(57)【要約】  生体試料からエキソソームを単離する方法を提供する。該方法は、ｉ）生体試料に対して第１の遠心分離を行って該試料から約７〜１０ミクロンより大きい細胞残屑を除去し、その後上清を得る工程、ｉｉ）工程ｉ）で得られた上清に対して遠心分離を行い、該上清から微小小胞体を除去する工程、ｉｉｉ）工程ｉｉ）で得られた上清を精密ろ過し、精密ろ過により得られた上清を回収する工程、ｉｖ）精密ろ過により工程ｉｉｉ）で得られた上清に対して超遠心分離を少なくとも１回行い、エキソソームペレットを得る工程、およびｖ）工程ｉｖ）で得られたエキソソームペレットを生理的溶液に再懸濁し、密度勾配を用いた第２の超遠心分離を行い、エキソソームペレット画分を分離する工程を含む。上記方法により、有利なことに、完全性と安定性が維持された、本質的に混入粒子のないエキソソームが得られる。
2017526388.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料からエキソソームを単離する方法であって、
ｉ）生体試料に対して第１の遠心分離を行って該試料から約７〜１０ミクロンより大きい細胞残屑を除去し、その後上清を得る工程、
ｉｉ）工程ｉ）で得られた上清に対して遠心分離を行い、該上清から微小小胞体を除去する工程、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で得られた上清を精密ろ過し、精密ろ過により得られた上清を回収する工程、
ｉｖ）精密ろ過により工程ｉｉｉ）で得られた上清に対して超遠心分離を少なくとも１回行い、エキソソームペレットを得る工程、および
ｖ）工程ｉｖ）で得られたエキソソームペレットを生理的溶液に再懸濁し、密度勾配を用いた第２の超遠心分離を行い、エキソソームペレット画分を分離する工程
を含む方法。
【請求項２】
工程ｉｉ）が、４０，０００〜６０，０００×ｇの速度で３０〜９０分間の遠心分離を行うことを含む、請求項１の方法。
【請求項３】
前記遠心分離を５０，０００×ｇの速度で１時間行う、請求項２の方法。
【請求項４】
工程ｉｉ）が、上清に対して第２の遠心分離を１２，０００〜１５，０００×ｇの速度で３０〜９０分間行うことを含み、得られた上清に対して第３の遠心分離を４０，０００〜６０，０００×ｇの速度で３０〜９０分間行う、請求項１の方法。
【請求項５】
第２の遠心分離を、１４，０００×ｇの速度で１時間行い、第３の遠心分離を、５０，０００×ｇの速度で１時間行う、請求項４の方法。
【請求項６】
第１の遠心分離を、１０００〜４０００×ｇの速度で１０〜６０分間行い、さらに任意選択で、この第１の遠心分離を繰り返し行う、請求項１の方法。
【請求項７】
工程ｉｉｉ）の上清を、０．２〜１０ミクロンのフィルター、好ましくは０．２２ミクロンのフィルターを用いて少なくとも１回精密ろ過する、請求項１の方法。
【請求項８】
工程ｉｖ）の超遠心分離を、１１０，０００〜１７０，０００×ｇの速度で１〜３時間行い、得られたペレットを生理的溶液に懸濁し、さらに任意選択で、超遠心分離を同じ速度で繰り返し行う、請求項１の方法。
【請求項９】
工程ｖ）の第２の超遠心分離を、ショ糖密度勾配、コロイドシリカ密度勾配およびイオジキサノール勾配から選択される密度勾配を用いて、１１０，０００〜１７０，０００×ｇの速度で１〜３時間行う、請求項１の方法。
【請求項１０】
３０％／７０％（ｖ／ｖ）コロイドシリカ密度勾配を用いる、請求項９の方法。
【請求項１１】
工程ｖ）のエキソソームペレット画分を、生理的溶液に再懸濁して、超遠心分離を１１０，０００〜１７０，０００×ｇの速度で１〜３時間行い、さらに任意選択で、得られたペレットに対して超遠心分離を１回または２回繰り返し行う、請求項１０の方法。
【請求項１２】
前記ペレットを生理的溶液に懸濁する、請求項１の方法。
【請求項１３】
生体試料からエキソソームを単離する方法であって、
ｉ）生体試料に対して第１の遠心分離を１０００〜４０００×ｇの速度で１０〜６０分間行い、さらに任意選択で、この第１の遠心分離を繰り返し行う工程、
ｉｉ）工程ｉ）で得られた上清に対して第２の遠心分離を１２，０００〜１５，０００×ｇの速度で３０〜９０分間行う工程、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で得られた上清に対して第３の遠心分離を４０，０００〜６０，０００×ｇの速度で３０〜９０分間行う工程、
ｉｖ）工程ｉｉｉ）で得られた上清を０．２〜１０ミクロンのフィルターで精密ろ過して、精密ろ過により得られた上清を回収する工程、
ｖ）精密ろ過により工程ｉｖ）で得られた上清に対して超遠心分離を１１０，０００〜１７０，０００×ｇの速度で１〜３時間少なくとも１回行い、ペレットを得る工程、
ｖｉ）任意選択で、工程ｖ）で得られたペレットを再懸濁し、工程ｖ）の超遠心分離を繰り返し行う工程、
ｖｉｉ）工程ｉｖ）で得られたペレットを生理的溶液に再懸濁し、超遠心分離を、ショ糖密度勾配およびコロイドシリカ密度勾配から選択される密度勾配を用いて、１１０，０００〜１７０，０００×ｇの速度で１〜３時間行い、エキソソームペレット画分を得る工程、および
ｖｉｉｉ）工程ｖ）のエキソソームペレット画分を生理的溶液に再懸濁し、工程ｖ）でコロイドシリカ密度勾配を用いた場合は、得られた溶液に対して超遠心分離を１１０，０００〜１７０，０００×ｇの速度で１〜３時間行い、さらに任意選択で、得られたペレットに対して超遠心分離を１回または２回繰り返し行う工程
を含む方法。
【請求項１４】
直径が２０ｎｍ未満の粒子および１２０ｎｍより大きい粒子が本質的に排除されているエキソソームを含むエキソソームペレット、または該エキソソームペレットが再懸濁された生理的溶液。
【請求項１５】
前記エキソソームのゼータ電位が少なくとも約３０ｍＶ、好ましくは４０ｍＶ以上の大きさである、請求項１４のペレットまたは溶液。
【請求項１６】
エキソソームタンパク質の含量が約１００〜２０００μｇである、請求項１４のペレットまたは溶液。
【請求項１７】
前記エキソソームに外因性のカーゴが充填されている、請求項１４のペレットまたは溶液。
【請求項１８】
前記外因性のカーゴが、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、アプタマー、ｍｉＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、リボザイム、糖、治療用化合物、低分子およびポリマーからなる群から選択される、請求項１７のペレットまたは溶液。
【請求項１９】
前記カーゴが、二次構造を含むカーゴまたは２０塩基対を超えるサイズのカーゴである、請求項１７のペレットまたは溶液。
【請求項２０】
請求項１の方法の工程を含む使用説明書を含み、さらに請求項１の方法の実施に有用な溶液または器具を１以上含む、請求項１の方法の実施に使用するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全体としてエキソソームに関し、より詳細には生体試料からエキソソームを単離する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物体において、組織や細胞は、周囲の微小環境に最適化できるように、常に互いに連絡を取り合う必要がある。細胞間や組織間のシグナル伝達としては、これまでに、酵素、ホルモン、サイトカイン、ケモカインなどのタンパク質によるシグナル伝達系が報告されている。しかし、多くのペプチドは、循環環境に晒されて存在し続けることは不可能である。さらに、ｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡはいずれも細胞外の環境においては極めて不安定であり、組織間や臓器間の輸送にはこれらを内包するものが必要である。したがって、これらの因子は、エキソソーム、微小小胞体およびアポトーシス小体などの小さい二重膜の細胞外小胞（ＥＣＶ）に内包された状態で分泌される。これらの小胞は、その由来となる細胞内の場所によって、構造的特性および生化学的特性がそれぞれ異なっており、小胞の構造的特性および生化学的特性は、生体内システムにおける各小胞の機能および役割に影響を与えている。例えば、エキソソームは、概して均一な集団であり、その大きさは約４０〜１２０ｎｍである。一方、微小小胞体およびアポトーシス小体は外形が不揃いであり、その大きさは、微小小胞体で１００ｎｍから１０００ｎｍであり、アポトーシス小体では１０００ｎｍを超える。これらのＥＣＶはいずれも、タンパク質、生体脂質、核酸などの様々な生物活性分子を含有しており、細胞同士が直接接触することなく、これらの物質が細胞間で輸送される。したがって、ＥＣＶは、細胞間のコミュニケーションの一形態であり、生理的プロセスおよび病的プロセスの双方に関与している可能性がある。実際、体内循環するＥＣＶが、がん、炎症、自己免疫疾患および心疾患の発症に関与することを示す知見が増えてきている。
【０００３】
エキソソーム関連のシグナル伝達および生物学は、様々な病的状態や疾患バイオマーカーの創出との関わりという面から、この１０年の間に広く研究が進められてきた。しかし、細胞代謝や臓器間クロストークの促進におけるエキソソームの生理的な役割を明らかにしようとする研究は少ない。エキソソーム研究が進まない主な原因の１つは、エキソソームの標準的または機能的な単離方法が欠如していることである。多くの単離方法が公開されているが、これらの方法では、生化学的分析やその他の様々な用途（治療用ペイロード（タンパク質、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）の送達などを含む）に必要な十分な量と質を備えた精製エキソソーム集団を得ることはできない。さらに、超遠心分離やろ過を必要としない方法がキットの形態で商業化されているが、この方法は、純粋なエキソソーム画分を単離する能力および／または生物学的評価もしくは治療用送達に必要な十分な質を備えたエキソソームを単離する能力において大きな欠点がある。
【０００４】
したがって、研究目的で生体試料からエキソソームを単離するための改良された方法を提供すること、および／または診断もしくは治療において使用するためのエキソソームを開発することができれば望ましい。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書に記載の通り、今般、新規のエキソソーム単離方法が開発された。
【０００６】
したがって、本発明の第１の態様において、生体試料からエキソソームを単離する方法が提供される。該方法は、
ｉ）生体試料に対して第１の遠心分離を行って該試料から約７〜１０ミクロンより大きい細胞残屑を除去し、その後上清を得る工程、
ｉｉ）工程ｉ）で得られた上清に対して遠心分離を行い、該上清から微小小胞体を除去する工程、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で得られた上清を精密ろ過し、精密ろ過により得られた上清を回収する工程、
ｉｖ）精密ろ過により工程ｉｉｉ）で得られた上清に対して超遠心分離を少なくとも１回行い、エキソソームペレットを得る工程、および
ｖ）工程ｉｖ）で得られたエキソソームペレットを生理的溶液に再懸濁し、密度勾配を用いた第２の超遠心分離を行い、エキソソームペレット画分を分離する工程
を含む。
【０００７】
本発明の別の一態様において、直径が２０ｎｍ未満の粒子および１２０ｎｍより大きい粒子が本質的に排除されているエキソソームを含むエキソソームペレット、または該エキソソームペレットが再懸濁されたエキソソームを含む溶液が提供される。
【０００８】
本発明の別の一態様において、直径が４０〜１２０ｎｍより大きい粒子および４０〜１２０ｎｍ未満の粒子が本質的に排除されているエキソソームを含む組成物であって、前記エキソソームに外因性のカーゴが充填されている組成物が提供される。
【０００９】
本発明のさらなる一態様において、生体試料からエキソソームを単離するための本明細書に記載の方法を実施するのに有用なキットが提供される。
【００１０】
本発明におけるこれらの態様およびその他の態様は、下記の詳細な説明において以下の図面を参照することにより明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の一実施形態における方法を用いて、ヒト（Ａ）およびマウス（Ｂ）の試料から得られたエキソソームのサイズを示したグラフである。
【００１２】
【図２】トウモロコシ外皮（Ａ）およびザクロ種子（Ｂ）から単離したエキソソームのサイズを示したグラフである。
【００１３】
【図３】本発明の単離方法をスケールアップした一実施形態における、エキソソームのサイズ（Ａ）およびゼータ電位（Ｂ）を示したグラフである。
【００１４】
【図４】本発明の単離方法をスケールアップした一実施形態における、エキソソームタンパク質の収量を示したグラフである。
【００１５】
【図５】市販のエキソソーム単離キットを用いて単離した精製物（Ａ）および本発明の一態様における単離方法を用いて得られたエキソソーム精製物（Ｂ）の電子顕微鏡による観察結果を示した図である。
【００１６】
【図６】市販の単離キット（Ｓ１〜６）を用いて得られたエキソソームの濃度およびＢＳＡ標準液との比較において、本発明の一態様による単離方法（ＥＸ１〜６）を用いて得られたエキソソームの濃度を示した比色分析画像（Ａ）およびグラフ（Ｂ）である。
【００１７】
【図７】別のエキソソーム単離方法（ＡおよびＢ）を用いて試料から単離したエキソソームのサイズ（直径：単位ｎｍ）を示したグラフである。
【００１８】
【図８】ＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡをトランスフェクション試薬と共に送達した場合と、先行技術による方法で単離したエキソソームを用いて送達した場合の試料中のＧＡＰＤＨ発現レベルを比較したグラフである。
【００１９】
【図９】ＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡをトランスフェクション試薬と共に送達した場合と、本発明の一実施形態により単離したエキソソームを用いて送達した場合の試料中のＧＡＰＤＨ発現レベルを比較したグラフである。
【００２０】
【図１０】本発明の一実施形態により単離したエキソソームと、先行技術による別の単離方法で単離したエキソソームによる、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡおよびペプチドの取り込みを比較したグラフである。
【００２１】
【図１１】本発明の一実施形態で単離したエキソソームを投与したマウスの生存率と、先行技術による別の単離方法で単離したエキソソームを投与したマウスの生存率とを比較したグラフである。
【００２２】
【図１２】ｍｏｄＲＮＡ−Ｖｅｇｆａ（Ａ）、ｍｏｄＲＮＡ−Ｖｅｇｆａ充填エキソソーム（ＡおよびＢ）およびｍＲＮＡ−Ｖｅｇｆａ充填エキソソーム（Ｂ）をそれぞれ心筋細胞に送達した場合のＶＥＧＦ−ａの発現レベルを比較したグラフである。
【００２３】
【図１３】エキソソームの体内分布を経時的に比較したグラフである。
【００２４】
【図１４】市販のキットを用いて単離したＳＥＤエキソソームおよびＥＮＤエキソソームの生物活性と、本発明の一態様における方法を用いて単離したＳＥＤエキソソームおよびＥＮＤエキソソームの生物活性とを比較したグラフである。
【００２５】
【図１５】本発明の一態様における方法を用いて単離したＳＥＤエキソソームまたはＥＮＤエキソソームを投与した運動量の少ない（ＳＥＤ）マウス、ならびにコントロールのＳＥＤマウスおよびＥＮＤマウスを用いて行った活動持久力試験の結果を比較したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
生体試料からエキソソームを単離する新規の方法を提供する。該方法は、
ｉ）生体試料に対して第１の遠心分離を行って該試料から約７〜１０ミクロンより大きい細胞残屑を除去し、その後上清を得る工程、
ｉｉ）工程ｉ）で得られた上清に対して遠心分離を行い、該上清から微小小胞体およびアポトーシス小体を除去する工程、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で得られた上清を精密ろ過し、精密ろ過により得られた上清を回収する工程、
ｉｖ）精密ろ過により工程ｉｉｉ）で得られた上清に対して超遠心分離を少なくとも１回行い、エキソソームペレットを得る工程、および
ｖ）工程ｉｖ）で得られたエキソソームペレットを生理的溶液に再懸濁し、密度勾配を用いた第２の超遠心分離を行い、エキソソームペレット画分を分離する工程
を含む。
【００２７】
「エキソソーム」という用語は、直径が約４０〜１２０ｎｍ、好ましくは約５０〜１００ｎｍ、例えば約６０ｎｍ、約７０ｎｍ、約８０ｎｍ、約９０ｎｍまたは約１００ｎｍである、細胞由来の小胞を意味する。エキソソームは、哺乳動物の任意の適当な生体試料から単離することが可能であり、生体試料としては、全血、血清、血漿、尿、唾液、母乳、脳脊髄液、羊水、腹水、骨髄および哺乳動物培養細胞（例えば、（野生型または不死化）未熟樹状細胞、誘導多能性幹細胞、非誘導多能性幹細胞、線維芽細胞、血小板、免疫細胞、網状赤血球、腫瘍細胞、間葉系幹細胞、衛星細胞、造血幹細胞、膵臓幹細胞、白色前駆脂肪細胞、ベージュ前駆脂肪細胞など）が挙げられるが、これらに限定されない。当業者であれば、培養細胞試料は、各細胞に適した培地（エキソソーム非含有血清を使用）中で維持されることは十分に理解できるだろう。エキソソームは、他の小胞とは異なる特定の表面マーカーを含有する。表面マーカーとしては、例えばＣＤ９、ＣＤ３７、ＣＤ４４、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ１５１などのテトラスパニン；インテグリン、ＩＣＡＭ−１、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３１などの標的マーカーまたは接着マーカー；およびアネキシン、ＴＳＧ１０１、ＡＬＩＸなどの膜融合マーカーが挙げられ、さらに、Ｒａｂ５ｂ、ＨＬＡ−Ｇ、ＨＳＰ７０、ＬＡＭＰ２（リソソーム関連膜タンパク質）およびＬＩＭＰ（リソソーム内在性膜タンパク質）などのその他のエキソソーム膜貫通型タンパク質なども挙げられる。エキソソームは、非哺乳動物または非哺乳動物の培養細胞から得ることもできる。エキソソームの生合成に関与する分子機構は進化的に保存されていると考えられているので、非哺乳動物から得られたエキソソームは、表面マーカーとして、哺乳動物の表面マーカーのアイソフォーム、例えば、ＣＤ９のアイソフォームやＣＤ６３のアイソフォーム（ＣＤ９とＣＤ６３によってエキソソームと他の細胞由来小胞とを区別することができる）などを有する。本明細書における「哺乳動物」という用語は、以下に限定されないが、ヒトや、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギなどの家畜に加えて、マウス、ラット、ウサギ（これらに限定されない）などの非家畜動物も包含することを意図するものである。「非哺乳動物」という用語は、例えば、細菌などの微生物、ハエ類、蠕虫類、植物、果物／野菜（例えば、トウモロコシ、ザクロなど）、酵母などから得られたエキソソームを包含することを意図するものである。
【００２８】
本発明の一態様において、生体試料からエキソソームを単離する方法は、生体試料から不要な大きい細胞残屑、すなわち、約７〜１０ミクロンより大きい細胞、細胞成分、アポトーシス小体などを除去する第１の工程を含む。この工程は、通常遠心分離によって行われる。例えば、４℃、１０００〜４０００×ｇで１０〜６０分間の遠心分離、好ましくは１５００〜２５００×ｇ、例えば２０００×ｇで、１０〜３０分、１２〜２８分、１４〜２４分、１５〜２０分、１６分、１７分、１８分および１９分から選択される時間の遠心分離を行う。当業者であれば、この単離工程が、市販の適当な実験室用遠心機（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）製、Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ（登録商標）製など）を用いて行われることは十分に理解できるだろう。エキソソームを高純度で単離するために、必要に応じて、得られた上清に対して第２の遠心分離工程を行い、細胞残屑およびアポトーシス小体（少なくとも約７〜１０ミクロンのサイズの残屑など）をさらに除去してもよい。この工程は、本発明の方法の第１工程、すなわち、４℃、１０００〜４０００×ｇで１０〜６０分間、好ましくは１５００〜２５００×ｇ、例えば２０００×ｇで、選択した特定の時間行う遠心分離を繰り返すことにより行われる。
【００２９】
細胞残屑を分離した後、第１の遠心分離工程を１回以上実施して得られた上清を、残屑を含むペレットから（デカントまたはピペットを用いた吸引によって）分離し、次いで、必要に応じて追加の（第２の）遠心分離工程、すなわち、４℃、１２，０００〜１５，０００×ｇで３０〜９０分間の遠心操作を含む工程を行って、中型サイズの残屑（例えば６ミクロンより大きい残屑）を除去してもよい。一実施形態において、この遠心分離工程は、４℃、１４，０００×ｇで１時間行われる。得られた上清は、再度、残屑を含むペレットから分離する。
【００３０】
得られた上清を回収し、第３の遠心分離工程、すなわち、４℃、４０，０００〜６０，０００×ｇで３０〜９０分間の遠心操作を含む工程を行って、０．３ミクロンより大きい（例えば、約０．３〜６ミクロン）小〜中型の微小小胞体などの夾雑物をさらに除去する。一実施形態において、この遠心分離工程は、５０，０００×ｇで１時間行われる。得られた上清をペレットから分離してさらなる処理に供する。
【００３１】
次いで、この上清をろ過、例えば、精密ろ過して、細菌類およびより大きい微小小胞体などの約０．２２ミクロン以上の残屑を除去する。ろ過は、同じポアサイズのフィルター（例えば０．２２ミクロンのフィルター）を用いて１回以上行ってもよい。あるいは、２つ以上のフィルターを用いてろ過を行ってもよく、この場合、同じポアサイズのフィルターを使用してもよく、使用するフィルターのポアサイズを段階的に小さくしてもよい。後者の例としては、４０〜５０ミクロンのフィルターに１回以上通し、２０〜３０ミクロンのフィルターに１回以上通し、１０〜２０ミクロンのフィルターに１回以上通し、０．２２〜１０ミクロンのフィルターに１回以上通すといった方法が挙げられる。この工程に用いられる適当なフィルターには、０．４５ミクロンのフィルターおよび０．２２ミクロンのフィルターが含まれる。
【００３２】
次いで、精密ろ過により得られた上清（濾液）を、適当な生理的溶液、好ましくは滅菌した生理的溶液（例えば、水溶液、生理食塩水または糖含有溶液）と１：１の比率（例えば、生理的溶液１０ｍＬに対して上清１０ｍＬ）で混合してもよい。これにより、次の超遠心分離操作においてエキソソームの凝集を防ぎ、エキソソームの完全性を保つことができる。次いで、エキソソームを含む溶液に対して超遠心分離を行って、エキソソームおよび混在する残りの微小小胞体（１００〜２２０ｎｍ）をペレット状にする。この超遠心分離工程は、４℃、１１０，０００〜１７０，０００×ｇで１〜３時間、例えば、１７０，０００×ｇで３時間行われる。この超遠心分離工程は、良好な結果を得るために、必要に応じて繰り返し行ってもよく、例えば２回以上行ってもよい。この工程の実施においては、任意の市販の超遠心分離機（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）製、Ｂｅｃｋｍａｎ（登録商標）製など）を使用することができる。得られたエキソソーム含有ペレットを、確立された手法により上清から分離し、適当な生理的溶液に再懸濁する。
【００３３】
超遠心分離を行った後、再懸濁したエキソソーム含有ペレットに対して密度勾配分離を行い、エキソソームと混在する微小小胞体とをそれぞれの密度に基づいて分離する。様々な密度勾配を用いることが可能であり、例えば、ショ糖勾配、コロイドシリカ密度勾配またはイオジキサノール勾配を用いることができる。また、エキソソームと混在する微小小胞体との分離が十分に可能であれば、その他の密度勾配（例えば、ショ糖勾配の１．１００〜１．２００ｇ／ｍＬショ糖画分と同様に機能する密度勾配）も用いることができる。したがって、密度勾配の例には、２０〜５０％のショ糖を含む０．２５〜２．５Ｍの連続的なショ糖密度勾配による分離（例えば、ショ糖クッション遠心分離）、コロイドシリカ密度勾配、例えば、Ｐｅｒｃｏｌｌ（商標）勾配分離（ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）でコーティングされた直径１５〜３０ｎｍのコロイドシリカ粒子を、例えば、（ＲＮＡ分解酵素、ＤＮＡ分解酵素をいずれも含まない）水で３０％／７０％（ｗ／ｗ）に希釈したものを含む）、およびイオジキサノール勾配（例えば、６〜１８％のイオジキサノール）の使用が含まれる。選択した勾配液に、エキソソームを再懸濁した溶液を加えて、１１０，０００〜１７０，０００×ｇの速度で１〜３時間超遠心分離を行う。得られたエキソソームペレットを分離し、生理的溶液に再懸濁する。
【００３４】
密度勾配分離後に得られたエキソソームペレットの再懸濁液は、使用した密度勾配によっては、そのまま使える状態となる。例えば、密度勾配としてショ糖勾配を使用した場合、適切なショ糖画分を回収した後、回収した他のショ糖画分と混合してもよく、また、再懸濁したエキソソームペレットはそのまま使える状態にあるが、好ましくは超遠心分離（４℃、１１０，０００〜１７０，０００×ｇの速度で１〜３時間）による洗浄工程に供してもよい。密度勾配として、例えば、コロイドシリカ（Ｐｅｒｃｏｌｌ（商標））密度勾配またはイオジキサノール密度勾配を使用した場合、本質的に純粋なエキソソーム含有ペレットを得るために、再懸濁したエキソソームペレットをさらに複数回の洗浄工程、例えば、４℃、１１０，０００〜１７０，０００×ｇの速度でそれぞれ１〜３時間行う超遠心分離工程に１〜３回供してもよい。得られたペレットを上清から分離した後、使用に適した生理学的に許容される溶液に再懸濁してもよい。
【００３５】
当業者であれば十分に理解できるだろうが、各遠心分離工程または各超遠心分離工程で得られたエキソソームペレットを、次の遠心分離工程の前に、適当な生理的溶液（例えば、滅菌ＰＢＳ、０．９％滅菌生理食塩水または糖含有の０．９％滅菌緩衝生理食塩水）を用いて洗浄してもよい。
【００３６】
本発明の方法により、有利なことに、少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約９５％またはそれ以上の純度を有するとともに、生物学的に完全な状態である、哺乳動物および非哺乳動物のエキソソームが得られる手段が提供される。本明細書における「少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約９５％またはそれ以上の純度」とは、すなわち、直径が２０ｎｍ未満であるかまたは１２０ｎｍより大きい細胞残屑、アポトーシス小体および微小小胞体が「本質的に排除されている」こと、好ましくは４０ｎｍ未満であるかまたは１２０ｎｍより大きい細胞残屑、アポトーシス小体および微小小胞体が「本質的に排除されている」ことを意味する。また、「生物学的に完全な状態」としては、例えば、凝集したり塊状になっておらず、かつ切れたり、穴が開くなどの破損がない状態が挙げられる。本明細書に記載の方法で単離されるエキソソームは高い安定性を示し、このことは、単離したエキソソームの混合物／溶液のゼータ電位（例えば、ゼータ電位が少なくとも±３０ｍＶの大きさであり、例えば、≦−３０または≧＋３０、好ましくは少なくとも４０ｍＶ、５０ｍＶ、６０ｍＶ、７０ｍＶ、８０ｍＶまたはそれ以上の大きさである）によって確認することができる。「ゼータ電位」という用語は、コロイド分散液の界面動電電位を意味し、ゼータ電位の大きさは、分散液中で隣接する同じ電荷を持つ粒子（エキソソーム）間の静電反発力の程度を示す。エキソソームに関しては、ゼータ電位の大きさが３０ｍＶ以上であれば、安定性は中程度であり、すなわち、溶液中または分散液中で凝集が起こらない状態である。ゼータ電位の大きさが４０〜６０ｍＶであれば、安定性は良好であり、また、６０ｍＶより大きければ、安定性は優れている。
【００３７】
さらに、本発明の単離方法により、エキソソームを大量に取得することができる。例えば、１〜４ｍＬの哺乳動物の血清もしくは血漿、または１５〜２０ｍＬの細胞培養液（少なくとも約２×１０６個の細胞）から、総タンパク質の量として約１００〜２０００μｇのエキソソームを得ることができる。したがって、高収量を可能にする本発明の方法により、少なくとも約５μｇ／μＬ、好ましくは少なくとも約１０〜２５μｇ／μＬの濃度のエキソソーム含有溶液を容易に調製することができる。本明細書において、任意の所定の数値に関する「約」という用語は、その数値の偏差が最大１０％であること、すなわちその数値より最大１０％大きいか最大１０％小さいことを意味する。
【００３８】
本明細書に記載の方法で単離されるエキソソームは、有益なことに、完全性を保持しているとともに、高い純度（直径が２０ｎｍ未満であるかまたは１２０ｎｍより大きい物質の存在が「本質的に排除されている」）、安定性およびｉｎ  ｖｉｔｒｏとｉｎ  ｖｉｖｏの双方の生物活性を有するものであり、このようなエキソソームはこれまで得ることは不可能であった。したがって、本発明のエキソソームは、例えば、診断および／または治療において、比類なく有用である。また、本発明のエキソソームは非アレルゲン性であることが確認されていることから、自己、同種異系および異種に対して安全に使用できる。
【００３９】
本発明の方法を用いて得られたエキソソームは、薬学的または生理学的に許容される担体と組み合わせて、治療用の製剤として調製してもよい。「薬学的に許容される」または「生理学的に許容される」という表現は、医薬分野および獣医学分野において使用が許容されていること、すなわち、許容できない毒性を示すなどの生理的使用に不適な点が認められないことを意味する。当業者であれば、エキソソーム製剤の使用目的によって、選択する担体が異なることは十分に理解できるだろう。一実施形態において、エキソソームは、点滴または注射（例えば、皮下注射、腹腔内注射、筋肉内注射または静脈内注射）による投与に適した製剤に調製される。よって、発熱物質を含まない滅菌水溶液（必要に応じて緩衝液または等張液としてもよい）などの生理学的に許容される医療グレードの担体に懸濁した懸濁剤として調製される。使用可能な担体としては、蒸留水（ＲＮＡ分解酵素、ＤＮＡ分解酵素をいずれも含まない）、糖（例えば、ショ糖またはデキストロース）を含有する滅菌溶液、または塩化ナトリウムを含む滅菌生理食塩水（必要に応じて緩衝液としてもよい）が挙げられる。好適な生理食塩水は、様々な濃度の塩化ナトリウムを含んでいてもよく、例えば、通常の生理食塩水（０．９％）、１／２生理食塩水（０．４５％）、１／４生理食塩水（０．２２％）の他、これらより高濃度（例えば、３％〜７％またはそれ以上）の塩化ナトリウムを含む溶液も使用できる。必要に応じて、生理食塩水は塩化ナトリウム以外の成分、例えば、デキストロースなどの糖を含んでいてもよい。塩化ナトリウム以外の成分を含む生理食塩水としては、例えば、リンゲル液（例えば、乳酸リンゲル液または酢酸リンゲル液）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリスヒドロキシメチルアミノメタン緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）、アール平衡塩類溶液（ＥＢＳＳ）、標準クエン酸生理食塩水（ＳＳＣ）、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）、ゲイ平衡塩類溶液（ＧＢＳＳ）などが挙げられる。
【００４０】
他の実施形態において、エキソソームは、以下の投与経路に限定されないが、経口、鼻腔内、腸内、局所、舌下、動脈内、髄内、髄腔内、吸入、眼内、経皮、膣内、直腸内などの経路からの投与に適した製剤に調製され、各製剤はそれぞれの投与経路に適した担体を含む。例えば、局所適用するエキソソーム組成物は、適当な担体を配合して調製することができる。局所適用されるクリーム剤、ローション剤および軟膏剤は、トリグリセリド基剤などの適当な基剤を用いて調製することができる。このようなクリーム剤、ローション剤および軟膏剤は、界面活性剤をさらに含有していてもよい。好適な噴射剤を用いたエアロゾル製剤を調製することも可能である。また、本発明における組成物には、投与方法に拘わらず、他の補助剤を配合してもよく、例えば、微生物の増殖および／または長期保管中の分解を防ぐために、抗菌剤、酸化防止剤およびその他の保存剤を本発明における組成物に配合してもよい。
【００４１】
また、エキソソームペレットは、使用前に保存することも可能である。例えば、確立された方法に従って、４℃で冷蔵保存してもよく、凍結または凍結乾燥させて保存してもよい。エキソソームペレットは、任意の生理学的に許容される担体中に保存してもよく、必要に応じて低温安定化剤および／またはガラス化剤（例えば、ＤＭＳＯ、グリセロール、トレハロース、ポリヒドロキシアルコール（例えば、メトキシグリセロール、プロピレングリコールなど）、Ｍ２２など）を添加した該担体中に保存してもよい。
【００４２】
本発明の方法で単離されるエキソソームは、その比類なき特性（例えば、高純度、完全性および安定性）から、哺乳動物における疾患またはその他の病的症状の治療に用いるカーゴ（例えば、生体材料、治療用化合物などの物質）を送達するための媒体として使用できる点で有利である。本発明で単離されるエキソソームが有する高い純度および安定性により、該エキソソームへの外因性のカーゴの充填が可能である。本発明のエキソソームを用いて送達することができるカーゴとしては、例えば、エキソソームに本来存在しない（外部由来の）外因性物質が挙げられる。例えば、ＤＮＡ（核内ＤＮＡでもミトコンドリアＤＮＡでもよい）、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなどのＲＮＡ、アプタマーおよびその他の核酸含有分子などの核酸分子、ペプチド、タンパク質、リボザイム、糖、ポリマー、治療薬、低分子などが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、本発明で単離されるエキソソームは、例えば、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質／ペプチドなどの二次構造を有する化合物の送達や、例えば、２０塩基対を超えるサイズの核酸分子（例えば、５０塩基対を超えるサイズの核酸分子または１００塩基対を超えるサイズの核酸分子）、ペプチド、タンパク質などの大きな化合物の送達に特に有用である。
【００４３】
カーゴは、当技術分野で既に確立されている、細胞へのカーゴの導入方法により、本発明のエキソソームに導入することができる。したがって、例えば、約２０〜１０００Ｖ／ｃｍの電圧を印加するエレクトロポレーション法により、カーゴをエキソソームに導入することができる。また、カチオン性脂質をベースとするトランスフェクション試薬を用いたトランスフェクションにより、カーゴをエキソソームに導入してもよい。好適なトランスフェクション試薬としては、例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ（商標）トランスフェクション試薬、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）３０００トランスフェクション試薬、またはＰＬＵＳ（商標）試薬と併用するＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＬＴＸ試薬が挙げられるが、これらに限定されない。カーゴの充填には、適量のトランスフェクション試薬が用いられるが、その量は、使用する試薬、試料およびカーゴにより異なってもよい。例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ（商標）トランスフェクション試薬を用いる場合は、約０．１５μＬ〜１０μＬの使用量で、１００ｎｇ〜２５００ｎｇのｍＲＮＡまたはタンパク質をエキソソームに充填することができる。また、その他の方法を用いてエキソソームにカーゴを導入してもよく、例えば、タンパク質を導入するために膜透過性ペプチドを使用してもよい。
【００４４】
本発明により単離されるエキソソームは、その完全性および安定性から、所望のカーゴを１０μｇのエキソソームタンパク質当たり、ｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡであれば少なくとも約１ｎｇ、タンパク質であれば少なくとも約３０μｇ充填することができる点で有利である。
【００４５】
当業者であれば十分に理解できるだろうが、カーゴを充填する前または充填した後に、カーゴを送達するための媒体としての有効性を高めるために、本発明のエキソソームに標的指向性を有する部分を付与する修飾をさらに施してもよい。この点に関して、特定の種類の細胞または組織を特異的に標的とする物質が組み込まれたエキソソームを作製してもよい。この標的特異的な物質、例えば標的細胞上または標的組織上に存在するレセプターまたはリガンドに対して親和性を有するペプチドは、例えば、当技術分野で確立されている方法を用いてエキソソームの膜マーカー（前述したもの）と融合させることによって、エキソソームの膜内に組み込んでもよい。
【００４６】
本発明の別の一態様において、本発明のエキソソーム単離方法の実施に有用な試薬または器具を１以上含むキットが提供される。このキットには、本発明の単離方法の実施手順が詳細に記載された使用説明書、例えば、本方法が、
ｉ）生体試料に対して第１の遠心分離を行って該試料から約７〜１０ミクロンより大きい細胞残屑を除去し、その後上清を得る工程、
ｉｉ）工程ｉ）で得られた上清に対して遠心分離を行い、該上清から微小小胞体を除去する工程、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で得られた上清を精密ろ過し、精密ろ過により得られた上清を回収する工程、
ｉｖ）精密ろ過により工程ｉｉｉ）で得られた上清に対して超遠心分離を少なくとも１回行い、エキソソームペレットを得る工程、および
ｖ）工程ｉｖ）で得られたエキソソームペレットを生理的溶液に再懸濁し、密度勾配を用いた第２の超遠心分離を行い、エキソソームペレット画分を分離する工程
を含むことが示された使用説明書がさらに含まれる。
【００４７】
したがって、本発明のキットは、使用説明書に加えて、上記方法の実施に有用な溶液を含んでいてもよい。例えば、試料を遠心分離した後、エキソソーム含有ペレットを再懸濁するための生理的溶液；緩衝液；洗浄液；または密度勾配分離を行うための密度勾配溶液を１以上含んでいてもよい。さらに、本発明のキットには、生体試料用の容器、試験管、遠心管、精密ろ過フィルターなどの器具が１以上含まれていてもよい。
【００４８】
以下の実施例において本発明の実施形態について説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものと解釈すべきではない。
【実施例】
【００４９】
実施例１：ヒト生体試料からのエキソソームの単離
健康なヒト被験者から血液と尿の検体を採取した。血清を分離するために、血液を室温で１時間放置して凝固させた後、４℃、２，０００×ｇで１５分間遠心した。同様に、尿検体も４℃、２，０００×ｇで１５分間遠心して、細胞残屑を除去した。血漿を分離するために、採取後すぐに血液を４℃、２，０００×ｇで１５分間遠心し、５μｇのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍＬの原液、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を加えて３７℃で２０分間処理した。これ以降は、すべての検体（血清１ｍＬ、血漿１ｍＬおよび尿）に対して同一の処理を行う。
【００５０】
混在する浮遊細胞をさらに除去するために、第１の遠心分離で得られた上清を４℃、２０００×ｇで６０分間遠心した（省略可能）。次いで、上清を４℃、１４，０００×ｇで６０分間遠心した（省略可能）。得られた上清を４℃、５０，０００×ｇで６０分間遠心した。次いで、得られた上清を４０μｍのフィルターでろ過した後、０．２２μｍのシリンジフィルターでろ過した（２回）。次いで、ろ過した上清を慎重に超遠心管に移し、同量の滅菌ＰＢＳ（ｐＨ７．４、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で希釈した。次いで、固定角ローターを用いて、超遠心分離を４℃、１１０，０００〜１７０，０００×ｇで２時間行った。次いで、得られたペレットをＰＢＳに再懸濁し、再度遠心分離を４℃、１１０，０００〜１７０，０００×ｇで２時間行った（省略可能）。次いで、ペレットを、慎重な操作により２５ｍＬの滅菌ＰＢＳ（ｐＨ７．４、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に再懸濁し、超遠心管に準備した４ｍＬの３０％／７０％Ｐｅｒｃｏｌｌ（商標）勾配クッション（０．２２μｍのフィルターでろ過滅菌した水を用いて調製）または３０％Ｔｒｉｓ／ショ糖／滅菌水クッション（３００ｇのプロテアーゼ非含有ショ糖、２４ｇのＴｒｉｓ塩基、５００ｍＬの滅菌水、ｐＨ７．４、０．２２μｍのフィルターでろ過滅菌）の上に静かに添加した。これを、４℃、１５０，０００〜１７０，０００×ｇで９０分間遠心した。シリンジを用いて、エキソソーム画分（勾配界面にある境界明瞭なペレット層）を慎重に採取し、５０ｍＬの滅菌ＰＢＳ（ｐＨ７．４、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で希釈した後、４℃、１１０，０００〜１７０，０００×ｇで９０分間遠心して精製エキソソームを得た（ショ糖勾配を用いた場合にはこの手順は省略可能である）。得られたエキソソームを、滅菌ＰＢＳまたは０．９％滅菌生理食塩水に再懸濁し、後の分析（ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ）に使用した。エキソソーム画分の純度は、少なくとも２つの独立したエキソソーム膜マーカー（この実施例ではＣＤ９およびＣＤ６３）を用いて、サイズ分布測定、免疫金標識／ウェスタンブロッティングにより確認した。
【００５１】
ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ（商標））により、各検体におけるエキソソームの収量を求めたところ、血清、血漿および尿からの収量は、２〜２０μｇ／μＬであった。エキソソーム画分の純度を、定性的に免疫金標識法で確認したところ、平均粒径は９０ｎｍであり、２０〜１２０ｎｍの範囲外の混入物はごく微量であった。また、エキソソームの安定性についても、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＤｅｌｓａＭａｘ動的光散乱分析装置を用いて調べたところ、血清から単離したエキソソームのゼータ電位は−８０．４ｍＶであった（図１Ａを参照）。
【００５２】
実施例２：マウスから単離したエキソソーム
実施例１に記載の超遠心分離法により、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスから採取した血清１ｍＬからエキソソームを単離した。単離したエキソソームを電子顕微鏡で観察し、エキソソームのサイズを調べた（拡大倍率：１４０，０００倍）。また、単離したエキソソームを可視化するナノ粒子トラッキング解析を、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＤｅｌｓａＭａｘ動的光散乱分析装置を用いて行った。マウス血清から得られたエキソソームの平均サイズは約９０ｎｍであった（図１Ｂを参照）。単離したエキソソームにおいて、ＣＤ６３（エキソソーム膜に多く存在する）に対する免疫金標識を行って電子顕微鏡で観察し、血清由来エキソソーム画分の純度および完全性を調べた（拡大倍率：１２５，０００倍）。
【００５３】
ＢＣＡアッセイによるエキソソーム総タンパク質の収量は１４．２μｇ／μＬであった。単離したエキソソームの安定性は、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＤｅｌｓａＭａｘ動的光散乱分析装置を用いて調べた。その結果、血清から単離したエキソソームのゼータ電位は−７８．１ｍＶであった。
【００５４】
実施例３：樹状細胞からの単離
ヒトまたはマウスの未熟樹状細胞を、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５ｎｇ／ｍＬマウスＧＭ−ＣＳＦおよび２０％ウシ胎児血清を含有するアルファ最小必須培地中で６５〜７０％コンフルエントに達するまで増殖させた。馴化培地を回収するために、細胞を滅菌ＰＢＳ（ｐＨ７．４、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で２回洗浄した後、前述の培地（エキソソーム除去ウシ胎児血清を含む）を加えた。４８時間後に、ヒトまたはマウスの未熟樹状細胞の培養液から馴化培地を回収した。細胞残屑を除去するために、回収した培地（１０ｍＬ）を４℃、２，０００×ｇで１５分間遠心した。続いて、混在する浮遊細胞をさらに除去するために、４℃、２０００×ｇで６０分間遠心してもよい。次いで、上清を４℃、１４，０００×ｇで６０分間遠心した。得られた上清を４℃、５０，０００×ｇで６０分間遠心した。次いで、得られた上清を４０μｍのフィルターでろ過した後、０．２２μｍのシリンジフィルターでろ過した（２回）。次いで、得られた上清を、慎重に超遠心管に移し、同量の滅菌ＰＢＳ（ｐＨ７．４、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で希釈した。次いで、固定角ローターを用いて、超遠心分離を４℃、１００，０００〜１７０，０００×ｇで２時間行った。得られたペレットをＰＢＳに再懸濁し、再度遠心分離を４℃、１００，０００〜１７０，０００×ｇで２時間行った。ペレットを、慎重な操作により２５ｍＬの滅菌ＰＢＳ（ｐＨ７．４、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に再懸濁し、超遠心管に準備した４ｍＬの３０％／７０％Ｐｅｒｃｏｌｌ（商標）勾配クッション（０．２２μｍのフィルターでろ過滅菌した水を用いて調製）の上に静かに添加した。これを、４℃、１００，０００〜１７０，０００×ｇで９０分間遠心した。シリンジを用いて、勾配界面にあるエキソソームペレット含有画分を慎重に採取し、５０ｍＬの滅菌ＰＢＳ（ｐＨ７．４、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で希釈した後、最後に４℃、１００，０００〜１７０，０００×ｇで９０分間遠心して精製エキソソームを得た。得られたエキソソームペレットを、滅菌ＰＢＳまたは０．９％滅菌生理食塩水に再懸濁し、後の用途に供した。エキソソーム画分の純度に関しては、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＤｅｌｓａＭａｘ動的光散乱分析装置を用いたサイズ分布測定により、４０〜１２０ｎｍの範囲外の混入物がごく微量であることを確認するとともに、エキソソーム膜マーカーであるＣＤ９、ＣＤ６３、ＴＳＧ１０１およびＡＬＩＸを用いて、免疫金標識／ウェスタンブロッティングによる確認も行った。
【００５５】
実施例４：植物からのエキソソームの単離
穀粒（４つのトウモロコシの穂軸から採取）およびザクロ種子（４つのザクロの実から採取）をそれぞれホモジナイズして、得られたホモジネートを１００μｍのフィルターを用いてろ過した。ろ過したホモジネートを、実施例１に記載のエキソソーム単離方法に供した。図２（ＡおよびＢ）に示すように、上記の植物からエキソソームを単離することができた。
【００５６】
実施例５：エキソソーム産生のスケールアップ
検体量を増やして、例えば、検体を入れる容器を９６ウェルディッシュから、４８ウェルディッシュ、２４ウェルディッシュ、１２ウェルディッシュ、６ウェルディッシュに、６０ｃｍウェルプレートから１００ｃｍウェルプレートに、Ｔ−１５０フラスコから、Ｔ−１７５フラスコ、Ｔ−２２５フラスコ（すべてＣｏｒｎｉｎｇ製）に拡張して操作を行い、エキソソームの単離に成功した。単離したエキソソームの質および完全性はいずれも同程度であり、例えば、平均サイズは約７８ｎｍ（直径）であり、ゼータ電位は約−８７ｍＶであった（図３ＡおよびＢ）。
【００５７】
また、１Ｌまたは３ＬのＣＥＬＬｉｎｅ（商標）バイオリアクターフラスコ（Ｗｈｅａｔｏｎ）を用いた、未熟樹状細胞からのエキソソームの単離も行った。１Ｌまたは３Ｌのバイオリアクターを用いて単離したエキソソームにおいても、前述の小スケールで単離したエキソソームと同様の平均サイズ（直径）およびゼータ電位が維持されていた。
【００５８】
したがって、本発明の方法は容易に拡張することが可能である。ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）で求めたエキソソームタンパク質の収量は、約４ｍｇ（９６ウェルプレート使用）から約１４００ｍｇ（３Ｌのバイオリアクター使用）に及び、この範囲で直線性が認められた（図４ＡおよびＢ）。
【００５９】
実施例５：市販の各種キットを使用したエキソソーム単離方法の比較
Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）、Ｃｅｌｌ  Ｇｕｉｄａｎｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）、Ｎｏｒｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（商標）、Ｑｉａｇｅｎ（商標）、Ｅｘｉｑｏｎ（商標）およびＳｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標）から市販されているエキソソーム単離キットを各メーカーの使用説明書に従って使用し、血清からエキソソームを単離した。
【００６０】
これらのキットを使用して得られた結果と、実施例１〜３に記載の方法を使用して得られた結果とを比較した。上記キットを使用して単離したエキソソームは、実施例１〜３の方法を使用して単離したエキソソームより質が劣っていた。具体的に述べると、電子顕微鏡観察により、市販のキットで得られた精製物中には、残屑の混入や微小小胞体の凝集が認められたが、実施例１〜３の方法では、平均直径９０ｎｍの円形のエキソソームが凝集せずに得られていた（図５）。
【００６１】
実施例１の方法を使用して単離したエキソソームの量（ＢＣＡタンパク質アッセイで測定した総タンパク質の量：１０〜２５μｇ／μＬ）は、試験に使用したどの市販キットで単離したタンパク質の量（ＢＣＡタンパク質アッセイで測定した総タンパク質の量：０．１〜０．５μｇ／μＬ）よりも顕著に多かった。したがって、図６に示すように、市販のキット（Ｓ１〜Ｓ６）のタンパク質収量と比べると、実施例１〜３の方法（ＥＸ１〜ＥＸ６）により約８０〜１００倍量のエキソソームを得ることができた。さらに、市販のキットを使用して単離した精製物は、ゼータ電位が−１０ｍＶを超えている（すなわち−１０〜０ｍＶ）ことから、その安定性は低く、また急速に凝集が認められた。一方、実施例１〜３の方法で単離したエキソソームのゼータ電位は−８０．４ｍＶ（ヒト）および−７８．１ｍＶ（マウス）で、エキソソームも円形で凝集しなかったことから、安定性において明らかな相違が示された。また、実施例１〜３の本発明の方法を使用して単離したエキソソームの生理的緩衝液に対する溶解性と比較して、市販のキットを使用して単離した精製物は、生理的緩衝液に非常に溶けにくかったことも特筆すべき点である。市販のキットを使用して得られたペレットは、生理的緩衝液、またはＲＩＰＡ緩衝液、尿素緩衝液などの界面活性剤をベースとした緩衝液に効率よく懸濁することができなかった。
【００６２】
実施例６：エキソソーム単離方法の比較
Ｍａｔｔｈｅｗ  Ｊ．Ａ．Ｗｏｏｄｓ博士の研究室から、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２９，４：３４１（２０１１）およびＥｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｖｏｌ  ７，１２：２１１２（２０１２）の２つの文献が発表されている。各文献において本発明に関連する内容は本明細書に組み込まれるものとし、いずれの文献もｉｎ  ｖｉｖｏにおけるｓｉＲＮＡの治療用送達のためのエキソソームの使用を提案するものである。Ａｌｖａｒｅｚ−ＥｒｖｉｔｉらおよびＥｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉらの方法を用いて、未熟樹状細胞の培養液からエキソソームを得た。これらの方法は、簡潔に述べると、培養液に対して、遠心分離を４℃、３００ｇで１０分間行い、次いで、得られた上清を、１２，０００ｇで３０分間遠心した後、１２０，０００ｇで７０分間遠心してエキソソームをペレット状にするというものである。
【００６３】
図７Ａに示すように、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉらの方法を用いて得られたエキソソーム精製物のタンパク質収量は、１．６７μｇ／μＬであり、該精製物は、直径が約５ｎｍから１×１０４ｎｍを超えるサイズまでの粒子を含み、粒子のゼータ電位は−２０．４ｍＶ（「やや不安定（ｉｎｃｉｐｉｅｎｔ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ）」であることを示す）であった。図７Ｂに示すように、Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉらの方法を用いて得られた精製物のタンパク質収量は、１．８９μｇ／μＬであり、該精製物は、直径が１０ｎｍ未満から約１００ｎｍまでの粒子を含み、粒子のゼータ電位は−１５．７ｍＶ（「やや不安定（ｉｎｃｉｐｉｅｎｔ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ）」であることを示す）であった。これとは対照的に、本発明の方法（実施例１〜３）で単離した精製物のタンパク質収量は、総タンパク質として１０〜２５μｇ／μＬであり、エキソソームの平均直径は約９０ｎｍで、膜断片（例えば１０ｎｍ未満）や大きな微小小胞体（１０００ｎｍより大きい）の混入は認められず、さらに、エキソソームのゼータ電位は「優れている」とされる範囲（例えば、約−８０．４ｍＶ（ヒト）、−７８．１ｍＶ（マウス））であった。
【００６４】
Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉら（２０１２）の方法で単離したエキソソームと、本発明の単離方法で単離したエキソソームの有効性を比較するために、Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉらの文献に記載の方法と同様にして、エキソソームにｓｉＲＮＡを充填した。具体的には、Ｃ２Ｃ１２細胞から分化させた筋管を、Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉらの方法で得られたエキソソームに内包したＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡまたは本発明の単離方法により単離したエキソソームに内包したＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡで処理した。エキソソームへのＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡの充填は、Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉらの文献に記載の方法と同様に、４００Ｖおよび１２５μＦの条件のエレクトロポレーションにより行った。また、トランスフェクション試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００）を用いて、筋管をＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡで処理したものをポジティブコントロールとし、スクランブルｓｉＲＮＡ（ｓｃＲＮＡ）で処理したものをネガティブコントロールとした。
【００６５】
独立して行った３回の試験において、ｓｉＲＮＡを内包したＥｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉらの方法で得られたエキソソームにより、ＧＡＰＤＨ量が約３５％抑制された（図８）。ＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡを内包した本発明の単離方法（実施例３）で単離したエキソソームにより、ＧＡＰＤＨ量が約６５％抑制された（図９）。したがって、本発明の単離方法で単離したエキソソームの方が、遺伝子抑制に関して顕著に高い性能を有しており、よってカーゴの取り込み能力が高いことが示された。
【００６６】
Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉらの方法で得られたエキソソームを用いて、別の種類のカーゴを充填または内包する能力についても測定を行い、本発明の単離方法で単離したエキソソームの充填能力と比較した。エキソソームへの充填は、エレクトロポレーションにより、上記と同様にして行った。ｓｉＲＮＡ（ＧＡＰＤＨ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ｍｉＲＮＡ（ｍｍｕ−ｍｉＲ−２３ａ、アクセッション番号：ＭＩ００００５７１）、ｍＲＮＡ（ＧＡＡ、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００１１５９３２４．１）およびペプチド（ｒＧＡＡ、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００１１５２７９６．１）などの各種カーゴをエキソソームに充填した。
【００６７】
図１０に示すように、Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉらの方法で得られたエキソソームにおけるカーゴの充填能力は限定的であった。Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉらの方法で得られたエキソソームは、ｓｉＲＮＡの充填においては幾分か能力を示したが、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡおよびペプチドの充填能力は全くないか、あってもごくわずかであった。それに比べて、本発明の単離方法で単離したエキソソームは、ｓｉＲＮＡ（Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉらの方法を用いて単離したエキソソームと比べて２．２２倍のｓｉＲＮＡ充填量）、ｍｉＲＮＡ（Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉらの方法を用いて単離したエキソソームと比べて２５倍）、ｍＲＮＡおよびペプチド（Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉらの方法を用いて単離したエキソソームにはｍＲＮＡまたはペプチドを全く充填することができなかったとすれば、計算上比率は無限大となる）のいずれの充填能力も１００％を示した。
【００６８】
最後に、Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉらの方法で得られたエキソソームと、本発明の単離方法で単離したエキソソームの安全性を比較した。安全性を評価するために、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウス（１群６匹）に、ヒトの未熟樹状細胞から調製した、異種由来の空のエキソソーム（０．９％滅菌生理食塩水に再懸濁したもの）１０μｇ（エキソソーム総タンパク質として）を静脈内注射により週１回、合計４回投与した。エキソソームの投与前または投与期間中は、これらのマウスへの抗ヒスタミン薬（例えば、ベナドリル）の投与は行わなかった。Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉらの方法で調製したエキソソーム精製物を注射したマウスは、４回目の注射までにすべて死亡した。一方、本発明の単離方法で単離したエキソソームを注射したマウスの死亡率は０であり、いずれのマウスでも副作用は認められなかった（図１１を参照）。
【００６９】
実施例７：修飾ＲＮＡのエキソソームへの充填および送達
本発明の単離方法で単離したエキソソームにおける修飾ＲＮＡを充填または送達する能力を測定し、エキソソームを使用せずに修飾ＲＮＡを送達した場合と比較した。５００ｎｇの非修飾（生理的）ｍＲＮＡ−Ｖｅｇｆａまたは５００ｎｇのｍｏｄＲＮＡ−Ｖｅｇｆａ（合成方法はＺａｎｇｉら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３１，８９８−９０７（２０１３）に記載されており、この文献において本発明に関連する内容は本明細書に組み込まれるものとする）を、エキソソーム（エキソソーム総タンパク質として２０μｇ）に充填した。充填は、カチオンベースのトランスフェクション試薬を用いて、過去に報告されている方法と同様にして行った。
【００７０】
初代培養心筋細胞を、空のエキソソーム、ｍｏｄＲＮＡ−Ｖｅｇｆａ、ｍｏｄＲＮＡ−Ｖｅｇｆａ充填エキソソームまたはｍＲＮＡ−Ｖｅｇｆａ充填エキソソームでそれぞれ処理した。ｍｏｄＲＮＡ−Ｖｅｇｆａ単独で処理した細胞では、効率的なトランスフェクションを行うために、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を使用した。ＶＥＧＦ−Ａタンパク質の産生量を経時的に（０〜１８０時間）測定した。処理した細胞において、ＶＥＧＦ−Ａタンパク質の産生量は、約２０時間にピークに達し、約１４４時間でベースラインに戻るという一定の産生パターンを示した。しかし、産生されたＶＥＧＦ−Ａの総量を見ると、ｍＲＮＡ−ＶｅｇｆａエキソソームまたはｍｏｄＲＮＡ−Ｖｅｇｆａエキソソームで処理した細胞の産生量（約１０ｎｇ／ｍＬ）は、ｍｏｄＲＮＡ−Ｖｅｇｆａ単独で処理した細胞における産生量（約３．２ｎｇ／ｍＬ）の約３倍であった（図１２ＡおよびＢを参照）。したがって、非修飾ＲＮＡおよび修飾ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ−ＶｅｇｆａおよびｍｏｄＲＮＡ−Ｖｅｇｆａはいずれも、エキソソームに効率的に充填され、外因性のトランスフェクション試薬と併用しなくても細胞へと送達されることが示された。
【００７１】
さらに、エキソソームを治療用送達媒体として用いる場合、ｍＲＮＡ自体への修飾（ｍｏｄＲＮＡ）が不要であること、また、非修飾のｍＲＮＡを内包したエキソソームとの比較結果より、ｍＲＮＡへの修飾は治療上有利とはならないことは明らかである（図１２Ｂ）。
【００７２】
実施例８：エキソソームの体内分布
ｉｎ  ｖｉｖｏモデルシステムにおいて、本発明の単離方法で単離したエキソソームが様々な組織に効果的に取り込まれることを確認するために、単離したエキソソームを、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＥセラミド蛍光色素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて標識した。ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＲセラミドは、赤色蛍光色素（吸収／発光極大波長約５８９／６１７ｎｍ）であり、Ｄ−エリスロスフィンゴシンから調製され、生物活性を有する天然のスフィンゴ脂質と同じ立体配座を有する。マウスに全量１００μｇの標識エキソソーム（０．９％滅菌生理食塩水に懸濁したもの）を静脈内投与し、投与直後（０分）、投与後１０分および投与後２０分に、マウスの組織／臓器（大腿四頭筋、心臓、脳、肝臓、腎臓、肺、鼠蹊部白色脂肪組織、褐色脂肪組織、膵臓および大腸）ならびに血液を採取した（１群４匹）。血清および組織ホモジネートの蛍光を測定し、様々な組織／臓器中に存在する標識エキソソームを定量化するために、血液（血漿）の測定値に対する比として表した。０分の時点では、蛍光のほとんどが血液中で観察されたが、標識エキソソームが広く体内に非特異的に分布するにつれて、継時的に（投与後１０分および２０分）様々な組織／臓器における蛍光が増加した（図１３）。
【００７３】
実施例９：エキソソームのｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物活性試験
ヒトの初代培養皮膚線維芽細胞の増殖試験により、実施例１の方法を用いて単離したエキソソームの生物活性と、市販のキットを用いて単離したエキソソームの生物活性とを比較した。ヒトの初代培養皮膚線維芽細胞は、標準的な手法を用いて、健康なヒト被験者の皮膚生検から単離した。エキソソームは、実施例１に記載した方法と同様にして、または市販のエキソソーム単離キットを用いて、運動量の少ない人（ＳＥＤ）および運動量の多い人（ＥＮＤ）の血清から単離した。単離したエキソソームをそれぞれ同量（エキソソーム総タンパク質として１００ｎｇ／μＬ）用いて皮膚線維芽細胞を処理し、細胞を５日間培養した（ｎ＝３／処理）。
【００７４】
エキソソーム処理後、Ｖｙｂｒａｎｔ（登録商標）ＭＴＴ細胞増殖アッセイ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を行い、細胞増殖について検討を行った。図１４に示すように、本発明の方法を用いて単離したＳＥＤおよびＥＮＤのエキソソームは、市販品による方法を用いて同じ検体から単離したＳＥＤおよびＥＮＤのエキソソームよりヒト皮膚線維芽細胞の増殖効果が高かった。生理的な変動（例えば、被験者またはサンプリング時間が異なることによるもの）の影響を避けるために、この比較に用いた血清検体は、同じ運動量の多い人または同じ運動量の少ない人から同時刻に採取されたものであることに留意されたい。対応のないｔ検定を用いてデータを分析し、平均±ＳＥＭとして示した。＊ｐ＜０．０５  運動量の少ない人の群と運動量の多い人の群との比較。
【００７５】
１つの特定の説明に限定するものではないが、市販のキットで単離したエキソソームにおける生物活性の欠如は、疎水性環境におけるエキソソームの機械的な切断やエキソソームの「凝集」とともに、エキソソームの不十分な精製にも起因している可能性がある。
【００７６】
実施例１０：単離したエキソソームのｉｎ  ｖｉｖｏにおける生物活性
実施例１の方法を用いて単離したエキソソームは、ｉｎ  ｖｉｖｏ環境において生物活性を有していることが示された。ＭｃＭａｓｔｅｒ大学内の中央動物施設で飼育した雄性Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスを、温度および湿度が管理されている室内のマイクロアイソレータケージに収容し、飼料および水を自由摂取させて、１２時間ごとの明暗サイクルの環境下で飼育した。３ヶ月齢のマウスを、運動量の少ない群（ＳＥＤ：運動ができないように回転かごがロックされた回転かごケージに収容）と運動訓練を受ける群（ＥＮＤ：トレッドミルトレーニング：Ｅｃｏ  ３／６トレッドミル（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、１５ｍ／分で６０分間の運動を週５回２ヶ月間実施）とに無作為に振り分けた（Ｎ＝１５０／群）。ただし、両群間で体重が等しくなるようにした。マウスからエキソソームを単離する前に、過去の文献（Ｓａｆｄａｒら，ＰＮＡＳ，１０８（１０）：４１３５−４０（２０１１））に記載の方法と同様にして、持久力評価負荷試験を行い、ＥＮＤ群のマウスがＳＥＤマウスより高い有酸素能力を有することを確認した。
【００７７】
ＳＥＤマウスおよびＥＮＤマウスの血液から、実施例１の方法を用いてエキソソームを単離した。単離したエキソソームを、エキソソーム総タンパク質の濃度が１μｇ／μＬになるように０．９％滅菌生理食塩水に再懸濁した。エキソソームを含む溶液（１００〜１５０μＬエキソソーム含有生理食塩水）、すなわちＳＥＤマウスのエキソソームまたはＥＮＤマウスのエキソソームを、ＳＥＤマウスの別のコホート集団に週５回静脈内投与した。このとき、ドナーとレシピエントとが１対１で対応するようにした。６週間の投与終了後、各群のマウス（ＳＥＤエキソソームを投与したＳＥＤマウスおよびＥＮＤエキソソームを投与したＳＥＤマウス）を自発活動量測定ケージ（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に２４時間収容して、自発運動能力を測定した。次いで、これらのマウスを持久力評価負荷試験に供した。これとは別のＣ５７Ｂｌ／６Ｊマウスのコホート集団である、運動量の少ない（ＳＥＤ）マウスおよび持久力訓練を受けた（ＥＮＤ；自発的回転かご走行ケージで１０週間訓練された）マウスを、それぞれ持久力訓練適応のネガティブコントロールおよびポジティブコントロールとして、持久力評価負荷試験にそれぞれ供した。対応のないｔ検定を用いてデータを分析し、平均±ＳＥＭとして示した。＊ｐ＜０．０５、ＳＥＤ群とＥＮＤ群との比較；§ｐ＜０．０５、ＳＥＤ＋ＳＥＤ  ＥＸＯ群とＳＥＤ＋ＥＮＤ  ＥＸＯ群との比較。
【００７８】
運動量の少ない（ＳＥＤ）マウスにＥＮＤエキソソームを投与した場合、ＳＥＤマウスに投与したＳＥＤエキソソームの作用とは異なり、基礎の自発活動量および最大持久力の増加が見られた（図１５）。運動量の少ないマウスにＥＮＤエキソソームを６週間投与し、その間「運動量の少ない状態」を維持した場合の基礎の自発活動量および最大持久力は、自発的回転かごケージで６週間訓練されたマウスのそれと同程度であった。
【００７９】
本明細書に引用されている参考文献における本発明に関連する部分は参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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