(57)【要約】  本発明は、化学療法誘発末梢神経障害（ＣＩＰＮ）の予防および／または治療のためのＣＸＣＲ２アンタゴニストの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＩＰＮの予防および／または治療において使用するための、ＣＸＣＲ２アンタゴニスト。
【請求項２】
ＣＩＰＮの予防において使用するための、請求項１に記載のＣＸＣＲ２アンタゴニスト。
【請求項３】
ＣＩＰＮが白金含有化学療法薬により引き起こされる、請求項１または２に記載のＣＸＣＲ２アンタゴニスト。
【請求項４】
ＣＩＰＮがオキサリプラチンにより引き起こされる、請求項３に記載のＣＸＣＲ２アンタゴニスト。
【請求項５】
ＣＸＣＲ２受容体結合アッセイで測定した場合にＣＸＣＲ２受容体に対するｐＩＣ５０値が７．０以上である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＣＸＣＲ２アンタゴニスト。
【請求項６】
アッセイａ）で測定した場合にＣＸＣＲ２受容体に対するｐＩＣ５０値が７．０以上である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＣＸＣＲ２アンタゴニスト。
【請求項７】
アッセイｂ）で測定した場合にＣＸＣＲ２受容体に対するｐＡ２値が８．０以上である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＣＸＣＲ２アンタゴニスト。
【請求項８】
アッセイｃ）で測定した場合にＣＸＣＲ２受容体に対するｐＩＣ５０値が８．０以上である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＣＸＣＲ２アンタゴニスト。
【請求項９】
アッセイｄ）で測定した場合にＣＸＣＲ２受容体に対するｐＩＣ５０値が５．０以上である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＣＸＣＲ２アンタゴニスト。
【請求項１０】
ＣＸＣＲ２に対する選択性がＣＸＣＲ１の２９倍以上である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＣＸＣＲ２アンタゴニスト。
【請求項１１】
溶解度が１０μｇ／ｍｌである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＣＸＣＲ２アンタゴニスト。
【請求項１２】
Ｌｏｇ  Ｄ７．４の膜透過性が−２〜＋４である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＣＸＣＲ２アンタゴニスト。
【請求項１３】
アンタゴニストが、式（Ａ）の１−（４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（ピペラジン−１−イルスルホニル）フェニル）−３−（２−クロロ−３−フルオロフェニル）尿素：
【化１】
2017527542.tif 000056
、
式（Ｂ）の１−（４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（ピペリジン−３−イルスルホニル）フェニル）−３−（３−フルオロ−２−メチルフェニル）尿素：
【化２】
2017527542.tif 000057
、
式（Ｃ）の１−（４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（（（Ｒ）−３−メチルテトラヒドロフラン−３−イル）スルホニル）フェニル）−３−（（Ｒ）−２−メチルシクロペント−２−エン−１−イル）尿素：
【化３】
2017527542.tif 000058
、
式（Ｄ）の１−（４−クロロ−３−（（１，４−ジメチルピペリジン−４−イル）スルホニル）−２−ヒドロキシフェニル）−３−（２−クロロ−３−フルオロフェニル）尿素：
【化４】
2017527542.tif 000059
、
式（Ｅ）の（Ｒ）−１−（４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（（４−メチルテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）スルホニル）フェニル）−３−（２−クロロシクロペント−２−エン−１−イル）尿素：
【化５】
2017527542.tif 000060
、
式（Ｆ）の（Ｒ）−１−（３−（ｔｅｒｔ−ブチルスルホニル）−４−シアノ−２−ヒドロキシフェニル）−３−（２−メチルシクロペント−２−エン−１−イル）尿素：
【化６】
2017527542.tif 000061
、
式（Ｇ）の１−（４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（（トランス−３−（ピロリジン−１−イル）シクロブチル）スルホニル）フェニル）−３−（（Ｒ）−２−メチルシクロペント−２−エン−１−イル）尿素：
【化７】
2017527542.tif 000062
、
式（Ｈ）の１−（４−クロロ−３−（（トランス−３−（ジメチルアミノ）シクロブチル）スルホニル）−２−ヒドロキシフェニル）−３−（（Ｒ）−２−メチルシクロペント−２−エン−１−イル）尿素：
【化８】
2017527542.tif 000063
、
式（Ｉ）の（Ｒ）−１−（４−クロロ−３−（（１，１−ジフルオロエチル）スルホニル）−２−ヒドロキシフェニル）−３−（２−メチルシクロペント−２−エン−１−イル）尿素：
【化９】
2017527542.tif 000064
、
式（Ｊ）の１−（４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（（（Ｓ）−３−メチルテトラヒドロフラン−３−イル）スルホニル）フェニル）−３−（（Ｒ）−２−メチルシクロペント−２−エン−１−イル）尿素：
【化１０】
2017527542.tif 000065
、
式（Ｋ）の１−（４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（（（Ｓ）−３−メチルテトラヒドロフラン−３−イル）スルホニル）フェニル）−３−（（Ｒ）−２−クロロシクロペント−２−エン−１−イル）尿素：
【化１１】
2017527542.tif 000066
、および
式（Ｌ）の１−（４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（（（Ｒ）−３−メチルテトラヒドロフラン−３−イル）スルホニル）フェニル）−３−（（Ｒ）−２−クロロシクロペント−２−エン−１−イル）尿素：
【化１２】
2017527542.tif 000067
、
またはその薬学的に許容可能な塩からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＣＸＣＲ２アンタゴニスト。
【請求項１４】
請求項１３に記載の式（Ａ）のＣＸＣＲ２アンタゴニスト１−（４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（ピペラジン−１−イルスルホニル）フェニル）−３−（２−クロロ−３−フルオロフェニル）尿素またはその薬学的に許容可能な塩：
【化１３】
2017527542.tif 000068
。
【請求項１５】
請求項１３に記載の式（Ｂ）のＣＸＣＲ２アンタゴニスト１−（４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（ピペリジン−３−イルスルホニル）フェニル）−３−（３−フルオロ−２−メチルフェニル）尿素またはその薬学的に許容可能な塩：
【化１４】
2017527542.tif 000069
。
【請求項１６】
請求項１３に記載の式（Ｊ）のＣＸＣＲ２アンタゴニスト１−（４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（（（Ｓ）−３−メチルテトラヒドロフラン−３−イル）スルホニル）フェニル）−３−（（Ｒ）−２−メチルシクロペント−２−エン−１−イル）尿素またはその薬学的に許容可能な塩：
【化１５】
2017527542.tif 000070
。
【請求項１７】
ＣＩＰＮの予防および／または治療において使用するための、ａ）請求項１〜１６のいずれか一項に記載のＣＸＣＲ２アンタゴニストと、ｂ）１以上の薬学的に許容可能な賦形剤とを含んでなる、医薬組成物。
【請求項１８】
経口投与に適した、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
ａ）ＣＸＣＲ２アンタゴニストと、ｂ）白金化合物（例えば、オキサリプラチン）、タキサン、ビンカアルカロイド、サリドマイドおよびボルテゾミブからなる群から選択される１種以上の一次化学療法薬とを含んでなる、組合せ。
【請求項２０】
一次化学療法薬がオキサリプラチンである、請求項１９に記載の組合せ。
【請求項２１】
ＣＸＣＲ２アンタゴニストが１種以上の一次化学療法薬の前または同時に投与される、請求項１９または２０に記載の組合せ。
【請求項２２】
必要とするヒトにおけるＣＩＰＮの予防および／または治療のための方法であって、ＣＸＣＲ２アンタゴニストを投与することを含んでなる、方法。
【請求項２３】
ＣＸＣＲ２アンタゴニストが請求項１〜１６のいずれか一項に記載されたものである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＣＩＰＮの予防および／または治療のための薬剤の製造における、ＣＸＣＲ２アンタゴニストの使用。
【請求項２５】
ＣＸＣＲ２アンタゴニストが請求項１〜１６のいずれか一項に記載されたものである、請求項２４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
技術分野
本発明は、化学療法誘発末梢神経障害（ＣＩＰＮ）の予防および／または治療のＣＸＣＲ２アンタゴニストの使用に関する。
【０００２】
背景技術
ＣＩＰＮは、化学療法処置レジメンを受けている患者が被る末梢神経系への損傷と定義される。ＣＩＰＮは、白金化合物（例えば、オキサリプラチン）、タキサン、ビンカアルカロイド、サリドマイド、およびより新規な薬剤、例えばボルテゾミブを含む多くの化学療法薬の優勢な主要用量制限副作用である[Balayssac, Expert Opin. Drug Saf., 10, 407-417, 2011)]。これは末梢器官神経毒性および神経障害は患者の生活の質に大きな影響を持ち、有効な療法の中断を要することがあるので、多くの多様な癌において処置の大きな制限となる。
【０００３】
オキサリプラチンは、重篤な急性および慢性末梢神経障害を引き起こすことが知られている[Cassidy and Misset, Semin. Oncol., 29, 11-20 (2002); Extra, Semin. Oncol., 25, 13-22 (1998);  Pasetto, Crit. Rev. Oncol. Hematol., 59, 159-168 (2006);およびQuasthoff and Hartung, J. Neurol., 249, 9-17 (2002)]。オキサリプラチンは、反復処置後の後期でラット坐骨神経の線維の変性を生じ[Kawashiri, Eur. J. Pain, 15, 344 (2011)]、オキサリプラチンによる慢性処置は、マウスモデルにおける後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンの萎縮および有髄線維の軸策損傷を誘発する[Renn, Mol. Pain, 7, 29 (2011); Cavaletti, Eur. J. Cancer, 37, 2457 (2001)] 。オキサリプラチンモデルでは、齧歯類の感覚終点の早期変性が見られ、それぞれ冷アセトン刺激およびフォンフライ式(von Frey）フィラメントを用い、温度(Neuropharmacology, 79 (2014) 432-443; Pain, 101 (2003) 65-77)および機械的刺激(Neuropharmacology, 79 (2014) 432-443; Brain Research, 784(1998)154-162)に対する感受性の増大がもたらされる。
【０００４】
例えば、オキサリプラチンを含む処置レジメン（例えば、２週間ごとに８５ｍｇ／ｍ２）は、運動関与のない対称性軸策型感覚遠位一次神経障害へと進行する患者の９５％に即時「低温」感受性一過性感覚異常および四肢筋痙攣をもたらす[Argyriou, Cancer Treatment Reviews, 43, 368-377 (2008)]。
【０００５】
ＤＲＧ内のオキサリプラチン取り込みと白金蓄積およびその感覚ニューロンは、オキサリプラチンの神経毒性の主要な決定因子である(Jong, J.Pharmacol. Exp. Ther., 338(2):537-47 (2011)。加えて、炎症カスケードの活性化は、損傷を受けたニューロン環境への免疫細胞の浸潤により、ＣＩＰＮの誘発および進行に役割を果たす[Wang, Cytokine, 59, 3-9 (2012)]。
【０００６】
炎症誘発性ケモカイン受容体ＣＸＣＲ２は感覚ニューロンで発現され、そのリガンドは、ニューロンの興奮を支配するナトリウム流およびカリウム流の増加の調節に関連付けられている[Wang, Mol. Pain, 24, 38 (2008); Yang, Mol. Pain, 5, 26 (2009)]。末梢ニューロン損傷では、齧歯類におけるＣＸＣＲ２＋炎症誘発性分泌免疫細胞の動員もまた、一部の急性および持続性疼痛状態に関与し、これがＣＸＣＲ２拮抗作用により遮断されることが知られている[Manjavachi, Eur. J. Pain, 14, 23-31 (2010); Kiguchi, J. Pharmacol. Exp. Ther., 340, 577-587 (2012); Stadtmann & Zarbock, Front. Immunol., 3, 263 (2012)]。ＣＸＣＲ２リガンドは、侵害受容プロセシングに関与するＴＲＰｖ１チャネル[Dong, Neurosci. Bull., 28, 155-164 (2012)]の機能を調節し、感覚ニューロンにおけるカルシウム流入および疼痛を媒介するペプチドカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）の放出を刺激する(Qin, J. Neurosci. Res., 82, 51-62 (2005)ことが示されている。ヒト末梢神経外植片およびシュワン細胞培養物は、ＩＬ−８などのＣＸＣＲ２炎症誘発性サイトカインを発現[Ozaki, NeuroReport, 19, 31-35 (2008)]および分泌[Rutkowski, J. Neuroimmunol., 101, 47-60 (1999)]し、このサイトカインは、糖尿病性およびアルコール性神経障害ならびに長さ依存的小線維神経障害[AboElAsar, Cytokine, 59, 86-93 (2012)]; (Michalowska-Wender, Folia Neuropathol., 45, 78-81 (2007); Uceyler, Neurology, 74, 1806 (2010)]において有意に上昇している。ニューロンＣＸＣＲ２受容体系はまた、ニューロンの連絡を支配する再髄鞘形成[Veenstra & Ransohoff, J. Neuroimmunol., 246, 1-9 (2012)]およびシナプスの可塑性(Xiong, J. Neurosci. Res., 71, 600-607 (2003)のプロセスを調節することも知られている。
【０００７】
ＣＸＣＲ２受容体およびそのリガンドはまた結腸直腸癌でもアップレギュレートされ、化学耐性 [Acharyya, Cell, 150, 165-178 (2012)]、腫瘍増殖、血管形成、癌細胞増殖および腫瘍微小環境への好中球動員[Verbeke, Cytokine & Growth Factor Review, 22, 345-358 (2012)]に関連付けられている。
【０００８】
現在のところ、ＣＩＰＮの予防および／または治療のために承認された治療選択肢は無い。
【発明の概要】
【０００９】
第１の側面によれば、本発明は、ＣＩＰＮの予防および／または治療において使用するためのＣＸＣＲ２アンタゴニストを提供する。
【００１０】
第２の側面によれば、本発明は、必要とするヒトにおけるＣＩＰＮの予防および／または治療のための方法であって、ＣＸＣＲ２アンタゴニストを投与することを含んでなる方法を提供する。
【００１１】
第３の側面によれば、本発明は、ＣＩＰＮの予防および／または治療のための薬剤の製造におけるＣＸＣＲ２アンタゴニストの使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、ラットにおける慢性絞扼神経損傷(chronic constriction injury)（ＣＣＩ）後の足逃避閾値(paw withdrawal threshold)（ＰＷＴ）への影響を示すグラフである。
【図２】図２は、マウスにおける慢性絞扼神経損傷後のＰＷＴへの影響を示すグラフである。
【図３】図３は、ラットにおける慢性絞扼神経損傷後の坐骨神経のｍＲＮＡレベルへの影響を示す一連のグラフである。
【図４】図４は、マウスにおける慢性絞扼神経損傷後の坐骨神経のｍＲＮＡレベルへの影響を示す一連のグラフである。
【図５】図５は、ラットにおける１回（単回）のオキサリプラチン注射後のＰＷＴへの影響を示すグラフである。
【図６】図６は、マウスにおける１回のオキサリプラチン注射後のＰＷＴへの影響を示すグラフである。
【図７】図７は、ラットにおける１回のオキサリプラチン注射後の左坐骨神経のｍＲＮＡレベルへの影響を示す一連のグラフである。
【図８】図８は、マウスにおける１回のオキサリプラチン注射後の左坐骨神経におけるｍＲＮＡレベルへの影響を示す一連のグラフである。
【図９】図９は、化学療法誘発神経障害のラットモデルにおける式（Ａ）の化合物による予防的処置後のＰＷＴへの影響を示すグラフである。
【図１０】図１０は、式（Ａ）の化合物またはそのビヒクルによる処置後のラットにおける坐骨神経の、オキサリプラチンにより低減された神経伝導速度への影響を示すグラフである。
【図１１】図１１は、式（Ａ）の化合物またはそのビヒクルによる処置後のラットの体重への影響を示すグラフである。
【図１２】図１２は、オキサリプラチン処置ラットにおける式（Ａ）の化合物による処置後の坐骨神経のミエリン鞘の厚さへの影響を示す一連の３枚の光学顕微鏡写真である。
【図１３】図１３は、オキサリプラチン処置ラットにおける式（Ａ）の化合物による処置後の坐骨神経のミエリン鞘の厚さへの影響を示す棒グラフである。
【発明の具体的説明】
【００１３】
これまでに、ＣＸＣＲ２の調節が末梢神経障害、特に、ＣＩＰＮに対する有効な予防および／または治療選択肢を提供するという開示は無かった。本明細書に記載の機序証明臨床試験プロトコールは、ＣＸＣＲ２の強力かつ選択的アンタゴニストがＣＩＰＮに対する有効な治療選択肢となり得るというヒトでのエビデンスを提供すると思われる。この機序証明臨床試験は、オキサリプラチンを含む化学療法処置レジメンのサイクルを着手しようとする結腸直腸癌患者において実施されるべきである。ＣＸＣＲ２アンタゴニストによる処置は、化学療法サイクル中およびその前後に間欠的に投与される。このレジメンは、最も高いオキサリプラチンの全身暴露とともに最も高いＣＸＣＲ２阻害を保証する。この試験では、化学療法の各サイクルの前、サイクル中およびサイクル後の様々な関連エンドポイントを測定する。プライマリーエンドポイントは、神経生理学的追跡技術を用いた末梢神経興奮性の測定である。結節軸策電位依存性ナトリウムチャネル(nodal axonal voltage-gated sodium channels)の機能不全により引き起こされるとされている[Krishnan, Muscle Nerve, 32, 51-60 (2005)]、オキサリプラチンを含む処置レジメンにより引き起こされる知覚神経興奮性（ＳＥ）の急激な増加は、確立されている神経生理学的神経伝導速度マーカーよりも早期に検出可能であり、オキサリプラチン誘発末梢神経障害の発生および重篤度を予測することが示唆されている[Park, Brain, 132, 10, 2712-23 (2009)]。５回目のオキサリプラチン前のＳＥのベースラインからの１５％の上昇は、１２回目のオキサリプラチン処置の終了までに中等度〜重度の神経毒性を有する症例の８０％の検出を可能とした。
【００１４】
さらに、機序証明臨床試験プロトコールは、オキサリプラチンサイクルの過程で、知覚神経興奮性の変化に関連する患者転帰情報を得ることにより、強力かつ選択的なＣＸＣＲ２アンタゴニストがＣＩＰＮの予防および／または治療に有効であるというエビデンスを提供するように設計されている。
【００１５】
加えて、ＣＸＣＲ２アンタゴニストの前臨床試験は、オキサリプラチンの抗増殖性作用に対してＣＸＣＲ２阻害の有害な影響は無いことを証明している[Ning, Mol. Cancer Ther., 11, 1353-1364 (2012)]。機序証明試験は、癌関連のエンドポイントに対するオキサリプラチンを含む処置レジメンの有効性も監視する。
【００１６】
よって、第１の側面によれば、本発明は、ＣＩＰＮの予防および／または治療において使用するためのＣＸＣＲ２アンタゴニストを提供する。
【００１７】
本明細書で使用する場合、ＣＸＣＲ２アンタゴニストという用語は、ＣＸＣＲ２受容体におけるアゴニスト介在性応答を阻害する化合物を意味する。
【００１８】
本明細書で使用する場合、予防という用語は、神経損傷および／または結果的な神経機能不全（神経生理学的追跡技術により測定される）完全に停止させること、または神経損傷の進行および／または神経機能の変化を緩徐化することを意味する。予防は、ａ）化学療法薬による健康な神経に対する損傷が起こらない、または損傷が実質的に起こらない状態；ｂ）損傷を受けた神経（例えば、化学療法の初期サイクルにより引き起こされる）が化学療法薬によりさらに損傷を受けない、または損傷を実質的に受けない状況；およびｃ）神経への損傷（化学療法の初期サイクルの累積的作用により引き起こされる）が化学療法の以前のいずれのサイクルに比べても低減される状況を包含すると認識される。
【００１９】
本明細書で使用する場合、治療（処置）という用語は、神経損傷および／または結果的な神経機能不全（神経生理学的追跡技術により測定される）が修復または逆転されて神経機能の改善に至り、それにより神経障害の症状を軽減するＣＩＰＮの逆転または部分的逆転を意味する。
【００２０】
ＣＩＰＮは、神経障害の中でも独特である。糖尿病性神経障害およびアルコール性神経障害などの他のほとんどの神経障害では、神経因性症状は発作／神経損傷が起こった後のある時点で経験される。化学療法を受けている患者における神経障害の発生の尤度、特に、オキサリプラチン化学療法により受ける神経障害の高い罹患率[Decision Resorces LLC, Kantar Health, Oncology Analyser, Intrinsiq Database; De Gramont, J. Clin. Oncol., 18, 2938-2947 (2000)]は、化学療法薬が投与される前または投与と同時にＣＸＣＲ２アンタゴニストを投与することは、神経障害発生の急性発症を予防する、および慢性持続性神経因性病態の確立を予防する可能性を持つ。機序証明臨床試験は、この予防的側面を神経興奮性尺度の調節のエビデンスおよびそれらの示唆される、患者転帰への予測翻訳を介して評価する。１つの実施形態では、本発明は、ＣＩＰＮの予防において使用するためのＣＸＣＲ２アンタゴニストを提供する。
【００２１】
上述のように、例えば、白金化合物（例えば、オキサリプラチン）、タキサン、ビンカアルカロイド、サリドマイドおよびボルテゾミブなど、多くの化学療法薬がＣＩＰＮを引き起こすことが知られている。１つの実施形態では、ＣＩＰＮは、白金含有化学療法薬を含んでなる化学療法により引き起こされる。１つの実施形態では、ＣＩＰＮは、オキサリプラチンを含んでなる化学療法により引き起こされる。１つの実施形態では、ＣＩＰＮは、白金含有化学療法薬により引き起こされる。さらなる実施形態では、ＣＩＰＮは、オキサリプラチンにより引き起こされる。
【００２２】
本発明とともに使用するためのＣＸＣＲ２アンタゴニストの適性は、標準的な製薬実務に従い、その効力、選択性、吸収、代謝、薬物動態学、毒性などの評価によって決定することができる。
【００２３】
ＣＸＣＲ２アンタゴニストの効力は、以下の実験の節に記載されるアッセイａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）などの容易に利用可能なアッセイ方法を用いて決定され得る。
【００２４】
アッセイａ）は、組換え発現されたヒトＣＸＣＲ２受容体に対するヒト内因性アゴニストＩＬ−８の、放射性標識された結合を測定する。アッセイｂ）は、受容体自体の下流でリポーター遺伝子構築物を介して測定される組換え発現されたヒトＣＸＣＲ２受容体に対する機能活性を測定する。アッセイｃ）は、受容体自体の下流でリポーター遺伝子構築物を介して測定される組換え発現されたヒトＣＸＣＲ２受容体に対する機能活性を測定する。アッセイｄ）は、受容体自体の下流でフローサイトメトリーセルソーティングプロトコールにより測定される全血中の天然発現ヒトＣＸＣＲ２に対する細胞機能活性を測定する。各アッセイでは、アゴニストにより媒介されるエンドポイントの阻害がアンタゴニスト効力を決定付ける。あるアンタゴニストに関して、効力は使用するアッセイによって異なり得る。しかしながら、熟練の薬理学者であれば、効力を決定する際に異なるアッセイからの結果を容易に比較することができる。
【００２５】
１つの実施形態では、ＣＸＣＲ２アンタゴニストは、ＣＸＣＲ２受容体結合アッセイで測定した場合にＣＸＣＲ２受容体に対するｐＩＣ５０値が７．０以上である。さらなる実施形態では、ＣＸＣＲ２アンタゴニストは、受容体結合アッセイで測定した場合にＣＸＣＲ２受容体に対するｐＩＣ５０値が７．８以上である。
【００２６】
１つの実施形態では、ＣＸＣＲ２アンタゴニストは、アッセイａ）で測定した場合にＣＸＣＲ２受容体に対するｐＩＣ５０値が７．０以上である。さらなる実施形態では、ＣＸＣＲ２アンタゴニストは、アッセイａ）で測定した場合にＣＸＣＲ２受容体に対するｐＩＣ５０値が７．８以上である。
【００２７】
１つの実施形態では、ＣＸＣＲ２アンタゴニストは、アッセイｂ）で測定した場合にＣＸＣＲ２受容体に対するｐＡ２値が８．０以上である。さらなる実施形態では、ＣＸＣＲ２アンタゴニストは、アッセイｂ）で測定した場合にＣＸＣＲ２受容体に対するｐＡ２値が８．２以上である。
【００２８】
１つの実施形態では、ＣＸＣＲ２アンタゴニストは、アッセイｃ）で測定した場合にＣＸＣＲ２受容体に対するｐＩＣ５０値が８．０以上である。さらなる実施形態では、ＣＸＣＲ２アンタゴニストは、アッセイｃ）で測定した場合にＣＸＣＲ２受容体に対するｐＩＣ５０値が８．８以上である。
【００２９】
１つの実施形態では、ＣＸＣＲ２アンタゴニストは、アッセイｄ）で測定した場合にＣＸＣＲ２受容体に対するｐＩＣ５０値は５．０以上である。さらなる実施形態では、ＣＸＣＲ２アンタゴニストは、アッセイｄ）で測定した場合にＣＸＣＲ２受容体に対するｐＩＣ５０値が５．４以上である。
【００３０】
ＣＸＣＲ１受容体と比較したＣＸＣＲ２受容体におけるＣＸＣＲ２アンタゴニストの選択性は、アッセイａ）およびｅ）を用いて決定され得る。選択性比は、当業者により、関連する特定の受容体の対応するＩＣ５０値の比によって容易に決定され得る。１つの実施形態では、ＣＸＣＲ２アンタゴニストは、ＣＸＣＲ２に対する選択性がＣＸＣＲ１の２９倍以上である。さらなる実施形態では、ＣＸＣＲ２アンタゴニストは、ＣＸＣＲ２に対する選択性がＣＸＣＲ１の５０倍以上である。１つの実施形態では、ＣＸＣＲ２アンタゴニストは、ＣＸＣＲ２に対する選択性がＣＸＣＲ１の１００倍以上である。
【００３１】
経口バイオアベイラビリティは、経口投与された薬物の、体循へ到達する特性を意味する。薬物の経口バイオアベイラビリティを決定する因子は、溶解度、膜透過性、代謝安定性およびおそらくは能動輸送体の関与である。一般に、スクリーニングカスケードでは、まず、潜在的負担を特定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験を使用し、次いで、経口バイオアベイラビリティを決定するためのｉｎ  ｖｉｖｏ評価へ進む。
【００３２】
溶解、すなわち、消化管（ＧＩＴ）の水性内容物により薬物の可溶化は、ＧＩＴを模倣する適当なｐＨで行うｉｎ  ｖｉｔｒｏ溶解度試験から予測することができる。１つの実施形態では、ＣＸＣＲ２アンタゴニストは、１０μｇ／ｍｌの最小溶解度を有する。溶解度は、Adv. Drug Deliv. Rev., 23, 3-25 (1997)に記載されているものなどの当技術分野で公知の標準的手順によって決定することができる。
【００３３】
膜透過性は、化合物が生体膜を通過する割合を意味する。親油性は、これを予測する上で重要な特性であり、有機溶媒およびバッファーを用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｌｏｇ  Ｄ７．４測定により定義される。１つの実施形態では、ＣＸＣＲ２アンタゴニストは、−２〜＋４、より好ましくは、−１〜＋３のＬｏｇ  Ｄ７．４を有する。Ｌｏｇ  Ｄ７．４は、J. Pharm. Pharmacol. , 42:144 (1990)に記載されているものなどの当技術分野で公知の標準的手順によって決定され得る。
【００３４】
代謝安定性は、吸収および排泄過程でのＧＩＴまたは肝臓の化合物代謝能を取り扱う。ミクロソーム、肝細胞などのアッセイ系は、代謝負担の予測指標である。１つの実施形態では、ＣＸＣＲ２アンタゴニストは、アッセイ系において低〜中等度の肝除去に見合う代謝安定性を示す。アッセイ系およびデータ操作の例は、Curr. Opin. Drug Disc. Devel., 4, 36-44 (2001); Drug Met. Disp., 28,1518-1523 (2000)に記載されている。
【００３５】
上記過程の相互作用のために、薬物がヒトにおいて潜在的に経口利用可能であるというさらなる評価は、前臨床種における。絶対的バイオアベイラビリティは、これらの試験で、その化合物を経口および静脈経路によって投与することにより決定される。動物における経口バイオアベイラビリティの評価の例は、Drug Met. Disp., 29, 82-87 (2001); J. Med Chem., 40, 827-829 (1997); Drug Met. Disp., 27, 221-226 (1999)に見出すことができる。
【００３６】
本発明とともに使用するのに好適なＣＸＣＲ２アンタゴニストは、欧州特許公報ＥＰ１  ５５８  ２５９  Ｂ１およびＥＰ２  ００９  ９９２  Ｂ１に開示されている。これらの公報の内容、特に、特許請求の範囲の治療上有効な化合物の一般式およびそこに例示されている化合物は、引用することにより本明細書の開示の一部とされる。
【００３７】
１つの実施形態では、本発明とともに使用するためのＣＸＣＲ２アンタゴニストは、
式（Ａ）
【化１】
2017527542.tif 000002
の１−（４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（ピペラジン−１−イルスルホニル）フェニル）−３−（２−クロロ−３−フルオロフェニル）尿素；
式（Ｂ）
【化２】
2017527542.tif 000003
の１−（４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（ピペリジン−３−イルスルホニル）フェニル）−３−（３−フルオロ−２−メチルフェニル）尿素；
式（Ｃ）
【化３】
2017527542.tif 000004
の１−（４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（（（Ｒ）−３−メチルテトラヒドロフラン−３−イル）スルホニル）フェニル）−３−（（Ｒ）−２−メチルシクロペント−２−エン−１−イル）尿素；
式（Ｄ）
【化４】
2017527542.tif 000005
の１−（４−クロロ−３−（（１，４−ジメチルピペリジン−４−イル）スルホニル）−２−ヒドロキシフェニル）−３−（２−クロロ−３−フルオロフェニル）尿素；
式（Ｅ）
【化５】
2017527542.tif 000006
の（Ｒ）−１−（４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（（４−メチルテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）スルホニル）フェニル）−３−（２−クロロシクロペント−２−エン−１−イル）尿素；
式（Ｆ）
【化６】
2017527542.tif 000007
の（Ｒ）−１−（３−（ｔｅｒｔ−ブチルスルホニル）−４−シアノ−２−ヒドロキシフェニル）−３−（２−メチルシクロペント−２−エン−１−イル）尿素；
式（Ｇ）
【化７】
2017527542.tif 000008
の１−（４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（（トランス−３−（ピロリジン−１−イル）シクロブチル）スルホニル）フェニル）−３−（（Ｒ）−２−メチルシクロペント−２−エン−１−イル）尿素；
式（Ｈ）
【化８】
2017527542.tif 000009
の１−（４−クロロ−３−（（トランス−３−（ジメチルアミノ）シクロブチル）スルホニル）−２−ヒドロキシフェニル）−３−（（Ｒ）−２−メチルシクロペント−２−エン−１−イル）尿素；
式（Ｉ）
【化９】
2017527542.tif 000010
の（Ｒ）−１−（４−クロロ−３−（（１，１−ジフルオロエチル）スルホニル）−２−ヒドロキシフェニル）−３−（２−メチルシクロペント−２−エン−１−イル）尿素；
式（Ｊ）
【化１０】
2017527542.tif 000011
の１−（４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（（（Ｓ）−３−メチルテトラヒドロフラン−３−イル）スルホニル）フェニル）−３−（（Ｒ）−２−メチルシクロペント−２−エン−１−イル）尿素；
式（Ｋ）
【化１１】
2017527542.tif 000012
の１−（４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（（（Ｓ）−３−メチルテトラヒドロフラン−３−イル）スルホニル）フェニル）−３−（（Ｒ）−２−クロロシクロペント−２−エン−１−イル）尿素；および
式（Ｌ）
【化１２】
2017527542.tif 000013
の１−（４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（（（Ｒ）−３−メチルテトラヒドロフラン−３−イル）スルホニル）フェニル）−３−（（Ｒ）−２−クロロシクロペント−２−エン−１−イル）尿素；またはその薬学的に許容可能な塩からなる群から選択される。
【００３８】
式（Ａ）の化合物は、欧州特許ＥＰ１  ５５８  ２５９  Ｂ１、実施例１に記載の方法に従って製造され得る。
【００３９】
式（Ｂ）の化合物は、欧州特許ＥＰ２  ００９  ９９２  Ｂ１、実施例１に記載の方法に従って製造され得る。
【００４０】
式（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）、（Ｇ）、（Ｈ）、（Ｉ）、（Ｊ）、（Ｋ）および（Ｌ）の化合物は、下記の方法に従って製造され得る。製造に関してはまた国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０６１６１８も参照。
【００４１】
さらなる実施形態では、ＣＸＣＲ２アンタゴニストは、式（Ａ）の１−（４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（ピペラジン−１−イルスルホニル）フェニル）−３−（２−クロロ−３−フルオロフェニル）尿素またはその薬学的に許容可能な塩である。
【化１３】
2017527542.tif 000014
【００４２】
さらなる実施形態では、ＣＸＣＲ２アンタゴニストは、式（Ｂ）の１−（４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（ピペリジン−３−イルスルホニル）フェニル）−３−（３−フルオロ−２−メチルフェニル）尿素またはその薬学的に許容可能な塩である。
【化１４】
2017527542.tif 000015
【００４３】
さらなる実施形態では、ＣＸＣＲ２アンタゴニストは、式（Ｃ）の１−（４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（（（Ｒ）−３−メチルテトラヒドロフラン−３−イル）スルホニル）フェニル）−３−（（Ｒ）−２−メチルシクロペント−２−エン−１−イル）尿素または薬学的に許容可能な塩である。
【化１５】
2017527542.tif 000016
【００４４】
さらなる実施形態では、ＣＸＣＲ２アンタゴニストは、式（Ｊ）の１−（４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（（（Ｓ）−３−メチルテトラヒドロフラン−３−イル）スルホニル）フェニル）−３−（（Ｒ）−２−メチルシクロペント−２−エン−１−イル）尿素またはその薬学的に許容可能な塩である。
【化１６】
2017527542.tif 000017
【００４５】
ＣＸＣＲ２アンタゴニストは、単独で投与することもできるが、一般には、意図される投与経路および標準的な製薬実務に対して選択される好適な製薬賦形剤、希釈剤または担体との混合物として投与される。
【００４６】
ＣＸＣＲ２アンタゴニストは、必ずというわけではないが通常、適当な経路によって患者に投与する前に医薬組成物へと処方される。よって、別の側面では、本発明は、ａ）ＣＸＣＲ２アンタゴニストと、ｂ）ＣＩＰＮの予防および／または治療において使用するための１以上の薬学的に許容可能な賦形剤とを含んでなる医薬組成物を提供する。
【００４７】
本発明の医薬組成物は、本発明の化合物が分配されたバルク形態で製造および包装され、次いで、患者に与えてよい（例えば、散剤およびシロップ）。あるいは、本発明の医薬組成物は、投与形として製造および包装されてもよく、この場合、物理的に分離した各投与形は本発明の化合物を含有する。よって、別の側面において、本発明は、本発明の医薬組成物を含んでなる投与形を提供する。約６５〜８０ｋｇの体重を有する平均的なヒト対象では、分離した各投与形は一般に５ｍｇ〜１００ｍｇの本発明の化合物を含有する。当業者は、小児および高齢者など、体重がこの範囲外にある対象に必要な用量レベルを容易に決定することができる。
【００４８】
本発明の組成物は一般に、所望の投与経路により患者に投与するために適合した投与形へと処方される。例えば、投与形には、（１）錠剤、カプセル剤、カプレット剤、丸剤、トローチ剤、散剤、シロップ、エリキシル剤、懸濁液、溶液、エマルション、サシェ剤およびカシェ剤などの経口投与に適合したもの；（２）無菌溶液、懸濁液、インプラントおよび再構成用粉末などの非経口投与に適合したもの；（３）経皮パッチなどの経皮投与に適合したもの；（４）坐剤、膣坐剤およびフォームなどの直腸および膣投与に適合したもの；（５）ドライパウダー、エアゾール、懸濁液および溶液（スプレーおよび滴剤）などの吸入および鼻腔内に適合したもの；（６）クリーム、軟膏、ローション、溶液、ペースト、滴剤、スプレー、フォームおよびゲルなどの局所投与に適合したもの；（７）滴剤、軟膏、スプレー、懸濁液およびインサートなどの眼投与に適合したもの；（８）トローチ剤、パッチ、スプレー、滴剤、チューンガムおよび錠剤などの頬側および舌下投与に適合したものが含まれる。１つの実施形態では、投与形は経口投与に適する。１つの実施形態では、組成物は経口投与に適合している。
【００４９】
本明細書で使用する場合、用語「薬学的に許容可能な賦形剤」は、ＣＸＣＲ２アンタゴニストと感知できるほどには反応もしなければ、ＣＸＣＲ２アンタゴニストの治療活性に望ましくない影響をもたらさない物質を意味する。薬学的に許容可能な賦形剤は、選択された特定の投与形によって異なる。加えて、薬学的に許容可能な賦形剤は、組成物において役立ち得る特定の機能に関して選択することができる。例えば、特定の薬学的に許容可能な賦形剤は、均質な投与形の製造を助けるそれらの能力に関して選択することができる。特定の薬学的に許容可能な賦形剤は、安定な投与形の製造を助けるそれらの能力に関して選択することができる。特定の薬学的に許容可能な賦形剤は、ひと度患者に投与されると、ある器官または身体部分から別の器官または身体部分への、本発明の１または複数の化合物の運搬または輸送を助けるそれらの能力に関して選択することができる。特定の薬学的に許容可能な賦形剤は、患者のコンプライアンスを高めるそれらの能力に関して選択することができる。特定の薬学的に許容可能な賦形剤は、その病態を治療するために適当な速度でのＣＸＣＲ２アンタゴニストの放出を助けるそれらの能力に関して選択することができる。
【００５０】
経口投与に適合した組成物とともに使用するための薬学的に許容可能な賦形剤としては、希釈剤および増量剤（例えば、ラクトース、スクロース、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルファー化デンプン、セルロース、微晶質セルロース、硫酸カルシウム、および第二リン酸カルシウム）；結合剤（例えば、デンプン、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルファー化デンプン、ゼラチン、アラビアガム、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸、トラガカントガム、グアーガム、ポビドン、セルロースおよびヒドロキシプロピルメチルセルロース）；崩壊剤（例えば、デンプン、クロスポビドン、グリコール酸ナトリウムデンプン、クロスカルメロース、アルギン酸およびカルボキシメチルセルロースナトリウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、およびドデシル硫酸ナトリウム）；流動促進剤（例えば、タルクおよびコロイド二酸化ケイ素）；造粒剤；コーティング剤；湿潤剤；溶媒；補助溶媒；沈殿防止剤；乳化剤；甘味剤；香味剤；矯味剤；着色剤；固化防止剤；保湿剤；キレート剤；可塑剤；増粘剤；速度変更剤；酸化防止剤；保存剤；安定剤；界面活性剤；および緩衝剤が含まれる。当業者は、特定の薬学的に許容可能な賦形剤が２つ以上の機能を果たす場合があり、どの程度の賦形剤が処方物中に存在するかおよび他のどんな成分が処方物中に存在するかによって、別の機能を果たす場合があることを認識するであろう。１つの実施形態では、錠剤、カプセル剤、カプレット剤および丸剤などの経口投与に適合した投与形は、本発明の化合物の即放出、遅延放出、改変放出、持続放出、パルス放出または制御放出のために処方され得る。
【００５１】
当業者は、ＣＸＣＲ２アンタゴニストとともに使用するための適当な量の薬学的に許容可能な賦形剤を決定することを可能とする当技術分野の知識および技能をもっている。加えて、薬学的に許容可能な賦形剤を記載し、薬学的に許容可能な賦形剤を選択するのに有用であり得る、当業者に利用可能ないくつかの資料がある。例として、Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company)、The Handbook of Pharmaceutical Additives (Gower Publishing Limited)、およびThe Handbook of Pharmaceutical Excipients (the American Pharmaceutical Association and the Pharmaceutical Press)が挙げられる。本発明の医薬組成物は、当業者に公知の技術および方法を用いて製造することができる。当技術分野で慣用される方法のいくつかがRemington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company)に記載されている。
【００５２】
以下の処方例は単に例示であり、本発明の範囲を限定するものではない。
【００５３】
【表１】
2017527542.tif 000018
【００５４】
本発明によれば、ＣＸＣＲ２アンタゴニストは、化学療法薬の投与により引き起こされるＣＩＰＮを予防および／または治療する。よって、ＣＸＣＲ２アンタゴニストは、化学療法薬と併用投与され得る。本発明の１つの実施形態では、ＣＩＰＮの予防および／または治療のためのＣＸＣＲ２アンタゴニストは、１種以上の一次化学療法薬と組み合わせ、活性薬剤は、以下のリスト：白金化合物（例えば、オキサリプラチン）、タキサン、ビンカアルカロイド、サリドマイドおよびボルテゾミブから選択される。さらなる実施形態では、一次化学療法薬はオキサリプラチンである。
【００５５】
多くの場合、化学療法薬は、難治性集団の治療を含め、効果的な服薬遵守抗癌治療のための治療選択肢を増やす付加的薬剤（例えば、他の化学療法薬、血管新生阻害剤、制吐剤）と併用投与される。本発明のさらなる実施形態では、ＣＸＣＲ２アンタゴニストは、ａ）一次化学療法薬、およびｂ）ベバシズマブ、イリノテカン、カペシタビン、セツキシマブ、パニツムマブ、レゴラフェニブおよびＺｉｖ−アフリバーセプトからなる群から選択される付加的薬剤とともに投与される。
【００５６】
活性薬剤の組合せが投与される場合、それらは同時に、個別に、または逐次に投与され得る。１つの実施形態では、ＣＸＣＲ２アンタゴニストは、化学療法薬が投与される前または同時に投与される。
【００５７】
本発明は以下のさらなる側面に基礎を提供すると認識される。第１の側面に関して以上に明示された実施形態はこれらの側面に拡張される：
必要とするヒトにおいてＣＩＰＮを予防および／または治療するための方法であって、ＣＸＣＲ２アンタゴニストを投与することを含んでなる方法；
ＣＩＰＮの予防および／または治療のための薬剤の製造におけるＣＸＣＲ２アンタゴニストの使用；
ＣＸＣＲ２アンタゴニストと上記に定義される付加的活性薬剤とを含んでなるＣＩＰＮのための予防および／または治療のための医薬の組合せ；
必要とするヒトにおいてＣＩＰＮを予防および／または治療するための方法であって、ＣＸＣＲ２アンタゴニストと上記に定義される付加的活性薬剤とを含んでなる医薬の組合せを投与することを含んでなる方法；
ＣＸＣＲ２アンタゴニストと上記に定義される付加的活性薬剤とを含んでなる、患者におけるＣＩＰＮの予防および／または治療のための薬剤の製造のための医薬の組合せの使用；
ａ）ＣＸＣＲ２アンタゴニストを含んでなる第１の医薬組成物；ｂ）上記に定義される付加的活性薬剤を含んでなる第２の組成物；およびｃ）第１および第２の組成物のための容器を含んでなる、ＣＩＰＮの予防および／または治療のためのキット；ならびに
ａ）ＣＸＣＲ２アンタゴニストを含んでなる第１の医薬組成物；ｂ）上記に定義される付加的活性薬剤を含んでなる第２の組成物；およびｃ）第１および第２の組成物のための容器を含んでなる、ＣＩＰＮの予防および／または治療のための薬剤の製造におけるキットの使用。
【実施例】
【００５８】
ａ）ＣＸＣＲ２およびＣＸＣＲ１に関する受容体結合アッセイ
比活性２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌの［１２５Ｉ］ＩＬ−８（ヒト組換え、ＩＭ２４９）をＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｃｏｒｐ．、アーリントンハイツ、ＩＬから入手した。他の全ての化学薬品は分析グレードのものであった。高レベルの組換えヒトＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２受容体は、本アッセイを実施するために必要とされる程度まで、本明細書の開示の一部とされるHolmes, et al., Science, 1991, 253, 1278に記載されるようにチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で個々に発現させた。チャイニーズハムスター卵巣膜を、ホモジナイゼーションバッファーを１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、１ｍＭ  ＰＭＳＦ（α−トルエン−スルホニルフルオリド）、２．５ｍｇ／Ｌロイペプチンおよび０．１ｍｇ／ｍｌアプロチニンを含有する４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ  ｐＨ７．５に替えたこと以外は、本アッセイを実施するために必要とされる程度まで、本明細書の開示の一部とされるHaour, et al., J. Biol. Chem., 249 pp 2195-2205 (1974)に従って調製した。膜タンパク質濃度は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ試薬を用い、標品としてウシ血清アルブミンを用いて測定した。総ての結合アッセイは、９６ウェルマイクロプレート（オプティプレート９６、Ｐａｃｋａｒｄ）形式にて、コムギ麦芽凝集素ビーズを用いるシンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡアッセイ）を用いて実施した。ＣＨＯ−ＣＸＣＲ２およびＣＨＯ−ＣＸＣＲ１膜を、アッセイ前に、結合バッファー；２５ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する２０ｍＭ  Ｂｉｓ  Ｔｒｉｓプロパン、ｐＨ８中、４℃で３０分間、ビーズとともにプレインキュベートした。化合物を１００％ＤＭＳＯで終濃度（最終１ｎＭ〜１０００ｎＭおよび５％ＤＭＳＯ）まで希釈した。アッセイは、結合バッファー、コムギ麦芽凝集素ビーズ、種々の濃度の化合物、５％ＤＭＳＯ、０．０４％ＣＨＡＰ、０．００２５％ＢＳＡおよび０．２２５ｎＭ［１２５Ｉ］ＩＬ−８で前処理した膜を含有する０．１ｍｌ反応バッファー中で行った。９６ウェルプレートを振盪プラットフォーム上で１時間インキュベートした。インキュベーションの終了時に、これらのプレートを２０００ＲＰＭで５分間回転させ、Ｔｏｐ  Ｃｏｕｎｔカウンターで計数した。
【００５９】
このアッセイでは、＞５のｐＩＣ５０値を示す化合物が活性と見なされる。
【００６０】
式（Ａ）の化合物は、ＣＸＣＲ２受容体に対しては７．８のｐＩＣ５０値およびＣＸＣＲ１受容体に対しては５．５の値を示す。このアッセイで測定した場合に、従って、式（Ａ）の化合物はＣＸＣＲ２に対してＣＸＣＲ１の１８８倍の選択性がある。
【００６１】
式（Ｂ）の化合物は、ＣＸＣＲ２受容体に対して７．９のｐＩＣ５０値、ＣＸＣＲ１受容体に対して６．０の値を示す。従って、このアッセイで測定した場合に、式（Ｂ）の化合物は、ＣＸＣＲ２に対してＣＸＣＲ１の７８倍の選択性がある。
【００６２】
ｂ）カルシウム動員アッセイ
ＣＸＣＲ２およびＧαｌ６を安定発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を、５％ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で維持しながら、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＨＡＭの）１：１、ｗ／１０％ＦＣＳ（熱失活）、ｗ／２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、ｗ／０．４ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８中で、８０％コンフルエンシーまで増殖させた。アッセイを行う２４時間前に細胞を採取し、９６ウェルの黒色壁、透明底のプレート（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｖｉｅｗ）に播種し（ウェル当たり４０，０００細胞）、ＣＯ２インキュベーターに戻した。アッセイ当日、化合物を１００％ＤＭＳＯで所望のアッセイ濃度の３００倍に連続希釈した。増殖培地を細胞から吸引し、１００μＬのロード培地（Ｅａｒｌの塩  ｗ／Ｌグルタミン、０．１％ＢＳＡ（Ｓｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐ．からのＢｏｖｕｎｌｉｎａｒ  ＣｏｈｅｎフラクションＶ）、４ｕＭフロ−４−アセトキシメチルエステル蛍光指示色素（フロ−４ＡＭ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）および２．５ｍＭプロベネシドを含むＥＭＥＭ）に置き換え、ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で１時間インキュベートした。ロード培地を吸引し、Ｅａｒｌの塩  ｗ／Ｌ−グルタミン、０．１％ゼラチンおよび２．５ｍＭプロベネシドを含む１００μＬのＥＭＥＭｂに置き換え、さらに１０分間インキュベートした。ＤＭＳＯ中３００倍の連続希釈化合物（３μＬ）を、２９７マイクロリットルのＫＲＨ（１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、４．６ｍＭ  ＫＣｌ、１．０３ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１．０ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１１ｍＭグルコース、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４））  ｗ／２．５ｍＭプロベネシドおよび０．１％ゼラチン（この時点では３倍の化合物）の入った９６ウェルプレートに移した。細胞から培地を吸引し、細胞をＫＲＨ  ｗ／２．５ｍＭプロベネシド、ｗ／０．１％ゼラチンで３回洗浄した。０．１％ゼラチンを含むＫＲＨ（１００μＬ）  ｗ／２．５ｍＭプロベネシドをウェルに加えた後、ＫＲＨ  ｗ／２．５ｍＭプロベネシドおよび０．１％ゼラチン中、５０μＬの３倍化合物をウェルに加え、ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で１０分間インキュベートした。これらのプレートを、従前に記載されたように[Sarau et al., Mol. Pharmacol., Sep., 56(3), 657-63 (1999)]、分析のためにＦＬＩＰＲ（Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、サニーヴェール、カリフォルニア州）に置いた。ＣＸＣＲ２に関する、１．０ｎＭ  ｌＬ−８により誘導される最大ヒトＩＬ−８誘導性Ｃａ２＋動員のパーセント、すなわちＥＣ８０濃度を各濃度の化合物で決定し、ｌＣ５０を１．０ｎＭ  ＩＬ−８により誘導される最大応答の５０％を阻害する化合物の濃度として計算した。
【００６３】
このアッセイで測定した場合、式（Ａ）の化合物は、ＣＸＣＲ２受容体に対して８．４のｐＡ２値を示す。
【００６４】
このアッセイで測定した場合、式（Ｂ）の化合物は、ＣＸＣＲ２受容体に対して８．２のｐＡ２値を示す。
【００６５】
ｃ）ＣＸＣＲ２  Ｔａｎｇｏアッセイ
このアッセイでは、ＴＥＶプロテアーゼ部位およびＧａｌ４−ＶＰ１６転写因子に連結された組換えヒトＣＸＣＲ２を含む安定細胞株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において、リガンドにより誘導される受容体ＣＸＣＲ２の活性化を測定する。受容体に対するリガンドの結合は、受容体へのアレスチンタンパク質（プロテアーゼタグを有する）の動員をもたらし、つながれていた転写因子の放出を誘発する。転写因子は核に入り、リポーター遺伝子の転写を活性化する。ＣＸＣＲ２の活性化を阻害する化合物の能力を、リポーター遺伝子の活性を測定することにより間接的に評価する。
【００６６】
低温保存細胞のバイアルを液体窒素から取り出し、水浴中３７℃で穏やかに振盪しながら３７℃で急速解凍した。細胞内容物を回収し、アッセイ培地に約２００，０００細胞／ｍｌの密度で再懸濁させた。総ての試験化合物をＤＭＳＯ中に１０ｍＭの濃度で溶解させた後、１０点用量応答曲線を作成するために、Ｅｃｈｏ（Ｌａｂｃｙｔｅ）濃度応答プログラム（５０ｎｌ／ウェル）を用い、３８４ウェルアッセイプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ７８１０９０）中に連続希釈した。無細胞対照、非刺激対照および陽性対照を、総てのアッセイのプレートでＤＭＳＯ濃度が一定であったことを確認するための５０ｎｌ／ウェルの純粋ＤＭＳＯとともにロードした。Ｍｕｌｔｉ−ｄｒｏｐ  Ｃｏｍｂｉ（Ｔｈｅｒｍｏ）を標準カセットとともに用い、化合物含有アッセイプレートの無細胞対照ウェルには５０μｌのアッセイ培地を加え；非刺激対照ウェル（ウェル当たり約１０，０００細胞）にはｈＣＸＣＬ１（ＣＸＣＲ２リガンド）不含の細胞懸濁液５０μｌを加え；アッセイプレートの残りのウェルには８０ｎＭ  ｈＣＸＣＬ１を含む細胞懸濁液５０μｌ（ウェル当たり約１０，０００細胞）を加えた。これらの細胞を３７℃／５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。Ｍｕｌｔｉ−ｄｒｏｐ  Ｃｏｍｂｉ（Ｔｈｅｒｍｏ）をスモールチューブカセットとともに用い、１０μｌの６倍基質混合物（ＬｉｖｅＢＬＡｚｅｒ（商標）−ＦＲＥＴ  Ｂ／Ｇ基質（ＣＣＦ４−ＡＭ）カタログ番号Ｋ１０９６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．から）を各ウェルに加え、プレートを暗所、室温で２時間インキュベートした。次に、プレートを、ＥｎＶｉｓｉｏｎにて、１つの励起チャネル（４０９ｎｍ）と２つの発光チャネル（４６０ｎｍおよび５３０ｎｍ）を用いて読み取った。
【００６７】
バックグラウンドを差し引いた青色発光値を、バックグラウンドを差し引いた緑色発光値で割ることにより、各ウェルについて青色／緑色発光比（４６０ｎｍ／５３０ｎｍ）を計算した。用量応答曲線はシグモイド用量応答モデルに基づいた。各プレートについて、総ての比のデータを、陽性対照（ｈＣＸＣＬ１）の最大発光比と陰性対照（ＤＭＳＯ）の最小発光比に基づいて正規化した。
【００６８】
このアッセイで測定した場合、式（Ａ）の化合物は、ＣＸＣＲ２受容体に対して９．２のｐＩＣ５０を示した。
【００６９】
このアッセイで測定した場合、式（Ｂ）の化合物は、ＣＸＣＲ２受容体に対して８．８のｐＩＣ５０を示した。
【００７０】
このアッセイで測定した場合、式（Ｃ）の化合物は、ＣＸＣＲ２受容体に対して９．０のｐＩＣ５０を示した。
【００７１】
このアッセイで測定した場合、式（Ｄ）の化合物は、ＣＸＣＲ２受容体に対して８．９のｐＩＣ５０を示した。
【００７２】
このアッセイで測定した場合、式（Ｅ）の化合物は、ＣＸＣＲ２受容体に対して８．８のｐＩＣ５０を示した。
【００７３】
このアッセイで測定した場合、式（Ｆ）の化合物は、ＣＸＣＲ２受容体に対して９．７のｐＩＣ５０を示した。
【００７４】
このアッセイで測定した場合、式（Ｇ）の化合物は、ＣＸＣＲ２受容体に対して９．０のｐＩＣ５０を示した。
【００７５】
このアッセイで測定した場合、式（Ｈ）の化合物は、ＣＸＣＲ２受容体に対して９．０のｐＩＣ５０を示した。
【００７６】
このアッセイで測定した場合、式（Ｉ）の化合物は、ＣＸＣＲ２受容体に対して９．４のｐＩＣ５０を示した。
【００７７】
このアッセイで測定した場合、式（Ｊ）の化合物は、ＣＸＣＲ２受容体に対して９．０のｐＩＣ５０を示した。
【００７８】
ｄ）ヒト全血アッセイ
バージョンｉ）
ヒト血液は、健常な同意成人から、訓練を受けた医療専門家により、２２５μｌの０．２５ＭＥＤＴＡを含有する１０ｍｌシリンジで静脈穿刺して７ｍｌの血液を満たすことによって得た（ＣＸＣＬ１刺激中３７℃で維持）。
【００７９】
試験化合物を１００％ＤＭＳＯに１０ｍＭの濃度となるように溶かし、１．２％ＤＭＳＯでアッセイ濃度の１２倍となるように希釈した（ＤＭＳＯ終濃度０．１％）。
【００８０】
アッセイ：  １００μｌの全血を、１０μｌの１．２％ＤＭＳＯ（アッセイ濃度０．１％）または１．２％ＤＭＳＯに溶かした化合物１０μｌ（アッセイ濃度範囲０．１μＭ〜１０μＭ）を含有するアッセイチューブまたは９６ウェルＵ底透明プレートに加えた後、３７℃で１０分間インキュベートし、その後、ＤＰＢＳ中０．１％ＢＳＡ（陰性対照）１０μｌまたはＤＰＢＳ中０．１％ＢＳＡに溶かした１２０ｎＭ  ＣＸＣＬ１（ＧＲＯα、Ｐｒｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ，Ｉｎｃ）１０μｌ（アッセイ濃度は、ＣＸＣＬ１のＥＣ８０である１０ｎＭ）を加え、３７℃でさらに１０分間、穏やかに振盪しながらインキュベートし、その後、氷上に置き、２５０μｌのＣｅｌｌＦｉｘまたは２５０μｌの３．７％  ｖ／ｖパラホルムアルデヒド（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を加えることによりアッセイを終了させた。１分後、５０μｌの固定血液を、１０μｌの抗ＣＤ１１ｂ−ＦＩＴＣ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）および５μｌの抗ヒトＣＤ１６−ＰＥ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）を含有するチューブに加え、穏やかに混合し、全サンプルを５００μｌの冷ＤＰＢＳに加えた。ＬＳＲフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）またはＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩを用いて分析する前に、細胞を４℃にて１０分間、核酸染色剤であるＬＤＳ−７５１（Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）１０μｌで染色し、サイトメーター閾値の設定を、赤血球を排除するようにする。分析はＣｅｌｌ  ＱｕｅｓｔソフトウエアまたはＦＡＣｓｄｉｖａを用いて行った。好中球集団は、一連のゲート設定、すなわち、側方散布図と前方散布図における総ての顆粒球に対する最初のゲート設定、次いで、顆粒球集団（ＣＤ１６＋好中球、ＣＤ１６−好酸球）内のＣＤ１６＋（ＰＥ蛍光）細胞に対するゲート設定により決定した。各サンプルの好中球集団の平均ＦＩＴＣ蛍光は本発明者らのＣＸＣＲ２活性化に関するバイオマーカーであるＣＤ１１ｂ含量と直接関連するので、これを評価した。
【００８１】
各サンプルの平均蛍光を決定した。陽性対照は、１０ｎＭ  ＣＸＣＬ１（阻害剤無し）で刺激したサンプルの蛍光値と定義される。陰性対照は、ビヒクル処置サンプル（ＣＸＣＬ１無し、阻害剤無し）の蛍光値として定義される。平均陰性対照値を、各サンプルから差し引いた。次に、総てのサンプルを平均陽性対照に対して正規化した。
【００８２】
アッセイのこのバージョンで測定した場合、式（Ａ）の化合物は、ＣＸＣＲ２受容体に対して５．７のｐＩＣ５０を示した。
【００８３】
アッセイのこのバージョンで測定した場合、式（Ｂ）の化合物は、ＣＸＣＲ２受容体に対して６．４のｐＩＣ５０を示した。
【００８４】
アッセイのこのバージョンで測定した場合、式（Ｄ）の化合物は、ＣＸＣＲ２受容体に対して５．４のｐＩＣ５０を示した。
【００８５】
バージョンｉｉ）
同意成人から静脈穿刺により血液を抜き取り、抗凝固ヘパリン（１０μＬ／ｍＬ血液）を含有するＳｔｅｒｉｌｉｎチューブに注いだ。総ての試験化合物を４ｍＭとなるようにＤＭＳＯに溶かし、１０点用量応答曲線を提供するためにプレートにおいて１：３で連続希釈した。次に、化合物を−ＰＢＳ［リン酸緩衝生理食塩水（塩化カルシウムおよび塩化マグネシウム不含）］で１００倍希釈し、その後、１μＬを、ＦＸを用いて９６Ｕ底Ｃｏｓｔａｒプレートに分注した。これは、血液を添加した後に、最終ＤＭＳＯ濃度を０．２５％に引き下げるために、化合物については１０ｕＭの最終アッセイ濃度でスクリーニングされるように行った。
【００８６】
１０μＬの血液を、マルチチャネルピペットを用いて化合物プレートに移し、穏やかにタップして、３７℃で１５分間インキュベートした。１５分後、刺激剤ＧＲＯαを０．１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）−ＰＢＳで１００ｎＭに希釈し、終濃度３３ｎＭとなるように５μＬをプレート全体に分注した。プレートを穏やかにタップして、３７℃でさらに１５分間インキュベートした。このプレートを氷上に１分間置いた後、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（所在：Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍｕｎｒｏ  Ｈｏｕｓｅ、Ｔｒａｆａｌｇａｒ  Ｗａｙ、Ｂａｒ  Ｈｉｌｌ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）およびから購入したＣＤ１１ｂ−ＦＩＴＣ（４０ｕｇ／ｍＬ）、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（所在：Ｔｈｅ  Ｄａｎｂｙ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ、Ｅｄｍｕｎｄ  Ｈａｌｌｅｙ  Ｒｏａｄ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐａｒｋ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）から購入したＣＤ１６−ＰＥ（原液濃度１００試験、原液２ｍＬ容量を１：５希釈する）からなる１０μＬの抗体カクテルを加えた。プレートを暗所、氷上に１時間置いた。次に、細胞を、２００μＬ／ウェルの１倍ＦＡＣＳ（Ｆｌｏｗ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ）溶解溶液（Ｂｅｃｔｏｎ  ａｎｄ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ−ＢＤ）を用い、暗所、氷上で２０分間固定した。プレートを１６００ｒｐｍで５分間遠心分離し、２００μＬの氷冷ＰＢＳに再懸濁させた。この工程を２回繰り返し、フローサイトメトリー分析のために最終工程でプレートを、５０μＬの氷冷−ＰＢＳを用いて再懸濁させた。
【００８７】
サンプルを、ＨｙｐｅｒＣｙｔサンプリング装置（ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ）を流速２μＬ／秒で用いるＢｅｃｔｏｎ  ａｎｄ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（ＢＤ）−Ａｃｕｒｒｉ  Ｃ６フローサイトメーターに流した。ＣＤ１１ｂのアップレギュレーションは、好中球でモニタリングし、側方散乱とＣＤ１６発現の両方の組合せを用いて特定した。
【００８８】
アッセイのこのバージョンで測定した場合、式（Ｊ）の化合物は、ＣＸＣＲ２受容体に対して７．４のｐＩＣ５０を示した。
【００８９】
アッセイのこのバージョンで測定した場合、式（Ｄ）の化合物は、ＣＸＣＲ２受容体に対して５．８のｐＩＣ５０を示した。この値は、このアッセイのバージョンｉｉ）で測定した場合に式Ｄの化合物で得られた５．４のｐＩＣ５０と同等であり、従って、アッセイｄ）のバージョンｉ）とｉｉ）からの結果は比較できるものである。
【００９０】
ｅ）ＧＰＣＲアレスチンアッセイ
本発明の特定の化合物はまた、ＤｉｓｃｏｖｅＲＸ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（４２５０１  Ａｌｂｒａｅ  Ｓｔｒｅｅｔ、フリーモント、ＣＡ  ９４５３８、米国）により、ＣＸＣＲ２およびＣＸＣＲ１を含む受容体パネルに対するそれらの活性を決定するためのそれらのＧＰＣＲアレスチンアッセイでも試験された。
【００９１】
ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ  ＣＨＯ細胞株は、標準的手順に従って冷凍原株から拡大培養した。細胞を白色壁３８４ウェルマイクロプレートに総容量２０μＬで播種し、試験前に適当な時間、３７℃でインキュベートした。
【００９２】
これらの細胞をアンタゴニストとともにプレインキュベートした後、ＥＣ８０濃度でアゴニスト刺激を行った。アッセイバッファー中、５倍サンプルを作製するためにサンプル原液の中間希釈を行った。５μＬの５倍サンプルを細胞に加え、３７℃または室温で３０分間インキュベートした。ビヒクル濃度は１％であった。アッセイバッファー中６倍ＥＣ８０アゴニスト５μＬを細胞に加え、３７℃または室温で９０分または１８０分間インキュベートした。
【００９３】
アッセイシグナルを１２．５または１５μＬ（５０％  ｖ／ｖ）のＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ検出試薬カクテルの１回の添加により生成した後、室温で１時間インキュベートした。マイクロプレートを、シグナル精製後に、化学発光シグナル検出のためのＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（商標）装置を用いて読み取った。
【００９４】
化合物活性を、ＣＢＩＳデータ分析スーツ（ＣｈｅｍＩｎｎｏｖａｔｉｏｎ、ＣＡ）を用いて分析した。阻害パーセンテージを、下式：阻害率％＝１００％×（１−（試験サンプルの平均ＲＬＵ−ビヒクル対照の平均ＲＬＵ）／（ＥＣ８０対照の平均ＲＬＵ−ビヒクル対照の平均ＲＬＵ））を用いて計算した。
【００９５】
このアッセイで測定した場合、式（Ｊ）の化合物は、ＣＸＣＲ２受容体に対しては８．３、ＣＸＣＲ１受容体に対しては５．４のｐＩＣ５０値を示した。このアッセイで測定した場合、式（Ｊ）の化合物は、ＣＸＣＲ２に対してＣＸＣＲ１の７３０倍の選択性がある。
【００９６】
このアッセイで測定した場合、式（Ｄ）の化合物は、ＣＸＣＲ２受容体に対しては７．０、ＣＸＣＲ１受容体に対しては５．６のｐＩＣ５０値を示した。このアッセイで測定した場合、式（Ｄ）の化合物は、ＣＸＣＲ２に対してＣＸＣＲ１の２９倍の選択性がある。
【００９７】
ｆ）結腸直腸癌細胞株増殖アッセイにおけるオキサリプラチンおよび式（Ａ）の化合物の効果
細胞増殖アッセイ：  細胞を９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に異なる細胞密度で播種した：ＨＣＴ１１６、ウェル当たり５００細胞；Ｃａｃｏ−２、ウェル当たり１０００細胞。培地の総容量はウェル当たり９０μｌであった。細胞を３７℃および５％ＣＯ２インキュベーターで２４時間インキュベートした。
【００９８】
オキサリプラチンおよび式（Ａ）の化合物濃度系をＤＰＢＳでさらに希釈した。ＨＣＴ１１６細胞株実験におけるオキサリプラチンの終濃度は、５００μＭから３倍希釈で１５濃度と１つの対照であった。Ｃａｃｏ−２細胞株実験におけるオキサリプラチンの終濃度は、５５．５μＭから３倍希釈で９濃度と１つの対照であった。式（Ａ）の化合物の終濃度は８．５μＭであった。
【００９９】
５μＬのオキサリプラチンを５μｌのビヒクルまたは式（Ａ）の化合物とともに培地に加え、３７℃および５％ＣＯ２インキュベーターでさらに７２時間インキュベートした。細胞増殖速度は、製造者の説明書に従い、１００μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えることにより測定した。１０分のインキュベーション後、細胞溶解液をオプティプレート−３８４ウェルに移し、ＢｉｏＴｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ（商標）４ハイブリッドマイクロプレートリーダーにより、Ｇｅｎ５ソフトウエアを用いて発光を記録した。総てのデータ点は５反復で生成した。３回の独立した実験を行った。
【０１００】
データ分析：  ｐＩＣ５０値は、シグモイド濃度応答（変動傾斜）を用い、ソフトウエアＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５により計算した。総てのデータを、３回の独立した実験から決定された平均±平均の標準誤差として表した。
【０１０１】
Ｃａｃｏ−２およびＨＣＴ１１６の両細胞株の基本増殖に対する式（Ａ）の化合物単独（８．５μＭ）の効果を、３回の独立した実験から決定された一元配置ＡＮＯＶＡ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５）により分析した。確立されているオキサリプラチンの生物学的効果との関連で式（Ａ）の化合物単独の効果の適切な統計評価を可能とするために、これらの分析にオキサリプラチン濃度応答曲線の全体およびビヒクル対照の両方から生成した総てのデータを含めた。
【０１０２】
結果：  オキサリプラチンは、Ｃａｃｏ−２およびＨＣＴ１１６の両細胞株において、それぞれｐＩＣ５０値５．９２３±０．０４７および６．０４９±０．０１６で、細胞増殖に対する濃度依存的阻害を示した。８．５μＭ濃度の式（Ａ）の化合物の存在下で、これらオキサリプラチンの細胞増殖能の阻害は、それぞれｐＩＣ５０値５．９５±０．０７および６．０５±０．０２で、影響を受けなかった。
【０１０３】
Ｃａｃｏ−２およびＨＣＴ１１６細胞株では、それぞれ２．７±２．１％および８．９±０．７％で、式（Ａ）の化合物単独による基本増殖の有意な低下は見られなかった。加えて、これらの効果は各オキサリプラチン濃度応答曲線に見られる生物学的に関連のある統計的差異に満たなかった。従って、式（Ａ）の化合物（８．５μＭ）単独は、これら２つの細胞株の基本細胞増殖に対して効果を持たなかった。
【０１０４】
ｇ）慢性絞扼神経損傷齧歯類(chronic constriction injury rodents)における前臨床遺伝子発現
神経因性疼痛の慢性絞扼神経損傷（ＣＣＩ）モデルは、４か所の結紮(ligature)による坐骨神経の片側的な軽い結紮を含む。この結果、末梢の炎症細胞の動員ならびに脊髄の小膠細胞および星状細胞の活性化によって部分的に引き起こされる痛覚過敏、アロディニアおよび自発痛（異所性発火）が生じる。このモデルは、臨床で見られる神経因性疼痛の症状および病因の一部を模擬すると考えられている(Bennett and Xie, Pain 1988 33(1):87-107 (1988); Field et al., Pain 83(2):303-11 (1999)。齧歯類における感覚終点の初期変化はＣＣＩモデルで見られており、それぞれ冷アセトン刺激およびフォンフライ式フィラメントを用いて温度 (Neuropharmacology, 79 (2014) 432-443; Pain, 101 (2003) 65-77)および機械的刺激(Neuropharmacology, 79 (2014) 432-443; Brain Research, 784(1998)154-162)に対する感受性の増強をもたらした。
【０１０５】
雄のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（ハーラン、ＵＫ．２００〜２５０グラム）は、標準的なケージングおよび実験室条件下、４群で、１２／１２明暗周期、食物（５ＣＲ４、Ｐｕｒｉｎａ）および水（テストボックスに設置している間を除く）に自由に接近させて飼育した。到着日から環境エンリッチメントを図り、自体損傷を防ぐ助けとするために月曜（キャッスル）、水曜（ハウス）および金曜（チューブ）に変更を行った。雄のＣ５７ＢＬ６マウス（ハーラン、ＵＫ．６〜７週齢）は、標準的なケージングおよび実験室条件および環境エンリッチメント下、５群で、１２／１２明暗周期、食物（５ＣＲ４、Ｐｕｒｉｎａ）および水（テストボックスに設置している間を除く）に自由に接近させて飼育した。
【０１０６】
行動パート：
ベースライン試験：  ベースライン逃避閾値を決定するために、手術前に総ての動物に機械的アロディニアの行動試験を行った。ラット試験のため、フォンフライ式ヘアを用いた刺激に対する最後の２つ（３つのうち）のベースライン足逃避閾値（ＰＷＴ）の平均をベースラインとした。マウス試験では、ベースラインデータは別の２日（−１日目と０日目）に収集した。
【０１０７】
手術手順：  酸素と混合したイソフルラン麻酔下（３：１、１Ｌ／分）、左後脚の中大腿部を剃毛し、メスで皮膚に切開部を設けた。大腿二頭筋層を鋭利なはさみで最初の切開を入れ、次に鈍ばさみで広げることによって裂開させた。総坐骨神経を露出させ、坐骨神経を１ｍｍ間隔で、３か所（マウスの場合）または４か所（ラットの場合）、プロレン（マウスの場合）またはクロミックガット（ＳＭＩ）（ラットの場合）で軽く結紮した。次に、神経を筋肉層下に戻し、術創を吸収性の縫合糸（Ｖｉｃｒｙｌ）で閉じた。偽手術動物には、神経を結紮せずに同じ手順を施した。
【０１０８】
行動試験は、手術３日後に開始し、３日目と７日目に機械的応答閾値を取得した。ＣＣＩ術処置後１日目、３日目および７日目に、ＤＲＧおよび坐骨神経から組織を採取した。１日目および３日目の組織採取と３日目の行動評価には、外科術を施した動物の別の群を使用した。組織は総て、適当なサイズの、ラベルを貼ったチューブにいれ、液体窒素中に入れることにより急速凍結させた。
【０１０９】
静的機械的（触覚）アロディニア：
ラット：  動物を、底を上げた０．５ｃｍ２格子のメッシュ底のプラットフォームに入れ、プレキシガラス容器を逆さにして動物にかぶせて置いた。試験は、最初１５〜２０分の順応／馴化期間の後に行った。逃避閾値の測定は、較正済み（力；ｇ）フォンフライ式モノフィラメント（Ｔｏｕｃｈ−Ｔｅｓｔ  Ｓｅｎｓｏｒｙ  Ｅｖａｌｕａｔｏｒ；Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｍａｒｋｅｔｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）を、後脚の足底表面にフィラメントを軽く屈曲させるのに十分な力でおよそ８秒間適用して達成した。逃避閾値は、Ｄｉｘｏｎのアップダウン法[Dixon, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 20, 441-62 (1980); Chaplan et al., J. Neurosci. Methods, Jul, 53(1), 55-63 (1994)]を用い、刺激強度を増減して評価することにより決定した。刺激からの即時の素早い逃避応答（または肢振り）のみを、陽性応答を表すと見なした。
【０１１０】
マウス：  静的機械的アロディニアは、較正済み（力；ｇ）フォンフライ式モノフィラメント（Ｔｏｕｃｈ−Ｔｅｓｔ  Ｓｅｎｓｏｒｙ  Ｅｖａｌｕａｔｏｒ；Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｍａｒｋｅｔｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）を後脚の足底表面に適用して逃避閾値を測定することにより評価した。動物を、試験前３０〜４０分間、底を上げた金属メッシュ上の個別パースペックスボックスに入れた。段階的フォンフライ式ヘアシリーズ（０．０７、０．１６、０．４、０．６および１ｇ）を順に、１秒オン、１秒オフで１０回繰り返すプロトコールで適用した。各ヘアは足の腹側表面の中央に、垂直に、それが軽く屈曲するまで適用した。１０回のうち５回の応答を誘導するように動物の後ろ足に適用された力がＰＷＴとして記録される。刺激からの即時の素早い逃避応答（または肢振り）のみを、陽性応答を表すと見なした。ＰＷＴは、術後、機械的アロディニアの発生をモニタリングするために、連続２日（−１日目と０日目）に評価し、３日目と７日目に再評価した。
【０１１１】
統計分析：  行動データは、「処置」を対象間効果および「日」を対象内効果とし、通例の２元配置ＡＮＯＶＡを用いてＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍにより分析した。ボンフェローニ法を用いて事後分析を行った。＜０．０５のｐ値を統計的に有意であると見なした。
【０１１２】
ｍＲＮＡ発現：  触覚行動エンドポイントに従い、ＮＰＹ（ニューロペプチドＹ）、ＣＸＣＲ２、およびその同族リガンドＣＸＣＬ１の発現レベルに対するＣＣＩの効果を評価するためにＱｕａｎｔ  Ｓｔｕｄｉｏ  Ｏｐｅｎ  Ａｒｒａｙを用いた。
【０１１３】
ラットおよびマウスの坐骨神経を切り出し、液体窒素中で急速凍結させた。これらの組織は、ＣＸＣＲ２およびＣＸＣＬ１のＲＮＡ分析のために処理するまで−８０℃で凍結保存するか、またはドライアイス上で保存した。ＡｃｔＢ、ＧＡＰＤＨ、ＨＰＲＴ１およびＭＡＰＫ６を内部アッセイ対照および標品として用い、ＮＰＹをＣＣＩの対照として用いた。
【０１１４】
以下の遺伝子を、ＴａｑＭａｎ（商標）Ｑ−ＰＣＲを用いて測定した。アッセイを用いて、前増幅プールを作製した。
【０１１５】
【表２】
2017527542.tif 000019
【０１１６】
【表３】
2017527542.tif 000020
【０１１７】
全ＲＮＡ単離：  各組織サンプルについて、製造者の説明書に従い、Ｒｏｃｈｅ  ＭａｇｎａＬｙｓｅｒ上のＧｒｅｅｎ  Ｂｅａｄチューブ（Ｒｏｃｈｅ）内のＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  ＬＣ溶解バッファー（Ｒｏｃｈｅ）中で組織をホモジナイズすることにより１つのＲＮＡサンプルを調製し、製造者の手引き書の説明に従ってＲｏｃｈｅ  ＭａｇｎａＰｕｒｅ  ＲＮＡ単離システム（Ｒｏｃｈｅ）を用い、全ＲＮＡ単離を行った。サンプルを５０μＬアリコート中に溶出させ、必要とされるまで−８０℃で保存した。
【０１１８】
ＲＮＡ定量および完全性の評価：  各全ＲＮＡサンプルを、製造者の手引き書に従い、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｑｕｂｉｔにて定量した。全ＲＮＡサンプルの代表的サンプルの完全性を、製造者の手引き書に従い、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｒにて、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｉｃｏキット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて評価した。ＲＮＡは、ＲＩＮ(RNA integrity number)が６以上であった場合に許容可能な品質と見なした。
【０１１９】
第１鎖ｃＤＮＡ合成：  第１鎖ｃＤＮＡは、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｖｉｌｏキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、各全ＲＮＡ５０ｎｇから合成した。各ＲＮＡをＲＮアーゼ不含水で１１μＬとし、各ＲＮＡサンプルに１４μＬのマスターミックスを加えた。
【０１２０】
マスターミックスは下記表に基づいて構成した：
【０１２１】
【表４】
2017527542.tif 000021
【０１２２】
これらのサンプルをＤＮＡサーモサイクラー中で、２５℃で１０分間、４２℃で６０分間、次いで、８５℃で５分間インキュベートした。合成後、ｃＤＮＡを使用のための準備まで−２０℃で保存した。
【０１２３】
前増幅：  Ｔａｑｍａｎアッセイ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の前増幅プールを、１０μＬの各２０倍アッセイ（合計１６アッセイ：４つの目的遺伝子（ラット）、４つのハウスキーパー（ラット）、４つの目的遺伝子（マウス）および４つのハウスキーパー（マウス））を一緒に混合し、０．２倍希釈する（８４０μＬ  ＴＥバッファー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を加えることによる）ことで作製した。
【０１２４】
各２５μＬのｃＤＮＡを下記のものとのインキュベーションにより増幅した：
【０１２５】
【表５】
2017527542.tif 000022
【０１２６】
下記のサイクル条件を使用した：
【０１２７】
【表６】
2017527542.tif 000023
【０１２８】
前増幅産物を使用のための準備まで−２０℃で保存し、その後、ＴａｑＭａｎ  Ｏｐｅｎ  Ａｒｒａｙに流す前に０．１倍ＴＥ（ｐＨ８．０）で１：１０希釈した。
【０１２９】
ＴａｑＭａｎ（商標）リアルタイム定量的ＰＣＲ：  ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏオープンアレイをＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓガイドラインに従って設定および実施した。２倍ＴａｑＭａｎ（商標）ＯｐｅｎＡｒｒａｙ（商標）リアルタイムＰＣＲマスターミックス（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ：４４６２１６４）を混合し、下記の成分を合わせた：
【０１３０】
【表７】
2017527542.tif 000024
【０１３１】
１．２μＬの各前増幅ｃＤＮＡを３．８μＬのＯｐｅｎ  Ａｒｒａｙマスターミックスと混合し、Ａｃｃｕｆｉｌｌ（商標）システムによりＯｐｅｎ  Ａｒｒａｙに分注するためのＡｃｃｕｆｉｌｌ３８４ウェルプレートに入れた。Ｏｐｅｎ  Ａｒｒａｙ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｔｒａｃｋｅｒソフトウエアを用いてサンプルの追跡を行った。Ｏｐｅｎ  ＡｒｒａｙはＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ上で実施し、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏで分析および品質管理を行い、得られたファイルをデータ分析のためにＡｒｒａｙＳｔｕｄｉｏにエクスポートした。
【０１３２】
ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  Ｏｐｅｎ  Ａｒｒａｙによるマウスおよびラットの坐骨神経におけるＣＸＣＲ２、ＣＸＣＬ１およびＮＰＹ発現の評価：  ＡｒｒａｙＳｔｕｄｉｏにおける分析：  ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ．ｔｘｔファイルにＯｐｅｎＡｒｒａｙバーコードで注釈を付け、Ｔａｒｇｅｔ  Ｎａｍｅ値が空欄の列を総て削除し、ＡｒｒａｙＳｔｕｄｉｏのための形式となるまでソートした。個々のＯｐｅｎ  Ａｒｒａｙ．ｔｘｔファイルをＡｒｒａｙ  Ｓｔｕｄｉｏにアップロードした。「逆転写無し」、「鋳型対照無し」および「水ブランク」データも調べたが、最終的な分析からは除いた。主成分分析（ＰＣＡ）を４つのハウスキーピング遺伝子について行った。外れ値データは最初のＰＣＡ実行から除いた。ハウスキーピング遺伝子の共分散の効果に関して補正を行った後、このモデルを用いて各遺伝子および処置の平均ｌｏｇ２（存在量）を評価した。分析の全直線モデルおよび分析因子を選択し、実行した。これにより、正規化データのサマリー表、除いた外れ値のサマリー表、各遺伝子の係数およびその遺伝子が正規化により改善されたかどうかを示すＰ値が作成された。生物学的複製サンプルが一緒にクラスター化されていたかどうかを確認するために、これらのデータを３元主成分分析により分析した。各時点での異なる処置間での異なる値の倍率を出すために、これらのデータを各モデルおよび種内で１元ＡＮＯＶＡにより分析した。平均差異がゼロを含まないベイズ事後確率を計算した。０．９５を越える確率を、平均差異がゼロとは有意に異なったことを示すと見なした。ＣＣＩモデルでは、組織など同側および反対側のサンプルを比較した。
【０１３３】
結果：  組織発現で見た場合、ＣＣＩを含むラットおよびマウス試験間の群でベースライン足逃避閾値（ＰＷＴ）に差は無かった。
【０１３４】
ＣＣＩは、ラット（図１）およびマウス（図２）の両方で、ＰＷＴの有意な低下により反映される、顕著な機械的アロディニア表現型を誘発した。ラットでは、ＣＣＩ群のＰＷＴは、術後３日目と７日目に、ベースライン値およびこれらの時点での偽手術群と比較した場合に有意に低下していた（図１）。（値は平均±ＳＥＭである。＊＊Ｐ＜０．０１は、同時点での偽手術群と比較した場合の有意性を示す、２元ＡＮＯＶＡ。ベースライン：ｎ＝２０／群；３日目：ｎ＝１５／群；７日目：ｎ＝１０／群）。同様に、マウスも、慢性絞扼神経損傷後に機械的アロディニアを生じた。ＣＣＩ群のＰＷＴは、術後３日目と７日目に有意に低下していた（図２）。（値は平均±ＳＥＭである。＊＊＊Ｐ＜０．００１は、同時点での偽手術群と比較した場合の有意性を示す、２元ＡＮＯＶＡ。−１日目：偽手術群はｎ＝２０、ＣＣＩ群はｎ＝２１；０日目：偽手術群はｎ＝２０、ＣＣＩ群はｎ＝１０；３日目：偽手術群はｎ＝１５、ＣＣＩ群はｎ＝１６；７日目：偽手術群はｎ＝１０、ＣＣＩ群はｎ＝１１）。
【０１３５】
図３（ラット）および図４（マウス）から、ラットおよびマウスの両方で、偽手術処置動物と比較した場合の変化倍率の統計的に有意な増加を証拠とするように、ＣＣＩ誘発後１日目に坐骨神経のＣＣＩ部位（同側；ｉｐｓｉ）において、ＣＸＣＲ２およびＣＸＣＬ１の発現プロファイルが有意に上昇していたことが見て取られる。感覚神経ペプチドであるニューロペプチド−Ｙ（ＮＰＹ）の発現プロファイルは、ラットで、偽手術処置動物と比較した場合に、ＣＣＩ誘発後３日目に坐骨神経のＣＣＩ部位（同側；ｉｐｓｉ）において唯一有意に上昇していた。図３から、偽手術処置動物または反対側組織と比較して、ＣＸＣＲ２およびそのリガンドＣＸＣＬ１  ｍＲＮＡは、ＣＣＩ術後の初期段階の同側坐骨神経で有意に増加しており、７日目までに弱まったことが見て取れる。ニューロペプチド−Ｙ（ＮＰＹ）ｍＲＮＡは、７日目に偽手術動物および反対側組織と比較して統計的に異なっていた。値は平均値として示される。＃は、ベイズの事後確率＞０．９５により評価される、各時点ｎ＝５／群での、同時点でのＣＣＩおよび偽手術ラット間の有意な差を示し、＊は同時点の反対側と同側坐骨神経の間の有意な差を示す。ｉｐｓｉ＝同側；ｃｏｎｔｒａ＝反対側。図４（マウス）から、偽手術動物または反対側組織と比較して、ＣＸＣＲ２、およびそのリガンドＣＸＣＬ１  ｍＲＮＡは、ＣＣＩ術後の初期段階の同側坐骨神経で有意に増加しており、７日目までに弱まったことが見て取れる。ニューロペプチド−Ｙ（ＮＰＹ）ｍＲＮＡは、測定が行われたいずれの時点でも偽手術動物または反対側組織と比較して統計的に異なっていなかった。値は平均値として示される。＃は、ベイズの事後確率＞０．９５により評価される、各時点ｎ＝５での、同時点でのＣＣＩおよび偽手術マウス間の有意な差を示し、＊は同時点の反対側と同側坐骨神経の間の有意な差を示す。ｉｐｓｉ＝同側；ｃｏｎｔｒａ＝反対側。
【０１３６】
要約：  両齧歯類種におけるＣＣＩ手順は、ロバストな機械的アロディニアの発生を引き起こした。両種において、ＣＸＣＲ２およびＣＸＣＬ１  ｍＲＮＡ発現の増強は、機械的アロディニアの時間的評価の早期に明白であった。また、ラットにおいて感覚ニューロペプチドＹ発現の変化も見られた。ラットにおけるこのプロファイルは、ＣＣＩモデルにおけるＣＸＣＲ２系および感覚ニューロペプチドの既知の感受性と一致すると思われ、この方法論をオキサリプラチンモデルにおけるこれらのタンパク質の検出に使用することを可能とする。
【０１３７】
ｈ）オキサリプラチン誘発急性感覚傷害齧歯類における前臨床遺伝子発現
成体雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（２３０〜３００ｇ）を、パースペックスケージにて３〜５個体の群で、一定の温度および湿度（温度：２１±１℃、明：暗周期１２：１２時間）の制御された環境下、食物および水を自由に摂らせて飼育した。成体雄Ｃ５７  ＢＬ６マウス（２１〜３０ｇ）を、パースペックスケージにて３〜５個体の群で、一定の温度および湿度（温度：２１±１℃、明：暗周期１２：１２時間）の制御された環境下、食物および水を自由に摂らせて飼育した。これらの動物は、試験開始前に少なくとも１週間、移動から回復される。
【０１３８】
ベースライン試験：  ベースライン逃避閾値を決定するために、注射前に総ての動物に機械的アロディニアの行動試験を行った。フォンフライ式ヘアを用いた刺激に対するベースラインＰＷＴを最後の２日（−１日目と０日目）に取得した。
【０１３９】
神経障害誘発：  ５％デキストロース中、オキサリプラチンの２ｍｇ／ｍｌ溶液を作製した。ラットでは、０日目に一用量のオキサリプラチン１２ｍｇ／ｋｇを６ｍｌ／ｋｇの容量で腹腔内経路を介して投与した。ビヒクル対照群には、５％デキストロース溶液６ｍｌ／ｋｇをｉｐで施した。マウスでは、０日目に一用量のオキサリプラチン１５ｍｇ／ｋｇを７．５ｍｌ／ｋｇの容量で腹腔内経路を介して投与した。ビヒクル対照群には、５％デキストロース溶液７．５ｍｌ／ｋｇをｉｐで施した。
【０１４０】
行動パート：
機械的アロディニアの発生は、一用量のビヒクルまたはオキサリプラチンのいずれかの投与後にＰＷＴを測定することにより決定した。ＰＷＴは、連続２日（−１日目と０日目）決定し、その後、１日目、３日目および／または７日目に再評価した。
【０１４１】
ラット：  動物を、試験前少なくとも４０分間、底を上げた金属メッシュ上の個別パースペックスボックスに入れた。最低力（約１ｇ）のフィラメントから始め、各フィラメントを足の腹側表面の中央に、垂直に、軽く屈曲するまで６秒間適用した。刺激時に動物が足を逃避したか、または引き上げた場合には、試験したもののすぐ下の力でヘアを使用した。応答が観察されなければ、すぐ上の力でヘアを試験した。信頼性のある応答（５回の試行のうち３回が陽性）を誘導するのに必要であった最小の力をＰＷＴの値として記録した。
【０１４２】
マウス：  動物を、試験前３０〜４０分間、底を上げた金属メッシュ上の個別パースペックスボックスに入れた。段階的フォンフライ式ヘアシリーズ（０．０７、０．１６、０．４、０．６および１ｇ）を順に、１秒オン、１秒オフで１０回繰り返すプロトコールで適用した。各ヘアは足の腹側表面の中央に、垂直に、それが軽く屈曲するまで適用した。１０回のうち５回の応答を誘導するように動物の後ろ足に適用された力をＰＷＴとして記録した。
【０１４３】
組織のサンプリング：  試験の終了時に、動物をイソフルラン＋酸素からなる混合ガスで麻酔し、断頭により屠殺した。各側から坐骨神経セグメントを外科的に摘出し、分析用天秤で秤量して記録した。各側からの坐骨神経を個別に２ｍｌ  Ｃｏｒｎｉｎｇバイアルに入れた。組織を液体窒素中で急速凍結させた後、−８０℃で保存した。
【０１４４】
統計分析：  行動データは、「処置」を対象間効果および「日」を対象内効果とし、通例の２元配置ＡＮＯＶＡを用いてＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍにより分析した。ボンフェローニ法を用いて事後分析を行った。＜０．０５のｐ値を統計的に有意であると見なした。
【０１４５】
遺伝子発現パート：  ラットおよびマウスの坐骨神経を切り出し、液体窒素中で急速凍結させた。これらの組織は、ＣＸＣＲ２およびＣＸＣＬ１のＲＮＡ分析のために処理するまで−８０℃で凍結保存するか、またはドライアイス上で保存した。ＡｃｔＢ、ＧＡＰＤＨ、ＨＰＲＴ１およびＭＡＰＫ６を内部アッセイ対照および標品として用い、ＮＰＹをオキサリプラチン誘発損傷の対照として用いた。
【０１４６】
以下の遺伝子を、ＴａｑＭａｎ（商標）Ｑ−ＰＣＲを用いて測定した。アッセイを用いて、前増幅プールを作製した。
【０１４７】
【表８】
2017527542.tif 000025
【０１４８】
【表９】
2017527542.tif 000026
【０１４９】
全ＲＮＡ単離：  各組織サンプルについて、製造者の説明書に従い、Ｒｏｃｈｅ  ＭａｇｎａＬｙｓｅｒ上のＧｒｅｅｎ  Ｂｅａｄチューブ（Ｒｏｃｈｅ）内のＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  ＬＣ溶解バッファー（Ｒｏｃｈｅ）中で組織をホモジナイズすることにより１つのＲＮＡサンプルを調製し、製造者の説明に従ってＲｏｃｈｅ  ＭａｇｎａＰｕｒｅ  ＲＮＡ単離システム（Ｒｏｃｈｅ）を用い、全ＲＮＡ単離を行った。サンプルを５０μＬアリコート中に溶出させ、必要とされるまで−８０℃で保存した。
【０１５０】
ＲＮＡ定量および完全性の評価：  各全ＲＮＡサンプルを、製造者の説明書に従い、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｑｕｂｉｔにて定量した。全ＲＮＡサンプルの代表的サンプルの完全性を、製造者の説明書に従い、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｒにて、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｉｃｏキット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて評価した。ＲＮＡは、ＲＩＮが６以上であった場合に許容可能な品質と見なした。
【０１５１】
第１鎖ｃＤＮＡ合成：  第１鎖ｃＤＮＡは、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｖｉｌｏキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、各全ＲＮＡ５０ｎｇから合成した。各ＲＮＡをＲＮアーゼ不含水で１１μＬとし、各ＲＮＡサンプルに１４μＬのマスターミックスを加えた。マスターミックスは下記表に基づいて構成した：
【０１５２】
【表１０】
2017527542.tif 000027
【０１５３】
これらのサンプルをＤＮＡサーモサイクラー中で、２５℃で１０分間、４２℃で６０分間、次いで、８５℃で５分間インキュベートした。合成後、ｃＤＮＡを使用のための準備まで−２０℃で保存した。
【０１５４】
前増幅：  Ｔａｑｍａｎアッセイ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の前増幅プールを、１０μＬの各２０倍アッセイ［合計１６アッセイ：４つの目的遺伝子（ラット）、４つのハウスキーパー（ラット）］を一緒に混合し、０．２倍希釈する［８４０μＬ  ＴＥバッファー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を加えることによる）］ことで作製した。各２５μＬのｃＤＮＡを下記のものとのインキュベーションにより増幅した：
【０１５５】
【表１１】
2017527542.tif 000028
【０１５６】
下記のサイクル条件を使用した：
【０１５７】
【表１２】
2017527542.tif 000029
【０１５８】
前増幅産物を使用のための準備まで−２０℃で保存し、その後、ＴａｑＭａｎ  Ｏｐｅｎ  Ａｒｒａｙに流す前に０．１倍ＴＥ（ｐＨ８．０）で１：１０希釈した。
【０１５９】
ＴａｑＭａｎ（商標）リアルタイム定量的ＰＣＲ：  ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏオープンアレイをＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓガイドラインに従って設定および実施した。２倍ＴａｑＭａｎ（商標）ＯｐｅｎＡｒｒａｙ（商標）リアルタイムＰＣＲマスターミックス（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ：４４６２１６４）を混合し、下記の成分を合わせた：
【０１６０】
【表１３】
2017527542.tif 000030
【０１６１】
１．２μＬの各前増幅ｃＤＮＡを３．８μＬのＯｐｅｎ  Ａｒｒａｙマスターミックスと混合し、Ａｃｃｕｆｉｌｌ（商標）システムによりＯｐｅｎ  Ａｒｒａｙに分注するためのＡｃｃｕｆｉｌｌ３８４ウェルプレートに入れた。Ｏｐｅｎ  Ａｒｒａｙ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｔｒａｃｋｅｒソフトウエアを用いてサンプルの追跡を行った。Ｏｐｅｎ  ＡｒｒａｙはＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ上で実施し、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏで分析および品質管理を行い、得られたファイルをデータ分析のためにＡｒｒａｙＳｔｕｄｉｏにエクスポートした。
【０１６２】
ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  Ｏｐｅｎ  Ａｒｒａｙによるラットの坐骨神経におけるＣＸＣＲ２、ＣＸＣＬ１、ＮＰＹ、およびＣＧＲＰ発現の評価
ＡｒｒａｙＳｔｕｄｉｏにおける分析：  ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ．ｔｘｔファイルにＯｐｅｎＡｒｒａｙバーコードで注釈を付け、Ｔａｒｇｅｔ  Ｎａｍｅ値が空欄の列を総て削除し、ＡｒｒａｙＳｔｕｄｉｏのための形式となるまでソートした。個々のＯｐｅｎ  Ａｒｒａｙ．ｔｘｔファイルをＡｒｒａｙ  Ｓｔｕｄｉｏにアップロードした。「逆転写無し」、「鋳型対照無し」および「水ブランク」データも調べたが、最終的な分析からは除いた。主成分分析（ＰＣＡ）を４つのハウスキーピング遺伝子について行った。外れ値データは最初のＰＣＡ実行から除いた。ハウスキーピング遺伝子の共分散の効果に関して補正を行った後、このモデルを用いて各遺伝子および処置の平均ｌｏｇ２（存在量）を評価した。分析の全直線モデルおよび分析因子を選択し、実行した。これにより、正規化データのサマリー表、除いた外れ値のサマリー表、各遺伝子の係数およびその遺伝子が正規化により改善されたかどうかを示すＰ値が作成された。生物学的複製サンプルが一緒にクラスター化されていたかどうかを確認するために、これらのデータを３元主成分分析により分析した。各時点での異なる処置間での異なる値の倍率を出すために、これらのデータを各モデルおよび種内で１元ＡＮＯＶＡにより分析した。平均差異がゼロを含まないベイズ事後確率を計算した。平均差異がゼロを含まないベイズ事後確率を計算した。確率が０．９５を越えれば、平均差異がゼロとは有意に異なることを意味する。各組織を別々に比較した。
【０１６３】
結果：  オキサリプラチンを含むラットおよびマウス試験間の群でベースラインＰＷＴに差は無かった。図５（ラット）および図６（マウス）から見て取れるように、オキサリプラチン処置は、両齧歯類種において、Ｄａｙ１日目からのＰＷＴの有意な低下により表されるように顕著な機械的アロディニアを引き起こし、これは７日目まで維持された。図５では、ラットが一用量のオキサリプラチンの後に機械的アロディニアを発症したことが見て取れる。オキサリプラチン群のＰＷＴは１日目、３日目および７日目で有意に低下していた。値は平均±ＳＥＭである。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１は、同時点でのビヒクル群と比較した場合の有意性を示す、２元ＡＮＯＶＡ。−２日目、−１日目、０日目：ｎ＝２０／群；１日目：ｎ＝５／群；３日目：ｎ＝１５／群；７日目：ｎ＝１０／群。図６では、マウスが一用量のオキサリプラチンの後に機械的アロディニアを発症したことが見て取れる。オキサリプラチン群のＰＷＴは１日目、３日目および７日目で有意に低下していた。値は平均±ＳＥＭである。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１は、同時点でのビヒクル群と比較した場合の有意性を示す、２元ＡＮＯＶＡ。−２日目、−１日目、０日目：ｎ＝２０／群；１日目：ｎ＝５／群；３日目：ｎ＝１５／群；７日目：ｎ＝１０／群。
【０１６４】
図７（ラット）および図８（マウス）から見て取れるように、オキサリプラチン処置後のＣＸＣＲ２およびＮＰＹ  ｍＲＮＡの発現プロファイルは、ラット左坐骨神経においてオキサリプラチン処置後１日目で有意に上昇していたが、マウスでは明らかでなかった。左坐骨神経におけるオキサリプラチン処置後のＣＸＣＬ１  ｍＲＮＡの発現プロファイルは、両種でオキサリプラチン処置後に統計的に異ならなかった。図７から、左坐骨神経で、ＣＸＣＲ２およびそのリガンドＣＸＣＬ１  ｍＲＮＡは、ＮＰＹ  ｍＲＮＡと同様に、オキサリプラチン注射後早い段階で（１日目）高い増加を示したことが見て取れる。値は平均値として示される。＃は、ベイズの事後確率＞０．９５により評価される、各時点ｎ＝１０での、同時点のオキサリプラチンおよびビヒクル群間の有意な差を示す。図８から、左坐骨神経で、ＣＸＣＲ２またはそのリガンドＣＸＣＬ１  ｍＲＮＡもＮＰＹ  ｍＲＮＡもオキサリプラチン注射後７日以内に有意性を持った増加を示さなかったことが見て取れる。値は平均値として示される。＃は、ベイズの事後確率＞０．９５により評価される、各時点ｎ＝１０での、同時点のオキサリプラチンおよびビヒクル群間の有意な差を示す。
【０１６５】
要約：  ラットおよびマウスは両方とも、単回のオキサリプラチン投与後にロバストな機械的アロディニアを発症した。しかしながら、ＣＸＣＲ２およびＮＰＹ  ｍＲＮＡ発現における初期の統計的に有意な変化（左坐骨神経で増加）はラットでのみ明らかであった。従って、オキサリプラチン誘発機械的アロディニアに対するＣＸＣＲ２受容体の薬理学的阻害の効果を探索する可能性を持つ主要種としてラットを選択した。
【０１６６】
ｉ）オキサリプラチン誘発急性感覚損傷ラットに対する前臨床ＣＸＣＲ２アンタゴニストの効果
動物：  ６０個体の成体雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、ＵＫ．２３０〜３００ｇ）をこの試験に用いた。動物をパースペックスケージにて３〜５個体の群で、一定の温度および湿度（温度：２１±１℃、明：暗周期１２：１２時間）の制御された環境下、食物および水を自由に摂らせて飼育した。それらは、試験開始前に少なくとも１週間、移動から回復させた。
【０１６７】
式（Ａ）の化合物を、湿式造粒とその後の１％メチルセルロース（ＭＣ）中での音波処理により、０．５ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌおよび５ｍｇ／ｍｌ懸濁液（それぞれ５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇおよび５０ｍｇ／ｋｇ投与を目的とする）として調製した。処方物は毎週調製し、４℃にて光から保護して保存した。投与容量は１０ｍｌ／ｋｇであった。化合物は投与期間中、絶えず撹拌した。メチルセルロース（Ｓｉｇｍａ）水で１％（水１００ｍｌ当たり１ｇ）とし、完全に溶解するまでスターラー上に置いた。ビヒクル処置動物には１％ＭＣを１０ｍｌ／ｋｇ  ｐ．ｏで、ｂ．ｉ．ｄ．にて投与した。
【０１６８】
オキサリプラチン（Ｔｏｃｒｉｓ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）は、５％デキストロース（Ｂａｘｔｅｒ）中で音波処理を行うことにより、２ｍｇ／ｍｌ溶液（１２ｍｇ／ｋｇを目的とする）として調製した。処方物は投与の当日に新たに調製した。投与容量は６ｍｌ／ｋｇであった。
【０１６９】
試験スキーム：  試験スキームを表１に示す。オキサリプラチンは０日目に１回注射し、３用量の式（Ａ）の化合物を−１日目〜６日目に毎日２回与えた。ＰＷＴは−２日目、−１日目、０日目、３日目および７日目に試験した。
【０１７０】
【表１４】
2017527542.tif 000031
【０１７１】
下記の５群を試験した。
【０１７２】
【表１５】
2017527542.tif 000032
【０１７３】
化学療法誘発神経障害の誘発：  一用量のオキサリプラチン１２ｍｇ／ｋｇを６ｍｌ／ｋｇの容量で腹膜内（ｉ．ｐ．）注射した。オキサリプラチンは、使用前に２ｍｇ／ｍｌとなるように５％デキストロースに溶かした。顕著な機械的アロディニアを特徴とする神経因性疼痛の発生は、逃避応答（ＰＷＴ、下記参照）を惹起するために後ろ足に適用する段階的フォンフライ式ヘアシリーズを用いてモニタリングした。ビヒクル対照群には、５％デキストロース溶液６ｍｌ／ｋｇをｉ．ｐ．で施した。動物には試験する順序と同じ順序で注射を行った。
【０１７４】
動物を、試験前少なくとも４０分間、底を上げた金属メッシュ上の個別パースペックスボックスに入れた。最低力（約１ｇ）のフィラメントから始め、各フィラメントを足の腹側表面の中央に、垂直に、軽く屈曲するまで６秒間適用した。刺激時に動物が足を逃避したか、または引き上げた場合には、試験したもののすぐ下の力でヘアを使用した。応答が観察されなければ、すぐ上の力でヘアを試験した。信頼性のある応答（５回の試行のうち３回が陽性）を誘導するのに必要であった最小の力をＰＷＴの値として記録した。ＰＷＴは、一用量のビヒクルまたはオキサリプラチンのいずれかの投与の後に、機械的アロディニアの発生をモニタリングするために、連続３日（−２日目、−１日目および０日目）に評価し、３日目と７日目に再評価した。−２日目と−１日目はオキサリプラチン投与前のベースラインと見なされ、０日目はオキサリプラチン注射当日に行った測定であった。
【０１７５】
統計分析：  行動データは、「処置」を対象間効果および「日」を対象内効果とし、２元反復測定ＡＮＯＶＡにより分析した。ボンフェローニ法を用いて事後分析を行った。＜０．０５のｐ値を統計的に有意であると見なした。事後分析は計画的対比比較[InVivoStat; Clark et al., J. Psychopharmacology, 26(8) 1136-1142 (2012)]を用いて行った。
【０１７６】
結果：  オキサリプラチンの注射は機械的アロディニアの発生をもたらし、これはＰＷＴのフォンフライ評価を用いて測定された。オキサリプラチンに先立つ式（Ａ）の化合物による予防的処置（−１日目に開始）は、オキサリプラチン誘発機械的アロディニアの発生の回避をもたらした。これはオキサリプラチン(Oxalipatin)処置後３日目には総ての用量レベルで、およびオキサリプラチン処置後７日目では２０および５０ｍｇ／ｋｇのｂｉｄ  ｐｏで明らかであった。図９が示すように、オキサリプラチンのボーラス注射は、顕著な機械的アロディニアの発生をもたらした。ＰＷＴは、３日目および７日目でＶｅｈ／Ｖｅｈ群と比較して有意に低下した。式（Ａ）の化合物の予防的投与は、オキサリプラチン処置により確立された機械的アロディニアを抑制し、ＰＷＴはＯｘａ／Ｖｅｈ群と比較して有意に増加した。値は平均±ＳＥＭである。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１は、Ｏｘａ／Ｖｅｈ群と比較した場合の有意性を示し、＋＋ｐ＜０．０１および＋＋＋ｐ＜０．００１は、Ｏｘａ／Ｖｅｈ群と比較した場合の有意性を示す、２元ＡＮＯＶＡ。Ｏｘａ＝オキサリプラチン；Ｖｅｈ＝ビヒクル；５、２０および５０ｍｐｋ＝ｍｇ／ｋｇとしてのｂｉｄ  ｐｏでの式（Ａ）の化合物の用量レベル。
【０１７７】
要約：  オキサリプラチンの単回のボーラス注射は、ラットにおいて機械的アロディニアの発生をもたらした。式（Ａ）の化合物による予防的処置は、機械的アロディニアの発生を弱めた。３日目に、式（Ａ）の化合物の３種類総ての用量レベル（５、２０および５０ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ．ｂ．ｉ．ｄ）が、オキサリプラチンおよびビヒクル群と比較して機械的アロディニアを軽減した。７日目まで、２０および５０ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ．ｂ．ｉ．ｄで式（Ａ）の化合物のみを受容した動物において機械的アロディニアのロバストな軽減がなお提示されていた。
【０１７８】
ｊ）反復投与オキサリプラチンによる誘発される感覚損傷ラットに対する前臨床ＣＸＣＲ２アンタゴニストの効果
化学療法処置がヒトおよび齧歯類における神経の伝導能に有意な低下を引き起こすことは十分に確認されている[Renn et al., Mol. Pain, 26;7:29, (2011)]。従って、オキサリプラチンにより誘発される行動過敏に関する検討を評価するために、ヒトが被る化学療法誘発末梢神経障害の神経生理学的性質におけるＣＸＣＲ２機構の関与をさらに探るため、坐骨神経の電気生理学的(eletrophysiological)研究を行った。
【０１７９】
雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（１０９〜１６７ｇ、約５週齢）を、ケージにて３個体の群で、一定の温度および湿度（温度：２５±３℃、明：暗周期１２：１２時間）の制御された環境下、食物（２５ｇ／ラット／日のＬａｂＤｉｅｔ  ５０５３）および水を自由に摂らせて飼育した。
【０１８０】
化合物の調製：  式（Ａ）の化合物は、１％メチルセルロース（ＭＣ）（ｗ／ｖ）で２ｍｇ／ｍＬ懸濁液として調製した。ＭＣ（Ｓｉｇｍａ  カタログ番号４２３２３８）を水で１％（ｗ／ｖ）（水１００ｍＬ当たり１ｇ）とし、完全に溶解するまでスターラー上に置いた。処方物は、６〜８日ごとに毎回４００〜７００ｍＬ中に調製し、光から保護して４℃で保存した。２０ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ．用量を得るために使用した投与容量は１０ｍＬ／ｋｇであった。ビヒクル処置動物には、１％ＭＣ  ｗ／ｖ  １０ｍＬ／ｋｇ  ｐ．ｏ．をｂ．ｉ．ｄ．で投与した。
【０１８１】
オキサリプラチン（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）を５％グルコース（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）溶液に加え、溶解するまで３０分間音波処理を施した。毎回の注射の前に新鮮な溶液を調製した。対照ビヒクル動物は５％  ｗ／ｖグルクロース(Gluclose)５ｍｌ／ｋｇで処置した。グルコース（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  カタログ番号Ｇ７０２１）をｍｉｌｌｉ−Ｑ水で５％（ｗ／ｖ）（水１００ｍＬ当たり５ｇ）とし、完全に溶解するまでスターラー上に置いた。それを無菌０．２μｍフィルター（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  カタログ番号５９５−４５２０）を用いて濾過し、室温で保存した。
【０１８２】
Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットを用いた処置レジメン：  雄Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットに、式（Ａ）の化合物（２０ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ．  ｂ．ｉ．ｄ．）またはそのビヒクル（１％メチセルロース(methycellulose)１０ｍｌ／ｋｇ  ｐ．ｏ．  ｂ．ｉ．ｄ．）を、０日目に開始して４週間（２８日）毎日投与した。各日に、投与は午前中に１回行い、その後、およそ８時間後の番に２回目の投与を行った。１日目の２４時間後に式（Ａ）の化合物による前処置を開始し、動物にオキサリプラチン（４ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）またはそのビヒクル（グルコース溶液５％ｗ／ｖ：１ｍｌ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）のいずれかを短時間の３％イソフルラン（Ａｂｂｏｔｔ）麻酔下で投与した。このオキサリプラチンまたはそのビヒクルによる処置を、４週間、週に２回（１、３、８、１０、１５，１７、２２、２４日目）、式（Ａ）の化合物またはビヒクルによる午前中の前処置の９０分後に繰り返した。
【０１８３】
よって、ラットは以下の群に無作為に割り付けた：
【表１６】
2017527542.tif 000033
【０１８４】
体重追跡：  ラットの体重を４週間、週に２回、１、３、９、１１、１６、１８、２３、および２５日目に測定した。５週目の体重値は、伝導速度試験を行った際に２９、３０および３１日目からの群のそれぞれに関するデータを合わせたものである。これらの試験を実施する科学者には、総てのデータ分析が完了するまで動物が受けていた処置を伏せた。
【０１８５】
データは、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウエアを用いて分析した。これらのデータは平均値±ＳＥＭとして表した。パラメーターにおける差異の統計的有意性は、２元配置ＡＮＯＶＡと、その後のダネット検定で決定した。＜０．０５のｐ値を統計的に有意であると見なした。
【０１８６】
坐骨神経伝導速度の測定：  神経伝導速度は、式（Ａ）の化合物またはそのビヒクルによる４週間処置後の２９日目〜３１日目の間に右坐骨神経で測定した。処置群はこれらの日のそれぞれに秤量し、これらの試験を実施する科学者には、総てのデータ分析が完了するまで動物が受けていた処置を伏せた。伝導速度の測定後、ラットの左坐骨神経を組織学的研究のために採取した（方法については下記参照）。
【０１８７】
ラットを抱水クロラール（３５０ｍｇ／ｋｇ、３．５ｍＬ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）で麻酔した。外科的深度の麻酔に達したところで、坐骨切痕および右後肢の足関節の上の筋肉を注意深く露出させた。右坐骨神経を注意深く特定し、Jamieson et al., Br. J. Cancer, 88(12):1942-7 (2003)に記載されているように、第二指と第三指の間に置いた電極から活動電位を記録し、坐骨切痕および足関節の白金ワイヤ電極を介して神経を刺激する（５Ｖ、０．５秒、単一波パルス）ことにより、伝導速度を測定した。坐骨切痕と足関節の間の長さを測定した。
【０１８８】
活動電位は、ＣＥＤ  １９０２  ｍｋ  ＩＶ  プログラマブル増幅器／フィルターおよびＤＳ２Ａ−ＭＫ．ＩＩ  Ｉｓｏｌａｔｅｄ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ−Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ｖｏｌｔａｇｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）を備えたＣＥＤ  Ｍｉｃｒｏ１４０１−３科学デジタルデータレコーダーを用いて記録し、データはウインドウズソフトウエア用ＣＥＤ  Ｓｉｇｎａｌ−バージョン６（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）により分析した。
【０１８９】
神経伝導速度は、坐骨切痕と足関節の間の長さを刺激部位における潜時の間の鎖［潜時（坐骨切痕）−潜時（足関節）］で割った商として計算した。
【０１９０】
データは、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウエアを用いて分析した。これらのデータは平均値±ＳＥＭとして表した。パラメーターにおける差異の統計的有意性は、２元配置ＡＮＯＶＡと、その後のテューキー検定で決定した。＜０．０５のｐ値を統計的に有意であると見なした。
【０１９１】
坐骨神経の組織学的評価：  伝導速度の測定後、ラットの左坐骨神経を組織学的研究のために採取した。これらの試験を実施する科学者には、総てのデータ分析が完了するまで動物が受けていた処置を伏せた。
【０１９２】
左坐骨神経（遠位端）の１ｃｍセグメントの位置を特定し、注意深く切り出した。神経を４％パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  カタログ番号：Ｐ６１４８）中で一晩、次いで、０．２％グリシン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  カタログ番号：１５５２７）で一晩固定した。リン酸緩衝生理食塩水［リン酸第一ナトリウム（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  カタログ番号：０４２７０）；リン酸第二ナトリウム（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  カタログ番号：３０４２７）；塩化ナトリウム（ＢＤＨ  カタログ番号：７６４７−１４−５）］で洗浄した後、坐骨神経を２％四酸化オスミウム中で２時間、後固定した。３０％から７０％エタノールまで脱水した後、神経サンプルをパラフィンワックスに包埋し、神経を２μｍ厚の切片とし（Ｌｅｉｃａミクロトームを使用）、スライド（Ｓｕｐｅｒｉｏｒ  Ｍａｅｒｉｅｎｆｅｌｄ）に載せ、５８℃で風乾した。次に、これらの切片を１００％キシレン（ＢＤＨ；  ＣＡＳ  Ｎｏ  １３３０−２０−７）に浸漬し、その後、１００％から７０％エタノールまで（Ｍｅｒｃｋ；ＣＡＳ  ｎｏ：６４−１７−５）、次いで１００％Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で再水和させた。次に、神経を１％トルイジンブルーで染色し、水および７５％エタノールで洗浄した後、そのスライドにカバーガラスを載せた。一番鮮明で完全な神経切片を分析用に選択した。画像は自動直立複合顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＤＭ  ６０００Ｂ）を用いて取得した。坐骨神経の神経線維（ミエリン鞘を含む）の内部領域および全域の断面積を、Di Cesare Mannelli et al., J. Pain, 14(12): 1585-600 (2013)に記載されているように、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ６０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて自動測定した。次に、神経のミエリン鞘の厚さの尺度として、坐骨神経の神経線維の全面積に対する内部面積の比を計算した。
【０１９３】
データは、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウエアを用いて分析した。これらのデータは平均値±ＳＥＭとして表した。パラメーターにおける差異の統計的有意性は、２元配置ＡＮＯＶＡと、その後のテューキー検定で決定した。＜０．０５のｐ値を統計的に有意であると見なした。
【０１９４】
結果：  慢性ラットＣＩＰＮモデルを用い、体重、伝導速度および坐骨神経のミエリン鞘の厚さを調べた。神経伝導速度は、２９日目、３０日目および３１日目に測定した。２９、３０または３１日目の間で各処置群の伝導速度に差は見られなかった。オキサリプラチン処置ラットは、坐骨切痕と足関節の間に、ビヒクル処置対照（４０．２８±１．３０ｍ／秒）（ｐ＜０．０５）と比較して、有意に低い伝導速度（３５．９９±０．５９ｍ／秒）を示した。式（Ａ）の化合物処置は、ラットにおいてオキサリプラチンにより誘発される伝導速度の低下を有意に予防した（４０．８３±１．４５ｍ／秒）（ｐ＜０．０５）（図１０）。Ｖｅｈ／Ｏｘａ処置群と式（Ａ）の化合物／Ｏｘａ処置群の間で体重に有意な差は無かった（図１１）。坐骨神経のミエリン鞘の厚さに対する式（Ａ）の化合物の効果を、組織学的染色を用いて検討した。総ての群からの神経線維の代表的な横断面を図１２に示す。神経のミエリン鞘の厚さを定量した。図１３から、オキサリプラチン処置ラットは、ビヒクル対照（０．１３±０．０１）（ｐ＜０．００１）と比較して、神経線維の全面積に対する内部面積のより高い比（０．２３±０．０２）により示されるように、ミエリン鞘の有意な薄化を示した。オキサリプラチン処置ラットへの式（Ａ）の化合物の経口投与は、神経線維の全面積に対する内部面積のより低い比（０．１７±０．０１）（ｐ＜０．０５）により示されるように、Ｖｅｈ／Ｏｘａ処置と比較して坐骨神経のミエリン鞘の厚さの増大を示した。よって、式（Ａ）の化合物による予防的処置は、オキサリプラチン処置により誘発される坐骨神経伝導速度の障害を抑制した。図１０：値は平均±ＳＥＭである。＊Ｐ＜０．０５はＶｅｈ／Ｖｅｈ群と比較した場合のＶｅｈ／Ｏｘａの有意性を示し、＃ｐ＜０．０５はＶｅｈ／Ｏｘａ群と比較した場合の式（Ａ）の化合物／Ｏｘａの有意性を示す、一元配置ＡＮＯＶＡ。Ｖｅｈ／Ｖｅｈ、ｎ＝１３；Ｖｅｈ／Ｏｘａ、ｎ＝１２；式（Ａ）の化合物／Ｏｘａ、ｎ＝１２。図１１では、式（Ａ）の化合物がオキサリプラチンにより誘発される体重変化に影響を及ぼさなかったことが示される。２週間時点から、ビヒクル／ビヒクル処置群とビヒクル／オキサリプラチン処置群の間で体重に有意な差が見られた。体重は週に２回、４週間測定した。５週目の体重値は、伝導速度試験を行った際に２９、３０および３１日目からの群のそれぞれに関するデータを合わせたものである。試験したどの時点においても、ビヒクル／オキサリプラチン処置群と式（Ａ）の化合物／オキサリプラチン処置群の間で有意な差は見られなかった。値は平均±ＳＥＭである。＊＊＊ｐ＜０．００１はＶｅｈ／Ｏｘａと比較した場合のＶｅｈ／Ｖｅｈの有意性を示し、＃＃＃ｐ＜０．００１は化合物Ｄ／Ｏｘａ処置ラットと比較した場合のＶｅｈ／Ｖｅｈの有意性を示す；２元配置ＡＮＯＶＡとその後のダネット検定、ｎ＝１３（Ｖｅｈ／Ｖｅｈ）、ｎ＝１２（Ｖｅｈ／Ｏｘａ）、ｎ＝１２（化合物Ｄ／Ｏｘａ）。図１２および１３は、式（Ａ）の化合物がオキサリプラチンによる坐骨神経のミエリンの厚さの低下を予防したことを示す。図１２は、光学顕微鏡を用いて４０倍で取得した各群からの画像を示す。図１３は、神経線維のミエリン鞘の厚さをグラフで示す。坐骨神経の全神経線維（ミエリン鞘を含む）の総断面積に対する内部神経線維の断面積の比を評価した。オキサリプラチンは、ラットにおいて坐骨神経のミエリン鞘の厚さを低下させ、その影響は式（Ａ）の化合物処置により逆転された。値は平均±ＳＥＭである。＊＊＊ｐ＜０．００１はビヒクル／ビヒクル群と比較した場合のＶｅｈ／Ｏｘａの有意性を示し、＃ｐ＜０．０５はＶｅｈ／Ｏｘａ処置ラットと比較した場合の化合物Ｄ／Ｏｘａの有意性を示す；一元配置ＡＮＯＶＡとその後のテューキー検定、ｎ＝１２（Ｖｅｈ／Ｖｅｈ）、ｎ＝１２（Ｖｅｈ／Ｏｘａ）、ｎ＝１２（式（Ａ）の化合物／Ｏｘａ）。
【０１９５】
要約：  オキサリプラチンは、神経伝導速度および神経ミエリン鞘の厚さの低下により評価されるように、ラットにおいて末梢神経障害を誘発した。式（Ａ）の化合物による前処置は、オキサリプラチン処置ラットにおいて坐骨神経伝導速度の低下を予防したが、オキサリプラチン処置により誘発される体重低下には影響を及ぼさなかった。式（Ａ）の化合物はまた、オキサリプラチンにより誘発される坐骨神経のミエリン鞘における変化も改善した。
【０１９６】
これらの試験の結果は、式（Ａ）の化合物はラットにおいてオキサリプラチンにより誘発される、機械的刺激に対する過敏性の行動的特徴の変化、坐骨神経のミエリンの状態および神経伝導速度の低下を予防することを示す。これらは患者における化学療法誘発性の末梢神経障害に特徴的である。
【０１９７】
ｋ）機序証明臨床試験
ヒト患者のＣＩＰＮの治療における式（Ａ）の化合物の効果をさらに証明するために、機序証明臨床試験を実施することが意図される。可能性のある試験計画は次の通りである。
【０１９８】
臨床試験計画は、オキサリプラチンを含む化学療法処置を開始する予定の結腸直腸癌患者における二重盲検、プラセボ対照並行群間、機序証明試験である。
【０１９９】
このプロジェクトの概要は、おそらく、被験体が２週間ごとの抗癌化学療法のために診療施設に行くことを含む。各オキサリプラチン投与前にその診療施設の手順に従って慣例の臨床検査が実施される。被験者はオキサリプラチンｉｖ注入の２日前に式（Ａ）の化合物の服用を開始するように指示される。最初の６回のオキサリプラチン注入の間に、適格な被験者は、７日間、１日１回、午前中に式（Ａ）の化合物（ｘ錠ｘ  ｍｇまたはプラセボ）を服用するように指示される。式（Ａ）の化合物の投与計画は、オキサリプラチンの全身ピーク中にＣＸＣＲ２アンタゴニストの最大効果を達成するように設計される。この最初の試験では、間欠的投与が治療効力を最大にし、オキサリプラチンとの長期併用投与によるいずれの副作用の可能性も最小にする。６回目のサイクルの終了後、被験者は式（Ａ）の化合物またはプラセボでの処置を止め、臨床上適当であれば化学療法レジメンを続ける。
【０２００】
最初の７回の化学療法サイクル中、その間は診療施設で、評価は安全性、忍容性および薬物動態学を含む。臨床評価および神経興奮性プロファイルに関する主要電気生理学的測定は、ベースライン時とサイクル１、３、５、６および７のオキサリプラチン注入後２４〜４８時間の間に行う。診療施設への総ての訪問は、ＮＣＩ−ＣＴＣｖ４および総神経障害スコアおよびサブセット[TNSc; Cavaletti G F. B., J. Peripher. Nerv. Syst., Sep., 12(3), 210-5 (2007); Cornblath DR, Neurology, 53(8), 1660 (1999)]を使用する臨床評価を含む。腫瘍学的尺度は標準治療に従ってモニタリングする。
【０２０１】
主要尺度には、以下のものが含まれる：
・化学療法サイクル１の投与前と最後の式（Ａ）の化合物／プラセボ投与の後に続く化学療法サイクルの前との間の差として評価される感覚興奮性（超興奮性％）の変化。式（Ａ）の化合物の安全性：有害事象、臨床徴候、安全性検査所見およびバイタルサインのモニタリング。
・式（Ａ）の化合物のＰＫ。
【０２０２】
式（Ｄ）の化合物：  １−（４−クロロ−３−（（１，４−ジメチルピペリジン−４−イル）スルホニル）−２−ヒドロキシフェニル）−３−（２−クロロ−３−フルオロフェニル）尿素，トリフルオロ酢酸塩
【化１７】
2017527542.tif 000034
【０２０３】
１，４−ジオキサン（１０ｍＬ）および水（１ｍＬ）中、６−アミノ−３−クロロ−２−［（１，４−ジメチル−４−ピペリジニル）スルホニル］フェノール，二塩酸塩（中間体Ｄ１）（０．３０ｇ）の溶液に、ＮａＨＣＯ３（０．１９３ｇ）を加えた。この混合物を室温で１０分間撹拌した。次に、２−クロロ−１−フルオロ−３−イソシアナトベンゼン（０．１３１ｇ）を加えた。さらに１０分間、撹拌を続けた。その後、反応混合物を水（５０ｍＬ）で希釈し、ＥＡ（２×５０ｍＬ）で抽出した。次に、この溶液をブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、ＭＤＡＰにより精製し、標題生成物（１３０ｍｇ）を得た。
【０２０４】
中間体Ｄ１：  ６−アミノ−３−クロロ−２−（（１，４−ジメチルピペリジン−４−イル）スルホニル）フェノール，二塩酸塩
【化１８】
2017527542.tif 000035
【０２０５】
工程１：  −７８℃で、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（２５ｍＬ）中、４−（（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロベンゾ［ｄ］オキサゾール−７−イル）スルホニル）ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（０．３５ｇ）（中間体Ｄ２）の溶液に、ｎ−ブチルリチウム（０．３８３ｍＬ、シクロヘキサン中２．０Ｍ）を加えた。この混合物を−７８℃で１時間撹拌した。次に、ＭｅＩ（０．０４８ｍＬ）を加えた。撹拌を−７８℃で４時間続けた。その後、この反応物をＮＨ４Ｃｌ水溶液で急冷し、ＥＡ（２×５０ｍＬ）で抽出した。次に、この溶液をブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮し、４−（（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロベンゾ［ｄ］オキサゾール−７−イル）スルホニル）−４−メチルピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（０．４ｇ）を得た。
【０２０６】
工程２：  ジクロロメタン（ＤＣＭ）（２０ｍＬ）中、４−（（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロベンゾ［ｄ］オキサゾール−７−イル）スルホニル）−４−メチルピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（０．３５ｇ）の溶液に、ＴＦＡ（０．５７２ｍＬ）を加えた。この混合物を室温で一晩撹拌した。得られた溶液を真空濃縮し、２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロ−７−（（４−メチルピペリジン−４−イル）スルホニル）ベンゾ［ｄ］オキサゾール，トリフルオロ酢酸塩（０．３５ｇ）を得た。
【０２０７】
工程３：  Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（１０ｍＬ）中、２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロ−７−（（４−メチルピペリジン−４−イル）スルホニル）ベンゾ［ｄ］オキサゾール，トリフルオロ酢酸塩（０．３５ｇ）の溶液に、ＡｃＯＨ（０．０５４ｍＬ）およびホルムアルデヒド（０．７８８ｍＬ）を加えた。次に、この反応混合物を０℃に冷却し、１０分間撹拌した。その後、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（０．６ｇ）を少量ずつ加えた。反応の完了後、この混合物をＮａＨＣＯ３水溶液（２０ｍＬ）で急冷し、ＥＡ（２×５０ｍＬ）で抽出した。次に、この溶液をブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮し、２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロ−７−（（１，４−ジメチルピペリジン−４−イル）スルホニル）ベンゾ［ｄ］オキサゾール（０．３ｇ）を得た。
【０２０８】
工程４：  １，４−ジオキサン（１０ｍＬ）および水（１０ｍＬ）中、２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロ−７−（（１，４−ジメチルピペリジン−４−イル）スルホニル）ベンゾ［ｄ］オキサゾール（０．３ｇ）の溶液に、ＨＣｌ（０．６４０ｍＬ、水中３７％）を加えた。この混合物を１２０℃で３時間加熱した。その後、得られた溶液を真空濃縮して標題生成物（０．３ｇ）を得、これをそれ以上精製せずに次の工程で使用した。
【０２０９】
中間体Ｄ２：  ４−（（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロベンゾ［ｄ］オキサゾール−７−イル）スルホニル）ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化１９】
2017527542.tif 000036
【０２１０】
工程１：  ＤＣＭ（１００ｍＬ）中、４−ヒドロキシピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１０．０ｇ）の溶液に、ＴＥＡ（１３．９ｍＬ）を加え、次いで、氷浴中でＭｓＣｌ（４．７ｍＬ）を加えた。この混合物を室温で４時間撹拌した。水（１００ｍＬ）を加えた。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮し、４−（（メチルスルホニル）オキシ）ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１３．９ｇ）を白色固体として得た。MS(ES+) m/z 302 (MNa+)。
【０２１１】
工程２：  ＤＭＦ（１００ｍＬ）中、２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロベンゾ［ｄ］オキサゾール−７−チオール酸ナトリウム（１２．０ｇ）および４−（（メチルスルホニル）オキシ）ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１３．９ｇ）の溶液に、炭酸カリウム（６．３ｇ）を加えた。この混合物を８０℃で２時間撹拌した。ＥＡ（２００ｍＬ）を加えた。有機相をブライン（４×２００ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮し、４−（（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロベンゾ［ｄ］オキサゾール−７−イル）チオ）ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１９．３ｇ）を黄色油状物として得た。MS(ES+) m/z 369 (M-t-Bu+H+H+)。
【０２１２】
工程３：  ＤＣＭ（５０ｍＬ）中、４−（（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロベンゾ［ｄ］オキサゾール−７−イル）チオ）ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１９．３ｇ）の溶液に、０℃でｍＣＰＢＡ（２０．４ｇ）を加えた。室温で一晩撹拌した後、混合物をＮａＨＣＯ３水溶液およびＮａ２Ｓ２Ｏ３水溶液で急冷し、次いで、ＥＡ（２×１５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を洗浄し、乾燥させ、濃縮した。粗物質をメタノール／Ｈ２Ｏ中での再結晶化により精製し、４−（（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロベンゾ［ｄ］オキサゾール−７−イル）スルホニル）ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１４．０ｇ）を得た。MS(ES+) m/z 479 (MNa+)。
【０２１３】
式（Ｅ）の化合物：  （Ｒ）−１−（４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（（４−メチルテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）スルホニル）フェニル）−３−（２−クロロシクロペント−２−エン−１−イル）尿素
【化２０】
2017527542.tif 000037
【０２１４】
ピリジン（５ｍＬ）中、６−アミノ−３−クロロ−２−（（４−メチルテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）スルホニル）フェノール，塩酸塩（５０ｍｇ）（中間体Ｅ１）の溶液に、新鮮な（Ｒ）−１−クロロ−５−イソシアナトシクロペント−１−エン（中間体Ｅ２、トルエン中０．０３Ｍ、５ｍＬ）を加え、得られた混合物を室温で一晩撹拌した。この混合物をエタノール（５ｍＬ）で急冷し、減圧下で濃縮した。残渣をＭＤＡＰ（塩基性条件）で精製し、標題化合物（３４ｍｇ）を得た; 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 10.36 (br. s., 1H), 8.39 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 8.20 (s, 1H), 7.35 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.13 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 5.96-6.02 (m, 1H), 4.69-4.80 (m, 1H), 3.84 (dd, J = 11.7, 4.4 Hz, 2H), 3.49 (t, J = 11.2 Hz, 2H), 2.22-2.46 (m, 3H), 2.04 (td, J = 12.5, 5.1 Hz, 2H), 1.61-1.74 (m, 1H), 1.58-1.61 (m, 1H), 1.54-1.58 (m, 1H), 1.50 (s, 3H); MS(ES+) m/z 449 (MH+)。
【０２１５】
中間体Ｅ１：  ６−アミノ−３−クロロ−２−（（４−メチルテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）スルホニル）フェノール，塩酸塩
【化２１】
2017527542.tif 000038
【０２１６】
工程１：  ＤＣＭ（２００ｍＬ）中、テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−オール（１０．０ｇ）の溶液に、ＴＥＡ（１２．９ｇ）および塩化メタンスルホニル（１１．３ｇ）を加えた。この混合物を０℃で１時間撹拌した後、Ｈ２Ｏで洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮し、メタンスルホン酸テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル（１５．５ｇ）を得た。
【０２１７】
工程２：  アセトニトリル（５ｍＬ）中、２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロベンゾ［ｄ］オキサゾール−７−チオール（１８．０ｇ）およびＣｓ２ＣＯ３（１２．１ｇ）の溶液に、メタンスルホン酸テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル（１４．８ｇ）を加えた。この混合物を９０℃で１６時間撹拌した。室温まで冷却した後、この混合物を濃縮した。残渣をＥＡ（１００ｍＬ）とＨ２Ｏ（１００ｍＬ）の間で分液した。有機層を乾燥させ、濃縮し、２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロ−７−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）チオ）ベンゾ［ｄ］オキサゾール（２４．０ｇ）を得た。MS(ES+) m/z 326 (MH+)。
【０２１８】
工程３：  ＤＣＭ（１０００ｍＬ）中、２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロ−７−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）チオ）ベンゾ［ｄ］オキサゾール（２４．０ｇ）の溶液に、ｍＣＰＢＡ（３１．８ｇ）を加えた。この混合物を１５℃で２時間撹拌した後、Ｎａ２ＳＯ３水溶液で急冷した。ｐＨを約７に調整した。有機層を乾燥させ、濃縮し、２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロ−７−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）スルホニル）ベンゾ［ｄ］オキサゾール（１８．０ｇ）を得た。
【０２１９】
工程４：  ＴＨＦ（５０ｍＬ）中、２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロ−７−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）スルホニル）ベンゾ［ｄ］オキサゾール（５．０ｇ）の溶液に、−７８℃、窒素雰囲気下、ＢｕＬｉ（ヘキサン中２．５Ｍ、６．２ｍＬ）を加えた。この混合物を−７８℃で４５分間撹拌した。ＭｅＩ（２．２ｇ）を加えた。この反応混合物を−７８℃で１時間撹拌した後、ＮＨ４Ｃｌ水溶液で急冷した。有機層を乾燥させ、濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーにより精製し、２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロ−７−（（４−メチルテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）スルホニル）ベンゾ［ｄ］オキサゾール（４．８ｇ）を得た。MS(ES+) m/z 372 (MH+)。
【０２２０】
工程５：  １，４−ジオキサン（１０ｍＬ）中、２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロ−７−（（４−メチルテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）スルホニル）ベンゾ［ｄ］オキサゾール（１．０ｇ）の溶液に、ＨＣｌ水溶液（３７％、１０ｍＬ）を加えた。１１０℃で４時間還流させた後、この混合物を濃縮し、標題化合物（１．０ｇ）を灰色の固体として得た。MS(ES+) m/z 306 (MH+)。
【０２２１】
中間体Ｅ２：（Ｒ）−１−クロロ−５−イソシアナトシクロペント−１−エン
【化２２】
2017527542.tif 000039
【０２２２】
工程１：  メタノール（１０ｍＬ）中、シクロペント−２−エノン（１．２ｇ）の溶液に、過酸化水素溶液（３０％、０．５ｇ）を加えた。得られた混合物を室温で一晩撹拌した。冷水（３０ｍＬ）を加え、得られた混合物を飽和ＮａＨＣＯ３で中和した。水層をＤＣＭ（２×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空濃縮し、６−オキサビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２−オン（１．３ｇ）を黄色油状物として得た。
【０２２３】
工程２：  メタノール（１０ｍＬ）および水（３ｍＬ）中、６−オキサビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２−オン（２５ｇ）の溶液に、塩化セリウム（ＩＩＩ）七水和物（９５ｇ）を加えた。得られた混合物を７０℃で１時間撹拌した。冷水（３０ｍＬ）を加え、得られた混合物を飽和ＮａＨＣＯ３溶液で中和した。水層をＤＣＭ（２×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空濃縮し、２−クロロシクロペント−２−エノン（２９ｇ）を黄色油状物として得た。
【０２２４】
工程３：  メタノール（２０ｍＬ）中、２−クロロシクロペント−２−エノン（６００ｍｇ）の溶液に、塩化セリウム（ＩＩＩ）七水和物（１９１８ｍｇ）およびＮａＢＨ４（１９５ｍｇ）を加えた。得られた混合物を室温で１時間撹拌した。冷水（３０ｍＬ）を加え、得られた混合物を飽和ＮａＨＣＯ３溶液で中和した。水層をＤＣＭ（２×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空濃縮し、２−クロロシクロペント−２−エノール（４００ｍｇ）を黄色油状物として得た。
【０２２５】
工程４：  ＴＨＦ（２００ｍＬ）中、２−クロロシクロペント−２−エノール（２０．０ｇ）およびイソインドリン−１，３−ジオン（３７．２ｇ）の溶液に、０℃で、Ｐｈ３Ｐ（６６．４ｇ）およびＤＩＡＤ（４９．２ｍＬ）を加えた。この混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を真空で除去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（ＰＥ：ＥＡ＝１０：１で溶出）により精製し、２−（２−クロロシクロペント−２−エン−１−イル）イソインドリン−１，３−ジオン（１８．０ｇ）を黄色固体として得た。MS(ES+) m/z 248 (MH+)。
【０２２６】
工程５：  ２−（２−クロロシクロペント−２−エン−１−イル）イソインドリン−１，３−ジオン（１４ｇ）をＳＦＣにより精製し、（Ｒ）−２−（２−クロロシクロペント−２−エン−１−イル）イソインドリン−１，３−ジオン（５．０ｇ）を白色固体としておよび（Ｓ）−２−（２−クロロシクロペント−２−エン−１−イル）イソインドリン−１，３−ジオン（５．５ｇ）を黄色油状物として得た。（Ｒ）−２−（２−クロロシクロペント−２−エン−１−イル）イソインドリン−１，３−ジオン：キラルＨＰＬＣ（カラム：ＡＤ−Ｈ（２５０＊４．６ｍｍ、５ｕｍ）；移動相：ＭｅＯＨ／ＣＯ２＝１５％；流速：３．０ｍｌ／分；温度：４０℃）：ｔＲ＝２．５４分、ｅｅ％＝１００％； 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 7.74-7.98 (m, 4H), 6.04 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 5.32 (dd, J = 9.3, 1.9 Hz, 1H), 2.77 (ddd, J = 9.4, 8.0, 3.0 Hz, 1H), 2.41-2.62 (m, 2H), 2.22-2.39 (m, 1H)；（Ｓ）−２−（２−クロロシクロペント−２−エン−１−イル）イソインドリン−１，３−ジオン：キラルＨＰＬＣ（カラム：ＡＤ−Ｈ（２５０＊４．６ｍｍ、５ｕｍ）；移動相：ＭｅＯＨ／ＣＯ２＝１５％；流速：３．０ｍｌ／分；温度：４０℃）：ｔＲ＝３．０４分、ｅｅ％＝１００％；1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 7.32-8.36 (m, 4H), 6.03 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 5.31 (dd, J = 9.3, 1.8 Hz, 1H), 2.77 (ddd, J = 9.4, 8.0, 3.0 Hz, 1H), 2.40-2.64 (m, 2H), 2.32 (ddd, J = 14.2, 8.7, 3.8 Hz, 1H)。
【０２２７】
工程６：  エタノール（１００ｍＬ）中、（Ｒ）−２−（２−クロロシクロペント−２−エン−１−イル）イソインドリン−１，３−ジオン（３．５ｇ）の溶液に、ヒドラジン．Ｈ２Ｏ（０．７ｍＬ）を加えた。３時間還流させた後、この反応混合物を室温まで冷却した。沈澱を濾過し、ＥｔＯＨ（１０ｍＬ）ですすいだ。濾液を濃縮して溶媒の半分を除去した。この溶液にエーテル中ＨＣｌ（１Ｍ、２０ｍＬ）を加え、濃縮し、（Ｒ）−２−クロロシクロペント−２−エナミンを塩酸塩として得た（２．０ｇ）。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 8.53 (s, 3H), 6.22 (s, 1H), 4.19 (d, J = 5.8 Hz, 1H), 2.49-2.54 (m, 1H), 2.26-2.45 (m, 2H), 1.90-2.04 (m, 1H)。
【０２２８】
工程７：  トルエン（１５ｍＬ）中、（Ｒ）−２−クロロシクロペント−２−エナミン塩酸塩（６００ｍｇ）の溶液に、炭酸ビス（トリクロロメチル）（６９４ｍｇ）を加えた。この混合物を１２０℃で４時間撹拌した。次に、この混合物を室温まで冷却し、（Ｒ）−１−クロロ−５−イソシアナトシクロペント−１−エンのトルエン溶液を得た。この溶液は毎回新たに合成するべきである。
【０２２９】
式（Ｆ）の化合物：（Ｒ）−１−（３−（ｔｅｒｔ−ブチルスルホニル）−４−シアノ−２−ヒドロキシフェニル）−３−（２−メチルシクロペント−２−エン−１−イル）尿素
【化２３】
2017527542.tif 000040
【０２３０】
ピリジン（２０ｍＬ）中、４−アミノ−２−（ｔｅｒｔ−ブチルスルホニル）−３−ヒドロキシベンゾニトリル（中間体Ｆ１、４５０ｍｇ）の溶液に、新鮮な、トルエン（２０ｍＬ）中、（Ｒ）−５−イソシアナト−１−メチルシクロペント−１−エン（中間体Ｆ２、３２７ｍｇ）を加えた。この反応混合物を室温で一晩撹拌した。この混合物を水（５ｍＬ）で急冷し、濃縮した。残渣をＭＤＡＰ（酸性条件）で精製し、（Ｒ）−１−（３−（ｔｅｒｔ−ブチルスルホニル）−４−シアノ−２−ヒドロキシフェニル）−３−（２−メチルシクロペント−２−エン−１−イル）尿素（１２０ｍｇ）を得た。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 10.13 (br. s., 1H), 8.51-8.64 (m, 2H), 7.60 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.34 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 5.52 (s, 1H), 4.54 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 2.11-2.37 (m, 3H), 1.66 (s, 3H), 1.46-1.60 (m, 1H), 1.30-1.46 (m, 9H); MS(ES+) m/z 378 (MH+)。
【０２３１】
中間体Ｆ１：  ４−アミノ−２−（ｔｅｒｔ−ブチルスルホニル）−３−ヒドロキシベンゾニトリル
【化２４】
2017527542.tif 000041
【０２３２】
工程１：  反応はマイクロ波合成のために５バッチ（各６００ｍｇ）で行った後、精製のために合わせた：  ＮＭＰ（４ｍＬ）中、２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−７−（ｔｅｒｔ−ブチルスルホニル）−６−クロロベンゾ［ｄ］オキサゾール（中間体(Intermeduate)Ｆ３、０．６ｇ）とシアン化銅（Ｉ）（１．６ｇ）の混合物をマイクロ波内、１８０℃で９０分間撹拌した。冷却後、５バッチを合わせ、ＥＡ（１００ｍＬ）および水（１００ｍＬ）で希釈した。濾過後、有機層を分離し、洗浄し、乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（ＰＥ：ＥＡ＝１：０から７：３で溶出）により精製し、２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−７−（ｔｅｒｔブチルスルホニル）ベンゾ［ｄ］オキサゾール−６−カルボニトリル（１．０ｇ）を得た。MS(ES+) m/z 321 (MH+)。
【０２３３】
工程２：  エタノール（２５ｍＬ）および水（２５ｍＬ）中、２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−７−（ｔｅｒｔ−ブチルスルホニル）ベンゾ［ｄ］オキサゾール−６−カルボニトリル（１．０ｇ）の溶液に、水酸化ナトリウム（０．３ｇ）を加えた。得られた混合物を６０℃で１時間撹拌した後、減圧下で濃縮した。残渣を水（５０ｍＬ）で希釈し、クエン酸水溶液でｐＨ＝６に酸性化し、ＥＡ（２×５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を洗浄し、乾燥させ、濾過し、濃縮し、Ｎ−（３−（ｔｅｒｔ−ブチルスルホニル）−４−シアノ−２−ヒドロキシフェニル）ピバルアミド（１．１ｇ）を得た。MS(ES+) m/z 361 (MH+)。
【０２３４】
工程３：  ＴＨＦ（３０ｍＬ）中、Ｎ−（３−（ｔｅｒｔ−ブチルスルホニル）−４−シアノ−２−ヒドロキシフェニル）ピバルアミド（１．２ｇ）の溶液に、ＤＭＡＰ（０．０４ｇ）およびＢｏｃ２Ｏ（１．６ｍＬ）を加えた。この混合物を６０℃で２時間撹拌した。この混合物にヒドラジン．Ｈ２Ｏ（１．６ｍＬ）を加えた。得られた混合物を室温で一晩撹拌し、水（５０ｍＬ）で希釈し、ＥＡ（２×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を洗浄し、乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（ＰＥ：ＥＡ＝１：０から７：３で溶出）により精製し、（３−（ｔｅｒｔ−ブチルスルホニル）−４−シアノ−２−ヒドロキシフェニル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１．２ｇ）を得た。MS(ES+) m/z 355 (MH+)。
【０２３５】
工程４：  ＤＣＭ（２５ｍＬ）中、（３−（ｔｅｒｔ−ブチルスルホニル）−４−シアノ−２−ヒドロキシフェニル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１．２ｇ）の溶液に、ＴＦＡ（２．６ｍＬ）を加えた。得られた混合物を室温で一晩撹拌した。ＤＣＭを除去した。残渣をＮａＨＣＯ３水溶液で塩基性とし（ｐＨ＝８）、ＥＡ（２×５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を洗浄し、乾燥させ、濾過し、濃縮し、標題化合物（０．８ｇ）を得た。MS(ES+) m/z 255 (MH+)。
【０２３６】
中間体Ｆ２：（Ｒ）−５−イソシアナト−１−メチルシクロペント−１−エン
【化２５】
2017527542.tif 000042
【０２３７】
工程１：  ベンゼン（５００ｍＬ）中、２−メチルシクロペンタン−１，３−ジオン（２７．０ｇ）、２−メチルプロパン−１−オール（６２．５ｇ）およびＴｓＯＨ（４．６ｇ）の溶液を一晩、加熱還流した。溶媒を真空で除去し、残渣を真空下で蒸留し、３−イソブトキシ−２−メチルシクロペント−２−エノン（３４．５ｇ）を黄色油状物として得た。1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 3.92 (d, J = 6.6 Hz, 2H), 2.53-2.70 (m, 2H), 2.32-2.52 (m, 2H), 2.04 (dp, J = 13.3, 6.7 Hz, 1H), 1.64 (t, J = 1.5 Hz, 3H), 1.01 (d, J = 6.7 Hz, 6H); MS(ES+) m/z 169 (MH+)。
【０２３８】
工程２：  ＤＣＭ（３００ｍＬ）中、３−イソブトキシ−２−メチルシクロペント−２−エノン（３４．５ｇ）の溶液に、０℃でＤＩＢＡＬ−Ｈ（ヘキサン中１Ｍ、２５０ｍＬ）を滴下した。この反応混合物をこの温度で９０分間撹拌した。この反応物を水で急冷した後、ＤＣＭ（２００ｍＬ）とＨＣｌ溶液（１Ｍ、１００ｍＬ）で分液した。水層をＤＣＭ（２×２００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を飽和重炭酸ナトリウム溶液（１００ｍＬ）、ブライン（２００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空濃縮し、２−メチルシクロペント−２−エノールと２−メチルシクロペント−２−エノンの混合物（２７．０ｇ）を黄色油状物として得た。
【０２３９】
工程３：  ジエチルエーテル（２００ｍＬ）中、２−メチルシクロペント−２−エノール（２７．０ｇ）と酸化マンガン（ＩＶ）（５．０ｇ）の混合物を室温で一晩撹拌した。この混合物を濾過し、濾液を真空濃縮した。残渣を真空蒸留し、２−メチルシクロペント−２−エノン（１６．５ｇ）を無色の油状物として得た。
【０２４０】
工程４：  無水ＴＨＦ（２０ｍＬ）中、（Ｒ）−１−メチル−３，３−ジフェニルヘキサヒドロピロロ［１，２−ｃ］［１，３，２］オキサザボラン（トルエン中１Ｍ、３１．８ｍＬ）の溶液に、２−メチルシクロペント−２−エノン（１５．３ｇ）およびＢＨ３（ＴＨＦ中１Ｍ、１１１ｍＬ）を注意深く加えた。この混合物を１時間撹拌した。メタノール（１５０ｍｌ）を加え、得られた混合物をブラインで希釈した。水層をＤＣＭ（２×２００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空濃縮し、（Ｓ）−２−メチルシクロペント−２−エノール（未知のｅｅ％、１６．０ｇ）を黄色油状物として得た。
【０２４１】
工程５：  ＴＨＦ（２４０ｍＬ）中、（Ｓ）−２−メチルシクロペント−２−エノール（１６．０ｇ）およびイソインドリン−１，３−ジオン（３６．０ｇ）の溶液に、Ｎ２下でトリフェニルホスフィン（７７．０ｇ）を加えた。この混合物を０℃まで冷却した。アゾジカルボン酸ジイソプロピル（６３．４ｍＬ）をこの混合物に滴下した。３０分間撹拌した後、この混合物を０℃で一晩撹拌した。溶媒を除去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（ＰＥ：ＥＡ＝１０：１で溶出）により精製して粗生成物を得、これをＳＦＣにより精製し、（Ｒ）−２−（２−メチルシクロペント−２−エン−１−イル）イソインドリン−１，３−ジオン（１０．６ｇ、＞９８％ｅｅ）を白色固体として得た。キラルＨＰＬＣ（カラム：ＡＤ−Ｈ、４．６＊２５０ｍｍ、５μｍ、ＭｅＯＨ／ＣＯ２＝１０％、カラム温度：４０℃、ＣＯ２流速：２．７ｍＬ／分）：ｔＲ＝２．１７分、ｅｅ％：＞９８％；1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 7.83 (dd, J = 5.4, 3.1 Hz, 2H), 7.76-7.61 (m, 2H), 5.68 (s, 1H), 5.21 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 2.69 (dd, J = 5.7, 3.5 Hz, 1H), 2.42-2.30 (m, 2H), 2.22-2.12 (m, 1H), 1.61 (s, 3H); MS (ES+) m/z 228 (MH+)。
【０２４２】
工程６：  エタノール（１５０ｍＬ）中、（Ｒ）−２−（２−メチルシクロペント−２−エン−１−イル）イソインドリン−１，３−ジオン（１０．７ｇ）の溶液に、ヒドラジン．Ｈ２Ｏ（３．０ｍＬ）を加えた。３時間還流させた後、この反応混合物を室温まで冷却した。沈澱を濾過し、濾過ケーキをＥｔＯＨ（１０ｍＬ）ですすいだ。この濾液にジオキサン中ＨＣｌ（４Ｍ、５ｍＬ）を加え、この混合物を濃縮した。得られた残渣を水に溶かした後、凍結乾燥させ、塩酸塩としての（Ｒ）−２−メチルシクロペント−２−エナミン（６．３ｇ）を褐色固体として得、これを精製せずに次の工程で使用した。
【０２４３】
工程７：  トルエン（３０ｍＬ）中、（Ｒ）−２−メチルシクロペント−２−エナミン塩酸塩（４２０ｍｇ）の溶液に、トリホスゲン（５６０ｍｇ）を加えた。得られた混合物を１１０℃で６時間撹拌した。次に、この混合物を室温まで冷却し、（Ｒ）−５−イソシアナト−１−メチルシクロペント−１−エンのトルエン溶液を得た。この溶液は毎回新たに合成するべきである。
【０２４４】
工程８：  ＤＣＭ（３ｍＬ）および飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（３ｍＬ）中、（Ｒ）−２−メチルシクロペント−２−エナミン塩酸塩（２３ｍｇ）の溶液に、０℃で炭酸ビス（トリクロロメチル）（１８ｍｇ）を加えた。この混合物を０℃から２５℃まで２時間撹拌した。得られた二層を分離し、水層をＤＣＭ（６０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をブライン（１５ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、（Ｒ）−５−イソシアナト−１−メチルシクロペント−１−エン（２０ｍｇ）を白色固体として得、これをそれ以上精製せずにそのまま次の工程で使用した。MS(ES+) m/z 141(MH+)（Ｍ：水酸化アンモニウムによる尿素誘導体）。
【０２４５】
中間体Ｆ３：  ２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−７−（ｔｅｒｔ−ブチルスルホニル）−６−クロロベンゾ［ｄ］オキサゾール
【化２６】
2017527542.tif 000043
【０２４６】
工程１：  ＤＭＦ（３０ｍＬ）中、２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロベンゾ［ｄ］オキサゾール−７−チオール（３．０ｇ）の溶液に、２−ヨードプロパン（２．１ｇ）を加えた。この混合物を１００℃で２時間撹拌した。冷却後、溶媒を除去した。残渣をカラムクロマトグラフィーにより精製し、２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロ−７−（イソプロピルチオ）ベンゾ［ｄ］オキサゾール（３．５ｇ）を得た。
【０２４７】
工程２：  ＤＣＭ（４０ｍＬ）中、２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロ−７−（イソプロピルチオ）ベンゾ［ｄ］オキサゾール（３．５ｇ）の溶液に、１５℃で、ｍＣＰＢＡ（５．３ｇ）を加えた。この混合物を１５℃で４８時間撹拌した後、飽和Ｎａ２ＳＯ３溶液で急冷した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーにより精製し、２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロ−７−（イソプロピルスルホニル）ベンゾ［ｄ］オキサゾール（３．６ｇ）を得た。MS(ES+) m/z 316 (MH+)。
【０２４８】
工程３：  ＴＨＦ（１０ｍＬ）中、２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロ−７−（イソプロピルスルホニル）ベンゾ［ｄ］オキサゾール（３．０ｇ）の溶液に、ＬｉＨＭＤＳ（ＴＨＦ中１Ｍ、３１．７ｍＬ）を加えた。この混合物を−７８℃で１０分間撹拌した後、ヨードメタン（６．７４ｇ）を加えた。この混合物を−７８℃で１０分間撹拌した後、ＮＨ４Ｃｌ水溶液およびＨＣｌ水溶液（１０％）で急冷した。この混合物をＥＡで抽出した。有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。粗生成物をカラムクロマトグラフィーにより精製し、２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−７−（ｔｅｒｔ−ブチルスルホニル）−６−クロロベンゾ［ｄ］オキサゾール（Ｆ３、２．８ｇ）を得た。MS(ES+) m/z 330 (MH+)。
【０２４９】
式（Ｇ）の化合物：  １−（４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（（トランス−３−（ピロリジン−１−イル）シクロブチル）スルホニル）フェニル）−３−（（Ｒ）−２−メチルシクロペント−２−エン−１−イル）尿素，トリフルオロ酢酸塩
【化２７】
2017527542.tif 000044
【０２５０】
ピリジン（５ｍＬ）中、６−アミノ−３−クロロ−２−（（トランス−３−（ピロリジン−１−イル）シクロブチル）スルホニル）フェノール（中間体Ｇ１、８０ｍｇ）の溶液に、トルエン（５ｍＬ）中、（Ｒ）−５−イソシアナト−１−メチルシクロペント−１−エン（中間体Ｆ２、７４ｍｇ）溶液を加えた。この混合物を室温で一晩撹拌した。この混合物を濃縮し、得られた残渣をＤＭＦ（８ｍＬ）に再溶解させ、ＭＤＡＰにより精製し、トリフルオロ酢酸塩としての１−（４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（（トランス−３−（ピロリジン−１−イル）シクロブチル）スルホニル）フェニル）−３−（（Ｒ）−２−メチルシクロペント−２−エン−１−イル）尿素を（２１ｍｇ）白色固体として得た。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 10.44 (br. s., 2H), 8.28 (br. s., 1H), 8.18 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.13 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.10 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 5.52 (s, 1H), 4.49-4.62 (m, 2H), 4.02 (quin, J = 7.5 Hz, 1H), 2.82-3.23 (m, 2H), 2.64-2.80 (m, 5H), 2.11-2.36 (m, 3H), 1.80-2.08 (m, 4H), 1.67 (s, 3H), 1.45-1.64 (m, 1H); MS(ES+) m/z 454 (MH+)。
【０２５１】
中間体Ｇ１：  ６−アミノ−３−クロロ−２−（（（１ｒ，３ｒ）−３−（ピロリジン−１−イル）シクロブチル）スルホニル）フェノール
【化２８】
2017527542.tif 000045
【０２５２】
工程１：  ＤＣＭ（３０ｍＬ）中、シス−３−（（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロベンゾ［ｄ］オキサゾール−７−イル）スルホニル）シクロブタノール（中間体Ｇ２、３．０ｇ）の溶液に、０℃、窒素雰囲気下で、ＴＥＡ（２．６ｇ）および塩化メタンスルホニル（１．２ｇ）を加えた。得られた混合物をこの温度で３０分間撹拌した。この混合物を  ＮａＨＣＯ３水溶液で急冷し、ＤＣＭ（２×３０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相を洗浄し、乾燥させ、濃縮し、メタンスルホン酸シス−３−（（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロベンゾ［ｄ］オキサゾール−７−イル）スルホニル）シクロブチル（２．６ｇ）を得た。MS(ES+) m/z 422 (MH+)。
【０２５３】
工程２：  ＤＭＦ（３０ｍＬ）中、メタンスルホン酸シス−３−（（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロベンゾ［ｄ］オキサゾール−７−イル）スルホニル）シクロブチル（２．４ｇ）の溶液に、炭酸カリウム（１．６ｇ）およびピロリジン（０．５ｇ）を加えた。この混合物を８０℃で一晩撹拌した。水（２０ｍＬ）を加えた。粗生成物をＥＡ（３×８０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相をブラインで洗浄し、濾過し、濃縮して粗生成物を得、これをカラムクロマトグラフィー（ＰＥ：ＥＡ＝２：１で溶出）により精製し、２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロ−７−（（トランス−３−（ピロリジン−１−イル）シクロブチル）スルホニル）ベンゾ［ｄ］オキサゾール（２．０ｇ）を得た。MS(ES+) m/z 397 (MH+)。
【０２５４】
工程３：  ２−（Ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロ−７−（（トランス−３−（ピロリジン−１−イル）シクロブチル）スルホニル）ベンゾ［ｄ］オキサゾール（２．０ｇ）をジオキサン（５０ｍＬ）および水（５０ｍＬ）中ＨＣｌに溶かした。この反応混合物を１２０℃で一晩撹拌した。溶媒を除去して粗生成物（１．５ｇ）を得、これを出発材料として２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロ−７−（（トランス−３−（ピロリジン−１−イル）シクロブチル）スルホニル）ベンゾ［ｄ］オキサゾール（１．３ｇ）を用いた同じ反応の別のバッチと合わせた。この混合物を分取ＨＰＬＣにより精製し、標題化合物（６１４ｍｇ）を得た。MS(ES+) m/z 331 (MH+)。
【０２５５】
中間体Ｇ２：  シス−３−（（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロベンゾ［ｄ］オキサゾール−７−イル）スルホニル）シクロブタノール
【化２９】
2017527542.tif 000046
【０２５６】
工程１：  ＤＭＦ（２５０ｍＬ）中、２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロベンゾ［ｄ］オキサゾール−７−チオール（２５．０ｇ）の溶液に、４−ブロモブト−１−エン（１６．８ｇ）、次いで、Ｋ２ＣＯ３（２１．４ｇ）を加えた。得られた混合物を６０℃で４時間撹拌した。冷却後、それを水（１Ｌ）に注ぎ、ＥＡ（２×２００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を水およびブラインで洗浄した。Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた後、有機層を濃縮し、７−（ブト−３−エン−１−イルチオ）−２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロベンゾ［ｄ］オキサゾール（２７．６ｇ）を得た。MS(ES+) m/z 296 (MH+)。
【０２５７】
工程２：  氷水で冷却した、ＤＣＭ（４００ｍＬ）中、７−（ブト−３−エン−１−イルチオ）−２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロベンゾ［ｄ］オキサゾール（２７．６ｇ）の溶液にｍＣＰＢＡ（８４．０ｇ）を少量ずつ加えた。室温で一晩撹拌した後、ＮａＨＣＯ３水溶液およびＮａ２Ｓ２Ｏ３水溶液を加えた。この混合物をＤＣＭ（２×５００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を水およびブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ＰＥ：ＥＡ＝１：０から７：３で溶出）により精製し、２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロ−７−（（２−（オキシラン−２−イル）エチル）スルホニル）ベンゾ［ｄ］オキサゾール（２６．０ｇ）を得た。
【０２５８】
工程３：  ＴＨＦ（２００ｍＬ）中、２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロ−７−（（２−（オキシラン−２−イル）エチル）スルホニル）ベンゾ［ｄ］オキサゾール（１０．０ｇ）の溶液に、−７０℃で、臭化メチルマグネシウム（エーテル中３Ｍ、３８．８ｍＬ）を加えた。この混合物をゆっくり温め、室温で一晩撹拌した。この反応混合物をＮＨ４Ｃｌ水溶液に注ぎ、ＥＡ（２×２００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過した。溶媒を除去した後、粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ＰＥ：ＥＡ＝４：１から３：２で溶出）により精製し、シス−３−（（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロベンゾ［ｄ］オキサゾール−７−イル）スルホニル）シクロブタノール（７．２ｇ）を得た。
【０２５９】
式（Ｈ）の化合物：  １−（４−クロロ−３−（（トランス−３−（ジメチルアミノ）シクロブチル）スルホニル）−２−ヒドロキシフェニル）−３−（（Ｒ）−２−メチルシクロペント−２−エン−１−イル）尿素，トリフルオロ酢酸塩
【化３０】
2017527542.tif 000047
【０２６０】
ピリジン（５ｍＬ）中、６−アミノ−３−クロロ−２−（（トランス−３−（ジメチルアミノ）シクロブチル）スルホニル）フェノール（中間体Ｈ１、１００ｍｇ）の溶液に、新鮮な、トルエン（５ｍＬ）中、（Ｒ）−５−イソシアナト−１−メチルシクロペント−１−エン（中間体Ｆ２、４０ｍｇ）を加えた。この反応混合物を室温で一晩撹拌した後、水（５ｍＬ）で急冷した。溶媒を除去した。残渣をＭＤＡＰ（酸性条件）により精製し、１−（４−クロロ−３−（（トランス−３−（ジメチルアミノ）シクロブチル）スルホニル）−２−ヒドロキシフェニル）−３−（（Ｒ）−２−メチルシクロペント−２−エン−１−イル）尿素をトリフルオロ酢酸塩（４０ｍｇ）として得た。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 10.46 (br. s., 1H), 8.32 (s, 1H), 8.16 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.06-7.17 (m, 2H), 5.52 (s, 1H), 4.50-4.58 (m, 1H), 4.40-4.50 (m, 1H), 3.98 (quin, J = 7.9 Hz, 1H), 2.62-2.82 (m, 10H), 2.11-2.36 (m, 3H), 1.67 (s, 3H), 1.49-1.59 (m, 1H); MS(ES+) m/z 428 (MH+)。
【０２６１】
中間体Ｈ１：  ６−アミノ−３−クロロ−２−（（トランス−３−（ジメチルアミノ）シクロブチル）スルホニル）フェノール
【化３１】
2017527542.tif 000048
【０２６２】
工程１：  炭酸カリウム（２６２ｍｇ）を室温でＤＭＦ（３ｍＬ）中、メタンスルホン酸シス−３−（（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロベンゾ［ｄ］オキサゾール−７−イル）スルホニル）シクロブチル（中間体Ｈ２；２００ｍｇ）および塩酸ジメチルアミン（７７ｍｇ）の溶液に加えた。この反応混合物を１００℃で１２時間撹拌した後、出発材料としてメタンスルホン酸シス−３−（（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロベンゾ［ｄ］オキサゾール−７−イル）スルホニル）シクロブチル（２００ｍｇ）を用いた同じ反応の別のバッチと合わせた。合わせた混合物をＥＡ（５０ｍＬ）で希釈した。有機相を水（２×２０ｍＬ）およびブライン（２０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮し、トランス−３−（（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロベンゾ［ｄ］オキサゾール−７−イル）スルホニル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルシクロブタンアミン（２５０ｍｇ）を褐色油状物として得た。MS(ES+) m/z 371 (MH+)。
【０２６３】
工程２：  ＨＣｌ水溶液（３５％、５ｍＬ）を、室温で、１，４−ジオキサン（１０ｍＬ）および水（１０ｍＬ）中、トランス−３−（（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロベンゾ［ｄ］オキサゾール−７−イル）スルホニル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルシクロブタンアミン（５５０ｍｇ）の溶液に加えた。この反応混合物を１２０℃で３時間撹拌した後、出発材料としてトランス−３−（（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロベンゾ［ｄ］オキサゾール−７−イル）スルホニル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルシクロブタンアミン（４００ｍｇ）を用いた同じ反応の別のバッチと合わせた。合わせた混合物を濃縮した。残渣をＭｅＯＨに溶かした。ＮａＨＣＯ３水溶液をｐＨ＝８まで加えた。この混合物を濃縮した。得られた残渣をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝５０：１で溶出）により精製し、標題化合物（２２０ｍｇ）を黒色油状物として得た。MS(ES+) m/z 305 (MH+)。
【０２６４】
中間体Ｈ２：  メタンスルホン酸シス−３−（（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロベンゾ［ｄ］オキサゾール−７−イル）スルホニル）シクロブチル
【化３２】
2017527542.tif 000049
【０２６５】
ＤＣＭ（２０ｍＬ）中、シス−３−（（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロベンゾ［ｄ］オキサゾール−７−イル）スルホニル）シクロブタノール（中間体Ｇ２、１．０ｇ）およびＮ，Ｎ−ジエチルプロパン−２−アミン（０．９ｍＬ）の溶液に、０℃で、塩化メタンスルホニル（０．３ｍＬ）を加えた。この混合物を０℃で４時間撹拌した。次に、この反応混合物を水に注ぎ、ＤＣＭ（２×５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相を洗浄し、乾燥させ、濃縮し、メタンスルホン酸シス−３−（（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロベンゾ［ｄ］オキサゾール−７−イル）スルホニル）シクロブチル（１．３ｇ）を無色の固体として得た。MS(ES+) m/z 422 (MH+)。
【０２６６】
式（Ｉ）の化合物：  （Ｒ）−１−（４−クロロ−３−（（１，１−ジフルオロエチル）スルホニル）−２−ヒドロキシフェニル）−３−（２−メチルシクロペント−２−エン−１−イル）尿素
【化３３】
2017527542.tif 000050
【０２６７】
ピリジン（５ｍＬ）中、６−アミノ−３−クロロ−２−（（１，１−ジフルオロエチル）スルホニル）フェノール（中間体Ｉ１、８４ｍｇ）の溶液に、（Ｒ）−５−イソシアナト−１−メチルシクロペント−１−エン（中間体Ｆ２、トルエン中０．１５Ｍ、４ｍＬ）を加えた。この反応混合物を室温で一晩撹拌した。この混合物を濃縮し、残渣をＤＭＦ（８ｍＬ）に溶かし、ＭＤＡＰにより精製し、（Ｒ）−１−（４−クロロ−３−（（１，１−ジフルオロエチル）スルホニル）−２−ヒドロキシフェニル）−３−（２−メチルシクロペント−２−エン−１−イル）尿素（１５ｍｇ）を白色固体として得た。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 10.53 (br. s., 1H), 8.28 (s, 1H), 8.26 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.17 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.07 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 5.52 (br. s., 1H), 4.44-4.62 (m, 1H), 2.23-2.36 (m, 2H), 2.16-2.23 (m, 1H), 2.09 (t, J = 19.2 Hz, 3H), 1.67 (s, 3H), 1.47-1.59 (m, 1H); MS(ES+) m/z 395 (MH+)。
【０２６８】
中間体Ｉ１：  ６−アミノ−３−クロロ−２−（（１，１−ジフルオロエチル）スルホニル）フェノール
【化３４】
2017527542.tif 000051
【０２６９】
工程１：  −７８℃で撹拌したアセトニトリル（８０ｍＬ）および水（８０ｍＬ）中、２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロベンゾ［ｄ］オキサゾール−７−チオール（６．０ｇ）および水酸化カリウム（１３．９ｇ）の溶液に、ホスホン酸ジエチル（ブロモジフルオロメチル）（１１．９ｇ）を一度に加えた。この混合物を室温まで温め、３０分間撹拌した。ＥＡ（２００ｍＬ）を加えた。有機相を分離した。水相をＥＡ（２×１００ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮し、２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロ−７−（（ジフルオロメチル）チオ）ベンゾ［ｄ］オキサゾール（７．２ｇ）を無色の油状物として得た。MS(ES+) m/z 292 (MH+)。
【０２７０】
工程２：  ０℃で、ＤＣＭ（２００ｍＬ）中、２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロ−７−（（ジフルオロメチル）チオ）ベンゾ［ｄ］オキサゾール（７．２ｇ）の溶液に、ｍＣＰＢＡ（１９．５ｇ）を加え、２時間撹拌した。出発材料が完全に消費されなかったので、さらなるｍＣＰＢＡ（１９．５ｇ）を追加した。この混合物を室温で一晩撹拌した。次に、Ｎａ２ＳＯ３水溶液を加えた。有機相を分離し、飽和炭酸ナトリウム溶液およびブラインで洗浄した。得られた溶液を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（ＰＥ：ＥＡ＝１：０−２：３で溶出）により精製し、２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロ−７−（（ジフルオロメチル）スルホニル）ベンゾ［ｄ］オキサゾール（３．２ｇ）を白色固体として得た。MS(ES+) m/z 324 (MH+)。
【０２７１】
工程３：  ＴＨＦ（３０ｍＬ）およびＨＭＰＡ（２７ｍＬ）中、２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロ−７−（（ジフルオロメチル）スルホニル）ベンゾ［ｄ］オキサゾール（２．２ｇ）およびヨードメタン（４．２ｍＬ）の溶液に、ＬＤＡ（ＴＨＦ中２Ｍ、１３．５ｍＬ）を加えた。この混合物を−５０℃で３０分間撹拌した。この混合物を飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液および１０％ＨＣｌで中和した。ＥＡ（５０ｍＬ）を加えた。有機層をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空濃縮した。粗生成物を、出発材料として２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロ−７−（（ジフルオロメチル）スルホニル）ベンゾ［ｄ］オキサゾール（１．０ｇ）を用いた同じ反応の別のバッチと合わせた。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ＰＥ：ＥＡ＝１：０−３：２で溶出）により精製し、２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロ−７−（（１，１−ジフルオロエチル）スルホニル）ベンゾ［ｄ］オキサゾール（１．０ｇ）を白色固体として得た。MS(ES+) m/z 338 (MH+)。
【０２７２】
工程４：  １，４−ジオキサン（２０ｍＬ）中、２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロ−７−（（１，１−ジフルオロエチル）スルホニル）ベンゾ［ｄ］オキサゾール（１．０ｇ）の溶液に、濃ＨＣｌ溶液（２０ｍＬ）を加えた。この混合物を１１０℃で４時間還流させた後、濃縮した。得られた残渣をＥＡ（２０ｍＬ）に溶かした。この溶液のｐＨをＴＥＡで８に調整した。この混合物を濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（ＰＥ：ＥＡ＝１：０から１：４で溶出）により精製し、標題化合物（１．０ｇ）を淡褐色固体として得た。MS(ES+) m/z 272 (MH+)。
【０２７３】
式（Ｊ）の化合物：  １−（４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（（（Ｓ）−３−メチルテトラヒドロフラン−３−イル）スルホニル）フェニル）−３−（（Ｒ）−２−メチルシクロペント−２−エン−１−イル）尿素
【化３５】
2017527542.tif 000052
【０２７４】
および式（Ｃ）の化合物：  １−（４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（（（Ｒ）−３−メチルテトラヒドロフラン−３−イル）スルホニル）フェニル）−３−（（Ｒ）−２−メチルシクロペント−２−エン−１−イル）尿素
【化３６】
2017527542.tif 000053
【０２７５】
ピリジン（２０ｍＬ）中、６−アミノ−３−クロロ−２−（（３−メチルテトラヒドロフラン−３−イル）スルホニル）フェノール（中間体ＪＣ１、３０００ｍｇ）の溶液に、（Ｒ）−５−イソシアナト−１−メチルシクロペント−１−エン（中間体Ｆ２、２２７９ｍｇ）を加えた。得られた混合物を４０℃で１２時間撹拌した。冷水（３０ｍＬ）を加え、水層をＤＣＭ（２×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮し、１−（４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（（３−メチルテトラヒドロフラン−３−イル）スルホニル）フェニル）−３−（（Ｒ）−２−メチルシクロペント−２−エン−１−イル）尿素（４．１ｇ）を暗色固体として得た。この化合物の一部（３．０ｇ）を酸性条件下、ＳＦＣおよびＭＤＡＰにより精製し、純粋な２つの鏡像異性体：１−（４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（（（Ｓ）−３−メチルテトラヒドロフラン−３−イル）スルホニル）フェニル）−３−（（Ｒ）−２−メチルシクロペント−２−エン−１−イル）尿素（式（Ｊ）の化合物、６６６ｍｇ）および１−（４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（（（Ｒ）−３−メチルテトラヒドロフラン−３−イル）スルホニル）フェニル）−３−（（Ｒ）−２−メチルシクロペント−２−エン−１−イル）尿素（式（Ｃ）の化合物、６２６ｍｇ）を得た。
【０２７６】
式（Ｊ）の化合物：ＨＰＬＣ（Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＩＣカラム（４．６＊２５０ｍｍ、５ｕＭ）、１：１  ＡＣＮ／ＩＰＡ（０．５％ＤＥＡ含有）、ＣＯ２流速：２．５５ｍＬ／分；補助溶媒流速：０．４５ｍＬ／分；背圧：１２０バール）；ｔｒ＝１６．９分；＞９３％ｅｅ；1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 10.53 (s, 1H), 8.36 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 8.17 (s, 1H), 7.14 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.05 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 5.51 (s, 1H), 4.49-4.63 (m, 1H), 4.33 (d, J = 10.3 Hz, 1H), 3.76-3.89 (m, 2H), 3.61 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 2.68 (dt, J = 13.3, 7.9 Hz, 1H), 2.10-2.35 (m, 3H), 1.91-2.02 (m, 1H), 1.67 (s, 3H), 1.44-1.58 (m, 4H); MS(ES+) m/z 415 (MH+);
式（Ｃ）の化合物：ＨＰＬＣ（Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＩＣカラム（４．６＊２５０ｍｍ、５ｕＭ）、１：１  ＡＣＮ／ＩＰＡ（０．５％ＤＥＡ含有）、ＣＯ２流速：２．５５ｍＬ／分；補助溶媒流速：０．４５ｍＬ／分；背圧：１２０バール）；ｔｒ＝１４．３分；＞９９％ｅｅ； 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 10.52 (s, 1H), 8.36 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 8.17 (s, 1H), 7.14 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.05 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 5.51 (s, 1H), 4.49-4.61 (m, 1H), 4.33 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 3.75-3.91 (m, 2H), 3.61 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 2.68 (dt, J = 13.3, 7.9 Hz, 1H), 2.09-2.37 (m, 3H), 1.90-2.02 (m, 1H), 1.67 (s, 3H), 1.42-1.59 (m, 4H); MS(ES+) m/z 415 (MH+); 
【０２７７】
中間体ＪＣ１：  ６−アミノ−３−クロロ−２−（（３−メチルテトラヒドロフラン−３−イル）スルホニル）フェノール
【化３７】
2017527542.tif 000054
【０２７８】
工程１：  氷水で冷却した、ＤＣＭ（１００ｍＬ）中、テトラヒドロフラン−３−オール（５．０ｇ）の溶液に、ＴＥＡ（１１．９ｍＬ）およびＭｓＣｌ（４．９ｍＬ）を加えた。得られた反応混合物を０℃で３時間撹拌した後、ＮａＨＣＯ３水溶液で急冷した。この混合物をＥＡ（２×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相を洗浄し、乾燥させ、濾過し、濃縮し、メタンスルホン酸テトラヒドロフラン−３−イル（６．２ｇ）を得た。
【０２７９】
工程２：  ＤＭＦ（１００ｍＬ）中、２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロベンゾ［ｄ］オキサゾール−７−チオール酸ナトリウム（１１．８ｇ）の溶液に、メタンスルホン酸テトラヒドロフラン−３−イル（６．２ｇ）およびＫ２ＣＯ３（７．７ｇ）を加えた。得られた反応混合物を８０℃で一晩撹拌した。冷却後、それを水（５００ｍＬ）に注ぎ、ＥＡ（２×１５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相を洗浄し、乾燥させ、濃縮し、２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロ−７−（（テトラヒドロフラン−３−イル）チオ）ベンゾ［ｄ］オキサゾール（１１．４ｇ）を得た。
【０２８０】
工程３：  氷水で冷却した、ＤＣＭ（２００ｍＬ）中、２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロ−７−（（テトラヒドロフラン−３−イル）チオ）ベンゾ［ｄ］オキサゾール（７．４ｇ）の溶液に、ｍＣＰＢＡ（１１．７ｇ）を加えた。得られた混合物を室温で２日にわたって撹拌した後、ＮａＨＣＯ３水溶液およびＮａ２Ｓ２Ｏ３水溶液で急冷した。この混合物をＥＡ（２×２００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相を洗浄し、乾燥させ、濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（ＰＥ中０−４０％ＥＡで溶出）により精製し、２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロ−７−（（テトラヒドロフラン−３−イル）スルホニル）ベンゾ［ｄ］オキサゾール（４．３ｇ）を得た。MS(ES+) m/z 344 (MH+)。
【０２８１】
工程４：  ドライアイス−エタノールで冷却した、ＴＨＦ（１００ｍＬ）中、２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロ−７−（（テトラヒドロフラン−３−イル）スルホニル）ベンゾ［ｄ］オキサゾール（４．３ｇ）およびＭｅＩ（２．０ｍＬ）の溶液に、ＬｉＨＭＤＳ（ＴＨＦ中１Ｍ、３１．３ｍＬ）を加えた。得られた混合物をゆっくり温め、室温で３０分間撹拌した。ＮＨ４Ｃｌ水溶液を加えた。この混合物をＥＡ（２×１５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相を洗浄し、乾燥させ、濃縮し、２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロ−７−（（３−メチルテトラヒドロフラン−３−イル）スルホニル）ベンゾ［ｄ］オキサゾール（４．４ｇ）を得た。MS(ES+) m/z 358 (MH+)。
【０２８２】
工程５：  １，４−ジオキサン（１５０ｍＬ）中、２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−６−クロロ−７−（（３−メチルテトラヒドロフラン−３−イル）スルホニル）ベンゾ［ｄ］オキサゾール（４．４ｇ）の溶液に、ＨＣｌ水溶液（３７％、３０．３ｍＬ）を加えた。この混合物を１２０℃で一晩還流させた後、濃縮した。残渣を水（１００ｍＬ）に溶かした。溶液のｐＨをＮａＨＣＯ３水溶液で８に調整し、ＥＡで抽出した。有機相を洗浄し、濃縮した。得られた残渣をカラムクロマトグラフィー（ＰＥ中０−８０％ＥＡの勾配で溶出）により精製し、標題化合物（２．４ｇ）を得た。MS(ES+) m/z 292 (MH+)。
【０２８３】
式（Ｋ）の化合物：  １−（４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（（（Ｓ）−３−メチルテトラヒドロフラン−３−イル）スルホニル）フェニル）−３−（（Ｒ）−２−クロロシクロペント−２−エン−１−イル）尿素および式（Ｌ）の化合物：  １−（４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（（（Ｒ）−３−メチルテトラヒドロフラン−３−イル）スルホニル）フェニル）−３−（（Ｒ）−２−クロロシクロペント−２−エン−１−イル）尿素
【化３８】
2017527542.tif 000055
【０２８４】
ピリジン（２０ｍＬ）中、６−アミノ−３−クロロ−２−（（３−メチルテトラヒドロフラン−３−イル）スルホニル）フェノール（中間体ＪＣ１、６００ｍｇ）の溶液に、新鮮な、トルエン（２０ｍＬ）中、（Ｒ）−１−クロロ−５−イソシアナトシクロペント−１−エン（中間体Ｅ２、４４３ｍｇ）を加えた。この混合物を室温で一晩撹拌した。得られた溶液を水（５ｍＬ）で急冷し、濃縮した。残渣をＭＤＡＰ（酸性条件）で精製し、１−（４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（（３−メチルテトラヒドロフラン−３−イル）スルホニル）フェニル）−３−（（Ｒ）−２−クロロシクロペント−２−エン−１−イル）尿素（２０５ｍｇ）を得た。この化合物の一部（１６０ｍｇ）をキラル分離（ＡＤ−Ｈ（４．６＊２５０ｍｍ、５ｕｍ）、補助溶媒ＭｅＯＨ、１％ＤＥＡ）、次いで、ＭＤＡＰ（酸性条件）により精製し、１−（４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（（（Ｓ）−３−メチルテトラヒドロフラン−３−イル）スルホニル）フェニル）−３−（（Ｒ）−２−クロロシクロペント−２−エン−１−イル）尿素および１−（４−クロロ−２−ヒドロキシ−３−（（（Ｒ）−３−メチルテトラヒドロフラン−３−イル）スルホニル）フェニル）−３−（（Ｒ）−２−クロロシクロペント−２−エン−１−イル）尿素（式（Ｋ）の化合物および式（Ｌ）の化合物、それぞれ３７ｍｇおよび３１ｍｇ）を紫色の固体として得た。
異性体１：  ＨＰＬＣ（ＡＤ−Ｈカラム（４．６＊２５０ｍｍ、５ｕＭ）、ＩＰＡ（０．１％ＤＥＡを含有）、ＣＯ２流速：２．２５ｍＬ／分；補助溶媒流速：０．７５ｍＬ／分；背圧：１４９バール）；ｔｒ＝４．７分；＞９９％ｅｅ；1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 10.49 (s, 1H), 8.37 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 8.25 (s, 1H), 7.38 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.16 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 5.99 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 4.73 (s, 1H), 4.34 (d, J = 10.1 Hz, 1H), 3.72-3.97 (m, 2H), 3.61 (d, J = 10.1 Hz, 1H), 2.67 (m, 1H), 2.18-2.47 (m, 3H), 1.84-2.04 (m, 1H), 1.57-1.78 (m, 1H), 1.49 (s, 3H); MS(ES+) m/z 435 (MH+)。
異性体２：  ＨＰＬＣ（ＡＤ−Ｈカラム（４．６＊２５０ｍｍ、５ｕＭ）、ＩＰＡ（０．１％ＤＥＡを含有）、ＣＯ２流速：２．２５ｍＬ／分；補助溶媒流速：０．７５ｍＬ／分；背圧：１４９バール）；ｔｒ＝５．５分；＞９３％ｅｅ；1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 10.49 (s, 1H), 8.37 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 8.24 (s, 1H), 7.37 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.16 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 5.99 (s, 1H), 4.73 (s, 1H), 4.34 (d, J = 10.1 Hz, 1H), 3.71-3.96 (m, 2H), 3.61 (d, J = 10.1 Hz, 1H), 2.62-2.78 (m, 1H), 2.19-2.44 (m, 3H), 1.84-2.06 (m, 1H), 1.56-1.78 (m, 1H), 1.49 (s, 3H); MS(ES+) m/z 435 (MH+)。
【図１】
2017527542.tif 000071
【図２】
2017527542.tif 000072
【図３】
2017527542.tif 000073
【図４】
2017527542.tif 000074
【図５】
2017527542.tif 000075
【図６】
2017527542.tif 000076
【図７】
2017527542.tif 000077
【図８】
2017527542.tif 000078
【図９】
2017527542.tif 000079
【図１０】
2017527542.tif 000080
【図１１】
2017527542.tif 000081
【図１２】
2017527542.tif 000082
【図１３】
2017527542.tif 000083
【国際調査報告】
2017527542.tif 000084
2017527542.tif 000085
2017527542.tif 000086
2017527542.tif 000087