(57)【要約】  本明細書には、ポリマーファイバーを得るために、ポリマー溶液をコレクター上へとエレクトロスピニング処理する；ポリマーファイバーを架橋結合する；および複数の細胞をポリマー足場組成物に加える、ことによってポリマー足場組成物を生成することにより軟骨性のインプラントを生成する方法が開示され、ここで、複数の細胞は、軟骨性のインプラントを形成するために軟骨性細胞を含む。【選択図】図１７Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマー足場組成物を生成する方法であって、該方法は、
ａ）ポリマーファイバーを形成するために、第１ポリマーを含む第１ポリマー溶液および第２ポリマーを含む第２ポリマー溶液を、コレクター上へとエレクトロスピニング処理する工程を含み、該エレクトロスピニング処理する工程が、
ｉ）第１エミッターにおいて第１ポリマー溶液に第１電圧をかけ、第１ポリマー溶液を第１エミッター出口に通して放出すること；および
ｉｉ）第２エミッターにおいて第２ポリマー溶液に第２電圧をかけ、第２ポリマー溶液を第２エミッター出口に通して放出することを含み、該方法はさらに、
ｂ）ポリマー足場組成物を生成するために、ポリマーファイバーを架橋結合する工程、
を含む、方法。
【請求項２】
第１ポリマー及び／又は第２ポリマーが、ポリ乳酸、コラーゲン、メタクリル化したコラーゲン、キトサン、ゼラチン、ラテックス、デキストラン、フィブロイン、ケラチン、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ポリグリコール酸、ポリジオキサノン、ポリ（炭酸プロピレン）、ポリ（酸化エチレン）、ポリ（エステル−ウレタン）尿素、ポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、およびそれらの組み合わせから成る群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１ポリマー溶液をエレクトロスピニング処理することによって、コレクター上で第１の複数のポリマーファイバーを生成し、ここで、第２ポリマー溶液が、コレクター上で第２の複数のポリマーファイバーを生成することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第１ポリマー溶液をエレクトロスピニング処理することおよび第２ポリマー溶液をエレクトロスピニング処理することが、連続して生じることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
第１ポリマー溶液および第２ポリマー溶液をエレクトロスピニング処理することが、同時に生じることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
第１エミッター出口が、第１内部を備えた第１チューブを含み、第２エミッター出口が、第２内部を備えた第２チューブを含み、ここで、第２チューブが第１チューブの内部にあり、第１チューブおよび第２チューブが同軸であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
第１ポリマー溶液および第２ポリマー溶液が、エミッター出口からコレクター上に放出されると、第１ポリマー溶液は、第２ポリマー溶液をカプセル化して、ポリマーファイバーを形成し、ここで、ポリマーファイバーは、
ａ）第１ポリマーを含むシェル；および
ｂ）第２ポリマーを含むコア、
を含む構造を有することを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
シェルが、第１ポリマーから本質的に成ることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
第１ポリマーが、コラーゲンであることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
第２ポリマーが、ポリ乳酸、コラーゲン、メタクリル化したコラーゲン、キトサン、ゼラチン、ラテックス、デキストラン、フィブロイン、ケラチン、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ポリグリコール酸、ポリジオキサノン、ポリ（炭酸プロピレン）、ポリ（酸化エチレン）、ポリ（エステル−ウレタン）尿素、ポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、およびそれらの組み合わせから成る群から選択されることを特徴とする、請求項７乃至９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
第２ポリマーが、ポリ乳酸であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
第１電圧及び／又は第２電圧が、約１５ｋＶから約２０ｋＶであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
コレクターに電圧をかける工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
電圧が、約−１０ｋＶから約−１ｋＶであることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
エレクトロスピニング処理および架橋結合が、同時に生じることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
架橋結合が、エレクトロスピニング処理後に生じることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
細胞を播種したポリマー足場組成物を形成するために、ポリマーファイバーを複数の細胞と接触させる工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
ポリマーファイバーを複数の細胞と接触させる工程が、ポリマーファイバー上へと複数の細胞をエレクトロスプレー処理することを含むことを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ポリマー溶液をエレクトロスピニング処理することおよび複数の細胞をエレクトロスプレー処理することが、同時に生じることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
複数の細胞をエレクトロスプレー処理することが、架橋結合前に生じることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
複数の細胞をエレクトロスプレー処理することおよびポリマーファイバーを架橋結合することが、同時に生じることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
ポリマー溶液をエレクトロスピニング処理すること、複数の細胞をエレクトロスプレー処理すること、およびポリマーファイバーを架橋結合することが、同時に生じることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
複数の細胞をポリマー足場組成物中にカプセル化する工程を含むことを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
複数の細胞が、間葉系幹細胞、半月板細胞、軟骨芽細胞、軟骨細胞、またはそれらの組み合わせを含むことを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
複数の細胞が、生体模倣ゲル中で懸濁されることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項２６】
生体模倣ゲルが、ＩＩ型コラーゲン、コンドロイチン硫酸塩、ヒアルロナン、またはそれらの組み合わせを含むことを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
生体模倣ゲルをアルギン酸塩と架橋結合させる工程をさらに含むことを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
生体模倣ゲルが、１つ以上の成長因子を含むことを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
細胞を播種したポリマー足場組成物を細胞培養物中で維持する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項３０】
細胞培養物が、ＴＧＦベータを含むことを特徴とする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
コレクターが、固定されていることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
コレクターが、回転コレクターを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
コレクターまたはその部分が、円錐形を有することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
ポリマーファイバーが、約５ｎｍから１０μｍの間の直径を有することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
ポリマーファイバーが、約５０ｎｍから約５μｍの間の直径を有することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
ポリマーファイバーが、約１μｍの直径を有することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
ポリマー足場組成物を生体模倣ゲルと接触させる工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
複数のポリマー足場組成物を生成する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
多層構成物を形成するために複数のポリマー足場組成物を組み合わせる工程をさらに含むことを特徴とする、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
生体模倣ゲルおよびポリマー足場組成物を層状化する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
ポリマーファイバーを架橋結合する工程が、光架橋結合を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
ポリマーファイバーを複数回光架橋結合する工程を含むことを特徴とする、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
コラーゲン足場組成物を生成する方法であって、該方法は、
ｉ）コラーゲン繊維を形成するために、コラーゲンおよび溶媒から本質的に成るポリマー溶液をコレクター上へとエレクトロスピニング処理する工程；および
ｉｉ）コラーゲン足場組成物を生成するためにコラーゲン繊維を架橋結合する工程、
を含む、方法。
【請求項４４】
ポリマー溶液が、コラーゲン以外にポリマーを含まないことを特徴とする、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
エレクトロスピニング処理および架橋結合が、同時に生じることを特徴とする、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
細胞を播種したコラーゲン足場組成物を形成するために、コラーゲン繊維を複数の細胞と接触させる工程をさらに含むことを特徴とする、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
コラーゲン繊維を複数の細胞と接触させる工程が、複数の細胞をコラーゲン繊維上へとエレクトロスプレー処理することを含むことを特徴とする、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
ポリマー溶液をエレクトロスピニング処理することおよび複数の細胞をエレクトロスプレー処理することが、同時に生じることを特徴とする、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
複数の細胞をエレクトロスプレー処理することが、ポリマー溶液をエレクトロスピニング処理した後に生じることを特徴とする、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
複数の細胞をエレクトロスプレー処理することが、コラーゲン繊維を架橋結合した後に生じることを特徴とする、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
複数の細胞をエレクトロスプレー処理することが、コラーゲン繊維を架橋結合する前に生じることを特徴とする、請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
複数の細胞をエレクトロスプレー処理することおよびポリマーファイバーを架橋結合することが、同時に生じることを特徴とする、請求項４７に記載の方法。
【請求項５３】
ポリマー溶液をエレクトロスピニング処理すること、複数の細胞をエレクトロスプレー処理すること、およびポリマーファイバーを架橋結合することが、同時に生じることを特徴とする、請求項４７に記載の方法。
【請求項５４】
複数の細胞が、間葉系幹細胞、半月板細胞、軟骨芽細胞、軟骨細胞、またはそれらの組み合わせを含むことを特徴とする、請求項４６に記載の方法。
【請求項５５】
半月板細胞が、血管の半月板細胞を含むことを特徴とする、請求項４６に記載の方法。
【請求項５６】
半月板細胞が、無血管の半月板細胞を含むことを特徴とする、請求項４６に記載の方法。
【請求項５７】
複数の細胞が、生体模倣ゲル中で懸濁されることを特徴とする、請求項４６に記載の方法。
【請求項５８】
生体模倣ゲルが、ＩＩ型コラーゲン、コンドロイチン硫酸塩、ヒアルロナン、およびそれらの組み合わせを含むことを特徴とする、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
生体模倣ゲルをアルギン酸塩と架橋結合させる工程をさらに含むことを特徴とする、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
生体模倣ゲルが、１つ以上の成長因子を含むことを特徴とする、請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
細胞を播種したコラーゲン足場組成物を細胞培養物中で維持する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項４３に記載の方法。
【請求項６２】
細胞培養物が、ＴＧＦベータを含むことを特徴とする、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
エレクトロスピニング処理することが、ポリマー溶液に電圧をかけることを含むことを特徴とする、請求項４３に記載の方法。
【請求項６４】
電圧が、約１５ｋＶから約２０ｋＶであることを特徴とする、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
コレクターに電圧をかける工程をさらに含むことを特徴とする、請求項４３に記載の方法。
【請求項６６】
電圧が、約−１０ｋＶから約−１ｋＶであることを特徴とする、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
コレクターが、固定されていることを特徴とする、請求項４３に記載の方法。
【請求項６８】
ポリマーファイバーが、ランダムに配向されたポリマーファイバーを含むことを特徴とする、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
コレクターが、回転コレクターであることを特徴とする、請求項４３に記載の方法。
【請求項７０】
コレクターまたはその部分が、円錐形を有することを特徴とする、請求項４３に記載の方法。
【請求項７１】
エレクトロスピニング処理することが、コラーゲン繊維を回転コレクター上に整列させることを含むことを特徴とする、請求項４３に記載の方法。
【請求項７２】
複数のコラーゲン足場組成物を生成する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項４３に記載の方法。
【請求項７３】
多層構成物を形成するために複数のコラーゲン足場組成物を組み合わせる工程をさらに含むことを特徴とする、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
多層構成物を生体模倣ゲルと接触させる工程をさらに含むことを特徴とする、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
生体模倣ゲルおよびコラーゲン足場組成物を層状化する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
ポリマーファイバーを架橋結合することが、光架橋結合を含むことを特徴とする、請求項４３に記載の方法。
【請求項７７】
ポリマーファイバーを複数回光架橋結合する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
複数のコラーゲン繊維を含むポリマー足場組成物であって、コラーゲン繊維が、エレクトロスピニング処理および架橋結合される、ポリマー足場組成物。
【請求項７９】
ａ）第１ポリマーを含むシェル；および
ｂ）第２ポリマーを含むコア、
を含む構造を有する複数のポリマーファイバーを含むポリマー足場組成物であって、
ポリマーファイバーが、エレクトロスピニング処理および架橋結合される、ポリマー足場組成物。
【請求項８０】
第１ポリマーが、コラーゲンを含むことを特徴とする、請求項７９に記載のポリマー足場組成物。
【請求項８１】
第１ポリマーが、コラーゲンから本質的に成ることを特徴とする、請求項７９に記載のポリマー足場組成物。
【請求項８２】
ポリマーファイバーが、整列されることを特徴とする、請求項７８乃至８１のいずれか１項に記載のポリマー足場組成物。
【請求項８３】
ポリマー足場組成物が、生分解性であることを特徴とする、請求項７８乃至８１のいずれか１項に記載のポリマー足場組成物。
【請求項８４】
細胞を播種したポリマー足場組成物であって、該細胞を播種したポリマー足場組成物が、
ａ）複数のコラーゲン繊維を含むポリマー足場組成物であって、コラーゲン繊維が、エレクトロスピニング処理および架橋結合される、ポリマー足場組成物；および
ｂ）複数の細胞、
を含む、細胞を播種したポリマー足場組成物。
【請求項８５】
細胞を播種したポリマー足場組成物であって、該細胞を播種したポリマー足場組成物が、
ａ）ｉ）第１ポリマーを含むシェル；および
ｉｉ）第２ポリマーを含むコア、
を含む構造を有する複数のポリマーファイバーを含むポリマー足場組成物であって、ポリマーファイバーが、エレクトロスピニング処理および架橋結合される、ポリマー足場組成物；および
ｂ）複数の細胞、
を含む、細胞を播種したポリマー足場組成物。
【請求項８６】
第１ポリマーファイバーが、コラーゲンであることを特徴とする、請求項８５に記載の細胞を播種したポリマー足場組成物。
【請求項８７】
第２ポリマーファイバーが、ポリ乳酸であることを特徴とする、請求項８５に記載の細胞を播種したポリマー足場組成物。
【請求項８８】
ポリマーファイバーが、整列されることを特徴とする、請求項８４または８５に記載の細胞を播種したポリマー足場組成物。
【請求項８９】
複数の細胞が、半月板細胞を含むことを特徴とする、請求項８４または８５に記載の細胞を播種したポリマー足場組成物。
【請求項９０】
細胞を播種したポリマー足場組成物が、半月板インプラントまたはその部分を含むことを特徴とする、請求項８４または８５に記載の細胞を播種したポリマー足場組成物。
【請求項９１】
ポリマーファイバーが、生分解性であることを特徴とする、請求項８４または８５に記載の細胞を播種したポリマー足場組成物。
【請求項９２】
被験体において組織欠損を処置する方法であって、該方法が、複数のコラーゲン繊維を含むポリマー足場組成物を被験体に投与する工程を含み、ここで、コラーゲン繊維が、エレクトロスピニング処理および架橋結合される、方法。
【請求項９３】
被験体において組織欠損を処置する方法であって、該方法が、
ａ）第１ポリマーを含むシェル；および
ｂ）第２ポリマーを含むコア、
を含む構造を有する複数のポリマーファイバーを含むポリマー足場組成物を投与する工程を含み、
ここで、ポリマーファイバーが、エレクトロスピニング処理および架橋結合される、方法。
【請求項９４】
被験体において組織欠損を処置する方法であって、該方法が、細胞を播種したポリマー足場組成物を投与する工程を含み、該細胞を播種したポリマー足場組成物が、
ａ）複数のコラーゲン繊維を含むポリマー足場組成物であって、コラーゲン繊維が、エレクトロスピニング処理および架橋結合される、ポリマー足場組成物；および
ｂ）複数の細胞、
を含む、方法。
【請求項９５】
被験体において組織欠損を処置する方法であって、該方法が、細胞を播種したポリマー足場組成物を投与する工程を含み、該細胞を播種したポリマー足場組成物が、
ａ）ｉ）第１ポリマーを含むシェル；および
ｉｉ）第２ポリマーを含むコア、 
を含む構造を有する複数のポリマーファイバーを含むポリマー足場組成物であって、ポリマーファイバーが、エレクトロスピニング処理および架橋結合される、ポリマー足場組成物；および
ｂ）複数の細胞、
を含む、方法。
【請求項９６】
組織欠損の処置が、結果として、関節軟骨に対する損傷の予防につながることを特徴とする、請求項９２乃至９５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９７】
組織欠損は、骨関節炎が原因であることを特徴とする、請求項９２乃至９５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９８】
ポリマー溶液をエレクトロスピニング処理するためのシステムであって、該システムが、
ｉ）ポリマー溶液を受ける及び放出することができるエミッター；
ｉｉ）シリンジポンプ；
ｉｉｉ）エミッターに電圧を提供するパワーサプライ；および
ｉｖ）エミッターによって生成されたポリマーファイバーを受けるための回転コレクター、
を含む、システム。
【請求項９９】
回転コレクターまたはその部分が、Ｖ字型、円錐形、およびその組み合わせから選択される形状を有することを特徴とする、請求項９８に記載のシステム。
【請求項１００】
第１エミッター出口を有する第１エミッターおよび第２エミッター出口を有する第２エミッターを含み、第１エミッター出口が、第１内部を備えた第１導管を含み、第２エミッター出口が、第２内部を備えた第２導管を含み、ここで、第２導管が第１導管の内部にあり、第１導管および第２導管が同軸であることを特徴とする、請求項９８または９９に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜相互参照＞
本出願は、２０１４年３月１４日に出願の米国仮特許出願第６１／９５３，５５０号、および２０１４年３月１８日に出願の米国仮特許出願第６１／９５５，０８２号の利益を主張し、その両方は、引用によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【０００２】
本明細書には、ポリマー足場組成物（ｐｏｌｙｍｅｒ ｓｃａｆｆｏｌｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）を生成する方法が開示され、該方法は、ポリマーファイバーを形成するために、第１ポリマーを含む第１ポリマー溶液および第２ポリマーを含む第２ポリマー溶液を、コレクター上へとエレクトロスピニング処理する（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｉｎｎｉｎｇ）工程を含み、該エレクトロスピニング処理する工程が、第１エミッターにおいて第１ポリマー溶液に第１電圧をかけ、第１ポリマー溶液を第１エミッター出口に通して放出すること；および第２エミッターにおいて第２ポリマー溶液に第２電圧をかけ、第２ポリマー溶液を第２エミッター出口に通して放出することを含み、該方法はさらに、ポリマー足場組成物を生成するために、ポリマーファイバーを架橋結合する工程を含む。幾つかの実施形態では、第１ポリマー及び／又は第２ポリマーは、ポリ乳酸、コラーゲン、メタクリル化したコラーゲン、キトサン、ゼラチン、ラテックス、デキストラン、フィブロイン、ケラチン、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ポリグリコール酸、ポリジオキサノン（ｐｏｌｙｄｉａｘａｎｏｎｅ）、ポリ（炭酸プロピレン）、ポリ（酸化エチレン）、ポリ（エステル−ウレタン）尿素、ポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される。幾つかの実施形態では、第１ポリマー溶液のエレクトロスピニング処理によって、コレクター上で第１の複数のポリマーファイバーが生成され、ここで、第２ポリマー溶液は、コレクター上で第２の複数のポリマーファイバーを生成する。幾つかの実施形態では、第１ポリマー溶液をエレクトロスピニング処理し第２ポリマー溶液をエレクトロスピニング処理することが、連続して生じる。幾つかの実施形態では、第１ポリマー溶液および第２ポリマー溶液のエレクトロスピニングは、同時に生じる。幾つかの実施形態では、第１エミッター出口は第１内部を備えた第１導管を含み、第２エミッター出口は第２内部を備えた第２チューブを含み、ここで、第２チューブは第１チューブの内部に存在し、第１チューブおよび第２チューブは同軸である。幾つかの実施形態では、第１ポリマー溶液および第２ポリマー溶液が、エミッター出口からコレクター上に放出されると、第１ポリマー溶液は、第２ポリマー溶液をカプセル化して、ポリマーファイバーを形成し、ここで、ポリマーファイバーは、第１ポリマーを含むシェル、および第２ポリマーを含むコア、を含む構造を有する。幾つかの実施形態では、シェルは、第１ポリマーから本質的に成る。幾つかの実施形態では、第１ポリマーは、コラーゲンである。幾つかの実施形態では、第１ポリマー溶液は、ＰＢＳとエタノールの混合溶媒に溶解されたコラーゲンを含む。幾つかの実施形態では、第１ポリマー溶液は、１６ｗｔ％の溶液に溶解されたコラーゲンを含む。幾つかの実施形態では、第１ポリマー溶液は、ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ）に溶解されたコラーゲンを含む。幾つかの実施形態では、第１ポリマー溶液は、水に溶解されたコラーゲンを含む。幾つかの実施形態では、コラーゲンは、メタクリル化されたコラーゲンであり、ポリマーファイバーは、メタクリル化され���コラーゲンを含む。幾つかの実施形態では、該方法は、ポリマーファイバーからオキシダントを放出する工程であって、結果としてポリマーファイバーの１つ以上の間の化学結合をもたらす工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、オキシダントを放出する工程は、ポリマー足場組成物をリボフラビンと接触させることを含む。幾つかの実施形態では、該方法は、ポリマー足場組成物を光開始剤と接触させる工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、該方法は、ポリマーファイバーからオキシダントを放出するためにポリマー足場組成物を紫外線に露出する工程であって、結果として、ポリマーファイバーの１つ以上の間の化学結合をもたらす工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、第２ポリマーは、ポリ乳酸、コラーゲン、メタクリル化したコラーゲン、キトサン、ゼラチン、ラテックス、デキストラン、フィブロイン、ケラチン、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ポリグリコール酸、ポリジオキサノン、ポリ（炭酸プロピレン）、ポリ（酸化エチレン）、ポリ（エステル−ウレタン）尿素、ポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン），およびそれらの組み合わせから成る群から選択される。幾つかの実施形態では、第２ポリマーは、ポリ乳酸である。幾つかの実施形態では、ポリ乳酸は、ジクロロメタンとＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドの混合溶媒中に溶解される。幾つかの実施形態では、ポリ乳酸は、１０ｗｔ％の溶液中に溶解される。幾つかの実施形態では、第１電圧及び／又は第２電圧は、約１５ｋＶ乃至約２０ｋＶである。幾つかの実施形態では、該方法は、コレクターに電圧をかける工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、電圧は、約−１０ｋＶ乃至約−１ｋＶである。幾つかの実施形態では、エレクトロスピニングと架橋結合は、同時に生じる。幾つかの実施形態では、架橋結合は、エレクトロスピニング後に生じる。幾つかの実施形態では、コラーゲンはビオチンに共役され、コレクターはアビジンを含む。幾つかの実施形態では、該方法は、細胞を播種したポリマー足場組成物を形成するために、ポリマーファイバーを複数の細胞と接触させる工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、ポリマーファイバーを複数の細胞と接触させる工程は、ポリマーファイバー上へと複数の細胞をエレクトロスプレー処理する（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙｉｎｇ）ことを含む。幾つかの実施形態では、ポリマー溶液のエレクトロスピニングおよび複数の細胞のエレクトロスプレーは、同時に生じる。幾つかの実施形態では、複数の細胞のエレクトロスプレーは、ポリマー溶液のエレクトロスピニング後に生じる。幾つかの実施形態では、複数の細胞のエレクトロスプレーは、ポリマーファイバーの架橋結合後に生じる。幾つかの実施形態では、複数の細胞のエレクトロスプレーは、架橋結合前に生じる。幾つかの実施形態では、複数の細胞のエレクトロスプレーおよびポリマーファイバーの架橋結合は、同時に生じる。幾つかの実施形態では、ポリマー溶液のエレクトロスピニング、複数の細胞のエレクトロスプレー、およびポリマーファイバーの架橋結合は、同時に生じる。幾つかの実施形態では、該方法は、複数の細胞をポリマー足場組成物中にカプセル化する工程を含む。幾つかの実施形態では、複���の細胞は、間葉系幹細胞、半月板細胞、軟骨芽細胞、軟骨細胞、またはその組み合わせを含む。幾つかの実施形態では、半月板細胞は、血管の半月板細胞を含む。幾つかの実施形態では、半月板細胞は、無血管の半月板細胞を含む。幾つかの実施形態では、半月板細胞は、血管の半月板細胞および無血管の半月板細胞を含む。幾つかの実施形態では、複数の細胞は、生体模倣ゲル（ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ ｇｅｌ）中で懸濁される。幾つかの実施形態では、複数の細胞は、生体模倣ゲルの１ミリリットル当たり約５０，０００個の細胞の密度を有している。幾つかの実施形態では、生体模倣ゲルは、ＩＩ型コラーゲン、コンドロイチン硫酸塩、ヒアルロナン、またはその組み合わせを含む。幾つかの実施形態では、該方法は、生体模倣ゲルをアルギン酸塩と架橋結合させる工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、生体模倣ゲルは、１つ以上の成長因子を含む。幾つかの実施形態では、生体模倣ゲルは、酵素を含む。幾つかの実施形態では、酵素は、プロテアーゼである。幾つかの実施形態では、プロテアーゼは、コラゲナーゼである。幾つかの実施形態では、該方法は、細胞を播種したポリマー足場組成物を細胞培養物中で維持する工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、細胞培養物は、ＴＧＦベータを含む。幾つかの実施形態では、ＴＧＦベータは、細胞培養物中に約１０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する。幾つかの実施形態では、該方法は、約１週間から約３週間の間、細胞を播種したポリマー足場組成物を細胞培養物中で維持する工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、該方法は、約２週間、細胞を播種したポリマー足場組成物を細胞培養物中で維持する工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、ポリマー溶液をエレクトロスピニング処理する工程は、第１ポリマー溶液及び／又は第２ポリマー溶液を、シリンジポンプを備えるコレクターへと及び／又はエミッターに通してコレクター上へと供給することを含む。幾つかの実施形態では、シリンジポンプは、約２．０ｍＬ／ｈの供給率で作動する。幾つかの実施形態では、コレクターは、固定されている。幾つかの実施形態では、ポリマーファイバーは、ランダムに配向されたポリマーファイバーを含む。幾つかの実施形態では、エミッター出力とコレクターとの間の間隔は、約１６ｃｍである。幾つかの実施形態では、ポリマーファイバーは、架橋結合後に約０．１ＭＰａから約１０００ＭＰａの間の平均の最大抗張力を有する。幾つかの実施形態では、ポリマーファイバーは、架橋結合後に約１ＭＰａから約５００ＭＰａの間の平均の最大抗張力を有する。幾つかの実施形態では、ポリマーファイバーは、架橋結合後に約１ＭＰａから約１００ＭＰａの間の平均の最大抗張力を有する。幾つかの実施形態では、ポリマーファイバーは、架橋結合後に約２５ＭＰａから約９０ＭＰａの間の平均の最大抗張力を有する。幾つかの実施形態では、コレクターは、回転コレクター（ｒｏｔａｔｉｎｇ ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ）を含む。幾つかの実施形態では、コレクターは、回転ドラムコレクター（ｒｏｔａｔｉｎｇ ｄｒｕｍ ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ）を含む。幾つかの実施形態では、コレクターまたはその部分は、円錐形を有する。幾つかの実施形態では、エレクトロスピニング処理は、ポリマーファイバーを回転コレクター上に整列させることを含む。幾つかの実施形態では、該方法は、約２４００ＲＰＭで回転コレクターを回転させる工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、エミッター出力とコレクターとの間の間隔は、約１２ｃｍである。幾つかの実施形態では、ポリマーファイバーは、架橋結合後に整列されたファイバーと平行な方向に約１ＭＰａから約２０００ＭＰａの間の平均の最大抗張力を有する。幾つかの実施形態では、ポリマーファイバーは、架橋結合後に整列されたファイバーと平行な方向に約１０ＭＰａから約１０００ＭＰａの間の平均の最大抗張力を有する。幾つかの実施形態では、ポリマーファイバーは、架橋結合後に整列されたファイバーと平行な方向に約１２５ＭＰａから約３２５ＭＰａの間の平均の最大抗張力を有する。幾つかの実施形態では、ポリマーファイバーは、約５ｎｍから１０μｍの間の直径を有する。幾つかの実施形態では、ポリマーファイバーは、約５０ｎｍから約５μｍの間の直径を有する。幾つかの実施形態では、ポリマーファイバーは、約１μｍの直径を有する。幾つかの実施形態では、該方法は、コレクターをアルミ箔で覆う工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、該方法は、コレクターを薬剤で覆う工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、薬剤は、非粘着性薬剤を含む。幾つかの実施形態では、非粘着性薬剤は、ポリテトラフルオロエチレンを含む。幾つかの実施形態では、該方法は、ポリマー足場組成物を生体模倣ゲルと接触させる工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、生体模倣ゲルは、ポリマー足場組成物またはその一部の全体にわたって分配される。幾つかの実施形態では、該方法は、複数のポリマー足場組成物を生成する工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、該方法は、多層構成物を形成するために、複数のポリマー足場組成物を組み合わせる工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、該方法は、多層構成物を生体模倣ゲルと接触させる工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、該方法は、生体模倣ゲルおよびポリマー足場組成物を層状化する工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、該方法は、身体部分に類似させるようにポリマー足場組成物または多層構成物を形作る工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、身体部分は、膝半月板またはその一部である。幾つかの実施形態では、ポリマーファイバーを架橋結合する工程は、光架橋結合（
ｐｈｏｔｏｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ）を含む。幾つかの実施形態では、該方法は、ポリマーファイバーを複数回光架橋結合する工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、ポリマーファイバーを架橋結合する工程は、ポリマーファイバーを化学的橋架溶液と接触させることを含む。幾つかの実施形態では、化学的橋架溶液は、アルデヒド、グルタルアルデヒド、塩化カルシウム、またはＴｒｏｕｔの試薬から選択される化学物質を含む。
【０００３】
さらに、本明細書には、コラーゲン足場組成物（ｃｏｌｌａｇｅｎ ｓｃａｆｆｏｌｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）を生成する方法が開示され、該方法は、コラーゲン繊維を形成するために、コラーゲンおよび溶媒から本質的に成るポリマー溶液をコレクター上へとエレクトロスピニング処理する工程；およびコラーゲン足場組成物を生成するためにコラーゲン繊維を架橋結合する工程を含む。幾つかの実施形態では、ポリマー溶液は、コラーゲン以外にポリマーを含まない。幾つかの実施形態では、エレクトロスピニングおよび架橋結合は、同時に生じる。幾つかの実施形態では、架橋結合は、エレクトロスピニング後に生じる。幾つかの実施形態では、溶媒は、ＰＢＳおよびエタノールを含む。幾つかの実施形態では、コラーゲンは、１６ｗｔ％の溶液に溶解される。幾つかの実施形態では、溶媒は、ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ）を含む。幾つかの実施形態では、溶媒は、水を含む。幾つかの実施形態では、コラーゲンはメタクリル化されたコラーゲンであり、コラーゲン繊維はメタクリル化されたコラーゲン繊維である。幾つかの実施形態では、該方法は、メタクリル化されたコラーゲン繊維からオキシダントを放出する工程であって、結果として、メタクリル化されたコラーゲン繊維の１つ以上の間の化学結合をもたらす工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、オキシダントを放出する工程は、コラーゲン足場組成物をリボフラビンと接触させることを含む。幾つかの実施形態では、該方法は、コラーゲン足場組成物を光開始剤と接触させる工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、該方法は、メタクリル化されたコラーゲン繊維からオキシダントを放出するためにコラーゲン足場組成物を紫外線に露出する工程であって、結果として、メタクリル化されたコラーゲン繊維の１つ以上の間の化学結合をもたらす工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、コラーゲンはビオチンに共役され、コレクターはアビジンを含む。幾つかの実施形態では、該方法は、細胞を播種したコラーゲン足場組成物を形成するために、コラーゲン繊維を複数の細胞と接触させる工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、コラーゲン繊維を複数の細胞と接触させる工程は、複数の細胞をコラーゲン繊維上へとエレクトロスプレー処理することを含む。幾つかの実施形態では、ポリマー溶液のエレクトロスピニングおよび複数の細胞のエレクトロスプレーは、同時に生じる。幾つかの実施形態では、複数の細胞のエレクトロスプレーは、ポリマー溶液のエレクトロスピニング後に生じる。幾つかの実施形態では、複数の細胞のエレクトロスプレーは、コラーゲン繊維の架橋結合後に生じる。幾つかの実施形態では、複数の細胞のエレクトロスプレーは、コラーゲン繊維の架橋結合前に生じる。幾つかの実施形態では、複数の細胞のエレクトロスプレーおよびポリマーファイバーの架橋結合は、同時に生じる。幾つかの実施形態では、ポリマー溶液のエレクトロスピニング、複数の細胞のエレクトロスプレー、およびポリマーファイバーの架橋結合は、同時に生じる。幾つかの実施形態では、該方法は、細胞を播種したコラーゲン足場組成物中に複数の細胞をカプセル化する。幾つかの実施形態では、複数の細胞は、間葉系幹���胞、半月板細胞、軟骨芽細胞、軟骨細胞、またはその組み合わせを含む。幾つかの実施形態では、半月板細胞は、血管の半月板細胞を含む。幾つかの実施形態では、半月板細胞は、無血管の半月板細胞を含む。幾つかの実施形態では、半月板細胞は、血管の半月板細胞および無血管の半月板細胞を含む。幾つかの実施形態では、複数の細胞は、生体模倣ゲル中で懸濁される。幾つかの実施形態では、複数の細胞は、生体模倣ゲルの１ミリリットル当たり約５０，０００個の細胞の密度を有している。幾つかの実施形態では、生体模倣ゲルは、ＩＩ型コラーゲン、コンドロイチン硫酸塩、ヒアルロナン、およびその組み合わせを含む。幾つかの実施形態では、該方法は、生体模倣ゲルをアルギン酸塩と架橋結合させる工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、生体模倣ゲルは、１つ以上の成長因子を含む。幾つかの実施形態では、生体模倣ゲルは、酵素を含む。幾つかの実施形態では、酵素は、プロテアーゼである。幾つかの実施形態では、プロテアーゼは、コラゲナーゼである。幾つかの実施形態では、該方法は、細胞をコラーゲン足場組成物に加えた後に、細胞生存率、細胞形態および遺伝子発現のために複数の細胞を分析する工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、該方法は、細胞を播種したコラーゲン足場組成物を細胞培養物中で維持する工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、細胞培養物は、ＴＧＦベータを含む。幾つかの実施形態では、ＴＧＦベータは、１０ｎｇ／ｍｌの細胞培養物の濃度で存在する。幾つかの実施形態では、該方法は、約１週間から約３週間の間、細胞を播種したコラーゲン足場組成物を細胞培養物中で維持する工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、該方法は、約２週間、細胞を播種したコラーゲン足場組成物を細胞培養物中で維持する工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、エレクトロスピニング処理は、ポリマー溶液に電圧をかけることを含む。幾つかの実施形態では、電圧は、約１５ｋＶ乃至約２０ｋＶである。幾つかの実施形態では、該方法は、コレクターに電圧をかける工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、電圧は、約−１０ｋＶ乃至約−１ｋＶである。幾つかの実施形態では、エレクトロスピニング処理は、エミッターにポリマー溶液を充填し、ポリマー溶液をエミッター出力に通して放出することを含む。幾つかの実施形態では、ポリマー溶液をエレクトロスピニング処理する工程は、ポリマー溶液を、シリンジポンプを備えるエミッターへと及び／又はエミッターに通して供給することを含む。幾つかの実施形態では、シリンジポンプは、約２．０ｍＬ／ｈの供給率で作動する。幾つかの実施形態では、コレクターは、固定されている。幾つかの実施形態では、ポリマーファイバーは、ランダムに配向されたポリマーファイバーを含む。幾つかの実施形態では、エミッター出力とコレクターとの間の間隔は、約１６ｃｍである。幾つかの実施形態では、ポリマーファイバーは、架橋結合後に約０．１ＭＰａから約１０００ＭＰａの間の平均の最大抗張力を有する。幾つかの実施形態では、ポリマーファイバーは、架橋結合後に約１ＭＰａから約５００ＭＰａの間の平均の最大抗張力を有する。幾つかの実施形態では、ポリマーファイバーは、架橋結合後に���１ＭＰａから約１００ＭＰａの間の平均の最大抗張力を有する。幾つかの実施形態では、コレクターは、回転コレクターである。幾つかの実施形態では、コレクターは、回転ドラムコレクターである。幾つかの実施形態では、コレクターは、図３および図４Ａに描写されるコレクターのように形作られる。幾つかの実施形態では、エレクトロスピニング処理は、コラーゲン繊維を回転コレクター上に整列させることを含む。幾つかの実施形態では、該方法は、約２４００ＲＰＭで回転コレクターを回転させる工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、エミッター出力とコレクターとの間の間隔は、約１２ｃｍである。幾つかの実施形態では、コラーゲン繊維は、架橋結合後に整列されたファイバーと平行な方向に、約１ＭＰａから約２０００ＭＰａの間の平均の最大抗張力を有する。幾つかの実施形態では、コラーゲン繊維は、架橋結合後に整列されたファイバーと平行な方向に、約１０ＭＰａから約１０００ＭＰａの間の平均の最大抗張力を有する。幾つかの実施形態では、コラーゲン繊維は、約５ｎｍから１０μｍの間の直径を有する。幾つかの実施形態では、コラーゲン繊維は、約５０ｎｍから５μｍの間の直径を有する。幾つかの実施形態では、コラーゲン繊維は、約１μｍの直径を有する。幾つかの実施形態では、該方法は、コレクターをアルミ箔で覆う工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、該方法は、コレクターを薬剤で覆う工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、薬剤は、非粘着性薬剤を含む。幾つかの実施形態では、非粘着性薬剤は、ポリテトラフルオロエチレンを含む。幾つかの実施形態では、該方法は、複数のコラーゲン足場組成物を生成する工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、該方法は、多層構成物を形成するために複数のコラーゲン足場組成物を組み合わせる工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、該方法は、多層構成物を生体模倣ゲルと接触させる工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、該方法は、生体模倣ゲルおよびコラーゲン足場組成物を層状化する工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、該方法は、身体部分に類似させるようにコラーゲン足場組成物または多層構成物を形作る工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、身体部分は、膝半月板またはその一部である。幾つかの実施形態では、ポリマーファイバーを架橋結合する工程は、光架橋結合を含む。幾つかの実施形態では、該方法は、ポリマーファイバーを複数回光架橋結合する工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、ポリマーファイバーを架橋結合する工程は、ポリマーファイバーを化学的橋架溶液と接触させることを含む。幾つかの実施形態では、化学的橋架溶液は、アルデヒド、グルタルアルデヒド、塩化カルシウム、またはＴｒｏｕｔの試薬から選択される化学物質を含む。幾つかの実施形態では、該方法は、化学的橋架溶液を化学的橋架溶液エミッターへと充填する工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、該方法は、化学的橋架溶液エミッターから化学的橋架溶液を放出する工程およびポリマー溶液を同時にエレクトロスピニング処理する工程をさらに含み、ここで、化学的橋架溶液およびポリマー溶液は、コレクター上にある前に組み合わせられる。
【０００４】
本明細書には、複数のコラーゲン繊維を含むポリマー足場組成物が開示され、こここで、コラーゲン繊維は、エレクトロスピニング処理および架橋結合される。
【０００５】
さらに本明細書には、第１ポリマーを含むシェル、および第２ポリマーを含むコア、を含む構造を有する複数のポリマーファイバーを含むポリマー足場組成物が開示され、ここで、ポリマーファイバーは、エレクトロスピニング処理および架橋結合される。幾つかの実施形態では、第１ポリマーは、コラーゲンを含む。幾つかの実施形態では、第１ポリマーは、コラーゲンから本質的に成る。幾つかの実施形態では、ポリマーファイバーは、整列される。幾つかの実施形態では、ポリマー足場組成物は、生分解性である。
【０００６】
本明細書には、細胞を播種したポリマー足場組成物が開示され、該細胞を播種したポリマー足場組成物は、複数のコラーゲン繊維を含むポリマー足場組成物であって、コラーゲン繊維が、エレクトロスピニング処理および架橋結合される、ポリマー足場組成物；および複数の細胞、を含む。
【０００７】
さらに本明細書には、細胞を播種したポリマー足場組成物が開示され、該細胞を播種したポリマー足場組成物は、第１ポリマーを含むシェル、および第２ポリマーを含むコア、を含む構造を有する複数のポリマーファイバーを含むポリマー足場組成物であって、ポリマーファイバーが、エレクトロスピニング処理および架橋結合される、ポリマー足場組成物；および複数の細胞、を含む。幾つかの実施形態では、第１ポリマーファイバーは、コラーゲンである。幾つかの実施形態では、第２ポリマーファイバーは、ポリ乳酸である。幾つかの実施形態では、ポリマーファイバーは、整列される。幾つかの実施形態では、複数の細胞は、軟骨細胞を含む。幾つかの実施形態では、複数の細胞は、半月板細胞を含む。幾つかの実施形態では、細胞を播種したポリマー足場組成物は、半月板インプラントまたはその部分を含む。幾つかの実施形態では、ポリマーファイバーは、生分解性である。幾つかの実施形態では、ポリマーファイバーは、少なくとも約６か月の湿潤強度の半減期を有する。
【０００８】
本明細書には、被験体において組織欠損を処置する方法が開示され、該方法は、複数のコラーゲン繊維を含むポリマー足場組成物を被験体に投与する工程を含み、ここで、コラーゲン繊維は、エレクトロスピニング処理および架橋結合される。
【０００９】
さらに本明細書には、被験体において組織欠損を処置する方法が開示され、該方法は、第１ポリマーを含むシェル、および第２ポリマーを含むコア、を含む構造を有する複数のポリマーファイバーを含むポリマー足場組成物を投与する工程を含み、ここで、ポリマーファイバーは、エレクトロスピニング処理および架橋結合される。
【００１０】
本明細書には、被験体において組織欠損を処置する方法が開示され、該方法は、細胞を播種したポリマー足場組成物を投与する工程を含み、該細胞を播種したポリマー足場組成物は、複数のコラーゲン繊維を含むポリマー足場組成物であって、コラーゲン繊維が、エレクトロスピニング処理および架橋結合される、ポリマー足場組成物；および複数の細胞、を含む。
【００１１】
さらに本明細書には、被験体において組織欠損を処置する方法が開示され、該方法は、細胞を播種したポリマー足場組成物を投与する工程を含み、該細胞を播種したポリマー足場組成物は、第１ポリマーを含むシェル、および第２ポリマーを含むコア、を含む構造を有する複数のポリマーファイバーを含むポリマー足場組成物であって、ポリマーファイバーが、エレクトロスピニング処理および架橋結合される、ポリマー足場組成物；および複数の細胞、を含む。幾つかの実施形態では、組織欠損の処置は、結果として、関節軟骨に対する損傷の予防につながる。幾つかの実施形態では、組織欠損は、骨関節炎が原因である。幾つかの実施形態では、組織欠損は、関節欠損または関節損傷が原因である。幾つかの実施形態では、関節損傷は、肘損傷、手首損傷、頚部損傷、腰部怪我、肩損傷、膝故障、足首損傷、脊椎損傷、指損傷およびつま先損傷から選択される。幾つかの実施形態では、関節損傷は、膝損傷を含む。幾つかの実施形態では、膝損傷は、半月板障害を含む。幾つかの実施形態では、複数の細胞は、被験体に由来する。幾つかの実施形態では、複数の細胞は、第２被験体に由来する。幾つかの実施形態では、被験体は、ヒトである幾つかの実施形態では、複数の細胞は、動物に由来する。幾つかの実施形態では、動物は、ブタである。
【００１２】
本明細書には、被験体において半月板またはその一部を交換する方法が開示され、該方法は、請求項８−１６のいずれか１つの細胞を播種したポリマー足場組成物を注入する工程を含む。
【００１３】
さらに本明細書には、関節欠損の処置に使用するための細胞を播種したポリマー足場組成物が開示され、ここで、細胞を播種したポリマー足場組成物は、本明細書に開示される方法のいずれか１つによって作られる。
【００１４】
本明細書には、関節欠損の処置に使用するためのポリマー足場組成物が開示され、ここで、該ポリマー足場組成物は、本明細書に開示される方法ののいずれか１つによって作られる。
【００１５】
さらに本明細書には、ポリマー溶液をエレクトロスピニング処理するためのシステムが開示され、該システムは、ポリマー溶液を受ける及び放出することができるエミッター；シリンジポンプ；エミッターに電圧を提供するパワーサプライ；およびエミッターによって生成されたポリマーファイバーを受けるためのコレクター、を含む。幾つかの実施形態では、システムは、複数の細胞を受ける及び放出することができるエミッターをさらに含む。幾つかの実施形態では、コレクターは、接地プレートコレクター（ｇｒｏｕｎｄｅｄ ｐｌａｔｅ ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ）を含む。幾つかの実施形態では、コレクターは、回転コレクターを含む。幾つかの実施形態では、回転コレクターは、Ｖ字型の回転コレクターである。幾つかの実施形態では、回転コレクターまたはその部分は、円錐形を有する。幾つかの実施形態では、システムは、第１エミッター出口を有する第１エミッターおよび第２エミッター出口を有する第２エミッターを含む。幾つかの実施形態では、第１エミッター出口は第１内部を備えた第１導管を含み、第２エミッター出口は第２内部を備えた第２チューブを含み、ここで、第２チューブは第１チューブの内部にあり、第１チューブおよび第２チューブは同軸である。幾つかの実施形態では、エミッターは、固定されている。幾つかの実施形態では、エミッターは、可動性である。幾つかの実施形態では、システムは、エミッター用のプラットフォームをさらに含む。幾つかの実施形態では、プラットフォームは調整可能な高さを有する。幾つかの実施形態では、エミッターは、ニードルを含む。幾つかの実施形態では、ニードルは、２１ゲージのニードルである。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
本発明の新しい特徴は、特に、添付の特許請求の範囲内に明記される。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が用いられる実施形態を説明する以下の詳細な説明と、以下の添付図面とを引用することによって得られるであろう。
【００１７】
【図１Ａ】図１Ａは、ランダムに配向されたファイバーのエレクトロスピニングを例示する。溶液中のポリマーをニードル（スピナレットとも呼ばれる）に通して押し出すために、シリンジポンプが使用される。ニードルに高圧がかけられて、ニードルを出るポリマー溶液を充填する（ｃｈａｒｇｅｓ）。接地コレクタープレート（ｇｒｏｕｎｄｅｄ ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ ｐｌａｔｅ）が、荷電されたポリマーをジェットとして引きつけるために電圧差を提供する。ポリマージェットは、空気中で乾燥し、ファイバーは、接地プレート上のマットとしてランダムに堆積する。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ランダムに配向されたポリマーファイバーを備えたエレクトロスピニング処理されたポリマー足場を示す。
【図２】図２は、整列されたファイバーのエレクトロスピニングを例示する。溶液中のポリマーをニードル（スピナレットとも呼ばれる）に通して押し出すために、シリンジポンプが使用される。ニードルに高圧がかけられて、ニードルを出るポリマー溶液を充填する。補助電極または負極が、荷電されたポリマーをジェットとして引きつけるために電圧差を提供する。回転コレクターは、補助電極に達する前にファイバーを遮断し、整列されたエレクトロスピニング処理したファイバーを収集する。
【図３】図３は、ヒト半月板の形状でファイバーをエレクトロスピニング処理するのに使用されるカスタム形状の回転シリンダ上に整列されたエレクトロスピニング処理したファイバーを収集するプロセスを例示する。ドラムシリンダ用に低負電圧を使用することが、より小さな電場を作るためのエレクトロスピニングにより好適である。
【図４Ａ】図４Ａは、半月板（右）の形状でファイバーをエレクトロスピニング処理するのに使用されるカスタム形状の回転シリンダ（左）を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、数片の半月板形状のエレクトロスピニング処理したコラーゲンを示す。
【図５】Ａ−Ｄは、三成分マトリックスのゲル（ｔｒｉ−ｍａｔｒｉｘ ｇｅｌ）においてヒト間葉系幹細胞を播種された、およびアルギン酸塩中にカプセル化され、異なる成長因子を使用して２週間培養された、多層構成物を形成するために、円筒状の回転ドラムシリンダ上でエレクトロスピニング処理され、続いて盤（ｄｉｓｃｓ）に切断された、整列されたコラーゲンの巨視的画像を表す。
【図６】Ａ−Ｃは、複数のポリマー足場組成物のエレクトロスピニング処理する装置および生成の概略図を示す。（Ａ）ランダムなポリ乳酸（ＰＬＡ）ファイバーを生成するために、接地プレートコレクターが使用され、（Ｂ）整列されたＰＬＡファイバーを堆積させるために、回転コレクターが使用された。（Ｃ）多層の生成のプロセス。ＩＩ型コラーゲン、コンドロイチン硫酸塩およびヒアルロナンから成るヒドロゲル中にカプセル化されたヒト半月板細胞は、ベース（ｂａｓｅ）整列されたＰＬＡ足場上に播種され、その後、同じ繊維配向で別の足場が配置された。この後、細胞の別の層およびもう１つの足場層が続いた。層を一緒に保持するために、２％のアルギン酸塩の層は、スタック（ｓｔａｃｋ）全体にわたって堆積され、架橋結合された。
【図７】Ａ−Ｆは、エレクトロスピニング処理した（ＥＳ）ＰＬＡ足場および細胞の応答の走査型電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）を示す。（Ａ）ランダムに配向されたＥＳ ＰＬＡファイバーのＳＥＭ（Ｍａｇ．１２５０ｘ）および（Ｂ）整列されたＥＳ ＰＬＡファイバーのＳＥＭ（Ｍａｇ．１２５０ｘ）。（Ｃ）ランダムなＥＳ ＰＬＡファイバー上で培養されたヒト半月板細胞のＳＥＭ（Ｍａｇ．６２５ｘ）および（Ｄ）整列されたＥＳ ＰＬＡファイバー上で培養されたヒト半月板細胞のＳＥＭ（Ｍａｇ．５００ｘ）。（Ｅ−Ｆ）共焦点顕微鏡が実証する生存度（生／死）およびランダムな足場および整列された足場上で培養した整列された細胞（Ｍａｇ．１０ｘ）。
【図８】Ａ−Ｂは、ランダムな又は整列されたＰＬＡのエレクトロスピニング処理した足場上で培養されたヒトの血管および無血管の半月板細胞の遺伝子発現の相対的な倍率変化を示す。（Ａ）増加したＣＯＬ１Ａ１およびＳＯＸ９の遺伝子発現。単原子層制御（ｍｏｎｏｌａｙｅｒ ｃｏｎｔｒｏｌｓ）に対する減少したアグリカン発現。（Ｂ）ランダムな及び整列されたＰＬＡのエレクトロスピニング処理した足場上のＣＯＭＰ発現（ｎ＝４−５のドナー）。発現レベルは、単原子層制御（点線）に比例する。
【図９Ａ】図９Ａは、ランダムに配向された及び整列されたＥＳ ＰＬＡ足場の機械試験の結果を示す。ランダムに配向された、（繊維配向に沿って）整列された、および繊維配向に垂直であるＰＬＡ足場に対するヤング率（ＭＰａ）。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ランダムに配向された及び整列されたＥＳ ＰＬＡ足場の機械試験の結果を示す。細胞を用いる又は用いない、培養中の経時的なランダムに配向された及び整列されたエレクトロスピニング処理したＰＬＡ足場のヤング率（ＭＰａ）（１週および３週）。
【図９Ｃ】図９Ｃは、ランダムに配向された及び整列されたＥＳ ＰＬＡ足場の機械試験の結果を示す。各条件に対する応力／歪み曲線。
【図９Ｄ】図９Ｄは、ランダムに配向された及び整列されたＥＳ ＰＬＡ足場の機械試験の結果を示す。整列されたＰＬＡ足場の歪みにおいて「つま先−領域」を示す（Ｃ）における応力−歪み曲線の点線で描かれた領域。
【図９Ｅ】図９Ｅは、ランダムに配向された及び整列されたＥＳ ＰＬＡ足場の機械試験の結果を示す。各条件に対する極限応力の読取値（ｒｅａｄｉｎｇｓ）（ＭＰａ）。
【図９Ｆ】図９Ｆは、ランダムに配向された及び整列されたＥＳ ＰＬＡ足場の機械試験の結果を示す。細胞を用いる又は用いない、培養中の経時的なランダムな及び整列されたエレクトロスピニング処理したＰＬＡ足場に対する極限応力（ＭＰａ）。
【図１０】Ａ−Ｆは、多層（ｍｕｌｔｉ−ｌａｙｅｒ）整列されたＰＬＡ細胞を播種した足場の組織学的検査および免疫組織化学的検査を示す。（Ａ−Ｂ）２週間培養された構築物のサフラニンＯ／ファストグリーン染色。矢印は３つの整列されたＰＬＡ足場層を示し、矢頭はアルギン酸塩の層を指す。（Ｃ−Ｄ）Ｉ型コラーゲンの免疫染色。（Ｅ−Ｆ）アイソタイプコントロール染色。（Ｍａｇ．ＡおよびＣ＝１０ｘ；ＢおよびＤ＝４０ｘ）。
【図１１Ａ】図１１Ａは、エレクトロスピニング処理した（ＥＳ）コラーゲン足場および細胞の応答の走査型電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）を示す。ランダムに配向されたＥＳコラーゲン繊維のＳＥＭ
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、エレクトロスピニング処理した（ＥＳ）コラーゲン足場および細胞の応答の走査型電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）を示す。整列されたＥＳコラーゲン繊維のＳＥＭ。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、エレクトロスピニング処理した（ＥＳ）コラーゲン足場および細胞の応答の走査型電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）を示す。ランダムに配向されたＥＳコラーゲン繊維のヒト半月板細胞（スケールバー＝５μｍ）。架橋結合によるランダムなＥＳコラーゲン足場の機械試験。
【図１１Ｄ】図１１Ｄは、エレクトロスピニング処理した（ＥＳ）コラーゲン足場および細胞の応答の走査型電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）を示す。整列されたＥＳコラーゲン繊維のヒト半月板細胞（スケールバー＝５μｍ）。架橋結合による整列されたＥＳコラーゲン足場の機械試験。
【図１１Ｅ】図１１Ｅは、エレクトロスピニング処理した（ＥＳ）コラーゲン足場および細胞の応答の走査型電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）を示す。ランダムな、（繊維配向に沿って）整列された、および繊維配向に垂直であるコラーゲン足場に対するヤング率（ＭＰａ）。
【図１１Ｆ】図１１Ｆは、エレクトロスピニング処理した（ＥＳ）コラーゲン足場および細胞の応答の走査型電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）を示す。各条件に対する応力／歪み曲線。白いバーは、架橋結合されていないＥＳコラーゲン足場を表わし、黒のバーは、１時間１ＸＰＢＳ中で０．２５％のグルタルアルデヒドにおいて架橋結合されたＥＳコラーゲン足場である。
【図１２Ａ】図１２Ａは、三成分マトリックスのゲルを用いて、ランダムに配向された及び整列されたＥＳコラーゲン足場上に播種された、およびＴＧＦベータ１を有するＩＴＳ＋（１０ｎｇ／ｍｌ）中で１４日間培養された、血管および無血管の領域からのヒト半月板細胞（ｎ＝４）の相対的な遺伝子発現プロファイルを示す。図１２Ａは、ＣＨＡＤおよびＣＯＬ１Ａ１に対する相対的な遺伝子発現レベルを示す。発現は、単層培養細胞（点線）に比例するように示される。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、三成分マトリックスのゲルを用いて、ランダムに配向された及び整列されたＥＳコラーゲン足場上に播種された、およびＴＧＦベータ１を有するＩＴＳ＋（１０ｎｇ／ｍｌ）中で１４日間培養された、血管および無血管の領域からのヒト半月板細胞（ｎ＝４）の相対的な遺伝子発現プロファイルを示す。図１２Ｂは、ＡＧＧおよびＴＨＹ１に対する相対的な遺伝子発現レベルを示す。発現は、単層培養細胞（点線）に比例するように示される。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、三成分マトリックスのゲルを用いて、ランダムに配向された及び整列されたＥＳコラーゲン足場上に播種された、およびＴＧＦベータ１を有するＩＴＳ＋（１０ｎｇ／ｍｌ）中で１４日間培養された、血管および無血管の領域からのヒト半月板細胞（ｎ＝４）の相対的な遺伝子発現プロファイルを示す。図１２Ｃは、ＣＯＭＰに対する相対的な遺伝子発現レベルを示す。発現は、単層培養細胞（点線）に比例するように示される。
【図１３Ａ】図１３Ａは、細胞なしでの、エレクトロスピニング処理された日の整列されたＰＬＡファイバーを示す。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、細胞なしでの、エレクトロスピニング処理されてから３０日後の整列されたＰＬＡファイバーを示す。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、軟骨細胞を用いた、エレクトロスピニング処理されてから３０日後の整列されたＰＬＡファイバーを示す。
【図１４Ａ】図１４Ａは、Ｉ型コラーゲンファイバーの整列されたマット上で培養された線維軟骨細胞（ｆｉｂｒｏｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ）の走査電子顕微鏡画像を示す（ｘ１０，０００）。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、Ｉ型コラーゲンファイバーの整列されたマット上で培養された線維軟骨細胞の走査電子顕微鏡画像を示す（ｘ２，５００）。
【図１５】図１５は、エレクトロスピニング処理した層間に生細胞を用いてエレクトロスピニング処理したマットの層を生成するために、交互に、ポリマー溶液をエレクトロスピニング処理し、細胞をエレクトロスプレー処理する工程を示す。
【図１６】Ａ−Ｂは、連続するエレクトロスプレー処理およびエレクトロスピニング処理の１か月後の高い細胞生存率を示す：（Ａ）接地コレクター上でエレクトロスプレー処理された細胞；（Ｂ）負に帯電したコレクター上でエレクトロスプレー処理された細胞。
【図１７Ａ】図１７Ａは、埋め込まれた生細胞を用いてエレクトロスピニング処理したマットの層を生成するための、同時のエレクトロスピニング処理およびエレクトロスプレー処理の工程を例示する。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、同時のエレクトロスプレー処理およびエレクトロスピニング処理の１か月後の高い細胞生存率を例示する。
【図１８】Ａ−Ｃは、１０Ｘ倍率（Ａ）および試験片中の２つの異なる領域の４０Ｘ倍率（ＢおよびＣ）での、２週間の培養後の二層の培養組織サンプルの顕微鏡画像を示す。ラインは、エレクトロスピニング処理した層を指す。
【図１９】図１９は、ＴＧＦベータ１または３で刺激された、間葉系幹細胞を用いる複数のコラーゲン層からの半月板状の遺伝子発現を示す。
【図２０Ａ】図２０Ａは、整列されたＥＳコラーゲン繊維の形態学的構造を示す。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、ランダムなＥＳコラーゲン繊維の形態学的構造を示す。
【図２０Ｃ】図２０Ｃは、ランダムに整列されたエレクトロスピニング処理したコラーゲン足場上に播種された半月板の無血管および血管の細胞を示す。
【図２０Ｄ】図２０Ｄは、整列されたコラーゲン足場上の（Ｄ）細胞の上に播種された半月板の無血管および血管の細胞を示す。
【図２１Ａ】図２１Ａは、グルタルアルデヒドを用いて、乾燥された及び架橋結合された、ランダムなＥＳコラーゲン繊維、整列されたＥＳコラーゲン繊維、および整列された繊維足場の方向に垂直なＥＳコラーゲン繊維のの平均縦弾性係数を示す。
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、１週間または３週間後に細胞を用いて又は用いずに、乾燥された及び架橋結合された、ランダムなＥＳコラーゲン繊維、整列されたＥＳコラーゲン繊維、および整列された繊維足場の方向に垂直なＥＳコラーゲン繊維のの平均縦弾性係数を示す。
【図２１Ｃ】図２１Ｃは、乾燥された及び架橋結合された、ランダムなＥＳコラーゲン繊維、整列されたＥＳコラーゲン繊維、および整列された繊維足場の方向に垂直なＥＳコラーゲン繊維の平均縦弾性係数を示す。それぞれのサンプルに対する極限応力が示される。
【図２１Ｄ】図２１Ｄは、乾燥された及び架橋結合された、ランダムなＥＳコラーゲン繊維、整列されたＥＳコラーゲン繊維、および整列された繊維足場の方向に垂直なＥＳコラーゲン繊維の平均縦弾性係数を示す。それぞれのサンプルに対する極限応力が示される。
【図２２Ａ】図２２Ａは、新しく合成した整列されたＥＳの純粋なコラーゲンおよび混合したコラーゲンおよびポリ乳酸層におけるＩ型コラーゲンの量を示す。
【図２２Ｂ】図２２Ｂは、ランダムな又は整列されたコラーゲン足場上で培養された血管または無血管の領域に由来する細胞の相対的な遺伝子発現を示す。
【図２２Ｃ】図２２Ｃは、ランダムな又は整列されたコラーゲン足場上で培養された血管または無血管の領域に由来する細胞の相対的な遺伝子発現を示す。
【図２２Ｄ】図２２Ｄは、ランダムな又は整列されたコラーゲン足場上で培養された血管または無血管の領域に由来する細胞の相対的な遺伝子発現を示す。
【図２２Ｅ】図２２Ｅは、ランダムな又は整列されたコラーゲン足場上で培養された血管または無血管の領域に由来する細胞の相対的な遺伝子発現を示す。
【図２２Ｆ】図２２Ｆは、ランダムな又は整列されたコラーゲン足場上で培養された血管または無血管の領域に由来する細胞の相対的な遺伝子発現を示す。
【図２３Ａ】図２３Ａは、半月板断裂をシミュレートするために、ウシの膝から採取され、無血管の半月板組織内の外科的切断で切断された、新鮮な半月板を示す。
【図２３Ｂ】図２３Ｂは、ウシの半月板の外科的に生成された縦断裂に注入された細胞を播種したコラーゲン足場の概略図を示す。
【図２３Ｃ】図２３Ｃは、制御修復されていない（ｃｏｎｔｒｏｌ ｕｎｒｅｐａｉｒｅｄ）断裂に関する注入された足場と天然組織との間の断裂内の組織学的分析を示す。矢印は、治癒していない断裂を指す。
【図２３Ｄ】図２３Ｄは、細胞なしで足場を用いて修復された断裂に関する注入された足場と天然組織との間の断裂内の組織学的分析を示す。矢印は、治癒していない断裂を指す。
【図２３Ｅ】図２３Ｅは、足場および細胞を用いて修復された垂直断裂に関する注入された足場と天然組織との間の断裂内の組織学的分析を示す。矢印は、治癒した断裂を指す。
【図２３Ｆ】図２３Ｆは、足場および細胞を用いて修復された水平断裂に関する注入された足場と天然組織との間の断裂内の組織学的分析を示す。矢印は、治癒した断裂を指す。
【図２４】図２４は、ヒドロゲルにおいてヒト半月板細胞を用いて複数のコラーゲン層を生成する概略的な例示的プロセスを示し、該ヒドロゲルは、ＩＩ型コラーゲン、コンドロイチン硫酸塩およびヒアルロナンを含有し、細胞は、各層に対して５０マイクロリットル中で１ｍｌ当たり１００万個の細胞の密度で播種される。結果として生じる多層構成物は、組織中で周辺のコラーゲン繊維束を模倣するだろう。
【図２５Ａ】図２５Ａは、組織中で周辺のコラーゲン繊維束を模倣する、低倍率での１４日後の多層構成物中に播種された、半月板細胞のライブ（明領域または白色領域）染色を示す。
【図２５Ｂ】図２５Ｂは、多重層の中で接種された汚れることは、組織中で周辺のコラーゲン繊維束を模倣する、より高い倍率での１４日後の多層構成物中に播種された、半月板細胞のライブ（明領域または白色領域）染色を示す。
【図２６Ａ】図２６Ａは、１０Ｘ倍率での２週間培養した多層構成物のサフラニンＯファストグリーン染色を用いる半月板状の線維組織の形成を示す。
【図２６Ｂ】図２６Ｂは、４０Ｘ倍率での２週間培養した多層構成物のサフラニンＯファストグリーン染色を用いる半月板状の線維組織の形成を示す。
【図２６Ｃ】図２６Ｃは、１０Ｘ倍率での２週間培養した多層構成物のＨ＆Ｅ染色を用いる半月板状の線維組織の形成を示す。
【図２６Ｄ】図２６Ｄは、４０Ｘ倍率での２週間培養した多層構成物のＨ＆Ｅ染色を用いる半月板状の線維組織の形成を示す。
【図２７Ａ】図２７Ａは、１０Ｘ倍率でのＩ型コラーゲンの免疫染色を示す。
【図２７Ｂ】図２７Ｂは、４０Ｘ倍率でのＩ型コラーゲンの免疫染色を示す。
【図２７Ｃ】図２７Ｃは、２週間後の多層構成物におけるＩ型コラーゲンの免疫染色を示す。
【図２８Ａ】図２８Ａは、図２４に示される概略図に従って生成された、培養組織の半月板状の形状の盤の半分の拡大平面図を示す（ｍｍスケール）。
【図２８Ｂ】図２８Ｂは、図２４に示される概略図に従って生成された、培養組織の半月板状の形状の盤の半分の拡大側面図を示す（ｍｍスケール）。
【図２９Ａ】図２９Ａは、コラーゲンシェルおよびポリ乳酸コアを有するエレクトロスピニング処理したファイバーを生成するために同軸にエレクトロスピニング処理するための概略図を示す。
【図２９Ｂ】図２９Ｂは、典型的なドラムコレクターを示す。
【図３０Ａ】図３０Ａは、ファイバーを溶解する洗浄前に同軸にスピニング処理したコラーゲンの組織形態を示す。
【図３０Ｂ】図３０Ｂは、ファイバーを溶解する洗浄後に同軸にスピニング処理したコラーゲンの組織形態を示す。
【図３０Ｃ】図３０Ｃは、ファイバーを溶解しない洗浄前に０．２５％のグルタルアルデヒドで架橋結合された同軸にスピニング処理したコラーゲンを示す。
【図３０Ｄ】図３０Ｄは、ファイバーを溶解しない洗浄後に０．２５％のグルタルアルデヒドで架橋結合された同軸にスピニング処理したコラーゲンを示す。
【図３１】図３１は、架橋結合された及びされなかった、エレクトロスピニング処理した純粋なコラーゲン繊維と比較した、同軸にスピニング処理したＰＬＡコア、コラーゲン−シェルファイバーの機械的性質を示す。
【図３２】Ａは、播種の１週間後の、架橋結合されていない同軸にスピニング処理したコラーゲン−シェル／ＰＬＡ−コア足場上で接種された、カルセインＡＭ染色された（生きた）半月板の無血管細胞の共焦点顕微鏡画像を示す。Ｂは、播種の２週間後の、架橋結合されていない同軸にスピニング処理したコラーゲン−シェル／ＰＬＡ−コア足場上で接種された、カルセインＡＭ染色された（生きた）半月板の無血管細胞の共焦点顕微鏡画像を示す。Ｃは、播種の１週間後の、架橋結合された同軸にスピニング処理したコラーゲン−シェル／ＰＬＡ−コア足場上で接種された、カルセインＡＭ染色された（生きた）半月板の無血管細胞の共焦点顕微鏡画像を示す。Ｄは、播種の２週間後の、架橋結合された同軸にスピニング処理したコラーゲン−シェル／ＰＬＡ−コア足場上で接種された、カルセインＡＭ染色された（生きた）半月板の無血管細胞の共焦点顕微鏡画像を示す。
【図３３Ａ】図３３Ａは、１週間後の、細胞を積んだ（ｃｅｌｌ−ｌａｄｅｎ）同軸にスピニング処理した足場に対する細胞のない同軸にスピニング処理した足場の機械的性質を示す。
【図３３Ｂ】図３３Ｂは、１週間後の、細胞を積んだ架橋結合された純粋なコラーゲン足場に対する細胞のない架橋結合された純粋なコラーゲン足場の機械的性質を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
多くの組織は、再生または修復する能力を有しておらず、そのため、組織への損傷または傷害は、回復不能である。乏しい治癒能力に加えて、軟骨などの組織への損傷も、結果として著しい痛み及び不能につながる。手術においてさえ、機能の回復は、しばしば制限される。組織を、改変された細胞または作り上げられた組織インプラントに取り替えることの関心が高まっている。しかしながら、組織インプラントを作り上げて実装することには、幾つかの困難がある。理想的には、組織インプラントは、レシピエントの免疫系によって拒絶される有毒成分または異物を含有していない。さらに、組織インプラントは、レシピエントの内因性細胞によってリモデリングされ、分解され、血管新生化され、および浸潤される能力を有するだろう。本明細書に開示される方法、組成物、およびシステムは、組織修復および組織置換に関連するこれらの及び他の問題に対処する。
【００１９】
ポリマー足場組成物を生成する方法
本明細書には、幾つかの実施形態において、ポリマー足場組成物を生成する方法が開示され、該方法は、ｉ）ポリマーファイバーを形成するためにコレクター上でポリマー溶液をエレクトロスピニング処理する工程；およびｉｉ）ポリマー足場を生成するためにポリマーファイバーを架橋結合する工程、を含む。幾つかの実施形態では、エレクトロスピニング処理は、エミッター出口を含むエミッターにポリマー溶液を充填すること、およびポリマーファイバーを形成するためにエミッター出口からポリマー溶液を放出することを含む。
【００２０】
エレクトロスピニング
幾つかの実施形態では、エレクトロスピニング処理は、ポリマー溶液に電圧をかけることを含む。幾つかの実施形態では、ポリマー溶液に電圧をかけることによって、結果として荷電されたポリマー溶液がもたらされる。幾つかの実施形態では、該方法は、コレクターに接地電圧をかける工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、コレクターに接地電圧をかける工程によって、荷電されたポリマー溶液をコレクターに引きつける電圧差がもたらされる。幾つかの実施形態では、荷電されたポリマー溶液をコレクターに引きつけることによって、結果として、ポリマー溶液が線または糸の形状でコレクターと接触するように、コレクターへのポリマー溶液の流動または噴射がもたらされる。幾つかの実施形態では、ポリマー溶液は、ポリマーファイバーを生成するために重合する。幾つかの実施形態では、ポリマー溶液は、ポリマーファイバーを生成するために、線または糸の形状で重合する。幾つかの実施形態では、ポリマー溶液は、ポリマーファイバーがコレクターと接触する前に、ポリマーファイバーを形成するように重合する。幾つかの実施形態では、ポリマー溶液は、ポリマー溶液がコレクターと接触する前に、ポリマーファイバーの少なくとも一部を形成するように部分的に重合する。幾つかの実施形態では、ポリマー溶液は、ポリマー溶液がコレクターと接触した後に、ポリマーファイバーの少なくとも一部を形成するように重合する。
【００２１】
幾つかの実施形態では、エレクトロスピニング処理は、ポリマー溶液に、約１ｋＶ、約２ｋＶ、約３ｋＶ、約４ｋＶ、約５ｋＶ、約６ｋＶ、約７ｋＶ、約８ｋＶ、約９ｋＶ、約１０ｋＶ、約１１ｋＶ、約１２ｋＶ、約１３ｋＶ、約１４ｋＶ、約１５ｋＶ、約１６ｋＶ、約１７ｋＶ、約１８ｋＶ、約１９ｋＶ、約２０ｋＶ、約２１ｋＶ、約２２ｋＶ、約２３ｋＶ、約２４ｋＶ、約２５ｋＶ、約２６ｋＶ、約２７ｋＶ、約２８ｋＶ、約２９ｋＶ、約３０ｋＶ、約３５ｋＶ、約４０ｋＶ、約４５ｋＶ、または約５０ｋＶの電圧をかけることを含む。幾つかの実施形態では、エレクトロスピニング処理は、ポリマー溶液に約１５ｋＶ乃至約２０ｋＶの電圧をかけることを含む。幾つかの実施形態では、エレクトロスピニング処理は、ポリマー溶液に約１７ｋＶの電圧をかけることを含む。幾つかの実施形態では、該方法は、第２のポリマー溶液に比べて、異なる電圧を第１ポリマー溶液にかける工程をさらに含む。
【００２２】
幾つかの実施形態では、コレクターに接地電圧をかける工程は、コレクターに負電圧をかけることを含む。幾つかの実施形態では、接地電圧は、ポリマー溶液にかけられた電圧と同じである絶対値を有する。幾つかの実施形態では、接地電圧は、ポリマー溶液にかけられた電圧とは異なる絶対値を有する。幾つかの実施形態では、接地電圧は、ポリマー溶液にかけられた電圧未満である絶対値を有する。幾つかの実施形態では、接地電圧は、ポリマー溶液にかけられた電圧より大きい絶対値を有する。幾つかの実施形態では、接地電圧は、約−１ｋＶ、約−２ｋＶ、約−３ｋＶ、約−４ｋＶ、約−５ｋＶ、約−６ｋＶ、約−７ｋＶ、約−８ｋＶ、約−９ｋＶ、約−１０ｋＶ、約−１１ｋＶ、約−１２ｋＶ、約−１３ｋＶ、約−１４ｋＶ、約−１５ｋＶ、約−１６ｋＶ、約−１７ｋＶ、約−１８ｋＶ、約−１９ｋＶ、または約−２０ｋＶである。幾つかの実施形態では、接地電圧は、約−２５ｋＶ、約−３０ｋＶ、約−４０ｋＶ、または約−５０ｋＶである。幾つかの実施形態では、エレクトロスピニング処理は、コレクターに−１ｋＶの電圧をかけることを含む。
【００２３】
幾つかの実施形態では、該方法は、ポリマー溶液に２０ｋＶをかける工程を含み、−１ｋＶがコレクターにかけられる。幾つかの実施形態では、電圧差は、約１ｋＶ、約２ｋＶ、約３ｋＶ、約４ｋＶ、約５ｋＶ、約６ｋＶ、約７ｋＶ、約８ｋＶ、約９ｋＶ、約１０ｋＶ、約１１ｋＶ、約１２ｋＶ、約１３ｋＶ、約１４ｋＶ、約１５ｋＶ、約１６ｋＶ、約１７ｋＶ、約１８ｋＶ、約１９ｋＶ、約２０ｋＶ、約２１ｋＶ、約２２ｋＶ、約２３ｋＶ、約２４ｋＶ、約２５ｋＶ、約２６ｋＶ、約２７ｋＶ、約２８ｋＶ、約２９ｋＶ、約３０ｋＶ、約３５ｋＶ、約４０ｋＶ、約４５ｋＶ、約５０ｋＶ、約５５ｋＶ、約６０ｋＶ、約６５ｋＶ、約７０ｋＶ、約７５ｋＶ、約８０ｋＶ、約８５ｋＶ、約９０ｋＶ、約９５ｋＶ、または約１００ｋＶである。
【００２４】
幾つかの実施形態では、エレクトロスピニング処理は、ポリマー溶液を、シリンジポンプを備えるコレクターへと及び／又はエミッターに通してコレクター上へと供給することを含む。幾つかの実施形態では、シリンジポンプは、約０．０１ｍＬ／ｈ、約０．０２ｍＬ／ｈ、約０．０３ｍＬ／ｈ、約０．０４ｍＬ／ｈ、約０．０５ｍＬ／ｈ、約０．０６ｍＬ／ｈ、約０．０７ｍＬ／ｈ、約０．０８ｍＬ／ｈ、約０．０９ｍＬ／ｈ、約０．１ｍＬ／ｈ、約０．２ｍＬ／ｈ、約０．３ｍＬ／ｈ、約０．４ｍＬ／ｈ、約０．５ｍＬ／ｈ、約０．６ｍＬ／ｈ、約０．７ｍＬ／ｈ、約０．８ｍＬ／ｈ、約０．９ｍＬ／ｈ、約１．０ｍＬ／ｈ、約１．１ｍＬ／ｈ、約１．２ｍＬ／ｈ、約１．３ｍＬ／ｈ、約１．４ｍＬ／ｈ、約１．５ｍＬ／ｈ、約１．６ｍＬ／ｈ、約１．７ｍＬ／ｈ、約１．８ｍＬ／ｈ、約１．９ｍＬ／ｈ、約２．０ｍＬ／ｈ、ｈ約２．１ｍＬ／ｈ、約２．２ｍＬ／ｈ、約２．３ｍＬ／ｈ、約２．４ｍＬ／ｈ、約２．５ｍＬ／ｈ、約２．６ｍＬ／ｈ、約２．７ｍＬ／ｈ、約２．８ｍＬ／ｈ、約２．９ｍＬ／ｈ、約３．０ｍＬ／ｈ、約４．０ｍＬ／ｈ、約５．０ｍＬ／ｈ、約６．０ｍＬ／ｈ、約８．０ｍＬ／ｈ、または約１０．０ｍＬ／ｈの供給率で作動する。幾つかの実施形態では、シリンジポンプは、約２ｍＬ／ｈの供給率で作動する。幾つかの実施形態では、シリンジポンプは、約１ｍＬ／ｈの供給率で作動する。
【００２５】
幾つかの実施形態では、該方法は、エミッター出口をコレクターとはある距離を置いて位置決めする工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、エミッター出口を距離を置いて位置決めする工程によって、ポリマー足場組成物のサイズを調整する。幾つかの実施形態では、該方法は、エミッター出口をコレクターから遠くにの位置決めすることによって生成されたポリマー足場組成物に比べて、小さなポリマー足場組成物を生成するために、エミッター出口をコレクターの近くに位置決めする工程を含む。幾つかの実施形態では、該方法は、エミッター出口を、コレクターから約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、または約３０ｃｍに位置決めする工程を含む。幾つかの実施形態では、該方法は、エミッター出口をコレクターから１６ｃｍに位置決めする工程を含む。幾つかの実施形態では、該方法は、エミッター出口をコレクターから１２ｃｍに位置決めする工程を含む。幾つかの実施形態では、エミッターは、固定されている。幾つかの実施形態では、該方法は、エミッターを移動させる工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、エミッターを移動させる工程およびエレクトロスピニング処理は、同時に生じる。幾つかの実施形態では、エミッターを移動させる工程およびエレクトロスピニング処理は、連続して生じる。
【００２６】
複数のポリマー溶液をエレクトロスピニング処理する工程
幾つかの実施形態では、該方法は、コレクター上にポリマーファイバーを形成するために複数のポリマー溶液をエレクトロスピニング処理する工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、該方法は、複数のエミッターに複数のポリマー溶液を充填する工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、該方法は、複数のポリマー溶液の各ポリマー溶液をコレクター上へと同時にエレクトロスピニング処理する工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、該方法は、複数のポリマー溶液の各ポリマー溶液をコレクター上へと連続してエレクトロスピニング処理する工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、該方法は、複数のポリマー溶液をエレクトロスピニング処理する工程をさらに含み、ここで、複数のポリマー溶液は、異なる特性を有する。幾つかの実施形態では、限定しない例によって、異なる特性は、ポリマー同一性、ポリマー濃度、タンパク質含有量、化学的含有量、塩分含有量、塩濃度および粘度から選択される。
【００２７】
幾つかの実施形態では、該方法は、同軸にエレクトロスピニング処理する工程を含む。幾つかの実施形態では、同軸のスピニング処理は、第１ポリマー溶液および第２のポリマー溶液をエレクトロスピニング処理することを含む。幾つかの実施形態では、同軸のスピニング処理は、第１エミッターに第１ポリマー溶液を充填すること及び第２エミッターに第２ポリマー溶液を充填することを含む。幾つかの実施形態では、第１エミッターおよび第２エミッターは、２つの同心チャネル（例えば、外部チャネル内の内部チャネル）を有する中空ニードル／シリンダに接続される。幾つかの実施形態では、第１ポリマー溶液は、ニードルの内部チャネルを通って放出され、第２ポリマー溶液は、ニードルの外部チャネルを通って放出される。幾つかの実施形態では、ポリマーファイバーを生成するために、第２ポリマー溶液および第１ポリマー溶液がニードルの先端で放出されると、第２ポリマー溶液は、第１ポリマー溶液を囲む／カプセル化する。幾つかの実施形態では、ポリマーファイバーは、コアを含み、ここで、コアは、第１ポリマー溶液の第１のポリマーおよびシェルを含み、該シェルは、第２ポリマー溶液の第２ポリマーを含む。幾つかの実施形態では、同軸のエレクトロスピニング処理は、単一のポリマー溶液のエレクトロスピニング処理と比較して、ファイバーおよび足場の機械的性質を向上させる。幾つかの実施形態では、コアではなくシェルが、外部環境（例えば組織）に露出される。幾つかの実施形態では、コアは、ポリ乳酸を含む。幾つかの実施形態では、シェルは、コラーゲンを含む。幾つかの実施形態では、シェルは、コラーゲンから本質的に成る。幾つかの実施形態では、第２ポリマーは、第１ポリマーよりも、宿主組織に注入されたときに宿主免疫反応をそれほど引き起こさない。幾つかの実施形態では、コアは、第２ポリマーを含むだけのポリマーファイバーまたはエレクトロスピニング処理したポリマー足場に比べて、ポリマーファイバー及び／又はエレクトロスピニング処理したポリマー足場の強度を増大させる。前述の方法の典型的な実施形態は、本出願の実施例９および図２９−３３に実証される。
【００２８】
幾つかの実施形態では、該方法は、第１の複数のポリマーファイバーをコレクター上でエレクトロスピニング処理するために第１ポリマー溶液に第１電圧をかける工程および第２の複数のポリマーファイバーをコレクター上でエレクトロスピニング処理するために第２ポリマー溶液に第２電圧をかける工程を含む。幾つかの実施形態では、第１の複数のポリマーファイバーのエレクトロスピニング処理および第２の複数のポリマーファイバーのエレクトロスピニング処理は、同時に生じる。幾つかの実施形態では、第１の複数のポリマーファイバーのエレクトロスピニング処理および第２の複数のポリマーファイバーのエレクトロスピニング処理は、連続して生じる。幾つかの実施形態では、第１の複数のポリマーファイバーのエレクトロスピニング処理および第２の複数のポリマーファイバーのエレクトロスピニング処理は、連続して生じ、その結果、エレクトロスピニング処理された足場が生成され、該エレクトロスピニング処理された足場は、第１の複数のポリマーファイバーおよび第２の複数のポリマーファイバーを含む。幾つかの実施形態では、第１の複数のポリマーファイバーは、第２の複数のポリマーファイバーによってカプセル化される。幾つかの実施形態では、第２の複数のポリマーファイバーは、外部環境（例えば組織）に露出される複数のポリマーファイバーである。幾つかの実施形態では、第１の複数のポリマーファイバーは、ポリ乳酸を含む。幾つかの実施形態では、第２の複数のポリマーファイバーは、コラーゲンを含む。幾つかの実施形態では、第２の複数のポリマーファイバーは、コラーゲンから本質的に成る。幾つかの実施形態では、エレクトロスピニング処理した足場は、宿主組織に注入されたときに宿主免疫反応を引き起こしそうにない外部コラーゲン繊維を含む。幾つかの実施形態では、エレクトロスピニング処理した足場は、コラーゲン繊維を含むだけのエレクトロスピニング処理した足場に比べて、エレクトロスピニング処理した足場の強度を増大させる内部ポリ乳酸繊維を含む。
【００２９】
幾つかの実施形態では、該方法は、複数のポリマー溶液の各ポリマー溶液に同じ電圧をかける工程を含む。幾つかの実施形態では、複数のポリマー溶液は、少なくとも第１ポリマー溶液および第２ポリマー溶液を含む。幾つかの実施形態では、該方法は、第１ポリマー溶液に第１電圧をかける工程および第２ポリマー溶液に第２電圧をかける工程を含み、ここで、第１電圧および第２電圧は同じである。幾つかの実施形態では、該方法は、第１ポリマー溶液に第１電圧をかける工程および第２ポリマー溶液に第２電圧をかける工程を含み、ここで、第１電圧および第２電圧は異なる。
【００３０】
ランダムに配向されたポリマーファイバーをエレクトロスピニング処理する工程
幾つかの実施形態で本明細書に開示されるように、エレクトロスピニング処理する工程は、ポリマー溶液が鞭または殻ざおで打つような方法でエミッターから出るようにポリマー溶液をエミッター出口から放出すること、およびコレクター上にランダムに配向されたポリマーファイバーを形成するためにコレクター上に載せることを含む。幾つかの実施形態では、コレクターは、固定されたコレクターである。幾つかの実施形態では、コレクターは、固定されたプレートコレクターである。幾つかの実施形態では、固定されたコレクターは、接地コレクターである。幾つかの実施形態では、該方法は、コレクターを移動させる工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、エレクトロスピニング処理する工程およびコレクターを移動させる工程は、同時に生じる。幾つかの実施形態では、エレクトロスピニング処理する工程およびコレクターを移動させる工程は、連続して生じる。
【００３１】
整列したポリマーファイバーをエレクトロスピニング処理する工程
幾つかの実施形態では、該方法は、ポリマーファイバーを形成するためにポリマー溶液をコレクター上でエレクトロスピニング処理する工程を含み、ここで、ポリマーファイバーは整列される。幾つかの実施形態では、該方法は、回転コレクター上へとポリマー溶液をエレクトロスピニング処理することによってポリマーファイバーを整列させる工程を含む。幾つかの実施形態では、回転コレクターは、接地コレクターである。幾つかの実施形態では、該方法は、約１００ＲＰＭ、約２００ＲＰＭ、約３００ＲＰＭ、約４００ＲＰＭ、約５００ＲＰＭ、約６００ＲＰＭ、約８００ＲＰＭ、約９００ＲＰＭ、約１０００ＲＰＭ、約１１００ＲＰＭ、約１２００ＲＰＭ、約１４００ＲＰＭ、約１６００ＲＰＭ、約１８００ＲＰＭ、約２０００ＲＰＭ、約２２００ＲＰＭ、約２２５０ＲＰＭ、約２３００ＲＰＭ、約２３５０ＲＰＭ、約２４００ＲＰＭ、約２４５０ＲＰＭ、約２５００ＲＰＭ、約２５５０ＲＰＭ、約２６００ＲＰＭ、約２８００ＲＰＭ、約３０００ＲＰＭ、約３２００ＲＰＭ、約３４００ＲＰＭ、約３６００ＲＰＭ、約３８００ＲＰＭ、約４０００ＲＰＭ、約４２００ＲＰＭ、約４４００ＲＰＭ、約４６００ＲＰＭ、約４８００ＲＰＭ、約５０００ＲＰＭ、約５２００ＲＰＭ、約５４００ＲＰＭ、約５６００ＲＰＭ、約５８００ＲＰＭ、または約６０００ＲＰＭ、で回転コレクターを回転させる工程を含む。幾つかの実施形態では、該方法は、約２４００ＲＰＭで回転コレクターを回転させる工程を含む。幾つかの実施形態では、該方法は、定速で回転コレクターを回転させる工程を含む。幾つかの実施形態では、該方法は、交互の速度（ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ ｓｐｅｅｄ）で回転コレクターを回転させる工程を含む。幾つかの実施形態では、該方法は、可変速度で回転コレクターを回転させる工程を含む。幾つかの実施形態では、該方法は、回転コレクターを回転させる工程、回転を止める工程、および回転を再開させる工程を含む。幾つかの実施形態では、該方法は、整列（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）の程度を制御するために回転コレクターの回転速度を制御する工程を含む。幾つかの実施形態では、整列の程度を制御することによって、ポリマーファイバーの機械的性質を調整する。
【００３２】
幾つかの実施形態では、該方法は、回転コレクターを回転させる工程、回転を止める工程、および回転を再開させる工程を含み、それによって、コレクター上にポリマーファイバーを形成し、ここで、ポリマーファイバーは、ランダムに配向されたポリマーファイバーおよび整列されたポリマーファイバーを含む。
【００３３】
コレクターの準備
幾つかの実施形態では、該方法は、材料または製剤でコレクターを覆う工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、覆う工程は、エレクトロスピニング処理の前に生じる。幾つかの実施形態では、覆う工程は、コーティング、スプレー、ダスティング（ｄｕｓｔｉｎｇ）、散布、洗浄、研磨、および被覆（ｗｒａｐｐｉｎｇ）から選択される。幾つかの実施形態では、材料または製剤は、液体、油、エマルジョン、ゲル、紙、ポリマー、樹脂、箔、およびワックスから選択される。幾つかの実施形態では、該方法は、アルミ箔でコレクターを覆う工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、該方法は、非粘着性薬剤でコレクターを覆う工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、コレクターを非粘着性薬剤で覆う工程によって、ポリマー足場組成物がコレクターにくっつくことを防ぐ。幾つかの実施形態では、コレクターを非粘着性薬剤で覆う工程によって、ポリマー足場組成物が、容易にコレクターから取り除かれることが可能となる。幾つかの実施形態では、コレクターを非粘着性薬剤で覆う工程によって、ポリマー足場組成物が、損傷されることなくコレクターから取り除かれることが可能となる。幾つかの実施形態では、覆う工程は、コレクターで非粘着性薬剤の膜を生成するために、非粘着性薬剤でコレクターをスプレーすることを含む。幾つかの実施形態では、非粘着性薬剤は、ポリマーを含む。幾つかの実施形態では、ポリマーは、アクリルポリマーを含む。幾つかの実施形態では、ポリマーは、フルオロポリマーを含む。幾つかの実施形態では、ポリマーは、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）を含む。
【００３４】
多層構成物を生成する方法
幾つかの実施形態では、該方法は、複数のポリマー足場組成物を生成する工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、該方法は、１つ以上のコレクターで複数のポリマー足場組成物を生成する工程を含む。幾つかの実施形態では、該方法は、複数のポリマー足場組成物を同時に生成する工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、該方法は、複数のポリマー足場組成物を連続して生成する工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、該方法は、多層構成物を形成するために複数のポリマー足場組成物を組み合わせる工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、該方法は、多層構成物を形成するために、複数のポリマー足場組成物を別々に生成し、コレクターでない表面上の複数のポリマー足場組成物を組み合わせる工程を含む。幾つかの実施形態では、多層構成物を形成するために複数のポリマー足場組成物を組み合わせる工程は、１つのコレクター上で連続して複数のポリマー足場組成物を生成することを含む。幾つかの実施形態では、該方法は、多層構成物を形成するために、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のポリマー足場組成物を組み合わせる工程を含む。幾つかの実施形態では、該方法は、多層構成物を形成するために、少なくとも３つのポリマー足場組成物を組み合わせる工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、該方法は、多層構成物を形成するために、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、または約１００のポリマー足場組成物を組み合わせる工程を含む。幾つかの実施形態では、該方法は、多層構成物を形成するために、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、または約１０００のポリマー足場組成物を組み合わせる工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、該方法は、多層構成物を形成するために、約１０，０００、約１００，０００、または約１，０００，０００ポリマー足場組成物を組み合わせる工程をさらに含む。
【００３５】
細胞を播種したポリマー足場組成物および細胞を播種した多層構成物を生成する方法
本明細書には、幾つかの実施形態において、細胞を播種したポリマー足場組成物を生成する方法が開示され、該方法は、ｉ）ポリマーファイバーを形成するためにコレクター上でポリマー溶液をエレクトロスピニング処理する工程；ｉｉ）ポリマーファイバーを架橋結合する工程；およびｉｉｉ）ポリマーファイバーを細胞と接触させる工程、を含む。
【００３６】
本明細書には、幾つかの実施形態において、細胞を播種したポリマー足場組成物を生成する方法が開示され、該方法は、ｉ）ポリマーファイバーを形成するためにコレクター上でポリマー溶液をエレクトロスピニング処理する工程；ｉｉ）ポリマー足場組成物を生成するためにポリマーファイバーを架橋結合する工程；およびｉｉｉ）細胞を播種したポリマー足場組成物を形成するためにポリマー足場組成物を細胞と接触させる工程、を含む。
【００３７】
幾つかの実施形態では、該方法は、ポリマーファイバーを複数の細胞と接触させる工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、該方法は、ポリマー足場組成物を複数の細胞と接触させる工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、該方法は、多層構成物を生成するために複数のポリマー足場組成物をエレクトロスピニング処理する工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、該方法は、細胞を播種した多層構成物を生成するために多層構成物を細胞と接触させる工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、該方法は、多層構成物を生成するために細胞を播種した多層構成物を複数の細胞と接触させる工程をさらに含む。別段の定めがない限り、幾つかの実施形態では、用語、細胞を播種したポリマー足場組成物および細胞を播種した多層構成物は、交換可能に使用される。
【００３８】
幾つかの実施形態では、ポリマーファイバーを細胞または複数の細胞と接触させる工程は、ポリマー溶液がエレクトロスピニング処理されると、そのポリマー溶液へと複数の細胞をエレクトロスプレー処理することを含む（例えば、ポリマー溶液のエレクトロスピニング処理および複数の細胞のエレクトロスプレー処理は、同時に生じる）。幾つかの実施形態では、ポリマー溶液は、第１出口を備えるポリマー溶液エミッターに充填され、複数の細胞は、第２出口を備える細胞エミッターに充填される。幾つかの実施形態では、第１出口および第２出口は、ポリマー溶液が、放出されたときに複数の細胞と接触するように接近して位置付けられる。幾つかの実施形態では、第１出口および第２出口はポリマー溶液が、放出されたときに複数の細胞と接触するように接近して配向される。幾つかの実施形態では、ポリマーファイバーを細胞または複数の細胞と接触させる工程は、コレクター上へと複数の細胞をエレクトロスプレー処理すること、およびコレクター上へと同時にポリマー溶液をエレクトロスピニング処理することを含む。
【００３９】
幾つかの実施形態では、ポリマー足場組成物を細胞または複数の細胞と接触させる工程は、複数の細胞をエレクトロスプレー処理することを含む。幾つかの実施形態では、ポリマー足場組成物を細胞または複数の細胞と接触させる工程は、ポリマー足場組成物上へと複数の細胞をエレクトロスプレー処理することを含む。幾つかの実施形態では、ポリマー足場組成物を細胞または複数の細胞と接触させる工程は、コレクター上へと複数の細胞をエレクトロスプレー処理することを含む。
【００４０】
幾つかの実施形態では、複数の細胞をエレクトロスプレー処理することは、複数の細胞に電圧をかけることを含む。幾つかの実施形態では、エレクトロスプレー処理は、エミッターに複数の細胞を充填すること、および複数の細胞に電圧をかけることを含む。幾つかの実施形態では、該方法は、ポリマー足場組成物上へと複数の細胞をエレクトロスプレー処理する工程を含む。幾つかの実施形態では、該方法は、ポリマー足場組成への複数の細胞をエレクトロスプレー処理する工程を含む。
【００４１】
幾つかの実施形態では、エレクトロスプレー処理は、複数の細胞に、約１ｋＶ、約２ｋＶ、約３ｋＶ、約４ｋＶ、約５ｋＶ、約６ｋＶ、約７ｋＶ、約８ｋＶ、約９ｋＶ、約１０ｋＶ、約１１ｋＶ、約１２ｋＶ、約１３ｋＶ、約１４ｋＶ、約１５ｋＶ、約１６ｋＶ、約１７ｋＶ、約１８ｋＶ、約１９ｋＶ、約２０ｋＶ、約２１ｋＶ、約２２ｋＶ、約２３ｋＶ、約２４ｋＶ、約２５ｋＶ、約２６ｋＶ、約２７ｋＶ、約２８ｋＶ、約２９ｋＶ、約３０ｋＶ、約３５ｋＶ、約４０ｋＶ、約４５ｋＶまたは約５０ｋＶの電圧をかけることを含む。幾つかの実施形態では、エレクトロスプレー処理は、複数の細胞に約１５ｋＶ乃至約２０ｋＶの電圧をかけることを含む。幾つかの実施形態では、エレクトロスプレー処理は、複数の細胞に約１７ｋＶの電圧をかけることを含む。
【００４２】
幾つかの実施形態では、該方法は、エレクトロスピニング処理および架橋結合を同時に行う工程を含む。幾つかの実施形態では、該方法は、複数の細胞のエレクトロスピニング処理およびエレクトロスプレー処理を同時に行う工程を含む。幾つかの実施形態では、該方法は、エレクトロスピニング処理、エレクトロスプレー処理、および架橋結合を同時に行う工程を含む。幾つかの実施形態では、該方法は、エレクトロスピニング処理および架橋結合を連続して行う工程を含む。幾つかの実施形態では、該方法は、複数の細胞のエレクトロスピニング処理およびエレクトロスプレー処理を連続して行う工程を含む。幾つかの実施形態では、該方法は、エレクトロスピニング処理、エレクトロスプレー処理、および架橋結合を連続して行う工程を含む。幾つかの実施形態では、該方法は、架橋結合前にエレクトロスピニング処理およびエレクトロスプレー処理を同時に行う工程を含む。幾つかの実施形態では、該方法は、エレクトロスプレー処理前にエレクトロスピニング処理および架橋結合を同時に行う工程を含む。
【００４３】
幾つかの実施形態では、エレクトロスピニング処理およびエレクトロスプレー処理を同時に行う工程は、結果として、ポリマーファイバーおよび複数の細胞を含む三次元構成物をもたらす。幾つかの実施形態では、エレクトロスピニング処理およびエレクトロスプレー処理を同時に行う工程によって、ポリマー足場組成物全体にわたって複数の細胞を分配する。幾つかの実施形態では、エレクトロスピニング処理およびエレクトロスプレー処理を同時に行う工程によって、ポリマー足場組成物の一部において複数の細胞を分布させる。幾つかの実施形態では、同時にエレクトロスピニング処理しエレクトロスプレー処理することは、それについてポリマー足場組成物または部分中の複数の細胞を分配する。幾つかの実施形態では、該方法は、ポリマー足場組成物上への複数の細胞のエレクトロスプレー処理前に、コレクターからポリマー足場組成物を取り除く工程をさらに含む。
【００４４】
幾つかの実施形態では、細胞または複数の細胞は、生体模倣ゲル中で懸濁される。幾つかの実施形態では、該方法は、生体模倣ゲル中で懸濁された複数の細胞をエレクトロスプレー処理する工程を含む。幾つかの実施形態では、ポリマー足場組成物を細胞または複数の細胞と接触させる工程は、ポリマー足場組成物を生体模倣ゲル中の複数の細胞と接触させることを含む。幾つかの実施形態では、ポリマー足場組成物を細胞または複数の細胞と接触させる工程は、多層構成物を生体模倣ゲル中の複数の細胞と接触させることを含む。幾つかの実施形態では、該方法は、生体模倣ゲルの層を生成するために、生体模倣ゲル中の複数の細胞をエレクトロスプレー処理する工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、ポリマー足場組成物を生体模倣ゲル中の複数の細胞と接触させることは、ポリマー足場組成物上で生体模倣ゲルの層を生成することを含む。幾つかの実施形態では、ポリマー足場組成物を生体模倣ゲル中の複数の細胞と接触させることは、多層構成物を生体模倣ゲルの層と接触させることを含む。幾つかの実施形態の中で、細胞を播種した多層構成物を生成する方法は、ポリマー足場組成物の層および生体模倣ゲルの層を交互に生成する工程を含み、ここで、結果として生じる多層構成物は、ポリマー足場組成物の層および生体模倣ゲルの層を交互にすることを含む。
【００４５】
幾つかの実施形態では、該方法は、生体模倣ゲルの層を生成する工程およびポリマー足場組成物を生成する工程を含む。幾つかの実施形態では、該方法は、２つのポリマー足場組成物間に生体模倣ゲルの１つの層を生成する工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、該方法は、生体模倣ゲルの２つの層間に１つのポリマー足場組成物を層状化する工程を含む。幾つかの実施形態では、該方法は、約３つの生体模倣ゲルの層および約３つのポリマー足場を交互にする工程を含む。幾つかの実施形態では、該方法は、約５つの生体模倣ゲルの層および約５つのポリマー足場を交互にする工程を含む。幾つかの実施形態では、該方法は、約１０の生体模倣ゲルの層および約１０のポリマー足場を交互にする工程を含む。幾つかの実施形態では、該方法は、約２５の生体模倣ゲルの層および約２５のポリマー足場を交互にする工程を含む。幾つかの実施形態では、該方法は、約５０の生体模倣ゲルの層および約５０のポリマー足場を交互にする工程を含む。幾つかの実施形態では、該方法は、約１００の生体模倣ゲルの層および約１００のポリマー足場を交互にする工程を含む。幾つかの実施形態では、該方法は、約１０００の生体模倣ゲルの層および約１０００のポリマー足場を交互にする工程を含む。幾つかの実施形態では、該方法は、ポリマー足場組成物間に生体模倣ゲルの複数の層を生成する工程を含む。幾つかの実施形態では、該方法は、生体模倣ゲルの層間に複数のポリマー足場組成物を生成する工程を含む。
【００４６】
幾つかの実施形態では、該方法は、コレクター上へと生体模倣ゲルをエレクトロスプレー処理する工程およびコレクター上へと同時にポリマー溶液をエレクトロスピニング処理する工程を含み、その結果、生体模倣ゲルは、ポリマー足場組成物に埋め込まれる。幾つかの実施形態では、該方法は、コレクター上へと生体模倣ゲルをエレクトロスプレー処理する工程およびコレクター上へと同時にポリマー溶液をエレクトロスピニング処理する工程を含み、その結果、生体模倣ゲルは、ポリマー足場組成物の全体にわたって分配される。幾つかの実施形態では、該方法は、コレクター上へと生体模倣ゲルをエレクトロスプレー処理する工程およびコレクター上へと同時にポリマー溶液をエレクトロスピニング処理する工程を含み、その結果、生体模倣ゲルは、ポリマー足場組成物の一部において分配される。
【００４７】
幾つかの実施形態では、該方法は、コレクター上へと複数の生体模倣ゲルをエレクトロスプレー処理する工程を含む。幾つかの実施形態では、該方法は、コレクター上へと同時に複数の生体模倣ゲルをエレクトロスプレー処理する工程を含む。幾つかの実施形態では、該方法は、コレクター上へと連続して複数の生体模倣ゲル剤をエレクトロスプレー処理する工程を含む。幾つかの実施形態では、該方法は、ポリマー足場組成物上へと同時に複数の生体模倣ゲルをエレクトロスプレー処理する工程を含む。幾つかの実施形態では、該方法は、ポリマー足場組成物上へと連続して複数の生体模倣ゲルをエレクトロスプレー処理する工程を含む。
【００４８】
架橋結合
ポリマーファイバーの化学的架橋結合
幾つかの実施形態では、該方法は、ポリマーファイバーを架橋結合する工程を含む。幾つかの実施形態では、ポリマーファイバーを架橋結合する工程は、ポリマーファイバーを化学的橋架溶液と接触させることを含む。幾つかの実施形態では、化学的橋架溶液は、液体である。幾つかの実施形態では、化学的橋架溶液は、気体／蒸気である。幾つかの実施形態では、該方法は、ポリマー足場組成物のポリマーファイバーを架橋結合する工程を含む。幾つかの実施形態では、該方法は、細胞を播種したポリマー足場組成物のポリマーファイバーを架橋結合する工程を含む。幾つかの実施形態では、該方法は、細胞を播種した多層構成物のポリマーファイバーを架橋結合する工程を含む。幾つかの実施形態では、ポリマーファイバーを化学的橋架溶液と接触させる工程は、複数の細胞を加える前に生じる。幾つかの実施形態では、該方法は、ポリマーファイバーを化学的橋架溶液と接触させた後に、ポリマーファイバーを洗浄する工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、該方法は、化学的橋架溶液を化学的橋架溶液エミッターへと充填する工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、該方法は、化学的橋架溶液を化学的橋架溶液エミッターからコレクター上へと放出する工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、該方法は、ポリマーファイバー上への化学的橋架溶液エミッターから放出する工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、該方法は、化学的橋架溶液を化学的橋架溶液エミッターから放出する工程およびポリマー溶液を同時にエレクトロスピニング処理する工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、該方法は、化学的橋架溶液を化学的橋架溶液エミッターから放出する工程およびポリマー溶液をエレクトロスピニング処理する工程をさらに含み、ここで、化学的橋架溶液およびポリマー溶液は、コレクター上にある前に組み合わせられる。幾つかの実施形態では、架橋結合する工程は、ポリマーファイバーを化学的橋架溶液と接触させることを含み、これは、複数の細胞を加えた後に生じる。幾つかの実施形態では、ポリマーファイバーを化学的橋架溶液と接触させること及び複数の細胞を加えることは、同時に生じる。
【００４９】
幾つかの実施形態では、化学的橋架溶液は、アルデヒドを含む。幾つかの実施形態では、化学的橋架溶液は、Ｔｒｏｕｔの試薬を含む。幾つかの実施形態では、化学的橋架溶液は、ポリマーファイバーに対するグルタルアルデヒド溶液を含む。幾つかの実施形態では、グルタルアルデヒド溶液は、ＰＢＳ中の約０．０５％乃至約５％ｗ／ｗの溶液である。幾つかの実施形態では、グルタルアルデヒド溶液は、ＰＢＳ中の約０．１％乃至１％ｗ／ｗの溶液である。幾つかの実施形態では、グルタルアルデヒド溶液は、ＰＢＳ中の約０．２５％ｗ／ｗの溶液である。幾つかの実施形態では、化学的橋架溶液は、塩化カルシウム溶液を含む。幾つかの実施形態では、塩化カルシウム溶液は、約５０ｍＭ、約７５ｍＭ、約１００ｍＭ、約１２５ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１７５ｍＭ、または約２００ｍＭである。幾つかの実施形態では、塩化カルシウム溶液は、約１２０ｍＭである。
【００５０】
ポリマーファイバーの光架橋結合
幾つかの実施形態では、ポリマーファイバーを架橋結合する工程は、ポリマーファイバーを光架橋結合することを含む。幾つかの実施形態では、該方法は、ポリマー足場組成物のポリマーファイバーを光架橋結合する工程を含む。幾つかの実施形態では、該方法は、細胞を播種したポリマー足場組成物のポリマーファイバーを光架橋結合する工程を含む。幾つかの実施形態では、該方法は、細胞を播種した多層構成物のポリマーファイバーを光架橋結合する工程を含む。幾つかの実施形態では、ポリマーファイバーの光架橋結合およびポリマー足場組成物に複数の細胞を加えることは、同時に生じる。幾つかの実施形態では、ポリマーファイバーの光架橋結合は、ポリマー足場組成物または多層構成物に複数の細胞を加えた後に生じる。幾つかの実施形態では、ポリマーファイバーの光架橋結合は、ポリマー足場組成物または多層構成物に複数の細胞を加える前に生じる。幾つかの実施形態では、光架橋結合は、一度生じる。幾つかの実施形態では、光架橋結合は、１回を超えて生じる。幾つかの実施形態では、光架橋結合は、約１回、約２回、約３回、約４回、約５回、約１０回、約１５回、約２０回、約２５回、約５０回、または約１００回生じる。幾つかの実施形態では、光架橋結合は、約１秒、約２秒、約３秒、約５秒、約１０秒、約１５秒、約２０秒、約２５秒、約３０秒、約３５秒、約４０秒、約４５秒、約５０秒、約５５秒、約６０秒、約６５秒、約７０秒、約７５秒、約８０秒、約８５秒、約９０秒、約９５秒、約１００秒、約１０５秒、約１１０秒、約１１５秒、約１２０秒、約１２５秒、約１３０秒、約１３５秒、約１４０秒、約１４５秒、約１５０秒、約１６０秒、または約１８０秒未満の間生じる。幾つかの実施形態では、光架橋結合は、約２分未満の間生じる。
【００５１】
幾つかの実施形態では、ポリマーファイバーがメタクリル化されたコラーゲン繊維を含む場合、架橋結合は、メタクリル化されたコラーゲン繊維をオキシダントに露出する工程を含み、結果として、メタクリル化されたコラーゲン繊維間に化学結合が生じる。幾つかの実施形態では、オキシダントの放出は、ポリマー足場組成物にリボフラビンを加えることを含む。幾つかの実施形態では、オキシダントの放出は、ポリマー足場組成物をエオシンと接触させることを含む。幾つかの実施形態では、該方法は、光開始剤をポリマー足場組成物に加える工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、該方法は、オキシダントを放出するためにポリマー足場組成物を光に露出する工程をさらに含み、結果として、メタクリル化されたコラーゲン繊維の１つ以上の間に化学結合が生じる。幾つかの実施形態では、該方法は、オキシダントを放出するためにポリマー足場組成物を紫外線に露出する工程をさらに含み、結果として、メタクリル化されたコラーゲン繊維間に化学結合が生じる。
【００５２】
生体模倣ゲルの架橋結合
幾つかの実施形態では、該方法は、細胞を播種したポリマー足場組成物の生体模倣ゲルを架橋結合させる工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、該方法は、細胞を播種した多層構成物の生体模倣ゲルを架橋結合させる工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、生体模倣ゲルをアルギン酸塩と架橋結合することによって、複数の細胞を適所に保持する。幾つかの実施形態では、生体模倣ゲルをアルギン酸塩と架橋結合することによって、複数の細胞を一時的に適所に保持する。幾つかの実施形態では、生体模倣ゲルをアルギン酸塩と架橋結合することによって、増殖または移動するまで複数の細胞を適所に保持する。幾つかの実施形態では、生体模倣ゲルの架橋結合は、生体模倣ゲルを生体模倣ゲルが架橋結合する溶液と接触させることを含む。幾つかの実施形態では、生体模倣ゲルが架橋結合する溶液は、アルギン酸塩を含む。幾つかの実施形態では、該方法は、生体模倣ゲルをアルギン酸塩と架橋結合させる工程および複数の細胞をポリマー足場組成物に同時に加える工程を含む。幾つかの実施形態では、該方法は、複数の細胞をポリマー足場組成物に加えた後に生体模倣ゲルをアルギン酸塩と架橋結合させる工程を含む。
【００５３】
幾つかの実施形態では、該方法は、架橋結合の前にコレクターからポリマー足場組成物を取り除く工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、該方法は、コレクター上のポリマー足場組成物を架橋結合する工程をさらに含む。
【００５４】
ポリマー足場組成物／構成物のさらなる修飾
幾つかの実施形態では、該方法は、ポリマー足場組成物、細胞を播種したポリマー足場組成物、または細胞を播種した多層構成物を修飾する又は形作る工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、該方法は、ポリマー足場組成物、多層構成物、細胞を播種したポリマー足場組成物、または細胞を播種した多層構成物を、切断する、融解する、燃焼する、細かく切る、刻む、エッチングする、刈り取る、破壊する、曲げる、ねじる、折り重ねる、または打つ工程を含む。
【００５５】
幾つかの実施形態では、該方法は、身体部分またはその一部に類似させるようにポリマー足場組成物を形作る工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、該方法は、身体部分またはその一部に類似させるように細胞を播種したポリマー足場組成物を形作る工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、該方法は、身体部分またはその一部に類似させるように多層構成物を形作る工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、該方法は、身体部分またはその一部に類似させるように細胞を播種した多層構成物を形作る工程をさらに含む。
【００５６】
幾つかの実施形態では、身体部分は、鼻、耳、頭骨、鎖骨、食道、気管、気管支、肋骨、肋骨郭、骨、肩、肘、手首、指、手、骨盤、腰部、脊椎、椎間板、尾骨、脚、膝、膝半月板、足首、足およびつま先、またはその一部から選択される。幾つかの実施形態では、身体部分は、膝半月板またはその一部である。幾つかの実施形態では、身体部分は、内側半月板またはその一部である。幾つかの実施形態では、身体部分は、外側半月板またはその一部である。
【００５７】
幾つかの実施形態では、身体部分は、臓器またはその一部である。幾つかの実施形態では、臓器は、心臓、腎臓、筋肉、表皮、脳、眼、肺、胃、腸、結腸、子宮、卵巣、前立腺、膀胱、肝臓、膵臓、胸腺、横隔膜、またはその一部から選択される。幾つかの実施形態では、臓器の一部は、心臓弁を含む。幾つかの実施形態では、臓器の一部は、血管を含む。
【００５８】
幾つかの実施形態では、身体部分は、腺である。幾つかの実施形態では、腺は、副腎、脳下垂体および甲状腺から選択される。
【００５９】
幾つかの実施形態では、身体部分は、骨を含む。
【００６０】
細胞を播種したポリマー足場組成物のために細胞を得て培養する工程
幾つかの実施形態では、該方法は、対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）、死体、臓器または組織から複数の細胞を採取する又は分離する工程をさらに含む。ここで、複数の細胞は、死体から採取され、幾つかの実施形態では、複数の細胞は、死後、約１時間未満、約２時間未満、約４時間未満、約６時間未満、約１２時間未満、約２４時間未満、約３６時間未満、約４８時間未満、または約７２時間未満で採取される。幾つかの実施形態では、複数の細胞は、死後約７２時間未満で死体から採取される。幾つかの実施形態では、複数の細胞を分離する工程は、軟骨細胞を細かく切ることを含む。幾つかの実施形態では、複数の細胞を分離する工程は、組織を酵素溶液（例えばトリプシン）と接触させる工程を含む。幾つかの実施形態では、複数の細胞を分離する工程は、複数の細胞を抗生物質及び／又は抗真菌剤で処置することを含む。幾つかの実施形態では、抗生物質は、ペニシリン、ストレプトマイシン、アクチノマイシンＤ、アンピシリン、ブラストサイジン、カルベニシリン、セフォタキシム、ホスミドマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ポリミキシンＢ、およびそれらの組み合わせから選択される。幾つかの実施形態では、抗真菌剤は、アムホテリシンＢ、ナイスタチン、ナタマイシン、およびそれらの組み合わせから選択される。
【００６１】
幾つかの実施形態では、該方法は、ポリマー足場組成物を接触させる前に細胞培養物中で複数の細胞を培養する工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、複数の細胞は、２４時間未満、２日未満、３日未満、または１週間未満の間、細胞培養物中で維持される。幾つかの実施形態では、複数の細胞は、１週間を超えて細胞培養物中で維持される。幾つかの実施形態では、複数の細胞は、約１週間乃至約３週間の間、細胞培養物中で維持される。幾つかの実施形態では、複数の細胞は、約２週間、細胞培養物中で維持される。幾つかの実施形態では、複数の細胞は、約１か月間、細胞培養物中で維持される。幾つかの実施形態では、複数の細胞は、１か月間を超えて、細胞培養物中で維持される。
【００６２】
幾つかの実施形態では、該方法は、複数の細胞が、細胞培養中で約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％のコンフルエンスまで成長したときに、ポリマー足場組成物をその複数の細胞と接触させる工程を含む。
【００６３】
幾つかの実施形態では、該方法は、ポリマー足場組成物を軟骨細胞と接触させる工程を含む。本明細書で使用されるように、幾つかの実施形態では、用語、軟骨細胞、軟骨性細胞、線維軟骨細胞（ｆｉｂｒｏｃａｒｔｉｌａｇｉｎｏｕｓ ｃｅｌｌｓ）、軟骨芽細胞、半月板細胞、およびそれらの前駆細胞は、交換可能に使用される。幾つかの実施形態では、軟骨細胞は、ヒト軟骨細胞である。幾つかの実施形態では、ヒト軟骨細胞は、細胞培養物中で８０％乃至９０％コンフルエントである。幾つかの実施形態では、該方法は、５％のＣＯ２を含有している加湿空気を用いて約３７℃でヒト軟骨細胞を培養する工程、および細胞培養培地を約４日ごとに変更する工程をさらに含む。
【００６４】
細胞を播種したポリマー足場組成物の培養
幾つかの実施形態では、該方法は、細胞を播種したポリマー足場組成物を細胞培養物中で維持する工程を含む。幾つかの実施形態では、該方法は、２４時間未満、２日未満、３日未満、または１週間未満の間、細胞を播種したポリマー足場組成物を細胞培養物中で維持する工程を含む。幾つかの実施形態では、該方法は、１週間以上、細胞を播種したポリマー足場組成物を細胞培養物中で維持する工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、該方法は、約１週間乃至約３週間の間、細胞を播種したポリマー足場組成物を細胞培養物中で維持する工程を含む。幾つかの実施形態では、該方法は、約２週間、細胞を播種したポリマー足場組成物を細胞培養物中で維持する工程を含む。幾つかの実施形態では、該方法は、約１か月間、細胞を播種したポリマー足場組成物を細胞培養物中で維持する工程を含む。幾つかの実施形態では、該方法は、１か月間を超えて、細胞を播種したポリマー足場組成物を細胞培養物中で維持する工程を含む。
【００６５】
幾つかの実施形態では、細胞培養物は、約１％、約２％、約３％、約５％、約７％、約１０％、または約２０％のＯ２の大気を含む。幾つかの実施形態では、細胞培養物は、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、または約１０％のＣＯ２の大気を含む。幾つかの実施形態では、細胞培養物は、約３０℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、または４２℃の大気を含む。
【００６６】
幾つかの実施形態では、該方法は、細胞を播種したポリマー足場組成物を低温で保存する工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、該方法は、細胞を播種したポリマー足場組成物を約４℃で保存する工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、該方法は、細胞を播種したポリマー足場組成物を凍結する工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、該方法は、細胞を播種したポリマー足場組成物を細胞培養条件の温度で輸送する工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、該方法は、細胞を播種したポリマー足場組成物を約４℃で輸送する工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、該方法は、細胞を播種したポリマー足場組成物を冷凍して輸送する工程をさらに含む。
【００６７】
幾つかの実施形態では、該方法は、複数の細胞を活性または外観に関して分析する工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、限定しない例によって、活性または外観は、生存度、分化、増殖、形態、付着性、アポトーシス、移動、ポリマー足場組成物との統合、タンパク質発現、遺伝子発現、およびそれらの組み合わせから選択される。幾つかの実施形態では、限定しない例によって、分析は、共焦点顕微鏡法、蛍光顕微鏡法、走査電子顕微鏡法、リアルタイムＰＣＲ、定量ＰＣＴ、クロマチン免疫沈降、免疫組織化学的検査、免疫染色、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ノーザンブロット、サザンブロット、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション、核型分析、蛍光活性化細胞分類、細胞数計算（ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ）、染着、粒子取り込み、移動アッセイ、付着アッセイ、またはその任意の組み合わせから選択される方法を含む。幾つかの実施形態では、複数の細胞を遺伝子発現に関して分析することは、Ｉ型コラーゲン（アルファＩ）（ＣＯＬ１Ａ１）、ＳＯＸ９、コンドロアドヘリン（ｃｈｏｎｄｒｏａｄｈｅｒｉｎ）（ＣＨＡＤ）、 アグリカン（ＡＧＧ）、ＴＨＹ−１、または軟骨オリゴマー基質タンパク質（ＣＯＭＰ）の遺伝子発現を測定することを含む。幾つかの実施形態では、該方法は、複数の細胞の遺伝子発現を細胞培養容器中のそれらの遺伝子発現と比較する工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、限定しない例によって、細胞培養容器は、皿、フラスコ、スライド、マトリックス、チューブ、およびチャンバから選択される。幾つかの実施形態では、細胞培養容器は、プラスチック、ポリマー、金属、紙、ワックス、ゲル、樹脂、およびガラスから選択される材料を含む。
【００６８】
組織工学
本明細書には、幾つかの実施形態において、組織工学の方法が開示され、該方法は、ｉ）ポリマー足場組成物を生成するためにポリマー溶液をエレクトロスピニング処理する工程；ｉｉ）細胞培養物にポリマー足場組成物を入れる工程；ｉｉｉ）細胞培養物を複数の細胞と接触させる工程；およびｉｖ）培養組織を生成するために複数の細胞を繁殖させる工程、を含む。本明細書にはさらに、幾つかの実施形態において、組織工学の方法が開示され、該方法は、ｉ）ポリマー足場組成物を生成するためにポリマー溶液をエレクトロスピニング処理する工程；ｉｉ）細胞を播種したポリマー足場組成物を形成するためにポリマー足場組成物を複数の細胞と接触させる工程；ｉｉｉ）細胞培養物に細胞を播種したポリマー足場組成物を入れる工程；およびｉｖ）培養組織を生成するために複数の細胞を繁殖させる工程、を含む。幾つかの実施形態では、細胞培養物は、細胞溶液を含む。幾つかの実施形態では、細胞溶液は、細胞培養培地を含む。幾つかの実施形態では、ポリマー足場組成物は、細胞のための生体模倣環境を提供する。幾つかの実施形態では、ポリマー足場組成物は、複数の細胞の成長および分化を支持する。幾つかの実施形態では、該方法は、複数の細胞を繁殖させる工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、該方法は、培養組織の形状を変更する工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、限定しない例によって、培養組織の形状を変更する工程は、培養組織を切断する、刻む、成型する、押す、適合させる、圧縮する、圧搾する、回転させる、または折り重ねることを含む。幾つかの実施形態では、該方法は、細胞培養を細胞外マトリックス成分と接触させる工程をさらに含む。
【００６９】
幾つかの実施形態では、限定しない例によって、培養組織は、維管束組織、骨軟骨組織、表皮組織、筋組織、腸組織、ニューロン組織、筋膜、硬膜、 生殖組織、膵臓組織、眼組織、耳、眼、角膜、鼻、脳、鼻腔、歯、骨、軟骨、皮膚、食道、気管、胸腺、甲状腺、心臓、心臓弁、血管、肺、横隔膜、リンパ節、胸、乳頭、胃、腸、結腸、直腸、膵臓、ひ臓、膀胱、腎臓、肝臓、卵巣、子宮、前立腺、脂肪組織、骨格筋、平滑筋、皮膚、およびそれらの一部、並びにそれらの組み合わせから選択される。
【００７０】
足場組成物
本明細書には、様々な実施形態において、複数のポリマーファイバーを含むポリマー足場組成物が開示され、ここで、ポリマーファイバーは、エレクトロスピニング処理され、架橋結合される。幾つかの実施形態では、ポリマー足場組成物は、本明細書に開示される方法によって生成される。幾つかの実施形態では、該方法は、ポリマーファイバーを形成するためにポリマー溶液をコレクター上へとエレクトロスピニング処理する工程；およびポリマー足場を生成するためにポリマーファイバーを架橋結合する工程、を含む。幾つかの実施形態では、ポリマーファイバーは、シェルを含む。幾つかの実施形態では、シェルは、コラーゲンを含む。幾つかの実施形態では、シェルは、コラーゲンから本質的に成る。幾つかの実施形態では、ポリマーファイバーは、コアを含む。幾つかの実施形態では、コアは、ポリ乳酸を含む。
【００７１】
幾つかの実施形態では、ポリマー足場組成物のポリマーファイバーは、コラーゲンから本質的に成る。
【００７２】
幾つかの実施形態では、ポリマー足場組成物は、孔を有する。幾つかの実施形態では、孔は、ポリマーファイバー間の空間あるいは開口部である。幾つかの実施形態では、孔は、平均孔径を有する。幾つかの実施形態では、平均孔径は、約１ｎｍ、約５ｎｍ、約１０ｎｍ、約１５ｎｍ、約２０ｎｍ、約２５ｎｍ、約５０ｎｍ、約１００ｎｍである。幾つかの実施形態では、平均孔径は、約１００ｎｍ、約２００ｎｍ、約３００ｎｍ、約４００ｎｍ、約５００ｎｍ、約６００ｎｍ、約７００ｎｍ、約８００ｎｍ、約９００ｎｍ、または約１ミクロンである。幾つかの実施形態では、平均孔径は、１μｍより大きい。幾つかの実施形態では、平均孔径は、約１μｍ、５μｍ、約１０μｍ、約１５μｍ、約２０μｍ、約２５μｍ、約５０μｍ、約７５μｍ、約１００μｍ、約１２５μｍ、約１５０μｍ、約３００μｍ、または約５００μｍである。
【００７３】
幾つかの実施形態では、ポリマー足場組成物は、生分解性である。幾つかの実施形態では、エレクトロスピニング処理したポリマーファイバーまたはポリマー足場組成物は、約２週、約３週、約４週、約５週、約６週、約７週、約８週、約９週、約１０週、約１２週、約４か月、約５か月、約６か月、約７か月、約８か月、約９か月、約１０か月、約１１か月、または約１年の湿潤強度の半減期を有する。幾つかの実施形態では、エレクトロスピニング処理したポリマーファイバーは、約６か月の湿潤強度の半減期をゆ有する。幾つかの実施形態では、ポリマー足場組成物は、再生組織の割合と一致する分解率を有する。幾つかの実施形態では、ポリマー足場組成物は、対象（例えば、損傷の部位）に置かれたときに分解し、再生された組織と取り替えられる。
【００７４】
幾つかの実施形態では、ポリマー足場組成物は、細胞外マトリックス成分またはその一部をさらに含む。幾つかの実施形態では、細胞外マトリックス成分は、ヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、チンパンジー、サル、ラット、ブタ、マウス、ウサギ、または合成反応に由来する。幾つかの実施形態では、ポリマー足場組成物は、支持材、タンパク質、糖タンパク質、プロテオグリカン、１つの、生化学的薬剤（ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）、またはその組み合わせをさらに含む。幾つかの実施形態では、ポリマー足場組成物は、生体模倣ゲルをさらに含む。
【００７５】
幾つかの実施形態では、ポリマー足場組成物は、コンドロイチン硫酸塩、ヒアルロナン、コラゲナーゼ、ラブリシン、またはその組み合わせをさらに含む。幾つかの実施形態では、ポリマー足場組成物は、関節内潤滑剤（ｊｏｉｎｔ ｌｕｂｒｉｃａｎｔ）をさらに含む。幾つかの実施形態では、関節内潤滑剤は、ゼラチン、ヘパリン、関節液、またはその組み合わせを含む。
【００７６】
細胞を播種したポリマー足場／多層構成物の組成物
本明細書には、幾つかの実施形態において、細胞を播種したポリマー足場組成が開示され、該細胞を播種したポリマー足場組成は、ｉ）エレクトロスピニング処理および架橋結合される複数のポリマーファイバーを含むポリマー足場組成物、およびｉｉ）複数の細胞を含む。本明細書にはさらに、細胞を播種した多層構成物が開示され、該細胞を播種した多層構成物は、ｉ）エレクトロスピニング処理および架橋結合される複数のポリマーファイバーを含む複数のポリマー足場組成物、およびｉｉ）複数の細胞を含む。幾つかの実施形態では、ポリマーファイバーは、シェルを含む。幾つかの実施形態では、シェルは、コラーゲンを含む。幾つかの実施形態では、シェルは、コラーゲンから本質的に成る。幾つかの実施形態では、ポリマーファイバーは、コアを含む。幾つかの実施形態では、コアは、ポリ乳酸を含む。幾つかの実施形態では、細胞を播種したポリマー足場組成物および細胞を播種した多層構成物は、本明細書に記載される方法のいずれかによって生成される。
幾つかの実施形態では、細胞を播種したポリマー足場組成物および細胞を播種した多層構成物は、被験体への投与に適している。幾つかの実施形態では、細胞を播種したポリマー足場組成物および細胞を播種した多層構成物は、インプラントまたはその一部を含む。幾つかの実施形態では、インプラントは、半月版インプラントである。幾つかの実施形態では、インプラントは、椎間インプラントである。幾つかの実施形態では、細胞を播種したポリマー足場組成物は、組織またはその一部を交換する。幾つかの実施形態では、組織は、軟骨、靭帯、腱、硬膜、筋膜、心臓組織、表皮組織、骨格筋、平滑筋、腸組織、ニューロン組織、骨軟骨組織、および維管束組織から選択される。幾つかの実施形態では、細胞を播種したポリマー足場組成物は、身体部分またはその一部を交換する。幾つかの実施形態では、限定しない例によって、身体部分は、眼、角膜、脳、鼻腔、歯、骨、関節、食道、気管、胸腺、甲状腺、心臓、心臓弁、血管、肺、横隔膜、リンパ節、胸、乳頭、胃、腸、
結腸、直腸、膵臓、ひ臓、膀胱、腎臓、肝臓、卵巣、子宮、前立腺、またはその一部から選択される。
【００７７】
幾つかの実施形態では、身体部分は、鼻、耳、頭骨、鎖骨、食道、気管、気管支、肋骨郭、骨、肩、肘、手首、指、手、骨盤、腰、脊椎、椎間板、尾骨、脚、膝、膝半月板、足首、足、またつま先、あるいはその一部から選択される。幾つかの実施形態では、身体部分は、膝半月板またはその一部である。幾つかの実施形態では、身体部分は、内側半月板またはその一部である。幾つかの実施形態では、身体部分は、外側半月板またはその一部である。
【００７８】
幾つかの実施形態では、細胞を播種したポリマー足場組成物および細胞を播種した多層構成物のポリマーファイバーは、コラーゲン（例えば、細胞を播種したコラーゲン足場組成物）から本質的に成る。幾つかの実施形態では、細胞を播種したコラーゲン足場組成物および細胞を播種した多層構成物は、被験体の内因性酵素によって、生分解性であり、無毒であり、および対象に置かれたときにリモデリングされることが可能である。
【００７９】
デバイス／システム
本明細書には、幾つかの実施形態において、ポリマー溶液をエレクトロスピニング処理するためのシステムが開示され、該システムは、ｉ）エミッター；ｉｉ）エミッターによって生成されたポリマーファイバーを受けるためのコレクター；およびｉｉｉ）エミッターおよびコレクターに電圧を提供するパワーサプライ、を含む。幾つかの実施形態では、該システムは、本明細書に開示される方法のいずれかを実行するために実装される。幾つかの実施形態では、その方法は、ポリマーファイバーを形成するためにコレクター上へとポリマー溶液をエレクトロスピニング処理する工程；およびポリマー足場を生成するためにポリマーファイバーを架橋結合する工程、を含む。
【００８０】
エミッター
幾つかの実施形態では、エミッターは、シリンジおよびニードルを含む。幾つかの実施形態では、エミッターは、スピナレットを含む。幾つかの実施形態では、エミッターは、シリンジを含む。幾つかの実施形態では、エミッターは、ポリマー溶液を充填する及び含有するためのポリマー溶液チャンバを含む。幾つかの実施形態では、限定しない例によって、ポリマー溶液チャンバは、容器、シリンジ、ボトル、バレル、チューブ、カップ、フラスコ、シリンダ、キャピラリ、チャネル、パイプ、およびボックスから選択される。幾つかの実施形態では、エミッターは、エミッター出口を含み、そこを通って、ポリマー溶液はエミッターから放出される。幾つかの実施形態では、限定しない例によって、エミッター出口は、先端部（ｔｉｐ）、ニードル、キャピラリ、コーン、ファンネル、ノズル、穴部、およびそれらの組み合わせから選択される。幾つかの実施形態では、限定しない例によって、エミッターは、ガラス、プラスチック、樹脂、金属、ゴム、ポリマー、またはそれらの組み合わせから選択される材料を含む。
【００８１】
幾つかの実施形態では、ポリマー溶液チャンバは、約１ｍＬ、約２ｍＬ、約３ｍＬ、約４ｍＬ、約５ｍＬ、約１０ｍＬ、約１５ｍＬ、約２０ｍＬ、約２５ｍＬ、約３０ｍＬ、約３５ｍＬ、約４０ｍＬ、約４５ｍＬ、約５０ｍＬ、約５５ｍＬ、約６０ｍＬ、約６５ｍＬ、約７０ｍＬ、約７５ｍＬ、約８０ｍＬ、約８５ｍＬ、約９０ｍＬ、約９５ｍＬ、約１００ｍＬから選択される容積を有する。幾つかの実施形態では、シリンジ容積は、約２００ｍＬ、約３００ｍＬ、約４００ｍＬ、約５００ｍＬ、約６００ｍＬ、約７００ｍＬ、約８００ｍＬ、約９００ｍＬ、または約１Ｌから選択される。
【００８２】
幾つかの実施形態では、エミッター出口は、ニードルを含む。幾つかの実施形態では、ニードルは、３ゲージのニードル、４ゲージのニードル、５ゲージのニードル、６ゲージのニードル、７ゲージのニードル、８ゲージのニードル、９ゲージのニードル、１０ゲージのニードル、１１ゲージのニードル、１２ゲージのニードル、１３ゲージのニードル、１４ゲージのニードル、１５ゲージのニードル、１６ゲージのニードル、１７ゲージのニードル、１８ゲージのニードル、１９ゲージのニードル、２０ゲージのニードル、２１ゲージのニードル、２２ゲージのニードル、２３ゲージのニードル、２４ゲージのニードル、２５ゲージのニードル、２６ゲージのニードル、２７ゲージのニードル、２８ゲージのニードル、２９ゲージのニードル、３０ゲージのニードル、３１ゲージのニードル、３２ゲージのニードル、３３ゲージのニードル、３４ゲージのニードル、および３５ゲージのニードルから選択される。幾つかの実施形態では、ニードルは、２１ゲージのニードルを含む。
【００８３】
幾つかの実施形態では、ニードルの長さは、約１ｍｍ、約５ｍｍ、または約１ｃｍである。幾つかの実施形態では、ニードルの長さは、約１／８インチ、約１／４インチ、約１／２インチ、約３／４インチ、約１インチ、約１ １／４インチ、約１ １／２インチ、約１ ３／４インチ、約２インチ、約２ １／４インチ、約２ １／２インチ、約２ ３／４インチ、約３インチ、約３ １／４インチ、約３ １／２インチ、約３ ３／４インチ、約４インチ、約４ １／４インチ、約４ １／２インチ、約４ ３／４インチ、または約５インチである。
【００８４】
幾つかの実施形態では、該システムは、シリンジポンプをさらに含む。
【００８５】
図６のＡおよびＢを参照すると、幾つかの実施形態では、システムは、エミッター及び／又はコレクター用のプラットフォームをさらに含む。幾つかの実施形態では、プラットフォームは、固定されている。幾つかの実施形態では、プラットフォームは、テーブル、壁、または床に固定される。幾つかの実施形態では、プラットフォームは、可動性である（例えば、車輪上に載せられる）。幾つかの実施形態では、プラットフォームは、調整可能な高さを有する。
【００８６】
コレクター
幾つかの実施形態では、コレクターは、表面材料を含む。幾つかの実施形態では、限定しない例によって、表面材料は、プラスチック、セラミック、金属、ガラス、樹脂、ワックス、粒子、合成素材、自然発生の産物、およびそれらの組み合わせから選択される。幾つかの実施形態では、コレクターは、液体、油、ゲル、紙、ポリマー、またはワックスでコーティングされるか、スプレーされるか、または覆われる。幾つかの実施形態では、コレクターは、アルミ箔で覆われる。幾つかの実施形態では、コレクターは、非粘着性薬剤で覆われる。幾つかの実施形態では、非粘着性薬剤は、油を含む。幾つかの実施形態では、非粘着性薬剤は、ワックスを含む。幾つかの実施形態では、非粘着性薬剤は、ポリマーを含む。幾つかの実施形態では、限定しない例によって、ポリマーは、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）を含む。
【００８７】
幾つかの実施形態では、コレクターは、接地プレートコレクターである。幾つかの実施形態では、コレクターは、回転コレクターである。幾つかの実施形態では、コレクターは、回転ドラムコレクターである。幾つかの実施形態では、コレクターは、マンドレルである。幾つかの実施形態では、コレクターは、円筒状である。幾つかの実施形態では、回転コレクターは、その回転軸を見下ろすと、円形、卵形、不規則形状、正方形、水平、平面、とがっている、曲がっている、長方形、または多角形である。幾つかの実施形態では、回転コレクターは、その回転軸を見下ろすと、円形である。幾つかの実施形態では、回転コレクターは、その回転軸を見下ろすと、可変の幅または直径を有している。幾つかの実施形態では、回転コレクターは、その回転軸を見下ろすと、可変形状を有している。幾つかの実施形態では、図３および図４Ａを参照すると、回転コレクターは、Ｖ字型の回転コレクターである。図４Ｂおよび図５を参照すると、幾つかの実施形態では、Ｖ字型の回転コレクター上へとポリマー溶液をエレクトロスピニング処理することによって、数片の半月板形状のエレクトロスピニング処理したコラーゲンが生成される。幾つかの実施形態では、コレクターは、所望の身体部分またはその一部の形状およびサイズを模倣するポリマー足場組成物を生成するように形作られる。幾つかの実施形態では、所望の身体部分は、半月板である。幾つかの実施形態では、回転コレクターは、円錐形である。幾つかの実施形態では、回転コレクターは、２つの端部を有する。幾つかの実施形態では、回転コレクターの第１端部は、第２端部より小さな幅または直径を有している。幾つかの実施形態では、回転コレクターの第１端部は、第２端部と類似した又は同じ幅または直径を有している。幾つかの実施形態では、回転コレクターの第１端部は、第２端部とは異なる形状を有している。幾つかの実施形態では、回転コレクターの第１端部は、第２端部と類似した又は同じ形状を有している。幾つかの実施形態では、回転コレクターの端部の幅または直径は、約１ｍｍ、約２ｍｍ、約３ｍｍ、約４ｍｍ、約５ｍｍ、約６ｍｍ、約７ｍｍ、約８ｍｍ、約９ｍｍ、約１ｃｍ、約２ｃｍ、約３ｃｍ、約４ｃｍ、約５ｃｍ、約６ｃｍ、約７ｃｍ、約８ｃｍ、約９ｃｍ、約１０ｃｍ、約１１ｃｍ、約１２ｃｍ、約１３ｃｍ、約１４ｃｍ、約１５ｃｍ、約１６ｃｍ、約１７ｃｍ、約１８ｃｍ、約１９ｃｍ、または約２０ｃｍである。幾つかの実施形態では、回転コレクターの端部の直径は、約２５ｃｍ、約３０ｃｍ、約３５ｃｍ、約４０ｃｍ、約４５ｃｍ、約５０ｃｍ、約５５ｃｍ、約６０ｃｍ、約６５ｃｍ、約７０ｃｍ、約７５ｃｍ、約８０ｃｍ、約８５ｃｍ、約９０ｃｍ、約９５ｃｍ、または約１メートルである。
【００８８】
デバイスコントローラ
幾つかの実施形態では、システムは、本明細書に開示される方法を実行する及び本明細書に開示される組成物を生成するためのコンピュータをさらに含む。幾つかの実施形態では、コンピュータは、ポリマー溶液をエレクトロスピニング処理するためにシリンジを操作するための、プロセッサ、メモリデバイス、オペレーティングシステム、およびソフトウェアモジュールを含む。幾つかの実施形態では、コンピュータは、デジタル処理デバイスを含み、コントローラの機能を実行する１つ以上のハードウェア中央処理装置（ＣＰＵ）を含む。さらなる実施形態では、システムは、実行可能な指示を行うように構成されたオペレーティングシステムを含む。幾つかの実施形態では、オペレーティングシステムは、デバイスのハードウェアを管理し、アプリケーションの実行のためのサービスを提供する、プログラムおよびデータを含むソフトウェアである。当業者は、適切なサーバのオペレーティングシステムが、限定しない例として、ＦｒｅｅＢＳＤ、ＯｐｅｎＢＳＤ、ＮｅｔＢＳＤ（登録商標）、Ｌｉｎｕｘ（登録商標）、Ａｐｐｌｅ（登録商標）Ｍａｃ ＯＳ Ｘ Ｓｅｒｖｅｒ（登録商標）、Ｏｒａｃｌｅ（登録商標）Ｓｏｌａｒｉｓ（登録商標）、Ｗｉｎｄｏｗｓ Ｓｅｒｖｅｒ（登録商標）、およびＮｏｖｅｌ（登録商標）ＮｅｔＷａｒｅ（登録商標）を含むことを認識するだろう。当業者は、適切なパーソナルコンピュータのオペレーティングシステムが、限定しない例として、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｗｉｎｄｏｗ（登録商標）、Ａｐｐｌｅ（登録商標）Ｍａｃ ＯＳ Ｘ（登録商標）、ＵＮＩＸ（登録商標）、およびＧＮＵ／Ｌｉｎｕｘ（登録商標）などのＵＮＩＸ（登録商標）様のオペレーティングシステムを含むことを認識するだろう。幾つかの実施形態では、オペレーティングシステムは、クラウドコンピューティングによって提供される。当業者は、適切なモバイルスマートフォンのオペレーティングシステムが、限定しない例として、Ｎｏｋｉａ（登録商標）Ｓｙｍｂｉａｎ（登録商標）ＯＳ、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＯＳ（登録商標）、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎ Ｍｏｔｉｏｎ（登録商標）ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ ＯＳ（登録商標）、Ｇｏｏｇｌｅ（登録商標）、Ａｎｄｒｏｉｄ（登録商標）、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｗｉｎｄｏｗｓ Ｐｈｏｎｅ（登録商標）ＯＳ、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｗｉｎｄｏｗｓ Ｍｏｂｉｌｅ（登録商標）ＯＳ、Ｌｉｎｕｘ（登録商標）、Ｐａｌｍ（登録商標）、およびＷｅｂＯＳ（登録商標）を含むことを認識するだろう。幾つかの実施形態では、システムは、ストレージ及び／又はメモリデバイスを含む。幾つかの実施形態では、ストレージ及び／又はメモリデバイスは、一時的または恒久的なデータまたはプログラムを保存するために使用される１つ以上の物理装置である。幾つかの実施形態では、メモリデバイスは、揮発性メモリであり、保存した情報を維持するための動力を必要とする。幾つかの実施形態では、メモリデバイスは、不揮発性メモリであり、デジタル処理デバイスに動力が供給されないときに、保存した情報を保持する。さらなる実施形態では、不揮発性メモリは、フラッシュメモリを含む。幾つかの実施形態では、不揮発性メモ���は、ダイナミック・ランダム・アクセス・メモリ（ＤＲＡＭ）を含む。幾つかの実施形態では、不揮発性メモリは、強誘電体ランダムアクセスメモリ（ＦＲＡＭ（登録商標））を含む。幾つかの実施形態では、不揮発性メモリは、相変化ランダムアクセスメモリ（ＰＲＡＭ）を含む。幾つかの実施形態では、ストレージデバイスは、限定しない例として、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、フラッシュメモリデバイス、磁気ディスクドライブ、磁気テープドライブ、光ディスクドライブ、およびクラウドコンピューティングベースのストレージを含む、ストレージデバイスである。幾つかの実施形態では、ストレージ及び／又はメモリデバイスは、本明細書に開示されるものなどのデバイスの組み合わせである。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるシステムは、ユーザインターフェースを含む。さらなる実施形態では、ユーザインターフェースは、グラフィックユーザインターフェース（ＧＵＩ）を含む。またさらなる実施形態では、ユーザインターフェースは、インタラクティブであり、本明細書に記載されるシステムおよびプリントヘッドとインタラクトするためのメニューおよびオプションをユーザに提示する。さらなる実施形態では、システムは、ユーザに視覚情報を送信するためのディスプレイスクリーンを含む。幾つかの実施形態では、ディスプレイは、ブラウン管（ＣＲＴ）である。幾つかの実施形態では、ディスプレイは、液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）である。更なる実施形態では、ディスプレイは、薄膜トランジスタ液晶ディスプレイ（ＴＦＴ−ＬＣＤ）である。幾つかの実施形態では、ディスプレイは、有機発光ダイオード（ＯＬＥＤ）ディスプレイである。様々なさらなる実施形態では、ＯＬＥＤディスプレイは、パッシブマトリクスＯＬＥＤ（ＰＭＯＬＥＤ）またはアクティブマトリクスＯＬＥＤ（ＡＭＯＬＥＤ）のディスプレイである。幾つかの実施形態では、ディスプレイは、プラズマディスプレイである。他の実施形態では、ディスプレイは、ビデオプロジェクターである。またさらなる実施形態では、ディスプレイは、本明細書に開示されるものなどのディスプレイの組み合わせである。幾つかの実施形態では、デバイスは、ユーザから情報を受信するための入力デバイスを含む。幾つかの実施形態では、入力デバイスは、キーボードである。幾つかの実施形態では、入力デバイスは、キーパッドである。特定の実施形態では、入力デバイスは、通信制限（例えば、年齢、虚弱、不能などが原因）のある対象による使用のための単純化されたキーパッドであり、ここで、各キーは、色、形状、および健康／通信概念に関係している。幾つかの実施形態では、入力デバイスは、限定しない例として、マウス、トラックボール、トラックパッド、ジョイスティック、ゲームコントローラ、またはスタイラスを含むポインティングデバイスである。幾つかの実施形態では、入力デバイスは、タッチスクリーンまたはマルチタッチスクリーンである、ディスプレイスクリーンである。他の実施形態では、入力デバイスは、声または他の音の入力を捕らえるマイクロホンである。他の実施形態では、入力デバイスは、動作または視覚の入力を捕らえるビデオカメラである。またさらなる実施形態では、入力デ���イスは、本明細書に開示されるものなどのデバイスの組み合わせである。幾つかの実施形態では、本明細書に開示されるシステム、およびソフトウェアモジュールは、イントラネットベースである。幾つかの実施形態では、システムおよびソフトウェアモジュールは、インターネットベースである。さらなる実施形態では、システムおよびソフトウェアモジュールは、ワールド・ワイド・ウェブベースである。またさらなる実施形態では、システムおよびソフトウェアモジュールは、クラウドコンピューティングベースである。他の実施形態では、システムおよびソフトウェアモジュールは、限定しない例として、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、フラッシュメモリデバイス、ＲＡＭ（例えば、ＤＲＡＭ、ＳＲＡＭなど）、ＲＯＭ（例えば、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭなど）、磁気テープドライブ、磁気ディスクドライブ、光ディスクドライブ、光磁気ドライブ、ソリッドステートドライブ、およびそれらの組み合わせを含む、データストレージデバイスに基づく。
【００８９】
幾つかの実施形態では、システムは、光架橋結合デバイス（ｐｈｏｔｏｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ ｄｅｖｉｃｅ）をさらに含む。
【００９０】
処置の方法
本明細書には、幾つかの実施形態において、被験体において組織欠損を処置する方法が開示され、該方法は、本明細書に開示されるポリマー足場組成物を被験体に投与する工程を含む。幾つかの実施形態では、ポリマー足場組成物は、複数のポリマーファイバーを含み、ここで、ポリマーファイバーは、エレクトロスピニング処理され、架橋結合される。幾つかの実施形態では、ポリマーファイバーは、コラーゲンから本質的に成る。幾つかの実施形態では、ポリマーファイバーは、シェルを含む。幾つかの実施形態では、シェルは、コラーゲンを含む。幾つかの実施形態では、シェルは、コラーゲンから本質的に成る。幾つかの実施形態では、ポリマーファイバーは、コアを含む。幾つかの実施形態では、コアは、ポリ乳酸を含む。
【００９１】
本明細書にはさらに、幾つかの実施形態において、被験体において組織欠損を処置する方法が開示され、該方法は、本明細書に開示される細胞を播種したポリマー足場組成物を被験体に投与する工程を含む。本明細書にはさらに、幾つかの実施形態において、被験体において組織欠損を処置する方法が開示され、該方法は、本明細書に開示される細胞を播種した多層構成物を被験体に投与する工程を含む。幾つかの実施形態では、ポリマー足場組成物は、複数のポリマーファイバーを含み、ここで、ポリマーファイバーは、エレクトロスピニング処理され、架橋結合される。幾つかの実施形態では、組織欠損は、関節欠損を含む。幾つかの実施形態では、ポリマーファイバーは、コラーゲンから本質的に成る。幾つかの実施形態では、ポリマーファイバーは、シェルを含む。幾つかの実施形態では、シェルは、コラーゲンを含む。幾つかの実施形態では、シェルは、コラーゲンから本質的に成る。幾つかの実施形態では、ポリマーファイバーは、コアを含む。幾つかの実施形態では、コアは、ポリ乳酸を含む。
【００９２】
幾つかの実施形態では、関節欠損は、関節軟骨を含むか又は含んだ。幾つかの実施形態では、関節軟骨は、摩耗され、腐食され、損傷され、裂かれ、分解され、退化され、すり減らされ、傷跡を残され、または悪化される。幾つかの実施形態では、関節軟骨は、半月板またはその一部である。幾つかの実施形態では、半月板は、大腿顆と脛骨との間のクッションを提供する。幾つかの実施形態では、組織欠損を処置する方法は、大腿顆と脛骨との間にポリマー足場組成物を投与する工程を含む。幾つかの実施形態では、細胞を播種したポリマー足場組成物は、半月板からの軟骨損失を防ぐ。幾つかの実施形態では、細胞を播種したポリマー足場組成物は、半月板、大腿顆、または脛骨への損傷を防ぐ。当業者は、これらの方法が、類似した関節および状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）に適用され得ることを理解するだろう。
【００９３】
幾つかの実施形態では、組織欠損は、疾患または疾病が原因である。幾つかの実施形態では、疾患または疾病は、骨関節炎を含む。幾つかの実施形態では、疾患または疾病は、関節の悪化を含む。幾つかの実施形態では、疾患または疾病は、関節欠損または関節損傷を含む。幾つかの実施形態では、関節は、肘、手首、頚部、顎、鎖骨、肩甲骨、腰、肩、膝、足首、足、脊柱、指、またはつま先に位置する。幾つかの実施形態では、関節損傷は、膝損傷障を含む。幾つかの実施形態では、関節損傷は、半月板障害を含む。幾つかの実施形態では、疾患または疾病は、円板状半月を含む。幾つかの実施形態では、被験体は、半月板移植を必要としている。幾つかの実施形態では、被験体は、腫瘍半月板切除を受けている。
【００９４】
幾つかの実施形態では、疾患または疾病は、関節リウマチ、痛風、偽痛風、敗血症性関節炎、強直性脊椎炎、若年性特発性関節炎、スティル病、狼瘡、感染、関節炎、乾癬、反応的性関節炎、エーラース‐ダンロス症候群、ヘモクロマトーシス、肝炎、ライム病、クローン病、潰瘍性大腸炎、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病、高免疫グロブリン血症Ｄ、サルコイドーシス、ＴＮＦ受容体関連周期熱症候群、ヴェーゲナー肉芽腫症、家族性地中海熱、全身性紅斑性狼瘡、軟骨異栄養症、肋軟骨炎、または再発性多発性軟骨炎から選択される。幾つかの実施形態では、被験体は、椎間板ヘルニア、軟骨腫、軟骨肉腫、および多形腺腫を有する。
【００９５】
幾つかの実施形態では、疾患または疾病は、関節症を含む。幾つかの実施形態では、関節症は、脊椎関節症、反応性関節症、腸疾患性関節症、結晶性関節症、糖尿病性関節症、神経障害性関節症から選択される。
【００９６】
幾つかの実施形態では、疾患または疾病は、肥満症である。幾つかの実施形態では、疾病は、老化である。幾つかの実施形態では、疾病は、火傷である。幾つかの実施形態では、疾病は、切断である。幾つかの実施形態では、疾病は、先天的欠損症または先天的欠陥症である。幾つかの実施形態では、疾患または疾病は、自己免疫性疾患である。
【００９７】
幾つかの実施形態では、疾病は、筋骨格外傷、スポーツによる損傷、自動車事故、感染、または腫瘍から選択される。
【００９８】
幾つかの実施形態では、組織欠損を処置する方法は、免疫反応または組織拒絶反応を回避するために被験体から複数の細胞を引き出す工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、該方法は、第２被験体から複数の細胞を引き出す工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、被験体は、ヒトである。幾つかの実施形態では、組織欠損を処置する方法は、ヒト以外の動物から複数の細胞を引き出す工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、動物は、ヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、チンパンジー、サル、ラット、ブタ、マウス、およびウサギから選択される。幾つかの実施形態では、動物は、ブタである。
【００９９】
幾つかの実施形態では、組織欠損を処置する方法は、活発な関節運動をさらに含み、ここで、活発な関節運動は、制限的な付着物（ａｄｈｅｓｉｏｎｓ）および瘢痕組織の形成を防ぐ。幾つかの実施形態では、該方法は、組織リモデリング活性をさらに含む。幾つかの実施形態では、組織リモデリング活性は、新生組織（ｎｅｏｔｉｓｓｕｅ）形成、細胞外マトリックス沈着、細胞外マトリックス形成、および宿主組織のポリマー足場組成物との統合から選択される。
【０１００】
ポリマー溶液
本明細書には、幾つかの実施形態において、ポリマー溶液をエレクトロスピニング処理するための方法およびシステムが開示される。幾つかの実施形態では、ポリマー溶液は、タンパク質を含む。幾つかの実施形態では、ポリマー溶液は、炭水化物を含む。幾つかの実施形態では、炭水化物は、グリコサミノグリカンである。幾つかの実施形態では、ポリマー溶液は、脂肪族ポリエステルを含む。幾つかの実施形態では、脂肪族ポリエステルは、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、そのコポリマーまたはその混合物から選択される。幾つかの実施形態では、ポリマー溶液は、生分解性ポリマーを含む。幾つかの実施形態では、ポリマー溶液は、コラーゲン、キトサン、ゼラチン、ラテックス、デキストラン、フィブロイン、ケラチン、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ポリグリコール酸、ポリジオキサノン、ポリ（炭酸プロピレン）、ポリ（酸化エチレン）、ポリ（エステル−ウレタン）尿素、ポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、またはその組み合わせから選択されるポリマーを含む。幾つかの実施形態では、ポリマー溶液は、キトサン−ポリ（Ｌ−乳酸−ｃｏ−ε−カプロラクトン）の混合物を含む。幾つかの実施形態では、ポリマー溶液は、ポリ乳酸−ゼラチンの混合物を含む。幾つかの実施形態では、ポリマー溶液は、ポリ乳酸−ケラチンの混合物を含む。幾つかの実施形態では、ポリマー溶液は、ゼラチン−ヒドロキシアパタイトの混合物を含む。幾つかの実施形態では、ポリマー溶液は、ヒアルロン酸またはその誘導体を含む。幾つかの実施形態では、ポリマー溶液は、カプロラクトンおよびリン酸エチルエチレンのコポリマーを含む。幾つかの実施形態では、ポリマー溶液は、ポリ乳酸を含む。幾つかの実施形態では、ポリマー溶液は、ジクロロメタンおよびＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドの混合溶媒に溶解されたポリ乳酸を含む。
【０１０１】
幾つかの実施形態では、ポリマー溶液は、生体適合性ポリマーを含む。幾つかの実施形態では、生体適合性ポリマーは、コラーゲンを含む。幾つかの実施形態では、コラーゲンは、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲンＶ型コラーゲン、ＶＩ型コラーゲン、ＶＩＩ型コラーゲン、ＶＩＩＩ型コラーゲン、ＩＸ型コラーゲン、Ｘ型コラーゲン、ＸＩ型コラーゲン、ＸＩＩ型コラーゲン、ＸＩＩＩ型コラーゲン、ＸＩＶ型コラーゲン、ＸＶ型コラーゲン、ＸＶＩ型コラーゲン、ＸＶＩＩ型コラーゲン、ＸＶＩＩＩ型コラーゲン、ＸＩＸ型コラーゲン、ＸＸ型コラーゲン、ＸＸＩ型コラーゲン、ＸＸＩＩ型コラーゲン、ＸＸＩＩＩ型コラーゲン、ＸＸＩＶ型コラーゲン、ＸＸＶ型コラーゲン、ＸＸＶＩ型コラーゲン、ＸＸＶＩＩ型コラーゲン、ＸＸＶＩＩＩ型コラーゲン、およびそれらの組み合わせから選択される。
【０１０２】
幾つかの実施形態では、ポリマー溶液は、ポリマーの１つのタイプから本質的に成る。幾つかの実施形態では、ポリマーは、コラーゲン（例えばコラーゲン溶液）から本質的に成る。幾つかの実施形態では、ポリマー溶液は、コラーゲンから本質的に成り、他のポリマーを含まない。幾つかの実施形態では、ポリマーは、約９０％、約９２％、約９４％、約９６％、約９８％、約９９％、または約１００％の純粋なコラーゲンである。幾つかの実施形態では、ポリマーは、本質的に純粋なコラーゲンである。幾つかの実施形態では、コラーゲンは、メタクリル化されたコラーゲンを含む。幾つかの実施形態では、コラーゲンは、ＰＢＳ、エタノール、水、ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ）、およびそれらの組み合わせから選択される溶媒中に溶解される。幾つかの実施形態では、コラーゲンは、ＰＢＳ／エタノールの混合物中で溶解される。幾つかの実施形態では、コラーゲンは、水中に溶解される。幾つかの実施形態では、コラーゲンは、ＨＦＩＰ中に溶解される。幾つかの実施形態では、コラーゲン溶液は、コラーゲンから本質的に成るポリマーファイバーを含むポリマー足場組成物（例えばコラーゲン足場組成物）を提供する。幾つかの実施形態では、コラーゲン足場組成物は、被験体に投与されることが可能である。
【０１０３】
幾つかの実施形態では、ポリマー足場組成物は、ポリマーの１つのタイプから本質的に成り、ここで、ポリマーは、コラーゲンであり、被験体に無毒である。幾つかの実施形態では、ポリマー足場組成物は、ポリマーの１つのタイプから本質的に成り、ここで、ポリマーは、コラーゲンであり、コラーゲン以外のポリマーを含むポリマー足場組成物と比べて、被験体に対してそれほど毒性ではない。幾つかの実施形態では、ポリマー足場組成物は、ポリマーの１つのタイプから本質的に成り、ここで、ポリマーは、コラーゲンであり、被験体から免疫反応を誘発しない。幾つかの実施形態では、ポリマー足場組成物は、ポリマーの１つのタイプから本質的に成り、ここで、ポリマーは、コラーゲンであり、コラーゲン以外のポリマーを含むポリマー足場組成物よりも被験体からより小さな免疫反応を誘発する。幾つかの実施形態では、ポリマー足場組成物は、ポリマーの１つのタイプから本質的に成り、ここで、ポリマーは、コラーゲンであり、被験体において容易にリモデリングされ及び／又は統合される。幾つかの実施形態では、コラーゲンは、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲンＶ型コラーゲン、ＶＩ型コラーゲン、ＶＩＩ型コラーゲン、ＶＩＩＩ型コラーゲン、ＩＸ型コラーゲン、Ｘ型コラーゲン、ＸＩ型コラーゲン、ＸＩＩ型コラーゲン、ＸＩＩＩ型コラーゲン、ＸＩＶ型コラーゲン、ＸＶ型コラーゲン、ＸＶＩ型コラーゲン、ＸＶＩＩ型コラーゲン、ＸＶＩＩＩ型コラーゲン、ＸＩＸ型コラーゲン、ＸＸ型コラーゲン、ＸＸＩ型コラーゲン、ＸＸＩＩ型コラーゲン、ＸＸＩＩＩ型コラーゲン、ＸＸＩＶ型コラーゲン、ＸＸＶ型コラーゲン、ＸＸＶＩ型コラーゲン、ＸＸＶＩＩ型コラーゲン、ＸＸＶＩＩＩ型コラーゲン、およびそれらの組み合わせから選択される。幾つかの実施形態では、コラーゲンは、メタクリル化されたコラーゲンを含む。
【０１０４】
幾つかの実施形態では、ポリマーは、約１ｗｔ％の溶液、約２ｗｔ％の溶液、約４ｗｔ％の溶液、約６ｗｔ％の溶液、約８ｗｔ％の溶液、約１０ｗｔ％の溶液、約１２ｗｔ％の溶液、約１４ｗｔ％の溶液、約１５ｗｔ％の溶液、約１６ｗｔ％の溶液、約１７ｗｔ％の溶液、約１８ｗｔ％の溶液、約１９ｗｔ％の溶液、２０ｗｔ％の溶液、または約２２ｗｔ％の溶液まで溶解される。幾つかの実施形態では、ポリマー溶液は、１６ｗｔ％の溶液まで溶解されたＩ型コラーゲンを含む。
【０１０５】
幾つかの実施形態では、ポリマー溶液は、約１ｗｔ％の溶液、約２ｗｔ％の溶液、約４ｗｔ％の溶液、約６ｗｔ％の溶液、約８ｗｔ％の溶液、約１０ｗｔ％の溶液、約１２ｗｔ％の溶液、約１４ｗｔ％の溶液、約１５ｗｔ％の溶液、約１６ｗｔ％の溶液、約１７ｗｔ％の溶液、約１８ｗｔ％の溶液、約１９ｗｔ％の溶液、２０ｗｔ％の溶液、または約２２ｗｔ％の溶液まで溶解されたポリ乳酸を含む。幾つかの実施形態では、ポリマー溶液は、１０ｗｔ％の溶液まで溶解されたポリ乳酸を含む。
【０１０６】
幾つかの実施形態では、ポリマー溶液は、親水性成分をさらに含む。幾つかの実施形態では、親水性成分は、ポリエチレングリコールおよびヒドロキシルアパタイトから選択される。幾つかの実施形態では、ポリマーは、ビオチンに共役される。幾つかの実施形態では、コレクターは、アビジンを含む。
【０１０７】
幾つかの実施形態では、ポリマー溶液は、細胞外マトリックス成分をさらに含む。幾つかの実施形態では、限定しない例によって、細胞外マトリックス成分は、ナイドジェン、エンタクチン、ラミニン、インテグリン、ジストログリカン、プロテオグリカン、パールカン、フィブリリン、基質接着分子、およびそれらの組み合わせから選択される。
【０１０８】
幾つかの実施形態では、ポリマー溶液は、酵素をさらに含む。幾つかの実施形態では、酵素は、プロテアーゼである。幾つかの実施形態では、プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、およびコラゲナーゼから選択される。
【０１０９】
幾つかの実施形態では、ポリマー溶液は、塩を含む。幾つかの実施形態では、限定しない例によって、塩は、マンガン塩、リン塩、マグネシウム塩、およびカルシウム塩から選択される。
【０１１０】
ポリマーファイバー
本明細書には、幾つかの実施形態において、ポリマーファイバーを含む組成物およびポリマーファイバーの生成のための方法およびシステムが開示される。幾つかの実施形態では、ポリマーファイバーは、約１ｎｍと１０ｎｍの間、約１０ｎｍと２０ｎｍの間、約２０ｎｍと３０ｎｍの間、約３０ｎｍと４０ｎｍの間、約４０ｎｍと５０ｎｍの間、約６０ｎｍと７０ｎｍの間、約７０ｎｍと８０ｎｍの間、約８０ｎｍと９０ｎｍの間、約９０ｎｍと１００ｎｍの間、約１００ｎｍと２００ｎｍの間、約２００ｎｍと約３００ｎｍの間、約３００ｎｍと４００ｎｍの間、約４００ｎｍと５００ｎｍの間、約５００ｎｍと６００ｎｍの間、約６００ｎｍと７００ｎｍの間、約７００ｎｍと８００ｎｍの間、約８００ｎｍと９００ｎｍの間、約９００ｎｍと１０００ｎｍの間の平均直径を有する。幾つかの実施形態では、ポリマーファイバーは、約１００ｎｍと１０００ｎｍの間の平均直径を有する。
【０１１１】
幾つかの実施形態では、ポリマーファイバーは、１ＭＰａ未満の平均の最大抗張力を所有する。幾つかの実施形態では、ポリマーファイバーは、架橋結合後に約０．１ＭＰａから約２０００ＭＰａの間の平均の最大抗張力を有する。幾つかの実施形態では、ポリマーファイバーは、架橋結合後に約０．１ＭＰａから約１０００ＭＰａの間の平均の最大抗張力を有する。幾つかの実施形態では、ポリマーファイバーは、架橋結合後に約１ＭＰａから約５００ＭＰａの間の平均の最大抗張力を有する。幾つかの実施形態では、ポリマーファイバーは、架橋結合後に約１ＭＰａから約１００ＭＰａの間の平均の最大抗張力を有する。幾つかの実施形態では、ポリマーファイバーは、架橋結合後に約１ＭＰａから約１０ＭＰａの間の平均の最大抗張力を有する。幾つかの実施形態では、ポリマーファイバーは、架橋結合後に、約１０ＭＰａから約２０ＭＰａの間、約２０ＭＰａから約３０ＭＰａの間、約３０ＭＰａから約４０ＭＰａの間、約４０ＭＰａから約５０ＭＰａの間、約５０ＭＰａから約６０ＭＰａの間、約６０ＭＰａから約７０ＭＰａの間、約７０ＭＰａから約８０ＭＰａの間、約８０ＭＰａから約９０ＭＰａの間、約９０ＭＰａから約１００ＭＰａの間、約１００ＭＰａから約１１０ＭＰａの間、約１１０ＭＰａから約１２０ＭＰａの間、約１２０ＭＰａから約１３０ＭＰａの間、約１３０ＭＰａから約１４０ＭＰａの間、約１４０ＭＰａから約１５０ＭＰａの間、約１５０ＭＰａから約１６０ＭＰａの間、約１６０ＭＰａから約１７０ＭＰａの間、約１７０ＭＰａから約１８０ＭＰａの間、約１８０ＭＰａから約１９０ＭＰａの間、約１９０ＭＰａから約２００ＭＰａの間、約２５０ＭＰａ、約３００ＭＰａ、約３５０ＭＰａ、約４００ＭＰａ、または約５００ＭＰａ、の平均の最大抗張力を有する。
【０１１２】
幾つかの実施形態では、ポリマーファイバーは、ポリ乳酸繊維を含む。幾つかの実施形態では、ポリ乳酸繊維は、ランダムに配向されたポリ乳酸繊維である。幾つかの実施形態では、ランダムに配向されたポリ乳酸繊維は、架橋結合後に約２５ＭＰａから約９０ＭＰａの間の平均の最大抗張力を有する。
【０１１３】
幾つかの実施形態では、ポリマーファイバーは、ポリ乳酸を含む。幾つかの実施形態では、ポリ乳酸繊維は、整列される。幾つかの実施形態では、整列したポリ乳酸繊維は、架橋結合後に約１２５ＭＰａから約３２５ＭＰａの間の平均の最大抗張力を有する。
【０１１４】
幾つかの実施形態では、ポリマーファイバーは、コラーゲン繊維、弾性繊維、細網繊維、またはその組み合わせを含む。幾つかの実施形態では、コラーゲン繊維は、アルファポリペプチド鎖を含む。幾つかの実施形態では、弾性繊維は、弾性のミクロフィブリルおよびエラスチンを含む。幾つかの実施形態では、細網繊維は、ＩＩＩ型コラーゲンを含む。
【０１１５】
細胞
本明細書には、幾つかの実施形態において、細胞またはその使用を含む、方法、組成物、およびシステムが開示される。幾つかの実施形態では、複数の細胞は、角化細胞、外分泌性上皮細胞、ホルモン分泌細胞、上皮細胞、神経または感覚細胞、光受容細胞、筋細胞、細胞外マトリックス細胞、血液細胞、心血管細胞、内皮細胞、血管平滑筋細胞、腎臓細胞、膵細胞、免疫細胞、幹細胞、胚細胞、哺育細胞、間質細胞、星細胞、肝細胞、胃腸細胞、肺細胞、気管細胞、血管細胞、骨格筋細胞、心細胞、皮膚細胞、平滑筋細胞、結合組織細胞、角膜細胞、尿生殖器細胞、乳腺細胞、生殖細胞、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、筋線維芽細胞、シュワン細胞、脂肪細胞、骨細胞、骨髄細胞、軟骨細胞、周細胞、中皮細胞、内分泌組織由来細胞、間質細胞、始原細胞、リンパ細胞、内胚葉由来細胞、外胚葉由来細胞、中胚葉由来細胞、周皮細胞、それらの前駆細胞、およびそれらの組み合わせ、から選択される。
【０１１６】
幾つかの実施形態では、複数の細胞は、軟骨性細胞、軟骨細胞、軟骨芽細胞、結合組織線維芽細胞、腱線維芽細胞、骨髄細網組織線維芽細胞、非上皮線維芽細胞、周皮細胞、骨原性細胞、骨芽細胞、破骨細胞、半月板細胞、またはそれらの組み合わせから選択される。
【０１１７】
幾つかの実施形態では、複数の細胞は、軟骨性細胞を含む。幾つかの実施形態では、軟骨性細胞は、血管細胞である。幾つかの実施形態では、軟骨性細胞は、無血管細胞である。幾つかの実施形態では、複数の細胞は、半月板細胞を含む。幾つかの実施形態では、半月板細胞は、血管細胞である。幾つかの実施形態では、半月板細胞は、無血管細胞である。
【０１１８】
幾つかの実施形態では、複数の細胞は、組織に由来するか、または組織から分離される。幾つかの実施形態では、組織は、結合組織を含む。幾つかの実施形態では、結合組織は、軟骨を含む。幾つかの実施形態では、結合組織は、腱を含む。幾つかの実施形態では、結合組織は、靭帯を含む。幾つかの実施形態では、結合組織は、筋膜を含む。幾つかの実施形態では、結合組織は、硬膜を含む。
【０１１９】
幾つかの実施形態では、複数の細胞は、幹細胞、骨髄幹細胞、始原細胞、全能細胞、多能性細胞、人工多能性幹細胞、未分化細胞、分化した細胞、分化する細胞、分化転換する細胞（ｔｒａｎｓ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ）、成人からの細胞、小児からの細胞、胚細胞、臍帯細胞、循環細胞、常在細胞、付着細胞、悪性細胞、腫瘍細胞、増殖細胞、休止細胞、老化細胞、アポトーシス細胞、サイトカインを生成する細胞、移動する細胞、およびそれらの組み合わせから選択される。
【０１２０】
幾つかの実施形態では、複数の細胞は、細胞接着分子を発現する。幾つかの実施形態では、細胞接着分子は、アドヘリン、カドヘリン、カルシンテニン（ｃａｌｓｙｎｔｅｎｉｎ）、クローディン、クラスター分化タンパク質（ｃｌｕｓｔｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）、コンタクチン、免疫グロブリン、インテグリン、レクチン、ネクチン、オクルジン、ビンキュリン、ポリミン（ｐｏｒｉｍｉｎ）、ポドプラニン、ポドカリキシン、ペリオスチン、ニューロトリミン（ｎｅｕｒｏｔｒｉｍｉｎ）、ニューレキシン、およびセレクチンの１つ以上から選択される。幾つかの実施形態では、細胞接着分子は、受容体である。幾つかの実施形態では、細胞接着分子は、膜貫通型タンパク質である。
【０１２１】
幾つかの実施形態では、複数の細胞は、遺伝子組み換えの細胞を含む。幾つかの実施形態では、遺伝子組み換えの細胞は、核酸の一時的なトランスフェクションによって遺伝子組み換えされる。幾つかの実施形態では、一時的なトランスフェクションは、リン酸カルシウムのトランスフェクション、リポソームのトランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション、またはソノポレーション（ｓｏｎｏ−ｐｏｒａｔｉｏｎ）から選択される。幾つかの実施形態では、遺伝子組み換えの細胞は、核酸を形質導入する、レトロウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルスによって遺伝子組み換えされる。幾つかの実施形態では、核酸は、ベクター、プラスミド、遺伝子、非コード核酸、エキソン、イントロン、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡから選択される。幾つかの実施形態では、核酸は、遺伝子を含む。幾つかの実施形態では、遺伝子は、真核性遺伝子である。幾つかの実施形態では、遺伝子は、原核生遺伝子である。
【０１２２】
幾つかの実施形態では、複数の細胞は、遺伝子突然変異を含む。幾つかの実施形態では、複数の細胞は、自然発生の遺伝子突然変異を含む。幾つかの実施形態では、自然発生の遺伝子突然変異は、生殖細胞系遺伝子突然変異または体細胞系遺伝子突然変異である。幾つかの実施形態では、複数の細胞は、誘導遺伝子突然変異を含む。幾つかの実施形態では、誘導遺伝子突然変異は、ランダム遺伝子突然変異または標的遺伝子突然変異を含む。幾つかの実施形態では、複数の細胞中の１つ以上の遺伝子は、遺伝子突然変異を含む。幾つかの実施形態では、複数の細胞中の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０遺伝子は、遺伝子突然変異を含む。幾つかの実施形態では、複数の細胞中の１０を超える遺伝子は、遺伝子突然変異を含む。幾つかの実施形態では、遺伝子は、複数の遺伝子突然変異を含む。
【０１２３】
幾つかの実施形態では、複数の細胞は、タグ、マーカー、または検出可能な酵素活性を有するタンパク質を発現する。幾つかの実施形態では、タグは、蛍光タンパク質である。幾つかの実施形態では、蛍光タンパク質は、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ−Ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ−モノマー、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＥＹＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ ＥＧＦＰ、ＣｙＰｅｔ、ｍＣＦＰｍ、Ｃａｒｕｌｅａｎ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ＧＦＰ、またはＹＦＰである。幾つかの実施形態では、タグは、ペプチドである。幾つかの実施形態では、ペプチドは、ｍｙｃ−タグ、ｃ−ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧ−タグ、Ｈｉｓ−タグ、ポリヒスチジンタグ、ＨＡ−タグ、Ｖ５、ＶＳＶＧ、ｓｏｆｔａｇ１、ｓｏｆｔａｇ３、発現タグ、Ｓタグ、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ジニトロフェニル、トリニトロフェニル、ペリジニンクロロフィルタンパク質複合体、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、ビオチン、フィコエリトリン（ＰＥ）、ストレプトアビジン、アビジン、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ＳＵＭＯタグ、チオレドキシン、ポリ（ＮＡＮＰ）、ポリ−Ａｒｇ、カルモジュリン結合タンパク質、ＰｕｒＦフラグメント、ケトステロイドイソメラーゼ、ＰａＰ３．３０、ＴＡＦ１２ヒストン型折り畳みドメイン、マルトース結合タンパク質、ビーズ、およびそれらの組み合わせまたはそれらの一部である。幾つかの実施形態では、マーカーは、パルミトイル化、ミリストイル化、グリコシル化、またはニトロシル化である。
【０１２４】
細胞溶液
幾つかの実施形態では、複数の細胞は、細胞溶液中にある。幾つかの実施形態では、複数の細胞は、細胞溶液中で懸濁される。幾つかの実施形態では、複数の細胞は、リマー足場組成物に複数の細胞を加える前に細胞溶液中で懸濁される。幾つかの実施形態では、複数の細胞は、エレクトロスプレー処理の前に細胞溶液中で懸濁される。幾つかの実施形態では、細胞溶液は、バイオゲル、ヒドロゲル、生体模倣ゲル、細胞培養培地、緩衝液、食塩水、または生物培地から選択される。
【０１２５】
幾つかの実施形態では、限定しない例によって、細胞溶液は、細胞培養培地を含む。幾つかの実施形態では、細胞培養培地は、Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔｓ、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ／Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｆ−１２ Ｍｅｄｉａ、Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１０ Ｍｅｄｉａ、Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１２ Ｍｅｄｉａ、Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ、Ｍｅｄｉｕｍ １９９、ＲＰＭＩ−１６４０ Ｍｅｄｉｕｍ、Ａｍｅｓ’ Ｍｅｄｉａ、ＢＧＪｂ Ｍｅｄｉｕｍ （Ｆｉｔｔｏｎ−Ｊａｃｋｓｏｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、Ｃｌｉｃｋ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ、ＣＭＲＬ−１０６６ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｇｌａｓｃｏｗ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ （ＧＭＥＭ）、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ （ＩＭＤＭ）、Ｌ−１５ Ｍｅｄｉｕｍ （Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ）、ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｍｅｄｉｕｍ、ＮＣＴＣ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｓｗｉｍ’ｓ Ｓ−７７ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｗａｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅ、およびそれらの組み合わせから選択される。幾つかの実施形態では、細胞培養培地は、生体血清（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｅｒｕｍ）を含む。幾つかの実施形態では、生体血清は、ウシ胎児血清、ウシ胎仔血清、ヤギ胎児血清、ウマ胎児血清、またはそれらの組み合わせを含む。幾つかの実施形態では、細胞培養培地の生体血清含有量は、約０．５％ｖ／ｖ、約１％ｖ／ｖ、約２％ｖ／ｖ、約５％ｖ／ｖ、約１０％ｖ／ｖ、約１５％ｖ／ｖ、約２０％ｖ／ｖ、約５０％ｖ／ｖ、約９９％ｖ／ｖ、または約１００％ｖ／ｖである。幾つかの実施形態では、細胞培養培地は、緩衝剤を含む。幾つかの実施形態では、限定しない例によって、緩衝剤は、ＭＥＳ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、アセトアミドグリシン（Ａｃｅｔａｍｉｄｏｇｌｙｃｉｎｅ）、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＨＥＰＰＳ、トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、グリシンアミド（Ｇｌｙｃｉｎａｍｉｄｅ）、ビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、ＴＡＰＳ、およびそれらの組み合わせから選択される。
【０１２６】
幾つかの実施形態では、細胞溶液は、生体模倣ゲルを含む。本明細書で使用されるように、幾つかの実施形態では、用語、生体模倣ゲル、バイオゲル、およびヒドロゲルは、交換可能に使用される。幾つかの実施形態では、生体模倣ゲルは、ポリマーを含む。幾つかの実施形態では、限定しない例によって、ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＥＧマクロマー、ポリエチレングリコールメタクリラート（ＰＥＧＭＡ）、ポリエチレンジメタクリラート（ＰＥＧＤＭＡ）、ポリ（ヒドロキシ−エチルメタクリラート）（ＰＨＥＭＡ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ポリイミド（ＰＩ）、ポリアクリレート（ＰＡＡ）、ポリウレタン（ＰＵ）、ＰＥＧ−ラクチド、ＰＥＧ−グリコリド、またはそれらの組み合わせから選択される。幾つかの実施形態では、生体模倣ゲルは、ＰＥＧＤＭＡヒドロゲルを含む。幾つかの実施形態では、ＰＥＧＤＭＡヒドロゲルは、１０％ｗ／ｖのＰＥＧＤＭＡヒドロゲルである。幾つかの実施形態では、ＰＥＧＤＭＡヒドロゲルは、２０％ｗ／ｖのＰＥＧＤＭＡヒドロゲルである。幾つかの実施形態では、生体模倣ゲルは、ポリマーを含まない。幾つかの実施形態では、ＰＥＧマクロマーは、アクリラート、メタクリラート、アリルエーテル、マレイミド、ビニルスルホン、ＮＨＳエステル、およびビニルエーテル基などの、反応性鎖末端を含む。幾つかの実施形態では、ＰＥＧのアルコール鎖末端は、塩基の存在下で酸塩化物（例えば、塩化アクリル、塩化メタクリロイル）によってエステル化される。幾つかの実施形態では、ＰＥＧ鎖末端は、２−クロロエチルビニルエーテルまたは臭化アリルなどの、ハロゲン化アルキルとの反応によって塩基性条件下でエーテル化される。幾つかの実施形態では、アクリラート、メタクリラート、ビニルスルホン、マレイミド、ビニルエーテル、およびアリルエーテルは、段階的成長の（ｇｒｏｗｔｈ ｎｅｔｗｏｒｋ）ネットワーク形成または重合が可能である。幾つかの実施形態では、重合は、レドックスで生成されたラジカル（例えば、加硫酸アンモニウムおよびＴＥＭＥＤ）、または光で生成されたラジカルを使用して始められる。
【０１２７】
幾つかの実施形態では、生体模倣ゲルは、アルギン酸塩、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）、ヒアルロナン、フィブリノゲン、コンドロイチン硫酸塩、グリセロール、セルロース、アガロース、ゼラチン、キトサン、パラフィン、シリカ、フィブリン、またはそれらの組み合わせをさらに含む。幾つかの実施形態では、生体模倣ゲルは、ペプチド、アミノ酸、ジペプチド、プロテオグリカン、糖タンパク質、界面活性剤、デンプン、またはそれらの組み合わせを含む。
【０１２８】
幾つかの実施形態では、細胞溶液は、糖タンパク質を含む。幾つかの実施形態では、糖タンパク質は、ラブリシンを含む。幾つかの実施形態では、細胞溶液は、関節内潤滑剤を含む。幾つかの実施形態では、関節内潤滑剤は、ゼラチン、ヘパリン、関節液、またはその組み合わせを含む。
【０１２９】
幾つかの実施形態では、細胞溶液は、タンパク質、ペプチド、塩、ｐＨバッファー、細胞外マトリックス成分、化学物質、生化学的因子、多糖類、薬物およびカルボン酸を含む。
【０１３０】
幾つかの実施形態では、限定しない例によって、薬物は、抗生物質及び／又は抗真菌剤から選択される。幾つかの実施形態では、限定しない例によって、抗生物質は、ペニシリン、ストレプトマイシン、アクチノマイシンＤ、アンピシリン、ブラストサイジン、カルベニシリン、セフォタキシム、ホスミドマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ポリミキシンＢ、およびそれらの組み合わせから選択される。幾つかの実施形態では、限定しない例によって、抗真菌剤は、アムホテリシンＢ、ナイスタチン、ナタマイシン、およびそれらの組み合わせから選択される。幾つかの実施形態では、限定しない例によって、薬物は、抗炎症薬である。幾つかの実施形態では、抗炎症薬は、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）である。幾つかの実施形態では、限定しない例によって、ＮＳＡＩＤは、サリチル酸、アセチルサリチル酸、イブプロフェン、イブプロフェンリジン、デフルニサル（ｄｅｆｌｕｎｉｓａｌ）、サルサレート、トリサルチル酸コリンマグネシウム、ナプロキセン、フェノプロフェン、ケトプロフェン、デクスケトプロフェン、フルビプロフェン（ｆｌｕｂｉｐｒｏｆｅｎ）、エキサプロジン（ｅｘａｐｒｏｚｉｎ）、ロキソプロフェン、インドメタシン、トルメチン、スリンダク、エトドラク、およびスルホンアニリドから選択される。幾つかの実施形態では、非ステロイド性抗炎症薬は、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）阻害剤である。幾つかの実施形態では、ＣＯＸ阻害剤は、ＣＯＸ１阻害剤、ＣＯＸ２阻害剤、およびそれらの組み合わせから選択される。幾つかの実施形態では、ＣＯＸ阻害剤は、アセトアミノフェンまたはその誘導体である。幾つかの実施形態では、抗炎症薬は、ステロイドである。幾つかの実施形態では、限定しない例によって、ステロイドは、グルココルチコイド、プレドニゾン、メチルプレドニゾン（ｍｅｔｈｙｌｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ）、プレドニゾロン、メドロール、ベクロメタゾン（ｂｅｃｌｏｍｅｔｈｓｏｎｅ）、ブデソニド、フルニソリド、フルチカゾン、およびトリアムシノロンから選択される。
【０１３１】
幾つかの実施形態では、限定しない例によって、細胞溶液は、タンパク質及び／又はペプチドを含む。幾つかの実施形態では、タンパク質及び／又はペプチドは、ホルモン、成長因子、プロテアーゼ、酵素、キナーゼ、サイトカイン、ケモカイン、構造タンパク質、リガンド、およびそれらの組み合わせから選択される。
【０１３２】
幾つかの実施形態では、限定しない例によって、成長因子は、アドレノメデュリン（ＡＭ）、アンジオポエチン（Ａｎｇ）、自己分泌型細胞運動刺激因子、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、エリトロポイエチン（ＥＰＯ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、果粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、増殖分化因子９（ＧＤＦ９）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、肝癌由来増殖因子（ＨＤＧＦ）、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、遊走刺激因子（Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）、ミオスタチン（Ｍｙｏｓｔａｔｉｎ）（ＧＤＦ−８）、神経成長因子（ＮＧＦ）および他のニューロトロフィン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、形質転換増殖因子アルファ（ＴＧＦアルファ）、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦベータ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）、ウシ胎児ソマトトロピン、およびそれらの組み合わせから選択される。幾つかの実施形態では、成長因子は、ＴＧＦベータである。
【０１３３】
幾つかの実施形態では、ＴＧＦベータは、約１ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ、約３ｎｇ／ｍＬ、約４ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約６ｎｇ／ｍＬ、約７ｎｇ／ｍＬ、約８ｎｇ／ｍＬ、約９ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１１ｎｇ／ｍＬ、約１２ｎｇ／ｍＬ、約１３ｎｇ／ｍＬ、約１４ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約１６ｎｇ／ｍＬ、約１７ｎｇ／ｍＬ、約１８ｎｇ／ｍＬ、約１９ｎｇ／ｍＬ、または約２０ｎｇ／ｍＬの濃度を有する。幾つかの実施形態では、ＴＧＦベータは、細胞培養培地中で、約５０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ約３００ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ、または約１μｇ／ｍＬの濃度で存在する。幾つかの実施形態では、ＴＧＦベータは、細胞培養培地の１０ｎｇ／ｍｌの濃度を有する。
【０１３４】
幾つかの実施形態では、タンパク質は、ＩＩ型コラーゲン、コンドロイチン硫酸塩、ヒアルロナン、およびそれらの組み合わせから選択される。幾つかの実施形態において、タンパク質は、酵素である。幾つかの実施形態では、酵素は、プロテアーゼである。幾つかの実施形態では、限定しない例によって、プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパルテートプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、エキソペプチダーゼ、エンドペプチダーゼ、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、エラスターゼ、カルボキシペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、トロンビン、プラスミン、カテプシン、またはヘビ毒から選択される。幾つかの実施形態では、プロテアーゼは、コラゲナーゼである。
【０１３５】
幾つかの実施形態では、細胞溶液は、支持材を含む。幾つかの実施形態では、支持材は、細胞外マトリックス成分またはそのフラグメントを含む。幾つかの実施形態では、限定しない例によって、細胞外マトリックス成分は、ナイドジェン、エンタクチン、ラミニン、インテグリン、ジストログリカン、パールカン、フィブリリン、フィブリン、フィブロネクチン、基質接着分子、およびそれらの組み合わせから選択される。
【０１３６】
幾つかの実施形態では、細胞外マトリックス成分は、ヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、チンパンジー、サル、ラット、ブタ、マウス、ウサギ、または合成反応に由来する。
【０１３７】
幾つかの実施形態では、細胞溶液は、細胞分化薬剤（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ）を含む。幾つかの実施形態では、細胞溶液は、細胞培養上清または細胞培養調整培地を含む。
【０１３８】
幾つかの実施形態では、複数の細胞は、１ミリリットル当たり１個未満の細胞の細胞溶液の密度を有する。幾つかの実施形態では、複数の細胞は、約１０細胞／ｍＬ未満の細胞溶液の密度を有する。幾つかの実施形態では、複数の細胞は、約１００細胞／ｍＬ未満の細胞溶液の密度を有する。幾つかの実施形態では、複数の細胞は、約１００細胞／ｍＬ、約２００細胞／ｍＬ、約３００細胞／ｍＬ、約４００細胞／ｍＬ、約５００細胞／ｍＬ、約６００細胞／ｍＬ、約７００細胞／ｍＬ、約８００細胞／ｍＬ、約９００細胞／ｍＬ、または約１，０００細胞／ｍＬの細胞溶液の密度を有する。幾つかの実施形態では、複数の細胞は、１，０００細胞／ｍＬを超える細胞溶液の密度を有する。幾つかの実施形態では、複数の細胞は、１ミリリットル当たり、約１０，０００、約１５，０００、約２０，０００、約２５，０００、約３０，０００、約３５，０００、約４０，０００、約４５，０００、約５０，０００、約５５，０００、約６０，０００、約６５，０００、約７０，０００、約７５，０００、約８０，０００、約８５，０００、約９０，０００、または約１００，０００個の細胞の細胞溶液の密度を有する．幾つかの実施形態では、複数の細胞は、１００，０００細胞／ｍＬを超える細胞溶液の密度を有する。幾つかの実施形態では、複数の細胞は、１ミリリットル当たり約５０，０００個の細胞の細胞溶液の密度を有する。
【０１３９】
本発明の好ましい実施形態が、本明細書に示され、記載されている一方で、そのような実施形態が単に例示目的のみで提供されることは当業者に明白である。多数の変更、変化、および置換が、本発明から逸脱することなく、当業者によって想到されるであろう。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代替案が、本発明を実行する際に利用されることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義するものであり、これらの特許請求の範囲およびそれらの同等物の範囲内の方法および構造が、それによって包含されることが意図される。
【実施例】
【０１４０】
実施例１：ポリ乳酸（ＰＬＡ）溶液からの整列されたファイバーを備えたナノファイバー状の、生分解性および生体模倣の足場をエレクトロスピニング処理する工程
【０１４１】
本研究では、ＰＬＡのナノファイバー状のマトリックスを、生分解性および生体模倣の足場へとエレクトロスピニング処理した。ファイバー沈着を回転コレクター上へと配向することによって、ＰＬＡのナノファイバー状の足場を整列させ、整列の程度を、コレクターの回転速度によって制御した。この制御可能な足場は、順に、足場の異方性の機械的性質を決定した。エレクトロスピニング処理したＰＬＡナノファイバーの細胞適合性および細胞行動を分析するために、正常なヒトの血管および無血管の領域の半月板細胞を、ＰＬＡナノファイバー状のマトリックス上に播種した。その後、多層構成物を、組織学的検査によって形成し、特徴づけた。
【０１４２】
材料および方法
ポリ乳酸（ＰＬＡ）足場の製作
ＰＬＡ（Ｍｖ＝１００，０００、ＮａｔｕｒｅＷｏｒｋｓ ＬＬＣ，ＵＳＡ）を、室温で４８時間撹拌することによって、ジクロロメタンとＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）の混合溶媒（８／２ｗ／ｗ）中に溶解し、均質な１０ｗｔ％の溶液を得た。ＰＬＡ溶液を、シリンジに充填し、これを、２．０ｍＬ／ｈの供給率でシリンジポンプ（ＫＤＳ２００， ＫＤ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．， ＵＳＡ）によって促した（ｄｒｉｖｅｎ）。テフロン（登録商標）のチューブを、シリンジと２１Ｇのニードル（０．５ｍｍの内径）を接続するために使用し、これを水平にセットアップした。ＰＬＡ溶液に１５〜２０ｋＶの電圧をかけるために、電圧を調節したＤＣパワーサプライ（ＮＮＣ−３０ｋＶ−２ｍＡ携帯型，ＮａｎｏＮＣ，Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）を使用し、ポリマージェットを生成した。エレクトロスピニング処理したファイバーを、アルミ箔によって覆われたコレクター上のウェブ（ｗｅｂ）の形状で堆積せた。ランダムなファイバーを収集するために、紡糸距離（ｔｉｐ−ｔｏ−ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ ｄｉｓｔａｎｃｅ）（ＴＣＤ）を、コレクターとして平板上で１６ｃｍに設定した。整列したファイバーを収集するために、回転ドラムコレクター（〜２４００ｒｐｍ）を、ドラムの接線からニードル先端部まで１２ｃｍのところに置いた。ランダムな及び整列したエレクトロスピニング処理した足場を生成するために使用されるシステムの概略図を、図６のＡおよびＢに示す。
【０１４３】
ＰＬＡ足場の組織形態の評価
エレクトロスピニング処理したＰＬＡ足場の形態を、１０ｋＶの加速電圧を有する走査電子顕微鏡検査（ＳＥＭ）（Ｐｈｉｌｉｐｓ ＸＬ３０， ＦＥＩ Ｃｏ．， Ａｎｄｏｖｅｒ， ＭＡ）下で研究した。足場を、イオンスパッタ装置（Ｅｍｉｔｅｃｈ Ｋ５７５Ｘ， ＥＭ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ， Ｅｎｇｌａｎｄ）を使用して、イリジウムで覆った。個々のエレクトロスピニング処理したファイバーの直径を、画像処理ソフトウェア（Ｉｍａｇｅ Ｊ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， ＵＳＡ）を使用して、ＳＥＭ画像から測定した。
【０１４４】
組織および細胞の分離
正常なヒト半月板（内側および外側）を、組織バンク（Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄの認可を有する）の６人のドナー（平均年齢：２９．８±４．７；年齢層：２３−３５歳；女性２人、男性４人）から得た。正常な半月板を、前に報告された巨視的および組織学的な採点システム（Ｐａｕｌｉ， ｅｔ ａｌ．， ２０１１）に従って選択した。半月板（血管領域）の外側１／３（無血管領域）および内側２／３を、メスで分離し、５−６時間、ＤＭＥＭ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ Ｉｎｃ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ）中のコラゲナーゼ（２ｍｇ／ｍＬ；  Ｃ５１３８， Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）および１％のペニシリン−ストレプトマイシン−ファンギゾン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）を使用して、酵素的に消化した。消化した組織を、１００μｍのセルストレイナー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ）に通してフィルターにかけ、１０％の子ウシ血清（Ｏｍｅｇａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ． Ｔａｒｚａｎａ， ＣＡ）および１％のペニシリン／ストレプトマイシン／ゲンタマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補足したＤＭＥＭ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）中で単層培養において播種した。足場を播種する実験での使用前に、細胞を１継代の間培養した。
【０１４５】
単層状のＥＳ ＰＬＡ足場上の細胞培養
半月板の無血管または血管の領域からのヒト細胞を、６ウェルのプレートにおいて１ｍＬ当たり１ｘ１０６の密度でランダムな及び整列したＰＬＡ足場上へと別々に接種した。１０％の子ウシ血清、および１％のペニシリン、ストレプトマイシン、およびゲンタマイシンを補足したＤＭＥＭ中で細胞を３−５日間培養し、細胞付着および足場コロニー形成を可能にした。続いて、培地を、１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦベータ１（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ， Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ， ＮＪ）を補足した無血清のＩＴＳ＋培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に変更した。培地での２週間の培養を３−４日ごとに変更した後、足場上の細胞を、共焦点顕微鏡法により細胞の生存率に関して、および組織学的検査およびＳＥＭにより細胞形態に関して評価した。
【０１４６】
ＰＬＡ足場の機械的性質
ＰＬＡ足場の機械的性質を、引張試験（１群当たりｎ＝１０）によって定量化した。ランダムな及び整列した足場の両方を、以下の３つの異なる条件下で試験した：ｉ）試験した新たにエレクトロスピニング処理した乾燥した足場を、生成の１日以内にあった；ｉｉ）足場を、無血管のヒト半月板細胞で播種し、１週間および３週間培養した；およびｉｉｉ）足場を、細胞なしで１週間および３週間培養した。エレクトロスピニング処理した足場を、カスタムパンチを使用して、８ｍｍのゲージ長および２ｍｍの幅で、ドッグボーン形状の試験片へと切断した。各足場の厚さを、デジタルキャリパを使用して測定し、平均±標準偏差（ＳＤ）として報告した。培養細胞を播種した無細胞の足場の機械試験のために、ヒトの無血管細胞（０．５ｘ１０６、細胞／各サンプル）を、ドッグボーン形状の整列したＰＬＡ足場上で播種した。すべての培養物に、１日間、１０％の子ウシ血清および１％のペニシリン、ストレプトマイシン、およびゲンタマイシンをＤＭＥＭ中で補足し、細胞付着および足場コロニー形成を可能にした。続いて、培地を、培地を、１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦベータ１（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ， Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ， ＮＪ）を補足した無血清のＩＴＳ＋培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に変更した。培地での１週間および３週間の培養を、３−４日ごとに変更した後、細胞を播種した及び播種しなかった足場を、機械的性質のために評価した。
【０１４７】
試験片を、５００Ｎのロードセルでの一軸試験機（Ｉｎｓｔｒｏｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｔｅｓｔｉｎｇ Ｍａｃｈｉｎｅ， ３３４２ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｏｌｕｍｎ Ｍｏｄｅｌ； Ｎｏｒｗｏｏｄ， ＭＡ）のグリップに載せ、試験し、１ｍｍ／秒の歪速度で失敗した。ゲージ長の外部で失敗したサンプルからのデータを廃棄した。ヤング率を、応力−歪み曲線の線形セグメントの勾配から計算した。最大抗張力（ＵＴＳ）を、失敗前に最大荷重（ｍａｘｉｍｕｍ ｌｏａｄ）で計算した。値を、平均±標準偏差として表わした。
【０１４８】
ＰＬＡ足場の機械的性質
ヒトの無血管半月板細胞（継代１）を、１ｍＬ当たり１ｘ１０６細胞で、ＩＩ型コラーゲン、コンドロイチン硫酸塩、およびヒアルロナン（各々１ｍｇ）から成るヒドロゲル中で懸濁した。ヒドロゲル中で懸濁した細胞を、１つの整列したＰＬＡ足場（５０μＬ）上で接種さし、その後、別の足場シートをその上に層状化した。別の細胞層を、適用し、その後、最後の第３の足場を上に層状化した（図６のＣ）。足場層を安定化させるために、２％のアルギン酸塩（ＰＲＯＮＯＶＡ ＵＰ ＬＶＧ； Ｎｏｖａｍａｔｒｉｘ， Ｓａｎｄｖｉｋａ， Ｎｏｒｗａｙ）の層を、構成物上に調剤し、２０分間塩化カルシウム（１２０ｍＭ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中で架橋結合した。層状になった構成物を、ＴＧＦベータ１（１０ｎｇ／ｍＬ）を補足した無血清培地中で培養した。
【０１４９】
細胞生存度の評価
ＰＬＡ足場上で培養した細胞の生存度を、カルセイン（Ｃａｌｃｅｉｎ）−ＡＭおよびエチジウムホモダイマー（Ｅｔｈｉｄｉｕｍ Ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）−１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から成る生／死判定キット（ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ ｋｉｔ）および以前に記載したような（Ｇｒｏｇａｎ， ｅｔ ａｌ．， ２００２）レーザー共焦点顕微鏡（ＬＳＭ−５１０， Ｚｅｉｓｓ， Ｊｅｎａ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して観察した。
【０１５０】
単層状のＰＬＡ足場上の無血管の半月板細胞の細胞形態
エレクトロスピニング処理したＰＬＡ足場上で成長させた細胞の高分解能の特徴を観察するために、ＳＥＭを使用した。７日目および１４日目の培養時間後、基質上の細胞を、ＰＢＳで洗浄し、１時間ＰＢＳ中で２．５％ｗ／ｖのグルタルアルデヒド溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で固定した。固定後、それらを、各々、１０分間ＰＢＳで３回洗浄した。その後、細胞を、各々３０分間、類別した一連の（ａ ｇｒａｄｅｄ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ）エタノール（５０％、７０％、および９０％）中で脱水し、マイナス４℃より下の温度で２４時間１００％のエタノール中に残した。次に、それらを、臨界点ドライヤー（Ａｕｔｏｓａｍｄｒｉ−８１５， Ｓｅｒｉｅｓ Ａ， Ｔｏｕｓｉｍｉｓ Ｉｎｃ．， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）で完全に乾燥するまで、１００％のエタノール中で維持した。その後、乾燥したサンプルを、ＳＥＭ検査用のイリジウムを用いてイオンスパッタ法によって表面を金属化した。足場および付着細胞の形態を、ＳＥＭ（Ｐｈｉｌｉｐｓ ＸＬ３０， ＦＥＩ Ｃｏ．， Ａｎｄｏｖｅｒ， ＭＡ）によって観察した。
【０１５１】
組織学的検査および免疫組織化学的検査
無血管の半月板細胞を播種したＰＬＡ足場層を、Ｚ−Ｆｉｘ（ＡＮＡＴＥＣＨ， Ｂａｔｔｌｅ Ｃｒｅｅｋ， ＭＩ）中に固定し、パラフィンに埋め込んだ。５−７μｍの切片を、Ｈ＆ＥおよびサフラニンＯファストグリーンで染色した。免疫組織化学的検査によるＩ型コラーゲンの検出のために、切断部を、２時間ヒアルロニダーゼで処理し（Ｒｏｂｅｒｔｓ， ｅｔ ａｌ．， ２００９）、１０μｇ／ｍＬでＩ型コラーゲンに対する一次抗体（クローン：Ｉ−８Ｈ５；ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ， Ｓａｎｔａ Ａｎａ， ＣＡ）でインキュベートした。二次抗体染色および検出の手順を、前に記載したように（Ｇｒｏｇａｎ， ｅｔ ａｌ．， ２００９）続けた。非特異性の染色をモニタリングするために、アイソタイプコントロールを使用した。
【０１５２】
ＲＮＡ分離およびＲＴ−ＰＣＲ
総ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙのミニキット（Ｑｉａｇｅｎ， Ｈｉｌｄｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して単層状のＰＬＡ構成物から分離し、第１鎖ｃＤＮＡを、製造業者のプロトコル（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）に従って作製した。定量ＲＴ−ＰＣＲを、ＴａｑＭａｎ（登録商標）の遺伝子発現試薬を使用して実行した。ＣＯＬ１Ａ１、アグリカン、ＳＯＸ９、ＣＯＭＰおよびＧＡＰＤＨを、Ａｓｓａｙｓ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ（商標）のプライマー／プローブセット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して検出した。遺伝子発現レベルを標準化するために、ＧＡＰＤＨを、ΔＣｔ方法を用いて活用した。
【０１５３】
統計分析
繊維直径、機械的性質、および遺伝子発現レベルの差の有意性を統計的に評価するために、スチューデントｔ検定を使用した。０．０５未満のＰ値を、有意であると考えた。
【０１５４】
結果
エレクトロスピニング処理したランダムな及び整列されたＰＬＡ繊維状足場の制御された生成
整列した及びランダムなエレクトロスピニング処理したＰＬＡファイバーの形態学的構造を、図７に示す。使用される回転ドラム速度（〜２４００ｒｐｍ）および送達パラメータは、高度の整列（図７のＢ）を有する足場構造をもたらした。整列したファイバーの平均直径は、１．２５±０．３１μｍ（範囲：０．４６−２．３２μｍ）であり、ランダムなＰＬＡファイバーに対しては１．３１±０．５６μｍ（範囲：０．７０−３．８４μｍ）であった。ランダムな足場は、０．１５±０．０４ｍｍの厚さを有し；整列した足場の厚さは、０．０９±０．０３ｍｍであった。
【０１５５】
細胞形態および組織化は、ＰＬＡ繊維配向に依存する。
ランダムにエレクトロスピニング処理したＰＬＡ足場上で播種された細胞を、平らにし、多方向の伸展とともに広げ（図７のＣ）、一方で、整列したＰＬＡ足場上の細胞を、ファイバーの方向に沿って伸長した（図７のＤ）。形態と整列のこれらの差は、共焦点像にも反映され（図７のＥおよびＦ）、これは、両方の足場に対する高い細胞生存度の証拠を提供した。
【０１５６】
半月板細胞の表現型は、繊維配向によって又は分離の領域から変更されない。
単層培養中の半月板細胞と比較して（図８で点線によって示されたベースラインの制御遺伝子発現レベル）、ランダムな及び整列したＥＳ ＰＬＡ足場の両方の上で培養された血管領域および無血管領域のいずれかに由来する細胞は、増加したＣＯＬ１Ａ１、ＳＯＸ９（図８のＡ）、およびＣＯＭＰ（図８のＢ）の遺伝子発現レベルを示した。アグリカンｍＲＮＡの減少が、両方の足場上の細胞において見られた（２倍）（図８のＡ）。
【０１５７】
整列したエレクトロスピニング処理したＰＬＡ足場の高引張性の機械的性質
ランダムな及び整列した足場のヤング率および最大抗張力（ＵＴＳ）を、図９および表１に示す。ランダムな足場は、６７．３１±２．０４のＭＰａの平均縦弾性係数を有する。整列したナノファイバーと平行な方向に試験された、整列した足場は、ランダムな足場と比較して、３２２．４２±３４．４０ＭＰａの著しく大きな（ｐ＜０．００１）縦弾性係数をもたらした。しかしながら、整列した方向に垂直な縦弾性係数は、７．１８±１．２７ＭＰａであり、ランダムな足場（ｐ＜０．００１）より著しく低かった。同様に、整列した足場のＵＴＳは、著しく（ｐ＜０．００１）より高かった：ランダムなＥＳ足場において測定された３．８±０．２１ＭＰａと比較して、１４．２４±１．４５ＭＰａ（整列の方向に平行）。
【０１５８】
ランダムな足場は、前降伏領域（ｐｒｅ−ｙｉｅｌｄ ｒｅｇｉｏｎ）で比較的線形の応力−歪み曲線を示し、降伏後に非線形に伸びた。繊維配向の方向で試験された整列した足場は、「つま先領域」を有して応力のより急激な増加および変形の増加（図９Ｃ）をもたらし、歪み領域においてより初期の比較的隣接した点で，たわみ（ｙｉｅｌｄｅｄ）、失敗した。整列した足場を、回転方向に垂直な方向で測定し、はるかに低い応力−歪み応答を示した。
【０１５９】
【表１】
2017516601.tif 000003
【０１６０】
細胞を播種した及び対になった無細胞の足場の機械的性質を、培養中の時間とともに引張試験を介して評価した（表２）。すべての足場の剛性は、培養中の時間とともに幾らかの減少を示した。しかしながら、細胞を播種した足場は、より高い剛性を一貫してもたらし、高い最大抗張力に達した。
【０１６１】
【表２】
2017516601.tif 000004
【０１６２】
多層ＰＬＡの細胞を播種した足場は、半月板状の新生組織の形成を支持する
整列した足場を使用する多層構成物を作製したが、その理由は、これが３００ＭＰａを超える縦弾性係数を有する周辺のコラーゲン繊維束を模倣するためである。ヒトの無血管半月板細胞を、ＩＩ型コラーゲン、コンドロイチン硫酸塩、およびヒアルロナン（各々１ｍｇ）で構成される生体模倣ゲル内の３つの足場上へと播種し、塩化カルシウムと架橋結合した２％のアルギン酸塩の層とともに適所に保持した（図６のＣ）。２週齢の構成物は、サフラニンＯネガティブ（Ｓａｆｒａｎｉｎ−Ｏ ｎｅｇａｔｉｖｅ）（図１０のＡおよびＢ）であった新生組織を生成し、細胞外マトリックスは、Ｉ型コラーゲンで構成され（図１０のＣおよびＤ）、細胞は、ＥＳ ＰＬＡファイバーと同じ方向／配向に伸長された。さらに、新生組織は、ＰＬＡ足場の３つの層を一緒に融合し、細胞は、３層の構成物の内部に及びその全体にわたって浸潤し、分配された。
【０１６３】
実施例２：半月板の組織工学：エレクトロスピニング処理したコラーゲンへの細胞播種
本研究では、Ｉ型コラーゲンで構成されるエレクトロスピニング構造および半月板の血管および無血管の領域からのヒトの半月板細胞を播種した天然ヒドロゲルの生成を、天然組織を模倣する足場を生成するために組み合わせた。
【０１６４】
材料および方法
ウシのＩ型コラーゲン（ＰＢＳおよびエタノール中に１６ｗｔ％の溶液）を、０．１ｍＬ／ｈの供給率および１５〜２０ｋＶの電圧でシリンジポンプの送達によってエレクトロスピニング処理した（ＥＳ）。ランダムなＥＳ足場を、平らなプレートコレクター上で生成し、整列したＥＳ足場を、回転ドラムシリンダ上に収集した。ＥＳ足場を、ＰＢＳ中のグルタルアルデヒド溶液（０．２５％）において架橋結合した。４人のドナーからのヒト半月板を、組織バンク（Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄによって認可された）から得て、細胞を、コラゲナーゼにおいて酵素消化を介して分離し、１０％のＣＳ＋１％のＰＳＧを有するＤＭＥＭ中で１継代の間、培養拡張した（ｃｕｌｔｕｒｅ ｅｘｐａｎｄｅｄ）。培養細胞を、６ウェルのプレートにおいて１足場（２ｘ３ｃｍ）当たり５０ｘ１０３の密度で足場上で播種した。播種した足場（ランダムな又は整列したコラーゲン）を、ＴＧＦベータ１（１０ｎｇ／ｍｌ）を補足した無血清培地（ＩＴＳ＋）に変更する前に、４−５日間１０％のＣＳ培地を有するＤＭＥＭ中で培養し、新生半月板組織の形成を促進した。細胞を播種した足場を、分析前の２週間培養した。多層の細胞を播種した足場を生成するために、ヒトの無血管半月板細胞を、１ｍｌ当たり５０ｘ１０３の細胞で、ＩＩ型コラーゲン、コンドロイチン硫酸塩、およびヒアルロナン（各々１ｍｇ）から成るヒドロゲル中にカプセル化した。細胞を、１つの整列したコラーゲン足場（５０μｌ）上へと播種し、これを６ｍｍの直径の盤へと切断した。細胞を播種した足場の３つの層を、２％のアルギン酸塩で安定化し、ＴＧＦベータ１（１０ｎｇ／ｍｌ）を補足した無血清培地中で培養した。細胞生存度を判定するために、選択したマットを、生／死判定試薬中でインキュベートした。２週齢の多層構成物を、Ｉ型コラーゲンの免疫染色のために、固定し（Ｚ−ｆｉｘ）、染色した（Ｈ＆ＥおよびサフラニンＯ）か、または処理した。ＥＳコラーゲン足場の形態および平均直径並びに細胞相互作用を、走査電子顕微鏡法によって観察した。ＧＡＰＤＨに対する、ＣＨＡＤ、ＣＯＬ１Ａ１、アグリカン、ＴＨＹ１の遺伝子発現レベルを、２週後に、ランダムな及び整列したコラーゲン足場上で培養された半月板細胞中で評価した。１サンプル当たりの遺伝子の各々を、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルによって標準化し、新生組織サンプル中の遺伝子発現レベルを、単層培養された標準化したｍＲＮＡレベルと比較した。単軸引張の機械的な剛性および強度を、８ｍｍのゲージ長および２ｍｍの幅を有するドッグボーン形状の試験片へと切断された足場上で測定した。
【０１６５】
結果
ＥＳコラーゲン足場の特徴づけ：整列した及びランダムなＥＳコラーゲンＩ型ファイバーの形態学的特徴を、図１１Ａおよび図１１Ｂで示す。ランダムなＥＳコラーゲン繊維は、真にランダムに見えたが（図１１Ａ）、使用される回転ドラム速度および送達パラメータを使用して生成された足場は、高秩序の（ａ ｈｉｇｈ ｏｒｄｅｒ ｏｆ）配列を有する足場構造の生成に成功した（図１１Ｂ）。平均の整列した繊維直径は、ランダムなファイバー（範囲：２５０−７２０ｎｍ）に対して、４５６±９７ｎｍ（範囲：３４０−８６０ｎｍ）および４６７±７６ｎｍであった。
【０１６６】
細胞形態およびコラーゲン繊維配置：ランダムなＥＳコラーゲン足場上で播種された細胞を、平らにし、多方向の伸展とともに広げ（図１１Ｃ）、一方で、整列したコラーゲン足場上の細胞を、ファイバーの方向に沿って伸長した（図１１Ｄ）。この形態および整列の反応も、共焦点像で捕らえ、ここで、細胞は８０％を超えて生存可能であった。
【０１６７】
機械的性質：ＧＡ架橋結合しなかった（Ｎｏｎ−ＧＡ ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ）ランダムにＥＳ配向した（ＥＳ ｏｒｉｅｎｔｅｄ）足場は、３２．４８±１１．８４ＭＰａの平均の縦弾性係数を有したが、一方で、架橋結合されたランダムな足場は、５７．５６±２８．１１ＭＰａの平均の縦弾性係数を有した。整列したナノファイバーと平行な方向で試験された、架橋結合されていない整列した足場は、１７８．７２±７８．５３ＭＰａの著しくより大きな（ｐ＜０．００１）縦弾性係数を有し、架橋結合にかかわらずランダムな足場と比較して架橋結合されたときに、２１４．７６±７５．４１ＭＰａまでさらに増加した（図１１Ｅ−Ｆ）。
【０１６８】
新生半月板組織の形成：単層培養と比較して、ランダムな及び整列したＥＳコラーゲン足場の両方の上で培養された半月板細胞は、増加したＣＯＬ１Ａ１、ＣＨＡＤ、およびＣＯＭＰ ｍＲＮＡのレベルを示した（図１２）。両方の半月板細胞型に関して、整列したＥＳコラーゲン足場は、ランダムなＥＳ足場上で培養された細胞と比較して、ＣＯＬ１Ａ１ ｍＲＮＡのレベルを増加させた。より高いＡＧＧ遺伝子発現が、整列したコラーゲン状態で観察された（図１２Ｂ）が、ランダムなコラーゲン足場上で培養された細胞では、ＡＧＧレベルの著しい変化は見られなかった。ランダムなマット上で培養された血管半月板細胞は、整列したマット上で培養された血管細胞と比較して、ＣＯＭＰ ｍＲＮＡのレベルの相対的な減少を示した（図１２Ｃ）。生成した新生組織はすべて、サフラニンＯ染色の欠如およびＩ型コラーゲンの広範囲な沈着を示した。
【０１６９】
議論
この研究は、ランダムな及び整列したＥＳコラーゲン足場を生成する能力を実証する。両方の足場は、類似した及び均一の繊維直径を有し、細胞付着を可能にし、細胞の形態および整列を変更し、最小の細胞毒性を示し、および新生半月板組織の形成を支持するように見える。整列したＥＳコラーゲン足場は、半月板組織を模倣する細胞整列を促進したが、一方で、ランダムなＥＳコラーゲン足場は、ＣＨＡＤ、ＣＯＭＰ、およびＣＯＬ１Ａ１の高い発現を有する半月板表現型への単層培養された半月板細胞の分化を支援するように見えた。整列したコラーゲン足場の方向に平行且つ垂直である縦弾性係数の８倍の差とともに、一連の異方性挙動が生成され、一方で、整列した足場の縦弾性係数は、ランダムに配向された足場よりもおよそ５倍高かった。ヒトにおいて、９３−２９８ＭＰａに及ぶヤング率を有する周辺の張力において正常な半月板の剛性および強度の著しい領域変化が観察される。この研究で生成されたコラーゲン足場の機械的性質は、結果として、ヒトの半月板の引張特性に類似した引張特性をもたらした。全体として、ＥＳコラーゲン足場の生成は、関節負荷（ｊｏｉｎｔ−ｌｏａｄｉｎｇ）環境で残存するための生物学的および機械的な質を有するように見える半月板移植組織を人工的に作る有望な手段かもしれない。
【０１７０】
未処置の損傷した又は退化した半月板は、骨関節炎の進行につながりかねない。半月板組織の特性および機械的性質を模倣することができる及び半月板組織の形成を支持することができる足場システムは、半月板障害を処置する及び骨関節炎の形成につながりかねない退行性変化を防ぐ又は遅らせる有望な手段を表わす。
【０１７１】
実施例３：細胞を播種したポリマー足場生成：同時のエレクトロスピニング処理およびエレクトロスプレー処理によって、細胞をポリマー足場に埋め込む。
ポリマー溶液は、シリンジポンプの送達によってエレクトロスピニング処理される（ＥＳ）。ランダムなポリマーファイバーは、平らなプレートコレクター上で生成され、整列したＥＳポリマーファイバーは、回転ドラムシリンダ上に収集される。同時に、細胞は、コレクター上へとエレクトロスプレー処理され、細胞が埋め込まれた細胞を播種したポリマー足場組成物を生成する。ＥＳポリマーファイバーは、収集されると光架橋結合される。光架橋結合に代わるものとして、無毒な化学的橋架溶液が、エレクトロスピニング処理およびエレクトロスプレー処理後に加えられ、ポリマーファイバーを架橋結合する。
【０１７２】
実施例４：細胞を播種したコラーゲン足場生成：同時のエレクトロスピニング処理およびエレクトロスプレー処理によって、細胞をコラーゲン足場に埋め込む。
コラーゲン溶液は、シリンジポンプの送達によってエレクトロスピニング処理される。コラーゲンは、水中で溶解される。代替的に、コラーゲンは、ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ）中の１６重量％のコラーゲンの作用濃度で、ＨＦＩＰ中で溶解される。ランダムなコラーゲン繊維は、平らなプレートコレクター上で生成され、整列したＥＳポリマーファイバーは、回転ドラムシリンダ上に収集される。同時に、細胞は、コレクター上へとエレクトロスプレー処理され、細胞が埋め込まれた細胞を播種したポリマー足場組成物を生成する。ＥＳコラーゲン繊維は、収集されると光架橋結合される。光架橋結合に代わるものとして、無毒な化学的橋架溶液が、エレクトロスピニング処理およびエレクトロスプレー処理後に加えられ、ポリマーファイバーを架橋結合する。リボフラビンをポリマー足場組成物に加えることによってメタクリル化されたコラーゲン繊維からオキシダントが放出される。代替的に、光開始剤が、ポリマー足場組成物に加えられ、ポリマー足場組成物を紫外線に露出することによって、メタクリル化されたコラーゲン繊維からオキシダントが放出され、結果として、メタクリル化されたコラーゲン繊維間の化学結合がもたらされる。
【０１７３】
実施例５：生分解性の半月板コラーゲンインプラント（コラーゲン、メタクリル化した、Ｖ字型の、半月板細胞）の生成
メタクリル化したコラーゲンは、水中で溶解され、メタクリル化されたコラーゲン溶液を生成する。代替的に、コラーゲンは、ＨＦＩＰ中の１６重量％のコラーゲンの作用濃度で、ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ）中で溶解される。メタクリル化したコラーゲン溶液は、回転式のＶ字型ドラムシリンダ上へのシリンジポンプの送達によってエレクトロスピニング処理され、整列したＥＳメタクリル化されたコラーゲン繊維で構成される半月板のように形作られるコラーゲン足場を生成する。４人のドナーからのヒト半月板を、組織バンクから得て、半月板細胞を、コラゲナーゼにおいて酵素消化を介して分離し、１０％のＣＳ＋１％のＰＳＧを有するＤＭＥＭ中で１継代の間、培養拡張する。半月板細胞を、コレクター上のメタクリル化されたコラーゲン溶液のエレクトロスピニング処理と同時にコレクター上へとエレクトロスプレー処理し、半月板細胞が埋め込まれたメタクリル化されたコラーゲン足場組成物を生成する。コラーゲン繊維が生成されると、光開始剤を含む溶液も、コラーゲン繊維に加え、細胞を播種したコラーゲン足場組成物は、コレクター上で形成されると断続的な紫外線に露出される。半月板細胞が埋め込まれたメタクリル化されたコラーゲン足場組成物を紫外線に露出することによって、メタクリル化されたコラーゲン繊維からオキシダントが放出され、結果として、メタクリル化されたコラーゲン繊維間の化学的結合がもたらされ、それにより、結果として生じる半月板細胞が埋め込まれたメタクリル化されたコラーゲン足場組成物は、生体培地において不溶性となるが、インビボで無毒且つ生分解性となる。半月板細胞が埋め込まれたメタクリル化されたコラーゲン足場組成物は、結果として、被験体にすぐに注入される半月板インプラントをもたらす。代替的に、半月板インプラントは、細胞培養培地中で培養されるか、または被験体に注入する前にさらに修飾される。
【０１７４】
実施例６：エレクトロスピニング処理したコラーゲン繊維状足場、機械的性質および遺伝子発現
１６％ｗ／ｖのウシのＩ型コラーゲン（Ｓｅｍｅｄ Ｓ、酸可溶性、ＤＳＭ、ＮＬ）を、種類、１：１ｖ／ｖの比率で２０ｘリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）およびエタノール中で溶解した。コラーゲン溶液を、シリンジに入れ、これを、０．１−０．２ｍＬ／ｈの供給率で、シリンジポンプ（ＫＤＳ２００， ＫＤ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．， ＵＳＡ）によって制御した。テフロン（登録商標）のチューブを、シリンジと０．５ｍｍの内径を有する２１Ｇのニードルを接続するために使用した。コラーゲン繊維を、アルミ箔によって覆われたコレクター上へとエレクトロスピニング処理した。ランダムなファイバーを作り上げるために、平らなプレートを、１６ｃｍの紡糸距離でコレクターとして使用した。整列したファイバーを作り上げるために、名目上２４００ｒｐｍで回転するドラムを、ニードル先端部から（ドラムの接線曲面から）１２ｃｍの距離に置いた。電圧を調節したＤＣパワーサプライ（ＮＮＣ−３０ｋＶ−２ｍＡ携帯型，ＮａｎｏＮＣ，Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）によって、かけた電圧は、１５ｋＶから２０ｋＶまで変動し、ポリマージェットを生成した。エレクトロスピニング処理したコラーゲン足場を、１時間１ｘＰＢＳ中の０．２５％のグルタルアルデヒド（シグマ・オールドリッチ）に浸すことによって架橋結合した。固定後、足場を、エタノールを用いて各々１０分間３回洗浄した。
【０１７５】
整列した及びランダムなＥＳコラーゲン繊維の形態学的構造を、図２０Ａおよび図２０Ｂに示す。高度の整列を有する足場構造を生成するために、２４００ｒｐｍの回転ドラム速度を使用した。整列したファイバーの平均直径は、４９６±９７ｎｍであり、ランダムなコラーゲン繊維に対しては、４６７±７６ｎｍであった。架橋結合したランダム足場は、０．２５±０．０４ｍｍであったが、一方で、架橋結合した整列された足場は、０．２５±０．０３ｍｍの厚さであった。共焦点像（図１のＣおよびＤ）は、整列した足場のより高い細胞生存度の証拠を提供した。ランダムに整列したエレクトロスピニング処理したコラーゲン足場上で播種された半月板の無血管および血管の細胞を、平らにし、多方向の伸展とともに広げ（図２０Ｃ）；一方で、整列したコラーゲン足場上の細胞を、ファイバーの方向に沿って伸長した（図２０Ｄ）。
【０１７６】
グルタルアルデヒドとの架橋結合によって、乾燥したランダムな足場の平均の縦弾性係数は、５７．５６±２８．１１ＭＰａに増加した（図２１Ａ）。架橋結合によってまた、整列したファイバーの方向に平行な又は垂直な張力で試験されたときの乾燥した整列されたコラーゲン繊維の平均の縦弾性係数は増加した（図２１Ａ）。整列したナノファイバーと平行な方向に試験されたときの整列した足場は、架橋結合にかかわらず、ランダムな足場と比較して、著しくより大きな縦弾性係数をもたらした（ｐ＜０．００１）。他方では、整列したファイバーの方向に垂直な縦弾性係数は、架橋結合後に３２．１８±２１．６８ＭＰａとなり、これは、ランダムな足場より著しく低かった（ｐ＜０．００１）。縦弾性係数と同様に、架橋結合された整列した足場のＵＴＳは、著しく（ｐ〈０．００１）より高かった：架橋結合されたランダムな足場で測定された１．１９±０．６３のＭＰａと比較して、４．９７±２．０１ＭＰａ（整列の方向と平行）（図２１Ｃ）。細胞および無細胞の足場の両方の剛性は、培養中の時間とともに減少した（図２１Ｂ）。しかしながら、細胞を播種した足場は、無細胞の足場と比べて、一貫してより剛性であり、より高い最大抗張力に達した（図２１Ｄ）。
【０１７７】
細胞を播種した足場の機械的性質の増加の理由を特定するために、ＥＬＩＳＡを使用して、新しく合成されたＩ型コラーゲンを測定し（図２２Ａ）、ｑＰＣＲを使用して、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子発現を測定した（図２２Ｂ）。細胞を播種した足場におけるＩ型コラーゲンのタンパク質は、陰性対照（無細胞の足場）よりも著しく高く；これは、ＥＬＩＳＡが、足場を作り上げるためのコラーゲンではなく、新しく合成されたタンパク質を検出していたことを実証している。
【０１７８】
足場および特定遺伝子の応答によって支持された半月板状の表現型は、細胞源と足場の組織化との間で異なった。単層培養中の半月板細胞と比較して（図２２Ｂ−Ｆで点線によって示されるベースラインの制御遺伝子発現レベル）、ランダムなコラーゲン足場または整列したコラーゲン足場のいずれか上で培養された血管領域または無血管領域のいずれかに由来する細胞は、著しく高いレベルのＣＯＬ１Ａ１、ＳＯＸ９、ＣＯＭＰ、ＣＨＡＤ、およびＡＧＧの遺伝子を発現した（Ｐ＜０．０５）。アグリカンｍＲＮＡレベルは、減少した（ランダムな足場）か、または変わらなかった（整列した足場、図２２Ｆ）。概略的に、ＣＯＬ１Ａ１およびＣＨＡＤ ｍＲＮＡの発現レベルは、両方の足場上の両方の半月板細胞源に対して比較可能であった（図２２Ｂおよび２２Ｅ）。
【０１７９】
実施例７：エキソビボの半月板欠損症モデルにおけるＥＳ細胞を播種した足場の統合および新生組織形成。
新鮮な半月板を、ウシの膝から採取し、切断した。外科的切断部を、無血管の半月板組織内に生成し、半月板断裂を擬態した（図２３Ａ）。ヒトの半月板細胞を、コラーゲン整列した足場上で接種し、４週間予め培養した。その後、細胞を播種した足場を、ウシの半月板組織の外植片（ｅｘｐｌａｎｔｓ）（図２３Ｂ）中の外科的に生成された縦断裂に注入した。修復された半月板組織を３週間培養した後に、組織学的分析によって、注入された足場と天然組織との間の断裂内の新しい組織の生成；および宿主組織への新生組織の統合（図２３Ｃ）：修復されていない断裂；（図２３Ｄ）：細胞なしでの足場で修復した断裂；図２３Ｅおよび２３Ｆ：細胞を用いる足場で修復した断裂、を明らかにした。矢印は、治癒されてない断裂（図２３ＣおよびＤ）および治癒された断裂（図２３ＥおよびＦ）を指す。
【０１８０】
実施例８：純粋なコラーゲン繊維を有する多層構成物の生成
実施例６に詳述されるように、エレクトロスピニング処理した単層コラーゲン足場を生成した。その後、足場を盤へと切断した。ＩＩ型コラーゲン、コンドロイチン硫酸塩、およびヒアルロナンを含有しているヒドロゲル中のヒトの半月板細胞の交互の層を有する盤を層状化することによって、多層構成物を生成した。結果として生じる多層構成物は、組織中の周辺のコラーゲン繊維束を模倣した。細胞を、各層に対して５０マイクロリットルで１ｍｌ当たり１００万個の細胞の密度で播種した。細胞は、図２５Ａおよび図２５Ｂに示されるように播種後１４日間生存し、２週間培養した構成物のサフラニンＯファストグリーン染色は、軟骨の存在を示した（図２６Ａ−Ｂ）。盤半分の巨視的な平面図および側面図を、図２８Ａおよび図２８Ｂに示す。
【０１８１】
実施例９：同軸のエレクトロスピニング処理の方法
電圧を、ドラム上へと別々のシリンジにおいてコラーゲンおよびＰＬＡ溶液にかけ、ＰＬＡファイバーコアおよびコラーゲン繊維シェルを有するエレクトロスピニング処理したファイバーを生成した。シリンジは、別々であり、それを（中空シリンダ内の中空シリンダのような）２つの同心チャネルを有する中空ニードルに接続した。ＰＬＡ溶液を、ニードルの内部チャネルに通して放出し、コラーゲン溶液を、ニードルの外部チャネルに通して放出した。ニードルの先端部で、コラーゲンは、ＰＬＡを囲み（カプセル化し）、コラーゲンをコーティングされたＰＬＡの糸が形成される。このセットアップの概略図については、図２９を参照。溶液およびエレクトロスピニング処理するパラメータは、表３に示される。
【０１８２】
【表３】
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【０１８３】
細胞を、０．２５％のグルタルアルデヒドと架橋結合し、ＰＢＳで一度洗浄した（図３０Ｄ）。架橋結合されない場合、足場を溶解した（図３０Ｃ）。ヤング率を、Ｉｎｓｔｒｏｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｔｅｓｔｉｎｇ Ｍａｃｈｉｎｅ（３３４２ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｏｌｕｍｎ Ｍｏｄｅｌ）で測定し、それは、同軸の足場の機械的性質が、コラーゲンのみの足場より高く、ヒトの半月板のヤング率に匹敵する（周方向：１００−３００ＭＰａ、径方向：１０−３０ＭＰａ）ことを示した。
【０１８４】
細胞生存度を、蛍光共焦点顕微鏡を使用して、生細胞に対してはカルセインＡＭで、および死細胞に対してはエチジウムホモダイマー−１で評価した。架橋されていない同軸の足場の場合には、コラーゲン材は、溶解し、ＰＬＡファイバーの表面に集められ、これは、ＰＬＡファイバー単独よりも高い適合生を実証している。細胞を、架橋結合された同軸の足場に均等に分配した（図３２のＡ−Ｄを参照）。細胞を積んだ同軸の足場は、細胞を積んだ単一のコラーゲン足場よりもはるかに高い機械的性質を有する（図３３Ａ−Ｂを参照、Ｙ軸スケールに留意）。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２２Ｅ】
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【図２２Ｆ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２３Ｅ】
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【図２３Ｆ】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２６Ｄ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【図３０Ｄ】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【国際調査報告】
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