(57)【要約】  核酸構築物を提供する。当該構築物は、タバコ茎えそウイルス（ＴＲＶ）配列と、目的ゲノムの標的配列中の配列特異的切断を仲介する単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をコードする核酸配列とを含み、ＴＲＶ配列は機能性２ｂ配列を欠くものである。当該構築物を含む植物細胞および遺伝子編集における当該構築物の使用も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
タバコ茎えそウイルス（ＴＲＶ）配列と、目的ゲノム中の標的配列中の配列特異的切断を仲介する単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をコードする核酸配列とを含む核酸構築物であって、前記ＴＲＶ配列が機能性２ｂ配列を欠くものである、核酸構築物。
【請求項２】
前記ＴＲＶが機能性コートタンパク質を欠失している、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項３】
前記ＴＲＶが異種性エンハンサー配列を含む、請求項１または２に記載の核酸構築物。
【請求項４】
前記異種性エンハンサー配列がΩエンハンサーを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項５】
前記ｓｇＲＮＡをコードする前記核酸配列が、複数のリボザイム配列と隣接する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項６】
前記複数のリボザイム配列が互いに同一でない、請求項５に記載の核酸構築物。
【請求項７】
前記ｓｇＲＮＡが少なくとも２つのｓｇＲＮＡを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項８】
前記少なくとも２つのｓｇＲＮＡが、単一の標的遺伝子に対するものである、請求項７に記載の核酸構築物。
【請求項９】
前記少なくとも２つのｓｇＲＮＡが、それぞれ異なる標的遺伝子に対するものである、請求項７に記載の核酸構築物。
【請求項１０】
前記少なくとも２つのｓｇＲＮＡの転写が、単一のプロモーターによるものである、請求項７〜９のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項１１】
配列特異的にゲノムＤＮＡを切断するために前記ｓｇＲＮＡに結合するヌクレアーゼをコードする追加の核酸配列をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項１２】
前記ヌクレアーゼがＣａｓ９またはＲＩＳＣである、請求項１１に記載の核酸構築物。
【請求項１３】
前記標的配列が前記目的ゲノムに対して内在性である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項１４】
前記標的配列が前記目的ゲノムに対して外来性である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項１５】
前記ｓｇＲＮＡおよび前記ヌクレアーゼの転写が、２つの個別のプロモーターによって制御される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項１６】
前記ＴＲＶが、ＴＲＶ１およびＴＲＶ２を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項１７】
前記ＴＲＶが、ＴＲＶ２を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項１８】
請求項１〜１５、１６および１７のいずれか一項に記載の核酸構築物と、配列特異的にゲノムＤＮＡを切断するために前記ｓｇＲＮＡに結合するヌクレアーゼをコードする核酸構築物とを含む、核酸構築物システム。
【請求項１９】
前記ヌクレアーゼがＣａｓ９またはＲＩＳＣである、請求項１８に記載の核酸構築物システム。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の核酸構築物または構築物システムを含む細胞。
【請求項２１】
植物細胞である、請求項２０に記載の細胞。
【請求項２２】
請求項２１に記載の植物細胞を含む植物。
【請求項２３】
請求項２２に記載の植物の植物部位。
【請求項２４】
成長点である、請求項２３に記載の植物部位。
【請求項２５】
植物のゲノムに遺伝子型変異を発生させるための方法であって、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の核酸構築物あるいは請求項１８または１９に記載の核酸構築物システムを植物に導入することを含み、前記（ｓｇＲＮＡ）が、植物の標的配列における配列特異的切断を仲介し、それにより前記植物ゲノムに遺伝子型変異を発生させる、方法。
【請求項２６】
前記変異が、欠失、挿入および点突然変異からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記変異が少なくとも２世代に渡って安定である、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
除草剤耐性植物を作製するための方法であって、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の核酸構築物あるいは請求項１８または１９に記載の核酸構築物システムを植物に導入することを含み、前記（ｓｇＲＮＡ）が、植物に除草剤感受性を付与する遺伝子内の標的配列における配列特異的切断を仲介し、それにより除草剤耐性植物を作製する、方法。
【請求項２９】
病原体耐性植物を作製するための方法であって、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の核酸構築物あるいは請求項１８または１９に記載の核酸構築物システムを植物に導入することを含み、前記（ｓｇＲＮＡ）が、植物に病原体感受性を付与する遺伝子内の標的配列における配列特異的切断を仲介し、それにより病原体耐性植物を作製する、方法。
【請求項３０】
病原体耐性植物を作製するための方法であって、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の核酸構築物あるいは請求項１８または１９に記載の核酸構築物システムを植物に導入することを含み、前記（ｓｇＲＮＡ）が、病原体遺伝子内の標的配列における配列特異的切断を仲介するものである、病原体耐性植物を作製する、方法。
【請求項３１】
非生物的ストレス耐性が増加した植物を作製するための方法であって、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の核酸構築物あるいは請求項１８または１９に記載の核酸構築物システムを植物に導入することを含み、前記（ｓｇＲＮＡ）が、植物に非生物的ストレス感受性を付与する遺伝子内の標的配列における配列特異的切断を仲介し、それにより非生物的ストレス耐性が増加した植物を作製する、方法。
【請求項３２】
前記植物が双子葉植物である、請求項２１に記載の細胞、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の植物または植物部位、あるいは請求項２５〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、ゲノム編集のための核酸構築物、より詳細には、標的化ゲノム改変のためのオリゴヌクレオチド−酵素複合体、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム、の要素を発現する、タバコ茎えそウイルス（ＴＲＶ）に基づく核酸構築物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated endonuclease 9）は、ヒト、酵母、ゼブラフィッシュ、線形動物、ショウジョウバエおよび植物ならびにいくつかの他の生物を含む広範な生物種において、効率的なゲノム編集を仲介することが示されている。
【０００３】
ＣＲＩＳＰＲは、標的化遺伝子破壊および標的化遺伝子挿入のための簡単な手法を提供する。遺伝子破壊のための主な要素には、ヌクレアーゼドメインを含有するＣａｓ９タンパク質および標的ＲＮＡに対する配列特異性を提供するガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）が含まれる（Johnson et. al. Comparative assessments of CRISPR-Cas nucleases' cleavage efficiency in planta. 2014. Plant Mol Biol. Nov 18.）。ｓｇＲＮＡの５’末端の最初の２０ヌクレオチドの配列は、標的配列に相補的であり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムに特異性を提供する。ｓｇＲＮＡの３’部分は、Ｃａｓ９活性のために必要な二次構造を形成する。ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを特異的に標的に運び、次にＣａｓ９は、標的ＤＮＡのプロトスペーサー近接モチーフ（ＰＡＭ）部位で２本鎖の切断を生じる。２本鎖の切断の非相同性末端結合修復は、標的遺伝子を破壊する欠失または小さな挿入（インデル）をもたらすことが多い。
【０００４】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用する植物ゲノムの安定な改変のための方法は、いまだ開発中である。
【０００５】
追加的背景技術としては以下のものが挙げられる。
米国特許出願第２０１４０２７３２３５号；
(i) Nekrasov V, Staskawicz B, Weigel D, Jones JD, Kamoun S: Targeted mutagenesis in the model plant Nicotiana benthamiana using Cas9 RNA-guided endonuclease. Nat Biotechnol2013, 31:691-693; 
(ii) Shan Q, Wang Y, Li J, Zhang Y, Chen K, Liang Z, Zhang K, Liu J, Xi JJ, Qiu JL, Gao C: Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol 2013, 31:686-688; 
(iii) Li JF, Norville JE, Aach J, McCormack M, Zhang D, Bush J, Church GM, Sheen J: Multiplex and homologous recombination-mediated genome editing in Arabidopsis and Nicotiana benthamiana using guide RNA and Cas9. Nat Biotechnol 2013, 31:688-691; 
(iv) Feng Z, Zhang B, Ding W, Liu X, Yang DL, Wei P, Cao F, Zhu S, Zhang F, Mao Y, Zhu JK: Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system. Cell Res2013, 23:1229-1232; 
(v) Mao Y, Zhang H, Xu N, Zhang B, Gao F, Zhu JK: Application of the CRISPR-Cas system for efficient genome engineering in plants. Mol Plant doi:10.1093/mp/sst121 (August 20, 2013);
(vi) Xie K, Yang Y: RNA-guided genome editing in plants using a CRISPR-Cas system. Mol Plant  doi:10.1093/mp/sst119 (August 17, 2013);
(vii) Miao J, Guo D, Zhang J, Huang Q, Qin G, Zhang X, Wan J, Gu H, Qu LJ: Targeted mutagenesis in rice using CRISPR-Cas system. Cell Res 2013, 23:1233-1236; 
(viii) Jiang W, Zhou H, Bi H, Fromm M, Yang B, Weeks DP: Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated targeted gene modification in Arabidopsis, tobacco, sorghum and rice. Nucleic Acids Res doi:10.1093/nar/gkt780 (September 2, 2013).
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、タバコ茎えそウイルス（ＴＲＶ）配列と、目的ゲノムの標的配列中の配列特異的切断を仲介する単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をコードする核酸配列とを含む核酸構築物であって、ＴＲＶ配列が機能性２ｂ配列を欠いている核酸構築物が提供される。
【０００７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＴＲＶは機能性コートタンパク質を欠失している。
【０００８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＴＲＶは異種性エンハンサー配列を含む。
【０００９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、異種性エンハンサー配列はΩエンハンサーを含む。
【００１０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ｓｇＲＮＡをコードする核酸配列は複数のリボザイム配列と隣接する。
【００１１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、リボザイム配列は互いに同一ではない。
【００１２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ｓｇＲＮＡは少なくとも２つのｓｇＲＮＡを含む。
【００１３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、少なくとも２つのｓｇＲＮＡは単一の標的遺伝子に対するものである。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、少なくとも２つのｓｇＲＮＡは異なる標的遺伝子に対するものである。
【００１５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、少なくとも２つのｓｇＲＮＡの転写は、単一のプロモーターによるものである。
【００１６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、核酸構築物は、配列特異的にゲノムＤＮＡを切断するためにｓｇＲＮＡに結合するヌクレアーゼをコードする追加の核酸配列をさらに含む。
【００１７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ヌクレアーゼはＣａｓ９またはＲＩＳＣである。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、標的配列は目的ゲノムに対して内在性である。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、標的配列は目的ゲノムに対して外来性である。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ｓｇＲＮＡおよびヌクレアーゼの転写は、２つの個別のプロモーターによって制御される。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＴＲＶはＴＲＶ１およびＴＲＶ２を含む。
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＴＲＶはＴＲＶ２を含む。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、前記核酸構築物と、配列特異的にゲノムＤＮＡを切断するためにｓｇＲＮＡに結合するヌクレアーゼをコードする核酸構築物とを含む、核酸構築物システムが提供される。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ヌクレアーゼはＣａｓ９またはＲＩＳＣである。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、核酸構築物または構築物システムを含む細胞が提供される。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞は植物細胞である。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、植物細胞を含む植物が提供される。
【００２８】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、植物の植物部位が提供される。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、植物部位は成長点である。
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、植物のゲノムに遺伝子型変異を発生させるための方法であって、核酸構築物あるいは核酸構築物システムを植物に導入することを含み、（ｓｇＲＮＡ）が、植物の標的配列における配列特異的切断を仲介し、それにより植物ゲノムに遺伝子型変異を発生させる、方法が提供される。
【００３１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、変異は、欠失、挿入および点突然変異からなる群から選択される。
【００３２】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、除草剤耐性植物を作製するための方法であって、核酸構築物あるいは核酸構築物システムを植物に導入することを含み、（ｓｇＲＮＡ）が、植物に除草剤感受性を付与する遺伝子内の標的配列における配列特異的切断を仲介し、それにより除草剤耐性植物を作製する、方法が提供される。
【００３３】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、病原体耐性植物を作製するための方法であって、核酸構築物あるいは核酸構築物システムを植物に導入することを含み、（ｓｇＲＮＡ）が、病原体遺伝子内の標的配列における配列特異的切断を仲介するものである、病原体耐性植物を作製する、方法が提供される。
【００３４】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、病原体耐性植物を作製するための方法であって、核酸構築物あるいは核酸構築物システムを植物に導入することを含み、（ｓｇＲＮＡ）が、病原体遺伝子内の標的配列における配列特異的切断を仲介するものである、病原体耐性植物を作製する、方法が提供される。
【００３５】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、非生物的ストレス耐性が増加した植物を作製するための方法であって、核酸構築物あるいは核酸構築物システムを植物に導入することを含み、（ｓｇＲＮＡ）が、植物に非生物的ストレス感受性を付与する遺伝子内の標的配列における配列特異的切断を仲介し、それにより非生物的ストレス耐性が増加した植物を作製する、方法が提供される。
【００３６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、植物は双子葉植物である。
【００３７】
他に定義する場合を除いて、本明細書において使用されるすべての技術的および／または科学的用語は、本発明が関係する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料を本発明の実施形態の実施および検査に使用することは可能であるが、例示的な方法および／または材料を後述する。矛盾する場合は、定義を含み、本特許明細書を優先する。加えて、材料、方法および例は単なる例示であり、必ずしも限定を意図しない。
【００３８】
単なる例示ではあるが、添付の図面を参照しながら、本発明のいくつかの実施形態について本明細書に記載する。ここで特に図面に詳細に参照するが、示される詳細は例示に過ぎず、本発明の実施形態の具体的な考察を目的とすることを強調する。この観点において、図面と合わせた説明は、本発明の実施形態がどのように実行され得るかを当業者に明らかにする。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１Ａ】ガイドＲＮＡを含むＴＲＶベクターマップの図であり、配列番号７にも示したＴＲＶ  ＲＮＡ２−リボザイム−ＮｐｔＩＩ−ｓｇＲＮＡリボザイム：ＤｓＲｅｄ構築物のマップである。
【図１Ｂ】配列番号８にも示したＴＲＶ  ＲＮＡ２−リボザイム−ＰＤＳ−ｓｇＲＮＡリボザイム：−ＤｓＲｅｄ構築物のマップである。
【図１Ｃ】配列番号６にも示したＲＮＡ２−ＣＰ−ｓｇＰ−ＱＱＲ−ｓｇＲＮＡ構築物（リボザイムを含まない）のマップである。
【図１Ｄ】リボザイムの隣接するＤｓＲｅｄ２を発現するＴＲＶ  ＲＮＡ２のマップである。
【図１Ｅ】配列番号１８にも示される、ＱＱＲ−ｓｇＲＮＡおよびＤｓＲｅｄの両方を発現するＴＲＶ  ＲＮＡ２のマップである。
【図１Ｆ】ｈＣａｓ９の発現のためのバイナリーベクターｐｋ７ＷＧＦ２−ｈＣａｓ９のマップである。
【図２】複数のリボザイムに隣接するＴＲＶ  ＤｓＲｅｄのベクター（図１Ｄ）を感染させたＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの画像である。ＤｓＲｅｄは、接種から６日後および１０日後（ｄｐｉ）に、浸潤部位から離れた植物部位で検出された。
【図３】Ｃａｓ９を一過性で発現するバイナリーベクタープラスミドおよび適切なｓｇＲＮＡを発現するＴＲＶ（図１Ａ〜Ｂ）を同時に接種したときに、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの標的遺伝子ＮｐｔＩＩ（図３のＡ）またはＰＤＳ（図３のＢ）において検出された、標的部位のインデルを示す。この実験では、ｓｇＲＮＡは、そこに隣接するリボザイムの存在故に、正しいサイズに切断された。（処理した組織のゲノムＤＮＡを、ｓｇＲＮＡ部位で標的を認識する制限酵素で消化することによる）標的の濃縮は、図３のＡでは実施したが、図３のＢでは実施しなかった。図３のＡ−混合物ｉを接種したＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ（下記表２）。図３のＢ−混合物ｉｉを接種したＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ（下記表２）。
【図４】接種後３日（３ｄｐｉ）の葉におけるＤｓＲｅｄの検出。
【図５】ＧＵＳの活性化。ＧＵＳの活性化は、Ｃａｓ９と、ＧＵＳコード配列のＡＴＧコドンと同じ読み枠内に終止コドンを挿入することでＧＵＳの発現をサイレンシングした遺伝子との両方を保持する、二重トランスジェニック植物において可視化される。ＧＵＳレポーターは、これらの植物が構築物１ｃで感染された場合に再活性化された（図１Ａ〜図１Ｆ、表１）。
【図６】ｐＴＲＶ２−ＱＱＲ−ｓｇＲＮＡ（＃３３２５、配列番号６）によって標的化された、ｍＧＵＳ遺伝子断片のＤＮＡ配列を示す。
【図７】ｐＴＲＶ２  ΔＣＰ（図１Ｅの構築物＃３３３７、配列番号１８）からＤｓＲｅｄと、−ＱＱＲ−ｓｇＲＮＡとの両方を全体で発現している、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａおよびペチュニアをそれぞれ示す画像である。
【図８】ｇＲＮＡに隣接するリボザイムの、ゲノム編集の効率に対する寄与の分析を目的したベクターの模式的な図である。
【図９】リボザイムを有する（図８の１Ａ）または有さない（図８の２Ａ）ウイルスベクターの接種から７日後に検出されたＤｓＲｅｄ２シグナルを示す。ＤｓＲｅｄ２−赤色蛍光、ＢＦ−明視野。
【図１０】種々のｓｇＲＮＡ発現ウイルスベクターを使用する遺伝子編集を示す画像である。矢印は、５２５ｂｐの制限酵素耐性ｎｐｔＩＩ遺伝子ＰＣＲ産物を示す。
【図１１】処理１ライブラリー（上部画像、混合物１）および処理２ライブラリー（下部画像、混合物２）から得た、個々に編集した配列を示す。インデルは赤色の四角で強調した。
【図１２】多重ベクターおよびそれらの対照ベクターを模式的に表す図である（下記表３〜４と同様）。
【図１３】二重ｓｇＲＮＡ発現ウイルスベクターを使用する多重化を示す画像である（下記表３〜４と同様）。
【図１４】ウイルスで送達した二重ｓｇＲＮＡ配列を使用した、ＤＮＡ断片の正確な欠失を示す。変異していないｎｐｔＩＩ配列セグメント（上部配列）と、変異したｎｐｔＩＩ配列セグメント（下部配列）との間の比較。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的部位を黄色で強調した。ＰＡＭは緑色で強調した。
【図１５】ウイルスで送達した二重ｓｇＲＮＡ配列を使用した、ＤＮＡ断片の欠失を示す。変異したｎｐｔＩＩ  ＰＣＲ産物を使用して作製した大腸菌ライブラリーの６つの代表的な配列。６つのうちの２つは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ＤＮＡ切断機構から予測される事象の大部分を表す、正確な１２６ｂｐの欠失を示す。ここに示した他の配列は、ライブラリーにおいても検出された、１２６ｂｐよりも大きな欠失であった。ソフトウェアの限界および欠失サイズ故に、欠失した配列の最初および最後のみの、変異していないｎｐｔＩＩとの比較を示した。
【図１６】二重ｓｇＲＮＡおよびＤｓＲｅｄ２発現ウイルスベクターを使用した多重化を示す画像である。
【図１７】内因性ＴＯＭ１およびＴＯＭ３（配列番号８０、８１）ペチュニア遺伝子に対する２つのガイドＲＮＡを含むＴＲＶベクターマップの模式図である。
【図１８】マルチプレックス（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）二重ｓｇＲＮＡ発現ウイルスベクターを使用した、ＴＯＭ１の標的部位改変を示す画像である。
【図１９】マルチプレックス二重ｓｇＲＮＡ発現ウイルスベクターを使用した、ＴＯＭ３の標的部位改変を示す画像である。
【図２０】マルチプレックス二重ｓｇＲＮＡ発現ウイルスベクターを使用した、ＴＯＭ１の変異した導入標的部位を示す。
【図２１】マルチプレックス二重ｓｇＲＮＡ発現ウイルスベクターを使用した、ＴＯＭ３の変異した導入標的部位を示す。
【図２２】ＲＮＡ２−ΔＣＰ−ｓｇＱＱＲ−ＤｓＲｅｄ２構築物のマップである。
【図２３】Ｃａｓ９／ｍＧＵＳトランスジェニックタバコ葉における、ｍＧＵＳ標的部位の効率的な編集を示す。
【図２４】Ｃａｓ９／ｍＧＵＳトランスジェニックタバコカルスにおける、ｍＧＵＳ標的部位の効率的な編集を示す。
【図２５】図２４のタバコカルスから抽出したｍＧＵＳ編集配列のシーケンシングの結果を示す。ｍＧＵＳ遺伝子の部分配列である。ｓｇＱＱＲ標的部位を黄色で強調し、ＰＡＭは緑色で強調した。変異した配列をｄｅｌ１およびｄｅｌ２と称し、それぞれ４ｂｐおよび１１ｂｐの欠失を有する。
【図２６】３Ｇ植物の葉におけるキメラＧＵＳの染色を示す。
【図２７】母植物（Ｔ０）と、それらの後代（Ｔ１）との、改変されたｍＧＵＳ対立遺伝子のシーケンシング結果の比較である。ＡＴＧコドンを緑色で下線し、ＴＧＡコドンを赤色で下線した。ＷＴは、トランスジェニックタバコ植物に存在する元のｍＧＵＳ配列である。インデルは赤い四角で印を付けた。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、ゲノム編集のための核酸構築物、より詳細には、標的化ゲノム改変のためのオリゴヌクレオチド−酵素複合体、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム、の要素を発現する、タバコ茎えそウイルス（ＴＲＶ）に基づく核酸構築物に関する。
【００４１】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明を利用する際には、下記の説明または実施例に記載の詳細に必ずしも限定されないことを理解されたい。本発明は、他の実施形態であることが可能である。また、種々の方法で実施もしくは実行することが可能である。
【００４２】
ゲノム配列を正確に改変し、部位特異的に遺伝子発現パターンを制御する能力は、植物バイオテクノロジーにおいて有望である。
【００４３】
本発明を実施化しながら、本発明者らは、ＴＲＶに基づくシステムを使用して、ｓｇＲＮＡ／ヌクレアーゼ複合体をタバコ植物およびペチュニアに導入し、目的の標的遺伝子における配列特異的なヌクレオチドの良好な挿入および欠失を証明した。本発明者らは、改変が内在性または外来性の標的配列内のいずれでもよく、複数のｓｇＲＮＡをマルチプレックスで含有する単一のＴＲＶベクターを使用しながら複数の遺伝子を標的化し、さらに変異が少なくとも２世代に渡って安定であることを示した。
【００４４】
ＴＲＶプロモーターは、ｓｇＲＮＡの転写を効率的に仲介することが見出された。ウイルス感染細胞／植物において既に観察された表現型によって、植物の選択はさらに効率的になり、これは、ゲノム変異を付与する上で、一過性の発現系の使用が効率的であることを示唆している。
【００４５】
したがって本改変ツールは、農業、園芸および基礎植物生物学の必要に対処するためのデザイナー植物の産生に使用可能な、次世代ゲノム編集プラットホームである。
【００４６】
よって本発明の態様によれば、タバコ茎えそウイルス（ＴＲＶ）配列と、目的ゲノムの標的配列中の配列特異的切断を仲介する単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をコードする核酸配列とを含む核酸構築物であって、前記ＴＲＶ配列が機能性２ｂ配列を欠くものである、核酸構築物が提供される。
【００４７】
本明細書において使用される「核酸構築物」または「ベクター」は、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターを指す。
【００４８】
本明細書において使用される「タバコ茎えそウイルス」または「ＴＲＶ」または「ｐＴＲＶ」は、ＴＲＶ核酸を含む１種または複数種のベクターを指す。
【００４９】
ＴＲＶは、２分節ゲノムを有するプラス鎖ＲＮＡウイルスである、即ち、ゲノムが２つのプラスセンスの１本鎖ＲＮＡに分割されており、ウイルス粒子に別々にキャプシド形成され得ることを意味する。２つのＴＲＶゲノムＲＮＡは、ＴＲＶ−ＲＮＡ１（ＴＲＶ１またはｐＴＲＶ１）およびＴＲＶ−ＲＮＡ２（ＴＲＶ２またはｐＴＲＶ２）と称される。ＲＮＡ１は、複製および宿主植物中の移動を仲介するポリペプチドをコードし、一方ＲＮＡ２は、コートタンパク質および、２ｂ（配列番号２７）を含む、線形動物による植物間のウイルス転移に関する要素をコードする。
【００５０】
ＴＲＶ−ＲＮＡ１レプリコンは、複製開始部位、１３４ｋＤａおよび１９４ｋＤａ複製酵素などの１つまたは複数のＴＲＶ複製酵素、移動タンパク質ならびにＴＲＶ  １６ｋＤａシステインリッチタンパク質などのシステインリッチタンパク質を典型的には含む。
【００５１】
ＴＲＶ−ＲＮＡ２レプリコンは、複製開始部位、ＴＲＶウイルスコートタンパク質などのウイルスコートタンパク質および異種性配列を含む。ｐＴＲＶコートタンパク質は、典型的には植物から植物への伝播のために機能する。２ｂは、植物間の線形動物によるウイルス転移に関する要素の１つである。
【００５２】
本明細書において後述するように、非必須構造遺伝子は、例えば、遺伝子発現のための複数のクローニング部位の提供、および／または１種以上の目的の発現産物をコードするために、異種性核酸配列によって置換されてもよい。
【００５３】
別の具体的な実施形態によれば、ｐＴＲＶ２は、機能性コートタンパク質を欠いており、それによりＴＲＶ２をサテライトベクターとして機能できるようにしている。
【００５４】
上記の代わりに、または上記に加えて、ＴＲＶ（例えば、ｐＴＲＶ２）の核酸配列は、機能性２ｂ配列（例えば、配列番号２７）を欠失している。具体的な実施形態によれば、不正確なオープンリーディングフレームの翻訳をもたらす可能性があるＡＴＧを含有しないように、２ｂ配列を欠失させる。よって配列は、２ｂ配列の内の３００ｂｐもしくは２００ｂｐ未満しか含まないか、または２ｂ配列を完全に欠失している。２ｂ配列の欠失は、成長点組織での効率的な発現、および長い核酸配列／そのポリペプチド産物、例えば少なくとも２ｋｂの塩基または６３３アミノ酸を超えるもの、の効率的な発現を提供するように機能する。
【００５５】
したがって具体的な実施形態によれば、核酸構築物は、当該ｃＤＮＡの転写を可能にする少なくとも１つのｃｉｓ作用性要素を含むＴＲＶ  ｃＤＮＡを包含する。一例は、前記ウイルスにとって外来性である、異種性ヌクレオチド配列、この場合はｓｇＲＮＡをコードする配列に、作動可能に連結したプロモーター（例えばサブゲノムプロモーター、例えば配列番号２３）である。
【００５６】
本明細書において使用される「異種性ヌクレオチド配列」は、天然に存在するＴＲＶに、天然に存在する部分ではない配列および／または本来のＴＲＶゲノムの本来の配置ではない配列である。
【００５７】
欠失されたＯＲＦは、非翻訳領域（ＵＴＲ）の上流で、異種性ヌクレオチド配列（例えば、ｓｇＲＮＡ）によって置換されてもよい。
【００５８】
特定の実施形態では、ベクターはＤＮＡベクターである。したがって、それは、ＴＲＶ−ＲＮＡ１レプリコンまたはＴＲＶ−ＲＮＡ２レプリコンの転写を促進するように位置付けられた（作動可能に連結された）植物活性プロモーターを含む。例えば植物活性プロモーターは、ＴＲＶ−ＲＮＡ１レプリコンまたはＴＲＶ−ＲＮＡ２レプリコンの５’末端に位置してもよい。
【００５９】
「植物活性プロモーター」という用語は、ＴＲＶベクターまたは他の植物発現可能ベクターで感染／形質転換された宿主植物において機能するプロモーターを指す。
【００６０】
本明細書において使用される「植物発現可能」という表現は、プロモーター配列と、そこに加えられたまたは含まれていた任意の追加的制御因子とが、植物細胞、組織または器官、好ましくは単子葉類もしくは双子葉類の植物細胞、組織または器官において、発現を少なくとも誘導、付与、活性化または増強可能であることを意味している。本発明のいくつかの実施形態の方法において有用なプロモーターの好ましい例を、下記の表Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶに示す。
【００６１】
【表１】
2017535296.tif 000002
【００６２】
【表２】
2017535296.tif 000003
【００６３】
【表３】
2017535296.tif 000004
【００６４】
【表４ａ】
2017535296.tif 000005
【００６５】
【表４ｂ】
2017535296.tif 000006
【００６６】
特定の実施形態では、ＴＲＶ−ＲＮＡ１またはＴＲＶ−ＲＮＡ２は、２つ以上の植物活性プロモーターに作動可能に連結されている。特定の実施形態では、１種以上の異種性核酸の追加的発現を駆動する１つまたは複数の追加的植物活性プロモーターを含むことが望ましい場合がある。したがって、例えば、各ｓｇＲＮＡは植物プロモーターに作動可能に連結され、同様にヌクレアーゼも、植物プロモーターに作動可能に連結される。
【００６７】
特定の実施形態では、（例えば、ｓｇＲＮＡをコードする）異種性核酸配列は、サブゲノムＲＮＡから発現され、その転写は、内在性ＴＲＶサブゲノムプロモーターによって促進される。サブゲノムプロモーターの例示的配列を配列番号２３に示した。
【００６８】
特定の実施形態では、転写物の読み過ごしを制限するために、転写ターミネーターをＲＮＡ転写物の３’末端に配置してもよい。例えば、転写ターミネーターは、ＴＲＶ−ＲＮＡ１レプリコンまたはＴＲＶ−ＲＮＡ２レプリコンの３’末端に配置してもよい。一般に使用される植物転写ターミネーターはノパリン合成酵素ターミネーター（ＮＯＳｔ、配列番号２４）である。
【００６９】
特定の実施形態では、ｐＴＲＶ１ベクターまたはｐＴＲＶ２ベクターへの改変は、エンハンサーの付加を含む。遺伝子の転写レベルを増強するために、任意のエンハンサーをウイルス発現ベクターに挿入することができる。例えばオメガエンハンサー（配列番号２５）を、本発明のｐＴＲＶ１ベクターまたはｐＴＲＶ２ベクターにクローニングしてもよい。
【００７０】
任意のＴＲＶに基づくベクターは、本発明の実施形態に含まれる。
【００７１】
具体的な実施形態によれば、本発明で使用する２つのＴＲＶゲノムＲＮＡベクターは、本明細書において、ｐＴＲＶ１（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号：ＡＦ４０６９９０）およびｐＴＲＶ２（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号：ＡＦ４０６９９１）と称され、ｐＴＲＶ１は宿主植物において複製および移動を仲介するポリペプチドをコードし、一方、ｐＴＲＶ２はコートタンパク質をコードする。
【００７２】
上記の代わりに、本発明のウイルスベクターは、ＴＲＶ関連ウイルス（例えば、タバコ茎えそウイルスＮ５株、ＨＭＶまたはタバコ茎えそウイルスＴＣＭ株）に基づくものでもよい。
【００７３】
他のＴＲＶ−ＲＮＡ１ベクターおよびＴＲＶ−ＲＮＡ２ベクターの例は、例えばRatcliff, F. Martin-Hernandez, A. M. and Baulcombe, D. C. (2001) Tobacco rattle virus as a vector for analysis of gene function by silencing. Plant J. 25, 237-245およびHernandez et al., 1997、Ｒａｔｃｌｉｆｆｅらの米国特許第６，３６９，２９６号、Ｄｉｎｅｓｈらの米国特許出願第２００３０１８２６８４号および米国特許第８，７９１，３２４号に記載されている。
【００７４】
本明細書において使用する、「単一ガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」は、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびｔｒａｎｓコードＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）からなるキメラＲＮＡ分子を指す。ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質の部位特異的標的化を規定する。この配列は、長さが１９〜２２ヌクレオチドであり、例えば標的に相補的な連続的な２０ヌクレオチドであって、典型的には、ｓｇＲＮＡ分子の５’末端に配置されている。ｃｒＲＮＡは、標的配列と１００％の相補性を有してもよいが、標的配列と少なくとも８０％、８５％、９０％および９５％の包括的な相同性であっても、本教示の範囲内とする。
【００７５】
ｔｒａｃｒＲＮＡは、長さ１００〜３００ヌクレオチドであり、ヌクレアーゼ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体を形成するＣａｓ９タンパク質、のための結合部位を提供する。
【００７６】
具体的な実施形態によれば、標的配列は目的ゲノムに対して内在性である。すなわち、ゲノムに存在する標的配列は、野生型ゲノムと同じコピー数であり、ゲノム位置も同じである。
【００７７】
具体的な実施形態によれば、標的配列は目的ゲノムに対して外来性である。本明細書においては異種性とも称される。そのような場合、標的配列は、ゲノム中ではあるが、異なった位置に存在する遺伝子であったり、または完全な外来性遺伝子、即ち、標的配列を含むゲノムには存在しないものでもよい。
【００７８】
具体的な実施形態によれば、さまざまな標的核酸配列に相補的である複数のｇＲＮＡを植物細胞に提供し、ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９酵素は、部位特異的にさまざまな標的核酸配列を切断する。複数のｇＲＮＡは、本明細書に記載の単一のまたは複数のＴＲＶベクターによってコードされ得る。複数のｓｇＲＮＡの使用は多重化を可能にする。
【００７９】
具体的な実施形態によれば、単一の標的遺伝子（例えばベクターＢ２）または複数の標的遺伝子（例えば図１７）に対する複数のｓｇＲＮＡが構築物に存在する。そのような複数（例えば１超、２超、３超、４超、５超、例えば、２〜５つ、２〜４つ、２〜３つ）のｓｇＲＮＡは、単一のプロモーター下に配置される。複数のｓｇＲＮＡは、スペーサーによって互いに分けられていても、分けられていなくてもよい。
【００８０】
このようなマルチプレックスな構成、すなわち、単一のサブゲノムプロモーターの支配下のマルチプレックスな構成は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いるいかなるゲノム編集方法にも応用され得ることが理解される。したがって、少なくとも２つのｓｇＲＮＡを単一のプロモーターの支配下に含む核酸構築物が提供される。
【００８１】
そのような核酸構築物は、原核細胞または真核細胞、例えば哺乳動物（ヒト等）、植物、昆虫および酵母といった、いかなる細胞にも使用可能である。
【００８２】
具体的な実施形態によれば、ｓｇＲＮＡをコードする核酸配列は、リボザイム−ｓｇＲＮＡ−リボザイム（ＲＧＲ）配列（例えば、配列番号２１および２２）を生成するようにリボザイム配列が隣接している。ＲＧＲの一次転写物はｓｇＲＮＡを放出するように自己触媒切断を受けることが示唆されている。ＲＧＲ構成によってｓｇＲＮＡ転写のために使用され得るプロモーターの範囲が広げることも検討されているが、ＴＲＶサブゲノムプロモーターの使用によって、リボザイムが隣接せずとも、ｓｇＲＮＡの効率的な転写が可能になることを本願で見出した。ＲＧＲストラテジーは、全ウイルスレプリコンが完全に転写された場合に、目的の任意の発現産物（例えば、レポーター、農業的に価値がある形質（例えばストレス耐性など））が接種された組織において発現され、ガイドＲＮＡが同じ組織においても作製されることを保証する。
【００８３】
したがって、ＲＧＲ構成では、ｓｇＲＮＡは、第１のリボザイム配列の５’および第２のリボザイム配列の３’に融合される。これらそれぞれのリボザイム配列は、自己切断型リボザイムである。
【００８４】
具体的な実施形態によれば、リボザイムは、ハンマーヘッド型リボザイムである。
【００８５】
リボザイム配列を設計する方法は当技術分野において周知であり、Lincoln TA, Joyce GF (February 2009). "Self-sustained replication of an RNA enzyme". Science 323 (5918): 1229-1232にも教示されている。
【００８６】
具体的な実施形態によれば、第１のおよび第２のリボザイム配列は同一でない。
【００８７】
具体的な実施形態によれば、第１のおよび第２のリボザイム配列は同一である。
【００８８】
ハンマーヘッド型リボザイムの具体例を、配列番号４および５に示している。ＲＧＲ配列の具体例を、配列番号２１および２２に示している。
【００８９】
述べたとおり、ＴＲＶ配列（例えば、ＴＲＶ２）は、少なくとも１つ（例えば２つ、３つまたはそれ以上）の単一ガイドＲＮＡをコードする。
【００９０】
したがって、具体的な実施形態によれば、ｓｇＲＮＡは、植物ゲノム中の複数の標的配列を標的とする少なくとも２つのｓｇＲＮＡを含む。複数のｓｇＲＮＡは、単一のＴＲＶレプリコンから、または複数のＴＲＶ構築物から転写され得る。具体的な実施形態によれば、これらそれぞれのｓｇＲＮＡは、植物プロモーター、例えば、ＴＲＶのサブゲノムプロモーターの制御下にある。
【００９１】
切断を仲介するために、核酸構築物はヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９またはＲＩＳＣをコードする核酸配列をさらに含んでもよい。
【００９２】
本明細書において使用される「ヌクレアーゼ」とは、配列特異的にゲノムＤＮＡを切断するためにｓｇＲＮＡに結合する酵素を指し、特異性はｃｒＲＮＡによって付与されるものである。
【００９３】
そのような酵素の例はＣａｓ９およびＲＩＳＣである。
【００９４】
上記の代わりに、または上記に加えて、Ｃａｓ９は別の核酸構築物によってコードされてもよく、それによりＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体は核酸構築物系によってコードされる。
【００９５】
具体的な実施形態によれば、Ｃａｓ９は配列番号９または１０に示したものであるが、植物における発現を改善するために配列を改変してもよく、例えば、配列番号９および１０に加えて、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％相同な配列および同一の配列（例えば、初期設定パラメーターでＢｌａｓｔ（Ｎ）／（Ｐ）を使用すること）も本明細書の範囲内である。
【００９６】
Ｃａｓ９は、プロトスペーサー近接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接するＤＮＡ標的配列にガイドされる単量体ＤＮＡヌクレアーゼである。Ｃａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣおよびＨＮＨヌクレアーゼに対して相同な２つのヌクレアーゼドメインを含む。ＨＮＨヌクレアーゼドメインは相補的ＤＮＡ鎖を切断し、一方で、ＲｕｖＣ様ドメインは非相補鎖を切断し、結果として平滑切断部が標的ＤＮＡに導入される。
【００９７】
ＲＩＳＣ酵素は、Martinez J, Tuschl T. RISC is a 5' phosphomonoester-producing RNA endonuclease. Genes Dev. 2004;18:975-980に教示されている。植物における発現を改善するための配列の改変、すなわち、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％相同な配列および同一の配列（例えば、初期設定パラメーターでＢｌａｓｔ（Ｎ）／（Ｐ）を使用すること）についても、上記文献の範囲内である。
【００９８】
したがって本教示は、ヌクレアーゼ、例えばＲＩＳＣおよびＣａｓ９の、天然に存在するもの、ならびに合成物およびコドン最適化物に参照する。
【００９９】
本発明のいくつかの実施形態のポリペプチドに対応する核酸配列は、植物発現のために最適化されてもよい。そのような配列の改変の例には、これらに限らないが、目的の植物種において典型的に見出されるものにさらに近づくように変更されたＧ／Ｃ含有量、および一般にコドン最適化と称される目的の植物種において典型的には見出されないコドンの除去を含む。
【０１００】
「コドンの最適化」という表現は、目的の植物内のコドン使用頻度に近づくように、構造遺伝子またはその断片内での使用に適切なＤＮＡヌクレオチドを選択することを指す。したがって最適化された遺伝子または核酸配列とは、本来の遺伝子または天然に存在する遺伝子のヌクレオチド配列が、植物内で統計的に好ましいまたは統計的に支持されるコドンを利用するように改変されている遺伝子を指す。ヌクレオチド配列は、典型的にはＤＮＡレベルで解析し、植物種における発現のために最適化されたコード領域を任意の好適な手順、例えばSardana et al. (1996, Plant Cell Reports 15:677-681)に記載の方法で決定する。この方法では、コドン使用頻度の標準偏差、即ち、コドン使用頻度バイアスの測定は、初めに、高発現植物遺伝子に対する、本来の遺伝子の各コドンの使用頻度の二乗比例偏差（ｓｑｕａｒｅｄ  ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ  ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）を得て、続いて平均二乗偏差の算出によって算出され得る。使用される式は：１  ＳＤＣＵ＝ｎ＝１Ｎ［（Ｘｎ−Ｙｎ）／Ｙｎ］２／Ｎであり、式中Ｘｎは高発現植物遺伝子におけるコドンｎの使用頻度であり、Ｙｎは目的遺伝子におけるコドンｎの使用頻度であり、Ｎは目的遺伝子におけるコドンの総数である。双子葉植物の高発現遺伝子におけるコドン使用頻度の表は、Murray et al. (1989, Nuc Acids Res. 17:477-498)のデータを使用して収集される。
【０１０１】
特定の植物細胞型において好ましいコドン使用頻度に応じて核酸配列を最適化する１つの方法は、いかなる他の統計的計算も行わずに、コドン最適化表の直接使用に基づくものである。コドン最適化表は、例えば、ＮＩＡＳ（National Institute of Agrobiological Sciences）DNA bank in Japan (www(dot)kazusa(dot)or(dot)jp/codon/）を通じてオンラインで提供されるコドン使用頻度データベースである。コドン使用頻度データベースは、多数の異なる種についてのコドン使用頻度表を含み、それらはＧｅｎｂａｎｋに登録されたデータに基づいて統計的に決定されたものである。
【０１０２】
特定の種（例えば、イネ）における各アミノ酸について最も好ましいまたは最も支持されているコドンを決定するために上記表を使用することによって、目的タンパク質をコードする天然に存在するヌクレオチド配列を特定の植物種に対してコドン最適化することができる。これは、アミノ酸に関しては、特定種のゲノムにおいて発生率が統計的に低いコドンを、統計的により支持されている対応するコドンで置換することによって達成される。しかし、既存の制限部位を欠失させたり、潜在的に有用な接合部（シグナルペプチドまたは終結カセットを加えるための５’末端および３’末端、正確な全長配列を産生するための配列の切断および生じたセグメントの接合に使用可能な内部部位）に新たな制限部位を作製したり、ｍＲＮＡの安定性または発現に負の影響を与え得るヌクレオチド配列を除去するために、１種または複数種のあまり支持されていないコドンを選択することもできる。
【０１０３】
天然に存在するコードヌクレオチド配列は、改変を行う前に、特定の植物種において統計的に支持されているコドンに対応する多数のコドンを既に含有している場合がある。したがって、本来のヌクレオチド配列のコドン最適化は、特定の植物において本来のヌクレオチド配列内のどのコドンが統計的に支持されていないかを決定すること、および決定したコドンを、特定の植物のコドン使用頻度表に従って改変することで、コドン最適化誘導体を産生することを含む。改変ヌクレオチド配列は、植物コドン使用頻度に対して完全にまたは部分的に最適化されてもよいが、但し、改変ヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質が、対応する天然に存在する遺伝子または本来の遺伝子によってコードされるタンパク質より高いレベルで産生されなければならない。コドン使用頻度の変更による合成遺伝子の構築は、例えば、ＰＣＴ特許出願第９３／０７２７８号に記載されている。
【０１０４】
核局在化を確実にするために、ヌクレアーゼコード配列は、天然に存在するＣａｓ９配列に対して内在性または異種性である核局在化ドメインに翻訳的に融合されてもよい。具体的な実施形態によれば、ＮＬＳはＳＶ４０のものである。
【０１０５】
本教示が植物ゲノム改変に関することから、ヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９またはＲＩＳＣは、ミトコンドリアおよびクロロプラストなどの他のゲノム含有オルガネラに対して、ミトコンドリア局所化シグナルまたはクロロプラスト改変シグナルをそれぞれ使用して、反応させてもよい。
【０１０６】
所与のベクター上の複数のコード配列のいずれもが、サブゲノムプロモーター（ｓｇＰ、配列番号２３）などのプロモーターを介して転写されてもよい。
【０１０７】
したがって、具体的な実施形態によれば、前記ｓｇＲＮＡおよび前記ヌクレアーゼの転写は、２つの個別のサブゲノムプロモーター（ｓｇＰ）によって制御される。
【０１０８】
上記の代わりに、Ｃａｓ９は、異なるベクターによってコードされる。異なるベクターは、例えば、ＷＯ２００９／１３０６９５に教示されるｐＴＲＶに基づくベクター、Ｔ−ＤＮＡバイナリーベクター（例えば、ｐＧＲＥＥＮ、ｐＢＩＮ１９、ｐＫ７ＷＧＦ２およびｐＰＶＰ）、またはジェミニウイルスに基づくベクター（例えば、ＷＯ２００７／１４１７９０およびＷＯ２０１０／００４５６１に教示されるもの）等の他のウイルスに基づくベクターなどである。
【０１０９】
記述のとおり、ＴＲＶ核酸配列およびそのヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９またはＲＩＳＣ）コード配列は、ベクターの一部である。一般にベクターは、増殖および宿主細胞への導入を促進するように設計された核酸構築物である。特定の実施形態では、ベクターは、アグロバクテリウム仲介形質転換での使用のために設計され、ＴＲＶ１、ＴＲＶ２および／またはヌクレアーゼレプリコンに隣接するＴ  ＤＮＡ配列を含有するＤＮＡベクターである。隣接するＴ  ＤＮＡ配列は、宿主植物細胞のゲノムへのレプリコンの挿入を仲介する。アグロバクテリウムと共に使用するためのベクターは、バイナリー形質転換ベクターと称され、ｐＧｒｅｅｎ、ＰＢＩＮ１９、ｐＫ７ＷＧＦ２またはｐＣＡＳＳ２などの多数が当技術分野において周知である。特定の実施形態では、ベクターは、大腸菌で維持されるように設計され、このようなベクターは、一般的に大腸菌の複製開始点および、抗生物質耐性遺伝子などの選択マーカーを含む。特定の実施形態では、ベクターは、植物選択マーカーを含んでもよい。ベクターは、例えば、粒子衝突法による導入（例えば、ベクターでコートされたタングステン微小粒子を送達するように装備された銃の使用、または細胞のシリコンウイスカー（ｓｉｌｉｃｏｎ  ｗｈｉｓｋｅｒ）への曝露）のために設計されてもよい。例えばTaylor and Fauquet, 2002, DNA and Cell Biology 21:963-77を参照されたい。そのような送達系の場合、ベクターは、ＲＮＡまたはＤＮＡであり、植物染色体への移行を促進するための特定の配列も含有する必要はない。植物細胞に核酸配列を導入するための他の方法は、本明細書に後述されている。
【０１１０】
特定の実施形態では、本発明は、本発明の構築物または核酸構築物システムを含む細胞を提供する。細胞は、大腸菌細胞またはアグロバクテリウム・ツメファシエンス細胞などの細菌細胞であってもよい。
【０１１１】
本発明の構築物または核酸構築物システムを含む細胞は、植物細胞であってもよい。特定の実施形態では、本発明は、ＴＲＶ−ＲＮＡ１ベクターおよびＴＲＶ−ＲＮＡ２ベクターの両方を含む植物細胞を提供する。多くの場合、ベクターそれ自体は細胞中に保持されないが、レプリコン部分は保持されており、したがって、特定の実施形態では、本発明は、ＴＲＶ−ＲＮＡ１レプリコンおよびＴＲＶ−ＲＮＡ２レプリコンを含む植物細胞を提供する。上記の代わりに、または上記に加えて植物細胞は、ＴＲＶレプリコンまたは構築物のいかなるレムナントも含まないＣＲＩＳＰＲ／ヌクレアーゼ活性の結果である遺伝子改変を含む。上記の代わりに、または上記に加えて細胞は、ヌクレアーゼをコードするレプリコンまたは構築物を含む。
【０１１２】
本発明の植物細胞は、細胞懸濁物またはカルスの形成過程にある細胞（例えば組織培養物）のように、培養細胞であってもよい。植物細胞は、生植物内または死植物内、または植物産物内にあってもよい。
【０１１３】
さらなる実施形態では、本発明は、本発明のＴＲＶ−ＲＮＡ１レプリコンおよび／またはＴＲＶ−ＲＮＡ２レプリコンを含む、好ましくは被包する、ウイルスまたはウイルス粒子を提供する。
【０１１４】
本明細書において使用される用語「植物」は、植物全体、植物の祖先、および子孫植物とその部位（種子、シュート、茎、根（塊茎を含む））、および植物の細胞、組織および器官を包含する。植物はいかなる形態であってもよく、懸濁培養、胚、成長点領域、カルス組織、葉、配偶体、胞子体、花粉および小胞子が含まれる。本発明の方法において特に有用な植物は、緑色植物スーパーファミリーに属するすべての植物、特に単子葉植物および双子葉植物である、下記に列挙する種から選ばれる飼料用（ｆｏｄｄｏｒ  ｏｒ  ｆｏｒａｇｅ）マメ、観賞植物、食用作物、樹木または低木を含む。Acacia spp.、Acer spp.、Actinidia spp.、Aesculus spp.、Agathis australis、Albizia amara、Alsophila tricolor、Andropogon spp.、Arachis spp、Areca catechu、Astelia fragrans、Astragalus cicer、Baikiaea plurijuga、Betula spp.、Brassica spp.、Bruguiera gymnorrhiza、Burkea africana、Butea frondosa、Cadaba farinosa、Calliandra spp、Camellia sinensis、Canna indica、Capsicum spp.、Cassia spp.、Centroema pubescens、Chacoomeles spp.、Cinnamomum cassia、Coffea arabica、Colophospermum mopane、Coronillia varia、Cotoneaster serotina、Crataegus spp.、Cucumis spp.、Cupressus spp.、Cyathea dealbata、Cydonia oblonga、Cryptomeria japonica、Cymbopogon spp.、Cynthea dealbata、Cydonia oblonga、Dalbergia monetaria、Davallia divaricata、Desmodium spp.、Dicksonia squarosa、Dibeteropogon amplectens、Dioclea spp、Dolichos spp.、Dorycnium rectum、Echinochloa pyramidalis、Ehraffia spp.、Eleusine coracana、Eragrestis spp.、Erythrina spp.、Eucalypfus spp.、Euclea schimperi、Eulalia vi/losa、Pagopyrum spp.、Feijoa sellowlana、Fragaria spp.、Flemingia spp、Freycinetia banksli、Geranium thunbergii、GinAgo biloba、Glycine javanica、Gliricidia spp、Gossypium hirsutum、Grevillea spp.、Guibourtia coleosperma、Hedysarum spp.、Hemaffhia altissima、Heteropogon contoffus、Hordeum vulgare、Hyparrhenia rufa、Hypericum erectum、Hypeffhelia dissolute、Indigo incamata、Iris spp.、Leptarrhena pyrolifolia、Lespediza spp.、Lettuca spp.、Leucaena leucocephala、Loudetia simplex、Lotonus  bainesli、Lotus spp.、Macrotyloma axillare、Malus spp.、Manihot esculenta、Medicago saliva、Metasequoia glyptostroboides、Musa sapientum、Nicotianum spp.、Onobrychis spp.、Ornithopus spp.、Oryza spp.、Peltophorum africanum、Pennisetum spp.、Persea gratissima、Petunia spp.、Phaseolus spp.、Phoenix canariensis、Phormium cookianum、Photinia spp.、Picea glauca、Pinus spp.、Pisum sativam、Podocarpus totara、Pogonarthria fleckii、 Pogonaffhria squarrosa、Populus spp.、Prosopis cineraria、Pseudotsuga menziesii、Pterolobium stellatum、Pyrus communis、Quercus spp.、Rhaphiolepsis umbellata、Rhopalostylis sapida、Rhus natalensis、Ribes grossularia、Ribes spp.、Robinia pseudoacacia、Rosa spp.、Rubus spp.、Salix spp.、Schyzachyrium sanguineum、Sciadopitys vefficillata、Sequoia sempervirens、Sequoiadendron giganteum、Sorghum bicolor、Spinacia spp.、Sporobolus fimbriatus、Stiburus alopecuroides、Stylosanthos humilis、Tadehagi spp、Taxodium distichum、Themeda triandra、Trifolium spp.、Triticum spp.、Tsuga heterophylla、Vaccinium spp.、Vicia spp.、Vitis vinifera、Watsonia pyramidata、Zantedeschia aethiopica、Zea mays、アマランス、アーティチョーク、アスパラガス、ブロッコリー、ブルッセル芽キャベツ、キャベツ、キャノーラ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、コラードグリーン、アマ、ケール、レンズマメ、アブラナ、オクラ、タマネギ、ジャガイモ、イネ、ダイズ、麦わら、サトウダイコン、サトウキビ、ヒマワリ、トマト、スカッシュティー（ｓｑｕａｓｈ  ｔｅａ）。上記の代わりに、藻類および他の非緑色植物を本発明のい���つかの実施形態の方法で使用することもできる。
【０１１５】
具体的な実施形態によれば、植物は双子葉植物である。
【０１１６】
具体的な実施形態によれば、植物は作物植物である。
【０１１７】
具体的な実施形態によれば、植物は園芸的価値があるものである。
【０１１８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、植物はPetunia hybridaを含む。
【０１１９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、植物はNicotiana tabacumを含む。
【０１２０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、植物はArabidopsis thaliana、Artemisia sp.、Artemisia annua、Beta vulgaris、Solanum tuberosum、Solanum pimpinellifolium、Solanum lycopersicum、Solanum melongena、Spinacia oleracea、Pisum sativum、Capsicum annuum、Cucumis sativus、Nicotiana benthamiana、Nicotiana tabacum、Zea mays、Brassica napus、Gossypium hirsutum cv. Siv'on、Oryza sativaおよびOryza glaberrimaからなる群より選択される。
【０１２１】
外来性遺伝子を単子葉植物および双子葉植物の両方に導入するための種々の方法がある（Potrykus, I., Annu. Rev. Plant. Physiol., Plant. Mol. Biol. (1991) 42:205-225、Shimamoto et al., Nature (1989) 338:274-276）。
【０１２２】
外来性ＤＮＡの植物ゲノムＤＮＡへの安定な組み込みを行うための基本的な方法には、２つの主なアプローチが含まれる。
【０１２３】
（ｉ）アグロバクテリウム仲介遺伝子移行：  Klee et al. (1987) Annu. Rev. Plant Physiol. 38:467-486；Molecular Biology of Plant Nuclear Genes, eds. Schell, J., and Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989)のCell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6におけるKlee and Rogers p. 2-25、Gatenby, in Plant Biotechnology, eds. Kung, S. and Arntzen, C. J., Butterworth Publishers, Boston, Mass. (1989) p. 93-112。
【０１２４】
（ｉｉ）直接ＤＮＡ取り込み：Molecular Biology of Plant Nuclear Genes eds. Schell, J., and Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989)のCell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6におけるPaszkowski et al. p. 52-68；プロトプラストへのＤＮＡの直接取り込み法を含む方法、Toriyama, K. et al. (1988) Bio/Technology 6:1072-1074。植物細胞の短い電気ショックによって誘導されるＤＮＡ取り込み： Zhang et al. Plant Cell Rep. (1988) 7:379-384、Fromm et al. Nature (1986) 319:791-793。粒子衝突法による導入による植物細胞または組織へのＤＮＡ注入、Klein et al. Bio/Technology (1988) 6:559-563；McCabe et al. Bio/Technology (1988) 6:923-926；Sanford, Physiol. Plant. (1990) 79:206-209、マイクロピペットシステムを使用する方法： Neuhaus et al., Theor. Appl. Genet. (1987) 75:30-36；Neuhaus and Spangenberg, Physiol. Plant. (1990) 79:213-217；細胞培養、胚またはカルス組織のガラス繊維またはシリコンカーバイトウイスカー形質転換：米国特許第５，４６４，７６５号、または発芽花粉とＤＮＡとの直接インキュベーションによる、DeWet et al. in Experimental Manipulation of Ovule Tissue, eds. Chapman, G. P. and Mantell, S. H. and Daniels, W. Longman, London, (1985) p. 197-209およびOhta, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83:715-719。
【０１２５】
アグロバクテリウムシステムは、植物ゲノムＤＮＡに組み込まれる規定のＤＮＡセグメントを含有するプラスミドベクターの使用を含む。植物組織の接種方法は、植物種およびアグロバクテリウム送達系に応じて変化する。広く使用される手法は、葉片手順であり、これは植物全体の分化の開始のために良好な原料を提供する、任意の組織外植片で実施され得る。Horsch et al. in Plant Molecular Biology Manual A5, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1988) p. 1-9。補足的手法は、アグロバクテリウム送達系を減圧浸潤と組合せて用いる。アグロバクテリウムシステムは、トランスジェニック双子葉植物の生成において特に有望である。
【０１２６】
植物細胞へ直接ＤＮＡを移行させるための種々の方法がある。電気穿孔法では、プロトプラストを、強い電場に短時間曝露する。微量注入では、非常に小さなマイクロピペットを使用してＤＮＡを直接細胞に機械的に注入する。粒子衝突法ではＤＮＡを硫酸マグネシウム結晶またはタングステン粒子などの微粒子（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）に吸着させ、微粒子を物理的に加速させては細胞または植物組織中に入れる。
【０１２７】
安定な形質転換に続いて、植物の増殖を実施する。植物増殖の最も一般的方法は、種子によるものである。しかし種子増殖による再生には、作物に均一性が欠如するというヘテロ接合性による欠陥が存在し、これは、種子はメンデルの法則によって支配される遺伝的変化に従って植物によって産生されるためである。基本的に種子は、それぞれが遺伝的に異なり、それぞれそれが固有の形質と共に成長する。したがって、再生された植物が親トランスジェニック植物と同一の形質および特徴を有するように形質転換植物を産生することが好ましい。したがって、形質転換植物の迅速で一貫した再生産が可能な、ミクロ増殖法によって形質転換植物が再生されることが好ましい。
【０１２８】
ミクロ増殖は、選択された親植物または栽培品種から切り出された１つの組織片から新世代の植物を成長させる手法である。この手法は、融合タンパク質を発現する好ましい組織を有する植物の大量再生産を可能にする。産生される新世代植物は、元の植物と遺伝的に同一であり、そのすべての特徴を有する。
【０１２９】
ミクロ増殖は、短期間で良質の植物材料の大量産生を可能にし、元のトランスジェニック植物または形質転換植物の特徴の保存における、選択された栽培品種の迅速な増殖を提供する。クローニング植物の有利な点は、植物増殖の速度ならびに産生される植物の品質および均一性である。
【０１３０】
ミクロ増殖は、複数の工程からなる手法であって、工程間の培養培地または成長条件の変更を必要とする。それによりミクロ増殖手法には４つの基本的な工程が含まれる：  工程１、初期組織培養；工程２、培養組織の増殖；工程３、分化および植物形成；ならびに工程４、温室における培養および馴化。工程１、初期組織培養では、培養組織を確立し、混入物がないことを認証する。工程２では、生産目標を達成するのに十分な数の組織試料を得るために、初期培養組織を増殖させる。工程３では、工程２で成長した組織試料を分割し、個々の苗に成長させる。工程４では、形質転換植物の苗を馴化のための温室に移動し、天然の環境で成長できるように、植物の光耐性を徐々に高めてゆく。
【０１３１】
安定な形質転換が現在好ましいが、葉細胞、成長点細胞または植物全体の一過性形質転換も本発明のいくつかの実施形態において想定される。
【０１３２】
一過性形質転換は、上記の直接ＤＮＡ移行方法のいずれかによって、または改変植物ウイルスを用いたウイルス感染によって実施可能である。
【０１３３】
植物宿主の形質転換に有用であることが示されているウイルスには、ＣａＭＶ、ＴＭＶおよびＢＶが含まれる。植物ウイルスを使用する植物の形質転換は、米国特許第４，８５５，２３７号（ＢＧＶ）、ＥＰ−Ａ６７，５５３（ＴＭＶ）、特開昭６３−１４６９３号（ＴＭＶ）、ＥＰＡ１９４，８０９（ＢＶ）、ＥＰＡ２７８，６６７（ＢＶ）およびGluzman, Y. et al., Communications in Molecular Biology: Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, pp. 172-189 (1988)に記載されている。植物を含む多数の宿主に外来性ＤＮＡを発現させるために使用される偽ウイルス粒子は、ＷＯ８７／０６２６１に記載されている。
【０１３４】
植物における非ウイルス外来性核酸配列の導入および発現のための植物ＲＮＡウイルスの構築は、上述した文献、ならびにDawson, W. O. et al., Virology (1989) 172:285-292；Takamatsu et al. EMBO J. (1987) 6:307-311；French et al. Science (1986) 231:1294-1297；およびTakamatsu et al. FEBS Letters (1990) 269:73-76において説明されている。
【０１３５】
ウイルスがＤＮＡウイルスである場合、好適な改変をウイルスそのものに行ってもよい。外来性ＤＮＡを含む所望のウイルスベクターの構築を容易にするために、上記の代わりに、初めにウイルスを細菌プラスミドにクローニングしてもよい。次いでウイルスを、プラスミドから切り出してもよい。ウイルスがＤＮＡウイルスである場合、細菌の複製開始点をウイルスＤＮＡに結合し、それをは細菌によって複製させてもよい。このＤＮＡの転写および翻訳は、ウイルスＤＮＡをキャプシド形成するコートタンパク質を産生する。ウイルスがＲＮＡウイルスである場合、ウイルスは一般にｃＤＮＡとしてクローニングされ、プラスミドに挿入される。次いでプラスミドは、構築物の全てを作製するために使用される。次に、プラスミドのウイルス配列を転写し、ウイルス遺伝子を翻訳してウイルスＲＮＡをキャプシド形成する１種以上のコートタンパク質を産生することによって、ＲＮＡウイルスを産生する。
【０１３６】
本発明のいくつかの実施形態の構築物に含まれるものなどの、非ウイルス性外来性核酸配列を植物に導入し、発現させるための植物ＲＮＡウイルスの構築は、上記文献および米国特許第５，３１６，９３１号に説明されている。
【０１３７】
一実施形態では、ウイルス核酸から本来のコートタンパク質コード配列が欠失され、本来のものではない植物ウイルスコートタンパク質コード配列および本来のものではないプロモーター（好ましくは本来のものではないコートタンパク質コード配列のサブゲノムプロモーター）が挿入された植物ウイルス核酸が提供される。挿入された配列は、植物宿主における発現、組換え植物ウイルス核酸のパッケージング、および組換え植物ウイルス核酸による宿主の全体的感染を確実にすることが可能なものである。上記の代わりに、コートタンパク質遺伝子に本来のものではない核酸配列を挿入し、タンパク質が産生されるようにすることで、不活化することもできる。組換え植物ウイルス核酸は、１つまたは複数の付加的な、本来のものではないサブゲノムプロモーターを含有してもよい。本来のものではないサブゲノムプロモーターは、それぞれ、植物宿主中の隣接する遺伝子または核酸配列を転写または発現させることができ、且つ互いにおよび本来のサブゲノムプロモーターとの組換えはできないものである。本来のものではない（外来性の）核酸配列は、複数の核酸配列を含む場合には、本来の植物ウイルスサブゲノムプロモーターに隣接するように、または本来の植物ウイルスサブゲノムプロモーターおよび本来のものではない植物ウイルスサブゲノムプロモーターに隣接するように挿入されてもよい。本来のものではない核酸配列は、所望の産物を産生するように、サブゲノムプロモーターの調節下で、宿主植物において転写または発現される。
【０１３８】
第２の実施形態では、組換え植物ウイルス核酸は第１の実施形態と同様に提供されるが、但し、本来のコートタンパク質コード配列ではなく、本来のものではないコートタンパク質サブゲノムプロモーターの中の１つに隣接して配置されている。
【０１３９】
第３の実施形態では、天然コートタンパク質遺伝子がそのサブゲノムプロモーターに隣接し、１つまたは複数の本来のものではないサブゲノムプロモーターがウイルス核酸に挿入されている、組換え植物ウイルス核酸が提供される。挿入された本来のものではないサブゲノムプロモーターは、植物宿主において隣接する遺伝子を転写または発現させることができるが、互いの組み換え、および天然のサブゲノムプロモーターとの組換えはできないものである。本来のものではない核酸配列は、当該配列が宿主植物において所望の産物を産生するようにサブゲノムプロモーターの調節下で転写または発現されるように、本来のものではないサブゲノム植物ウイルスプロモーターに隣接して挿入されてもよい。
【０１４０】
第４の実施形態では、組換え植物ウイルス核酸は、第３の実施形態の場合と同様に提供されるが、但し、本来のコートタンパク質コード配列が本来のものではないコートタンパク質コード配列によって置換されている。
【０１４１】
ウイルスベクターは、組換え植物ウイルス核酸のコードするコートタンパク質によってキャプシド形成されて、組換え植物ウイルスを産生する。組換え植物ウイルス核酸または組換え植物ウイルスは、適切な宿主植物を感染させるために使用される。組換え植物ウイルス核酸は、所望のタンパク質を産生するための、宿主における複製、宿主における全体への拡散、所望のタンパク質の産生のための、宿主における１種以上の外来性遺伝子（単離された核酸）の転写または発現を行うことができる。
【０１４２】
上記に加えて、本発明のいくつかの実施形態の核酸分子は、クロロプラストゲノムに導入されてもよく、それによりクロロプラストでの発現が可能になる。
【０１４３】
外来性核酸配列をクロロプラストのゲノムに導入するための技術は周知である。この技術は、次の手順を含む。最初に、細胞あたりのクロロプラストの数を約１に低減するように植物細胞を化学的に処理する。次いで、少なくとも１つの外来性核酸分子をクロロプラストに導入することを目的として、粒子衝突法により、外来性核酸を細胞に導入する。外来性核酸は、クロロプラストに固有の酵素によって容易に実行される相同組換えによって、クロロプラストゲノムに組み込まれるように、選択する。この目的を達成するために、外来性核酸は、目的の遺伝子に加えて、クロロプラストゲノム由来の少なくとも１つの核酸伸長鎖を含む。さらに外来性核酸は選択マーカーを含み、これは連続的な選択手順によって、選択後のクロロプラストゲノムのすべてまたは実質的にすべてのコピーが外来性核酸を含むことの確認のために機能する。この技術に関連するさらなる詳細は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，９４５，０５０号および第５，６９３，５０７号から見出すことができる。したがってポリペプチドは、クロロプラストのタンパク質発現系によって産生されて、クロロプラストの内膜に組み込まれてもよい。
【０１４４】
本構築物を使用して、任意のＤＮＡ含有オルガネラの植物ゲノムについて、変異体を生成することができる。
【０１４５】
興味深いことに、本発明者らは、そのような遺伝的変異が（交配後に）遺伝性であり、少なくとも２世代に渡って安定であることを見出した。
【０１４６】
本明細書において使用される「遺伝子型変異」という表現は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド配列（少なくとも２ヌクレオチド）が予め決定されたゲノム部位で選択的に変更されるか、変異される工程を指し、変異誘発とも称される。ゲノム部位は、コード性のゲノム部位または非コード性のゲノム部位（例えば、プロモーター、ターミネーター、スプライス部位、ポリＡ）でもよい。この変更は、標的遺伝子中へのＤＮＡ２本鎖切断（ＤＳＢ）の形成に続く、１種以上の核酸の欠失、１種以上の核酸の無作為挿入、所望の配列を保有する異種核酸の導入、または相同組換えの結果でもよい。本教示による遺伝子型変異は、一過性でも、安定でもよい。本教示による遺伝子型変異は典型的にはＤＳＢの形成によって行われるが、本発明では、１本鎖の変異も範囲内である。遺伝子型変異は、表現型変異と関連するものでもよい。本教示の配列特異的または部位特異的な性質は、したがって、表現型変異を特異的に設計するように使用され得る。
【０１４７】
２つの植物発現ベクターを同じ植物細胞に導入してもよいことを理解されたい。これら２つの植物発現ベクターは、植物細胞に同時にまたは別々の時期に導入されてもよい。そのような２つの発現ベクターは、異なる異種配列をコードする核酸配列を含んでもよい。例えば、ｓｇＲＮＡ（ｐＴＲＶ２）ａ  ｐＴＲＶ１をコードする核酸配列を含む発現ベクターと、ヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９またはＲＩＳＣ）をコードする核酸ベクターである。３つの発現ベクターを、例えば１：１：１の比で同時に導入し、植物細胞における異種遺伝子の発現を可能にすることもできる。
【０１４８】
次のセクションは、そのような変異を生成するための、非限定的な応用例を提供する。
【０１４９】
本発明のいくつかの実施形態のＣＲＩＳＰＲ／ヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９またはＲＩＳＣ）複合体は、配列特異的に無作為に挿入された核酸からなる署名を作製するために使用されてもよく、本明細書においてタグ化とも称される。この署名は、「遺伝子マーク」として使用され得る。この用語は、本明細書において一般的な用語である「遺伝子マーカー」とは区別して使用される。後者の用語が集団中の個体において天然に存在する遺伝的変異を指す一方で、本明細書において使用される用語、遺伝子マークは、人工的な（人が生成した）、検出可能な遺伝的変異であって、遺伝性であってもよいものを特異的に示す。
【０１５０】
ＤＳＢは、植物の表現型に影響を与えないように、典型的には非コード領域（非オープンリーディングフレームの配列）に対して、（例えばタグ化のために）導入される。しかしタグ化は、コード領域に対して行ってもよい。高品質の遺伝子マークは、植物のゲノムに固有なように選択し、世代を通じて導入され得る配列変異を確実にする。
【０１５１】
いくつかの目的、例えば規制目的で商業的に流通される植物に公知のマークを付けることは、規制当局が容易にマークを同定し、マークを付けた生物の製造者、販売業者、所有者または使用者を同定できることから望ましい場合がある。他の目的のためには、機密保持が有利な場合がある。例えば、知的財産法によって保護された最高製品の遺伝子マークの遺伝的改変の試みを妨害するためには、後者が妥当である。
【０１５２】
規制の対象でもある、知的財産で保護された生物は、したがって本発明の有用な実施形態によれば、（ａ）公知である少なくとも１つの固有のＤＮＡ配列；および（ｂ）少なくとも遺伝子マークとしては公知ではない、少なくとも１つの固有のＤＮＡ配列によって遺伝子的にマークされている。
【０１５３】
異種配列（例えばコード配列または非コード配列）を導入するために、本明細書に記載のように、初めにＤＳＢを植物ＤＮＡに作製する。外来性ＤＮＡの組み込みがこれらのＤＮＡ切断部位において高頻度で生じることは当業者に十分周知である［Salomon et al., EMBO J (1998) 17: 6086-6095；Tzfira et al., Plant Physiol (2003) 133: 1011-1023；Tzfira et al., Trends Genet (2004) 20: 375-383、Cai et al. (2009) Plant Mol Biol. Accepted: 14 Dec. 2008］。一旦、標的細胞中に、例えばエピソームプラスミド上に、存在すると、外来性ＤＮＡは、植物ＤＮＡ中にＤＳＢを生成するためにＣＲＩＳＰＲ／ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９またはＲＩＳＣ）複合体を使用してプラスミドから切り出すことができる。エピソームプラスミドから放出された外来性ＤＮＡは、次いで植物非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）タンパク質によって細胞ＤＮＡに組み込まれる。ＤＳＢは、植物細胞において相同組換え（ＨＲ）に基づく遺伝子標的化の増強ももたらし得る（Puchta et al. Proc Natl Acad Sci USA (1996) 93: 5055-5060）。
【０１５４】
述べたとおり、本教示は遺伝子型変異を作製するために使用され得る。したがってＣＲＩＳＰＲ／ヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９またはＲＩＳＣ）複合体は、目的の異種遺伝子を導入するために、目的の遺伝子座のコード領域または非コード領域にＤＳＢを生成するように設計することができる。植物ゲノム中のそのような変更は、植物遺伝子発現（上記本明細書に詳細に記載されている）および植物の表現的特徴（例えば色、香りなど）に対して、付加または変更を結果的にもたらし得る。
【０１５５】
さらに、ＣＲＩＳＰＲ／ヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９またはＲＩＳＣ）複合体は、遺伝子発現をノックアウトすることによって遺伝子型変異を作製するために使用され得る。よって、ＣＲＩＳＰＲ／ヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９またはＲＩＳＣ）複合体を、目的の遺伝子座のコード領域または非コード領域中にＤＳＢを作製するように設計して、非センス突然変異またはミスセンス突然変異を誘導してもよい。上記の代わりに、１組のＣＲＩＳＰＲ／ヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９またはＲＩＳＣ）複合体（例えば、または同じものの組合せ）を、ゲノムの配列全体を切り出すために使用することで、遺伝子発現をノックアウトすることもできる。
【０１５６】
本発明のＣＲＩＳＰＲ／ヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９またはＲＩＳＣ）複合体は、植物の配偶子および種子中に遺伝子型変異を誘導するために使用してもよい。それにより本発明のＣＲＩＳＰＲ／ヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９またはＲＩＳＣ）複合体は、配偶子中に特異的または非特異的な突然変異を誘導するために使用されてもよく、受精後に遺伝子型で改変された種子およびその結果として改変植物をもたらす。
【０１５７】
本発明のＣＲＩＳＰＲ／ヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９またはＲＩＳＣ）複合体は、植物のカルスに対して遺伝子型変異を誘導するために使用されてもよい。それにより本発明のＣＲＩＳＰＲ／ヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９またはＲＩＳＣ）複合体は、未成熟胚の胚盤および成熟胚の胚盤細胞を含む胚形成カルス細胞、第１節由来カルスの細胞、分裂実生節、分裂種子、実生の内側の葉の葉鞘、および受精した胚襄の接合子に、特異的または非特異的な突然変異を誘導するために使用することができる。
【０１５８】
本発明の植物カルスが植物全体に分化（例えば再生）可能であり、それにより遺伝子型変異を含む植物を生成できることを理解されたい。
【０１５９】
本発明のヌクレオチド（ｓｇＲＮＡ）／ヌクレアーゼ（例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＲＩＳＣ）複合体は、植物のゲノムに非特異的突然変異を導入することによって変異体を作製するために使用することもできる。
【０１６０】
さらに本発明のｓｇＲＮＡ（例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＲＩＳＣ）複合体は、植物病原体による感染と闘うために使用してもよい。
【０１６１】
したがって、本発明は、病原体による植物の感染を処置する方法を想定する。病原体耐性植物の作製を含む方法は、本発明のいくつかの実施形態の発現ベクターを植物に導入することを含む方法であって、ｓｇＲＮＡ／ヌクレアーゼ（例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＲＩＳＣ）複合体の核酸結合ドメインが、病原体に対する感受性を付与する遺伝子へのヌクレアーゼの特異的標的化を仲介し、それにより病原体耐性植物を作製する。
【０１６２】
本明細書において使用される「植物病原体」は、植物において疾患の原因となる生物を指す。感染性疾患を生じる生物は、真菌、卵菌、細菌、ウイルス、ウイロイド、ウイルス様生物、フィトプラズマ、原虫、線形動物および寄生植物を含む。
【０１６３】
植物の病原体感染のために必要な遺伝子を欠いた植物を作製することが望ましい。したがって、一実施形態によれば、病原体に対する感受性を付与する遺伝子をノックアウトすることで、病原体への耐性を増加させる。
【０１６４】
本発明は、植物において雄性不稔をもたらす方法も想定する。この方法は、雄性不稔に関連するミトコンドリアまたはクロロプラスト中の構造遺伝子または機能遺伝子を植物において上方制御することを含み、本発明のいくつかの実施形態の植物発現ベクターと、ミトコンドリアまたはクロロプラストのゲノムを標的とした場合に、ミトコンドリアまたはクロロプラストの当該構造遺伝子または機能遺伝子を上方制御することのできる少なくとも１つの異種性核酸配列を含む核酸発現構築物とを、植物に導入することによって上方制御し、ここでｓｇＲＮＡ（例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＲＩＳＣ）複合体のｓｇＲＮＡは、ミトコンドリアまたはクロロプラストのゲノムへの特異的標的化を仲介し、それにより植物において雄性不稔をもたらす。
【０１６５】
したがって、例えば核酸発現構築物は、（例えばＣＭＳ関連遺伝子の）コード異種性核酸配列、または（例えばＣＭＳ関連遺伝子の発現を増強するための強力なプロモーターの）非コード異種性核酸配列と、ｓｇＲＮＡ（例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＲＩＳＣ）複合体（ミトコンドリアゲノムまたはクロロプラストゲノム上のものと同一のもの）のための結合部位を含む。ｓｇＲＮＡ／ヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９またはＲＩＳＣ）複合体による切断の際には、異種性核酸配列はクロロプラストまたはミトコンドリアのゲノム中の予め決定された部位に挿入される。
【０１６６】
本明細書で上述したように、細胞質性雄性不稔（ＣＭＳ）は、ミトコンドリアの機能障害と関連する。このため、ｓｇＲＮＡ／ヌクレアーゼ（例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＲＩＳＣ）複合体は、（既に詳細に上述した）ミトコンドリア局在化シグナル、およびミトコンドリアゲノムに特異的な切断部位を含むように設計される。上方制御され得る具体的な遺伝子は、これらに限らないが、ｎａｄ３およびｒｐｓ１２の近傍に配置されているペチュニアｐｃｆキメラ、Ｂ−ａｔｐ６遺伝子（すなわちｏｒｆ７９）の下流のイネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）配列、トウモロコシのＴ−ｕｒｆ１３およびｏｒｆ２２１、ａｔｐＡの下流のＨｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｓｐ．ｏｒｆ２３９、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｓｐ．のａｔｐ６の上流のｏｒｆ（例えばｏｒｆ１３９、ｏｒｆ２２４またはｏｒｆ１３８およびｏｒｆ１５８）を含む。ＣＭＳを誘導するために、これらのゲノム配列は、典型的には植物において転写される。故に、本発明の教示は、上述した方法を用いて、（例えばコード配列を付加することによって）これらの配列を標的とすること、またはこれらの過剰発現によるＣＭＳの達成を想定していると理解されたい。
【０１６７】
核ゲノムとミトコンドリアゲノムとの間の不適合性によって生じるＣＭＳ表現型は、同系交配を予防し、ハイブリッド産生を有利にする重要な農学的形質として使用されることを理解されたい。
【０１６８】
上述したように、ＣＭＳの誘導は、β−ケトチオラーゼなどのクロロプラスト遺伝子の過剰発現によっても達成され得る。クロロプラストゲノムによるβ−ケトチオラーゼの過剰発現は、ＣＭＳを誘導することが既に報告されている［Ruiz et al (2005) Plant Physiol. 138 1232-1246］。したがって、本教示もまた、上述した方法を用いて、クロロプラスト遺伝子の標的化またはその（例えばβ−ケトチオラーゼの）過剰発現によるＣＭＳの達成を想定していると理解されたい。
【０１６９】
本発明は、除草剤耐性植物の作製方法をさらに想定している。この方法は、本発明のいくつかの実施形態の植物発現ベクターを植物に導入することを含み、複合体（例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＲＩＳＣ）のｓｇＲＮＡドメインは、除草剤に対する感受性を付与する遺伝子への特異的標的化を仲介し、それにより除草剤耐性植物を作製する。
【０１７０】
遺伝的に改変された植物の分野においては、除草剤に対して耐性を有する植物の遺伝子工学的作製が強く望まれることを理解されたい。さらに、大部分の除草剤は、植物細胞小器官内（例えばクロロプラスト内）の経路を標的とする。よって、除草剤耐性植物を作製するためには、ｓｇＲＮＡ／ヌクレアーゼ（例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＲＩＳＣ）複合体を、（詳細に上述したような）クロロプラスト局在化シグナルと、クロロプラストゲノムに特異的な切断部位とを含むように設計する。クロロプラストゲノムにおいて標的とされ得る具体的な遺伝子としては、これらに限定されないが、クロロプラスト遺伝子ｐｓｂＡ（光合成キノン結合膜タンパク質ＱＢをコードする、除草剤アトラジンの標的）およびＥＰＳＰ合成酵素の遺伝子（核遺伝子であるが、その過剰発現またはクロロプラスト中の蓄積は、ＥＰＳＰの転写速度を増加させ、酵素の代謝回転を低減することによって植物を除草剤グリホサートに対して耐性にする）が挙げられる。
【０１７１】
上記の代わりに、植物で発現されると除草剤への耐性を与えるタンパク質（例えば、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）の発現を上方制御することによって、植物に除草剤耐性を誘導してもよい。したがって、除草剤耐性を付与するタンパク質の発現のために、異種性核酸配列（例えばホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）を含む核酸発現構築物を植物に導入する。
【０１７２】
同様に提供されるのは、非生物的ストレス耐性が増加した植物の作製方法であって、植物に本明細書に記載の核酸構築物を導入することを含み、前記（ｓｇＲＮＡ）は、植物に非生物的ストレスに対する感受性を付与する遺伝子の標的配列中の配列特異的切断を仲介し、それにより非生物的ストレス耐性が増加した植物を作製する。
【０１７３】
本明細書において使用される「非生物的ストレス」という用語は、植物の代謝、成長、生殖および／または生存への任意の有害作用を指す。したがって非生物的ストレスは、例えば塩分、浸透圧ストレス、水分欠乏、渇水、洪水、凍結、低温もしくは高温、重金属毒性、嫌気状態、栄養素欠乏（例えば、窒素欠乏もしくは窒素制限）、大気汚染またはＵＶ照射などの、最適下限の環境成長条件によって誘導され得る。
【０１７４】
本明細書において使用される「非生物的ストレス耐性」という用語は、代謝、成長、生産性および／または生存に実質的な変更を受けることなく、非生物的ストレスを耐える植物の能力を指す。
【０１７５】
本明細書において使用される用語「約」は±１０％を指す。
【０１７６】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」およびそれらの活用形は「含むが、これらに限定されない」を意味する。
【０１７７】
用語「からなる」は「含み、これらに限定される」を意味する。
【０１７８】
用語「から本質的になる」は、組成物、方法または構造が追加の成分、工程および／または部分を含んでもよいが、但し、追加の成分、工程および／または部分が請求項に規定の組成物、方法または構造の基本的な且つ新規な特徴を物質的に変更しない場合にのみ含んでよいことを意味する。
【０１７９】
本明細書において使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が他を明確に示す場合を除いて、複数に対する参照も含むものとする。例えば用語「化合物」または「少なくとも１種の化合物」は、複数の化合物を含み、そこには混合物も含まれる。
【０１８０】
本出願全体を通じて、本発明の種々の実施形態を範囲形式で提示する場合がある。範囲形式での記載は単に便宜上および簡潔さのためであり、本発明の範囲についての柔軟性のない限定と解釈されるべきでないことを理解されたい。したがって範囲の記載は、その範囲内の可能な全ての副範囲のみならず、その範囲内の個々の数値も含むものと解釈すべきである。例えば、１から６という範囲の記載は、１から３、１から４、１から５、２から４、２から６、３から６などの副範囲、および範囲内の個々の数、例えば１、２、３、４、５および６を具体的に開示すると見なすべきである。これは、範囲の幅にかかわらず適用される。
【０１８１】
本明細書において数値範囲が示される場合、常にその範囲内の任意の引用された数字（分数または整数）を含むことを意味する。最初に示された数と２番目に示された数「との間の範囲におよぶ／およんでいる」と、最初に示された数「から」２番目に示された数「までの範囲におよぶ／およんでいる」という表現は、本明細書で互換的に用いられ、最初および２番目に示された数ならびにそれらの間のすべての分数および整数を含むことを意味する。
【０１８２】
本明細書において使用される用語「方法」は、所望の課題を達成するための様式、手段、技術および手順であって、これらに限定されるものではないが、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の実務家に周知の様式、手段、技術および手順、または周知の様式、手段、技術および手順から容易に開発されるものを含む。
【０１８３】
特定の配列表に参照する場合、そのような参考は、微少な配列の変異を含む、相補鎖に実質的に対応する配列をも包含するものと理解されたい。配列の変異は、例えばシーケンシングエラー、クローニングエラー、または塩基置換、塩基欠失もしくは塩基付加を生じる他の変化の結果であるが、但し、このような変異の頻度は５０ヌクレオチド中に１未満、または１００ヌクレオチド中に１未満、または２００ヌクレオチド中に１未満、または５００ヌクレオチド中に１未満、または１０００ヌクレオチド中に１未満、または５，０００ヌクレオチド中に１未満、または１０，０００ヌクレオチド中に１未満である。
【０１８４】
本発明のある特性が、明瞭さのために、別々の実施形態に関連して記載されている場合でも、これら特性は組み合わされて１つのの実施形態として提供可能であることを理解されたい。反対に、簡潔さのために、１つの実施形態に関連して記載されている本発明の種々の特性は、個別に、または好適な部分的組み合わせ、または好適であると考えられる、ここに記載した本発明の他の実施形態として提供してもよい。種々の実施形態に関連して記載された特定の特性は、これらの要素無しでは実施形態が実施不可能である場合を除いて、これらの実施形態の必須要件と見なすものではない。
【０１８５】
上記のように説明し、後述する特許請求の範囲で請求する本発明の種々の実施形態および態様についての実験的なサポートが、次の実施例によって提供される。
【０１８６】
実施例
下記実施例に参照するが、上記説明と共に、これらは本発明を限定することなく説明するものである。
【０１８７】
一般的に、本明細書で使用される命名法、および本発明に用いる実験手順は、分子技術、生化学的技術、微生物学的技術および組換えＤＮＡ技術を含む。そのような技術は、文献において完全に説明されている。例えば下記を参照されたい。"Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998);下記に記載の手法：米国特許第４，６６６，８２８号、第４，６８３，２０２号、第４，８０１，５３１号、第５，１９２，６５９号および第５，２７２，０５７号；"Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980);入手可能な免疫アッセイは特許文献および科学論文に詳細に記載されており、例えば、下記を参照：米国特許第３，７９１，９３２号、第３，８３９，１５３号、第３，８５０，７５２号、第３，８５０，５７８；３，８５３，９８７号、第３，８６７，５１７号、第３，８７９，２６２号、第３，９０１，６５４号、第３，９３５，０７４号、第３，９８４，５３３号、第３，９９６，３４５号、第４，０３４，０７４号、第４，０９８，８７６号、第４，８７９，２１９号、第５，０１１，７７１号、および第５，２８１，５２１号； "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); “Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996)。これらすべては、本明細書に完全に記載されたのと同様に、参照により本発明に組み込まれる。他の一般的な参考文献を、本明細書を通じて提供する。それらに記載された手順は、当技術分野において十分周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。それらに含まれるすべての情報は、参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例１】
【０１８８】
ＧＲＮＡ発現ｐＴＲＶ２ベクターは、内在性遺伝子および外来性遺伝子を効率的に標的化できる
材料および方法
ベクターの構築
ｓｇＲＮＡのｐＴＲＶ２ベクターへのクローニング
リボザイム−ＲＮＡ−リボザイムカセットとしてのｓｇＲＮＡのクローニングは、Yangbin Gao and Yunde Zhaoの次の論文に従って実施した："Self-processing of ribozyme-flanked RNAs into guide RNAs in vitro and in vivo for CRISPR-mediated genome editing".  J. Integr. Plant Biol. 2014 Apr;56(4):343-9。
【０１８９】
ＲＮＡ分子は、ハンマーヘッド型リボザイム（Pley et al. 1994（配列番号４））を５’末端に、ｎｐｔＩＩ遺伝子（配列番号１）またはＰＤＳ遺伝子（配列番号２）を標的とするガイドＲＮＡを中央に、そして肝炎デルタウイルス（ＨＤＶ）リボザイム（Ferre-D’Amare et al. 1998（配列番号５））を含有するように設計した。リボザイム−ＲＮＡ−リボザイムカセットは、５’および３’末端にそれぞれＨｉｎｄＩＩＩ部位およびＢｇｌＩＩ部位を有する直鎖状ＤＮＡとして作製した。カセットのｐＴＲＶ２  Δ２ｂ：［２ｓｇＰｒｏｍｏｔｅｒ−ＤｓＲｅｄ］へのクローニングは、これらの制限酵素を使用して行った。これら酵素による消化によって、ウイルスベクター構築物からＴＲＶコートタンパク質（ＣＰ）遺伝子を除去し、代わりにリボザイム−ＲＮＡ−リボザイムを配置した（配列番号２１および２２）。
【０１９０】
ＱＱＲ−ｓｇＲＮＡ（ＱＱＲ＝２４ｎｔ配列（ｔｔｃｔｔｃｃｃｃｔｃｃｔｇａｇｇｇｇａａｇａａ、配列番号２６）は、ＡＴＧコドンの下流のＧＵＳ遺伝子に挿入された終止コドンを含む。このカセットを、ｐＴＲＶ２−Δ２ｂにＣＰ遺伝子の５’側ののＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングした。次いでＴＲＶのＣＰ遺伝子をＢｇｌＩＩ消化によって完全に除去し、ＣＰ遺伝子（配列番号６）を含まないプラスミドに再ライゲーションした。図１Ａ〜Ｆを参照されたい。
【０１９１】
ＴＲＶベクターをレポーター遺伝子の付加によって、ＱＱＲ−ｓｇＲＮＡを含むｓｇＲＮＡ：ｐＴＲＶ２  ΔＣＰ−Δ２ｂだけを発現するように改善した。このレポーター遺伝子は、ｓｇＲＮＡと、レポーター遺伝子および付随する蛍光タンパク質の両方の発現によって、ＴＲＶによる植物全体の感染の追跡を可能にするものである。クローニングは、２つのサブゲノムプロモーター（ウイルスプロモーター名：ＴＲＶ  ２ｂ−ＰｒｏおよびＰＥＢＶ  ｃｐ−Ｐｒｏ）ならびにＤｓＲｅｄ２遺伝子（配列番号１８）を含有するＰＣＲ増副産物を挿入することによって行った。この増副産物を、ＢｇｌＩＩおよびＳｍａＩで予め消化したＱＱＲ−ｓｇＲＮＡを含むｐＴＲＶ２  ΔＣＰ−Δ２ｂの配列にライゲーションした。
【０１９２】
Ｃａｓ９タンパク質（配列番号１９）を含むバイナリープラスミドｐＫ７ＷＧＦ２−ｈＣａｓ９を、図１Ｆに例示するＣａｓ９のための発現ベクターとして使用した。
【０１９３】
植物材料および接種
ＮｐｔＩＩ（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ）を過発現するＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物を獲得するために、野生型Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの葉片にｐＣＧＮ１５５９ベクターを保有するＥＨＡ１０５アグロバクテリウムを接種した（Ben-Zvi et al., 2008）。ＮｐｔＩＩ耐性小植物を回収し、自家受粉し、それらのＦ１後代をさらなるＴＲＶ接種のために使用した。
【０１９４】
Ｃａｓ９／ｍＧＵＳ過発現Ｎ．ｔａｂａｃｃｕｍ植物を獲得するために、ｍＧＵＳ過発現Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｃｕｍ植物（Marton et al., 2010）を、ｅＧＦＰ−ｈＣａｓ９過発現植物（Nekrasov et al, 2013）と交配して、さらなるＴＲＶ接種のために使用したＦ１後代を得た。
【０１９５】
葉浸潤アッセイのために、公知の記載（Sugimoto and Meyerowitz 2013）に従い、ＮｐｔＩＩ過発現Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ種子を気相方法によって表面滅菌に付した。次いで滅菌種子を個々にペトリ皿中の、以下の成分を添加した、１／４濃度のＭｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）培地（米国、Ｃａｉｓｓｏｎ社）に播種した：適切なビタミン、１％（ｗ／ｖ）ショ糖、２００ｍｇ  Ｌ−１カナマイシンおよび０．８％アガロース。１０日目のカナマイシン耐性小植物を馴化のために鉢に移した。葉浸潤アッセイ（Sparkes et al., 2006）を使用したウイルス接種に供する前に、植物を初めに３週間育成した。さらに具体的には、アグロバクテリウム培養物を４０ｍｇ  Ｌ−１カナマイシンを添加したＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地中で２８℃、２５０ｒｐｍで一晩増殖させた。次いで細胞を遠心分離によって回収し、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１００μＭアセトシリンゴンからなる浸潤緩衝液中にＯＤ６００が５となる濃度で再懸濁した。ｐＴＲＶ１を保持しているアグロバクテリウム細菌懸濁物を、ｐＴＲＶ２を保持しているアグロバクテリウム懸濁物およびＣａｓ９発現カセットを含むバイナリープラスミドを保有するアグロバクテリウム懸濁物と１：１：１の割合で混合した。次いで混合培養物を浸潤緩衝液で最終的なＯＤ６００が０．５になるように１０倍希釈した。次いでアグロバクテリウム懸濁物を、個々のＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物の１組の葉の背軸面に注入した。接種した植物を試料採取まで２５℃の温室で成長させた。
【０１９６】
Ａｇｒｏ浸漬（ｄｉｐｐｉｎｇ）アッセイのために、ｍＧＵＳ過発現Ｎ．ｔａｂａｃｃｕｍ植物とｅＧＦＰ−ｈＣａｓ９過発現Ｎ．ｔａｂａｃｃｕｍ植物との間の交配から得られたＦ１種子を、表面滅菌し、個々にペトリ皿中の、以下の成分を添加した、１／４濃度のＭＳ培地に播種した：適切なビタミン、１％（ｗ／ｖ）ショ糖、２００ｍｇ  Ｌ−１カナマイシンおよび０．８％アガロース。アグロバクテリウム培養物を上記のとおりに調製した。ｐＴＲＶ１細菌性懸濁物をｐＴＲＶ２懸濁物と１：１の割合で混合した。次いで混合した培養物を浸潤緩衝液で最終的なＯＤ６００が０．５になるように１０倍希釈した。約１５０個の１４日目のカナマイシン耐性実生をアグロバクテリウム溶液に浸し、２分間減圧した。処理後、実生をＭＳ培地ペトリ皿（適切なビタミン、１％（ｗ／ｖ）ショ糖および０．８％アガロースを添加したもの）に移し、４８時間暗所に置いた。次いで実生を、新たなＭＳ培地ペトリ皿（適切なビタミン、１％（ｗ／ｖ）ショ糖、３００ｍｇ  Ｌ−１カルベニシリンおよび０．８％アガロースを添加したもの）再度移し、最初の７２時間は、回復のために点灯した成長室に置いた。ＧＵＳ活性を分析するために、接種５日後に実生を１０ｍｌ  Ｘ−ｇｌｕｃ溶液（Jefferson, 1986）に移し、３７℃で一晩インキュベートし、青色ＧＵＳ染色が検出可能になるまで７０％エタノール溶液で３回洗浄した。
【０１９７】
画像化
ＤＣ３００ＦＸカメラ（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌｔｄ．）を備えた実体蛍光顕微鏡（ＭＺＦＬＩＩＩ）を感染植物組織器官の蛍光および光画像化のために使用した。
【０１９８】
標的化植物の分子分析
Ａｇｒｏ浸漬に付したＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの葉（試料サイズ約２ｃｍ２の接種した葉片由来）から、ＣＴＡＢ抽出法を使用して全ＤＮＡを単離した（Murray and Thompson 1980）。ＤＮＡ試料を、制限酵素部位喪失法（Marton et al., 2010）を使用してインデル突然変異について分析した。簡潔には、精製したＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ  ＤＮＡ試料を最初に、ＮｐｔＩＩ標的のためのＥｈｅＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社）、またはＰＤＳ標的のためのＭｌｙＩ（ＳｃｈＩ）（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社）によって消化した。消化したＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ  ＤＮＡを、ＮｐｔＩＩ標的配列を含む５２５ｂｐ領域を増幅するためには５’ＡＧＡＣＡＡＴＣＧＧＣＴＧＣＴＣＴＧＡＴ（配列番号１３）および５’ＧＧＣＣＡＴＴＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧＡＴＡ（配列番号１４）のそれぞれフォワードおよびリバースプライマー、そしてＰＤＳ標的配列を含む４５０ｂｐ領域を増幅するためには、５’ＧＣＴＴＴＧＣＴＴＧＡＧＡＡＡＡＧＣＴＣＴＣ（配列番号１５）および５’ＡＣＡＴＡＡＣＡＡＡＴＴＣＣＴＴＴＧＣＡＡＧＣ（配列番号１６）のそれぞれフォワードおよびリバースプライマーを使用するＰＣＲ増幅に供した。
【０１９９】
増幅したＰＣＲ産物を適切な制限酵素で処理し、消化産物をＤＮＡ電気泳動によって分離した。特定の制限酵素耐性（「未切断」）バンドをゲルから切り出し、精製し、ｐＧＥＭＴ  ｅａｓｙ  Ｔ／Ａ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングし、無作為に選択したプラスミドをＤＮＡシーケンシングによって分析した。
【０２００】
Ａｇｒｏ接種したＮ．ｔａｂａｃｃｕｍの葉から、ＣＴＡＢ抽出法（Murray and Thompson 1980）を使用して全ＤＮＡを単離した。精製したＮ．ｔａｂａｃｃｕｍ  ＤＮＡ試料を、ｍＧＵＳ標的配列を含む６７０ｂｐ領域を増幅するために、５’ＣＴＡＴＣＣＴＴＣＧＣＡＡＧＡＣＣＣＴＴＣＣ（配列番号１７）および５’ＧＴＣＴＧＣＣＡＧＴＴＣＡＧＴＴＣＧＴＴＧＴＴＣ（配列番号２８）のそれぞれフォワードおよびリバースプライマーを使用するＰＣＲ増幅に供した。
【０２０１】
増幅したＰＣＲ産物をＢｕｓ３６Ｉ（Ｆｅｒｍａｎｔａｓ社）によって消化し、消化産物をＤＮＡ電気泳動によって分離した。特定の制限酵素耐性（「未切断」）バンドをゲルから切り出し、精製し、ｐＧＥＭＴ  ｅａｓｙ  Ｔ／Ａ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングし、無作為に選択したプラスミドをＤＮＡシーケンシングによって分析した。
【０２０２】
結果
３種の異なるＴＲＶ構築物を作製した（図１Ａ〜ＣおよびＥ）。図１Ａおよび１Ｂは、ＮｐｔＩＩまたはＰＤＳにそれぞれ特異的なｓｇＲＮＡに隣接するリボザイムを含有する構築物を示す。ＮｐｔＩＩ遺伝子は、トランスジェニックＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ中に存在し、ＰＤＳ遺伝子はＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａに内在性である。図１Ｃは、リボザイムを含まずに、ＣＰ遺伝子の代わりにＴＲＶベクター（１Ｃ）をクローニングしたｓｇＲＮＡを含有する。ｓｇＲＮＡは、ＡＴＧコドンのすぐ後のフレーム中に挿入された終止コドンで発現が抑制されたＧＵＳ遺伝子（配列番号２６、Marton et al., 2010）で形質転換されたトランスジェニックＮ．ｔｏｂａｃｃｕｍにおいて、ｕｉｄＡ  ＯＲＦの始めの終止コドンを除去し、ＧＵＳの発現を回復させるために設計された。
【０２０３】
【表５】
2017535296.tif 000007
【０２０４】
簡潔には、単一ガイドＲＮＡ配列（ｓｇＲＮＡ）を次のリボザイム対：ハンマーヘッド（ＨＨ）リボザイムおよびＨＤＶリボザイム、の間にクローニングする。クローニングは、ＴＲＶのコートタンパク質サブゲノムプロモーターの制御下に行う。ＤｓＲｅｄ２マーカーを別々のウイルスサブゲノムプロモーターの制御下、下流にクローニングする。リボザイム対は予め規定された部位でＲＮＡ分子を自己プロセシングし、成熟した、機能性ガイドＲＮＡを作製する。このクローニングストラテジーは、全ウイルスレプリコンが完全に転写される場合に、ＤｓＲｅｄ２が接種された組織中で検出され、ガイドＲＮＡが同じ組織中でも作製されることを保証する。接種された組織での適切なｓｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質との共発現は、標的配列を特異的に同定し切断するＣＲＩＳＰＲ機構を活性化すると考えられる。
【０２０５】
隣接するリボザイムが存在するＴＲＶベクター構築物が、リボザイムが隣接する遺伝子を発現する一方で、十分に増殖することを検証するために、リボザイムの隣接するＤｓＲｅｄレポーター遺伝子を有する構築物（ＴＲＶベクター１ｄ）をＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉に浸潤した。図２には、浸潤部位から離れた植物部位でも、６ｄｐｉおよび１０ｄｐｉのＤｓＲｅｄ２を発現することが観察できる。
【０２０６】
ＮｐｔＩＩトランスジェニックＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａを混合物ｉまたは混合物ｉｉでの浸潤によって処理した場合（表２）、ＮｐｔＩＩおよびＰＤＳ遺伝子それぞれにおけるインデル（挿入または欠失）が観察された（図３ＡおよびＢ）。例えば、ＮｐｔＩＩ標的について、スクリーニングされた配列６０個のうち全部で２４個のインデルがあった−効率は４０％。
【０２０７】
【表６】
2017535296.tif 000008
【０２０８】
このシステムは、インデルを有する標的部位について材料および方法に記載した濃縮法を実施しなくともインデルが検出できる程度に、十分に効率的であった。ＰＤＳ標的については、スクリーニングされた配列４６個のうち全部で３個のインデルがあった−効率６．５％（図３Ｂ）。
【０２０９】
図４Ａ〜Ｃは、ＤｓＲｅｄレポーターが、構築物を含有するリボザイムを感染させた植物組織において、散発性ではあるが発現されており（図４Ａおよび４Ｂ）、リボザイム活性にもかかわらず、対照構築物（図４Ｃ）よりも低い強度ではあるが、ウイルスは増殖し続けていることを示しており、同時に標的部位では高効率でインデルが得られる（図３Ａおよび３Ｂ）。
【０２１０】
追加的実験において、構築物１ｄ（上記表１）を使用して、ＧＵＳ抑制終止コドンを含む配列を標的とするｓｇＲＮＡを、構築物のコートタンパク質（ＣＰ）サブゲノムプロモーターの制御下に挿入した。図５に見られるとおり、ＧＵＳ発現は、いくつかの細胞において回復される。インデル事象がいくらか無作為であること（図３Ａ〜Ｂ）を考慮すると、観察された多数の青色細胞はシステムの高効率を示している。このことは、ｓｇＲＮＡが機能性になるためにリボザイムによって特異的に切断される必要がなく、このＴＲＶベクターは、リボザイムの存在下または不在下のいずれでも、ｓｇＲＮＡを発現することにおいて機能性であることを証明している。リボザイムプロセシングの重要性は、下記の実施例２においてさらに考察される。
【０２１１】
＃３３２５  ＱＱＲ−ｓｇＲＮＡ発現ＴＲＶベクター（構築物１ｃ（表１））で処理したＮ．ｔａｂａｃｃｕｍのゲノム上のＤＮＡ分析（図５に示す）は、酵素の予測された部位に欠失を示した（図６）。これは、観察されるＧＵＳ再活性化がＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９活性の結果であることを立証している。ウイルスベクターｐＴＲＶ  ΔＣＰ  Δ２ｂ  ＱＱＲ−ｓｇＲＮＡ  ２ｓｐＰ−ＤｓＲｅｄ（＃３３３７）をＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａおよびＰｅｔｕｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａに浸潤した。両方の植物において非常に強い全体的な感染が観察された（図７Ａ〜Ｂ）。
【実施例２】
【０２１２】
リボザイムの隣接するｇＲＮＡは編集効率を増加させる
ゲノム編集のためのリボザイム仲介プロセッシングの効率を試験するために、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子配列（「ｎｐｔＩＩ−ｋ」と呼ばれる）中の２０ｂｐ部位を標的とする、同じｓｇＲＮＡ配列を含有する２つのＲＮＡ２デザイン（図８の構成１Ａ（図１Ａのベクターに類似したもの）および２Ａ）の活性を試験した。第３の構築物、３Ａ（図８を参照）も、負の対照として作製した。ベクター３Ａは本来のウイルスコートタンパク質と、ＤｓＲｅｄ２遺伝子とを有するが、ｓｇＲＮＡを有さない。すべての構築物およびそれらの標的を表１に記載する。
【０２１３】
ＨＨリボザイムｓｇＲＮＡ − ｎｐｔＩＩ−ｋ  ＨＤＶ − リボザイムを、合成配列（配列番号２１）として発注した。この断片を、コートタンパク質ＣＤＳの代わりに、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｇｌＩＩを有するＴＲＶ２配列にクローニングした。最終ステップは、ＴＲＶをバイナリープラスミドにクローニングすることであった。
【０２１４】
【表７】
2017535296.tif 000009
【０２１５】
【表８】
2017535296.tif 000010
【０２１６】
他の解析は、実施例１と同様に実施した。
【０２１７】
結果
ｎｐｔＩＩ遺伝子を発現するトランスジェニックＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物を作製した。これらの植物におけるｎｐｔＩＩの存在は、ＰＣＲおよびカナマイシン含有成長培地中での発芽によって認められた。ｎｐｔＩＩ陽性Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物の若葉に、アグロバクテリウム混合物の１番または２番（上記表２参照）を接種した。対照として他のｎｐｔＩＩ植物にアグロバクテリウム混合物の３番を接種した。植物組織におけるウイルスの拡散をＤｓＲｅｄ２シグナルをモニタリングすることによって接種７日後に試験した。リボザイムを含むＲＮＡ２ベクター（図８の構成１Ａ）によって処理した植物では、ＤｓＲｅｄ２シグナルは浸潤した葉だけに限定されていた。茎およびシュートへのシグナルの移動は検出されなかった（図９）。
【０２１８】
リボザイムを含まないＲＮＡ２ベクター（図８の２Ａ）によって処理した植物では、ＤｓＲｅｄ２シグナルは浸潤した葉ならびに離れた茎およびシュートの両方において検出された（図９）。さらにＤｓＲｅｄ２の強度は、１Ａで処理した場合よりも、２Ａで処理した葉において非常に高かった（図９）。
【０２１９】
これらの結果は、リボザイムがウイルスＲＮＡの継続的な自己消化を実施することによって、ウイルスの複製および移動を妨げ得ることを示している。成熟ｓｇＲＮＡを放出する一方で、それらは「自滅的」でもあり、植物組織全体のウイルス感染を限定している。
【０２２０】
接種７日後に、接種した葉（ＤｓＲｅｄ２陽性領域）から直接ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を採取した。３種のｇＤＮＡ試料を３種の別々の植物から抽出した（３回の生物学的反復）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの遺伝子編集活性を調べるために制限部位喪失アッセイを使用した。
【０２２１】
簡潔には、ＤＮＡを、ｎｐｔＩＩ−ｋ標的配列中で切断するＥｈｅＩ制限酵素で最初に消化して、変異した配列を有する試料を濃縮した。次いでｎｐｔＩＩ遺伝子（５２５ｂｐ；配列番号５５）の標的セグメントの直接ＰＣＲ増幅を、特異的プライマー（配列番号５６および５７）を使用して実施した。ＰＣＲ産物をＥｈｅＩ制限酵素で消化し、未切断バンドをモニタリングした。
【０２２２】
３種の対照試料（処理３）では、変異していない４７５ｂｐ＋５０ｂｐ消化産物のみがゲルで検出された（図１０、５０ｂｐバンドは見られない）。一方で、２種の実験試料（処理１および２）では、３本のバンドが検出できた−変異していない４７５ｂｐおよび５０ｂｐ消化産物ならびに、遺伝子編集の結果としてＥｈｅＩ消化に耐性である、５２５ｂｐの推定変異産物（図１０）。処理１と２とを比較することによって、５２５ｂｐの未消化バンドの強度は、その大部分が処理１において処理２よりも高いことが見出され、これはウイルスベクター中のリボザイムの存在が接種された組織での変異配列量を増加させていることを意味している。
【０２２３】
これらの結果をさらに調べるために、処理１および処理２の両方について、未切断５２５ｂｐ  ＰＣＲ産物を精製し、大腸菌ライブラリーを作るためにｐＧＥＭ−Ｔベクターにクローニングした。６４個の個々の事象を各ライブラリーからスクリーニングし、関連プラスミドをシーケンシングした。両方のライブラリーにおいてｎｐｔＩＩ−ｋ標的配列が多く検出された（図１１）。しかし、処理１ライブラリー（＋リボザイム）では、シーケンシングしたプラスミドの９３％が標的配列中にインデルを有し、一方、処理２（−リボザイム）では、シーケンシングしたプラスミドの６３％のみが標的配列中にインデルを有した。この差異は、ウイルスベクターデザインにおけるリボザイムの存在が、ｓｇＲＮＡの的確な放出を改善し、結果として、リボザイムを含まないｓｇＲＮＡを保持しているウイルスベクターと比較して標的部位のさらに効率的な編集に寄与することを明らかに示している。しかし、リボザイムの存在は、ウイルスベクターによるｓｇＲＮＡ発現には必要ではなく、極めて効率的なｇＤＮＡ編集がいずれの方法でも検出できた。
【０２２４】
結論として、ＲＮＡ２ベクターデザインへのリボザイムの付加は、遺伝子編集率を大きく増加させるが、やがてウイルスレプリコンの自己プロセシングにより、植物体でのウイルス拡散を妨げ、システムの感染能力を制限する。
【実施例３】
【０２２５】
ｐＴＲＶシステムは、種々のＤＮＡ上の位置に複数のｓｇＲＮＡを同時に送達することができる
本発明のＴＲＶに基づくシステムが、離れた位置のＤＮＡ断片に特異的欠失を導入するためのＣａｓ９タンパク質の発現と共に、少なくとも２種のｓｇＲＮＡを同時に（単一のＲＮＡ２骨格から）植物細胞へ効率的に送達することを示すために、次の実験を行った。これら２種（さらに多い可能性もある）ｓｇＲＮＡは、いくつかの別々のサブゲノムプロモーターから発現されることができる（図１２の例Ｂ３、Ｂ４）、または単一のサブゲノムプロモーターの下で、互いに繋がれる場合があり（図１２中の例Ｂ２）、これらの場合すべてにおいて２種（さらに多い可能性もある）異なる位置に同時にインデルを生成する。
【０２２６】
ウイルスベクターの拡散をモニタリングするためのＲＮＡ２配列へのＤｓＲｅｄ２マーカーの付加は、二重ｓｇＲＮＡ  ＤＮＡ編集を妨げないことを示す。
【０２２７】
材料および方法
設計およびクローニング−ｎｐｔＩＩ遺伝子配列を標的とする２つのｓｇＲＮＡ配列を作製し、ｎｐｔＩＩ−ｋ（上記参照、配列番号１）およびｎｐｔＩＩ−Ｉ（配列番号５３）と命名した。ｎｐｔＩＩ遺伝子上のこれら２種の標的配列間の距離は１２６ｂｐであった。図１２に記載のとおり、ＤｓＲｅｄ２マーカーと共にまたはなしで、ｓｇＲＮＡを種々の方法でＲＮＡ２ベクターにクローニングした。
【０２２８】
【表９】
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【０２２９】
【表１０】
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【０２３０】
Ｂ１ベクターは、初めに、ｎｐｔＩＩ−Ｉ  ｓｇＲＮＡ（配列番号５３）をＰＥＢＶ  ｓｇＰの次のＨｐａＩ−ＸｈｏＩとしてＴＲＶ２にクローニングすることによって構築した。次いで、ＡａｔＩＩおよびＳｎａＢＩを使用して、２ｓｇＰ−ｎｐｔＩＩ−Ｉ  ｓｇＲＮＡカセットを切断し、ＤｓＲｅｄカセットの代わりに２Ａに挿入した。ベクターＢ２、Ｂ３およびＢ４について、ｎｐｔＩＩ−ｋ  ｓｇＲＮＡ、２ｂ  ｓｇＰ、およびＤｓＲｅｄの一部を含み、ＰｓｔＩ部位が末端となる合成配列（配列番号９６）を発注した。ベクターＢ２は、ＸｈｏＩ−ＢｇｌＩＩ断片としてｎｐｔＩＩ−ｋ  ｓｇＲＮＡを、それと同じ、ベクター２Ａと全く同様に予め調製したｎｐｔＩＩ−Ｉ  ｓｇＲＮＡに隣接する部位にクローニングして作製した。２Ａと全く同じｎｐｔＩＩ−ｉ  ｓｇＲＮＡを有する同じＴＲＶベクターに、ＡａｔＩＩ−Ｂｓｕ３６Ｉとして、合成配列（配列番号９６）由来のｎｐｔＩＩ−ｋ  ｓｇＲＮＡを加えて、Ｂ３ベクターを作製した。ベクターＢ４は、配列番号９６由来のｎｐｔＩＩ−ｋ  ｓｇＲＮＡを、２Ａ様ベクターの２ｂ  ｓｇＰの下流へクローニングし、ＤｓＲｅｄの上流へ融合させることによって作製した。このベクターでは、ｎｐｔＩＩ−ｋ  ｓｇＲＮＡおよびＤｓＲｅｄは同じプロモーターによって転写される。
【０２３１】
他の分析は実施例１に記載のとおり行った。
【０２３２】
ｎｐｔＩＩ遺伝子を発現している上記トランスジェニックＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物を使用した。ｎｐｔＩＩ陽性Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物の若葉に、アグロバクテリウム混合物の１番（上記表４を参照）を接種した。対照として、他のｎｐｔＩＩ植物にアグロバクテリウムの混合物５番を接種した。ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を接種の１０日後に接種された組織から直接採取した。２種のｇＤＮＡ試料を２つの個別の植物から抽出した。ＤＮＡを初めに、ｎｐｔＩＩ標的配列内で切断するＥｈｅＩ制限酵素およびＰｖｕＩＩ制限酵素でそれぞれ消化して、変異した配列を有する試料を濃縮した。次いで、ｎｐｔＩＩ遺伝子（３９０ｂｐ、配列番号５８）の標的セグメントの直接ＰＣＲ増幅を特異的プライマー（配列番号５６および５９）を使用して実施した。２つの対照試料（処理５）では、変異していない３９０ｂｐ産物だけが増幅され、一方、２つの実験試料（処理１）では、２本のバンド−変異していない３９０ｂｐ産物および２６４ｂｐの推定変異産物が検出された（図１３）。
【０２３３】
次に、より短い、２６４ｂｐのＰＣＲ産物を精製し、直接シーケンシングし（配列番号６０）、大腸菌ライブラリーを作るためにｐＧＥＭ−Ｔベクターにクローニングした。精製断片の直接シーケンシングは、ｎｐｔＩＩ−ｋ標的部位と、ｎｐｔＩＩ−Ｉ標的部位との間のセグメントの正確な欠失を表す、正確に１２６ｂｐの欠失をもたらした（図１４）。ライブラリーのさまざまなプラスミドのシーケンシングは、２６４ｂｐの断片が事象の５０％を超えることを明らかにした。さらに、１２６ｂｐよりも大きな欠失を有する種々の断片（図１５、配列番号６１〜６４）も検出された。このデータは、ＴＲＶの多重化はｓｇＲＮＡ対を送達し、一過的に発現されたＣａｓ９と組み合わせることも可能であり、効率的であることを示している。
【０２３４】
ＤｓＲｅｄ２をウイルスベクター拡散についてのマーカーとして使用した。ＤｓＲｅｄ２のＲＮＡ２−ｓｇＲＮＡへの追加は、植物における感染および潜在的に変異した組織の追跡を可能にする。
【０２３５】
したがって、さらに３種のＲＮＡ２構築物を作製した。これらは、それぞれｓｇｎｐｔＩＩ−ｋ／ｓｇｎｐｔＩＩ−ｉおよびＤｓＲｅｄ２の両方を、異なるサブゲノムプロモーターの制御下で発現している（図１２のＢ２、Ｂ３、Ｂ４を参照）。
【０２３６】
ｎｐｔＩＩ陽性Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物の若葉に、アグロバクテリウム混合物２番、混合物３番および混合物４番（上記表４を参照）を、３つの別の植物固体のそれぞれ３枚の別々の葉に接種した。対照として、別のｎｐｔＩＩ植物にアグロバクテリウム混合物５番を接種した。接種から７日後、蛍光を可視化した。高ＤｓＲｅｄ２シグナルをすべての浸潤した葉において検出した。ＤｓＲｅｄ２陽性葉片をすべての植物から採取した。
【０２３７】
ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）をＤｓＲｅｄ２陽性組織から、接種７日後に抽出した。合計１０種のｇＤＮＡ試料を１０の別々の植物固体から抽出した。最初にＤＮＡをｎｐｔＩＩ標的配列中で切断するＥｈｅＩ制限酵素およびＰｖｕＩＩ制限酵素でそれぞれ消化して、変異した配列を有する試料を濃縮した。次いで、ｎｐｔＩＩ遺伝子（３９０ｂｐ；配列番号５８）の標的セグメントの直接ＰＣＲ増幅を実施した。対照試料（処理５）では、変異していない３９０ｂｐ産物だけが増幅され、一方で、他の３回の実験（処理２、３、４）のそれぞれでは、少なくとも１つの試料から２つのＰＣＲバンド−変異していない３９０ｂｐ産物および２６４ｂｐの推定変異産物（図１６；配列番号６０）が検出された。実験の反復のいくつかにおいては、変異していない産物だけが増幅される場合もあった。これらは、試料間のウイルスの安定性または感染品質による差異として説明できる。いずれにせよ、各実験におけるさらに短い（変異した）ｎｐｔＩＩ産物の存在は、さまざまに設計されたＲＮＡ２構築物がいずれも多重化可能であり、ＤｓＲｅｄ２マーカー付加がこの能力を妨げないことを実証している。
【０２３８】
次に、多重化の手法を、ペチュニア内因性遺伝子の改変を目的として実施した。後述するように、実際にはｐＴＲＶに基づくシステムは、２種の内因性Ｐｅｔｕｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ遺伝子（以下、ＴＯＭ１およびＴＯＭ３と称す、配列番号９４および９５）に特異的改変を導入するために、少なくとも２種のｓｇＲＮＡを（単一のＲＮＡ２骨格から）同時に効率的に送達することができる。実験は、Ｃａｓ９タンパク質を構成的に発現している植物で実施した。
【０２３９】
Ｃａｓ９遺伝子（配列番号１９）を構成的に発現しているトランスジェニックペチュニア植物（Ｂｌｕｅ  Ｒａｙ変種）を使用した。Ｃａｓ９陽性ペチュニア植物の若葉にＴＲＶ１およびＴＲＶ２のアグロバクテリウム混合物（比１：１、図１７；配列番号７５）を接種した。ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を接種１０日後に、接種した組織から直接採取した。ＴＯＭの遺伝子標的配列内で切断する、Ｂｓｕ３６Ｉ制限酵素でＤＮＡをそれぞれ消化し、変異した配列を有する試料を濃縮した。それぞれの遺伝子の標的セグメントの直接ＰＣＲ増幅を、特異的プライマー（ＴＯＭ１のための配列番号７６〜７７、ＴＯＭ３のための配列番号７８〜７９）および別のＢｓｕ３６Ｉ消化物を使用して実施した。ＴＯＭ１標的部位では、３つすべての試料で、ＷＴ植物と比べて比較的濃い未切断バンドを示した（図１８）。ＴＯＭ３試料では、試料２が、ＷＴと比較して顕著な未切断バンドを有していた（図１９）。
【０２４０】
次に、各遺伝子の未切断バンドを精製し、２種の大腸菌ライブラリーを作製するためにｐＧＥＭ−Ｔベクターにクローニングした。各ライブラリーのプラスミドシーケンシングは、両方のＴＯＭの標的部位が改変されたことを明らかにした。ＴＯＭ１の部位で最も一般的な改変は、１ｂｐの挿入または欠失であり、さらに１０ｂｐおよび１１ｂｐ欠失もみられた（図１３）（配列番号８２〜８５）。ＴＯＭ３の部位では、数ｂｐの挿入および欠失を含む、さらに可変性の改変が見られた（図１４）（配列番号８６〜９１）。
【実施例４】
【０２４１】
本発明のｐＴＲＶシステムによって導入されたゲノム変異導入は遺伝性である
本発明者らは、ｓｇＲＮＡを安定なＣａｓ９発現と組合せて保持するウイルスベクターを植物組織に感染させることによって、ゲノム突然変異（インデル）が誘導され、これらは遺伝されることを示すことを目的とした。
【０２４２】
そのようにするために、Ｃａｓ９タンパク質（配列番号９）およびＧＵＳレポーター遺伝子の変異導入バージョン（ｍＧＵＳとして周知；配列番号５４）の両方を構成的に発現するトランスジェニックタバコ植物（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）を用いた。
【０２４３】
ｍＧＵＳは、ＡＴＧ開始コドンの隣に位置する人工終止コドン（ＴＧＡ）を有し、これによって、実施例１に記載のとおり、ＧＵＳ活性タンパク質の産生を妨げる。終止コドンに隣接する配列はＱＱＲ（配列番号４６）と称される。第１世代Ｃａｓ９／ｍＧＵＳタバコ植物（Ｔ０）を自家受粉させ、両方の導入遺伝子について、通常はヘテロ接合性であるＴ１種子を産生した。これらの種子をさらなる処理のために使用した。ＱＱＲ部位に位置する２０ｂｐヌクレオチド配列を標的とするためのｓｇＲＮＡを転写するために、ＲＮＡ２構築物を調製した（ｓｇＱＱＲと称す、ｍＧＵＳの５’末端に位置し、ＴＧＡ終止コドンも含む）。ＲＮＡ２構築物は、ウイルスの拡散をモニタリングするためのＤｓＲｅｄ２マーカータンパク質も含んでいた（配列番号１８、構築物１Ｅ、図２２）。配列のこの部分における、ＣＲＩＳＰＲ誘導性インデル事象の予測される結果は、組織中の少なくとも一部の標的細胞におけるＧＵＳコード配列の回復である。
【０２４４】
ＲＮＡ２構築物の活性を調べるために、若いＣａｓ９／ｍＧＵＳタバコ植物の葉にａｇｒｏ混合物１を接種した（下記表５）。ＤｓＲｅｄ２シグナルの拡散を７日間追跡した。
【０２４５】
浸潤した葉の大部分でシグナルを検出した（図２３）。ＤｓＲｅｄ２陽性葉を次いで植物から外し、ＧＵＳ染色処理のために使用した。ゲノム編集事象の一部でＴＧＡコドンが除外され、それによりＧＵＳ遺伝子の正確なコード配列が回復し、ＧＵＳ陽性青色染色が現れることが推定された。予測されたとおり、相当数のＧＵＳ陽性パッチが葉表面で検出された（図２３）。このデータは、Ｃａｓ９の構成的発現と共にウイルスベクターが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９機構によってｍＧＵＳ標的を効率的に編集したことを示唆している。
【０２４６】
次にＣａｓ９／ｍＧＵＳタバコＴ１実生を発芽させ、それらの子葉をＡｇｒｏ混合物１で感染させた（表５）。
【０２４７】
【表１１】
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【０２４８】
接種７日後、ＤｓＲｅｄ２陽性子葉を切り出し、タバコ再生培地（３％ショ糖、１．５μｇ／ｍｌ  ゼアチンおよび０．１μｇ／ｍｌ  ＮＡＡ−ＳＰＥＣＩＦＹを添加したＭＳ培地）を含むプレートに移した。１７個のカルスを産生した１７個の子葉をすべて採取した。ゲノムＤＮＡをすべてのカルスから採取し、Ｃａｓ９とｍＧＵＳとの両方の存在がＰＣＲによって確認できたのは８個のカルスのみであった。再生工程はこれら８個のカルスのみで継続した。組織におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９活性を調べるためのＧＵＳ染色のために、カルス片を採取した（葉試料採取について先に説明のとおり）。再び、青色のパッチを検出し、これは感染したカルス組織のいくらかの部分でのＧＵＳコード配列の回復を示している（図２４）。ほとんどの場合ｍＧＵＳ編集は、ＴＧＡコドンの除外またはＧＵＳの回復を生じず、おそらく、非青色カルス片の多数が標的部位のシーケンシングによってのみ検出可能な多数のインデル突然変異を有していることに着目されたい。実際にｇＤＮＡを抽出および分析した場合、図２５に例示のとおり、ＱＱＲ標的部位に欠失突然変異が検出できた（配列番号６５〜６６）。発達している８個のカルスから４４個の小植物を単離した。すべての小植物を発根培地を含むプレートに移し、各植物からｇＤＮＡ分析およびＧＵＳ染色のために葉を採取した。すべての植物において、ＱＱＲ標的部位も含有するｍＧＵＳコード配列のセグメントを増幅するためにＰＣＲを使用した。ＱＱＲ標的配列の中央を切断する制限酵素（Ｂｓｕ３６Ｉ）を、それが改変されたかどうかを調べるために使用した（制限部位喪失法としても周知）。２９個の植物（６６％）では、すべてのＰＣＲ産物が制限酵素によって消化され、それらがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによって全く改変されていないことを示唆している。４４個の植物のうち９個（２０％）は、ＰＣＲ産物の部分消化を示し、増幅されたＰＣＲ産物の一部が制限酵素によって消化され、一部はされなかったことを意味しており、ｍＧＵＳコピーのいずれか１つだけが改変された、または植物がインデル事象についてキメラであることを示唆している。４４個の植物のうち６個（１３．５％）はＰＣＲ産物の消化に完全に耐性であり、すべての増幅されたＰＣＲ産物が制限酵素によって消化されなかったことを意味している。これらの植物が、改変さた対立遺伝子を次世代に移行するための最良の候補であり、その理由は、Ｔ０植物の分子分析がいかなる「野生型」の非改変ｍＧＵＳ配列も検出していないためである。要約すると、４４個の植物のうち１５個（３４％）は、さまざまなレベルで変異した標的対立遺伝子の証拠を示した。
【０２４９】
興味深いことに、４４個の植物のうち３個（７％）がＧＵＳ染色を示し、インデル突然変異の結果としてＧＵＳ読み枠が回復したことを表している。３個すべての植物（３Ｅ、３Ｆ、３Ｇ）は同じカルス（カルス番号３）に由来し、シーケンシングは、すべてがＴＧＡ終止コドンを除外し、適切なＧＵＳタンパク質の産生をもたらす、同じ３ｂｐ欠失事象を有することを示した（図２６および表６）。不運なことに、これらの植物の分子分析およびＧＵＳ染色パターンは、それらがキメラの性質を有し、それにより活性ＧＵＳ対立遺伝子が次世代へ遺伝される可能性は低いことを示した（図２６）。したがって、上述したとおり、消化に対する完全な耐性が分子分析において見られた６個の植物のみの種子を生育させることを決定した。植物株名および対応するインデル事象および変異したＱＱＲ標的配列の配列番号を下記表６に示す。
【０２５０】
【表１２】
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【０２５１】
６個の変異した植物を自家受粉させ、数百の種子が結実した。各植物の１０個の種子を発芽させた。若い実生プールをｇＤＮＡを抽出するために使用した。ＱＱＲ標的部位も含有するｍＧＵＳコード配列のセグメントを増幅し、制限酵素（Ｂｓｕ３６Ｉ）を適用した。６個すべての植物のＰＣＲ産物は、まだ完全にＢｓｕ３６Ｉ酵素に耐性であり、それらのシーケンシングは、調べたすべての株のそれぞれにおいて、正確なインデル突然変異が後代に遺伝されていることを明らかにした。母植物（Ｔ０）およびそれらの後代（Ｔ１）の改変ｍＧＵＳ対立遺伝子の配列比較を図２７に示した。これらの結果は、タバコ組織に送達されたｓｇＱＱＲは、これらの組織におけるＣａｓ９の活性と共に、調査した事例の１００％において変異した対立遺伝子をそれらの後代に安定して受け継ぐ改変タバコ植物を産生したことを明らかに示している。本明細書に示されたウイルスベクターおよび実験手法は、生殖系列を通じた改変事象の遺伝を保証する。
【０２５２】
本発明は、その具体的な実施形態と併せて記載されているが、多数の代替、改変および変法が当業者に明らかであることは明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の精神およびその広範に含まれるこのようなすべての代替、改変および変法を包含することが意図される。
【０２５３】
本明細書において述べられたすべての刊行物、特許および特許出願は、それぞれ個々の刊行物、特許または特許出願を具体的かつ個別に記載したのと同様に、本明細書に組み込まれるものとする。さらに、本願におけるいかなる参考文献の引用または同定は、そのような参考文献が、本発明に対する先行技術であることの承認として解釈されるべきでない。セクションの見出しが使用される範囲で、それらが必然的に限定として解釈されるべきでない。
【０２５４】
参考文献
（他の参考文献は本出願全体を通じて引用される）
Ben Zvi M, Florence N, Masci T, Ovadis M, Shklarman E, Ben-Meir H, Tzfira T, Dudareva N, Vainstein A (2008) Interlinking showy traits: co-engineering of scent and colour biosynthesis in flowers. Plant Biotechnology Journal 6: 403-415;
Jefferson R, Burgess S, Hirsh D (1986) BETA-GLUCURONIDASE FROM ESCHERICHIA-COLI AS A GENE-FUSION MARKER. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 83: 8447-8451 Johnson RA, Gurevich V, Filler S, Samach A, Levy AA (2014), Comparative assessments of CRISPR-Cas nucleases' cleavage efficiency in planta. Plant Mol Biol. Nov 18;
Murray M, Thompson W (1980) Rapid isolation of high molecular- weight plant DNA. Nucleic Acids Research 8: 4321-4325;
Sparkes I, Runions J, Kearns A, Hawes C (2006) Rapid, transient expression of fluorescent fusion proteins in tobacco plants and generation of stably transformed plants. Nature Protocols 1: 2019-2025;
Sugimoto K, Meyerowitz EM (2013) Regeneration in Arabidopsis tissue culture. Methods Mol Biol. 959: 265-275;
Belhaj K, Chaparro-Garcia A, Kamoun S, Nekrasov V (2013) Plant genome editing made easy: targeted mutagenesis in model and crop plants using CRISPR/Cas system. Plant Methods 9, 39;
Marton I, Zuker A, Shklarman E, Zeevi V, Tovkach A, Roffe S, Ovadis M, Tzfira T and Vainstein A (2010) Non-transgenic genome modification in plant cells. Plant Physiol 154: 1079-1087.
【配列表フリーテキスト】
【０２５５】
配列番号１：  ｎｐｔＩＩ（ｋ）−ｓｇＲＮＡのヌクレオチド配列
配列番号２：  ＰＤＳ  ｓｇＲＮＡのヌクレオチド配列
配列番号３：  ＱＱＲ  ｓｇＲＮＡカセットのヌクレオチド配列
配列番号４：  ハンマーヘッド（ＨＨ）リボザイムのヌクレオチド配列
配列番号５：  デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）  リボザイムのヌクレオチド配列
配列番号６：  ＱＱＲ−ｓｇＲＮＡを含むｐＴＲＶ２  ＣＰ−２ｂのヌクレオチド配列
配列番号７：  ｐＴＲＶ２  ＣＰ−ｎｐｔＩＩ（ｋ）−ｓｇＲＮＡ：２ｂ：ＤｓＲｅｄのヌクレオチド配列
配列番号８：  ｐＴＲＶ２  ＣＰ−ＰＤＳ−ｓｇＲＮＡ：  ２ｂ：ＤｓＲｅｄのヌクレオチド配列
配列番号９：  Ｃａｓ９のヌクレオチド配列
配列番号１０：  Ｃａｓ９のアミノ酸配列
配列番号１１：  一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号１２：  一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号１３：  一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号１４：  一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号１５：  一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号１６：  一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号１７：  一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号１８：  ｐＴＲＶ  ＣＰ  ２ｂ  ＱＱＲ−ｓｇＲＮＡ  ２ｓｐＰ−ＤｓＲｅｄのヌクレオチド配列
配列番号１９：  ｐＫ７ＷＧＦ２−ｈＣａｓ９のヌクレオチド配列
配列番号２０：  ｐＴＲＶ  ２ｂ  ｒｉｂｏ−ＤｓＲｅｄ−ｒｉｂｏのヌクレオチド配列
配列番号２１：  ＲＧＲ１ＲＧＲ１のヌクレオチド配列
配列番号２２：  ＲＧＲ２のヌクレオチド配列
配列番号２３：  ＣＰ  サブゲノムプロモーターのヌクレオチド配列
配列番号２４：  ＮＯＳターミネーターのヌクレオチド配列
配列番号２５：  ｏｍｅｇａエンハンサーのヌクレオチド配列
配列番号２６：  ｑｑｒのヌクレオチド配列
配列番号２７：  全長２ｂのヌクレオチド配列
配列番号２８：  一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号２９：  Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ標的遺伝子ＮｐｔＩＩから検出される標的部位のヌクレオチド配列
配列番号３０：  −８ｂｐのインデルを有する、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ標的遺伝子ＮｐｔＩＩから検出される標的部位のヌクレオチド配列
配列番号３１：  −８ｂｐのインデルを有する、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ標的遺伝子ＮｐｔＩＩから検出される標的部位のヌクレオチド配列
配列番号３２：  −２ｂｐのインデルを有する、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ標的遺伝子ＮｐｔＩＩから検出される標的部位のヌクレオチド配列
配列番号３３：  ＋１ｂｐのインデルを有する、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ標的遺伝子ＮｐｔＩＩから検出される標的部位のヌクレオチド配列
配列番号３４：  ＋１ｂｐのインデルを有する、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ標的遺伝子ＮｐｔＩＩから検出される標的部位のヌクレオチド配列
配列番号３５：  −１０ｂｐのインデルを有する、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ標的遺伝子ＮｐｔＩＩから検出される標的部位のヌクレオチド配列
配列番号３６：  ＋１ｂｐのインデルを有する、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ標的遺伝子ＮｐｔＩＩから検出される標的部位のヌクレオチド配列
配列番号３７：  ＋１ｂｐのインデルを有する、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ標的遺伝子ＮｐｔＩＩから検出される標的部位のヌクレオチド配列
配列番号３８：  −１ｂｐのインデルを有する、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ標的遺伝子ＮｐｔＩＩから検出される標的部位のヌクレオチド配列
配列番号３９：  ＋１ｂｐのインデルを有する、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ標的遺伝子ＮｐｔＩＩから検出される標的部位のヌクレオチド配列
配列番号４０：  ＋１ｂｐのインデルを有する、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ標的遺伝子ＮｐｔＩＩから検出される標的部位のヌクレオチド配列
配列番号４１：  −８ｂｐのインデルを有する、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ標的遺伝子ＮｐｔＩＩから検出される標的部位のヌクレオチド配列
配列番号４２：  Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ標的遺伝子ＰＤＳから検出される標的部位のヌクレオチド配列
配列番号４３：  ＋１ｂｐのインデルを有する、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ標的遺伝子ＰＤＳから検出される標的部位のヌクレオチド配列
配列番号４４：  ＋１ｂｐのインデルを有する、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ標的遺伝子ＰＤＳから検出される標的部位のヌクレオチド配列
配列番号４５：  −３ｂｐのインデルを有する、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ標的遺伝子ＰＤＳから検出される標的部位のヌクレオチド配列
配列番号４６：  ｐＴＲＶ２−ＱＱＲ−ｓｇＲＮＡの標的であるｍＧＵＳ遺伝子断片のヌクレオチド配列
配列番号４７：  −４ｂｐのインデルを有する、ｐＴＲＶ２−ＱＱＲ−ｓｇＲＮＡの標的であるｍＧＵＳ遺伝子断片のヌクレオチド配列
配列番号４８：  ＋１ｂｐのインデルを有する、ｐＴＲＶ２−ＱＱＲ−ｓｇＲＮＡの標的であるｍＧＵＳ遺伝子断片のヌクレオチド配列
配列番号４９：  ＴＲＶ  ＲＮＡ２−ＣＰ−ｓｇＮｐｔＩＩ−ｋ−  ｓｇＮｐｔＩＩ−ｉのヌクレオチド配列
配列番号５０：  ＴＲＶ  ＲＮＡ２−ＣＰ−ｓｇＮｐｔＩＩ−ｉ−  ｓｇＮｐｔＩＩ−ｋＤｓＲｅｄ２のヌクレオチド配列
配列番号５１：  ＴＲＶ  ＲＮＡ２−ＣＰ−ｓｇＮｐｔＩＩ−ｉ−  ｓｇＮｐｔＩＩ−ｋＤｓＲｅｄ２のヌクレオチド配列
配列番号５２：  ＴＲＶ  ＲＮＡ２−ＣＰ−ｓｇＮｐｔＩＩ−ｉ−  ｓｇＮｐｔＩＩ−ｋＤｓＲｅｄ２のヌクレオチド配列
配列番号５３：  ｎｐｔＩＩ（ｉ）−ｓｇＲＮＡのヌクレオチド配列
配列番号５４：  ｍＧＵＳカセットとｎｐｔＩＩカセットとを含むＴ−ＤＮＡのヌクレオチド配列
配列番号５５：  ＮｐｔＩＩ遺伝子の部分ヌクレオチド配列
配列番号５６：  ｎｐｔＩＩ  ８０Ｆプライマー
配列番号５７：  ｎｐｔＩＩ  ６０４Ｒプライマー
配列番号５８：  ＮｐｔＩＩ遺伝子の部分ヌクレオチド配列
配列番号５９：  ｎｐｔＩＩ  ４７０Ｒプライマー
配列番号６０：  １２６ｂｐの欠失を有する、ＮｐｔＩＩ遺伝子の部分ヌクレオチド配列
配列番号６１：  １３８ｂｐの欠失を有する、ＮｐｔＩＩ遺伝子の部分ヌクレオチド配列
配列番号６２：  １３９ｂｐの欠失を有する、ＮｐｔＩＩ遺伝子の部分ヌクレオチド配列
配列番号６３：  １４５ｂｐの欠失を有する、ＮｐｔＩＩ遺伝子の部分ヌクレオチド配列
配列番号６４：  １５０ｂｐの欠失を有する、ＮｐｔＩＩ遺伝子の部分ヌクレオチド配列
配列番号６５：  ４ｂｐの欠失を有する、ＭＧＵＳ遺伝子の部分ヌクレオチド配列
配列番号６６：  １１ｂｐの欠失を有する、ＭＧＵＳ遺伝子の部分ヌクレオチド配列
配列番号６７：  ＴＲＶ  ＲＮＡ２−ＣＰ−ｓｇＮｐｔＩＩ−ｋ２ｓｇＰ−ＤｓＲｅｄ２のヌクレオチド配列
配列番号６８：  タバコ株３Ｅ、３Ｆ、３Ｇの変異ＱＱＲ標的配列
配列番号６９：  タバコ株５Ｃの変異ＱＱＲ標的配列
配列番号７０：  タバコ株５Ｆの変異ＱＱＲ標的配列
配列番号７１：  タバコ株５Ｈの変異ＱＱＲ標的配列
配列番号７２：  タバコ株６Ａの変異ＱＱＲ標的配列
配列番号７３：  タバコ株７Ｂの変異ＱＱＲ標的配列
配列番号７４：  タバコ株８Ａの変異ＱＱＲ標的配列
配列番号７５：  内因性のＴＯＭ３ペチュニア遺伝子およびＴＯＭ１ペチュニア遺伝子（大文字）のための２つのガイドＲＮＡを有するＴＲＶのヌクレオチド配列
配列番号７６：  ＴＯＭ１フォワード１１０Ｆプライマー
配列番号７７：  ＴＯＭ１リバース７８３Ｒプライマー
配列番号７８：  ＴＯＭ３フォワード６２３Ｆプライマー
配列番号７９：  ＴＯＭ３リバース４１１Ｒプライマー
配列番号８０：  ＴＯＭ１標的部位のヌクレオチド配列
配列番号８１：  ＴＯＭ３標的部位のヌクレオチド配列
配列番号８２：  変異ＴＯＭ１標的部位、植物３７６９−４の１塩基欠失
配列番号８３：  変異ＴＯＭ１標的部位、植物３７６９−２７に見られる１塩基挿入
配列番号８４：  変異ＴＯＭ１標的部位、植物３７６９−４１に見られる１０塩基欠失
配列番号８５：  変異ＴＯＭ１標的部位、植物３７６９−４３に見られる１１塩基欠失
配列番号８６：  変異ＴＯＭ３標的部位、植物３７４２−６６に見られる７塩基欠失
配列番号８７：  変異ＴＯＭ３標的部位、植物３７６９−４に見られる１塩基欠失
配列番号８８：  変異ＴＯＭ３標的部位、植物３７６９−９に見られる１塩基挿入
配列番号８９：  変異ＴＯＭ３標的部位、植物３７６９−１に見られる３塩基欠失
配列番号９０：  変異ＴＯＭ３標的部位、植物３７６９−３に見られる６塩基欠失
配列番号９１：  変異ＴＯＭ３標的部位、植物３７６９−６に見られる８塩基欠失および２塩基挿入
配列番号９２：  変異ＴＯＭ３標的部位、植物３７６９−９に見られる１塩基欠失
配列番号９３：  変異ＴＯＭ１標的部位、植物３７６９−２７に見られる１塩基挿入
配列番号９４：  ＴＯＭ１のＰｅｔｕｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａのコード配列（文献より転記）
配列番号９５：  ＴＯＭ３のＰｅｔｕｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａのコード配列（文献より転記）
配列番号９６：  合成配列
配列番号９７：  −２ｂｐのインデルを有する、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ標的遺伝子ＮｐｔＩＩから検出される標的部位のヌクレオチド配列  
配列番号９８：  −８ｂｐのインデルを有する、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ標的遺伝子ＮｐｔＩＩから検出される標的部位のヌクレオチド配列
配列番号９９：  −３６ｂｐのインデルを有する、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ標的遺伝子ＮｐｔＩＩから検出される標的部位のヌクレオチド配列
配列番号１００：  −８ｂｐ＋１ｂｐのインデルを有する、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ標的遺伝子ＮｐｔＩＩから検出される標的部位のヌクレオチド配列
配列番号１０１：  ＋１ｂｐのインデルを有する、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ標的遺伝子ＮｐｔＩＩから検出される標的部位のヌクレオチド配列
配列番号１０２：  ＋１ｂｐのインデルを有する、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ標的遺伝子ＮｐｔＩＩから検出される標的部位のヌクレオチド配列
配列番号１０３：  −３ｂｐのインデルを有する、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ標的遺伝子ＮｐｔＩＩから検出される標的部位のヌクレオチド配列
配列番号１０４：  −８ｂｐのインデルを有する、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ標的遺伝子ＮｐｔＩＩから検出される標的部位のヌクレオチド配列
配列番号１０５：  ＋１ｂｐのインデルを有する、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ標的遺伝子ＮｐｔＩＩから検出される標的部位のヌクレオチド配列
配列番号１０６：  −６ｂｐのインデルを有する、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ標的遺伝子ＮｐｔＩＩから検出される標的部位のヌクレオチド配列
配列番号１０７：  −８ｂｐのインデルを有する、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ標的遺伝子ＮｐｔＩＩから検出される標的部位のヌクレオチド配列
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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