(57)【要約】  エケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞のゲノムにおける標的配列のゲノム修飾のための組成物および方法が提供される。この方法および組成物は、環状ポリヌクレオチド修飾鋳型と組み合わせてガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系を利用して、エケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞のゲノム内の標的部位を編集するための有効な系を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
エケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞のゲノムのヌクレオチド配列を編集するための方法であって、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ配列および環状ポリヌクレオチド修飾鋳型を含む少なくとも１つの組換えＤＮＡコンストラクトを、誘導プロモータに機能可能なように結合したＣａｓ９エンドヌクレアーゼＤＮＡ配列を含むＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に提供する工程を含み、前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼＤＮＡ配列が、前記Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞のゲノムの標的部位に二重鎖切断を導入することができるＣａｓ９エンドヌクレアーゼをコードし、前記ポリヌクレオチド修飾鋳型が、前記ヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチド修飾を含む、方法。
【請求項２】
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞のゲノムのヌクレオチド配列が、プロモータ配列、ターミネータ配列、調節要素配列、コード配列、プロファージ、偽遺伝子、および外来遺伝子からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む前記組換えＤＮＡコンストラクトが、環状プラスミドによって提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記組換えＤＮＡコンストラクトおよび前記環状ポリヌクレオチド修飾鋳型がそれぞれ、別個のプラスミドに提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記組換えＤＮＡコンストラクトおよび前記環状ポリヌクレオチド修飾鋳型が、１つのプラスミドに提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記組換えＤＮＡコンストラクトおよび前記環状ポリヌクレオチド鋳型が、エレクトロポレーション、熱ショック、ファージ送達、交配、コンジュゲーション、および形質導入からなる群から選択される１つの手段によって提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記標的部位が、第１のゲノム領域および第２のゲノム領域に隣接し、前記環状ポリヌクレオチド鋳型が、前記第１のゲノム領域に相同の第１の領域および前記第２のゲノム領域に相同の第２の領域をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞が、外来組換えタンパク質を発現しない、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞が、ＲｅｃＥＴタンパク質、λ−ｒｅｄタンパク質、およびＲｅｃＢＣＤ阻害剤を含む群から選択されるタンパク質を発現しない、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞から子孫細胞を増殖させる工程をさらに含み、前記子孫細胞が、前記ヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチド修飾を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
標的部位が、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｇａｌＫ遺伝子内に位置する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法によって作製されたＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞。
【請求項１３】
請求項１２に記載のＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞から作製されたＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株。
【請求項１４】
ｇａｌＫ変異Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を作製するための方法であって：
ａ）ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ配列および少なくとも１つの環状ポリヌクレオチド修飾鋳型を含む少なくとも１つの環状組換えＤＮＡコンストラクトを、誘導プロモータに機能可能なように結合したＣａｓ９エンドヌクレアーゼＤＮＡ配列を含むＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に提供する工程であって、前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼＤＮＡ配列が、前記Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノムのｇａｌＫゲノム配列内の標的部位に二重鎖切断を導入することができるＣａｓエンドヌクレアーゼをコードし、前記環状ポリヌクレオチド修飾鋳型が、前記ｇａｌＫゲノム配列の少なくとも１つのヌクレオチド修飾を含む、工程；
ｂ）（ａ）のＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞から子孫細胞を増殖させる工程；および
ｃ）前記少なくとも１つのヌクレオチド修飾の存在について（ｂ）の子孫細胞を評価する工程を含む、方法。
【請求項１５】
エケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞のゲノムのヌクレオチド配列を編集するための方法であって、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ配列、環状ポリヌクレオチド修飾鋳型を含む少なくとも第１の組換えＤＮＡコンストラクト、および誘導プロモータに機能可能なように結合したＣａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ配列を含む第２の組換えＤＮＡコンストラクトをＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に提供する工程を含み、前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼが、前記Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞のゲノムの標的部位に二重鎖切断を導入し、前記ポリヌクレオチド修飾鋳型が、前記ヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチド修飾を含む、方法。
【請求項１６】
前記第１の組換えＤＮＡコンストラクト、前記第２の組換えＤＮＡコンストラクト、および前記環状ポリヌクレオチド修飾鋳型がそれぞれ、別個のプラスミドに提供される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１の組換えＤＮＡコンストラクト、前記第２の組換えＤＮＡコンストラクト、および前記環状ポリヌクレオチド修飾鋳型が、１つのプラスミドに提供される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１４年１２月１７日出願の米国仮特許出願第６２／０９２９１４号明細書の利益を主張するものであり、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、細菌分子生物学の分野、特に、エケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）のゲノムにおけるヌクレオチド配列を編集するための組成物および方法に関する。
【０００３】
電子的手段によって提出された配列表の参照
配列表の認証謄本が、２０１５年１１月１７日作成の２０１５１１１７＿ＣＬ６２５６ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔのファイル名の、１０６キロバイトのサイズを有するＡＳＣＩＩフォーマットの配列表としてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出され、明細書と同時に出願される。このＡＳＣＩＩフォーマットの文書内に含有される配列表は、本明細書の一部であり、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
生物における遺伝子の機能を理解する方法が、その発現を阻害することである。遺伝子発現の阻害は、例えば、遺伝子のＤＮＡ配列を分断して、または欠失させて、遺伝子の「ノックアウト」をもたらすことによって達成され得る（非特許文献１）。遺伝子ノックアウトは殆どの場合、相同組換え（ＨＲ）を介して実行され、この技術は、細菌から哺乳類まで広範囲の生物にわたって適用可能である。遺伝子機能を研究するための別の方式が、遺伝的「ノックイン」を介してなされ得、これもまた通常、ＨＲによって実行される。遺伝子ターゲティング用のＨＲは、標的とされるＤＮＡ部位が二重鎖切断を含む場合に高められることが示された（非特許文献２；非特許文献３）。したがって、ＨＲ媒介ＤＮＡターゲティングを促進するように二本鎖切断を導入する戦略が開発されてきた。例えば、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼが、特定のＤＮＡ部位を切断するように操作されて、ポリヌクレオチド修飾鋳型ＤＮＡが存在する場合に、この部位でのＨＲのレベルが高められた（非特許文献４；非特許文献５）。同様に、人工メガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼ）および転写活性化因子様エフェクタ（ＴＡＬＥ）ヌクレアーゼもまた、ＨＲ媒介ＤＮＡターゲティングで用いるために開発された（非特許文献６；非特許文献７）。
【０００５】
ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された、等間隔にスペーサが入った、短い回文リピート）ＤＮＡ切断系をコードする遺伝子座が、細菌ゲノムの約４０％、そして古細菌ゲノムの大半で排他的に見出されている（非特許文献８；非特許文献９）。特に、ＩＩ型ＣＲＩＰＳＲ系のＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）、Ｃａｓ９が、ＨＲを刺激する部位特異的ＤＮＡ鎖切断を導入する手段として開発された（米国仮特許出願第６１／８６８７０６号明細書、２０１３年８月２２日出願）。Ｃａｓ９のＲＮＡ構成要素の配列は、Ｃａｓ９が、（ｉ）ＲＮＡ構成要素の一部と相補的な配列、および（ｉｉ）プロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を含有するＤＮＡを認識して切断するように設計し得る。
【０００６】
天然のＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体は、２つのＲＮＡ配列、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む。ｃｒＲＮＡは、５’から３’の方向に、標的ＤＮＡ部位と相補的なユニーク配列、および、ｃｒＲＮＡが由来したＣＲＩＳＰＲ遺伝子座のリピート領域によってコードされる配列の一部を含有する。ｔｒａｃｒＲＮＡは、５’から３’の方向に、ｃｒＲＮＡのリピート領域とアニールする配列、およびステムループ含有部分を含有する。最近の研究では、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が開発され、これは、５’から３’の方向に、ｃｒＲＮＡ、およびこれに結合するｔｒａｃｒＲＮＡを含有するキメラ配列である（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許出願第１４／４６３，６８７号明細書、２０１４年８月２０日出願
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ａｕｓｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３６：９２１−９２４
【非特許文献２】Ｒｕｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２２：５１９−５３４
【非特許文献３】Ｓｍｉｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：５０１２−５０１９
【非特許文献４】Ｂｉｂｉｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３００：７６４
【非特許文献５】Ｂｉｂｉｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２１：２８９−２９７
【非特許文献６】Ｅｐｉｎａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：２９５２−２９６２
【非特許文献７】Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２９：１４３−１４８
【非特許文献８】Ｈｏｒｖａｔｈ  ａｎｄ  Ｂａｒｒａｎｇｏｕ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２７：１６７−１７０
【非特許文献９】Ｋａｒｇｉｎｏｖ  ａｎｄ  Ｈａｎｎｏｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ３７：７−１９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
組換えＤＮＡ技術により、生物のゲノムのＤＮＡ配列を修飾する、したがって、生物の表現型を変更することが可能となった。いくつかのアプローチが、生物、例えば、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のゲノムにおける特定の修飾部位を標的とするために開発されてきたが、エケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞のゲノムにおけるヌクレオチド配列を編集するためのより効率的かつ効果的な方法の要望がなお存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本開示は、エケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞のゲノムにおける標的配列のゲノム修飾のための組成物および方法を含む。この方法および組成物は、環状ポリヌクレオチド修飾鋳型と組み合わせてガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系（ＲＧＥＮとも呼ばれる）を利用して、エケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞のゲノム内の標的部位を編集するための有効な系を提供する。この方法および組成物はまた、環状ドナーＤＮＡと組み合わせてガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系を利用して、エケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞に遺伝子をノックインするための有効な系も提供する。
【００１１】
本開示の一実施形態では、この方法は、エケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞のゲノムのヌクレオチド配列を編集するための方法を含み、この方法は、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ配列および環状ポリヌクレオチド修飾鋳型を含む少なくとも１つの組換えＤＮＡコンストラクトを、誘導プロモータに機能可能なように結合したＣａｓ９エンドヌクレアーゼＤＮＡ配列を含むＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に提供する工程を含み、前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼＤＮＡ配列が、前記Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞のゲノムの標的部位に二重鎖切断を提供することができるＣａｓ９エンドヌクレアーゼをコードし、前記ポリヌクレオチド修飾鋳型が、前記ヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチド修飾を含む。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞のゲノムのヌクレオチド配列は、プロモータ配列、ターミネータ配列、調節要素配列、コード配列、プロファージ、偽遺伝子、外来遺伝子、内在性遺伝子からなる群から選択され得る。ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡコンストラクトは、環状プラスミドによって提供することができる。組換えＤＮＡコンストラクトおよび環状ポリヌクレオチド修飾鋳型はそれぞれ、別個のプラスミドに提供することができる。組換えＤＮＡコンストラクトおよび環状ポリヌクレオチド修飾鋳型は、１つのプラスミドに提供することができる。組換えＤＮＡコンストラクトおよび環状ポリヌクレオチド鋳型は、エレクトロポレーション、熱ショック、ファージ送達、交配、コンジュゲーション、および形質導入からなる群から選択される１つの手段によって提供することができる。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞のゲノムの標的部位は、第１のゲノム領域および第２のゲノム領域に隣接することができ、環状ポリヌクレオチド鋳型は、前記第１のゲノム領域に相同の第１の領域および前記第２のゲノム領域に相同の第２の領域をさらに含む。
【００１２】
一実施形態では、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞は、外来組換えタンパク質、ＲｅｃＥＴタンパク質、λ−ｒｅｄタンパク質、またはＲｅｃＢＣＤ阻害剤を発現しない。
【００１３】
本開示の一実施形態では、この方法は、ｇａｌＫ変異Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を作製する方法を含む、この方法は：（ａ）ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ配列および少なくとも１つの環状ポリヌクレオチド修飾鋳型を含む少なくとも１つの環状組換えＤＮＡコンストラクトを、誘導プロモータに機能可能なように結合したＣａｓ９エンドヌクレアーゼＤＮＡ配列を含むＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に提供する工程であって、前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼＤＮＡ配列が、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノムのｇａｌＫゲノム配列内の標的部位に二重鎖切断を提供することができるＣａｓエンドヌクレアーゼをコードし、前記環状ポリヌクレオチド修飾鋳型が、前記ｇａｌＫゲノム配列の少なくとも１つのヌクレオチド修飾を含む、工程；（ｂ）（ａ）のＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞の子孫細胞を増殖させる工程；（ｃ）前記少なくとも１つのヌクレオチド修飾の存在について（ｂ）の子孫細胞を評価する工程を含む。
【００１４】
本開示の一実施形態では、この方法は、エケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞のゲノムのヌクレオチド配列を編集するための方法を含み、この方法は、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ配列、環状ポリヌクレオチド修飾鋳型を含む少なくとも第１の組換えＤＮＡコンストラクト、および誘導プロモータに機能可能なように結合したＣａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ配列を含む第２の組換えＤＮＡコンストラクトをＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に提供する工程を含み、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼが、前記Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞のゲノムの標的部位に二重鎖切断を提供し、前記ポリヌクレオチド修飾鋳型が、前記ヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチド修飾を含む。第１の組換えＤＮＡコンストラクト、第２の組換えＤＮＡコンストラクト、および環状ポリヌクレオチド修飾鋳型はそれぞれ、別個のプラスミドに提供することができる。第１の組換えＤＮＡコンストラクト、第２の組換えＤＮＡコンストラクト、および環状ポリヌクレオチド修飾鋳型は、１つのプラスミドに提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】Ｃａｓ９プラスミドを含むＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞での在来標的の遺伝子編集のためのポリヌクレオチド修飾鋳型を含む環状プラスミド（鋳型プラスミド）の使用。この図は、編集されるべき在来標的（Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の標的ゲノムに位置する）および誘導プロモータ（例えば、Ｐｂａｄ）によって駆動されるＣａｓ９発現カセットを含むＣａｓ９プラスミドを含むＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を例示している。２つの相同領域（相同組換えを可能にするＨＲ１およびＨＲ２）に隣接した在来標的配列（黒いバーで示されている）に対する所望の編集（白い星で示されている）を含むポリヌクレオチド修飾鋳型が、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を発現することができるガイドＲＮＡ発現カセットを含むガイドＲＮＡプラスミドと共に、鋳型プラスミドによってＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞（Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ発現が誘導された）に提供される。誘導されたＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを発現することができ、かつ相同組換え媒介遺伝子編集を可能にする在来標的配列の切断を媒介することができるガイドＲＮＡ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ複合体（ＲＧＥＮとも呼ばれる）を形成する。
【図２】Ｃａｓ９プラスミドが欠如したＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞での在来標的の編集のための遺伝子ポリヌクレオチド修飾鋳型を含む環状プラスミド（鋳型プラスミド）の使用。この図は、編集されるべき在来標的配列（Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の標的ゲノムに位置する）プロモータを含むＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を例示している。２つの相同領域（相同組換えを可能にするＨＲ１およびＨＲ２）に隣接した在来標的配列（黒いバーとして示されている）に対する所望の編集（白い星で示されている）を含むポリヌクレオチド修飾鋳型が、ガイドＲＮＡプラスミド（ガイドＲＮＡ発現カセットを含む）およびＣａｓ９プラスミド（Ｐｂａｄによって駆動される誘導性Ｃａｓ９発現カセットを含む）と共に、鋳型プラスミドによってＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に提供される。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞が誘導されると、誘導された細胞は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを発現することができ、かつ相同組換え媒介遺伝子編集を可能にする在来標的配列の切断を媒介することができるガイドＲＮＡ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ複合体（ＲＧＥＮとも呼ばれる）を形成する。
【図３】可変標的ドメイン（ＶＴ）（灰色）に連結されたＣａｓエンドヌクレアーゼ認識ドメイン（ＣＥＲ）ドメイン（黒色）を含む単一ガイドポリヌクレオチドを示している。
【図４】アラビノースでの誘導前および誘導後のＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞のｐＲＦ４８からのＣａｓ９発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示している。マーカーの重みは、キロダルトン（ｋＤａ）で示されている。ゲルのＣａｓ９に一致するバンドが示されている（Ｃａｓ９）。
【図５】Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｇａｌＫ遺伝子（黒色）を例示している。ｇａｌＫにおける４つの在来標的部位は、標的部位名が付された矢印によって示され、この矢印の方向は、標的ＤＮＡのフォワード鎖またはリバース鎖を示している。
【図６】ガイドＲＮＡ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ複合体（ＲＧＥＮ）での遺伝子編集後のガラクトース耐性Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｇａｌＫ遺伝子座のコロニーＰＣＲからのＤＮＡのアガロースゲルを示している。各レーンは、個々のガラクトース耐性コロニーに一致している。マーカーの重みは、キロベース（ｋｂ）で示されている。所望の編集（欠失）のサイズは、バンドの隣に示されている。未編集対立遺伝子のサイズも示されている（ＷＴ）。２つの対照反応（ＷＴおよびｐＲＦ１１３）は、ＷＴおよび編集対立遺伝子のそれぞれを示すためにゲルで実施される。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
【表１】
2017538422.tif 000003
【００１７】
【表２】
2017538422.tif 000004
【００１８】
【表３】
2017538422.tif 000005
【００１９】
引用される全ての特許文献および非特許文献の開示は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【００２０】
本明細書中で用いられる用語「本開示」または「開示される本開示」は、限定することが意味されるのではなく、全般的に、特許請求の範囲において定義される、または本明細書中に記載されるあらゆる開示に当てはまる。これらの用語は、本明細書中で互換的に用いられる。
【００２１】
組成物および方法は、エケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞のゲノムの標的配列のゲノム修飾用に提供される。この方法および組成物は、環状ポリヌクレオチド修飾鋳型と組み合わせてガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系を利用して、エケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞のゲノム内の標的部位を編集するための有効な系を提供する。
【００２２】
Ｃａｓ９プラスミドを含むＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞での在来標的の遺伝子の編集のためのポリヌクレオチド修飾鋳型を含む環状プラスミド（鋳型プラスミド）の使用が、図１に例示され、本明細書中で説明される。この図は、編集されるべき在来標的（Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）標的ゲノムに位置する）および誘導プロモータ（例えば、Ｐｂａｄ）によって駆動されるＣａｓ９発現カセットを含むＣａｓ９プラスミドを含むＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を例示している。２つの相同領域（相同組換えを可能にするＨＲ１およびＨＲ２）に隣接した在来標的配列（黒いバーで示されている）に対する所望の編集（白い星で示されている）を含むポリヌクレオチド修飾鋳型が、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を発現することができるガイドＲＮＡ発現カセットを含むガイドＲＮＡプラスミドと共に、鋳型プラスミドによってＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞（Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ発現が誘導された）に提供される。誘導Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを発現することができ、かつ相同組換え媒介遺伝子編集を可能にする在来標的配列の切断を媒介することができるガイドＲＮＡ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ複合体（ＲＧＥＮとも呼ばれる）を形成する。
【００２３】
Ｃａｓ９プラスミドが欠如したＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞での在来標的の編集のための遺伝子ポリヌクレオチド修飾鋳型を含む環状プラスミド（鋳型プラスミド）の使用が、図２に例示され、本明細書中で説明される。この図は、編集されるべき在来標的配列（Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）標的ゲノムに位置する）を含むＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を例示している。２つの相同領域（相同組換えを可能にするＨＲ１およびＨＲ２）に隣接した在来標的配列（黒いバーとして示されている）に対する所望の編集（白い星で示されている）を含むポリヌクレオチド修飾鋳型が、ガイドＲＮＡプラスミド（ガイドＲＮＡ発現カセットを含む）およびＣａｓ９プラスミド（Ｐｂａｄによって駆動される誘導性Ｃａｓ９発現カセットを含む）と共に、鋳型プラスミドによってＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に提供される。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞が誘導されると、誘導された細胞は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを発現することができ、かつ相同組換え媒介遺伝子編集を可能にする在来標的配列の切断を媒介することができるガイドＲＮＡ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ複合体（ＲＧＥＮとも呼ばれる）を形成する。
【００２４】
目的のポリヌクレオチドを含むドナーＤＮＡを含む環状プラスミドも、本明細書に記載されるように遺伝子ノックイン・Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）に使用することができる。
【００２５】
用語「ＣＲＩＳＰＲ」（クラスター化された、等間隔にスペーサが入った、短い回文リピート）は、例えば、外来ＤＮＡを破壊するために細菌細胞および古細菌細胞によって用いられる、クラスＩ、ＩＩまたはＩＩＩ  ＤＮＡ切断系の因子をコードする特定の遺伝子座を指す（Ｈｏｒｖａｔｈ  ａｎｄ  Ｂａｒｒａｎｇｏｕ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２７：１６７−１７０）。ＣＲＩＳＰＲ系の構成要素は、本明細書中で異種の方法において、細胞におけるＤＮＡターゲティングに利用される。
【００２６】
用語「ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系」および「ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系」は、本明細書中で互換的に用いられ、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを、少なくとも１つのＲＮＡ構成要素と複合させて利用するＤＮＡ切断系を指す。例えば、Ｃａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と複合させることができる。別の例において、Ｃａｓ９は、ガイドＲＮＡと複合させることができる。ゆえに、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、およびガイドＲＮＡは、本明細書中で、ＲＮＡ構成要素の非限定的な例である。
【００２７】
用語ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）エンドヌクレアーゼは、本明細書中で、Ｃａｓ遺伝子によってコードされるＣａｓタンパク質を指す。Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、適切なＲＮＡ構成要素と複合すると、特定のＤＮＡ標的配列の全て、または一部を切断することができる。例えば、特定のＤＮＡ標的配列中に二本鎖切断を導入することができる；これ以外にも、特定のＤＮＡ標的配列の一方の鎖または双方の鎖を切断することができると特徴付けられ得る。Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓと複合したｃｒＲＮＡまたはガイドＲＮＡによる標的配列の認識によって媒介されて、標的配列にてＤＮＡ二重鎖を解いて、少なくとも一本のＤＮＡ鎖を切断する。Ｃａｓエンドヌクレアーゼによる標的配列のそのような認識およびカットは典型的には、正確なプロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）が、ＤＮＡ標的配列の３’末端に位置決めされれば、またはＤＮＡ標的配列の３’末端に隣接すれば、生じる。これ以外にも、Ｃａｓタンパク質は、本明細書中で、適切なＲＮＡ構成要素と複合化する場合、ＤＮＡ切断活性またはニッキング活性を欠くかもしれないが、ＤＮＡ標的配列に依然として特異的に結合することができる。好ましいＣａｓタンパク質は、本明細書において、Ｃａｓ９である。
【００２８】
「Ｃａｓ９」（以前はＣａｓ５、Ｃｓｎ１、またはＣｓｘ１２と呼ばれた）は、本明細書中で、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡとの、またはガイドＲＮＡとの複合体を形成して、ＤＮＡ標的配列の全てまたは一部を特異的に認識して切断する、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のＣａｓエンドヌクレアーゼを指す。Ｃａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン、およびＨＮＨ（Ｈ−Ｎ−Ｈ）ヌクレアーゼドメインを含み、これらはそれぞれ、標的配列にて一本鎖ＤＮＡを切断する（双方のドメインが協調して作用すると、ＤＮＡ二本鎖が切断されるが、一方のドメインの活性ではニックに至る）。一般に、ＲｕｖＣドメインは、サブドメインＩ、ＩＩ、およびＩＩＩを含み、ドメインＩは、Ｃａｓ９のＮ末端近くに位置決めされ、そしてサブドメインＩＩおよびＩＩＩは、タンパク質の中央に位置決めされて、ＨＮＨドメインにフランキングする（Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  １５７：１２６２−１２７８）。「Ａｐｏ−Ｃａｓ９」は、ＲＮＡ構成要素と複合化しないＣａｓ９を指す。Ａｐｏ−Ｃａｓ９は、ＤＮＡに結合することができるが、非特異的であり、そしてＤＮＡを切断することができない（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ５０７：６２−６７）。
【００２９】
用語「ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ」（ｃｒＲＮＡ）は、本明細書中で、１つまたは複数のＣａｓタンパク質（例えばＣａｓ９）との複合体を形成することができるＲＮＡ配列を指し、複合体にＤＮＡ結合特異性を付与する。ｃｒＲＮＡは、ＤＮＡ標的配列の鎖と相補的である「可変ターゲティングドメイン」［ＶＴ］を含有するので、ＤＮＡ結合特異性を付与する。ｃｒＲＮＡはさらに、ｃｒＲＮＡが由来するＣＲＩＳＰＲ遺伝子座のリピート領域によってコードされる「リピート配列」（「ｔｒａｃｒＲＮＡメイト配列」）を含む。ｃｒＲＮＡのリピート配列は、ｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端の配列にアニールすることができる。本来のＣＲＩＳＰＲ系におけるｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される「プレｃｒＲＮＡ」に由来する。プレｃｒＲＮＡは、スペーサ領域およびリピート領域を含む；スペーサ領域は、ＤＮＡ標的部位配列と相補的なユニーク配列を含有する。本来の系におけるプレｃｒＲＮＡは、複数の異なるｃｒＲＮＡにプロセシングされ、それぞれがガイド配列、およびリピート配列の一部を有する。ＣＲＩＳＰＲ系は、例えば、ＤＮＡターゲティング特異性のために、ｃｒＲＮＡを利用する。
【００３０】
本明細書中で用語「トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）」は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系に用いられる非コードＲＮＡを指し、５’から３’の方向に、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ  ＩＩ型ｃｒＲＮＡのリピート領域とアニールする配列、および（ｉｉ）ステムループ含有部分を含有する（Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４７１：６０２−６０７）。
【００３１】
「ＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ」（ｃｒＲＮＡ）は、任意選択により、ＲＮＡ構成要素に代えて使用することができる。ｃｒＤＮＡは、本明細書中に開示のｃｒＲＮＡの配列に対応するＤＮＡ配列を有する。ｃｒＤＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＤＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体として使用され得、その複合体は、次にＲＧＥＮタンパク質構成要素と関連付けられ得る。米国特許出願第６１／９５３，０９０号明細書は、ｃｒＤＮＡ、およびＲＧＥＮ媒介ＤＮＡターゲティングでのその使用を開示している。したがって、ｃｒＲＮＡに関する本明細書中の開示は全て、ｃｒＤＮＡの使用に同様に適用することができる。ゆえに、ｃｒＤＮＡを組み込む本明細書中の実施形態は、それに代えて、「ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ」（ＲＧＥＮ）を、少なくとも１つのＣａｓタンパク質と少なくとも１つのｃｒＤＮＡを含む複合体と言うことができよう。
【００３２】
本明細書で使用される用語「ガイドポリヌクレオチド」は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼと複合体を形成し、ＣａｓエンドヌクレアーゼがＤＮＡ標的部位を認識し、場合により切断することを可能にするポリヌクレオチド配列を指す。ガイドポリヌクレオチドは一本鎖分子であっても二本鎖分子であってもよい。ガイドポリヌクレオチド配列は、ＲＮＡ配列であっても、ＤＮＡ配列であっても、それらの組合せ（ＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列）であってもよい。任意選択により、ガイドポリヌクレオチドは、限定はされないが、ロックド核酸（ＬＮＡ）、５−メチルｄＣ、２，６−ジアミノプリン、２’−フルオロＡ、２’−フルオロＵ、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、ホスホロチオエート結合、コレステロール分子への結合、ポリエチレングリコール分子への結合、Ｓｐａｃｅｒ１８（ヘキサエチレングリコール鎖）分子への結合、または環化をもたらす５’から３’への共有結合などの、少なくとも１つのヌクレオチド、リン酸ジエステル結合または結合修飾を含み得る。
【００３３】
リボ核酸のみを含むガイドポリヌクレオチドは、「ガイドＲＮＡ」とも呼ばれる。ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体と呼ばれる（ＲＧＥＮとも呼ばれる）Ｃａｓエンドヌクレアーゼとの複合体を形成し得る。用語「ガイドＲＮＡ」（ｇＲＮＡ）および「単一ガイドＲＮＡ」（ｓｇＲＮＡ）は、本明細書中で互換的に用いられる。本明細書のｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡに機能可能なように結合したｃｒＲＮＡを含むキメラ配列を指すこともある。あるいは、ｇＲＮＡは、例えば、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの合成融合体を指すこともある。ｇＲＮＡは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ認識（ＣＥＲ）ドメインが続く可変標的ドメインを有することで特徴付けることもできる。ＣＥＲドメインは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列が続くｔｒａｃｒＲＮＡメイト配列（ｍａｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含み得る。
【００３４】
ガイドポリヌクレオチドは、標的ＤＮＡのヌクレオチド配列に相補的な第１のヌクレオチド配列ドメイン（可変ターゲティングドメインまたはＶＴドメインとも呼ばれる）と、Ｃａｓエンドヌクレアーゼポリペプチドと相互作用する第２のヌクレオチド配列ドメイン（Ｃａｓエンドヌクレアーゼ認識ドメインまたはＣＥＲドメインとも呼ばれる）とを含む二本鎖分子（二本鎖ガイドポリヌクレオチドとも呼ばれる）であってよい。二本鎖ガイドポリヌクレオチドのＣＥＲドメインは、相補性領域とハイブリダイズする２つの別々の分子を含む。この２つの別々の分子は、ＲＮＡ、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列であってよい。いくつかの実施形態では、ＣＥＲドメインと、ＣＥＲドメインに結合したＶＴドメインを含む二本鎖ガイドポリヌクレオチド（「ｃｒヌクレオチド」）の第１の分子を、「ｃｒＤＮＡ」（ＤＮＡヌクレオチドの連続ストレッチからなるとき）、「ｃｒＲＮＡ」（ＲＮＡヌクレオチドの連続ストレッチからなるとき）、または「ｃｒＤＮＡ−ＲＮＡ」（ＤＮＡヌクレオチドとＲＮＡヌクレオチドの組み合わせからなるとき）と呼ぶ。
【００３５】
ガイドポリヌクレオチドはまた、標的ＤＮＡのヌクレオチド配列に相補的な第１のヌクレオチド配列ドメイン（可変ターゲティングドメインまたはＶＴドメインと呼ばれる、図３）と、Ｃａｓエンドヌクレアーゼポリペプチドと相互作用する第２のヌクレオチド配列ドメイン（Ｃａｓエンドヌクレアーゼ認識ドメインまたはＣＥＲドメインとも呼ばれる、図３）とを含む一本鎖分子（二本鎖ガイドポリヌクレオチドとも呼ばれる）であってもよい。「ドメイン」により、それは、ＲＮＡ、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列であり得るヌクレオチドの連続ストレッチを意味する。一本鎖ガイドポリヌクレオチドのＶＴドメインおよび／またはＣＥＲドメインは、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、またはＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列を含み得る。いくつかの実施形態では、一本鎖ガイドポリヌクレオチドは、ｔｒａｃｒヌクレオチド（ＣＥＲドメインを含む）に結合したｃｒヌクレオチド（ＣＥＲドメインに結合したＶＴドメインを含む）を含み、その結合はＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、またはＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列を含むヌクレオチド配列である。ｃｒヌクレオチドおよびｔｒａｃｒヌクレオチド由来の配列からなる一本鎖ガイドポリヌクレオチドは、「一本鎖ガイドＲＮＡ」（ＲＮＡヌクレオチドの連続ストレッチからなるとき）、「一本鎖ガイドＤＮＡ」（ＤＮＡヌクレオチドの連続ストレッチからなるとき）、または「一本鎖ガイドＲＮＡ−ＤＮＡ」（ＤＮＡヌクレオチドとＲＮＡヌクレオチドの組み合わせからなるりとき）と呼ばれ得る。
【００３６】
したがって、ある実施形態では、ガイドポリヌクレオチドとＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、互いに複合体を形成することができ（「ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体」と呼ばれ、あるいは、また、「ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系」と呼ばれる）、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体に細胞（例えば、植物細胞）のゲノム標的部位を標的とするよう指示し、場合により、Ｃａｓエンドヌクレアーゼに、ゲノム標的部位へ一本鎖切断または二本鎖切断を導入させる。ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、少なくとも１つのＣＰＰと結合することができ、そのような複合体は、細胞（例えば、植物細胞）のゲノム標的部位に結合し、場合により、一本鎖切断または二本鎖切断を行うことができる。
【００３７】
用語「可変ターゲティングドメイン」または「ＶＴドメイン」は、本明細書中で互換的に使用され、二本鎖ＤＮＡ標的部位の一方の鎖（ヌクレオチド配列）に相補的なヌクレオチド配列を指す。第１のヌクレオチド配列ドメイン（ＶＴドメイン）と標的配列との間の相補性率は、少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６３％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％であり得る。可変標的ドメインの長さは、少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では、可変ターゲティングドメインは１２〜３００ヌクレオチドの隣接するストレッチを含む。可変ターゲティングドメインは、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、修飾ＤＮＡ配列、修飾ＲＮＡ配列（例えば、本明細書に開示の修飾を参照）またはそれらの任意の組み合わせから構成され得る。
【００３８】
ガイドポリヌクレオチドの「Ｃａｓエンドヌクレアーゼ認識ドメイン」または「ＣＥＲドメイン」という用語は、本明細書中で互換的に使用され、Ｃａｓエンドヌクレアーゼポリペプチド（例えば、ガイドポリヌクレオチドの第２のヌクレオチド配列ドメイン）と相互に作用するヌクレオチド配列を指す。ＣＥＲドメインは、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、修飾ＤＮＡ配列、修飾ＲＮＡ配列（例えば、本明細書に開示の修飾を参照）またはそれらの任意の組み合わせから構成され得る。
【００３９】
用語「ＲＮＡ−ガイドエンドヌクレアーゼ」、「ＲＧＥＮ」、「ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体」、「ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系」は、本明細書中で互換的に用いることができ、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された、等間隔にスペーサが入った、短い回文リピート）−関連（Ｃａｓ）タンパク質および少なくとも１つのＲＮＡ構成要素を含む複合体を指す。用語「ＲＧＥＮのタンパク質構成要素」および「ＲＧＥＮタンパク質構成要素」は、本明細書中で互換的に用いられ、ＲＧＥＮのエンドヌクレアーゼ構成要素である、またはこの一部を形成するＣａｓタンパク質を指す。ある実施形態におけるタンパク質構成要素は、完全なエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）であり得；そのようなタンパク質構成要素は、代わりにＲＧＥＮの「エンドヌクレアーゼ構成要素」と呼ばれることもある。本明細書のＲＧＥＮは、典型的には、少なくとも１つのＲＮＡ構成要素とのその結合性を考えると、特定のＤＮＡ標的活性を有する。
【００４０】
本明細書の用語「ＲＮＡ構成要素」は、ＤＮＡ標的配列の鎖に相補的なリボ核酸配列を含むＲＧＥＮのＲＮＡ構成要素を指す。この相補的な配列は、本明細書中では「ガイド配列」または「可変標的ドメイン」配列と呼ばれる（図３）。本明細書の適切なＲＮＡ構成要素の例としては、ｃｒＲＮＡおよびガイドＲＮＡが挙げられる。ある実施形態におけるＲＮＡ構成要素（例えば、ガイドＲＮＡのみ、ｃｒＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡ）は、ＲＧＥＮを特定のＤＮＡターゲティングに適するようにすることができる。
【００４１】
簡潔に述べると、ＲＧＥＮのＲＮＡ構成要素は、標的部位配列におけるＤＮＡ配列と相補的である配列を含む。この相補性に基づいて、ＲＧＥＮは、特定のＤＮＡ標的部位配列を特異的に認識して切断することができる。本明細書のＲＧＥＮは、４つの既知のＣＲＩＳＰＲ系（Ｈｏｒｖａｔｈ  ａｎｄ  Ｂａｒｒａｎｇｏｕ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２７：１６７−１７０）、例えば、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のいずれかのＣａｓタンパク質（複数可）および適切なＲＮＡ構成要素（複数可）を含み得る。好ましい実施形態におけるＲＧＥＮは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ  ＩＩ系）および少なくとも１つのＲＮＡ構成要素（例えば、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ、またはｇＲＮＡ）を含む。
【００４２】
したがって、ＲＧＥＮタンパク質構成要素は、Ｃａｓ９などのＣａｓタンパク質を指し得る。適切なＣａｓタンパク質の例として、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系の１つまたは複数のＣａｓエンドヌクレアーゼが挙げられる（Ｂｈａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．４５：２７３−２９７（参照によって本明細書に組み込まれる））。Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓタンパク質は、例えば、Ｃａｓ３タンパク質またはＣａｓ４タンパク質であってよい。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓタンパク質は、例えば、Ｃａｓ９タンパク質であってよい。ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓタンパク質は、例えば、Ｃａｓ１０タンパク質であってよい。特定の好ましい実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質が用いられる。ある実施形態におけるＣａｓタンパク質は、細菌タンパク質または古細菌タンパク質であってよい。本明細書中でＩ〜ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓタンパク質は典型的に、起源が原核生物である；例えば、Ｉ型およびＩＩＩ型Ｃａｓタンパク質は、細菌種または古細菌種に由来し得るが、ＩＩ型Ｃａｓタンパク質（すなわちＣａｓ９）は、細菌種に由来し得る。他の実施形態において、適切なＣａｓタンパク質として、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、それらの相同体、またはそれらの修飾型の１つまたは複数が挙げられる。
【００４３】
開示される本開示の他の態様において、本明細書中でＣａｓタンパク質は、以下の属のいずれに由来してもよい：アエロピルム（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ）属、ピロバキュラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ）属、スルフォロブス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）属、アルカエオグロブス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）属、ハロアーキュラ（Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ）属、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｎ）属、メタノコッカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、メタノサルシーナ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）属、メタノピラス（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ）属、ピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ピクロフィルス（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ）属、サーモプラズマ（Ｔｈｅｒｎｉｏｐｌａｓｎｉａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、アクウィフェクス（Ａｑｕｉｆｒｘ）属、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｖｒｏｍｏｎａｓ）属、クロロビウム（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）属、サームス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、クロストリディウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、サーモアナエロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）属、フゾバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アザーカス（Ａｚａｒｃｕｓ）属、クロモバクテリウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）属、ニトロソモナス（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）属、デサルフォビブリオ（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）属、ジオバクター（Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ）属、マイクロコッカス（Ｍｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属、ウォリネラ（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ）属、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）属、メチロコッカス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）属、フォトバクテリウム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）属、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）属、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）属、またはテルモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）属。これ以外にも、本明細書中のＣａｓタンパク質は、例えば、米国特許出願公開第２０１０／００９３６１７号明細書（この文献は参照によって本明細書に組み込まれる）に開示される配列番号４６２〜４６５、４６７〜４７２、４７４〜４７７、４７９〜４８７、４８９〜４９２、４９４〜４９７、４９９〜５０３、５０５〜５０８、５１０〜５１６、または５１７〜５２１のいずれによってコードされてもよい。
【００４４】
ＲＧＥＮタンパク質構成要素は、例えば、Ｃａｓ９アミノ酸配列を含み得る。この型のタンパク質構成要素を含むＲＧＥＮは、通常、ＲＧＥＮのエンドヌクレアーゼ構成要素としてＣａｓ９を有すると見なされ得る。本明細書中でＣａｓ９タンパク質、および本明細書中で他のＣａｓタンパク質のアミノ酸配列は、例えば、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種（例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、サーモフィルス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Ｓ．ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、ストレプトコッカス・オラリス（Ｓ．ｏｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・マカカエ（Ｓ．ｍａｃａｃａｅ）、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ（Ｓ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・アンギノサス（Ｓ．ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）、ストレプトコッカス・コンステラトゥス（Ｓ．ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ）、ストレプトコッカス・プセウドポルシヌス（Ｓ．ｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ））、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属種（例えばリステリア・イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ））、スピロプラズマ（Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ）属種（例えばスピロプラズマ・アピス（Ｓ．ａｐｉｓ）、スピロプラズマ・シルフィディコーラ（Ｓ．ｓｙｒｐｈｉｄｉｃｏｌａ））、ペプトストレプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）科種、アトポビウム（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ）属種、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）属種（例えばポルフィロモナス・カトニアエ（Ｐ．ｃａｔｏｎｉａｅ））、プレボテーラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）属種（例えばプレボテラ・インテルメディア（Ｐ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、ベイロネラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）属種、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）属種（例えば、トレポネーマ・ソクランスキィ（Ｔ．ｓｏｃｒａｎｓｋｉｉ）、トレポネーマ・デンティコラ（Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ））、カプノシトファガ（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ）属種、フィネゴルディア（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ）属種（例えばフィネゴルディア・マグナ（Ｆ．ｍａｇｎａ））、コリオバクテリア（Ｃｏｒｉｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）科種（例えばＣ．バクテリウム（Ｃ．ｂａｃｔｅｒｉｕｍ））、オルセネラ（Ｏｌｓｅｎｅｌｌａ）属種（例えばオルセネラ・プロフューザ（Ｏ．ｐｒｏｆｕｓａ））、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）属種（例えば、ヘモフィルス・スプトルム（Ｈ．ｓｐｕｔｏｒｕｍ）、ヘモフィルス・ピットマニエ（Ｈ．ｐｉｔｔｍａｎｉａｅ））、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）属種（例えばパスツレラ・ベッティアエ（Ｐ．ｂｅｔｔｙａｅ））、オリビバクター（Ｏｌｉｖｉｂａｃｔｅｒ）属種（例えばオリビバクター・シティエンシス（Ｏ．ｓｉｔｉｅｎｓｉｓ））、エピリソニモナス（Ｅｐｉｌｉｔｈｏｎｉｍｏｎａｓ）属種（例えばエピリソニモナス・テナックス（Ｅ．ｔｅｎａｘ））、メソニア（Ｍｅｓｏｎｉａ）属種（例えばメソニア・モビリス（Ｍ．ｍｏｂｉｌｉｓ））、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属種、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属種（例えばセレウス菌（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ））、アクイマリーナ（Ａｑｕｉｍａｒｉｎａ）属種（例えばアクイマリーナ・ムエレリ（Ａ．ｍｕｅｌｌｅｒｉ））、クリセオバクテリウム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属種（例えばクリセオバクテリウム・パルストレ（Ｃ．ｐａｌｕｓｔｒｅ））、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属種（例えばバクテロイデス・グラミニソルベンス（Ｂ．ｇｒａｍｉｎｉｓｏｌｖｅｎｓ））、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）属種（例えば髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ））、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）属種（例えばフランシセラ・ノビシダ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ））、またはフラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属種（例えば、フラボバクテリウム・フリギダリウム（Ｆ．ｆｒｉｇｉｄａｒｉｕｍ）、フラボバクテリウム・ソリ（Ｆ．ｓｏｌｉ））に由来してよい。本明細書中のある態様において、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９が好ましい。別の例として、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（ＲＮＡ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：７２６−７３７）（この文献は参照によって本明細書に組み込まれる）に開示されるＣａｓ９タンパク質のいずれであってもよい。
【００４５】
したがって、本明細書中でＣａｓ９タンパク質の配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｇ３ＥＣＲ１（サーモフィルス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、ＷＰ＿０２６７０９４２２、ＷＰ＿０２７２０２６５５、ＷＰ＿０２７３１８１７９、ＷＰ＿０２７３４７５０４、ＷＰ＿０２７３７６８１５、ＷＰ＿０２７４１４３０２、ＷＰ＿０２７８２１５８８、ＷＰ＿０２７８８６３１４、ＷＰ＿０２７９６３５８３、ＷＰ＿０２８１２３８４８、ＷＰ＿０２８２９８９３５、Ｑ０３ＪＩ６（サーモフィルス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、ＥＧＰ６６７２３、ＥＧＳ３８９６９、ＥＧＶ０５０９２、ＥＨＩ６５５７８（ストレプトコッカス・プセウドポルシヌス（Ｓ．ｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓ））、ＥＩＣ７５６１４（ストレプトコッカス・オラリス（Ｓ．ｏｒａｌｉｓ））、ＥＩＤ２２０２７（ストレプトコッカス・コンステラトゥス（Ｓ．ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ））、ＥＩＪ６９７１１、ＥＪＰ２２３３１（ストレプトコッカス・オラリス（Ｓ．ｏｒａｌｉｓ））、ＥＪＰ２６００４（ストレプトコッカス・アンギノサス（Ｓ．ａｎｇｉｎｏｓｕｓ））、ＥＪＰ３０３２１、ＥＰＺ４４００１（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ＥＰＺ４６０２８（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ＥＱＬ７８０４３（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ＥＱＬ７８５４８（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ＥＲＬ１０５１１、ＥＲＬ１２３４５、ＥＲＬ１９０８８（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ＥＳＡ５７８０７（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ＥＳＡ５９２５４（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ＥＳＵ８５３０３（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ＥＴＳ９６８０４、ＵＣ７５５２２、ＥＧＲ８７３１６（ストレプトコッカス・ディスガラクティエ（Ｓ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ））、ＥＧＳ３３７３２、ＥＧＶ０１４６８（ストレプトコッカス・オラリス（Ｓ．ｏｒａｌｉｓ））、ＥＨＪ５２０６３（ストレプトコッカス・マカカエ（Ｓ．ｍａｃａｃａｅ））、ＥＩＤ２６２０７（ストレプトコッカス・オラリス（Ｓ．ｏｒａｌｉｓ））、ＥＩＤ３３３６４、ＥＩＧ２７０１３（ストレプトコッカス・パラサングイニス（Ｓ．ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ））、ＥＪＦ３７４７６、ＥＪＯ１９１６６（連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種ＢＳ３５ｂ）、ＥＪＵ１６０４９、ＥＪＵ３２４８１、ＹＰ＿００６２９８２４９、ＥＲＦ６１３０４、ＥＲＫ０４５４６、ＥＴＪ９５５６８（ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ））、ＴＳ８９８７５、ＥＴＳ９０９６７（連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種ＳＲ４）、ＥＴＳ９２４３９、ＥＵＢ２７８４４（連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種ＢＳ２１）、ＡＦＪ０８６１６、ＥＵＣ８２７３５（連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種ＣＭ６）、ＥＷＣ９２０８８、ＥＷＣ９４３９０、ＥＪＰ２５６９１、ＹＰ＿００８０２７０３８、ＹＰ＿００８８６８５７３、ＡＧＭ２６５２７、ＡＨＫ２２３９１、ＡＨＢ３６２７３、Ｑ９２７Ｐ４、Ｇ３ＥＣＲ１、またはＱ９９ＺＷ２（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））（これらは参照によって組み込まれる）に開示されるＣａｓ９アミノ酸配列のいずれを含んでもよい。これらのＣａｓ９タンパク質配列のいずれの変異体が用いられてもよいが、本明細書中のＲＮＡ構成要素と関連する場合に、ＤＮＡに向けた、特異的な結合活性を、そして場合によっては切断またはニッキング分解活性を有するべきである。そのような変異体は、基準Ｃａｓ９のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含んでよい。
【００４６】
これ以外にも、本明細書中のＣａｓ９タンパク質は、例えば、配列番号１〜２によってコードされてもよい。さらにこれ以外にも、本明細書中のＣａｓ９タンパク質は、例えば、配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号３の残基１〜１３６８、２〜１３６８または２〜１３７９を含んでよい。さらにこれ以外にも、Ｃａｓ９タンパク質は、例えば、前述のアミノ酸配列のいずれかと少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含んでよい。そのような変異体Ｃａｓ９タンパク質は、本明細書中のＲＮＡ構成要素と関連する場合に、ＤＮＡに向けた特異的な結合活性を、そして場合によっては、切断またはニッキング活性を有するべきである。
【００４７】
本明細書中で用いられるＣａｓタンパク質（例えばＣａｓ９）の起源は、ＲＮＡ構成要素が由来する同じ種であってもよいし、異なる種であってもよい。例えば、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種（例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはサーモフィルス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））に由来するＣａｓ９タンパク質を含むＲＧＥＮは、同じ連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種に由来する配列（例えば、ｃｒＲＮＡ反復配列、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）を有する少なくとも１つのＲＮＡ構成要素と複合化されてよい。これ以外にも、本明細書中で用いられるＣａｓタンパク質（例えばＣａｓ９）の起源は、ＲＮＡ構成要素が由来するのとは異なる種であってよい（Ｃａｓタンパク質およびＲＮＡ構成要素は、互いに異種起源であってよい）；そのような異種起源のＣａｓ／ＲＮＡ構成要素ＲＧＥＮは、ＤＮＡターゲティング活性を有するはずである。
【００４８】
特定の標的ＤＮＡ配列に向けた、本明細書中のＣａｓタンパク質の結合活性および／またはエンドヌクレオチド結合分解活性の判定は、例えば米国特許第８６９７３５９号明細書（この文献は参照によって本明細書に開示される）に開示されるような、当該技術分野において知られているあらゆる適切なアッセイによって評価されてよい。判定は、例えば、細胞中でＣａｓタンパク質および適切なＲＮＡ構成要素を発現させてから、ｉｎｄｅｌの存在が予測されるＤＮＡ標的部位を調査することによってなされてよい（Ｃａｓタンパク質は、この特定のアッセイにおいて、典型的に完全なエンドヌクレオチド結合分解活性［二本鎖切断活性］を有することになる）。予測される標的部位での改変／修飾（例えば、ｉｎｄｅｌ）の存在についての調査は、例えば、ＤＮＡ配列決定法を介して、または標的配列の機能の欠如についてアッセイすることにより改変／修飾形成を推測することによって、なされ得る。
【００４９】
さらに別の例において、Ｃａｓタンパク質活性は、Ｃａｓタンパク質および適切なＲＮＡ構成要素を適切な標的配列を含有するＤＮＡポリヌクレオチドと混合するインビトロアッセイにより決定し得る。このアッセイは、切断活性が欠失したＣａｓタンパク質による結合（例えば、ゲルシフト）、またはポリヌクレオチド鎖切断能のあるＣａｓタンパク質による切断を検出するために使用することができる。
【００５０】
本明細書中のＣａｓタンパク質、例えばＣａｓ９は、ある態様では、さらに、異種の核局在化配列（ＮＬＳ）を含む。本明細書中の異種ＮＬＳアミノ酸配列は、例えば、本明細書中の細胞の核内で検出可能な量のＣａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質−ＣＰＰ複合体の蓄積を駆動するのに十分な強度を有し得る。ＮＬＳは、塩基性の、正に帯電する残基（例えば、リシンおよび／またはアルギニン）の１つ（一分節）または複数（例えば、二分節）の短い配列（例えば、２〜２０残基）を含んでよく、そして、タンパク質表面上に曝されるのであれば、Ｃａｓアミノ酸配列中のどこに位置決めされてもよい。ＮＬＳは、例えば、本明細書中のＣａｓタンパク質のＮ末端またはＣ末端に機能可能なように結合してよい。例えば、２つ以上のＮＬＳ配列が、Ｃａｓタンパク質に、例えばＣａｓタンパク質のＮ末端およびＣ末端に結合してよい。本明細書中の適切なＮＬＳ配列の非限定的な例としては、米国特許第６６６０８３０号明細書および同第７３０９５７６号明細書（例えば、その中の表１）に開示されるものが挙げられる（これらの文献はいずれも参照によって本明細書に組み込まれる）。本明細書中に開示されるＣａｓタンパク質は、例えば、ＣＰＰと結合させることができる（ＣＰＰに共有結合したＣａｓタンパク質の例）。そのようなＣａｓ−ＣＰＰ融合タンパク質がまた上記のようなＮＬＳを含むことができることは理解されよう。Ｃａｓタンパク質が、異なる細胞小器官（例えば、ミトコンドリア）をターゲティングするアミノ酸配列と融合する実施形態においては、そのようなＣａｓタンパク質が、通常、ＮＬＳを含まないこともまた理解されよう。
【００５１】
Ｃａｓタンパク質は、１つ以上の異種タンパク質ドメイン（例えば、Ｃａｓタンパク質に加えて１つ、２つ、３つ、またはそれ以上のドメイン）を含む融合タンパク質の一部であり得る。例えば、Ｃａｓタンパク質は、ＣＰＰおよび／または１つ以上の追加の異種アミノ酸配列に共有結合することができる（２０１４年８月１３日出願の米国仮特許出願第６２／０３６６５２号明細書を参照されたい）。Ｃａｓタンパク質はまた、ＣＰＰを含まない１つ以上のさらなる異種アミノ酸配列に共有結合し得る（そのような実施形態では、ＣＰＰは、Ｃａｓ融合タンパク質に非共有結合的に結合するであろう）。Ｃａｓタンパク質を含む融合タンパク質は、任意のさらなるタンパク質配列を、そして場合によっては任意の２つのドメイン間に、例えばＣａｓと第１の異種ドメインとの間にリンカー配列を含み得る。本明細書中でＣａｓタンパク質に融合し得るタンパク質ドメインの例として、限定されないが、エピトープタグ（例えば、ヒスチジン［Ｈｉｓ、ポリ−ヒスチジン］、Ｖ５、ＦＬＡＧ、インフルエンザヘマグルチニン［ＨＡ］、ｍｙｃ、ＶＳＶ−Ｇ、チオレドキシン［Ｔｒｘ］）、リポータ（例えば、グルタチオン−５−トランスフェラーゼ［ＧＳＴ］、ホースラディッシュペルオキシダーゼ［ＨＲＰ］、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ［ＣＡＴ］、ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ［ＧＵＳ］、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質［ＧＦＰ］、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン色蛍光タンパク質［ＣＦＰ］、黄色蛍光タンパク質［ＹＦＰ］、青色蛍光タンパク質［ＢＦＰ］）、および以下の活性の１つまたは複数を有するドメインが挙げられる：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性（例えば、ＶＰ１６またはＶＰ６４）、転写抑制活性、転写終止因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性、および核酸結合活性。他の実施形態におけるＣａｓタンパク質は、ＤＮＡ分子または他の分子、例えばマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ−タグ、Ｌｅｘ  Ａ  ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、ＧＡＬ４Ａ  ＤＮＡ結合ドメイン、および単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）ＶＰ１６と結合するタンパク質と融合し得る。本明細書中でＣａｓタンパク質を含む融合タンパク質の一部であってよい付加的なドメインが、米国特許出願公開第２０１１／００５９５０２号明細書に開示されており、この文献は参照によって本明細書に組み込まれる。Ｃａｓタンパク質が異種起源のタンパク質（例えば転写因子）に融合する実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、（本明細書中の適切なＲＮＡ構成要素と複合した場合に）ＤＮＡ認識および結合活性を有するが、ＤＮＡニッキング活性も切断活性も有していない。
【００５２】
本明細書中のＣａｓタンパク質に結合することができる異種ドメインの他の例としては、特定の細胞小器官にタンパク質をターゲティングするアミノ酸配列（すなわち、局在化シグナル）が挙げられる。ターゲティングされ得る細胞小器官の例としては、ミトコンドリアおよびクロロプラストが挙げられる。通常、そのようなターゲティングドメインは、エキストラ核ＤＮＡ部位をターゲティングする場合、ＮＬＳに代えて使用される。ミトコンドリアターゲティング配列（ＭＴＳ）は、例えば、Ｃａｓタンパク質のＮ末端またはその近傍に位置し得る。ＭＴＳの例は、米国特許出願公開第２００７／００１１７５９号明細書および同第２０１４／０１３５２７５号明細書に開示されている（これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる）。クロロプラストターゲティング配列は、例えば、米国特許出願公開第２０１０／０１９２２６２号明細書および同第２０１２／００４２４１２号明細書に開示されているものであり得る（これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる）。
【００５３】
ＲＧＥＮのタンパク質構成要素は、例えば、細胞の染色体またはエピソーム上の標的部位配列に相補的な配列を含む少なくとも１つのＲＮＡ構成要素と結合することができる（これにより、完全なＲＧＥＮを構成する）。そのような実施形態のＲＧＥＮは、標的部位配列に結合することができ、場合により、標的部位配列のＤＮＡ一本鎖または二本鎖を切断することができる。ＲＧＥＮは、例えば、ＤＮＡ標的配列の一本鎖または二本鎖を切断することができる。他の例では、ＲＧＥＮは、ＤＮＡ標的配列の二本鎖を切断することができる。これらの全ての実施形態において、ＲＧＥＮタンパク質構成要素は、ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体中の少なくとも１つのＣＰＰに共有結合的に、または非共有結合的に結合することができることは理解されよう。本明細書中でのＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体とＲＮＡ構成要素との結合は、ＲＧＥＮ−ＣＰＰ複合体の形成と見なされ得る。同様に、ＲＧＥＮに関する本明細書中の開示は、特に断らない限り、ＲＧＥＮ−ＣＰＰ複合体のＲＧＥＮ構成要素に適用することができる。
【００５４】
ＤＮＡ標的配列の双方の鎖を切断することができる本明細書中のＲＧＥＮは典型的に、エンドヌクレアーゼドメインの全てを機能的な状態で有するＣａｓタンパク質（例えば、各エンドヌクレアーゼドメインの一部または全ての活性を保持する野生型エンドヌクレアーゼドメインまたはその変異体）を含む。ゆえに、Ｃａｓタンパク質の各エンドヌクレアーゼドメインの一部または全ての活性を保持する野生型Ｃａｓタンパク質（例えば、本明細書中に開示されるＣａｓ９タンパク質）またはその変異体が、ＤＮＡ標的配列の双方の鎖を切断することができるＲＧＥＮの適切な例である。機能的なＲｕｖＣおよびＨＮＨヌクレアーゼドメインを含むＣａｓ９タンパク質は、ＤＮＡ標的配列の双方の鎖を切断することができるＣａｓタンパク質の例である。本明細書中でＤＮＡ標的配列の双方の鎖を切断することができるＲＧＥＮは典型的に、カット部位にて平滑末端（すなわち、ヌクレオチド突出部がない）が形成されるように、双方の鎖を同じ位置にてカットする。
【００５５】
ＤＮＡ標的配列の一本鎖を切断することができる本明細書中のＲＧＥＮは、本明細書中で、ニッカーゼ活性（例えば、部分的切断能力）を有すると特徴付けられ得る。本明細書中でＣａｓニッカーゼ（例えばＣａｓ９ニッカーゼ）は典型的に、ＣａｓがＤＮＡ標的配列の一本鎖のみを切断する（すなわち、ニックを入れる）ことを可能にする一機能的エンドヌクレアーゼドメインを含む。例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼは、（ｉ）突然変異した、機能不全ＲｕｖＣドメイン、および（ｉｉ）機能的ＨＮＨドメイン（例えば野生型ＨＮＨドメイン）を含んでよい。別の例として、Ｃａｓ９ニッカーゼは、（ｉ）機能的ＲｕｖＣドメイン（例えば野生型ＲｕｖＣドメイン）、および（ｉｉ）突然変異した、機能不全ＨＮＨドメインを含んでよい。
【００５６】
本明細書中での使用に適したＣａｓ９ニッカーゼの非限定的な例が、Ｇａｓｉｕｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０９：Ｅ２５７９−Ｅ２５８６）、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７：８１６−８２１），Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３９：９２７５−９２８２）、および米国特許出願公開第２０１４／０１８９８９６号明細書に開示されており、これらの文献は参照によって本明細書に組み込まれる。例えば、本明細書中のＣａｓ９ニッカーゼは、Ａｓｐ−３１置換（例えば、Ａｓｐ−３１−Ａｌａ）（突然変異したＲｕｖＣドメインの例）、またはＨｉｓ−８６５置換（例えばＨｉｓ−８６５−Ａｌａ）、Ａｓｎ−８８２置換（例えばＡｓｎ−８８２−Ａｌａ）、もしくはＡｓｎ−８９１置換（例えばＡｓｎ−８９１−Ａｌａ）（突然変異したＨＮＨドメインの例）を有するサーモフィルス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９を含んでよい。また例えば、本明細書中のＣａｓ９ニッカーゼは、Ａｓｐ−１０置換（例えばＡｓｐ−１０−Ａｌａ）、Ｇｌｕ−７６２置換（例えばＧｌｕ−７６２−Ａｌａ）、もしくはＡｓｐ−９８６置換（例えばＡｓｐ−９８６−Ａｌａ）（突然変異したＲｕｖＣドメインの例）、またはＨｉｓ−８４０置換（例えばＨｉｓ−８４０−Ａｌａ）、Ａｓｎ−８５４置換（例えば、Ａｓｎ−８５４−Ａｌａ）、もしくはＡｓｎ−８６３置換（例えばＡｓｎ−８６３−Ａｌａ）（突然変異したＨＮＨドメインの例）を有する化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を含んでよい。化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９に関して、３つのＲｕｖＣサブドメインは概して、アミノ酸残基１〜５９、７１８〜７６９、および９０９〜１０９８にそれぞれ位置決めされ、ＨＮＨドメインは、アミノ酸残基７７５〜９０８に位置決めされる（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １５６：９３５−９４９）。
【００５７】
本明細書中のＣａｓ９ニッカーゼは、必要に応じて、細胞において種々の目的で用いられ得る。例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼは、適切なポリヌクレオチド修飾鋳型との、ＤＮＡ標的部位配列での、またはその近くでのＨＲを誘発するのに用いられてよい。ニックが入ったＤＮＡは、ＮＨＥＪプロセス用の担体ではなく、ＨＲプロセスによって認識されるので、特定の標的部位のニッキングＤＮＡにより、部位は、適切なポリヌクレオチド修飾鋳型とのＨＲをより受け入れ易くなるはずである。
【００５８】
別の例として、一対のＣａｓ９ニッカーゼが、ＤＮＡターゲティングの特異度を高めるのに用いられてよい。一般にこれは、２つのＣａｓ９ニッカーゼを与えることによってなされ得、これらが、ガイド配列が様々なＲＮＡ構成要素との関連により、所望のターゲティング領域における反対側の鎖のＤＮＡ配列近くを標的とし、かつそこにニックを入れる。各ＤＮＡ鎖のそのような近くでの切断により、ＤＳＢ（すなわち、一本鎖突出部を有するＤＳＢ）が生じ、これはその後、ＮＨＥＪ（ｉｎｄｅｌ形成の原因となる）またはＨＲ（提供されるならば、適切なポリヌクレオチド修飾鋳型との組換えの原因となる）用の担体として認識される。これらの実施形態における各ニックは、例えば、互いと少なくとも約５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００（または５から１００までのあらゆる整数）塩基離れてよい。先に記載されるように、本明細書中で１つまたは２つのＣａｓ９ニッカーゼタンパク質が、Ｃａｓ９ニッカーゼ対に用いられてよい。例えば、突然変異したＲｕｖＣドメインを有するが、機能するＨＮＨドメインのないＣａｓ９ニッカーゼ（すなわち、Ｃａｓ９  ＨＮＨ＋／ＲｕｖＣ−）が用いられてよい（例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９  ＨＮＨ＋／ＲｕｖＣ−）。各Ｃａｓ９ニッカーゼ（例えば、Ｃａｓ９  ＨＮＨ＋／ＲｕｖＣ−）は、各ニッカーゼをそれぞれの特定のＤＮＡ部位に標的として向けるガイドＲＮＡ配列を有する本明細書中の適切なＲＮＡ構成要素を用いることによって、互いに近い（最大で１００塩基対離れている）特定のＤＮＡ部位に導かれることになる。
【００５９】
ある実施形態におけるＲＧＥＮは、ＤＮＡ標的部位配列に結合することができるが、標的部位配列にていかなる鎖も切断しない。そのようなＲＧＥＮは、全ヌクレアーゼドメインが、突然変異した、機能不全であるＣａｓタンパク質を含んでよい。例えば、ＤＮＡ標的部位配列に結合することができるが、標的部位配列にていかなる鎖も切断しない本明細書中のＣａｓ９タンパク質は、突然変異した、機能不全ＲｕｖＣドメイン、および突然変異した、機能不全ＨＮＨドメインの双方を含んでよい。そのようなＣａｓ９タンパク質の非限定的な例は、先に開示されるＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン突然変異およびＨＮＨヌクレアーゼドメイン突然変異（例えば、Ａｓｐ−１０置換、例えばＡｓｐ−１０−Ａｌａ、およびＨｉｓ−８４０置換、例えばＨｉｓ−８４０−Ａｌａを有する化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）のいずれかを含む。標的ＤＮＡ配列に結合するがこれを切断しない本明細書中のＣａｓタンパク質は、遺伝子発現を調整するために用いられてよく、例えば、その場合には、Ｃａｓタンパク質は、転写因子（またはその一部）（例えば、リプレッサまたは活性化因子、例えば本明細書中で開示されるもののいずれか）と融合し得る。例えば、Ａｓｐ−１０置換（例えばＡｓｐ−１０−Ａｌａ）およびＨｉｓ−８４０置換（例えばＨｉｓ−８４０−Ａｌａ）を有する化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を含むＣａｓ９は、ＶＰ１６転写活性化因子ドメインまたはＶＰ６４転写活性化因子ドメインに融合し得る。そのようなＲＧＥＮのＲＮＡ構成要素に用いられるガイド配列は、例えば、遺伝子プロモータまたは他の調節要素（例えばイントロン）中のＤＮＡ配列と相補的であることになる。
【００６０】
本明細書中のＲＧＥＮは、標的部位配列、および非従来型酵母の染色体、エピソーム、またはゲノム中の他のあらゆるＤＮＡ分子における標的部位配列の１本鎖または２本鎖に結合することができ、そして場合によってはこれを切断することができる。標的配列のこの認識および結合は、ＲＧＥＮのＲＮＡ構成要素が、標的配列の鎖と相補的である配列（ガイド配列）を含むならば、特異的である。
【００６１】
用語「標的部位」、「標的配列」、「標的ＤＮＡ」、「ＤＮＡ標的配列」、「標的遺伝子座」、および「プロトスペーサ」などは、本明細書中で互換的に用いられる。標的部位配列は、本明細書中のＲＧＥＮが認識し、結合し、かつ任意選択によりニックを入れるまたは切断することができる細胞のゲノムにおける染色体、エピソーム、またはその他のＤＮＡ分子上のポリヌクレオチド配列を指す。標的部位は、（ｉ）細胞中の内在部位／在来部位であってもよいし、（ｉｉ）ゲノム中に自然に生じ得ない、細胞とは異種起源でってもよいし、（ｉｉｉ）本来生じる位置に対して非相同ゲノム位置に見られてもよい。
【００６２】
本明細書中の標的部位配列は、長さが少なくとも１３ヌクレオチドであり、そして（ある実施形態において、適切なＰＡＭが、標的配列に隣接するならば）ガイド配列とハイブリダイズすることができ、かつ標的配列にＣａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質複合体の配列特異的結合を誘導することができるべき（ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡの）可変標的ドメインに十分に相補的な鎖を有する。切断／ニック部位（ヌクレオチド鎖切断ＣａｓまたはニッキングＣａｓが該当する）は、標的配列内であってもよいし（例えば、Ｃａｓ９が用いられる）、または切断／ニック部位は、標的配列外であってもよい（例えば、非相同エンドヌクレアーゼドメイン、例えば、ＦｏｋＩ酵素に由来するものに融合されたＣａｓ９が用いられる）。標的部位配列を、ＲＧＥＮ欠失切断活性またはＲＧＥＮ欠失ニッキング活性により結合されることも可能である。
【００６３】
本明細書中の「人工標的部位」または「人工標的配列」は、細胞のゲノム中に導入された標的配列を指す。一部の実施形態における人工標的配列は、細胞のゲノム中の在来標的配列と配列が同じであり得るが、ゲノム中の異なる位置（非相同位置）に位置してもよいし、細胞のゲノム中の同じ位置に位置するならば在来標的配列と異なってもよい。
【００６４】
本明細書中で標的配列の長さは、例えば、少なくとも１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０ヌクレオチド；１３から３０ヌクレオチド；１７から２５ヌクレオチド；または１７から２０ヌクレオチドであってよい。この長さは、ＰＡＭ（プロトスペーサ隣接モチーフ）配列を含んでも除いてもよい。また、本明細書中で標的配列の鎖は、ガイド配列とハイブリダイズし、かつＣａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質複合体の、標的配列への配列特異的結合を導くのに十分な、（ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡの）可変標的ドメインとの相補性を有する（適切なＰＡＭが標的配列に隣接する場合、以下参照）。ガイド配列と、その対応するＤＮＡ標的配列の鎖との相補性の程度は、例えば、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％である。本明細書中で標的部位は、例えば、遺伝子産物（例えば、タンパク質またはＲＮＡ）をコードする配列中に位置決めされてもよいし、非コード配列（例えば、調節配列または「ジャンク」配列）中に位置決めされてもよい。
【００６５】
本明細書中の「プロトスペーサ隣接モチーフ」（ＰＡＭ）は、本明細書中のＲＧＥＮによって認識される短い配列を指す。本明細書中のＰＡＭの配列および長さは、用いられるＣａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質複合体に応じて異なってよいが、典型的には、例えば、２、３、４、５、６、７、または８ヌクレオチド長である。
【００６６】
ＰＡＭ（プロトスペーサ隣接モチーフ）配列が、標的部位配列に隣接してよい。ＰＡＭ配列は、本明細書中のＲＧＥＮによって認識される短いＤＮＡ配列である。関連するＰＡＭ、およびＤＮＡ標的配列の最初の１１のヌクレオチドは、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡターゲティングおよび切断にとっておそらく重要である（Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３１：２３３−２３９）。本明細書中でＰＡＭ配列の長さは、用いられるＣａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質複合体に応じて変動し得るが、典型的には、例えば、２、３、４、５、６、７、または８ヌクレオチド長である。ＰＡＭ配列は、例えば、標的部位中で、ＲＮＡ構成要素のガイド配列と相補的である鎖と相補的である標的部位配列から直ぐ下流にあり、またはその下流２または３ヌクレオチド以内にある。ＲＧＥＮが、ＲＮＡ構成要素と複合化した、エンドヌクレオチド結合分解活性のあるＣａｓ９タンパク質である本明細書中の実施形態において、Ｃａｓ９は、ＲＮＡ構成要素によって導かれて標的配列に結合し、ＰＡＭ配列の上流にある第３のヌクレオチド位置の直ぐ５’側の双方の鎖を切断する。標的部位の以下の例を考える：ＰＡＭ配列：
【化１】
2017538422.tif 000006
Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＧであってよく、Ｘは、この例の配列において、Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＧであってよい（Ｘは、ＮＰＡＭと呼ぶこともできる）。ＰＡＭ配列は、この例において、ＸＧＧである（下線が引かれている）。適切なＣａｓ９／ＲＮＡ構成要素複合体は、この標的を、二重下線が引かれたＮの直ぐ５’側で切断することになる。配列番号５２におけるＮのストリングは、例えば、本明細書中のＲＮＡ構成要素中のガイド配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の標的配列を表す（ＤＮＡ標的配列のどのＴも、ＲＮＡガイド配列の全てのＵとアラインすることになる）。Ｃａｓ９複合体のＲＮＡ構成要素のガイド配列は、この標的配列（本明細書中の標的部位を代表する）での認識および結合の際に、Ｎのストリングの相補体配列とアニールすることになる；ガイド配列と標的部位相補体とのパーセント相補性は、例えば、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％である。Ｃａｓ９ニッカーゼがゲノム中の配列番号５２を標的とするのに用いられる場合、ニッカーゼは、ニッカーゼ中のどのエンドヌクレアーゼドメインが機能不全であるかに応じて、相補鎖の、二重下線が引かれたＮの直ぐ５’側、または同じ位置にニックを入れることになる。核酸分解活性を有していないＣａｓ９（ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインの双方が機能不全）がゲノム中の配列番号５２を標的とするのに用いられる場合、標的配列を認識してこれに結合することになるが、配列にいかなるカットも入れることはない。
【００６７】
本明細書中でＰＡＭは典型的に、利用されることになるＲＧＥＮのタイプを考慮して選択される。本明細書中でＰＡＭ配列は、Ｃａｓ、例えば、Ｃａｓが由来し得る、本明細書中に開示されるあらゆる種に由来する、例えばＣａｓ９を含むＲＧＥＮによって認識されるものであってよい。ある実施形態において、ＰＡＭ配列は、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、サーモフィルス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、トレポネーマ・デンティコラ（Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、またはフランシセラ・ノビシダ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ）に由来するＣａｓ９を含むＲＧＥＮによって認識されるものであってよい。例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来する適切なＣａｓ９は、ＮＧＧのＰＡＭ配列（Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＧであってよい）を有するゲノム配列を標的とするのに用いられ得る。他の例として、以下のＰＡＭ配列を有するＤＮＡ配列を標的とする場合、適切なＣａｓ９が、以下の種のいずれかに由来してよい：サーモフィルス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（ＮＮＡＧＡＡ）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（ＮＧＧ）、ＮＮＡＧＡＡＷ［Ｗは、ＡまたはＴである］、ＮＧＧＮＧ）、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（ＮＮＮＮＧＡＴＴ）、トレポネーマ・デンティコラ（Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）（ＮＡＡＡＡＣ）、またはフランシセラ・ノビシダ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ）（ＮＧ）（これらの特定の全ＰＡＭ配列中のＮは、Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＧである）。本明細書中の有用なＣａｓ９／ＰＡＭの他の例として、Ｓｈａｈ  ｅｔ  ａｌ．（ＲＮＡ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：８９１−８９９）およびＥｓｖｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０：１１１６−１１２１）に開示されるものが挙げられ、これらの文献は参照によって本明細書に組み込まれる。本明細書中の標的配列の例は、配列番号４３に従うが、「ＸＧＧ」ＰＡＭは、前述のＰＡＭのいずれか１つによって置換されている。
【００６８】
本明細書中のＲＮＡ構成要素は、細胞の染色体またはエピソームの標的部位配列に相補的な配列を含み得る。ＲＧＥＮは標的部位配列に特異的に結合することができ、そして場合によっては、その標的部位配列の一本鎖または二本鎖を、この配列相補体に基づいて切断することができる。したがって、開示される開示のある実施形態では、ＲＮＡ構成要素の相補配列は、ガイド配列または可変ターゲティングドメインと呼ぶこともできる。
【００６９】
本明細書中のＲＮＡ構成要素のガイド配列（例えば、ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡ）は、例えば、少なくとも１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０リボヌクレオチド長；１３〜３０リボヌクレオチド長；１７〜２５リボヌクレオチド長；または１７〜２０リボヌクレオチド長であってよい。一般に、本明細書中のガイド配列は、標的配列とハイブリダイズし、かつＣａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質複合体の、標的配列への配列特異的結合を導くのに十分な、標的ＤＮＡ配列の鎖との相補性を有する（適切なＰＡＭが標的配列に隣接する場合）。例えば、ガイド配列と、その対応するＤＮＡ標的配列との相補性の程度は、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％である。ガイド配列は、細胞中のＤＮＡ標的配列にＲＧＥＮを標的として向けるように、然るべく操作されてよい。
【００７０】
本明細書中のＲＮＡ構成要素は、例えば、ガイド配列およびリピート（ｔｒａｃｒＲＮＡメイト）配列を含むｃｒＲＮＡを含んでよい。ガイド配列は典型的に、ｃｒＲＮＡの５’末端に、またはその近く（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の塩基以内）に位置決めされる。ｃｒＲＮＡのガイド配列の下流には、ｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端の配列と相補的であり、かつこれとハイブリダイズすることができる「リピート」配列または「ｔｒａｃｒＲＮＡメイト」配列がある。ガイド配列およびｔｒａｃｒＲＮＡメイト配列は、直接隣接してもよいし、例えば、１、２、３、４、またはそれ以上の塩基によって分離されてもよい。ｔｒａｃｒＲＮＡメイト配列は、例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端に対する配列相補性が、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％である。一般に、相補性の程度は、２つの配列のうちのより短い方の全長に沿う、ｔｒａｃｒＲＮＡメイト配列およびｔｒａｃｒＲＮＡ配列の５’末端の最適アラインメントに関するものであってよい。本明細書中のｔｒａｃｒＲＮＡメイト配列の長さは、例えば、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８リボヌクレオチド長であってよく、そしてｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端の同じ、または類似した長さ（例えば、プラスマイナス１、２、３、４、または５塩基）の配列とハイブリダイズする。本明細書中のｃｒＲＮＡの長さは、例えば、少なくとも約１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、もしくは４８リボヌクレオチド；約１８〜４８リボヌクレオチド；または約２５〜５０リボヌクレオチドであってよい。
【００７１】
ｔｒａｃｒＲＮＡは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のＣａｓ９タンパク質がＲＧＥＮ中に含まれる実施形態において、ｃｒＲＮＡと共に含むことができる。本明細書中のｔｒａｃｒＲＮＡは、５’から３’の方向に、（ｉ）ｃｒＲＮＡのリピート領域（ｔｒａｃｒＲＮＡメイト配列）とアニールする配列、および（ｉｉ）ステムループ含有部分を含む。（ｉ）の配列の長さは、例えば、先に開示されるｔｒａｃｒＲＮＡメイト配列長のいずれかと同じであってもよいし、類似（例えば、プラスマイナス１、２、３、４、または５塩基）であってもよい。本明細書中のｔｒａｃｒＲＮＡ（すなわち、配列構成要素［ｉ］および［ｉｉ］）の全長は、例えば、少なくとも約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、または９０（または３０から９０までのあらゆる整数）リボヌクレオチドであってよい。ｔｒａｃｒＲＮＡはさらに、３’末端に１、２、３、４、５、またはそれ以上のウラシル残基を含んでよく、これは、転写ターミネータ配列によるｔｒａｃｒＲＮＡの発現によって存在し得る。
【００７２】
本明細書中のｔｒａｃｒＲＮＡは、細菌種、例えば、限定されるものではないが、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属から得ることができる（例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、サーモフィルス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、または参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第８６９７３５９号およびＣｈｙｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（ＲＮＡ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：７２６−７３７）に開示されているものを含み得る。
【００７３】
用語「リボザイム」、「リボ核酸酵素」、および「自己切断リボザイム」は、本明細書中で互換的に用いられる。リボザイムは、特定の部位、特にリボザイム配列に対するシス部位（すなわち、自己触媒的である、または自己切断する）にてＲＮＡを切断することができる二次、三次、および／または四次構造（複数可）を形成する１つ以上のＲＮＡ配列を指す。リボザイム核酸分解活性の一般的な性質が説明されている（ｅ．ｇ．，Ｌｉｌｌｅｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３９：６４１−６４６）。「ハンマーヘッドリボザイム」（ＨＨＲ）は、本明細書中で、触媒反応に関与する、３つの塩基対ステムおよび高度に保存された非相補的ヌクレオチドのコアで構成された小さな触媒ＲＮＡモチーフを含み得る。参照によって本明細書に組み込まれるＰｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  ３７２：６８−７４）  ａｎｄ  Ｈａｍｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（ＲＮＡ  １８：８７１−８８５）が、ハンマーヘッドリボザイムの構造および活性を開示している。本明細書中のハンマーヘッドリボザイムは、例えば、Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（参照によって本明細書に組み込まれるＣｅｌｌ  ８１：９９１−１００２）によって開示される「最小のハンマーヘッド」配列を含み得る。
【００７４】
用語「ターゲティング」、「遺伝子ターゲティング」、「ＤＮＡターゲティング」、「編集」、「遺伝子編集」、および「ＤＮＡ編集」は、本明細書中で互換的に用いられる。本明細書中のＤＮＡターゲティングは、特定のＤＮＡ配列、例えば、細胞の染色体またはエピソームでのｉｎｄｅｌ、ノックアウト、またはノックインの特定の導入であってよい。一般に、ＤＮＡターゲティングは、本明細書中で、適切なＲＮＡ構成要素に結合したＣａｓタンパク質で細胞中の特定のＤＮＡ配列における一方の鎖または双方の鎖を切断することによって行うことができる。そのようなＤＮＡ切断は、二本鎖切断（ＤＳＢ）の場合、標的部位におけるｉｎｄｅｌの形成をもたらし得るＮＨＥＪプロセスを促進することができる。また、切断が一本鎖切断（ＳＳＢ）であるかＤＳＢであるかを問わず、ＨＲプロセスは、適切なポリヌクレオチド修飾鋳型またはドナーＤＮＡがＤＮＡニック部位またはＤＮＡ切断部位に存在する場合は、促進され得る。そのようなＨＲプロセスは、ポリヌクレオチド修飾鋳型の配列に応じて、標的部位にノックアウトまたはノックインを導入するのに用いることができる。あるいは、本明細書中のＤＮＡターゲティングは、標的ＤＮＡ配列に対する本明細書中のＣａｓ／ＲＮＡ構成要素複合体の特異的な結合を指し得、Ｃａｓタンパク質は、（Ｃａｓタンパク質のヌクレオチド鎖切断ドメインの状態に応じて）ＤＮＡ鎖をカットしたりカットしなかったりする。
【００７５】
本明細書中の用語「ｉｎｄｅｌ」は、染色体またはエピソーム中の標的ＤＮＡ配列中の１つまたは複数のヌクレオチド塩基の挿入（ｉｎｓｅｔｉｏｎのｉｎ）または欠失（ｄｅｌｉｔｉｏｎのｄｅｌ）を指す。そのような挿入または欠失は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の塩基であってよい。ある実施形態におけるｉｎｄｅｌは、さらに大きく、少なくとも約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、または約１００塩基であってよい。ｉｎｄｅｌが遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内に導入されると、ｉｎｄｅｌは、多くの場合、フレームシフト突然変異を生じさせることによって、ＯＲＦによってコードされるタンパク質の野生型発現を妨害する。
【００７６】
用語「ノックアウト」、「遺伝子ノックアウト」、および「遺伝的ノックアウト」は、本明細書中で互換的に用いられる。ノックアウトは、本明細書中で、Ｃａｓタンパク質でのターゲティングによって部分的にまたは完全に機能しなくなった細胞のＤＮＡ配列を表す；ノックアウト前のそのようなＤＮＡ配列は、アミノ酸配列をコードし得る、または、例えば、調節機能（例えば、プロモータ）を有し得る。ノックアウトは、ターゲティング部位の、その部位に隣接した、もしくはその近傍の配列の機能を弱める、もしくは完全に破壊する、（Ｃａｓ媒介切断によって促進されるＮＨＥＪによる）ｉｎｄｅｌによって、または（適切なポリヌクレオチド修飾鋳型も使用される場合は、Ｃａｓ媒介切断またはニッキングによって促進されるＨＲによる）特定の配列の除去によって生じさせることができる。あるいは、本明細書中では、ノックアウトされたＤＮＡポリヌクレオチド配列は、例えば、部分的または全体的に妨害または下方制御されているとして特徴付けることができる。
【００７７】
用語「ノックイン」、「遺伝子ノックイン」、および「遺伝的ノックイン」は、本明細書中で互換的に用いられる。ノックインは、（適切なドナーＤＮＡも使用される場合は、Ｃａｓ媒介切断またはニッキングによって促進されるＨＲによる）Ｃａｓタンパク質でのターゲティングによる、細胞中の特定のＤＮＡ配列でのＤＮＡ配列の置換または挿入を表す。ノックインの例としては、目的のポリヌクレオチド、異種アミノ酸コード配列の遺伝子コード領域への特定の挿入、または転写調節要素の遺伝子座への特定の挿入がある。
【００７８】
用語「組換えＤＮＡ分子」、「組換えコンストラクト」、「発現コンストラクト」、「コンストラクト」、「コンストラクト」、および「組換えＤＮＡコンストラクト」は、本明細書中で互換的に用いられる。組換えコンストラクトは、核酸断片の人工的な組み合わせ、例えば、自然界では全てが同時には見られない調節配列およびコード配列を含む。例えば、コンストラクトは、異なる源から得られる調節配列およびコード配列、または同じ源から得られるが、自然界に見られる方式とは異なる方式で配列された調節配列およびコード配列を含み得る。このようなコンストラクトは、それ自体を使用してもよいし、ベクターもしくはプラスミドと共に使用してもよい。熟練した技術者であれば、異なる独立した遺伝子編集事象が、異なるレベルおよびパターンの発現となり得（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）  ＥＭＢＯ  Ｊ  ４：２４１１−２４１８；Ｄｅ  Ａｌｍｅｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）  Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２１８：７８−８６）、このため、所望の発現レベルおよびパターンを示す株を得るために複数の事象が、典型的にはスクリーニングされることも理解されよう。このようなスクリーニングは、ＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析、ＰＣＲ、リアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、タンパク質の発現の免疫ブロット分析、酵素もしくは活性アッセイ、および／または表現型分析を含む、完成した標準的な分子生物学アッセイ、生化学アッセイ、および他のアッセイであり得る。
【００７９】
本明細書中で用いられる用語「発現」は、前駆形態または成熟形態のいずれかでの機能的最終産物（例えば、ｍＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、またはタンパク質）の産生を指す。
【００８０】
本明細書中の用語「提供すること」は、核酸（例えば、発現コンストラクト、プラスミド）またはタンパク質を細胞に提供すること（導入すること）を指す。提供することは、核酸が細胞のゲノムに組み込まれ得る核酸の真核細胞または原核細胞への組み入れについての言及を含み、かつ核酸またはタンパク質の細胞への一過性の提供についての言及も含む。提供することは、電気穿孔法（Ｇｒｅｅｎ  ＭＲ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．２０１２．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）、熱ショック処置（Ｇｒｅｅｎ  ＭＲ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．２０１２．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）、化学処置（Ｇｒｅｅｎ  ＭＲ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．２０１２．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）、ファージ送達（Ｔｙｌｅｒ  ＢＭ，Ｇｏｌｄｂｅｒｇ  ＲＢ．１９７６．Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｇｅｎｅｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｅｎｔｅｒｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｂｙ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｐ１．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １２５：１１０５−１１１１）、交配、コンジュゲーション、および形質導入（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．１９９４．ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．）についての言及を含む。核酸断片（例えば、組換えＤＮＡコンストラクト／発現コンストラクト）の細胞への挿入の文脈における提供することは、「トランスフェクション」、または「形質転換」、または「形質導入」を含み、かつ核酸断片が細胞のゲノム（例えば、大きい管状ゲノム、プラスミド）に組み込まれて自律レプリコンに変換され得る、または一過性に発現され得る核酸断片の原核細胞への組み込みについての言及を含む。
【００８１】
生物／細胞に提供された核酸分子は、生物／細胞で自律的に複製する核酸分子、または生物／細胞のゲノムに組み込まれる核酸分子、または複製する、もしくは組み込まれることなく細胞で一過性に存在する核酸分子であり得る。細胞に提供され得る核酸分子の非限定の例、例えば、プラスミドおよび線状ＤＮＡ分子が本明細書中に開示される。
【００８２】
本明細書中に記載されるように、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系は、目的のゲノムヌクレオチド配列の編集を可能にするために同時送達されるポリヌクレオチド修飾鋳型と組み合わせて使用することができる。また、本明細書中に記載されるように、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系を使用する各実施形態では、ガイドポリヌクレオチドがリボ核酸のみを含むのではなく、ガイドポリヌクレオチドが、ＲＮＡ−ＤＮＡ分子の組み合わせを含む、またはＤＮＡ分子のみを含むように、同様のガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系を構成することができる。
【００８３】
「修飾ヌクレオチド」または「編集ヌクレオチド」は、その非修飾ヌクレオチド配列と比較すると少なくとも１つの変更を含む目的のヌクレオチド配列を指す。そのような「変更」は、例えば：（ｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの置換、（ｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、（ｉｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、または（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の任意の組み合わせを含む。
【００８４】
用語「ポリヌクレオチド修飾鋳型」は、編集されるべきヌクレオチド配列と比較すると少なくとも１つのヌクレオチドの修飾を含むポリヌクレオチドを指す。ヌクレオチド修飾は、例えば：（ｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの置換、（ｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、（ｉｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、または（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の任意の組み合わせを含み得る。任意選択により、ポリヌクレオチド修飾鋳型は、少なくとも１つのヌクレオチド修飾に隣接する相同ヌクレオチド配列をさらに含み得、隣接する相同ヌクレオチド配列は、編集されるべき所望のヌクレオチド配列に十分な相同性を提供する。
【００８５】
本明細書中で用いられる「ドナーＤＮＡ」は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼの標的部位に挿入されるべき目的のポリヌクレオチドを含むＤＮＡコンストラクトである。ドナーＤＮＡコンストラクトは、目的のポリヌクレオチドに隣接する第１および第２の相同領域をさらに含み得る。ドナーＤＮＡの第１および第２の相同領域は、それぞれ植物ゲノムの標的部位に存在する、またはこれに隣接する第１および第２のゲノム領域と相同性を共有する。
【００８６】
ポリヌクレオチド修飾鋳型またはドナーＤＮＡは、ＤＮＡ標的部位で相同組換え（ＨＲ）を受け得る。本明細書中のポリヌクレオチド修飾鋳型またはドナーＤＮＡ内の「相同配列」は、例えば、標的部位もしくはその近傍の配列と１００％の同一性を有する、または標的部位もしくはその近傍の配列と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、もしくは約９９％の同一性を有する少なくとも約２５ヌクレオチドの配列を、例えば、含んでもよいし、この配列からなってもよい。
【００８７】
ポリヌクレオチド修飾鋳型またはドナーＤＮＡは、標的部位の配列に非相同な配列（または塩基対）によって分離された２つの相同配列を有し得る。そのようなポリヌクレオチド修飾鋳型またはドナーＤＮＡのこれらの２つの相同配列は、「相同アーム」と呼ぶことができ、これらは非相同配列に隣接する。標的部位と、２つの相同アームを有するポリヌクレオチド修飾鋳型またはドナーＤＮＡとの間のＨＲは、典型的には標的部位の配列の編集となる。
【００８８】
相同領域は、切断された標的部位における相同組換えを促進するのに十分な任意の長さであり得る。例えば、相同領域は、この相同領域が、対応するゲノム領域で相同組換えを受けるのに十分な相同性を有するように、少なくとも５〜１０、５〜１５、５〜２０、５〜２５、５〜３０、５〜３５、５〜４０、５〜４５、５〜  ５０、５〜５５、５〜６０、５〜６５、５〜  ７０、５〜７５、５〜８０、５〜８５、５〜９０、５〜９５、５〜１００、５〜２００、５〜３００、５〜４００、５〜５００、５〜６００、５〜７００、５〜８００、５〜９００、５〜１０００、５〜１１００、５〜１２００、５〜１３００、５〜１４００、５〜１５００、５〜１６００、５〜１７００、５〜１８００、５〜１９００、５〜２０００、５〜２１００、５〜２２００、５〜２３００、５〜２４００、５〜２５００、５〜２６００、５〜２７００、５〜２８００、５〜２９００、５〜３０００、５〜３１００、またはそれ以上の塩基の長さを有し得る。「十分な相同性」は、２つのポリヌクレオチド配列が、相同組換え反応の基質として働くために十分な構造的類似性を有することを意味する。構造的類似性は、各ポリヌクレオチド断片の全長、およびポリヌクレオチドの配列類似性を含む。配列類似性は、配列の全長に対するパーセント配列同一性によって、および／または局所類似性、例えば、１００％の配列同一性を有する連続ヌクレオチド、および配列の長さの一部に対してパーセント配列同一性を含む保存領域によって説明することができる。
【００８９】
標的およびポリヌクレオチド修飾鋳型またはドナーＤＮＡによって共有される相同性または配列同一性の程度は、異なっても良く、かつ全長、および／または約１〜２０ｂｐ、約２０〜５０ｂｐ、約５０〜１００ｂｐ、約７５〜１５０ｂｐ、約１００〜２５０ｂｐ、約１５０〜３００ｂｐ、約２００〜４００ｂｐ、約２５０〜５００ｂｐ、約３００〜６００ｂｐ、約３５０〜７５０ｂｐ、約４００〜８００ｂｐ、約４５０〜９００ｂｐ、約５００〜１０００ｂｐ、約６００〜１２５０ｂｐ、約７００〜１５００ｂｐ、約８００〜１７５０ｂｐ、約９００〜２０００ｂｐ、約１〜２．５ｋｂ、約１．５〜３ｋｂ、約２〜４ｋｂ、約２．５〜５ｋｂ、約３〜６ｋｂ、約３．５〜７ｋｂ、約４〜８ｋｂ、約５〜１０ｋｂ、もしくは標的部位の全長までの範囲における整数値の単位を有する領域を含んでも良い。これらの範囲は、範囲内の全ての整数を含み、例えば、１〜２０ｂｐの範囲は、１ｂｐ、２ｂｐ、３ｂｐ、４ｂｐ、５ｂｐ、６ｂｐ、７ｂｐ、８ｂｐ、９ｂｐ、１０ｂｐ、１１ｂｐ、１２ｂｐ、１３ｂｐ、１４ｂｐ、１５ｂｐ、１６ｂｐ、１７ｂｐ、１８ｂｐ、１９ｂｐ、および２０ｂｐを含む。相同の程度は、少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％のパーセント配列同一性を含む２つのポリヌクレオチドの整列された全長に対するパーセント配列同一性によっても表現することができる。十分な相同性は、ポリヌクレオチド長と全体のパーセント配列同一性と任意選択による連続ヌクレオチドまたは局所パーセント配列同一性の保存領域との任意の組み合わせを含み、例えば、十分な相同性は、標的遺伝子座の領域に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する７５〜１５０ｂｐの領域として表現することができる。十分な相同性は、２つのポリヌクレオチドが、高ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする予測される能力によって表現することもでき、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ（１９９４）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）；ａｎｄ，Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照されたい。
【００９０】
一実施形態では、本開示は、エケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞のゲノムにおけるヌクレオチド配列を編集するための方法を説明し、この方法は、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ配列および環状ポリヌクレオチド修飾鋳型を含む少なくとも１つの組換えＤＮＡコンストラクトを、誘導プロモータに機能可能なように結合したＣａｓ９エンドヌクレアーゼＤＮＡ配列を含むＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に提供する工程を含み、前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼＤＮＡ配列が、前記Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞のゲノムの標的部位に二重鎖切断を提供することができるＣａｓ９エンドヌクレアーゼをコードし、前記ポリヌクレオチド修飾鋳型が、前記ヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチド修飾を含む。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞のゲノムのヌクレオチド配列は、プロモータ配列、ターミネータ配列、調節要素配列、コード配列、プロファージ、偽遺伝子、外来遺伝子、内在性遺伝子からなる群から選択され得る。ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡコンストラクトは、環状プラスミドによって提供することができる。組換えＤＮＡコンストラクトおよび環状ポリヌクレオチド修飾鋳型は、別個のプラスミドに提供してもよいし、１つのプラスミドに提供してもよい。組換えＤＮＡコンストラクトおよび環状ポリヌクレオチド鋳型は、エレクトロポレーション、熱ショック、ファージ送達、交配、コンジュゲーション、および形質導入からなる群から選択される１つの手段、またはこれらのいずれか１つの組み合わせによって提供することができる。
【００９１】
編集されるべきヌクレオチド配列は、編集される細胞に対して内在性、人工、先在、またはトランスジェニックの配列であり得る。例えば、細胞のゲノムのヌクレオチド配列は、在来遺伝子、変異遺伝子、非在来遺伝子、外来遺伝子、または細胞のゲノムに安定に組み込まれた導入遺伝子であり得る。そのようなヌクレオチドの編集により、さらに望ましい表現型または遺伝子型となり得る。
【００９２】
一実施形態では、本開示は、エケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞のゲノムのヌクレオチド配列を編集するための方法を説明し、この方法は、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ配列、環状ポリヌクレオチド修飾鋳型を含む少なくとも１つの第１の組換えＤＮＡコンストラクト、および誘導プロモータに機能可能なように結合したＣａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ配列を含む第２の組換えＤＮＡコンストラクトをＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に提供する工程を含み、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼが、前記Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞のゲノムの標的部位に二重鎖切断を導入し、前記ポリヌクレオチド修飾鋳型が、前記ヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチド修飾を含む。
【００９３】
本開示の一実施形態では、この方法は、エケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞のゲノムに目的のポリヌクレオチド配列を挿入する方法を含み、この方法は、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ配列および環状ドナーＤＮＡを含む少なくとも１つの組換えＤＮＡコンストラクトを、誘導プロモータに機能可能なように結合したＣａｓ９エンドヌクレアーゼＤＮＡ配列を含むＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に提供する工程を含み、前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼＤＮＡ配列が、前記Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞のゲノムの標的部位に二重鎖切断を導入することができるＣａｓ９エンドヌクレアーゼをコードし、前記ドナーＤＮＡが、ポリヌクレオチドを含む。
【００９４】
前記Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の標的部位の例としては、糖利用遺伝子（ｓｕｇａｒ  ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｇｅｎｅ）（例えば、ガラクトキナーゼ、ｇａｌＫ）、代謝関連遺伝子（例えば、イソクエン酸脱水酵素、ｉｃｄ（Ｋａｂｉｒ  ＭＭ，Ｓｈｉｍｉｚｕ  Ｋ．２００４．．Ａｐｐｌｉｅｄ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６５：８４−９６）、生合成遺伝子（例えば、チミジル酸生成酵素、ｔｈｙＡ（Ｂｅｌｆｏｒｔ  Ｍ，Ｍａｌｅｙ  Ｇ，Ｐｅｄｅｒｓｅｎ−Ｌａｎｅ  Ｊ，Ｍａｌｅｙ  Ｆ．．ＰＮＡＳ．１９８３．８０（１６）：４９１４−１８）、転写制御因子（例えば、一般的ストレス応答調節因子（ｇｅｎｅｒａｌ  ｓｔｒｅｓｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）、ｒｐｏＳ（Ｎｏｔｌｅｙ−ＭｃＲｏｂｂ  Ｌ，Ｋｉｎｇ  Ｔ，Ｆｅｒｅｎｃｉ  Ｔ（２００２）Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８４（３）；８０６−１１．ＰＭＩＤ：１１７９０７５１）、シグナル伝達タンパク質（例えば、無酸素酸化還元調節のためのセンサー、ａｒｃＢ（Ｉｕｃｈｉ  Ｓ，Ｍａｔｓｕｄａ  Ｚ，Ｆｕｊｉｗａｒａ  Ｔ，Ｌｉｎ  ＥＣ（１９９０）．Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １９９０；４（５）；７１５−２７．ＰＭＩＤ：２２０１８６８）、ｔＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡアラニン、ａｌａＵ（Ｓｉｅｋｅｖｉｔｚ  Ｐ，Ｚａｍｅｃｎｉｋ  ＰＣ（１９８１）．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ９１（３  Ｐｔ  ２）；５３ｓ−６５ｓ．ＰＭＩＤ：７０３３２４４））、ストレス応答タンパク質（例えば、ファージショックタンパク質Ａ、ｐｓｐＡ（Ａｄａｍｓ  Ｈ，Ｔｅｅｒｔｓｔｒａ  Ｗ，Ｄｅｍｍｅｒｓ  Ｊ，Ｂｏｅｓｔｅｎ  Ｒ，Ｔｏｍｍａｓｓｅｎ  Ｊ（２００３）．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  ２００３；１８５（４）；１１７４−８０．ＰＭＩＤ：１２５６２７８６））、リボソーム構成要素（例えば、Ｓ１２リボソームタンパク質、ｒｐｓＬ（Ｆｕｎａｔｓｕ  Ｇ，Ｙａｇｕｃｈｉ  Ｍ，Ｗｉｔｔｍａｎｎ−Ｌｉｅｂｏｌｄ  Ｂ（１９７７）．“Ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓ１２  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｓｍａｌｌ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｓｕｂｕｎｉｔ．”ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ７３（１）；１２−７．ＰＭＩＤ：３２００３４）、および２３ｓリボソームＲＮＡ、ｒｒｌＤ（Ａｒｋｏｖ  ＡＬ，Ｈｅｄｅｎｓｔｉｅｒｎａ  ＫＯ，Ｍｕｒｇｏｌａ  ＥＪ（２００２）．“Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｗｏ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｏｆ  ２３Ｓ  ｒＲＮＡ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ．”Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８４（１８）；５０５２−７．ＰＭＩＤ：１２１９３６２１））、ＤＮＡ複製（例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩＩ、ｐｏｌＢ（Ｃｈｅｎ  Ｈ，Ｂｒｙａｎ  ＳＫ，Ｍｏｓｅｓ  ＲＥ（１９８９）．“Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｏｌＢ  ｇｅｎｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｐｒｏｄｕｃｔ．”Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６４（３４）；２０５９１−５．ＰＭＩＤ：２６８４９８１））、転写装置（例えば、ＲＮＡポリメラーゼのβ’サブユニ��ト、ｒｐｏＣ（Ｓｑｕｉｒｅｓ  Ｃ，Ｋｒａｉｎｅｒ  Ａ，Ｂａｒｒｙ  Ｇ，Ｓｈｅｎ  ＷＦ，Ｓｑｕｉｒｅｓ  ＣＬ（１９８１）．“Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｔ  ｔｈｅ  ｅｎｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｂｅｔａ’ｓｕｂｕｎｉｔ（ｒｐｏＣ）．”Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９８１；９（２４）；６８２７−４０．ＰＭＩＤ：６２７８４５０）、トランスポーター（例えば、ラクト―スペルメアーゼ、ｌａｃＹ（Ｂｕｃｈｅｌ  ＤＥ，Ｇｒｏｎｅｎｂｏｒｎ  Ｂ，Ｍｕｌｌｅｒ−Ｈｉｌｌ  Ｂ（１９８０）．“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌａｃｔｏｓｅ  ｐｅｒｍｅａｓｅ  ｇｅｎｅ．”Ｎａｔｕｒｅ  １９８０；２８３（５７４７）；５４１−５．ＰＭＩＤ：６４４４４５３））、ファージ付着部位（例えば、λ付着部位、ａｔｔＢ（Ｌａｎｄｙ  Ａ，Ｒｏｓｓ  Ｗ（１９７７）．“Ｖｉｒａｌ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌａｍｂｄａ  ａｔｔ  ｓｉｔｅｓ．”Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９７（４３０９）；１１４７−６０．ＰＭＩＤ：３３１４７４））、プロファージ遺伝子（例えば、細胞分裂のｒａｃプロファージ阻害剤、ｋｉｌＲ（Ｃｏｎｔｅｒ  Ａ，Ｂｏｕｃｈｅ  ＪＰ，Ｄａｓｓａｉｎ  Ｍ（１９９６）．“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｇｅｎｅ  ｆｔｓＺ  ａｓ  ｔｈｅ  ｋｉｌ  ｇｅｎｅ  ｏｆ  ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｐｈａｇｅ  Ｒａｃ．”Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７８（１７）；５１００−４．ＰＭＩＤ：８７５２３２５））、または細胞分裂（例えば、細胞分裂環、ｆｔｓＺ（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ＡＣ，Ｋｅｎａｎ  ＤＪ，Ｈａｔｆｕｌｌ  ＧＦ，Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ＮＦ，Ｓｐｉｅｇｅｌｂｅｒｇ  Ｒ，Ｄｏｎａｃｈｉｅ  ＷＤ（１９８４）．“ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｇｅｎｅｓ  ｆｔｓＱ  ａｎｄ  ｆｔｓＡ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｕｎｉｔｓ．”Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １６０（２）；５４６−５５．ＰＭＩＤ：６０９４４７４））が挙げられる。標的部位に適したさらなる遺伝子が同定された。（Ｋａｒｐ  ＰＤ，Ｗｅａｖｅｒ  Ｄ，Ｐａｌｅｙ  Ｓ，Ｆｕｌｃｈｅｒ  Ｃ，Ｋｕｂｏ  Ａ，Ｋｏｔｈａｒｉ  Ａ，Ｋｒｕｍｍｅｎａｃｋｅｒ  Ｍ，Ｓｕｂｈｒａｖｅｔｉ  Ｐ，Ｗｅｅｒａｓｉｎｇｈｅ  Ｄ，Ｇａｍａ−Ｃａｓｔｒｏ  Ｓ，Ｈｕｅｒｔａ  ＡＭ，Ｍｕｎｉｚ−Ｒａｓｃａｄｏ  Ｌ，Ｂｏｎａｖｉｄｅｓ−Ｍａｒｔｉｎｅｚ  Ｃ，Ｗｅｉｓｓ  Ｖ，Ｐｅｒａｌｔａ−Ｇｉｌ  Ｍ，Ｓａｎｔｏｓ−Ｚａｖａｌｅｔａ  Ａ，Ｓｃｈｒｏｄｅｒ  Ｉ，Ｍａｃｋｉｅ  Ａ，Ｇｕｎｓａｌｕｓ  Ｒ，Ｃｏｌｌａｄｏ−Ｖｉｄｅｓ  Ｊ，Ｋｅｓｅｌｅｒ  ＩＭ，Ｐａｕｌｓｅｎ  Ｉ．２０１４．Ｔｈｅ  ＥｃｏＣｙｃ  Ｄａｔａｂａｓｅ．ＥｃｏＳａｌ  Ｐｌｕｓ  ２０１４；Ｋｅｓｅｌｅｒ  ＩＭ，Ｃｏｌｌａｄｏ−Ｖｉｄｅｓ  Ｊ，Ｓａｎｔｏｓ−Ｚａｖａｌｅｔａ  Ａ，Ｐｅｒａｌｔａ−Ｇｉｌ  Ｍ，Ｇａｍａ−Ｃａｓｔｒｏ  Ｓ，Ｍｕｎｉｚ−Ｒａｓｃａｄｏ  Ｌ，Ｂｏｎａｖｉｄｅｓ−Ｍａｒｔｉｎｅｚ  Ｃ，Ｐａｌｅｙ  Ｓ，Ｋｒｕｍｍｅｎａｃｋｅｒ  Ｍ，Ａｌｔｍａｎ  Ｔ，Ｋａｉｐａ  Ｐ，Ｓｐａｕｌｄｉｎｇ  Ａ，Ｐａｃｈｅｃｏ  Ｊ，Ｌａｔｅｎｄｒｅｓｓｅ  Ｍ，Ｆｕｌｃｈｅｒ  Ｃ，Ｓａｒｋｅｒ  Ｍ，Ｓｈｅａｒｅｒ  ＡＧ，Ｍａｃｋｉｅ  Ａ，Ｐａｕｌｓｅｎ  Ｉ，Ｇｕｎｓａｌｕｓ  ＲＰ，Ｋａｒｐ  ＰＤ．２０１１．ＥｃｏＣｙｃ：ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３９：Ｄ５８３−５９０．；Ｋｅｓｅｌｅｒ  ＩＭ，Ｂｏｎａｖｉｄｅｓ−Ｍａｒｔｉｎｅｚ  Ｃ，Ｃｏｌｌａｄｏ−Ｖｉｄｅｓ  Ｊ，Ｇａｍａ−Ｃａｓｔｒｏ  Ｓ，Ｇｕｎｓａｌｕｓ  ＲＰ，Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＤＡ，Ｋｒｕｍｍｅｎａｃｋｅｒ  Ｍ，Ｎｏｌａｎ  ＬＭ，Ｐａｌｅｙ  Ｓ，Ｐａｕｌｓｅｎ  ＩＴ，Ｐｅｒａｌｔａ−Ｇｉｌ  Ｍ，Ｓａｎｔｏｓ−Ｚａｖａｌｅｔａ  Ａ，Ｓｈｅａｒｅｒ  ＡＧ，Ｋａｒｐ  ＰＤ．２００９．ＥｃｏＣｙｃ：ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３７：Ｄ４６４−４７０；．Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ：Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９８７  Ｆｉｒｓｔ  ｅｄ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．
【００９５】
用語「細胞透過ペプチド」（ＣＰＰ）および「タンパク質形質導入ドメイン」（ＰＴＤ）は、本明細書中で互換的に用いられる。ＣＰＰは、積み荷タンパク質、特に、本明細書中の１つ以上のＲＧＥＮタンパク質構成要素（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）の細胞取り込みを促進し得る、典型的には長さが約５〜６０のアミノ酸残基のペプチドを指す。そのような積み荷タンパク質は、１つ以上のＣＰＰと共有結合または非共有結合により結合することができる。ＣＰＰはまた、ある実施形態では、脂質二重層、ミセル、細胞膜、オルガネラ膜、小胞膜、または細胞壁の１つ以上を横断／貫通して積み荷タンパク質の移動または横断を促進することができるとして特徴付けることができる。本明細書中のＣＰＰは、ある実施形態では、カチオン性、両親媒性、または疎水性であり得る。（例えば、参照によって本明細書に組み込まれる、２０１４年８月１３日出願の米国仮特許出願第６２／０３６６５２号明細書を参照されたい）。
【００９６】
用語「容量パーセント（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｂｙ  ｖｏｌｕｍｅ）」、「容量パーセント（ｖｏｌｕｍｅ  ｐｅｒｃｅｎｔ）」、「ｖｏｌ％」、および「ｖ／ｖ％」は、本明細書中で互換的に用いられる。溶液中の溶質の容量パーセントは、式：［（溶質の容量）／（溶液の容量）］×１００％を用いて決定することができる。
【００９７】
用語「重量パーセント」、「重量パーセンテージ（ｗｔ％）」、および「重量−重量パーセンテージ（％ｗ／ｗ）」は、本明細書中で互換的に用いられる。重量パーセントは、組成物、混合物、または溶液中に含まれる材料の質量ベースでのパーセンテージを指す。
【００９８】
用語「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、および「核酸配列」は、本明細書中で互換的に用いられる。これらの用語は、ヌクレオチド配列などを包含する。ポリヌクレオチドは、任意選択により合成、非天然、または変更されたヌクレオチド塩基を含有する、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡのポリマーであってよい。ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはそれらの混合物の１つ以上のセグメントで構成されてよい。ヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド）は、以下の一文字の記号表示で呼ぶことができる：「Ａ」がアデニル酸またはデオキシアデニル酸（それぞれＲＮＡまたはＤＮＡの場合）、「Ｃ」がシチジル酸またはデオキシチジル酸（それぞれＲＮＡまたはＤＮＡの場合）、「Ｇ」がグアニル酸またはデオキグアニル酸（それぞれＲＮＡまたはＤＮＡの場合）、「Ｕ」がウリジル酸（ＲＮＡの場合）、「Ｔ」がデオキシチミジル酸（ＤＮＡの場合）、「Ｒ」がプリン（ＡまたはＧ）、「Ｙ」がピリミジン（ＣまたはＴ）、「Ｋ」がＧまたはＴ、「Ｈ」がＡ、Ｃ、またはＴ、「Ｉ」がイノシン、「Ｗ」がＡまたはＴ、そして「Ｎ」が任意のヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ配列について述べる場合は、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＧであり得；ＲＮＡ配列について述べる場合は、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｕ、またはＧであり得る）。本明細書中に開示される任意のＲＮＡ配列（例えば、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｇＲＮＡ）は、適切なＤＮＡ配列によってコードされ得る。
【００９９】
本明細書中で用いられる用語「単離された」は、その天然起源から完全に、または部分的に精製されたポリヌクレオチドまたはポリペプチド分子を指す。場合によっては、単離されたポリヌクレオチドまたはポリペプチド分子は、より大きな組成物、緩衝液系、または試薬混合物の一部である。例えば、単離されたポリヌクレオチドまたはポリペプチド分子は、細胞内または生物内に異種として含まれてよい。
【０１００】
用語「遺伝子」は、コード領域からＲＮＡを発現するＤＮＡポリヌクレオチド配列を指し（ＲＮＡは、ＤＮＡポリヌクレオチド配列から転写される）、このＲＮＡは、メッセンジャＲＮＡ（タンパク質をコードする）またはタンパク質非コードＲＮＡ（例えば、本明細書中のｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、またはｇＲＮＡ）であってよい。遺伝子は、コード領域のみを指してもよいし、コード領域の上流および／または下流に調節配列（例えば、プロモータ、５’非翻訳領域、３’転写ターミネータ領域）を含んでもよい。タンパク質をコードするコード領域は代わりに、本明細書中で「オープンリーディングフレーム」（ＯＲＦ）と呼ぶことができる。「在来」または「内在性」の遺伝子は、自然界に見られる、その自己調節配列を有する遺伝子を指す；そのような遺伝子は、宿主細胞のゲノム中の、その自然な位置に位置している。「キメラ」遺伝子は、在来遺伝子でなく、自然界では一緒に見られない調節配列およびコード配列を含む（すなわち、調節領域およびコード領域が互いに異種起源である）あらゆる遺伝子を指す。したがって、キメラ遺伝子は、様々な源に由来する調節配列およびコード配列を含んでもよいし、同じ源に由来するが、自然界で見られる方式とは異なる方式で配列された調節配列およびコード配列を含んでもよい。「外来」または「異種起源」遺伝子は、遺伝子導入によって宿主生物中に導入される遺伝子を指す。外来／異種起源遺伝子は、非在来生物中に挿入される在来遺伝子、在来宿主内の新しい位置に導入される在来遺伝子、またはキメラ遺伝子を含んでよい。本明細書中に開示されるある実施形態におけるポリヌクレオチド配列は、異種起源である。「コドン最適化」オープンリーディングフレームは、宿主細胞の好ましいコドン使用頻度を模倣するように設計されたコドン使用頻度を有する。
【０１０１】
「修飾遺伝子」または「編集遺伝子」は、その非修飾遺伝子配列と比較したときに少なくとも１つの変更を含む目的の遺伝子を指す。そのような「変更」は、例えば：（ｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの置換、（ｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、（ｉｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、または（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の任意の組み合わせを含む。
【０１０２】
本明細書中で用いられる「調節配列」は、遺伝子の転写開始部位（例えば、プロモータ）、５’非翻訳領域、および３’非コード領域の上流に位置するヌクレオチド配列を指し、調節配列は、遺伝子から転写されるＲＮＡの転写、プロセシングもしくは安定性、または翻訳に影響を与え得る。本明細書中の調節配列としては、プロモータ、エンハンサ、サイレンサ、５’非翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクタ結合部位、ステム−ループ構造、および遺伝子発現の調節に関与する他の要素を挙げることができる。本明細書中の１つ以上の調節要素は、本明細書中のコード領域とは異種起源であってよい。
【０１０３】
本明細書中で用いられる「プロモータ」は、遺伝子からのＲＮＡの転写を制御することができるＤＮＡ配列を指す。一般に、プロモータ配列は、遺伝子の転写開始部位の上流にある。プロモータは、その全体が在来遺伝子に由来してもよいし、自然界に見られる様々なプロモータに由来する様々な要素から構成されてもよいし、合成ＤＮＡセグメントを含んでもよい。あらゆる状況下、殆どの時点で遺伝子を細胞で発現させるプロモータは、一般に「構成プロモータ」と呼ばれる。本明細書中の１つ以上のプロモータは、本明細書中のコード領域とは異種起源であってよい。
【０１０４】
本明細書中で用いられる「強力プロモータ」は、単位時間あたり比較的多数の産生開始を導くことができるプロモータを指し、かつ／または、細胞における遺伝子の平均転写レベルよりも高い遺伝子転写レベルを駆動するプロモータである。
【０１０５】
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）構成プロモータは、当分野で周知であり、転写因子による調節が欠如したプロモータを含み、かつＲＮＡポリメラーゼのみによって認識される（Ｓｈｉｍａｄａ  Ｔ，Ｙａｍａｚａｋｉ  Ｙ，Ｔａｎａｋａ  Ｋ，Ｉｓｈｉｈａｍａ  Ａ．Ｔｈｅ  ｗｈｏｌｅ  ｓｅｔ  ｏｆ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｂｙ  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＲｐｏＤ  ｈｏｌｏｅｎｚｙｍｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１４．Ｍａｒ  ６；９（３）：ｅ９０４４７；Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００２，Ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ａ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｖｏｌ．２９７  ｎｏ．５５８４  ｐｐ．１１８３−１１８６）。
【０１０６】
本明細書中で用いられる用語「３’非コード配列」、「転写ターミネータ」、および「ターミネータ」は、コード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を指す。これには、ポリアデニル化認識配列、およびｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼすことができる調節シグナルをコードする他の配列が含まれる。
【０１０７】
本明細書中で用いられる用語「カセット」は、タンパク質コードＲＮＡまたはタンパク質非コードＲＮＡをコードするＤＮＡ配列に機能可能なように結合したプロモータを指す。カセットは、任意選択により３’非コード配列に機能可能なように結合してよい。
【０１０８】
ポリヌクレオチドに関して本明細書中で用いられる用語「上流の」および「下流の」はそれぞれ、「５’の」および「３’の」を指す。
【０１０９】
本明細書中で用いられる用語「発現」は、（ｉ）コード領域からのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質非コードＲＮＡ、例えばｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、またはｇＲＮＡ）の転写、または（ｉｉ）ｍＲＮＡからのポリペプチドの翻訳を指す。
【０１１０】
遺伝子またはポリヌクレオチド配列の発現を説明するために用いられる場合、用語「下方制御」、「妨害」、「阻害」、「不活化」、および「サイレンシング」は、ポリヌクレオチド配列の転写が減少される、または無くなる場合の言及では、本明細書中で互換的に用いられる。これにより、ポリヌクレオチド配列からのＲＮＡ転写産物が減少する、または無くなり、結果として（遺伝子がＯＲＦを含むならば）ポリヌクレオチド配列に由来するタンパク質発現が減少する、または無くなる。あるいは、下方制御は、ポリヌクレオチド配列によって産生される転写産物からのタンパク質の翻訳が減少される、または無くなる場合を指すこともある。あるいはまた、下方制御は、ポリヌクレオチド配列によって発現されるタンパク質の活性が低下した場合を指すこともある。細胞における上記プロセス（転写、翻訳、タンパク質活性）のいずれかの減少は、適切な対照細胞の転写、翻訳、またはタンパク質活性に対して約２０％、約３０％、４約０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約１００％であり得る。下方制御は、例えば、本明細書中に開示されるターゲティング事象（例えば、ｉｎｄｅｌ、ノックアウト）の結果であり得る。
【０１１１】
用語「対照細胞」および「適切な対照細胞」は、本明細書中で互換的に用いられ、特定の修飾（例えば、ポリヌクレオチドの過剰発現、ポリヌクレオチドの下方制御）がなされた細胞（すなわち、「実験細胞」）に対して呼ぶことができる。対照細胞は、実験細胞の特定の修飾を有していない、またはこれを発現しないあらゆる細胞であり得る。例えば、対照細胞は、実験細胞の直接の親細胞であってよく、この親細胞は、実験細胞中に存在する特定の修飾を有していない。あるいは、対照細胞は、一世代以上によって除去された実験細胞の親細胞であってよい。あるいはまた、対照細胞は、実験細胞の兄弟細胞であってよく、この兄弟細胞は、実験細胞中に存在する特定の修飾を含まない。
【０１１２】
本明細書中で用いられる用語「増大」は、量または活性の増大が、比較される量または活性よりも、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、５０％、１００％、または２００％高い量または活性を指し得る。用語「増大」、「上昇」、「増強」、「〜を超える」、および「向上」は、本明細書中で互換的に用いられる。用語「増大」は、例えば、タンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現を特徴付けるために用いることができ、「発現の増大」は、「過剰発現」を意味することもある。
【０１１３】
本明細書中で用いられる用語「機能可能なように結合」は、一方の機能が他方によって影響されるような２つ以上の核酸配列の結合を指す。例えば、プロモータは、コード配列の発現に影響を及ぼすことができる場合、そのコード配列と機能可能なように結合している。すなわち、コード配列は、プロモータの転写制御下にある。コード配列は、例えば、調節配列に機能可能なように結合し得る。また、例えば、ｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡメイト配列がｔｒａｃｒＲＮＡの５’配列とアニールするように、本明細書中のｔｒａｃｒＲＮＡに機能可能なように結合（融合）し得る。
【０１１４】
本明細書中で用いられる用語「組換え」は、例えば、化学合成による、または遺伝子工学技術による核酸の単離セグメントの操作による、通常であれば分離している配列の２つのセグメントの人工的な組み合わせを指す。
【０１１５】
本明細書中の組換えコンストラクト／ベクター（例えば、本明細書中のＲＮＡ構成要素カセットをコードするＤＮＡポリヌクレオチド、または本明細書中のＣａｓタンパク質もしくはＣａｓ−ＣＰＰ融合タンパク質をコードするＤＮＡポリヌクレオチド）を調製するための方法は、例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｄ．Ｒｕｓｓｅｌｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１）；Ｔ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８４）；およびＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，２００２）に記載されている標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術に従うことができる。
【０１１６】
「表現型マーカー」は、可視マーカーおよびス選択マーカーを含むクリーニングマーカーまたは選択マーカーであり、選択マーカーは、陽性選択マーカーでも陰性選択マーカーでもよい。あらゆる表現型マーカーを使用することができる。具体的には、スクリーニングマーカーまたは選択マーカーは、多くの場合、特定の条件下で、ＤＮＡセグメントを含む分子もしくは細胞の同定を可能にする、またはこれらの分子もしくは細胞の選択またはこれらの分子もしくは細胞に対する選択を可能にする当該ＤＮＡセグメントを含む。これらのマーカーは、限定はされないが、ＲＮＡ、ペプチド、もしくはタンパク質の産生などの活性をコードしてもよいし、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、無機および有機の化合物もしくは組成物などの結合部位を提供してもよい。
【０１１７】
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）用の選択マーカーの例としては、抗生物質耐性（アンピシリン、カルベニシリン、ペニシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、テトラサイクリン、エリスロマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシ）および栄養要求性マーカー（アミノ酸生合成、糖利用、およびビタミン生合成）（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．１９９４．ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ）が挙げられる。
【０１１８】
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）でのスクリーニングマーカーとしては、蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ）、糖利用（ラクトース、リボース、グルコース、スクロース、ガラクトース、グリセロール）（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．１９９４．ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ）、およびユニークなプライマー結合部位の形成が挙げられる。
【０１１９】
ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列に関して本明細書中で用いられる用語「配列同一性」または「同一性」は、指定された比較枠で最大に一致するように整列されたときに同一である２つの配列中の核酸残基またはアミノ酸残基を指す。このため、「配列同一性のパーセンテージ」または「パーセント同一性」は、比較枠で最適に整列された２つの配列を比較することによって決定された値を指し、比較枠内のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の一部は、基準配列（付加または欠失を含まない）と比較して、２つの配列の最適なアラインメントのために付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでよい。パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が双方の配列に存在する位置の数を決定してマッチした位置の数を得て、このマッチした位置の数を比較枠内の位置の総数で除し、そしてこの値に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出される。ＤＮＡ配列とＲＮＡ配列との間で配列同一性を算出する場合、ＤＮＡ配列のＴ残基が、ＲＮＡ配列のＵ残基と整列させて「同一」と見なすことができることを理解されたい。第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとのパーセント相補性を決定することを目的として、（ｉ）例えば、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドの相補配列との間（または第２のポリヌクレオチドと第１のポリヌクレオチドの相補配列との間）のパーセント同一性、および／または（ｉｉ）正準なワトソンおよびクリックの塩基対を形成し得る第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとの間の塩基のパーセンテージを決定することによって、このパーセント相補性を得ることができる。
【０１２０】
Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のウェブサイトにてオンラインで利用可能なＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）アルゴリズムを使用して、例えば、本明細書中に開示される２つ以上のポリヌクレオチド配列間のパーセント同一性（ＢＬＡＳＴＮアルゴリズム）、またはポリペプチド配列間のパーセント同一性（ＢＬＡＳＴＰアルゴリズム）を測定することができる。あるいは、配列間のパーセント同一性は、Ｃｌｕｓｔａｌアルゴリズム（例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷまたはＣｌｕｓｔａｌＶ）を用いて行うことができる。アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ法を用いるマルチアラインメントでは、デフォルト値を、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０およびＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に一致させることができる。Ｃｌｕｓｔａｌ法を用いるタンパク質配列のペアワイズアラインメントおよびパーセント同一性の計算のデフォルトパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５であってよい。核酸の場合は、これらのパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝４であってよい。あるいはまた、配列間のパーセント同一性は、ＥＭＢＯＳＳアルゴリズム（例えば、ｎｅｅｄｌｅ）を用いて行ってよく、このときのパラメータは、例えば、ＢＬＯＳＵＭ行列（例えば、ＢＬＯＳＵＭ６２）を用いると、ＧＡＰ  ＯＰＥＮ＝１０、ＧＡＰ  ＥＸＴＥＮＤ＝０．５、ＥＮＤ  ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝ｆａｌｓｅ、ＥＮＤ  ＧＡＰ  ＯＰＥＮ＝１０、ＥＮＤ  ＧＡＰ  ＥＸＴＥＮＤ＝０．５である。
【０１２１】
本明細書中で、第２の配列と「相補的」である第１の配列は、第２の配列と「アンチセンス」の向きにあると呼ぶこともできる。
【０１２２】
種々のポリペプチドアミノ酸配列およびポリヌクレオチド配列が、開示される本発明のある実施形態の特徴として本明細書中に開示される。本明細書中に開示される配列と少なくとも約７０〜８５％、約８５〜９０％、または約９０％〜９５％同一である配列の変異体が用いられてよい。あるいは、変異アミノ酸配列または変異ポリヌクレオチド配列は、本明細書中に開示される配列と、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有し得る。変異アミノ酸配列または変異ポリヌクレオチド配列は、開示される配列と同一の機能／活性、または開示される配列の少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、もしくは約９９％の機能／活性を有する。
【０１２３】
本明細書中のＣａｓ９タンパク質の各アミノ酸位置にある本明細書中に開示される全てのアミノ酸残基は例である。あるアミノ酸が、類似した構造的特徴および／または電荷の特徴を互いに共有する（すなわち、保存されている）とすると、Ｃａｓ９中の各位置のアミノ酸は、開示される配列にあるアミノ酸であってもよいし、以下のように、保存アミノ酸残基で置換されてもよい（「保存的アミノ酸置換」）：
１．以下の小さい脂肪族の非極性または僅かな極性の残基は、互いに置換してよい：Ａｌａ（Ａ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｇｌｙ（Ｇ）；
２．以下の負に帯電した極性残基およびそれらのアミドは、互いに置換してよい：Ａｓｐ（Ｄ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｇｌｎ（Ｑ）；
３．以下の正に帯電した極性残基は、互いに置換してよい：Ｈｉｓ（Ｈ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｌｙｓ（Ｋ）；
４．以下の脂肪族の非極性残基は、互いに置換してよい：Ａｌａ（Ａ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｍｅｔ（Ｍ）；および
５．以下の大きい芳香族残基は、互いに置換してよい：Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｔｒｐ（Ｗ）。
【０１２４】
本明細書中の細菌細胞、例えば、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞のゲノムは、細胞中に自律的に存在し得る（複製して、娘細胞に継代し得る）ＤＮＡ分子を指す。ゲノムＤＮＡは、細胞に対して在来または異種起源であり得る。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）内のゲノムＤＮＡの例として、大きい環状ＤＮＡ分子に位置するＤＮＡ、およびプラスミドＤＮＡが挙げられる。
【０１２５】
本明細書中の用語「細胞」は、あらゆる種類の細胞、例えば、原核細胞または真核細胞を指す。真核細胞は、核および他の膜で包まれた構造体（細胞小器官）を有するが、原核細胞には核がない。ある実施形態の細胞は、哺乳類細胞または非哺乳類細胞であり得る。非哺乳類細胞は、真核細胞であってもよいし、原核細胞であってもよい。例えば、本明細書中の非哺乳類細胞は、微生物細胞、または非哺乳動物である多細胞生物、例えば、植物、昆虫、線虫、鳥類、両生類、爬虫類、もしくは魚類の細胞を指し得る。本明細書中の微生物細胞は、例えば、真菌細胞（例えば、酵母細胞）、原核細胞、原生生物細胞（例えば、藻類細胞）、鞭毛虫細胞、黄色植物細胞、または卵菌細胞を指し得る。本明細書中の原核細胞は、例えば、細菌細胞または古細菌細胞であり得る。
【０１２６】
細菌細胞は、球菌、桿菌、スピロヘータ、スフェロプラスト、プロトプラストなどの形態のものであり得る。細菌の他の非限定的な例としては、グラム陰性菌およびグラム陽性菌が挙げられる。細菌のさらに他の非限定的な例としては、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属（例えば、サルモネラ・ティフィ（Ｓ．ｔｙｐｈｉ）、サルモネラ・エンテティジス（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属（例えば、シゲラ・ディセンテリアエ（Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ））、エケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属（例えば、エケリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ））、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）属、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エドワードシエラ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ）属、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）属、エウインゲラ（Ｅｗｉｎｇｅｌｌａ）属、クライベラ（Ｋｌｕｙｖｅｒａ）属、モルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）属、プラノコッカス（Ｐｌａｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストマトコッカス（Ｓｔｏｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属（例えば、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ））、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属（例えば、ビブリオ・コレラエ（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、プレシオモナス（Ｐｌｅｓｓｉｏｍｏｎａｓ）属、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）属（例えば、ヘモフィルス・インフルエンザエ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ））、アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）属、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）属（例えば、マイコプラズマ・ニューモニア（Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ））、ウレアプラズマ（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）属、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）属、コクシエラ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ）属、ロシャリメア（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ）属、エーリキア（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属（例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニア（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属（例えば、エンテロコッカス・ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ））、アエロコッカス（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ゲメラ（Ｇｅｍｅｌｌａ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属（例えば、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ））、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）（例えば、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌ．ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ））、ペディコッカス（Ｐｅｄｉｃｏｃｃｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属（例えば、バチルス・セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・スブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・ツリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ））、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属（例えば、コリネバクテリウム・ジフテリアエ（Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ））、アルカノバクテリウム（Ａｒｃａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アクチノミケス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）属、ロードコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属（例えば、リステリア・モノシトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ））、エリシペロリクス（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）、ガードネレラ（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ）属、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）属（例えば、ナイセリア・メニングギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ナイセリア・ゴノルホエアエ（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ））、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属、アクロバクター（Ａｒｃｏｂａｃｔｅｒ）属、ウォリネラ（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ）属、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）属（例えば、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ））、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、アキネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属（例えば、アグロバクテリウム・ツメファキエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ））、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、クリセオモナス（Ｃｈｒｙｓｅｏｍｏｎａｓ）属、コマモナス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）属、エイケネラ（Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ）属、フラビモナス（Ｆｌａｖｉｍｏｎａｓ）属、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、モラキセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）属、オリゲラ（Ｏｌｉｇｅｌｌａ）属、プセウドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属（例えば、プセウドモナス・アエルギノサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））、シュワネラ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）属、ウエークセラ（Ｗｅｅｋｓｅｌｌａ）属、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）属、フランシエセラ（Ｆｒａｎｃｉｅｓｅｌｌａ）属、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）属、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）属、アフピア（Ａｆｉｐｉａ）属、バルトネラ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）属、カリマトバクテリウム（Ｃａｌｙｍｍａｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、カルディオバクテリウム（Ｃａｒｄｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ストレプトバチルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、スピリルム（Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属、ペプトストレプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ペプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、サルキニア（Ｓａｒｃｉｎｉａ）属、コプロコッカス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、モビルンカス（Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ）属、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ユーバクテリウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属（例えば、ラクトバチルス・ラクチス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ））、ロチア（Ｒｏｔｈｉａ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属（例えば、クロストリジウム・ボツリヌム（Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウム・ペルフリンゲンス（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ））、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）属、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）属、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ビロフィリア（Ｂｉｌｏｐｈｉｌａ）、レプトトリキア（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ）、ウォリネラ（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ）属、アシダミノコッカス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、メガスフェラ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）属、ヴェイロネラ（Ｖｅｉｌｏｎｅｌｌａ）属、ノルカルディア（Ｎｏｒｃａｒｄｉａ）属、アクチノマドゥラ（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ）属、ノルカルディオプシス（Ｎｏｒｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ）属、ストレプトミケス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、ミクロポリスポラス（Ｍｉｃｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａｓ）属、テルモアクチノミセス（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）属、ミコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属（例えば、ミコバクテリウム・ツベルクロシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ミコバクテリウム・ボヴィス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）、ミコバクテリウム・レプラエ（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）、トレポネマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）属、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）属（例えば、ボレリア・ブルグドｒフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、およびクラミジアエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ）属が挙げられる。細菌は、場合によって、植物または動物（例えば、ヒト）の有害生物／病原体と見なされ得る。ある実施形態では、細菌は、混合微生物集団（例えば、他の細菌を含有、または酵母および／もしくは他の細菌を含有）に含まれ得る。
【０１２７】
ある実施形態では、古細菌細胞は、ユリ古細菌門、クレン古細菌門、ナノ古細菌門、コル古細菌門、アイガー古細菌門、タウム古細菌門など、任意の古細菌門に由来するものであってよい。本明細書中の古細菌は、例えば、好極限性（例えば、殆どの生命にとって有害となる、物理的または地球化学的に過酷な条件で成長および／または増殖することができる）であってよい。好極限性古細菌の例としては、好熱性（例えば、４５〜１２２℃の温度で成長できる）、超好熱性（例えば、８０〜１２２℃の温度で成長できる）、好酸性（例えば、３以下のｐＨレベルで成長できる）、好アルカリ性（例えば、９以下のｐＨレベルで成長できる）および／または好塩性（例えば、高塩濃度［２０〜３０％  ＮａＣｌ］で成長できる）のものが挙げられる。古細菌種の例としては、ハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属種（例えば、ハロバクテリウム・ウォルカニイ（Ｈ．ｖｏｌｃａｎｉｉ））、スルフォロブス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）属種（例えば、スルフォロブス・ソルファタリクス（Ｓ．ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）、スルフォロブス・アシドカルダリウス（Ｓ．ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ））、テルモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属種（例えば、テルモコッカス・アルカリフィルス（Ｔ．ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｓ）、テルモコッカス・セレール（Ｔ．ｃｅｌｅｒ）、テルモコッカス・キトノファグス（Ｔ．ｃｈｉｔｏｎｏｐｈａｇｕｓ）、テルモコッカス・ガンマトレランス（Ｔ．ｇａｍｍａｔｏｌｅｒａｎｓ）、テルモコッカス・ヒドロテルマリス（Ｔ．ｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ）、テルモコッカス・コダカレンシス（Ｔ．ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ）、テルモコッカス・リトラリス（Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）、テルモコッカス・ペプトノフィルス（Ｔ．ｐｅｐｔｏｎｏｐｈｉｌｕｓ）、テルモコッカス・プロフンドゥス（Ｔ．ｐｒｏｆｕｎｄｕｓ）、テルモコッカス・ステッテリ（Ｔ．ｓｔｅｔｔｅｒｉ））、メタノカルドコッカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ）属種（例えば、メタノカルドコッカス・テルモリトトロフィクス（Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、メタノカルドコッカス・ヤナシイ（Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ））、メタノコッカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）属種（例えば、メタノコッカス・マリパルディス（Ｍ．ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）、メタノテルモバクター（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ）属種（例えば、メタノテルモバクター・マルブルゲンシス（Ｍ．ａｒｂｕｒｇｅｎｓｉｓ）、メタノテルモバクター・テルマウトトロフィクス（Ｍ．ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ））、アーケオグロブス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）属種（例えば、アーケオグロブス・フルギドゥス（Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓ））、ニトロソプミルス（Ｎｉｔｒｏｓｏｐｕｍｉｌｕｓ）属種（例えば、ニトロソプミルス・マリティムス（Ｎ．ｍａｒｉｔｉｍｕｓ））、メタロスファエラ（Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ）属種（例えば、メタロスファエラ・セドゥラ（Ｍ．ｓｅｄｕｌａ））、フェロプラズマ（Ｆｅｒｒｏｐｌａｓｍａ）属種、テルモプラズマ（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ）属種、メタノブレビバクター（���ｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ）属種（例えば、メタノブレビバクター・スミチイ（Ｍ．ｓｍｉｔｈｉｉ））、およびメタノスフェラ（Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｈａｅｒａ）属種（例えば、メタノスフェラ・スタットマナエ（Ｍ．ｓｔａｄｔｍａｎａｅ））が挙げられる。
【０１２８】
リアコンビニアリングは、線状の二本鎖および一本鎖ポリヌクレオチド編集鋳型を用いる細菌ＤＮＡの編集を可能にする（Ｄａｔｓｅｎｋｏ  ＫＡ，Ｗａｎｎｅｒ  ＢＬ．２０００．Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ｕｓｉｎｇ  ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９７：６６４０−６６４５；Ｔｈｏｍａｓｏｎ  ＬＣ，Ｓａｗｉｔｚｋｅ  ＪＡ，Ｌｉ  Ｘ，Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏ  Ｎ，Ｃｏｕｒｔ  ＤＬ．２０１４．Ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ：ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｕｓｉｎｇ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ／ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．１０６：１  １６  １１−１１  １６  ３９）。線状または一本鎖編集鋳型を利用するためには、外来性ファージリコンビナーゼタンパク質の発現が必要である（Ｄａｔｓｅｎｋｏ  ＫＡ，Ｗａｎｎｅｒ  ＢＬ．２０００．Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ｕｓｉｎｇ  ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９７：６６４０−６６４５；参照によって本明細書に組み込まれる、２０１０年１月１５日に発行された「ＤＮＡクローニング法（ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ）」という名称の米国特許第７，７３６，８５１号明細書）。典型的には、小さい変化、例えば、点変異または欠失は、短い一本鎖オリゴヌクレオチド編集鋳型を用いて生じさせることができる。しかしながら、大きい変化または遺伝子の挿入の場合は、低い組換え頻度（ｃａ  １０−５〜１０−７）に起因する所望の編集を含むコロニーを分離するために、ポリヌクレオチド編集鋳型に選択マーカーの存在が必要である。編集が行われたら、選択マーカーを除去しなければらないが、ゲノムに傷が残る場合が多い（Ｄａｔｓｅｎｋｏ  ＫＡ，Ｗａｎｎｅｒ  ＢＬ．２０００．Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ｕｓｉｎｇ  ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９７：６６４０−６６４５）。
【０１２９】
外来性リコンビナーゼ（複数可）は、細胞に加えて在来の相同組換え機構によって提供される（すなわち、非在来手段によって発現される）相同組換え系のタンパク質を含む。
【０１３０】
ＲｅｃＥＴタンパク質は、ＲａｃプロファージのＡＴＰ非依存性、ｒｅｃＡ非依存性相同組換え経路のタンパク質を含む（Ｋｕｚｍｉｎｏｖ  Ａ．１９９９．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｌ  ｒｅｐａｉｒ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ｌａｍｂｄａ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｒｅｖｉｅｗｓ：ＭＭＢＲ  ６３：７５１−８１３）。
【０１３１】
λ−ｒｅｄタンパク質は、ファージλのｒｅｄタンパク質、ｒｅｄβタンパク質、およびｒｅｄγタンパク質を含む（Ｓｍｉｔｈ  ＧＲ．１９８８．Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｒｏｃａｒｙｏｔｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ５２：１−２８）。
【０１３２】
ＲｅｃＢＣＤ阻害剤は、ＲｅｃＢＣＤに結合してその機能を阻害するタンパク質（例えば、λＧａｍタンパク質）を含む（Ｍｕｒｐｈｙ  ＫＣ．２００７．Ｔｈｅ  ｌａｍｂｄａ  Ｇａｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ＲｅｃＢＣＤ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｄｓＤＮＡ  ｅｎｄｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ３７１：１９−２４）。
【０１３３】
（ｉｉ）ガイドＲＮＡまたはＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列、に機能可能なように結合した（ｉ）プロモータ、を含むＤＮＡポリヌクレオチド配列は、典型的には、本明細書中に記載されるガイドＲＮＡまたはｃａｓエンドヌクレアーゼの安定性および／または一過性の発現に使用することができる。そのようなポリヌクレオチド配列は、例えば、プラスミド、コスミド、ファージミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、ウイルス、もしくは線状ＤＮＡ（例えば、線状ＰＣＲ産物）、またはポリヌクレオチド配列を細胞に提供するのに有用なその他の種類のベクターもしくはコンストラクト内に含めることができる。
【０１３４】
細菌プロモータとしては、バクテリオファージλプロモータレフト（ＰＬ：ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｌｅｆｔ）（Ｍｅｎａｒｔ  Ｖ，Ｊｅｖｓｅｖａｒ  Ｓ，Ｖｉｌａｒ  Ｍ，Ｔｒｏｂｉｓ  Ａ，Ｐａｖｋｏ  Ａ．２００３．Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ｖｅｒｓｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｓｔｒｏｎｇ  ＰＲ，ＰＬ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ  ｆｒｏｍ  ｐｈａｇｅ  ｌａｍｂｄａ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ８３：１８１−１９０）、バクテリオファージλプロモータライト（ＰＲ：ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｒｉｇｈｔ）（Ｍｅｎａｒｔ  Ｖ，Ｊｅｖｓｅｖａｒ  Ｓ，Ｖｉｌａｒ  Ｍ，Ｔｒｏｂｉｓ  Ａ，Ｐａｖｋｏ  Ａ．２００３．Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ｖｅｒｓｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｓｔｒｏｎｇ  ＰＲ，ＰＬ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ  ｆｒｏｍ  ｐｈａｇｅ  ｌａｍｂｄａ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ８３：１８１−１９０）、アラビノース利用オペロンプロモータ（ＰＢＡＤ）（Ｇｕｚｍａｎ  ＬＭ，Ｂｅｌｉｎ  Ｄ，Ｃａｒｓｏｎ  ＭＪ，Ｂｅｃｋｗｉｔｈ  Ｊ．１９９５．Ｔｉｇｈｔ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｒａｂｉｎｏｓｅ  ＰＢＡＤ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７７：４１２１−４１３０）、ファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ調節プロモータ（ＰＴ７）（Ｉｋｅｄａ  ＲＡ，Ｌｉｇｍａｎ  ＣＭ，Ｗａｒｓｈａｍａｎａ  Ｓ．１９９２．Ｔ７  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｃｏｎｔａｃｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０：２５１７−２５２４）、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のラクト―ス利用オペロンのプロモータ（Ｐｌａｃ，（Ｇｒｏｎｅｎｂｏｒｎ  Ｂ．１９７６．Ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈａｇｅ  ｌａｍｂｄａ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ  ｕｎｄｅｒ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌａｃ  ｐｒｏｍｏｔｏｒ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆ｇｅｎｅｒａｌ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ：ＭＧＧ  １４８：２４３−２５０）、ハイブリッドｔｒｐおよびｌａｃプロモータ（Ｐｔａｃ）（ｄｅ  Ｂｏｅｒ  ＨＡ，Ｃｏｍｓｔｏｃｋ  ＬＪ，Ｖａｓｓｅｒ  Ｍ．１９８３．Ｔｈｅ  ｔａｃ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ：ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｈｙｂｒｉｄ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｔｒｐ  ａｎｄ  ｌａｃ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ８０：２１−２５）、およびファージＴ５プロモータ（Ｂｕｊａｒｄ  Ｈ，Ｇｅｎｔｚ  Ｒ，Ｌａｎｚｅｒ  Ｍ，Ｓｔｕｅｂｅｒ  ��，Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｍ，Ｉｂｒａｈｉｍｉ  Ｉ，Ｈａｅｕｐｔｌｅ  ＭＴ，Ｄｏｂｂｅｒｓｔｅｉｎ  Ｂ．１９８７．Ａ  Ｔ５  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｂａｓｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５５：４１６−４３３）が挙げられる。細菌での発現に適した他のプロモータも述べられている（Ｇｒｅｅｎ  ＭＲ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．２０１２．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｅ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ｋａｒｐ  ＰＤ，ｅｔ  ａｌ．．２０１４．Ｔｈｅ  ＥｃｏＣｙｃ  Ｄａｔａｂａｓｅ．ＥｃｏＳａｌ  Ｐｌｕｓ  ２０１４；Ｋｅｓｅｌｅｒ  ＩＭ  ｅｔ  ａｌ．．２０１１．ＥｃｏＣｙｃ：ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３９：Ｄ５８３−５９０）。
【０１３５】
ある実施形態において、ＲＮＡ構成要素を発現するカセットを含むＤＮＡポリヌクレオチドは、ＲＮＡ構成要素配列の下流に、適切な転写終止配列を含む。本明細書中で有用な転写終止配列の例は、米国特許出願公開第２０１４／０１８６９０６号明細書に開示されており、この文献は参照によって本明細書に組み込まれる。そのような実施形態は、通常、ターミネータ配列の選択に応じて、ＲＮＡ構成要素配列の末端の後ろに、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、またはそれ以上の残基を含む。これらの付加的な残基は、例えば、ターミネータ配列の選択に応じて、全てＵ残基であってもよいし、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％がＵ残基であってもよい。あるいは、リボザイム配列（例えば、ハンマーヘッドまたはＨＤＶリボザイム）は、ＲＮＡ構成要素配列の（下流の、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のヌクレオチド）３’側にあってよい。３’リボザイム配列は、それ自体をＲＮＡ構成要素配列から切断するように然るべく位置が定められ得る。そのような切断により、転写産物は、例えば、ＲＮＡ構成要素配列の末端にて正確に終止するか、または、ＲＮＡ構成要素配列の末端に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、もしくはそれ以上の残基が続くことになる。
【０１３６】
ＤＮＡ標的部位配列に結合することができるが、標的部位配列の任意の鎖を切断することができない、本明細書中のＲＧＥＮは、他の実施形態におけるＤＮＡターゲティング法で使用することができる。機能不全ヌクレアーゼドメインのみを有するが、特異的なＤＮＡ結合活性を保持している、本明細書で開示する任意のＲＧＥＮはこの種のターゲティング法で使用することができる。
【０１３７】
アクチベーター転写因子またはそのアクチベータードメインに結合または溶融したＲＧＥＮは、１つ以上のポリヌクレオチド配列の発現を上方調節するために使用することができる。そのような活性化ＲＧＥＮを組み込んだ方法は、任意選択により転写上方調節法または活性化法と特徴づけることができる。そうした方法における転写上方調節のレベルは、例えば、活性化ＲＧＥＮを適用する前の転写レベルと比べて、少なくとも約２５％、５０％、７５％、１００％、２５０％、５００％または１０００％にすることができる。
【０１３８】
本明細書中のターゲティング法は、例えば、この方法で２つ以上のＤＮＡ標的部位が標的にされるような方法で行われることができる。そのような方法は、任意選択により、多重法として特徴づけられる。ある実施形態では、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはこれより多くの標的部位が同時に標的にされることができる。多重法は、通常、複数の異なるＲＮＡ成分（その各々がＲＧＥＮを固有のＤＮＡ標的部位に導く）が提供される、本明細書中のターゲティング法により行われる。例えば、インビトロでＲＧＥＮ−ＣＰＰ複合混合物を調製する（例えば、ＲＮＡ成分をＲＧＥＮタンパク−ＣＰＰ複合体に結合させるために、本明細書で開示された手順にしたがって）ために、２種以上の異なるＲＮＡ成分が使用され、その後この混合物は細胞と接触させられる。
【０１３９】
本明細書による多重ターゲティングの他の態様は、細胞に入り込んできたＲＧＥＮタンパク−ＣＰＰ複合体のＲＧＥＮタンパク質構成要素と結合する、２種以上の異なるＲＮＡ成分を細胞内に提供することを含むことができる。そのような方法は、例えば、（ｉ）特定のＲＮＡ成分を発現する個別のＤＮＡポリヌクレオチド、および／または２つ以上のＲＮＡ成分をエンコードする少なくとも１つのＤＮＡポリヌクレオチドを細胞に提供することを含むことができる（例えば、タンデムのリボザイム−ＲＮＡ成分カセットについて開示した下記を参照）。
【０１４０】
多重法は任意選択により同一配列に極めて近いＤＮＡ部位（例えば、プロモーターまたはオープン・リーディング・フレーム）および／または互いに隔たっている部位（例えば、異なる遺伝子および／またはクロモソームで）を標的にすることができる。他の実施形態における多重法は、求められるターゲッティングの成果に応じて（エンドヌクレアーゼ−またはニッカーゼ−コンピテンとＲＧＥＮが使われるならば）、適切なポリヌクレオチド修飾鋳型を用いて（ＨＲ用）または用いずに（インデルおよび／または塩基置換を導くＮＨＥＪ用）行われることができる。さらに他の実施形態では、多重法は、本明細書中に開示したように、抑止または活性化ＲＧＥＮを用いて行われることができる。例えば、特定の代謝経路で関与する遺伝子などの遺伝子セットを下方調節する多重抑止ＲＧＥＮが提供されることができる。
【０１４１】
本明細書中に開示される組成物および方法の非限定の例として、以下が挙げられる：
１．エケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞のゲノムのヌクレオチド配列を編集するための方法であって、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ配列および環状ポリヌクレオチド修飾鋳型を含む少なくとも１つの組換えＤＮＡコンストラクトを、誘導プロモータに機能可能なように結合したＣａｓ９エンドヌクレアーゼＤＮＡ配列を含むＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に提供する工程を含み、前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼＤＮＡ配列が、前記Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞のゲノムの標的部位に二重鎖切断を導入することができるＣａｓ９エンドヌクレアーゼをコードし、前記ポリヌクレオチド修飾鋳型が、前記ヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチド修飾を含む、方法。
２．Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞のゲノムのヌクレオチド配列が、プロモータ配列、ターミネータ配列、調節要素配列、コード配列、プロファージ、偽遺伝子、外来遺伝子、および内在性遺伝子からなる群から選択される、実施形態１に記載の方法。
３．ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む前記組換えＤＮＡコンストラクトが、環状プラスミドによって提供される、実施形態１に記載の方法。
４．組換えＤＮＡコンストラクトおよび環状ポリヌクレオチド修飾鋳型がそれぞれ、別個のプラスミドに提供される、実施形態１に記載の方法。
５．組換えＤＮＡコンストラクトおよび環状ポリヌクレオチド修飾鋳型が、１つのプラスミドに提供される、実施形態１に記載の方法。
６．組換えＤＮＡコンストラクトおよび環状ポリヌクレオチド鋳型が、エレクトロポレーション、熱ショック、ファージ送達、交配、コンジュゲーション、および形質導入からなる群から選択される１つの手段によって提供される、実施形態１に記載の方法。
７．前記標的部位が、第１のゲノム領域および第２のゲノム領域に隣接し、環状ポリヌクレオチド鋳型が、前記第１のゲノム領域に相同の第１の領域および前記第２のゲノム領域に相同の第２の領域をさらに含む、実施形態１に記載の方法。
８．Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞が、外来組換えタンパク質を発現しない、実施形態１に記載の方法。
９．Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞が、ＲｅｃＥＴタンパク質、λ−ｒｅｄタンパク質、およびＲｅｃＢＣＤ阻害剤を含む群から選択されるタンパク質を発現しない、実施形態１に記載の方法。
１０．前記Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞から子孫細胞を増殖させる工程をさらに含み、この子孫細胞が、前記ヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチド修飾を含む、実施形態１に記載の方法。
１１．標的部位が、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｇａｌＫ遺伝子内に位置する、実施形態１に記載の方法。
１２．実施形態１に記載の方法によって作製されたＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞。
１３．実施形態１２に記載のＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞から作製されたＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株。
１４．ｇａｌＫ変異Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を作製するための方法であって：
（ａ）ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ配列および少なくとも１つの環状ポリヌクレオチド修飾鋳型を含む少なくとも１つの環状組換えＤＮＡコンストラクトを、誘導プロモータに機能可能なように結合したＣａｓ９エンドヌクレアーゼＤＮＡ配列を含むＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に提供する工程であって、前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼＤＮＡ配列が、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノムのｇａｌＫゲノム配列内の標的部位に二重鎖切断を導入することができるＣａｓエンドヌクレアーゼをコードし、前記環状ポリヌクレオチド修飾鋳型が、前記ｇａｌＫゲノム配列の少なくとも１つのヌクレオチド修飾を含む、工程；
（ｂ）（ａ）のＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞から子孫細胞を増殖させる工程；および
（ｃ）前記少なくとも１つのヌクレオチド修飾の存在について（ｂ）の子孫細胞を評価する工程を含む、方法。
１５．エケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞のゲノムのヌクレオチド配列を編集するための方法であって、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ配列、環状ポリヌクレオチド修飾鋳型を含む少なくとも第１の組換えＤＮＡコンストラクト、および誘導プロモータに機能可能なように結合したＣａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ配列を含む第２の組換えＤＮＡコンストラクトをＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に提供する工程を含み、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼが、前記Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞のゲノムの標的部位に二重鎖切断を導入し、前記ポリヌクレオチド修飾鋳型が、前記ヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチド修飾を含む、方法。
１６．第１の組換えＤＮＡコンストラクト、第２の組換えＤＮＡコンストラクト、および環状ポリヌクレオチド修飾鋳型がそれぞれ、別個のプラスミドに提供される、実施形態１５に記載の方法。
１７．第１の組換えＤＮＡコンストラクト、第２の組換えＤＮＡコンストラクト、および環状ポリヌクレオチド修飾鋳型が、１つのプラスミドに提供される、実施形態１に記載の方法。
【実施例】
【０１４２】
開示される本開示は、以下の実施例においてさらに明らかにされる。これらの実施例が、本開示のある好ましい態様を示す一方、単に説明の目的で示されていることは理解されるべきである。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者であれば、本開示の必須の特徴を確認することができ、そして、その精神および範囲を逸脱しない範囲で、本開示の種々の変更および改変を行なって、種々の用途および条件に適合させることができる。
【０１４３】
実施例１
エケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）に使用されるＣａｓ９エンドヌクレアーゼ発現ベクターの作製
この実施例では、エケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）のゲノム編集用の誘導Ｃａｓ９発現ベクターを作製した。インデューサ―に応答するＣａｓ９発現を確認した。
【０１４４】
化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ）Ｍ１  ＧＡＳ  ＳＦ３７０由来のＣａｓ９遺伝子（配列番号１）を、当分野で公知の標準的な技術によってヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属コドン最適化した（配列番号２）。細胞の核にＣａｓ９タンパク質を局在化させるために、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）一分節（ｍｏｎｏｐａｒｔｉｔｅ）（ＭＡＰＫＫＫＲＫＶ、配列番号３）核局在化シグナルを、Ｃａｓ９オープンリーディングフレームのカルボキシ末端に組み込んだ。ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属コドン最適化Ｃａｓ９遺伝子を、標準的な分子生物学技術によってヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属構成プロモータ、ＦＢＡ１（配列番号４）に融合した。ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属コドン最適化Ｃａｓ９発現カセット（配列番号５）の一例は、ＦＢＡ構成プロモータ、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属コドン最適化Ｃａｓ９、およびＳＶ４０核局在化シグナルを含む。Ｃａｓ９発現カセットを、プラスミドｐＺｕｆにクローニングし、この新規なコンストラクトは、ｐＺｕｆＣａｓ９（配列番号６）と呼ばれる。
【０１４５】
ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属コドン最適化Ｃａｓ９−ＳＶ４０融合遺伝子（配列番号７）を、標準的な分子生物学の技術を用いてｐＺｕｆＣａｓ９から増幅した。反応用のプライマーは、ＧＧＧＧＧＡＡＴＴＣＧＡＣＡＡＧＡＡＡＴＡＣＴＣＣＡＴＣＧＧＣＣＴＧＧ（フォワード、配列番号８）ならびに５’ＥｃｏＲＩ部位および３’ＨｉｎｄＩＩＩ部位を融合体に付加するＣＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＧＡＣＣＴＴＴＣＧ（リバース、配列番号９）とした。ＰＣＲ産物（配列番号１０）を、標準的な技術を用いて精製した。精製された断片を、ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから得たｐＢＡＤ／ＨｉｓＢのＥｃｏＲＩ部位およびＨｉｎｄＩＩＩ部位（配列番号１１）にクローニングしてｐＲＦ４８（配列番号１２）を作製した。
【０１４６】
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ  １０細胞（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、ｐＲＦ４８で形質転換した。この形質転換細胞を、Ｌブロス（１％（ｗ／ｖ）Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、１％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）＋１００μｇ／ｍｌアンピシリン＋０．４％（ｗ／ｖ）グルコースで維持して、Ｃａｓ９タンパク質の発現を阻止した。細胞を、Ｌブロス＋１００μｇ／ｍｌアンピシリン＋０．４％（ｗ／ｖ）グルコース中、３７℃、２２０ＲＰＭで一晩増殖させた。この細胞を、２．８Ｌ  Ｆｅｒｎｂａｃｈフラスコ内の１Ｌの２×ＹＴ培地（１．６％  Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、１．０％（ｗ／ｖ）酵母エキス、０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）で１：１００に希釈した。培養物を、ＯＤ６００が０．４３８に達するまで３７℃、２２０ＲＰＭで増殖させた。１ｍｌの培養物をペレットにして、４３．８μｌの１×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液に再懸濁し、−２０℃で凍結した。Ｌ−アラビノースを０．２％（ｗ／ｖ）の最終濃度まで添加して、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属最適化Ｃａｓ９遺伝子を駆動するＰＢＡＤプロモータを誘導した。培養物を１８℃にして、１８０ＲＰＭで２０時間遠心分離した。
【０１４７】
Ｌ−アラビノースによる誘導後、ＯＤ６００は３．０１であった。０．３３２ｍｌの培養物のアリコートをペレットにした。細胞を、１００μｌの１×ｌａｅｍｍｅｌｉ緩衝液に再懸濁した。誘導前および誘導後の両方のサンプルを９５℃に５分間加熱し、１０μｌを、１２．５％トリス−グリシンＳＤＳポリアクリルアミドゲルに添加した。２００ボルトを３０分間ゲルに印加した。ゲルを、ブルー染色を用いて単純に染色して、タンパク質バンドを判別した。アラビノース誘導プロモータの制御下のＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）でのヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属最適化Ｃａｓ９タンパク質の発現はロバストであった（図４）。
【０１４８】
実施例２
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｇａｌＫ遺伝子をターゲティングする単一ガイドＲＮＡをコードする環状発現プラスミドの作製
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の内在性ｇａｌＫ遺伝子を修飾（編集）するために、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｇａｌＫ遺伝子内の４つの（４）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ標的部位を特定した（図５）：ｇａｌＫ−１（配列番号１３、表１）、ｇａｌＫ−２（配列番号１４、表１）、ｇａｌＫ−３（配列番号１５、表１）、およびｇａｌＫ−４（配列番号１６、表１）。
【０１４９】
【表４】
2017538422.tif 000007
【０１５０】
ＰＡＭドメイン（表１に定義されている）が欠如したゲノムｇａｌＫ１標的配列に一致するＤＮＡ断片を化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ認識ドメイン（配列番号１７）に融合して、単一ガイドＤＮＡの完全なＤＮＡ鋳型を作製した。ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ断片は、配列番号１８〜２１に示されている。ｇａｌ１Ｋ−１〜ｇａｌ１Ｋ−４のｓｇＲＮＡは、配列番号２２〜２５に示されている。
【０１５１】
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞のｓｇＲＮＡを発現させるために、４つのｓｇＲＮＡ発現カセットを作製した（配列番号２８〜３１）。ｓｇＲＮＡは、バクテリオファージλのＰＬプロモータの制御下に置いた（配列番号２６）。ｓｇＲＮＡの転写終結を誘導するために、ＣＲドメインの３’末端を強力なバクテリオファージλターミネータに融合した（配列番号２７）。Ｇａｌｋ−１  ｓｇＲＮＡ発現カセット（配列番号２８）を、ｇａｌＫ−１ゲノム標的部位（配列番号１３）を標的とするように設計した。Ｇａｌｋ−２  ｓｇＲＮＡ発現カセット（配列番号２９を、ｇａｌＫ−１ゲノム標的部位（配列番号１４）を標的とするように設計した。Ｇａｌｋ−３  ｓｇＲＮＡ発現カセット（配列番号３０）を、ｇａｌＫ−３ゲノム標的部位（配列番号１５）を標的とするように設計した。Ｇａｌｋ−４  ｓｇＲＮＡ発現カセット（配列番号３１）を、ｇａｌＫ−４ゲノム標的部位（配列番号１６）を標的とするように設計した。
【０１５２】
各ｓｇＲＮＡ発現カセットは、５’ＨｉｎＤＩＩＩ制限部位（ＡＡＧＣＴＴ）および３’ＢａｍＨＩ制限部位（ＧＧＡＴＣＣ）を含んでいた。各ｓｇＲＮＡ発現カセットをｐＡＣＹＣ１８４（配列番号３２）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ部位にクローニングして、環状プラスミド（ガイドＲＮＡプラスミド、図１および図２を参照）ｐＲＦ５０（標的ｇａｌＫ−１、配列番号３３）、ｐＲＦ５１（標的ｇａｌＫ−２、配列番号３４）、ｐＲＦ５３（標的ｇａｌＫ−３、配列番号３５）、およびｐＲＦ５５（標的ｇａｌＫ―４、配列番号３６）を作製した。
【０１５３】
実施例３
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）での遺伝子編集のためのポリヌクレオチド修飾鋳型を含む環状プラスミドの作製
（例えば、ｇａｌＫ遺伝子の遺伝子欠失）を用いるＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）での遺伝子編集（修飾）を可能にするために、以下のようにｇａｌＫ遺伝子の一部が欠如したポリヌクレオチド修飾鋳型（ｇａｌＫ欠失鋳型とも呼ばれる）を作製した：
【０１５４】
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｇａｌＫ遺伝子の翻訳開始部位のすぐ５’側の４５４ｂｐの断片（配列番号３７）を標準的なＰＣＲ技術で、クローニング用の５’ＨｉｎＤＩＩＩ制限部位を付加するフォワードプライマー（ＧＧＧａａｇｃｔｔｇｇａｔｔａｔｇｔｔｃａｇｃｇｃｇａｇｃ、配列番号３８）および上流の重複伸長産物（配列番号４０）を生成するためのｇａｌＫ遺伝子の停止コドンのすぐ３’側の２０ｂｐの配列を付加するリバースプライマー（ｔｇｃｃａｇｔｇｃｇｇｇａｇｔｔｔｃｇｔＴＴＣＴＴＡＣＡＣＴＣＣＧＧＡＴＴＣＧＣ、配列番号３９）を用いて増幅した。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｇａｌＫ遺伝子の翻訳停止部位のすぐ３’側の３７６ｂｐ（配列番号４１）を標準的なＰＣＲ技術で、ｇａｌＫ遺伝子の開始コドンのすぐ５’側の２０ｂｐの配列を付加するフォワードプライマー（ＧＣＧＡＡＴＣＣＧＧＡＧＴＧＴＡＡＧＡＡａｃｇａａａｃｔｃｃｃｇｃａｃｔｇｇｃａ、配列番号４２）および下流の重複伸長産物（配列番号４４）を生成する３’ＨｉｎＤＩＩＩ制限部位を付加するリバースプライマー（ＧＧＧａａｇｃｔｔＧＣＡＡＡＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＣＧＡＴＣＧ、配列番号４３）を用いて増幅した。ＰＣＲ産物を、Ｚｙｍｏ  ｃｌｅａｎおよび濃縮カラムを用いて精製した。１０ｎｇの各ＰＣＲ産物を使用して、５’断片用のフォワードプライマー（ＧＧＧａａｇｃｔｔｇｇａｔｔａｔｇｔｔｃａｇｃｇｃｇａｇｃ、配列番号３８）および３’断片のリバースプライマー（ＧＧＧａａｇｃｔｔＧＣＡＡＡＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＣＧＡＴＣＧ、配列番号４３）を用いて重複する２０ｎｔを伸長させた。完全長ｇａｌＫ欠失鋳型（配列番号４５）を、条件的付きで複製するプラスミドｐＫＤ３（配列番号４６）のＨｉｎＤＩＩＩ部位にクローニングして、環状ｇａｌＫ欠失鋳型プラスミドｐＲＦ１１３（配列番号４７）を作製した。ｇａｌＫ欠失鋳型プラスミドｐＲＦ１１３（図１および図２では鋳型プラスミドと呼ばれる）は、Ｐｉタンパク質（Ｉｎｕｚｕｋａ  Ｍ．１９８５．Ｐｌａｓｍｉｄ−ｅｎｃｏｄｅｄ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｔ  ａｌｌ  ｔｈｒｅｅ  ｏｒｉｇｉｎｓ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｄ  Ｒ６Ｋ  ＤＮＡ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔｅｒｓ  １８１：２３６−２４０）の発現カセットが欠如し、これにより、このプラスミドは自律的に複製することができない。したがって、この環状鋳型がＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に提供されると、この環状鋳型は、ＲＧＥＮ媒介遺伝子編集の鋳型として機能し得るが、複製しないため、前記Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞から培養されるいずれの子孫細胞にも存在しない。
【０１５５】
実施例４
ポリヌクレオチド修飾鋳型を含む環状プラスミドと組み合わせてガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系を用いるＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｇａｌＫ遺伝子の効率的なゲノム編集
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｇａｌＥ遺伝子の欠失を含む菌株ＥＦ４４は、毒性産物リン−ガラクトースの蓄積により、増殖培地中のガラクトースの存在に感受性がある（Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ：Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ａｕｔｈｏｒｓ：Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｃ．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，Ｊｏｈｎ  Ｌ．Ｉｎｇｒａｈａｍ，Ｒｏｙ  Ｃｕｒｔｉｓｓ  ＩＩＩ．ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．１９８７）。この菌株では、ガラクトースキナーゼ（ｇａｌＫ）をコードする遺伝子の機能の喪失をもたらす変異が、ガラクトース感受性を低下させ、菌株がガラクトースの存在下でも増殖することができる。
【０１５６】
Ｃａｓ９発現カセットを含むＣａｓ９プラスミド（図１に示されている）を含むＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を作製するために、プラスミドｐＲＦ４８を、以下のようにＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＥＦ４４に導入した。菌株ＥＦ４４菌株をｐＲＦ４８（配列番号１２）で形質転換し、コロニーを、１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび０．４％（Ｗ／Ｖ）グルコースを含むＬブロス寒天プレートで選択してｐＢＡＤプロモータからのＣａｓ９遺伝子の発現を阻止し、Ｃａｓ９プラスミドを含むＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＥＦ５６（ΔｇａｌＥ  ｐＲＦ４８）を作製した。
【０１５７】
ＥＦ５６の単一コロニーを、１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび０．４％（Ｗ／Ｖ）グルコースを含むＬブロスに接種し、３７℃、２３０ＲＰＭで１８時間増殖させた。次いで、菌株を、１００μｇ／ｍｌアンピシリン含む新鮮なＬブロスで希釈し、３７℃、２３０ＲＰＭで２時間増殖させた。Ｌ−アラビノースを、０．２％（Ｗ／Ｖ）の最終濃度まで添加して、ＰＢＡＤプロモータからのＣａｓ９の発現を誘導し、そして細胞をさらに１時間増殖させた。細胞を、標準的なプロトコルによってエレクトロコンピテントにした。１００μｌの誘導されたエレクトロコンピテントＥＦ５６細胞を、２００ｎｇのｐＡＣＹＣ１８４（配列番号３２）、ｐＲＦ５０（配列番号３３）、ｐＲＦ５１（配列番号３４）、ｐＲＦ５３（配列番号３５）、またはｐＲＦ５５（配列番号３６）と、１μｇのｐＲＦ１１３（配列番号４７）、１μｇの線状ポリヌクレオチド修飾鋳型（配列番号４４）、またはゼロのポリヌクレオチド修飾鋳型プラスミドＤＮＡとで形質転換した。細胞を、１ｍＭのギャップのキュベットで、１７５０ボルトで電気穿孔した。１ｍｌのＳＯＣ培地を添加し、細胞を、３７℃、２３０ＲＰＭで３時間回復させた。細胞を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含む１．５％（ｗ／ｖ）寒天で固化されたＬブロスプレートにプレーティングして、ｐＲＦ４８（配列番号１２）および対応するｐＡＣＹＣ１８４（配列番号３２）、ｐＲＦ５０（配列番号３３）、ｐＲＦ５１（配列番号３４）、ｐＲＦ５３（配列番号３５）、またはｐＲＦ５５（配列番号３６）の両方を含む細胞を選択した。プレートを３７℃で２０時間インキュベートした。
【０１５８】
コロニーを、ガラクトース耐性分離株をスクリーニングするためにレプリカ平板法を用いて、１００μｇ／ｍｌアンピシリン／２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＬブロスプレートから、０．２％（ｗ／ｖ）グリセロールおよび０．２％（ｗ／ｖ）ガラクトースを含む１．５％（ｗ／ｖ）寒天で固化された最少Ａ培地に移した。各形質転換について、ガラクトース耐性の頻度を、ガラクトース耐性コロニーの数を元のプレートのコロニーの総数で除して算出した（表２）。
【０１５９】
【表５】
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【０１６０】
頻度は、標的部位によって異なった。相同組換えの頻度を決定するために、ｇａｌＫ遺伝子座（配列番号４８）を標準的なＰＣＲ技術で、フォワードプライマー（ｇｇｃｇａａｇａｇａａｔｃａａｃａｃｔｇｇ、配列番号４９）およびリバースプライマー（ＧＣＡＡＡＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＣＧＡＴＣＧ、配列番号５０）を用いた。ＷＴ株では、ｇａｌＫ遺伝子座全体（配列番号４８）を増幅し、長さが１７１７ｂｐのＰＣＲ産物を得る。組換えが、ｇａｌＫ遺伝子座とＨＲポリヌクレオチド修飾鋳型ｐＲＦ１１３との間に生じた細胞では、ＰＣＲ産物は、５６９ｂｐの長さである（配列番号５０）。図６は、７５％のＨＲ頻度のｐＲＦ５０／ｐＲＦ１１３編集実験でのコロニー増幅のゲルを示している。ＨＲ頻度を、ｇａｌＫの欠失対立遺伝子が増幅されたコロニー（正確な編集を示唆する）の数を、コロニーＰＣＲによってアッセイされたコロニーの総数で除して決定した。ポリヌクレオチド修飾鋳型の非存在下でＧａｌＲであるコロニーは、ｇａｌＫ遺伝子座の増幅に失敗している。
【０１６１】
この実施例は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｇａｌＫ遺伝子の効率的なゲノム編集が、ポリヌクレオチド修飾鋳型を含む環状プラスミドと組み合わせてガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系を用いてうまく達成されたことを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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