(57)【要約】  本開示は、トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１プロモーター由来のミニマルコアプロモーターエレメントとイネユビキチン３プロモーター由来の完全長ヌクレオチド配列エレメントを用いて、植物または植物細胞中でのヌクレオチド配列の転写を促進するための組成物および方法に関する。いくつかの実施形態は、２つの作動可能に連結されたヌクレオチド配列の転写を促進するように植物中で機能することができる合成二方向性プロモーターに関する。
2017532963.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１プロモーターとイネユビキチン３プロモーター由来の複数のプロモーターエレメントを含む合成イネユビキチン３二方向性ポリヌクレオチドプロモーター。
【請求項２】
前記プロモーターエレメントがミニマルコアプロモーターを含む、請求項１に記載の合成イネユビキチン３二方向性ポリヌクレオチドプロモーター。
【請求項３】
前記ミニマルコアプロモーターが、配列番号２に少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、請求項２に記載の合成イネユビキチン３二方向性ポリヌクレオチドプロモーター。
【請求項４】
前記プロモーターエレメントがイントロンを含む、請求項１に記載の合成イネユビキチン３二方向性ポリヌクレオチドプロモーター。
【請求項５】
前記イントロンが配列番号４に少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、請求項４に記載の合成イネユビキチン３二方向性ポリヌクレオチドプロモーター。
【請求項６】
前記イントロンが配列番号６に少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、請求項４に記載の合成イネユビキチン３二方向性ポリヌクレオチドプロモーター。
【請求項７】
前記プロモーターエレメントが５’−ＵＴＲを含む、請求項１に記載の合成イネユビキチン３二方向性ポリヌクレオチドプロモーター。
【請求項８】
前記５’−ＵＴＲが、配列番号３に少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、請求項７に記載の合成イネユビキチン３二方向性ポリヌクレオチドプロモーター。
【請求項９】
前記５’−ＵＴＲが、配列番号５に少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、請求項７に記載の合成イネユビキチン３二方向性ポリヌクレオチドプロモーター。
【請求項１０】
前記プロモーターエレメントが上流プロモーターエレメントを含む、請求項１に記載の合成イネユビキチン３二方向性ポリヌクレオチドプロモーター。
【請求項１１】
前記上流プロモーターエレメントが、配列番号７に少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、請求項１０に記載の合成イネユビキチン３二方向性ポリヌクレオチドプロモーター。
【請求項１２】
前記トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１プロモーターが、配列番号８に少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の合成イネユビキチン３二方向性ポリヌクレオチドプロモーター。
【請求項１３】
前記イネユビキチン３プロモーターが、配列番号９に少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の合成イネユビキチン３二方向性ポリヌクレオチドプロモーター。
【請求項１４】
前記合成二方向性ポリヌクレオチドプロモーターが、配列番号１に少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の合成イネユビキチン３二方向性ポリヌクレオチドプロモーター。
【請求項１５】
配列番号１に少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む前記合成二方向性ポリヌクレオチドの３’末端に作動可能に連結された第１の、対象のポリヌクレオチド配列を含む、請求項１４に記載の合成イネユビキチン３二方向性ポリヌクレオチドプロモーター。
【請求項１６】
配列番号１に少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む前記合成二方向性ポリヌクレオチドの５’末端に作動可能に連結された第２の、対象のポリヌクレオチド配列を含む、請求項１４に記載の合成イネユビキチン３二方向性ポリヌクレオチドプロモーター。
【請求項１７】
前記対象のポリヌクレオチド配列が形質を含む、請求項１５または１６に記載の合成イネユビキチン３二方向性ポリヌクレオチドプロモーター。
【請求項１８】
前記形質が、殺虫剤抵抗性形質、除草剤耐性形質、窒素利用効率形質、水利用効率形質、栄養価形質、ＤＮＡ結合形質、選択可能マーカー形質、およびその任意の組合せからなる群から選択される、請求項１７に記載の合成イネユビキチン３二方向性ポリヌクレオチドプロモーター。
【請求項１９】
トランスジェニック植物細胞を生産するための方法であって、
ａ）少なくとも１つの、対象のポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された合成イネユビキチン３二方向性ポリヌクレオチドプロモーターを含む遺伝子発現カセットで植物細胞を形質転換するステップと、
ｂ）前記遺伝子発現カセットを含む形質転換植物細胞を単離するステップと、
ｃ）少なくとも１つの、対象のポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された前記合成イネユビキチン３二方向性ポリヌクレオチドプロモーターを含むトランスジェニック植物細胞を生産するステップと
を含む方法。
【請求項２０】
植物細胞を形質転換することが植物形質転換法を用いて実施される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記植物形質転換法が、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換法、バイオリスティック形質転換法、炭化ケイ素形質転換法、プロトプラスト形質転換法、およびリポソーム形質転換法からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記対象のヌクレオチド配列が前記トランスジェニック植物細胞全体を通じて構成的に発現される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記対象のヌクレオチド配列が前記トランスジェニック植物細胞のゲノム内に安定的に組み入れられる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
ｅ）前記トランスジェニック植物細胞をトランスジェニック植物に再生するステップと、
ｆ）少なくとも１つの、対象のポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された前記合成イネユビキチン３二方向性ポリヌクレオチドプロモーターを含む前記遺伝子発現カセットを含む前記トランスジェニック植物を得るステップ
をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記トランスジェニック植物細胞が単子葉トランスジェニック植物細胞または双子葉トランスジェニック植物細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記双子葉トランスジェニック植物細胞が、シロイヌナズナ（Arabidopsis）植物細胞、タバコ植物細胞、ダイズ植物細胞、キャノーラ植物細胞、およびワタ植物細胞からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記単子葉トランスジェニック植物細胞が、トウモロコシ植物細胞、イネ植物細胞、ヤマカモジグサ（Brachypodium）植物細胞、およびコムギ植物細胞からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記合成イネユビキチン３二方向性ポリヌクレオチドが、配列番号１を含む、請求項１９に記載の合成イネユビキチン３二方向性ポリヌクレオチドプロモーター。
【請求項２９】
配列番号１を含む前記合成イネユビキチン３二方向性ポリヌクレオチドプロモーターの３’末端に作動可能に連結された第１の、対象のポリヌクレオチド配列を含む、請求項１９に記載の合成イネユビキチン３二方向性ポリヌクレオチドプロモーター。
【請求項３０】
配列番号１を含む前記合成イネユビキチン３二方向性ポリヌクレオチドプロモーターの５’末端に作動可能に連結された第２の、対象のポリヌクレオチド配列を含む、請求項１９に記載の合成イネユビキチン３二方向性ポリヌクレオチドプロモーター。
【請求項３１】
植物細胞において対象のポリヌクレオチド配列を発現するための方法であって、前記植物細胞内に合成イネユビキチン３二方向性ポリヌクレオチドプロモーターに作動可能に連結された前記対象のポリヌクレオチド配列を導入するステップを含む方法。
【請求項３２】
前記合成イネユビキチン３二方向性ポリヌクレオチドプロモーターに作動可能に連結された前記対象のポリヌクレオチド配列が植物形質転換法により前記植物細胞内に導入される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記植物形質転換法が、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換法、バイオリスティック形質転換法、炭化ケイ素形質転換法、プロトプラスト形質転換法、およびリポソーム形質転換法からなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記対象のポリヌクレオチド配列が前記植物細胞全体を通じて構成的に発現される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記対象のポリヌクレオチド配列が前記植物細胞のゲノム内に安定的に組み入れられる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記トランスジェニック植物細胞が単子葉植物細胞または双子葉植物細胞である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
前記双子葉植物細胞が、シロイヌナズナ（Arabidopsis）植物細胞、タバコ植物細胞、ダイズ植物細胞、キャノーラ植物細胞、およびワタ植物細胞からなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記単子葉植物細胞が、トウモロコシ植物細胞、イネ植物細胞、ヤマカモジグサ（Brachypodium）植物細胞、およびコムギ植物細胞からなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記合成イネユビキチン３二方向性ポリヌクレオチドが、配列番号１に少なくとも９０％の配列同一性を含む、請求項３１に記載の合成イネユビキチン３二方向性ポリヌクレオチドプロモーター。
【請求項４０】
配列番号１を含む前記合成イネユビキチン３二方向性ポリヌクレオチドプロモーターの３’末端に作動可能に連結された第１の、対象のポリヌクレオチド配列を含む、請求項３１に記載の合成イネユビキチン３二方向性ポリヌクレオチドプロモーター。
【請求項４１】
配列番号１を含む前記合成イネユビキチン３二方向性ポリヌクレオチドプロモーターの５’末端に作動可能に連結された第２の、対象のポリヌクレオチド配列を含む、請求項３１に記載の合成イネユビキチン３二方向性ポリヌクレオチドプロモーター。
【請求項４２】
合成イネユビキチン３二方向性ポリヌクレオチドプロモーターを含むトランスジェニック植物細胞。
【請求項４３】
トランスジェニックイベントを含む、請求項４２に記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項４４】
前記トランスジェニックイベントが農学的形質を含む、請求項４３に記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項４５】
前記農学的形質が、殺虫剤抵抗性形質、除草剤耐性形質、窒素利用効率形質、水利用効率形質、栄養価形質、ＤＮＡ結合形質、選択可能マーカー形質、またはその任意の組合せからなる群から選択される、請求項４４に記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項４６】
前記農学的形質が除草剤耐性形質を含む、請求項４４に記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項４７】
前記除草剤耐性形質がａａｄ−１コード配列を含む、請求項４６に記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項４８】
商品生産物を生産する、請求項４２に記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項４９】
前記商品生産物が、タンパク質濃縮物、タンパク質分離物、穀物、ミール、小麦粉、油、または繊維からなる群から選択される、請求項４８に記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項５０】
双子葉植物細胞または単子葉植物細胞からなる群から選択される、請求項４２に記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項５１】
前記単子葉植物細胞がトウモロコシ植物細胞である、請求項５０に記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項５２】
前記合成イネユビキチン３二方向性ポリヌクレオチドが、配列番号１に少なくとも９０％の配列同一性を含む、請求項４２に記載のトランスジェニック植物細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本出願は、「合成二方向性植物プロモーター」についての２０１４年１１月１１日提出の米国特許仮出願第６２／０７８，２１４号明細書の出願日の利益を主張する。
【０００２】
本開示は一般的には植物または植物細胞中でのヌクレオチド配列の転写を促進するための組成物および方法に関する。いくつかの実施形態は、作動可能に連結されたヌクレオチド配列の転写を促進するように植物内で機能する合成イネユビキチン３（Ｒｕｂｉ３）二方向性プロモーターに関する。特定の実施形態は、合成プロモーターを含む方法（例えば、核酸分子を細胞内に導入する）ならびに合成プロモーターを含む細胞、細胞培養物、組織、生物、および生物の部分、ならびにそこから生産される産物に関する。
【背景技術】
【０００３】
多くの植物種は、農学的に望ましい形質または特徴を導入すること、例えば、栄養価品質を改善すること、収量を増やすこと、有害生物もしくは疾患抵抗性を付与すること、乾燥およびストレス耐性を増やすこと、園芸性質（色素沈着および成長などの）を改善すること、除草剤抵抗性を与えること、植物から産業的に有用な化合物および／もしくは材料の生産を可能にする、ならびに／または医薬品の生産を可能にするために他の種由来のトランス遺伝子で形質転換することができる。トランス遺伝子を植物細胞内に導入し、安定的に組み入れられたトランス遺伝子のコピーを含有する稔性トランスジェニック植物をその後回収すれば、望ましい形質または特徴を有するトランスジェニック植物を生産することが可能になる。
【０００４】
遺伝子発現の制御および調節は数多くの機構を通じて起き得る。遺伝子の転写開始は遺伝子発現の支配的な制御機構である。転写の開始は一般に、転写される遺伝子の５’側に隣接しているまたは上流領域に位置しているポリヌクレオチド配列により制御される。これらの配列は集合的にプロモーターと呼ばれる。プロモーターは一般に、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を産生することができるように、ＲＮＡポリメラーゼが転写を開始するためのシグナルを含有している。成熟ｍＲＮＡはリボソームにより転写され、それによってタンパク質を合成する。ＤＮＡ結合タンパク質はプロモーターＤＮＡ配列と特異的に相互作用して転写複合体の形成を促進し、遺伝子発現プロセスを開始する。植物中でトランス遺伝子の発現を駆動する上で機能的である種々の真核生物プロモーターが植物から単離され特徴付けられている。環境刺激、養分可給性、または熱ショック、嫌気状態、もしくは重金属の存在を含む有害条件に応答して遺伝子発現に影響を及ぼすプロモーターが単離され特徴付けられている。発生中にまたは組織もしくは器官特異的な形で遺伝子発現を制御するプロモーターも存在する。さらに、植物中でトランス遺伝子の発現を駆動する上で機能的である細菌およびウイルスから単離された原核生物プロモーターが単離され特徴付けられている。
【０００５】
真核生物において発現の能力を有する典型的なプロモーターは、ミニマルプロモーターおよび他のシスエレメントからなる。ミニマルプロモーターは基本的には、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌＩＩ）、ＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）、およびＴＢＰ関連因子（ＴＡＦ）が結合して転写を開始することができるＴＡＴＡボックス領域である。しかし、大半の例では、ＴＡＴＡモチーフ以外の配列エレメントが正確な転写に必要である。そのような配列エレメント（例えば、エンハンサー）は、多くの場合、位置および／または配向非依存する形で近くの遺伝子の発現の全体レベルを上昇させることが分かっている。いくつかのｐｏｌＩＩ遺伝子の転写開始部位近くの他の配列（例えば、ＩＮＲ配列）は、転写活性化にも寄与する因子に代わりの結合部位を提供し、機能的ＴＡＴＡエレメントを欠くプロモーターにおいて転写のためのコアプロモーター結合部位さえも代わりに提供することもある。Zenzie-Gregory et al. (1992) J, Biol. Chem. 267: 2823-30。
【０００６】
他の遺伝子調節エレメントには、特異的ＤＮＡ結合因子と相互作用する配列が含まれる。これらの配列モチーフはシスエレメントと呼ばれることもあり、通常、位置および配向依存性であるが、遺伝子コード配列の５’側もしくは３’側、またはイントロン中に見出される場合がある。そのようなシスエレメントは、組織特異的または発生特異的転写因子が個別にまたは組み合わせて結合するが、プロモーターの時空間的発現を転写レベルで決定することができる。上流シスエレメント、続いてミニマルプロモーターという配置が典型的には特定のプロモーターの極性を確立する。基礎研究でもバイオテクノロジー応用でもクローニングされ広く使用されてきた植物中のプロモーターは一般に、一方向性であり、その３’末端（すなわち、下流）で融合している１つの遺伝子のみに指示を出す。Xie et al. (2001) Nat. Biotechnol. 19(7):677-9;米国特許第６，３８８，１７０号明細書を参照されたい。
【０００７】
植物プロモーター中で多くのシスエレメント（または「上流調節配列」）が同定されてきた。これらのシスエレメントは作動可能に連結された遺伝子に対してそれが行使する制御の種類は様々である。いくつかのエレメントは環境応答（例えば、温度、湿度、および創傷）に応答して作動可能に連結された遺伝子の転写を増加するように作用する。他のシスエレメントは発生上の合図（例えば、発芽、種子成熟、および開花）に応答する場合もあれば、空間情報（例えば、組織特異性）に応答する場合もある。例えば、Langridge et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3219-23を参照されたい。特定のプロモーターエレメントの制御の種類は典型的にはプロモーターの固有の性質であり、すなわち、そのようなプロモーターの制御下にある異種遺伝子は、プロモーターエレメントが単離された元の天然の遺伝子の制御に従って発現される可能性がある。同文献。これらのエレメントはまた、典型的には、他のエレメントと交換することができ、遺伝子の発現に対するその特徴的な固有の制御を維持する。
【０００８】
代謝工学および形質スタッキングのためには複数の遺伝子を植物内に導入する必要がある場合が多く、その遺伝子は頻繁に同一または相同のプロモーターにより制御される。しかし、相同性ベースの遺伝子サイレンシング（ＨＢＧＳ）が、複数の導入されたトランス遺伝子がその遺伝子を駆動する相同なプロモーターを有するときに生じる可能性がある。Mol et al. (1989) Plant Mol. Biol. 13:287-94。したがって、ＨＢＧＳはトランスジェニック植物において広範に起きることが報告されてきた。例えば、Vaucheret and Fagard (2001) Trends Genet. 17:29-35を参照されたい。ＨＢＧＳという現象を説明するいくつかの機構が提案されているが、その機構すべてが、プロモーター中の配列相同性が細胞認識機構を始動させて、反復遺伝子のサイレンシングを生じるという特長を含んでいる。Matzke and Matzke (1995) 47:23-48; Fire (1999) Trends Genet. 15:358-63; Hamilton and Baulcombe (1999) Science 286:950-2; Steimer et al. (2000) Plant Cell 12:1 165-78。さらに、異なるトランス遺伝子の類似するレベルの発現パターンを得るために同じプロモーターを繰り返し使用すると、反復プロモーター中の競合する転写因子（ＴＦ）結合部位が過剰になることがあり、そのために内在性ＴＦが枯渇して転写が下方調節されることがある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
トランスジェニックイベントの単一遺伝子座内に強く発現する多重遺伝子形質を組み入れるはるかに大きな必要性があることを考慮すると、そのようなトランスジェニックイベントを創製することに関連する技術的課題を減らすことを提供する解決策は重要である。さらに具体的には、トランスジェニック植物においてＨＢＧＳを回避する戦略であって、機能的に等価であるが最小の配列相同性を有する合成プロモーターの開発を含む戦略が望ましい。そのような合成プロモーターが作物植物においてトランス遺伝子を発現するために使用される場合、ＨＢＧＳを回避するまたは減少させるのに役立つことができる。Mourrain et al. (2007) Planta 225(2):365-79; Bhullar et al. (2003) Plant Physiol. 132 :988-98。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
主題の開示の実施形態では、本開示は、イネユビキチン３プロモーターおよびトウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１プロモーター由来の複数のプロモーターエレメントを含む合成イネユビキチン３二方向性ポリヌクレオチドプロモーターに関する。さらなる実施形態では、主題の開示は種々のプロモーターエレメントを含む。したがって、プロモーターエレメントはイントロンを含む。いくつかの例では、プロモーターエレメントは５’−ＵＴＲを含む。さらに、プロモーターエレメントは上流プロモーターエレメントを含む。さらに、プロモーターエレメントはミニマルコアプロモーターを含む。主題の開示の実施形態では、本開示は、トランスジェニック植物細胞を生産するための方法であって、ａ）少なくとも１つの、対象のポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された合成イネユビキチン３二方向性ポリヌクレオチドプロモーターを含む遺伝子発現カセットで植物細胞を形質転換するステップと、ｂ）遺伝子発現カセットを含む形質転換植物細胞を単離するステップと、ｃ）少なくとも１つの、対象のポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された合成イネユビキチン３二方向性ポリヌクレオチドプロモーターを含むトランスジェニック植物細胞を生産するステップとを含む方法に関する。主題の開示の実施形態では、本開示は、植物細胞において対象のポリヌクレオチド配列を発現するための方法であって、合成イネユビキチン３二方向性ポリヌクレオチドプロモーターに作動可能に連結された対象のポリヌクレオチド配列を植物細胞内に導入するステップを含む方法に関する。主題の開示の実施形態では、本開示は、合成イネユビキチン３二方向性ポリヌクレオチドプロモーターを含むトランスジェニック植物細胞に関する。
【００１１】
前述のおよび他の特徴は、付随する図を参照して進むいくつかの実施形態についての以下の詳細な説明からさらに明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ｐＤＡＢ１１３１２２のプラスミドマップを示す図である。
【図２】ｐＤＡＢ１１３１４２のプラスミドマップを示す図である。
【図３】構築物ｐＤＡＢ１１３１２２またはｐＤＡＢ１１３１４２のいずれかで形質転換されたコーン植物のＶ６葉組織におけるＣｒｙ３４発現のグラフである。
【図４】構築物ｐＤＡＢ１１３１２２またはｐＤＡＢ１１３１４２のいずれかで形質転換されたコーン植物のＶ６葉組織におけるＣｒｙ３５発現のグラフである。
【図５】構築物ｐＤＡＢ１１３１２２またはｐＤＡＢ１１３１４２のいずれかで形質転換されたコーン植物のＶ６葉組織におけるＡＡＤ−１発現のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
Ｉ．いくつかの実施形態の概要
トランスジェニック植物の開発はますます複雑になりつつあり、典型的には単一遺伝子座内に複数のトランス遺伝子をスタックさせる必要がある。Xie et al. (2001) Nat. Biotechnol. 19(7):677-9を参照されたい。それぞれのトランス遺伝子が通常、発現のための独特のプロモーターを必要とするので、複数のプロモーターが１つの遺伝子スタック内で異なるトランス遺伝子を発現する必要がある。遺伝子スタックのサイズを増やすことに加えて、これは頻繁に、異なるトランス遺伝子の類似するレベルの発現パターンを得るためには同じプロモーターを繰り返し使用することになる。このアプローチは、複数のトランス遺伝子が同じプロモーターにより発現されると遺伝子サイレンシングまたはＨＢＧＳが生じることがあるために問題になる場合が多い。反復プロモーター中の競合する転写因子（ＴＦ）結合部位が過剰になるために内在性ＴＦが枯渇し転写下方調節が生じることがある。トランス遺伝子のサイレンシングは、トランス遺伝子を発現するために生産されるトランスジェニック植物の性能には望ましくない。トランス遺伝子内の反復配列は多くの場合、遺伝子座内相同組換えをもたらし、ポリヌクレオチド再編成および望ましくない表現型または農業生産力を生じる。
【００１４】
基礎研究またはバイオテクノロジー応用のために使用される植物プロモーターは一般に、一方向性であり、その３’末端（下流）で融合された１つの遺伝子のみを調節する。種々の所望の形質または特徴を有するトランスジェニック植物を生産するため、所望の形質および特徴をコードするトランス遺伝子の発現を駆動するために配置されるプロモーターの数を減らすのは有用だと考えられる。特に、代謝工学および形質スタッキングのために複数のトランス遺伝子を植物内に導入する必要があり、それによって複数のトランス遺伝子の発現を駆動させる複数のプロモーターを必要とする適用ではそうである。プロモーターに隣接する２つのトランス遺伝子の発現を駆動させることが可能な単一イネユビキチン３合成二方向性プロモーターを開発することにより、トランスジェニック作物の成育に必要なプロモーターの総数を減らし、それによって同じプロモーターの繰り返し使用を減らし、トランスジェニック構築物のサイズを減少させ、および／またはＨＢＧＳの可能性を減少させることができる。そのようなプロモーターは、既知のシスエレメントをＤＮＡの新規のもしくは合成ストレッチに導入することにより、または代わりに、１つのプロモーターのドメインを他の異種プロモーター由来の機能的に等価なドメインで置き換える「ドメインスワッピング（domain swapping）」により生成することが可能である。
【００１５】
本明細書の実施形態は、１つのプロモーターが、プロモーターのそれぞれの末端に１つずつ、２つの遺伝子の発現を指示することができるように、Oryza sativa（イネ）ユビキチン３遺伝子（例えば、Ｒｕｂｉ３）由来の一方向性プロモーターを使用して合成イネユビキチン３二方向性プロモーターを設計した工程を利用する。合成イネユビキチン３二方向性プロモーターを使えば、当業者は同じプロモーターの繰り返し使用を減らしトランスジェニック構築物のサイズを減少させつつ植物細胞および植物内にトランス遺伝子をスタックさせることができる。さらに、単一の合成イネユビキチン３二方向性プロモーターを用いて２つの遺伝子の発現を調節すれば、例えば、２つの遺伝子がそれぞれ宿主において単一の形質に貢献している場合に有用であり得るなどの、同じ条件下で２つの遺伝子を同時発現する能力も提供できる。植物においてプロモーターの二方向性機能の使用は、トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１プロモーター（国際出願第２０１３／１０１３４３号パンフレット）、ＣａＭＶ３５プロモーター（Barfield and Pua (1991) Plant Cell Rep. 10(6-7):308-14; Xie et al. (2001),上記）、およびｍａｓプロモーター（Velten et al. (1984) EMBO J. 3(12):2723-30; Langridge et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3219-23）を含む、いくつかの場合で報告されている。
【００１６】
植物遺伝子における遺伝子発現の転写開始および調整は、プロモーター内に集合的に配置されている種々のＤＮＡ配列エレメントにより指示される。真核生物プロモーターはミニマルコアプロモーターエレメント（ｍｉｎＰ）、およびさらに上流調節配列（ＵＲＳ）からなる。コアプロモーターエレメントは、転写の正確な開始を指示するのに十分な最小ストレッチの連続ＤＮＡ配列である。植物中のコアプロモーターは、ＣＡＡＴおよびＴＡＴＡボックスなどの転写の開始と関連するカノニカル領域も含む。ＴＡＴＡボックスエレメントは通常、転写の開始部位のおおよそ２０から３５ヌクレオチド上流に位置している。
【００１７】
ｍｉｎＰの活性化はＵＲＳに依存しており、このＵＲＳには種々のタンパク質が結合してその後、転写開始複合体と相互作用する。ＵＲＳは、ＵＲＳを含むプロモーターの時空間的発現パターンを決定するＤＮＡ配列からなる。プロモーターの極性は多くの場合、ｍｉｎＰの配向により決定され、ＵＲＳは双極性である（すなわち、ＵＲＳはその配向とは無関係に機能する）。
【００１８】
いくつかの実施形態の特定の例では、元々トウモロコシ（Zea mays）に由来する改変トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１プロモーター（ＺｍＵｂｉ１）のミニマルコアプロモーターエレメント（ｍｉｎＵｂｉ１０Ｐ）を使用して、既に記載されている二方向性プロモーターという観点において固有の発現制御特徴を提供するように植物中で機能する合成イネユビキチン３二方向性プロモーターを工学的に作製する。実施形態には、天然のトウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１プロモーターに由来するミニマルコアプロモーターエレメントヌクレオチド配列（ｍｉｎＰＺｍＵｂｉ１）をさらに含む合成イネユビキチン３二方向性プロモーターが含まれる。
【００１９】
トウモロコシ（Zea mays）ｃ．ｖ．Ｂ７３に元々由来するＺｍＵｂｉ１プロモーターは、転写開始部位の約８９９塩基５’側内およびさらに転写開始部位の約１０９３塩基３’側内のトウモロコシゲノムに位置する配列を含む。Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18(4):675-89（トウモロコシ（Zea mays）ｃ．ｖ．Ｂ７３  ＺｍＵｂｉ１遺伝子を説明している）。いくつかの実施例で使用されるＢ７３に由来する改変ＺｍＵｂｉ１プロモーターは、おおよそ２ｋｂプロモーターであり、ＴＡＴＡボックス；２つの重複熱ショックコンセンサスエレメント；本明細書ではＺｍＵｂｉ１エキソンと呼ばれる、転写開始部位に直に隣接する８２または８３ヌクレオチド（基準鎖に応じて）リーダー配列；および１０１５〜１０１６ヌクレオチドイントロンを含有する。トウモロコシ（Zea）種およびトウモロコシ（Zea mays）遺伝子型に由来する他のトウモロコシユビキチンプロモーターバリアントは、ＴＡＴＡエレメントおよび上流熱ショックコンセンサスエレメントからなるｍｉｎＰエレメント周辺に高度な配列保存を示すことがある。したがって、本発明の実施形態は、合成二方向性植物プロモーターを構築するためのミニマルコアプロモーターエレメントとしてのＺｍＵｂｉ１プロモーターのこの短い（約２００ｎｔ）高度に保存された領域（例えば、配列番号２）の使用により例示される。
【００２０】
イネ（Oryza sativa）に元々由来するイネユビキチン３プロモーターは、転写開始部位の約１９９０塩基５’側内のイネゲノムに位置する配列を含む。E Sivamani, and R Qu (2006) Expression enhancement of a rice polyubiquitin promoter. Plant Molecular Biology 60: 225-239。いくつかの実施例で使用されるイネ（Oryza sativa）由来の改変イネビキチン−３プロモーターはおおよそ２ｋｂプロモーターであり、ＴＡＴＡボックス、５’ＵＴＲ／イントロン配列、およびイネビキチン−３コード配列の開始に位置する下流エンハンシングエレメントを含有する。イネ（Oryza）種およびイネ（Oryza sativa）遺伝子型由来の他のイネユビキチン３プロモーターバリアントはこれらのプロモーターエレメント周辺で高度な配列保存を示すことがある。
【００２１】
ＩＩ．略字
ＡｔＵｂｉ１０    シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ユビキチン１０
ＢＣＡ            ビシンコニン酸
ＣａＭＶ          カリフラワーモザイクウイルス
ＣｓＶＭＶ        キャッサバ葉脈モザイクウイルス
ＣＴＰ            葉緑体輸送ペプチド
ＨＢＧＳ          相同性ベースの遺伝子サイレンシング
ｍｉｎＵｂｉ１Ｐ  ＺｍＵｂｉ１ミニマルコアプロモーター
ＯＬＡ            オリゴライゲーション増幅
ＰＣＲ            ポリメラーゼ連鎖反応
ＲＣＡ            ローリングサークル増幅
ＲＵｂｉ３        イネユビキチン３
ＲＴ−ＰＣＲ      逆転写酵素ＰＣＲ
ＳＮｕＰＥ        単一ヌクレオチドプライマー伸長
ＵＲＳ            上流調節配列
ＺｍＵｂｉ１      トウモロコシ（Zea Mays）ユビキチン１
【００２２】
ＩＩＩ．用語
本出願全体を通じて、いくつかの用語が使用される。そのような用語に与えられる範囲を含め、明細書および特許請求の範囲についての明確で一貫した理解を提供するために、以下の定義が提供される。
【００２３】
イントロン：本明細書で使用されるように、用語「イントロン」とは、遺伝子（または対象の発現されるポリヌクレオチド配列）に含まれ転写されるが翻訳されない任意の核酸配列を指す。イントロンにはＤＮＡの発現される配列内の非翻訳核酸配列、ならびにそれから転写されるＲＮＡ分子中の対応する配列が含まれる。
【００２４】
単離された：「単離された」生物学的成分（核酸またはタンパク質などの）は、成分の化学的または機能的変化をもたらしつつ（例えば、核酸は、その核酸を染色体中の残りのＤＮＡに接続している化学結合を壊すことにより染色体から単離されることがある）、その成分が天然に存在する生物の細胞中の他の生物学的成分（すなわち、他の染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにタンパク質）から実質的に分離されている、それから離れて生産されている、またはそれから離れて精製されている。「単離され」ている核酸分子およびタンパク質には、標準精製法により精製された核酸分子およびタンパク質が含まれる。この用語は、宿主細胞において組換え発現により調製された核酸およびタンパク質、ならびに、化学的に合成された核酸分子、タンパク質、およびペプチドも包含する。
【００２５】
遺伝子発現：核酸転写単位（例えば、ゲノムＤＮＡを含む）のコードされた情報が細胞における作動部分、非作動部分、または構造的部分に変換されるプロセスで、タンパク質の合成を含む場合が多い。遺伝子発現は外部シグナル、例えば、遺伝子発現を増加させるまたは減少させる薬剤への細胞、組織、または生物の曝露により影響を受けることがある。遺伝子の発現はＤＮＡからＲＮＡからタンパク質までの経路の任意の場所で調節することも可能である。遺伝子発現の調節は、例えば、転写、翻訳、ＲＮＡ輸送およびプロセッシングに作用する制御、ｍＲＮＡなどの中間分子の分解を通じて、または特定のタンパク質分子が作られた後におけるその活性化、不活性化、区画化、もしくは分解を通じて、またはその組合せにより起こる。遺伝子発現は、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、ウェスタンブロット、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｓｉｔｕ、もしくはｉｎ  ｖｉｖｏタンパク質活性アッセイ（複数可）を限定せずに含む、当技術分野で公知のいかなる方法によってもＲＮＡレベルでまたはタンパク質レベルで測定することが可能である。
【００２６】
相同性ベースの遺伝子サイレンシング：本明細書で使用されるように、「相同性ベースの遺伝子サイレンシング」（ＨＢＧＳ）は転写遺伝子サイレンシングと転写後遺伝子サイレンシングの両方を含む総称である。非連結サイレンシング遺伝子座による標的遺伝子座のサイレンシングは、それぞれプロモーターまたは転写配列に対応した二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の産生のために転写開始（転写遺伝子サイレンシング；ＴＧＳ）またはｍＲＮＡ分解（転写後遺伝子サイレンシング；ＰＴＧＳ）から生じることがある。異なる細胞成分がそれぞれのプロセスに関与していることから、ｄｓＲＮＡ誘導ＴＧＳおよびＰＴＧＳはおそらく、古代の共通の機構の多様化から生じていることが示唆される。しかし、ＴＧＳとＰＴＧＳの厳密な比較を成し遂げるのは、その比較が一般に異なるサイレンシング遺伝子座の分析に頼っているために困難であった。異なる標的遺伝子のプロモーターと転写配列に対応したｄｓＲＮＡの産生のために、ＴＧＳとＰＴＧＳの両方を始動させる単一トランス遺伝子遺伝子座を本発明者らは記載する。Mourrain et al. (2007) Planta 225:365-79。ｓｉＲＮＡが相同配列上でＴＧＳおよびＰＴＧＳを始動させる実際の分子である可能性が高く、ｓｉＲＮＡはこのモデルでは、トランス遺伝子配列のメチル化の内在性プロモーター内への伝播を通じて相同配列のサイレンシングおよびメチル化をシスでおよびトランスで始動させると考えられる。同文献。
【００２７】
核酸分子：本明細書で使用されるように、用語「核酸分子」（または「核酸」もしくは「ポリヌクレオチド」）とは、ポリマー形態のヌクレオチドを指し、これはＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成形態および上記の混合ポリマーのセンス鎖とアンチセンス鎖の両方を含むことができる。ヌクレオチドとは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはいずれかの種類のヌクレオチドの改変型を指す。本明細書で使用される「核酸分子」は「核酸」および「ポリヌクレオチド」と同義である。核酸分子は、別途明記されていなければ、通常は少なくとも１０塩基長である。この用語は未定の長さのＲＮＡまたはＤＮＡの分子を指すこともできる。この用語は一本および二本鎖形態のＤＮＡを含む。核酸分子は、天然に存在するおよび／または天然に存在しないヌクレオチド連結により互いに連結された天然に存在するおよび改変ヌクレオチドのいずれかまたは両方を含むことができる。
【００２８】
核酸分子は、当業者であれば容易に認識するように、化学的にもしくは生化学的に修飾することができる、または非天然のもしくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含有することができる。そのような修飾は、例えば、標識、メチル化、天然に存在するヌクレオチドのうちの１つまたは複数の類似物での置換、ヌクレオチド間修飾（例えば、電荷を帯びていない連結：例えば、メチルホスホン酸、ホスホトリエステル、ホスホロアミド酸、カルバミン酸など；電荷を帯びた連結：例えば、ホスホロチオエート、ジチオリン酸など；ペンデント部分：例えば、ペプチド；インターカレーター：例えば、アクリジン、ソラレンなど；キレート剤；アルキル化剤；および改変された連結：例えば、アルファアノマー核酸など）が含まれる。用語「核酸分子」には、一本鎖、二本鎖、部分的二重鎖、三重鎖、ヘアピン型の、環状の、およびパドロックド立体構造を含む、任意のトポロジカル立体構造も含まれる。
【００２９】
転写はＤＮＡ鎖に沿って５’から３’様式で進行する。これは、ＲＮＡは伸長する鎖の３’末端へのリボヌクレオチド−５’−三リン酸の連続付加（ピロリン酸を除去しなければならない）により作られることを意味する。線形または環状核酸分子では、個別のエレメント（例えば、特定のヌクレオチド配列）は、それがさらなるエレメントから５’方向の同じ核酸に結合しているまたは結合していると考えられる場合、さらなるエレメントに対して、「上流」または「５’側」にあると呼ぶことができる。同様に、個別のエレメントは、それがさらなるエレメントから３’方向の同じ核酸に結合しているまたは結合していると考えられる場合、そのさらなるエレメントに対して、「下流」または「３’側」にあることができる。
【００３０】
本明細書で使用される塩基の「位置」とは、指定された核酸内の所与の塩基またはヌクレオチド残基がどこにあるかを指す。指定された核酸は基準核酸との整列（下参照）により定義することができる。
【００３１】
ハイブリダイゼーション：オリゴヌクレオチドおよびその類似物は、ワトソン−クリック、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン水素結合を含む水素結合により相補的塩基間でハイブリダイズする。一般に、核酸分子は、ピリミジン（シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）、およびチミン（Ｔ））またはプリン（アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ））のいずれかである窒素塩基からなる。これらの窒素塩基はピリミジンとプリンの間で水素結合を形成し、ピリミジンのプリンへの結合は「塩基対合」と呼ばれる。さらに具体的には、ＡはＴまたはＵに水素結合し、ＧはＣに結合する。「相補的な」とは２つの異なる核酸配列または同じ核酸配列の２つの異なる領域間で起こる塩基対合を指す。
【００３２】
「特異的にハイブリダイズ可能な」および「特異的に相補的な」は、オリゴヌクレオチドとＤＮＡまたはＲＮＡ標的の間で安定した特異的な結合が起きるのに十分な程度の相補性を示す用語である。オリゴヌクレオチドは特異的にハイブリダイズ可能であるためにはその標的配列に１００％相補的である必要はない。オリゴヌクレオチドの標的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子への結合により標的ＤＮＡまたはＲＮＡの正常な機能が妨げられ、特異的結合が望ましい条件下で、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイまたは系の場合の生理的条件下で、オリゴヌクレオチドの非標的配列への非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性がある場合には、オリゴヌクレオチドは特異的にハイブリダイズ可能である。そのような結合は特異的ハイブリダイゼーションと呼ばれる。
【００３３】
特定の厳密度を生じるハイブリダイゼーション条件は、選択されたハイブリダイゼーション方法の性質ならびにハイブリダイズしている核酸配列の組成および長さに応じて変動する。一般に、ハイブリダイゼーションの温度およびハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度（特に、Ｎａ＋および／またはＭｇ２＋濃度）がハイブリダイゼーションの厳密性に寄与するが、洗浄回数も厳密性に影響する。特定の厳密度を達成するのに必要なハイブリダイゼーション条件に関する計算はSambrook et al. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, chs. 9 and 11で考察されている。
【００３４】
本明細書で使用されるように、「厳密な条件」とは、ハイブリダイゼーション分子とＤＮＡ標的の間でのミスマッチが５０％未満である場合にのみハイブリダイゼーションが起こる条件を包含する。「厳密な条件」には、さらに特定のレベルの厳密性が含まれる。したがって、本明細書で使用されるように、「中程度の厳密性」条件とは、配列ミスマッチが５０％を超える分子ではハイブリダイズしない条件であり、「高厳密性」の条件とはミスマッチが２０％を超える配列ではハイブリダイズしない条件、「超高厳密性」の条件とはミスマッチが１０％を超える配列ではハイブリダイズしない条件である。
【００３５】
特定の実施形態では、厳密な条件は、６５℃でのハイブリダイゼーション、続いて６５℃での０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳを用いた４０分間の洗浄を含むことが可能である。
【００３６】
以下は代表的、非限定的ハイブリダイゼーション条件である。
超高厳密性：５×ＳＳＣ緩衝液中６５℃、１６時間のハイブリダイゼーション；それぞれ２×ＳＳＣ緩衝液中室温で１５分間の２度の洗浄；およびそれぞれ０．５×ＳＳＣ緩衝液中６５℃、２０分間の２度の洗浄。
高厳密性：５×〜６×ＳＳＣ緩衝液中６５〜７０℃、１６〜２０時間のハイブリダイゼーション；それぞれ２×ＳＳＣ緩衝液中室温で５〜２０分間の２度の洗浄；およびそれぞれ１×ＳＳＣ緩衝液中５５〜７０℃、３０分間の２度の洗浄。
中程度の厳密性：６×ＳＳＣ緩衝液中室温から５５℃で１６〜２０時間のハイブリダイゼーション；それぞれ２×〜３×ＳＳＣ緩衝液中室温から５５℃で２０〜３０分間の少なくとも２度の洗浄。
【００３７】
特定の実施形態では、特異的にハイブリダイズ可能な核酸分子は超高厳密性ハイブリダイゼーション条件下で結合したままでいることが可能である。これらのおよびさらなる実施形態では、特異的にハイブリダイズ可能な核酸分子は高厳密性ハイブリダイゼーション条件下で結合したままでいることが可能である。これらのおよびさらなる実施形態では、特異的にハイブリダイズ可能な核酸分子は中程度の厳密性ハイブリダイゼーション条件下で結合したままでいることが可能である。
【００３８】
オリゴヌクレオチド：オリゴヌクレオチドは短い核酸ポリマーである。オリゴヌクレオチドはより長い核酸セグメントの切断により、または個々のヌクレオチド前駆体を重合化することにより形成することができる。自動合成装置を使えば、数百塩基対長までのオリゴヌクレオチドの合成が可能になる。オリゴヌクレオチドは相補的ヌクレオチド配列に結合することができるので、ＤＮＡまたはＲＮＡを検出するためのプローブとして使用することができる。ＤＮＡで構成されたオリゴヌクレオチド（オリゴデオキシリボヌクレオチド）は、小さなＤＮＡ配列を増幅するための技法であるＰＣＲにおいて使用することができる。ＰＣＲでは、オリゴヌクレオチドは典型的には「プライマー」と呼ばれ、このプライマーによりＤＮＡポリメラーゼはオリゴヌクレオチドを伸長して相補鎖を複製することが可能になる。
【００３９】
配列同一性：本明細書で使用される用語「配列同一性」または「同一性」とは、２つの核酸またはポリペプチド配列という文脈では、特定の比較窓にわたって最大一致を求めて整列させた場合同じである２つの配列中の残基を指す。
【００４０】
本明細書で使用されるように、用語「配列同一性のパーセンテージ」とは、２つの最適に整列された配列（例えば、核酸配列およびアミノ酸配列）を比較窓にわたって比較することにより決定される値を指すことがあり、比較窓内の配列の一部が２つの配列の最適整列のための基準配列（付加も欠失も含まない）と比べて付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含むことがある。パーセンテージは、両方の配列に同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が存在する位置の数を決定して、マッチした位置の数を得て、マッチした位置の数を比較窓中の位置の総数で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることにより計算される。
【００４１】
比較するために配列を整列させる方法は当技術分野では周知である。種々のプログラムおよび整列アルゴリズムが、例えば、Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444; Higgins and Sharp (1988) Gene 73:237-44; Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5: 151-3; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16: 10881-90; Huang et al. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-65; Pearson et al. (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-31; Tatiana et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50に記載されている。配列整列法および相同性計算の詳細な考察は、例えば、Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10に見出すことができる。
【００４２】
国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ；Altschul et al. (1990)）は、いくつかの配列解析プログラムと接続して使用するための、国立バイオテクノロジー情報センター（Bethesda、MD）およびインターネット上を含むいくつかの供給源から入手可能である。このプログラムを使用して配列同一性を決定する方法の説明は、インターネット上のＢＬＡＳＴの「ｈｅｌｐ」セクション下で入手可能である。核酸配列の比較では、ＢＬＡＳＴ（Ｂｌａｓｔｎ）プログラムの「Ｂｌａｓｔ２配列」機能はデフォルトパラメータを使用して用いることができる。基準配列に対してはるかに大きな類似性のある核酸配列は、この方法によって評価する場合、パーセンテージ同一性の増加を示すことになる。
【００４３】
作動可能に連結された：第１の核酸配列は、その第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的な関係にある場合、第２の核酸配列と作動可能に連結している。例えば、プロモーターは、そのプロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、そのコード配列と作動可能に連結している。組換え的に産生される場合、作動可能に連結された核酸配列は一般に連続しており、必要に応じて、同じリーディングフレームに２つのタンパク質コード領域をつなぎ合わせる。しかし、エレメントは作動可能に連結されるためには連続している必要はない。
【００４４】
プロモーター：ＤＮＡのうち一般に上流（遺伝子の５’領域の方向）に位置しており転写に必要な領域。プロモーターはそれが制御している遺伝子の適切な活性化または抑制を可能にすることができる。プロモーターは、転写因子により認識される特異的な配列を含有することができる。これらの因子はプロモーターＤＮＡ配列に結合して、遺伝子のコード領域からＲＮＡを合成する酵素であるＲＮＡポリメラーゼを動員することができる。
【００４５】
形質転換された：核酸分子が細胞ゲノム内に組み込まれることによりまたはエピソーム複製により、その核酸分子が細胞によって安定的に複製される場合、細胞内に形質導入される核酸分子により細胞は「形質転換され」る。本明細書で使用されるように、用語「形質転換」は核酸分子をそのような細胞内に導入することが可能となるあらゆる技法を包含する。例には、ウイルスベクターを用いたトランスフェクション；プラスミドベクターを用いた形質転換；エレクトロポレーション（Fromm et al. (1986) Nature 319:791-3）；リポフェクション（Feigner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7）；マイクロインジェクション（Mueller et al. (1978) Cell 15:579-85）；アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介移入（Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7）；直接ＤＮＡ取込み；ウィスカー媒介形質転換；および微粒子銃（Klein et al. (1987) Nature 327:70）が含まれるが、これらに限定されない。
【００４６】
トランス遺伝子：外来性核酸配列。一実施例では、トランス遺伝子は遺伝子配列（例えば、除草剤抵抗性遺伝子）、産業的にもしくは薬学的に有用な化合物をコードする遺伝子、または望ましい農業形質をコードする遺伝子である。さらに別の実施例では、トランス遺伝子はアンチセンス核酸配列であり、このアンチセンス核酸配列の発現が標的核酸配列の発現を阻害する。トランス遺伝子はトランス遺伝子に作動可能に連結した調節配列（例えば、プロモーター）を含有することができる。いくつかの実施形態では、対象の核酸配列はトランス遺伝子である。しかし、他の実施形態では、対象のポリヌクレオチド配列は、内在性核酸配列の追加のゲノムコピーが望ましい内在性核酸配列、または宿主生物における標的核酸分子の配列に関してアンチセンス配向であるポリヌクレオチド配列である。
【００４７】
トランスジェニックイベント：トランスジェニック「イベント」は、異種ＤＮＡ、すなわち、対象のトランス遺伝子を含む核酸構築物を用いた植物細胞の形質転換、トランス遺伝子の植物のゲノム内への挿入から生じる植物個体群の再生、および特定のゲノム位置への挿入により特徴付けられる特定の植物の選択により生じる。用語「イベント」とは、異種ＤＮＡを含む最初の形質転換体およびその形質転換体の子孫を指す。用語「イベント」とは、形質転換体とゲノム／トランス遺伝子ＤＮＡを含む別の変種との間での性的異系交雑により生み出される子孫も指す。反復親への反復戻し交雑の後でさえ、形質転換された親由来の挿入されたトランス遺伝子ＤＮＡおよび隣接ゲノムＤＮＡ（ゲノム／トランス遺伝子ＤＮＡ）は交雑種の子孫に同じ染色体位置で存在する。用語「イベント」とは、挿入されたＤＮＡを含む１つの親系統（例えば、最初の形質転換体と自家受粉から生じる子孫）と挿入されたＤＮＡを含有しない親系統の性的交雑の結果として対象のトランス遺伝子を含む挿入されたＤＮＡを受ける子孫に移入されると予想される挿入されたＤＮＡおよび挿入されたＤＮＡに直に隣接するフランキングゲノム配列を含む最初の形質転換体およびその子孫由来のＤＮＡも指す。
【００４８】
ベクター：細胞内に導入され、それによって形質転換細胞を生産する核酸分子。ベクターは、複製起点などの、宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含むことができる。例には、外来性ＤＮＡを細胞内に運ぶプラスミド、コスミド、バクテリオファージ、またはウイルスが含まれるが、これらに限定されない。ベクターは、１つもしくは複数の遺伝子、アンチセンス分子、および／または選択可能マーカー遺伝子ならびに当技術分野では公知の他の遺伝子エレメントを含むことも可能である。ベクターは、細胞に形質導入する、細胞を形質転換する、または細胞に感染し、それによって細胞にベクターによりコードされている核酸分子および／またはタンパク質を発現させることができる。ベクターは、場合により、核酸分子の細胞内への侵入を助ける材料（例えば、リポソーム、タンパク質コーディングなど）を含んでいてもよい。
【００４９】
別途具体的に説明されていなければ、本明細書で使用される専門用語および科学用語はすべて本開示が属する分野の当業者であれば一般に理解しているのと同じ意味を有する。分子生物学における一般的用語の定義は、例えば、Lewin, Genes V, Oxford University Press, 1994 (ISBN 0- 19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-021 82-9); およびMeyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)に見出すことができる。
【００５０】
本明細書で使用されるように、冠詞「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が別途明白におよび明確に指示していなければ複数の参照を含む。
【００５１】
ＩＶ．合成二方向性プロモーター、ＲＵｂｉ３、およびそれを含む核酸
本開示は二方向性プロモーターとして機能することができる合成ヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。いくつかの実施形態では、合成二方向性プロモーターは１つまたは２つの、対象のポリヌクレオチド配列（複数可）に作動可能に連結することができる。例えば、合成イネユビキチン３二方向性プロモーターは、対象のヌクレオチド配列（複数可）の少なくとも１つ（例えば、１つまたは両方）の転写を調節するように、遺伝子をコードする１つまたは２つの、対象のポリヌクレオチド配列（複数可）（例えば、プロモーターのそれぞれの末端に１つずつ、２つの遺伝子）に作動可能に連結することができる。いくつかの実施形態では、イネユビキチン３プロモーター由来のＵＲＳを合成イネユビキチン３二方向性プロモーターに組み込むことにより、特定の発現および調節パターン（例えば、イネユビキチン３プロモーターの制御下の遺伝子により示されるパターンなどの）を、合成イネユビキチン３二方向性プロモーターに作動可能に連結されている対象のポリヌクレオチド配列に関して達成することができる。
【００５２】
本発明のいくつかの実施形態は、一方向性トウモロコシユビキチン１遺伝子（ＺｍＵｂｉ１）プロモーター由来のミニマルコアプロモーターエレメントを天然のプロモーターの分子文脈とは異なる分子文脈に組み込んで合成二方向性プロモーターを工学的に作製することにより本明細書中に例示される。このミニマルコアプロモーターエレメントは本明細書では「ｍｉｎＵｂｉ１Ｐ」と呼ばれ、おおよそ２００ｎｔ長である。複数のトウモロコシ（Zea）種およびトウモロコシ（Z. mays）遺伝子型由来のｍｉｎＵｂｉ１Ｐエレメントの塩基配列決定および解析により、機能的ｍｉｎＵｂｉ１Ｐエレメントは高度に保存されており、したがって、ｍｉｎＵｂｉ１Ｐエレメントが、例えば、配列番号２のｍｉｎＵｂｉ１Ｐエレメントに対して少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、および／または少なくとも約１００％配列同一性を共有している場合、転写のイニシエータとしてその機能を保持できることが明らかにされた。本発明のいくつかの実施形態において有用であり得るｍｉｎＵｂｉ１Ｐエレメントの特徴は、例えば、限定せずに、ヌクレオチド配列の前述の高度な保存、少なくとも１つのＴＡＴＡボックスの存在、および／または少なくとも１つ（例えば、２つ）の熱ショックコンセンサスエレメント（複数可）の存在を含むことができる。特定のｍｉｎＵｂｉ１Ｐエレメントでは、１つよりも多い熱ショックコンセンサスエレメントがｍｉｎＵｂｉ１Ｐ配列内で重複していることがある。
【００５３】
実施形態では、ｍｉｎＵｂｉ１Ｐエレメントを天然のプロモーター（すなわち、イネユビキチン３）の分子文脈とは異なる分子文脈に組み込んで合成二方向性プロモーターを工学的に作製するプロセスは、イネユビキチン３プロモーターの残りの配列に関してｍｉｎＵｂｉ１Ｐエレメントの配向を逆にしたままで、ｍｉｎＵｂｉ１Ｐエレメントをイネユビキチン３プロモーター核酸内に組み込むことを含むことができる。したがって、合成イネユビキチン３二方向性プロモーターは、それがイネユビキチン３プロモーターヌクレオチド配列の３’側に位置している対象のヌクレオチド配列に作動可能に連結されるように、イネユビキチン３プロモーターヌクレオチド配列の３’側に位置し、イネユビキチン３プロモーターヌクレオチド配列に関して逆の配向であるｍｉｎＵｂｉ１Ｐミニマルコアプロモーターエレメントを含むことができる。例えば、ｍｉｎＵｂｉ１Ｐエレメントはイネユビキチン３プロモーターの３’末端に逆の配向で組み込むことができる。
【００５４】
合成二方向性イネユビキチン３プロモーターは、ｍｉｎＵｂｉ１Ｐエレメントと天然のイネユビキチン３プロモーターのエレメントに加えて、１つまたは複数の追加の配列エレメントも含むことができる。いくつかの実施形態では、合成二方向性イネユビキチン３プロモーターは、プロモーターＵＲＳ、エキソン（例えば、リーダーまたはシグナルペプチド）、イントロン、スペーサー配列、および／または前述のいずれかのうちの１つまたは複数の組合せを含むことができる。例えば、限定せずに、合成二方向性イネユビキチン３プロモーターは、イネユビキチン３またはＺｍＵｂｉ１プロモーター由来のＵＲＳ配列、イネユビキチン３またはＺｍＵｂｉ１遺伝子由来のイントロン、イネユビキチン３またはＺｍＵｂｉ１遺伝子由来のリーダーペプチドをコードするエキソン、イネユビキチン３またはＺｍＵｂｉ１遺伝子由来のイントロン、およびこれらの組合せを含むことができる。
【００５５】
合成二方向性イネユビキチン３プロモーターは、ｍｉｎＵＢｉ１ＰエレメントとｍｉｎＵｂｉ１Ｐを含む天然のプロモーターイネユビキチン３のエレメントに加えて、１つまたは複数の追加の配列エレメントも含むことができる。いくつかの実施形態では、合成二方向性イネユビキチン３プロモーターは、プロモーターＵＲＳ、エキソン（例えば、リーダーまたはシグナルペプチド）、イントロン、スペーサー配列、および／または前述のいずれかのうちの１つまたは複数の組合せを含むことができる。例えば、限定せずに、合成二方向性イネユビキチン３プロモーターは、トウモロコシ（Zea Mays）ユビキチン１プロモーター由来のＵＲＳ配列、ＡＤＨ遺伝子由来のイントロン、トウモロコシ（Zea Mays）ユビキチン遺伝子由来のリーダーペプチドをコードするエキソン、トウモロコシ（Zea Mays）ユビキチン遺伝子由来のイントロン、およびこれらの組合せを含むことができる。
【００５６】
プロモーターＵＲＳを含むプロモーターのいくつかの実施形態では、ＵＲＳは合成プロモーターに特定の調節特性を付与するように選択することができる。公知のプロモーターは、それが作動可能に連結された遺伝子に対して行使する制御の種類（例えば、環境応答、発生合図、および空間情報）のばらつきが大きく、異種プロモーターに取り込まれるＵＲＳは典型的には、そのＵＲＳがその天然のプロモーターと作動可能に連結された遺伝子（複数可）に関して示す制御の種類を維持する。Langridge et al. (1989)上記。既に特徴付けられており、いくつかの実施形態に従う合成二方向性イネユビキチン３プロモーター内に含まれるＵＲＳを含有することがある真核生物プロモーターの例には、例えば、限定せずに、米国特許第６，４３７，２１７号明細書（トウモロコシＲＳ８１プロモーター）；米国特許第５，６４１，８７６号明細書（イネアクチンプロモーター）；米国特許第６，４２６，４４６号明細書（トウモロコシＲＳ３２４プロモーター）；米国特許第６，４２９，３６２号明細書（トウモロコシＰＲ−１プロモーター）；米国特許第６，２３２，５２６号明細書（トウモロコシＡ３プロモーター）；米国特許第６，１７７，６１１号明細書（構成的トウモロコシプロモーター）；米国特許第６，４３３，２５２号明細書（トウモロコシＬ３オレオシンプロモーター）；米国特許第６，４２９，３５７号明細書（イネアクチン２プロモーター、およびイネアクチン２イントロン）；米国特許第５，８３７，８４８号明細書（根特異的プロモーター）；米国特許第６，２９４，７１４号明細書（光誘発性プロモーター）；米国特許第６，１４０，０７８号明細書（塩誘発性プロモーター）；米国特許第６，２５２，１３８号明細書（病原菌誘発性プロモーター）；米国特許第６，１７５，０６０号明細書（亜リン酸欠損誘発性プロモーター）；米国特許第６，３８８，１７０号明細書（二方向性プロモーター）；米国特許第６，６３５，８０６号明細書（ガンマコイキシン（gamma-coixin）プロモーター）；および米国特許出願公開第０９／７５７，０８９号明細書（トウモロコシ葉緑体アルドラーゼプロモーター）に記載されるプロモーターが含まれる。
【００５７】
追加の例示的な原核生物プロモーターには、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）プロモーター（Ebert et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(16):5745-9）；オクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）プロモーター（アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の腫瘍誘発プラスミド上に担持されている）；カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）１９Ｓプロモーターなどのカリモウイルスプロモーター（Law ton et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9:315-24）；ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（Odell et al. (1985) Nature 313:810-2）；ゴマノハグサ（figwort）モザイクウイルス３５Ｓ−プロモーター（Walker et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(19):6624-8）；スクロースシンターゼプロモーター（Yang and Russell (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4144-8）；Ｒ遺伝子複合体プロモーター（Chandler et al. (1989) Plant Cell 1:1175-83）；ＣａＭＶ３５Ｓ（米国特許第５，３２２，９３８号明細書、米国特許第５，３５２，６０５号明細書、米国特許第５，３５９，１４２号明細書、および米国特許第５，５３０，１９６号明細書）；ＦＭＶ３５Ｓ（米国特許第６，０５１，７５３号明細書、および米国特許第５，３７８，６１９号明細書）；ＰＣ１ＳＶプロモーター（米国特許第５，８５０，０１９号明細書）；ＳＣＰ１プロモーター（米国特許第６，６７７，５０３号明細書）；およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）Ｎｏｓプロモーター（GenBank Accession No.V00087; Depicker et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet.1 :561-73; Bevan et al. (1983) Nature 304: 184-7）などが含まれる。
【００５８】
いくつかの実施形態では、合成イネユビキチン３二方向性プロモーターはさらにエキソンを含むことができる。例えば、プロモーターに作動可能に連結された対象のポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドを特定の細胞内位置および／または区画に対して標的化するまたは運ぶことが望ましい場合がある。これらのおよび他の実施形態では、コード配列（エキソン）は、残りの合成イネユビキチン３二方向性プロモーター配列とポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の間の核酸分子内に組み込むことができる。これらのエレメントは、合成イネユビキチン３二方向性プロモーターが、ポリペプチドの残りと機能的な関係にある組み込まれたコード配列によりコードされたペプチドを含むポリペプチド（またはプロモーターに作動可能に連結されている２つのポリペプチドコード配列のうちの１つもしくは両方）の発現を促進するように、当業者の裁量に従って配置することができる。特定の例では、リーダー、輸送、またはシグナルペプチド（例えば、トウモロコシ（Zea mays）Ｕｂｉ１リーダーペプチド）をコードするエキソンを組み込むことができる。
【００５９】
合成イネユビキチン３二方向性プロモーターに組み込まれたエキソンがコードすることができるペプチドには、例えば、限定せずに、ユビキチン（例えば、トウモロコシ（Zea mays）Ｕｂｉ１）リーダーペプチド、葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ）（例えば、シロイヌナズナ（A. thaliana）ＥＰＳＰＳ  ＣＴＰ(Klee et al. (1987) Mol. Gen. Genet. 210:437-42））、およびペチュニア（Petunia hybrida）ＥＰＳＰＳ  ＣＴＰ（della-Cioppa et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:6873-7））が含まれ、ジカンバモノオキシゲナーゼ（ＤＭＯ）の葉緑体ターゲティングについてＰＣＴ国際公開第２００８／１０５８９０号パンフレットに例証されている。
【００６０】
本発明のいくつかの実施形態では、イントロンも合成イネユビキチン３二方向性プロモーター中に、例えば、残りの合成イネユビキチン３二方向性プロモーター配列とそのプロモーターに作動可能に連結されている対象のポリヌクレオチド配列の間に組み込むことができる。いくつかの例では、合成イネユビキチン３二方向性プロモーター中に組み込まれるイントロンは、限定せずに、翻訳開始配列の上流の完全にプロセシングされたｍＲＮＡに存在する翻訳リーダー配列として機能する５’ＵＴＲであってよい（そのような翻訳リーダー配列は、一次転写物のｍＲＮＡへのプロセシング、ｍＲＮＡ安定性、および／または翻訳効率に影響を及ぼすことがある）。翻訳リーダー配列の例には、トウモロコシおよびペチュニア熱ショックタンパク質リーダー（米国特許第５，３６２，８６５号明細書）、植物ウイルス外皮タンパク質リーダー、植物ルビスコリーダー、および他のものが含まれる。例えば、Turner and Foster (1995) Molecular Biotech. 3(3):225-36を参照されたい。５’ＵＴＲの非限定的例には、ＧｍＨｓｐ（米国特許第５，６５９，１２２号明細書）、ＰｈＤｎａＫ（米国特許第５，３６２，８６５号明細書）、ＡｔＡｎｔｌ、ＴＥＶ（Carrington and Freed (1990) J. Virol. 64: 1590-7）、およびＡＧＲｔｕｎｏｓ（GenBank Accession No.V00087,およびBevan et al. (1983) Nature 304: 184-7）が含まれる。特定の例では、トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１イントロンを合成イネユビキチン３二方向性プロモーター中に組み込むことができる。
【００６１】
場合によっては合成イネユビキチン３二方向性プロモーター内に組み込んでもよい追加の配列には、例えば、限定せずに、３’非翻訳配列、３’転写終結領域、およびポリアデニル化領域が含まれる。これらは対象のポリヌクレオチド配列（例えば、合成イネユビキチン３二方向性プロモーターに作動可能に連結されている対象の配列）の下流に位置する遺伝子エレメントであり、ポリアデニル化シグナル、および／または転写、ｍＲＮＡプロセシング、もしくは遺伝子発現に影響を及ぼすことができる他の調節シグナルとなるポリヌクレオチドが含まれる。ポリアデニル化シグナルは、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸ヌクレオチドの付加を引き起こすように植物内で機能することができる。ポリアデニル化配列は、天然の遺伝子由来でも、種々の植物遺伝子由来でも、またはＴ−ＤＮＡ遺伝子由来でもよい。３’転写終結領域の非限定的例はノパリンシンターゼ３’領域（nos 3'; Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7）である。異なる３’非翻訳領域の使用の例は、Ingelbrecht et al, (1989) Plant Cell 1 :671-80に提示されている。ポリアデニル化シグナルの非限定的例には、エンドウマメ（Pisum sativum）ＲｂｃＳ２遺伝子（Ps.RbcS2-E9; Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3: 1671-9）およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）Ｎｏｓ遺伝子（GenBank Accession No. E01312）由来のシグナルが含まれる。
【００６２】
いくつかの実施形態では、合成イネユビキチン３二方向性プロモーターはプロモーターを含む核酸を標的生物のゲノムの特定の遺伝子座に対して標的化することを促進する１つまたは複数のヌクレオチド配列（複数可）を含む。例えば、宿主中のゲノムＤＮＡ配列のセグメント（例えば、珍しいまたは独特のゲノムＤＮＡ配列）に相同である１つまたは複数の配列を含むことができる。いくつかの例では、これらの相同配列は、宿主ゲノム中の相同ＤＮＡの部位で合成イネユビキチン３二方向性プロモーターを含む核酸の組換えおよび組入れを導くことができる。特定の例では、合成イネユビキチン３二方向性プロモーターは、珍しいまたは独特の位置で配列を認識してその珍しいまたは独特の位置での組入れを促進する、工学的に操作されたヌクレアーゼ酵素を利用して、このプロモーターを含む核酸を宿主ゲノムのその珍しいまたは独特の位置に対して標的化することを促進する１つまたは複数のヌクレオチド配列を含む。ヌクレアーゼ酵素として亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼを用いるそのような標的組入れシステムは米国特許出願公開第１３／０１１，７３５号明細書に記載されている。この特許文献全体の内容はこの参照により本明細書に組み込まれる。
【００６３】
他の実施形態では、本開示は、形質を含む対象のポリヌクレオチド配列を実施形態としてさらに含む。形質は殺虫剤抵抗性形質、除草剤耐性形質、窒素利用効率形質、水利用効率形質、栄養価形質、ＤＮＡ結合形質、選択可能マーカー形質、およびその任意の組合せであり得る。
【００６４】
さらなる実施形態では、形質はトランスジェニックイベントとしてトランスジェニック植物細胞内に組み入れられる。追加の実施形態では、トランスジェニックイベントは商品生産物を生産する。したがって、組成物は主題の開示のトランスジェニック植物細胞由来であり、前記組成物はミール、小麦粉、タンパク質濃縮物、または油からなる群から選択される商品生産物である。さらなる実施形態では、形質転換植物細胞由来のトランスジェニック植物により生産される商品生産物が含まれ、商品生産物は検出可能な量の本発明の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、そのような商品生産物は、例えば、トランスジェニック植物を入手しそれから食物または餌を調製することにより生産することができる。本発明の核酸配列のうちの１つまたは複数を含む商品生産物には、例えば、限定せずに、ミール、油、破砕もしくは全粒穀物または植物の種、および本発明の核酸配列のうちの１つまたは複数を含む組換え植物または種子の任意のミール、油、または破砕もしくは全粒穀物を含む任意の食品生産物が含まれる。１つまたは複数の商品または商品生産物中の本発明の配列のうちの１つまたは複数が検出されれば、その商品または商品生産物が１つまたは複数の農学的形質を発現するように設計されたトランスジェニック植物から生産されていることの事実上の証拠である。
【００６５】
合成イネユビキチン３二方向性プロモーターを含む核酸は、例えば、限定せずに、ＲＣＡ、ＰＣＲ増幅、ＲＴ−ＰＣＲ増幅、ＯＬＡ、およびＳＮｕＰＥを含む、当技術分野で公知の任意の技法を使用して生産することができる。これらのおよび他の等価な技法は当業者には周知であり、例えば、限定せずに、さらにSambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rdEd., Cold Spring Harbor Laboratory, 2001;およびAusubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1998に詳細に記載されている。上で引用した参考文献はすべて、前述のマニュアルの両方を含み、この参照により、そこに提供される任意の図、図式、および／または表を含め、その全体が本明細書に組み込まれる。
【００６６】
Ｖ．合成二方向性プロモーター、ＲＵｂｉ３を含む核酸分子の細胞への送達
本開示は合成イネユビキチン３二方向性プロモーターを含む核酸分子で細胞を形質転換するための方法も提供する。核酸分子を植物内に導入するための当技術分野で公知の多数の技法のうちの任意のもの使用して、いくつかの実施形態に従う合成イネユビキチン３二方向性プロモーターを含む核酸分子で植物を形質転換し、例えば、１つもしくは複数の合成イネユビキチン３二方向性プロモーターを宿主植物ゲノム内に導入し、および／またはこのプロモーターに作動可能に連結された１つもしくは複数の、対象のポリヌクレオチドをさらに導入することができる。
【００６７】
植物の形質転換に適した方法には、ＤＮＡを細胞内に導入することが可能であるいかなる方法でも、例えば、限定せずに、エレクトロポレーション（例えば、米国特許第５，３８４，２５３号明細書参照）、微粒子銃（例えば、米国特許第５，０１５，５８０号明細書、米国特許第５，５５０，３１８号明細書、米国特許第５，５３８，８８０号明細書、米国特許第６，１６０，２０８号明細書、米国特許第６，３９９，８６１号明細書、および米国特許第６，４０３，８６５号明細書参照）、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換（例えば、米国特許第５，６３５，０５５号明細書、米国特許第５，８２４，８７７号明細書、米国特許第５，５９１，６１６号明細書、米国特許第５，９８１，８４０号明細書、および米国特許第６，３８４，３０１号明細書参照）、およびプロトプラスト形質転換（例えば、米国特許第５，５０８，１８４号明細書参照）が含まれる。前述の技法などの技法の適用を通じて、実質的にいかなる植物種の細胞でも安定的に形質転換することができ、これらの細胞は当業者には公知の技法によってトランスジェニック植物に成長させることができる。例えば、ワタ形質転換という文脈において特に有用であり得る技法は米国特許第５，８４６，７９７号明細書、米国特許第５，１５９，１３５号明細書、米国特許第５，００４，８６３号明細書、および米国特許第６，６２４，３４４号明細書に記載されており；特にアブラナ属（Brassica）植物の形質転換のための技法は、例えば、米国特許第５，７５０，８７１号明細書に記載されており；ダイズの形質転換のための技法は、例えば、米国特許第６，３８４，３０１号明細書に記載されており；ならびにトウモロコシの形質転換のための技法は、例えば、米国特許第７，０６０，８７６号明細書、米国特許第５，５９１，６１６号明細書、およびＰＣＴ国際公開第９５／０６７２２号パンフレットに記載されている。
【００６８】
受容細胞への外来性核酸の送達がもたらされた後、形質転換細胞は一般に、さらなる培養および植物体再生のために同定される。形質転換体を同定する能力を改善するために、形質転換体を生成するのに使用する形質転換ベクターと一緒に選択可能またはスクリーニング可能マーカー遺伝子を用いようとすることもある。この場合、潜在的に形質転換された細胞集団は、細胞を選択剤（複数可）に曝露することによりアッセイすることが可能である、または細胞は所望のマーカー遺伝子形質についてスクリーニングすることが可能である。
【００６９】
選択剤への曝露されても生き延びる細胞、またはスクリーニングアッセイにおいてプラスのスコアが付いた細胞は、植物体の再生を支持する培地で培養することができる。いくつかの実施形態では、いかなる適切な植物組織培養培地（例えば、ＭＳおよびＮ６培地）でも、成長調節物質などのさらなる物質を含むことにより改変することができる。組織は、植物体再生の試みを開始するのに十分な組織が入手可能になるまで、または反復ラウンドの手動選択に続いて、組織の形態が再生に適するまで（例えば、少なくとも２週間）成長調節物質を備えた基本培地上に維持し、その後、苗条形成を促す培地に移す。培養物は、十分な苗条形成が生じ終えるまで定期的に移される。苗条が形成された後は根形成を促す培地に移される。十分な根が形成された後は、植物体はさらなる成長と成熟のために土壌に移すことが可能である。
【００７０】
再生中の植物での合成イネユビキチン３二方向性プロモーターを含む所望の核酸分子の存在を確かめるため、種々のアッセイを実施することができる。そのようなアッセイには、例えば、サザンおよびノーザンブロッティングとＰＣＲなどの分子生物学的アッセイ；例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡおよび／またはウェスタンブロット）または酵素的機能によりタンパク質産物の存在を検出するなどの生化学的アッセイ；葉または根アッセイなどの植物部分アッセイ；ならびに全再生植物の表現型の分析が含まれる。
【００７１】
標的組入れイベントは、例えば、例えば対象の核酸分子に対して特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用するＰＣＲ増幅によりスクリーニングすることができる。ＰＣＲ遺伝子型判定は、ゲノムに組み入れられた対象の核酸分子を含有すると予想される単離された宿主植物カスル組織由来のゲノムＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、それに続くＰＣＲ増幅産物の標準クローニングおよび配列解析を含むが、これらに限定されないと理解されている。ＰＣＲ遺伝子型判定の方法は十分に説明されており（例えば、Rios et al. (2002) Plant J. 32:243-53参照）、細胞培養物を含むいかなる植物種または組織型由来のゲノムＤＮＡにも適用することができる。標的配列と導入された配列の両方に結合するオリゴヌクレオチドプライマーの組合せをＰＣＲ増幅反応において順次使用するまたは複数同時に用いることができる。標的部位、導入された核酸配列、および／またはこれらの２つの組合せにアニールするように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを作製することができる。したがって、ＰＣＲ遺伝子型判定戦略は、例えば、限定せずに、植物ゲノム中の特異的配列の増幅、植物ゲノム中の複数の特異的配列の増幅、植物ゲノム中の非特異的配列の増幅、および前述のいずれかの組合せを含むことができる。当業者であれば、プライマーと増幅反応の追加の組合せを考案してゲノムを調べることができる。例えば、導入された核酸配列の境界の外側の標的に特異的な核酸配列（複数可）にアニールするように一組のフォワードおよびリバースオリゴヌクレオチドプライマーを設計することができる。
【００７２】
導入された核酸分子に、例えば、そこに含まれる対象のポリヌクレオチド配列内のコード領域に対応する配列で、または核酸分子の他の部分に特異的にアニールするようにフォワードおよびリバースオリゴヌクレオチドプライマーを設計することができる。これらのプライマーは上に記載されるプライマーと併せて使用することができる。オリゴヌクレオチドプライマーは所望の配列に従って合成することができ、市販されている（例えば、Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IAより）。増幅に続いて、増幅産物のクローニングおよび塩基配列決定、または直接配列解析が可能である。当業者であれば、ＰＣＲ遺伝子型判定中に生成される増幅産物の解析のための代わりの方法を想定してもよい。一実施形態では、遺伝子標的に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーをＰＣＲ増幅において用いる。
【００７３】
ＶＩ．合成二方向性プロモーター、ＲＵｂｉ３を含む細胞、細胞培養物、組織、および生物
本発明のいくつかの実施形態は、例えば、核酸構築物中に存在することができる合成イネユビキチン３二方向性プロモーターを含む細胞も提供する。特定の例では、いくつかの実施形態に従う合成イネユビキチン３二方向性プロモーターは、植物細胞および植物においてトランス遺伝子の発現を調節するための調節配列として利用することができる。いくつかのそのような例では、対象のポリヌクレオチド配列（例えば、トランス遺伝子）に作動可能に連結された合成二方向性ＲＵｂｉ３プロモーターを使用すれば、所与の数の、対象のポリヌクレオチド配列の発現を調節するのに必要な相同プロモーターの数を減らし、および／または所与の数の、対象のヌクレオチド配列を導入するのに必要な核酸構築物（複数可）のサイズを減らすことができる。さらに、合成イネユビキチン３二方向性プロモーターを使用すれば、同じ条件（すなわち、ＲＵｂｉ３プロモーターが活性である条件）下で２つの作動可能に連結された対象のヌクレオチド配列の同時発現が可能になる。そのような例は、例えば、２つの作動可能に連結された対象のポリヌクレオチド配列がそれぞれ、対象のヌクレオチド配列を含むトランスジェニック宿主における単一の形質に寄与し、対象のヌクレオチド配列の同時発現がトランスジェニック宿主におけるこの形質の発現に有利に影響する場合には、特に有用になり得る。
【００７４】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の合成イネユビキチン３二方向性プロモーター（複数可）および／または対象のヌクレオチド配列（複数可）を含むトランスジェニック植物は、植物中での、対象のヌクレオチド配列（複数可）の発現により付与される（例えば、導入される、増強される、または寄与される）１つまたは複数の望ましい形質を有することができる。そのような形質は、例えば、限定せずに、昆虫、他の有害生物、および病原体に対する抵抗性；除草剤に対する耐性；増強された安定性、収率、または貯蔵寿命；環境耐性；医薬品生産；工業製品生産；および栄養強化を含み得る。いくつかの例では、望ましい形質は、対象のポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された合成イネユビキチン３二方向性プロモーターを含む核酸分子で植物を形質転換することにより付与することができる。いくつかの例では、望ましい形質は、繁殖を介して後代植物として生産される植物に付与することができ、その形質は、合成イネユビキチン３二方向性プロモーターに作動可能に連結された対象のヌクレオチド配列を含む親植物からその植物に渡される合成イネユビキチン３二方向性プロモーターに作動可能に連結された１つまたは複数の、対象のヌクレオチド配列により付与することができる。
【００７５】
いくつかの実施形態に従うトランスジェニック植物は、本発明の核酸分子で形質転換すること、または本発明の核酸分子で形質転換された植物と繁殖させることができる任意の植物であってよい。したがって、植物は双子葉植物でも単子葉植物でもよい。いくつかの例で使用するための双子葉植物の非限定的例には、アルファルファ、マメ、ブロッコリー、キャベツ、キャノーラ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、ハクサイ、ワタ、キュウリ、ナス、レタス、メロン、エンドウマメ、コショウ、ピーナッツ、ジャガイモ、カボチャ（pumpkin）、ダイコン、ナタネ、ホウレンソウ、ダイズ、カボチャ（squash）、サトウダイコン、ヒマワリ、タバコ、トマト、およびスイカが含まれる。いくつかの例で使用するための単子葉植物の非限定的例には、ヤマカモジグサ（Brachypodium）、コーン、タマネギ、イネ、モロコシ、コムギ、ライムギ、アワ、サトウキビ、カラスムギ、ライコムギ、スイッチグラス、および芝草が含まれる。
【００７６】
いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物はいかなる様式でも使用するまたは栽培することができ、合成イネユビキチン３二方向性プロモーターおよび／または作動可能に連結された対象のポリヌクレオチド配列が存在することが望ましい。したがって、そのようなトランスジェニック植物は、特に、本発明に従う核酸分子で形質転換されることにより１つまたは複数の所望の形質もしくはトランスジェニックイベントを有するように工学的に操作することができる、または当業者には公知のいかなる方法によっても収穫するもしくは栽培することができる。
【００７７】
以下の実施例は特定の特長および／または実施形態を説明するために提供される。実施例を、本開示を例証される特定の特長または実施形態に限定するものと解釈するべきではない。
［実施例］
【実施例１】
【００７８】
二方向性プロモーターの設計
トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１（ＺｍＵｂｉ１）およびイネユビキチン３（Ｒｕｂｉ３）プロモーター由来の遺伝子調節エレメントを含有する二方向性プロモーターを設計し、配列番号１として提示している。この二方向性プロモーターは、完全長Ｒｕｂｉ３プロモーター（塩基対１，３１４〜３，３０３；配列番号９）の５’末端に逆相補性配向で融合した部分的ＺｍＵｂｉ１プロモーター（塩基対１〜１，３１３；配列番号８）の配列を含有している。部分的ＺｍＵｂｉ１プロモーターの成分は、２１５ｂｐ領域のＺｍＵｂｉ１ミニマルコアプロモーター（塩基対１，０９９〜１，３１３で下線フォント；配列番号２）、ＺｍＵｂｉ１  ５’非翻訳領域（塩基対１，０１６〜１，０９７で太字フォント；配列番号３）、およびＺｍＵｂｉ１イントロン（塩基対１〜１，０１５で小文字フォント；配列番号４）を含有している。完全長イネＵｂｉ３プロモーターの成分は、上流およびコアプロモーター領域（塩基対１，３１４〜２，０９６でイタリックフォント；配列番号７）、イネＵｂｉ３  ５’非翻訳領域（塩基対２，０９７〜２，１６３で太字と下線フォント；配列番号５）、およびイネＵｂｉ３イントロン（塩基対２，１６４〜３，３０３で下線と小文字フォント；配列番号６）を含有している。配列番号１：
【００７９】
【化１】
2017532963.tif 000003
2017532963.tif 000004
【実施例２】
【００８０】
植物形質転換構築物
植物体において二方向性プロモーターの発現を試験するための植物形質転換構築物を設計した。最終二方向性プロモーター構築物は、１つのレポーター遺伝子を駆動するトウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１ミニマルコアプロモーターを第２のレポーター遺伝子を駆動する主要なイネユビキチン３プロモーターの上流におよび逆相補性配向で挿入することにより生成した。２つのバイナリープラスミド、ｐＤＡＢ１１３１２２（図１；配列番号２２）およびｐＤＡＢ１１３１４２（図２；配列番号２３）は、Ｃｒｙ３４Ａｂ１（Li H, Olson M, Lin G, Hey T, Tan SY, Narva KE (2013) Bacillus thuringiensis Cry34Ab1/Cry35Ab1 interactions with western corn rootworm midgut membrane binding sites. PLoS One 8: e53079）とＣｒｙ３５Ａｂ１（Li H, Olson M, Lin G, Hey T, Tan SY, Narva KE (2013) Bacillus thuringiensis Cry34Ab1/Cry35Ab1 interactions with western corn rootworm midgut membrane binding sites. PLoS One 8: e53079）トランス遺伝子の両方を駆動する配列番号１の新規の二方向性プロモーターを含有するように構築され、ジャガイモ（Solanum tuberosum）ＳｔＰｉｎＩＩ  ３’ＵＴＲ（An et al, (1989) Plant Cell 1 ; 1 15-22）またはトウモロコシ（Zea mays）Ｐｅｒ５  ３’ＵＴＲ（米国特許第６，６９９，９８４号明細書）のいずれかで終結させた。こうして得られた構築物は、二方向性プロモーターの５’および３’末端に作動可能に連結された２つの異なるトランス遺伝子を駆動させる配列番号１の単一二方向性プロモーターを含有していた。この構築物は、トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１プロモーター（Christensen et al, (1992) Plant Molecular Biology 18; 675-689）、ａａｄ−１遺伝子（米国特許第７，８３８，７３３号明細書）、およびトウモロコシ（Zea mays）リパーゼ３’ＵＴＲ（米国特許第７，１７９，９０２号明細書）を含有した選択可能マーカー遺伝子発現カセットも含む。
【実施例３】
【００８１】
トウモロコシ形質転換
上記構築物を使用してトウモロコシ細胞を形質転換した。実験構築物は、近交系トウモロコシ（Zea mays）ｃ．ｖ．Ｂ１０４から単離した未成熟胚のアグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換を介してトウモロコシに形質転換した。使用した方法はIshida et al., (1996) Nature Biotechnol 14:745-750およびFrame et al, (2006) Plant Cell Rep 25: 1024-1034により公表された方法に類似しているが、いくつかの修正および改良を加えてその方法がハイスループット形質転換に適用可能になるようにした。トウモロコシにいくつかのトランスジェニックイベントを生じさせるために使用した方法の例を本明細書に与えている。
【００８２】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の形質転換
バイナリー発現ベクターはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株ＤＡｔ１３１９２（ＲｅｃＡ欠損三元株）（国際公開第２０１２０１６２２２号パンフレット）内に形質転換した。細菌コロニーを選択し、バイナリープラスミドＤＮＡを単離して制限酵素消化により確かめた。
【００８３】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）培養開始
アグロバクテリウム（Agrobacterium）培養物はグリセロールストックからＡＢミニマル培地上に画線し、２０℃、暗所で３日間インキュベートした。次に、アグロバクテリウム（Agrobacterium）培養物はＹＥＰ培地のプレート上に画線し、２０℃、暗所で１日間インキュベートした。
【００８４】
実験日、実験における構築物の数に適した体積で接種用培地とアセトシリンゴンの混合物を調製した。接種用培地は、無菌使い捨て２５０ｍｌフラスコにピペットで移した。１００％ジメチルスルホキシド中アセトシリンゴンの１Ｍストック溶液を、最終アセトシリンゴン濃度が２００μＭとなるような体積で接種用培地を含有するフラスコに添加した。
【００８５】
各構築物に、ＹＥＰプレートから１〜２ループのアグロバクテリウム（Agrobacterium）を、無菌使い捨て５０ｍｌ遠心分離チューブ内の１５ｍｌの接種用培地／アセトシリンゴン混合物に懸濁させ、６００ｎｍ（Ｏ．Ｄ．６００）での溶液の光学密度を分光光度計で測定した。次に、懸濁液を追加の接種用培地／アセトシリンゴン混合物を使用して０．２５〜０．３５Ｏ．Ｄ．６００まで希釈した。次に、アグロバクテリウム（Agrobacterium）懸濁液のチューブを、使用する前に１から４時間の間室温で約７５ｒｐｍに設定したプラットフォームシェーカー上に水平に置いた。
【００８６】
穂無菌化および胚単離
トウモロコシ（Zea mays）品種Ｂ１０４由来の穂を受粉の１０〜１２日後に収穫した。収穫された穂は穀皮を取り（de-husked）、市販の漂白剤（Ultra CLOROX（登録商標）Germicidal Bleach、６．１５％次亜塩素酸ナトリウム）と２滴のＴｗｅｅｎ２０の２０％溶液に２０分間浸漬させて表面無菌化し、続いてラミナーフローフード内において無菌脱イオン水で３回すすいだ。未成熟接合体胚（１．８〜２．２ｍｍ長）をそれぞれの穂から無菌的に切り取り、２μｌの１０％ＢＲＥＡＫ−ＴＨＲＵ（登録商標）Ｓ２３３界面活性剤（Evonik Industries AG, Essen, Germany）を添加している２．０ｍｌのアグロバクテリウム（Agrobacterium）懸濁液を含有する１つまたは複数のマイクロ遠心分離チューブに分配した。形質転換は、米国特許出願公開第２０１３／０１５７３６９号明細書に記載される方法に従って進めた。
【実施例４】
【００８７】
分子的確証
推定トランスジェニックトウモロコシ植物は、ｃｒｙ３４Ａｂ１およびａａｄ−１定量的ＰＣＲアッセイを使用してトランス遺伝子の存在についてＶ２〜３葉期で試料採取した。全ＤＮＡはＭＡＧＡＴＴＲＡＣＴ（登録商標）ＤＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者の使用説明書により使用して、葉試料から抽出した。
【００８８】
対象の遺伝子を検出するため、遺伝子特異的ＤＮＡ断片を、ｃｒｙ３４Ａｂ１遺伝子に対するＦＡＭ標識蛍光プローブおよび内在性インベルターゼ基準遺伝子対照に対するＨＥＸ標識蛍光プローブを含有するＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プライマー／プローブセットを用いて増幅させた。次のプライマーはｃｒｙ３４Ａｂ１およびインベルターゼ内在性基準遺伝子増幅のために使用した。プライマー配列は以下の通りであった。
Ｃｒｙ３４Ａｂ１プライマー／プローブ：
フォワードプライマー：ＴＱ．８ｖ６．１．Ｆ：ＧＣＣＡＴＡＣＣＣＴＣＣＡＧＴＴＧ（配列番号１０）
リバースプライマー：ＴＱ．８ｖ６．１．Ｒ：ＧＣＣＧＴＴＧＡＴＧＧＡＧＴＡＧＴＡＧＡＴＧＧ（配列番号１１）
プローブ：ＴＱ．８ｖ６．１．ＭＧＢ．Ｐ：５’−／５６−ＦＡＭ／ＣＣＧＡＡＴＣＣＡＡＣＧＧＣＴＴＣＡ／ＭＧＢ（配列番号１２）
インベルターゼプライマー：
フォワードプライマー：インベルターゼＦ：ＴＧＧＣＧＧＡＣＧＡＣＧＡＣＴＴＧＴ（配列番号１３）
リバースプライマー：インベルターゼＲ：ＡＡＡＧＴＴＴＧＧＡＧＧＣＴＧＣＣＧＴ（配列番号１４）
インベルターゼプローブ：５’−／５ＨＥＸ／ＣＧＡＧＣＡＧ  ＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＴ／３ＢＨＱ＿１／−３’（配列番号１５）
【００８９】
次に、５μｌのＲｏｃｈｅ  ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０プローブマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）；最終濃度４００ｎＭとなるように１０μＭストックからそれぞれ０．４μｌのＴＱ．８ｖ６．１．Ｆ、ＴＱ．８ｖ６．１．Ｒ、インベルターゼＦ、およびインベルターゼＲプライマー；最終濃度２００ｎＭとなるように５μＭストックからそれぞれ０．４μｌのＴＱ．８ｖ６．１．ＭＧＢ．Ｐおよびインベルターゼプローブ、最終濃度０．１％となるように０．１μｌの１０％ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）；２μｌの１０ｎｇ／μｌゲノムＤＮＡならびに０．５μｌの水を含有する１０μｌ反応の最終体積でＰＣＲ反応を実施した。ＤＮＡは以下の条件：１サイクルの９５℃で１０分間；４０サイクルの以下の３段階：９５℃で１０秒間；５８℃で３５秒間および７２℃で１秒間、ならびに最終サイクル４℃で１０秒間の下でＲｏｃｈｅ  ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０システムにおいて増幅させた。ｃｒｙ３４Ａｂ１コピー数は未知の試料（ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０による出力）についての標的（対象の遺伝子）／基準（インベルターゼ遺伝子）値をＣｒｙ３４Ａｂ１コピー数対照の標的／基準値と比較することにより決定した。さらに、バイナリーベクタープラスミド骨格の偶発的組入れによる混入は、バイナリーベクター骨格上に担持されるスペクチノマイシン（Ｓｐｅｃ）耐性遺伝子に特異的な加水分解プローブアッセイにより検出した。
【００９０】
ａａｄ−１遺伝子の検出は、インベルターゼ内在性基準遺伝子を使用してｃｒｙ３４Ａｂ１遺伝子について上に記載した通りに実施した。ａａｄ−１プライマー配列は以下の通りであった。
ＡＡＤ１フォワードプライマー：ＴＧＴＴＣＧＧＴＴＣＣＣＴＣＴＡＣＣＡＡ（配列番号１６）
ＡＡＤ１リバースプライマー：ＣＡＡＣＡＴＣＣＡＴＣＡＣＣＴＴＧＡＣＴＧＡ（配列番号１７）
ＡＡＤ１プローブ：５’−ＦＡＭ／ＣＡＣＡＧＡＡＣＣＧＴＣＧＣＴＴＣＡＧＣＡＡＣＡ−ＭＧＢ／ＢＨＱ−３’（配列番号１８）
【００９１】
トランスジェニック植物を生産するために使用されるバイナリー骨格中に存在するｓｐｅｃ遺伝子の検出は以下の配列のプライマーを用いてアッセイした。
ＳＰＣ１ａ：ＣＴＴＡＧＣＴＧＧＡＴＡ  ＡＣＧＣＣＡＣ（配列番号１９）
ＳＰＣ１ｓ：ＧＡＣＣＧＴＡＡＧＧＣＴＴＧＡＴＧＡＡ（配列番号２０）
ＴＱＳＰＣ（ＦＡＭプローブ）：ＣＧＡＧＡＴＴＣＴＣＣＧＣＧＣＴＧＴＡＧＡ（配列番号２１）
【００９２】
最後に、Ｃｒｙ３４Ａｂ１、Ｃｒｙ３５Ａｂ１およびＡＡＤ−１葉ＥＬＩＳＡアッセイのために、８〜１２Ｔ０からＶ６に対象の遺伝子を含有する植物体を試料採取した。複数の葉パンチを試料採取した。葉Ｃｒｙ３４Ａｂ１（Ａｇｄｉａ、Ｉｎｃ．、Ｅｌｋａｒｔ、ＩＮ）、Ｃｒｙ３５Ａｂ１（Ａｃａｄｉａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＡＡＤ−１（Ａｇｄｉａ、Ｉｎｃ．、Ｅｌｋａｒｔ、ＩＮ）ＥＬＩＳＡアッセイは製造業者の使用説明書により実施した。葉ＥＬＩＳＡアッセイは百万分率（ｐｐｍ、またはｍｇ全植物タンパク質あたりのｎｇタンパク質）として表した。全タンパク質濃度は、ＰＩＥＲＣＥ  ６６０（商標）ｎｍタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を供給業者の使用説明書に従って使用して決定した。
【実施例５】
【００９３】
トウモロコシにおけるトランス遺伝子発現
ＣＲＹ３４  ＥＬＩＳＡ結果によれば、Ｒｕｂｉ３二方向性プロモーター（配列番号１）が構築物ｐＤＡＢ１１３１２２およびｐＤＡＢ１１３１４２で形質転換されたＴ０イベントにおいてＣｒｙ３４Ａｂ１およびＣｒｙ３５Ａｂ１の発現を駆動したことが示された。図３および４は、構築物ｐＤＡＢ１１３１２２およびｐＤＡＢ１１３１４２からの二方向性プロモーターについての解析結果を示している。データから、コーン植物において配列番号１のＲＵｂｉ３二方向性プロモーターを使用するＣｒｙ３４およびＣｒｙ３５タンパク質産生が一貫して行われていることが明らかである。Ｃｒｙ３４（図３、表１）、Ｃｒｙ３５（図４、表２）およびＡＡＤ１（図５、表３）の発現レベルは構築物ｐＤＡＢ１１３１２２とｐＤＡＢ１１３１４２の両方で類似していた。データは、本発明において開示されるＲｕｂｉ３二方向性プロモーターが、単一の二方向性プロモーターエレメントからの２つのトランス遺伝子の同時発現のためのトランスジェニック形質を作製するのに有用であることを示している。
【００９４】
【表１】
2017532963.tif 000005
【００９５】
【表２】
2017532963.tif 000006
【００９６】
【表３】
2017532963.tif 000007
【００９７】
要約すると、配列番号１の新規のＲＵｂｉ３二方向性プロモーターを設計し特徴付けた。遺伝子発現構築物において使用するための調節エレメントである配列番号の新規のＲＵｂｉ３二方向性プロモーターが初めて開示される。イネユビキチン３とトウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１プロモーターが新規の合成イネユビキチン３二方向性プロモーターに変換された。新規の合成イネユビキチン３二方向性プロモーターは、双子葉植物（例えば、ダイズ）でも単子葉植物（例えば、コーン）でも機能的であるトウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１プロモーターとイネユビキチン３プロモーター由来の複数のプロモーターエレメントを含む。二方向性プロモーターから得られる第１と第２の、対象のヌクレオチドの発現レベルは一方向性プロモーター遺伝子構築物に匹敵すると思われる。二方向性プロモーターは、二方向性プロモーターのどちらかの末端に融合されている複数のトランス遺伝子配列の発現を強く駆動する。
【００９８】
いくつかの例示的な態様および実施形態を上で考察してきたが、当業者であれば特定の変更、並べ替え、追加およびその部分的組合せを認識するであろう。したがって、以下の添付の特許請求の範囲および今後導入される特許請求の範囲は、その真の趣旨および範囲内であるそのような変更、並べ替え、追加およびその部分的組合せを含むと解釈されることが意図されている。
【図１】
2017532963.tif 000008
【図２】
2017532963.tif 000009
【図３】
2017532963.tif 000010
【図４】
2017532963.tif 000011
【図５】
2017532963.tif 000012
【配列表】
2017532963000001.app
【国際調査報告】
2017532963.tif 000013
2017532963.tif 000014
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