(57)【要約】本発明は、腫瘍抑制における核受容体レチノイド関連オーファン受容体γ(RORγ)の役割の発見に関する。RORγが導入および発現されると、自然免疫細胞内で、腫瘍細胞の認識および抑制を誘発する遺伝子活性化が起こる。従って、本明細書に記載の様々な態様において、本発明は、好中球特異的プロモーターの制御下で、RORγをコードする核酸配列を含むウイルスベクターを含む組成物または細胞を包含する。さらに、本発明は、自然免疫細胞の抗腫瘍免疫を付与するか、または増大させる組成物を対象に投与することによって癌を処置する方法、対象において抗腫瘍免疫を提供するための方法、哺乳動物において細胞集団または組織に対する自然免疫応答を刺激する方法、および抗腫瘍免疫応答を診断する方法に関する。さらに、本発明は、上述の方法を実施するためのキットを包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
レチノイド関連オーファン受容体γ(RORγ)をコードする核酸配列を含むウイルスベクターを含む組成物であって、RORγの発現が好中球特異的プロモーターの制御下にある、組成物。
【請求項２】
RORγをコードする核酸配列を含むウイルスベクターを含む細胞であって、RORγの発現が好中球特異的プロモーターの制御下にある、細胞。
【請求項３】
RORγをコードする核酸配列を含むウイルスベクターを含むCD34陽性(CD34+)細胞であって、RORγの発現が、好中球特異的プロモーター、構成的プロモーター、および誘導性プロモーターからなる群より選択されるプロモーターの制御下にある、CD34陽性(CD34+)細胞。
【請求項４】
好中球に分化するように拘束され、RORγをコードする核酸配列を含むウイルスベクターを含むCD34+細胞であって、RORγの発現が、好中球特異的プロモーター、構成的プロモーター、および誘導性プロモーターからなる群より選択されるプロモーターの制御下にある、CD34+細胞。
【請求項５】
ウイルスベクターが、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターからなる群より選択される、請求項1〜4のいずれか一項記載の組成物または細胞。
【請求項６】
好中球特異的プロモーターがCD11B(SEQ ID NO.8)である、請求項1〜5のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７】
それを必要とする哺乳動物において癌を処置する方法であって、レチノイド関連オーファン受容体γ(RORγ)をコードする核酸配列を含むウイルスベクターを含む組成物を哺乳動物に投与する工程を含み、RORγの発現が、好中球特異的プロモーター、構成的プロモーター、および誘導性プロモーターからなる群より選択されるプロモーターの制御下にある、方法。
【請求項８】
それを必要とする哺乳動物において癌を処置する方法であって、RORγをコードする核酸配列を含むウイルスベクターを含む細胞を哺乳動物に投与する工程を含み、RORγの発現が、好中球特異的プロモーター、構成的プロモーター、および誘導性プロモーターからなる群より選択されるプロモーターの制御下にある、方法。
【請求項９】
それを必要とする哺乳動物において癌を処置する方法であって、RORγをコードする核酸配列を含むウイルスベクターを含むCD34陽性(CD34+)細胞を哺乳動物に投与する工程を含み、RORγの発現が、好中球特異的プロモーター、構成的プロモーター、および誘導性プロモーターからなる群より選択されるプロモーターの制御下にある、方法。
【請求項１０】
それを必要とする哺乳動物において癌を処置する方法であって、好中球に分化するように拘束されたCD34+細胞を哺乳動物に投与する工程を含み、該細胞がRORγをコードする核酸配列を含むウイルスベクターを含み、RORγの発現が、好中球特異的プロモーター、構成的プロモーター、および誘導性プロモーターからなる群より選択されるプロモーターの制御下にある、方法。
【請求項１１】
哺乳動物において抗腫瘍免疫を提供するための方法であって、RORγをコードする核酸配列を含むウイルスベクターを含む組成物を哺乳動物に投与する工程を含み、RORγの発現が、好中球特異的プロモーター、構成的プロモーター、および誘導性プロモーターからなる群より選択されるプロモーターの制御下にある、方法。
【請求項１２】
哺乳動物において細胞集団または組織に対する自然免疫応答を刺激するための方法であって、RORγをコードする核酸配列を含むウイルスベクターを含む組成物を哺乳動物に投与する工程を含み、RORγの発現が、好中球特異的プロモーター、構成的プロモーター、および誘導性プロモーターからなる群より選択されるプロモーターの制御下にある、方法。
【請求項１３】
ウイルスベクターが、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターからなる群より選択される、請求項7〜12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
好中球特異的プロモーターがCD11B(SEQ ID NO.8)である、請求項7〜13のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
それを必要とする哺乳動物において抗腫瘍免疫の活性化または活性を診断する方法であって、哺乳動物に由来する生物学的試料におけるレチノイド関連オーファン受容体γ(RORγ)の発現レベルを測定する工程を含み、正常対照RORγ発現レベルと比較したRORγ発現レベルの増加が、哺乳動物が抗腫瘍免疫を有するか、または抗腫瘍免疫を発生していることを示す、方法。
【請求項１６】
生物学的試料が、血液、白血球、および好中球からなる群より選択される少なくとも1つを含む、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
発現レベルが正常対照レベルより少なくとも10％高い、請求項15記載の方法。
【請求項１８】
発現レベルが、遺伝子のmRNAの検出、遺伝子によってコードされるタンパク質の検出、および遺伝子によってコードされるタンパク質の生物学的活性の検出からなる群より選択される方法によって測定される、請求項15記載の方法。
【請求項１９】
哺乳動物がヒトである、請求項7〜12または請求項15のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
レチノイド関連オーファン受容体γ(RORγ)に対するプローブセットおよびそれを使用するための説明書を含むキットであって、説明書が、
i.それを必要とする哺乳動物に由来する試料中の自然免疫細胞におけるRORγレベルを検出すること、
ii.抗腫瘍免疫の存在または非存在を示すこと、ならびに
iii.RORγをコードするウイルス核酸配列を含む組成物を哺乳動物に投与する工程を含み、RORγの発現が、好中球特異的プロモーター、構成的プロモーター、および誘導性プロモーターからなる群より選択されるプロモーターの制御下にある、抗腫瘍免疫処置を哺乳動物において施行、変更、または終了するべきかどうかを助言すること
を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、35U.S.C.119条(e)に基づいて、2014年10月3日に出願された米国特許仮出願第62/059,342号に係る優先権を主張する。この出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
連邦政府の支援による研究または開発に関する記載
本発明は米国立衛生研究所によって付与された助成金HG002357に基づいて政府の支援を受けてなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
過去数十年間に癌の処置および診断は著しく進歩してきた。現在の癌処置選択肢には、外科手術、化学療法、放射線療法、および免疫療法が含まれる。最近では、免疫系を刺激することにねらいを定めた免疫療法処置が、癌との闘いにおいて有望な成果を収め、非常に多くの研究を引きつけてきた。
【０００４】
免疫療法は非常に高い効果がある可能性があるが、腫瘍が生じた臓器に関係なく、通常、ごく一部の患者しか療法に応答しない。さらに、これらの処置の一部は高度に個別化され、このような処置を桁外れに高額なものにする特殊な状況以外において施行することが不可能であった。あらゆるタイプの癌に対する免疫療法の効力を改善するために、また、免疫療法をさらに利用しやすく、手が届く価格にするために、この分野における新たな発見が明らかに必要とされている。
【０００５】
自然免疫系(マウスおよびヒトの双方)の細胞には、様々な系列の癌細胞を標的とし、死滅させる生来の能力があることが報告されている。この現象は長年にわたって認識されてきたが、この癌死滅能力を導く機構を研究者たちは解明できなかった(Cui et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2003; 100(11):6682-7（非特許文献1）; Hicks et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2006; 103(20):7753-8（非特許文献2）; Sanders et al., -BMC Cancer. 2010; 10: 121（非特許文献3）)。
【０００６】
十年以上前に、SR/CRと名付けられた癌耐性マウスに、正常マウスに対して壊滅的な影響を与える漸増用量の癌性サルコーマ180(S180)細胞を投与した時に、癌耐性マウスは腫瘍発生に対して免疫があることが発見された。癌耐性形質は遺伝することが判明し、SR/CRマウスの一マウス世代が交配された(Cui et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2003; 100(11):6682-7（非特許文献1）; Hicks et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2006（非特許文献2）)。残念なことに、この表現型を担う重要な遺伝子は容易に同定されなかった(Riedlinger et al., BMC Cancer. 2010; 10: 179（非特許文献4）)。
【０００７】
細胞レベルでの驚くべき発見は、SR/CRマウスの抗癌活性が自然免疫系(例えば、好中球、ナチュラルキラー細胞、およびマクロファージ)によって支配されているということであった。免疫系の最初の反応者である好中球およびマクロファージが癌細胞に向かって移動し、癌細胞を死滅させる役割を果たしていた。抗癌免疫に関連する文献のほぼ全てが自然免疫系ではなく適応免疫系(例えば、T細胞)に基づいていたので、これは驚くべき発見であった。最も驚嘆する一連の実験は、PTEN腫瘍抑制遺伝子が前立腺特異的にノックアウトされたマウスにSR/CR白血球を移入することを伴った。PTENノックアウトマウスは、通常、前立腺腫瘍で100％死ぬ。SR/CRマウスに由来する白血球で処置したPTEN変異マウスは全て、対照である未処置PTENマウスより長生きした(Sanders A.M., 2007, Thesis: 「Characterization of the Inheritance, Effector Mechanisms, and Response Against Endogenous Cancers in the SR/CR mouse Model of Cancer Resistance」; Wake Forest University（非特許文献5）)。インビトロ癌死滅アッセイを用いたヒト好中球およびマクロファージにおける実験は標的癌細胞株の攻撃において様々な程度の効率を示し、健常な若い対象の死滅活性は年をとった対象と比較して有効であったことを示した。しかしながら、白血球における重要なプレーヤーは同定されていないままであった(Koch et al., APMIS. 2012; 120(12):974-87（非特許文献6）)。
【０００８】
癌細胞の増殖を食い止め、癌細胞の死を誘発し、それによって癌を処置するための新たな療法が明らかに必要とされている。本発明はこの需要を満たす。さらに、本発明は、癌のタイプに関係なく、ユニバーサルで広範な抗腫瘍免疫療法の需要を満たす。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Cui et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2003; 100(11):6682-7
【非特許文献２】Hicks et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2006; 103(20):7753-8
【非特許文献３】Sanders et al., -BMC Cancer. 2010; 10: 121
【非特許文献４】Riedlinger et al., BMC Cancer. 2010; 10: 179
【非特許文献５】Sanders A.M., 2007, Thesis: 「Characterization of the Inheritance, Effector Mechanisms, and Response Against Endogenous Cancers in the SR/CR mouse Model of Cancer Resistance」; Wake Forest University
【非特許文献６】Koch et al., APMIS. 2012; 120(12):974-87
【発明の概要】
【００１０】
下記で説明するように、本発明は、抗癌療法のために自然免疫系を改変する組成物および方法を特徴とする。
【００１１】
一局面において、本発明は、レチノイド関連オーファン受容体γ(RORγ)をコードする核酸配列を含むウイルスベクターを含む組成物であって、RORγの発現が好中球特異的プロモーターの制御下にある、組成物を提供する。
【００１２】
別の局面において、本発明は、RORγをコードする核酸配列を含むウイルスベクターを含む細胞であって、RORγの発現が好中球特異的プロモーターの制御下にある、細胞を提供する。
【００１３】
さらに別の局面において、本発明は、RORγをコードする核酸配列を含むウイルスベクターを含むCD34陽性(CD34+)細胞であって、RORγの発現が、好中球特異的プロモーター、構成的プロモーター、および誘導性プロモーターからなる群より選択されるプロモーターの制御下にある、CD34陽性(CD34+)細胞を提供する。
【００１４】
さらに別の局面において、本発明は、好中球に分化するように拘束され、RORγをコードする核酸配列を含むウイルスベクターを含むCD34+細胞であって、RORγの発現が、好中球特異的プロモーター、構成的プロモーター、および誘導性プロモーターからなる群より選択されるプロモーターの制御下にある、CD34+細胞を提供する。
【００１５】
別の局面において、本発明は、それを必要とする哺乳動物において癌を処置する方法であって、レチノイド関連オーファン受容体γ(RORγ)をコードする核酸配列を含むウイルスベクターを含む組成物を哺乳動物に投与する工程を含み、RORγの発現が、好中球特異的プロモーター、構成的プロモーター、および誘導性プロモーターからなる群より選択されるプロモーターの制御下にある、方法を提供する。
【００１６】
さらに別の局面において、本発明は、それを必要とする哺乳動物において癌を処置する方法であって、RORγをコードする核酸配列を含むウイルスベクターを含む細胞を哺乳動物に投与する工程を含み、RORγの発現が、好中球特異的プロモーター、構成的プロモーター、および誘導性プロモーターからなる群より選択されるプロモーターの制御下にある、方法を提供する。
【００１７】
さらに別の局面において、本発明は、それを必要とする哺乳動物において癌を処置する方法であって、RORγをコードする核酸配列を含むウイルスベクターを含むCD34陽性(CD34+)細胞を哺乳動物に投与する工程を含み、RORγの発現が、好中球特異的プロモーター、構成的プロモーター、および誘導性プロモーターからなる群より選択されるプロモーターの制御下にある、方法を提供する。
【００１８】
別の局面において、本発明は、それを必要とする哺乳動物において癌を処置する方法であって、好中球に分化するように拘束されたCD34+細胞を哺乳動物に投与する工程を含み、該細胞がRORγをコードする核酸配列を含むウイルスベクターを含み、RORγの発現が、好中球特異的プロモーター、構成的プロモーター、および誘導性プロモーターからなる群より選択されるプロモーターの制御下にある、方法を提供する。
【００１９】
さらに別の局面において、本発明は、哺乳動物において抗腫瘍免疫を提供するための方法であって、RORγをコードする核酸配列を含むウイルスベクターを含む組成物を哺乳動物に投与する工程を含み、RORγの発現が、好中球特異的プロモーター、構成的プロモーター、および誘導性プロモーターからなる群より選択されるプロモーターの制御下にある、方法を提供する。
【００２０】
さらに別の局面において、本発明は、哺乳動物において細胞集団または組織に対する自然免疫応答を刺激するための方法であって、RORγをコードする核酸配列を含むウイルスベクターを含む組成物を哺乳動物に投与する工程を含み、RORγの発現が、好中球特異的プロモーター、構成的プロモーター、および誘導性プロモーターからなる群より選択されるプロモーターの制御下にある、方法を提供する。
【００２１】
本明細書において詳述された任意の局面の様々な態様において、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターからなる群より選択される。様々な態様において、好中球特異的プロモーターはCD11B(SEQ ID NO.8)である。
【００２２】
別の局面において、本発明は、それを必要とする哺乳動物において抗腫瘍免疫の活性化または活性を診断する方法であって、哺乳動物に由来する生物学的試料におけるレチノイド関連オーファン受容体γ(RORγ)の発現レベルを測定する工程を含み、正常対照RORγ発現レベルと比較したRORγ発現レベルの増加が、哺乳動物が抗腫瘍免疫を有するか、または抗腫瘍免疫を発生していることを示す、方法を提供する。
【００２３】
本明細書において詳述された任意の局面の様々な態様において、生物学的試料は、血液、白血球、および好中球からなる群より選択される少なくとも1つを含む。様々な態様において、発現レベルは正常対照レベルより少なくとも10％高い。様々な態様において、発現レベルは、遺伝子のmRNAの検出、遺伝子によってコードされるタンパク質の検出、および遺伝子によってコードされるタンパク質の生物学的活性の検出からなる群より選択される方法によって測定される。
【００２４】
本明細書において詳述された任意の局面の様々な態様において、哺乳動物はヒトである。
【００２５】
さらに別の局面において、本発明は、レチノイド関連オーファン受容体γ(RORγ)に対するプローブセットおよびそれを使用するための説明書を含むキットであって、説明書が、それを必要とする哺乳動物に由来する試料中の自然免疫細胞におけるRORγレベルを検出すること;抗腫瘍免疫の存在または非存在を示すこと;ならびにRORγをコードするウイルス核酸配列を含む組成物を哺乳動物に投与する工程を含み、RORγの発現が、好中球特異的プロモーター、構成的プロモーター、および誘導性プロモーターからなる群より選択されるプロモーターの制御下にある、抗腫瘍免疫処置を哺乳動物において施行、変更、または終了するべきかどうかを助言することを含む、キットを提供する。
【００２６】
本発明によって定義される組成物および物は、下記で示される実施例と関連して単離されたか、または別のやり方で製造された。本発明の他の特徴および利点は詳細な説明および添付の特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
本発明を例示する目的で、本発明のある特定の態様を図面に図示する。しかしながら、本発明は、図面に図示した態様の厳密な配置および手段に限定されない。
【図１】SR/CR試料および対照試料のRNA-Seqならびにインビトロ機能アッセイを含むワークフローの概要を示す。チオグリコレートによって誘発した腹膜好中球を対照マウスおよびSR/CRマウスから採取した(Cytospinによって調製したギムザ染色試料の形態学的分析に基づいて>85％純粋であった)。全RNAを採取し、RNA-Seqを実施するのに使用した。RNA-Seqデータの解析が、SR/CR好中球においてRNAレベルで差次的にアップレギュレートしていた、いくつかの候補の機能試験と、SR/CR癌死滅機構のエフェクターとしてのRORγの決定につながった。
【図２】反復実験のRNA-Seq相関を証明した散布図グラフである。データから、個々の対照/WT反復実験間(図2A)および反復実験したSR/CR間(図2B)の重複部分に高い一貫性があることが証明された。WT1対WT3、SR/CR1対SR/CR3なども等しく一貫性があった。
【図３】野生型(WT)とSR/CRマウスとの間の主成分分析(PCA)を図示したグラフである。
【図４】RNA-Seqデータからの上位(top)ディファレンシャルディスプレイ陽性を図示した表である。重要だとみなされたコーディングRNAおよびノンコーディングRNAのレベルの偽発見率(FDR)スコアは<0.05であった。RORγ(Rorc)およびクラスBスカベンジャー受容体(Scart2、WC1.1、Cd6)ならびにCD148チロシンホスファターゼ受容体に注目すべきである。RORγは、a)2倍を超える発現増加と、b)0.5未満のFDR値という判断基準を満たす唯一の転写因子であった(RORγの初回P値は0.00065であった)。
【図５】RORγがSR/CR形質マーカーであることを証明したプロットである。RNAレベルではSR/CRマウス由来の好中球のRORγは対照マウス由来の好中球と比べて一貫して高かった。これは、オリジナルのSR/CR BALB/cマウスを戻し交配したマウス近交系であるC57BL/6マウスから単離した好中球において得られた。
【図６】HF1骨髄系前駆細胞における対照トランスジーンのレンチウイルス発現を図示した一連の画像である。Mach7レンチウイルスを介して緑色蛍光タンパク質(GFP)を送達した。構成的プロモーターであるhEF1αが起こすMach7-GFP発現は、標的HF1細胞株において、ほぼ一様に分布することが見出された。このアッセイによって、HF1細胞株モデルにおける社内レンチウイルスベクターによるトランスジーン発現のレベルは、さらなるアッセイ開発に適していることが裏付けられた。蛍光顕微鏡でGFPが視覚化されたことで、HF1細胞において、レンチウイルスを介して送達されたトランスジーンの発現が活発なことが裏付けられた。
【図７】HF1細胞が好中球に効率的に分化することを証明した一連の画像である。Ly-6Cラット抗体である抗Ly-6G (NIMP-R14, Abcam)を用いて確認した時に、一段階プロトコールを用いて、(トランスジーンを発現しているか、発現していないかによらず)HF1好中球は好中球に効率的に分化した。
【図８】好中球に癌細胞死滅性を付与するタンパク質および/またはRNAの能力に関する機能的細胞生物学アッセイの概略を示した模式図である。RORγをコードするレンチウイルスを用いてHF1前駆細胞を感染させる。抗生物質を添加して、レンチウイルスに感染していないHF1前駆体を全滅させる。次いで、G-CSFを用いてHF1-RORγトランスジェニック骨髄系前駆細胞を分化させ、次いで、レンカ(Renca)癌細胞の単層プレートに加える。HF1-RORγ好中球はプラスチックディッシュに付着しないが、レンカ細胞に到達する。48時間後に、好中球を洗い流し、生存能力の消失について対照細胞と比較するために、レンカ細胞をクリスタルバイオレットで染色する。
【図９】マウスRORγ(mRORγ)を発現するレンチウイルスに感染させた好中球がインビトロアッセイにおいて癌細胞の数を減らすことを証明した画像である。レンカ細胞を組織培養処理済み6ウェルディッシュに一晩、24時間にわたって付着および増殖させた。次いで、HF1-mRORγ好中球を1:1、10:1、および20:1の様々な好中球:レンカ細胞比で加えた。48時間のインキュベーション期間後に、好中球を含有する培地を吸引し、プレートをPBSで洗浄した後に、レンカ細胞の固定と、50％エタノールに溶解した1％クリスタルバイオレットによる染色を同時に行った。HF1-mRORγ細胞は一貫して対照より多くのレンカ細胞を消失させた。
【図１０】pInducer21誘導性レンチウイルスの概略である。mRORγをTRE2誘導性プロモーターの下流にクローニングした。ドキシサイクリンを添加し、構成的に発現されるrtTA3転写トランス活性化タンパク質を活性化させると、この構築物に感染した細胞はmRORγを生成する。
【図１１】HoxA9 HF1細胞株を好中球に分化させる能力を証明した画像である。HF1細胞を標準的な増殖培地中で維持するか、または食塩水で洗浄し(図11A)、20ng/mLのG-CSFの存在下で3日間(図11B)または6日間(図11C)増殖させた。細胞を、示された回数でサイトスピンにかけ、ギムザ染色した。矢印は、好中球に特有の多葉性の核をはっきりと示す細胞を示す。
【図１２】pInducer21レンチウイルスRORγを用いて改変された免疫細胞がインビトロアッセイにおいて癌細胞の数を減らすことができることを証明した画像である。レンカ細胞を組織培養処理済み6ウェルディッシュに一晩、24時間にわたって付着および増殖させた。次いで、分化したHF1誘導性RORγ細胞を20:1(好中球:レンカ)の比でドキシサイクリンを伴わずに(-ドキシサイクリン(図12Aおよび12E))、またはドキシサイクリンと共に(+ドキシサイクリン、図12B、12C、12D、12F、12G、および12H)加えた。48時間のインキュベーション期間後に、好中球を含有する培地を吸引し、プレートをPBSで洗浄した後に、レンカ細胞を4％パラホルムアルデヒドとPBSで固定した。分化させ、ドキシサイクリンを介してRORγが発現するように誘導したトランスジェニックHF1細胞は一貫して、ドキシサイクリンによってRORγが誘導されなかった分化したHF1トランスジェニック細胞より多くのレンカ細胞を消失させた。
【図１３】Mach7構成的レンチウイルスベクターの詳細な全体像を示した図である。Mach7レンチウイルスベクターは、ヒトEF1αプロモーターを介してヒトRORγ(hRORγ)の発現を起こす。hEF1αプロモーターに対してアンチセンス方向に、ヒトPGKプロモーターはブラストサイジン耐性タンパク質の産生を起こす。この構築物に感染し、ブラストサイジンを用いて選択された標的細胞の大半はhRORγを発現する。
【図１４】ヒト好中球分化モデルにおけるヒトRORγの分化および発現を証明した画像である。NB4細胞をMach7-hRORγレンチウイルスに感染させ、hRORγを視覚化するために抗HA抗体で染色した(図14A、挿入図)。ブラストサイジン選択を生き延びたNB4細胞はhRORγ陽性であった。オールトランスレチノイン酸(ATRA)を用いて細胞をさらに分化させ、6日後に、スライドに載せてサイトスピンにかけ、ギムザ染色した(図14B〜14D)。さらに、分化した好中球の顕著な特徴であるニトロブルーテトラゾリウム還元能力について分化した細胞を試験するために、6日目の細胞をニトロブルーテトラゾリウムアッセイ(NBT)に供した。細胞をホルボール(phorbal)ミリステートアセテート(PMA)で30分間刺激し、その後にサイトスピンにかけ、4％パラホルムアルデヒドで固定した。正常分化についての論文において報告されたように、NBTが還元されることで約10％の細胞に黒色の沈殿物が生じた(図14D、挿入図)。
【図１５】例示的なヒトRORγ天然アミノ酸配列(図15A; SEQ ID NO:1. GenBank: CAG33717.1; NCBI ref. NP 005051.2; Swiss-Prot ref. P51449.2)および例示的なヒトRORγ cDNA核酸配列(図15B; SEQ ID NO:9. GenBank: CAG33717.1; NCBI ref.NM_005060.3)のリストである。
【図１６−１】Mach7レンチウイルスベクター核酸配列(SEQ ID NO:2)である。
【図１６−２】図１６−１の続きの図である。
【図１６−３】図１６−２の続きの図である。
【図１７】マウスRORC核酸配列(SEQ ID NO:3)である。
【図１８】マウスRORγアミノ酸配列(SEQ ID NO:4および5)である。SEQ ID NO:4は、死滅アッセイにおいて機能的結果を示したRORγロングアイソフォームに対応する。このアイソフォームは主に脂肪細胞および筋肉細胞において発現しており、驚いたことに、本発明における免疫細胞において活性があることが見出された。SEQ ID NO:5はRORγショートアイソフォームに対応し、死滅アッセイにおいて不活性であった。
【図１９−１】ヒトRORC(hRORC)核酸配列(SEQ ID NO:6)である。この配列は、hRORCの多くの可能性のある変種の図である。
【図１９−２】図１９−１の続きの図である。
【図１９−３】図１９−２の続きの図である。
【図１９−４】図１９−３の続きの図である。
【図１９−５】図１９−４の続きの図である。
【図１９−６】図１９−５の続きの図である。
【図２０−１】プラスミドpInducer21(pICEE-DESTとも知られる)の核酸配列(SEQ ID NO:7)である。
【図２０−２】図２０−１の続きの図である。
【図２０−３】図２０−２の続きの図である。
【図２１】プロモーターCD11B核酸配列(SEQ ID NO:8)である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
発明の詳細な説明
本発明は、腫瘍抑制における核受容体レチノイド関連オーファン受容体γ(RORγ)の役割の思いもよらない発見に関する。RORγタンパク質をコードするRORC遺伝子が導入および発現されると、自然免疫細胞内で、腫瘍細胞の認識および抑制を誘発する遺伝子活性化が起こる。従って、本明細書に記載の様々な態様において、本発明は、好中球特異的プロモーターの制御下で、RORγをコードする核酸配列を含むウイルスベクターを含む、組成物または細胞を包含する。さらに、本発明は、自然免疫細胞の抗腫瘍免疫を付与するか、または増大させる組成物を対象に投与することによって癌を処置する方法、対象において抗腫瘍免疫を提供するための方法、哺乳動物において細胞集団または組織に対する自然免疫応答を刺激する方法、および抗腫瘍免疫応答を診断する方法に関する。さらに、本発明は、上述の方法を実施するためのキットを包含する。
【００２９】
定義
特に定義のない限り、本明細書において用いられる技術用語および科学用語は全て、本発明が属する当業者に一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様のまたは等価な任意の方法および材料を、本発明を試験するための実施において使用することができるが、好ましい材料および方法を本明細書において説明する。本発明を説明および特許請求する際には以下の専門用語が用いられる。
【００３０】
本明細書において用いられる専門用語は特定の態様を説明することだけを目的とし、限定することを目的としないことも理解しなければならない。
【００３１】
本明細書において用いられる冠詞「1つの」および「ある」は、冠詞の文法上の目的語の1つまたは複数(すなわち、少なくとも1つ)を指すために用いられる。例として、「1つの要素」は1つの要素または複数の要素を意味する。
【００３２】
量、期間などの測定可能な値について言及している時に、本明細書において用いられる「約」という用語は、指定された値からの±20％または±10％、より好ましくは±5％、さらにより好ましくは±1％、なおより好ましくは±0.1％のばらつきが、開示された方法を実施するのに適しているので、このようなばらつきを包含することを意味する。
【００３３】
本明細書において用いられる「10％高い」とは、対照より少なくとも10％以上、例えば、20％、30％、40％、もしくは50％、60％、70％、80％、90％高い、またはそれより高い発現レベル、および/あるいは1.1倍、1.2倍、1.4倍、1.6倍、1.8倍、2.0倍高い、またはそれより高い発現レベル、ならびにその間の任意の、および全ての全増加分または部分的な増加分を指す。
【００３４】
本明細書において用いられる「対照」または「参照」という用語は同義に用いられ、比較の基準として用いられる値(例えば、健常対象におけるRORC発現レベル)を指す。
【００３５】
本明細書において用いられる「対象」または「患者」はヒトでも非ヒト哺乳動物でもよい。非ヒト哺乳動物には、例えば、家畜およびペット、例えば、ヒツジ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、およびマウス哺乳動物が含まれる。好ましくは、対象はヒトである。
【００３６】
本明細書において用いられる「変異」とは、天然状態からの変化をもたらすDNA配列中の変化である。変異は、少なくとも1つのデオキシリボ核酸塩基、例えば、プリン(アデニンおよび/もしくはチミン)ならびに/またはピリミジン(グアニンおよび/もしくはシトシン)の欠失および/または挿入および/または重複および/または置換を含んでもよい。変異は、生物(対象)の観察可能な特徴(表現型)の識別可能な変化を生じてもよく、生じなくてもよい。
【００３７】
本明細書において用いられる「免疫原性」という用語は、抗原またはエピトープなどの、ある特定の物質が哺乳動物の体内で免疫応答を誘発できることである。この免疫応答は体液性および/または細胞性でもよい。
【００３８】
本明細書において用いられる「活性化」という用語は、目に見えて分かる生化学的変化または形態学的変化を誘導するのに十分な細胞表面部分連結が起こった後の細胞の状態を指す。免疫細胞の文脈では、活性化は白血球および他の免疫細胞の移行である。T細胞の文脈では、このような活性化は、細胞増殖を誘導するように十分に刺激されているT細胞の状態を指す。T細胞の活性化はまた、サイトカイン産生および調節性または細胞溶解性のエフェクター機能の遂行を誘導することもある。他の細胞の文脈では、この用語は、特定の物理化学的プロセスのアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを意味する。
【００３９】
本明細書において用いられる「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は同義に用いられ、ペプチド結合で共有結合したアミノ酸残基で構成される化合物を指す。タンパク質またはペプチドは少なくとも2つのアミノ酸を含有しなくてはならず、タンパク質配列またはペプチド配列を構成することができるアミノ酸の最大数に制限は設けられない。ポリペプチドは、ペプチド結合によって互いにつながっている2つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質を含む。本明細書において用いられる、この用語は、当技術分野において、例えば、一般的にペプチド、オリゴペプチド、およびオリゴマーとも呼ばれる短い鎖と、当技術分野において一般的にタンパク質と呼ばれる長い鎖の両方を指す。タンパク質の中には多くのタイプがある。「ポリペプチド」には、例えば、特に、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチド変種、修飾されたポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が含まれる。ポリペプチドには、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、またはその組み合わせが含まれる。
【００４０】
本発明の文脈において、よく現れる核酸塩基については以下の略語が用いられる。「A」はアデノシンを指す。「C」はシトシンを指す。「G」はグアノシンを指す。「T」はチミジンを指す。「U」はウリジンを指す。
【００４１】
本明細書において用いられる「RNA」という用語はリボ核酸と定義される。
【００４２】
本明細書において用いられる「免疫療法剤」という用語は、患者の免疫系を調整する任意の薬剤を含むことを意味する。「免疫療法」とは、患者の免疫系を変える処置を指す。
【００４３】
本明細書において用いられる「治療」という用語は処置および/または予防を意味する。治療効果は、疾患状態の抑制、軽快、または根絶によって得られる。
【００４４】
「処置」という用語は、本発明の文脈において用いられる時には、疾患または障害に対する治療的処置ならびに予防的または抑制的な措置を含むことを意味する。従って、例えば、処置という用語は、疾患または障害が発症する前または発症した後に薬剤を投与し、それによって、疾患または障害の全徴候を阻止する、または取り除くことを含む。別の例として、疾患が臨床的に発現した後に疾患の症状と闘うための薬剤の投与は、疾患の「処置」を含む。これは癌の予防を含む。
【００４５】
「生物学的試料」という用語は、生物または生物の成分(例えば、細胞)から得られた試料を指す。試料は、任意の生物学的な組織または液体の試料でもよい。しばしば、試料は、患者から得られた試料である「臨床試料」である。このような試料には、骨髄、心臓組織、痰、血液、リンパ液、血球(例えば、白血球)、組織もしくは細針生検試料、尿、腹水、および胸膜液、またはこれらに由来する細胞が含まれるが、これに限定されない。生物学的試料はまた、組織学的な目的で採取した組織切片、例えば、凍結切片を含んでもよい。
【００４６】
「RORγ」は、RORC遺伝子によってコードされるレチノイド(RAR)関連オーファン受容体γタンパク質アミノ酸配列を指す。RORγは、転写因子の核受容体ファミリーのメンバーである。これらのタンパク質は、胚発生中に、および成人において起こる多くの生理学的プロセスの重要な制御因子として機能する。場合によっては、「RORγ」および「RORC」という用語が同義に用いられる。「RORγ」という用語は、RORγ遺伝子核酸配列を指すのに用いられる場合がある。RORγ核酸配列はまた本明細書において「RORC」と呼ばれることもある。
【００４７】
「マウスRORγタンパク質」とは、SEQ.ID.NO.4(アイソフォーム1)またはSEQ.ID.NO.5(RORγ-tもしくはアイソフォーム2)、あるいはRORγの生物学的な機能または活性を有するそれらの断片と少なくとも約85％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを意味する。RORγの生物学的な機能または活性の例には、転写因子活性、ならびに胚発生中に、および成人において起こる生理学的プロセスの調節が含まれるが、これに限定されない。
【００４８】
「マウスRORγポリヌクレオチド」とは、マウスRORγタンパク質をコードする核酸配列を意味する。例示的なマウスRORγポリヌクレオチド配列はSEQ.ID.NO.3に示される。
【００４９】
「ヒトRORγタンパク質」とは、NCBI参照番号NP 005051.2(SEQ.ID.NO.1)またはNCBI参照番号NP001001523、あるいはRORγの生物学的な機能または活性を有するそれらの断片と少なくとも約85％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを意味する。RORγの生物学的な機能または活性の例には、転写因子活性、ならびに胚発生中に、および成人において起こる生理学的プロセスの調節が含まれるが、これに限定されない。
【００５０】
「ヒトRORγポリヌクレオチド」とは、マウスRORγタンパク質をコードする核酸配列を意味する。例示的なヒトRORγポリヌクレオチド配列はSEQ.ID.NO.9に示される。
【００５１】
「宿主」は、この用語が本明細書において用いられる時には、遺伝子操作することができる原核生物または真核生物を含む。このような宿主の例は、Maniatis et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012)において見られる。「宿主」、「宿主細胞」、「宿主系」、および「発現宿主」という用語は本明細書において同義に用いられる。
【００５２】
「認識配列」という用語は、制限エンドヌクレアーゼ、修飾メチラーゼ、およびリコンビナーゼを含む、タンパク質、DNA分子、またはRNA分子によって認識される(タンパク質、DNA分子、またはRNA分子が結合する)特定のDNA配列を指す。例えば、Creリコンビナーゼの認識配列は、8塩基対コア配列に隣接する2つの13塩基対逆方向反復(リコンビナーゼ結合部位として役立つ)で構成される34塩基対配列のloxPである。Sauer, B., Current Opinion in Biotechnology 5:521-527 (1994)の図1を参照されたい。認識配列の他の例は、バクテリオファージλのインテグラーゼによって認識される、attB、attP、attL、およびattR配列である。attBは、2つの9塩基対コアタイプInt結合部位と、1つの7塩基対重複領域を含有する約25塩基対配列である。attPは、コアタイプInt結合部位およびアームタイプInt結合部位と補助タンパク質IHF、FIS、およびXisのための部位を含有する約240塩基対配列である。Landy, Current Opinion in Biotechnology 3:699-707 (1993)を参照されたい。このような部位はまた、方法および産物を強化するために本発明に従って操作もされる。
【００５３】
「リコンビナーゼ」という用語は、特定の組換え部位におけるDNAセグメントの交換を触媒する酵素を指す。
【００５４】
本明細書において用いられる「外因性」という用語は、生物、細胞、組織、もしくは系から導入された任意の材料、または生物、細胞、組織、もしくは系の外で産生された任意の材料を指す。
【００５５】
本明細書において用いられる「発現」という用語は、プロモーターによって引き起こされる特定のヌクレオチド配列の転写および/または翻訳と定義される。
【００５６】
「ベクター」とは、単離された核酸を含み、単離された核酸を細胞内部に送達するのに使用することができる組成物である。直鎖ポリヌクレオチド、イオン性化合物または両親媒性化合物と結合したポリヌクレオチド、プラスミド、およびウイルスを含むが、これに限定されない非常に多くのベクターが当技術分野において公知である。従って、「ベクター」という用語は、自己複製プラスミドまたはウイルスを含む。この用語はまた、細胞への核酸の移入を容易にする非プラスミド化合物および非ウイルス化合物、例えば、ポリリジン化合物、リポソームなどを含むとも解釈されるはずである。ウイルスベクターの例には、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが含まれるが、これに限定されない。
【００５７】
「発現ベクター」とは、発現させようとするヌクレオチド配列に機能的に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現に十分なシス作用エレメントを含む。発現のための他のエレメントは宿主細胞によって供給されてもよく、インビトロ発現系内に入れて供給されてもよい。発現ベクターには、組換えポリヌクレオチドを組み込む、当技術分野において公知の発現ベクターの全て、例えば、コスミド、プラスミド(例えば、裸のプラスミド、またはリポソームの中に含まれるプラスミド)ならびにウイルス(例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス)が含まれる。
【００５８】
本明細書において用いられる「レンチウイルス」とは、レトロウイルス科の属の1つを指す。レンチウイルスは、非分裂細胞を感染させることができるという点でレトロウイルスの中でユニークである。レンチウイルスは、十分な量の遺伝情報を宿主細胞DNAに送達することができるので、最も効率的な遺伝子送達ベクター方法の1つである。HIV、SIV、およびFIVは全てレンチウイルスの例である。レンチウイルスに由来するベクターは、インビボおよびエクスビボで、かなりのレベルの遺伝子移入を成し遂げる手段を提供する。
【００５９】
「等価な」という用語は、ヌクレオチド配列に関して用いられる時には、機能的に等価なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を指すことが理解される。等価なヌクレオチド配列は、1つまたは複数のヌクレオチド置換、付加、または欠失だけが異なる配列、例えば、対立遺伝子変種を含み、従って、遺伝暗号の縮重のために本明細書に記載の核酸のヌクレオチド配列と異なる配列を含む。
【００６０】
「ハイブリダイゼーション」とは、核酸鎖が塩基対合によって相補鎖と結合する任意のプロセスを指す。二本の一本鎖核酸が二本鎖二重鎖を形成する時に「ハイブリダイズ」する。二本鎖領域は、一本鎖核酸の一方もしくは両方の完全長、または一方の一本鎖核酸の全てと他方の一本鎖核酸の部分配列を含んでもよく、二本鎖領域は各核酸の部分配列を含んでもよい。ハイブリダイゼーションはまた、二本の鎖が二本鎖らせんを形成しているままであれば、ある特定のミスマッチを含む二重鎖を形成することも含む。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、本質的に特異的なハイブリダイゼーションをもたらすハイブリダイゼーション条件を指す。プローブとテンプレート核酸の標的部位の「特異的ハイブリダイゼーション」という用語は、ハイブリダイゼーションシグナルをはっきりと解読することができるように、プローブが主に標的とハイブリダイズすることを指す。さらに本明細書において説明するように、特異的ハイブリダイゼーションをもたらす、このような条件は、相同性領域の長さ、領域のGC含有率、ハイブリッドの融解温度「Tm」に応じて変化する。従って、ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション溶液および洗浄液の塩含有率、酸性度、および温度の点で異なる。
【００６１】
DNAまたはRNAなどの核酸に関して本明細書において用いられる「単離された」という用語は、それぞれ、天然の高分子供給源に存在する他のDNAまたはRNAから分離された分子を指す。本明細書において用いられる、単離された、という用語はまた、組換えDNA法によって生成された時には細胞材料、ウイルス材料、もしくは培養培地を実質的に含まない核酸またはペプチド、または化学合成された時には化学前駆体もしくは他の化学物質も指す。さらに、「単離された核酸」とは、断片として天然には存在せず、天然状態で見出されないと思われる核酸断片を含むことを意味する。「単離された」という用語はまた、他の細胞タンパク質から単離されたポリペプチドも指すために本明細書において用いられ、精製されたポリペプチドおよび組換えポリペプチドの両方を包含することを意味する。「単離された細胞」または「単離された細胞集団」とは、天然環境には存在しない細胞または細胞集団である。
【００６２】
本明細書において用いられる「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸(DNA)、適宜、リボ核酸(RNA)などのポリヌクレオチドを指す。この用語はまた、等価物として、ヌクレオチド類似体から作られたRNAまたはDNAの類似体と、説明されている態様に当てはまる時には一本鎖(センスまたはアンチセンス)ポリヌクレオチドおよび二本鎖ポリヌクレオチドを含むことも理解されるはずである。EST、染色体、cDNA、mRNA、およびrRNAは、核酸と言及される可能性のある分子の代表例である。
【００６３】
「実質的に同一の」または「実質的に相同の」とは、参照アミノ酸配列(例えば、本明細書に記載のアミノ酸配列のいずれか1つ)または参照核酸配列(例えば、本明細書に記載の核酸配列のいずれか1つ)に対して少なくとも60％の同一性を示すポリペプチドまたは核酸分子を意味する。好ましくは、このような配列は、アミノ酸レベルまたは核酸において、比較のために用いられる配列と少なくとも70％、より好ましくは80％または85％、より好ましくは90％、95％、またはさらには99％同一である。「パーセント同一性」または「パーセント相同性」は本明細書において同義に用いられる。
【００６４】
配列同一性は、典型的には、配列分析ソフトウェア(例えば、Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705のSequence Analysis Software Package、BLAST、BESTFIT、GAP、またはPILEUP/PRETTYBOXプログラム)を用いて測定される。このようなソフトウェアは、様々な置換、欠失、および/または他の修飾に対する相同性の程度を割り当てることによって同一配列または類似配列を突き合わせる。保存的置換は、典型的には、以下の各グループ:グリシン、アラニン;バリン、イソロイシン、ロイシン;アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン;セリン、スレオニン;リジン、アルギニン;およびフェニルアラニン、チロシンの中での置換を含む。同一性の程度を確かめる例示的なアプローチでは、近縁関係にある配列を示すe-3〜e-100の確率(probability)スコアを用いてBLASTプログラムが用いられることがある。
【００６５】
本明細書において用いられる「プロモーター」という用語は、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始するのに必要な、細胞の合成機構、または導入された合成機構によって認識されるDNA配列と定義される。
【００６６】
本明細書において用いられる「プロモーター/制御配列」という用語は、プロモーター/制御配列に機能的に連結された遺伝子産物の発現に必要な核酸配列を意味する。場合によっては、この配列はコアプロモーター配列でもよく、他の場合では、この配列は、遺伝子産物の発現に必要な、エンハンサー配列および他の調節エレメントも含んでもよい。プロモーター/制御配列は、例えば、組織特異的に遺伝子産物を発現させるプロモーター/制御配列でもよい。
【００６７】
「構成的」プロモーターは、遺伝子産物をコードまたは指定するポリヌクレオチドと一緒に機能的に連結された時に、細胞のほとんどの、または全ての生理学的条件下で、その遺伝子産物を細胞内で産生させるヌクレオチド配列である。
【００６８】
「誘導性」プロモーターは、遺伝子産物をコードまたは指定するポリヌクレオチドと一緒に機能的に連結された時に、実質的に、プロモーターに対応する誘導物質が細胞に存在する場合にだけ、その遺伝子産物を細胞内で産生させるヌクレオチド配列である。
【００６９】
「組織特異的」プロモーターは、遺伝子産物をコードまたは指定するポリヌクレオチドと一緒に機能的に連結された時に、実質的に、細胞が、プロモーターに対応する組織タイプの細胞の場合にだけ、その遺伝子産物を細胞内で産生させるヌクレオチド配列である。
【００７０】
「好中球特異的プロモーター」とは、遺伝子産物をコードまたは指定するポリヌクレオチドと一緒に機能的に連結された時に、好中球または好中球に分化するように拘束された細胞において遺伝子産物の発現を起こすことができるヌクレオチド配列である。一部の態様において、RORγの発現は好中球特異的プロモーターの制御下にある。他の一部の態様において、好中球特異的プロモーターは、実質的に、細胞が、好中球または好中球に分化するように拘束された細胞の場合にだけ、その遺伝子産物を細胞内で産生させる。好中球特異的プロモーターの例には、インテグリンαプロモーターCD11B(図21、SEQ ID NO:8; Shelley and Arnaout, Proc Natl Acad Sci U S A. 1991; 88(23): 10525-9を参照されたい)またはαデフェンシンプロモーターDEFA1、DEFA2、DEFA3、およびDEFA4が含まれるが、これに限定されない。
【００７１】
「幹細胞」は、望ましい細胞タイプに分化することができる細胞を指す。幹細胞には、胚性幹(ES)細胞;成人幹細胞;および体性幹細胞、例えば、拘束されていない中胚葉に由来するSP細胞が含まれる。「全能性」幹細胞は、中胚葉、内胚葉、および外胚葉の細胞を含む全ての組織タイプに分化することができる。「多分化能性」または「多能性」の幹細胞は、いくつかの運命のうちの少なくとも2つに分化することができる細胞である。
【００７２】
「変種」という用語は、ポリヌクレオチド配列の文脈において用いられる時には、遺伝子またはそのコード配列の変種に関連するポリヌクレオチド配列を包含することがある。この定義はまた、例えば、「対立遺伝子」、「スプライス」、「種」、または「多型」変種も含むことがある。これらのポリペプチドには、一般的に、互いに対して有意なアミノ酸同一性がある。多型変種は、ある特定の種の個体間にある、特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列の変化である。多型変種は、ポリヌクレオチド配列が1塩基だけ異なる「一塩基多型」(SNP)を包含することがある。SNPの存在は、例えば、ある特定の集団、疾患状態、または疾患状態の性質を示すことがある。
【００７３】
本明細書において用いられる「癌」という用語は、癌腫、肉腫を含むが、これに限定されない任意の悪性腫瘍を含む。癌は、細胞が制御されずに、および/または異常に分裂し、次いで、周囲組織に侵入し、破壊することから生じる。本明細書において用いられる「増殖する」および「増殖」とは、有糸分裂している細胞を指す。本明細書において用いられる「転移」とは、原発部位から悪性腫瘍が離れて拡散することを指す。癌細胞は血流を通って、リンパ系を通って、体腔を通過して、またはその任意の組み合わせで転移してもよい。
【００７４】
「癌腫」という用語は、周囲組織に浸潤し、転移を生じる傾向がある、上皮細胞で構成されている悪性の新たな成長を指す。
【００７５】
「寛解させる」または「処置する」という用語は、実施した行為の結果として、癌またはメラノーマに関連する臨床徴候および/または症状が和らげられることを意味する。モニタリングされる徴候または症状は、特定の癌またはメラノーマに特有のものであり、熟練した臨床家に周知であり、同様に、徴候および状態をモニタリングするための方法も熟練した臨床家に周知である。例えば、熟練した臨床家は、特定の腫瘍に通常用いられる画像診断法を用いて(例えば、腫瘍をモニタリングするために超音波または磁気共鳴画像(MRI)を用いて)、腫瘍のサイズまたは成長速度をモニタリングできることを知っている。
【００７６】
本明細書において用いられる「抗腫瘍効果」という用語は、例えば、腫瘍量の減少、腫瘍細胞数の減少、転移数の減少、平均余命の延長、腫瘍細胞増殖の減少、腫瘍細胞生存率の減少、または癌状態に関連する様々な生理学的症状の寛解を含むが、これに限定されない様々な手段によって明らかにすることができる生物学的効果を指す。「抗腫瘍効果」はまた、最初の場所での腫瘍発生の阻止における本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、細胞、および抗体の能力によっても明らかにすることができる。
【００７７】
本明細書において用いられる「異種移植片」という用語は、ある種のドナーから採取し、別の種のレシピエントに移植した組織の移植片を指す。
【００７８】
説明
本発明は、腫瘍抑制における核受容体レチノイド関連オーファン受容体γ(RORγ)の役割の発見に関する。RORγが発現されると、自然免疫細胞内で、腫瘍細胞の認識および抑制を誘発する遺伝子活性化が起こる。
【００７９】
組成物
本発明は、細胞において核受容体レチノイド関連オーファン受容体γ(RORγ)またはその生物学的に機能する断片の発現を誘発する組成物を提供する。当技術分野において理解されるように、生物学的に機能する断片は、完全長配列の生物学的機能を保持する完全長配列の一部である。
【００８０】
一態様において、前記組成物は、ヒトRORγ(SEQ ID NO:6を有するRORC遺伝子(図19); SEQ ID NO:9を有するRORC cDNA(図15))、またはその生物学的に機能する断片をコードする配列を含む、単離された核酸を含む。一態様において、前記核酸は、マウスRORγをコードする配列(SEQ ID NO:3)またはその生物学的に機能する断片をコードする配列を含む。RORγをコードする単離された核酸配列は、当技術分野において公知の様々な組換え方法を用いて、例えば、標準的な技法を用いて、前記遺伝子を発現する細胞に由来するライブラリーをスクリーニングすることによって、前記遺伝子を含むことが分かっているベクターから前記遺伝子を得ることによって、または前記遺伝子を含有する細胞および組織から直接単離することによって入手することができる。または、RORC遺伝子はクローニングではなく合成によって生成することができる。さらに、内因性RORC遺伝子座は、発現レベルおよび/もしくは発現のタイミングを変えるように、ならびに/またはRORCもしくはRORC断片の活性を変えるように哺乳動物細胞において改変されてもよい。
【００８１】
別の態様において、前記組成物は、RORγをコードする、もしくは改変されたRORγをコードする(例えば、融合タンパク質をコードする)、またはRORγ遺伝子標的の1つをコードする、インビトロで生成された組換えRNA、または原核細胞もしくは真核細胞から抽出された組換えRNAを含む。
【００８２】
さらに、本発明は、本明細書において開示されたペプチドとかなりの相同性をもつペプチドをコードする単離された核酸を包含する。好ましくは、本発明のペプチドをコードする単離された核酸のヌクレオチド配列は、本発明のペプチドをコードする単離された核酸のヌクレオチド配列と「実質的に相同」である、すなわち、約60％相同、より好ましくは約70％相同、さらにより好ましくは約80％相同、より好ましくは約90％相同、さらにより好ましくは約95％相同、さらにより好ましくは約99％相同である。
【００８３】
一態様において、前記組成物は、ヒトRORγ(SEQ ID NO:1)またはその生物学的に機能する断片に対応する単離されたアミノ酸を含む。ある特定の態様において、RORγの生物学的に機能する断片は、完全長RORγの機能を保持しているペプチドを含む。一態様において、前記アミノ酸はマウスRORγ(SEQ ID NO:4および5)またはその生物学的に機能する断片を含む。
【００８４】
一態様において、RORγ発現の下流標的の発現を増強または阻害するために、RORγ(ヒトまたはマウスのいずれかに由来する、SEQ ID NO:1、4、および5(図15; 図18))はN末端またはC末端を介してアクチベーター(例えば、HSV VP16ドメイン)またはリプレッサー(例えば、KRABドメイン)と融合される。例えば、スカベンジャー受容体の発現を増強するためにRORγ-VP16融合タンパク質が利用され、結果として、改変された免疫細胞の癌細胞へのさらに強力なホーミングおよび結合応答を誘導する。別の例は、RORγの核内移行と、その後のRORγ標的遺伝子の上流にある認識部位との結合を増強するために核局在化シグナル(nls)とRORγを融合することであろう。スカベンジャー受容体の発現を増強するためにRORγ-nls融合タンパク質が利用され、結果として、改変された免疫細胞の癌細胞へのさらに強力なホーミングおよび結合応答を誘導する。
【００８５】
さらなる態様において、標的プロモーターへのRORγ標的化および/もしくは結合を増大させる可能性のある変異、または標的プロモーターへのRORγ標的化および/もしくは結合を増大させない可能性のある変異も考慮されてもよい。
【００８６】
別の態様において、特注のDNA結合タンパク質を用いることによってRORγの特異的標的の発現が増強または抑制される。非限定的な例には、特異的なgRNAまたはgRNAセットと結び付けられた、エンドヌクレアーゼ活性および/またはニッキング活性が失われるように変異された、ジンクフィンガータンパク質、Tal様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、およびCas9が含まれる。改変されたDNA結合タンパク質は免疫幹細胞に導入され、特異的な遺伝子発現を活性化する。例えば、改変されたCas9は、RORγスカベンジャー受容体標的と推定されるScar2の発現を誘導するのに用いられるだろう。または、改変されたCas9タンパク質は、推定RORγ受容体標的であるCD148を抑制するのに用いられるだろう。さらに、自然免疫系細胞に、hRORγ cDNAを有する遺伝子断片を導入するために、ゲノムを改変する能力をもつ、あらゆるバージョンのDNA結合タンパク質を使用することができる。これには、様々なバージョンの相同組換えの1つを介した、hRORγ遺伝子座のゲノム改変、またはhRORγの上流もしくは下流にあるゲノムDNAの改変が関与するだろう。さらに、内因性hRORγ遺伝子座を改変するために、短い、例えば、1kbpより小さい、天然の、または化学修飾されたオリゴヌクレオチドを使用できるかもしれない。または、相同組換えまたは同様の現象が起こる様々な手段によって、RORC遺伝子座またはRORC遺伝子座の上流活性もしくは下流活性を改変する意図を持って、大きな、例えば、1kbp以上のゲノムクローンが導入されてもよい。
【００８７】
本発明はまた、本発明の単離された核酸が挿入されたベクターも含む。当技術分野には、本発明において有用な適切なベクターが十分にある。簡潔に要約すると、RORγをコードする天然核酸または合成核酸の発現は、典型的には、RORγまたはその一部をコードする核酸をプロモーターに機能的に連結し、この構築物を発現ベクターに組み入れることによって成し遂げられる。使用しようとするベクターは真核細胞における複製、任意で、組込みに適している。典型的なベクターは、望ましい核酸配列の発現調節に有用な転写ターミネーターおよび翻訳ターミネーター、開始配列、ならびにプロモーターを含有する。本発明のベクターはまた核酸の標準的な遺伝子送達プロトコールにも使用することができる。遺伝子送達のための方法は当技術分野において公知である。例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,399,346号、同第5,580,859号、同第5,589,466号を参照されたい。
【００８８】
本発明の単離された核酸は多数のタイプのベクターに入れてクローニングすることができる。例えば、前記核酸は、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、およびコスミドを含むが、これに限定されないベクターに入れてクローニングすることができる。特に関心があるベクターには、発現ベクター、複製ベクター、プローブ作製ベクター、およびシークエンシングベクターが含まれる。
【００８９】
さらに、ベクターはウイルスベクターの形で細胞に供給されてもよい。ウイルスベクター技術は当技術分野において周知であり、例えば、Sambrook et al.(4th Edition, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 2012)ならびに他のウイルス学マニュアルおよび分子生物学マニュアルに記載されている。ウイルスはベクターとして有用であり、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、シンドビスウイルス、ガンマレトロウイルス、およびレンチウイルスを含むが、これに限定されない。一般的に、適切なベクターは、少なくとも1種類の生物において機能する複製起点、プロモーター配列、便利な制限エンドヌクレアーゼ部位、ならびに1種類または複数種の選択マーカー(例えば、WO01/96584;WO01/29058;および米国特許第6,326,193号)を含有する。
【００９０】
哺乳動物細胞に遺伝子移入するために多数のウイルスに基づく系が開発されている。例えば、レトロウイルスは遺伝子送達系のための便利なプラットフォームを提供する。当技術分野において公知の技法を用いて、選択された遺伝子をベクターに挿入し、レトロウイルス粒子の中に入れることができる。次いで、組換えウイルスを単離し、インビボまたはエクスビボのいずれかで対象の細胞に送達することができる。多数のレトロウイルス系が当技術分野において公知である。一部の態様において、アデノウイルスベクターが用いられる。多数のアデノウイルスベクターが当技術分野において公知である。一態様において、レンチウイルスベクターが用いられる。例えば、レンチウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクターは、トランスジーンを娘細胞に長期間、安定して組込み、増殖させることができるので長期遺伝子移入を成し遂げるのに適切なツールである(例えば、pInducer21、SEQ ID NO:7、Meerbrey et al., PNAS Vol.108:9; 3665-3670, 2011)。レンチウイルスベクターには、肝細胞などの非増殖細胞に形質導入を生じさせることができる点で、マウス白血病ウイルスなどのオンコレトロウイルスに由来するベクターを上回る付加的な利点がある。レンチウイルスベクターにはまた、免疫原性が低いという付加的な利点がある。別の態様において、前記組成物は、アデノ随伴ウイルス(AAV)に由来するベクターを含む。
【００９１】
一部の態様において、本発明のベクターはまた、本発明によって作製されたプラスミドベクターでトランスフェクトされた細胞または本発明によって作製されたウイルスに感染した細胞において、トランスジーンが転写、翻訳、および/または発現されるようにトランスジーンに機能的に連結された従来の制御エレメントも含む。本明細書において用いられる「機能的に連結された」配列は、関心対象の遺伝子に隣接する発現制御配列と、トランスで、すなわち関心対象の遺伝子を制御するために、ある距離をおいて働く発現制御配列を両方とも含む。発現制御配列には、適切な転写開始配列、終結配列、プロモーター配列、およびエンハンサー配列;効率的なRNAプロセシングシグナル、例えば、スプライシングシグナルおよびポリアデニル化(ポリA)シグナル;細胞質mRNAを安定化する配列;翻訳効率を高める配列(すなわち、コザックコンセンサス配列);タンパク質安定性を高める配列;ならびに望ましい時には、コードされる産物の分泌を高める配列が含まれる。天然プロモーター、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、および/または組織特異的プロモーターを含む、かなりの数の発現制御配列が当技術分野において公知であり、利用することができる。
【００９２】
一態様において、関心対象の幹細胞(例えば、リンパ球系列の自然免疫細胞)において発現を起こすために、リンパ系特異的プロモーターまたは任意のリンパ系に偏ったプロモーターが用いられる。別の態様において、関心対象の幹細胞においてRORγトランスジーンの発現を起こすために、骨髄系特異的プロモーターまたは任意の骨髄系に偏ったプロモーターが用いられる。関心対象のトランスフェクト細胞がどういったものかは本明細書において下記で詳細に説明される。特定の態様において、プロモーターは、インテグリンαプロモーターCD11B(図21、SEQ ID NO:8; Shelley and Arnaout, Proc Natl Acad Sci U S A. 1991; 88(23): 10525-9を参照されたい)またはαデフェンシンプロモーターDEFA1、DEFA2、DEFA3、およびDEFA4などがあるが、これらに限定されない好中球特異的プロモーターである。
【００９３】
一態様において、関心対象の幹細胞が完全に分化するまでRORγの発現は抑制される。別の態様において、幹細胞が好中球、マクロファージ、またはナチュラルキラー細胞に分化するにつれて、RORγトランスジーンの発現が誘導される。
【００９４】
さらなる態様において、RORγが自動誘導されることで、トランスジーンが患者に送達される前にエクスビボで分化してトランスジーンが誘導されるか、または改変された幹細胞が患者に移入された後に、自然分化もしくは人工的に誘導される分化によってRORγタンパク質が産生される。
【００９５】
場合によっては、関心対象の遺伝子、関心対象のポリペプチド(例えば、RORγ)またはその一部の発現を評価するために、細胞に導入される発現ベクターは、トランスフェクションまたはウイルスベクターによる感染が求められている細胞の集団から発現細胞を特定および選択するのを容易にする選択マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子のいずれか、またはその両方も含有してもよい。他の局面において、選択マーカーは別々のDNA断片に乗せて運ばれてもよく、コトランスフェクション手順において用いられてもよい。選択マーカーおよびレポーター遺伝子は両方とも、宿主細胞における発現を可能にするために適切な制御配列に隣接されてもよい。有用な選択マーカーには、例えば、抗生物質耐性遺伝子、例えば、neoなどが含まれる。
【００９６】
トランスフェクトされた可能性のある細胞を特定するために、および制御配列の機能を評価するためにレポーター遺伝子が用いられる。一般的に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物または組織に存在せず、レシピエント生物または組織によって発現されず、発現が、何らかの容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性によって明らかにされるポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、DNAがレシピエント細胞に導入された後に適切な時間でアッセイされる。適切なレポーター遺伝子には、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、または緑色蛍光タンパク質遺伝子(例えば、Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82)が含まれ得る。適切な発現系は当技術分野において周知であり、公知の技法を用いて調製されてもよく、商業的に購入されてもよい。一般的に、最高レベルのレポーター遺伝子発現を示す最小5'隣接領域をもつ構築物がプロモーターとして同定される。このようなプロモーター領域はレポーター遺伝子に連結され、プロモーターによって引き起こされる転写を調整する能力について薬剤を評価するのに用いられてもよい。
【００９７】
遺伝子を細胞に導入する方法または遺伝子を発現させる方法も当技術分野において周知である。発現ベクターの状況では、このベクターを、当技術分野において任意の方法によって宿主細胞、例えば、哺乳動物細胞、細菌細胞、酵母細胞、または昆虫細胞に容易に導入することができる。例えば、発現ベクターを物理的手段、化学的手段、または生物学的手段によって宿主細胞に導入することができる。
【００９８】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための物理的方法には、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微粒子銃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが含まれる。ベクターおよび/または外因性核酸を含む細胞を生成するための方法は当技術分野において周知である。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, volumes 1-3 (4th edition, Cold Spring Harbor Press, NY 2012)を参照されたい。
【００９９】
関心対象のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための生物学的方法には、DNAベクターおよびRNAベクターの使用が含まれる。ウイルスベクター、特に、レトロウイルスベクターは、遺伝子を哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞に挿入するための最も広く用いられる方法になっている。レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスI、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスなどから他のウイルスベクターを得ることができる。例えば、米国特許第5,350,674号および同第5,585,362号を参照されたい。
【０１００】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための化学的手段には、コロイド分散系、例えば、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質に基づく系が含まれる。インビトロおよびインビボで送達ビヒクルとして使用するための例示的なコロイド系はリポソーム(例えば、人工膜小胞)である。
【０１０１】
非ウイルス送達系が利用される場合、例示的な送達ビヒクルはリポソームである。(インビトロ、エクスビボ、またはインビボで)核酸を宿主細胞に導入するために脂質製剤の使用が考えられる。別の局面において、核酸は脂質と結合されてもよい。脂質と結合した核酸はリポソームの水性内部の中に入れられてもよく、リポソームの脂質二重層の中に分散していてもよく、リポソームとオリゴヌクレオチドの両方に結合する連結分子を介してリポソームに結合されてもよく、リポソームの中に封入されてもよく、リポソームと複合体化されてもよく、脂質を含有する溶液中に分散されてもよく、脂質と混合されてもよく、脂質と組み合わされてもよく、脂質に溶解した懸濁液として含まれてもよく、ミセルと一緒に含まれてもよく、ミセルと複合体化されてもよく、別の方法で脂質と結合されてもよい。脂質、脂質/DNA、または脂質/発現ベクターに関連する組成物は、溶解状態で任意の特定の構造に限定されない。例えば、これらは、二重層構造で、ミセルとして、または「崩壊した(collapsed)」構造を伴って存在してもよい。これらはまた、単に、溶液中に分散しているだけでもよく、おそらく、サイズまたは形状が均一でない凝集物を形成している。脂質は、天然脂質でも合成脂質でもよい脂肪物質である。例えば、脂質は、細胞質内で天然に生じる脂肪液滴、ならびに長鎖脂肪族炭化水素およびその誘導体、例えば、脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、およびアルデヒドを含有する化合物クラスを含む。
【０１０２】
使用に適した脂質は商業的供給業者から入手することができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン(「DMPC」)はSigma, St. Louis, MOから入手することができる。リン酸ジセチル(「DCP」)はK & K Laboratories(Plainview, NY)から入手することができる。コレステロール(「Choi」)はCalbiochem-Behringから入手することができる。ジミリスチルホスファチジルグリセロール(「DMPG」)および他の脂質はAvanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, AL.)から得られる場合がある。クロロホルムまたはクロロホルム/メタノールに溶解した脂質の原液は約-20℃で保管することができる。クロロホルムはメタノールより容易に蒸発するので、唯一の溶媒として用いられる。「リポソーム」は、閉じられた脂質二重層または凝集物を作製することで形成された様々な単一膜および多重膜の脂質ビヒクルを含む総称的な用語である。リポソームは、リン脂質二重層膜と内部水性媒体を有する小胞構造をもつと特徴付けることができる。多重膜リポソームには、水性媒体によって分けられた複数の脂質層がある。リン脂質が過剰量の水溶液に懸濁されると、多重膜リポソームは自発的に形成する。脂質成分は自己再編成した後に、閉じた構造が形成され、脂質二重層の間に水と、溶解した溶質が閉じ込められる(Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10)。しかしながら、溶解状態で、通常の小胞構造とは異なる構造を有する組成物も包含される。例えば、脂質はミセル構造をとってもよく、単に、不均一な脂質分子凝集物として存在してもよい。リポフェクタミン-核酸複合体も意図される。
【０１０３】
他の場合では、RORγは、リン酸カルシウムトランスフェクション、ナノ粒子、タンパク質とコンジュゲートしたDNA、ペプチドまたはペプチド核酸とコンジュゲートしたDNA、ペプチドまたはタンパク質が、RORγをコードするDNAと相互作用するか、または直接コンジュゲートされているタンパク質形質導入(例えば、TATまたはポリ-アルギニンペプチド)を介して送達される。
【０１０４】
細胞
一態様において、幹細胞株が本発明において用いられる。別の態様において、幹細胞株はRORγを用いて改変されてもよく、RORγ標的遺伝子(またはそのホモログ)の発現レベルを変えるように改変されてもよい。
【０１０５】
一態様において、幹細胞株は、細胞の自然免疫細胞ファミリーに属する。このような細胞の非限定的な例は、好中球、好酸球、好塩基球、マクロファージ、樹状細胞、マスト細胞、マスト細胞、一部のB細胞(B1細胞)、および一部のT細胞(例えば、ナチュラルキラーT細胞)である。
【０１０６】
さらに別の態様において、免疫細胞を体外で分化させるか、または宿主内で、例えば、ナチュラルキラー細胞まで分化させる。
【０１０７】
さらなる態様において、インビトロまたはインビボで分化を完了した免疫細胞が無関係の免疫細胞タイプから一段階または複数の段階で得られる。例えば、人工多能性幹(iPS)細胞を、患者から、または複数の患者のドナー材料として機能することが意図される細胞から分化させることができる。これらのiPS細胞またはiPS由来細胞を、RORγまたは下流RORγ標的遺伝子を発現するように改変し、次いで、患者に送達する。他の例には、一段階または複数の段階で骨髄系前駆体または成熟骨髄系細胞に分化転換される可能性がある細胞が含まれる。
【０１０８】
骨髄系前駆細胞の供給源
骨髄系前駆細胞は、CDw127(IL-7受容体α);CD117(c-kit)タンパク質、および分化系列が拘束された細胞の表面で発現しているマーカーのカクテルを含む、細胞表面にあるマーカーを特異的に認識する試薬を用いて細胞の複合混合物から分離することができる。本発明の骨髄系前駆細胞は抗原CD34の陽性発現(CD34+)に基づいて特徴付けられる。一般的な例として、これらの細胞は、Fcγ受容体(FcγR)、IL-7Rαネガティブ、sca-1ネガティブ、lineageネガティブ、およびc-kitハイの発現でも特徴付けられるが、これに限定されない発現でも特徴付けられる。
【０１０９】
一態様において、骨髄系前駆細胞を濃縮するための方法が提供される。濃縮された細胞集団は、通常は、選択された表現型の細胞を少なくとも約90％、さらに通常は、選択された表現型の細胞を少なくとも95％有する。本細胞集団は、親和性試薬、例えば、モノクローナル抗体を用いて特定される特定のマーカーに基づいて他の細胞、例えば、造血細胞から分離される。骨髄系前駆細胞は、骨髄、脾臓、肝臓、臍帯血、末梢血、動員末梢血、卵黄嚢などを含む、胎児、新生児、年少者、または成人でもよい任意の造血前駆細胞供給源から単離することができる。自家移植または同種移植の場合、骨髄および動員末梢血が好ましい出発材料である。末梢血の場合、化学療法;G-CSFもしくはGM-CSFまたはその両方で処置された後に、前駆細胞は骨髄区画から末梢血流に動員される。末梢血前駆細胞(PBPC)を動員するために、多数の単一化学療法剤および併用化学療法剤が用いられてきた。これらの薬剤を投与する際には、全ての場合において、効果的なPBPC動員と、造血幹細胞プールへの可能性のある損傷と、全体的な患者の耐性とのバランスを見つけなければならない。パクリタキセルは、幹細胞プールを傷つけることなくPBPCを効果的に動員することが見出されている。末梢血幹細胞の総説は、Shpall et al.(1997) Annu Rev Med 48:241-251において見出され、幹細胞動員の特徴付けは、Moog et al.(1998) Ann Hematol 77(4): 143-7において見出され得る。代わりの細胞供給源として、1991年10月29日に発行された米国特許第5,061,620号および1992年2月11日に発行された米国特許第5,087,570号に記載の造血幹細胞が細胞供給源となるようにインビボまたはインビトロで培養されてもよい。
【０１１０】
別の態様において、骨髄系前駆細胞は任意の哺乳動物種、例えば、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、げっ歯類、例えば、マウス、ラット、ハムスター、霊長類など、特にヒトから得ることができる。前記組織は、生きているドナーからの生検もしくはアフェレーシス(aphoresis)によって得られるか、死んで約48時間以内に、死んだドナーもしくは死につつあるドナーから得られるか、または新鮮に凍結した組織、死んで約12時間以内に凍結した組織から得られ、約-20℃より低い温度で、通常、ほぼ液体窒素の温度(-180℃)で無期限に維持されてもよい。骨髄系前駆細胞は細胞表面マーカーの発現によって特徴付けられる。これらのマーカーのいくつかについては、発現のレベルは低いか、または中間である。細胞を特定のマーカーについて「ポジティブ」または「ネガティブ」と呼ぶことは、ありふれたことであるが、実際の発現レベルは量的な特徴である。細胞表面にある分子の数は数ログ異なる場合があるが、それでもなお「ポジティブ」と特徴付けられる。染色レベルが特徴付けられると、細胞集団間の微妙な区別が可能になる。
【０１１１】
さらに別の態様において、細胞の染色強度はフローサイトメトリーによってモニタリングすることができる。フローサイトメトリーでは、レーザーが、量的な蛍光色素レベル(抗体に結合した細胞表面抗原の量に比例する)を検出する。フローサイトメトリーすなわちFACSはまた抗体染色の強度ならびに他のパラメータ、例えば、細胞サイズおよび光散乱に基づいて細胞集団を分離するのに使用することもできる。染色の絶対レベルは特定の蛍光色素および抗体調製物によって異なる場合があるが、対照と比べてデータを基準化することができる。
【０１１２】
さらなる態様において、骨髄系前駆細胞は、上記の特徴を有する細胞を濃縮する技法によって細胞の複合混合物から分離される。組織から細胞を単離するために、分散または懸濁に適した溶液が用いられる場合がある。一般的にこのような溶液は、低濃度の、一般的には5〜25mMの許容される緩衝液と共に、好都合にウシ胎仔血清または他の天然因子が加えられた、平衡塩類溶液、例えば、生理食塩水、PBS、ハンクス液などである。便利な緩衝液には、HEPES、リン酸緩衝液、乳酸緩衝液などが含まれる。
【０１１３】
一態様において、骨髄系前駆細胞集団の分離では、実質的に純粋な集団を得るために親和性分離を利用することができる。親和性分離のための技法には、抗体でコーティングした磁気ビーズを用いた磁気分離、アフィニティクロマトグラフィー、モノクローナル抗体と結合した細胞傷害剤またはモノクローナル抗体と共に用いられる細胞傷害剤、例えば、補体および細胞毒、ならびに固体マトリックス、例えば、プレートに結合された抗体を用いた「パニング」、または他の便利な技法が含まれ得る。正確な分離を提供する技法には、様々な程度の精巧さ(sophistication)、例えば、マルチカラーチャンネル、低角度・鈍角光散乱検出チャンネル(low angle and obtuse light scattering detecting channel)、インピーダンスチャンネルなどを有することができる蛍光活性化セルソーターが含まれる。死細胞に結合する色素(例えば、ヨウ化プロピジウム)を用いることによって、死細胞を除いて細胞を選択することができる。選択された細胞の生存能力に過度に有害でない任意の技法を使用することができる。
【０１１４】
別の態様において、親和性試薬は、上記で示された細胞表面分子に特異的な受容体またはリガンドでもよい。抗体試薬に加えて、ペプチド-MHC抗原とT細胞受容体のペア;ペプチドリガンドと受容体;エフェクターと受容体分子などが用いられてもよい。抗体およびT細胞受容体はモノクローナルでもポリクローナルでもよく、トランスジェニック動物、免疫された動物、不死化されたヒトB細胞または動物B細胞、抗体またはT細胞受容体をコードするDNAベクターでトランスフェクトされた細胞などによって産生されてもよい。抗体の調製および特異的結合メンバーとしての使用に対する適性の詳細は当業者に周知である。
【０１１５】
さらに別の態様において、抗体は親和性試薬として用いられる。都合よく、これらの抗体は、分離において使用するための標識とコンジュゲートされる。標識には、特定の細胞タイプの分離を楽にするために、直接分離するのを可能にする磁気ビーズ、支持体に結合したアビジンまたはストレプトアビジンを用いて取り出すことができるビオチン、蛍光活性化セルソーターと共に使用することができる蛍光色素などが含まれる。役に立つ蛍光色素には、フィコビリンタンパク質、例えば、フィコエリトリンおよびアロフィコシアニン、フルオレセイン、およびテキサスレッドが含まれる。しばしば、それぞれのマーカーを独立して選別するために、抗体ごとに異なる蛍光色素で標識される。抗体は細胞懸濁液に添加され、利用可能な細胞表面抗原に結合するのに十分な期間にわたってインキュベートされる。インキュベーションは、通常、少なくとも約5分であり、通常、約30分より短い。分離の効率が抗体の欠如によって制限されないように、反応混合物中には十分な濃度の抗体があることが望ましい。適切な濃度は滴定によって決定される。細胞が分離される培地は、細胞の生存能力を維持する任意の培地である。好ましい培地は、0.1〜0.5％BSAを含有するリン酸緩衝食塩水である。様々な培地が市販されており、ダルベッコ変法イーグル培地(dMEM)、ハンクス基本塩溶液(Hank's Basic Salt Solution)(HBSS)、ダルベッコリン酸緩衝食塩水(dPBS)、RPMI、イスコブ(Iscove)培地、5mM EDTAなどを含有する、往々にして、ウシ胎仔血清、BSA、HSAなどが加えられるPBSを含め、細胞の性質に応じて使用することができる。次いで、標識された細胞はc-kit、IL-7Rα、およびlinパネルの発現について分離される。選択された集団は、c-kitハイ、linネガティブ、IL-7Rαネガティブである。この細胞集団はまたFcγRおよびCD34の発現に基づいてサブセットに分けることができるかもしれない。分離された細胞は、細胞の生存能力を維持する、通常、コレクションチューブの底に血清のクッションがある任意の適切な培地の中に収集することができる。様々な培地が市販されており、往々にして、ウシ胎仔血清が加えられる、dMEM、HBSS、dPBS、RPMI、イスコブ培地などを含めて細胞がどういったものかに応じて使用することができる。
【０１１６】
他の態様において、前記細胞は、ローテータによって様々な長さの時間にわたって、様々な速度で、2〜10℃または室温のいずれかでインキュベートされてもよい。さらなる態様において、細胞は洗浄工程後に凍結することもできる。管理された凍結の方法が用いられてもよく、-20℃でまたは液体窒素中で管理せずに、すぐに凍結する方法も用いられてもよい。ある特定の態様において、凍結保存した細胞は解凍および洗浄され、本発明の方法を用いて活性化される前に室温で1時間静置する。
【０１１７】
一態様において、誘導性hRORγを用いて改変された骨髄系前駆体は、好中球への分化が求められるまで維持培地中で培養される。次いで、骨髄系前駆体は維持培地から、分化を誘導するのに用いられる培地、ならびにhRORγトランスジーンの発現を誘導するドキシサイクリンに切り替えられる。次いで、hRORγトランスジーンを発現する分化した好中球は(例えば、非小細胞肺癌をもつ)患者の静脈内に送達される。次いで、hRORγトランスジェニック好中球は標的癌細胞に向かって進み、標的癌細胞に結合し、標的癌細胞の増殖を阻害するか、または標的癌細胞の細胞死を誘導する。
【０１１８】
別の態様において、前駆細胞は、不死化剤を用いることによって幹様(stem-like)状態で維持される。例えば、誘導性hTERTまたは誘導性Hoxa9もしくはHoxB8(例えば、レンチウイルスもしくはタンパク質形質導入を介して送達される)あるいは細胞寿命を付与する能力がある他のタンパク質が、通常、寿命が限られている骨髄系前駆体を不死化するのに用いられる場合がある。そうすることで、抗癌性免疫細胞を生産して、患者のための万能なドナー細胞「バンク」を生産するプロセスをさらに容易に産業化するために、寿命が限られている骨髄系株を無限に培養できるかもしれない。この万能な細胞バンクはRORγなどの因子を用いて改変し、増やすことができるが、細胞および遺伝子の発現パターンならびにゲノム配列が当業者に公知の方法によって確かめられた時に変化していない限り、再度、導き出す必要はないだろう。
【０１１９】
さらに別の態様では、化学処理または放射線を用いることで、これ以上、細胞分裂できないようにされている細胞において、RORγまたはRORγ標的遺伝子がアップレギュレートまたは抑制される。結果として、例えば、レトロウイルスが挿入されることで、細胞増殖および/または細胞分裂を誘導するタンパク質がアップレギュレートされても、ドナー細胞は、歯止めのない増殖によって患者を潜在的に傷つける脅威とならないだろう。
【０１２０】
別の態様において、ユニバーサルな移植を可能にするために、天然でMHCクラス分子レベルが低いまたは人工的にMHCクラス分子レベルが低減された細胞において、RORγまたはその下流標的の1つもしくは複数が改変されてもよい。
【０１２１】
診断および処置
一態様において、本発明は、対象において癌または癌もしくは転移を発症する素因を診断する方法に関する。前記方法は、対象に由来する生物学的試料中の免疫細胞(例えば、好中球)におけるRORγ遺伝子の発現レベルを測定する工程を含み、正常対照RORγ発現レベルと比較したRORγ発現レベルの増加が、対象に癌があるか、または癌もしくは転移を発症する素因があることを示す。
【０１２２】
別の態様において、本発明は、癌の処置を必要とする対象において、癌を処置するための免疫療法処置の効力を確かめるための方法に関する。前記方法は、対象に由来する生物学的試料中の好中球細胞におけるRORγ遺伝子の発現レベルを測定する工程を含み、正常対照におけるRORγ発現レベルと比較したRORγ発現レベルの増加が、免疫療法処置が有効であることを示す。本発明の一部の局面において、癌の処置は固形腫瘍の処置を含んでもよく、転移の処置を含んでもよい。転移は、癌化細胞または悪性細胞が移動しており、癌をある部位から別の部位に拡散させている癌の一形態である。このような癌には、皮膚、乳房、脳、子宮頸部、精巣などの癌が含まれる。さらに具体的には、癌には、以下の臓器または系:心臓、肺、胃腸、尿生殖路、肝臓、骨、神経系、婦人科学、血液学、皮膚、および副腎が含まれ得るが、これに限定されない。さらに、本明細書の方法は、神経膠腫(シュワン腫、グリア芽細胞腫、星状細胞腫)、神経芽細胞腫、クロム親和細胞腫、傍神経節腫(paraganlioma)、髄膜腫、副腎皮質癌、腎臓癌、様々なタイプの血管癌、骨芽細胞型骨癌(osteoblastic osteocarcinoma)、前立腺癌、卵巣癌、子宮筋腫、唾液腺癌、脈絡叢癌、乳癌、膵臓癌、結腸癌、および巨核芽球性白血病を処置するのに使用することができる。皮膚癌には、悪性メラノーマ、基底細胞癌、扁平上皮癌、カポジ(Karposi)肉腫、黒子、異形成母斑、脂肪腫、血管腫、皮膚線維腫、ケロイド、および乾癬が含まれる。
【０１２３】
一態様において、本発明は、RORγをコードする核酸配列を含むウイルスベクターを対象に投与することによって抗腫瘍免疫を提供する方法および自然免疫応答を刺激するための方法であって、RORγの発現が好中球特異的プロモーターの制御下にある、方法を含む。
【０１２４】
別の態様において、免疫刺激は、RORγをコードする核酸配列を含むウイルスベクターを含む細胞(例えば、CD34+細胞)であって、RORγの発現が好中球特異的プロモーターの制御下にある細胞(例えば、CD34+細胞)を対象に投与することによって成し遂げられる。
【０１２５】
一態様において、ヒトRORγ(hRORγ)処置に適した対象には、以下が含まれ得る:癌処置を受ける必要があるヒト対象または任意の野生哺乳動物もしくは家畜化した哺乳動物。ヒト癌患者以外の哺乳動物の場合にはhRORγ(SEQ ID NO:1)の適切なホモログ、例えば、癌療法または予防のために免役改変を受けている飼い犬の場合にはイヌRORγが利用されるだろう。
【０１２６】
別の態様において、RORγ産物またはRORγ標的遺伝子は望ましい細胞集団内で間接的にアップレギュレートされてもよい。間接的な活性化には、例えば、hRORγ発現に影響を及ぼす、転写因子、キナーゼ、ホスファターゼもしくは任意のタンパク質、ペプチド、または翻訳されないマクロRNAもしくはマイクロRNAの異所発現が含まれ得る。本発明はまた、自然免疫系細胞に同様の癌死滅活性を付与するために、hRORγの重要な下流標的を標的とするように人工的に作製された人工ジンクフィンガータンパク質または他のゲノムDNA結合タンパク質を伴うこともある。
【０１２７】
さらに別の態様において、あらゆる、可能性のある制御不能なドナー細胞増殖から患者を守るために、RORγまたはRORγ標的遺伝子を用いて改変された免疫細胞にキルスイッチ(kill switch)が組み込まれる。例えば、当技術分野において訓練を受けた人に公知の方法によって、プロドラッグ変換酵素であるチミジンキナーゼ(TK)の継続的な産生がドナー免疫細胞に遺伝子工学によって導入される場合がある。そして次に、プロドラッグであるガンシクロビルが投与されると、TKを産生する細胞は排除される。このアプローチは、一例として、免疫細胞が、制御不能な増殖の原因となる遺伝子損傷を獲得しており、患者から排除しなければならない場合に有用である。
【０１２８】
さらなる態様において、hRORγに基づく処置と他の処置は、hRORγの発現および/もしくは機能または有効なRORγ下流標的の発現および/もしくは機能を妨害しない限り、あるいは癌細胞に狙いを定めるように(もしくはさらに良く狙いを定めるように)、癌細胞をブロックするように、および/または癌細胞の死を引き起こすように改変されている好中球または他の免疫細胞タイプの枯渇を引き起こさない限り、これらの並行処置は組み合わされてもよい。
【０１２９】
一態様において、RORγを含む組成物の送達は、癌の予防を必要とする対象において癌の予防に使用することができるかもしれない。
【０１３０】
別の態様では、遺伝子構成またはライフスタイル(例えば、喫煙者)によって癌に罹患しやすいことが確認された患者には、癌予防の手段として機能する、長い寿命(例えば、1年の寿命)をもつ改変された造血細胞が与えられてもよい。非限定的な例は、多能性分化能をもつ初期造血幹細胞、またはもはや分裂しないが、長い寿命を保っている成人マクロファージである。この場合、関心対象の細胞は好中球より長い寿命をもつ。これらの細胞は、RORγもしくはRORγ下流標的、例えば、スカベンジャー受容体(例えば、Scart2ホモログ)を生産するように、またはCD148もしくはCD148エフェクターを阻害するように改変され、次いで、癌を発症するリスクがある患者に送達される。
【０１３１】
投与/投薬
投与計画は、有効量を構成するものに影響を及ぼす可能性がある。例えば、治療用製剤は、癌に関連する外科的介入の前もしくは後に、または患者が癌と診断された直後に患者に投与されてもよい。さらに、いくつかの分割投与量ならびに時間をずらした投与量が毎日または連続して投与されてもよい。または、用量は連続注入されてもよく、ボーラス注入されてもよい。さらに、治療状況または予防状況の緊急性により示されるように、治療用製剤の投与量は比例して増加または減少されてもよい。
【０１３２】
本発明の組成物は、公知の手順を用いて、患者にある癌を処置するのに有効な投与量および期間で、患者、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトに投与されてもよい。治療効果を実現するのに必要な治療用化合物の有効量は、使用される特定の化合物の活性、投与時間、前記化合物の排出速度、処置期間、前記化合物と併用される他の薬物、化合物、または材料、疾患または障害の状態、処置されている患者の年齢、性別、体重、状態、身体全体の健康、および前病歴などの要因、ならびに医学分野において周知の同様の要因に従って変化することがある。最適な治療応答を提供するように投与計画が調整されてもよい。例えば、いくつかの分割量が毎日投与されてもよい。または、治療状況の緊急性により示されるように用量が比例して減らされてもよい。本発明の治療用化合物の有効な用量範囲の非限定的な例は約0.01〜50mg/体重kg/日である。当業者であれば、関連する要因を研究し、過度の実験なく治療用化合物の有効量に関する決定を下すことができるだろう。
【０１３３】
前記化合物は、1日に数回もの頻度で動物に投与されてもよく、1日に1回、1週間に1回、2週間に1回、1ヶ月に1回などの少ない頻度で、数ヶ月に1回もしくは1年に1回またはそれ未満などのさらに少ない頻度で投与されてもよい。1日あたりに投薬される量の化合物が、非限定的な例では、毎日、1日おきに、2日ごとに、3日ごとに、4日ごとに、または5日ごとに投与されてもよいことが理解される。例えば、1日おきに投与する場合、月曜日に1日あたり5mgの用量を開始し、水曜日に、その後の1日あたり5mgの第1の用量を投与し、金曜日に、その後の1日あたり5mgの第2の用量を投与してもよい。投薬の頻度は当業者に容易に明らかであり、処置されている疾患のタイプおよび重篤度ならびに動物のタイプおよび年齢などがあるが、これらに限定されない任意の数の要因に左右される。
【０１３４】
投与経路
当業者は、投与のために複数の経路を使用することができるが、特定の経路が別の経路より速やかで、かつ効果的な反応を提供できることを認識する。
【０１３５】
本発明の任意の組成物の投与経路には、吸入投与、経口投与、鼻投与、直腸投与、非経口投与、舌下投与、経皮投与、経粘膜投与(例えば、舌下投与、舌投与、(経頬)頬投与、(経尿道)尿道投与、腟投与(例えば、経腟投与および膣周囲投与)、(鼻腔内)鼻投与、ならびに(経直腸)直腸投与)、膀胱内投与、肺内投与、十二指腸内投与、胃内投与、くも膜下腔内投与、皮下投与、筋肉内投与、皮内投与、動脈内投与、静脈内投与、気管支内投与、吸入投与、ならびに局部投与が含まれる。適切な組成物および剤形には、例えば、錠剤、カプセル、カプレット、丸剤、ジェルカプセル、トローチ、分散液、懸濁液、溶液、シロップ、顆粒、ビーズ、経皮パッチ、ゲル、散剤、ペレット、マグマ、ロゼンジ、クリーム、ペースト、硬膏剤、ローション、ディスク、坐剤、鼻投与用または経口投与用の液体スプレー、吸入用の乾燥散剤またはエアロゾル化製剤、膀胱内投与用の組成物および製剤などが含まれる。本発明において有用だと考えられる製剤および組成物は、本明細書に記載の特定の製剤および組成物に限定されないことが理解されるはずである。
【０１３６】
関心対象の遺伝子(RORγ)の発現の対照標準量
本発明の方法は、対象に由来する生物学的試料中の好中球細胞におけるRORγ発現の測定量と、RORγ発現の対照量(すなわち、参照)を比較する工程を含む。
【０１３７】
一態様において、RORγ発現の標準対照レベルは、健常対象の自然免疫細胞(例えば、好中球)におけるRORγ発現レベルを測定することによって得ることができる。好ましくは、健常対象は同様の年齢、性別、および人種の対象であり、どのタイプの重篤な疾患とも、特に、どのタイプの癌とも診断されたことがない。
【０１３８】
別の態様において、RORγ発現の対照量は、当技術分野において受け入れられているRORγ発現の値である。この参照値は、標準的な統計方法を適用することによって、RORγ発現の平均(average)値または平均(mean)値に基づいて対象群について計算されたベースライン値でもよい。
【０１３９】
一態様において、発現レベルは、遺伝子のmRNAの検出、遺伝子によってコードされるタンパク質の検出、および遺伝子によってコードされるタンパク質の生物学的活性の検出からなる群より選択される方法によって測定される。
【０１４０】
本発明のある特定の局面において、RORγ発現レベルは対象に由来する試料中で測定される。試料は、好ましくは、本明細書において引用された試料に加えて、腫瘍細胞、腫瘍細胞の周囲から出た任意の液体(すなわち、白血病の血液、腫瘍組織など)、または腫瘍と生理学的に接触しているか、もしくは腫瘍の近くにある任意の液体、または他の任意の体液を含み、これらも本発明に含まれると考えなければならない。特定の態様において、前記試料は、好ましくは、自然免疫細胞(例えば、好中球)を含む。
【０１４１】
測定方法
RORγ発現レベルを測定するために当業者に公知の任意の方法を使用することができる。例えば、マイクロアレイを使用することができる。マイクロアレイは当技術分野において公知であり、遺伝子産物(例えば、mRNA、ポリペプチド、その断片など)と配列が対応するプローブを既知の位置に特異的にハイブリダイズまたは結合させることができる表面で構成される。関心対象の少なくとも1つの遺伝子を検出するために、ハイブリダイゼーション試料は、試験試料を少なくとも1つの核酸プローブと接触させることによって形成される。RORγを検出するための好ましいプローブは、RORγ mRNAにハイブリダイズすることができる標識核酸プローブである。核酸プローブは、例えば、完全長核酸分子またはその一部、例えば、長さが少なくとも10、15、もしくは20ヌクレオチドであり、ストリンジェントな条件下で適切な標的と特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドでもよい。ハイブリダイゼーション試料は、核酸プローブが関心対象の標的に特異的にハイブリダイズするのに十分な条件下で維持される。特異的ハイブリダイゼーションは、適宜、高ストリンジェンシー条件下または中程度のストリンジェンシー条件下で行うことができる。好ましい態様において、特異的ハイブリダイゼーションのためのハイブリダイゼーション条件は高ストリンジェンシーである。次いで、特異的ハイブリダイゼーションを、存在する場合、標準的な方法を用いて検出する。核酸プローブと、試験試料中の遺伝子との間に特異的ハイブリダイゼーションが起これば、核酸プローブに存在する配列は対象のmRNAにも存在する。複数の核酸プローブも使用することができる。スキャナーによって検出されたハイブリダイゼーション強度データは自動的に取得され、Affymetrix Microarray Suite(MASS)ソフトウェアによって処理される。150の標的強度を用いた発現レベルに対して生データが基準化される。少数の異なる遺伝子のmRNA発現プロファイルを測定する代わりの方法は、例えば、古典的なTaqMan(登録商標)Gene Expression AssaysまたはTaqMan(登録商標)Low Density Arrayマイクロ流体カード(micro fluidic card)(Applied Biosystems)のいずれかによる方法である。特に、本発明は好ましくはqPCRシステムを利用する。非限定的な例には、Bio-rad(Berkley, California)から市販されているPrimePCRPathways(登録商標)などの市販のキットが含まれる。
【０１４２】
試料の転写状態、特にmRNAも、当技術分野において公知の他の核酸発現技術によって測定することができる。当業者に公知の任意の方法を用いて試料からmRNAを単離することができる。非限定的な例には、市販のキット、例えば、Qiagen(Netherlands)から市販されているRNeasy(登録商標)またはMolecular Research Center, Inc.(Cincinnati, Ohio)から市販されているMini Kit the TRI Reagent(登録商標)が含まれ、これらを用いてRNAを単離することができる。一般的に、単離されたmRNAは、当技術分野において公知の方法を用いて増幅することができる。例えば、PCRまたはRT-PCR法を用いた増幅システムが当業者に公知である。増幅技術の概要については、例えば、Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York(1995)を参照されたい。
【０１４３】
mRNA発現をプロファイルするための別の正確な方法は、第一、第二、第三の、ならびにそれに続く次世代シークエンシング技術を含む次世代シークエンシング(NGS)の使用でもよい。
【０１４４】
本発明の他の局面では、試料中にあるペプチドまたはポリペプチドの量を測定するための当技術分野において公知の全ての手段によって、ペプチド、ポリペプチドの量を測定するか、またはその生物学的活性を検出することができる。これらの手段は、様々なサンドイッチアッセイ形式、競合アッセイ形式、または他のアッセイ形式で標識分子を利用し得るイムノアッセイ装置および方法を含む。このようなアッセイは、ペプチドまたはポリペプチドの存在または非存在を示すシグナルを発する。さらに、シグナルの強さを、好ましくは、試料中に存在するポリペプチドの量と直接的または間接的(例えば、逆比例(reverse-proportional))に相関させることができる。さらに適切な方法は、ペプチドまたはポリペプチドに特有の物理的特性または化学的特性、例えば、その正確な分子量またはNMRスペクトルを測定する工程を含む。前記方法は、好ましくは、バイオセンサー、イムノアッセイと連結した光学装置、バイオチップ、分析装置、例えば、質量分析計、NMR分析器、またはクロマトグラフィー装置を含む。さらに、方法は、マイクロ-プレートELISAをベースとする方法、完全自動化イムノアッセイまたはロボットイムノアッセイ(例えば、Elecsys(商標)分析器で利用可能)、CBA(酵素コバルト結合アッセイ、例えば、Roche-Hitachi(商標)分析器で利用可能)、およびラテックス凝集アッセイ(例えば、Roche-Hitachi(商標)分析器で利用可能)を含む。
【０１４５】
キット
本発明は、少なくともRORγの検出に有用な、標識された(例えば、フルオレサー(fluorescer)、クエンチャーなど)、または標識されていない一組の好ましい抗体を含む。
【０１４６】
ある特定の態様では、キットが提供される。本明細書を考慮して、これらの方法において使用するための市販のキットが当業者に公知である。一般的に、キットは、関心対象のポリペプチドもしくは核酸またはmRNAの存在を検出するのに適した検出試薬を含む。
【０１４７】
別の態様において、キットはプローブセットまたは抗体のパネルを含む。プローブセットは、自然免疫細胞におけるRORγレベルを検出し、抗腫瘍免疫に関する情報を提供するように設計される。プローブセットは、特定のゲノムにある可能な限り多くのペプチドを検出することを目的としたプローブセットより小さく、かつ安価であるので特に有用である。本発明において、前記プローブセットは、癌発生率に関する情報を提供するポリペプチドの検出を対象にしている。プローブセットはまた、癌に関する情報を提供しないペプチドを検出する多数または少数のプローブを含んでもよい。このようなプローブは対照として、および基準化のために有用である(例えば、スパイクイン(spiked-in)マーカー)。プローブセットは乾燥した混合物でもよく、溶解した混合物でもよい。一部の態様では、プローブセットを固体支持体に結合させて、プローブアレイを形成することができる。プローブは、抗体、または核酸(例えば、DNA、RNA、DNAおよびRNAの化学修飾型)、LNA(ロックド核酸)、またはPNA(ペプチド核酸)、または関心対象のペプチド配列もしくは核酸配列と特異的に相互作用することができる他の任意のポリマー化合物でもよい。
【０１４８】
さらに別の態様において、キットは、キットを必要とする哺乳動物に由来する試料中の自然免疫細胞におけるRORγレベルを検出すること、抗腫瘍免疫の存在または非存在を示すこと、およびRORγをコードするウイルス核酸配列を含む組成物を哺乳動物に投与する工程を含み、RORγの発現が好中球プロモーターの制御下にある、抗腫瘍免疫処置を哺乳動物において施行、変更、または終了するべきかどうかを助言することを含む使用のための説明書を含む。
【実施例】
【０１４９】
今から、以下の実施例に関連して本発明を説明する。これらの実施例は例示目的のためだけに提供される。本発明は、これらの実施例に限定されると解釈してはならず、反対に、本明細書において提供される開示の結果として明らかになる任意および全てのバリエーションを包含すると解釈しなければならない。
【０１５０】
これ以上の説明なく、当業者は、前述の説明と以下の説明に役立つ実施例を用いて、本発明の化合物を作製および利用することができ、特許請求された方法を実施することができると考えられる。従って、以下の実施例は、本発明の好ましい態様を具体的に指し示し、決して、本開示の残りの部分を限定すると解釈してはならない。
【０１５１】
本明細書において開示された実験において用いられた材料および方法を今から説明する。
【０１５２】
材料および方法
RNA-Seq.
SR/CRディファレンシャルディスプレイに用いたRNA-Seqライブラリー調製プロトコールは、当技術分野において公知の一般的なRNAseqプロトコールに基づいた(TruSeq protocol, Illumina, San Diego, CA)。簡単に述べると、このプロトコールは以下の工程:
-mirVana RNA Isolation Kitを用いた全RNAおよびマイクロRNAの単離
-AmbionのMicroPoly(A)Purist Kitを用いたポリAの精製
-RNA断片化
-二本鎖cDNA合成-Invitrogen(カタログ番号11917-020).
-End-It DNA End Repair Kit Epicentre(カタログ番号ER0720)を用いた末端修復
-3'末端への「A」塩基の付加
-アダプター連結: PromegaのLigaFast(カタログ番号M8221)およびIlluminaのPE Adapter Oligo Mix(部品番号1001782)を使用する
-ライブラリーを増幅するためのPCRおよびサイズ選択:Phusion DNAポリメラーゼ、NEB(カタログ番号F-531)およびIlluminaプライマーを使用する
を含む。
【０１５３】
細胞死滅アッセイ
Gateway System Entryベクター(Life Technologies)の中に含まれるマウスRORγ cDNA(マウスRORC核酸、SEQ ID NO:3、図17)を、LR Clonase(Life Technologies)を用いたLR組換え反応を介してMach7 Yaleレンチウイルスベクター(SEQ ID NO:2、図16)に移入した。処理された試料を、熱ショック形質転換を介してケミカルコンピテントTop 10細胞(Life Technologies)に形質転換し、LB+100ug/mLアンピシリンプレート上で30℃で一晩、選択した。シングルコロニーをつつき、激しく振盪しながら2mLのLB+100ug/mLアンピシリン中で30℃で一晩、増殖させた。細菌をペレット化し、Qiagen Qiaprep spin miniprepキットを用いてDNA抽出した。各調製物の約0.5〜1.0マイクログラムのDNAを制限酵素BsrGI(New England Biolabs)で37℃で2時間、消化した。全消化物を、0.5ug/mL臭化エチジウムを含有する1％w/v TAEアガロースゲルにロードし、60Vで一定電圧で数時間、流した。感染性レンチウイルス粒子を作製するために、正しいインサートサイズと、Mach7レンチウイルスベクターと互いに関係のあるバックボーンのある2つのクローンを選択した。
【０１５４】
一過的レンチウイルスパッケージングプロトコールを用いることによって、Mach7-mRORγ構築物のウイルスパッケージングを行った。トランスフェクション前の晩に、HEK293誘導細胞株VNRCを、10％熱失活胎仔ウシ血清(Life Technologies)を含有し、抗生物質を含まないDMEM細胞培地(Life Technologies)が入っている10cm組織培養ディッシュに約5x10E7細胞/ウェルでプレートした。翌日、細胞が約90％のコンフルエンスに達していたら、細胞をトランスフェクトした。レンチウイルスパッケージングミックスは、以下の比:2.5ugのMach7-mRORγ、3.3ugのパッケージングプラスミドpCMVRDelta8.91、および0.8ugのエンベローププラスミドpMD2.Gの3種類のベクターからなった。レンチウイルスパッケージングミックスを無血清DMEMで希釈し、14マイクロリットルのリポフェクタミン2000(Life Technologies)を含有する等量の無血清DEMEと混合した。混合物を室温で30分インキュベートした後に、1日早くプレートしたVNRC細胞に滴下した。VNRC細胞を5％CO2の加湿チャンバーに入れてインキュベートし、48時間、静置した。トランスフェクトして48時間後に、細胞培養上清を収集し、細胞破片を除去するために300xgで室温で5分間、遠心分離し、残っている細胞破片を全て除去するために0.45ミクロンPVDFシリンジフィルターで濾過した。
【０１５５】
感染用の標的細胞株はHF-1骨髄系前駆細胞であった。組換えマウスGM-CSFの存在下で継続して培養することによって、HF-1前駆体を前駆状態で維持した。1クローンにつき5mLの未希釈ウイルス上清を200万個のHF-1に添加した。1個の細胞を1mLの培養培地(IMDM、15％熱失活胎仔ウシ血清、および2.5ug/mLマウスGM-CSF)に懸濁した。感染を助けるために、6ug/mLの臭化ヘキサジメトリン(Polybrene, Sigma Aldrich)を感染混合物に添加した。次いで、ウイルス粒子の接触とHF-1細胞の感染(「スピンフェクション(spinfection)」と呼ばれるプロセス)を助けるために、試料を1000xgで1時間、遠心分離した。スピンフェクション後に、HF-1で処理した試料を、既にある培地に再懸濁し、5mLのさらなるGM-CSF培地で覆った後に、T25ベント式(vented)組織培養フラスコに移し、37Cで一晩インキュベートした。翌日、感染したHF-1細胞をペレット化し、新鮮なHF1培養培地に再懸濁した。感染させて48時間後に、Mach7-mRORγ構築物を安定に組み込んだ細胞クローンを選択するためにブラストサイジンを最終濃度15ug/mLで細胞培養物に添加した。対照として、ウイルス感染と選択が有効なことを確かなものにするために、Mach7-赤色蛍光タンパク質(mRFP)と平行してウイルス産生を行った。同様に、Mach7-緑色蛍光タンパク質(GFP)が対照として用いられ、蛍光顕微鏡を用いた検査の際に、ほぼ全ての細胞において発現していることが確かめられた(図6)。細胞死滅アッセイのために、Mach7-mRORγおよび対照をさらに増殖させた。
【０１５６】
癌細胞死滅能力がHF-1由来好中球に付与されたかどうか確かめるために、腎臓癌細胞株レンカ(American Type Culture Collection)を選択した。レンカ細胞は付着性であり、懸濁細胞株であるHF-1由来好中球と比べて細胞死を直接視覚化することができる(図8)。細胞を洗浄して培地からGM-CSFを除去することによってHF1細胞(未変化またはトランスジェニック)を分化させ、好中球系列への分化を促進するために50ng/mL G-CSFを加えた。分化がうまくいったことは、分化培地中で72時間、培養した細胞に対する好中球特異的抗体NIMP-R14(Abcam)を用いた陽性免疫染色によって確かめられた(図7)。HF-1由来株を効率的に分化できたことが確かめられたら、様々な細胞株をHF-1培養培地中で増殖させた。アッセイ前の晩に、レンカ細胞をDMEM+10％胎仔ウシ血清に6ウェルあたり3x10E5細胞の密度でプレートすることによって癌死滅アッセイを行った。翌朝、G-CSF培地中で72時間分化していたHF-1細胞株をペレット化し、新鮮なG-CSF培地に再懸濁した。次いで、様々な比のHF-1株を、プレートしたレンカ細胞(レンカは約25〜35％コンフルエンスに達していた)のウェルに添加し、共培養物を37Cで48時間インキュベートした。細胞死滅アッセイは、細胞培養上清を吸引して好中球を除去し、視覚化を楽にする目的でレンカ細胞を固定し、染色するために1％w/vクリスタルバイオレットを含む50％エタノール水溶液を1ウェルにつき2mL添加することによって終了した(図9)。Mach7-mRORγを用いて改変されたHF-1細胞と同時インキュベートしたレンカ細胞の細胞死滅効果がかなりあったことが一貫して確かめられた。RFPまたは近縁関係にあるmRORγスプライスフォームmRORγ-tもしくはリボ核(ribonuclear)RNA snora69のいずれかを用いて改変されたHF-1細胞に由来する対照好中球は、最も高い比の20:1好中球:レンカ細胞で死滅も示さず、わずかな毒性も示さなかった(図9)。
【０１５７】
実施例1:トランスクリプトーム分析から、SR/CRマウスにおいて大幅にアップレギュレートされた候補遺伝子が明らかになった
試料は以下からなった。ナイーブSR/CRマウス(以前に癌細胞が投与されていない)に由来する約2000万個の好中球を、対照同腹子に由来する好中球と比較した。どの試料がi)癌耐性マウスおよびii)野生型対照マウスに属するかについての情報を記録した。3つのSR/CR好中球試料と3つの対照同腹子好中球試料のトランスクリプトームを、次世代シークエンシング(TruSeq protocol, Illumina, San Diego, CAを用いたRNA-Seq)を介して評価した(図2A〜2B)。各試料から6000万の読み取りデータを入手した(図1)。計算解析によって、SR/CRマウスにおいて大幅にアップレギュレートされた候補遺伝子が強調された(図3)。例えば、これらの結果から、スカベンジャー受容体が大幅にアップレギュレートされ、走化性応答に関与する受容体の発現が変化し、核受容体RORγが45倍アップレギュレートされたことが分かった。これらの結果に基づいて、SR/CRマウスにおいて最も劇的にアップレギュレートされた因子を細胞培養モデルにおける異所発現によって解析した。増加倍率および統計的に有意なP値に基づいた多数の上位スコア因子(図4)をレンチウイルス発現ベクターに組み込んだ。一例として、これらの因子は、RORγ、スプライスバリアントRORγ-t、およびsnora69からなるが、これに限定されない。
【０１５８】
実施例2:マウスRORγが送達および発現されると、インビトロで得られた好中球に癌死滅活性が付与される
レンチウイルス構築物を用いてHF1-Hoxa9骨髄系前駆細胞を感染させた。HF1-Hoxa9細胞はGM-CSF因子の存在下で培養されている限り前駆状態で維持された。GM-CSFが取り除かれ、G-CSFの存在下で培養が行われると、細胞のほぼ100％が好中球に分化した。これらの分化したトランスジェニック好中球を、付着レンカ癌細胞を含有するウェルに好中球(懸濁細胞)を添加する細胞死滅アッセイにおいて使用した。48時間後にクリスタルバイオレット染色が行われると、付着性癌細胞が消失した/無くなったかどうかが確かめられる(図9)。付着性癌細胞に影響を及ぼした(付着性癌細胞株の増殖を遅くした、および/または付着性癌細胞株の細胞死をもたらした)唯一の因子がRORγであった。RNA-Seqデータ解析において、RORγは、野生型好中球対照と比較して統計的に有意なP値をもち、かつかなり大幅にアップレギュレートされた(45倍増加した)唯一の転写因子であることが観察された。この結果を、Taqman qRT-PCRによってさらに検証した(図5)。これらの結果から、対照と比較して癌耐性SR/CRマウスに由来する好中球においてRORγが大幅にアップレギュレートされていることが確認された。この結果からまた、SR/CRマウスを確かめるためのマーカーとして、おそらくヒト好中球の抗癌死滅活性と相関関係のあるマーカーとしてRORγを使用できることも確認された。
【０１５９】
SR/CRマウスの発現プロファイルと、RORγを用いて行った機能細胞生物学アッセイの組み合わせから、RORγは、SR/CRマウスに、癌に抵抗する、さらには高悪性度(aggressive)前立腺癌モデルにおいて原発腫瘍を抑制する素晴らしい能力を与えた重要な因子であることが分かる。この情報には、癌細胞を攻撃するように成熟好中球または幹細胞を改変できるだけでなく、健康状態がおおむね良い成熟好中球または幹細胞が癌にならないように保護する手段(ワクチンと考え方が似ている)も提供することで癌療法を改革する可能性がある。
【０１６０】
実施例3:マウスRORγが誘導発現されると、インビトロで得られた好中球に癌死滅活性が付与される
誘導性レンチウイルス構築物(pInducer21)を用いて、Hoxa9 HF1骨髄系前駆細胞を感染させた。ドキシサイクリンが添加され、構成的に発現されるrtTA3転写トランス活性化タンパク質が活性化されると、この構築物に感染した細胞はmRORγを産生する(図10)。
【０１６１】
HoxA9 HF1細胞株を好中球に分化させるために、HF1細胞を標準的な増殖培地中で維持するか、または食塩水で洗浄し(図11A)、20ng/mLのG-CSFの存在下で3日間(図11B)または6日間(図11C)増殖させた。細胞を、示された回数でサイトスピンにかけ、ギムザ染色した。図11Bに示した矢印は、好中球に特有の多葉性の核をはっきりと示した細胞を示す。
【０１６２】
pInducer21レンチウイルスRORγを用いて改変された免疫細胞はインビトロアッセイにおいて癌細胞の数を減らすことができた。レンカ細胞を組織培養処理済み6ウェルディッシュに一晩、24時間にわたって付着および増殖させた。次いで、分化したHF1誘導性RORγ細胞を20:1(好中球:レンカ)の比で、ドキシサイクリンを伴わずに(-ドキシサイクリン(図12Aおよび12E))、またはドキシサイクリンと共に(+ドキシサイクリン図12B、12C、12D、12F、12G、および12H)加えた。48時間のインキュベーション期間後に、好中球を含有する培地を吸引し、プレートをPBSで洗浄した後に、レンカ細胞を4％パラホルムアルデヒドとPBSを用いて固定した。分化させ、ドキシサイクリンを介してRORγが発現するように誘導したトランスジェニックHF1細胞は一貫して、ドキシサイクリンによってRORγが誘導されなかった分化したHF1トランスジェニック細胞より多くのレンカ細胞を消失させた。
【０１６３】
実施例4:マウスにおける異種移植アッセイ
成熟T細胞を産生しない無胸腺C57BL/6 foxn1/foxn1ヌードマウスを用いて異種移植実験を行う。foxn1/foxn1はまた、正常毛包を生じることができないことに起因してヌードでもある。この形質のために皮下異種移植片を容易に視覚化することができる。最初に、このアッセイの正の対照としてレンカおよびS180癌細胞が役立つ。培養物から採取したS180細胞を直接注射することによって、サイズが400〜800mgの皮下腫瘍を作製する。マウスの処置は、細胞が完全に分化し、RORγ発現が誘導されているトランスジェニックRORγ-MPROトランスジェニック細胞から始まる。数投与量のRORγ-MPRO由来好中球を、好中球の平均数が4x108個の腹腔内注射で試験する。RORγ-MPRO細胞を移入して24時間後から始めて、マウスの腫瘍量の変化を毎日モニタリングする。非誘導RORγ-MPROおよび親MPRO対照に対するRORγ-MPRO細胞の効果を確かめる際には、腫瘍形成性ヒト細胞株に進行する前に、KLN205およびLL/2マウス肺癌細胞を用いて試験をすぐに行う。体重の10％を超える腫瘍を発達した、癌細胞株で処置したマウスを屠殺し、切片化および組織学的検査のために腫瘍および周囲組織をホルマリンで固定する。退縮が30日を超えて全く変化しなくなるまで、または腫瘍成長が再開するまで、腫瘍退縮の証拠があるマウスを飼育する。基準を満たした腫瘍については、マウスを屠殺し、病理学的検査のために腫瘍を採取する。ヒト癌細胞株を用いて行う異種移植アッセイは、マウスにおいて行う異種移植アッセイと同様に行う。
【０１６４】
実施例5:マウス実験に基づくヒト骨髄系前駆体の改変
ヒトRORγホモログをヒト骨髄系前駆体に送達するために、配列を確認したヒトRORγをpInducer21ベクターにクローニングする(SEQ ID NO:7; 図20)。ヒトRORγ-pInducer21構築物を用いて、いくつかの組織供給元から市販されているヒトCD34+骨髄系前駆体、例えば、臍帯血(StemCell Technologies Inc.)、骨髄(Astarte Biologics Inc.)、および末梢血(Allcells Inc.)に感染させる。レンチウイルス上清を用いて、新しく解凍したCD34+骨髄系前駆体に、培養培地中で24時間の回復期間後に感染させる。標準的な方法を用いてレンチウイルス上清を作製し、次いで、濃縮した後に、少量のCD34+を約2〜4時間、感染させる。レンチウイルス感染中およびレンチウイルス感染後に、CD34+細胞を維持し、SCF、Flt3L、IL-2、およびTPOを含有する特殊な培地中で増殖させる。この特定のサイトカインと増殖因子の組み合わせは、CD34+細胞の開始集団を8日以内に平均40倍増やすことが当技術分野において公知である(Murray et al. Exp Hematol. (6): 1019-28, 1999; Singh et al. Radiat Res. 177(6):781-91, 2012)。さらに、8日目の細胞の大半は、細胞表面マーカーCD33およびCD34の存在に基づいて骨髄系前駆体で構成されることが見出された。
【０１６５】
実施例6:ヒト好中球分化モデルにおけるヒトRORγの分化および発現
ヒトRORγをヒト骨髄系前駆体に送達するために、ヒトRORγをMach7構成的レンチウイルスベクターに入れてクローニングした(図13)。Mach7レンチウイルスベクターはヒトEF1αプロモーターを介してヒトRORγ(hRORγ)の発現を起こす。
【０１６６】
NB4細胞にMach7-hRORγレンチウイルスを感染させ、hRORγを視覚化するために抗HA抗体で染色した(図14A、挿入図)。ブラストサイジン選択を生き延びたNB4細胞はhRORγ陽性であった。オールトランスレチノイン酸(ATRA)を用いて細胞をさらに分化させ、6日後に、スライドに載せてサイトスピンにかけ、ギムザ染色した(図14B〜14D)。さらに、分化した好中球の顕著な特徴であるニトロブルーテトラゾリウム還元能力について分化した細胞を試験するために、6日目の細胞をニトロブルーテトラゾリウムアッセイ(NBT)に供した。細胞をホルバールミリステートアセテート(PMA)で30分間刺激し、その後にサイトスピンにかけ、4％パラホルムアルデヒドで固定した。正常分化についての論文において報告されたように、NBTが還元されることで約10％の細胞に黒色の沈殿物が生じた(図14D、挿入図)。
【０１６７】
実施例7:RORγ免疫細胞プロファイルおよび調節される因子を確かめるためのqRT-PCR/RNA-SeqおよびChIP-Seqの使用
細胞死滅アッセイにおいて標的癌細胞株の細胞死(アポトーシスまたは壊死)を誘導することが確かめられたRORγ免疫細胞株を、定量逆転写PCR(qRT-PCR)ならびにディープシークエンシング実験に利用する。結果によって、人工的に作製された機能的RORγ免疫細胞がそのSR/CR対応物を再現しているかどうか確かめることができる。具体的には、全RNAを、(a)対照細胞と、RORγトランスジェニック細胞、(b)「休止」状態の細胞と、ドキシサイクリンを用いてトランスジーンが発現するように誘導された細胞、および(c)骨髄前駆状態にある細胞と、ATRAを用いて好中球に分化させた細胞から単離した。全RNAをTaqman qRT-PCR反応(Life Technologies)に供し、レベルが大幅に(+または-4倍)変化したことが以前に確かめられた転写物を、人工的に作製したSR/CR様骨髄系株において類似性について調べる。RNAに基づく実験と平行して、RORγトランスジェニックMPRO細胞および対照細胞株を、誘導されていない未分化な状態で増殖させ、次いで、分化するように誘導する。誘導して数日後には、かなりの(>95％)分化が起こっており、細胞をトリパンブルー排除によって生存率についてチェックし、生存率が高ければ使用する。それぞれのトランスジェニック株について合計約2x107個の細胞を採取し、ホルムアルデヒドを用いた架橋結合、超音波処理、免疫沈降(例えば、抗マウスRORγ抗体を用いたRORγのプルダウン)、架橋結合の逆転およびChIP'd DNAの単離、最後にライブラリー構築およびHiSeqシークエンシングの標準的なプロトコールに従ってChIP-Seqのために処理した。癌細胞死滅能力をもつ好中球において、どの直接的なRORγ標的が大幅に変化したかを確かめるために、ChIP-Seqから得た結果とTaqmanアッセイからの結果を相互に参照する。RNA-Seqおよびインシリコプロモーター分析データに基づいて、いくつかの強力な、RORγによって調節される遺伝子候補を選択する。
【０１６８】
実施例8:RORγの下流にある重要な因子を特定する
どのRORγ標的が、トランスジェニック骨髄系列細胞のSR/CR様表現型を部分的に担っている可能性があるのか、またはトランスジェニック骨髄系列細胞のSR/CR様表現型にとって必要でない可能性があるのかを確かめるために、cDNA異所発現またはshRNAノックダウンを使用する。潜在的に重要なcDNAの異所発現を2通り試験する。第1のシナリオでは、RORγ標的であり、細胞において大幅にアップレギュレートされていると確認されたcDNAを、pInducer21(特に、改変されていないpInducer21ベクター)を用いることによってMPRO細胞において異所発現させる。第2のシナリオでは、RORγを発現する好中球においてダウンレギュレートされている転写物に相当するcDNAを再導入する。ダウンレギュレートされている遺伝子のレベルを人工的に増加させると、場合によっては、癌死滅が無効化し、おそらく、SR/CR様好中球の癌ホーミング能力が無効化する可能性がある。この目的は、ダウンレギュレートされることがRORγ表現型に不可欠な、RORγの下流にある遺伝子を系統的に同定することである。これらの実験のために、GFPカセットを、赤色蛍光タンパク質(RFP)オープンリーディングフレームと、それに続く2Aペプチドスプライス部位およびピューロマイシン耐性で置換することによってpInducer21を改変する。そうすることで、既にGFPの蛍光を発するRORγトランスジェニック細胞が再度、改変される。RORγによって発現がアップレギュレートされるORFの場合、RFPが同時に産生されることで、関心対象のshRNAを産生する細胞に印を付けるTRIPZレンチウイルスベクター(Thermo Fisher Scientific, Inc.)を用いることによって、shRNAがトランスジェニックRORγ-MPRO細胞に送達される。これらの実験のために、shRNAインサートは工学によってレンチウイルス、または購入した既製のTRIPZウイルス上清に入れられる。以前に改変されていないMPRO細胞における相加効果が生じると、何らかのタンパク質がRORγの有効性に何らかの影響を及ぼしたとみなされる。例えば、高度にダウンレギュレートされているCD148受容体のノックダウンと、高度にアップレギュレートされているスカベンジャー受容体2(Scart2)をアップレギュレーションによって表現型効果だけが生じれば、市販のMPRO細胞株においてpInducer21(アップレギュレーション)とTRIPZ(ダウンレギュレーション)を組み合わせることで、これらの効果が組み合わされた。
【０１６９】
本明細書において引用された全ての特許、特許出願、刊行物の開示は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１７０】
本発明は特定の態様に関連して開示されたが、本発明の他の態様およびバリエーションが本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく当業者によって考案され得ることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、全てのこのような態様および等価なバリエーションを含むと解釈されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図１９−４】
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【図１９−５】
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【図１９−６】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２０−３】
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【図２１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年7月5日(2017.7.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
関連出願の相互参照
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
本願は、35U.S.C.119条(e)に基づいて、2014年10月3日に出願された米国特許仮出願第62/059,342号に係る優先権を主張する。この出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
[本発明1001]
レチノイド関連オーファン受容体γ(RORγ)をコードする核酸配列を含むウイルスベクターを含む組成物であって、RORγの発現が好中球特異的プロモーターの制御下にある、組成物。
[本発明1002]
RORγをコードする核酸配列を含むウイルスベクターを含む細胞であって、RORγの発現が好中球特異的プロモーターの制御下にある、細胞。
[本発明1003]
RORγをコードする核酸配列を含むウイルスベクターを含むCD34陽性(CD34+)細胞であって、RORγの発現が、好中球特異的プロモーター、構成的プロモーター、および誘導性プロモーターからなる群より選択されるプロモーターの制御下にある、CD34陽性(CD34+)細胞。
[本発明1004]
好中球に分化するように拘束され、RORγをコードする核酸配列を含むウイルスベクターを含むCD34+細胞であって、RORγの発現が、好中球特異的プロモーター、構成的プロモーター、および誘導性プロモーターからなる群より選択されるプロモーターの制御下にある、CD34+細胞。
[本発明1005]
ウイルスベクターが、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターからなる群より選択される、本発明1001〜1004のいずれかの組成物または細胞。
[本発明1006]
好中球特異的プロモーターがCD11B(SEQ ID NO.8)である、本発明1001〜1005のいずれかの組成物。
[本発明1007]
それを必要とする哺乳動物において癌を処置する方法であって、レチノイド関連オーファン受容体γ(RORγ)をコードする核酸配列を含むウイルスベクターを含む組成物を哺乳動物に投与する工程を含み、RORγの発現が、好中球特異的プロモーター、構成的プロモーター、および誘導性プロモーターからなる群より選択されるプロモーターの制御下にある、方法。
[本発明1008]
それを必要とする哺乳動物において癌を処置する方法であって、RORγをコードする核酸配列を含むウイルスベクターを含む細胞を哺乳動物に投与する工程を含み、RORγの発現が、好中球特異的プロモーター、構成的プロモーター、および誘導性プロモーターからなる群より選択されるプロモーターの制御下にある、方法。
[本発明1009]
それを必要とする哺乳動物において癌を処置する方法であって、RORγをコードする核酸配列を含むウイルスベクターを含むCD34陽性(CD34+)細胞を哺乳動物に投与する工程を含み、RORγの発現が、好中球特異的プロモーター、構成的プロモーター、および誘導性プロモーターからなる群より選択されるプロモーターの制御下にある、方法。
[本発明1010]
それを必要とする哺乳動物において癌を処置する方法であって、好中球に分化するように拘束されたCD34+細胞を哺乳動物に投与する工程を含み、該細胞がRORγをコードする核酸配列を含むウイルスベクターを含み、RORγの発現が、好中球特異的プロモーター、構成的プロモーター、および誘導性プロモーターからなる群より選択されるプロモーターの制御下にある、方法。
[本発明1011]
哺乳動物において抗腫瘍免疫を提供するための方法であって、RORγをコードする核酸配列を含むウイルスベクターを含む組成物を哺乳動物に投与する工程を含み、RORγの発現が、好中球特異的プロモーター、構成的プロモーター、および誘導性プロモーターからなる群より選択されるプロモーターの制御下にある、方法。
[本発明1012]
哺乳動物において細胞集団または組織に対する自然免疫応答を刺激するための方法であって、RORγをコードする核酸配列を含むウイルスベクターを含む組成物を哺乳動物に投与する工程を含み、RORγの発現が、好中球特異的プロモーター、構成的プロモーター、および誘導性プロモーターからなる群より選択されるプロモーターの制御下にある、方法。
[本発明1013]
ウイルスベクターが、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターからなる群より選択される、本発明1007〜1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
好中球特異的プロモーターがCD11B(SEQ ID NO.8)である、本発明1007〜1013のいずれかの方法。
[本発明1015]
それを必要とする哺乳動物において抗腫瘍免疫の活性化または活性を診断する方法であって、哺乳動物に由来する生物学的試料におけるレチノイド関連オーファン受容体γ(RORγ)の発現レベルを測定する工程を含み、正常対照RORγ発現レベルと比較したRORγ発現レベルの増加が、哺乳動物が抗腫瘍免疫を有するか、または抗腫瘍免疫を発生していることを示す、方法。
[本発明1016]
生物学的試料が、血液、白血球、および好中球からなる群より選択される少なくとも1つを含む、本発明1015の方法。
[本発明1017]
発現レベルが正常対照レベルより少なくとも10％高い、本発明1015の方法。
[本発明1018]
発現レベルが、遺伝子のmRNAの検出、遺伝子によってコードされるタンパク質の検出、および遺伝子によってコードされるタンパク質の生物学的活性の検出からなる群より選択される方法によって測定される、本発明1015の方法。
[本発明1019]
哺乳動物がヒトである、本発明1007〜1012または本発明1015のいずれかの方法。
[本発明1020]
レチノイド関連オーファン受容体γ(RORγ)に対するプローブセットおよびそれを使用するための説明書を含むキットであって、説明書が、
i.それを必要とする哺乳動物に由来する試料中の自然免疫細胞におけるRORγレベルを検出すること、
ii.抗腫瘍免疫の存在または非存在を示すこと、ならびに
iii.RORγをコードするウイルス核酸配列を含む組成物を哺乳動物に投与する工程を含み、RORγの発現が、好中球特異的プロモーター、構成的プロモーター、および誘導性プロモーターからなる群より選択されるプロモーターの制御下にある、抗腫瘍免疫処置を哺乳動物において施行、変更、または終了するべきかどうかを助言すること
を含む、キット。
本発明によって定義される組成物および物は、下記で示される実施例と関連して単離されたか、または別のやり方で製造された。本発明の他の特徴および利点は詳細な説明および添付の特許請求の範囲から明らかである。
【国際調査報告】
2017532325.tif 000032
2017532325.tif 000033