(57)【要約】本発明は、癌を治療する方法を提供する。2017526702.tif 000004
2017526702.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
能動免疫療法を与えられている対象にPPARγアゴニストを投与する段階を含む、対象の癌治療レジメンの有効性を高める方法。
【請求項２】
能動免疫療法が、非特異的能動免疫療法または特異的能動免疫療法である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
非特異的能動免疫療法がサイトカインである、請求項2記載の方法。
【請求項４】
サイトカインが、GM-CSF、MCSF、またはIL-4である、請求項3記載の方法。
【請求項５】
GM-CSFが、GM-CSF分泌細胞を介して投与されるか、またはポリマー足場に付着させられる、請求項4記載の方法。
【請求項６】
特異的能動免疫療法が、養子T細胞療法または腫瘍関連抗原ワクチンである、請求項2記載の方法。
【請求項７】
T細胞がキメラ抗原受容体T細胞(CART)である、請求項6記載の方法。
【請求項８】
免疫チェックポイント阻害剤が対象にさらに投与される、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
免疫チェックポイント阻害剤が、CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、またはキラー免疫グロブリン受容体(KIR)に特異的な抗体である、請求項9記載の方法。
【請求項１０】
PPARγアゴニストがチアゾリジンジオンである、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
チアゾリジンジオンが、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、トログリタゾン、ネトグリタゾン、またはシグリタゾンである、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
癌が、黒色腫、非小細胞肺癌(NSCLC)、小細胞肺癌(SCLC)、膀胱癌、または前立腺癌である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
PPARγアゴニストおよび能動免疫療法を対象に施す段階を含む、対象の癌を治療する方法。
【請求項１４】
非特異的能動免疫療法がサイトカインである、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
サイトカインが、GM-CSF、MCSF、またはIL-4である、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
GM-CSFが、GM-CSF分泌細胞を介して投与されるか、またはポリマー足場に付着させられる、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
免疫チェックポイント阻害剤を対象に投与する段階をさらに含む、請求項11〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
免疫チェックポイント阻害剤が、CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、またはキラー免疫グロブリン受容体(KIR)に特異的な抗体である、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
PPARγアゴニストがチアゾリジンジオンである、請求項11〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
チアゾリジンジオンが、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、トログリタゾン、ネトグリタゾン、またはシグリタゾンである、請求項18記載の方法。
【請求項２１】
癌が、黒色腫、非小細胞肺癌(NSCLC)、小細胞肺癌(SCLC)、膀胱癌、または前立腺癌である、請求項12〜20のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
PPARγアゴニストを対象に投与する段階を含む、それを必要とする対象において制御性T細胞(Treg)の数を減少させる方法。
【請求項２３】
対象が癌に罹患している、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
対象が、能動免疫療法治療薬(treatment)、免疫チェックポイント阻害剤、または両方を与えられている、請求項24記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、2014年9月8日に出願された米国特許仮出願第62/047,467号および2014年9月25日に出願された米国特許仮出願第62/055,234号に対する優先権およびその恩典を主張するものであり、これらそれぞれの内容は、その全体が参照により組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、全体として、癌を治療することに関する。
【０００３】
政府の権利
本発明は、国立癌研究所によって授与されたR01CA143083のもとで、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
癌監視(cancer surveillance)仮説は、1957年にBurnetおよびThomasによって明確な形にされた。これは、a)体細胞変異またはウイルス産物が原因で免疫系にとって「外来性」である腫瘍抗原の存在、b)腫瘍の増殖を制限する、免疫系による癌監視、およびc)癌免疫療法という考え、を仮定する。(当時、この話題に関する調査は行われなかったが)これらの仮定から引き出せる結論は、進行性腫瘍は免疫編集されており、免疫回避のメカニズムを発達させているというものである。
【０００５】
腫瘍関連抗原の存在、免疫系が抗腫瘍免疫応答を開始する能力、さらには、逆説的に、免疫回避のメカニズムに関する本発明者らの知識、これらはすべて、腫瘍免疫療法が実現可能な戦略であることを示唆している。免疫療法に期待されること(promise)は、腫瘍に限定された細胞障害性および免疫記憶の誘導である;その結果、従来の治療法によって衰弱を引き起こす作用を伴いながら患者の寿命をただ延ばすのではなく、癌の治癒を思い描くことができる。
【０００６】
腫瘍免疫療法を明らかにする必要がある。
【発明の概要】
【０００７】
様々な局面において、本発明は、能動免疫療法を与えられている対象にPPARγアゴニストを投与することによって、対象の癌治療レジメンの有効性を高める方法を含む。
【０００８】
別の局面において、本発明は、PPARγアゴニストおよび能動免疫療法を対象に施すことによって対象の癌を治療する方法を含む。
【０００９】
さらなる局面において、本発明は、PPARγアゴニストを対象に投与することによって、それを必要とする対象において制御性T細胞(Treg)の数を減少させる方法を含む。この対象は、癌に罹患している。この対象は、能動免疫療法治療薬(treatment)、免疫チェックポイント阻害剤、または両方を与えられている。
【００１０】
能動免疫療法は、非特異的能動免疫療法または特異的能動免疫療法である。非特異的能動免疫療法は、サイトカインである。サイトカインは、GM-CSF、MCSF、またはIL-4である。GM-CSFは、GM-CSF分泌細胞を介して投与されるか、またはポリマー足場に付着させられる。特異的能動免疫療法は、養子T細胞療法または腫瘍関連抗原ワクチンである。T細胞療法は、キメラ抗原受容体T細胞(CART)である。
【００１１】
いくつかの局面において、免疫チェックポイント阻害剤が対象にさらに投与される。免疫チェックポイント阻害剤は、CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、またはキラー免疫グロブリン受容体(KIR)に特異的な抗体である。免疫チェックポイント阻害剤の非限定的な例には、イピリムマブ、トレメリムマブ、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、ピジリズマブ、MPDL3280A、MEDI4736、BMS-936559、MSB0010718C、およびAMP-224が含まれる。PPARγアゴニストは、ロシグリタゾン(Rosi)、ピオグリタゾン、トログリタゾン、ネトグリタゾン、またはシグリタゾンなどのチアゾリジンジオンである。癌は、黒色腫、非小細胞肺癌(NSCLC)、小細胞肺癌(SCLC)、膀胱癌、または前立腺癌である。
【００１２】
他に規定されない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語はすべて、本発明が関連する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において説明されるものと同様または等価な方法および材料を、本発明の実践において使用することができるが、適切な方法および材料を後述する。本明細書において言及する刊行物、特許出願、特許、および他の参照文献はすべて、その全体が参照により明確に組み入れられる。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先される。さらに、本明細書において説明される材料、方法、および例は、例示にすぎず、限定することを意図しない。
【００１３】
本発明のその他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになり、それらに包含される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】完全長PPAR-γのアイソフォームおよびドメイン[1]。
【図２】B16細胞および様々な組織におけるPPAR-γの発現。指定した組織から溶解物を作製し、PPAR-γ発現について解析した。正規化のためのB-アクチン発現。
【図３】過剰発現された内因性PPAR-γタンパク質の検出により、肺胞マクロファージにおけるPPAR-γ発現を維持するためにGM-CSFが必要であることが確認された。高齢動物で認められるタンパク症が混乱を起こす(confounding)影響を小さくするために、2週齢マウスに由来する肺胞マクロファージを気管支肺胞洗浄(BAL)によって採取した。各マウスからのBALの内容全体を溶解し、1つのレーンに添加した。3匹のWT動物および3匹のGM-CSF-/-動物を上に示している。2種のPPAR-γアイソフォームのそれぞれを形質導入したB16細胞を陽性対照として使用した。
【図４】播種後5時間目の、分裂増殖していない腹腔マクロファージにおけるPPAR-γ発現。腹腔細胞を洗浄によって採取し、次いで、5時間、平板培養した。非接着細胞を洗い落とし、接着細胞をインサイチューで溶解した。各レーンは、1匹のマウスに相当する。
【図５】チオグリコラート誘発腹腔マクロファージにおけるPPAR-γ発現。腹腔細胞を洗浄によって採取し、CD19を除去した。残存細胞を溶解し、個々のマウスに由来する溶解物を各レーンに添加した。
【図６】性腺周囲脂肪組織におけるPPAR-γ発現。脂肪組織を溶解緩衝液中で機械的に粉砕して、溶解物を得た。各レーンは、個々のマウスに相当する。
【図７】CD11b除去脾細胞におけるPPAR-γ発現。各レーンは、個々のマウスに相当する。
【図８】フローサイトメトリーによるPPAR-γの検出。A。B16細胞中の過剰発現されたPPAR-γの検出。肺胞マクロファージ中の内因性PPAR-γの検出。
【図９】骨髄特異的KOのPPAR-γ産生。腹腔洗浄液(lavage)を採取し、2〜4時間、平板培養した。非接着細胞を洗い落とし、接着細胞から溶解物を作製した。β-アクチン発現を正規化のために使用した。
【図１０】骨髄性細胞中のPPAR-γを遺伝学的に除去すると、B16マウス黒色腫モデルにおけるワクチン接種の効率が低下する。A。予防的ワクチン治療レジメンの概略図。B。WTマウスおよびPPAR-γ KOマウスの生存曲線。「flのみ」マウスまたは「creのみ」マウスを対照として使用した場合に同様の結果が得られたことに注目されたい。4回繰り返して行った(ワクチン接種した対照の総数n=27、KOの総数n=25)。一部のKOは保護されたが、KOコホートは、対照と比べて、腫瘍チャレンジに対する防御の低下を常に示した。C。腫瘍チャレンジ後60日目の腫瘍発生率。D。腫瘍チャレンジ後60日目の生存状況(統計学的に有意ではない)。図10Eおよび10Fは、LysM(Lysin Motif)の媒介によるPPAR-gの条件的欠失がGVAX有効性に与える影響を説明する。図10Eは、GVAXで治療したKOマウスが腫瘍発生率の上昇を示すことを表すグラフである。図10Fは、治療された対照(con)マウスと比べて、KOマウスの生存率が減少していることを表す。
【図１１】CD1d発現は、ナイーブなPPAR-γ KO脾臓において変わらないままである。脾臓を機械的に消化し、CD11c、CD11c、CD19、CD1d、および死細胞を識別するための色素について染色した。生細胞を用いて、指定された集団にゲートをかけた。
【図１２】CD1d発現は、ワクチン接種されたPPAR-γ KO脾臓において変わらないままである。脾臓を機械的に消化し、CD11c、CD11c、CD19、CD1d、および死細胞を識別するための色素について染色した。生細胞を用いて、指定された集団にゲートをかけた。
【図１３】PPAR-γ KOマウスに由来する肺胞マクロファージは、CD1dの同等の表面発現を保持する。BALをフローサイトメトリーのために染色し、CD11c発現に基づいて肺胞マクロファージを同定し、CD1dを用いて同時標識した。本発明者らの研究では、ワクチン接種部位に動員されたAPCにおけるCD1d発現の欠陥に取り組むことができなかった。これらは、回収し、次いでフローサイトメトリーによって研究するのが技術的に困難であることがその理由であった。したがって、本発明者らは、GM-CSFが持続的に放出されワクチン接種部位が明白であることにより、動員されたAPCを容易に回収できる、B16 GM生ワクチン接種(live-B16 GM vaccine)モデルを使用した。
【図１４】対照マウスおよびPPAR-γ KOマウスのGM生ワクチン接種部位において、同数の顆粒球集団、単球集団、および1つのDC集団を区別することができる。25匹を超える対照動物および約12匹のPPAR-γ KO動物を検査した。Gr-1識別を4匹の動物に対して実施し、他の動物では、CD14を用いて、CD11b SPの単球画分を区別した。
【図１５】PPAR-γ KOのGM生ワクチン接種部位の顆粒球、単球、およびDCの活性化状態に、差は検出されなかった。対照(赤)およびKO(青)ワクチン接種部位に由来するDP細胞(上の2つのヒストグラム)、単球(中央の2つのヒストグラム)、および顆粒球(下の2つのヒストグラム)に対する、MHCII(左)、CD80(中央)、およびCD86(右)染色。
【図１６】ワクチン接種部位に動員されたCD11b SP細胞およびCD11b CD11c DP細胞におけるCD1d発現は、PPAR-γ KOマウスにおいて影響を受けなかった。11日目〜14日目に、ワクチン接種部位を処理した。1グループにつき4〜7匹の動物を処理した。
【図１７】ワクチン接種部位に動員された骨髄性細胞におけるPD-L1発現は、PPAR-γ KOにおいて影響を受けない。対照(赤)およびKO(青)ワクチン接種部位に由来するDP細胞(上の2つのヒストグラム)、単球(中央の2つのヒストグラム)、および顆粒球(下の2つのヒストグラム)に対するPD-L1染色。
【図１８】ワクチン接種部位に動員されたAPCのサブセット。対照およびKOそれぞれについて、少なくとも6〜8匹のマウスを解析した。
【図１９】ナイーブまたはワクチン接種を受けたCD4およびCD8と生ワクチン接種部位APCとの同時培養では、PPAR-γ KOの欠陥が明らかにならなかった。磁性ビーズを用いてB16-GM腫瘍から骨髄性細胞を集め、あらかじめワクチン接種を受けたマウスまたはナイーブマウスに由来する脾臓CD4細胞およびCD8細胞と共に培養した。A。FoxP3+およびFoxP3-のCD4およびCD8のCFSE希釈。B。CD4によるサイトカイン産生。C。CD8によるサイトカイン産生。50,000個のAPCを500,000個のT細胞と共に培養した。3回の実験にわたって、1グループにつき7〜9匹のマウスを試験した。
【図２０】対照またはPPAR-γ KOのワクチン接種部位APCと共に培養されたNKT細胞は、類似したサイトカインプロファイルを示す。GM生ワクチン接種部位に由来する50000個のAPCを、50000個の24.8NKT細胞クローンまたは体細胞核移植マウスに由来するVb7発現初代NKTと共に48時間培養した。aGC添加の場合、APCを500ng/mlのaGCと共に2〜4時間インキュベートし、次いで、繰り返し洗浄した。
【図２１Ａ】GSEAは、骨髄性細胞におけるPPAR-γ減少と一致するKO dLNの差を示す。dLNは、GVAX後5日目に採取し、RNA-Seqによって解析した。GSEAを実施して、Immgenデータベース中に存在する全モジュールを濃縮について検査した。A。骨髄性細胞においてPPAR-γによって誘導されることが公知である遺伝子セット。
【図２１Ｂ】GSEAは、骨髄性細胞におけるPPAR-γ減少と一致するKO dLNの差を示す。dLNは、GVAX後5日目に採取し、RNA-Seqによって解析した。GSEAを実施して、Immgenデータベース中に存在する全モジュールを濃縮について検査した。B。PPAR-γによって抑制されることが公知である遺伝子セット。
【図２２Ａ】GSEAおよびフローサイトメトリーは、PPAR-γ KO dLNにおいてTregが増加し、CD8:FoxP3比が低下していることを示している。A。Treg中で濃縮されているImmgenモジュールが赤で示され、KO dLN中での濃縮に関する対応するp値が記載されている。5回の実験において、対照マウスおよびKOマウスについて、それぞれ約25匹のマウスを評価した。
【図２２Ｂ】GSEAおよびフローサイトメトリーは、PPAR-γ KO dLNにおいてTregが増加し、CD8:FoxP3比が低下していることを示している。B。フローサイトメトリーによる、ワクチン接種後6〜8日目の対照dLNおよびKO dLNならびにそれらのCD8:Treg比の代表的な比較。5回の実験において、対照マウスおよびKOマウスについて、それぞれ約25匹のマウスを評価した。
【図２２Ｃ】GSEAおよびフローサイトメトリーは、PPAR-γ KO dLNにおいてTregが増加し、CD8:FoxP3比が低下していることを示している。C。LNのCD8:Treg比の定量。5回の実験において、対照マウスおよびKOマウスについて、それぞれ約25匹のマウスを評価した。
【図２３】腫瘍浸潤白血球の解析により、PPAR-γ KOマウスの腫瘍におけるT細胞浸潤が減少していることが明らかにされる。対照の雌またはKO雌を、B16生細胞(105個)でチャレンジし、1日目に、放射線照射済のGM-CSF分泌B16細胞(106個)を異なる部位にワクチン接種した。14日目に腫瘍を採取し、計量し、処理して単細胞懸濁液にし、次いでそれらを、CD45およびCD3に対する抗体で染色した。サイズ/散乱プロファイルおよびCD45染色の欠如に基づいて腫瘍細胞を排除した。1グループにつき8〜12匹のマウスを研究した。図23Aは、腫瘍チャレンジおよび解析を行うための治療的ワクチン接種の予定表を表す。図23Bは、腫瘍重量および細胞集団の特徴付けを表す一連のグラフである。
【図２４】FoxP3+制御性細胞に対するCD8+T細胞の比は、ワクチン接種されたPPAR-γ KO動物に由来する腫瘍において低下している。対照の雌またはKO雌を、B16生細胞(105個)でチャレンジし、1日目に、放射線照射済のGM-CSF分泌B16細胞(106個)を異なる部位にワクチン接種した。14日目に腫瘍を採取し、計量し、処理して単細胞懸濁液にし、次いでそれらを、CD45およびCD3に対する抗体で染色した。サイズ/散乱プロファイルおよびCD45染色の欠如に基づいて腫瘍細胞を排除した。1グループにつき8〜12匹のマウスを研究した。図24Aは、腫瘍チャレンジおよび解析を行うための治療的ワクチン接種の予定表を表す。図24Bは、細胞集団の特徴付けを表す一連のグラフである。
【図２５】KO dLNは、Treg誘引性ケモカインを、より高いレベルで産生する。GVAX後の指定された時間にdLNを採取した。5×105個の細胞を平板培養し、48時間後に上清を採取した。ELISAによってケモカインレベルを測定した。各データポイントは、技術的反復に相当する。各時点および性別について、1グループにつき3〜4匹のマウスを試験した。対照およびKOそれぞれの5つの平均値(性別および時間)に対して一対比較法を実施して、p値を得た。
【図２６】GVAX dLNに由来する対照CD8およびKO CD8は、Trp-2ペプチドに応答して、同等レベルのIFN-γを産生する。3〜4個のLNを集め、500,000個のリンパ球を10ug/mlの指定ペプチドと共に平板培養した。48時間目に採取した上清をELISAによって解析した。データは、3回の実験の代表値である。
【図２７】KO LNでは、ランゲルハンス細胞に特異的な遺伝子モジュールの発現が増大している。dLNは、GVAX後5日目に採取し、RNA-Seqによって解析した。GSEAを実施して、Immgenデータベース中に存在する全モジュールを濃縮について検査した。
【図２８】LCは、中程度のレベルのリゾチームMを発現する。ImmgenのGene Skylineデータビューアを用いて、主要な白血球集団におけるリゾチームM発現を可視化した。
【図２９】リンパ節中のランゲリン発現DCに対する染色戦略。リンパ節を機械的に消化して単細胞懸濁液を得た。生きているB220-MHCIIhi細胞にゲートをかけた。
【図３０】CD207+細胞の総数またはCD103発現の頻度は、PPAR-γ KOにおいて影響されていない。4回の実験において、対照LCおよびKO LCについて、それぞれ少なくとも14匹のマウスを解析した。
【図３１】Rosiは、6〜8日間の処置後、ワクチン流入領域リンパ節中のCD8とTregのバランスに影響を与えない。データは、1グループにつき4〜5匹のマウスを用いた実験3回を代表している。
【図３２】飲料水を介して20mg/kg/日のRosiを送達すると、GVAXで治療したマウスにおいて腫瘍内CD8:Treg比が改善する。105個の生きた腫瘍細胞でマウスをチャレンジし(左脇腹)、106個の放射線照射済B16-GM細胞をワクチン接種した(腹部)。12日間、マウスの(their)飲料水にRosiまたはDMSOを加えた。14日目に腫瘍を採取した。2回の実験からデータを集めた。各データポイントは、1匹のマウスに相当する。
【図３３Ａ】Rosiを媒介として免疫相関現象(correlates)が良くなるのには、骨髄性細胞におけるPPAR-γ発現が必要である。PPAR-gアゴニストであるRosiは、腫瘍内CD8:Treg比、GVAX+抗CTLA-4組合せ抗腫瘍免疫療法の有効性を改善し、かつワクシニア感染マウスにおいてウイルス排除を促進する。図33Aは、105個の生きた腫瘍細胞でマウスをチャレンジし(左脇腹)、1×106個の放射線照射済B16-GM細胞をワクチン接種した(腹部)実験から得られたグラフを表す。12日間、マウスの飲料水にRosiまたはDMSOを加えた。14日目に腫瘍を採取した。2回の実験からデータを集めた。各データポイントは、1匹のマウスに相当する。
【図３３Ｂ】Rosiを媒介として免疫相関現象が良くなるのには、骨髄性細胞におけるPPAR-γ発現が必要である。PPAR-gアゴニストであるRosiは、腫瘍内CD8:Treg比、GVAX+抗CTLA-4組合せ抗腫瘍免疫療法の有効性を改善し、かつワクシニア感染マウスにおいてウイルス排除を促進する。図33Bは、B16黒色腫を有するGVAX治療マウスの生存率に対するRosiの影響(上のパネル)、GVAX+抗CTLA-4で治療した腫瘍におけるB16腫瘍の発生率に対するRosiの影響(中央のパネル)、およびB16黒色腫を有するGVAX+抗CTLA-4マウスの生存率に対するRosiの影響を表す。
【図３４】Rosiは、GVAX+CTLA-4治療の有効性を強化する。方法のところで説明するように、マウスは同じ日にチャレンジおよびワクチン接種(3×106個)を受けた。飲料水を介して、12〜14日間、Rosi処置が施された(20mg/kg/日)。0日目(200ug)、3日目(100ug)、および6日目(100ug)に、抗CTLA4またはアイソタイプを腹腔内注射した。
【図３５Ａ】GM-CSFおよびPPAR-γ調節物質でヒトPBMCを処理すると、マウスの研究で認められたTreg効果が再現される。A。Rosiで処理した2つの代表的なドナーPBMC。
【図３５Ｂ】GM-CSFおよびPPAR-γ調節物質でヒトPBMCを処理すると、マウスの研究で認められたTreg効果が再現される。B。各ドナーについて定量されたTreg数。各データポイントは、1つのドナーに相当する。
【図３５Ｃ】GM-CSFおよびPPAR-γ調節物質でヒトPBMCを処理すると、マウスの研究で認められたTreg効果が再現される。C。GM-CSFで処理したヒトPBMC培養物中のTreg数に対するPPAR-γ阻害の影響。
【図３６】Rosiで処理すると、GM-CSFで処理されたヒト単球によるCCL17発現は減少する。1×106個のCD14+ヒトPBMCを、GM-CSFおよび10uM Rosiまたは溶媒対照と共に5日間培養し、ELISAによってCCL17を測定した。ウェル1つ当たりの単球の数に対して、CCL17レベルを正規化した。対照ウェルとRosiで処理したウェルとで、単球の数に差はなかった。
【図３７】Rosiで処理された(treated Rosi)接着性PBMCを解析した結果、数も活性化状態も変化していなかった。各データポイントは、1つのドナーに相当する。4〜5日間の培養後、解析を実施した。
【図３８Ａ】DC関連遺伝子およびMLR(mixed lymphocyte reactions)における機能のPPAR-g欠失の影響。A。KEGGシグナル伝達「PPAR-gシグナル伝達」に関連しているいくつかの遺伝子の発現が、KO dLNにおいて減少している。
【図３８Ｂ】DC関連遺伝子およびMLRにおける機能のPPAR-g欠失の影響。B。モジュール296の発現が、KO dLNにおいて減少している。
【図３８Ｃ】DC関連遺伝子およびMLRにおける機能のPPAR-g欠失の影響。C。DC関連遺伝子が、KOにおいて調節異常になっている。
【図３９Ａ】KO LN DCは、ナイーブな遊走性DCシグネチャーを保持し、MLRにおけるCD8の生存率減少を支援する。図39Aは、KO LNにおけるナイーブmigDCの遺伝子シグネチャーの発現増大を表す。
【図３９Ｂ】KO LN DCは、ナイーブな遊走性DCシグネチャーを保持し、MLRにおけるCD8の生存率減少を支援する。KO DCと共に培養されたBalb/c脾細胞は、増殖の減少を示し、CD8 T細胞の総数に顕著な影響を与えた(図39Bおよび39C)。
【図３９Ｃ】KO LN DCは、ナイーブな遊走性DCシグネチャーを保持し、MLRにおけるCD8の生存率減少を支援する。KO DCと共に培養されたBalb/c脾細胞は、増殖の減少を示し、CD8 T細胞の総数に顕著な影響を与えた(図39Bおよび39C)。
【図４０Ａ】Lys-M-Cre;PPAR-g flマウスのGVAX流入領域LNにおけるT細胞欠陥。図40Aは、Treg関連遺伝子セットの発現がKO dLNにおいて増大していることを表す。
【図４０Ｂ】Lys-M-Cre;PPAR-g flマウスのGVAX流入領域LNにおけるT細胞欠陥。図40Bは、dLNのフローサイトメトリープロットを表す。
【図４０Ｃ】Lys-M-Cre;PPAR-g flマウスのGVAX流入領域LNにおけるT細胞欠陥。図40Cは、LN細胞数(cellularity)、CD8出現率、およびCD8:Treg比の定量を表す。各データポイントは、1匹のマウスに相当する。
【図４０Ｄ】Lys-M-Cre;PPAR-g flマウスのGVAX流入領域LNにおけるT細胞欠陥。図40Dは、Tregを動員するケモカインの発現がKO dLNにおいて増大していることを表すグラフである。
【図４０Ｅ】Lys-M-Cre;PPAR-g flマウスのGVAX流入領域LNにおけるT細胞欠陥。図40Eおよび40Fは、ワクシニアを乱切接種したマウスに由来する4日間培養されたLNから得られたCD8数(フローサイトメトリーによって評価)およびCCL22発現(ELISAによって評価)を表す一連のグラフである。
【図４０Ｆ】Lys-M-Cre;PPAR-g flマウスのGVAX流入領域LNにおけるT細胞欠陥。図40Eおよび40Fは、ワクシニアを乱切接種したマウスに由来する4日間培養されたLNから得られたCD8数(フローサイトメトリーによって評価)およびCCL22発現(ELISAによって評価)を表す一連のグラフである。
【図４１】GVAXで治療したマウスに由来するTregは、高レベルの共抑制性受容体TIGITおよびCTLA4を発現する。図41Aは、TIGIT発現のフローサイトメトリープロットである。図41Bは、ナイーブなLN(図41Aおよび41B)およびGVAX後6〜8日目に採取されたLN(図41Cおよび41D)におけるCTLA-4発現のフローサイトメトリープロットである。
【図４２】PPAR-gアゴニストRosiは、GVAX+抗CTLA4との組合せでルイス肺癌の潰瘍化を少なくし、生存率を向上させる。図42Aは、GVAX+抗CTLA-4マウスの皮下ルイス肺癌の潰瘍化に対するRosiの効果を表す。図42Bは、異所性皮下ルイス肺癌に罹患しているGVAX+抗CTLA-4マウスの生存率に対するRosiの効果を表す。
【図４３】Tregの動員および増殖を抑制する際のPPAR-gの役割は、GM-CSFで処理されたヒト単球において保存されている。図43Aおよび43Bは、GM-CSF発現細胞株と共に培養されたヒト単球中のCCl17(図43A)およびCCl22(図43B)に対するPPAR-gアゴニストRosiおよびPPARgの影響を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明は、癌ワクチンによって刺激される防御免疫にPPAR-γが必要であるという意外な発見にある程度基づいている。免疫療法と組み合わせてPPAR-γアゴニストを投与した結果、治療的効果が大きくなった。さらに、投与により、制御性T細胞(Treg)の発生が減少する。
【００１６】
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)は、骨髄系列の細胞を通じて、状況依存的な抗炎症機能または炎症促進機能をもたらす。GM-CSFシグナル伝達は、転写因子であるペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ(PPAR-γ)の発現を誘導する。本発明者らは、マウス黒色腫のB16モデルを用いて、GVAX、すなわちGM-CSF(顆粒球マクロファージコロニー刺激因子)に基づいた癌免疫療法、に対する抗腫瘍応答における骨髄性細胞中のPPAR-γの役割を調べた。GVAXとは、GM-CSF腫瘍細胞ワクチンである。GVAXは、自己由来の腫瘍細胞または同種異系の腫瘍細胞を免疫原として利用する;このアプローチにおいて、腫瘍細胞は、GM-CSFを発現するように遺伝子改変される。
【００１７】
LysM-Creを用いて骨髄系列中のPPAR-γを選択的に減少させるとGVAXの有効性が低くなることが発見されたが、公知のメカニズムではこれを説明することができなかった。LysM(リシンモチーフ)は、N-アセチルグルコサミン部分との相互作用を通してペプチドグリカンおよびキチンに非共有結合的に結合するタンパク質モチーフである。GVAX流入領域リンパ節のRNASeqにより、LysM-Cre;PPAR-γ flマウス(PPAR-γ KO)においてFoxP3ならびに共抑制受容体CTLA-4およびTIGITなどの制御性T細胞マーカーが増加していることが確認された。フローサイトメトリーによって、PPAR-γ KOリンパ節においてTregの出現率が実際に増加し、制御性T細胞に対するCD8 T細胞の比(CD8:Treg)の大幅な低下が認められることが、確認された。Tregを動員するケモカインCCL17およびCCL22は、流入領域リンパ節中で上方調節されていた。重要なことには、PPAR-γ KOマウスの腫瘍ではCD8:Treg比が低下しており、GVAX有効性の低下の説明がついた。
【００１８】
GM-CSFで処理したヒトPBMCにおけるPPAR-γの薬理学的な活性化または不活性化により、ヒトにおいてT細胞数を調節する際のPPAR-γの役割が保存されていることが示された。FDAに認可された低分子リガンドであるロシグリタゾン(Rosi)を用いてマウスにおいてPPAR-γを刺激すると(agonism)、ワクチン流入領域リンパ節および腫瘍におけるCD8:Treg比が改善した。機能獲得型のデータから、Rosiを免疫療法の補助剤として使用できることが示唆された。腫瘍内Tregはどれも、高レベルのCTLA-4およびTIGITを発現していた。したがって、本発明者らは、GVAXおよび抗CTLA-4の併用療法に対する応答にRosiが与える影響を試験した。本発明者らは、GVAXおよび抗CTLA4を用いて治療される腫瘍保有マウスの腫瘍発生率および全生存をRosiが改善することを発見した。
【００１９】
本発明者らのデータから、Tregの数を調節する際に骨髄性細胞中のPPAR-γが果たす新規な役割が確認された。PBMCのエクスビボ研究で認められるように、この経路はヒトにおいて保存されている。さらに、本発明者らは、Rosiを用いて腫瘍内のエフェクター細胞と制御性細胞の比を高めることによって免疫治療応答を向上させることができるという前臨床エビデンスも提供する。
【００２０】
したがって、本発明は、能動免疫療法を与えられている対象にPPARγアゴニストを投与することによって、対象の癌治療レジメンの有効性を高める方法を提供する。
【００２１】
さらに、本発明は、PPARγアゴニストおよび能動免疫療法を対象に施すことによって対象の癌を治療する方法も含む。
【００２２】
さらなる局面において、本発明は、PPARγアゴニストを対象に投与することによって、それを必要とする対象において制御性T細胞(Treg)の数を減少させる方法を含む。
【００２３】
実施例のセクションで提示するデータは、GVAXの有効性を維持する際にLysM発現細胞におけるPPAR-g発現が予想外に必要とされることを示している。KOにおけるCCL22上方調節およびCD8数に対する影響は、ワクシニア流入領域LNにおいて保存されている。さらに、ヒト単球においても、CCL17およびCCL22はPPAR-g活性化によって下方調節され、Tregの数は同時培養において減少する。したがって、調査された表現型は、細胞ワクチン接種(GVAX)、ウイルスワクチン接種(ワクシニア)のマウスモデルおよびヒト単球において保存されている。
【００２４】
遺伝子シグネチャーのハイスループット解析および機能アッセイ法の組合せを用いて、本発明者らは、LN樹状細胞の欠陥を特定する。ナイーブな遊走性DCの遺伝子シグネチャーが残存していることから、機能的欠陥の一部がmigDCサブセット中に存在することが示唆される。単球は、LysM-Creマウスにおいて最も広範囲にわたって研究されているサブセットであり、一部の古典的なDCサブタイプおよび好中球に影響を及ぼすことが公知である。さらに、炎症条件下で、単球は、皮膚から遊走する抗原保有DCを再増殖(repopulate)させることができる。したがって、本発明者らの知見が樹状細胞中の細胞内因的欠陥を反映している可能性がある。しかし、別の仮説は、LNマクロファージが欠陥を有しており、それが原因で移入(immigrant)DCの活性が低くなるというものである。本発明者らは、LN DCに加えて他の細胞型の欠陥を除外することはできない。実際に、本発明者らは、KO LN中に詰め込まれている、CD163、CD169などいくつかのマクロファージ遺伝子、エラスターゼおよび好中球顆粒タンパク質などの好中球遺伝子、ならびに肥満細胞プロテアーゼをコードする遺伝子を発見している。今後の研究で、本発明者らは、KO dLN中の複雑な欠陥を特定し調査することを望んでいる。
【００２５】
KOマウスは、GVAXに対するT細胞応答に欠陥を有している。重要なことには、腫瘍部位におけるCD8:Treg比が低下している。Satoらは、細胞溶解性T細胞と制御性T細胞のバランスの方が、細胞溶解性細胞の絶対数と比べて、治療法に対する患者の応答に関して明瞭な階層化および相関関係を与えたことを示す最初の臨床データを公開した。それ以来、抗CTLA4と組み合わせたGVAXの第I相試験を含む多数の研究によって、CD8:Treg比が多くの癌の徴候を示すことが判明した。本発明者らは、ロシグリタゾン治療の際のTreg減少の根底にある細胞変化の最初の証拠を提供するが、ゲムシタビン、すなわち骨髄由来サプレッサー細胞を標的とすることが公知である化合物と組み合わせたRosiがTreg数を減少させることが以前に示されていたことに注目することは興味深い。
【００２６】
CD8:Treg比の低下は、培養時のT細胞生存率の低下およびTreg動員ケモカインの発現の増大と相関関係がある。本発明者らは、抗原特異的T細胞の生存に欠陥はあるが、動員の増加によってTreg数は増加するモデルを提案する。しばしば、CCL17およびCCL22は、Tregの動員に関係があるとされてきた。しかし、様々なT細胞サブセットの動員に対するそれらの相対的効果は、状況依存的である。例えば、CCL17は、アテローム性動脈硬化症においてTregを動員するよりむしろ減少させることが公知である。CCL17はまた、Th2応答の向上にも関係があるとされている。CCL17は、遺伝子発現解析においてGM-CSFおよびPPAR-γに依存性の遺伝子として単独で検出されていた。CCL17機能の大半のエクスビボ研究は、GM-CSFによって誘導された樹状細胞を用いて実施される。興味深いことに、CCL17は、ペプチドワクチンに加えてGM-CSFを患者に投与する腫瘍ワクチン研究において、より優れた予後の指標であることが判明した。しかし、この効果は、シクロホスファミド、すなわちTreg調節剤で治療した患者でしか認められなかった。ヘルパーT細胞および制御性T細胞に対するCCL17の矛盾したように見受けられる効果を考慮すれば、上記のデータと一致する1つの仮説は、CCL17は免疫賦活機能もTregの誘導に加えて有しており;Tregが抑制されると前者が優勢になるというものであろう。CCL22のGM-CSF依存性の上方調節およびアポトーシス胸腺細胞で処理した樹状細胞からのTregの誘導が、以前に説明されている。したがって、CCL22の媒介によるTreg誘導が、GM-CSF依存性細胞ワクチンによって誘導されるワクチン応答においてある役割を果たすはずであることは、意外ではない。本発明者らの知るところでは、CCL22はこれまで、PPAR-γに関係があるとされていなかった。CCL17分泌は、骨髄性細胞においてのみ認められていた。CCL22の生産者もまた、通常、骨髄に由来している。しかし、まれな研究で、CCL22はCD8細胞およびNK細胞によって発現されることが示されていた。
【００２７】
GVAXを単独で用いた場合、RosiはCD8:Treg比を改善したが、腫瘍サイズおよび生存には影響は与えなかった。しかし、GVAXおよび抗CTLA4を組み合わせた場合、明らかな利益を示した。いくつかの研究から、共抑制分子に対して単一の抗体を用いた治療は不十分であるが、二重遮断またはTreg除去は、マウス腫瘍モデルにおいて首尾良く退縮をもたらし得ることが示されている。組合せ免疫療法もまた、臨床実践において台頭している標準的方法(standard)である。GVAXおよび抗CTLA4の逐次的送達が患者において試験されており、本発明者らのデータから、Rosi、GVAX、および抗CTLA-4の3つの組合せが顕著な利益を実現できたことが示唆されている。抗CTLA4(イピリムマブ)は最近認可された免疫療法であるため、これらの知見は刺激的である。
【００２８】
いかなる特定のメカニズムにも理論にも仮説にも拘泥しないが、Rosiが抗CTLA-4の存在下でのみ腫瘍増殖に影響を与える理由に関して、いくつかの仮説を立てることができる。腫瘍は、免疫回避のために多くの重複したメカニズムを有している。したがって、有利なCD8:Treg比にもかかわらず、CD8は、CTLA4が遮断されるまで機能不全である可能性がある。CTLA4遮断は、CD8の内因的役割を果たし得るか、または残存するTregもしくはさらに腫瘍に内在する骨髄性細胞上でのその発現を介して起こり得る。さらに、Rosiは、患者の腫瘍内Tregを標的とするためのファースト・イン・クラス治療法を提供する。マウスでは、抗CD25を含む、Tregを標的とするためのいくつかの戦略が存在するが、臨床(in the clinic)では、Tregを標的とするためのものは存在しない。CD25遮断は、エフェクターT細胞のCD25レベルに影響を及ぼし得るため、臨床用途には非実用的である。
【００２９】
細胞性と非細胞性の両方の他のワクチン接種アプローチを用いてKOマウスおよびRosi処置を試験することにより、PPAR-γの免疫賦活役割およびその治療的価値をさらに解明することが可能になるであろう。調査され得る1つの相乗作用は、Rosi処置と組み合わせたPD-1/PD-L1経路の遮断によるものである。PD-1は、GVAXで治療したマウスのTILSにおいて発現されるが、PD-1は、KO dLNのRNASeqでは差次的発現遺伝子として出現しなかった。PD-1遮断との組合せは、Rosiとチェックポイント遮断との相乗作用のメカニズムに関する本発明者らの理解に情報を与える。KO dLN中で増加している共抑制受容体は、新しく同定されたTIGITである。(対照動物またはKO動物の)GVAX dLNまたは腫瘍部位に由来するTregは、TIGIT陽性である。GVAXにおけるTregおよびPPAR-γの役割に関する本発明者らのデータを考慮すれば、GVAX、TIGIT遮断、およびRosiの3つからなる組合せは、調査すべき有望な手段であると思われる。
【００３０】
ワクチン応答ならびにT細胞およびDCの表現型の欠陥は部分的であるが重要である。PPAR-γは公知の免疫抑制効果を有していることに留意することが重要である。以前に公表されている、PPAR-gによるIFN-g応答の抑制と一致して、IFN-g誘導性遺伝子の遺伝子セットがKOにおいて上方調節されていた。したがって、本発明者らが認識する比較的少ない欠陥は、PPAR-γの免疫抑制効果と腫瘍促進性(pro-tumor)免疫効果を合わせたものである。このことは、全身的Rosi処置が、細胞依存性の炎症促進効果または抗炎症効果を有し得ることを暗に示す。今後の研究は、Rosiを局所的に提供すること、またはRosiを公知の細胞型に導くことを予定している。
【００３１】
治療方法
対象にPPAR-γアゴニストを投与することによって、癌治療の有効性は高まる。この対象は、能動免疫療法を与えられている。PPAR-γアゴニストは、対象に能動免疫療法治療薬が与えられるのと同時に、前に、または後に、投与されてよい。いくつかの局面において、対象には、免疫チェックポイント阻害剤がさらに投与される。また、PPAR-γアゴニストを対象に投与することによって、それを必要とする対象において制御性T細胞(Treg)の数を減少させる方法も、本発明に含まれる。それを必要とする対象には、癌に罹患しており、能動免疫療法治療薬および/または免疫チェックポイント阻害剤を与えられている対象が含まれる。
【００３２】
本明細書において説明する方法は、様々な癌の症状を緩和するのに有用である。
【００３３】
治療は、対象における腫瘍のサイズ、広がり(prevalence)、または転移能の低減といった臨床的利益を治療がもたらす場合、有効である。治療が予防的に適用される場合、「有効な」とは、治療が腫瘍形成を遅延させるか、もしくは予防するか、または腫瘍の臨床症状の内のある症状を予防もしくは緩和することを意味する。有効性は、個々の腫瘍タイプを診断または治療するための任意の公知の方法に関連して判定される。
【００３４】
PPARγアゴニスト
グリタゾン受容体としても公知のペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ(PPAR-γもしくはPPARG)またはNR1C3(核受容体サブファミリー1、グループ1、メンバー3)は、ヒトにおいてPPARG遺伝子にコードされているII型核受容体である。PPARGの2つのアイソフォームがヒトおよびマウスで検出されている:PPAR-γ1(筋肉以外のほぼすべての組織に存在する)およびPPAR-γ2(主に脂肪組織および腸に存在する)。
【００３５】
PPARGは、脂肪酸貯蔵およびグルコース代謝を調節する。PPARGによって活性化された遺伝子は、脂肪細胞による脂質取込みおよび脂肪生成を促進する。PPARGノックアウトマウスは、高脂肪食を与えられた場合に、脂肪組織を作ることができない。
【００３６】
PPAR-γアゴニストとは、受容体に結合し、受容体を活性化して生物学的応答を引き起こす、化合物である。
【００３７】
PPAR-γアゴニストは、低分子であることができる。本明細書において使用される「低分子」とは、約5kD未満〜50ダルトンの範囲、例えば、約4kD未満、約3.5kD未満、約3kD未満、約2.5kD未満、約2kD未満、約1.5kD未満、約1kD未満、750ダルトン未満、500ダルトン未満、約450ダルトン未満、約400ダルトン未満、約350ダルトン未満、300ダルトン未満、250ダルトン未満、約200ダルトン未満、約150ダルトン未満、約100ダルトン未満の分子量を有している組成物を意味することを意図している。低分子は、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣体、炭水化物、脂質、または他の有機分子もしくは無機分子であることができる。化学的混合物および/または生物学的混合物、例えば、真菌抽出物、細菌抽出物、もしくは藻類抽出物のライブラリーが当技術分野において公知であり、本発明のアッセイ法のいずれかを用いてスクリーニングすることができる。
【００３８】
例えば、PPAR-γアゴニストは、チアゾリジンジオンである。好ましくは、チアゾリジンジオンは、ロシグリタゾン(Rosi)、ピオグリタゾン、トログリタゾン、ネトグリタゾン、シグリタゾン、ネトグリタゾン、またはリボグリタゾンである。別の局面において、PPAR-γアゴニストは、サログリタザル、マグノロール、ホノキオール、ファルカリンジオール、レスベラトロール、アモルフルチン1、ケルセチン、またはリノレン酸である。
【００３９】
PPAR-γアゴニストは、PPAR-γを活性化する抗体またはその断片である。アゴニスト抗体を設計および作製するための方法は、当技術分野において周知である。
【００４０】
能動免疫療法
能動免疫療法は、免疫応答を引き起こす方法で抗原を提示することによって免疫系を刺激しようとするものである。
【００４１】
免疫系が腫瘍に対する応答を得るためには、その腫瘍が、それ自身と周囲の正常組織とを区別する抗原を有していなければならない。
【００４２】
能動免疫療法には2つのタイプ、すなわち非特異的免疫療法および特異的免疫療法がある。
【００４３】
非特異的能動免疫療法は、サイトカインおよび他の細胞シグナル伝達を用いて、全身的な免疫系応答を生じさせる。サイトカインには、例えば、GM-CSFおよびMCSFが含まれる。サイトカインは、サイトカインを分泌するように操作された細胞を介して送達されるか、またはサイトカインはポリマー足場に付着させられる。
【００４４】
特異的能動免疫療法は、癌細胞によって発現される特異的抗原に焦点を合わせた、細胞性免疫応答および抗体免疫応答を生じさせることを含む。特異的能動免疫療法は、例えば、抗原特異的ワクチン、または抗腫瘍T細胞の養子移入を含む。腫瘍関連抗原に対する免疫応答を誘導するために多数のプラットホームが開発されており、臨床的に評価されている。抗原特異的ワクチン接種は、全細胞に基づくワクチン、ならびにペプチドおよび全タンパク質に基づくアプローチを含む。代替のアプローチとして、抗原特異的ワクチンは、T細胞養子移入によって腫瘍特異的T細胞集団の出現率を上げることを含む。抗腫瘍T細胞養子移入により、内因性の宿主免疫系が外因性ワクチンに応答する必要が回避され、並外れた数の細胞の送達を伴って量的有意性を提供することができる。また、このアプローチによって、投与されるT細胞集団を直接操作すること、およびまた最適なT細胞存続および機能維持を支援するために宿主を適切な状態にすること(conditioning)が可能になる。T細胞養子移入は、キメラ抗原受容体T細胞(CARTS)の使用を含む。
【００４５】
免疫チェックポイント阻害剤
免疫チェックポイントとは、付随的な組織損傷を最低限にするために自己寛容を維持し、末梢組織での生理学的免疫応答の持続期間および大きさを調節するのに非常に重要である、免疫系に組み込まれている極めて多数の阻害経路を指す。腫瘍が、特に、腫瘍抗原に対して特異的であるT細胞に対する免疫耐性の主なメカニズムとしていくつかの免疫チェックポイント経路を勝手に使用する(co-opt)ことが、現在、明らかである。免疫チェックポイントの多くは、リガンド‐受容体相互作用によって開始されるため、抗体を用いてそれらを容易に遮断することができ、または組換え型のリガンドもしくは受容体を用いてそれらを調節することができる。
【００４６】
免疫チェックポイントには、CTLA-4、Pd-1、PD-L1、PD-L2、キラー免疫グロブリン受容体(KIR)、LAG3、B7-H3、B7-H4、TIM3、A2aR、CD40L、CD27、OX40、4-1BB、TCR、BTLA、ICOS、CD28、CD80、CD86、ICOS-L、B7-H4、HVEM、4-1BBL、OX40L、CD70、CD40、およびGAL9が含まれる。
【００４７】
免疫チェックポイント阻害剤の非限定的な例には、イピリムマブ、トレメリムマブ、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、ピジリズマブ、MPDL3280A、MEDI4736、BMS-936559、MSB0010718C、およびAMP-224が含まれる。
【００４８】
治療的投与
本発明は、能動免疫療法化合物、PPAR-γアゴニスト、免疫チェックポイント阻害剤、またはそれらの任意の組合せを含む組成物を対象に投与する段階を含む。
【００４９】
別法として、本発明は、能動免疫療法化合物、もしくは免疫チェックポイント阻害剤、またはPPAR-γ KO研究において下方調節されている1つもしくは複数の遺伝子(全リストについては図38を参照されたい)の発現を増大させ、その結果、それら下方調節されている1つもしくは複数の遺伝子の発現が増大する、化合物を、対象に投与する段階、またはPPAR-γ KO研究において上方調節されている1つもしくは複数の遺伝子(全リストについては図38を参照されたい)の発現を減少させ、その結果、それら上方調節されている1つもしくは複数の遺伝子の発現が減少する、化合物を、対象に投与する段階、あるいはそれらの任意の組合せを含む。
【００５０】
治療的化合物の有効量は、好ましくは、約0.1mg/kg〜約150mg/kgである。当業者が認識しているとおり、有効用量は、投与経路、賦形剤の使用量、および癌の症状を治療、予防、または緩和するための他の抗増殖剤または治療物質の使用を含む他の治療的治療薬との同時投与に応じて変動する。治療レジメンは、癌に罹患している哺乳動物、例えばヒト患者を標準的方法を用いて同定することによって実施する。
【００５１】
用量は、1回または複数回投与されてよい。いくつかの態様において、治療的化合物は、所定の継続期間の間、週に1回、週に2回、週に3回、週に4回、週に5回、週に6回、または週に7回、投与されるのが好ましい。所定の継続期間は、1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月、7ヶ月、8ヶ月、9ヶ月、10ヶ月、11ヶ月、または最長で1年であってよい。
【００５２】
薬学的化合物は、当技術分野において公知の方法を用いて、このような個体に投与される。好ましくは、化合物は、経口的に、直腸に、経鼻的に、局所的に、または非経口的に、例えば、皮下に、腹腔内に、筋肉内に、および静脈内に投与される。阻害剤は、任意で、癌を治療するための治療的薬物のカクテルの成分として配合される。非経口投与に適している製剤の例には、等張性生理食塩水、5％グルコース溶液、または他の標準的な薬学的に許容される賦形剤に溶かした活性物質の水性液剤が含まれる。PVPまたはシクロデキストリンなどの標準的な可溶化剤もまた、治療的化合物を送達するための薬学的賦形剤として利用される。
【００５３】
本明細書において説明する治療的化合物は、従来の方法を用いて、他の投与経路用の組成物に配合される。例えば、治療的化合物は、経口投与用のカプセル剤または錠剤に配合される。カプセル剤は、ゼラチンまたはセルロースなど任意の標準的な薬学的に許容される材料を含んでよい。錠剤は、従来の手順に従って、治療的化合物と固形担体および滑沢剤との混合物を圧縮することによって製剤化され得る。固形担体の例には、デンプンおよび糖ベントナイトが含まれる。化合物は、結合剤、例えば、ラクトースもしくはマンニトール、従来の増量剤、および錠剤化剤を含む、ハードシェル錠剤またはカプセル剤の形態で投与される。他の製剤には、軟膏剤、坐剤、パスタ剤、スプレー剤、貼付剤、クリーム剤、ゲル剤、吸収性スポンジ、またはフォーム剤が含まれる。このような製剤は、当技術分野において周知の方法を用いて製造される。
【００５４】
治療的化合物は、その化合物が罹患組織に直接接触した際に有効である。したがって、化合物は局所的に投与される。あるいは、治療的化合物は、全身的に投与される。例えば、これらの化合物は、吸入によって投与される。これらの化合物は、適切な噴射剤、例えば二酸化炭素のようなガスを含む加圧された容器もしくはディスペンサー、またはネブライザーからエアロゾルスプレーの形態で送達される。
【００５５】
さらに、化合物は、対象の隣接組織および周辺組織に化合物をゆっくりと放出する固体マトリックスまたは吸収性マトリックスを(器官に直接的に、または皮下に)埋め込むことによっても投与される。
【００５６】
いくつかの態様において、本明細書において説明する治療的化合物は、化学療法剤、放射線療法、または有糸分裂阻害剤など別の治療物質と組み合わせて投与されることが好ましい。いくつかの局面において、有糸分裂阻害剤は、さらに染色体不安定性を誘導して、癌細胞を標的とするまで本発明の有効性を高めるために、本発明の治療的化合物を投与する前に投与される。有糸分裂阻害剤の例には、タキサン(すなわち、パクリタキセル、ドセタキセル)、およびビンカアルカロイド(すなわち、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン)が含まれる。
【００５７】
定義
「治療」とは、疾患の発症を予防することまたは疾患の病変もしくは症状を変えることを意図して行われる介入である。したがって、「治療」とは、治療的処置と予防的または防止的な措置の両方を意味する。治療を必要とする者には、障害を既に有する者、ならびに障害を予防すべき者が含まれる。腫瘍(例えば癌)治療において、治療物質は、腫瘍細胞の病変を直接的に減らし得るか、または他の治療物質、例えば放射線による治療および/もしくは化学療法に対する腫瘍細胞の感受性を高め得る。本明細書において使用される場合、「寛解される」または「治療」とは、ごく普通の統計学的試験を用いて測定した場合に、症状が、正規化された値(例えば、健常な患者または個体において得られる値)に近づいている、例えば、正規化された値との差が50％未満である、好ましくは、正規化された値との差が約25％未満である、より好ましくは、正規化された値との差が10％未満である、およびさらにより好ましくは、正規化された値との差が有意ではないことを意味する。
【００５８】
したがって、治療することは、抑制すること、阻害すること、予防すること、処置すること、またはそれらの組合せを含み得る。とりわけ、治療することは、持続的進行までの時間を延ばすこと、寛解を促進すること、寛解を誘導すること、寛解の程度を高めること(augmenting)、回復を速めること、代替治療薬の有効性を高めること、もしくは代替治療薬に対する耐性を低めること、またはそれらの組合せを意味する。とりわけ、「抑制すること」または「阻害すること」とは、症状発現を遅らせること、疾患の再発を予防すること、再発エピソードの回数もしくは頻度を少なくすること、症状エピソード間の潜伏期を長くすること、症状の重症度を軽くすること、急性エピソードの重症度を軽くすること、症状の数を減らすこと、疾患に関係のある症状の発生率を低くすること、症状の潜伏期を短くすること、症状を寛解すること、二次的症状を減らすこと、二次感染を減らすこと、患者の生存を延長すること、またはそれらの組合せを意味する。これらの症状は一次性であるが、別の態様において、症状は二次性である。「一次性」とは、増殖性障害の直接的な結果である症状を意味し、一方、二次性とは、主な原因に由来するか、または主な原因の結果として起こる症状を意味する。症状は、疾患または病理学的状態の任意の徴候であり得る。
【００５９】
「癌または腫瘍細胞の治療」とは、本明細書の全体にわたって説明する、ある量のペプチドまたは核酸が、次の効果の内の1つまたは複数をもたらすことができることを意味する:(1)(i)減速および(ii)完全な増殖停止を含む、腫瘍増殖の阻害;(2)腫瘍細胞数の減少;(3)腫瘍サイズの維持;(4)腫瘍サイズの縮小;(5)末梢器官への腫瘍細胞浸潤の(i)減少、(ii)減速、もしくは(iii)完全な予防を含む、阻害;(6)転移の(i)減少、(ii)減速、もしくは(iii)完全な予防を含む、阻害;(7)(i)腫瘍サイズの維持、(ii)腫瘍サイズの縮小、(iii)腫瘍増殖の減速、(iv)侵襲の減少、減速、もしくは予防をもたらし得る、抗腫瘍免疫応答の増強;および/または(8)疾患に関連する1つもしくは複数の症状の重症度もしくは数の、ある程度までの軽減。
【００６０】
本明細書において使用される場合、「寛解された症状」または「治療された症状」とは、ごく普通の統計学的試験を用いて測定した場合に、正規化された値に近づいている、例えば、正規化された値との差が50％未満である、好ましくは、正規化された値との差が約25％未満である、より好ましくは、正規化された値との差が10％未満である、およびさらにより好ましくは、正規化された値との差が有意ではない、症状を意味する。
【００６１】
本明細書において使用される場合、「薬学的に許容される」成分とは、過度の有害な副作用(毒性、刺激、およびアレルギー反応など)を伴わず、妥当な利益/リスク比に相応し、ヒトおよび/または動物に使用するのに適しているものである。
【００６２】
本明細書において使用される場合、「安全かつ有効な量」または「治療的量」という用語は、本発明の様式で使用された場合に、過度の有害な副作用(毒性、刺激、またはアレルギー反応など)を伴わず、妥当な利益/リスク比に相応し、所望の治療応答をもたらすのに十分である、成分の量を意味する。「治療的有効量」とは、所望の治療応答をもたらすのに有効である、本発明の化合物の量を意味する。例えば、癌の増殖を遅らせるか、もしくは癌を縮小させるか、または転移を予防するのに有効な量。個々の安全かつ有効な量または治療的有効量は、治療される個々の病態、患者の身体状態、治療される哺乳動物または動物のタイプ、治療期間、(もしあれば) 併用療法の性質、ならびに使用される具体的な製剤、および化合物またはその誘導体の構造などの因子に応じて変動すると考えられる。
【００６３】
本明細書において使用される場合、「癌」とは、限定されるわけではないが、白血病、リンパ腫、黒色腫、癌腫、および肉腫を含む、哺乳動物において認められるあらゆるタイプの癌または新生物もしくは悪性腫瘍を意味する。癌の例は、脳、乳房、膵臓、子宮頸部(cervix)、結腸、頭頸部、腎臓、肺、非小細胞肺、黒色腫、中皮腫、卵巣、肉腫、胃、子宮、および髄芽腫の癌である。その他の癌には、例えば、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、乳癌、卵巣癌、肺癌、横紋筋肉腫、原発性血小板血症、原発性マクログロブリン血症、小細胞肺腫瘍、原発性脳腫瘍、胃癌、結腸癌、悪性膵臓インスリノーマ(insulanoma)、悪性カルチノイド、膀胱癌、前癌性皮膚病変、精巣癌、リンパ腫、甲状腺癌、神経芽細胞腫、食道癌、尿生殖路癌、悪性高カルシウム血症、子宮頸癌、子宮内膜癌、副腎皮質癌、および前立腺癌が含まれる。
【００６４】
「増殖性障害」とは、正常細胞より速く増殖する細胞、すなわち腫瘍細胞によって引き起こされる疾患または病態である。増殖性障害には、良性腫瘍および悪性腫瘍が含まれる。腫瘍の構造に基づいて分類される場合、増殖性障害には、固形腫瘍および造血器腫瘍が含まれる。
【００６５】
「患者」または「個体」という用語は本明細書において同義的に使用され、治療される哺乳動物対象を意味し、ヒト患者が好ましい。いくつかの場合において、本発明の方法は、限定されるわけではないが、マウス、ラット、およびハムスターを含むげっ歯動物;ならびに霊長類を含む、実験動物において、獣医学用途において、および疾患の動物モデルの開発において、使用される。
【００６６】
「調節する」という用語は、前述の活性のいずれかを、例えば、増加させる(increased)、増強する、増大させる(increased)、高める、刺激する(アゴニストとして作用する)、促進する、低下させる、減少させる、抑制する、遮断する、または弱める(antagonized)(アンタゴニストとして作用する)ことを意味する。調節によって、活性を、ベースライン値と比べて、例えば1倍、2倍、3倍、5倍、10倍、100倍を超えるまで、増大させることができる。また、調節によって、ベースライン値を下回るまで活性を低下させることもできる。
【００６７】
本明細書において使用される場合、(例えば、発現ベクター、核酸、送達ビヒクル、および作用物質などを)「細胞に投与すること」という用語は、その分子を用いて細胞に形質導入すること、トランスフェクトすること、微量注入すること、エレクトロポレーションすること、または注射すること(shooting)を意味する。いくつかの局面において、分子は、(例えば、細胞融合により、または送達細胞が標的細胞に近接している際に送達細胞を溶解させることにより)標的細胞を送達細胞と接触させることによって、標的細胞中に導入される。
【００６８】
本明細書において使用される場合、「分子」は、本発明の方法によって治療法において使用され、患者中で検出され得る、任意のベクター、抗体、タンパク質、および薬物などを包含するために総称的に使用される。例えば、一緒に働いて、治療的効果を促進し得るか、または細胞における遺伝子移入および/もしくは遺伝子発現の有効性もしくは選択性を高め得る、異なるタイプの遺伝子をコードする複数の異なるタイプの核酸送達ベクター。核酸送達ベクターは、裸の核酸として、または細胞中への核酸の侵入を容易にするための1種もしくは複数種の分子と結合した送達ビヒクル中に入れられて、提供され得る。適切な送達ビヒクルには、リポソーム製剤、ポリペプチド、多糖、リポ多糖、ウイルス製剤(例えば、ウイルス、ウイルス粒子、および人工のウイルスエンベロープなどを含む)、および細胞送達ビヒクルなどが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【実施例】
【００６９】
実施例1:骨髄性細胞および非骨髄性細胞においてPPAR-γ発現を維持する際のGM-CSFの役割
方法
ウイルス作製
標準的な組換えDNA技術を用いて、PPAR-γの各アイソフォームをコードするcDNAをレトロウイルスベクターpMFG中に挿入した。ウイルス組立てに必要なタンパク質構成要素を発現するパッケージング細胞株293GPG中に、リポフェクトアミンを用いてpMFG-PPAR-γプラスミドをトランスフェクトした。2日目から開始して数日間、分泌されたウイルスを含む上清を採取した。高速超遠心分離法によってウイルス粒子を沈殿させ、OptiMem中に再懸濁し、必要になるまで-80℃で保存した。
【００７０】
B16の培養および感染
10％FCSおよび抗生物質を含むDMEM中でB16を培養した。感染させるために、1×105〜2×105個のB16を播種し、ポリブレンおよび濃縮されたウイルスと共にインキュベートした。24時間後、培養物を洗浄し、コンフルエントにならせた。
【００７１】
PPAR-γタンパク質を検出するための、溶解物の調製およびウェスタンブロット
磁性ビーズ(Miltenyi Biotec)を用いて、CD11b細胞の除去を行った。細胞を次のものに溶解した:10％プロテアーゼ阻害剤(Sigma-Aldrich;カタログ番号P8340)を含むRIPA緩衝液ならびにImM Na3OV4およびPMSF。溶解直後に、試料を短時間、超音波処理し、次いで、15000g、4℃で15分間、遠心沈殿させた。上清を採取し、ドデシル硫酸リチウムおよび100mM DTTを含むローディング緩衝液と共に70℃まで加熱した。
【００７２】
ウェスタンブロット法のために、ウサギ抗PPAR-γ抗体(CellSignaling、81B8)を使用し、続いて、アルカリホスファターゼが結合された二次的物質(secondary)を使用した。化学発光基質を用いて、ブロットを発色させた(Vector Labs、SK-6605)。ImageJソフトウェアを用いて濃度測定を行った。
【００７３】
ウェスタンブロットによるPPAR-γの検出
本発明者らは、PPAR-γを検出して、GM-CSFとのその関係およびGM-CSF-/-マウスにおける骨髄に特異的な減少を確認するための着実なアッセイ法を必要とした。本発明者らは、各アイソフォームを過剰発現するB16由来細胞株を作製し、市販の抗体をスクリーニングして、PPAR-γが着実かつ特異的に検出されるものを選択した(図2)。本発明者らは、肺胞マクロファージおよび腹腔マクロファージ;ならびにCD11b+脾臓細胞をスクリーニングした。CD11bは、単球および好中球において発現される。したがって、この集団は、脾臓単球、マクロファージ、単球由来樹状細胞、および好中球を含む。本発明者らはまた、(内因性の陽性対照としての)性腺周囲脂肪パッド、骨髄全体、およびCD11b分別後に残される脾臓の塊(bulk spleen)も試験した。本発明者らは、脾臓の骨髄性細胞中にも新しく回収した腹腔マクロファージ中にもPPAR-γを検出することができなかった。最も重要なことには、この抗体を用いて、内因性PPAR-γを肺胞マクロファージ中に検出することができた(図2)。導入部で概説したように、GM-CSFは、肺胞マクロファージの生物学の重要な局面を実現し、したがって、それらは、GM-CSFに誘導される遺伝子を研究するための重要な細胞型となる。
【００７４】
結果
PPAR-γは、肺胞マクロファージ中のGM-CSFの標的である
肺胞マクロファージにおけるPPAR-γ発現はGM-CSF依存性であることが以前に示された。本発明者らは、これらの知見を確認することができた。GM-CSF KOマウスに由来する肺胞マクロファージでは、PPAR-γが完全に欠乏していた(図3)。興味深いことに、本発明者らは、新しく単離された腹腔マクロファージが検出可能量のPPAR-γタンパク質を発現しないことを見出した。組織培養皿に接着すると、発現が上方調節され、これはGM-CSF依存性ではなかった(図4)。本発明者らはまた、チオグリコラート誘発の結果、PPAR-γが発現するかどうか、およびそれはGM-CSFに依存するかも試験した。チオグリコラートで誘発すると、顕著であるがGM-CSF非依存性であるPPAR-γを、腹腔マクロファージ中に検出することができる(図5)。さらに、性腺周囲脂肪パッドおよびCD11b除去脾臓におけるPPAR-γ発現もまた、GM-CSF非依存性であった(図6および7)。マウスによって発現はかなり変動したため、性腺周囲脂肪については2つの実験を示している。これらの知見から、PPAR-γは、ある特定のマクロファージにおいてGM-CSFの標的であること、および分化または解剖学的位置によって、PPAR-γ発現のGM-CSF依存性に差が生じたことが示唆された。GM-CSF受容体を発現しない脂肪およびリンパ球(CD11b除去脾臓)において、PPAR-γ発現は、GM-CSFに依存しないと予想される。
【００７５】
本発明者らはまた、PPAR-γ発現をフローサイトメトリーによって検出できるかどうかも試験した。本発明者らは、B16において異所発現を検出することができた(図8)が、肺胞マクロファージにおいて内因性発現を検出することはできなかった。
【００７６】
考察
上記の研究は、様々な骨髄組織ならびに選択された非骨髄組織におけるPPAR-γ発現の体系的解析である。PPAR-γが欠乏した様々な骨髄性集団のアポトーシス細胞食作用の欠陥を考慮すれば、本発明者らが肺胞マクロファージでしかPPAR-γ発現を検出できなかったのは意外である。本発明者らは、肺胞マクロファージにおける恒常的(homeostatic)PPAR-γ発現がGM-CSFの存在に完全に依存していることを見出している。GM-CSFには、粘膜表面で果たすべき重要な役割があり、したがって、腸粘膜中の骨髄性集団もまたGM-CSF依存性のPPAR-γ発現を示す可能性がある。本発明者らのデータは、様々な骨髄性サブタイプにおけるPPAR-γ mRNA発現に関する最近公開された解析に一致している。Gautierらはまた、腹腔マクロファージが炎症条件下でのみPPAR-γを発現することを見出した。本発明者らの知る限りでは、これは、マクロファージにおけるPPAR-γ発現を接着がもたらすことの初めての証拠である。Gautierらはまた、炎症部位に動員された単球がPPAR-γを発現することも示している。したがって、下記の章において、本発明者らは、LysM-Cre;PPAR-γ flマウスにおいて、GVAXに対する免疫応答が影響を受けるかどうかを試験した。
【００７７】
実施例2:単球系における遺伝子機能喪失がGVAXに与える影響:候補メカニズムに関する研究
方法
LysM-Cre;PPAR-γ flの作製
市販されているLysM-Creマウス(Jackson Laboratory, 4781)およびPPAR-γ flマウス(Jackson Laboratory, 4584)を交雑させた。F1×F1交雑により、Creおよびflのホモ接合性動物が生じ、これらは生存能力があり繁殖力があった。
【００７８】
脾細胞の再刺激
脾臓を粉砕し、赤血球溶解に供し、70umの濾過器を通過させて、単細胞懸濁液を得た。2×106個の細胞を、放射線照射済B16細胞50,000個を含む培地2ml中に播種した。4日後にサイトカインレベルを測定した。
【００７９】
腫瘍の処理
B16-GM腫瘍を採取し計量した。腫瘍を1〜3mmの細片に細断し、200ユニットのコラゲナーゼIVおよび10ug/mlのDNA分解酵素を含む培地中で37℃にて45〜75分間、インキュベートした。インキュベーション後、組織を繰り返しピペッティングしてばらばらにし、70um濾過器を用いて濾した。Optiprep(Sigma-Aldrich)を用いて、遠心分離のための勾配を生じさせた。蒸留水中に0.85％NaClおよび10mMトリシンを含む溶液25mlを、別の蒸留水5mlおよび8.71mlのOptiprepと混合した。この勾配を、腫瘍単細胞懸濁液を含む培地の下に層状に重ね、400g、室温で25分間、回転させ、ゆっくりと減速した。境界面を採取し、フローサイトメトリーのために解析するか、または同時培養のために使用した。
【００８０】
同時培養実験
ナイーブな脾臓およびワクチン接種した脾臓を処理して単細胞懸濁液にした。抗CD8標識磁性ビーズを用いて、CD8を選択した。それに続いて、磁性ビーズを再び用いて、ネガティブ選択によってCD4を回収した。50,000個のAPCを500,000個のCD4またはCD8と共にインキュベートした。
【００８１】
NKT細胞同時培養のために、50,000個のAPCを、50,000個の24.8NKTまたはVb7体細胞核移植マウスに由来する初代NKTと共にインキュベートした。これらのマウスのCD4はすべてNKT細胞である。また、CD4- NKT細胞も存在する。初代NKTを精製するために、磁性ビーズを用いて、CD4についてのネガティブ選択を実施した。aGC添加の場合、APCを500ng/mlのaGCと共に2〜4時間インキュベートし、次いで、繰り返し洗浄した。
【００８２】
結果
LysM-Cre;PPAR-γ flマウスは、PPAR-γの著しい減少を示し、GM-CSF KOマウスの肺病変を再現する
本発明者らは、LysM-Creマウスを、pparg座位をはさむloxP部位を有するマウスと交雑した。図9に示すように、PPAR-γ KOマウスに由来する腹腔マクロファージでは、PPAR-γタンパク質発現が90％超、低下していた。PPAR-γ KOマウスは、BALにおいてタンパク質蓄積および炎症のいくらかの証拠を示しており、組織学的解析により、肺胞タンパク症と一致する軽度の病理学的変化が明らかになった(データ不掲載)。PPAR-γ KOマウスのタンパク症はGM-CSF欠乏マウスのものほど重症ではないことが以前に示されており、これは、PPAR-γが、GM-CSFによって調節されるサーファクタント恒常性に関与している下流エフェクターの内の1つにすぎないことを暗示している。
【００８３】
PPAR-γ KOマウスは、予防的GVAX後に、腫瘍チャレンジに対する防御の低下を示す
LysM-Creマウスを用いてPPAR-γを組織特異的に欠失させることにより、GVAXによって誘導される抗腫瘍免疫応答における骨髄性PPAR-γの役割を本発明者らが検討することが可能になった。(生きた野生型(WT)腫瘍細胞でチャレンジする1週間前に)予防的にGVAXを施されたマウスは、腫瘍増殖がしないように保護され、腫瘍を伴わない長期の生存を示した(図10a、b)。事前のワクチン接種がない場合、腫瘍増殖は、骨髄性PPAR-γの減少の影響を受けなかった(図10b)。驚くべきことに、本発明者らは、PPAR-γ KOマウスにおいてワクチン有効性が低下していることを発見した(図10b-代表的な生存曲線、(c)腫瘍発生率および(d)生存に関する統計、4回繰り返した研究に基づく)。
【００８４】
これらのデータは、LysM-Cre発現細胞におけるPPAR-γの機能が、GVAXによって誘導される完全な防御免疫に必要とされることを示している。PPAR-γが果たすことが公知である免疫抑制的役割を考慮すれば、これは予想外の知見である。本発明者らは、PPAR-γ KOにおけるワクチン有効性の低下を説明する候補メカニズムを捜し求め、DCにおけるPPAR-γの機能が最適なNKT細胞活性化にとって重要であり得ることを示唆する報告を見つけた。本発明者らは、GVAXによって誘導される腫瘍防御にNKT細胞が必要とされることをCD1d KOマウスの事例から知っている。CD1d KOマウスでの本発明者らの研究において、放射線照射済B16細胞によってインビトロで再刺激した脾細胞を用いて測定されるように、NKT細胞が減少すると、GVAXによって誘導されるTh2応答が小さくなった[5]。PPAR-γはマクロファージの「M2」活性化にとって重要であると仮定されているため、このGM-CSF/NKT細胞/Th2サイトカイン連関(axis)は、PPAR-γ欠乏マウスにおけるワクチン接種活性の低下に関連している可能性がある。Balb/c背景のPPAR-γ KOマウスは、リーシュマニア(Leishmania)に対するTh2応答を欠いている[6]。したがって、再刺激アッセイ法ならびに他のエクスビボアッセイ法およびインビトロアッセイ法を用いて、本発明者らは、NKT機能またはTh2産生がPPAR-γ KOマウスにおいて損なわれているかどうか試験した。
【００８５】
ワクチン接種されたマウスに由来する脾細胞を再刺激しても、PPAR-γ KOの抗腫瘍サイトカイン応答に明らかな欠陥はひとつも確認されない。
【００８６】
ワクチン接種の数日後に採取され放射線照射済B16と共に培養された脾細胞は、顕著なサイトカイン応答を示す。本発明者らの研究室は、この応答のTh2構成要素がNKT細胞に媒介されることを以前に示した。本発明者らは、PPAR-γ KOマウスが、IFN-γ、GM-CSF、IL-5、IL-13、およびIL-10を含む、試験されるTh1タイプおよびTh2タイプのサイトカインを同程度のレベルまたは若干高いレベルで産生することを発見した(表1)。
【００８７】
（表１）B16細胞で再刺激されたPPAR-γ KO脾細胞は、サイトカインプロファイルの変化を示さない。データは、マウス5〜6匹を代表している。2×106個の脾細胞を50,000個の放射線照射済B16細胞と共に培養した。上清中のサイトカインレベルをELISAによって測定した。ND-検出されず。
2017526702.tif 000003
【００８８】
CD1d発現はPPAR-γ KOマウスにおいて影響を受けない
PPAR-γリガンドRosiは、GM-CSFおよびIL-4によって誘導されたヒトDCにおいてCD1d発現を誘導することが示されている。この発現増大により、NKT細胞活性化が高まる[7]。したがって、本発明者らは、PPAR-γ KO 骨髄性サブセットにおけるCD1d発現を試験した。図11に示すように、本発明者らは、CD11b発現またはCD11c発現のいずれかに基づいて定義されるナイーブな脾臓骨髄性サブセットにおいてCD1d発現の差を検出しなかった。CD11b+CD11c-細胞は、単球、マクロファージ、または好中球のいずれかであってよい。CD11b+CD11c+細胞は、CD11c+CD11b-細胞が古典的DCである単球由来樹状細胞であるとみなされている。多数の入手可能なマーカーを用いてさらに分類することが可能であるが、本発明者らは、これら2種のマーカーをCD1d発現の予備スクリーニングを行うための手段として使用した。本発明者らは、PPAR-γ KOのナイーブな脾臓中の様々な骨髄性細胞集団においてCD1d発現が影響を受けていないことを発見した。対照として、本発明者らはまた、その部分集団(辺縁帯B細胞)が高レベルのCD1dを発現することが公知であるB細胞も試験し、野生型細胞およびPPAR-γ欠乏細胞の両方が同程度の発現を示すことを発見した。しかし、第2章で説明し、その後Gautierらによって確認された[8]研究から、本発明者らは、定常状態の骨髄性脾臓サブセットにおいてPPAR-γは容易に検出できないことを認識した。本発明者らは、ワクチン接種したマウスの脾臓骨髄性細胞を試験し、PPAR-γ KOに欠陥がないことを再び発見した(図12)。PPAR-γは肺胞マクロファージ中で安定的に(robustly)検出可能であるため、本発明者らは肺胞マクロファージにおける発現が影響を受けるかどうか試験した。PPAR-γ KOマウス由来の肺胞マクロファージさえ、CD1d発現に欠陥がなかった(図13)。
【００８９】
フローサイトメトリーでは、B16-GM生ワクチン接種部位に由来するPPAR-γ KO APCの大きな欠陥は明らかにならなかった
本発明者らは再びCD11bおよびCD11cをマーカーとして用いて、GM生ワクチン接種(vaccine)部位の骨髄性集団を同定した(図14a)。さらに、本発明者らは、Gr-1を用いて、CD11bシングルポジティブ細胞を顆粒球性(Gr-1+)または単球性(Gr-1-)に分類した(図14b)。これらのワクチン接種部位は実際には進行性腫瘍であるため、PPAR-γ KOマウスにおいてそれらの増殖が影響を受けないことに注目することが重要である(図14c)。本発明者らは、PPAR-γ KOワクチン接種部位中のCD11b、CD11c、およびGr-1に基づいて定義される様々な骨髄性サブセットの出現率(14dおよび14e)にも、それらの絶対数(データ不掲載)にも、まったく差を見出さなかった。本発明者らは、MHCII、CD80、およびCD86を用いて顆粒球画分、単球画分、および樹状画分の活性化状態をさらに試験し、PPAR-γ KOにおいて、いかなる差も見出さなかった(図15)。
【００９０】
次いで、本発明者らは、CD11b SP(単球および顆粒球)ならびにCD11c CD11b DP(単球由来樹状細胞)をCD1d発現について試験した。図16に示したように、本発明者らは、PPAR-γ KOマウスに由来するワクチン接種部位APCにおいてCD1d発現の欠陥を認めなかった。したがって、本発明者らは、LysM発現細胞におけるPPAR-γ減少はマウスのCD1d発現に影響を及ぼさないと結論を下した。本発明者らは、培養ヒトDCにRosiが与える影響を報告している公開データを用いて、PPAR-γ KOにおけるワクチン有効性の低下を引き起こし得るさらなる候補を明らかにできるだろうかと考えた。本発明者らは、公的に入手可能なデータセットを再解析し、培養ヒトDCのRosi処理によってPD-L1発現が減少することを発見した(DFCI Bioinformatics CoreでVladimir Brusicおよび David Delucaによって実施されたバイオインフォマティクス解析)。このことから、PD-L1発現がPPAR-γ KOにおいて上方調節され得ることが示唆された。PD-L1はGM-CSFによって誘導されることが公知であり、APC上での発現増大は、ワクチン有効性の低下を招き得る。しかし、ワクチン接種部位に動員された細胞をフローサイトメトリー解析したところ、PD-L1のいかなる欠陥も示されなかった(図17)。
【００９１】
これらの活性化マーカーが広範囲に発現されていることから、これらの骨髄性細胞をさらに下位分類することが可能であろうことが示唆された。本発明者らは、マーカーCD14、CD103、およびLy6cを試験した(図18)。CD14発現およびLy6c発現が、単球で認められている。Ly6c発現細胞をLy6hi(炎症性単球)およびLy6loにさらに細分することができる。CD103+ DCは、いくつかの解剖学的部位に存在しており、恒常的条件下でTregを介して免疫寛容を維持している。しかし、それらは、非常に効率的に交差提示し、免疫応答時にCD8応答を開始する[7]。GM-CSF KOでは、いくつかの非リンパ性コンパートメントでCD103+ DCの数が減少していた。本発明者らは、PPAR-γ KOにおいて、これらのマーカーまたは部分集団のいずれにも、差を検出しなかった(データ不掲載)。
【００９２】
ワクチン接種部位APCを様々なエフェクター細胞サブセットと同時培養したところ、PPAR-γ KOのいかなる欠陥も明らかにならなかった
発現マーカーに基づくと、ワクチン接種部位に由来するPPAR-γ KO APCが存在し、野生型マウスと比べて類似した表面マーカーを発現すると思われた。本発明者らは、本発明者らの解析を拡大適用して、PPAR-γ欠乏APCの機能的能力を調査した。本発明者らは、ナイーブマウスまたはワクチン接種マウスの脾臓に由来するCD4細胞およびCD8細胞と共に、B16-GM腫瘍に由来する骨髄性細胞(CD11bおよびCD11cをマーカーとして用いる)を培養した。ワクチン接種部位APCに応答してこれらのアッセイ法において増殖した唯一のT細胞は、ナイーブマウスに由来するFoxP3+ CD4+制御性T細胞であった(図19a)。GM-CSFは、腸におけるTreg恒常性に必要とされることが公知であり、培養状態のTregの増殖を促進する(promote)ことができる。TregをPPAR-γ KOワクチン接種部位APCと共に培養した場合、対照APCと比べてTreg増殖に差はなかった(図19a)。ワクチン接種マウスに由来するCD4およびCD8は、APCに応答してサイトカインを産生したが、CD4によるIL-2、IFN-γ、およびIL-5の産生レベル(19b)ならびにCD8によるIFN-γ産生レベル(19c)は、APCがPPAR-γ KOマウスに由来した場合、差がなかった。
【００９３】
本発明者らはまた、KOでのワクチン欠陥におけるNKT細胞の役割(もしあれば)に関する本発明者らの調査も継続した。本発明者らの研究において、CD1d上の脂質抗原の利用可能性は、PPAR-γによって誘導されたカテプシンDによって調節されることが示唆された。したがって、本発明者らは、NKTをワクチン接種部位APCと共に培養して、それらのサイトカイン応答を測定した。2種の異なる供給源のNKT細胞を使用した:細胞株、または体細胞核移植によって作製されたVb7に限定された(restricted)マウスに由来する初代NKT細胞(Stephanie Dougan、未発表のデータ)。簡単に説明すると、Vb7発現NKT細胞の核を抜き取り、除核した卵母細胞に入れ、次いでその卵母細胞を胚盤胞期まで成長させた。Vb7胚盤胞に由来する胚性幹細胞株をWT胚盤胞中に注入した。キメラ胚盤胞を偽妊娠マウスに移植した。得られたキメラ仔マウスを交配してVb7マウス系統を得ることができる。TCRa遺伝子座は、WT動物において絶対的な対立遺伝子排除を示さないため(全T細胞の30％で、TCRaの両方の対立遺伝子が再配列されており、10％は両方の対立遺伝子を発現する)、これらのマウスのT細胞コンパートメントは極めて限定されているが、クローンではない。Vb7マウスのT細胞コンパートメントは、いくらかのCD8 T細胞が存在するものの、NKT細胞に発達する傾向(skewed towards)がある。
【００９４】
NKT細胞株(24.8)または初代Vb7 NKT細胞のサイトカインプロファイルは、対照ワクチン接種部位またはKOワクチン接種部位に由来するAPCの存在下で、類似していた(図20)。GM生ワクチン接種部位に由来するCD11b+細胞と24.8細胞とを同時培養した際に検出可能な唯一のサイトカインはIL-2であり、これは、CD11b細胞にα-ガラクトシルセラミドを添加することによって著しい影響は受けなかった(aGC、データ不掲載)。KO APCを用いて刺激した場合、24.8細胞によるIL-2産生に差はなかった(図20a)。初代Vb7 NKT細胞は、aGCで刺激すると、IL-2、IL-5(図20b)、IL-13およびIFN-γ(図20c)を産生したが、内因性リガンドの場合は産生しなかった。PPAR-γ KO APCにおけるCD1dの発現または再利用がなにかしら変化すると、aGCに対するNKT細胞応答は、影響を受けると思われる。同様に、細胞表面または分泌性いずれかの共刺激リガンドがKOにおいて異なる場合には、aGCに対するNKT細胞応答は、影響を受ける可能性がある。しかしPPAR-γ KO APCを使用した場合も、aGCを添加されたAPCに対する初代NKT細胞のサイトカイン応答は不変のままであった。
【００９５】
考察
PPAR-γは、マクロファージおよび樹状細胞において多くの免疫抑制機能を有していることが公知である。本発明者らの予想とは異なり、LysM-Creを用いてPPAR-γを欠失させると、放射線照射済のGM-CSF分泌B16細胞が後続の腫瘍チャレンジに対する防御免疫を刺激する能力が低下した。以前の報告により、NKT細胞活性化におけるPPAR-γの役割が示唆されていたが、本発明者らは、PPAR-γ欠乏マウスにおいてNKT細胞に関する明らかな欠陥を発見することができなかった。その代わりに、本発明者らは、a)PPAR-γ KOマウスにおいて、CD1d発現が影響を受けないこと、およびb)サイトカイン放出に基づいて測定したところ、ワクチン接種部位APCによるNKT細胞活性化も影響を受けないこと、を発見した。本発明者らはまた、ワクチン接種部位APCとナイーブマウスおよびワクチン接種マウスに由来するCD4細胞およびCD8細胞とを用いて同時培養アッセイ法も行ったが、PPAR-γ KO ワクチン接種部位の欠陥を明らかにすることができなかった。さらに、野生型マウスおよびPPAR-γ欠乏マウスのGM-CSF分泌腫瘍細胞の部位には、類似した骨髄性細胞が動員された。まとめると、これらの結果から、PPAR-γのこれまで知られていない機能が、ワクチン接種応答の障害に関与し得るという可能性が持ち上がった。この可能性は、本発明者らが次の実施例で詳細な発現プロファイリング解析を用いて取り組む論点である。
【００９６】
実施例4:GVAX流入領域リンパ節における遺伝子発現のハイスループット解析および骨髄性細胞におけるPPAR-γの新規な役割の特定
方法
RNASeq
ワクチン接種後5日目にdLNを採取した。4匹のマウスから得たLNを集め、RNAを抽出した。RNAをHiSeqに供し、約20,000個の遺伝子について転写物レベルを測定した(Center for Canter Computational Biology, DFCI)。対照については2回の技術的反復を実施し、KOについては3回実施した。
【００９７】
遺伝子セット濃縮解析(GSEA)
Immgenデータベース中の利用可能な全遺伝子セット(その当時、約300セット)を用いてGSEAを実施して、対照LNまたはKO LNにおいて遺伝子シグネチャーが差次的に表されたモジュールおよび関連する細胞型を同定した。
【００９８】
組合せ免疫療法
GVAX+CTLA-4とRosiの相乗作用を調査する実験のために、本発明者らは、2種の異なるチャレンジ用量、すなわち105または4×105を用いた。ワクチン接種用量は3×106個のB16-GM細胞であり、チャレンジ用量を用いる脇腹と反対側の腹部に1回皮下注射した。RosiまたはDMSOは、飲料水に加えて20mg/kg/日で12日間、与えた。抗CTLA-4(9D9、BioXcell)またはアイソタイプを次のようにマウスに腹腔内注射した:0日目に200ug、3日目および6日目に100ug。
【００９９】
結果
ワクチン流入領域リンパ節の遺伝子発現プロファイリング
ワクチンによって誘導された防御応答を裏付けて、同側の鼠径リンパ節は形態学的に、かつ細胞数の点で、めざましく増大した(5〜10倍、データ不掲載)。1種類の特定の細胞型に偏らずにワクチンエフェクターのメカニズムを解析するために、本発明者らは、ワクチン接種後5日目に流入領域リンパ節からRNAを採取し、RNA-Seqを実施した。4匹のマウスから得た流入領域リンパ節を集めて、ばらつきを小さくした。
【０１００】
流入領域リンパ節における遺伝子発現の変化を特定するために、RNASeqデータから得た転写物レベルを遺伝子セット濃縮解析(GSEA)によって解析した。本発明者らは、イムノロジカルゲノムプロジェクトコンソーシアム(Immunological Genome project consortium)(Immgen.org)を通じて利用可能な遺伝子セットを用いて、特定の細胞型およびシグナル伝達経路に対応するモジュールを同定した。興味深いことに、肺胞マクロファージ中で濃縮されていることが以前に示されているPPAR-γ依存性遺伝子発現モジュールが、PPAR-γ KOリンパ節中では対照と比べて低発現であった(underrepresented)ことから、PPAR-γ依存性の骨髄性遺伝子発現が減少していることが確認された(図21a)。PPAR-γによって抑制されることが公知である遺伝子セットがKOにおいて上方調節されていたことから、PPAR-γの機能欠損が確認された(図21b)。これらの知見を総合すると、遺伝子発現プロファイルをより詳細に解析することにより、PPAR-γ欠乏マウスにおけるワクチン応答の障害を正確に深く理解できる(provide insights)可能性があることが示された。
【０１０１】
興味深いことに、CTLA4は、KOリンパ節において上方調節を示している上位の遺伝子の内の1つであった(最後の遺伝子、図21b、前のページ)。CTLA4は、制御性T細胞ならびに活性化されたエフェクター細胞および消耗されたエフェクター細胞において強く発現されている。GSEAによって、Tregに特異的な遺伝子発現モジュールがKOにおいて上方調節されていることが示された(図22a)。本発明者らは、フローサイトメトリーによって、Tregのこの起こり得る変化を確認しようとした。図22bに示すように、Treg出現率は増加している。Tregは、抗腫瘍エフェクターT細胞の主な調節因子であるため、本発明者らは、このことがCD8+ T細胞に影響を与え得るのではないかと考えた。実際、ワクチン投与後6〜8日目に、CD8:Treg比は、対照マウスと比べてKO流入領域リンパ節において低下していた(図22c)。
【０１０２】
興味深いことに、CTLA4は、KOリンパ節において上方調節を示している上位の遺伝子の内の1つであった(最後の遺伝子、図21b、前のページ)。CTLA4は、制御性T細胞ならびに活性化されたエフェクター細胞および消耗されたエフェクター細胞において強く発現されている。GSEAによって、Tregに特異的な遺伝子発現モジュールがKOにおいて上方調節されていることが示された(図22a)。本発明者らは、フローサイトメトリーによって、Tregのこの起こり得る変化を確認しようとした。図22bに示すように、Treg出現率は増加している。Tregは、抗腫瘍エフェクターT細胞の主な調節因子であるため、本発明者らは、このことがCD8+ T細胞に影響を与え得るのではないかと考えた。実際、ワクチン投与後6〜8日目に、CD8:Treg比は、対照マウスと比べてKO流入領域リンパ節において低下していた(図22c)。
【０１０３】
腫瘍中のCD8:Treg比もまた、KOにおいて低下している。
本発明者らは、流入領域リンパ節で観察されたCD8 TエフェクターとFoxP3+ Tregのバランスの変化が、腫瘍部位でも認められるだろうかと考えた。これらの実験のために、本発明者らは、どのマウスも進行性腫瘍を有するように、治療的ワクチン接種モデルに移行した。図23に示すように、GVAXで治療したKOマウスに由来する14日目の(d14)B16腫瘍は、腫瘍の単細胞懸濁液においてCD45+細胞の出現率の変化を示さなかった。しかし、KOマウスにおけるCD3+T細胞の出現率は、対照と比べて有意に低下していた。腫瘍サイズが大きくなる、有意ではない傾向があった。腫瘍増殖に対する効果を欠いていることは、確立された腫瘍の発達にGM-CSF分泌腫瘍細胞ワクチンが影響を与える能力が限定的であることを反映している可能性があり、したがって、PPAR-γ依存性の大きな寄与を検出する能力が妨げられる。11日目の(d11)腫瘍を用いた場合も、同様の結果が得られた(データ不掲載)。
【０１０４】
本発明者らは、CD8、CD4の表面発現およびFoxP3に関する細胞内染色に基づいて、CD3浸潤物をさらに分類した。KO腫瘍におけるCD8およびTregの総回収量は、少ないCD3が原因で予想されたとおり、減少していた(図24)。しかし、この効果はCD8コンパートメントにおいて、より顕著(かつ統計学的に有意)であり、その結果、KOマウスのCD8:Treg比は低下した。腫瘍部位におけるTregに対するCD8のバランスが、臨床研究におけるいくつかの癌に関する重要な予後変数として明らかになってきている。
【０１０５】
KO dLN中のDC関連遺伝子およびDCによるT細胞刺激に対する影響
CD8:Treg比が低下した原因を特定するために、本発明者らは、流入領域LNを解析した。本発明者らは、RNASeqによるLN全体のハイスループットかつ偏りのない解析を実施した。GVAX投与後5日目に、各マウスから流入領域LNを採取した。各試料について、4〜5個の流入領域リンパ節を集めた。
【０１０６】
骨髄性細胞は、流入領域リンパ節において比較的希少な集団である。したがって、本発明者らは、LysMCreを用いてPPAR-gを欠失させると、流入領域LN全体のRNASeqにおいてPPAR-g標的遺伝子発現の同定可能な差異が生じるかを、最初に試験した。本発明者らは、いくつかの標準的な(canonical)PPAR-g標的遺伝子がKO流入領域リンパ節において減少していることを発見した(図38A)。これまでに、PPAR-gによって制御される遺伝子モジュールが、肺胞マクロファージにおいて同定されている。このモジュール中のマクロファージ遺伝子の内のいくつかもまた、KOにおいて減少していた(図38B)。本発明者らが、本発明者らの全リンパ節RNASeqにおいて骨髄系に限定された遺伝子発現変化を同定できたこと、また、PPAR-gの機能的欠陥を実証したことが、これらのデータによって裏付けられた。
【０１０７】
次いで、本発明者らは、Immgenデータベース(Immgen.org、マウスのすべての免疫細胞型をマイクロアレイによってプロファイリングする研究室の共同事業体)においてプロファイリングされた全遺伝子モジュール(約300個)を取得した。遺伝子モジュールは、同時発現されることが見出された、かつそれらが発現される細胞型および刺激について注釈を付けられている、遺伝子と定義される。本発明者らは、遺伝子セット濃縮解析(GSEA)によって、これらの遺伝子モジュールの内のいずれかがKOにおいて変化しているかどうかを問うた。本発明者らは、樹状細胞中で濃縮されている大きな遺伝子セットがKOにおいて減少していることを発見した(図38C、Immgen.orgにおける、大まかな(coarse)モジュール26)。DC濃縮は、Immgen.orgの様々な免疫細胞サブセットのマイクロアレイ解析により、実験によって定められる。
【０１０８】
フローサイトメトリー解析によって、流入領域リンパ節中のCD11c+(DCに関するマーカー)細胞の多く(large fraction)がMHCIIhiかつCCR7+であることが示され、GVAX流入領域リンパ節中の主なDC集団が遊走性DCであることが示唆された(データ不掲載)。以前の研究により、ナイーブなマウス遊走性DCにおいて免疫寛容の徴候が確認されていた。本発明者らは、下方調節されている多くのDC遺伝子とは対称的に、migDCのナイーブな免疫寛容誘発徴候がKO dLNにおいて保持されていることを発見した(図39A)。これらのデータから、KO流入領域リンパ節において樹状細胞の免疫賦活能力が低下していることが示唆された。混合リンパ球反応(MLR)において、KO dLNに由来するCD11c+細胞では、T細胞を活性化する能力が低下していた(図39B、39C)。
【０１０９】
KO dLNにおける制御性T細胞遺伝子シグネチャーおよびCD8:Treg比に対する影響
DC遺伝子シグネチャーおよび機能的欠陥から、T細胞機能に対する影響が示唆された。したがって、本発明者らは次に、RNASeqが任意のT細胞欠陥を明らかにするかを評価した。腫瘍部位でTregが増加していることに一致して、本発明者らは、KOにおいてTreg特異的遺伝子モジュールが増加していることを発見した(図40A)。FoxP3、IL2RA (CD25)、CTLA-4などTregに特異的または豊富な遺伝子は、KO dLNにおいて有意に濃縮されていた。本発明者らは、Treg出現率の上昇をフローサイトメトリーによって確認した(図40Bおよび40C)。興味深いことに、TILデータおよびMLRにおいて減少したT細胞増殖に一致して、本発明者らは、KO dLNにおいてCD8の出現率が低下し、CD8:Treg比が低下していることも発見した(図40C)。
【０１１０】
制御性T細胞出現率の上昇の根拠を調査するために、本発明者らは再び、樹状細胞遺伝子発現に焦点を合わせた。KO dLNにおいて、本発明者らは、骨髄性細胞によって産生されるケモカインであり、制御性T細胞を動員することが公知であるCCL22の発現の増大を発見した(データ不掲載)。同様の機能が、CCL22と共通の受容体を共用するCCL17によって果たされる。したがって、本発明者らは、対照dLNおよびKO dLNにおけるCCL17およびCCL22の発現をELISAによって試験した。本発明者らは、流入領域LN DCのPPAR-g欠乏とTregに対する影響との間に存在し得る関連を提供する、KO dLNにおける両方のケモカインのレベル上昇を発見した(図40D)。
【０１１１】
PPAR-gの組織特異的欠失のこれらの影響が本発明者らの皮膚ワクチン接種モデルに拡大適用するかどうか理解するために、本発明者らは、ワクシニアウイルスを乱切接種した(scarred)対照マウスおよびKOマウスのdLNにおけるCCL22およびCD8の生存レベルを比較した。本発明者らは、KOマウスでは、対照マウスの同じくワクシニア乱切接種モデルと比べて、CD8生存数が減少しており(図40E)、CCL22が増加している(図40F)ことを発見した。これらのデータから、皮膚ワクチン接種における防御的T細胞機能を促進する際に骨髄性PPAR-gが必要であることが示唆される。
【０１１２】
本発明者らは、共抑制受容体CTLA-4およびTIGITの発現がKOにおいて上方調節されていることに注目することに興味を持った(図40A)。本発明者らは、ナイーブなLNにおけるこれらの受容体の細胞表面発現が限定的であることを発見した(図41A、B)。GVAXで治療したマウスでは、dLNにおいてこれらの受容体を発現する主要なT細胞集団は、FoxP3陽性の制御性サブセットであった(図41C、D)。FoxP3-細胞(まとめて「エフェクターT細胞」と名付けられる)は、ワクチン接種後でさえ、CTLA-4陰性およびTIGIT陰性のままであった(図41C、D)。さらに、本発明者らは、GVAXで治療したマウス(対照およびKO)の腫瘍内TregすべてがTIGIT陽性であることも発見した。
【０１１３】
ロシグリタゾンによってPPAR-gを薬理学的に活性化すると、免疫療法に対する応答が向上する
以前の実験で、本発明者らは、リゾチームM発現細胞におけるPPAR-gの遺伝子欠損がGVAX有効性を低下させ得ることを発見した。本発明者らは、今度は、薬理学的機能獲得によってワクチン有効性を向上させることができるかどうかを問うた。ロシグリタゾンは、臨床用に認可されたPPAR-gリガンドである。本発明者らは、本発明者らの治療的ワクチン接種モデルに目を向けて、腫瘍内リンパ球を試験した。本発明者らは、GVAXおよびロシグリタゾン(飲料水に溶かし、20mg/kg)で治療したマウスにおいてCD8:Treg比が上昇していることを発見した。LysM-Cre;PPAR-g flマウスではCD8:Treg比の改善は起こらず、ロシグリタゾンが骨髄性PPAR-gに作用することによってCD8:Treg比を改善するという証拠も提供されなかった。これらのデータは、機能喪失のデータを補足するものであり、PPAR-gがGVAXに対する免疫応答を援助できるというさらなる証拠を与える。しかし、CD8:Treg比が改善したにもかかわらず、マウスの生存率は改善しなかった(図33B)。
【０１１４】
GVAXのみを用いる治療的ワクチン接種は、本発明者らの治療計画において防御的有効性を示すには不十分である(図33B、上のパネル)。したがって、本発明者らは、チェックポイント遮断の形態で追加の免疫療法を提供すると、モデルが寛容になってロシグリタゾンによる生存率の改善を示す可能性があるという仮説を立てた。本発明者らはCTLA-4遮断抗体を用いた。これは、臨床で積極的に推し進められ使用されている戦略である。実際、GVAXおよび抗CTLA4の組合せは、本発明者らのモデルにおいていくらかの治療的利益を与えた(図33B、中央のパネルおよび下のパネル)。重要なことには、ロシグリタゾンは、GVAXおよび抗CTLA4で治療したマウスにおいて、腫瘍発生率(図33B、中央のパネル)および生存率(図33B、中央のパネル)をさらに改善した。
【０１１５】
これらのデータが、特定の1種の細胞株に限定される可能性を排除するために、本発明者らは、異所性ルイス肺癌を皮下移植した別のモデルで、GVAX+抗CTLA4治療マウスに対するロシグリタゾンの影響を試験した。ルイス肺癌は、浸潤性細胞株であり、潰瘍化を招く場合がある。本発明者らは、GVAX+抗CTLA-4治療マウスにおける潰瘍化の発生率(図42A)および生存率(図42B)が、ロシグリタゾンによって、大きくではないが有意に改善されることを発見した。したがって、本発明者らのデータは、2つの独立したモデルにおいて、PPAR-gの新規な炎症促進役割の証拠を提供して、FDA認可薬ロシグリタゾンの新しい適応症(indication of use)を示唆する。
【０１１６】
ヒト単球におけるPPAR-g機能の保存
これらのデータの臨床的関連性を理解するため、およびPPAR-gのこの役割がヒトにおいて保存されているかどうか確認するために、本発明者らは、ヒト単球をGM-CSFで処理してPPAR-g発現を誘導した。GM-CSFの他に、単球をRosiまたはPPAR-gアンタゴニストであるT0070907で処理した。単球におけるCCL17(図43A)およびCCL22(図43B)の発現は、ロシグリタゾンによって減少した。T0070907処理がCCL17およびCCL22の発現を増大させるという逆の効果を与えたことは、これらのデータに頑健性を加えた。さらに、本発明者らは、ロシグリタゾンが、自己由来T細胞と同時培養されたこれらのGM-CSF処理単球中のTregの数を減少させ、対照的にGM-CSF未処理培養物では効果を示さないことも発見した(図35Aおよび35B)。
【０１１７】
KO LNは、Treg促進サイトカインCCL17およびCCL22の発現を増大させた
Treg出現率の上昇およびCD8:Treg比に対する効果を説明するために、本発明者らは、本発明者らのRNASeqデータに立ち戻った。興味深いことに、ケモカインCCL17(TARC)およびCCL22(MDC)の発現は、KO遺伝子セットにおいて上方調節されていた。CCL17およびCCL22は、それらの受容体CCR4を介したTreg動員に関係があるとされている。興味深いことに、CCL17およびCCL22を産生することが公知である主なサブセットは、マクロファージおよび樹状細胞である。本発明者らは、CCL17およびCCL22の産生の変化をELISAによって試験した。図25は、3つの異なる時点における、PPAR-γ KO GVAX dLNによるCCL17およびCCL22の発現の増大を示している。
【０１１８】
CD8 T細胞のIFN-γ応答は、KOにおいて不完全ではない
本発明者らは、増加したTregがCD8機能に対してどのような影響を有しているかを問うた。図26に示すように、対照LNおよびKO LNに由来するCD8は、GVAXに対する抗B16応答において標的とされるメラノサイト特異的タンパク質であるTrp-2に由来する免疫優性ペプチドに応答して、同等レベルのIFN-γを分泌した。本発明者らは、脾臓の再刺激における同等のIFN-γレベル(章3、表2)およびRNASeqにおけるIFN-γ応答遺伝子シグネチャーの増大(図21)を既に認識していたため、これらのデータは意外ではない。現在、本発明者らは、CD8の媒介によるB16腫瘍死滅がTreg増加の結果として不完全になっているかどうかを判定するために細胞障害性アッセイ法の最適化に取り組んでいる。しかし、本発明者らは、RNASeqからは、KOのグランザイムにもパーフォリンにも、いかなる減少も検出しなかった(データ不掲載)。
【０１１９】
KO LNでは、ランゲルハンス細胞に関する遺伝子発現シグニチャーが増大している
特に、骨髄性細胞はCCL17およびCCL22の主要な生産者であるため、PPAR-γ欠乏によって、流入領域リンパ節中の細胞で提示される抗原が変化する可能性がある。これに関連して、ランゲルハンス細胞(LC)のImmgenモジュールは、対照と比べてKO LNにおいて濃縮されていた(図27)。この見解と一致して、公開されている報告は、PPAR-γがLCによって発現され得ることを示している。
【０１２０】
本発明者らは、リゾチームMがLCにおいて発現され、したがって、PPAR-γ欠失によって直接的に影響され得るかを、Immgenデータベースを用いて確認した。図28に示すように、LCはリゾチームMを発現した。
【０１２１】
LCは、活性化されると皮膚リンパ節に移動する。LCは、ランゲリンまたはCD207を発現する。しかし、最近の研究において、皮膚DCもまたCD207を発現することが示されている。EpCAMおよびCD103に基づいてさらに識別することが可能であるが、皮膚樹状細胞サブセットを定義する際のそれらの有用性については依然としていくらかの議論が交わされている[2]。図29は、LCを同定し、LCと皮膚ランゲリン発現DCとを識別するための本発明者らの染色戦略を示す。本発明者らは、LCをCD207+EpCAM+細胞として同定した。本発明者らは、CD103発現に基づいて2つのサブセットを検出することができた。さらに、本発明者らは、CD207- MHCIIhi EpCAM-樹状細胞サブタイプも検出することができた。DCの3つのサブセットすべてがCCR7を発現したことから、これらが遊走性DCであることが示唆された。したがって、CD207-サブセットは皮膚DCである可能性がある。予想されたとおり、LCはCD8発現について陰性であった。
【０１２２】
本発明者らは、本発明者らのゲーティング戦略に基づいて、LC全体にも比較上の集団であるCD103+ LCにも数的な欠陥を確認することはできなかった(図30)。PPAR-γ欠乏によってLC機能が変化するかどうかを判定するには、さらなる研究が必要である。本発明者らは、KOの潜在的な機能的欠陥を特定するためにLN APCを様々なT細胞サブセットと同時培養する研究を計画している。
【０１２３】
ロシグリタゾンを用いてPPAR-γを薬理学的に活性化すると、一貫した機能獲得表現型が示され、免疫療法としての可能性が確認された
PPAR-γのいくつかの合成アゴニストが入手可能である。これらの内の1つであるロシグリタゾン(Rosi)は、十分に特徴決定されており、糖尿病の管理のために臨床用に認可されている。本発明者らのモデルシステムにおいて、PPAR-γの選択的減少がTreg数の増加を引き起こすことを考慮して、本発明者らは、GVAXで治療したマウスをロシグリタゾンで治療するとTreg数が減少し、LNおよび腫瘍中のCD8:Treg比が改善するかどうかを試験した。
【０１２４】
Rosiは、患者に経口的に与えられる。したがって、本発明者らは、飲料水によってマウスにそれを送達することに決めた。本発明者らは、ワクチン接種と同じ日にRosi処置を開始した。Rosi GOF実験を遺伝子LOFと比較できるようにするために、本発明者らは、ワクチン接種後6〜8日目に、DMSOおよびRosiで処置したLNを比較した。図31に示すように、RosiまたはDMSOで処置したGVAXマウスにおいて、CD8出現率およびTreg出現率にも、ならびにCD8:Treg比にも有意な差はなかった。(CD8/Treg比が上昇する傾向はあると思われる)。
【０１２５】
しかし、12日間のRosi処置は、腫瘍浸潤リンパ球の顕著な増大を示した(図32)。印象的なことには、KOマウスではCD3浸潤が減少していたのに対し、Rosiで処置したマウスでは、CD3浸潤および全CD45+浸潤が改善していた。このことと一致して、CD8およびTregの絶対数は多かったものの、Rosiで処置したマウスでは、CD8:Treg比が高くなっていた。この機能獲得表現型は、骨髄系列におけるPPAR-γの遺伝子機能喪失と一致している。
【０１２６】
Rosiの全身送達によるCD8:Treg比の改善には、骨髄性PPAR-γが必要である
経口的Rosi処置は、いくつかの細胞型に影響を与えるであろうと予想される。したがって、本発明者らは、Rosiの媒介による免疫浸潤物(immune infiltrates)の改善が骨髄性PPAR-γを本当に必要とするかどうか検討したいと考えた。図33に示すように、CD45+浸潤物、CD3+浸潤物、ならびにCD8:Treg比は、骨髄性細胞でのPPAR-γ発現の非存在下でRosi処置した場合、変わらないままであった(統計的有意性なし)。
【０１２７】
Rosiによって、GVAXおよびCTLA-4遮断を用いる組合せ治療に対する抗腫瘍応答が向上する
本発明者らは、放射線照射済のGM-CSF分泌B16細胞をワクチン接種されたマウスをRosiで処置した場合、CD8:Treg比は改善されるにもかかわらず、チャレンジ腫瘍のサイズは影響を受けないことに気付いた(図32)。この結果と一致して、併用治療は、生存期間を延長しなかった(データ不掲載)。しかし、本発明者らは、CD8/Treg 比の改善により、ワクチン接種の効力を増強することが公知である他の組合せ戦略の有効性が向上し得るのではないかと考えた。これに関連して、CTLA-4抗体遮断は、GVAXとの組合せで、腫瘍内CD8機能を向上させること、および腫瘍内Tregを除去することが公知である。CTLA-4はまた、KO dLNにおいて上方調節された遺伝子として出現していた。さらに、B16に向かって進むT細胞(エフェクターおよび制御性の両方)は、CTLA-4を発現することが公知である。したがって、本発明者らは、GVAX+CTLA4に対する応答にRosi処置が与える影響を試験した。図 34に示すように、Rosi処置は、GVAX+CTLA4と共に、生存率を有意に高めた。このRosiの利点は、2種の異なるチャレンジ用量に対して観察された。
【０１２８】
考察
本発明者らは、骨髄性細胞におけるPPAR-γのこれまで確認されていなかった機能を明らかにした。すなわち、マウスにおいて、GM-CSF分泌腫瘍細胞ワクチン接種に応答するTreg数を抑制する。PPAR-γのこの機能は、これまでに説明されている免疫抑制効果とは異なる。しかし、本発明者らのアッセイ法において、GVAX有効性がKOにおいて低下しているので、PPAR-γのこの免疫賦活性役割は優性である。本発明者らは、PPAR-γ減少の結果、dLNおよび腫瘍中のTreg数が増え、リンパ節上清中のエフェクター対Treg比が低下し、Treg動員サイトカインが増加することを実証した。Treg増加がワクチン欠陥の一因であることを明確に示すために、本発明者らは、対照マウスおよび抗CD25抗体を用いて既存Tregを除去したKOマウスにおけるワクチン有効性を試験している。
【０１２９】
本発明者らは、PPAR-γの合成リガンドであるロシグリタゾンを用いて、一貫したGOF表現型を実証することができた。さらに、本発明者らは、RosiがGVAX+CTLA-4に対する免疫応答を強化できることを示すこともできた。RosiはFDAに認可された低分子であり、有望な免疫療法として患者において評価することができたため、これらは、臨床的意義があるデータである可能性がある。
【０１３０】
実施例5:ヒトPBMCでのGM-CSF機能の研究におけるPPAR-γ調節の影響
方法
GM-CSFとのヒトPBMC培養
血小板ドナーに由来する白血球除去部分(collar)を勾配遠心分離することによって、ヒトPBMCを得た。4×106個の細胞を105個のK562-WTまたはK562-GMと共に平板培養した。対照条件およびGM処置条件を、48時間毎に10uMのRosiまたはDMSOに曝露した。培養4〜6日目に、細胞を採取した。2mM EDTAと共に37℃でインキュベーションすることによって、接着細胞を得た。1mM EDTAの存在下でフローサイトメトリーのために細胞を染色した。Invitrogen製のLive/Dead固定可能色素を用いて、死細胞を識別した。抗体は、BD Biosciences、Biolegend、およびEbioscienceから調達した。
【０１３１】
PPAR-γ調節
Rosiは、Adipogenから粉末として入手した。それをDMSO中に再懸濁し、10uM Rosiまたは等体積のDMSOを48時間毎に使用した。PPAR-γのアンタゴニストであるT0070907を1uMで使用し、48時間毎に添加した。
【０１３２】
CCL17測定
ELISA(DY364, R&D Systems)を用いてCCL17レベルを測定した。
【０１３３】
結果
ヒト末梢血単核細胞培養物は、GM-CSFで処理するとTreg細胞の増加を示し、これは、骨髄性PPAR-γの刺激(agonism)によって相殺される
本発明者らは、PPAR-γリガンドRosiが、GM-CSFによって誘導されるTreg増殖の程度を小さくできることを発見した(図35a、b)。マウスとヒトとでこの経路が保存されていることは、GM-CSFによって誘導されるTreg増殖がPPAR-γアンタゴニストによって増加することによってさらに強調される(図35c)。PPAR-γアンタゴニストを用いた研究は、マウスの遺伝子機能喪失を再現する。PPAR-γ調節は、GM-CSFの存在下でのみ有効であり、K562-WTとの培養物では有効ではなかった。
【０１３４】
Rosiによって、GM-CSFで処理した初代ヒト単球によるCCL17産生が減少する
PPAR-γ活性化によって、マウスの機能喪失研究で認められたケモカイン過剰発現も減少するかどうかを試験するために、本発明者らは、ヒトPBMC由来CD14+細胞をGM-CSFと共に培養した。さらに、これらの培養物をDMSOまたはRosiで処理した。予備データ中で、本発明者らは、Rosi処理によって、GM-CSFで処理したヒト単球によるCCL17産生が減少することを発見している(図36)。
【０１３５】
Rosiは、接着性PBMC中の対照単球またはGM処理単球の活性化状態に影響を与えなかった
次に、本発明者らは、培養状態の骨髄性細胞にRosi処理が与える影響を評価した。散乱およびCD14陽性に基づいて、骨髄性細胞の総数を算出した。活性化の指標として、HLA-DRおよびCD40の発現を定量した。さらに、接着細胞は、樹状細胞表現型を示唆するCD1cを発現した(データ不掲載)。骨髄性細胞の総数、活性化の状態、またはCD1cの発現は、Rosiで処理した対照条件でもGM条件でも影響を受けなかった(図37)。
【０１３６】
考察
前述の研究は、GM-CSFによって誘導されたTregを抑制する際のPPAR-γの役割がヒトにおいて保存されていることを示す
PBMC培養物では、全細胞がRosiに曝露され、したがって、様々な細胞型に対する効果のすべて(sum)を本発明者らが観察することが可能である。しかし、RosiがGM-CSFの存在下でのみTreg数を減少させることができ、したがって骨髄性細胞の必要性を暗示していることに注目することが重要である。マウスのデータと合わせて、本発明者らの研究は、PPAR-γの新規かつ治療的に重要な機能を特定した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３４】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３５Ｃ】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３８Ｃ】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図３９Ｃ】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４０Ｃ】
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【図４０Ｄ】
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【図４０Ｅ】
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【図４０Ｆ】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【国際調査報告】
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