(57)【要約】  植物成長媒介実体または物質を植物に、特に窒素固定細菌を植物細胞に導入する方法であり、前記方法は、前記植物成長媒介実体または物質をテルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）の株と組み合わせて、植物内に植物に（ｉｎｔｏ  ｐｌａｎｔｓ  ｔｏ  ａ  ｐｌａｎｔ）投与するステップを含んでなる。本方法で使用される組成物および細菌が、本発明のさらなる態様を形成する。
2017523782.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物成長媒介実体または物質をテルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）株と組み合わせて植物に投与するステップを含んでなる、植物成長媒介実体または物質を植物に導入する方法。
【請求項２】
前記テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）の株が、テルリバチルス・サッカロフィルス（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｕｓ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記テルリバチルス・サッカロフィルス（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｕｓ）の株が、配列番号１〜４のいずれか１つを含んでなる、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記植物成長媒介実体または物質が、窒素固定細菌である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記窒素固定細菌が、レバン被覆を形成する細菌である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記窒素固定細菌が、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）（Ｇｄ）である、請求項４または請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）が、投与に先だって前記Ｇｄと密接に結合する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）と植物成長媒介実体または物質との組み合わせが、成長植物に投与される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記植物が、前記組み合わせの投与に先だって傷処理を受ける、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）および窒素固定細菌の組み合わせが種子に投与される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）の株を含んでなる、農業組成物。
【請求項１２】
窒素固定細菌をさらに含んでなる、請求項１０に記載の農業組成物。
【請求項１３】
前記窒素固定細菌が、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）（Ｇｄ）である、請求項１２に記載の農業組成物。
【請求項１４】
前記テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）の株が、テルリバチルス・サッカロフィルス（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｕｓ）、テルリバチルス・ハロフィルス（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、テルリバチルス・ゴリエンシス（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｏｒｉｅｎｓｉｓ）またはテルリバチルス・アイジンゲンシス（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｉｄｉｎｇｅｎｓｉｓ）である、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の農業組成物。
【請求項１５】
前記テルリバチルス・サッカロフィルス（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｕｓ）の株が、配列番号１〜４のいずれか１つを含んでなる、請求項１３に記載の農業組成物。
【請求項１６】
前記テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）が使用されて、植物成長媒介実体または物質の植物への移入が容易にされる、農業におけるテルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）の株の使用。
【請求項１７】
植物成長媒介実体または物質が、前記植物細胞に移入される窒素固定細菌である、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）の株が、テルリバチルス・サッカロフィルス（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｃｃｈｒｏｐｈｉｌｕｓ）またはテルリバチルス・ハロフィルス（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、テルリバチルス・ゴリエンシス（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｏｒｉｅｎｓｉｓ）またはテルリバチルス・アイジンゲンシス（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｉｄｉｎｇｅｎｓｉｓ）である、請求項１６または請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）の株と窒素固定細菌の株を共に混合することで得られる、農業で利用するための組み合わせ。
【請求項２０】
窒素固定細菌が、レバン被覆を形成する細菌である、請求項１８に記載の組み合わせ。
【請求項２１】
前記窒素固定細菌が、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）（Ｇｄ）である、請求項１９または請求項２０に記載の組み合わせ。
【請求項２２】
テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）の株が、テルリバチルス・サッカロフィルス（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｃｃｈｒｏｐｈｉｌｕｓ）、テルリバチルス・ハロフィルス（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、テルリバチルス・ゴリエンシス（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｏｒｉｅｎｓｉｓ）またはテルリバチルス・アイジンゲンシス（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｉｄｉｎｇｅｎｓｉｓ）である、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の組み合わせ。
【請求項２３】
テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）の株と窒素固定細菌の株との組み合わせを調製する方法であって、前記株を双方の株の増殖を支持する培地中で共培養するステップを含んでなる、方法。
【請求項２４】
前記窒素固定細菌がＧｄである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記培地が、ＭＹＰまたはＳＹＰから選択される、請求項２３または請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
植物成長媒介物質を発現するように形質転換されている、テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）の組換え株。
【請求項２７】
テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）または請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の組み合わせによってコロニー形成される、植物または種子。
【請求項２８】
テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）を含有する、請求項２７に記載の植物から得られる種子または子孫。
【請求項２９】
窒素固定細菌をさらに含んでなる、請求項２８に記載の種子または子孫。
【請求項３０】
前記窒素固定細菌が、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）（Ｇｄ）である、請求項２９に記載の種子または子孫。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物成長を促進する方法、ならびに微生物、および本方法に有用なものを含んでなる組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
窒素固定細菌グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）（Ｇｄ）は、植物細胞にコロニー形成でき（細胞内コロニー形成）、ひいてはこれらの植物の成長を促進することが知られている（欧州特許出願公開第Ａ−１４２２９９号明細書）。しかし、この有用な機能をもたらす様々なＧｄ株の能力は、作物の性質、適用様式、および使用される特定のＧｄ株などの要因次第で変動し得る。例えば、サトウキビまたは甜菜などの糖分に富む作物は、Ｇｄによってより容易にコロニー形成されてもよく、より高レベルのコロニー形成を支持してもよいことが分かった。さらに、植物細胞内でコロニー形成する能力は、Ｇｄの株毎に変動してもよい。特定の株は、様々な投与条件下で、細胞に効率的にコロニー形成する能力を実証した一方で、例えば、国際公開第２０１０／０２２５１７号パンフレットに記載されるようなその他のものは、大体において細胞間で機能するようである。細胞内コロニー形成は、植物の窒素供給を促進し、ひいては植物成長を改善する、より効率的かつ効果的な手段を提供することが期待される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
出願人らは、細菌、特に窒素固定細菌による植物細胞のコロニー形成を容易にする、さらなる細菌系統を発見した。
【０００４】
最初にメキシコから得られた、植物細胞にコロニー形成することが知られていたＧｄ株を使用して実施された開発研究は、最初の株の大規模な培養後に、株のコロニー形成特性が改善したようであることを認めた。この時点での株の特性評価は、実際に、Ｇｄと密接に結合する別の細菌があるという、驚くべき発見を明らかにした。この株は、胞子形成グラム陽性細菌であり、テルリバチルス・サッカロフィルス（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｕｓ）およびテルリバチルス・ハロフィルス（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）と近縁関係にある、テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）として特徴付けられた。
【０００５】
以前に、この株は、イチゴ果実における灰色カビ病の生物的防除で使用されてもよく（Ｅｓｓｈａｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００９）１０６  ８３３−８４６）、さらにそれは、植物発芽を促進してもよく（国際公開第２０１４／１９３７４６号パンフレット）、または植物成長促進活性を有してもよい（国際公開第２１０４／２０１０４４号パンフレット）ことが提言されている。
【０００６】
これらの２つの生物の共存は極めて驚くべきことであり、確かに先例がないと考えられる。テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）が、どのようにしてＧｄ株とこのように結合するようになったかは不明確である。テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）は、以前、日本またはインドの土壌中で発見された生物であり（Ｓｕｎ−Ｙｏｕｎｇ  Ａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００７），５７，５１−５５，Ｋａｄｙａｎ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３；２９：１５９７−１６１０）またいく種かの植物中の内生細菌でもある（Ｐｒｅｖｅｅｎａ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｃ．Ｓｃｉ  Ｌｉｆｅ（２０１３）３２（３）：１７３−７，Ｃｈａｎｄｎａ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．ＢＣＭ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．２０１４，１４：３３）。しかし、テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）は、それらが植物細胞に侵入してもよいような様式で植物細胞と相互作用してもよいようであり、したがってＧｄなどの有用な窒素固定細菌の植物コロニー形成活動を容易にする。特に、テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）は、Ｇｄなどの窒素固定細菌との共同体中で機能して、植物細胞への侵入およびコロニー形成を容易にするようである。
【０００７】
本発明に従って、植物成長媒介実体または物質をテルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）の株と組み合わせて、植物に投与するステップを含んでなる、植物成長媒介実体または物質を植物細胞に導入する方法が提供される。
【０００８】
出願人らは、配列番号１〜４のいずれか１つを含んでなる株によって例示されるように、テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、特にテルリバチルス・サッカロフィルス（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｕｓ）またはテルリバチルス・ハロフィルス（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）が、植物にコロニー形成し得ることを発見した。しかし、テルリバチルス・ゴリエンシス（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｏｒｉｅｎｓｉｓ）またはテルリバチルス・アイジンゲンシス（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｉｄｉｎｇｅｎｓｉｓ）をはじめとする、その他のテルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）の株が使用されてもよい。コロニー形成は、細胞間であってもよく、またはそれは、植物細胞に侵入してもよい（細胞内コロニー形成）。
【０００９】
その結果、これらの細菌を使用して、植物成長媒介実体または物質を植物に移入し、植物細胞にさえも移入してもよい。
【００１０】
適切には、植物成長媒介物質は、当該技術分野で理解されるように、植物の衛生または健康、ならびに成長特性に影響を及ぼす任意の物質である。
【００１１】
それらとしては、殺真菌剤、除草剤、殺虫剤または植物成長調節物質などの農薬化合物または小分子が挙げられる。
【００１２】
しかし、特にそれらは、生物学的物質を含んでなる。
【００１３】
これらとしては、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子などの核酸が挙げられる。例えば、核酸は、ＲＮＡ分子、例えば、植物ウイルスを阻害する、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）などのＲＮＡｉであってもよい。植物ウイルスは、既知の植物ウイルスのいずれであってもよいが、特定例としては、タバコモザイクウイルス、トマト黄化壊疽病ウイルス、トマト黄化縮葉病ウイルス、キュウリモザイクウイルス、ジャガイモウイルスＹ、カリフラワーモザイクウイルス、アフリカ系キャッサバモザイクウイルス、セイヨウスモモポックスウイルス、ブロムモザイクウイルスおよびジャガイモウイルスＸ、柑橘類トリステザウイルス、オオムギ黄萎病ウイルス、ジャガイモ葉巻病ウイルス、およびトマトブッシースタントウイルスが挙げられる。
【００１４】
代案としては、生物学的物質は、エフェクタータンパク質、植物ホルモン、殺虫剤または植物成長調節物質などのタンパク質またはペプチドである。
【００１５】
植物成長媒介物質は、別々にまたは混和材料中のどちらかで、テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）と共に投与されてもよい。
【００１６】
しかし、テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）がこのようにして使用される場合、それは、必要な生物学的物質を植物中で発現するように、特に分泌もするように、適切に遺伝子修飾される。遺伝子形質転換は、従来の組換えＤＮＡ技術を使用して、具体的には、前記生物学的物質をコードする核酸配列を含んでなるベクターによって、テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）の株を形質転換することで、達成されてもよい。形質転換細胞を培養して、植物に投与するための株を生産してもよい。形質転換されたテルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、およびそれらの調製方法は新規であり、本発明のさらなる態様を形成する。
【００１７】
しかし特定の実施形態では、成長媒介実体または物質は、生きた窒素固定細菌などの異なる細菌である。窒素固定細菌は、植物に有益な影響を及ぼすことが良く知られ、ひいては本発明の特定の実施形態を形成する一方で、出願人らは、テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）が細菌と相互作用して、インドール酢酸（ＩＡＡ）のような植物ホルモンなどの物質の産生を改変し得ることを発見した。
【００１８】
インドール酢酸（ＩＡＡ）は、最も生理学的活性の高いオーキシンの１つである。ＩＡＡは、ＰＧＰＲをはじめとするいくつかの微生物による、Ｌ−トリプトファン代謝の一般的産物である。Ｇｄは、ＩＡＡを高濃度で産生することが報告されている。ＩＡＡは、植物中で根の伸長を促進するが、植物環境内のこのホルモンの過剰量は、植物成長の阻害を引き起こし得る。したがってＧｄによるＩＡＡ産生の調節は、植物成長に対する利点を提供してもよい。
【００１９】
その結果、ＩＡＡなどのホルモンが細菌によって産生される場合、テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）の存在の結果として、生産量が例えば、増大するなど改変され、これらの細菌は、改変された植物ホルモン供給を提供するために、テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）と共に植物に投与されてもよい。
【００２０】
しかし、本発明の特定の実施形態に従って、窒素固定細菌を植物細胞に導入する方法が提供され、前記方法は、前記窒素固定細菌をテルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）の株と組み合わせて、植物に投与するステップを含んでなる。
【００２１】
出願人らは、配列番号１〜４のいずれか１つを含んでなる株によって例示されるように、テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、特に、テルリバチルス・サッカロフィルス（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｔｓ）またはテルリバチルス・ハロフィルス（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）が、Ｇｄなどの窒素固定細菌の植物に対する効果を向上させ得ることを発見した。理論により拘束されることなく、これは、テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）が、例えば、Ｇｄ中のレバン産生を増大させることで、またはＧｄにとって炭素源として機能してもよい、それ自身のレバンを供給することで、Ｇｄなどの窒素固定細菌による植物細胞のコロニー形成を促進し、または例えば、ニトロゲナーゼ活性を改善することで窒素固定を別の様式で改善することによってもよい。
【００２２】
出願人らは、Ｔｓなどのテルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）とＧｄとの混合培養物中で、それぞれ上方制御されるニトロゲナーゼ活性およびレバンスクラーゼ産生（ｎｉｆＨおよびｌｓｄＡ）の双方に、Ｇｄ遺伝子が関与する証拠を発見した。さらに、Ｔｓなどのテルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）は、種子表面などの表面に良好に接着して、混合培養物中で付着性を向上させるようである。この性質は、コロニー形成を促進し得る、バイオフィルムの形成を助けてもよい。
【００２３】
その結果、これらの細菌が使用されて、例えば、窒素固定細菌の植物コロニー形成特性を改善することで、または別の手段で、植物成長を改善してもよい。
【００２４】
窒素固定細菌は、適切には、別々にまたは混和材料中のどちらかで、テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）と共に投与されるが、好ましくは共培養中にある。
【００２５】
テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）は、その他の細菌、特にテルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）に支持環境を提供してもよい、レバン被覆を形成する細菌と、密接に結合できるようである。このような窒素固定細菌の特定の例は、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）（Ｇｄ）である。しかし、テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）はまた、アゾトバクター属（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、ベイジェリンキア属（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、およびスピリルム・リポフェルム（Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ）などのその他の窒素固定細菌の植物細胞への導入を促進してもよい。
【００２６】
テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）は、適切には、投与に先だってＧｄなどの窒素固定細菌と密接に結合する。特に、細菌は一緒に共培養されてもよい。したがって例えば、テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）細菌のサンプルが、Ｇｄなどの窒素固定細菌の培養に添加されてもよく、結果として得られた混合物が培養される。いく種かの細菌、特にＧｄの場合、ひとたび適切な共培養が確立されたら、特定条件下において細菌は分離し難くなるので、さらなるテルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）の導入は不必要なこともある。しかしその他の事例では、株は、例えば以下に例示されるように、別の株よりも１つの株の増殖に有利に働く培地中で培養することで、分離可能であってもよい。
【００２７】
適切な培養条件としては、のような寒天含有培地などの適切な細菌増殖培地の提供が挙げられる。培地は、必要ならば、例えば欧州特許出願公開第Ａ−１４２２９９７号明細書に記載されるような３％（ｗ／ｖ）スクロース溶液をはじめとする、追加的な細菌栄養素を含有してもよい。培養は、例えば２０〜３７℃などの一定範囲の温度、典型的には約２５℃で実施されてもよい。
【００２８】
特定の実施形態では、Ｔｓなどのテルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）とＧｄとの組み合わせは、その中でそれぞれの株が個別に培養され、得られた株が必要な比率で使用直前に混合される処理によって調製される。この方法は、培養される特定の株の良好なまたは最適な増殖を確実にするように、培地が選択されてもよいという利点を有する。したがって例えば、Ｇｄは、有利には、Ｃｏｃｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００６  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｐｌａｎｔ，Ｖｏｌｕｍｅ  ４２，７４−８２に記載されるようなジャガイモデキストロースブロス／寒天（ＰＤＢ／ＰＤＡ、Ｆｌｕｋａ）、またはＡＴＧＵＳを含んでなる培地、ならびにＣａｌｖａｌｃａｎｔｅ＆Ｄｏｂｅｒｅｉｎｅｒ，Ｐｌａｎｔ  ａｎｄ  Ｓｏｉｌ，１０８，２３−３１によって記載されるようなＬＧＩＰなどのスクロースベースの培地中で培養されてもよい。
【００２９】
同様に、Ｔｓなどのテルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）は、適切には、ルリア・ベルターニブロス（ＬＢ）上（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，（２００１））、またはＭａｒｉｎｅ  Ａｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ）上で培養されてもよい。しかし、出願人らは、その中で、Ｔｓなどのテルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）とＧｄの双方が維持されてもよい、特定の培地があることを発見した。
【００３０】
特定の実施形態では、共培養は、テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）およびＧｄの双方を同一培地中で培養することで調製される。このような培地としては、例えば、特に、例えば、Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌｕｍｅ  ６１，１２４４−１２５１によって記載されるようなＭＹＰ培地（ｄ−マンニトール、酵母抽出物、およびペプトン）、またはｄａ  Ｓｉｌｖａ−Ｆｒｏｕｆｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｒａｚｉｌｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，４０（４）８６６−８７８によって記載されるようなスクロース、酵母抽出物およびカリウム塩（リン酸一および二カリウム）のＳＹＰ培地などのマンニトールまたはスクロースベースの培地が挙げられる。必要ならば、従来法の手順を使用して、その他の培地が選択され試験されてもよい。培地は、適切には、特にＧｄを維持するスクロースと、Ｔｓなどのテルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）の増殖を促進する塩（ＮａＣｌ）との双方を含んでなってもよい。
【００３１】
このようにして、引き続く混合の必要なしに、共培養が効率的かつ簡単に調合されてもよい。このような共培養をこのようにして調製する方法は、本発明のさらなる態様を形成する。
【００３２】
窒素固定細菌に対するテルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）の相対量は、細菌成長、用いられる窒素固定細菌の特定株などの要素次第で変動する。典型的に、窒素固定細菌は、存在する優勢な株のままである。例えば、組み合わせ中に存在するテルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）の量は、適切には、全細菌の０．１〜４５％、１〜２０％をはじめとして１〜４０％など、例えば、約５％である。共培養が使用される場合、株の比率は、培養物を生産するのに使用される特定培地中で、それぞれの株がいかに良く成長するかに左右されてもよい。しかし、適用のために培養が混合される場合、比率はより容易に選択可能であってもよい。通常、Ｇｄは過剰に存在し、約２：１のＧｄ：テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）の比率が、最適ニトロゲナーゼ活性を提供することが分かっている。
【００３３】
テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）と窒素固定細菌の組み合わせは、それらが植物細胞に入れるようにする適切な様式で、植物細胞に投与される。例えば、テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）と窒素固定細菌の組み合わせは、成長植物に投与される。例えば、組み合わせは、例えば、欧州特許出願公開第Ａ−１４２２９９号明細書に記載される方法を使用して、植物またはそれらの増殖培地に、例えば、発芽の１〜７日以内など、発芽時またはそのすぐ後に塗布されてもよい。
【００３４】
別の実施形態では、組成物は、植栽操作中に組成物が播き溝に散布される、公知の「畝間」技術を使用して散布される。
【００３５】
別の実施形態では、植物は、前記組み合わせの投与に先だって傷処理を受ける。この方法は、出願人らの同時係属英国特許出願中で、窒素固定細菌の投与に関して記載される。傷は、偶発的または自然損傷の結果であってもよく、そこで窒素固定細菌が、修復成長を促進してもよい。しかし、特定の実施形態では、傷は、芝刈り（観賞用芝）、草刈り（サイレージおよび乾草作物）、株出し栽培（バナナ、パイナップル、サトウキビ、ソルガム、イネ、キマメ、綿、アバカ、ラミー）、剪定（果樹、ブドウの木）、家畜による摂取または収穫などの処理によって引き起こされる、損傷の結果である。特に、傷は、葉または茎などの植物の「地上」部分に見られる。
【００３６】
この実施形態は、特に、芝刈り、草刈り、株出し栽培（ｒａｔｉｏｎｉｎｇ）、剪定によって、または収穫によって、植物に「損傷」を与える予備段階をさらに含んでなってもよい。組み合わせは、適切には、植物に損傷が与えられてから、例えば４８時間以内、例えば１０時間以内など２４時間以内、適切には１〜２時間以内など、このような処理の実施から比較的短い時間内に塗布される。
【００３７】
代案としては、テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）および窒素固定細菌の組み合わせが、例えば、種子粉衣として種子に施される。
【００３８】
これらの事例では、テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）および窒素固定細菌のそれぞれが、農業組成物の形態で投与されてもよい。組成物は、順次または同時に投与されてもよく、またはそれらは共に混合されてもよい。
【００３９】
テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）の株と例えば農業上許容される担体とを含んでなる農業組成物は、新規であり、および本発明のさらなる態様を形成する。テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）は、例えば、水の添加時に再構成可能な凍結乾燥形態などの乾燥形態であってもよい。さらに、必要ならば、それらはマイクロカプセル化されて、安定性を向上させてもよい。
【００４０】
しかし、特に、組成物は、植物成長媒介実体または物質をさらに含んでなる。テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）が、植物成長媒介物質を発現する組換え株である場合、それは農業組成物の唯一の活性成分を構成してもよい。
【００４１】
しかし特に、組成物は、窒素固定細菌をさらに含んでなる。
【００４２】
特定の実施形態では、農業組成物は、テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）と、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）（Ｇｄ）などの窒素固定細菌とを含んでなる。テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）の株は、適切にはテルリバチルス・サッカロフィルス（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｕｓ）またはテルリバチルス・ハロフィルス（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）であるが、またテルリバチルス・ゴリエンシス（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｏｒｉｅｎｓｉｓ）またはテルリバチルス・アイジンゲンシス（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｉｄｉｎｇｅｎｓｉｓ）であってもよく、特に、配列番号１〜４のいずれか１つを含んでなるテルリバチルス・サッカロフィルス（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｕｓ）の株である。
【００４３】
組み合わせは、テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）および窒素固定細菌は、例えば、上述されるように、水の添加によって水で戻せる凍結乾燥形態などの乾燥形態であってもよい、共培養物の形態であってもよい。組み合わせまたは共培養は、上述されるようにマイクロカプセル化されて、安定性を向上させてもよい。
【００４４】
本発明の組成物適切には水などの溶媒を含んでなるが、必要ならば、植物油などの有機溶媒またはパラフィンまたは灯油などの炭化水素が、使用されてもよい。適切には、あらゆる有機溶剤は、大豆油、ヒマワリ油、キャノーラ油（アブラナ油）、綿実油、ヒマシ油、亜麻仁油またはパーム油またはこれらの混合物などの植物油である。
【００４５】
組成物は、増粘剤、分散剤、希釈剤、湿潤剤、固体担体などの当該技術分野で公知の添加剤または賦形剤をさらに含んでなってもよい。
【００４６】
特定の実施形態では、組成物は多糖類をさらに含んでなる。適切な多糖類としては、植物、動物または微生物源に由来する親水コロイド多糖類が挙げられる。
【００４７】
特に、これらとしては、多糖類アラビアガム、ガティガム、カラヤガムおよびトラガカントガムなどの滲出ガム；カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたは微結晶セルロースなどのセルロース誘導体、例えば、コーンスターチ、タピオカデンプン、ジャガイモデンプン、米デンプン、小麦デンプンをはじめとするデンプンおよび誘導体、そしてα化デンプン、酸化デンプン、エチル化デンプン、デンプンデキストリンまたはマルトデキストリンなどのそれらの改質バージョン；ペクチン；寒天、アルギン酸塩、カラゲナン、およびファーセレラン（ｆｕｃｅｌｌａｒａｎ）などの海藻に由来する多糖類；グアーガムおよびローカストビーンガムなどの種子ガム；キサンタンガムおよびジェランガムなどの微生物発酵に由来する多糖類；およびキトサンなどの窒素含有多糖類；またはこれらの混合物が挙げられる。
【００４８】
特定の実施形態では、多糖類は、アラビアガム、ガティガム、カラヤガムまたはトラガカントガムなどの滲出ガム多糖類である。多糖類の特定の例は、アラビアガムである。
【００４９】
存在する多糖類の量は、意図される投与様式次第で変動する。しかし、典型的に、０．１〜１％（ｗ／ｗ、例えば、０．１〜０．５％ｗ／ｗ、約０．３％ｗ／ｗなどの多糖類を含んでなる組成物が使用される。例えば、０．１〜１％（ｗ／ｖ）、例えば、０．１〜０．５％（ｗ／ｖ）、約０．３％（ｗ／ｖ）などの多糖類が使用される。
【００５０】
組成物は、界面活性剤または合成洗剤をさらに含んでなってもよい。適切な界面活性剤または洗剤としては、「ツイーン」（登録商標）、例えばツイーン８０の商品名の下に販売されるものなどの非イオン性洗剤が挙げられる。ツイーン８０は、非イオン性合成洗剤であり；７０％が脂肪酸オレイン酸から構成され、残部は、リノレン酸、パルミチン酸、およびステアリン酸の組み合わせである。１％溶液のｐＨは、５．５〜７．２の範囲である。それは、物質を医療用および食品中で乳化および分散するために、広く利用されている。それは因子抗菌剤としての活性が、わずかまたは皆無である（Ｄａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｄａｔａ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ：１９８６），ｐ．２８９）。
【００５１】
組成物中に存在する界面活性剤の量は、特定の界面活性剤、実施される処理タイプ、および投与方法などの要素次第で変動する。しかし、典型的に、組成物は、０．０００５〜０．２％（ｖ／ｖ）、例えば０．０００５〜０．１５％（ｖ／ｖ）、約０．００１％（ｖ／ｖ）などを含んでなる。
【００５２】
適切には、存在するテルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）および窒素固定細菌のための栄養素もまた、組成物中で提供され、典型的な栄養素は、欧州特許出願公開第Ａ−１４２２９９７号明細書に記載されるような３％（ｗ／ｖ）スクロース溶液である。
【００５３】
テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）の応用は、これまで解明されていない。したがって、本発明のさらなる態様は、特に植物成長媒介実体または物質、特に窒素固定細菌を植物、特に植物細胞に移入するための、テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）の株の農業における使用を提供する。ここでもテルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）の株は、適切には、テルリバチルス・サッカロフィルス（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｃｃｈｒｏｐｈｉｌｕｓ）またはテルリバチルス・ハロフィルス（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）ならびにテルリバチルス・ゴリエンシス（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｏｒｉｅｎｓｉｓ）またはテルリバチルス・アイジンゲンシス（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｉｄｉｎｇｅｎｓｉｓ）であり、特に配列番号１〜４のいずれか１つを含んでなる。
【００５４】
例えば、配列番号１〜４のいずれか１つを含んでなる、テルリバチルス・サッカロフィルス（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｕｓ）の株は、適切には、本発明で使用するために単離または精製形態である。
【００５５】
代案としては、本発明は、上述されるような植物成長媒介物質を発現するように形質転換されている、テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）の組換え株を提供する。
【００５６】
さらなる態様では、本発明は、テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）の株と窒素固定細菌の株とを共に混合することで得られる、農業で使用される組み合わせを提供する。窒素固定細菌は、適切には、Ｇｄなどのレバン被覆を形成する細菌である。適切には上述されるような株であるテルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）は、その被覆と結合するようになってもよく、例えばそれは、前記被覆の中または上にあることが可能である。
【００５７】
上述されるように、テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）はまた、窒素固定細菌の細胞への侵入を促進してもよく、その結果、細菌を細胞に輸送してもよい。なおもさらなる態様では、上述されるような窒素固定細菌と組み合わされてもよい、テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）によってコロニー形成される、特に細胞内テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）を有する、植物または種子が提供される。
【００５８】
ひとたびこのようにして植物にコロニーが形成されると、植物種子、またはその他の子孫もまた、細胞内テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、そして使用される場合はＧｄなどの窒素固定細菌を含んでなり、これらは本発明のさらなる態様を構成する。
【００５９】
本発明をここで、一例として添付の概略図面を参照して、具体的に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｓｔｏｏｌキットを使用して、窒素固定細菌Ｇｄから抽出されたＤＮＡサンプルのＰＣＲフィンガープリントを示し、ＰＣＲはＢｏｘプライマーを使用して実施され、図１（Ａ）中、左列から右列に、以下に相当し、１＝１００  ｂｐラダー；２、３＝ＬＮ  ｒｅｐ  １；４、５＝ＬＮ  ｒｅｐ２；６、７＝ＬＮ  ｒｅｐ  ３；８、９＝ＬＮ  ｒｅｐ  ４；１０、１１＝ＬＮ  ｒｅｐ  ５；１２、１３＝ＦＤ  ｒｅｐ  Ａ１；１４、１５＝ＦＤ  ｒｅｐ  Ａ２；１６、１７−ＦＤ  ｒｅｐ  Ａ３；１８＝対照；１９＝１００ｂｐラダー；および図１（Ｂ）中、左列から右列に、以下に相当する。１＝１００ｂｐラダー；２、３＝ＦＤ  ｒｅｐ  Ａ４；４、５＝ＦＤ  ｒｅｐ  Ａ５；６、７＝ＬＮ  ｒｅｐ  １；８、９＝ＬＮ  ｒｅｐ  ２；１０、１１＝ＬＮ  ｒｅｐ  ３；１２、１３＝ＬＮ  ｒｅｐ  ４；１４，１５＝ＬＮ  ｒｅｐ  ５；１６、１７＝生鮮標本；１８＝対照；１９＝１００ｂｐラダー；ＬＮ＝液体窒素、ＦＤ＝凍結乾燥。
【図２】Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅキットを使用して細菌から抽出され、Ｂｏｘプライマーを使用して増幅されたＤＮＡの「クローン」単一コロニーサンプルのＰＣＲフィンガープリントを示し、全てのセットで、カラムは左から右に、以下に相当する。１００ｂｐラダー；コロニー１三重反復試験反応；コロニー２三重反復試験反応；コロニー３三重反復試験反応；コロニー４三重反復試験反応；ＤＮＡなしの対照；１００ｂｐ後者（ｌａｔｔｅｒ）。
【図３】本研究で発見された生物と、テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）種の多配列アラインメントを示し、ＤＤ２ＢＲ、ＤＤ１ＢＲ、ＤＤ３ＢＲ、およびＤＤ４ＢＲは、本研究で単離された配列であり、それぞれ配列番号１〜４に相当し、ＡＢ２４３８４９は対応するテルリバチルス・ハロフィルス（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）配列（配列番号９）であり、ＡＢ２４３８４５は対応するテルリバチルス・サッカロフィルス（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｃｃｈｒｏｐｈｉｌｕｓ）配列（配列番号１０）である。
【図４】５２時間にわたるＰＤＢ中のＧｄ（△、低酸素添加；○、高酸素添加）およびＴｓ（●）の増殖曲線の比較を示す。ｌｏｇ１０（ｃｆｕ／ｍｌ）としての高酸素添加Ｇｄ培養の細胞数（□）。複製サンプル平均としてのＯＤ。各回の細胞数は、二連で播種された３つの希釈液の平均として表される。各プレートからの標準偏差としての誤差棒。
【図５】ＬＢ中のＴｓの増殖曲線を示す。ｌｏｇ１０（ｃｆｕ／ｍｌ）してのＴｓ培養の細胞数（△）。ＯＤは複製サンプル平均である。各回の細胞数は、二連で播種された３つの希釈液の平均として表される。各プレートからの標準偏差としての誤差棒。
【図６】Ｈｅｒｂｓｔの人工海水（Ｈ’ｓ）を含有または非含有の異なる培地中における、Ｇｄ、Ｔｓ、およびＧｄ＋Ｔｓ混合培養物の増殖の比較を示すグラフである。
【図７】１２０時間にわたるＭＹＰおよびＳＹＰ中の能力アッセイの結果を示す。培養物の成長は、６００ｎｍにおけるＯＤ（ａおよびｂ）として示され、細胞の生存率は１ｍｌあたりのコロニー形成単位（ｃｆｕ／ｍｌ）（ｃおよびｄ）として示される。
【図８】それらの６００ｎｍにおけるＯＤの比較で、次のようなＧｄ：Ｔｓ双方の株の異なる比率における、Ｇｄ単一培養物とＧｄ＋Ｔｓ混合培養物によるエチレン産生の間の相関を示す。（●）Ｇｄ：Ｔｓ２：１；（◇）Ｇｄ：Ｔｓ１：１；△）Ｇｄ：Ｔｓ１：２。趨勢線と回帰方程式の双方は、説明文に示されるパターンで標識される。
【図９】接種の１５日後に（ｄｐｉ）わたる、２つの異なる培地ＭＹＰおよびＳＹＰ中における、単一培養物（Ｇ）および混合培養物（ＧＴ）によるレバン産生を示す。２回の反復の平均。誤差棒は、平均値の標準偏差に相当する。経時的な各サンプル間（ａ、ｂ、およびα、β）の有意差、および各試料採取時間（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）における異なるサンプルの間の有意差群が、標識される。
【図１０】２つの異なる培地（ＳＰおよびＭＰ）中の単一培養物（Ｇｄ）との関連で、混合培養物（Ｇｄ＋Ｔｓ）のｎｉｆＨおよびｌｓｄＡ相対発現を示す。遺伝子発現は、ＲＴ−ｑＰＣＲを使用して定量化された。データ正規化のための参照遺伝子として、２３Ｓが使用された。各条件について、ＣＴは３回の反復から測定された。
【図１１】Ｇｄ、Ｔｓ、および異なる比率の双方の株の混合培養物が人工表面に付着する能力を判定する実験の結果を示すグラフである。データは、５個の独立したサンプルの平均値±平均値の標準誤差（ｓｅ）である。共通した文字の値は、ＬＳＤ検定によって有意差がない（Ｆ≦０．０５）。
【図１２】種子あたりのｃｆｕのｌｏｇ１０として、接種後に種子表面から回収された細胞数を示すグラフである。データは、３回の反復試験の平均値±平均値の標準誤差である。共通した文字の値は、ＬＳＤ検定によって有意差がない（Ｆ≦０．０５）。
【図１３】植物の接種および植物グロースチャンバー内の培養の２週間後における、ＧｄによるＯＳＲ植物のコロニー形成を示すグラフである。この図において、「ＯＲＥＰ」はアブラナ根着生結果を表し、「ＯＲＥＮ」はアブラナ根内生結果を表し、「ＯＬＥＮ」はアブラナ葉内生結果を表す。データは、サンプルあたり４枚のプレート内のｃｆｕ計数（ｃｆｕ／ｍｌのｌｏｇ１０として）の平均値±平均値の標準誤差である。共通した文字の値は、ＬＳＤ検定によって有意差がない（Ｆ＜０．０５）。
【図１４】植物の接種および植物グロースチャンバー（Ｆｉｔｏｔｒｏｎ）内の培養の２週間後における、ＴｓによるＯＳＲ植物のコロニー形成を示すグラフである。データは、サンプルあたり４枚のプレート内のｃｆｕ計数（ｃｆｕ／ｍｌのｌｏｇ１０として）の平均値±平均値の標準誤差である。共通した文字の値は、ＬＳＤ検定によって有意差がない（Ｆ＜０．０５）。
【図１５】様々な処理後に、植物重量を測定する実験の結果を示すグラフである。（ａ）は測定された湿潤重量を示し、（ｂ）は測定された乾燥重量を示し、（ｃ）は導かれた水の重量を示す。データは、サンプルあたり７個の植物の平均値±平均値の標準誤差である。共通の文字の値は、ＬＳＤ検定によって有意差がない（ａおよびｃ、Ｆ＜０．０５；ｂ、Ｆ＝０．１）。
【図１６】３日後における、ＳＹＰ中のＧｄ、Ｔｓ、および混合培養について、レバン定量を示すグラフである。データは、３回の反復試験の平均値±平均値の標準誤差である。共通した文字の値は、ＬＳＤ検定によって有意差がない（Ｆ＜０．００１）。
【図１７】Ｇｄ上の植物ホルモンＩＡＡの産生に対する、テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）の効果を示すグラフである。値は、３日の反復の平均を示し、誤差棒は標準誤差（ｓｅ）を示す。同一文字のサンプルには、ＬＳＤ検定によって有意差がない（Ｆ＜０．００１）。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
実施例１
組み合わせの同定
研究を実施して、Ｇｄ株を特性決定した。使用された株は、Ａｚｏｔｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ  ａｎｄ  ＣＡＢＩ  ＵＫから入手可能なＩＭＩ５０１９８６（現在のＩＭＩ５０４９９８）から長期間にわたり培養されて、優れた植物細胞コロニー形成特性を有することが分かった「試験株」を含んだ。
【００６２】
株は、最初に、ＡＴＧＵＳ培地（［０．８％（ｗ／ｖ）寒天、酵母抽出物（２．７ｇＬ−１）、グルコース（２．７ｇＬ−１）、マンニトール（１．８ｇＬ−１）、ＭＥＳ緩衝液（４．４ｇＬ−１）、Ｋ２ＨＰ０４（０．６５ｇＬ−１）、ｐＨ６．５］上で培養され、２５℃で培養された。しかしＡＴＧＵＳブロスの使用が、株の質と再現性を改善することが分かった。
【００６３】
ＰＣＲフィンガープリント法は、保存の前および後のサンプル（株の冷凍保存および凍結乾燥サンプルをはじめとする）上で実施された。ＤＮＡ抽出は、製造業者の使用説明書に従って使用される、Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ、ＤＮｅａｓｙ  ｔｉｓｓｕｅまたはＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｓｔｏｏｌキットを使用して実施された。各サンプルのＤＮＡ濃度は、分光光度計（ＧｅｎｅＱｕａｎｔ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＫ）によって評価された。次に、各サンプルについて濃度が１０ｎｇ／μｌに標準化された。
【００６４】
細菌反復単位ＢＯＸ＆ＩＳＳＲ「ＴＧＴ」プライマーを使用したＰＣＲフィンガープリント法が実施され、ゲル電気泳動が使用されて、ＤＮＡ断片が分離された。全てのＰＣＲ反応は、二連で実施され反復された。
【００６５】
ＤＮＡは、全ての保存サンプルおよび「野生型」サンプルから成功裏に抽出された。しかし、「試験株」に関するＢｏｘおよびＴｇＴプライマーの双方のＰＣＲ結果は、相反した。バンド形成パターンは、別々の反復試験全体にわたり、１００％同様であるべきであることが期待されたが、いくつかのバンドは、全てのサンプルで共通するようであったが、いくつかは追加のバンドが出現して明白に異なった。「類似バンド」の強度もまた、異なる処理間で異なった。Ｂｏｘプライマーを使用して得られた結果は、通常、より良く、最高８本の明白なバンドを含んだ。
【００６６】
研究は、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｓｔｏｏｌ抽出キットを使用して抽出されたＤＮＡを使用して、反復された。これは、より質が良く、より整合性のあるフィンガープリントを与えた。しかし、全てのサンプルで共通のバンドが出現したが、同一サンプルのいくつかの反復試験の間で、バンド形成プロファイルには明らかな差があった（図１）。プロファイルは反復試験全体にわたり同一であるべきであるが、同一複製の複製反応内では、特にそうあるべきである。同一サンプルの反復試験に関連するボックス内のバンド形成パターンの比較から明らかなように、これは事実と異なった。
【００６７】
この時点で実施された株の部分的１６ＳｒＤＮＡ配列解析は、生物が主にＧｄであることを示した。
【００６８】
予想外のプロファイル再現性不能のために、方法は修正様式で繰り返され、サンプルが同一であることを確実にするために、単一Ｇｄ系統に由来する４個の単一コロニーが使用された。コロニーはＡＴＧＵＳブロス中で培養され、Ｇｄレバンのあらゆる可能な阻害または保護効果に起因するあらゆる問題を排除するために、ＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮｅａｓｙ  ｔｉｓｓｕｅキットグラム陽性細菌プロトコルを使用して、４個の各コロニーから抽出された。サンプルには、Ｂｏｘ  ＰＣＲが実施され（４日間にわたり三連反応を使用して）、再現可能で一様なプロファイルが観察された（図２）。
【００６９】
驚くことに、引き続く単一コロニー由来サンプルの部分的１６ＳｒＤＮＡ配列解析は、テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）種との＞９９％マッチを与え、最も近いマッチはＴ．サッカロフィルス（Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｕｓ）であった（図３を参照されたい）。
【００７０】
実施例２
株の分離
双方の生物の単離を試すために、異なるｐＨおよびＮａＣｌ濃度における試験株の選択的培養が試みられた。しかし、ＮａＣｌ培地上では何も増殖しなかったが、ｐＨ５．５寒天上で増殖が観察され、ｐＨ９．５培地上で２つの形態型が気づかれた。文献からの情報は、Ｇｄがより高いｐＨでは増殖しないことを示唆したので、第２の生物が単離されたと思われた。しかし、部分的１６ＳｒＤＮＡ配列解析は、双方の単離物がＧｄであったことを明らかにした。
【００７１】
引き続くグラム染色は確証的でなかったが、可能なグラム陽性桿菌の痕跡がある、グラム陰性桿菌（すなわちＧｄ）の優勢を明らかにした。
【００７２】
より酸性のｐＨ条件がＧｄ増殖に有利に働くべきである一方で、テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）は、より高いｐＨ（すなわちよりアルカリ性）条件により容易に耐えるべきである。配列決定研究によって示されるように、この研究では、Ｇｄからテルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）を分離することは可能でなかった。Ｇｄが優勢な株のままであったという事実は、テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）が全体的細胞集団中に非常に低い数で存在することを示唆する。しかし、この実験では、Ｇｄは、以前記載されたよりも高いアルカリ性条件に耐えたようであった。これは、テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）の存在に起因してもよく、それは相利共生様式で作用して、これを達成する。同様に、テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）は、特定のＧｄ株の植物細胞コロニー形成活性の増大の原因と思われる。
【００７３】
さらに、特定状況下における株の分離で遭遇された困難さは、これらの２つの株の間に形成された非常に密接な結合の徴候である。理論により拘束されることなく、テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）の「好糖」特性の意味するところは、それがＧｄのレバンに付着し、またはそれに組み込まれることが可能であり、またはほぼ確実でさえあるようである。代案としては、Ｇｄは、炭素源としてテルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）のレバンを利用してもよい。
【００７４】
実施例３
テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）株とＧｄ株の共培養
これらの実験で使用される株は、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、（ＩＭＩ５０４９５８−ＣＡＢＩ（ＵＫ））およびテルリバチルス・サッカロフィルス（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｕｓ）、ＣＢＳ  Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｅｎｔｒｅによって提供される株（ＡＺ０００８）、テルリバチルス・グロリエンシス（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｏｒｉｅｎｓｉｓ）（ＡＺ０００７）、テルリバチルス・ハロフィルス（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）（ＡＺ０００９）、およびテルリバチルス・アイジンゲンシス（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｉｄｉｎｇｅｎｓｉｓ）（ＡＺ００１０）であった。個々にまたは組み合わせのどちらかで株を培養するために、一連の培地が使用された。
【００７５】
一連の培地、特にＧｄの増殖を支持することが知られているものが、Ｔｓの増殖もまた支持するかどうかを判断するために、試験された。
【００７６】
これらは、以下を含んだ。
１．ジャガイモデキストロースブロス／寒天（ＰＤＢ／ＰＤＡ、Ｆｌｕｋａ）。
２．ＡＴＧＵＳ（２．７ｇＬ−１グルコース、０．６５ＫＨ２ＰＯ４、４．８ｇＬ−１Ｋ２ＨＰＯ４、１．８ｇＬ−１マンニトール、４．４ｇＬ−１２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ水和物）、２．７ｇＬ−１酵母抽出物）（Ｃｏｃｋｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，２００６．）
３．Ｍａｒｉｎｅ  Ａｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ）
いずれの場合にも、新鮮プレート内のコロニーから、１００ｍｌのブロス（ＧｄではＰＤＢ、ＴｓではＬＢ）中でスタータ培養が調製されて、１５０ｒｐｍで振盪しながら２８℃で培養された。０．１のＯＤ６００で正規化された培養の１０μｌが、５ｍｌの滅菌培地が入った遠心管内に二連で接種され、同一条件で培養された。サンプル毎に単一管が使用され、各使用後に廃棄された。サンプルは、接種の０、４、８、１６、２０、２４、２８、３２、４０、４４、４８、および５２時間後に採取されて、ＯＤ６００が測定され、ＰＤＡまたはＭａｒｉｎｅ  Ａｇａｒ上で連続希釈播種されて、生存細胞数（ｃｆｕ／ｍｌ）が数えられた。
【００７７】
４日後の結果が以下の表に示され、その中では、異なる増殖レベルが次のように示される。＋＋＋非常に高い増殖、＋＋（高い増殖）、＋（増殖）、（＋）（不明瞭な増殖）、−（増殖なし）。
【００７８】
【表１】
2017523782.tif 000003
【００７９】
ＡＴＧＵＳがテルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）増殖を支持しない一方で、Ｍａｒｉｎｅ  Ａｇａｒはテルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）を支持して、Ｇｄは支持しないことが明らかであった。ＰＤＡ中のテルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）増殖は、不明瞭または不確実であった。
【００８０】
次に、上に記載される培養条件下で５２時間にわたり、ＰＤＢ中の増殖曲線が構築され、これは図４に示される。Ｇｄの増殖は、培養への酸素添加の影響を受け、より低い酸素添加レベルではより緩慢であった。
【００８１】
しかしＴｓは、数日間の培養後にＰＤＢ中で増殖できなかった。しかしそれは、図５に示されるように、ルリア・ベルターニブロス（ＬＢ）中で成功裏に増殖した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．＆Ｒｕｓｓｅｌ，Ｄ．，２００１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ．）。
【００８２】
Ｇｄ増殖は、ＬＢ中で試験された。また、双方の株について、栄養素寒天（ＮＡ）中の増殖が調べられた。１週間後、Ｇｄは、ＮＡでもＭａｒｉｎｅ  Ａｇａｒ上でも増殖せず、ＬＢ上ではＧｄは発育不良であった。
【００８３】
それらが、追加的な株増殖を支持するかどうかを判断するために培地の修正が試みられた。特に、Ｇｄ増殖に必須であると報告されたスクロースが、ＬＢに添加された。同様に、ＰＤＢは、それがＴｓ増殖を確実に支持するように、塩化ナトリウムの添加によって修正された。しかし、Ｔｓは、高濃度の塩によってさえも、ＰＤＢ中で増殖する能力を示さなかったという意味では、結果は不成功であった一方で、それは、スクロースによって修正されたＬＢ中で、４８時間の培養後に増殖を示した。Ｇｄは、ＰＤＢ中の塩濃度の影響を受け、それは１％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌで増殖できたが、より高い塩分ではできなかった。それはスクロースが添加されたＬＢ中で増殖できず、これらの培地の適合性の欠如が示唆された。
【００８４】
ＧｄおよびＴｓが共に増殖するかどうかを判断するために、異なる培地が試験された。培地は、次のとおりであった。
ＭＹＰ（２５ｇＬ−１ｄ−マンニトール、３ｇＬ−１酵母抽出物、３ｇＬ−１ペプトン；ｐＨ６．２）（Ｙａｍａｄａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７．Ｂｉｏｓｉｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ６１，ｐｐ．１２４４−１２５１）；および
ＳＹＰ（１０ｇＬ−１スクロース、３ｇＬ−１酵母抽出物、１ｇｌ−１Ｋ２ＨＰＯ４、３ｇＬ−１ＫＨ２ＰＯ４；ｐＨ５．８）（Ｓｉｌｖａ−Ｆｒｏｕｆｅ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００９）Ｂｒａｚｉｌｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，４０（４），ｐｐ．８６６−８７８）。
【００８５】
これらの２種の培地で、スクロース（ＳＹＰ）およびマンニトール（ＭＹＰ）の異なる炭素源が試験された。Ｔｓの増殖を改善するために、Ａｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，２００７  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ５７，ｐｐ．５１−５５によって推奨されるように、全ての懸濁媒体には、０．５×Ｈｅｒｂｓｔの人工海水が添加された。培地は、株ＴｓおよびＧｄの双方について、Ｈｅｒｂｓｔの溶液含有または非含有で試験された。ＰＤＢについても同様に実施された。
【００８６】
培養増殖は、λ＝６００ｎｍのＯＤに関して測定された。また、ＡＴＧＵＳおよび／またはＭａｒｉｎｅ  Ａｇａｒ上に播種することで、生存細胞が調べられ、ＧｄおよびＴｓが検出された。Ｇｄの培養では、培養はまたＬＧＩＰ上にも播種されて、これらの培養からの窒素固定能力が試験された。
【００８７】
図６のグラフは、双方の株がＳＹＰおよびＭＹＰ中で良好に成長したことを示す。Ｔｓは、塩溶液の添加後および長期培養後のみＰＤＢ中で増殖したが、この場合はＧｄが増殖しなかった。Ｇｄは、人工海水で修正されたいかなる培地中でも増殖を示さなかった。混合培養物は、塩溶液なしで、単一培養物よりも高い増殖を提示したが、これは、その中で細胞が最適増殖培地（ＧｄではＡＴＧＵＳ、およびＴｓではＭａｒｉｎｅ  Ａｇａｒ）上に播種されて４日間培養される細胞生存率試験から明らかなように、培地中の双方の株の増殖に起因すると思われる。結果は、下の表１に報告される。
【００８８】
【表２】
2017523782.tif 000004
【００８９】
表１．２４時間および４８時間にわたる修正培地中の培養からの細胞生存率。混合培養物中では、細胞生存率はＧｄ／Ｔｓとして表される。異なるレベルの増殖は、次のように示される。＋＋＋非常に高い増殖、＋＋（高い増殖）、＋（増殖）、（＋）（不明瞭な増殖）、−（増殖なし）。
【００９０】
結果は、ＳＹＰおよびＭＹＰの双方の培地が、ＧｄとＴｓの混合培養物のための増殖培地として適することを示す。単一培養中にある場合、Ｔｓ増殖は、Ｈｅｒｂｓｔの人工海水がこれらの培地に添加されると改善された。しかしどちらの培地中でも、Ｔｓの増殖はＧｄ増殖と比較して経時的に遅くなった。この傾向は、以下の能力アッセイでより詳細に観察され得た。
【００９１】
これらのアッセイでは、ＧｄおよびＴｓの別々の培養が、適切な培地中で１５０ｒｐｍで撹拌しながら、２８℃で２４〜４８時間にわたり培養された。培養は、０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ溶液で２回洗浄されて使用済み培地が除去され、ＯＤ６００が調べられて０．２（約１０８ｃｆｕ／ｍｌ）に調節された。サンプルあたり１本の管で、５ｍｌの選択培地（ＭＹＰおよびＳＹＰ）の最終容積に、１ｍｌの各培養物（ＧｄおよびＴｓ）が接種された。サンプルは、接種の０、６、２４、３６、４８、５４、および１２０時間後に採取されて、ＯＤ６００が測定され、選択培地としてＡＴＧＵＳ、ＬＧＩＰ、およびＭａｒｉｎｅ  Ａｇａｒ上に二連で連続希釈播種された。ＧｄおよびＴｓの単一培養物は、対照と同じ条件を使用して接種され培養された。
【００９２】
結果は、図７に示される。どちらの株もこれらの培地中で増殖できるが、Ｔｓは、ＭＹＰよりもＳＹＰ中の単一培養物として、より高濃度に増殖した。混合培養物中では、株の挙動は、ＳＹＰおよびＭＹＰ中で同様であった。これは、Ｇｄの存在が、ＭＹＰ中のＴｓ増殖にいくつかの利点をもたらすことを示唆する。Ｇｄ増殖は、細胞生存率に関してＴｓの存在の影響を受けないようであった。
【００９３】
その結果、これらの培地は、生存能力があるＧｄとＴｓの共培養を生成するのに適した。
【００９４】
実施例４
生体外窒素固定
アセチレン（Ｃ２Ｈ２）のエチレン（Ｃ２Ｈ４）への還元は、天然サンプル中でニトロゲナーゼ活性を測定するための間接的方法である（Ｃｏｊｈｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｖｏｌｕｍｅ  １９９３．１０６  ｐｐ３４１−３４６）。
【００９５】
ＧｄおよびＴｓ培養は、ＭＹＰおよびＳＹＰ中で調製され、１５０ｒｐｍで振盪しながら２８℃で培養された。２日間の培養後、培養は遠心分離されて（４，０００ｒｐｍ、１５分間）、０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ溶液で洗浄された。結果として得られたペレットは修正培地に再懸濁され、それらの１つは窒素非含有であり；具体的には、上に記載されるＭＹＰおよびＳＹＰ培地であるが、酵母抽出物の添加がない（以下、それぞれＭＰおよびＳＰと称される）。培養のＯＤ６００は、Ｇｄでは１、およびＴｓでは０．５に調節された。サンプルは、単一培養物では１ｍｌのＧｄ、混合サンプルでは１：１、２：１、および１：２のＧｄ：Ｔｓ比で（培養のＯＤ６００を基準とする）、１ｍｌのＧｄ＋１ｍｌのＴｓを５ｍｌのブロス最終容積に接種することで調製された。管は密封され、１０％の空気量がアセチレンで置換された。静止培養として２８℃で１、２、４、および８日間の培養後に、サンプル中のエチレン産生が、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によって分析された。サンプルのＯＤ６００および細胞数もまた、試験された。各サンプルは、三連で調製された。
【００９６】
ＳＰおよびＭＰ培地中で培養された、単一Ｇｄ培養物および混合Ｇｄ＋Ｔｓ培養物からのエチレン産生は、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によって測定された。全ての実験において、ＭＰ中で培養されたサンプルではアセチレン還元は検出されず；４日間の培養前にはＳＰ中でも、単一培養中でさえも、検出されなかった。エチレン産生は、４および８日間の培養後に単一培養物および混合培養物のＳＰ培地中のサンプルで検出された。
【００９７】
ＧＣによって測定されたエチレン産生のピークは高い変動を示したが、図８に示されるように、値の間には一定の相関があった。Ｇｄ：Ｔｓの関係が２：１の場合、混合サンプルのエチレン産生は、単一培養物のほぼ２倍であった。株間の比率が変化すると、双方のタイプのサンプル間の相関は変化し、ＴｓがＧｄよりも高濃度（１：２）である場合、単一培養物よりも混合培養物で２５％低い。ＧｄおよびＴｓが同一比で混合されると、Ｇｄ単一培養物に関してエチレン産生に変動はない。これらの結果は、Ｔｓの存在が酵素ニトロゲナーゼの活性を修飾でき、この効果はＧｄとＴｓの相対比に関連することを示す。
【００９８】
実施例５
Ｇｄによるレバン産生に対するＴｓの効果
ＯＤ６００が約０．２である双方の株の一晩培養物が、１ｍｌのＧｄ＋１ｍｌのＴｓで、１００ｍｌのＭＹＰおよびＳＹＰが入ったフラスコに接種され、１４日間培養された。レバン産生に関する分析に先だって、２日毎にサンプルが採取され、１ｍｌの各培養物が−２０℃で二連で保存された。ＯＤ６００が測定され、ＡＴＧＵＳおよびＭａｒｉｎｅ  Ａｇａｒ上に連続希釈播種されて、試料採取時の双方の株の細胞数が推定された。対照として、ＭＹＰおよびＳＹＰ中のＧｄの単一培養物が、同一条件で接種されて培養された。サンプル中のレバンを抽出して定量化するために、サンプルを３容積のメタノールで沈殿させて、乾燥して容積がおよそ１ｍｌに低下するまで、６０℃に設定された加熱ブロックに載せた。沈殿は、１ｍｌのＨ２Ｏに溶解された。０．０１ＭＨ２ＳＯ４を添加して、１２１℃で１時間インキュベートすることで、酸加水分解が実施された。インキュベーション後、５００μｌのＤＮＳＡ試薬（１ｇの３，５−ジニトロサリチル酸、０．４ＭのＮａＯＨ、および３０ｇのＫ−Ｎａ酒石酸四水和物を含有する１００ｍｌの水溶液）が添加され混合された。管は沸騰水に１５分間入れられて、５００μｌの４０％（ｗ／ｖ）Ｋ−Ｎａ酒石酸が添加され混合された。サンプルの吸光度が５４０ｎｍで測定され、一連のグルコース標準からの検量線を使用してグルコース濃度が推定された。
【００９９】
結果は、図９に示される。レバン産生は、最初の数日間はＭＹＰよりもＳＹＰ中の培養でより高かった。ＭＹＰ中で培養されたサンプルが、経時的なレバン産生に有意差を示さなかった一方で、ＳＹＰ中で培養されたサンプルでは、統計学的有意差があった。試料採取時間に関して値を比較すると、接種の３日後および８日間の培養後に、４個のサンプル間に有意差があった。
【０１００】
実施例６
ニトロゲナーゼおよびレバンスクラーゼ（ｌｅｖａｎｓｕｃｒｏｓｅ）遺伝子の発現
培養の８日後に、ＳＰ中で培養された単一Ｇｄ培養物および混合培養物Ｇｄ＋Ｔｓサンプル間でニトロゲナーゼ活性の差が検出されたので、これらのサンプルからＲＮＡが抽出され、遺伝子発現がｑＰＣＲによって評価された。出願人らは、リアルタイムＰＣＲまたはｑＰＣＲによって、異なる培養条件下における、酵素ニトロゲナーゼおよびレバンスクラーゼ（ｌｅｖａｎｓｕｃｒｏｓｅ）の遺伝的発現に任意の差があるかどうかを調査した。
【０１０１】
サンプルは、実施例４で前述したように調製された。ＯＤ６００を１に補正した後、５０ｍｌのＭＰおよびＳＰの最終容積に、単一培養物では５ｍｌのＧｄ、混合培養物では５ｍｌのＧｄ＋５ｍｌのＴｓが接種されて、２８℃で静止培養として培養された。８日間の培養後、１ｍｌのサンプルが保存されて、ｑＰＣＲのためにＲＮＡが抽出された。ＲＮＡは、製造業者のプロトコルに従って、Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）で単離された。下流ＲＴ−ｑＰＣＲ用途に適するＲＮＡ純度および完全性は、２６０ｎｍ／２８０ｎｍおよび２６０ｎｍ／２３０ｎｍにおける吸光度の比率を測定することで確認された。製造会社の使用説明書に従って、ＤＮａｓｅ  Ｉキット（Ｓｉｇｍａ）を使用してサンプルＤＮａｓｅ消化が実施され、サンプル中にＤＮＡが存在しないことが確実にされた。製造業者のマニュアルに従って実施される、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、第１鎖ｃＤＮＡ合成が実施された。１μｇのＲＮＡを用いて、逆転写反応が実施された。ｃＤＮＡは１：５に希釈されて、次にＲＴ−ｑＰＣＲで使用された。
【０１０２】
ｑＰＣＲ。ＲＴ−ｑＰＣＲは、ｉＴａｐ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢｉｏＲａｄ）を使用して、ＣＦＸ９６（商標）リアルタイムシステム（ＢｉｏＲａｄ）上で実施された。プライマーは、反応物あたり３．７５μＭおよび１０ｎｇのｃＤＮＡで使用された。熱サイクルは、次のようにして実施された。９５℃で２分間、４０サイクルの９５℃で５秒間および６０℃で１５秒間。次のように溶融曲線を実施して、プライマーの傾向を調べた。６０℃〜９５℃で５秒毎に０．５℃の増大。全てのＲＴ−ｑＰＣＲアッセイは、３回の技術的反復試験および非テンプレート対照を使用して実施された。２３Ｓのプライマーを使用して、標準遺伝子が増幅され（Ｇａｌｉｓａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１２）Ｏｃｔ；９１（１）：１−７）、ｎｉｆＨ（順方向：５’−ＴＣＧＡＣＧＡＣＣＴＣＣＣＡＧＡＡＴＡＣ−３’（配列番号５）；逆方向：５’−ＣＣＴＴＧＴＡＧＣＣＧＡＴＣＴＴＣＡＧＣ−３’）（配列番号６）、およびｌｓｄＡ（順方向：５’−ＡＣＧＣＣＧＡＴＣＡＧＴＴＣＡＡＧＣＴＡＴ−３’（配列番号７）；逆方向：５’−ＣＣＴＧＧＴＴＣＧＴＧＴＡＧＧＴＣＴＧＧ−３’）（配列番号８）遺伝子のプライマーを使用して、酵素ニトロゲナーゼおよびレバンスクラーゼ（ｌｅｖａｎｓｕｃｒｏｓｅ）遺伝子がそれぞれ標的化された。全てのプライマーの増幅効率が試験され、効率値は、テンプレートの連続希釈から作成された標準曲線から得られた勾配に関して計算された。増幅効率は、各サイクルで増幅されたテンプレートの百分率として計算された（％効率＝（Ｅ−１）＊１００；Ｅ＝１０−１／ｓｌｏｐｅ）。９０％〜１０５％の範囲にある％Ｅは、高い増幅効率を示唆する。
【０１０３】
本実験の結果は、図１０に示される。単一Ｇｄ培養物、特にＳＰ中で培養されたサンプルと比較して、混合培養物中で、ｎｉｆＨおよびｌｓｄＡの遺伝子発現に増大傾向があるようである。
【０１０４】
ｑＰＣＲによるニトロゲナーゼおよびレバンスクラーゼ（ｌｅｖａｎｓｕｃｒｏｓｅ）遺伝子発現の試験は、双方の酵素について発現が増大する傾向を示す。これらのｑＰＣＲ実験は、ニトロゲナーゼ発現におけるＴｓの存在の効果を示し、それはＧｄとＴｓの混合培養によって生じる条件に対する応答として、特にＳＰ中において、しかしＭＰ中においてもある程度、増大するようである。
【０１０５】
同様にレバンスクラーゼ（ｌｅｖａｎｓｕｃｒｏｓｅ）遺伝子は、この第２の微生物の存在下でその発現が増大する傾向を示し、窒素固定とレバン産生の間に相関があるように見えるため、それは窒素固定に関連し得るが、これは恐らく、酵素活性を阻害し得る酸素拡散を回避する、ニトロゲナーゼに対するレバンによって生じる保護環境に起因する。Ｇｄによって産生される粘液基質は、嫌気的環境を維持するために細菌によって利用されることが実証されている（Ｄｏｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００２，ｐｐ１７５４−１７５９）。レバンはＧｄによって分泌される主要な菌体外多糖であるので、それは、ＮａＣｌ、スクロース、および乾燥などのその他の非生物的ストレスに対する耐性に加えて、酸素からのニトロゲナーゼ保護に関与し得る（Ｖｅｌａｚｑｕｅｚ−Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１１  ｖｏｌ  １９３，１３９−１４９）。
【０１０６】
実施例７
Ｇｄの付着に対するＴｓの効果
Ｇｄ単一培養物と比較したＧｄ＋Ｔｓ混合培養物の付着力の評価は、（Ｆａｖｒｅ−Ｂｏｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００７）７（３３）ｐｐ１−１２）に記載されるように、培養物が人工表面（遠心管）に付着する能力を測定することで実施される。ＧｄおよびＴｓのスタータ培養は、それぞれＳＹＰ中で調製され（ｄａ  Ｓｉｌｖａ−Ｆｒｏｕｆｅ，ｅｔ  ａｌ．，２００９、前出）、ＳＹＰはＨｅｒｂｓｔの人工海水で修正された（Ａｎ，ｅｔ  ａｌ．，２００７、前出）。１５０ｒｐｍで２８℃における４８時間の培養後、培養物はＰＢＳ（４０００ｒｐｍ、１５分間）で２回洗浄され、ペレットは、１および０．５のＯＤ６００でＰＢＳに再懸濁された。サンプルは、単一培養物では１ｍｌのＧｄまたはＴｓ、混合サンプルでは１：１、２：１、および１：２．のＧｄ：Ｔｓ比で（培養のＯＤ６００を基準とする）、１ｍｌのＧｄ＋１ｍｌのＴｓを１０ｍｌのＳＹＰ最終容積に接種することで調製された。１．５ｍｌのサンプルを１５ｍｌ遠心管内に分散させることで、処理あたり５回の反復が調製され、２８℃の静止培養中で８日間培養された。
【０１０７】
細胞の表面への付着を調べるために培地が除去されて、管は１．５ｍｌのＰＢＳで洗浄され、細胞は１０ｍｌのメタノールで１５分間固定された。アルコールが除去されて、管は風乾された。形成されたバイオフィルムは、０．１％ｗ／ｖのクリスタルバイオレットで５分間染色された。染料は、蒸留水で洗浄され風乾された。その後、染料は、１０ｍｌの３３％氷酢酸に再懸濁された。サンプルの吸光度は、５９５ｎｍで測定された。対照として、１．５ｍｌのＳＹＰが入った５本の管をインキュベートして、同様に処理した。空試験からの値は背景と見なされ、それは、残りのサンプルで得られた値から差し引かれた。
【０１０８】
結果は、図１１に示される。この実験は、細胞培養物が人工表面に付着する傾向を示し、それはＧｄが異なる条件において、バイオフィルムを形成する能力の指標であり得る。バイオフィルム形成は、植物コロニー形成特性に影響を及ぼすことが期待される。この能力は、混合培養としてのＴのｓ組み合わせによって、特に１：１の比率で、向上されるようである。
【０１０９】
実施例８
付着および種子発芽
１００％エタノールに浸漬することで、アブラナ（ＯＳＲ）種子が滅菌され、ボルテックスされ２分間静置され、その後、滅菌脱イオン水（ＳＤＷ）で３回完全に洗浄されボルテックスされた。その後、種子は、１％（ｖ／ｖ）ツイーン８０添加７０％（ｖ／ｖ）漂白剤に浸漬されて、ボルテックスされ３０分間静置された。その後、それらはＳＤＷによって少なくともさらに５回完全に再洗浄されてボルテックスされた。
【０１１０】
種菌を調製するために、ＧｄおよびＴｓの新鮮培養物が、最適培地中で２４時間培養された。ＯＤは、Ｇｄでは０．３５（約１０８ｃｆｕ／ｍｌ）、Ｔｓでは０．２および０．１（それぞれ、約１０８ｃｆｕ／ｍｌおよび約１０６ｃｆｕ／ｍｌ）に調節された。培養物は、３％（ｖ／ｖ）スクロース、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０、および０．３％（ｖ／ｖ）アラビアガムを含んでなる水性組成物中で希釈された。処理は、次のとおりであった。ａ）対照、水のみ；ｂ）Ｇｄ、約２．５・１０５ｃｆｕ／ｍｌ；ｃ）Ｔｓ、約２．５・１０５ｃｆｕ／ｍｌ；ｄ）１：１のＧｄ＋Ｔｓ、どちらの株も約２．５・１０５ｃｆｕ／ｍｌ；ｅ）２：１のＧｄ＋Ｔｓ、Ｇｄは約２．５・１０５ｃｆｕ／ｍｌ、Ｔｓは約２．５・１０３ｃｆｕ／ｍｌ。実際の種菌濃度は、次のとおりであった：
【０１１１】
【表３】
2017523782.tif 000005
【０１１２】
滅菌種子は、異なる処理剤に３０分間浸漬された。
【０１１３】
種子の処理後、溶液は廃棄されて、種子は、３ｍｌのＳＤＷで湿らせたガラス繊維紙と共に、裏返したペトリ皿に載せ載せられた。プレートはアルミニウムホイルで覆って遮光され、２１℃で培養された。細菌の種子への付着を試験するために、処理あたり２０個の種子の３つのグループが、５ｍｌのＰＢＳで洗浄され、２０℃で２時間激しく振盪された。得られた溶液は連続希釈され、ＬＧＩＰおよびＭａｒｉｎｅ  Ａｇａｒ培地上に播種された。次に、プレートは、２８℃で４日間培養された。種子表面から回収された細胞数が数えられて、結果は図１２に示される。
【０１１４】
２４時間の培養後、発芽が数えられて発芽率が計算され、５ｍｌのＭｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）基本培地（Ｓｉｇｍａ  Ｍ０４０４）を入れた円錐管内に入れられた。植物は、少なくとも２枚の本葉が成長するまで、植物グロースチャンバー内で培養された（周期：１５℃および６０％ＲＨで１２時間の暗期／２８℃および６０％ＲＨで１２時間の明期）。処理あたり１５本の植物が培養された。
【０１１５】
結果は、種子へのＧｄおよびＴｓの付着が、異なる処理毎に差を示したことを示す。この株が植物抽出物中に検出されたにもかかわらず、種子からＴｓを再分離することは可能でなく、これが種子表面に十分に付着したことが示唆された。混合培養物は、単一Ｇｄ培養物と比較して回収率の低下を示し、したがって付着の向上を示した。
【０１１６】
種子の接種および発芽後、発芽苗は、植物グロースチャンバー内でさらに１５日間培養された。各処理からの７本の苗が処理されて、表面滅菌後に、根および葉から抽出物が得られた。
【０１１７】
根表面からの着生微生物の再分離のための手順は、種子付着アッセイで使用されたものと同様であった。具体的には、根は等張緩衝液でも洗浄されて、根表面に形成した着生微生物コロニーが再分離された。
【０１１８】
内生コロニー形成では、１０％（ｖ／ｖ）漂白剤に１０分間浸漬することで根および葉表面が滅菌され、ｐＨが８．０に調節され、植物はＳＤＷで洗浄されて、１ｍｌのＰＢＳ中で浸軟された（Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈａｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０００，６６（５）２１８５−２１９１）。植物抽出物は連続希釈され、ＬＧＩＰおよびＭａｒｉｎｅ  Ａｇａｒ上に二連で播種された。結果は、それぞれ図１３および１４に示される。
【０１１９】
未接種植物は汚染を示さず、異なる処理間の相互汚染も見られなかった。Ｔｓのみによる植物接種を除き、植物内の内生結合中でＴｓを回収することは可能でなかったが、この細菌は根の表面に見られた。それでもなおＴｓは、Ｇｄと関連して接種されると、より少数のコロニーを根に形成した（図１４）。
【０１２０】
Ｇｄの回収は、処理間の重大な差を示した（図１３）。Ｇｄの単一培養物による植物接種が、根と葉の間で内生菌として再単離された微生物数に本質的に差がなかった一方で、植物内のＧｄ分布は、それらが混合培養で接種された場合、植物の異なる部分（根と葉の対比）で、そしてまたＧのみで接種された植物に関して変化した。比率２：１のＧｄ＋Ｔｓで接種された植物は、植物表面のコロニー形成が単一接種と同一であったという事実にもかかわらず、改善された内生コロニー形成を示した。さらに、組み合わせた種菌による処理は、植物内の細菌の移動に影響を与え、葉への局在性に有利に働くようであった。植物地上部の内部から単離された数は、純粋なＧｄ培養物で接種された植物に関して、混合培養で接種された植物１０倍より高かった。
【０１２１】
さらに、ひとたび植物が十分に成長したら、いくつかは管から取り出されて、湿潤および乾燥重量が測定された。結果は、図１５に示される。
【０１２２】
植物パラメータの測定値は、ＬＳＤに関してＧｄによる多様な処理間で差を示さないが、それはＧｄ＋Ｔｓ（１：１）で処理された植物の乾燥重量（ＤＷ）がより高い傾向を示し、対照植物に関して、この混合処理のＤＷ間に有意差があり、それは湿潤重量であるにもかかわらず、１：１混合物中のＧｄ＋Ｔｓで処理された植物のバイオマスが増大する傾向を示す（図１５）。
【０１２３】
実施例９
レバン産生および定量
ＯＤ６００が約０．２である双方の株の一晩培養物が、１ｍｌのＧｄ＋１ｍｌのＴｓで、１００ｍｌのＳＹＰが入ったフラスコに接種され、３日間培養された。サンプルは、３日間にわたり毎日採取され、レバン産生を分析するために、三連で１ｍｌの各培養物のアリコートが−２０℃で保存された。ＯＤ６００が測定されて、ＡＴＧＵＳおよびＭａｒｉｎｅ  Ａｇａｒ上に連続希釈播種され、双方の株のｃｆｕが得られた。ＳＹＰ中のＧｄおよびＴｓの単一培養物は、対照と同一条件で接種されて培養された。
【０１２４】
サンプル中のレバンを抽出して定量化するために培養物は、最初に遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、２０分間、４℃）されて、上清がデカントされ新しい管に入れられた。サンプルは、実施例５に記載されるように３容積のメタノールで沈殿され、乾燥して容積がおよそ１ｍに低下するまで、６０℃に設定された加熱ブロック（Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ）に入れられた。沈殿物は、１ｍｌの水に溶解された。５Ｍの０．２％Ｈ２ＳＯ４を添加して酸加水分解が実施され、１２１℃で１時間インキュベートされた。インキュベーション後、５００μｌのＤＮＳＡ試薬（１００ｍｌ中、５０ｍｌのＨ２Ｏに溶解された１ｇの３，５−ジニトロサリチル酸、２０ｍｌの２Ｍ  ＮａＯＨ、３０ｇのＫ−Ｎａ酒石酸四水和物）が添加され混合された。管は沸騰水に１５分間入れられて、５００μｌの４０％Ｋ−Ｎａ酒石酸が添加され混合された。サンプルの吸光度が５４０ｎｍで測定され、一連のグルコース標準からの検量線を使用してグルコース濃度が推定された。
【０１２５】
最近の研究は、テルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）種についてレバンスクラーゼ（ｌｅｖａｎｓｕｃｒｏｓｅ）およびｌｅｖａｎａｓｅ酵素の存在を示した（Ｌｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎｎｏｕｎｃｅｍｅｎｔｓ  ２０１５  ３（２），ｐｐ  ｅ００１２６−１５）ので、Ｔｓからのレバンもまた定量化された。
【０１２６】
結果は、図１６に示される。比率１：１の混合培養中のレバン濃度に有意差がなかった一方で、双方の株により高濃度のＧｄが提供された場合は、培地中で検出されたレバンの定量には大きな低下があった。この場合、培地中のレバン濃度は単一Ｇｄ培養物と同様の傾向に従ったが、レバン濃度に対するより強い効果があった。理論により拘束されることなく、これは、双方の株によるスクロース消費およびレバン分解に起因してもよい。
【０１２７】
実施例１０
Ｇｄによる植物ホルモン産生に対するテルリバチルス属（Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）の効果
Ｇｄが、単独で、またはＴｓの存在下で、オーキシンＩＡＡを産生する能力を調べるために、Ｇｄ、Ｔｓ、Ｇｄ＋Ｔｓ（１：１）、およびＧｄ＋Ｔｓ（２：１）の培養物がＳＹＰ中で調製され、２８℃、１５０ｒｐｍで１週間培養された。全ての培養のサンプル（１ｍｌ）は、培養の最初の３日間は毎日、そして７日目に、三連で採取された。サンプルは、１３０００ｒｐｍで５分間遠心脱水され、上清がガラス管に回収された。上清は、１容積のサンプルあたり４容積のＳａｌｏｗｓｋｉ試薬（１５０ｍｌのＨ２ＳＯ４９６％、２５０ｍｌのＨ２Ｏおよび７．５ｍｌのＦｅＣｌ３０．５Ｍ）と混合された。ピンク色の発色は、ＩＡＡ産生を示した。
【０１２８】
分光光度計を使用してＯＤ５３５が読み取られた。ＩＡＡの濃度は、標準ＩＡＡグラフによって推定された。最終値は、各サンプルについて３回の反復試験の平均として計算され、誤差は標準誤差を用いて計算された。
【０１２９】
結果は、図１７に示される。Ｔｓの存在下で、Ｔｓはいかなる有意な程度にもＩＡＡを産生しなかった一方で、ＧｄによるＩＡＡの産生は全体的に増大したことが明らかであり、ＴｓがＧｄの挙動を改変したことが示唆された。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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