(57)【要約】  本発明は、精製タンパク質のエンドトゥエンドの連続製造のためのプロセス及びその機器であり、本プロセスは、連続的で一致したアウトフロー及びインフローを有する第1及び第2のプロセシングユニットを含む統合型機器の使用を含み、それにより、タンパク質培養システム及びクロマトグラフィーシステムの統合手段が提供される。
2017515501.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a.第1のプロセシングユニット及び第2のプロセシングユニットである各プロセシングユニットが、流体入口、流体出口、及び流体送達デバイスを含み、第1及び第2のプロセシングユニットが、一方のプロセシングユニットの出口から次のプロセシングユニットの入口へ流体が流れる状態で少なくとも1つの流体接続により直列に接続される、少なくとも2つの独立プロセシングユニット、並びに
b.追加の液体を流体接続に導入するための少なくとも1つの手段、
c.余剰な液体を流体接続から除去するための少なくとも1つの手段
を含む機器。
【請求項２】
a.第1のプロセシングユニット及び第2のプロセシングユニットである各プロセシングユニットが、流体入口、流体出口、及び流体送達デバイスを含み、第1及び第2のプロセシングユニットが、一方のプロセシングユニットの出口から次のプロセシングユニットの入口へ流体が流れる状態で少なくとも1つの流体接続により直列に接続される、少なくとも2つの独立プロセシングユニット、並びに
b.追加の液体を流体接続に導入するための手段を提供する、2つのプロセシングユニット間の流体接続における少なくとも1つの流体入口、
c.余剰な液体を流体接続から除去するための手段を提供する、2つのプロセシングユニット間の流体接続における少なくとも1つの流体出口
を含む、請求項1に記載の機器。
【請求項３】
前記流体接続の入口が、一方向フロー制御により制限され、液体がプロセシングユニット間の流体接続に向かって一方向に流れるよう制限するフロー方向を有する、請求項1又は2に記載の機器。
【請求項４】
前記流体接続の出口が、一方向フロー制御により制限され、液体がプロセシングユニット間の流体接続から一方向に流れるよう制限するフロー方向を有する、請求項1から3のいずれか一項に記載の機器。
【請求項５】
流体送達デバイスのうちの少なくとも1つがポンプを含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の機器。
【請求項６】
a.請求項1から5のいずれか一項に記載の機器を使用して培養ユニットを精製ユニットに接続するポンプにより培養上清のアウトフローが提供される、細胞株を培養ユニットにおいて培養する工程、及び
b.ポンプにより提供されるフィードインフローを伴う前記精製ユニット上でタンパク質精製を実施する工程
を含む、細胞株からの組換えタンパク質製造方法。
【請求項７】
タンパク質が、凝固因子、凝固因子を含む融合タンパク質、インスリン、GLP誘導体、GH、受容体、及び抗体、たとえばFAbからなる群から選択される、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
培養ユニットのアウトフローが精製システムへのフィードと一致する、請求項6又は7に記載の方法。
【請求項９】
a.第1及び第2のプロセシングユニットである各プロセシングユニットが、流体入口、流体出口、及び流体送達デバイスを含み、第1及び第2のプロセシングユニットが、一方のプロセシングユニットの出口から次のプロセシングユニットの入口へ流体が流れる状態で少なくとも1つの流体接続により直列に接続される、少なくとも2つの独立プロセシングユニット、
b.2つのプロセシングユニット間の流体接続における少なくとも1つの流体入口、並びに
c.2つのプロセシングユニット間の流体接続における少なくとも1つの流体出口
を含む、目的の分子を異成分からなる流体混合物から分離するための機器。
【請求項１０】
前記流体接続の入口が、一方向フロー制御により制限され、液体がプロセシングユニット間の流体接続に向かって一方向に流れるよう制限するフロー方向を有する、請求項9に記載の機器。
【請求項１１】
第1のプロセシングユニットが、バイオリアクター、発酵槽ユニット、管状リアクター、限外濾過ユニット、ホモジナイザー、遠心ユニット、及びクロマトグラフィーユニットからなる群から選択され、これらのそれぞれが、連続又は半連続インフロー、好ましくは連続インフローを伴う、請求項9又は10に記載の機器。
【請求項１２】
第2のプロセシングユニットが、典型的には、限外濾過ユニット、ホモジナイザー、遠心ユニット、及びクロマトグラフィーユニットからなる群から選択され、これらのそれぞれが、連続又は半連続アウトフロー、好ましくは連続アウトフローを伴う、請求項9から11のいずれか一項に記載の機器。
【請求項１３】
第1のプロセシングユニットが、連続アウトフローを伴う培養ユニット、たとえば灌流培養ユニットであり、第2のプロセスユニットが、連続インフローを伴うクロマトグラフィーシステムである、請求項9から12のいずれか一項に記載の機器。
【請求項１４】
目的のタンパク質を含有する流体混合物を製造する第1のプロセシング工程、
一方向のフローにより流体混合物を、第1のプロセシング工程の出口から第2のプロセシング工程の入口へと移動させる工程、
余分な液体を除去するか、又は適合する液体を追加することにより、第1のプロセシング工程から送達される液体の流量を、第2のプロセシング工程において受け取られる液体の流量のそれと一致させる工程、
目的のタンパク質を含有する更に精製された流体混合物を製造する第2のプロセシング工程
を含む、標的タンパク質を異成分からなる流体混合物から分離するための方法。
【請求項１５】
第1のプロセシング工程が、目的のタンパク質を含有する清澄化した細胞培養物回収流体をもたらす連続培養プロセスであり、第2のプロセシング工程が、標的タンパク質を含有する部分的に精製された流体をもたらす連続クロマトグラフィープロセスである、請求項14に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、精製タンパク質の連続製造のための統合型方法(integrated process)及びその機器に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質を大規模で経済的に精製することは、バイオテクノロジー及び製薬業界にとってますます重要な問題になっている。典型的には、タンパク質は、そのタンパク質の遺伝子を含有する組換えプラスミドを挿入することによりそのタンパク質を産生するよう操作された、哺乳動物、酵母又は細菌のいずれかの細胞株を使用した細胞培養により製造される。使用される細胞株は生物であるので、糖、アミノ酸、及び成長因子を含有する複合成長培地を給餌されなければならない。細胞に給餌された化合物の混合物及び細胞自体の副生成物から所望のタンパク質を、ヒト治療剤としての使用に十分な純度へと分離することは、困難な課題をもたらす。バイオ医薬業界は、厳しい製品品質要求にかないうる、費用対効果の高い、柔軟な製造戦略を絶えず探求している。この文脈において、自動化連続製造プロセスは、高い容積生産性及び一貫した製品品質を伴う定常状態運転を提案することにより、魅力的なバイオプロセシング解決策を提供する可能性を有する。上流の灌流培養(perfusion cultivation)と下流の連続捕捉(continuous capture)とを統合する戦略は、以前に報告されている[Warikooら、Integrated continuous production of recombinant therapeutic proteins、Biotechnol. Bioeng. 109: 3018〜3029頁(2012)]。
【０００３】
バッチ製造から連続製造への転換を通じたプロセス強化は、複数の業界において適用されてきており、現在ではバイオプロセシング業界において関心が生じつつある。重要な要素は、定常状態運転、短い滞留及びプロセシング時間、能率化されたプロセスフロー並びに高い容積生産性である。器具サイズの減少及び中間保持工程の除去は、設備の最小化を可能にし、投資コストの顕著な低減をもたらす。
【０００４】
バイオテクノロジーでは、連続プロセシングはまた、タンパク質品質に関して利点を提供する可能性を有する。プロセシング時間の減少及び中間保持工程の除去は、酵素的、化学的及び物理的分解/変性への標的タンパク質の曝露を減少させ、そのことによりタンパク質品質が高められる。
【０００５】
連続的に作動する2つの独立したプロセスユニットを接続するとき、(たとえばオーバーフロー/過圧又は気泡によるプロセス障害を回避するために)それらのフローを一致させること、すなわち、上流ユニットのアウトフローを下流ユニットのそれと一致させることが困難である。
【０００６】
一般的な解決策は、2つのユニットの間のバッファーとして作用する中間サージ容器を導入することである。たとえば、Warikooら(Biotechnol. Bioeng. 2012;109:3018〜3029頁)は、中間サージバッグにより連続捕捉クロマトグラフィーユニットと統合されている灌流培養を記載している。WO2006/039588は、サージ容器が、連続清澄化を限外濾過又は半連続高速クロマトグラフィーと統合するために使用される例を記載している(Vogelら、Biotechnol. Bioeng. 2012;109: 3049〜3058頁)。
【０００７】
米国特許第4,630,639号は、管路により接続された2つのシステムを開示し、この管路が今度は定流量制御弁及び定圧制御弁を有し、第1のシステムは水力源でありえ、第2のシステムはシリンダーでありうる。
【０００８】
WO2011/037522は、出口から入口へと直列に接続され、使用される分離ユニットのラインを形成する、2つの分離ユニット、並びに、各分離ユニット間にインラインで提供される、分離ユニットのラインにおける一方の分離ユニットから次の分離ユニットへ流れる流体の少なくとも1つの環境特性パラメーターを連続的にモニタリング及び調整するための検知及び調整手段を含む分離システムに関する。
【０００９】
本研究は、サージ容器の使用なしに統合型システムを可能にする。なぜなら、このようなデバイスはタンパク質にとって安定性で問題があるからである。標的分子の、その発現から精製又は単離までのプロセシング時間は、本方法により低減される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】WO2006/039588
【特許文献２】米国特許第4,630,639号
【特許文献３】WO2011/037522
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Warikooら、Integrated continuous production of recombinant therapeutic proteins、Biotechnol. Bioeng. 109: 3018〜3029頁(2012)
【非特許文献２】Vogelら、Biotechnol. Bioeng. 2012;109: 3049〜3058頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、一態様において、上流及び下流が組み合わされたエンドトゥエンドの連続バイオプロセシングプラットフォームを実現する連続プロセシングコンセプトに関する。
【００１３】
連続プロセスにおける2つの独立したプロセスユニットを接続するとき、それらのフローを一致させること、すなわち、先行するユニットのアウトフローを後続のユニットのそれと一致させることが困難である。本発明により、プロセシング時間を増加させ、酵素的、化学的及び物理的分解/変性へのタンパク質の曝露を増加させる中間保存/サージ容器を導入する従来の工程を回避する機器及び方法が開発された。物品の開発時間、プロセシング時間及びコストを更に低減可能であり、中間保持タンクを要しない改善した自動化分離システムを提供することは、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の第1の態様は、
a.第1のプロセシングユニット及び第2のプロセシングユニットである各プロセシングユニットが、流体入口、流体出口、及び流体送達デバイスを含み、第1及び第2のプロセシングユニットが、一方のプロセシングユニットの出口から次のプロセシングユニットの入口へ流体が流れる状態で少なくとも1つの流体接続により直列に接続される、少なくとも2つの独立プロセシングユニット、並びに
b.追加の液体を流体接続に導入するための少なくとも1つの手段、
c.余剰な液体を流体接続から除去するための少なくとも1つの手段
を含む機器に関する。
【００１５】
本発明の更なる一態様は、
a.第1及び第2のプロセシングユニットである各プロセシングユニットが、流体入口、流体出口、及び流体送達デバイスを含み、第1及び第2のプロセシングユニットが、一方のプロセシングユニットの出口から次のプロセシングユニットの入口へ流体が流れる状態で少なくとも1つの流体接続により直列に接続される、少なくとも2つの独立プロセシングユニット、
b.2つのプロセシングユニット間の流体接続における少なくとも1つの流体入口、
c.2つのプロセシングユニット間の流体接続における少なくとも1つの流体出口
を含む機器に関する。
【００１６】
本発明の関連する一態様は、
i.本発明の機器を使用して、培養ユニットを(自動化)精製ユニットに接続するポンプにより培養上清のアウトフローが提供される、培養ユニットにおいて細胞株を培養する工程、
ii.ポンプにより提供されるフィードインフローを伴う前記(自動化)精製ユニット上でタンパク質精製を実施する工程
を含む、細胞株からの組換えタンパク質製造方法に関する。
【００１７】
本発明は、
i.目的のタンパク質を含有する流体混合物を製造する第1のプロセシング工程、
ii.一方向のフローにより流体混合物を、第1のプロセシング工程の出口から第2のプロセシング工程の入口へと(中間保持容器の使用なしに)移動させる工程、
iii.余剰な液体を除去するか、又は適合する液体を追加することにより、第1のプロセシング工程から送達される液体の流量を、第2のプロセシング工程において受け取られる液体の流量のそれと一致させる工程、
iv.目的のタンパク質を含有する更に精製された流体混合物を製造する第2のプロセシング工程
を含む異成分からなる流体混合物から標的タンパク質を分離するための方法に更に関する。
【００１８】
本発明の別の関連する一態様は、
i.第1のプロセシング工程により、目的のタンパク質を含有する流体混合物を製造する工程、
ii.余剰な液体を除去するか、又は適合する液体を追加することにより、第1のプロセシング工程から送達される液体の流量を、第2のプロセシング工程において受け取られる液体の流量のそれと一致させる工程を含む、流体混合物を第1のプロセシング工程の出口から第2のプロセシング工程の入口へと移動させる工程、
iii.前記第2のプロセシング工程により、目的のタンパク質を含有する更に精製された流体混合物を製造する工程
を含む、異成分からなる流体混合物から目的のタンパク質を分離するための方法に関する。
【００１９】
とりわけ、工程ii)の移動及び一致は、中間保持容器の使用なしに行われる。
【００２０】
本発明は、精製タンパク質の連続又は半連続製造のためのプロセスに更に関し、このプロセスは、
a.連続アウトフローを有する、分離ユニットを伴う細胞培養バイオリアクター、
b.連続インフローを伴うタンパク質を少なくとも部分的に精製するための手段、たとえばクロマトグラフィーを実施するための手段又は濾過のための手段、
c.バイオリアクターのアウトフロー及びタンパク質を少なくとも部分的に精製するための手段のインフローを一致させるための、2つの三叉コネクター及び2つの逆止め弁を伴うデバイス
を含む統合型機器の使用を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】第1のプロセシングユニット、(a)システム1ポンプ、第2のプロセシングユニット、(b)システム2ポンプ、逆止め弁(c)及び(d)、並びにたとえばバッファー溶液のフロー(e)及びたとえば採取タンクへの(f)余剰フローを含む本発明の一実施形態を示す図である。
【図２】第1のプロセシングユニット、(a)システム1ポンプ、第2のプロセシングユニット、(b)システム2ポンプ、逆止め弁(c)及び(d)、並びにたとえばバッファー溶液のフロー(e)及びたとえば採取タンクへの(f)余剰フローを含む本発明の一実施形態の更なる一構成を示す図である。
【図３】第1のプロセシングユニット、(a)システム1ポンプ、第2のプロセシングユニット、(b)システム2ポンプ、逆止め弁(c)及び(d)、並びにたとえばバッファー溶液のフロー(e)及びたとえば採取タンクへの(f)余剰フローを含む本発明の一実施形態の更なる別の一構成を示す図である。
【図４】第1のプロセシングユニット、(a)システム1ポンプ、第2のプロセシングユニット、(b)システム2ポンプ、逆止め弁(c)及び(d)、システム1からの追加フロー(e)及びたとえば採取タンクへの(f)余剰フローを含む本発明の一実施形態の一構成を示す図である。
【図５】統合型連続精製でのタンパク質灌流製造、(a)新鮮な培地供給、(b)フィードポンプ(蠕動ポンプ-レベルセンサーにより制御)、(c)細胞培養バイオリアクター、(d)ATF細胞保持デバイス、(e)ブリードポンプ(蠕動ポンプ-バイオマス/静電容量信号により制御)、(f)細胞廃棄容器、(g)0.22μmアブソリュートフィルター、(h)ハーベストポンプ(蠕動ポンプ-所定の潅流量に設定)、(i)逆止め弁1、(j)AKTA試料適用ポンプ、(k)並列捕捉カラム、(l)逆止め弁2、(m)容器、(n)バッファーフラスコ、(o)AKTA勾配ポンプ、(p)ミキサー、(q)廃棄物容器、(r)カラム3及び5、(s)カラム2、4及び6、(t)UV及び電導度検出器並びに(u)最終精製タンパク質プールを含む本発明の一実施形態のためのセットアップを示す図である。
【図６】実施例1における最終ゲル濾過プールにおいてRP-HPLCにより測定されるFVIII濃度を示す図である。
【図７】実施例1における最終ゲル濾過プールのSDS-PAGEを示す図である。
【図８】実施例2における最終ゲル濾過工程からのUVクロマトグラムの一例を示す図である。
【図９】実施例2における統合型運転の期間を示す図である。左パネル:生細胞密度(VCD)。右パネル:対応するサブバッチにおける精製ダイマー及びダイマー分率の(ゲル濾過クロマトグラムに基づく)推定。
【図１０】実施例2における統合型運転の期間を示す図である。左パネル:対応するサブバッチにおける精製ダイマー及びダイマー分率の(ゲル濾過クロマトグラムに基づく)推定。右パネル:培養条件の変化前、変化中及び変化後の、選択されたゲル濾過クロマトグラム。
【図１１】FVII変異体の統合型連続捕捉において、実施例3における統合型運転の期間の捕捉収率を示す図である。
【図１２】FVII変異体の統合型連続捕捉において、実施例3におけるATF灌流培養について生細胞密度(VCD)、生存率、及び力価を示す図である。灰色の領域は、統合型連続培養及び捕捉の期間を示す。
【図１３】初期流量の75%に低減されたAKTA精製システムのインフローを伴う実施例4における連続運転中の採取タンクの質量増加を示す図である。
【図１４】実施例4におけるサブバッチの収率評価のためのSE-HPLCクロマトグラムを示す図である。示されるのは、初期AKTA精製システムインフロー流量の100%(A)、75%(B)及び125%(C)で流したサブバッチである。
【図１５】実施例4で流したモノクローナル抗体サブバッチのSDS-PAGEによる製品品質評価を示す図である。示されるサブバッチは、初期AKTA精製システムインフロー流量の100%(A)、75%(B)及び125%(C)で流したサブバッチである。
【図１６】上流及び下流統合型インスリン前駆体製造のためのセットアップを示す図である。凡例(a)酵母成長培地供給、(b)フィードポンプ、(c)バイオリアクター、(d)蠕動ポンプ、(e)採取容器、(f)ダブルヘッド蠕動ポンプ、(g)廃棄物ボトル、(h)クロスフロー濾過容器、(i)クロスフロー濾過0.2μmフィルター、(j)クロスフロー濾過ポンプ(TMP制御)、(k)希釈バッファー、(l)逆止め弁1を伴うバッファーフラスコ、(m)逆止め弁2を伴う容器、(n)インライン希釈を伴うピストンポンプ、(o)希釈バッファー、(p)バッファー[たとえば100mMトリスバッファーpH8(溶出バッファー)]、(q)勾配ピストンポンプ、(r)ミキサー、(s)並列捕捉カラム、(t)廃棄物フラスコ、(u)UV及び電導度検出器並びに(v)最終精製タンパク質プール。
【図１７】回収されたインスリン前駆体のSDS-PAGEを示す図である。レーンA.はインスリン前駆体を含み、レーンB.はALP消化インスリン前駆体を含む。マーカーはSeeBlue Plus2であり、それは非還元条件である。
【図１８】(1.)フローがフラスコから出ることのみを可能にする逆止め弁を伴うバッファーフラスコ及び(2.)フローがタンク内に入ることのみ可能にする逆止め弁を伴う余剰採取タンクを間に有する、AKTAと連結されたクロスフロー濾過デバイスを示す図である。両方のフラスコを秤にかけた。AKTAフローは、11ml/分(100%)に初期設定した。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
連続プロセスデザインは、能率化されたプロセスフロー及び高い容積生産性を含む複数の利点を提示する。これは、器具サイズの低減及び中間保持工程の除去を可能にし、ひいては、コンパクトな設備及び投資コストの低減を可能にする。バイオプロセシングについては、総プロセシング時間の低減及び中間保存の除去がまた、酵素的、化学的及び物理的変性への製品の曝露を減少させる。これは、脆弱なタンパク質の製造について、連続プロセシングを特に魅力的なものとする。
【００２３】
本発明の一部として、本発明者らは、灌流培養及び自動化多段階精製に基づく複雑で脆弱なタンパク質のエンドトゥエンドの製造のための統合型連続フレームワークを開発した。上流では、統合型システムは、ATF細胞保持システムを伴う撹拌タンクバイオリアクターからなっていてもよい。オンライン静電容量プローブを使用した生存バイオマスの自動フィードバック制御は、定常状態での堅調な長期運転を、したがって下流プロセシングのための一定の一貫した製品流を保証する。清澄化した回収物は、連続精製ユニットとして用いられる濾過又はクロマトグラフィーシステム、たとえば、これに限定しないが、AKTAクロマトグラフィーシステム等の任意の従来のクロマトグラフィーシステムに直接入ってもよい。2つの交代性捕捉カラムが、十分な柔軟性及び個別のカラムの制御を伴って、多段階精製トレーンに先行してもよい。
【００２４】
統合型セットアップは、中間保存なしに効率的に細胞培養培地を精製タンパク質に変換するコンパクトな自動化ベンチトップファクトリーを提供する。それは、従来のバッチ式プロセシングと比較して、発現の開始から精製タンパク質までのリードタイムを低減する。更に、統合型アプローチは、「過不足ない」製造及び資源のより良好な使用を可能にする、プロセスの連続モニタリングもまた提供する。
【００２５】
標的分子は、試料中の1つ又は複数の不純物から単離、分離又は精製される、任意の分子、物質若しくは化合物又はそれらの混合物を指す。標的分子は、典型的にはタンパク質、核酸配列又はヌクレオチド、たとえばDNA又はRNA配列である。タンパク質、たとえば発現させられた第1のプロセシングユニットからの試料の一部であるものは、典型的には第2のプロセシングユニットにおいて精製にかけられる。好ましい一実施形態において、標的分子は、タンパク質又は2種以上のタンパク質の混合物である。非常に好ましい一実施形態において、標的分子は、抗体若しくは凝固因子、たとえば第V、第VII、第VIII、第IX、第X、及び第XIII因子、又はそれらのコンジュゲート及び変異体である。標的分子はまた、凝固因子、及び凝固因子と、タンパク質、たとえば抗体若しくはその断片との、アルブミンバインダー、たとえば脂肪酸鎖との、又は、タンパク質、たとえばアルブミンとの融合物若しくはコンジュゲートから選択されてもよい。標的タンパク質は、代わりに、インスリン、その変異体、及びインスリンのプロセシングにおいて使用される酵素、たとえばトリプシン又はリシル特異的プロテアーゼ、たとえばアクロモバクター・リティクス(Achromobacter lyticus)プロテアーゼから選択されてもよい。
【００２６】
「抗体」という用語は、抗原に特異的に結合する能力を有するタンパク質を指す。典型的には、抗体は、2つの重鎖及び2つの軽鎖からなる基本的な4つのポリペプチド鎖構造を有し、前記鎖は、たとえば鎖間ジスルフィド結合により安定化される。抗体は、モノクローナルであってもポリクローナルであってもよく、モノマー又はポリマー形態で存在していてもよく、たとえば、ペンタマー形態で存在するIgM抗体及び/又はモノマー、ダイマー又はマルチマー形態で存在するIgA抗体である。抗体にはまた、多重特異性抗体(たとえば二重特異性抗体)及び、リガンド特異的結合ドメインを保持するか又はそれを含むよう改変される限り、抗体断片が含まれていてもよい。「断片」という用語は、無傷（intact）又は完全抗体又は抗体鎖よりも少ないアミノ酸残基を含む、抗体又は抗体鎖の部分又は一部を指す。断片は、無傷又は完全抗体又は抗体鎖の化学的又は酵素的処理を介して得られる。断片はまた、組換え手段により得られる。組換えにより製造されたとき、断片は、単独で又は融合タンパク質と呼ばれるより大きなタンパク質の一部として発現されうる。例示的断片には、Fab、Fab'、F(ab')2、Fc及び/又はFv断片が含まれる。例示的融合タンパク質には、Fc融合タンパク質が含まれる。本発明によれば、融合タンパク質はまた、「抗体」という用語に包含される。
【００２７】
上で論じたとおり、いくつかの実施形態において、抗体は、Fc領域を含有するタンパク質、たとえば免疫グロブリンである。いくつかの実施形態において、Fc領域を含有するタンパク質は、別のポリペプチド又はその断片と融合された免疫グロブリンのFc領域を含む組換えタンパク質である。例示的ポリペプチドには、たとえば、レニン、成長ホルモン、たとえばヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモン、成長ホルモン放出因子、副甲状腺ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、リポタンパク質、a-1-アンチトリプシン、インスリン、インスリンa鎖、インスリン[ベータ]鎖、プロインスリン、及びインスリンのプロセシングにおいて使用される酵素、たとえばトリプシン又はリシル特異的プロテアーゼ、たとえばアクロモバクター・リティクスプロテアーゼ、卵胞刺激ホルモン、カルシトニン、黄体形成ホルモン、グルカゴン、凝固因子、たとえば第V因子、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、第X因子、第XIII因子、組織因子、及びフォン・ヴィルブランド因子、抗凝固因子、たとえばプロテインC、心房性ナトリウム利尿因子、肺表面活性剤、プラスミノーゲン活性化因子、たとえばウロキナーゼ又はヒト尿若しくは組織型プラスミノーゲン活性化因子(t-PA)、ボンベシン、トロンビン、造血成長因子、腫瘍壊死因子-a及び-ベータ、エンケファリナーゼ、RANTES[活性化制御、正常T細胞発現及び分泌(regulated on activation normally T- cell expressed and secreted)]、ヒトマクロファージ炎症性タンパク質(MIP-1-a)、血清アルブミン、たとえばヒト血清アルブミン、ミュラー管抑制因子(Muellerian-inhibiting substance)、レラキシンa鎖、レラキシン[ベータ]鎖、プロレラキシン、マウス生殖腺刺激ホルモン関連ペプチド、微生物タンパク質、たとえば[ベータ]-ラクタマーゼ、DNase、IgE、細胞毒性Tリンパ球関連抗原(CTLA)(たとえば、CTLA-4)、インヒビン、アクチビン、血管内皮成長因子(VEGF)、ホルモン又は成長因子の受容体、プロテインA又はD、リウマチ因子、神経栄養因子、たとえば骨由来神経栄養因子(BDNF)、ニューロトロフィン-3、-4、-5、又は-6(NT-3、NT-4、NT-5、又はNT-6)、又は神経成長因子、たとえばNGF-[ベータ]、血小板由来成長因子(PDGF)、線維芽細胞成長因子(FGF)、上皮成長因子(EGF)、形質転換成長因子(TGF)、たとえばTGF-アルファ及びTGF-[ベータ]、TGF-2、TGF-3、TGF-4、又はTGF-[ベータ][デルタ]、インスリン様成長因子-I及び-II(IGF-I及びIGF-II)、des(l-3)-IGF-I(脳IGF-I)、インスリン様成長因子結合タンパク質(IGFBP)、CDタンパク質、たとえばCD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD34、及びCD40、エリスロポエチン、骨誘導因子、免疫毒素、骨形成タンパク質(BMP)、インターフェロン、たとえばインターフェロン-[アルファ]、-[ベータ]、及び-[ガンマ]、コロニー刺激因子(CSF)、たとえばM-CSF、GM-CSF及びG-CSF、インターロイキン(IL)、たとえばIL-IからIL-IO、スーパーオキシドジスムターゼ、T細胞受容体、表面膜タンパク質、崩壊促進因子、ウイルス抗原、たとえばAIDSエンベロープの一部、輸送タンパク質、ホーミング受容体、アドレシン、調節タンパク質、インテグリン、たとえばCD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4及びVCAM、腫瘍関連抗原、たとえばHER2、HER3又はHER4受容体、並び上に挙げたポリペプチドのうちの任意のものの断片及び/又は変異体が含まれる。加えて、本発明による抗体は、上に挙げたポリペプチドのうち��任意のものに特異的に結合する任意のタンパク質又はポリペプチド、それらの断片又は変異体である。
【００２８】
好適な一実施形態において、第1のプロセシングユニットは、連続アウトフローを伴う培養ユニット、たとえば灌流培養ユニットである。培養ユニットは、懸濁又は付着細胞の培養のための任意のシステム、たとえば灌流培養システムであり、典型的には、細胞及び細胞培地配合物を含む。細胞培養、細胞灌流又は細胞灌流培養は、宿主細胞又は生物が標的タンパク質を生成する任意のシステム、たとえば標的タンパク質を含む回収細胞培養液を伴うシステムを意味することが意図されている。第1のプロセシングユニットの実施形態は、細胞灌流システム、たとえば細胞保持システムを備えるバイオリアクター及び発酵槽を含む。このような細胞保持システムの一例は、フィルターハウジングに接続され標準的バイオリアクターに取り付けられたポンプヘッド内で上方に動き、次に下方に動く隔膜の作用により創出される、Alternating Tangential Flowの技術に基づくATF(商標)システムである。第1のプロセシングユニット、たとえば培養ユニットは、第2のプロセシングユニットによるプロセシングのための試料を提供する。
【００２９】
「試料」という用語は、標的分子を含有する任意の組成物又は混合物を指す。論じたとおり、試料は、第1のプロセシングユニットからの生物学的又は他のソースに由来していてもよい。生物学的ソースには真核生物及び原核生物ソース、たとえば植物及び動物細胞、組織及び器官が含まれる。試料はまた、標的分子と混合されて見出される希釈剤、バッファー、洗剤、及び汚染種、デブリ等を含んでいてもよい。
【００３０】
典型的には、プロセシングユニットの一方又は両方が、標的分子の精製を伴う。
【００３１】
本明細書において互換的に使用される「精製」、「分離」、又は「単離」という用語は、標的分子及び1つ又は複数の不純物を含む組成物又は試料から、標的分子の純度を増加させることを指す。典型的には、標的分子の純度は、組成物から少なくとも1つの不純物を(全部又は一部)除去することにより増加する。
【００３２】
「クロマトグラフィー」という用語は、目的の分析物(たとえば標的分子)を、混合物中に存在する他の分子から分離する任意の種類の手法を指す。通常は標的分子は、混合物の個々の分子の、移動相の影響下で固定媒体を移動する速度の差、又は結合及び溶出プロセスの差の結果として他の分子から分離される。「マトリックス」又は「クロマトグラフィーマトリックス」という用語は、本明細書において互換的に使用され、分離プロセスにおいて標的分子(たとえば、Fc領域含有タンパク質、たとえば免疫グロブリン)を混合物中に存在する他の分子から分離する、任意の種類の吸着剤、樹脂又は固相を指す。非限定的な例には、粒子性、モノリシック又は繊維性樹脂が、カラム又はカートリッジ中に置かれうる膜とともに含まれる。マトリックスを形成するための物質の例には、多糖(たとえばアガロース及びセルロース)、及び他の機械的に安定なマトリックス、たとえばシリカ[たとえば制御細孔ガラス(controlled pore glass)]、ポリ(スチレンビニル)ベンゼン、ポリアクリルアミド、セラミック粒子並びに上のもののうちの任意のものの誘導体が含まれる。本発明の方法に好適な典型的なマトリックスタイプの例は、陽イオン交換樹脂、親和性樹脂、陰イオン交換樹脂又は混合モード樹脂である。「リガンド」は、クロマトグラフィーマトリックスに結合され、マトリックスの結合特性を決定する官能基である。「リガンド」の例には、イオン交換基、疎水性相互作用基、親水性相互作用基、親硫黄相互作用基、金属親和性基、親和性基、生物親和性基、及び混合モード基(前述のものの組合せ)が含まれるが、これらに限定されない。本明細書において使用できるいくつかの好ましいリガンドには、強い陽イオン交換基、たとえばスルホプロピル、スルホン酸、強い陰イオン交換基、たとえばトリメチルアンモニウムクロリド、弱い陽イオン交換基、たとえばカルボン酸、弱い陰イオン交換基、たとえばN5Nジエチルアミノ又はDEAE、疎水性相互作用基、たとえばフェニル、ブチル、プロピル、ヘキシル、並びに親和性基、たとえばプロテインA、プロテインG、及びプロテインLが含まれるが、これらに限定されない。
【００３３】
「アフィニティークロマトグラフィー」という用語は、標的タンパク質(たとえば、目的のFc領域含有タンパク質又は抗体)が標的タンパク質に特異的なリガンドに特異的に結合する、タンパク質分離手法を指す。このようなリガンドは一般に、生体特異的リガンドと呼ばれる。いくつかの実施形態において、生体特異的リガンド(たとえば、プロテインA又はその機能的変異体)は、クロマトグラフィーマトリックス物質と共有結合し、溶液がクロマトグラフィーマトリックスと接触する際に溶液中の標的タンパク質とアクセス可能である。標的タンパク質は、一般に、クロマトグラフィー工程中に生体特異的リガンドに対するその特異的結合親和性を保持する一方で、混合物中の他の溶質及び/又はタンパク質は、リガンドに感知可能又は特異的に結合しない。固定化リガンドに対する標的タンパク質の結合は、汚染タンパク質又はタンパク質不純物が、クロマトグラフィーマトリックスを通過することを可能にする一方で、標的タンパク質は、固相物質上の固定化リガンドに特異的に結合されたままである。次に、特異的に結合した標的タンパク質は、好適な条件下(たとえば、低pH、高pH、高塩、競合リガンド等)で固定化リガンドから活性形態で除去され、溶出バッファーとともにクロマトグラフィーカラムを通過し、以前にカラムを通過させられた汚染タンパク質又はタンパク質不純物を含まない。そのそれぞれの特異的結合タンパク質、たとえば抗体を精製するためのリガンドとして、任意の成分を使用できる。しかしながら、本発明による様々な方法において、プロテインAが、Fc領域含有標的タンパク質のためのリガンドとして使用される。生体特異的リガンド(たとえば、プロテインA)からの標的タンパク質(たとえば、Fc領域含有タンパク質)の溶出のための条件は、当業者により容易に決定できる。いくつかの実施形態において、プロテインG若しくはプロテインL又はそれらの機能的変異体を、生体特異的リガンドとして使用できる。いくつかの実施形態において、生体特異的リガンド、たとえばプロテインAは、5〜9のpH範囲で、Fc領域含有タンパク質への結合、洗浄又は生体特異的リガンド/標的タンパク質コンジュゲートの再平衡化のために使用され、その後、少なくとも1種の塩を含有する約4以下のpHを有するバッファーで溶出される。
【００３４】
述べたとおり、本発明の一態様は、
a.第1のプロセシングユニット及び第2のプロセシングユニットである各プロセシングユニットが、流体入口、流体出口、及び流体送達デバイスを含み、第1及び第2のプロセシングユニットが、一方のプロセシングユニットの出口から次のプロセシングユニットの入口へ流体が流れる状態で少なくとも1つの流体接続により直列に接続される、少なくとも2つの独立プロセシングユニット、
b.追加の液体を流体接続に導入するための少なくとも1つの手段、並びに
c.余剰な液体を流体接続から除去するための少なくとも1つの手段
を含む機器に関する。
【００３５】
代替的定義によれば、機器は典型的には、
a.第1のプロセシングユニット及び第2のプロセシングユニットである各プロセシングユニットが、流体入口、流体出口、及び流体送達デバイスを含み、第1及び第2のプロセシングユニットが、一方のプロセシングユニットの出口から次のプロセシングユニットの入口へ流体が流れる状態で少なくとも1つの流体接続により直列に接続される、少なくとも2つの独立プロセシングユニット、
b.追加の液体を流体接続に導入するための手段を提供する、2つのプロセシングユニット間の流体接続における少なくとも1つの流体入口、並びに
c.余剰な液体を流体接続から除去するための手段を提供する、2つのプロセシングユニット間の流体接続における少なくとも1つの流体出口
を含む。
【００３６】
入口のフロー方向は、一方向フロー制御により好適には制限され、液体が2つのプロセシングユニット間の流体接続に向かって一方向に流れるよう制限する。前記流体接続の入口は、好ましくは、一方向フロー制御により制限され、液体がプロセシングユニット間の流体接続に向かって一方向に流れるよう制限するフロー方向を有する。
【００３７】
代わりに又は組み合わせて、出口のフロー方向は、一方向フロー制御により制限され、液体がプロセシングユニット間の流体接続から一方向に流れるよう制限してもよい。好ましくは、前記流体接続の出口は、一方向フロー制御により制限され、液体がプロセシングユニット間の流体接続から一方向に流れるよう制限するフロー方向を有する。入口又は出口の一方向フローを制限する手段は、典型的には、逆止め弁である。
【００３８】
様々な実施形態において、機器の流体送達デバイスのうちの少なくとも1つが、ポンプを含む。流体送達デバイスのうちの一方又は両方が、ポンプを含んでいてもよい。
【００３９】
本発明の機器は、典型的には、細胞株からの組換えタンパク質製造のための使用が意図されている。したがって、本発明の更なる一態様は、
i.本発明により定義される任意の機器を使用して、培養ユニットを精製ユニットに接続するポンプにより培養上清のアウトフローが提供される、培養ユニットにおいて細胞株を培養する工程、及び
ii.ポンプにより提供されるフィードインフローを伴う前記精製ユニット上でタンパク質精製を実施する工程
を含む、細胞株からの組換えタンパク質製造方法に関する。精製ユニットは、典型的には、当業者に知られている自動化精製ユニットである。
【００４０】
限定しないが、細胞株は、原核又は真核細胞に由来してもよいが、典型的には哺乳動物細胞株である。細胞株は、酵母、細菌細胞株、及び真核細胞株からなる群から選択されてもよい。典型的な細菌細胞株は、大腸菌(Escherichia coli)、枯草菌(B. subtilis)、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)、及びシュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)から選択されてもよい。真核細胞株は、出芽酵母(S.cerevisiae)並びにまたバチルス(Bacillus)属のもの、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、及び糸状菌、たとえばアスペルギルス属(Aspergillus)、トリコデルマ属(Trichoderma)、ミセリオフトラ・サーモフィラ(Myceliophthora thermophila)から更に選択されてもよい。細胞株は、更に、バキュロウイルス感染細胞、非溶解昆虫細胞発現昆虫細胞、又は哺乳動物細胞(HeLa、HEK 293)に由来していてもよい。細胞株は、植物系、たとえばタバコだけでなく、トマト、レタス、ニンジン植物及びトランスプラストミック植物、たとえば葉緑体発現ベクターを含むものに由来していてもよい。細胞株は、哺乳動物系、たとえばウシ[たとえばオーロックス(Bos primigenius)]、マウス[たとえばハツカネズミ(Mus musculus)]、チャイニーズハムスター卵巣、ベビーハムスター腎臓及びヒト胎児腎臓細胞に由来していてもよい。
【００４１】
限定しないが、標的タンパク質は、糖ペプチドに含まれるポリペプチドであってもよい。興味深い実施形態は、タンパク質が、抗体、凝固因子、たとえば、第V、第VII、第VIII、第IX、第X、及び第XIII因子、又はそれらの変異体、可溶性受容体、成長ホルモン、及びインスリン又はそれらの変異体からなる群から選択され、特に、タンパク質は、凝固因子及び抗体からなる群から選択される。タンパク質精製は、典型的には、濾過又はクロマトグラフィーにより実施される。
【００４２】
本発明の一態様は、
a.第1及び第2のプロセシングユニットである各プロセシングユニットが、流体入口、流体出口、及び流体送達デバイスを含み、第1及び第2のプロセシングユニットが、一方のプロセシングユニットの出口から次のプロセシングユニットの入口へ流体が流れる状態で少なくとも1つの流体接続により直列に接続される、少なくとも2つの独立プロセシングユニット、
b.2つのプロセシングユニット間の流体接続における少なくとも1つの流体入口、
c.2つのプロセシングユニット間の流体接続における少なくとも1つの流体出口
を含む、目的の分子を異成分からなる流体混合物から分離するための機器に関する。
【００４３】
第1のプロセシングユニットは、典型的には、バイオリアクター、発酵槽ユニット、管状リアクター、限外濾過ユニット、ホモジナイザー、遠心ユニット、及びクロマトグラフィーユニットからなる群から選択でき、これらのそれぞれが、連続又は半連続アウトフロー、好ましくは連続アウトフローを伴う。第2のプロセシングユニットは、典型的には、限外濾過ユニット、ホモジナイザー、遠心ユニット、及びクロマトグラフィーユニットからなる群から選択され、これらのそれぞれが、連続又は半連続アウトフロー、好ましくは連続インフローを伴う。
【００４４】
好適な実施形態の組合せにおいて、第1のプロセシングユニットは、連続アウトフローを伴う培養ユニット、たとえば灌流培養ユニットであり、第2のプロセスユニットは、連続インフローを伴うクロマトグラフィーシステムである。
【００４５】
好適な実施形態の更なる組合せにおいて、第1のプロセシングユニットは、連続アウトフローを伴う限外濾過ユニットであり、第2のプロセスユニットは、連続インフローを伴うクロマトグラフィーシステムである。
【００４６】
好適な実施形態の組合せにおいて、第1のプロセシングユニットは、連続又は半連続アウトフローを伴うクロマトグラフィーシステム、たとえばAktaクロマトグラフィーシステムであり、第2のプロセスユニットは、連続インフローを伴う限外濾過ユニットである。
【００４７】
好適な実施形態の更なる組合せにおいて、第1のプロセシングユニットは、連続アウトフローを伴う疑似移動床式クロマトグラフィーシステムであり、第2のプロセスユニットは、連続インフローを伴うクロマトグラフィーシステム、たとえばAktaクロマトグラフィーシステムである。
【００４８】
好適な実施形態の別の組合せにおいて、第1のプロセシングユニットは、連続又は半連続アウトフローを伴うクロマトグラフィーシステム、たとえばAktaクロマトグラフィーシステムであり、第2のプロセスユニットは、連続インフローを伴うクロマトグラフィーシステム、たとえばAktaクロマトグラフィーシステムである。
【００４９】
好適な実施形態の更に別の組合せにおいて、第1のプロセシングユニットは、連続又は半連続アウトフローを伴う管状リアクターであり、第2のプロセスユニットは、連続インフローを伴うクロマトグラフィーシステム、たとえばAktaクロマトグラフィーシステムである。
【００５０】
好適な実施形態の更に別の組合せにおいて、第1のプロセシングユニットは、連続アウトフローを伴うホモジナイザーであり、第2のプロセスユニットは、連続インフローを伴う連続遠心器である。
【００５１】
好適な実施形態の更に別の組合せにおいて、第1のプロセシングユニットは、連続アウトフローを伴う連続発酵であり、第2のプロセスユニットは、連続インフローを伴う連続遠心器である。
【００５２】
好適な実施形態の別の組合せにおいて、第1のプロセシングユニットは、連続アウトフローを伴う連続遠心器であり、第2のプロセスユニットは、連続インフローを伴うクロマトグラフィーシステム、たとえばAktaクロマトグラフィーシステムである。
【００５３】
実施形態のそれぞれにおいて、半連続出口フローが、連続入口フローと一致させられうる。たとえば、第1のプロセシングユニット、たとえばホモジナイザーからの出口フローは、連続する第2のプロセシングユニット、たとえば遠心器内へのパルスでありうる。本発明は、パルス間のフローの低減が提供されるか、又は「ブランクが満たされ」フローが一致させられることを提供する。
【００５４】
本発明の更なる一態様は、本明細書において定義される機器の使用を含む、少なくとも1つの標的分子を含有する液体を精製するための方法に関する。
【００５５】
本発明の興味深い一態様は、
i.目的のタンパク質を含有する流体混合物を製造する第1のプロセシング工程、
ii.一方向のフローにより流体混合物を、第1のプロセシング工程の出口から第2のプロセシング工程の入口へと(中間保持容器の使用なしに)移動させる工程、
iii.余剰な液体を除去するか、又は適合する液体を追加することにより、第1のプロセシング工程から送達される液体の流量を、第2のプロセシング工程において受け取られる液体の流量のそれと一致させる工程、
iv.目的のタンパク質を含有する更に精製された流体混合物を製造する第2のプロセシング工程
を含む、標的タンパク質を異成分からなる流体混合物から分離するための方法に関する。
【００５６】
本発明のいくつかの実施形態において、第1のプロセシング工程により製造される流体混合物が、流体混合物が第2のプロセシング工程の入口へと移動させられる前に、たとえば濾過により部分的に精製されることが好ましいであろう。
【００５７】
本発明の例示的一実施形態において、第1のプロセシング工程は、目的のタンパク質を含有する清澄化した細胞培養物回収流体をもたらす連続培養プロセスであり、第2のプロセシング工程は、標的タンパク質を含有する部分的に精製された流体をもたらす連続クロマトグラフィープロセスである。
【００５８】
本発明は、精製タンパク質の連続又は半連続製造のためのプロセスに更に関し、このプロセスは、
a.連続アウトフローを有する、分離ユニットを伴う細胞培養バイオリアクター、
b.連続インフローを伴うタンパク質を少なくとも部分的に精製するための手段、たとえばクロマトグラフィーを実施するための手段又は濾過のための手段、
c.バイオリアクターのアウトフロー及びタンパク質を少なくとも部分的に精製するための手段のインフローを一致させるための、2つの三叉コネクター及び2つの逆止め弁を伴うデバイス
を含む、統合型機器の使用を含む。
【００５９】
統合型システムの上流部分である第1のプロセシングユニットは、ATF細胞保持システムを使用して、灌流モードで作動するバイオリアクターを含んでいてもよい。オンライン静電容量プローブを使用した生細胞濃度のフィードバック制御を、定常状態での堅調な長期運転を保証するために適用できる。下流では、AKTAが、適用のインライン希釈オプションに続き、柔軟でよく制御された多段階精製システムの前に、2つの交代性クロマトグラフィー捕捉カラムへと導く。バイオリアクターからの流れのインライン希釈を有するというオプション(すなわち、pH調整、塩の添加等)は、捕捉法の選択肢を広げる。下流プロセスモニタリングは、カラム弁間のフロー経路に検出器を有することにより達成される。更に、バッファー交換カラムを、個々のカラム工程間で電導度及び/又はpH等のパラメーターを調整し、様々なカラムの組合せでの精製プロセスの自動化を可能にするために使用する。すべて合わせて、これは、エンドトゥエンドのセットアップを非常に柔軟にする。
【００６０】
第1のプロセシング工程が灌流培養であり、第2のプロセシング工程が連続多段階精製を含む実施形態は、柔軟で生産性の高い製造ユニットを可能にする。更に、保持工程又はサージ容器の除去は、望ましくないタンパク質分解のリスクを最小化し、これは、複雑で不安定なタンパク質の製造に理想的に好適なものとする。結果として、エンドトゥエンドの連続製造戦略は、化学的に規定の培地を使用してCHO細胞に発現する複雑な組換えタンパク質で例示されると考えられる。
【００６１】
本発明の一実施形態において、本発明は、多段階精製を、カラム間の完全制御及びクロマトグラフィーシステム、たとえばAKTAクロマトグラフィーシステム上での連続運転の可能性と組み合わせる。これら2つの態様を組み合わせることにより、基本的なクロマトグラフィーシステム、たとえばAKTAシステムを、連続精製ユニットへと転換できる。提示されたセットアップは、個別化ソフトウェア戦略のようなカスタマイズされた部分のない既製の解決策に基づき、そのことにより、自動化及び連続クロマトグラフィーを広く利用可能なものとする。
【００６２】
連続プロセスにおける2つの独立したプロセスユニットを接続するとき、それらのフローを一致させること、すなわち、先行するユニットのアウトフローを後続のユニットのそれと一致させることが困難である。先行技術において、これは、中間保存/サージ容器を導入することにより解決されてきた。これは、不要な保存を導入し、このことは、プロセシング時間を増加させ、酵素的、化学的及び物理的分解/変性へのタンパク質の曝露を増加させる。
【００６３】
半連続プロセスを連続プロセスに接続するときにはまた、フローを一致させるという困難があり、先行技術の解決策は、保存/サージ容器である。サージ容器はやはり、不要な保存を導入し、このことは、総プロセス時間を増加させ、タンパク質安定性を低減させる。
【００６４】
本発明の典型的な一実施形態によれば、2つの連続プロセシングユニット間の直接接続、又は連続ユニットと接続された1つの半連続ユニットは、中間サージ/保存容器なしに、2つの三叉コネクター及び2つの逆止め弁を伴う配置を用いる(様々な構成については図1〜図3を参照のこと)。第1のプロセシングユニットから送達されるフローが、第2のプロセシングユニットにより必要とされるものよりも低い場合、差分フロー(e)が、たとえば適合するバッファー溶液の供給に接続された、逆止め弁(c)を介して送達される。第1のプロセシングユニットから送達されるフローが、第2のプロセシングユニットにより受け取られるものよりも高い場合、余剰フロー(f)が、逆止め弁(d)を通じて、たとえば採取タンクへと進む。
【００６５】
第1のプロセシングユニットからのフローが半連続的で、バッチで送達される場合、第1のプロセシングユニットからのフローがゼロである第1のプロセシングユニットの休止期間中にフローを維持するのに必要とされる液体は、たとえば適合するバッファー溶液の供給に接続された、逆止め弁(c)を介して送達される。
【００６６】
このようにして、プロセスに導入される追加の保存及びプロセシング時間は存在しない。
【００６７】
図1〜図3に示す包括的構成の変形形態には、差分及び/又は余剰フローが、第1のプロセシングユニット及び/又は第2のプロセシングユニットから来る構成が含まれる。たとえば、差分フロー(e)がシステム1から来る図4を参照のこと。これの特定の一実施は、ATF灌流培養システムがAKTA精製システムに接続される図5に見ることができる。ATFハーベストポンプ(h)により送達されるフローが、AKTAポンプ(j)により受け取られるフローよりも低い場合、差分フローが逆止め弁(i)を介して受け取られる。ATFポンプから送達されるフローが、AKTAポンプ(j)により受け取られるものよりも高い場合、余剰フローが、逆止め弁(l)を通じて、たとえば採取容器(m)へと進む。
【００６８】
論じたとおり、本発明の方法は、機器内に少なくとも第1及び第2のプロセシングユニット機器を組み合わせることを伴い、プロセシングユニットは、一方のプロセシングユニットの出口から次のプロセシングユニットの入口へ流体が流れる状態で少なくとも1つの流体接続により直列に接続される。個別には、各プロセシングユニットは、独立プロセシングユニットである。
【００６９】
第1のプロセシングユニットは、典型的には、バイオリアクター、発酵槽ユニット、管状リアクター、限外濾過ユニット、ホモジナイザー、遠心ユニット、及びクロマトグラフィーユニットからなる群から選択され、これらのそれぞれが、連続又は半連続アウトフロー、好ましくは連続アウトフローを伴う。
【００７０】
第2のプロセシングユニットは、典型的には、限外濾過ユニット、ホモジナイザー、遠心ユニット、及びクロマトグラフィーユニットからなる群から選択され、これらのそれぞれが、連続又は半連続アウトフロー、好ましくは連続インフローを伴う。
【００７１】
一実施形態において、第1のプロセシングユニットは、連続アウトフローを伴う培養ユニット、たとえば灌流培養ユニットであり、第2のプロセスユニットは、連続インフローを伴うクロマトグラフィーシステム、たとえばAktaクロマトグラフィーシステムである。この実施形態は、非限定的に図5に示される。
【００７２】
別の好適な一実施形態において、第1のプロセシングユニットは、連続アウトフローを伴う限外濾過ユニットであり、第2のプロセスユニットは、連続インフローを伴うクロマトグラフィーシステム、たとえばAktaクロマトグラフィーシステムである。
【００７３】
別の好適な一実施形態において、第1のプロセシングユニットは、連続又は半連続アウトフローを伴うクロマトグラフィーシステム、たとえばAktaクロマトグラフィーシステムであり、第2のプロセスユニットは、連続インフローを伴う限外濾過ユニットである。
【００７４】
別の好適な一実施形態において、第1のプロセシングユニットは、連続アウトフローを伴う疑似移動床式クロマトグラフィーシステムであり、第2のプロセスユニットは、連続インフローを伴うクロマトグラフィーシステム、たとえばAktaクロマトグラフィーシステムである。
【００７５】
別の好適な一実施形態において、第1のプロセシングユニットは、連続又は半連続アウトフローを伴うクロマトグラフィーシステム、たとえばAktaクロマトグラフィーシステムであり、第2のプロセスユニットは、連続インフローを伴うクロマトグラフィーシステム、たとえばAktaクロマトグラフィーシステムである。
【００７６】
別の好適な一実施形態において、第1のプロセシングユニットは、連続又は半連続アウトフローを伴う管状リアクターであり、第2のプロセスユニットは、連続インフローを伴うクロマトグラフィーシステム、たとえばAktaクロマトグラフィーシステムである。
【００７７】
別の好適な一実施形態において、第1のプロセシングユニットは、連続アウトフローを伴うホモジナイザーであり、第2のプロセスユニットは、連続インフローを伴う連続遠心器である。
【００７８】
別の好適な一実施形態において、第1のプロセシングユニットは、連続アウトフローを伴う連続発酵であり、第2のプロセスユニットは、連続インフローを伴う連続遠心器である。
【００７９】
別の好適な一実施形態において、第1のプロセシングユニットは、連続アウトフローを伴う連続遠心器であり、第2のプロセスユニットは、連続インフローを伴うクロマトグラフィーシステム、たとえばAktaクロマトグラフィーシステムである。
【００８０】
本発明を、所望の機能を実施するデバイスによる、製品(一時的な保存には不安定又は不便)の成長/合成/調製のため(又は中間保存デバイスの非存在下で)、2つの連続プロセス工程を統合プロセスへと連結することに一般的に関するものとして記述できる。
【００８１】
本発明の態様は、統合システムへと、ATFモジュールを伴う細胞培養バイオリアクターを、タンパク質の精製のためのカラムのセットに連結することに関していてもよく、これらの両方が連続インフロープロセスであり、また、連続インフロープロセス方法のタイプ(培養、濾過、クロマトグラフィー、均質化、遠心)を限定せずに、2つのインフロープロセス工程を連結することに関していてもよい。
【００８２】
より具体的には、デバイスは、タンパク質(タンパク質のタイプを限定しない)の調製及び精製における使用のためのデバイスに関していてもよい。
【００８３】
不安定なタンパク質、たとえばFVIIIが、具体的には可能にされるが、デバイスは、その利点のうちの少なくともいくつかを、すべてのタンパク質、たとえば凝固因子、インスリン、GLP誘導体、GH、受容体、抗体/FAb等の調製及び精製において提供する。
【００８４】
以下の実施形態が、本発明を実施する好ましい様式である。
1.a.第1のプロセシングユニット及び第2のプロセシングユニットである各プロセシングユニットが、流体入口、流体出口、及び流体送達デバイスを含み、第1及び第2のプロセシングユニットが、一方のプロセシングユニットの出口から次のプロセシングユニットの入口へ流体が流れる状態で少なくとも1つの流体接続により直列に接続される、少なくとも2つの独立プロセシングユニット、並びに
b.追加の液体を流体接続に導入するための少なくとも1つの手段、
c.余剰な液体を流体接続から除去するための少なくとも1つの手段
を含む機器。
【００８５】
2.a.第1のプロセシングユニット及び第2のプロセシングユニットである各プロセシングユニットが、流体入口、流体出口、及び流体送達デバイスを含み、第1及び第2のプロセシングユニットが、一方のプロセシングユニットの出口から次のプロセシングユニットの入口へ流体が流れる状態で少なくとも1つの流体接続により直列に接続される、少なくとも2つの独立プロセシングユニット、並びに
b.追加の液体を流体接続に導入するための手段を提供する、2つのプロセシングユニット間の流体接続における少なくとも1つの流体入口、
c.余剰な液体を流体接続から除去するための手段を提供する、2つのプロセシングユニット間の流体接続における少なくとも1つの流体出口
を含む、実施形態1に記載の機器。
【００８６】
3.前記流体接続の入口が、一方向フロー制御により制限され、液体がプロセシングユニット間の流体接続に向かって一方向に流れるよう制限するフロー方向を有する、実施形態1又は2に記載の機器。
【００８７】
4.前記流体接続の出口が、一方向フロー制御により制限され、液体がプロセシングユニット間の流体接続から一方向に流れるよう制限するフロー方向を有する、実施形態1から3のいずれかに記載の機器。
【００８８】
5.一方向フローの手段が逆止め弁である、実施形態3又は4に記載の機器。
【００８９】
6.流体送達デバイスのうちの少なくとも1つがポンプを含む、実施形態1から5のいずれかに記載の機器。
【００９０】
7.i.実施形態1から5のいずれかに記載の機器を使用して、培養ユニットを精製ユニットに接続するポンプにより培養上清のアウトフローが提供される、培養ユニットにおいて細胞株を培養する工程、及び
ii.ポンプにより提供されるフィードインフローを伴う前記精製ユニット上でタンパク質精製を実施する工程
を含む、細胞株からの組換えタンパク質製造方法。
【００９１】
8.細胞株が哺乳動物細胞株である、実施形態7に記載の方法。
【００９２】
9.タンパク質が、凝固因子、凝固因子を含む融合タンパク質、インスリン、GLP誘導体、GH、受容体、及び抗体、たとえばFAbからなる群から選択される、実施形態7又は8に記載の方法。
【００９３】
10.タンパク質が、凝固因子及び抗体からなる群から選択される、実施形態9に記載の方法。
【００９４】
11.培養ユニットのアウトフローが精製システムへのフィードと一致する、実施形態7から10のいずれかに記載の方法。
【００９５】
12.タンパク質精製が、クロマトグラフィー、濾過又はそれらの組合せにより実施される、実施形態7から11のいずれかに記載の方法。
【００９６】
13.a.第1及び第2のプロセシングユニットである各プロセシングユニットが、流体入口、流体出口、及び流体送達デバイスを含み、第1及び第2のプロセシングユニットが、一方のプロセシングユニットの出口から次のプロセシングユニットの入口へ流体が流れる状態で少なくとも1つの流体接続により直列に接続される、少なくとも2つの独立プロセシングユニット、
b.2つのプロセシングユニット間の流体接続における少なくとも1つの流体入口、
c.2つのプロセシングユニット間の流体接続における少なくとも1つの流体出口
を含む機器。
【００９７】
14.a.第1及び第2のプロセシングユニットである各プロセシングユニットが、流体入口、流体出口、及び流体送達デバイスを含み、第1及び第2のプロセシングユニットが、一方のプロセシングユニットの出口から次のプロセシングユニットの入口へ流体が流れる状態で少なくとも1つの流体接続により直列に接続される、少なくとも2つの独立プロセシングユニット、
b.2つのプロセシングユニット間の流体接続における少なくとも1つの流体入口、並びに
c.2つのプロセシングユニット間の流体接続における少なくとも1つの流体出口
を含む、目的の分子を異成分からなる流体混合物から分離するための実施形態13に記載の機器。
【００９８】
15.前記流体接続の入口が、一方向フロー制御により制限され、液体がプロセシングユニット間の流体接続に向かって一方向に流れるよう制限するフロー方向を有する、実施形態13又は14に記載の機器。
【００９９】
16.前記流体接続の出口が、一方向フロー制御により制限され、液体がプロセシングユニット間の流体接続から一方向に流れるよう制限するフロー方向を有する、実施形態13又は14に記載の機器。
【０１００】
17.一方向フローの手段が逆止め弁である、実施形態15又は16に記載の機器。
【０１０１】
18.第1のプロセシングユニットが、バイオリアクター、発酵槽ユニット、管状リアクター、限外濾過ユニット、ホモジナイザー、遠心ユニット、及びクロマトグラフィーユニットからなる群から選択され、これらのそれぞれが、連続又は半連続インフロー、好ましくは連続インフローを伴う、実施形態13から17のいずれかに記載の機器。
【０１０２】
19.第2のプロセシングユニットが、典型的には、限外濾過ユニット、ホモジナイザー、遠心ユニット、及びクロマトグラフィーユニットからなる群から選択され、これらのそれぞれが、連続又は半連続アウトフロー、好ましくは連続アウトフローを伴う、実施形態13から18のいずれかに記載の機器。
【０１０３】
20.第1のプロセシングユニットが、連続アウトフローを伴う培養ユニット、たとえば灌流培養ユニットであり、第2のプロセスユニットが、連続インフローを伴うクロマトグラフィーシステムである、実施形態13から19のいずれかに記載の機器。
【０１０４】
21.第1のプロセシングユニットが、連続アウトフローを伴う限外濾過ユニットであり、第2のプロセスユニットが、連続インフローを伴うクロマトグラフィーシステムである、実施形態13から19のいずれかに記載の機器。
【０１０５】
22.第1のプロセシングユニットが、連続又は半連続アウトフローを伴うクロマトグラフィーシステム、たとえばAktaクロマトグラフィーシステムであり、第2のプロセスユニットが、連続インフローを伴う限外濾過ユニットである、実施形態13から19のいずれかに記載の機器。
【０１０６】
23.第1のプロセシングユニットが、連続アウトフローを伴う疑似移動床式クロマトグラフィーシステムであり、第2のプロセスユニットが、連続インフローを伴うクロマトグラフィーシステムである、実施形態13から19のいずれかに記載の機器。
【０１０７】
24.第1のプロセシングユニットが、連続又は半連続アウトフローを伴うクロマトグラフィーシステム、たとえばAktaクロマトグラフィーシステムであり、第2のプロセスユニットが、連続インフローを伴うクロマトグラフィーシステム、たとえばAktaクロマトグラフィーシステムである、実施形態13から19のいずれかに記載の機器。
【０１０８】
25.第1のプロセシングユニットが、連続又は半連続アウトフローを伴う管状リアクターであり、第2のプロセスユニットが、連続インフローを伴うクロマトグラフィーシステム、たとえばAktaクロマトグラフィーシステムである、実施形態13から19のいずれかに記載の機器。
【０１０９】
26.第1のプロセシングユニットが、連続アウトフローを伴うホモジナイザーであり、第2のプロセスユニットが、連続インフローを伴う連続遠心器である、実施形態13から19のいずれかに記載の機器。
【０１１０】
27.第1のプロセシングユニットが、連続アウトフローを伴う連続発酵であり、第2のプロセスユニットが、連続インフローを伴う連続遠心器である、実施形態13から19のいずれかに記載の機器。
【０１１１】
28.第1のプロセシングユニットが、連続アウトフローを伴う連続遠心器であり、第2のプロセスユニットが、連続インフローを伴うクロマトグラフィーシステム、たとえばAktaクロマトグラフィーシステムである、実施形態13から19のいずれかに記載の機器。
【０１１２】
29.実施形態13から32のいずれかに記載の機器の使用を含む、少なくとも1つの標的分子を含有する液体を精製するための方法。
【０１１３】
30.i.目的のタンパク質を含有する流体混合物を製造する第1のプロセシング工程、
ii.一方向のフローにより流体混合物を、第1のプロセシング工程の出口から第2のプロセシング工程の入口へと移動させる工程、
iii.余分な液体を除去するか、又は適合する液体を追加することにより、第1のプロセシング工程から送達される液体の流量を、第2のプロセシング工程において受け取られる液体の流量のそれと一致させる工程、
iv.目的のタンパク質を含有する更に精製された流体混合物を製造する第2のプロセシング工程
を含む、標的タンパク質を異成分からなる流体混合物から分離するための方法。
【０１１４】
31.第1のプロセシング工程が、目的のタンパク質を含有する清澄化した細胞培養物回収流体をもたらす連続培養プロセスであり、第2のプロセシング工程が、標的タンパク質を含有する部分的に精製された流体をもたらす連続クロマトグラフィープロセスである、実施形態30に記載の方法。
【０１１５】
32.a.連続アウトフローを有する、分離ユニットを伴う細胞培養バイオリアクター、
b.連続インフローを伴うタンパク質を少なくとも部分的に精製するための手段、たとえばクロマトグラフィーを実施するための手段又は濾過のための手段、
c.バイオリアクターのアウトフロー及びタンパク質を少なくとも部分的に精製するための手段のインフローを一致させるための、2つの三叉コネクター及び2つの逆止め弁を伴うデバイス
を含む統合型機器の使用を含む、精製タンパク質の連続又は半連続製造のための方法。
【実施例】
【０１１６】
(実施例1-Bドメイン欠失FVIII変異体の統合型連続製造)
Bドメイン欠失FVIII変異体[Thimら、Haemophilia (2010)、16、349〜359頁に記載]を製造するためのプロセスを、統合型連続製造セットアップへと転用した。
【０１１７】
簡潔に述べると、FVIII変異体を発現するクローンチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株を、化学的に規定の動物成分非含有培地中で培養した。増殖後、細胞株を、精製のための清澄化した細胞回収物のアウトプットを送達する灌流モードで運転するATF細胞保持システムを伴う5L撹拌タンクバイオリアクターに接種するために使用した。一定の生存バイオマスを維持するよう、オンライン静電容量プローブからフィードバック制御を使用してブリード速度を操作した。
【０１１８】
4つのクロマトグラフィー工程:
・Capto MMCカラム(GE HealthCare社、Uppsala、Sweden)上での捕捉工程
・免疫親和性クロマトグラフィー工程
・陰イオン交換クロマトグラフィー(Macro-Prep 25Q Support、BioRad Laboratories社、Hercules、CA、USA)
・ゲル濾過工程(Superdex 200、GE HealthCare社)
を含む元のバッチモード精製手順を、AKTA Pureクロマトグラフィーシステム(GE Healthcare社)上での連続精製手順に転用した。これを、二重交代性捕捉カラム(dual alternating capture columns)を用い、その後自動化多段階精製することにより達成した。手動希釈に替えて、バッファー交換カラム(Sephadex G-25、GE Healthcare社)を、工程1〜2及び3〜4の間に導入し、したがってカラム数を6に増加させた。一方の捕捉カラムには回収物をロードする一方で、精製及び清澄化は、他方の捕捉カラム上で実行し、以後のクロマトグラフィー工程には中間保存が一切ない。このようにして、AKTAクロマトグラフィーシステムを、およそ16時間のサイクル時間で、清澄化した細胞培養回収物の連続インプットと、精製タンパク質のサブバッチを送達する半連続アウトプットとを伴うシステムに転換した。
【０１１９】
Bドメイン欠失FVIII変異体の製造のための統合型連続システムが、上流ユニット(ATF灌流セットアップ)からの出口を、下流ユニット(AKTAシステム)の入口に接続することにより得られた。図5を参照のこと。ATFからの流量は、ハーベストポンプ(h)により制御され、AKTAへの流量は、試料適用ポンプ(j)により制御される。連続運転のため、これらの流量は、オーバーフロー/過圧又は気泡/低圧によるプロセス障害を回避するよう一致させる必要がある。プロセスフローにおいて任意の中間保存を導入することなしにこれを解決するため、2つの三叉接続及び2つの逆止め弁を伴う配置を用いた。ハーベストポンプ(h)により送達されるフローが、試料適用ポンプ(j)により受け取られるフローよりも低い場合、差分フローが逆止め弁(i)を介してATFシステムから受け取られる。ハーベストポンプ(h)から送達されるフローが、試料適用ポンプ(j)により受け取られるものよりも高い場合、余剰フローが、逆止め弁(l)を通じて、たとえば採取容器(m)へと進む。
【０１２０】
結果
ATF灌流セットアップ及び下流AKTAシステムを、本発明の機器を使用して接続した。接続したとき、ATF及びAKTAの両方を個別且つ独立に微調整した。これは、たとえば、上流ATF灌流セットアップを考慮することなく、無菌動作条件及び新鮮な細胞培地の供給に関して細胞培養を危険にさらすことなしに下流AKTAが停止及び開始されることを意味した。次に、統合型連続製造セットアップを、培養第24日と培養第31日の間に、灌流培養システムにおいて、Bドメイン欠失FVIII変異体の発現について評価した。11の精製サブバッチに相当する1週間の中断のない連続運転の後、統合型システムを意図的に停止した。最終ゲル濾過工程から得られたプールを、RP-HPLC及びSDS-PAGEにより測定し(図6及び図7)、見てわかるとおり、力価及び品質に関してアウトプットは一定で一貫していた。これは、提案されたセットアップが、定常状態での長期の統合型連続運転が可能であることを示す。
【０１２１】
工程間の中間保存を伴うバッチモードプロセスにおいて、清澄化した回収物から精製タンパク質までの通常のプロセシング時間は、少なくとも約4日である。提示された統合型連続プロセスにおいて、サブバッチ内の平均プロセシング時間は16時間である。プロセシング時間の低減により、統合型連続アプローチは、分解しがちな脆弱なタンパク質によく適したものとなっている。バッチモードプロセスと比較して、統合型連続プロセスはまた、培養の開始から最終精製タンパク質までのリードタイムを少なくとも3日間低減する。更に、精製クロマトグラムは、各サブバッチにおける精製タンパク質の量に関する情報を提供し、これは、統合型プロセスの連続モニタリングを提供する。これは、たとえば、十分なタンパク質が製造されたときに運転を停止する(「ちょうど十分」な製造)ために使用でき、リードタイムを更に一層低減することを可能にする。
【０１２２】
(実施例2-ダイマータンパク質の統合型連続製造)
ダイマー形態の組換えタンパク質を製造するための統合型連続セットアップを設計した。
【０１２３】
組換えタンパク質を発現するクローンチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株を、化学的に規定の動物成分非含有培地中で培養した。増殖後、細胞株を、精製のための清澄化した細胞回収物のアウトプットを送達する灌流モードで運転するATF細胞保持システムを伴う5L撹拌タンクバイオリアクターに接種するために使用した。一定の生存バイオマスを維持するよう、オンライン静電容量プローブからフィードバック制御を使用してブリード速度を操作した。清澄化した回収物は、モノマー及びダイマーの両方の形態の組換えタンパク質を含有する。
【０１２４】
3つのクロマトグラフィー工程:
・免疫親和性クロマトグラフィー工程
・イオン交換クロマトグラフィー工程
・ゲル濾過工程
を含む連続精製手順を、AKTA Pureクロマトグラフィーシステム(GE Healthcare社)上で実施した。これを、二重交代性捕捉カラムを用い、その後自動化多段階精製することにより達成した。一方の捕捉カラムには回収物をロードする一方で、精製及び清澄化は、他方の捕捉カラム上で実行し、以後のクロマトグラフィー工程には中間保存が一切ない。このようにして、AKTAクロマトグラフィーシステムを、およそ18時間のサイクル時間で、清澄化した細胞培養回収物の連続インプットと、精製タンパク質のサブバッチを送達する半連続アウトプットとを伴うシステムに転換した。
【０１２５】
ダイマー形態の組換えタンパク質の製造のための統合型連続システムが、クロマトグラフィーカラム4〜6が必要ないことを除いて実施例1に記載のとおり、上流ユニット(ATF灌流セットアップ)からの出口を、下流ユニット(AKTAシステム)の入口に接続することにより得られた。重要なことに、最終ゲル濾過工程からのUV吸光度クロマトグラムは、図8の例を参照されたいが、精製ダイマーの量を、たとえばダイマー及びモノマーピーク下の面積の積分により、ダイマーとモノマーとの間の比又はダイマー分率とともにモニタリングするために使用できる。
【０１２６】
結果
ATF灌流セットアップ及び下流AKTAシステムを、三叉コネクターユニットを使用して接続した。接続したとき、ATF及びAKTAの両方を個別且つ独立に微調整した。これは、たとえば、上流ATF灌流セットアップを考慮することなく、無菌動作条件及び新鮮な細胞培地の供給に関して細胞培養を危険にさらすことなしに下流AKTAが停止及び開始されることを意味した。次に、統合型連続製造セットアップを、培養第18日と培養第29日の間に、灌流培養において、組換えタンパク質の発現について評価した。この期間中、培養における望ましい作動点の変化(生存バイオマスの増加)があった。およそ11日に相当する15の精製サブバッチの後、統合型システムを意図的に停止した。
【０１２７】
生存バイオマスが増加するとき、ゲル濾過クロマトグラムから推定されるとおり精製ダイマーの量が同時に増加する(図9を参照のこと)。更に、培養における変化によりダイマー分率が増加することが示される。変化前、変化中及び変化後の個々のクロマトグラムの視覚的検査は、培養における変化によるダイマー分率の増加が実際にあることを示唆する(図10を参照のこと)。
【０１２８】
やはり、本実施例は、提案されたセットアップが、長期の統合型連続運転が可能であることを示す。特に、本実施例は、プロセス変化を追跡し、製品品質属性の変化を検出することによる統合システムのモニタリング能力を更に示す。
【０１２９】
(実施例3-FVII変異体の統合型連続捕捉)
組換えFVII変異体の培養及び捕捉のための統合型連続セットアップを設計した。
【０１３０】
FVII変異体を発現するチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株を、化学的に規定の動物成分非含有培地中で培養した。増殖後、細胞株を、精製のための清澄化した細胞回収物のアウトプットを送達する灌流モードで運転するATF細胞保持システムを伴う15L撹拌タンクバイオリアクターに接種するために使用した。生存バイオマスにおける定常状態を、一定の細胞ブリード速度により達成した。
【０１３１】
免疫親和性クロマトグラフィーに基づく連続捕捉手順を、AKTA Pureクロマトグラフィーシステム(GE Healthcare社)上で、二重交代性捕捉カラムを用いて実施した。一方の捕捉カラムには回収物をロードする一方で、精製及び清澄化は、他方の捕捉カラム上で実行する。このようにして、AKTAクロマトグラフィーシステムを、およそ24時間のサイクル時間で、清澄化した細胞培養回収物の連続インプットと、捕捉タンパク質のサブバッチを送達する半連続アウトプットとを伴うシステムに転換した。
【０１３２】
FVII変異体の培養及び捕捉のための統合型連続システムが、クロマトグラフィーカラム2〜6が必要ないことを除いて実施例1に記載のとおり、上流ユニット(ATF灌流セットアップ)からの出口を、下流ユニット(AKTAシステム)の入口に接続することにより得られた。
【０１３３】
培養物及びATF回収物中のFVII変異体力価を、親和性HPLCにより測定した。捕捉プール中のFVII変異体力価を、SE-HPLCにより測定した。
【０１３４】
結果
統合型連続製造セットアップを、培養第7日と培養第28日の間に、灌流培養において、FVII変異体の発現について評価した(図12を参照のこと)。21日に相当する21の捕捉サブバッチの後、統合型システムを意図的に停止した。
【０１３５】
捕捉収率は、平均74%の前後でわずかに変化するが、経時的な性能の減少の傾向又は他の徴候はなかった(図11)。本実施例は、提案されたセットアップが、長期の統合型連続運転が可能であることを更に示す。
【０１３６】
(実施例4-モノクローナル抗体の統合型連続製造)
モノクローナル抗体を製造するための統合型連続セットアップを設計した。
【０１３７】
IgG4型のモノクローナル抗体を発現するクローンCHO細胞株を、化学的に規定の動物成分非含有培地中で培養した。増殖後、細胞株を、精製のための清澄化した回収物のアウトプットを送達する灌流モードで運転するATF細胞保持システムを伴う5L撹拌タンクバイオリアクターに接種するために使用した。温度設定点を、培養7日後に、36.5℃から32℃に変化させて細胞成長を低減し、一定の速度で細胞ブリードを開始した。
【０１３８】
単一のプロテインA親和性クロマトグラフィー工程を含む連続精製手順を、AKTA Explorerクロマトグラフィーシステム(GE Healthcare社)上で実施した。これを、二重交代性捕捉カラムを用いることにより達成した。このようにして、AKTAクロマトグラフィーシステムを、およそ2.5時間のサイクル時間で、清澄化した細胞培養回収物の連続インプットと、精製タンパク質のサブバッチを送達する半連続アウトプットとを伴うシステムに転換した。
【０１３９】
モノクローナル抗体の製造のための統合型連続システムが、図4に示す機器を使用して、上流ユニット(ATF灌流セットアップ)を下流ユニット(AKTAシステム)に接続することにより得られた。この統合は、実施例1に詳細に記載されている。
【０１４０】
結果
統合型連続製造セットアップを、灌流培養の培養第8日に実施した短期製造について評価した。システムを試験し、精製システム上の流量の変化に対するシステムの堅調性を評価するため、3つのサブバッチを製造した。これを容易にするため、AKTAシステム上での2.5mL/分の初期流量の100%(サブバッチA)、75%(サブバッチB)、及び125%(サブバッチC)にそれぞれ相当するインフロー流量をAKTAシステム上で使用して、3つの連続サブバッチを流した。
【０１４１】
100%設定で、灌流システムのアウトフローが精製システムのインフローとほぼ一致することが観察された。流量は、灌流アウトフロー及び精製インフローについてそれぞれ、2.59mL/分及び2.5mL/分であり、少量の液体を採取タンク中に観察できた。AKTAシステムのインフローが75%に低減されたとき、灌流回収物は、0.72g/分の流量で採取タンクへと流れた(100%AKTAフローでの完全一致で0.63g/分と予測された)。図13を参照のこと。これは、第1のシステムのアウトフローが第2のシステムのインフローよりも高い、両方が接続されたシステムにおいて一定のフローを維持する統合デバイスの能力を示す。
【０１４２】
統合デバイスが逆の状況において好適かどうかを調査するため、AKTAシステムインフローを、開始値の125%まで増加させた。結果として、灌流システムの総希釈率は増加した。
【０１４３】
精製サブバッチの定量についてのSE-HPLCクロマトグラムを図14に示す。サブバッチAからサブバッチBへのAUCの減少を観察でき、これは、AKTAシステム上のポンプ速度の減少によるロード容積の減少と相関する。サブバッチA及びサブバッチCからのAUCと比較して、増加を観察できる。この増加は、ロード容積の増加よりも低く、これは、灌流システムにおける希釈率の増加による回収物の力価の低減に帰すことができる。図15に示すとおり、すべてのサブバッチの製品品質は同等だった。
【０１４４】
これは、統合デバイスが、2つの独立に運転される連続ユニット運転のフローを一致させることができることを示す。更にそれは、統合デバイスを使用した連続製造セットアップについてのフロー変化に対するロバスト性を示す。
【０１４５】
(実施例5-インスリン前駆体の統合型連続捕捉)
インスリン前駆体を製造するための統合型連続セットアップを設計した。
【０１４６】
インスリン前駆体を発現する組換えサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)株を、標準酵母成長培地(グルコース、酵母抽出物、塩、及びビタミン)中で、連続培養セットアップで、好気条件下の0.3L実験用バイオリアクター内で成長させた。バイオリアクター内の一定の容量を維持するため、培養ブロスを頻繁にポンプで排出し、バッファーフラスコ内へと導き、そこからブロスは、細胞分離のための精密濾過セットアップへと連続的にポンプで注入する。細胞の除去後に、フローを、インライン希釈を用いることによりpHが低下する前に本発明の機器を通じて移動させ、細胞非含有回収物をCIEX捕捉カラムに適用する。細胞非含有回収物の連続フローを取り扱うことができるよう、SP Sepharose FF(GE Healthcare社)を含む二重交代性捕捉カラムを使用した。捕捉カラムの一方がロードされるとき、他方は洗浄、溶出、及び再平衡化し、次にそれらを切り替え、再び切り替える、ということを繰り返す。セットアップ全体を、図16に見ることができる。
【０１４７】
実験の目的は、(1.)インスリン前駆体を連続的且つ統合的に製造可能であることを検証すること、及び(2.)本発明の機器が、細胞分離デバイス(クロスフロー濾過デバイス)と精製セットアップ(改変AKTAエクスプローラー)との間のフローの望ましくない変動に対抗できるかどうかを評価することであった。
【０１４８】
結果:
インスリン前駆体を連続的に、統合された上流及び下流デバイスで製造可能であることを検証するため、回収したペプチドを、リシン特異的ALP酵素で処理し、SDS-PAGEで分析した(図17)。SDS-PAGEは、予測されたものを示す。インスリン前駆体はALPにより成熟させられる。
【０１４９】
図1に示すセットアップの試験を行うとき、逆止め弁1を伴うバッファーフラスコ(図16の凡例を参照のこと)及び逆止め弁2を伴う余剰採取フラスコ(図16の凡例項目m)を秤にかけ、それらの質量をモニタリングした。
【０１５０】
図18において、期間Aにおいて、AKTAポンプを、細胞分離デバイスからのアウトフローのフローに対応すると考えられる値に設定した。だが、細胞分離デバイスからのフローははるかに高いことが示された。なぜなら、余剰が、質量の増加により検出される採取容器に導かれたからである。期間Bにおいて、AKTAフローを150%まで増加させたが、それでも余剰な液体が余剰採取フラスコ中に採取された。期間Cにおいて、初期AKTAフローの200%で、余剰採取容器内への余剰な液体のフローは停止し、細胞分離デバイスからのアウトフローと精製セットアップへのインフローが等しいことが示された。期間Dでは、AKTAを休止し、結果として液体は直接採取容器内に導かれ、期間Eでは、クロスフロー濾過デバイスを停止し、結果として液体はバッファーフラスコのみから引き出された。この2時間の試験中、クロスフローデバイス及び精製機器の両方が、強制的な流量のミスマッチを強制したにもかかわらず、妨げられることなく動作し続けた。
【０１５１】
クロス濾過装置はある程度その膜を通じて、浸透側の圧力が変化するとき、それゆえAKTAフローが変化するときにフローを変化させる。そのことは、クロスフロー濾過膜からのフローがないとき、バッファーフラスコ(凡例項目l、図16)から引き出された液体を有することのみが予測されたことを意味し、このことが観察された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2017515501.tif 000015
【図１４】
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【図１５】
2017515501.tif 000017
【図１６】
2017515501.tif 000018
【図１７】
2017515501.tif 000019
【図１８】
2017515501.tif 000020
【国際調査報告】
2017515501.tif 000021
2017515501.tif 000022
2017515501.tif 000023