(57)【要約】  血液または血漿の流れと接触させることができる固体担体を含むアフェレシス装置であって、該固体担体が、血漿または血液またはＣＳＦなどのＨＴＴを含む他の体液から特定の様式でＨＴＴもしくはそのフラグメントを吸着することができる、１つまたは複数のＨＴＴ結合分子を含むことを特徴とする、アフェレシス装置を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アフェレシスにおいて、ヒト体液、とりわけヒト血漿または血清から過剰量のＨＴＴまたは変異ＨＴＴまたはそれらのフラグメントを除去するために用いられる、ハンチントン病の予防および／または処置における使用のための、ＨＴＴ結合分子、とりわけ抗体。
【請求項２】
該抗体が、モノクローナル抗体またはそのＨＴＴ結合フラグメント、とりわけＦａｂ、Ｆｄ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、またはＳｃＦｖフラグメントである、請求項１に記載の使用のためのＨＴＴ結合分子、とりわけ抗体。
【請求項３】
該抗体がポリクローナル抗体である、請求項１または２に記載の使用のための、ＨＴＴ結合分子、とりわけ抗体。
【請求項４】
該抗体が、ヒト個体の血液と接触させるのに適する固体担体に結合されている、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用のための、ＨＴＴ結合分子、とりわけ抗体。
【請求項５】
該抗体が、ＰＲＲおよび／またはＣ６に特異的である、請求項１から４のいずれか一項に記載の使用のための、ＨＴＴ結合分子、とりわけ抗体。
【請求項６】
該抗体が、モノクローナル抗体である、好ましくはヒト抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体またはキメラモノクローナル抗体である、請求項１から５のいずれか一項に記載の使用のための、ＨＴＴ結合分子、とりわけ抗体。
【請求項７】
該抗体が、モノクローナル抗体であって、それが、ＧＹＳＦＴＤＦＹ（配列番号５４）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＩＤＰＫＮＧＤＴ（配列番号５５）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、ＡＴＹＹＧＹＴＭＤＹ（配列番号５６）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、ＳＳＶＴＳＳＹ（配列番号５７）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＳＴＳ（配列番号５８）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、およびＨＱＹＲＲＰＰＲＴ（配列番号５９）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含み、該抗体は、好ましくはモノクローナル抗体ＰＲＲ１３である、請求項１から６のいずれか一項に記載の使用のための、ＨＴＴ結合分子、とりわけ抗体。
【請求項８】
該抗体が、モノクローナル抗体であって、それが、ＧＹＴＦＴＥＹＴ（配列番号６６）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＩＮＰＮＮＧＧＴ（配列番号６７）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、ＡＳＬＤＧＲＤＹ（配列番号６８）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、ＱＳＬＬＮＳＲＴＲＫＮＹ（配列番号６９）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＷＡＳ（配列番号７０）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、およびＫＱＳＹＮＬＬＴ（配列番号７１）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含み、該抗体が、好ましくはモノクローナル抗体Ｃ６−１７である、請求項１から６のいずれか一項に記載の使用のための、ＨＴＴ結合分子、とりわけ抗体。
【請求項９】
該抗体が、モノクローナル抗体であって、それが、ＧＦＴＦＮＴＹＡ（配列番号７２）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＩＲＳＫＳＮＮＹＡＴ（配列番号７３）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、ＶＲＨＧＥＹＧＮＰＷＦＡＹ（配列番号７４）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、ＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹ（配列番号７５）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＫＶＳ（配列番号７６）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、およびＳＱＳＴＨＶＰＹＴ（配列番号７７）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含み、該抗体が、好ましくはモノクローナル抗体Ｍ１Ｄ１である、請求項１から６のいずれか一項に記載の使用のための、ＨＴＴ結合分子、とりわけ抗体。
【請求項１０】
血液または血漿の流れと接触させることができる固体担体を含むアフェレシス装置であって、該固体担体がＨＴＴ結合分子を含むことを特徴とする、アフェレシス装置。
【請求項１１】
ＨＴＴ結合分子が、抗ＨＴＴ抗体または抗ＨＴＴ結合分子、とりわけ請求項１から９のいずれか一項に記載の抗体から選択されることを特徴とする、請求項１０に記載の装置。
【請求項１２】
担体が、無菌かつパイロジェンフリーカラムであることを特徴とする、請求項１０または１１に記載の装置。
【請求項１３】
少なくとも２つの異なるＨＴＴ結合分子を含むことを特徴とする、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１４】
ハンチントン病の予防および／または処置のための予防装置および／または処置装置を提供するための、請求項１０から１３のいずれか一項に記載の装置の使用。
【請求項１５】
請求項１から９のいずれか一項に記載のハンチンチン結合分子を含む固体アフェレシス担体を含むハンチントン病の予防および／または処置に使用するためのキットであって、該担体が、無菌かつパイロジェンフリーカラムである、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハンチントン病の処置および予防における使用のための薬剤および方法を提供することに関する。
【背景技術】
【０００２】
ハンチントン病は、常染色体優性遺伝形式の稀な単一遺伝子疾患である。それは、ヒト第４染色体上のハンチンチン（ＨＴＴ）遺伝子のコーディング領域内のＣＡＧトリヌクレオチド反復配列の伸長により発症する（Novak ＆ Tabrizi, 2011）。原因となる伸長したＣＡＧ反復配列は、複製過程における遺伝子の不安定性およびＲＮＡスプライシングの変化と関係している。しかしながら、最も重要なのは、コードされたタンパク質が、タンパク質のＮ末端部分の伸長されたポリグルタミン（ｐｏｌｙＱ）配列により構造が変化し、構造的に変化した、かつ変異したハンチンチンタンパク質およびそのタンパク質フラグメントが、時間の経過と共に、脳および他の組織または細胞内に蓄積することである。この過程は、例えばアルツハイマー疾患またはパーキンソン病または多系統萎縮症のような他の神経変性タンパク質症（proteinopathy）と似ており、ここで、共通因子（common denominator）は、タンパク質分解産物を組み合わせた凝集体形成およびタンパク質線維形成である。ハンチントン病において、病理学的特徴は、主に、線条体および大脳皮質における凝集および分解ハンチンチンタンパク質の蓄積を含む、進行性神経変性である。
【０００３】
ハンチントン病の臨床症状は、気分の変化や認知の問題から始まり、続いて不安定な歩行や運動障害へ予測可能に少しずつ進行する。身体能力は、時間とともに、精神的能力の減退と精神および行動上の問題と合わせて、明白な協調運動障害へと悪化する。平均余命は、最初の臨床症状後、約２０年である。症状は、大きく変化し得て、発症年齢は、変異ハンチンチンの原因としての働きを裏付ける変異型ハンチンチン遺伝子中のＣＡＧ反復配列の数と逆相関することが報告されている。
【０００４】
ハンチントン病の処置または予防法はない。症状を制御するために、患者のフルタイムのケアが、疾患の後期ステージで必要とされており、患者と患者の社会環境に対する負担はかなりのものである。薬学的および非薬物治療などの対症療法は、症状のいくつかを緩和することができる。
【０００５】
ハンチントン病の病因および遺伝的原因についての現在の理解では、変異型ハンチンチンは、疾患の改善された標的化戦略のための主な標的と見なされているが、従来法ではそうは見なされていなかった（Yu et al., 2014）。動物モデルからの臨床遺伝学的証拠および機能的証拠に基づいて（Bard et al., 2014）、ハンチンチンを減少させる戦略は、そのような概念に関連する分子暴露にもかかわらず、最も重要な方法と見なされている（Zheng ＆ Diamond, 2012）。現在の戦略は、一般的に、脳内における影響を受けた神経内の標的部位への治療薬の送達方法の欠如によって妨げられている。このことは、現在開発中のＤＮＡまたはｍＲＮＡを標的とするアプローチにとって重要である（Davidson, 2012）。別のアプローチは、脳内において細胞内ハンチンチンを標的とするウイルスベクターが提供する細胞内発現抗体(イントラボディ)を用いることからなる（Butler et al., 2012）。前臨床モデルで証明されたその機能性にもかかわらず、これらのアプローチは、標的部位への主に送達の課題に直面している。加えて、例えばｓｃＦｖベースのイントラボディなどの“外来”構造物（Messer ＆ Joshi, 2013）は、宿主に新しいエピトープを構成する可能性があり、それ故に、治療薬に対する望ましくない体液性免疫応答または“外来”タンパク質を発現および提示する細胞に対するＴ細胞応答を誘導するリスクがある。
【０００６】
ＷＯ２０１２／１４０３７６Ａ１は、治療用ペプチドｐｅｐ４およびｐｅｐ４２を開示しているが、両ペプチドは、ＨＴＴのｃ６切断部位まで伸長されていない。ＷＯ２０１０／０１５５９２Ａ２は、変異させたポリＱタンパク質のアッセイを開示している。Koら(Brain Res. Bull. 56 (2001): 319−329）は、ＨＴＴモノクローナル抗体であって、主に、ＨＴＴのポリＱドメインに結合する抗体を開示している。Persichettiら(Mol. Med. 1 (1995): 374−383）は、抗体誘導ペプチドＨＰ１およびＨＰ１２を開示している。
【０００７】
ＵＳ２００７／００２６０２９Ａ１は、アルツハイマー病を処置および予防するためのアフェレシス装置を開示している。Weissら（Anal. Biochem. 395(2009): 8−15）は、動物およびヒト組織における変異ＨＴＴの検出法を開示している。Butlerら(Prog. Neurobiol. 97(2011): 190−204）は、ＨＤ患者のための抗体療法を開示している。ＵＳ２０１０／０２３３１８０Ａ１は、ＨＴＴのポリＰ領域に結合する抗体を開示している。Chenら(Chem. Biol. 18(2011): 1113−1125）は、ＨＤ治療のための、伸長ポリＱペプチドを示唆している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ２０１２／１４０３７６Ａ１
【特許文献２】米国特許出願第２００７／００２６０２９号
【特許文献３】米国特許出願第２０１０／０２３３１８０号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Bard et al., 2014, Journal of Biomolecular Screening, Volume 19(2), 191−204
【非特許文献２】Butler et al., 2012, Progress in Neurobiology, Volume 97(2): 190−204
【非特許文献３】Davidson, 2012, Molecular Therapy, Volume 20(10): 1838
【非特許文献４】Ellrichmann et al., 2013, Clin Dev Immunol., 2013; 2013: 541259
【非特許文献５】Graham et al., 2010, J Neurosci., Volume 30(45):15019−29
【非特許文献６】Ko et al., 2001, Brain Research Bulletin, Volume 56(3/4): 319−329
【非特許文献７】Liu, 2007, Journal of the American Society for Mass Spectrometry. Volume 18(7):1249−64
【非特許文献８】Mandler et al.; Acta Neuropathologica 127 (2014): 861−879
【非特許文献９】Messer ＆ Joshi, 2013, Neurotherapeutics, Volume 10: 447−458
【非特許文献１０】Modregger et al., 2002, Human Molecular Genetics, Volume 11(21):2547−58
【非特許文献１１】Novak ＆ Tabrizi, 2011, International Review of Neurobiology, Volume 98: 297−323
【非特許文献１２】O'Hagan ＆ Valiante, 2003, Nature Reviews Drug Discovery, Volume 2(9): 727−35
【非特許文献１３】Singh ＆ O'Hagan, 1999, Nature Biotechnology, Volume 17(11): 1075−81
【非特許文献１４】Southwell et al., 2011, PloS ONE, Volume 6(1): e16676
【非特許文献１５】Stadler et al.; Angewandte Chemie International Edition England 2008; Vol 47(37):7132−5
【非特許文献１６】Tezel et al., 2012, Investigative Ophthalmology ＆ Visual Science Volume 53(13): 8222−31
【非特許文献１７】Trauger et al., 2014, Brain, Volume 137(3):819−33
【非特許文献１８】Warby et al., 2008, Human Molecular Genetics, Volume 17(15): 2390−2404
【非特許文献１９】Weiss et al., Analytical Biochemistry 2009; Vol 395(1):8−15
【非特許文献２０】Weiss et al., 2012, The Journal of Clinical Investigation, Volume 122(10): 3731−3736
【非特許文献２１】Weiss et al. 2014, 9th Annual Huntington's Disease Therapeutics Conference (CHDI); Palm Springs USA, Abstract.
【非特許文献２２】Wong et al. 2014; 9th Annual Huntington's Disease Therapeutics Conference (CHDI); Palm Springs USA, Abstract.
【非特許文献２３】Yu et al., 2014, Trends in Pharmacological Sciences, Volume 35(2): 53−62
【非特許文献２４】Zhang et al.; Current Protocols in Immunology 2008; Chapter: Unit-14.1
【非特許文献２５】Zheng ＆ Diamond, 2012, Progress in Molecular Biology and Translational Science, Volume 107: 189−214
【発明の概要】
【００１０】
ハンチントン病の別の治療法を提供するために、ハンチンチンを標的とすることができる抗体を含むアフェレシス装置を本発明により提供する。ハンチントン病においては、症状が、この疾患の全身的性質を示す、免疫系、末梢組織、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）および代謝系を含む全身的変化を伴うという意識が高まっている。一例として、病理学的なハンチンチン蓄積はＣＮＳに限定されるものではなく、末梢血細胞でも検出され得る（Weissら、2012）。初代ヒトマクロファージ／単球におけるハンチンチンの発現の低下により、自然免疫系の障害は、ハンチンチンを標的とするＲＮＡ干渉により部分的に逆転できる（Traugerら、2014）。
【００１１】
血液細胞内のハンチンチンの検出の他に、可溶性ハンチンチンまたはハンチンチンフラグメントが、偶然、健常ドナーのヒト血漿プロテオームで検出され（Liu et al 2007）、またはこれまでハンチントン病に関連ないとされていた緑内障患者の血漿中でＥＬＩＳＡにより検出された（Tezel et al 2012）。ハンチントン病における免疫系の重要な役割は認識されていたが（Ellrichmann et al., 2013）、細胞外ハンチンチンの可能性のある原因となる働きはほとんど無視されてきた。近年、血漿およびＣＳＦハンチンチンは、単に、疾患の進行をモニタリングするための潜在的バイオマーカーとして示唆された（Weiss et al., 2014）。可能性のある病因の標的化において、疾患を進行させる細胞外ハンチンチンタンパク質は、これまで治療標的とは考えられておらず、例えばハンチンチン抗体を用いてアフェレシスを行うことが治療的利益をもたらし得るかどうかは示されていなかった。
【００１２】
本発明は、ハンチントン病の新たな治療戦略、とりわけ症状の単なる制御を超える戦略を提供することを目的とする。ハンチントン病に関連する症状の発症を予防または遅延させるための手段を提供することもまた、別の目的である。
【００１３】
従って、本発明は、ハンチントン病の処置のためまたはその臨床症状の発症を遅延させるためのＨＴＴ捕捉用アフェレシス装置を提供する。本発明のハンチンチン−アフェレシスは、ハンチントン病の処置において全く新しいアプローチであり、本発明によって顕著に高い効果が得られることが示される。本発明のアフェレシス装置は、ＨＴＴ結合分子（すなわち、ハンチントン病患者の血漿（全血、血清または他の血液成分；以下、“血漿”についての全ての言及は、通常、任意の他の体液、とりわけ血清などの血液由来のものにも適用可能である）または他の体液（ＣＳＦなどのＨＴＴまたはＨＴＴフラグメントを含む可能性のある）中に含まれるＨＴＴおよび／またはＨＴＴフラグメントに特異的に結合する分子（“受容体”））を用いる。従って、本発明の“ＨＴＴ捕捉”または“ＨＴＴ結合”には、ＨＴＴに由来する（および生理的および／または病理学的に関連する）ＨＴＴフラグメントの捕捉も含まれ、それは、体外循環された血液または血漿からアフェレシス装置へ捕捉または結合され得る。好ましいＨＴＴフラグメントは、本明細書に記載のプロテアーゼ切断部位またはＨＴＴの同等の酵素基質部位などの血漿ＨＴＴの構造的に露出した／アクセス可能なドメインに由来するＨＴＴフラグメントペプチドである。すべてのかかるＨＴＴフラグメントは、本発明のＨＴＴ−アフェレシス吸着剤（“ＨＴＴ結合分子”；“ＨＴＴ結合受容体”）を作製するための、ｍＡｂ作製にも適している。
【００１４】
本発明の“ＨＴＴ捕捉”または“ＨＴＴ結合”は、他の分子に関連する形でのＨＴＴ（またはそのフラグメント）の結合をさらに含む。
【００１５】
本発明の“ＨＴＴ結合分子”は、ＨＴＴ（またはその天然に存在し、かつ病理学的に関連するフラグメント）に特異的に結合する任意の分子であり得る。ＨＴＴ結合分子の特に好ましいグループは、抗ＨＴＴ抗体、好ましくはモノクローナルまたはポリクローナル抗ＨＴＴ抗体に基づく結合分子であり、それは、固体表面上に容易に固定化され得る。かかる抗体のＨＴＴ結合フラグメントまたは誘導体、例えばＦａｂ、Ｆｄ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖまたはＳｃＦｖフラグメントがとりわけ好ましい。ＨＴＴ結合分子は、例えば、作製効率、折り畳み効率、安定性、プロテアーゼ抵抗性、ｐＨ抵抗性、親和性または固定化能に基づく、収益性（providablility）に対するその効果によって選択することができる。
【００１６】
ＨＴＴ（およびそのフラグメント）に対する高い親和性および特異性を有する、好ましい本発明のＨＴＴ結合分子（“アフェレシス吸着剤”とも言う）は、血流へのタンパク質分解フラグメントの流出を阻止するために、安定であり、かつプロテアーゼ抵抗性である（流出が特定のアフェレシスの構成に関係する場合、流出したヒト／ヒト化抗体フラグメントがマウスフラグメントよりも低免疫原性であるため、ヒト抗体またはヒト化抗体（またはその誘導体）が好ましい；しかしながら、通常、一般的に、血漿と接触するとタンパク質分解を起こしやすい“安定でない”吸着剤分子は除かれるため、これは大きな問題とはならない）。多量のＨＴＴ結合分子が必要とされるため、そのようなＨＴＴ結合分子の組み換えタンパク質産生は（血清などからの精製よりもむしろ）最初の選択である。これは、費用対効果が高く、タンパク質が小さく、かつ哺乳動物細胞、酵母、細菌または植物タンパク質生産系において正しい折り畳みおよび適時に高収率の産生に関してロバスト性であることを意味する。
【００１７】
アフェレシス装置の適切な使用もまた、ｐＨショックにより実施され得るリサイクル（脱着）を必要とされ得るため、好適な吸着剤は、ｐＨ抵抗性でなければならず、すなわち、ＨＴＴ結合分子は、その親和性および特異性を妨げないように、正しくリフォールディングされなければならない。
【００１８】
好ましいＨＴＴ結合分子は、マトリックス支持体上に、好ましくは共有結合により、組換えｍＡＢなどの任意の組換えタンパク質または優先的にはＦａｂまたはｓｃＦｖなどの小分子に適用可能な指向性／有向性固定化（とりわけ、分子上の１つの定義された反応基により（システイン、一級アミン、人為的に導入されたアルデヒドなど−例えばvan Vught R et al. Comput Struct Biotechnol J. 2014; PMID: 24757499による総説を参照のこと））により、効率よく固定化されるべきである。
【００１９】
（体外の）血液または血漿の流れ（要すれば、ハンチントン病患者の血液から取り出されたＨＴＴを含む）を、この固体表面上に適用して、本発明のアフェレシス装置の固体表面上のＨＴＴ結合分子にＨＴＴを結合させることによって、ＨＴＴを特異的に除去する。特に、ポリプロリンに富む領域、または例えばハンチンチンタンパク質のアミノ酸の位置５８６の既報のプロテアーゼ切断部位の周囲の領域などの他の構造的に露出される部位などの、ＨＴＴの免疫原性エピトープを特に標的とする特定の抗体は、本発明のアフェレシス装置に使用することができる。以下では、この病因学的／機能的に重要な切断領域は、“カスパーゼ領域５８６”と言う。Graham et al., 2006は、変異型ヒトハンチンチン導入遺伝子を保有するマウスにおける表現型を阻害する遺伝子的手段によってカスパーゼ６の切断を阻止することを明らかにした。Wongら(Wong 2014)は、他のプロテアーゼもこの領域に到達可能であるという証拠を提供した。
【００２０】
本発明で初めて、ハンチントン病を治療するためにアフェレシスにより血漿ハンチンチンを標的とすることが提案された。これまで、（細胞外）血漿ＨＴＴは、この疾患を処置するための標的として考慮されていなかった。さらに、作用機序モードは、インビトロでの食作用アッセイによって、ならびにアフェレシスで処置した動物におけるＨＴＴレベルのインビボでの低下および血漿ＨＴＴ標的化がヒト患者にも有益であることを示す説得力のあるＰ．Ｏ．Ｃ．（概念実証）を提供する動物モデルにおける表現型効果によって、本発明により当然に（ただし、本発明をそのような機序に限定されることなく）提供される。
【００２１】
さらに、本発明のアフェレシス装置で使用される抗体を提供するＨＴＴ由来ペプチドは、本発明で提供される。本発明において、このような抗体を提供するための最も関連のあるペプチドのコアエピトープが定義されている。ＨＴＴのカスパーゼ領域由来のペプチドは、ＨＴＴに特異的に結合する抗体（ＡＢ抗体）を提供し、誘導するのに使用するために提供される。これらのペプチドは、バイオマーカーの評価／検出におけるＨＴＴレベルの決定のためのツールおよび（コンパニオン）診断のツールなどとして、治療的アフェレシス（単独で、またはワクチンと組み合わせて）によりの診断および治療に有用である種々のモノクローナル抗体（ｍＡＢ）を製造するために使用されている。
【００２２】
本明細書で用いる“ハンチンチン”、“ハンチンチンタンパク質”または“ＨＴＴ”は、ハンチンチン遺伝子の発現産物を意味する。タンパク質の詳細は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  データベース（２０１４年５月１４日に最終更新された、バージョン１４８）中のＰ４２８５８（HD＿HUMAN）で利用可能である（本明細書中に援用する）。ＨＴＴのアミノ酸位置１８で始まるポリＱ領域における変化のために、カスパーゼ切断部位は、ＵｎｉＰｒｏｔデータベースエントリーにてアミノ酸５８４と５８５の間であると言われる。科学文献および本明細書では、カスパーゼ切断部位は、アミノ酸残基５８６と５８７の間（すなわち、“ＶＬＤ”の後、“ＧＴＤ”の前、すなわち、ＤとＧの間）であると言われる。従って、本発明の“Ｃ６切断領域”または“Ｃ６切断領域５８６”は、Ｐ４２８５８（ＨＤ＿ヒト）ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースエントリ中の位置５８４のアミノ酸に相当する。
【００２３】
例えば、本発明のアフェレシス装置に用いる抗体は、ＰＲＲドメイン（プロリンに富む領域：Ｐｒｏｌｉｎｅ−Ｒｉｃｈ  Ｒｅｇｉｏｎ）と呼ばれる、ハンチンチンの、第二の機能的に定義された領域を標的とし得る。この領域は、これまで、例えばＰＡＣＳＩＮ１（Modregger et al., 2002）などとの細胞内タンパク質相互作用に関与することが示され、一本鎖Ｆｖフラグメント（Southwell et al., 2011）を用いて潜在的イントラボディ標的化領域として評価されている。
【００２４】
本発明の一態様において、本発明で提供する抗体は、血漿中のハンチンチンの病因的役割がこれまで認識されていなかったので、例えば、実施例６に示すように、これまでに提案されていない戦略の、ハンチンチンの血漿レベルを低下させるための血漿アフェレシスに使用することができる。
【００２５】
本発明は、ＰＲＲおよびｃ６領域に由来するペプチドを開示している。本発明のペプチドは、以下のいくつかの共通の特徴を反映する顕著に有益な技術的関係を有する：（１）本発明の全てのＰＲＲ−およびＣ６−由来のペプチドは、特定の免疫原性を共有する；それらのエピトープは、特に、アクセス可能である（例えば、実施例１に示す通り、Ｎ末端またはポリＱ領域に由来するペプチドとは対照的に）；特に、それらのエピトープの標的化は、以下の実施例部分に記載のインビボ例での機能に示されるように、治療効果を達成するのに関連性が高い。（２）本発明のペプチドは、プロテアーゼのアクセシビリティまたはタンパク質−タンパク質相互作用などの構造的／機能的な関係性が実証されている、ＨＴＴの複数領域にマッピングされる。（３）最も重要なことは、これらの２つのエピトープのコンビナトリアル標的化は、（単一のエピトープの使用とは対照的に）効率的な治療効果を提供する。
【００２６】
これに関連して、全てのＨＴＴ由来のペプチドがＨＴＴの処置に使用できるのではないことが特記される。これは、以下の実施例部分にも示されている。実際に、あるペプチドは、他のものよりも免疫原性である。さらに、特定のペプチドの組合せ（例えば、血漿クリアランスおよび運動効果に関して、ＰＲＲ−およびＣ６−領域ペプチドの組み合わせ）は、より強い有効性を示す。本発明はまた、ＨＴＴの処置のためのペプチドの有利な組み合わせを提供する。既に記載の通り、本発明では、（治療の原則として）細胞外ＨＴＴを標的とする治療用ワクチンが提供される。ＨＴＴは常に細胞内で凝集するタンパク質として公知であるため、このことのみで、既に完全に新規な戦略である。
【００２７】
本発明のペプチドおよび本発明のワクチン標的化領域は、該領域／ペプチドの（１）アクセシビリティ、および（２）免疫原性により、定義されている。加えて、ペプチドの任意の組み合わせ（以下のインビボでの実施例に示す通り）は、増強したＨＴＴクリアランスおよび表現型の（運動および組織学的な）変化を提供する。これらの変化は、実施例にも示す通り、Ｆｃ受容体介在性クリアランス機序（食作用）により説明することができる。Ｆｃ受容体介在性の食作用は、２つまたは２以上の単一エピトープに対してＨＴＴを標的化する、より高い有効性を説明する抗原−抗体複合体の多価性を必要とする：複数のＦｃ部分を提示する抗原／抗体複合体は、１つの単一抗体によって結合された単一のＨＴＴ分子よりも食作用によって排除される可能性が高い。
【００２８】
このことは、先行技術には開示も示唆もされていなかった。例えば、ＷＯ２０１２／１４０３７６Ａ１に記載される治療用ペプチドｐｅｐ４およびｐｅｐ４２、またはMillerら (2003)に記載されるＨＴＴのＮ末端に由来するペプチドは、本発明のペプチドとは異なるＨＴＴ領域に由来する。さらにより重要なことには、例えばＷＯ２０１２／１４０３７６Ａ１に記載のこれらのペプチドは、例えばワクチンなどの何らかの治療目的のために（すなわち、生体内でのＢ細胞免疫応答を誘導するために）意図されたり、または使用されてはいない。その代わり、ＷＯ２０１２／１４０３７６Ａ１は、凝集の阻害（すなわち、ＨＴＴまたはそのフラグメントとの直接的な干渉による）に使用することができるペプチドを記載しており、それは、ワクチンに必要とされるような免疫応答の誘導には関与しない。ＷＯ２０１０／０１５５９２Ａ２に記載の抗体は、ＦＲＥＴアッセイまたは他のインビトロの分析手段による、ＨＴＴ（またはその凝集体もしくはフラグメント）の検出のためのプローブとして作製された。これらの抗体を提供する目的は、実験目的／分析目的または診断であって、治療目的ではなかった。一般に、これまで、抗ＨＴＴ抗体をハンチントン病の処置のための治療目的に使用できることは、提案されてもいないし、実証されてもいない。さらに、ＷＯ２０１０／０１５５９２Ａ２に記載の抗体は何れも、本発明のワクチン接種用ペプチドと重複していない。最後に、Persichettiら(1995)に記載のペプチド“ＨＰ１”および“ＨＰ１２”は、ワクチン療法に使用するためではなく、試験条件下でのＨＴＴ検出（例えば、ウェスタンブロットまたはＩＨＣによるＨＴＴ検出など）のための分析的プローブを提供するために、ポリクローナル抗血清の作製のために使用されていた。同じことが、例えば、Ko et al. (2001)に記載のような、ペプチド免疫化によってではなく、ポリＱ−ＨＴＴ−ＧＳＴ融合タンパク質によって製造されたモノクローナル抗体（例えば、ＭＷ１−８）について言える。
【００２９】
従って、本発明のペプチドは、治療用ワクチンの製造に適していることが特記されることが重要であり、一方、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を製造するための先行技術文献記載のペプチドは、分析的使用または診断的使用のためのプローブを提供するように設計されている。
【００３０】
従って、ＰＲＲおよびＣ６領域に由来する本発明のペプチドは、特に有益である。両グループ共、とりわけ配列番号１、４、１６、１９および２８；ならびに、配列番号２、３、６−１８および２０−５０は、高度に免疫原性である；そして、配列番号１−４は、インビボ実験でのそれらの機能的性能のために大いに好ましい。
【００３１】
本発明のアフェレシス装置において使用する抗体を提供するためのＨＴＴタンパク質の免疫原性ペプチドは、ｐ６７７３（ＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＱＰＱＰＣ、配列番号１）、ｐ７５６４（ＣＰＳＤＳＳＥＩＶＬＤ、配列番号２）、ｐ７５４３（ＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＣ、配列番号３）、ｐ７５４３ａ（ＤＮＱＹＬＧＬＱＩＣ；配列番号８８）、とりわけ誘導体ｐ９３９４（ＫＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＫＣ；配列番号９１）、ｐ９３９５（ＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＫＫＣ；配列番号９２）、ｐ９３９６（ＫＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＫＫＧＣ；配列番号９３）、ｐ９３９７（ＫＤＮＱＹＬＧＬＱＩＫＫＧＣ；配列番号９４）；ｐ７５４３ｂ（ＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＣ；配列番号８９）、ｐ７５４３ｃ（ＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＣ；配列番号９０）、ｐ６７７１（ＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＣ、配列番号４）、ｐ６７７６（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号３６）、ｐ６７７７（ＣＳＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮ、配列番号３７）、およびｐ８３４６（ＣＧＰＡＶＡＥＥＰＬＨＲＰ、配列番号５）を含む。これらの配列の“Ｃ”残基は、通常、リンカーとして使用される（および、導入されている）。Ｎ末端またはＣ末端におけるこのシステインリンカー（任意の他のリンカーとして、例えば−ＧＣ、−ＧＧＣ、−ＫＣ、−ＫＣＣ、−ＫＣＣ、−ＫＫＣ、−ＫＫＧ、−ＫＣＧ、−ＫＧＣ、−ＫＫＧＣ、−ＫＫＣＧなど（およびそれらのＮ末端変異体、例えばＣＧ−、ＣＧＧ−など）または例えばペプチドｐ６７７５、ｐ６７６８、ｐ９３９４、ｐ９３９５、ｐ９３９６またはｐ９３９７のそれぞれに使用されるようなスペーサーとしての、例えば、ベータ−アラニンまたはリシンなどのアミノ酸とシステインとの同様の組み合わせなど、あるいは免疫学的特性を妨げることなく、リンカーもしくはスペーサー機能または改善されたペプチド溶解度を提供する他の化学的部分として）は、存在するか、存在しないか、またはペプチドのＣ末端もしくはＮ末端のいずれか（すなわち、ペプチド鎖の何れかの末端）に提供されてよい。リンカーペプチドと溶解度向上剤とのかかる組み合わせは、例えばリシン誘導体ｐ９３９４−ｐ９３９７に提供されている。他の態様において、リンカーは、Ｎ末端またはＣ末端以外の他のアミノ酸位置、例えばセリン、リシン、アルギニン、チロシン、スレオニン、アスパラギンまたはグルタミン酸、アスパラギンまたはグルタミン、ヒスチジン、メチオニンなどの官能基を有するアミノ酸に提供されてもよい（とりわけ、誘導体ｐ９３９４（ＫＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＫＣ；配列番号９１）、ｐ９３９５（ＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＫＫＣ；配列番号９２）、ｐ９３９６（ＫＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＫＫＧＣ；配列番号９３）、ｐ９３９７（ＫＤＮＱＹＬＧＬＱＩＫＫＧＣ；配列番号９４））；しかしながら、かかる態様において、治療は、ペプチドの免疫学的特性がそのような結合によって顕著に妨害されないように注意しなければならない。
【００３２】
さらなる抗体を誘導する免疫原性ペプチドは、ｐ８８５５（ＳＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＤＣ、配列番号６）、ｐ８８５８（ＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬＣ、配列番号７）、ｐ８８５９（ＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬＧＣ、配列番号８）、ｐ８８６０（ＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬＧＬＣ、配列番号９）、ｐ８８６１（ＬＤＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＣ、配列番号１０）、ｐ８８６２（ＤＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＣ、配列番号１１）、ｐ８８６９（ＣＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱ、配列番号１２）、ｐ８８６８（ＣＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧ、配列番号１３）、ｐ８８７０（ＣＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰ、配列番号１４）、ｐ８８７１（ＣＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＱ、配列番号１５）、ｐ６７７２（ＣＰＱＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰ、配列番号１６）、ｐ８８６４（ＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＣ、配列番号１７）、ｐ８８６５（ＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＣ、配列番号１８）、ｐ６７７５（ＰＰＰＱＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＱＰＱＰａＣ、配列番号１９）、ｐ８８５４（ＰＳＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＣ、配列番号２０）、ｐ８８５６（ＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＣ、配列番号２１）、ｐ８８５７（ＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＣ、配列番号２２）、ｐ８８６６（ＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＱＣ、配列番号２３）およびｐ８８６７（ＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＱＤＣ、配列番号２４）からなる群より選択され、ここで、Ｎ末端またはＣ末端システイン残基（Ｃ）は、存在しても、存在しなくてもよく、またはＣ末端もしくはＮ末端の何れかに存在してよい。
【００３３】
他の好適な抗体を誘導する免疫原性ペプチドは、ｐ６７６３（ＣａＭＡＴＬＥＫＬＭＫＡＦＥＳＬＫＳＦＱ、配列番号２５）、ｐ６７６４（ＣａＫＬＭＫＡＦＥＳＬＫＳＦＱ、配列番号２６）、ｐ６７６５（ＣＥＥＱＱＲＱＱＱＱＱＱＱ、配列番号２７）、ｐ６７６８（ＱＱＱＱＱＱＰＰＰＰＰＰＰＰａＫＫＫＣ、配列番号２８）、ｐ７５４１（ＣＳＥＩＶＬＤ、配列番号２９）、ｐ７５５２（ＣＳＳＥＩＶＬＤ、配列番号３０）、ｐ７５６２（ＣＤＳＳＥＩＶＬＤ、配列番号３１）、ｐ７５６３（ＣＳＤＳＳＥＩＶＬＤ、配列番号３２）、ｐ７５６７（ＣＥＩＶＬＤ、配列番号３３）、ｐ７５６８（ＣＩＶＬＤ、配列番号３４）、ｐ７６０５（ＣＳＥＩＶＬ、配列番号３５）、ｐ６７７６（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号３６）、ｐ６７７７（ＣＳＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮ、配列番号３７）、ｐ６７７６ｂ（ＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬＣ、配列番号３８）、ｐ７７５２（ＣＡＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号３９）、ｐ７７５３（ＣＳＡＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号４０）、ｐ７７５４（ＣＳＥＡＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号４１）、ｐ７７５５（ＣＳＥＩＡＬＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号４２）、ｐ７７５６（ＣＳＥＩＶＡＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号４３）、ｐ７７５７（ＣＳＥＩＶＬＡＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号４４）、ｐ７７５８（ＣＳＥＩＶＬＤＡＴＤＮＱＹＬ、配列番号４５）、ｐ７７４５（ＣＳＥＩＶＬＤＧＡＤＮＱＹＬ、配列番号４６）、ｐ７７４６（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＡＮＱＹＬ、配列番号４７）、ｐ７７４７（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＤＡＱＹＬ、配列番号４８）、ｐ７７４８（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＡＹＬ、配列番号４９）、ｐ７７４９（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＡＬ、配列番号５０）およびｐ７７５０（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＡ、配列番号５１）からなる群より選択され、ここで、Ｎ末端またはＣ末端システイン残基（Ｃ）は、存在しても、存在しなくてもよく、またはＣ末端もしくはＮ末端の何れかに存在してよい。
【００３４】
本発明によれば、免疫原性は、所定のペプチドに対する抗体を誘発するための、抗原またはエピトープなどの特定の物質の能力である。
【００３５】
好ましくは、これらのペプチドは、少なくとも７個のアミノ酸長であり、好ましい長さは、１６個まで、好ましくは１４または２０個のアミノ酸残基までである（例えば、７または８から２０、７または８から１６個など）。配列番号１から５１のペプチドのＮ末端またはＣ末端の“Ｃ”は、リンカーとして提供され、それは、存在しても、存在しなくてもよく、あるいは担体への固定化を可能にする別のアミノ酸または化学的リンカーで置き換えられてよい。さらなる連結アミノ酸は、ペプチドのこの末端の、“Ｃ”（システイン残基）の直前または“Ｃ”の直後の何れかに、提供されてよい。“Ｃ”はまた、カップリングに必要でない場合、および／または免疫原性が、担体に“Ｃ”以外の手段で結合させることにより保持されている場合は、なくてもよい。あるいは、これらのペプチドのフラグメント、好ましくは７アミノ酸残基の最小の長さのフラグメント（システイン残基の前の１つまたはそれ以上のアミノ酸を削除する）もまた、本発明に従って使用することができる。あるいは、免疫原性ペプチドの免疫原性および特異性に影響を与えない極性または荷電アミノ酸を、ペプチドの溶解度を増加させるために使用することができる。従って、本発明のアフェレシス装置用の抗体を提供するのに使用されるペプチドは、７から３０個、好ましくは７から２０個、より好ましくは７から１６個、最も好ましくは８個のアミノ酸残基を含む。しかしながら、より長いペプチドもまた、例えば、実施例１に示すように、抗ＨＴＴ抗体誘導抗原として用いてもよい。
【００３６】
本発明のハンチントン病の予防は、少なくとも１つのＨＴＴアレル中に反復されるＣＡＧ数の増加に基づくハンチントン病症状を発症しやすい個体における、運動および精神症状または免疫学的変化および代謝変化などのハンチントン病関連症状の突発発生および／または発症を予防または遅延させることと定義される。
【００３７】
本発明のハンチントン病の処置は、変異ＨＴＴを有すると遺伝的に同定された個体（すなわち、少なくとも１つのＨＴＴアレルにおいて２６以上のＣＡＧリピートを有する個体）および例えば、実施例２および３のように、その症状に基づいてハンチントン病陽性と診断され、ハンチントン病の動物モデルにおける表現型の変化を誘導することによって示されるような遺伝子型を有する個体における、舞踏様運動および精神症状を伴った運動などのハンチントン病関連運動症状、または免疫学的変化および代謝変化を改善するように定義される。
【００３８】
本発明のアフェレシス装置で使用される抗体は、本明細書に記載のＨＴＴタンパク質の少なくとも１つのペプチドを特異的に認識するポリクローナル抗体血清から提供され得る。
【００３９】
本発明のアフェレシス装置で使用される抗体は、例えば、親和性クロマトグラフィーなどの、当業者に公知の技術によって、抗体血清またはハイブリドーマ上清から精製することができる。本発明のアフェレシス装置で使用される抗体はまた、哺乳動物細胞発現系またはバキュロウイルス−、酵母−、植物−もしくは細菌の発現系を用いて、あるいは、インビトロ産生条件を制御するためにインビトロ転写／翻訳系を一体として用いて、当業者に公知の好適なタンパク質発現ベクター中の対応するｃＤＮＡの過剰発現により得ることができる。
【００４０】
例えば、該薬理学的組成物中に含まれるポリクローナル抗体血清は、ｐ６７７３（ＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＱＰＱＰＣ、配列番号１）、ｐ７５６４（ＣＰＳＤＳＳＥＩＶＬＤ、配列番号２）、ｐ７５４３（ＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＣ、配列番号３）、ｐ７５４３ａ（ＤＮＱＹＬＧＬＱＩＣ；配列番号８８）、とりわけ誘導体ｐ９３９４（ＫＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＫＣ；配列番号９１）、ｐ９３９５（ＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＫＫＣ；配列番号９２）、ｐ９３９６（ＫＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＫＫＧＣ；配列番号９３）、ｐ９３９７（ＫＤＮＱＹＬＧＬＱＩＫＫＧＣ；配列番号９４）；ｐ７５４３ｂ（ＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＣ；配列番号８９）、ｐ７５４３ｃ（ＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＣ；配列番号９０）、ｐ６７７１（ＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＣ、配列番号４）、ｐ８３４６（ＣＧＰＡＶＡＥＥＰＬＨＲＰ、配列番号５）、ｐ８８５５（ＳＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＤＣ、配列番号６）、ｐ８８５８（ＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬＣ、配列番号７）、ｐ８８５９（ＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬＧＣ、配列番号８）、ｐ８８６０（ＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬＧＬＣ、配列番号９）、ｐ８８６１（ＬＤＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＣ、配列番号１０）、ｐ８８６２（ＤＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＣ、配列番号１１）、ｐ８８６９（ＣＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱ、配列番号１２）、ｐ８８６８（ＣＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧ、配列番号１３）、ｐ８８７０（ＣＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰ、配列番号１４）、ｐ８８７１（ＣＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＱ、配列番号１５）、ｐ６７７２（ＣＰＱＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰ、配列番号１６）、ｐ８８６４（ＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＣ、配列番号１７）、ｐ８８６５（ＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＣ、配列番号１８）、ｐ６７７５（ＰＰＰＱＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＱＰＱＰａＣ、配列番号１９）、ｐ８８５４（ＰＳＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＣ、配列番号２０）、ｐ８８５６（ＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＣ、配列番号２１）、ｐ８８５７（ＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＣ、配列番号２２）、ｐ８８６６（ＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＱＣ、配列番号２３）、ｐ８８６７（ＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＱＤＣ、配列番号２４）、ｐ６７６３（ＣａＭＡＴＬＥＫＬＭＫＡＦＥＳＬＫＳＦＱ、配列番号２５）、ｐ６７６４（ＣａＫＬＭＫＡＦＥＳＬＫＳＦＱ、配列番号２６）、ｐ６７６５（ＣＥＥＱＱＲＱＱＱＱＱＱＱ、配列番号２７）、ｐ６７６８（ＱＱＱＱＱＱＰＰＰＰＰＰＰＰａＫＫＫＣ、配列番号２８）、ｐ７５４１（ＣＳＥＩＶＬＤ、配列番号２９）、ｐ７５５２（ＣＳＳＥＩＶＬＤ、配列番号３０）、ｐ７５６２（ＣＤＳＳＥＩＶＬＤ、配列番号３１）、ｐ７５６３（ＣＳＤＳＳＥＩＶＬＤ、配列番号３２）、ｐ７５６７（ＣＥＩＶＬＤ、配列番号３３）、ｐ７５６８（ＣＩＶＬＤ、配列番号３４）、ｐ７６０５（ＣＳＥＩＶＬ、配列番号３５）、ｐ６７７６（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号３６）、ｐ６７７７（ＣＳＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮ、配列番号３７）、ｐ６７７６ｂ（ＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬＣ、配列番号３８）、ｐ７７５２（ＣＡＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号３９）、ｐ７７５３（ＣＳＡＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号４０）、ｐ７７５４（ＣＳＥＡＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号４１）、ｐ７７５５（ＣＳＥＩＡＬＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号４２）、ｐ７７５６（ＣＳＥＩＶＡＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号４３）、ｐ７７５７（ＣＳＥＩＶＬＡＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号４４）、ｐ７７５８（ＣＳＥＩＶＬＤＡＴＤＮＱＹＬ、配列番号４５）、ｐ７７４５（ＣＳＥＩＶＬＤＧＡＤＮＱＹＬ、配列番号４６）、ｐ７７４６（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＡＮＱＹＬ、配列番号４７）、ｐ７７４７（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＤＡＱＹＬ、配列番号４８）、ｐ７７４８（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＡＹＬ、配列番号４９）、ｐ７７４９（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＡＬ、配列番号５０）およびｐ７７５０（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＡ、配列番号５１）、好ましくはｐ６７７３（ＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＱＰＱＰＣ、配列番号１）、ｐ７５６４（ＣＰＳＤＳＳＥＩＶＬＤ、配列番号２）、ｐ７５４３（ＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＣ、配列番号３）、ｐ６７７１（ＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＣ、配列番号４）、ｐ６７７６（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号３６）、ｐ６７７７（ＣＳＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮ、配列番号３７）、ｐ８３４６（ＣＧＰＡＶＡＥＥＰＬＨＲＰ、配列番号５）、ｐ８８５５（ＳＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＤＣ、配列番号６）、ｐ８８５８（ＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬＣ、配列番号７）、ｐ８８５９（ＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬＧＣ、配列番号８）、ｐ８８６０（ＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬＧＬＣ、配列番号９）、ｐ８８６１（ＬＤＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＣ、配列番号１０）、ｐ８８６２（ＤＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＣ、配列番号１１）、ｐ８８６９（ＣＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱ、配列番号１２）、ｐ８８６８（ＣＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧ、配列番号１３）、ｐ８８７０（ＣＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰ、配列番号１４）、ｐ８８７１（ＣＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＱ、配列番号１５）、ｐ６７７２（ＣＰＱＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰ、配列番号１６）、ｐ８８６４（ＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＣ、配列番号１７）、ｐ８８６５（ＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＣ、配列番号１８）、ｐ６７７５（ＰＰＰＱＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＱＰＱＰａＣ、配列番号１９）、ｐ８８５４（ＰＳＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＣ、配列番号２０）、ｐ８８５６（ＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＣ、配列番号２１）、ｐ８８５７（ＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＣ、配列番号２２）、ｐ８８６６（ＮＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＱＣ、配列番号２３）、およびｐ８８６７（ＱＹＬＧＬＱＩＧＱＰＱＤＣ、配列番号２４）、とりわけｐ６７７３（ＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＱＰＱＰＣ、配列番号１）、ｐ７５６４（ＣＰＳＤＳＳＥＩＶＬＤ、配列番号２）、ｐ７５４３（ＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＣ、配列番号３）、ｐ６７７１（ＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＣ、配列番号４）、ｐ６７７６（ＣＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮＱＹＬ、配列番号３６）、ｐ６７７７（ＣＳＤＳＳＥＩＶＬＤＧＴＤＮ、配列番号３７）、およびｐ８３４６（ＣＧＰＡＶＡＥＥＰＬＨＲＰ、配列番号５）からなる群より選択される少なくとも１つのペプチドに対して作られる。
【００４１】
アフェレシス抗体が得られ得るポリクローナル抗体血清は、ｐ６７７３（配列番号１）およびｐ６７７１（配列番号４）の少なくとも１つのペプチドに対して作製される。あるいは、または組み合わせて、ポリクローナル抗体血清は、ペプチドｐ７５４３（配列番号３）に対して作製され得る。
【００４２】
あるいは、または組み合わせて、ポリクローナル抗体血清は、ペプチドｐ７５６４（配列番号２）に対して作製され得る。
【００４３】
あるいは、または組み合わせて、ポリクローナル抗体血清は、ペプチドｐ６７７６（配列番号３６）に対して作製され得る。
【００４４】
別の面によれば、本発明は、ＨＴＴまたはその天然に存在するフラグメントに対するモノクローナル抗体を含むアフェレシス装置に関する。本発明のモノクローナル（ならびに、ポリクローナル）抗体は、“単離された抗体”としてハンチントン病を有する患者の血液または血漿の流れに接触するアフェレシス装置の表面上に固定化される。“単離された”抗体は、その天然環境下の成分から分離されたものである。ある態様において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフィー（例えば、イオン交換または逆相ＨＰＬＣ）により決定されるように、９５％以上または９９％以上の純度である。そのような純度は、通常、アフェレシス装置のための品質管理の前提条件を満たすために必要とされる。モノクローナル抗体については、該抗体をコードする核酸も利用可能である。単一のベクターまたは別個のベクター中のかかる核酸分子（複数可）を含む抗体の重鎖および軽鎖（またはそのフラグメント）をコードするような核酸分子、ならびに宿主細胞内の１つまたはそれ以上の位置に存在するような核酸分子（複数可）は、本発明のアフェレシス装置のための抗体を産生するのに使用できる。
【００４５】
本明細書で用いる用語“モノクローナル抗体”とは、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を意味し、すなわち、該集団に含まれる個々の抗体は、同一であり、かつ／または、例えば、天然に生じる変異を含むか、またはモノクローナル抗体調製物の製造中に生じる、可能性のある変異体抗体（そのような変異体は、一般にわずかに存在する）を除いて、同一のエピトープに結合する。一般的に、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。従って、“モノクローナル”なる修飾語は、抗体の実質的に均一な抗体集団から得られるという該抗体の特徴を示し、何らかの特定の方法による抗体の産生を要すると解釈されるべきではない。例えば、本発明で用いるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組み換えＤＮＡ法、ファージ−、酵母−または哺乳動物細胞−ディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法（そのような方法およびモノクローナル抗体を作製するための他の例示的方法は本明細書に記載されている）を含むが、これらに限定されない、種々の技術によって作製できる。
【００４６】
本発明はまた、ペプチドｐ６７７３（配列番号１）内に含まれる配列“ＬＬＰＱＰ”を有するＨＴＴタンパク質のエピトープ、とりわけコアエピトープＬＬＰＱＰ（配列番号７７）に結合可能な結合ドメインを有する本発明のアフェレシス装置で使用するためのモノクローナル抗体“ＰＲＲ１３”を提供する。本発明により、本発明の試験で供された、この最小限のコアエピトープ、すなわちコアエピトープＬＬＰＱＰ（配列番号７７）に対するｍＡＢが提供される。好ましい態様において、該モノクローナル抗体は、例えば実施例５に記載の通り、ペプチド配列ＧＹＳＦＴＤＦＹ（配列番号５４）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＩＤＰＫＮＧＤＴ（配列番号５５）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、ＡＴＹＹＧＹＴＭＤＹ（配列番号５６）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、ＳＳＶＴＳＳＹ（配列番号５７）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＳＴＳ（配列番号５８）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２およびＨＱＹＲＲＰＰＲＴ（配列番号５９）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含むモノクローナル抗体ＰＲＲ１３であることを特徴とする。
【００４７】
ＣＤＲは、相補性決定領域であり、抗体の可変領域を表し、それにより抗体はその特異的エピトープに結合する。重鎖の種類と数は、それぞれ、抗体のクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体を決定する。抗体は、ラムダまたはカッパ型であり得る２つの同一の軽鎖を含む。
【００４８】
本発明によれば、本発明のアフェレシス装置に用いるモノクローナル抗体は、好ましくは、非ヒト抗体のＣＤＲがヒト抗体フレームワークに導入され、それにより元のハイブリドーマに由来するマウス抗体の親和性および特異性が少なくとも維持され、かつ新たに製造されたタンパク質のヒトに対するＴ細胞およびＢ細胞の免疫原性が最小化されるように適合された改変抗体（ヒト化モノクローナル抗体）である。このことは、とりわけ、望ましくない、最小量の吸着剤タンパク質が、患者の血液中に漏れている（例えばタンパク質分解または固定化された吸着剤タンパク質に影響を与える他のタンパク質分解過程による、切断フラグメントの産生が原因の可能性がある）場合に、必要とされる。ＣＤＲはまた、二重特異性またはキメラモノクローナル抗体、増強された安定化機能を有する抗体などの他の作製された形態にも導入することができる。本発明のアフェレシス装置に用いる抗体は、ヒト抗ＨＴＴ抗体が好ましい。
【００４９】
ヒトまたはヒト化抗体が本発明において利点を有し得る一方で、マウス抗体などの他のＨＴＴ結合分子もまた、本発明のアフェレシス装置に使用できる。本発明の特に好ましい態様は、２以上のタイプのＨＴＴ結合分子を用い、例えば、ＨＴＴの異なる領域に結合する少なくとも２つの抗ＨＴＴ抗体（または、ＨＴＴ結合抗体フラグメント）を用いる。それらはまた、異なる起源（例えば、ヒト抗体またはヒト化抗体およびマウス抗体）であってよい。ＨＴＴ結合分子はまた、それらの安定性および固定化様式（例えば、それらのリサイクル可能性）により、またはそれらの親和性および特異性により選択されてよい。平衡解離定数（ＫＤ）によって定義される抗体の親和性は、好ましくは１０−７から１０−９の範囲であり、すなわち、ナノモル（ｎＭ）範囲であって、ある程度高い親和性である。特異性および親和性を高めるために、一般的に、２つ以上の抗体を組合せるのが好ましい。ワクチン処置のインビボ効果と同様に（以下参照）、２つ以上の抗体の親和性／組合せの効果は、血漿からの標的タンパク質の効率的なクリアランスを達成するために好ましい。
【００５０】
“ヒト抗体”は、ヒトもしくはヒト細胞によって産生される抗体またはヒト抗体のレパートリーもしくは他のヒト抗体をコードする配列を利用する非ヒト供給源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、特に、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を除外する。“ヒトコンセンサスフレームワーク”は、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨフレームワーク配列の選択において、最も一般的に生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般的に、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからのものである。一般的に、配列のサブグループは、Kabat, E.A. et al, Sequences of Proteins of Immunoglobulin Interest, 5th ed., Bethesda MD (1991), NIH Publication 91−3242, Vols. 1−3に記載のようなサブグループである。一態様において、ＶＬについて、サブグループは、前出のＫａｂａｔらのサブグループκＩである。一態様において、ＶＨについて、サブグループは、前出のＫａｂａｔらのサブグループＩＩＩである。
【００５１】
“ヒト化”抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基およびヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を意味する。“フレームワーク”または“ＦＲ”は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を意味する。可変ドメインのＦＲは、一般的に４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４で構成されている。従って、ＨＶＲおよびＦＲ配列は一般的に、ＶＨ（または、ＶＬ）において、次の順序で示される：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。任意の態様において、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、一般的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含んでいてよく、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全てまたは実質的に全ては、非ヒト抗体のものに対応し、かつＦＲの全ておよび実質的に全ては、ヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、必要に応じて、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでいてよい。抗体の“ヒト化変異体”、例えば、非ヒト抗体は、ヒト化された抗体を意味する。好ましい一態様では、マウスＨＶＲは、“ヒト化抗体”を調製するために、ヒト抗体のフレームワーク領域に移植される。マウス可変領域のアミノ酸配列は、ヒトの生殖細胞系抗体Ｖ遺伝子のコレクションに合わせて、配列同一性および相同性に基づいて選別される。アクセプター配列は、高い全体的な配列相同性および必要に応じて、アクセプター配列に既に存在する正しい天然の（canonical）残基に基づいて選択される。生殖細胞系のＶ遺伝子は、重鎖のＨＶＲ３の先頭までの領域、さらに軽鎖のＨＶＲ３の真ん中までのみをコードする。従って、生殖細胞系のＶ遺伝子の遺伝子は、Ｖドメイン全体に配置されているわけではない。ヒト化構築物は、ヒトフレームワーク１から３、マウスＨＶＲ、およびヒトＪＫ４に由来するヒトフレームワーク４配列、ならびに軽鎖および重鎖のためのＪＨ４配列をそれぞれ含む。１つの特定のアクセプター配列を選択する前に、ドナー抗体のいわゆる天然（canonical）ループ構造を決定することができる。これらの天然ループ構造は、いわゆる標準的な（canonical）位置に存在する残基の種類によって決定される。これらの位置は、ＨＶＲ領域の外にあり（部分的に）、親（ドナー）抗体のＨＶＲコンホメーションを保持するために、最終的な構築物を機能的に等価に保つ必要がある。ＷＯ２００４／００６９５５Ａ１において、抗体をヒト化するための方法は、非ヒト成熟抗体中のＨＶＲのカノニカル（canonical）ＨＶＲ構造タイプを識別する工程；ヒト抗体可変領域用のペプチド配列ライブラリーを得る工程；該ライブラリーにおける可変領域のカノニカルＨＶＲ構造タイプを決定する工程；ならびに、カノニカルＨＶＲ構造が、非ヒトおよびヒト可変領域内の対応する位置の非ヒト抗体のカノニカルＨＶＲ構造タイプと同じであるヒト配列を選択する工程、を含むことが報告されている。まとめると、可能性のあるアクセプター配列は、全体的に高い相同性に基づいて選択され、要すれば、それに加えて、アクセプター配列に既に存在する正しい天然の残基の存在に基づいて選択される。ある場合に、単一のＨＶＲ移植は、非ヒト抗体の結合特異性の部分的な保持のみをもたらす。少なくとも幾つかの特定の非ヒトフレームワーク残基が、結合特異性を再構成するために必要であり、また、ヒトフレームワーク中にも移植されなければならない、すなわち、いわゆる“逆突然変異（back mutation）”が、非ヒトＨＶＲの導入に加えて行われなければならないことが明らかになっている（例えば、Queen et al., PNAS 86 (1989), 10029−10033を参照のこと)。これらの特定のフレームワークアミノ酸残基は、ＦＲ−ＨＶＲ相互作用に関与し、ＨＶＲの立体構造（ループ）を安定化する。ある場合には、より近似のヒト生殖細胞系配列を選択するために、フォワード変異もまた導入される。従って、“本発明の抗体のヒト化変異体”（それは、例えば、マウス由来のもの）は、ＶＨおよびＶＬが上記の標準的技術によりヒト化されたマウス抗体配列に基づく抗体（ＨＶＲ移植され、ならびに要すればその後に、フレームワーク領域およびＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、ＨＶＲ−Ｌ１またはＨＶＲ−Ｌ２中の任意のアミノ酸が変異され、一方で、ＨＶＲ−Ｈ３およびＨＶＲ−Ｌ３は修飾されていない抗体を含む）を意味する。
【００５２】
一般的に、マウス由来のヒト患者の処置に使用するのに適する抗体または他の厳選されたｍＡＢを開発するための技術は、十分に確立されている（Safdari et al 2013；ＰＭＩＤ：２４５６８２７９に記載）。従って、本明細書に記載の抗体は、このような検証技術、とりわけＣＤＲ移植に基づく方法（例えば、Kim ＆ Hong Methods Mol Biol. 2012;907:237−45 [PMID: 22907355] または Whitelegg, N. ＆ Rees, AR Antibody variable Regions: Towards a Unified modeling method. In: Methods in Molecular Biology, Biotechnology and Medicine, (Ed. Lo, B), 2004; 248:51−91に記載) [PMID: 14970491]、生殖細胞系ヒト化または“超ヒト化”(例えば、Pelat, T. Et al., Mini Rev Med Chem. 2009 Dec;9(14):1633−8を参照）[PMID: 20105119]、およびリサーフェイシング（resurfacing）（例えば、Mader and Kunert et al., Prot.Eng.Des.Selec. 2010, 23, 947−954に記載)[PMID: 21037278]、またはこれらの確立された技術に基づく関連する方法を適用することにより、改善された抗体を提供するための方法を開発するために用いられる。
【００５３】
本明細書で用いる“超可変領域”または“ＨＶＲ”は、配列において超可変である抗体可変ドメイン領域（“相補性決定領域”または“ＣＤＲ”）および／または構造的に定まったループを形成する領域（“超可変ループ”）および／または抗原接触残基を含む領域（“抗原と接触する領域”）を意味する。一般的に、抗体は、ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、そしてＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）の、６つのＨＶＲを含む。ＨＶＲの例は、本明細書に記載されている。
【００５４】
本発明により、配列番号６０から６５のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％）、９８％）、９９％）、または１００％配列の同一性を有する、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列および／または軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む抗ＨＴＴ抗体もまた、本発明のアフェレシス装置に使用できる。任意の態様において、少なくとも９０％＞、９１％＞、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するＶＨ配列は、対照配列に対して、置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むが、その配列を含む抗ＨＴＴ抗体は、ＨＴＴに、とりわけ提示されるエピトープに結合する能力を保持している。任意の態様において、配列番号６０から６５において、合計１から１０個のアミノ酸が、置換、挿入および／または欠失されている。任意の態様において、置換、挿入または欠失は、ＨＶＲの外側の領域（すなわち、ＦＲ）に生じる。
【００５５】
本発明の抗ＨＴＴ抗体の好ましい変異体は、図２７に記載されている（すなわち、変異体ｈＰＲＲ１３−２から−１６およびｈＣ６−１７−２から−１６）。従って、Ｈ／Ｌフレームワーク中にアミノ酸置換を有する抗ＨＴＴ抗体は、本発明に特に好ましい。さらに、これらの変異体の全ての組み合わせも特に好ましい。例えば、ＰＲＲ抗体の重鎖について、１つのｗｔ＋３つの変異体が存在し、軽鎖についても、１つのｗｔ＋３つの変異体が存在する。これは、図２７の表に列記されるように４ｘ４の変異体の可能性のある組み合わせを提供する。ｍＡＢ  ｈｕＣ６−１７について、以下の組み合わせが好ましい：軽鎖：１つのｗｔ＋１つの変異体；重鎖：１つのｗｔ＋７つの変異体、合計１６種の変異体。
【００５６】
対照ポリペプチド配列に対する“アミノ酸配列の同一性パーセント（％）”は、配列を整列させ、必要であれば、最大の配列同一性パーセントを達成するために、ギャップを導入した後、いかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮しないとした場合の、該対照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列のアミノ酸残基の割合として定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアライメントは、当技術分野の範囲内の種々の方法、例えば、公的に入手可能なコンピューターソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮもしくはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアまたはＥＭＢＯＳＳソフトウェアパッケージの“ｎｅｅｄｌｅ”ペアワイズ配列アライメントアプリケーションを使用することにより達成することができる。当業者であれば、配列をアラインするための適切なパラメーター（比較される配列の全長にわたって最大アライメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む）を決定することができる。本発明の目的のために、しかしながら、アミノ酸配列の同一性パーセント（％）の値は、ＥＭＢＯＳＳソフトウェアパッケージのコンピュータプログラム“ｎｅｅｄｌｅ”の配列アライメント（European Molecular Biology Laboratory; Rice et al., EMBOSS: the European Molecular Biology Open Software Suite, Trends Genet. 2000 Jun;16(6):276−7、ＰＭＩＤ：１０８２７４５６から入手可能）を用いて計算される。
【００５７】
ｎｅｅｄｌｅプログラムは、ウェブサイトhttp://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss needle/でアクセスすることができるが、http://emboss.sourceforge.net/からＥＭＢＯＳＳパッケージの一部としてローカルインストール用にダウンロードできる。それは、多くの広く使用されているＬｉｎｕｘなどのＵＮＩＸオペレーティングシステム上で動作する。
【００５８】
２つのタンパク質配列をアラインするために、ｎｅｅｄｌｅプログラムは、好ましくは、以下のパラメーターを使用して実行される：
コマンドライン：needle −auto −stdout −asequence SEQUENCE_FILE_A −bsequence SEQUENCE_FILE_B −datafile EBLOSUM62 −gapopen 10.0 −gapextend 0.5 −endopen 10.0 −endextend 0.5 −aformat3 pair −sprotein1 −sprotein2(Align_format: pair Report_file: stdout)。
【００５９】
所定のアミノ酸配列Ａの、所定のアミノ酸配列Ｂに対するアミノ酸配列の同一性パーセント（％）（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂに対する、それとの、またはそれと比較して(to, with, or against)ある特定のアミノ酸配列の同一性パーセント（％）を有するか、または含む所定のアミノ酸配列Ａと表現することもできる）は、以下のように計算される：
分率Ｘ／Ｙ×１００
（式中、Ｘは、配列アライメントプログラムｎｅｅｄｌｅによって、そのプログラムによるＡおよびＢのアライメントにおいて完全な一致として採点されたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂのア総ミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡのアミノ酸配列の同一性パーセント（％）は、Ａに対するＢのアミノ酸配列の同一性パーセント（％）と等しくならないことが認識される。特に別段の記載がない限り、本明細書に用いるアミノ酸配列の同一性パーセント（％）の値はすべて、すぐ前の段落に記載したように、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを用いて得られる。
【００６０】
任意の態様において、本発明で提供される抗体はキメラ抗体である。特定のキメラ抗体が、例えば、ＵＳ４，８１６，５６７Ａ；および、Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851−6855）に記載されている。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、または非ヒト哺乳動物、例えばサル由来の可変領域）およびヒト定常領域を含む。さらなる例において、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが、親抗体のものから変更されている“クラススイッチ”抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合フラグメントを含む。
【００６１】
任意の態様において、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。一般的に、非ヒト抗体は、親の非ヒト抗体の特異性および親和性を保持しながら、ヒトに対する免疫原性を低減するためにヒト化されている。一般的に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（またはその部分）が非ヒト抗体に由来し、そしてＦＲ（またはその部分）がヒト抗体配列に由来する、１つまたは複数の可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、場合によっては、ヒト定常領域の少なくとも一部を含み得る。ある態様において、ヒト化抗体のあるＦＲ残基は、例えば、抗体の特異性または親和性を回復または改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）からの対応する残基で置換されている。ヒト化抗体およびそれらを作製する方法は、例えば、ＷＯ２００４／００６９５５Ａ１（カノニカル構造を介したアプローチ）に報告されている。
【００６２】
任意の態様において、本発明で提供する抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で公知の種々の技術を用いて作製することができる。ヒト抗体は、抗原暴露に応答して、ヒト可変領域を有する無傷のヒト抗体または無傷の抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することにより調製することができる。このような動物は、一般的に、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置換するか、または染色体外に存在するか、もしくは該動物の染色体に無作為に挿入されている、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含む。このようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、一般的に不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得る方法については、Lonberg, Nat. Biotech. 23 (2005) 1117−1125、ＸＥＮＯマウス(商標)技術を記載するＵＳ６，０７５，１８１および６，１５０，５８４；ＨｕＭａｂ（登録商標）技術を記載するＵＳ５，７７０，４２９Ａ；Ｋ−Ｍマウス（登録商標）技術を記載するＵＳ７，０４１，８７０Ａ、ならびにVelociマウス(登録商標)技術を記載するＵＳ２００７／００６１９００Ａ１を参照のこと。かかる動物によって作製された無傷の抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることにより、さらに修飾されてよい。
【００６３】
ヒト抗体はまた、ハイブリドーマベースの方法によって作製することができる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒトミエローマおよびマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株が記載されているヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術により作製されたヒト抗体はまた、Li et al, PNAS 103(2006) 3557−3562に記載されている。さらなる方法は、例えば、ＵＳ７，１８９，８２６（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載する）に記載のもの、またはトリオーマ技術によって作製されたものを含む。ヒト抗体はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することにより作製され得る。その後、かかる可変ドメイン配列を、所望のヒト定常ドメインと組み合わせることができる。抗体ライブラリーからのヒト抗体の選択のための技術を以下に記載する。
【００６４】
本発明のアフェレシス装置で使用される抗体はまた、１つまたは複数の所望の活性を有する抗体のためのコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。例えば、種々の方法が、ファージディスプレイライブラリーを作製し、所望の結合特性を有する抗体についてかかるライブラリーをスクリーニングするために、当技術分野において知られている。このような方法は、例えばFellouse, PNAS(2004) 12467−12472にさらに記載されている。
【００６５】
特定のファージディスプレイ法では、ＶＨおよびＶＬ遺伝子のレパートリーを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別個にクローニングし、ファージライブラリー中に無作為に組み込み、その後、それを抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、典型的には、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントまたはＦａｂフラグメントのいずれかのような抗体フラグメントを提示する。免疫化された供給源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要がなく、免疫原に対する高親和性抗体を提供する。あるいは、天然のレパートリー（例えば、ヒト由来）は、免疫化することなく、非自己およびまた自己抗原の広範囲に抗体の単一の供給源を提供するためにクローン化することができる。最後に、天然ライブラリーはまた、幹細胞から非再配列Ｖ遺伝子セグメントをクローニングし、高度に可変のＣＤＲ３領域をコードし、インビトロで再編成を達成するためにコードされるランダム配列を含むＰＣＲプライマーを用いて、合成することができる。ヒト抗体ファージライブラリーを記載するさらなる文献には、例えば、ＵＳ５，７５０，３７３Ａ、ＵＳ２００５／００７９５７４Ａ１、ＵＳ２００５／０１１９４５５Ａ１、ＵＳ２００５／０２６６０００Ａ１、ＵＳ２００７／０１１７１２６Ａ１、ＵＳ２００７／０１６０５９８Ａ１、ＵＳ２００７／０２３７７６４Ａ１、ＵＳ２００７／０２９２９３６Ａ１、およびＵＳ２００９／０００２３６０Ａ１が含まれる。ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体または抗体フラグメントは、本明細書においてヒト抗体またはヒト抗体フラグメントとみなされる。
【００６６】
任意の態様において、本明細書に記載のアフェレシス装置で使用される抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性は、少なくとも２つの異なる部位に結合特異的を有するモノクローナル抗体である。任意の態様において、両方の結合特異性は、標的の２以上のエピトープに同時に結合させることによって、ＨＴＴタンパク質またはそのフラグメントに対するＨＴＴの結合活性および／または特異性を増大させるのを助ける。特定の態様において、二重特異性または多重特異性抗体は、別個の血漿ＨＴＴタンパク質フラグメントが、それぞれ異なるエピトープに吸着される必要がある場合、ＨＴＴの２以上のエピトープを位置決定するために用いられる。一例として、１つのエピトープは、１つのフラグメント上に位置し、一方、他のエピトープ(複数可)は、ＨＴＴの物理的に別個のフラグメント上に位置する。両方のフラグメントが血漿からの吸着に必要とされる場合、ＨＴＴタンパク質の別個のフラグメント上にそれぞれ存在する少なくとも２つのエピトープを標的とする吸着器上に配置される必要がある。任意の態様において、結合特異性の１つは、ＨＴＴに対してであり、他方は、例えば、ＨＴＴまたはそのフラグメントとの物理的会合で血漿中に存在するＨＴＴ相互作用タンパク質などの、ハンチントン病患者の血液から抽出されるべき任意の他の抗原に対するものである。二重特異性抗体は完全長抗体または抗体フラグメントとして調製することができる。多重特異性抗体を作製するための技術としては、限定されるものではないが、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組換え共発現（ＷＯ９３／０８８２９Ａ、ＵＳ５，７３１，１６８Ａ）を含む。多重特異性抗体はまた、抗体のＦｃヘテロ二量体分子を作製するための静電ステアリング効果を操作することにより（ＷＯ２００９／０８９００４Ａ）；２つまたはそれ以上の抗体またはフラグメントを架橋することにより（例えば、ＵＳ４，６７６，９８０Ａ）；ロイシンジッパーを用いて、二重特異性抗体を作製することにより；二重特異性抗体フラグメントを産生するための“二重特異性抗体”技術を用いることにより（例えば、Holliger et al, PNAS 90(1993) 6444−6448）；および、単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を用いて；および、三重特異性抗体を作製することによっても、作製することができる。“オクトパス抗体”を含む３つ以上の機能的抗原結合部位を有するように操作された抗体もまた、本発明に包含される（例えば、ＵＳ２００６／００２５５７６Ａ１）。本明細書で用いる抗体またはフラグメントにはまた、ＨＴＴに結合し、ならびに別の異なる抗原に結合する、抗原結合部位を含む“２重作用(Dual Acting）Ｆａｂ”または“ＤＡＦ”も含まれる（例えば、ＵＳ２００８／００６９８２０Ａ１を参照のこと）。本発明の抗体またはフラグメントにはまた、ＷＯ２００９／０８０２５１Ａ、ＷＯ２００９／０８０２５２Ａ、ＷＯ２００９／０８０２５３Ａ、ＷＯ２００９／０８０２５４Ａ、ＷＯ２０１０／１１２１９３Ａ、ＷＯ２０１０／１１５５８９Ａ、ＷＯ２０１０／１３６１７２Ａ、ＷＯ２０１０／１４５７９２Ａ、およびＷＯ２０１０／１４５７９３Ａに記載の多重特異性抗体も含まれる。
【００６７】
本明細書で定義される、特に好ましい二重特異性抗体は、ＨＴＴに対する２以上の結合領域、とりわけＰＲＲおよびＣ６の両方に対する結合領域を含む。
【００６８】
任意の態様において、本明細書に記載の抗体のアミノ酸配列変異体が意図される。例えば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適当な修飾を導入すること、またはペプチド合成により、製造することができる。かかる修飾には、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失、および／または挿入および／または置換が含まれる。欠失、挿入および置換の任意の組み合わせにより、最終構築物に到達することができ、最終的な構築物は、所望の特徴、例えば抗原結合特性を有する。
【００６９】
任意の態様において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換突然変異誘発のための目的の部位には、ＨＶＲおよびＦＲが含まれる。保存的置換は、“好ましい置換”の見出しを付した、以下の表に示される。より実質的な変化は、アミノ酸側鎖クラスを参照して以下に提供される。アミノ酸置換は、目的の抗体に導入されてよく、製品は、所望の活性、とりわけ保持された／改善された抗原結合性、または改善された安定性についてスクリーニングされた。
【００７０】
【表１】
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【００７１】
アミノ酸は、共通の側鎖特性に応じてグループ分けすることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｉｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族性：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【００７２】
非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスに交換することを必要とする。置換変異体の一種は、親抗体（例えば、ヒト化またはヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基の置換を含む。一般的には、さらなる試験のために得られた変異体(複数可)は、親抗体と比較し、特定の生物学的特性（例えば、増大した親和性、免疫原性の低下）における修飾（例えば、改善）を有しており、および／または実質的に親抗体の特定の生物学的特性を保持しているであろう。例示的な置換変異体は、例えば、本明細書に記載のものなどのファージディスプレイベースの親和性成熟技術を用いて、都合よく作製され得る、親和性成熟抗体である。簡潔には、１つ以上のＨＶＲ残基を変異させ、変異体抗体は、ファージ上に提示され、特定の生物学的活性（例えば結合親和性）についてスクリーニングされる。改変（例えば、置換）は、例えば、抗体の親和性を向上させるために、ＨＶＲにおいて行われてもよい。このような改変は、ＨＶＲ“ホットスポット”中、すなわち、体細胞成熟過程中に高頻度で突然変異を受けるコドンによってコードされた残基、および／またはＳＤＲ（−ＣＤＲ）に行われ得て、結果として生じた変異体ＶＨまたはＶＬの結合親和性が試験される。親和性成熟は、二次ライブラリーから構築し、再選択することによって行われる。親和性成熟のいくつかの態様では、多様性は、種々の方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、またはオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発）のいずれかによって成熟のために選択された可変遺伝子に導入される。その後、二次ライブラリーが作成される。ライブラリーは、その後、所望の親和性を有する任意の抗体変異体を同定するためにスクリーニングされる。多様性を導入する別の方法は、いくつかのＨＶＲ残基が（例えば、一度に４−６残基）が無作為化されたＨＶＲ指向のアプローチを伴う。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発またはモデリングを用いて、特に同定することができる。特に、ＣＤＲ−Ｈ３およびＣＤＲ−Ｌ３は、標的とされることが多い。
【００７３】
任意の態様において、置換、挿入または欠失は、そのような改変が、実質的にＨＴＴに結合する抗体の能力を低下させない限り、１つまたは複数のＨＶＲ内に存在してよい。例えば、実質的に結合親和性を低下させない保存的改変（例えば、本明細書で提供される、保存的置換）が、ＨＶＲに存在してよい。このような改変は、ＨＶＲの“ホットスポット”またはＳＤＲ外であり得る。上記の変異体ＶＨおよびＶＬ配列の特定の態様では、各ＨＶＲのいずれかは改変されていないか、または１個、２個もしくは３個以下のアミノ酸置換を含む。突然変異誘発のために標的とすることができる抗体の残基または領域の同定のための有用な方法は、“アラニンスキャニング突然変異”と呼ばれる。この方法では、標的残基（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、ＬｙｓおよびＧｌｕなどの荷電残基）の残基または群を同定し、中性アミノ酸または負荷電アミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）によって置換して、抗原と抗体の相互作用が影響を受けるかどうかを決定する。さらなる置換は、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸位置に導入することができる。あるいは、またはさらに、抗原−抗体複合体の結晶構造は、抗体と抗原との間の接触点を同定する。このような接触残基および隣接残基は、置換の候補として標的化または除去することができる。変異体は、それらが所望の特性を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされ得る。アミノ酸配列挿入には、アミノ末端および／またはカルボキシル末端の１残基から１００以上の残基を含むポリペプチドの長さの範囲の融合体、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体には、抗体の血清半減期を増加させる酵素（例えば、ＡＤＥＰＴのための）またはポリペプチドに対する抗体のＮ末端またはＣ末端への融合が含まれる。
【００７４】
ハンチンチンのＰＲＲ（プロリンに富む領域）部位は、タンパク質のポリＱ配列の近隣に位置している。ＰＲＲ領域がハンチンチンタンパク質と機能的に関連することが文献から公知である（Modregger et al 2002）。細胞内ハンチンチンのＰＲＲ領域を標的とする組み換えｓｃＦｖライブラリーに由来する細胞内抗体（intrabody）は、ＨＴＴタンパク質の変異型の細胞内ターンオーバーを選択的に増加させることにより、ハンチントン病の動物モデルにおいて有益であることが示されている（Southwell et al., 2011）。ＰＲＲ領域に隣接するポリプロリンストレッチを認識するモノクローナル抗体は、プローブとして既報である（Ko et al. 2001による、ｍＡＢ  ＭＷ７）が、ヒトプロテオーム内のハンチンチンに対してユニークではなく、ポリプロリンストレッチからなるそのエピトープの低複雑度（low complexity）であるため、ハンチントン病における治療上の使用は検討されておらず、また実証されてもいない。より一般的には、アフェレシスによるハンチンチンの標的化は、ハンチンチンが細胞内標的にのみ適した細胞内標的と見なされていたため、これまでは考慮されてこなかった。５以上の連続するプロリンを有するエピトープに結合するモノクローナル抗体ＭＷ７（Ko et al., 2001）とは対照的に、本発明のｍＡＢ  ＰＲＲ１３は、複雑なエピトープを有し、例えば実施例５に示す通り、ｐ６７７３上に含まれるそのコアエピトープに特異的かつ選択的に結合する。しかしながら、両方の抗体を、本発明のアフェレシス装置に使用することができる。
【００７５】
本発明により、本発明のアフェレシス装置における固定化された抗ＨＴＴモノクローナル抗体の使用がとりわけ好ましい。
【００７６】
本発明は、例えば実施例４に示す通り、ｐ７５４３の配列（配列番号３）または好ましくはＣ６−１７のコアエピトープを含むＨＴＴタンパク質またはそのフラグメントに結合可能な結合ドメインを有する本発明のアフェレシス装置で使用するためのモノクローナル抗体を提供する。好ましい態様において、該モノクローナル抗体は、例えば実施例５に示す通り、ＧＹＴＦＴＥＹＴ（配列番号６６）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＩＮＰＮＮＧＧＴ（配列番号６７）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、ＡＳＬＤＧＲＤＹ（配列番号６８）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、ＱＳＬＬＮＳＲＴＲＫＮＹ（配列番号６９）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＷＡＳ（配列番号７０）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２およびＫＱＳＹＮＬＬＴ（配列番号７１）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３、を含むモノクローナル抗体Ｃ６−１７であることを特徴とする。
【００７７】
本発明により、カスパーゼ領域５８６は、カスパーゼ６およびカスパーゼ２、８または１０などの他のプロテアーゼによるプロテアーゼ切断に感受性であるハンチンチンタンパク質の位置５８６で、これまでに定義されたカスパーゼ切断部位の周囲のＨＴＴタンパク質上の領域と称される（Wong et al. 2014）。この領域内のプロテアーゼ切断の病因的役割は、Ｇｒａｈａｍら（２００６年）により既報であり、結果として生じたハンチンチンフラグメントの予防または低減が有益であると認識されている。本発明において、例えば実施例１および７に示す通り、この領域に由来する特定のペプチドが、同じ領域に由来する隣接ペプチドよりもハンチンチンに対して予想外に強力にアクセス可能な抗体を誘導できることが実証されている。これらのペプチドにより作製された抗体は、本発明のアフェレシス装置における使用に好ましい。
【００７８】
さらに別の態様において、本発明は、例えば実施例５、図１７に示す通り、ｐ７５６４の配列（配列番号２）または好ましくはＭ１Ｄ１のエピトープを有するＨＴＴタンパク質のペプチドに結合可能な結合ドメインを有する本発明のアフェレシス装置における使用のためのモノクローナル抗体を提供する。好ましい態様において、該モノクローナル抗体は、例えば実施例５に記載の通り、モノクローナル抗体Ｍ１Ｄ１であることを特徴とし、それは、ＧＦＴＦＮＴＹＡ（配列番号７２）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＩＲＳＫＳＮＮＹＡＴ（配列番号７３）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、ＶＲＨＧＥＹＧＮＰＷＦＡＹ（配列番号７４）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、ＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹ（配列番号７５）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＫＶＳ（配列番号７６）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２およびＳＱＳＴＨＶＰＹＴ（配列番号７７）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３、を含む。
【００７９】
ヒトプロテオーム内に高頻度で発生するペプチド５８３ＩＶＬＤ５８６に由来する従来技術のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体（Warby et al., 2008）とは対照的に、抗体Ｍ１Ｄ１は、例えば実施例４、図１２および実施例５、図１７に示す通り、カスパーゼにより切断されたハンチンチンタンパク質に対して高い特異性を提供することにより、ヒトＲｅｆＳｅｑタンパク質データベース内でユニークである、遊離Ｃ末端アスパラギン酸を含むハンチンチン由来配列ＳＳＥＩＶＬＤからなるコアエピトープを認識する。Ｗａｒｂｙらの抗体とは対照的に、本発明の抗体はより特異的である。それはまた、“ＩＶＬＤ”とは異なるコアエピトープを有する（実施例１、図３参照）。この高い特異性はまた、“ＩＶＬＤ”（Ｗａｒｂｙによる）が、ヒトプロテオーム内で数１００回生じるが、一方、Ｍ１Ｄ１エピトープは、ＢＬＡＳＴ−ＲｅｆＳｅｑ分析によりたった１回のみであるという事実による。本発明で提供されるＭ１Ｄ１は、ユニークなＣＤＲのアイソタイプＩｇＭとは異なるクローンである。しかしながら、既に述べたように、全てのこれらの抗体は、ＨＴＴに対するその特異性のための本発明のアフェレシス装置において使用可能である。好ましい態様により、ｍＡＢの組み合わせは、本発明によって使用される。このような組み合わせは、組み合わせ／結合力（avidity）の面で有益であり得る。ＨＴＴのカスパーゼ６による切断により生じるネオエピトープに対するＭ１Ｄ１の特異性は、それが、ＨＴＴの既報の毒性のＮ末端フラグメントを特異的に除去できるため（例えば、Graham et al 2006および本明細書に引用した文献）、アフェレシスに特に有益である。
【００８０】
好ましい態様により、本発明のアフェレシス装置に使用される抗体は、以下のＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を含む：
＞Ｃ６−１７  ＶＨコンセンサス  アミノ酸配列：
ＭＧＷＳＣＩＭＬＦＬＬＳＧＴＡＧＶＬＳＥＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＥＹＴＭＨＷＶＫＱＳＨＧＫＳＬＥＷＩＧＧＩＮＰＮＮＧＧＴＲＹＮＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＶＤＲＳＳＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＳＬＤＧＲＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＡＫＴＴＡＰＳＶＦＰＬＡ（配列番号６０）
＞  Ｃ６−１７  ＶＬコンセンサス  アミノ酸配列：
ＭＶＬＭＬＬＬＬＷＶＳＧＴＣＧＤＩＶＭＳＱＳＰＳＳＬＡＶＳＡＧＥＫＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＲＴＲＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＶＹＳＣＫＱＳＹＮＬＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＳＥＱＬＴＳＧＧＡＳＶＶＣＦＬＮＮＦＹＰＫ（配列番号６１）。
【００８１】
好ましい態様により、本発明のアフェレシス装置に使用される抗体は、以下のＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を含む：
＞ＰＲＲ１３  ＶＨコンセンサス  アミノ酸配列：
ＭＧＷＳＷＶＭＬＦＬＬＳＧＴＧＧＶＬＳＥＶＱＬＱＱＳＡＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＤＦＹＭＫＷＶＫＱＳＨＧＫＧＬＥＷＩＧＤＩＤＰＫＮＧＤＴＦＹＮＱＫＦＫＧＲＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＮＳＬＴＴＥＤＳＡＶＹＹＣＡＴＹＹＧＹＴＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳＡＫＴＴＡＰＳＶＹＰＬＡＰＶＣＧＤＴＴＧＳＳＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＦ（配列番号６２）
＞ＰＲＲ１３  ＶＬコンセンサス  アミノ酸配列：
ＭＤＦＱＶＱＩＦＳＦＬＬＩＳＡＳＶＩＭＳＲＧＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＬＧＥＲＶＴＭＴＣＴＡＳＳＳＶＴＳＳＹＬＨＷＹＱＱＫＰＧＳＳＰＫＬＷＩＹＳＴＳＮＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＨＱＹＲＲＰＰＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＳＥＱＬＴＳＧＧＡＳＶＶＣＦＬＮＮＦＹＰＲ（配列番号６３）。
【００８２】
好ましい態様により、本発明のアフェレシス装置に使用される抗体は、以下のＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を含む：
＞Ｍ１Ｄ１  ＶＨコンセンサス  アミノ酸配列：
ＭＤＦＧＬＳＷＶＦＦＶＶＦＹＱＧＶＨＣＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＫＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＴＹＡＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＲＳＫＳＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＤＲＦＴＩＳＲＤＤＳＱＳＭＬＹＬＱＭＮＮＬＫＴＥＤＴＡＭＹＹＣＶＲＨＧＥＹＧＮＰＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＥＳＱＳＦＰＮＶＦＰＬ（配列番号６４）
＞Ｍ１Ｄ１  ＶＬコンセンサス  アミノ酸配列：
ＭＫＬＰＶＲＬＬＶＬＭＦＷＩＰＡＳＳＳＤＶＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＦＣＳＱＳＴＨＶＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＳＥＱＬＴＳＧＧＡＳＶＶＣＦＬＮＮＦＹＰＫ（配列番号６５）。
【００８３】
好ましい態様により、本発明の抗体は、ヒト化抗体、とりわけ以下のＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を含む抗体である：
＞  ｈＰＲＲ１３  ＶＬ（重鎖可変領域）：
ＥＩＶＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＴＡＳＳＳＶＴＳＳＹＬＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＴＳＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＨＱＹＲＲＰＰＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲ（配列番号９５）
＞  ｈＰＲＲ１３  ＶＨ（重鎖可変領域）：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＰＥＶＫＫＰＧＡＴＶＫＩＳＣＫＶＳＧＹＴＦＴＤＦＹＭＫＷＶＱＱＡＰＧＲＧＬＥＷＭＧＤＩＤＰＫＮＧＤＴＦＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＭＴＡＤＴＳＴＧＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＴＡＶＹＦＣＡＳＹＹＧＹＴＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＡＳ（配列番号９６）
＞  ｈＣ６−１７  ＶＬ（軽鎖可変領域）：
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＲＴＲＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＫＱＳＹＮＬＬＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号９７）
＞  ｈＣ６−１７  ＶＨ（重鎖可変領域）：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＥＹＴＭＨＷＶＲＱＡＰＧＲＧＬＥＷＭＧＧＩＮＰＮＮＧＧＴＲＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＲＴＡＹＶＥＬＳＲＬＴＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＳＬＤＧＲＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ］（配列番号９８）。
【００８４】
本発明は、ハンチントン病の予防および／または処置における使用のための抗体またはＨＴＴ結合分子を提供し、該抗体またはＨＴＴ結合分子またはそれに由来するフラグメント（そのＦａｂまたはＦ（ａｂ）２など）は、治療的アフェレシスにおける血漿からの可溶性または凝集ＨＴＴおよびＨＴＴ由来フラグメントの除去のための吸着剤として使用される。アフェレシスで使用するためのかかる抗体は、好ましくは、ＨＴＴの免疫原性ペプチドに結合するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である。具体的には、実施例１に示す通り、免疫原性ペプチドｐ６７７３（配列番号１）またはｐ７５４３（配列番号３）またはｐ７５６４（配列番号２）に結合し、かつ免疫学的に接近可能な領域ＰＲＲおよびカスパーゼ切断領域５８６に結合する、モノクローナル抗体または抗体由来フラグメントは、例えば実施例６  図１８に記載の通り、ｍＡＢ  ＰＲＲ１３およびｍＡＢ  Ｃ６−１７について実証されたように、アフェレシスにおいて使用するのに特に好ましい。抗体の組み合わせ、例えば本明細書に記載の抗体の２またはそれ以上の組み合わせの使用もまた、好ましい。好ましくは、本発明の抗ＨＴＴ抗体は、血液、より具体的にはヒト個体の血漿と接触させるのに適する固体担体に結合されている。
【００８５】
本発明により、血漿アフェレシスは、患者の血液が、１つの特定の成分を分離し、残りを血液循環に戻す装置を通過する医療技術として定義される。本発明により、アフェレシスは、本発明で提供される抗体またはその誘導体を使用することにより血漿から可溶性または凝集ハンチンチン、またはそれに由来するフラグメントを分離するために使用される。本発明により、アフェレシス装置は、血液または血漿の流れと接触させることができ、ＨＴＴタンパク質に結合する受容体を有する、固体カラムを含む。無菌かつパイロジェンフリーカラムは、アフェレシス担体としての使用に好ましい。本明細書中、“カラム”は、タンパク質が化学的に結合可能なマトリックス材を有する任意の形状のモジュールとして定義される。ＨＴＴタンパク質に結合し、カラムに結合されている、特異的受容体は、例えば、抗体、Ｆａｂ、Ｆｄ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖまたはＳｃＦｖフラグメントなどの抗原結合分子であり得る。カラムのマトリックス材に結合された受容体が抗体を含むとき、該抗体は、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、ラクダまたはサメなどの動物において周知の手段によって産生されたポリクローナル抗体であり得る。あるいは、カラムに結合した抗体は、抗原として、ヒトＨＴＴまたはそのフラグメントを用いて周知の手段によって産生されるモノクローナル抗体であり得る。カラムに結合される抗原結合分子が動物において産生されるとき、例えば熱処理（ＵＳ５，８１７，５２８Ａ）または当技術分野で公知の任意の他の技術によって、該動物の血清中に存在するウイルスを不活性化するのを確実にすることが、特に重要である。動物血清または抗体もしくは抗原結合分子の他の供給源が病原体を含まないことが確認されたなら、それは、好ましくは、ＵＳ５，８１７，５２８Ａに従って治療カラム産物に結合するのに適当な抗原結合分子を選択するために精製される。好適には、精製工程は、それに結合されたアルブミンを有するマトリックス材料を含む第一のカラム（“プレカラム”）上に抗原結合分子溶液を入れ、その後、それに結合されたヒトハンチンチンを含むマトリックス材料を含む第二のカラム（“ワーキングカラム”）に通して行われる。治療カラムに結合するための抗原結合分子の溶液は、所望でない物質が結合するプレカラムを通すことにより精製される。プレカラムからの溶出液は、次に、所望でない物質がカラムから流出することを可能にしながら、所望の抗原結合分子に結合するワーキングカラムに通す。全ての工程に滅菌バッファーを用いる。次いで、所望の抗原結合分子を、ＵＳ５，８１７，５２８Ａの記載または当業者に公知の任意の他の技術の通り、例えば連続するクエン酸ナトリウム／クエン酸、および酢酸ナトリウム／酢酸の溶出バッファーを使用して機能的状態でワーキングカラムから溶出する。集めた抗原結合分子は、その後、無菌条件下で無菌マトリックス材料に結合される。好ましくは、マトリックス材料は、セファロース(商標)、デキストラン、アガロース、セルロースなどの炭水化物ベースの材料である。他の好適なマトリックス材料には、ガラスからなるビーズ、繊維、膜もしくはフィルムまたはポリメタクリレート、ポリスチレンおよびポリアミドなどの合成���リマーなどの、オートクレーブマトリックスが含まれる。ビーズが使用される場合には、ビーズの直径は、アフェレシスの液相が循環することができる限り、限定されるものではない。しかしながら、流動抵抗を低減するために、５０から３０００μｍ、とりわけ２００から３０００μｍの直径を有するビーズの使用が好ましい。マトリックス材料は、ＵＳ５，８１７，５２８Ａまたは当業者に公知の任意の他の技術により、滅菌溶液を予め濯ぎ、低温でさらに蒸気処理することによって滅菌される。次いで、ＵＳ５，８１７，５２８Ａの記載または当業者に公知の任意の他の技術により、無菌かつパイロジェンフリーのマトリックス材料は、臭化シアン溶液とのインキュベーションによって活性化される。続いて、所望の抗原結合分子を、インキュベートすることによりカラムに結合させる。あるいは、活性化およびカップリングを、ＵＳ５，８１７，５２８Ａまたは当業者に公知の任意の他の技術に従って、抗原結合分子を１，１’カルボニルジイミダゾールと共にインキュベートすることにより、同時に達成することもできる。カップリング工程が完了すると、それに結合した抗体を有するマトリックス材を十分に洗浄し、シアン酸エステル、無菌性および発熱性について試験する。カラムに固定される抗体の量およびカラムサイズは制限されない。結合されたマトリックス材料はまた、総結合タンパク質、および結合タンパク質の結合活性について試験する。次いで、マトリックス材料は、滅菌され、発熱物質除去されたシラン化ガラスハウジングに無菌条件下で充填されて、無菌かつパイロジェンを含まないタンパク質を結合したカラムを形成する。アフェレシス装置を通る流速は、回路のチューブの内径を適当に選択するか、または補助ポンプを用いて制御することができる（ＵＳ４，７７０，７７４Ａ）。本発明のカラムは、吸着されたＨＴＴタンパク質またはそのフラグメントを溶出することにより繰り返し使用することができる。
【００８６】
本発明はさらに、血液または血漿の流れと接触させることができる固体担体を含むアフェレシス装置であって、該固体担体が、特異的かつ選択的にＨＴＴを結合する受容体または吸着剤を含むことを特徴とするアフェレシス装置を提供する。アフェレシス装置の担体はさらに、無菌かつパイロジェンフリーカラムであると定義される。
【００８７】
本発明により、本発明で提供されるアフェレシス装置は、ハンチントン病の予防および／または治療のための予防および／または治療装置を提供するために優先的に使用される。
【００８８】
本発明はさらに、ハンチンチン結合受容体または吸着剤を含む固体のアフェレシス担体を含むハンチントン病の予防および／または治療における使用のためのキットであって、該担体がまた無菌かつパイロジェンフリーカラムであるキットを提供する。
【００８９】
さらに別の態様において、本発明は、以下の工程を含む、哺乳動物におけるハンチントン病のインビトロでの診断法を提供する：ハンチントン病を診断するため、疾患の進行をモニターするため、あるいは、該サンプル中のＨＴＴレベルが、健常個体またはハンチントン病により遺伝的な影響を受けない個体の対照サンプルと比較して増加する場合、バイオマーカーとしてＨＴＴを使用するために、本発明の抗体、とりわけ抗体ＰＲＲ１３、Ｍ１Ｄ１およびＣ６−１７を用いて、哺乳動物のサンプル中の遊離の、凝集した、複合体化したまたはフラグメント化したＨＴＴのレベルを決定する工程。本発明の過程においては、ハンチントン病の病変もまた、血漿および他の体液および組織材料中に存在するＨＴＴの(低い)量と相関することが示された。このような（低い）ＨＴＴレベルの変化の決定は、本発明の抗体を用いて可能であることが判明したが、もちろん、ＨＴＴレベルの変化を疾患および疾患状態に相関させることは、本発明の開示後の他の技術においても可能となっている。従って、本発明のツールを用いて疾患の診断が可能となったたけでなく、疾患の処置をモニターすることも可能となった。この診断面は、本発明のアフェレシス装置を用いて処置されることが計画されているか、またはそれを用いて処置されている患者を診断し、かつモニターするために、本発明のアフェレシス技術と組み合わせることができる。
【００９０】
従って、本発明は、以下の工程を含む、哺乳動物におけるハンチントン病のインビトロでの診断のための方法を提供する：
−  抗体ＰＲＲ１３、Ｍ１Ｄ１またはＣ６−１７を単独で、または組み合わせて用いて、哺乳動物のサンプル中の野生型または変異型ハンチンチンまたはそのフラグメントのレベルを決定する工程；
−  該サンプル中の野生型または変異型ハンチンチンのレベルが、ハンチントン病に遺伝的に影響を受けない健康な個体の対照サンプルと比較して増加する場合、ハンチントン病と診断する工程；
−  そして、必要に応じて、好ましくは能動的または受動的ワクチン接種から選択される、顕在化前および顕性のハンチントン病患者のサンプル中のハンチンチンを低減する治療戦略の効果をモニタリングする工程。
【００９１】
本発明により、サンプル中の変異型ＨＴＴレベルの決定は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫アッセイ（ＥＩＡ）、樹脂およびビーズなどの他の表面および担体上の免疫沈降法、質量分析、ウェスタンブロット、またはＦＲＥＴベースのアッセイもしくは好適な造影法（例えば、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ）などの免疫組織化学分析および免疫蛍光ベースの分析ならびにフローサイトメトリーまたは当業者に公知の任意の他の技術などの免疫沈降アッセイまたは捕捉ベースのアッセイを主に伴う。
【００９２】
本発明により、サンプルは、好ましくは、脳脊髄液（ＣＳＦ）、血液、血漿、血清、尿、唾液、汗もしくは涙液、または他の体液もしくは組織抽出物および細胞抽出物、とりわけ、そこで（変異型）ハンチンチン発現および構造が変化する、脳組織、筋肉組織および血液由来細胞から得られる。
【００９３】
本発明により、哺乳動物としては、ヒトが特に好ましい。
【００９４】
さらに、本発明は、以下の工程を含む、哺乳動物における能動的または受動的ワクチン接種を表すような、ハンチントン病のステージまたはハンチンチンを標的とする新しい治療の効果をインビトロで決定するための方法を提供する：
−  抗体ＰＲＲ１３、Ｍ１Ｄ１またはＣ６−１７を単独で、または組み合わせて用いて、哺乳動物のサンプル中の野生型または変異型ハンチンチンまたはそのフラグメントのレベルを決定する工程（これらの抗体は、ハンチンチンタンパク質またはそのフラグメントを捕捉し、検出するために、次いで、生化学的手段、質量分析または他の分析法による検出のために、単独で、または組み合わせて用いられ得る）；そして
−ハンチントン病のステージを決定する工程。
【００９５】
かかる決定は、所定の患者におけるＨＴＴレベルによっても可能である：これは、所定の患者のＨＴＴレベル（の変化）を経時的に比較すること（同じ個体における相対的決定）により疾患の進行をモニターするために使用することができるだけでなく、疾患ステージの初期診断（患者のコホートと既知の疾患状態を有する患者のコホートとの相関の絶対的決定）にも使用できる。“ＨＴＴレベルの変化”は、−少なくとも長期に亘る処置における−例えば、本発明により処置された患者の血漿ＨＴＴレベルが下がる（例えば、図９に示す通り）ような、ＨＴＴレベルの低下であり得る。しかしながら、一部の患者またはある疾患ステージ（とりわけ、他の治療戦略と組み合わせた場合）において、処置の開始時での、ＨＴＴレベルの増加が生じ得る可能性もある。それにもかかわらず、これは、例えば抗体が、血漿中のタンパク質を逆説的に安定化させることができるが、同時にその病理学的活性を阻止するため、処置の成功の指標でもある。この現象は、例えば、抗ＩｇＥ処置後の逆説的なＩｇＥの増加に見られた。別の例は、安定化によって予想外の増加またはその成長促進作用をもたらす成長ホルモンに対する抗体である。
【００９６】
さらに、本発明は、以下の工程を含む、哺乳動物において、ハンチントン病の進行をモニターするため、またはハンチントン病の治療の有効性をモニターするための方法を提供する：
−  本発明のＰＲＲ１３、Ｍ１Ｄ１およびＣ６−１７を用いて、哺乳動物のサンプルにおける変異型ＨＴＴレベルを決定する工程、および
−  変異型ＨＴＴの得られたレベルを、変異型ＨＴＴレベルの最初の測定で、好ましくは疾患関連症状の診断時の測定で得られた変異型ＨＴＴのレベルと比較することにより、ハンチントン病の進行またはハンチントン病の処置の効果を決定する工程であって、ここで、ＨＴＴレベルの変化（“変化”とは、通常、上記で説明する通り、少なくとも長期的なＨＴＴレベルの低下である。）は、治療の成功の指標であり、好ましくは治療の予後目標および調整のために使用される指標である。
【００９７】
また、この方法は、治療目的としての細胞外ＨＴＴ枯渇の効果が初めて示されたため、本発明により可能になっている。
【００９８】
本発明のアフェレシス法において、“健常”と“病的”ＨＴＴ（すなわち、“野生型”または“変異型”ＨＴＴ）とを区別する抗体を使用することは重要ではない。これは、これらの２つの形態を区別できない（また、両形態に結合する）抗体もまた、アフェレシス装置において（または、本発明の診断法において）使用することができ、一般的にこれらの方法において好ましいことを意味する。
【００９９】
本発明のアフェレシス装置は、特定のハンチンチンカスパーゼ領域５８６抗体および抗血清およびｓｃＦｖ’ｓ、Ｆａｂ、Ｆｄ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦＡＢ、細胞内抗体またはＦｖ、または任意の他の形態、とりわけ本明細書に記載の好ましい形態のいずれか（単一のＨＴＴ結合分子種として、または結合活性および特異性を増加させるために２以上のＨＴＴ結合分子の組み合わせとして）などの、それらに由来する構造体を含んでいてよい。
【０１００】
本発明の特に好ましい態様において、ハンチンチン（ＨＴＴ）のカスパーゼ領域５８６を標的とする抗体または抗原結合分子は、例えば実施例２および３に示される通り、上記のハンチンチンのカスパーゼ領域５８６の少なくとも１つの免疫原性ペプチドまたは組合せを含む上記の特定のペプチドで免疫化することにより生成されるアフェレシス装置に使用される。
【０１０１】
本発明はさらに、まだこれに限定されることなく、以下の実施例および図面に記載されているが、それらに限定されることはない。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】図１は、ヒトハンチンチンのＰＲＲ領域およびカスパーゼ領域５８６（それぞれ、ＰＲＲおよびＣ６と示す）に由来するペプチドの、ＥＬＩＳＡによる、ハンチンチンの低免疫原性Ｎ末端およびポリＱ領域と比較した免疫力価分析を示す。
【０１０３】
【図２】図２は、ヒトハンチンチンのＰＲＲおよびカスパーゼ領域５８６に由来するペプチドにより誘導されたマウス免疫血清を示す。組み換え６１０アミノ酸Ｎ末端ハンチンチンフラグメントを、ＥＬＩＳＡ設定で一過的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の抽出物から捕捉し、免疫血清と共にインキュベートして、それにより誘導された抗体の結合性および特異性を示す。
【０１０４】
【図３】図３は、免疫ペプチドｐ６７７６に対して惹起された個々の免疫血清が、該免疫ペプチド（ｌｏｇＥＣ５０として示される）に対して同等の抗ペプチドＥＬＩＳＡ力価を供することを示す。
【０１０５】
【図４】図４は、図３の同じ抗血清が、タンパク質捕捉ＥＬＩＳＡ（ＯＤ；抗ｒｅｃＨＴＴ６１０）により測定された抗組み換えハンチンチンシグナルにおいて相違を示し、それ故に、免疫応答の個々の差が実証されることを示す。
【０１０６】
【図５】図５は、ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）担体もしくはＰＢＳで処理したＲ６／１マウスまたはＫＬＨ担体で処理した野生型マウスと比較したとき、ペプチドワクチン（ｐ６７７１、ｐ６７７３）で処理したＲ６／１マウスにおけるハンチンチンシグナル（ＥＭ４８）が変化しないことを示す（数字は、ハンチンチン特異的ｍＡＢ  ＥＭ４８を用いる修正した光学濃度［ＣＯＤ］を示す；エラーバー＝標準偏差；ｎ＝１０）。
【０１０７】
【図６】図６は、図５の結果とは対照的に、変異型ヒトＨＴＴ（ＥＭ４８により標識）を含むシナプトフィジンで標識したシナプス（ｍＡＢ  ＳＹ３８を用いて）の数が、ペプチド処置の有益な効果を示唆するＫＬＨで処理したＲ６／１マウスと比較した時、ペプチドワクチンで処理したＲ６／１マウス（ｐ６７７１、ｐ６７７３）において顕著に減少することを示す（ｐ＝０，００１）。
【０１０８】
【図７】図７は、ニューロン特異的なマーカーのＮｅｕＮ、Ｒ６／１マウスを用いて、ＫＬＨまたはＰＢＳで処理した対照群と比較したとき、ペプチドワクチンで処理した群（ｐ６７７１、ｐ６７７３）において、大脳基底核での有意な神経保護効果を示すことを示している。
【０１０９】
【図８】図８は、大脳基底核のＧＦＡＰ染色が、ＫＬＨおよびＰＢＳ対照それぞれと比較したとき、ペプチドワクチンで処理したＲ６／１動物（ｐ６７７１、ｐ６７７３）において、アストログリア活性化の有意でない減少を示すことを示している。
【０１１０】
【図９】図９は、単一ワクチン、組み合わせワクチンまたは担体対照（ＫＬＨ）で処理後１２カ月の時点での、それぞれｗｔおよびＹＡＣ１２８をトランスフェクトした動物におけるＦＲＥＴ分析による血漿ハンチンチン決定を示す。
【０１１１】
【図１０】図１０は、種々の示される単一および組み合わせペプチドワクチンで処理されたトランスジェニックＹＡＣ１２８マウスにおける、４、６、８、１０月および１２か月で行われた（“平均Ｍ４”〜“平均Ｍ１２”として示される）、落下までの時間（秒平均値として示される；一群当たりの動物、ｎ＝２５）を測定する処置および対照ＹＡＣ１２８マウスのロータロッド試験を示す。
【０１１２】
【図１１】図１１は、単一アミノ酸のアラニン置換を含む所定のペプチドを用いたペプチドＥＬＩＳＡによるアラニン置換スキャニングによって決定された５種のｐ６７７６ワクチンにより誘導された抗血清のコアエピトープを示す。
【０１１３】
【図１２】図１２は、ｍＡＢ  Ｍ１Ｄ１が、ｒｅｃＨＴＴ６１０よりも強く、Ｃ末端に遊離アスパラギン酸５８６を有する組み換えハンチンチンフラグメントを特異的に認識することを示す。
【０１１４】
【図１３】図１３は、ペプチドｐ６７７３で免疫化したマウス由来のハイブリドーマからの上清が、ペプチドＥＬＩＳＡにより試験したとき、９つの予めスクリーニングした候補クローンのうち７つにおいて、免疫ペプチドの強力な認識を提供することを示す。
【０１１５】
【図１４】図１４は、９つのｍＡＢ候補のうち２つのみ、図１３に示すＰＲＲ１３およびＰＲＲ１８が、ｒｅｃＨＴＴ６１０捕捉ＥＬＩＳＡにより試験したとき、組み換えハンチンチンを特異的に認識することを示す。
【０１１６】
【図１５】図１５は、ペプチドｐ７５４３免疫化マウス由来の４つの予め選択した抗ハンチンチンｍＡＢの特異性分析を示す。
【０１１７】
【図１６】図１６は、ペプチドＥＬＩＳＡによる、“切断された”ペプチドｐ７５６４に対する特異性の決定によって予め選択されたｍＡＢのスクリーニングを示す。
【０１１８】
【図１７】図１７は、ｍＡＢ  Ｍ１Ｄ１が、遊離Ｃ末端アスパラギン酸を含む少なくとも７ＡＡの長さのカスパーゼ６切断領域由来のハンチンチンペプチドを認識することを示す。
【０１１９】
【図１８】図１８は、アイソタイプ対照抗体ＩｇＧと比較した、ｍＡＢ  ＰＲＲ１３およびＣ６−１７を用いるヒト血清からの組み換えハンチンチンｒｅｃＨＴＴ６１０の特異的枯渇を示す。
【０１２０】
【図１９−２１】図１９−２１は、本発明により用いる抗体の認識能力を示す。
【０１２１】
【図２２−２３】図２２−２３は、抗体のヒト化についての例を示す。
【実施例】
【０１２２】
実施例
実施例１：ハンチンチンのＮ末端を標的とするペプチドの同定
動物の免疫化
抗ＨＴＴ抗体を誘導するペプチドを、システインを介したペプチドカップリングのための標準的な推奨手順に従って、アミン−スルフヒドリル架橋リンカーとしてＧＭＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ／Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号２２３０９）を用いてＫＬＨ担体に結合させた。結合ペプチドを、注射当たり、２００μｌ容量中に３０μｇの結合したペプチドを用いて、水酸化アルミニウムゲルアジュバント（１μｇ／ｍｌの終濃度；アルヒドロゲル；Ｂｒｅｎｎｔａｇ、カタログ番号２１６４５−５１−２）を用いて製剤した。免疫化は、一般的に、メスのＢＡＬＢ／ｃマウスに上記の製剤を用いて行った（一般的に、１群当たり５匹のマウス、１０週齢）。対照群は、非結合ＫＬＨおよび／またはＰＢＳおよびアジュバントのみを用いて免疫化した。動物を、２週間の一定の間隔で３〜６回ワクチン接種し、血漿または血清を、各接種（boost）の一日前および最後の採血にて採取した。
【０１２３】
ペプチドＥＬＩＳＡ
マウスにおけるペプチドにより誘発される免疫応答を、抗凝固剤としてヘパリンを用いてＥＬＩＳＡにより決定した。ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｂ）を、システイン含有ペプチドが安定なチオエーテル結合により結合された担体としてマレイミド活性化されたＢＳＡでコーティングした。滴定のために、血漿希釈液を添加し、ペプチド特異的抗体を、ストレプトアビジン−ＰＯＤ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１０８９１５３）と組み合わせた検出抗体としてビオチン化抗マウスＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号１０３４−０８）によって定量化し、次いで、ＡＢＴＳを用いて色素反応させた。ＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて４パラメータロジスティック曲線近似を用いて決定した。
【０１２４】
Ｎ末端ハンチンチンフラグメントｒｅｃＨＴＴ６１０を含む細胞抽出物の作製
２つのＣ末端Ｖ５タグにより伸長されたヒトハンチンチンタンパク質のＮ末端６１０アミノ酸のコーディング領域を含むＤＮＡを合成し、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ制限部位により真核発現ベクターｐＣＤＨ−ＥＦ１−ＭＣＳ  ＩＲＥＳ  Ｐｕｒｏ（ＳＢＩ；カタログ番号ＣＤ５３２Ａ１）中にクローニングして、プラスミドｐｒｅｃＨＴＴ６１０を得た。クローニング法は、制限消化およびライゲーション反応（ＮＥＢクイックリガーゼキット；カタログ番号Ｍ２２００Ｌ）、細菌の形質転換、その後のクローン選択および分析を含んで、製造者により示される通り、本質的に、標準的な分子生物学的手順に従って行った。アガロースゲルからのＤＮＡフラグメント調製物を、標準的なＤＮＡ精製キット（Quiagen；カタログ番号２７１０６）を用いて行った。ＨＥＫ２９３フリースタイル細胞（Invitrogen；カタログ番号Ｒ７９０−０７）を、製造者により示される通りに培地中で培養し、ｐｒｅｃＨＴＴ６１０（または、対照として空のベクター）をＭＡＸｒｅａｇｅｎｔ（Invitrogen；カタログ番号１６４４７−１００）およびＯｐｔｉｍｅｍ（Ｇｉｂｃｏ；カタログ番号３１９８５）を用いて一過的にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４−４８時間後に、ＮＰ−４０抽出バッファー（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  ＮＰ−４０、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８）を用いて細胞溶解して、ＨＥＫ細胞溶解物を得て、アリコートに分け、−８０℃で貯蔵した。タンパク質濃度を、Ｑｕｂｉｔ（Invitrogen；カタログ番号Ｑ３２８６６）を製造業者の指示書に従って用いて測定した。
【０１２５】
タンパク質捕捉ＥＬＩＳＡによるハンチンチンの検出
Ｎ末端フラグメントＨＴＴ６１０への抗体の結合を、５０μｌの１：５０００希釈したウサギ抗Ｖ５  ｍＡＢ（Sigma、カタログ番号Ｖ８１３７）でコーティングしたＭａｘｉｓｏｒｂ(商標)ＥＬＩＳＡプレート（Ｔｈｅｒｍｏ；カタログ番号４３９４５４）を用いて、、ブロッキングバッファー（ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０）でブロッキングし、マウス抗ＨＴＴ血清のいくつかの希釈液（１：１００；１：３００および１：９００）または対照としてｍＡＢ２１６６（１：２０００希釈；Millipore、カタログ番号ＭＡＢ２１６６）と共に室温にて１時間インキュベート後に、ＨＥＫ細胞抽出物からの組み換えハンチンチン（１００ｎｇ／μｌ総タンパク質）を捕捉して、標準的タンパク質捕捉ＥＬＩＳＡ法により決定した。ＥＬＩＳＡインキュベーション、洗浄および検出法を、標準的な手順に従って行った。
【０１２６】
血漿からの抗体の親和的精製
ヨードアセチル活性化磁気ビーズ（ＢｃＭａｇ(商標)；Biocloneカタログ番号ＦＧ−１０２）を、製造業者のプロトコルに従ってシステイン含有ペプチドと結合させた。室温で２時間血漿／ｍＡＢをインキュベーション後、ビーズを高塩緩衝液（３５０ｍＭの最終ＮａＣｌ濃度に添加された、ＰＢＳ、０，２％  トライトンＸ−１００）で洗浄し、結合抗体を酸溶出により回収した（１００ｍＭ  グリシン；ｐＨ２，８で、４溶出工程）。７５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８の終濃度で中和したのち、抗体を、１００μｌ容量のＳｐｉｎ−Ｘ  ＵＦ５００チューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号ＣＬＳ４３１４７８）に濃縮し、タンパク質濃度を、タンパク質抽出物について記載の通りに測定した。
【０１２７】
結果：
ハンチンチンペプチドで免疫化したマウスからの免疫血清は、ハンチンチンタンパク質のポリプロリンに富む領域（ＰＲＲ）およびカスパーゼ領域５８６（Ｃ６）に由来するペプチドが、一般的に、それぞれタンパク質のポリグルタミン（ポリＱ）またはＮ末端領域（最初の１７アミノ酸を含む）に由来する相当するペプチドよりもペプチドＥＬＩＳＡ分析（図１）においてより高い力価を提供することを示す。タンパク質ＥＬＩＳＡ（図２）により分析するとき、ＰＲＲ由来免疫血清およびカスパーゼ領域５８６由来免疫血清は、特異的かつ免疫原性のペプチド候補の定義を可能とする免疫ペプチドのペプチド配列に応じて、抗ハンチンチンタンパク質シグナル強度（図４）およびタンパク質特異性（図２）に違いを示す。ペプチドｐ７５６４は、Ｃ末端にアスパラギン酸を含むハンチンチン配列を特異的に認識する免疫血清を誘導し（図３）、それにより、位置５８６にてハンチンチンのカスパーゼ切断により生成された疾患特異的なハンチンチンのネオエピトープに対する手段を提供する。図１：ＥＬＩＳＡによる免疫力価分析は、ヒトハンチンチンのＰＲＲ領域およびカスパーゼ領域５８６に由来するペプチド（それぞれ、ＰＲＲおよびＣ６として示される）が、平均力価が１：１００００未満であるポリグルタミン領域またはＮ末端由来ペプチド（それぞれ、ｐｏｌｙＱおよびＮｔｅｒとして示される）で免疫化した動物とは対照的に、ペプチド免疫化したマウスにおいて１：１００００以上の平均力価を提供することを明らかにする。力価は、５つの個々の血清からの平均ＥＣ５０を表す；エラーバーは、標準偏差を示す。
【０１２８】
図２：ヒトハンチンチンのＰＲＲおよびカスパーゼ領域５８６に由来するペプチドからのマウス免疫血清を、一時的にトランスフェクトしたＨＥＫ細胞の抽出物から捕捉された組み換え６１０アミノ酸Ｎ末端ハンチンチンフラグメントに対するタンパク質捕捉ＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。抗ハンチンチン（“ｒｅｃＨＴＴ６１０”）およびバックグラウンドシグナル（“ＣＴＲＬ”）は、ペプチドＥＬＩＳＡ（図１に表示）に見られるように、均一な抗ペプチドシグナル分布にも関わらず異なるペプチド間で異なる。棒グラフは、１：１００の血清希釈で、それぞれ組み換えハンチンチン（ＯＤ［ｒｅｃＨＴＴ６１０抽出物］；薄い灰色の棒グラフ）または対照抽出物（ＯＤ［モックをトランスフェクトした対照（ｃｔｒｌ）抽出物］；濃い灰色の棒グラフ）の何れかに対して試験した、５つの集められた免疫血清それぞれのシグナルを表す。
【０１２９】
図３：免疫ペプチドｐ６７７６に対して惹起された５つの個々の免疫血清は、免疫ペプチドに対して同等の抗ペプチドＥＬＩＳＡ力価を提供する（ｌｏｇＥＣ５０として示される）。
【０１３０】
図４：抗ペプチド力価（図３に示す）とは対照的に、同じ免疫血清は、タンパク質捕捉ＥＬＩＳＡ（ＯＤ；抗ｒｅｃＨＴＴ６１０）により測定される抗組み換えハンチンチンシグナルにおいて相違を示し、免疫応答の個人差が実証される。
【０１３１】
実施例２：変異体ヒトハンチンチンの第一エクソンを過剰発現するトランスジェニックＲ６／１マウスのペプチド免疫は、大脳基底核内の神経病理学的マーカーに反映された有益な変化を提供する。
比較的強力なプロモーターの下でのヒト変異ハンチンチンのエクソン１を発現するＲ６／１マウス（Bard et al. 2014およびそこに引用される文献）は、実施例１に記載の通りに、８、１０、１４および２４週でワクチン接種を受けた。力価をモニターするために、血漿を、８、１６、２８および３２週目に採取した。
【０１３２】
免疫組織化学
免疫組織化学による分析は、本質的に、大脳基底核のタンパク質検出マーカーとして抗体ＥＭ４８、ＳＹ３８、ＧＦＡＰおよびＮｅｕＮ（Millipore、それぞれカタログ番号ＭＡＢ５３７４、ＭＡＢ５２５８、ＡＢ５８０４およびＭＡＢ３７７）を用いて、Mandler et al. 2014 [PMID: 24525765]に記載の通りに行った。
【０１３３】
結果：
ペプチドで免疫化した６月齢のトランスジェニックＲ６／１マウスの大脳基底核の免疫組織化学的分析は、変異ヒトハンチンチンの第一エクソンの過剰発現を示した。ペプチド免疫の効果は、ペプチドｐ６７７１およびｐ６７７３で免疫化ものと、対照群（ＫＬＨ、ＰＢＳ）とを組織病理学的に比較した。明確な神経保護およびおよびシナプスでのハンチンチン減少効果は、ＰＲＲ由来ワクチンでの免疫化に際して観察され、それによって、ペプチドによって誘導される抗ＨＴＴ抗体は、ＨＴＴ表現型に対するインビボでの有益な効果を提供することが可能であることが実証された。
【０１３４】
図５：ＫＬＨ担体もしくはＰＢＳで処理したＲ６／１マウスまたはＫＬＨ担体で処理した野生型マウスと比較したとき、ペプチドワクチン（ｐ６７７１、ｐ６７７３）で処理したＲ６／１マウスにおいてハンチンチンシグナル（ＥＭ４８）の変化はなかった（数字は、ハンチンチン特異的ｍＡＢ  ＥＭ４８を用いて修正した光学密度［ＣＯＤ］である；エラーバー＝標準偏差；ｎ＝１０）。
【０１３５】
図６：対照的に、変異型ヒトＨＴＴ（ＥＭ４８でマーク）を含むシナプトフィジンでマークされたシナプス（ｍＡＢ  ＳＹ３８を用いて）は、ＫＬＨで処理したＲ６／１マウスと比較したとき、ペプチドで処理したＲ６／１マウス（ｐ６７７１、ｐ６７７３）において顕著に減少した（ｐ＝０，００１）（スチューデントのｔ検定；処理群あたり、ｎ＝１０匹の動物）。数字は、ＥＭ４８シグナルと共局在するＳＹ３８陽性シナプスの比率（％）を示す（エラーバー＝標準偏差；ＣＯＤ＝修正光学密度）。
【０１３６】
図７：ニューロン特異的なマーカーＮｅｕＮを用いて、Ｒ６／１マウスは、ＫＬＨまたはＰＢＳで処理した対照群と比較したとき、ペプチド処理群（ｐ６７７１、ｐ６７７３）において大脳基底核に有意な神経保護効果を表す（それぞれ、ｐ＝０，００２およびｐ＝０，０１。スチューデントのｔ検定；ｎ＝１０）．Ｗｔ  ＫＬＨ＝野生型対照；数字は、修正光学密度（ＣＯＤ）を示す；エラーバー＝標準偏差。
【０１３７】
図８：大脳基底核のＧＦＡＰ染色は、それぞれＫＬＨおよびＰＢＳ対照と比較したとき、ペプチド処理したＲ６／１動物（ｐ６７７１、ｐ６７７３）におけるアストログリア活性化の有意でない減少を示す（ＣＯＤ＝修正光学密度；ｗｔ  ＫＬＨ＝野生型対照；エラーバー＝標準偏差）。
【０１３８】
実施例３：組合せワクチン処置は、４−１２月齢の動物におけるロータロッド試験によって測定されるように運動の改善と合わて、ＹＡＣ１２８トランスジェニックマウスにおける減少した血漿ハンチンチンレベルをもたらし、それによって、組合せペプチドによって誘導される抗ＨＴＴ抗体が、ＨＴＴ表現型に対するインビボでの有益な効果を提供することができることを実証する。
【０１３９】
ＹＡＣ１２８マウスの免疫化
全長の変異型ヒトハンチンチンを発現するＹＡＣ１２８マウス（Bard et al. 2014およびそこに引用される文献を参照のこと）およびＷＴ対照同腹子の５つのコホートは、合計１５０匹のＹＡＣ１２８および合計２５匹のＷＴから構成した。ＷＴマウスを、ＫＬＨ対照で処理した。ＹＡＣ１２８マウスを、５つの実験ペプチド処理群およびＫＬＨ対照群を含む６つの処理群に分けた。マウスを、実施例１に記載の通りに、１、２、３、６および９月齢で皮下注射によって処理した。組み合わせ免疫については、１用量当たり３０μｇの総ペプチド量を、２００μｌの用量当たり各１５μｇ＋１５μｇの２つのペプチドを組み合わせることによって維持した。
【０１４０】
ワクチン処理したＹＡＣ１２８マウスにおける血漿ハンチンチンレベルの決定
血漿ハンチンチンレベルを、Weiss et al. 2009 [PMID: 19664996]に既報の２つの検出抗体間の比をもたらすＦＲＥＴ（フェルスター共鳴エネルギー転移）ベースの検出アッセイによって決定した。抗ＨＴＴ抗体による血漿ＨＴＴの減少とＹＡＣ１２８マウスにおける関連する表現型の変化との間の相関関係は、血漿ＨＴＴ減少のための抗体ベースの治療戦略の有用性についての証拠を提供する。ペプチドにより誘導された抗体による血漿ＨＴＴの減少が有益であることが実証され、それ故に、対応するペプチド由来のモノクローナル抗体は、具体的には、本明細書で示される通り、血漿ＨＴＴを減らすために、治療的アフェレシス法のために有益であることが、期待できる。
【０１４１】
ロータロッド試験
２月齢のＹＡＣ１２８マウスを、毎分１８回転の一定のスピード（ＲＰＭ）で回転棒（Ｕｇｏ  Ｂａｓｉｌｌｅ）上にて３日連続して訓練した。マウスは、１時間の試行間間隔（inter−trial interval；ITI）で１日当たり３ｘ１２０秒の訓練試行を受けた。ロッドから落ちたマウスは、試行中に直ちに交換した。各訓練試行についての最初の落下までの時間と落下数を記録した。各マウスについて３回の試行の平均値を記録した。２から１２月齢の２月間隔での縦ロータロッド試験のために、５ＲＰＭから４０ＲＰＭで３００秒以上の加速プログラムを使用した。マウスは、１時間のＩＴＩで３回の試験を受け、最初の落下までの時間記録した。３回の試験の平均値を記録した。
【０１４２】
結果：
図９：それぞれｗｔおよびＹＡＣ１２８トランスジェニック動物における、単回免疫処理、組合せ免疫処理または担体対照（ＫＬＨ）処理の１２月後での、ＦＲＥＴ分析による血漿ハンチンチン決定。ＰＲＲおよびカスパーゼ領域５８６領域からのペプチドを用いた（それぞれ、ｐ６７７１およびｐ７５６４＆ｐ７５４３）。血漿ハンチンチンの有意な減少は、担体対照処理（ＫＬＨ）の血漿ハンチンチンレベルと比較したとき、ペプチドの組合せｐ７５４３＋ｐ７５６４またはｐ７５４３＋ｐ６７７１を用いる併用処理により達成され得る（それぞれ、ｐ＜０，００１およびｐ＜０，０１；スチューデントのｔ検定；処理群あたりｎ＝２５匹の動物）。数字は、相対単位（ＦＲＥＴ）を示す；エラーバーは標準偏差を示す。
【０１４３】
図１０：落下までの時間（秒単位の平均値として示す；一群あたりｎ＝２５匹の動物）を測定する、処理および対照ＹＡＣ１２８マウスにおけるロータロッド試験を、記載される通り、種々の単一および組合せペプチド免疫化で処置されたトランスジェニックＹＡＣ１２８マウスにおいて、４、６、８、１０および１２月（“平均Ｍ４”−“平均Ｍ１２”と示される）に行った。特に、組み合わせ群“ｐ７５４３＋７５６４”および“ｐ７５４３＋ｐ６７７１”は、それぞれ単一のペプチドで処理された群ｐ７５４３、ｐ６７７１および７５６４と比較したとき、この試験において全体的に優れた性能を示した。運動の改善は、担体対照群と比較したとき、組み合わせ群ｐ７５４３＋７５６４においてＭ４−Ｍ１０で有意に改善された（それぞれ、ｐ＜０，０３、０，０２、０，０１；スチューデントのｔ検定、ｎ＝２５）。この知見は、図９に記載の通り、血漿ハンチンチン低下と一致し、ハンチントン病患者の血液中のＨＴＴの低下が有益であることを示す。
【０１４４】
実施例４：ペプチドｐ６７７３、ｐ７５６４およびｐ７５４３での免疫化によって得られたモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体のエピトープマッピング
コアエピトープの決定
ペプチドエピトープマッピングを、実施例１に記載の通りにＥＬＩＳＡにより、あるいはStadler et al. 2008に記載のペプチドマイクロアレイを適用することにより、力価値（ＯＤ［ＥＣ５０］）の決定によってアラニン置換スキャニングを用いて行った。簡潔には、ペプチドの各位置での単一アラニン置換を含むペプチドをアレイ上にスポットし、単一の位置での置換によるシグナルの欠失を、蛍光標識された二次抗体とＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社によるＯｄｙｓｓｅｙイメージングシステムとの組み合わせによって決定した。これは、エピトープへのペプチドの各個々のアミノ酸の寄与の評価を可能にした。この方法を用いて、元の免疫化ペプチドのマッピングに加えて、各個々の位置についての単一のアラニン置換変異体もマッピングするか、またはペプチドをマイクロアレイ上にスポットし、それぞれモノクローナル抗体または免疫血清をハイブリダイズさせて試験した。アラニン置換されたペプチドから得られたシグナルが、元の免疫ペプチドからのシグナルの７０％未満まで低下したとき、それぞれのアラニン置換されたアミノ酸位置を、コアエピトープの一部として定義した。個々の血清またはｍＡＢから得られたコアエピトープ配列を以下に記載する。
【０１４５】
結果：
ポリクローナル、アフィニティー精製された抗体およびモノクローナル抗体を、ＰＲＲ領域由来のペプチド（ｐ６７７１およびｐ６７７３を含む）およびカスパーゼ領域５８６由来のペプチド（ｐ７５４３およびｐ６７７６を含む）で免疫した個々のマウスから誘導した。エピトープを、アラニンスキャニングを用いてマッピングした。簡潔には、個々の血清およびモノクローナル抗体のエピトープを、ペプチドマイクロアレイまたは常套のペプチドＥＬＩＳＡの何れかを用いて各位置についての単一アミノ酸置換を有するペプチドに対する抗体を試験することにより決定した（図１１に例示の通り）。
【０１４６】
アラニン置換スキャニングによって決定されるような、ＰＲＲ領域由来のペプチドｐ６７７１およびｐ６７７３についてのペプチドおよびエピトープアライメント：
ＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＣ．．．．．．免疫ペプチドｐ６７７１
ＬＰＱＰＰＰＱＡＱＰＬＬＰＱＰＱＰＣ．．免疫ペプチドｐ６７７３
．．．．．．．．．．ＬＬＰＱＰ．．．．．ｍＡＢ  ＰＲＲ１３についてマッピングされたエピトープ
．．．．ＰＰＱＡＱＰＬ．．．．．．．．．ポリクローナルｐ６７７３血清１についてマッピングされたエピトープ
．．．．ＰＰＱＡＱＰ．．．．．．．．．．ポリクローナルｐ６７７３血清２についてマッピングされたエピトープ
．．．．．．．．ＱＰＬＬ．．．．．．．．ポリクローナルｐ６７７３血清３についてマッピングされたエピトープ
．．．．．ＰＱＡＱＰＬＬ．．．．．．．．ポリクローナルｐ６７７３血清４についてマッピングされたエピトープ
（配列番号１、４および７７−８１）。
【０１４７】
ｐ７５４３ワクチンのペプチドおよびエピトープアライメントは、アラニン置換スキャニングによって決定されるように、ポリクローナル免疫血清およびｍＡＢ  Ｃ６−１７を誘導した。
ＧＴＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧＣ    免疫ペプチドｐ７５４３
ＱＹＬＧＬＱＩＧ      モノクローナルＡＢ  Ｃ６−１７についてマッピングされたエピトープ
ＹＬＧＬＱＩＧ      ポリクローナルｐ７５４３血清１についてマッピングされたエピトープ
ＤＮＱＹＬＧＬＱＩＧ    ポリクローナルｐ７５４３血清２についてマッピングされたエピトープ
ＤＮＱＹＬＧＬ          ポリクローナルｐ７５４３血清３についてマッピングされたエピトープ
ＹＬＧＬＱＩＧ    ポリクローナルｐ７５４３血清４についてマッピングされたエピトープ
（配列番号３および８２−８６）。
【０１４８】
アスパラギン酸５８６にわたるカスパーゼ領域５８６に由来するペプチドについてのペプチドアライメントおよびエピトープアライメント：
【０１４９】
図１１：５つのｐ６７７６により誘導された免疫血清のコアエピトープを、単一アミノ酸のアラニン置換を含む記載されるペプチドを用いるペプチドＥＬＩＳＡによりアラニン置換スキャニングによって決定した。５つの血清（濃色から淡色の棒グラフで示される）を、記載の通り、アラニン置換ペプチドにハイブリダイズさせた（ペプチド配列について、表１参照）。その結果、５匹の動物のうち２匹が、それぞれアラニン置換ペプチドｐ７７５４、ｐ７７５６、ｐ７７５７およびｐ７７５８によりシグナルの減少を示し、それによって、アミノ酸配列ＩＶＬＤを有するコアエピトープを示す。数字は、力価ＯＤ（ｌｏｇＥＣ５０）の比率を示している［Ａｌａ置換ペプチド：ｗｔ−ペプチド］。
【０１５０】
ｐ７５６４により誘導された抗血清およびｍＡＢ  Ｍ１Ｄ１のエピトープマッピングは、実施例５、図１７に提供される。
【０１５１】
図１２：ｍＡＢ  Ｍ１Ｄ１は、ｒｅｃＨＴＴ６１０よりも強力に、Ｃ末端に遊離アスパラギン酸５８６を有する組み換えハンチンチンフラグメントを特異的に認識する。タンパク質ＥＬＩＳＡを、６１０および５８６アミノ酸長の組み換えハンチンチン（それぞれ、ＨＴＴ６１０およびＨＴＴ５８６）を用いて行った（実施例１に記載の通りに）。値は、ｍＡＢ  Ｍ１Ｄ１シグナル（ＯＤ；実施例１で説明した通りの、タンパク質捕捉ＥＬＩＳＡ）と、ｍＡＢ  ２１６６対照抗体シグナルとの比を示す。値は、タンパク質ローディング対照として両フラグメント中に存在する内部エピトープを認識する対照ｍＡＢ  ２１６６に対して正規化した。
【０１５２】
実施例５：モノクローナル抗体ＰＲＲ１３、Ｃ６−１７およびＭ１Ｄ１の生成および特性化
モノクローナル抗体
モノクローナル抗体の製造および単離のために、ＣｌｏｎａＣｅｌｌ−ＨＹハイブリドーマクローニングキット（STEMCELL technologies, カタログ番号２８４１１）を製造業者の指示書に従って用いた。簡潔には、ハイブリドーマの融合を、ＨＡＴ選択下で骨髄腫細胞株ＳＰ２−０を用いて実施し、最初に、上清を、それぞれ免疫ペプチドおよびバックグラウンド決定のための無関係の対照ペプチドを用いてペプチドＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。Ｍ１Ｄ１の場合に、遊離Ｃ末端アスパラギン酸を含むペプチドｐ６７７６に対するＥＬＩＳＡを、実施例５に記載の通り、遊離Ｃ末端アスパラギン酸を含む切断されたペプチドに対する特異性を決定するために用いた。候補ｍＡＢを、記載の通りに親和的に精製し、実施例に記載の通りにタンパク質ＥＬＩＳＡによりｒｅｃＨＴＴ６１０に対して試験した。スクリーニングした融合クローンの数は、一般的に、各融合についてそれぞれ５００個であった。ＶＬおよびＶＨ領域のスクリーニングについて、融合クローンからｍＲＮＡを抽出し、オリゴ（ｄＴ）プライマーを用いて逆転写し、そして可変ドメインプライマーを用いてＰＣＲ増幅して、ＶＨおよびＶＬ領域の両方を増幅させた。ＶＨおよびＶＬ生成物を、標準的なＰＣＲクローニング法（Invitrogen、カタログ番号Ｋ４５６０−０１）を用いてクローニングし、ＴＯＰ１０細胞中に形質転換し、ＰＣＲにより陽性の形質転換体をスクリーニングした。選択したコロニーを採取し、ＡＢＩ３１３０ｘｌ遺伝子分析器でのＤＮＡ配列決定により分析した。
【０１５３】
抗体のアフィニティー精製
ｍＡＢおよびポリクローナル抗体を、ハイブリドーマ上清（ＳＮ）および血漿のそれぞれから、製造業者のプロトコルに従ってシステイン含有ペプチドが結合されているＢｃＭａｇ(商標)ヨードアセチルにより活性化した磁気ビーズ（Ｂｉｏｃｌｏｎｅ、ＦＧ−１０２）を用いて単離した。室温で２時間、血漿／ＳＮのインキュベーション後、ビーズを高塩緩衝液（ＰＢＳ、０．２％  トライトンＸ−１００、３５０ｍＭの終濃度までＮａＣｌを添加）で洗浄し、結合した抗体を酸性溶出緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号２１００４）で４回溶出した。ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８（７５ｍＭの終濃度）で中和後、溶出された抗体を濃縮し、緩衝液を、Ｓｐｉｎ−Ｘ  ＵＦ５００チューブ（Corning、ＣＬＳ４３１４７８）を用いて１００μｌ容量のＰＢＳに交換した。抗体濃度を、Ｑｕｂｉｔシステム（Invitrogen、ＣａｔＮｒ．Ｑ３２８６６）を製造業者の指示書に従って用いて測定した。
【０１５４】
結果：
抗体ＰＲＲ１３は、ペプチドｐ６７７３を免疫原として用いるハイブリドーマ技術によって生成された。ペプチドｐ６７７３は、実施例２に示す通りＲ６／１トランスジェニック動物の能動免疫において有益な神経保護効果を示し、ｐ６７７１と重複する。ＰＲＲ１３を、図１１に示す通り、ＰＲＲに由来するペプチドを認識する候補ｍＡＢを予め選択された９つから選択した。図１３に列記した候補ｍＡＢのうち、ＰＲＲ１３を、図１２に示す通り、組み換えＨＴＴ６１０にハイブリダイズしたとき、その好ましいシグナル／ノイズ比に基づいて選択した。
【０１５５】
図１３：ペプチドｐ６７７３で免疫化したマウスに由来するハイブリドーマからの上清は、ペプチドＥＬＩＳＡによって試験したとき、９つの予めスクリーニングした候補クローンのうち７つで、免疫ペプチドの強力な認識を提供する。
【０１５６】
図１４：特異的抗ペプチドシグナル（図１１）とは対照的に、９つのｍＡＢ候補のうち２つのみ、すなわちＰＲＲ１３およびＰＲＲ１８のみが、ｒｅｃＨＴＴ６１０捕捉ＥＬＩＳＡ（実施例１で説明した通り）により試験したとき、組み換えハンチンチンを特異的に認識する。これらの２つの候補は、優れたシグナル対ノイズ比（すなわち、＞＝４；計算されたｒｅＨＴＴ６１０特異的シグナル：ＨＥＫ対照抽出物）を提供し、ＰＲＲ１３を、エピトープの特徴付け（実施例４を参照）および可変鎖配列決定（以下参照）のために選択した。ＰＲＲ１３を、ＩｇＧサブタイプマウスＩｇＧ２ａとして決定した。
【０１５７】
＞ＰＲＲ１３  ＶＨ  コンセンサス  アミノ酸配列（配列番号６２）：
ＭＧＷＳＷＶＭＬＦＬＬＳＧＴＧＧＶＬＳＥＶＱＬＱＱＳＡＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＤＦＹＭＫＷＶＫＱＳＨＧＫＧＬＥＷＩＧＤＩＤＰＫＮＧＤＴＦＹＮＱＫＦＫＧＲＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＮＳＬＴＴＥＤＳＡＶＹＹＣＡＴＹＹＧＹＴＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳＡＫＴＴＡＰＳＶＹＰＬＡＰＶＣＧＤＴＴＧＳＳＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＦ
＞ＰＲＲ１３  ＶＬ  コンセンサス  アミノ酸配列（配列番号６３）：
ＭＤＦＱＶＱＩＦＳＦＬＬＩＳＡＳＶＩＭＳＲＧＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＬＧＥＲＶＴＭＴＣＴＡＳＳＳＶＴＳＳＹＬＨＷＹＱＱＫＰＧＳＳＰＫＬＷＩＹＳＴＳＮＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＨＱＹＲＲＰＰＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＳＥＱＬＴＳＧＧＡＳＶＶＣＦＬＮＮＦＹＰＲ。
【０１５８】
抗体Ｃ６−１７を、免疫原としてペプチドｐ７５４３を用いてハイブリドーマ技術によって作製した。ペプチドｐ７５４３は、実施例３に示されているように、ＹＡＣ１２８トランスジェニック動物において有益な治療効果を示した。抗ｒｅｃＨＴＴ６１０シグナルは、図１３に示すように、このスクリーニングからの４つの予め選択されたｍＡＢ間で同等であったが、シグナル対ノイズ比は、ｒｅｃＨＴＴ６１０捕捉ＥＬＩＳＡ（実施例１に記載の通りに行う）を示す図１４に示す通り、これらの候補間で有意に異なった。その特異性およびＩｇＧサブタイプ（マウスＩｇＧ２ａとして決定される）に基づいて、Ｃ６−１７を、エピトープの特徴付け（実施例４を参照）および可変鎖配列決定のために選択した。
【０１５９】
図１５：ペプチドｐ７５４３で免疫化したマウスに由来する４つの予め選択された抗ハンチンチンｍＡＢの特異性分析。４つのｍＡＢ候補体の値は、対照抽出物に対する組み換えハンチンチン特異的ＯＤ−シグナル（実施例１に記載の通りタンパク質捕捉ＥＬＩＳＡにより決定される）のシグナル対ノイズ比を示す。ｍＡＢ  Ｃ６−１７は、最良のシグナル対ノイズ比を提供する。
【０１６０】
＞Ｃ６−１７  ＶＨ  コンセンサス  アミノ酸配列（配列番号６０）：
ＭＧＷＳＣＩＭＬＦＬＬＳＧＴＡＧＶＬＳＥＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＥＹＴＭＨＷＶＫＱＳＨＧＫＳＬＥＷＩＧＧＩＮＰＮＮＧＧＴＲＹＮＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＶＤＲＳＳＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＳＬＤＧＲＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＡＫＴＴＡＰＳＶＦＰＬＡ
＞  Ｃ６−１７  ＶＬ  コンセンサス  アミノ酸配列（配列番号６１）：
ＭＶＬＭＬＬＬＬＷＶＳＧＴＣＧＤＩＶＭＳＱＳＰＳＳＬＡＶＳＡＧＥＫＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＲＴＲＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＶＹＳＣＫＱＳＹＮＬＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＳＥＱＬＴＳＧＧＡＳＶＶＣＦＬＮＮＦＹＰＫ。
【０１６１】
抗体Ｍ１Ｄ１を、免疫原としてペプチドｐ７５６４を用いてハイブリドーマ技術によって作製した。ペプチドｐ７５６４は、実施例３に記載の通り、ＹＡＣ１２８トランスジェニック動物において有益な治療効果を示す。モノクローナル抗体Ｍ１Ｄ１を、実施例１、図３に示す通り、例えばｐ６７７６などの配列に包含されるこのアスパラギン酸残基を含むペプチドに対する、Ｃ末端に遊離アスパラギン酸を含むペプチドへの結合のディファレンシャルスクリーニングによって選択した。“切断された”配列に対するその特異性に基づいて、モノクローナル抗体Ｍ１Ｄ１を、さらなるエピトープの特徴付けおよび可変鎖配列決定のために選択した。それをマウスＩｇＭと表記し、それは、カスパーゼ６またはアミノ酸位置Ｄ５８６を切断する任意の他のプロテアーゼによるタンパク質または対応するペプチド配列の切断の際に生成されるヒトハンチンチンフラグメントのネオエピトープに結合する。
【０１６２】
図１６：ペプチドＥＬＩＳＡ（実施例１で説明した通り）による“切断された”ペプチドｐ７５６４に対する特異性の決定による、予め選択されたｍＡＢのスクリーニング。例えば、Ｍ１−Ｃ２とは対照的に、ｍＡＢ  Ｍ１Ｄ１は、最も好ましいｐ７５６４対ｐ６７７６のＯＤシグナル比を示す。従って、Ｍ１Ｄ１は、位置５８６でのタンパク質分解的切断によって生成されるネオエピトープに特異的である。ｐ７５６４のＣ末端アスパラギン酸は、カスパーゼ６および可能性のある他のカスパーゼにより生成されたＣ末端切断点に対応する。従って、実施例３に示すように、治療的に有益なペプチドｐ７５６４を用いて作製されたポリクローナル抗血清と同様にこの部位での特異的切断を検出するための手段が提供される。
【０１６３】
図１７：ｍＡＢ  Ｍ１Ｄ１は、遊離Ｃ末端アスパラギン酸を含む少なくとも７ＡＡ長のカスパーゼ６切断領域からのハンチンチンペプチドを認識する。これとは対照的に、より短いペプチドまたは遊離Ｃ末端アスパラギン酸を有さないペプチドは、Ｍ１Ｄ１によって認識されないか、またはごく弱い認識であり、これにより、切断されたヒトハンチンチンタンパク質の遊離アミノ酸位置５８６などの遊離ＣＯＯＨ末端アスパラギン酸を有する切断された配列に対するこのモノクローナル抗体の特異性が実証される（棒グラフは、１ｎｇ／μｌのｍＡＢ濃度でのペプチドＥＬＩＳＡからのＯＤを示す；ペプチドの名称は左から右へ、以下の通りである：ｐ７５６４、ｐ７５６２、ｐ７５５２、ｐ７５４１、ｐ７５６７、ｐ７５６８、ｐ７６０５、ｐ６７７７）。
【０１６４】
＞Ｍ１Ｄ１  ＶＨ  コンセンサス  アミノ酸配列（配列番号６４）：
ＭＤＦＧＬＳＷＶＦＦＶＶＦＹＱＧＶＨＣＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＫＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＴＹＡＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＲＳＫＳＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＤＲＦＴＩＳＲＤＤＳＱＳＭＬＹＬＱＭＮＮＬＫＴＥＤＴＡＭＹＹＣＶＲＨＧＥＹＧＮＰＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＥＳＱＳＦＰＮＶＦＰＬ
＞Ｍ１Ｄ１  ＶＬ  コンセンサス  アミノ酸配列（配列番号６５）：
ＭＫＬＰＶＲＬＬＶＬＭＦＷＩＰＡＳＳＳＤＶＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＦＣＳＱＳＴＨＶＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＳＥＱＬＴＳＧＧＡＳＶＶＣＦＬＮＮＦＹＰＫ。
【０１６５】
実施例６−ヒト血清からのハンチンチンタンパク質の低減のためのモノクローナル抗体ＰＲＲ１３およびＣ６−１７の使用
ハンチンチンの低減
１００μｇの常磁性ストレプトアビジン被覆ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｔ１、カタログ番号６５６０１）を、２０ｎｇ／μｌのビオチニル化ｍＡＢを含む５０μｌの緩衝液中で、室温にて１時間、インキュベートした。ヒト血清をＰＢＳで１：４希釈し、そして実施例１に記載の通りにそれぞれ得られた、ｒｅｃＨＴＴ６１０およびモックをトランスフェクトした細胞からのタンパク質抽出物を５０から１００ｎｇ／μｌの最終的な抽出物濃度で用いてスパイクした。ビオチニル化ｍＡＢをストレプトアビジンビーズに結合させ、血清を含むハンチンチン細胞抽出物と共に、ＲＴにて一晩、インキュベートした。ストリンジェントなビーズ洗浄（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ）後に、モノクローナル抗体によるｒｅｃＨＴＴ６１０枯渇の有効性を確認するために、インプット血清（ｒｅｃＨＴＴ６１０を含む）、モック血清およびｒｅｃＨＴＴ６１０を枯渇させた血清を、実施例１と同様にｒｅｃＨＴＴ６１０捕捉ＥＬＩＳＡによって試験した。
【０１６６】
結果：
ｍＡｂｓ  ＰＰＲ１３およびＣ６−１７が、血漿ハンチンチンの治療的アフェレシスのための特異的な吸着剤として利用可のであることを証明するために、過剰量の組み換えハンチンチンｒｅｃＨＴＴ６１０を、健常なドナーからのヒト血清に添加し、その後、ビオチン固定化ｍＡＢ  ＰＲＲ１３、Ｃ６−１７および対照ＩｇＧのそれぞれによるエキソビボ枯渇に付した。図１８に示す通り、モノクローナル抗体ＰＲＲ１３およびＣ６−１７は、ヒト血漿からの過剰量のハンチンチンを効率的に枯渇させたが、ＩｇＧは枯渇させなかった。従って、これらの抗体は、ハンチンチンの処置のための治療アフェレシスのための便利な吸着剤を提供する。ハンチントン病の治療的アフェレシス処置におけるこれらの抗体の有用性は、ｍＡＢ  ＰＰＲ１３およびＣ６−１７が免疫ペプチドとしてｐ６７７３およびｐ７５４３を用いて作製されたという事実により、支持される。これらの標的領域由来のペプチドは、それぞれ実施例２および３に示されるように、トランスジェニック動物モデルにおけるハンチントン病表現型を減少させる抗体を誘導することができる。同様に、対応するｍＡＢは、図１８に示される通り、ＨＴＴを枯渇させることにより同様の利点をもたらすことが期待される。
【０１６７】
図１８：アイソタイプ対照抗体ＩｇＧと比較して、ｍＡＢ  ＰＲＲ１３およびＣ６−１７を用いるヒト血清からの組み換えハンチンチンｒｅｃＨＴＴ６１０の特異的枯渇。血漿中のハンチンチンシグナルの減少により反映される通り（実施例１に記載のようなタンパク質ＥＬＩＳＡにより測定される）、これらのｍＡｂは、治療アフェレシスに必要とされる、ハンチンチンを効率的に吸着し、かつ低減することができる。グラフは、枯渇前（Ｉｎｐｕｔ）、特異的抗体（ｍＡＢ  ＰＲＲ１３およびＣ６−１７）によって枯渇後、およびアイソタイプ対照抗体（ＩｇＧ）によって枯渇後に検出されたハンチンチンシグナル（ＯＤとして；タンパク質捕捉ＥＬＩＳＡにより測定）の量を表す。
【０１６８】
表１：使用に好ましいペプチド（ペプチド名／ペプチド領域／ペプチド配列（Ｃは、担体タンパク質にカップリングするためのものであり；ペプチドのＮ末端またはＣ末端に提供され得る）、遊離Ｃ末端アスパラギン酸がエピトープに必要とされるｐ７５６４、ｐ７５４１、ｐ７５５２、ｐ７５６２、ｐ７５６３、ｐ７５６７またはｐ７５６８を除く）；ペプチドリストは、名称、タンパク質領域へのマッピング（領域：Ｎｔｅｒ＝Ｎ末端、ポリＱ＝ポリグルタミンストレッチ、ＰＲＲ＝ポリプロリンに富む領域、Ｅｘ１＝エクソン１へのマッピング、Ｃ６＝カスパーゼ切断５８６領域）およびアミノ酸配列（一文字コード；Ｎｔｅｒ＞Ｃｔｅｒ；ａ＝ベータ−アラニン；ｂ＝ビオチン）を示す。
【０１６９】
実施例７−治療アフェレシスのための吸着剤としてのｍＡＢ  ＰＲＲ１３またはｍＡＢ  Ｃ６−１７の使用。
ビオチニル化抗ＨＴＴ抗体ｍＡＢ  ＰＲＲ１３、ｍＡＢ  Ｃ６−１７および無関係の対照抗体（“ｃｔｒｌ  ｍＡＢ”）を、磁気ストレプトアビジンビーズ上に固定化し、組み換えＨＴＴ６１０を発現する一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ細胞（“ＨＴＴ”と記載）からの細胞抽出物またはトランスフェクトされていないＨＥＫ細胞（“ｃｔｒｌ”と記載）からの対照抽出物でスパイクした、ＰＢＳで１：１に希釈したヒト血清と共にインキュベートした。ｍＡＢ  ＰＲＲ１３またはｍＡＢ  Ｃ６−１７によりコーティングされた吸着ビーズは、それぞれｒｅｃＨＴＴ捕捉を示した（図１９；“ＰＲＲ１３およびＣ６−１７”と記載；ｙ軸は、捕捉されたｒｅｃＨＴＴ６１０タンパク質の抗Ｖ５検出結果のＯＤを示す）。無関係のＣＴＲＬ抽出物（ｃｔｒｌ）または無関係の抗体（ｃｔｒｌ  ｍＡＢ）によりコーティングされたビーズは、バックグラウンド対照を提供した。結果として、本発明は、例えば治療アフェレシスに必要とされるような、血清または他の体液中のＨＴＴの存在に対する吸着剤としてのこれらの抗体の使用例を提供する。
【０１７０】
方法：ＨＴＴの枯渇
１００μｇの常磁性ストレプトアビジンビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｔ１、カタログ番号６５６０１）を、ＲＴにて１時間、５０μｌの緩衝液中、２０ｎｇ／μｌのビオチニル化ｍＡＢと供にインキュベートした。ヒト血清をＰＢＳで１：４に希釈し、そして実施例１に記載の通り調製した、ｒｅｃＨＴＴ６１０およびモックをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞からのタンパク質抽出物を５０から１００ｎｇ／μｌの最終的な抽出物濃度で用いてスパイクした。ビオチニル化ｍＡＢをストレプトアビジンビーズに結合させ、血清を含むｒｅｃＨＴＴ６１０抽出物と共に、ＲＴにて一晩、インキュベートした。ｒｅｃＨＴＴ６１０枯渇の有効性を確認するために、インプット血清（ｒｅｃＨＴＴ６１０を含む）、モック血清およびｒｅｃＨＴＴ６１０を枯渇させた血清を、実施例１と同様にｒｅｃＨＴＴ６１０捕捉ＥＬＩＳＡを用いて試験した。抗体をコーティングしたビーズによる血清のＲｅｃ  ＨＴＴ６１０枯渇を、以下の設定でオンビーズＥＬＩＳＡを用いて定量化した：結合したｒｅｃＨＴＴ６１０を検出するために、ビーズを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ緩衝液を用いて厳重(stringently)に洗浄し、その後、ウサギＶ５抗体（１：５０００）と共にインキュベートした。
【０１７１】
実施例８−補足例１ｂの使用：本発明のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体は、伸長した８２アミノ酸長のポリＱストレッチ（ｍｕｔＨＴＴ６１０  Ｑ８２）を含む変異型ＨＴＴ（ｍｕｔＨＴＴ）もまた認識する。
組み換えｍｕｔＨＴＴ６１０  Ｑ８２を一時的に発現するＨＥＫ細胞由来の上清を、ＥＬＩＳＡプレート上に直接コーティングし、その後、ｍＡＢ  ＰＲＲ１３（５ｎｇ／μｌ）、ポリクローナルｐ９３９５血清混合物（１：１００希釈；５匹の免疫化動物由来）および無関係のｍＡＢ（５ｎｇ／μｌ）と共にインキュベートした。結果を図２０に示す。Ｙ軸は、実施例１と同様のＥＬＩＳＡプロトコルを適用したことにより、記載の通り、ｍＡＢ  ＰＲＲ１３、５匹のｐ９３９５で免疫化した動物から集めた血清および無関係のｍＡＢを用いてＥＬＩＳＡから得られたＯＤ値を示す。ＥＬＩＳＡアッセイのバックグラウンドシグナルを決定するために、記載の通りに、ｍＡＢ  ＰＲＲ１３および集めたｐ９３９５血清を、１，２５ｎｇ／ｍｌ細胞抽出物と共にインキュベートした。
【０１７２】
実施例９：ｍＡＢ  ＰＲＲ１３およびＣ６−１７のそれぞれの配列情報に基づく組み換えＦａｂの誘導体化。
ＰＲＲ１３  ＦＡＢおよびＣ６−１７  ＦＡＢを、ＨＥＫ細胞に一過的にトランスフェクトし、上記のようにＨＴＴ６１０をトランスフェクトしたＨＥＫ細胞からの細胞抽出物を用いてＨＴＴ捕捉ＥＬＩＳＡにより試験した。ｍＡＢ  ２１６６（１：２０００）を陽性対照抗体として用いた。結果を図２１に示す。ＦＡＢ  ＰＲＲ１３およびＦＡＢ  Ｃ６−１７の結合シグナル（ｙ軸上にＯＤ値；薄い灰色の棒グラフ）は、ｘ軸上に示される通り、抗ＨＴＴ対照抗体ｍＡＢ  ２１６６と直接比較して示されている。バックグラウンドシグナルは、濃い灰色の棒グラフで示される非トランスフェクトＨＥＫ細胞に由来する対照抽出物（ＣＴＲＬ  ｅｘｔｒ）を用いて測定した。これは、いずれかのｍＡＢの誘導体が吸着剤としても使用できることを例示している。
【０１７３】
方法−ＦＡＢ発現：
抗体ＰＲＲ１３およびＣ６−１７の軽鎖および重鎖（ＩｇＧのヒンジ領域を有する、または有しない）を、上清（ＳＮ）中に組み換えＦＡＢを得るために、ＣＭＶ駆動遺伝子発現ベクターにクローニングした。ＳＮを、トランスフェクションの２４から４８時間後に集め、これらの構築物の発現および結合機能を、ペプチドＥＬＩＳＡおよびｒｅｃ  ＨＴＴ６１０  ＥＬＩＳＡにより確認した。
【０１７４】
実施例１０−抗体のヒト化
ａ）元の抗体ＰＲＲ１３およびｈＣ６−１７それぞれの抗体のヒト化を、以下のように行った：重鎖および軽鎖可変領域のプロトタイプのフレームワークを、ｈＰＲＲ１３−１から−１６のシリーズおよびｈＣ６−１７−１から−１６のシリーズそれぞれの作製に使用した。該シリーズは、図２２に示す通り、重鎖（指定されたフレームワークＨ）および／または軽鎖（指定されたフレームワークＬ）中に１つまたは複数のアミノ酸位置に修飾を含むプロトタイプの変異体を含む。数字は、以下のヒト化抗体に示される、フレームワーク領域内のアミノ酸の位置を反映している。
ｈＰＲＲ１３シリーズ軽鎖可変領域
［ＥＩＶＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＴＡＳＳＳＶＴＳＳＹＬＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＴＳＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＨＱＹＲＲＰＰＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲ］；
ｈＰＲＲ１３重鎖可変領域
［ＥＶＱＬＶＥＳＧＰＥＶＫＫＰＧＡＴＶＫＩＳＣＫＶＳＧＹＴＦＴＤＦＹＭＫＷＶＱＱＡＰＧＲＧＬＥＷＭＧＤＩＤＰＫＮＧＤＴＦＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＭＴＡＤＴＳＴＧＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＴＡＶＹＦＣＡＳＹＹＧＹＴＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＡＳ］；
ｈＣ６−１７軽鎖可変領域
［ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＲＴＲＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＫＱＳＹＮＬＬＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ］；
ｈＣ６−１７重鎖可変領域
［ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＥＹＴＭＨＷＶＲＱＡＰＧＲＧＬＥＷＭＧＧＩＮＰＮＮＧＧＴＲＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＲＴＡＹＶＥＬＳＲＬＴＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＳＬＤＧＲＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ］。
【０１７５】
方法：ヒトｖＬＣおよびｖＨＣ配列を合成し、発現ベクターｐＦＵＳＥ２ｓｓ  ＣＬｇ−ｈｋ（ＥｃｏＲＩ／ＮｈｅＩ）およびｐＦＵＳＥｓｓ  ＣＨＩｇ−ｈＧ１（ＥｃｏＲＩ／ＢｓｉＷＩ）中にクローニングした。クローニング法は、制限消化およびライゲーション反応（ＮＥＢ  Ｑｕｉｃｋ  ｌｉｇａｓｅ  ｋｉｔ；カタログ番号Ｍ２２００Ｌ）、細菌の形質転換、その後のクローン選択および分析を含む、製造者によって示されるような、本質的に標準的な分子生物学的手順に従って行った。アガロースゲルからのＤＮＡフラグメントの調製を、標準的なＤＮＡ精製キット（Quiagen；カタログ番号２７１０６）を用いて行った。ＨＥＫ２９３フリースタイル細胞（Invitrogen；カタログ番号Ｒ７９０−０７）を製造者によって示されル通りに培地中で増殖させ、表に示すようなｈｕ  ＡＢ重鎖および軽鎖ベクターの異なる組み合わせで一過的に同時トランスフェクトした。細胞培養ＳＮを、トランスフェクションの２４から４８時間後に集め、１：３０に濃縮し、その後、Ｓｐｉｎ−Ｘ  ＵＦ５００チューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＣＬＳ４３１４７８）を用いて緩衝液を交換した（ＰＢＳ）。濃縮ヒト抗体−ＳＮを、インビトロにおいてＥＬＩＳＡを用いてペプチドおよびタンパク質結合について試験した（実施例１の通り）。さらなる特徴付けを、本実施例９を通して示される通りに行った。
【０１７６】
ｂ）例としては、ａ）に記載のフレームワーク変異体（図２２参照）を含むヒト化ｍＡＢ  ＰＲＲ１３誘導体ｈＰＲＲ１３−１０、ｈＰＲＲ１３−１２およびｈＰＲＲ１３−１４（薄い灰色の棒グラフ）によるｒｅｃＨＴＴ６１０タンパク質の認識を、対照抽出物（濃い灰色の棒グラフ）と比較して、タンパク質ＥＬＩＳＡ（実施例１と同様に行った；図２３参照、ｙ軸は、ｒｅｃ  Ｈｔｔ６１０結合活性を示す［ＯＤ］）により実証することができる。
【０１７７】
【表２】
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【表３】
2017523165.tif 000004
【０１７８】
能動的ワクチン接種にとりわけ好ましい（“++ active vacc.”）
能動的ワクチン接種に好ましい（“+ active vacc.”）
ｍＡＢ作製に好ましい（“mAB generation”）
Ｃ６切断阻害に好ましい（“C6阻害”）。
【０１７９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年9月7日(2016.9.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハンチンチン（ＨＴＴ）結合分子を含む、血液または血漿と接触させることができる固体担体を含む、アフェレシス装置。
【請求項２】
ＨＴＴ結合分子が抗ＨＴＴ抗体である、請求項１に記載のアフェレシス装置。
【請求項３】
ＨＴＴ結合分子が、モノクローナル抗体またはそのＨＴＴ結合フラグメントである、請求項１に記載のアフェレシス装置。
【請求項４】
ＨＴＴ結合分子が、Ｆａｂ、Ｆｄ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、またはＳｃＦｖフラグメントから選択される、請求項３に記載のアフェレシス装置。
【請求項５】
該抗体がポリクローナル抗体である、請求項２に記載のアフェレシス装置。
【請求項６】
該抗体が、ＨＴＴのＰＲＲ領域および／またはＣ６領域に特異的である、請求項２から５のいずれか一項に記載のアフェレシス装置。
【請求項７】
該抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体またはキメラモノクローナル抗体から選択されるモノクローナル抗体である、請求項１から４および６のいずれか一項に記載のアフェレシス装置。
【請求項８】
該抗体が、ＧＹＳＦＴＤＦＹ（配列番号５４）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＩＤＰＫＮＧＤＴ（配列番号５５）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、ＡＴＹＹＧＹＴＭＤＹ（配列番号５６）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、ＳＳＶＴＳＳＹ（配列番号５７）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＳＴＳ（配列番号５８）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、およびＨＱＹＲＲＰＰＲＴ（配列番号５９）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、モノクローナル抗体である、請求項１から４および６から７のいずれか一項に記載のアフェレシス装置。
【請求項９】
該抗体がモノクローナル抗体ＰＲＲ１３である、請求項８に記載のアフェレシス装置。
【請求項１０】
該抗体が、ＧＹＴＦＴＥＹＴ（配列番号６６）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＩＮＰＮＮＧＧＴ（配列番号６７）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、ＡＳＬＤＧＲＤＹ（配列番号６８）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、ＱＳＬＬＮＳＲＴＲＫＮＹ（配列番号６９）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＷＡＳ（配列番号７０）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、およびＫＱＳＹＮＬＬＴ（配列番号７１）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、モノクローナル抗体である、請求項１から４および６から７のいずれか一項に記載のアフェレシス装置。
【請求項１１】
該抗体がモノクローナル抗体Ｃ６−１７である、請求項１０に記載のアフェレシス装置。
【請求項１２】
該抗体が、ＧＦＴＦＮＴＹＡ（配列番号７２）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＩＲＳＫＳＮＮＹＡＴ（配列番号７３）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、ＶＲＨＧＥＹＧＮＰＷＦＡＹ（配列番号７４）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、ＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹ（配列番号７５）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＫＶＳ（配列番号７６）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、およびＳＱＳＴＨＶＰＹＴ（配列番号７７）を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、モノクローナル抗体である、請求項１から４および６から７のいずれか一項に記載のアフェレシス装置。
【請求項１３】
該抗体がモノクローナル抗体Ｍ１Ｄ１である、請求項１２に記載のアフェレシス装置。
【請求項１４】
担体が、無菌かつパイロジェンフリーカラムであることを特徴とする、請求項１から１３のいずれか一項に記載のアフェレシス装置。
【請求項１５】
少なくとも２つの異なるＨＴＴ結合分子を含むことを特徴とする、請求項１から１４のいずれか一項に記載のアフェレシス装置。
【国際調査報告】
2017523165.tif 000028
2017523165.tif 000029
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