(57)【要約】対象疾患の抗原を少なくとも１つコードし、アデノウイルスゲノムの非必須領域を置換する少なくとも１つの外来性ヌクレオチド配列が挿入された、血清型９トリアデノウイルスベクター（ＦＡｄＶ−９）を含有する組み換えワクチンであって、対象疾患の少なくとも１つの抗原をコードし、アデノウイルスゲノムの非必須領域を置換する、前記少なくとも１つの外来性ヌクレオチド配列は、491と2782ヌクレオチドの間に位置する、前記組み換えワクチン。このワクチンのベクターは、産業規模での製造に対し安定的である。同様に、このワクチンが、マレック病に対するワクチンと併用されて投与された場合でさえ、両ワクチンは、互いの干渉により影響されない適切な免疫応答を生じさせる。同じように、当該組み換えワクチンの効果は、母親由来抗体により影響されず、たった１回の投与であっても、早期及び持続的防御反応の両方を誘導することができる。【選択図】図１６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象疾患の抗原を少なくとも１つコードし、及びアデノウイルスゲノムの非必須領域を置換する少なくとも１つの外来性ヌクレオチド配列が挿入されている、血清型９トリアデノウイルスベクター（ＦＡｄＶ−９）、ならびに薬学的に受容可能なビヒクル、アジュバント、及び／または賦形剤を含有する組み換えワクチンであって、前記外来性ヌクレオチド配列が、491と2782ヌクレオチドの間に位置することを特徴とする、前記組み換えワクチン。
【請求項２】
前記ＦＡｄＶ−９ベクターが、生（活性）または不活化である、請求項１に記載の組み換えワクチン。
【請求項３】
前記ＦＡｄＶ−９ベクターが、配列番号１を含有する、請求項１に記載の組み換えワクチン。
【請求項４】
前記外来性ヌクレオチド配列が、トリインフルエンザ、封入体肝炎、トリ感染性喉頭気管炎、ニューカッスル病、伝染性ファブリキウス嚢病、伝染性気管支炎、メタニューモウイルスにより引き起こされる疾患（ＭＰＮＶ）、マレック病、トリ感染性貧血から選択される対象疾患の抗原、またはＦＡｄＶ−９ベクター中の挿入が可能なサイズの任意の他の遺伝子を少なくとも１つコードしている、請求項１に記載の組み換えワクチン。
【請求項５】
前記外来性ヌクレオチド配列が、トリインフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）、封入体肝炎ウイルス血清型４及び８の突起及びヘキソン、トリ由来の感染性喉頭気管炎ウイルス（ＬＴＩ）の糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）及び糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）、ニューカッスル病ウイルスのＨＮ及びＦタンパク質、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスのＶＰ２タンパク質、感染性気管支炎ウイルスのＳ１タンパク質及びＳ２タンパク質、メタニューモウイルス（ＭＰＮＶ）のＦタンパク質、ならびにトリの伝染性貧血のＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３タンパク質、を含む群の抗原をコードしている、請求項４に記載の組み換えワクチン。
【請求項６】
前記トリインフルエンザウイルスのＨＡが、当該タンパク質のＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７及びＨ９亜型のうちの少なくとも１つから選択される、請求項５に記載の組み換えワクチン。
【請求項７】
前記外来性ヌクレオチド配列が、ウイルスベクターとして用いられているＦＡｄＶ−９とは異なるトリアデノウイルスの抗原を少なくとも１つコードしている遺伝子を含有する、請求項１に記載の組み換えワクチン。
【請求項８】
抗原応答を得るために必要とされるウイルス濃度が、投与量当たり、少なくとも１０５．０ＤＩＣＣ５０％である、請求項１に記載の組み換えワクチン。
【請求項９】
抗原応答を得るために必要とされるウイルス濃度が、投与量当たり、少なくとも１０６．０ＤＩＣＣ５０％である、請求項８に記載の組み換えワクチン。
【請求項１０】
前記ワクチンが生（活性）である場合、前記薬学的に受容可能なビヒクルは水性溶液であり、好ましくは、ＴＰＧＡ安定化剤（トレハロース、リン酸塩、グルタミン酸塩、アルブミン）を含有する水性溶液、ペプトン安定化剤を含有する水性溶液、及びスキムミルクを含有する水性溶液からなる群から選択される、請求項２に記載の組み換えワクチン。
【請求項１１】
前記ワクチンが不活化である場合、前記薬学的に受容可能なビヒクルは、水性溶液またはエマルションである、請求項２に記載の組み換えワクチン。
【請求項１２】
前記薬学的に受容可能なビヒクルが、水−油エマルション、油−水エマルション、または水−油−水エマルションである、請求項１１に記載の組み換えワクチン。
【請求項１３】
前記生ワクチンまたは活性ワクチンが、筋肉内、鼻内、皮下、散布、吸入、経口、または飲水を介して、またはｉｎ  ｏｖｏで投与されるよう調製される、請求項２に記載の組み換えワクチン。   
【請求項１４】
前記不活化ワクチンが、筋肉内または皮下、好ましくは皮下に投与されるよう調製される、請求項２に記載の組み換えワクチン。
【請求項１５】
マレック病全粒子ワクチンを含有する、請求項１に記載の組み換えワクチン。
【請求項１６】
同じ対象疾患、または異なる対象疾患のいずれか由来の抗原を少なくとも２つコードし、491及び2782ヌクレオチドの間に位置する前記アデノウイルスのゲノム非必須領域を置換する、少なくとも２つの外来性ヌクレオチド配列が挿入されたＦＡｄＶ−９ベクターを含有する、請求項１に記載の組み換えワクチン。
【請求項１７】
同じ対象疾患、または異なる対象疾患のいずれかの、第一のワクチンの抗原とは異なる抗原を少なくとも１つコードし、491及び2782ヌクレオチドの間に位置する前記アデノウイルスのゲノム非必須領域を置換する、少なくとも１つの外来性ヌクレオチド配列が挿入された、ＦＡｄＶ−９ベクターに基づいた第二のワクチンを含有する、請求項１に記載の組み換えワクチン。
【請求項１８】
対象疾患の抗原をコードし、491及び2782ヌクレオチドの間に位置する前記アデノウイルスのゲノム非必須領域を置換する、外来性ヌクレオチド配列が挿入された、血清型９トリアデノウイルス組み換えウイルス（ＦＡｄＶ−９）のマスターシードであって、前記マスターシードは、細胞培養中での６〜１１回の継代後に得られる、前記マスターシード。
【請求項１９】
動物において免疫反応を生じさせることができる組み換えワクチンを作製するための、対象疾患の抗原をコードし、491及び2782ヌクレオチドの間に位置するアデノウイルスゲノム非必須領域を置換する、外来性ヌクレオチド配列が挿入された、血清型９トリアデノウイルスベクター（ＦＡｄＶ−９）の使用。
【請求項２０】
前記組み換えワクチンが、単回投与、または２回以上の投与で投与される、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記組み換えワクチンが、単回投与で投与される、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
前記組み換えワクチンが、単独、または他の組み換えもしくは非組み換え、生（活性）もしくは不活化ワクチンと共に投与される、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
前記組み換えワクチンが、マレック病に対するワクチンと共に投与される、請求項２２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルスベクターに基づいたワクチンに関するものであり、より具体的には、血清型８トリアデノウイルス組み換えベクターに基づいたワクチンに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アデノウイルスは、直径７０〜９０ｎｍ、無エンベロープ型の直線状、二本鎖ＤＮＡウイルスであり、正二十面体型のカプシドを有し、当該カプシドは２４０個のヘキソン（ｈｅｘｏｎ）、１２個のペントン（ｐｅｎｔｏｎ）、及び正二十面体の各頂点から伸びる突起（ｆｉｂｅｒ）により形成されている。これらヘキソン、ペントン及び突起は、アデノウイルスの主要抗原であり、その血清型を決定する。
【０００３】
アデノウイルスのゲノムは約３０〜４５ｋｂのサイズであり、４つの初期領域（Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３及びＥ４）及び５つの後期領域（Ｌ１〜Ｌ５）を有している。
【０００４】
アデノウイルスは様々な種から単離されており、主要な属は２つ、トリから単離されたトリアデノウイルス（Ａｖｉａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、及び哺乳類から単離されたマストアデノウイルス（Ｍａｓｔａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）である。
【０００５】
アデノウイルスは、感染性が高いこと、及びそれらの多くが非病原性であることを理由として、ワクチン作製のための組み換えベクターの好適な候補とみなされている。さらにアデノウイルスベクターは、大きなサイズの遺伝子を効率的に翻訳することができ、及び動物において、広範な免疫反応を誘導することができる。それにもかかわらず、アデノウイルスの特有な構造は、各種ごとに固有の異種遺伝子の挿入部位に関する研究が必要であり、また、組み換えウイルスベクターへと転換された際の、様々な公知のアデノウイルスの生物学的挙動を一般化するのは事実上、不可能であることが知られている。
【０００６】
これまでのところ、特にヒト、サル、トリ、ブタに関し、組み換えワクチンとして利用できる可能性にかけ、アデノウイルスがベクターとして用いられている。特に、トリアデノウイルス（ＦａｄＶ）は組み換えワクチンの精緻化に関し、候補となる可能性があることが知られている。しかしながら、以下に記述されるように、アデノウイルスの製造が、通常、非常に低収率の細胞株から行われていること、または本来、連続継代でウイルスベクターの安定性の獲得が損なわれてしまうため、必要とされる安定性でラージスケールの製造を行うことが不可能であることを理由として、多くの場合で、市販レベルでトリアデノウイルスを上手く利用できる可能性が、特に獣医学産業において妨げられており、従って、今日のところ、トリアデノウイルスでベクター化されたワクチンが存在しないことが容易に理解されるであろう。
【０００７】
たとえば国際特許出願公開WO94/24268には、異種ヌクレオチド配列が少なくとも１つ挿入されたＦＡｄＶ組み換えベクターが記載されており、それらは疾患感受性のトリにおける免疫反応の惹起に有用であると記載されている。この書面によると、異種遺伝子の置換または挿入に適し得るアデノウイルスゲノムの非必須領域は、ゲノムの右末端に位置しており、好ましくは、(97及び99.9 m.u.)の0.0038と0.0039の間に位置する領域である。この書面によると、どうやらこの組み換えワクチンは、たとえばマレック病ウイルス、ニューカッスル病ウイルスのワクチンなど、他のウイスルに対するワクチンと組み合わせて利用することができるらしいが、このことに関する証拠はない。さらに、この書面では、ラージスケール製造のための細胞株での連続継代後に得られたアデノウイルスの挙動については、いずれも解説がなされていない。
【０００８】
また、米国特許第6,296,852号には、ウイルスゲノムの非必須領域に異種ヌクレオチド配列が挿入された血清型９ＦＡｄＶベクター（ＦＡｄＶ−９）が記載されている。これらの領域は、ゲノムの左末端及び／または右末端に位置する非コード領域であってもよく、好ましくは、右末端（３’）上、 (60及び100 m.u.)の0.0023と0.0039の間に位置する領域である。WO94/24268の書面によると、この特許は、外来性遺伝子の挿入のための、可能性のある別のより広範な領域を特定したが、細胞株中の連続継代後のその挙動、特に完全性についてはいずれも解説されていない。
【０００９】
他の書面（Corredor, J. C. and Nagy, E., the non-essential left end region of the fowl adenovirus 9 genome is suitable for foreign gene insertion/replacement. Virus Research. Vol 149, 167-174; 2010）において、ＦＡｄＶ−９ゲノムの５’末端の非必須領域もまた、組み換えベクターを産生するための外来性遺伝子の挿入または置換に適した部位でありうることが開示されている。たとえば、かかるベクターのうちの１つは、491〜2782ヌクレオチドの間に位置する非必須領域と、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）をコードする遺伝子を置換して得られた。しかしながら、この書面も他と同様に、出来上がった当該ウイルスベクターが、疾患の抗原をコードする外来性遺伝子をその中に挿入された際に安定であるかどうか、及び組み換えワクチンを得るための適切な細胞系中でそれらを複製させることで安定であるかどうかは示されておらず、当該書面は遺伝子発現の報告を示すのみであり、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイは欠いていた。加えて、当該構成、及び対象疾患に対する防御レベルはいずれも言及されていない。
【００１０】
これまでで理解されるように、ＦＡｄＶゲノムの非必須領域は、外来性ヌクレオチド配列が挿入され得る、または置換され得る可能性のある部位であることが知られている。しかしながら、当分野で報告されているベクターは、細胞培養中での様々な継代後、挿入された異種遺伝子が欠落してしまうことを理由として、産業規模での組み換えワクチン製造を行う際の不安定さという欠点を有している。
【００１１】
さらに、当分野では、トリ、主には家禽の治療におけるアデノウイルスベクターの使用は、鳥類業界において広く用いられているワクチンであるマレック病ワクチンへの干渉を理由として忌避されている。マレック病（ＥＭ）は、飼育鳥を侵すヘルペスウイルスにより発生する病気であり、脚または羽の麻痺を誘発するリンパ増殖性疾患、及びリンパ系腫瘍、ならびに死をもたらす。この疾患を予防するために、一価または多価の活性ワクチンが主には皮下またはｉｎ−ｏｖｏで適用される。
【００１２】
コストを下げ、適用時の効果を高めるために、少なくとも２種のワクチンを同時投与することが好ましい場合もある。しかしながら、上述の書面と同様に、国際特許出願公開WO94/24268は、マレックワクチンと組み合わせたアデノウイルスの利用可能性を開示しているが、その後の研究により、死亡率と、鳥類、好ましくは長寿の鳥類上に両疾患により生じた病変部位の分析が行われた際、市販の雌鶏と同様、アデノウイルスワクチンとマレックウイルスワクチンは、フィールドにおいて深刻な干渉を起こすことが示されている。
【００１３】
現在、ＥＭに対する全粒子（ｗｈｏｌｅ  ｖｉｒｕｓ）ワクチンと、アデノウイルスベクターの組み換えワクチンを同時に適用することにより、以下のメカニズムによってＥＭに対するワクチンが当該組み換えワクチンに干渉することが知られている：ａ）異なる複製動態、ｂ）両ワクチンは、鳥類において、その複製のために同じ細胞型を競合すること、及びｃ）ＥＭウイルスは鳥類において免疫抑制を生じさせること。どうやら、この干渉が克服されるためには、及び組み換えワクチンの外来性遺伝子に関連した疾患に対する効果的なワクチン化が達成されるためには、当該組み換えワクチンをより高い用量で投与すること、またはＥＭに対するワクチンの用量を減少させる必要があるようだ（Breedlove et al. , Avian influenza adenovirus-vectored in-ovo vaccination; target embryo tissues and combination with Marek's disease vaccine. Avian Disease. Vol. 55, 667-673; 2011）。しかしながら、同じBreedloveらの参照文献に、アデノウイルス組み換えワクチンの用量を増加させることにより、ＥＭに対するワクチンとの一時的な干渉が生じ、それによりＥＭワクチンの効果が消失し、フィールドにおいて重大な問題が生じることが示されている。これは、今日のところ、マレック病ワクチンにより付与された防御と干渉しない、外来性遺伝子を用いて組み換えアデノウイルスウイルスベクターに基づいたワクチンを製剤化することができず、逆もまた真であることを意味する。
【００１４】
同様に、母親由来の抗体も、ワクチンとの干渉を引き起こす可能性のある他の因子である。母親由来の抗体は生まれたばかりの動物に防御を付与するが、その存在はワクチンの効果を阻害または減ずる可能性があり、そのため、生じた免疫応答は最適なものではなくなる。
【００１５】
概して、ワクチン開発で見受けられる他の試みは、ワクチンのために用いられるフォーミュラの機能としての、防御が得られる時間及び当該防御の期間である。
【００１６】
早期防御を与えるワクチン、すなわち、適用から非常に短い時間で防御を与えるワクチンはまた、有効期間も短く、防御レベルが急速に落ち、そのため定期的な再ワクチンが必要である。対照的に、長持ちする、または長期持続型の防御を与えるワクチンは、防御を得るまでより長い時間がかかる（後期防御）が、当該防御は長期間持続し、通常、所望される防御効果を得るために必要な再ワクチンの回数は少ない。通常、ある動物群において持続的な防御を得るためには、ワクチンが完全に発現する間に当該動物が病を得てしまう可能性を回避するため、早期防御ワクチンと後期防御ワクチンを組み合わせて適用する必要がある。
【００１７】
当分野では、活性ウイルス（ａｃｔｉｖｅ  ｖｉｒｕｓ）ワクチンは通常、早期または初期の防御を与えるものであり、その適用から短時間で始動する、受容可能ではあるが持続しないレベルの防御を与える。他方で、不活化ウイルス（ｄｅａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ）ワクチンは、活性ウイルスよりも長期持続する防御を与えるが、それを得るには長い時間が必要であり、すなわち、防御は遅く、多くの場合において頻度は低いがそれらもまた再ワクチン化が必要である。
【００１８】
たとえば、Stineら（Evaluation of inactivated newcastle disease, avian diseases, Vol. 24, No. 1 (Jan. - Mar., 1980), pp. 99-111）は、ＮＤＶに対する３種のワクチン：エマルションに溶解した不活化ワクチン、Al(OH)3に吸着させた不活化ワクチン、及び市販の生ワクチンを評価したところ、生ワクチンは、不活化ワクチンよりも１週早く、ニワトリにおいてＨＩ力価を生じさせ、一方、エマルションに溶解させた不活化ワクチンは持続的な免疫反応を生じさせた。
【００１９】
同様に、Folitseら（Efficacy of combined killed-in-oil emulsion and alive newcastle disease vaccines in chickens, Avian Diseases, Vol. 42, No. 1 (Jan. - Mar., 1998), pp. 173-178）は、油中に乳化されたＮＤＶ不活化ワクチンは、活性ワクチンで従前にワクチン化されたトリにおいて、高く持続的な循環抗体値を誘導したとする報告があることに言及している。   同様に、Folitseらは、ＮＤＶ不活化ワクチンと、ＮＤＶに対する活性ワクチンの併用投与で高い抗体反応が得られた理由は、最初に生ウイルスが急速に複製し、初期免疫応答が惹起され、次いで継続的ではあるが遅発型の不活化ワクチンの抗原放出が続き、これが強化投与のように機能したという事実によるものであろうと述べている。
【００２０】
また、Toro ら(Avian influenza mucosal vaccination in chickens with replication-defective recombinant adenovirus vaccine, Avian Diseases 55:43-47, 2011)は、コドン最適されたトリインフルエンザＨ５遺伝子を発現する、複製のためのアデノウイルス成分を含まない組み換えアデノウイルスワクチンにより付与された防御を評価するため、当該ワクチンを５日齢の産卵用鳥に適用させ、一部の例においては、１５日齢になったときに再ワクチンを行った。その結果、再ワクチンが行われたトリのみが高い抗体価を発現させたことが示された。これらの抗体価は、９日齢から検出されはじめ、３２日齢で最大に達した。
【００２１】
同様に、マレックウイルスのように、早期防御及び持続防御の両方を付与する特殊な活性ウイルスも数種存在している。しかし、マレックウイルスはベクターとして用いることができ、及び当分野では、マレック病に対する早期及び持続的な防御は１回の適用で達成されることが示されているが、挿入外来性抗原に対しては、早期防御は達成されず、後期及び持続防御のみ、現れることが示されている。
【００２２】
様々な挿入部位が開示されているが、他方で継代培養後、細胞株上での複製において適切な安定性が得られないこともあり、当分野の状況から理解されるように、アデノウイルス、特に当分野では血清型９トリアデノウイルスＦＡｄＶ−９は、任意の外来性遺伝子を有する、鳥類に対する組み換えワクチンとして産業規模で成功裏に利用することはできていない。一方で、マレック病ワクチンはアデノウイルスの作用機序と干渉するという事実があり、逆もまたしかりであることから、マレック病ワクチンとアデノウイルスを併用して使用することは、当分野では明白に忌避されている。さらに、１回のみの適用で、使用されるウイルスベクターに挿入された外来性抗原に対する早期防御及び持続的防御の両方を達成するウイルス組み換えワクチンを得ることは不可能であった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
本発明の目的
従来技術の背景を考慮し、本発明の目的は、血清型９トリアデノウイルスの組み換えワクチンを提供することであり、この場合において当該ベクターは、産業規模で製造される際に安定である。
【００２４】
本発明の他の目的は、マレック病に対するワクチンと組み換えワクチンが併用して投与された場合でも、両ワクチンが、互いの干渉による影響を受けずに適切な免疫反応を生じさせる組み換えワクチンを提供することである。
本発明のさらなる目的は、その効果が、母親由来抗体により影響を受けない、及び最適な免疫反応を誘導する組み換えワクチンを提供することである。
【００２５】
本発明のさらに他の目的は、防御的、すなわち適用から最初の１９日目のうちに、及び、持続的、すなわち適用後少なくとも９０日までの両方の防御反応を誘導する組み換えワクチンを期することである。
【００２６】
本発明のさらに他の目的は、１回の適用のみで、当該ワクチンに含有されるウイルスベクターに挿入された外来性抗原に関連した疾患に対する、早期防御及び持続的防御の両方を達成する組み換えワクチンを期することである。
【００２７】
本発明の特徴を考慮した新規の態様は、添付の請求項において具体的に確立されるものである。しかしながら、一部の実施形態、特徴、及び一部の目的ならびにそれらの利点は、添付の図面に関連して解釈する際に、詳細な説明からより良く理解されるものである。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明に従い作製された、トリインフルエンザＨＡ挿入を有するＦＡｄＶ−９組み換えウイルスのＤＮＡ制限酵素地図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本発明に従い作製された、トリインフルエンザＨＡ挿入を有するＦＡｄＶ−９組み換えウイルスの、制限酵素消化により得られたＤＮＡ断片が示されたアガロースゲルである。
【図１Ｃ】図１Ｃは、非感染ＣｅＬｉ細胞培養と、本発明に従い作製された、トリインフルエンザＨＡ挿入を有するＦＡｄＶ−９組み換えウイルスで感染した同細胞培養である。
【図２Ａ】図２Ａは、本発明に従い作製された、封入体肝炎突起（Ｆｉｂｅｒ）−４挿入を伴うＦＡｄＶ−９組み換えウイルスのＤＮＡ制限酵素地図を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、本発明に従い作製された、封入体肝炎突起（Ｆｉｂｅｒ）−４挿入を伴うＦＡｄＶ−９組み換えウイルスの制限酵素消化により得られたＡＤＮ断片を示すアガロースゲルである。
【図２Ｃ】図２Ｃは、非感染ＣｅＬｉ細胞培養と、本発明に従い作製された、封入体肝炎突起（Ｆｉｂｅｒ）−４を伴うＦＡｄＶ−９組み換えウイルスで感染した同細胞培養である。
【図３Ａ】図３Ａは、本発明に従い作製された、鳥類における感染性喉頭気管炎ウイルスの糖タンパク質Ｂの挿入を伴う、ＦＡｄＶ−９組み換えウイルスのＤＮＡ制限酵素地図を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、本発明に従い作製された、鳥類における感染性喉頭気管炎ウイルスの糖タンパク質Ｂの挿入を伴うＦＡｄＶ−９組み換えウイルスの制限酵素消化により得られたＤＮＡ断片を示すアガロースゲルである。
【図３Ｃ】図３Ｃは、非感染ＣｅＬｉ細胞培養と、本発明に従い作製された、鳥類における感染性喉頭気管炎の糖タンパク質Ｂの挿入を伴うＦＡｄＶ−９組み換えウイルスで感染した同細胞培養である。
【図４Ａ】図４Ａは、本発明に従い作製された、ニューカッスル病ウイルスのＨＮタンパク質挿入を伴うＦＡｄＶ−９組み換えウイルスのＤＮＡ制限酵素地図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、本発明に従い作製された、ニューカッスル病のＨＮタンパク質挿入を伴うＦＡｄＶ−９組み換えウイルスの制限酵素消化により得られたＤＮＡ断片を示すアガロースゲルである。
【図４Ｃ】図４Ｃは、非感染ＣｅＬｉ細胞培養と、本発明に従い作製された、ニューカッスル病のＨＮタンパク質挿入を伴うＦＡｄＶ−９組み換えウイルスで感染した同細胞培養である。
【図５Ａ】図５Ａは、ゲノムの38,807と40,561ヌクレオチドの間に挿入された、ニューカッスル病ウイルスのＨＮタンパク質挿入を伴うＦＡｄＶ−９組み換えウイルスのＤＮＡ制限酵素地図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ゲノムの38,807と40,561ヌクレオチドの間に挿入された、ニューカッスル病ウイルスのＨＮタンパク質挿入を伴うＦＡｄＶ−９組み換えウイルスの制限酵素消化により得られたＤＮＡ断片を示すアガロースゲルである。
【図５Ｃ】図５Ｃは、ＣｅＬｉ細胞培養での２回の継代後にゲノムの38,807と40,561ヌクレオチドの間に挿入された、ニューカッスル病ウイルスのＨＮタンパク質挿入を伴うＦＡｄＶ−９組み換えウイルスの制限酵素消化により得られたＤＮＡ断片を示すアガロースゲルである。
【図６】図６は、１日齢（ＤＥ）で採取された血清で、ｉｎ−ｏｖｏで免疫化された市販の軽種鶏（ＣＲＬ）の赤血球凝集抑制試験（ＩＨ）の結果を示すグラフである。
【図７】図７は、１０ＤＥで採取された血清でｉｎ−ｏｖｏで免疫化されたＣＲＬ鶏のＩＨ結果を示すグラフである。
【図８】図８は、１９ＤＥで採取された血清で、１８日のインキュベーション後（ＤＩ）、または１ＤＥでｉｎ  ｏｖｏで免疫化されたＣＲＬ鶏のＩＨの結果を示すグラフである。
【図９】図９は、１９ＤＥで採取された血清で、１８ＤＩまたは１ＤＥでｉｎ  ｏｖｏで免疫化され、及び１０ＤＥで再免疫化されたＣＲＬ鶏のＩＨの結果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、３１ＤＥで採取された血清で、１８ＤＩまたは１ＤＥで、ｉｎ  ｏｖｏで免疫化されたＣＲＬ鶏のＩＨの結果を示すグラフである。
【図１１】図１１は、３１ＤＥで採取された血清で、１８ＤＩまたは１ＤＥでｉｎ  ｏｖｏで免疫化され、及び１０ＤＥで再免疫化されたＣＲＬ鶏のＩＨの結果を示すグラフである。
【図１２】図１２は、３８ＤＥで採取された血清で、１８ＤＩまたは１ＤＥで、ｉｎ  ｏｖｏで免疫化されたＣＲＬ鶏のＩＨの結果を示すグラフである。
【図１３】図１３は、３８ＤＥで採取された血清で、１８ＤＩまたは１ＤＥでｉｎ  ｏｖｏで免疫化され、及び１０ＤＥで再免疫化されたＣＲＬ鶏のＩＨの結果を示すグラフである。
【図１４】図１４は、４５ＤＥで採取された血清で、１８ＤＩまたは１ＤＥで、ｉｎ  ｏｖｏで免疫化されたＣＲＬ鶏のＩＨの結果を示すグラフである。
【図１５】図１５は、４５ＤＥで採取された血清で、１８ＤＩまたは１ＤＥでｉｎ  ｏｖｏで免疫化され、及び１０ＤＥで再免疫化されたＣＲＬ鶏のＩＨの結果を示すグラフである。
【図１６】図１６は、１ＤＥで免疫化され、１０ＤＥで再ワクチン化され、または再免疫化されず、及び１９ＤＥでチャレンジが行われたＣＲＬ鶏の有効性の結果を示すグラフである。
【図１７】図１７は、１ＤＥで免疫化され、１０ＤＥで再ワクチン化をされ、または再免疫化されず、及び３１ＤＥでチャレンジが行われたＣＲＬ鶏の有効性の結果を示すグラフである。
【図１８】図１８は、１ＤＥで免疫化され、１０ＤＥで再ワクチン化をされ、または再免疫化されず、及び９３ＤＥでチャレンジが行われたＣＲＬ鶏の有効性の結果を示すグラフである。
【図１９】図１９は、１９ＤＥで採取された血清を用いて１ＤＥで免疫化され、１０ＤＥで再ワクチン化をされ、または再免疫化されなかったＣＲＬ鶏のＩＨの結果を示すグラフである。
【図２０】図２０は、３１ＤＥで採取された血清を用いて１ＤＥで免疫化され、１０ＤＥで再ワクチン化をされ、または再免疫化されなかったＣＲＬ鶏のＩＨの結果を示すグラフである。
【図２１】図２１は、９３ＤＥで採取された血清を用いて１ＤＥで免疫化され、１０ＤＥで再ワクチン化をされ、または再免疫化されなかったＣＲＬ鶏のＩＨの結果を示すグラフである。
【図２２】図２２は、１ＤＥ及び１０ＤＥで免疫化され、及び３１ＤＥでチャレンジが行われた、特定病原体除去下（ＬＰＥ）の鶏の有効性の結果を示すグラフである。
【図２３】図２３は、３１ＤＥで採取された血清で、１ＤＥ及び１０ＤＥで免疫化されたＬＰＥ鶏のＩＨの結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明の開発の間に、対象疾患抗原を少なくとも１つコードし、及びアデノウイルスゲノムの非必須領域、具体的には491と2782ヌクレオチドの間に位置するゲノム非必須領域を置換する少なくとも１つの外来性ヌクレオチド配列が挿入されている、血清型９トリアデノウイルスベクター（ＦＡｄＶ−９）、ならびに薬学的に受容可能なビヒクル、アジュバント、及び／または賦形剤を含有する組み換えワクチンが、当該対象疾患に対する適切な防御をもたらすこと、また、当該アデノウイルスベクターは細胞培養での連続継代が行われた際に、挿入された当該外来性ヌクレオチド配列を失わないことから、産業規模で製造された際に安定的であることが見いだされた。同様に、この組み換えワクチンが、マレック病全粒子ワクチンと併用され投与されてもワクチン化されたトリにおける有効性を失わないこと、及びこの組み換えワクチンと共に投与された際に当該マレックワクチンも有効性を失わないことは、予想外のことである。同様に、本発明の組み換えワクチンは、その効果が、生まれたばかりの動物において母親由来の抗体により影響を受けないという利点をもたらし、及びたった１度の適用で、早期防御及び持続的防御を提供する。
【００３０】
この意味において、本発明の目的に対し、早期防御は当該ワクチンの適用から１９日以内に得られるものであり、一方で、持続的防御は当該ワクチンの適用後、少なくとも９０日まで得られるものである。
【００３１】
使用されるアデノウイルスベクターは、生（活性）であっても、または不活化であってもよい。生、または活性という用語は、その組み換えベクターが複製能力を維持していることを意味する一方で、不活化とは、外来性ヌクレオチド配列を有するアデノウイルス組み換えベクターが複製能力を失っていることを意味する。たとえばホルムアルデヒドまたはベータ−プロピオラクトンを用いた化学的不活化などの当分野に公知の物理的手順または化学的手順を用いて組み換えベクターの不活化は行われる（Office International des Epizooties 2008）。（Newcastle Disease. OIE Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. Office International des Epizooties. France, p. 576-589)
【００３２】
上述のように、使用されるベクターは、任意の株を含む、血清型９トリアデノウイルス（ＦＡｄＶ−９）である。好ましくは、ＦＡｄＶ−９は、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号、EU979376、AF083975、HQ697594、AF508958、AF339923、EU847634、EU847629、EU847628、DQ323986、AY683550、EU847635、NC_000899、及びAC_000013から選択される。
【００３３】
外来性ヌクレオチド配列に関しては、対象疾患の抗原を少なくとも１つコードするものであり、好ましくは、当該抗原は、トリインフルエンザ、封入体肝炎、トリ感染性喉頭気管炎、ニューカッスル病、伝染性ファブリキウス嚢病、伝染性気管支炎、メタニューモウイルスにより引き起こされる疾患（ＭＰＮＶ：ｄｉｓｅａｓｅ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）、マレック病、トリ感染性貧血から選択される少なくとも１つの疾患の抗原、またはアデノウイルスベクター中の挿入が可能なサイズの任意の他の遺伝子である。より好ましくは、トリインフルエンザの遺伝子が用いられる。
【００３４】
本発明の特定の実施形態において、外来性ヌクレオチド配列は、インフルエンザウイルスの１８種のヘマグルチニン亜型または免疫原性変異体から選択されるトリインフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）、より好ましくは当該タンパク質のＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７またはＨ９亜型のうちの少なくとも１つ、封入体肝炎ウイルス血清型４及び８の突起及びヘキソン、トリ由来の感染性喉頭気管炎ウイルス（ＬＴＩ）の糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）及び糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）、ニューカッスル病ウイルスのＨＮ及びＦタンパク質、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスのＶＰ２タンパク質、感染性気管支炎ウイルスのＳ１タンパク質及びＳ２タンパク質、メタニューモウイルス（ＭＰＮＶ）のＦタンパク質、ならびにトリの伝染性貧血のＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３タンパク質、を含む群をコードする遺伝子からなる。
【００３５】
同様に、外来性ヌクレオチド配列は、ウイルスベクターとして用いられているＦＡｄＶ−９とは異なるトリアデノウイルスの抗原を少なくとも１つコードする遺伝子を含んでもよい。
【００３６】
本発明の対象の外来性遺伝子を含有するアデノウイルスベクターワクチンは、対象のヌクレオチド配列のＰＣＲ増幅を行い、その後に、すでに増幅されたそれをアデノウイルスベクターの内部に挿入することにより調製されてもよく、当該ベクター中、491〜2782ヌクレオチドの間に位置する非必須ゲノム領域は排除されている。外来性遺伝子の挿入及び、アデノウイルスの非必須領域の欠失は、分子生物学分野の標準的なクローニング技術を用いて行われる。従って、そのように作製された感染性クローンは、組み換えウイルスを産生させるために細胞培養物中にトランスフェクトされる。
【００３７】
ウイルスは、たとえばトリ起源の不死化肝細胞（ＣｅＬｉ）、市販の細胞株、または明確にアデノウイルス増殖のために設計された細胞株などの、その増殖に適した任意のシステム中で、少なくとも抗原応答が得られるために必要とされるウイルス濃度に達するまで、好ましくは、少なくとも投与量当たり、１０５．０ＤＩＣＣ５０％、より好ましくは投与量当たり少なくとも１０６．０ＤＩＣＣ５０％まで複製される。
【００３８】
たとえば、組み換えウイルスは、免疫ペルオキシダーゼテストに対する力価が最小で投与量当たり１０６．０ＤＩＣＣ５０％に達するまで、静態的増殖系を用いて、細胞培養ボトル中で、マイクロキャリー中で、ラージスケールの細胞産生系で、またはＲｏｌｌｅｒボトル系において、特定の培養培地で増殖したＣｅＬｉ細胞株において、複製されてもよい。この力価は、同種の細胞中、５〜１０回のブラインド継代を行った後に達成され得る。さらに、回収物を遠心し、分画化し、凍結を維持させ、それによりいわゆるマスターシード（ＭＳ：ｍａｓｔｅｒ  ｓｅｅｄ）が得られる。
【００３９】
プロダクションシード（ＳＰ：ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｓｅｅｄ）を作製するために、同じ細胞上でマスターシードを用いてさらなる継代を行い、及びワクチンを作製するためにこれからさらにもう１回継代を行う。
【００４０】
従って、本発明は、血清型９トリアデノウイルス組み換えウイルス（ＦＡｄＶ−９）のマスターシードを含むものであり、当該ウイルスは対象疾患の抗原をコードする、外来性ヌクレオチド配列が挿入され、アデノウイルスゲノムの非必須領域、具体的には491〜2782ヌクレオチドの間に位置する領域が置換されており、当該マスターシードは、細胞培養中、６〜１１回の継代後に得られる。
【００４１】
ワクチンが生ワクチンまたは活性ワクチンである実施形態において、当該ワクチンは活性ウイルス、好ましくは、低病原性または当分野公知の手順により弱毒化された天然病原性トリアデノウイルスから選択されるウイルスである。他方で、ワクチンが不活化ワクチンである場合、抗原反応を得るために必要とされるウイルス濃度が得られた時点で、当該ウイルスの不活化がすすめられる。好ましくは、不活化は、当分野に公知の物理的手順または化学的手順を介して行われ、好ましくはホルムアルデヒドまたはベータ−プロピオラクトンによる化学的不活化を介して行われる。
【００４２】
本発明のワクチンが生ワクチンまたは活性ワクチンである場合、薬学的に受容可能なビヒクルは水性溶液であり、好ましくは、ＴＰＧＡ安定化剤（トレハロース、リン酸塩、グルタミン酸塩、アルブミン）を含有する水性溶液、ペプトン安定化剤を含有する水性溶液、及びスキムミルクを含有する水性溶液からなる群から選択される。
【００４３】
本発明のワクチンが不活化ワクチンである場合、薬学的に受容可能なビヒクルは、好ましくは水性溶液、またはエマルションである。より具体的には、使用されるビヒクルは、好ましくは、水−油、油−水、または水−油−水（ＷＯＷ）のエマルション、好ましくは水−油−水のエマルションである。
【００４４】
生ワクチンまたは活性ワクチンの投与に関しては、筋肉内、鼻内、皮下、散布、吸入、飲水により経口、またはｉｎ  ｏｖｏで、各場合において適切な手段及び方法を用いて行なわれてもよい。不活化ワクチンの場合、筋肉内または皮下、好ましくは皮下で投与される。
【００４５】
同様に、本発明の組み換えワクチンは、単独、または生（活性）もしくは不活化の、たとえばマレック病に対するワクチンなどの他の組み換えワクチンまたは非組み換えワクチンと併せてのいずれかで、単回投与、２回以上の投与で投与されてもよい。
【００４６】
同様に、本発明のワクチンが単回投与または単回適用される場合、当該ワクチンに含有される当該ウイルスベクターに挿入された外来性ヌクレオチド配列によりコードされる抗原に関連した対象疾患に対する早期防御及び持続的防御の両方が達成される。
【００４７】
さらなる実施形態において、同じ対象疾患または異なる対象疾患のいずれか由来の抗原を少なくとも２つコードする少なくとも２つの外来性ヌクレオチド配列が挿入され、アデノウイルスゲノムの非必須領域、具体的には491〜2782ヌクレオチドの間に位置する領域が置換された、本発明に従う血清型９トリアデノウイルス（ＦＡｄＶ−９）のベクターを含有する多価組み換えワクチンが記載される。
【００４８】
本発明のある実施形態において、対象疾患の少なくとも１つの抗原をコードする少なくとも１つの外来性ヌクレオチド配列が挿入され、アデノウイルスゲノムの非必須領域、具体的には490〜2782ヌクレオチドに位置する領域が置換された、本発明に従う血清型９トリアデノウイルス（ＦＡｄＶ−９）のベクターに基づく第一のワクチン、及び、同じ対象疾患、または異なる対象疾患のいずれかの、第一のワクチンとは異なる抗原を少なくとも１つコードする少なくとも１つの外来性ヌクレオチド配列を有し、アデノウイルスゲノムの非必須領域、具体的には491〜2782ヌクレオチドの間に位置する領域が置換された、本発明に従う血清型９トリアデノウイルス（ＦＡｄＶ−９）のベクターに基づく少なくとも第二のワクチン、を含有する多価ワクチンが記載される。多価ワクチンは、生ワクチンもしくは活性ワクチン、または不活化型ワクチンであってもよい。
【００４９】
同様に、本発明は、対象疾患抗原をコードする外来性ヌクレオチド配列が挿入され、アデノウイルスゲノムの非必須領域、具体的には491〜2782ヌクレオチドに位置する領域が置換された、本発明に従う血清型９トリアデノウイルス（ＦＡｄＶ−９）のベクターに基づく少なくとも１つのワクチンと組み合わせて、マレック病全粒子ワクチンを含有する多価ワクチンを予期するものである。多価ワクチンは、生ワクチンもしくは活性ワクチン、または不活化型ワクチンであってもよい。
【００５０】
さらに、本発明の他の態様において、動物の疾患に対するワクチン化方法が開示され、当該方法は、対象の疾患抗原をコードする外来性ヌクレオチド配列が挿入され、それによりアデノウイルスゲノムの非必須領域、具体的には491〜2782ヌクレオチドに位置する領域が置換された、血清型９トリアデノウイルス（ＦＡｄＶ−９）のベクターを含有する、本発明に従う組み換えワクチンと、薬学手的に受容可能なビヒクル、アジュバント、及び／または賦形剤を動物に供給すること、を含み、この場合において当該ワクチンは、動物に免疫応答を惹起させることができる。
【００５１】
外来性ヌクレオチド配列は、対象疾患、好ましくはトリインフルエンザ、封入体肝炎、トリ感染性喉頭気管炎、ニューカッスル病、伝染性ファブリキウス嚢病、伝染性気管支炎、メタニューモウイルスにより引き起こされる疾患（ＭＰＮＶ）、マレック病、トリ感染性貧血から選択される少なくとも１つの疾患由来の抗原、またはアデノウイルスベクターへの挿入が可能なサイズの任意の他の遺伝子をコードする。好ましくは、トリインフルエンザ抗原が用いられる。
【００５２】
好ましくは、外来性ヌクレオチド配列は、インフルエンザウイルスの１８種のヘマグルチニン亜型または免疫原性変異体から選択されるトリインフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）、より好ましくは当該タンパク質のＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７またはＨ９亜型のうちの少なくとも１つ、封入体肝炎ウイルス血清型４または８の突起及びヘキソン、トリ由来の感染性喉頭気管炎ウイルスの糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）及び糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）、ニューカッスル病ウイルスのＨＮ及びＦタンパク質、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスのＶＰ２タンパク質、感染性気管支炎ウイルスのＳ１タンパク質及びＳ２タンパク質、メタニューモウイルス（ＭＰＮＶ）のＦタンパク質、ならびにトリの伝染性貧血のＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３タンパク質、を含む群をコードする遺伝子、からなる。
【００５３】
同様に、適切な防御を達成するために必要とされる組み換えワクチンの濃度は、少なくとも投与量当たり、１０５．０ＤＩＣＣ５０％、より好ましくは投与量当たり少なくとも１０６．０ＤＩＣＣ５０％である。
【００５４】
生または活性組み換えワクチンは、筋肉内、鼻内、皮下、散布、吸入、飲水による経口、またはｉｎ  ｏｖｏで、各場合において適切な手段及び方法を用いて投与されてもよい。不活化ワクチンの場合、当該ワクチンは筋肉内または皮下、好ましくは皮下に投与される。同様に、本発明の組み換えワクチンは、単独、または生（活性）もしくは不活化の、たとえばマレック病に対するワクチンなどの他の組み換えワクチンまたは非組み換えワクチンと併せてのいずれかで、単回投与、または２回以上の投与で投与されてもよい。
【００５５】
同様に、本発明のワクチンが単回投与または単回適用される場合、当該ワクチンに含有される当該ウイルスベクターに挿入された外来性ヌクレオチド配列によりコードされる抗原に関連した対象疾患に対する早期防御及び持続的防御の両方が達成される。
【００５６】
本発明は、以下の実施例によりさらに理解されるが、それら実施例は本発明の好ましい実施形態の適切な理解を可能とするための解説の目的のためにのみ示されるものであり、上述の詳細な説明に基づき実施され得る、他の解説されない実施形態は存在しないと暗示するものではない。
【実施例】
【００５７】
実施例１ ＦＡｄＶ−９ベクターの作製
【００５８】
最初に、リバースジェネティクスにより作製され、ＦＶ１領域（1-〜491ヌクレオチドの間に含有される）及びＦＶ２領域（2,782〜7,453ヌクレオチドの間に含有される）を含有する配列番号１を含有するＦＡｄＶ−９の４５ｋｂのゲノムから、491〜2,782ヌクレオチドの間、すなわちゲノムの５’末端に含有される、非必須領域の2,291ｐｂを除去した。さらに、対象遺伝子に固有のＳｗａｌ部位を、４９１部位に挿入した。
【００５９】
このゲノムをｐＢｇプラスミド中にサブクローニングし、その末端に固有の制限酵素部位を得て、培養中での生ウイルスの作製を可能にした。
【００６０】
さらに、オリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲ技術により、ＥｃｏＲＶ部位をＦＶ−２に導入し、それによって中間体ｐΔＬ２．４を得た。
【００６１】
この中間体において、4,391〜7,453ヌクレオチドの間に含まれるオリジナルのゲノム断片は削除され、2,100ｐｂの組み換え配列が残った。さらに、ＰＣＲのＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＶ断片を、ＥｃｏＲＶ−Ｐｍｅｌで切り出して短絡化し、ＡｄＥＡＳＹのｐＳｈｕｔｔｌｅ中にクローニングした。ＥｃｏＲＩ部位は維持された。
【００６２】
４９１ヌクレオチドのＳｗａＩ部位において、ｐＶＡＸ由来の発現カセットが、ＣＭＶ、ｐｏｌｉＬｉｎｋｅｒ及びＰｏｌｉＡを用いてクローニングされ、また、当該カセットは対象遺伝子のクローニングに特有のＰｍｅＩ部位が含有され、それにより対象の感染性クローンを得た。感染性クローンの細胞培養中でのトランスフェクションにより、対象の組み換えウイルスが作製される。
【００６３】
実施例２ 細胞培養中でのｒＦＡｄＶ−９−４３５組み換えウイルスｒＦＡｄＶ−９−４３５の作製
【００６４】
実施例１に記載の技法に従い、低病原性トリインフルエンザウイルスＶＩＡＢＰ−Ｈ５Ｎ２由来のＨ５遺伝子が挿入されている、ＦＡｄＶ−９感染性クローン、４３５株（ｒＦＡｄＶ９−４３５）を得た。当該クローンのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号はＦＪ８６４６９０であり、配列番号２を含有している。
【００６５】
最初に、マスターシード（ＳＭ）を得るため、ｒＦＡｄＶ９−４３５を、細胞培養ボトルにおいてＤＭＥＭ  Ｆ１２＋Ｇｌｕｔａｍａｘ培養培地で増殖させたＣｅＬｉ細胞株中で複製させた（静的系）。７回のブラインド継代を同じ細胞型で行った後、１０６．０ＤＩＣＣ５０％の免疫ペルオキシダーゼテストの力価を得た。回収物を２０分間、５００ｇで遠心し、１．５ｍＬの冷凍保存バイアル中で分け、−７０℃〜−８０℃の温度で、極低温凍結で維持した。
【００６６】
テストは、ＳＭに対し、細菌、トリマイコプラズマ、真菌及び酵母の存在を排除するために行われ、ならびに当該ＭＳがトリウイルスフリーであることを証明するために行われた。
【００６７】
さらに、ＳＭを、特定病原体未感染（ＳＰＦ）のニワトリにおいて検証し、無毒性、力価、免疫原性、及び適切な防御及び免疫原性を惹起するために必要とされる最小用量を決定した。
【００６８】
プロダクションシードを作製するために、同じ細胞（ＣｅＬｉ）上でマスターシードを用いてさらなる継代を行った。
【００６９】
実施例３ 他の組み換えウイルスの作製
【００７０】
上述と同じ技法に従い、追加のＦＡｄＶ−９組み換えウイルスを、表１に示される内容に従い得た。
【表１】
2017526737.tif 000003
【００７１】
これら組み換えベクターは、ＸｈｏＩ消化により特徴解析された。図１Ａにおいて、ｒＦＡｄＶ９−Ｈ７ＩＡ組み換えベクターのＤＮＡ制限酵素地図を示す。４．７ｋｂのバンドは、異種遺伝子がクローニングされた制限酵素断片を示す。図１Ｂにおいて、３６２９ｂｐが観察され、それはトリインフルエンザＨＡ遺伝子に相当しており、このことから、ｒＦＡｄＶ９−Ｈ７ＩＡ組み換えベクターは実際にこの遺伝子が挿入されており、さらには当該ベクターが細胞培養中で１０回の継代を行った後も安定であることを示している。図１Ｃ、左側に、非感染ＣｅＬｉ細胞培養物が観察される一方で、右側には１．１ｘ１０６ＵＦＰのウイルス力価でｒＦＡｄＶ９−Ｈ７ＩＡ組み換えベクターがＣｅＬｉ細胞中で増幅したことにより引き起こされた細胞変性作用が観察され、このことから、当該組み換えベクターが安定に及び正常にＣｅＬｉ細胞培養中で振る舞ったことにより、良好な細胞変成作用が生じたことを示している。
【００７２】
さらに、図２Ａにおいて、ｒＦＡｄＶ９−Ｆｉｂ  ＨＣＩ組み換えベクターのＤＮＡ制限酵素地図を示す。１．４ｋｂのバンドは、異種遺伝子がクローニングされた制限酵素断片を示し、一方で図２Ｂにおいて、血清型４封入体肝炎の突起４の遺伝子に相当する1652ｐｂのバンドが見られ、ｒＦＡｄＶ９−Ｆｉｂ  ＨＣＩ組み換えベクターは実際にこの遺伝子が挿入され、さらに、当該ベクターは細胞培養中で１０回の継代後も安定であることを示している。最後に、図２Ｃの左側に、非感染ＣｅＬｉ細胞培養が見受けられ、一方で、右側に、１．４ｘ１０５ＵＦＰのウイルス力価でｒＦＡｄＶ９−Ｆｉｂ  ＨＣＩ組み換えベクターがＣｅＬｉ細胞中で増幅したことにより引き起こされた細胞変性作用が観察され、このことから、当該組み換えベクターは安定に及び正常にＣｅＬｉ細胞培養中で振る舞ったことにより、良好な細胞変成作用が生じたことを示している。
【００７３】
図３Ａにおいて、ｒＦＡｄＶ９−ｇＢＬＴ組み換えベクターのＤＮＡ制限酵素地図を示す。５．６ｋｂのバンドは、異種遺伝子がクローニングされた制限酵素断片を示す。図３Ｂにおいて、トリ感染性喉頭気管炎のｇＢ遺伝子に相当する4,573ｐｂのバンドが示され、ｒＦＡｄＶ９−ｇＢＬＴ組み換えベクターは実際にこの遺伝子が挿入され、当該ベクターは細胞培養中で１０回の継代後も安定であることを示している。図３Ｃにおいて、左側に、非感染ＣｅＬｉ細胞培養が見受けられ、一方で、右側に、２．６ｘ１０６ＵＦＰのウイルス力価でｒＦＡｄＶ９−ｇＢＬＴ組み換えベクターがＣｅＬｉ細胞中で増幅したことにより引き起こされた細胞変性作用が観察された。上述のことから、当該組み換えベクターはＣｅＬｉ細胞培養中で安定であることが示されている。
【００７４】
図４Ａにおいて、ｒＦＡｄＶ９−ＨＮ組み換えベクターのＤＮＡ制限酵素地図を示す。４．８ｋｂのバンドは、異種遺伝子がクローニングされた制限酵素断片を示す。図４Ｂにおいて、ニューカッスル病のＨＮ遺伝子に相当する996ｂｐのバンドが示され、それと共に、ｒＦＡｄＶ９−ＨＮ組み換えベクターが実際にこの遺伝子が挿入され、当該ベクターが、細胞培養中で１０回の継代後も安定であることを示している。図４Ｃにおいて、左側に、非感染ＣｅＬｉ細胞培養が見受けられ、一方で、右側に、１．３ｘ１０６ＵＦＰのウイルス力価でｒＦＡｄＶ９−ＨＮ組み換えベクターがＣｅＬｉ細胞中で増幅したことにより引き起こされた細胞変性作用が観察された。上述のことから、当該組み換えベクターはＣｅＬｉ細胞培養中で安定であることが示されている。
【００７５】
実施例４ 他の公知のアデノウイルスベクターによるＦＡｄＶ−９組み換えベクターの作製
【００７６】
ＦＡｄＶ−９の４５ｋｂのゲノムを、プラスミドのｐＷＥ−１５中にクローニングした。このゲノムは、ＴＲ−１（37,648〜37,812ヌクレオチドの間に位置する）及びＴＲ−２（38,707〜40,561ヌクレオチドの間に位置する。すなわち、３´末端の(60及び100mu)中の0.0023と0.0039の間）と呼ばれるタンデム中に２つの反復ブロックを有しており、それらはウイルスの複製には必須ではない。
【００７７】
その後、ｐＷＥ−１５中のこのゲノムを、プラスミドｐＢｇにサブクローニングし、ゲノム末端に、細胞培養中でのウイルス産生の間のＤＮＡの直線化に有用なＰａｃＩ部位を付加した。
【００７８】
中間体を作製するために、ＴＲ−２領域をＰＣＲにより増幅し、両末端に、固有のＣｅｕｌ部位及びＰｌ−ＳｃｅＩ部位と共に細菌プラスミドｐＴＲＥ−２中にクローニングした。その後、ニューカッスル病ウイルスのＨＮ遺伝子の発現を操作するためのＣＭＶ−ポリリンカーを含有する発現カセットを挿入し、それによって、感染性クローンｐＦΔＴＲ２−ＣＭＶ  ＨＮを得た。
【００７９】
ｐＦΔＴＲ２−ＣＭＶ  ＨＮ組み換えウイルスは、ＣｅＬｉ細胞培養中に感染性クローンをトランスフェクションすることにより得た。
【００８０】
図５Ａにおいて、ｒＦΔＴＲ２−ＣＭＶ  ＨＮ組み換えベクターのＤＮＡ制限酵素地図を見ることができる。3,473ｋｂのバンドは、異種遺伝子がクローニングされた制限酵素断片を示す。図５Ｂにおいて、ニューカッスル病ウイルスのＨＮ遺伝子に相当する3,473ｂｐを示す、Ｘｈｏｌを用いてＤＮＡ消化されたバンドが示されており、それとともに、ｒＦΔＴＲ２−ＣＭＶ  ＨＮ組み換えベクターが実際にこの遺伝子が挿入されたことが示される。 それにもかかわらず、図５Ｃにおいて、１．１ｘ１０４ＵＦＰのウイルス力価を用いて、ＣｅＬｉ細胞培養中で２回の継代が行われた後、ＨＮ遺伝子に相当する3,473ｂｐのバンドが消失したことが観察され、このことから、ｒＦΔＴＲ２−ＣＭＶ  ＨＮベクターは、細胞培養中での継代後、外来性遺伝子挿入を失い、それにより、組み換えワクチンの産業向け製造には不安定であり、不適切であることが示される。
【００８１】
実施例５ トリインフルエンザのＨ５挿入を有するＦＡｄＶ−９組み換えウイルス：ｒＦＡｄＶ−９−４３５を用いた活性ワクチンを作製する方法
【００８２】
ＣｅＬｉ細胞株をＲｏｌｌｅｒシステム中で定常的に培養した。この目的のために、Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ（ＢＣＴ）から得た３２回継代ウイルスをＴ２５バイアル中に融かした。[1] ３回の連続継代を１：３の比率で２〜３日ごとに行い、増殖速度（ＴＤ＝２４時）を回復させた。増殖速度が回復された時点で、細胞を、Ｔ７５ボックス及びＴ２２５ボックス（１：３の比率）中で増殖させ、８０％コンフルエンスになったとき、実施例２に従い得た、０．１ＤＩＣＣ５０％／ｍＬの感染多重度（ｍｏｉ）を有するプロダクションシードを用いて感染させた。感染後５日目に、内容物ごとバイアルを２４時間、−７０℃に凍結させた。次いで、それらを溶かし、内容物を回収し、２０分間、５００ｇで遠心した。作製された量に応じて、パッケージした。
【００８３】
免疫ペルオキシダーゼにより回収物を力価測定し、１０５．３ＤＩＣＣ５０％／投与量に達するよう、安定化剤としてＴＰＧＡ  ｃｂｐと、回収された液体を加えることにより製剤化した。実験用ワクチンは、使用するまで−２０℃〜−３０℃の間の温度で凍結を維持した。
【００８４】
実施例６ マレック病に対するワクチンを用いて、または用いずに適用されたｒＦＡｄＶ９−４３５組み換え活性ワクチンのｉｎ  ｖｉｖｏ評価
【００８５】
実験は、本発明の活性ワクチンの有効性の測定を目的として、及びマレック病に対するワクチンと組み合わせて鳥類に投与された際に、影響を与えないこと、及び影響を与えられないことの実証を目的として行われた。ワクチンは、ｉｎ  ｏｖｏ及び皮下に投与された。
【００８６】
この目的に対し、２７０羽の１日齢（ＤＥ）の市販Ｌｅｇｈｏｒｎ軽種鶏（ＣＲＬ）を用いて、これを表２に示される内容に従い、３０匹ごと、９群に分けた。
【００８７】
ｒＦＡｄＶ９−４３５活性ワクチンを、尿膜腔（Ａｉ）を介して１０６．１ＤＩＣＣ５０％／０．２ｍＬの比率でインキュベーション（ＤＩ）を１８日間行った後、２群及び６群に対しては単独でｉｎ  ｏｖｏで適用され、１群及び５群に対してはマレック株ＨＶＴに対するワクチンと組み合わされて混合及び適用された。他方で、実験は、１０６．１ＤＩＣＣ５０％／０．２ｍＬの比率でｒＦＡｄＶ９−４３５ワクチンを用いた免疫化に対し、首の中部及び上部に、孵化（ＤＥ）の翌日、皮下（ＳＣ）に当該ワクチンを適用して実験が行われた。ワクチン単独は、４群及び８群に対して投与され、ならびに３群及び７群に対してはマレック株ＨＶＴに対するワクチンと組み合わせて混合及び適用された。最終的に、１０ＤＥで、５〜８群は、１０６．５ＤＩＣＣ５０％／０．５ｍＬのｒＦＡｄＶ９−４３５ワクチンを皮下投与により再ワクチン化された。
【００８８】
【表２】
2017526737.tif 000004
【００８９】
動物は、アイソレーションユニット中で飼育され、各チャレンジに対し、１０羽のニワトリごと、３つの亜群に群を分け、１９ＤＥ、３１ＤＥ、及び４５ＤＥでチャレンジされた。
【００９０】
チャレンジウイルスは高病原性トリインフルエンザウイルスのＶＩＡＡＰ−Ｈ５Ｎ２、A/chicken/Queretaro株であり、１０７．５ＤＩＥＰ５０％／０．３ｍＬが各ニワトリに適用されるよう、ｐＨ７．２までＰＢＳで調製され、各ニワトリが投与された量は、各々の目に０．０６ｍｌ（２滴）、及び鼻孔に０．０９ｍｌ（３滴）が適用された。
【００９１】
実施例６Ａ 有効性の評価
【００９２】
臨床データを評価するためにチャレンジ後、１０日間、毎日、全群が観察された。各ニワトリは個々に検査され、表３のデータに従い、数値でスコア化された。
【００９３】
【表３】
2017526737.tif 000005
【００９４】
各実験群の臨床データの重症度（ＭＣＤＳ）に対する最大値は、個々の値の加算の平均に相当する。死亡率（Ｍ）は、１０日間の観察の間、累積ベースで推定され、臨床シグナルの最大値を１００％で調節した。
【００９５】
群の最大罹患率（ＭＭ）は、１０日の観察期間のうちの１日における病鳥の最大割合に等しい。罹患率指数（ＩＭｂ）は、以下のように算出された。
【数１】
2017526737.tif 000006
たとえば、
【数２】
2017526737.tif 000007
【００９６】
１９ＤＥ、３１ＤＥ、及び４５ＤＥでＶＩＡＡＰ−Ｈ５Ｎ２を用いてチャレンジされたニワトリに対する死亡率に対する防御（ＰＭ：ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｔｏｗａｒｄｓ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ）及びＩＭｂに対する防御の結果を表４に提示する。
【００９７】
【表４】
2017526737.tif 000008
【００９８】
見てわかるように、有効性の結果から、Ｈ５Ｎ２トリインフルエンザの制御における使用に対する、本発明のｒＦＡｄＶ９−４３５ワクチンの効果が確認され、及び他のトリインフルエンザ亜型の制御に用いられ得ることが示唆される。
【００９９】
同様に、これらの結果から、マレック病に対するワクチンの混合及び適用は、ｒＦＡｄＶ９−４３５活性ワクチンと併用適用した際に干渉しないことが確認される。
【０１００】
実施例６Ｂ 免疫原性評価
【０１０１】
赤血球凝集抑制試験（ＩＨ）の結果から、ワクチン化群及び対照群の両方の、ＶＩＡ−４３５の抗原（Ａｇ）に対する抗体価は非常に高い母親由来抗体価を示し、１ＤＥで得られたトリ血清中では、２９．３で２９．０（図６）、１０ＤＯで得られた血清に対しては２８．６〜２８．８（図７）であった。
【０１０２】
全群（対照群及びワクチン化群の両方。ｉｎ  ｏｖｏで免疫化された群、またはＤＥで免疫化され１０ＤＥでｒＦＡｄＶ９−４３５の再ワクチン化された群を含む）から１９ＤＥで得られた血清の場合においては、検出された抗体価は、２３．６〜２４．６の範囲であった（図８及び９）。
【０１０３】
上記の結果から、検出された抗体価は、ｒＦＡｄＶ９−４３５のワクチン投与により誘導されない母親由来抗体に相当することが示される。
【０１０４】
しかしながら、上述のように、異なる群に対する１９ＤＥでの早期チャレンジに対し投与されたＰＭは９０％〜１００％であったことから、本発明のワクチンの有効性は、ＶＩＡ−４３５に対する母親由来抗体により影響されなかったことが示される。さらに、細胞型特異的免疫応答を刺激し、チャレンジの前に防御を生み出すことが可能であることが示唆され、このことは、細胞性免疫はウイルス疾患の制御に対し重要であることを指摘した科学文献と合致する。
【０１０５】
さらに、３１ＤＥで得られた血清に関し、図１０において見られるように、結果から、ｉｎ  ｏｖｏで免疫化された群はＩＨテストに対し検出可能レベルの抗体反応を示さず、一方で、ＤＥで免疫化された群に対しては、ｒＦＡｄＶ９−４３５ワクチンに起因する抗体価は、５群及び６群で２６．３〜２５．８の力価が検出され、平均２２．１であった非ワクチン化対照群とは対照的であった。
【０１０６】
図１１に示されるように、ｉｎ  ｏｖｏで免疫化され１０ＤＥでの再ワクチン化された群の場合、中程度のｒＦＡｄＶ９−４３５ワクチン誘導抗体価が検出され、それぞれ５群及び６群で、２４．４〜２４．０であった。   比較として、非ワクチン化対照群は、平均１０２．１のＩＨ抗体価であり、これは技術的に陰性の力価と見なされるものである。ＤＥで免疫化され、１０ＤＥで再ワクチン化された群の場合には、７群及び８群のそれぞれに対し、２６．９及び２６．８という結果であり、既往免疫応答が存在していたことが示唆される。
【０１０７】
３８Ｄで得られた血清の場合には、図１２の結果から、ｉｎ  ｏｖｏで免疫化された群に対し、最初のｒＦＡｄＶ９−４３５ワクチンによって、ＶＩＡ−４３５Ａｇに対する当該抗体群の検出が可能となり、より具体的には、１群は２４．４、及び２群は２４．１であった。
【０１０８】
他方で、ＤＥで免疫化された群に対しては、抗体価は３群及び４群のそれぞれに対し２８．８及び２８．４の力価であり、平均２１．２であった非ワクチン化対照群とは対照的であった。
【０１０９】
それによって、ｉｎ  ｏｖｏで免疫化され、１０ＤＥで再ワクチン化された群に対し、３群及び４群のそれぞれに対し２５．５及び２６．１の力価で、ｒＦＡｄＶ９−４３５ワクチンに対する誘導抗体価が検出され、比較として、非ワクチン化の対照群に対しては平均１０１．２の力価が得られた。
【０１１０】
ＤＥで免疫化され、１０ＤＥで再ワクチン化された群の場合は、７群及び８群のそれぞれに対し、２８．９及び２８．４の力価であり、このことから、３８ＤＥでさえ、全群に対し抗体価の上昇が維持されたことが示唆される。
【０１１１】
最後に、４５ＤＯで得られた血清に対し、図１４で理解されるように、ｉｎ  ｏｖｏで免疫化された群に対し、結果から、ｒＦＡｄＶ９−４３５ワクチンによりＶＩＡ−４３５Ａｇに対する抗体が検出されたことが示され、１群に対しては２４．３、２群に対しては２４．６であり、一方で、３群及び４群に対しては、抗体価はそれぞれ２８．４及び２８．１の力価であり、平均２０．８が得られた非ワクチン化対照群とは対照的であった。
【０１１２】
ｉｎ  ｏｖｏで免疫化され、１０ＤＥで再ワクチン化された群において（図１５）、ｒＦＡｄＶ９−４３５ワクチンにより誘導された抗体価は、５群及び６群のそれぞれにたいし２６．６及び２６．８で検出され、比較として、非ワクチン化対照群は平均１００．８が得られた。
【０１１３】
ＤＥで免疫化され、１０ＤＥで再ワクチン化された群の場合には、７群及び８群のそれぞれに対し２９．６及び２１０．０の結果であり、このことから、４５ＤＥでさえ、抗体価は、５群及び６群と同レベルで維持された一方で、７群及び８群に対しては、抗体価の上昇が維持されていたことが示唆される。
【０１１４】
上述から分かるように、これらの結果は、本発明に従い作製されたｒＦＡｄＶ９−４３５ワクチンは、３１ＤＥからの検出があったｉｎ  ｏｖｏでワクチン化された群、ｉｎ  ｏｖｏでワクチン化され、１０ＤＥで再ワクチン化された群に対して、ＩＨテストに関し検出可能なレベルの抗体を誘導する能力を有していることを示す。     一方で、ＤＥでワクチン化され、再ワクチン化されなかった群に対しては、３１ＤＥから検出されたが、力価はｉｎ  ｏｖｏでワクチン化され、１０ＤＥで再ワクチン化された群の力価よりも高かった。ＤＥでワクチン化され１０ＤＥで再ワクチン化された群に関しては、この時点で、検出された抗体価から有力な既往反応は明らかにされなかった
【０１１５】
１群（ｉｎ  ｏｖｏワクチン化）に対する抗体価は、３８ＤＥで最初に検出され、３群（ＤＥでワクチン化）に対しては抗体価の上昇が検出され、このことから、ｒＦＡｄＶ９−４３５ワクチンは３８ＤＥでさえ液性免疫の上昇を維持していたことが示唆される。同様に、３８ＤＥで、ｉｎ  ｏｖｏでワクチン化され、１０ＤＥで再ワクチン化された群に対し、ｉｎ  ｏｖｏのみで投与された群よりも高い抗体価の上昇が記録された一方で、ＤＥでワクチン化され１０ＤＥで再ワクチン化された群に対しては、３８ＤＥでの抗体上昇は、ＤＥでの１回の投与のみを受けた群と比較し、有意差はなかった。
【０１１６】
ｉｎ  ｏｖｏでワクチンの単回投与を受けた群、及びＤＥでワクチンの単回投与を受けた群の両方で、抗体価は４５ＤＥで、３８ＤＥと実質的に同じ抗体価で維持されていたことから、これらの群に対し、ＩＨテストにより検出可能な循環抗体は３８ＤＥで最大値に達することが示唆される。ｉｎ  ｏｖｏ及び孵化翌日でワクチン化され、１０ＤＥで再ワクチン化された群に対して、抗体価の有力な上昇はまだ検出されていた。
【０１１７】
実施例７ 単独、またはマレック病ワクチンと併用したｒＦＡｄＶ９−４３５活性ワクチンの、９３ＤＥでのチャレンジを用いたｉｎ  ｖｉｖｏ評価
【０１１８】
２つ目の実験は、本発明の活性ワクチンの有効性を測定するために行われた。
【０１１９】
表５に示される内容に従い、ワクチンは、３０羽ごとの６群に分けられた１８０羽のＣＲＬニワトリに対し、ＳＣを介して投与された。本発明と併用して使用されたマレック病に対するＨＶＴワクチンは、４２００ＵＦＰ／ｍＬの力価を有する市販ワクチンであり、市販の実験指示書に従い行われた。
【０１２０】
以下の実施例の目的に対し、１回のニワトリ投与量（ＤＰ）は、ＤＩＣＣ５０％で表されている、各トリに投与された投与量の対数尺度の指数に相当しているとみなされ、たとえば１０７．１ＤＩＣＣ５０％の１回投与量が投与された場合、これは７．１ＤＰと等しい。
【０１２１】
動物はアイソレーションユニット中で飼育され、１９、３１及び９３ＤＥで、０．３ｍＬのＶＩＡＡＰ−Ｈ５Ｎ２（A/chicken/Queretaro/14588-19/95株）を用いて眼内投与及び鼻孔内でチャレンジされ、各ニワトリに対し、０．３ｍＬ中、１０８．０ＤＩＥＰ５０％が適用された。
【０１２２】
【表５】
2017526737.tif 000009
【０１２３】
実施例７Ａ 有効性評価
【０１２４】
各チャレンジの後、１０日間の間、毎日全ての群を観察した。臨床評価を行うために、各ニワトリは個々に綿密に検査され、表３に従い、観察された臨床変化により数値を与えられた。
【０１２５】
Ｍ及びＩＭｂは、実施例６Ａに示される内容に準じて算出された。結果は図１６〜１８に示す。
【０１２６】
１９ＤＥでの早期チャレンジの前の効果の結果から、マレックワクチン自身の希釈剤に溶解したＨＶＴワクチンと混合され、または単独で、７．１ＤＰで０．２ｍＬの割合でＳＣを介して適用されたｒＦＡｄＶ９−４３５ベクター化ワクチンは、それぞれ、１８．４％と１９．３％の低いＩＭｂで、７０％の死亡率の防御（ＰＭ）をもたらした。この結果から、ｒＦＡｄＶ９−４３５ワクチンの免疫原性能力は、マレック病に対するＨＶＴワクチンにより影響を受けないことが確認される。
【０１２７】
１９ＤＥでの早期チャレンジの前の効果の結果から、マレックＨＶＴワクチンと共に、または単独で適用されたｒＦＡｄＶ９−４３５ベクター化ワクチンは、低いＩＭｂで７０％〜９０％のＰＭを生じさせることが示される（図１６を参照）。この結果から、ｒＦＡｄＶ９−４３５ワクチンの免疫原性能力はマレックに対するＨＶＴワクチンにより影響を受けないことが確認される。
【０１２８】
同様に、これらの結果から、ｒＦＡｄＶ９−４３５ワクチンの孵化翌日での６．１ＤＰの１回の適用のみで、７．１ＤＰの単回適用が投与される場合と同様の防御、または第二の投与が１０ＤＥで投与された場合と同様の防御をトリに与えることが示唆される。
【０１２９】
３１ＤＥでのチャレンジの場合、図１７に示される結果から、単独またはマレックに対するＨＶＴワクチンと併用して、ＳＣを介して適用されたｒＦＡｄＶ９−４３５ベクター化ワクチンは、すべての免疫化群において実質的にゼロのＩＭｂと１００％のＰＭを生じさせたことが示唆され、それと共に、ｒＦＡｄＶ９−４３５ワクチンの免疫原性能力はマレックに対するＨＶＴワクチンにより影響を受けないことも確認される。
【０１３０】
同様に、ｒＦＡｄＶ９−４３５の６．１ＤＰの単回適用は、３１ＤＥでのチャレンジに対し優れた防御をもたらすのに十分であることが観察される。
【０１３１】
同じように、図１８において、９３ＤＥでの後期チャレンジ前の効果の結果から、単独またはマレック病のＨＶＴワクチンと併用した本発明のセクタ化ワクチンは、実質的にゼロのＩＭｂと１００％のＰＭを生じさせることが示唆される。それとともに、ｒＦＡｄＶ９−４３５ワクチンは、孵化の翌日に投与される６．１ＤＰの単回投与を用いた場合でさえ、少なくとも９３ＤＥまで同じ免疫原性能力を維持することが示される。
【０１３２】
実施例７Ｂ 免疫原性の評価
【０１３３】
血清試料は、１９、３１、及び０３ＤＥで全群から採取され、使用されるまで−２０℃で維持された。ＩＨテストにおいて、連続二倍希釈された血清に、ＶＩＡＢＰ−４３５の４赤血球凝集素単位（ＵＨＡ）を当てた。
【０１３４】
結果を図１９〜２１に要約する。ＰＭとＩＭｂの結果に相似性が観察され、１９、３１及び９３ＤＥで行われたチャレンジに対する、免疫群で測定された抗体価は、すべての検証されたワクチンに対し、類似している。
【０１３５】
実施例８ ＳＣを介した適用と比較した、ＩＭを介して適用されたｒＦＡｄＶ９−４３５組み換え活性ワクチンの効果、及び羽嚢に対するマレック病のＨＶＴウイルスの検出
【０１３６】
表６に示される内容に従い、３３０羽のＬＰＥニワトリを用いて、各１５羽ずつ２２群に分けた。ワクチンは１ＤＥで、ならびに孵化後異なる時間（ＨＥ）及びＤＥで（非ワクチン化対照群を除く）、単独またはマレック病の市販ＨＶＴワクチンと併用されて投与された。マレック病ワクチンは４２００ＵＦＰ／ｍＬの力価を有し、投与は市販の実験指示書に従い行われた。
【０１３７】
トリはアイソレーションユニット中で飼育され、３１ＤＥで眼内及び鼻孔を介して、０．３ｍＬのＶＩＡＡＰ−Ｈ５Ｎ２（A/chicken/Queretaro/14588-19/95株）を用いてチャレンジされ、各ニワトリに対し１０８．０ＤＩＥＰ５０％の投与量が適用された。
【０１３８】
【表６−１】
2017526737.tif 000010
【表６−２】
2017526737.tif 000011
【０１３９】
実施例８Ａ マレックウイルスＨＶＴ株の検出
【０１４０】
ワクチン化後（ＰＶ）の１５日目、免疫化群及び非ワクチン化対照群の各々の５羽のニワトリから３つの羽嚢を得て、ｐＨ７．２でＰＢＳと１：５の比率で浸軟マス（ｍａｃｅｒａｔｅｄ  ｍａｓｓ）を準備するために用いて、ＰＣＲ及びＰＣＲｔｒ検査を当該試料で行った。検査結果を表７に示す。
【０１４１】
【表７】
2017526737.tif 000012
【０１４２】
観察されるように、マレックに対するＨＶＴ株ワクチン単独で、または異なるワクチン化スケジュールでｒＦＡｄＶ９−４３５と共にワクチン化されたすべての群において、羽嚢上でのＨＶＴウイルス検出に特異的なＰＣＲ検査に対し、陽性が得られた。対照的に、ｒＦＡｄＶ９−４３５のみで免疫化された群、及び非ワクチン化対照群は、同じＰＣＲ／ＨＶＴ検査に対し陰性であった。
【０１４３】
ＰＣＲｔｒ検査に関しては、ＨＶＴワクチンのみでワクチン化した群に対する結果は、９．７ｘ１０６．０であった一方で、ＨＶＴとｒＦＡｄＶ９−４３５の適用を用いて異なるスケジュールで免疫化したすべての群については、結果は、１．６ｘ１０６．０〜８．３ｘ１０６．０に変化した。ｒＦＡｄＶ９−４３５のみでワクチン化した群、及び非ワクチン化対照群の場合は、結果は陰性であった。
【０１４４】
ｒＦＡｄＶ９−４３５ワクチンの投与経路（ＳＣまたはＩＭ）及びマレック病のＨＶＴウイスルの発症機序（ＳＣ）に従い、ＰＣＲ及びＰＣＲｔｒの両方の結果から、ＨＶＴワクチンウイルスは異なる器官で適切に複製され、最終的には羽嚢に落ち着く一方で、ＰＣＲｔｒ検査で検出された１０を底とする対数での差異（有意ではない）は、ＨＶＴウイルスの複製、器官におけるウイルス量または循環に、適切なＨＶＴワクチン免疫反応が無効化される程度にまでｒＦＡｄＶ９−４３５ワクチンが干渉することを示さなかった。
【０１４５】
実施例８Ｂ 有効性評価
【０１４６】
全群が、チャレンジ後（ＰＤ）、１０日間毎日観察された。臨床評価を行うために、各ニワトリは個々に綿密に検査され、表３に従い、観察された臨床変化により数値を与えられた。
【０１４７】
ＰＭ及びＩＭｂは、実施例６Ａに示される内容に準じて算出された。また、結果は表７に示す。
【０１４８】
有効性の結果から、ＨＶＴワクチンと共に、またはＨＶＴワクチンは伴わず、及び異なるワクチン化スケジュールでＳＣまたはＩＭを介して適用されたｒＦＡｄＶ９−４３５ワクチンは、すべての場合において優れた１００％のＰＭ及び実質的にゼロのＩＭｂを生じさせることができた一方で、非ワクチン化対照は最大ＩＭｂが１００％、ＰＭは０％であったことが示される。
【０１４９】
実施例８Ａ及び８Ｂの結果によると、マレック病に対するＨＶＴ株ワクチン、及びＩＡＡＰ−Ｈ５Ｎ２に対するｒＦＡｄＶ９−４３５ワクチンは、当該２つのワクチンのいずれの免疫反応にも影響を与えることなく、一緒に用いることができると言えるであろう。
【０１５０】
実施例９ ＳＣを介した適用と比較した、ＩＭを介して適用されたｒＦＡｄＶ９−４３５組み換え活性ワクチンの効果
【０１５１】
ＬＰＥニワトリ各１０羽で５群を作り、表８に従い、そのうちの４群にワクチン化を行い、１群は非ワクチン化対照とした。
【０１５２】
ニワトリはアイソレーションユニット中で飼育され、０．３ｍＬのＶＩＡＡＰ−Ｈ５Ｎ２（A/chicken/Queretaro/14588-19/95株）を用いて、眼内及び鼻孔を介して３１ＤＥでチャレンジされ、各ニワトリに対し、７．５ＤＰが適用された。
【０１５３】
【表８】
2017526737.tif 000013
【０１５４】
実施例９Ａ 有効性の評価
【０１５５】
全ての群は、ＰＤ後、１０日間毎日観察された。臨床評価を行うために、各ニワトリは個々に綿密に検査され、表３に従い、観察された臨床変化により数値を与えられた。
【０１５６】
ＰＭ及びＩＭｂは、実施例６Ａに示される内容に準じて算出された。結果を図２２に示す。
【０１５７】
ＶＩＡＡＰ−Ｈ５Ｎ２を用いて３１ＤＥでチャレンジを行う前の有効性の結果から、Ｇ１及びＧ２で孵化翌日にＩＭを介して適用されたｒＦＡｄＶ９−４３５ベクター化ワクチンは、それぞれ、１．２及び２．３のＩＭｂと共に１００％のＰＭを付与したことが示唆される。ＳＣを介して免疫化されたＧ３及びＧ４の結果は、１．３及び２．６のＩＭＢ、ならびに１００％のＰＭであり、このことから、ｒＦＡｄＶ９−４３５ワクチンの投与に対する、ＳＣ経路ならびにＩＭ経路利用の実用性が確認される。
【０１５８】
実施例９Ｂ 免疫原性の評価
【０１５９】
血清試料は３１ＤＥで全群から採取され、使用されるまで−２０℃で維持された。ＩＨテストにおいて、連続二倍希釈された血清に、ＶＩＡＢＰ−４３５の４赤血球凝集素単位（ＵＨＡ）を当てた。
【０１６０】
ＩＨテストの結果を図２３に示す。３１ＤＥで採取された血清は、それぞれ、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３及びＧ４に対し、平均で２４．６、２５．１、２４．５及び２４．８を示していることから、チャレンジ前のトリの防御との強い相関が示唆される。
これらの結果から、本発明のワクチンは、ＩＭを介して投与された場合、及びＳＣを介して投与された場合、循環抗体の誘導に等しく効果的であることが確認される。
【０１６１】
実施例１０ トリ感染性喉頭気管炎に対するｒＦＡｄＶ９−ｇＢ組み換え活性ワクチンのｉｎ  ｖｉｖｏ評価
【０１６２】
実施例５と同様に、トリ感染性喉頭気管炎（ＬＴＩ）の糖タンパク質Ｂ挿入を有するトリアデノウイルスベクターの組み換えワクチン、いわゆるｒＦＡｄＶ９−ｇＢワクチンを作製し、その有効性を検証した。
【０１６３】
９０羽のＬＰＥニワトリを、１０羽ごと、９群に分け、１群を非ワクチン化対照群に、１群を非ワクチン化及び非チャレンジ対照群に、ならびに７群を以下のワクチンを用いて免疫化し、それらを用いた：ａ）ｒＦＡｄＶ９−ｇＢワクチン、及びｂ）ニワトリ胚改変活性ウイルス（ＣＥＰ−ＬＴＩ）を用いた市販ワクチン。これらの群を、表９に示される内容に従い免疫化した。
【０１６４】
動物はアイソレーションユニット中で飼育され、３１ＤＥで高ウイルス負荷量のＬＴＩウイルス（ｖｖＬＴＩ）、ＵＳＡ６３，１４０株を用いてチャレンジし、それらは各ニワトリに対し、０．３ｍＬ中、３．９ＤＰの適用量で各ニワトリに適用され、それぞれの目に２滴、及びそれぞれの鼻孔に３滴、適用された。
【０１６５】
【表９】
2017526737.tif 000014
【０１６６】
実施例１０Ａ 有効性の評価
【０１６７】
全ての群が、ＰＤ９日の間、毎日観察された。臨床評価を行うために、各ニワトリは個々に綿密に検査され、表３に従い、観察された臨床変化により数値を与えられた。
【０１６８】
Ｍ及びＩＭｂは、実施例６Ａに示される内容に準じて算出された。結果を表１０に示す。
【０１６９】
ワクチン化ＬＰＩニワトリのそれぞれの群で観察されたＩＭｂの結果から、ｖｖＬＴＩを用いたＰＤ９日で、臨床兆候は、非ワクチン化対照のＧ８に対して観察されたものよりも低く、ほとんどの場合、低〜中強度であった。
【０１７０】
ＳＣを介して７．１及び／または７．５ＤＰのｒＦＡｄＶ９−ｇＢワクチンを用いて免疫化されたＧ１、Ｇ２及びＧ３に対しては、ＩＭｂはそれぞれ６．２、６．１及び３．５であった一方で、１０倍低い用量のｒＦＡｄＶ９−ｇＢワクチン（６．１及び／または６．５ＤＰ）を用いて免疫化されたＧ４群、Ｇ５群、及びＧ６群に対しては、同様のＩＭｂが得られ、それぞれ、６．５、６．３、及び５．２であった（表１０）。これらの結果から、１０倍低い用量のｒＦＡｄＶ９−ｇＢベクター化ワクチンを使用しても、免疫化されたトリにおいて、ＬＴの臨床兆候の出現に対し、ワクチン化トリの防御に有意差は現れなかったことが示唆される。他方で、ＬＴＩウイルスのｇＢ遺伝子挿入を有する本発明の組み換えワクチンのｒＦＡｄＶ９−ｇＢは、喉頭および気管に対し、市販のＣＥＰ−ＬＴＩワクチンにやや劣る病変防御の結果を示した。
【０１７１】
Ｍに関しては、いずれの群においても観察されなかった。
【表１０】
2017526737.tif 000015
【０１７２】
実施例１０Ｂ 肉眼的病変の防御に対する有効性の評価
【０１７３】
チャレンジの９日後、全群のトリをと殺し、各群のトリの喉頭及び気管を精査し、肉眼的病変（喉頭及び気管の粘膜下層の漿液性滲出液及び点状出血の存在）の有無を決定し、非ワクチン化でチャレンジ有の値５（＋＋＋＋＋）を割り当てられたＧ８と、ワクチン化もチャレンジも行われず値ゼロ（−）を割り当てられた対照群（Ｇ９と呼ばれる）との肉眼的変化の程度を比較した。
【０１７４】
表１０に示される、様々な群のワクチン化ＬＰＥニワトリにおいて観察された肉眼的病変防御の結果から、ｒＦＡｄＶ９−ｇＢワクチンで免疫化されたすべての群が（１０倍低い用量の本ワクチンが適用されたＧ４、Ｇ５及びＧ６群に対してさえも）、似たような肉眼的病変防御指数を示し、ＣＥＰ−ＬＴＩ市販ワクチンにより生じた防御と非常に類似していた。
【０１７５】
これらの結果から、１０倍低い用量のｒＦＡｄＶ９−ｇＢの使用は、免疫化されたトリにおける肉眼的病変の出現低下に有意差を示さなかったことが確認され、及びそれとともに完全ウイルスで作製されニワトリ胚中で増殖させた市販ワクチンで得られる結果と近しい結果を、その市販ワクチンに伴うリスク無く、得ることが可能であることが確認された。
【０１７６】
上述によると、血清型９トリアデノウイルスベクターでの組み換えワクチンは、安定的な組み換えワクチンを作り出すものであり、それにより、マレック病ワクチンと組み合わせた場合でさえ、有効性があり、その効果は母親由来抗体の存在により影響を受けないことが理解され得、及び当分野の当業者であれば、上述及び添付の図面に解説される血清型９トリアデノウイルスベクターでの組み換えワクチンならびにその使用の実施形態は、解説のみを目的としており、本発明を限定するものではなく、その詳細におけるいくつかの検討事項の変化が、本発明の範囲を逸脱せずに可能であることが明らかであろう。たとえば、多様な外来性遺伝子と共に、細胞培養の連続継代で安定性を得ることが可能であること、及びワクチン処方のための受容可能な異なるタイプのビヒクルを用いることが可能であることが経験的に示されている。
【０１７７】
それゆえに、本発明は、先行技術により求められること、及び添付の請求項の範囲によるものを除き、制限されるべきではない。
【図１Ａ】
2017526737.tif 000016
【図１Ｂ】
2017526737.tif 000017
【図１Ｃ】
2017526737.tif 000018
【図２Ａ】
2017526737.tif 000019
【図２Ｂ】
2017526737.tif 000020
【図２Ｃ】
2017526737.tif 000021
【図３Ａ】
2017526737.tif 000022
【図３Ｂ】
2017526737.tif 000023
【図３Ｃ】
2017526737.tif 000024
【図４Ａ】
2017526737.tif 000025
【図４Ｂ】
2017526737.tif 000026
【図４Ｃ】
2017526737.tif 000027
【図５Ａ】
2017526737.tif 000028
【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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