(57)【要約】  本開示は概してＥＧＦＲ抗体、および単独の場合または様々な化学療法剤と組み合わせた場合の腫瘍抑制に対するインビトロおよびインビボでのその抗体の治療効果に関する。特に本開示はＥＧＦＲ抗体を単独で、または化学療法剤と組み合わせて投与することを含む癌の治療方法に関する。【選択図】図１
2017515798.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表２に示されているアミノ酸配列を備える抗体。
【請求項２】
前記抗体がＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）を含み、ガラクトース−α−１，３−ガラクトースを欠いている、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体が検出可能マーカーに結合している、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
前記検出可能マーカーが放射性核種を含む、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
前記検出可能マーカーが蛍光標識を含む、請求項３に記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体が１種類以上の追加治療薬に結合している、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
前記１種類以上の追加治療薬が化学療法剤を含む、請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
前記化学療法剤がビンカアルカロイド、微小管破壊剤、血管新生阻害剤、治療用抗体、ＥＧＦＲ標的化薬剤、チロシンキナーゼ標的化薬剤、遷移金属錯体、プロテアソーム阻害剤、代謝拮抗剤  アルキル化剤、プラチナ系薬剤、アントラサイクリン抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、マクロライド、レチノイド、ゲルダナマイシンまたはその誘導体、アドリアマイシン、コルヒチン、シクロホスファミド、アクチノマイシン、ブレオマイシン、ヅアノルビシン（ｄｕａｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドキソルビシン、エピルビシン、マイトマイシン、メトトレキサート、ミトキサントロン、フルオロウラシル、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、メチル−ＣＣＮＵ、シスプラチン、エトポシド、インターフェロン、カンプトテシンおよびその誘導体、フェネステリン、タキサン類およびそれらの誘導体、トペテカン（ｔｏｐｅｔｅｃａｎ）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、タモキシフェン、ピポスルファン、ｎａｂ−５４０４、ｎａｂ−５８００、ｎａｂ−５８０１、イリノテカン、ＨＫＰ、オルタタキセル、ゲムシタビン、オキサリプラチン、ハーセプチン（登録商標）、ビノレルビン、ドキシル（登録商標）、カペシタビン、アリムタ（登録商標）、アバスチン（登録商標）、ベルケイド（登録商標）、タルセバ（登録商標）、ニューラスタ（Ｎｅｕｌａｓｔａ）（登録商標）、ラパチニブ、ソラフェニブ、およびエルロチニブからなる群より選択される、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
請求項１に記載の抗体および薬学的に許容可能な担体または賦形剤を含む組成物。
【請求項１０】
ビンカアルカロイド、微小管破壊剤、血管新生阻害剤、治療用抗体、ＥＧＦＲ標的化薬剤、チロシンキナーゼ標的化薬剤、遷移金属錯体、プロテアソーム阻害剤、代謝拮抗剤  アルキル化剤、プラチナ系薬剤、アントラサイクリン抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、マクロライド、レチノイド、ゲルダナマイシンまたはその誘導体、アドリアマイシン、コルヒチン、シクロホスファミド、アクチノマイシン、ブレオマイシン、ヅアノルビシン（ｄｕａｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドキソルビシン、エピルビシン、マイトマイシン、メトトレキサート、ミトキサントロン、フルオロウラシル、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、メチル−ＣＣＮＵ、シスプラチン、エトポシド、インターフェロン、カンプトテシンおよびその誘導体、フェネステリン、タキサン類およびそれらの誘導体、トペテカン（ｔｏｐｅｔｅｃａｎ）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、タモキシフェン、ピポスルファン、ｎａｂ−５４０４、ｎａｂ−５８００、ｎａｂ−５８０１、イリノテカン、ＨＫＰ、オルタタキセル、ゲムシタビン、オキサリプラチン、ハーセプチン（登録商標）、ビノレルビン、ドキシル（登録商標）、カペシタビン、アリムタ（登録商標）、アバスチン（登録商標）、ベルケイド（登録商標）、タルセバ（登録商標）、ニューラスタ（Ｎｅｕｌａｓｔａ）（登録商標）、ラパチニブ、ソラフェニブ、およびエルロチニブからなる群より選択される化学療法剤をさらに含む請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
請求項１に記載の抗体をコードする核酸を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞。
【請求項１２】
前記核酸がＣＨＯ細胞ゲノムから分離している複製可能ベクター上に存在する、請求項１１に記載のＣＨＯ細胞。
【請求項１３】
前記核酸がＣＨＯ細胞ゲノム中に安定的に組み込まれている、請求項１１に記載のＣＨＯ細胞。
【請求項１４】
必要とする対象において癌を治療するための方法であって、請求項１に記載の抗体を前記対象に投与することを含む前記方法。
【請求項１５】
ビンカアルカロイド、微小管破壊剤、血管新生阻害剤、治療用抗体、ＥＧＦＲ標的化薬剤、チロシンキナーゼ標的化薬剤、遷移金属錯体、プロテアソーム阻害剤、代謝拮抗剤  アルキル化剤、プラチナ系薬剤、アントラサイクリン抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、マクロライド、レチノイド、ゲルダナマイシンまたはその誘導体、アドリアマイシン、コルヒチン、シクロホスファミド、アクチノマイシン、ブレオマイシン、ヅアノルビシン（ｄｕａｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドキソルビシン、エピルビシン、マイトマイシン、メトトレキサート、ミトキサントロン、フルオロウラシル、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、メチル−ＣＣＮＵ、シスプラチン、エトポシド、インターフェロン、カンプトテシンおよびその誘導体、フェネステリン、タキサン類およびそれらの誘導体、トペテカン（ｔｏｐｅｔｅｃａｎ）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、タモキシフェン、ピポスルファン、ｎａｂ−５４０４、ｎａｂ−５８００、ｎａｂ−５８０１、イリノテカン、ＨＫＰ、オルタタキセル、ゲムシタビン、オキサリプラチン、ハーセプチン（登録商標）、ビノレルビン、ドキシル（登録商標）、カペシタビン、アリムタ（登録商標）、アバスチン（登録商標）、ベルケイド（登録商標）、タルセバ（登録商標）、ニューラスタ（Ｎｅｕｌａｓｔａ）（登録商標）、ラパチニブ、ソラフェニブ、およびエルロチニブからなる群より選択される１種類以上の追加治療薬を投与することをさらに含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体が１種類以上の追加治療薬に結合している、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記１種類以上の追加治療薬が化学療法剤を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記化学療法剤がビンカアルカロイド、微小管破壊剤、血管新生阻害剤、治療用抗体、ＥＧＦＲ標的化薬剤、チロシンキナーゼ標的化薬剤、遷移金属錯体、プロテアソーム阻害剤、代謝拮抗剤  アルキル化剤、プラチナ系薬剤、アントラサイクリン抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、マクロライド、レチノイド、ゲルダナマイシンまたはその誘導体、アドリアマイシン、コルヒチン、シクロホスファミド、アクチノマイシン、ブレオマイシン、ヅアノルビシン（ｄｕａｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドキソルビシン、エピルビシン、マイトマイシン、メトトレキサート、ミトキサントロン、フルオロウラシル、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、メチル−ＣＣＮＵ、シスプラチン、エトポシド、インターフェロン、カンプトテシンおよびその誘導体、フェネステリン、タキサン類およびそれらの誘導体、トペテカン（ｔｏｐｅｔｅｃａｎ）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、タモキシフェン、ピポスルファン、ｎａｂ−５４０４、ｎａｂ−５８００、ｎａｂ−５８０１、イリノテカン、ＨＫＰ、オルタタキセル、ゲムシタビン、オキサリプラチン、ハーセプチン（登録商標）、ビノレルビン、ドキシル（登録商標）、カペシタビン、アリムタ（登録商標）、アバスチン（登録商標）、ベルケイド（登録商標）、タルセバ（登録商標）、ニューラスタ（Ｎｅｕｌａｓｔａ）（登録商標）、ラパチニブ、ソラフェニブ、およびエルロチニブからなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記対象が陰性対照試料と比較して上昇した抗セツキシマブＩｇＥレベルを有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記対象が陰性対照試料と比較して上昇した抗ガラクトース−α−１，３−ガラクトースＩｇＥレベルを有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記対象がセツキシマブに対して過敏性であるか、またはセツキシマブに対する過敏性反応を有しやすいか決定することをさらに含む請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記対象の血清試料中の抗セツキシマブＩｇＥまたは抗ガラクトース−α−１，３−ガラクトースＩｇＥの存在を測定することが決定に含まれ、陰性対照試料と比較して上昇した抗セツキシマブＩｇＥレベルまたは抗ガラクトース−α−１，３−ガラクトースＩｇＥレベルによって前記対象がセツキシマブに対して過敏性であること、またはセツキシマブに対する過敏性反応を有しやすいことが示される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）の使用が測定に含まれる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１に記載の抗体を作製する方法であって、表２に示されているアミノ酸配列をコードする核酸とチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を接触させることを含む前記方法。
【請求項２５】
前記核酸が前記ＣＨＯ細胞のゲノム中に安定的に組み込まれている、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、参照により全体が本明細書に援用される２０１４年９月１６日に出願された米国特許仮出願第６２／０５１１２６号の優先権を主張する。
【０００２】
本発明の分野
本開示は概して抗ＥＧＦＲ抗体の治療的使用法に関する。特に本開示はＥＧＦＲ発現癌の治療用の抗ＥＧＦＲ抗体を含む方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）は細胞外リガンド結合ドメイン、経膜断片および細胞内チロシンキナーゼドメインから構成される。上皮成長因子（ＥＧＦ）およびトランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦα）などのリガンドが結合するとＥＧＦＲはホモ二量体を形成するか、またはＥｒｂＢファミリーの他のメンバーとヘテロ二量体を形成し、それによって細胞内ドメインの自己リン酸化とＲａｓ誘導性ＭＡＰキナーゼ経路、ＰＩ３キナーゼ経路およびＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路をはじめとする下流シグナル伝達経路の活性化を引き起こす。この活性化によって癌細胞増殖、アポトーシス阻害、および浸潤活性化のシグナルを送ることができ、腫瘍誘導性血管新生を促進することができる。ＥＧＦＲを発現するヒト癌は認可済み抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体であるセツキシマブ（アービタックス（登録商標））のような受容体シグナル伝達および腫瘍細胞増殖を妨げるＥＧＦＲ特異的抗体で治療されることが多い。
【０００４】
セツキシマブの直接的作用機序はリガンド受容体結合の妨害とそれによるＥＧＦＲチロシンキナーゼのリガンド媒介性活性化の阻害である。このＥＧＦＲ遮断の結果として腫瘍微小環境中の腫瘍細胞または間質細胞においてＥＧＦＲシグナル伝達経路によって制御される様々な過程が混乱する（Fan Z, et al. 1994、Abanell J, et al. 2001、Prewett M, et al. 1996、Huang SM, et al. 1999、Fan Z, et al. 1993a、Fan Z, et al. 1993b）。抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および受容体内部移行をはじめとする他の機構が同様に重要な役割を果たす可能性がある（Kawaguchi Y, et al. 1996、Kimura H, et al. 2007）。ＡＤＣＣは細胞のＦｃγＲとモノクローナル抗体との間の相互作用に依存し、ナチュラルキラー細胞、単球、マクロファージ、活性化Ｔリンパ球および顆粒球が関わる自然免疫応答を引き起こす。受容体内部移行は利用できる細胞表面受容体の数を下方制御し、したがって、ＥＧＦＲ活性化に影響し得る。
【０００５】
過敏性反応はセツキシマブの頻繁に起こる副作用であり、受容者にとって致命的になる場合があり得る。本開示は、セツキシマブをさらに使用することを不可能にするセツキシマブに対する感受性を有する個体にとって有用な代替的ＥＧＦＲ標的化療法を提供する。特に本開示はセツキシマブと同じ特異性および効力を有しているが、セツキシマブよりも免疫反応性を低くし、且つ、安定性を高くする修飾を有している抗ＥＧＦＲ抗体を提供する。その抗体はＥＧＦＲ発現癌の治療に単独で、または１種類以上の追加治療薬と組み合わせたときに有用である。
【発明の概要】
【０００６】
１つの態様では本開示は表２に示されているアミノ酸配列を備える抗体を提供する。幾つかの実施形態では前記抗体はＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）を含み、ガラクトース−α−１，３−ガラクトースを欠いている。
【０００７】
幾つかの実施形態では前記抗体は検出可能マーカーに結合している。幾つかの実施形態では前記検出可能マーカーは放射性核種を含む。幾つかの実施形態では前記検出可能マーカーは蛍光標識を含む。
【０００８】
幾つかの実施形態では前記抗体は１種類以上の追加治療薬に結合している。幾つかの実施形態では前記１種類以上の追加治療薬は化学療法剤を含む。
【０００９】
幾つかの実施形態では前記化学療法剤はビンカアルカロイド、微小管破壊剤、血管新生阻害剤、治療用抗体、ＥＧＦＲ標的化薬剤、チロシンキナーゼ標的化薬剤、遷移金属錯体、プロテアソーム阻害剤、代謝拮抗剤  アルキル化剤、プラチナ系薬剤、アントラサイクリン抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、マクロライド、レチノイド、ゲルダナマイシンまたはその誘導体、アドリアマイシン、コルヒチン、シクロホスファミド、アクチノマイシン、ブレオマイシン、ヅアノルビシン（ｄｕａｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドキソルビシン、エピルビシン、マイトマイシン、メトトレキサート、ミトキサントロン、フルオロウラシル、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、メチル−ＣＣＮＵ、シスプラチン、エトポシド、インターフェロン、カンプトテシンおよびその誘導体、フェネステリン、タキサン類およびそれらの誘導体、トペテカン（ｔｏｐｅｔｅｃａｎ）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、タモキシフェン、ピポスルファン、ｎａｂ−５４０４、ｎａｂ−５８００、ｎａｂ−５８０１、イリノテカン、ＨＫＰ、オルタタキセル、ゲムシタビン、オキサリプラチン、ハーセプチン（登録商標）、ビノレルビン、ドキシル（登録商標）、カペシタビン、アリムタ（登録商標）、アバスチン（登録商標）、ベルケイド（登録商標）、タルセバ（登録商標）、ニューラスタ（Ｎｅｕｌａｓｔａ）（登録商標）、ラパチニブ、ソラフェニブ、およびエルロチニブからなる群より選択される。
【００１０】
１つの態様では本開示は表２に示されているアミノ酸配列を備える抗体および薬学的に許容可能な担体または賦形剤を含む組成物を提供する。
【００１１】
幾つかの実施形態では前記組成物はビンカアルカロイド、微小管破壊剤、血管新生阻害剤、治療用抗体、ＥＧＦＲ標的化薬剤、チロシンキナーゼ標的化薬剤、遷移金属錯体、プロテアソーム阻害剤、代謝拮抗剤  アルキル化剤、プラチナ系薬剤、アントラサイクリン抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、マクロライド、レチノイド、ゲルダナマイシンまたはその誘導体、アドリアマイシン、コルヒチン、シクロホスファミド、アクチノマイシン、ブレオマイシン、ヅアノルビシン（ｄｕａｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドキソルビシン、エピルビシン、マイトマイシン、メトトレキサート、ミトキサントロン、フルオロウラシル、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、メチル−ＣＣＮＵ、シスプラチン、エトポシド、インターフェロン、カンプトテシンおよびその誘導体、フェネステリン、タキサン類およびそれらの誘導体、トペテカン（ｔｏｐｅｔｅｃａｎ）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、タモキシフェン、ピポスルファン、ｎａｂ−５４０４、ｎａｂ−５８００、ｎａｂ−５８０１、イリノテカン、ＨＫＰ、オルタタキセル、ゲムシタビン、オキサリプラチン、ハーセプチン（登録商標）、ビノレルビン、ドキシル（登録商標）、カペシタビン、アリムタ（登録商標）、アバスチン（登録商標）、ベルケイド（登録商標）、タルセバ（登録商標）、ニューラスタ（Ｎｅｕｌａｓｔａ）（登録商標）、ラパチニブ、ソラフェニブ、およびエルロチニブからなる群より選択される化学療法剤をさらに含む。
【００１２】
１つの態様では本開示は表２に示されているアミノ酸配列を備える抗体をコードする核酸を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を提供する。幾つかの実施形態では前記核酸はＣＨＯ細胞ゲノムから分離している複製可能ベクター上に存在する。幾つかの実施形態では前記核酸はＣＨＯ細胞ゲノム中に安定的に組み込まれている。
【００１３】
１つの態様では本開示は必要とする対象において癌を治療するための方法であって、表２に示されているアミノ酸配列を備える抗体を前記対象に投与することを含む前記方法を提供する。
【００１４】
幾つかの実施形態では前記方法はビンカアルカロイド、微小管破壊剤、血管新生阻害剤、治療用抗体、ＥＧＦＲ標的化薬剤、チロシンキナーゼ標的化薬剤、遷移金属錯体、プロテアソーム阻害剤、代謝拮抗剤  アルキル化剤、プラチナ系薬剤、アントラサイクリン抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、マクロライド、レチノイド、ゲルダナマイシンまたはその誘導体、アドリアマイシン、コルヒチン、シクロホスファミド、アクチノマイシン、ブレオマイシン、ヅアノルビシン（ｄｕａｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドキソルビシン、エピルビシン、マイトマイシン、メトトレキサート、ミトキサントロン、フルオロウラシル、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、メチル−ＣＣＮＵ、シスプラチン、エトポシド、インターフェロン、カンプトテシンおよびその誘導体、フェネステリン、タキサン類およびそれらの誘導体、トペテカン（ｔｏｐｅｔｅｃａｎ）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、タモキシフェン、ピポスルファン、ｎａｂ−５４０４、ｎａｂ−５８００、ｎａｂ−５８０１、イリノテカン、ＨＫＰ、オルタタキセル、ゲムシタビン、オキサリプラチン、ハーセプチン（登録商標）、ビノレルビン、ドキシル（登録商標）、カペシタビン、アリムタ（登録商標）、アバスチン（登録商標）、ベルケイド（登録商標）、タルセバ（登録商標）、ニューラスタ（Ｎｅｕｌａｓｔａ）（登録商標）、ラパチニブ、ソラフェニブ、およびエルロチニブからなる群より選択される１種類以上の追加治療薬を投与することをさらに含む。
【００１５】
幾つかの実施形態では前記抗体は１種類以上の追加治療薬に結合している。幾つかの実施形態では前記１種類以上の追加治療薬は化学療法剤を含む。幾つかの実施形態では前記化学療法剤はビンカアルカロイド、微小管破壊剤、血管新生阻害剤、治療用抗体、ＥＧＦＲ標的化薬剤、チロシンキナーゼ標的化薬剤、遷移金属錯体、プロテアソーム阻害剤、代謝拮抗剤  アルキル化剤、プラチナ系薬剤、アントラサイクリン抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、マクロライド、レチノイド、ゲルダナマイシンまたはその誘導体、アドリアマイシン、コルヒチン、シクロホスファミド、アクチノマイシン、ブレオマイシン、ヅアノルビシン（ｄｕａｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドキソルビシン、エピルビシン、マイトマイシン、メトトレキサート、ミトキサントロン、フルオロウラシル、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、メチル−ＣＣＮＵ、シスプラチン、エトポシド、インターフェロン、カンプトテシンおよびその誘導体、フェネステリン、タキサン類およびそれらの誘導体、トペテカン（ｔｏｐｅｔｅｃａｎ）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、タモキシフェン、ピポスルファン、ｎａｂ−５４０４、ｎａｂ−５８００、ｎａｂ−５８０１、イリノテカン、ＨＫＰ、オルタタキセル、ゲムシタビン、オキサリプラチン、ハーセプチン（登録商標）、ビノレルビン、ドキシル（登録商標）、カペシタビン、アリムタ（登録商標）、アバスチン（登録商標）、ベルケイド（登録商標）、タルセバ（登録商標）、ニューラスタ（Ｎｅｕｌａｓｔａ）（登録商標）、ラパチニブ、ソラフェニブ、およびエルロチニブからなる群より選択される。
【００１６】
幾つかの実施形態では前記対象は陰性対照試料と比較して上昇した抗セツキシマブＩｇＥレベルを有する。幾つかの実施形態では前記対象は陰性対照試料と比較して上昇した抗ガラクトース−α−１，３−ガラクトースＩｇＥレベルを有する。
【００１７】
幾つかの実施形態では前記方法は前記対象がセツキシマブに対して過敏性であるか、またはセツキシマブに対する過敏性反応を有しやすいか決定することをさらに含む。幾つかの実施形態では前記対象の血清試料中の抗セツキシマブＩｇＥまたは抗ガラクトース−α−１，３−ガラクトースＩｇＥの存在を測定することが決定に含まれ、陰性対照試料と比較して上昇した抗セツキシマブＩｇＥレベルまたは抗ガラクトース−α−１，３−ガラクトースＩｇＥレベルによって前記対象がセツキシマブに対して過敏性であること、またはセツキシマブに対する過敏性反応を有しやすいことが示される。幾つかの実施形態では酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）の使用が測定に含まれる。
【００１８】
１つの態様では本開示は表２に示されているアミノ酸配列を備える抗体を作製する方法であって、表２に示されているアミノ酸配列をコードする核酸とチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を接触させることを含む前記方法を提供する。幾つかの実施形態では前記核酸は前記ＣＨＯ細胞のゲノム中に安定的に組み込まれている。
【００１９】
本明細書に含まれる図面は本明細書中に開示される技術の非限定的な例となる実施形態を示し、読者の本開示の理解を支援するために提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】腫瘍細胞株Ａ５４９およびＦａＤｕにおけるＬＲ００４およびアービタックス（登録商標）によるＥＧＦＲのＴＧＦ誘導性リン酸化の阻害を示している図である。
【図２】下咽頭癌ＦａＤｕ細胞に対するＬＲ００４およびアービタックス（登録商標）の効果をＡＤＣＣに示している図である。
【図３−１】酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって示されるＬＲ００４およびアービタックス（登録商標）の結合特異性を示している図である。
【図３−２】酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって示されるＬＲ００４およびアービタックス（登録商標）の結合特異性を示している図である。
【図４】ＥＬＩＳＡによって示される可溶性ＥＧＦＲに対するＬＲ００４およびアービタックス（登録商標）の結合を示している図である。
【図５】腫瘍細胞株における細胞表面ＥＧＦＲに対するＬＲ００４またはアービタックス（登録商標）の結合を示している図である。
【図６−１】アービタックス（登録商標）によるＥＧＦＲ発現細胞株におけるＦＩＴＣ標識ＬＲ００４の結合の抑制を示している図である。
【図６−２】アービタックス（登録商標）によるＥＧＦＲ発現細胞株におけるＦＩＴＣ標識ＬＲ００４の結合の抑制を示している図である。
【図７】ＭＤＡ−ＭＢ−４６８癌細胞におけるＬＲ００４（ＬＲ−００４）によるＦＩＴＣ標識アービタックス（登録商標）の結合の抑制を示している図である。
【図８−１】腫瘍細胞株のインビトロ増殖に対するＬＲ００４またはアービタックス（登録商標）の効果を示している図である。検査された細胞株には（Ａ）ＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌細胞、（Ｂ）結腸癌細胞株ＬｏＶｏ、（Ｃ）下咽頭癌株ＦａＤｕ、および（Ｄ）Ａ４３１類表皮癌細胞が含まれた。ＬＲ００４およびアービタックス（登録商標）によるインビトロ増殖抑制はＣＣＫ−８アッセイ（ＡおよびＢ）またはＡＴＰＬｉｔｅアッセイ（ＣおよびＤ）によって決定された。
【図８−２】腫瘍細胞株のインビトロ増殖に対するＬＲ００４またはアービタックス（登録商標）の効果を示している図である。検査された細胞株には（Ａ）ＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌細胞、（Ｂ）結腸癌細胞株ＬｏＶｏ、（Ｃ）下咽頭癌株ＦａＤｕ、および（Ｄ）Ａ４３１類表皮癌細胞が含まれた。ＬＲ００４およびアービタックス（登録商標）によるインビトロ増殖抑制はＣＣＫ−８アッセイ（ＡおよびＢ）またはＡＴＰＬｉｔｅアッセイ（ＣおよびＤ）によって決定された。
【図９】ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス中のＧＥＯ腫瘍増殖に対する高用量のＬＲ００４またはアービタックス（登録商標）の効果を示している図である。データは各群の全マウスの平均を表しており、バーはＳＤを表している（Ｎ＝５匹／群）。
【図１０】ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス中のＧＥＯ腫瘍増殖に対するＬＲ００４用量応答のインビボ効果を示している図である。データは各群の全マウスの平均を表しており、バーはＳＤを表している（Ｎ＝８匹／群）。
【図１１】カニクイザルへの静脈内投与（１８ｍｇ／ｋｇ）後のＬＲ００４およびアービタックス（登録商標）の濃度時間プロファイルを示している図である。
【図１２】カニクイザルでの静脈内投与後の血清中ＬＲ００４濃度を示している図である。
【図１３】１日目、２１日目、２８日目、および３５日目に１８ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与した後のカニクイザルにおけるＬＲ００４の血清中濃度を示している図である。
【図１４Ａ】ＲＰ−ＨＰＬＣによって決定されたＬＲ００４およびアービタックス（登録商標）のシアル酸修飾を示している図である。
【図１４Ｂ】ＲＰ−ＨＰＬＣによって決定されたＬＲ００４およびアービタックス（登録商標）のシアル酸修飾を示している図である。
【図１５】ＥＬＩＳＡによって決定されたＬＲ００４およびアービタックス（登録商標）のＮｅｕ５Ｇｃ（Ｎ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ））レベルを示している図である。
【図１６Ａ】示差走査熱量分析（ＤＳＣ）によって決定されたＬＲ００４およびアービタックス（登録商標）の熱安定性を示している図である。
【図１６Ｂ】示差走査熱量分析（ＤＳＣ）によって決定されたＬＲ００４およびアービタックス（登録商標）の熱安定性を示している図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
Ｉ．  一般事項
本開示はＥＧＦＲ発現癌の治療に有用なＥＧＦＲ特異的抗体を含む方法および組成物を提供する。しっかりとした技術理解をもたらすため、本明細書中に開示される技術のある特定の態様、方式、実施形態、変化および特徴が様々なレベルの詳しさで下に説明されていることが理解されるべきである。
【００２２】
別途定義されない限り、本明細書中に使用される全ての技術用語および科学用語は本技術が属する分野の当業者によって共通して理解されるものと同じ意味を概ね有する。本明細書および添付されている特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、内容から別段の明確な指示が無い限り、複数形の指示物を含む。例えば、「（単数の）細胞」への言及は２つ以上の細胞の組合せ等を含む。概して、本明細書中に使用される命名法、ならびに細胞培養、分子遺伝学、有機化学、分析化学、および核酸化学の実験法、および下で説明されるハイブリダイゼーションは当技術分野においてよく知られており、且つ、一般的に使用されるものである。標準的技術を核酸およびペプチドの合成に使用する。標準的技術、またはそれらの変法を化学合成および化学分析に使用する。本明細書中に引用される全ての参照文献は参照により全体が本明細書に援用され、且つ、それぞれ個々の刊行物、特許、または特許出願の全体が全ての目的のために参照によって具体的および個別に援用される場合と同程度に全ての目的のために援用される。
【００２３】
本明細書中に使用されるある特定の 用語の定義を以下に提供する。Illustrated Dictionary of Immunology、第２版（Cruse, J.M. および Lewis, R.E.編、ボカラトン、フロリダ州、ＣＲＣプレス、１９９５年）中に他の用語の定義を見つけ出すことができる。
【００２４】
本明細書において使用される場合、「相乗作用」または「相乗剤」という用語は２つ以上の薬剤、存在、因子、または物質の間で生じる効果であって、それらの個々の効果の合計よりも大きな効果をもたらすものを指す。ある実施形態ではＬＲ００４抗体および化学療法剤などの生物活性薬剤間の相乗作用が薬物相互作用係数（すなわち、ＣＤＩ）によって決定される（例えば、Cao SS, et al., Potentiation of antimetabolite antitumor activity in vivo by dipyridamole and amphotericin B. Cancer Chemother Pharmacol 1989; 24: 181-186を参照されたい）。幾つかの実施形態ではＣＤＩは次のように計算される：ＣＤＩ＝ＡＢ／Ａ×Ｂ。各群の化学発光に準じて、ＡＢは混合群の対照群に対する比率であり、ＡまたはＢは個々の薬剤群の対照群に対する比率である。ＣＤＩ値が１未満であるときにその薬品の組合せは相乗的である。２つ以上の成分の間の相乗的相互作用を決定するとき、幾つかの実施形態では治療を必要とする患者にそれらの成分を様々な重量／重量比率範囲で投与することによって、および／または様々な用量で投与することによって効果に最適な範囲、および効果に適した各成分の絶対用量範囲を判定することができる。１つの種における相乗作用の観察によって他の種における効果を予測することができ、そのような試験の結果を有効用量の予測に使用することができる。
【００２５】
本明細書において使用される場合、「有意な相乗作用」または「有意に相乗的」という用語は２つ以上の薬剤、存在、因子、または物質の間で生じる効果であって、それらの個々の効果の合計よりも統計学的に有意に大きな効果をもたらすものを指す。例として、限定されないが、ＣＤＩ値が０．７未満であるときにある薬品の組合せが有意に相乗的である。
【００２６】
本明細書において使用される場合、「相加的」という用語は２つ以上の薬剤、存在、因子、または物質の間で生じる効果であって、それらの個々の効果の合計と等しい効果をもたらすものを指す。
【００２７】
本明細書において使用される場合、「相殺作用」または「拮抗的」という用語は２つ以上の薬剤、存在、因子、または物質の間で生じる効果であって、それらの個々の効果の合計よりも小さい効果をもたらすものを指す。例として、限定されないが、ＣＤＩ値が１を超えるときにある薬品の組合せが相加的である。
【００２８】
本明細書において使用される場合、「ＥＧＦＲ」という用語は細胞外タンパク質リガンドの上皮成長因子（ＥＧＦ）ファミリーのメンバーの細胞表面受容体を指す。その受容体は４種類の関連の受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）、すなわち、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ−１）、ＨＥＲ２／ｃ−ｎｅｕ（ＥｒｂＢ−２）、Ｈｅｒ３（ＥｒｂＢ−３）、およびＨｅｒ４（ＥｒｂＢ−４）のうちのメンバーである。当技術分野においてよく知られているようにＥＧＦＲの突然変異による活性化によってリガンド非依存的シグナル伝達、細胞増殖と細胞成長の促進、および様々な癌の発生が引き起こされ得る。
【００２９】
本明細書において使用される場合、対象への薬剤または薬品の投与は自己投与および他人による投与を含む。記載されるような健康状態の様々な治療方法または予防方法が「実質的なもの」であるとされ、それには総合的な治療または予防が含まれるが、決して総合的ではない治療または予防も含まれ、且つ、ある生物学的または医学的に適切な成果が達成されることも理解されるべきである。
【００３０】
本明細書において使用される場合、「アミノ酸」という用語には天然アミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物が含まれる。天然アミノ酸は遺伝コードによってコードされるアミノ酸、ならびに後で修飾されるアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は天然アミノ酸と同じ基本的化学構造、すなわち、水素に結合しているα炭素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基を有する化合物、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルフオキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。そのような類似体は修飾型Ｒ基を有しているか（例えば、ノルロイシン）、または修飾型ペプチド骨格を有しているが、天然アミノ酸と同じ基本的化学構造を保持する。アミノ酸模倣物は、アミノ酸の一般的な化学構造と異なる構造を有するが、天然アミノ酸と同様に機能する化合物を指す。本明細書においてアミノ酸をそれらの一般的に知られている三文字の記号またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会によって推奨される一文字の記号のどちらかで参照することができる。同様に、ヌクレオチドをそれらの一般的に受け入れられている一文字のコードで参照することができる。
【００３１】
本明細書において使用される場合、「抗体」という用語は免疫グロブリン遺伝子に由来するフレームワーク領域を含むポリペプチド、または抗原、例えばＥＧＦＲに特異的に結合し、認識するその断片を意味する。抗体という用語の使用には単鎖全長抗体を含む全長抗体およびそれらの抗原結合性断片を含む意味がある。「抗体」という用語には、所望の生物活性または機能を示す限り、二特異性抗体および多重特異性抗体が含まれる。
【００３２】
本明細書において使用される場合、「抗体関連ポリペプチド」という用語は、可変領域だけを含み得る、または次のポリペプチド要素、すなわち、抗体分子のヒンジ領域、ＣＨ1ドメイン、ＣＨ2ドメイン、およびＣＨ3ドメインの全てまたは一部と共同して可変領域を含み得る単鎖抗体をはじめとする抗原結合性抗体断片を意味する。本開示には可変領域およびヒンジ領域、ＣＨ1ドメイン、ＣＨ2ドメイン、およびＣＨ3ドメインのあらゆる組合せも含まれる。本技術の抗体分子には、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）2、Ｆｄ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、およびＶLドメインまたはＶHドメインのどちらかを含む断片が含まれるがこれらに限定されない。例には（ｉ）ＶLドメイン、ＶHドメイン、ＣLドメインおよびＣＨ1ドメインから構成される一価断片であるＦａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結合している２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）2断片、（ｉｉｉ）ＶHドメインとＣＨ1ドメインから構成されるＦｄ断片、（ｉｖ）単腕の抗体のＶLドメインとＶHドメインから構成されるＦｖ断片、（ｖ）ＶHドメインから構成されるｄＡｂ断片（Ward, et al., Nature 341: 544-546, 1989）、および（ｖｉ）単離相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。したがって「抗体断片」は完全長抗体の一部、一般にはその抗原結合領域または可変領域を含み得る。抗体断片の例にはＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）2断片、およびＦｖ断片、ディアボディ、直鎖状抗体、単鎖抗体分子、および（複数の）抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。単鎖抗体分子は多数の個々の分子、例えば二量体、三量体、または他の多量体を有する重合体を含み得る。
【００３３】
本明細書において使用される場合、「生体試料」という用語は生存細胞に由来する試料物質、または生存細胞に接触した試料物質を意味する。「生体試料」という用語は対象から単離された組織、細胞および生体液、ならびに対象内に存在する組織、細胞および生体液を含むものとする。本技術の生体試料には、全血、血漿、精液、唾液、涙液、尿、糞便、汗、バッカル、皮膚、脳脊髄液、および毛髪が含まれるがこれらに限定されない。内臓の生検または癌から生体試料を得ることもできる。
【００３４】
本明細書において使用される場合、「ＣＤＲ移植抗体」という用語は「受容側」抗体の少なくとも１つのＣＤＲが望ましい抗原特異性を有する「ドナー側」抗体のＣＤＲ「移植片」によって置き換えられている抗体を意味する。
【００３５】
本明細書において使用される場合、「キメラ抗体」という用語は組換えＤＮＡ技術を用いて１つの種に由来するモノクローナル抗体のＦｃ定常領域（例えばマウスＦｃ定常領域）が別の種の抗体に由来するＦｃ定常領域（例えばヒトＦｃ定常領域）と置き換えられている抗体を意味する。概要について、Ｒｏｂｉｎｓｏｎらの国際出願ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９号明細書、Ａｋｉｒａらの欧州特許出願第１８４１８７号明細書、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉの欧州特許出願第１７１４９６号明細書、Ｍｏｒｒｉｓｏｎらの欧州特許出願第１７３４９４号明細書、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒらの国際公開第８６／０１５３３号パンフレット、Ｃａｂｉｌｌｙらの米国特許第４８１６５６７号明細書、Ｃａｂｉｌｌｙらの欧州特許出願第１２５０２３号明細書、 Better, et al., Science 240: 1041-1043, 1988、Liu, et al., Proc Natl Acad Sci USA 84: 3439-3443, 1987、Liu, et al., J Immunol 139: 3521-3526, 1987、Sun, et al., Proc Natl Acad Sci USA 84: 214-218, 1987、Nishimura, et al., Cancer Res 47: 999-1005, 1987、Wood, et al., Nature 314: 446-449, 1885、および Shaw, et al., J Natl Cancer Inst 80: 1553-1559, 1988を参照されたい。
【００３６】
本明細書において使用される場合、「比較ウィンドウ」という用語は、２０〜６００個まで、一般的には約５０〜約２００個、より一般的には約１００〜約１５０個のアミノ酸またはヌクレオチドからなる群より選択される数の連続的位置のうちのいずれか１つの連続的位置の分節であって、ある配列および基準配列の２つの配列を最適になるように整列させた後にその同じ数の連続的位置のその基準配列に対してその配列を比較することができる分節を意味する。
【００３７】
本明細書において使用される場合、「コンセンサスＦＲ」という用語はコンセンサス免疫グロブリン配列中のフレームワーク（ＦＲ）抗体領域を意味する。抗体のＦＲ領域は抗原と接触しない。
【００３８】
本明細書において使用される場合、「コンセンサス配列」という用語は関連の配列からなるファミリーの中で最も頻繁に現れるアミノ酸（またはヌクレオチド）から形成される配列を指す（例えば、 Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany 1987を参照されたい）。すなわち、あるタンパク質ファミリーにおいて、コンセンサス配列中の各位置がそのファミリーの中でその位置に最も頻繁に現れるアミノ酸によって占められている。２つのアミノ酸が等しい頻度で現れる場合、どちらもコンセンサス配列に含まれ得る。
【００３９】
本明細書において使用される場合、細胞または組織に適用されたときの「接触する（ｃｏｎｔａｃｔｅｄ）」という用語は、本技術のＥＧＦＲ抗体、抗体組成物、細胞傷害性薬剤または部分、遺伝子、タンパク質および／またはアンチセンス配列が標的細胞に送達される過程、またはその標的細胞の直近に配置される過程を指す。この送達はインビトロまたはインビボの送達であり得、且つ、組換えベクター系の使用を伴い得る。
【００４０】
本明細書において使用される場合、「細胞傷害性部分」という用語は、細胞に接近すると、または細胞によって吸収されると細胞増殖を抑制する、または細胞死を促進する部分を意味する。この点で適切な細胞傷害性部分には放射性薬剤または放射性同位体（放射性核種）、分化誘導剤、阻害剤および小化学毒薬などの化学傷害性薬剤、有毒タンパク質およびそれらの誘導体、ならびにヌクレオチド配列（またはそれらのアンチセンス配列）が含まれる。したがって、細胞傷害性部分は、非限定的な例として、化学療法剤、光活性化毒物、または放射性薬剤であり得る。
【００４１】
本明細書において使用される場合、「ディアボディ」という用語は２つの抗原結合部位を有する小抗体断片であって、同じポリペプチド鎖の中に軽鎖可変ドメイン（ＶL）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶH）を含む断片（ＶH  ＶL）を指す。同じ鎖にあるそれら２つのドメインの間で対合するには短すぎるリンカーを使用することでそれらのドメインを別の鎖の相補的ドメインと対合させ、２つの抗原結合部位を作製させる。例えば、欧州特許第４０４０９７号明細書、国際公開第９３／１１１６１号パンフレット、および 30 Hollinger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993) にディアボディのことがさらに充分に記載されている。
【００４２】
本明細書において使用される場合、組成物の「有効量」という用語は所望の治療効果および／または予防効果を達成するために充分である量、例えば、治療されている疾患、例えば、標的ポリペプチドと関連する疾患に付随する症状の予防またはその減少を引き起こす量である。対象に投与される本技術の組成物の量は疾患の種類と重症度、ならびに一般健康状態、年齢、性別、体重、および薬品への忍容性などの個体の特性に左右される。その量は疾患の程度、重症度、および種類にも左右される。当業者はこれらの因子および他の因子に応じて適切な投薬量を決定することができる。本技術の組成物を相互に併用投与することも１種類以上の追加の治療用化合物と共に投与することもできる。
【００４３】
本明細書において使用される場合、「発現」には次のこと、すなわち、遺伝子の前駆体ｍＲＮＡへの転写、成熟ｍＲＮＡを作製するためのその前駆体ｍＲＮＡのスプライシングおよび他のプロセッシング、ｍＲＮＡ安定性、その成熟ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳（コドン利用度およびｔＲＮＡ利用可能性を含む）、および、適切な発現と機能に必要である場合はその翻訳産物のグリコシル化および／または他の修飾のうちの１つ以上が含まれるがこれらに限定されない。
【００４４】
本明細書において使用される場合、「遺伝子」という用語は、発現を制御するプロモーター、エクソン、イントロン、および他の非翻訳領域をはじめとするＲＮＡ産物の制御された生合成のための全ての情報を含むＤＮＡの分節を意味する。
【００４５】
本明細書において使用される場合、「遺伝子型」という用語は、個体中の相同染色体対上のある遺伝子座の１つ以上の多型部位または突然変異部位に見られるヌクレオチド対の一致しない５’から３’方向への配列を意味する。本明細書において使用される場合、遺伝子型には完全遺伝子型および／または部分遺伝子型が含まれる。
【００４６】
本明細書において使用される場合、「ヒト配列抗体」という用語はヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および（存在する場合は）定常領域を有する抗体を含む。本技術のヒト配列抗体はヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでの無作為突然変異形成または部位特異的突然変異形成によって、またはインビボでの体細胞突然変異によって導入された突然変異）を含み得る。例えば、ＰＣＴ国際公開第０１／１４４２４号パンフレットおよび第００／３７５０４号パンフレットに記載されるように非ヒト遺伝子導入動物中でそのような抗体を作製することができる。しかしながら、「ヒト配列抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、マウスなどの別の哺乳類種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植されている抗体（例えばヒト化抗体）を含まないものとする。
【００４７】
本明細書において使用される場合、非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」型という用語は非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含むキメラ抗体である。たいてい、ヒト化抗体は受容側の超可変領域残基が所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）に由来する超可変領域残基によって置き換えられているヒト免疫グロブリンである。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基が対応する非ヒト残基によって置き換えられている。さらに、ヒト化抗体はその受容側抗体またはそのドナー抗体に見られない残基を含んでもよい。これらの修飾は結合親和性などの抗体の性能をさらに改良するために行われる。ヒト化抗体は少なくとも１つの可変ドメイン、通常は２つの可変ドメインのうちの実質的に全てを含み、可変ドメイン内では超可変ループの全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、且つ、結合親和性を改善する１つ以上のアミノ酸置換がＦＲ領域に含まれ得るが、それらのＦＲ領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のＦＲ領域であることが一般的である。ＦＲにおけるこれらのアミノ酸置換の数は通常はＨ鎖では６以下であり、Ｌ鎖では３以下である。ヒト化抗体は免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。さらに詳しくは、Jones, et al., Nature 321:522-525 (1986)、Reichmann, et al., Nature 332:323-329 (1988)、および Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992) を参照されたい。
【００４８】
１つの実施形態では本開示は本技術のＥＧＦＲ抗体のアミノ酸修飾を企図している。例えば、本抗体の結合親和性および／または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合があり得る。本ＥＧＦＲ抗体のアミノ酸配列変異体は適切なヌクレオチド変化を抗体核酸に導入することによって、またはペプチド合成によって調製され得る。そのような修飾には、例えば、ＥＧＦＲ結合部位のアミノ酸配列内の残基からの欠失、および／またはそれらの残基への挿入、および／またはそれらの残基の置換が含まれる。目的の抗体を得るために、得られた抗体が所望の特性、例えば生物活性を有する限り、欠失、挿入、および置換のあらゆる組合せが行われる。修飾にはタンパク質のグリコシル化パターンの変更も含まれる。突然変異形成にとって好ましい位置の特定に有用な方法は Science, 244:1081-1085 (1989)内でＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓによって記載された「アラニンスキャニング突然変異形成」と呼ばれる。その後、変異型抗体を所望の活性についてスクリーニングする。
【００４９】
本明細書において使用される場合、「超可変領域」という用語は抗原結合性の原因となる抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は一般に「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」に由来するアミノ酸残基（例えば、ＶL内の残基約２４〜３４（Ｌ１）、残基約５０〜５６（Ｌ２）および残基約８９〜９７（Ｌ３）近辺、およびＶH内の残基約３１〜３５Ｂ（Ｈ１）、残基約５０〜６５（Ｈ２）および残基約９５〜１０２（Ｈ３）近辺（Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第５版、公衆衛生局、米国国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州、（１９９１年））、および／または「超可変ループ」に由来するアミノ酸残基（例えば、ＶL内の残基２６〜３２（Ｌ１）、残基５０〜５２（Ｌ２）および残基９１〜９６（Ｌ３）、およびＶH内の残基２６〜３２（Ｈ１）、残基５２Ａ〜５５（Ｈ２）および残基９６〜１０１（Ｈ３）（Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）を含む。
【００５０】
本明細書において使用される場合、「同一である」またはパーセント「同一性」という用語は、２つ以上の核酸またはポリペプチド配列についての文脈で使用されるとき、ＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムを下に記載される初期パラメーターで使用して測定されると、または手動の整列および目視検査（例えば、ＮＣＢＩウェッブサイトを参照されたい）によって測定されると同じである２つ以上の配列または部分配列、または特定のパーセンテージの同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する（すなわち、比較ウィンドウまたは指定された領域の上で比較され、対応が最大になるように整列させられたときに特定の領域（例えば、本明細書に記載される抗体をコードするヌクレオチド配列または本明細書に記載される抗体のアミノ酸配列）の上で約６０％の同一性を有する、好ましくは６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い同一性を有する）２つ以上の配列または部分配列を指す。その後、そのような配列は「実質的に同一である」と言われる。この用語は検査配列の賛辞も指す、または検査配列の賛辞にも適用され得る。その用語は欠失および／または付加を有する配列、ならびに置換を有する配列も含む。下で説明するように、好ましいアルゴリズムはギャップ等を報告することができる。幾つかの実施形態では同一性は少なくとも約２５アミノ酸長またはヌクレオチド長である領域にわたって存在し、加えて、または代わりに、幾つかの実施形態では同一性は５０〜１００アミノ酸長またはヌクレオチド長である領域にわたって存在する。
【００５１】
「単離された」または「精製された」ポリペプチドまたはその生物学的活性部分はそのポリペプチドが由来する細胞源または組織源の細胞性物質または他の汚染混入ポリペプチドを実質的に含まず、または化学合成されたときには化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。例えば、単離ＥＧＦＲ抗体は、その抗体が由来する細胞源または組織源の細胞性物質または他の汚染混入ポリペプチドを実質的に含まない抗体である。そのような汚染混入ポリペプチドにはその抗体の生物活性に干渉しても干渉しなくてもよい酵素、ホルモン、および他のタンパク質性溶質および非タンパク質性溶質が含まれ得る。
【００５２】
本明細書において使用される場合、「細胞死を誘導する」または「細胞死を誘導することが可能である」という語句は生存細胞が生存不能になることを引き起こす薬剤の能力を指す。幾つかの実施形態ではＬＲ００４抗体はインビトロまたはインビボで癌細胞に細胞死を誘導する。細胞死および細胞生存性はトリパンブルー排出アッセイおよび他の細胞生存性アッセイのような当技術分野の様々な方法によって決定され得る。本技術では細胞死は「プログラム細胞死」としても知られる「アポトーシス」を指し、それはカスパーゼ活性化、細胞表面へのアネキシンＶの結合、ＤＮＡ断片化、細胞体積の減少、小胞体の拡大、細胞断片化、および／または膜小胞（アポトーシスボディ）の形成によって示される。限定されないが、アネキシンＶ染色、ＤＮＡ断片化、またはカスパーゼ活性化の検出をはじめとする当技術分野において知られている方法を用いてアポトーシスを測定することができる。
【００５３】
本明細書において使用される場合、「完全抗体」という用語はジスルフィド結合によって相互接続されている少なくとも２本の重（Ｈ）鎖ポリペプチドと２本の軽（Ｌ）鎖ポリペプチドを有する抗体を意味する。各重鎖は重鎖可変領域（本明細書においてＨＣＶＲまたはＶHと略される）および重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は３つのドメインＣＨ1、ＣＨ2およびＣＨ3から構成される。各軽鎖は軽鎖可変領域（本明細書においてＬＣＶＲまたはＶLと略される）および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は１つのドメインＣLから構成される。ＶH領域およびＶL領域は相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性領域とそれらの領域に散在しているフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存されている領域にさらに細分化され得る。各ＶHおよび各ＶLはアミノ末端からカルボキシル末端に向かって次の順序、すなわち、ＦＲ1、ＣＤＲ1、ＦＲ2、ＣＤＲ2、ＦＲ3、ＣＤＲ3、ＦＲ4で配置されている３つのＣＤＲと４つのＦＲから構成される。重鎖と軽鎖の可変領域は抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）をはじめとする宿主組織または宿主因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。
【００５４】
本明細書において使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、その集団を構成する個々の抗体は少量で存在し得る可能な自然発生突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、単一の抗原部位を指向する。さらに、様々な決定基（エピトープ）を指向する様々な抗体を含むことが通常である従来の（ポリクローナル）抗体調製物と対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基を指向する。「モノクローナル」という修飾語は実質的に均一な抗体集団から得られたものとしてのその抗体の特徴を表しており、いずれか特定の方法によってその抗体を作製することが必要であると解釈されてはならない。例えば、本技術に準じて使用される予定のモノクローナル抗体はKohler, et al., Nature 256:495 (1975)によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製され得る、または組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４８１６５６７号明細書を参照されたい）によって作製され得る。「モノクローナル抗体」は、例えば Clackson, et al., Nature 352:624-628 (1991) および Marks, et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991) に記載されている技術を使用してファージ抗体ライブラリーからも単離され得る。
【００５５】
本明細書において使用される場合、「健康状態」という用語は、限定されないが、治療および／または予防が望ましい１種類以上の身体的および／または精神的症状として現れるあらゆる体調または疾患を含み、且つ、以前および新規に特定された疾患および他の障害を含む。
【００５６】
本明細書において使用される場合、「修飾物質」という用語は阻害剤および活性化剤を含む。阻害剤は、例えば、標的分子に結合する、標的分子の刺激を部分的または全体的に遮断する、標的分子の活性化を低下、防止、遅延化する、標的分子を不活性にする、鈍感にする、または標的分子の活性を下方制御する薬剤である。活性化剤は、例えば、標的分子に結合する、標的分子の活性化を刺激する、上昇させる、開放する、活性化する、促進する、亢進する、標的分子を鋭敏にする、または標的分子の活性を上方制御する薬剤である。幾つかの実施形態ではその標的分子はＥＧＦＲ受容体である。修飾物質には標的分子の天然リガンドの遺伝的改変型、ならびに天然リガンドおよび合成リガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、小化学分子等が含まれる。
【００５７】
本明細書において使用される場合、「中和抗体」という用語は標的分子の少なくとも１つの生物学的機能を除去する、または著しく低減させることができる抗体分子を意味する。幾つかの実施形態ではその標的分子はＥＧＦＲ受容体である。
【００５８】
本明細書において使用される場合、「薬学的に許容可能な担体」という用語は医薬投与に適合するあらゆる全ての溶媒、分散媒体、被覆材、抗細菌化合物および抗菌化合物、等張性化合物および吸収遅延化合物等を含むものとする。
【００５９】
本明細書において使用される場合、「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語はペプチド結合または改変型ペプチド結合によって相互に結合している２つ以上のアミノ酸を含む重合体、すなわち、ペプチドアイソスターを意味するために本明細書中で互換的に使用される。ポリペプチドはペプチド、グリコペプチド、またはオリゴマーと一般的に呼ばれる短鎖とタンパク質と一般的に呼ばれるそれより長い鎖の両方を指す。ポリペプチドは２０種類の遺伝子にコードされるアミノ酸以外のアミノ酸を含み得る。ポリペプチドには翻訳後プロセッシングのような天然の過程か、または当技術分野においてよく知られている化学修飾技術のどちらかによって修飾されたアミノ酸配列が含まれる。そのような修飾は基本的な教科書、およびより詳しい研究論文、ならびに大著の研究文献によく記載されている。特定の実施形態ではそのポリペプチドはＥＧＦＲ受容体に由来するポリペプチド配列を含む。
【００６０】
本明細書において使用される場合、「組換え」という用語は、例えば、細胞、または核酸、タンパク質、またはベクターに関して使用されるとき、その細胞、核酸、タンパク質またはベクターが異種性の核酸またはタンパク質の導入によって、または天然の核酸またはタンパク質の改変によって修飾されていること、またはその物質がそのように修飾された細胞に由来することを表している。したがって、例えば、組換え細胞は天然（非組換え）型のその細胞内では見られない遺伝子を発現し、または他の場合では異常に発現する、低発現する、または全く発現しない天然遺伝子を発現する。
【００６１】
本明細書において使用される場合、「サルベージ受容体結合エピトープ」という語句はＩｇＧ分子のインビボ血清中半減期の増加の原因となるＩｇＧ分子（例えばＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、またはＩｇＧ4）のＦｃ領域のエピトープを指す。抗体の血清中半減期を増加させるため、例えば米国特許第５７３９２７７号明細書に記載されるようにサルベージ受容体結合エピトープを抗体（特に抗体断片）に組み入れることができる。
【００６２】
本明細書において使用される場合、「単鎖抗体」または「単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）」という用語はＦｖ断片の２つのドメインであるＶLおよびＶHの抗体融合分子を指す。Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶLおよびＶHは別々の遺伝子によってコードされているが、組換え法を使用し、ＶL領域とＶH領域が対になって一価の分子を形成している単一のタンパク質鎖（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる。例えば、 Bird, et al., Science 242: 423-426, 1988、および Huston, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883, 1988を参照されたい）としてそれらのドメインが作製されることを可能にする合成リンカーによってそれらの遺伝子を結合することができる。「抗体」断片という用語への言及はそのような単鎖抗体を含み、そのような単鎖抗体は組換え技術または完全抗体の酵素切断または化学切断によって調製され得る。
【００６３】
本明細書において使用される場合、「小分子」という用語は約５ｋＤａ未満の分子量、より好ましくは約２ｋＤａ未満の分子量を有する組成物を意味する。小分子は、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、グリコペプチド、ペプチド模倣物、炭水化物、脂質、リポ多糖、これらの分子の組合せ、または他の有機分子または無機分子の組合せであり得る。
【００６４】
本明細書において使用される場合、受容体およびリガンドの「特異的結合」という用語は少なくとも１０-6Ｍの結合親和性を有する受容体とリガンドとの間の接触を意味する。幾つかの実施形態ではリガンドは少なくとも約１０-7Ｍ、１０-8Ｍ、１０-9Ｍ、１０-10Ｍ、１０-11Ｍ、または１０-12Ｍの親和性で結合する。幾つかの実施形態ではその受容体およびリガンドはＥＧＦＲおよびＥＧＦＲ抗体である。幾つかの実施形態ではそのＥＧＦＲ抗体はＬＲ００４抗体である。
【００６５】
本明細書において使用される場合、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という語句は、プローブが典型的には複雑な核酸混合物中のその標的部分配列にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない条件を意味する。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、状況毎に異なる。配列が長くなるほど高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションについての広範な指導はTijssen著、Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Probes, 「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays」（１９９３年）中に見出される。一般に、ストリンジェントな条件は規定のイオン強度  ｐＨにおける特定の配列の融点（Ｔm）よりも約５〜１０℃低くなるように選択される。Ｔmは標的に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする（規定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度での）温度である（標的配列が過剰に存在するとき、Ｔmでプローブの５０％が平衡状態のもので占められる）。ストリンジェントな条件はホルムアミドなどの不安定化剤の添加によっても達成され得る。選択的または特異的なハイブリダイゼーションについて、陽性のシグナルはバックグラウンドの少なくとも２倍であり、好ましくはバックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍である。例となるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は次のとおりであり得る：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％ＳＤＳ、４２℃においてインキュベーション、または５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃においてインキュベーション、６５℃において０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で洗浄。
【００６６】
本明細書において使用される場合、「対象」という用語は動物、好ましくはヒトなどの哺乳類動物を指すが、別の哺乳類動物、例えば飼育動物（例えばイヌ、ネコ等）、家畜（例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ等）および実験動物（例えばサル、ラット、マウス、ウサギ、モルモット等）でもあり得る。
【００６７】
本明細書において使用される場合、「アミノ酸置換」という用語はペプチド内のアミノ酸の異なるアミノ酸への変更を指す。当技術分野において知られているように、アミノ酸置換はそのペプチドの生物活性に対するそれらの置換の効果に応じて「保存的」または「非保存的」であり得る。いわゆる「保存的置換」は下の表中、「好ましい置換」という項目に示されている。
【表１】
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【００６８】
本明細書において使用される場合、「標的細胞」という用語は本技術のＥＧＦＲ抗体が標的とすることができる対象（例えばヒトまたは動物）の中のあらゆる細胞を意味する。
【００６９】
本明細書において使用される場合、「治療薬」という用語は、有効量で存在するとそれを必要とする対象に所望の治療効果をもたらす化合物を意味するものとする。
【００７０】
本明細書において使用される場合、「治療すること」または「治療」または「緩和」という用語は治療処置を指す。癌細胞がＥＧＦＲを発現している癌の対象が治療量のＥＧＦＲ抗体を受容した後に癌の１種類以上の兆候および症状の観察可能および／または測定可能な減少または不在、例えば、限定されないが、その個体に存在する癌細胞の数の減少、腫瘍サイズ、腫瘍重量、または腫瘍数の減少、腫瘍増殖および／または転移の抑制、疼痛の寛解期間の長期化、疼痛の除去または軽減、罹患率および死亡率の低下、体重増、またはクオリティ・オブ・ライフの全般的な改善を含む前記観察可能および／または測定可能な減少または不在を示す場合にその対象はその癌の「治療」に成功している。疾患または病状の「予防」またはそれを「予防すること」は予防的または防止的手段であって、標的とした病態または障害を予防すること、または遅延化（軽減）することが目的である手段を指す。
【００７１】
本明細書において使用される場合、「可変」という用語は可変ドメインのある特定の分節の配列が抗体間でかなり異なっているという事実を指す。Ｖドメインは抗原結合を媒介し、且つ、特定の抗体のその特定の抗原に対する特異性を規定する。しかしながら、可変ドメインのアミノ酸鎖にわたって均一に可変性が分布しているわけではない。代わりにＶ領域はそれぞれ９〜１２アミノ酸長である「超可変領域」と呼ばれる非常に可変性に富む短めの領域によって分けられている１５〜３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる相対的に不変のアミノ酸鎖から構成される。天然の重鎖と軽鎖の可変ドメインは、３つの超可変領域によって接続されている大抵βシート構成を採っている４つのＦＲをそれぞれ含み、それらの超可変領域はそのβシート構造と接続しているループを形成し、幾つかの事例ではそのβシート構造の一部を形成するループを形成する。各鎖の超可変領域はＦＲによって近傍にまとめられ、他の鎖の超可変領域と共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第５版、公衆衛生局、米国国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州、（１９９１年）を参照されたい）。定常ドメインは直接的には抗体の抗原への結合に関与していないが、定常ドメインは抗体ＡＤＣＣの関与などの様々なエフェクター機能を示す。
【００７２】
ＩＩ．  ＬＲ００４抗体および抗体複合体
ＬＲ００４はヒト上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）のＮ末端部分に特異的に結合する組換えヒト／マウスキメラモノクローナル抗体である。ＥＧＦＲは１型受容体型チロシンキナーゼまたはＥｒｂＢ１／ＨＥＲ１としても知られるヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ）ファミリーまたはＥｒｂＢファミリーのメンバーである。そのファミリーの他のメンバーにはＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ＥｒｂＢ３（ＨＥＲ３）およびＥｒｂＢ４（ＨＥＲ４）が含まれる。腫瘍細胞におけるＥＧＦＲシグナル伝達は増殖、生存、損傷修復、接着、移動、および血管新生をはじめとする新生物成長に影響する細胞機能の多様なネットワークの調節を引き受けている。ＥＧＦＲは上皮起源の多数のヒト癌において様々なレベルで発現している。ＥＧＦＲを一般的に発現する上皮腫瘍には膀胱、乳房、子宮頸部、結腸、頭頚部、腎臓、肺、膵臓、および前立腺の腫瘍が含まれる。過剰発現または突然変異を介したＥＧＦＲの誤調節により構成的活性または欠陥的受容体発現低下が引き起こされ、細胞の悪性形質転換が引き起こされ得る。ＥＧＦＲの癌原性効果にはＤＮＡ合成の開始、細胞増殖、浸潤、および転移の亢進が含まれる。
【００７３】
ＬＲ００４は改良型のセツキシマブであり、同じ作用機序を有し、その作用機序には細胞内シグナル伝達の阻害、細胞周期進行の阻害、アポトーシスの誘導、ならびにＤＮＡ修復、血管形成、腫瘍細胞不死性、浸潤、および転移の阻害など、下流効果の阻害を引き起こすＥＧＦＲリガンド結合の阻止が含まれる。インビトロおよびインビボのＥＧＦＲのＴＧＦ誘導性リン酸化のＬＲ００４阻害、ＡＤＣＣの刺激、および抗腫瘍性効果を実証する試験を下に提示する。ＬＲ００４は翻訳後炭水化物修飾の違いのために過敏性反応を誘導する可能性がセツキシマブよりも低く、且つ、これらの副作用のためにセツキシマブ治療の継続が不可能である対象の治療に有用である。
【００７４】
ＬＲ００４のアミノ酸配列をＤｒｕｇ  Ｂａｎｋにおいて公開されているセツキシマブ配列（受託番号：ＤＢ００００２）から改変した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析によってＬＲ００４と市販のセツキシマブの配列の比較を実施した。ＬＲ００４のＦａｂ配列はセツキシマブのものと同一であるが、表２において太字で示されている５アミノ酸によってＦｃ配列が異なる。ＬＲ００４は重鎖の残基２２２〜２２４にＰｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒリピートを有し、一方でセツキシマブはそのリピートを含まない。ＣＨ３の残基アスパラギン酸３６１およびロイシン３６３がＬＲ００４に存在する。対照的に、ＣＨ３のグルタミン酸３６１およびメチオニン３６３がセツキシマブに見られる。これらの違いはＬＲ００４（Ｇ１ｍ１、１７）とセツキシマブ（Ｇ１ｍ３）の異なるＩｇＧ１  Ｆｃアロタイプを表す。認可されたモノクローナル抗体の間では両方のアロタイプが一般的である。軽鎖のアミノ酸配列および重鎖の可変領域のアミノ酸配列はセツキシマブのものと同一である。
【００７５】
ＬＲ００４の軽鎖と重鎖の理論上の分子量はそれぞれ２３７１８Ｄａ（アルキル化ＬＣ）と５３０３７Ｄａ（アルキル化ＨＣ、Ｇ０Ｆ／Ｇ０Ｆ）である。機能的ＬＲ００４は４本のポリペプチド鎖、および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる約２００ＫＤａの見かけの分子量から構成される。ＩＥＦによってｐＩマーカーバンド７．０と８．６の間に検出可能である多数のバンドがＬＲ００４に特徴的であり、ＬＲ００４の異なる電荷アイソフォームを表している。
【００７６】
ＬＲ００４抗体はセツキシマブと比較して炭水化物構造に２つの差異を含み、そのことはその抗体を作製する態様に起因する。セツキシマブがＳＰ２／０細胞内で発現する一方でＬＲ００４はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞内で発現する。結果として、ＬＲ００４のシアル酸はセツキシマブでのＮ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）と対照的にＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）である。ＮＡＮＡはＮＧＮＡよりもヒト的であると考えられている。加えて、セツキシマブが強力なオリゴサッカリド免疫原であるガラクトース−α−１，３−ガラクトース（Ｇａｌα１，３Ｇａｌ）を高いレベルで含む一方でＬＲ００４はそのような炭水化物構造体を検出可能な量で含まない。ＣＨＯ細胞での発現によって特筆すべきことにセツキシマブのものよりも免疫反応性がずっと低いグリカンプロファイルがＬＲ００４に与えられる。これらの２つの修飾により、ＬＲ００４は同じ作用機序と効力を有しているが、セツキシマブよりも安全な製品である。下に示されるように、ＬＲ００４は反復投与治療計画においてセツキシマブよりも長い血清中半減期、および上昇した熱安定性も示す。
【００７７】
ＬＲ００４のアミノ酸配列が表２に提供されている。軽鎖は２１４アミノ酸を含み、重鎖は４５２アミノ酸を含む。軽鎖の配列はセツキシマブのものと同一である。表２において、ジスルフィド結合の位置が接続されている直線で示されており、重鎖上に占められている２つのＮ−グリカン部位に下線が施されており、一方の部位は可変（Ｆｖ）領域のフレームワーク３内、Ａｓｎ88であり、シアル酸、Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）を含む糖鎖を有し、他方の部位はＣＨ２ドメイン内、Ａｓｎ302である。重鎖上に１つのＮ末端ピログルタミン酸が存在する。ＬＲ００４抗体の物理化学的特性および生物学的特性が表３において要約されている。
【００７８】
本明細書に含まれる実施例において説明されるように、ＬＲ００４はヒトＥＧＦＲに特異的に結合し、且つ、ＥＧＦＲ発現腫瘍細胞の増殖およびシグナル伝達を抑制する。インビトロ試験によってＥＧＦＲリン酸化および下咽頭癌（ＦａＤｕ）細胞におけるＡＤＣＣに対するＬＲ００４の効果が示される。記載される薬力学評価にはインビトロでのＥＬＩＳＡおよびＳＰＲをベースとする結合親和性試験、ＥＬＩＳＡ結合特異性試験ならびに完全腫瘍細胞に対するＬＲ００４結合のフローサイトメトリー評価が含まれる。抗腫瘍活性もヒト癌細胞株においてインビトロで、およびヒト結腸癌ＧＥＯ細胞由来腫瘍を用いるマウス異種移植試験においてインビボで示される。セツキシマブと比較したＬＲ００４の効力が追加のインビボ効力試験によってさらに示される。
【００７９】
ＬＲ００４はＥＧＦＲ発現癌の治療に有用であり、単独で、または１種類以上の追加治療薬と組み合わせて投与される。とりわけ、ＬＲ００４はセツキシマブを使用する継続的治療を不可能にするセツキシマブに対する過敏性を有する患者の治療に有用である。
【表２】
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【表３】
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【００８０】
１つの態様では本開示はＥＧＦＲ発現癌の治療用の抗体および同抗体を含む組成物を提供する。幾つかの実施形態ではその抗体はＬＲ００４である。幾つかの実施形態ではその抗体は追加薬剤に結合したＬＲ００４である。幾つかの実施形態ではその追加薬剤は検出可能マーカーまたは治療薬を含む。幾つかの実施形態ではその検出可能マーカーには蛍光マーカーまたは放射性マーカーが含まれるがこれらに限定されない。幾つかの実施形態ではその治療薬は癌治療薬などの化学療法剤を含む。
【００８１】
一般に、薬物動態安定性および対象に対する全体的な毒性の低下の必要性を適切に考慮してあらゆる適切な技術によってＬＲ００４抗体に治療部分を結合することができる。治療用、細胞傷害用、または標識／画像化用の薬剤（すなわち、「部分」）は直接的または間接的に（例えばリンカー基を介して）抗体に連結され得る。部分とＬＲ００４抗体の各々が他方と反応することが可能である官能基を有するときにそれらの間の直接的反応が可能である。例えば、アミノ基またはスルフヒドリル基などの求核基はアンハイドライドまたは酸ハライドなどのカルボニル含有基と、または良好な脱離基（例えばハライド）を含むアルキル基と反応することが可能であり得る。あるいは、適切な化学リンカー基を使用することができる。リンカー基は結合能力への干渉を避けるために部分からＬＲ００４抗体を引き離すためのスペーサーとして機能し得る。リンカー基は部分またはＬＲ００４抗体の上の置換基の化学反応性を上昇させ、そうしてカップリング効率を上昇させるようにも機能し得る。化学反応性の上昇は、その上昇が無ければ使用不可能である部分、または部分上の官能基の使用も促進し得る。
【００８２】
適切な結合化学にはマレイミジルリンカーおよびアルキルハライドリンカー（抗体部分上のスルフヒドリルと反応する）およびスクシンイミジルリンカー（抗体部分上の第一級アミンと反応する）が含まれる。幾つかの第一級アミン基およびスルフヒドリル基が免疫グロブリン上に存在し、追加の基を組換え免疫グロブリン分子内に設定することができる。ホモ官能性とヘテロ官能性の両方の様々な二官能性試薬または多重官能性試薬（イリノイ州ロックフォードのピアース・ケミカル社のカタログに記載されているものなど）をリンカー基として使用することができることが当業者に明らかである。カップリングは、例えば、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基または酸化炭水化物残基を介して影響を受け得る（例えば、米国特許第４６７１９５８号明細書を参照されたい）。
【００８３】
代替的なカップリング方法として、米国特許第５０５７３１３号明細書および第５１５６８４０号明細書に記載されているようにグリコシル化部位の酸化炭水化物基を介してＬＲ００４抗体に部分を連結することができる。部分にＬＲ００４抗体を連結するさらに別の代替的方法はストレプトアビジン／ビオチン、またはアビジン／ビオチンなどの非共有結合ペアの使用による。これらの実施形態ではそのペアの一方のメンバーがＬＲ００４抗体に共有結合し、その結合ペアの他方のメンバーがその部分に共有結合する。
【００８４】
細胞傷害性部分または治療部分が本技術の免疫複合体のＬＲ００４抗体部分から遊離しているときにより強力である場合、細胞へ内部移行している間に、または内部移行すると切断され得るリンカー基、または細胞外環境中で時間経過によって徐々に切断され得るリンカー基が望ましい場合があり得る。多種多様な切断可能リンカー基が記載されている。これらのリンカー基からの細胞傷害性部分の細胞内放出の例には、例えば、ジスルフィド結合の還元による切断（例えば、米国特許第４４８９７１０号明細書）、感光性結合への照射による切断（例えば、米国特許第４６２５０１４号明細書）、誘導体化アミノ酸側鎖の加水分解による切断（例えば、米国特許第４６３８０４５号明細書）、血清中補体媒介性加水分解による切断（例えば、米国特許第４６７１９５８号明細書）、および酸触媒加水分解（例えば、米国特許第４５６９７８９号明細書）が含まれるがこれらに限定されない。
【００８５】
１つの実施形態ではＬＲ００４抗体を１つより多くの治療部分、細胞傷害性部分、および／または画像化部分に連結する。ＬＲ００４抗体を多重誘導体化することで幾つかの細胞傷害性戦略を同時に実施することができ、ＬＲ００４抗体を幾つかの視覚化技術用の造影剤として有用なものにすることができ、または視覚化技術による追跡用に治療用抗体を標識することができる。１つの実施形態では細胞傷害性部分の複数の分子を１つのＬＲ００４抗体に連結する。１つの実施形態ではＬＲ００４抗体を細胞傷害性部分、治療部分、および標識／画像化部分からなる群より選択される少なくとも２つの部分からなる混合物に連結する。すなわち、１種類より多くの部分を１つのＬＲ００４抗体に連結することができる。例えば、ポリヌクレオチドまたはアンチセンス配列などの治療部分を化学傷害性部分または放射線傷害性部分と併せてＬＲ００４抗体に結合して化学傷害性療法または放射線傷害性療法の有効性を高めることができ、ならびに所望の治療効果を得るために必要である必要な投薬量を減少させることができる。特定の実施形態と無関係に１つよりも多くの部分を有する免疫複合体を様々な方法で調製することができる。例えば、１つよりも多くの部分をＬＲ００４抗体に直接的に連結することができ、または複数の結合用部位を提供するリンカー（例えばデンドリマー）を使用することができる。あるいは、１つよりも多くの細胞傷害性部分を保持する能力を有する担体を使用することができる。
【００８６】
上で説明したように、ＬＲ００４抗体は直接的な、またはリンカー基を介した共有結合、および非共有結合を含む様々な方式で前記部分を担持することができる。１つの実施形態ではその抗体をカプセル化担体と組み合わせる。それらのカプセル化担体によってその治療用組成物が標的細胞の近傍に放出を集中しつつ時間経過によってＬＲ００４抗体化学傷害性部分を徐々に放出することが可能になり得るので、これは化学傷害性治療実施形態において特に有用である。
【００８７】
１つの実施形態ではＬＲ００４抗体を放射性核種である細胞傷害性部分と連結する。細胞傷害性部分として使用するのに好ましい放射性核種は薬理学的投与に適切な放射性核種である。そのような放射性核種には123Ｉ、125Ｉ、131Ｉ、90Ｙ、211Ａｔ、67Ｃｕ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、212Ｐｂ、および212Ｂｉが含まれる。ヨウ素同位体およびアスタチン同位体の使用に関して大量の文献が蓄積されているのでそれらの同位体が本技術の治療用組成物中に使用するのにより好ましい放射性核種である。数ミリメートルの有効範囲を有する他のβ線放射性核種がそうであるように131Ｉが特に好ましい。ヨードゲン、Ｎ−スクシンイミジル３−［211Ａｔ］アスタトベンゾエート、Ｎ−スクシンイミジル３−［131Ｉ］ヨードベンゾエート（ＳＩＢ）、およびＮ−スクシンイミジル５−［131Ｉ］ヨードｂ−３−ピリジンカルボキシレート（ＳＩＰＣ）を含む幾つかの公知の複合体化試薬のうちのいずれかを利用して123Ｉ、125Ｉ、131Ｉ、または211Ａｔを本組成物および本方法に使用されるＬＲ００４抗体に結合することができる。列挙したヨード試薬にはあらゆるヨウ素同位体を利用することができる。核医学分野の当業者に知られている適切なキレート化薬剤によって他の放射性核種をＬＲ００４抗体に結合することができる。
【００８８】
１つの実施形態ではＬＲ００４抗体を化学傷害性部分と連結する。化学傷害性薬剤にはメトトレキサートおよびピリミジン類似体とプリン類似体などの小分子薬が含まれるがこれらに限定されない。化学毒物分化誘導剤にはホルボールエステルおよび酪酸が含まれる。化学傷害性部分をＬＲ００４抗体に直接的に結合することができる。１つの実施形態では化学リンカーを介してＬＲ００４抗体を細胞傷害性部分に連結する。別の実施形態では部分を担体中にカプセル封入し、次にそれをＬＲ００４抗体に連結する。
【００８９】
１つの実施形態ではＬＲ００４抗体をタンパク毒素部分と連結する。細胞傷害性部分としての使用に好ましい毒素タンパク質には、例えば、アクチノマイセート抗生物質またはストレプトミセス抗生物質、デュオカルマイシン、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジドネ（ａｎｔｈｒａｃｉｎ  ｄｉｄｎｅ）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド類、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシンおよびそれらの類似体または相同体が含まれるがこれらに限定されない。細胞傷害性部分としての使用に好ましい毒素タンパク質にはリシン、アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン、緑膿菌外毒素、志賀毒素、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、および医学生化学分野において知られている他の毒素タンパク質がさらに含まれる。これらの毒素薬剤は特に血管内注射された場合に対象において望ましくない免疫応答を誘発し得るので、それらの毒素薬剤をＬＲ００４抗体への連結用の担体の中にカプセル封入することが好ましい。
【００９０】
１つの実施形態ではＬＲ００４抗体を酵素活性毒素と連結する。酵素活性毒素は細菌起源または植物起源のものであり得、またはそのような毒素の酵素活性断片（「Ａ鎖」）であり得る。本技術において有用である酵素活性毒素およびそれらの断片はジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、αサルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシ阻害剤、クルシン、クロチン、サポアオナリア・オフィシナリス（Ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、およびエノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）である。ＬＲ００４抗体の細胞傷害性部分との結合は様々な二官能性タンパク質カップリング剤を使用して行われる。そのような試薬の例はＳＰＤＰ、ＩＴ、イミドエステルの二官能性誘導体、そのようなアジプイミド酸ジメチルＨＣｌ、スベリン酸ジスクシンイミジルなどの活性エステル、グルタルアルデヒドなどのアルデヒド、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなどのビスアジド化合物、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなどのビスジアゾニウム誘導体、トリレン２，６−ジイソシアネートなどのジイソシアネート、およびビス−１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなどのビス活性フッ素化合物である。毒素の溶解性部分をＬＲ００４抗体のＦａｂ断片に結合することができる。
【００９１】
１つの実施形態ではＬＲ００４抗体を治療部分と連結する。治療部分には、例えば、代謝拮抗剤（例えばメトトレキサート、６‐メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５‐フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えばメクロレタミン、チオエパ（ｔｈｉｏｅｐａ）  クロラムブチル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびｃｉｓ−ジクロロジアミンプラチナ（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン類（例えばダウノルビシン（以前のダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えばダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、シスプラチン、ブレオマイシンサルフェート、カルムスチン、クロラムブチル、シクロホスファミドヒドロキシウレアまたはリシンＡ、および抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が含まれるがこれらに限定されない。
【００９２】
そのような治療部分をＬＲ００４抗体に結合する技術はよく知られており、例えば、Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy、 Reisfeldら（編）、243〜56頁のArnonら著、「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」 (Alan R. Liss社、1985年)、Controlled Drug Delivery (第２版)、 Robinsonら（編）、623〜53頁のHellstromら著、「Antibodies For Drug Delivery」 (Marcel Dekker社、1987年)、Monoclonal Antibodies ‘84: Biological And Clinical Applications, Pincheraら（編）、475〜506頁のThorpe著、「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review」 (1985年)、Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwinら（編）、303〜16頁の「Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」 (Academic Press社、 1985年)、およびThorpe, et al., “The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”, Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982) を参照されたい。
【００９３】
１つの実施形態ではＬＲ００４抗体を標識部分、すなわち、検出可能基と連結する。ＬＲ００４抗体に結合した特定の標識または検出可能基は、それがその抗体の特異的結合に著しい干渉を与えない限り、本技術の重要な態様ではない。その検出可能基は検出可能な物理的または化学的特性を有しているあらゆる物質であり得る。そのような検出可能標識は免疫アッセイおよびイメージングの分野においてよく開発されており、概してそのような方法で有用なほとんど全ての標識を本技術に適用することができる。したがって、標識は分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、電気的手段、光学的手段、または化学的手段によって検出可能なあらゆる組成物である。有用な標識には磁性ビーズ（例えばダイナビーズ（商標））、蛍光色素（例えばフルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミン等）、放射性標識（例えば3Ｈ、14Ｃ、35Ｓ、125Ｉ、121Ｉ、112Ｉｎ、99ｍＴｃ）、他の画像化薬剤、例えばマイクロバブル（超音波画像化法用）、18Ｆ、11Ｃ、15Ｏ、（陽電子放射断層撮影法用）、99mＴＣ、111Ｉｎ（単光子放出断層撮影法用）、酵素（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびＥＬＩＳＡにおいて一般的に使用される他のもの）、および金コロイドまたは着色ガラスビーズまたは着色プラスチックビーズ（例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等）のような熱量測定用標識が含まれる。そのような標識の使用について記載している特許には米国特許第３８１７８３７号明細書、第３８５０７５２号明細書、第３９３９３５０号明細書、第３９９６３４５号明細書、第４２７７４３７号明細書、第４２７５１４９号明細書、および第４３６６２４１号明細書が含まれ、それぞれの全体が全ての目的のために参照により本明細書に援用される。Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals（第６版、Molecular Probes社、ユージーン、オレゴン州）も参照されたい。
【００９４】
当技術分野においてよく知られている方法に従ってアッセイの所望の成分に前記標識を直接的または間接的に連結することができる。上で示されたように、広い範囲の標識を必要とされる感度、その化合物との結合のし易さ、必要な安定性、利用可能な計器装備、および消耗品の供給量に応じて選択して使用することができる。
【００９５】
非放射性標識は間接的な手段によって結合されることが多い。一般に、リガンド分子（例えばビオチン）は前記分子に共有結合される。その後、もともと検出可能であるか、または検出可能酵素、蛍光化合物、または化学発光化合物などのシグナル系に共有結合しているかのどちらかである抗リガンド（例えばストレプトアビジン）分子にそのリガンドが結合する。多数のリガンドおよび抗リガンドを使用することができる。リガンドが天然の抗リガンド、例えばビオチン、チロキシン、およびコルチゾールを有する場合、標識されたその天然抗リガンドと併せてそのリガンドを使用することができる。あるいは、ＬＲ００４抗体と組み合わせてあらゆるハプテン化合物または抗原性化合物を使用することができる。
【００９６】
例えば、酵素またはフルオロフォアとの結合によって前記分子をシグナル発生化合物に直接的に結合することもできる。標識として興味深い酵素は主に加水分解酵素、特にホスファターゼ、エステラーゼ、おおびグリコシダーゼ、または酸化還元酵素、特にペルオキシダーゼである。標識性部分として有用な蛍光化合物には、例えば、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン等が含まれるがこれらに限定されない。標識性部分として有用な化学発光化合物には、例えば、ルシフェリンおよび２，３−ジヒドロフタラジンジオン類、例えばルミノールが含まれるがこれらに限定されない。使用することができる様々な標識系またはシグナル発生系の総説について、米国特許第４３９１９０４号明細書を参照されたい。
【００９７】
標識検出手段は当業者によく知られている。したがって、例えば、標識が放射性標識である場合、検出手段にはシンチレーションカウンターまたはオートラジオグラフィーにおけるもののような写真フィルムが含まれる。標識が蛍光標識である場合、その標識はフルオロクロームを適切な波長の光で励起し、それにより生じる蛍光を検出することで検出され得る。その蛍光は写真フィルムによって、電荷結合素子（ＣＣＤ）または光電子増倍管などの電子検出器の使用などによって視覚的に検出され得る。同様に、酵素標識はその酵素に適切な基質を供給し、それにより生じる反応産物を検出することで検出され得る。最後に簡単な比色性標識がその標識に付随する色を観察することで簡単に検出され得る。したがって、様々なディップスティックアッセイにおいて、結合した金はピンク色で現れることが多く、一方で様々な結合したビーズはそのビーズの色で現れる。
【００９８】
ＩＩＩ．  ＬＲ００４の調製
ＬＲ００４はヒトＥＧＦＲのＮ末端部分に特異的に結合する組換えヒト／マウスキメラモノクローナル抗体である。ＬＲ００４の重鎖と軽鎖の配列が表２に提供されている。上で考察したように、その配列はＤｒｕｇ  Ｂａｎｋにおいて公開されているセツキシマブ配列（受託番号：ＤＢ００００２）から５つのアミノ酸変化を組み入れて改変された。
【００９９】
ＬＲ００４抗体は、当技術分野において知られている方法を用いてＣＨＯ細胞内で作製され得る。これらの細胞内でその抗体を作製することによってＳＰ２／０細胞内で作製されるセツキシマブと比較して２つの差異が炭水化物構造に生じる。特に、ＬＲ００４のシアル酸はセツキシマブでのＮ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）と対照的にＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）である。ＮＡＮＡはＮＧＮＡよりもヒト的であると考えられている。加えて、セツキシマブが強力なオリゴサッカリド免疫原であるガラクトース−α−１，３−ガラクトースを高いレベルで含む一方でＬＲ００４はそのような炭水化物構造体を検出可能な量で含まない。ＬＲ００４のグリカンプロファイルはセツキシマブのグリカンプロファイルよりも免疫反応性がずっと低く、それによってＬＲ００４はヒト対象への投与にとってより安全なものになる。また、これらの配列および翻訳後の差異のため、ＬＲ００４は反復投与治療計画においてセツキシマブよりも長い血清中半減期、および上昇した熱安定性を示す。
【０１００】
当技術分野において知られている方法を用いてＣＨＯ細胞内で組換えＬＲ００４抗体を発現させることができる。幾つかの実施形態では宿主ＣＨＯ細胞内に導入された哺乳類発現ベクターを使用してその抗体を発現させる。幾つかの実施形態では宿主ＣＨＯ細胞ゲノムに安定的に組み込まれた組換え配列からその抗体を発現させる。
【０１０１】
ＬＲ００４抗体をコードする組換えポリヌクレオチドコンストラクトはその抗体のコード配列に機能的に連結している発現制御配列を含むことが典型的である。したがって、本技術の別の態様はＬＲ００４抗体をコードする１つ以上の核酸配列を含有するベクターを含む。多様な集団のベクターを作製するための方法がＬｅｒｎｅｒらの米国特許第６２９１１６０号明細書、第６６８０１９２号明細書に記載されている。
【０１０２】
哺乳類発現ベクターを使用してＣＨＯ細胞内で本技術のＬＲ００４抗体をコードする核酸を発現させることができる。哺乳類発現ベクターの例にはｐＣＤＭ８（Seed,. Nature 329: 840, 1987）およびｐＭＴ２ＰＣ（Kaufman,, et al., EMBO J. 6: 187-195, 1987）が含まれるがこれらに限定されない。例えば、一般的に使用されるプロモーターはポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、およびシミアンウイルス４０に由来する。ＬＲ００４抗体の発現に有用な真核細胞用の適切な発現系について、例えば、Sambrookら著、MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 第２版、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー、コールドスプリングハーバー・ラボラトリープレス社、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州、１９８９年の第１６章と第１７章を参照されたい。
【０１０３】
別の態様では本開示はＬＲ００４コード配列を含む哺乳類発現ベクターが導入されているＣＨＯ細胞を提供する。幾つかの実施形態ではそれらのＬＲ００４コード配列はＣＨＯ細胞のゲノムから分離している複製可能ベクター上に存在する。幾つかの実施形態ではそれらのＬＲ００４コード配列はＣＨＯ細胞のゲノム中に安定的に組み込まれている。
【０１０４】
一旦発現するとＬＲ００４抗体は、当技術分野において知られている方法を用いて単離および精製され得る。その抗体の生物活性は、当技術分野において知られており、且つ、本明細書に記載されている方法を用いて決定され得る。例えば、その抗体のＥＧＦＲに対する結合特異性を評価することによってインビトロで、ＥＧＦＲリン酸化をインビトロまたはインビボで阻害するその抗体の能力を評価することで、およびインビトロまたは動物モデルでの腫瘍細胞増殖に対するその抗体の効果を評価することでその抗体の生物活性を決定することができる。
【０１０５】
ＩＶ．  治療法
１つの態様では本開示はＥＧＦＲ発現癌を治療するための方法であって、必要とする対象にＬＲ００４抗体を単独で、または１種類以上の追加治療薬と組み合わせて投与すること含む前記方法を提供する。幾つかの実施形態では前記１種類以上の治療薬はタンパク質またはペプチド、例えばアブリン、リシンＡ、緑膿菌外毒素、またはジフテリア毒素のような酵素活性毒素、またはその活性断片など；腫瘍壊死因子またはインターフェロン−αなどのタンパク質；または例えばリンホカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、または他の増殖因子のような生物学的応答修飾因子を含む。
【０１０６】
幾つかの実施形態では前記治療薬は、微小管形成を破壊する薬剤であるビンカアルカロイド類（コルヒチンおよびその誘導体等）、血管新生阻害剤、治療用抗体、ＥＧＦＲ標的化薬剤、チロシンキナーゼ標的化薬剤（チロシンキナーゼ阻害剤等）、遷移金属錯体、プロテアソーム阻害剤、代謝拮抗剤（ヌクレオシド類似体等）、アルキル化剤、プラチナ系薬剤、アントラサイクリン抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、マクロライド、レチノイド（全トランスレチノイン酸またはその誘導体等）、ゲルダナマイシンまたはその誘導体（１７−ＡＡＧ等）、および当技術分野においてよく認識されている他の標準的な化学療法剤を含むがこれらに限定されない化学療法剤を含む。
【０１０７】
幾つかの実施形態では前記化学療法剤にはアドリアマイシン、コルヒチン、シクロホスファミド、アクチノマイシン、ブレオマイシン、ヅアノルビシン（ｄｕａｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドキソルビシン、エピルビシン、マイトマイシン、メトトレキサート、ミトキサントロン、フルオロウラシル、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、メチル−ＣＣＮＵ、シスプラチン、エトポシド、インターフェロン、カンプトテシンおよびその誘導体、フェネステリン、タキサン類およびそれらの誘導体（例えば、タキソール、パクリタキセルおよびそれらの誘導体、タキソテレおよびそれらの誘導体等）、トペテカン（ｔｏｐｅｔｅｃａｎ）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、タモキシフェン、ピポスルファン、ｎａｂ−５４０４、ｎａｂ−５８００、ｎａｂ−５８０１、イリノテカン、ＨＫＰ、オルタタキセル、ゲムシタビン、オキサリプラチン、ハーセプチン（登録商標）、ビノレルビン、ドキシル（登録商標）、カペシタビン、アリムタ（登録商標）、アバスチン（登録商標）、ベルケイド（登録商標）、タルセバ（登録商標）、ニューラスタ（Ｎｅｕｌａｓｔａ）（登録商標）、ラパチニブ、ソラフェニブ、エルロチニブ、アービタックス（登録商標）、それらの誘導体、当技術分野において知られている化学療法剤等のうちの１種類以上が含まれる。幾つかの実施形態では前記化学療法剤はチオコルヒチン誘導体および担体タンパク質（アルブミン等）を含むナノ粒子を含む組成物である。
【０１０８】
幾つかの実施形態では前記化学療法剤は、限定されないが、カルボプラチン、ナベルビン（登録商標）（ビノレルビン）、アントラサイクリン（ドキシル（登録商標））、ラパチニブ（ＧＷ５７０１６）、ハーセプチン（登録商標）、ゲムシタビン（ジェムザール（登録商標））、カペシタビン（ゼローダ（登録商標））、アリムタ（登録商標）、シスプラチン、５‐フルオロウラシル（５−Ｆｕ）、エピルビシン、シクロホスファミド、アバスチン（登録商標）、ベルケイド（登録商標）等をはじめとする抗新生物剤である。
【０１０９】
本明細書における化学療法剤への言及はその化学療法剤またはその誘導体に当てはまり、したがって、本技術はこれらの実施形態（薬剤；薬剤または誘導体）のいずれかを含む。化学療法剤または他の化学部分の「誘導体」または「類似体」にはその化学療法剤または部分に構造的に類似している化合物、またはその化学療法剤もしくは部分と同じ一般化学分類内にある化合物が含まれるがこれらに限定されない。幾つかの実施形態ではその化学療法剤または部分の誘導体または類似体はその化学療法剤または部分の類似の化学的特性および／または物理的特性（例えば、官能基性を含む）を保持する。
【０１１０】
１つの態様では本開示は癌を治療するための方法であって、対象がセツキシマブに対して過敏であるか、または対象がセツキシマブに対する過敏性反応を有しやすいか決定することを含む前記方法を提供する。幾つかの実施形態ではその方法はその対象の血清中に抗セツキシマブＩｇＥが存在するか決定することを含む。幾つかの実施形態ではその方法はその対象の血清中に抗ガラクトース−α−１，３−ガラクトース（Ｇａｌα１，３Ｇａｌ）  ＩｇＥが存在するか決定することを含む。幾つかの実施形態では抗セツキシマブＩｇＥまたは抗Ｇａｌα１，３Ｇａｌ  ＩｇＥはＥＬＩＳＡによって測定される。幾つかの実施形態では抗セツキシマブＩｇＥまたは抗Ｇａｌα１，３Ｇａｌ  ＩｇＥは放射性アレルゲン吸着検査を用いて測定される。幾つかの実施形態では抗セツキシマブＩｇＥまたは抗Ｇａｌα１，３Ｇａｌ  ＩｇＥはＩｍｍｕｎｏＣＡＰ（登録商標）を用いて測定される。
【０１１１】
ＥＬＩＳＡによる抗セツキシマブＩｇＥまたは抗Ｇａｌα１，３Ｇａｌ  ＩｇＥの検出は、当技術分野において知られているプロトコル、例えば、Plum, et al., J. Biol. Chem. 286(50):43103-43111 (2011)、Mariotte, et al., mAbs 3(4):396-401 (2011)、および Chung, et al., N. Engl. J. Med. 358(11):1109-1117 (2008) に開示されているプロトコルを用いて行われ得る。例えば、Ｇａｌα１，３Ｇａｌまたはセツキシマブ自体を被覆試薬として使用してＩｇＥ結合用の固定化決定基を提供することができる。それらの固定化決定基に結合した抗セツキシマブＩｇＥまたは抗Ｇａｌα１，３Ｇａｌ  ＩｇＥは、ＩｇＥ特異的二次抗体ならびにその標識を現像および／または定量するための適切な手段を用いて検出され得る。
【０１１２】
患者試料は適切な血清および／または生化学試薬を使用して調製された陽性対照および陰性対照と比較され得る。例えば、セツキシマブ過敏性を有することが知られている対象の血清を使用して調製された陽性対照と共にセツキシマブ過敏性を有しないことが知られている対象の血清を使用して陰性対照を調製してよい。セツキシマブ過敏性の定義および等級は National Cancer Institute Common Toxicity Criteria, 第３．１１，１６版に記載されている症状に基づいてよく、それによって第１級反応の特徴が３８℃（華氏１００．４度）未満の発熱を伴う一時的な潮紅または発疹として提示され、第２級反応の特徴が３８℃を超える発熱を伴う、または伴わない発疹または潮紅、じんま疹、および呼吸困難として提示され、第３級の特徴が発疹、呼吸困難、および低血圧として提示され、第４級の特徴がアナフィラキシーとして提示される。
【０１１３】
当技術分野において知られているように、血清中抗セツキシマブＩｇＥまたは抗Ｇａｌα１，３Ｇａｌ  ＩｇＥを有する対象はそのＩｇＥを有しない対象よりも高いセツキシマブに対する重症の過敏性の発生率を有する。したがって、対象の抗セツキシマブＩｇＥまたは抗Ｇａｌα１，３Ｇａｌ  ＩｇＥのレベルはその対象がセツキシマブに対する重症の過敏性を有したことがあるか、または有しやすいか、およびその対象がセツキシマブを用いる治療の候補であるかということについての指標として機能し得る。陰性対照よりも高いレベルの抗セツキシマブＩｇＥまたは抗Ｇａｌα１，３Ｇａｌ  ＩｇＥは、対象が陰性対照よりも高いレベルの抗セツキシマブＩｇＥまたは抗Ｇａｌα１，３Ｇａｌ  ＩｇＥを有していない対象と比較して上昇したセツキシマブ過敏性のリスクを有することを示している。
【０１１４】
幾つかの実施形態では上昇したセツキシマブ過敏性のリスクを有する対象は、上昇したセツキシマブ過敏性のリスクを有していない対象よりも少なくとも約１〜少なくとも約９９パーセント高い血清中抗セツキシマブＩｇＥレベルまたは抗Ｇａｌα１，３Ｇａｌ  ＩｇＥを有する。幾つかの実施形態ではその対象は、上昇したセツキシマブ過敏性のリスクを有していない対象よりも少なくとも約１パーセント、約２パーセント、約３パーセント、約４パーセント、約５パーセント、約６パーセント、約７パーセント、約８パーセント、約９パーセント、約１０パーセント、約１１パーセント、約１２パーセント、約１３パーセント、約１４パーセント、約１５パーセント、約１６パーセント、約１７パーセント、約１８パーセント、約１９パーセント、約２０パーセント、約２１パーセント、約２２パーセント、約２３パーセント、約２４パーセント、約２５パーセント、約２６パーセント、約２７パーセント、約２８パーセント、約２９パーセント、約３０パーセント、約３１パーセント、約３２パーセント、約３３パーセント、約３４パーセント、約３５パーセント、約３６パーセント、約３７パーセント、約３８パーセント、約３９パーセント、約４０パーセント、約４１パーセント、約４２パーセント、約４３パーセント、約４４パーセント、約４５パーセント、約４６パーセント、約４７パーセント、約４８パーセント、約４９パーセント、約５０パーセント、約５１パーセント、約５２パーセント、約５３パーセント、約５４パーセント、約５５パーセント、約５６パーセント、約５７パーセント、約５８パーセント、約５９パーセント、約６０パーセント、約６１パーセント、約６２パーセント、約６３パーセント、約６４パーセント、約６５パーセント、約６６パーセント、約６７パーセント、約６８パーセント、約６９パーセント、約７０パーセント、約７１パーセント、約７２パーセント、約７３パーセント、約７４パーセント、約７５パーセント、約７６パーセント、約７７パーセント、約７８パーセント、約７９パーセント、約８０パーセント、約８１パーセント、約８２パーセント、約８３パーセント、約８４パーセント、約８５パーセント、約８６パーセント、約８７パーセント、約８８パーセント、約８９パーセント、約９０パーセント、約９１パーセント、約９２パーセント、約９３パーセント、約９４パーセント、約９５パーセント、約９６パーセント、約９７パーセント、約９８パーセント、約９９パーセント、約９９パーセント高い抗セツキシマブＩｇＥレベルまたは抗Ｇａｌα１，３Ｇａｌ  ＩｇＥレベルを有する。
【０１１５】
幾つかの実施形態では上昇したセツキシマブ過敏性のリスクを有する対象は少なくとも約１〜少なくとも約１００倍高い血清中抗セツキシマブＩｇＥレベルまたは抗Ｇａｌα１，３Ｇａｌ  ＩｇＥレベルを有する。幾つかの実施形態ではその対象は、上昇したセツキシマブ過敏性のリスクを有していない対象よりも少なくとも約１倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１１倍、約１２倍、約１３倍、約１４倍、約１５倍、約１６倍、約１７倍、約１８倍、約１９倍、約２０倍、約２１倍、約２２倍、約２３倍、約２４倍、約２５倍、約２６倍、約２７倍、約２８倍、約２９倍、約３０倍、約３１倍、約３２倍、約３３倍、約３４倍、約３５倍、約３６倍、約３７倍、約３８倍、約３９倍、約４０倍、約４１倍、約４２倍、約４３倍、約４４倍、約４５倍、約４６倍、約４７倍、約４８倍、約４９倍、約５０倍、約５１倍、約５２倍、約５３倍、約５４倍、約５５倍、約５６倍、約５７倍、約５８倍、約５９倍、約６０倍、約６１倍、約６２倍、約６３倍、約６４倍、約６５倍、約６６倍、約６７倍、約６８倍、約６９倍、約７０倍、約７１倍、約７２倍、約７３倍、約７４倍、約７５倍、約７６倍、約７７倍、約７８倍、約７９倍、約８０倍、約８１倍、約８２倍、約８３倍、約８４倍、約８５倍、約８６倍、約８７倍、約８８倍、約８９倍、約９０倍、約９１倍、約９２倍、約９３倍、約９４倍、約９５倍、約９６倍、約９７倍、約９８倍、約９９倍、約９９倍高い抗セツキシマブＩｇＥレベルまたは抗Ｇａｌα１，３Ｇａｌ  ＩｇＥレベルを有する。
【０１１６】
ＬＲ００４抗体は、ＥＧＦＲ発現癌の治療のためにそれを必要とする対象への投与に適切な医薬組成物に組み込まれ得る。それらの医薬組成物は特定の投与経路に適切な形態の薬学的に許容可能な担体と共にその抗体を含むことが一般的である。薬学的に許容可能な担体は投与される特定の組成物ならびにその組成物を投与するために用いられる特定の方法に従って部分的に決定される。したがって、抗体組成物の投与向けの医薬組成物の多種多様な適切な製剤が存在する（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing社、イーストン、ペンシルバニア州、第１８版、１９９０年を参照されたい）。それらの医薬組成物は無菌で実質的に等張性のものとして、且つ、米国食品医薬品局の全ての医薬品製造基準（ＧＭＰ）規制を完全に遵守して製剤されることが一般的である。
【０１１７】
「薬学的に許容可能な」という用語、「生理学的に許容可能な」という用語、およびそれらの文法上の変形は、それらが組成物、担体、希釈剤および試薬を指すとき、互換的に使用され、且つ、その組成物の投与を不可能にする程度にまで望ましくない生理学的効果をもたらすことなくそれらの物質を対象に投与または塗布することが可能であることを表す。例えば、「薬学的に許容可能な賦形剤」は概して安全であり、無毒であり、且つ、望ましい医薬組成物の調製に有用である賦形剤を意味し、人間用製薬用途と同様に獣医用途にも許容可能である賦形剤を含む。そのような賦形剤は固体、液体、半固体、またはエアロゾル組成物の場合では気体であり得る。「薬学的に許容可能な塩およびエステル」は薬学的に許容可能であり、且つ、所望の薬理学的特性を有する塩およびエステルを意味する。そのような塩には前記抗体中に存在する酸性プロトンが無機塩基または有機塩基と反応可能である場合に形成され得る塩が含まれる。適切な無機塩にはアルカリ金属、例えばナトリウムおよびカリウム、マグネシウム、カルシウム、およびアルミニウムと形成される無機塩が含まれる。適切な有機塩にはアミン塩基、例えばエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、Ｎ−メチルグルカミン等のような有機塩基と形成される有機塩が含まれる。そのような塩には無機酸（例えば塩酸および臭化水素酸）および有機酸（例えば酢酸、クエン酸、マレイン酸、ならびにメタンスルホン酸およびベンゼンスルホン酸などのアルカンスルホン酸およびアレーンスルホン酸）と形成される酸付加塩も含まれる。薬学的に許容可能なエステルには前記抗体中に存在するカルボキシ基、スルホニルオキシ基、およびホスホンオキシ基から形成されるエステル、例えばＣ1~6アルキルエステルが含まれる。
【０１１８】
そのような担体または希釈剤の好ましい例には水、生理食塩水、リンゲル溶液、ブドウ糖溶液、および５％ヒト血清アルブミンが含まれるがこれらに限定されない。リポソームおよび不揮発性油などの非水性ベヒクルも使用してよい。医薬活性物質用のそのような媒体および化合物の使用は当技術分野においてよく知られている。どの従来の媒体または化合物でもそれが前記抗体と不適合である場合を除いて前記組成物中でのその使用を企図している。補足的活性化合物も前記組成物に組み込むことができる。
【０１１９】
本技術の医薬組成物は意図した投与経路、例えば非経口経路、局所経路、静脈内経路、経口経路、皮下経路、動脈内経路、皮内経路、経皮経路、直腸経路、頭蓋内経路、腹膜内経路、鼻腔内経路、筋肉内経路、または呼吸器投与などと適合するように製剤される。
【０１２０】
幾つかの実施形態では製剤は局所的に病変組織に直接的に投与される。幾つかの実施形態では製剤は全身に投与される。幾つかの実施形態では製剤はボーラスとして投与される。幾つかの実施形態では製剤は長期放出送達用に投与される。
【０１２１】
非経口適用、皮内適用、または皮下適用に使用される水剤または懸濁剤は次の成分を含み得る：注射用水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの無菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベン類などの抗細菌化合物；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート化合物；酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩などの緩衝剤、および塩化ナトリウムまたはブドウ糖などの浸透圧調節用化合物。塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基でｐＨを調節することができる。非経口調製物をガラス製またはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器、または多用量バイアルの中に封入することができる。
【０１２２】
注射用途に適切な医薬組成物には無菌水剤（水溶性である場合）または分散剤、および無菌注射剤または分散剤の即時調製用の無菌粉剤が含まれる。静脈内投与のため、適切な担体には生理食塩水、静菌水、クレモフォールＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ、パーシッパニー、ニュージャージー州）、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。全ての場合で前記組成物は無菌的でなくてはならず、且つ、容易な注射器通過性が存在する程度にまで流動的であるべきである。前記組成物は製造条件および貯蔵条件下で安定的でなくてはならず、且つ、細菌および真菌などの微生物の汚染混入活動に対抗して保護されなければならない。前記担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、およびそれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒体であり得る。例えば、レシチンなどの被覆材の使用によって、分散剤の場合は必要な粒度の維持によって、および界面活性剤の使用によって適切な流動性を維持することができる。様々な抗細菌化合物および抗菌化合物、例えばパラベン類、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等によって微生物の活動の防止を達成することができる。等張性化合物、例えば糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、塩化ナトリウムを前記組成物中に含むことが多くの場合で好ましい。注射用組成物の吸収の長期化は、吸収を遅らせる化合物、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを前記組成物中に含むことでもたらされ得る。
【０１２３】
無菌注射剤は、上で列挙した成分のうちの１つ、またはそれらの組合せを含む適切な溶媒中に必要な量の前記抗体を組み入れ、必要に応じて続いてフィルター滅菌することで調製され得る。一般的に、分散剤は基礎分散媒体および上で列挙した成分のうちの必要な他の成分を含む無菌ベヒクルに前記抗体を組み入れることで調製される。無菌注射剤の調製用の無菌粉剤の場合では、前記有効成分とあらゆる追加の所望の成分の事前に無菌濾過した溶液からそれらの粉末を生じさせる真空乾燥および凍結乾燥が調製方法である。本技術の薬剤は、前記有効成分の持続放出またはパルス放出を許すように製剤され得るデポー注射薬または移植調製物の形態で投与され得る。
【０１２４】
経口用組成物は一般に不活性の希釈剤または食べられる担体を含む。それらの組成物はゼラチンカプセルに封入されるか、錠剤に圧縮され得る。経口治療用投与目的のため、ＬＲ００４抗体または抗体複合体は賦形剤と組み合わされ、錠剤、トローチ、またはカプセル剤の形態で使用され得る。口腔洗浄液として使用するために液体の担体を使用して経口用組成物を調製することもでき、その液体担体中の前記化合物は経口適用され、ブクブクされ、そして吐き出される、または飲み込まれる。薬学的に適合する結合剤化合物、および／またはアジュバント物質を前記組成物の一部として含むことができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ等は次の成分、または同様の性質の化合物のうちのいずれかを含むことができる：ミクロクリスタリンセルロース、トラガカントガムまたはゼラチンなどの結合剤；デンプンまたはラクトースなどの賦形剤；アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、またはコーンスターチなどの崩壊化合物；ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓなどの滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素などの滑材；ショ糖またはサッカリンなどの甘味化合物；またはペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ香料などの着香化合物。
【０１２５】
吸入による投与のため、前記抗体は加圧容器、または適切な噴射剤、例えば二酸化炭素などの気体を含むディスペンサー、またはネブライザからエアロゾルスプレーの形態で送達される。
【０１２６】
全身投与は経粘膜性手段または経皮性手段によっても行われ得る。経粘膜投与または経皮投与のため、透過予定の隔壁にとって適切な透過剤が前記製剤に使用される。そのような透過剤は概ね当技術分野において知られており、例えば、経粘膜投与用には界面活性剤、胆汁塩、およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は鼻腔用スプレー剤または坐剤の使用を介して達成され得る。経皮投与のため、前記抗体は当技術分野において概ね知られているように軟膏、膏薬、ゲル剤、またはクリーム剤に製剤される。
【０１２７】
前記抗体は直腸送達用に坐剤（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を含むもの）または停留浣腸の形態の医薬組成物としても調製され得る。
【０１２８】
１つの実施形態では抗体は、移植物およびミクロカプセル送達系をはじめとする制御放出製剤のように身体からの急速排出からその抗体を守る担体と共に調製される。エチレンビニルアセテート、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生物分解性生体適合性重合体を使用することができる。そのような製剤の調製のための方法は当業者にとって明らかである。それらの物質をＡｌｚａ社およびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社から購入することもできる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を有する感染細胞を標的としたリポソームを含む）も薬学的に許容可能な担体として使用することができる。これらは当業者に知られている方法に従って、例えば、米国特許第４５２２８１１号明細書に記載されているように調製され得る。
【０１２９】
投与のし易さ、および投薬量の均一性のために投薬単位剤形で経口用組成物または非経口用組成物を製剤することが特に有利である。本明細書において使用される場合、投薬単位剤形は治療を受ける対象への単位投薬量として適した物理的に分離した単位を指す。各単位は必要とされる医薬担体と共に所望の治療効果をもたらすことが計算されている所定の量の抗体を含む。本技術の投薬単位剤形の仕様は前記抗体および達成される予定の特定の治療効果の独自の特徴、および対象の治療用の前記抗体の調剤技術に固有の制限によって決定され、且つ、それらに直接的に左右される。
【０１３０】
本技術の核酸分子をベクターに挿入し、遺伝子治療ベクターとして使用することができる。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与（例えば米国特許第５３２８４７０号明細書を参照されたい）または定位的注入（例えば、Chen,, et al., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3054-3057を参照されたい）によって対象に送達され得る。その遺伝子治療ベクターの医薬製剤は許容可能な希釈剤中のその遺伝子治療ベクターを含むことができ、またはその遺伝子送達ベヒクルが埋め込まれている遅延放出マトリックスを含むことができる。あるいは、その完全な遺伝子送達ベクターが完全なままで組換え細胞、例えばレトロウイルスベクターから産生され得る場合、その医薬製剤はその遺伝子送達系を産生する１つ以上の細胞を含み得る。それらの医薬組成物を投与指示書と共にコンテナ容器、パック、または分注器に含めることができる。
【０１３１】
１つの態様では本開示はインビボ腫瘍画像化方法であって、Ｘ線写真術、ＮＭＲまたはＥＳＲによる検出に適切な検出可能標識に結合したある量のＬＲ００４抗体を対象に投与することを含む前記方法を提供する。Ｘ線写真術のため、適切な標識には検出可能な放射線を放射するバリウムまたはセシウムなどの放射性同位体が含まれる。ＮＭＲおよびＥＳＲの適切なマーカーには当技術分野において知られている方法を用いて前記抗体に組み入れることができる、または結合させることができる重水素などの検出可能な特徴的スピンを有するマーカーが含まれる。
【０１３２】
放射性同位体（例えば131Ｉ、112Ｉｎ、99ｍＴｃ）、放射線不透過物質、または核磁気共鳴によって検出可能である物質などの適切な検出可能画像化部分で標識されているＬＲ００４抗体を対象に（例えば、非経口的に、皮下に、または腹膜内に）導入する。対象の体格および使用される画像化系が診断画像を作製するために必要な画像化部分の量を決定することが当技術分野において理解される。放射性同位体部分の場合では、ヒト対象について、注入される放射活性の量は通常は約５〜２０ミリキュリーまでの99ｍＴｃの範囲になる。その後、標識ＬＲ００４抗体は特異的な標的ポリペプチドを含む細胞の場所に優先的に蓄積する。例えば、インビボ腫瘍画像化法はS. W. Burchiel, et al., Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer 13 (1982) に記載されている。
【０１３３】
本技術のＬＲ００４抗体はＥＧＦＲ発現癌の治療に有用であり、とりわけセツキシマブを用いる治療を続行することができない対象におけるＥＧＦＲ発現癌の治療に有用である。本技術の組成物および方法は、限定されないが、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、結腸直腸癌、頭頚部癌、腎臓癌、肺癌、膵臓癌、および前立腺癌を含むＥＧＦＲ阻害が有用である全ての癌の治療に有用である。
【０１３４】
治療のためにインビボで使用されるとき、ＬＲ００４抗体は有効量（すなわち、所望の治療効果を有する量）で対象に投与される。用量および投薬法はその個体に存在するＥＧＦＲ発現性疾患の程度、および問題のその特定の疾患の特徴に左右される。幾つかの実施形態ではその抗体は所望の程度の治療が得られるまで数日、数週間、数か月、または数年にわたって繰り返し投与される。
【０１３５】
幾つかの実施形態ではＬＲ００４抗体は１種類以上の追加治療薬と併せて投与される。幾つかの実施形態ではその抗体および追加治療薬はＥＧＦＲ発現癌の治療に相乗的効果を示す。すなわち、その組合せの抗体と治療薬により、例えば、腫瘍退縮の促進または腫瘍増殖の抑制に関して相加的効果よりも大きな効果が生じる。幾つかの実施形態ではその相乗的効果によって、それぞれ単独で使用される場合に有効である用量よりも少ない用量のその抗体および１種類以上の追加薬剤の投与が可能になる。
【０１３６】
治療効果または予防効果の達成に充分である本技術の組成物の有効量は典型的には１日に体重キログラム当たり約０．０００００１ｍｇから１日に体重キログラム当たり約１０，０００ｍｇまでの範囲になる。幾つかの実施形態では投薬範囲は１日に体重キログラム当たり約０．０００１ｍｇから１日に体重キログラム当たり約１００ｍｇまでである。幾つかの実施形態ではそれらの組成物は１日に約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇまでの投薬範囲、または１日に約０．０１〜５ｍｇ／ｋｇまでの投薬範囲で投与される。例えば、投薬量は１日に体重ｋｇ当たり１ｍｇまたは１０ｍｇであり得、または１日に１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得る。幾つかの実施形態では抗体の一回の投薬量は体重ｋｇ当たり０．１〜１０，０００マイクログラムまでの範囲になる。幾つかの実施形態では担体中の抗体濃度は送達されたミリリットル当たり０．２〜２０００マイクログラムまでの範囲になる。例示的な治療計画は２週間毎に１回、または１カ月に１回、または３〜６か月に１回の投与を必要とする。一回の投薬と投薬の間の間隔は週毎、月毎、または年毎であり得る。対象における血中抗体レベルを測定することで指示されるように、間隔は不定期であることもあり得る。
【０１３７】
幾つかの方法では１〜１０００μｇ／ｍｌの血漿中抗体濃度を、および幾つかの方法では２５〜３００μｇ／ｍｌの血漿中抗体濃度を達成するために投薬量が調節される。あるいは、製剤を持続放出製剤として投与することができ、その場合では必要される投与頻度がより少ない。投薬量および頻度は対象における前記抗体の半減期に応じて変化する。
【０１３８】
幾つかの実施形態ではＬＲ００４抗体の有効量によって対象に対して実質的な毒性が生ずることなく治療上の利益がもたらされる。その抗体の毒性は細胞培養物または実験動物において標準的な薬学的手法によって、例えばＬＤ50（集団の５０％にとって致命的な用量）またはＬＤ100（集団の１００％にとって致命的な用量）の決定によって決定され得る。毒性効果と治療効果との間の用量の比率が治療指数である。これらの細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータをヒトでの使用にとって無毒である投薬範囲の制定に使用することができる。本明細書に記載される抗体の投薬量は、毒性がほとんど無い、または全く無い有効用量を含む循環濃度の範囲内にあることが好ましい。投薬量は用いられる剤形および利用される投与経路に応じてこの範囲内で変化し得る。正確な製剤、投与経路および投薬量は対象の状態を考慮して個々の医師によって選択され得る。例えば、The Pharmacological Basis of Therapeutics内のFinglら著、第１章（１９７５年）を参照されたい。
【０１３９】
ＥＧＦＲ発現癌の治療に使用されるＬＲ００４抗体を含むキットも本技術の範囲内にある。そのキットは特定の投与経路に適切な前記抗体の製剤を含んでよく、適切なコンテナ容器内に包装されているその製剤を投与するための手段を所望により含んでよい。そのキットはＬＲ００４抗体を投与するためにそのキットを使用するための指示書をさらに含み得る。
【０１４０】
幾つかの実施形態ではそのキットはＬＲ００４抗体の製剤を１種類以上の追加治療薬または検出可能標識と共に含む。
【実施例】
【０１４１】
本技術の好ましい実施形態をさらに充分に例示するために以下の実施例を提示する。これらの実施例は、添付されている特許請求の範囲によって規定されるように本技術の範囲を限定すると決して解釈されるべきではない。
【０１４２】
実施例１．  ＥＧＦＲリン酸化の阻害
ヒト肺癌細胞株Ａ５４９および下咽頭癌細胞株ＦａＤｕを使用してリン酸化アッセイおよびその後のＥＬＩＳＡ分析を実施した。様々な濃度のＬＲ００４またはアービタックス（登録商標）が存在する中で細胞を氷上で７５０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦで１時間にわたって刺激した。刺激後に細胞をＰＢＳで洗浄し、後のＥＬＩＳＡ分析用に細胞溶解緩衝液で溶解した。ＥＧＦ受容体であるＥＧＦＲ／ＨＥＲ２／ＨＥＲ３のリン酸化をＨＲＰ結合ｐＴｙｒ−４Ｇ１０モノクローナル抗体で探索することによって決定し、ＥＬＩＳＡを用いて検出した。
【０１４３】
これらのインビトロ分析の結果はＬＲ００４とアービタックス（登録商標）の両方が腫瘍細胞株Ａ５４９とＦａＤｕの両方において検査した全ての濃度で同様の程度までＥＧＦＲのリン酸化を阻害することができることを示した（図１）。
【０１４４】
実施例２．  ＬＲ００４依存性細胞介在性細胞傷害
抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は治療用モノクローナル抗体の腫瘍に対する重要な作用機序である。この試験の目的はＬＲ００４およびアービタックス（登録商標）がインビトロで腫瘍細胞に対するＡＤＣＣを媒介することができるか決定することであった。
【０１４５】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を健康なドナーから入手し、エフェクター細胞として使用した。下咽頭癌細胞株であるＦａＤｕを標的細胞として使用した。ＦａＤｕ細胞を５×１０3細胞／ウェルの密度で９６ウェル形式に播種した。三回の実験で様々な濃度（０．０１〜１０，０００ｎｇ／ｍＬ）のＬＲ００４を個々のウェルに添加し、３０：１のエフェクター細胞：標的細胞比率でエフェクター細胞を添加し、３７℃で４時間にわたってインキュベートし、且つ、ＣｙｔｏＴｏｘ９６非放射性細胞傷害アッセイを用いてＡＤＣＣを調査した。
【０１４６】
結果が図２に示されている。ＬＲ００４は下咽頭癌ＦａＤｕ細胞に対して顕著なＡＤＣＣ活性を誘導した。３０：１のエフェクター：標的比率および１００ｎｇ／ｍＬのＬＲ００４濃度でＡＤＣＣが抗腫瘍細胞傷害の最高のパーセンテージに達した。健康なドナーのＰＢＭＣによるＡＤＣＣ活性のパーセンテージは、ＬＲ００４基準対照試料（ＬＲ００４−２０１３０７００１）およびバルク溶液（ＬＲ００４−０３４−２０１３０４００２）の両方において調査された全ての濃度（０．０１〜１０，０００ｎｇ／ｍＬ）でＬＲ００４とアービタックス（登録商標）の両方に応じて同様であった。さらに、腫瘍細胞ＦａＤｕに対するＬＲ００４媒介性ＡＤＣＣには用量依存性があり、ＬＲ００４とアービタックス（登録商標）の類似する抗腫瘍作用機序を裏付けた。
【０１４７】
ＬＲ００４を使用して実施された主要薬理学試験には可溶性ヒトＥＧＦＲおよびＥＧＦＲ発現細胞を使用する無細胞系での結合試験、ＥＧＦＲ陽性癌細胞株を使用するインビトロ抗腫瘍活性試験、およびＥＧＦＲ陽性ヒト腫瘍異種移植モデルにおけるインビボ抗腫瘍活性が含まれる。
【０１４８】
実施例３．  ＬＲ００４結合特異性および親和性
Ａ．  ＥＬＩＳＡによって測定される固定化受容体への結合
ＬＲ００４の結合特異性をＥＬＩＳＡによりインビトロで評価した。精製したＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、およびＨＥＲ３をマイクロプレート上に被覆し、その後でブロックした。ＬＲ００４基準物質（ＬＲ００４−ＲＳ−２０１３０７００１）、３ロットのＬＲ００４バルク溶液（ＬＲ００４−０３４−２０１３０４００２、ＬＲ００４−０３４−２０１３０４００４、ＬＲ００４−０３４−２０１３０５００５）、ならびにアービタックス（登録商標）、および無関係の抗体対照ｈＩｇＧ１をそれぞれ２０００ｎｇ／ｍＬ、４００ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、１６ｎｇ／ｍＬ、３．２ｎｇ／ｍＬ、０．６４ｎｇ／ｍＬおよび０．１２８ｎｇ／ｍＬまで希釈し、前記固定化抗原を含むウェルに添加した。プレートを３７℃で３０分間にわたってインキュベートし、洗浄した。固定化抗原とのＬＲ００４またはアービタックス（登録商標）の結合をＨＲＰ標識二次抗体およびＴＭＢ基質で検出した。
【０１４９】
図３に示されているように、ＬＲ００４とアービタックス（登録商標）の両方がＥＧＦＲ抗原だけに結合し、ＨＥＲ２抗原またはＨＥＲ３抗原に結合せず、目的のＥＧＦＲ標的に対する高い特異性を示唆した。ＬＲ００４はアービタックス（登録商標）のものとほぼ同一のＥＧＦＲに対する結合親和性を示した。
【０１５０】
Ｂ．  ＢＩＡｃｏｒｅによって測定される可溶性ＥＧＦＲへの結合
ｓＥＧＦＲに対するＬＲ００４の結合親和性を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）およびＥＬＩＳＡによって決定し、アービタックス（登録商標）の結合親和性と比較した。ＳＰＲアッセイではＬＲ００４またはアービタックス（登録商標）をＣＭ５  ＢＩＡｃｏｒｅセンサーチップ上に固定し、非架橋タンパク質を除去し、そして未反応部位をブロックした。そのセンサー表面上に８ｎＭ、１６ｎＭ、３２ｎＭ、６４ｎＭ、および１２８ｎＭの濃度の精製組換えヒトｓＥＧＦＲタンパク質を連続的に流した。アッセイの実行と実行の間にチップ表面を１０ｍＭのグリシン塩酸（ｐＨ２．５）で再生した。
【０１５１】
ＥＬＩＳＡでは再びｓＥＧＦＲをマイクロプレートのウェルに固定した。ＬＲ００４またはアービタックス（登録商標）を希釈し、ｓＥＧＦＲで被覆されたウェルに添加した。３７℃で１時間のインキュベーションの後にそのプレートを洗浄した。固定化ｓＥＧＦＲに対するＬＲ００４またはアービタックス（登録商標）の結合をＨＲＰ標識抗ヒトＦｃモノクローナル抗体およびＴＭＢ基質で検出した。各ウェルの光学密度（ＯＤ）を波長４５０ｎｍで決定した。この方法論を用いてＬＲ００４およびアービタックス（登録商標）についてそれぞれ３．２３ｎＭと３．５ｎＭのＫｄ値（図４および表４）。
【０１５２】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ／ＢＩＡｃｏｒｅ）を使用して、アービタックス（登録商標）の結合について観察されたＫｄ値（Ｋｄ＝３．８８ｎＭ）と類似する２．８０ｎＭのＫｄ値でｓＥＧＦＲが固定化ＬＲ００４に結合することがわかった（下の表４を参照されたい）。
【表４】
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【０１５３】
Ｃ．  フローサイトメトリーによって測定される細胞表面ＥＧＦＲへの結合
細胞表面ＥＧＦ受容体へのＬＲ００４の結合を異なるＥＧＦＲ発現レベルを有する９種類の腫瘍細胞株においてフローサイトメトリーによって評価した。市販のアービタックス（登録商標）をこれらの実験の対照薬として使用した。細胞濃度を２×１０6細胞／ｍＬに調節し、１×１０5細胞を使用して結合アッセイを実施した。２つの異なる濃度（２００ｎｇ／ｍＬおよび１０００ｎｇ／ｍＬ）のＬＲ００４またはアービタックス（登録商標）をそれらの細胞に添加し、４℃で１時間にわたって共保温した。それらの細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ＲＰＥ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧと共に４℃でインキュベートした。細胞を洗浄し、フローサイトメトリー分析用に２５０ｍＬのＰＢＳに再懸濁した。蛍光強度の幾何平均（Ｇ平均）を記録し、データ分析に使用した。
【０１５４】
図５に示されているように、ＥＧＦ受容体に対するＬＲ００４の結合が可変的レベルのＥＧＦＲ発現を有する胃癌細胞株ＭＫＮ２８、類表皮癌細胞株Ａ４３１、下咽頭癌細胞株ＦａＤｕ、大腸腺癌細胞株ＣＯＬＯ２０５、膵臓腺癌細胞株ＡｓＰＣ−１、肝細胞癌細胞株ＨｅｐＧ２および７４０２、乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８およびＭＣＦ−７を含む９種類の異なる腫瘍細胞株において検出された。最も顕著な結合がＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌細胞およびＡ４３１類表皮癌株において観察された。ＥＧＦＲに対するＬＲ００４の結合活性は調査された腫瘍細胞株の全てにおいてアービタックス（登録商標）の結合活性と類似しており、それら２種類の抗体がＥＧＦＲ結合部位において類似の構造ドメインを有している可能性があることを示唆した。
【０１５５】
その後、高ＥＧＦＲ発現細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＦａＤｕおよびＡ４３１をＬＲ００４結合試験の標的細胞として使用した。第１の実験ではＬＲ００４をＦＩＴＣ標識し、非標識アービタックス（登録商標）を競合性リガンドとして使用した。第２シリーズの実験ではアービタックス（登録商標）を同様にＦＩＴＣ標識し、ＬＲ００４を競合性リガンドとして使用した。それぞれの場合において、細胞濃度を２×１０6細胞／ｍＬに調節し、１×１０5細胞で結合アッセイを実施した。等量のＦＩＴＣ結合ＬＲ００４を様々な濃度のアービタックス（登録商標）またはヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体（８０、１６、３．２、０．６４、０．１２８、および０μｇ／ｍＬ）と混合し、前記高ＥＧＦＲ発現標的細胞に添加した。氷上で１時間のインキュベーションの後に０．２％ＢＳＡを含有する冷ＰＢＳでそれらの細胞を洗浄した。細胞を洗浄し、フローサイトメトリー分析用に２５０μＬのＰＢＳに再懸濁した。
【０１５６】
図６に示されているように、アービタックス（登録商標）はＥＧＦＲ発現細胞株への結合についてＬＲ００４と競合することが示された。標的細胞表面ＥＧＦ受容体に対するＬＲ００４の結合は用量依存的にアービタックス（登録商標）によって抑制された。高用量処理（２０μｇ／ｍＬ）によってＦＩＴＣ結合ＬＲ００４の結合がほとんど完全に阻止された。対照的に、対照モノクローナル抗体（ヒトＩｇＧ１）はＥＧＦ受容体とのＬＲ００４の結合を阻止することができず、ＬＲ００４がアービタックス（登録商標）と共にＥＧＦ受容体の類似のリガンド結合性エピトープを認識する可能性があることを示唆した。アービタックス（登録商標）によるＬＲ００４の結合の抑制について計算されたＩＣ50値が表５に示された。
【表５】
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【０１５７】
異なるアプローチを使用するに当たり、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８をＬＲ００４による標識アービタックス（登録商標）の結合の抑制についての標的細胞株として選択した。結合アッセイを１×１０5腫瘍細胞で実施した。ＦＩＴＣ結合アービタックス（登録商標）を様々な濃度のＬＲ００４またはヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体（８０、１６、３．２、０．６４、０．１２８、および０μｇ／ｍＬ）と混合し、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞に添加した。氷上で１時間のインキュベーションの後に０．２％ＢＳＡを含有する冷ＰＢＳで細胞を洗浄した。細胞を再懸濁し、フローサイトメトリー分析によって分析した。
【０１５８】
図７に示されているように、ＬＲ００４はＭＤＡ−ＭＢ−４６８の結合についてアービタックス（登録商標）と競合することが示された。標的細胞表面ＥＧＦ受容体に対するアービタックス（登録商標）の結合は用量依存的にＬＲ００４によって抑制された。高用量処理（２０μｇ／ｍＬ）によって受容体に対するＦＩＴＣ結合ＬＲ００４がほとんど完全に阻止された。対照的に、対照モノクローナル抗体（ヒトＩｇＧ１）はＥＧＦ受容体とのＬＲ００４の結合を阻止することができなかった。この試験の結果は標識ＬＲ００４を使用した以前の実験において観察された結果と同等であり、ＬＲ００４とアービタックス（登録商標）がＥＧＦ受容体の同じリガンド結合性エピトープを認識することを示唆した。
【０１５９】
実施例４．  ＬＲ００４インビトロ抗腫瘍活性
ＬＲ００４の抗腫瘍活性もインビトロで直接的に調査した。乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、結腸癌細胞ＬｏＶｏ、下咽頭癌細胞ＦａＤｕ、および類表皮癌細胞Ａ４３１を含む４種類のヒト癌細胞株をこの試験で検査した。
【０１６０】
第１の試験においてＭＤＡ−ＭＢ−４６８およびＬｏＶｏを使用した。各細胞株（５，０００細胞）を一晩にわたって培養した。それらの腫瘍細胞株の培養上清を廃棄し、異なる濃度のＬＲ００４またはアービタックス（登録商標）を添加した。３７℃で４８時間のインキュベーションの後に２０μＬのＣＣＫ−８混合基質を各ウェルに添加し、３７℃で３時間にわたってインキュベートした。マイクロプレートリーダーを使用してＯＤ４５０ｎｍを決定した。
【０１６１】
別の実験において、ＦａＤｕおよびＡ４３１（５，０００細胞）を三回の実験において９６ウェル平底プレート内で異なる濃度のＬＲ００４またはアービタックス（登録商標）と共に培養した。３７℃で９６時間のインキュベーションの後に基質を各ウェルに添加し、暗所で１０分間にわたってインキュベートした。化学発光法を用いてＲＬＵ（相対化学発光単位）を決定した。抑制率（ＩＲ）を次のように計算した：ＩＲ（％）＝（非処理細胞のＲＬＵ値−処理細胞のＲＬＵ値）／（非処理細胞のＲＬＵ値）。
【０１６２】
結果が図８に示されている。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８は選択した４種類の細胞株の中で最も前記抗体に対して敏感な細胞株であり、Ａ４３１およびＦａＤｕの反応はそれより弱かった。両方の抗体は各細胞の増殖を同じ程度にまで抑制することができ、ＬＲ００４がアービタックス（登録商標）と類似のインビトロ抗腫瘍活性を有することを示唆した。
【０１６３】
実施例５．  ＬＲ００４インビボ抗腫瘍活性
ＬＲ００４およびアービタックス（登録商標）を使用するヒト腫瘍異種移植試験にＢＡＬＢ／ｃヌードマウスを使用した。腫瘍担持マウスの構築に５匹のマウスからなる小グループを使用した。ヒト結腸癌細胞株ＧＥＯおよびヒト肺癌細胞株Ａ５４９を両方とも異種移植モデルの開発に使用したが、ＧＥＯ株を用いた結果だけがここで提示される。ヌードマウスの後部右脇腹に腫瘍細胞を皮下注射した。それらの腫瘍が４００〜６００ｍｍ3の体積に達したところで良好な腫瘍および健康条件を有する腫瘍担持マウスを選択した。腫瘍を取り出し、２〜３ｍｍ３のサイズの小片に切断し、ヌードマウスの後部右脇腹に皮下接種した。腫瘍体積が１００〜３００ｍｍ3になったところで群あたり１０匹のマウスの割合でマウスを対照群、ＬＲ００４またはアービタックス（登録商標）の低投与群、中投与群、および高投与群に無作為に割り当てた。週に２回マウスに静脈内投与を行った。カリパスを使用して腫瘍の寸法を週に２回測定し、安楽死の後に腫瘍重量を測定し、腫瘍重量抑制率を各群について計算した。それらの結果はその率が６０％以下であったら陰性と考えられ、その率が６０％超であったら陽性と考えられる。
【０１６４】
図１０は高用量（１００〜２００ｍｇ／ｋｇのＬＲ００４）および１００ｍｇ／ｋｇのアービタックス（登録商標）の定着ＧＥＯヒト大腸癌異種移植片に対するインビボ抗腫瘍効果を示している。３週間にわたって週に２回マウスに投与を行った。
【０１６５】
次の実験において、ＬＲ００４を用いて用量応答を実施し、再び高用量のアービタックス（登録商標）を対照として使用した。この実験ではマウスは１００ｍｇ／ｋｇ／投与のアービタックス（登録商標）または２５、５０または１００ｍｇ／ｋｇ／投与のＬＲ００４の注射を４週間にわたって週に２回受けた。各群は８匹のマウスから構成された。
【０１６６】
結果が図１０に示されている。ＬＲ００４およびアービタックス（登録商標）は両方とも両方の試験において腫瘍体積を著しく減少させた。第２の実験を再び繰り返してＬＲ００４およびアービタックス（登録商標）の全ての用量によって非常に類似した結果と完全な腫瘍抑制を得た。それら２種類の抗体の間、またはこれらの実験で使用されたＬＲ００４の異なる用量の間に有意差は無かった。
【０１６７】
実施例６．  ＬＲ００４薬力学
これらの最初の完了したインビトロおよびインビボ薬理学試験に加え、ＳＷ９４８大腸腺癌株、Ａ４３１類表皮癌株およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌腫瘍株を含む他の幾つかの異なるＥＧＲＦ発現腫瘍種に対するＬＲ００４の効力を表６および表７に示されているように評価する。
【表６】
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【０１６８】
ＧＥＯ腫瘍株、ＳＷ９４８腫瘍株およびＡ４３３１腫瘍株を使用する試験をＢＡＬＢ／ｃヌードマウスで実施し、且つ、（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍をＮＯＤ  ＳＣＩＤマウスにおいて評価する）。固形腫瘍を最初に小グループのＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおいてインビボで増殖させる。腫瘍が４００〜６００ｍｍ3になったところで腫瘍を切り出し、２〜３ｍｍ3の小片に切断し、小グループのマウスに皮下接種する。腫瘍が１００〜３００ｍｍ3になったところでマウスをランダム化し、およびマウスにベヒクル、アービタックス（登録商標）（用量未定）または低用量、中用量または高用量のＬＲ００４を４週間にわたって週に２回静脈内投与する。腫瘍細胞移植後最大で４週間にわたってマウスを観察し、腫瘍体積を測定および算出する。最終的な屠殺の後に腫瘍重量を測定し、抑制率または抑制効果を対照と比べて各処理群について計算する。それらの結果はその率が６０％以下であったら陰性と考えられ、その率が６０％超であったら陽性と考えられる。これらの細胞株を使用する主要な試験の全体的なデザインが下に提示されている。
【表７】
2017515798.tif 000009
【０１６９】
これらの４種類の腫瘍種を使用する５０匹のマウスからなる各試験を各腫瘍種についてＮ＝２で一度繰り返す。１０匹のオスを使用する各主要スタッドの前に５匹のオスマウスおよび低用量と高用量のＬＲ００４および既知の有効用量のアービタックス（登録商標）を使用してＬＲ００４とアービタックス（登録商標）の両方についてより小規模のパイロット試験を実施する。後のＬＲ００４の反復投与安全性試験の投与範囲を決定するためにこれらの最終的な効力試験の結果を使用する。
【０１７０】
実施例７：薬理学
Ａ．  カニクイザルにおけるＬＲ００４の薬物動態
パイロット薬物動態（ＰＫ）試験を小グループのオスカニクイザルにおいて表８に示されるように実施した。２匹のオスザルに１８ｍｇ／ｋｇの用量のＬＲ００４を１時間の静脈内点滴として投与した。２匹のサルからなる第２群に下の表８に記載されているように同様に１８ｍｇ／ｋｇの用量のアービタックス（登録商標）を投与した。投与後の２４日（５７７時間）のうちの表示されている時点で血液試料を採取し、血清試料を調製し、上に記載されたように検証済みＥＬＩＳＡによってＬＲ００４濃度またはアービタックス（登録商標）濃度について分析した。
【表８】
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【０１７１】
オスカニクイザルでは１８ｍｇ／ｍＬでの単回静脈内点滴の後にＬＲ００４とアービタックス（登録商標）のカイネティクスがほぼ同一であった。Ｃmax値はアービタックス（登録商標）およびＬＲ００４についてそれぞれ４０３〜４２３の範囲であり、１時間というＴmaxは１時間の点滴の最後に対応した。ＡＵＣレベルによって評価される曝露は実質的に同一であった（３０〜３２ｍｇ・時間／Ｌ）。半減期値も非常に類似しており、アービタックス（登録商標）およびＬＲ００４についてそれぞれ１３３〜１３７時間であった。図１１および表９に示されているように、ＬＲ００４は市販のアービタックス（登録商標）製品について既に確定されたカイネティクスと合致するカイネティクスを示した。
【表９】
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【０１７２】
Ｂ．  単回静脈内投与および反復静脈内投与によるサルにおけるＬＲ００４の薬物動態
性別毎に６匹のカニクイザルからなる群を表１０に示されるように１８ｍｇ／ｋｇ用量のアービタックス（登録商標）の単回投与または１日目、２１日目、２８日目および３５日目でのアービタックス（登録商標）の反復静脈内投与、または６ｍｇ／ｋｇ、１８ｍｇ／ｋｇもしくは５４ｍｇ／ｋｇの用量のＬＲ００４の単回投与または１日目、２１日目、２８日目および３５日目での１８ｍｇ／ｋｇの用量のＬＲ００４の反復静脈内投与のいずれかで処理した。６ｍｇ／ｋｇの用量で投与されたサルについては投与前、および０．３３時間、０．６７時間、１時間、２時間時間、３時間、５時間、９時間、１３時間、２５時間、４９時間、９７時間、１４５時間、１９３時間、２４１時間（１０日）の時点で、１８ｍｇ／ｋｇの用量での投与後は最大で１８日間にわたって、５４ｍｇ／ｋｇの用量での投与については最大で２８日間にわたって各動物から血液試料を採取し、血清試料を調製した。１８ｍｇ／ｋｇの用量でＬＲ００４またはアービタックス（登録商標）のどちらかを反復投与されたサルについて、表１０に提示されているように３５日目での最後の投与の後に血液試料を最大で２２日間（５２９時間）にわたって採取した。検証済みＥＬＩＳＡ法を用いてＬＲ００４またはアービタックス（登録商標）の濃度について血清試料をアッセイした。
【表１０】
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【０１７３】
オスおよびメスのカニクイザルへの６ｍｇ／ｋｇ、１８ｍｇ／ｋｇまたは５４ｍｇ／ｋｇの用量でのＬＲ００４の単回静脈内投与後にこの抗体について用量依存的血清曝露および一次血清中カイネティクスを観察した（図１２）。最大血清中濃度（Ｃmax）は６ｍｇ／ｋｇおよび５４ｍｇ／ｋｇの投与レベルについてそれぞれ１４８μｇ／ｍＬから９９２μｇ／ｍＬまでの範囲であった。観察されたＴmaxは３つ全ての投与レベルで約１時間であり、この実験で決定されたＬＲ００４の半減期は用量と共に増加し、６ｍｇ／ｋｇでの５１時間から１８ｍｇ／ｋｇでの９８時間、５４ｍｇ／ｋｇでの１１６時間までの範囲であった（表１１）。しかしながら、ＡＵＣ値によって決定される全体的曝露は比較的に用量に比例し、クリアランスは比較的に一定であり、且つ、０．７〜０．８ｍＬ／ｈｒ・ｋｇの範囲であった。１８ｍｇ／ｋｇの投与レベルについて観察されたこれらのパラメーターは、カニクイザルにおいてこの同じ投与レベルでアービタックス（登録商標）について決定されたパラメーターと一致した。
【表１１】
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【０１７４】
１８ｍｇ／ｋｇの用量でのＬＲ００４とアービタックス（登録商標）の両方の反復投与（１日目、２１日目、２８日目および３５日目での４回の投与）について、両方の抗体が一致したカイネティクスを示し、且つ、２１日目、２８日目および３５日目での投与直後には（ＬＲ００４の）ピーク血清中レベル（図１３）がわずかに高かったが、時間経過による著しい蓄積を示さなかった。
【０１７５】
これらの血清レベルは１８ｍｇ／ｋｇの用量のアービタックス（登録商標）での静脈内投与後に観察されたレベルと明確には異ならなかった。１回目の投与後の両方の化合物のカイネティクスの比較により、アービタックス（登録商標）と比べてわずかに高い分布容積（ＶD）とわずかに低いＣｍａｘおよびＡＵＣ(0~∞)しかＬＲ００４について示されなかった。しかしながら４回目の投与により、ＬＲ００４は４回目の投与後にアービタックス（登録商標）と比較してずっと高いＶDと長い半減期を示したが、ＣmaxおよびＡＵＣ値はそれら２つの製品の間で同等であった。この試験におけるＬＲ００４またはアービタックス（登録商標）の最初および最後（４回目）の投与についての薬物動態パラメーターが下の表１２に提示されている。
【表１２】
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【０１７６】
実施例８：ＬＲ００４炭水化物構造
Ａ．  逆相高速液体クロマトグラフィー
１１．５％（体積／体積）酢酸を使用し、８０℃で６０分間にわたって保温してＬＲ００４およびアービタックス（登録商標）の酸加水分解を実施した。０．６１９ｍｇ／ｍＬのＮＡＮＡおよび０．６５１ｍｇ／ｍＬのＮＧＮＡを含むストック溶液からシアル酸標準物質をＭｉｌｌｉ  Ｑ水中に調製した。ＤＭＢ（４，５−メチレンジオキシ−１，２−フェニレンジアミンジヒドロクロリド）標識反応を各試料につき三回実施した。１０または４０μＬ（タンパク質濃度に応じて０．３〜０．６μｇ）の酸加水分解タンパク質を２００μＬのＤＭＢ標識溶液（７ｍＭのＤＭＢ、１．４Ｍの酢酸、０．７５Ｍのβ−メルカプトエタノール、および１８ｍＭの亜ジチオン酸ナトリウム）と混合することで標識反応を５５℃で３時間にわたって実施した。１ｍＬのＭｉｌｌｉ  Ｑ水の中に５０μＬずつアリコットをとり、ボルテックスすることで反応を停止させた。タンパク質濃度に応じて２５〜１００μＬ（３〜９ｎｇ）を逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）分析用に注入した。
【０１７７】
０．５μｍプレカラムフィルター付きのＸｂｒｉｄｇｅ  ＨＰＬＣカラム、３．０ｍｍ×１００ｍｍ、３．５μｍを使用してＲＰ−ＨＰＬＣを実施した。蛍光検出器を３７３ｎｍの励起光および４４８ｎｍの放射光用に構成した。カラム温度は３０℃であり、オートサンプラーを４℃に設定した。移動相Ａは７％メタノール／９３％Ｍｉｌｌｉ  Ｑ水（体積／体積）であり、移動相Ｂは７％メタノール／５０％アセトニトリル／４３％Ｍｉｌｌｉ  Ｑ水であり、流速は０．４ｍＬ／分であり、濃度勾配は表１３に示されるものであった。
【表１３】
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【０１７８】
結果が図１４に示されている。図１４Ａはそれぞれ６分未満および６分超の時点に移動するＮＧＮＡ標準物質とＮＡＮＡ標準物質のピークを示している。図１４ＢはＮＡＮＡに対応する６分超の時点にあるＬＲ００４由来シアル酸の移動を示している。対照的にアービタックス（登録商標）由来シアル酸はＮＧＮＡに対応する６分未満の時点に移動する。
【０１７９】
Ｂ．  Ｎｅｕ５Ｇｃ（Ｎ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ））のＥＬＩＳＡ検出
アービタックス（登録商標）およびＬＲ００４を１００μｇ／ｍＬまで希釈し、２．５、５．５、および１０μｇ／ウェルの割合でマイクロタイタープレートに添加した。プレートを４℃で一晩にわたって被覆した。ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄し、２００μｌの０．５％ＰＢＳＴを使用して室温で１時間にわたってブロックした。ウェルを１：１０００のニワトリ抗Ｎｅｕ５Ｇｃ  ＩｇＹまたはＩｇＹアイソタイプ対照と共に室温で２時間にわたってインキュベートし、ＰＢＳＴで５回洗浄し、そして１：１０００ロバ抗ニワトリＩｇＹ−Ｆｃ−ＨＲＰと室温で１時間にわたってインキュベートした。洗浄後にＴＭＢ基質を使用してウェルを現像し、１０％のＨ2ＳＯ4を添加することで停止させた。吸光度を４５０ｎｍで測定した。
【表１４】
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【０１８０】
結果が表１４および図１５に示されている。アービタックス（登録商標）試料は陰性対照のレベルの１．８７〜１．９７倍のＮｅｕ５Ｇｃレベルを示した。対照的にＬＲ００４は陰性対照と同等のＮｅｕ５Ｇｃレベルを示した。
【０１８１】
実施例９：ＬＲ００４の熱安定性
示差走査熱量分析（ＤＳＣ）によってＬＲ００４の熱安定性を決定した。ＬＲ００４およびアービタックス（登録商標）を製剤緩衝液（１００ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのグリシン、０．０１％のポリソルベート８０、１０ｍＭのクエン酸、ｐＨ５．５）中に５ｍｇ／ｍｌの濃度で調製した。標準プロトコルを用いてＳＩＩセイコーＤＳＣ上でＤＳＣを実施した。全ての試料を分析前に５分間にわたって脱気した。参照セルを製剤緩衝液で充填した。試料を６０℃／時間の速度で４℃から１００℃まで加熱した。
【０１８２】
結果が図１６に示されている。図１６ＡはＬＲ００４が８８．８４℃の融点を有していることを示している。図１６Ｂはアービタックス（登録商標）が８５．２８℃の融点を有していることを示している。したがって、ＬＲ００４はアーブティックス（Ｅｒｂｕｔｉｘ）（登録商標）よりも高い程度の熱安定性を有する。
【０１８３】
同等物
本発明は本願において記載された特定の実施形態の面から限定されず、それらの実施形態は本発明の個々の態様の一つの例示として意図されている。当業者にとって明らかであるように、本発明の趣旨と範囲から逸脱することなく本発明の改変と変更を多数行うことができる。本明細書において列挙されたものに加え、本発明の範囲内にある機能的に同等の方法および装置が前述の説明から当業者に明らかである。そのような改変および変更は添付されている特許請求項の範囲に含まれるものとする。本発明は、添付されている特許請求の範囲に権利がある全範囲の同等物と共にそのような特許請求の範囲の面からのみ限定されるものとする。本発明は特定の方法、試薬、化合物  組成物、または生物系に限定されず、それらは当然変化し得ることが理解されるべきである。本明細書において使用された用語法は特定の実施形態を説明することだけを目的としており、限定を意図していないことも理解されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
2017515798.tif 000022
【図６−１】
2017515798.tif 000023
【図６−２】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
2017515798.tif 000028
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年10月21日(2016.10.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８２】
結果が図１６に示されている。図１６ＡはＬＲ００４が８８．８４℃の融点を有していることを示している。図１６Ｂはアービタックス（登録商標）が８５．２８℃の融点を有していることを示している。したがって、ＬＲ００４はアーブティックス（Ｅｒｂｕｔｉｘ）（登録商標）よりも高い程度の熱安定性を有する。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕表２に示されているアミノ酸配列を備える抗体。
〔２〕前記抗体がＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）を含み、ガラクトース−α−１，３−ガラクトースを欠いている、前記〔１〕に記載の抗体。
〔３〕前記抗体が検出可能マーカーに結合している、前記〔１〕に記載の抗体。
〔４〕前記検出可能マーカーが放射性核種を含む、前記〔３〕に記載の抗体。
〔５〕前記検出可能マーカーが蛍光標識を含む、前記〔３〕に記載の抗体。
〔６〕前記抗体が１種類以上の追加治療薬に結合している、前記〔１〕に記載の抗体。
〔７〕前記１種類以上の追加治療薬が化学療法剤を含む、前記〔６〕に記載の抗体。
〔８〕前記化学療法剤がビンカアルカロイド、微小管破壊剤、血管新生阻害剤、治療用抗体、ＥＧＦＲ標的化薬剤、チロシンキナーゼ標的化薬剤、遷移金属錯体、プロテアソーム阻害剤、代謝拮抗剤  アルキル化剤、プラチナ系薬剤、アントラサイクリン抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、マクロライド、レチノイド、ゲルダナマイシンまたはその誘導体、アドリアマイシン、コルヒチン、シクロホスファミド、アクチノマイシン、ブレオマイシン、ヅアノルビシン（ｄｕａｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドキソルビシン、エピルビシン、マイトマイシン、メトトレキサート、ミトキサントロン、フルオロウラシル、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、メチル−ＣＣＮＵ、シスプラチン、エトポシド、インターフェロン、カンプトテシンおよびその誘導体、フェネステリン、タキサン類およびそれらの誘導体、トペテカン（ｔｏｐｅｔｅｃａｎ）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、タモキシフェン、ピポスルファン、ｎａｂ−５４０４、ｎａｂ−５８００、ｎａｂ−５８０１、イリノテカン、ＨＫＰ、オルタタキセル、ゲムシタビン、オキサリプラチン、ハーセプチン（登録商標）、ビノレルビン、ドキシル（登録商標）、カペシタビン、アリムタ（登録商標）、アバスチン（登録商標）、ベルケイド（登録商標）、タルセバ（登録商標）、ニューラスタ（Ｎｅｕｌａｓｔａ）（登録商標）、ラパチニブ、ソラフェニブ、およびエルロチニブからなる群より選択される、前記〔７〕に記載の抗体。
〔９〕前記〔１〕に記載の抗体および薬学的に許容可能な担体または賦形剤を含む組成物。
〔１０〕ビンカアルカロイド、微小管破壊剤、血管新生阻害剤、治療用抗体、ＥＧＦＲ標的化薬剤、チロシンキナーゼ標的化薬剤、遷移金属錯体、プロテアソーム阻害剤、代謝拮抗剤  アルキル化剤、プラチナ系薬剤、アントラサイクリン抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、マクロライド、レチノイド、ゲルダナマイシンまたはその誘導体、アドリアマイシン、コルヒチン、シクロホスファミド、アクチノマイシン、ブレオマイシン、ヅアノルビシン（ｄｕａｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドキソルビシン、エピルビシン、マイトマイシン、メトトレキサート、ミトキサントロン、フルオロウラシル、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、メチル−ＣＣＮＵ、シスプラチン、エトポシド、インターフェロン、カンプトテシンおよびその誘導体、フェネステリン、タキサン類およびそれらの誘導体、トペテカン（ｔｏｐｅｔｅｃａｎ）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、タモキシフェン、ピポスルファン、ｎａｂ−５４０４、ｎａｂ−５８００、ｎａｂ−５８０１、イリノテカン、ＨＫＰ、オルタタキセル、ゲムシタビン、オキサリプラチン、ハーセプチン（登録商標）、ビノレルビン、ドキシル（登録商標）、カペシタビン、アリムタ（登録商標）、アバスチン（登録商標）、ベルケイド（登録商標）、タルセバ（登録商標）、ニューラスタ（Ｎｅｕｌａｓｔａ）（登録商標）、ラパチニブ、ソラフェニブ、およびエルロチニブからなる群より選択される化学療法剤をさらに含む前記〔９〕に記載の組成物。
〔１１〕前記〔１〕に記載の抗体をコードする核酸を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞。
〔１２〕前記核酸がＣＨＯ細胞ゲノムから分離している複製可能ベクター上に存在する、前記〔１１〕に記載のＣＨＯ細胞。
〔１３〕前記核酸がＣＨＯ細胞ゲノム中に安定的に組み込まれている、前記〔１１〕に記載のＣＨＯ細胞。
〔１４〕必要とする対象において癌を治療するための方法であって、前記〔１〕に記載の抗体を前記対象に投与することを含む前記方法。
〔１５〕ビンカアルカロイド、微小管破壊剤、血管新生阻害剤、治療用抗体、ＥＧＦＲ標的化薬剤、チロシンキナーゼ標的化薬剤、遷移金属錯体、プロテアソーム阻害剤、代謝拮抗剤  アルキル化剤、プラチナ系薬剤、アントラサイクリン抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、マクロライド、レチノイド、ゲルダナマイシンまたはその誘導体、アドリアマイシン、コルヒチン、シクロホスファミド、アクチノマイシン、ブレオマイシン、ヅアノルビシン（ｄｕａｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドキソルビシン、エピルビシン、マイトマイシン、メトトレキサート、ミトキサントロン、フルオロウラシル、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、メチル−ＣＣＮＵ、シスプラチン、エトポシド、インターフェロン、カンプトテシンおよびその誘導体、フェネステリン、タキサン類およびそれらの誘導体、トペテカン（ｔｏｐｅｔｅｃａｎ）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、タモキシフェン、ピポスルファン、ｎａｂ−５４０４、ｎａｂ−５８００、ｎａｂ−５８０１、イリノテカン、ＨＫＰ、オルタタキセル、ゲムシタビン、オキサリプラチン、ハーセプチン（登録商標）、ビノレルビン、ドキシル（登録商標）、カペシタビン、アリムタ（登録商標）、アバスチン（登録商標）、ベルケイド（登録商標）、タルセバ（登録商標）、ニューラスタ（Ｎｅｕｌａｓｔａ）（登録商標）、ラパチニブ、ソラフェニブ、およびエルロチニブからなる群より選択される１種類以上の追加治療薬を投与することをさらに含む前記〔１４〕に記載の方法。
〔１６〕前記抗体が１種類以上の追加治療薬に結合している、前記〔１４〕に記載の方法。
〔１７〕前記１種類以上の追加治療薬が化学療法剤を含む、前記〔１４〕に記載の方法。
〔１８〕前記化学療法剤がビンカアルカロイド、微小管破壊剤、血管新生阻害剤、治療用抗体、ＥＧＦＲ標的化薬剤、チロシンキナーゼ標的化薬剤、遷移金属錯体、プロテアソーム阻害剤、代謝拮抗剤  アルキル化剤、プラチナ系薬剤、アントラサイクリン抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、マクロライド、レチノイド、ゲルダナマイシンまたはその誘導体、アドリアマイシン、コルヒチン、シクロホスファミド、アクチノマイシン、ブレオマイシン、ヅアノルビシン（ｄｕａｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドキソルビシン、エピルビシン、マイトマイシン、メトトレキサート、ミトキサントロン、フルオロウラシル、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、メチル−ＣＣＮＵ、シスプラチン、エトポシド、インターフェロン、カンプトテシンおよびその誘導体、フェネステリン、タキサン類およびそれらの誘導体、トペテカン（ｔｏｐｅｔｅｃａｎ）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、タモキシフェン、ピポスルファン、ｎａｂ−５４０４、ｎａｂ−５８００、ｎａｂ−５８０１、イリノテカン、ＨＫＰ、オルタタキセル、ゲムシタビン、オキサリプラチン、ハーセプチン（登録商標）、ビノレルビン、ドキシル（登録商標）、カペシタビン、アリムタ（登録商標）、アバスチン（登録商標）、ベルケイド（登録商標）、タルセバ（登録商標）、ニューラスタ（Ｎｅｕｌａｓｔａ）（登録商標）、ラパチニブ、ソラフェニブ、およびエルロチニブからなる群より選択される、前記〔１４〕に記載の方法。
〔１９〕前記対象が陰性対照試料と比較して上昇した抗セツキシマブＩｇＥレベルを有する、前記〔１４〕に記載の方法。
〔２０〕前記対象が陰性対照試料と比較して上昇した抗ガラクトース−α−１，３−ガラクトースＩｇＥレベルを有する、前記〔１４〕に記載の方法。
〔２１〕前記対象がセツキシマブに対して過敏性であるか、またはセツキシマブに対する過敏性反応を有しやすいか決定することをさらに含む前記〔１４〕に記載の方法。
〔２２〕前記対象の血清試料中の抗セツキシマブＩｇＥまたは抗ガラクトース−α−１，３−ガラクトースＩｇＥの存在を測定することが決定に含まれ、陰性対照試料と比較して上昇した抗セツキシマブＩｇＥレベルまたは抗ガラクトース−α−１，３−ガラクトースＩｇＥレベルによって前記対象がセツキシマブに対して過敏性であること、またはセツキシマブに対する過敏性反応を有しやすいことが示される、前記〔２１〕に記載の方法。
〔２３〕酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）の使用が測定に含まれる、前記〔２２〕に記載の方法。
〔２４〕前記〔１〕に記載の抗体を作製する方法であって、表２に示されているアミノ酸配列をコードする核酸とチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を接触させることを含む前記方法。
〔２５〕前記核酸が前記ＣＨＯ細胞のゲノム中に安定的に組み込まれている、前記〔２４〕に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１および配列番号２に示されているアミノ酸配列を備える抗体。
【請求項２】
前記抗体がＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）を含み、ガラクトース−α−１，３−ガラクトースを欠いている、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
配列番号１および配列番号２に示されているアミノ酸配列を備える抗体を含む組成物。
【請求項４】
ビンカアルカロイド、微小管破壊剤、血管新生阻害剤、治療用抗体、ＥＧＦＲ標的化薬剤、チロシンキナーゼ標的化薬剤、遷移金属錯体、プロテアソーム阻害剤、代謝拮抗剤  アルキル化剤、プラチナ系薬剤、アントラサイクリン抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、マクロライド、レチノイド、ゲルダナマイシンまたはその誘導体、アドリアマイシン、コルヒチン、シクロホスファミド、アクチノマイシン、ブレオマイシン、ヅアノルビシン（ｄｕａｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドキソルビシン、エピルビシン、マイトマイシン、メトトレキサート、ミトキサントロン、フルオロウラシル、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、メチル−ＣＣＮＵ、シスプラチン、エトポシド、インターフェロン、カンプトテシンおよびその誘導体、フェネステリン、タキサン類およびそれらの誘導体、トペテカン（ｔｏｐｅｔｅｃａｎ）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、タモキシフェン、ピポスルファン、ｎａｂ−５４０４、ｎａｂ−５８００、ｎａｂ−５８０１、イリノテカン、ＨＫＰ、オルタタキセル、ゲムシタビン、オキサリプラチン、ハーセプチン（登録商標）、ビノレルビン、ドキシル（登録商標）、カペシタビン、アリムタ（登録商標）、アバスチン（登録商標）、ベルケイド（登録商標）、タルセバ（登録商標）、ニューラスタ（Ｎｅｕｌａｓｔａ）（登録商標）、ラパチニブ、ソラフェニブ、およびエルロチニブからなる群より選択される化学療法剤をさらに含む請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
請求項１に記載の抗体をコードする核酸を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞であって、前記核酸が、ＣＨＯ細胞ゲノムから分離している複製可能ベクター上に存在するか、又は、ＣＨＯ細胞ゲノム中に安定的に組み込まれている、細胞。
【請求項６】
必要とする対象において癌を治療するための、請求項３又は４に記載の組成物。
【請求項７】
前記治療が、ビンカアルカロイド、微小管破壊剤、血管新生阻害剤、治療用抗体、ＥＧＦＲ標的化薬剤、チロシンキナーゼ標的化薬剤、遷移金属錯体、プロテアソーム阻害剤、代謝拮抗剤  アルキル化剤、プラチナ系薬剤、アントラサイクリン抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、マクロライド、レチノイド、ゲルダナマイシンまたはその誘導体、アドリアマイシン、コルヒチン、シクロホスファミド、アクチノマイシン、ブレオマイシン、ヅアノルビシン（ｄｕａｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドキソルビシン、エピルビシン、マイトマイシン、メトトレキサート、ミトキサントロン、フルオロウラシル、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、メチル−ＣＣＮＵ、シスプラチン、エトポシド、インターフェロン、カンプトテシンおよびその誘導体、フェネステリン、タキサン類およびそれらの誘導体、トペテカン（ｔｏｐｅｔｅｃａｎ）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、タモキシフェン、ピポスルファン、ｎａｂ−５４０４、ｎａｂ−５８００、ｎａｂ−５８０１、イリノテカン、ＨＫＰ、オルタタキセル、ゲムシタビン、オキサリプラチン、ハーセプチン（登録商標）、ビノレルビン、ドキシル（登録商標）、カペシタビン、アリムタ（登録商標）、アバスチン（登録商標）、ベルケイド（登録商標）、タルセバ（登録商標）、ニューラスタ（Ｎｅｕｌａｓｔａ）（登録商標）、ラパチニブ、ソラフェニブ、およびエルロチニブからなる群より選択される１種類以上の治療薬を投与することをさらに含む請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記抗体が放射性核種又は蛍光標識に結合しているか、又は、前記抗体が１種類以上の追加治療薬に結合している、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
放射性核種又は蛍光標識に結合しているか、又は、１種類以上の追加治療薬に結合している、請求項１に記載の抗体。
【請求項１０】
前記治療薬がビンカアルカロイド、微小管破壊剤、血管新生阻害剤、治療用抗体、ＥＧＦＲ標的化薬剤、チロシンキナーゼ標的化薬剤、遷移金属錯体、プロテアソーム阻害剤、代謝拮抗剤  アルキル化剤、プラチナ系薬剤、アントラサイクリン抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、マクロライド、レチノイド、ゲルダナマイシンまたはその誘導体、アドリアマイシン、コルヒチン、シクロホスファミド、アクチノマイシン、ブレオマイシン、ヅアノルビシン（ｄｕａｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドキソルビシン、エピルビシン、マイトマイシン、メトトレキサート、ミトキサントロン、フルオロウラシル、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、メチル−ＣＣＮＵ、シスプラチン、エトポシド、インターフェロン、カンプトテシンおよびその誘導体、フェネステリン、タキサン類およびそれらの誘導体、トペテカン（ｔｏｐｅｔｅｃａｎ）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、タモキシフェン、ピポスルファン、ｎａｂ−５４０４、ｎａｂ−５８００、ｎａｂ−５８０１、イリノテカン、ＨＫＰ、オルタタキセル、ゲムシタビン、オキサリプラチン、ハーセプチン（登録商標）、ビノレルビン、ドキシル（登録商標）、カペシタビン、アリムタ（登録商標）、アバスチン（登録商標）、ベルケイド（登録商標）、タルセバ（登録商標）、ニューラスタ（Ｎｅｕｌａｓｔａ）（登録商標）、ラパチニブ、ソラフェニブ、およびエルロチニブからなる群より選択される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
前記対象が（a）陰性対照試料と比較して上昇した抗セツキシマブレベルを有するか、（ｂ）陰性対照試料と比較して上昇した抗ガラクトース−α−１，３−ガラクトースＩｇＥレベルを有するか、（ｃ）セツキシマブに対して過敏性であるか、または（ｄ）セツキシマブに対する過敏性反応を有しやすい、請求項６に記載の組成物。
【国際調査報告】
2017515798.tif 000038
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