(57)【要約】本開示は、（ａ）１×１０６Ｄａを超える分子量；（ｂ）１モル当たり約１０％未満のメチル化度；および（ｃ）１モル当たり約２％から約１５％の範囲の介在性ラムノース含量:のうち少なくとも一つを有する、合成免疫原性Ｖｉ抗原として有用な、Ｏ−アセチル化高分子ポリガラクツロン酸またはその医薬上許容される塩を提供する。本開示はさらに、Ｏ−アセチル化高分子ポリガラクツロン酸またはその医薬上許容される塩、これらを含む医薬組成物および／またはワクチン組成物を製造する方法、および前述のいずれかを使用して免疫化する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）１×１０６Ｄａを超える分子量、
（ｂ）１モル当たり約１０％未満のメチル化度、および
（ｃ）１モル当たり約２％から約１５％の範囲の介在性ラムノース含量
のうち少なくとも一つを有する、Ｏ−アセチル化高分子ポリガラクツロン酸（ＯＡｃ−ＨＰＧＡ）またはその医薬上許容される塩。
【請求項２】
１×１０６Ｄａを超える分子量を有する、請求項１に記載のＯＡｃ−ＨＰＧＡまたはその医薬上許容される塩。
【請求項３】
Ｏ−アセチル化度が、１００％を超えるか、Ｃ２またはＣ３の位置のいずれかにおいて５０％を超える、請求項１または２のいずれか一項に記載のＯＡｃ−ＨＰＧＡまたはその医薬上許容される塩。
【請求項４】
ＯＡｃ−ＨＰＧＡが合成免疫原性Ｖｉ抗原である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＯＡｃ−ＨＰＧＡまたはその医薬上許容される塩。
【請求項５】
実質的にＶｉ多糖類ワクチンと同じ抗原性を有し、免疫原性である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＯＡｃ−ＨＰＧＡまたはその医薬上許容される塩。
【請求項６】
２回目の免疫化において、抗体力価の２倍以上の上昇を誘導する、請求項１−５のいずれか一項に記載のＯＡｃ−ＨＰＧＡまたはその医薬上許容される塩。
【請求項７】
蛋白質担体に結合することなく、２歳未満の人々において、合成免疫原性Ｖｉ抗原として有効である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＯＡｃ−ＨＰＧＡまたはその医薬上許容される塩。
【請求項８】
腸チフスに対するワクチンとして有効である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＯＡｃ−ＨＰＧＡまたはその医薬上許容される塩。
【請求項９】
１×１０６Ｄａを超える分子量を有し、１モル当たり約１０％未満のメチル化度であり、およびＯ−アセチル化度が１００％を超えるか、Ｃ２またはＣ３の位置のいずれかにおいて５０％を超える、請求項１〜８のいずれか一項に記載のＯＡｃ−ＨＰＧＡまたはその医薬上許容される塩。
【請求項１０】
高分子ポリガラクツロン酸（ＨＰＧＡ）またはその塩と、酢酸および無水酢酸の混合物とを反応させることを含む方法により形成され、ＨＰＧＡが次のうち少なくとも１つを有する、Ｏ−アセチル化高分子ポリガラクツロン酸（ＯＡｃ−ＨＰＧＡ）またはその医薬上許容される塩：
（ａ）１×１０６Ｄａを超える分子量、
（ｂ）１モル当たり約１０％未満のメチル化度、および
（ｃ）１モル当たり約２％から約１５％の範囲の介在性ラムノース含量。
【請求項１１】
前記方法がさらに、酢酸および無水酢酸の混合物との反応の前に、ＨＰＧＡまたはその塩の酸性ゲルを形成することを含む、請求項１０に記載のＯＡｃ−ＨＰＧＡまたはその医薬上許容される塩。
【請求項１２】
前記方法がさらに、ＨＰＧＡまたはその塩と過塩素酸とを反応させることを含む、請求項１０または１１のいずれか一項に記載のＯＡｃ−ＨＰＧＡまたはその医薬上許容される塩。
【請求項１３】
ＨＰＧＡがアロエベラに由来する、請求項１０−１２のいずれか一項に記載のＯＡｃ−ＨＰＧＡまたはその医薬上許容される塩。
【請求項１４】
ＯＡｃ−ＨＰＧＡのＯ−アセチル化度が、１００％を超えるか、Ｃ２またはＣ３の位置のいずれかにおいて５０％を超える、請求項１０−１３のいずれか一項に記載のＯＡｃ−ＨＰＧＡまたはその医薬上許容される塩。
【請求項１５】
合成免疫原性Ｖｉ抗原である、請求項１０−１４のいずれか一項に記載のＯＡｃ−ＨＰＧＡまたはその医薬上許容される塩。
【請求項１６】
ＯＡｃ−ＨＰＧＡが実質的にＶｉ多糖類ワクチンと同じ抗原性を有し、免疫原性である、請求項１０−１５のいずれか一項に記載のＯＡｃ−ＨＰＧＡまたはその医薬上許容される塩。
【請求項１７】
蛋白質担体に結合することなく、２歳未満の人々において、合成免疫原性Ｖｉ抗原として有効である、請求項１０−１６のいずれか一項に記載のＯＡｃ−ＨＰＧＡまたはその医薬上許容される塩。
【請求項１８】
腸チフスに対するワクチンとして有効である、請求項１０−１７のいずれか一項に記載のＯＡｃ−ＨＰＧＡまたはその医薬上許容される塩。
【請求項１９】
ＯＡｃ−ＨＰＧＡが、２回目の免疫化において、抗体力価の２倍以上の上昇を誘導する、請求項１０−１８のいずれか一項に記載のＯＡｃ−ＨＰＧＡまたはその医薬上許容される塩。
【請求項２０】
高分子ポリガラクツロン酸（ＨＰＧＡ）またはその塩と、酢酸および無水酢酸の混合物とを反応させることを含み、ＨＰＧＡが次のうち少なくとも１つを有する、Ｏ−アセチル化高分子ポリガラクツロン酸（ＯＡｃ−ＨＰＧＡ）またはその医薬上許容される塩を製造する方法：
（ａ）１×１０６Ｄａを超える分子量、
（ｂ）１モル当たり約１０％未満のメチル化度、および
（ｃ）１モル当たり約２％から約１５％の範囲の介在性ラムノース含量。
【請求項２１】
酢酸および無水酢酸の混合物と反応させる前に、ＨＰＧＡまたはその塩の酸性ゲルを形成することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＨＰＧＡまたはその塩を過塩素酸と反応させることをさらに含む、請求項２０または２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
ＨＰＧＡがアロエベラに由来する、請求項２０−２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
請求項２０−２３のいずれか一項に記載の方法により形成される、Ｏ−アセチル化高分子ポリガラクツロン酸（ＯＡｃ−ＨＰＧＡ）またはその医薬上許容される塩。
【請求項２５】
ＯＡｃ−ＨＰＧＡのＯ−アセチル化度が、１００％を超えるか、Ｃ２またはＣ３の位置のいずれかにおいて５０％を超える、請求項２４に記載のＯＡｃ−ＨＰＧＡまたはその医薬上許容される塩。
【請求項２６】
実質的にＶｉ多糖類ワクチンと同じ抗原性を有する合成免疫原性Ｖｉ抗原であり、免疫原性である、請求項２４または２５のいずれか一項に記載のＯＡｃ−ＨＰＧＡまたはその医薬上許容される塩。
【請求項２７】
蛋白質担体に結合することなく、２歳未満の人々において、合成免疫原性Ｖｉ抗原として有効である、請求項２４−２６のいずれか一項に記載のＯＡｃ−ＨＰＧＡまたはその医薬上許容される塩。
【請求項２８】
腸チフスに対するワクチンとして有効である、請求項２４−２７のいずれか一項に記載のＯＡｃ−ＨＰＧＡまたはその医薬上許容される塩。
【請求項２９】
ＯＡｃ−ＨＰＧＡが、２回目の免疫化において、抗体力価の２倍以上の上昇を誘導する、請求項２４−２８のいずれか一項に記載のＯＡｃ−ＨＰＧＡまたはその医薬上許容される塩。
【請求項３０】
請求項１−１９または２４−２９のいずれか一項に記載のＯＡｃ−ＨＰＧＡまたはその医薬上許容される塩、および、少なくとも１つの医薬上許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項３１】
さらに蛋白質担体を含む、請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
蛋白質担体がＯＡｃ−ＨＰＧＡに結合している、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
腸チフスに対して対象を免疫化する方法であって、それを必要とする対象に、請求項１−１９または２４−２９のいずれか一項に記載のＯＡｃ−ＨＰＧＡまたはその医薬上許容される塩、または請求項３０−３２のいずれか一項に記載の医薬組成物を有効量投与することを含む、方法。
【請求項３４】
医薬組成物の投与が抗体応答を誘導する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
医薬組成物の投与が、２回目の免疫化において、抗体力価の２倍以上の上昇を誘導する、請求項３３または３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
請求項１−１９若しくは２４−２９のいずれか一項に記載のＯ−アセチル化高分子ポリガラクツロン酸（ＯＡｃ−ＨＰＧＡ）若しくはその医薬上許容される塩、または請求項３０−３２のいずれか一項に記載の医薬組成物の、合成免疫原性Ｖｉ抗原としての使用であって、前記Ｖｉ抗原が実質的にＶｉ多糖類ワクチンと同じ抗原性を有し、免疫原性である、使用。
【請求項３７】
腸チフスに対するワクチンに用いられる医薬の製造のための、請求項１−９若しくは２４−２９のいずれか一項に記載のＯ−アセチル化高分子ポリガラクツロン酸（ＯＡｃ−ＨＰＧＡ）若しくはその医薬上許容される塩、または請求項３０−３２のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１４年５月８日に出願された、米国仮特許出願第６１／９９０，４９３号の利益を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本開示は、広く医薬の分野に関するものであり、具体的には微生物学、免疫学、およびワクチンに関するものであり、より具体的には、腸チフスワクチンに関するものである。
【背景技術】
【０００３】
背景
腸チフス熱は、急性の、重篤な熱性疾病である。腸チフス熱は、サルモネラ・チフィ（S. typhi）により、引き起こされる。毎年、１６００万から３３００万の新しい腸チフスの症例と、５０万から６０万の死亡が生じていると推定される。汚染された食品と水が、主な感染源である。感染リスクは、衛生状態が不良な、発展途上国、例えば、アジア、アフリカ、中南米で最も高い。
【０００４】
当該細菌は、経口摂取後の小腸の粘膜バリアに侵入する。細菌はその後、血液循環を経て肝臓および脾臓に到達し、当該疾病を引き起こす。いくつかの異なる抗生物質療法が、腸チフスを治療するために用いられてきた。しかし、S. typhiの多剤耐性株が出現し、これらの高価な治療を無効にしてきた。従って、低価格で効果的なワクチンの広範な使用は、依然として、腸チフスの影響を低減するのに最も有効な方法である。
【０００５】
現在、腸チフスを制御するのに有効なワクチンには２タイプあり、単回投与で非経口的に投与されるＶｉ多糖類ワクチンと、経口の弱毒性Ｔｙ２１ａ生ワクチンである。Ｖｉ多糖類ワクチンは、２歳以上の人においての使用が認可されており、３年間持続する約７０％の防御を提供する。経口液体生ワクチンは、２歳を超える人においての使用が認可されており、３回または４回投与後に、約５３−７８％の防御を与える。カプセル形態の別の経口生ワクチンは、５歳を超える人に承認されており、４回投与後に、同様のレベルの防御を提供する。
【０００６】
薬剤耐性株の増加と広がりに伴う、多くの地域での腸チフスの継続的に高い発生率により、２０００年に、ＷＨＯは、腸チフスが実質的な公衆衛生上の問題である地域において、これらのワクチンを学童期の子供に免疫化することを推奨するようになった。米国において、当該ワクチンは高価であり、主に旅行客と軍人に与えられている。
【０００７】
Ｖｉ多糖類ワクチンは、Ｖｉ莢膜多糖類に基づいている（図１）。それは、（α―１，４）、２−デオキシ―２−Ｎ−アセチルガラクツロン酸であり、Ｃ３で可変的にＯ−アセチル化され（６０−９０％；Szu and Bystricky, Enzymol. 363:552-567 (2003)）、細菌を補体媒介性溶解およびファゴサイトーシスから保護する莢膜を形成する。Ｖｉワクチンは、長年の研究の後に開発され、最終的にはＶｉ多糖類が防御抗原であり、改良された精製方法により、変性することなく製造可能であることが、示された。現在、２つのＶｉ多糖類ワクチンが米国とヨーロッパで利用可能であり、Sanofi-Pasteurにより製造されたワクチン(Typhim Vi（登録商標）)と、GSKにより製造されたワクチン(Typherix（登録商標）)である。各ワクチン投与量は、２５μｇのＶｉ多糖類と、保存料としてのフェノールで処方され、筋肉内注射または皮下注射で投与される。米国では、２年ごとに再接種が推奨されている。Ｖｉ多糖類ワクチンはまた、インドおよび中国を含む他の国でも製造されている。
【０００８】
当該ワクチンは、野生型S. typhi株Ty2の大量発酵と、培養上清からの多糖類の沈殿、その後のさらなる下流の精製ステップにより、製造される(Product inserts, Typhim Vi（登録商標）およびTypherix（登録商標）)。製造技術は、１９７０年代および１９８０年代に開発された。S. typhiはグラム陰性細菌であるため、グラム陰性細菌の菌体内部毒素またはリポ多糖類、細胞壁成分のコンタミネーションが、常に潜在的な安全リスクである。
【０００９】
Ｖｉワクチンは、たいていの多糖類ベースのワクチンと同様に、Ｔ細胞非依存性抗原であり、再接種において、追加免疫を誘発したり、あるいは記憶応答を誘発したりしない(WHO/IVB/12.02)。Ｖｉワクチンは、２歳未満の乳児または幼児においても有効でない。従って、Ｖｉ多糖類−蛋白質結合ワクチンが、Ｖｉ多糖類の蛋白質担体への共有結合により、開発されている。当該結合ワクチンは、Ｔ細胞依存性抗原であり、再接種において、追加免疫効果を有する。
【００１０】
Ｏ−アセチル化および分子量は、Ｖｉ多糖類の免疫原性の重要な決定要因である。研究により、Ｃ３のＯ−アセチル基の除去が、免疫原性を低下させることが分かってきている。Jarvis et al., J. Bacteriol. 94:1406-1410 (1967)；Szewczyk and Taylor, Infect. Immun. 29:539-544 (1980)；Szu et al., Infect. Immun. 59:4555-4561 (1991)；Rijpkema et al., Biologicals. 32:11-6 (2004)。立体構造モデルにより、Ｃ３の、かさ高い、無極性のＯ−アセチル基が、両側に列をなして突き出ることにより、多糖類分子の表面のほとんどを成し、一方、カルボキシル基および（Ｃ２の）Ｎ−アセチル基が、ほとんど包埋されるか、軸の近くに位置していることが分かった。Szu et al., Infect. Immun. 59:4555-4561 (1991)。このことは、Ｏ−アセチル基が、優位な免疫原性決定要因であることと、一致している。Ｏ−アセチル化の量は、Ｏ−アセチル化度（ＤＯＡｃ、Ｏ−アセチル基／Ｇａｌ ＵＡ［ｍｏｌｅ／ｍｏｌｅ］の割合）または、多糖類１ｍｇ当たりのアセチル基含量（μｍｏｌｅ）として、表される。Ｃ２のＮ−アセチル基もまた、免疫原性において重要な役割を果たす。
【００１１】
研究によりまた、Ｖｉ多糖類の免疫原性は、その分子量が減少した時に、低下することが分かってきている。Martin et al., J. Bacteriol. 94:1411-1416 (1967)；Szu et al., Infect. Immun. 59:4555-4561 (1991)。このことは、多糖類抗原モデルのデキストランＢ５１２（ｄｘ）によってなされた発見と一致しており、本発見は、当該多糖類抗原の免疫原性が分子量の減少と共に低下することを示している。Gonzalez-Fernandez et al., Vaccine. 26:292-300 (2008)。
【００１２】
Ｏ−アセチル基含量および分子量は、現在のＶｉワクチン(Product insert, Typhim Vi（登録商標）)の効力の指標である。強力なＶｉ多糖類ワクチンの製造は、Ｖｉ多糖類構造の保存に左右される。強力なＶｉ多糖類を製造する初期の多くの試みが、精製工程において多糖類が分解されたために、失敗に終わった。
【００１３】
植物ペクチンは、Ｖｉ多糖類と同じ骨格を持つ。それらは、可変的にメチル化された、α−１,４結合ポリガラクツロン酸（ＰＧＡ）である。リンゴおよび柑橘類の果実由来の植物ペクチンは、食品工業において、最も広く用いられている。ペクチンのメチル化は、メタノールによりガラクツロン酸残基のカルボキシル基のエステル化を通じて、自然に生じる。５０％未満のメチル化度（ＤＭ）のペクチンは、低メトキシル（ＬＭ）ペクチンと規定され、一方、５０％を超えるＤＭのペクチンは、高メトキシル（ＨＭ）ペクチンと規定されている。１０％未満のＤＭのＬＭペクチンは、ＰＧＡと考えられる。最終産物として、ＰＧＡはしばしば、ナトリウム塩の形態またはポリガラクツロン酸ナトリウムとして製造される。従って、「ポリガラクツロン酸」という用語は、本明細書において、「ポリガラクツロン酸塩」と互換的に用いられる。ＬＭペクチンおよびＰＧＡは、一般に、アルカリ性のｐＨ条件下で、ＨＭペクチンの脱メチル化によって獲得される。これらの条件はメチル基を除去するが、必ずポリマー骨格を破壊し、分子量の減少をもたらす。
【００１４】
市販のＬＭペクチンまたはＰＧＡは、Ｖｉ多糖類の抗原性を解析して、合成Ｖｉ多糖類ワクチンを製造する目的で、Ｏ−アセチル化されている。結果として得られたアセチル化産物は、天然のＶｉ多糖類と同じ抗原性を有することが、見出された。Szewczyk and Taylor, Infect. Immun. 29:539-544 (1980)；Szu et al., Infect. Immun. 62:5545-5549 (1994)。しかしながら、当該アセチル化産物は、動物において免疫原性ではなかった。Szu et al., Infect. Immun. 62:5545-5549 (1994)。この原因は、天然のＶｉ多糖類の１−２×１０６Ｄａと比較して、使用した市販のＬＭペクチンの分子量（約４ｘ１０５Ｄａ）が低いことであった。同文献。多糖類抗原の免疫原性が分子量に左右されることは、他の多糖類抗原によって示されてきている。Gonzalez-Fernandez et al., Vaccine. 26:292-300 (2008)。しかしながら、Ｏ−アセチル化ＬＭペクチンは、ひとたび蛋白質担体と結合すると免疫原性であったが、その抗体応答レベルは、Ｖｉ多糖類−蛋白質結合体よりもずっと低かった。Szu et al., Infect. Immun. 62:5545-5549 (1994)；Kossaczka et al., Infect. Immun. 67:5806-5810 (1997)。従って、蛋白質担体に結合しなくても免疫原性である、腸チフスに対する新規の合成Ｖｉ多糖類ワクチンを開発する必要がある。
【発明の概要】
【００１５】
概要
本開示は、（ａ）１×１０６Ｄａを超える分子量；（ｂ）１モル当たり約１０％未満のメチル化度；および（ｃ）１モル当たり約２％から約１５％の範囲の介在性ラムノース含量:のうち少なくとも一つを有する、合成免疫原性Ｖｉ抗原として有用な、Ｏ−アセチル化高分子ポリガラクツロン酸またはその医薬上許容される塩を提供する。本開示はさらに、Ｏ−アセチル化高分子ポリガラクツロン酸またはその医薬上許容される塩、これらを含む医薬組成物および／またはワクチン組成物を調製する方法、および前述のいずれかを使用して免疫化する方法を提供する。
【００１６】
異なる植物源由来のペクチンは、異なる化学的特性および物理的特性を有する。アロエベラＬ由来の高分子ポリガラクツロン酸（ＨＰＧＡ）(ＧｅｌＳｉｔｅ（登録商標）、その医薬上許容される塩を含む)は、U.S. Patent Nos. 5,929,051、7,705,135および7,691,986に記載されるように同定され、製造されており、これらの文献は全て、参照により本明細書に組み込まれる。アロエベラは、世界の熱帯および亜熱帯地域で広く栽培されている植物である。ＨＰＧＡは特有の特徴を有する。ＨＰＧＡは天然において低メトキシル含量であり（「ＤＭ」＜１０％）、非常に高分子量であり（＞１×１０６Ｄａ）、高いＧａｌＵＡ（ナトリウム塩）含量（＞９０％）である。ＨＰＧＡの化学的特性および物理的特性を、表１にまとめている。ＨＰＧＡは水に可溶性であるが、生理食塩水または緩衝生理食塩水（１５０ ｍＭ ＮａＣｌ）には直接には難溶性である。ＬＭペクチンのように、ＨＰＧＡはカルシウムイオンとゲルを形成することができる。ゲル化は、カルシウムと混合すると、直ちに生じる。ＨＰＧＡは通常は９９％を超える純度を有し、必要最低限の量の中性糖および蛋白質（＜０．５％）を含有する。これらの優れた化学的特性および物理的特性が、ＨＰＧＡを他に存在する全てのペクチンまたはＰＧＡから区別している。
【表１】
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【００１７】
本明細書で規定されるように、ＨＰＧＡは、（１）１×１０６Ｄａを超える分子量、（２）１モル当たり約１０％未満のメチル化度、および（３）１モル当たり約２％から約１５％の範囲の介在性ラムノース含量、の特性のうち、少なくとも１つを有する高分子ポリガラクツロン酸である。
【００１８】
本明細書で規定されるように、ＯＡｃ−ＨＰＧＡは、（１）１×１０６Ｄａを超える分子量、（２）１モル当たり約１０％未満のメチル化度、および（３）１モル当たり約２％から約１５％の範囲の介在性ラムノース含量、の特性のうち、少なくとも１つを有する、Ｏ−アセチル化高分子ポリガラクツロン酸である。
【００１９】
本開示のいくつかの態様において、ＨＰＧＡはＧｅｌＳｉｔｅ（登録商標）である。ＧｅｌＳｉｔｅ（登録商標）は、アロエベラＬ由来のｃＧＭＰを使って製造される。製造工程には、U.S. Patent 7,691,986に詳細に記載されたように、植物素材を細かく刻むこと、抽出、清澄化、および０．２μｍのろ過、その後の精製ステップが含まれる。最終産物は乾燥物質である。商業的には、結果として得られるＨＰＧＡはまた、ＧｅｌＳｉｔｅ（登録商標）ポリマーとして知られる。ＧｅｌＳｉｔｅ（登録商標）についてのドラッグマスターファイル（ＤＭＦ）は２００５年にＦＤＡに提出され、毎年新しい製品情報とともに更新されている。
【００２０】
本開示は、安全性、有効性、およびコストの点で、現在のＶｉワクチンよりも顕著な有意性がある新しい腸チフスワクチンとして用いることができる合成および免疫原性のＶｉ抗原を提供する。合成Ｖｉ抗原、Ｏ−アセチル化高分子ポリガラクツロン酸（ＯＡｃ−ＨＰＧＡ、例えばＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標））またはその医薬上許容される塩は、新規高分子ポリガラクツロン酸（ＨＰＧＡ、例えばＧｅｌＳｉｔｅ（登録商標））のＯ−アセチル化により作成される。上述のＨＰＧＡの新規の特性により、ＨＰＧＡは、Ｏ−アセチル化によって、合成Ｖｉ多糖類アナログに対する理想的な基質となる。
【００２１】
ＯＡｃ−ＨＰＧＡ、例えばＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）は、化学的方法によって、非常に高収量（重量収量＞１００％）で、製造される。これは、Ｏ−アセチル基／Ｇａｌ ＵＡ［ｍｏｌｅ／ｍｏｌｅ］の割合としての高いＯ−アセチル化度（ＤＯＡｃ）（＞１００％またはＣ２またはＣ３の位置のいずれかにおいて＞５０％（ｍｏｌｅ／ｍｏｌｅ））、あるいは、多糖類１ｍｇ当たりのアセチル基含量（μｍｏｌｅ）としての高いＯ−アセチル化度（ＤＯＡｃ）（＞４．６μｍｏｌｅ／ｍｇ）を有し、および、高分子量を有し（＞１ｘ１０６Ｄａ）、その結果現在のＶｉワクチンの効力仕様をしのぐ。ＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）は、Ｖｉ多糖類と同様の、あるいは実質的に同じ抗原性を有し、そのままで高い免疫原性である。さらに重要なことに、当該合成抗原は、致死量の生きたS. typhiを負荷された動物において、完全に防御性であった。さらに、ＯＡｃ−ＨＰＧＡは、追加免疫効果または記憶免疫応答を保持し、２回目の免疫化において、２倍を超える抗体力価の増加を示す。このことは、多糖類抗原の中では非常に珍しく、蛋白質担体に結合することなく、２歳未満の人々において、ＯＡｃ−ＨＰＧＡを有効にする可能性がある。
【００２２】
したがって、少なくとも１つの以下を有する、Ｏ−アセチル化高分子ポリガラクツロン酸（ＯＡｃ−ＨＰＧＡ）またはその医薬上許容される塩を提供することは、本開示の１つの目的である：
（ａ）１×１０６Ｄａを超える分子量、
（ｂ）１モル当たり約１０％未満のメチル化度、および
（ｃ）１モル当たり約２％から約１５％の範囲の介在性ラムノース含量。
【００２３】
いくつかの態様において、ＯＡｃ−ＨＰＧＡまたはその医薬上許容される塩は、１×１０６Ｄａを超える分子量を有する。
【００２４】
いくつかの態様において、ＯＡｃ−ＨＰＧＡまたはその医薬上許容される塩のＯ−アセチル化度（ＤＯＡｃ）が、１００％を超えるか、Ｃ２またはＣ３の位置のいずれかにおいて５０％を超える。
【００２５】
いくつかの態様において、ＯＡｃ−ＨＰＧＡは、１×１０６Ｄａを超える分子量を有し、１モル当たり約１０％未満のメチル化度であり、Ｏ−アセチル化度が、１００％を超えるか、Ｃ２またはＣ３の位置のいずれかにおいて５０％を超える。
【００２６】
いくつかの態様において、ＯＡｃ−ＨＰＧＡは合成免疫原性Ｖｉ抗原である。
【００２７】
いくつかの態様において、ＯＡｃ−ＨＰＧＡまたはその医薬上許容される塩は、実質的にＶｉ多糖類ワクチンと同じ抗原性を有し、免疫原性である。
【００２８】
いくつかの態様において、ＯＡｃ−ＨＰＧＡまたはその医薬上許容される塩は、２回目の免疫化において、抗体力価の２倍以上の上昇を誘導する。
【００２９】
いくつかの態様において、ＯＡｃ−ＨＰＧＡまたはその医薬上許容される塩は、蛋白質担体に結合することなく、２歳未満の人々において、合成免疫原性Ｖｉ抗原として有効である。
【００３０】
いくつかの態様において、ＯＡｃ−ＨＰＧＡまたはその医薬上許容される塩は、腸チフスに対するワクチンとして有効である。
【００３１】
本開示はさらに、方法を単純化し、高い回収率または収量を保証するために、本開示のＨＰＧＡの特有の特性を組み込んだ、ＯＡｃ−ＨＰＧＡを製造する方法を提供する。ＯＡｃ−ＨＰＧＡ（例えば、ＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標））は、植物ベースの出発物質（例えば、ＧｅｌＳｉｔｅ（登録商標））から、大量に製造することができる。
【００３２】
従って、高分子ポリガラクツロン酸（ＨＰＧＡ）またはその塩と、酢酸および無水酢酸の混合物とを反応させることを含む方法により形成され、ＨＰＧＡが次のうち少なくとも１つを有する、Ｏ−アセチル化高分子ポリガラクツロン酸（ＯＡｃ−ＨＰＧＡ）またはその医薬上許容される塩を提供することは、本開示のもう１つの目的である：
（ａ）１×１０６Ｄａを超える分子量、
（ｂ）１モル当たり約１０％未満のメチル化度、および
（ｃ）１モル当たり約２％から約１５％の範囲の介在性ラムノース含量。
【００３３】
高分子ポリガラクツロン酸（ＨＰＧＡ）またはその塩と、酢酸および無水酢酸の混合物とを反応させることを含み、ＨＰＧＡが次のうち少なくとも１つを有する、Ｏ−アセチル化高分子ポリガラクツロン酸（ＯＡｃ−ＨＰＧＡ）またはその医薬上許容される塩を製造する方法を提供することは、本開示のさらなる目的である：
（ａ）１×１０６Ｄａを超える分子量、
（ｂ）１モル当たり約１０％未満のメチル化度、および
（ｃ）１モル当たり約２％から約１５％の範囲の介在性ラムノース含量。
【００３４】
いくつかの態様において、前記方法はさらに、酢酸および無水酢酸の混合物と反応させる前に、ＨＰＧＡまたはその塩と酸性ゲルを形成することを含む。
【００３５】
いくつかの態様において、前記方法はさらに、ＨＰＧＡまたはその塩と、過塩素酸とを反応させることを含む.
【００３６】
いくつかの態様において、前記方法で用いられるＨＰＧＡはアロエベラに由来する。
【００３７】
記載した方法のいずれかに従った方法により形成された、ＯＡｃ−ＨＰＧＡまたはその医薬上許容される塩を提供することもまた、本開示の１つの目的である。
【００３８】
本開示のさらなる目的は、本開示のＯＡｃ−ＨＰＧＡまたはその医薬上許容される塩を含み、場合により少なくとも１つの医薬上許容される賦形剤を含む、医薬組成物を提供することである。
【００３９】
いくつかの態様において、医薬組成物はさらに蛋白質担体を含む。
【００４０】
いくつかの態様において、蛋白質担体はＯＡｃ−ＨＰＧＡに結合している。
【００４１】
腸チフスに対して対象を免疫化する方法であって、それを必要とする対象にＯＡｃ−ＨＰＧＡまたは医薬上許容される塩を有効量投与することを含む方法を提供することはまた、本開示のもう１つの目的である。
【００４２】
いくつかの態様において、本開示はまた、Ｏ−アセチル化ポリガラクツロン酸（ＯＡｃ−ＨＰＧＡ）を動物またはヒトに投与することにより、サルモネラ・チフィに対して防御免疫応答を誘導する方法を提供する。例えば、本開示は、サルモネラ・チフィおよび／または腸チフスに対して対象を免疫化する方法であって、ＯＡｃ−ＨＰＧＡまたはその医薬上許容される塩、または本開示に従った前述のいずれかの医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
【００４３】
いくつかの態様において、医薬組成物の投与が、抗体応答を誘導する。
【００４４】
いくつかの態様において、医薬組成物の投与が、２回目の免疫化において、抗体力価の２倍以上の上昇を誘導する。
【００４５】
ＯＡｃ−ＨＰＧＡまたはその医薬上許容される塩、または医薬組成物の、実質的にＶｉ多糖類ワクチンと同じ抗原性を有し、免疫原性である、合成免疫原性Ｖｉ抗原としての使用を提供することは、本開示の１つの目的である。
【００４６】
腸チフスに対するワクチンに用いられる薬物の製造のための、ＯＡｃ−ＨＰＧＡまたはその医薬上許容される塩、または医薬組成物の使用を提供することは、本開示のさらなる目的である。
【００４７】
本開示はさらに、場合により少なくとも１つの医薬上許容される賦形剤を含んで、ＯＡｃ−ＨＰＧＡによって調製される、腸チフスワクチンを提供する。ＯＡｃ−ＨＰＧＡは場合により、潜在的にさらに免疫原性を高めるために、蛋白質担体と結合させてもよい。
【００４８】
１ｋｇのＯＡｃ−ＨＰＧＡで、１回の投与当たり２５−５０μｇのワクチンを２，０００万−４，０００万回投与することができる可能性がある。ＯＡｃ−ＨＰＧＡは植物ベースであるため、S.typhiなどのグラム陰性細菌から精製されたワクチンにおいて最も危険な汚染物質である、菌体内毒素（リポ多糖類、ＬＰＳ）を含まない。現存のＶｉ多糖類ワクチンと比較して、ＯＡｃ−ＨＰＧＡは、はるかに安全で、より安価で、より有効なワクチンであろう。経済的優位性はまた、世界中、特に発展途上国の特有の地域において、腸チフスワクチンの製造および使用を拡大することを、より簡単に、またより手頃な価格にする。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】Ｖｉ多糖類、ＨＰＧＡ（例えば、ＧｅｌＳｉｔｅ（登録商標））、およびＯＡｃ−ＨＰＧＡ（ＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標））の構造を図示している。基本的なガラクツロン酸（Ｇａｌ ＵＡ）残基が、Ｖｉ多糖類、ＨＰＧＡおよびＯＡｃ−ＨＰＧＡに対して示されている。
【００５０】
【図２】ＯＡｃ−ＨＰＧＡ（ＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標））を製造するためのＯ−アセチル化方法を図示している。アスタリスクは、少量の過塩素酸の触媒としての任意の使用を示している。
【００５１】
【図３】デキストランスタンダードと共に、ＧｅｌＳｉｔｅ（登録商標）およびＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）の分子ふるいクロマトグラムを図示している。使用したデキストランスタンダードは、１，５９７、２１４．８、および３９．９ｋＤａであった。
【００５２】
【図４】免疫拡散法により試験した、Ｏ−アセチル化ポリガラクツロン酸（ＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標））の抗原性を示している。各ウェルは、２０μｌの多糖類（２００μｇ／ｍｌ）、あるいは参照血清（中心のウェル）を受けた。アガロースプレートを、ウエットチャンバーで一晩保持した。ウェルには、次のように負荷した：１）ＧｅｌＳｉｔｅ（登録商標）；２）Ｏ−アセチル化ポリガラクツロン酸１×；３）Ｏ−アセチル化ポリガラクツロン酸２×；４）Ｏ−アセチル化ポリガラクツロン酸３×；およびＣ）Ｖｉ多糖類。
【００５３】
【図５】ＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）に対する免疫応答における、ＤＯＡｃのあらゆる影響を図示している。Ｂａｌｂ／ｃマウスは、Ｖｉワクチンまたは様々なＤＯＡｃを有するＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）により、２．５μｇ／マウスで、４週間空けて、２回免疫化した。特異的ＩｇＧを、抗原としてＶｉ多糖類（Ａ）またはＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）（Ｂ）を用いて、測定した。
【００５４】
【図６】ＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）の用量依存的なあらゆる影響を図示している。Ｂａｌｂ／ｃマウスを、様々な示した用量で、６週間空けて、ＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）（ＤＯＡｃ、１．７５）により２回免疫化した。特異的ＩｇＧを、抗原としてＶｉ多糖類（Ａ）またはＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（Ｂ）を用いて、ＥＬＩＳＡで測定した。
【００５５】
【図７】あらゆる交差反応性を図示している。様々な研究グループ由来の貯蔵した血清サンプルは、ＧｅｌＳｉｔｅ（登録商標）（Ａ）、ＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）（Ｂ）またはＶｉ多糖類（Ｃ）と反応した。
【００５６】
【図８】クロスブースティング（cross-boosting）の影響を図示している。特異的ＩｇＧ抗体を、Ｖｉ多糖類（Ａ）またはＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）（Ｂ）で測定した。
【００５７】
【図９】ＩｇＧサブクラスの分布を示している。様々なサブクラスの特異的ＩｇＧ抗体を、ＥＬＩＳＡで測定した。力価は、終点により決定した（バックグラウンドよりも２倍高い、≧０．２ＯＤ）。抗体は、抗原としてＶｉ多糖類（Ａ）またはＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）（Ｂ）を用いて測定した。
【００５８】
【図１０】生きたS.Typhiよる致死性の負荷に対する防御を図示している。Ｂａｌｂ／ｃマウスは、Ｖｉワクチンまたは様々なＤＯＡｃを有するＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）により、２．５μｇ／マウスで、４週間空けて、２回免疫化した。マウスを、２回目の免疫化後、２週間目に、１００ ＬＤ５０のS.Typhiで負荷した。
【００５９】
【図１１】ＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）の免疫原性とＤＯＡｃの相関を図示している。Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝６）を、様々なＤＯＡｃを有するＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）により、２．５μｇ／マウスで、４週間空けて、２回免疫化した。１回目および２回目の免疫化後の２週間目（ｗ２）に回収したそれぞれの血清サンプルにおける特異的ＩｇＧを、抗原として、Ｖｉ多糖類（Ａ）またはＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）（Ｂ）を用いて、測定した。
【００６０】
【図１２】ＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）の防御と、ＤＯＡｃの相関を図示している。Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝６）を、様々なＤＯＡｃを有するＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）により、２．５μｇ／マウスで、４週間空けて、２回免疫化した。動物を、２回目の免疫化後３週間目に、１００ ＬＤ５０のS.Typhiで、負荷した。Ａ、生存％；Ｂ、平均体重。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
詳細な記述
本Ｏ−アセチル化方法は、Schweiger (1964)により記載された方法に基づいている。高分子量のために、ＨＰＧＡ（例えば、ＧｅｌＳｉｔｅ（登録商標））は低ｐＨ（約ｐＨ２．０）でゲルを形成し、これは、Schweiger, J. Org. Chem. 29:2973 - 2975 (1964) による方法の最初のステップとして記載されたカルシウム沈殿物の調製を不要にする。このことは、固体またはビーズの形態でのＨＰＧＡ（例えば、ＧｅｌＳｉｔｅ（登録商標））のアセチル化を可能にし、アセチル化方法中の簡便なハンドリングと回収を可能にする。アセチル化反応の終了時には、ＯＡｃ−ＨＰＧＡビーズは、酸性ｐＨが中性ｐＨに上がることにより、可溶化された。当該アセチル化方法は、方法の単純性とアセチル基の付加のために、１００％を超える収量であり、非常に効率的である。
【００６２】
アセチル化は、しかしながら、Carson and Maclay, J. Am. Chem. Soc. 68:1015-1017 (1946) によって記載される方法を含む、他の方法によって達成され得る。
【００６３】
「Ｏ−アセチル化」または「Ｏ−アセチル化された」という用語は、糖残基のＣ２およびＣ３の位置のアセチル基の付加を指す。各糖残基のＣ２およびＣ３の両方の位置がアセチル化された際に、最大のＯ−アセチル化度（２００％）に達する。
【００６４】
結果として得られたＯＡｃ−ＨＰＧＡ（例えば、ＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標））は、少なくとも１３０％または１００％、あるいはＣ２またはＣ３の位置のいずれかにおいて少なくとも６５％または５０％のＯ−アセチル化度（ＤＯＡｃ）と、高分子量（＞１．０×１０６Ｄａ）とを有し、その結果天然のＶｉ多糖類（Ｃ３における６０−９０％のアセチル化、および１−２×１０６Ｄａ）に非常によく似ている。ＤＯＡｃは、反応時間を延長させることにより、容易に１７５％以上増加させることができる。アセチル基の付加のために、ＯＡｃ−ＨＰＧＡはまた、増加した分子量を有する。
【００６５】
現在認可されているＶｉワクチンの効力指標は、Ｏ−アセチル基含量（Ｏ−アセチル基［Ｃ３］／ｍｇが２μｍｏｌｅ以上）およびＶｉ多糖類の分子量（多糖類の５０％が、２．５×１０４Ｄａ以上）である(WHO Expert Committee on Biological スタンダードization, 1993)。従って、ＯＡｃ−ＨＰＧＡは、現在のＶｉワクチンの効力指標を両方とも、容易に満たし、超えている（Ｃ２またはＣ３のいずれかのＯ−アセチル基／ｍｇが２．５μｍｏｌを超え、多糖類の７０％が１×１０６Ｄａ以上である、表２および図３）。
【００６６】
ＨＰＧＡ(例えば、ＧｅｌＳｉｔｅ（登録商標））とは異なり、ＯＡｃ−ＨＰＧＡ（例えば、ＧｅｌＳｉｔｅＯＡｃ（商標））はもはやカルシウムとゲルを形成しない。また、ＨＰＧＡと異なり、ＯＡｃ−ＨＰＧＡは生理食塩水または緩衝生理食塩水（１５０ｍＭ ＮａＣｌ）に直接溶解可能である。これらの結果は、Ｏ−アセチル化はＨＰＧＡの基本的な化学特性および機能特性を変化させ、結果として得られた産物であるＯＡｃ−ＨＰＧＡは新規の化学物質であることを示している。
【００６７】
ＯＡｃ−ＨＰＧＡは、参照抗Ｖｉ多糖類血清により示されているように、抗原性である（図４）。ＯＡｃ−ＨＰＧＡはＶｉ多糖類と同じ抗原性を持つ。重要なことに、ＨＰＧＡとの反応は得られず、ＯＡｃ−ＨＰＧＡは非アセチル化親分子とは交差反応しないことを示す。
【００６８】
ＯＡｃ−ＨＰＧＡ、例えばＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）は、マウスにおいて免疫原性である（図５）。特異的抗体は、抗原としてＶｉ多糖類またはＯＡｃ−ＨＰＧＡを用いて、ＥＬＩＳＡで検出可能である。既に、アセチル化ＬＭペクチンは、天然のＶｉ多糖類と比較して低分子量（４×１０５Ｄａ）であるために、マウスにおいて免疫原性でないことが分かっている。Szu et al. Infect. Immun. 62:5545-5549 (1994)。ＯＡｃ−ＨＰＧＡははるかに高い分子量を有し、このことは、ある程度、その免疫原性の原因であり得る。この場合も、その親分子（ＨＰＧＡ）との交差反応性は観察されず、このことは、ＯＡｃ−ＨＰＧＡにより誘導される特異的抗体が、Ｖｉ多糖類の最も重要な免疫原性決定基であるＯ−アセチル基に対するものであることを示している。
【００６９】
注目すべきことに、ＯＡｃ−ＨＰＧＡは追加免疫効果または記憶免疫応答を有し、２回目の免疫化において、抗体力価の２倍以上の上昇を示す。並行して試験したＶｉワクチン（Ｔｙｐｈｉｍ Ｖｉ（登録商標））においては、このような追加免疫効果は観察されなかった。多糖類抗原は、Ｔ細胞非依存性であり、免疫記憶または追加免疫効果を欠くことが知られている。記憶免疫応答または追加免疫応答は、多糖類抗原では、蛋白質担体と結合させることによってはじめて達成される。従って、ＯＡｃ−ＨＰＧＡは、いかなる結合もなしに、それ自体で追加免疫効果を有する点で非常に独特であり、これは、その新規の化学特性によるものであろう。さらに、追加免疫効果は、２回目の投与の際に、ＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）によってのみでなく、Ｖｉワクチンによってもまた、誘導され得る。このことは、ＯＡｃ−ＨＰＧＡとＶｉ多糖類との構造的な類似性を裏付ける。当該追加免疫効果は、２歳未満の人々において、蛋白質担体に結合することなくＯＡｃ−ＨＰＧＡを有効にさせる可能性がある。
【００７０】
「追加免疫効果」という用語は、「記憶免疫応答」と互換可能に用いられ、２回目の免疫化または再接種後の約２倍以上の免疫応答の増加を指す。
【００７１】
ＯＡｃ−ＨＰＧＡは、生きたS.typhiの致死量を付加された動物において完全に防御性であり、このことはＯＡｃ−ＨＰＧＡにより誘導された免疫応答がS typhiに対して防御性であることを示している。合わせると、これらの発見は、製造、費用、記憶応答、蛋白質担体に結合しない状態での２歳未満の人々における潜在的な有効性に関して、現在のＶｉワクチンに対する明確な優位性を有する新規の腸チフスＶｉワクチンとして、ＯＡｃ−ＨＰＧＡを開発できることを示す。ＯＡｃ−ＨＰＧＡは、植物源からの豊富で高品質なＨＰＧＡを用いたシンプルな化学的方法によって、大量に生産することができる。ＯＡｃ−ＨＰＧＡ １ｋｇから、１投与あたり２５−５０μｇ多糖類のワクチンを、２，０００万−４，０００万回投与分、製造できる可能性がある。植物起源であるため、ＯＡｃ−ＨＰＧＡは、S. typhiなどのグラム陰性細菌の細胞壁成分であり、これらの細菌から精製されたワクチンの最も危険な汚染物質である、菌体内毒素またはＬＰＳを含まない。従って、当該合成ワクチンは、現在認可されているＶｉワクチンよりもより安全で安価であり得る。経済的優位性は、世界中、特に発展途上国の特有の地域において、腸チフスワクチンの製造および使用を拡大することを、より簡単に、またより手頃な価格にする。さらに、ＯＡｃ−ＨＰＧＡは、２歳未満の子供にとってさらにより免疫原性および防御性が高い可能性がある結合型ワクチンの開発に、用いることができる。
【実施例】
【００７２】
実施例１：ＧｅｌＳｉｔｅ（登録商標）ポリマーのＯ−アセチル化
ＧｅｌＳｉｔｅ（登録商標）のＯ−アセチル化に対して、２つの異なる方法を評価した：１つはCarson and Maclay (1946)により記載され、他方はSchweiger (1964)により記載された方法である。両方法とも、ＧｅｌＳｉｔｅ（登録商標）をＯ−アセチル化することができた。Ｓｃｈｗｅｉｇｅｒ法が、ＧｅｌＳｉｔｅ（登録商標）の特有の特性にとって、およびＯ−アセチル化産物の獲得にとって、より効果的であり、より好適であることがわかった。Ｓｃｈｗｅｉｇｅｒ法は、ホルムアミドまたはピリジンを使用しない。代わりに、触媒として、過塩素酸を少量使用する。さらに、Ｓｃｈｗｅｉｇｅｒ法による全工程は、室温で行われる。従って、Ｓｃｈｗｅｉｇｅｒ法を、ＧｅｌＳｉｔｅ（登録商標）のアセチル化のために選択して改変した。
【００７３】
方法。Ｓｃｈｗｅｉｇｅｒ法から改変された方法は、６つのシンプルなステップから成る（図２）。本来のＳｃｈｗｅｉｇｅｒ法と比較して、ＧｅｌＳｉｔｅ（登録商標）の２つの明確な特性−酸性ゲル化および酸性型における水への不溶性により、はるかに単純化されている。最初のステップは、基質またはＧｅｌＳｉｔｅ（登録商標）を、希塩酸、続いて氷酢酸でリンスすることにより、ナトリウム塩型から酸性型へ変換することである。ＧｅｌＳｉｔｅ（登録商標）の新規の特性の１つは、低ｐＨで効果的にゲル化し、下流のステップに耐えることができる強固な酸性ゲルビーズまたは鎖を形成することである。本来のＳｃｈｗｅｉｇｅｒ法では最初に、酸洗浄ステップに先立ち、カルシウム沈殿物を調製した。それゆえ、これは、ＧｅｌＳｉｔｅ（登録商標）のＯ−アセチル化には必要でなく、除かれている。アセチル化の後、ゲルビーズまたは鎖は、酸性型のアセチル化ＧｅｌＳｉｔｅ（登録商標）が水に不溶性であるがゆえに、損失なく、アセチル化試薬を取り除くために脱イオン水で洗浄される。洗浄後、アセチル化ＧｅｌＳｉｔｅ（登録商標）は続いてＮａＯＨで中和することにより可溶化され、酸からナトリウム塩へ変換される。全工程を、最後の乾燥ステップを除いて、１日で完了することができる。
【００７４】
用いた全ての試薬は、Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) から入手した。１グラムスケールに基づく、基本的な方法を、簡単に以下に記載する。
【００７５】
ＧｅｌＳｉｔｅ（登録商標）水溶液（５ｍｇ／ｍｌを２００ｍｌ：合計１グラム）を、ＧｅｌＳｉｔｅ（登録商標）ゲルビーズを生産するために、１リットルの０．１Ｍ ＨＣｌに滴下した。ゲルビーズを回収して、各回１５分を３回、１００ｍｌの酢酸で洗浄した。ゲルビーズを、２００ｍｌの酢酸／無水酢酸（１：１）混合液に懸濁した。攪拌しながら、２ｍｌの過塩素酸（７０％）を、０、３０分、６０分、および９０分の時点で０．５ｍｌを０．１ｍｌずつに分けて、２時間にわたって段階的に添加した。ゲルビーズをその後１２０分後に、ステンレススチールストレーナーで回収して、水で大規模に洗浄した。それらを３００ｍｌの水に懸濁して、０．１Ｍ ＮａＯＨでｐＨを約７に調整することで溶解し、エタノールで沈殿させて、真空下で乾燥させた。
【００７６】
方法評価。収量およびＤＯＡｃを含む主要パラメーターに関して、方法を評価した。
１）収量。重量収量は一貫して１００％を超えていた。このような高収量は、効率的な生産を保証し、出発物質および試薬の使用を最大限にする。これは、アセチル基の付加が、ＧｅｌＳｉｔｅ（登録商標）の分子量を増加させることと一致しており、本方法は最小限の損失で実行され得る。酸性ゲルビーズは最低でも直径２ｍｍであり、アセチル化方法中に、容易に回収できる。
２）Ｏ−アセチル化度（ＤＯＡｃ）。ＤＯＡｃは、ＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）の主要パラメーターである。本アセチル化方法は、非常に効率的であり、たった１回の反応後に１３０％を超えるＤＯＡｃを生じた。ＤＯＡｃは、アセチル化反応の持続時間、並びに使用した無水酢酸の濃度によって、制御することができた。ＤＯＡｃは、過塩素酸の添加の間隔を同じ３０分で維持しながら、反応時間を増加させるに伴い、さらに増加させることができた。１７５％あるいは７．５μｍｏｌｅ／ｍｇ程度の高いＤＯＡｃを獲得した。Ｃ２およびＣ３部位が完全にアセチル化された際の、最大ＤＯＡｃは２００％である。一方、低ＤＯＡｃ、例えば８０％は、無水酢酸の濃度を、反応混合物の約１０％の程度の低さに低下させることによってまた、獲得することができ、その結果、評価のために、さらに広い範囲のＤＯＡｃを有するＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）を作り出すことができた。
３）分子量。アセチル化後、分子量は一貫して増加した（表２および図３）。このことは、ＧｅｌＳｉｔｅ（登録商標）へのアセチル基の付加と一致しており、該方法が親分子（ＧｅｌＳｉｔｅ（登録商標））の分解を引き起こさないことを示しており、従って、最終産物ＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）の高分子量の維持を保証する。
４）酸性ゲル化。希塩酸中での強固な酸性ゲルの形成は、アセチル化方法の効率に重要である。市販の低分子量ＰＧＡは、下流の工程中に分解する軟質ゲルしか形成しないことが観察された。従って、ＧｅｌＳｉｔｅ（登録商標）の高分子量は、方法の効率にとって重要である。
５）過塩素酸。アセチル化は、触媒としての少量の過塩素酸の付加によって開始される。２０％過塩素酸は、７０％過塩素酸とちょうど同程度有効であることが分かった。さらに、高ＤＯＡｃ（＞１００％）は、上述の１グラムのＧｅｌＳｉｔｅ（登録商標）との反応混合物中での、たった０．１２５ｍｌの２０％過塩素酸の使用により、容易に獲得することができた。さらに、酢酸中の１％過塩素酸はまた、同量の過塩素酸で用いられた場合と等しく有効であることが分かった。７０％過塩素酸は強酸である。従って、１％または２０％過塩素酸の使用は、有害な試薬の使用を最小限にし、方法の安全性を増す。
６）乾燥。方法の最後に、ＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）を容易に凍結乾燥することができ、エタノール沈殿の利用を不要にした。
【表２】
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【００７７】
実施例２：アセチル化ＧｅｌＳｉｔｅ（登録商標）ポリマーの特徴解析
１．分子量
デキストランスタンダードによるＨＰＬＣ ＳＥＣ（分子ふるいクロマトグラフィー）を、ＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）の分子量を決定するために用いた。多糖類などのポリマーの分子量は、現在一般的に、より進歩したＨＰＬＣ−ＭＡＬＬＳ(多角度光散乱検出器)法を用いて決定されている。しかしながら、デキストランスタンダードによるＨＰＬＣ ＳＥＣは、既刊文献のＶｉ多糖類研究において、Ｖｉワクチン効力を測定するために、最も広く使われており、従って既報の結果と直接比較することができるために、該方法を採用した。簡潔に言うと、移動相として、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで０．１Ｍ酢酸アンモニウムおよび２００ｐｐｍアジ化ナトリウムを用いて、Shodex OH pak SB-806HQ (300 x 8 mm)、 Shodex OHpak SB-805HQ (300 x 8 mm)、および Shodex OHpak SB-804HQ (300 x 8 mm)を使用した。ピーク頂点の分子量の値を、デキストランスタンダード(Phenomenex broad MWD、８スタンダード、１０−２００ｋＤａ)と比較して報告した（図３）。ＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）の分子量は、試験した全てのバッチにおいて、開始時のＧｅｌＳｉｔｅ（登録商標）の分子量と比較して、同じか高いことが分かった（＞２×１０６Ｄａ）（表２）。このことは、アセチル基の付加による分子量の増加と一致している。
【００７８】
２．Ｏ−アセチル化度（ＤＯＡｃ）
Hestrin, J. Biol. Chem. 180:249-261 (1949) により記載された方法を、改変して用いた。アセチルコリン、塩酸ヒドロキシルアミンおよび塩化鉄を含む全ての試薬は、Sigma Chemical Co (St. Louis, MO)から入手した。該アッセイは、９６穴プレートで行った。サンプルは、約０．２ｍｇ／ｍｌ（ｗ／ｖ）において２連で試験した。アセチルコリンをスタンダードとして用いた。ＤＯＡｃは、Ｇａｌ ＵＡ残基に対するアセチル基のモル比もしくはパーセントとして、または現在のＶｉワクチンのＤＯＡｃの仕様に用いられている単位であるμｍｏｌｅ／ｍｇとして表した。Ｇａｌ ＵＡ含量は、ＧｅｌＳｉｔｅ（登録商標）製品の試験販売結果に基づいた。
【００７９】
上述の最初の方法の条件に基づき、１３４％−１５３％のＤＯＡｃのＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）が得られ、これらはＣ２またはＣ３の位置のいずれかにおける６７％−７６％に対応していた（表２）。ＤＯＡｃはまた、μｍｏｌｅ／ｍｇに基づき表されてもよい（表２）。ＤＯＡｃはさらに、アセチル化反応時間を延ばすことによって、１７５％またはＣ２またはＣ３の位置のいずれかにおいて８７．５％程度の高さまで増加させることができ、理論上の最大である２００％に近づいた。一方で、反応条件を調整して、反応混合物中の無水酢酸濃度を低下させることによって、例えば８０％の低いＤＯＡｃ（実施例５）もまた得ることができた。
【００８０】
３．カルシウムゲル化
カルシウム存在下でゲル化するＧｅｌＳｉｔｅ（登録商標）およびＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）の能力は、カルシウム溶液とＧｅｌＳｉｔｅ（登録商標）またはＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）溶液とを混合することにより決定した。従って、約０．２％（ｗ／ｖ）サンプル溶液（２−３ｍｌ）を、０．５−１ｍｌの塩化カルシウム溶液と直接混合させた。ＧｅｌＳｉｔｅ（登録商標）溶液は直ちにゲルを形成し、一方ＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）とはゲル形成は生じなかった。ゲル形成は、全てのサンプル溶液がゲルに変化して、もはや自由に流れることができないことにより、示された。ＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）溶液は、塩化カルシウムと混合させた後に、流動性溶液のままであった。
【００８１】
また、ＧｅｌＳｉｔｅ（登録商標）とは異なり、ＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）は、直接生理食塩水または緩衝整理食塩水（１５０ｎＭ ＮａＣｌ）に直接溶解することができた。これらの結果は、Ｏ−アセチル化がＧｅｌＳｉｔｅ（登録商標）の基本的な化学特性および機能特性を変化させたこと、および得られた製品であるＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）が新規の化学物質であることを示している。
【００８２】
４．免疫原性
Szu et al. Infect. Immun. 62:5545-5549 (1994) に記載されるように、免疫拡散法を、１％アガロースで行った。シトロバクター・フロインデイ（Citrobacter freundii）由来の参照Ｖｉ多糖類抗原と、S. typhiに対する参照ロバ（burro）血清は、国立小児保険発育研究所（ＮＩＣＨＤ）から入手した。ＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）は参照血清と陽性の沈降線を形成した。Carson and Maclay 法により１、２および３回アセチル化した後に得られたサンプルで示されたように、沈降線の強度はＤＯＡｃの上昇に伴い増加した（図４）。ＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）とＶｉ多糖類の沈降線が重なっていることから証明されるように、ＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）はＶｉ多糖類と同じ、あるいは実質的に同じ抗原性を有していた；非アセチル化ＧｅｌＳｉｔｅ（登録商標）とは、反応は見られなかった（図４）。本明細書で用いられる場合、「Ｖｉ多糖類と同じ、あるいは実質的に同じ抗原性」という用語は、ＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）が、抗Ｖｉ多糖類血清または抗体に反応性であることを意味する。例えば、図４に見られ、上記で論じたように、ＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）はSzu et al.の免疫拡散法において、参照血清と陽性の沈降線を形成し、これはＶｉ多糖類の免疫拡散法の沈降線と重なっていた。
【００８３】
５．Ｖｉ多糖類とワクチンとの比較
ＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）は、１３０％を超えるＯ−アセチル化度（５．５８μｍ／ｍｇ）、あるいは、Ｃ２およびＣ３のＯ−アセチル化部位間の分布が均一であると仮定してＣ２またはＣ３のいずれかにおいて６５％を超えるＯ−アセチル化度（２．７９μｍ／ｍｇ）を有し、１×１０６Ｄａを超える分子量を有する（表２）。天然のＶｉ多糖類は、１−２×１０６Ｄａの分子量を有し、６０−９０％のＣ３の位置のＯ−アセチル化度を有する(Szu and Bystricky, 2003)。従って、ＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）は、２つの免疫原性の重要な決定要因である、ＤＯＡｃおよび分子量に基づき、Ｖｉ多糖類と非常に類似している。
【００８４】
現在認可されているＶｉワクチンの効力指標は、Ｖｉ多糖類のＯ−アセチル化含量（≧２μｍｏｌｅ／ｍｇ［Ｃ３において］）と分子量（多糖類の５０％が≧２．５×１０４Ｄａ）である(WHO Expert Committee on Biological Standardization, 1993; Keitel et al., 1994)。Ｃ２またはＣ３の位置のいずれかにおけるＤＯＡｃが容易に２．５μｍｏｌ／ｍｇ（＞６５％）を超え、多糖類の７０％以上が、分子量１×１０６Ｄａ以上であるため、ＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）は両方の効力の仕様を超えている。
【００８５】
実施例３：Ｏ−アセチル化ＧｅｌＳｉｔｅ（登録商標）（ＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標））の免疫原性
ＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）の免疫原性を、認可されているＶｉワクチン(Typhim Vi（登録商標）; Sanofi-Pasteur)と比較して、Ｂａｌｂ／ｃマウスで調べた。マウス群（ｎ＝１０）に対して、右後肢に筋肉内注射することによって、示された投与量で、５０μｌ ＰＢＳ中のＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）またはＴｙｐｈｉｍ Ｖｉワクチンにより免疫化した。動物は、４週間空けて２回免疫化し、血清サンプルは２週間ごとに回収した。
【００８６】
特異的抗体を、既報のように、９６穴プレートで、ＥＬＩＳＡにより測定した。Szu et al., Enzymol. 363:552-567 (2003)。共に、腸チフス研究でよく知られている、ＮＩＣＨＤおよびInternational Vaccine Institute (IVI)から入手したＶｉ多糖類を、ＥＬＩＳＡプレートを覆うための抗原として用いた。参照血清は、ＮＩＣＤＨから入手した、４０ＥＬＩＳＡ ｕｎｉｔｓ／ｍｌの過免疫マウス血清であった。抗体力価は、スタンダードとして該参照血清を用いて、CDC ELISA program (http://www.cdc.gov/ncidod/dbmd/bimb/elisa.htm)を使用して決定した。
【００８７】
１．ＤＯＡｃおよび抗原投与量の影響
ＤＯＡｃの影響：異なるＤＯＡｃを有する３つのＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）サンプル（１３６％、１５５％、もしくは１７５％ｍｏｌｅ／ｍｏｌｅ、または５．６、６．５、もしくは７．５μｍｏｌｅ／ｍｇ）を試験した。結果は、特異的ＩｇＧ応答レベルが、ＤＯＡｃと相関することが見出されたことを示した−ＤＯＡｃが高いと、免疫応答も高かった（図５）。これは、特異的ＩｇＧを、Ｖｉ抗原を用いて測定したか（図５Ａ）、あるいは合成抗原ＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）を用いて測定したか（図５Ｂ）に関わらず、１回目の免疫化後において特に正しい。最低のＤＯＡｃ（１３６％）を有するＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）は、一貫して、ほとんどの時点で、最低の力価を生じた。１５５％または１７５％のＤＯＡｃを有するＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）サンプルは非常に類似した応答レベルを示し、１５５％または１７５％ＤＯＡｃのＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）が、等しく有効であり得ることを示唆した。この、免疫応答におけるＤＯＡｃ依存効果は、さらに、８０％程度の低いＤＯＡｃを有するＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）を評価することによって、示された（実施例５）。
【００８８】
抗原投与量の影響：ＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）抗原投与量の影響もまた、４つの異なる投与量レベル（１、２．５、５、および１０μｇ）で、１７５％のＤＯＡｃを有するＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）を用いて試験した。ＶｉまたはＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）のいずれかを用いて測定した抗体応答は、特に２回目の免疫化後に、抗原用量依存的であった（図６）。
【００８９】
Ｖｉワクチンとの比較：１５５％または１７５％ＤＯＡｃを有するＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）は、１回目の免疫化後およびＶｉ抗原を用いて測定した時点を除いて、一貫して、Ｖｉワクチンと同等の、またはより高い抗体力価を誘導した（図５および６）。ＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）抗原で測定した場合、ＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）により誘導された特異的抗体力価は、Ｖｉワクチンにより誘導された抗体力価よりも高く、最大で１０倍であった。これは、ＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）のより高いＤＯＡｃと、より多くのアセチル基の存在によるものであろう。合わせて、これらの結果は、ＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）は、Ｖｉワクチンと比較した場合に、免疫原性が高いことを示している。
【００９０】
２．交差反応性
ＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）によって誘導される抗体の特異性は、Ｖｉ多糖類およびＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）と比較した親分子（ＧｅｌＳｉｔｅ（登録商標））との反応によって評価した。抗原投与量依存性実験（図６）から、２回目の免疫化後８週間目に回収された、貯蔵した血清サンプルによる結果を、図７に示す。血清サンプルは、１：４０という低い開始希釈度で試験し、ＮＩＣＤＨから入手した参照血清もまた本試験に含めた（１：２０００の開始希釈度）。ＧｅｌＳｉｔｅ（登録商標）との反応は、ＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）のいずれの投与量レベルにおいても見られず（図７Ａ）、一方ＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）に対しては、高い飽和レベルの反応が得られた（図７Ｂ）。これらの結果は、上述の免疫拡散法により得られた結果と一致している。それらは、ＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）に対して生じた反応が、ＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）のＯ−アセチル基に向けられたものであることを示している。このことは、さらに、ＥＬＩＳＡにおいて、異なるＤＯＡｃ（１３４％−１７５％）を有するＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）を抗原として用いることで確認されており、抗体反応レベルは、ＤＯＡｃと相関していることが示された。
【００９１】
３．追加免疫効果
特有の追加免疫効果または記憶免疫応答が、実施した全ての動物実験において、２回目の免疫化で、ＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）により、一貫して観察された。図５および６に示されるように、Ｖｉ抗原またはＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）抗原に対して測定された、３つ全てのＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）群の力価は、２回目の免疫化後に、１回目の免疫化後の最大力価と比較して、少なくとも２倍および最大４倍を超えて増加し、Ｖｉワクチンによる力価よりもはるかに高くなった。このような追加免疫効果は、Ｖｉワクチンでは見られなかった。広範囲のＤＯＡｃを有するＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）によるさらなる評価によって、１００％程度の低いＤＯＡｃにおいて、追加免疫効果と完全な防御を獲得できることが示された（実施例５）。
【００９２】
さらに、当該新規追加免疫効果を確かめるために、1つの抗原により１回目の免疫化を動物に行い、続いて、同じまたは異なる抗原によって２回の追加免疫化を行う、クロスブースティング実験を行った（図８）。結果は、ＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）により初回刺激を受けた全ての動物が、ＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）またはＶｉワクチンによる２回目の免疫化で、追加免疫効果を示すことを明らかにした（図８）。Ｖｉワクチンにより得られた追加免疫レベルは、Ｖｉ多糖類により測定した場合、ＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）による追加免疫レベルよりも高かった（図８Ａ）。これは、Ｏ−アセチル基に基づく追加免疫と、Ｖｉ多糖類の他の部分に対する抗体の誘導との、相加効果を反映している可能性がある。
【００９３】
Ｖｉワクチンによってのみ、初回刺激および追加免疫された動物は、追加免疫効果を示さなかった。Ｖｉワクチンにより初回刺激を受け、ＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）により追加免疫された動物は、より低い程度であり、ＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）に対して抗体を測定した場合にのみ検出可能であるが、追加免疫効果を示した（図８Ｂ）。３回目の免疫化では、さらなる追加免疫効果は観察されなかった。これらの結果は共に、特に初回刺激の免疫化としてＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標)を用いる場合に、Ｖｉ多糖類によるクロスブースティングが生じうること、従って、ＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）の新規の追加免疫効果と、そのＶｉ多糖類への構造的類似性をさらに裏付けることを示した。
【００９４】
４．ＩｇＧサブクラス
ＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）の特有の追加免疫効果は、ＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）がＴ細胞依存性抗原であり得ることを示唆する。Ｔ細胞依存性免疫応答の特徴の１つは、多糖類結合型ワクチンの場合は純粋な多糖類抗原と比べた、初回刺激免疫化後の、サブクラスの変化またはスイッチングである。それゆえ、１回目および２回目の免疫化後の２週間目に回収した貯蔵血清サンプルを用いて、ＩｇＧサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３）およびＩｇＭの分布をＥＬＩＳＡにより調べた。ＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）を注射した動物は、１回または２回の免疫化後のいずれにおいても高いＩｇＧ１レベルを示した（図９）。全てのＩｇＧの力価は、２回目の免疫化後に、２倍以上増加した。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、およびＩｇＧ２ｂの力価において、より大きな増加が、２回目の免疫化後に観察され、ＩｇＧ２ａが力価の最大の増加を示した（図９）。この、ＩｇＧサブクラスのプロファイルは、Ｔｈ２に偏ったＴ細胞活性化が、ＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）に対する応答に関係している可能性があることを示唆している。当該応答は、Ｖｉ−結合型ワクチン (An et al., 2012)および肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumonia）多糖類結合型ワクチン (Safari et al., 2011)により得られる応答に類似している。ＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）とは異なり、Ｖｉワクチンは、２回目の免疫化後に全てのＩｇＧサブクラスにおいて同じか減少した力価を示したが、ＩｇＧ２ａは例外であり、２倍の増加を示した。いずれのワクチンにおいても、ＩｇＭのレベルには、明らかな違いは見られなかった。
【００９５】
実施例４：Ｏ−アセチル化ＧｅｌＳｉｔｅ（登録商標）ポリマーの防御効果
ＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）により誘導された特異的免疫応答の防御効果を、既に報告された(Park et al., 2002)、生きたS.typhiによる抗原投与実験において評価した。１５匹の、６〜８週齢の老齢雌Ｂａｌｂ／ｃマウス群を、異なるＤＯＡｃ（１３６％または１５５％）を有するＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）またはＶｉワクチンを用いて、２．５μｇ／マウスで、４週間空けて、２回の筋肉内注射によって免疫化した。コントロールには、バッファー溶液を投与した。２回目の免疫化後２週間目に、各群の１０匹のマウスに、０．５ｍｌ ５％豚胃粘液ムチン中の細菌を、１００ ＬＤ５０（１，０００ＣＰＵ／マウス）で腹腔内投与により、抗原投与した。用いた細菌は、サルモネラ・エンテリカ亜種（Salmonella enterica subsp）であった。腸チフス菌（Enterica serovar typhi (S. typhi)）は、ＡＴＣＣから入手した（Item number 19430）。
【００９６】
結果は、２つのＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）群と、Ｖｉワクチン群を含む、全ての免疫化した動物において防御効果が見られることを示した（図１０）。全ての非免疫コントロールマウスは３日以内に死亡した。防御効果が見られた群間では違いは見られず（図１０）、ＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）が、Ｖｉワクチンと全く同様に防御性であることを示した。加えて、１３６％または１５５％のＤＯＡｃを有する２つのＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）群は防御において違いを示さず、１３６％のＤＯＡｃを有するＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）が、全く同様に防御性であり得ることを示した。防御効果が見られた全てのマウスが、抗原投与後１−３日に、軽微な一過性の体重減少（＜１０％）を経験したが、その後正常レベルに回復した（図１０Ｂ）。また、特異的抗体を、上述のようにＶｉ抗原またはＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）抗原で測定し、図５で示した結果と同様の結果が得られた。
【００９７】
実施例５：ＤＯＡｃと、免疫原性および防御との、さらなる相関
ＤＯＡｃは、ＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）の重要な仕様である。従って、ＤＯＡｃと防御との相関をさらに証明することが重要である。より広い範囲のＤＯＡｃ（８０％−１５３％）を有する一連のＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）追加サンプルを、それ故に作成し、免疫原性および防御について選別した。結果は、抗体力価および防御のレベルがＤＯＡｃと直接相関して増加することを示した（図１１および１２）。０％ＤＯＡｃである非アセチル化ＧｅｌＳｉｔｅ（登録商標）は、Ｖｉ多糖類またはＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）のいずれかに対する検出可能な抗体をいずれも誘導せず、いかなる防御も与えなかったが、このことはさらに、ＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）により誘導された抗体がＯ−アセチル基に向けられることを示す。重要なことに、８０％ＤＯＡｃを有するＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）は、最低の抗体力価を示し、２回目の免疫化後に追加免疫効果を示さず、部分的な防御を与えるのみであったが、一方、より高いＤＯＡｃ（≧１００％）を有する他のＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）は、追加免疫効果を伴ってはるかに高い抗体力価を生じ（＞１０倍）、完全な防御を与えた。一方で、８０％ＤＯＡｃを有するＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）は、低い抗体力価であったが（２回目の免疫化後Ｖｉに対して０．２３９Ｕ／ｍｌ：図１１Ａ）、それでも８３％防御を与え（図１２Ａ）、ＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）により誘導される抗体の防御性が高いことが示唆された。まとめると、これらの結果は、１００％以上のＤＯＡｃを有するＧｅｌＳｉｔｅ−ＯＡｃ（商標）が追加免疫効果を伴って完全に防御性であり得ることを示唆し、このことは、当該ワクチンのＤＯＡｃの仕様を確立するための、確固たる基礎を形成する。
【００９８】
本開示の他の実施形態は、本明細書に開示された本開示の明細書および実施を考慮すると、当業者には明らかであろう。明細書および実施例は、次の特許請求の範囲によって示される本開示の真の範囲および精神により、単に例示に過ぎないとみなされることが意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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