(57)【要約】  メラニン細胞またはメラニン生成に直接的に影響を及ぼすことなく、色素過剰皮膚病変部と色素過剰皮膚病変部周囲の皮膚との間の色のコントラストを低減させることに対して有効性を有する物質を特定する方法が提供される。該方法は、以下のステップ：色素過剰皮膚病変部に試験対象の物質を含有する組成物を塗布するステップ；および一定時間間隔後に、該組成物が、皮膚の色素過剰病変部の表皮基底層中での、ケラチン生成細胞の増殖の阻害、ケラチン生成細胞の分化の刺激、および真皮乳頭の圧縮変形の改善のうちの少なくとも1つを生じさせているか否かを観察するステップ；を含む。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
メラニン細胞またはメラニン生成に直接的に影響を及ぼすことなく、色素過剰皮膚病変部と色素過剰皮膚病変部周囲の皮膚との間の色のコントラストを低減させることに対して有効性を有する物質を特定する方法であって、以下のステップ：
(a)色素過剰皮膚病変部に試験対象の物質を含有する組成物を塗布するステップ；および
(b)一定時間間隔後に、該組成物が、皮膚の色素過剰病変部の表皮基底層中での、ケラチン生成細胞の増殖の阻害、ケラチン生成細胞の分化の刺激、および真皮乳頭の圧縮変形の改善のうちの少なくとも1つを生じさせているか否かを観察するステップ
を含む、上記方法。
【請求項２】
前記時間間隔が少なくとも約1ヵ月である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記時間間隔が少なくとも約2ヵ月である、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記時間間隔が少なくとも約3ヵ月である、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記時間間隔が少なくとも約4ヵ月である、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
ケラチン生成細胞の増殖の阻害に対する組成物の効果が、反射型共焦点顕微鏡観察（RCM）を用いて評価される、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
ケラチン生成細胞の分化の刺激に対する組成物の効果が、反射型共焦点顕微鏡観察（RCM）を用いて評価される、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
真皮乳頭の圧縮変形の改善に対する組成物の効果が、反射型共焦点顕微鏡観察（RCM）を用いて評価される、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
皮膚を明色化するための方法であって、以下のステップ：皮膚の色素過剰病変部の表皮基底層中での、ケラチン生成細胞の増殖の阻害、ケラチン生成細胞の分化の刺激、および真皮乳頭の圧縮変形の改善のうちの少なくとも1つを生じさせる少なくとも1種の活性物質を含む局所用組成物を、該明色化を必要とする皮膚に塗布するステップを含み、該活性物質が、メラニン細胞またはメラニン生成に直接的に影響を及ぼすことなく、色素過剰病変部周囲の皮膚と比較して色素過剰病変部での皮膚の明色化を可能にする、上記方法。
【請求項１０】
前記局所用組成物が、メラニン細胞またはメラニン生成に直接的に影響を及ぼす皮膚明色化活性物質をさらに含む、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
色素過剰皮膚病変部と色素過剰病変部周囲の皮膚との間の色のコントラストを低減させるための改善された局所用化粧組成物であって、該組成物が、メラニン細胞またはメラニン生成に直接的に影響を及ぼす少なくとも1種の第1の活性物質を、それに対して化粧品として許容されるビヒクル中に含み、改善が、該組成物中に、メラニン細胞またはメラニン生成に直接的に影響を及ぼすことなく、皮膚の色素過剰病変部の表皮基底層中での、ケラチン生成細胞の増殖の阻害、ケラチン生成細胞の分化の刺激、および真皮乳頭の圧縮変形の減少のうちの少なくとも1つを生じさせるための第2の活性物質を含めることを含む、上記化粧組成物。
【請求項１２】
皮膚の色素過剰病変部と色素過剰病変部周囲の皮膚との間の色のコントラストを低減させるためのレジメンであって、以下のステップ：
(a)メラニン細胞またはメラニン生成に直接的に影響を及ぼすことなく、皮膚の色素過剰病変部の表皮基底層中での、ケラチン生成細胞の増殖の阻害、ケラチン生成細胞の分化の刺激、および真皮乳頭の圧縮変形の改善のうちの少なくとも1つのための第1の皮膚明色化活性物質を、それに対して化粧品として許容されるビヒクル中に含む、第1の化粧組成物を、そのような色のコントラストの低減を必要とする皮膚に塗布するステップ；および
(b)メラニン細胞またはメラニン生成に直接的に影響を及ぼす第2の皮膚明色化活性物質を、それに対して化粧品として許容されるビヒクル中に含む、第2の化粧組成物を、そのような色のコントラストの低減を必要とする皮膚に塗布するステップ
を含み；(a)および(b)は、いずれの順序でも行なうことができる、上記レジメン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚の色素過剰病変部でのケラチン生成細胞の増殖を阻害し、かつ分化を刺激する物質を同定するためのモデルに関する。そのような物質は、色素過剰病変部と周囲皮膚との間の色のコントラストを低減し、それにより肌の色（skin tone）を均一化する。
【背景技術】
【０００２】
消費者、特に女性の全世界的な関心事は、肌色の不均一性である。特定の皮膚細胞、すなわちメラニン細胞は、皮膚の色を決定する色素の生成を担う。メラニン細胞はメラニン色素を生成し、これを、表皮中の周囲のケラチン生成細胞へと排出する。ケラチン生成細胞は、天然の細胞再生プロセスにより、皮膚表面に向かって上方へと移動させられる。
【０００３】
皮膚は、老化するにつれて、その外観に直接的に影響する変質を受ける。環境要因（主に太陽からの紫外線（UV）照射への曝露）およびホルモン要因（皮膚の菲薄化および細胞再生速度の低下をもたらす）の作用が、不均一な肌の色をもたらし得る。DNA損傷を引き起こすことが示されているUV照射への曝露もまた、皮膚中のメラニンの分布に影響する。UV照射は、反応性酸素分子種（ROS）をつくり出すことができ、これは、メラニン細胞中のチロシナーゼおよび他の酵素を活性化することにより、メラニン生成を刺激する。加えて、細胞再生の遅延に伴い、ケラチン生成細胞とメラニン細胞とが、より長く接触したままになる。この接触時間の増大の結果として、ケラチン生成細胞へと移行するメラニン量が増大する。表皮がその厚みを減らすにつれ、増大した量の暗色色素を含有するこれらのメラニン細胞およびケラチン生成細胞が皮膚の表面に近づき、したがって、より目に見えるようになる。
【０００４】
日光黒子（solar lentigo）または加齢斑（age spot）は、平坦で褐色の良性皮膚病変であり、典型的には老齢の皮膚で、特に手の上側表面、顔および前腕に生じる。これらの病変部の出現は、蓄積された断続的なUV曝露に関連し、皮膚の光損傷（photodamage）についての臨床的マーカーであると考えられる。日光黒子はまた、汚染空気中の微粒子レベルへの曝露にも関連する。これらの病変は、白色人種およびアジア系集団の両方に共通するが、アジア系個体の皮膚でより早く起こり、かつより明らかであるようである。
【０００５】
組織学的研究により、病変部皮膚は、表皮基底層（すなわち、表皮の最下層であって、真皮に隣接し、メラニン細胞およびケラチン生成細胞を含む）の色素過剰、メラニン細胞数の増加、および真皮乳頭（表皮領域へと表層上で突出し、表皮の隣接する下向きの突起と連結する）の伸長、を特徴とすることが示されている（Mehregan, A.H., Lentigo senilis and its evolutions. Invest Dermatol. 1975; 65(5): 429-433；Montagna, W. et al. A reinvestigation of solar lentigines. Arch Dermatol 1980; 116: 1151-1154）。これらの複雑な構造的変化は、表皮分裂速度の増大および真皮-表皮境界部の動揺の結果であり得ることが示唆されている（Noblesse, E., et al. Ultrastructure in senile lentigo. Skin Pharmaco. Physiol. 2006; 19: 95-100）。また、ケラチン生成細胞増殖因子およびインターロイキン1αの放出が日光黒子の色素過剰の一因であることも示唆されている（Chen, N. et al. The role of keratinocyte growth factor in melanogenesis: a possible mechanism for the initiation of solar lentigines. Exp. Dermatol. 19(10), 865-872, 2010）。黒子内の遺伝子発現の分析によって、微小炎症応答（microinflammatory response）に関連する遺伝子のアップレギュレーションも示唆されている（Goyarts, E. et al. Morphological Changes Associated with Aging: Age Spots and the Microinflammatory Model of Skin Aging. Ann. N.Y Acad. Sci. 1119:32-39, 2007）。このことは、炎症応答の一部として黒子内で観察されるケラチン生成細胞の過剰増殖と整合する。
【０００６】
白人女性の加齢斑に関する本発明者らの臨床試験は、隣接する皮膚と比較して、これらの加齢斑に伴う上昇した表皮増殖速度を示している。反射型共焦点顕微鏡観察（RCM）により、強屈折基底細胞（hyperrefractive basal cell）の配列パターンが円形（非病変部皮膚に関連）から不規則な非円形形状（日光黒子に典型的）へとシフトするなどの、真皮乳頭の深刻な構造的変形が明らかになった。加えて、真皮乳頭数の増大が観察された。5年間にわたって行われた研究では、時間が経過するにつれ、日光黒子がさらに濃く、かつ大きくなり、真皮乳頭がさらに変形することも示されている（Pollefliet, C. et al. Morphological characterization of solar lentigines by in vivo reflectance confocal microscopy: a longitudinal approach. Int J Cosmet Sci. Apr: 35(2):149-55, 2013）。
【０００７】
不均一な色素沈着は、多くの人々、特に女性にとっての懸念事項である。加齢斑は特に、大多数の人々により見かけ上魅力的でないと見なされる。肌の色の不均一さおよび、特に、皮膚の色素過剰領域または暗色の（加齢による）シミの外観が、多数の皮膚明色化剤（lightening agent）の発売を導いてきた。ファンデーションおよびコンシーラーは、多くの場合に、肌の色の差異をカバーまたはカモフラージュするために用いられる。加えて、メラニン生成カスケードに作用する美容処置、特に酵素チロシナーゼを阻害するものが、日光黒子中に存在するメラニン量を減少させ、色素沈着したシミを明色化することが示されている。そのような薬剤としては、限定するものではないが、ヒドロキノン（メラニン細胞に対して細胞毒性を有すると言われている）、およびアルブチンをはじめとするその誘導体；ビタミンC（アスコルビン酸）およびその誘導体などのチロシナーゼ阻害剤；コウジ酸；ポリフェノール；ベンズアルデヒドおよびベンゾエート誘導体；およびビタミンAの誘導体であるレチノイドが挙げられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Mehregan, A.H., Lentigo senilis and its evolutions. Invest Dermatol. 1975; 65(5): 429-433
【非特許文献２】Montagna, W. et al. A reinvestigation of solar lentigines. Arch Dermatol 1980; 116: 1151-1154
【非特許文献３】Noblesse, E., et al. Ultrastructure in senile lentigo. Skin Pharmaco. Physiol. 2006; 19: 95-100
【非特許文献４】Chen, N. et al. The role of keratinocyte growth factor in melanogenesis: a possible mechanism for the initiation of solar lentigines. Exp. Dermatol. 19(10), 865-872, 2010
【非特許文献５】Goyarts, E. et al. Morphological Changes Associated with Aging: Age Spots and the Microinflammatory Model of Skin Aging. Ann. N.Y Acad. Sci. 1119:32-39, 2007
【非特許文献６】Pollefliet, C. et al. Morphological characterization of solar lentigines by in vivo reflectance confocal microscopy: a longitudinal approach. Int J Cosmet Sci. Apr: 35(2):149-55, 2013
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ヒドロキノンの全体的な安全性にもかかわらず、紅斑、皮膚刺激、接触皮膚炎、および周囲皮膚の色素沈着減少をはじめとするその潜在的な悪性作用が、他の、より安全な皮膚明色化剤を見い出すことに対する興味を亢進させてきた。
【００１０】
本発明者らによるここでの発見は、ケラチン生成細胞の増殖を阻害しかつそれらの分化を刺激する物質がまた、驚くべきことでありまた予期せぬことに、加齢斑の外観を改善し、かつ皮膚をより均一な色調にすることである。さらに驚くべきことに、これらの物質は、古典的な皮膚美白化活性物質（すなわち、メラニン生成カスケードに影響することが知られている活性物質）ではない。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、肌の色の均一さ（evenness）を高める新規美白化剤を特定するためのモデルを提供する。これらの新規美白化剤を含有する処方は、古典的な美白化処方と同様に、従来の美白化活性物質に起因する潜在的な有害作用を有さずに、加齢斑と加齢斑周囲の皮膚との間の色のコントラストを低減させる機能を発揮する。
【００１２】
本発明によれば、メラニン細胞またはメラニン生成に直接的に影響を及ぼすことなく、色素過剰皮膚病変部と色素過剰皮膚病変部周囲の皮膚との間の色のコントラストを低減させることに対して有効性を有する物質を特定する方法が提供され、該方法は、以下のステップ：
(a)色素過剰皮膚病変部に試験対象の物質を含有する組成物を塗布するステップ；および
(b)一定時間間隔後に、例えば、少なくとも約1ヵ月後、2、3または4ヵ月後などに、該組成物が、皮膚の色素過剰病変部の表皮基底層中での、ケラチン生成細胞の増殖の阻害、ケラチン生成細胞の分化の刺激、および真皮乳頭の圧縮変形の改善のうちの少なくとも1つを生じさせているか否かを観察するステップ
を含む。
【００１３】
好ましくは、皮膚の色素過剰病変部の表皮基底層中での、ケラチン生成細胞の増殖の阻害、ケラチン生成細胞の分化の刺激、および真皮乳頭の圧縮変形の改善のうちの少なくとも1つを改善する試験処方の有効性は、反射型共焦点顕微鏡観察（RCM）を用いて評価される。
【００１４】
皮膚を明色化するための方法もまた提供され、該方法は、以下のステップ：皮膚の色素過剰病変部の表皮基底層中での、ケラチン生成細胞の増殖の阻害、ケラチン生成細胞の分化の刺激、および真皮乳頭の圧縮変形の改善のうちの少なくとも1つを生じさせる少なくとも1種の活性物質を含む局所用組成物を、該明色化を必要とする皮膚に塗布するステップを含み、該活性物質は、メラニン細胞またはメラニン生成に直接的に影響を及ぼすことなく、色素過剰病変部周囲の皮膚と比較して色素過剰病変部での皮膚の明色化を可能にする。一部の実施形態では、局所用組成物は、メラニン細胞またはメラニン生成に直接的に影響を及ぼす皮膚明色化活性物質をさらに含む。
【００１５】
本発明はまた、色素過剰皮膚病変部と色素過剰病変部周囲の皮膚との間の色のコントラストを低減させるための改善された局所用化粧組成物にも関し、該組成物は、メラニン細胞またはメラニン生成に直接的に影響を及ぼす少なくとも1種の第1の活性物質を、それに対して化粧品として許容されるビヒクル中に含み、改善が、該組成物中に、メラニン細胞またはメラニン生成に直接的に影響を及ぼすことなく、皮膚の色素過剰病変部の表皮基底層中での、ケラチン生成細胞の増殖の阻害、ケラチン生成細胞の分化の刺激、および真皮乳頭の圧縮変形の減少のうちの少なくとも1つを生じさせる第2の活性物質を含めることを含む。
【００１６】
本発明はさらに、皮膚の色素過剰病変部と色素過剰病変部周囲の皮膚との間の色のコントラストを低減させるためのレジメンに関し、該レジメンは、以下のステップ：
(a)メラニン細胞またはメラニン生成に直接的に影響を及ぼすことなく、皮膚の色素過剰病変部の表皮基底層中での、ケラチン生成細胞の増殖の阻害、ケラチン生成細胞の分化の刺激、および真皮乳頭の圧縮変形の改善のうちの少なくとも1つのための第1の皮膚明色化活性物質を、それに対する化粧品として許容されるビヒクル中に含む、第1の化粧組成物を、そのような色のコントラストの低減を必要とする皮膚に塗布するステップ；および
(b)メラニン細胞またはメラニン生成に直接的に影響を及ぼす第2の皮膚明色化活性物質を、それに対する化粧品として許容されるビヒクル中に含む、第2の化粧組成物を、そのような色のコントラストの低減を必要とする皮膚に塗布するステップ；
を含み、(a)および(b)は、いずれの順序でも行なうことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】ベースラインでの、およびフィトフィックス（Phytofix）を含有するが従来の美白化活性物質を含有しない分化刺激処方を用いた4ヵ月の処置期間後の、色素過剰病変部での真皮乳頭環（dermal papillary ring）の円形指数を表わす棒グラフである。
【図１Ｂ】ベースラインでの、ならびにフィトフィックスおよび従来の美白化活性物質を含有しない処方を用いた4ヵ月の処置期間後の、色素過剰病変部での真皮乳頭環の円形指数を表わす棒グラフである。
【図１Ｃ】図1Aおよび図1Bに示される円形指数の差異を示す棒グラフである。
【図２Ａ】フィトフィックス含有分化刺激処方を用いて処置された色素過剰病変部での真皮乳頭数を示す棒グラフである。
【図２Ｂ】フィトフィックスおよび従来の美白化活性物質を含有しない処方を用いて処置された色素過剰病変部での真皮乳頭数を示す棒グラフである。
【図２Ｃ】図2Aおよび図2Bで示される真皮乳頭数で観察される差異を示す棒グラフである。
【図３】皮膚処置から1、2、3および4ヵ月後の日光黒子の皮膚と周囲皮膚との色のコントラストデータを表わすグラフである。
【図４Ａ】本発明の分化刺激処方を用いて処置された日光黒子のダーモスコープ写真のセットである。
【図４Ｂ】本発明の分化刺激処方およびそれに続いて慣用の美白化活性物質を含有する処方を用いて処置された日光黒子のダーモスコープ写真のセットである。
【図５】本発明の分化刺激処方を用いて、または分化刺激処方およびそれに続いて慣用の美白化活性物質を含有する処方を用いて処置された日光黒子での乳頭環（papillary ring）の円形指数に対する影響を、該分化刺激処方用のビヒクル/基材を用いた処置と比較して示す棒グラフのセットである。
【図６】本発明の分化刺激処方を用いた処置後の円形指数の改善を表わす、日光黒子のダーモスコープ写真、および真皮-表皮境界面で記録された日光黒子の反射型共焦点顕微鏡（RCM）画像のセットである。
【図７】本発明の分化刺激処方を用いて、または分化刺激処方およびそれに続いて慣用の美白化活性物質を含有する処方を用いて処置された日光黒子中に存在する真皮乳頭数を、該分化刺激処方用のビヒクル/基材を用いた処置と比較して表わす棒グラフのセットである。
【図８】本発明の分化刺激処方を用いた処置後の真皮乳頭環数の改善を表わす、日光黒子のダーモスコープ写真、および真皮-表皮境界面で記録された日光黒子のRCM画像のセットである。
【図９Ａ】本発明の分化刺激処方を用いて、または分化刺激処方およびそれに続いて慣用の美白化活性物質を含有する処方を用いて処置された日光黒子の表皮厚に対する効果を、該分化刺激処方用のビヒクル/基材を用いた処置と比較して表わす棒グラフのセットである。
【図９Ｂ】本発明の分化刺激処方を用いて、または分化刺激処方およびそれに続いて慣用の美白化活性物質を含有する処方を用いて処置された日光黒子の角質層の厚みに対する効果を、該分化刺激処方用のビヒクル/基材を用いた処置と比較して表わす棒グラフのセットである。
【図１０】本発明の分化刺激処方を用いて、または分化刺激処方およびそれに続いて慣用の美白化活性物質を含有する処方を用いて処置された日光黒子の自家蛍光により測定される表皮増殖を、該分化刺激処方用のビヒクル/基材を用いた処置と比較して表わす棒グラフのセットである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
日光黒子は、光老化した皮膚（photoaged skin）で一般的に見られる。これは、慢性的に光を浴びた皮膚に現れる日光黒子または色素過剰の加齢斑もしくは病変部により特徴付けられる。これらの斑点は良性であり、50歳以上の個体の皮膚に典型的に生じる。顕微鏡的研究から、メラニン蓄積およびメラニン過剰産生の排出の減少を有する色素過剰基底層、表皮乳頭間隆起（epidermis rete ridges）の伸長、ならびにケラチン生成細胞基底部微小絨毛（keratinocyte basal microvillosity）の増加に関連する真皮・表皮境界部の無秩序化および崩壊（バリア品質の低下）等の、隣接する正常皮膚と比較した病変部皮膚の顕著な変質が見られることが知られている。
【００１９】
本発明者らによる以前の研究により、これらの病変部が、経皮水分蒸散量（Transepidermal Water Loss；TEWL）の増大およびカスパーゼ-14活性の低下を生じることが示されており、このことは、加齢斑がバリア機能障害により特徴付けられるという他者の観察を支持している。RCMを用いた本発明者らによる研究によって、日光黒子での真皮乳頭の深刻な構造的変形が確認され、これにより本発明者らは、変形が可変的であるか否かを検討することとなった。変形を改善または逆転させる種々の局所用化粧処方の能力を、以下で議論される通りに試験した。
【実施例】
【００２０】
1. 日光黒子の形態に対する化粧品原材料の作用
41名のボランティアが、4ヵ月間の臨床試験に登録された。明らかに目に見える加齢斑を手に有するパネリストのみが参加できた。パネリストの平均年齢は61歳であり、最低年齢および最高年齢はそれぞれ47歳および74歳であった。すべてのボランティアが白人であり、フィッツパトリック皮膚分類II型またはIII型を示した。試験領域は、両手のそれぞれの背側の日光黒子であった。いずれかの種類の皮膚科的障害あるいはエタノールおよび/もしくは化粧品に対する過敏症またはアレルギーを有するパネリストは、試験から除外された。書面によるインフォームド・コンセントを、試験への参加前にそれぞれのボランティアから得た。
【００２１】
ヒマワリ、オオムギおよびキュウリ抽出物に由来するスフィンゴ脂質、トリグリセリドおよびステロールを含有する活性物質であるフィトフィックス（Phytofix）は、皮膚の膜の構造を模倣すると言われており、その皮膚バリア修復特性のために広く用いられている。従来の美白化活性物質を含有しない種々の処方を、それらの加齢斑明色化効果について評価した。フィトフィックスを含有する処方1〜3、ならびにフィトフィックスを含有しない処方4および5を、以下の表1に示す。
【００２２】
処方1を12名のパネリストに対して試験した（1個の加齢斑/パネリスト、合計で12個の加齢斑）。処方2を13名のパネリストに塗布し（1個の加齢斑/パネリスト、合計で13個の加齢斑）、処方3は16名のパネリストにより使用され（2個の加齢斑/パネリスト、合計で32個の加齢斑）、処方4を14名のパネリストに対して試験し（1個の加齢斑/パネリスト、合計で14個の加齢斑）、処方5は10名のパネリストにより使用された（1個の加齢斑/パネリスト、合計で10個の加齢斑）。各パネリストは、手の背側表面全体に、4ヵ月間にわたって1日2回（朝および夕）、処方をたっぷり塗布した。パネリストは、臨床試験の期間中、手にいかなる他の化粧品も使用しないように指示された。研究者により選択された、それぞれの手の1個の加齢斑を、1ヵ月毎に評価した。
【００２３】
【表１】
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【００２４】
処方1は、以下の通りに調製される：
容器中で3％ブチレングリコールを70℃まで加熱し、1％カーボワックスを添加し、2000rpmで混合することにより、バッチの開始時にプレミックスB（シーケンス10）を調製する。
別個の補助ケトル中にて、以下のシーケンスを行なう：
シーケンス1：補助ケトルに10％ヒアルロン酸を添加し、8rpmで容器ごと回してかき混ぜる（side sweep）。
シーケンス2：補助ケトルに0.5％Tween 20を加える。
シーケンス3：補助ケトルに23％Gransil TMG-5を添加して2500rpmで混合し、
補助ケトルに10％Gransil IDSを添加し、
補助ケトルに5％DM-fluidを添加し、
補助ケトルに2％パーメチルを添加し、
補助ケトルに0.5％フィトフィックスを添加し、
温度を25℃に調整する。
シーケンス4：補助ケトルに1％KF-6017を加えて、均一かつ滑らかになるまで混合する。
シーケンス5：主ケトルに38％脱イオン水を加え、
50℃で加熱し、
531rpmで混合し、
5rpmで容器ごと回してかき混ぜ（side weep）、
主ケトルに0.05％EDETAを添加し、
主ケトルに0.1％リボ核酸ナトリウムを添加し、
温度を25℃に調整する。
シーケンス6：主ケトルに0.6％アリストフレックス（Aristoflex）（50-3214）を加える。
容器に3％ブチレングリコールを導入し、70℃で加熱し、続いて0.3％Barguard cpを添加することにより、プレミックスA（シーケンス9）を調製する。
シーケンス7：主ケトルに0.2％フェノキセトール（Phenoxetol）を加え、補助ケトルからのバッチを導入する。
シーケンス8：主ケトルに0.2％ビタミンEを添加する。
シーケンス9：主ケトルにプレミックスAを添加する。
シーケンス10：主ケトルにプレミックスBを添加する。
シーケンス11：主ケトルに1.5％シマルゲル（Simulgel）600を添加する。
シーケンス12：主ケトルに0.026％FD＆Cイエロー5番を添加し、
主ケトルに0.009％FD＆Cイエロー6番を添加して、均一になるまで混合する。
【００２５】
処方2は、以下の通りに調製される：
容器に2.5％Tween40を添加し、3000rpmで混合し、0.5％フィトフィックスを添加し、80℃まで加熱して、続いて加熱を止めることにより、プレミックスB（シーケンス3）を調製する。
別個の容器に5％脱イオン水を加え、2500rpmで混合し、0.1％リボ核酸を添加することにより、プレミックスC（シーケンス5）を調製する。
別個の容器に2％Hydroliteを加え、2000rpmで混合し、容器を40℃まで加熱し、0.7％ブロニドックス（Bronidox）を添加することにより、プレミックスD（シーケンス6）を調製する。
シーケンス1：主ケトルに47.87％脱イオン水を添加し、
60℃に温度を調整し、続いて12rpmで容器ごとまわしてかき混ぜ、910rpmで混合し、
主ケトルに0.02％Edetaを添加し、
主ケトルに0.75％スクロースを添加し、
主ケトルに10％ヒアルロン酸を添加し、
主ケトルに0.1％ゲルマジド（Germazide）を添加し、
主ケトルに0.5％ソルビトールを添加し、
主ケトルに0.75％Rhodasurfを添加し、
主ケトルに0.05％クエン酸を添加する。
シーケンス2：補助ケトルに5％Xiameterを添加し、
1000rpmで混合し、
60℃で加熱し、
補助ケトルに10％Xiameterを添加し、
補助ケトルに3％DM-fluidを添加し、
補助ケトルに1％ミリスチルアルコールを添加し、
補助ケトルに0.5％コーン油を添加し、
補助ケトルに0.75％KF-6017を添加し、
補助ケトルに0.01％BHTを添加する。
シーケンス3：主ケトルにプレミックスBを添加し、続いて補助ケトルからのバッチを加える。
シーケンス4：主ケトルを30℃設定で冷却する。温度が40℃に到達したら、0.1％Grasnow AEを主ケトルに加え、
主ケトルに2.5％Catezomesを添加し、
主ケトルに2％酵母抽出物を添加し、
主ケトルに0.5％バイオ変換シラカバ（Bio-converted white birch）を加え、1220rpmで混合し、続いて15rpmで容器ごと回してかき混ぜる。
シーケンス5：主ケトルにプレミックスCを添加する。
シーケンス6：主ケトルにプレミックスDを添加する。
シーケンス7：主ケトルに0.2％マスケントブレンド（Maskent blend）を加える。
シーケンス8：主ケトルに0.197％苛性ソーダを添加することにより、pHを5に調整する。
シーケンス9：主ケトルに3.4％セピゲル（Sepigel）305を添加する。
【００２６】
処方3は、以下の通りに調製される：
容器に2.5％Tween40を添加し、3000rpmで混合し、0.5％フィトフィックスを添加し、80℃まで加熱して、続いて加熱を止めることにより、プレミックスB（シーケンス3）を調製する。
別個の容器に5％脱イオン水を加え、2500rpmで混合し、0.1％リボ核酸を添加することにより、プレミックスC（シーケンス6）を調製する。
別個の容器に2％Hydroliteを加え、2000rpmで混合し、40℃まで加熱し、0.7％ブロニドックス（Bronidox）を添加することにより、プレミックスD（シーケンス8）を調製する。
シーケンス1：主ケトルに47.87％脱イオン水を添加し、
60℃に温度を調整し、
12rpmで容器ごと回してかき混ぜ、
910rpmで混合し、
主ケトルに0.02％Edetaを添加し、
主ケトルに0.75％スクロースを添加し、
主ケトルに10％ヒアルロン酸を添加し、
主ケトルに0.1％ゲルマジド（Germazide）を添加し、
主ケトルに0.5％ソルビトールを添加し、
主ケトルに0.75％Rhodasurfを添加し、
主ケトルに0.05％クエン酸を添加する。
シーケンス2：補助ケトルに5％Xiameter（68-0451）を添加し；
1000rpmで混合し、
60℃まで加熱し、
補助ケトルに10％Xiameterを添加し、
補助ケトルに3％DM-fluidを添加し、
補助ケトルに1％ミリスチルアルコールを添加し、
補助ケトルに0.5％コーン油を添加し、
補助ケトルに0.75％KF-6017（60-0031）を添加し、
補助ケトルに0.01％BHT（51-0669）を添加する。
シーケンス3：主ケトルにプレミックスBを添加し、続いて補助ケトルの内容物を加える。
シーケンス4：加熱を止め、主ケトルを30℃設定で冷却する。温度が40℃に到達したら、0.1％Grasnow AEを主ケトルに加え、
主ケトルに2.5％Catezomesを添加し、
主ケトルに2％酵母抽出物を添加し、
主ケトルに0.5％バイオ変換シラカバ（Bio-converted white birch）を加え、
1220rpmで混合し、続いて15rpmで容器ごと回してかき混ぜる。
シーケンス5：主ケトルにプレミックスCを添加する。
シーケンス6：主ケトルにプレミックスDを添加する。
シーケンス7：主ケトルに0.2％マスケントブレンド（Maskent blend）を加える。
シーケンス8：主ケトルに0.197％苛性ソーダを添加することにより、pHを5に調整する。
シーケンス9：主ケトルに3.4％セピゲル（Sepigel）305を添加する。
【００２７】
処方4は、以下の通りに調製される：
シーケンス1：補助ケトルに10％ヒアルロン酸を添加し、8rpmで容器ごと回してかき混ぜる。
シーケンス2：補助ケトルに0.5％Tween 20を加える。
シーケンス3：補助ケトルに23％Gransil TMG-5を添加し、
2500rpmで混合し、
補助ケトルに10％Gransil IDSを添加し、
補助ケトルに5％DM-fluidを添加し、
補助ケトルに2％パーメチルを添加し、
温度を25℃に調整する。
シーケンス4：補助ケトルに1.5％KF-6017を加えて、均一かつ滑らかになるまで混合する。
シーケンス5：主ケトルに38％脱イオン水を加え、
50℃で加熱し、
481rpmで混合し、
5rpmで容器ごと回してかき混ぜ、
主ケトルに0.05％EDETAを添加し、
加熱を止める。
シーケンス6：主ケトルを25℃まで冷却する。温度が25℃に到達したら、主ケトルに0.6％アリストフレックスを加える。
容器に3％ブチレングリコールを添加し、70℃まで加熱し、続いて0.3％Barguard cpを添加し、続いて1％カーボワックス30を添加し、2000rpmで混合することにより、プレミックスA（シーケンス8）を調製する。
シーケンス7：主ケトルに0.2％フェノキセトールを加える。補助ケトルからのすべての成分を、主ケトルに添加する。
シーケンス8：主ケトルにプレミックスAを添加する。
シーケンス9：主ケトルに1.5％シマルゲル600を添加する。
シーケンス10：主ケトルに0.026％FD＆Cイエロー5番を添加し、
主ケトルに0.009％FD＆Cイエロー6番を添加して、均一になるまで混合する。
【００２８】
処方5は、以下の通りに調製される：
シーケンス1：補助ケトルに10％ヒアルロン酸を添加し、8rpmで容器ごと回してかき混ぜる。
シーケンス2：補助ケトルに0.5％Tween 20を加える。
シーケンス3：補助ケトルに23％Gransil TMG-5を添加し、
2500rpmで混合し、
補助ケトルに10％Gransil IDSを添加し、
補助ケトルに5％DM-fluidを添加し、
補助ケトルに2％パーメチルを添加し、温度を25℃に調整する。
シーケンス4：補助ケトルに1.5％KF-6017を加えて、均一かつ滑らかになるまで混合する。
シーケンス5：主ケトルに38％脱イオン水を加え、
主ケトルを50℃まで加熱し、
481rpmで混合し、続いて5rpmで容器ごと回してかき混ぜ、
主ケトルに0.05％EDETAを添加し、加熱を止める。
シーケンス6：主ケトルを25℃まで冷却し、温度が25℃に到達したら、主ケトルに0.6％アリストフレックスを加える。
容器に3％ブチレングリコールを添加し、70℃で加熱し、続いて0.3％Barguard cpを添加し、1％カーボワックス30を添加し、2000rpmで混合することにより、プレミックスA（シーケンス8）を調製する。
シーケンス7：主ケトルに0.2％フェノキセトールを加え；続いて、補助ケトルの内容物を主ケトルに添加する。
シーケンス8：主ケトルにプレミックスAを添加する。
シーケンス9：主ケトルに1.5％シマルゲル600を添加する。
シーケンス10：主ケトルに0.026％FD＆Cイエロー5番を添加し、
主ケトルに0.009％FD＆Cイエロー6番を添加して、均一になるまで混合する。
【００２９】
本試験では、日光黒子の形態に対する化粧品原材料の作用を、処置前および4ヵ月間の処置後に、ビバスコープ（Vivascope, Lucid 1500）を用いて反射型共焦点顕微鏡観察（RCM）により評価した。RCMは、皮膚の「in vivo」検査のための非侵襲的技術である。ビバスコープは、手の背側に配置される。超音波ゲル（屈折率1.36）が、対物レンズと皮膚との間の浸漬媒体として用いられる。RCMは、500×500μm視野の水平組織画像を取得し、水平面（XY軸）上の同じ点での、角質層から真皮上層（superficial dermis）までの3μm間隔で徐々に深くなる個別の画像群（Z軸スタック）を取得する、自動コマ送り装置を有する。それぞれの加齢斑から、6枚の皮膚の光学切片が、角質層から真皮上層にわたって取得された。
【００３０】
共焦点顕微鏡では、ダイオードレーザーからの近赤外光が、顕微鏡的に皮膚標的に焦点を合わせられる。この光が様々な屈折率を有する細胞構造を通過する際に、自然に反射し、次に、この反射光を捕捉して、コンピュータソフトウェアにより2次元のグレースケール画像へと再構成する。顕微鏡の焦点を合わせる（つまり、Z軸上の焦点を調整する）ことにより、皮膚内の異なるレベルでの画像を取得することが可能になる。検出には、メラニン、ヘモグロビンおよび細胞小器官によりもたらされる内在性の微小構造特異的なコントラストの存在が必要とされる。メラニンは、色素沈着した皮膚での最適なコントラスト物質であり、その高い屈折度によりメラニン含有細胞の検出を可能にする。このタイプの市販の顕微鏡システムは、組織学的分析に用いるために十分に詳細な画像をつくり出すことができる（Calzavara-Pinton P., Longo C., Venturini M., Sala R., Pellacani G. Photochem Pholobiol. 2008 Nov-Dec; 84(6): 1421-30）。ビバスコープ 1500システムは、生存組織を通して複数の層にわたって一枚ずつ（layer by layer）、リアルタイムで細胞の撮影をする能力を有する反射型共焦点顕微鏡である。これらの画像は、皮膚およびその様々な層の厚みならびに真皮乳頭環の形状を測定するために用いることができる。ビバスコープ 1500は、20mW未満の電力で作動する830nmの近赤外レーザーを用い、開口数0.9の30倍対物レンズが装着される。
【００３１】
円形指数および強屈折真皮乳頭数（mm2当たり）は、RCM画像から算出した。正円の円形指数は100に等しく；したがって、より低い指数は円からのより明らかな逸脱に対応する。真皮乳頭環数の増加もまた、皮膚の非病変領域と比較した病変部での変形した形態に関連し、環の数の減少は、形態の改善であると見なされる。時間依存的な効果は、対応のあるスチューデントt検定を用いて評価した。処置同士の差異は、対応のないサンプルに対するスチューデントt検定を用いて評価した。結果を、図1A、B、C；ならびに図2A、B、Cに表わす。
【００３２】
図1Aは、ベースライン、ならびにフィトフィックスを含むかまたは含まず、従来の美白化活性物質を含有しない処方を用いた4ヵ月間の処置期間後の円形指数を表わす。それぞれが0.5％フィトフィックスを含有する処方1、2および3を用いた処置は、病変部（加齢斑）の真皮乳頭の円形指数（72.33〜73.69）での統計学的に有意な増大（p＜10-4）を示し、色素過剰斑の基底膜の変形した形態の改善（すなわち、減少）を示唆する。非病変部皮膚の真皮乳頭の円形指数は約80であることが見出された（図示せず）。図1Bに示される通り、フィトフィックスを含まない処方4および5を用いた4ヵ月間の処置は、円形指数（75.24〜74.71）に対して効果を示さなかった。
【００３３】
処置の前後に観察された円形指数の差異を、フィトフィックスを用いる処置または用いない処置に対して算出した（図1C）。フィトフィックスを含有する処方は1.4の円形指数の増加を示し、変形した形態の改善を示唆するが、一方でフィトフィックスを含まない処方に関では改善は見られなかった（すなわち、0.5の減少）。2種類の処方セットの間の差異は統計学的に有意であり、フィトフィックスが、観察された効果に寄与していることを示唆する。
【００３４】
本発明者らは以前に、（処置なしで）経時的に加齢斑の平均円形指数が5年間で1.7減少することを示した（Pollefliet, C. et al. Morphological characterization of solar lentigines by in vivo reflectance confocal microscopy: a longitudinal approach. Int J Cosmet Sci. Apr: 35(2):149-55, 2013）。
【００３５】
図2Aに示される通り、フィトフィックス含有処方1、2および3を用いて処置した色素過剰病変部での真皮乳頭数は、160.7から151.7に減少した。この現象は、図2Bに示される通り、フィトフィックスを含有しない処方4および5を用いて処置した病変部については観察されず、この場合は、真皮乳頭数は138.7から153.3へと増加した。
【００３６】
処置前後での真皮乳頭数の差異もまた算出された。この差異は、図2Cに示される通り、フィトフィックス含有処方に関しては負の数であり（−9.0）、乳頭環数の減少を示した。フィトフィックスを含まない処方を用いた病変部の処置は逆の傾向を示し（＋14.6）、処置間の差異は、統計学的に有意な範囲に達した。
【００３７】
本発明者らは以前に、（処置なしで）経時的に加齢斑の真皮乳頭の平均数が5年間で18.7増加する傾向にあることを示した（Pollefliet, C. et al. Morphological characterization of solar lentigines by in vivo reflectance confocal microscopy: a longitudinal approach. Int J Cosmet Sci. Apr: 35(2):149-55, 2013）。
【００３８】
本発明者らによる以前の研究では、約0.001wt％〜約2wt％の範囲で処方中に用いられたフィトフィックスが、色素過剰病変部での基底膜の形態の改善での有効性を表わすことが示された（結果は示さず）。
【００３９】
色素過剰病変部の基底膜の形態に対してプラスの効果を示すそれぞれの処方は、フィトフィックスに加えてリボ核酸ナトリウムも含有することが判明した。しかしながら、リボ核酸ナトリウムを含有するがフィトフィックスは含まない処方を用いて、基底膜の形態の改善は見られなかったので、本発明者らは、形態に対するプラスの効果はリボ核酸ナトリウムにより引き起こされたものではないと結論付けた（結果は示さず）。
【００４０】
本発明者らはまた、一部のケースでは、古典的な美白化活性物質、例えばUP302（すなわち、キキョウラン（Dianella ensifolia）植物体由来のジメトキシトリルプロピルレゾルシノール）または糖蜜抽出物をフィトフィックスと組み合わせて含有する処方が、フィトフィックスを含有するが古典的な美白化活性物質を含まない処方により示された日光黒子の形態に対するプラスの効果の消失をもたらしたことも観察した（結果は示さず）。その一方で、酵母抽出物XP、廃糖蜜（Black strap molasses）、フィトクラー（Phytoclar）II、AS-G（アスコルビルグルコシド）粉末およびカワラタケ（Trametes versicolor）をはじめとする公知の美白化活性物質の組み合わせと共にフィトフィックスを含有する一部の処方を用いた処置、またはクロミグワ（Morus nigra）（クワ（mulberry））根抽出物、コガネバナ（Scutellaria baicalensis）抽出物およびビフェニラ種（Vitis vinifera）（ブドウ）抽出物をはじめとする公知の美白化活性物質の組み合わせと共にフィトフィックスを含有する処方を用いた処置が、基底膜の形態の改善を示した（結果は示さず）。しかしながら、フィトフィックスに加えてこれらの公知の美白化活性物質を含有する処方を用いた処置は、フィトフィックスを含有するが公知の美白化活性物質を含まない処方の使用と比較して形態のさらなる改善を生じさせなかった。
【００４１】
データにより、全般的に、フィトフィックスを含有する局所用処方1、2および3が、日光黒子の基底膜の形態を改善することができたが、フィトフィックスを含有しない処方4および5はそれができなかったことが示される。また、従来の美白化活性物質の非存在下に物質フィトフィックスを含有する処方を用いた皮膚の処置は、加齢斑の皮膚の変形した基底膜に対するプラスの効果を有し、かつこの変形を正常化する傾向があった。この効果は、フィトフィックスを含まない処方を用いて色素過剰病変部を処置した場合には観察されなかった。さらに、フィトフィックス含有処方への数種類の従来の美白化活性物質の添加は、加齢斑の基底膜の形態にプラスの変化を生じさせるフィトフィックスの能力に対する明らかな作用は有さず、その一方で、フィトフィックス含有処方中の他の従来の美白化活性物質の組み合わせは、形態に対するフィトフィックスのプラスの効果を中和するように見えた。色素過剰病変部の基底膜の形態を改善するフィトフィックスの有効性に負の影響を与え得る処方中の成分の混合を回避するために、不適合性について調査する必要性が残されている。
【００４２】
2. 肌色および日光黒子における真皮乳頭の形態に対する分化刺激活性物質の効果
本試験では、種々の処方（以下の表2に示される）を、不均一な肌色および/または日光黒子の真皮乳頭の形態を改善するその能力について評価した。3つのパネリスト群のそれぞれの日光黒子を、以下のうちのいずれかを用いて処置した：(1)以下の活性物質を含有する分化刺激処方：サリチル酸（抗増殖機能）、レスベラトロール（Sirt-1活性化機能）、MPC（遊走機能）、スクラレオリド（Sclareolide）（すなわち、スクラレオリドについて力価決定されたクラリセージ発酵抽出物；成熟機能）およびフィトフィックス（皮膚バリア回復機能）、または(2)分化刺激処方およびそれに続く以下の公知の美白化活性物質を含有する美白化処方：酵母抽出物XP、ホウロクタケ属（Trametes）抽出物、AS-G粉末、フィトクラー（Phytoclar）II；ニビトール（Nivitol）UP-302、およびビアピュア・リコリス（Viapure licorice）、または(3)対照処方、すなわち、水溶性活性物質用基材もしくはビヒクル。
【００４３】
【表２】
2017532956.tif 000005
2017532956.tif 000006
【００４４】
処方6は、以下の通りに調製された：
シーケンス1：補助ケトルに10％ヒアルロン酸を添加し、8rpmで容器ごと回してかき混ぜる。
シーケンス2：補助ケトルに0.5％Tween 20を加える。
シーケンス3：補助ケトルに23％Gransil TMG-5を添加し、2500rpmで混合し、
補助ケトルに10％Gransil IDSを添加し、
補助ケトルに5％DM-fluidを添加し、
補助ケトルに2％パーメチルを添加し、温度を25℃に調整する。
シーケンス4：補助ケトルに1.5％KF-6017を加えて、均一かつ滑らかになるまで混合する。
シーケンス5：主ケトルに38.35％脱イオン水を加え、主ケトルを50℃の設定で加熱し、
481rpmで混合し、続いて5rpmで容器ごと回してかき混ぜ、
主ケトルに0.05％EDETAを添加し、続いて加熱を止める。
シーケンス6：主ケトルを25℃まで冷却し、主ケトルに0.6％アリストフレックスを加え、続いて補助ケトルの内容物を添加する。
容器に3％ブチレングリコールを添加し、70℃まで加熱し、0.2％フェノキセトールを添加し、続いて0.3％Barguard cpを添加し、その後に1％カーボワックス30を添加し、2000rpmで混合することにより、プレミックスA（シーケンス7）を調製する。
シーケンス7：主ケトルにプレミックスAを添加する。
シーケンス8：主ケトルに1.5％シマルゲル600を添加して、均一になるまで混合する。
【００４５】
処方7は、以下の通りに調製された：
シーケンス1：補助ケトルに10％ヒアルロン酸を添加し、8rpmで容器ごと回してかき混ぜる。
シーケンス2：補助ケトルに0.5％Tween 20を加える。
シーケンス3：補助ケトルに23％Gransil TMG-5を添加し、2500rpmで混合し、
補助ケトルに10％Gransil IDSを添加し、
補助ケトルに5％DM-fluidを添加し、
補助ケトルに2％パーメチルを添加し、温度を25℃に調整する。
シーケンス4：補助ケトルに1.5％KF-6017を加えて、均一かつ滑らかになるまで混合する。
シーケンス5：主ケトルに35.25％脱イオン水を加え、
50℃まで加熱し、
481rpmで混合し、続いて5rpmで容器ごと回してかき混ぜ、
主ケトルに0.05％EDETAを添加し、
主ケトルに0.5％MPCを添加し、
主ケトルに1％フィトフィックスを添加し、続いて加熱を止める。
シーケンス6：主ケトルを25℃まで冷却し；主ケトルに0.6％アリストフレックスを加え；続いて補助ケトルの内容物を主ケトルに添加する。
容器に3％ブチレングリコールを添加し、70℃まで加熱し、続いて、以下の成分を一つずつ加え：0.2％フェノキセトール、0.3％Barguard cp、1％カーボワックス30、0.25％サリチル酸、0.05％クラリセージ、および0.1％レスベラトロール、そして2000rpmで混合することにより、プレミックスA（シーケンス7）を調製する。
シーケンス7：主ケトルにプレミックスAを添加する。
1％脱イオン水および0.2％Tris amino ultraを容器中で組み合わせることにより、プレミックスB（シーケンス8）を調製する。
シーケンス8：主ケトルにプレミックスBを添加する。
シーケンス9：主ケトルに1.5％シマルゲル600を添加して、均一になるまで混合する。
【００４６】
処方8は、以下の通りに調製された：
容器に3％ブチレングリコールを導入し、70℃まで加熱し、続いて150rpmで混合し、0.3％Barguard CPを添加し、次に0.1％テトラヒドロクルクミノイドを添加することにより、プレミックスB（シーケンス11）を調製する。
容器に3％ブチレングリコールを導入し、1％カーボワックスを添加し、70℃まで加熱し、2000rpmで混合し、0.18％ニビトールUP-302を添加し、次に0.1％ビアピュア・リコリス（Viapure licorice）を添加し、続いて0.03％ビアピュア・シトラス（Viapure Citrus）を添加することにより、プレミックスC（シーケンス12）を調製する。
容器に4％脱イオン水を導入し、150rpmで混合し、1.8％AS-G粉末を添加し、続いて0.645％Tris amino ultraを添加することにより、プレミックスD（シーケンス13）を調製する。
シーケンス1：補助ケトルに10％ヒアルロン酸を添加し、15rpmで容器ごと回してかき混ぜる。
シーケンス2：補助ケトルに0.5％Tween 20を加える。
シーケンス3：補助ケトルに23％Gransil TMG-5を添加し、2500rpmで混合し、
補助ケトルに10％Gransil IDSを添加し、
補助ケトルに5％DM-fluidを添加し、
補助ケトルに2％パーメチルを添加し、
温度を25℃に調整する。
シーケンス4：補助ケトルに1.5％KF-6017を加えて、均一かつ滑らかになるまで混合する。
シーケンス5：主ケトルに17.46％脱イオン水（53-0061）を加え、
30℃まで加熱し、
温度が30℃に到達したら、530rpmで混合し、続いて12rpmで容器ごと回してかき混ぜ、
主ケトルに0.2％カフェインを添加し、
主ケトルに0.05％EDETAを添加し、
主ケトルに0.1％リボ核酸ナトリウムを添加し、
加熱を止めて、25℃まで冷却する。
シーケンス6：主ケトルの温度が25℃に到達したら、主ケトルに5％酵母抽出物XPを添加し、
主ケトルに2％酵母抽出物NAGを添加し、
主ケトルに0.5％Rice defense complexを添加し、
主ケトルに1％フィトクラー（Phytoclar）を添加し、
主ケトルに0.5％バイオ変換シラカバを添加する。
シーケンス7：主ケトルに2％ホウロクタケ属（Trametes）抽出物を添加し、1800rpmで均一になるまで混合し、続いて10rpmで容器ごと回してかき混ぜる。
シーケンス8：主ケトルに0.6％アリストフレックスを添加する。
シーケンス9：主ケトルに0.2％フェノキセトールを加え、続いて補助ケトルの内容物を主ケトルに添加する。
シーケンス10：主ケトルに0.2％ビタミンEを添加する。
シーケンス11：主ケトルにプレミックスBを添加する。
シーケンス12：主ケトルにプレミックスCを添加する。
シーケンス13：主ケトルにプレミックスDを添加し、830rpmで均一になるまで混合し、続いて12rpmで容器ごと回してかき混ぜる。
シーケンス14：主ケトルに2.5％Catezomesを添加する。
シーケンス15：主ケトルに1.5％シマルゲル600を添加する。
シーケンス16：主ケトルに0.026％FD＆Cイエロー5番を添加して、続いて主ケトルに0.009％FD＆Cイエロー6番を添加する。
【００４７】
46名のボランティアが、4ヵ月間の臨床試験に登録された。明らかに目に見える加齢斑を手に有するパネリストのみが参加を許可された。パネリストの平均年齢は62歳であり、最低年齢および最高年齢はそれぞれ44歳および82歳であった。すべてのボランティアが白人であり、フィッツパトリック皮膚分類II型またはIII型を示した。試験領域は、両手のそれぞれの背側の日光黒子であった。いずれかの種類の皮膚科的障害あるいはエタノールおよび/もしくは化粧品に対する過敏症またはアレルギーを有するパネリストは、試験から除外された。書面によるインフォームド・コンセントを、試験への参加前にそれぞれのボランティアから得た。
【００４８】
第1処置群は、14名のパネリストを含んだ（2個の加齢斑/パネリスト、合計で28個の加齢斑）。各パネリストは、対照として機能するビヒクル処方である処方6を用いて、片手につき1箇所の加齢斑を自分で処置した。16名のパネリストからなる第2群（2個の加齢斑/パネリスト、合計で32個の加齢斑）は、分化刺激処方である処方7を用いて、片手につき1箇所の加齢斑を自分で処置した。第3群では、2種類の処方が提供された：分化刺激処方である処方7および美白化処方である処方8である。この群の16名のボランティア（2個の加齢斑/パネリスト、合計で32個の加齢斑）は、片手につき1箇所の加齢斑に分化刺激処方を塗布し、5分後に、分化刺激処方の上から美白化処方を塗布するように依頼された。3つすべての群で、パネリストは、4ヵ月間にわたって1日2回、処方を塗布した。それぞれのパネリストが、両手を自分で処置した。パネリストは、手の背側表面全体に、4ヵ月間にわたって1日2回（朝および夕）、処方をたっぷり塗布した。パネリストは、臨床試験の期間中、手にいかなる他の化粧品も使用しないように指示された。それぞれの手について、1個の加齢斑が研究者により選択され、その1個の加齢斑が1ヵ月毎に評価された。
【００４９】
臨床試験の開始時（すなわち、処置前）ならびに1、2、3および4ヵ月後に、ダーモスコープカメラ（Dermalite Pro II、Olympus SP-510UZデジタルカメラに接続）を用いて加齢斑のダーモスコープ写真を取得した。Dermalite Pro II二重偏波皮膚鏡（dual-polarization dermatoscope）を用いて、加齢斑の写真を交差偏波モードで取得した。交差偏波光は、皮膚の深部色素沈着を強調する。
【００５０】
これらの写真を、色素過剰斑と周囲皮膚との間のコントラストの算出のために用いた。写真を白黒写真に変換し、そこから濃淡値（grey value）を算出した。（周囲皮膚の濃淡値−加齢斑の濃淡値）と定義される色のコントラストを、それぞれの加齢斑について算出した。
【００５１】
色素過剰斑を、その生来の状態での皮膚のリアルタイム可視化を可能にするビバスコープ（Lucid 1500）を用いたin vivo RCMによっても評価した。解析は、基底膜で取得した共焦点画像に集中させた。これらの画像から、mm2当たりの真皮乳頭数をカウントし、強屈折真皮乳頭の円形指数を算出した。円形指数は、円に対する強屈折基底細胞の整列パターンを指す形状係数である。この式に従うと、正円の円形指数は100に等しく；より低い指数は円からのより明らかな逸脱に対応し、日光黒子で一般的に見られるような強屈折細胞の整列パターンの変形を示す。表皮の厚みもまた算出された。
【００５２】
1ヵ月間および4ヵ月間の処置後、皮膚自家蛍光（すなわち、皮膚の内因性蛍光）を、表皮増殖を評価するためにSkinskan（Horiba社）を用いて測定した（λex/λem＝295/345nm；反射スペクトル350〜700nm）。表皮増殖データを、350nmで測定した対応する反射スペクトルデータを用いて補正した。蛍光分光法を用いて、励起および発光の変化の影響を調べることができる。一部のin vivo蛍光バンドは、特定のアミノ酸またはタンパク質修飾に依るものとすることができる。トリプトファンに起因する蛍光バンド（λex/λem＝295/345nm）が、表皮増殖または細胞再生についてのマーカーとして提案されている。
【００５３】
時間依存的な影響を、反復測定ANOVA演算を用いて評価した。時点間の有意な差異を、多重比較のための事後テューキー検定（post hoc Tuckey test）によりさらに決定した。ビバスコープデータは、対応のあるスチューデントt検定を用いて統計学的に評価した。
結果を、図3、4A、4B、5、6〜8、9A、9Bおよび10に図示する。
【００５４】
図3は、処置の結果として得られた日光黒子と周囲皮膚との間の皮膚色のコントラストデータを表わす。分化刺激処方を用いた処置は、未処置皮膚と比較して、1、2、3および4ヵ月後にそれぞれ2％（p＝0.96）、6％（p＝0.24）、20％（p＜10-4）および26％（p＜10-4）のコントラストの減少を生じた。分化刺激処置を美白化処置と組み合わせた場合、1ヵ月間の処置後に統計学的に有意な差異が既に観察された。この組み合わせ処置は、1、2、3および4ヵ月後にそれぞれ7％（p＝0.02）、17％（p＝0.0001）、19％（p＝0.0001）および28％（p＝0.0001）のコントラストの減少を生じた。ビヒクル処方を用いた処置の結果、同じ期間でコントラストの変化は観察されなかった。
【００５５】
分化刺激処方を用いて処置した日光黒子のダーモスコープ写真を、図4Aに示す。上側の組写真は処置後の色のコントラストの典型的な改善を示し、下側の組写真は現行の試験設定で見出された最大の改善を示す。
【００５６】
分化刺激処方およびそれに続いて美白化処方を用いて処置した日光黒子のダーモスコープ写真を、図4Bに示す。上側の組写真は処置後の色のコントラストの典型的な改善を示し、下側の組写真は現行の試験設定で見出された最大の改善を示す。両方の処置に関して、平均的改善を示す1つの例が提示され、最大の改善を表わす別の例が提示される。組み合わせ処置に関しては、1ヵ月間の処置後に既に有意な差異に達し、したがって、分化刺激処方単独での処置と比較して、より迅速な色のコントラストの減少が見られた。
【００５７】
日光黒子の真皮乳頭の形態（すなわち、円形指数および真皮乳頭環数）を、RCM（ビバスコープ）を用いて調べた。円形指数についての結果を、図5に示す。分化刺激処方を用いた4ヵ月間の処置後には、円形指数の統計学的に有意な増大が観察され、基底膜の改善を示した。正円の円形指数は100に等しく、より低い指数は円からのより明らかな逸脱に対応する。非病変部皮膚の真皮乳頭の円形指数は、92付近であることが見出された（データ示さず）。
ビヒクル群および組み合わせ処置群では、4ヵ月間の処置後に真皮乳頭の円形指数に変化は見られなかった。
【００５８】
図6は、日光黒子の真皮-表皮界面で記録されたRCM（ビバスコープ）画像の例を示す。これらの画像は、分化刺激処方を用いた4ヵ月間の処置後の平均改善および最大改善を表わす。
【００５９】
図7に示される通り、処置前のレベルと比較して、4ヵ月間の処置後の真皮乳頭数の統計学的に有意な減少が、分化刺激活性物質を含有する処方を用いて処置された群、ならびに分化刺激活性物質を含有する処方および美白化処方の両方を用いて処置された群で観察された。非病変部皮膚での真皮乳頭数は、mm2当たり約20個の乳頭であることが観察された（データ示さず）。
【００６０】
図8に示される通り、真皮-表皮界面で取得されたRCM（ビバスコープ）画像は、分化刺激処方を用いた4ヵ月間の処置後の乳頭環の平均減少および最大減少を表わす。
【００６１】
記録されたビバスコープ画像をさらに、表皮厚の定量化のために用いた。図9Aに示される通り、分化刺激処方を用いた4ヵ月間の処置後に、表皮厚（角質層は除く）の統計学的に有意な増大が観察された。加えて、図9Bに示される通り、角質層の肥厚化が見られた。ビヒクルを用いた処置または組み合わせ処置後には変化は見られなかった。
【００６２】
皮膚自家蛍光（295/345nmで測定）結果を図10に示す。これらの波長でのシグナルは、表皮増殖に関するマーカーであるトリプトファンと関連する。分化刺激処方を用いた処置は、4ヵ月後の表皮増殖での統計学的に有意な減少をもたらした。他の処置については変化が見られなかった。
【００６３】
4ヵ月間にわたる分化刺激処方を用いた処置は、日光黒子の可視的な外観および形態の改善をもたらした。古典的な美白化成分を含有する美白化処方を、分化刺激処方を塗布してから5分後に塗布した場合、肌色の同様の改善が、4ヵ月間の処置後に記録された。それにもかかわらず、組み合わせ処置は、分化刺激処方単独での使用と比較して、基底膜の改善に関して若干効果が弱かった。より少ない真皮乳頭環がカウントされたが、円形指数については改善が検出できなかった。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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