(57)【要約】  本発明は、癌を有する患者が上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤に応答する可能性が高いかどうかを予測するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって、前記患者の腫瘍サンプルにおけるｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ（配列番号１）ｍｉＲＮＡの少なくとも１つの標的遺伝子の発現レベルを決定することを含んでなり、前記ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの標的遺伝子がＤＢＮＤＤ２およびＥＰＢ４１Ｌ４Ｂから選択される方法に関する。本発明はまた、ＤＢＮＤＤ２および／またはＥＰＢ４１Ｌ４Ｂの発現、ならびにＥＧＦＲ阻害剤に対する応答と正または負の相関がある少なくとも１つの他のパラメーターを測定するためのキットに関する。本発明はまた、前記ＥＧＦＲ阻害剤に応答すると予測された患者におけるＥＧＦＲ阻害剤の治療的使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌を有する患者が上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤に応答する可能性が高いかどうかを予測するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって、前記患者の腫瘍サンプルにおけるｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ（配列番号１）ｍｉＲＮＡの少なくとも１つの標的遺伝子の発現レベルを決定することを含んでなり、前記ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの標的遺伝子がＤＢＮＤＤ２およびＥＰＢ４１Ｌ４Ｂから選択される、方法。
【請求項２】
前記患者がＫＲＡＳ野生型癌を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記患者が、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、甲状腺癌、鼻咽頭癌、前立腺癌、頭頸部癌、肝臓癌、腎臓癌、膵臓癌、膀胱癌および脳癌から選択される癌に罹患している、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記癌が結腸直腸癌、特に、転移性結腸直腸癌である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＥＧＦＲ阻害剤が抗ＥＧＦＲ抗体、特に、セツキシマブまたはパニツムマブである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記サンプルが腫瘍組織生検または腫瘍外科切除片の全体もしくは一部である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの少なくとも１つの標的遺伝子の発現レベルが、前記ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの標的遺伝子により産生される転写産物の量をｉｎ  ｖｉｔｒｏで、好ましくは定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定することにより核酸レベルで決定される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐｉｓの少なくとも１つの標的遺伝子の発現レベルが高いほど、患者がＥＧＦＲ阻害剤治療に応答する可能性が高い、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの少なくとも１つの標的遺伝子の発現レベルに基づいて予後スコアを決定することをさらに含んでなり、該予後スコアが、患者がＥＧＦＲ阻害剤に応答する可能性が高いかどうかを示すものである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記予後スコアが式：
予後スコア＝ａ＊ｘ＋ｂ
であり、式中、
ｘは、患者のサンプルで測定されたＤＢＮＤＤ２の発現レベルの対数であり、
ａおよびｂは、参照サンプルのプールに基づいて事前に決定されたパラメーターであり、かつ、
患者は、その患者の予後スコアが閾値ｃよりも大きければまたは小さければＥＧＦＲ阻害剤に応答するまたは応答しないと予測され、ここで、前記ｃの値は参照サンプルの同じプールに基づいて決定されたものであり、
ａが正であるとき、その患者は、その患者の予後スコアが閾値ｃ以上であればＥＧＦＲ阻害剤に応答すると予測され、その予後スコアが閾値ｃより小さければＥＧＦＲ阻害剤に応答しないと予測され、
ａが負であるとき、その患者は、その患者の予後スコアが閾値ｃ以下であればＥＧＦＲ阻害剤に応答すると予測され、その患者の予後スコアが閾値ｃより大きければＥＧＦＲ阻害剤に応答しないと予測される、
請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記予後スコアが式：
予後スコア＝ａ＊ｘ＋ｂ
であり、式中、
ｘは、患者のサンプルで測定されたＤＢＮＤＤ２の発現レベルの対数であり、
ａおよびｂは、参照サンプルのプールに基づいて事前に決定されたパラメーターであり、かつ、
ａが正であるか負であるかによって、
ａが正であれば、予後スコアが高いほどＥＧＦＲ阻害剤治療に応答する確率が高く、
ａが負であれば、予後スコアが低いほどＥＧＦＲ阻害剤治療に応答する確率が高い、
請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
参照サンプルのプールに基づいて較正されたノモグラムに基づき、応答しないリスクを決定することをさらに含んでなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ＥＧＦＲ阻害剤に対する応答と正または負の相関がある少なくとも１つの他のパラメーターを決定すること、および前記ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの少なくとも１つの標的遺伝子の発現レベルと前記他のパラメーターを考慮した総合スコアを算出することをさらに含んでなり、前記総合スコアは前記患者がＥＧＦＲ阻害剤に応答する可能性が高いかどうかを示す、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
癌を有する患者が上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤に応答する可能性が高いかどうかを決定するためのキットであって、
ａ）前記患者のサンプルにおいてｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ（配列番号１）ｍｉＲＮＡの少なくとも１つの標的遺伝子の発現レベルを決定するための試薬であって、前記ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの標的遺伝子がＤＢＮＤＤ２およびＥＰＢ４１Ｌ４Ｂから選択される、試薬、および
ｂ）ＥＧＦＲ阻害剤に対する応答と正または負の相関がある少なくとも１つの他のパラメーターを決定するための試薬であって、
ｉ）ＥＧＦＲ阻害剤に対する応答と正または負の相関がある少なくとも１つのｍｉＲＮＡ、特にｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ（配列番号１）ｍｉＲＮＡまたはｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐ（配列番号３４）ｍｉＲＮＡ、の発現レベルを決定するための試薬、および／または
ｉｉ）ＥＧＦＲ阻害剤に対する応答と正または負の相関がある少なくとも１つの突然変異を検出するための試薬
から選択される、試薬
を含んでなる、またはからなる、キット。
【請求項１５】
癌に罹患している患者の治療に使用するためのＥＧＦＲ阻害剤であって、該患者が請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法によりＥＧＦＲ阻害剤に対して応答する可能性が高いと分類された患者である、ＥＧＦＲ阻害剤。
【請求項１６】
癌に罹患している患者の治療に使用するためのＥＧＦＲ阻害剤であって、該治療が、前記患者が請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法によりＥＧＦＲ阻害剤に応答する可能性が高いかどうかを予測する予備工程を含んでなり、前記患者が請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法によりＥＧＦＲ阻害剤に応答する可能性が高いと予測された場合にのみ、その患者に前記ＥＧＦＲ阻害剤が投与される、ＥＧＦＲ阻害剤。
【請求項１７】
癌に罹患している患者を治療するための方法であって、
（ｉ）本発明による方法により、前記患者がＥＧＦＲ阻害剤に応答する可能性が高いかどうかを決定すること、および
（ｉｉ）前記患者がＥＧＦＲ阻害剤に応答する可能性が高いと決定された場合に、前記患者にＥＧＦＲ阻害剤を投与すること
を含んでなる、方法。
【請求項１８】
患者がＥＧＦＲ阻害剤に応答する可能性が低いと決定された場合に、前記患者に別の抗癌治療を投与する工程（ｉｉｉ）をさらに含んでなる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記別の抗癌治療が
ａ）ＶＥＧＦ阻害剤、
ｂ）ＶＥＧＦ阻害剤とＦＯＬＦＯＸの組合せ、
ｃ）ＶＥＧＦ阻害剤とＦＯＬＦＩＲＩの組合せ、
ｄ）５−ＦＵ、および
ｅ）５−ＦＵとマイトマイシンＢの組合せ
から選択される、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ（配列番号１）ｍｉＲＮＡの少なくとも１つの標的遺伝子の発現レベルに基づき、癌治療の化学療法を個人に合わせるため、特に、１以上の上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤に対する患者の応答性をそのような薬剤による治療の前に評価するための方法を提供し、前記ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの標的遺伝子はＤＢＮＤＤ２およびＥＰＢ４１Ｌ４Ｂから選択される。
【背景技術】
【０００２】
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）経路は、ヒト上皮癌の発生および進行において重要である。ＥＧＦＲ阻害剤との併用治療は、より効果的かつ持続的なＡｋｔ阻害を介して、機能的ＥＧＦＲに依存する自己分泌増殖経路を有する種々のヒト癌細胞において、相乗的な増殖阻害活性およびアポトーシス誘導活性を有する。
【０００３】
ＥＧＦＲ阻害剤は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、頭頸部癌、結腸直腸癌、およびＨｅｒ２陽性乳癌を含む様々な癌の治療に対して承認済みであるか、または試験されており、標準療法に加えられつつある。ＥＧＦＲ標的の細胞内チロシンキナーゼドメインか細胞外ドメインのいずれかを標的とし得るＥＧＦＲ阻害剤は、一般に集団応答率の低さを悩みとし、多くの場合、効果のないまたは最適でない化学療法、ならびに不要な薬物毒性および出費をもたらす。例えば、セツキシマブ（ＥＧＦＲの細胞外ドメインを標的とするキメラモノクローナル抗体）による結腸直腸癌治療に関して報告されている臨床応答率は約１１％であり(Cunningham et al, N Engl Med 2004;351: 337-45)、エルロチニブによるＮＳＣＬＣ治療に関して報告されている臨床応答率は約８．９％である(Shepherd F A, et al, N Engl J Med 2005; 353:123-132)。
【０００４】
特に、ＫＲＡＳ突然変異の場合には耐性が認められている。
【０００５】
結腸直腸癌では、ＫＲＡＳ突然変異は抗ＥＧＦＲ抗体に対する耐性と明らかに関連があるので(Lievre et al, Cancer Res. 2006 66(8):3992-5)、非突然変異型ＫＲＡＳ患者において、この療法に対する応答の欠如を予測できる他のマーカーを同定することが大きな挑戦の１つである。中でも、癌遺伝子の増幅または活性化突然変異、および上記の腫瘍抑制遺伝子の不活性化突然変異は、例えば、ＥＧＦＲ下流リンタンパク質発現の測定により評価されるＥＧＦＲ下流シグナル伝達経路の活性化レベルなど、関連のある候補である。
【０００６】
肺癌では、３群の患者が明らかになっており、第１群は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（ＥＧＦＲ  ＴＫＩ）の使用が転帰を改善することが分かっている、ＥＧＦＲ変異型腫瘍を有する患者であり、第２群は、抗ＥＧＦＲ療法がおそらく良好な選択肢とはならない、ＫＲＡＳ変異型腫瘍を有する患者であり、第３群は、応答が予測できない非ＥＧＦＲ変異型かつＫＲＡＳ変異型腫瘍である。非変異型腫瘍群における薬物応答に関連するマーカーで、これまでに有益であることが分かっているものはない。
【０００７】
よって、特許療法のより良い個別化のためには、ＥＧＦＲ阻害剤に対する患者の応答性をそのような薬剤による治療の前に予測する必要がある。
【０００８】
従来技術において、種々の抗癌治療に対する感受性または耐性におけるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の関与に関する多数の文献が存在する。特に、ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０７３５３５には、癌を有する患者が上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤に応答する可能性が高いかどうかを予測するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法が記載され、その方法は、前記患者のサンプルにおけるｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ（旧称ｈｓａ−ｍｉＲ−３１＊、配列番号１）ｍｉＲＮＡの発現レベルを決定することを含んでなる。より詳しくは、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの発現が低いほど、患者がＥＧＦＲ阻害剤治療に応答する可能性は高い。
【０００９】
同様に、従来技術において、種々の抗癌治療に対する感受性または耐性における様々な遺伝子の関与に関する多数の文献が存在する。しかしながら、ほとんどの場合、研究は部分的であり、不完全であり、実際には、治療に対する臨床応答または非応答の真の予測を可能とするものではない。事実、多くの場合で、研究は、特定の治療に対して感受性もしくは耐性の細胞株におけるか、または患者腫瘍から単離された腫瘍細胞において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの遺伝子の発現の分析に限定されている。さらに、多くの研究では、２つの細胞集団間または患者集団間での発現レベルの違いが示されるものの、新たな患者において応答または非応答の予測を実際に可能とする閾値またはスコアは示されていない。このことは、１つには、多くの研究が臨床現場で得られるデータを欠いているという第１の欠点に関連している。さらに、臨床現場で得られたデータをいくらか示している場合であっても、これらのデータはほとんどの場合で後向きでしかなく、独立したコホートにおける予測法をバリデートするデータを欠いている場合が多い。
【００１０】
従来技術の研究の様々な欠点を鑑みれば、このような療法がいくつかの選択肢のうちの１つとなる患者において、ＥＧＦＲ阻害剤に対する応答を予測するための真の、バリデートされた方法がなお必要である。本発明は、この必要に対する対応を提供する。
【００１１】
ＤＢＮＤＤ２（ディスビンディン（ディストロブレビン結合タンパク質１）ドメイン含有２）(dysbindin (dystrobrevin binding protein 1) domain containing 2)はヒトカゼインキナーゼ−１の結合相手であることが開示されている(Yin H et al. Biochemistry. 2006 Apr 25;45(16):5297-308)。加えて、マイクロアレイグローバルプロファイリングを用い、ＤＢＮＤＤ２は、種々の腫瘍細胞で（ＷＯ２０１００６５９４０；ＷＯ２０１００５９７４２；ＷＯ２００９１３１７１０；ＷＯ２００７１１２０９７）、またはラパマイシン（ＷＯ２０１１０１７１０６）もしくはタモキシフェン（ＷＯ２０１０１２７３３８）に感受性もしくは耐性の癌細胞の間で示差的に発現されることが判明している。しかしながら、この遺伝子は癌に特に関連しているとは思われず、ＥＧＦＲ阻害剤に対する応答の予測におけるこの遺伝子の関与は開示されていない。
【００１２】
ＥＰＢ４１Ｌ４Ｂ（赤血球膜タンパク質バンド４．１ライク４Ｂ）(erythrocyte membrane protein band 4.1 like 4B)は、膜貫通タンパク質を細胞骨格に連結するか、またはキナーゼおよび／もしくはホスファターゼ酵素活性を原形質膜に連結することができ、発癌および転移に関与することが記載されているＦＥＲＭファミリータンパク質のタンパク質である。特に、ＥＰＢ４１Ｌ４Ｂ（ＥＨＭ２としても知られる）は、前立腺癌(Wang J, et al. Prostate. 2006 Nov 1;66(15):1641-52; Schulz WA, et al. BMC Cancer.2010 Sep 22;10:505)および乳癌(Yu H et al. Mol Cancer Res 2010;8:1501-1512)の悪性度の高さと関連付けられている。従って、この遺伝子は少なくとも２種類の癌の悪性度と不良な予後に関連付けられている。さらに、タキソテール（ドセタキセル、ＷＯ２００７０７２２２５およびＷＯ２００８１３８５７８参照）に感受性の癌細胞株と耐性の癌細胞株の間で示差的に発現されることが判明している。しかしながら、癌患者のＥＧＦＲ阻害剤に対する応答能または応答しないことに対するその関与の開示は無かった。
【００１３】
本発明者らは、ｍｉＲＮＡの名称に基づくか、または遺伝子名に基づいて応答指令信号を送ることができる６つのデータベースからの情報を組み込んだ新たなデータベースを実装した。１つ目の場合（ｍｉＲＮＡ名に基づくクエリー）、データベースは、公開情報または構造情報に基づいてクエリーｍｉＲＮＡの候補標的と考えられる遺伝子名を答え、候補標的遺伝子は利用可能な情報に基づいて最も可能性が高いから可能性が低いまでの順位付けを行う。クエリーが遺伝子名に基づく場合、データベースは、そのクエリー遺伝子が標的とされる（またはされない）可能性のある候補ｍｉＲＮＡを答える。
【発明の概要】
【００１４】
なぜｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの高い発現がＥＧＦＲ阻害剤治療に対ウイルスする低い応答に関連するのかを理解する目的で、本発明者らは、このｍｉＲＮＡの標的遺伝子の同定を試みた。この目的で、本発明者らは、天然にはｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ発現が弱い３つの結腸直腸腺癌（ＣＲＣ）細胞株をｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐミミックまたは陰性対照ミミックでトランスフェクトし、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐを過剰発現するまたは発現の弱い細胞株間で示差的に発現される遺伝子を解析した。有意にダウンレギュレーションまたはアップレギュレーションを受けていた合計７４の遺伝子が同定された。ｍｉＲＮＡは主としてそれらの標的遺伝子の発現を低下させることによって機能するので、本発明者らは４７のダウンレギュレーション遺伝子に着目した。候補標的の数を限定し、誤った直接標的遺伝子を回避するために、本発明者らはさらに、ｍｉＲＮＡおよび候補標的に関する６つのデータベースで入手可能な情報に基づいてｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ解析を行った。公開データベースで提供されるほとんどのｍｉＲＮＡ標的遺伝子はバリデートされておらず、構造データまたは断片的実験データに基づいた、多かれ少なかれあり得る候補に過ぎないことに留意することが重要である。これに基づき、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの２５の候補標的遺伝子をさらなる分析のために選択した。本発明者らは、ＥＧＦＲ阻害剤で処置された患者の腫瘍サンプルにおけるこれらのｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ候補標的遺伝子の発現をさらに分析した（なお、ＲＥＣＩＳＴ判定基準に基づくそれらの治療応答状態は既知である）。
【００１５】
これらの分析に基づき、本発明者らは驚くことに、ＤＢＮＤＤ２およびＥＰＢ４１Ｌ４Ｂが両方とも、それらの発現が癌細胞株においてｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの過剰発現により有意にダウンレギュレーションを受けていることから、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ標的遺伝子であること、ならびにこれらの遺伝子はそれぞれ独立に癌患者のＥＧＦＲ阻害剤治療に対する応答能に有意に関連していたことを見出した。本発明者らはさらに、これらの遺伝子がそれぞれ単独で癌患者におけるＥＧＦＲ阻害剤に対する応答を、信頼性をもって予測するために使用可能であることを確認した。これらの遺伝子にはデータベースにおいて、ＨＡＵＳ４などのより高い確率でｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの候補標的遺伝子と見なされているものやＳＴＡＴ３、ＦＥＭ１Ａ、ＥＨＢＰ１およびＳＥＣ３１Ａなどの癌に関連していることが既知のものがいくつかあるものの、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの他の２３の候補標的遺伝子には、癌患者のＥＧＦＲ阻害剤治療応答能に有意に関連することが判明したものは無かった。このことは、遺伝子の癌との単なる関連では、その遺伝子が特定の癌治療に対する応答のバイオマーカーとして使用可能であるということを合理的に期待するには十分でないことを明らかに示している。これはまた、公開データベースに開示されている特定のｍｉＲＮＡの多数の候補標的遺伝子のうち少数のものだけがこのｍｉＲＮＡの真の標的であること、および真の標的は必ずしも最も上位の候補ではないことを示している。
【００１６】
驚くことに、ＥＧＦＲ阻害剤治療に応答しない患者で有意にダウンレギュレーションを受けていることが判明した２つの遺伝子は、癌に関連することが特に知られていない遺伝子（ＤＢＮＤＤ２）と癌に関連することが知られている遺伝子（ＥＰＢ４１Ｌ４Ｂ）であるが、その高い発現レベルは不良な予後に関連していた。これに対し、本発明では、ＥＧＦＲ阻害剤に対する応答の欠如、従って不良な予後に関連しているのは、ＥＰＢ４１Ｌ４Ｂの低い発現である。これらの結果から、予後のバイオマーカーは（一般に）、特定の治療に対する応答のバイオマーカーでもあると合理的に期待され得ないことが確認される。
【００１７】
本発明者らによって得られた結果（実施例１参照）に基づき、本発明は、癌を有する患者が上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤に応答する可能性が高いかどうかを予測するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法を提供し、その方法は、前記患者のサンプルにおけるｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ（配列番号１）ｍｉＲＮＡの少なくとも１つの標的遺伝子の発現レベルを決定することを含んでなり、前記ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの標的遺伝子がＤＢＮＤＤ２およびＥＰＢ４１Ｌ４Ｂから選択される。
【００１８】
好ましくは、患者はＫＲＡＳ野生型癌を有する。
【００１９】
癌は好ましくは、結腸直腸癌、好ましくは、転移性結腸直腸癌である。
【００２０】
最も好ましい実施態様では、本発明は、転移性結腸直腸癌を有する患者がセツキシマブまたはパニツムマブなどの上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤に応答する可能性が高いかどうかを予測するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法を提供し、その方法は、前記患者の腫瘍サンプルにおけるｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ（配列番号１）ｍｉＲＮＡの少なくとも１つの標的遺伝子の発現レベルを決定することを含んでなり、前記ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの標的遺伝子がＤＢＮＤＤ２およびＥＰＢ４１Ｌ４Ｂから選択される。
【００２１】
本発明はまた、癌を有する患者が上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤に応答する可能性が高いかどうかを決定するためのキットであって、前記患者のサンプルにおいてｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ（配列番号１）ｍｉＲＮＡの少なくとも１つの標的遺伝子の発現レベルを決定するための試薬（ここで、前記ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの標的遺伝子はＤＢＮＤＤ２およびＥＰＢ４１Ｌ４Ｂから選択される）、およびＥＧＦＲ阻害剤に対する応答と正または負の相関がある少なくとも１つの他のパラメーターを決定するための試薬を含んでなる、またはからなるキットを提供する。
【００２２】
本発明はさらに、癌に罹患している患者の治療に使用するためのＥＧＦＲ阻害剤に関し、ここで、前記患者は本発明による方法によって応答する可能性が高いと分類されている。
【００２３】
本発明はまた、本発明の方法によって「応答者」と分類されている患者の癌治療における使用を意図した薬物を製造するためのＥＧＦＲ阻害剤の使用に関する。
【００２４】
本発明はまた、癌に罹患している患者を治療するための方法であって、（ｉ）本発明の方法により、前記患者がＥＧＦＲ阻害剤に応答する可能性が高いかどうかを決定すること、および（ｉｉ）前記患者がＥＧＦＲ阻害剤に応答する可能性が高いと決定された場合に、前記患者にＥＧＦＲ阻害剤を投与することを含んでなる方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１：実施例１の２０名のｍＣＲＣ患者におけるＤＢＮＤＤ２（図１Ａ）およびＥＰＢ４１Ｌ４Ｂ（図１Ｂ）のｌｏｇ２発現レベルとｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの間の相関。
【図２】図２：実施例２の２０名のｍＣＲＣ患者におけるＤＢＮＤＤ２のｌｏｇ２発現レベルとｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの間の相関。
【図３】図３：Ａ：抗ＥＧＦＲに基づく化学療法で処置したｍＣＲＣ患者の進行リスク（すなわち、不応答リスク）を予測するために、実施例２の２０名のｍＣＲＣ患者におけるＤＢＮＤＤ２のｌｏｇ２発現に基づいて確立されたノモグラムツール。
【図４】図４：実施例２の２０名のｍＣＲＣ患者におけるＤＢＮＤＤ２発現を共変量とする多変量コックス比例ハザードモデル。
【図５】図５：実施例３の４２名のｍＣＲＣ患者におけるＤＢＮＤＤ２（図５Ａ）およびＥＰＢ４１Ｌ４Ｂ（図５Ｂ）のｌｏｇ２発現レベルとｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの間の相関。
【図６】図６：ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ発現レベルに基づいて予測した進行リスク（低または高）に従う実施例３の患者におけるＤＢＮＤＤ２（図６Ａ）およびＥＰＢ４１Ｌ４Ｂ（図６Ｂ）の発現。
【発明の具体的説明】
【００２６】
定義
「患者」は、齢または性を問わず、任意の哺乳動物 、好ましくは、ヒトであり得る。
患者は、癌に罹患している。患者は、任意の化学療法薬により治療をすでに受けていてもよいし、または未治療であってもよい。
【００２７】
癌は、好ましくは、ＥＧＦＲを介したシグナル伝達経路が関与する癌である。特に、癌は、例えば、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、甲状腺癌、鼻咽頭癌、前立腺癌、頭頸部癌、腎臓癌、膵臓癌、膀胱癌、または脳癌であり得る(Ciardello F et al. N Engl J Med. 2008 Mar 13;358(11):1160-74; Wheeler DL et al. Nat Rev Clin Oncol. 2010 September; 7(9): 493-507; Zeineldin R et al. J Oncol. 2010;2010:414676; Albitar L et al. Mol Cancer 2010;9:166; Leslie KK et al. Gynecol Oncol. 2012 Nov;127(2):345-50; Mimeault M et al. PLoS One.2012;7(2):e31919; Liebner DA et al. Ther Adv Endocrinol Metab. 2011 Oct;2(5): 173-95; Leboulleux S et al. Lancet Oncol. 2012 Sep;13(9):897-905; Pan J et al. Head Neck. 2012 Sep 13; Chan SL et al. Expert OpinTher Targets. 2012 Mar;16 Suppl 1 :S63-8; Chu H et al. Mutagenesis.2012 Oct 15; Li Y et al. Oncol Rep. 2010 Oct;24(4): 1019-28; Thomasson M et al. Br J Cancer 2003, 89:1285-1289; Thomasson M et al. BMC Res Notes.2012 May 3;5:216)。特定の実施態様では、腫瘍は固形組織腫瘍および／または事実上、上皮のものである。例えば、患者は、結腸直腸癌患者、Ｈｅｒ２陽性またはＨｅｒ２陰性（特に、トリプルネガティブ、すなわち、Ｈｅｒ２陰性、エストロゲン受容体陰性およびプロゲステロン受容体陰性）乳癌患者、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者、頭頸部癌患者（特に、頭頸部扁平上皮癌患者）、膵臓癌患者、または子宮内膜癌患者であり得る。より詳しくは、患者は、結腸直腸癌患者、Ｈｅｒ２陽性またはＨｅｒ２陰性（特に、トリプルネガティブ）乳癌患者、肺癌（特に、ＮＳＣＬＣ）患者、頭頸部癌患者（特に、頭頸部扁平上皮癌患者）、または膵臓癌患者であり得る。
【００２８】
好ましい実施態様では、癌は結腸直腸癌であり、さらに好ましくは、癌は転移性結腸直腸癌である。実際に、実施例１に示したデータは、ＤＢＮＤＤ２またはＥＰＢ４１Ｌ４Ｂ発現レベルが結腸直腸癌におけるＥＧＦＲ阻害剤（特に、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体、例えば、セツキシマブおよびパニツムマブ）治療に対する応答の予測因子として使用可能であることを明らかに示している。
【００２９】
ＥＧＦＲシグナル伝達経路が関与することが知られている癌において得られたこれらの結果は、ＤＢＮＤＤ２および／またはＥＰＢ４１Ｌ４Ｂの発現レベルが、肺癌、卵巣癌、子宮内膜、甲状腺癌、鼻咽頭癌、前立腺癌、頭頸部癌、腎臓癌、膵臓癌、膀胱癌、または脳癌などの、ＥＧＦＲシグナル伝達経路が関与することが知られている他のいずれの癌においても、ＥＧＦＲ阻害剤（特に、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体、例えば、セツキシマブおよびパニツムマブ）に対する応答の予測因子として使用可能であることを明らかに示唆している。
【００３０】
従って、別の好ましい実施態様では、癌はＨｅｒ２陽性またはＨｅｒ２陰性（特に、トリプルネガティブ）乳癌、好ましくは、Ｈｅｒ２陰性（特に、トリプルネガティブ）乳癌である。
【００３１】
さらに別の好ましい実施態様では、癌は肺癌、特に、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。
【００３２】
さらに別の好ましい実施態様では、癌は膵臓癌である。
【００３３】
この予測はＥＧＦＲ阻害剤治療に関するものであるので、患者の腫瘍は好ましくはＥＧＦＲ陽性である。
【００３４】
好ましくは、患者は、ＫＲＡＳ野生型腫瘍を有し、すなわち、患者の腫瘍のＫＲＡＳ遺伝子は、コドン１２、１３（エキソン１）、または６１（エキソン３）で変異していない。言い換えれば、ＫＲＡＳ遺伝子は、コドン１２、１３および６１において野生型である。
【００３５】
野生型、すなわち、非変異型のコドン１２、１３（エキソン１）、および６１（エキソン３）はそれぞれグリシン（Ｇｌｙ、コドン１２）、グリシン（Ｇｌｙ、コドン１３）、およびグルタミン（Ｇｌｎ、コドン６１）に相当する。野生型参照ＫＲＡＳアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００４９７６．２（配列番号２４）に見出すことができる。
【００３６】
特に、患者の腫瘍のＫＲＡＳ遺伝子は、以下の突然変異のいずれをも示さない(Bos. Cancer Res 1989;49:4682-4689; Edkins et al. Cancer Biol Ther. 2006 August; 5(8): 928-932; Demiralay et al. Surgical Science, 2012, 3, 111-115)：
Ｇｌｙ１２Ｓｅｒ（ＧＧＴ＞ＡＧＴ）
Ｇｌｙ１２Ａｒｇ（ＧＧＴ＞ＣＧＴ）
Ｇｌｙ１２Ｃｙｓ（ＧＧＴ＞ＴＧＴ）
Ｇｌｙ１２Ａｓｐ（ＧＧＴ＞ＧＡＴ）
Ｇｌｙ１２Ａｌａ（ＧＧＴ＞ＧＣＴ）
Ｇｌｙ１２Ｖａｌ（ＧＧＴ＞ＧＴＴ）
Ｇｌｙ１３Ａｒｇ（ＧＧＣ＞ＣＧＣ）
Ｇｌｙ１３Ｃｙｓ（ＧＧＣ＞ＴＧＣ）
Ｇｌｙ１３Ａｓｐ（ＧＧＣ＞ＧＡＣ）
Ｇｌｙ１３Ａｌａ（ＧＧＣ＞ＧＣＣ）
Ｇｌｙ１３Ｖａｌ（ＧＧＣ＞ＧＴＣ）
【００３７】
好ましくは、患者の腫瘍のＫＲＡＳ遺伝子はまた、以下の突然変異のいずれをも示さない(Demiralay et al. Surgical Science, 2012, 3, 111-115)：
Ｇｌｙ１２Ｐｈｅ（ＧＧＴ＞ＴＴＴ）
Ｇｌｙ１３Ｓｅｒ（ＧＧＣ＞ＡＧＣ）
【００３８】
好ましくは、患者の腫瘍のＫＲＡＳ遺伝子はまた、以下の突然変異のいずれをも示さない(Bos. Cancer Res 1989;49:4682-4689; Tarn et al. Clin Cancer Res 2006;12:1647-1653; Edkins et al. Cancer Biol Ther. 2006 August; 5(8): 928-932; Demiralay et al. Surgical Science, 2012, 3, 111-115)：
Ｇｌｎ６１Ｈｉｓ（ＣＡＡ＞ＣＡＣ）
Ｇｌｎ６１Ｈｉｓ（ＣＡＡ＞ＣＡＴ）
Ｇｌｎ６１Ａｒｇ（ＣＡＡ＞ＣＧＡ）
Ｇｌｎ６１Ｌｅｕ（ＣＡＡ＞ＣＴＡ）
Ｇｌｎ６１Ｇｌｕ（ＣＡＡ＞ＧＡＡ）
Ｇｌｎ６１Ｌｙｓ（ＣＡＡ＞ＡＡＡ）
Ｇｌｎ６１Ｐｒｏ（ＣＡＡ＞ＣＣＡ）
【００３９】
患者のＫＲＡＳの状態を知るには、当技術分野で公知のいずれの方法を用いてもよい。
【００４０】
例えば、腫瘍組織を顕微解剖し、パラフィン包埋組織ブロックからＤＮＡを抽出する。ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２、１３、および６１を包含する領域を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅する。突然変異の状態は、ＰＣＲプローブを用いた対立遺伝子識別法(Laurent-Puig P, et al, J Clin Oncol. 2009, 27(35):5924-30)によるか、またはパイロシーケンス法(Ogino S, et al. J Mol Diagn 2008;7:413-21)などの他の任意の方法により判定する。
【００４１】
「サンプル」とは、患者に由来するいずれの生体サンプルであってもよく、核酸を含有する。このようなサンプルの例としては、体液（血液、血漿、唾液、尿、精液を含む）、組織、細胞サンプル、器官、生検などが挙げられる。好ましくは、サンプルは腫瘍サンプル、好ましくは、腫瘍組織生検または腫瘍外科切除片の全体もしくは一部である。サンプルは、従来技術に従って採取してよく、そのまま診断に用いてもよいし、または保存してもよい。腫瘍サンプルは新鮮物、冷凍物またはパラフィン包埋物であってもよい。通常、利用可能な腫瘍サンプルは冷凍物またはパラフィン包埋物であり、ほとんどの場合、パラフィン包埋物である。本発明者らは、冷凍およびパラフィン包埋両方の腫瘍サンプルが使用可能であることを示した。
【００４２】
「参照サンプル」とは、ＥＧＦＲ阻害剤治療に対して陽性または陰性の応答が知られている患者の腫瘍サンプル（特に、腫瘍生検または腫瘍外科切除片の全体もしくは一部）を意味する。好ましくは、参照サンプルのプールは、少なくとも１人（好ましくは数人、より好ましくは少なくとも５人、より好ましくは少なくとも６人、少なくとも７人、少なくとも８人、少なくとも９人、少なくとも１０人）の応答患者と、少なくとも１人（好ましくは数人、より好ましくは少なくとも６人、少なくとも７人、少なくとも８人、少なくとも９人、少なくとも１０人）の非応答患者を含んでなる。応答者（「陽性」とも称される）および非応答者（「陰性」とも称される）参照サンプルの数が多いほど、本発明による予測方法の信頼性が良好となる。
【００４３】
本発明に関して、「応答する可能性が高い」または「応答者」である患者は、抗ＥＧＦＲ阻害剤による治療に応答し得る、すなわち、その患者の症状の少なくとも１つが緩和されると期待される、またはその疾患の進展が停止される、もしくは緩徐化される患者を意味する。ＲＥＣＩＳＴ判定基準(Eisenhauer et al, European Journal of Cancer, 2009, 45:228-247)による完全応答者、部分応答者、または安定患者は、本発明に関して「応答する可能性が高い」または「応答者」とみなされる。
【００４４】
固形腫瘍では、ＲＥＣＩＳＴ判定基準は、少なくとも１つの測定可能な病巣の存在に基づく国際標準である。「完全応答」は、総ての標的病巣の消失を意味し、「部分応答」は、標的病巣の最大直径の合計における３０％の減少を意味し、「進行性疾患」は、標的病巣の最大直径の合計における２０％の増大を意味し、「安定疾患」は、上記の判定基準を満たさない変化を意味する。
【００４５】
より好ましくは、「応答者」患者は、良好な無進行生存期間（ＰＦＳ）を示すと予測され、すなわち、前記患者は疾患の症状の悪化なく、少なくとも２５週間生存する可能性があり、かつ／またはこのような患者は良好な全生存期間（ＯＳ）を示し、すなわち、前記患者は少なくとも１４か月生存する可能性がある。
【００４６】
「予測」または「予後」とは、患者がＥＧＦＲ阻害剤による治療に応答する確率または尤度を意味する。
【００４７】
本発明によれば、ＥＧＦＲ阻害剤による阻害に対する腫瘍細胞増殖の感受性は、腫瘍細胞がｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ標的遺伝子ＤＢＮＤＤ２およびＥＰＢ４１Ｌ４Ｂを発現するかどうかおよびそのレベルによって予測される。
【００４８】
用語「治療する」または「治療」とは、癌の進行を安定化させる、緩和する、治癒する、または軽減することを意味する。
【００４９】
「ｍｉＲＮＡ」または「マイクロＲＮＡ」は、ＤＮＡから転写されるがタンパク質には翻訳されない遺伝子（非コードＲＮＡ）によりコードされている約２１〜２４、好ましくは２１〜２３ヌクレオチド長の一本鎖分子であり、その代わりとして、それらはプリｍｉＲＮＡとして知られる一次転写産物から、プレｍｉＲＮＡと呼ばれる短いステム−ループ構造へ、そして最終的には機能的ｍｉＲＮＡへとプロセシングする。成熟過程で、各プレｍｉＲＮＡは高い相補性を有する２つの異なるフラグメントを生じ、一方はプリｍｉＲＮＡをコードする遺伝子の５’アームに起源し、他方は３’アームに起源する。成熟ｍｉＲＮＡ分子は１以上のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子と部分的に相補的であり、それらの主要な機能は遺伝子発現をダウンレギュレートすることである。
【００５０】
ｍｉＲＮＡには国際命名法があり(Ambros V et al, RNA 2003 9(3):277-279; Griffiths-Jones S. NAR 2004 32(データベース公開):D109-D111; Griffiths-Jones S et al. NAR 2006 34(データベース公開):D140-D144; Griffiths-Jones S et al. NAR 2008 36(データベース公開):D154-D158;およびKozomara A et al. NAR 2011 39(データベース公開):D152-D157)、http://www.mirbase.org/においてｍｉＲＢａｓｅから入手可能である。各ｍｉＲＮＡは、下記のように所定の形式で独自の名称が割り当てられる。
【００５１】
・成熟ｍｉＲＮＡの場合には、ｓｓｓ−ｍｉＲ−Ｘ−Ｙ、ここで、
・ｓｓｓはｍｉＲＮＡの種を示す３文字コードであり、「ｈａｓ」はヒトを表す。
・ｍｉＲの大文字「Ｒ」は、成熟ｍｉＲＮＡを表すことを示す。しかしながら、文献の著者によっては、成熟ｍｉＲＮＡに「ｍｉｒ」とも誤用している場合がある。この場合には、「−Ｙ」に存在により成熟ｍｉＲＮＡを表すと認識することができる。
・Ｘは、特定の種におけるｍｉＲＮＡの配列に割り当てられた独自の任意の数字であり、相同性の高いいくつかのｍｉＲＮＡが知られている場合には、この後に１文字が続き得る。例えば、「２０ａ」および「２０ｂ」は、相同性の高いｍｉＲＮＡを表す。
・Ｙは、プレｍｉＲＮＡの切断により得られた成熟ｍｉＲＮＡがプリｍＲＮＡをコードする遺伝子の５’アームに相当するか（その場合、Ｙは「５ｐ」）または３’アームに相当するか（その場合、Ｙは「３ｐ」）を示す。ｍｉＲＮＡのこれまでの国際命名法においては、「−Ｙ」は存在しない。その後、プリｍｉＲＮＡをコードする遺伝子の５’アームまたは３’アームのいずれかから得られた２つの成熟ｍｉＲＮＡは、ｎのすぐ後に「＊」の印があるかないかによって識別された。「＊」の印があれば、その配列はあまり頻繁に検出されないｍｉＲＮＡに相当することを示した。このような分類が変化を受けたことから、「３ｐ」および「５ｐ」コードを用いた新たな分類が実施された。
【００５２】
・プリｍｉＲＮＡの場合には、ｓｓｓ−ｍｉｒ−Ｘ、ここで、
・ｓｓｓはｍｉＲＮＡの種を示す３文字コードであり、「ｈａｓ」はヒトを表す。
・ｍｉｒの小文字「ｒ」は、成熟ｍｉＲＮＡではなく（「−Ｙ」がないことで確認される）プリｍｉＲＮＡを表すことを示す。
・ｎは、特定の種におけるｍｉＲＮＡの配列に割り当てられた独自の任意の数字であり、相同性の高いいくつかのｍｉＲＮＡが知られている場合には、この後に１文字が続き得る。
【００５３】
各ｍｉＲＮＡにはまた、その配列に受託番号が割り当てられる。
【００５４】
本発明で検出する２つの遺伝子（ＤＢＮＤＤ２およびＥＰＢ４１Ｌ４Ｂ）により標的とされるｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ（旧称ｈｓａ−ｍｉＲ−３１＊）である。この名称において、「ｈｓａ」はヒトｍｉＲＮＡに関するものであることを意味し、「ｍｉＲ」は成熟ｍｉＲＮＡを意味し、「３１」はこの特定のｍｉＲＮＡに割り当てられた任意の数字を意味し、「３ｐ」はプリｍｉＲＮＡをコードする遺伝子の３’アームから得られた成熟ｍｉＲＮＡを意味する。
【００５５】
ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐは、UGCUAUGCCAACAUAUUGCCAU（配列番号１）である
（http://www.mirbase.orgにおいて受託番号ＭＩＭＡＴ０００４５０４）。
【００５６】
「ＤＢＮＤＤ２」は、ヒトの２０番染色体（２０ｑ１３．１２）に位置する、ＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子データベースで「ディスビンディン（ディストロブレビン結合タンパク質１ドメイン含有２）(dysbindin (dystrobrevin binding protein 1) domain containing 2)」の公式記号（ＨＵＧＯ遺伝子命名法委員会（ＨＧＮＣ）により承認された公式の名称および記号）である。それはＵｎｉＧｅｎｅデータベース受託番号Ｈｓ．７３０６４３に相当する。この遺伝子に関して用いられるさらなる記号としては、ＣＫ１ＢＰ（「カゼインキナーゼ−１結合タンパク質」(casein kinase-1 binding protein)）、ＨＳＭＮＰ１、ＲＰ３−４５３Ｃ１２．９、およびＣ２０ｏｒｆ３５がある。ＤＢＮＤＤ２は、「ＳＣＦアポトーシス応答タンパク質１」としても知られる。下表１に詳細に示すように、このタンパク質にはいくつかのｍＲＮＡ変異体によりコードされている５つのアイソフォーム（ａ〜ｅ）が知られている。
【００５７】
【表１】
2017503478.tif 000002
【００５８】
「ＥＰＢ４１Ｌ４Ｂ」は、ヒトの９番染色体（９ｑ３１−ｑ３２）に位置する、ＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子データベースで「赤血球膜タンパク質バンド４．１ライク４Ｂの公式記号(erythrocyte membrane protein band 4.1 like 4B)」（ＨＧＮにより承認された公式の名称および記号）である。それはＵｎｉＧｅｎｅデータベース受託番号Ｈｓ．５９１９０１に相当する。この遺伝子に関して用いられるさらなる記号としては、ＣＧ１およびＥＨＭ２（「Expressed in Highly Metastatic cells 2」）がある。ＥＰＢ４１Ｌ４Ｂはまた、「ＦＥＲＭ含有タンパク質ＣＧ１」としても知られる。下表２に詳細に示すように、このタンパク質には２つのｍＲＮＡ変異体によりコードされている２つのアイソフォーム（１および２）が知られている。
【００５９】
【表２】
2017503478.tif 000003
【００６０】
サンプルにおいてＤＢＮＤＤ２および／またはＥＰＢ４１Ｌ４Ｂ発現レベルを検出する方法
ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ標的遺伝子ＤＢＮＤＤ２および／またはＥＰＢ４１Ｌ４Ｂの発現レベルは、当業者に公知のいずれの技術によって決定してもよい。特に、各遺伝子発現レベルは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、患者のサンプルから始め、ゲノムおよび／または核酸および／またはタンパク質レベルで測定し得る。好ましい実施態様では、発現プロファイルは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで各遺伝子の核酸転写産物の量を測定することにより決定される。別の実施態様では、発現プロファイルは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで各遺伝子によって産生されるタンパク質の量を測定することにより決定される。
【００６１】
このような測定は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、患者のサンプル、特に、腫瘍サンプルから始めて行い、必ずサンプルの変換を含む。実際に、サンプルの何らかのタイプの変換なしに行うことのできる特定の遺伝子発現レベルの測定はない。
【００６２】
ほとんどの技術が遺伝子ＤＮＡ、転写産物またはタンパク質に特異的に結合する試薬の使用に頼るものであり、従って、検出試薬をさらに含む改変サンプルとなる。
【００６３】
加えて、ほとんど技術が特定の試薬と結合する前に患者のサンプルからのＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはタンパク質の何らかの予備抽出も含む。従って、特許請求する方法もまた、患者のサンプルからＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはタンパク質を抽出する予備工程を含んでなり得る。さらに、ｍＲＮＡが抽出される場合、それらは一般に、ｍＲＮＡよりも安定なｃＤＮＡに逆転写される。従って、特許請求する方法もまた、患者のサンプルから抽出したｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する工程を含んでなり得る。
【００６４】
質量分析による検出は、特定の試薬との予備結合を必ずしも含まない。しかしながら、それは抽出されたＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはタンパク質に費やされる時間の大部分である。備抽出工程無しでサンプルに直接行う場合であっても、それはレーザー光によるサンプルからの分子の多少の抽出を含み、次に、抽出された分子が分光計により分析される。
【００６５】
いずれにせよ、どの技術を用いる場合でも、遺伝子発現レベルの測定後のサンプルの状態は患者から採取した最初のサンプルに比べて変換されている。
【００６６】
核酸転写産物の量は、当業者に公知のいずれの技術によっても測定することができる。特に、測定は、抽出されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）サンプルに対して直接、または抽出されたｍＲＮＡから当業者に周知の技術によって調製した逆転写相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に対して行ってよい。ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡサンプルから、核酸転写産物の量は、核酸マイクロアレイ、定量的ＰＣＲ、次世代シーケンシングおよび標識プローブとのハイブリダイゼーションを含む、当業者に公知のいずれの技術を用いて測定してもよい。
【００６７】
特に、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）が使用可能である。いくつかの実施態様では、ｑＲＴ−ＰＣＲは、ＲＮＡ標的の検出および定量の両方に使用することができる(Bustin et al., 2005, Clin. Sci., 109:365-379)。ｑＲＴ−ＰＣＲにより得られた定量結果は定性データよりも情報量が多い場合があり、アッセイの標準化および品質管理を簡単にすることができる。よって、いくつかの実施態様では、ｑＲＴ−ＰＣＲに基づくアッセイが、細胞に基づくアッセイの際にｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ標的遺伝子ＤＢＮＤＤ２および／またはＥＰＢ４１Ｌ４Ｂの発現レベルを測定するために有用であり得る。ｑＲＴ−ＰＣＲ法はまた、患者の療法のモニタリングにも有用であり得る。ｑＲＴ−ＰＣＲは周知であり、当業者には容易に利用可能な技術であり、厳密な記載を必要としない。ｑＲＴ−ＰＣＲに基づく方法の例は、例えば、米国特許第７，１０１，６６３号に見出すことができる。市販のｑＲＴ−ＰＣＲに基づく方法（例えばＴａｑｍａｎ(登録商標）アレイ）が例えば使用可能であり、プライマーおよび／またはプローブの設計は以下の表１および２に開示されているＤＢＮＤＤ２および／またはＥＰＢ４１Ｌ４Ｂの配列に基づいて容易になされる。
【００６８】
核酸アッセイまたはアレイもまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで患者のサンプル中の遺伝子転写産物の量を測定することによりｉｎ  ｖｉｔｒｏでサンプル中の遺伝子の発現レベルを評価するために使用可能である。いくつかの実施態様では、核酸マイクロアレイは、作製または購入可能である。アレイは一般に、固相支持体とその支持体に接触した少なくとも１つの核酸（ｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチド）を含み、このオリゴヌクレオチドが遺伝子の少なくとも一部に対応する。サンプル中のｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ標的遺伝子ＤＢＮＤＤ２および／またはＥＰＢ４１Ｌ４Ｂの存在を判定するために、いずれの好適なアッセイプラットフォームも使用可能である。例えば、アッセイは膜、チップ、ディスク、テストストリップ、フィルター、ミクロスフェア、マルチウェルプレートなどの形態であり得る。アッセイ系は、遺伝子に対応する核酸（ｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチド）が結合された固相支持体を備え得る。固相支持体は例えば、プラスチック、ケイ素、金属、樹脂またはガラスを含んでなり得る。アッセイ成分は、遺伝子を検出するためのキットとして一緒に調製および包装することができる。標的核酸サンプルの発現プロファイルを決定するために、前記サンプルを標識し、ハイブリダイゼーション条件でマイクロアレイと接触させると、マイクロアレイ表面に結合されているプローブ配列と相補的な標的核酸間で複合体の形成が起こる。次に、標識されたハイブリダイズ複合体の存在を検出する。マイクロアレイハイブリダイゼーション技術の多くの変形が当業者に利用可能である。
【００６９】
別の実施態様では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ標的遺伝子ＤＢＮＤＤ２および／またはＥＰＢ４１Ｌ４Ｂの発現レベルの測定は、患者のサンプルから抽出された遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ）のシーケンシングによって行ってもよい。
【００７０】
さらに別の実施態様では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ標的遺伝子ＤＢＮＤＤ２および／またはＥＰＢ４１Ｌ４Ｂの発現レベルの測定は、患者のサンプルから抽出された総タンパク質中の遺伝子コードタンパク質の量を測定するためのタンパク質マイクロアレイによって行ってもよい。
【００７１】
患者の分類
ＤＢＮＤＤ２および／またはＥＰＢ４１Ｌ４Ｂの発現レベルに基づく分類
ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ標的遺伝子ＤＢＮＤＤ２および／またはＥＰＢ４１Ｌ４Ｂの発現が高いほど、患者にとって良好である。従って、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ標的遺伝子ＤＢＮＤＤ２および／またはＥＰＢ４１Ｌ４Ｂの発現レベルが高いほど、患者がＥＧＦＲ阻害剤治療に応答する可能性が高い。一つの実施態様では、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ標的遺伝子ＤＢＮＤＤ２および／またはＥＰＢ４１Ｌ４Ｂが対照値よりも高い場合、患者は「応答者」、すなわち、ＥＧＦＲ阻害剤による治療に応答する可能性が高いとみなされる。
【００７２】
このような対照値は、上記で定義したように、参照サンプルのプールに基づいて決定することができる。特に、図６は、参照サンプルのプールに基づき、ＤＢＮＤＤ２およびＥＰＢ４１Ｌ４Ｂ発現レベルの対照値（ＤＢＮＤＤ２：ＥＰＢ４１Ｌ４Ｂ発現レベルの対数）を定義することができ、これによりＥＧＦＲ阻害剤治療に対する応答または非応答を予測可能であることを明らかに示す。
【００７３】
しかしながら、好ましい実施態様では、この方法は、少なくとも１つのｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ標的遺伝子ＤＢＮＤＤ２およびＥＰＢ４１Ｌ４Ｂの発現レベルに基づく予後スコアまたは指数を決定することをさらに含んでなり、その予後スコアは、患者がＥＧＦＲ阻害剤に応答する可能性が高いかどうかを示す。特に、前記予後スコアは、それが所定の閾値よりも高いか低いか（二分結果）によって、その患者がＥＧＦＲ阻害剤に応答する可能性が高いかどうかを示し得る。別の実施態様では、ＥＧＦＲ阻害剤に対する応答または非応答の離散確率は、予後スコアから導くことができる。
【００７４】
患者がＥＧＦＲ阻害剤治療に応答する確率は、ＥＧＦＲ阻害剤治療が患者に投与される場合に、この患者が病勢の進行を伴ってまたは伴わずに生存する確率と関係している。
【００７５】
結果として、予後スコアは、上記で定義したようにｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ標的遺伝子ＤＢＮＤＤ２およびＥＰＢ４１Ｌ４Ｂの少なくとも１つの発現レベルと参照サンプルのプールの無進行生存率（ＰＦＳ）または全生存率（ＯＳ）の間の相関の分析に基づいて決定することができる。従って、ＰＦＳまたはＯＳをｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ標的遺伝子ＤＢＮＤＤ２およびＥＰＢ４１Ｌ４Ｂの少なくとも１つの発現レベルと相関させる関数であるＰＦＳおよび／またはＯＳスコアは、ＥＧＦＲ阻害剤に対する応答の予測のための予後スコアとして使用することができる。好ましくは、病勢進行の不在はＥＧＦＲ阻害剤治療に対する応答の明らかな指標となるので、ＰＦＳスコアが使用される。
【００７６】
本発明者らによって得られた実験データは、患者のＥＧＦＲ阻害剤治療に応答する確率がＤＢＮＤＤ２およびＥＰＢ４１Ｌ４Ｂの発現レベルの対数に直線的な負の相関があることを示す（図１、２および５参照）。好ましい実施態様では、前記予後スコアは、従って、下式で表される：
予後スコア＝ａ＊ｘ＋ｂ、式中、ｘは、患者のサンプルで測定されたＤＢＮＤＤ２および／またはＥＰＢ４１Ｌ４Ｂの発現レベルの対数（好ましくは、「ｌｏｇ２」と表される２を底とする対数）であり、かつ、ａおよびｂは、上記で定義されたように、参照サンプルのプールに基づいて事前に決定されたパラメーターである。
【００７７】
ａが正／負であるかによって、その患者は、その患者の予後スコアが閾値ｃ以上／以下であればＥＧＦＲ阻害剤に応答する、その予後スコアが閾値ｃより小さければ／大きければＥＧＦＲ阻害剤に応答しないと予測することができ、ここで、ｃの値も同じ参照サンプルプールに基づいて決定されたものであり、
ａが正であるとき、その患者は、その患者の予後スコアが閾値ｃ以上であればＥＧＦＲ阻害剤に応答すると予測し、その患者の予後スコアが閾値ｃより小さければＥＧＦＲ阻害剤に応答しないと予測することができ、
あるいは、ａが負であるとき、その患者は、その患者の予後スコアが閾値ｃ以下であればＥＧＦＲ阻害剤に応答すると予測し、その患者の予後スコアが閾値ｃより大きければＥＧＦＲ阻害剤に応答しないと予測することができる。
【００７８】
別の実施態様では、ＥＧＦＲ阻害剤に対する応答または不応答の離散確率は、ａ＊ｘ＋ｂ予後スコアから導くことができる。予後スコアとＥＧＦＲ阻害剤治療に対する応答の確率の間の厳密な相関は、同じ参照サンプルセットに基づいて決定することができる。ａが正／負であるかによって、予後スコアが高い／低いほど、高いＥＧＦＲ阻害剤治療に対する応答確率を示す：
ａが正であれば、予後スコアが高いほどＥＧＦＲ阻害剤治療に応答する確率が高く（すなわち、ＰＦＳスコアの場合には、疾患進行の確率が低く）、
あるいは、ａが負であれば、予後スコアが低いほどＥＧＦＲ阻害剤治療に応答する確率が高い（すなわち、ＰＦＳスコアの場合には、疾患進行の確率が低い）。
【００７９】
癌を有する患者がＥＧＦＲ阻害剤に応答する可能性が高いかどうかというこの予測はまた、ノモグラムを使用して行うこともできる。ノモグラムでは、対象とするスコアの各変数に対して点数スケールが設定される。ある患者について、各変数の点数スケールから対応する点数を選択することにより、それぞれの変数に点数を割り当てる。離散変数の場合（例えば、遺伝子発現レベル）、ある変数に帰属する点数は、その変数の値と直線的に相関させる。二分変数の場合（とり得る値が２つだけ）、とり得る２つの値または変数のそれぞれに異なる２つの値が帰属する。次に、各変数に割り当てられた点数を加算することで対象スコアを算出する（合計点数）。このスコアの値に基づき、次に、総合スコアが閾値（二分スコア）よりも劣っているか優れているかによって良好な応答予後か不良な応答予後かを、または治療に対する応答もしくは非応答の確率を患者に与えることができる。
【００８０】
ノモグラムは主としていくつかの異なる変数を合わせて総合スコアとする際に有用であることは明らかである（ＤＢＮＤＤ２とＥＰＢ４１Ｌ４Ｂの発現レベル；ＤＢＮＤＤ２および／またはＥＰＢ４１Ｌ４Ｂの発現レベルとｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ発現レベル；またはＤＢＮＤＤ２および／またはＥＰＢ４１Ｌ４Ｂの発現レベルとＢＲＡＦの状態を合わせた総合スコアを使用する可能性については下記を参照）。しかしながら、ノモグラムはまた、ＤＢＮＤＤ２またはＥＰＢ４１Ｌ４Ｂ発現レベルなどの１つの変数だけに基づく予後スコアを表すために使用してもよい。この場合、合計点数は単一の変数に割り当てられた点数に相当する。
【００８１】
ＤＢＮＤＤ２の対数（ｌｏｇ２）発現レベルに基づき結腸直腸癌患者で進行リスク（すなわち、ＥＧＦＲ阻害剤に対する不応答リスク）の決定を可能とするノモグラムの一例を図３に示す（以下の実施例２も参照）。
【００８２】
よって、本発明に従い、癌を有する患者がＥＧＦＲ阻害剤に応答する可能性が高いかどうかを予測するための方法の一実施態様では、その方法は、参照サンプルのプールに基づいて較正されたノモグラムに基づき不応答リスクを決定することをさらに含んでなる。ノモグラムはＯＳまたはＰＦＳデータに基づいて較正することができる。ＯＳに基づいて較正された場合、不応答リスクは死亡リスクに相当する。ＰＦＳに基づいて較正された場合、不応答リスクは疾病進行リスクに相当する（図３参照）。
【００８３】
上記で説明したように、ＤＢＮＤＤ２およびＥＰＢ４１Ｌ４Ｂはそれぞれｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの標的遺伝子であること、およびＥＧＦＲ阻害剤に対する応答に独立に有意に関連することが分かっているので、ＤＢＮＤＤ２およびＥＰＢ４１Ｌ４Ｂのうち１つだけの発現レベルを測定し、本発明による方法における予測のために使用してもよい。
【００８４】
しかしながら、本発明による方法はまた、患者のサンプルにおいてＤＢＮＤＤ２とＥＰＢ４１Ｌ４Ｂの両方の発現レベルを決定し、ＤＢＮＤＤ２とＥＰＢ４１Ｌ４Ｂの発現の組合せに基づいて応答または不応答を予測することも含んでなり得る。ＤＢＮＤＤ２とＥＰＢ４１Ｌ４Ｂの発現レベルを組み合わせた総合スコアは、特に、参照サンプルのプールに基づいて作成することができる。ノモグラムもまたＤＢＮＤＤ２とＥＰＢ４１Ｌ４Ｂの発現レベルを組み合わせて総合スコアを得るために使用可能であり、次にこの総合スコアを不応答リスク（すなわち、ＰＦＳスコアについては、疾患進行リスク）と相関させることができる。
【００８５】
ＤＢＮＤＤ２および／またはＥＰＢ４１Ｌ４Ｂの発現レベルとＥＧＦＲ阻害剤に対する応答と正または負の相関があるさらなるパラメーターに基づく分類
ＥＧＦＲ阻害剤に対する応答は、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ標的遺伝子ＤＢＮＤＤ２およびＥＰＢ４１Ｌ４Ｂの少なくとも１つの発現レベルのみに基づいて予測することができ（実施例１、２および３参照）、本発明による方法はまた、ＥＧＦＲ阻害剤に対する応答と正または負の相関がある少なくとも１つの他のパラメーターを決定することも含んでなり得る。
【００８６】
この場合、ＤＢＮＤＤ２および／またはＥＰＢ４１Ｌ４Ｂの発現レベルと他のパラメーターを組み合わせた総合スコアが特に、参照サンプルのプールに基づいて作成することができる。
【００８７】
点数スケールが総合スコアの各変数に対して設定されているノモグラムもまた、ＤＢＮＤＤ２および／またはＥＰＢ４１Ｌ４Ｂの発現レベルと他のパラメーターを組み合わせて総合スコアを得るために使用可能であり、次にこの総合スコアを不応答リスク（すなわち、ＰＦＳスコアについては、疾患進行リスク）と相関させることができる。ある患者について、各変数の点数スケールから対応する点数を選択することにより、それぞれの変数に点数を割り当てる。離散変数の場合（例えば、ＤＢＮＤＤ２またはＥＰＢ４１Ｌ４Ｂ発現レベルまたは年齢）、ある変数に帰属する点数は、その変数の値と直線的に相関させる。二分変数の場合（ＢＲＡＦ突然変異の状態または性別など、とり得る値が２つだけ）、とり得る２つの値または変数のそれぞれに異なる２つの値が帰属する。
【００８８】
次に、各変数に割り当てられた点数を加算することで総合スコアを算出する（合計点数）。この総合スコアの値に基づき、次に、総合スコアが閾値（二分スコア）よりも劣っているか優れているかによって良好な応答予後か不良な応答予後かを、または治療に対する応答もしくは非応答の確率を患者に与えることができる。
【００８９】
各変数の点数スケールは、それを上回る／下回ると応答予後が良好または不良であるという閾値、または総合スコアと応答もしくは非応答の確率との間の相関と同様に、参照サンプルの同じプールに基づいて決定することができる。
【００９０】
このようなＥＧＦＲ阻害剤に対する応答と正または負の相関がある他のパラメーターは特に以下のものから選択することができる：
・年齢；
・性別；
・ＤＢＮＤＤ２およびＥＰＢ４１Ｌ４Ｂの発現レベルを測定するために上記で開示した方法により、ゲノムレベルおよび／または核酸レベル（特に、各遺伝子の核酸転写産物の量を測定することによる）および／またはタンパク質レベルで測定され得る、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの発現レベル；および／または
・ＥＧＦＲ阻害剤に対する応答と正または負の相関がある少なくとも１つの突然変異の存在または不在。
【００９１】
このような突然変異は、当業者に公知のいずれの方法によって検出してもよく、特に下表３に記載のものを含む。
【００９２】
【表３】
2017503478.tif 000004
【００９３】
ＥＧＦＲ阻害剤
本発明は、１以上の上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤に対する患者の応答性を、そのような薬剤による治療の前に予測することを可能とする。
【００９４】
ＥＧＲＦ阻害剤はＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤であってよく、あるいはＥＧＦＲ標的の細胞外ドメインを標的とするものであってもよい。特定の実施態様では、ＥＧＦＲ阻害剤は、チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、エルロチニブ、ゲフィチニブ、もしくはラパチニブ、またはＥＧＦＲ細胞外ドメインを標的とする分子、例えば、セツキシマブまたはパニツムマブである。
【００９５】
好ましくは、ＥＧＦＲ阻害剤は、抗ＥＧＦＲ抗体、好ましくは、モノクローナル抗体、特に、セツキシマブまたはパニツムマブである。
【００９６】
ＥＧＦＲ細胞外ドメインを標的とする分子（抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体、例えば、セツキシマブまたはパニツムマブを含む）は、主として結腸直腸癌の治療または乳癌治療に使用される。結果として、患者の癌が結腸直腸癌（特に、転移性結腸直腸癌）または乳癌であれば、本発明による方法は、ＥＧＦＲ細胞外ドメインを標的とする分子、特に、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体、例えば、セツキシマブまたはパニツムマブに対する応答を予測するために使用可能であることが好ましい。
【００９７】
これに対して、チロシンキナーゼＥＧＦＲ阻害剤は主として肺癌（特に、非小細胞肺癌、ＮＳＣＬＣ）の治療に使用されるので、患者の癌が肺癌（特に、非小細胞肺癌、ＮＳＣＬＣ）であれば、本発明による方法は、チロシンキナーゼＥＧＦＲ阻害剤、例えば、エルロチニブ、ゲフィチニブ、またはラパチニブに対する応答を予測するために使用可能であることが好ましい。
【００９８】
膵臓癌または頭頸部癌（特に、頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ））では、チロシンキナーゼＥＧＦＲ阻害剤および抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体が療法として試験されているので、患者の癌が膵臓癌または頭頸部癌（特に、頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ））であれば、本発明による方法は、チロシンキナーゼＥＧＦＲ阻害剤（例えば、エルロチニブ、ゲフィチニブ、もしくはラパチニブ）または抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体（例えば、セツキシマブもしくはパニツムマブ）のいずれかに対する応答を予測することが可能である。
【００９９】
セツキシマブおよびパニツムマブは、現在、臨床で主として使用されている抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体である。しかしながら、ニモツズマブ（ＴｈｅｒａＣＩＭ−ｈ−Ｒ３）、マツズマブ（ＥＭＤ７２０００）、およびザルツムマブ（ＨｕＭａｘ−ＥＧＦｒ）などのさらなる抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体が開発中である。本発明による方法はまた、特に、患者が結腸直腸癌（特に、転移性結腸直腸癌）、乳癌、膵臓癌または頭頸部癌（特に、頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ））に罹患している場合には、これらの抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体またはさらに開発され得るであろう他の任意の抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体（フラグメントを含む）に対する応答を予測するために使用可能である。
【０１００】
同様に、エルロチニブ、ゲフィチニブ、およびラパチニブは、現在、臨床で主として使用されているチロシンキナーゼＥＧＦＲ阻害剤である。しかしながら、カネルチニブ（ＣＩ−１０３３）、ネラチニブ（ＨＫＩ−２７２）、アファチニブ（ＢＩＢＷ２９９２）、ダコミチニブ（ＰＦ２９９８０４，ＰＦ−００２９９８０４）、ＴＡＫ−２８５、ＡＳＴ−１３０６、ＡＲＲＹ３３４５４３、ＡＧ−１４７８（チルホスチンＡＧ−１４７８）、ＡＶ−４１２、ＯＳＩ−４２０（デスメチルエルロチニブ）、ＡＺＤ８９３１、ＡＥＥ７８８（ＮＶＰ−ＡＥＥ７８８）、ペリチニブ（ＥＫＢ−５６９）、ＣＵＤＣ−１０１、ＡＧ４９０、ＰＤ１５３０３５ＨＣｌ、ＸＬ６４７、およびＢＭＳ−５９９６２６（ＡＣ４８０）などのさらなるチロシンキナーゼＥＧＦＲ阻害剤が開発中である。本発明による方法はまた、特に、患者が肺癌（特に、非小細胞肺癌、ＮＳＣＬＣ）、膵臓癌、または頭頸部癌（特に、頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ））に罹患している場合には、これらのチロシンキナーゼＥＧＦＲ阻害剤またはさらに開発され得るであろう他の任意のチロシンキナーゼＥＧＦＲ阻害剤に対する応答を予測するために使用可能である。
【０１０１】
キット
本発明はまた、癌を有する患者が上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤に応答する可能性が高いかどうかを決定するためのキットであって、
ａ）前記患者のサンプル（好ましくは、腫瘍生検または腫瘍外科切除片の全体もしくは一部などの腫瘍サンプル）においてｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ（配列番号１）ｍｉＲＮＡの少なくとも１つの標的遺伝子の発現レベルを決定するための試薬（ここで、前記ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの標的遺伝子はＤＢＮＤＤ２およびＥＰＢ４１Ｌ４Ｂから選択される）、および
ｂ）ＥＧＦＲ阻害剤に対する応答と正または負の相関がある少なくとも１つの他のパラメーターを決定するための試薬（このような試薬は特に、
ｉ）前記患者のサンプル（好ましくは、腫瘍生検または腫瘍外科切除片の全体もしくは一部などの腫瘍サンプル）において、ＥＧＦＲ阻害剤と正または負の相関がある少なくとも１つのｍｉＲＮＡ、特に、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ（配列番号１）ｍｉＲＮＡまたはｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐ（配列番号３４）ｍｉＲＮＡの発現レベルを決定するための試薬、および／または
ｉｉ）上記表３に記載されたものなど、ＥＧＦＲ阻害剤に対する応答と正または負の相関がある少なくとも１つの突然変異を検出するため
の試薬を含み得る）
を含んでなる、またはからなるキットに関する。
【０１０２】
前記患者のサンプルにおいて、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ標的遺伝子ＤＢＮＤＤ２およびＥＰＢ４１Ｌ４Ｂの少なくとも１つ、またはＥＧＦＲ阻害剤、特に、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐそれ自体もしくはｈｓａ−ｍｉＲ−３１−５ｐに対する応答と正または負の相関がある少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルを決定するための試薬は、特に、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ標的遺伝子ＤＢＮＤＤ２およびＥＰＢ４１Ｌ４Ｂの少なくとも１つに特異的なプライマー対（フォワードおよびリバースプライマー）および／もしくはプローブ、またはｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ標的遺伝子ＤＢＮＤＤ２およびＥＰＢ４１Ｌ４Ｂの少なくとも１つに特異的な配列を含んでなるマイクロアレイを含み得る。プライマーおよび／またはプローブの設計は、当業者ならば、上記の表１および２に開示されているＤＢＮＤＤ２および／またはＥＰＢ４１Ｌ４Ｂの配列に基づいて容易に行うことができる。
【０１０３】
ＥＧＦＲ阻害剤に対する応答と正または負の相関がある少なくとも１つの突然変異を検出するための試薬としては、シーケンシング前に対象遺伝子の全体もしくは一部を増幅するための少なくとも１つのプライマー対、または例えば、ＡＢＩ  ７９００ＨＴ配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティ、ＣＡ）での対立遺伝子識別アッセイにおいて使用するための５’末端がリポーター色素で標識された特異的プローブのセット（ＢＲＡＦ突然変異Ｖ６００の検出に関しては、Laurent-Puig P, et al, J ClinOncol. 2009, 27(35):5924-30およびLievre et al. J ClinOncol. 2008 Jan 20;26(3):374-9を参照）を含み得る。
【０１０４】
本発明のキットは、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ標的遺伝子ＤＢＮＤＤ２およびＥＰＢ４１Ｌ４Ｂの少なくとも１つの発現レベルおよび他の供試パラメーターに基づいて、患者がＥＧＦＲ阻害剤に応答する可能性が高いかどうかを決定するための説明書をさらに含んでなり得る。特に、総合スコアおよび総合スコア（合計点数）と予測（応答／非応答または応答もしくは非応答の確率）との間の相関に含まれる総ての変数の点数スケールを含んだノモグラムが含まれてよい。
【０１０５】
薬物、治療的使用および治療方法
本発明の方法は、ＥＧＦＲ阻害剤に関して報告されている臨床応答率に見合う率でＥＧＦＲ阻害剤に対する患者の応答性を予測する。
【０１０６】
よって、癌を有する患者を治療するための方法がさらに提供され、その方法は、患者に少なくとも１種類のＥＧＦＲ阻害剤を投与することを含んでなり、この場合、前記患者は上記のような方法によって「応答者」または「応答する可能性が高い」と予測（または分類）されている。
【０１０７】
特に、本発明は、癌に罹患している患者を治療するための方法に関し、その方法は、（ｉ）本発明による方法によって、患者がＥＧＦＲ阻害剤に応答する可能性が高いかどうかを決定すること、および（ｉｉ）前記患者がＥＧＦＲ阻害剤に応答する可能性が高いと決定された場合に、前記患者にＥＧＦＲ阻害剤を投与することを含んでなる。
【０１０８】
本方法は、患者がＥＧＦＲ阻害剤に応答する可能性が低いと決定された場合に、前記患者に別の抗癌治療を投与する工程（ｉｉｉ）をさらに含んでなり得る。このような別の抗癌治療は具体的な癌およびそれまでに試されている治療にもよるが、特に、放射線療法、他の化学療法分子、または他の抗原に対するモノクローナル抗体（抗Ｈｅｒ２、抗ＶＥＧＦ、抗ＥＰＣＡＭ、抗ＣＴＬＡ４など）などの他の生物工学製品から選択されてよい。
【０１０９】
特に、結腸直腸癌の場合、患者がＥＧＦＲ阻害剤に応答する可能性が低いと決定された場合には、工程（ｉｉｉ）で投与される別の抗癌治療は、
・ＶＥＧＦ阻害剤、特に、抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体（例えば、ベバシズマブ）、有利には、ＦＯＬＦＯＸ（ロイコボリン（フォリン酸）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、およびオキサリプラチンの合剤）またはＦＯＬＦＩＲＩ（ロイコボリン（フォリン酸）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、およびイリノテカンの合剤）化学療法との併用から選択してよく、
・あるいは、患者がすでにＶＥＧＦ阻害剤により、場合により、ＦＯＬＦＯＸまたはＦＯＬＦＩＲＩ化学療法と併用して上手く治療できなかった場合には、５−ＦＵとともに、場合により、マイトマイシンＢも併用して投与することができる。特定の抗腫瘍薬投与計画なしで生活の質を最大化することを意図して投与される治療と定義されるベストサポーティブケア（すなわち、抗癌治療ではない）を患者にさらに投与してもよい。
【０１１０】
本発明のもう１つの目的は、上記で定義した方法によって患者が応答する可能性が高いと分類された場合に、癌に罹患している患者の治療に使用するためのＥＧＦＲ阻害剤である。本発明はまた、癌に罹患している患者の治療に使用するためのＥＧＦＲ阻害剤に関し、前記治療は、上記で定義した方法によって前記患者がＥＧＦＲ阻害剤に応答する可能性が高いかどうかを予測する予備工程を含んでなり、前記ＥＧＦＲ阻害剤は、上記で定義した方法によって前記患者がＥＧＦＲ阻害剤に応答する可能性が高いと予測された場合にのみ患者に投与される。前記患者は、結腸直腸癌、より詳しくは、転移性結腸直腸癌患者であり得る。あるいは、前記患者は、乳癌、特に、トリプルネガティブ乳癌患者であり得る。あるいは、前記患者は、肺癌、特に、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者であり得る。あるいは、前記患者は、頭頸部癌、特に、頭頸部扁平上皮癌患者であり得る。あるいは、前記患者は、膵臓癌患者であり得る。本発明はまた、上記のような本発明の方法によって「応答者」と分類された患者における癌の治療に使用することを意図した薬剤の製造のためのＥＧＦＲ阻害剤の使用に関する。
【０１１１】
好ましい実施態様では、ＥＧＦＲ阻害剤は、抗ＥＧＦＲ抗体、好ましくは、セツキシマブまたはパニツムマブである。あるいは、ＥＧＦＲ阻害剤は、チロシンキナーゼＥＧＦＲ阻害剤、特に、エルロチニブ、ゲフィチニブ、またはラパチニブであり得る。
【０１１２】
好ましい実施態様では、
・患者は結腸直腸癌、特に、転移性結腸直腸癌に罹患しており、ＥＧＦＲ阻害剤は抗ＥＧＦＲ抗体、好ましくは、セツキシマブまたはパニツムマブであり；
・患者は乳癌、特に、トリプルネガティブ乳癌に罹患しており、ＥＧＦＲ阻害剤は抗ＥＧＦＲ抗体、好ましくは、セツキシマブまたはパニツムマブであり；
・患者は肺癌、特に、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）に罹患しており、ＥＧＦＲ阻害剤はチロシンキナーゼＥＧＦＲ阻害剤、特に、エルロチニブ、ゲフィチニブ、またはラパチニブであり；
・患者は頭頸部癌、特に、頭頸部扁平上皮癌、または膵臓癌に罹患しており、ＥＧＦＲ阻害剤は抗ＥＧＦＲ抗体（好ましくは、セツキシマブまたはパニツムマブ）またはチロシンキナーゼＥＧＦＲ阻害剤（特に、エルロチニブ、ゲフィチニブ、またはラパチニブ）である。
【０１１３】
実施例および図面は本発明を例示するものであり、その範囲を限定しない。
【実施例】
【０１１４】
実施例１：ＤＢＮＤＤ２およびＥＰＢ４１Ｌ４Ｂはｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの標的であり、ＥＧＦＲ阻害剤に対する応答を独立に予測する
患者および方法
患者
患者セットは、男性１４名と女性６名の２０名のｍＣＲＣ（転移性結腸直腸癌）患者から構成された。年齢の中央値は６６．４９±１１．９歳であった。全患者がイリノテカンとセツキシマブの組合せを受容した。セツキシマブの導入前の化学療法系統の数を記録した。進行までの経過観察の中央値は２０週であり、全生存期間の中央値は１０か月であった。総ての腫瘍サンプルは切除片に由来し、ホルマリンで固定し、パラフィン包埋した（ＦＦＰＥ）。
【０１１５】
細胞培養およびトランスフェクション
本発明者らは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ、マナサス、ＣＡ）からｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ発現の弱い３つの結腸直腸腺癌細胞株：ＨＴＢ−３７、ＣＣＬ−２２２およびＣＣＬ−２２０−１を選択した。ＨＴＢ−３７細胞は、安定なグルタミンを２０％ウシ胎仔血清および１％ペニシリン／ストレプトマイシンとともに含むダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）の培養培地で維持した。ＣＣＬ−２２２細胞およびＣＣＬ−２２０−１細胞は、安定なグルタミンを１０％ウシ胎仔血清とともに含むＲＰＭＩ  １６４０培養培地で維持した。これらの細胞を温度３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。
【０１１６】
総ての細胞をｍｉＲＶａｎａ  ｍｉＲＮＡミミック陰性対照またはｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ  ｍｉＲＶａｎａ  ｍｉＲＮＡミミック（Ａｍｂｉｏｎ）でトランスフェクトした。ＣＣＬ−２２２については、トランスフェクションは、２μｌのリポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘを用い、製造者のプロトコールに従い、リバーストランスフェクションプロトコールで、１２ウェルプレートにて２５ｐｍｏｌのＭｉＲＮＡミミックおよび６００００細胞を用いて行った。ＣＣＬ−２２０−１およびＨＢＴ２７については、トランスフェクションは、４μｌのＲｉｂｏＣｅｌｌｉｎ（ＢｉｏＣｅｌｌＣｈａｌｌｅｎｇｅ、トゥーロン、フランス）を製造者のプロトコールに従って用い、１２ウェルプレートにて１２．５ｐｍｏｌのｍｉＲＮＡミミックおよび１０００００細胞を用いて行った。総ての細胞株について、トランスフェクション２４時間後に細胞を採取し、ｍｉＲＮｅａｓｙ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）で全ＲＮＡの抽出を行うまでにＱｉａｚｏｌを用いてＲＮＡを保護した。トランスフェクションの有効性を評価するために、下記のようにｍｉＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ発現レベルの特異的定量を行った。
【０１１７】
遺伝子発現の測定
遺伝子発現マイクロアレイは、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＨｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  １．０を用いて行った。５０ｎｇの全ＲＮＡをＯｖａｔｉｏｎ  ＰｉｃｏＳＬ  ＷＴＡ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｖ２（Ｎｕｇｅｎ、サンカルロス、ＣＡ）に従って逆転写した。次に、ＳＰＩＡ技術に基づいて増幅を行った。Ｎｕｇｅｎプロトコールに従って精製した後、２．５μｇの一本鎖ＤＮＡを断片化およびＥｎｃｏｒｅ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｍｏｄｕｌｅ（Ｎｕｇｅｎ）を用いたビオチン標識のために使用した。Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００を用いて断片化の制御を行った後、次に、ｃＤＮＡを４５℃で１７時間、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  １．０  ＳＴ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）とハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、チップをフルイディックステーションＦＳ４５０にて特定のプロトコール（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）に従って洗浄し、ＧＣＳ３０００  ７Ｇを用いてスキャンした。次に、画像をＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃｏｎｓｏｌｅソフトウエア（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）で解析して生データ（ＣＥＬファイル）および品質管理のためのメトリクスを得た。
【０１１８】
細胞株およびＦＦＰＥ患者サンプルでの標的発現のｑＲＴ−ＰＣＲバリデーションは、ＦＦＰＥサンプルでは２０ｎｇの全ＲＮＡまたは５０ｎｇの全ＲＮＡ細胞培養サンプルに対し、ＡＢＩ７９００ＨＴリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いて行った。総ての反応を３反復で行った。発現レベルは、ΔΔＣｔ方法によってＲＮＡ１８ＳおよびＧＡＰＤＨレベルに対して正規化した。
【０１１９】
ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析
本発明者らは、６つの個々の予測データベース（ＰＩＴＡ、ｐｉｃＴａｒ  ５−ｗａｙ、Ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ．ｏｒｇ、ＭｉｃｒｏＣｏｓｍおよびｍｉＲＤＢ）からの最新のｍｉｃｒｏＲＮＡ標的予測を統合したデータポータルを開発した。このポータルは、各マイクロＲＮＡ／標的の関係を予測するマイクロＲＮＡ予測データベースの数と個々の予測データベースからの各ｍｉＲＮＡの予測の順位を考慮して、候補遺伝子のリストによって共標的される可能性のあるマイクロＲＮＡを決定することを可能とする。このデータベースは、報告した分析を行うために２０１２年１１月に更新したものである。
【０１２０】
統計分析
生存の統計分析は、Ｒパッケージ‘ｓｕｒｖｉｖａｌ’および‘ｒｍｓ’を用いて行った。単変量および多変量解析はコックス比例回帰ハザードモデルを用い、ハザード比（ＨＲ）を生成した。ノモグラムはコックス比例回帰ハザードモデルに基づいて開発されたものであり、無進行生存の確率を予測する。
【０１２１】
偽陽性率（ＦＤＲ）補正ｐ値は、多重検定補正のためのＢｅｎｊａｍｉｎｉおよびＨｏｃｈｂｅｒｇ法を用いて算出した。ｃｏｒ．ｔｅｓｔ関数を用い、発現値間のピアソン相関を適合するｐ値とともに算出した。統計的有意性は、総ての解析でｐ＜０．０５で設定した。
【０１２２】
結果
ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ発現の弱い３つのＣＲＣ細胞株をｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐミミックまたはミミック対照でトランスフェクトした。トランスフェクションの有効性は、死亡または増殖欠陥なく、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐレベルの１５００倍の平均上昇により証明した。トランスフェクト細胞の発現プロファイル解析により、本発明者らは、下表４に記載の通り、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐにより有意にダウンレギュレーションを受けた４７の遺伝子（ｆｃ＜０．７７、ｐ＜０．０５）と有意にアップレギュレーションを受けた２７の遺伝子（ｆｃ＜１．３、ｐ＜０．０５）の同定が可能であった。
【０１２３】
【表４】
2017503478.tif 000005
【０１２４】
マイクロＲＮＡの役割はその転写産物標的の分解を含むので、６つのウェブで利用可能なものからの情報を含むデータベースが５４のダウンレギュレーションを受けた遺伝子をｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ推定標的として予測するかどうか検討した。このデータベースはｍｉＲＮＡ名または遺伝子名のいずれかをクエリーとし得る。ｍｉＲＮＡ名をクエリーとする場合、データベースは、データベースに含まれる構造データおよび潜在的実験データに基づき、それらの遺伝子がクエリーｍｉＲＮＡの真の標的である確率の序列によって順位付けされた（最も可能性が高いから可能性が低いまで）候補標的遺伝子の一覧を答える。これに対して、遺伝子名をクエリーとする場合には、データベースは、データベースに含まれる構造データおよび潜在的実験データに基づき、それらのｍｉＲＮＡがクエリー遺伝子の真の標的である確率の序列によって順位付けされた（最も可能性が高いから可能性が低いまで）ｍｉＲＮＡ候補の一覧を答える。このデータベースはｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ名とｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐを過剰発現するＣＲＣ細胞株でダウンレギュレーションを受けていることが判明した遺伝子の名称をクエリーとした（４７遺伝子、表４参照）。
【０１２５】
下表５は、ｈａｓ−ｍｉＲ−３１−３ｐの推定直接標的として同定された、ＤＢＮＤＤ２およびＥＰＢ４１Ｌ４Ｂを含む表４のダウンレギュレーション遺伝子を示す。それはまた、データベースが遺伝子名を用いて照会された場合にはｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの順位を示し、データベースがｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ名を用いて照会された場合には、遺伝子の順位を示す。
【０１２６】
【表５】
2017503478.tif 000006
【０１２７】
４７のダウンレギュレーションを受けた遺伝子のうち、２５がｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの推定直接標的であると予測され、この予測データベースで上位を示した。この数および遺伝子の順位は有意である（並べ替え検定による両検定でＰ＜０．０００１）。予想されたように、ｍｉＲ−３１−３ｐでトランスフェクトされた細胞において２７のアップレギュレーションを受けた遺伝子のうち１つを除いて、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの標的であると予測されたものは無く、唯一予測されたものも最低位の標的順位であった。
【０１２８】
ｑＲＴ−ＰＣＲで２５の推定直接標的遺伝子と２７の間接標的遺伝子のバリデーションを行ったところ、これらの４７遺伝子のうち４５が、アレイで得られたレベルに匹敵する発現レベルを示した。
【０１２９】
最後に、これらの遺伝子の発現を患者のＦＦＰＥ腫瘍サンプルで分析したところ、それらのうち２つがｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ発現レベルとの有意な負の相関を示した：ＤＢＮＤＤ２およびＥＰＢ４１Ｌ４Ｂ（図１Ａおよび１Ｂ参照）。
【０１３０】
加えて、ノンパラメトリック層別解析を用い、これら２つの遺伝子は無進行生存期間に関連することが判明した（ＤＢＮＤＤ２ではｐ＝０．００４、ＥＰＢ４１Ｌ４Ｂではｐ＝０．０２５）。これらの結果を考え合わせると、ＤＢＮＤＤ２およびＥＰＢ４１Ｌ４Ｂの発現は不良または良好な予後を有するｍＣＲＣ患者間、すなわち、不応答と応答ｍＣＲＣ患者の間を識別できたことが示唆される。
【０１３１】
実施例２：ＥＧＦＲ阻害剤に対する応答を予測するためのＤＢＮＤＤ２およびＥＰＢ４１Ｌ４Ｂ発現を用いるツールの作出
患者および方法
患者
患者のセットは、男性１３名と女性７名の２０名のｍＣＲＣ患者から構成された。年齢の中央値は６７±１１．２歳であった。総てが登録時に転移性疾患を有していた。これらの全患者は、ＫＲＡＳ野生型転移性結腸癌を発症していた。全患者がイリノテカンおよびオキサリプラチンと組み合わせた５−フルオロウラシルに基づく治療計画に不応であると見られた。これらの患者に抗ＥＧＦＲに基づく化学療法を施し、８名の患者はパニツムマブ、１０名の患者はセツキシマブ、２名の患者はパニツムマブとセツキシマブの組合せを受容した。セツキシマブおよびパニツムマブの導入前の化学療法系統の数を記録した。進行までの経過観察の中央値は２１週であり、全生存期間の中央値は８．９か月であった。
【０１３２】
遺伝子発現の測定
ＦＦＰＥ患者サンプルに対するＤＢＮＤＤ２およびＥＰＢ４１Ｌ４Ｂ発現のｑＲＴ−ＰＣＲを、２０ｎｇの全ＲＮＡについて、ＡＢＩ７９００ＨＴリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いて行った。総ての反応を３反復で行った。発現レベルは、ΔΔＣｔ方法によってＧＡＰＤＨレベルに対して正規化した。
【０１３３】
統計分析
生存の統計分析は、Ｒパッケージ‘ｓｕｒｖｉｖａｌ’および‘ｒｍｓ’を用いて行った。単変量および多変量解析はコックス比例回帰ハザードモデルを用い、ハザード比（ＨＲ）を生成した。ノモグラムはコックス比例回帰ハザードモデルに基づいて開発されたものであり、無進行生存の確率を予測する。
【０１３４】
遺伝子およびｍｉＲＮＡ発現値比較分析は、ノンパラメトリック検定（クラスカル・ウォリス検定）を、ｐＲを用いたペアワイズウィルコクソン検定とともに用いて行った。
【０１３５】
ｃｏｒ．ｔｅｓｔ関数を用い、発現値間のピアソン相関を適合するｐ値とともに算出した。統計的有意性は、総ての解析でｐ＜０．０５で設定した。
【０１３６】
結果
ＤＢＮＤＤ２およびＥＰＢ４１Ｌ４Ｂの発現を腫瘍サンプルで分析した。統計分析は、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ発現レベルとの有意な負の相関を示した：（ＤＢＮＤＤ２に関して図２参照）。加えて、ノンパラメトリック層別解析を用い、これら２つの遺伝子は無進行生存期間に関連することが判明した（ＤＢＮＤＤ２ではｐ＝０．０２５）。これらの結果に基づき、抗ＥＧＦＲで処置されたｍＣＲＣ患者の応答を予測するためツールを得るために、共変量としての多変量コックス比例ハザードモデルの状態と遺伝子発現のｌｏｇ２を用いてＰＦＳに基づくノモグラムを構築したところ、進行リスク（すなわち、不応答リスク、図３および４参照）を予測することが可能であった。
【０１３７】
実施例３：新しい独立したコホートにおけるＥＧＦＲ阻害剤に対するＤＢＮＤＤ２およびＥＰＢ４１Ｌ４Ｂの予測値の再現
患者および方法
患者
患者のセットは、男性２７名と女性１５名の４２名のｍＣＲＣ（転移性結腸直腸癌）患者から構成された。年齢の中央値は５９±１２．１歳であった。総てが登録時に転移性疾患を有していた。全患者が、オキサリプラチンおよびイリノテカン化学療法に基づく治療計画下での進行の後、イリノテカンおよびパニツムマブの組合せにより第３系統の治療で処置された。進行までの経過観察の中央値は２３週であり、全生存期間の中央値は９．６か月であった。２６サンプルがＦＦＰＥで、１６サンプルが冷凍組織で入手できた。
【０１３８】
遺伝子発現の測定
冷凍またはＦＦＰＥ患者サンプルに対する標的発現のｑＲＴ−ＰＣＲバリデーションを、２０ｎｇの全ＲＮＡについて、ＡＢＩ７９００ＨＴリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いて行った。総ての反応を３反復で行った。発現レベルは、ΔΔＣｔ方法によってＲＮＡ１８ＳまたはＧＡＰＤＨレベルに対して正規化した。
【０１３９】
統計分析
生存の統計分析は、Ｒパッケージ‘ｓｕｒｖｉｖａｌ’および‘ｒｍｓ’を用いて行った。単変量および多変量解析はコックス比例回帰ハザードモデルを用いて生成した。遺伝子およびｍｉＲＮＡ発現値比較分析は、ノンパラメトリック検定（クラスカル・ウォリス検定）を、ｐＲを用いたペアワイズウィルコクソン検定とともに用いて行った。
【０１４０】
統計的有意性は、総ての分析についてｐ＜０．０５で設定した。
【０１４１】
結果
ＤＢＮＤＤ２およびＥＰＢ４１Ｌ４Ｂの発現を患者腫瘍ＦＦＰＥサンプルで分析した。それらはｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ発現レベルとの有意な負の相関を示した：（図５Ａおよび５Ｂ参照）。これら２つの遺伝子の発現と特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０７３５３５に記載の通りにｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐの発現レベルに基づいて算出された応答／不応答の予測の間に相関が見られた（図６参照）。
【０１４２】
コックスモデルを用い、これら２つの遺伝子は無進行生存期間と関連することが見出された（ＧＡＰＤＨ正規化を用いたＤＢＮＤＤ２でｐ＝０．００４、ＲＮＡ  １８Ｓ正規化を用いたＥＰＢ４１Ｌ４Ｂでｐ＝０．０２７）。
【０１４３】
これらの結果から、ＤＢＮＤＤ２およびＥＰＢ４１Ｌ４Ｂの発現は不良または良好な予後を有するｍＣＲＣ患者、すなわち、不応答と応答ｍＣＲＣ患者の間を識別できたことが確認される。
【０１４４】
参照文献
2017503478.tif 000007
2017503478.tif 000008
【図１】
2017503478.tif 000009
【図２】
2017503478.tif 000010
【図３】
2017503478.tif 000011
【図４】
2017503478.tif 000012
【図５】
2017503478.tif 000013
【図６】
2017503478.tif 000014
【配列表】
2017503478000001.app
【国際調査報告】
2017503478.tif 000015
2017503478.tif 000016
2017503478.tif 000017
2017503478.tif 000018