(57)【要約】  本発明は光合成細胞膜小胞を含有する光合成明反応産物生産用組成物および前記組成物を利用した光合成明反応産物の生産方法に関するものである。また、本発明は光合成細菌または藻類の細胞膜から小胞を分離する段階を含む光合成明反応単位体の製造方法に関するものである。
2017503529.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光合成細胞膜小胞（ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｖｅｓｉｃｌｅ）を含有する光合成明反応産物生産用組成物であって、前記細胞膜はラン色細菌（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）または藻類（ａｌｇａｅ）のチラコイド細胞膜（ｔｈｙｌａｋｏｉｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＴＭ）および紫色非硫黄細菌（ｐｕｒｐｌｅ  ｎｏｎ−ｓｕｌｆｕｒ  ｂａｃｔｅｒｉａ）の湾入細胞膜（ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＩＣＭ）で構成された群から選択される１つ以上の細胞膜であることを特徴とする、光合成明反応産物生産用組成物。
【請求項２】
前記光合成明反応産物は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）で構成された群から選択される１つ以上の明反応産物であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ラン色細菌は、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．）、シネココッカス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、ノストック属（Ｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．）、アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ  ｓｐ．）、グロイオバクター属（Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）およびシアノバクテリウム属（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）で構成される群から選択されるラン色細菌であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記紫色非硫黄細菌銀ロードバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）、ロドスピリリウム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｐ．）、ロドシュードモナス属（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、ロゼオバクター属（Ｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．）およびルブリビバクス属（Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘ  ｓｐ．）で構成される群から選択される紫色非硫黄細菌であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物は、ラン色細菌または藻類のチラコイド細胞膜から分離された小胞および紫色非硫黄細菌の湾入細胞膜から分離された小胞を同時に含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記ラン色細菌または藻類のチラコイド細胞膜から分離された小胞および紫色非硫黄細菌の湾入細胞膜から分離された小胞は、互いに異なる波長帯の光を吸収することを特徴とする、請求項１または請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記互いに異なる波長帯の光は可視光線および赤外線であることを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記ラン色細菌または藻類のチラコイド細胞膜から分離された小胞内クロロフィルａ（ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ  ａ、Ｃｈｌ  ａ）の濃度は、１μｇクロロフィルａ／ｍｌ〜１ｍｇクロロフィルａ／ｍｌであることを特徴とする、請求項１または請求項５に記載の組成物。
【請求項９】
前記紫色非硫黄細菌の湾入細胞膜から分離された小胞内バクテリオクロロフィルａ（ｂａｃｔｅｒｉｏｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ  ａ、Ｂｃｈｌ  ａ）の濃度は、１μｇバクテリオクロロフィルａ／ｍｌ〜１ｍｇバクテリオクロロフィルａ／ｍｌであることを特徴とする、請求項１または請求項５に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ラン色細菌または藻類のチラコイド細胞膜から分離された小胞および紫色非硫黄細菌の湾入細胞膜から分離された小胞は、直径が１〜５００ｎｍであることを特徴とする、請求項１または請求項５に記載の組成物。
【請求項１１】
請求項１または請求項５に記載された光合成明反応産物生産用組成物を含む、光合成明反応遂行単位体。
【請求項１２】
光合成細菌または藻類の細胞膜から分離された小胞（ｖｅｓｉｃｌｅ）に光を照射する段階を含む、光合成明反応産物の生産方法。
【請求項１３】
前記細胞膜はラン色細菌（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）または藻類のチラコイド細胞膜（ｔｈｙｌａｋｏｉｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＴＭ）および紫色非硫黄細菌（ｐｕｒｐｌｅ  ｎｏｎ−ｓｕｌｆｕｒ  ｂａｃｔｅｒｉａ）の湾入細胞膜（ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＩＣＭ）で構成された群から選択される１つ以上の細胞膜であることを特徴とする、請求項１２に記載の生産方法。
【請求項１４】
下記の段階を含む光合成細胞膜小胞（ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｖｅｓｉｃｌｅ）を利用した、光合成明反応産物の生産方法：
ａ）ラン色細菌（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）または藻類のチラコイド細胞膜（ｔｈｙｌａｋｏｉｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＴＭ）および紫色非硫黄細菌（ｐｕｒｐｌｅ  ｎｏｎ−ｓｕｌｆｕｒ  ｂａｃｔｅｒｉａ）の湾入細胞膜（ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＩＣＭ）で構成された群から選択される１つ以上の細胞膜から小胞を分離する段階；
ｂ）前記分離された小胞を含む光合成明反応遂行単位体を製造する段階；および
ｃ）前記光合成明反応遂行単位体に光を照射して光合成明反応産物を生産する段階。
【請求項１５】
前記光合成明反応産物は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）で構成された群から選択される１つ以上の明反応産物であることを特徴とする、請求項１２または請求項１４に記載の生産方法。
【請求項１６】
前記ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）は、追加的な酵素処理がなくてもニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）に転換可能であることを特徴とする、請求項１５に記載の生産方法。
【請求項１７】
前記ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）は追加的な酵素処理がなくてもニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）に転換可能であることを特徴とする、請求項１５に記載の生産方法。
【請求項１８】
前記小胞は、ラン色細菌または藻類のチラコイド細胞膜および紫色非硫黄細菌の湾入細胞膜から分離された小胞を同時に含むことを特徴とする、請求項１３または請求項１４に記載の生産方法。
【請求項１９】
前記光は可視光線または赤外線区間に該当する波長の光であることを特徴とする、請求項１２または請求項１４に記載の生産方法。
【請求項２０】
ラン色細菌（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）または藻類のチラコイド細胞膜（ｔｈｙｌａｋｏｉｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＴＭ）および紫色非硫黄細菌（ｐｕｒｐｌｅ  ｎｏｎ−ｓｕｌｆｕｒ  ｂａｃｔｅｒｉａ）の湾入細胞膜（ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＩＣＭ）で構成された群から選択される１つ以上の細胞膜から小胞を分離する段階を含む、光合成明反応遂行装置の製造方法。
【請求項２１】
前記細胞膜から小胞を分離する段階は下記の段階を含むことを特徴とする、請求項２０に記載の製造方法：
ａ）ラン色細菌、藻類または紫色非硫黄細菌を破砕して破砕物を製造する段階；および
ｂ）前記破砕物に含まれた細胞膜をショ糖濃度勾配（ｓｕｃｒｏｓｅ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）下に遠心分離を遂行して細胞膜から小胞を分離する段階。
【請求項２２】
前記破砕はガラスビーズ（ｇｌａｓｓ  ｂｅａｄ）を利用した破砕法または超音波を利用した破砕法（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）を使用して遂行することを特徴とする、請求項２１に記載の製造方法。
【請求項２３】
前記ショ糖濃度は５〜５０％であることを特徴とする、請求項２１に記載の製造方法。
【請求項２４】
前記遠心分離は５０，０００〜５００，０００ｇの力で２０分〜２４時間遂行することを特徴とする、請求項２１に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は光合成細胞膜小胞を含有する光合成明反応産物生産用組成物および前記組成物を利用した光合成明反応産物の持続的生産方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現代産業の構造は、化学工業の原料物質とエネルギー源の大部分を化石燃料に依存せざるを得ない。化石燃料の量は限定されており、このような化石燃料の利用は経済的問題とともに多様な環境問題を発生させている。このような状況で化石燃料に代わる新再生エネルギーに関する研究が続けられており、太陽光を利用するエネルギー生産技術は人類が依存せざるを得ない究極的なエネルギー技術の一つに該当する。光エネルギー利用技術は光エネルギーを化学エネルギーまたは電気エネルギーに変換させる技術であって、多様な方法によって実現でき得るが、その中でも生体で起きる光合成（ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）は３５億年の進化過程を経る中で現在のような光エネルギー利用機能を保有するようになった。
【０００３】
光合成は植物だけでなく、藻類（ａｌｇａｅ）および多様な微生物によって遂行される。このような光合成は電子供与体の種類によって大きく酸素発生光合成および非酸素発生光合成に区分される。酸素発生光合成は植物と藻類そしてラン色細菌（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）などで起きるが、電子供与体が水（Ｈ２Ｏ）で酸素を発生することをその特徴とする。このような酸素発生光合成は植物内の細胞小器官である葉緑体（ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ）または藻類および微生物に存在する特異的な細胞膜構造であるチラコイド細胞膜（ｔｈｙｌａｋｏｉｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）で起きる。光エネルギーは電子を興奮させて一連の電子の流れを誘導し、このような電子の流れ過程で陽子を移動させて膜内外での陽子濃度勾配を引き起こす。結果的に陽子の濃度勾配は、アデノシン三リン酸合成酵素（ＡＴＰ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）の作用を通じてアデノシン三リン酸（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＡＴＰ）の合成につながる。また、このような電子の流れは、フェレドキシン（ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ）に伝達され、最終的にニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ＋）を還元させ、還元されたニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を生成させる。このとき、生成されたＮＡＤＰＨは、ピリジンヌクレオチドトランス脱水素酵素（ｐｙｒｉｄｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｒａｎｓｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、Ｐｎｔ）の作用によってニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）にも転換され得る。
【０００４】
非酸素発生光合成は、紫色非硫黄細菌（ｐｕｒｐｌｅ  ｎｏｎ−ｓｕｌｆｕｒ  ｂａｃｔｅｒｉａ）、紫色硫黄細菌（ｐｕｒｐｌｅ  ｓｕｌｆｕｒ  ｂａｃｔｅｒｉａ）、緑色非硫黄細菌（ｇｒｅｅｎ  ｎｏｎ−ｓｕｌｆｕｒ  ｂａｃｔｅｒｉａ）、緑色硫黄細菌（ｇｒｅｅｎ  ｓｕｌｆｕｒ  ｂａｃｔｅｒｉａ）およびヘリオバクテリア（Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒｉａ）などで遂行されるものと知られており、植物および藻類で起きる酸素発生光合成とは異なり、その過程中に酸素を発生させないことをその特徴とする。特に紫色非硫黄細菌ではこのような光合成メカニズムが細胞膜の内部方向に湾入される湾入細胞膜（ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）で起きる。これら菌株の湾入細胞膜に存在する光反応中心体（ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｃｅｎｔｅｒ）では光エネルギーによる光化学反応が誘導されて循環式電子伝達（ｃｙｃｌｉｃ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）を誘導し、この過程で発生する陽子の濃度勾配をその動力としてアデノシン三リン酸合成酵素が作用し、アデノシン二リン酸（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＡＤＰ）および無機リン酸からＡＴＰを合成することになる。反面湾入細胞膜に存在する複合体Ｉ（ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｉ）により陽子が膜の反対方向に移動する逆電子伝達（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｆｌｏｗ）が起きると、アデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）を還元させ、還元されたニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を生成させることになる。その後、電子を失ったキノン（ｑｕｉｎｏｎｅ）も湾入細胞膜に存在する琥珀酸脱水素酵素（ｓｕｃｃｉｎａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ｃｏｍｐｌｅｘII）の作用によって琥珀酸がフマル酸（ｆｕｍａｒａｔｅ）に転換される過程で電子を再び得ることになる。このようなメカニズムで生成されたＮＡＤＨは酸素発生光合成でと同じようにピリジンヌクレオチドトランス脱水素酵素の作用によってＮＡＤＰＨに転換され得る。
【０００５】
ＡＴＰおよびＮＡＤ（Ｐ）Ｈは生体内で多様な生化学的反応を媒介する酵素の補酵素（ｃｏｆａｃｔｏｒ）として作用する。したがって生体はＡＴＰおよびＮＡＤ（Ｐ）Ｈの持続的な合成を必要とするが、多様な代謝物質が有するエネルギーを消耗してこのような補酵素を生産する酵素反応が知られている。解糖過程（ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ）とクエン酸回路（ｃｉｔｒｉｃ  ａｃｉｄ  ｃｙｃｌｅまたはＴＣＡ  ｃｙｃｌｅ）がその代表的な例であり、葡萄糖（ｇｌｕｃｏｓｅ）を分解する過程で関連酵素の作用によってＡＴＰおよびＮＡＤＨを生成させることができる。合わせて、生体外での生化学反応のためにＡＴＰおよびＮＡＤ（Ｐ）Ｈを合成できる方法が知られている。ＡＴＰの合成のための構成として、クレアチンリン酸（ｃｒｅａｔｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）およびクレアチンホスホキナーゼ（ｃｒｅａｔｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｋｉｎａｓｅ）の用法が知られているが、クレアチンホスホキナーゼはクレアチンリン酸のリン酸基をアデノシン二リン酸に伝達してＡＴＰを合成する反応を媒介する。すなわち、この酵素はクレアチンリン酸を消耗してＡＤＰからＡＴＰを合成することができる。また、葡萄糖−６−リン酸脱水素酵素（ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）は葡萄糖−６−リン酸を消耗して同時にＮＡＤＰ＋を還元させてＮＡＤＰＨの生成反応を媒介することができる。しかし、これらの反応を実際に有用物質生産のための生体外酵素反応に適用する場合、その反応過程でクレアチンリン酸または葡萄糖−６−リン酸を消耗し続けることになるため、費用が大きく増加してその現実性が低いという問題点がある。
【０００６】
大韓民国出願特許第１０−２０１１−７０１７１３５号で提示された発明は、ＡＴＰを再生する目的の、分離された組成物がチラコイド膜を含むことができることを提案している。しかし、チラコイド膜がＡＴＰを生産する光リン酸化（ｐｈｏｔｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）反応を遂行するためには陽子の濃度勾配が形成されることが必須であるが、膜内外が空間的に分離された構造である小胞（ｖｅｓｉｃｌｅ）形態の膜ではなく平面構造の膜自体ではこのような目的を達成できない。実際に、前記出願ではチラコイド膜を利用してＡＴＰを生成する結果を提示できていない。また、前記特許ではチラコイド膜を利用してＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生産するための方法を提示していない。
【０００７】
また、大韓民国出願特許第１０−２００８−００２１１２７号で提示された発明は、分離されたチラコイド細胞膜をその有効成分として利用するという点では本発明と類似しているが、チラコイド細胞膜に存在する膵臓の脂質分解酵素（ｌｉｐａｓｅ）に対する抑制成分を利用して人体に満腹感を与えて肥満を制御する用法を提示することをその主な構成としているという点で本願とはその内容が異なる。
【０００８】
前記した背景技術として説明された事項は、本発明の背景に対する理解増進のためのものに過ぎず、この技術分野で通常の知識を有した者にすでに知られている従来技術に該当するものと認められてはならない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】大韓民国出願特許第１０−２０１１−７０１７１３５号
【特許文献２】大韓民国出願特許第１０−２００８−００２１１２７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者らは、ラン色細菌または紫色非硫黄細菌のような光合成細菌または藻類を利用してＡＴＰおよびＮＡＤ（Ｐ）Ｈのような光合成明反応産物を持続的に生産できる方法を見出すために努力した。その結果、前記細菌または藻類の細胞膜に存在する小胞だけを分離して光合成明反応遂行機構を構成する場合、水以外の追加的な電子供与体または追加的な基質なしに持続的に光合成明反応産物を生産できることを確認することによって本発明を完成した。
【００１１】
したがって、本発明の目的は光合成細胞膜小胞を含有する光合成明反応産物生産用組成物を提供するところにある。
本発明の他の目的は光合成明反応産物生産用組成物を含む光合成明反応単位体を提供するところにある。
【００１２】
本発明のさらに他の目的は光合成細胞膜小胞を分離する段階を含む光合成明反応単位体の製造方法を提供するところにある。
【００１３】
本発明のさらに他の目的は光合成細胞膜小胞に光を照射する段階を含む光合成明反応産物の生産方法を提供するところにある。
【００１４】
本発明の他の目的および利点は下記の発明の詳細な説明、特許請求の範囲および図面によってより明確となる。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の一様態によれば、本発明は光合成細胞膜小胞（ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｖｅｓｉｃｌｅ）を含有する光合成明反応産物生産用組成物を提供する。
【００１６】
本発明の他の様態によれば、本発明は光合成細胞膜小胞に光を照射する段階を含む光合成明反応産物の生産方法を提供する。
【００１７】
本発明者らは、ラン色細菌または紫色非硫黄細菌のような光合成細菌または藻類を利用してＡＴＰおよびＮＡＤ（Ｐ）Ｈのような光合成明反応産物を持続的に生産できる方法を見出すために努力した。その結果、前記細菌または藻類の細胞膜に存在する小胞だけを分離して光合成明反応遂行機構を構成する場合、水以外の追加的な電子供与体または追加的な基質なしに持続的に光合成明反応産物を生産できることを確認した。
【００１８】
本発明で使用された用語、「光合成細胞膜小胞（ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｖｅｓｉｃｌｅ）」は、光エネルギーを利用して光合成を遂行できる光合成細菌（ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ）または藻類（ａｌｇａｅ）で小胞（ｖｅｓｉｃｌｅ）の形態で分離され得、適切な光が照射される条件で光合成の明反応を遂行できる細胞膜−蛋白質複合体を意味する。
【００１９】
本発明で使用された用語、「光合成細菌（ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ）」は、光エネルギーを利用して光合成を遂行できる細菌を意味し、電子供与体の種類によって大きく酸素発生光合成細菌および非酸素発生光合成細菌に区分することができる。
【００２０】
酸素発生光合成は、電子供与体が水（Ｈ２Ｏ）で酸素を発生することをその特徴とし、代表的には藻類（ａｌｇａｅ）またはラン色細菌（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）で前記酸素発生光合成がなされる。藻類またはラン色細菌は前記光合成を遂行する特異的な細胞膜構造であるチラコイド細胞膜（ｔｈｙｌａｋｏｉｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＴＭ）を有している。
【００２１】
本発明で使用された用語、「チラコイド細胞膜の小胞（ｖｅｓｉｃｌｅ）」は、前記チラコイド細胞膜に含まれたもので、二種類の光系（ｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍ）と電子伝達機能を有する複数の蛋白質が含まれた細胞膜単位体をいう。前記チラコイド細胞膜の小胞は一般細胞膜小胞とは異なり光エネルギーを利用してＡＴＰおよびＮＡＤＰＨを生産する能力を有する。
【００２２】
本発明の好ましい具現例によれば、前記チラコイド細胞膜小胞を収得できるラン色細菌はシネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．）、シネココッカス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、ノストック属（Ｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．）、アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ  ｓｐ．）、グロイオバクター属（Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）およびシアノバクテリウム属（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）で構成される群から選択されるラン色細菌である。
【００２３】
非酸素発生光合成は光合成過程のうちに酸素を発生させないことをその特徴とし、代表的には紫色非硫黄細菌（ｐｕｒｐｌｅ  ｎｏｎ−ｓｕｌｆｕｒ  ｂａｃｔｅｒｉａ）、紫色硫黄細菌（ｐｕｒｐｌｅ  ｓｕｌｆｕｒ  ｂａｃｔｅｒｉａ）、緑色非硫黄細菌（ｇｒｅｅｎ  ｎｏｎ−ｓｕｌｆｕｒ  ｂａｃｔｅｒｉａ）、緑色硫黄細菌（ｇｒｅｅｎ  ｓｕｌｆｕｒ  ｂａｃｔｅｒｉａ）およびヘリオバクテリア（Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒｉａ）などで前記非酸素発生光合成が遂行される。特に紫色非硫黄細菌ではこのような光合成メカニズムが細胞膜の内部方向に湾入される湾入細胞膜（ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＩＣＭ）で起きる。
【００２４】
本発明で使用された用語、「湾入細胞膜の小胞」は、前記湾入細胞膜に含まれたもので、光反応中心体と光吸収体（ｌｉｇｈｔ  ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）そして電子伝達機能を有する複数の蛋白質が含まれた細胞膜単位体をいう。前記湾入細胞膜の小胞は一般細胞膜小胞とは異なり光エネルギーを利用してＡＴＰおよびＮＡＤＨを生産する能力を有する。
【００２５】
本発明の好ましい具現例によれば、前記湾入細胞膜小胞を収得できる紫色非硫黄細菌はロードバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）、ロドスピリリウム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｐ．）、ロドシュードモナス属（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、ロゼオバクター属（Ｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．）およびルブリビバクス属（Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘ  ｓｐ．）で構成される群から選択される紫色非硫黄細菌である。
【００２６】
前記ロードバクター属紫色非硫黄細菌にはロドバクタースフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）を始めてロドバクターカプシュラタス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）、ロドバクターアピグメンタム（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ａｐｉｇｍｅｎｔｕｍ）、ロドバクターアエストゥアリ（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｓｔｕａｒｉｉ）、ロドバクターブラスチカス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｂｌａｓｔｉｃｕｓ）、ロドバクターチャングレンシス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃｈａｎｇｌｅｎｓｉｓ）、ロドバクターアゾトフォルマンス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ）、ロドバクターオバタス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｏｖａｔｕｓ）、ロドバクターグルコニカム（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｕｃｏｎｉｃｕｍ）、ロドバクタージョーリー（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｊｏｈｒｉｉ）、ロドバクターリトラリス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）、ロドバクターマリス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｒｉｓ）、ロドバクターメガロピルス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｍｅｇａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、ロドバクタービナイクマリー（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎａｙｋｕｍａｒｉｉ）、ロドバクタービリジス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｒｉｄｉｓ）、ロドバクターマシリエンシス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、ロドバクターデニトリフィカンス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、ロドバクターベルドカムピー（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｖｅｌｄｋａｍｐｉｉ）などがある。
【００２７】
前記ロドスピリリウム属紫色非硫黄細菌にはロドスピリリウムルブラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍ）をはじめとして、ロドスピリリウムセンテヌム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｃｅｎｔｅｎｕｍ）、ロドスピリリウムインジエンシス（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｉｎｄｉｅｎｓｉｓ）、ロドスピリリウムオリゼー（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｏｒｙｚａｅ）、ロドスピリリウムフォトメトリクム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｕｍ）、ロドスピリリウムモリシュイアヌム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｍｏｌｉｓｃｈｉａｎｕｍ）、ロドスピリリウムサルファレキシゲンス（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｕｌｆｕｒｅｘｉｇｅｎｓ）などがある。
【００２８】
前記ロドシュードモナス属紫色非硫黄細菌にはロドシュードモナスパルストゥリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ   ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）をはじめとして、ロドシュードモナスアキドフィリア（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｃｉｄｏｐｉｌｉａ）、ロドシュードモナスブーンケルジー（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｂｏｏｎｋｅｒｄｉｉ）、ロドシュードモナスフェカーリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、ロドシュードモナスハルウジエ（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｈａｒｗｏｏｄｉａｅ）、ロドシュードモナスジュリアリチェン（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｊｕｌｉａｌｉｃｈｅｎ）、ロドシュードモナスオリゼー（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｒｙｚａｅ）、ロドシュードモナスパンゴンゲンジス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｎｇｏｎｇｅｎｓｉｓ）、ロドシュードモナスペントテナテキシゲンス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｅｎｔｏｔｈｅｎａｔｅｘｉｇｅｎｓ）、ロドシュードモナスレノバセンシス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｒｈｅｎｏｂａｃｅｎｓｉｓ）、ロドシュードモナスサーモトレランス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）などがある。
【００２９】
前記ロゼオバクター属紫色非硫黄細菌にはロゼオバクターデニトリフィカンス（Ｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）をはじめとしてロゼオバクターリトラリス（Ｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）、ロゼオバクタープリオニチス（Ｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ｐｒｉｏｎｉｔｉｓ）などがある。
【００３０】
また、前記ルブリビバクス属紫色非硫黄細菌にはルブリビバクスゼラチノサス（Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘ  ｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓ）などがある。
【００３１】
本発明で使用された用語、「光合成明反応産物」は、前記光合成細菌または藻類が光エネルギーを化学エネルギーに転換する明反応（ｌｉｇｈｔ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を遂行した結果生産された産物を意味し、前記産物はアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）で構成された群から選択される１つ以上の明反応産物を含む。
【００３２】
本発明はチラコイド細胞膜小胞と湾入細胞膜小胞を収得し、前記分離された光合成特異的細胞膜小胞を利用した明反応を菌体外部でなされるようにして、多様な生化学反応を進行できるＡＴＰおよびＮＡＤ（Ｐ）Ｈのような光合成明反応産物を生産するエネルギー生産単位体（ｅｎｅｒｇｙ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｕｎｉｔ）として、前記光合成細菌と別途に分離された光合成明反応遂行単位体を構成しようと考案されたものである。
【００３３】
本発明で光合成が起きる条件とは、光合成細菌の明反応を誘導するための条件で適切な光（波長と光度）、温度、空気組成を必要とし、当業者であれば光合成細菌の具体的種類によって最適な条件を決めることができるはずである。例えば、藻類またはラン色細菌の光合成は約２０〜３７℃、嫌気または好気条件、約５−５００ｍｉｃｒｏ  Ｅｉｎｓｔｅｉｎ／ｍ２・ｓ（μｍｏｌｅ  ｐｈｏｔｏｎｓ／ｍ２・ｓ）の光度そして好ましくは、４００−７００ｎｍ波長の光が与えられる条件で遂行され得る。このような波長領域を満たすために蛍光灯とＬＥＤなどを光源として使用することができる。一つの実施例においては、ラン色細菌の光合成が５０ｍｉｃｒｏ  Ｅｉｎｓｔｅｉｎ／ｍ２・ｓの白色光（蛍光灯）、好気、３０℃条件で遂行される。また、紫色非硫黄細菌の光合成は約２０〜３７℃、嫌気または微細好気、約３−３００Ｗａｔｔｓ／ｍ２の光度そして好ましくは、３５０−１０００ｎｍ波長の光が与えられる条件で遂行され得る。ここで微細好気条件とは、酸素の分圧が５％以内の濃度である条件と定義することができる。このような波長領域を満たすために白熱灯とハロゲン灯（ｈａｌｌｏｇｅｎ  ｌａｍｐ）などを光源として使用することができる。他の一つの実施例においては紫色非硫黄細菌の光合成が１５Ｗａｔｔｓ／ｍ２の光、嫌気、３０℃条件で遂行される。
【００３４】
ラン色細菌または藻類の明反応機構を含むチラコイド細胞膜小胞銀光エネルギーを利用して電子を伝達する過程にて膜内外での陽子濃度勾配を作り、このような濃度勾配による運動エネルギーを動力にしてアデノシン三リン酸合成酵素の作用を通じてＡＤＰおよび無機リン酸をＡＴＰに転換させる能力を有する。また、紫色非硫黄細菌の光反応中心体では光エネルギーによる光化学反応が誘導されて循環式電子伝達を誘導することになり、この過程においても発生する陽子の濃度勾配をその動力にしてアデノシン三リン酸合成酵素がＡＴＰを合成することになる。図１は分離されたチラコイド細胞膜小胞と湾入細胞膜小胞によったＡＴＰの合成効率を測定した結果を表わす。二種類の細胞膜小胞の両方とも光が与えられていない暗条件ではＡＴＰの合成速度が光が提供される光条件に比べてその水準が低く表われ、このような結果に基づいて光が与えられた時に生成されるＡＴＰのほとんどは光合成明反応の産物であると判断することができる。
【００３５】
本願ではＡＴＰを明反応を通じて生産するためのチラコイド細胞膜小胞と湾入細胞膜小胞の最適濃度を確認した。このためにチラコイド細胞膜小胞の定量はクロロフィルａ（ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ  ａ、Ｃｈｌ  ａ）の濃度を基準とし、湾入細胞膜小胞の定量はバクテリオクロロフィルａ（ｂａｃｔｅｒｉｏｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ  ａ、Ｂｃｈｌ  ａ）の濃度を基準とした。
【００３６】
前記藻類またはラン色細菌のチラコイド細胞膜から分離された小胞内クロロフィルａの濃度は、好ましくは、１μｇクロロフィルａ／ｍｌ〜１ｍｇクロロフィルａ／ｍｌ、より好ましくは、５μｇクロロフィルａ／ｍｌ〜２００μｇクロロフィルａ／ｍｌである。万一、クロロフィルａの濃度が前記範囲未満の場合、光合成が充分に起きないため、ＡＴＰおよびＮＡＤ（Ｐ）Ｈの生産において低い生産速度を示してしまう問題点が発生し、万一、クロロフィルａの濃度が前記範囲を超過する場合、光の透過性が制限されてＡＴＰおよびＮＡＤ（Ｐ）Ｈの生産効率がそれ以上増加せずに飽和される結果につながり得る。
【００３７】
また、前記紫色非硫黄細菌の湾入細胞膜から分離された小胞内バクテリオクロロフィルａの濃度は好ましくは、１μｇバクテリオクロロフィルａ／ｍｌ〜１ｍｇバクテリオクロロフィルａ／ｍｌ、より好ましくは、５μｇバクテリオクロロフィルａ／ｍｌ〜２００μｇバクテリオクロロフィルａ／ｍｌである。万一、バクテリオクロロフィルａの濃度が前記範囲未満の場合、光合成が充分に起きないため、ＡＴＰおよびＮＡＤ（Ｐ）Ｈの生産において低い生産速度を示してしまう問題点が発生し、万一、バクテリオクロロフィルａの濃度が前記範囲を超過する場合、光の透過性が制限されてＡＴＰおよびＮＡＤ（Ｐ）Ｈの生産効率がそれ以上増加せずに飽和される結果につながり得る。
【００３８】
図２は前記方法で決定されたチラコイド細胞膜小胞と湾入細胞膜小胞の添加濃度によるＡＴＰの合成効率を示していいる。その結果、二種類の細胞膜小胞で両方ともその添加濃度の増加によるＡＴＰの合成の速度増加が観察され、細胞膜小胞の一定濃度以上でＡＴＰの合成速度が飽和されるものと示された。これは光機構が光を吸収する性質があって高濃度の光合成機構存在時に光の透過性が低くなるため、適正濃度以上の光合成細胞膜小胞の使用は非効率的であり得ることを意味する。もちろん、光を提供する条件を変化させて光エネルギーをより強く照射すれば光合成細胞膜小胞の最適使用範囲も増加するはずであるので、当業者であれば研究開発の目的に沿って光エネルギーを提供する条件を考慮して光合成細胞膜小胞の最適濃度を決めて適用することができるはずである。
【００３９】
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の組成物は藻類またはラン色細菌のチラコイド細胞膜から分離された小胞および紫色非硫黄細菌の湾入細胞膜から分離された小胞を同時に含むものである。
【００４０】
チラコイド細胞膜小胞と湾入細胞膜小胞は、吸収波長が互いに異なるため、一つの種類の小胞が吸収しない領域の光エネルギーを他の種類の小胞が吸収するので、二つの種類の光合成細胞膜小胞を同時に使用して明反応を誘導する場合、限定された空間でより高い効率でＡＴＰを合成することができるはずである。図３はこのような予想に基づいて湾入細胞膜小胞だけを使用してＡＴＰを生産する場合とチラコイド細胞膜小胞と湾入細胞膜小胞を同時に使用してＡＴＰを生産する場合のＡＴＰの合成効率を測定した結果を示している。その結果、二つの種類の光合成細胞膜小胞をすべて添加してテストした場合、ＡＴＰの合成効率が高く現れた。このような結果は二つの種類の光合成細胞膜小胞が互いに異なる特定波長の光だけを吸収するため、一つの種類の光合成細胞膜小胞を高濃度に使用するより二つの種類の光合成細胞膜小胞を同時に適用すると、より効率的なＡＴＰ合成が起き得る事実を意味する。
【００４１】
したがって、本発明の組成物が藻類またはラン色細菌のチラコイド細胞膜から分離された小胞および紫色非硫黄細菌の湾入細胞膜から分離された小胞を同時に含む場合、互いに異なる波長帯の光、例えば、可視光線波長帯および赤外線波長帯の光を同時に吸収して最高の効率で光合成明反応産物を生産することができる。
【００４２】
チラコイド細胞膜小胞で光合成過程中に起きる電子の流れは最終的にニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ＋）を還元させ、還元されたニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を生成させる。このとき、生成されたＮＡＤＰＨは膜蛋白質であるピリジンヌクレオチドトランス脱水素酵素の作用によって、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）に転換され得る。分離されたチラコイド細胞膜小胞が光が与えられる条件でＡＴＰを合成する活性とともにＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨを還元させる活性を示すかの可否を検証するために、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの還元効率を測定した。ＮＡＤＰＨの合成効率を測定するためにはチラコイド細胞膜小胞が存在する反応溶液にＮＡＤＰ＋だけを添加したが、ＮＡＤＨの合成効率を測定するためにはチラコイド細胞膜小胞が存在する反応溶液にＮＡＤ＋およびＮＡＤＰ＋をすべて添加してテストした。図４は光を照射して決定されたチラコイド細胞膜小胞によったＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの合成効率を示している。その結果、暗条件でのＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの合成速度はすべて光条件に比べて顕著に低く現れ、このような結果から生成されたＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの大部分は光を利用した光合成明反応の産物ということが分かる。図４でＮＡＤＰＨの生成効率がＮＡＤＨに比べて高く現れたため、チラコイド細胞膜小胞だけで明反応単位体を構成する場合、ＡＴＰおよびＮＡＤＰＨを消耗する生合成反応を誘導するのに最も適切に適用できるであろう。もちろん、チラコイド細胞膜小胞のヌクレオチドトランス脱水素酵素の作用によってＮＡＤＨも生成され得るので、前記酵素の活性を高める多様な追加的な努力を通じてＮＡＤＨ生産効率を増進させる方法も可能であろう。
【００４３】
湾入細胞膜では、チラコイド細胞膜とは異なり、光合成過程でＮＡＤＨを主に生産すると知られている。そしてこのとき、生成されたＮＡＤＨは膜蛋白質であるピリジンヌクレオチドトランス脱水素酵素の作用によって、ＮＡＤＰＨに転換され得る。分離された湾入細胞膜小胞が光が与えられる条件でＡＴＰを合成する活性だけを有するのではなくＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨを還元させる活性を示すかの可否を確認するために、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの還元効率をテストした。ＮＡＤＨの合成効率を測定するためには琥珀酸とＮＡＤ＋だけを反応溶液に添加したが、ＮＡＤＰＨの合成効率を測定するためには琥珀酸、ＮＡＤ＋およびＮＡＤＰ＋をすべて添加した。図５は湾入細胞膜小胞によったＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの合成効率を測定した結果を示している。暗条件でのＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの合成速度は光条件での結果に比べて顕著に低く現れ、したがって生成されたＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの大部分は光を利用した光合成明反応の産物であることが分かる。湾入細胞膜小胞では予想通りにＮＡＤＨの生成効率がＮＡＤＰＨに比べて相対的に高く現れ、したがって湾入細胞膜小胞だけで明反応単位体を構成する場合、ＡＴＰおよびＮＡＤＨを消耗する生合成反応を誘導するのに有用に使用できるものと判断される。
【００４４】
しかし、湾入細胞膜小胞がＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生成する過程でその電子供与体として琥珀酸の使用が要求されるので、外部物質を投入することなく水溶液上の水から電子を得て持続的にＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生産できるチラコイド細胞膜小胞の能力と対比される。したがって、ＡＴＰの合成のためにはチラコイド細胞膜小胞と湾入細胞膜小胞の両方とも使用することができるが、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの生産のためにはチラコイド細胞膜小胞を適用する方法がより効率的な構成であり得る。ただし、チラコイド細胞膜小胞と湾入細胞膜小胞は、吸収波長が互いに異なるため、二つの種類の光合成特異的細胞膜小胞を同時に使用して明反応を誘導すれば限定された空間でより高い効率を表わすことができるので、チラコイド細胞膜小胞と湾入細胞膜小胞を同時構成する代わりに、反応液に琥珀酸を添加しない場合、チラコイド細胞膜小胞は、ＡＴＰおよびＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生産するようになり、湾入細胞膜小胞は、ＡＴＰだけを生成することになるであろう。したがって、当業者であれば本願で提供する情報に基づいて研究開発の目的に沿ってチラコイド細胞膜小胞と湾入細胞膜小胞をそれぞれ適用して構成したり、または前記二つの種類の光合成特異的細胞膜小胞を同時に添加する構成が可能であろう。
【００４５】
本発明のさらに他の様態によれば、本発明は前記光合成明反応産物生産用組成物を含む光合成明反応遂行単位体を提供する。
【００４６】
本発明で使用された用語、「光合成明反応遂行単位体」とは、前記光合成細胞膜小胞、好ましくは、チラコイド細胞膜小胞および湾入細胞膜小胞で構成された群から選択される１つ以上の分離された小胞を含有する組成物を含む前記光合成細菌または藻類と別途に光合成明反応を遂行できる機構または装置の一つの構成単位（ｕｎｉｔ）を意味する。このような単位体が集まって一つの大きな集合体を構成することができる。
【００４７】
本発明の好ましい具現例によれば、本発明は下記の段階を含む光合成細胞膜小胞を利用した光合成明反応産物の生産方法に関するものである：
ａ）光合成細菌または藻類、好ましくは、ラン色細菌または藻類のチラコイド細胞膜および紫色非硫黄細菌の湾入細胞膜で構成された群から選択される１つ以上の細胞膜から小胞を分離する段階；
ｂ）前記分離された小胞を含む光合成明反応単位体を構成する段階；および
ｃ）前記光合成明反応単位体に光を照射して光合成明反応産物を生産する段階．
【００４８】
前記光合成明反応遂行単位体は収得された細胞膜小胞を単純に水溶液溶液に遊離して製造することもできるが、このような方法は一時的な効果を表わすのに過ぎないこともあり得る。前記のような方法で進行させる場合、反応溶液内に該当生産物が蓄積され得、これを回収する過程で明反応単位体に含まれている小胞の構造および機能が損傷する恐れがあるため、最も好ましい構成にはなれない。したがって、収得したチラコイド細胞膜小胞と湾入細胞膜小胞をそれぞれまたは共に構成するために、その空隙の大きさ（Ｐｏｒｅ  ｓｉｚｅ）がチラコイド細胞膜小胞と湾入細胞膜小胞に比べて小さい透析膜（ｄｉａｌｙｓｉｓ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）やフィルタ膜（ｆｉｌｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）など、多様な種類と形態の膜を適用する場合、前記小胞より大きさの小さい光合成明反応産物が前記透析膜やフィルタ膜空隙に透過し、小胞の構造および機能が損傷することなく前記光合成明反応産物を収得することができる。前記ラン色細菌または藻類のチラコイド細胞膜から分離された小胞および紫色非硫黄細菌の湾入細胞膜から分離された小胞は、直径が好ましくは、１〜５００ｎｍ、より好ましくは、１０〜２００ｎｍであるからこれより空隙大きさが小さい透析膜やフィルタ膜などが有用に利用され得る。
【００４９】
また、柱（ｃｏｌｕｍｎ）形態の反応槽を構成する場合、平面形態の膜を適用することができ、３次元的な反応槽を構成する場合も空間形態の膜を適用することができる。またチラコイド細胞膜小胞と湾入細胞膜小胞をそれぞれまたは共に構成して明反応単位体を製造するためには、プラスチックやビニルなどの化学物質硬化過程とともにチラコイド細胞膜小胞と湾入細胞膜小胞をその内部に固定して明反応単位体を製造するナノ単位の格子構造を利用した構成が可能となり得る。合わせてチラコイド細胞膜小胞と湾入細胞膜小胞の表面に存在する脂質や膜蛋白質の中の一つ以上と結合可能な物質を反応槽構成時に特定部分の表面に付着させることによって、チラコイド細胞膜小胞と湾入細胞膜小胞を固定して明反応単位体を製造する構成が可能となり得る。
【００５０】
本発明のさらに他の様態によれば、本発明は光合成細菌または藻類の細胞膜から小胞を分離する段階を含む光合成明反応単位体の製造方法を提供する。
【００５１】
前記小胞の分離段階は前記光合成細菌または藻類を破砕する段階および前記破砕された破砕物から小胞を分離する段階を含んで構成され得る。
【００５２】
本発明で培養された光合成細菌または藻類からチラコイド細胞膜小胞と湾入細胞膜小胞を分離するために細胞を破砕する方法には特に制限はないが、好ましくは、光合成特異的細胞膜の損傷を最小化する物理的な方法を使用した方がよい。その具体的な方法としては、ガラスビーズ（ｇｌａｓｓ  ｂｅａｄ）の強い混合による破砕法、超音波を利用した破砕法（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）、そして高圧力射出を利用した破砕法（Ｆｒｅｎｃｈ  Ｐｒｅｓｓ使用）が好ましい。反面ＳＤＳなどの洗剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）またはクロロホルム（ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）などの有機溶媒を使用して細胞を破砕する化学的な方法は細胞膜構造および機能の損傷を引き起こす恐れがあるため、好ましくない。
【００５３】
本発明で光合成細菌または藻類を破砕した後、チラコイド細胞膜小胞と湾入細胞膜小胞を分離する方法は特に制限されないが、好ましくは、ショ糖濃度勾配（ｓｕｃｒｏｓｅ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）を利用した遠心分離法（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）を使用することができ、この方法は光合成特異的細胞膜の比重による分離を誘導する。またチラコイド細胞膜小胞と湾入細胞膜小胞は、１−５００ｎｍ範囲の直径を有することができ、より好ましくは、１０−２００ｎｍ範囲の直径を有するので、この範囲よりその空隙大きさが大きいか小さい多様な種類と形態の膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）を使用する、大きさによる分離法も有用な代案となり得る。
【００５４】
ショ糖濃度勾配を利用した遠心分離法を使用する場合、前記ショ糖濃度は５〜５０％、チラコイド細胞膜小胞の場合、好ましくは、１０〜５０％、湾入細胞膜小胞の場合、好ましくは、５〜３５％のショ糖濃度勾配下で遠心分離を遂行する。前記濃度範囲未満の場合では光合成細胞膜小胞の比重よりショ糖の比重が低いので遠心分離が起きない問題が発生する可能性があり、前記範囲を超過する場合にはその比重が過度に高いため同様に遠心分離が起きない問題が発生され得る。
【００５５】
前記ショ糖濃度勾配下で、遠心分離は５０，０００〜５００，０００ｇの力で２０分〜２４時間遂行した方がよく、チラコイド細胞膜小胞の場合、好ましくは、１００，０００〜４００，０００ｇの力で１〜２０時間、湾入細胞膜小胞の場合、好ましくは、６０，０００〜２００，０００ｇの力で３０分〜１０時間遂行する。前記範囲未満の場合では、一般細胞膜と光合成細胞膜小胞がすべて上澄み液の上端に存在して分離されない問題が発生する可能性があり、前記範囲を超過する場合には一般細胞膜と光合成細胞膜小胞がすべて沈殿して分離されない問題が発生され得る。
【００５６】
医薬品、健康補助食品、化粧品原料など高付加価値生体由来素材を生体から分離して精製する場合、その費用が非常に高い場合が多い。したがって、このような有用物質をその合成酵素および前駆体を使用して試験管内で直接製造しようとする工程開発の努力が続けられてきた。しかし、多様な酵素反応は、そのエネルギー源として主にＡＴＰまたはＮＡＤ（Ｐ）Ｈを要求することになるが、化学的に合成して使用する場合はもちろん、既に知られている酵素を利用してＡＤＰおよびＮＡＤ（Ｐ）＋からＡＴＰおよびＮＡＤ（Ｐ）Ｈを再生する場合にもエネルギーの根源となる基質を供給し続けなければならないため、これらの物質を利用した工程開発には大きな費用が要求されるという問題点があった。本発明が提供するＡＴＰおよびＮＡＤ（Ｐ）Ｈ生産方法は従来の方法とは異なり、光照射条件下で光合成細胞膜小胞を利用して持続的にＡＴＰおよびＮＡＤ（Ｐ）Ｈを提供することができ、その過程で水以外には追加的な電子供与体が不要であるため、ＡＴＰまたはＮＡＤ（Ｐ）Ｈの経済的な生産が可能である。
【発明の効果】
【００５７】
本発明の特徴および利点を要約すれば次のとおりである：
（１）本発明は光合成細胞膜小胞を含有する光合成明反応産物生産用組成物および前記組成物を利用した光合成明反応産物の生産方法を提供する。
（２）また、本発明は光合成細菌または藻類の細胞膜から小胞を分離する段階を含む光合成明反応単位体の製造方法を提供する。
（３）本発明に係る組成物を利用すれば光照射条件下で光合成細胞膜小胞を利用して持続的に光合成明反応産物を提供することができ、異なる波長の光を吸収する異なる起源の小胞を組み合わせて光合成明反応単位体を構成する場合、前記光合成明反応産物の生産量を最大化することができる。また、本発明に係る光合成明反応産物の生産方法は水以外には追加的な電子供与体が不要であるため、ＡＴＰまたはＮＡＤ（Ｐ）Ｈの経済的な生産が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】チラコイド細胞膜（ＴＭ）小胞または湾入細胞膜（ＩＣＭ）小胞を利用して光を照射した条件（ｌｉｇｈｔ）と光を照射していない条件（ｄａｒｋ）でアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の生成程度をテストした結果を示している。各条件でＡＴＰの生産速度はｎｍｏｌｅ／ｍｉｎ・ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎの値で示した。
【図２】チラコイド細胞膜（ＴＭ）小胞または湾入細胞膜（ＩＣＭ）小胞を濃度別に使用して光を照射した条件（ｌｉｇｈｔ）とそうでない条件（ｄａｒｋ）でアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の生産速度をテストした結果を示している。上の図面はチラコイド細胞膜小胞によるＡＴＰの生産速度を、下の図面は湾入細胞膜小胞によるＡＴＰの生産速度をそれぞれ示す。チラコイド細胞膜小胞と湾入細胞膜小胞の濃度はそれぞれクロロフィルａ（Ｃｈｌ  ａ）およびバクテリオクロロフィルａ（Ｂｃｈｌ  ａ）の濃度を基準として決定した。各濃度条件でのＡＴＰの生産速度をｎｍｏｌｅ／ｍｉｎで示した。
【図３】吸収波長が互いに異なるチラコイド細胞膜小胞と湾入細胞膜小胞を同時に使用してアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の生産効率を増進させた結果を示している。チラコイド細胞膜小胞と湾入細胞膜小胞の濃度はそれぞれクロロフィルａ（Ｃｈｌ  ａ）およびバクテリオクロロフィルａ（Ｂｃｈｌ  ａ）の濃度を基準として決定した。チラコイド細胞膜（ＴＭ）小胞を使用しないかその使用量を４０μｇ  Ｃｈｌ  ａ／ｍｌの濃度で固定した二つの条件で湾入細胞膜（ＩＣＭ）小胞を濃度別に組み合わせた後、広い波長の光を放出する白熱灯を１５Ｗａｔｔｓ／ｍ２の強さで照射しながらＡＴＰの生産速度を測定してその値をｎｍｏｌｅ／ｍｉｎで示した。
【図４】チラコイド細胞膜小胞を利用して光を照射した条件（ｌｉｇｈｔ）とそうでない条件（ｄａｒｋ）でニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ＋）を還元させる効率を測定した結果を示している。ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの生産速度はｎｍｏｌｅ／ｍｉｎ・ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎの値で示した。
【図５】湾入細胞膜小胞を利用して光を照射した条件（ｌｉｇｈｔ）とそうでない条件（ｄａｒｋ）でニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ＋）を還元させる効率を測定した結果を示している。ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの生産速度はｎｍｏｌｅ／ｍｉｎ・ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎの値で示した。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は本発明をより具体的に説明するためのもので、本発明の要旨により本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないということは当業界で通常の知識を有した者において自明であろう。
【実施例】
【００６０】
実施例１：ラン色細菌のチラコイド細胞膜小胞分離
ラン色細菌の明反応機構を含むチラコイド細胞膜小胞を分離するために、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）ｓｐ．  ＰＣＣ  ６８０３を対象菌株として使用した。前記菌株の成長のためにその組成が一部変形されたＢＧ１１最小培地［１８ｍＭ硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ３）、０．２３ｍＭリン酸一水素カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）、０．３０ｍＭ硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ）、０．２４ｍＭ塩化カルシウム（ＣａＣｌ２２Ｈ２Ｏ）、３１μＭクエン酸（ｃｉｔｒｉｃ  ａｃｉｄ）、２３μＭクエン酸鉄アンモニウム（ｆｅｒｒｉｃ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）、０．１９ｍＭ炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３）、８．８ｍＭチオ硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｔｈｉｏｓｕｌｆａｔｅ）、４６μＭほう酸（Ｈ３ＢＯ３）、１４μＭ塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）、０．７７μＭ硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ４７Ｈ２Ｏ）、１．６μＭモリブデン酸ナトリウム（Ｎａ２ＭｏＯ４２Ｈ２Ｏ）、０．３２μＭ硫酸銅（ＣｕＳＯ４５Ｈ２Ｏ）、０．１７μＭ硝酸コバルト（ＩＩ）（Ｃｏ（ＮＯ３）２６Ｈ２Ｏ）（Ｃｒａｔｚ  ａｎｄ  Ｍｙｅｒｓ．  １９５５．  Ａｍ．  Ｊ．  ｂｏｔ．  ４２：２８２−２８７）］を使用し、ここに菌株の早い成長のためにフィルターで滅菌された葡萄糖（ｇｌｕｃｏｓｅ）を１０ｍＭとなるように添加した。シネコシスティス菌株を３００ｍｌ容量のフラスコに５０ｍｌのＢＧ１１最小培地をいれた後接種して１００ｒｐｍ（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｐｅｒ  ｍｉｎｕｔｅ）で振盪培養し、３０℃の好気性条件で成長させ、このときの光度は約５０ｍｉｃｒｏ  Ｅｉｎｓｔｅｉｎ／ｍ２・ｓとなるように蛍光灯の白色光を使用した。菌株の６００ｎｍでの吸光度が約１．０になった時、１  ｌｉｔｅｒ容量のフラスコに５００ｍｌのＢＧ１１最小培地をいれた後菌株を再び接種して前記成長条件で菌株の６００ｎｍでの吸光度が約２．０となるように培養した。
【００６１】
ラン色細菌を前記光合成条件で培養した後細胞を約７，０００ｇの力で４℃で１０分間遠心分離を遂行して収得し、収得された菌体は１ｍＭのＥＤＴＡを含有する１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５）バッファー約１０ｍｌを利用して溶解させ、氷水に入れて維持した。溶解した細胞を破砕するためにガラスビーズ（ｇｌａｓｓ  ｂｅａｄ）を使用しているが、ガラスビーズを細胞が溶けているバッファー溶液に満杯となるようにいれた後、２分間５回（合計１０分）間強く振って細胞を破砕した。その後、破砕されていない細胞、大きい細胞断片およびガラスビーズは約３，０００ｇの力で４℃で１０分間遠心分離を遂行して除去した。このとき、得られた上澄み液（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）は多様な水溶性細胞構成物質および細胞膜（小胞含む）を含むが、全体細胞膜を収得するために１００，０００ｇの力で３０分の間遠心分離を遂行した。その後全体細胞膜のうちチラコイド細胞膜小胞を純粋分離するために１０−５０％のショ糖濃度勾配（ｓｕｃｒｏｓｅ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）下で１３０，０００ｇの力で１５時間の間遠心分離を遂行した。その後分離されて現れた複数の層の中から３８−４２％のショ糖濃度に該当する部分を収得し、これを再び１８７，０００ｇの力で４５分の間遠心分離して濃縮した。前記遠心分離後に底に落ちた細胞膜小胞は、０．２５Ｍのショ糖を含有する１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５）バッファーに溶かした後、ｄｅｘｔｒａｎ  Ｔ−５００およびＰＥＧ  ３３５０を使用する層分離法（ｐｈａｓｅ  ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ、Ｎｏｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８．  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ４３６：１８９−１９２）を遂行し、下部から５番目および６番目の層からラン色細菌のチラコイド細胞膜小胞が存在して緑色を示す部分を収得して使用した。
【００６２】
実施例２：紫色非硫黄細菌の湾入細胞膜小胞分離
紫色非硫黄細菌の明反応機構を含む湾入細胞膜小胞を分離するために、ロドバクタースフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）２．４．１（ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−８０８、Ｃｏｈｅｎ−Ｂａｚｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．  １９５６．  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｃｏｍｐ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ４９：２５−６８）を対象菌株として使用し、この菌株の成長のためにシストロム最小培地［２０ｍＭリン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、３．８ｍＭ硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）、３４ｍＭ琥珀酸（ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）、０．５９ｍＭ  Ｌ−グルタミン酸（Ｌ−ｇｌｕｔａｍａｔｅ）、０．３０ｍＭ  Ｌ−アスパラギン酸（Ｌ−ａｓｐａｒｔａｔｅ）、８．５ｍＭ塩化ナトリウム、１．０５ｍＭニトリロトリ酢酸（ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、１．２ｍＭ塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２６Ｈ２Ｏ）、０．２３ｍＭ塩化カルシウム（ＣａＣｌ２７Ｈ２Ｏ）、２５μＭ硫酸第１鉄（ＦｅＳＯ４７Ｈ２Ｏ）、０．１６μＭモリブデン酸アンモニウム（（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４４Ｈ２Ｏ）、４．７μＭ  ＥＤＴＡ、３８μＭ硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ４７Ｈ２Ｏ）、９．１μＭ硫酸マンガン（ＭｎＳＯ４Ｈ２Ｏ）、１．６μＭ硫酸銅（ＣｕＳＯ４５Ｈ２Ｏ）、０．８５μＭ硝酸コバルト（ＩＩ）（Ｃｏ（ＮＯ３）２６Ｈ２Ｏ）、１．８μＭほう酸（Ｈ３ＢＯ３）、８．１μＭニコチン酸、１．５μＭチアミン塩酸塩、４１ｎｍ  ｂｉｏｔｉｎ（ｂｉｏｔｉｎ）（Ｓｉｓｔｒｏｍ．  １９６２．  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２８：６０７−６１６）］を使用した。ロドバクタースフェロイデス菌株を３００ｍｌ容量のフラスコに３０ｍｌのシストロム最小培地をいれた後接種して２５０ｒｐｍで振盪培養しながら３０℃の好気性条件で成長させた。菌株の６６０ｎｍでの吸光度が約１．０になった時、１  ｌｉｔｅｒ容量の透明容器に酸素が入らないようにシストロム最小培地を満杯にさせて菌株を接種して１５Ｗａｔｔｓ／ｍ２光度の白熱灯光が与えられる嫌気条件で菌株の６６０ｎｍでの吸光度が約２．０となるように培養した。
【００６３】
前記光合成条件で培養されたロドバクタースフェロイデス細胞は、約７，０００ｇの力で４℃で１０分間遠心分離を遂行して収得し、収得された菌体は１ｍＭのＥＤＴＡを含有する１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５）バッファー約１０ｍｌを利用して溶解させ、氷水に入れて維持した。溶解された細胞を破砕するために５分ずつ４回（合計２０分）間超音波を利用した細胞破砕法（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）を遂行した。その後、破砕されなかった細胞および大きい細胞断片は約１０，０００ｇの力で４℃で３０分間遠心分離を遂行して除去した。このとき、得られた上澄み液は多様な水溶性細胞構成物質および細胞膜（小胞含む）を含むが、湾入細胞膜を純粋分離するために５−３５％のショ糖濃度勾配下で９６，０００ｇの力で４時間の間遠心分離を遂行した。その後、分離されて現れた複数の層の中からロドバクタースフェロイデスの光合成機構が含まれた湾入細胞膜小胞が存在して茶色を示す部分を収得して使用した。
【００６４】
実施例３：前記光合成細胞膜小胞を利用したアデノシン三リン酸の生成確認
ラン色細菌の明反応機構を含むチラコイド細胞膜小胞は、光が与えられる条件で水から出てきた電子を伝達する過程で陽子を移動させて膜内外での陽子濃度勾配を作り、このような濃度勾配による運動エネルギーを動力にしてアデノシン三リン酸合成酵素の作用を通じてＡＤＰおよび無機リン酸をＡＴＰに転換させる。これと類似してロドバクタースフェロイデスの光反応中心体では光エネルギーによる光化学反応が誘導され、循環式電子伝達を誘導することになり、この過程で発生する陽子の濃度勾配をその動力にしてアデノシン三リン酸合成酵素が作用してＡＴＰを合成することになる。したがって、本実施例では、分離されたチラコイド細胞膜小胞と湾入細胞膜小胞が光が与えられる条件で明反応を遂行する活性を示すかの可否を確認するために、ＡＴＰの合成効率をテストした。ＡＴＰの生成効率はＡＴＰを選択的に検出できる多様な方法（主にＡＴＰを消耗してその動力で透明な基質を転換させる酵素反応を使用して特定波長に対する吸光度または蛍光を有する最終生産物の生成を誘導し、これを測定することでＡＴＰを定量する方法が使用される）により測定することができるため、当業者であれば研究開発の目的に沿って最適な方法を決定することができるであろうが、本実施例では、ＡＴＰを定量的に測定する方法としてＡＴＰ測定ｋｉｔ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）を使用した。
【００６５】
反応のために、５０ｍＭ濃度のＰＢＳバッファー（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、ｐＨ  ７．４）を使用し、基質としてはＡＤＰを１ｍＭの濃度となるように添加した３０℃条件で反応を進めた。使用したチラコイド細胞膜小胞と湾入細胞膜小胞が含有する蛋白質の水準を定量してその蛋白質濃度を決定し、数回のＡＴＰ生産速度測定値は二つの種類の細胞膜小胞が含有した蛋白質の濃度値で標準化した。ＡＴＰの合成程度は５７０ｎｍでの吸光度の変化を通じて測定し、知っている多様な濃度のＡＴＰを使用して同じ実験を進めて標準曲線（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｃｕｒｖｅ）を製作し、測定された吸光度値をＡＴＰの生成量に転換させることができた。このように決定されたＡＴＰの生成量を時間による値で示してＡＴＰの生産速度を単位蛋白質および分当たり生成されるＡＴＰのｎｍｏｌｅ値で表現した。図１は、前記方法で決定されたチラコイド細胞膜小胞と湾入細胞膜小胞によるＡＴＰの合成効率を示している。二つの種類の細胞膜小胞の両方とも光が与えられていない暗条件でのＡＴＰの合成速度は光が提供される光条件に比べて顕著に低く現れ、これは本実施例で生成されたＡＴＰの大部分は光を利用した光合成明反応の産物であると判断することができる。本実施例でチラコイド細胞膜小胞のＡＴＰ合成効率を測定するために５０ｍｉｃｒｏ  Ｅｉｎｓｔｅｉｎ／ｍ２・ｓ光度の蛍光灯光を使用し、湾入細胞膜小胞のＡＴＰ合成効率を測定するためには１５Ｗａｔｔｓ／ｍ２光度の白熱灯光を使用した。
【００６６】
実施例４：前記光合成細胞膜小胞の濃度によるアデノシン三リン酸生成効率試験
ＡＴＰを明反応を通じて生産するためのチラコイド細胞膜小胞と湾入細胞膜小胞の最適濃度を確認しようとした。このために分離されたチラコイド細胞膜小胞と湾入細胞膜小胞を多様な濃度で添加した後、実施例３と同じ方法でＡＴＰの合成速度を測定した。本実施例でチラコイド細胞膜小胞の定量は、クロロフィルａ（ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ  ａ）の濃度を基準とし、湾入細胞膜小胞の定量はバクテリオクロロフィルａ（ｂａｃｔｅｒｉｏｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ  ａ）の濃度を基準とした。分離されたチラコイド細胞膜小胞と湾入細胞膜小胞の一部をアセトン：メタノール（ａｃｅｔｏｎｅ：ｍｅｔｈａｎｏｌ、７：２）混合溶媒で抽出すると、細胞膜小胞から色素であるクロロフィルａまたはバクテリオクロロフィルａを抽出することができる。このとき、約６６０ｎｍの波長で測定されるクロロフィルａと約７８０ｎｍの波長で測定されるバクテリオクロロフィルａの吸光度を測定した後、すでに知っている濃度のクロロフィルａまたはバクテリオクロロフィルａを測定して製作した標準曲線に代入することによって分離されたチラコイド細胞膜小胞と湾入細胞膜小胞の濃度を定量した。
【００６７】
図２は前記方法で決定されたチラコイド細胞膜小胞と湾入細胞膜小胞の添加濃度によるＡＴＰの合成効率を示している。その結果、二つの種類の細胞膜小胞の両方とも光条件でその添加濃度の増加によるＡＴＰの合成の速度増加が観察され、暗条件ではＡＴＰの合成程度が低く現れた。チラコイド細胞膜小胞では約８０μｇクロロフィルａ／ｍｌの濃度でＡＴＰの合成速度が飽和され、湾入細胞膜小胞の場合にも同じように約１００μｇバクテリオクロロフィルａ／ｍｌの濃度でＡＴＰの合成速度が飽和されるものと示された。これは高濃度の光機構存在時に光機構が光を吸収して光の透過性が低くなるため、適正濃度以上の光合成細胞膜小胞の使用は非効率的であり得ることを意味する。もちろん、光を提供する条件を変化させて光エネルギーをより強く照射すれば光合成細胞膜小胞添加の最適濃度範囲も大きくなるのであろうから、当業者であれば研究開発の目的に沿って光エネルギーを提供する条件を考慮して光合成細胞膜小胞の使用濃度を決定できるはずである。
【００６８】
実施例５：吸収波長が互いに異なる二つの種類の光合成細胞膜小胞を利用したアデノシン三リン酸生成効率試験
チラコイド細胞膜小胞は、６６０ｎｍの波長周辺とより短い短波長を吸収する反面、湾入細胞膜小胞は、直接的には８００−９００ｎｍ範囲波長の光エネルギーを光合成に利用する。したがって、この二つの種類の光合成細胞膜小胞を同時に使用して明反応を誘導する場合、吸収波長が互いに異なる部分の光エネルギーを吸収しないため、互いの光合成効率に影響を及ぼさないはずであろうから、限定された空間でより高い効率でＡＴＰを合成できるものと予想された。これを確認するために分離されたチラコイド細胞膜小胞の濃度を固定した状態で湾入細胞膜小胞を多様な濃度で添加した後、実施例３と同じ方法でＡＴＰの合成速度を測定した。二つの種類の光合成細胞膜小胞のＡＴＰ合成効率を同時に測定するために光源の波長範囲がより広い白熱灯光を１５Ｗａｔｔｓ／ｍ２の強さで使用した。図３はこのような予想に基づいてチラコイド細胞膜小胞だけを使用してＡＴＰを生産する場合とチラコイド細胞膜小胞と湾入細胞膜小胞を同時に使用してＡＴＰを生産する場合のＡＴＰの合成効率を測定した結果を示している。湾入細胞膜小胞の濃度が６０−８０μｇバクテリオクロロフィルａ／ｍｌの濃度を越える条件からは、添加された光機構の濃度によりＡＴＰの合成速度がそれ以上増加せずにその値が飽和されたが、ＡＴＰの合成速度が飽和されなかった低い濃度の添加条件でだけでなく飽和条件の濃度で二つの種類の光合成細胞膜小胞を添加してテストした場合にＡＴＰの合成効率がより高く現れた。このような結果は二つの種類の光合成細胞膜小胞が互いに異なる特定波長の光だけを吸収するため、一つの種類の光合成細胞膜小胞を高濃度で使用してＡＴＰの合成速度が飽和される現象を止揚し、二つの種類の光合成細胞膜小胞を同時に適用すればより効率的なＡＴＰ合成が起き得ることを意味する。
【００６９】
実施例６：チラコイド細胞膜小胞を利用したニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）の還元試験
チラコイド細胞膜小胞で光の存在時に起きる電子の流れは、フェレドキシンに伝達され、最終的にニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ＋）を還元させ、還元されたニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を生成させる。このとき、生成されたＮＡＤＰＨは細胞膜小胞に存在すると推定されるピリジンヌクレオチドトランス脱水素酵素の作用によって、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）に転換され得る。このような還元されたＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨは生体内の多様な生合成反応に必須的に要求されるので、ＡＴＰとともに光合成明反応の主要な産物となる。したがって、本実施例では、分離されたチラコイド細胞膜小胞が光が与えられる条件でＡＴＰを合成する活性だけを有するのではなく、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨを還元させる活性を示すかの可否を確認するために、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの還元効率をテストした。ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの還元効率は二つの物質を選択的に検出できる多様な方法（主にＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨを酸化させてその動力で透明な基質を転換させる酵素反応を使用して特定波長に対する吸光度または蛍光を有する最終生産物の生成を誘導し、これを測定することでＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨを定量する方法が使用される）により測定することができるため、当業者であれば研究開発の目的に沿って最適な方法を決定することができるであろうが、本実施例では、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨを定量的に測定する方法としてＮＡＤＨ測定ｋｉｔ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）およびＮＡＤＰＨ測定ｋｉｔ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）をそれぞれ使用した。二つの種類のｋｉｔはそれぞれＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨを選択的に測定することに使用された。
【００７０】
反応のために５０ｍＭ濃度のＰＢＳバッファー（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、ｐＨ  ７．４）を使用し、基質としては１ｍＭ  ＮＡＤ＋および１ｍＭ  ＮＡＤＰ＋が添加された溶液を使用して３０℃条件で反応を進めた。ＮＡＤＰＨの合成効率を測定するためにＮＡＤＰ＋だけを反応溶液に添加したが、ＮＡＤＨの合成効率を測定するためにはＮＡＤ＋およびＮＡＤＰ＋をすべて添加した。使用したチラコイド細胞膜小胞が含有する蛋白質の定量を通じてその蛋白質濃度を決定し、数回の測定値はチラコイド細胞膜小胞が含有した蛋白質の濃度値で標準化した。ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの合成程度は４５０ｎｍでの吸光度の変化を通じて測定し、知っている多様な濃度のＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨをそれぞれ使用して同じ実験を進めて標準曲線を製作し、測定された吸光度値をそれぞれＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの生成量に転換させることができた。このように決定されたＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの生成量を時間による値で示してＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの生産速度を分当たり生成されるＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨのｎｍｏｌｅ値で表現した。図４は５０ｍｉｃｒｏ  Ｅｉｎｓｔｅｉｎ／ｍ２・ｓ光度の蛍光灯光を照射して前記方法で決定されたチラコイド細胞膜小胞によるＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの合成効率を表わす。その結果、光が与えられなかった暗条件でのＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの合成速度は光が提供される光条件に比べて顕著に低く現れ、これは本実施例で生成されたＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの大部分は光を利用した光合成明反応の産物であると判断することができる。結果的にＮＡＤＰＨの生成効率がＮＡＤＨに比べて相対的に高く現れ、したがって、チラコイド細胞膜小胞を使用して明反応産物を生成させる方法はＡＴＰまたはＮＡＤＰＨを消耗する生合成反応を誘導するのに有用に使用されるはずである。ただし、図４の結果でヌクレオチドトランス脱水素酵素の作用によって、相当な水準のＮＡＤＨも生成されるという事実も確認されたので、チラコイド細胞膜小胞に存在するヌクレオチドトランス脱水素酵素のこのような活性を利用してＮＡＤＨを消耗する生合成反応を誘導する用法としても適用することができるであろう。
【００７１】
実施例７：湾入細胞膜小胞を利用したニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）の還元試験
湾入細胞膜小胞でＡＴＰの生成のための光リン酸化過程とは異なり、逆電子伝達が起きると、複合体ＩＩである琥珀酸脱水素酵素の作用によって、琥珀酸がフマル酸に転換されて複合体Ｉでアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）を還元させ、還元されたニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を生成させることになる。このとき、生成されたＮＡＤＨは酸素発生光合成と同じようにピリジンヌクレオチドトランス脱水素酵素の作用によって、ＮＡＤＰＨに転換され得る。したがって、本実施例では、分離された湾入細胞膜小胞が光が与えられる条件でＡＴＰを合成する活性だけを有するのではなくＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨを還元させる活性を示すかの可否を確認するために、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの還元効率を実施例６で提示した方法によりテストした。
【００７２】
反応のために５０ｍＭ濃度のＰＢＳバッファー（ｐＨ  ７．４）を使用し、基質としては１ｍＭ  ＮＡＤ＋および１ｍＭ  ＮＡＤＰ＋が添加された溶液を使用して３０℃条件で反応を進めた。ここに実施例６とは異なって、電子供与体として５ｍＭの琥珀酸をさらに添加させた。ＮＡＤＨの合成効率を測定するためには琥珀酸とＮＡＤ＋だけを反応溶液に添加したが、ＮＡＤＰＨの合成効率を測定するためには琥珀酸、ＮＡＤ＋およびＮＡＤＰ＋をすべて添加した。使用した湾入細胞膜小胞が含有する蛋白質の定量を通じてその蛋白質濃度を決定し、数回の測定値は湾入細胞膜小胞が含有した蛋白質の濃度値で標準化した。図５は１５Ｗａｔｔｓ／ｍ２光度の白熱灯光を照射して前記方法で決定された湾入細胞膜小胞によるＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの合成効率を表わす。その結果、実施例６と同じように光が与えられなかった暗条件でのＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの合成速度は光が提供される光条件に比べて顕著に低く現れ、これを根拠に本実施例で生成されたＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの大部分は光を利用した光合成明反応の産物であることが分かる。反面湾入細胞膜小胞では実施例６での結果とは違いＮＡＤＨの生成効率がＮＡＤＰＨに比べて顕著に高く現れ、したがって、湾入細胞膜を使用して明反応産物を生成させる方法はＡＴＰまたはＮＡＤＨを消耗する生合成反応を誘導するのに有用に使用できるものと判断される。ただし、ヌクレオチドトランス脱水素酵素の作用によって、一部ＮＡＤＰＨも生成されるという事実も確認されたので、ヌクレオチドトランス脱水素酵素の活性を高めるための多様な追加的な試みを通じてＮＡＤＰＨ生産効率を増進させる方法も可能であろう。
【００７３】
合わせて互いに異なる領域帯の波長を有する光エネルギーを使用するチラコイド細胞膜小胞および湾入細胞膜小胞を同時に使用してＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの合成効率を増進させる方法に対しては具体的に例示しなかったが、当業者であれば実施例５で例示したチラコイド細胞膜小胞および湾入細胞膜小胞を同時に使用してＡＴＰの合成効率を増進させる方法を参照してこれを容易に達成できるはずである。
【００７４】
以上で本発明の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界の通常の知識を有した者にとってこのような具体的な技術は単なる好ましい具現例に過ぎず、これに本発明の範囲が制限されるものではないことは明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は添付された請求項とその等価物によって定義されるべきである。
【図１】
2017503529.tif 000003
【図２】
2017503529.tif 000004
【図３】
2017503529.tif 000005
【図４】
2017503529.tif 000006
【図５】
2017503529.tif 000007
【国際調査報告】
2017503529.tif 000008
2017503529.tif 000009
2017503529.tif 000010
2017503529.tif 000011
2017503529.tif 000012
2017503529.tif 000013
2017503529.tif 000014
2017503529.tif 000015