(57)【要約】母体血のメタボロミクス解析に基づく胎児奇形の早期診断のための非侵襲的方法が、本明細書において記載される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
分類モデルを訓練するために奇形の胎児を有する母親および健康な胎児を有する母親から収集された血液試料の分析の第１相、ならびに妊婦から収集された血液試料のＧＣＭＳ分析および該第１相において確立された該分類モデルに基づくクラスメンバーシップの割り当ての第２相を含む、母体血のメタボロミクス解析に基づく胎児奇形の早期診断のための方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、該第１相が、以下の工程：
１．代謝産物の抽出および誘導体化；
２．ＧＣＭＳまたはＧＣ×ＧＣＭＳ分析；
３．データマトリックスの作成；
４．分類モデルの構造化；
を含む方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、該第２相が、以下の工程：
１．代謝産物の抽出および誘導体化；
２．ＧＣＭＳまたはＧＣ×ＧＣＭＳ分析；
３．データマトリックスの作成；
４．クラスメンバーシップの割り当て；
を含む方法。
【請求項４】
妊娠の第一期における胎児奇形の診断のための、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胎児奇形の早期診断のための非侵襲的方法に、より具体的には母体血のメタボロミクス解析に基づく胎児奇形の早期診断のための非侵襲的方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
胎児発生の欠陥（ｄｅｆｅｃｓ）は、合わせて全妊娠の２〜３％の頻度に達し(Hoyert DL, Mathews, T.J., Menacker F, et al. Annual summary of vital statistics: 2004. Pediatrics 2006; 117: 168-83)、周産期死亡および乳児死亡の約２１％(T.J. Mathews, M.S., and Marian f. MacDorman, Infant Mortality Statistics From the 2008 Period Linked Birth/Infant Death Data Set, National Vital Statistics Reports, 2012; 60 (5))、ならびにかなりの数の障害の症例および慢性疾患の原因である。これらの理由のため、胎児奇形のスクリーニングは、ほとんどの先進国において一般的な臨床診療である。この目的のための最も一般的に用いられる診断方法論は、超音波検査であり、それは非侵襲的方法であり、母親および胎児の両方に対して安全である。しかし、胎児奇形の検出におけるその有効性は、操作者の経験および用いられる設備の質に依存し、特定の臨床状態、例えば羊水過少症、母体肥満、または複雑な胎児の異常においては、いずれにしても低下する。
【０００３】
そのような臨床方法論の主な限界は、妊娠の第二期の前に先天性欠陥を検出することができないことである。一方で、妊娠の第一期において既に明確な疾患奇形の一部を同定することができる他の診断法、例えば絨毛膜標本採取および羊水穿刺が存在する。しかし、これらの方法は、トリソミーまたは他の形態の染色体病理（ｃｒｏｍｏｓｏｍｏｐａｔｈｉｅｓ）のような明確な先天性異常の一部に関してのみ有用であり、そしてそれらは侵襲的であり、従って母親および胎児の両方を重篤な合併症の重大な危険に晒す。
【０００４】
従って、胎児奇形を妊娠の第一期において優れた感度および特異性で検出することができる非侵襲的診断法の必要性が、非常に感じられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Hoyert DL, Mathews, T.J., Menacker F, et al. Annual summary of vital statistics: 2004. Pediatrics 2006; 117: 168-83
【非特許文献２】T.J. Mathews, M.S., and Marian f. MacDorman, Infant Mortality Statistics From the 2008 Period Linked Birth/Infant Death Data Set, National Vital Statistics Reports, 2012; 60 (5)
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、母体血のメタボロミクス解析、ならびにＰＬ−ＤＡおよびＯＰＬＳ−ＤＡ判別分析の両方のモデルならびにコンピューター学習モデル（ＳＶＭおよび決定木）も用いる多変量解析によって得られた結果の統合に基づく胎児奇形の早期診断のための非侵襲的診断法に関する。
【０００７】
“メタボロミクス”は、一般に、ある生物の小分子の代謝プロフィールの研究による細胞プロセスの分析を定義する。“メタボロミクス解析”により、本発明者らは、生物学的試料中の最大限の数の代謝産物の同定および濃度の決定を目標としたプロセスの実行を指す。
【０００８】
用語“メタボロミクス”は、一般に、ある生物に由来する小分子のメタボロミクスプロフィール研究による細胞プロセスの分析を指す。
用語“メタボロミクスプロフィール”により、本発明者らは、生物学的試料中の最大限の数の代謝産物の同定および濃度の決定を目標としたプロセスの実行を指す。
【０００９】
用語“代謝産物”は、一般に細胞または細胞のセットの同化作用型または異化作用型の生物学的プロセスに由来する小分子を指す。用語“代謝産物”により、本発明者らは、生物学的試料内で同定可能および測定可能である可能性のある１０００ダルトン未満の分子量を有する全部の分子を指す。
【００１０】
現在までに、ヒト血清中の数千種類の代謝産物が同定されており、メタボロミクスの適用は、多くの疾患、例えば統合失調症(Kaddurah-Daouk R., Metabolic profiling of patients with schizophrenia, PLOS Med 2006; 8:e363)、髄膜炎(Subramanian A. et al., Proton MR/CSF analysis and a new software as predictors for the differentiation of meningitis in children, NMR Biomed 2005; 18: 213-25)および結腸癌(C Denkert., et al., Metabolite profiling of human colon carcinoma - deregulation of TCA cuycle and amino acid turnover, Mol Cancer 2008; 7:1-15)におけるバイオマーカーの開発を可能にしてきた。
【００１１】
しかし、産科におけるメタボロミクスの使用は、今のところ子癇前症(RO Bahado-Singh, R. Akolekar, R. Mandal et al., Metabolomics and first-trimester prediction of early-onset preeclampsia, Journal of Maternal-Fetal and Neonatal Medicine, vol. 25(10): 1840-7,2012)、成長における制限(RPHorgan, OF Broadhurst, SKWalsh et al., Metabolic profiling uncovers a phenotypic signature of small for gestational age in early pregnancy, Journal of Proteome Research, vol. 10(8): 3660-73, 2011)の研究；および核磁気共鳴（ＮＭＲ）を用いた研究に限られてきた。現在までに、胎児奇形の診断のために、質量分析および計量化学技法と組み合わせられたガスクロマトグラフィーにおいて実施された研究は、文献において報告されていない。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の診断法は、２つの相に基づく。第１段階において、明確に奇形の胎児を有する母親からの試料および確実に健康な胎児を有する母親からの試料が分析され、これらの分類によってモデルが訓練される。訓練相として定義されるこの相は、２つの群の血液中の代謝プロフィールの特徴を作り出し、定めるように設計されている。表現“代謝プロフィール”は、代謝産物の相対比率に依存する、代謝産物が患者の血液中でとる特定のパターンを指す。
【００１３】
第２段階において、未知の試料が、ＧＣＭＳ分析を施され、結果として得られたクロマトグラムが、前もって訓練されたモデルに従って分類され、そうして最も可能性の高いクラスを推定する。
【００１４】
従って、診断プロセスは、個々の代謝産物の濃度の測定に基づくのではなく、代謝産物のクラスター全体がバイオマーカーと考えられ；前記の代謝産物は、それらが２つの群において異なる比率で存在する点で、２つの異なるクラスへの挿入を可能にする。
【００１５】
より詳細には、第１相は、いくつかの下位相（ｓｕｂ−ｐｈａｓｅｓ）に基づく：
１．代謝産物の抽出および誘導体化；
２．ＧＣＭＳまたはＧＣ×ＧＣＭＳ分析；
３．データ配列作成；
４．分類モデルの構造化。
【００１６】
第２相は、第１相の最初の３つの下位相の未知の試料への適用および第１相で公式化された分類モデルの質問（ｑｕｅｓｔｉｏｎ）に基づくメンバーシップの最も可能性の高いクラスの帰属を含む。
【００１７】
本発明の方法は、それが妊娠の第一期において既に用いられることができるという利点を有する。
代謝産物の抽出および誘導体化
５０Ｌの溶血血液を、２ｍＬのエッペンドルフチューブ中に移し、２０μＬの１ｇ／Ｌのリビトールの溶液および５００μＬのメタノールを添加する。溶液をボルテックスにおいて３０秒間混合する。７０℃で１５分間加熱した後、試料を２０℃において１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。上清の２００μＬのアリコート（ａｌｉｑｕｏｔ）を収集し、新しい２ｍＬのエッペンドルフチューブに移し、２００μＬの水および１００μＬのクロロホルムを添加し、ボルテックスにおいて３０秒間混合し、２０℃において４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離する。上清の２００μＬのアリコートを再度採取し、０．２ｍＬのガラスバイアル中に移し、窒素流の下で乾燥させ、次いでピリジン中２０ｍｇ／ｍＬのメトキシルアミン塩酸塩５０μＬを添加し、反応を暗所で２０℃において１６時間実施する。終了時に、１％トリメチルクロロシラン（ＴＭＣＳ）を含むＮ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド（ＢＳＴＦＡ）５０μＬをそれぞれのバイアルに添加し、シラン処理反応を７０℃で１６時間実施する。
【００１８】
本発明の目的に有用な代謝産物間の分離を得るため、一次元ガスクロマトグラフィーにおいて、および二次元ガスクロマトグラフィーにおいても操作することが可能である。二次元技法の最高の分解能は、分類においてよりよい正確さを与える可能性があるが、“本発明の操作の実験的証拠”において示されているように、最も一般的に知られている一次元ガスクロマトグラフィーを用いて操作することも可能である。
【００１９】
ＭＤＧＣＭＳ分析
二次元ガスクロマトグラフィーに関して、０．１０μｍのフィルム厚を有するＳＬＢ−５ｍｓ  ２０．０ｍ×内径０．１８ｍｍのタイプの一次カラム［シルフェニレン（ｓｙｌｐｈｅｎｉｌｅｎｅ）ポリマー、極性においてポリ（５％ジフェニル／９５％メチルシロキサン）に事実上同等である］（Ｓｕｐｅｌｃｏ）（第１オーブン中に配置されている）が用いられ、それはインターフェイス（ＳＧＥ）の位置１〜７のポートに接続されている。０．２５μｍのフィルム厚を有するＢＰＸ−５０  ５．０ｍ×内径０．２５ｍｍは、インターフェイスの位置７に接続されている。ＢＰＸ−５０  １．５ｍ×内径０．２５ｍｍ、０．２５μｍは、位置６において固定されており、３２０℃にした（ｐｕｔ）炎イオン化検出器（ＦＩＤ）に接続されており、一方で５．０ｍの分析カラム（ＦＩＤに接続されているカラムと化学的に同一）が、ｑＭＳシステムに接続されている。ＦＩＤに接続されているカラムは、第２次元における流れを低減するために、そして典型的でない化合物がクロマトグラフィーのランダムな変動の結果ではないことを確かめるために用いられる。４０μＬの外部キャピラリー（ステンレス鋼で作製された２０ｃｍ×外径０．７１ｍｍ×内径０．５１ｍｍ）が、ＳＧＥインターフェイスのポート３および４を接続するために用いられる。温度プログラムは、２つのオーブンに対して同じである：８０℃で１分間、次いで３℃／分において３２０℃まで加熱し、１分間保つ。初期ヘリウム圧（一定線形速度）は、１２９．６ｋＰａで固定される。やはり一定線形速度の条件で作動する初期補助ヘリウム圧ＡＰＣ（先行制御圧）は、９０．４ｋＰａに設定され、注入体積は、１：１０のスプリット比で１μＬに設定される。調節期間（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｐｅｒｉｏｄ）は、４．１秒に設定される（４．０秒の蓄積期間、０．１秒の注入期間）。四重極質量分析計の条件は、以下の通りである：イオン化方式：電子衝撃（７０ｅＶ）、質量範囲：４０〜８００ｍ／ｚ、走査速度：１０，０００ａｍｕ／秒。
【００２０】
ＧＣＭＳ分析
一次元ガスクロマトグラフィーに対して、ＺＢ５−ｍｓ  ６０．０ｍ×内径０．２５ｍｍ×０．２５μｍのタイプのカラム［シルフェニレン（ｓｙｌｐｈｅｎｉｌｅｎｅ）ポリマー、極性においてポリ（５％ジフェニル／９５％メチルシロキサン）に事実上同等である］（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）が用いられる。
【００２１】
ＧＣの温度プログラムは、８０℃で１分間、次いで３℃／分で３００℃まで加熱、そして１．６７分間の保持時間を与える。初期ヘリウム圧（一定線形速度）は、１２９．６ｋＰａで固定される。注入体積は、１：２の分割比で１μＬに設定される。四重極質量分析計の条件は、以下の通りである：イオン化方式：電子衝撃（７０ｅＶ）、質量範囲：４０〜８００ｍ／ｚ、走査速度：１０，０００ａｍｕ／秒。
【００２２】
データ配列作成
ＳＣＡＮモードにおいて得られたガスクロマトグラムは、ガスクロマトグラフィーによるプロットのバックグラウンドノイズの１０倍より大きい面積を有するピーク全部を同定するために統合される。それぞれのピークは、１つの数量化（ｑｕａｎｔｉｚａｔｉｏｎ）ｍ／ｚシグナルに基づいて、および少なくとも２つの品質認定（ｑｕａｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）ｍ／ｚシグナルに基づいて同定されなければならない。統合の結果、定量化は、標準化された百分率面積の方法を用いて実施され、リビトールのピークは、定量分析のための、そして保持時間の中心位置調整（ｃｅｎｔｅｒｉｎｇ）のための基準として用いられる。この数量化により得られた結果（標準化された百分率面積）は、マトリックスに移され、ここでそれぞれの試料は、行（ｌｉｎｅ）を表し、列（ｃｏｌｕｍｎｓ）は、それらのガスクロマトグラフィー保持時間により独特に同定された様々な代謝産物により表される。
【００２３】
マトリックスの最初の列は、試料のクラスを定めるために用いられる。最も単純なシナリオでは、２つのクラス“正常な胎児”および“奇形の胎児”のみが予想されることができ；この二分法の分類に基づく本発明の証拠は、本発明者らにより、“本発明の操作の実験的証拠”において示されているが、彼らは、十分な数の観察を置くことにより特定の奇形のクラスが分離され得る、より複雑な分類のシナリオを想像することが可能であると考えている。
【００２４】
分類モデルの構造化
様々な分類モデルが、本発明の目的に適しており；特に、ＰＬＳ−ＤＡ、ＯＰＬＳ−ＤＡ、ＳＶＭおよび決定木モデルの性能が、積極的に評価されてきた。
【００２５】
ＰＬＳ−ＤＡ
ＰＬＳは、元の変数（Ｘ）の線形の組み合わせにより特定のクラスのメンバーシップ（Ｙ）を提供することができる情報を引き出すために多変量回帰技法を用いる、管理された方法である。ＰＬＳ回帰は、Ｒ言語のｐｌｓパッケージにより提供されるＰＬＳＲ関数を用いて実施される(Ron Wehrens and Bjorn Helge-Mevik. Pls: Partial Least Squares Regression (PLSR) and Principal Component Regression (PCR), 2007, Rパッケージバージョン2.1-0)。分類および交差検証は、ｃａｒｅｔパッケージによる対応するラッパー関数を用いて実施される(Max Kuhn. Contributions from Jed Wing and Steve Weston and Andre Williams.caret: Classification and Regression Training, 2008, Rパッケージバージョン3.45)。クラス識別における有効性を評価するために、並べ替え検定が実施される。それぞれの並べ替えにおいて、ＰＬＳ−ＤＡモデルが、データ（Ｘ）および交換されたクラスラベル（Ｙ）から、元のクラスの割り当てに基づくモデルに関する交差検証により決定される構成要素の最適な数を用いることにより構築される。２タイプの統計検定が、クラス間の識別力を測定するために実施される。第１の統計検定は、モデルの訓練相における予測正確性に基づく。第２の統計検定は、クラス内およびクラス間での二次距離（ｑｕａｄｒａｔｉｃ  ｄｉｓｔａｎｃｅｓ）の合計の間の比率（Ｂ／Ｗ比）に従う分離距離に基づく。
【００２６】
ＯＰＬＳ−ＤＡ
直交部分最小二乗法−判別分析（ＯＰＬＳ−ＤＡ）は、データマトリックスにおける直交クラス（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｌｙ  ｃｌａｓｓ）のバリエーションを管理するために提案されてきたＰＬＳ−ＤＡ技法の重要な発展である。ＯＰＬＳ−ＤＡは、ＰＬＳ−ＤＡモデルの分類性能を増大させる。分類の性能は、データの配列をｋ個のランダムな部分集合に分けることによる“ｋ倍交差検証”に基づいて推定される。それぞれの計算サイクルに関して、ｋの部分集合の１つは、試験セットとして取っておかれ、残りのｋ−１個の部分集合は、トレーナーの役割を果たす。ｋ個の部分集合のそれぞれは、試験セットとして１回使用され、ｋ個の精度値を生成する。分類の正確さは、ｋ個の部分集合における正確率（ａｃｃｕｒａｃｙ  ｒａｔｅｓ）の平均として計算される。そのモデルは、検証されるために、一個抜き交差検証（ＬＯＯＣＶ）の方法による交差検証を受ける。分類を実施するため、カーネルパラメーターが選択され、それは、交差検証の最大精度に対応する。データマトリックスは、ｋ個の部分集合への分割を受ける前に、平均および単位分散に合わせて大きさを調整される（ｓｃａｌｅｄ）。換言すると、訓練データの平均および標準偏差は、中心を示すために、そして試験データの大きさを調整するために用いられる。一度訓練されたら、モデルは、データが“過剰適合”をもたらしたかどうかをチェックするために用いられる。これを行うため、既知のクラスラベルを有する検証セットが作成され、そうしてそれが訓練データの正確率と比較可能な正確率を与えるかどうかが検証される。別の方法は、現行モデルが偽であるリスク、すなわち、そのモデルは部分集合セットにのみよく当てはまるが、新しい観察に対して適当なＹを予測することはないというリスクを評価するのを助ける、Ｒ２／Ｑ２のプロット検証である。Ｒ２の値は、モデルにより説明されることができる訓練セットの百分率変動である。Ｑ２の値は、交差検証されたＲ２の尺度である。この検証は、元のモデルの当てはまりのよさを、マトリックスはそのままに保たれている一方で観察Ｙの順序がランダムに並べ替えられているデータに基づく異なるモデルの当てはまりのよさと比較する。モデルの妥当性に関する基準は、以下の通りである：
１．並べ替えられたデータセットにおけるＱ２の値の全部が、現在のデータセットにおいて推定されたＱ２の値よりも低くなければならない。これがチェックされない場合、それはそのモデルが過剰適合していることを意味する。
【００２７】
２．回帰線（真のＱ２の点（ｐｏｉｎｔ  Ｑ２  ｒｅａｌ）を並べ替えられたＱ２の値（ｖａｌｕｅｓ  ｐｅｒｍｕｔｅｄ  Ｑ２）のクラスターの重心につなぐ線）が、負のｙ軸切片の値を有する。
【００２８】
ＳＶＭ
サポートベクターマシン（ＳＶＭ）は、機械学習に管理される分類用途のための比較的新しい技法である。ＳＶＭは、１９８２年にVapnikにより最初に提案された(Vapnik, V. Estimation of Dependences Based on Empirical Data, Springer Verlag: ニューヨーク, 1982)。本質的に二項分類器であるＳＶＭの基本原理は、以下のものである：２つのクラスを有するデータのセットを与えられ、線形分類器が超平面の形態で構築され、それは、同時の経験的分類誤差の最小化および幾何マージンの最大化において最大マージンを有する。線形に分離可能ではないデータセットの場合、元のデータがより高い次元の特徴空間中にマッピングされ、線形分類器がこの新しい空間において構築され（これは“カーネルとして知られている）、それは元の入力の空間における線形分類器の構築と同等である。このマッピングは、カーネル関数により暗に与えられる。
【００２９】
トレーニングデータのセット：Ｘｉ∈Ｒｎ、ｉ＝１、...、ｍ（ここで、それぞれのＸｉは２つのカテゴリー：ｙｉ∈{−１、１}の１つに入る）を与えられると、ＳＶＭは、そのパラメーターが以下の凸最適化問題の解から得られるような（ｗ、ｂ）により与えられる超平面を決定し：
【００３０】
【数１】
2017516118.tif 000002
【００３１】
それは次の条件下にあり：
ｙｉ（ｗｔｘｉ＋ｂ）≧１−εｉ
εｉ≧０
式中、ｃは正則化パラメーターであり、それは学習精度および項予測の間で折り合いをつけ、εは、分類誤差の数の尺度である。項の正則化を含めることは、過剰適合の問題を低減する。
【００３２】
決定木
決定木は、データの再帰分割に基づいて分類モデルを構築する。典型的には、決定木のアルゴリズムは、データのセット全体と共に開始し、データは、１以上の属性の値に基づいて２以上の部分群に分けられ、次いでそれぞれの部分集合は、それぞれの部分集合の大きさが適切なレベルに達するまで、繰り返しより小さい部分集合に分けられる。モデリングプロセス全体は、木の構造で表され、生成されたモデルは、規則“〜ならば〜である（ｉｆ−ｔｈｅｎ）”のセットとして要約されることができる。決定木は、解釈するのが容易であり、計算的に多くを要求せず、ノイズの多いデータをうまく処理することができる。決定木のほとんどは、本発明の目的でもある分類問題に取り組む。この文脈において、その技法は、分類木とも呼ばれる。木の構造を用いた表現において、ノードはデータのセットを表し、データのセット全体は、根におけるノードとして表される。
【実施例】
【００３３】
本発明の機能の実験的証拠
本発明の診断法は、メタボロミクス解析から出発して開発されており、胎児奇形の診断を有する妊婦から、および胎児奇形の病理の非存在の臨床的確実性を有する対照の妊婦から収集された血液試料に対して実施される。
【００３４】
試料収集
試料は、胎児奇形の診断後に中絶を受け、自発的に血液試料を提供した１００人の健康な妊婦から収集された。血液試料は、妊娠中絶の直前に、ＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）チューブを用いて採取され、分析まで−３０℃で凍結された。羊水穿刺または超音波検査による胎児奇形の疑わしい診断は、オートプシーの（ａｕｔｏｐｉｃ）外植（ｅｘｐｌａｎｔ）後の胎児の検査により確証された。それぞれの血液試料は、同じ妊娠の週の、類似の個人的、身体的および社会的特徴（体重、身長、肥満度指数、年齢、結婚歴、経済状態等）を有する人から採取された同等の対照試料と関係付けられた。
【００３５】
代謝産物の抽出および誘導体化
試料の抽出および誘導体化は、発明を実施するための形態の段落における条件に従って実施された。
【００３６】
クロマトグラフィーでの決定
ＧＣＭＳ分析およびＧＣ×ＧＣＭＳは、島津の機器を用いて、発明を実施するための形態の段落で与えられた情報に従って実施された。
【００３７】
統計分析
データの多変量統計分析（ＰＬＳ−ＤＡおよびＯＰＬＳ−ＤＡ）および機械学習（ＳＶＭおよび決定木）が、ＳＩＭＰＣＡ−Ｐ  １３．０（Ｕｍｅｔｒｉｃｓ）、ＲａｐｉｄＭｉｎｅｒ  ５．３（Ｒａｐｉｄ−Ｉ）およびＲ（Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ、ウィーン）を用いて、クロマトグラムに対して実施され、（リビトールのピーク面積に基づいて）標準化および補正された。値は、平均を中心とし、分散は標準化された。
【００３８】
結果
胎児奇形（ＦＭ）の１００の症例から、および１００の対照から結果が得られた。ＦＭの症例および対照の人口統計学的および臨床的特徴が、表１において示されており、一方で調べられた奇形が、表２において列挙されている。
【００３９】
【表１】
2017516118.tif 000003
【００４０】
【表２】
2017516118.tif 000004
【００４１】
ＴＩＣクロマトグラムにおいて、通常は１５０より多くのシグナルが単一の試料中で認められ、これらのピークの一部は、それらが他の試料において対応して見付からなかったため、低すぎる濃度のため、または代謝産物として確証されるためには乏しいスペクトルの質のため、それ以上調べられなかった。合計１１６の内因性代謝産物、例えばアミノ酸、有機酸、炭水化物、脂肪酸およびステロイド類が、検出された。ピークの同定のため、線形保持指標（ＬＲＩ）が、最大１０の表にされたデータおよび同定されたデータの間の差を許容値として置くことにより用いられ、一方でＮＩＳＴライブラリーにおける検索に関する適合性の最小値は、８５％最小値に置かれた。ピーク面積は、リビトールの信号に対して標準化および補正された。結果は、マトリックスファイルにおいて要約され、カンマにより分離され（ＣＳＶ）、統計処理のために適切なソフトウェア中にロードされた。
【００４２】
代謝プロフィールに関して、ＯＰＬＳ−ＤＡモデルは、予測構成要素および３つの直交構成要素を用いることにより、申し分のない予測およびモデリング能力を示した（Ｒ２Ｙｃｕｍ＝０．９７１、Ｑ２ｃｕｍ＝０．３７２）。他の分類モデルは、優れた分類能力を示した（ＯＰＬＳ−ＤＡよりは低かったが）。いくつかのアプローチが、未知の試料のクラスの決定的な割り当てのために可能である。単一のモデルの応答を用いることも、またはより複雑な決定アルゴリズムにおいて個々のモデルの応答を統合することも可能である。
【国際調査報告】
2017516118.tif 000005
2017516118.tif 000006
2017516118.tif 000007