(57)【要約】本発明は、ワクチンとして使用することができる高力価ウイルス様ベシクル(VLV)を生じさせる高力価ハイブリッドウイルスベクターの発見に関する。本発明には、進化したハイブリッドウイルスベクターワクチンを生じさせ、かつ高力価VLVを選択する組成物および方法、特定の疾患または障害を処置するおよび/または予防するまたはそれに対する免疫性を与える方法、ならびにそれにより産生したVLV組成物を投与した対象においてメモリーT細胞免疫応答およびメモリーB細胞免疫応答を誘導する方法が含まれる。さらに、本発明は、対象にワクチン接種するための薬学的組成物ならびに高力価タンパク質発現システムを包含する。2017515509.tif 000008
2017515509.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルファウイルス非構造タンパク質ヌクレオチド配列をコードするDNA配列に機能的に連結されているプロモーター配列を含み、該DNA配列が、アルファウイルスサブゲノムRNAプロモーターに機能的に連結され、それが、2Aペプチドをコードする2A DNAに機能的に連結され、次にそれが、水疱性口内炎ウイルス（VSV）Gタンパク質をコードするVSV G DNAに機能的に連結されている、DNA配列を含む、高力価ハイブリッドウイルスベクターであって、
該アルファウイルス非構造タンパク質ヌクレオチド配列が、G-4700-A、A-5424-G、G-5434-A、T-5825-C、T-5930-C、A-6047-G、G-6783-A、G-6963-A、G-7834-A、T-8859-A、T-8864-C、G-9211-A、A-10427-G、G-11560-A、A-11871-G、およびT-11978-Cからなる群より選択される変異のうちの少なくとも2つを含み、
該ベクターが、アルファウイルス構造タンパク質をコードする機能的ヌクレオチド配列を欠いており、
さらに、該ベクターを細胞培養において増やす際に、少なくとも1 mlあたり107プラーク形成単位（pfu）の力価のウイルス様ベシクル（VLV）が得られる、
高力価ハイブリッドウイルスベクター。
【請求項２】
アルファウイルスがセムリキ森林ウイルス(SFV)である、請求項1記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
【請求項３】
サブゲノムRNAプロモーターがセムリキ森林ウイルス(SFV)プロモーターである、請求項1記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
【請求項４】
2A DNAが、ゾセア・アシグナ(Thosea asigna)ウイルスDNAであり、かつT2Aペプチドをコードする、請求項1記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
【請求項５】
請求項1記載の高力価ハイブリッドウイルスベクターによって生じたレプリコンRNAを含む、ウイルス様ベシクル(VLV)。
【請求項６】
プロモーター配列が構成性プロモーターである、請求項1記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
【請求項７】
プロモーター配列がサイトメガロウイルス前初期プロモーターである、請求項6記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
【請求項８】
少なくとも5×107 pfu/mlの力価のVLVが得られる、請求項1記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
【請求項９】
少なくとも1×108 pfu/mlの力価のVLVが得られる、請求項8記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
【請求項１０】
少なくとも1つの異種タンパク質をコードするDNAが、アルファウイルスサブゲノムRNAプロモーターと2A DNAとの間に挿入される、請求項1記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
【請求項１１】
少なくとも1つの異種タンパク質が、感染性疾患、悪性疾患および自己免疫疾患からなる群より選択される疾患に関連する、請求項10記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
【請求項１２】
感染性疾患が、エシェリキア属(Escherichia)、ストレプトコッカス属(Streptococcus)、スタフィロコッカス属(Staphylococcus)、ボルデテラ属(Bordetella)、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)、マイコバクテリウム属(Mycobacterium)、ナイセリア属(Neisseria)、ヘモフィルス属(Haemophilus)、放線菌(Actinomycete)、ストレプトミセス菌(Streptomycete)、ノカルジア属(Nocardia)、エンテロバクター属(Enterobacter)、エルシニア属(Yersinia)、フランシセラ属(Fancisella )、パストレラ属(Pasturella )、モラクセラ属(Moraxella)、アシネトバクター属(Acinetobacter)、エリジペロスリックス属(Erysipelothrix)、ブランハメラ属(Branhamella)、アクチノバチルス属(Actinobacillus)、ストレプトバチルス属(Streptobacillus)、リステリア属(Listeria)、カリマトバクテリウム属(Calymmatobacterium)、ブルセラ属(Brucella)、バチルス属(Bacillus)、クロストリジウム属(Clostridium)、トレポネーマ属(Treponema)、サルモネラ属(Salmonella)、クレブシエラ属(Kleibsiella )、ビブリオ属(Vibrio)、プロテウス属(Proteus)、エルウイニア属(Erwinia)、ボレリア属(Borrelia)、レプトスピラ属(Leptospira)、スピリルム属(Spirillum)、カンピロバクター属(Campylobacter)、シゲラ属(Shigella)、レジオネラ属(Legionella)、シュードモナス属(Pseudomonas)、アエロモナス属(Aeromonas)、リケッチア属(Rickettsia)、クラジミア属(Chlamydia)、コクシエラ属(Coxiella)、ボレリア属およびマイコプラスマ属(Mycoplasma)からなる群より選択される原核生物に起因する、請求項11記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
【請求項１３】
感染性疾患が、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、A型肝炎ウイルス(HAV)、B型肝炎(HBV)、C型肝炎(HCV)、任意の他の肝炎関連ウイルス、ヒトパピローマウイルス(HPV)および特に高リスク発がん性ヒトパピローマウイルス型、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス(KSHV)(ヒトヘルペスウイルス8(HHV-8)としても公知)、単純ヘルペスウイルス(HSV)(任意のサブタイプ)、呼吸器多核体ウイルス(RSV)および関連する呼吸器ウイルス、インフルエンザウイルス、SARS関連コロナウイルス(SARS-CoV)を含むコロナウイルス、ライノウイルス、アデノウイルス、SIV、ロタウイルス、ヒトパピローマウイルス、アルボウイルス、麻疹ウイルス、ポリオウイルス、風疹ウイルス、ムンプスウイルス、パポバウイルス、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、水痘ウイルス、ハンタウイルス 、ならびに任意の新興ウイルス、特に、エボラウイルス、マーブルグウイルス、西ナイルウイルス(WNV)、セントルイス脳炎ウイルス(SLEV)、リフトバレー熱ウイルス(RVFV)、およびブニヤウイルス科の他のメンバーからなる群より選択されるウイルスに起因する、請求項11記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
【請求項１４】
感染性疾患が、アピコンプレクサ類およびトリパノソーマ類からなる群より選択される原生動物に起因する、請求項11記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
【請求項１５】
悪性疾患が、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)、濾胞性非ホジキンリンパ腫、悪性メラノーマ、ヘアリーセル白血病、多発性骨髄腫、カルチノイド症候群および肝臓およびリンパ節転移を伴うカルチノイド腫瘍、AIDS関連カポジ肉腫、腎細胞がん、大腸の腺がん、頭頸部扁平上皮がん、結腸がん、肺がん、乳がん、胃がん、前立腺がん、ならびに子宮内膜がんからなる群より選択されるがんである、請求項11記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
【請求項１６】
自己免疫疾患が、アジソン病、セリアック病、皮膚筋炎、グレーブス病、橋本甲状腺炎、多発性硬化症、重症筋無力症、悪性貧血、反応性関節炎、関節リウマチ、シェーグレン症候群、全身性エリトマトーデス、およびI型糖尿病からなる群より選択される、請求項11記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
【請求項１７】
請求項1記載の高力価ハイブリッドウイルスベクターにより産生されるウイルス様ベシクル（VLV）を含む、組成物。
【請求項１８】
請求項10記載の高力価ハイブリッドウイルスベクターにより産生されるウイルス様ベシクル（VLV）を含む、組成物。
【請求項１９】
異種タンパク質が、感染性疾患、悪性疾患、および自己免疫疾患からなる群より選択される疾患に関連する、請求項18記載の組成物。
【請求項２０】
異種タンパク質に対する免疫性を対象に与える方法であって、少なくとも107 pfu/mlの請求項18記載のVLVを含む組成物を該対象に投与する工程を含み、異種タンパク質の発現が該対象において免疫応答を誘導する、方法。
【請求項２１】
異種タンパク質が、感染性疾患、悪性疾患、および自己免疫疾患からなる群より選択される疾患に関連する、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
対象において疾患を処置および／または予防する方法であって、治療的有効量の請求項16記載の組成物を、そのような処置を必要とする対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項２３】
疾患が、感染性疾患、悪性疾患、および自己免疫疾患からなる群より選択される疾患である、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
対象にワクチン接種する方法であって、薬学的に許容される量の請求項18記載の組成物を該対象に投与する工程を含み、該組成物の投与が該対象において免疫応答を誘発する、方法。
【請求項２５】
組成物が対象に予防的に投与される、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
組成物が対象に治療的に投与される、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
組成物がアジュバントと組み合わせて投与される、請求項24記載の方法。
【請求項２８】
アジュバントが、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、Quil A、Detox、ISCOM、およびスクアレンからなる群より選択される、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
対象において異種タンパク質に対するメモリーT細胞免疫応答を生じさせる方法であって、（a）請求項18記載の組成物を対象に、該対象において免疫応答を誘発するのに有効な量で投与する工程；（b）第2のその後の時期に、第2の有効量の請求項18記載の組成物を投与する工程を含み、該異種タンパク質に対するTメモリー細胞が該対象において生じる、方法。
【請求項３０】
対象において異種タンパク質に対する適応B細胞免疫応答を生じさせる方法であって、（a）請求項18記載の組成物を対象に、該対象において免疫応答を誘発するのに有効な量で投与する工程；（b）第2のその後の時期に、第2の有効量の請求項18記載の組成物を投与する工程を含み、該異種タンパク質に対するBメモリー細胞が該対象において生じる、方法。
【請求項３１】
アルファウイルス非構造タンパク質ヌクレオチド配列をコードするDNA配列に機能的に連結されているプロモーター配列を含み、該DNA配列が、アルファウイルスサブゲノムRNAプロモーターに機能的に連結され、それが、2Aペプチドをコードする2A DNAに機能的に連結され、次にそれが、水疱性口内炎ウイルス（VSV）Gタンパク質をコードするVSV G DNAに機能的に連結されている、DNA配列を含む、高力価ハイブリッドウイルスベクターを含むタンパク質発現システムであって、
SFV非構造タンパク質ヌクレオチド配列が、G-4700-A、A-5424-G、G-5434-A、T-5825-C、T-5930-C、A-6047-G, G-6783-A、G-6963-A、G-7834-A、T-8859-A、T-8864-C、G-9211-A、A-10427-G、G-11560-A、A-11871-G、およびT-11978-Cからなる群より選択される変異のうちの少なくとも2つを含み、
該ベクターが、SFV構造タンパク質をコードする機能的ヌクレオチド配列を欠いており、
さらに、該ベクターを細胞培養において増やす際に、少なくとも1 mlあたり107プラーク形成単位（pfu）の力価のウイルス様ベシクル（VLV）が得られる、
タンパク質発現システム。
【請求項３２】
アルファウイルスがセムリキ森林ウイルス(SFV)である、請求項31記載のタンパク質発現システム。
【請求項３３】
サブゲノムRNAプロモーターがセムリキ森林ウイルス(SFV)プロモーターに由来する、請求項31記載のタンパク質発現システム。
【請求項３４】
2A DNAが、ゾセア・アシグナウイルスDNAであり、かつT2Aペプチドをコードする、請求項31記載のタンパク質発現システム。
【請求項３５】
請求項31記載の高力価ハイブリッドウイルスベクターにより生じるレプリコンRNAを含む、ウイルス様ベシクル(VLV)。
【請求項３６】
プロモーター配列が構成性プロモーターである、請求項31記載のタンパク質発現システム。
【請求項３７】
プロモーター配列がサイトメガロウイルス前初期プロモーターである、請求項36記載のタンパク質発現システム。
【請求項３８】
少なくとも5×107 pfu/mlの力価のVLVが得られる、請求項31記載のタンパク質発現システム。
【請求項３９】
少なくとも1×108 pfu/mlの力価のVLVが得られる、請求項38記載のタンパク質発現システム。
【請求項４０】
少なくとも1つの異種タンパク質をコードするDNAが、アルファウイルスサブゲノムRNAプロモーターと2A DNAとの間に挿入される、請求項31記載のタンパク質発現システム。
【請求項４１】
VLVにおけるVSV Gタンパク質の発現を安定化する方法であって、VLV Gタンパク質の発現がVLVの複製の間中維持されるように、2Aペプチドをコードする2A DNAを、VSV Gタンパク質をコードするDNAに機能的に連結させる工程を含む、方法。
【請求項４２】
VLVにおける異種タンパク質の発現を安定化する方法であって、異種タンパク質の発現がVLVの複製の間中維持されるように、2Aペプチドをコードする2A DNAを異種タンパク質をコードするDNAに機能的に連結させ、次に、VSV Gタンパク質に機能的に連結させる工程を含む、方法。
【請求項４３】
以下の工程を含む、高力価 RNAウイルス様ベシクル(VLV)を選択する方法：
(i) アルファウイルス構造タンパク質を含まないウイルス構造タンパク質をコードするRNA配列を含むハイブリッドウイルスベクターを細胞培養において継代することによって、VLVを生じさせる工程；および
(ii)生じたVLVを、細胞培養におけるVLVの大規模な継代およびVLVの定方向突然変異誘発からなる群より選択される少なくとも1つの手法を用いて、高力価VLVについてスクリーニングする工程。
【請求項４４】
ハイブリッドウイルスベクターRNA配列がアルファウイルス非構造タンパク質をコードする、請求項43記載の方法。
【請求項４５】
非構造タンパク質がセムリキ森林ウイルス(SFV)非構造タンパク質である、請求項44記載の方法。
【請求項４６】
ウイルス構造タンパク質がラブドウイルス糖タンパク質を含む、請求項43記載の方法。
【請求項４７】
糖タンパク質が水疱性口内炎ウイルス(VSV)Gタンパク質である、請求項46記載の方法。
【請求項４８】
高力価VLVが少なくとも1 mlあたり107プラーク形成単位(pfu)を産生する、請求項43記載の方法。
【請求項４９】
高力価VLVが、免疫応答を誘導するのに有効な量で対象に投与される、請求項43記載の方法。
【請求項５０】
対象が哺乳動物である、請求項20、22、24、29、30および49のいずれか一項記載の方法。
【請求項５１】
哺乳動物がヒトである、請求項50記載の方法。
【請求項５２】
SFV構造タンパク質ヌクレオチド配列を欠き、かつVSV G タンパク質ヌクレオチド配列と、G-4700-A、A-5424-G、G-5434-A、T-5825-C、T-5930-C、A-6047-G、G-6783-A、G-6963-A、G-7834-A、T-8859-A、T-8864-C、G-9211-A、A-10427-G、G-11560-A、A-11871-GおよびT-11978-Cからなる群より選択される変異のうち少なくとも2つを含むSFV非構造タンパク質ヌクレオチド配列とを含む、少なくとも107プラーク形成単位(pfu)の力価を有するRNAウイルス様ベシクル(VLV)。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2014年5月16日に出願された米国特許仮出願第61/994,161号に対して米国特許法第119条(e)の下で優先権を主張し、その出願はこれによってその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
連邦支援の研究開発に関する陳述
本発明は、National Institute of Healthにより授与された助成金R37 AI040357およびR01 AI45510の下で、政府の援助でなされた。政府は、本発明においてある一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ワクチン接種は、公衆衛生の最大のサクセスストーリーの1つである。今日では、かつて小児の致死的疾患を引き起こしたウイルスの多くに対して防御をもたらすワクチンが、世界中で日常的に用いられている。しかしながら、ウイルスの不活性化または弱毒化を用いる典型的なワクチン開発法は、最も致命的なヒト病原体の一部に対しては失敗しており、新たなアプローチを必要としている。分子ウイルス学の進歩は、ウイルスの遺伝子操作を可能にし、ワクチン開発の新たな機会を開いている。ウイルスの遺伝子改変は、その弱毒化を可能にするだけではなく、他のウイルス由来の配列を取り込み、ある病原体を別の病原体のワクチン担体に変えることも可能にする。ウイルスベクターは、抗体(B細胞)、ヘルパーT細胞(CD4+T細胞)、および細胞傷害性Tリンパ球(CTL、CD8+T細胞)が媒介する免疫を含む広範囲の免疫応答を刺激するという点で典型的なワクチンに対する利点を示すことから、ワクチンを送達するための有望なツールとして研究されている。これらのウイルスベクターワクチンは、種々の感染性疾患および悪性疾患に対して使用することができる(Polo and Dubensky, Jr.Drug Discov Today. 2002, Jul 1;7(13):719-27(非特許文献1); Small and Hildegund, Curr Opin Virol. 2011, October 1; 1(4): 241-245(非特許文献2))。しかしながら、ウイルスベクターに基づくワクチンの使用には制限が存在する。例えば、ウイルスベクターに対する既存の抗ベクター免疫は、ワクチンを不活性化する可能性があり、関心対象の導入遺伝子のクローニング能を限定するという問題を提示する。この技術の効率を改善し、その制限を克服するために、非常に多くの研究が進行中である(Nayak and Herzog. Gene Therapy, 2009, 17 (3): 295-304(非特許文献3))。
【０００４】
エンベロープRNAウイルスは、高度に組織化された構造を有する。1つまたは複数のヌクレオキャプシドタンパク質がそのRNAをキャプシドで包み、多くの場合、マトリックスタンパク質がキャプシドと膜の間にあり、1つまたは複数の膜貫通糖タンパク質が、マトリックスまたはヌクレオキャプシドタンパク質と相互作用し、効率的な粒子集合体へと導く。一旦、粒子が細胞から放出されると、1つまたは複数の糖タンパク質が、細胞の受容体に結合し、膜融合を触媒し、新たな細胞へのウイルスの侵入を可能にする。
【０００５】
セムリキ森林ウイルス(Semliki Forest Virus) (SFV)などのアルファウイルスは、膜で包まれたプラス鎖のRNAウイルスであり、nsP1〜4と呼ばれる4種類の非構造タンパク質および3種類の構造タンパク質：キャプシド、E1膜貫通糖タンパク質、およびE2膜貫通糖タンパク質をコードする。nsp1〜4タンパク質は、ゲノムRNAの最初の2/3から翻訳される。これらのタンパク質は、ゲノムRNAの複製を導く複合体を形成し、アンチゲノムRNAを形成し、次いで、アンチゲノムRNAがコピーされ、全長プラス鎖RNAおよび構造タンパク質をコードするサブゲノムmRNAを形成する。キャプシドタンパク質は、細胞質においてゲノムRNAを包み、SFV糖タンパク質を含む膜において細胞表面から出芽するヌクレオキャプシドを生じさせる。アルファウイルスRNA複製は、小球体(spherule)と呼ばれる電球形の膜結合区画内で起こり、小球体は、最初に細胞表面上で形成され、次いで、エンドサイトーシスによって取り込まれ、複数の小球体を含む細胞変性液胞(cytopathic vacuole)を形成する(Spuul et al., 2010. Journal of virology 84:7543-7557(非特許文献4))。レプリカーゼタンパク質は、小球体の細胞質側に局在する(Froshauer et al., 1988. The Journal of cell biology 107:2075-2086(非特許文献5))。小球体中で複製したRNAがSFV出芽前にヌクレオキャプシド内にパッケージングされる方法は知られていない。構造タンパク質遺伝子のいずれかを欠くアルファウイルスRNAレプリコンは、依然として細胞内で効率的に複製することができるが、細胞を超えて増えることはできない。
【０００６】
水疱性口内炎ウイルス (VSV)は、単一の膜糖タンパク質(G)、マトリックスタンパク質、およびヌクレオキャプシドタンパク質、ならびにウイルスポリメラーゼを形成する2種類のタンパク質をコードする、マイナス鎖RNAウイルスである(Rose and Whitt, 2001. Rhabdoviridae: The Viruses and Their Replication, p. 1221-1240. In D. Knipe and P. Howley (ed.), Fields' Virology. Lippencott-Raven, Philadelphia(非特許文献6))。注目すべきことには、SFV非構造タンパク質およびVSV Gタンパク質だけをコードするSFV RNAレプリコンで細胞をトランスフェクトすると、VSV Gタンパク質を含む膜で包まれた感染性の小胞が生じる(Rolls et al., 1994. Cell 79:497-506(非特許文献7))。これらの感染性のウイルス様ベシクル(VLV)は低力価になるが、組織培養細胞においてウイルスと同様に継代できる。粒子は、レプリコンRNAおよびVSV Gタンパク質を含有するが、エンベロープRNAウイルスとは異なり、RNAの周囲に密集したヌクレオキャプシドタンパク質を含有していないことから、非常に低い密度を有する(Rolls et al., 1994. Cell 79:497-506(非特許文献7))。これらのVLVが生じるメカニズムは特定されていない。他のタンパク質を発現するこれらのVLVは、実験用ワクチンとしての有用性が証明されている(Rose et al., 2008. PNAS 105:5839-5843(非特許文献8); Schell et al., 2011. Journal of virology 85:5764-5772(非特許文献9))。しかし、ワクチンプラットフォームとしてのVLVシステムには2つの重大な制限：VLVの相対的に低い力価、および継代時に外来遺伝子の発現が急速に消失することが存在する。
【０００７】
当技術分野において、安定的な外来遺伝子発現をサポートしながら、強力な免疫応答を誘導する高いワクチン力価を生じる、より効率的なウイルスベクターワクチンシステムを産生する方法に対するニーズが明確に存在する。本発明はこのニーズを満たすものである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Polo and Dubensky, Jr.Drug Discov Today. 2002, Jul 1;7(13):719-27
【非特許文献２】Small and Hildegund, Curr Opin Virol. 2011, October 1; 1(4): 241-245
【非特許文献３】Nayak and Herzog. Gene Therapy, 2009, 17 (3): 295-304
【非特許文献４】Spuul et al., 2010. Journal of virology 84:7543-7557
【非特許文献５】Froshauer et al., 1988. The Journal of cell biology 107:2075-2086
【非特許文献６】Rose and Whitt, 2001. Rhabdoviridae: The Viruses and Their Replication, p. 1221-1240. In D. Knipe and P. Howley (ed.), Fields' Virology. Lippencott-Raven, Philadelphia
【非特許文献７】Rolls et al., 1994. Cell 79:497-506
【非特許文献８】Rose et al., 2008. PNAS 105:5839-5843
【非特許文献９】Schell et al., 2011. Journal of virology 85:5764-5772
【発明の概要】
【０００９】
発明の簡単な概要
本発明は、アルファウイルス非構造タンパク質ヌクレオチド配列をコードするDNA配列に機能的に連結されているプロモーター配列を含み、該DNA配列が、アルファウイルスサブゲノムRNAプロモーターに機能的に連結され、それが、2Aペプチドをコードする2A DNAに機能的に連結され、次にそれが、水疱性口内炎ウイルス(VSV)Gタンパク質をコードするVSV G DNAに機能的に連結されている、DNA配列を含む、高力価ハイブリッドウイルスベクターの組成物およびその使用の方法を提供する。本発明の高力価ハイブリッドウイルスベクターのアルファウイルス非構造タンパク質ヌクレオチド配列は、G-4700-A、A-5424-G、G-5434-A、T-5825-C、T-5930-C、A-6047-G、G-6783-A、G-6963-A、G-7834-A、T-8859-A、T-8864-C、G-9211-A 、A-10427-G 、G-11560-A 、A-11871-GおよびT-11978-Cからなる群より選択される変異のうち少なくとも2つを含み、本発明のベクターは、アルファウイルス構造タンパク質をコードする機能的ヌクレオチド配列を欠いている。さらに、本発明のベクターを細胞培養において増やすと、少なくとも1 mlあたり107プラーク形成単位(pfu)の力価のウイルス様ベシクル(VLV)が得られる。
【００１０】
別の局面において、本発明は、アルファウイルス非構造タンパク質ヌクレオチド配列をコードするDNA配列に機能的に連結されているプロモーター配列を含み、該DNA配列が、アルファウイルスサブゲノムRNAプロモーターに機能的に連結され、それが、2Aペプチドをコードする2A DNAに機能的に連結され、次にそれが、水疱性口内炎ウイルス(VSV)Gタンパク質をコードするVSV G DNAに機能的に連結されている、DNA配列を含む、高力価ハイブリッドウイルスベクターを含むタンパク質発現システムを含み、ここで、アルファウイルス非構造タンパク質配列は、G-4700-A、A-5424-G、G-5434-A、T-5825-C、T-5930-C、A-6047-G、G-6783-A、G-6963-A、G-7834-A、T-8859-A、T-8864-C、G-9211-A 、A-10427-G 、G-11560-A 、A-11871-GおよびT-11978-Cからなる群より選択される変異のうち少なくとも2つを含み、ベクターは、アルファウイルス構造タンパク質をコードする機能的ヌクレオチド配列を欠いており、さらに、ベクターを細胞培養において増やすと、少なくとも1 mlあたり107プラーク形成単位(pfu)の力価のウイルス様ベシクル(VLV)が得られる。
【００１１】
本発明はまた、VLVにおけるVSV Gタンパク質の発現を安定させる方法も含む。方法は、VLV Gタンパク質の発現がVLVの複製の間を通して維持されるように、2Aペプチドをコードする2A DNAを、VSV Gタンパク質をコードするDNAに機能的に連結する工程を含む。
【００１２】
本発明は、VLVにおける異種タンパク質の発現を安定させる方法をさらに含む。方法は、異種タンパク質の発現がVLVの複製の間を通じて維持されるように、2Aペプチドをコードする2A DNAを、異種タンパク質をコードするDNAに機能的に連結し、次に、VSV Gタンパク質に機能的に連結させる工程を含む。
【００１３】
いくつかの態様において、アルファウイルスはセムリキ森林ウイルス(SFV)である。他の態様において、サブゲノムRNAプロモーターはセムリキ森林ウイルス(SFV)プロモーターである。
【００１４】
いくつかの態様において、2A DNAはゾセア・アシグナ(Thosea asigna)ウイルスDNAであり、T2Aペプチドをコードする。いくつかの態様において、高力価ハイブリッドウイルスベクターは、レプリコンRNAを含むウイルス様ベシクル (VLV)を生じる。いくつかの態様において、高力価ハイブリッドウイルスベクターのプロモーター配列は構成性プロモーターである。他の態様において、プロモーター配列はサイトメガロウイルス前初期プロモーターである。いくつかの態様において、少なくとも5×107 pfu/ml VLVの力価が得られる。他の態様において、少なくとも1×108 pfu/mlの力価のVLVが得られる。いくつかの態様において、少なくとも1つの異種タンパク質をコードするDNAが、高力価ハイブリッドウイルスベクターのSFVサブゲノムRNAプロモーターと2A DNAとの間に挿入される。
【００１５】
別の局面において、本発明は、本発明の高力価ハイブリッドウイルスベクターによって産生されるウイルス様ベシクル(VLV)を含む組成物を提供する。
【００１６】
いくつかの態様において、ウイルス様ベシクル(VLV)を含む組成物は、少なくとも1つの異種タンパク質をコードするDNAがSFVサブゲノムRNAプロモーターと2A DNAとの間に挿入されている、本発明の高力価ハイブリッドウイルスベクターにより産生される。
【００１７】
別の局面において、本発明は、異種タンパク質に対する免疫性を対象に与える方法を含む。方法は、本発明の高力価ハイブリッドウイルスベクターにより産生された少なくとも107 pfu/mlのVLVを含む組成物を対象に投与する工程を含み、ここで、少なくとも1つの異種タンパク質をコードするDNAはSFVサブゲノムRNAプロモーターと2A DNAとの間に挿入され、異種タンパク質の発現が対象における免疫応答を誘導する。
【００１８】
本発明はまた、対象における疾患を処置および/または予防する方法を含む。方法は、本発明の高力価ハイブリッドウイルスベクターにより産生された治療的有効量のウイルス様ベシクル(VLV)組成物を、そのような処置の必要がある対象に投与する工程を含み、ここで、少なくとも1つの異種タンパク質をコードするDNAはSFVサブゲノムRNAプロモーターと2A DNAとの間に挿入される。他の態様において、疾患は、感染性疾患、悪性疾患および自己免疫疾患からなる群より選択される。
【００１９】
本発明はまた、組成物の投与が対象において免疫応答を誘発する、対象にワクチン接種する方法も提供する。ワクチン接種の方法は、本発明の高力価ハイブリッドウイルスベクターによって産生されたウイルス様ベシクル(VLV)組成物の薬学的に許容可能な量の組成物を対象に投与する工程を含み、ここで、少なくとも1つの異種タンパク質をコードするDNAはSFVサブゲノムRNAプロモーターと2A DNAとの間に挿入される。
【００２０】
いくつかの態様において、対象において免疫応答を誘発する組成物は予防的に投与される。他の態様において、組成物は対象に治療的に投与される。さらなる態様において、組成物はアジュバントと組み合わせて投与される。いっそうさらなる態様において、アジュバントは、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、Quil A、Detox、ISCOMおよびスクアレンからなる群より選択される。
【００２１】
別の局面において、本発明には、対象において異種タンパク質に対するメモリーT細胞免疫応答を生じさせる方法が含まれる。方法は、本発明の高力価ハイブリッドウイルスベクターによって産生されたVLV組成物を対象に、対象において免疫応答を誘発するのに有効な量で投与する工程であって、少なくとも1つの異種タンパク質をコードするDNAがSFVサブゲノムRNAプロモーターと2A DNAとの間に挿入されている、工程、および第2のその後の時期に、第2の有効量の前記VLV組成物を投与する工程であって、異種タンパク質に対するTメモリー細胞が対象において生じる、工程を含む。
【００２２】
本発明にはまた、対象において異種タンパク質に対する適応B細胞免疫応答を生じさせる方法も含まれる。方法は、本発明の高力価ハイブリッドウイルスベクターによって産生されるVLV組成物を対象に、対象において免疫応答を誘発するのに有効な量で投与する工程であって、少なくとも1つの異種タンパク質をコードするDNAがSFVサブゲノムRNAプロモーターと2A DNAとの間に挿入される、工程、および第2のその後の時期に、第2の有効量の前記VLV組成物を投与する工程であって、異種タンパク質に対するBメモリー細胞が対象において生じる、工程を含む。
【００２３】
いくつかの態様において、異種タンパク質は、感染性疾患、悪性疾患および自己免疫疾患からなる群より選択される疾患に関連する。さらなる態様において、感染性疾患は、エシェリキア属(Escherichia)、ストレプトコッカス属(Streptococcus)、スタフィロコッカス属(Staphylococcus)、ボルデテラ属(Bordetella)、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)、マイコバクテリウム属(Mycobacterium)、ナイセリア属(Neisseria)、ヘモフィルス属(Haemophilus)、放線菌(Actinomycete)、ストレプトミセス菌(Streptomycete)、ノカルジア属(Nocardia)、エンテロバクター属(Enterobacter)、エルシニア属(Yersinia)、フランシセラ属(Fancisella)、パストレラ属(Pasturella)、モラクセラ属(Moraxella)、アシネトバクター属(Acinetobacter)、エリジペロスリックス属(Erysipelothrix)、ブランハメラ属(Branhamella)、アクチノバチルス属(Actinobacillus)、ストレプトバチルス属(Streptobacillus)、リステリア属(Listeria)、カリマトバクテリウム属(Calymmatobacterium)、ブルセラ属(Brucella)、バチルス属(Bacillus)、クロストリジウム属(Clostridium)、トレポネーマ属(Treponema)、サルモネラ属(Salmonella)、クレブシエラ属(Kleibsiella)、ビブリオ属(Vibrio)、プロテウス属(Proteus)、エルウイニア属(Erwinia)、ボレリア属(Borrelia)、レプトスピラ属(Leptospira)、スピリルム属(Spirillum)、カンピロバクター属(Campylobacter)、シゲラ属(Shigella)、レジオネラ属(Legionella)、シュードモナス属(Pseudomonas)、アエロモナス属(Aeromonas)、リケッチア属(Rickettsia)、クラジミア属(Chlamydia)、コクシエラ属(Coxiella)、ボレリア属およびマイコプラスマ属(Mycoplasma)からなる群より選択される原核生物に起因する。いっそうさらなる態様において、感染性疾患は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、A型肝炎ウイルス(HAV)、B型肝炎(HBV)、C型肝炎(HCV)、任意の他の肝炎関連ウイルス、ヒトパピローマウイルス(HPV)および特に高リスク発がん性ヒトパピローマウイルス型、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス(KSHV)(ヒトヘルペスウイルス8(HHV-8)としても公知)、単純ヘルペスウイルス(HSV)(任意のサブタイプ)、呼吸器多核体ウイルス(RSV)および関連する呼吸器ウイルス、インフルエンザウイルス、SARS関連コロナウイルス(SARS-CoV)を含むコロナウイルス、ライノウイルス、アデノウイルス、SIV、ロタウイルス、ヒトパピローマウイルス、アルボウイルス、麻疹ウイルス、ポリオウイルス、風疹ウイルス、ムンプスウイルス、パポバウイルス、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、水痘ウイルス、ハンタウイルス、ならびに任意の新興ウイルス、特に、エボラウイルス、マーブルグウイルス、西ナイルウイルス(WNV)、セントルイス脳炎ウイルス(SLEV)、リフトバレー熱ウイルス(RVFV)、およびブニヤウイルス科の他のメンバーからなる群より選択されるウイルスに起因する。いっそうさらなる態様において、感染性疾患は、アピコンプレクサ類およびトリパノソーマ類からなる群より選択される原生動物に起因する。いっそうさらなる態様において、悪性疾患は、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)、濾胞性非ホジキンリンパ腫、悪性メラノーマ、ヘアリーセル白血病、多発性骨髄腫、カルチノイド症候群および肝臓およびリンパ節転移を伴うカルチノイド腫瘍、AIDS関連カポジ肉腫、腎細胞がん、大腸の腺がん、頭頸部扁平上皮がん、結腸がん、肺がん、乳がん、胃がん、前立腺がん、ならびに子宮内膜がんから��る群より選択されるがんである。さらに他の態様において、自己免疫疾患は、アジソン病、セリアック病、皮膚筋炎、グレーブス病、橋本甲状腺炎、多発性硬化症、重症筋無力症、悪性貧血、反応性関節炎、関節リウマチ、シェーグレン症候群、全身性エリトマトーデス、およびI型糖尿病からなる群より選択される。
【００２４】
別の局面において、本発明には、高力価RNAウイルス様ベシクル(VLV)を選択する方法が含まれる。方法は、アルファウイルス構造タンパク質を含まないウイルス構造タンパク質をコードするRNA配列を含むハイブリッドウイルスベクターを細胞培養において継代培養することによってVLVを生じさせる工程、および生じたVLVを、細胞培養におけるVLVの大規模な継代培養およびVLVの定方向突然変異誘発からなる群より選択される少なくとも1つの手法を用いて、高力価VLVについてスクリーニングする工程を含む。
【００２５】
いくつかの態様において、ハイブリッドウイルスベクターRNA配列はアルファウイルス非構造タンパク質をコードする。いくつかの態様において、非構造タンパク質はセムリキ森林ウイルス (SFV)非構造タンパク質である。他の態様において、ウイルス構造タンパク質はラブドウイルス糖タンパク質を含む。他の態様において、糖タンパク質は水疱性口内炎ウイルス(VSV) Gタンパク質である。さらなる態様において、高力価VLVは、少なくとも1 mlあたり107プラーク形成単位(pfu)を産生する。いっそうさらなる態様において、高力価VLVは、免疫応答を誘導するのに有効な量で対象に投与される。
【００２６】
いくつかの態様において、対象は哺乳動物である。他の態様において、哺乳動物はヒトである。
【００２７】
さらなる局面において、発明には、少なくとも107プラーク形成単位(pfu)の力価を有するRNAウイルス様ベシクル(VLV)が含まれる。本発明のRNA VLVは、SFV構造タンパク質ヌクレオチド配列を欠き、かつVSV Gタンパク質ヌクレオチド配列、およびG-4700-A、A-5424-G、G-5434-A、T-5825-C、T-5930-C、A-6047-G、G-6783-A、G-6963-A、G-7834-A、T-8859-A、T-8864-C、G-9211-A、A-10427-G、G-11560-A、A-11871-GおよびT-11978-Cからなる群から選択される変異のうち少なくとも2つを含むSFV非構造タンパク質ヌクレオチド配列を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
本発明を例証する目的で、本発明のある特定の態様を図面に示す。しかし、本発明は、図面に示されている態様の正確な配置および手段に限定されない。
【図１Ａ】VLV DNA構築物を示す一連の図である。CMVプロモーターを有するDNAベクター中に再構築したp50 RNAゲノム：pCMV-SFVG-p50Rのマップ。
【図１Ｂ】VLV DNA構築物を示す一連の図である。高力価の進化したVLVにおける欠失および11種のアミノ酸変化を示す。
【図２】VSV Gがp50 VLVの構造タンパク質であることを示す画像である。
【図３】p50 VLVの電子顕微鏡写真を図示する一連の画像である。図3A〜3B：粒子の多くは、その表面上にタンパク質スパイク、おそらくVSV Gタンパク質を有しているように見える(矢印)。図3C：本方法によりTEMのために調製された粒子の一部は、壊れて、核酸を放出しているようにも見える。図3D：固定されず、VSV Gに対する抗体で、続いて12 nm金粒子にコンジュゲートされた二次抗体で標識された粒子に対するTEM。粒子は次いで、リンタングステン酸でネガティブ染色された。
【図４】VSVと比較したp50 VLVの増殖を図示する一連のグラフおよび画像である。図4A：感染後のpfu/mlの数を示す、VSVと比較したp50 VLVの増殖曲線。図4B：VLV力価のプラークサイズがVSVより約8〜10倍低いことを示すプレート。
【図５】DNA起動(DNA-launched)ベクター(pCMVSFVG-p50R)におけるp50 VLVゲノムの再構築を図示する図である。
【図６】VLVに感染した細胞の薄切片電子顕微鏡写真を例示する一連の画像である。感染後7時間の細胞の固定した薄切片のTEM。図6A〜6B：低力価VLVに感染した細胞の形質膜は、往々にして細い「くびれ部分」によって細胞表面に付着しているように見える多数の球状構造を示した(白矢印)。図6C：くびれ部分によって膜に付着しているSFV小球体(白矢印)を含む典型的なCPVである細胞内液胞。図6D〜6E：p50 VLVに感染した低力価VLV細胞は、細胞表面から出芽しているように見えるベシクルをごくまれに示した。これらはまた、多くの場合において、くびれ様構造によって連結されているようにも見える(白矢印)。
【図７】PTAPモチーフが高力価VLV産生に必要とされることを明らかにするグラフである。
【図８】高力価VLVにおける一本のmRNAからのSIV GagおよびVSV Gの発現を図示する一連の図および画像である。図8A：VLV遺伝子マップの図示。図8B：SIV GagおよびVSV Gに対する抗体によるSDS-PAGEおよびウエスタンブロッティング。VLVに感染した細胞からのGagおよびG両者の発現を検証した。
【図９】高力価VLVの発生のモデルを図示する一連の画像である。図9A：SFVレプリコンを含む小球体は通常、細胞表面に輸送され、次いで、エンドサイトーシスによって急速に取り込まれる。図9B：VSV Gを発現するSFVレプリコンのエンドサイトーシスはVSV Gによって阻害される。感染性VLVの非効率的な放出。図9C：継代したVLVは、細胞ESCRT機構を用いる効率的な発芽を可能にする、nsP1におけるPTAP配列およびさらなる変異を進化させた。
【図１０】ゲノムおよびサブゲノムG mRNAのノーザンブロット解析を表す画像である。このブロットは、pCMV-SFVG-Δ1672またはpCMV-SFVG-p50Rに感染させた細胞由来のVLVに感染した細胞で発現させた9.2-kbゲノムレプリコンRNAおよびサブゲノム1.9-kb VSV Gタンパク質(VSVG)mRNAの位置を示す。未感染細胞からのRNAのレーンはUNIFと表示する。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
発明の詳細な説明
本発明は、進化したウイルス様粒子(VLV)が、以前に記載された(米国特許出願第12/747,59号; Rolls et al., 1994. Cell 79:497-506およびRolls et al., 1996. Virology 218:406-41)VLV粒子より、はるかに高力価(1000倍以上)になり、かつ外来遺伝子をより安定に発現できるという予想外の発見に関する。よって、本明細書に記載の種々の態様において、変異アルファウイルス非構造タンパク質ヌクレオチド配列、変異非アルファウイルス構造ヌクレオチド配列、および真核生物プロモーターをコードするDNAを含み、高力価VLVを産生する、進化したハイブリッドウイルスベクターワクチンの作製に関する組成物および方法が開示される。加えて、本発明には、VLVを選択する組成物および方法、特定の疾患または障害を処置するおよび/または予防するまたはそれに対する免疫性を与える方法、ならびに本発明のVLVを投与した対象におけるメモリーT細胞免疫応答およびメモリーB細胞免疫応答を誘導する方法が含まれる。
【００３０】
定義
別途定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと同様または同等の任意の方法および材料が、本発明の試験の実施において使用され得るが、好ましい材料および方法が、本明細書に記載されている。本発明を説明および特許請求する中で、以下の用語法を使用することになる。
【００３１】
本明細書において使用される用語法は、特定の態様を説明するだけの目的であり、限定するようには意図されないこともまた、理解されるべきである。
【００３２】
本明細書において使用される際、「a」および「an」という冠詞は、冠詞の文法上の目的語の1つまたは1つより多く（すなわち、少なくとも1つ）を指すように使用される。例として、「要素」は、1つの要素または1つより多い要素を意味する。
【００３３】
本明細書において使用される際、量、時間的継続期間などのような測定可能な値を指す場合に、「約」という用語は、特定された値から、±20％または±10％、より好ましくは±5％、さらにより好ましくは±1％、なおより好ましくは±0.1％の変動を、そのような変動が開示される方法を行うのに適切である際に、包含するように意味される。
【００３４】
本明細書において使用される際、「より大きい」とは、対照よりも、少なくとも10％もしくはそれより多く、例えば、20％、30％、40％、もしくは50％、60％、70％、80％、90％高いかまたはそれよりも高い、ならびに／または、1.1倍、1.2倍、1.4倍、1.6倍、1.8倍、2.0倍高いかまたはそれよりも高い、ならびに、それらの間の任意のおよびすべての全増分または部分的増分である、発現レベルを指す。
【００３５】
本明細書において使用される際、「対照」または「参照」という用語は、互換的に使用され、比較の標準として使用される値を指す。
【００３６】
本明細書において使用される「対象」または「患者」は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物であり得る。非ヒト哺乳動物は、例えば、ヒツジ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、およびマウスの哺乳動物などの、家畜およびペットを含む。好ましくは、対象はヒトである。
【００３７】
本明細書において使用される「変異」とは、その天然の状態からの変更を結果としてもたらす、DNA配列における変化である。変異は、プリン（アデニンおよび／もしくはチミン）ならびに／またはピリミジン（グアニンおよび／もしくはシトシン）などの少なくとも1つのデオキシリボ核酸塩基の欠失および／または挿入および／または重複および／または置換を含むことができる。変異は、生物の観察可能な特徴（表現型）において識別可能な変化をもたらしてもよいし、またはもたらさなくてもよい。
【００３８】
本明細書において使用される「進化した」または「進化する」という用語は、継続的な世代にわたる生物学的集団の遺伝形質における変化（すなわち、進化）を指す。進化的プロセスは、種、個々の生物、ならびにDNAおよびタンパク質などの分子を含む、生物学的組織のあらゆるレベルで、多様性を生じさせる（Hall and Hallgrimsson, eds. 2008, Strickberger's Evolution (4th ed.), Jones & Bartlett）。本発明の文脈において、「進化した」ハイブリッドウイルスは、有益な変異を蓄積し、培養の50継代後に、元のハイブリッドウイルスよりも1000倍高い力価を有するVLVを産生した。
【００３９】
「ワクチン接種」とは、抗原が関係している疾患または障害を予防または処置する手助けをする免疫応答を対象において誘発するために、対象に抗原を接種するプロセスを指す。「免疫化」という用語は、本明細書においてワクチン接種と互換的に使用される。
【００４０】
本明細書において使用される「免疫原性」という用語は、抗原または生物が動物に投与された際に動物において免疫応答を誘発する、抗原または生物の生得的能力を指す。したがって、「免疫原性を増強すること」は、抗原または生物が動物に投与された際に動物において免疫応答を誘発する、抗原または生物の能力を増大させることを指す。免疫応答を誘発する抗原または生物の能力の増大は、中でも、抗原または生物に結合する抗体のより多くの数、抗原または生物に対する抗体のより大きな多様性、抗原または生物に特異的なT細胞のより多くの数、抗原または生物に対する、より大きな細胞傷害性T細胞またはヘルパーT細胞の応答、抗原に応答したサイトカインのより多くの発現などによって測定することができる。
【００４１】
本明細書において使用される「活性化」という用語は、注目に値する生化学的または形態学的変化を誘導する、十分な細胞表面部分の連結後の細胞の状態を指す。T細胞の文脈内で、そのような活性化は、細胞増殖を誘導するように十分に刺激されているT細胞の状態を指す。T細胞の活性化はまた、サイトカイン産生、および制御性または細胞溶解性のエフェクター機能の遂行も誘導し得る。他の細胞の文脈内で、この用語は、特定の物理化学的プロセスの上方制御または下方制御のいずれかを暗示する。
【００４２】
「活性化T細胞」という用語は、細胞分裂、サイトカイン産生、制御性もしくは細胞溶解性のエフェクター機能の遂行を現在経験しており、かつ／または「活性化」のプロセスを最近経験したT細胞を意味する。
【００４３】
「体液性免疫」または「体液性免疫応答」は、両方とも、B細胞媒介性免疫を指し、Bリンパ球（B細胞）により産生および分泌される高度に特異的な抗体によって媒介される。
【００４４】
「予防」とは、障害に対するワクチン接種のための薬学的組成物の使用を指す。
【００４５】
「アジュバント」とは、抗原の免疫原性を強化することができる物質を指す。アジュバントは、1つの物質または物質の混合物であることができ、免疫系に直接作用することによって、または抗原の徐放を提供することによって機能する。アジュバントの例は、アルミニウム塩、ポリアニオン、細菌糖ペプチド、およびフロイント不完全のような徐放剤である。
【００４６】
「送達ビヒクル」とは、抗原を特異的な細胞に標的化し、かつ、免疫系による抗原の有効な認識を促進する手助けをする組成物を指す。最もよく知られた送達ビヒクルは、リポソーム、ウィロソーム、マイクロスフェアおよびナノスフェアを含むマイクロ粒子、ポリマー、細菌ゴースト、細菌多糖類、弱毒化細菌、ウイルス様粒子、弱毒化ウイルス、およびISCOMである。
【００４７】
「の中に組み込まれる」または「にカプセル化される」とは、マイクロ粒子、細菌ゴースト、弱毒化細菌、ウイルス様粒子、弱毒化ウイルス、ISCOM、リポソーム、および好ましくはウィロソームなどの送達ビヒクル内にある抗原性ペプチドを指す。
【００４８】
本明細書において使用される際、「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は、互換的に使用され、ペプチド結合により共有結合で連結されたアミノ酸残基から構成される化合物を指す。タンパク質またはペプチドは、少なくとも2個のアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質またはペプチドの配列を含み得るアミノ酸の最大数に制限は設けられていない。ポリペプチドは、ペプチド結合により互いに接続された2個以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質を含む。本明細書において使用される際、用語は、当技術分野において、例えば、ペプチド、オリゴペプチド、およびオリゴマーとも一般的に呼ばれる短い鎖、ならびに、多くのタイプが存在する、当技術分野においてタンパク質と概して呼ばれるより長い鎖の両方を指す。「ポリペプチド」は、中でも、例えば、生物学的活性断片、実質的に相同のポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドのバリアント、改変ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質を含む。ポリペプチドは、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、またはこれらの組み合わせを含む。
【００４９】
本明細書において使用される「融合タンパク質」とは、ペプチド結合または他の化学結合によって互いに連結された2つ以上のタンパク質を含む、タンパク質を指す。タンパク質は、ペプチド結合もしくは他の化学結合によって直接、または、本明細書においてスペーサーと呼ばれる、2つ以上のタンパク質の間の1つまたは複数のアミノ酸を伴って、互いに連結することができる。
【００５０】
本発明の文脈において、一般的に存在する核酸塩基について以下の略語を使用する。「A」はアデノシンを指し、「C」はシトシンを指し、「G」はグアノシンを指し、「T」はチミジンを指し、および「U」はウリジンを指す。
【００５１】
本明細書において使用される「RNA」という用語は、リボ核酸として定義される。
【００５２】
「形質転換する」、「形質転換すること」、および「形質転換」は、単離された核酸を生物の内部中に導入するプロセスを指すように、本明細書において使用される。
【００５３】
本発明の文脈内で使用される「処置」という用語は、疾患または障害のための治療的処置、および予防的もしくは抑制的措置を含むように意味される。本明細書において使用される際、「処置」という用語、ならびに「処置する」および「処置すること」などの関連用語は、疾患状態またはその少なくとも1つの症状の進行、重症度、および／または継続期間の低減を意味する。したがって、「処置」という用語は、対象のためになることができる任意のレジメンを指す。処置は、現状に関してでもよいし、または予防的（予防的処置）であってもよい。処置は、治癒的、緩和的、または予防的効果を含み得る。「治療的」および「予防的」処置に対する本明細書における言及は、その最も広い文脈において考慮されるべきである。「治療的」という用語は、対象が完全回復まで処置されることを、必ずしも意味しない。同様に、「予防的」とは、対象が最終的に疾患状態にかからないであろうことを、必ずしも意味しない。したがって、例えば、処置という用語は、それにより疾患または障害のすべての徴候を予防または除去する、疾患または障害の発症の前または後の作用物質の投与を含む。別の例として、疾患の症状と戦うための疾患の臨床症状発現後の作用物質の投与は、疾患の「処置」を含む。
【００５４】
「生物学的」または「生物学的試料」という用語は、生物から、または生物の構成要素（例えば、細胞）から得られた試料を指す。試料は、任意の生物学的組織または体液であり得る。しばしば、試料は、患者に由来する試料である「臨床試料」であると考えられる。そのような試料は、骨髄、心臓組織、痰、血液、リンパ液、血液細胞（例えば、白血球）、組織もしくは細針生検試料、尿、腹水、および胸水、またはそれら由来の細胞を含むが、これらに限定されない。生物学的試料はまた、組織学的目的で取得された凍結切片などの、組織の切片も含む。
【００５５】
ヌクレオチド配列に関して使用される場合の「同等」という用語は、機能的に同等のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を指すように理解される。同等のヌクレオチド配列は、1個または複数のヌクレオチドの置換、付加、または欠失により異なる配列、例えば対立遺伝子バリアントを含むことになり；したがって、遺伝コードの縮重のために本明細書に記載されている核酸のヌクレオチド配列とは異なる配列を含む。
【００５６】
「ハイブリダイゼーション」とは、核酸の鎖が塩基対形成を通して相補鎖と結合する任意のプロセスを指す。二本の一本鎖核酸は、二本鎖の二重鎖を形成する場合に「ハイブリダイズする」。二本鎖性の領域は、一本鎖核酸の一方もしくは両方の完全長、または一方の一本鎖核酸のすべておよびもう一方の一本鎖核酸の部分配列を含むことができるか、または、二本鎖性の領域は、各核酸の部分配列を含むことができる。ハイブリダイゼーションはまた、二本の鎖が依然として二本鎖ヘリックスを形成しているという条件で、ある一定のミスマッチを含有する二重鎖の形成も含む。「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」とは、本質的に特異的なハイブリダイゼーションを結果としてもたらすハイブリダイゼーション条件を指す。鋳型核酸の標的部位に対するプローブの「特異的ハイブリダイゼーション」という用語は、ハイブリダイゼーションシグナルが明らかにとらえられるような、主に標的に対するプローブのハイブリダイゼーションを指す。本明細書にさらに記載されているように、特異的ハイブリダイゼーションを結果としてもたらすそのような条件は、相同性の領域の長さ、領域のGC含量、ハイブリッドの融解温度「Tm」に応じて変動する。したがって、ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション溶液および洗浄液の塩含量、酸性度、および温度において変動することになる。
【００５７】
DNAまたはRNAなどの核酸について、本明細書において使用される「単離された」という用語は、巨大分子の天然供給源に存在している、それぞれ、他のDNAまたはRNAから分離されている分子を指す。本明細書において使用される単離されたという用語はまた、組換えDNA技術により産生された場合には細胞材料、ウイルス材料、もしくは培養培地を、または、化学的に合成された場合には化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない、核酸またはペプチドも指す。その上、「単離された核酸」とは、断片として天然に存在せず、天然の状態においては見出されないであろう核酸断片を含むように意味される。「単離された」という用語はまた、他の細胞タンパク質から単離されているポリペプチドを指すように、本明細書において使用され、精製ポリペプチドおよび組換えポリペプチドの両方を包含するように意味される。「単離された細胞」または「単離された細胞の集団」とは、その天然の環境には存在しない細胞または細胞の集団である。
【００５８】
本明細書において使用される際、「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（DNA）、および、適切な場合は、リボ核酸（RNA）などのポリヌクレオチドを指す。用語はまた、同等物として、ヌクレオチド類似体から作製されたRNAまたはDNAのいずれかの類似体、ならびに、記載されている態様に適用可能な際に、一本鎖（センスまたはアンチセンス）および二本鎖のポリヌクレオチドを含むようにも理解されるべきである。EST、染色体、cDNA、mRNA、およびrRNAは、核酸と呼ばれ得る分子の代表的な例である。
【００５９】
ポリヌクレオチド配列の文脈において使用される際の「バリアント」という用語は、遺伝子またはそのコード配列のものに関連するポリヌクレオチド配列を包含し得る。この定義はまた、例えば、「対立遺伝子」、「スプライシング」、「種」、または「多型」バリアントも含み得る。ポリペプチドは、概して、互いに対して有意なアミノ酸同一性を有することになる。多型バリアントとは、所定の種の個体間での、特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列における変動である。多型バリアントは、ポリヌクレオチド配列が一塩基変わっている「一塩基多型」（SNP）を包含し得る。SNPの存在は、例えば、ある特定の集団、疾患状態、または疾患状態の性向を示し得る。
【００６０】
「改善すること」または「処置すること」という用語は、疾患と関連する臨床徴候および／または症状が、行われた作用の結果として少なくなることを意味する。モニターされるべき徴候または症状は、熟練した臨床医に周知であろう。
【００６１】
本明細書において使用される際、「併用療法」により、第1の作用物質が別の作用物質と共に投与されることが意味される。「と組み合わせて」または「と共に」とは、1つの処置様式の別の処置様式に加えた投与を指す。そのように、「と組み合わせて」とは、個体に対する、1つの処置様式の、他の処置様式の送達の前、その間、またはその後の投与を指す。そのような組み合わせは、単一処置レジメンまたはレジメの一部であると考えられる。
【００６２】
範囲：本開示を通して、本発明の種々の局面を、範囲形式で示すことができる。範囲形式での記載は、単に利便性および簡潔性のためであり、本発明の範囲に対する融通のきかない限定と解釈されるべきではないことが、理解されるべきである。したがって、範囲の記載は、具体的に開示されているすべての可能な部分範囲、ならびにその範囲内の個々の数値を有すると考えられるべきである。例えば、1〜6などの範囲の記載は、具体的に開示されている、1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6などのような部分範囲、ならびに、その範囲内の個々の数、例えば、1、2、2.7、3、4、5、5.3、および6を有すると考えられるべきである。これは、範囲の広さに関わらずあてはまる。
【００６３】
「力価」とは、参照試料と比較したウイルスまたはウイルスベクターの濃度の数値的測定単位であり、濃度は、ウイルスの活性、または単位体積の緩衝液中のウイルスの数の測定のいずれかにより決定される。ウイルスストックの力価は、例えば、ウイルスの1つの溶液または複数の溶液（典型的には連続希釈液）の、例えば軟寒天法を用いたHeLa細胞に対する感染性の測定（Graham & Van Der eb (1973) Virology 52:456-467を参照されたい）により、または細胞に与えられる耐性、例えば、ウイルスもしくはベクターによってコードされるG418耐性のモニタリングにより、またはUV分光光度法によるウイルスの定量（Chardonnet & Dales (1970) Virology 40:462-477を参照されたい）により、決定される。
【００６４】
本明細書において使用される際、「薬学的組成物」という用語は、本発明内で有用な少なくとも1つの化合物と、担体、安定剤、希釈剤、アジュバント、分散剤、懸濁剤、濃化剤、および／または賦形剤などの他の化学的構成要素との混合物を指す。薬学的組成物は、化合物の生物への投与を促進する。静脈内、経口、エアロゾル、非経口、眼、肺、および局所投与を含むがこれらに限定されない、化合物を投与する複数の技術が、当技術分野に存在する。
【００６５】
「薬学的に許容される担体」という言語は、本発明の化合物を、それがその意図される機能を果たし得るように対象内でまたは対象へ運搬または輸送することに関与する、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される材料、組成物、または担体、例えば、液体もしくは固体充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、またはカプセル化材料を含む。典型的に、そのような化合物は、身体の1つの器官または部分から、身体の別の器官または部分へと運搬または輸送される。各々の塩または担体は、製剤の他の成分と適合性であり、かつ対象に有害ではない意味で「許容され」なければならない。薬学的に許容される担体として働き得る材料のいくつかの例は、以下を含む：ラクトース、グルコース、およびスクロースなどの糖；コーンスターチおよびバレイショデンプンなどのデンプン；セルロース、ならびに、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロースなどのその誘導体；トラガント末；麦芽；ゼラチン；タルク；ココアバターおよび坐剤ワックスなどの賦形剤；落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、および大豆油などの油；プロピレングリコールなどのグリコール；グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコールなどのポリオール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；発熱物質を含まない水；等張生理食塩水；リンガー溶液；エチルアルコール；リン酸緩衝溶液；希釈剤；顆粒化剤；潤滑剤；結合剤；崩壊剤；湿潤剤；乳化剤；着色剤；放出剤；コーティング剤；甘味剤；着香剤；芳香剤；保存剤；抗酸化剤；可塑剤；ゲル化剤；濃化剤；硬膜剤；硬化剤；懸濁剤；界面活性剤；保湿剤；担体；安定剤；ならびに薬学的製剤において使用される他の非毒性適合性物質、またはこれらの任意の組み合わせ。本明細書において使用される際、「薬学的に許容される担体」はまた、化合物の活性と適合性であり、かつ対象に生理学的に許容される、任意のおよびすべてのコーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、ならびに吸収遅延剤なども含む。補足的な活性化合物もまた、組成物中に組み入れられ得る。
【００６６】
本明細書において使用される「抗体」または「Ab」という用語は、抗原上の特異的なエピトープに特異的に結合する免疫グロブリン分子に由来するタンパク質、またはポリペプチド配列を指す。抗体は、天然供給源または組換え供給源に由来するインタクトな免疫グロブリンであることができ、および、インタクトな免疫グロブリンの免疫反応部分であることができる。本発明において有用な抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、細胞内抗体（「イントラボディ」）、Fv、FabおよびF(ab)2、ならびに一本鎖抗体（scFv）およびヒト化抗体を含む、様々な形態で存在し得る（Harlow et al., 1998, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY；Harlow et al., 1989, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York；Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883；Bird et al., 1988, Science 242:423-426）。抗体は、天然供給源または組換え供給源に由来し得る。抗体は、典型的に、免疫グロブリン分子の四量体である。
【００６７】
本明細書において使用される「抗原」または「Ag」という用語は、免疫応答を惹起する分子として定義される。この免疫応答は、抗体産生、もしくは特異的な免疫適格細胞の活性化のいずれか、または両方を含み得る。当業者は、事実上すべてのタンパク質またはペプチドを含む任意の巨大分子が、抗原として働けることを理解するであろう。さらに、抗原は、組換えまたはゲノムDNAに由来することができる。当業者は、免疫応答を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分的ヌクレオチド配列を含む任意のDNAが、したがって、その用語が本明細書において使用されるような「抗原」をコードすることを理解するであろう。さらに、当業者は、抗原が、遺伝子の完全長ヌクレオチド配列により単独でコードされる必要はないことを理解するであろう。本発明が、1つより多い遺伝子の部分的ヌクレオチド配列の使用を含むが、これに限定されないこと、および、これらのヌクレオチド配列が、望ましい免疫応答を誘発するように種々の組み合わせで配置されることが、容易に明らかである。その上、当業者は、抗原が、「遺伝子」によりコードされる必要は全くないことを理解するであろう。抗原は、合成で生成でき、または生物学的試料に由来できることが、容易に明らかである。そのような生物学的試料は、組織試料、腫瘍試料、細胞、または生物学的体液を含むことができるが、これらに限定されない。
【００６８】
本明細書において使用される「異種抗原」とは、抗原を含むかまたは発現する生物にとって内因性ではない抗原を指す。例として、ウイルス抗原または腫瘍抗原を含むかまたは発現するウイルスワクチンベクターは、異種抗原を含む。本明細書において使用される「異種タンパク質」とは、その供給源に関わらず、対象において有益な免疫応答を誘発するタンパク質を指す。
【００６９】
本明細書において定義される際、「アルファウイルス」は、ウイルスの第IV群トガウイルス科（Togaviridae family）のメンバーである。アルファウイルスは、アウラウイルス、ババンキウイルス（Babanki virus）、バーマ森林ウイルス、ベバルウイルス、カバソウウイルス（Cabassou virus）、チクングンヤウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、エバーグレーズウイルス（Everglades virus）、フォートモーガンウイルス（Fort Morgan virus）、ゲタウイルス、ハイランズウイルス（Highlands virus）、キジラガチウイルス（Kyzylagach virus）、マヤロウイルス、メトリウイルス（Me Tri virus）、ミデルブルグウイルス（Middelburg virus）、モッソダスペドラスウイルス（Mosso das Pedras virus）、ムカンボウイルス、ヌドゥムウイルス、オニョンニョンウイルス、ピクスナウイルス、リオネグロウイルス、ロスリバーウイルス、サギアマウイルス（Sagiama virus）、サケ膵臓病ウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、ミナミゾウアザラシウイルス、トナテウイルス（Tonate virus）、トロカラウイルス（Trocara virus）、ウナウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、およびワタロアウイルスを含むが、これらに限定されない。
【００７０】
本明細書において定義される際、「アルファウイルス非構造タンパク質」は、nsp1、nsp2、nsp3、およびnsp4からなる群より選択することができる。
【００７１】
本明細書において定義される際、「アルファウイルス構造タンパク質」は、アルファウイルスキャプシドタンパク質、および少なくとも1つのスパイクタンパク質からなる群より選択することができる。
【００７２】
「特異的に結合する」、「選択的に結合する」、または「結合特異性」という用語は、本発明のヒト化抗体または結合化合物の、非標的エピトープに結合した場合に結果として生じるものよりも高い親和性でVSV上に存在する標的エピトープに結合する能力を指す。ある特定の態様において、特異的結合とは、非標的エピトープに対する親和性よりも少なくとも10、50、100、250、500、または1000倍高い親和性での、標的への結合を指す。
【００７３】
本明細書において使用される際、「有効量」または「治療的有効量」という用語は、特定の疾患状態を予防するために必要とされる、または、疾患状態もしくはその少なくとも1つの症状もしくはそれと関連する状態の重症度を低減させるか、および／または改善する、本発明のベクターから生じたウイルス様粒子の量を意味する。
【００７４】
本明細書において使用される「プロモーター」という用語は、細胞の合成機構、または導入された合成機構によって認識され、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始するために必要とされるDNA配列として定義される。
【００７５】
本明細書において使用される際、「プロモーター／制御配列」という用語は、プロモーター／制御配列に機能的に連結されている遺伝子産物の発現に必要とされる核酸配列を意味する。いくつかの事例において、この配列は、コアプロモーター配列であり得、他の事例において、この配列はまた、遺伝子産物の発現に必要とされるエンハンサー配列および他の制御エレメントも含み得る。プロモーター／制御配列は、例えば、組織特異的様式で遺伝子産物を発現するものであり得る。
【００７６】
「構成性」プロモーターとは、遺伝子産物をコードまたは特定するポリヌクレオチドと機能的に連結されている場合に、遺伝子産物が細胞において細胞の大部分またはすべての生理学的条件下で産生されるようにする、ヌクレオチド配列である。
【００７７】
「誘導性」プロモーターとは、遺伝子産物をコードまたは特定するポリヌクレオチドと機能的に連結されている場合に、遺伝子産物が細胞において、実質的に、プロモーターに対応する誘導物質が細胞に存在するときにのみ産生されるようにする、ヌクレオチド配列である。
【００７８】
「ベクター」とは、単離された核酸を含み、細胞の内部に単離された核酸を送達するために使用することができる物体の組成物である。直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と会合したポリヌクレオチド、プラスミド、およびウイルスを含むがこれらに限定されない、多数のベクターが、当技術分野において公知である。本開示において、「ベクター」という用語は、自己複製ウイルスを含む。
【００７９】
「2A」または「2Aペプチド」という用語は、自己プロセシングウイルスペプチドである。2Aペプチドは、単一のORF転写単位において異なるタンパク質をコードする配列を分離することができる（Ryan et al., 1991, J Gen Virol 72:2727-2732）。2Aペプチドによる切断は当初、自己タンパク質分解事象により媒介されると考えられており、2Aペプチドは「自己切断ペプチド」と呼ばれていた。結局、リボソームスキップメカニズムが提示され、2Aおよび2A様配列は、現在は自己切断ペプチドではなくCHYSEL（cis作用性加水分解酵素因子）と呼ばれている（Donnelly et al., 2001, J Gen Virol 82:1013-1025）。タンパク質を2Aまたは2Aペプチド配列と連結させることにより、単一のORFに由来する複数の別個のタンパク質（本質的に等モル量）の細胞発現が、結果として生じる（de Felipe et al., 2006, Trends Biotechnol 24:68-75）。
【００８０】
説明
組成物
本発明は、図1に示されている高力価ハイブリッドウイルスベクターの発見に、一部基づく。ベクターは、表1に示されているような、G-4700-A、A-5424-G、G-5434-A、T-5825-C、T-5930-C、A-6047-G、G-6783-A、G-6963-A、G-7834-A、T-8859-A、T-8864-C、G-9211-A、A-10427-G、G-11560-A、A-11871-G、およびT-11978-Cからなる群より選択される変異のうちの少なくとも2つを含む、アルファウイルス非構造タンパク質ヌクレオチド配列をコードするDNA配列に機能的に連結されているプロモーター配列を含む、DNA配列を含む。これらの配列は、アルファウイルスサブゲノムRNAプロモーターに対応する第2のプロモーター配列を特定するDNAに機能的に連結されている。この配列は、次に、水疱性口内炎ウイルス（VSV）Gタンパク質をコードするDNAに機能的に連結されている。ベクターは、アルファウイルス構造タンパク質をコードする機能的なヌクレオチド配列を欠いている。ベクターを細胞培養において増やす際には、高力価のウイルス様ベシクル（VLV）が得られ、例えば、少なくとも1 mlあたり107プラーク形成単位（pfu）の力価が得られる。
【００８１】
本発明にはまた、SFV構造タンパク質ヌクレオチド配列を欠き、かつVSV Gタンパク質ヌクレオチド配列およびSFV非構造タンパク質ヌクレオチド配列を含む、少なくとも107プラーク形成単位(pfu)の力価を有する、RNAウイルス様ベシクル(VLV)も含まれる。1つの局面において、SFV非構造タンパク質ヌクレオチド配列は、G-4700-A、A-5424-G、G-5434-A、T-5825-C、T-5930-C、A-6047-G、G-6783-A、G-6963-A、G-7834-A、T-8859-A、T-8864-C、G-9211-A 、A-10427-G 、G-11560-A 、A-11871-G、およびT-11978-Cからなる群より選択される変異のうち少なくとも2つを含む。
【００８２】
本発明の高力価ハイブリッドウイルスベクターを作製する方法は、本明細書の実験例のセクションにおいて詳細に説明されている。
【００８３】
1つの局面において、アルファウイルスはセムリキ森林ウイルス(SFV)である。別の局面において、サブゲノムRNAプロモーターはセムリキ森林ウイルス(SFV)プロモーターである。
【００８４】
1つの局面において、VSV Gタンパク質をコードするVSVは、当技術分野において公知である任意のVSVセロタイプ由来であることができる。VSVセロタイプの非限定的な例は、インディアナ（IND-VSV）セロタイプおよびニュージャージー（NJ-VSV）セロタイプを含む。
【００８５】
1つの局面において、サイトメガロウイルス前初期プロモーターが本明細書中で例証されているが、本発明は、このプロモーター配列に限定されるように解釈されるべきではない。本発明において有用であるプロモーター配列は、高レベルの遺伝子発現を誘導する任意のプロモーターを含む。そのようなプロモーターは、本明細書中の他の場所で開示されているものを含み得るが、これらに限定されない。
【００８６】
本発明の別の局面において、ハイブリッドウイルスベクターは、細胞培養において増やす際に、少なくとも5×107 pfu/ml、少なくとも1×108 pfu/ml、またはそれより大きい力価を達成し得る。
【００８７】
本発明の組成物のさらなる局面は、サブゲノムアルファウイルスプロモーターとVSV Gタンパク質をコードするDNAとの間に挿入されている異種タンパク質をコードするDNAを含む。ここで、異種タンパク質をコードするDNAは、ゾセア・アシグナ（Thosea asigna）ウイルス由来のT2AペプチドをコードするDNAに機能的に連結されており（Szymczak et al., 2004. Nature Biotechnology 22:589-594）、これは次に、VSV Gタンパク質をコードするDNAに機能的に連結されている。このように、結果として生じる本発明のVLVにおける異種タンパク質の発現は、VSV Gタンパク質の発現に実際上結びつけられており、VSV Gタンパク質は、ベクターの複製のために不可欠である。したがって、異種タンパク質の発現は安定化され、ハイブリッドベクターにおけるこのタンパク質を発現する遺伝子の連続した存在が保証される。
【００８８】
いくつかの態様において、2Aペプチドは、ウマ鼻炎Aウイルス（E2A）、口蹄疫ウイルス（F2A）、ブタテッショウウイルス-1（P2A）、ゾセア・アシグナウイルス（T2A）、および当技術分野において公知である任意の2Aペプチドまたはその断片からなる群より選択される。さらなる態様において、2Aペプチドは、T2Aペプチド、または当技術分野において公知であるその任意のT2A断片である。
【００８９】
ある特定の態様において、異種遺伝子は、必ずしもアルファウイルスサブゲノムプロモーター配列でなくてもよいRNAウイルスプロモーター配列の支配下にあることができる。異種プロモーター配列の発現を駆動するRNAプロモーター配列のそのような改変および変動は、当業者が本発明を実施する際に彼らに明らかになるであろう。ベクターはまた、本発明により産生されたハイブリッドウイルスベクターに感染した細胞において、その転写、翻訳、および／または発現を可能にする様式で異種遺伝子に機能的に連結されている、従来の調節エレメントも含み得る。
【００９０】
本明細書において使用される際、「機能的に連結されている」配列は、関心対象の遺伝子と隣接している発現調節配列、および、関心対象の遺伝子を調節するためにトランスでまたはある距離を置いて作用する発現調節配列の両方を含む。発現調節配列は、適切な転写開始、終結、プロモーター、およびエンハンサー配列；スプライシングシグナルおよびポリアデニル化（ポリA）シグナルなどの効率的なRNAプロセシングシグナル；細胞質mRNAを安定化する配列；翻訳効率を増強する配列（すなわち、Kozakコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を増強する配列；ならびに、望ましい場合には、コードされる産物の分泌を増強する配列を含む。天然、構成性、誘導性、および／または組織特異的であるプロモーターを含む、多数の発現調節配列が存在し、本発明の組成物中で使用され得る当技術分野において公知である。「機能的に連結されている」とは、DNAの発現および調節配列に加えて、RNAの発現および調節配列を含むように解釈されるべきである。
【００９１】
追加のプロモーターエレメント、例えばエンハンサーが、転写開始の頻度を制御する。典型的に、これらは、開始部位の30〜110 bp上流の領域に位置するが、数多くのプロモーターが、同様に開始部位の下流に機能的エレメントを含有することが、最近示されている。エレメントが逆であるか、または互いに対して移動されている場合にプロモーター機能が保存されているように、プロモーターエレメント間の間隔は、しばしば柔軟である。チミジンキナーゼ（tk）プロモーターにおいて、プロモーターエレメント間の間隔は、活性が低下し始める前に50 bp離れた状態まで増大させることができる。プロモーターに応じて、個々のエレメントは、転写を活性化するために、協力的にまたは独立的にのいずれかで機能し得る。
【００９２】
1つの態様において、適しているプロモーターは、前初期サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに機能的に連結されている任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動することができる、強い構成性プロモーター配列である。適しているプロモーターの別の例は、伸長成長因子-1α（EF-1α）である。しかし、シミアンウイルス40（SV40）初期プロモーター、マウス乳がんウイルス（MMTV）、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）の長い末端反復（LTR）プロモーター、MoMuLVプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびに、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、およびクレアチンキナーゼプロモーターなどであるがこれらに限定されないヒト遺伝子プロモーターを含むが、これらに限定されない、他の構成性プロモーター配列もまた使用され得る。さらに、本発明は、構成性プロモーターの使用に限定されるべきではない。誘導性プロモーターもまた、本発明の一部として企図される。誘導性プロモーターの使用により、そのような発現が望ましい場合には、それが機能的に連結されているポリヌクレオチド配列の発現をオンにし、または、発現が望ましくない場合には発現をオフにすることができる、分子スイッチが提供される。誘導性プロモーターの例は、メタロチオニン（metallothionine）プロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、およびテトラサイクリンプロモーターを含むが、これらに限定されない。
【００９３】
本発明は、さらに、1つまたは複数の特異的な細胞のタイプにおいて所定の異種遺伝子の発現を駆動する組織特異的プロモーター（例えば、デスミンプロモーター、ミオグロビンプロモーター、筋肉クレアチンキナーゼプロモーター、哺乳動物トロポニン1プロモーター、および骨格α-アクチンプロモーター）の使用を含む。さらに、当技術分野において公知である任意の人工合成プロモーターを、これらのプロモーターが異種遺伝子にとって最適な効率および安定性を提供できる際に、本発明の中で使用することができる。加えて、エンハンサー配列が、ベクター内に含有されている遺伝子の発現を制御する。典型的に、エンハンサーは、タンパク質因子と結合して、遺伝子の転写を増強する。エンハンサーは、それが制御する遺伝子の上流または下流に位置し得る。エンハンサーはまた、特異的な細胞または組織タイプにおいて転写を増強するために組織特異的であってもよい。
【００９４】
関心対象の異種遺伝子の発現を評価するために、細胞中に導入されるべき発現ベクターはまた、ハイブリッドウイルスベクターを通して感染させようとした細胞の集団からの発現細胞の特定および選択を促進するために、選択可能なマーカー遺伝子もしくはレポーター遺伝子、または両方を含有することもできる。他の局面において、選択可能なマーカーは、分離したDNA片上で運搬され、共感染／トランスフェクション手順において使用されてもよい。選択可能なマーカーおよびレポーター遺伝子の両方は、宿主細胞における発現を可能にするのに適切な制御配列と隣接していてもよい。有用な選択可能なマーカーは、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子などのような抗生物質耐性遺伝子を含む。
【００９５】
レポーター遺伝子は、潜在的に感染した細胞を特定するため、および制御配列の機能性を評定するために使用される。概して、レポーター遺伝子は、レシピエントの生物または組織に存在しないか、またはそれらにより発現されておらず、かつ、その発現がいくつかの容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性により明示されるポリペプチドをコードする遺伝子である。適しているレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼ、または緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子を含み得る（例えば、Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82）。
【００９６】
本発明が、本発明の高力価ハイブリッドウイルスベクターによって発現される異種遺伝子の性質に限定されないことは、当業者には明らかである。遺伝子の発現が対象に利点をもたらす、任意の適した異種遺伝子が用いられうる。例えば、異種遺伝子は、対象におけるその発現がウイルスによる感染に対する免疫を付与するウイルスタンパク質であってもよい。同様に、異種遺伝子は、細菌抗原、病原体抗原、真菌抗原、がん抗原、有害な自己免疫反応に関与する抗原、またはそれに対する免疫応答が利点をもたらす任意の他のタンパク質であってもよい。
【００９７】
異種タンパク質
本発明において、本発明の高力価ハイブリッドウイルスベクターは、本発明で有用な任意の異種タンパク質をコードしてもよく、本発明のハイブリッドウイルスベクターにタンデムに挿入される1つより多い異種タンパク質をコードしてもよい。典型的には、異種タンパク質は、ペプチド断片、ポリペプチド、タンパク質、または融合タンパク質である。任意で、異種タンパク質は、対象へのベクターの投与の後に対象において異種タンパク質に対して細胞媒介免疫応答が誘導されるのに適している。
【００９８】
ある特定の態様において、異種タンパク質は、典型的には宿主において感染性疾患を引き起こす病原生物に由来する異種遺伝子によりコードされる。ある特定の態様において、病原生物は、グラム陽性細菌またはグラム陰性細菌などの原核細胞であってもよく、または病原細胞は、原性生物、寄生体、または真菌、例えば酵母であってもよい。
【００９９】
ある特定の態様において、異種タンパク質が由来する病原生物は、これらに限定されるわけではないが、エシェリキア属、ストレプトコッカス属、スタフィロコッカス属、ボルデテラ属、コリネバクテリウム属、マイコバクテリウム属、ナイセリア属、ヘモフィルス属、放線菌、ストレプトミセス菌、ノカルジア属、エンテロバクター属、エルシニア属、フランシセラ属、パストレラ属、モラクセラ属、アシネトバクター属、エリジペロスリックス属、ブランハメラ属、アクチノバチルス属、ストレプトバチルス属、リステリア属、カリマトバクテリウム属、ブルセラ属、バチルス属、クロストリジウム属、トレポネーマ属、サルモネラ属、クレブシエラ属、ビブリオ属、プロテウス属、エルウイニア属、ボレリア属、レプトスピラ属、スピリルム属、カンピロバクター属、シゲラ属、レジオネラ属、シュードモナス属、アエロモナス属、リケッチア属、クラジミア属、コクシエラ属、ボレリア属およびマイコプラスマ属のメンバーからなる群より選択されてもよい。
【０１００】
ある特定の態様において、異種タンパク質はウイルスペプチドであってもよい。異種タンパク質が由来するウイルスは、これらに限定されるわけではないが、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、A型肝炎ウイルス(HAV)、B型肝炎(HBV)、C型肝炎(HCV)、任意の他の肝炎関連ウイルス、ヒトパピローマウイルス(HPV)および特に高リスク発がん性ヒトパピローマウイルス型、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス(KSHV)(ヒトヘルペスウイルス8(HHV-8)としても公知)、単純ヘルペスウイルス(HSV)(任意のサブタイプ)、呼吸器多核体ウイルス(RSV)および関連する呼吸器ウイルス、インフルエンザウイルス、SARS関連コロナウイルス(SARS-CoV)を含むコロナウイルス、ライノウイルス、アデノウイルス、SIV、ロタウイルス、ヒトパピローマウイルス、アルボウイルス、麻疹ウイルス、ポリオウイルス、風疹ウイルス、ムンプスウイルス、パポバウイルス、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、水痘ウイルス、ハンタウイルス 、ならびに任意の新興ウイルス、特に、エボラウイルス、マーブルグウイルス、西ナイルウイルス(WNV)、セントルイス脳炎ウイルス(SLEV)、リフトバレー熱ウイルス(RVFV)、およびブニヤウイルス科の他のメンバーからなる群より選択されてもよい。
【０１０１】
いくつかの態様において、異種タンパク質は原生動物病原体に由来することができ、原生動物は典型的には、細胞内原生動物、例えば、アピコンプレクサ類のマラリア原虫(Plasmodium spp.)、トキソプラズマ・ゴンディ(Toxoplasma gondii)およびクリプトスポリジウム・パルバム(Cryptosporidium parvum)；またはトリパノソーマ類：リーシュマニア属(Leishmania spp.)およびトリパノソーマ・クルージ(Trypanosoma cruzi)であってもよい。
【０１０２】
ある特定の態様において、異種タンパク質は酵母または真菌に由来しうる。真菌は、アクレモニウム属(Acremonium)、アルテルナリア属(Alternaria)、アミロミセス属(Amylomyces)、アルスロデルマ属(Arthoderma)、アスペルギルス属(Aspergillus)、オーレオバシディウム属(Aureobasidium)、ブラストシゾミセス属(Blastochizomyces)、ボトリチス属(Botrytis)、カンジダ属(Candida)、クラドスポリウム属(Cladosporium)、クリプトコックス属(Crytococcus)、タマホコリカビ属(Dictyostelium)、エモンシア属(Emmonsia)、フザリウム属(Fusarium)、ゲオミセス属(Geomyces)、ゲオトリクム属(Geotrichum)、ミクロスポルム属(Microsporum)、アカパンカビ属(Neurospora)、ペシロミセス属(Paecilomyces)、ペニシリウム属(Penicillium)、ピライラ属(Pilaira)、ピチロスポルム属(Pityrosporum)、ニューモシスチス属(Pneumocystis)、クモノスカビ属(Rhizopus)、ロドトルラ属(Rhodotorula)、サッカロミセス属(Saccharomyces)、スタキボトリス属(Stachybotrys)、トリコフィトン属(Trichophyton)、トリコスポロン属(Trichoporon)、またはヤロウイア属(Yarrowia)を含む群から選択される属に由来してもよい。
【０１０３】
いくつかの態様において、異種タンパク質はがんに由来してもよい。そのような態様において、異種タンパク質は、腫瘍特異的抗原であるか、または腫瘍特異的抗原の断片である。ある特定の態様において、がんは、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)、濾胞性非ホジキンリンパ腫、悪性メラノーマ、ヘアリーセル白血病、多発性骨髄腫、カルチノイド症候群ならびに肝臓およびリンパ節転移を伴うカルチノイド腫瘍、AIDS関連カポジ肉腫、腎細胞がん、大腸の腺がん、頭頸部扁平上皮がんに由来してもよい。がんはまた、器官および固形組織、例えば、結腸がん、肺がん、乳がん、胃がん、前立腺がん、および子宮内膜がんに由来してもよい。このような異種タンパク質が本発明の組成物および方法で用いられると、結果として生じる免疫応答はがんと戦う可能性があり、よって、これらのベクターにより産生されるベクターおよびウイルスは腫瘍溶解性となるように設計されている。
【０１０４】
さらに他の態様において、異種タンパク質は、自己免疫疾患の病理に関連していてもよい。自己免疫障害に通常影響を受ける器官および組織には、これらに限定されるわけではないが、血管、結合組織、内分泌腺、例えば甲状腺または膵臓など、関節、筋肉、赤血球、および皮膚が含まれる。そのような異種タンパク質が有用である可能性がある自己免疫(または自己免疫関連)障害の例には、これらに限定されるわけではないが、アジソン病、セリアック病、皮膚筋炎、グレーブス病、橋本甲状腺炎、多発性硬化症、重症筋無力症、悪性貧血、反応性関節炎、関節リウマチ、シェーグレン症候群、全身性エリトマトーデス、およびI型糖尿病が含まれる。
【０１０５】
本発明の方法
本発明のベクターは、種々の適用において、疾患に対する免疫性を対象に与える、および/または対象における疾患を処置する、予防する、もしくは疾患のリスクを減少させるのに有用なVLVを生じさせるのに有用である。
【０１０６】
したがって、本発明には、異種タンパク質に対する免疫性を対象に与える方法が含まれる。方法は、異種遺伝子をコードするDNAを含む高力価ハイブリッドウイルスベクターによって産生されるウイルス様ベシクル(VLV)を含む組成物を対象に投与する工程を含む。異種遺伝子の発現は、対象において、それによってコードされる異種タンパク質に対する免疫応答を誘導する。本発明にはさらに、異種遺伝子をコードするDNAを含む本発明の高力価ハイブリッドウイルスベクターによって産生されるウイルス様ベシクル(VLV)を含む組成物を対象に投与する工程を含み、かつ異種遺伝子の発現が対象に対して利点をもたらす、その必要がある対象を処置する方法も含まれる。1つの局面において、本発明には、対象において異種タンパク質に対するメモリーT細胞免疫応答を生じさせる方法が含まれる。別の局面では、対象において異種タンパク質に対する適応B細胞免疫応答を生じさせる。
【０１０７】
加えて、本発明には、対象が疾患を発症するリスクを減少させる方法が含まれる。方法は、異種遺伝子をコードするDNAを含む高力価ハイブリッドウイルスベクターによって産生されるウイルス様ベシクル(VLV)を含む組成物を対象に投与する工程を含む。異種遺伝子の発現は、それによってコードされる異種タンパク質に対する免疫応答を対象において誘導し、それによって、対象が異種タンパク質に関連する疾患を発症するリスクを減少させる。
【０１０８】
本発明にはまた、高力価 RNAウイルス様ベシクル(VLV)を選択する方法も含まれる。この選択は、アルファウイルス構造タンパク質を含まないウイルス構造タンパク質をコードするRNA配列を含むハイブリッドウイルスベクターを細胞培養において継代する工程、および細胞培養におけるVLVの大規模な継代、VLVの定方向突然変異誘発、または当技術分野において公知の任意の他の選択方法を用いて、生じたVLVを高力価VLVについてスクリーニングする工程によって達成される。1つの局面において、ハイブリッドウイルスベクターRNA配列はアルファウイルス非構造タンパク質をコードする。別の局面において、非構造タンパク質はセムリキ森林ウイルス(SFV)非構造タンパク質である。
【０１０９】
薬学的組成物および製剤
本発明のVLVは、薬学的組成物として製剤化され得る。
【０１１０】
そのような薬学的組成物は、対象への投与に適している形態であってもよく、または、薬学的組成物は、1つもしくは複数の薬学的に許容される担体、1つもしくは複数の追加の成分、またはこれらのいくつかの組み合わせをさらに含んでよい。薬学的組成物の種々の構成要素は、当技術分野において周知であるように、生理学的に許容される塩の形態で、例えば、生理学的に許容されるカチオンまたはアニオンとの組み合わせで、存在してもよい。
【０１１１】
1つの態様において、本発明の方法を実施するのに有用な薬学的組成物は、105〜109のPFUの用量を送達するように投与されてもよい。
【０１１２】
1つの態様において、本発明の方法を実施するのに有用な薬学的組成物は、アジュバントを含み得る。本発明により企図される、適しているアジュバントは、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、Quil A、Detox、ISCOM、またはスクアレンを含むが、これらに限定されない。
【０１１３】
本発明の方法において有用である薬学的組成物は、吸入、経口、直腸、膣、非経口、局所、経皮、肺、鼻内、頬、眼、クモ膜下腔内、静脈内、または別の経路の投与のために適切に開発され得る。他の企図される製剤は、計画されたナノ粒子、リポソーム調製物、活性成分を含有する再密封された赤血球、および免疫学に基づく製剤を含む。投与の経路は、当業者に容易に明らかであり、処置される疾患のタイプおよび重症度、処置される獣医学的患者またはヒト患者のタイプおよび齢などを含む、任意の数の要因に依存する。
【０１１４】
本明細書において提供される薬学的組成物の説明は、ヒトへの倫理的な投与に適している薬学的組成物を主に対象にしているが、そのような組成物は、概して、すべての種類の動物への投与に適していることが、当業者により理解される。組成物を種々の動物への投与に適するようにするための、ヒトへの投与に適している薬学的組成物の改変は、十分に理解されており、通常の熟練した獣医薬理学者は、そのような改変を、もしあるとしても単に通常の実験法で、設計および実施することができる。本発明の薬学的組成物の投与が企図される対象は、ヒト、他の霊長類、ならびに、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、およびイヌなどの商業的哺乳動物を含む哺乳動物を含むが、これらに限定されない。
【０１１５】
本発明の組成物は、組成物の総重量により約0.005％〜2.0％の保存剤を含み得る。保存剤は、環境中の汚染物質に曝露された場合に腐敗を予防するために使用される。
【０１１６】
投与／投薬
投与のレジメンは、有効量を構成するものに影響を及ぼし得る。例えば、本発明の高力価ハイブリッドウイルスベクターは、単一用量で、いくつかの分割された投薬量で、対象に投与されてもよく、および、時差的な投薬量が、毎日もしくは逐次的に投与されてもよく、または、用量は、継続的に注入されてもよく、もしくはボーラス注射であってもよい。さらに、投薬量は、治療的または予防的状況の緊急性によって示されるように、比例して増大または減少させてもよい。
【０１１７】
対象、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトへの本発明の組成物の投与は、公知の手順を使用し、対象において疾患を処置するのに有効な投薬量かつ期間で、実施され得る。意図される結果を達成するのに必要な組成物の有効量は、変動することになり、処置または予防されるべき疾患、処置される対象の年齢、性別、体重、状態、全身の健康、および事前の病歴などの要因、ならびに医学技術分野において周知である同様の要因に依存することになる。特定の態様において、投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、組成物を単位剤形において製剤化することが、特に有利である。本明細書において使用される単位剤形とは、処置されるべき対象のための単位投薬量として適した物理的に別個の単位を指し；各単位は、必要とされる薬学的ビヒクルと関連して望ましい治療効果を生じるように計算された、あらかじめ決定された量の治療用化合物を含有する。本発明の単位剤形は、組成物および発現されるべき異種タンパク質の独自の特徴、ならびに達成されるべき特定の治療効果によって規定され、かつそれに直接依存する。
【０１１８】
投与の経路
1つより多い経路を投与のために使用することができるが、特定の経路が、別の経路よりも即時のかつ有効な反応を提供できることを、当業者は認識しているであろう。本発明の組成物のいずれかの投与の経路は、吸入、経口、鼻、直腸、非経口、舌下、経皮、経粘膜（例えば、舌下、舌、（経）頬、（経）尿道、膣（例えば、経膣的および膣周囲的）、鼻（内）、および（経）直腸）、膀胱内、肺内、十二指腸内、胃内、クモ膜下腔内、皮下、筋肉内、皮内、動脈内、静脈内、気管支内、吸入、ならびに局所投与を含む。
【０１１９】
キット
いくつかの態様において、本明細書に記載されているような、所与の疾患、障害、もしくは状態、またはその症状を処置、予防、または改善するためのキットであって、a）本明細書に記載されているような化合物または組成物；および任意でb）本明細書に記載されているような追加の作用物質または療法を含むキットが、提供される。キットは、疾患、障害、または状態を処置、予防、または改善するようにキットを使用するための説明書または標識を、さらに含むことができる。なおさらなる態様において、本発明は、本明細書に記載されているような、所与の疾患、障害、もしくは状態、またはその症状についてのアッセイのためのキットにまで及ぶ。そのようなキットは、例えば、PCRもしくは他の核酸ハイブリダイゼーション技術（マイクロアレイ）由来の試薬、または免疫学に基づく検出技術（例えば、ELISpot、ELISA）用の試薬を含有し得る。
【実施例】
【０１２０】
本発明を次に、以下の実施例に関して説明する。これらの実施例は、例証の目的だけで提供され、本発明は、決してこれらの実施例に限定されるように解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書において提供される教示の結果として明確になる任意のおよびすべての変形物を包含するように解釈されるべきである。
【０１２１】
さらなる説明なしで、当業者は、前述の説明および以下の例証となる実施例を用いて、本発明の化合物を作製および利用でき、かつ特許請求される方法を実施できることが、確信される。したがって、以下の実施例は、本発明の好ましい態様を具体的に指摘し、決して本開示の残りの部分を限定するように解釈されるべきではない。
【０１２２】
本明細書中で開示される実験において使用される材料および方法を、次に説明する。
【０１２３】
材料および方法
プラスミドDNA内でのp50 VLVゲノムの再構築
Life TechnologiesからのSuperScript III RT-PCRキットおよび15 DNAプライマー対をp50VLV由来のRNAと共に用いて、p50 VLVゲノムをカバーする、オーバーラップするdsDNA断片を作製した。断片の配列を決定し(Yale Keck Facility)、DNAstarソフトウエアを用いてアセンブルした。プラスミドpBK-SFVG-E660GagからのSIV gag遺伝子を、SFVキャプシドタンパク質をコードする合成遺伝子と置換することによって、プラスミドpCMV-SFVG-CAP(図1A〜1B)を作製した。p50 VLVゲノム配列中に見られる1,672ヌクレオチド欠失を、Bpu10I〜SpeI部位に及ぶ合成DNA断片を用いてpCMV-SFVGCAP中に導入した(図5)。残りの変異を、p50 VLV RNAからRT-PCRによって調製した図示した制限断片を用いて段階的に導入した。部位特異的変異を、Agilent TechnologiesからのQuik-Change II突然変異誘発キットを用いて作製した。
【０１２４】
VLVの力価測定
p50 VLVの力価を、BHK-21(ATCC CCL 10)細胞単層に対する段階的希釈および標準的な2-dプラークアッセイを用いてルーチン的に測定した。低力価VLVプラークを解剖顕微鏡を用いて計数し、その力価を間接免疫蛍光顕微鏡法を用いて測定し、感染中心におけるVSV Gタンパク質発現を検出した。
【０１２５】
p50 VLVの精製
5％(wt/vol)FBSを含むDMEM中のおよそ107個のBHK-21細胞を10のMOIでp50 VLVに感染させ、37℃にて24時間インキュベートした。次いで、培地を800×gにて5分間遠心分離し、細胞および細胞デブリを取り除いた。次いで、10 mlの培地を28 mLの10％(wt/vol)スクロースを含むPBS上に層状にし、Beckman SW28ローターで25,000 rpmにて1.25時間遠心分離した。VLVのペレットを200 μLのPBSで再懸濁し、次いで、4.5 mLの10％スクロースを含むPBS上に層状にし、Beckman SW41ローターで40,000 rpmにて1時間遠心分離した。ペレットを100 μLのPBSで再懸濁した。VSVビリオンを並行して増殖させかつ精製し、SDS/PAGEゲル電気泳動用のマーカーを提供した。
【０１２６】
VLVおよびVLV感染細胞の電子顕微鏡検査
上述のように調製したVLV(およそ5 μL)を、プラズマイオン化により疎水化された、カーボン被覆EMグリッドに塗布した。グリッドを1％グルタルアルデヒドで2分間固定し、続いて、PBS(pH 7.4)および水で洗浄し、次いで、2％(wt/vol)酢酸ウラニルで染色し、風乾した。免疫金標識のために、試料を、1％BSA含むPBSでプレインキュベートしたグリッドに塗布した。グリッド上の未固定の試料を、VSV Gに対するマウスモノクローナル抗体と共に直接インキュベートし、1％BSAを含むPBSで洗浄し、12 nm金粒子にコンジュゲートしたロバ抗マウスIgG(Abcam)と共にインキュベートした。次いで、グリッドを洗浄し、2％(wt/vol)リンタングステン酸で染色し、次いで、乾燥させた。グリッドをFEI 120kV透過型電子顕微鏡で検分した。電子画像をGatan 4k×4k CCDカメラで取得した。
【０１２７】
VLVに感染したBHK細胞を、2％(wt/vol)グルタルアルデヒドを含む0.1 Mカコジル酸ナトリウム緩衝剤(pH 7.4)で1時間室温にて固定した。同じ緩衝剤ですすいだ後に、細胞を室温にて30分間0.5％OsO4で後固定した。次いで、検体を、2％水性酢酸ウラニルで30分間一括して染色し、100％まで段階的なエタノールで脱水し、Poly/bed 812で24時間包埋した。薄片(60 nm)をLeicaウルトラミクロトームで切り取り、酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で後染色した。試料グリッドをFEI Tencai Biotwin透過型電子顕微鏡で80 kVにて調べた。画像を、iTEM(Olympus)ソフトウエアを装備したMorada CCDカメラを用いて撮影した。
【０１２８】
次に、本実験の結果を以下の実施例において説明する。
【０１２９】
実施例1：大規模な継代は高力価VLVを生じる
組織培養における大規模な継代を通して、進化後に高力価になるVLVを生じるために、図1A〜図1Bに図示した出発DNA構築物を使用した。この構築物を用いて生じたSFVレプリコンRNAは、第1のサブゲノムプロモーターからVSV Gを、および第2のプロモーターからSFVキャプシドタンパク質を発現する。この構築物から感染性粒子が導き出され、VLVに典型的な低力価（およそ105感染単位/ml）を呈することが見出された。より高い力価になるであろう粒子を進化させることが可能であるかどうかを判定するために、BHK細胞上でのVLVの継代を1年の期間にわたって追跡した。最初の継代において、細胞変性効果（CPE）を示す細胞由来の培地の5％を、6 cmディッシュ上の新鮮なBHK細胞の上に移し、次いで、強いCPEが3〜5日までに発生した。SFVキャプシドタンパク質の発現は、継代8までに完全に失われ、その発現が粒子産生を阻害していたことが示唆された。連続した継代に伴って、粒子力価の増大、および24時間未満でのずっとより急速なCPE発生が認められた。継代50までに、VLVは、5×107 pfu/mlより高い力価に達するように進化し、2日後にBHK細胞上に変動するサイズの目に見えるプラークを形成した。この時点で、大きなプラークを選択し、その後「p50 VLV」と呼ばれることになるクローン化したVLVストックを生じるために使用した。このp50 VLVは、出発ベクターをおよそ1000倍上回る増大である、およそ108 pfu/mlの力価になる。
【０１３０】
VSVに対するVLVの増殖速度を、従来の一段増殖曲線を用いて比較した。典型的には、最大VLV力価(およそ108 pfu/mL)に高多重度感染後12から24時間で達することが判明した。これに対して、最大VSV力価(およそ109 pfu/mL)には感染後10から12時間で達した。
【０１３１】
実施例2：精製したp50 VLVは唯一の構造タンパク質としてVSV Gを含む
p50 VLV中にどのタンパク質が存在するか決定するために、BHK細胞を10 cmディッシュ上でおよそ10の感染多重度(MOI)でp50 VLVまたはVSVに感染させた。細胞が大規模な CPEを示した24時間後に、培地中のVSV粒子またはVLVを2回の超遠心分離により精製した。次いで、VLVおよびVSV粒子中のタンパク質をSDS-PAGE、続いて銀染色によって分析した。図2に示すように、VSVビリオン粒子は5種類のタンパク質N、P、M、GおよびLを含んだ一方で、精製したp50 VLV粒子は唯一の明らかな構造タンパク質としてVSV Gタンパク質を含んだ。SFVキャプシドタンパク質(29.8 kDa)の痕跡は存在せず、初期継代時にその発現が失われていることと一致した。p50 VLVに感染した5×106 BHK細胞からのVLVタンパク質の総収量はおよそ20 μgであり、VSVに感染した同じ数の細胞は約60 μgの総ウイルスタンパク質を生じた。未感染のBHK細胞由来の培地からは測定可能なタンパク質収量は回収されなかった。
【０１３２】
実施例3：電子顕微鏡検査によるp50粒子の特性解析
タンパク質特性解析のために用いられる精製した粒子を、グルタルアルデヒド固定化および酢酸ウラニルによるネガティブ染色の後に透過型電子顕微鏡検査(TEM)により撮像した。例を図3A〜3Cに示す。粒子の多くは、その表面上にタンパク質スパイク、おそらくVSV Gタンパク質(VSVG)を有しているように見えた(矢印)。この方法によってTEM用に調製された粒子の一部は、壊れて、核酸を放出しているようにも見えた(図3C)。
【０１３３】
次に、固定化されておらず、かつVSV Gに対する抗体で続いて12 nm金粒子にコンジュゲートした二次抗体で標識したVLV粒子に対してTEMを行った。次いで、粒子をリンタングステン酸でネガティブ染色した(図3D)。TEM画像は、金粒子の輪(halo)によって多数のベシクルの表面が明らかに標識されていることを示し、その表面上のVSV Gの存在を示した。ベシクルの直径は50〜200 nmの範囲であった。サイズ分布は、以前に記載された低力価VLVで観察されたものと同様であった(米国特許第12/747,59号; Rolls et al.,  1994. Cell 79:497-506およびRolls et al., 1996. Virology 218:406-41)。
【０１３４】
実施例4：p50 VLV粒子の増殖
VSVと比較してp50 VLVの増殖速度を試験するために、従来の一段増殖曲線(図4A)を行った。細胞をp50 VLVまたはVSVいずれかに10の感染多重度(MOI)で感染させ、次いで、投入粒子を取り除き、次いで、試料を指定した時間で培地から取り出し、プラークアッセイにより力価を測定した。VLVの増殖速度は、感染後12時間で最大力価に達するVSVと同様であった。VLV力価はVSVより約8〜10倍低く、その小さなプラークサイズと一致した(図4B)。
【０１３５】
実施例5：p50 VLVゲノムの配列
p50 VLVゲノムのコンセンサス配列を決定するために、逆転写およびPCRを行って、ゲノム全体をカバーする、オーバーラップするDNA断片を生じ、次いで、これらの断片を配列決定した。アセンブルした配列は、（ヌクレオチド13333と13334との間に位置するベクター欠失において）1672ヌクレオチドの大きな欠失を明らかにし、これにより、第2のSFVプロモーター、キャプシド遺伝子全体、および、ポリ(A)の前のSFV配列の187ヌクレオチド以外のすべてが除去されていた（図1）。
【０１３６】
この欠失に加えて、下記の表1に列挙する16種の一塩基変化があった。これらのうちの10種は、SFV非構造タンパク質の4つすべてにおいてアミノ酸を変化させ、1種はVSV Gにおいてアミノ酸を変化させ、4種の変異はサイレントであった（図1、表1）。
【０１３７】
（表１）p50VLVにおけるヌクレオチドおよびアミノ酸の変化
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*アミノ酸は、SFV nsP1〜4ポリタンパク質において、またはVSV Gタンパク質において番号付けされている。太字で下線のテキストは、変化したアミノ酸を示す。
【０１３８】
高力価ハイブリッドウイルスベクター：pCMV-SFVG-p50Rのヌクレオチド配列 (SEQ ID NO: 1と呼ばれる)を、本明細書中の他の部分で、「実施例」の最後の部分で提供する。
【０１３９】
実施例6：DNA起動ベクターにおけるp50 VLVレプリコンの再構築
プラスミドDNA内で高力価p50 VLV配列を再構成し、かつどの配列変化がp50 VLVの高力価表現型を生じさせるのに関与しているか決定するために、p50 VLV配列の段階的再構築をDNA起動ベクターにおいて開始した(図5)。最初に、「1672」ヌクレオチド欠失を、欠失を含む合成DNA断片を用いてプラスミド内に導入した。この断片は、pCMV-SFV-GCAPの唯一のBpu10I部位およびSpe I部位の間に挿入され、pCMV-SFVG-Δ1672を生じた。この構築物は、高力価VLVを産生せず(わずか2×105/ml)、欠失はVLV力価を増加させるのにわずかな効果しか有していなかったことを示した。次いで、p50 VLV RNAの逆転写およびPCRを用いて、示した制限部位、EcoRV-BstEII、BstEII-BglII、およびBglII-Bpu10Iに及ぶDNA断片を作製した。次いで、p50 VLV変異を含むこれらの断片を用いて、pCMV-SFVG-Δ1672プラスミドDNA中の対応する断片を置換し、R1、R2、R2,3 および R1,2,3と表示される組換え体を作製した。すべての構築物を配列決定し、p50 VLVコンセンサスに合致しなかったすべての構築物を廃棄した。興味深いことに、細胞の上へのこれら初期組換え体のトランスフェクション後に、それらは様々な力価を生じたが、いずれも高力価p50、プラーク形成VLVを生じなかった。しかしながら、変異のすべてを一緒に組換え体R1,2,3(pCMV-SFV-G-p50Rと表されるプラスミド)の中に入れると、高力価表現型が回復した。これらの結果は、進化した変異の何らかの組み合わせが高力価表現型を生じるのに必要とされることを示唆した。それらはまた、変異のサブセットの取り込み(例えば、R1組換え体内に)が複製に有害であることも示した。VSV G外部ドメインにおける変異N34Dが高力価 VLVの作製に必要とされないことも後の構築物において決定された。
【０１４０】
増強変異がレプリコンRNA合成に影響を与えたかどうかを決定するために、ノーザンブロットを行い、pCMV-SFVG-Δ1672またはpCMV-SFVG-p50Rに由来するVLVに感染させた細胞におけるレプリコンRNAまたはサブゲノムG mRNAを検出した。発明者らは、これらの細胞においてRNAの量、またはサブゲノムRNAに対するレプリコンの比率において有意差を認めなかった(図10)。
【０１４１】
実施例7：感染細胞のTEMは高力価VLVの生成の可能性あるメカニズムを示唆する
SFVレプリコンからのVSV Gタンパク質の発現によって生じるVLVの以前の研究では、もっと低い力価の感染性ベシクルを生じさせるメカニズムは決定されなかった(米国特許出願第12/747,59号; Rolls et al., 1994. Cell 79:497-506およびRolls et al., 1996. Virology 218:406-411)。可能性のある説明は、それらは、細胞変性液胞(CPV)内の小球体と呼ばれる膜陥入において大部分が見られるが、時折細胞表面上にも見られるSFV複製複合体から生じるというものであった(Froshauer et al., 1988. The Journal of Cell Biology 107:2075-2086; Grimley et al., 1968. Journal of Virology 2:1326-1338)。より最近の研究は、SFV小球体は最初に細胞表面で形成され、次いで、エンドサイトーシスによって取り込まれ、最終的には、細胞質内のCPV中に蓄積されることを示している(Spuul et al., 2010. Journal of Virology 84:7543-7557)。
【０１４２】
低力価VLV対高力価VLVの出芽を調べるために、3'欠失を含む構築物(pCMV-SFVG-Δ1672)からのVLV、および該欠失および16箇所の変異を含むR1,2,3構築物(pCMV-SFVG-p50)からのVLVを最初に調製した。これらは細胞に感染させるために用いられ、感染後7時間での細胞の固定された薄片のTEMが実施された。低力価(Δ1672)VLVに感染した細胞の形質膜は、細い「くびれ部分」によって細胞表面に付着しているようにしばしば見える多数のおよそ60〜70 nm球状構造を示した(図6Aおよび6B、矢印)。「くびれ部分」によって膜に付着したSFV小球体を含む典型的CPVである細胞内液胞(図6C)も見出された。細胞表面上のこれらの小球体は、CPVで見られる球状構造と実質的に同一であるように見え、多くの場合RNAであると思われる高密度の中心スポットを含んだ(Froshauer et al., 1988. The Journal of cell biology 107:2075-2086)。
【０１４３】
低力価VLVの結果とは対照的に、p50 VLVに感染した細胞は、細胞表面から出芽しているように見えるベシクルのみをところどころ示した(図6Dおよび6E)。これらはまた、多くの場合において、くびれ様構造によって連結されているように見えた(矢印)。これらの結果は、p50 VLVは効率的に出芽する一方で、低力価VLVは細胞表面に付着したままである可能性があることを示唆した。
【０１４４】
実施例8：後期ドメインモチーフはp50 VLV nsP1タンパク質において選択された
細胞表面から出芽する多くのエンベロープウイルスは、多胞体内に出芽するベシクルにカーゴをソーティングするために細胞が通常用いる、細胞出芽機構(ESCRT複合体と呼ばれる)をリクルートする(Votteler and Sundquis, 2013. Cell host & microbe 14:232-241; Weiss, E. R., and H. Gottlinger, 2011. Journal of molecular biology 410:525-533)。これらのウイルスは、出芽部位にESCRT複合物の成分をリクルートするその内膜タンパク質中に後期ドメインと呼ばれる配列モチーフを有する。これらのモチーフにおける変異は、細胞からのウイルス粒子の不完全な出芽、および膜性のくびれ部分による保持をもたらす。低力価VLVは細胞表面上に多数の小球体を保持しているように見えることから、p50 VLVゲノムにおける配列変化を調べ、継代がSFV非構造タンパク質のいずれかの後期ドメイン配列について選択されているかどうかを決定した。実際、nsP1における4つの変異のうち1つは、nsP1のC末端の近くでアミノ酸配列PIAPをPTAPに変えていることが見出された(表1)。P(T/S)APは、タンパク質tsG101に結合し、ESCRTタンパク質複合体のリクルートを開始し、ウイルス出芽を促進する、内部ウイルス膜タンパク質中の共通モチーフであり、nsP1は、nsP1、2、3および4の複合体からなるSFV複製複合体の膜アンカーである。
【０１４５】
実施例9：高力価p50 VLVが出芽においてESCRT経路を使用しているというさらなる証拠
ユビキチン化は多くの場合、カーゴの多胞体(MVB)へのソーティングに関与し、MG-132などのユビキチン化の阻害剤は多くの場合、MVB/ESCRT経路を乗っ取るウイルス(例えば、HIV)の出芽を阻害する(Taylor et al., 2007, Journal of Virology 81:13631-13639; Weiss and  Gottlinger, 2011, Journal of Molecular Biology 410:525-533)。この概念を用いて、p50 VLVへの感染後の細胞のMG-132処理が高力価p50 VLVの産生を55倍阻害することを示した。この阻害は、p50 VLVがESCRT経路を用いて出芽を促進するという考えと一致した。実験は以下のように行った：BHK細胞をp50 VLV(10 pfu/細胞)に1時間感染させ、洗浄し、次いで、100 uM MG-132の存在下または非存在下で24時間インキュベートした。次いで、VLV力価をプラークアッセイにより決定した。
【０１４６】
実施例10：PTAPモチーフは、高力価粒子放出に必要ではあるが、十分ではない
図5に示すR1組換え体により得られた結果は、PTAPモチーフは高力価VLVを生じさせるのに十分ではないことを示唆する。しかしながら、この解釈は、他の変異の非存在下で有害である可能性のあるnsP1における他の3つの変異およびnsP2における1つの変異の存在によって複雑になる。PTAP変異が高力価粒子産生に必要であるかどうかを決定するために、完全に再構成されたp50ベクター(pCMVSFVG-p50R、図5)においてPTAPモチーフだけを変異し、元のPIAP配列に戻した。次いで、BHK細胞上へのトランスフェクション後のPIAP構築物およびPTAP構築物について得られた力価を比較した。トランスフェクション後48時間後に得られた力価は、PIAPでは1.2×106 i.u/mlおよびPTAPでは1×108 i.u./mlであり、高力価の生成におけるPTAPモチーフの重要な役割が示された。
【０１４７】
加えて、これらのトランスフェクションから導き出される感染性VLVを用いる一段増殖曲線を行い、感染性p50VLV-PTAPおよびp50VLV-PIAP放出の動態を分析した。この実験の結果を図7に示す。両方の構築物とも24時間でプラトーに到達し類似する増殖動態を示した。しかしながら、p50-PIAP変異体収量は、より後の時点ではp50-PTAPと比較して50から100倍低減した。これらの結果は、PTAPモチーフがVLVの効率的な生成に必要であることを意味する。
【０１４８】
PTAP変異が高力価 VLVの生成に十分であるかどうかを決定するために、PTAPモチーフだけを生じる変異をpCMV-SFVG-Δ1672プラスミド(図5)に導入し、VLVを得た。このDNAの細胞上へのトランスフェクション後に得られたVLV力価は1 mLあたりわずか1.1×105であり、PTAPモチーフ単独では効率的なVLV産生を推進するのに十分ではないことを意味した。
【０１４９】
実施例11：高力価VLVにおける外来遺伝子発現の安定化
ワクチンベクターとしてVLVを用いる以前の研究では、第2のサブゲノムmRNAプロモーターから外来遺伝子が発現することが見出された(Rose et al., 2008. PNAS 105:5839-5843; Schell et al., 2011. Journal of Virology 85:5764-5772)。外来遺伝子の発現は多くの場合、VLVのわずか2〜3継代の後に失われることも見出された(Rolls et al., 1996. Virology 218:406-411; Rolls et al., 1994. Cell 79:497-506)。喪失は典型的には、第2のプロモーターおよび第2の遺伝子の一部または全部を含む欠失を伴った。VLVにおけるより優れた遺伝子安定性を生じさせることが可能かどうか決定するために、一本のmRNAにおいて必須G遺伝子の発現と非必須外来遺伝子の発現とを連結させることに基づく、新たな戦略を開発した。外来タンパク質およびVSV Gの等モル発現を得るために、2つのオープンリーディングフレーム(ORF)を、ゾセア・アシグナウイルス由来の18アミノ酸T2Aペプチドで分離して連結させた(Szymczak et al., 2004. Nature Biotechnology 22:589-594)。このペプチドおよび他の関連ペプチドは、一本のmRNAから複数のタンパク質を発現させるために用いられている(Szymczak-Workman et al., 2012. Cold Spring Harbor protocols 2012:199-204)。これらのペプチドは当初、自己切断性であると考えられていたが、現在では、それらはリボソームの「スキッピング」を引き起こすと考えられる。リボソーム機能は、GlyおよびPro間のペプチド結合形成を妨げるペプチドによって改変され、上流タンパク質の放出を引き起こすが、下流ペプチドの連続的な翻訳は可能にする(Szymczak-Workman et al., 2012. Cold Spring Harbor protocols 2012:199-204)。VSV Gの上流に外来遺伝子を置くことによって、上流リーティングフレームの発現を維持する強力な選択となるはずである。
【０１５０】
この戦略を、図8Aで図解するように、18アミノ酸T2Aペプチド
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で分離してVSV G遺伝子ORFの上流にサル免疫不全ウイルス(SIV)gag遺伝子ORFを置くことにより試験した。この発現カセットを、単一のサブゲノムSFVプロモーターの後ろの単一G遺伝子に代えてpCMV-p50Rベクターにクローン化した。この構築物から回収したVLVは、少なくとも108 pfu/mlの力価を生じ、このことは、追加の遺伝子の発現がVLV力価を有意に低下させなかったことを示した。VLVに感染した細胞からのGagおよびGの発現を、SIV GagおよびVSV Gに対する抗体を用いてSDS-PAGEおよびウエスタンブロッティングにより検証した(図8B)。Gag上のT2AペプチドのC末端伸長は、別のサブゲノムプロモーターから発現させたGagと比較すると、GagおよびGag切断産物の移動度を減少させた(図8B)。別のプロモーターからGagを発現するVLVは、わずか5継代後にGag発現の喪失を示したが、T2AペプチドによりGに連結させ発現させたGagは少なくとも10継代の間安定していた。
【０１５１】
実施例12：高力価VLVによる安全性試験
本発明のワクチン接種試験において、低力価VLVまたは高力価VLVによる鼻腔内経路または筋肉内経路を用いたとき、マウスにおいて体重減少または他の発症の徴候は観察されなかった。高力価VLVの毒性の可能性についても、マウスの尾静脈内に5×106 PFUを注入することにより試験した。体重減少、行動修正、および他の神経機能障害の徴候はマウスにおいて観察されなかった。高力価VLVに関連する神経毒性の可能性についても、頭蓋内(IC)経路により試験した。成体マウス(n＝5)に、Hamiltonシリンジを用いて、脳の左前頭葉内に105 PFUのVLVを定位的に注射した。マウスは6週間観察され、いかなる神経機能障害の徴候もいかなる他の有害な徴候もなく健康な状態を保った。これに対し、この経路により投与されたVSVは10 PFUですら、10日以内に致死性の脳炎を引き起こす。よって、粒子上にVSV Gタンパク質が豊富であるにも関わらず、おそらく、そのインビボでの複製は非常に限定されているために、粒子は脳において病原性を有さない。実際のエンベロープRNAウイルスとは異なり、これらのVLVはそのRNAを保護するヌクレオキャプシドを欠いており、自然免疫応答により非常に迅速に制御されるものと思われる。
【０１５２】
実施例13：高力価VLV粒子は免疫原性を保持する
高力価VLVが免疫原性を保持するかどうかを決定するために、マウスに106または105プラーク形成単位(PFU)いずれかで筋肉内にワクチン接種し、28日後にVSVに対する中和抗体(nAb)について血清を試験した。この単回ワクチン接種後に、VSV nAb力価は平均して、1:960(106 PFU群)および1:640(105 PFU)であった。ワクチン接種しなかったマウスは検出可能なnAbを有さなかった(＜1:20)。これらの結果は、継代したVLVが強力なnAb反応を生じる能力を保持していたことを示す。
【０１５３】
実施例14：低力価VLVおよび高力価VLVの生成のモデル
図9A〜9Cは、高力価VLV粒子の生成のモデルを示す。図9Aは、VSV GをコードしないSFVレプリコンは最初に、形質膜にて電球形の小球体に形成されることを示す。次いで、これらの小球体はエンドサイトーシスによって急速に取り込まれ、最終的に、SFVレプリコンを含む細胞中に見られる古典的な細胞変性液胞（CPV）中に蓄積される(Spuul et al., 2010. Journal of Virology 84:7543-7557)。表面にVSV Gを発現するSFVレプリコンの場合には、小球体のエンドサイトーシスはおそらくVSV Gによって阻害され(Whitaker-Dowling et al., 1983. Virology 131:137-143; Wilcox et al., 1983. The Journal of Cell Biology 97:1444-145)、その結果、図9Aおよび9Bに見られるように細胞表面上に捕捉される小球体のレベルが高くなる。これらの小球体は効率的に発芽することができないが、時折、細胞表面から放出され、隣接細胞に感染する。VLVの大規模な継代の後、SFV nsP1タンパク質のC末端近くの「後期ドメイン」PTAPモチーフを生じさせる1つの変異を含む、複数の変異が選択された。この変異は、細胞表面からのVLVの放出を引き起こしたために選択された。nsPタンパク質におけるさらなる変異は、おそらくESCRT複合体に対するPTAPモチーフの曝露を高めて、細胞表面から小球体を急速に切断させることによって(図9C)、より高い水準の粒子産生に寄与する可能性がある。
【０１５４】
高力価VLV表現型を生じさせるために2つ以上の変異が必要であることは、高力価VLVを進化させるのに大規模な継代が必要とされることと一致する。本明細書で提示したモデルは、低力価VLVに感染した細胞の表面上には、多数のおよそ60-から70-nm小球体様構造が存在する一方で、PTAPおよび他の変異を含むVLVに感染した細胞は見かけ上細胞表面から出芽するベシクルを時折示すだけであったという観察に一部基づく。HIV-1および他のウイルスの同様の蓄積が、ウイルスがその後期ドメインモチーフに変異を有しているときに見られる(Weiss et al., 2011, J Mol Biol 410(4):525-533; Gottlinger et al., 1991, Proc Natl Acad Sci USA 88(8):3195-3199)。VLVがもっぱら小球体の出芽から導き出されているのであれば、精製したp50 VLVはより均一な直径を有していると予測されうる。しかしながら、本明細書において観察された精製VLVおよびTEMにより以前に観察された(Rolls et al., 1994, Cell 79(3):497-506)精製VLVの直径は約50〜200 nmに及んだ。サイズの範囲についての1つの可能な説明は、2つ以上のVLVの融合であり、これはVSV Gによって触媒され、より大きなベシクルを生じる可能性がある。より小さなVLVだけが小球体から導き出され、かつより大きなベシクルはいくつかの他のメカニズムを通じて生じるという可能性もある。
【０１５５】
すべてのプラス鎖RNAウイルスは、複製時にそのRNAを隔離するためにいくつかの種類の膜結合区画を使用する。一部のウイルスでは、これらの区画はレプリカーゼタンパク質の殻で裏打ちされているという証拠が存在する。SFVの場合には、小球体がレプリカーゼタンパク質殻を含むという証拠は存在しない。nsPは、小球体くびれ部分の細胞質側に位置しているように見える(Froshauer et al., 1988, J Cell Biol 107(6 Pt 1):2075-2086)。ESCRT経路による多胞体の生成時に形成される膜陥入は、内部タンパク質殻を欠いており、SFV小球体に似ている。よって、ESCRT経路の一部の成分は通常SFV小球体形成に関与するが、膜切断に必要とされる成分は欠いているかまたは阻害されている可能性がある。p50 VLVで選択された変異は、切断に必要とされるさらなる成分のリクルートをもたらすことができるか、または切断の阻害を解除する可能性がある。銀染色(図2および図3A〜3D)は、構造タンパク質はp50 VLVにおいてVSV G以外は検出されなかったことを明らかにし、このことは、それらの中でタンパク質殻を形成する主要な成分は存在しないことを示唆した。
【０１５６】
理論に束縛されるものではないが、エンベロープRNAウイルスの進化のある初期の段階には、小球体が、細胞から出芽しかつキャプシドを欠く原始的なウイルス粒子の直接前駆体であった可能性があると推測することは興味深い。キャプシドは、後に進化し、より効率的なRNAのパッケージング、より優れた安定性、および自然免疫メカニズムによる認識からの遮断を可能にした可能性がある。
【０１５７】
本発明に関連する並行した研究において、p50 VLVの免疫原性および潜在的病原性の試験によって、本発明のVLVは免疫原性を保持しかつ病原性を欠いていることが示された。よって、これらの進化したVLVは、ワクチンベクターとしておよび種々のワクチン適用のためにまたは初回免疫刺激および追加免疫のための大いなる可能性を有している。
【０１５８】
本明細書において引用されている各々のおよびあらゆる特許、特許出願、および刊行物の開示は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１５９】
本発明は特定の態様に関連して開示されているが、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、本発明の他の態様および変形物が当業者により考案され得ることが、明らかである。添付の特許請求の範囲は、すべてのそのような態様および同等の変形物を含むと解釈されるように意図される。
【０１６０】
高力価ハイブリッドウイルスベクター：pCMV-SFVG-p50Rのヌクレオチド配列(5'-3') (SEQ ID NO:1)
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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