(57)【要約】免疫系を有する対象内の癌細胞を治療するための組成物であり、該組成物は、少なくとも一つの変異を有するヤタポックスウイルス属のウイルスを、含む。ある実施態様では、該変異は、該ウイルスによる、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）結合タンパク質の発現抑制をもたらす。別の実施態様では、該ウイルスによる、チミジンキナーゼ（ＴＫ）の発現抑制をもたらす。別の実施態様では、該変異は、細菌性フラジェリンを発現させる導入遺伝子をもつウイルスを作用させる。【選択図】図１
2017526633.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫系を有する対象内の癌細胞を治療するための組成物であって、少なくとも一つの変異を有するヤタポックスウイルス属のウイルスを含み、前記少なくとも一つの変異は、前記ウイルスによるＴＮＦ結合タンパク質の発現抑制をもたらす、組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物であって、前記ウイルスが、ＭＨＣ−１軽鎖に結合可能な構造を有するＴＮＦ結合タンパク質の発現を抑制する、組成物。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の組成物であって、前記ウイルスが、細菌性フラジェリンタンパク質を発現させる導入遺伝子をコードするヤタポックスウイルスである、組成物。
【請求項４】
請求項３に記載の組成物であって、重合したフラジェリンタンパク質が、前記細菌性フラジェリンの主要成分である、組成物。
【請求項５】
請求項３又は４に記載の組成物であって、前記導入遺伝子が、ネズミチフス菌の遺伝子（「ｆｌｉＣ」）の産物である、組成物。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれかに記載の組成物であって、前記ウイルスが、タナポックスウイルス（ＴＰＶ）である、組成物。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれかに記載の組成物であって、前記少なくとも一つの変異が、ＴＰＶの２Ｌ遺伝子によってコードされる前記ＴＮＦ結合タンパク質の発現を抑制する、組成物。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれかに記載の組成物であって、前記ウイルスが、第二の変異を有し、前記第二の変異が、前記ウイルスによるチミジンキナーゼの発現抑制をもたらす、組成物。
【請求項９】
請求項１ないし５ならびに７又は８のいずれかに記載の組成物であって、前記ウイルスが、タナポックスウイルス（ＴＰＶ）であり、第二の変異が、ＴＰＶの６６Ｒ遺伝子によってコードされるチミジンキナーゼの発現を抑制する、組成物。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれかに記載の組成物であって、前記ウイルスが、さらに、前記対象の前記免疫系を活性化させる導入遺伝子をコードする、組成物。
【請求項１１】
請求項１ないし１０のいずれかに記載の組成物であって、前記ウイルスが、さらに、前記癌細胞のアポトーシスを増大させる導入遺伝子をコードする、組成物。
【請求項１２】
請求項１ないし１１のいずれかに記載の組成物であって、前記ウイルスが、さらに、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光レポーターを導入する導入遺伝子をコードする、組成物。
【請求項１３】
請求項１ないし１２のいずれかに記載の組成物であって、前記ウイルスが、さらに、緑色蛍光タンパク質蛍光レポーターを導入する導入遺伝子をコードする、組成物。
【請求項１４】
少なくとも一つの遺伝子を対象内の癌細胞に送達する方法であって：
ヤタポックスウイルス属のウイルスを変異させて、ＭＨＣ−１軽鎖に結合可能な構造を有するＴＮＦ結合タンパク質の発現を抑制するように改変すること；及び
前記改変されたヤタポックスウイルス属のウイルスを、前記対象の全身に投与すること：
が含まれる、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、さらに、前記ウイルス内の前記少なくとも一つの遺伝子をコードすることで前記ウイルスを改変することが含まれ、前記少なくとも一つの遺伝子が、前記対象における、前記癌細胞のアポトーシスを増大させる又は免疫応答を活性化させる、方法。
【請求項１６】
免疫系を有する対象内の癌細胞を治療するための組成物であって、少なくとも一つの変異を有するヤタポックスウイルス属のウイルスを含み、前記少なくとも一つの変異が、ＴＮＦ結合タンパク質の発現抑制をもたらす、組成物。
【請求項１７】
請求項１６に記載の組成物であって、前記ウイルスが、ＭＨＣ−１軽鎖に結合可能な構造を有するＴＮＦ結合タンパク質の発現を抑制する、組成物。
【請求項１８】
請求項１６に記載の組成物であって、前記ウイルスが、細菌性フラジェリンタンパク質を発現させる導入遺伝子をコードするヤタポックスウイルスである、組成物。
【請求項１９】
請求項１８に記載の組成物であって、前記導入遺伝子が、ネズミチフス菌の遺伝子（「ｆｌｉＣ」）の産物である、組成物。
【請求項２０】
請求項１６に記載の組成物であって、前記ウイルスが、タナポックスウイルス（ＴＰＶ）であり、前記少なくとも一つの変異が、ＴＰＶの２Ｌ遺伝子によってコードされる前記ＴＮＦ結合タンパク質の発現を抑制する、組成物。
【請求項２１】
請求項１６に記載の組成物であって、前記ウイルスが、第二の変異を有し、第二の変異が、前記ウイルスによるチミジンキナーゼの発現抑制をもたらす、組成物。
【請求項２２】
請求項１６に記載の組成物であって、前記ウイルスが、タナポックスウイルス（ＴＰＶ）であり、第二の変異が、ＴＰＶの６６Ｒ遺伝子によってコードされるチミジンキナーゼの発現を抑制する、組成物。
【請求項２３】
請求項１６に記載の組成物であって、前記ウイルスが、さらに、前記対象の前記免疫系を活性化させる導入遺伝子をコードする、組成物。
【請求項２４】
請求項１６に記載の組成物であって、前記ウイルスが、さらに、前記癌細胞のアポトーシスを増大させる導入遺伝子をコードする、組成物。
【請求項２５】
免疫系を有する対象内の癌細胞を治療するための組成物であって、少なくとも一つの変異を有するヤタポックスウイルス属のウイルスを含み、前記少なくとも一つの変異が、チミジンキナーゼ（ＴＫ）の発現抑制をもたらす、組成物。
【請求項２６】
請求項２５に記載の組成物であって、前記ウイルスが、細菌性フラジェリンタンパク質を発現させる導入遺伝子をコードするヤタポックスウイルスである、組成物。
【請求項２７】
請求項２６に記載の組成物であって、前記導入遺伝子が、ネズミチフス菌の遺伝子（「ｆｌｉＣ」）の産物である、組成物。
【請求項２８】
請求項２５に記載の組成物であって、前記ウイルスが、タナポックスウイルス（ＴＰＶ）であり、前記少なくとも一つの変異が、ＴＰＶの６６Ｒ遺伝子によってコードされる前記チミジンキナーゼ（ＴＫ）の発現を抑制する、組成物。
【請求項２９】
請求項２５に記載の組成物であって、前記ウイルスが、第二の変異を有し、第二の変異が、前記ウイルスによるＴＮＦ結合タンパク質の発現抑制をもたらす、組成物。
【請求項３０】
請求項２５に記載の組成物であって、前記ウイルスが、タナポックスウイルス（ＴＰＶ）であり、第二の変異が、ＴＰＶの２Ｌ遺伝子によってコードされる前記ＴＮＦ結合タンパク質の発現を抑制する、組成物。
【請求項３１】
請求項３０に記載の組成物であって、前記ウイルスが、ＭＨＣ−１軽鎖に結合可能な構造を有するＴＮＦ結合タンパク質の発現を抑制する、組成物。
【請求項３２】
請求項２５に記載の組成物であって、前記ウイルスが、さらに、前記癌細胞のアポトーシスを増大させる導入遺伝子をコードする、組成物。
【請求項３３】
請求項２５に記載の組成物であって、前記ウイルスが、さらに、前記対象の前記免疫系を活性化させる導入遺伝子をコードする、組成物。
【請求項３４】
少なくとも一つの遺伝子を対象内の癌細胞に送達する方法であって：
ヤタポックスウイルス属のウイルスを変異させて、ＭＨＣ−１軽鎖に結合可能な構造を有するＴＮＦ結合タンパク質の発現を抑制するように改変すること；ならびに
前記改変されたヤタポックスウイルス属のウイルスを、前記対象の全身に投与すること：
が含まれる、方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の方法であって、さらに、前記ウイルス内の前記少なくとも一つの遺伝子をコードすることで前記ウイルスを改変することが含まれ、前記少なくとも一つの遺伝子が、前記対象における、前記癌細胞のアポトーシスを増大させる又は免疫応答を活性化させる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、対象内の癌細胞を治療するための組成物及びその方法に、関する。
【発明の概要】
【０００２】
本開示の一つの態様は、免疫系を有する対象内の癌細胞を治療するための組成物である。該組成物は、少なくとも一つの変異を有するヤタポックスウイルス属のウイルスを、含む。該少なくとも一つの変異は、該ウイルスによる、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）結合タンパク質の発現抑制をもたらす。
【０００３】
本開示の別の態様は、免疫系を有する対象内の癌細胞を治療するための、ヤタポックスウイルス属のウイルスを含む、組成物であって、該ウイルスは、少なくとも一つの変異を有し、該少なくとも一つの変異は、チミジンキナーゼ（ＴＫ）の発現抑制をもたらす。
【０００４】
本開示の別の態様において、免疫系を有する対象内の癌細胞を治療するための該組成物には、細菌性フラジェリンを発現させる導入遺伝子をコードするポックスウイルスが、含まれる。
【０００５】
本開示のさらに別の態様において、癌細胞を有する対象を治療する方法には、該対象に組成物を投与することが含まれ、該組成物には、そのウイルスによるＴＮＦ結合タンパク質の発現抑制をもたらす少なくとも一つの変異を有するヤタポックスウイルス属のウイルスが、含まれる。
【０００６】
本開示のさらに別の態様によれば、ＭＨＣクラス１分子（ＭＨＣ−１）軽鎖に結合可能な構造を有するＴＮＦ結合タンパク質の発現を抑制するように、ヤタポックスウイルス属のウイルスを変異させて改変した、少なくとも一つの遺伝子が、対象内の癌細胞に送達される。該ウイルスは、該ウイルス中で少なくとも一つの遺伝子をコードするようにも改変され、該ウイルス中でコードされる該少なくとも一つの遺伝子は、該癌細胞の促進されたアポトーシスをもたらす、又は該対象内の免疫応答を活性化させる。該改変されたウイルスは、該対象に投与される。
【０００７】
本明細書に記載の癌性腫瘍を治療するための医薬組成物及び方法は、癌細胞の効果的な治療が可能であり、従来型の治療方法では可能性のある重篤な感染又は副作用のリスクが限定され、そしていくつかのケースでは、従来型の治療方法との併用が可能である。本明細書に記載の改変されたポックスウイルスは、未改変のポックスウイルスに比べ、増大した癌選択性及び増大した癌致死性を有する結果を示しており、投与した対象において軽度で自己限定性の発熱性疾患のみを引き起こす等の好ましい腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）特性を維持すると期待される。
【０００８】
本発明のこれらのならびに他の、特性、利点、及び目的は、当業者が以下の明細書の記載、請求項、及び添付の図面を検討する際に、さらに理解され、正しく評価されるはずである。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、発現した導入遺伝子及び蛍光レポーター遺伝子を挿入するためのｐ２ＫＯ法によって改変された際の、組み換えタナポックスウイルス（ＴＰＶ）の一つの実施形態を示す、概略図である。
【図２Ａ】図２Ａは、ＨＣＴ  １１６細胞を異種移植され、かつビヒクル（対照溶液のみ）で治療された、無胸腺ヌードマウスにおける腫瘍体積の平均値を示す、グラフである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＨＣＴ  １１６細胞を異種移植され、かつ組み換えＴＰＶの一つの実施形態（ＴＰＶ／ｅｇｆｐ）で治療された、無胸腺ヌードマウスにおける腫瘍体積の平均値を、ビヒクル（対照溶液のみ）で治療された際の腫瘍体積の平均値と比較して示す、グラフである。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ＨＣＴ  １１６細胞を異種移植され、かつ組み換えＴＰＶの一つの実施形態（ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ６６Ｒ／ｍＭＣＰ−１）で治療された、無胸腺ヌードマウスにおける腫瘍体積の平均値を、ビヒクル（対照溶液のみ）で治療された際の腫瘍体積の平均値と比較して示す、グラフである。
【図２Ｄ】図２Ｄは、ＨＣＴ  １１６細胞を異種移植され、かつ組み換えＴＰＶの一つの実施形態（ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ６６Ｒ／ｍＧＭ−ＣＳＦ）で治療された、無胸腺ヌードマウスにおける腫瘍体積の平均値を、ビヒクル（対照溶液のみ）で治療された際の腫瘍体積の平均値と比較して示す、グラフである。
【図２Ｅ】図２Ｅは、ＨＣＴ  １１６細胞を異種移植され、かつ組み換えＴＰＶの一つの実施形態（ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ６６Ｒ／ｆｌｉＣ）で治療された、無胸腺ヌードマウスにおける腫瘍体積の平均値を、ビヒクル（対照溶液のみ）で治療された際の腫瘍体積の平均値と比較して示す、グラフである。
【図２Ｆ】図２Ｆは、ＨＣＴ  １１６細胞を異種移植され、かつ組み換えＴＰＶの一つの実施形態（ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ６６Ｒ）で治療された、無胸腺ヌードマウスにおける腫瘍体積の平均値を、ビヒクル（対照溶液のみ）で治療された際の腫瘍体積の平均値と比較して示す、グラフである。
【図２Ｇ】図２Ｇは、ＨＣＴ  １１６細胞を異種移植され、かつ組み換えＴＰＶの一つの実施形態（ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ２Ｌ）で治療された、無胸腺ヌードマウスにおける腫瘍体積の平均値を、ビヒクル（対照溶液のみ）で治療された際の腫瘍体積の平均値と比較して示す、グラフである。
【図２Ｈ】図２Ｈは、ＨＣＴ  １１６細胞を異種移植され、かつ組み換えＴＰＶの一つの実施形態（ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ２Ｌ／Δ６６Ｒ／ｆｌｉＣ）で治療された、無胸腺ヌードマウスにおける腫瘍体積の平均値を、ビヒクル（対照溶液のみ）で治療された際の腫瘍体積の平均値と比較して示す、グラフである。
【図３】図３には、蛍光レポーター遺伝子を発現するように改変された組み換えＴＰＶの一つの実施形態の感染によって産生された、感染後２日目、４日目、及び６日目でのウイルス性プラークの一つの実施形態の図が、含まれる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本明細書に記載の目的のため、用語の「上側の」、「下側の」、「右側の」、「左側の」、「反対側の」、「正面の」、「垂直の」、「水平の」、及びそれらの派生語は、図１の方向に合わせた際の、該組成物に関する。しかし、特記しない限り、該組成物には様々な代替の方向が想定され得て、該方法が様々なステップを含み得ることを、理解すべきである。添付される図面に示される、及び本明細書の以下に記載される、特定の発明ならびにプロセスは、添付される請求の範囲に定義される本発明の概念の単なる例示であることも、理解すべきである。したがって、請求項において特記されない限り、本明細書に開示される実施形態に関する、特定の寸法及び他の物理的特性が、本発明を限定すると考えるべきではない。
【００１１】
癌細胞及び／又は形質転換細胞の注入といういくつかの選択肢が、ワクシニアンウイルス（ＶＡＣＶ）等のいくつかのウイルスの腫瘍溶解療法の変形形態であることが示されてきたが、タナポックスウイルス（ＴＰＶ）を含むがこれに限定されない、ヤタポックスウイルス属のポックスウイルス等の野生型ポックスウイルスは、一般に、高度の天然の癌選択性を有するとは考えられていない。著しい天然の癌選択性を有しないウイルスにおいては、遺伝子操作を用いて、癌細胞選択性が強化されている。
【００１２】
ポックスウイルスは、必ずしも高度の天然の癌選択性を有しないが、ポックスウイルス及びより具体的にヤタポックスウイルス属のポックスウイルスは、いくつかの固有の特性を有しており、そのために腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）として使用するための改変に適している。ポックスウイルスは、大量の遺伝物質が加えられても収容できるウイルスゲノムを有しており、かつ攻撃能力及び防護能力のための固有の配列を備えている。ポックスウイルスのゲノムは、感染に関係する細胞表面のエピトープを宿主の免疫監視機構からの隠蔽、いくつかの宿主の免疫反応及び炎症反応の阻止及び回避、ならびに、宿主のサイトカイン及びサイトカイン受容体を模倣する、ウイルスによってコードされるペプチドによる細胞外環境からの信号の途絶、に当てられる、様々な免疫調節タンパク質をコードする。また、ポックスウイルスは、二種類の異なる子孫ビリオン、成熟ビリオン（ＭＶ）及びエンベロープ型ビリオン（ＥＶ）、を産生する。ＭＶ型の子孫ウイルスは、単一の脂質二重層内に封入され、細胞溶解によってのみ宿主細胞から放出される。ＥＶ型の子孫ウイルスは、二つ目の外側のエンベロープを獲得した後に、宿主細胞から、おそらく宿主細胞のトランスゴルジネットワークから、活発に放出され、感染された細胞から放出されるまでは被覆ビリオン（ＷＶ）と呼ばれ、その後にはＥＶ型ビリオンと呼ばれる。ＥＶ型のポックスウイルスは、血流及びリンパ管ネットワークを介して動き回ることで宿主内の遠隔部位に該ポックスウイルスをまき散らすことになる、特殊な形状のウイルスである。ＥＶ型は、細胞外環境に露出される膜貫通タンパク質を６個しか有していないのに対し、ＭＶ型は約２０個を有しているため、この目的のために良く研究されている。露出されるエピトープの数が少ないことは、ＭＶ型に比べて、ＥＶ型が免疫無効化から逃れやすいことを、意味する。
【００１３】
また、ヤタポックスウイルス属の一員でありかつ野生型ポックスウイルスである、タナポックスウイルス（ＴＰＶ）は、ＯＶの発現において有利である別の特性を有しており、このためにＯＶ発現に好ましいヤタポックスウイルス属の一員である。ＴＰＶに感染したヒトは、軽度かつ自己限定性の発熱性疾患を経験するだけであるが、おそらくこれは、ＴＰＶの感染が通常は身体末梢部に限定されるためである。赤道アフリカの地域（そこではＴＰＶ感染が風土病である）から離れた地域では、ヒトはＴＰＶに対して免疫学的にナイーブである。その上、ＴＰＶの人から人への感染は観察されておらず、ＯＶにおいて非常に望ましい安全性を有している。
【００１４】
遺伝子操作されたポックスウイルスの試料は、ヤタポックスウイルス属の試料を含め、本明細書に開示され、癌細胞治療用の組成物に取り込まれるＯＶとして用いられ、癌細胞を治療する方法において用いられる。組み換えＴＰＶを取り込むいくつかの好ましい実施形態を含む、いくつかの好ましい実施形態も本明細書に記載される。
【００１５】
要約すると、以下にさらに記載のように、本開示の一つの態様は、免疫系を有する対象内の癌細胞を治療するための組成物である。一つの態様において、該組成物は、少なくとも一つの変異を有するヤタポックスウイルス属のウイルスを、含む。該少なくとも一つの変異は、該ウイルスによる、ＴＮＦ結合タンパク質の発現抑制をもたらす。本開示の別の態様は、免疫系を有する対象内の癌細胞を治療するための、ヤタポックスウイルス属のウイルスを含む、組成物であって、該ウイルスは、チミジンキナーゼ（ＴＫ）の発現抑制をもたらす少なくとも一つの変異を有する。別の態様において、該組成物には、細菌性フラジェリンを発現させる導入遺伝子をコードするポックスウイルスが、含まれる。本明細書では、用語の「対象」には、ヒト及び動物の対象、ならびに好ましくは哺乳類の対象が、含まれる。
【００１６】
以下により詳細に記載されるように、癌細胞を有する対象を治療する方法には、該対象に組成物を投与することが含まれ、該組成物は、本明細書に記載の通りである。例えば、一つの実施形態において、該組成物には、そのウイルスによるＴＮＦ結合タンパク質の発現抑制をもたらす、少なくとも一つの変異を有するヤタポックスウイルス属のウイルスが、含まれる。別の実施形態において、該組成物には、ヤタポックスウイルス属のウイルスが含まれ、該ウイルスは、ＴＫの発現抑制をもたらす少なくとも一つの変異を有する。さらに別の実施形態において、該組成物には、細菌性フラジェリンを発現させる導入遺伝子をコードするポックスウイルスが含まれる。これらの変異のいずれか又は全ては、単独で又は何らかの組合せで、該組成物内に存在することができる。また、該組成物は、標的として一群の癌細胞に送達されることができ、あるいは対象の全身に送達されることができる。
【００１７】
本開示のさらに別の態様によれば、以下により詳細に記載されるように、ＭＨＣ−１軽鎖に結合可能な構造を有するＴＮＦ結合タンパク質の発現を抑制するように、ヤタポックスウイルス属のウイルスを変異させて改変した、少なくとも一つの遺伝子が、対象内の癌細胞に送達される。該ウイルスは、該ウイルス中で少なくとも一つの遺伝子をコードするようにも改変され、該ウイルス中でコードされる該少なくとも一つの遺伝子は、該癌細胞の促進されたアポトーシスをもたらす、又は該対象内の免疫応答を活性化させる。該改変されたウイルスは、該対象に投与される。
【００１８】
いくつかの実施形態において、該ポックスウイルスは、本明細書においてＴＮＦ結合タンパク質とも呼ばれる、ＴＮＦ結合活性を有する宿主域因子の発現を抑制するように、遺伝子改変される。発現が抑制される、該ＴＮＦ結合タンパク質は、ＭＨＣ−１重鎖に構造が類似しており、該コードされるＴＮＦ結合タンパク質は、ＭＨＣ−１軽鎖と相互作用できる。ＴＰＶにおいて、該ＴＮＦ結合タンパク質は、２Ｌ遺伝子でコードされる。該２Ｌ遺伝子が該ＴＮＦ結合タンパク質の発現を除去するように又は抑制するように別の形で変異されている、組み換えＴＰＶは、本明細書において、「２Ｌ欠失」又は「Δ２Ｌ」と呼ばれることもある。正常なポックスウイルスの感染において、分泌されるＴＮＦ結合タンパク質は、該感染された細胞と相互作用するために存在するＴＮＦに結合して効果的にＴＮＦの量を減らすことで、宿主の炎症及び抗ウイルス性免疫応答を鈍らせるように、作用する。ポックスウイルスにとってはこれが望ましい転帰であるが、ポックスウイルスをＯＶとして用いる場合、治療対象の腫瘍が被る炎症の量が、減るのではなく、増えることが有利である。該ポックスウイルスとしての組み換えＴＰＶに基づくＯＶで治療される腫瘍を有するヒト対象において、該組み換えＴＰＶにおける２Ｌ遺伝子を除去すると、（２Ｌ遺伝子を有するＴＰＶに感染した腫瘍に比べ）、該腫瘍部位でのＴＮＦの濃度を効果的に増大させることができる。ＴＮＦの濃度が増大すると、最終的には、腫瘍クリアランスを増やすように作用することができる。以前に、該２Ｌ遺伝子がマウスのＴＮＦにではなく、ヒトのＴＮＦに結合することが示されていたため、本明細書に記載されるいくつかの組み換えＴＰＶにおける２Ｌ遺伝子の除去が、マウス実験時の腫瘍クリアランスにおける重要因子であると考えられたことはないが、霊長類及び人類の腫瘍クリアランスにおけるより重要な因子であると考えられている。該２Ｌ遺伝子の除去は、異種移植された無胸腺ヌードマウスにおいて用いられた組み換えＴＰＶの特定の実施例において実施され、その場合には、マウスでの実験が、癌のウイルス療法のよりヒトに近い霊長類モデルにおけるポックスウイルスに基づくＯＶのさらなる実験に対する重要なステップであるため、本明細書に記載のように、該異種移植片がヒトの癌細胞で作られた。
【００１９】
いくつかの実施形態において、該ポックスウイルスの癌選択性は、チミジンキナーゼ（ＴＫ）の発現を抑制するように該ポックスウイルスを改変することで、増大する。ＴＰＶにおいて、ＴＫをコードする遺伝子は６６Ｒとして知られている。ＴＫの発現抑制のために６６Ｒ遺伝子が除去されている又は他の形で変異されている、組み換えＴＰＶは、本明細書において、「６６Ｒ欠失」又は「Δ６６Ｒ」と呼ばれることもある。ＴＫの腫瘍細胞における活性は、癌細胞内の細胞質チミジンキナーゼ１（ＴＫ１）の活性のために、構造的に高い。これは正常な細胞と対照的であって、正常な細胞においては、ＴＫの活性レベルが細胞周期のＳ期に最高となり、他の期ではほぼ検知不能である。細胞質ＴＫ１は、ヌクレオチド合成における一つのステップ、チミジンのチミジンモノホスフェートへの変換、を触媒する。このため、癌細胞は、細胞周期を通してＴＫ１を発現させ、その結果、細胞周期のどの段階でも利用可能な、チミジンモノホスフェートの大きな細胞質プールを有することになる。ＴＫをコードする遺伝子を抑制することで、特にヤタポックスウイルス属のポックスウイルスにおいて、該ポックスウイルスは、ＴＫをコードする遺伝子が未処理の場合に比べて、より高い癌細胞選択性を有する。６６Ｒ遺伝子の除去は、マウスが通常はＴＰＶの動物宿主でないにも関わらず、本明細書に記載の異種移植された無胸腺ヌードマウスにおいて用いられた組み換えＴＰＶの特定の実施例のいくつかにおいて実施された。この環境での６６Ｒ遺伝子の除去は、６６Ｒ遺伝子の除去が、許容細胞（ヒト癌性腫瘍細胞等）に非複製ＴＰＶをもたらさないことを、示した。
【００２０】
また、該ポックスウイルスの癌致死性は、導入遺伝子を有するポックスウイルスをコードして、癌細胞のアポトーシスを増大させる又は対象の免疫系を活性化することで、増大させることができる。該ポックスウイルスをコードするのに用いることができる導入遺伝子の例には、サイトカイン、ケモカイン、抗原提示ポリペプチド、又は細菌性抗原を、発現する遺伝子が含まれるが、これらに限定されるものではない。本明細書において、サイトカインは、免疫細胞を刺激する、免疫細胞の成長を促進する、又は免疫細胞を特定の部位に向かわせる等の、免疫細胞又は免疫系を改変する効果を有するタンパク質又はポリペプチドを意味する。いくつかの好ましい実施形態において、用いられる該ポックスウイルスは、顆粒球−単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージ走化性因子タンパク質１（ＣＣＬ２、ＭＣＰ−１及びＭＣＦ−１とも呼ばれる）、あるいは細菌性フラジェリン（ＦｌｉＣ、サルモネラ・エンテリカにおけるｆｌｉＣ遺伝子の産物）によって作動可能になった、組み換えＴＰＶである。マウスに用いるための組み換えＴＰＶで実験する際に、該組み換えＴＰＶに適合する場合、これらの導入遺伝子のマウス（ｍ）バージョン、すなわち、ｍＧＭ‐ＣＳＦ、ｍＣＣＬ２、ｍＭＣＰ−１、ｍＭＣＦ−１を用いた。試験又は治療を実施する対象用のこれらの導入遺伝子の好適なバージョン又は効果的なバージョンを用いることが好ましい。
【００２１】
重合したフラジェリンは、本開示にしたがって用いられる細菌性鞭毛の主要な成分である。本明細書に記載の特定の実験で用いられた該フラジェリンは、ネズミチフス菌遺伝子の産物、ｆｌｉＣであった。ｆｌｉＣ及び他の細菌性フラジェリンは、ｔｏｌｌ様受容体５（ＴＬＲ５）の同族リガンドであって、ＭｙＤ８８依存性細胞内シグナリングを介する哺乳類細胞における固有の免疫応答、最終的には転写因子ＮＦκＢの活性化の、強力な活性化因子である。該フラジェリンは、強力でかつ多面的な病原性因子であって、細菌の病原性において他の重要な役割を有する。
【００２２】
上記のポックスウイルスの実施形態におけるゲノムの改変に加えて、蛍光レポーター導入遺伝子が、任意選択で、該ポックスウイルスのゲノム内に挿入される。培養細胞におけるウイルス感染の可視化は、蛍光レポーター導入遺伝子の包含によって大幅に容易になり、その結果、本明細書に記載のポックスウイルス変異体を用いる研究が容易になる。好ましい蛍光レポーター導入遺伝子には、レポーターのｍＣｈｅｒｒｙ（励起波長、５８７ｎｍ；発光波長、６１０ｎｍ）及び高感度緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ：励起波長、４７５ｎｍ；発光波長、５０９ｎｍ）が含まれる。
【００２３】
該ポックスウイルスの好ましい実施形態には、好ましくは、上記の変異又は挿入のいずれか又は全てを有するヤタポックスウイルス属のウイルスが含まれ、該変異又は挿入は、好ましくは、ｐ２ＫＯベクター法を用いて実施される。一つの好ましい実施形態において、ヤタポックスウイルス属の一員である、組み換えＴＰＶは、本明細書で用いられるｐ２ＫＯ法で改変され、その概略は図１に示される。図１に示されるように、二つのワクシニアウルス（ＶＡＣＶ）由来の初期／後期合成プロモーターが、該ウイルスをコードするための所望される発現される導入遺伝子（例えば、ｍＧＭ−ＣＳＦ、ｍＣＣＬ２、ｍＭＣＰ−１、ｍＭＣＦ−１、ｆｌｉＣ）及び任意選択の蛍光レポーター導入遺伝子の発現を推進するために、用いられる。図１に示されるｐ２ＫＯベクター法の実施形態には、ｐ２ＫＯ発現カセット（左側及び右側の側面、該発現される導入遺伝子又は蛍光レポーター導入遺伝子を含む少なくとも一つの介在するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と、少なくとも一つのプロモーターを、含む）をＴＰＶのウイルスゲノムに、以下により詳細に記載されるように、トランスフェクション／感染の処置の間の相同組み換えダブルクロスオーバーを介して移植することが含まれる。この様にして、該ｐ２ＫＯ発現カセットは、ウイルスゲノムのフランキング配列を用いることで、ＴＰＶのウイルスゲノム内の特定の部位に導かれ、組み換えＴＰＶ内での所望される発現される導入遺伝子及び任意選択の蛍光レポーター導入遺伝子の同時発現と共に、所望される遺伝子の標的化除去を、もたらす。
【００２４】
図１に示される該ＴＰＶ  ｐ２ＫＯ発現カセットの実施形態において、複数のポックスウイルス初期／後期合成プロモーターが、多数の導入遺伝子の発現を可能にした。該ｐ２ＫＯ発現カセットは、標的遺伝子に由来するウイルスゲノムのフランキング配列を用いることで、ウイルスゲノム内の特定の部位への挿入を導き、該ウイルスを作動可能にする、蛍光レポーター導入遺伝子及び発現される導入遺伝子の同時発現と共に、所望される遺伝子の標的化除去を、もたらした。図１に示される実施形態には、蛍光レポーター導入遺伝子及び発現される導入遺伝子の双方が示されている。別の実施形態においては、蛍光レポーター導入遺伝子又は発現される導入遺伝子のいずれかが、ウイルスゲノム内への挿入のための該ｐ２ＫＯ発現カセット内に存在することができる。該左側及び右側の側面は、固有の制限認識部位の対に結合されている。該フランキング領域は、５'−（左側）側面上のＳａｃ  Ｉ制限酵素認識部位とＮｏｔ  Ｉ制限酵素認識部位との間、３'−（右側）側面上のＥｃｏＲ  Ｉ制限酵素認識部位とＨｉｎｄ  ＩＩＩ制限酵素認識部位との間で、ｐ２ＫＯベクターにライゲートされる。発現されるべき遺伝子（該蛍光レポーター導入遺伝子及び／又は該発現される導入遺伝子）は、固有の５'−ＢａｍＨ  Ｉ制限酵素認識部位及び３'−Ｘｍａ  Ｉ制限酵素認識部位に結合される。これらにより、好適な制限酵素認識部位に結合したＰＣＲ増幅産物の単純かつ指向性のライゲーションが可能となる。
【００２５】
本明細書に記載の実施例のためのｐ２ＫＯ法において用いられる関連プライマーを、以下の表１に示す。それぞれのケースで、挿入される制限エンドヌクレアーゼ認識部位を下線で示す。該当する場合、フォワードプライマーにおいて、その開始コドンを灰色の陰影付きの太字で、リバースプライマーにおいて、その停止コドンを灰色の陰影付きの太字で、示す。本明細書に記載の実施例において用いられる左側及び右側の側面プライマーは、開始コドン又は停止コドンを含まなかった。
【００２６】
表１：ｐ２ＫＯ除去／挿入ベクターの調製に用いられるプライマー
2017526633.tif 000003
【００２７】
発現される導入遺伝子の挿入部位に関してｐ２ＫＯ法の様々な実施形態において用いられるＯＲＦには、ｍＣＣＬ２導入遺伝子、ｍＧＭ−ＣＳＦ導入遺伝子、及びｆｌｉＣ導入遺伝子が含まれる。以下に引用の実施例において用いられるｍＣＣＬ２導入遺伝子は、ＯＲＦ含有プラスミド（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄから入手可能）として購入したｍＣＣＬ２  ｃＤＮＡクローンＯＲＦを用いて、調製した。以下に引用の実施例において用いられるｍＧＭ−ＣＳＦ導入遺伝子は、Ｇｒａｎｔ  ＭｃＦａｄｄｅｎ博士から提供されたｍＧＭ−ＣＳＦのｃＤＮＡクローンＯＲＦを用いて、調製した。ｍＣＣＬ２、ｍＧＭ−ＣＳＦ、及びｆｌｉＣのＯＲＦは、それらのベクターからＰＣＲによって増幅し、得られた増幅産物の５'終端及び３'終端上に、それぞれ、ＢａｍＨＩ制限酵素認識配列及びＸｍａＩ制限酵素認識配列を加えた。該ｍＣＣＬ２、ｍＧＭ−ＣＳＦ、及びｆｌｉＣのＯＲＦを、ｐ２ＫＯ除去／挿入ベクター内にライゲートさせた。
【００２８】
本明細書では、ｐ２ＫＯ法を用いて産生される組み換えＴＰＶの様々な実施形態を記述するため、下記の表２に示される、以下の略語を用いる。ｐ２ＫＯ除去／挿入法が本明細書に記載されるが、該ゲノムからの遺伝子除去又は該ゲノム内への導入遺伝子挿入用に知られているいかなる方法も、本明細書に記載の組み換えＴＰＶの形成に使用可能であることを、理解すべきである。
【００２９】
表２：組み換えＴＰＶの略語
2017526633.tif 000004
【００３０】
マウス宿主において組み換えＴＰＶを試験するための好適な細胞株を選定するため、最小に改変された組み換えＴＰＶのＴＰＶ／ｅｇｆｐをヒト大腸癌細胞株群に対して試験して、最良のウイルス複製を可能にし、直接的なウイルスによる癌細胞の溶解効果を最大化する、細胞株を選択した。ＴＰＶ／ｅｇｆｐの複製について試験したヒト大腸癌（ｈＣＲＣ）細胞株には、ＨＣＴ  １１６、ＣＯＬＯ２０５、ＳＷ１４６３、及びＷｉＤｒが含まれた。癌細胞のウイルス溶解は、いくつかのケースにおける腫瘍クリアランスにとって重要であるが、ウイルス細胞溶解は、腫瘍の生存及びクリアランスに影響する多くの要因の一つにすぎず、免疫細胞動員も役割を果たすことができる。ＨＣＴ  １１６が、対照であるヨザル腎臓（ＯＭＫ）細胞株より少ない子孫ビリオンを産生したが、ＨＣＴ  １１６は、試験したｈＣＲＣ細胞株の内で生産性が最も高かった。また、ＨＣＴ  １１６が惹起する腫瘍において、多くのＯＶが特性化されている。これらの理由から、ｉｎ  ｖｉｖｏでの組み換えＴＰＶの癌溶解能をさらに特性化する実験に、ＨＣＴ  １１６を用いた。
【００３１】
組み換えＴＰＶの様々な実施形態を評価するため、５×１０６個のＨＣＴ  １１６細胞を無胸腺ヌードマウスの背面に皮下注射することにより、ＨＣＴ  １１６細胞株で無胸腺ヌードマウスに腫瘍を惹起させた。腫瘍の大きさが７５ｍｍ３に達した際、５匹ずつのマウスを無作為に対照群又は実験群に分けた。実験初日（腫瘍の大きさが７５ｍｍ３に達した日、０日目）に、１００μＬのビヒクルのみ（ａ群に）又は組み換えＴＰＶ（ｂ群〜ｈ群に）を単回注射し、その後腫瘍の体積を３日間隔で測定した。下式を用いて、平均腫瘍体積を算出した：
平均腫瘍体積＝（長さ）×（幅）×（高さ）×π／６          式（１）
【００３２】
ＨＣＴ  １１６が惹起した腫瘍の異種移植片は、組み換えＴＰＶによる治療の間、予期したレベルに体積が増大しなかった。しかし、多数の二次性腫瘍が、組み換えＴＰＶによる治療を受けたマウスに発生した。また、ＨＣＴ  １１６同所異種移植モデルを含む、いくつかのｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究において、ＨＣＴ  １１６細胞は、高度に運動性でかつ侵襲性であると、報告されている。
【００３３】
図２Ａは、５×１０６個のＨＣＴ  １１６細胞を異種移植され、その後ビヒクルのみの対照溶液で治療された無胸腺ヌードマウスにおける３６日間（腫瘍の大きさが７５ｍｍ３を超えた日に始まる）にわたり観察された、平均腫瘍成長を示す。白丸で示される、平均腫瘍体積は、ほぼ１５日目まで増大し、この時点で、その体積は、残りの期間、ほぼ１００ｍｍ３で安定していた。標準誤差（ＳＥＭ）をバー（＋／−１ＳＥＭ）で示す。安定した腫瘍体積は、最初の異種移植片に同一の又は類似した個数のＨＣＴ  １１６細胞を用い、ヌードマウスにおける未治療のＨＣＴ  １１６腫瘍の体積が同一の間隔に渡って漸増することを示した、数件の先行研究とは対照的である。例えば、ＨＣＴ  １１６惹起腫瘍の体積がほぼ８日間で倍増することが、報告されている。また、ヌードマウスにおけるＨＣＴ  １１６異種移植片に対するＯＶ治療剤としてワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）を検討した最近の研究は、図２Ａに示す期間に類似する期間内にＨＣＴ  １１６腫瘍が４０００ｍｍ３にまで成長したことを、示した。
【００３４】
図２Ｂに示される実施形態において、黒四角は、ＴＰＶ／ｅｇｆｐで治療されたＢ群のマウスの平均腫瘍体積を示し、対照のＡ群の平均腫瘍体積を共に示す。バーは、対照のＡ群における腫瘍体積及びＢ群における腫瘍体積の標準誤差（＋／−１ＳＥＭ）を示す。
【００３５】
図２Ｃに示される実施形態において、黒四角は、ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ６６Ｒ／ｍＭＣＰ−１で治療されたＣ群のマウスの平均腫瘍体積を示し、対照のＡ群の平均腫瘍体積を共に示す。バーは、対照のＡ群における腫瘍体積及びＣ群における腫瘍体積の標準誤差（＋／−１ＳＥＭ）を示す。
【００３６】
図２Ｄに示される実施形態において、黒四角は、ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ６６Ｒ／ｍＧＭ−ＣＳＦで治療されたＤ群のマウスの平均腫瘍体積を示し、対照のＡ群の平均腫瘍体積を共に示す。バーは、対照のＡ群における腫瘍体積及びＤ群における腫瘍体積の標準誤差（＋／−１ＳＥＭ）を示す。
【００３７】
図２Ｅに示される実施形態において、黒四角は、ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ６６Ｒ／ｆｌｉＣで治療されたＥ群のマウスの平均腫瘍体積を示し、対照のＡ群の平均腫瘍体積を共に示す。バーは、対照のＡ群における腫瘍体積及びＥ群における腫瘍体積の標準誤差（＋／−１ＳＥＭ）を示す。
【００３８】
図２Ｆに示される実施形態において、黒四角は、ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ６６Ｒで治療されたＦ群のマウスの平均腫瘍体積を示し、対照のＡ群の平均腫瘍体積を共に示す。バーは、対照のＡ群における腫瘍体積及びＦ群における腫瘍体積の標準誤差（＋／−１ＳＥＭ）を示す。
【００３９】
図２Ｇに示される実施形態において、黒四角は、ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ２Ｌで治療されたＧ群のマウスの平均腫瘍体積を示し、対照のＡ群の平均腫瘍体積を共に示す。バーは、対照のＡ群における腫瘍体積及びＧ群における腫瘍体積の標準誤差（＋／−１ＳＥＭ）を示す。
【００４０】
図２Ｈに示される実施形態において、黒四角は、ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ２Ｌ／Δ６６Ｒ／ｆｌｉＣで治療されたＨ群のマウスの平均腫瘍体積を示し、対照のＨ群の平均腫瘍体積を共に示す。バーは、対照のＡ群における腫瘍体積及びＨ群における腫瘍体積の標準誤差（＋／−１ＳＥＭ）を示す。
【００４１】
本明細書での使用のための組み換えＴＰＶの特に好ましい実施形態は、二重ノックアウト背景（Δ６６Ｒ及びΔ２Ｌ）に付加されたｆｌｉＣ導入遺伝子を有する組み換えＴＰＶである。我々の結果は、２Ｌ及び６６Ｒの双方を欠失しｆｌｉＣ導入遺伝子を発現する組み換えＴＰＶが、ＨＣＴ  １１６腫瘍異種移植片に対する着実かつ安定な治療効果を生じさせたことを、示す。本明細書での使用のための組み換えＴＰＶの別の好ましい実施形態は、単一ノックアウトウイルス（Δ６６Ｒ）に付加されたｆｌｉＣ導入遺伝子を有する組み換えＴＰＶである。単一ノックアウト組み換えＴＰＶの実施形態の双方（ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ６６Ｒ及びＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ２Ｌ）は、少なくとも二つの時点での腫瘍体積における統計的に有意な低減を示し、いずれの場合でも、認められた腫瘍体積における有意な低減は、ウイルス療法の植菌の時点から時間的に遠く離れていた。単一ノックアウト組み換えＴＰＶの双方は、これらの遅い時点での効果が持続する傾向にあると、思われた。実際、ＴＰＶ／ｅｇｆｐウイルスを例外として、試験した組み換えＴＰＶの全ての実施形態は、ある程度の腫瘍除去効果を生じさせ、上記の組み換えＴＰＶが好ましいと、思われた。Ｔ細胞依存性の適応可能な免疫応答が、ヌードマウスにおいて重度に損なわれているため、本明細書に記載の実施例は、固有の免疫応答が対象における腫瘍を低減できる可能性があり、したがって、固有の免疫応答の活性化因子を作動可能にする組み換えＴＰＶが免疫不全症候群の対象において有用であると期待されることを、示す。その結果、我々は、固有の免疫応答の活性化因子を作動可能にするＯＶも免疫不全症候群の患者において有効であるはずと、結論付ける。
【００４２】
高度に保存された病原菌関連分子パターン（ＰＡＭＰ）として、フラジェリンは、細胞質免疫監視機構に関わる検出分子の標的である。例えば、Ｎｏｄ様受容体のＮＣＬＲ４（Ｉｐａｆとしても知られている）は、フラジェリンを検知すると、Ｉｐａｆインフラマソームの活性化をもたらし、次にＩｐａｆインフラマソームは、カスパーゼ−１を活性化し、マクロファージ内のサイトカインであるインターロイキン１β（ＩＬ−１β）の成熟を活性化させる。ＯＶ感染の過程で産生される予想されるＦｌｉＣの量は小さいものの、マウスにおいて、たとえ微量の細菌性フラジェリン（５μｇ／動物以下）であっても尾静脈注射で投与されると、サイトカインであるＴＮＦ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、及びケモカインであるＭＩＰ−２（ＩＬ−８）の全身における（すなわち、器官と血漿における）上昇、さらにはＭＥＫ細胞内信号系における変化を、引き起こす。したがって、哺乳類細胞におけるＦｌｉＣの作用は、ＴＬＲ依存性ＰＡＭＰ検知系に部分的に依存しており、まだ十分に解明されていない。しかし、本明細書に記載の結果に基づくと、ＦｌｉＣを発現させる組み換えＴＰＶによる固有の免疫応答の活性化が、無傷の固有の免疫応答を有するヌードマウスにおける腫瘍量の低減に寄与すると、思われる。
非限定的実施形態のリスト
【００４３】
実施形態Ａは、免疫系を有する対象内の癌細胞を治療するための組成物であって、少なくとも一つの変異を有するヤタポックスウイルス属のウイルスを含み、該少なくとも一つの変異は、該ウイルスによるＴＮＦ結合タンパク質の発現抑制をもたらす。
【００４４】
実施形態Ａの該組成物であって、該ウイルスが、ＭＨＣ−１軽鎖に結合可能な構造を有するＴＮＦ結合タンパク質の発現を抑制する。
【００４５】
実施形態Ａのあるいは一つ又は複数の介入特性を有する実施形態Ａの該組成物であって、該ウイルスが、細菌性フラジェリンタンパク質を発現させる導入遺伝子をコードするヤタポックスウイルスである。
【００４６】
実施形態Ａのあるいは一つ又は複数の介入特性を有する実施形態Ａの該組成物であって、重合したフラジェリンタンパク質が、該細菌性フラジェリンの主要成分である。
【００４７】
実施形態Ａのあるいは一つ又は複数の介入特性を有する実施形態Ａの該組成物であって、該導入遺伝子が、ネズミチフス菌の遺伝子（「ｆｌｉＣ」）の産物である。
【００４８】
実施形態Ａのあるいは一つ又は複数の介入特性を有する実施形態Ａの該組成物であって、該ウイルスが、タナポックスウイルス（ＴＰＶ）であり、該少なくとも一つの変異が、ＴＰＶの２Ｌ遺伝子によってコードされるＴＮＦ結合タンパク質の発現を抑制する。
【００４９】
実施形態Ａのあるいは一つ又は複数の介入特性を有する実施形態Ａの該組成物であって、該ウイルスが、第二の変異を有し、第二の変異が、該ウイルスによるチミジンキナーゼの発現抑制をもたらす。
【００５０】
実施形態Ａのあるいは一つ又は複数の介入特性を有する実施形態Ａの該組成物であって、該ウイルスが、タナポックスウイルス（ＴＰＶ）であり、第二の変異が、ＴＰＶの６６Ｒ遺伝子によってコードされるチミジンキナーゼの発現を抑制する。
【００５１】
実施形態Ａのあるいは一つ又は複数の介入特性を有する実施形態Ａの該組成物であって、該ウイルスが、さらに、癌細胞のアポトーシスを増大させる導入遺伝子をコードする。
【００５２】
実施形態Ａのあるいは一つ又は複数の介入特性を有する実施形態Ａの該組成物であって、該ウイルスが、さらに、対象の免疫系を活性化させる導入遺伝子をコードする。
【００５３】
実施形態Ａのあるいは一つ又は複数の介入特性を有する実施形態Ａの該組成物であって、該ウイルスが、さらに、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光レポーターを導入する導入遺伝子をコードする。
【００５４】
実施形態Ａのあるいは一つ又は複数の介入特性を有する実施形態Ａの該組成物であって、該ウイルスが、さらに、緑色蛍光タンパク質蛍光レポーターを導入する導入遺伝子をコードする。
【００５５】
実施形態Ｂは、免疫系を有する対象内の癌細胞を治療するための組成物であって、少なくとも一つの変異を有するヤタポックスウイルス属のウイルスを含み、該少なくとも一つの変異は、チミジンキナーゼ（ＴＫ）の発現抑制をもたらす。
【００５６】
実施形態Ｂの該組成物であって、該ウイルスが、細菌性フラジェリンタンパク質を発現させる導入遺伝子をコードするポックスウイルスである。
【００５７】
実施形態Ｂのあるいは一つ又は複数の介入特性を有する実施形態Ｂの該組成物であって、該導入遺伝子が、ネズミチフス菌の遺伝子（「ｆｌｉＣ」）の産物である。
【００５８】
実施形態Ｂのあるいは一つ又は複数の介入特性を有する実施形態Ｂの該組成物であって、該ウイルスは、タナポックスウイルス（ＴＰＶ）であり、該少なくとも一つの変異は、ＴＰＶの６６Ｒ遺伝子によってコードされるチミジンキナーゼの発現を抑制する。
【００５９】
実施形態Ｂのあるいは一つ又は複数の介入特性を有する実施形態Ｂの該組成物であって、該ウイルスは、第二の変異を有し、第二の変異が、該ウイルスによるＴＮＦ結合タンパク質の発現抑制をもたらす。
【００６０】
実施形態Ｂのあるいは一つ又は複数の介入特性を有する実施形態Ｂの該組成物であって、該ウイルスが、タナポックスウイルス（ＴＰＶ）であり、第二の変異が、ＴＰＶの２Ｌ遺伝子によってコードされるＴＮＦ結合タンパク質の発現を抑制する。
【００６１】
実施形態Ｂのあるいは一つ又は複数の介入特性を有する実施形態Ｂの該組成物であって、該ウイルスが、ＭＨＣ−１軽鎖に結合可能な構造を有するＴＮＦ結合タンパク質の発現を抑制する。
【００６２】
実施形態Ｂのあるいは一つ又は複数の介入特性を有する実施形態Ｂの該組成物であって、該ウイルスが、さらに、癌細胞のアポトーシスを増大させる導入遺伝子をコードする。
【００６３】
実施形態Ｂのあるいは一つ又は複数の介入特性を有する実施形態Ｂの該組成物であって、該ウイルスが、さらに、対象の免疫系を活性化させる導入遺伝子をコードする。
【００６４】
実施形態Ｃは、少なくとも一つの遺伝子を対象内の癌細胞に送達する方法であって：
ヤタポックスウイルス属のウイルスを変異させて、ＭＨＣ−１軽鎖に結合可能な構造を有するＴＮＦ結合タンパク質の発現を抑制するように改変すること；及び
該改変されたヤタポックスウイルス属のウイルスを、該対象の全身に投与すること：
が含まれる。
【００６５】
実施形態Ｃの該方法であって、さらに、該ウイルス内の少なくとも一つの遺伝子をコードすることで該ウイルスを改変することが含まれ、該少なくとも一つの遺伝子が、該対象における、癌細胞のアポトーシスを増大させる又は免疫応答を活性化させる。
実験の詳細な説明
【００６６】
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから得た、ＯＭＫ（ヨザルの腎臓）細胞、ＨＣＴ  １１６、ＣＯＬＯ  ２０５、ＳＷ１４６３、及びＷｉＤｒ細胞株を、用いた（それぞれ、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションの製品番号ＣＲＬ−１５５６、ＣＣＬ−２４７、ＣＣＬ−２２２、ＣＣＬ−２３４、及びＣＣＬ−２１８として入手可能）。ＯＭＫ細胞は、本明細書に記載の、該ウイルスの増幅及びウイルス力価測定に、用いた。該細胞株は、１０％（容積／容積）ウシ胎仔血清（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから入手可能）で補ったＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能）、及び５０μｇ／ｍＬの硫酸ゲンタミン（ＡＭＲＥＳＣＯから入手可能）からなる完全増殖培地で、増殖させた。ウイルス感染の後、細胞株の細胞単層を、ウシ胎仔血清の濃度を２％に下げた以外は完全増殖培地と同一な維持培地で維持した。細胞を、５％ＣＯ２雰囲気中にて３７℃でインキュベートした。細胞数カウント試験及び細胞生存性試験は、０．２％（重量／容積）のトリパンブルーを用いてノイバウウェル改良血球計で実施した。
実験１：対照
【００６７】
野生型ＴＰＶ（Ｋｅｎｙａ株）は、（米国、ジョージア州、アトランタの米国疾病管理センターの）Ｊｏｓｅｐｈ  Ｅｓｐｏｓｉｔｏ博士から提供された。該野生型ＴＰＶを、本明細書に記載のように改変して、蛍光レポーターのＥＧＦＰを発現する、対照組み換えＴＰＶを形成した（他の遺伝子改変なし）。要約すると、該ｐ２ＫＯ法を用い、二つの同等なワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）由来の初期／後期合成プロモーターを用いて、対照組み換えＴＰＶ内に蛍光レポーター遺伝子の発現を推進した。該対照組み換えＴＰＶを形成するため、ｐ２ＫＯ発現カセット（左側の側面及び右側の側面、介在するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、ならびに該プロモーターを含む）を、トランスフェクション／感染の処置の間の相同組み換えダブルクロスオーバーを介して野生型ＴＰＶのウイルスゲノムに移植した。組換え用のフランキング領域は、５'−（左側）側面上のＳａｃ  Ｉ制限酵素認識部位とＮｏｔ  Ｉ制限酵素認識部位との間、３'−（右側）側面上のＥｃｏＲ  Ｉ制限酵素認識部位とＨｉｎｄ  ＩＩＩ制限酵素認識部位との間で、ｐ２ＫＯベクター内にライゲートした。
実験２：トランスフェクション／感染の処置
【００６８】
これらの例示的実施形態において用いる該組み換えＴＰＶを産生するため、トランスフェクション／感染の処置を用いた。要約すると、トランスフェクション試薬製造業者のトランスフェクション手順にしたがい、精製されたｐ２ＫＯベクター１μｇ当たりトランスフェクション試薬１μＬの濃度で、ｊｅｔＰＲＩＭＥトランスフェクション試薬（ＰｏｌｙＰｌｕｓ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ＳＡから入手可能）を用いて、ＯＭＫ細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの約５時間後に、細胞当たり１プラーク形成単位（ｐｆｕ／細胞数）の野生型ＴＰＶ（Ｋｅｎｙａ株、非蛍光）でＯＭＫ細胞単層に植菌した。植菌から５日後に、感染した細胞単層を、氷上でゴム製の細胞スクレイパーでこすり落とし、−８０℃での冷凍及び解凍を３サイクル行い、４℃で１５秒間超音波処理し、段階希釈し、約９０％コンフルエンスで新たに形成したＯＭＫ細胞単層上にのせ、０．５％のメチルセルロースを含む維持培地を重ねた。蛍光を発する、良く分離されたプラークを採取し、それぞれを少なくとも３回プラーク精製して、目視でわかる野生型の（非蛍光の）プラークを含まない、ウイルス調製物を産生した。培養中に野生型のプラークが目視でわからず、かつ野生型ＴＰＶのＤＮＡがＰＣＲで検出されない限り、サンプルは純粋であると、考えた。
実験３：ウイルス性導入遺伝子の発現の確認
【００６９】
ＦｌｉＣの発現の確認は、ウェスタンブロッティングでおこなった。ｍＣＣＬ２及びｍＧＭ−ＣＳＦの発現の確認は、Ｌｕｍｉｎｅｘ多分析物サイトカイン検出アッセイ（メリーランド大学サイトカインコア研究室から入手可能）でおこなった。分析用のサンプルは、６０ｍｍ組織培養ディッシュ（細胞成長に利用可能な２２．１ｃｍ２の表面積を有する）内の半コンフルエントなＯＭＫ細胞単層を、１０ｐｆｕ／細胞数のＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ６６Ｒ／ｍＣＣＬ２、ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ６６Ｒ／ｍＧＭ−ＣＳＦ、及びＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ２Ｌ／Δ６６Ｒ／ｆｌｉＣを用いて感染させて、調製した。上清（３ｍＬ／ディッシュ）及び細胞質抽出物は、感染後の表示される時点で、調製した。ＦｌｉＣ検出については、抽出された溶解物をウェスタンブロッティングで分析した。タンパク質をＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから入手可能）に転写し、２０００倍希釈（容積／容積）で抗ＦｌｉＣモノクローナル抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから入手可能）にてプローブした。ブロック剤として、５％（重量／容積）の脱脂粉乳を用いた。二次抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したモノクローナル抗マウスＩｇＧ（Ａｂｃａｍから入手可能）で、２５００倍希釈で用いた。ＥＣＬ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｐｉｅｒｃｅ）で可視化した。ｐ２ＫＯベクターを含むが、ｆｌｉＣ、ｍＧＭ−ＣＳＦ、又はｍＣＣＬ２の挿入を含まないＴＰＶ組み換え体の実施形態を対照とした。
実験４：細胞密度の測定
【００７０】
４種類のヒト大腸癌細胞株及び対照のＯＭＫ細胞は、１日後に９０％コンフルエンシーを達成するように、別々に１２ウェルプレート（各細胞株当たり３ウェル）に植菌した。各ウェル（細胞成長に利用可能な３．８ｃｍ２の表面積を有する）をトリプシン処理し、トリパンブルー色素排除により、生存性に関してカウントし、評価した。これは、各細胞株について、ウイルスｐｆｕ／細胞数の指定された数での実験が正しかったことを確認するために、実施された。
実験５：ウイルスの力価
【００７１】
サンプル中に存在する、生存能力がある組み換えＴＰＶビリオンの数を測定するため、プラークアッセイを用いた。要約すると、ウイルスのサンプルを、氷上で１５秒間超音波処理し、維持培地中で段階希釈し、６ウェルプレート（サンプルの各希釈についてｎ＝３）中のほぼコンフルエントなＯＭＫ細胞単層上に植菌した。室温で１時間ゆるやかに搖動して、ウイルスを吸着させた。ついで、植菌を除去し、各ウェルを、事前に温めた維持培地１ｍＬで２回優しく洗浄した。洗浄後、重層培地２ｍＬを加え、感染したＯＭＫ細胞単層を３７℃で１０日間インキュベートした。その後、重層培地を除去し、感染したＯＭＫ細胞単層を染色した（３７％ホルムアルデヒド中の０．１％クリスタルバイオレットを用いて）。プレートを、蒸留水で洗浄し、風乾し、プラークの数をカウントした。
実験６：実験動物
【００７２】
雄性で新生児の無胸腺ヌードマウス（Ｎｕｄｅ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ／ｎｕ）（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｒｉｅｓを介して入手可能）は、入手時点で４週齢であり、実験開始前に、１週間馴化させた。マウスは、個別に、透明なポリカーボネート製ケージに入れ、１２時間照明／１２時間暗黒のサイクル下に置いた。餌及び水は、自由に摂取させた。実験動物の収容条件、取扱い、及び治療の全ては、ウェスタン・ミシガン大学の施設内での動物の保護及び使用に関する委員会が承認した、プロトコール（ＩＡＣＵＣプロトコール番号１３−０７−０１）に従った。
実験７：ヌードマウスにおける腫瘍異種移植片用の細胞株の選択
【００７３】
無胸腺ヌードマウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ研究を開始する前に、我々は、ＴＰＶ／ｅｇｆｐに感染される際に、どのｈＣＲＣ細胞株が最も高いウイルス生産性を有するのか、判断した。４種のｈＣＲＣ由来細胞株：ＨＣＴ  １１６、ＷｉＤｒ、ＳＷ１４６３、及びＣＯＬＯ２０５：におけるＴＰＶ／ｅｇｆｐの複製能を、評価した。陽性対照として、ＯＭＫ細胞を用いた。各細胞株を１２ウェルプレート（細胞成長に利用可能な３．８ｃｍ２の表面積を有する）に播種し、０．１ｐｆｕ／細胞数のＴＰＶ／ｅｇｆｐを各ウェル内に植菌した。感染から４日後に、溶解物を収集し、プラークアッセイで分析した。
実験８：腫瘍の惹起及び測定
【００７４】
腫瘍は、おおよそ第一腰椎より上の背面への５×１０６個のＨＣＴ  １１６細胞の皮下注射によって、無胸腺ヌードマウスに産生された。皮下注射の後に、トリパンブルー色素排除による生存性評価がおこなわれ、注射時及び注射後に細胞が生存性であることが、確認された。可視可能になると、腫瘍を、デジタルキャリパー（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈモデル６ＺＢＴＭＣＯ）を用いて、主軸（長さ）、短軸（幅）、及びＺ方向の寸法（高さ）にそって、測定した。ついで、該腫瘍の体積を、本明細書に記載の式１を用いて、推定した。腫瘍の推定サイズが、７５ｍｍ３に達した時又は７５ｍｍ３を超えた時に、各実験動物を、無作為に、対照群（ａ群）又は７つの実験群（ｂ群〜ｈ群）の内の一つに割り付けた。
実験９：ヌードマウスにおけるＨＣＴ  １１６異種移植片のウイルス療法
【００７５】
各治療群は、５匹又は６匹の担腫瘍無胸腺ヌードマウスで構成された。腫瘍体積が７５ｍｍ３に達する又は７５ｍｍ３を超えると、単回ウイルス療法注射を各担腫瘍マウスに投与した。ウイルス療法注射は、通常の生理食塩水で希釈された粗ＯＭＫ細胞溶解物１００μＬに懸濁された５×１０６ｐｆｕの単回注射として、腫瘍内に投与された。その後、各マウスの体重及び腫瘍体積を、３日間隔で測定して、記録した。全体で３９日間に渡る１３の時点でのデータを集めた。組み換えＴＰＶの注射の投与によって引き起こされる予想されない炎症又は他の注入効果を照合するため、本明細書でａ群と示した、ビヒクル対照群を用いた。この対照群は、ＨＣＴ  １１６細胞を投与されたが、模擬の組み換えＴＰＶ（ビヒクル１００μＬのみ）の注射のみを受けた、実験動物で構成された。この群は、「模擬ウイルス療法」群又はＡ群と呼ばれた。全ての実験群は、組み換えＴＰＶの治療効果を評価するため、Ａ群と比較された。
【００７６】
治療効果を評価するため、Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定（Ｗｉｌｃｏｘｏｎの順位和検定と呼ばれることもある）を用いて、各実験群を該対照群ａと比較した。組み換えＴＰＶによる治療は、群内の平均腫瘍体積が該模倣注入対照に比べ有意に低減した際に、有意な治療効果を有すると、判断した。本研究を通して、有意水準をｐ＜０．０５とした。
結果：ｐ２ＫＯポックスウイルスの除去／挿入ベクター
【００７７】
ｐ２ＫＯポックスウイルスの除去／挿入ベクターは、短時間でかつ信頼性高く、全ての所望されるＴＰＶ遺伝子を除去すると同時に、除去された遺伝子を所望される発現される蛍光レポーター導入遺伝子及び／又は所望される発現される導入遺伝子で置き換えるように、設計して構築した。培養細胞におけるウイルス感染の可視化は、蛍光レポーターのｍＣｈｅｒｒｙ及びＥＧＦＰを包含したことで、大幅に容易になった。二種類の蛍光レポーターを用いることで、ｆｌｉＣの挿入を有する二重欠失組み換えＴＰＶ（ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ２Ｌ／Δ６６Ｒ／ｆｌｉＣ）の同定及び単離が可能になった。ＯＭＫ細胞単層への該ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ２Ｌ／Δ６６Ｒ／ｆｌｉＣウイルスの感染により産生されたウイルス性プラークを図３に示し、それぞれ、ｍＣｈｅｒｒｙ及びＥＧＦＰが関与する、鮮やかな橙赤色及び緑色の同時発現を合わせて示す。
【００７８】
基本ベクター（すなわち、蛍光レポーター導入遺伝子を含むが、発現される任意選択の導入遺伝子を含まない）の全体の配列は、Ｍ１３フォワードプライマー及びＭ１３リバースプライマーの結合配列間の領域のＰＣＲ増幅によって産生されたアンプリコンのＤＮＡ配列決定法で、確認した。ｍＣＣＬ２、ｍＧＭ−ＣＳＦ、又はｆｌｉＣをコードするＯＲＦの挿入は、ｐ２ＫＯベクターをトランスフェクション／感染に用いる前に、精確な配置及び配向を確認するため、ＤＮＡ配列決定法で確認した。組み換えＴＰＶの２Ｌ、６６Ｒのいずれか又は両方がノックアウトされていることは、テンプレートとして組み換えウイルス性ＤＮＡを用いた、ＰＣＲ産物のアガロース・ゲル分析によって確認した。
結果：トランスフェクション／感染
【００７９】
植菌後４日〜５日までに、該ＯＭＫ細胞単層における蛍光レポーターの発現が明白となり、野生型ＴＰＶに感染した細胞の細胞質区画における該ｐ２ＫＯベクターからの遺伝子発現を、示した。該ｐ２ＫＯベクターによってトランスフェクトされたがその後に野生型ＴＰＶによって植菌されなかった、対照培養物においては、蛍光が認められなかった。その後、さらに使用する前に、テンプレートとして組み換えウイルス性ゲノムＤＮＡを用いるＰＣＲで、ウイルス性サンプルの純度を確認した。全てのウイルス性ＤＮＡサンプルについて、アンピシリン抵抗性遺伝子の存在を精査したが、いずれの組み換えＴＰＶにおいても検出されなかった。これは、全ての組み換えＴＰＶが、シングルクロスオーバーではなく、ダブルクロスオーバーから生じたことを、示す。
結果：ウイルス性導入遺伝子の発現の確認
【００８０】
挿入されたＯＲＦが、組み換えＴＰＶ（ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ６６Ｒ／ｍＣＣＬ２、ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ６６Ｒ／ｍＧＭ−ＣＳＦ、及びＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ２Ｌ／Δ６６Ｒ／ｆｌｉＣを含む）で感染された細胞内で発現されたことを示すため、６０ｍｍディッシュ（２０ｃｍ２の成長面積を有する）内のＯＭＫ細胞単層に、関係する組み換えＴＰＶを植菌し、上記のように、細胞溶解物及び培養上清における導入遺伝子の発現を分析した。ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ２Ｌ／Δ６６Ｒ／ｆｌｉＣを植菌されたＯＭＫ細胞からの溶解物のウェスタンブロッティングでは、モノクローナル抗ＦｌｉＣ抗体を用いてプローブした。明らかに５０ｋＤａの分子量を有する単一バンドが認められ、予想通りに、ＦｌｉＣの陽性対照と同一であった。このバンドの強度は、植菌後３日から６日の間に次第に増大した。ＦｌｉＣ導入遺伝子は、模倣感染細胞においては検出されなかった。感染した細胞の溶解物及びそれらの培養上清を分析して、ｍＣＣＬ２及びｍＧＭ−ＣＳＦの存在を測定した。両導入遺伝子は、高度に発現し、感染された細胞の上清内に大量に存在していた（ｍＣＣＬ２は４．９ｎｇ／ｍＬ、ｍＧＭ−ＣＳＦは１０．０ｎｇ／ｍＬ超）。ｍＧＭ−ＣＳＦ及びｍＣＣＬ２の双方は、感染された細胞又は対照の非感染細胞の細胞質抽出物において、わずかに検知可能又は検知不能であり、ＴＰＶで感染された細胞において、これらの導入遺伝子は発現されなかった。このデータは、ｍＧＭ−ＣＳＦ及びｍＣＣＬ２の双方が、予想通りに、感染された細胞から分泌された一方、予想通りに、ＦｌｉＣが、感染された細胞の細胞質内に蓄積されたことを、示す。
結果：細胞密度の測定
【００８１】
本研究に用いられた各細胞株は、測定されたコンフルエンスに近いそのコンフルエント密度（細胞／ｃｍ２）を有していた。ＯＭＫ対照細胞株は、約１．０×１０５細胞／ｃｍ２のコンフルエント密度を有していた。該大腸癌細胞株について測定されたコンフルエント密度は、以下の通りであった：ＨＣＴ  １１６は、約１．４×１０５細胞／ｃｍ２のコンフルエント密度を有していた；ＣＯＬＯ２０５は、約６．９×１０５細胞／ｃｍ２のコンフルエント密度を有していた；ＳＷ１４６３は、約４．５×１０５細胞／ｃｍ２のコンフルエント密度を有していた；ＷｉＤｒは、約２．５×１０５細胞／ｃｍ２のコンフルエント密度を有していた。：これらの値は、これらの細胞株を植菌する際に用いるｐｆｕの数の算出に用いられた。
結果：ヌードマウスにおけるＨＣＴ  １１６異種移植片のウイルス療法
【００８２】
無胸腺ヌードマウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ研究を開始する前に、上記のように、ＯＭＫ細胞が、ＴＰＶ／ｅｇｆｐに感染される際に、最も高いウイルス生産性を有するｈＣＲＣ細胞株であることが、わかった。ＯＭＫ細胞は、約３×１０６子孫ｐｆｕ／ウェルの産生を可能にする、最良の宿主細胞であった。試験したｈＣＲＣ細胞株の内、ＨＣＴ  １１６は、約７×１０５子孫ｐｆｕ／ウェルの平均収率（ｎ＝３）を有する、最も多い子孫ビリオンを産生した。したがって、我々は、本研究のｉｎ  ｖｉｖｏ相にＨＣＴ  １１６を選択した。
【００８３】
該組み換えＴＰＶの癌溶解能を評価するため、無胸腺ヌードマウス（Ｎｕｄｅ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ／ｎｕ）内に腫瘍を惹起させた。ＨＣＴ  １１６細胞の生存率測定により、注入時点で９９％超が生存可能と、わかった。ＨＣＴ  １１６の注入後に、全体的に１週間から３週間以内に腫瘍が７５ｍｍ３に達した。ＴＰＶ／Δ６６Ｒ（Ｆ群）、ＴＰＶ／Δ２Ｌ（Ｇ群）、及びＴＰＶ／Δ２Ｌ／Δ６６Ｒ／ｆｌｉＣ（Ｈ群）による治療は全て、模倣注入対照と比べた際に、二つ又はそれ以上の時点で、腫瘍サイズにおける有意な低減をもたらした。ＴＰＶ／Δ２Ｌで治療された腫瘍（Ｇ群）は、二つの時点、治療後３３日目（４７．６％の低減）及び３６日目（６５．２％の低減）、で模倣注入腫瘍より有意に小さかった。ＴＰＶ／Δ６６Ｒで治療された腫瘍（Ｆ群）は、二つの時点、治療後２７日目（３４．９％の低減）及び３６日目（５２％の低減）、で模倣注入腫瘍より有意に小さかった。ＴＰＶ／Δ２Ｌ／Δ６６Ｒ／ｆｌｉＣで治療された腫瘍（Ｈ群）は、着実かつ安定な治療効果を示し、六つの時点、治療後１５日目（５６．１％の低減）、２１日目（６２．０％の低減）、２４日目（６３．８％の低減）、２７日目（５９．５％の低減）、３３日目（５５．３％の低減）、及び３６日目（６９．６％の低減）、で模倣注入腫瘍に比べ、体積が有意に低減された。
【００８４】
最初の試験は、ヒト大腸癌細胞株を用いて実施されたが、本明細書に記載の薬理学的ウイルス療法は、幅広い癌の治療における使用を、意図している。本明細書に記載の医薬組成物によって治療されるべき癌の非限定的なリストには、基底細胞癌、癌、繊毛癌、グリオーマ、上皮内腫瘍、白血病、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、黒色腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、ならびに胆道、膀胱、骨、脳、乳房、中枢神経系（ＣＮＳ）、頸部、結腸及び直腸、結合組織、消化器、子宮内膜細胞、食道、眼、胃、頭部及び頸部、腎臓、喉頭、肝臓、肺、膵臓、前立腺、口腔、卵巣、呼吸器、皮膚、胃、睾丸、甲状腺、子宮、及び泌尿器の癌が、含まれる。
【００８５】
本明細書に記載の医薬組成物は、治療上有効な量で投与されるべきである。本明細書では、用語の「治療上有効な量」は、投与後に、所望される治療結果を達成するのに有効な、薬剤の量を、意味する。治療上有効な量は、対象者の病状、年齢、性別、及び体重、薬剤の形状、ならびにその剤形の対象者に所望される応答を生じさせる能力等の要因により、患者毎に変わり得る。該治療上有効な量は、少量の安全な量から始めてより高量に増量しながら、治療効果（例えば、癌細胞の成長の低減）ならびに何らかの有害な副作用の存在をモニターすることで、決定できる。該医薬組成物は、所望されるウイルス療法の効果をもたらす、該ポックスウイルス、ウイルス性核酸、又は発現ベクターを、含むことができる。
【００８６】
該医薬組成物は、当分野で知られているいずれかの好適な剤形又は経路で投与されることができ、それらには、全身に又は局所に治療上有効な量を提供するための、非経口、経口、腸内、口腔、経鼻、局所、直腸、膣内、経粘膜、表皮、経皮、皮膚、眼、肺、及び皮下の投与経路が含まれるが、これらに限定されるものではない。該薬剤は、特定の投与経路に適した、製剤又は調合液で対象に投与される。該薬物剤形の投与に適した製剤には、エアロゾル、分散系、乳濁液、移植、リポソーム系製剤、点鼻剤、パッチ、粉体、溶液、スプレー、座薬、及び懸濁液が含まれるが、これらに限定されるものではない。該製剤は、単位剤形であることができ、当分野で既知の方法で調製できる。これらの製剤又は剤形を調製する方法は、本開示のポックスウイルス又は核酸を、一種又は複数種の薬理学的に許容されるキャリアーと組み合わせるステップを含むが、さらに、安定剤、保存料、及び薬剤の細胞内取り込みを補助するトランスフェクション促進剤等の添加剤を含むことができるが、これらに限定されるものではない。好適な安定剤は、アルブミン、ＥＤＴＡ、グリシン、及びグルタミン酸ナトリウムを含むことができるが、これらに限定されるものではない。好適な保存料は、抗生物質、ヒドキシ安息香酸メチル、フェノール、２−フェノキシエタノール、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、及びチメロサールを含むことができるが、これらに限定されるものではない。
【００８７】
該医薬組成物は、治療が必要な対象の癌部位の標的組織又は器官内に局所的に送達されることができる。該組成物の有効な量は、シリンジを用いて、対象の皮膚を介して癌部位に、又は露出された手術野に、直接注入される。いくつかの実施形態において、該医薬組成物は、埋め込み可能な投薬器具を用いて、注入されることができる。
【００８８】
例示的実施形態に示されかつ記載されるような、該組成物の成分の構成及び配置が、例示のためだけのものであることを、知ることも重要である。本発明の少数の実施形態のみが、この開示に詳細に記載されているが、この開示を精査する当業者なら、記載された主題の新規な教示及び利点から実質的に逸脱することなく、多くの改変（例えば、様々な要素の大きさ、寸法、構造、形状、及び形態における変形、パラメーターの値、上乗せ配置、材料の使用、色、配向等）が可能であることを、容易に理解するはずである。例えば、一体的に形成されると示される要素は、多数の部分で構成されることができ、あるいは多数の部分で示される要素は、一体的に形成されることができ、界面の操作は、留保する又は他に変えることができ、構造の長さ又は幅ならびに／あるいは本システムの部材又はコネクター又は他の要素は、変えることができ、該要素の間に規定される調整位置の特性又は数は、変えることができる。本システムの要素及び／又は部品は、十分な強度又は耐久性、幅広い色のいずれか、質感、ならびに組合せを提供する幅広い材料のいずれかから、構成することができることに、留意すべきである。したがって、そのような改変の全ては、本発明の範囲内に含まれるように意図されている。所望される例示的実施形態及び他の例示的実施形態の設計、操作条件、及び配列における、他の置き換え、改変、変化、及び省略は、本発明の精神から逸脱することなく、なされることができる。
【００８９】
記載された方法内のいずれの記載されたプロセス又はステップも、本発明の範囲内の構造を形成するための他の開示されたプロセス又はステップと組み合わせ得ることを、理解すべきである。本明細書に開示された例示的な構造及びプロセスは、説明のためのものであり、限定するものと解釈されるべきではない。
【００９０】
本発明の概念から逸脱することなく、上記の構造及び方法に関して、変形及び改変をなすことができることも、理解すべきで、さらに、そのような概念は、これらの請求項にそれらの言語で明確に特記されない限り、以下の請求項によって包含されることが意図されていると、理解すべきである。
【００９１】
上記は、示された実施形態のみの記載と考えられる。当業者及び本発明をなそうとする者又は本発明を用いようとする者なら、本発明を改変するはずである。したがって、図面に示される実施形態及び上記の実施形態が、説明のためだけのものであって、本発明の範囲を限定する意図はなく、本発明の範囲は、均等論を含む、特許法の原則にしたがって解釈される際に、以下の請求項によって規定されることを、理解すべきである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図３】
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【国際調査報告】
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