(57)【要約】肺がん試料の分子サブタイピングのための方法および組成物が提供されている。具体的には、患者の肺がんサブタイプが、腺癌、扁平上皮癌、または神経内分泌（小細胞癌およびカルチノイドの両方を包含する）であるかどうかを評価する方法が、本明細書に提供されている。患者の肺がんサブタイプが、腺癌、扁平上皮癌、小細胞癌、またはカルチノイド肺がんであるかどうかを評価する方法も提供されている。本明細書に提供した方法は、患者から得られる肺がん試料において、核酸レベルで、表１〜表６のクラシファイヤーバイオマーカーまたはこれらのサブセットのレベルをプローブすることを必要とする。クラシファイヤーバイオマーカーのレベルに部分的に基づいて、肺がん試料は、特定の肺がんサブタイプとして分類される。
2017516501.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の肺がんサブタイプが、腺癌、扁平上皮癌、または神経内分泌（小細胞癌およびカルチノイドの両方を包含する）であるかどうかを評価する方法であって、
（ａ）該患者から得られる肺がん試料において、核酸レベルで表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、または表６の少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーのレベルをプローブするステップであって、
（ｉ）該試料を、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、または表６の該少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーの核酸分子の部分に実質的に相補的である５種またはそれ超のオリゴヌクレオチドと、該５種またはそれ超のオリゴヌクレオチドをこれらの相補体または実質的な相補体にハイブリダイズするのに適した条件下で混合すること；
（ｉｉ）ハイブリダイゼーションが、該５種またはそれ超のオリゴヌクレオチドとこれらの相補体または実質的な相補体との間で起こるかどうかを検出すること；
（ｉｉｉ）該検出するステップに基づいて該少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーのハイブリダイゼーション値を得ること
を含むステップと；
（ｂ）該少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーの該ハイブリダイゼーション値を、少なくとも１つの試料訓練セットからの参照ハイブリダイゼーション値（複数可）と比較するステップであって、該少なくとも１つの試料訓練セットは、参照腺癌試料からのハイブリダイゼーション値、参照扁平上皮癌試料からのハイブリダイゼーション値、参照神経内分泌試料からのハイブリダイゼーション値、またはこれらの組合せを含む、ステップと；
該比較するステップの結果に基づいて該肺がん試料を腺癌、扁平上皮癌、または神経内分泌サブタイプとして分類するステップと
を含む方法。
【請求項２】
患者の肺がんサブタイプが、腺癌、扁平上皮癌、小細胞癌、またはカルチノイドであるかどうかを評価する方法であって、
（ａ）該患者から得られる肺がん試料において、核酸レベルで表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、または表６の少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーのレベルをプローブするステップであって、
（ｉ）該試料を、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、または表６の該少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーの核酸分子の部分に実質的に相補的である５種またはそれ超のオリゴヌクレオチドと、該５種またはそれ超のオリゴヌクレオチドをこれらの相補体または実質的な相補体にハイブリダイズするのに適した条件下で混合すること；
（ｉｉ）ハイブリダイゼーションが、該５種またはそれ超のオリゴヌクレオチドとこれらの相補体または実質的な相補体との間で起こるかどうかを検出すること；
（ｉｉｉ）該検出するステップに基づいて該少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーのハイブリダイゼーション値を得ること
を含むステップと；
（ｂ）該少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーの該ハイブリダイゼーション値を、少なくとも１つの試料訓練セットからの参照ハイブリダイゼーション値（複数可）と比較するステップであって、該少なくとも１つの試料訓練セットは、参照腺癌試料からのハイブリダイゼーション値、参照扁平上皮癌試料からのハイブリダイゼーション値、参照小細胞癌試料からのハイブリダイゼーション値、参照カルチノイド試料からのハイブリダイゼーション値、またはこれらの組合せを含む、ステップと；
該比較するステップの結果に基づいて該肺がん試料を腺癌、扁平上皮癌、小細胞癌、またはカルチノイドサブタイプとして分類するステップと
を含む方法。
【請求項３】
前記比較するステップが、前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーの前記ハイブリダイゼーション値と、前記参照ハイブリダイゼーション値との間の相関を決定することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記比較するステップが、前記少なくとも５種のバイオマーカーの平均発現比を決定することと、該平均発現比を、前記試料訓練セットにおける前記参照値から得られる該少なくとも５種のバイオマーカーの平均発現比と比較することとをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記プローブするステップが、前記混合するステップの前に前記核酸またはその部分を単離することを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ハイブリダイゼーションが、ｃＤＮＡプローブをｃＤＮＡバイオマーカーにハイブリダイズし、それによって非天然複合体を形成することを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ハイブリダイゼーションが、ｃＤＮＡプローブをｍＲＮＡバイオマーカーにハイブリダイズし、それによって非天然複合体を形成することを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記プローブするステップが、前記試料中の前記核酸を増幅することを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表１Ａ、表１Ｂ、または表１Ｃの少なくとも１０のバイオマーカー、少なくとも２０のバイオマーカー、または少なくとも３０のバイオマーカーを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表２の少なくとも１０のバイオマーカー、少なくとも２０のバイオマーカー、または少なくとも３０のバイオマーカーを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表３の少なくとも１０のバイオマーカー、少なくとも２０のバイオマーカー、または少なくとも３０のバイオマーカーを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表４の６つのバイオマーカーを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表５の６つのバイオマーカーを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表６の少なくとも１０のバイオマーカー、少なくとも２０のバイオマーカー、または少なくとも３０のバイオマーカーを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表１Ａ、表１Ｂ、または表１Ｃの約５〜約２０のクラシファイヤーバイオマーカー、約１０〜約３０のクラシファイヤーバイオマーカー、約１０〜約４０のクラシファイヤーバイオマーカー、または約２０〜約４０クラシファイヤーバイオマーカーを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表２の約５〜約２０のクラシファイヤーバイオマーカー、約１０〜約３０のクラシファイヤーバイオマーカー、約１０〜約４０のクラシファイヤーバイオマーカー、または約２０〜約４０のクラシファイヤーバイオマーカーを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表３の約５〜約２０のクラシファイヤーバイオマーカー、約１０〜約３０のクラシファイヤーバイオマーカー、約１０〜約４０のクラシファイヤーバイオマーカー、または約２０〜約４０のクラシファイヤーバイオマーカーを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表６の約５〜約３０のクラシファイヤーバイオマーカー、約１０〜約３０のクラシファイヤーバイオマーカー、約５０〜約２０のクラシファイヤーバイオマーカー、または約２０〜約３０のクラシファイヤーバイオマーカーを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表１Ａ、表１Ｂ、または表１Ｃに示したクラシファイヤーバイオマーカーのそれぞれを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表２に示したクラシファイヤーバイオマーカーのそれぞれを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表３に示したクラシファイヤーバイオマーカーのそれぞれを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表６に示したクラシファイヤーバイオマーカーのそれぞれを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記試料が、パラフィンに包埋された肺細胞を含む、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記試料が、新鮮凍結試料である、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
肺組織試料が、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）肺組織試料、新鮮および凍結組織試料から選択される、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表１Ａに示したクラシファイヤーバイオマーカーのそれぞれを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表１Ｂに示したクラシファイヤーバイオマーカーのそれぞれを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表１Ｃに示したクラシファイヤーバイオマーカーのそれぞれを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表１４に示したクラシファイヤーバイオマーカーである、請求項１から８および２３から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーが、表１５に示したクラシファイヤーバイオマーカーである、請求項１から８および２３から２５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２０１４年５月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／００５，２２９号からの優先権を主張し、その全体が全ての目的について本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
配列表に関する陳述
本願と関連した配列表は、紙のコピーの代わりにテキストフォーマットで提供されており、本明細書に参照により組み込まれている。配列表を含有するテキストファイルの名称は、ＧＮＣＮ＿００４＿０１ＷＯ．ｔｘｔである。テキストファイルは、１７ＫＢであり、２０１５年５月３０日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。
【背景技術】
【０００３】
肺がんは、米国におけるがん死の主要原因であり、２２０，０００を超える新しい肺がん症例が毎年同定されている。肺がんは、組織診断によって一般に決定されるサブタイプ（小細胞癌、非小細胞癌、カルチノイド、腺癌、および扁平上皮癌）を有する異種疾患である。肺がんの様々な形態的サブタイプの区別が患者管理の指導において重要であり、追加の分子検査が特異的な治療標的マーカーを同定するのに使用される。形態のばらつき、限られた組織試料、および治療的に標的とされるマーカーの、長くなる一方のリストの評価の必要性は、現在の診断基準にとっての難題となっている。組織学的診断再現性の試験は、同じ病理学者における合致および病理学者間の合致が限定的であることを示している。
【０００４】
新しい療法が肺がんの特定のサブタイプにますます向けられている一方（ベバシズマブおよびペメトレキセド）、組織学的診断再現性の試験は、同じ病理学者における合致が限定的であること、および病理学者間ではさらに合致することが少ないことを示している。低分化型腫瘍、矛盾する免疫組織化学検査結果、およびほんの限られた数の染色しか実施することができない小体積生検は依然として、現在の診断基準とっての難題である（TravisおよびRekhtman、Sem  Resp  and  Crit  Care  Med、２０１１年；３２巻（１号）：２２〜３１頁；Travisら、Arch  Pathol  Lab  Med、２０１３年；１３７巻（５号）：６６８〜８４頁；Tangら、J  Thorac  Dis、２０１４年；６巻（Ｓ５号）：Ｓ４８９〜Ｓ５０１頁）。
【０００５】
ＴＣＧＡ肺がんゲノムプロジェクトに提出された肺がん試料の専門的な病理学的再レビューを伴う最近の例では、提出された肺腫瘍の１５〜２０％が再分類されており、このことから、形態に基づく診断が難題であり続けていることが確認された。（Cancer  Genome  Atlas  Research  Network、「Comprehensive  genomic  characterization  of  squamous  cell  lung  cancers.」、Nature、４８９巻、７４１７号（２０１２年）：５１９〜５２５頁；Cancer  Genome  Atlas  Research  Network、Comprehensive  molecular  profiling  of  lung  adenocarcinoma、Nature、５１１巻、７５１１号（２０１４年）：５４３〜５５０頁、これらのそれぞれは、その全体が本明細書に参照により組み込まれている）。したがって、肺がんサブタイプを決定するためのより信頼できる手段の必要性が存在する。本発明は、この必要性および他の必要性に対処するものである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】TravisおよびRekhtman、Sem  Resp  and  Crit  Care  Med、２０１１年；３２巻（１号）：２２〜３１頁
【非特許文献２】Travisら、Arch  Pathol  Lab  Med、２０１３年；１３７巻（５号）：６６８〜８４頁
【非特許文献３】Tangら、J  Thorac  Dis、２０１４年；６巻（Ｓ５号）：Ｓ４８９〜Ｓ５０１頁
【非特許文献４】「Comprehensive  genomic  characterization  of  squamous  cell  lung  cancers.」、Nature、４８９巻、７４１７号（２０１２年）：５１９〜５２５頁
【非特許文献５】Comprehensive  molecular  profiling  of  lung  adenocarcinoma、Nature、５１１巻、７５１１号（２０１４年）：５４３〜５５０頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一態様では、患者の肺がんサブタイプが、腺癌、扁平上皮癌、または神経内分泌（neuroendocrine）（小細胞癌およびカルチノイドの両方を包含する）であるかどうかを評価する方法。一実施形態では、本方法は、患者から得られる肺がん試料において、核酸レベルで表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、または表６の少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカー（classifier  biomarker）のレベルをプローブすることを含む。プローブするステップは、一実施形態では、試料を、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、または表６の少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーの核酸分子の部分に実質的に相補的である５種またはそれ超のオリゴヌクレオチドと、これらの５種またはそれ超のオリゴヌクレオチドをこれらの相補体または実質的な相補体にハイブリダイズするのに適した条件下で混合すること；ハイブリダイゼーションが、これらの５種またはそれ超のオリゴヌクレオチドとこれらの相補体または実質的な相補体との間で起こるかどうかを検出すること；および検出するステップに基づいて少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーのハイブリダイゼーション値を得ることを含む。次いで、少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーのハイブリダイゼーション値を、少なくとも１つの試料訓練セットからの参照ハイブリダイゼーション値（複数可）と比較し、ここで、少なくとも１つの試料訓練セットは、参照腺癌、扁平上皮癌、または神経内分泌試料からのハイブリダイゼーション値を含む。比較するステップの結果に基づいて肺がん試料を腺癌、扁平上皮癌、または神経内分泌試料として分類する。
【０００８】
別の態様では、患者の肺がんサブタイプが、腺癌、扁平上皮癌、小細胞癌、またはカルチノイドであるかどうかを評価する方法が提供されている。一実施形態では、本方法は、患者から得られる肺がん試料において、核酸レベルで表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、または表６の少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーのレベルをプローブすることを含む。プローブするステップは、一実施形態では、試料を、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、または表６の少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーの核酸分子（nucleic  molecules）の部分に実質的に相補的である５種またはそれ超のオリゴヌクレオチドと、これらの５種またはそれ超のオリゴヌクレオチドをこれらの相補体または実質的な相補体にハイブリダイズするのに適した条件下で混合すること；ハイブリダイゼーションが、これらの５種またはそれ超のオリゴヌクレオチドとこれらの相補体または実質的な相補体との間で起こるかどうかを検出すること；および検出するステップに基づいて少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーのハイブリダイゼーション値を得ることを含む。次いで、少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーのハイブリダイゼーション値を、少なくとも１つの試料訓練セットからの参照ハイブリダイゼーション値（複数可）と比較し、ここで、少なくとも１つの試料訓練セットは、参照腺癌、扁平上皮癌、小細胞癌またはカルチノイド試料からのハイブリダイゼーション値を含む。比較するステップの結果に基づいて肺がん試料を腺癌、扁平上皮癌、小細胞癌、またはカルチノイドとして分類する。
【０００９】
さらに別の態様では、患者の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）サブタイプが、腺癌または扁平上皮癌であるかどうかを評価する方法が提供されている。一実施形態では、本方法は、患者から得られる肺がん試料において、核酸レベルで表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、または表６の少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーのレベルをプローブすることを含む。プローブするステップは、一実施形態では、試料を、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、または表６の少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーのｃＤＮＡ分子の部分に実質的に相補的である５種またはそれ超のオリゴヌクレオチドと、これらの５種またはそれ超のオリゴヌクレオチドをこれらの相補体または実質的な相補体にハイブリダイズするのに適した条件下で混合すること；ハイブリダイゼーションが、これらの５種またはそれ超のオリゴヌクレオチドとこれらの相補体または実質的な相補体との間で起こるかどうかを検出すること；および検出するステップに基づいて少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーのハイブリダイゼーション値を得ることを含む。次いで、少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーのハイブリダイゼーション値を、少なくとも１つの試料訓練セットからの参照ハイブリダイゼーション値（複数可）と比較し、ここで、少なくとも１つの試料訓練セットは、参照腺癌および／または扁平上皮癌試料からのハイブリダイゼーション値を含む。比較するステップの結果に基づいてＮＳＣＬＣ試料を腺癌または扁平上皮癌として分類する。
【００１０】
一実施形態では、比較するステップは、少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーのハイブリダイゼーション値と、参照ハイブリダイゼーション値との間の相関を決定することを含む。
【００１１】
一実施形態では、プローブするステップは、混合するステップの前に核酸またはその部分を単離することを含む。さらなる実施形態では、ハイブリダイゼーションは、ｃＤＮＡをｃＤＮＡにハイブリダイズし、それによって非天然複合体を形成すること、またはｃＤＮＡをｍＲＮＡにハイブリダイズし、それによって非天然複合体を形成することを含む。なおさらなる実施形態では、プローブするステップは、試料中の核酸を増幅することを含む。
【００１２】
一実施形態では、少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーは、約５〜約５０、約１０〜約５０、約１５〜約５０、約２０〜約５０、または約２５〜約５０のバイオマーカーを含む。別の実施形態では、少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーは、約５〜約３０、約１０〜約３０、約１５〜約３０、約２０〜約３０のクラシファイヤーバイオマーカーを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１Ａ〜１Ｄは、腺癌（図１Ａ）、扁平上皮癌（図１Ｂ）、小細胞癌（図１Ｃ）、およびカルチノイド（図１Ｄ）についての例示的な遺伝子発現ヒートマップを例示する。
【００１４】
【図２】図２は、ＦＦＰＥ  ＲＴ−ＰＣＲ遺伝子発現データセットについての遺伝子発現階層的クラスタリングのヒートマップである。
【００１５】
【図３】図３は、７７のＦＦＰＥ試料についての病理学的レビューおよびＬＳＰ予測の比較である。各矩形は、試料数によって並べられた単一試料を表す。矢印は、病理学的レビューおよび遺伝子発現の両方によって元の診断と合致しなかった６つの試料を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書で使用される場合、「発現プロファイル」は、弁別的遺伝子（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｖｅ  ｇｅｎｅ）の相対存在量、レベル、発現の存在または非存在の測定に対応する１つまたは複数の値を含む。発現プロファイルは、肺がんの診断の前もしくは後の被験体に由来するものであってもよく、処置もしくは療法の前もしくは後の１つもしくは複数の時点で被験体から収集される生体試料に由来するものであってもよく、処置もしくは療法がない（例えば、肺がんと診断され、もしくは肺がんのリスクにあると診断された被験体における疾患の進行をモニターするため、もしくは疾患の発生を評価するために）間の１つもしくは複数の時点で被験体から収集される生体試料に由来するものであってもよく、または健康な被験体から収集してもよい。
【００１７】
本明細書に提供するバイオマーカーパネルおよび方法は、様々な態様では、（ｉ）患者のＮＳＣＬＣサブタイプが、腺癌もしくは扁平上皮癌であるかどうか、（ｉｉ）患者の肺がんサブタイプが、腺癌、扁平上皮癌、もしくは神経内分泌（小細胞癌、およびカルチノイドの両方を包含する）であるかどうか、かつ／または（ｉｉｉ）患者の肺がんサブタイプが、腺癌、扁平上皮癌、小細胞癌、もしくはカルチノイドであるかどうかを評価するのに使用される。
【００１８】
例えば、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、および表６に開示したバイオマーカーパネルまたはそのサブセットは、様々な実施形態では、患者の肺がんサブタイプを評価および分類するのに使用される。一実施形態では、表１４または表１５のバイオマーカーパネルまたはそのサブセットが、患者の肺がんサブタイプを評価および分類するのに使用される。
【００１９】
一般に、本明細書に提供する方法は、特定の肺がんサブタイプとして肺がん試料を分類するのに使用される。一実施形態では、本方法は、患者から得られる肺がん試料において、核酸レベルで表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、または表６の少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーのレベルをプローブするステップを含む。プローブするステップは、一実施形態では、試料を、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、または表６の少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーの核酸分子、例えば、ｃＤＮＡ分子またはｍＲＮＡ分子の部分に実質的に相補的である５種またはそれ超のオリゴヌクレオチドと、これらの５種またはそれ超のオリゴヌクレオチドをこれらの相補体または実質的な相補体にハイブリダイズするのに適した条件下で混合すること；ハイブリダイゼーションが、これらの５種またはそれ超のオリゴヌクレオチドとこれらの相補体または実質的な相補体との間で起こるかどうかを検出すること；および検出するステップに基づいて少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーのハイブリダイゼーション値を得ることを含む。次いで、少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーのハイブリダイゼーション値を、少なくとも１つの試料訓練セットからの参照ハイブリダイゼーション値（複数可）と比較する。例えば、少なくとも１つの試料訓練セットは、参照腺癌、扁平上皮癌、神経内分泌試料、小細胞癌試料からのハイブリダイゼーション値を含む。例えば、比較するステップの結果に基づいて肺がん試料を腺癌、扁平上皮癌、神経内分泌、または小細胞癌として分類する。
【００２０】
肺組織試料は、ヒト被験体から単離される任意の試料であり得る。例えば、一実施形態では、分析は、パラフィンワックスに包埋された肺生検で実施される。本発明のこの態様は、小さい生検からでも主要な組織型を正確に同定することによって現在の診断を改善する手段を提供する。ＲＴ−ＰＣＲ法を含む本発明の方法は、感度がよく、正確であり、パラフィン包埋試料を用いて使用するためのマルチアナライト能力を有する。例えば、参照により本明細書に組み込まれている、Croninら（２００４年）、Am.  J  Pathol.、１６４巻（１号）：３５〜４２頁を参照。
【００２１】
ホルマリン固定およびパラフィンワックス中の組織包埋は、光学顕微鏡評価の前に組織を処理するためのユニバーサル手法である。ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）標本によって与えられる主要な利点は、組織切片における細胞形態学的詳細および構成的形態学的詳細の保存である。（Foxら（１９８５年）、J  Histochem  Cytochem、３３巻：８４５〜８５３頁）。生検標本が処理される標準的な緩衝ホルマリン固定液は、典型的には、３７％ホルムアルデヒドおよび１０〜１５％メチルアルコールを含有する水溶液である。ホルムアルデヒドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでタンパク質−核酸架橋およびタンパク質−タンパク質架橋の形成をもたらす高度に反応性の双極性化合物である（Clarkら（１９８６年）、J  Histochem  Cytochem、３４巻：１５０９〜１５１２頁；McGheeおよびvon  Hippel（１９７５年）、Biochemistry、１４巻：１２８１〜１２９６頁、それぞれ本明細書に参照により組み込まれている）。
【００２２】
一実施形態では、本明細書で使用される試料は、個体から得られ、新鮮凍結パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織を含む。しかし、他の組織および試料タイプも本明細書で使用するのに適用できる。
【００２３】
ＦＦＰＥ組織からＲＮＡを単離するための方法は、当技術分野で公知である。一実施形態では、トータルＲＮＡは、参照により本明細書に組み込まれているBibikovaら（２００４年）、American  Journal  of  Pathology、１６５巻：１７９９〜１８０７頁によって記載されているようにＦＦＰＥ組織から単離することができる。同様に、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＲＮＡ  Ｐａｒａｆｆｉｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を使用することができる。パラフィンは、キシレン抽出、その後のエタノール洗浄によって除去される。ＲＮＡは、ＤＮａｓｅ  Ｉ処理ステップが含まれる、ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）を使用して、切片にされた組織ブロックから単離することができる。ＲＮＡは、供給業者の指示に従ってトリゾール試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）を使用して凍結試料から抽出することができる。測定可能な残留するゲノムＤＮＡを有する試料を、ＤＮａｓｅＩ処理に再び付し、ＤＮＡ混入についてアッセイすることができる。すべての精製、ＤＮａｓｅ処理、および他のステップは、製造者のプロトコールに従って実施され得る。トータルＲＮＡを単離した後、試料を、使用するまで−８０℃で貯蔵することができる。
【００２４】
ｍＲＮＡ抽出のための一般的な方法は、当技術分野で周知であり、Ausubelら編、Current  Protocols  in  Molecular  Biology、John  Wiley  &  Sons、New  York、１９８７〜１９９９年を含めた分子生物学の標準的な教科書に開示されている。パラフィン包埋組織からＲＮＡを抽出するための方法は、例えば、RuppおよびLocker（Lab  Invest.、５６巻：Ａ６７頁、１９８７年）ならびにDe  Andresら（Biotechniques、１８巻：４２〜４４頁、１９９５年）に開示されている。特に、ＲＮＡ単離は、製造者の指示に従って、Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｃａｌｉｆ．）などの商業的製造者製の精製キット、バッファセット、およびプロテアーゼを使用して実施され得る。例えば、培養物中の細胞に由来するトータルＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙミニカラムを使用して単離することができる。他の市販のＲＮＡ単離キットとしては、ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ（商標）Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）およびＰａｒａｆｆｉｎ  Ｂｌｏｃｋ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘ．）が挙げられる。組織試料からのトータルＲＮＡは、例えば、ＲＮＡ  Ｓｔａｔ−６０（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ、Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ、Ｔｅｘ．）を使用して単離することができる。腫瘍から調製されるＲＮＡは、例えば、塩化セシウム密度勾配遠心分離によって単離することができる。さらに、多数の組織試料を、例えば、Chomczynskiの単一ステップＲＮＡ単離プロセス（米国特許第４，８４３，１５５号、すべての目的に関してその全体が参照により組み込まれている）などの当業者に周知の技法を使用して容易に処理することができる。
【００２５】
一実施形態では、試料は、肺組織試料、例えば、腺癌試料から回収される細胞を含む。細胞は、当技術分野で公知の標準技法を使用して生体試料から回収され得る。例えば、一実施形態では、細胞は、細胞試料を遠心分離し、ペレット化された細胞を再懸濁することによって回収される。細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの緩衝液中に再懸濁することができる。細胞懸濁液を遠心分離して細胞ペレットを得た後、細胞を溶解させて、核酸、例えば、メッセンジャーＲＮＡを抽出することができる。任意の種類のさらなる処理に付されたものを含めて、被験体から得られるすべての試料は、被験体から得られていると見なされる。
【００２６】
試料は、一実施形態では、本明細書に示したバイオマーカーの組合せのバイオマーカーレベルを検出する前にさらに処理される。例えば、細胞試料または組織試料中のｍＲＮＡは、試料の他の成分から分離され得る。試料を濃縮および／または精製してｍＲＮＡをその非天然状態で単離することができ、その理由は、ｍＲＮＡは、その天然環境にないためである。例えば、研究により、ｉｎ  ｖｉｖｏでのｍＲＮＡの高次構造は、同じ配列のｉｎ  ｖｉｔｒｏ構造と異なることが示されている（例えば、すべての目的に関してその全体が本明細書に組み込まれている、Rouskinら（２０１４年）、Nature、５０５巻、７０１〜７０５頁を参照）。
【００２７】
試料に由来するｍＲＮＡは、一実施形態では、合成ＤＮＡプローブにハイブリダイズされ、このプローブは、一部の実施形態では、検出部分（例えば、検出可能標識、捕捉配列、バーコード報告配列）を含む。したがって、これらの実施形態では、非天然ｍＲＮＡ−ｃＤＮＡ複合体が、バイオマーカーを検出するために最終的に作製および使用される。別の実施形態では、試料に由来するｍＲＮＡは、検出可能標識、例えば、フルオロフォアで直接標識される。さらなる実施形態では、非天然標識ｍＲＮＡ分子は、ｃＤＮＡプローブにハイブリダイズされ、複合体が検出される。
【００２８】
一実施形態では、ｍＲＮＡが試料から得られると、それは、ハイブリダイゼーション反応において相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換され、または１種または複数種のｃＤＮＡプローブと一緒にハイブリダイゼーション反応において使用される。ｃＤＮＡは、ｉｎ  ｖｉｖｏで存在せず、したがって、非天然分子である。さらに、ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドは、合成のものであり、ｉｎ  ｖｉｖｏで存在しない。ｃＤＮＡがｉｎ  ｖｉｖｏで存在しないことに加えて、ｃＤＮＡは、ｍＲＮＡと必然的に異なり、その理由は、それがデオキシリボ核酸を含み、リボ核酸を含まないためである。次いでｃＤＮＡは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または当業者に公知の他の増幅法によって増幅される。例えば、採用され得る他の増幅法としては、すべての目的に関してその全体が参照により組み込まれているリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（すべての目的に関してその全体が参照により組み込まれている、WuおよびWallace、Genomics、４巻：５６０頁（１９８９年）、Landegrenら、Science、２４１巻：１０７７頁（１９８８年））、転写増幅（すべての目的に関してその全体が参照により組み込まれている、Kwohら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、８６巻：１１７３頁（１９８９年））、自己持続配列複製（すべての目的に関してその全体が参照により組み込まれている、Guatelliら、Proc.  Nat.  Acad.  Sci.  USA、８７巻：１８７４頁（１９９０年））、ならびに核酸ベース配列増幅（ＮＡＳＢＡ）が挙げられる。ＰＣＲ増幅のためのプライマーを選択するためのガイドラインは、当業者に公知である。例えば、すべての目的に関してその全体が参照により組み込まれている、McPhersonら、PCR  Basics:  From  Background  to  Bench、Springer-Verlag、２０００年を参照。この増幅反応の産物、すなわち、増幅されたｃＤＮＡは、必然的に非天然産物である。第１に、上述したように、ｃＤＮＡは、非天然分子である。第２に、ＰＣＲの場合では、増幅プロセスは、出発材料のあらゆる個々のｃＤＮＡ分子について数億のｃＤＮＡコピーを作り出す機能を果たす。生成されるコピーの数は、ｉｎ  ｖｉｖｏで存在するｍＲＮＡのコピーの数からはるかにかけ離れている。
【００２９】
一実施形態では、ｃＤＮＡは、断片に追加のＤＮＡ配列（例えば、アダプター、レポーター、捕捉配列もしくは部分、バーコード）を導入するプライマーで増幅され（例えば、アダプター特異的プライマーを使用して）、またはｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡバイオマーカー配列は、追加の配列（例えば、アダプター、レポーター、捕捉配列もしくは部分、バーコード）を含むｃＤＮＡプローブに直接ハイブリダイズされる。したがって、増幅および／またはｍＲＮＡのｃＤＮＡプローブへのハイブリダイゼーションは、追加の配列を導入し、非天然ハイブリッドを形成することによって、非天然一本鎖ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡから非天然二本鎖分子を作り出す機能を果たす。さらに、当業者に公知であるように、増幅手順は、これらと関連した誤り率を有する。したがって、増幅により、ｃＤＮＡ分子にさらなる修飾が導入される。一実施形態では、アダプター特異的プライマーを用いた増幅中に、検出可能標識、例えば、フルオロフォアが一本鎖ｃＤＮＡ分子に付加される。したがって、増幅はまた、少なくとも（ｉ）ｃＤＮＡは、ｉｎ  ｖｉｖｏで存在しないこと、（ｉ）アダプター配列がｃＤＮＡ分子の両端に付加されて、ｉｎ  ｖｉｖｏで存在しないＤＮＡ配列が作製されること、（ｉｉ）増幅と関連した誤り率により、ｉｎ  ｖｉｖｏで存在しないＤＮＡ配列がさらに作り出されること、（ｉｉｉ）自然において存在するものと比較した場合のｃＤＮＡ分子の異種構造、および（ｉｖ）ｃＤＮＡ分子への検出可能標識の化学的付加のために、自然において存在しないＤＮＡ複合体を作り出す機能を果たす。
【００３０】
一部の実施形態では、目的のバイオマーカーの発現は、非天然ｃＤＮＡ分子の検出を介して核酸レベルで検出される。
【００３１】
一部の実施形態では、肺がんサブタイピングのための方法は、クラシファイヤーバイオマーカーセットの発現レベルを検出することを含む。一部の実施形態では、検出することは、核酸レベルでの表１Ａ、１Ｂ、もしくは１Ｃ、表２、表３、表４、表５、または表６のクラシファイヤーバイオマーカーのすべてを含む。別の実施形態では、表１Ａ、１Ｂ、または１Ｃのクラシファイヤーバイオマーカーのサブセットが、例えば、約５〜約２０についてプローブされる。一実施形態では、プローブされるバイオマーカーのサブセットは、表１Ａ、１Ｂ、もしくは１Ｃ、表２、表３、表４、表５、または表６のクラシファイヤーバイオマーカーのうちの約５〜約５０、約５〜約４０、約５〜約３０、または約５〜約２５を含む。別の実施形態では、プローブされるバイオマーカーのサブセットは、表１Ａ、１Ｂ、もしくは１Ｃ、表２、表３、表４、表５、または表６のクラシファイヤーバイオマーカーのうちの約１０〜約５０、約１０〜約４０、約１０〜約３０、または約１０〜約２５を含む。さらに別の実施形態では、プローブされるバイオマーカーのサブセットは、表１Ａ、１Ｂ、もしくは１Ｃ、表２、表３、表４、表５、または表６のクラシファイヤーバイオマーカーのうちの５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０を含む。なお別の実施形態では、プローブされるバイオマーカーのサブセットは、表１Ａ、１Ｂ、もしくは１Ｃ、表２、表３、表４、表５、または表６のクラシファイヤーバイオマーカーのうちの少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、または少なくとも約５０を含む。プローブされるバイオマーカーの数は、本明細書に提供する方法で最初に使用されるオリゴヌクレオチドの数を指示することが理解されるべきである。例えば、表１Ａ、１Ｂ、もしくは１Ｃ、表２、表３、表４、表５、または表６のバイオマーカーのうちの５または１０がプローブされる場合、それぞれ５オリゴヌクレオチドまたは１０オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドをバイオマーカーまたはこれらの断片にハイブリダイズするのに適した条件下で試料と混合される。
【００３２】
一実施形態では、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、および表６のいずれかにおけるバイオマーカーのうちの約５〜約１０、約５〜約１５、約５〜約２０、約５〜約２５、約５〜約３０、約５〜約３５、約５〜約４０、約５〜約４５、約５〜約５０が、肺がんサブタイプを決定する方法においてプローブされる。別の実施形態では、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５のうちのいずれか１つからの、または表６からのバイオマーカーのそれぞれが、患者の肺がん試料の肺がんサブタイプを決定する方法においてプローブされる。
【００３３】
検出することは、それだけに限らないが、ＲＮＡ−ｓｅｑ、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、マイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ、または別のハイブリダイゼーションアッセイ、例えば、クラシファイヤーバイオマーカーに特異的なプライマーおよび／もしくはプローブを用いた、例えば、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇアッセイなどを含めた任意の適当な技法によって実施することができる。表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、および表６に提供されたプライマーは、単に例示的な目的のためであり、本発明を限定すると解釈されるべきでないことが留意されるべきである。
【００３４】
本明細書に記載のバイオマーカーは、目的の核酸配列、または逆転写反応においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成的に得られるこれらの非天然ｃＤＮＡ産物のいずれかの全配列または部分配列を含むＲＮＡを含む。用語「断片」は、一般に、少なくとも１０、１５、２０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、８００、９００、１，０００、１，２００、もしくは１，５００の連続したヌクレオチド、または最大で、本明細書に開示の全長バイオマーカーポリヌクレオチド中に存在するヌクレオチドの数を含むポリヌクレオチドの部分を指すように意図されている。バイオマーカーポリヌクレオチドの断片は、一般に、少なくとも１５、２５、３０、５０、１００、１５０、２００、もしくは２５０の連続したアミノ酸、または最大で、本発明の全長バイオマーカータンパク質中に存在するアミノ酸の総数をコードする。
【００３５】
一部の実施形態では、ＲＮＡ転写物またはその発現産物などの過剰発現は、試料中のすべての測定される転写物（もしくはこれらの産物）であり得る参照ＲＮＡ転写物もしくはこれらの発現産物、またはＲＮＡ転写物（もしくはこれらの非天然ｃＤＮＡ産物）の特定の参照セットのレベルに正規化することによって決定される。正規化は、アッセイされるＲＮＡまたはｃＤＮＡの量、および使用されるＲＮＡまたはｃＤＮＡの品質のばらつきの両方の差異を補正し、または正規化するために実施される。したがって、アッセイは、典型的には、周知のハウスキーピング遺伝子、例えば、ＧＡＰＤＨおよび／またはβ−アクチンなどを含めたある特定の正規化遺伝子の発現を測定し、組み込む。代わりに、正規化は、アッセイされるバイオマーカーのすべて、またはその大きいサブセットの平均シグナルまたは中央値シグナルに基づくことができる（グローバル正規化手法）。
【表１Ａ−１】
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【表１Ａ−２】
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【表１Ａ−３】
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【表１Ａ−４】
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【表１Ａ−５】
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【表１Ｂ−１】
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【表１Ｂ−２】
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【表１Ｂ−３】
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【表１Ｂ−４】
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【表１Ｂ−５】
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【表１Ｃ−１】
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【表１Ｃ−２】
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【表１Ｃ−３】
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【表１Ｃ−４】
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【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【表４】
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【表５】
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【表６−１】
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【表６−２】
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【表６−３】
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【００３６】
単離ｍＲＮＡを、それだけに限らないが、サザン分析もしくはノーザン分析、ＰＣＲ分析、およびプローブアレイ、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇアッセイを含むハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイにおいて使用することができる。ｍＲＮＡレベルを検出するための一方法では、単離ｍＲＮＡまたは合成ｃＤＮＡを、検出されている遺伝子によってコードされるｍＲＮＡにハイブリダイズすることができる核酸分子（プローブ）と接触させることを含む。核酸プローブは、例えば、長さが少なくとも７、１５、３０、５０、１００、２５０、または５００ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドなどのｃＤＮＡまたはその部分であり、本発明の非天然ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡバイオマーカーにストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするのに十分であり得る。
【００３７】
上記に説明したように、一実施形態では、ｍＲＮＡが試料から得られると、それは、ハイブリダイゼーション反応で相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換される。ｃＤＮＡは、ｉｎ  ｖｉｖｏで存在せず、したがって非天然分子である。さらなる実施形態では、次いでｃＤＮＡは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または当業者に公知の他の増幅法によって増幅される。この増幅反応の産物、すなわち、増幅されたｃＤＮＡは、必然的に非天然産物である。上述したように、ｃＤＮＡは、非天然分子である。第２に、ＰＣＲの場合では、増幅プロセスは、出発材料のあらゆる個々のｃＤＮＡ分子について数億のｃＤＮＡコピーを作り出す機能を果たす。生成されるコピーの数は、ｉｎ  ｖｉｖｏで存在するｍＲＮＡのコピーの数からはるかにかけ離れている。
【００３８】
一実施形態では、ｃＤＮＡは、断片に追加のＤＮＡ配列（アダプター配列）を導入するプライマーで増幅される（アダプター特異的プライマーを使用して）。したがって増幅は、既に非天然のｃＤＮＡにバーコード、アダプター、および／またはレポーター配列を導入することによって、非天然一本鎖ｃＤＮＡから非天然二本鎖分子を作り出す機能を果たす。一実施形態では、アダプター特異的プライマーを用いた増幅中に、検出可能標識、例えば、フルオロフォアが、一本鎖ｃＤＮＡ分子に付加される。したがって、増幅はまた、少なくとも（ｉ）ｃＤＮＡは、ｉｎ  ｖｉｖｏで存在しないこと、（ｉ）アダプター配列がｃＤＮＡ分子の両端に付加されて、ｉｎ  ｖｉｖｏで存在しないＤＮＡ配列が作製されること、（ｉｉ）増幅と関連した誤り率により、ｉｎ  ｖｉｖｏで存在しないＤＮＡ配列がさらに作り出されること、（ｉｉｉ）自然において存在するものと比較した場合のｃＤＮＡ分子の異種構造、および（ｉｖ）ｃＤＮＡ分子への検出可能標識の化学的付加のために、自然において存在しないＤＮＡ複合体を作り出す機能を果たす。
【００３９】
一実施形態では、合成ｃＤＮＡ（例えば、増幅されたｃＤＮＡ）は、例えば、マイクロアレイを介して、プローブを用いたハイブリダイゼーションを介して固体表面に固定化される。別の実施形態では、ｃＤＮＡ産物は、ｃＤＮＡ産物とハイブリダイズする蛍光プローブの導入を介するリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介して検出される。例えば、一実施形態では、バイオマーカー検出は、定量的蛍光発生ＲＴ−ＰＣＲ（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いた）によって評価される。ＰＣＲ分析については、周知の方法が、分析で使用するためのプライマー配列の決定について当技術分野で利用可能である。
【００４０】
本明細書に提供されるバイオマーカーは、一実施形態では、捕捉プローブおよび／またはレポータープローブを使用するハイブリダイゼーション反応を介して検出される。例えば、ハイブリダイゼーションプローブは、ビーズ、ガラス、またはシリコン基板などの固体表面に誘導体化されたプローブである。別の実施形態では、捕捉プローブが溶液中に存在し、患者の試料と混合され、その後、例えば、ビオチン−アビジン相互作用（例えば、ビオチンが捕捉プローブの一部であり、アビジンが表面上にある場合）を介した表面へのハイブリダイゼーション産物の付着が続く。ハイブリダイゼーションアッセイは、一実施形態では、捕捉プローブおよびレポータープローブの両方を採用する。レポータープローブは、捕捉プローブまたはバイオマーカー核酸のいずれかにハイブリダイズすることができる。次いで例えばレポータープローブは、試料中のバイオマーカー（複数可）のレベルを決定するためにカウントおよび検出される。捕捉プローブおよび／またはレポータープローブは、一実施形態では、検出可能標識、および／または表面への官能化を可能にする基を含有する。
【００４１】
例えば、ｎＣｏｕｎｔｅｒ遺伝子分析システム（例えば、すべての目的に関してその全体が参照により組み込まれている、Geissら（２００８年）、Nat.  Biotechnol.、２６巻、３１７〜３２５頁を参照）を、本明細書に提供する方法とともに使用するのに適用できる。
【００４２】
その開示全体がすべての目的に関して参照により組み込まれている米国特許第７，４７３，７６７号および同第８，４９２，０９４号に記載されたハイブリダイゼーションアッセイを、本明細書に提供する方法で使用するのに、すなわち、本明細書に記載のバイオマーカーおよびバイオマーカー組合せを検出するのに適用できる。
【００４３】
バイオマーカーレベルは、膜ブロット（ハイブリダイゼーション分析、例えば、ノーザン、サザン、ドットなどで使用されるものなど）、またはマイクロウェル、試料チューブ、ゲル、ビーズ、または繊維（もしくは結合した核酸を含む任意の固体支持体）を使用してモニターすることができる。例えば、それぞれその全体が参照により組み込まれている、米国特許第５，７７０，７２２号、同第５，８７４，２１９号、同第５，７４４，３０５号、同第５，６７７，１９５号、および同第５，４４５，９３４号を参照。
【００４４】
一実施形態では、マイクロアレイがバイオマーカーレベルを検出するのに使用される。マイクロアレイは、異なる実験間の再現性のためにこの目的に特に非常に適している。ＤＮＡマイクロアレイは、多数の遺伝子の発現レベルを同時に測定するための一方法をもたらす。各アレイは、固体支持体に付着された捕捉プローブの再現可能なパターンからなる。標識されたＲＮＡまたはＤＮＡは、アレイ上の相補的プローブにハイブリダイズされ、次いでレーザースキャニングによって検出される。アレイ上の各プローブのハイブリダイゼーション強度が決定され、相対的な遺伝子発現レベルを表す定量的値に変換される。例えば、それぞれその全体が参照により組み込まれている、米国特許第６，０４０，１３８号、同第５，８００，９９２号、および同第６，０２０，１３５号、同第６，０３３，８６０号、および同第６，３４４，３１６号を参照。高密度オリゴヌクレオチドアレイは、試料中の多数のＲＮＡについてのバイオマーカープロファイルを決定するのに特に有用である。
【００４５】
機械的合成法を使用してこれらのアレイを合成するための技法は、例えば、米国特許第５，３８４，２６１号に記載されている。平面アレイ表面が一般に使用されるが、アレイは、実質的に任意の形状の表面、またはさらには多数の表面上に製作することができる。アレイは、ビーズ、ゲル、ポリマー表面、繊維（光ファイバーなど）、ガラス、または任意の他の適切な基板上の核酸（またはペプチド）であり得る。例えば、それぞれその全体が参照により組み込まれている、米国特許第５，７７０，３５８号、同第５，７８９，１６２号、同第５，７０８，１５３号、同第６，０４０，１９３号、および同第５，８００，９９２号を参照。アレイは、診断またはすべてを含むデバイスの他の操作を可能にするような様式で包装され得る。例えば、それぞれその全体が参照により組み込まれている、米国特許第５，８５６，１７４号および同第５，９２２，５９１号を参照。
【００４６】
遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）が、一実施形態では、本明細書に記載の方法において採用される。ＳＡＧＥは、各転写物のために個々のハイブリダイゼーションプローブを準備する必要なく、多数の遺伝子転写物の同時のかつ定量的な分析を可能にする方法である。最初に、転写物をユニークに同定するのに十分な情報を含有する短い配列タグ（約１０〜１４ｂｐ）が生成され、ただし、タグは、各転写物内のユニークな位置から得られる。次いで、多くの転写物が一緒に連結されて長い連続分子が形成され、それを配列決定し、同時に複数のタグの実体  （identity）を明らかにすることができる。転写物の任意の集団の発現パターンを、個々のタグの存在量を決定し、各タグに対応する遺伝子を同定することによって定量的に評価することができる。その全体が参照により組み込まれている、Velculescuら、Science、２７０巻：４８４〜８７頁、１９９５年；Cell、８８巻：２４３〜５１頁、１９９７年を参照。
【００４７】
核酸レベルでのバイオマーカーレベル分析の追加の方法は、Brennerら（その全体が参照により組み込まれている、Nat.  Biotech.、１８巻：６３０〜３４頁、２０００年）によって記載されているような、配列決定法、例えば、ＲＮＡｓｅｑ、次世代配列決定、および大規模並列処理特徴配列決定（ＭＰＳＳ）の使用である。これは、非ゲルベースシグネチャー配列決定を、別個の直径５μｍのマイクロビーズ上の数百万の鋳型のｉｎ  ｖｉｔｒｏクローニングと組み合わせる配列決定手法である。最初に、ＤＮＡ鋳型のマイクロビーズライブラリーが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏクローニングによって構築される。この後に、高密度で（典型的には３．０×１０６マイクロビーズ／ｃｍ２超）、フローセル内で鋳型含有マイクロビーズの平面アレイがアセンブルされる。各マイクロビーズ上のクローニングされた鋳型の遊離端が、ＤＮＡ断片分離を必要としない蛍光ベースシグネチャー配列決定法を使用して同時に分析される。この方法は、酵母ｃＤＮＡライブラリーから数十万の遺伝子シグネチャー配列を単一のオペレーションで同時かつ正確にもたらすことを示した。
【００４８】
免疫組織化学検査法も本発明のバイオマーカーのレベルを検出するのに適している。試料を後の調製のために凍結させ、または固定液中に直ちに入れることができる。組織試料を、試薬、例えば、ホルマリン、グルタルアルデヒド（gluteraldehyde）、メタノールなどで処理することによって固定し、パラフィンに包埋することができる。ホルマリン固定パラフィン包埋組織試料から免疫組織化学的分析のためのスライドを調製するための方法は、当技術分野で周知である。
【００４９】
一実施形態では、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、または表６のバイオマーカー（またはそのサブセット、例えば、５〜２０、５〜３０、５〜４０のバイオマーカー）のレベルは、試料中のすべてのＲＮＡ転写物、もしくはこれらの非天然ｃＤＮＡ発現産物、もしくはタンパク質産物、または試料中のＲＮＡ転写物の参照セット、もしくはこれらの非天然ｃＤＮＡ発現産物の参照セット、もしくはこれらのタンパク質産物の参照セットの発現レベルに対して正規化される。
【００５０】
全体にわたって示されているように、本明細書に示した方法は、患者の肺がんサブタイプを決定するための方法を提供する。バイオマーカーレベルが、例えば、非天然ｃＤＮＡバイオマーカーレベルまたは非天然ｍＲＮＡ−ｃＤＮＡバイオマーカー複合体を測定することによって決定されると、バイオマーカーレベルを、例えば、検出されたレベルの統計的方法または直接比較を使用して参照値または参照試料と比較することで、肺がん分子サブタイプの決定が行われる。比較に基づいて、患者の肺がん試料は、例えば、神経内分泌、扁平上皮癌、腺癌として分類される。別の実施形態では、比較に基づいて、患者の肺がん試料は、扁平上皮癌、腺癌、または小細胞癌として分類される。別の実施形態では、比較に基づいて、患者の肺がん試料は、扁平上皮癌、腺癌、小細胞癌、またはカルチノイド肺がんとして分類される。
【００５１】
一実施形態では、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、または表６の少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーのハイブリダイゼーション値は、少なくとも１つの試料訓練セットからの参照ハイブリダイゼーション値（複数可）と比較され、ここで、少なくとも１つの試料訓練セットは、参照試料（複数可）からのハイブリダイゼーション値を含む。さらなる実施形態では、少なくとも１つの試料訓練セットは、腺癌試料、扁平上皮癌試料、神経内分泌試料、小細胞肺癌試料、カルチノイド肺がん試料、またはこれらの組合せからの、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、または表６の少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーのハイブリダイゼーション値を含む。別の実施形態では、少なくとも１つの試料訓練セットは、以下の表Ａに提供した参照試料からの、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、表６の少なくとも５種のクラシファイヤーバイオマーカーのハイブリダイゼーション値を含む。
【表Ａ】
2017516501.tif 000031
【００５２】
バイオマーカーの検出されたレベルを参照値および／または参照試料と比較するための方法が、本明細書に提供されている。この比較に基づいて、一実施形態では、被験体の試料から得たバイオマーカーレベルと参照値との間の相関が得られる。次いで肺がんサブタイプの評価が行われる。
【００５３】
様々な統計的方法を、患者から得られるバイオマーカーレベルと、例えば、少なくとも１つの試料訓練セットからの参照バイオマーカーレベルとの比較を助けるのに使用することができる。
【００５４】
一実施形態では、教師ありパターン認識法（supervised  pattern  recognition  method）が採用される。教師ありパターン認識法の例として、それだけに限らないが、最短重心法（ｎｅａｒｅｓｔ  ｃｅｎｔｒｏｉｄ  ｍｅｔｈｏｄ）（Dabney（２００５年）、Bioinformatics、２１巻（２２号）：４１４８〜４１５４頁、およびTibshiraniら（２００２年）、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、９９巻（１０号）：６５７６〜６５７２頁）；クラス分析のソフト独立型モデリング（ＳＩＭＣＡ）（例えば、Wold、１９７６年を参照）；部分最小二乗分析（ＰＬＳ）（例えば、Wold、１９６６年；Joreskog、１９８２年；Frank、１９８４年；Bro,  R.、１９９７年を参照）；線形判別分析（ＬＤＡ）（例えば、Nillson、１９６５年を参照）；Ｋ−最近接分析（ＫＮＮ）（例えば、Brownら、１９９６年を参照）；人工ニューラルネットワーク（ＡＮＮ）（例えば、Wasserman、１９８９年；Ankerら、１９９２年；Hare、１９９４年を参照）；確率的ニューラルネットワーク（ＰＮＮ）（例えば、Parzen、１９６２年；Bishop、１９９５年；Speckt、１９９０年；Broomheadら、１９８８年；Patterson、１９９６年を参照）；規則誘導（ＲＩ）（例えば、Quinlan、１９８６年を参照）；およびベイジアン法（例えば、Bretthorst、１９９０年ａ、１９９０年ｂ、１９８８年を参照）を挙げることができる。一実施形態では、遺伝子発現データに基づいて腫瘍サブタイプを同定するためのクラシファイヤーは、そのそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれている、Mullinsら（２００７年）、Clin  Chem.、５３巻（７号）：１２７３〜９頁に記載された重心ベース法である。
【００５５】
他の実施形態では、教師なし訓練手法が採用され、したがって、訓練セットは使用されない。
【００５６】
再び教師あり学習手法について試料訓練セットに言及すると、一部の実施形態では、試料訓練セット（複数可）は、腺癌試料からのクラシファイヤーバイオマーカーのすべて（例えば、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、表６のいずれかのすべてのクラシファイヤーバイオマーカー）の発現データを含むことができる。一部の実施形態では、試料訓練セット（複数可）は、扁平上皮癌試料、腺癌試料、および／または神経内分泌試料からのクラシファイヤーバイオマーカーのすべて（例えば、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、表６のいずれかのすべてのクラシファイヤーバイオマーカー）の発現データを含むことができる。一部の実施形態では、試料訓練セット（複数可）は、試料間変動を除去するために正規化される。
【００５７】
一部の実施形態では、比較することは、パラメトリックであってもノンパラメトリックであってもよい、例えば任意の適当な多変量統計分析モデルなどの統計的アルゴリズムを適用することを含み得る。一部の実施形態では、統計的なアルゴリズムを適用することは、ヒト肺組織試料から得た発現データと、腺癌および扁平上皮癌訓練セット（複数可）からの発現データとの間の相関を決定することを含むことができる。一部の実施形態では、（例えば）、一個抜き交差検証（ＬＯＯＣＶ）などの交差検証が実施される。一部の実施形態では、積分相関が実施される。一部の実施形態では、スピアマン相関が実施される。一部の実施形態では、重心ベース法が、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Mullinsら（２００７年）、Clin  Chem.、５３巻（７号）：１２７３〜９頁に記載されているように、かつ遺伝子発現データに基づいて統計的アルゴリズムのために採用される。
【００５８】
被験体に由来する試料（検査試料）に対して実施された遺伝子発現の結果は、生体試料（複数可）、または正常であると分かっている、もしくは疑われる生体試料（複数可）（「参照試料」もしくは「正常試料」、例えば、非腺癌試料）に由来するデータと比較することができる。別の実施形態では、参照試料または参照バイオマーカーレベルデータは、肺がんサブタイプ、例えば、腺癌、扁平上皮癌、神経内分泌、小細胞癌、および／またはカルチノイドを有することが分かっている個体から得られ、またはそれに由来する。
【００５９】
参照試料は、検査試料と同じ時間または異なる時間にアッセイされ得る。代わりに、参照試料からのバイオマーカーレベル情報を、後日アクセスするためにデータベースまたは他の手段に保管してもよい。
【００６０】
検査試料に対するアッセイのバイオマーカーレベル結果を、参照試料に対する同じアッセイの結果と比較することができる。一部の場合では、参照試料に対するアッセイの結果は、データベースまたは参照値（複数可）からのものである。一部の場合では、参照試料に対するアッセイの結果は、当業者によって公知の、または一般に認められている値または値の範囲である。一部の場合では、比較は定性的である。他の場合では、比較は定量的である。一部の場合では、定性的比較または定量的比較は、それだけに限らないが、以下の１つまたは複数を伴い得る：蛍光値、スポット強度、吸光度値、化学発光シグナル、ヒストグラム、臨界閾値、統計的有意性値、本明細書に記載の遺伝子の発現レベル、ｍＲＮＡコピー数を比較すること。
【００６１】
一実施形態では、オッズ比（ＯＲ）が、各バイオマーカーレベルパネル測定値について計算される。ここで、ＯＲは、患者の測定されたバイオマーカー値とアウトカム、例えば、肺がんサブタイプとの間の関連性の尺度である。例えば、すべての目的に関してその全体が参照により組み込まれている、J.  Can.  Acad.  Child  Adolesc.  Psychiatry、２０１０年；１９巻（３号）：２２７〜２２９頁を参照。
【００６２】
一実施形態では、指定された統計的信頼水準が、肺がんサブタイプに関する信頼水準をもたらすために決定され得る。例えば、９０％超の信頼水準が、肺がんサブタイプの有用な予測因子であり得ると決定される場合がある。他の実施形態では、ある程度ストリンジェントな信頼水準が選択され得る。例えば、約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、９９．５％、または９９．９％または少なくとも約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、９９．５％、または９９．９％の信頼水準が選択され得る。もたらされる信頼水準は、一部の場合では、試料の品質、データの品質、分析の品質、使用される具体的な方法、および／または分析される遺伝子発現値の数（すなわち、遺伝子の数）に関連している場合がある。応答の尤度をもたらすための指定された信頼水準は、偽陽性または偽陰性の予期された数に基づいて選択され得る。指定された信頼水準を実現し、または診断力を伴ったマーカーを同定するためにパラメーターを選択するための方法は、それだけに限らないが、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析、バイノーマルＲＯＣ、主成分分析、オッズ比分析、部分最小二乗分析、特異値分解、最小絶対収縮および選択演算子分析（selection  operator  analysis）、最小角回帰、および閾値勾配による正則化（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）法が挙げられる。
【００６３】
肺がんサブタイプの決定は、一部の場合では、バイオマーカーレベルデータを正規化するおよび／またはバイオマーカーレベルデータの信頼性を改善するように設計されたアルゴリズムの適用によって改善される。本発明の一部の実施形態では、データ分析は、処理される個々のデータ点が多数であることに起因して、本明細書に記載の様々なアルゴリズムを適用するために、コンピューターまたは他のデバイス、機械または装置を利用する。「機械学習アルゴリズム」は、例えば、肺がんサブタイプを決定するために１つまたは複数のバイオマーカーレベルプロファイルを特徴付けるのに採用される、「クラシファイヤー」としても当業者に公知の計算ベースの予測方法を指す。例えば、マイクロアレイベースハイブリダイゼーションアッセイ、配列決定アッセイ、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇアッセイなどによって決定されるバイオマーカーレベルは、一実施形態では、プロファイルを分類するためにアルゴリズムにかけられる。教師あり学習では、一般に、クラスの中の相違（例えば、腺癌陽性、腺癌陰性、扁平上皮癌陽性、扁平上皮癌陰性、神経内分泌陽性、神経内分泌陰性、小細胞癌陽性、小細胞癌陰性、カルチノイド陽性、カルチノイド陰性）を認識するためにクラシファイヤーを「訓練し」、次いで独立した検査セットでクラシファイヤーの精度を「検査する」。新しい未知の試料について、クラシファイヤーを使用して、例えば、１つまたは複数の特定の試料が属するクラス（例えば、（ｉ）腺癌対扁平上皮癌対神経内分泌、または（ｉｉ）腺癌対扁平上皮癌対小細胞癌対カルチノイドなど）を予測することができる。
【００６４】
一部の実施形態では、ロバストなマルチアレイ平均（ＲＭＡ）法が、未加工データを正規化するのに使用される場合がある。ＲＭＡ法は、いくつかのマイクロアレイ上のそれぞれのマッチしたセルについてバックグラウンド補正した強度を計算することによって始まる。一実施形態では、バックグラウンド補正値は、すべての目的に関してその全体が参照により組み込まれている、Irizarryら（２００３年）、Biostatistics、４月、４巻（２号）：２４９〜６４頁によって記載されているように正の値に制限される。バックグラウンド補正後、次いで、それぞれのバックグラウンド補正されたマッチしたセルの強度の底２の対数が得られる。次いで、各マイクロアレイについてバックグラウンド補正され、対数変換され、マッチした強度は、分位数正規化法を使用して正規化される。分位数正規化法では、各入力アレイおよび各プローブ値について、アレイパーセンタイルプローブ値が、すべてのアレイパーセンタイル点の平均で置き換えられる。この方法は、その全体が参照により組み込まれている、Bolstadら、Bioinformatics、２００３年によってより完全に記載されている。分位数正規化の後、次いで正規化されたデータを線形モデルにフィッティングして、各マイクロアレイの各プローブについての強度尺度を得ることができる。次いで、Ｔｕｋｅｙのメディアンポリッシュアルゴリズム（すべての目的に関してその全体が参照により組み込まれている、Tukey,  J.  W.、Exploratory  Data  Analysis、１９７７年）を使用して、正規化されたプローブセットデータについて対数スケール強度レベルを決定することができる。
【００６５】
様々な他のソフトウェアプログラムを実装することができる。ある特定の方法では、特徴選択およびモデル推定を、ｇｌｍｎｅｔを使用してｌａｓｓｏペナルティを用いてロジスティック回帰によって実施することができる（その全体が参照により組み込まれている、Friedmanら（２０１０年）、Journal  of  statistical  software、３３巻（１号）：１〜２２頁）。未加工の読みは、ＴｏｐＨａｔを使用してアラインできる（その全体が参照により組み込まれている、Trapnellら（２００９年）、Bioinformatics、２５巻（９号）：１１０５〜１１頁）。諸方法では、上位の特徴（１０〜２００の範囲のＮ）が、ｅ１０７１ライブラリー（その全体が参照により組み込まれている、Meyer  D.、Support  vector  machines:  the  interface  to  libsvm  in  package  e1071.、２０１４年）を使用して線形サポートベクターマシン（ＳＶＭ）（その全体が参照により組み込まれている、Suykens  JAK、Vandewalle  J.、Least  Squares  Support  Vector  Machine  Classifiers、Neural  Processing  Letters、１９９９年；９巻（３号）：２９３〜３００頁）を訓練するのに使用される。信頼区間は、一実施形態では、ｐＲＯＣパッケージ（その全体が参照により組み込まれている、Robin  X、Turck  N、Hainard  Aら、pROC:  an  open-source  package  for  R  and  S+  to  analyze  and  compare  ROC  curves、BMC  bioinformatics、２０１１年；１２巻：７７頁）を使用して計算される。
【００６６】
さらに、データをフィルタリングして、疑わしいと見なされ得るデータを除去してもよい。一実施形態では、約４、５、６、７、または８未満のグアノシン＋シトシンヌクレオチドを有するマイクロアレイプローブに由来するデータは、これらの異常なハイブリダイゼーション傾向または二次構造問題に起因して信頼できないと見なされる場合がある。同様に、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２超のグアノシン＋シトシンヌクレオチドを有するマイクロアレイプローブに由来するデータは、これらの異常なハイブリダイゼーション傾向または二次構造問題に起因して信頼できないと一実施形態では見なされる場合がある。
【００６７】
本発明の一部の実施形態では、プローブセットからのデータは、これらが検出可能なレベル（バックグラウンドより上）で同定されない場合、分析から除外され得る。
【００６８】
本開示の一部の実施形態では、分散を呈さない、または低い分散を呈するプローブセットは、さらなる分析から除外され得る。低分散プローブセットは、カイ二乗検定を介して分析から除外される。一実施形態では、プローブセットは、その変換された分散が、（Ｎ−ｌ）自由度を有するカイ二乗分布の９９パーセント信頼区間の左にある場合、低分散であると見なされる。（Ｎ−ｌ）＊プローブセット分散／（遺伝子プローブセット分散）。Ｃｈｉ−Ｓｑ（Ｎ−ｌ）について、Ｎが、入力ＣＥＬファイルの数である場合、（Ｎ−ｌ）は、カイ二乗分布の自由度であり、「遺伝子についてのプローブセット分散」は、遺伝子にわたるプローブセット分散の平均である。本発明の一部の実施形態では、所与のｍＲＮＡまたはｍＲＮＡの群についてのプローブセットは、これらが、ＧＣ含有量、信頼性、分散などについて以前に記載したフィルターステップを通過する最小数未満のプローブを含有する場合、さらなる分析から除外される場合がある。例えば、一部の実施形態では、所与の遺伝子または転写物クラスターについてのプローブセットは、これらが、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５未満、または約２０未満のプローブを含有する場合、さらなる分析から除外され得る。
【００６９】
バイオマーカーレベルデータ分析の方法は、一実施形態では、本明細書に提供される特徴選択アルゴリズムの使用をさらに含む。本発明の一部の実施形態では、特徴選択は、ＬＩＭＭＡソフトウェアパッケージ（すべての目的に関してその全体が参照により組み込まれている、Smyth,  G.  K.（２００５年）、Limma:linear  models  for  microarray  data.  In:  Bioinformatics  and  Computational  Biology  Solutions  using  R  and  Bioconductor、R.  Gentleman、V.  Carey、S.  Dudoit、R.  Irizarry、W.  Huber(編)、Springer、New  York、３９７〜４２０頁）を使用することによってもたらされる。
【００７０】
バイオマーカーレベルデータ分析の方法は、一実施形態では、プレクラシファイヤーアルゴリズム（pre-classifier  algorithm）の使用を含む。例えば、アルゴリズムは、特異的分子フィンガープリントを使用して、試料をこれらの組成に従って予め分類し、次いで補正／正規化因子を適用することができる。次いでこのデータ／情報を、最終的な分類アルゴリズムに送ることができ、このアルゴリズムは、その情報を組み込んで最終的な診断を助ける。
【００７１】
バイオマーカーレベルデータ分析の方法は、一実施形態では、本明細書に提供されるクラシファイヤーアルゴリズムの使用をさらに含む。本発明の一実施形態では、対角線形判別分析（diagonal  linear  discriminant  analysis）、ｋ−近傍法、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）アルゴリズム、線形サポートベクターマシン、ランダムフォレストアルゴリズム、もしくは確率モデルベース法、またはこれらの組合せが、マイクロアレイデータを分類するために提供される。一部の実施形態では、試料（例えば、様々なバイオマーカーレベルプロファイルの、様々な肺がんサブタイプの、および／または腺癌の様々な分子サブタイプの）を区別する同定されたマーカーは、目的のクラス間のバイオマーカーレベルの差異の統計的有意性に基づいて選択される。一部の場合では、統計的有意性は、偽発見率（ＦＤＲ）についてのＢｅｎｊａｍｉｎ  Ｈｏｃｈｂｅｒｇまたは別の補正を適用することによって調整される。
【００７２】
一部の場合では、クラシファイヤーアルゴリズムは、すべての目的に関してその全体が参照により組み込まれている、FishelおよびKaufmanら、２００７年、Bioinformatics、２３巻（１３号）：１５９９〜６０６頁に記載されたものなどのメタ分析手法を追加されている場合がある。一部の場合では、クラシファイヤーアルゴリズムは、再現性分析などのメタ分析手法を追加されている場合がある。
【００７３】
バイオマーカーレベルデータの分析に事後確率を導出および適用するための方法は、当技術分野で公知であり、例えば、すべての目的に関してその全体が参照により組み込まれている、Smyth,  G.  K.、２００４年、Stat.  Appi.  Genet.  Mol.  Biol.、３巻：論文３に記載されている。一部の場合では、事後確率を本発明の方法において使用して、クラシファイヤーアルゴリズムによって提供されるマーカーをランク付けすることができる。
【００７４】
バイオマーカーレベルプロファイリングの結果の統計的評価は、肺がんサブタイプ（例えば、腺癌、扁平上皮癌、神経内分泌、小細胞癌、カルチノイド）を示す１つまたは複数の定量的値をもたらし得る。一実施形態では、データは、患者ケアを指導するのにその最も有用な形態で医師に直接提示され、または臨床試験における患者集団もしくは所与の薬物投与についての患者集団を定義するのに使用される。分子プロファイリングの結果は、それだけに限らないが、スチューデントＴ検定、両側Ｔ検定、ピアソン順位和分析、隠れマルコフモデル分析、ｑ−ｑプロットの分析、主成分分析、一元配置ＡＮＯＶＡ、二元配置ＡＮＯＶＡ、ＬＩＭＭＡなどを含めた当技術分野で公知のいくつかの方法を使用して統計的に評価することができる。
【００７５】
一部の場合では、精度は、元の診断の精度を決定するために経時的に被験体を追跡することによって決定され得る。他の場合では、精度は、確定的な様式で、または統計的方法を使用して確立され得る。例えば、受信者動作特性（ＲＯＣ）分析を使用することによって、最適なアッセイパラメーターを決定して、具体的なレベルの精度、特異性、正の予測値、負の予測値、および／または偽発見率を実現することができる。
【００７６】
一部の場合では、バイオマーカーレベルプロファイリングアッセイの結果は、分子プロファイリング事業、個人、医療提供者、または保険提供者の代表またはエージェントによるアクセスのためにデータベースに入力される。一部の場合では、アッセイ結果は、医療専門家などの事業の代表、エージェント、またはコンサルタントによる試料分類、同定、または診断を含む。他の場合では、データのコンピューター分析またはアルゴリズム分析は、自動的に提供される。一部の場合では、分子プロファイリング事業は、個人、保険提供者、医療提供者、研究者、または政府機関に、実施される分子プロファイリングアッセイ、コンサルティングサービス、データ分析、結果の報告、またはデータベースアクセスのうちの１つまたは複数について対価請求する場合がある。
【００７７】
本発明の一部の実施形態では、バイオマーカーレベルプロファイリングアッセイの結果は、コンピュータースクリーンでの報告として、または紙の記録として提示される。一部の実施形態では、報告は、それだけに限らないが、参照試料または参照値（複数可）と比較したバイオマーカーのレベル（例えば、コピー数または蛍光強度などによって報告される）；肺がんサブタイプ、提案される療法のうちの１つまたは複数などの情報を含み得る。
【００７８】
一実施形態では、クラシファイヤーバイオマーカープロファイリングの結果は、腺癌陽性、腺癌陰性、扁平上皮癌陽性、扁平上皮癌陰性、神経内分泌陽性、神経内分泌陰性、小細胞癌陽性、小細胞癌陰性、カルチノイド陽性、カルチノイド陰性、またはこれらの組合せのうちの１つまたは複数に分類することができる。
【００７９】
本発明の一部の実施形態では、結果は、訓練されたアルゴリズムを使用して分類される。本発明の訓練されたアルゴリズムには、既知の遺伝子発現値および／または正常試料、例えば、腺癌の特定の分子サブタイプと診断された個体からの試料の参照セットを使用して開発されたアルゴリズムが含まれる。一部の場合では、既知の遺伝子発現値の参照セットは、肺がんの特定の分子サブタイプと診断された個体から得られる。
【００８０】
試料のカテゴリー化に適したアルゴリズムとしては、それだけに限らないが、ｋ−近傍法、サポートベクターマシン、線形判別分析、対角線形判別分析、アップダウン、ナイーブベイジアンアルゴリズム、ニューラルネットワークアルゴリズム、隠れマルコフモデルアルゴリズム、遺伝的アルゴリズム、またはこれらの任意の組合せが挙げられる。
【００８１】
バイナリークラシファイヤーが実際の真の値（例えば、生体試料からの値）と比較されるとき、典型的には４つの可能なアウトカムがある。予測からのアウトカムが、ｐ（「ｐ」は、欠失症候群または重複症候群の存在などの陽性のクラシファイヤー出力である）であり、実際の値もｐである場合、それは、真の陽性（ＴＰ）と呼ばれるが、実際の値がｎである場合、それは、偽陽性（ＦＰ）と言われる。反対に、予測アウトカムおよび実際の値の両方がｎ（「ｎ」は、欠失症候群または重複症候群なしなどの陰性のクラシファイヤー出力である）であるとき、真の陰性が起こっており、偽陰性は、予測アウトカムがｎであり、一方、実際の値がｐであるときである。一実施形態では、肺がんの分子サブタイプを決定しようとする検査を考慮されたい。この場合において偽陽性は、人が、彼または彼女が実際には有していない分子サブタイプについて検査結果を得るとき起こる。他方において偽陰性は、試料が実際には特定の肺がんサブタイプとして特徴付けられるべきである肺がん試料であるのに、人が陰性の検査結果を得、試料が特定の肺がんサブタイプでないと示唆されるとき起こる。
【００８２】
陽性予測値（ＰＰＶ）、または精密度（precision  rate）、または疾患の検査後確率は、正しい肺がんサブタイプと診断される被験体の割合である。これは、陽性の検査が、検査されている基礎状態を反映する確率を反映する。しかしその値は、変動し得る疾患の有病率に依存する。一例では、以下の特性が提供される：ＦＰ（偽陽性）；ＴＮ（真の陰性）；ＴＰ（真の陽性）；ＦＮ（偽陰性）。偽陽性率（α）＝ＦＰ／（ＦＰ＋ＴＮ）−特異性；偽陰性率（β）＝ＦＮ／（ＴＰ＋ＦＮ）−感度；検出力＝感度＝１−β；尤度比陽性＝感度／（ｌ−特異性）；尤度比陰性＝（１−感度）／特異性。陰性予測値（ＮＰＶ）は、正しく診断されている陰性試験結果を有する被験体の割合である。
【００８３】
一部の実施形態では、主題方法のバイオマーカーレベル分析の結果は、所与の診断が正しい統計的信頼水準をもたらす。一部の実施形態では、このような統計的信頼水準は、少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％超、またはそれ超である。
【００８４】
一部の実施形態では、本方法は、試料中のバイオマーカーレベルと、例えば、少なくとも１つの訓練セット中に存在する参照バイオマーカーレベルとの比較に基づいて特定の肺がんサブタイプとして肺組織試料を分類することをさらに含む。一部の実施形態では、肺組織試料は、比較の結果が、１つまたは複数の判定基準、例えば、例えば、最小パーセント合致、（例えば）カッパ統計量などのパーセンテージ合致に基づいて計算される統計量の値、最小相関（例えば、ピアソン相関）などを満たす場合、特定のサブタイプとして分類される。
【００８５】
本明細書に記載の方法は、ソフトウェア（メモリーに記憶され、かつ／もしくはハードウェアで実行される）、ハードウェア、またはこれらの組合せによって実施され得ることが意図されている。ハードウェアモジュールは、例えば、汎用プロセッサー、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、および／または特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）を含み得る。ソフトウェアモジュール（ハードウェアで実行される）は、Ｕｎｉｘユーティリティ（登録商標）、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｊａｖａ（登録商標）、Ｒｕｂｙ、ＳＱＬ、ＳＡＳ（登録商標）、Ｒプログラミング言語／ソフトウェア環境、ビジュアルベーシック（商標）、ならびに他のオブジェクト指向の、手続型の、または他のプログラミング言語および開発ツールを含めた様々なソフトウェア言語（例えば、コンピューターコード）で表現することができる。コンピューターコードの例としては、それだけに限らないが、コンパイラーによって生成されるものなどの、マイクロコードまたはマイクロインストラクション、マシンインストラクション、ウェブサービスを作製するのに使用されるコード、およびインタープリターを使用してコンピューターによって実行されるより高いレベルのインストラクションを含有するファイルが挙げられる。コンピューターコードの追加の例としては、それだけに限らないが、制御信号、暗号化されたコード、および圧縮コードが挙げられる。
【００８６】
本明細書に記載の一部の実施形態は、本明細書に開示の様々なコンピューターで実装される操作および／または方法を実施するためにインストラクションまたはコンピューターコードを有する非一時的なコンピューター可読媒体（非一時的プロセッサー可読媒体またはメモリーと呼ぶこともできる）を伴ったデバイスに関する。コンピューター可読媒体（またはプロセッサー可読媒体）は、それがそれ自体で一時的伝搬信号（例えば、空間またはケーブルなどの伝送媒体で情報を搬送する伝搬電磁波）を含まないという意味で非一時的である。媒体およびコンピューターコード（コードと呼ぶこともできる）は、１つまたは複数の具体的な目的のために設計および構築されたものであり得る。非一時的コンピューター可読媒体の例としては、それだけに限らないが、磁気記憶媒体、例えば、ハードディスク、フロッピーディスク（登録商標）、および磁気テープ；コンパクトディスク／デジタルビデオディスク（ＣＤ／ＤＶＤ）などの光記憶媒体、コンパクトディスク−リードオンリーメモリー（ＣＤ−ＲＯＭ）、およびホログラフィックデバイス；光ディスクなどの光磁気記憶媒体；搬送波信号処理モジュール（carrier  wave  signal  processing  module）；ならびにプログラムコードを記憶および実行するように特別に構成されているハードウェアデバイス、例えば、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、プログラマブルロジックデバイス（ＰＬＤ）、リードオンリーメモリー（ＲＯＭ）、およびランダムアクセスメモリー（ＲＡＭ）デバイスが挙げられる。本明細書に記載の他の実施形態は、例えば、本明細書に論じたインストラクションおよび／またはコンピューターコードを含むことができるコンピュータープログラム産物に関する。
【００８７】
一部の実施形態では、少なくとも５種のバイオマーカー、約５〜約２０種のバイオマーカー、約５〜約５０種のバイオマーカー、約５〜約４０種のバイオマーカー、または約５〜約３０種のバイオマーカー（例えば、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、および表６に開示したような）は、少なくとも約７０％、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、最大で１００％、および間のすべての値の予測成功率で肺がんのタイプおよび／またはサブタイプを分類することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示のバイオマーカーの任意の組合せ（例えば、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、および表６、ならびにこれらのサブコンビネーションにおける）を使用して、少なくとも約７０％、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、最大で１００％、および間のすべての値の予測成功率を得ることができる。
【００８８】
一部の実施形態では、少なくとも５種のバイオマーカー、約５〜約２０種のバイオマーカー、約５〜約５０種のバイオマーカー、約５〜約４０種のバイオマーカー、または約５〜約３０種のバイオマーカー（例えば、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２、表３、表４、表５、および表６に開示したような）は、少なくとも約７０％、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、最大で１００％、および間のすべての値の感度または特異性で肺がんタイプおよび／またはサブタイプを分類することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示のバイオマーカーの任意の組合せを使用して、少なくとも約７０％、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、最大で１００％、および間のすべての値の感度または特異性を得ることができる。
【００８９】
一部の実施形態では、本発明の方法を実践するための１つまたは複数のキットがさらに提供されている。キットは、クラシファイヤーバイオマーカーのバイオマーカーレベルを検出するための少なくとも１種の試薬、例えば、抗体、核酸プローブまたはプライマーを含む任意の製造品（例えば、パッケージまたは容器）を包含することができる。キットは、本発明の方法を実施するためのユニットとして販売促進し、流通させ、または販売することができる。さらに、キットは、キットおよびその使用のための方法を記載している添付文書を含有することができる。
【００９０】
一実施形態では、患者の肺がんサブタイプを決定すると、患者は、適当な療法、例えば、血管新生阻害剤を用いた化学療法または薬物療法について選択される。一実施形態では、療法は、血管新生阻害剤療法であり、血管新生阻害剤は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）阻害剤、ＶＥＧＦ受容体阻害剤、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）阻害剤、またはＰＤＧＦ受容体阻害剤である。
【００９１】
別の実施形態では、血管新生阻害剤は、インテグリンアンタゴニスト、セレクチンアンタゴニスト、接着分子アンタゴニスト（例えば、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、血小板内皮接着分子（ＰＣＡＭ）、血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ）のアンタゴニスト）、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）のアンタゴニスト）、塩基性線維芽細胞成長因子アンタゴニスト、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）モジュレーター、または血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）モジュレーター（例えば、ＰＤＧＦアンタゴニスト）である。
【００９２】
一実施形態では、上記に示したように、患者の肺がんサブタイプを決定すると、患者は、適当な療法、例えば、血管新生阻害剤を用いた化学療法または薬物療法について選択される。一実施形態では、血管新生阻害剤は、インターフェロンガンマ１β、ピルフェニドンを伴ったインターフェロンガンマ１β（Ａｃｔｉｍｍｕｎｅ（登録商標））、ＡＣＵＨＴＲ０２８、αＶβ５、アミノ安息香酸カリウム、アミロイドＰ、ＡＮＧ１１２２、ＡＮＧ１１７０、ＡＮＧ３０６２、ＡＮＧ３２８１、ＡＮＧ３２９８、ＡＮＧ４０１１、抗ＣＴＧＦ  ＲＮＡｉ、アプリジン、サルビアおよびチョウセンゴミシ（ｓｃｈｉｓａｎｄｒａ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）を伴ったキバナオウギ（ａｓｔｒａｇａｌｕｓ  ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ）抽出物、アテローム硬化性プラークブロッカー、アゾル（Azol）、ＡＺＸ１００、ＢＢ３、結合組織成長因子抗体、ＣＴ１４０、ダナゾール、エスブリエット、ＥＸＣ００１、ＥＸＣ００２、ＥＸＣ００３、ＥＸＣ００４、ＥＸＣ００５、Ｆ６４７、ＦＧ３０１９、フィブロコリン、フォリスタチン、ＦＴ０１１、ガレクチン−３阻害剤、ＧＫＴ１３７８３１、ＧＭＣＴ０１、ＧＭＣＴ０２、ＧＲＭＤ０１、ＧＲＭＤ０２、ＧＲＮ５１０、ヘベロン（Ｈｅｂｅｒｏｎ）アルファＲ、インターフェロンα−２β、ＩＴＭＮ５２０、ＪＫＢ１１９、ＪＫＢ１２１、ＪＫＢ１２２、ＫＲＸ１６８、ＬＰＡ１受容体アンタゴニスト、ＭＧＮ４２２０、ＭＩＡ２、マイクロＲＮＡ  ２９ａオリゴヌクレオチド、ＭＭＩ０１００、ノスカピン、ＰＢＩ４０５０、ＰＢＩ４４１９、ＰＤＧＦＲ阻害剤、ＰＦ−０６４７３８７１、ＰＧＮ００５２、ピレスパ、ピルフェネックス、ピルフェニドン、プリチデプシン、ＰＲＭ１５１、Ｐｘ１０２、ＰＹＮ１７、ＰＹＮ１７を伴ったＰＹＮ２２、レリベルゲン、ｒｈＰＴＸ２融合タンパク質、ＲＸＩ１０９、セクレチン、ＳＴＸ１００、ＴＧＦ−β阻害剤、トランスフォーミング成長因子、β−受容体２オリゴヌクレオチド，ＶＡ９９９２６０、ＸＶ６１５、エンドスタチン、ＸＶＩＩＩ型コラーゲンに由来する２０ｋＤａ  Ｃ末端断片、アンギオスタチン（プラスミンの３８ｋＤａ断片）、またはタンパク質のトロンボスポンジン（ＴＳＰ）ファミリーのメンバーのうちの１種または複数種である。さらなる実施形態では、血管新生阻害剤は、ＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２、ＴＳＰ−３、ＴＳＰ−４、およびＴＳＰ−５である。
【００９３】
一実施形態では、療法は、可溶性ＶＥＧＦ受容体、例えば、可溶性ＶＥＧＦＲ−１およびニューロピリン１（ＮＰＲ１）、アンジオポエチン−１、アンジオポエチン−２、バソスタチン、カルレティキュリン、血小板因子−４、メタロプロテイナーゼの組織阻害剤（ＴＩＭＰ）（例えば、ＴＩＭＰ１、ＴＩＭＰ２、ＴＩＭＰ３、ＴＩＭＰ４）、軟骨由来血管新生阻害剤（例えば、ペプチドトロポニンＩおよびコンドロモジュリンＩ（chrondomodulin  I）、トロンボスポンジンモチーフ１を伴ったディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ、インターフェロン（ＩＦＮ）（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ）、ケモカイン、例えば、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフを有するケモカイン（例えば、インターフェロンガンマ誘導タンパク質１０または小誘導性サイトカインＢ１０としても公知のＣＸＣＬ１０）、インターロイキンサイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８）、プロトロンビン、抗トロンビンＩＩＩ断片、プロラクチン、ＴＮＦＳＦ１５遺伝子によってコードされるタンパク質、オステオポンチン、マスピン、カンスタチン、プロリフェリン関連タンパク質、アンジオポエチン−１、アンジオポエチン−２、アンギオスタチン、エンドスタチン、バソスタチン、トロンボスポンジン、カルレティキュリン、血小板因子−４、ＴＩＭＰ、ＣＤＡＩ、インターフェロンα、インターフェロンβ、血管内皮成長因子阻害剤（ＶＥＧＩ）メタ−１、メタ−２、プロラクチン、ＶＥＧＩ、ＳＰＡＲＣ、オステオポンチン、マスピン、カンスタチン、プロリフェリン関連タンパク質（ＰＲＰ）、レスチン、ＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２、インターフェロンガンマ１β、ＡＣＵＨＴＲ０２８、αＶβ５、アミノ安息香酸カリウム、アミロイドＰ、ＡＮＧ１１２２、ＡＮＧ１１７０、ＡＮＧ３０６２、ＡＮＧ３２８１、ＡＮＧ３２９８、ＡＮＧ４０１１、抗ＣＴＧＦ  ＲＮＡｉ、アプリジン、サルビアおよびチョウセンゴミシを伴ったキバナオウギ抽出物、アテローム硬化性プラークブロッカー、アゾル、ＡＺＸ１００、ＢＢ３、結合組織成長因子抗体、ＣＴ１４０、ダナゾール、エスブリエット、ＥＸＣ００１、ＥＸＣ００２、ＥＸＣ００３、ＥＸＣ００４、ＥＸＣ００５、Ｆ６４７、ＦＧ３０１９、フィブロコリン、フォリスタチン、ＦＴ０１１、ガレクチン−３阻害剤、ＧＫＴ１３７８３１、ＧＭＣＴ０１、ＧＭＣＴ０２、ＧＲＭＤ０１、ＧＲＭＤ０２、ＧＲＮ５１０、ヘベロンアルファＲ、インターフェロンα−２β、ＩＴＭＮ５２０、ＪＫＢ１１９、ＪＫＢ１２１、ＪＫＢ１２２、ＫＲＸ１６８、ＬＰＡ１受容体アンタゴニスト、ＭＧＮ４２２０、ＭＩＡ２、マイクロＲＮＡ  ２９ａオリゴヌクレオチド、ＭＭＩ０１００、ノスカピン、ＰＢＩ４０５０、ＰＢＩ４４１９、ＰＤＧＦＲ阻害剤、ＰＦ−０６４７３８７１、ＰＧＮ００５２、ピレスパ、ピルフェネックス、ピルフェニドン、プリチデプシン、ＰＲＭ１５１、Ｐｘ１０２、ＰＹＮ１７、ＰＹＮ１７を伴ったＰＹＮ２２、レリベルゲン、ｒｈＰＴＸ２融合タンパク質、ＲＸＩ１０９、セクレチン、ＳＴＸ１００、ＴＧＦ−β阻害剤、トランスフォーミング成長因子、β−受容体２オリゴヌクレオチド，ＶＡ９９９２６０、ＸＶ６１５、またはこれらの組合せである。
【００９４】
さらに別の実施形態では、患者の肺がんサブタイプを決定すると、患者は、パゾパニブ（ヴォトリエント）、スニチニブ（スーテント）、ソラフェニブ（ネクサバール）、アキシチニブ（インライタ）、ポナチニブ（アイクルシグ）、バンデタニブ（カプレルサ）、カボザンチニブ（コメトリク（Cometrig））、ラムシルマブ（サイラムザ）、レゴラフェニブ（スチバーガ）、ziv−アフリベルセプト（ザルトラップ）、またはこれらの組合せを用いた適当な療法について選択される。さらに別の実施形態では、患者の肺がんサブタイプを決定すると、患者は、ＶＥＧＦ阻害剤を用いた適当な療法について選択される。さらなる実施形態では、ＶＥＧＦ阻害剤は、アキシチニブ、カボザンチニブ、アフリベルセプト、ブリバニブ、チボザニブ、ラムシルマブ、またはモテサニブである。なおさらなる実施形態では、ＶＥＧＦ阻害剤は、モテサニブである。
【００９５】
さらに別の実施形態では、患者の肺がんサブタイプを決定すると、患者は、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）アンタゴニストを用いた適当な療法について選択される。例えば、ＰＤＧＦアンタゴニストは、一実施形態では、抗ＰＤＧＦアプタマー、抗ＰＤＧＦ抗体もしくはその断片、抗ＰＤＧＦ受容体抗体もしくはその断片、または低分子アンタゴニストである。一実施形態では、ＰＤＧＦアンタゴニストは、ＰＤＧＦＲ−αまたはＰＤＧＦＲ−βのアンタゴニストである。一実施形態では、ＰＤＧＦアンタゴニストは、抗ＰＤＧＦ−βアプタマーＥ１００３０、スニチニブ、アキシチニブ、ソラフェニブ（sorefenib）、イマチニブ、イマチニブメシル酸塩、ニンテダニブ、パゾパニブＨＣｌ、ポナチニブ、ＭＫ−２４６１、ドビチニブ、パゾパニブ、クレノラニブ、ＰＰ−１２１、テラチニブ、イマチニブ、ＫＲＮ６３３、ＣＰ６７３４５１、ＴＳＵ−６８、Ｋｉ８７５１、アムバチニブ、チボザニブ、マシチニブ、モテサニブ二リン酸塩、ドビチニブ二乳酸、リニファニブ（ＡＢＴ−８６９）である。
【実施例】
【００９６】
本発明を、以下の実施例を参照することによってさらに例示する。しかし、これらの実施例は、上述した実施形態のように、例示的であり、本発明の範囲を制限すると決して解釈されるべきでないことに留意されるべきである。
方法
【００９７】
２，１６８の肺がん試料を含むいくつかの公的に利用可能な肺がん遺伝子発現データセット（ＴＣＧＡ、ＮＣＩ、ＵＮＣ、Ｄｕｋｅ、Ｅｘｐｏ、Ｓｅｏｕｌ、Ｔｏｋｙｏ、およびＦｒａｎｃｅ）をアセンブルして、肺腫瘍の形態学的分類を補完するように開発された５７の遺伝子発現肺サブタイプパネル（ＬＳＰ）をバリデートした。ＬＳＰは、５２の肺腫瘍分類遺伝子＋５つのハウスキーピング遺伝子を含んでいた。遺伝子発現データおよび肺腫瘍形態学的分類の両方を有するデータセットを選択した。ゲノムデータの３つのカテゴリーを、データセット：Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３＋２（ｎ＝８８３）（「Ａ−８３３」とも呼ばれる）、Ａｇｉｌｅｎｔ  ４４Ｋ（ｎ＝３３４）（「Ａ−３３４」とも呼ばれる）、およびＩｌｌｕｍｉｎａ  ＲＮＡｓｅｑ（ｎ＝９５１）（「Ｉ−９５１」とも呼ばれる）で表した。データソースを表７に提供し、正規化法を表８に提供する。腺癌、カルチノイド、小細胞癌、および扁平上皮癌の確定診断を有する試料を、分析で使用した。
【表７−１】
2017516501.tif 000032
【表７−２】
2017516501.tif 000033
【表８】
2017516501.tif 000034
【００９８】
Ａ−８３３データセットを、以前に記載した方法に従って、腺癌、カルチノイド、小細胞癌、および扁平上皮癌遺伝子重心（ｇｅｎｅ  ｃｅｎｔｒｏｉｄ）を計算するための訓練として使用した。次いで、Ａ−８３３データで訓練された遺伝子重心を正規化されたＴＣＧＡおよびＡ−３３４データセットに適用して、公的に利用可能な遺伝子発現データを使用して肺腫瘍を分類するＬＳＰの能力を調査した。Ａ−８３３訓練重心（ｔｒａｉｎｉｎｇ  ｃｅｎｔｒｏｉｄ）をＡ−８３３データセットに適用するために、評価を、一個抜き（ＬＯＯ）交差検証を使用して実施した。スピアマン相関を、Ａ−８３３遺伝子発現訓練重心に対する腫瘍試料遺伝子発現結果について計算した。腫瘍に、最大に相関した重心に対応するゲノム定義の組織学的型（カルチノイド、小細胞癌、腺癌、および扁平上皮癌）を割り当てた。２クラス、３クラス、および４クラス予測を探索した。正しい予測を、腫瘍の組織学的診断にマッチするＬＳＰコールとして定義した。パーセント合致を、すべての予測の数によって除した正しい予測の数として定義し、合致カッパ統計量を計算した。
【００９９】
１０の肺腫瘍ＲＮＡ発現データセットを組み合わせて、３つのプラットフォーム特異的データセット（Ａ−８３３、Ａ−３３４、およびＩ−９５１）にした。患者集団は、多様であり、病期１〜病期ＩＶの範囲の腫瘍を有する喫煙者および非喫煙者を含んでいた。３つのデータセットの試料特性および肺がん診断は、表９に含まれている。
【表９】
2017516501.tif 000035
【０１００】
２クラス、３クラス、および４クラス予測因子について予測された腫瘍型を、腫瘍形態学的分類およびパーセント合致と比較し、Ｆｌｅｉｓｓカッパを各予測因子について計算した（表１０ａ、１０ｂ、および１０ｃ）。
【表１０ａ】
2017516501.tif 000036
【表１０ｂ】
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【表１０ｃ】
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【０１０１】
形態学的分類単独に基づく肺がん診断の観察者間再現性の評価は、以前に公開されている。全体的な観察者間合致は、タイピングスキームの単純化で改善した。包括的な２００４世界保健機関分類システムを使用して、観察者間合致は低かった（ｋ＝０．２５）。合致は、治療上意味がある扁平上皮／非扁平上皮の２タイプ区別に診断を単純化すると改善した（ｋ＝０．５５）。観察者間診断の合致を、本バリデーション試験における２、３、および４クラスＬＳＰ診断の合致と比較する（表１１）。
【表１１】
2017516501.tif 000039
【０１０２】
肺がんの様々な形態学的なサブタイプの間の区別は、ますます重要になっており、その理由は、治療剤開発および患者管理が、各腫瘍のユニークな特徴により特異的に標的化された状態になっているためである。組織学的診断は、挑戦的であり得、いくつかの試験は、形態学的な診断の再現性が限定的であることを実証している。ｐ６３およびＴＴＦ−１などのいくつかの免疫組織化学検査マーカーを加えると、診断的精密さが改善されるが、多くの肺がん生検は、サイズおよび／または細胞充実度が限られており、複数のＩＨＣマーカーを使用する完全な特徴付けを妨げている。合致は、組織学的診断のより大きい精度および／またはＲＮＡ発現結果のより大きな精密さにおそらく起因して、他のデータセットと比較してＴＣＧＡ  ＲＮＡｓｅｑデータセットにおけるすべてのクラシファイヤー（２、３、および４タイプ）について著しくより良好であった（％合致範囲９１％〜９４％）。以下に記載するいくつかの限定事項にもかかわらず、本試験は、ＬＳＰが肺腫瘍のタイピングにおける組織診断の貴重な補助となるものであり得ることを実証する。
【０１０３】
数百の肺がん試料を有する複数のデータセットでは、肺サブタイプパネル（ＬＳＰ）を使用する分子プロファイリングは、光学顕微鏡で得られる診断と有利には匹敵し、病理学者の再評価より高いレベルの合致を示した。ＲＮＡベース腫瘍サブタイピングは、特に、組織が限定的であり、形態学的診断が不明確なままであるとき、診療所において貴重な情報を提供することができる。
【０１０４】
以下の参考文献の開示は、すべての目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれている。
ａ．American  Cancer  Society.  Cancer  Facts  and  Figures、２０１４年。
ｂ．National  Comprehensive  Cancer  Network  (NCCN)  Clinical  Practice  Guideline  in  Oncology.  Non-Small  Cell  Lung  Cancer.、２版、２０１３年。
ｃ．Grilley  Olson  JE、Hayes  DN、Moore  DTら、Arch  Pathol  Lab  Med、２０１３年；１３７巻：３２〜４０頁
ｄ．Thunnissen  E、Boers  E、Heideman  DAら、Virchows  Arch、２０１２年；４６１巻：６２９〜３８頁。
ｅ．Wilkerson  MD、Schallheim  JM、Hayes  DNら、J  Molec  Diagn、２０１３年；１５巻：４８５〜４９７頁。
ｆ．Li  B、Dewey  CN、BMC  Bioinformatics、２０１１年、１２巻：３２３頁、doi:10.1186/1471-2105-12-323
ｇ．Yang  YH、Dudoit  S、Luu  Pら、Nucleic  Acids  Research、２００２年、３０巻：ｅ１５頁。
ｈ．Hubbell  E、Liu、W、Mei  R、Bioinformatics、（２００２年）１８巻（１２号）：１５８５〜１５９２頁、doi:10.1093/bioinformatics/18.12.1585。
ｉ．Travis  WD、Brambilla  E、Muller-Hermelink  HK、Harris  CC、Pathology  and  Genetics  of  Tumors  of  the  Lung,  Pleura,  Thymus,  and  Heart.、３版、Lyon、France：IARC  Press；２００４年、World  Health  Organization  Classification  of  Tumors：１０巻。
ｊ．Travis  WDおよびRekhtman  N、Sem  Resp  and  Crit  Care  Med、２０１１年；３２巻（１号）：２２〜３１頁。
（実施例２）
複数の新鮮凍結およびホルマリン固定パラフィン包埋肺腫瘍遺伝子発現データセットの肺がんサブタイピング
【０１０５】
２，１７７の試料を含む複数のデータセットをアセンブルして、肺サブタイプパネル（ＬＳＰ）遺伝子発現クラシファイヤーを評価した。データセットは、２，０９９の新鮮凍結肺がん試料を含むいくつかの公的に利用可能な肺がん遺伝子発現データセット（ＴＣＧＡ、ＮＣＩ、ＵＮＣ、Ｄｕｋｅ、Ｅｘｐｏ、Ｓｅｏｕｌ、およびＦｒａｎｃｅ）、ならびに７８のＦＦＰＥ試料から新しく収集された遺伝子発現データを含んでいた。データソースを以下の表１２に提供する。７８のＦＦＰＥ試料は、ＩＲＢ承認プロトコールを使用してノースカロライナ大学チャペルヒル校（ＵＮＣ−ＣＨ）で収集された、アーカイブされた残留する肺腫瘍試料であった。ＡＤ、カルチノイド、小細胞癌（ＳＣＣ）、またはＳＱＣの確定診断を有する試料のみを、分析で使用した。ゲノムデータの合計４カテゴリーが分析に利用可能であった：Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３＋２（ｎ＝６９３）、Ａｇｉｌｅｎｔ  ４４Ｋ（ｎ＝３４４）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＲＮＡｓｅｑ（ｎ＝１，０６２）、および新しく収集されたｑＲＴ−ＰＣＲ（ｎ＝７８）データ。
【０１０６】
アーカイブされたＦＦＰＥ肺腫瘍試料（ｎ＝７８）を、以下の改変とともに、以前に記載されたｑＲＴ−ＰＣＲ遺伝子発現アッセイ（すべての目的に関してその全体が本明細書に参照により組み込まれている、Wilkersonら、J  Molec  Diagn、２０１３年；１５巻：４８５〜４９７頁）を使用して分析した。ＲＮＡを、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＲＮＡ  Ｐａｒａｆｆｉｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を使用して、ＦＦＰＥ組織の１つの１０μｍの切片から抽出した。抽出したＲＮＡを５ｎｇ／μＬに希釈し、第１の鎖のｃＤＮＡを、ランダム六量体（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（登録商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）と組み合わせて遺伝子特異的３’プライマーを使用して合成した。ＡＢＩ７９００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）をｑＲＴ−ＰＣＲに使用して、ＳＹＢＲ緑色蛍光（５３０ｎｍ）を連続的にモニターした。ＡＢＩ７９００定量ソフトウェアは、増幅曲線および関連した閾値サイクル（Ｃｔ）値を生成した。試料とともに集めた元の臨床診断は、表１３にある。
【表１２】
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【表１３−１】
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【表１３−２】
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【表１３−３】
2017516501.tif 000043
【０１０７】
病理学的レビューは、追加の切片を収集および画像化したＦＦＰＥ肺腫瘍コホートについてのみ可能であった。各試料からの２つの連続した切片を、ヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色し、Ａｐｅｒｉｏ（商標）ＳｃａｎＳｃｏｐｅ（登録商標）スライドスキャナー（Ａｐｅｒｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖｉｓｔａ、ＣＡ）を使用してスキャンした。バーチャルスライドは、３２〜３２０対物レンズ（３４０拡大鏡）に等価な拡大率で観察することができた。病理学者レビューを元の臨床診断および遺伝子発現ベースサブタイプ分類に対して盲検化した。病理学的レビューベース組織学的サブタイプコールを元の診断と比較した（ｎ＝７８）。病理学的レビューの合致は、両方のスライドが元の診断と同じサブタイプに割り当てられた試料として定義した。
【０１０８】
すべての統計分析は、Ｒ３．０．２ソフトウェア（http://cran.R-project.org）を使用して行った。データ分析は、ＦＦについて、およびＦＦＰＥ腫瘍試料について別個に行った。
【０１０９】
新鮮凍結データセット分析：データセットを表１２に記載したように正規化した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘデータセットは、以前に記載された方法（Wilkersonら、PLoS  ONE.、２０１２年；７巻（５号）ｅ３６５３０頁、Doi:10.1371/journal.pone.0036530；Wilkersonら、J  Molec  Diagn、２０１３年；１５巻：４８５〜４９７頁、そのそれぞれは、すべての目的に関してその全体が本明細書に参照により組み込まれている）に従ってＡＤ、カルチノイド、ＳＣＣ、およびＳＱＣ遺伝子重心を計算するための訓練セットとして機能を果たした。
【０１１０】
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ訓練遺伝子重心を表１４に提供する。訓練セット遺伝子重心を、正規化されたＴＣＧＡ  ＲＮＡｓｅｑ遺伝子発現データセットおよびＡｇｉｌｅｎｔマイクロアレイ遺伝子発現データセットにおいて検査した。公的なＡｇｉｌｅｎｔデータセットからの欠損したデータに起因して、Ａｇｉｌｅｎｔ評価は、ＣＩＢ１、ＦＯＸＨ１、ＬＩＰＥ、ＰＣＡＭ１、ＴＵＢＡ１の遺伝子を除外して５２の遺伝子パネルではなく、４７の遺伝子クラシファイヤーを用いて実施した。
【表１４−１】
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【表１４−２】
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【表１５−１】
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【表１５−２】
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【０１１１】
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘデータの評価を、一個抜き（ＬＯＯ）交差検証を使用して実施した。スピアマン相関を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子発現訓練重心に対する腫瘍検査試料について計算した。腫瘍に、最大に相関した重心に対応するゲノム定義の組織学的型（ＡＤ、ＳＱＣ、またはＮＥ）を割り当てた。正しい予測を、腫瘍の元の組織学的診断にマッチするＬＳＰコールとして定義した。パーセント合致を、全予測の数によって除した正しい予測の数として定義し、合致カッパ統計量を計算した。
【０１１２】
ＦＦＰＥ試料分析からのｑＲＴ−ＰＣＲ：ＦＦＰＥ肺腫瘍試料のｑＲＴ−ＰＣＲデータから計算された、以前に公開された訓練重心（本明細書に参照により組み込まれている、Wilkersonら、J  Molec  Diagn、２０１３年；１５巻：４８５〜４９７頁）を、ＦＦＰＥ肺腫瘍組織からのｑＲＴ−ＰＣＲ遺伝子発現のこの新しい試料セットにおいて交差検証した。ＷｉｌｋｅｒｓｏｎらのＡＤおよびＳＱＣ重心を、公開された通り使用した（本明細書に参照により組み込まれている、Wilkersonら、J  Molec  Diagn、２０１３年；１５巻：４８５〜４９７頁）。神経内分泌遺伝子重心を、公開された遺伝子発現データ（ｎ＝１３０）（本明細書に参照により組み込まれている、Wilkersonら、J  Molec  Diagn、２０１３年；１５巻：４８５〜４９７頁）を使用して同様に計算した。ＦＦＰＥ組織評価についてのＷｉｌｋｅｒｓｏｎらの遺伝子重心（本明細書に参照により組み込まれている、Wilkersonら、J  Molec  Diagn、２０１３年；１５巻：４８５〜４９７頁）は、表１５に含まれている。ＦＦＰＥ試料遺伝子発現データをスケール変更して、遺伝子分散をＷｉｌｋｅｒｓｏｎらのデータとアラインした。データセット間の標識頻度の差異を考慮に入れた遺伝子特異的な換算係数を計算した。次いで遺伝子発現データを、中央値を中心とし、符号反転し（sign  flipped）（高いＣｔ＝低い存在量）、遺伝子特異的な換算係数を使用してスケール変更した。サブタイプは、各試料を３つのサブタイプ重心と相関させ、最高の相関重心（スピアマン相関）を有するサブタイプを割り当てることによって予測した。
【０１１３】
９つのＦＦ＋１つの新しいＦＦＰＥ  ｑＲＴ−ＰＣＲ遺伝子発現データセットを含む１０の肺腫瘍遺伝子発現データセットを組み合わせて、４つのプラットフォーム特異的データセットにした（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＲＮＡｓｅｑ、およびｑＲＴ−ＰＣＲ）。臨床情報が利用可能であったデータセットについては、患者集団は、多様であり、病期１〜病期ＩＶの範囲の腫瘍を有する喫煙者および非喫煙者を含んでいた。本試験で使用したデータセットの試料特性および肺がん診断は、表１６に含まれている。ＡＤ、ＳＱＣ、ＳＣＣ、またはカルチノイドの確定診断を伴わない試料を除外し、ｑＲＴ−ＰＣＲ分析に失敗した１つのＦＦＰＥ試料を除外した後、以下の試料がさらなるデータ分析に利用可能であった：Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（ｎ＝５３８）、Ａｇｉｌｅｎｔ（ｎ＝３２２）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＲＮＡｓｅｑ（ｎ＝９５１）、およびｑＲＴ−ＰＣＲ（ｎ＝７７）。
【表１６】
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【０１１４】
新しいＦＦＰＥデータセットの新規の評価の手段として、本発明者らは、ＦＦＰＥアーカイブ試料（ｎ＝７７）からのＬＳＰ遺伝子発現の階層的クラスタリングを実施した。予期されたように、この分析は、ＡＤ、ＳＱＣ、およびＮＥに対応する３つのクラスター／サブタイプを実証した（図２）。次いで、所定のＬＳＰ  ３−サブタイプ重心予測因子を４つすべてのデータセットに適用し、結果を腫瘍形態学的分類と比較した。パーセント合致およびＦｌｅｉｓｓカッパを各データセットについて計算した（表１７）。パーセント合致は、７８％〜９１％の範囲であり、カッパは、０．５７〜０．８５の範囲であった。
【０１１５】
独立した病理合致を評価する別の手段として、７７のＦＦＰＥ肺腫瘍の盲検化された病理学的レビューの元の形態学的診断との合致は、８２％（６３／７７）であることが判明した。１２／７７の場合では、盲検化された２つ組のスライドは、矛盾する結果をもたらし、１０／７７の場合では、２つ組の少なくとも一方は、「腺扁平上皮」、「大細胞」、または「高悪性度低分化癌」という確定的でない病理学的サブタイプ分類を有していた。７７の試料のそれぞれについての元の形態学的な診断、盲検化された病理学的レビュー、および遺伝子発現ＬＳＰサブタイプコールの比較を図３に示す。一致しない試料のオーバーラップ（すなわち、腫瘍サブタイプが病理学的レビューおよび遺伝子発現ＬＳＰコールの両方によって元の形態診断と合致しなかった６つの試料）の詳細を表１８に提供する。全体的に、元の病理学的コールに対するＬＳＰのこれらの一致値は、任意の２人の病理学者との間の一致と少なくとも同じぐらい大きく（Grilleyら、Arch  Pathol  Lab  Med、２０１３年；１３７巻：３２〜４０頁；Thunnissenら、Virchows  Arch、２０１２年；４６１巻（６号）：６２９〜３８頁、Doi:10.1007/s00428-012-1234-x.、２０１２年１０月１２日電子出版；Thunnissenら、Mod  Pathol、２０１２年；２５巻（１２号）：１５７４〜８３頁、Doi:10.1038/modpathol.2012.106；そのそれぞれは、すべての目的に関して本明細書に参照により組み込まれている）、したがって、本明細書に記載のアッセイでは、訓練された病理学者と少なくとも同じぐらいよく機能することが示唆される。
【０１１６】
本試験では、ＬＳＰは、信頼できるサブタイプ分類をもたらし、複数の遺伝子発現プラットフォームにわたって、かつＦＦＰＥ標本を使用するときでもその性能をバリデートした。新しくアッセイしたＦＦＰＥ試料の階層的クラスタリングは、５２のクラシファイヤーバイオマーカーのレベルに基づいて３つのサブタイプ（ＡＣ、ＳＱＣ、およびＮＥ）の良好な分離を実証した。ＬＳＰ重心を使用するときの形態診断との一致は、他のデータセットと比較してＴＣＧＡ試料と関連した非常に広範な病理学的レビューおよび組織学的診断の精度におそらく起因して、ＴＣＧＡ  ＲＮＡｓｅｑデータセットにおいて最大であった（合致＝９１％）。合致は、Ａｇｉｌｅｎｔデータセットにおいて最低であった（７８％）。このデータセットは、その分析について利用可能であった遺伝子の数が少なかったことによって影響された可能性がある。全体的に、ＬＳＰアッセイは、５２ではなく４７のみの遺伝子が分析のために存在したＡｇｉｌｅｎｔデータセットを除いてすべてのデータセットにおいて病理学的レビューより元の形態診断とのより高い一致を示した。
【０１１７】
盲検化された病理学的再レビューが可能であったＦＦＰＥ試料では、結果は、病理学的コールが、元の診断と常に一致しているとは限らず、これらは、各試料から提供される２つ組スライドにおいて必ずしも一貫していないことを示唆した。試料のサブセット（ｎ＝６）について、病理学的再レビューおよびＬＳＰ遺伝子発現分析の両方は、同じ代替の診断を示唆し、これから、本発明者らの「ゴールドスタンダード」であった元の形態学的診断の精度が疑問視された。
【０１１８】
本試験では、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘデータセットにおける少数のＮＥ腫瘍試料があり、ＡｇｉｌｅｎｔデータセットおよびＴＣＧＡデータセットの両方においてＮＥ試料が存在しなかった。これは、ＦＦＰＥ試料セット中の相対的に高い数のＮＥ試料（３１／７７）によって部分的に克服されたため、ＮＥ試料を同定するＬＳＰシグネチャーの能力の良好な検査がもたらされた。本試験の別の限定事項は、盲検化された病理学的再レビューに関する。盲検化された病理学的レビューは、２つの画像化された切片に基づき、複数の切片／ブロック、および潜在的にＩＨＣ染色剤が診断を行うのに利用可能である通常の組織診断の標準プラクティスを反映しなかった。
【０１１９】
上述した様々な実施形態は、さらなる実施形態をもたらすように組み合わせることができる。本明細書に参照され、かつ／または出願データシートに列挙された米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許刊行物のすべては、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。実施形態の態様は、必要であれば、様々な特許、出願、および刊行物の概念を採用してなおさらなる実施形態をもたらすように改変することができる。
【０１２０】
これらの変更および他の変更を、上記詳細な説明を踏まえると実施形態に行うことができる。一般に、以下の特許請求の範囲において、使用した用語は、本明細書および特許請求の範囲に開示した具体的な実施形態に特許請求の範囲を限定するように解釈されるべきでないが、このような特許請求の範囲が権利を与えられる均等物の全範囲とともにすべての可能な実施形態を含むように解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示によって限定されない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年2月2日(2017.2.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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