(57)【要約】試料中に存在又は潜在的に存在する一本鎖核酸についての分析方法は、標的核酸（もし試料中に存在するならば）が、レポーター鎖及び置換可能な短い鎖からなる問い合わせ二本鎖構造に元々存在しているレポーター鎖を置換し、それにハイブリダイズする工程を含む。レポーター鎖はその一端に又は一端に隣接して、検出可能なシグナルを提供することのできるレポーター部分により標識される。レポーター／標的二本鎖構造は、レポーター鎖がレポーター部分の反対側のその端部から（例えばλエキソヌクレアーゼによって）選択的に酵素消化されて、その部分を直接又は間接的な検出のために解放し、且つ一本鎖標的を再生するようになっており、再生された一本鎖標的は複数回の置換及び消化工程を循環して、結果的にシグナルの増幅を達成することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に存在又は潜在的に存在する標的核酸における一本鎖標的核酸配列について分析する方法において、
（ｉ）問い合わせ二本鎖核酸構造を提供する工程であって、前記問い合わせ二本鎖核酸構造は、
（ａ）標的鎖（前記試料中に存在する場合）における前記一本鎖標的核酸配列に特異的にハイブリダイズ可能であり、且つその一端に又はその方向に、検出可能なシグナルを提供することのできるレポーター部分によって標識される第１レポーター鎖であって、第１レポーター鎖及び前記一本鎖標的核酸配列のハイブリダイゼーションによって形成されたレポーター／標的二本鎖構造において、前記レポーター鎖が前記レポーター部分とは反対側のその端部から選択的に酵素消化されて、前記ハイブリダイズされた一本鎖標的核酸配列及び前記レポーター部分が解放されるように構成されている第１レポーター鎖と、
（ｂ）前記第１レポーター鎖より短く、且つそれとハイブリダイズされて、前記レポーター鎖が問い合わせオーバーハングを提供する問い合わせ二本鎖核酸構造を形成する第２の置換可能な鎖と、
を含む、工程と、
（ｉｉ）前記レポーター鎖及び標的核酸配列から成る二本鎖構造における前記レポーター鎖の前記選択的酵素消化を実行することのできる酵素を提供する工程と、
（ｉｉｉ）前記一本鎖標的核酸配列が、もし存在するならば、前記問い合わせ二本鎖核酸構造から前記第２の鎖を置換して、レポーター鎖のその後の酵素消化により前記レポーター鎖とハイブリダイズするような条件下で、分析を実行する工程と、
（ｉｖ）レポーター部分の有無を直接的又は間接的に検出する工程と、
を含む方法。
【請求項２】
前記一本鎖標的核酸は試料中に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
等温的に実行される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１レポーター鎖及び前記一本鎖標的核酸のハイブリダイゼーションによって形成された前記レポーター／標的二本鎖構造は平滑末端であり、且つ前記レポーター鎖の酵素消化は前記二本鎖構造の前記末端から進行する、請求項１又は３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
前記標的核酸鎖は前記レポーター鎖より長く、且つ前記レポーター／標的二本鎖構造に「テイル（tail）」を形成する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記テイルは２００塩基の最大長さを有する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記平滑末端は前記レポーター鎖の５’末端に存在する、請求項４乃至６の何れかに記載の方法。
【請求項８】
前記レポーター鎖の前記５’末端はリン酸化される、請求項１乃至７の何れかに記載の方法。
【請求項９】
前記酵素はλエキソヌクレアーゼである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記標的核酸は、５‐リン酸化末端を持つプライマーを用いて行われるＰＣＲ反応で産生される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記問い合わせ二本鎖核酸構造における前記オーバーハングは５乃至２０塩基を有する、請求項１乃至１０の何れかに記載の方法。
【請求項１２】
前記問い合わせ二本鎖核酸構造における前記オーバーハングは７乃至２０塩基を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記問い合わせ二本鎖核酸構造における前記オーバーハングは１５乃至１７塩基を有し、好ましくは１６塩基を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記酵素はλエキソヌクレアーゼであり、前記レポーター鎖は５’‐リン酸化末端を有し、前記問い合わせオーバーハングは１５乃至２０塩基を有し、前記反応は等温的に実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記レポーター／標的二本鎖構造において前記標的核酸鎖は、１００塩基の最大長さを有するテイルを有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記反応は３５℃乃至４０℃の温度で行われ、好ましくは３７℃で行われる、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記問い合わせオーバーハングは１５乃至１７塩基の長さを有する、請求項１４乃至１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記レポーター部分は発光部分である、請求項１乃至１７の何れかに記載の方法。
【請求項１９】
前記問い合わせ二本鎖核酸構造における前記レポーター部分の発光を消光するように、前記第２置換可能な鎖にクエンチャー部分が設けられる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記レポーター部分は、基質との反応によりシグナルを検出することのできる酵素である、請求項１乃至１８の何れかに記載の方法。
【請求項２１】
液相で実行される、請求項１乃至２０の何れかに記載の方法。
【請求項２２】
前記第２置換可能な鎖が前記固相に付着されることにより、前記問い合わせ二本鎖核酸構造は固相に固定化される、請求項１乃至２０の何れかに記載の方法。
【請求項２３】
前記固定化された問い合わせ二本鎖核酸構造が提供される反応領域と、前記レポーター部分から生じるシグナルが検出される下流の検出領域とを有する、アッセイ装置で実行され、前記方法の実行中に液体試料は前記反応領域から前記検出領域へ流れる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記アッセイ装置は、前記液体試料が加えられる上流の試料採取領域を有し、前記方法の実行中に、前記液体試料は前記試料採取領域から前記反応を介して前記検出領域へ流れる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記試料は液体試料である、請求項１乃至２４の何れかに記載の方法。
【請求項２６】
ナトリウムイオン及び塩素イオンの各々が８０ｍＭ未満の濃度を有する水性リン酸系緩衝液中で実行される、請求項１乃至２５の何れかに記載の方法。
【請求項２７】
前記緩衝液は２０乃至５０ｍＭのナトリウムイオン及び２乃至７ｍＭの塩素イオンの濃度を有する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記試料は生物由来である、請求項１乃至２７の何れかに記載の方法。
【請求項２９】
前記標的核酸配列はＡＡＴＴＧＧＴＣＧＣＡＴＡＡＣＡＡＴＡＧＡＡＡＴＡＴＡＴＧＣＣＡＡＧ、又は１つ若しくは２つの点変異を有するその変異体である、請求項１乃至２８の何れかに記載の方法。
【請求項３０】
試料中の標的核酸鎖における標的核酸配列を特定するための手順であって、前記標的核酸配列は第１配列又は塩基の変化によって前記第１配列とは異なる第２配列を有し、
（ｉ）前記第１配列と完全に相補的な配列を含むレポーター鎖を用いて、請求項１乃至２９の何れかに記載の方法を実行する工程と、
（ｉｉ）前記第２配列と完全に相補的な配列を含むレポーター鎖を用いて、請求項１乃至２９の何れかに記載の方法を実行する工程と、
（ｉｉｉ）工程（ｉ）及び（ｉｉ）の結果を比較して、前記標的配列が前記第１配列であるかそれとも前記第２配列であるかを判定する工程と、
を含む手順。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料、例えば生物由来の液体試料（例えば血液、尿、ＣＳＦ、若しくは痰のような体液、又は例えば均質化によって組織から調製されたもの）に特定の（「標的」）核酸配列が存在するか否かについて分析するための方法に関する。本発明はさらに詳しくは、試料中の標的核酸配列の存在によって表されるような医学的状態の診断に適用されるような方法に関するが、必ずしもそれに限定されない。標的核酸配列は例えば、「野生型」配列と比較して１つ以上の点変異を有するものであってよい。
【背景技術】
【０００２】
特定の核酸配列の存在を検出するための生物由来の試料の分析はよく確立された科学であり、特定の医学的状態を特定するために液体試料（例えば血液、尿、ＣＳＦ、若しくは痰のような体液、又は例えば均質化によって組織から調製されたもの）を分析するために、日常的に使用されている。医学的状態とは例えば、感染生物の特定の核酸配列の存在によって特徴付けることのできる感染であって、患者の体内に「侵入」した細菌又はウィルスによって生じる感染がある。さらなる可能性としては、健康人に存在する「野生型」配列の１つ以上の点変異によって特徴付けられる遺伝障害の検出がある。さらに別の可能性としては、患者が特定の医学的状態を有することが分かっているが、それに対して処方される治療がその医学的状態に関連付けられる核酸配列の１つ以上の点変異の有無によって影響される事例がある。このように、例えば、結腸直腸がんにおけるＫ‐ｒａｓ遺伝子の変異状態は、セツキシマブ（結腸直腸腫瘍があり且つ化学療法に反応しなかった患者に対して処方されるモノクローナル抗体（Ｋａｒａｐｅｔｉｓ，Ｃ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ  ２００８））による治療への患者の反応に悪影響を及ぼすことがあることが知られている。
【０００３】
試料中の標的核酸配列の有無を判定するための試料（例えば血液、尿、ＣＳＦ、組織、及び痰）のそのような分析の多くは、病院、診療所、及び他の医療センターで毎日、日常的に行われており、一般的に患者の試料を分析手順のために検査所（医療センターの敷地内に存在することもある）に送る必要がある。そのような分析はしばしば、標的核酸配列を（もし存在するならば）検出可能なレベルまで増幅することを利用する手順を用いて実行される。ｑＰＣＲは１つのそのような分析方法である。しかしながら、そのような方法（即ち、核酸の増幅を含む方法）の欠点は、正しく実行されなければ、ひとたび形成されたミスマッチが結果的に増幅された陰性（アボーティブ）シグナルを引き起こす可能性があることである。そのような方法のさらなる欠点は、結果を得るために長時間のゲル形成工程又はカラム分離工程が往々にして必要とされ、次いで結果についての熟練した解釈も必要とされることである。従って、試料が採取された時間から、必要な処置を処方することのできる医療従事者に結果が利用可能になるまで、かなり長い時間が経過することがある。
【０００４】
上述の通り、「偽陽性」（即ち、試料中に特定の核酸が存在していない場合において、存在するという結果を示すこと）を起こし易く、核酸配列における１つ以上の点変異の存在を必ずしも判定することができないという、ｑＰＣＲに関連する欠点もある。
【０００５】
実行が容易であり、迅速且つ正確な結果を出し、標的核酸配列における点変異の判定に信頼して使用することのできる、核酸分析の方法が求められている。本発明はこの要求に応えるものである。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、試料中に存在又は潜在的に存在する標的核酸における一本鎖標的核酸配列について分析する方法であって、以下の工程を含む方法を提供する。
（ｉ）以下の（ａ）及び（ｂ）を含む問い合わせ二本鎖核酸構造（interrogating  duplex nucleic acid structure）を提供する工程。
（ａ）標的鎖（試料に存在する場合）における一本鎖標的核酸配列に特異的にハイブリダイズ可能（hybridisable）であり、且つ検出可能なシグナルを提供することのできるレポーター部分（reporter moiety）によりその一端に又はその方向に標識される第１レポーター鎖（reporter strand）であって、第１レポーター鎖及び一本鎖標的核酸配列のハイブリダイゼーションによって形成されたレポーター／標的二本鎖構造において、レポーター鎖がレポーター部分とは反対側のその端部から選択的に酵素消化され、ハイブリダイズされた一本鎖標的核酸配列及びレポーター部分が解放されるように構成された前記レポーター鎖。
（ｂ）前記第１レポーター鎖より短く、且つそれとハイブリダイズされて、レポーター鎖が問い合わせオーバーハング（interrogating overhang）を提供する問い合わせ二本鎖核酸構造を形成する、第２の置換可能な鎖。
（ｉｉ）レポーター鎖及び標的核酸配列から成る二本鎖構造におけるレポーター鎖の前記選択的酵素消化を実行することのできる酵素を提供する工程。
（ｉｉｉ）一本鎖標的核酸配列が、もし存在するならば、第２の鎖を問い合わせ二本鎖核酸構造から置換して、レポーター鎖のその後の酵素消化によりレポーター鎖とハイブリダイズするような条件下で、分析を実行する工程。
（ｉｖ）レポーター部分の有無を直接的又は間接的に検出する工程。
【０００７】
以下でさらに詳しく説明するように、本発明の方法は、標的配列自体の増幅を必要とすることなく、試料中に存在する低レベルの標的核酸配列から検出可能なシグナルを提供するという、シグナル増幅の顕著な利点をもたらす。従って、核酸増幅手順中のミスマッチから生じる「偽陽性」は回避される。さらに、本発明の方法は、短期間に（試料中に存在する（標的配列を含む）標的核酸鎖の量及び／又はアッセイから要求される感度に応じて例えば１５〜３０分で）得られる、容易に読み取り可能であり且つ正確に検出可能なシグナルを提供するフォーマットで実行されてよく、それによって分析の結果を達成するために要する時間が、上述した先行技術の方法と比較して、かなり短縮される。
【０００８】
本発明の方法では、（標的配列を含む）標的核酸鎖は一般的にＤＮＡ配列であるが、ＲＮＡ配列であってもよい。試料中に二本鎖構造の標的核酸鎖が存在する場合には、標的核酸鎖は従来の変性技術によって単鎖化されてよいが、（二本鎖核酸構造の変性を防止するために）それは二本鎖核酸構造の試料への導入前に実行しなければならない。標的核酸鎖の性質によって、レポーター鎖及び第２の置換可能な鎖はＤＮＡ又はＲＮＡであってよい。
【０００９】
本発明の好適な実施形態では、標的配列、レポーター配列、及び置換可能な配列は全てＤＮＡ配列であってよい。しかし我々は他の可能性を排除しない。例えば、標的配列はＤＮＡであってよく、且つレポーター配列はＲＮＡであってよい。代替的に、標的配列はＲＮＡであってよく、且つレポーター配列はＤＮＡであってよい。
【００１０】
本発明の一実施形態では、標的核酸は、核酸増幅反応（例えばＰＣＲ）で生成されたアンプリコンであってよい。本発明の特定の実施形態では、ＰＣＲ反応は、ＰＣＲ産物の鎖の１つが本発明の方法の工程（ｉｉ）で使用されたのと同じ酵素によって消化され、他の（非消化）鎖が標的核酸として残されるように、プライマーにより実行されてよい。
【００１１】
試料は通常、生物由来及び／又は液体である。
【００１２】
本発明の方法では、標的核酸配列は分析物試料において独特なものとすべきである。独特な標的配列はより長い核酸鎖内に、従ってその一部として存在してよい。
【００１３】
レポーター鎖は標的核酸とハイブリダイズすることができなければならず、そうする際に、その全長（即ちレポーターの全長）に沿って、標的配列が存在する核酸標的鎖とハイブリダイズしなければならない。一般的に、レポーター鎖は、標的配列が存在する標的核酸鎖より短い。二本鎖核酸構造は、標的配列（もし存在するならば）を含む核酸鎖が第２のより短い鎖と置換して、結果的にレポーター鎖が標的核酸配列とハイブリダイズして、標的／レポーター二本鎖を形成することができるようになっている。
【００１４】
レポーター鎖は鎖の一端に又はそれに隣接してレポーター部分を有する。レポーター鎖に取り付けられた１つ以上のレポーター部分が存在してよい。本発明の特定の実施形態では、レポーター部分は発光部分であってよい。本発明の他の実施形態では、レポーター部分は酵素であってよい。
【００１５】
本発明の方法は、レポーター部分が設けられる端部とは反対側又はそれに隣接するレポーター鎖の端部から標的核酸配列とハイブリダイズする場合に、レポーター鎖の酵素分解を使用する。条件は、問い合わせ二本鎖核酸構造のどの鎖も、レポーター及び分析物配列のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖構造におけるレポーター鎖の消化と比較して、あまり消化されないようにするべきである。問い合わせ二本鎖構造の消化を防止する効率的な方法は、問い合わせ二本鎖の消化の確率が低くなるように、（問い合わせ二本鎖構造における）レポーター鎖のオーバーハングを充分に長くすることである（後掲の説明を参照されたい）。加えて、問い合わせ二本鎖構造の消化の阻止は、レポーター鎖の適切な構成、レポーター／標的二本鎖及び／又は使用される消化酵素（エキソヌクレアーゼ）の構成によって達成することもできる。従って、例えば、標的配列が存在する核酸構造はレポーター鎖より長くてよく、レポーター鎖の５’末端及び標的配列の３’末端は、レポーター／標的二本鎖に平滑末端を形成することができる（レポーター部分はレポーターの３’末端に設けられる）。エキソヌクレアーゼは平滑末端から５’から３’の方向に優先的に消化するものであってよい。分析混合物中の平滑末端は、レポーター／標的二本鎖によってもたらされるものだけであるので（レポーターの５’末端が平滑末端にある）、発生する鎖の顕著な消化はレポーター鎖の消化だけである。
【００１６】
一般的に、分析される試料中に標的核酸配列が存在すると仮定して、本発明の方法は、（後でさらに詳述する）以下の一連の工程から結果的に得られるシグナル増幅の顕著な特徴（後でさらに詳述する）を具現する。
（ｉ）問い合わせ二本鎖核酸構造における第２の置換可能な鎖、即ち標的配列を含む鎖を標的鎖によって置換して、レポーター／標的二本鎖を形成する工程；
（ｉｉ）レポーター／標的二本鎖におけるレポーター鎖をその一端から選択的に酵素消化して、遊離標的鎖を提供し、検出可能なシグナルに「寄与」する（後でさらに詳しく説明する）工程；
（ｉｉｉ）遊離標的鎖を工程（ｉ）に再循環させる工程。
【００１７】
上記工程（ｉｉ）において、検出可能なシグナルへの「寄与」は、標的／レポーター二本鎖から解放されてシグナル発生に関与するレポーター部分のおかげで達成される。工程（ｉ）及び（ｉｉ）を繰り返すたびに、レポーター部分がさらに解放される。レポーター部分はレポーター鎖の末端塩基に結合されてよく、その全長の消化によりレポーター部分の解放が達成される。しかし、我々は、レポーター部分を末端の内側の塩基に結合することで、レポーター部分が結合された塩基までレポーター鎖が消化された後、レポーター鎖の残部はそれ以上ハイブリダイズすることができないので、レポーター部分が解放される可能性も排除しない。
【００１８】
従って、試料中の標的核酸鎖の存在及び充分な量の問い合わせ二本鎖核酸構造（レポーター鎖にその関連レポーター部分を提供する）を前提として、標的鎖は工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を繰返し循環することができることは理解されるであろう。工程（ｉｉ）を繰り返すたびに、標的核酸鎖の再循環の結果もたらされる検出可能なシグナルへの「寄与」が増大し、増幅シグナルが発生する。
【００１９】
重要なことに、これまでの段落で記載したメカニズムの結果得られるシグナル増幅は、標的鎖又は標的配列を増幅する必要なく達成され、それによりそのような核酸増幅手順によって生じる「偽陽性」が回避される。
【００２０】
本発明の方法のさらなる重要な利点は、１つ以上の点変異を有する標的核酸配列の検出に対するその特異性にある。そのような実施形態はエキソヌクレアーゼ（レポーター鎖を消化するために）を利用し、消化は標的配列の「対向」塩基に対し非相補的なレポーター鎖の塩基までしか進まないと見込まれる。１つの塩基の違いを除いては相互に同一である第１及び第２の標的核酸配列を考えると、その場合、第２の標的配列は第１配列の点変異とみなすことができる。次に、第１の標的配列が存在し、且つレポーター鎖と完全に相補的であり、レポーター部分が消化が開始されるレポーター鎖の端部とは反対側の端部に又はそれに隣接して設けられる分析を考える。この場合、上述の通り、シグナル増幅が行われる。次に、最初の手順と同一のレポーター鎖を使用するが、第２の標的核酸配列が存在する、さらなる分析手順を考える。第２の標的核酸配列は、１か所にミスマッチがある以外はレポーター鎖と相補的である。第２の標的核酸配列及びレポーター鎖がハイブリダイズすると仮定すると、上述の通りレポーター鎖の酵素消化が開始され、レポーター鎖に沿ってミスマッチの位置まで続く。この位置で、レポーター鎖の酵素消化は終了するか、或いは遅くなると見込まれる。従って、第２の標的核酸におけるミスマッチの数に応じて、レポーター鎖の完全な消化は防止され、或いは少なくとも遅くなるので、第２の標的核酸配列は二本鎖構造の一部分のままであり（即ちレポーター鎖の非消化部分がある）、上述のようにシグナル増幅への関与のために再循環されない（又は比較的低い程度にしか再循環されない）。
【００２１】
従って、シグナルがこの第２の分析から得られたとしても、それは、第１の分析から得られる（増幅）シグナルよりかなり低い。
【００２２】
生物由来の試料が、野生型配列である標的核酸配列又は点変異を有する標的核酸配列を含むか否かを判定するために、次の２つの分析方法、即ち、
（ａ）野生型標的配列と完全に相補的な配列を有するレポーター鎖を使用する方法、及び
（ｂ）点変異を有する標的配列と完全に相補的な配列を有するレポーター鎖を使用する方法
を実行することができる。
【００２３】
試料中の標的核酸配列が野生型配列である場合、分析方法（ａ）は増幅シグナルをもたらすが、分析方法（ｂ）からのシグナルは著しく少ないか零である。逆に、生物試料中の標的核酸配列に点変異がある場合、逆のことが起きる。即ち、分析方法（ｂ）からのシグナルは、方法（ａ）からのシグナルより高い。これに基づいて、本発明の方法は、ｑＰＣＲでは特定できない点変異を容易に検出することができる。
【００２４】
本発明の方法の１つの特徴は、レポーター鎖が「問い合わせ」オーバーハングを有し、そこに標的配列を含む標的核酸鎖がハイブリダイズするように、レポーター鎖と、それにハイブリダイズされる第２のより短い鎖とを含む、問い合わせ二本鎖核酸構造である。オーバーハングは、標的核酸が（短い第２の鎖の置換により）レポーター鎖にハイブリダイズする充分な長さにする必要があるが、その「問い合わせ」機能を阻害するような二次的構造がオーバーハングに生じるほど長くすべきではない。オーバーハングの長さはこの方法の感度にも影響を及ぼし得る。オーバーハングが短すぎる場合、（より長いオーバーハングと比較して）エキソヌクレアーゼが問い合わせ二本鎖構造におけるレポーター鎖を消化して、レポーター部分を解放することができる可能性が増大し、従ってそれは、試料中に存在する分析物核酸の量に関係なく、検出されるシグナルに寄与する。この効果は、分析物配列の量が非常に低い分析においては顕著になり得るので、問い合わせ二本鎖構造におけるレポーター鎖の消化によって生じる寄与と比較して、分析物によって生じる検出シグナルへの寄与が低くなる。
【００２５】
理想的には、二本鎖構造におけるレポーター鎖によって形成されるオーバーハングは一般的に、少なくとも７塩基の長さになる。しかし、オーバーハングは理想的には２０塩基を超える長さにすべきではなく、１６塩基を超えないことがより好ましい。従って、オーバーハングは７塩基から１６塩基の長さにすることが好ましい。
【００２６】
通常、レポーター鎖は２４塩基から３５塩基の長さになる。
【００２７】
さらに、標的核酸（標的核酸配列を含む）にレポーター鎖をハイブリダイズすることによって形成される二本鎖構造は、この目的のために提供される酵素（エキソヌクレアーゼ）によってレポーター鎖が選択的に酵素消化されて標的鎖を解放し、上述の通り増幅を達成するために問い合わせ二本鎖核酸構造の第２のより短い鎖を置換するさらなる循環のために使用することができるようにしなければならない。エキソヌクレアーゼは、理想的には１５℃から４０℃の温度で、例えば３５℃から４０℃、例えば約３７℃で、等温消化を実行できるものであることが好ましい。
【００２８】
できれば、レポーター／標的二本鎖構造は、酵素によってレポーター鎖が平滑末端から消化されるように構成された平滑末端を有するものであってよい。レポーター／標的二本鎖に平滑末端が１つだけ存在し、標的核酸が二本鎖構造に（単一鎖）「テイル」をもたらすように、標的核酸鎖（標的核酸配列を含む）はレポーター鎖より長いことが最も好ましい。この「テイル」は約２００塩基までの長さ（例えば１００〜２００塩基）であってよい。２００塩基より長い場合、テイルと酵素分子との間に残留相互作用が生じることがあり、それは鎖消化のさらなる循環におけるその酵素の再使用を妨げる。本発明の好適な実施形態では、レポーター鎖は（二本鎖構造の平滑末端に）５’リン酸化末端を有し、酵素は、二本鎖構造の末端の構成に対し、ヒドロキシル化末端よりリン酸化末端に対し１０倍の優先度で、以下の優先順で、即ち５’陥凹＞平滑＞＞５’オーバーハングの順に、二本鎖ＤＮＡの１つの鎖を５’‐３’方向に前進的に劣化させるλエキソヌクレアーゼである。さらに、１００塩基より長い３’テイルは、λエキソヌクレアーゼの酵素活性を阻害することが知られている（Ｍｉｔｓｉｓ  ａｎｄ  Ｋｗａｇｈ，  １９９９）。従って、λエキソヌクレアーゼが使用される場合、二本鎖構造における「テイル」は１００塩基以下の長さである。本発明のこの実施形態では、レポーター／標的二本鎖構造におけるレポーター鎖の消化はレポーター鎖の５’リン酸化末端から始まり、５’リン酸化末端を消化して、さらなる置換の循環のために標的核酸鎖を解放し、上で詳述したように増幅を達成する。
【００２９】
本発明の方法におけるλエキソヌクレアーゼの使用に特に関連して、（且つ分析の感度を低減させるかもしれない問い合わせ二本鎖構造の消化の可能性について説明すると）、潜在的に平行して進行する２つの反応が分析に存在する（少なくとも問い合わせ二本鎖構造が固定化されない場合）（下記参照）。
【００３０】
第１の反応は、λエキソヌクレアーゼが、レポーター鎖及び分析物鎖のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖構造内のレポーター鎖を消化するものである。
【００３１】
第２の反応は、酵素が問い合わせ二本鎖構造内のレポーター鎖をも消化することがあるというものである。比較的低量の分析物（ｚモル乃至ａモル）で、酵素消化の大部分が問い合わせ二本鎖構造（ｐモル量存在する）で起こり、非常に少量の分析物を検出できないため、これは感度を限定するおそれがある。
【００３２】
このシステムに関する別の問題は、消化が等温であり、周囲温度で実行することができるが、温度が３７℃に近ければ近いほど、酵素は活性が高くなり、背景消化が多く発生するようになることである。λエキソヌクレアーゼは５’から３’の方向にしか消化できないので、レポーター鎖をその５’リン酸化末端から、又は置換可能なオリゴヌクレオチドを、レポータークエンチャーが設けられるその５’末端から消化し始める。置換可能なオリゴヌクレオチドの５’「クエンチャー部分を含む末端」は平滑末端を形成するが、クエンチャー部分は一般的に比較的大きい分子であり、立体障害を引き起こすので、酵素が置換可能なオリゴヌクレオチドの５’「クエンチャー部分を含む末端」を消化する可能性は低い。λエキソヌクレアーゼはレポーター鎖の５’リン酸化末端を認識し、その鎖を消化してレポーター部分を解放し、背景シグナルを発生する可能性が高い。しかし、一本鎖の５’リン酸化末端は、λエキソヌクレアーゼの活性部位に結合することができることが知られている。この場合、λエキソヌクレアーゼは問い合わせ二本鎖構造の二本鎖部に近接させることができ、これは背景消化を開始させ、背景シグナルを導く。
【００３３】
理論的には、レポーター鎖によってもたらされるオーバーハングのサイズが大きくなると、（ｉ）５’リン酸化末端は問い合わせ二本鎖構造の二本鎖から「安全な距離」に配置されるので、たとえλエキソヌクレアーゼがレポーター鎖のオーバーハングに結合されても、二本鎖分子を消化すべきものとして認識せず、或いは（ｉｉ）オーバーハングはより柔軟になり、従って酵素に結合する可能性が低くなり（この酵素の二本鎖分子に対する優先度は標的の柔軟性／安定性に関係することができる）、或いは（ｉｉｉ）長いオーバーハングはヘアピンを形成し、分析物鎖による置換は依然として発生することができるが、酵素の結合及び消化は阻止される。
【００３４】
実際には、約１６塩基のオーバーハングを使用し、高活性条件下（３７℃又は４０℃、１０Ｕ）で反応を実行すると、酵素活性は、問い合わせ二本鎖構造に対してより、レポーター鎖及び分析物鎖のハイブリダイゼーションによって形成された二本鎖構造に対して圧倒的に集中するので、背景消化は１時間のインキュベーション後に数万ＲＦＵ（相対蛍光単位）から数百ＲＦＵまで低下し、このようにしてシステムの感度は高くなる。
【００３５】
酵素がλエキソヌクレアーゼである場合、標的鎖は、プライマーの１つが５リン酸化末端を有するＰＣＲ反応で産出されてよい。得られた二本鎖のＰＣＲ産物では、５リン酸化末端を有する鎖はλエキソヌクレアーゼによって消化することができ、他の（非消化）鎖は標的核酸として残る。
【００３６】
本発明の方法で使用することのできるさらなるエキソヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼＩＩＩである。
【００３７】
エキソヌクレアーゼＩＩＩは、二本鎖ＤＮＡの３’ヒドロキシ末端からのモノヌクレオチドの段階的な除去を触媒する（Ｒｏｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓ，  １９８０）。この酵素は一本鎖ＤＮＡには作用せず、従って３’突出末端は切断に対し耐性がある（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ｗｅｂｓｉｔｅ）。従ってレポーターのオーバーハングが３’末端に位置する問い合わせ二本鎖を設計することができ、オーバーハングは一本鎖であるので、分析物の一本鎖ＤＮＡ分子がオーバーハングにハイブリダイズし、レポーターを置換して、エキソヌクレアーゼＩＩＩ消化の標的となる平滑な３’末端を形成しない限り、オーバーハングは消化されず、平滑な３’末端が形成されるとレポーターの消化のため、分析物の解放が導かれる。
【００３８】
標的配列を含む核酸鎖は、標準制限酵素技術を用いて、ずっと長い長さの天然由来の二本鎖配列から、切除後の核酸鎖が適切な長さを有し且つ標的核酸配列をも含むように切除されたものであってよい。本発明の方法で使用するための適切な長さの二本鎖配列の切除及びその一本鎖への変換は、当業界で周知の通り、制限酵素及び変性技術を使用することによって行われてよい。従って、例えば、置換増幅システムで使用することのできる分析物鎖を、以下の工程に従うことによって調製することができる。
１．適切な配列のｄｓＤＮＡを生成するゲノムＤＮＡをエンドヌクレアーゼ消化させる（従って、このシステムの配列選択は、２つの酵素を使用する場合のエンドヌクレアーゼ部位の利用可能性及びエンドヌクレアーゼ緩衝液の適合性に依存する）。
２．ｄｓＤＮＡエンドヌクレアーゼ産物を変性させ、ストレプトアビジン磁気ビーズに結合されたビオチン化オリゴヌクレオチド上の分析物配列を捕捉する。
３．磁石でビーズを捕集し、無関係のＤＮＡ配列を洗い流す。
４．磁気ビーズに結合されたビオチン化オリゴヌクレオチドを除いた分析物配列を変性させ、溶出液を分析物として使用する。
【００３９】
ゲノムＤＮＡを分析物として使用して特定のシグナルを生成するために、この特定の置換増幅システムを使用する代替的方法も存在する。
【００４０】
本発明に係る分析方法を実行するために一本鎖ＤＮＡを得、且つ（この場合）少なくとも半定量的結果を得るための代替的手順は、次の通りである。
（ａ）同量の２つのアリコートは、分析対象の二本鎖ＤＮＡ配列を含む（又は潜在的に含む）液体試料から得られる。便宜上、２つのアリコートをここでは「第１」及び「第２」アリコートと表す。
（ｂ）第１アリコートは、（より長い長さの）一本鎖ＤＮＡ内の配列にハイブリダイズする特定量の第１オリゴヌクレオチドの存在下で熱変性を受ける。混合物は次いで、ハイブリダイゼーションを促進する条件下（例えばＭｇＣｌ２の存在下）で、第１オリゴヌクレオチドを対象の一本鎖ＤＮＡ（もし存在すれば）にハイブリダイズすることにより再生される。ハイブリダイズされなかった第１オリゴヌクレオチドは、以下の工程（ｄ）で一本鎖標的核酸配列として役立つ。
（ｃ）工程（ｂ）は第２アリコートに対して、ただし（第１オリゴヌクレオチドと比較して）等モル量の、試料中のＤＮＡに対して非特異的な第２オリゴヌクレオチドを使用して、繰り返される。ハイブリダイズされなかった第２オリゴヌクレオチドは、以下の工程（ｅ）で一本鎖標的配列として役立つ。第２オリゴヌクレオチドは例えばサケＤＮＡ配列であってよい。
（ｄ）工程（ｃ）からの混合物は、本発明の方法に従って、レポーターが試料中の一本鎖の（即ちハイブリダイズされなかった）第１オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする問い合わせ二本鎖構造を用いて分析される。得られるシグナルは、ハイブリダイズされなかった第１オリゴヌクレオチドの量を表す。
（ｅ）工程（ｃ）からの混合物は、本発明の方法に従って、レポーターが第２オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする問い合わせ二本鎖核酸構造を用いて分析される。生成されるシグナルは、混合物中のハイブリダイズされなかった第２オリゴヌクレオチド（例えばサケＤＮＡ）の量を表す。
（ｆ）工程（ｄ）及び（ｅ）で得られたシグナルの差は、元の液体試料中の対象ＤＮＡの量を表す。
【００４１】
今説明した手順は、所与の量（例えば１００ｆｍｏｌ）の第１及び第２オリゴヌクレオチドの各々によってそれらのそれぞれの問い合わせ二本鎖構造に対して生成される増幅シグナルが同一であるか非常に似ていることを前提とする。そうなることを確実にする１つの方法は、同一（又は非常によく似た）熱力学特性を持つオリゴヌクレオチド配列を選択することである。例えば、レポーター配列、オーバーハング配列、及び置換可能なオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするレポーターの配列の全長にわたって同一又は非常によく似たＧＣ含量を有する配列を設計することが可能である。
【００４２】
本発明の方法は従来の水性緩衝液を用いて実行されてよい。しかし、酵素がλエキソヌクレアーゼである場合、緩衝液は従来のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）以外であることが好ましい。特に、（λエキソヌクレアーゼの場合）緩衝液は、（もし存在したとしても）比較的低濃度のナトリウムイオン及び塩素イオンを含むリン酸系水性緩衝液であることが好ましい。緩衝液はナトリウムイオン及び塩素イオンが各々８０ｍＭ未満の濃度であることが好ましく、６０ｍＭ未満であることがより好ましく、４０ｍＭ未満であることがさらに好ましい。ナトリウムイオン濃度は塩素イオン濃度と等しいかそれ以上であってよい。例えば、緩衝液は２０〜５０ｍＭ（例えば３５〜４５ｍＭ）の濃度のナトリウムイオン及び２〜７ｍＭ（例えば４〜６ｍＭ）の塩素イオンを有してよい。適切な緩衝液は、例えば適切な量のＮａ２ＨＰＯ４及びＫＣｌから調製されてよい。緩衝液は界面活性剤、例えばツイーン（Ｔｗｅｅｎ）を含んでよい。
【００４３】
本発明の方法は、溶液相で行われるか、或いは固相支持体を用いて、例えば問い合わせ二本鎖核酸構造の第２オリゴヌクレオチドがフロー経路（例えば毛細管フロー経路）で固定化されるフローベースのアッセイで行われてよい。
【００４４】
溶液相反応の場合、レポーター部分によって提供されるシグナルは、溶液相の反応中に検出されてよい。この場合、シグナル（試料中の標的核酸配列の有無を決定する）は液相で検出されてよい。この実施形態の場合、標的核酸が試料中に存在して、上記（ａ）〜（ｃ）に要約された一連の反応に関与することができない限り、シグナルが発生しないことが重要であり、そうでなければ間違った結果が得られることになる。従って、そのような溶液相アッセイでは、レポーター部分によるシグナル発生は、この一連の反応が起きるまで阻止されなければならない。これは、レポーター鎖に発光性（蛍光性又はりん光性）レポーター部分を使用し、且つ問い合わせ二本鎖核酸構造における第２の短い鎖に、第２の鎖が標的核酸によってレポーター鎖から置換されるまで発光を消光するクエンチャーを使用することによって、最も簡便に実行される。
【００４５】
フロー（例えば毛細管フロー）ベースのアッセイの場合、これは、「反応領域」及び「検出領域」を有するアッセイ装置を用いて実行されてよい。「反応領域」は、その短い（第２）鎖が毛細管経路上及び／又はその周りで固定化された問い合わせ二本鎖核酸構造を含む。液体は、「反応領域」から、レポーター部分によって生成されたシグナルの測定が行われる「検出領域」へ流れる。検出領域は反応領域から離れているので、レポーター部分をマスキングする必要がない。従って、レポーター鎖に付着したレポーター部分は、（一連の反応（ａ）〜（ｃ）が発生した場合にだけ、解放されて検出領域に送られる）非消光蛍光レポーター部分であってよい。代替的に、レポーター部分はそれ自体は検出されないが、適切な試薬／基質を例えば検出領域に提供することにより、解放されたレポーター部分が関与する反応の産物によって「間接的に」検出される。従って、例えばレポーター部分は、適切な基質により色を発生する酵素であってよい。酵素は例えばアルカリホスファターゼ又は西洋わさびペルオキシダーゼであってよい。それらの適切な基質を下の表１に示す。
【００４６】
【表１】
2017526389.tif 000003
【００４７】
次に、本発明について、単なる例として、添付の図面及び非限定実施例に関連してさらに詳しく記載する。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】溶液相分析として実行される本発明の方法の一実施形態を概略的に示す。
【図２】固相支持体を使用して実行される本発明の方法のさらなる実施形態を概略的に示す。
【図３】実施例１で使用したオリゴヌクレオチド配列の詳細を示す。
【図４】実施例１の方法を概略的に示す。
【図５】実施例１の結果を示す。
【図６】実施例２の結果を示す。
【図７】図７（ａ）は、実施例３で使用した配列の詳細を示す。図７（ｂ）は、実施例３で使用した配列の詳細を示す。図７（ｃ）は、実施例３の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
最初に図１を参照すると、それは本発明の分析方法の溶液相実施形態を示している。さらに詳しくは、図１（ａ）は、一緒にハイブリダイズされた２つの核酸（ＤＮＡ）鎖から成る問い合わせ二本鎖核酸構造を示す。さらに詳しくは、問い合わせ二本鎖核酸構造は、（ａ）５’末端がリン酸化され、３’末端に蛍光ラベル（Ｃｙ５）を備えた第１レポーター鎖と、
（ｂ）レポーター鎖の３’末端と相補的な配列を有し、その５’末端にＢＨＱ２（「ブラックホールクエンチャー２」）部分を備えた第２の短い鎖と、
を含む。
【００５０】
図１（ａ）から分かるように、レポーター鎖の５’領域は、問い合わせ二本鎖核酸構造にオーバーハングをもたらし、その目的については後でさらに詳しく述べる。
【００５１】
ＢＨＱ２部分はＣｙ５の蛍光を消光するように働く。
【００５２】
図１（ａ）にさらに示されるのは、レポーター鎖より長い長さを持つものとして図示された一本鎖核酸（ＤＮＡ）標的配列である。本発明の説明では、レポーター鎖及び標的鎖はそれらの５’末端及び３’末端からそれぞれ読み取って相互に完全に相補的であると考えられる。
【００５３】
液相でさらに提供されるのは酵素λエキソヌクレアーゼである。λエキソヌクレアーゼは図１（ａ）には示されないが、図１（ｂ）〜（ｄ）には楕円として示される。
【００５４】
都合よく、この方法は、溶液中で問い合わせ二本鎖核酸構造を「事前調製」することによって影響されることがある。この溶液自体は、分析対象の試料及びλエキソヌクレアーゼを溶液中に取り込むことによって、分析手順に使用されてよい。代替的に、問い合わせ二本鎖核酸構造を含む溶液は、標的配列及びλエキソヌクレアーゼを含む（又は潜在的に含む）液体混合物を形成することによって分析が実行される分析装置（例えばマイクロタイタープレート）のウェルに取り込むために、凍結乾燥されてよい。
【００５５】
図１（ｂ）に概略的に示す通り、標的配列がレポーターからクエンチャーオリゴヌクレオチドを置換し、それにハイブリダイズするように、反応はハイブリダイゼーション条件下で進む。それらの相補的配列の観点から、レポーター及び標的は、二本鎖構造にレポーターの５’末端及び標的の３’末端によって形成される平滑末端をもたらすようにハイブリダイズされる（図１（ｂ）参照）。
【００５６】
レポーターが二本鎖構造の平滑末端に５´リン酸化末端を持つことを前提として、λエキソヌクレアーゼは次に、図１（ｃ）に示すように、二本鎖構造上をそれに沿って通過するエキソヌクレアーゼ（「楕円」として示される）によって、レポーター鎖を５´末端から選択的に消化し始める。レポーター鎖の完全な消化により、元の標的鎖、消化に使用されるλエキソヌクレアーゼ分子、及び当初レポーター部分に結合されていたＣｙ５は今や、液相で全て遊離している。
【００５７】
正味の効果は、標的鎖（及びλエキソヌクレアーゼ）が、図１（ａ）〜（ｄ）に示すようにさらなる一連の反応を自由に受けることができることである。従って、全体的な効果は一種のシグナル増幅であり、即ち、エキソヌクレアーゼが分析混合物に提供されない場合（この場合、各標的鎖は１つのクエンチャー鎖を置換するように働くだけであり、従ってその関連ＢＨＱ２クエンチャーから１つのＣｙ５を解放するだけである）と比較して、各標的が１つ以上のＣｙ５を置換するので、蛍光シグナルの増幅が可能になる。
【００５８】
このシグナル増幅は、（本発明の方法によってもたらされる増幅無しには）検出可能なシグナルを提供するには不充分であった、非常に低レベルの標的分子の検出を可能にするので、本発明の顕著な特徴である。
【００５９】
溶液相実施形態について、特にレポーター部分がＣｙ５であり且つクエンチャーがＢＨＱ２であることに関連して上で説明してきた。しかし、蛍光レポーター部分及びクエンチャーの他の組合せを使用してもよいことは理解されるであろう。使用することのできる蛍光レポーター部分及びクエンチャーの組合せの例を次の表に示す。
【００６０】
【表２】
2017526389.tif 000004
【００６１】
しかし、上述した溶液相分析は一般的に、蛍光レポーター部分と共にクエンチャー部分を使用する必要があることは理解されるであろう。これは、言うまでもなく、（蛍光発光はクエンチャー鎖が（標的核酸によって）置換されることに依存するので）標的核酸が存在しなければ、蛍光レポーター部分から蛍光が発生しないことを確実にするためである。
【００６２】
Ｃｙ５又は使用することのできる他の蛍光レポーター部分からの蛍光発光の検出は、溶液相で、従来の手段によって、元の試料中の標的核酸の量の定量的尺度である（増幅された）蛍光の強度により、検出することができる。
【００６３】
次に図２を参照すると、それは、この場合固相支持体を用いて実行される、本発明に係る方法のさらなる実施形態を示している。好ましくは、図２の実施形態は、上流の試料採取領域及び下流の検出領域、並びに問い合わせ二本鎖核酸構造が、より詳しくはその第２の鎖が固相に連結され（且つ従ってそれが固定化される）おかげで、固定化される中間の「反応領域」を含むフロー（例えば毛細管フロー）経路を有するアッセイ装置で行われる。同様のそのようなアッセイ装置は（その毛細管経路に核酸を固定化する技術と共に）国際出願公開第２０１２／０４９４６５号公報に開示されている。
【００６４】
そのようなアッセイ装置では、標的核酸配列を（潜在的に）含む液体試料は試料採取領域に導入され、次いで問い合わせ二本鎖核酸構造が固定化されるフロー（例えば毛細管フロー）経路の領域に（例えば毛管作用によって）流動させることができ、フローは次いで、問い合わせ二本鎖核酸構造が固定化される下流の検出領域に続く。検出領域は、便宜上、シグナルの検出のために液体が流れ込むウェルである。
【００６５】
原則として、図２の実施形態は、標的核酸配列がレポーター配列を置換し、且つそれとハイブリダイズして「平滑末端」を持つ二本鎖構造を形成し、レポーター鎖が次いで（そのリン酸化５’末端から）λエキソヌクレアーゼによって消化されて標的核酸鎖を解放し、開放された標的核酸鎖が次いでさらなる置換反応（即ち問い合わせ二本鎖核酸構造からのレポーター鎖の置換）に参加することができるという点で、図１に記載した実施形態と全く同様に機能する。しかし、問い合わせ二本鎖核酸構造が固定化されるフロー（例えば毛細管フロー）をベースとする手順に適用される場合、図１の実施形態と比較して以下の相違が存在する。
【００６６】
第一に、上に示した通り、問い合わせ核酸構造はフロー（例えば毛細管フロー）経路の（内）壁に固定化される。図２にはそのような固定化された問い合わせ二本鎖核酸構造が１つしか示されていないが、フロー経路の長さに沿って、且つその内部の周りに固定化された多くのそのような構造が存在するであろう。
【００６７】
第二に、第２の鎖（即ちフロー経路の壁に固定化された鎖）はクエンチャーを担持しない。言い換えると、問い合わせ二本鎖核酸構造においてＣｙ５又は他の蛍光レポーター部分の消光が起きない。
【００６８】
第三に、レポーター部分は、基質が検出領域にもたらす反応によって色を生じる酵素（例えばアルカリホスファターゼ又は西洋わさびペルオキシダーゼ）とすることが可能である。
【００６９】
固相支持体を使用する本発明の方法の代替的実施形態では、固相支持体を、例えば問い合わせ二本鎖核酸構造が固定化されるマイクロタイタープレートのウェルの内面とすることができる。この実施形態の場合、図１の実施形態で記載した通り、レポーター部分は消光した発光部分でなければならない。
【００７０】
次に本発明を以下の非限定実施例に関連して説明する。
【実施例】
【００７１】
［実施例１］
［概要］
この実施例は、液体試料中のナイセリア・ゴノレア（淋菌、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  Ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）ＣＤＳ８から３４ヌクレオチド標的配列を検出するための本発明の方法の使用を実証するものであり、この方法は核酸の存在を検出するために蛍光ラベルを使用する。さらに詳しくは、この実施例は、本発明を使用しない対照方法と比較して、蛍光シグナルの増幅を実証する。加えて、この実施例は、野生型核酸配列と少なくとも１つの点変異のある同様の配列とを区別する本発明の方法の特異性の可能性を実証する。
【００７２】
最初に図３ａ及び図３ｂを参照する。図３ａは、太字で強調された独特な３４ヌクレオチド配列を組み込んだ、ナイセリア・ゴノレアＣＤＳ８の保存配列を示す。この３４ヌクレオチド配列は現在、ナイセリア・ゴノレアＣＤＳ８の検出のためのｑＰＣＲ法で使用されている。
【００７３】
図３ｂは、この実施例のために使用される「レポーター」、「クエンチャー」、「野生型」（「ＷＴ」）分析物、「１点変異」（「ＰＴ１」）分析物、及び「２点変異」（「ＰＴ２」）分析物の配列として用いられた、（独特な配列に基づく）ヌクレオチド配列を示す。
【００７４】
ＷＴ分析物配列は全て独特な配列（即ち、図３（ａ）において太字又は下線で強調された配列）の３４ヌクレオチドを含んでいた。ＰＴ１及びＰＴ２では、変異は小文字で表される。ＷＴと比較して、（ａ）ＰＴ１は、３´末端から３ヌクレオチドに１つの点変異（Ａの代わりにＣ）を有し、且つ（ｂ）ＰＴ２は、ＰＴ１と同一の変異及びその３’末端から７ヌクレオチドに追加の変異（Ａの代わりにＴ）を有していた。
【００７５】
その５’末端から読み取って、レポーター配列は、ＷＴ配列の３’末端から読み取る最初の２４ヌクレオチドと相補的な配列を備える２４ヌクレオチドを含んでいた。図３ｂに示す通り、レポーター配列はその５’末端がリン酸化され、その３’末端にＣｙ５レポーター部分を担持した。クエンチャー配列は、レポーター配列の３’末端の１７ヌクレオチド配列と相補的な１７ヌクレオチド配列を含んでいた。クエンチャー配列は、その５’末端にＢＨＱ２（「ブラックホールクエンチャー２」）を担持していた。
【００７６】
図３ｂに示す配列を考察すると明らかになるように、レポーター配列（２４ヌクレオチドから成る）は、５’末端（即ちリン酸化末端）に７塩基のオーバーハングを持つクエンチャー配列（１７ヌクレオチドから成る）にハイブリダイズすることができる。加えて、レポーター配列は、ＷＴ配列がその５’末端に１０塩基のオーバーハングを有するように、ＷＴ配列（３４ヌクレオチドから成る）にハイブリダイズすることができる。
【００７７】
上述した様々な配列間の「ハイブリダイゼーション関係」は図４に示されており、以下の説明から理解される通り、レポーター配列及びクエンチャー配列のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖（ここでＣｙ５の蛍光は消光される）におけるレポーター配列の７塩基のオーバーハングは、ＷＴ、ＰＴ１、及びＰＴ２分析物の配列のための「標的」を提供する。さらに詳しくは、ＷＴ、ＰＴ１、及びＰＴ２分析物の配列は、それらの３’末端が（レポーター／クエンチャー二本鎖における）レポーター配列の上記の７塩基のオーバーハングにハイブリダイズするようになっており、それは分析物配列とレポーター配列の完全なハイブリダイゼーション、及びレポーター配列からのクエンチャー配列の置換を容易にし、Ｃｙ５からの検出可能な蛍光発光をもたらす。
【００７８】
この実施例の方法は、レポーター配列及びクエンチャー配列のハイブリダイゼーションによって形成された二本鎖を利用して、λエキソヌクレアーゼの存在下でＷＴ、ＰＴ１、又はＰＴ２を含む試料を「調査」し、且つ図１に関連して充分に詳しく説明した手順に従って増幅シグナルを提供する。
【００７９】
[実験手順]
全てのオリゴヌクレオチドは、１μｌ当たり１０ｐｍｏｌでＴＥ緩衝液（１０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ８、１ｍＭのＥＤＴＡ）中に保存された。
【００８０】
問い合わせ二本鎖を産生するために、（上記ＴＥ緩衝液中の）レポーター及びクエンチャーオリゴヌクレオチドを、レポーター／クエンチャー／ＴＥが４／１０／６μｌの比率で、即ちクエンチャー１０ｐｍｏｌにつきレポーター４ｐｍｏｌの比率で、追加のＴＥ緩衝液と混合した。次いで混合物を９５℃で５分間変性させ、ＲＴで少なくとも１時間ハイブリダイズさせた。次いで、二本鎖混合物を置換溶液実験における問い合わせ二本鎖として使用した。
【００８１】
黒色ポリカーボネートストリップのウェルに２μｌの二本鎖混合物を添加した。特定の（個々の）ウェルに、１００ｆｍｏｌのＷＴ、ＰＴ１、及びＰＴ２分析物オリゴヌクレオチド（ＴＥ緩衝液中に１μｌのそれらの溶液）を添加した。分析物オリゴヌクレオチドは他のウェルには添加しなかった。各ウェルに８０μｌの８０％ＰＢＳ‐ツイーン０．２％、ｐＨ９．４‐ＫＯＨを５Ｕのλエキソヌクレアーゼ及び１０μｌのλエキソヌクレアーゼ緩衝液（６７ｍＭのグリシン‐ＫＯＨ、ｐＨ９．４、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０μｇ／ｍｌのＢＳＡ）と共に添加した。ウェル内の液体容量を水で１００μｌにした。
【００８２】
室温で反応を進行させ、２０分後及び４０分後に測定を行った。
【００８３】
１×λエキソヌクレアーゼ緩衝液の存在下で、１００μｌの８０％ＰＢＳ‐ツイーン０．２％、ｐＨ９．４‐ＫＯＨに対し０、１０、１００、及び１０００ｆｍｏｌのレポーターオリゴヌクレオチドのレポーター滴定曲線に照らして、Ｃｙ５蛍光をプレートリーダーにて測定した。滴定曲線を使用して読み出しＲＦＵ値を置換ｆｍｏｌに変換し、全ての分析物処理から０ｍｏｌ背景を差し引いて置換読み出し値を算出した。
【００８４】
［結果］
この実施例の結果は図５（ａ）及び図５（ｂ）に示す。
【００８５】
図５ａは、２０分（左側の棒）及び４０分（右側の棒）の期間におけるＷＴ、ＰＴ１、及びＰＴ２分析物の各々のレポーターオリゴヌクレオチドの置換（陰性対照を差し引く）を示す。２０分後、ＷＴ分析物は約７４ｆｍｏｌのレポーターオリゴヌクレオチドを置換し、４０分後にこの数字は約１４６ｆｍｏｌに達したことが分かる。対照的に、ＰＴ１の場合の対応する数字はそれぞれ約３５及び約６０であり、且つＰＴ２の場合はそれぞれ約１８及び１５であった。
【００８６】
従って、図５（ａ）は、時間の経過と共に、置換増幅が主にＷＴ分析物に対して達成されたことを示す。
【００８７】
図５（ｂ）は、２０分後及び４０分後の両方におけるＰＴ１及びＰＴ２分析物に対するＷＴ分析物の置換比を示す。２０分後の結果について、左側の棒はＷＴ／ＰＴ１比であり、右側の棒はＷＴ／ＰＴ２比である。４０分後の結果についても同様である。
【００８８】
図５（ｂ）から、２０分後のＷＴ／ＰＴ１の比は約２であり、ＷＴ／ＰＴ２の比は約４であることが分かる。４０分後の場合の対応する数字はそれぞれ約２及び１０であった。従って、一般的に、ＷＴ／ＰＴ１及びＷＴ／ＰＴ２の比は時間と共に増大し、ＰＴ１及びＰＴ２分析物では増幅が（ＷＴ分析物の場合より）遅いことが分かる。これはまた変異の数にも関係する。
【００８９】
［実施例２］
この実施例は、実施例１で使用されたＷＴ及びＰＴ１分析物に適用された場合の本発明の方法の特異性を再び実証する。
【００９０】
［実験手順］
全てのオリゴヌクレオチドは、１μｌ当たり１０ｐｍｏｌでＴＥ緩衝液（１０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ８、１ｍＭのＥＤＴＡ）中に保存された。
【００９１】
問い合わせ二本鎖を産生するために、（上記ＴＥ緩衝液中の）レポーター及びクエンチャーオリゴヌクレオチドを、レポーター／クエンチャー／ＴＥが４／１０／６μｌの比率で、即ちクエンチャー１０ｐｍｏｌにつきレポーター４ｐｍｏｌの比率で、追加のＴＥ緩衝液と混合した。次いで混合物を９５℃で５分間変性させ、ＲＴで少なくとも１時間ハイブリダイズさせた。次いで、二本鎖混合物を置換溶液実験における問い合わせ二本鎖として使用した。
【００９２】
黒色ポリカーボネートストリップのウェルに２μｌの二本鎖混合物を添加した。特定の（個々の）ウェルに、１０、１０、５０、１００、及び２００ｆｍｏｌのＷＴ及びＰＴ１分析物オリゴヌクレオチドを添加した（ＴＥ緩衝液中にそれらの溶液を添加した）。分析物オリゴヌクレオチドは他のウェルには添加しなかった。各ウェルに８０μｌの８０％ＰＢＳ‐ツイーン０．２％、ｐＨ９．４‐ＫＯＨを５Ｕのλエキソヌクレアーゼ及び１０μｌのλエキソヌクレアーゼ緩衝液（６７ｍＭのグリシン‐ＫＯＨ、ｐＨ９．４、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０μｇ／ｍｌのＢＳＡ）と共に添加した。ウェル内の液体容量を水で１００μｌにした。
【００９３】
室温で反応を進行させ、２０分後及び４０分後に測定を行った。
【００９４】
示した濃度の分析物オリゴヌクレオチドＷＴ及びＰＴ１を使用し、λエキソヌクレアーゼを省いて、手順を繰り返した。
【００９５】
１×λエキソヌクレアーゼ緩衝液の存在下で、１００μｌの８０％ＰＢＳ‐ツイーン０．２％、ｐＨ９．４‐ＫＯＨに対し０、１０、１００、及び１０００ｆｍｏｌのレポーターオリゴヌクレオチドのレポーター滴定曲線に照らして、プレートリーダーにてＣｙ５蛍光を測定した。滴定曲線を使用して読み出しＲＦＵ値を置換ｆｍｏｌに変換し、全ての分析物処理から０ｍｏｌ背景を差し引いて置換読み出し値を算出した。
【００９６】
［結果］
この実施例の結果は図６に示す。
【００９７】
図６は、使用した各濃度のＷＴ及びＰＴ１分析物によって置換されたレポーター配列の量を示す（単位はｆｍｏｌ）。いずれの濃度の場合も、ＷＴ分析物の結果は左側の棒である。最初に、λエキソヌクレアーゼを含まずに得られた結果を考慮すると、検出可能な蛍光はＷＴ及びＰＴ１分析物配列のどちらでも得られたが、どの濃度の分析物配列でも、最も強いシグナルは常にＷＴ配列で得られたことが注目される。同様の特異性はλエキソヌクレアーゼを取り込んだ試料でも維持された。
【００９８】
１０ｆｍｏｌの濃度のＰＴ１分析物を除いて（後述）、λエキソヌクレアーゼが存在する場合及び存在しない場合の両方で、どの特定の濃度の分析物配列でも、結果の比較は、蛍光シグナルの増幅が達成されたことを示す。例えば１００ｆｍｏｌの場合の結果を検討しよう。λエキソヌクレアーゼが存在しない場合、ＷＴ及びＰＴ１配列はそれぞれ約９３．９４ｆｍｏｌ及び３６．０８ｆｍｏｌのレポーター鎖を置換する一方、λエキソヌクレアーゼの存在下では、対応する数字はそれぞれ約２９６．８２及び８０．４９であった。従って、ＷＴ分析物は、平均すると各ＷＴ鎖が３つのレポーター鎖を置換する程度の増幅を達成した。より一般的には、結果は、全ての濃度のＷＴ鎖に対し様々な程度の増幅を示している。ＰＴ１鎖の場合も増幅があった。しかし、試験した各濃度で、ＰＴ１鎖の場合の増幅の程度はＷＴ鎖より小さかった。
【００９９】
ＰＴ１と完全に相補的なレポーター鎖を使用する同様の実験は、どの特定の濃度でも、ＷＴ鎖よりＰＴ１鎖の場合の方が増幅が大きくなることを示す１組の結果をもたらすことは理解されるであろう。
【０１００】
従って、本発明の方法は、野生型配列とそれに対する点変異を持つ配列とを容易に区別できることが分かるであろう。
【０１０１】
５Ｕのλエキソヌクレアーゼの存在下で、１０ｆｍｏｌ濃度のＰＴ１分析物の場合に置換されたレポーター配列の量（ｆｍｏｌ単位で測定される）が陰性であったことは注目される。これは、問い合わせ二本鎖構造における問い合わせオーバーハングが７塩基の長さであったことに起因する。従って、ＰＴ１分析物によって達成される置換と比較して、問い合わせ二本鎖構造の背景消化は相対的に高かった。ＰＴ１の実験の場合に得られた結果から背景置換を差し引くと、結果は陰性になった（おそらく、ＰＴ１の実験における背景が対照実験の場合より大きいため）。＃
【０１０２】
［実施例３］
この実施例は、本発明の方法の感度を向上するために４０℃で実行される等温反応における、１６塩基のオーバーハングを持つ問い合わせ二本鎖核酸構造の使用を実証する。
この実施例は、図７（ａ）に示すナイセリア・ゴノレアＣＤＳ８の配列に基づく分析物（ＷＴ）、レポーター、及びクエンチャーの配列を利用する。
【０１０３】
分析物、レポーター、及びクエンチャーの配列を図７（ｂ）に示す。分析物配列は、図８（ａ）の配列で強調されている４５ヌクレオチドを含んでいた。レポーター配列（その５´末端がリン酸化され、且つその３´末端にＣｙ５部分を備えていた）は、その５’末端から読み取って、分析物の３’末端から読み取る３５ヌクレオチド配列と相補的な３５ヌクレオチド配列を含んでいた。クエンチャー配列は（その５’末端から読み取って）、レポーター配列の３´末端の１９ヌクレオチドと相補的な１９ヌクレオチド配列を含んでいた。クエンチャー配列は、その５’末端にＢＨＱ２クエンチャー部分を備えていた。クエンチャー及びレポーター配列のハイブリダイゼーションによって調製された問い合わせ二本鎖構造は、レポーターの５’末端に１６塩基のオーバーハングを有していた。
【０１０４】
［実験手順］
オリゴヌクレオチドは、１μｌ当たり１０ｐｍｏｌでＴＥ緩衝液（１０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ８、１ｍＭのＥＤＴＡ）に保存された。
【０１０５】
問い合わせ二本鎖を産生するために、レポーター及びクエンチャーオリゴヌクレオチドをレポーター／クエンチャー＝１／３の比率で、即ち１０μｌのレポーター及び３０μｌのクエンチャーを混合し、合計でそれぞれ１００ｐｍｏｌ及び３００ｐｍｏｌのレポーター及びクエンチャーを含むようにした。混合物を短時間ボルテックスし、暗所で９５℃で３分間煮沸した。４６０μｌの１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．２％ツイーンを４０μｌのオリゴヌクレオチド混合物に添加し、それを短時間ボルテックスし、暗所でＲＴで１時間インキュベートした。５０μｌの混合物（二本鎖構造のレポーターオリゴヌクレオチドを１０ｐｍｏｌ含む）を装置又はプレートのウェル毎に添加し、別の１０μｌの１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．２％ツイーンをウェル毎に、０、１０ａｍｏｌ、１００ａｍｏｌ、又は１ｆｍｏｌの分析物配列、１×λエキソヌクレアーゼ緩衝液、及び１０Ｕのλエキソヌクレアーゼと共に添加し（１００μｌの反応容量中に６０％のＰＢＳ希釈液ができる）、４０℃で０．２％ツイーンの水溶液により全量を１００μｌにした。
【０１０６】
プレートリーダーにて、１×λエキソヌクレアーゼ緩衝液を含む１００μｌの６０％ＰＢＳ‐ツイーン０．２％、ｐＨ７．４‐ＫＯＨに対し０、１０、１００、及び１０００ｆｍｏｌのレポーター滴定曲線に照らして、Ｃｙ５蛍光を測定した。読み出しＲＦＵ値は滴定曲線を用いることによって置換ｆｍｏｌに変換し、全ての分析物処理から０ｍｏｌ背景を差し引いて置換読み出し値を算出した。
【０１０７】
［結果］
結果は図７（ｃ）に示す。
【０１０８】
図７（ｃ）に示す通り、１０ａｍｏｌの分析物配列は４．３５ｆｍｏｌを置換し、１００ａｍｏｌは７．７８ｆｍｏｌを置換し、１ｆｍｏｌは２８．６１ｆｍｏｌを置換し、それぞれ４３５、７７．８、及び２８．６１の増幅率（置換されたレポーター分子／分析物分子）を達成した（図３（ｃ））。分析物の濃度が高くなるにつれて増幅比が低下することは、一般的なできごとである。これはおそらく、分析物／レポーター置換二本鎖の濃度が高いと酵素が飽和するためである。しかし、この実施例は、（この場合）問い合わせ二本鎖構造に１６塩基のオーバーハングを用いて、本発明の方法によって達成することのできる感度を実証しており、１０ａｍｏｌ（即ち１０−１８ｍｏｌ）の分析物配列を含む試料から検出可能なシグナルが得られたことが注目される。
【０１０９】
［実施例４］
この実施例は、異なる組成の緩衝液を使用して本発明の方法に対する効果を実証する。
【０１１０】
この実施例では、異なる組のオリゴヌクレオチド（「オリゴ」）を利用した。これらのオリゴの配列を下の表２に示す。
【０１１１】
【表３】
2017526389.tif 000005
【０１１２】
表２に示す通り、オリゴは野生型のレポーター及びクエンチャー（ＲＧ及びＱＧ）、単一変異が組み込まれた同じオリゴ（ＲＧＭ及びＱＧＭ）、並びにＲＧ（ＡＧ）と１００％相補的な分析物オリゴを含んでいた。野生型形態の特定の配列（この場合ＡＧ配列）の存在を検出し、且つ単一点変異を含む同じ配列から区別するために、ＲＧ／ＱＧ及びＲＧＭ／ＱＧＭを使用して二本鎖を形成した。両方の二本鎖は、レポーター及びクエンチャーオリゴがハイブリダイズされた後、１６塩基のオーバーハング（レポーターの５´から３´まで）を形成し、二本鎖の二本鎖部分について両方のオリゴは１００％の相補性を持っていた。二本鎖の二本鎖部分に変異が組み込まれるので、１００％の相補性を維持するために、ＲＧＭ及びＱＧＭオリゴの両方に相同変異が組み込まれる。両方の二本鎖の配列アラインメントを下の表３に示す。
【０１１３】
【表４】
2017526389.tif 000006
【０１１４】
ＰＢＳ‐０．２％ツイーンは１３７ｍＭのＮａＣｌを含み、２５、５０、及び１００ｍＭの塩化ナトリウムはλエキソヌクレアーゼ活性をそれぞれ５２、８２、及び９９％阻害することが文献から知られている（Ｌｉｔｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ，１９６７）。この実施例の目的は、（ａ）様々な濃度の塩化ナトリウムを含む緩衝液中で反応を試験すること、及び（ｂ）塩化ナトリウム自体は配合されていないが、様々な濃度のナトリウムイオン及び塩素イオンを含む緩衝液で試験することであった。
【０１１５】
下の表４に記載する通り、様々な濃度のＮａＣｌ（１００、７５、５０、２５、及び０％の原ＰＢＳ  ＮａＣｌ濃度；全ての緩衝液が０．２％ツイーンを含有していた）を含む溶液を調製した。ＫＨ２ＰＯ４は、存在しなくても反応に影響しないので、添加しなかった（データは示さない）。
【０１１６】
【表５】
2017526389.tif 000007
【０１１７】
反応のため、ＲＧ／ＱＧ二本鎖に対してＡＧ分析物を使用した。二本鎖は、１０ｐｍｏｌのＲＧ及び１２ｐｍｏｌのＱＧオリゴ（それぞれ１μｌ及び１．２μｌのＴＥ中）を１本の試験管で一緒に混合し、９５℃で３分間インキュベートし、次いで別の緩衝液を用いて５０μｌの容量にすることによって調製した。次いで溶液を暗所で３０分間室温でハイブリダイズさせた。
【０１１８】
ハイブリダイゼーション後に、二本鎖溶液をピペットでマイクロプレートのウェルに移した。０又は１００ｆｍｏｌの分析物オリゴＡＧを含む１０μｌの等価緩衝液を二本鎖溶液に添加し、プレートリーダーにて初期置換（事前）を測定した。１μｌ（５Ｕ）のλエキソヌクレアーゼ、１０μｌの１０×λエキソヌクレアーゼ緩衝液（１×最終濃度：６７ｍＭグリシン‐ＫＯＨ、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、及び５０μｇ／ｍｌのＢＳＡ、ｐＨ９．４）、及び３９μｌの等価緩衝液を加えることによって容量を１００μｌにした。次いで、蛍光をすぐに（０分）、及びその後３０分まで１０分毎に読み出した。アッセイ中に試料を暗所で３７℃でインキュベートした。
【０１１９】
各条件は繰り返され、各時点で各緩衝液条件に対し、０ｍｏｌのＡＧの場合の各繰り返しの平均を１００ｆｍｏｌのＡＧの場合の各繰り返しの平均から差し引いて、分析物の存在によるシグナルの正味利得を算出した。結果は下の表５に示す。
【０１２０】
【表６】
2017526389.tif 000008
【０１２１】
表５の結果から分かるように、ＮａＣｌが０％の反応緩衝液は、１０分以降ではシグナルの最大正味利得をもたらした。以下の記述では０％緩衝液をリン酸緩衝液（ＰＢ）という。
【０１２２】
上述した手順を様々な濃度のＰＢで、即ち１×（１倍）、２×（２倍）、３×（３倍）、及び４×（４倍）の濃度で繰り返した。Ｎａ２ＨｐＯ４及びＫＣｌの濃度を下の表６に示す。
【０１２３】
【表７】
2017526389.tif 000009
【０１２４】
緩衝液は全て０．２％のツイーンを含んでいた。
【０１２５】
これらの繰り返しの目的は、反応に対して起こりうるＰＢ塩の有益な効果について試験することであった。結果は下の表７に示す。これは、各緩衝液条件／時点について、１００ｆｍｏｌのＡＧから０ｆｍｏｌのＡＧの平均を差し引いた後のＲＦＵ単位の正味蛍光を示す。
【０１２６】
【表８】
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【０１２７】
表７から、２×ＰＢの反応緩衝液が２０分以降に最大正味利得をもたらしたことが分かる。従って２×ＰＢは最良の正味蛍光効果を生み出すので、それ（２×ＰＢ）を、以下の実施例５のための反応緩衝液として選択した。
【０１２８】
［実施例５］
この実施例は、本発明の方法のＰＣＲアンプリコンへの適用を実証する。実施例は、上の表２に列挙したのと同じオリゴを、下の表８に示すプライマーと共に使用した。
【０１２９】
【表９】
2017526389.tif 000011
【０１３０】
要約すると、アンプリコンはＰＣＲ反応で生成された。ＰＣＲ反応では、プライマーの１つが５’末端（プライマーＰＯ４‐ＦＷ）でリン酸化され、従って５’末端でリン酸化された鎖の１つを持つアンプリコンが生成される。この鎖は酵素（λエキソヌクレアーゼ）によって認識され、リン酸化鎖は消化され、非リン酸化鎖（分析物鎖）を解放した。分析物鎖の３’末端はレポーターの５’末端にハイブリダイズし、置換を誘発した。置換された二本鎖上のレポーターは酵素によって消化され、下流での置換のために分析物を放出した。レポーターに対する分析物のハイブリダイゼーションが１００％特異的でない場合、反応は遅延又は遮断され、従って点変異分析に適切な配列の二本鎖を利用することができる。
【０１３１】
１０ｍｌの尿に由来する１２のナイセリア・ゴノレア陽性の尿ペレット臨床試料から抽出した５μｌのＤＮＡを、ＰＣＲ反応（５０μｌ）におけるテンプレートとして使用した。反応容量５０μｌ当たりのＰＣＲ成分濃度を表９に示し、ＰＣＲサイクリングプロトコールを表１０に示す。
【０１３２】
【表１０】
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【０１３３】
【表１１】
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【０１３４】
ＰＣＲ反応の終了後に、１０μｌの各アンプリコンを二本鎖ＲＧ／ＱＧ及びＲＧＭ／ＱＧＭに対する分析物として使用した。二本鎖及び実験のセットアップは、１０μｌの反応緩衝液プラス０ｆｍｏｌ及び１００ｆｍｏｌのオリゴＡＧの代わりに１０μｌのアンプリコンを使用したことを除いては、上述の通り（２×ＰＢ‐０．２％ツイーン）であった。
【０１３５】
全ての条件を繰り返し、ＲＧＭ／ＱＧＭ（変異二本鎖）シグナルをＲＧ／ＱＧ（野生型）シグナルから差し引いて、正味蛍光を算出した。結果は下の表１１に示す。それは、ナイセリア・ゴノレア陽性の試料／時点に対して、ＲＧＭ／ＱＧＭの平均をＲＧ／ＱＧシグナルから差し引いた後のＲＦＵ単位の正味蛍光を示す。
【０１３６】
【表１２】
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【０１３７】
全ての場合に、正味蛍光は時間の経過と共に増大し、分析対象の分析物配列が二本鎖ＲＧＭ／ＱＧＭに導入された変異を含まないことを示した。同じ効果は、オリゴＡＧ（野生型オリゴ）対ＲＧ／ＱＧ及びＲＧＭ／ＱＧＭ二本鎖の使用によっても観察された（データは示さない）。ＲＧＭ／ＱＧＭ二本鎖はＲＧ／ＱＧ二本鎖よりわずかに高い背景蛍光を示したので、正味利得は事前及び０分条件のいくつかに対して負であった。しかし、λエキソヌクレアーゼが反応に導入された直後に（１０分）、正味利得は正になり、その後は時間と共に増加し続けた。
【０１３８】
［参考文献］
Ｌｉｔｔｌｅ，  Ｊ．Ｗ．  Ｌｅｈｍａｎ，  Ｉ．Ｒ．  Ｋａｉｓｅｒ，  Ａ．Ｄ．  （１９６７）Ａｎ  ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  λＩ．  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  ｅｎｚｙｍｅ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  ２４２（４）：６７２−６７８
Ｐ  Ｇ  Ｍｉｔｓｉｓ  ａｎｄ  Ｊ  Ｇ  Ｋｗａｇｈ  （１９９９）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｍｂｄａ  ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｅｎｄｓ  ｏｆ  ＤＮＡ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２７（１５）：３０５７−３０６３．
Ｃ．Ｓ．  Ｋａｒａｐｅｔｉｓ  （２００８）Ｋ−ｒａｓ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｂｅｎｅｆｉｔ  ｆｒｏｍ  Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ  ｉｎ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ．    Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  ３５９  （１７）：１７５７−１７６５．
Ｒｏｇｅｒｓ，  Ｇ．Ｓ．  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓ，  Ｂ．  （１９８０）．  Ｌ．  Ｇｒｏｓｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｋ．  Ｍｏｌｄａｖｅ（Ｅｄ．），  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．．  ６５，  ２０１−２１１．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ．
【０１３９】
［補足］
［図の説明］
図２  固相アッセイでは、連結されたオリゴの目的は、後で分析物の標的になるレポーターオリゴを保持することである。増幅反応及び増幅は、溶液アッセイ場合（溶液中の置換された二本鎖におけるレポーターの酵素消化）と同様に続く。追加的な利点として、固相アッセイではクエンチャーの必要がないので、レポーター分子（Ｃｙ５）を酵素（即ちＨＲＰ又はアルカリホスファターゼ）に代替することができる。増幅反応の終了後に、フルオロフォアのための、又はＨＲＰ又はアルカリホスファターゼが可視シグナルを生成するための基質のある、「読み取り領域」に液体を移送することができる。
【０１４０】
図３（ａ．）  システムはナイセリア・ゴノレアＣＤＳ８内の特定の領域にマッピングする。下線された太字（ＡＡＴＴＧＧＴ）は、レポーターオーバーハングの配列である。太字（ＣＧＣＡＴＡＡＣＡＡＴＡＧＡＡＡＴ）は、二本鎖におけるクエンチャーオリゴとハイブリダイズされるレポーター配列の残部である。イタリック体の太字（ＡＴＡＴＧＣＣＡＡＧ）は、置換された二本鎖上に分析物によって産生される５’末端オーバーハングと相同の配列を表す。
【０１４１】
図３（ｂ．）  ナイセリア・ゴノレアＣＤＳ８内にマッピングするためのコーディングを持つオリゴ配列。ＰＴ１及びＰＴ２の点変異は、小字体（ｓｍａｌｌ  ｃａｐｔｉｏｎ）で表される。
【０１４２】
図４  オリゴ系略図。標的二本鎖は、分析物ＷＴ、ＰＴ１、及びＰＴ２の標的である５’の７ｂｐのオーバーハングを形成する。ヌクレオチド（ｎｔ）の数は原寸通り。
【０１４３】
図６  ５Ｕのλエキソヌクレアーゼは置換増幅を誘発するが、１点変異の特異性は維持される。
【０１４４】
図７（ａ．）  システムはナイセリア・ゴノレアＣＤＳ８内の特定領域にマッピングする。太字下線部（ＴＡＡＡＧＡＴＴＡＴＧＡＴＡＣ）はレポーターオーバーハングの配列である。太字（ＧＡＡＡＡＡＴＧＧＧＧＧＣＴＧＴＧＧＣ）は二本鎖におけるクエンチャーオリゴとハイブリダイズされるレポーター配列の残部である。イタリック体の太字（ＴＧＴＡＧＡＡＡＴＣ）は、置換された二本鎖上に分析物によって産生される５’末端オーバーハングと相同の配列を表す。
【０１４５】
図７（ｂ．）  ナイセリア・ゴノレアＣＤＳ８内にマッピングするためのコーディングを持つオリゴ配列。
【０１４６】
７（ｃ．）  より低いａｍｏｌ領域における置換増幅。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2017526389.tif 000023
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