(57)【要約】  本発明は、痰中のシグナル伝達兼転写活性化因子（ＳＴＡＴ，Signal Transducer and Activator of Transcription）タンパク質のリン酸化を測定するための方法及び治療剤を評価する際のそのような方法の適用に関する。
2017532578.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フローサイトメトリーを使用して痰試料中のＳＴＡＴリン酸化を測定するための方法。
【請求項２】
キナーゼ阻害剤の有効性及び／又は感度を評価するための方法であって、フローサイトメトリーを使用して痰試料中のＳＴＡＴリン酸化を測定することを含む、前記方法。
【請求項３】
キナーゼ阻害剤についての好適な用量範囲及び／又は投薬レジメンを評価するための方法であって、フローサイトメトリーを使用して痰試料中のＳＴＡＴリン酸化を測定することを含む、前記方法。
【請求項４】
試料が、実施される分析の一部として試料が供される各実験又は対照条件について、痰細胞を、およそ１００，０００〜５００，０００個含有している、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
いかなる炎症性細胞も活性化することなく細胞を分散するために痰試料をＤＴＴで処置し、任意で室温で振とうする痰処理ステップを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
痰処理ステップが、ＤＴＴを０．１％（ｗ／ｖ）未満の濃度で試料に添加すること、及び当該混合物を、室温で１５分超の間、穏やかに振とうすることを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
痰処理ステップが、少なくとも７０％の細胞生存率をもたらす、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
痰処理ステップが、試料中のいかなるプロテアーゼも阻害することをさらに含む、請求項５〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
１又は２以上のサイトカインで処置されるＳＴＡＴリン酸化誘導ステップを含む、請求項１〜８のいずれかに記載の方法であって、前記サイトカインが、任意でＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２３、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、成長ホルモン、プロラクチン及びエリスロポエチンからなる群から選択される、前記方法。
【請求項１０】
ＳＴＡＴが、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５Ａ、ＳＴＡＴ５Ｂ及び／又はＳＴＡＴ６である、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ＳＴＡＴがＳＴＡＴ１であり、
リン酸化が、ＩＦＮγ及び／又はＩＬ−６によって誘導される、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
キナーゼ阻害剤の存在下でＳＴＡＴリン酸化を誘導することを含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
痰細胞を１００％（ｖ／ｖ）メタノールで処置する細胞透過処理ステップを含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
フローサイトメトリーが：
（ｉ）少なくとも４％のマクロファージを含有する細胞；及び／又は
（ii）少なくとも１００μｌの試料体積
で実施される、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
ＩＦＮγを使用して、任意でキナーゼ阻害剤の存在下で、痰マクロファージにおいてＳＴＡＴ１リン酸化を誘導することを含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
痰試料中の１又は２以上の炎症バイオマーカーの、１又は複数のレベルを測定することをさらに含む、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法であって、前記バイオマーカーが、任意でサイトカイン、炎症促進性サイトカイン、ケモカイン、ＣＣ１６、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮγ、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＰ−１０、ＭＩＰ−１ｂ、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１２、好中球エラスターゼ、ＴＧＦβ、ＴＩＭＰ−１、ＴＮＦα及びＴＳＬＰからなる群から選択される、前記方法。
【請求項１７】
（ｉ）キナーゼ阻害剤の有効性及び／若しくは感度、並びに／又は（ii）キナーゼ阻害剤についての好適な用量範囲及び／若しくは投薬レジメンを評価するためのバイオマーカーとしてのｐＳＴＡＴの使用であって、フローサイトメトリーを使用して痰試料中のＳＴＡＴリン酸化を測定することを含む、前記使用。
【請求項１８】
キナーゼ阻害剤が：
（ｉ）吸入による投与に適応される、
（ii）経口投与に適応される、
（iii）静脈内投与に適応される、
（iv）選択的若しくは非選択的タンパク質キナーゼ阻害剤、任意でＳｒｃ、Ｃｓｋ、Ａｃｋ、Ｆａｋ、Ｔｅｃ、Ｆｅｓ、Ｓｙｋ、Ａｂｌ及びＪａｋ阻害剤からなる群から選択されていてもよいＰＴＫ阻害剤、若しくはＭＫ２阻害剤である、並びに／又は
（ｖ）肺疾患、好ましくは炎症性肺疾患、より好ましくはＴＨ１炎症によって特徴付けられる肺疾患、及び最も好ましくはＣＯＰＤ若しくはＩＰＦの治療若しくは予防のために適応される、
請求項１２若しくは１５に記載の方法、又は請求項１７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、痰に実施されるバイオマーカー方法論（methodology）に関する。具体的には本発明は、痰中のシグナル伝達兼転写活性化因子（ＳＴＡＴ，Signal Transducer and Activator of Transcription）タンパク質のリン酸化を測定するためのフローサイトメトリーに基づく方法及び治療剤としてのキナーゼ阻害剤を評価する際のそのような方法の適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物細胞におけるタンパク質機能の制御は、タンパク質キナーゼによって媒介される可逆的タンパク質リン酸化を介して調節されている。５００種類を超えて存在するキナーゼは、すべての細胞型において重要なシグナル伝達経路に関与している酵素である。
【０００３】
キナーゼ阻害剤は、抗炎症性疾患、腫瘍学並びに自己免疫及び移植などの医薬の他の領域についての有用な標的である。キナーゼ阻害剤は、単一のキナーゼに対して特異的ではなく、複数のキナーゼに対する幅広い活性を有する。キナーゼ阻害剤は、キナーゼ標的に対して選択的又は非選択的であってよい。
【０００４】
サイトカインは、細胞増殖及び分化、宿主防御並びに、細胞性免疫及びアレルギー型応答を含む免疫制御に関与するホルモン伝達物質である。１つの大きなサブグループ、Ｉ型及びII型サイトカインファミリーは、インターフェロン（ＩＦＮ，interferon）、インターロイキン（ＩＬ，interleukin）及びコロニー刺激因子（ＣＳＦ，colony stimulating factor）に結合する受容体を包含する。これらのサイトカインはすべてシグナル伝達の共通の方法、すなわちヤヌスキナーゼＳＴＡＴ（ＪＡＫ−ＳＴＡＴ，Janus kinase - STAT）経路を使用する（O’Shea JJ et al. N Engl J Med. 2013; 368:161-70）。
【０００５】
ＪＡＫは、種々のサイトカイン受容体によって活性化される非受容体チロシンキナーゼであり、７個のＳＴＡＴタンパク質のリン酸化を通じて遺伝子発現を制御する。ＪＡＫ１／３ヘテロ二量体はＴ細胞生存を制御するが、一方ＪＡＫ２は、ＩＦＮガンマ（ＩＦＮγ，IFN-gamma）及びＩＬ−１２／ＩＬ−２３シグナル伝達に加えて顆粒球マクロファージＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ，granulocyte-macrophage CSF）媒介性好中球生存を媒介する。ＳＴＡＴ４は、ＩＬ−１２及びＩＬ−２３によって活性化される。ＳＴＡＴ３（及びその下流遺伝子）は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ，chronic obstructive pulmonary disease）患者の肺実質において活性化される。
【０００６】
ｐ３８マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ，mitogen-activated protein kinase）経路（図１を参照されたい）は、幅広い範囲の細胞外刺激によって活性化される。ｐ３８キナーゼは、上流ＭＡＰＫキナーゼ（ＭＡＰＫＫ；ＭＫＫ，MAPK kinase）を介するリン酸化によって活性化され、次に下流基質の活性化を引き起こす。ＭＡＰＫ活性化タンパク質キナーゼ２（ＭＡＰＫＡＰＫ２；ＭＫ２，MAPK-activated protein kinase 2）は、サイトカイン産生、炎症性応答、エンドサイトーシス、細胞骨格の再構築、細胞遊走、細胞周期制御、クロマチンリモデリング、ＤＮＡ損傷応答及び転写制御に関与するｐ３８活性化セリン（Ｓｅｒ）／スレオニン（Ｔｈｒ）タンパク質キナーゼである。
【０００７】
ストレスに続いてＭＫ２は、次に核への移行を導き、多数の基質のリン酸化を方向付ける、ｐ３８ＭＡＰＫによるＴｈｒ２５、Ｔｈｒ２２２、Ｓｅｒ２７２及びＴｈｒ３３４でのリン酸化を介して活性化される。リン酸化ＭＫ２は、炎症性応答に関与し、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα，tumour necrosis factor alpha）及びＩＬ−６産生を制御することによって作用する。ＭＫ２は、線維症をもたらす場合がある熱ショックタンパク質２７（ＨＳＰ２７）のリン酸化も調節する。ｐ３８α／ＭＫ２は、炎症性マクロファージを含む白血球において高レベルで身体全体に偏在性に発現される。
【０００８】
ＳＴＡＴリン酸化は、ウエスタンブロッティングによって容易に検出され得るが、混合集団中の特定の細胞型の活性化を同定できない。フローサイトメトリーは、全血アッセイ及び末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ，peripheral blood mononuclear cell）における細胞内ＳＴＡＴ１リン酸化を検出するために使用されているが（Vakkila J et al. Scand J Immunol. 2008 Jan; 67(1):95-102、Marodi L et al. Clin Exp Immunol. 2001 Dec; 126(3):456-60）、痰においてはされていない。
【０００９】
選択的ＪＡＫ阻害剤、トファシチニブは、ＪＡＫ１、ＪＡＫ３及び、低い程度でＪＡＫ２を阻害するが、他のキナーゼ系、例えばチロシンキナーゼ２（ＴＹＫ２，tyrosine kinase 2）も阻害する。この薬物は、関節リウマチの治療のための臨床使用について承認されている。種々の継続中の臨床研究において炎症性腸疾患、乾癬及び腎臓移植を有する患者における臨床的改善に関連する抗炎症性活性も実証されている。
【００１０】
しかしＪＡＫ阻害剤は、顕著な有害作用に、特に高用量で使用された場合に関連する。これらの合併症は感染、詳細には結核、高脂血症及び、ＪＡＫ２阻害から直接生じる貧血などのさまざまな骨髄異常を含む。これらの合併症は、経口で送達され得る薬物の量を制限する。
【００１１】
初期の研究では全血アッセイが、白血球（全血及びＰＢＭＣ）におけるＳＴＡＴリン酸化経路を阻害するこれらの薬物の作用機序を確立するために使用された。これらの薬物が好中球及びしたがって好中球媒介性炎症をこの経路を介して直接阻害すると考えられた。
【００１２】
開発中の他のさらに最近の化合物は、急速な全身性クリアランスを有し、それにより吸入経路で与えられた場合に局所抗炎症性活性が最大化される一方で全身性有害事象を最少化するｐａｎ−ＪＡＫ阻害剤を含む。吸入薬は、炎症性肺疾患、例えばＣＯＰＤ、ＩＰＦ及び肺の他の炎症性状態の治療ための投与の好ましい経路である場合がある。
【００１３】
ＣＯＰＤは、息切れ、炎症及び炎症促進性マーカーレベルの増加によって特徴付けられる気道の炎症性疾患である。ＣＯＰＤは、好中球及びマクロファージを含む炎症性細胞数の増加を有する特定の表現型の患者における痰産生の増加によっても特徴付けられる。肺でのマクロファージ数は、例えば喘息よりもＣＯＰＤにおいてはるかに大きい（Barnes PJ. Nat Rev Immunol. 2008; 8:183-92 ["2008a"]）。肺マクロファージは、多形核好中球（ＰＭＮ，polymorphonuclear neutrophil）、単球及びＴ細胞を攻撃するケモカインの放出を通じてＣＯＰＤにおいて基本的な役割を有する（Ｔｈ１細胞、（Barnes PJ. COPD. 2004; 1; 59-70 ["2004a"]））。ＣＯＰＤでは、気道及び肺に蓄積するＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｔｈ１型である。
【００１４】
この後者に関してＴリンパ球は、サイトカインの主な供給源である。これらの細胞は、外来病原体の認識を可能にする抗原特異的受容体をそれらの細胞表面上に保持している。それらは、自己免疫疾患のエピソードの際には正常な組織も認識する場合がある。ＣＤ４及びＣＤ８として周知の細胞表面分子の存在によって識別されるＴリンパ球の２個の主なサブセットがある。ＣＤ４を発現しているＴリンパ球は、ヘルパーＴ細胞としても周知であり、これらは最も多産なサイトカイン産生者であると考えられている。このサブセットは、Ｔｈ１及びＴｈ２にさらに細分でき、それらが産生するサイトカインは、Ｔｈ１型サイトカイン及びＴｈ２型サイトカインとして周知である。Ｔｈ１型サイトカインは、細胞内寄生生物を死滅させ、自己免疫性応答を永続させる原因である炎症促進性応答を産生する傾向がある。ＩＦＮγは、主なＴｈ１サイトカインである。Ｔｈ２型サイトカインは、アトピーにおいてＩｇＥ及び好酸球応答の促進に関連するＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３並びに、より多い抗炎症性応答を有するＩＬ−１０も含む。
【００１５】
痰好中球は、ＣＯＰＤ疾患進行と相互関係があり、疾患活性の主要なバイオマーカーとして確立されている。ＩＬ−８、クララ細胞分泌タンパク質（ＣＣ−１６）などの痰中で同定された他のバイオマーカーは、疾患活性と関連し、疾患進行と相互関係がある（Dickens JA et al.  Respir Res. 2011 Nov; 12:146、Kim DK et al.  Am J Respir Crit Care Med. 2012 Dec; 186(12):1238-47）。
【００１６】
ＣＯＰＤもＩＦＮγの増加と関連する。この増加は、いくつかの場合に全身性であることが示されているが、さらに特徴的には増加は痰及び気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ，bronchial alveolar lavage）試料において見られる。ＩＦＮγは食作用を減少させ、マクロファージからの炎症性メディエーター放出を増加させる。ＩＦＮγは、ＳＴＡＴ１のリン酸化を介してＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路を活性化する。ＩＦＮγは、気道上皮細胞からのケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド９（ＣＸＣＬ９）、ＣＸＣＬ１０及びＣＸＣＬ１１などの炎症促進性サイトカインのさらなる放出又は上方制御の原因である場合もある（Barnes PJ. J Clin Invest. 2008 Nov; 118(11):3546-56 ["2008b"]）。
【００１７】
上記のとおりＪＡＫは、ＳＴＡＴ１を含む種々のタンパク質のリン酸化を触媒できる酵素のファミリーである。遺伝子関連研究は、ＳＴＡＴ１とＣＯＰＤとの間の関連を見出した。リン酸化ではＳＴＡＴ１は、炎症性バイオマーカーの転写及び発現を増加させる（Barnes PJ et al. Am J Respir Crit Care Med. 2006 Jul; 174(1):6-14、Barnes PJ.  Pharmacol Rev. 2004 Dec; 56(4):515-48 ["2004b"]）。ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路はＩＦＮγによって活性化することができ、ＪＡＫ阻害剤はこの経路を阻害し、それにより気道炎症を低減する目的で開発されている。この経路の阻害は、炎症性メディエーター放出を低減し、細菌のマクロファージ食作用を改善する。
【００１８】
ＩＰＦは、原因不明の致死性、慢性、進行性、線維化性、間質性肺炎である（American Thoracic Society; European Respiratory Society (ATS/ERS). Am J Respir Crit Care Med. 2002; 165:277-304）。ＩＰＦ患者の肺組織は、近位で活性化筋線維芽細胞蓄積（線維芽細胞病巣）及び正常肺構造を示す。ＩＰＦは、臨床的には免疫活性化及び線維芽細胞の周期性の急性刺激を介する炎症及び線維症の組合せとして示される。標的化筋線維芽細胞蓄積、細胞外マトリクス産生、細胞収縮性及び侵襲性能力は、線維症を低減すると予測される。トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β，transforming growth factor beta）の直接標的化は、宿主防御及び腫瘍監視におけるその中心的役割のために実りあるものではなかった。ＴＧＦ−β経路における遠位ノードを標的化すること、それによって筋線維芽細胞機能を武装解除しながらオフ標的効果を回避することは、魅力的な治療手法を表す。１つの遠位標的はＭＫ２である。
【００１９】
ＭＫ２阻害化合物は、気道の慢性炎症性状態における使用のための吸入抗炎症性療法としての潜在的活性を有する。ＭＫ２などのｐ３８ＭＡＰＫ経路における種々のステップを標的化することは、ＴＮＦα及びＨＳＰ２７などのそのようなバイオマーカーの低減を炎症及び線維症の低減可能性を有して生じる可能性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】O’Shea JJ et al. N Engl J Med. 2013; 368:161-70
【非特許文献２】Vakkila J et al. Scand J Immunol. 2008 Jan; 67(1):95-102
【非特許文献３】Marodi L et al. Clin Exp Immunol. 2001 Dec; 126(3):456-60
【非特許文献４】Barnes PJ. Nat Rev Immunol. 2008; 8:183-92 ["2008a"]
【非特許文献５】Barnes PJ. COPD. 2004; 1; 59-70 ["2004a"]
【非特許文献６】Dickens JA et al.  Respir Res. 2011 Nov; 12:146
【非特許文献７】Kim DK et al.  Am J Respir Crit Care Med. 2012 Dec; 186(12):1238-47
【非特許文献８】Barnes PJ. J Clin Invest. 2008 Nov; 118(11):3546-56 ["2008b"]
【非特許文献９】Barnes PJ et al. Am J Respir Crit Care Med. 2006 Jul; 174(1):6-14
【非特許文献１０】Barnes PJ.  Pharmacol Rev. 2004 Dec; 56(4):515-48 ["2004b"]
【非特許文献１１】American Thoracic Society; European Respiratory Society (ATS/ERS). Am J Respir Crit Care Med. 2002; 165:277-304
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
本発明者らは、キナーゼ阻害剤、詳細には吸入経路を介して送達されるキナーゼ阻害剤の臨床開発が、肺における活発な薬理学的活性を反映する新規バイオマーカーの開発によって増強されることを理解した。そのようなバイオマーカーが臨床開発のための類似の化合物の最適な選択、用量の最適な選択、用量範囲及び可能性がある薬力学的活性の予測を理解するための科学的根拠を提供するために利用できることを彼らは認識した。臨床研究における的確な用量及び用量範囲の早期の選択は、治療可能比（therapeutic ratio）をさらに明らかにし、より大きな患者研究に進む前に的確な用量選択を支援する薬理学的証明及び／又は機序研究の証明を可能にする。インビトロからの薬物作用の早期の理解及び早期のインビボ研究は、臨床薬開発での大幅な節約をもたらす。
【００２２】
この点を考慮し、本明細書に記載のとおり、本発明者らは、フローサイトメトリーを使用する痰試料中のＳＴＡＴリン酸化を測定するためのアッセイ系を開発した。疾患のマーカーであるＳＴＡＴリン酸化のフローサイトメトリーによる痰での測定は、キナーゼ阻害化合物、詳細には肺に吸入経路の投与を介して送達されるものの有効性及び感度の直接評価を可能にする。バイオマーカーとしてのＳＴＡＴリン酸化の使用も所与のキナーゼ阻害剤についての好適な投薬レジメンの評価を可能にする。さらに、痰に対する細胞内フローサイトメトリー法を確立することは、リン酸化ＳＴＡＴ（ｐＳＴＡＴ，phosphorylated STAT）を発現している具体的な細胞集団の同定、周知のウエスタンブロッティングに基づく方法を使用して以前は達成されていないことを可能にする。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
したがって第１の態様では本発明は、フローサイトメトリーを使用して痰試料中のＳＴＡＴリン酸化を測定するための方法を提供する。
【００２４】
第２の態様では本発明は、キナーゼ阻害剤の有効性及び／又は感度を評価するための方法であって、フローサイトメトリーを使用して痰試料中のＳＴＡＴリン酸化を測定することを含む方法を提供する。
【００２５】
第３の態様では本発明は、キナーゼ阻害剤についての好適な用量範囲及び／又は投薬レジメンを評価するための方法であって、フローサイトメトリーを使用して痰試料中のＳＴＡＴリン酸化を測定することを含む方法を提供する。
【００２６】
第４の態様では本発明は（ｉ）キナーゼ阻害剤の有効性及び／若しくは感度、並びに／又は（ii）キナーゼ阻害剤についての好適な用量範囲及び／若しくは投薬レジメンを評価するためのバイオマーカーとしてのｐＳＴＡＴの使用であって、フローサイトメトリーを使用して痰試料中のＳＴＡＴリン酸化を測定することを含む使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
本発明のより良い理解のため、及びその実施形態がどのように実行され得るかを示すために、一例として添付する線図にこれから言及する：
【図１】ｐ３８ＭＡＰＫ経路を示す図である。この複雑な経路は、多数の分枝からなり、他の経路とのクロストークは多数の異なる生物学的帰結を制御できる、例えばＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ３などの転写因子はサイトカイン産生を調節でき、ｐ３８制御／活性化キナーゼ（ＰＲＡＫ，p38 regulated/activated kinase）はＨＳＰ２７制御にも関与する。
【図２】ヒト痰細胞（sputum cell）の前方散乱／側方散乱プロファイルを示す図であり、フローサイトメトリーの際に使用されるゲーティング戦略を示している。デブリはゲートアウトされ（プロファイルの左手側の黒色集団線条として示される）、Ｐ１内に３種の異なる集団がマクロファージを含有するＰ４に特別な関心を伴ってゲートオンされた。マクロファージ（Ｐ４）のすぐ左の集団（Ｐ２）は、好中球を示し、プロファイルの下の小さな集団（Ｐ３）は未同定である。このようにＰ１内にゲートされた痰白血球は、好中球（Ｐ２）、未同定細胞（Ｐ３）及びマクロファージ（Ｐ４）に分離された。
【図３】ＣＯＰＤ対象１５名から得られた痰マクロファージにおけるキナーゼ阻害剤を含む又は含まないＩＦＮγ誘導細胞内ｐＳＴＡＴ１レベルを示すグラフである。２〜３個の試料が対象あたりに採取された。各試料は個々のデータ点（ｎ＝４０）として処置される。各試料中の細胞は、ＩＦＮγ（刺激）、ＩＦＮγ±ＪＡＫ阻害剤（刺激＋阻害剤）で処置された又は陰性対照（非刺激）であった。平均蛍光強度（ＭＦＩ，Mean fluorescence intensity）はフローサイトメトリーによって測定された。
【図４】ＣＯＰＤ対象１５名から得られた痰マクロファージにおけるキナーゼ阻害剤を含む又は含まないＩＦＮγ誘導細胞内ｐＳＴＡＴ１レベルを示すグラフである。２〜３個の試料が対象あたりに採取された。各データ点は対象（ｎ＝１５）あたりに算出された平均値を表す。各試料中の細胞は、ＩＦＮγ（刺激）、ＩＦＮγ±ＪＡＫ阻害剤（刺激＋阻害剤）で処置された又は陰性対照（非刺激）であった。平均蛍光強度（ＭＦＩ，Mean fluorescence intensity）はフローサイトメトリーによって測定された。
【図５】同じＣＯＰＤ対象１５名から３〜４回の繰り返しの来診で得られた痰上清中の炎症促進性サイトカイン濃度を示すグラフである。ＩＬ−１ｂレベルを示す。
【図６】同じＣＯＰＤ対象１５名から３〜４回の繰り返しの来診で得られた痰上清中の炎症促進性サイトカイン濃度を示すグラフである。ＩＬ−８レベルを示す。
【図７】同じＣＯＰＤ対象１５名から３〜４回の繰り返しの来診で得られた痰上清中の炎症促進性サイトカイン濃度を示すグラフである。マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ，macrophage inflammatory protein）−１ｂレベルを示す。
【図８】誘発痰上清中の選択されたサイトカイン／ケモカイン濃度を示すグラフである。前述のフローサイトメトリー研究とは別の研究において、誘発痰試料はＣＯＰＤ対象（臨床診断：ＧＯＬＤステージ１）１０名から得た。各痰試料を分割し、試料の半分は本発明の技術を使用して処理され（「改変」）、他の半分は当技術分野において周知の標準的技術を使用して処理された（「標準」）。２種の異なる処理手順後のサイトカイン／ケモカインレベルが比較された。
【図９】図８に例示のものと同じ誘発痰試料についての細胞生存率、扁平細胞混入及び白血球分画を示すグラフである。２種の異なる処理手順後の細胞データが比較された（「改変／０．０５％  ＤＴＴ」は、本発明の処理技術を指し、「標準／０．１％  ＤＴＴ」は当技術分野において周知の確立された技術を指す）。
【図１０】ＭＫ２阻害剤の濃度の増加を伴う又は伴わないＩＦＮγでの刺激後の痰マクロファージ中のＳＴＡＴ３リン酸化を示すグラフである。％刺激は、刺激ＭＦＩ／非刺激ＭＦＩ×１００として算出された。
【図１１】ＩＦＮγによって誘発痰由来のマクロファージ及び好中球中のＳＴＡＴ１（Ｙ７０１）リン酸化の刺激、並びにＭＫ２阻害剤の濃度を上昇させた予備インキュベーションに続くＩＦＮγ刺激後のそのようなリン酸化の阻害を示すグラフである（上グラフ）。ＭＫ２阻害剤の存在及び非存在下でのマクロファージ中のＳＴＡＴ１（Ｙ７０１）のリン酸化も％刺激として表される（下グラフ）。％刺激は、刺激ＭＦＩ／非刺激ＭＦＩ×１００として算出された。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
第１の態様では本発明は、フローサイトメトリーを使用する痰試料中のＳＴＡＴリン酸化の測定のために開発された方法に関する。痰試料は、下にさらに詳細に記載されるとおり個体から得られてよい。痰は、個体から直接、理想的には記載の方法を介して、新たに得られるべきであり、好ましくは痰細胞診の態様を維持するために一定の制限時間内に処理される。
【００２９】
Ａ．痰誘発
本発明の方法における使用のための痰試料は、個体から標準的で十分に確立された手順に従って得られてよい。誘発方法を使用することは、自発的に産生される痰を使用するよりも、後者がより低い細胞生存率をもたらすことから有利である（Pizzichini MM et al. Am J Respir Crit Care Med. 1996; 154(4 Pt 1):866-9）。例としてであって、決して限定する目的でなく、次の手順が続いてよい。
【００３０】
対象は、超音波ネブライザーのマウスピースを通じて３％（ｗ／ｖ）生理食塩水溶液ミストを５分間吸入する。
【００３１】
次いで横隔膜呼吸、息を吹く（huff）、震動（percussion）及び振動（vibrations）並びに呼気陽圧（positive expiratory pressure）技術などの痰流動化（mobilisation）技術が、痰試料の産生を助けるために利用される。対象は、痰を痰回収ポットに咳をして出すことを試みるように依頼される。
【００３２】
肺活量測定が、痰回収手順を通じて肺機能が維持されていることを確実にするための安全な測定として使用される。したがって１秒間努力呼気量（ＦＥＶ１，forced expiratory volume in one second）は、完全吸気後に１秒間に強制的に吐き出され得る空気の量である。３％（ｗ／ｖ）生理食塩水の吸入後にＦＥＶ１が１０％未満低下するとして、参加者は次の生理食塩水濃度（４％（ｗ／ｖ））を吸入し、上に詳述の手順を反復するように依頼される。
【００３３】
再度、４％（ｗ／ｖ）生理食塩水の吸入後にＦＥＶ１が１０％未満低下する場合、参加者は次の生理食塩水濃度（５％（ｗ／ｖ））を吸入し、上に詳述の手順を反復するように依頼される。
【００３４】
１５分間の噴霧（すなわち３回×５分間）後に回収された痰は、フローサイトメトリー分析のための検査室での処理に好適である。
【００３５】
これに関連して本発明者らは、フローサイトメトリー分析の感度が痰細胞中に含有されるマクロファージの数に比例することを推定した。彼らは、細胞サイズ及び本明細書に記載の粒度フローサイトメトリー法（Ｘ／Ｙゲートシステム）を使用して同定する異なる集団が有ることを確実にするために、各試料中に十分なマクロファージを有することが重要であることを認識した。すなわち本明細書に記載の技術は、マクロファージ集団におけるＳＴＡＴリン酸化の測定を可能にすることから、マクロファージ集団は分析を可能にするために十分なサイズでなければならない。小さすぎる集団は、フローサイトメトリー散布図での識別不能な細胞集団をもたらす。
【００３６】
任意のＳＴＡＴタンパク質のリン酸化を測定する場合、好適なマクロファージ集団を得るために十分な数の痰細胞が試料あたりに必要である。
【００３７】
痰試料での最適なＳＴＡＴリン酸化分析を可能にするために、細胞少なくとも２００，０００個が条件あたりに必要である。「条件」によって、試料中の細胞のプールが実施される分析の一部として供される実験又は対照条件が意味される。例えば「非染色」、「非刺激」及び「刺激」は、本明細書でさらに記載される３種のそのような条件である。したがって例示の方法により、ＩＦＮγで刺激された細胞中のＳＴＡＴリン酸化を非刺激対照と比較して測定するために、痰試料は理想的には痰細胞少なくとも４００，０００個を含有しているべきである（すなわち各条件について細胞２００，０００個）。ＳＴＡＴリン酸化の２つの刺激因子が対照と並行して評価される場合、試料は理想的には痰細胞少なくとも６００，０００個を含有するなど。したがって試料が得られたら、評価される１又は２以上の条件のために必要な数のプールに分割されてよく、各プールは実施されるＳＴＡＴリン酸化分析のために十分な数の細胞を含有している。
【００３８】
本発明者らの実験においておよそ４％の最少マクロファージ数がマクロファージ集団の正確なゲーティングを可能にする。試料のマクロファージ集団が４％を超える場合、それにより条件あたり細胞およそ２００，０００個の細胞数が正確なゲーティングを可能にする別個のマクロファージ集団をもたらす。本発明者らは、条件あたりにより多い及び／又は少ない細胞から有用なデータを得たが、本発明者らの経験から最良の結果は試料が少なくともおよそ４％マクロファージを含む細胞およそ２００，０００個を条件あたりに含有する場合に得られる。個体の特定の群から得られた痰試料は、１００％好中球を含有する場合があり、これらは方法による分析のために好適ではないことが見出された。この発見は、好中球はこのＳＴＡＴ炎症性経路における所望の主な細胞型ではないことも示唆している。
【００３９】
したがって痰試料は、痰細胞少なくとも１００，０００個、少なくとも１５０，０００個、少なくとも２００，０００個、少なくとも２５０，０００個、少なくとも３００，０００個、少なくとも３５０，０００個又は少なくとも４００，０００個を条件あたりに含有してよい。それ自体に上限はないが、痰試料は、細胞５００，０００個以下、４００，０００個以下、３００，０００個以下又は２５０，０００個以下を条件あたりに含有してよい。痰試料は、細胞およそ１００，０００〜５００，０００個、およそ１２５，０００〜３２５，０００個又はおよそ１５０，０００〜２５０，０００個を条件あたりに含有してよく、好ましくはそれは細胞およそ２００，０００個を条件あたりに含有する。本明細書に記載の方法における使用のための痰試料は、したがって痰細胞をこれらの数のいずれかで含有してよい。
【００４０】
試料のマクロファージ集団は、１％を超えてよい、２％を超えてよい又は３％を超えてよいが、好ましくはそれは４％を超え、さらに５％を超えてよい、６％を超えてよい、７％を超えてよい、８％を超えてよい、９％を超えてよい、１０％を超えてよい、１５％を超えてよい又は２０％を超えてよい。好ましい実施形態ではマクロファージ集団は、試料の３〜６％の領域にあり、最も好ましくは４〜５％の領域にある。
【００４１】
１又は２以上の試料は、繰り返しの来診で対象から回収されてよく、例えば２個、３個、４個以上の試料が数週間又は数カ月の期間にわたって採取されてよく、繰り返しの来診は理想的には最少７日間離れている。手順に必要であるだけ多くの繰り返しの来診は受け入れられるべきである。対象から複数の痰試料を採取することは、対象あたりで平均化された及び／又は統計的に分析された信頼できるデータを可能にし、統計解析の質を改善する。経時的に得られた系列の複数の試料は、規定の期間にわたってＳＴＡＴリン酸化レベルをモニターできるようにもする。
【００４２】
Ｂ．痰処理
痰試料は粘液混入物を含まない分析用の生細胞を得るために処理される。本発明者らは、そのような試料において測定されるフローサイトメトリーシグナルに痰処理が重要であると推定した。
【００４３】
本発明者らが克服しなければならない１つの問題は、痰は扱いが困難なことで有名であることである。これに関して痰の粘液内容物は、その中に所望の細胞及びバイオマーカーを含有し、遮蔽する。痰が身体から出されると、中の細胞は直ちに死滅し始める。したがって痰のいかなる処置も細胞を生かしておくために十分穏やかでありながら、粘液シェルを突破するために十分厳しい必要がある。
【００４４】
ＳＴＡＴリン酸化を測定するために当技術分野において使用される処理ステップは、痰に対しては好適でない。これらの技術は、痰と比較して異なる細胞環境中の異なるアレイの細胞を含有する全血で実施される。
【００４５】
同様に当技術分野における技術が、例えば健康及び疾患の痰液フェーズにおける痰細胞数及び／又は炎症性サイトカインレベルを測定するために痰に実施される場合、それらはＳＴＡＴリン酸化を測定するために設計されておらず、したがって好適でない。
【００４６】
したがってＳＴＡＴリン酸化の分析のために痰がどのように処理され得る又はされるべきであるかは、当業者に明らかではなかった。しかし本発明者らは、本発明の方法における使用のために好適であると彼らが示した次の手順を考案した（実施例１を参照されたい）。記載の技術は、本明細書に記載の新規フローサイトメトリー方法論との適合性を確実にするために、Pizzichini et al.（（Pizzichini E et al. Eur Respir J. 1996 Jun; 9(6):1174-80）を参照されたい、痰のために設計されたが、ＳＴＡＴリン酸化を測定するためではなかった）によって使用されたものから改変及び適合された。
【００４７】
誘発痰は、氷上で適切に保たれ、回収後可能な限り早く、好ましくは回収の１時間でなくとも４時間以内、さらにより好ましくは３時間以内、最も好ましくは２時間以内に処理される。即時処理は、高い細胞生存率を確実にするために望ましい。痰プラグは、処理のために選択され、遠心チューブに適切に移される。
【００４８】
選択された痰試料の体積は記され、等体積のダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ，Dulbecco’s phosphate buffered saline）が典型的には添加される。
【００４９】
試料を液化するために還元剤が加えられる。還元剤は濃い粘液を破壊し、細胞内部をそれらから分離できるようにする。任意の還元剤が使用され得るが、ジチオスレイトール（ＤＴＴ，dithiothreitol）が好ましい。ＤＴＴは、Sputolysin（登録商標）を含む任意の形態で提供されてよい。還元剤の最終濃度は、０．１％（ｗ／ｖ）未満、好ましくは０．０８％（ｗ／ｖ）未満及びより好ましくは０．０６％（ｗ／ｖ）未満の範囲であるべきである。およそ０．０５％（ｗ／ｖ）の最終濃度は好ましく、還元剤のこの濃度は、フローサイトメトリー分析のために好適な細胞を生じるだけでなく、高濃度と比較して所望のバイオマーカーのより高い収量を生じるために本発明者らによって見出された。これは、痰試料のための当技術分野における標準より顕著に低い濃度である。
【００５０】
次いでチューブは、プレートシェーカーにおよそ１５０〜およそ４５０ｒｐｍ、好ましくはおよそ３００ｒｐｍの穏やかな速度で適切に置かれる。チューブは、いかなる炎症性細胞も活性化することなく細胞を分散するために十分な長さの時間、室温で振とうされる。例えば、およそ１５分間からおよそ１時間の間は、粘液を破壊できるようにするために好適であるが、およそ３０分間は好ましい。このインキュベーション時間は、標準的痰処理技術よりおよそ３倍長い。
【００５１】
次いで試料は、パスツールピペットで穏やかに適切に混合され、およそ５分間〜およそ３０分間、好ましくはおよそ１５分間などの短時間さらに振とうしたままにされる。
【００５２】
記載の痰処理技術は、周知の痰アッセイ及び痰処理技術において用いられているものよりさらに穏やかな技術である。標準的痰処理技術は、典型的には０．１％（ｗ／ｖ）ＤＴＴ、インキュベーション時間１５分間、４００Ｇ、１０分間、４℃での遠心分離を使用する。本発明において使用される処理条件は、低濃度の還元剤、長いインキュベーション時間及び穏やかな試料操作を有利に含み、痰処理後の細胞生存率は典型的な試料について少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％及び最も好ましくは少なくとも８５％である。
【００５３】
例示の方法によっていくつかの実施形態では、痰試料は０．１％（ｗ／ｖ）未満の濃度のＤＴＴの有効量で処置され、試料は、細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上に細胞生存率を維持しながら、細胞を粘液から放出する抗体染色のために好適な条件下で撹拌又は振とうされていてもよい。
【００５４】
処理技術は、痰試料のプロテアーゼ阻害も含んでよい。プロテアーゼ阻害剤は、痰試料中に存在する又は処理方法の際に活性化された炎症性細胞から放出されるプロテアーゼの損傷効果を低減する観点から還元剤とのインキュベーション時に試料に加えられてよい。任意のプロテアーゼ阻害剤は使用されてよいが、好ましくはこれだけに限らないが、４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオライド塩酸塩（ＡＥＢＳＦ，4-(2-Aminoethyl) benzenesulfonyl fluoride hydrochloride）、ベスタチン、Ｅ−６４、ペプスタチンＡ、ホスホラミドン、ロイペプチン及びアプロチニンを含んでよいカクテルプロテアーゼ阻害剤が使用されてよい。プロテアーゼ阻害剤は、商業的に入手でき、製造者が推奨する濃度で使用されるべきである。したがって一実施形態では、痰処理ステップは試料中のいかなるプロテアーゼも阻害することをさらに含む。本発明者らは、この追加的ステップがフローサイトメトリー分析を使用して観察される刺激／非刺激シグナル分離に有益な効果を有し得ると考えている。
【００５５】
次いで処理試料は、遠心分離によってその細胞と液体画分とに分離されてよい。遠心分離は、細胞生存率を維持するために穏やかな処理であるべきである。試料は、１２００ｒｐｍ（２５８ｇ）、１０分間、室温で適切に遠心分離されてよいが、十分な分離を生じる任意の遠心分離条件が代替的に用いられてよい。
【００５６】
次いで細胞画分は、例えばＤＰＢＳを使用して洗浄されてよい。
【００５７】
痰上清は、回収されてよく、サイトカイン／ケモカインなどの所望の任意の炎症のバイオマーカーを測定するために使用されていてもよい（下を参照されたい）。
【００５８】
Ｃ．細胞計数
次いで細胞ペレットは、既知の体積のＤＰＢＳに適切に再懸濁される。細胞懸濁物は、細胞染色剤で染色されてよい。例えば染色は０．４％トリパンブルー溶液などへの希釈によって達成され得る。次いで試料は、標準的手順に従って顕微鏡を使用して細胞を計数するために血球計算器にロードされてよい。
【００５９】
上に提供された例について、懸濁物１ミリリットルあたりの全白血球数は、平均全白血球数に希釈係数を乗じ、１０４を乗じることによって算出され得る。
【００６０】
Ｄ．ＳＴＡＴリン酸化の誘導
痰が上に記載の液化を受け、全細胞数が実施された後、痰細胞は適切に遠心分離される。十分な分離を生じる任意の条件が用いられてよく、例示的条件は１２００ｒｐｍ、１０分間、室温である。細胞ペレットは、細胞およそ１．５×１０６個／ｍｌ〜細胞およそ２．５×１０６個／ｍｌの濃度、好ましくは細胞およそ２×１０６個／ｍｌの濃度でＤＰＢＳ中に適切に再懸濁される。試料は、典型的にはおよそ３７℃でおよそ１時間静置されたままにされる。
【００６１】
次いで細胞は、ＳＴＡＴリン酸化の刺激因子とインキュベートされてよい。任意のそのような刺激因子が使用されてよい。したがって一実施形態では方法は、１又は２以上のサイトカインでＳＴＡＴリン酸化を誘導することを含む。好適なサイトカインは、これだけに限らないが、ＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２３、上皮増殖因子（ＥＧＦ，epidermal growth factor）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ，platelet derived growth factor）、ＧＭ−ＣＳＦ、成長ホルモン、プロラクチン及びエリスロポエチンを含む。好ましくはＩＦＮγ及び／又はＩＬ−６が使用される。これらのサイトカインは、両方ともマクロファージ中のＳＴＡＴ１の刺激因子であるが、さまざまな異なる細胞応答を生じる。
【００６２】
任意のＳＴＡＴタンパク質のリン酸化は、本発明の方法を使用して測定されてよい。したがって一実施形態では方法は、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５Ａ、ＳＴＡＴ５Ｂ及び／又はＳＴＡＴ６リン酸化を測定するためである。好ましくは本発明の方法は、ＳＴＡＴ１又はＳＴＡＴ３リン酸化を測定するためである。
【００６３】
本発明者らは、さまざまなサイトカインを介する細胞刺激がＳＴＡＴ経路のさまざまな構成成分の最適なリン酸化を産生できると考えている。したがってさまざまなサイトカインがさまざまなＳＴＡＴタンパク質を検出するために使用され得る、例えばＩＦＮγは、実施例１及び４によって証明されるとおりＳＴＡＴ１を又は実施例３によって証明されるとおりＳＴＡＴ３を検出するために使用され得る。ＳＴＡＴリン酸化刺激因子と測定されるＳＴＡＴタンパク質との任意の及びすべての当座の組合せは、本発明の方法によって包含される。リン酸化は、リン酸化が生じるＳＴＡＴタンパク質中の任意のアミノ酸残基で測定され得る。ＳＴＡＴ１を例にとると、したがってリン酸化は、例えば残基７０１のチロシン（Ｙ７０１）、残基２７２のセリン又は残基２５、２２２若しくは３３４のスレオニンで測定され得る。したがって任意のリン酸化残基は、ＳＴＡＴタンパク質のリン酸化を測定する場合に標的にされ得る。一実施形態では方法は、ＩＦＮγ及び／又はＩＬ−６によって誘導されたＳＴＡＴ１リン酸化を測定するためである。サイトカインのその受容体への結合は、ＪＡＫの活性化及び続く細胞質性末端チロシン残基のリン酸化を引き起こす。ホスホチロシンは、ＳＴＡＴ上のＳｒｃ相同２（ＳＨ２，Src Homology 2）ドメインと相互作用し、活性化、二量体化、核移行及び転写活性化を生じる（Ivashkiv LB et al. Arthritis Res Ther. 2004; 6(4):159-68）。ＳＴＡＴタンパク質上のリン酸化チロシン残基に特異的な蛍光標識抗体は、商業的に入手でき、刺激に続く細胞内ｐＳＴＡＴタンパク質の検出を可能にする。各ＳＴＡＴタンパク質は、単一特異性抗体によって、製造者の説明書に従って検出され得る（種々の製造者のウェブサイト、例えばwww.bdbiosciences.comを参照されたい）。
【００６４】
したがって細胞は、代替処置（「条件」）のために別々のプールに分けられてよい。例えばＳＴＡＴ１リン酸化を評価するために、細胞の１つのプールはＩＦＮγだけ、第２のプールはＩＬ−６だけ並びに第３のプールはＩＦＮγ及びＩＬ−６とインキュベートされてよい。上に述べたものなどのサイトカインの他の組合せは、さまざまなＳＴＡＴタンパク質を刺激するために必要である可能性がある。
【００６５】
ＳＴＡＴリン酸化を誘導するために、細胞の好適な体積及び数を分析用に、ポリスチレンフローサイトメトリーチューブなどの中にアリコートにするべきである。およそ５０μｌ〜およそ５００μｌの範囲の試料体積は、好適であり、およそ１００μｌが好ましい。およそ１００，０００個〜およそ５００，０００個の範囲の細胞数が好適であり、およそ２００，０００個が好ましい。
【００６６】
好適な量のＳＴＡＴリン酸化の刺激因子が各試料に加えられる。最終濃度は、典型的にはおよそ１ｎｇ／ｍｌ〜およそ１００ｎｇ／ｍｌの範囲である、およそ１０ｎｇ／ｍｌは好ましい。したがって例としてＩＦＮγ（１００ｎｇ／ｍｌ）１０μｌは、各試料に加えられてよい（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）。陰性対照として同じ体積のＤＰＢＳ（例えばＤＰＢＳ  １０μｌ）は非刺激細胞に加えられてよい。
【００６７】
一実施形態では方法は、キナーゼ阻害剤の存在下でＳＴＡＴリン酸化を誘導することを含む。キナーゼ阻害剤は、吸入、経口又は静脈内投与に適応され得る。選択的及び非選択的タンパク質キナーゼ阻害剤を含む任意のキナーゼ阻害剤が使用され得る。そのような阻害剤は、これだけに限らないが、Ｓｒｃ、Ｃｓｋ、Ａｃｋ、Ｆａｋ、Ｔｅｃ、Ｆｅｓ、Ｓｙｋ、Ａｂｌ及び、ＰＦ  ９５６９８０（Axon Medchem社）、周知のＪＡＫ３選択的阻害剤を含むＪａｋ阻害剤を含む、タンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ，Protein Tyrosine Kinase）阻害剤を含む。ＭＫ２阻害剤も含まれる。したがって阻害は、任意のＳＴＡＴリン酸化経路において生じ得る、例えば、ＪＡＫ阻害剤はＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路を介するリン酸化を阻害するために使用されてよく、及び／又はＭＫ２阻害剤はＭＡＰＫ経路を介するリン酸化を阻害するために使用されてよい。キナーゼ阻害剤は、肺疾患、好ましくは炎症性肺疾患、より好ましくはこれだけに限らないが、ＣＯＰＤ、ＩＰＦ及び同様の状態を含むＴＨ１炎症性機序によって特徴付けられる肺疾患の治療又は予防のために適応され得る。キナーゼ阻害剤の存在下でＳＴＡＴリン酸化を誘導するために好適な方法は、下にさらに記載される。
【００６８】
次いで試料は、ウォーターバスで、およそ３７℃、およそ２０分間適切にインキュベートされる。任意の好適なインキュベーション条件は代替的に使用されてよい。
【００６９】
Ｅ．試料固定及び透過処理（Permeabilisation）
試料はウォーターバスから取り出され、遠心分離によってそれらの細胞と液体画分とに分離された。試料は２５８ｇ、５分間、室温で適切に遠心分離されてよいが、十分な分離を生じる任意の遠心分離条件が代替的に用いられてよい。
【００７０】
上清は除去され、細胞ペレットは好適な媒体に再懸濁される。例えば細胞ペレットは、１００μｌのＤＰＢＳ中４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドに再懸濁されてよい。次いで試料は、細胞を固定するためにウォーターバスで、およそ３７℃、およそ１５分間インキュベートされてよい。
【００７１】
固定は、それが細胞へのいかなるさらなる変化も妨げることから重要なステップである。刺激ステップの際に生じる細胞変化はパラホルムアルデヒドの添加によって永続的に「固定」され、さらなる変化は生じない。したがって細胞の状態のいかなる測定可能な差異も任意の続く操作よりむしろ刺激ステップに起因する。したがって本発明の方法は、細胞固定ステップを有利に含む。
【００７２】
細胞内フローサイトメトリー分析は細胞透過処理ステップも含む。これはｐＳＴＡＴに対して方向付けられた抗体を細胞に侵入できるようにする。細胞への侵入において、好適な検出系（セクションＦを参照されたい）にコンジュゲートされたこれらの抗体は細胞内標的ｐＳＴＡＴタンパク質に結合する。したがって本発明の方法は、抗ｐＳＴＡＴ抗体がそれらの細胞内標的に結合する場合は、透過処理ステップを含まなければならない。本発明者らは、細胞を透過処理するための標準的方法がこの抗体系を使用して機能しないことを見出した。むしろ本発明者らは、本発明の方法での使用のための新規細胞透過処理技術を考案した。ｐＳＴＡＴタンパク質に対して方向付けられた抗体を使用して良好な細胞内染色が生じることが本発明者らによって見出された１００％（ｖ／ｖ）メタノールが透過処理ステップのために使用される。
【００７３】
次いで（フローサイトメトリー）チューブは前述のウォーターバスから取り出され、典型的には２５８ｇ、５分間、室温で遠心分離される。十分な分離を生じる任意の遠心分離条件は代替的に用いられてよい。上清は除去され、細胞ペレットは、例えば０．８ｍｌ染色緩衝液（ＤＰＢＳ＋２％ヒト血清）に再懸濁される。
【００７４】
再びチューブは、典型的には２５８ｇ、５分間、室温で遠心分離される。上清は除去され、細胞ペレットは、例えば０．３５ｍｌの１００％（ｖ／ｖ）氷冷メタノール（−２０℃で保存）に再懸濁される。次いで試料は細胞を透過処理するために氷上で、２０分間適切にインキュベートされる。
【００７５】
Ｆ．フローサイトメトリーのための痰染色
チューブは、典型的には２５８ｇ、５分間、室温で遠心分離される。上清は除去され、細胞ペレットは、例えば０．８ｍｌ染色緩衝液に再懸濁される。
【００７６】
再びチューブは、典型的には２５８ｇ、５分間、室温で遠心分離される。上清は除去され、チューブは大部分の液体の除去を確実にするために研究用ティッシュペーパーで吸い取って乾燥された。
【００７７】
細胞ペレットは、染色緩衝液だけ、抗ｐＳＴＡＴ抗体又はアイソタイプ対照のさらなる量を添加されて染色緩衝液中に再懸濁される。任意の好適な染色緩衝液、典型的には１０％までのタンパク質が添加された生理食塩水溶液、好ましくはＤＰＢＳ＋２％ヒト血清は使用されてよい。任意の好適な抗体も使用されてよい。抗体は現在記載されている７種すべてのＳＴＡＴ分子について、種々の蛍光マーカー（フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ，fluorescein isothiocyanate）、フィコエリトリン（ＰＥ，phycoerythrin）、ペリジニンクロロフィル（ＰｅｒＣＰ，peridinin chlorophyll）、Alexa Fluor（登録商標）488及び647）でコンジュゲートされて商業的に入手できる（Ivashkiv LB et al. Arthritis Res Ther. 2004; 6(4):159-68）。好適な体積は当業者に周知である。例えば細胞ペレットは、染色緩衝液のみ２０μｌ（非染色細胞）又は、Alexa Fluor（登録商標）647コンジュゲート抗ｐＳＴＡＴ１抗体（PhosFlow、BD Biosciences社）（１．５μｇ／ｍｌ）（ＳＴＡＴ染色細胞）若しくはｐＳＴＡＴ１と同じ濃度でのアイソタイプ対照（対照細胞）２０μｌのいずれかを添加した染色緩衝液１００μｌに再懸濁されてよい。試料は、典型的には室温で、ホイルで覆って３０分間インキュベートされる。
【００７８】
次いでおよそ０．５ｍｌ〜およそ４ｍｌ、好ましくはおよそ２ｍｌの体積の染色緩衝液は、加えられてよく、チューブは２５８ｇ、４分間、室温で適切に遠心分離される。十分な分離を生じる任意の遠心分離条件は代替的に用いられてよい。上清は除去されてよく、細胞ペレットは、例えばフローサイトメトリー分析用に準備された染色緩衝液５００μｌに再懸濁される。
【００７９】
本明細書の開示の大部分が抗体での痰試料又はその細胞の処置に関するが、フローサイトメトリーのために好適な他の好適な検出試薬が当技術分野において周知であり、抗体に付加的に又は代替的に本明細書に開示の任意の方法において使用され得ることは理解される。
【００８０】
抗体及びその抗原結合断片に加えて、フローサイトメトリーによる細胞検出のために使用される試薬及びリガンドは、例えばこれだけに限らないが、所望の分子に結合する、好ましくは特異的に結合する他のリガンドを含む。例えばリガンドは、タンパク質、核酸又は小分子であってよい。リガンドは、典型的にはフローサイトメーターによる検出のためにフルオロフォアで標識される。標識化は、共有結合（例えば、蛍光標識一次抗体）又は非共有結合（例えば、一次検出リガンドに結合する蛍光標識二次抗体）であってよい。いくつかの実施形態では、フルオロフォアに付加的に又は代替的にリガンド又は試薬は、放射性同位元素、量子ドット又は他の好適な分子で標識されてよい。
【００８１】
好ましい実施形態ではリガンドは、ｐＳＴＡＴに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片である。本明細書において使用される用語「抗体（antibody）」及び「抗体（antibodies）」は、抗原結合部位を含有する分子、例えば免疫グロブリンを指す。抗体は、これだけに限らないが、モノクローナル抗体、二特異性抗体、多特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、ポリクローナル抗体、単一ドメイン抗体、ラクダ化抗体、１本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ，single-chain Fvs）、１本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合二特異性Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ，disulfide-linked bispecific Fvs）、細胞内抗体及び抗イデオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、抗Ｉｄ及び抗体への抗抗Ｉｄ抗体を含む）並びに上記のいずれかのエピトープ結合断片を含む。具体的には抗体は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な断片を含む。免疫グロブリン分子は、いずれのタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスであってもよい。
【００８２】
非限定的例の方法により、フローサイトメトリーによる痰試料中のＳＴＡＴリン酸化を測定するための方法は、痰試料又はその細胞を抗体若しくはその抗原結合断片、又はリン酸化ＳＴＡＴに特異的に結合する別のリガンドに接触させること、及びフローサイトメトリーによって抗体又はリガンド結合のレベルを検出又は測定することを含んでよい。
【００８３】
Ｇ．フローサイトメトリー
任意の製造者によって提供されたフローサイトメトリーのための装置及び機械は本発明の方法において使用され、製造者の説明書に従って操作されてよい。一実施形態では蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ（登録商標），fluorescence-activated cell sorting）が使用される。FACSCanto（登録商標）IIフローサイトメーター（BD BioSciences社、Oxford、UK）は使用されてよい。
【００８４】
痰において使用されたフローサイトメトリー法がこれまで少ないことからフローサイトメトリーの使用は有利である。本発明者らは、この少なさは細胞表面マーカーに結合する抗体に基づく検出系を提供する細胞表面マーカーをＤＴＴが切断し、感度を下げるという事実から説明できると考えている。抗体に基づく検出系と共に高感度で使用できる痰中のＳＴＡＴリン酸化を測定するためのフローサイトメトリーに基づく方法の提供は、したがって産業に大きな価値がある。本明細書に記載のフローサイトメトリーに基づく方法は、周知の方法と比較して感度が高く、痰試料中のより高いレベルのバイオマーカー測定をもたらすと考えられる。方法は、抗体の細胞内結合を可能にする細胞の固定及び透過処理によって可能になる、ＳＴＡＴシグナル伝達の細胞内レベルを有利に検出する。したがって方法は、産業における既存の要望を満たしている。
【００８５】
フローサイトメトリー分析のための手順は下に記載されている。当業者は、任意のフローサイトメトリー装置での使用のために次の手順をどのように適合するかを容易に理解する。
【００８６】
フローサイトメトリーは、細胞計数、細胞選別及び／又はバイオマーカー検出のために使用され得るレーザーに基づく技術である。フローサイトメトリーは、一般に電子検出装置（例えばフローサイトメーター）を通る懸濁細胞の通過する流れを含む。検出の前に細胞は、細胞又はそのサブセットを標識する試薬に典型的には接触される。典型的には開示された方法は、痰試料又はその細胞をｐＳＴＡＴに結合する試薬又はリガンドと接触させることを含む。好ましくはリガンド又は試薬はｐＳＴＡＴに特異的に結合する。フローサイトメトリーの際のリガンド又は試薬の検出は、細胞内又は表面上にｐＳＴＡＴを有する細胞を使用者が検出できるようにし、細胞内又は表面上にｐＳＴＡＴを有さない細胞からそれらを識別するために使用され得る。
【００８７】
結果は、使用者による検出設定の一定の閾値レベルが存在するかしないかを単に示すことができるだけである。いくつかの実施形態ではフローサイトメトリーは、試料の個々の細胞によって発現されたｐＳＴＡＴのレベルを測定するために使用されてよい。レベルは、定量的又は定性的であってよい。レベルは、例えば標識リガンドの平均蛍光強度であってよい。
【００８８】
実行者は、試料の細胞中のｐＳＴＡＴ発現レベルについての結論を出すために標準的分析技術を使用できる。いくつかの実施形態では細胞は、第２、第３又はそれ以上の検出可能なリガンドとも接触される。第２、第３又はそれ以上のリガンドは、例えば異なる細胞型（例えばマクロファージ及び好中球）、生細胞及び死細胞（例えばヨウ化プロピジウム）間を識別するため、又は他のバイオマーカー（例えばサイトカイン、細胞表面受容体など）を検出するために使用されてよい。いくつかの実施形態ではＳＴＡＴとｐＳＴＡＴとは別に検出され、使用者がそのリン酸化のレベルを比較してＳＴＡＴ全体のレベルを細胞の集団又は分集団の両方において決定できるようにする。
【００８９】
フローサイトメーターによって生成されたデータは、周知の技術を使用して分析されてよい。例えば結果は、ヒストグラムを作製するために１次元で、又は２次元ドットプロットで又はさらに３次元でプロットされてよい。プロット上の領域は、「ゲート」と称される一連のサブセット抽出を作るために、蛍光強度に基づいて、使用者、予め設定したアルゴリズムなどによって順次分離されてよい。そのような分析は、使用された検出リガンド（複数可）に基づいて使用者が元の細胞試料を分集団に特徴付けられるようにする。フローサイトメトリーデータの分析のためのソフトウェアは、当技術分野において周知であり、例えばWinMDI、Flowing Software、Cytobank、FCS Express、Flowjo、FACSDiva、CytoPaint（別名Paint-A-Gate）、VenturiOne、CellQuest Pro、Infinicyt及びCytospecを含む。
【００９０】
いくつかの実施形態では細胞は、フローサイトメーター（例えばＦＡＣＳ）によって１又は２以上の分集団に選別される。分集団は使用者によってさらなる分析のために保持されてよい。
【００９１】
ＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ３分析について本発明の方法が痰中のマクロファージ集団において機能するという驚くべき発見を、これらの細胞がＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ３リン酸化シグナルを産生できることから、本発明者らはした。本明細書ではＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ３によって例示されているが、方法はマクロファージ中のすべてのＳＴＡＴタンパク質に適用され得る。さまざまなＳＴＡＴタンパク質がさまざまな疾患状態に関連する可能性があり、リン酸化経路はさまざまなキナーゼ阻害剤によって阻害され得る（セクションＩを参照されたい）。マクロファージ中のＳＴＡＴリン酸化の観察は、驚くべきことであった；当技術分野における既存の知識に基づく、好中球が所望の推定される細胞であった。実際に好中球は、炎症に特に関連するキナーゼ経路における重要な細胞型であると従来は考えられていた。本発明者らは、純粋な好中球集団が研究された場合に、活性化シグナルを得ることはできず、ｐＳＴＡＴは検出できないという新規の重要な観察をした（例えば図１１（実施例４）を参照されたい）。したがって本発明の方法の開発は、マクロファージが実際にはＳＴＡＴリン酸化経路において所望の重要な細胞である可能性があることを同定し、これは新規の重要な科学的発見である。
【００９２】
実際に、フローサイトメトリーがｐＳＴＡＴ１を検出するために他の団体によって使用される、及び／又はそのような方法がＪＡＫ阻害剤の有効性を評価するために実施された場合、これが肺疾患と関連していたことはなく、痰において実施された測定はない。むしろそれらは、造血性及び骨髄増殖性障害に関する傾向があり、結果的に血液試料から測定値を取ることに強く焦点が当てられた。それらは、マクロファージが研究するための重要な細胞型であると述べてもいない。
【００９３】
肺において見出されるマクロファージは、ある種の刺激への応答において肺に常在し、増殖する場合がある。ＰＢＭＣ（単球）が全身循環から肺に移動することは常には想定されない（Murray P et al. Nat Rev Immunol. 2011; 11(11): 723-737）。常在性肺マクロファージは、Ｍ１及びＭ２マクロファージとして分類されており（Mantovani A,et al. Immunity. 2005; 23(4):344-6）、大まかにＭ１マクロファージは炎症促進性であり、Ｍ２マクロファージは抗炎症性である（Mantovani A,et al. Immunity. 2005; 23(4):344-6、Kunz LI, et al. Respir Res. 2011; 12:34）。Ｍ１マクロファージは、ケモカインＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０及びＣＸＣＬ１１の放出を引き起こすＩＦＮγによって刺激される（Mantovani A,et al. Immunity. 2005; 23(4):344-6）。ＣＯＰＤを発症することの影響はＭ２マクロファージの数の増加を生じる。Ｍ２マクロファージは高度に食作用性であり、食作用がＣＯＰＤを低下させることは広く報告されている。この見かけの矛盾の１つの説明は、食作用の低減がＣＯＰＤでの肺環境中のプロテアーゼレベルの増加のためである可能性がある。マクロファージのこのＭ２極性化は、肺実質のリモデリングを生じる。マクロファージ表現型の定常状態からＭ１低減−Ｍ２増加状態への極性化は、マクロファージがＣＯＰＤでのリモデリング事象についての原因であるが、慢性炎症においてはあまり重要でないことの指標である可能性がある（Shaykhiev R et al. J Immunol. 2009; 183(4):2867-83）。
【００９４】
本発明者らは、試料中に十分な数のマクロファージが存在する場合、フローサイトメトリーアッセイ系がＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ３リン酸化シグナルを検出することも推定した。アッセイは、本明細書ではＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ３によって例示されているが、マクロファージ中のすべてのＳＴＡＴタンパク質を評価するために使用されてよい。本発明者らは、痰試料中のマクロファージ４〜５％の領域の集団が十分な、異なるマクロファージ細胞集団をもたらすことを明らかにした（詳細にはセクションＡを参照されたい）。指針として、１０，０００個の全細胞数中にマクロファージ少なくとも４％、好ましくはマクロファージ少なくとも５％、より好ましくはマクロファージ少なくとも１０％、さらにより好ましくはマクロファージ少なくとも１５％及び最も好ましくはマクロファージ少なくとも２０％が、ＳＴＡＴ分析のためにフローサイトメトリー試料あたりに含まれ得る。一般に本発明者らの経験においてこの割合は、痰細胞数及び分画においても見られる。次いでフローサイトメトリーは、本明細書に記載のマクロファージ集団を同定するために使用されてよい。FACSCanto（登録商標）IIフローサイトメーター（BD Biosciences社、Oxford、UK）は、この分析ステップにおける使用のために好適である。
【００９５】
痰試料の体積、細胞数及び生存率はすべて本明細書に記載の方法の成功に寄与する。理想的にはフローサイトメトリーによる分析のための痰試料の体積は、少なくとも１００μｌ、好ましくは少なくとも２００μｌ、より好ましくは少なくとも３００μｌ及び最も好ましくは少なくとも４００μｌ又はさらに少なくとも５００μｌであるべきである。十分なサイズ及び質の試料は、ＣＯＰＤ及びＩＰＦ患者、喫煙者並びに他のそのような患者群及び集団から容易に得ることができる。
【００９６】
上記のとおり本発明者らは、フローサイトメトリー分析のために、マクロファージ少なくとも４％を含む条件あたり痰細胞およそ２００，０００個が、分析のための最終処理試料中に好適なマクロファージ集団を得るために元の試料あたりに含まれ得ることを推定した（詳細はセクションＡを参照されたい）。これに関して本発明者らは、痰細胞集団が１００％好中球からなる場合にアッセイが機能しないことを推定した。本発明者らは、フローサイトメトリーの際にゲーティング法を使用してこの発見を確認した（実施例１を参照されたい）。図２に例示のとおり、デブリはゲートアウトされ、Ｐ１内に３種の異なる集団がマクロファージを含有するＰ４に特別な関心を伴ってゲートオンされた。この方法によって好中球を単離及び同定することは、ＳＴＡＴ１リン酸化によって産生されるシグナルにいかなる変化も示さなかった。１００％好中球からなる痰試料が研究された場合、シグナル変化は検出されなかった。これは、新規の予想外の観察である。実際に痰好中球数は、ＣＯＰＤにおいて主なバイオマーカーとして過去に記載されたことがある。本明細書で提供するデータは、マクロファージがＣＯＰＤの肺炎症に最も関連し、重要なエフェクター細胞である可能性があることを反対に示唆している。したがってこの観察は、ＣＯＰＤ及び肺の他の炎症性状態における、薬物標的及び痰バイオマーカーのバイオマーカー解釈について直接の影響を有すると本発明者らによって考えられた。
【００９７】
咳はしばしば生じる臨床症状であるが、多くの場合痰を産生せず、ＩＰＦはさらに不均一な状態を表す。痰を産生する患者では形態は、ＣＯＰＤ患者において見られるものに類似している（Beeh KM et al. Respir Med. 2003; 97(6):634-9）。
【００９８】
したがってヒト痰細胞集団は、それらの前方散乱／側方散乱プロファイルによって決定され得る。細胞の物理的特性だけに基づくフローサイトメトリー分析を介した別々の細胞集団のこの区別は、周知の技術と比較して低濃度の還元剤（ＤＴＴなど）の使用を介して可能になる。したがってこれは、本発明の方法においては所望の細胞を見つけるための蛍光細胞表面マーカー抗体に対する必要性がないことも意味する。
【００９９】
ＳＴＡＴリン酸化は、刺激試料のＭＦＩを非刺激試料の値で割ることによってマクロファージ集団において測定され得る。１より大きな値（１を超える）は陽性染色を示す。本発明者らは、本明細書に記載の方法が刺激細胞と非刺激細胞との間を明らかに識別できることを示した（図３及び４）。
【０１００】
したがって本発明の方法では、痰試料中でＳＴＡＴリン酸化が検出される又は検出されない場合がある。それにより方法の最終ステップは、痰試料中のｐＳＴＡＴの存在又は非存在を決定することである可能性がある。方法の最終ステップは、痰試料中のｐＳＴＡＴの量を、典型的には他の痰試料と比較して決定することであってよく、上記のとおりそれはＭＦＩを単位として表され得る。ＭＦＩは蛍光強度の測定値であり、それ自体は用いられたコンジュゲート抗体の種類に依存する。ＭＦＩは、ｐＳＴＡＴ分子の数の化学量論的測定を提供しないが、ＭＦＩにおける相対的増加をＳＴＡＴリン酸化における相対的増加と等しくして同じ抗体で染色された２個の試料の直接比較をできるようにする。
【０１０１】
Ｈ．炎症のバイオマーカーの分析
一実施形態では本発明の方法は、個体から得られた同じ痰試料中の、サイトカイン又はケモカインなどの炎症の１又は２以上のバイオマーカーのレベル（複数可）を測定することを含む。この特性は、周知の痰技術と比較して低濃度の還元剤（ＤＴＴなど）の使用を介して可能になる。典型的には０．１％（ｗ／ｖ）ＤＴＴを使用する従来技術はサイトカイン分析を可能にするが、細胞の質は同時フローサイトメトリー分析のためには不十分である。しかし本発明において用いられるより穏やかな試料操作は、同じ痰試料でのＳＴＡＴリン酸化及びサイトカイン測定の組合せ分析を可能にする。０．０５％（ｗ／ｖ）ＤＴＴの使用及び穏やかな処理技術は本発明者らによって見出され、サイトカイン、ケモカイン及び他のバイオマーカー測定の感度の上昇ももたらす（実施例２を参照されたい）。
【０１０２】
炎症の例示的バイオマーカーは、これだけに限らないが、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＣＬ５及びＩＬ−６が優先されて、ＣＣ１６、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２（ＣＣＬ２）、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮγ、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、インターフェロンガンマ誘導タンパク質（ＩＰ，interferon gamma-induced protein）−１０、ＭＩＰ−１ｂ、マトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ，matrix metalloproteinase）−９、ＭＭＰ−１２、好中球エラスターゼ、ＴＧＦβ、メタロプロテイナーゼの組織阻害剤（ＴＩＭＰ，tissue inhibitor of metalloproteinases）−１、ＴＮＦα及び胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ，thymic stromal lymphopoietin）を含む。バイオマーカーは、炎症促進性サイトカインであってよい。炎症の任意のバイオマーカーは、本方法で測定される可能性があり、限定要因は利用可能な試料の体積、低レベルの炎症のバイオマーカーを検出不能にする潜在的希釈効果及び元の試料中の炎症のバイオマーカーの非存在である。
【０１０３】
炎症のさまざまなバイオマーカーは、ｐＳＴＡＴタンパク質のさまざまな組合せとの関連を評価するために測定されてよい。本明細書で例示及び図解のとおり、ＳＴＡＴ１リン酸化は、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＩＰ−１ｂ、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０及びＣＸＣＬ１１との関連で測定された。方法は、種々のＳＴＡＴ分子のリン酸化と関連する炎症のパターンの調査を可能にする。さまざまなキナーゼ阻害剤は、炎症のバイオマーカーのレベルにさまざまな効果を有する場合がある（セクションＩを参照されたい）。
【０１０４】
バイオマーカー（例えばサイトカイン）レベルは、例えばLuminex（登録商標）及び酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ，enzyme-linked immunosorbent assay）技術を当技術分野における標準的手順により使用して痰上清において測定されてよい。
【０１０５】
Ｉ．キナーゼ阻害剤評価
第２の態様では本発明は、キナーゼ阻害剤の有効性及び／又は感度を評価するための方法であって、フローサイトメトリーを使用して痰試料中のＳＴＡＴリン酸化を測定することを含む方法を提供する。方法は、肺から直接所望のヒト細胞型への薬物効果を決定できるようにする。
【０１０６】
キナーゼ阻害剤の「有効性を評価する」は、阻害剤がＳＴＡＴタンパク質のリン酸化を低減すること又は抑制することに活性であるかどうかを決定することを意味できる。これは、２つの異なるアプローチを使用して行われ得る；既知の濃度のキナーゼ阻害剤でスパイクされた痰試料が比較対照薬（comparator drug）又はプラセボでスパイクされたものと比較され得るインビトロ実験、これは臨床研究においてキナーゼ阻害剤が投与された患者のインビボ検査が続いてよい。
【０１０７】
刺激を５０％まで阻害するために必要な阻害剤の濃度（最大半量阻害濃度（ＩＣ５０））を決定するために痰細胞をインビトロで刺激する（ＳＴＡＴリン酸化の刺激因子で）前に、既知の濃度のキナーゼ阻害剤が加えられてよい。複数の既知の濃度のキナーゼ阻害剤が用量応答曲線を作成するため、すなわち少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％又は少なくとも８５％までＳＴＡＴリン酸化を低減するために必要なインビトロ用量を決定するために使用されてよい。結果としてこれは、将来のインビボ研究のための用量選択及び投与に関する予測を可能にする（下記の「好適な用量範囲及び／又は投薬レジメンを評価する」を参照されたい）。次にインビボ研究は、臨床設定でのＩＣ５０の直接の証拠になる；ＩＣ５０は、関連薬物が患者に投与され、続いて患者が分析用の痰試料を産生した後に患者試料から直接決定され得る。キナーゼ阻害剤の「有効性を評価する」は、したがってＳＴＡＴリン酸化の刺激に関して阻害剤のＩＣ５０を決定することを意味できる。したがってキナーゼ阻害剤の有効性を評価する方法は、痰試料が対象から予め除かれ、全評価工程が身体の外の処理試料において行われることからインビトロでの方法である。しかし方法は、薬物有効性のインビボの証拠を直接得るために臨床研究においても使用され得る。
【０１０８】
キナーゼ阻害剤の「感度を評価する」は、阻害剤が別のキナーゼ阻害剤又はプラセボ化合物と比較してＳＴＡＴリン酸化に対してどの程度有効であるかを決定することを意味してよい。阻害剤の効果は、別のキナーゼ阻害剤又はプラセボ化合物のものから顕著に異なっていてよい；例えば１個の阻害剤は、別のものと比較してＳＴＡＴタンパク質のリン酸化を低減すること又は抑制することに実質的にさらに強力であってよい。アッセイは、複数の化合物をそれらの効果を互いに評価して比較するために使用されてよい、すなわち新規キナーゼ阻害剤は「判断基準」又は市場をリードする化合物と比較されてよい。したがってキナーゼ阻害剤の「感度を評価する」は、阻害剤によって達成されるＳＴＡＴリン酸化における低減を、もしあれば別のキナーゼ阻害剤又はプラセボ化合物の同等量によって達成されるものと比較して、決定することを意味できる。それは、阻害剤のＩＣ５０をＳＴＡＴリン酸化の刺激に関して決定すること、及びそれを別のキナーゼ阻害剤又はプラセボ化合物のものと比較することを包含できる。したがってキナーゼ阻害剤の感度を評価する方法は、痰試料が対象から予め除かれ、全評価工程が身体の外の処理試料において行われることからインビトロでの方法である。
【０１０９】
したがってキナーゼ阻害剤の有効性及び／又は感度を評価するための方法は、典型的にはフローサイトメトリーによってキナーゼ阻害剤を含む被検痰試料中のＳＴＡＴリン酸化を測定することを含む。試料中のＳＴＡＴリン酸化のレベルは、ＳＴＡＴリン酸化がキナーゼ阻害剤の非存在下で測定される対照痰試料と比較されてよく、キナーゼ阻害剤は被検試料中のＳＴＡＴリン酸化のレベルが対照試料中よりも低い場合にＳＴＡＴリン酸化を調節すると決定される。方法は被検試料を、試料の細胞においてＳＴＡＴリン酸化を誘導する有効量で１又は２以上のサイトカインの有効量に接触させることさらに含んでよい。
【０１１０】
第３の態様において本発明は、キナーゼ阻害剤についての好適な用量範囲及び／又は投薬レジメンを評価するための方法であって、フローサイトメトリーを使用して痰試料中のＳＴＡＴリン酸化を測定することを含む方法を提供する。
【０１１１】
キナーゼ阻害剤についての「好適な用量範囲及び／又は投薬レジメンを評価する」は、阻害剤がＳＴＡＴタンパク質のリン酸化を低減すること又は抑制することに活性であるようにする用量範囲及び／又は投薬レジメンを決定することを意味できる。これは、例えば、上に記載のＳＴＡＴリン酸化の刺激に関して阻害剤のＩＣ５０を決定することを含んでよい。評価の目的は、典型的にはインビボでの使用のために好適である用量範囲及び／又は投薬レジメンを見出すことである。一実施形態では第２の態様により得られたインビトロデータは、続く臨床研究における使用のための好適な用量範囲及び／又は投薬レジメンを決定するために使用される。したがって第３の態様の方法は、インビトロでの方法であってよい。しかし典型的にはキナーゼ阻害剤についての「好適な用量範囲及び／又は投薬レジメンを評価する」は、キナーゼ阻害剤のインビボ効果を直接決定するため、並びに阻害剤がＳＴＡＴタンパク質のリン酸化を低減すること又は抑制することに活性であるようにする用量範囲及び／又は投薬レジメン（ＩＣ５０を含む）を決定するために両方のための臨床研究を実行することを含む。第２の態様からのインビトロ用量応答データは、インビボ研究のための用量範囲及び／又は投薬レジメンを決定するために用量送達方法、薬物吸収速度及び化合物の細胞取り込みに関するデータと組み合わされてよい。第３の態様の方法は、したがってインビボでの方法であってよい、又はそれはインビトロ及びインビボステップの両方を含んでよく、例えばそれは第２の態様の方法及び／又はヒトに投与される薬物並びに痰試料が得られ、評価される前に生きている生物内で実行される研究の少なくとも一部を含んでよい。「投薬レジメン」は、用量、投与の回数、投与の頻度若しくは時期及び／又は阻害剤が投与される期間を意味できる。
【０１１２】
痰試料は、任意の経路だが、好ましくは吸入によってキナーゼ阻害剤が投与された対象から採取されてよい。次いで試料は、第３の態様の方法を使用して、すなわちフローサイトメトリーを使用して痰試料中のＳＴＡＴリン酸化を測定することを含んで評価されてよい。
【０１１３】
選択的及び非選択的タンパク質キナーゼ阻害剤を含む任意のキナーゼ阻害剤がそのような方法の対象であり得る。上記のとおりそのような阻害剤は、これだけに限らないが、Ｓｒｃ、Ｃｓｋ、Ａｃｋ、Ｆａｋ、Ｔｅｃ、Ｆｅｓ、Ｓｙｋ、Ａｂｌ及び、ＰＦ  ９５６９８０、周知のＪＡＫ３選択的阻害剤を含むＪａｋ阻害剤を含む、ＰＴＫ阻害剤を含む。ＭＫ２阻害剤も含まれる。好ましくはキナーゼ阻害剤は、肺疾患、詳細には炎症性肺疾患、最も詳細にはこれだけに限らないがＣＯＰＤ、ＩＰＦ及び同様の状態を含むＴＨ１炎症によって特徴付けられる肺疾患の治療又は予防のために適応又は処方される。したがって一実施形態では第２の態様の方法は、キナーゼ阻害剤の有効性及び／又は感度を肺疾患において評価するためである。同様に一実施形態では第３の態様の方法は、キナーゼ阻害剤についての好適な用量範囲及び／又は投薬レジメンを肺疾患において評価するためである。好ましくはキナーゼ阻害剤は、ＪＡＫ阻害剤又はＭＫ２阻害剤である。
【０１１４】
キナーゼ阻害剤は、静脈内投与に関連する又は処方されてよい。好ましい実施形態ではキナーゼ阻害剤は、吸入又は経口送達に関連する又は処方される。最も好ましい実施形態ではキナーゼ阻害剤は、吸入送達に関連する又は処方される。
【０１１５】
キナーゼ阻害剤の吸入送達は、ＣＯＰＤ、ＩＰＦ及び同様の状態などの炎症性肺疾患を罹患している患者に有利点を提供でき、アッセイはそのような化合物の臨床開発に役立つ。吸入経路を介して投与されるキナーゼ阻害剤は、肺に直接送達されるように設計され、しばしば全身性活性がわずかである又はない；それによりＳＴＡＴリン酸化の測定について当技術分野において周知である全血アッセイは、これらの環境に関連しない。むしろ全血技術は、測定可能な血液レベルを生じる全身性薬物分布を有する経口薬の評価に関連する。したがって本発明の方法は、当技術分野において周知の方法が有さない重要な有用性を有する。
【０１１６】
第２及び第３の態様の方法は、評価されるキナーゼ阻害剤の存在下でＳＴＡＴリン酸化を誘導することによって実行され得る。それにより第１の態様について上に記載の手順（セクションＤを参照されたい）に従ってよいが、キナーゼ阻害剤は、痰細胞試料（インビトロ、第２の態様）に加えられてよい、又は臨床研究の一部として患者に投与されてよい（インビボ、第３の態様）。
【０１１７】
例えば第２の態様では細胞の１つのプールはＳＴＡＴリン酸化の１又は２以上の刺激因子（ＩＦＮγ又はＩＬ−６など）だけとインキュベートされてよく、細胞の第２のプールは１又は２以上の刺激因子及び評価されるキナーゼ阻害剤とインキュベートされてよい。第３の態様では細胞の１つのプールは吸入キナーゼ阻害剤を投与された対象由来であってよく、細胞の他のプールは異なる化合物（例えばプラセボ）を受けた者由来であってよい。細胞の複数のプールは、ＳＴＡＴリン酸化の異なる刺激因子と及び／又は評価される異なるキナーゼ阻害剤とインキュベートされてよい。ＳＴＡＴリン酸化刺激因子、測定されるＳＴＡＴタンパク質及び評価されるキナーゼ阻害剤の任意の及びすべての作業組合せは、本発明の方法によって包含される。好ましい実施形態ではＳＴＡＴ１リン酸化の測定は、本明細書においてＪＡＫ３選択的阻害剤、ＰＦ  ９５６９８０によって例示されるキナーゼ阻害剤の存在又は非存在下でＩＦＮγで刺激された痰マクロファージ細胞中で行われる。他の好ましい実施形態ではＳＴＡＴ１（Ｙ７０１）又はＳＴＡＴ３リン酸化の測定は、本明細書においてＭＫ２阻害剤によって例示されるキナーゼ阻害剤の存在又は非存在下でＩＦＮγで刺激された痰マクロファージ細胞中で行われる。
【０１１８】
例えば第２の態様では細胞１００μｌ（細胞２００，０００個）をポリスチレンチューブ（フローサイトメトリーチューブなど）の中にアリコートにし、又は細胞９０μｌ＋評価される阻害剤１０μｌを使用することができる（最終濃度１０−５Ｍ）。上記のとおり任意の好適な体積及び細胞数を分析用にアリコートにすることができる。阻害剤の任意の好適な量を加えることができ、阻害剤の最終濃度は典型的には１０−９Ｍ〜１０−３Ｍの範囲である。第３の態様では対象に投与される阻害剤の用量は、同様の範囲であってよい。いずれの態様でも正確な範囲は、評価される化合物の特徴、強度及び溶解度に依存する。当業者は、使用する好適な濃度を決める場合にそのような要因をどのように考慮するかを理解し、周知である。
【０１１９】
本発明の第１の態様のとおり、ＳＴＡＴリン酸化の刺激因子（又は陰性対照としてＤＰＢＳ）の好適な量が各試料に加えられ、試料はウォーターバス中で適切にインキュベートされ、次いで遠心分離され、上清が除去され、細胞ペレットはＤＰＢＳ中に再懸濁される。ウォーターバスでのさらなるインキュベーションに続いて、細胞はセクションＦ〜Ｇに記載のとおりフローサイトメトリー分析のために準備される。サイトカインレベルは、第１の態様のとおり痰上清においても測定され得る（セクションＨ）。
【０１２０】
したがって本発明の第１の態様について上に記載のすべての特性は、本発明の第２及び第３の態様に等しく適用される。
【０１２１】
本発明者らが理解するとおり、痰中のバイオマーカーとしてのＳＴＡＴリン酸化の測定は、薬物開発、詳細にはキナーゼ阻害剤の開発において、とりわけそれらが吸入されるものに潜在的有用性を有する。これに関して本発明の方法は、キナーゼ阻害剤、詳細にはＪＡＫ阻害剤及びＭＫ２阻害剤の（吸入される）用量送達を評価するために使用され得る。具体的には薬物動態及び／又は薬力学的関連は探索され得る。
【０１２２】
本発明者らの研究では（実施例１、３及び４を参照されたい）キナーゼ阻害剤がスパイクされた試料が刺激細胞の阻害を示すために使用された（ＩＦＮγでの刺激はフローサイトメトリーによって測定されるＳＴＡＴ１又はＳＴＡＴ３シグナルを産生する）。これは、必要な前臨床インビトロステップと見なされてよく、それにより方法は、臨床研究においてキナーゼ機序を阻害するために必要である可能性がある経口又は吸入薬の用量又は用量範囲を予測するために使用されてよい。したがってこのアッセイは、用量設定、用量処方及び期待される臨床応答を含む将来の臨床研究の設計及び実施を予測するために非常に有用である。
【０１２３】
臨床設定では患者は、既に薬物を吸入（又は適用可能な場合は経口又は静脈内薬を摂取）したことがあり、痰試料は薬物がインビボでどのように効果的に作用するかを示すために分析されてよい。
【０１２４】
明確に、経口又は静脈内投与後に、周知の全血アッセイは使用されてよいが、効果が肺においてだけ求められる場合は、本明細書に記載の痰アッセイだけが関連する。再び吸入薬、具体的には肺疾患のためのものは、作用の部位への局所送達及び通常、全身曝露の低減と等しい副作用の低減を含む有利点を有する。
【０１２５】
研究用（キナーゼ阻害剤でスパイクされた試料）から臨床由来試料（患者がキナーゼ阻害剤の用量を受けた後）への進行は、バイオマーカー法の潜在的有用性である。それは、ヒト細胞での化合物の前臨床検査から、化合物の臨床試験の際に実施される続く研究への滑らかな移行を可能にする。この工程は、臨床薬開発において貴重であり、「基礎から臨床へ（bench to bedside）」の薬物開発として周知である。
【０１２６】
したがって第４の態様では本発明は（ｉ）キナーゼ阻害剤の有効性及び／若しくは感度、並びに／又は（ii）キナーゼ阻害剤についての好適な用量範囲及び／又は投薬レジメンを評価するためのバイオマーカーとしてのｐＳＴＡＴの使用であって、フローサイトメトリーを使用して痰試料中のＳＴＡＴリン酸化を測定することを含む使用を提供する。
【０１２７】
そのような使用は、本発明の第２及び第３の態様について上に提示の任意の方法ステップを任意の組合せで含んでよい。
【０１２８】
非限定的例ではキナーゼ阻害剤についての好適な用量範囲及び／又は投薬レジメンを評価するための方法は、キナーゼ阻害剤を含む一連の被検痰試料においてＳＴＡＴリン酸化を測定することによって阻害剤のＩＣ５０を決定することを含んでよく、各被検痰試料は、キナーゼ阻害剤を異なる濃度で含む。ＳＴＡＴリン酸化を決定する方法は本明細書で提供され、例えば痰試料若しくはその細胞を抗体若しくはその抗原結合断片又はリン酸化ＳＴＡＴに特異的に結合する別のリガンドに接触させ、フローサイトメトリーによって抗体結合のレベルを測定することによって痰試料中のＳＴＡＴリン酸化を検出又は測定することを含む。
【０１２９】
したがって本発明は、痰中のＳＴＡＴリン酸化を測定するための幅広いバイオマーカー方法論に関する。痰法が高度に特異的であり、比較的一般的でなく、フローサイトメトリーに基づく方法が痰由来測定のために使用される限り本明細書に記載の観察が特有であることから、本発明は大きな有用性を有する。
【０１３０】
本明細書に記載のすべての特性（いかなる添付の特許請求の範囲、要約及び図面も含む）並びに／又はそう開示されたいかなる方法若しくは工程のすべてのステップは、そのような特性及び／又はステップの少なくともいくつかが互いに排他的である組合せを除いて、上記の態様のいずれとも任意の組合せで組み合わされてよい。
【０１３１】
［実施例］
本発明は次の実施例において例示のみの方法によって記載される：
【実施例１】
【０１３２】
ＣＯＰＤ対象由来の誘発痰試料におけるＳＴＡＴ１リン酸化及び炎症促進性サイトカインの測定
方法
ｉ．痰誘発
痰試料をＣＯＰＤ対象１５名から３又は４回の繰り返しの来診（すなわち対象あたり試料３〜４個）で回収した。それぞれの場合に対象は、超音波ネブライザーのマウスピースを通じて３％（ｗ／ｖ）生理食塩水溶液ミストを５分間吸入した。横隔膜呼吸、息を吹く、震動及び振動並びに呼気陽圧技術などの痰流動化技術を痰試料の産生を助けるために利用した。対象は、痰を痰回収ポットに咳をして出すことを試みるように依頼された。３％（ｗ／ｖ）生理食塩水の吸入後にＦＥＶ１が＜１０％までの降下の場合、参加者は次の生理食塩水濃度（４％ｗ／ｖ）を吸入し、上に詳述の手順を反復するように依頼された。再度、４％（ｗ／ｖ）生理食塩水の吸入後にＦＥＶ１が＜１０％までの降下の場合、参加者は次の生理食塩水濃度（５％ｗ／ｖ）を吸入し、上に詳述の手順を反復するように依頼された。１５分間の噴霧（すなわち３回×５分間）後に回収された痰をフローサイトメトリー分析のための検査室で処理した。
【０１３３】
ii．痰処理
誘発痰は氷上に保たれ、可能な限り早く、回収から２時間以内に処理した。痰プラグを処理のために選択し、遠心チューブに適切に移した。選択した痰試料の体積を記し、等体積のＤＰＢＳを添加した。試料を液化するためにSputolysin（登録商標）を最終濃度０．０５％（ｗ／ｖ）に加えた。細胞を分散するためにチューブをプレートシェーカーに（３００ｒｐｍ）、３０分間、室温に置いた。３０分間後、試料をパスツールピペットで穏やかに混合し、さらに１５分間振とうしたままにした。試料を１２００ｒｐｍで１０分間、室温で遠心分離した。痰上清を回収し、所望のサイトカイン／ケモカインを測定するために使用した。
【０１３４】
iii．細胞計数
細胞ペレットを既知の体積のＤＰＢＳに再懸濁した。細胞懸濁物を０．４％トリパンブルー溶液に希釈し、顕微鏡を使用して細胞を計数するために血球計算器にロードした。懸濁物１ミリリットルあたりの全白血球数を平均全白血球数に希釈係数を乗じ、１０４を乗じることによって算出した。
【０１３５】
iv．ＳＴＡＴリン酸化の誘導
痰試料に液化を受け、全細胞数が実施された後、痰細胞を１２００ｒｐｍで１０分間、室温で遠心分離し、ＤＰＢＳ中に細胞２×１０６個／ｍｌの濃度で再懸濁した。試料を３７℃で１時間静置したままにした。
【０１３６】
細胞１００μｌ（細胞２００，０００個）を、又は試料用にＪＡＫ阻害化合物（ＪＡＫ３選択的阻害剤、ＰＦ  ９５６９８０；最終濃度１０−５Ｍ）を使用して９０μｌ細胞＋１０μｌ阻害剤をポリスチレンフローサイトメトリーチューブの中にアリコートにした。１０μｌ  ＩＦＮγ（１００ｎｇ／ｍｌ）を加えた（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）。１０μｌ  ＤＰＢＳを非刺激細胞に加えた。試料をウォーターバスで３７℃、２０分間インキュベートした。
【０１３７】
ｖ．試料固定及び透過処理
試料をウォーターバスから取り出し、２５８ｇ、５分間、室温で遠心分離した。上清を除去し、細胞ペレットをＤＰＢＳ中の１００μｌ  ４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドに再懸濁した。試料をウォーターバスで３７℃、１５分間インキュベートした。
【０１３８】
チューブをウォーターバスから取り出し、２５８ｇ、５分間、室温で遠心分離した。上清を除去し、細胞ペレットを０．８ｍｌ染色緩衝液（ＤＰＢＳ＋２％ヒト血清）に再懸濁した。再びチューブを２５８ｇ、５分間、室温で遠心分離した。上清を除去し、細胞ペレットを０．３５ｍｌの１００％（ｖ／ｖ）氷冷メタノール（−２０℃で保存）に再懸濁した。次いで試料を氷上で、２０分間インキュベートした。
【０１３９】
vi．フローサイトメトリーのための痰染色
チューブを２５８ｇ、５分間、室温で遠心分離した。上清を除去し、細胞ペレットを０．８ｍｌ染色緩衝液に再懸濁した。
【０１４０】
チューブを２５８ｇ、５分間、室温で遠心分離した。上清を除去し、チューブは大部分の液体の除去を確実にするために研究用ティッシュペーパーで吸い取って乾燥した。
【０１４１】
細胞ペレットを染色緩衝液（非染色細胞）２０μｌ又は（１．５μｇ／ｍｌ）Alexa Fluor（登録商標）647コンジュゲート抗ｐＳＴＡＴ１抗体（ＳＴＡＴ染色細胞）若しくはｐＳＴＡＴ１と同じ濃度でのアイソタイプ対照（対照細胞）２０μｌのいずれかを添加した染色緩衝液１００μｌに再懸濁した。試料を室温で、ホイルで覆って３０分間インキュベートした。
【０１４２】
染色緩衝液２ｍｌを加え、チューブを２５８ｇ、５分間、室温で遠心分離した。上清を除去し、細胞ペレットをフローサイトメトリー分析用に準備した染色緩衝液５００μｌに再懸濁した。
【０１４３】
vii．痰フローサイトメトリー分析
ゲーティング戦略を図２に示す。デブリはゲートアウトされ、Ｐ１内に３種の異なる集団がマクロファージを含有するＰ４に特別な関心を伴ってゲートオンされた。マクロファージ（Ｐ４）のすぐ左の集団（Ｐ２）は、好中球を示し、プロファイルの下の小さな集団（Ｐ３）は未同定である。
【０１４４】
viii．刺激／非刺激のＭＦＩ比
マクロファージ集団中のＳＴＡＴリン酸化のレベルを刺激試料のＭＦＩを取り、非刺激試料についてのＭＦＩで割ることによって決定した。１より大きな値（１を超える）は陽性染色を示す。
【０１４５】
ix．バイオマーカー分析
痰上清中の炎症促進性サイトカイン及びケモカインのレベルをLuminex（登録商標）及びＥＬＩＳＡ技術を使用して分析した。
【０１４６】
結果
図３に見られるとおりマクロファージ中の細胞内ｐＳＴＡＴ１のレベルは、ＩＦＮγとのインキュベーション後にすべての試料において顕著に増加していた（非刺激ＭＦＩ  １２０．７±２３．９２対刺激ＭＦＩ  １９６．７±３３．９７）。
【０１４７】
ＩＦＮγ＋ＪＡＫ阻害剤とのインキュベーションは、ＳＴＡＴ１リン酸化の完全な阻害（ＭＦＩ  １１８．３±２４．４４）を生じた。
【０１４８】
図４は、平均値を示し、同じ傾向を例示している。
【０１４９】
好中球においてＳＴＡＴ１の上方制御はなかった。
【０１５０】
図５〜７に見られるとおり、炎症促進性サイトカイン（ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−８及びＭＩＰ−１ｂ）のレベルは、すべての痰上清において測定可能であり、繰り返しの来診にわたってレベルが一貫していた。
【０１５１】
炎症性サイトカイン／ケモカイン、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＣＬ５及びＩＬ−６において対応する増加があった（データ未記載）。
【０１５２】
結論
ＳＴＡＴ１リン酸化及び付随する炎症性サイトカインレベルは、これらの新規処理及び分析方法を介して痰試料において再現性よく測定できる。ＪＡＫ阻害剤によるＩＦＮγ刺激後のＳＴＡＴ１リン酸化の阻害も測定可能な事象として実証した。したがってこれらのデータは、アッセイ系の妥当性及び再現性を確認している。これらの方法は、将来の新規化合物、詳細には吸入によって肺へ直接送達されるものの開発のために適用できる。
【０１５３】
痰試料を分析するために新規フローサイトメトリー技術を使用するこの研究の結果は、マクロファージが炎症のＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路において重要な部分を演じていることを示している。たくさんの過去の研究は好中球性炎症に注目したが、これらのデータはマクロファージが重要であるだけでなく、それらが慢性気道炎症の制御に重要な役割を演じていることを示している。
【０１５４】
したがって痰試料にフローサイトメトリーを使用する能力は、具体的な細胞集団におけるシグナル伝達経路の活性化の詳細な分析を可能にする。
【０１５５】
本方法は、例えば痰誘発が気管支肺胞洗浄よりも侵襲性が少なく、ＣＯＰＤにおける炎症部位からの情報を提供することから、ＣＯＰＤの新規治療の有効性を評価する場合に有用である。
【実施例２】
【０１５６】
本発明の新規痰処理方法と当技術分野における標準的方法との比較
方法
ｉ．痰誘発
（実施例１に記載のものと）別の研究において、誘発痰試料を実施例１に記載のとおり得た。この研究では対象は、ＣＯＰＤの確定された臨床診断を有した（ＧＯＬＤステージ１）。試料を対象１０名から得た。
【０１５７】
ii．痰処理
各痰試料を差次的処理のために二分割した。
【０１５８】
各試料の半分をPizzichini E et al. Eur Respir J. 1996 Jun; 9(6):1174-80（０．１％（ｗ／ｖ）ＤＴＴの使用を含む）に記載の確立された痰技術により処理した。
【０１５９】
各試料の他の半分を実施例１に記載のとおり処理した（０．０５％（ｗ／ｖ）ＤＴＴ及び穏やかな操作技術を組み込む）。
【０１６０】
iii．バイオマーカー分析
痰上清中のサイトカイン及びケモカインレベルをLuminex（登録商標）技術を使用して分析した。
【０１６１】
iv．細胞分析
次いで分割した痰試料を当技術分野において周知の手順により細胞生存率、扁平細胞混入及び細胞分画について分析した。
【０１６２】
結果
図８に示すとおり、サイトカイン（ＩＬ−６）及びケモカイン（ＣＣＬ２、ＣＣＬ５及びＣＸＣＬ９）をすべての痰上清において検出した。しかしバイオマーカーレベルは、確立された技術を使用して処理されたものと比較して、本発明により処理された痰上清においてはいくつかのバイオマーカーレベルが３倍程度大きく増加していた。
【０１６３】
図９は、図８に示すものと同じ誘発痰試料からの細胞データを比較している。図９から、本発明の痰処理技術が確立された技術と比較して細胞生存率を顕著に改善したことが見られ、これに関して生存率中央値％は２６％〜７５％超に増加した。これらの同じ試料において扁平細胞混入％は、本発明の技術での処理後に低減した。重要なことに白血球分画は処理技術の差異によって影響されなかったことが示された。
【０１６４】
結論
したがって、本明細書に記載の誘発痰処理のための新規方法（０．０５％（ｗ／ｖ）ＤＴＴ及び穏やかな処理技術の使用を含む）は、バイオマーカー測定の感度を上昇させ、細胞生存率を上昇させ、扁平細胞混入を最少化する一方で細胞分画の整合性を維持することを実証した。
【実施例３】
【０１６５】
ＣＯＰＤ対象由来の誘発痰試料におけるＳＴＡＴ３リン酸化の測定
本研究は、さまざまなｐＳＴＡＴタンパク質がさまざまな抗体検出系を使用して測定でき、さまざまなキナーゼ阻害剤がこれらそれぞれのｐＳＴＡＴタンパク質経路を介して評価できることを示すために設計された。実施例１はＪＡＫ阻害化合物の存在及び非存在下でＩＦＮγによって（すなわちＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路を介して）誘導されたｐＳＴＡＴ１を測定するための抗ｐＳＴＡＴ１抗体の使用を実証したが、本実施例は、今回はＭＫ２阻害剤、すなわちＭＡＰＫ経路の阻害剤の存在及び非存在下で、ＩＦＮγによって（すなわち同様にＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路を介して）誘導されるｐＳＴＡＴ３を測定するための抗ｐＳＴＡＴ３抗体の使用を実証する。
【０１６６】
方法
実施例１の方法を正確に反復したが、今回はAlexa Fluor（登録商標）647コンジュゲート抗ｐＳＴＡＴ３抗体を使用して細胞内ＳＴＡＴ３リン酸化を測定した。付加的にＭＫ２阻害剤をＪＡＫ阻害化合物の代わりに検査した。阻害剤の濃度を上昇させて検査した（１μＭ、１０μＭ及び１００μＭ）；他は同じ条件を適用した。
【０１６７】
結果
図１０に見られるとおり、痰マクロファージにおける細胞内ｐＳＴＡＴ３のレベルは、ＩＦＮγとのインキュベーション後に１００％増加した（％刺激は刺激ＭＦＩ／非刺激ＭＦＩ×１００として算出した）。
【０１６８】
ＭＫ２阻害剤の濃度を上昇させた予備インキュベーションに続くＩＦＮγとのインキュベーションは、ＳＴＡＴ３リン酸化の阻害の増加を生じた。
【０１６９】
結論
データはＳＴＡＴ３リン酸化が本発明の新規処理及び分析方法を介して痰試料において再現性よく測定できたことを示している。したがってデータは、アッセイ系の妥当性及び再現性をさまざまなｐＳＴＡＴタンパク質にわたって確認する。
【０１７０】
ＳＴＡＴ３リン酸化の阻害も測定可能な事象として実証した。リン酸化はＩＦＮγによって、すなわちＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路を介して誘導されたが、阻害はＭＫ２阻害剤、すなわちＭＡＰＫ経路の阻害剤を使用して達成された。ＭＡＰＫ経路を介して阻害されるＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路を介するリン酸化の現象を実施例４に示す研究においてさらに調査した。本明細書に示すデータは、それでもやはり、アッセイ系の妥当性及び再現性を異なるｐＳＴＡＴ系及びＳＴＡＴリン酸化の異なる阻害剤にわたって確認するものである。
【０１７１】
したがってこれらのデータは、本明細書に開示の方法が将来の新規化合物、詳細には吸入によって肺へ直接送達されるものの開発のために適用できることのさらなる証拠を提供する。データは、マクロファージが重要であるだけでなく、それらが慢性気道炎症の制御に重要な役割を演じていることを確認している。
【実施例４】
【０１７２】
代替的（ＳＴＡＴ１（Ｙ７０１））経路における本発明の痰処理方法の実行
本研究は、さまざまな抗体検出系を使用して測定されるさまざまなｐＳＴＡＴタンパク質経路、及びさまざまなキナーゼ阻害剤によるそれぞれのｐＳＴＡＴ系の阻害のさらなる例を提供する。この研究では抗ｐＳＴＡＴ１（Ｙ７０１）抗体を、ＭＫ２阻害剤（すなわちＭＡＰＫ経路の阻害剤）の存在及び非存在下でＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路を介して特異的に生じるＳＴＡＴ１リン酸化を測定するために使用した。これに関してＳＴＡＴ１は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の刺激により残基Ｙ７０１でチロシンリン酸化され、それによりＭＡＰＫ経路の刺激でセリン２７２並びにスレオニン２５、２２２及び３３４でリン酸化されたＳＴＡＴ１から識別可能である。
【０１７３】
方法
ｉ．痰誘発
誘発痰試料を実施例１に記載のとおり得た。しかしこの研究では対象は喫煙者であった。痰を２名の対象から回収した。
【０１７４】
ii．痰処理
痰試料を実施例１に記載のとおり処理した。
【０１７５】
iii．細胞計数
細胞を実施例１に記載のとおり計数した。
【０１７６】
iv．ＳＴＡＴ１（Ｙ７０１）リン酸化誘導
ＳＴＡＴリン酸化を実施例１に記載のとおり誘導した。しかしこの研究では阻害化合物は１０ｎｇ／ｍｌのＭＫ２阻害剤であった。
【０１７７】
ｖ．試料固定及び透過処理
試料を固定し、実施例１に記載のとおり固定及び透過処理した。
【０１７８】
vi．フローサイトメトリーのための痰染色
試料を実施例１に記載のとおり染色した。しかしこの研究では、ＳＴＡＴ１（Ｙ７０１）リン酸化を特異的に検出するためにAlexa Fluor（登録商標）647コンジュゲート抗ｐＳＴＡＴ１（Ｙ７０１）抗体を使用した。
【０１７９】
vii．痰フローサイトメトリー分析
ゲーティング戦略は、実施例１に記載のもの（すなわち図２に示すもの）と同じであった。
【０１８０】
viii．刺激／非刺激のＭＦＩ比
マクロファージ集団中のＳＴＡＴ１（Ｙ７０１）リン酸化のレベルを刺激試料のＭＦＩを取り、非刺激試料についてのＭＦＩで割ることによって決定した。１より大きな値（１を超える）は陽性染色を示す。
【０１８１】
結果
図１１（上グラフ）において見られるとおり、マクロファージにおける細胞内ｐＳＴＡＴ１（Ｙ７０１）のレベルは、ＩＦＮγで刺激された場合に痰において増加した（非刺激ＭＦＩ  ３４５．５対刺激ＭＦＩ  ５１１）。ＭＫ２阻害剤での予備インキュベーションはＳＴＡＴ１（Ｙ７０１）リン酸化をＭＦＩ  ３９９．５に用量依存的様式で低減した。この傾向は好中球ではなかった。
【０１８２】
図１１（下グラフ）においてさらに明らかに見られるとおり、ＳＴＡＴ１（Ｙ７０１）のリン酸化における６３％低減はマクロファージにおいて最高用量の阻害剤（１００μＭ）で達成された。上記のとおりそのような低減は、好中球では見られなかった。
【０１８３】
結論
ＩＦＮγを使用して、ＳＴＡＴ１（Ｙ７０１）の細胞内リン酸化の上方制御を達成できた。ＳＴＡＴ１は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の刺激によりＹ７０１でチロシンリン酸化され、それ自体、ＳＴＡＴ１がセリン２７２並びにスレオニン２５、２２２及び３３４でリン酸化されるＭＡＰＫ経路の刺激で測定可能ではないはずである。しかしＭＫ２阻害剤をＩＦＮγで刺激された痰試料に加えた場合、ｐＳＴＡＴ１（Ｙ７０１）の阻害があった。
【０１８４】
シグナル伝達経路を扱う場合の問題は、種々の異なる経路間のクロストーク及び相互作用のレベルが大部分未知の因子であることである。ｐ３８ＭＡＰＫ経路は、リポ多糖類、浸透圧ショック及び、同様の効果を産生する場合がある広範なサイトカインを含む幅広い因子によって刺激されることが周知である。同様にＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路又はＮＦκβ経路などの他の経路は、相互作用する又はｐ３８ＭＡＰＫ経路の活性化を変更する因子を放出する場合がある。本明細書で表す研究においてこれが生じたことは完全に妥当である。図１から見られるとおり、ｐ３８から始まる下流経路の数は多く、これらの１つを遮断する効果を見るために、焦点を合わせた分析エンドポイントが必要である可能性がある。
【０１８５】
ＭＫ２阻害化合物が多くの吸入薬と同様に細胞によって急速に取り込まれるペプチドであることから、吸入された用量が肺の呼吸器上皮細胞によって取り込まれることが大いに考えられる。本発明者らは、したがって上皮細胞が標的細胞集団であり、これらの細胞が炎症性応答を変更することを仮定する。阻害化合物の有効性に応じてこれは、誘発痰試料の細胞性組成物における変化（すなわち全白血球数）及び／又は種々の分泌される炎症マーカー（ＩＬ−８、増殖制御がん遺伝子（growth regulated oncogene）アルファ（ＧＲＯ−α，growth regulated oncogene alpha））のレベルへの変化を生じる場合がある。代替的に抗炎症性化合物は、マクロファージ（又は他の免疫細胞）によって直接取り込まれる場合があり、これらの細胞型に直接の細胞内効果を有する。
【０１８６】
（参考文献）
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【図１】
2017532578.tif 000003
【図２】
2017532578.tif 000004
【図３】
2017532578.tif 000005
【図４】
2017532578.tif 000006
【図５】
2017532578.tif 000007
【図６】
2017532578.tif 000008
【図７】
2017532578.tif 000009
【図８】
2017532578.tif 000010
【図９】
2017532578.tif 000011
【図１０】
2017532578.tif 000012
【図１１】
2017532578.tif 000013
【手続補正書】
【提出日】平成29年5月12日(2017.5.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フローサイトメトリーを使用して痰試料中のＳＴＡＴリン酸化を測定するための方法であって、０．１％（ｗ／ｖ）未満の濃度の還元剤を前記痰に添加し、当該混合物を、１５分超の間、穏やかに振とうする痰処理ステップを含む、前記方法。
【請求項２】
キナーゼ阻害剤の有効性及び／又は感度を評価するための方法であって、フローサイトメトリーを使用して痰試料中のＳＴＡＴリン酸化を測定することを含み、０．１％（ｗ／ｖ）未満の濃度の還元剤を前記痰に添加し、当該混合物を、１５分超の間、穏やかに振とうする痰処理ステップを含む、前記方法。
【請求項３】
キナーゼ阻害剤についての好適な用量範囲及び／又は投薬レジメンを評価するための方法であって、フローサイトメトリーを使用して痰試料中のＳＴＡＴリン酸化を測定することを含み、０．１％（ｗ／ｖ）未満の濃度の還元剤を前記痰に添加し、当該混合物を、１５分超の間、穏やかに振とうする痰処理ステップを含む、前記方法。
【請求項４】
振とうステップを室温で実行する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
還元剤がジチオスレイトール（ＤＴＴ，dithiothreitol）である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
混合物を１５０〜４５０ｒｐｍの速度で振とうする、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
試料が、実施される分析の一部として試料が供される各実験又は対照条件について、痰細胞を、１００，０００〜５００，０００個含有している、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
痰処理ステップが、少なくとも７０％の細胞生存率をもたらす、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
痰処理ステップが、試料中のいかなるプロテアーゼも阻害することをさらに含む、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
１又は２以上のサイトカインで処置されるＳＴＡＴリン酸化誘導ステップを含む、請求項１〜９のいずれかに記載の方法であって、前記サイトカインが、任意でＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２３、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、成長ホルモン、プロラクチン及びエリスロポエチンからなる群から選択される、前記方法。
【請求項１１】
ＳＴＡＴが、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５Ａ、ＳＴＡＴ５Ｂ及び／又はＳＴＡＴ６である、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
ＳＴＡＴがＳＴＡＴ１であり、
リン酸化が、ＩＦＮγ及び／又はＩＬ−６によって誘導される、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
キナーゼ阻害剤の存在下でＳＴＡＴリン酸化を誘導することを含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
痰細胞を１００％（ｖ／ｖ）メタノールで処置する細胞透過処理ステップを含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
フローサイトメトリーが：
（ｉ）少なくとも４％のマクロファージを含有する細胞；及び／又は
（ii）少なくとも１００μｌの試料体積
で実施される、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
ＩＦＮγを使用して、任意でキナーゼ阻害剤の存在下で、痰マクロファージにおいてＳＴＡＴ１リン酸化を誘導することを含む、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
痰試料中の１又は２以上の炎症バイオマーカーの、１又は複数のレベルを測定することをさらに含む、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法であって、前記バイオマーカーが、任意でサイトカイン、炎症促進性サイトカイン、ケモカイン、ＣＣ１６、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮγ、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＰ−１０、ＭＩＰ−１ｂ、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１２、好中球エラスターゼ、ＴＧＦβ、ＴＩＭＰ−１、ＴＮＦα及びＴＳＬＰからなる群から選択される、前記方法。
【請求項１８】
（ｉ）キナーゼ阻害剤の有効性及び／若しくは感度、並びに／又は（ii）キナーゼ阻害剤についての好適な用量範囲及び／若しくは投薬レジメンを評価するためのバイオマーカーとしてのｐＳＴＡＴの使用であって、フローサイトメトリーを使用して痰試料中のＳＴＡＴリン酸化を測定することを含み、前記痰試料が、０．１％（ｗ／ｖ）未満の濃度の還元剤を前記痰に添加し、当該混合物を１５分超の間、穏やかに振とうする痰処理ステップを使用して調製される、前記使用。
【請求項１９】
振とうステップを室温で実行する、請求項１８に記載の（ｉ）キナーゼ阻害剤の有効性及び／若しくは感度、並びに／又は（ii）キナーゼ阻害剤についての好適な用量範囲及び／若しくは投薬レジメンを評価するためのバイオマーカーとしてのｐＳＴＡＴの使用。
【請求項２０】
キナーゼ阻害剤が：
（ｉ）吸入による投与に適応される、
（ii）経口投与に適応される、
（iii）静脈内投与に適応される、
（iv）選択的若しくは非選択的タンパク質キナーゼ阻害剤、任意のＳｒｃ、Ｃｓｋ、Ａｃｋ、Ｆａｋ、Ｔｅｃ、Ｆｅｓ、Ｓｙｋ、Ａｂｌ及びＪａｋ阻害剤からなる群から選択されていてもよいＰＴＫ阻害剤、若しくはＭＫ２阻害剤である、並びに／又は
（ｖ）肺疾患の治療若しくは予防のために適応される、
請求項１３若しくは１６に記載の方法、又は請求項１８に記載の使用。
【請求項２１】
キナーゼ阻害剤が、炎症性肺疾患の治療若しくは予防のために適応される、請求項２０に記載の方法又は使用。
【請求項２２】
キナーゼ阻害剤が、ＴＨ１炎症によって特徴付けられる肺疾患の治療若しくは予防のために適応される、請求項２０に記載の方法又は使用。
【請求項２３】
キナーゼ阻害剤が、ＣＯＰＤ若しくはＩＰＦの治療若しくは予防のために適応される、請求項２０に記載の方法又は使用。
【国際調査報告】
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