(57)【要約】  ここに開示するのは、免疫グロブリン(Ｉｇ)のＦｃ部分分子に親和性および特異性を有する細胞外ドメイン；Ｆｃ結合ドメイン；膜貫通ドメイン；少なくとも１の共刺激性シグナル伝達ドメイン；および免疫受容体チロシン活性化モチーフ(ＩＴＡＭ)を含む細胞質シグナル伝達ドメインを含む、キメラ受容体である。またここに提供されるのは、それをコードする核酸キメラ受容体およびキメラ受容体を発現する免疫細胞である。このような免疫細胞は、抗体依存性細胞介在細胞毒性増強および／または癌免疫療法のような抗体ベースの免疫療法増強に使用できる。
2017527310.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(ａ)Ｆｃ結合ドメイン；
(ｂ)膜貫通ドメイン；
(ｃ)少なくとも１の共刺激性シグナル伝達ドメイン；および
(ｄ) 免疫受容体チロシン活性化モチーフ(ＩＴＡＭ)を含む細胞質シグナル伝達ドメインを含むキメラ受容体であって；(ｃ)または(ｄ)がキメラ受容体のＣ末端に位置し、
(ｉ)(ａ)がＣＤ１６Ａの細胞外リガンド結合ドメインであるならば、(ｄ)はＦｃ受容体のＩＴＡＭドメインを含まず、
(ii)Ｎ末端からＣ末端方向で、Ｆ１５８  ＣＤ１６ＡまたはＶ１５８  ＣＤ１６Ａの細胞外リガンド結合ドメイン、ＣＤ８αのヒンジおよび膜貫通ドメイン、４−１ＢＢの共刺激性シグナル伝達ドメインおよびＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達ドメインを含む受容体ではない、
キメラ受容体。
【請求項２】
(ｄ)がキメラ受容体のＣ末端に位置する、請求項１に記載のキメラ受容体。
【請求項３】
(ａ)のＣ末端および(ｂ)のＮ末端に位置する(ｅ)ヒンジドメインをさらに含む、請求項１または請求項２に記載のキメラ受容体。
【請求項４】
シグナルペプチドをそのＮ末端に含む、請求項１〜３のいずれかに記載のキメラ受容体。
【請求項５】
(ａ)のＦｃ結合ドメインが：
(ｉ)所望によりＦｃガンマ受容体、Ｆｃアルファ受容体またはＦｃイプシロン受容体であるＦｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメイン、
(ii)免疫グロブリンのＦｃ部分に結合する抗体フラグメント、
(iii)免疫グロブリンのＦｃ部分またはＦｃ結合そのフラグメントに結合する天然に存在するタンパク質および
(iv)免疫グロブリンのＦｃ部分に結合する合成ポリペプチド
からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれかに記載のキメラ受容体。
【請求項６】
Ｆｃ結合ドメインが、ＣＤ１６Ａの細胞外リガンド結合ドメイン、ＣＤ３２ＡまたはＣＤ６４Ａである(ｉ)である、請求項５に記載のキメラ受容体。
【請求項７】
Ｆｃ結合ドメインがＣＤ３２ＡまたはＣＤ６４Ａの細胞外リガンド結合ドメインである、請求項６に記載のキメラ受容体。
【請求項８】
Ｆｃ結合ドメインが、単一鎖可変フラグメント(ＳｃＦｖ)、単ドメイン抗体またはナノボディである(ii)である、請求項５に記載のキメラ受容体。
【請求項９】
Ｆｃ結合ドメインが、プロテインＡまたはプロテインＧである(iii)である、請求項５に記載のキメラ受容体。
【請求項１０】
Ｆｃ結合ドメインが、Ｋｕｎｉｔｚペプチド、ＳＭＩＰ、アビマー、アフィボディ、ＤＡＲＰｉｎまたはアンチカリンである(iv)である、請求項５に記載のキメラ受容体。
【請求項１１】
(ｂ)の膜貫通ドメインが単回通過膜タンパク質である、請求項１〜１０のいずれかに記載のキメラ受容体。
【請求項１２】
膜貫通ドメインがＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６Ａ、ＯＸ４０、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳおよびＦＧＦＲ２Ｂからなる群から選択される膜タンパク質のものである、請求項１１に記載のキメラ受容体。
【請求項１３】
膜貫通ドメインがＣＤ８β、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６Ａ、ＯＸ４０、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳおよびＦＧＦＲ２Ｂからなる群から選択される膜タンパク質のものである、請求項１１に記載のキメラ受容体。
【請求項１４】
(ｂ)の膜貫通ドメインが天然に存在しない疎水性タンパク質セグメントである、請求項１〜１０のいずれかに記載のキメラ受容体。
【請求項１５】
(ｃ)の少なくとも１の共刺激性シグナル伝達ドメインが４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２８ＬＬ→ＧＧバリアント、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ１、ＬＦＡ１およびＣＤ２からなる群から選択される共刺激性分子のものである、請求項１〜１４のいずれかに記載のキメラ受容体。
【請求項１６】
(ｃ)の少なくとも１の共刺激性シグナル伝達ドメインがＣＤ２８、ＣＤ２８ＬＬ→ＧＧバリアント、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ１、ＬＦＡ１およびＣＤ２からなる群から選択される共刺激性分子のものである、請求項１〜１４のいずれかに記載のキメラ受容体。
【請求項１７】
キメラ受容体が２共刺激性シグナル伝達ドメインを含む、請求項１〜１６のいずれかに記載のキメラ受容体。
【請求項１８】
２共刺激性ドメインが
(ｉ)ＣＤ２８および４−１ＢＢ；または
(ii)ＣＤ２８ＬＬ→ＧＧバリアントおよび４−１ＢＢ
である、請求項１７に記載のキメラ受容体。
【請求項１９】
(ｄ)の細胞質シグナル伝達ドメインがＣＤ３ζまたはＦｃεＲ１γの細胞質ドメインである、請求項１〜１８のいずれかに記載のキメラ受容体。
【請求項２０】
(ｅ)のヒンジドメインがＣＤ８αまたはＩｇＧのものである、請求項３〜１９のいずれかに記載のキメラ受容体。
【請求項２１】
ヒンジドメインが天然に存在しないペプチドである、請求項３〜１９のいずれかに記載のキメラ受容体。
【請求項２２】
ヒンジドメインが伸長組み換えポリペプチド(ＸＴＥＮ)または(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)ｎポリペプチド(ここで、ｎは３〜１２(両端を含む)の整数である)である、請求項２１に記載のキメラ受容体。
【請求項２３】
キメラ受容体が表３に示す要素(ａ)〜(ｅ)を含む、請求項３に記載のキメラ受容体。
【請求項２４】
配列番号２〜１１から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載のキメラ受容体。
【請求項２５】
表４に示す要素(ａ)〜(ｅ)を含む、請求項３に記載のキメラ受容体。
【請求項２６】
配列番号１２〜１７から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載のキメラ受容体。
【請求項２７】
表５に示す要素(ａ)〜(ｅ)を含む、請求項３に記載のキメラ受容体。
【請求項２８】
配列番号１８〜３０および３２〜５６から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載のキメラ受容体。
【請求項２９】
請求項１〜２８のいずれかに記載のキメラ受容体をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
【請求項３０】
ＲＮＡ分子である、請求項２９に記載の核酸。
【請求項３１】
請求項２９に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項３２】
発現ベクターである、請求項３１に記載のベクター。
【請求項３３】
ウイルスベクターである、請求項３２に記載のベクター。
【請求項３４】
ウイルスベクターがレンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである、請求項３３に記載のベクター。
【請求項３５】
請求項２９または請求項３０に記載の核酸または請求項３１〜３４のいずれかに記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項３６】
免疫細胞である、請求項３５に記載の宿主細胞。
【請求項３７】
免疫細胞がナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球またはＴ細胞である、請求項３６に記載の宿主細胞。
【請求項３８】
内因性Ｔ細胞受容体の発現が阻止または排除されているＴ細胞である、請求項３５〜３７のいずれかに記載の宿主細胞。
【請求項３９】
(ａ)請求項２０または請求項３０に記載の核酸、請求項３１〜３４のいずれかに記載のベクターまたは請求項３５〜３８のいずれかに記載の宿主細胞および(ｂ)薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項４０】
Ｆｃ含有治療剤をさらに含む、請求項３９に記載の医薬組成物。
【請求項４１】
Ｆｃ含有治療剤がＦｃ融合タンパク質である、請求項４０に記載の医薬組成物。
【請求項４２】
Ｆｃ含有治療剤が治療抗体またはＦｃ融合タンパク質である、請求項４０に記載の医薬組成物。
【請求項４３】
Ｆｃ含有治療剤がアダリムマブ、Ａｄｏ−トラスツズマブエムタンシン、アレムツズマブ、バシリキシマブ、ベバシズマブ、ベリムマブ、ブレンツキシマブ、カナキヌマブ、セツキシマブ、ダクリズマブ、デノスマブ、ジヌツキシマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、エピラツズマブ、ゲムツズマブ、ゴリムマブ、インフリキシマブ、イピリムマブ、ラベツズマブ、ナタリズマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ラムシルマブ、リツキシマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、ウステキヌマブおよびベドリズマブからなる群から選択される治療抗体である、請求項４２に記載の医薬組成物。
【請求項４４】
(ｉ)請求項２９または請求項３０に記載の核酸、請求項３１〜３４のいずれかに記載のベクターまたは請求項３５〜３８のいずれかに記載の宿主細胞および(ii)薬学的に許容される担体を含む第一医薬組成物および
Ｆｃ含有治療剤および薬学的に許容される担体を含む第二医薬組成物
を含む、キット。
【請求項４５】
Ｆｃ含有治療剤がＦｃ融合タンパク質である、請求項４４に記載のキット。
【請求項４６】
Ｆｃ含有治療剤が治療抗体である、請求項４４に記載のキット。
【請求項４７】
治療抗体がアダリムマブ、Ａｄｏ−トラスツズマブエムタンシン、アレムツズマブ、バシリキシマブ、ベバシズマブ、ベリムマブ、ブレンツキシマブ、カナキヌマブ、セツキシマブ、ダクリズマブ、デノスマブ、ジヌツキシマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、エピラツズマブ、ゲムツズマブ、ゴリムマブ、インフリキシマブ、イピリムマブ、ラベツズマブ、ナタリズマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ラムシルマブ、リツキシマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、ウステキヌマブおよびベドリズマブからなる群から選択される、請求項４６に記載のキット。
【請求項４８】
対象における抗体依存性細胞介在細胞毒性(ＡＤＣＣ)増強または抗体ベースの免疫療法の効力増強に使用する医薬組成物であって、有効量の請求項１〜２８のいずれかに記載のキメラ受容体を発現する宿主免疫細胞および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項４９】
宿主免疫細胞がナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、Ｔ細胞またはこれらの組み合わせである、請求項４８に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項５０】
宿主免疫細胞が自己である、請求項４８または請求項４９に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項５１】
宿主免疫細胞が同種異系である、請求項４８または請求項４９に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項５２】
宿主免疫細胞がエクスビボで活性化される、増大されるまたは両方される、請求項４８〜５１のいずれかに記載の使用のための医薬組成物。
【請求項５３】
対象がＦｃ含有治療剤で処置されているまたは処置される、請求項４８〜５２のいずれかに記載の使用のための医薬組成物。
【請求項５４】
Ｆｃ含有治療剤が治療抗体またはＦｃ融合タンパク質である、請求項５３に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項５５】
Ｆｃ含有治療剤がアダリムマブ、Ａｄｏ−トラスツズマブエムタンシン、アレムツズマブ、バシリキシマブ、ベバシズマブ、ベリムマブ、ブレンツキシマブ、カナキヌマブ、セツキシマブ、セルトリズマブ、ダクリズマブ、デノスマブ、ジヌツキシマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、エピラツズマブ、ゲムツズマブ、ゴリムマブ、イブリツモマブ、インフリキシマブ、イピリムマブ、ラベツズマブ、ムロモナブ、ナタリズマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、オビヌツズマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ラムシルマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、トシリズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、ウステキヌマブおよびベドリズマブからなる群から選択される治療抗体である、請求項５４に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項５６】
対象が癌を有するヒト患者であり、Ｆｃ含有治療剤が癌処置用である、請求項５３〜５５のいずれかに記載の使用のための医薬組成物。
【請求項５７】
癌が癌腫、リンパ腫、肉腫、芽細胞腫および白血病からなる群から選択される、請求項５６に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項５８】
癌がＢ細胞起源の癌、乳癌、胃癌、神経芽腫、骨肉腫、肺癌、皮膚癌、前立腺癌、結腸癌、腎臓細胞癌、卵巣癌、横紋筋肉腫、白血病、中皮腫、膵臓癌、頭頸部癌、網膜芽細胞腫、神経膠腫、神経膠芽腫および甲状腺癌からなる群から選択される、請求項５７に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項５９】
Ｂ細胞起源の癌がＢ細胞系譜急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病およびＢ細胞非ホジキンリンパ腫からなる群から選択される、請求項５８に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項６０】
(ｉ)免疫細胞集団を提供し；
(ii)免疫細胞に請求項１〜２８のいずれかに記載のキメラ受容体をコードする核酸を導入し；そして
(iii)キメラ受容体の発現を可能にする条件下で免疫細胞を培養する
ことを含む、キメラ受容体を発現する免疫細胞を製造する方法。
【請求項６１】
免疫細胞集団が末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)由来である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
免疫細胞がナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、Ｔ細胞またはこれらの組み合わせである、請求項６０または請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
免疫細胞がヒト患者由来である、請求項６０〜６２のいずれかに記載の方法。
【請求項６４】
ヒト患者が癌患者である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
核酸がウイルスベクターである、請求項６０〜６４のいずれかに記載の方法。
【請求項６６】
ウイルスベクターがレンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
核酸がＲＮＡ分子である、請求項６０〜６４のいずれかに記載の方法。
【請求項６８】
ベクターがレンチウイルス形質導入、レトロウイルス形質導入、ＤＮＡエレクトロポレーションまたはＲＮＡエレクトロポレーションにより免疫細胞に導入される、請求項６０〜６７のいずれかに記載の方法。
【請求項６９】
(iv)キメラ受容体を発現する免疫細胞の活性化をさらに含む、請求項６０〜６８のいずれかに記載の方法。
【請求項７０】
免疫細胞がＴ細胞を含み、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、ＩＬ−２およびフィトヘマグルチニンの１以上の存在下で活性化される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
免疫細胞が、内因性Ｔ細胞受容体が阻止または排除されているＴ細胞である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
免疫細胞がナチュラルキラー細胞を含み、４−１ＢＢリガンド、抗４−１ＢＢ抗体、ＩＬ−１５、抗ＩＬ−１５受容体抗体、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１およびＫ５６２細胞の１以上の存在下で活性化される、請求項６９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、35 U.S.C. §119の下、２０１４年９月９日出願の米国仮出願番号６２／０４７,９１６に基づく優先権を主張し、これは、引用により本明細書に包含させる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
細胞ベースの療法、抗体療法およびサイトカイン療法を含む癌免疫療法は、正常組織に危害を加えずに、腫瘍細胞を攻撃する免疫応答の惹起に使用される。薬物耐性の遺伝的および細胞性の機構を回避し、かつ正常組織に危害を加えずに腫瘍細胞を標的とする可能性のために、多種多様な癌を処置する有望な選択肢である。Ｔリンパ球は、Ｔ細胞介在移植片対宿主病(ＧｖＨＤ)が疾患再発と逆相関し、免疫抑制離脱またはドナーリンパ球注入が再発を抑制し得る、血液系腫瘍に対する同種造血幹細胞移植(ＨＳＣＴ)の結果により示されるように、主要な抗腫瘍効果を発揮し得る。Weiden et al., N Engl J Med. 1979; 300(19):1068-1073; Porter et al., NEnglJ Med. 1994;330(2):100-106; Kolb et al., Blood. 1995; 86(5):2041-2050; Slavin et al., Blood. 1996;87(6):2195-2204;およびAppelbaum, Nature. 2001;411(6835):385-389。
【０００３】
細胞ベースの療法は、癌細胞に偏った反応性を有する細胞毒性Ｔ細胞を含み得る。Eshhar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.; 1993;90(2):720-724; Geiger et al., J Immunol. 1999;162(10):5931-5939; Brentjens et al., Nat. Med. 2003;9(3):279-286; Cooper et al., Blood. 2003;101(4):1637-1644;およびImai et al., Leukemia. 2004;18:676-684。一つの試みは、１以上のＴ細胞活性化シグナル伝達ドメインに融合した抗原結合ドメインを有するキメラ抗原受容体の発現である。抗原結合ドメインを経る癌抗原の結合はＴ細胞活性化を生じ、細胞毒性を誘発する。キメラ受容体発現自己Ｔリンパ球の注入を用いる臨床試験の最近の結果は、その臨床可能性の説得力のある証拠を提供している. Pule et al., Nat. Med. 2008;14(11):1264-1270; Porter et al., N Engl J Med; 2011; 25;365(8):725-733; Brentjens et al., Blood. 2011;118(18):4817-4828; Till et al.,  Blood. 2012;119(17):3940-3950; Kochenderfer et al., Blood. 2012;119(12):2709-2720;およびBrentjens et al., Sci Transl Med. 2013;5(177):177ra138。
【０００４】
モノクローナル抗体、抗体融合タンパク質および抗体薬物コンジュゲート(ＡＤＣ)のような抗体ベースの免疫療法は、多くのタイプの癌を含む広範な疾患の処置に使用される。このような療法は、正常細胞(例えば、非癌細胞)に対して、排除が望まれる細胞(例えば、癌細胞のような標的細胞)に差示的に発現される細胞表面分子の認識に依存し得る。抗体ベースの免疫療法の癌細胞への結合は、多様な機構、例えば、抗体依存性細胞介在細胞毒性(ＡＤＣＣ)、補体依存性細胞毒性(ＣＤＣ)または抗体−薬物コンジュゲート(ＡＤＣ)からのペイロードの直接細胞毒性活性により癌細胞死に至り得る。
【発明の概要】
【０００５】
発明の要約
本発明は、ＩｇＧ抗体のような免疫グロブリン(Ｉｇ)のＦｃ部分に対する親和性および特異性を有する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、少なくとも１の共刺激性シグナル伝達ドメインおよび免疫受容体チロシン活性化モチーフ(ＩＴＡＭ)を含む細胞質シグナル伝達ドメインを含むキメラ受容体の設計に基づく。このようなキメラ受容体構築物を発現する免疫細胞は、例えば、ＡＤＣＣ活性を増強することにより、抗体ベースの免疫療法のような免疫療法の効力を増強する。
【０００６】
したがって、本発明のある面は、(ａ)免疫グロブリンのＦｃ部分に結合する、例えば、ＩｇＧのＦｃ部分に結合する細胞外ドメイン(Ｆｃ結合ドメイン)；(ｂ)膜貫通ドメイン；(ｃ)少なくとも１の共刺激性シグナル伝達ドメイン；および(ｄ)ＩＴＡＭを含む細胞質シグナル伝達ドメインを含む、キメラ受容体に関する。少なくとも１の共刺激性シグナル伝達ドメインまたはＩＴＡＭを含む細胞質シグナル伝達ドメインのいずれかは、ここに記載するようなキメラ受容体構築物のＣ末端に局在化され得る。ある態様において、ＩＴＡＭ含有細胞質シグナル伝達ドメインは、キメラ受容体構築物のＣ末端に位置する。ある態様において、(ａ)はＣＤ１６(例えば、ＣＤ１６ＡまたはＣＤ１６Ｂ)の細胞外リガンド結合ドメインであり、(ｄ)はＦｃ受容体のＩＴＡＭを含まない。ある態様において、(ｄ)は、ＣＤ３ζまたはＦｃεＲ１γの細胞質シグナル伝達ドメインである。ここに記載するキメラ受容体のいずれかは、さらに(ｅ)ヒンジドメインを含んでよく、これは(ａ)のＣ末端および(ｂ)のＮ末端に位置し得る。
【０００７】
ある態様において、ここに記載するキメラ受容体構築物の(ａ)は、Ｆｃガンマ受容体、Ｆｃアルファ受容体またはＦｃイプシロン受容体のようなＦｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメインである。例えば、(ａ)は、ＣＤ１６の細胞外リガンド結合ドメイン(例えば、ＣＤ１６ＡまたはＣＤ１６Ｂ)、ＣＤ３２(例えば、ＣＤ３２ＡまたはＣＤ３２Ｂ)またはＣＤ６４(例えば、ＣＤ６４Ａ、ＣＤ６４ＢまたはＣＤ６４Ｃ)であり得る。ある例において、(ａ)はＣＤ１６の細胞外リガンド結合ドメインではない。他の態様において、(ａ)はＣＤ３２(例えば、ＣＤ３２ＡまたはＣＤ３２Ｂ)の細胞外リガンド結合ドメインである。
【０００８】
他の態様において、(ａ)は、ＩｇＧ分子のようなＩｇ分子のＦｃ部分に結合できる非Ｆｃ受容体天然に存在するタンパク質のものである。例えば、(ａ)はプロテインＡまたはプロテインＧの全てまたは一部であり得る。あるいは、(ａ)は、一本鎖可変フラグメント(ｓｃＦｖ)または単ドメイン抗体、ナノボディを含むが、これらに限定されないＩｇＧ分子のＦｃ部分に結合する抗体フラグメントであり得る。
【０００９】
さらに他の態様において、(ａ)は、Ｋｕｎｉｔｚドメインペプチド、小モジュラー免疫薬(ＳＭＩＰ)、アドネクチン、アビマー、アフィボディ、ＤＡＲＰｉｎまたはアンチカリンを含む、ＩｇＧ分子のＦｃ部分に結合できる設計された(例えば、天然に存在しない)ペプチドである。
【００１０】
これに代えてまたはこれに加えて、(ｂ)のキメラ受容体の膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６(例えば、ＣＤ１６ＡまたはＣＤ１６Ｂ)、ＯＸ４０、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＣＤ３２(例えば、ＣＤ３２ＡまたはＣＤ３２Ｂ)、ＣＤ６４(例えば、ＣＤ６４Ａ、ＣＤ６４ＢまたはＣＤ６４Ｃ)、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳおよびＦＧＦＲ２Ｂを含むが、これらに限定されない、単回通過膜タンパク質であり得る。ある例において、膜タンパク質はＣＤ８αではない。膜貫通ドメインはまた天然に存在しない疎水性タンパク質セグメントであり得る。
【００１１】
ここに記載するキメラ受容体構築物のいずれにおいても、ここに記載するキメラ受容体の少なくとも１の共刺激性シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢ(別名ＣＤ１３７)、ＣＤ２８、ＣＤ２８ＬＬ→ＧＧバリアント、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ１、ＬＦＡ１またはＣＤ２のような共刺激性分子のものであり得る。ある例において、少なくとも１の共刺激性シグナル伝達ドメインは４−１ＢＢ由来ではない。ある例において、キメラ受容体は２共刺激性シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ２８および４−１ＢＢまたはＣＤ２８ＬＬ→ＧＧバリアントおよび４−１ＢＢを含む。
【００１２】
ここに記載するキメラ受容体のいずれかにおいて、ヒンジドメインは、ＣＤ８αまたはＩｇＧのようなタンパク質のものであり得る。例えば、ヒンジドメインは、ＣＤ８αの膜貫通またはヒンジドメインのフラグメントであり得る。ある例において、ヒンジドメインはＣＤ８αのヒンジドメインではない。ある例において、ヒンジドメインは、種々の長さの親水性残基からなるポリペプチド(ＸＴＥＮ)または(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)ｎポリペプチド(ここで、ｎは３〜１２(両端を含む)の整数である)のような天然に存在しないペプチドである。
【００１３】
ある態様において、ここに記載するキメラ受容体のいずれかは、そのＮ末端にシグナルペプチド、例えば、配列番号６１のアミノ酸配列を含み得るＣＤ８αのシグナルペプチドをさらに含み得る。
【００１４】
ここに記載するキメラ受容体の例は、表３、表４および表５に示すような要素(ａ)〜(ｅ)を含み得る。ある例において、キメラ受容体は、対照配列のシグナルペプチドを除く、配列番号２〜３０および３２〜５６またはそのフラグメントから選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１５】
特定の態様において、ここに記載するキメラ受容体は、Ｆ１５８  ＦＣＧＲ３Ａの細胞外リガンド結合ドメイン(Ｆ１５８  ＣＤ１６Ａ)またはＶ１５８  ＦＣＧＲ３Ａバリアント(Ｖ１５８  ＣＤ１６Ａ)を含み得る。このような細胞外リガンド結合ドメインは、それぞれ、配列番号７０および配列番号５７のアミノ酸配列を含み得る。
【００１６】
他の特定の態様において、ここに記載するキメラ受容体はＣＤ８αのヒンジおよび膜貫通ドメインを含んでよく、これは配列番号５８のアミノ酸配列を含み得る。
【００１７】
これに代えてまたはこれに加えて、ここに記載するキメラ受容体は４−１ＢＢの共刺激性シグナル伝達ドメインを含んでよく、これは配列番号５９のアミノ酸配列を含み得る。
【００１８】
さらに他の特定の態様において、ここに記載するキメラ受容体はＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達ドメインを含んでよく、これは配列番号６０のアミノ酸配列を含み得る。
【００１９】
ある例において、ここに記載するキメラ受容体は、ＣＤ８αのシグナルペプチド、Ｆ１５８  ＣＤ１６ＡまたはＶ１５８  ＣＤ１６Ａの細胞外ドメイン、ＣＤ８αのヒンジおよび膜貫通ドメイン、４−１ＢＢの共刺激性シグナル伝達ドメインおよびＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達ドメインを含む受容体ではない。具体例において、ここに記載するキメラ受容体は、配列番号１または配列番号３１のアミノ酸配列を含まない。
【００２０】
他の面において、本発明は、ここに記載するキメラ受容体のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸(例えば、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子)；核酸を含むベクター(例えば、発現ベクター)；および宿主細胞(例えば、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球およびＴ細胞のような免疫細胞)に関する。ある態様において、ベクターはウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである。ある態様において、ベクターはトランスポゾンであるかまたはトランスポゾンを含む。
【００２１】
ある態様において、ここに記載するキメラ受容体のいずれかを発現する宿主細胞はＴリンパ球またはＮＫ細胞であり、この両者ともエクスビボで活性化および／または増大し得る。ある例において、Ｔリンパ球またはＮＫ細胞は、癌を有する患者(例えば、ヒト患者)から単離された自己Ｔリンパ球または自己ＮＫ細胞である。ある例において、Ｔリンパ球またはＮＫ細胞は同種異系Ｔリンパ球または同種異系ＮＫ細胞である。Ｔリンパ球は、内因性Ｔ細胞受容体の発現が阻止または排除される同種Ｔリンパ球であり得る。これに代えてまたはこれに加えて、Ｔリンパ球は、抗ＣＤ３／ＣＤ２８、ＩＬ−２およびフィトヘマグルチニンからなる群から選択される１以上の薬剤の存在下、活性化され得る。ＮＫ細胞は、ＣＤ１３７リガンドタンパク質、ＣＤ１３７抗体、ＩＬ−１５タンパク質、ＩＬ−１５受容体抗体、ＩＬ−２タンパク質、ＩＬ−１２タンパク質、ＩＬ−２１タンパク質およびＫ５６２細胞株からなる群から選択される１以上の薬剤の存在下、活性化され得る。
【００２２】
さらに他の面において、ここに記載されるのは、(ａ)ここに記載する核酸または宿主細胞のいずれかおよび(ｂ)薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。ある例において、組成物は、さらに抗体(例えば、ＩｇＧ抗体)またはＦｃ融合タンパク質のようなＦｃ含有タンパク質を含み得る。ある例において、抗体は癌細胞に細胞毒性である。このような抗体は、ヒトＣＤ１６(ＦＣＧＲ３Ａ)に結合するヒトまたはヒト化Ｆｃ部分を含み得る。治療抗体は、アダリムマブ、Ａｄｏ−トラスツズマブエムタンシン、アレムツズマブ、バシリキシマブ、ベバシズマブ、ベリムマブ、ブレンツキシマブ、カナキヌマブ、セツキシマブ、ダクリズマブ、デノスマブ、ジヌツキシマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、エピラツズマブ、ゲムツズマブ、ゴリムマブ、インフリキシマブ、イピリムマブ、ラベツズマブ、ナタリズマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ラムシルマブ、リツキシマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、ウステキヌマブまたはベドリズマブを含むが、これらに限定されない。
【００２３】
またここに提供されるのは、(ａ)ここに記載する核酸または宿主細胞のいずれかおよび薬学的に許容される担体を含む第一医薬組成物および(ｂ)抗体(例えば、ＩｇＧ抗体)またはＦｃ融合タンパク質(例えば、ここに記載するようなもの)のようなＦｃ含有タンパク質および薬学的に許容される担体を含む第二医薬組成物を含む、キットである。
【００２４】
さらに、本発明は、対象における抗体依存性細胞介在細胞毒性(ＡＤＣＣ)を増強する方法を提供する。方法は、処置を必要とする対象(例えば、ヒト癌患者)に有効量のここに提供するキメラ受容体のいずれかを発現する宿主細胞を投与することを含む。ある態様において、宿主細胞は、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、Ｔ細胞またはこれらの組み合わせのような免疫細胞である。ある例において、宿主免疫細胞は自己である。他の例において、宿主免疫細胞は同種異系。宿主免疫細胞のいずれかをエクスビボで活性化させても、増大させても、両者をさせてもよい。
【００２５】
対象は抗癌抗体による処置に付されてよく、これはヒトＣＤ１６に結合するヒトまたはヒト化Ｆｃ部分を含み得る。対象は、癌腫、リンパ腫、肉腫、芽腫および白血病のような癌を有する患者であり得る。例えば、患者は、Ｂ細胞起源の癌、乳癌、胃癌、神経芽腫、骨肉腫、肺癌、黒色腫、前立腺癌、結腸癌、腎臓細胞癌、卵巣癌、横紋筋肉腫、白血病およびホジキンリンパ腫を有し得る。Ｂ細胞起源の癌は、Ｂ細胞系譜急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病およびＢ細胞非ホジキンリンパ腫を含むが、これらに限定されない。
【００２６】
他の面において、本発明は、抗体ベースの免疫療法の効力を増加させる方法に関する。方法は、治療抗体(例えば、ここに記載する治療抗体のいずれか)で処置されているまたは処置される対象に有効量のここに提供するキメラ受容体のいずれかを発現する宿主細胞を投与することを含む。宿主免疫細胞例は、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、Ｔ細胞またはこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。ある例において、宿主免疫細胞は自己である。他の例において、宿主免疫細胞は同種異系である。宿主免疫細胞のいずれかをエクスビボで活性化させても、増大させても、両者をさせてもよい。
【００２７】
ある例において、キメラ受容体を担持する宿主細胞を、Ｆｃ含有タンパク質、例えば、ここに記載するようなものと共投与する。ある例において、キメラ受容体を担持する宿主細胞を、Ｆｃ含有タンパク質の前にまたは後に投与する。ある例において、キメラ受容体を担持する宿主細胞をまず投与し、Ｆｃ含有タンパク質を、治療応答が観察されるまで段階的に濃度を上げながら投与する。
【００２８】
ここに提供する方法のいずれかにおいて、対象は癌を有するヒト患者でよく、治療抗体は癌処置用である。ある例において、癌はリンパ腫、乳癌、胃癌、神経芽腫、骨肉腫、肺癌、皮膚癌、前立腺癌、結腸癌、腎臓細胞癌、卵巣癌、横紋筋肉腫、白血病、中皮腫、膵臓癌、頭頸部癌、網膜芽細胞腫、神経膠腫、神経膠芽腫または甲状腺癌である。
【００２９】
また本発明の範囲内にあるのは、(ａ)ヒト癌患者のような処置を必要とする対象におけるＡＤＣＣ活性の増強および／または抗体療法の効力増強において使用するための医薬組成物であって、ここに記載するキメラ受容体構築物のいずれかを発現するここに記載するような免疫細胞および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物および(ｂ)意図する処置に使用するための医薬の製造のためのこのような免疫細胞の使用である。医薬組成物のいずれかは、抗体またはＦｃ融合タンパク質のようなＦｃ含有治療剤をさらに含んでよくまたは併用してよい。
【００３０】
さらに、本発明は、ここに記載するようなキメラ受容体を発現する免疫細胞を製造する方法を提供する。方法は、(ｉ)免疫細胞集団を提供し；(ii)免疫細胞にベクター(例えば、レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターのようなウイルスベクター、トランスポゾンまたはトランスポゾン配列を含むベクター)またはここに提供するキメラ受容体のいずれかをコードするネイキッド核酸(例えば、ｍＲＮＡ)を導入し；そして(iii)キメラ受容体の発現を可能にする条件下で免疫細胞を培養することを含む。このような方法は、さらに(iv)キメラ受容体を発現する免疫細胞の活性化を含んでよい。免疫細胞がＴ細胞を含む例において、Ｔ細胞を、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、ＩＬ−２およびフィトヘマグルチニンの１以上の存在下で活性化し得る。Ｔ細胞を、内因性Ｔ細胞受容体の発現が阻止または排除されるように操作され得る。免疫細胞がナチュラルキラー細胞を含む例において、ナチュラルキラー細胞を、４−１ＢＢリガンド、抗４−１ＢＢ抗体、ＩＬ−１５、抗ＩＬ−１５受容体抗体、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１およびＫ５６２細胞の１以上の存在下で活性化し得る。
【００３１】
ある態様において、免疫細胞集団は末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)由来である。免疫細胞例は、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、Ｔ細胞またはこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。ある態様において、免疫細胞(例えば、ＰＢＭＣ)はヒト癌患者由来である。ある態様において、免疫細胞はヒトドナー由来である。ある態様において、免疫細胞は、ヒト患者またはヒトドナー由来の幹細胞または幹様細胞から分化される。ある態様において、免疫細胞は、ＮＫ−９２細胞のような確立された細胞株である。
【００３２】
ここに提供する方法のいずれかにおいて、ベクターを、レンチウイルス形質導入、レトロウイルス形質導入、ＤＮＡエレクトロポレーションまたはＲＮＡエレクトロポレーションにより免疫細胞に導入し得る。他の例において、ここに記載するキメラ受容体をコードするＲＮＡ分子を、発現のための免疫細胞に導入し得る。
【００３３】
本発明の多くの態様の詳細を、下記に示す。本発明の他の特性または利益は、いくつかの態様の詳細な記載およびまた添付する特許請求の範囲からも明らとなる。
【００３４】
図面の簡単な説明
添付する図面は本明細書の一部を構成し、本発明のある面をさらに示すために包含され、当該本発明はここに提示する具体的態様の詳細な記載と組み合わせてこれらの図面の１以上を参照することで、よりよく理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】Ｔ細胞におけるＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体の発現を示す図である。Ａ：ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体構築物の略図である。Ｂ：末梢血Ｔリンパ球におけるＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体の発現を示すグラフである。ＧＦＰ単独を含むベクター(偽)またはＧＦＰとＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζを含むベクターを形質導入した活性化Ｔリンパ球におけるＧＦＰまたはＣＤ３ζと組み合わせたＣＤ１６(Ｂ７３.１抗体)の発現を示すフローサイトメトリードットプロットである。各四分円における陽性細胞のパーセンテージを示す。Ｃ：ＧＦＰ単独またはＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζを形質導入したＴリンパ球からの細胞ライセートの代表的ウェスタンブロットを示す写真である。膜を抗ＣＤ３ζ抗体でプローブした。
【００３６】
【図２】Ｔ細胞サブセットにおけるＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体の発現を示す。Ａ：活性化ＣＤ３＋  Ｔリンパ球を、ＧＦＰ単独を含むベクター(偽)およびＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ構築物含有ベクターを形質導入した。ＣＤ１６の発現を、フローサイトメトリーでＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞において試験した。ドットプロットは、一つの代表的実験の結果を示す。Ｂ：３ドナーからのＴリンパ球で得た結果(平均±ＳＤ)の要約である(Ｐ＝Ｎ.Ｓ.)。
【００３７】
【図３】ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体の抗体結合能を示す。Ａ：ＧＦＰを含むベクター(偽)またはＧＦＰとＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζを含むベクターで形質導入し、リツキシマブと３０分インキュベートしたＴリンパ球；細胞表面に結合した抗体の量をフィコエリトリンにコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体(ＧＡＨ  ＩｇＧ)およびフローサイトメトリーで可視化した。Ｂ：リツキシマブと３０分インキュベートしたＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ(Ｖ１５８)またはＣＤ１６Ｆ−ＢＢ−ζ(Ｆ１５８)を形質導入したＪｕｒｋａｔ細胞。プロットは、ＧＦＰの平均蛍光強度(ＭＦＩ)と２受容体を発現する細胞で得られたＧＡＨ  ＩｇＧのＭＦＩの相関を比較する。Ｃ：リツキシマブ存在下カルセインＡＭ橙色−赤色で標識したＤａｕｄｉ細胞と共培養した、偽形質導入またはＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζを形質導入したＪｕｒｋａｔ細胞。細胞凝集塊は、各ドットプロットの上部右四分円で定量する。Ｄ：パネルＣに記載する凝集アッセイの要約。バーは３実験の平均±ＳＤを示す。リツキシマブ(“Ａｂ”)の存在下、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζを形質導入したＪｕｒｋａｔ細胞で測定した凝集は、他の３培養条件で測定されたものより有意に高かった(ｔ検定でＰ＜０.００１)。
【００３８】
【図４】ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζおよびＣＤ１６Ｆ−ＢＢ−ζ受容体のトラスツズマブおよびヒトＩｇＧに結合する相対的能力を示す。ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ(Ｖ１５８；黒色記号)またはＣＤ１６Ｆ−ＢＢ−ζ(Ｆ１５８；白色記号)を形質導入したＪｕｒｋａｔ細胞を、トラスツズマブまたはヒトＩｇＧと３０分インキュベートした。プロットは、ＧＦＰの平均蛍光強度(ＭＦＩ)およびいずれかの受容体を発現する細胞で得られたＰＥにコンジュゲートしたヤギ抗ヒト(ＧＡＨ)ＩｇＧのＭＦＩの間の相関を比較する(トラスツズマブおよびＩｇＧの両者についてＰ＜０.０００１)。
【００３９】
【図５】ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体に結合する免疫グロブリンは、Ｔ細胞活性化、溶解性顆粒の開口分泌および細胞増殖を誘発することを示す。Ａ：ＧＦＰを含むベクター(偽)またはＧＦＰとＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζを含むベクターを形質導入したＴリンパ球を、ＩＬ−２非存在下、４８時間リツキシマブで被覆したマイクロタイタープレートで培養した；ＣＤ２５の発現をフローサイトメトリーにより測定した。Ｂ：Ａに記載する試験結果の要約であり、バーは、ＧＦＰ＋細胞におけるＣＤ２５発現を示す(３ドナーからのＴ細胞での実験の平均±ＳＤ)；ＣＤ２５発現は、他の実験条件より、リツキシマブ(“Ａｂ”)存在下ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζを形質導入したＴリンパ球で有意に高かった(Ｐ≦０.００３)。Ｃ：ＧＦＰを含むベクター(偽)またはＧＦＰとＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζを含むベクターを形質導入した４ドナーからのＴリンパ球をＡのように(ｎ＝３)またはＤａｕｄｉ細胞(ｎ＝３)と４時間培養した；ＣＤ１０７ａ染色をフローサイトメトリーにより測定した。バーは６実験の平均±ＳＤを示す；ＣＤ１０７ａ発現は、他の実験条件よりリツキシマブ(“Ａｂ”)存在下ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζを形質導入したＴリンパ球で有意に高かった(Ｐ＜０.０００１)。Ｄ：４週間まで、単独でまたはリツキシマブと、Ｄａｕｄｉ細胞存在下または非存在下で培養した偽またはＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ形質導入Ｔリンパ球。記号は投入細胞数と比較した細胞回収パーセントを示す(３ドナーからのＴ細胞での実験の平均±ＳＤ)。
【００４０】
【図６】インビトロでのＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ  Ｔリンパ球介在抗体依存性細胞毒性を示す。Ａ：対応する抗体存在下の偽またはＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ形質導入Ｔリンパ球が介在する癌細胞株に対する細胞毒性の代表例。各記号は３培養の平均を示す(全３比較について対応のあるｔ検定でＰ＜０.０１)。データの完全セットを図７に示す。Ｂ：慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)を有する患者からの初代細胞に対する、リツキシマブ(“Ａｂ”)存在下または非存在下の偽またはＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ形質導入Ｔリンパ球の細胞毒性。各バー(各患者について異なる色調)は、２：１  Ｅ：Ｔ比で３連４時間アッセイで決定した平均(±ＳＤ)細胞毒性に対応する。ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ  Ｔ細胞および抗体での細胞毒性は、他の３条件のいずれかで測定されたより有意に高かった(Ｔ検定でＰ＜０.０００１)；偽形質導入Ｔ細胞で、抗体の添加は細胞毒性を高めた(Ｐ＝０.０１６)；全ての他の比較：Ｐ＞０.０５。Ｃ：間葉性間質細胞(ＭＳＣ)存在下、１：２  Ｅ：Ｔで２４時間後のパネルＢにおいて試験したのと同じＣＬＬサンプルに対する細胞毒性。各バーは２試験の平均に対応する。ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ  Ｔ細胞＋抗体での細胞毒性は、抗体単独(Ｐ＝０.０００２)または細胞単独(Ｐ＜０.０００１)より有意に高かった；抗体単独での細胞毒性は、細胞単独より有意に高かった(Ｐ＝０.００４５)。
【００４１】
【図７】４時間インビトロ細胞毒性アッセイの集合的結果を示す。偽またはＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ  Ｔリンパ球を、示す細胞株および非反応性ヒト免疫グロブリン(“Ｎｏ  Ａｂ”)または対応する抗体(“Ａｂ”)と共培養した。これは、ＤａｕｄｉおよびＲａｍｏｓに対してリツキシマブ、ＭＣＦ−７、ＳＫＢＲ−３およびＭＫＮ−７に対してトラスツズマブならびにＣＨＬＡ−２５５、ＮＢ１６９１、ＳＫ−Ｎ−ＳＨおよびＵ−２  ＯＳに対してｈｕ１４.１８Ｋ３２２Ａであった。Ｔ細胞および／または抗体非存在下で培養した腫瘍細胞と比較した、２：１比(ＣＨＬＡ−２５５について４：１)での細胞毒性を示す。結果は、ＮＢ１６９１およびＳＫ−ＢＲ−３について３ドナーおよび残りの細胞株について１ドナーのＴリンパ球で実施した３実験の平均(±ＳＤ)細胞毒性に対応する；Ｄａｕｄｉの結果は、２ドナーからの３測定およびさらに４ドナーからのＴリンパ球の一測定の平均(±ＳＤ)細胞毒性である。Ｔ細胞非存在下に培養に添加したときのリツキシマブ、トラスツズマブまたはｈｕ１４.１８Ｋ３２２Ａの平均細胞毒性は＜１０％であった。
【００４２】
【図８】ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ  Ｔリンパ球の細胞毒性が強力であり、特異的であり、かつ非結合ＩｇＧに影響されないことを示す。Ａ：神経芽腫細胞株ＮＢ１６９１と、非反応性ヒト免疫グロブリン(“Ｎｏ  Ａｂ”)またはｈｕ１４.１８Ｋ３２２Ａ抗体(“Ａｂ”)存在下、２４時間共培養したＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ  Ｔリンパ球。結果は、３実験の平均(±ＳＤ)細胞毒性に対応する。細胞毒性は、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ  Ｔ細胞単独と比較して、１：８  Ｅ：Ｔでも、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ細胞＋ｈｕ１４.１８Ｋ３２２Ａ抗体が有意に高いままであった(Ｐ＝０.０００２)。Ｂ：Ｂ細胞リンパ腫細胞株Ｄａｕｄｉと、４時間、２：１  Ｅ：Ｔでリツキシマブまたは非反応性抗体トラスツズマブまたはｈｕ１４.１８Ｋ３２２Ａ存在下、共培養した偽またはＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ形質導入Ｔリンパ球。結果は、３実験の平均(±ＳＤ)細胞毒性に対応する(“偽”結果は、各抗体での３実験の総計である)。リツキシマブでの細胞毒性は、他の全実験条件より有意に高かった(全比較についてＰ＜０.０００１)。Ｃ：種々の濃度の免疫治療抗体および競合非結合ＩｇＧ(抗体と同時に添加)存在下、８：１  Ｅ：Ｔでの腫瘍細胞株に対するＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζを発現するＴリンパ球の細胞毒性。記号は、各抗体濃度について少なくとも３測定の平均(±ＳＤ)を示す。各細胞株について、細胞毒性は、存在する非結合ＩｇＧ量と無関係に、統計的差はなかった。
【００４３】
【図９】ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζを発現するＴリンパ球受容体が、インビボで抗腫瘍活性を発揮することを示す。ＮＯＤ−ＳＣＩＤ−ＩＬ２ＲＧヌルマウスに、３×１０５  ルシフェラーゼ標識Ｄａｕｄｉ細胞をｉ.ｐ.注射した。リツキシマブ(１５０μg)を、４日目から開始して、４週間、週１回ｉ.ｐ.注射した。４マウスにおいて、他の処置は行わず、一方他の５マウスにおいて、最初のリツキシマブ注射後５日目および６日目にＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζを発現するＴリンパ球受容体(１×１０７  ｉ.ｐ.；ｎ＝５)を与えた；各４マウスの他の２群は、リツキシマブの代わりにＲＰＭＩ−１６４０のｉ.ｐ.注射後ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ  Ｔリンパ球またはＲＰＭＩ−１６４０媒体のみのｉ.ｐ.注射を受けた(“対照”)。Ａ：腫瘍増殖のインビボ造影結果。各記号は１バイオルミネセンス測定に対応する；線は１マウスにおける全測定値をつなぐ。Ｂ：代表的マウス(２／群)を各実験条件について示す。３日目の腹部画像を、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ＋リツキシマブ群のマウスにおける腫瘍存在を示すために、高い感度で処理した。バイオルミネセンスが５×１０１０光子／秒に達したとき、マウスを屠殺した。Ｃ：種々の処置群におけるマウスの全生存比較。
【００４４】
【図１０】ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζを発現するＴリンパ球受容体がインビボで抗腫瘍活性を発揮することを確認する。ＮＯＤ−ＳＣＩＤ−ＩＬ２ＲＧヌルマウスに、３×１０５  ルシフェラーゼ標識ＮＢ１６９１細胞をｉ.ｐ.注射した。Ｈｕ１４.１８Ｋ３２２Ａ抗体(２５μg)を、５日目から開始して、４週間、週１回ｉ.ｐ.注射した。４マウスにおいて、他の処置は行わず、一方他の４マウスにおいて、最初の抗体注射の後、６日目および７日目にＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζを発現するＴリンパ球受容体(１×１０７  ｉ.ｐ.；ｎ＝４)を与えた；各４マウスの他の２群は、抗体の代わりにＲＰＭＩ−１６４０のｉ.ｐ.注射の後ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ  Ｔリンパ球またはＲＰＭＩ−１６４０媒体のみのｉ.ｐ.注射(“対照”)を受けた。Ａ：腫瘍増殖のインビボ造影結果。各記号は１バイオルミネセンス測定に対応する；線は１マウスにおける全測定値をつなぐ。Ｂ：各実験条件下での全マウスの画像。バイオルミネセンスが１×１０１０光子／秒光子／秒に達したとき、マウスを屠殺した。Ｃ：種々の処置群におけるマウスの全生存比較。
【００４５】
【図１１】ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζを発現するＴリンパ球とＣＤ１６Ｆ−ＢＢ−ζ受容体の機能的差異を示す。Ａ：フローサイトメトリードットプロットは、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζまたはＣＤ１６Ｆ−ＢＢ−ζを形質導入したＴリンパ球におけるＣＤ１６(Ｂ７３.１抗体で検出)および緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)の発現を示す。各四分円における陽性細胞のパーセンテージを示す。Ｂ：ＣＤ１６ＶまたはＣＤ１６Ｆ受容体を形質導入したＴリンパ球をＤａｕｄｉ、ＳＫ−ＢＲ−３またはＮＢ１６９１細胞と、それぞれ、リツキシマブ、トラスツズマブおよびｈｕ１４.１８Ｋ３２２Ａ存在下培養した。全抗体を０.１μg／mLで使用した。記号は投入細胞数と比較した細胞回収パーセントを示す(３実験の平均±ＳＤ)；培養１〜３週目の細胞数は、全３培養について対応のあるｔ検定により有意に異なった(Ｄａｕｄｉ、Ｐ＝０.０００７；ＳＫ−ＢＲ−３、Ｐ＝０.０１６４；ＮＢ１６９１、Ｐ＝０.０２２)。Ｃ：種々の濃度のリツキシマブ存在下のＤａｕｄｉ細胞に対するＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζまたはＣＤ１６Ｆ−ＢＢ−ζ受容体を発現するＴリンパ球が介在する抗体依存性細胞毒性。各記号は、８：１(左)または２：１(右)Ｅ：Ｔでの３培養の平均±ＳＤを示す。ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζを伴うＴ細胞の細胞毒性は、ＣＤ１６Ｆ−ＢＢ−ζを伴うＴ細胞の細胞毒性より有意に高かった(いずれのＥ：ＴでもＰ＜０.００１)。
【００４６】
【図１２】本実験で使用したＣＤ１６キメラ受容体の略図を示す。
【００４７】
【図１３】種々のシグナル伝達ドメインを有するＣＤ１６Ｖ受容体の発現を示す。フローサイトメトリードットプロットは、緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)単独(偽)または種々のＣＤ１６Ｖ構築物を含むベクターを形質導入した活性化Ｔリンパ球におけるＧＦＰと組み合わせたＣＤ１６の発現(３Ｇ８抗体で検出)を示す。各四分円における陽性細胞のパーセンテージを示す。
【００４８】
【図１４】ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζが、異なるシグナル伝達性質を有するＣＤ１６Ｖ受容体より高いＴ細胞活性化、増殖および細胞毒性を誘発することを示す。Ａ：Ｄａｕｄｉ細胞およびリツキシマブ(０.１μg／mL)と４８時間共培養後の種々のキメラ受容体を発現するＴリンパ球における緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)ＭＦＩに対してプロットしたフローサイトメトリーによるＣＤ２５平均蛍光強度(ＭＦＩ)。ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζでのＣＤ２５発現は、ＣＤ１６Ｖ−ζ、ＣＤ１６Ｖ−ＦｃεＲＩγまたはシグナル伝達能を有しないＣＤ１６Ｖ(“ＣＤ１６Ｖ切断型”)により誘発されたものより有意に高かった(線形回帰分析によりＰ＜０.０００１)。Ｂ：種々のＣＤ１６Ｖ受容体を形質導入したＴリンパ球を、Ｄａｕｄｉ、ＳＫ−ＢＲ−３またはＮＢ１６９１細胞と、それぞれリツキシマブ、トラスツズマブおよびｈｕ１４.１８Ｋ３２２Ａ存在下で培養した。全抗体を０.１μg／mLで使用した。記号は、投入細胞数と比較した回収細胞パーセンテージを示す(３実験の平均±ＳＤ)；培養１〜３週目の細胞数は、全３培養について対応のあるｔ検定により、全ての他の受容体よりＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体で有意に高かった(Ｐ＜０.０００１)。Ｃ：それぞれ、リツキシマブ、トラスツズマブおよびｈｕ１４.１８Ｋ３２２Ａ存在下、Ｄａｕｄｉ、ＳＫ−ＢＲ−３およびＮＢ１６９１に対する種々のＣＤ１６Ｖ受容体を発現するＴリンパ球または偽形質導入Ｔ細胞のＡＤＣＣ。記号は、示すＥ：Ｔでの３培養の平均±ＳＤである。ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体での細胞毒性は、全ての他の受容体より有意に高く(全比較でｔ検定でＰ＜０.０００１)、一方、偽形質導入またはＣＤ１６Ｖ切断型受容体を形質導入したリンパ球の細胞毒性は、互いに有意に異ならなかった(Ｐ＞０.０５)；ＣＤ１６Ｖ−ＦｃεＲＩγでの細胞毒性は、Ｄａｕｄｉ(Ｐ＝０.００６)およびＳＫ−ＢＲ−３(Ｐ＝０.０１９)に対して、ＣＤ３−ζより有意に高かった；いずれかの受容体を発現するリンパ球は、偽形質導入またはＣＤ１６Ｖ切断型を形質導入したものより高い細胞毒性を有した(全比較でＰ＜０.０１)。
【００４９】
【図１５】ｍＲＮＡエレクトロポレーションによるＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体の発現を示す。Ａ：活性化Ｔリンパ球を、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ  ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ非存在下(偽)電気穿孔した；ＣＤ１６の発現を、２４時間後フローサイトメトリーで試験した。Ｂ：偽またはＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ電気穿孔Ｔ細胞の細胞毒性を、リツキシマブ存在下、Ｒａｍｏｓ細胞株に対して試験した。記号は、平均±ＳＤ細胞毒性パーセントを示す(ｎ＝３；全Ｅ：Ｔ比での比較についてＰ＜０.０１)。
【００５０】
【図１６】キメラ受容体配列番号１の発現を伴うおよび伴わないＪｕｒｋａｔ細胞に対するリツキサンの結合を示す。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、ｍＲＮＡ非存在下(パネルＡ)またはキメラ受容体配列番号１をコードするｍＲＮＡ(パネルＢ)存在下、電気穿孔し、リツキサンとインキュベートし、結合リツキサンを検出するためにＰＥ標識ヤギ抗ヒト抗体で染色し、フローサイトメトリーで分析した。パネルＡおよびＢにおいて、同じ四分円ゲートを各データセットに適用し、各四分円における細胞のパーセンテージを示し、上部右四分円はリツキサン陽性細胞を示す。パネルＣにおいて、細胞数を、偽電気穿孔細胞(白抜き)およびキメラ受容体配列番号１をコードするｍＲＮＡと電気穿孔した細胞(灰色)についてリツキサン染色の関数としてプロットした。
【００５１】
【図１７】リツキサンおよび標的Ｄａｕｄｉ細胞存在下、キメラ受容体配列番号１の発現を伴うまたは伴わないＪｕｒｋａｔ細胞におけるＣＤ２５の存在を示す。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、ｍＲＮＡ非存在下(パネルＡ)またはキメラ受容体配列番号１をコードするｍＲＮＡ存在下(パネル１７Ｂ)電気穿孔し、続いてツキサンおよび標的Ｄａｕｄｉ細胞とインキュベートした。細胞を、Ｊｕｒｋａｔ細胞を単離するためのＰＥ標識抗ＣＤ７抗体およびＣＤ２５発現を検出するためのＡＰＣ標識抗Ｃ２５抗体で染色し、フローサイトメトリーで分析した。ＣＤ７陽性細胞をパネルＡおよびＢにおいて示し、同じ四分円ゲートを各データセットに適用した。各四分円における細胞のパーセンテージを示し、上部右四分円はＣＤ２５陽性細胞を示す。パネルＣは、同じ実験のデータのヒストグラムを示す。ＣＤ７陽性細胞数を、偽電気穿孔細胞(白抜き)についてＣＤ２５染色の関数としてプロットし、キメラ受容体配列番号１をコードするｍＲＮＡと電気穿孔した細胞(灰色)についてＣＤ２５染色の関数としてプロットした。
【００５２】
【図１８】リツキサンおよび標的Ｄａｕｄｉ細胞の存在下、キメラ受容体配列番号１の発現を伴うまたは伴わないＪｕｒｋａｔ細胞におけるＣＤ６９の存在を示す。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、ｍＲＮＡ非存在下(パネルＡ)または配列番号１をコードするｍＲＮＡ存在下(パネルＢ)電気穿孔し、続いてリツキサンおよび標的Ｄａｕｄｉ細胞とインキュベートした。細胞を、Ｊｕｒｋａｔ細胞を単離するためのＰＥ標識抗ＣＤ７抗体およびＣＤ６９発現を検出するためのＡＰＣ標識抗Ｃ６９抗体で染色し、フローサイトメトリーで分析した。ＣＤ７陽性細胞をパネルＡおよびＢにおいて示し、同じ四分円ゲートを各データセットに適用した。各四分円における細胞のパーセンテージを示し、上部右四分円はＣＤ６９陽性細胞を示す。パネルＣは、同じ実験のデータのヒストグラムを示す。ＣＤ７陽性細胞数を、偽電気穿孔細胞(白抜き)およびキメラ受容体配列番号１をコードするｍＲＮＡと電気穿孔した細胞(灰色)についてＣＤ６９染色の関数としてプロットした。
【００５３】
【図１９】キメラ受容体の代表的抗ＣＤ３ζウェスタンブロット分析を示す。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、ｍＲＮＡ非存在下(レーン１)またはキメラ受容体配列番号１(レーン２)、配列番号３(レーン３)、配列番号１０(レーン４)、配列番号１１(レーン５)、配列番号１４(レーン６)、配列番号２(レーン７)、配列番号４(レーン８)、配列番号５(レーン９)、配列番号７(レーン１０)、配列番号８(レーン１１)、配列番号９(レーン１２)または配列番号６(レーン１３)をコードするｍＲＮＡで電気穿孔した。細胞を回収し、溶解させ、抗ＣＤ３ζ抗体でのウェスタンブロット分析により分析した。キメラ受容体タンパク質は、キメラ受容体ｍＲＮＡで電気穿孔した全細胞からのライセートで検出された。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
発明の詳細な記載
抗体ベースの免疫療法は、多くのタイプの癌を含む、広範な疾患の処置に使用される。このような療法は、しばしば、正常細胞(例えば、非癌細胞)と比較して、排除が望まれる細胞(例えば、癌細胞のような標的細胞)に差示的に発現される細胞表面分子の認識に依存する(Weiner et al. 細胞(2012) 148(6): 1081-1084)。いくつかの抗体ベースの免疫療法が、標的細胞(例えば癌細胞)の抗体依存性細胞介在細胞毒性を促進することがインビトロで示されており、その一部について、一般にこの作用機序はインビボでも同様であると考えられる。ＡＤＣＣは、細胞介在自然免疫機構であり、これによりナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、Ｔ細胞、単球細胞、マクロファージまたは好酸球のような免疫系のエフェクター細胞が、特異的抗体により認識される標的細胞(例えば、癌細胞)を能動的に溶解する。
【００５５】
ここに記載するキメラ受容体は、多数の利点を提供する。例えば、Ｆｃに結合する細胞外ドメインにより、ここに記載するキメラ受容体構築物は、特異的標的抗原(例えば、癌抗原)に直接結合するのではなく、抗体のＦｃ部分または他のＦｃ含有分子に結合できる。それゆえに、ここに記載するキメラ受容体構築物を発現する免疫細胞は、抗体または他のＦｃ含有分子により結合されるあらゆるタイプの細胞の細胞死を誘発できる。
【００５６】
本発明は、Ｆｃ含有分子(例えば、抗体またはＦｃ融合タンパク質)と結合できるキメラ受容体、それを発現する免疫細胞および該免疫細胞を標的細胞(例えば、癌細胞)に対するＡＤＣＣ効果の増大のために使用する方法を提供する。ここで使用するキメラ受容体は、宿主細胞の表面に発現でき、Ｆｃ部分を含む標的分子と結合できる細胞外ドメインおよびキメラ受容体を発現する免疫細胞のエフェクター機能を誘発するための１以上の細胞質シグナル伝達ドメインを含む天然に存在しない分子をいい、ここで、キメラ受容体の少なくとも２ドメインは異なる分子由来である。
【００５７】
抗体タンパク質のようなＦｃ含有分子は、標的細胞(例えば、癌細胞)の表面の細胞表面分子、受容体または炭水化物のような標的に結合できる。このようなＦｃ含有分子と結合できる受容体、例えばここに記載するキメラ受容体分子を発現する免疫細胞は、標的細胞結合抗体を認識し、この受容体／抗体結合が、免疫細胞の、細胞毒性顆粒の放出または細胞死誘発分子の発現のようなエフェクター機能の実行を刺激し、Ｆｃ含有分子により認識された標的細胞を細胞死に至らせる。
【００５８】
用語“約”または“凡そ”は、一部、どのように値が測定または決定されたか、すなわち、測定系の限界に依存する、当業者により決定される特定の値について許容される誤差範囲内であることを意味する。例えば、“約”は、当分野の実務による、許容される標準偏差内を意味し得る。あるいは、“約”は、ある値の最大±２０％、好ましくは最大±１０％、より好ましくは最大±５％、よりさらに好ましくは最大±１％の範囲内を意味し得る。あるいは、特に生物系または生物過程において、本用語は、ある値の同桁内、好ましくは２倍内を意味し得る。特定の値が本明細書および特許請求の範囲に記載されているとき、特に断らない限り、用語“約”が含意され、この文脈において、特定の値に対する許容される誤差範囲内を意味する。
【００５９】
本発明の状況において、ここに言及する疾患状態のいずれかに関する限り、用語“処置する”、“処置”などは、このような状態と関係する少なくとも１症状の緩和または軽減またはこのような状態の進行の遅延または逆転を意味する。本開示の意味の範囲内で、用語“処置する”はまた、発症(すなわち、疾患の臨床的顕在化の前の時間)抑止、遅延および／または疾患発症または悪化のリスク低減も意味する。例えば、癌に関連して、用語“処置する”は、患者の腫瘍負荷の除去もしくは軽減または転移の予防、遅延または阻止なども意味し得る。
【００６０】
ここで使用する用量または量に適用される用語“治療上有効”は、それを必要とする対象に投与したとき、所望の活性を生じるのに十分である化合物または本発明のキメラ受容体を含み、場合によりさらに腫瘍特異的細胞毒性モノクローナル抗体またはＦｃ部分を含む他の抗腫瘍分子(例えば、免疫グロブリンのＦｃ部分またはＦｃ含有ＤＮＡまたはＲＮＡと組み合わさった腫瘍表面受容体と結合するリガンド(例えば、サイトカイン、免疫細胞受容体))からなる複合性分子)を含む医薬組成物(例えば、Ｔリンパ球および／またはＮＫ細胞のような免疫細胞を含む組成物)の量をいう。本発明の状況の範囲内で、用語“治療上有効”は、本発明の方法により処置される障害の顕在化遅延、進行抑止、少なくとも１症状の緩和または軽減に十分である化合物または医薬組成物の量をいう。活性成分の組合せを投与するとき、組み合わせの有効量は、個々に投与したときに有効である各成分の量を含んでも、含んでいなくてもよい。
【００６１】
本発明の組成物と関連して使用される用語“薬学的に許容される”は、哺乳動物(例えば、ヒト)に投与したとき、生理学的に耐容性であり、一般に有害な反応を生じない分子およびこのような組成物の他の成分をいう。好ましくは、ここで使用する用語“薬学的に許容される”は、連邦政府もしくは州政府の規制当局により承認されたまたは米国薬局方もしくは他の一般に認識される薬局方に哺乳動物およびより特にヒトにおける使用のために記載されていることを意味する。
【００６２】
ここで使用する用語“対象”は、あらゆる哺乳動物をいう。好ましい態様において、対象はヒトである。
【００６３】
本明細書および添付する特許請求の範囲で使用する、単数表現は、文脈から他の解釈がされない限り、複数表現も含む。
【００６４】
Ｉ. キメラ受容体
ここに記載するキメラ受容体は、免疫グロブリンのＦｃ部分に結合親和性および特異性を有する細胞外ドメイン(“Ｆｃバインダー”)、膜貫通ドメイン、少なくとも１の共刺激性シグナル伝達ドメインおよびＩＴＡＭを含む細胞質シグナル伝達ドメインを含む。キメラ受容体は、宿主細胞で発現されるとき、細胞外リガンド結合ドメインが、標的分子(例えば、抗体またはＦｃ融合タンパク質)との結合のために細胞外に位置し、共刺激性シグナル伝達ドメインおよびＩＴＡＭ含有細胞質シグナル伝達ドメインが活性化および／またはエフェクターシグナル伝達の誘発のために細胞質に位置するように、設定される。ある態様において、ここに記載するようなキメラ受容体構築物は、Ｎ末端からＣ末端方向で、Ｆｃバインダー、膜貫通ドメイン、少なくとも１の共刺激性シグナル伝達ドメインおよびＩＴＡＭ含有細胞質シグナル伝達ドメインを含む。他の態様において、ここに記載するようなキメラ受容体構築物は、Ｎ末端からＣ末端方向で、Ｆｃバインダー、膜貫通ドメイン、ＩＴＡＭ含有細胞質シグナル伝達ドメインおよび少なくとも１の共刺激性シグナル伝達ドメインを含む。
【００６５】
ここに記載するキメラ受容体のいずれかは、さらにＦｃバインダーのＣ末端および膜貫通ドメインのＮ末端に位置し得るヒンジドメインを含み得る。これに代えてまたはこれに加えて、ここに記載するキメラ受容体構築物は、互いに連結しても、ＩＴＡＭ含有細胞質シグナル伝達ドメインにより分離されてもよい、２以上の共刺激性シグナル伝達ドメインを含み得る。キメラ受容体構築物における細胞外Ｆｃバインダー、膜貫通ドメイン、共刺激性シグナル伝達ドメインおよびＩＴＡＭ含有細胞質シグナル伝達ドメインは、互いに直接的にまたはペプチドリンカーを介して結合し得る。ある態様において、ここに記載するキメラ受容体のいずれかは、Ｎ末端にシグナル配列を含む。
【００６６】
Ａ. Ｆｃバインダー
ここに記載するキメラ受容体構築物は、Ｆｃバインダーである、すなわち、適当な哺乳動物(例えば、ヒト、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジまたはサル)の免疫グロブリンのＦｃ部分(例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭまたはＩｇＥ)に結合できる、細胞外ドメインを含む。適当なＦｃバインダーは、哺乳動物Ｆｃ受容体またはある細菌タンパク質(例えば、プロテインＡ、プロテインＧ)のような天然に存在するタンパク質に由来し得る。さらに、Ｆｃバインダーは、ここに記載するＩｇ分子のいずれかのＦｃ部分と高親和性および特異性で結合するように、特に設計された合成ポリペプチドであり得る。例えば、このようなＦｃバインダーは、免疫グロブリンのＦｃ部分と特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであり得る。例は、一本鎖可変フラグメント(ｓｃＦｖ)、単ドメイン抗体またはナノボディを含むが、これらに限定されない。あるいは、Ｆｃバインダーは、Ｋｕｎｉｔｚドメイン、小モジュラー免疫薬(ＳＭＩＰ)、アドネクチン、アビマー、アフィボディ、ＤＡＲＰｉｎまたはアンチカリンのようなＦｃ部分と特異的に結合する合成ペプチドであってよく、これは、ペプチドコンビナトリアルライブラリーをＦｃに対する結合活性についてスクリーニングすることにより同定され得る。
【００６７】
ある態様において、Ｆｃバインダーは、哺乳動物Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメインである。ここで使用する“Ｆｃ受容体は、多くの免疫細胞(Ｂ細胞、樹状細胞、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、マクロファージ、好中球、肥満細胞および好酸球を含む)の表面に発現され、抗体のＦｃドメインに結合特異性を発揮する、細胞表面結合受容体である。Ｆｃ受容体は、一般に、抗体のＦｃ(フラグメント結晶性)部分に結合特異性を有する少なくとも２免疫グロブリン(Ｉｇ)様ドメインからなる。いくつかの例において、Ｆｃ受容体の抗体のＦｃ部分への結合は、抗体依存性細胞傷害(ＡＤＣＣ)効果を誘発する。ここに記載するようなキメラ受容体の構築に使用するＦｃ受容体は、野生型対応物と比較してＦｃに対する親和性が増加していても、減少していてもよい、天然に存在する多型バリアント(例えば、ＣＤ１６  Ｖ１５８バリアント)であり得る。あるいは、Ｆｃ受容体は、Ｉｇ分子のＦｃ部分に対する結合親和性が変化した、１以上の変異(例えば、１０アミノ酸残基までの置換)を有する、野生型対応物の機能的バリアントであり得る。いくつかの例において、変異は、Ｆｃ受容体のグリコシル化パターンを、ゆえに、Ｆｃに対する結合親和性を変え得る。
【００６８】
下記表は、Ｆｃ受容体細胞外ドメインにおける多数の多型例を記載する(例えば、Kim et al., J. Mol. Evol. 53:1-9, 2001参照)：
【表１】
2017527310.tif 000003
【００６９】
Ｆｃ受容体は、それが結合できる抗体のアイソタイプに基づき、分類される。例えば、Ｆｃガンマ受容体(ＦｃγＲ)は、一般にＩｇＧ抗体、例えば、１以上のそのサブタイプ(すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４)に結合し；Ｆｃアルファ受容体(ＦｃαＲ)は、一般にＩｇＡ抗体に結合し、Ｆｃイプシロン受容体(ＦｃεＲ)は、一般にＩｇＥ抗体に結合する。ある態様において、Ｆｃ受容体はＦｃガンマ受容体、Ｆｃアルファ受容体またはＦｃイプシロン受容体である。Ｆｃガンマ受容体の例は、ＣＤ６４Ａ、ＣＤ６４Ｂ、ＣＤ６４Ｃ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ１６ＡおよびＣＤ１６Ｂを含むが、これらに限定されない。Ｆｃアルファ受容体の例は、ＦｃαＲ１／ＣＤ８９である。Ｆｃイプシロン受容体の例は、ＦｃεＲＩおよびＦｃεＲII／ＣＤ２３を含むが、これらに限定されない。下記表は、ここに記載するキメラ受容体の構築に使用するためのＦｃ受容体および対応するＦｃドメインに対するそれらの結合活性を記載する：
【表２】
2017527310.tif 000004
【００７０】
ここに記載するキメラ受容体において使用するためのＦｃ受容体のリガンド結合ドメインの選択は、当業者には明らかである。例えば、Ｆｃ受容体の結合が望まれる抗体のアイソタイプおよび望む結合相互作用の親和性のような因子により得る。
【００７１】
ある例において、(ａ)は、Ｆｃに対する親和性を調節し得る天然に存在する多型を組み込み得る、ＣＤ１６の細胞外リガンド結合ドメインである。ある例において、(ａ)は、１５８位に多型(例えば、バリンまたはフェニルアラニン)を組み込むＣＤ１６の細胞外リガンド結合ドメインである。ある態様において、(ａ)を、グリコシル化状態およびＦｃに対する親和性を変える条件下で産生する。
【００７２】
ある態様において、(ａ)は、組み込まれたキメラ受容体をＩｇＧ抗体のサブセットに対して特異的とする修飾を組み込む、ＣＤ１６の細胞外リガンド結合ドメインである。例えば、ＩｇＧサブタイプ(例えば、ＩｇＧ１)に対する親和性を高めるまたは弱める変異を組み込み得る。
【００７３】
ある例において、(ａ)は、Ｆｃに対する親和性を調節し得る天然に存在する多型を組み込み得る、ＣＤ３２の細胞外リガンド結合ドメインである。ある態様において、(ａ)を、グリコシル化状態およびＦｃに対する親和性を変える条件下で産生する。
【００７４】
ある態様において、(ａ)は、組み込まれたキメラ受容体をＩｇＧ抗体のサブセットに対して特異的とする修飾を組み込む、ＣＤ３２の細胞外リガンド結合ドメインである。例えば、ＩｇＧサブタイプ(例えば、ＩｇＧ１)に対する親和性を高めるまたは弱める変異を組み込み得る。
【００７５】
ある例において、(ａ)は、Ｆｃに対する親和性を調節し得る天然に存在する多型を組み込み得る、ＣＤ６４の細胞外リガンド結合ドメインである。ある態様において、(ａ)を、グリコシル化状態およびＦｃに対する親和性を変える条件下で産生する。
【００７６】
ある態様において、(ａ)は、組み込まれたキメラ受容体をＩｇＧ抗体のサブセットに対して特異的とする修飾を組み込む、ＣＤ６４の細胞外リガンド結合ドメインである。例えば、ＩｇＧサブタイプ(例えば、ＩｇＧ１)に対する親和性を高めるまたは弱める変異を組み込み得る。
【００７７】
他の態様において、Ｆｃバインダーは、ＩｇＧ分子のＦｃ部分に結合できる天然に存在する細菌タンパク質由来である。ここに記載するようなキメラ受容体の構築に使用するＦｃバインダーは、完全長タンパク質でも、その機能的フラグメントでもよい。プロテインＡは、元々細菌スタフィロコッカス・アウレウスの細胞壁で発見された４２kDa表面タンパク質である。それは、各々三重ヘリックス束に折りたたまれ、大部分の抗体のＦｃ領域ならびにヒトＶＨ３ファミリー抗体のＦａｂ領域との相互作用によりＩｇＧと結合できる、５ドメインからなる。プロテインＧは、哺乳動物ＩｇＧのＦａｂおよびＦｃ領域両者に結合する、Ｃ群およびＧ群連鎖球菌細菌に発現される約６０kDaのタンパク質である。天然プロテインＧはまたアルブミンに結合できるが、アルブミン結合が排除された組み換えバリアントが設計されている。
【００７８】
キメラ受容体において使用するためのＦｃバインダーはまたデノボでコンビナトリアルバイオロジーまたは管理進化法(directed evolution methods)を使用して産生してもよい。タンパク質スキャフォールド(例えば、ＩｇＧ由来ｓｃＦｖ、Ｋｕｎｉｔｚ型プロテアーゼ阻害剤由来Ｋｕｎｉｔｚドメイン、アンキリンリピート、プロテインＡからのＺドメイン、リポカリン、フィブロネクチンIII型ドメイン、ＦｙｎからのＳＨ３ドメインまたはその他)から出発して、表面上の一組の残基に対するアミノ酸側鎖を、バリアントスキャフォールドの大きなライブラリーを作るために、無作為に置換し得る。大きなライブラリーから、まず結合について選択することによりＦｃドメインのような標的に対する親和性を有する稀なバリアントを単離し、続いてファージ、リボソームまたは細胞ディスプレイにより増幅することが可能である。選択および増幅を繰り返し使用することにより、標的に対する最高親和性を有するタンパク質を単離することが可能である。Ｆｃ結合ペプチドは当分野で知られ、例えば、DeLano et al., Science, 287:5456 (2000); Jeong et al., Peptides, 31(2):202-206 (2009);およびKrook et al., J. Immunological Methods, 221(1-2):151-157 (1998)を参照のこと。Ｆｃ結合ペプチド例は、ETQRCTWHMGELVWCEREHN(配列番号８５)、KEASCSYWLGELVWCVAGVE(配列番号８６)またはDCAWHLGELVWCT(配列番号８７)のアミノ酸配列を含み得る。
【００７９】
ここに記載するＦｃバインダーのいずれかは、治療抗体のＦｃ部分に対する適当な結合親和性を有し得る。ここで使用する“結合親和性”は、見かけの結合定数またはＫＡである。ＫＡは、解離定数、ＫＤの逆数である。ここに記載するキメラ受容体のＦｃ受容体ドメインの細胞外リガンド結合ドメインは、抗体のＦｃ部分に対して少なくとも１０−５、１０−６、１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０Ｍまたはそれ以下の結合親和性ＫＤを有し得る。ある態様において、Ｆｃバインダーは、他の抗体、抗体のアイソタイプまたはそのサブタイプへのＦｃバインダーの結合親和性と比較して、ある抗体、抗体のアイソタイプまたはそのサブタイプに高結合親和性を有する。ある態様において、Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、他の抗体、抗体のアイソタイプまたはそのサブタイプに対するＦｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメインの結合と比較して、ある抗体、抗体のアイソタイプまたはそのサブタイプに特異性を有する。高親和性結合を有するＦｃガンマ受容体は、ＣＤ６４Ａ、ＣＤ６４ＢおよびＣＤ６４Ｃを含む。低親和性結合を有するＦｃガンマ受容体はＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ１６ＡおよびＣＤ１６Ｂを含む。高親和性結合を有するＦｃイプシロン受容体はＦｃεＲＩであり、低親和性結合を有するＦｃイプシロン受容体はＦｃεＲII／ＣＤ２３である。
【００８０】
Ｆｃ受容体またはＦｃバインダー(例えば、Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメイン)を含むキメラ受容体に対する結合親和性または結合特異性は、平衡透析、平衡結合、ゲル濾過、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴またはスペクトロスコピーを含む、多種多様な方法により決定できる。
【００８１】
ある態様において、Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、天然に存在するＦｃガンマ受容体、Ｆｃアルファ受容体またはＦｃイプシロン受容体の細胞外リガンド結合ドメインのアミノ酸配列と少なくとも９０％(例えば、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％)同一であるアミノ酸配列を含む。２アミノ酸配列の“同一性パーセント”は、Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993におけるように修飾された、Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990のアルゴリズムを使用して決定できる。このようなアルゴリズムは、Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム(version 2.0)に組み込まれる。ＢＬＡＳＴタンパク質サーチを、ＸＢＬＡＳＴプログラムで、本発明のタンパク質分子と相同であるアミノ酸配列を得るために、スコア＝５０、語長＝３で実施できる。２配列間にギャップが存在するとき、Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997に記載のように実施できる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを使用するとき、各プログラム(例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ)のデフォルトパラメータを使用できる。
【００８２】
また本発明の範囲内にあるのは、ここに記載するようなもののような、Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメインのバリアントである。ある態様において、バリアント細胞外リガンド結合ドメインは、対照細胞外リガンド結合ドメインのアミノ酸配列に対して、１０アミノ酸残基までの変動(例えば、１、２、３、４または５)を含み得る。ある態様において、バリアントは、遺伝子多型により天然に存在するバリアントであり得る。他の態様において、バリアントは、天然に存在しない修飾分子であり得る。例えば、変異を、グリコシル化パターンおよびゆえに対応するＦｃドメインに対するその結合親和性を変えるために、Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメインに組み込み得る。
【００８３】
ある例において、Ｆｃ受容体は、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ３２Ｃ、ＣＤ６４Ａ、ＣＤ６４Ｂ、ＣＤ６４Ｃまたはここに記載するようなそのバリアントであり得る。Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、ここに記載するようなＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ３２Ｃ、ＣＤ６４Ａ、ＣＤ６４Ｂ、ＣＤ６４Ｃの細胞外リガンド結合ドメインのアミノ酸配列に対して１０アミノ酸残基までの変動(例えば、１、２、３、４、５または８)を含み得る。１以上のアミノ酸変動を含むこのようなＦｃドメインを、バリアントと称し得る。Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメインのアミノ酸残基の変異は、変異を含まないＦｃ受容体ドメインに対して、抗体、抗体のアイソタイプまたはそのサブタイプに結合するＦｃ受容体ドメインの結合親和性増加に至り得る。例えば、Ｆｃガンマ受容体ＣＤ１６Ａの残基１５８の変異は、抗体のＦｃ部分に対するＦｃ受容体の結合親和性増加を生じ得る。ある態様において、変異は、Ｆｃガンマ受容体ＣＤ１６Ａの残基１５８でのフェニルアラニンからバリンへの置換であり、ＣＤ１６Ａ  Ｖ１５８バリアントと称する。ヒトＣＤ１６Ａ  Ｖ１５８バリアントのアミノ酸配列を下に示し、Ｖ１５８残基を太字で強調する(シグナルペプチドは斜体)：
【化１】
2017527310.tif 000005
【００８４】
抗体のような分子のＦｃ部分に対する結合親和性を増強または低減し得る、Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメインに行い得る代替的または付加的変異は当業者に明白である。ある態様において、Ｆｃ受容体はＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ａ  Ｖ１５８バリアント、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ３２Ｃ、ＣＤ６４Ａ、ＣＤ６４ＢまたはＣＤ６４Ｃである。ある態様において、ここに記載するキメラ受容体構築物の細胞外リガンド結合ドメインは、ＣＤ１６ＡまたはＣＤ１６Ａ  Ｖ１５８バリアントの細胞外リガンド結合ドメインではない。
【００８５】
Ｂ. 膜貫通ドメイン
ここに記載するキメラ受容体の膜貫通ドメインは、当分野で知られる任意の形態であり得る。ここで使用する“膜貫通ドメイン”は、細胞膜、好ましくは真核細胞膜において、熱力学的に安定であるあらゆるタンパク質構造をいう。ここで使用するキメラ受容体における使用に適合性の膜貫通ドメインは、天然に存在するタンパク質から得ることができる。あるいは、合成の、天然に存在しないタンパク質セグメント、例えば、細胞膜で熱力学的に安定である疎水性タンパク質セグメントであり得る。
【００８６】
膜貫通ドメインは、膜貫通ドメインの三次元構造に基づき、分類される。例えば、膜貫通ドメインは、アルファ螺旋、１を超えるアルファ螺旋の複合体、ベータバレルまたは細胞のリン脂質二重層に及ぶことができるあらゆる他の安定な構造の形であり得る。さらに、膜貫通ドメインは、これに加えてまたは代替的に、膜貫通ドメインが膜を通過する数およびタンパク質の配向を含む、膜貫通ドメイントポロジーに基づき分類され得る。例えば、単回通過膜タンパク質は細胞膜を１回通過し、多回通過膜タンパク質は、細胞膜を少なくとも２回(例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回またはそれ以上)通過する。
【００８７】
膜タンパク質は、細胞の内側および外側に対して、その終端および膜通過セグメントのポロジーにより、Ｉ型、II型またはIII型として定義され得る。Ｉ型膜タンパク質は、単一膜貫通領域を有し、タンパク質のＮ末端が細胞の脂質二重層の細胞外側に存在し、タンパク質のＣ末端が細胞質側に存在するように方向付けされる。II型膜プロテインはまた単一膜貫通領域を有するが、タンパク質のＣ末端が細胞の脂質二重層の細胞外側に存在し、タンパク質のＮ末端が細胞質側に存在するように方向付けされる。III型膜タンパク質は複数回膜貫通セグメントを有し、膜貫通セグメントの数およびＮ終端およびＣ終端位置によりさらに下位分類される。
【００８８】
ある態様において、ここに記載するキメラ受容体の膜貫通ドメインは、Ｉ型単回通過膜タンパク質由来である。単回通過膜タンパク質は、ＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲζ、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ６４、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ９、ＣＤ２２、ＣＤ３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ１５４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳおよびＦＧＦＲ２Ｂを含むが、これらに限定されない。ある態様において、膜貫通ドメインは、次のものから選択される膜タンパク質からである：ＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳおよびＦＧＦＲ２Ｂ。ある例において、膜貫通ドメインはＣＤ８αのものである。ある例において、膜貫通ドメインは４−１ＢＢ／ＣＤ１３７のものである。他の例において、膜貫通ドメインはＣＤ２８またはＣＤ３４のものである。さらに他の例において、膜貫通ドメインはヒトＣＤ８α由来ではない。ある態様において、キメラ受容体の膜貫通ドメインは単回通過アルファ螺旋である。
【００８９】
多回通過膜タンパク質からの膜貫通ドメインも、ここに記載するキメラ受容体における使用に適合性であり得る。多回通過膜タンパク質は、複合(少なくとも２、３、４、５、６、７またはそれ以上)アルファ螺旋またはベータシート構造を含み得る。好ましくは、多回通過膜プロテインのＮ末端およびＣ末端は脂質二重層の逆側に位置し、例えば、タンパク質のＮ末端が脂質二重層の細胞質側に存在し、タンパク質のＣ末端が細胞外側に存在する。多回通過膜タンパク質からの１または複数螺旋通過を、ここに記載するキメラ受容体の構築に使用できる。
【００９０】
ここに記載するキメラ受容体において使用するための膜貫通ドメインはまた合成の、天然に存在しないタンパク質セグメントの少なくとも一部も含み得る。ある態様において、膜貫通ドメインは、合成の、天然に存在しないアルファ螺旋またはベータシートである。ある態様において、タンパク質セグメントは、少なくとも約２０アミノ酸、例えば、少なくとも１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０またはそれ以上のアミノ酸である。合成膜貫通ドメインの例は当分野で、例えば米国特許７,０５２,９０６Ｂ１号およびＰＣＴ公開ＷＯ２０００／０３２７７６Ａ２号において知られ、それらの関連する開示を引用により本明細書に包含させる。
【００９１】
ある態様において、膜貫通ドメインのアミノ酸配列はシステイン残基を含まない。ある態様において、膜貫通ドメインのアミノ酸配列は１システイン残基を含む。ある態様において、膜貫通ドメインのアミノ酸配列は２システイン残基を含む。ある態様において、膜貫通ドメインのアミノ酸配列は２を超えるシステイン残基(例えば、３、４、５またはそれ以上)を含む。
【００９２】
膜貫通ドメインは、膜貫通ドメインのＣ末端側に位置する膜貫通領域および細胞質領域を含み得る。膜貫通ドメインの細胞質領域は、３またはそれ以上アミノ酸を含んでよく、ある態様において、脂質二重層における膜貫通ドメインの方向付けを助ける。ある態様において、１以上のシステイン残基が膜貫通ドメインの膜貫通領域に存在する。ある態様において、１以上のシステイン残基が膜貫通ドメインの細胞質領域に存在する。ある態様において、膜貫通ドメインの細胞質領域は、正荷電アミノ酸を含む。ある態様において、膜貫通ドメインの細胞質領域は、アミノ酸アルギニン、セリンおよびリシンを含む。
【００９３】
ある態様において、膜貫通ドメインの膜貫通領域は疎水性アミノ酸残基を含む。ある態様において、膜貫通領域は、大部分は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはバリンのような疎水性アミノ酸残基を含む。ある態様において、膜貫通領域は疎水性である。ある態様において、膜貫通領域はポリ−ロイシン−アラニン配列を含む。
【００９４】
タンパク質またはタンパク質セグメントの疎水性親水性指標または疎水性もしくは親水性特徴を、当分野で知られるあらゆる方法、例えばＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ疎水性親水性指標分析により評価できる。
【００９５】
Ｃ. 共刺激性シグナル伝達ドメイン
多くの免疫細胞は、細胞増殖、分化および生存促進ならびに細胞のエフェクター機能活性化のために、抗原特異的シグナルの刺激に加えて、共刺激を必要とする。ここに記載するキメラ受容体は、少なくとも１の共刺激性シグナル伝達ドメインを含む。ここで使用する用語“共刺激性シグナル伝達ドメイン”は、エフェクター機能のような免疫応答を誘発するために、細胞内のシグナル伝達を介在する、タンパク質の少なくとも一部をいう。ここに記載するキメラ受容体の共刺激性シグナル伝達ドメインは、シグナル伝達し、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球または好酸球のような免疫細胞が介在する応答を調節する共刺激性タンパク質からの細胞質シグナル伝達ドメインであり得る。
【００９６】
宿主細胞(例えば、免疫細胞)における共刺激性シグナル伝達ドメインの活性化は、細胞のサイトカイン産生および分泌、食作用性性質、増殖、分化、生存および／または細胞毒性増加または減少を誘発し得る。あらゆる共刺激性分子の共刺激性シグナル伝達ドメインは、ここに記載するキメラ受容体における使用のために適合性であり得る。共刺激性シグナル伝達ドメインのタイプは、キメラ受容体が発現される免疫細胞のタイプ(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球または好酸球)および所望の免疫エフェクター機能(例えば、ＡＤＣＣ効果)のような因子に基づき、選択される。キメラ受容体において使用するための共刺激性シグナル伝達ドメインの例は、Ｂ７／ＣＤ２８ファミリーのメンバー(例えば、Ｂ７−１／ＣＤ８０、Ｂ７−２／ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ１／ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ６、Ｂ７−Ｈ７、ＢＴＬＡ／ＣＤ２７２、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、Ｇｉ２４／ＶＩＳＴＡ／Ｂ７−Ｈ５、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ２／Ｂ７−ＤＣおよびＰＤＣＤ６)；ＴＮＦスーパーファミリーのメンバー(例えば,４−１ＢＢ／ＴＮＦＳＦ９／ＣＤ１３７、４−１ＢＢリガンド／ＴＮＦＳＦ９、ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＢＡＦＦ  Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７、ＣＤ２７リガンド／ＴＮＦＳＦ７、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、ＣＤ４０／ＴＮＦＳＦ５、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、ＤＲ３／ＴＮＦＲＳＦ２５、ＧＩＴＲ／ＴＮＦＲＳＦ１８、ＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ１８、ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、リンホトキシンアルファ／ＴＮＦ−ベータ、ＯＸ４０／ＴＮＦＲＳＦ４、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、ＲＥＬＴ／ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＴＡＣＩ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦアルファおよびＴＮＦ  ＲII／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ)；ＳＬＡＭファミリーのメンバー(例えば、２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４、ＢＬＡＭＥ／ＳＬＡＭＦ８、ＣＤ２、ＣＤ２Ｆ−１０／ＳＬＡＭＦ９、ＣＤ４８／ＳＬＡＭＦ２、ＣＤ５８／ＬＦＡ−３、ＣＤ８４／ＳＬＡＭＦ５、ＣＤ２２９／ＳＬＡＭＦ３、ＣＲＡＣＣ／ＳＬＡＭＦ７、ＮＴＢ−Ａ／ＳＬＡＭＦ６およびＳＬＡＭ／ＣＤ１５０)；およびＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ５３、ＣＤ８２／Ｋａｉ−１、ＣＤ９０／Ｔｈｙ１、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ３００ａ／ＬＭＩＲ１、ＨＬＡクラスＩ、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｉｋａｒｏｓ、インテグリンアルファ４／ＣＤ４９ｄ、インテグリンアルファ４ベータ１、インテグリンアルファ４ベータ７／ＬＰＡＭ−１、ＬＡＧ−３、ＴＣＬ１Ａ、ＴＣＬ１Ｂ、ＣＲＴＡＭ、ＤＡＰ１２、Ｄｅｃｔｉｎ−１／ＣＬＥＣ７Ａ、ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６、ＥｐｈＢ６、ＴＩＭ−１／ＫＩＭ−１／ＨＡＶＣＲ、ＴＩＭ−４、ＴＳＬＰ、ＴＳＬＰ  Ｒ、リンパ球機能関連抗原−１(ＬＦＡ−１)およびＮＫＧ２Ｃのようなあらゆる他の共刺激性分子を含むが、これらに限定されない、共刺激性タンパク質の細胞質シグナル伝達ドメインであり得る。ある態様において、共刺激性シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、���Ｘ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ１、ＬＦＡ１(ＣＤ１１ａ)またはＣＤ２またはその任意のバリアントのものである。他の態様において、共刺激性シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢに由来しない。
【００９７】
また本発明の範囲内にあるのは、共刺激性シグナル伝達ドメインが、免疫細胞の免疫応答を調節できるような、ここに記載する共刺激性シグナル伝達ドメインのいずれかのバリアントである。ある態様において、共刺激性シグナル伝達ドメインは、野生型対応物と比較して、１０アミノ酸残基までの変動(例えば、１、２、３、４、５または８)を含む。１以上のアミノ酸変動を含むこのような共刺激性シグナル伝達ドメインをバリアントと称し得る。
【００９８】
共刺激性シグナル伝達ドメインのアミノ酸残基の変異は、変異を含まない共刺激性シグナル伝達ドメインに対して、シグナル伝達増加および免疫応答の刺激増強を生じ得る。共刺激性シグナル伝達ドメインのアミノ酸残基の変異は、変異を含まない共刺激性シグナル伝達ドメインに対して、シグナル伝達減少および免疫応答の刺激低減を生じ得る。例えば、天然ＣＤ２８アミノ酸配列の残基１８６および１８７の変異は、キメラ受容体の共刺激性ドメインによる共刺激性活性増加および免疫応答誘発を生じ得る。ある態様において、変異は、ＣＤ２８共刺激性ドメインの１８６位および１８７位各々のリシンのグリシン残基への置換であり、ＣＤ２８ＬＬ→ＧＧバリアントと称する。ドメインの共刺激性活性を増強または低減し得る共刺激性シグナル伝達ドメインになし得るさらなる変異は当業者に明らかである。ある態様において、共刺激性シグナル伝達ドメインは４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＯＸ４０またはＣＤ２８ＬＬ→ＧＧバリアントのものである。ある態様において、共刺激性シグナル伝達ドメインは４−１ＢＢのものではない。
【００９９】
ある態様において、キメラ受容体は、１を超える共刺激性シグナル伝達ドメイン(例えば、２、３またはそれ以上)を含み得る。ある態様において、キメラ受容体は、２以上の同一共刺激性シグナル伝達ドメイン、例えば、２コピーのＣＤ２８の共刺激性シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、キメラ受容体は、ここに記載する任意の２以上の共刺激性タンパク質のような異なる共刺激性タンパク質からの２以上の共刺激性シグナル伝達ドメインを含む。共刺激性シグナル伝達ドメインのタイプの選択は、キメラ受容体と使用する宿主細胞のタイプ(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球または好酸球のような免疫細胞)および所望の免疫エフェクター機能のような因子に基づき得る。ある態様において、キメラ受容体は、２共刺激性シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、２共刺激性シグナル伝達ドメインはＣＤ２８および４−１ＢＢである。ある態様において、２共刺激性シグナル伝達ドメインはＣＤ２８ＬＬ→ＧＧバリアントおよび４−１ＢＢである。
【０１００】
Ｄ. 免疫受容体チロシン活性化モチーフ(ＩＴＡＭ)を含む細胞質シグナル伝達ドメイン
免疫受容体チロシン活性化モチーフ(ＩＴＡＭ)を含むあらゆる細胞質シグナル伝達ドメインを、ここに記載するキメラ受容体の構築に使用できる。ここで使用する“ＩＴＡＭ”は、多くの免疫細胞において発現されるシグナル伝達分子のテイル部分に一般に存在する保存的タンパク質モチーフである。本モチーフは、６〜８アミノ酸により離されたアミノ酸配列ＹｘｘＬ／Ｉ(ここで、ｘは独立して任意のアミノ酸である)の２反復を含み、保存されたモチーフＹｘｘＬ／Ｉｘ(６−８)ＹｘｘＬ／Ｉを産生する。シグナル伝達分子内のＩＴＡＭは、少なくとも一部、シグナル伝達分子の活性化後、ＩＴＡＭにおけるチロシン残基のリン酸化により介在される、細胞内のシグナル伝達に重要である。ＩＴＡＭはまた、シグナル伝達経路に関与する他のタンパク質のためのドッキング部位としても機能し得る。ある例において、ＩＴＡＭを含む細胞質シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζまたはＦｃεＲ１γのものである。他の例において、ＩＴＡＭ含有細胞質シグナル伝達ドメインはヒトＣＤ３ζに由来しない。さらに他の例において、ＩＴＡＭ含有細胞質シグナル伝達ドメインは、同じキメラ受容体構築物の細胞外リガンド結合ドメインがＣＤ１６Ａに由来するとき、Ｆｃ受容体由来ではない。
【０１０１】
ある具体的態様において、相加的または相乗的作用のために、数シグナル伝達ドメインを一緒に融合し得る。有用なさらなるシグナル伝達ドメインの非限定的例は、ＴＣＲゼータ鎖、ＣＤ２８、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＦｃεＲＩｙ、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＩＬＲＢ／ＣＤ１２２、ＩＬ−２ＲＧ／ＣＤ１３２およびＣＤ４０の１以上の一部または全てを含む。
【０１０２】
Ｅ. ヒンジドメイン
ある態様において、ここに記載するキメラ受容体は、さらに細胞外リガンド結合ドメインと膜貫通ドメインの間に位置するヒンジドメインを含む。ヒンジドメインは、タンパク質の２ドメイン間に一般に見られ、タンパク質の可動性および一方または両方のドメインの互いに対する移動を可能にし得るアミノ酸セグメントである。Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメインのこのような可動性およびキメラ受容体の膜貫通ドメインに対する移動を提供するあらゆるアミノ酸配列を使用できる。
【０１０３】
ヒンジドメインは、約１０〜１００アミノ酸、例えば、１５〜７５アミノ酸、２０〜５０アミノ酸または３０〜６０アミノ酸含み得る。ある態様において、ヒンジドメインは１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０または７５アミノ酸長であり得る。
【０１０４】
ある態様において、ヒンジドメインは、天然に存在するタンパク質のヒンジドメインである。ヒンジドメインを含むことが当分野で知られるあらゆるタンパク質のヒンジドメインが、ここに記載するキメラ受容体における使用に適合性である。ある態様において、ヒンジドメインは、天然に存在するタンパク質のヒンジドメインの少なくとも一部であり、キメラ受容体に可動性を与える。ある態様において、ヒンジドメインはＣＤ８αのものである。ある態様において、ヒンジドメインはＣＤ８αのヒンジドメインの一部、例えば、ＣＤ８αのヒンジドメインの少なくとも１５(例えば、２０、２５、３０、３５または４０)連続アミノ酸を含むフラグメントである。
【０１０５】
ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥまたはＩｇＤ抗体のような抗体のヒンジドメインもここに記載するキメラ受容体における使用に適合性である。ある態様において、ヒンジドメインは、抗体の定常ドメインＣＨ１およびＣＨ２を連結するヒンジドメインである。ある態様において、ヒンジドメインは抗体のものであり、抗体のヒンジドメインおよび抗体の１以上の定常領域を含む。ある態様において、ヒンジドメインは、抗体のヒンジドメインおよび抗体のＣＨ３定常領域を含む。ある態様において、ヒンジドメインは、抗体のヒンジドメインならびに抗体のＣＨ２およびＣＨ３定常領域を含む。ある態様において、抗体はＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥまたはＩｇＤ抗体である。ある態様において、抗体はＩｇＧ抗体である。ある態様において、抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４抗体である。ある態様において、ヒンジ領域は、ＩｇＧ１抗体のヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３定常領域を含む。ある態様において、ヒンジ領域はＩｇＧ１抗体のヒンジ領域およびＣＨ３定常領域を含む。
【０１０６】
天然に存在しないペプチドも、ここに記載するキメラ受容体のためのヒンジドメインとして使用してよい。ある態様において、Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメインのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端の間のヒンジドメインは、(ＧｌｙｘＳｅｒ)ｎリンカー(ここで、ｘおよびｎは、独立して、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２を含む３〜１２の間の整数またはそれ以上であり得る)のようなペプチドリンカーである。ある態様において、ヒンジドメインは(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)ｎ(配列番号７６)(ここで、ｎは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０を含む、３〜６０の間の整数またはそれ以上であり得る)である。ある態様において、ヒンジドメインは(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)３(配列番号７７)である。ある態様において、ヒンジドメインは(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)６(配列番号７８)である。ある態様において、ヒンジドメインは(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)９(配列番号７９)である。ある態様において、ヒンジドメインは(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)１２(配列番号８０)である。ある態様において、ヒンジドメインは(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)１５(配列番号８１)である。ある態様において、ヒンジドメインは(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)３０(配列番号８２)である。ある態様において、ヒンジドメインは(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)４５(配列番号８３)である。ある態様において、ヒンジドメインは(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)６０(配列番号８４)。
【０１０７】
他の態様において、ヒンジドメインは、種々の長さ(例えば、１０〜８０アミノ酸残基)の親水性残基からなる不定形ポリペプチドである、伸長型組み換えポリペプチド(ＸＴＥＮである。ＸＴＥＮペプチドのアミノ酸配列は当業者に明らかであり、例えば、引用により本明細書に包含させる米国特許８,６７３,８６０号に見ることができる。ある態様において、ヒンジドメインはＸＴＥＮペプチドであり、６０アミノ酸を含む。ある態様において、ヒンジドメインはＸＴＥＮペプチドであり、３０アミノ酸を含む。ある態様において、ヒンジドメインはＸＴＥＮペプチドであり、４５アミノ酸を含む。ある態様において、ヒンジドメインはＸＴＥＮペプチドであり、１５アミノ酸を含む。
【０１０８】
Ｆ. シグナルペプチド
ある態様において、キメラ受容体はまたポリペプチドのＮ末端にシグナルペプチド(別名シグナル配列)を含む。一般に、シグナル配列は、細胞における所望の部位にポリペプチドを標的化するペプチド配列である。ある態様において、シグナル配列は、キメラ受容体を細胞の分泌経路に標的化させ、キメラ受容体の脂質二重層への組込みおよび係留を可能にし得る。ここに記載するキメラ受容体における使用に適合性である、天然に存在するタンパク質のシグナル配列または合成の、天然に存在しないシグナル配列を含むシグナル配列は当業者に明らかである。ある態様において、シグナル配列はＣＤ８αからである。ある態様において、シグナル配列はＣＤ２８からである。他の態様において、シグナル配列は、マウスカッパ鎖からである。さらに他の態様において、シグナル配列はＣＤ１６からである。
【０１０９】
Ｇ. キメラ受容体の例
表３〜５は、ここに記載するキメラ受容体の例を提供する。この構築物例は、Ｎ末端からＣ末端方向順で、シグナル配列、Ｆｃバインダー(例えば、Ｆｃ受容体の細胞外ドメイン)、ヒンジドメインおよび膜貫通を有するが、共刺激性ドメインおよび細胞質シグナル伝達ドメインの位置は入れ替え得る。
【０１１０】
【表３】
2017527310.tif 000006
【０１１１】
【表４】
2017527310.tif 000007
【０１１２】
【表５】
2017527310.tif 000008
【表６】
2017527310.tif 000009
【表７】
2017527310.tif 000010
【０１１３】
キメラ受容体例のアミノ酸配列を下に提供する(シグナル配列は斜体)。
配列番号２：
【化２】
2017527310.tif 000011
【０１１４】
配列番号３：
【化３】
2017527310.tif 000012
【０１１５】
配列番号４：
【化４】
2017527310.tif 000013
【０１１６】
配列番号５：
【化５】
2017527310.tif 000014
【０１１７】
配列番号６：
【化６】
2017527310.tif 000015
【０１１８】
配列番号７：
【化７】
2017527310.tif 000016
【０１１９】
配列番号８：
【化８】
2017527310.tif 000017
【０１２０】
配列番号９：
【化９】
2017527310.tif 000018
【０１２１】
配列番号１０：
【化１０】
2017527310.tif 000019
【０１２２】
配列番号１１：
【化１１】
2017527310.tif 000020
【０１２３】
配列番号１２：
【化１２】
2017527310.tif 000021
【０１２４】
配列番号１３：
【化１３】
2017527310.tif 000022
【０１２５】
配列番号１４：
【化１４】
2017527310.tif 000023
【０１２６】
配列番号１５：
【化１５】
2017527310.tif 000024
【０１２７】
配列番号１６：
【化１６】
2017527310.tif 000025
【０１２８】
配列番号１７：
【化１７】
2017527310.tif 000026
【０１２９】
配列番号１８：
【化１８】
2017527310.tif 000027
【０１３０】
配列番号１９：
【化１９】
2017527310.tif 000028
【０１３１】
配列番号２０：
【化２０】
2017527310.tif 000029
【０１３２】
配列番号２１：
【化２１】
2017527310.tif 000030
【０１３３】
配列番号２２：
【化２２】
2017527310.tif 000031
【０１３４】
配列番号２３：
【化２３】
2017527310.tif 000032
【０１３５】
配列番号２４：
【化２４】
2017527310.tif 000033
【０１３６】
配列番号２５：
【化２５】
2017527310.tif 000034
【０１３７】
配列番号２６：
【化２６】
2017527310.tif 000035
【０１３８】
配列番号２７：
【化２７】
2017527310.tif 000036
【０１３９】
配列番号２８：
【化２８】
2017527310.tif 000037
【０１４０】
配列番号２９：
【化２９】
2017527310.tif 000038
【０１４１】
配列番号３０：
【化３０】
2017527310.tif 000039
【０１４２】
配列番号３１：
【化３１】
2017527310.tif 000040
【０１４３】
配列番号３２：
【化３２】
2017527310.tif 000041
【０１４４】
配列番号３３：
【化３３】
2017527310.tif 000042
【０１４５】
配列番号３４：
【化３４】
2017527310.tif 000043
【０１４６】
配列番号３５：
【化３５】
2017527310.tif 000044
【０１４７】
配列番号３６：
【化３６】
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【０１４８】
配列番号３７：
【化３７】
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【０１４９】
配列番号３８：
【化３８】
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【０１５０】
配列番号３９：
【化３９】
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【０１５１】
配列番号４０：
【化４０】
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【０１５２】
配列番号４１：
【化４１】
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【０１５３】
配列番号４２：
【化４２】
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【０１５４】
配列番号４３：
【化４３】
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【０１５５】
配列番号４４：
【化４４】
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【０１５６】
配列番号４５：
【化４５】
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【０１５７】
配列番号４６：
【化４６】
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【０１５８】
配列番号４７：
【化４７】
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【０１５９】
配列番号４８：
【化４８】
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【０１６０】
配列番号４９：
【化４９】
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【０１６１】
配列番号５０：
【化５０】
2017527310.tif 000059
【０１６２】
配列番号５１：
【化５１】
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【０１６３】
配列番号５２：
【化５２】
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【０１６４】
配列番号５３：
【化５３】
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【０１６５】
配列番号５４：
【化５４】
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【０１６６】
配列番号５５：
【化５５】
2017527310.tif 000064
【０１６７】
配列番号５６：
【化５６】
2017527310.tif 000065
【０１６８】
ある態様において、ここに記載するキメラ受容体は、ＣＤ１６の細胞外リガンド結合ドメイン(ＣＤ１６ＦまたはＣＤ１６Ｖ、別名Ｆ１５８  ＦＣＧＲ３ＡおよびＶ１５８  ＦＣＧＲ３Ａバリアント)、ＣＤ８αのヒンジおよび膜貫通ドメイン、４−１ＢＢの共刺激性シグナル伝達ドメインおよびＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達ドメイン、例えば、ここに開示するＣＤ１６Ｆ−ＢＢ−ζおよびＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζの１以上を含み得る。これらの要素のアミノ酸配列およびコード化ヌクレオチド配列例を下記表６に示す。
【０１６９】
【表８】
2017527310.tif 000066
【表９】
2017527310.tif 000067
【表１０】
2017527310.tif 000068
【０１７０】
ある例において、ここに記載するキメラ受容体は、上記要素の全てを含まない。例えば、ここに記載するキメラ受容体は、下記表７に記載するキメラ受容体のいずれでもなくてよく、または上記表６に記載する配列の１以上を含まなくてよい。
【０１７１】
【表１１】
2017527310.tif 000069
【０１７２】
他のここに開示するキメラ受容体と同様、これらの例示的キメラ受容体のＴ細胞およびＮＫ細胞のような免疫細胞における発現は、これらの細胞にＡＤＣＣ能力を与え、それゆえに、標的化腫瘍抗原と関係なく、モノクローナル抗体(ならびに免疫グロブリンのＦｃ部分またはＦｃ含有ＤＮＡまたはＲＮＡと組み合わせた腫瘍表面受容体と結合する、リガンド(例えば、サイトカイン、免疫細胞受容体)からなる、例えば、複合性分子のような、Ｆｃ部分を含む他の抗腫瘍分子の抗腫瘍能を顕著に増強する。
【０１７３】
他のここに記載するキメラ受容体と同様、これらの例示的キメラ受容体も、複数の腫瘍に対する抗体療法の効力を顕著に増大する能力を有する普遍的キメラ受容体である。下の実施例１に記載するように、レトロウイルス形質導入によりヒトＴ細胞において発現するとき、本発明のＶ１５８受容体は、共通Ｆ１５８バリアントを含む同一キメラ受容体(またここに提供する)と比較して、抗ＣＤ２０抗体リツキシマブのようなヒト化抗体を含むヒトＩｇＧに対して有意に高い親和性を有する。キメラ受容体の結合は、Ｔ細胞活性化、溶解性顆粒の開口分泌および増殖を誘発する。ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ発現Ｔ細胞は、ＣＬＬ培養を骨髄由来間葉性細胞で行ったときでも、低エフェクター：標的比で、リツキシマブ存在下、リンパ腫細胞株および初代慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)細胞を特異的に殺す。抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブは、乳癌および胃癌細胞に対しておよび抗ＧＤ２抗体ｈｕ１４.１８Ｋ３２２Ａは神経芽腫および骨肉腫細胞に対して、キメラ受容体介在抗体依存性細胞毒性(ＡＤＣＣ)を誘発する。実施例部分にさらに開示するように、キメラ受容体およびリツキシマブを組み合わせて発現するＴ細胞は免疫欠損マウスにおけるヒトリンパ腫細胞を根絶し、一方Ｔ細胞または抗体単独はしなかった。この技術の臨床解釈を容易にするために、キメラ受容体ｍＲＮＡのエレクトロポレーションに基づく方法を開発し、ウイルスベクターを使用しない効率的かつ一過性の受容体発現に至った。
【０１７４】
Ｈ. キメラ受容体を含む医薬組成物およびその製造
ここに記載するキメラ受容体のいずれかを、組み換え技術のような常法により製造できる。ここでのキメラ受容体を製造する方法は、Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、少なくとも１の共刺激性シグナル伝達ドメインおよびＩＴＡＭを含む細胞質シグナル伝達ドメインを含む、キメラ受容体のドメインの各々を含むポリペプチドをコードする核酸の産生を含む。ある態様において、核酸はまた、Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメインと膜貫通ドメインの間のヒンジドメインもコードする。キメラ受容体をコードする核酸は、シグナル配列もコードし得る。ある態様において、核酸配列は、配列番号２〜３０および３２〜５６により提供されるキメラ受容体例のいずれかをコードする。
【０１７５】
キメラ受容体の要素の各々の核酸は、通例の技術、例えば、当分野で知られる多種多様な源のいずれかからのＰＣＲ増幅により得ることができる。ある態様において、キメラ受容体の要素の１以上の配列をヒト細胞から得る。あるいは、キメラ受容体の要素の１以上の配列は合成され得る。要素(例えば、ドメイン)の各々の配列を、ＰＣＲ増幅またはライゲーションのような方法を使用して、直接的または間接的(例えば、ペプチドリンカーをコードする核酸配列を使用)に連結して、キメラ受容体をコードする核酸配列を形成できる。あるいは、キメラ受容体をコードする核酸は合成され得る。ある態様において、核酸はＤＮＡである。他の態様において、核酸はＲＮＡである。
【０１７６】
キメラ受容体タンパク質、それをコードする核酸およびこのような核酸を担持する発現ベクターのいずれかを薬学的に許容される担体と混合して医薬組成物を形成でき、これも本発明の範囲内である。“許容される”は、担体が組成物の活性成分(例えば、核酸、ベクター、細胞または治療抗体)と適合性であり、該組成物を投与する対象に対して負に影響しないことを意味する。本発明の方法において使用する医薬組成物のいずれかは、凍結乾燥製剤または水溶液の形で、薬学的に許容される担体、添加物または安定化剤を含み得る。
【０１７７】
緩衝液を含む薬学的に許容される担体は当分野で周知であり、リン酸、クエン酸および他の有機酸；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤；低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンのようなタンパク質；アミノ酸；疎水性ポリマー；単糖；二糖；および他の炭水化物；金属錯体；および／または非イオン性界面活性剤を含み得る。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover参照。
【０１７８】
本発明の医薬組成物は、処置する特定の適応症について必要に応じて、１以上のさらなる活性化合物、好ましくは互いに不利に影響しない、相補的活性を有するものを含んでよい。可能なさらなる活性化合物の非限定的例は、例えば、ＩＬ２ならびに下記組み合わせ処置の議論において記載される種々の薬剤を含む。
【０１７９】
II. キメラ受容体を発現する免疫細胞
ここに記載するキメラ受容体を発現する宿主細胞は、抗体(例えば、治療抗体)またはＦｃ融合タンパク質のようなＦｃ含有治療剤により結合される標的細胞を認識できる特異的細胞集団を提供する。抗体のＦｃ部分またはＦｃ融合タンパク質を伴い、このような宿主細胞(例えば、免疫細胞)に発現されるキメラ受容体構築物の細胞外リガンド結合ドメインの結合は、活性化シグナルをキメラ受容体構築物の共刺激性シグナル伝達ドメインおよびＩＴＡＭ含有細胞質シグナル伝達ドメインに伝達し、これが、次に宿主細胞の細胞増殖および／または宿主細胞により誘発されるＡＤＣＣ効果のようなエフェクター機能を活性化する。共刺激性シグナル伝達ドメインとＩＴＡＭを含む細胞質シグナル伝達ドメインの組み合わせは、細胞内の複数シグナル伝達経路の強固な活性化を可能にし得る。ある態様において、宿主細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、好酸球またはこれらの任意の組み合わせのような免疫細胞である。ある態様において、免疫細胞はＴ細胞である。ある態様において、免疫細胞はＮＫ細胞である。他の態様において、免疫細胞は確立された細胞株、例えば、ＮＫ−９２細胞であり得る。
【０１８０】
免疫細胞集団は、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)、骨髄、脾臓、リンパ節、胸腺または腫瘍組織のような任意の源から得ることができる。所望のタイプの宿主細胞を得るのに適する源は、当業者に明らかである。ある態様において、免疫細胞集団はＰＢＭＣに由来する。所望のタイプの宿主細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、好酸球または任意のこれらの組み合わせのような免疫細胞)は、細胞と刺激性分子を共インキュベートすることにより得られた細胞集団内で増大でき、例えば、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体をＴ細胞の増大に使用できる。
【０１８１】
ここに記載するキメラ受容体構築物のいずれかを発現する免疫細胞を構築するために、キメラ受容体構築物の安定なまたは一過性の発現用発現ベクターを、ここに記載する定法により構築し、免疫宿主細胞に導入し得る。例えば、キメラ受容体をコードする核酸を、適当なプロモーターと操作可能に結合したウイルスベクターのような適当な発現ベクターにクローン化し得る。核酸およびベクターを、適当な条件下、制限酵素と接触させて、互いに対形成でき、リガーゼにより連結できる相補的末端を各分子上に作ることができる。あるいは、合成核酸リンカーを、キメラ受容体をコードする核酸の終端にライゲートできる。合成リンカーは、ベクターにおける特定の制限部位に対応する核酸配列を含み得る。発現ベクター／プラスミド／ウイルスベクターの選択は、キメラ受容体の発現のための宿主細胞によるが、真核細胞における組込みおよび複製に適さなければならない。
【０１８２】
多種多様なプロモーターを、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)初期中間プロモーター、ウイルスＬＴＲ例えば、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＨＩＶ−ＬＴＲ、ＨＴＬＶ−１  ＬＴＲ、サルウイルス４０(ＳＶ４０)初期プロモーター、単純ヘルペスｔｋウイルスプロモーターを含むが、これらに限定されない、ここに記載するキメラ受容体の発現に使用できる。キメラ受容体の発現のためのさらなるプロモーターは、免疫細胞におけるあらゆる構成的に活性なプロモーターを含む。あるいは、あらゆる制御可能プロモーターを、発現が免疫細胞内に調節され得るように、使用し得る。
【０１８３】
さらに、ベクターは、例えば、次のものの一部または全部を含み得る：宿主細胞における安定なまたは一過性のトランスフェクタントの選択のためのネオマイシン遺伝子のような選択可能マーカー遺伝子；高レベルの転写のためのヒトＣＭＶの最初期遺伝子からのエンハンサー／プロモーター配列；ｍＲＮＡ安定性のためのＳＶ４０からの転写停止およびＲＮＡプロセシングシグナル；適切なエピソーム複製のためのＳＶ４０ポリオーマ複製起点およびＣｏｌＥ１；内部リボソーム結合部位(ＩＲＥＳｅｓ)、多用途多重クローニング部位；センスおよびアンチセンスＲＮＡのインビトロ転写のためのＴ７およびＳＰ６  ＲＮＡプロモーター；惹起されたとき、ベクターを担持する細胞の死を誘発する“自殺スイッチ”または“自殺遺伝子”(例えば、ＨＳＶチミジンキナーゼ、ｉＣａｓｐ９のような誘導性カスパーゼ)およびキメラ受容体発現を評価するためのレポーター遺伝子。
【０１８４】
ある具体的態様において、このようなベクターは自殺遺伝子も含む。ここで使用する用語“自殺遺伝子”は、自殺遺伝子を発現する細胞死を誘発する遺伝子をいう。自殺遺伝子は、遺伝子が発現されるとき、細胞をある因子、例えば、薬物に感受性を付与し、細胞が当該因子と接触したまたは当該因子にさらされたとき、細胞の死を引き起こす遺伝子をいう。自殺遺伝子は当分野で知られ(例えば、Suicide Gene Therapy: Methods and Reviews, Springer, Caroline J. (Cancer Research UK Centre for Cancer Therapeutics at the Institute of Cancer Research, Sutton, Surrey, UK), Humana Press, 2004参照)、例えば、単純ヘルペスウイルス(ＨＳＶ)チミジンキナーゼ(ＴＫ)遺伝子、シトシンデアミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、ニトロレダクターゼおよびカスパーゼ８のようなカスパーゼを含む。
【０１８５】
導入遺伝子を含むベクターを産生するための適当なベクターおよび方法は周知であり、当分野で利用可能である。キメラ受容体の発現のためのベクター製造は、例えば、ＵＳ２０１４／０１０６４４９号に見ることができ、ここに、その全体を引用により本明細書に包含させる。
【０１８６】
ここに記載するキメラ受容体構築物をコードする核酸配列を含むベクターのいずれも、本発明の範囲内である。このようなベクターまたはその中に含まれるキメラ受容体をコードする配列を、適当な方法により宿主免疫細胞のような宿主細胞に送達し得る。免疫細胞にベクターを送達する方法は当分野で周知であり、ＤＮＡエレクトロポレーション、ＲＮＡエレクトロポレーション、リポソームのようなトランスフェクション試薬またはウイルス形質導入を含む。
【０１８７】
ある態様において、キメラ受容体の発現のためのベクターを、ウイルス形質導入により宿主細胞に送達する。送達のためのウイルス方法の例は、組み換えレトロウイルス(例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／０７９３６号；ＷＯ９４／０３６２２号；ＷＯ９３／２５６９８号；ＷＯ９３／２５２３４号；ＷＯ９３／１１２３０号；ＷＯ９３／１０２１８号；ＷＯ９１／０２８０５号；米国特許５,２１９,７４０号および４,７７７,１２７号；ＧＢ特許２,２００,６５１号；およびＥＰ特許０３４５２４２号参照)、アルファウイルスベースのベクターおよびアデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)ベクター(例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／１２６４９号、ＷＯ９３／０３７６９号；ＷＯ９３／１９１９１号；ＷＯ９４／２８９３８号；ＷＯ９５／１１９８４号およびＷＯ９５／００６５５号参照)を含むが、これらに限定されない。ある態様において、キメラ受容体の発現のためのベクターはレトロウイルスである。ある態様において、キメラ受容体の発現のためのベクターはレンチウイルスである。
【０１８８】
レトロウイルス形質導入を記載する参考文献の例は、Anderson et al., 米国特許５,３９９,３４６号; Mann et al., Cell 33:153 (1983); Temin et al., 米国特許４,６５０,７６４号; Temin et al., 米国特許４,９８０,２８９号; Markowitz et al., J. Virol. 62:1120 (1988); Temin et al., 米国特許５,１２４,２６３号; Dougherty et al.の国際特許公開ＷＯ９５／０７３５８号、１９９５年３月１６日公開;およびKuo et al., Blood 82:845 (1993)を含む。国際特許公開ＷＯ９５／０７３５８は、初代Ｂリンパ球の高効率形質導入を記載する。また、例えば使用できるレトロウイルス形質導入およびｍＲＮＡエレクトロポレーションの具体的技術についての、下記実施例部分も参照のこと。
【０１８９】
キメラ受容体をコードするベクターを、宿主細胞にウイルスベクターを使用して導入する例において、免疫細胞に感染し、ベクターを運搬できるウイルス粒子を、当分野で知られるあらゆる方法で製造でき、例えばＰＣＴ出願ＷＯ１９９１／００２８０５Ａ２号、ＷＯ１９９８／００９２７１Ａ１号および米国特許６,１９４,１９１号に見ることができる。ウイルス粒子を細胞培養上清から採取し、ウイルス粒子と免疫細胞を接触させる前に単離および／または精製してよい。
【０１９０】
ある態様において、ここに記載するようなキメラ受容体のいずれかをコードするＲＮＡ分子を常法(例えば、インビトロ転写)により製造し、次いで、適当な宿主細胞、例えば、ここに記載するようなものに既知方法により導入し得る、例えば、Rabinovich et al., Human Gene Therapy 17:1027-1035。下記実施例に示すように、ｍＲＮＡエレクトロポレーションは、Ｔリンパ球における本発明のキメラ受容体の有効な発現をもたらす。
【０１９１】
宿主細胞へのここに提供するキメラ受容体のいずれかをコードするベクターまたはキメラベクターをコードする核酸(例えば、ＲＮＡ分子)の導入に続き、細胞を、キメラ受容体の発現を可能にする条件下で培養する。キメラ受容体をコードする核酸が制御可能プロモーターにより制御される例において、宿主細胞を、制御可能プロモーターが活性化される条件で培養する。ある態様において、プロモーターは誘導可能プロモーターであり、免疫細胞を、誘導性分子存在下または誘導性分子が産生される条件で培養する。キメラ受容体が発言されるか否かの決定は当業者に明らかであり、あらゆる既知方法で、例えば、定量的逆転写酵素ＰＣＲ(ｑＲＴ−ＰＣＲ)によるキメラ受容体コード化ｍＲＮＡの検出またはウェスタンブロッティング、蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリーを含む方法によるキメラ受容体タンパク質の検出により評価し得る。あるいは、キメラ受容体の発現は、免疫細胞を対象に投与した後、インビボで起こり得る。
【０１９２】
あるいは、ここに開示する免疫細胞のいずれかにおけるキメラ受容体構築物の発現を、キメラ受容体構築物をコードするＲＮＡ分子の導入により達成できる。このようなＲＮＡ分子をインビトロ転写または化学合成により製造できる。ＲＮＡ分子を、次いで、免疫細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、好酸球またはこれらの任意の組み合わせ)のような適当な宿主細胞に、例えば、エレクトロポレーションにより導入できる。例えば、ＲＮＡ分子を、Rabinovich et al., Human Gene Therapy, 17:1027-1035およびＷＯＷＯ２０１３／０４０５５７号に記載する方法に従い、合成し、宿主免疫細胞に導入できる。
【０１９３】
ここに記載するキメラ受容体を発現する宿主細胞のいずれかを製造する方法はまたエクスビボでの宿主細胞の活性化も含み得る。宿主細胞の活性化は、宿主細胞を、細胞がエフェクター機能(例えば、ＡＤＣＣ)を発揮できる活性化状態に刺激することを意味する。宿主細胞の活性化方法は、キメラ受容体の発現に使用する宿主細胞のタイプによる。例えば、Ｔ細胞は、エクスビボで抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、ＩＬ−２またはフィトヘマグルチニンのような分子の１以上の存在下活性化され得る。他の例において、ＮＫ細胞は、エクスビボで４−１ＢＢリガンド、抗４−１ＢＢ抗体、ＩＬ−１５、抗ＩＬ−１５受容体抗体、ＩＬ−２、ＩＬ１２、ＩＬ−２１およびＫ５６２細胞のような分子の１以上の存在下活性化され得る。ある態様において、ここに記載するキメラ受容体を発現する宿主細胞のいずれかは、対象への投与前にエクスビボで活性化される。宿主細胞が活性化されるか田舎の決定は当業者に明らかであり、細胞活性化と関係する１以上の細胞表面マーカーの発現、サイトカインの発現または分泌および細胞形態学の評価を含み得る。
【０１９４】
ここに記載するキメラ受容体を発現する宿主細胞のいずれかを製造する方法は、エクスビボでの宿主細胞の増大を含み得る。宿主細胞増大は、キメラ受容体を発現する細胞の数の増加をもたらす、例えば、宿主細胞を増殖させるまたは宿主細胞を増殖するよう刺激するあらゆる方法を含む。宿主細胞の刺激増大のための方法は、キメラ受容体の発現に使用する宿主細胞のタイプにより、当業者に明らかである。ある態様において、ここに記載するキメラ受容体を発現する宿主細胞のいずれかは、対象に投与する前にエクスビボで増大される。
【０１９５】
ある態様において、キメラ受容体を発現する宿主細胞は、対象に細胞を投与する前にエクスビボで増大および活性化される。宿主細胞活性化および増大を使用して、ウイルスベクターのゲノムへの組込みおよびここに記載するようなキメラ受容体をコードする遺伝子の発現を可能にし得る。ｍＲＮＡエレクトロポレーションを使用するならば、活性化および／または増大は必要でない可能性があるが、エレクトロポレーションは、活性化細胞で実施したとき、より効果的であり得る。いくつかの例において、キメラ受容体は、適当な宿主細胞において一過性に発現される(例えば、３〜５日間)。一過性発現は、毒性の可能性があるならば有利であり得て、副作用の可能性に関する臨床試験の初期相において役立ち得る。
【０１９６】
IV. キメラ受容体を発現する免疫細胞の免疫療法への適用
例示的な本発明のキメラ受容体は、Ｔリンパ球に対する抗体依存性細胞毒性(ＡＤＣＣ)能力を提供し、ＮＫ細胞におけるＡＤＣＣを増強する。受容体が腫瘍細胞に結合する抗体(またはＦｃ部分を含む他の抗腫瘍分子)に結合されたとき、Ｔ細胞活性化、持続的増殖および抗体(またはＦｃ部分を含むこのような他の抗腫瘍分子)により標的化される癌細胞に対する特異的細胞毒性が惹起される。下記実施例部分に開示するように、本発明のキメラ受容体を含むＴリンパ球は、Ｂ細胞リンパ腫、乳癌および胃癌、神経芽腫および骨肉腫、ならびに初代慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)を含む広範な腫瘍細胞型に対して、高度に細胞毒性であった。細胞毒性は、完全に、標的細胞に結合する特異的抗体の存在に依存した：可溶性抗体は、細胞溶解性顆粒の開口分泌を誘発せず、非特異的細胞毒性を引き起こさなかった。
【０１９７】
ＣＤ１６のＩｇのＦｃ部分に対する親和性の程度は、ＡＤＣＣ、ゆえに、抗体免疫療法に対する臨床的応答の重要な決定因子である。Ｉｇに高結合親和性を有し、優れたＡＤＣＣを介在するＶ１５８多型を有するＣＤ１６を、一例として選択した。Ｆ１５８受容体は、Ｔ細胞増殖およびＡＤＣＣの誘導においてＶ１５８受容体より低い効力であるが、Ｆ１５８受容体は、Ｖ１５８受容体よりインビボ毒性が低い可能性があり、ある臨床状況においては有用となる。
【０１９８】
本発明のキメラ受容体は、複数癌細胞型に対して単一受容体の使用を可能にすることにより、Ｔ細胞療法を容易にする。腫瘍が利用する免疫逃避機構を考慮して、最終的に有利であり得る戦略である、同時の複数抗原のターゲティングも可能にする。Grupp et al., N Engl J Med. 2013。抗体指向細胞毒性は、抗体投与を単に中止することにより、必要であればいつでも中止できる。本発明のキメラ受容体を発現するＴ細胞が、標的細胞への抗体結合によってのみ活性化されるため、非結合免疫グロブリンは、注入Ｔ細胞に何ら刺激を発揮しない。臨床的安全性は、自己免疫性反応性の何らかの可能性を限定するために、キメラ受容体を一過性に発現するためのｍＲＮＡエレクトロポレーションの使用によりさらに増強され得る。
【０１９９】
下記実施例部分に開示する結果は、自己Ｔ細胞の注入、エクスビボでの活性化および増大および本発明のキメラ受容体で遺伝子修飾後の再注入は、ＡＤＣＣを顕著に押し上げることを示唆する。組み合わせＣＤ３ζ／４−１ＢＢシグナル伝達もＴ細胞増殖をもたらすため、腫瘍部位への活性化Ｔ細胞蓄積があるはずであり、これはさらにその活性を増強し得る。
【０２００】
それゆえに、ある態様において、本発明は、処置を必要とする対象における癌の抗体ベースの免疫療法の効力を増加させる方法を提供し、当該対象は、癌細胞に結合でき、ヒトＣＤ１６に結合できるヒト化Ｆｃ部分を含む抗体で処置されており、該方法は、対象に治療有効量のＴリンパ球またはＮＫ細胞を投与することを含み、当該Ｔリンパ球またはＮＫ細胞は本発明のキメラ受容体を含む。
【０２０１】
Ａ. 免疫療法効力増大
ここに記載されるキメラ受容体(コード化核酸またはそれを含むベクター)を発現する宿主細胞(例えば、免疫細胞)は、対象におけるＡＤＣＣ増強および／または抗体ベースの免疫療法の効力増強に有用である。ある態様において、対象は、ヒト、サル、マウス、ウサギまたは飼育哺乳動物のような哺乳動物である。ある態様において、対象はヒトである。ある態様において、対象はヒト癌患者である。ある態様において、対象は、ここに記載する治療抗体のいずれかで処置されているまたは処置される。
【０２０２】
免疫細胞を薬学的に許容される担体と混合して医薬組成物を形成でき、これも本発明の範囲内である。
【０２０３】
ここに記載する方法を実施するために、有効量のここに記載するキメラ受容体構築物のいずれかを発現する免疫細胞を、処置を必要とする対象に投与できる。免疫細胞は対象に対して自己であってよく、すなわち、免疫細胞は処置を必要とする対象から得て、キメラ受容体構築物発現のために遺伝子操作され、次いで、同対象に投与される。対象への自己細胞投与は、非自己細胞の投与と比較して、宿主細胞の拒絶の低減をもたらし得る。あるいは、宿主細胞は同種細胞であり、すなわち、細胞を第一対象から得て、キメラ受容体構築物発現のために遺伝子操作され、第一対象とは異なるが、同じ種である第二対象に投与される。例えば、同種免疫細胞はヒトドナーに由来し、ドナーと異なるヒトレシピエントに投与され得る。
【０２０４】
ある態様において、免疫細胞を、最小２０％、例えば、５０％、８０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍またはそれ以上ＡＤＣＣ活性を増強するのに有効な量で対象に投与される。
【０２０５】
ある態様において、免疫細胞を、抗体ベースの免疫療法の効力を増強するために、治療Ｆｃ含有治療剤(例えば、抗体またはＦｃ融合タンパク質のようなＦｃ融合分子)と共使用する。抗体ベースの免疫療法を、対象において免疫療法が有用であると考えられるあらゆる疾患または障害の症状の処置、軽減または低減に使用する。このような療法において、治療抗体は、癌細胞において差示的に発現される(すなわち、非癌細胞で発現されないまたは非癌細胞で低レベルで発現される)細胞表面抗原と結合し得る。治療抗体により結合され、抗原または標的分子を発現する細胞がＡＤＣＣに付されることを示す抗原または標的分子の例は、ＣＤ１７／Ｌ１−ＣＡＭ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１３８、ＣＥＡ、ＤＳ６、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖIII、ＥＮＰＰ３、ＦＲ、ＧＤ２、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ２、ＩＬ−１３Ｒα２、メソセリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、Ｎｅｃｔｉｎ−４、ＰＳＭＡおよびＳＣＬ４４Ａ４を含むが、これらに限定されない。
【０２０６】
抗体ベースの免疫療法の効力は当分野で知られるあらゆる方法により評価でき、熟練した医療従事者には明らかである。例えば、抗体ベースの免疫療法の効力は、対象の生存または対象またはその組織もしくはサンプルにおける腫瘍もしくは癌負荷により評価し得る。ある態様において、免疫細胞を、抗体ベースの免疫療法の効力を、免疫細胞非存在下の効力と比較して、少なくとも２０％、例えば、５０％、８０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍またはそれ以上増強するのに有効な量で処置を必要とする対象に投与する。
【０２０７】
ここに記載する方法のいずれかにおいて、Ｔリンパ球またはＮＫ細胞のような免疫細胞は、処置に付される対象から単離した自己細胞であり得る。ある具体的態様において、対象への再導入前に、自己免疫細胞(例えば、Ｔリンパ球またはＮＫ細胞)をエクスビボで活性化および／または増大させる。他の態様において、免疫細胞(例えば、Ｔリンパ球またはＮＫ細胞)は同種細胞である。
【０２０８】
ある具体的態様において、Ｔリンパ球は、内因性Ｔ細胞受容体の発現が阻止または除去されている同種Ｔリンパ球である。ある具体的態様において、対象への導入前に、同種Ｔリンパ球をエクスビボで活性化および／または増大させる。Ｔリンパ球は、当分野で知られるあらゆる方法で、例えば、抗ＣＤ３／ＣＤ２８、ＩＬ−２および／またはフィトヘマグルチニン存在下、活性化され得る。
【０２０９】
ＮＫ細胞は、当分野で知られるあらゆる方法で、例えば、ＣＤ１３７リガンドタンパク質、ＣＤ１３７抗体、ＩＬ−１５タンパク質、ＩＬ−１５受容体抗体、ＩＬ−２タンパク質、ＩＬ−１２タンパク質、ＩＬ−２１タンパク質およびＫ５６２細胞株からなる群から選択される１以上の薬剤存在下で、活性化され得る。例えば、ＮＫ細胞の増大のための有用な方法の記載について米国特許７,４３５,５９６号および８,０２６,０９７号参照。例えば、本発明の方法において使用するＮＫ細胞は、主要組織適合抗原Ｉおよび／またはII分子を欠くまたはほとんど発現しない、膜結合ＩＬ−１５および４−１ＢＢリガンド(ＣＤＩ３７Ｌ)を発現するように遺伝子修飾されている細胞に曝すことにより優先的に増大させ得る。このような細胞株は、Ｋ５６２[ＡＴＣＣ、ＣＣＬ  ２４３；Lozzio et al., Blood 45(3): 321-334 (1975); Klein et al., Int. J. Cancer 18: 421-431 (1976)]およびウィルムス腫瘍細胞株ＨＦＷＴ(Fehniger et al., Int Rev Immunol 20(3-4):503-534 (2001); Harada H, et al., Exp Hematol 32(7):614-621 (2004))、子宮内膜腫瘍細胞株ＨＨＵＡ、黒色腫細胞株ＨＭＶ−II、肝芽腫細胞株ＨｕＨ−６、肺小細胞癌細胞株Ｌｕ−１３０およびＬｕ−１３４−Ａ、神経芽腫細胞株ＮＢ  １９およびＮ１３６９、精巣ＮＥＣ  １４からの胚癌細胞株、子宮頸癌細胞株ＴＣＯ−２および骨髄転移神経芽腫細胞株ＴＮＢ１[Harada, et al., Jpn. J. Cancer Res 93: 313-319 (2002)]を含むが、必ずしもこれらに限定されない。好ましくは使用する細胞株は、Ｋ５６２およびＨＦＷＴ細胞株のようにＭＨＣ  ＩおよびII分子の両者を欠くか、ほとんど発現しない。固体支持体を細胞株の代わりに使用し得る。このような支持体は、好ましくはその表面に、ＮＫ細胞と結合し、一次活性化事象および／または増殖性応答を誘発する、またはこのような作用を有する分子の結合ができ、それにより、スキャフォールドとして作用する、少なくとも１分子が結合していなければならない。支持体は、その表面に、ＣＤ１３７リガンドプロテインＡ  ＣＤ１３７抗体、ＩＬ−１５タンパク質またはＩＬ−１５受容体抗体が結合していてよい。好ましくは、支持体は、その表面にＩＬ−１５受容体抗体およびＣＤ１３７抗体結合を有する。
【０２１０】
上記方法のある態様において、対象へのＴリンパ球またはＮＫ細胞の導入(または再導入)に続いて、対象への治療有効量のＩＬ−２の投与がある。
【０２１１】
本発明のキメラ受容体は、キメラ受容体におけるＦｃバインダーに結合するＦｃ部分を有する特異的抗体が存在するかまたは産生され得る、癌腫、リンパ腫、肉腫、芽腫および白血病を含むが、これらに限定されないあらゆる癌の処置に使用し得る。本発明のキメラ受容体により処置できる癌の具体的非限定的例は、例えば、Ｂ細胞起源の癌(例えば、Ｂ細胞系譜急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病およびＢ細胞非ホジキンリンパ腫)、乳癌、胃癌、神経芽腫および骨肉腫を含む。
【０２１２】
ここに開示する方法を実施するために、有効量のキメラ受容体を発現する免疫細胞、Ｆｃ含有治療剤(例えば、Ｆｃ融合タンパク質および治療抗体のようなＦｃ含有治療タンパク質)またはその組成物を、静脈内投与のような適当な経路により、処置を必要とする対象(例えば、ヒト癌患者)に投与できる。キメラ受容体を発現する免疫細胞、Ｆｃ含有治療剤またはその組成物のいずれかを、対象に有効量で投与し得る。ここで使用する有効量は、投与により、対象に治療効果を与える各剤(例えば、宿主キメラ受容体を発現する細胞、Ｆｃ含有治療剤またはその組成物)の量をいう。ここに記載する細胞または組成物の両が治療効果を達成するか否かの決定は、当業者に明らかである。有効量は、当業者に認識されるとおり、処置する特定の状態、状態の重症度、年齢、身体的状態、体格、性別および体重を含む個々の患者パラメータ、処置期間、併用療養の性質(もしあれば)、具体的投与経路および医療従事者の知識および専門知識の範囲内の類似因子により変わる。ある態様において、有効量は、対象における何らかの疾患または障害を軽減、緩和、寛解、改善、症状低減または進行遅延させる。ある態様において、対象はヒトである。
【０２１３】
ある態様において、対象はヒト癌患者である。例えば、対象は、癌腫、リンパ腫、肉腫、芽細胞腫または白血病を有するヒト患者である。ここに開示する細胞および組成物の投与が適し得る癌の例は、例えば、リンパ腫、乳癌、胃癌、神経芽腫、骨肉腫、肺癌、皮膚癌、前立腺癌、結腸癌、腎臓細胞癌、卵巣癌、横紋筋肉腫、白血病、中皮腫、膵臓癌、頭頸部癌、網膜芽細胞腫、神経膠腫、神経膠芽腫および甲状腺癌を含む。
【０２１４】
本発明によって、患者は、約１０５〜１０１０またはそれ以上の細胞／体重キログラム(細胞／Kg)の範囲で本発明のキメラ受容体を含むＴリンパ球またはＮＫ細胞のような免疫細胞の治療上有効用量の注入により処置され得る。注入は、患者が耐容性であり得るならば所望の応答が達成されるまでできるだけ頻繁に多数回繰り返し得る。適切な注入用量およびスケジュールは患者毎に変わるが、特定の患者について処置医により決定され得る。一般に、初期用量約１０６細胞／Kgを注入し、１０８またはそれ以上の細胞／Kgまで漸増させる。ＩＬ−２を、注入後注入細胞を拡大させるために共投与し得る。ＩＬ−２の量は約１〜５×１０６国際単位／体表面積平方メートルであり得る。
【０２１５】
ある態様において、ここに開示するキメラ受容体のいずれかを発現する免疫細胞を、Ｆｃ含有治療剤(例えば、Ｆｃ融合タンパク質または治療抗体)で処置しているまたは処置する対象に投与する。ここに開示するキメラ受容体のいずれか１つを発現する免疫細胞を、Ｆｃ含有治療剤と共投与し得る。例えば、免疫細胞を、ヒト対象に治療抗体と同時に投与し得る。あるいは、免疫細胞を、抗体ベースの免疫療法の間にヒト対象に投与し得る。ある例において、免疫細胞および治療抗体をヒト対象に少なくとも４時間離れて、例えば、少なくとも１２時間離れて、少なくとも１日離れて、少なくとも３日離れて、少なくとも１週間離れて、少なくとも２週間離れてまたは少なくとも１ヶ月離れて投与し得る。
【０２１６】
治療Ｆｃ含有治療タンパク質の例は、アダリムマブ、Ａｄｏ−トラスツズマブエムタンシン、アレムツズマブ、バシリキシマブ、ベバシズマブ、ベリムマブ、ブレンツキシマブ、カナキヌマブ、セツキシマブ、ダクリズマブ、デノスマブ、ジヌツキシマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、エピラツズマブ、ゲムツズマブ、ゴリムマブ、インフリキシマブ、イピリムマブ、ラベツズマブ、ナタリズマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ラムシルマブ、リツキシマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、ウステキヌマブおよびベドリズマブを含むが、これらに限定されない。
【０２１７】
使用するＦｃ含有治療剤の適切な用量は、処置する癌のタイプ、疾患の重症度および経過、先の療法、患者の病歴および抗体に対する応答ならびに処置医の裁量による。抗体を、患者に１回または一連の処置の間に投与し得る。本発明の治療の進行を、慣用技術およびアッセイにより容易にモニターできる。
【０２１８】
Ｆｃ含有治療剤の投与は、全身投与ならびに疾患部位(例えば、原発腫瘍)への直接投与を含む、任意の適当な経路により実施できる。
【０２１９】
Ｂ. 組み合わせ処置
本明細書に記載する組成物および方法を、化学療法、手術、放射線、遺伝子療法などのような癌の他のタイプの療法と組み合わせて利用し得る。このような療法は、本発明の免疫療法と同時にまたは逐次的に(任意の順番で)適用し得る。
【０２２０】
さらなる治療剤と共投与するとき、各薬剤の適当な治療有効用量は、相加性または相乗性により、低減され得る。
【０２２１】
本発明の処置は、例えば、治療ワクチン(ＧＶＡＸ、ＤＣベースのワクチンなどを含むが、これらに限定されない)、チェックポイント阻害剤(ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３などを遮断する薬剤を含むが、これらに限定されない)またはアクティベーター(４１ＢＢ、ＯＸ４０などを増強する薬剤を含むが、これらに限定されない)のような、他の免疫調節性処置と組み合わせ得る。
【０２２２】
本発明の免疫療法との組み合わせに有用な他の治療剤の非限定的例は、(ｉ)抗血管形成剤(例えば、ＴＮＰ−４７０、血小板因子４、トロンボスポンジン−１、メタロプロテアーゼの組織阻害剤(ＴＩＭＰ１およびＴＩＭＰ２)、プロラクチン(１６Kdフラグメント)、アンジオスタチン(３８Kdフラグメントのプラスミノーゲン)、エンドスタチン、ｂＦＧＦ可溶性受容体、トランスフォーミング増殖因子ベータ、インターフェロンアルファ、可溶性ＫＤＲおよびＦＬＴ−１受容体、胎盤性プロリフェリン関連タンパク質ならびにCarmelietおよびJain (2000)により開示されたもの)；(ii)抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦバリアント、可溶性ＶＥＧＦ受容体フラグメント、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲを遮断できるアプタマー、中和抗ＶＥＧＦＲ抗体、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤およびこれらの任意の組み合わせのようなＶＥＧＦアンタゴニストまたはＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト；および(iii)例えば、ピリミジンアナログ(５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、カペシタビン、ゲムシタビンおよびシタラビン)、プリンアナログ、葉酸アンタゴニストおよび関連阻害剤(メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチンおよび２−クロロｄｅオキシアデノシン(クラドリビン))のような化学療法化合物；ビンカアルカロイド(ビンブラスチン、ビンクリスチンおよびビノレルビン)、タキサン(パクリタキセル、ドセタキセル)、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール、エポチロンおよびナベルビンのような天然産物、エピジポドフィロトキシン(エトポシド、テニポシド)、ＤＮＡ傷害剤(アクチノマイシン、アムサクリン、アントラサイクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトテシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シトキサン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ヘキサメチニルアミンオキサリプラチン、イフォスファミド、メルファラン、メクロレタミン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ニトロソ尿素、プリカマイシン、プロカルバジン、タキソール、タキソテール、テニポシド、トリエチレンチオホスホロアミドおよびエトポシド(ＶＰ１６))のような微小管撹乱物質を含む抗増殖性／有糸分裂阻害剤；ダクチノマイシン(アクチノマイシンＤ)、ダウノルビシン、ドキソルビシン(アドリアマイシン)、イダルビシン、アントラサイクリン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、プリカマイシン(ミトラマイシン)およびマイトマイシン酵素(Ｌ−アスパラギンを全身的に代謝し、自身のアスパラギンを合成する能力を有しない細胞を枯渇させるＬ−アスパラギナーゼ)のような抗生物質；抗血小板剤；窒素マスタード(メクロレタミン、シクロホスファミドおよびアナログ、メルファラン、クロラムブシル)、エチレンイミンおよびメチルメラミン(ヘキサメチルメラミンおよびチオテパ)、アルキルスルホネート−ブスルファン、ニトロソウレア(カルムスチン(ＢＣＮＵ)およびアナログ、ストレプトゾシン)、トラゼン−ダカルバジニン(ＤＴＩＣ)のような抗増殖性／抗有糸分裂アルキル化剤；葉酸アナログ(メトトレキサート)のような抗増殖性／抗有糸分裂代謝拮抗剤；白金配位複合体(シスプラチン、カルボプラチン)、プロカルバジン、ヒドロキシ尿素、ミトタン、アミノグルテチミド；ホルモン、ホルモンアナログ(エストロゲン、タモキシフェン、ゴセレリン、ビカルタミド、ニルタミド)およびアロマターゼ阻害剤(レトロゾール、アナストロゾール)；抗凝血剤(ヘパリン、合成ヘパリン塩およびトロンビンの他の阻害剤)；線維素溶解性剤(例えば組織プラスミノーゲン活性化因子、ストレプトキナーゼおよびウロキナーゼ)、アスピリン、ジピリダモール、チクロピジン、クロピドグレル、アブシキシマブ；抗遊走剤；抗分泌剤(ブレフェルジン)；免疫抑制剤(シクロスポリン、タクロリムス(ＦＫ−５０６)、シロリムス(ラパマイシン)、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル)；抗血管形成化合物(例えば、ＴＮＰ−４７０、ゲニステイン、ベバシズマブ)および増殖因子阻害剤(例えば、線維芽細胞増殖因子(ＦＧＦ)阻害剤)；アンギオテンシン受容体ブロッカー；一酸化窒素ドナー；抗センスオリゴヌクレオチド；抗体(トラスツズマブ)；細胞周期阻害剤および分化誘導因子(トレチノイン)；ｍＴＯＲ阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤(ドキソルビシン(アドリアマイシン)、アムサクリン、カンプトテシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、エニポシド、エピルビシン、エトポシド、イダルビシンおよびミトキサントロン、トポテカン、イリノテカン)、コルチコステロイド(コルチゾン、デキサメサゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾンおよびプレドニゾロン)；増殖因子シグナル伝達キナーゼ阻害剤；ミトコンドリア機能不全誘導因子およびカスパーゼアクティベーター；および染色質撹乱物質を含む。
【０２２３】
さらなる有用な薬剤の例について、またPhysician's Desk Reference, 59.sup.th edition, (2005), Thomson P D R, Montvale N.J.; Gennaro et al., Eds. Remington's The Science and Practice of Pharmacy 20.sup.th edition, (2000), Lippincott Williams and Wilkins, Baltimore Md.; Braunwald et al., Eds. Harrison's Principles of Internal Medicine, 15.sup.th edition, (2001), McGraw Hill, NY; Berkow et al., Eds. The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, (1992), Merck Research Laboratories, Rahway N.J.も参照のこと。
【０２２４】
Ｖ. 治療使用のためのキット
本発明はまた、抗体依存性細胞介在細胞毒性増強および抗体ベースの免疫療法増強におけるキメラ受容体の使用のためのキットも提供する。このようなキットは、任意の核酸または宿主細胞(例えば、ここに記載するようなもののような免疫細胞)および薬学的に許容される担体を含む第一医薬組成物および治療抗体および薬学的に許容される担体を含む第二医薬組成物を含む１以上の容器を含む。
【０２２５】
ある態様において、キットは、ここに記載する方法のいずれかに使用するための指示を含み得る。包含される指示は、対象における意図する活性、例えば、ＡＤＣＣ活性増強および／または抗体ベースの免疫療法の効力増強を達成するために、対象に第一および第二医薬組成物を投与する記載を含み得る。キットは、さらに対象が処置を必要とするか否かの同定に基づく、処置に適する対象の選択の記載を含み得る。ある態様において、指示は、処置を必要とする対象への第一および第二医薬組成物の投与の記載を含む。
【０２２６】
ここに記載するキメラ受容体ならびに第一および第二医薬組成物の使用に関する指示は、一般に意図する処置のための用量、投薬スケジュールおよび投与経路に関する情報を含む。容器は単位用量、大量包装(例えば、複数用量包装)または副次的単位用量であり得る。本発明のキットに提供される指示は、一般にラベルまたは添付文書に記載された指示である。ラベルまたは添付文書は、医薬組成物が対象における疾患または障害の処置、発症遅延および／または軽減に使用することを示す。
【０２２７】
ここに提供するキットは適当な包装である。適当な包装は、バイアル、ビン、ジャー、屈曲性包装などを含むが、これらに限定されない。また企図されるのは、吸入器、経鼻投与デバイスまたは注入デバイスのような特定のデバイスとの組み合わせに使用するパッケージである。キットは、無菌接近口を有し得る(例えば、容器は、皮下組織注射針により穿刺可能なストッパーを有する静注用溶液バッグまたはバイアルであり得る)。容器はまた無菌接続口も有し得る。医薬組成物における少なくとも１活性剤がここに記載するようなキメラ受容体である。
【０２２８】
キットは、所望により緩衝液および解釈上の情報のようなさらなる要素を提供し得る。通常、キットは、容器および容器の上にまたはそれに付随してラベルまたは添付文書を含む。ある態様において、本発明は、上記キットの要素を含む製造品を提供する。
【０２２９】
一般的技術
本発明の実施は、特に断らない限り、当業者の技術範囲内である、分子生物学(組み換え技術を含む)、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の慣用技術を用いる。このような技術は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed. 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1989) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed. 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds. 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.): Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al. eds. 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, et al., eds. 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practice approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds. Harwood Academic Publishers, 1995); DNA Cloning: A practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985); Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1986); Immobilized Cells and Enzymes (lRL Press, (1986); and B. Perbal, A practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel et al. (eds.)のような文献に十分に説明されている。
【０２３０】
さらに精緻化することなく、当業者は、上の記載に基づき、本発明をその最大範囲まで利用できると考えられる。次の具体的態様は、それゆえに、単に説明的であることを意図し、本発明のその余を限定する意図を全く有しない。ここに引用する全ての刊行物は、ここに引用する目的または対象のために、引用により本明細書に包含させる。
【実施例】
【０２３１】
実施例１. ＣＤ１６シグナル伝達受容体を発現するＴリンパ球は抗体依存的癌細胞死滅をもたらす
材料および方法
細胞
ヒトＢ細胞系譜リンパ腫細胞株ＤａｕｄｉおよびＲａｍｏｓ、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病細胞株Ｊｕｒｋａｔおよび神経芽腫細胞株ＣＨＬＡ−２５５、ＮＢ１６９１およびＳＫ−Ｎ−ＳＨは、St. Jude Children's Research Hospitalから入手可能であった。乳癌細胞株ＭＣＦ−７(ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−２２)およびＳＫ−ＢＲ−３(ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−３０)および骨肉腫細胞株Ｕ−２  ＯＳ(ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−９６)は、American Type Culture Collection(ATCC; Rockville, MD)から得た；胃癌細胞株ＭＫＮ７は、国立研究開発法人医薬基盤(日本国大阪)からであった。Ｄａｕｄｉ、ＣＨＬＡ−２５５、ＮＢ１６９１、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、ＳＫ−ＢＲ−３、ＭＣＦ−７、Ｕ−２  ＯＳおよびＭＫＮ７は、ホタルルシフェラーゼ遺伝子含有マウス幹細胞ウイルス(ＭＳＣＶ)−配列内リボソーム進入部位(ＩＲＥＳ)−緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)レトロウイルスベクターも形質導入した３４。形質導入細胞を、FACSAria cell sorter(BD Biosciences, San Jose, CA)でＧＦＰ発現について選択した。新たに診断され、かつ未処置のＢ細胞慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)患者からの末梢血または骨髄サンプルを、インフォームドコンセントおよびSingapore’s National University Hospitalが管理するDomain Specific Ethics Boardによる承認の後に得た。
【０２３２】
末梢血サンプルを、健常成人ドナーからの血小板献血の非特定化副産物から得た。単核細胞を、Accu-Prep Human Lymphocytes Cell Separation Media(Accurate Chemical & Scientific Corp., Westbury, N.Y.)での遠心により富化し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ(Invitrogen, Carlsbad, CA)と、１０％ウシ胎児血清(ＦＢＳ)、抗生物質、１００ＩＵインターロイキン(ＩＬ)−２(Roche, Mannheim, Germany)含有ＲＰＭＩ−１６４０中、３日間培養した。４日目、Ｔ細胞を、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ５６、ＣＤ１２３およびＣＤ２３５ａ抗体の混合物と磁気ビーズ(Pan T Cell Isolation Kit II; Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)を用いる陰性選択により精製した(純度、＞９８％)。精製Ｔ細胞を、隔日で１００ＩＵ  ＩＬ−２を添加しながら、上記培地に維持した。
【０２３３】
プラスミド、ウイルス産生および遺伝子形質導入
ｐＭＳＣＶ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ、ｐＥＱ−ＰＡＭ３(−Ｅ)およびｐＲＤＦをSt. Jude Children’s Research Hospital  Vector Development and Production Shared Resource(Memphis, TN)から得た１０。ＦＣＲＧ３Ａ  ｃＤＮＡをOrigene(Rockville, MD)から得て、そのＶ１５８Ｆバリアントを、プライマー“Ｆ”  ＣＴＴＣＴＧＣＡＧＧＧＧＧＣＴＴＧＴＴＧＧＧＡＧＴＡＡＡＡＡＴＧＴＧＴＣ(配列番号７３)および“Ｒ”  ＧＡＣＡＣＡＴＴＴＴＴＡＣＴＣＣＣＡＡＣＡＡＧＣＣＣＣＣＴＧＣＡＧＡＡＧ(配列番号７４)を使用するＰＣＲによる部位特異的変異誘発により産生した。ＣＤ８αヒンジおよび膜貫通ドメイン(配列番号６６)ならびに４−１ＢＢ(配列番号６７)およびＣＤ３ζ(配列番号６８)の細胞内ドメインをコードするポリヌクレオチドを、先に製造した抗ＣＤ１９−４１ＢＢ−ＣＤ３ζ  ｃＤＮＡからサブクローン化した。Imai et al., 2004。これらの分子を、ＰＣＲによる重複伸長によるスプライシングを使用して集合させた。構築物(“ＣＤ１６Ｆ−ＢＢ−ζ”および“ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ”)および発現カセットを、ＭＳＣＶ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターのＥｃｏＲＩおよびＭＬｕ１部位にサブクローン化した。
【０２３４】
ＲＤ１１４偽型レトロウイルスを産生するために、fuGENE 6またはX-tremeGENE 9(Roche, Indianapolis, IN)を使用して、３×１０６  ２９３Ｔ細胞を３.５μgのＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζをコードするｃＤＮＡ、３.５μgのｐＥＱ−ＰＡＭ３(−Ｅ)および３μgのｐＲＤＦで遺伝子導入した。Imai et al., 2004。２４時間で培地を１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０に変えた後、レトロウイルスを含む培地を４８〜９６時間後に添加し、RetroNectin(タカラ、日本国大津)被覆ポリプロピレンチューブに添加し、これを１４００ｇで１０分遠心し、３７℃で６時間インキュベートした。さらなる遠心および上清除去後、Ｔ細胞(１×１０５)をチューブに添加し、３７℃で２４時間静置した。次いで、細胞をＦＢＳ、抗生物質および１００ＩＵ／mL  ＩＬ−２含有ＲＰＭＩ−１６４０に、形質導入７〜２１日後の実験まで維持した
【０２３５】
ＣＤ１６の表面発現を、Ｒ−フィコエリトリン接合抗ヒトＣＤ１６(クローンＢ７３.１、BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA)を使用して、フローサイトメトリーで分析した。ウェスタンブロッティングについて、２×１０７  Ｔ細胞を１％プロテアーゼ阻害剤カクテル(Sigma)および１％ホスファターゼ阻害剤カクテル２(Sigma)含有Cellytic M lysis Buffer(Sigma, St Louis, MO)に溶解した。遠心後、ライセート上清を等量のＬＤＳ緩衝液(Invitrogen, Carlsbad, CA)で、還元緩衝液(Invitrogen)存在下または非存在下沸騰させ、次いでNuPAGE Novex 12% Bis-Tris Gel(Invitrogen)で分離した。タンパク質をポリビニリデンフルオライド(ＰＶＤＦ)膜に移し、これをマウス抗ヒトＣＤ３ζ(クローン８Ｄ３；BD eBioscience Pharmingen)、次いでヤギ抗マウスＩｇＧホースラディッシュペルオキシダーゼ−接合二次抗体(Cell Signaling Technology, Danvers, MA)とインキュベートした。抗体結合を、Amersham ECL Prime検出試薬(GE Healthcare)を使用して確認した。
【０２３６】
ｍＲＮＡエレクトロポレーション
ｐＶＡＸ１ベクター(Invitrogen, Carlsbad, CA)を、インビトロｍＲＮＡ転写の鋳型として使用した。ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ  ｃＤＮＡをｐＶＡＸ１のＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ部位にサブクローン化した。対応するｍＲＮＡをインビトロでT7 mScript mRNA産生系(CellScript, Madison, WI)で転写した。Shimasaki et al., Cytotherapy. 2012;14(7):830-40。
【０２３７】
エレクトロポレーションのために、Amaxa Nucleofector(Lonza, Walkersville, MD)を使用した；Cell Line Nucleofector Kit V(Lonza)中、２００ＩＵ／mL  ＩＬ−２で一夜活性化した１×１０７の精製Ｔ細胞を、２００μg／mL  ｍＲＮＡと混合し、プロセシングチャンバーに移し、プログラムＸ−００１を使用して遺伝子導入した。エレクトロポレーション直後、細胞をプロセシングチャンバーから２４ウェルプレートに移し、次いでＦＢＳ、抗生物質および１００ＩＵ／mL  ＩＬ−２含有ＲＰＭＩ−１６４０(Roche, Mannheim, Germany)で培養した。Shimasaki et al., Cytotherapy, 2012, 1-11も参照のこと。
【０２３８】
抗体結合、細胞結合および細胞増殖アッセイ
キメラ受容体抗体結合能を測定するために、キメラ受容体またはＧＦＰのみを含むベクターを形質導入したＴリンパ球(５×１０５)を、リツキシマブ(リツキサン、Roche；０.１〜１μg／mL)、トラスツズマブ(ハーセプチン；Roche；０.１〜１μg／mL)および／または精製ヒトＩｇＧ(R&D Systems, Minneapolis, MN；０.１〜１μg／mL)と３０分、４℃でインキュベートした。リン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)で２回洗浄後、細胞をヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＰＥ(Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL)と１０分、室温でインキュベートし、細胞染色をAccuri C6フローサイトメーター(BD Biosciences)を使用して測定した。
【０２３９】
受容体に結合した抗体が細胞凝集を促進するか否かの決定のために、ＣＤ２０陽性Ｄａｕｄｉ細胞をCellTrace calcein red-orange AM(Invitrogen)で標識し、リツキシマブ(０.１μg／mL)と３０分、４℃でインキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄後、細胞と、キメラ受容体形質導入または偽形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞を、１：１  Ｅ：Ｔ比で９６丸底プレート(Costar, Corning, NY)で６０分、３７℃でインキュベートした。異種細胞凝集塊を形成する細胞(カルセインＡＭ−ＧＦＰ二重陽性)の比をフローサイトメトリーにより決定した。
【０２４０】
細胞増殖を測定するために、キメラ受容体形質導入または偽形質導入Ｔ細胞１×１０６を２４ウェルプレート(Costar, Corning, NY)のウェルに、ＦＢＳ、抗生物質および５０ＩＵ／mL  ＩＬ−２含有ＲＰＭＩ−１６４０に入れた。Ｄａｕｄｉ細胞をＳｔｒｅｃｋ細胞防腐剤(Streck Laboratories, Omaha, NE)で処理して、増殖を停止させ、リツキシマブ(０.１μg／mL)で３０分、４℃で標識した。それらを、ウェルに、Ｔ細胞と１：１比で、０日目、７日目、１４日目および２１日目に添加した。培養後の生存可能Ｔ細胞数をフローサイトメトリーにより測定した。
【０２４１】
ＣＤ１０７脱顆粒および細胞毒性アッセイ
ＣＤ１６架橋結合が溶解性顆粒の開口分泌を引き起こすか否かを決定するために、キメラ受容体および偽形質導入Ｔ細胞(１×１０５)をリツキシマブ被覆９６ウェル平底プレートの各ウェルに添加し、４時間、３７℃で培養した。他の実験において、Ｔ細胞を、リツキシマブとプレインキュベートしたＤａｕｄｉ細胞と共培養した。フィコエリトリンに接合した抗ヒトＣＤ１０７ａ抗体(BD Biosciences)を培養開示しに添加し、１時間後ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ(０.１５μl；BD Biosciences)を添加した。ＣＤ１０７ａ陽性Ｔ細胞をフローサイトメトリーで分析した。
【０２４２】
細胞毒性を試験するために、標的細胞を１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０に懸濁させ、カルセインＡＭ(Invitrogen)で標識し、９６ウェル丸底プレート(Costar)に播種した。Ｔ細胞を、結果において示すような種々のＥ：Ｔ比で添加し、抗体リツキシマブ(リツキサン、Roche)、トラスツズマブ(ハーセプチン、Roche)またはｈｕ１４.１８Ｋ３２２Ａ(Dr. James Allay, St Jude Children’s GMP, Memphis, TNから得た；１μg／mL)存在下または非存在下、標的細胞と４時間共培養した。培養終了時、細胞を回収し、同量のＰＢＳに再懸濁し、ヨウ化プロピジウムを添加した。生存可能標的細胞数(カルセインＡＭ陽性、ヨウ化プロピジウム陰性)をAccuri C6フローサイトメーターを使用して計数した３４。接着性細胞株に関して、細胞毒性をルシフェラーゼ標識標的細胞を使用して試験した。接着性細胞株ＮＢ１６９１、ＣＨＬＡ−２５５、ＳＫ−ＢＲ−３、ＭＣＦ−７、Ｕ−２  ＯＳおよびＭＫＮ７に対する細胞毒性を測定するために、それらのルシフェラーゼ標識誘導体を使用した。少なくとも４時間プレーティング後、Ｔ細胞を上記のように添加した。共培養４時間後、Promega Bright-Gloルシフェラーゼ試薬(Promega, Madison, WI)を各ウェルに添加した；５分後、発光をプレートリーダーBiotek FLx800(BioTek, Tucson, AZ)を使用して測定し、Gen5 2.0 Data Analysis Softwareで解析した。
【０２４３】
異種移植実験
ルシフェラーゼを発現するＤａｕｄｉ細胞を、ＮＯＤ.Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  ＩＬ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ(ＮＯＤ／ｓｃｉｄ  ＩＬ２ＲＧｎｕｌｌ)マウス(Jackson Laboratory, Bar Harbor)に腹腔内注射した(ｉ.ｐ.；０.３×１０６細胞／マウス)。一部のマウスは、Ｄａｕｄｉ接種４日後リツキシマブ(１００μg)のｉ.ｐ.を、５日目および６日目のヒト初代Ｔ細胞ｉ.ｐ.注射を伴いにまたは伴わずに受けた。Ｔ細胞は、３日間抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで活性化されており、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体を形質導入し、ＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ＦＢＳに再懸濁し、１×１０７細胞／マウスで注射した。リツキシマブ注射を４週間毎週繰り返し、さらにＴリンパ球注射は行わなかった。全マウスは、４週間、週に２回１０００〜２０００ＩＵのＩＬ−２のｉ.ｐ.注射を受けた。ある群のマウスは、リツキシマブまたはＴ細胞ではなく、組織培養培地を受けた。
【０２４４】
腫瘍生着および増殖を、Xenogen IVIS-200システム(Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA)を使用して測定した。造影は、Ｄ−ルシフェリンカリウム塩(３mg／マウス)水溶液ｉ.ｐ.注射５分後から開始し、ルシフェラーゼ発現細胞から放出される光子をLiving Image 3.0ソフトウェアを使用して定量した。
【０２４５】
結果
ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体の発現
個体の約１／４に発現されるＦＣＧＲ３Ａ(ＣＤ１６)のＶ１５８多型は、高親和性免疫グロブリンＦｃ受容体を発現し、抗体療法に対する有利な応答と関連する。ＦＣＧＲ３Ａ遺伝子のＶ１５８バリアントをＣＤ８αのヒンジおよび膜貫通ドメイン、Ｔ細胞刺激性分子ＣＤ３ζおよび共刺激性分子４−１ＢＢと合わせた(図１Ａ)。ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ構築物およびＧＦＰを含むＭＣＳＶレトロウイルスベクターを、１２ドナーからの末梢血Ｔリンパ球の形質導入に使用した：ＣＤ３＋細胞における中央ＧＦＰ発現は８９.９％(範囲、７５.３％〜９７.１％)であった；同じ細胞において、抗ＣＤ１６染色により評価した中央キメラ受容体表面発現は８３.０％(６７.５％〜９１.８％)であった(図１Ｂ)。ＧＦＰのみを含むベクターを形質導入した同じドナーからのＴリンパ球は、９０.３％(６７.８％〜９８.７％)の中央ＧＦＰ発現を有したが、１.０％(０.１％〜２.７％)しかＣＤ１６を発現しなかった(図１Ｂ)。受容体の発現は、ＣＤ４＋とＣＤ８＋  Ｔ細胞で有意に異ならなかった：６９.８％±１０.８％ＣＤ４＋細胞がＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζで形質導入後ＣＤ１６＋であったのに対し、７７.６％±９.２％ＣＤ８＋細胞(図２)。
【０２４６】
キメラ受容体の他の要素が発現されていることを確実にするために、ＣＤ３ζの発現レベルをフローサイトメトリーにより測定した。図１Ｂに示すように、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ形質導入Ｔリンパ球は、偽形質導入細胞により発現されるよりはるかに高いレベルでＣＤ３ζを発現した：平均蛍光強度の平均(±ＳＤ)は前者で４５,９８５±１６,３６５であり、それに対し後者で１２,５４７±４,２９６であった(ｔ検定でＰ＝０.０２７；ｎ＝３；図１Ｂ)。キメラタンパク質の存在も、抗ＣＤ３ζ抗体でプローブするウェスタンブロッティングで決定した。図１Ｃに示すように、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ形質導入Ｔリンパ球は、還元条件下１６kDaの内因性ＣＤ３ζに加えて、約２５kDaのキメラタンパク質を発現した。非還元条件下、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζタンパク質は、単量体または５０kDaの二量体で発現されることが示された。
【０２４７】
Ｖ１５８対Ｆ１５８  ＣＤ１６受容体の抗体結合能
ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζキメラ受容体が免疫グロブリン(Ｉｇ)に結合する能力を試験するために、３ドナーからの末梢血Ｔリンパ球を形質導入した。図３Ａに示すように、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ発現Ｔリンパ球を、リツキシマブとインキュベーション後抗体で被覆した。トラスツズマブとヒトＩｇＧで類似する結果が得られた。
【０２４８】
高親和性ＦＣＧＲ３Ａ(ＣＤ１６)のＶ１５８多型を含むＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体のＩｇ結合能を、次いで、代わりにＦ１５８バリアントを含む同一受容体(“ＣＤ１６Ｆ−ＢＢ−ζ”)と比較した。Ｊｕｒｋａｔ細胞をいずれかの受容体で形質導入した後、リツキシマブおよび抗ヒトＩｇ  ＰＥ抗体(結合リツキシマブ)とインキュベートし、ＰＥ蛍光強度はＧＦＰと相関した。図３Ｂに示すように、ＧＦＰのあらゆるレベルで、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体を形質導入した細胞は、ＣＤ１６Ｆ−ＢＢ−ζ受容体を形質導入した細胞よりＰＥ蛍光強度が高く、前者が有意に高い抗体結合親和性を有したことを示した。トラスツズマブおよびヒトＩｇＧも、高い親和性でＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体により結合された(図４)。
【０２４９】
ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体への抗体結合がエフェクターおよび標的細胞の凝集を促進するか否かを決定するために、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ(およびＧＦＰ)発現Ｊｕｒｋａｔ細胞を、１：１比でＣＤ２０＋  Ｄａｕｄｉ細胞株(カルセインＡＭ赤色−橙色で標識)と６０分混合し、ＧＦＰ−カルセインダブレットの形成を、リツキシマブを添加してまたは添加せずに測定した。３実験で、共培養の事象の３９.０％±１.９％が、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体発現Ｊｕｒｋａｔ細胞およびリツキシマブが存在するならば、ダブレットであった(図３ＣおよびＤ)。それに反して、リツキシマブの代わりにヒトＩｇＧまたは偽形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞存在下では、リツキシマブの存在にかかわらず、＜５％ダブレットであった。
【０２５０】
ＩｇのＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζへの結合は、Ｔ細胞活性化、脱顆粒および細胞増殖を誘発する
固定化抗体により架橋されたＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体がＴリンパ球における活性化シグナルを誘発できるか否かを評価した。実際、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζを形質導入したＴリンパ球は、リツキシマブを被覆したプレートで培養したとき、Ｌ−２受容体発現(ＣＤ２５)が顕著に増加し、抗体非存在下または偽形質導入細胞では抗体が存在するか否かに関わらず、変化は観察されなかった(図５ＡおよびＢ)。
【０２５１】
ＩＬ−２受容体の発現に加えて、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体架橋は、ＣＤ１０７ａ染色により検出して、Ｔリンパ球における溶解性顆粒の開口分泌を引き起こした。それゆえに、４ドナーからのＴリンパ球をリツキシマブで被覆したマイクロタイタープレートに播種する(ｎ＝３)またはリツキシマブ存在下Ｄａｕｄｉ細胞と共培養する(ｎ＝３)６実験において、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζを発現するＴリンパ球はＣＤ１０７ａ陽性となった(図５Ｃ)。
【０２５２】
最後に、受容体架橋が細胞増殖を誘発できるか否かを決定した。図５Ｄに示すように、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζを発現するＴリンパ球は、リツキシマブおよびＤａｕｄｉ細胞(Ｔリンパ球と１：１比)存在下、増大した：３実験において、培養７日後の平均Ｔ細胞回収は、投入細胞の６３２％(±９７％)であった；培養４週間後、６８７７％(±１３９９％)であった。注目すべきは、非結合リツキシマブは、極めて高い濃度(１〜１０μg／mL)であっても、標的細胞非存在下では細胞増殖に顕著な効果を有さず、リツキシマブ非存在下または偽形質導入Ｔ細胞においては抗体および／または標的細胞の存在に関わらず、細胞増殖は生じなかった(図５Ｄ)。それゆえに、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体架橋は、持続的増殖をもたらすシグナルを誘発する。
【０２５３】
ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζを発現するＴリンパ球は、インビトロおよびインビボでＡＤＣＣを仲介する
ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ架橋結合が溶解性顆粒の開口分泌を惹起するとの観察は、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ  Ｔリンパ球が、特異的抗体存在下で標的細胞を殺すことができることを暗示した。実際、４時間インビトロ細胞毒性アッセイにおいて、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ  Ｔリンパ球は、リツキシマブ存在下、Ｂ細胞リンパ腫細胞株ＤａｕｄｉおよびＲａｍｏｓに対して高度に細胞毒性であった；５０％を超える標的細胞が、２：１  Ｅ：Ｔ比で共培養４時間後一般に溶解した(図６および図７)。それに反して、標的細胞死滅は、抗体非存在下または偽形質導入Ｔ細胞で低かった(図６および図７)。注目すべきことに、これらの実験で使用したエフェクター細胞は、ＣＤ３＋  Ｔリンパ球(＞９８％)に非常に富み、検出可能ＣＤ３−ＣＤ５６＋  ＮＫ細胞を含まなかった。リツキシマブ介在ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ  Ｔリンパ球の細胞毒性もＣＤ２０＋初代ＣＬＬ細胞で除去された(ｎ＝５)；図６Ｂに示すように、細胞毒性は、一般に２：１  Ｅ：Ｔ比で４時間共培養後、７０％を越えた。骨髄間葉性間質細胞は、免疫抑制性効果を発揮することが示された。これがＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ  Ｔリンパ球の細胞毒性能に影響するか否かを試験するために、骨髄由来間葉性間質細胞存在下、ＣＬＬ細胞と１：２  Ｅ：Ｔで２４時間共培養共培養した。図６Ｃに示すように、間葉性細胞は、ＡＤＣＣ介在リンパ球の死滅能力を低減させなかった。
【０２５４】
次に、異なる免疫治療抗体が、対応する抗原を発現する腫瘍細胞に対して類似する細胞毒性を発揮するか否かについて試験した。それゆえに、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ  Ｔリンパ球の細胞毒性を、ＨＥＲ２(乳癌細胞株ＭＣＦ−７およびＳＫ−ＢＲ−３および胃癌細胞株ＭＫＮ７)またはＧＤ２(神経芽腫細胞株ＣＨＬＡ−２５５、ＮＢ１６９１およびＳＫ−Ｎ−ＳＨおよび骨肉腫細胞株Ｕ２−ＯＳ)を発現する固形腫瘍細胞に対して試験した。抗体トラスツズマブをＨＥＲ２を標的とするのに使用し、ｈｕ１４.１８Ｋ３２２ＡをＧＤ２を標的とするのに使用した。ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ  Ｔリンパ球は、対応する抗体存在下、これらの細胞に対して高度に細胞毒性であった(図６および図７)。ＮＢ１６９１を用いる実験において、細胞毒性が培養を２４時間に伸ばして、低いＥ：Ｔ比で達成されるかも試験した。図８に示すように、細胞毒性は、ｈｕ１４.１８Ｋ３２２Ａ存在下、１：８比で５０％を超えた。ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ介在細胞死滅の特異性をさらに試験するために、ＣＤ２０＋  Ｄａｕｄｉ細胞を、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ  Ｔリンパ球および種々の特異性の抗体と培養した；リツキシマブのみは細胞毒性を介在したが、トラスツズマブまたはｈｕ１４.１８Ｋ３２２Ａ存在下、細胞毒性の増加はなかった(図８)。最後に、免疫治療抗体存在下のＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ介在細胞死滅が、非結合単量体ＩｇＧにより阻害されるか否かを決定した。図８に示すように、Ｔ細胞毒性は、ＩｇＧが細胞結合免疫治療抗体より最大１０００倍高い濃度で存在しても、影響されなかった。
【０２５５】
インビボでのＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ  Ｔリンパ球の抗腫瘍能を計測するために、ルシフェラーゼ標識Ｄａｕｄｉ細胞移植ＮＯＤ／ｓｃｉｄ  ＩＬ２ＲＧヌルマウスで実験を行った。腫瘍増殖を、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ  Ｔリンパ球＋リツキシマブ受けたマウスの生存造影により測定し、その結果を、リツキシマブまたはＴリンパ球単独を受けたまたは非処置のマウスと比較した。図９に示すように、リツキシマブ、続いてＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ  Ｔリンパ球を受けた以外の全マウスで腫瘍細胞は増大した。この組み合わせで処置した全５マウスは、腫瘍注射＞１２０日後も寛解したままであり、未処置または抗体または細胞単独を受けた１２マウス中０であったのと対照的であった。強い抗腫瘍活性も、神経芽腫細胞株ＮＢ１６９１を移植され、ｈｕ１４.１８Ｋ３２２ＡおよびＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ  Ｔリンパ球で処置したマウスで観察された(図１０)。
【０２５６】
ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζと他の受容体との比較
ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζまたはＣＤ１６Ｆ−ＢＢ−ζ受容体を担持するＴ細胞の機能比較は初めてのことであった。ＣＤ１６Ｆ−ＢＢ−ζ受容体はＴ細胞増殖およびＡＤＣＣを誘発し、これは、偽形質導入Ｔ細胞で測定されたものより高かった。それにもかかわらず、Ｉｇに対するその高い親和性に一致して、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体は、低親和性ＣＤ１６Ｆ−ＢＢ−ζ受容体により誘発されたものより顕著に高いＴ細胞増殖およびＡＤＣＣを誘発した(図１１)。
【０２５７】
次に、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ担持Ｔ細胞の機能を、異なるシグナル伝達性質を有する他の受容体を発現するＴ細胞と比較した。これらは、シグナル伝達能を有しない受容体(“ＣＤ１６Ｖ切断型”)、ＣＤ３ζを有するが、４−１ＢＢを有しない受容体(“ＣＤ１６Ｖ−ζ”)およびＣＤ１６ＶとＦｃεＲＩγの膜貫通および細胞質ドメインを組み合わせた先に記載された受容体(“ＣＤ１６Ｖ−ＦｃεＲＩγ”)を含んだ(図１２)。活性化Ｔ細胞へのレトロウイルス形質導入後、全受容体は高度に発言された(図１３)。図１４に示すように、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζは、他の全ての構築物より顕著に高い活性化、増殖および特異的細胞毒性を誘発した。
【０２５８】
ｍＲＮＡエレクトロポレーションによるＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体の発現
上記の全実験において、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ発現は、レトロウイルス形質導入により実施された。代替法である、ｍＲＮＡのエレクトロポレーションが、同様にＴリンパ球にＡＤＣＣ能を与えるか否かを私権した。２ドナーからの活性化Ｔリンパ球を電気穿孔し、高発現効率を得た：Ｔリンパ球の５５％および８２％が、エレクトロポレーション２４時間後ＣＤ１６＋となった(図１５Ａ)。第二ドナーにおいて、受容体発現を３日目にも試験し、その時点でそれは４３％であり、発現が７２〜９６時間持続した他の受容体での先の実験と類似する結果であった。ＡＤＣＣを、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ  ｍＲＮＡで電気穿孔したＴリンパ球において活性化した：リツキシマブ存在下、８０％Ｒａｍｏｓ細胞は、４時間後、２：１  Ｅ：Ｔ比で殺されたが、ｍＲＮＡ無しで電気穿孔した細胞は無効であった(図１５Ｂ)。
【０２５９】
全内容を引用により本明細書に包含させるKudo et al., Cancer Res. 2014 Jan 1;74(1):93-103も参照のこと。
【０２６０】
考察
ここに記載されるのは、Ｔリンパ球にＡＤＣＣを発揮する能力を与えるキメラ受容体である。ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体が、腫瘍細胞に結合した抗体により結合されたとき、Ｔ細胞活性化、持続的増殖および抗体により標的化された癌細胞に対する特異的細胞毒性が誘発される。ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ  Ｔリンパ球は、Ｂ細胞リンパ腫、乳癌および胃癌、神経芽腫および骨肉腫ならびに初代ＣＬＬ細胞を含む広範な腫瘍細胞型に対して高度に細胞毒性であった。細胞毒性は、標的細胞に結合した特異的抗体の存在に完全に依存した；非結合抗体は非特異的細胞毒性を惹起せず、細胞結合抗体の細胞毒性にも影響しなかった。ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ  Ｔ細胞も、この微小環境における既知免疫抑制性効果に関わらず、間葉性細胞層で培養したとき、ＣＬＬ細胞を殺した。さらに、リツキシマブ後に注入したＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ  Ｔリンパ球は、免疫欠損マウスに移植したＢ細胞リンパ腫細胞を除去し、抗ＧＤ２抗体存在下、神経芽腫細胞を移植したマウスにおける相当な抗腫瘍活性を有した。あわせると、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζを発現するＴ細胞は、インビトロおよびインビボで強いＡＤＣＣを発揮した。
【０２６１】
ＩｇのＦｃ部分に対するＣＤ１６の親和性はＡＤＣＣ、それゆえに、抗体免疫療法に対する臨床的応答に影響する重要な決定因子である。それゆえに、例えば糖鎖工学により、ＦｃγＲに対するＦｃフラグメントの親和性をさらに増大させるために、相当な労力が払われている。本発明のキメラ受容体を構築するために、Ｖ１５８多型を有するＦＣＧＲ３Ａ(ＣＤ１６)遺伝子(配列番号６５)を一例として選択した。このバリアントは、Ｉｇに対する高結合親和性を有し、優れたＡＤＣＣに介在する受容体をコードする。実際、より一般的なＦ１５８バリアントを含む同一キメラ受容体との左右交互の比較において、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζは、ヒトＩｇ  Ｆｃに結合する顕著に高い能力を有し、より活発な増殖および細胞毒性を誘発し、キメラ抗原受容体機能における親和性の役割に取り組む最近の試験結果をもたらした。現在の“第二世代”キメラ受容体は、刺激性分子と、共刺激性分子を、シグナル伝達増強および活性化誘発アポトーシス阻止のために組み合わせる。それゆえに、ＣＤ１６  Ｖ１５８を、ＣＤ３ζおよび４−１ＢＢによりタンデムに構成される刺激性分子と組み合わせた(ＣＤ１３７)。実際、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体は、ＣＤ３ζ単独またはＦｃεＲＩγを介してのみ作用する受容体より顕著に優れたＴ細胞活性化、増殖および細胞毒性を誘発した。
【０２６２】
腫瘍細胞表面抗原を認識し、刺激性シグナルを形質導入できる受容体を発現する遺伝子修飾されているＴ細胞の臨床的可能性は、臨床試験結果による証明が増え続けている。最も注目すべきことに、顕著な腫瘍減少および／または完全寛解が、ウイルス形質導入によりＣＤ１９またはＣＤ２０に対するキメラ抗原受容体を発現する自己Ｔリンパ球を受けた、Ｂ細胞悪性腫瘍を有する患者で報告されている。この戦略の他の腫瘍への拡大は、規制条件に従う、他のキメラ抗原受容体構築物の開発および大規模形質導入条件を含む、相当な労力を含む。これに関し、ここに記載するＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体は、複数癌細胞型に対して単一受容体の使用を可能にすることにより、Ｔ細胞療法の実行を促進する。単一特異性を有するキメラ受容体により標的化されたマーカーを欠くサブクローンにより誘発される白血病再発の最近の報告により説明されるように、腫瘍が利用する免疫逃避機構を考慮して、最終的に有利であり得る戦略である、同時の複数抗原のターゲティングも可能にする。抗体指向細胞毒性は、抗体投与を単に中止することにより、必要であればいつでも中止できる。ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζを発現するＴ細胞が、標的細胞への抗体結合によってのみ活性化されるため、可溶性免疫グロブリンは、注入Ｔ細胞に何ら刺激を発揮しない。ここに示されるように、ｍＲＮＡエレクトロポレーションは、本受容体を極めて効率的に発現できる。
【０２６３】
抗体療法は、多くの癌サブタイプについて標準治療となってきている；その臨床的効力は、大部分はＦｃ受容体の結合によりＡＤＣＣを誘発するその能力により決定される。ＡＤＣＣの主エフェクターはＮＫ細胞であるが、癌を有する患者において、その機能は障害され得る。例えば、ＨＥＲ２を過発現する胃癌細胞のトラスツズマブ介在ＡＤＣＣは、疾患初期患者または健常ドナーからのサンプルのものと比較して、胃癌患者および進行型疾患からの末梢血単核細胞より顕著に低いことが報告された。さらに、応答は、ＮＫ細胞阻害性受容体およびそのリガンドの遺伝子型を含む、他の因子に影響される可能性がある。ここに示す結果は、ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体で遺伝子操作した自己Ｔ細胞の注入は、ＡＤＣＣを顕著に押し上げることを示唆する。組み合わせＣＤ３ζ／４−１ＢＢシグナル伝達もＴ細胞増殖、をもたらすため、腫瘍部位への活性化Ｔ細胞蓄積があるはずであり、これはさらにその活性を増強し得る。ＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ受容体は、ｍＲＮＡエレクトロポレーションにより、活性化Ｔリンパ球だけでなく、休止末梢血単核細胞でも発現され、採血からＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ発現細胞注入までわずか数時間しかかからない方法であり、それゆえに臨床適用によく適している。
【０２６４】
実施例２. 種々のキメラ受容体の構築物
キメラ受容体配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１４をコードする核酸配列を、ベクターｐＶＡＸ１のＨｉｎｄIIIおよびＸｂａＩ部位にクローン化した。ＤＮＡベクターを、制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩでの消化により線形化し、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼでＲＮＡに転写した。ＲＮＡを、続いて、その５’末端をCellscriptからのScriptCap Capping EnzymeおよびScriptCap 2'-O-Methyltransferaseで酵素的にキャッピングし、Ｃａｐ  １構造を得て、次いでその３’末端をポリ−Ａポリメラーゼでポリアデニル化した。得られたｍＲＮＡを、Invitrogen Neonエレクトロポレーションシステムを使用してＪｕｒｋａｔ細胞に電気穿孔し、１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地で、３７℃で６時間培養した。
【０２６５】
次いで、培地中の電気穿孔細胞をＣＤ２０特異的抗体リツキサン(１０μg／mL)と、３７℃で３０分インキュベートした。細胞を回収し、フローサイトメトリー緩衝液(ＦＣ緩衝液；Ｃａ２＋およびＭｇ２＋不含ＤＰＢＳ、０.２％ウシ血清アルブミン、０.２％ＮａＮ３)で２回洗浄し、キメラ受容体発現を検出するためのＰＥ標識抗ＣＤ１６抗体または抗ＣＤ３２抗体(配列番号６について)または結合リツキサンを検出するためのＰＥ標識ヤギ抗ヒト抗体で染色した。染色細胞をフローサイトメトリーで分析した。全構築物からのキメラ受容体タンパク質は、ＰＥ標識抗ＣＤ１６または抗ＣＤ３２抗体で検出され、平均蛍光値は、３６,０００〜５３７,０００の範囲であった。Ｕｃｏｎｓｔｒｕｃｔ  １(配列番号１)は、最高発現レベルを示した。
【０２６６】
図１６(パネルＡ〜Ｃ)は、配列番号１  ｍＲＮＡで電気穿孔した細胞および偽電気穿孔細胞のリツキサン結合に関するフローサイトメトリーデータを示す。配列番号１をコードするｍＲＮＡで電気穿孔した９５％を超える細胞が、ヤギ−抗ヒト抗体で染色され、それに対し、偽電気穿孔細胞は２％未満であり、Ｊｕｒｋａｔ細胞表面に発現されたキメラ受容体がリツキサンに結合できたことを示す(図１６Ａおよび１６Ｂ)。ＰＥ標識ヤギ抗ヒト抗体で染色したとき、配列番号１  ｍＲＮＡ電気穿孔細胞の中央蛍光値は、偽電気穿孔細胞の中央蛍光値より約７００倍高かった(図１６Ｃ、表８)。配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９)、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１４について、類似する分析を行った。ＰＥ標識ヤギ抗ヒト抗体で染色したとき、これらの構築物についてのキメラ受容体ｍＲＮＡで電気穿孔した細胞の中央蛍光値は、偽電気穿孔細胞の中央蛍光値より約１４〜６８０倍高く(表８)、Ｊｕｒｋａｔ細胞の表面に発現されるこれらのキメラ受容体タンパク質全てがリツキサンに結合できたことを示す。
【０２６７】
これらの実験は、キメラ受容体配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１４が、全て、Ｊｕｒｋａｔ細胞で発現され、全てＣＤ２０特異的抗体リツキサンを結合することを示した。
【０２６８】
【表１２】
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【０２６９】
実施例３. キメラ受容体を発現する細胞はＴ細胞活性化マーカーを表示する
上記実施例２に開示したキメラ受容体を発現するＪｕｒｋａｔ細胞を、細胞表面活性マーカーＣＤ２５およびＣＤ６９の存在についてモニタリングすることにより、活性について評価した。これらの実験のために、Ｊｕｒｋａｔ細胞を、ｍＲＮＡ非存在下(偽)または上記実施例２のキメラ受容体構築物をコードするｍＲＮＡで、Invitrogen Neonエレクトロポレーションシステムを使用して電気穿孔し、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０培地で３７℃で８〜９時間増殖させた。細胞を回収し、１０％ウシ胎児血清、５０Ｕ／mLペニシリンおよび５０μg／mL  ストレプトマイシン含有ＲＰＭＩ−１６４０培地で洗浄した。これらの細胞を、１；１比で、Ｓｔｒｅｃｋ細胞防腐剤で固定されている、細胞表面発現ＣＤ２０を有するＤａｕｄｉ標的細胞およびＣＤ２０特異的抗体リツキサン(１０μg／mL)と混合した。この混合物を３７℃で１８〜２０時間、１０％ウシ胎児血清、５０Ｕ／mLペニシリンおよび５０μg／mL  ストレプトマイシン含有ＲＰＭＩ−１６４０培地でインキュベートした。細胞を回収し、Ｊｕｒｋａｔ細胞を検出するためのＰＥ標識抗ＣＤ７抗体ならびにそれぞれＪｕｒｋａｔ細胞上のＣＤ２５およびＣＤ６９発現を検出するためのＡＰＣ標識抗ＣＤ２５抗体またはＡＰＣ標識抗ＣＤ６９抗体で染色した。染色細胞をフローサイトメトリーにより評価した。
【０２７０】
ＣＤ７陽性細胞を、ＣＤ２５およびＣＤ６９両者の発現について評価した。配列番号１をコードするｍＲＮＡを用いる条件下で４５％を超えるＣＤ７陽性細胞がＡＰＣ標識抗ＣＤ２５抗体で染色され、それに対し、偽エレクトロポレーション条件におけるＣＤ７陽性細胞は３％未満であり、これらの実験条件下での、受容体を発現しない細胞に対する、キメラ受容体を発現するＪｕｒｋａｔ細胞上のＣＤ２５活性マーカーの発現増加を示した(図１７Ａおよび１７Ｂ)。ＣＤ７陽性細胞をＡＰＣ標識抗ＣＤ２５抗体での染色について評価したとき、配列番号１  ｍＲＮＡ条件での中央蛍光値は、偽電気穿孔細胞の中央蛍光値より約６.７倍高かった(図１７Ｃ、表８)。配列番号１をコードするｍＲＮＡを用いる条件下で９８％を超えるＣＤ７陽性細胞がＡＰＣ標識抗ＣＤ６９抗体で染色され、それに対し、偽エレクトロポレーション条件におけるＣＤ７陽性細胞は約４６％未満であり、これらの実験条件下での、受容体を発現しない細胞に対する、キメラ受容体を発現するＪｕｒｋａｔ細胞上のＣＤ６９活性マーカーの発現増加を示した(図１８Ａおよび１８Ｂ)。ＣＤ７陽性細胞をＡＰＣ標識抗ＣＤ６９抗体での染色について評価したとき、配列番号１  ｍＲＮＡ条件における中央蛍光値は、偽電気穿孔細胞の中央蛍光値より約６９倍高かった(図１８Ｃ、表８)。
【０２７１】
配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１４について、類似する分析を行った。ＣＤ７陽性細胞をＡＰＣ標識抗ＣＤ２５抗体での染色について評価したとき、細胞がこれらの構築物についてのキメラ受容体を発現する条件での中央蛍光値は、偽電気穿孔細胞の中央蛍光値より約２.３〜７.６倍高く(表８)、これらの実験条件下での、受容体を発現しない細胞に対する、キメラ受容体を発現するＪｕｒｋａｔ細胞上のＣＤ２５活性マーカーの発現増加を示した(表８)。ＣＤ７陽性細胞をＡＰＣ標識抗ＣＤ６９抗体での染色について評価したとき、細胞がこれらの構築物についてのキメラ受容体を発現する条件での中央蛍光値は、偽電気穿孔細胞の中央蛍光値より約１０〜６４倍高く(表８)、これらの実験条件下での、受容体を発現しない細胞に対する、キメラ受容体を発現するＪｕｒｋａｔ細胞上のＣＤ６９活性マーカーの発現増加を示した(表８)。
【０２７２】
これらの実験は、これらのキメラ受容体を発現するＪｕｒｋａｔ細胞が、これらの受容体がＣＤ２０特異的抗体リツキサンおよびＣＤ２０発現Ｄａｕｄｉ標的細胞と相互作用する条件下で、キメラ受容体を発現しないＪｕｒｋａｔ細胞に比して、活性マーカーＣＤ２５およびＣＤ６９の発現が増加したことを示す。
【０２７３】
実施例４. キメラ受容体はＪｕｒｋａｔ細胞上に発現される
キメラ受容体をコードするｍＲＮＡで電気穿孔したＪｕｒｋａｔ細胞を、抗ＣＤζ抗体を用いるウェスタンブロット分析によりキメラ受容体発現について分析した。これらの実験のために、Ｊｕｒｋａｔ細胞を、Invitrogen Neonエレクトロポレーションシステムを使用して、ｍＲＮＡ非存在下(偽)または上記実施例２の構築物をコードするｍＲＮＡで電気穿孔し、１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ−１６４０培地で３７℃で８〜９時間増殖させた。細胞を回収し、ＲＩＰＡ緩衝液(５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０mM  ＮａＣｌ、１mM  ＥＤＴＡ、１％ＮＰ−４０、０.５％デオキシコール酸ナトリウム、ｐＨ７.４)で、ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤存在下溶解させた。各ライセートについて、２５μgの総タンパク質を、４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓポリアクリルアミドゲルの１レーンに負荷した。タンパク質をＰＶＤＦ膜に移し、膜を５％乳のＴＢＳＴ緩衝液(５００mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１.５Ｍ  ＮａＣｌ、１％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７.４)で１時間、室温で遮断した。膜を、抗ＣＤζ抗体で、一夜、４℃でプローブし、ＴＢＳＴ緩衝液で３回洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒト二次抗体でプローブした。タンパク質バンドを、ホースラディッシュペルオキシダーゼ化学発光基質を使用して可視化した。
【０２７４】
ウェスタンブロット実験の結果を図１９に示す。抗ＣＤζ抗体は、ＣＤζ細胞内タンパク質配列を含むキメラ受容体タンパク質のＣ末端領域を検出する。全キメラ受容体構築物について、完全長受容体タンパク質に対応するバンドが検出された(レーン２〜１３)。キメラ受容体タンパク質の移動性は、タンパク質の異なる分子量と一致して変わる。
【０２７５】
これらの結果は、これらのキメラ受容体が、対応するｍＲＮＡでエレクトロポレーション後、全てＪｕｒｋａｔ細胞で発現されたことを示す。
【０２７６】
他の態様
本明細書に開示する全ての特性を、あらゆる組合せで組み合わせてよい。本明細書に開示する各特性を、同じ、等価なまたは類似目的で働く別の特性に置き換えてよい。それゆえに、他に明示しない限り、開示する各特性は、等価なまたは類似特性の一般的なシリーズの単なる例である。
【０２７７】
上記から、当業者は、本発明の必須特徴を容易に確認でき、その精神および範囲から逸脱することなく、本発明に多様な変更および修飾を付して、種々の用途および条件に適合させ得る。それゆえに、他の態様も特許請求の範囲の範囲内である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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