親水性塩基性アミノ酸であり、互換性があるだろう。同様に、疎水性アミノ酸であるイソロイシンは、ロイシン、メチオニン、またはバリンで置換できる。相互に置換可能である中性親水性アミノ酸には、アスパラギン、グルタミン、セリンおよびスレオニンが含まれる。
【００２２】
本発明は、「置換（substituted）」または「修飾（modified）」なる用語によって、天然のアミノ酸から改変または修飾されているアミノ酸を含む。
【００２３】
このように、保存的置換が、本発明に関連して、当業界においてあるアミノ酸を類似の特性を持つ別のアミノ酸で置換することとして認識されていることは、理解されるであろう。保存的置換の例は、下記の表Ａに示した。
【表１】
2017503484.tif 000002
【００２４】
あるいは、保存的アミノ酸はLehninger, 1975に記載された通り、すなわち、直下の表Ｂに示した通りに、グループ分け可能である。
【表２】
2017503484.tif 000003
【００２５】
さらに別の代案として、直下の表Ｃに例示的な保存的置換を示した。
【表３】
2017503484.tif 000004
【００２６】
予測サイン
腫瘍において差示的に発現される特定の遺伝子から成るマーカーのセットは、本明細書で規定されるアポトーシス促進ペプチドによる癌治療の有効性を予測する上で、正確性の改善を有利にもたらすことがわかった。
【００２７】
本発明のマーカーのセットは、癌患者がこのようなアポトーシス促進ペプチドによる治療に応答するか否かの可能性について情報を提供するために、臨床で用いることができる。本発明のマーカーセットは、癌患者を当該治療に応答する可能性のある応答者か非応答者のどちらか一方に分類することを可能にする。
【００２８】
本方法は、前記患者の生体試料において、少なくとも、ＶＩＭ、ＭＫ１６７、ＴＣＦ７Ｌ２、ＮＥＫ２、ＢＩＲＣ５、ＭＣＬ１、およびＰＬＫ１の各遺伝子の発現レベルを測定することを含む。
【００２９】
「ＶＩＭ、ＭＫ１６７、ＴＣＦ７Ｌ２、ＮＥＫ２、ＢＩＲＣ５、ＭＣＬ１、およびＰＬＫ１の各遺伝子」という用語は、前記全遺伝子の発現レベルが評価されることを意味する。
【００３０】
ＶＩＭは、ビメンチンをコードする遺伝子で、細胞の形状維持、細胞質の完全性、および細胞骨格の相互作用の安定化に関与している。ヒトＶＩＭ ｍＲＮＡの配列は、Genbank アクセッション番号 NM_003380（配列番号６３および６４）で入手可能である。
【００３１】
ＭＫ１６７（marker of proliferation Ki-67）は、細胞増殖と関連し、細胞増殖に必須であろう核タンパク質をコードしている。ヒト選択的スプライシング転写変異体が記載されている。長い転写物はGenbankにNM_002417（配列番号６５および６６）として記載され、短い転写物はNM_001145966（配列番号６７および６８）として記載されている。
【００３２】
ＴＣＦ７Ｌ２（transcription factor 7-like 2 (T-cell specific, HMG-box)）遺伝子は、Ｗｎｔシグナル伝達経路において重要な役割を果たす高移動度グループ（ＨＭＧ）ボックス含有転写因子をコードしている。複数の様々なアイソフォームをコードするいくつかの転写変異体が、当該遺伝子に対して発見されている。変異体１（Variant 1）は、最長のアイソフォームをコードしている（Genbank アクセッション番号 NM_001146274）（配列番号６９および７０）。
【００３３】
ＮＥＫ２（NIMA-related kinase 2）は、有糸分裂の制御に関与するセリン／スレオニンプロテインキナーゼをコードしている。当該タンパク質は中心体に局在化し、Ｇ１期には検出不能であるが、Ｓ期を通して連続的に蓄積し、Ｇ２期後期には最大レベルに達する。異なるＣ末端を伴う複数のアイソフォームをコードする選択的スプライシング転写物が、当該遺伝子に対して知られている。GenbankでNM_002497として開示されている変異体１（Variant 1）は、優勢の転写物を示し、最長のアイソフォーム（１、ＮＥＫ２Ａとしてもまた知られる）をコードしている（配列番号７１および７２）。
【００３４】
ＢＩＲＣ５（Homo sapiens baculoviral IAP repeat containing 5）は、アポトーシスを妨げる負の制御タンパク質をコードしている。異なるアイソフォームをコードする選択的スプライシング転写物変異体が、当該遺伝子に対して発見されている。最も頻繁に生じる転写物は、NM_001168としてGenbankに発表されている（配列番号７３および７４）。
【００３５】
ＭＣＬ１は、骨髄細胞白血病配列１（ＢＣＬ２関連）（myeloid cell leukemia sequence 1 (BCL2-related)）とも名付けられているが、抗アポトーシスタンパク質をコードし、Ｂｃｌ−２ファミリーの一員である。選択的スプライシングの結果様々な転写物変異体が生じる。選択的スプライシング短鎖遺伝子産物（アイソフォーム２およびアイソフォーム３）が、アポトーシスを促進して細胞死を誘導する一方、最長の遺伝子産物（アイソフォーム１）はアポトーシスを阻害することによって細胞の生存を増強する。最長のアイソフォームをコードする最長の転写物は、GenbankによってNM_021960として開示されている変異体１（variant 1）である（配列番号７５および７６）。
【００３６】
ＰＬＫ１は、ポロ様キナーゼ１（polo-like kinase 1）をコードする癌原遺伝子であり、セリン／スレオニンプロテインキナーゼとしても知られている。そのヒトｍＲＮＡ配列は、GenbankにNM_005030として発表されている（配列番号７７および７８）。
【００３７】
生体試料は好ましくは腫瘍ＤＮＡまたはＲＮＡを含む試料であり、好ましくは腫瘍組織生検である。例えば、生体試料は、フォルマリンで固定したパラフィン包埋腫瘍組織、または新鮮な凍結腫瘍組織であってもよい。
【００３８】
次に、本方法は、通常、前記遺伝子の発現レベルと少なくとも一つの対照値とを比較することを含む。
【００３９】
「対照値」という用語は、所定の応答プロファイルを示す腫瘍の群、すなわち、応答性患者の群あるいは抵抗性患者（治療に応答する見込みのない患者）の群の前記各遺伝子の発現レベルに対応する参照値である。
【００４０】
当該遺伝子の発現レベルに基づき、患者の分類は、例えば最短収縮重心（ＮＳＣ）アルゴリズムすなわち「Prediction Analysis of Microarrays」（ＰＡＭ）、サポートベクターマシーン（ＳＶＭ）アルゴリズムまたはｋ近傍（k-nearest neighbour）アルゴリズムのような、任意の一般的に用いられる最適なアルゴリズムを用いて、決定することができる。好ましくは、Tibshirani et al., PNAS 2002, 99(10):6567-6572に記載されるように、ＰＡＭが用いられる。「Prediction Analysis of Microarrays」（ＰＡＭ）は、最短収縮重心法を用いて遺伝子発現データから試料の分類を行う。
【００４１】
本方法はさらに、前記遺伝子の発現レベルが参照発現レベルと比較して高いか低いかを測定することを含む。例として、前記遺伝子の発現が対照値と比較して減少していることは、患者が治療に応答する見込みがあることを示し、あるいは、前記遺伝子の発現が対照値と比較して増加していることは、患者が治療に応答する見込みがないことを示しうる。
【００４２】
参照発現レベルは応答性の患者において安定した発現を示す遺伝子の発現レベル、および／または、抵抗性の患者において安定した発現を示す遺伝子の発現レベルであってよい。スコアは、下記の実施例のセクションでさらに詳細に記載されている通り、あらかじめ設定することが可能である。
【００４３】
参照発現レベルはまた、ヒト腫瘍試料のコホート中の前記遺伝子の発現レベルの平均値であってもよい。これらの遺伝子の発現プロファイルの組み合わせは、何らかの治療の前に、（ｉ）応答する見込みがあり、本明細書に記載のアポトーシス促進ペプチドによる治療が推奨されるとして、また（ｉｉ）応答する見込みがなく、本明細書に記載のアポトーシス促進ペプチドによる治療が推奨されないとして、分類されうる患者の状態について情報を与える。
【００４４】
これらの遺伝子の発現プロファイルの組み合わせはまた、前記治療の過程で、治療の有効性をモニターするための情報を与えることができる。この場合、「対照値」という用語は、異なる時間における当該遺伝子の発現レベルのことを意味しうる。
【００４５】
特定の実施形態において、本方法はさらに、好ましくはＶＣＡＭ、ＶＥＧＦＡ、ＴＮＦＡＩＰ３およびＢＢＣ３から成る群から選択される、少なくとも一つの他の遺伝子の発現レベルを測定することを含む。
【００４６】
発現の測定
生体試料の遺伝子発現レベルの測定は、様々な技術によって行うことができる。
【００４７】
好ましくは、当該測定は、試料と、プローブ、プライマーまたはリガンドのような選択性の試薬とを接触させ、それによって、元来試料中に存在した目的の核酸量を測定することを含む。接触は、プレート、マイクロタイターディッシュ、試験管、ウェル、グラス、カラムなどのような、任意の適した装置内で行うことができる。特定の実施形態において、核酸アレイまたは特定リガンドアレイのような、試薬で覆った基盤上で接触を行う。基盤は、固体あるいは半固体の基盤、例えばガラス、プラスチック、ナイロン、紙、金属、ポリマーなどを含む任意の適した担体であってよい。基盤は、スライド、メンブレン、ビーズ、カラム、ゲルなどのような、様々な形態やサイズであってよい。接触は、試薬と試料の核酸との間で形成される核酸ハイブリッドのような、検出可能な複合体に適した任意の条件下で行ってもよい。
【００４８】
発現は、通常、ｍＲＮＡの量を測ることによって決定することができる。
【００４９】
ｍＲＮＡの量を測る方法は、当業界ではよく知られている。例えば、試料（例えば、患者から調製した細胞または組織）に含まれる核酸を、まず始めに、スタンダードな方法によって、例えば、溶解性の酵素または化学溶液を使用するか、あるいは製造者の説明書に従って核酸結合樹脂で抽出することによって、抽出する。
【００５０】
抽出したｍＲＮＡはその後ハイブリダイゼーション（例えばノーザンブロット解析）および／または増幅（例えばＲＴ−ＰＣＲ）によって検出する。好ましくは、定量的または半定量的ＲＴ−ＰＣＲが好ましい。リアルタイムの定量的または半定量的ＲＴ−ＰＣＲは特に有利である。
【００５１】
他の増幅の方法には、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写増幅法、鎖置換増幅（ＳＤＡ）および核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）が含まれる。
【００５２】
少なくとも１０個のヌクレオチドを有し、本明細書で着目するｍＲＮＡに配列相補性または相同性を示す核酸は、ハイブリダイゼーションプローブまたは増幅プライマーとして有用である。当該核酸は、同等サイズの相同領域に同一である必要はないが、典型的には少なくとも約８０％同一であり、さらに好ましくは８５％、さらにいっそう好ましくは９０〜９５％同一であることは理解される。ある実施形態において、ハイブリダイゼーションを検出するために、検出可能なラベルのような適切な手段と併せて核酸を使用することは有利であろう。蛍光性、放射性、酵素性その他のリガンドを含む、広範囲の適切な指標が、当業界では知られている（例えば、アビジン／ビオチン）。
【００５３】
好ましい方法は、検出する遺伝子の領域に特異的にハイブリダイゼーションする（例えば、配列番号６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５または７７のそれぞれに特異的にハイブリダイゼーションする）、少なくともおよそ１０個のヌクレオチドのプライマーを使用する定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いる。ＰＣＲ反応において増幅産物を形成するために、二つのプライマーが、ターゲット領域の逆ストランドにアニールする。増幅産物のサイズは、典型的には、約６０〜約５００ｂｐの間であり、好ましくは約８０〜約２５０ｂｐである。
【００５４】
プライマーオリゴヌクレオチドは、一般的に１０〜４０のヌクレオチドを含み、好ましくは１０〜３０のヌクレオチドを含み、さらに好ましくは１５〜２５のヌクレオチドを含む。プライマーオリゴヌクレオチドは、好ましくは５６〜６４℃付近に融解温度（Ｔｍ）を持つ。プライマーオリゴヌクレオチドは、好ましくは標的とする配列の一部に１００％相補的である。
【００５５】
ＲＴ−ｑＰＣＲはまた、標的ＤＮＡ上のフォワード（５’）ＰＣＲプライマー結合サイトとリバース（３’）ＰＣＲプライマー結合サイトの間の配列にアニールするオリゴヌクレオチドであるプローブを有利に使用可能である。プローブのＴｍは一般的にプライマーのＴｍより高い。
【００５６】
本明細書に記載のＰＣＲは、このように好ましくは２サイクル以上繰り返され、好ましくは、１０〜５０サイクル繰り返される。ＰＣＲの各ステップの長さと温度は、サイクル数と同様、実際に必要なストリンジェンシーに従って調節される。アニーリング温度とタイミングは共に、プライマーがテンプレートにアニールすることが期待される効率によって、決定される。３０℃〜７２℃のアニーリング温度が用いられる。
【００５７】
鋳型分子の最初の変性は、通常９２℃〜９９℃の間、約１５秒で起こるが、好ましくは、約１分または４分から約１０〜１５分で起こり、単純なＰＣＲでは変性（９４〜９９℃、１５秒〜１分）、アニーリング（例えば、６０℃、１５秒〜２分）、および伸長（７２℃、１分）から成る２０〜５０サイクルが続く（ｑ−ＰＣＲにおいて、１分、６０℃ステップでは、伸長とアニーリングが同時に起こる）。任意の最後の伸長ステップ（単純なＰＣＲで有用）は、一般的に約４分、７２℃で実行され、４℃の不確定なステップ（０〜２４時間）が続いてもよい。
【００５８】
リアルタイム反応条件は、さらに、ＰＣＲ産物が産生された際に測定／検出するために、核酸検出剤（例えば、色素あるいはプローブ）を利用する。別の実施形態において、発現レベルはＤＮＡチップ解析によって決定される。当該ＤＮＡチップまたは核酸マイクロアレイは、マイクロチップ、スライドガラス、あるいは微粒子サイズビーズであり得る基盤に化学的に結合した種々の核酸プローブから成る。マイクロチップは、ポリマー、プラスチック、樹脂、シリカもしくはシリカベースの物質、カーボン、金属、無機ガラス、またはニトロセルロースで構成されてもよい。プローブは約１０〜約６０塩基対であり得るｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドのような核酸を含む。発現レベルを測定するために、被験者の試料を、（所望によりまず逆転写し、その後）標識してハイブリダイゼーションの条件でマイクロアレイと接触させ、マイクロアレイ表面に結合したプローブ配列と相補的な標的核酸の間で複合体を形成させる。標識されたハイブリダイズ複合体は、その後、検出され、定量化または半定量化することができる。標識化は様々な方法で、例えば放射性または蛍光の標識化を用いることで、達成可能である。マイクロアレイハイブリダイゼーション技術の多くの変形態様が、当業者にとって利用可能である。
【００５９】
特定の実施形態において、発現レベルは遺伝子のコピー数を測定することによって決定される。比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）が、全ゲノムにわたってＤＮＡのコピー数多型を調べるために開発された。ＣＧＨに伴って、差示的に標識された試験ゲノムＤＮＡおよび参照ゲノムＤＮＡを、正常な中期クロモソームに同時にハイブリダイズすると、クロモソームの長さに応じた蛍光の割合によって、ＤＮＡコピー数多型の細胞遺伝学的な表現が提供される。アレイしたＤＮＡ配列の蛍光割合によってＤＮＡのコピー数多型の遺伝子座別測定が可能になるアレイベースのＣＧＨは、マッピングの高分解能を達成するもう一つの手段を提示する。
【００６０】
特定の実施形態において、発現のレベルは、前記遺伝子によって発現したタンパク質の量を、例えばウェスタンブロッティングによって、評価することによって測定する。タンパク質量の測定は、ｍＲＮＡ量の測定に代わって、または加えて行ってもよい。
【００６１】
患者：
治療する患者は、好ましくはヒトの患者であり、腫瘍、特に癌腫瘍を発症している。
【００６２】
腫瘍は血液癌であってよく、特に急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、多発性骨髄腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫であってよく、または、非血液性癌であってよく、例えば、脳癌、類表皮癌（特に、肺がん、乳がん、卵巣癌）、頭頸部癌（扁平上皮癌）、膀胱癌、胃癌、膵臓癌、頭部癌、頸部癌、腎癌、結腸癌、前立腺癌、結腸直腸癌、食道癌または甲状腺癌、および黒色腫であってよい。
【００６３】
様々なタイプの癌には、限定されないが、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（endotheliosarcoma）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮細胞肉腫（lymphangioendothelio-sarcoma）、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、リンパ腫、白血病、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌腫、皮脂腺癌腫、乳頭癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌、肝細胞腫、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、頚部癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮性癌腫、神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫瘍、乏突起細胞腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、ぶどう膜黒色腫および乳癌を含んでもよい。
【００６４】
好ましい実施形態において、癌腫瘍は乳癌である。
【００６５】
アポトーシス促進ペプチド：
腫瘍を発症した患者が、カスパーゼ９とＰＰ２Ａとの間の相互作用を阻害することができるアポトーシス促進ペプチドによる治療に応答する可能性を測定するインビトロの方法、または、前記治療の有効性をモニターする方法が提供される。
【００６６】
一つ目の実施形態において、アポトーシス促進ペプチドは、ＰＰ２Ａに対する結合ドメインを含み、さらに具体的には、カスパーゼ９のＰＰ２Ａ結合ドメインを含んでもよく、または当該ドメインに由来してもよい。
【００６７】
従って、アポトーシス促進ペプチドは次のアミノ酸配列を含んでもよく、または次のアミノ酸配列に含まれてもよい：Y-X4a-ETLD-X4b-I-X5-EQWA-X6-S-X7（配列番号３）
（ここで、
X4aはバリンまたはイソロイシンであり； 
X4bはアスパラギン酸またはグリシンであり；
X5はフェニルアラニンまたはロイシンであり；
X6はアルギニンまたはヒスチジンであり；
X7はアミノ酸なしであり、またはグルタミン酸、グルタミン酸−アスパラギン酸、またはグルタミン酸−アスパラギン酸−ロイシンである）
；または、
一つ以上の化学修飾によって前記アポトーシス促進ペプチドから生じるタンパク質分解耐性ペプチド、もしくは実質的な相同ペプチド、好ましくは細胞のアポトーシスを誘導する能力を維持しつつ配列番号３に少なくとも８０％同一であるペプチド、さらに好ましくは一つ以上の保存的置換によって配列番号３から生じるペプチド。
【００６８】
このようなタンパク質分解耐性ペプチド、または相同ペプチドは、インビトロおよび／またはインビボにおいて、細胞のアポトーシスを誘導する。ある分子、例えばペプチドが細胞のアポトーシスを誘導するかどうかを判定するアッセイは、当業界ではよく知られており、例えば、細胞を候補となるペプチドとともに培養し、アポトーシスが前記候補ペプチドによって誘導されるかどうかを判定すること、例として、アネキシンＶおよびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）によって細胞を標識して、アネキシンＶ＋かつＰＩ−となった細胞をアポトーシス細胞として同定すること、を包含する。
【００６９】
好ましい実施形態において、X4aはバリンであり；X4bはアスパラギン酸であり；X5はフェニルアラニンであり；およびX6はヒスチジンである。
【００７０】
次いで、アポトーシス促進ペプチドは、配列 YVETLDDIFEQWAHSEDL（配列番号４）または YVETLDGIFEQWAHSEDL（配列番号１）を有利に含んでもよく、あるいはこれらから成ってもよい。
【００７１】
二つ目の実施形態において、アポトーシス促進ペプチドはカスパーゼ９への結合ドメインを含み、さらに具体的には、ＰＰ２Ａタンパク質のカスパーゼ９結合ドメインを含んでもよく、または当該ドメインに由来してもよい。
【００７２】
従って、アポトーシス促進ペプチドは次のアミノ酸配列を含んでもよく、または次のアミノ酸配列に含まれてもよい：
アミノ酸配列 DTLDHIRALDRLQEVPHEGP（配列番号５）；
一つ以上の化学修飾によって前記アポトーシス促進ペプチドから生じるタンパク質分解耐性ペプチド、または実質的な相同ペプチド、好ましくは細胞のアポトーシスを誘導する能力を維持しつつ配列番号５に少なくとも８０％同一であるペプチド、さらに好ましくは一つ以上の保存的置換によって配列番号５から生じるペプチド。
【００７３】
このようなタンパク質分解耐性ペプチド、または相同ペプチドは、インビトロおよび／またはインビボにおいて、細胞のアポトーシスを誘導する。ある分子、例えばペプチドが細胞のアポトーシスを誘導するかどうかを判定するアッセイは、当業界ではよく知られており、例えば、細胞を候補となるペプチドとともに培養し、アポトーシスが前記候補ペプチドによって誘導されるかどうかを判定すること、例として、アネキシンＶおよびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）によって細胞を標識して、アネキシンＶ＋かつＰＩ−となった細胞をアポトーシス細胞として同定すること、を包含する。
【００７４】
好ましくは、当該ペプチドは、ダウディ（Daudi）細胞において、また肺癌、ぶどう膜黒色腫、および乳癌の異種移植片モデルから単離された初代細胞において、アポトーシスを誘導する。好ましくは、当該ペプチドは、配列番号５に少なくとも８０％同一の配列、または一つ以上の化学修飾によって前記ペプチドから生じるタンパク質分解耐性ペプチドを含むか、これらから成る。配列番号５に少なくとも８０％同一である配列は、特に、ヒトＰＰ２Ａｃ（Swiss-Prot P67775-1 ）のアミノ酸位置１７５−１９４の天然の変異体であってよく、同等の哺乳類（例えば、マウス、ラット、サル、ネコ、イヌ、ウマ）のヒトＰＰ２Ａｃのアミノ酸位置１７５−１９４に対応する配列であってもよい。特に、配列番号５に少なくとも８０％同一の配列を含む、または当該配列から成るペプチドは、配列番号５のＮ末端あるいはＣ末端部分の、一つ、二つ、三つ、または四つのアミノ酸の欠失を有してもよく、例えば、前記ペプチドはTLDHIRALDRLQEVPHEGP（配列番号６）、LDHIRALDRLQEVPHEGP（配列番号７）、DHIRALDRLQEVPHEGP（配列番号８）、HIRALDRLQEVPHEGP（配列番号９）、DTLDHIRALDRLQEVPHEG（配列番号１０）、DTLDHIRALDRLQEVPHE（配列番号１１）、DTLDHIRALDRLQEVPH（配列番号１２）、またはDTLDHIRALDRLQEVP（配列番号１３）であってもよい。配列番号５と少なくとも８０％同一の配列を含む、または当該配列から成るペプチドは、配列番号５のＣ末端部分の一つまたは二つのアミノ酸の欠失もまた含んでよく、配列番号３のＮ末端部分の一つまたは二つのアミノ酸の欠失もまた含んでよい。例えば、前記ＰＰ２Ａｃペプチドは、TLDHIRALDRLQEVPHEG（配列番号１４）、LDHIRALDRLQEVPHE（配列番号１５）、TLDHIRALDRLQEVPHE（配列番号１６）、またはLDHIRALDRLQEVPHEG（配列番号１７）の配列を有してもよい。
【００７５】
特に好ましい実施形態において、配列番号５と少なくとも８０％同一の配列を含む、または当該配列から成るペプチドは、LDHIRALDRLQEVPHEGP（配列番号７）である。好ましくは、ペプチドは、配列DTLDHIRALDRLQEVPHEGP（配列番号５）を含む、または当該配列から成る。
【００７６】
細胞透過性ペプチド：
好ましい実施形態において、アポトーシス促進ペプチドは少なくとも一つの細胞透過性ペプチドと連結し、キメラペプチド構築物を形成する。細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）は、膜の損傷を伴うことなく細胞内へ移行することができる分子で、治療上のカーゴを運搬するベクターとしての使用の提唱がなされている。いくつかのＣＰＰが、Ｔａｔ、アンテナペディア、ＳＨＶ１ ＶＰ２２のように同定されている。これらのペプチドは、細胞膜を通過して、細胞質および／または核に到達することができる。本手法は、「Drug Phosphatase Technology」（ＤＰＴ）と命名され、国際特許出願ＷＯ２００３／０１１８９８およびＷＯ２００４／０１ １５９５に記載されている。
【００７７】
好ましくは、アポトーシス促進ペプチドは透過性ペプチドのＣ末端と融合している。
【００７８】
特定の実施形態において、アポトーシス促進ペプチドは二つ、三つ、またはそれを超える透過性ペプチドと連結してもよい。
【００７９】
好ましくは、細胞透過性ペプチドは以下の配列を含む、あるいは以下の配列から成る：
ａ）X1-KKKIK-Ψ-EI-X2-X3（配列番号１８）
（ここで、X1はアミノ酸なし、リジン残基、またはバリン−リジンであり；
X2はアミノ酸なし、リジン残基、またはリジン−イソロイシンであり；
X3はアミノ酸なし、または１〜４つのアミノ酸から成るアミノ酸配列であり；
Ψは任意のアミノ酸である）；
または、一つ以上の化学修飾によって配列番号１８から生じるタンパク質分解耐性ペプチドである、もしくは実質的な相同ペプチド、特に一つ以上の保存的置換によって配列番号１８から生じるペプチドである。
ｂ）(RQKRLI)3（配列番号１９）、(RHSRIG)3（配列番号２０）、RHSRIGIIQQRRTRNG（配列番号２１）、RHSRIGVTRQRRARNG（配列番号２２）、RRRRRRRSRGRRRTY（配列番号２３）、または相同ペプチド；
ｃ）Ｔａｔペプチド、ポリアルギニンペプチド、ＨＡ２−Ｒ９ペプチド、ペネトラチン（Penetratin）ペプチド（アンテナペディア（Antennapedia））、トランスポータン（Transportan）ペプチド、Vectocell（登録商標）ペプチド、マウロカルシン（maurocalcine）ペプチド、デカリジンペプチド、ＨＩＶ−Ｔａｔ由来ＰＴＤ４ペプチド、Ｂ型肝炎ウイルス転位モチーフ（Hepatitis B virus Translocation Motif）（ＰＴＭ）ペプチド、ｍＰｒＰ１−２８ペプチド、ＰＯＤ、ｐＶＥＣ、ＥＢ１、Ｒａｔｈ、ＣＡＤＹ、ヒスタチン（Histatin）５、Ａｎｔｐペプチド、Ｃｙｔ86-101ペプチド。
【００８０】
ある実施形態において、ａ）の細胞透過性ペプチドにおいて、X3がアミノ酸なしである、すなわち細胞透過性ペプチドがX1-KKKIK-「Ｃｙｔ86-101ペプチド」-EI-X2（配列番号２４）である。
【００８１】
別の実施形態において、ａ）の細胞透過性ペプチドにおいて、X1がVK、X2がKI、およびX3がアミノ酸なしである、すなわち細胞透過性ペプチドがVKKKKIK-Ψ-EIKI（配列番号２５）である。
【００８２】
好ましくは、Ψがアルギニン、リジン、アスパラギン、またはアラニンである。
【００８３】
従って、細胞透過性ペプチドは、VKKKKIKREIKI（配列番号２６）、VKKKKIKAEIKI（配列番号２７）、VKKKKIKKEIKI（配列番号２８）またはVKKKKIKNEIKI（配列番号２９）であり得る。
【００８４】
「Ｔａｔペプチド」とは、RKKRRQRRR（配列番号３０、Ｔａｔペプチド２）またはYGRKKRRQRRR（配列番号３１）の配列を持つペプチドを意味する。
【００８５】
「ポリアルギニンペプチド」とは、少なくとも９個のアルギニンから成るペプチドを意味する。好ましくは、ポリアルギニンペプチドは、R9（配列番号３２）またはR11（配列番号３３）の配列を持つペプチドである。
【００８６】
「ＨＡ２−Ｒ９ペプチド」とは、GLFEAIEGFIENGWEGMIDGWYG-R9（配列番号３４）の配列を持つペプチドを意味する。
【００８７】
「ペネトラチンペプチド」とは、RQIKIWFQNRRMKWKK（配列番号３５）の配列を持つペプチドを意味する。
【００８８】
「トランスポータンペプチド」（「Ａｎｔｐペプチド」とも呼ばれる）とは、GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL（配列番号３６）の配列を持つペプチドを意味する。
【００８９】
「Vectocell（登録商標）」とは、ヒトヘパリン結合タンパク質および／または抗ＤＮＡ抗体由来のペプチドを意味する。
【００９０】
「マウロカルシンペプチド」とは、GDCLPHLKLCKENKDCCSKKCKRRGTNIEKRCR （配列番号３７）の配列を持つペプチドを意味する。
【００９１】
「デカリジンペプチド」とは、KKKKKKKKKK（K10）（配列番号３８）の配列を持つペプチドを意味する。
【００９２】
「ＨＩＶ−Ｔａｔ由来ＰＴＤ４ペプチド」とは、YARAAARQARA（配列番号３９）の配列を持つペプチドを意味する。
【００９３】
「Ｂ型肝炎ウイルス転位モチーフ（ＰＴＭ）ペプチド」とは、PLSSIFSRIGDP（配列番号４０）の配列を持つペプチドを意味する。
【００９４】
「ｍＰｒＰ1-28ペプチド」とは、MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP（配列番号４１）の配列を持つペプチドを意味する。
【００９５】
「ＰＯＤペプチド」とは、GGG(ARKKAAKA)4（配列番号４２）の配列を持つペプチドを意味する。
【００９６】
「ｐＶＥＣペプチド」とは、LLIILRRRRIRKQAHAHSK（配列番号４３）の配列を持つペプチドを意味する。
【００９７】
「ＥＢ１ペプチド」とは、LIRLWSHLIHIWFQNRRLKWKKK（配列番号４４）の配列を持つペプチドを意味する。
【００９８】
「Ｒａｔｈペプチド」とは、TPWWRLWTKWHHKRRDLPRKPE（配列番号４５）の配列を持つペプチドを意味する。
【００９９】
「ＣＡＤＹペプチド」とは、GLWRALWRLLRSLWRLLWRA（配列番号４６）の配列を持つペプチドを意味する。
【０１００】
「ヒスタチン５ペプチド」は、DSHAKRHHGYKRKFHEKHHSHRGY（配列番号４７）の配列を持つペプチドを意味する。
【０１０１】
「Ｃｙｔ86-101ペプチド」は、KKKEERADLIAYLKKA（配列番号４８）の配列を持つペプチドを意味する。
【０１０２】
キメラ構築物：
本発明の方法は、有利なことに、腫瘍を発症した患者が、カスパーゼ９とＰＰ２Ａとの相互作用を阻害することができるアポトーシス促進ペプチドを細胞透過性ペプチドと融合して含むキメラペプチドによる治療に応答する可能性を測定すること、または前記治療の有効性をモニターする方法を可能にする。
【０１０３】
キメラペプチドはインビトロおよび／またはインビボにおいて細胞アポトーシスを誘導する。
【０１０４】
キメラペプチドは、好ましくは１７〜８０アミノ酸を含む長さを有してよく、好ましくは２０〜７０アミノ酸、さらに好ましくは２３〜４０アミノ酸を含む長さを有してよい。
【０１０５】
好ましい実施形態において、キメラペプチドは、
VKKKKIKREIKI-YVETLDGIFEQWAHSEDL（配列番号４９）
VKKKKIKREIKI-YIETLDGILEQWARSEDL（配列番号５０）
VKKKKIKAEIKI-YVETLDGIFEQWAHSEDL（配列番号５１）
VKKKKIKAEIKI-YIETLDGILEQWARSEDL（配列番号５２）
VKKKKIKKEIKI-YVETLDGIFEQWAHSEDL（配列番号５３）
VKKKKIKKEIKI-YIETLDGILEQWARSEDL（配列番号５４）
VKKKKIKNEIKI-YVETLDGIFEQWAHSEDL（配列番号５５）
VKKKKIKNEIKI-YIETLDGILEQWARSEDL（配列番号５６）
VKKKKIKREIKI-DTLDHIRALDRLQEVPHEGP（配列番号５７）
(RQKRLI)3-DTLDHIRALDRLQEVPHEGP（配列番号５８）、
(RHSRIG)3-DTLDHIRALDRLQEVPHEGP（配列番号５９）、
RHSRIGIIQQRRTRNG-DTLDHIRALDRLQEVPHEGP（配列番号６０）、
RHSRIGVTRQRRARNG-DTLDHIRALDRLQEVPHEGP（配列番号６１）、
RRRRRRRSRGRRRTY-DTLDHIRALDRLQEVPHEGP (配列番号６２）、
から成る群から選択される配列を含むか、前記配列から成る、または、前記キメラペプチドから一つ以上の化学修飾によって生じるタンパク質分解ペプチドである、もしくは実質的な相同ペプチド、好ましくは配列番号４９〜６２のアミノ酸配列から一つ以上の保存的置換によって生じるペプチドである。
【０１０６】
ペプチドの調製：
本明細書に記載のペプチドは、特許出願ＷＯ２０１０／１１２４７１またはＷＯ２０１２／０４２０３８に開示されており、当業者に知られている標準的な合成方法、例えば、化学合成あるいは遺伝子組換えを用いて合成できる。また、ペプチドは組換え体の技術を用いて合成してもよい。この場合、核酸および／または遺伝的構築物は、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列、前記配列の一つに相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、およびストリンジェントな条件下で前記ポリヌクレオチドとハイブリダイズする配列を含んでもよいし、あるいはこれらの配列から成ってもよい。
【０１０７】
タンパク質分解に対するさらなる防御：
本明細書に記載のペプチドのＮ末端およびＣ末端は、所望により、タンパク質分解に対して防御されていてもよい。例えば、Ｎ末端は、アセチル基の形でもよく、および／またはＣ末端はアミド基の形でもよい。タンパク質分解に耐性となるためのペプチドの内部修飾もまた、想定される。例えば、少なくとも−ＣＯＮＨ−ペプチド結合は、（ＣＨ２ＮＨ）還元性結合、（ＮＨＣＯ）レトロインバルソ結合（retro-inverso bond）、（ＣＨ２−Ｏ）メチレン−オキシ結合、（ＣＨ２−Ｓ）チオメチレン結合、（ＣＨ２ＣＨ２）カルバ結合（carba bond）、（ＣＯ−ＣＨ２）セトメチレン結合（cetomethylene bond）、（ＣＨＯＨ−ＣＨ２）ヒドロキシエチレン結合、（Ｎ−Ｎ）結合、Ｅ−アルセン結合（E-alcene bond）、あるいは−ＣＨ＝ＣＨ−結合によっても、修飾および置換される。
【０１０８】
例えば、ペプチドは、アセチル化、アシル化、アミド化、架橋結合、環化、ジスルフィド結合形成、共有結合性の架橋結合形成、システイン形成、ピログルタミン酸形成、ホルミル化、ガンマ−カルボシキル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリスチル化、酸化、リン酸化などによって修飾されてもよい。
【０１０９】
ペプチドは、Ｄ型のアミノ酸から成ってもよく、これはペプチドをタンパク質分解耐性にする。ペプチドはまた、分子内架橋によって安定化させてもよく、例えば、少なくとも二つのアミノ酸残基をオレフィン側鎖、好ましくはＣ３−Ｃ８アルケニル鎖、好ましくはペンテン−２−イル鎖により修飾し、続いていわゆる「ステープル（staple）」技術に従って、当該鎖を化学架橋させることによって安定化させてもよい。例えば、ｉ番目およびｉ＋４からｉ＋７番目の位置のアミノ酸は、反応性のオレフィン残基を示す非天然アミノ酸によって、置換することができる。これらのタンパク質分解耐性化学修飾ペプチドはすべて、本発明に包含される。
【０１１０】
本発明の別の局面として、尿クリアランスの低下および用いられる治療用量の減少のため、ならびに血漿中の半減期を延ばすために、ペプチドを、Ｃ末端またはリジン残基において、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子、特に１５００または４０００ＭＷのＰＥＧと、共有結合させる。さらに別の実施形態として、ドラッグデリバリーシステムのための生分解性および生体適合性のポリマー材料の中にペプチドを含ませ、微粒子を形成することによって、ペプチドの半減期を延ばすことができる。例えば、ポリマーおよびコポリマーはポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）である（ＵＳ２００７／０１８４０１５に例示されているように）。
【０１１１】
治療：
本明細書で規定されたアポトーシス促進ペプチドおよびキメラペプチドは、単独で、あるいは抗腫瘍薬、好ましくは化学療法薬と併せて同時投与で（すなわち同時に、単一の組成物としてあるいは別々の組成物として）、あるいは連続投与で使用することができる。
【０１１２】
ペプチドは、一般的には医薬上許容される担体と共に処方され、静脈内、経口、経皮、皮下、粘膜、筋肉内、肺内、鼻腔内、非経口、直腸、膣内および局所を含む任意の好都合な経路で投与することができる。鼻腔内経路が特に着目されている。有利なことに、腫瘍内投与もまた意図される。
【０１１３】
投薬量は、当業者によってアポトーシス促進効果が達成されるように選択され、また投与経路および用いられる投与形態に依存する。対象者に単回または分割投与で投与される一日当たりの総投与量は、例えば、一日当たり約０．００１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の量であり、好ましくは０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日である。約５ｍｇ／ｋｇの一日当たりの投与量が好ましい。投与単位の組成物は、一日の投与量を構成するために使用できるように、その約数の量を含んでもよい。しかしながら、任意の特定の患者に対する特異的な投与量のレベルは、体重、全身の健康状態、性別、食事、投与時間および経路、吸収および排出の速度、他の薬との組み合わせ、および治療中の特定の疾患の重症度を含む、様々なファクターによって決まることは理解されるであろう。
【０１１４】
本発明のさらなる局面および利点は、次の実施例のセクションに開示されるが、これらは例示的と見なされるべきであり、本出願の範囲を限定すると見なされるべきではない。
【実施例】
【０１１５】
実施例１：ＲＴ−ｑＰＣＲによる応答予測マーカーの同定
材料と方法
１．マウスモデル
乳癌患者の異種移植片（ＰＤＸ）を、患者の腫瘍フラグメントを免疫不全マウスに直接移植することによって得た（Arrouss et al, PlosOne. 2013. 8, e60816）。
【０１１６】
黒色腫患者の異種移植片は、Laurent C, et al. Mol Oncol 203; 7:625-36およびNemati F, et al. Clinical Cancer Res 2010; 16:2352-2362に記載されているようにして得た。
【０１１７】
キメラペプチドはVKKKKIKREIKI-YVETLDGIFEQWAHSEDL（配列番号４９）であり、ＤＰＴ−Ｃ９ｈと命名した。
【０１１８】
ＤＰＴ−Ｃ９ｈによって処置した９匹のモデル（５ｍｇ／ｋｇ／日 ＩＰ、週５日、４〜６週間）を、本研究のために選択した。すなわち、７匹の乳癌ＰＤＸ（ＢＣ１１、ＢＣ５２、ＢＣ１４３、ＢＣ１４６、ＢＣ１７３、ＢＣ２２７、およびＢＣ２５６）、および２匹の卵巣癌ＰＤＸ（ＯＶ１４およびＯＶＭ３３）である。治療の終わりに、ＢＣ１４６については、二つのコントロールグループの腫瘍および三つの処置グループの腫瘍を得て、それ以外はコントロールグループおよび処置グループのいずれも三つの腫瘍を回収した。回収した各腫瘍に対し、腫瘍体積を次式に従って推定した：Ｖ＝ａ×ｂ２／２、ａおよびｂは、直角に交わる腫瘍直径の最大値および最小値である。
【０１１９】
従って、まず始めに、含まれていた各腫瘍に対して、腫瘍成長速度（Tumor Growth Rate （ＴＧＲ））を、次式を用いて計算した：ＴＧＲ＝（Ｖｆ／Ｖ１）、Ｖｆは治療終了時の腫瘍体積であり、Ｖ１は治療開始時（１日目）の腫瘍体積である。次に、ＴＧＲの中央値を、各ＰＤＸモデルのコントロールグループおよび処置グループに対して定めた。最後に、比率を各ＰＤＸモデルに対して次のように計算した：処置グループのＴＧＲ中央値／対応するコントロールグループのＴＧＲ中央値。本発明者は、あるモデルの当該比率が≦０．５（ｐ＜０．０５）であればＤＰＴ−Ｃ９ｈに対する応答者であると見なし、当該比率が≧０．８であれば、抵抗者であると見なした。ここでは、３つのモデル（ＢＣ５２、ＢＣ１７３およびＯＶ１４）が応答者、４つのモデル（ＢＣ１１、ＢＣ１４６、ＢＣ２２７、およびＢＣ２５６）が抵抗者と考えられ、また２つのモデル（ＢＣ１４３およびＯＶＭ３３）は不明確なままであったため解析から除外した（表１）。
【表４】
2017503484.tif 000005
＋：応答者；−：抵抗者；ＮＤ：不明確
【０１２０】
２．ＲＴ−ｑＰＣＲの研究
全ＲＮＡを、RNeasy Plus Micro kit （Qiagen, Inc.）を用いて細胞選別画分から単離した。ＲＮＡの質を、試料ごとに定量化して完全性を決定するRNA 6000 Pico LabChip キットに基づいて、キャピラリー電気泳動（Bioanalyzer, Agilent, Inc.）によって評価した。３１個のヒト遺伝子の発現が研究されており、これらにおいてオルソロガスなマウスおよびヒトの遺伝子の発現が利用可能であろう。すなわち３１個のヒト遺伝子とは、以下の通りである。：
＊増殖：ＭＫＩ６７、ＰＬＫ１、ＡＵＲＫＡ、ＢＢＣ３（ＰＵＭＡ）、ＮＥＫ２、ＮＤＣ８０、ＡＵＲＫＢ、ＴＰＸ２。
＊アポトーシス：ＢＣＬ２、ＢＣＬ−ＸＬ、ｐ２１／ＣＤＫＮ１Ａ、ＴＲＡＦ２、ＭＣＬ１、ＢＩＲＣ５（サバイビン（Survivin））、ＣＡＳＰ９、ＢＩＲＣ２／ＩＡＰ１、ＢＩＲＣ３／ＩＡＰ２、ＢＩＲＣ４／ＸＩＡＰ、ＧＡＤＤ４５Ｂ、ＢＣＬ２Ａ１、ＬＥＦ１、ＴＣＦ７Ｌ２／ＴＣＦ４。
＊Ｗｔ：ＴＣＦ７Ｌ２／ＴＣＦ４。
＊転移／浸潤：ＭＭＰ９ＨＳ。
＊ＥＭＴ：ＶＩＭ、ＣＤＨ１。
＊血管新生：ＶＥＧＦＡＨＳ。
＊ＮＦκＢ：ＴＮＦＡＩＰ３、ＲＥＬＢ。
＊免疫／炎症：ＩＬ８、ＳＥＬＥ、ＶＣＡＭ、ＣＳＦ２、ＰＴＧＳ２／ＣＯＸ２、ＴＮＦ、ＣＣＬ２、ＣＣＬ８。
＊幹細胞：ＣＤ１３３。
＊代謝：ＳＬＣ２Ａ１（ＧＬＵＴ１）。
【０１２１】
コントロールは、ヒトおよびマウス両方のＴＢＰ（ＴＡＴＡボックス結合タンパク質）のＲＴ−ｑＰＣＲ値として規定した。
【０１２２】
３．バイオインフォマティクス解析
ＲＴ−ｑＰＣＲデータのバイオインフォマティクス解析は、ＴＧＲと相関する差示的に発現した遺伝子の教師なしクラスタリング解析、および最小遺伝子特性の決定を含んだ。
【０１２３】
結果
１．教師なしクラスタリング：
教師なしクラスタリングによって、１つのＢＣ１１腫瘍を除き、同一のモデルに由来する全ての腫瘍がクラスターを形成したことが示された。さらに、４つの抵抗者ＰＤＸがクラスターを形成し、このことは特異的遺伝子発現プロファイルがＤＰＴ−Ｃ９ｈのインビボでの有効性に関係し得ることを示唆している。
【０１２４】
２．差示的に発現した遺伝子：
応答性と抵抗性の腫瘍間で差示的に発現した遺伝子（Fold-Change≧１．５およびｐ値≦０．０１）の解析は、表２に示した。
【表５】
2017503484.tif 000006
○全ての遺伝子はダウンレギュレートされた。
【０１２５】
３．最小遺伝子特性：
３．１．スコアの決定および試料の分類：
最後に、予測的サインはＰＡＭ（Tibshirani et al. PNAS 2002, 99(10):6567-6572）を用いて決定した。「Prediction Analysis of Microarray」（ＰＡＭ）は最短収縮重心法を用いて遺伝子発現データから試料の分類を行う。ＰＡＭは、各試料グループを特徴づける発現をする重要な遺伝子のリストを提供する。ソフトウエアは、スタンフォード大学で開発された。
【０１２６】
Ｓスコアは、抵抗者または応答者であることがわかった未処置の７モデル（応答者モデル：ＢＣ５２、ＢＣ１７３およびＯＶ１４；抵抗者モデル：ＢＣ２２７、ＢＣ１４６、ＢＣ１１およびＢＣ２５６）から、ＲＴ−ｑＰＣＲ遺伝子発現値を用いて決定した。
【０１２７】
応答者のスコアおよび抵抗者のスコアは次式に従って決定した。
【数１】
2017503484.tif 000007
Expi：遺伝子iのＲＴ−ｑＰＣＲ発現値。
Meani Responder：表３の「応答者の値（Responder values）」の表で決定される遺伝子ｉの発現の平均。
StdDevi Responder：表３の「応答者の値（Responder values）」の表で決定される遺伝子ｉの発現の標準偏差。
αi Responder：表３の「応答者の値（Responder values）」の表で（ＰＡＭ特性より）決定される遺伝子ｉの重み因子。
Meani Resistant：表３の「抵抗者の値（Resistant values）」の表で決定される遺伝子ｉの発現の平均。
StdDevi Resistant：表３の「抵抗者の値（Resistant values）」の表で決定される遺伝子ｉの発現の標準偏差。
αi Resistant：表３の「抵抗者の値（Resistant values）」の表で（ＰＡＭ特性より）決定される遺伝子ｉの重み因子。
Scoreの解説：
■  試料は、ＳResponder＜２かつＳResistant＞５であれば、応答者と見なす。
■  試料は、ＳResponder＞５０かつＳResistant＜５であれば、抵抗者と見なす。
■  試料は、それ以外の場合は、未決定と見なす。
【表６−１】
2017503484.tif 000008
【表６−２】
2017503484.tif 000009
【０１２８】
３．２．特性の決定：
従って、本発明者は、応答者と抵抗者の試料の間の７つの最小遺伝子特性を決定した（ＶＩＭ、ＭＫＩ６７、ＴＣＦ７Ｌ２、ＮＥＫ２、ＢＩＲＣ５、ＭＣＬ１、およびＶＥＧＦＡ）（表４）。
【表７】
2017503484.tif 000010
【０１２９】
４．決定した最小遺伝子特性の確認：
既に決定した遺伝子特性は、その後、本解析に含まれる７つのＰＤＸモデルの全てのコントロール腫瘍を用いて確認した。本発明者は、試料を誤分類することなく、二つのグループ（応答者および抵抗者）に明確に識別する。
【０１３０】
実施例２：決定した最小遺伝子特性の適応性
実施例１で同定した遺伝子特性を、その後、種々の腫瘍集団で検討した。すなわち、Institut Curieのlaboratory of preclinical investigation（ＬＩＰ）で開発された乳癌ＰＤＸのパネル、乳癌患者の集団（de Cremoux, 2011 , BMC Cancer,11,pp. 215.）、ＬＩＰで開発されたぶどう膜黒色腫ＰＤＸのパネル、およびＬＩＰで開発された卵巣癌ＰＤＸのパネルである。全ての場合において、本発明者は、遺伝子特性が、ＤＰＴ−Ｃ９ｈに対して一方は「応答者」、もう一方は「抵抗者」と考えられる二つのグループを識別することを見出した。
【配列表】
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【国際調査報告】
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