(57)【要約】  本発明は、出発材料からポリフェノール類が富化された留分を提供するプロセスに関し、プロセスは、（ｉ）水性溶媒に出発材料を溶解する工程と、（ｉｉ）ｐＨ３未満（好ましくは約ｐＨ１）にｐＨを調整する工程と、（ｉｉｉ）出発材料をクロマトグラフ樹脂に接触させる工程と、（ｉｖ）クロマトグラフ樹脂からポリフェノール類を脱離させて、ポリフェノール類を含む溶出液を提供する工程と、（ｖ）溶出液のｐＨをｐＨ３．５超（好ましくはｐＨ４）に調整する工程と、（ｖｉ）溶出したポリフェノール類から溶出液を分離して、ポリフェノール類の富化留分を得る工程と、を含む。本発明は、このようなポリフェノール類富化留分を含む製品にも関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
出発材料からポリフェノール類の富化された留分を提供するプロセスであって、
（ｉ）水性溶媒に前記出発材料を溶解する工程と、
（ｉｉ）ｐＨ３未満（好ましくは約ｐＨ１）にｐＨを調整する工程と、
（ｉｉｉ）前記出発材料をクロマトグラフ樹脂に接触させる工程と、
（ｉｖ）前記クロマトグラフ樹脂から前記ポリフェノール類を脱離させて、前記ポリフェノール類を含む溶出液を提供する工程と、
（ｖ）前記溶出液のｐＨをｐＨ３．５超に調整する工程と、
（ｖｉ）前記溶出したポリフェノール類から前記溶出液を分離して、ポリフェノール類の富化された留分を得る工程と、を含む、プロセス。
【請求項２】
前記工程（ｉｉ）においてｐＨを調整する前に、前記工程（ｉ）で得られた溶解した出発材料にアルコールによる沈殿を施して、固相及び液相を提供する、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
前記工程（ｉｉ）においてｐＨを調整する前に、前記液相に蒸発処理を施して、前記液相から前記アルコールを除去する、請求項２に記載のプロセス。
【請求項４】
前記脱離中の温度が７０℃未満である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項５】
前記脱離溶離液が、ヒドロキシル成分を水性塩基と組み合わせて含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項６】
前記出発材料が、植物材料である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項７】
請求項１〜６に記載のプロセスから得ることのできる、ポリフェノール類の富化された留分。
【請求項８】
ポリフェノール類の含有量が、初期レベルと比較して乾物基準で少なくとも７０％増加している、請求項７に記載のポリフェノール類の富化された留分。
【請求項９】
ポリフェノール類のエチルエステルの含有量が、ポリフェノール類の総含有量と比較して乾物基準で２０％（ｗ／ｗ）未満である、請求項７又は８に記載のポリフェノール類の富化された留分。
【請求項１０】
前記ポリフェノールが、クロロゲン酸（ＣＧＡ）、カフェー酸、又はこれらの組み合わせである、請求項７〜９のいずれか一項に記載のポリフェノール類の富化された留分。
【請求項１１】
前記植物抽出物のクロロゲン酸（ＣＧＡ）の初期バランスが、精製後にも実質的に維持される、請求項７〜１０のいずれか一項に記載のポリフェノール類の富化された留分。
【請求項１２】
請求項７〜１１のいずれか一項に記載のポリフェノール類の富化された留分を含む、食品原材料。
【請求項１３】
請求項７〜１１のいずれか一項に記載のポリフェノール類の富化された留分、及び／又は請求項１２に記載の食品原材料を含む、食品製品。
【請求項１４】
アロマ、風味、及び／又はフォームを生成する前駆体としての、請求項７〜１１のいずれか一項に記載のポリフェノール類の富化された留分及び／又は請求項１２に記載の食品原材料の、使用。
【請求項１５】
請求項７〜１１のいずれか一項に記載のポリフェノール類の富化された留分と、医薬的に許容され得る担体とを含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、出発材料からポリフェノール類を精製するためのプロセスに関する。特に、本発明は、ポリフェノール類の富化留分、特に植物材料から得ることのできるクロロゲン酸類（ＣＧＡ類）の富化留分に関し、富化留分の異性体バランスは、出発材料と比較して実質的に維持されている。
【背景技術】
【０００２】
コーヒーなどの飲料の重要な特性に、「クリーマ」とも呼ばれる持続性のフォームと、アロマ強度とがあり、これらは重要な品質基準とみなされている。クリーマの量、口当たり、きめ細やかさ、色味、及び安定性は、消費者に対し魅力的に働きかける代表的な特徴群である。クリーマは、コーヒーの界面活性成分が抽出されることにより生じる。すなわち、タンパーで詰めたエスプレッソコーヒー素材に、加圧した湯を吹き付けることで気泡が生じ、この気泡が前述の界面活性成分により被覆され、安定化されるのである。
【０００３】
消費者は最初にコーヒーアロマの鮮烈さを知覚体験することから、コーヒーアロマも重要な特性の１つである。コーヒーの香りを嗅ぐとき、アロマがコーヒーの風味及びコーヒーのブライトネスの評価を助ける。焙煎の間に、多くの芳香化合物が形成され、あるいはコーヒー豆素材から放出され、コーヒー体験（アロマ及び風味）に影響を与える。最も重要なアロマ化合物前駆体の１つに、クロロゲン酸、特に、カフェオイルキナ酸がある。
【０００４】
したがって、様々な異なる種類の植物材料、例えば、ベリー類、ブドウ類、柑橘類、野菜類、穀類、ハーブ類、茶、コーヒー、ココアから、ポリフェノールの富化留分を単離することに関心が寄せられている。特に、食品製品及び飲料製品に、例えば、アロマ及び風味を付与するためにも、クロロゲン酸化合物類が富化されており、クロロゲン酸化合物類の異性体バランスがもとの植物材料と類似しているポリフェノール留分を単離することに関心が寄せられている。
【０００５】
更に、ポリフェノール類は、抗菌作用、抗ウイルス作用、抗突然変異作用、抗がん作用、抗増殖作用、及び血管拡張作用を有することが報告されている。ポリフェノール類は、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）により生じるう歯と対抗するのに有用であり得る抗菌活性を有し得る。ポリフェノール類は、認知、記憶、知能、動機づけ、注意力、及び集中力などの精神機能の向上を称する向知性薬として記載される。
【０００６】
しかしながら、食品法の栄養機能表示に関する規則の強化により、活性成分を確実に一定レベルにすること、並びに製造された製品により得られた科学的エビデンスに言及することが義務付けられている。
【０００７】
したがって、特にクロロゲン酸類（ＣＧＡ類）を含むポリフェノールが富化されており、クロロゲン酸バランスが、植物材料にもともと存在するクロロゲン酸バランスと類似している留分を提供するためのプロセスが必要とされている。続いて、富化留分は、食品製品の活性成分を確実に一定レベルにするよう使用することができ、並びに介入試験においては、コーヒーなどに由来するポリフェノール類の摂取間の相関関係及び所定の表示効果を実証するのに使用できる。
【０００８】
したがって、当該技術分野では、食品製品又は飲料の特性を増強するのに使用できる材料に由来する植物材料と比較して、最も確実な特性を有しており、ポリフェノール類、特に、クロロゲン酸の富化留分を提供するプロセスを提供することが必要とされている。
【発明の概要】
【０００９】
したがって、本発明は、ポリフェノールのバランスが維持されているか、あるいは実質的に維持されている、ポリフェノール類の精製のための新規プロセスを記載する。更に、本発明のプロセスは、プロセス中に形成される誘導体、例えば、ポリフェノール類のエチルエステル類の形成をほとんど生じない、あるいは全く生じないものであり得る。植物材料において天然に生じる天然型のポリフェノール類と同じ特性を有しないことから、エチルエステル類は望ましくない。更に、エチルエステル類は、もとの材料と比較して、富化留分のポリフェノールバランスを変更してしまう。
【００１０】
したがって、本発明の一態様は、出発材料からポリフェノール類の富化されている留分を提供するプロセスに関し、プロセスは、
（ｉ）水性溶媒に出発材料を溶解することと、
（ｉｉ）ｐＨ３未満にｐＨを調整することと、
（ｉｉｉ）出発材料をクロマトグラフ樹脂に接触させることと、
（ｉｖ）クロマトグラフ樹脂からポリフェノール類を脱離させて、ポリフェノール類を含む溶出液を提供することと、
（ｖ）溶出液のｐＨをｐＨ３．５超に調整することと、
（ｖｉ）溶出したポリフェノール類から溶出液を分離して、ポリフェノール類の富化された留分を得ることと、を含む。
【００１１】
本発明の別の態様は、本発明によるプロセスから得ることができる、ポリフェノール類の富化された留分に関する。
【００１２】
本発明の更に別の態様は、本発明によるポリフェノール類の富化された留分を含む食品原材料を提供することである。
【００１３】
本発明の更に別の態様は、本発明によるポリフェノール類の富化された留分、及び／又は本発明による食品原材料、を含む、食品製品を提供することである。
【００１４】
更なる態様は、アロマ、風味及び／又はフォームを生成する前駆体としての、本発明によるポリフェノール類の富化された留分及び／又は本発明による食品原材料の、使用に関する。
【００１５】
更に別の態様は、本発明によるポリフェノール類の富化された留分と、医薬的に許容され得る担体とを含む、医薬組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明のポリフェノール類の非限定例を示す。図中、（＊）印は、Ｒ１の結合点を表わす。
【図２】９０％エタノールを使用した場合の、ＣＱＡ類、ＦＱＡ類、ｄｉＣＱＡ類、及びカフェインの脱離動態を示す。
【図３】実験室規模での本発明による精製プロセスに関する具体的な実施形態を示す。
【図４】コーヒー生豆のポリフェノール富化留分の全体的な組成を、処理前のコーヒーと比較して示す。
【図５】コーヒー生豆のポリフェノール富化留分のＣＧＡ組成を、処理前のコーヒーと比較して示す。
【図６】７５％エタノール中、ｐＨ１、２、７．４、及び１２にて２時間後の５−ＣＱＡの分解を示す。
【図７】ｔ＝ＲＴ、５０℃、及び８０℃での５−ＣＱＡのエチルエステルへの変換を示す。
【図８】（ａ）５０℃で３時間以内、及び（ｂ）ＲＴで３６時間以内での５−ＣＱＡエステルの形成を示す。
【図９】製造規模のための、改良された精製プロトコールを示す。
【図１０】臨床試験に関し、脱カフェイン処理したコーヒー生豆のポリフェノール富化留分の全体的な組成を、処理前のコーヒーと比較して示す。
【図１１】脱カフェイン処理コーヒーの富化留分の詳細なＣＧＡ組成を、処理前のコーヒーと比較して示す。
【図１２】臨床試験に関し、カフェイン入りコーヒー生豆のポリフェノール富化留分の全体的な組成を、処理前のコーヒーと比較して示す。
【図１３】カフェイン入りコーヒーの富化留分の詳細なＣＧＡ組成を処理前のコーヒーと比較して示す。
【図１４】脱離混合物中のエタノールの割合を増加させて［（１）２０％、（２）５０％、（３）８０％］、一連の脱離工程を使用するクロロゲン酸の精製プロトコールを示す。
【図１５】もともとのコーヒー豆中のＣＧＡ類の相対的な組成と、エタノール勾配による脱離により得られた３通りの留分とを示す。
【図１６】３通りの異なるエタノール勾配による脱離留分のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。  本発明を以下により詳細に記載する。
【発明の詳細な説明】
【００１７】
本発明は、クロマトグラフ樹脂を使用して、ポリフェノール類の富化された留分を提供するための、新規プロセスを記載する。本発明により得られた富化留分は、富化留分中に存在するポリフェノール類（クロロゲン酸化合物類など）の異性体バランスが実質的に維持され、かつ植物材料中にもともと存在するポリフェノール類（クロロゲン酸化合物類など）の異性体バランスに類似することから、改良された特性群、特に、アロマ特性、芳香特性、及びフォーム形成特性を提供し得る。更に、本発明によるポリフェノール類の富化された留分を提供するためのプロセスは、高純度及び／又は良好な特性（製品性能）を備えた、富化留分も提供する。
【００１８】
本発明の一実施形態では、富化留分は、クロロゲン酸化合物類の含有量が、少なくとも４０％（ｗ／ｗ）、例えば、少なくとも５０％（ｗ／ｗ）、例えば、少なくとも６０％（ｗ／ｗ）、例えば、少なくとも７０％（ｗ／ｗ）などである。
【００１９】
本開示のプロセスは、その他の精製プロセスと比較していくつかの利点を有し得る。本発明の１つの利点は、富化留分のポリフェノール類、特にクロロゲン酸化合物類の異性体バランスを維持できることであり得る。別の利点は、このプロセスにより生成されるポリフェノール類のエチルエステル類が非常に限られている、あるいは全く生成されないという点であり得る。本発明の更なる利点は、高純度（すなわち、６０％超）が得られ得る点であり得る。
【００２０】
本発明のプロセスの概略図を、図３、９、及び１４に示す。各概略図は、本発明によるプロセスの具体的な実施形態を表す。
【００２１】
したがって、本発明の一態様は、出発材料からポリフェノール類の富化されている留分を提供するプロセスに関し、プロセスは、
（ｉ）水性溶媒に出発材料を溶解することと、
（ｉｉ）ｐＨ３未満にｐＨを調整することと、
（ｉｉｉ）出発材料をクロマトグラフ樹脂に接触させることと、
（ｉｖ）クロマトグラフ樹脂からポリフェノール類を脱離させて、ポリフェノール類を含む溶出液を提供することと、
（ｖ）溶出液のｐＨをｐＨ３．５超に調整することと、
（ｖｉ）溶出したポリフェノール類から溶出液を分離して、ポリフェノール類の富化された留分を得ることと、を含む。
【００２２】
このプロセスは、ポリフェノール化合物類、例えば図１中に示すポリフェノール化合物類の化学特性及び物理特性に基づき開発した。最も重要なポリフェノール類の１つは、コーヒー並びにその他の多くの植物材料で見られる最も一般的なポリフェノール類であるクロロゲン酸類（ＣＧＡ類）である。クロロゲン酸類（ＣＧＡ類）の具体的な（非限定的な）例は、３−カフェオイルキナ酸（３ＣＱＡ）、４−カフェオイルキナ酸（４ＣＱＡ）、５−カフェオイルキナ酸（５ＣＱＡ）、３，４−ジカフェオイル−キナ酸（３，４ｄｉＣＱＡ）、３，５−ジカフェオイル−キナ酸（３，５ｄｉＣＱＡ）、４，５−ジカフェオイル−キナ酸（４，５ｄｉＣＱＡ）、３−フェルロイルキナ酸（３ＦＱＡ）、４−フェルロイルキナ酸（４ＦＱＡ）、５−フェルロイルキナ酸（５ＦＱＡ）、及びカフェー酸である。
【００２３】
クロロゲン酸類は、概して６００ｇ／ｍｏｌ未満の低分子量化合物類である。クロロゲン酸類は、１つ又は複数の芳香族基（すなわち、フェノール部分）を担持する。いわゆるπ−πスタッキング相互作用とも呼ばれる、芳香環の間で非共有結合的に生じる相互作用は、これらの芳香族部分を含有する化合物類間で生じ得る。芳香族基を捕捉するマトリックスにクロロゲン酸を特異的に吸着する際にはこの特性が使用される。
【００２４】
クロロゲン酸類は酸−塩基特性（ｐＫａ＝３．２）を付与するキナ酸基を有している。ｐＫａ未満のｐＨでは、クロロゲン酸はプロトン化される。分子は帯電し、そのためより疎水性になる。ｐＫａ超のｐＨでは、酸度関数はカルボン酸形態未満であり、すなわち、帯電に起因して分子全体がより親水性であることを意味する。この特性を使用して、精製目的で分子の疎水性を調整できる。
【００２５】
ポリフェノール類を含む出発材料は、由来の異なるものであってよい。一実施形態では、出発材料は植物材料である。更なる実施形態では、植物材料は、コーヒー、例えば、生豆、カフェイン入りのコーヒー、脱カフェインコーヒー、及び脱カフェインコーヒー生豆、モルト、ココア、茶、ベリー類、グレープ類、野菜、柑橘類、ハーブ類、及び穀類からなる群から選択される。出発材料は、最初に例えばお湯に溶解することができる。タンパク質類、メラノイド類、及び多糖類、例えば、アラビノガラクタン類などといった高分子量（ＨＭＷ）化合物類を除去する目的で、上記の精製プロセスの開始前に、溶解した出発材料の初回の沈殿工程を実施することは有益であり得る。したがって一実施形態では、工程（ｉｉ）においてｐＨを調整する前に、例えば、工程（ｉ）で得た溶解した出発材料にアルコール（好ましくはエタノール）による沈殿を施して、固相及び液相を提供してもよい。更なる実施形態では、固相は、工程（ｉｉ）においてｐＨを調整する前に、濾過、遠心分離、及び／又はデカンテーションにより液相から分離することができる。任意選択的な分離工程に続いて、工程（ｉｉ）においてｐＨを調整する前に液相に蒸発処理を施して、液相からＨＭＷ類を沈殿させるために使用したアルコールが除去されてもよい。
【００２６】
ポリフェノール類の富化された留分は、異なる形態であってもよい。したがって、ポリフェノール類の富化された留分の一実施形態は、液体形態であっても乾燥形態であってもよい。更なる実施形態では、ポリフェノール類の富化された留分は凍結乾燥される。
【００２７】
以下の実施例１は、溶解した出発材料を８０％アルコールで沈殿させる特定の実施例を開示する。したがって、一実施形態では、アルコールはエタノールである。更なる実施形態では、エタノールなどのアルコールは、５０〜９９％（ｗ／ｗ）、例えば、６０〜９９％（ｗ／ｗ）、６０〜９０％（ｗ／ｗ）、７０〜９０％（ｗ／ｗ）、７５〜８５％（ｗ／ｗ）の範囲の濃度を有する。
【００２８】
本発明によるプロセスは、樹脂カラムに充填する前に出発材料をｐＨ３未満に酸性化することを含む。本発明の一実施形態では、工程（ｉｉ）におけるｐＨ調整は、ｐＨ２．５未満、好ましくはｐＨ２未満、より好ましくはｐＨ１．５未満、又は更により好ましくはｐＨ約１への調整である。別の実施形態では、使用する酸は、例えば、塩酸、硫酸、及びリン酸などの強酸からなる群から選択される。純水では、及び／又はより高いｐＨ値を使用した場合には、樹脂からＣＧＡ類が脱離する恐れがあることが、ｐＨを相対的に低くする理由である。その一方で、酸性条件下では、クロロゲン酸類はプロトン化形態及び疎水形態を保持することから、樹脂との相互作用が維持される。
【００２９】
以下に示す実施例２は、出発材料をクロマトグラフ樹脂上に充填する前にｐＨをｐＨ１に低減させることによる作用を表す。ｐＨ調整後、出発材料をクロマトグラフ樹脂上に充填する前に、材料を濾過して大きな残渣を除去してもよい。クロマトグラフ樹脂は、出発材料の精製を行う前に酸によりプレコンディショニング（pre-conditioned）してもよい。したがって、一実施形態では、クロマトグラフ樹脂は、酸により３未満のｐＨ、好ましくはｐＨ２未満、より好ましくはｐＨ１．５未満、又は更により好ましくはｐＨ約１にプレコンディショニングされる。別の実施形態では、カラムのプレコンディショニングに使用する酸は、塩酸、硫酸、及びリン酸からなる群から選択される。酸の正確な濃度は変更することができる。したがって一実施形態では、酸の濃度は、０．００１Ｍ〜１Ｍの範囲、好ましくは０．００１Ｍ〜０．５Ｍ、又は更により好ましくは０．０５Ｍ〜０．３Ｍの範囲である。
【００３０】
出発材料をクロマトグラフ樹脂上に充填した後、クロマトグラフ樹脂をすすぎ洗いして未結合の材料を除去することは有益であり得る。したがって、一実施形態では、ポリフェノール類を脱離させる前に、すすぎ液によりクロマトグラフ樹脂を処理することもできる。好ましくは、すすぎ液は、ｐＨ３未満、好ましくはｐＨ２未満、より好ましくはｐＨ１．５未満、更により好ましくはｐＨ約１である。一実施形態では、洗浄液は、塩酸、硫酸、又はリン酸などの酸を含む。酸の正確な濃度は異なり得ることから、本発明の一実施形態では、すすぎ液中の酸濃度は、０．００１Ｍ〜１Ｍ、好ましくは０．００１Ｍ〜０．５Ｍ、又は更により好ましくは０．０５Ｍ〜０．３Ｍの範囲であり得る。
【００３１】
実施例３は、０．１Ｍ  ＨＣｌでカラムをすすぎ洗いすることにより、すすぎ洗い工程を含めなかった場合と比較して、最終的な留分の純度が５０％から６６％に上昇するという効果を示す。したがって、脱離前にカラムをすすぎ洗いすることで、最終留分の純度を更に向上できると結論付けることができる。
【００３２】
出発材料とクロマトグラフ材料との比は、精製物の量に影響を及ぼし得る。カラムに過剰充填することで、カラムが飽和し、出発材料を溶解した留分がカラムに吸着できなくなることから、有益なポリフェノール化合物類の単離が不十分になる場合がある。したがって、本発明の一実施形態では、出発材料とクロマトグラフ材料との比は、２：１〜１：４（重量：重量基準）、例えば、１：１〜１：３（重量：重量基準）、例えば、約１：２（重量：重量基準）であり得る。
【００３３】
本発明の文脈では、用語「クロマトグラフ樹脂」は、クロマトグラフカラム内に存在し、出発材料の分離に関係するクロマトグラフ媒体を指す。本発明の一実施形態では、クロマトグラフ樹脂は、充填層式又は吸着流動層式に充填できる。異なる種類のクロマトグラフ樹脂を使用することもできる。したがって、本発明の一実施形態では、工程（ｉｉｉ）は、当業者に既知のポリマー樹脂及び／又は何らかのその他のクロマトグラフ媒体に対する、吸着クロマトグラフィーを含み得る。
【００３４】
脱離のため、クロマトグラフ樹脂とポリフェノール類のフェノール化合物類との相互作用は減弱させる必要がある。本発明の脱離工程には、異なるパラメーターが影響を与え得る。
【００３５】
本発明者らは、温度が、ヒドロキシル成分（例えばエタノール）の存在下での、ポリフェノール類のエチルエステル類の望ましくない形成に顕著な影響を及ぼすパラメーターになり得ることを見出した。
【００３６】
したがって、本発明の一実施形態では、脱離中の温度は、７０℃未満、例えば、６０℃未満、５０℃未満、４０℃未満とすることができる。別の実施形態では、温度は、例えば、２５〜３５℃の範囲など、１０〜４０℃の範囲であり、例えば、約３０℃である。実施例７は、ＣＧＡ類のエチルエステルの形成を回避するために温度を低く維持することの利点を示す。したがって、概して、プロセスの各工程中に可能な限り低温を維持することが有益となり得る。しかしながら、アッセイ速度（例えば、蒸発及び／又は脱離工程中）と、エチルエステル類の生成の回避とは、常にトレード・オフの関係である。
【００３７】
脱離プロセスに影響を与え得る別のパラメーターは、脱離溶離液の組成である。脱離溶離液は、ポリフェノール類の脱離を向上し得る様々な構成成分を含み得る。本発明の一実施形態では、脱離溶離液はヒドロキシル成分を含んでよく、好ましくはヒドロキシル成分はエタノールである。他のアルコール類又はアルコール類の組み合わせを脱離溶離液として使用することもできる。
【００３８】
本発明者らは、溶離液のｐＨと、脱離溶離液とが、ヒドロキシル化合物、例えば、エタノールの存在下でのプロセス中のポリフェノール類のエチルエステル類の望ましくない形成に顕著な影響を及ぼし得ることを見出した。本発明の一実施形態では、溶離液及び／又は脱離溶離液のｐＨは、例えば、ｐＨ３．５超、好ましくは約ｐＨ４、又は更により好ましくはｐＨ４〜５の範囲など、ｐＨ３超であり得る。高ｐＨ値、例えば、ｐＨ１２などの強アルカリ条件では、クロロゲン酸類のエチルエステルの望ましくない形成が低減され得るものの、ポリフェノール類には他の望ましくない反応が生じ得る。
【００３９】
本発明の更なる実施形態では、脱離溶離液は、水性塩基（aqueousbase）と組み合わせてヒドロキシル成分、好ましくはエタノールを含むことができ、水性塩基は好ましくはＫＯＨであり得る。
【００４０】
本発明の一実施形態では、脱離溶離液は、少なくとも２０％のヒドロキシル成分、例えば、少なくとも３０％のヒドロキシル成分、少なくとも４０％のヒドロキシル成分、少なくとも５０％のヒドロキシル成分、例えば、少なくとも６０％のヒドロキシル成分、少なくとも７０％のヒドロキシル成分、例えば、少なくとも８０％のヒドロキシル成分と、最大で２０％の水性塩基とを含んでよく、例えば、少なくとも９０％のヒドロキシル成分と最大１０％の水性塩基とを含んでよく、あるいはこれらの段階的な組み合わせを含んでもよい。
【００４１】
ポリフェノール類の富化された留分は多くの様々なポリフェノール化合物類及びクロロゲン酸化合物類を含み得ることから、段階的な溶離を行うことができる。したがって、本発明の一実施形態では、脱離溶離液は、
（ｉ）１０〜３０％の範囲、例えば、１５〜２５％、１７〜２３％、又は１９〜２１％のヒドロキシル成分、あるいは
（ｉｉ）４０〜６０％の範囲、例えば、４５〜５５％、４７〜５３％、又は４９〜５１％のヒドロキシル成分、あるいは
（ｉｉｉ）７０〜９０％の範囲、例えば、７５〜８５％、７７〜８３％、又は７９〜８１％のヒドロキシル成分を含み得る。
【００４２】
本発明の更なる実施形態では、脱離工程は、（ｉ）、（ｉｉ）、又は（ｉｉｉ）に記載のとおりの、例えば３通りすべての段階的な組み合わせなどの、２通り以上の濃度のヒドロキシル成分を脱離溶離液に含む、段階的な溶出であり得る。脱離中に濃度勾配をつけてヒドロキシル成分を加え、溶出を行うことにより、異なるポリフェノール化合物類を含む脱離溶離液を得ることも利点であり得る。したがって、本発明の一実施形態では、吸着中に、最高で１００％から最小で１％までの勾配として、例えば、最高で９０％から最小で１５％、最高で９０％から最小で７０％、最高で６０％から最小で４０％、最高で３０％から最小で１０％の勾配として、ヒドロキシル成分を提供できる。上記の実施形態では、ヒドロキシル成分は、最初は高濃度であるが、低濃度から高濃度へと勾配をつけることが有益となり得る。したがって、本発明の別の実施形態では、ヒドロキシル成分は、脱離中に、少なくとも１％から最高で１００％、例えば、少なくとも１５％から最高で９０％、少なくとも１０％から最高で３０％、少なくとも４０％から最高で６０％、少なくとも７０％から最高で９０％までの勾配をつけて提供され得る。更なる実施形態では、本発明による任意の勾配範囲を段階的に組み合わせた工程として脱離工程が提供される。段階的な溶出を有することにより、複数の溶出液を回収し（それぞれ、異なるポリフェノール類を異なる含有量で含む）、回収した溶出液のうち２つ以上を混合して、出発材料中に存在するポリフェノール類、特に、クロロゲン酸の異性体バランスとより正確に類似している、ポリフェノール類、特に、クロロゲン酸の異性体バランスを有する、最終的な生成物を得ることもできる。回収される溶出液が１つのみである場合、このような結果は得られない。
【００４３】
これまでに記載したとおり、温度は、エチルエステル類の形成に影響する。したがって、本発明の一実施形態では、脱離は、８０℃未満の温度、例えば、７５℃未満、５０℃未満、３５℃未満、又は２０〜３０℃の範囲で実施することができる。しかしながら、高温では脱離速度が速くなることから、すなわちこれもまたトレード・オフの関係である。
【００４４】
脱離後、エチルエステルの形成を回避するために溶出液のｐＨを更に調整することは有益であり得る。したがって、一実施形態では、ｐＨは、脱離後にｐＨ３．５〜６の範囲、例えば、３．５〜５、３．５〜４．５、４〜５、又はおよそ４若しくは５の範囲に調整される。
【００４５】
得られた溶出液はヒドロキシル成分を含んでおり、溶出液中のポリフェノール類の濃度を更に高める目的で、ポリフェノール類からヒドロキシル成分を分離してもよい。
【００４６】
溶出後の分離工程、及び任意選択的にｐＨ調整は、異なる方法で実施することもできる。本発明の一実施形態では、工程（ｖｉ）における分離は、蒸発により実施できる。エチルエステルの形成には温度も影響することから、溶出液の蒸発は、８０℃未満、例えば、７５℃未満、６０℃未満、４０〜６０℃の範囲、又は４５〜５℃の範囲、好ましくはおよそ５０℃の温度にて実施される。しかしながら、脱離の速度は高温下でははるかに速くなることから、これもまた、トレード・オフの関係である。蒸発後には、ヒドロキシル成分を含む蒸発相と、ポリフェノール類を含む凝縮相とが提供される。
【００４７】
好ましくは、残渣相中に存在するヒドロキシル成分の含有量は、５％（ｗ／ｗ）未満、より好ましくは１％（ｗ／ｗ）未満、更により好ましくは０．１％（ｗ／ｗ）未満、更により好ましくは０．０１％（ｗ／ｗ）未満である。
【００４８】
ｐＨ調整は、ヒドロキシル成分の分離（蒸発など）前又はヒドロキシル成分の分離（蒸発など）後に実施できることは理解されたい。更に、ｐＨ調整は、ヒドロキシル成分の分離前後に実施することもできる。したがって、本発明の一実施形態では、脱離溶離液のｐＨは、３．５〜６、例えば、３．５〜５、３．５〜４．５、４〜５、又はおよそ４又は５に調整できる。本発明の一実施形態では、蒸発などの分離工程は、分離の前、分離の後、あるいは分離の前後に実施される。分離工程後、脱離溶離液は、ポリフェノール類が、疎水性の、主に不溶性の形態で存在し得る酸性の溶液として存在し得る。ポリフェノール類をより良好に溶解する目的で、上記のｐＨ調整は有益であり得る。
【００４９】
工業に応用可能な精製プロトコールを作製する目的で、加工時間は重要であり得る。したがって、本発明の一実施形態では、加工時間は、３０時間以内など３６時間以内、例えば、２０時間以内など２５時間以内、例えば、１５時間以内など１８時間以内、例えば、１０時間以内など１２時間以内、例えば、５時間以内とすることができる。本発明の文脈では、加工時間は、出発材料の溶解から、ヒドロキシル成分を含む相と、ポリフェノール類を含む残留相（residual phase）とに溶出液を分離して本発明によるポリフェノール類の富化された留分を得るまでの時間に関係する。
【００５０】
ポリフェノール類の富化された留分を更に精製することもできる。したがって、本発明の一実施形態では、ポリフェノール類の富化された留分は、クロマトグラフィー、限外濾過、ナノ濾過、マイクロ濾過、逆浸透、又はこれらの任意の組み合わせにより更に精製することができる。最終生成物を凍結乾燥することもできる。
【００５１】
精製プロセスの他に、本発明は、このようなプロセスにより得ることのできる生成物にも関する。したがって、本発明の別の態様は、本発明のプロセスから得ることのできるポリフェノール類の富化された留分に関する。もともと出発材料で見られるポリフェノール類のバランス、特に、クロロゲン酸のバランスを構成することから、このような生成物は非常に特有のものになり得る。
【００５２】
本発明の一実施形態では、ポリフェノール類の富化された留分は、ポリフェノール類の含有量が乾物基準で少なくとも３５％（ｗ／ｗ）であり得るものであり、例えば、少なくとも４５％、少なくとも５５％、少なくとも６５％、又は少なくとも７５％である。したがって、本発明の一実施形態では、ポリフェノール類の富化された留分は、ポリフェノール類のエチルエステルの含有量が乾物基準で２０％（ｗ／ｗ）未満であり得るものであり、ポリフェノール類の総含有量に対しては、例えば１５％（ｗ／ｗ）未満、例えば、１０％（ｗ／ｗ）未満、５％（ｗ／ｗ）未満、例えば、１（ｗ／ｗ）未満、０．１〜２０％（ｗ／ｗ）、０．１〜１０％の範囲、０．１〜５％の範囲、０．１〜４％の範囲、０．１〜３％の範囲、０．１〜２％の範囲、又は０．１〜１％の範囲であり得る。本発明のより具体的な実施形態では、ポリフェノール類の富化された留分は、ポリフェノール類の含有量が乾物基準で少なくとも３５％（ｗ／ｗ）かつ乾物重量で２０％（ｗ／ｗ）未満であり得るものであり、ポリフェノール類の総含有量に対しては、例えば、ポリフェノール類のエチルエステルは０．１〜２０％（ｗ／ｗ）であり得る。
【００５３】
したがって、本発明の一実施形態では、ポリフェノールは、クロロゲン酸（ＣＧＡ）、カフェー酸、又はこれらの組み合わせであり得る。本発明の更なる実施形態では、クロロゲン酸（ＣＧＡ）は、３−カフェオイルキナ酸（３ＣＱＡ）、４−カフェオイルキナ酸（４ＣＱＡ）、５−カフェオイルキナ酸（５ＣＱＡ）、３，４−ジカフェオイル−キナ酸（３，４ｄｉＣＱＡ）、３，５−ジカフェオイル−キナ酸（３，５ｄｉＣＱＡ）、４，５−ジカフェオイル−キナ酸（４，５ｄｉＣＱＡ）、３−フェルロイルキナ酸（３ＦＱＡ）、４−フェルロイルキナ酸（４ＦＱＡ）、５−フェルロイルキナ酸（５ＦＱＡ）、カフェー酸、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択され得る。
【００５４】
本発明の更に別の実施形態では、ポリフェノール類の富化された留分は、３−カフェオイルキナ酸（３ＣＱＡ）、４−カフェオイルキナ酸（４ＣＱＡ）、５−カフェオイルキナ酸（５ＣＱＡ）、３，４−ジカフェオイル−キナ酸（３，４ｄｉＣＱＡ）、３，５−ジカフェオイル−キナ酸（３，５ｄｉＣＱＡ）、４，５−ジカフェオイル−キナ酸（４，５ｄｉＣＱＡ）、３−フェルロイルキナ酸（３ＦＱＡ）、４−フェルロイルキナ酸（４ＦＱＡ）、５−フェルロイルキナ酸（５ＦＱＡ）、及びカフェー酸を含み得る。
【００５５】
本発明の更なる実施形態では、富化（theenriched）留分は、３−カフェオイルキナ酸（３ＣＱＡ）、４−カフェオイルキナ酸（４ＣＱＡ）、５−カフェオイルキナ酸（５ＣＱＡ）、３，４−ジカフェオイル−キナ酸（３，４ｄｉＣＱＡ）、３，５−ジカフェオイル−キナ酸（３，５ｄｉＣＱＡ）、４，５−ジカフェオイル−キナ酸（４，５ｄｉＣＱＡ）、３−フェルロイルキナ酸（３ＦＱＡ）、４−フェルロイルキナ酸（４ＦＱＡ）、及び５−フェルロイルキナ酸（５ＦＱＡ）のそれぞれを内容物として有し、出発材料中に存在する含有量に対して、逸脱は最大でも３０％（ｗ／ｗ）であり、例えば、最大２５％（ｗ／ｗ）、例えば、最大２０％（ｗ／ｗ）、最大１５％（ｗ／ｗ）、例えば、最大１０％（ｗ／ｗ）である。
【００５６】
本発明の別の実施形態では、クロロゲン酸（ＣＧＡ）は、少なくとも５０％（ｗ／ｗ）のモノカフェオイルキナ酸、及び／又は最大で２５％（ｗ／ｗ）のジカフェオイルキナ酸を含み得る。別の同様の実施形態では、ポリフェノール類の富化された留分は、３−カフェオイルキナ酸（３ＣＱＡ）、４−カフェオイルキナ酸（４ＣＱＡ）、又は５−カフェオイルキナ酸（５ＣＱＡ）のそれぞれのうち少なくとも１種類を、例えば、これらの化合物類のうち少なくとも２種類を、好ましくはこれらの３種の化合物類のすべてを、乾物基準で少なくとも１２％（ｗ／ｗ）含む。
【００５７】
本発明の更なる実施形態では、ポリフェノール類の富化された留分は、３，４−ジカフェオイル−キナ酸（３，４ｄｉＣＱＡ）、３，５−ジカフェオイル−キナ酸（３，５ｄｉＣＱＡ）、又は４，５−ジカフェオイル−キナ酸（４，５ｄｉＣＱＡ）のそれぞれの少なくとも１種類を、例えば、これらの化合物類のうち少なくとも２種類を、好ましくはこれらの３種の化合物類のすべてを、乾物基準で１２％（ｗ／ｗ）未満含む。
【００５８】
本発明の尚更なる実施形態では、ポリフェノール類の富化された留分は、３−フェルロイルキナ酸（３ＦＱＡ）、４−フェルロイルキナ酸（４ＦＱＡ）、又は５−フェルロイルキナ酸（５ＦＱＡ）のうちの少なくとも１種類を、好ましくはこれらの３種すべてを、乾物基準で１２％（ｗ／ｗ）未満含む。
【００５９】
ポリフェノール類の富化された留分は、食品原材料として直接使用でき、又は食品原材料のフォーム部分として使用できる。したがって、本発明の更なる態様は、本発明によるポリフェノール類の富化された留分を含む食品原材料に関する。本発明の一実施形態では、食品原材料は、ポリフェノール類のエチルエステルを、食品原材料中のポリフェノール類の総量に対し０．１〜２０％（ｗ／ｗ）、例えば、０．１〜１０％の範囲、０．１〜５％の範囲、０．１〜４％の範囲、０．１〜３％の範囲、０．１〜２％の範囲、又は０．１〜１％の範囲で含み得る。
【００６０】
ポリフェノール類の富化された留分又は食品原材料を食品製品に使用できる。したがって、本発明の更なる態様は、本発明による、ポリフェノール類の富化された留分及び／又は食品原材料を含む食品製品に関する。一実施形態では、食品製品は、ポリフェノール類のエチルエステルを、食品製品中のポリフェノール類の総量に対し０．１〜２０％（ｗ／ｗ）、例えば、０．１〜１０％の範囲、０．１〜５％の範囲、０．１〜４％の範囲、０．１〜３％の範囲、０．１〜２％の範囲、又は０．１〜１％の範囲で含み得る。
【００６１】
ポリフェノール類は、食品製品を改良するため、様々な目的で使用できる。したがって、本発明の態様は、本発明によるポリフェノール類の富化された留分及び／又は本発明による食品原材料の、アロマ、風味及び／又はフォームを生成する前駆体としての使用に関する。
【００６２】
更なる態様では、本発明は、本発明によるポリフェノール類の富化された留分と、医薬的に許容され得る担体と、を含む、医薬組成物に関する。ポリフェノール類は、インビボで生物活性、例えば、酸化防止剤、酵素の活性剤／阻害剤、及び受容体としての活性を示し得ることから、医薬組成物と関係のある成分としてみなすことができる。
【００６３】
なお、本発明の一態様の文脈で記載されている実施形態及び特徴は、発明の他の態様にも当てはまることに注意が必要である。
【００６４】
以下、非限定的な実施例に置いて、本発明を更に詳細に記載する。
方法
【００６５】
留分
そのままの、又は脱カフェイン処理したロブスタ（Robusta）生豆から、コーヒー生豆留分を製造した。
【００６６】
樹脂
Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＦＰＸ６６（ＣＡＳ  Ｎ°９００３−６９−４）は、化学構造がマクロ網状の芳香族ポリマー、すなわちスチレンからなる市販の食品等級の樹脂である。スチレンの環は官能化されておらず、マトリックスは十分疎水性である。
【００６７】
実験室規模での実験のための精製設定
カラム：サーモジャケットをつけたＸＫ  ５０／３０ガラス製カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）
【００６８】
ベンチスケールでの精製設定
カラム：サーモジャケットをつけたＸＫ  ５０／１００ガラス製カラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）
【００６９】
ＨＰＬＣ−ＵＶによるクロロゲン酸類の分析
【００７０】
クロロゲン酸（ＣＧＡ）分析は、次の設定でＨＰＬＣ−ＵＶにより分析した：
システム−ＨＰＬＣは、Ｄｉｏｎｅｘ（登録商標）より供給されているＵｌｔｉｍａｔｅ  ３０００。このシステムに、クオータナリーポンプ、サンプルインジェクタ、紫外線検出器、及びソフトウェアのＣｈｒｏｍｅｌｅｏｎを備えた。
【００７１】
サンプルの調製−サンプルは粉末又は留分とした。２ｍｇ／ｍＬの濃度で粉末をメタノール：水（８０：２０）に溶解した。留分はメタノール：水（８０：２０）に希釈して、分析種を０．２ｍｇ／ｍＬ未満の範囲とした。
【００７２】
ＨＰＬＣ法−周囲温度にて、Ｓｐｈｅｒｉｓｏｒｂ  ＯＤＳ−１  ｃｏｌｕｍｎ、５μｍ、２５０ｘ４．６ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ）でクロマトグラフ分離を実施した。Ａ／Ｂの二成分勾配（Ａ：９２％水／８％アセトニトリル／１ｍＬ／Ｌオルトリン酸、Ｂ：５０％水／５０％アセトニトリル／２ｍＬ／Ｌオルトリン酸）を適用した。注入量は２０μＬとした。波長は、クロロゲン酸類分析については３２５ｎｍ、カフェイン分析については２７５ｎｍに設定した。
【００７３】
クロロゲン酸異性体−使用した方法により、４５分のうちにカフェイン及び９種の主要なクロロゲン酸類：３種類のカフェオイルキナ酸類（ＣＱＡ）、３種類のフェルロイルキナ酸類（ＦＱＡ）、３種類のジカフェオイルキナ酸類（ｄｉ−ＣＱＡ）、の濃度を求めることができた。
【００７４】
校正−外部標準により校正を行った。メタノール：水（８０：２０）中０．２ｍｇ／ｍＬの濃度で２種類の標準を使用した（５−ＣＱＡ及びカフェイン）。Ｂｉｏｐｕｒｉｆｙの高純度標準を使用して、クロロゲン酸異性体の換算係数を求めた。
【００７５】
他のＣＱＡ１００グラムあたりのグラム数で表される濃度を、次式により５−ＣＱＡから求めた：
【数１】
2017538668.tif 000002
式中、
Ｗは、新しく用意した試料１００ｇあたりのグラム数としての分析種の濃度である。
ＡＳは、試験サンプル溶液中の分析種のピーク面積である。
Ｃ０は、１ｍＬあたりのｍｇ数としての、標準中の分析種の濃度である（分析種が標準液中に存在しない場合は５−ＣＱＡ）。
Ｐは、純度が０．９５未満であるときの、標準中の分析種の純度である（純度が≧０．９５である場合、Ｐ＝１）。
Ｖｓは、試験液の体積（ｍＬ）である。
Ｄは、希釈係数（１０又は１）である。
Ｆは、５−ＣＱＡ標準をもとに他のクロロゲン酸異性体を計算可能にする補正係数（correction factor）である。
【００７６】
脱離試験及び留分組成についてのＬＣ−ＭＳ分析
コーヒー留分を、次のとおりＬＣ−ＵＶ−ＭＳ／ＭＳにより特性評価した：
システム：１２００ＳＬ、ＤＡＤ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）及びＱＴｏＦ  ６５２０（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して分析を実施した。
サンプル調製：直接注入
ＨＰＬＣ方法：ＱＴｏＦ  ６５２０（Ａｇｉｌｅｎｔ）に連結したＫｉｎｅｔｅｘ  Ｃ１８カラム、２．６μｍ、１００ｘ２．１ｍｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）でクロマトグラフ分離を実施した。２成分勾配Ａ／Ｂ（Ａ：０．１％ギ酸、Ｂ：ＭｅＯＨ中０．１％ギ酸）を適用した。
【００７７】
カラム温度は３０℃に維持した。サンプル濃度は、水中約１０ｍｇ／ｍＬとした。注入量は３μＬとした。波長は３２５ｎｍに設定し、参照は３８５ｎｍに設定した。いずれもバンド幅は２ｎｍとした。
【００７８】
ＭＳパラメーター：ポジティブ及びネガティブＥＳＩモードで質量分析計ＱＴＯＦ  ６５２０（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用し、クロロゲン酸類の脱離を追跡するためＭＳモードと、化合物の同定のため自動ＭＳ／ＭＳモードで操作した。
【００７９】
実施例１−沈殿
特に問題なく、お湯で５０％  ＴＣ（乾物含量）としてコーヒー生豆抽出物（すなわち、カフェイン含有／脱カフェイン）を調製した。
【００８０】
未処理の抽出物はカラムの目を詰まらせる恐れがあることから、コーヒー生豆抽出物の高分子量（ＨＭＷ）化合物類（すなわち、タンパク質類、メラノイド類、アラビノガラクタン類）を、８０％エタノール（Ｖ／Ｖ）による沈殿で除去した。ブフナー型のフィルター（ｐｏｒｏｓｉｔｙ  ｇｒａｄｅ  １）で濾過し、沈殿物を除去した。エタノールを更に蒸発させた。その後、ＨＰＬＣ−ＵＶにより処理の前後のＣＧＡ類の濃度を評価した。  
【００８１】
主要な結果は以下のとおり：
ＨＭＷ化合物類の沈殿後、カラムの目詰まりは観察されなかった。
８０％エタノール処理はクロロゲン酸の溶解度に影響を与えなかった。
ＣＧＡの損失はわずかであり、ほとんどが沈殿に含まれていた。
【００８２】
結論として、エタノールなどのアルコールは、本発明のプロセスに特に有用である。
【００８３】
実施例２−吸着
実施例１で得られたコーヒー溶液を使用して、最初に吸着を評価した。これにより、吸着率が低いことが明らかとなった。次に、実施例１で得られたコーヒー溶液をｐＨ１に酸性化して、ＣＧＡ種と樹脂の芳香族ポリマーとの疎水性相互作用の強度を高めた。ＨＰＬＣ−ＵＶによるＣＧＡの分析により、次のことが明らかとなった：
酸性化していない抽出物では、保持が少ない（１１％）。
【００８４】
ｐＨ１に酸性化すると、ポリフェノール類の保持が顕著に向上する。酸性化工程の吸着率は、中性ｐＨのコーヒー抽出物、すなわち、ｐＨ４〜７のものと比較しておよそ２倍であった。最終的な吸着率は、約１９％まで上昇した。この値は、後にコーヒー／樹脂の比を最適化することにより更に向上した。
【００８５】
酸性条件下では、ＣＧＡと、他の疎水性化合物類のみがカラムに捕捉されたのに対し、親水性分子（例えば、ミネラル類及び糖類）は通過した。
【００８６】
結論として、酸性環境は、本開示のプロトコールの吸着工程を改良した。
【００８７】
実施例３−カラムの洗浄
捕捉されなかったもののなおもカラムのデッドボリューム中に存在する化合物類を除去するため、水及び０．１Ｍ  ＨＣｌによる洗浄を実施した。後で、ＣＧＡについて洗浄水を検査した。主な研究結果は次のとおりである：
【００８８】
純水はＣＧＡ類を脱離させる傾向がある。
酸性条件下では、クロロゲン酸類はプロトン化形態及び疎水形態を保持することから、樹脂との相互作用が維持された。０．１Ｍ  ＨＣｌによるカラム洗浄でＣＧＡは脱離されなかった。
洗浄工程を含めると、最終的な富化留分の純度は、５０％から６６％に上昇する。
【００８９】
結論として、洗浄工程は、最終的な生成物の純度を向上する。
【００９０】
実施例４−脱離
ＣＧＡ類の脱離に際し、樹脂と、フェノール化合物類との間の疎水性相互作用は減弱した。食品等級の精製留分については、有機溶媒としてエタノールを選択した。脱離溶液のｐＨを上昇させるため、ＫＯＨ（１０−４Ｍ）を加えた。このエタノール／ＫＯＨ混合物（９０／１０  Ｖ／Ｖ）を脱離溶媒として使用して、純粋なエタノール又はエタノール／水混合物と比較した。研究結果は次のとおりである：
【００９１】
エタノール／水の使用では、ＣＧＡは十分には脱離しない。
脱離溶媒のｐＨを５に上昇させることにより、脱離効率を顕著に向上できる。エタノール／ＫＯＨの使用により、ＣＧＡは部分的に脱プロトン化され、すなわち、樹脂に対する親和性が低下することから、１００％の脱離が観察された。
温度を７０℃に上昇させることで、脱離の継続時間は３０％短縮される。
【００９２】
精製留分中のＣＧＡの組成が、処理前のコーヒーにおける組成と同じままであることを確認するためには、異なる異性体の脱離動態を知ること、並びにカフェインの含まれるサンプルに関しては同様にしてカフェインの脱離動態を知ることが重要である。したがって、一連の留分を脱離により回収した。図２に示されるとおり、この試験では次のことが明らかとなった：
【００９３】
９０％エタノールにより、ＣＱＡ類、ＦＱＡ類、及びｄｉ−ＣＱＡ類を同じ時間間隔内に溶出し、すべての異性体を同時に脱離させることができる。
単一の異性体に関しては、最大脱離も、小さな時間範囲内におさまる（データ非掲載）。
カフェインは、ＣＧＡとともに溶出を開始するが、脱離はＣＧＡよりもゆっくりとしたものである。
【００９４】
実施例５−コーヒー／樹脂比
コーヒー／樹脂比を最適化するため、吸着工程中にカラム出口で留分の回収を行った。それぞれの留分をＵＶにより３２５ｎｍ（ＣＧＡに特徴的な波長）で分析した。最適比は、ＣＧＡが再度カラムから溶出し始める、コーヒー溶液の体積に相当する。この溶液体積から、カラムを通過したコーヒー固形分に相当する質量を計算した。最適コーヒー／樹脂比は、１ｇの樹脂に対し約０．５５ｇのコーヒーであることが判明した。しかしながら、ある種のコーヒーと別の種類のコーヒーとでクロロゲン酸の内容は大幅に異なり得るものであり、同じ種類のコーヒーであれば、この比を変更してもよい。
【００９５】
実施例６−精製前後の組成−実験室規模
図３に記載の精製プロトコールの完了後、その成分を出発材料の内容と比較した。ＣＧＡ類の精製中に生じるその他の化合物類の変化を評価する目的で、凍結乾燥粉末をその組成について分析した。図４に示すとおり、主要な変化は次のとおりである：
【００９６】
ＣＧＡ類についての主要な変化。それらのレベルは、富化精製留分において約２倍高かった。
高極性であることから、炭化水素及び有機酸は顕著に減少した（量はそれぞれ１／１２及び１／１０）。
アミノ酸も減少したものの、炭化水素及び有機酸よりは少なかった。
もとのコーヒーは脱カフェインコーヒーであったものの、カフェインが存在しており、１．２％（３倍超）への富化が生じた；
特定されなかった化合物類の割合は「その他」として掲載しており、２．２を乗じる。この増加に関係する化合物類は、ＣＧＡ同様の疎水性を有する可能性があり、したがって、同様にプロセス中に吸着した。
【００９７】
富化ポリフェノール留分の詳細な組成を更に評価した。ＣＧＡプロファイルの分析により、図５に示すとおりの、以下の結果が明らかとなった。
実験室規模の精製プロトコール下で、ＣＧＡ濃度は３３％から５６％に上昇する。ＣＧＡ異性体の初期バランスは、富化精製画分でも維持される。
ＦＱＡバランスは同じままである。
ＣＱＡ中の相対含有量は、特に３−ＣＱＡがわずかに減少した。この異性体は極性が高いことから、樹脂に対するその吸着の乏しさが説明できる。
ｄｉ−ＣＱＡの内容量は、主に３，５及び４，５−ジ−ＣＱＡが上昇する。２種類のカフェー酸残基が、樹脂に対するこれらの異性体の親和性を高め（ＦＱＡ及びＣＱＡの代わりに）、より効率的な精製を可能にし得る。
遊離カフェー酸の割合が顕著に増加（５倍量）するのは、精製プロセス中のＣＱＡ類の加水分解に起因する可能性がある。
【００９８】
合計して、異性体バランスは、初回抽出物のものと近いとみなすことができる。
【００９９】
すべての精製工程を首尾よく最適化した後、純度約７０％のＣＧＡ留分と、保存されたＣＧＡバランスを得ることができた。富化係数は全体的に約２であった。このプロセスに関し、重要な工程は：
８０％エタノールで高分子量化合物類を沈殿することによる予備精製。
疎水性樹脂（すなわち、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＦＰＸ６６）に対する吸着工程を、吸着前に抽出物をｐＨ１に酸性化することにより最適化。
７０℃にてエタノール／ＫＯＨ  １０−４Ｍ（９０／１０）により脱離工程を実施。
蒸発中のＣＧＡの可溶性を維持し、かつ凍結乾燥時の分留の性能を向上させるため、ｐＨを５に調整。
富化留分は、微量ＣＧＡ、ＮＰＰＡ、ＤＫＰ、及びカフェインなどの芳香族部分を含むその他の疎水性化合物類も同様に富化されていた。
【０１００】
実施例７−精製前後の純粋な可溶性コーヒー組成物−実験室規模
実施例６における実験室規模の試験についての研究結果をもとに、図９に示すとおりに最適化したプロトコールを純粋な可溶性コーヒーに応用した。本発明の実施例において、以下の条件を適用した：
純粋な可溶性コーヒーを出発材料として使用した。
実験室規模のカラムにより、ポリフェノール富化留分の製造を行った。
【０１０１】
結果は以下のとおり：
実験室規模の精製プロトコール下で、富化留分したＣＧＡの含有量は１０％から２４％に上昇する。ＣＧＡ異性体の初期バランスは、富化精製留分において維持される。
実験室規模の精製プロトコール下で、ＣＧＡレベルは３３％から５６％に上昇する。ＣＧＡ異性体の初期バランスは、富化精製画分でも維持される。
最適化プロトコールは純粋な可溶性コーヒーに適用できる。
【０１０２】
実施例８−ＣＧＡからのエチルエステルの形成の回避
ＣＧＡからのエチルエステルの望ましくない形成に適したプロセス条件を調査した。ＣＧＡの分解動態及びそれぞれのＣＧＡエステルの形成は、このモデルの試験に準拠している。プロセス中、ＣＧＡのエチルエステル類が形成され得る。しかしながら、ＣＧＡバランス及び富化留分の特性に顕著な影響を及ぼし得ることから、これは望ましくない。
【０１０３】
以下のスキームは、エチルエステルを生じるエステル化の一般的な反応機構を示す。酸とアルコールとの間の反応は、プロトンの移動により触媒されるため、反応速度はｐＨ依存的なものとなる。第２の重要なパラメーターとして、化学反応の際に一般的に見られるとおり、温度は分解速度に影響を及ぼす。ＣＧＡ類のエチル化を回避するのに理想的な条件を求める目的で、両方のパラメーターを評価した。
【化１】
2017538668.tif 000003
【０１０４】
実験中は、次のパラメーター、すなわちｐＨ、温度、及び時間を変えて、５−ＣＱＡをエタノール（７５％エタノール溶液）の存在下で保管した。
【０１０５】
このプロセスは、モデルとして５−ＣＱＡエステル化を使用して、以下の条件下で実施した。
【０１０６】
それぞれの実験に関し、１０ｍｇの５−ＣＱＡを、４０ｍＬの７５％エタノール溶液に溶解した。
ｐＨ試験：ｐＨを、塩酸（３２％）でｐＨ１、ｐＨ２．７、及びｐＨ４に調整し、ＮａＯＨ溶液（４Ｎ）でｐＨ１２に調整し、すべてのサンプルを、８０℃に設定した実験室オーブン内に２時間置いた。
温度試験：塩酸（３２％）によりＣＱＡ溶液をｐＨ１に調整し、室温、あるいは５０℃又は８０℃に設定した実験室オーブン内のいずれかに２時間置いた。
時間試験：５−ＣＱＡ溶液のｐＨを１に調整し、室温又は５０℃に設定した実験室オーブン内に１時間、２時間、３時間、及び３６時間（室温のみ）置いた。
システム：この分析は、ＤＡＤ検出器（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ）及びＲｈｅｏｓ  ＨＰＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ）を使用してＬＣＱ  Ｄｅｃａ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ）を用い、ＬＣ−ＤＡＤ−ＭＳシステムで実施した。
サンプル調製：それぞれのパラメーターに関し、溶液のアリコートを１：１０に希釈し、ＬＣ／ＭＳ−ＤＡＤ分析に直接使用した。
ＨＰＬＣ法：周囲温度にて、Ｚｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｃ１８カラム、５μｍ、１５０＊３ｍｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ）で分離を実施した。２成分勾配Ａ／Ｂ（Ａ：０．１％ギ酸、Ｂ：メタノール）を適用した。
ＭＳパラメーター：使用した質量分析計はＬＣＱ−Ｄｅｃａであり、フルスキャンで操作し、化合物の同定に関してはデータ依存型ＭＳ／ＭＳモード（ｍ／ｚ  １００〜１０００）で操作した。
【０１０７】
ｐＨ
５−ＣＱＡの分解及び対応するエチルエステルの形成をＬＣ／ＭＳ−ＤＡＤにより定期検査した。図６は、異なるｐＨの７５％エタノール溶液中で２時間保管した５−ＣＱＡのクロマトグラムを示す。ｐＨ試験により以下のことが示される：
ｐＨ１では、２時間以内に５−ＣＱＡのエステルへの急速な変換が観察される。
ｐＨ２．７では、５−ＣＱＡエステル化は顕著に減少する。
ｐＨ４では、５−ＣＱＡは２時間後にもほとんど分解していない。
強アルカリ条件（ｐＨ１２）では、５−ＣＱＡの加水分解によりカフェー酸及びキナ酸を生成する、完全に異なる反応スキームが誘導される。更に、アルカリ条件は、３−ＣＱＡ及び４−ＣＱＡの出現により観察されるとおり、５−ＣＱＡの異性化に都合がよい。
【０１０８】
結論として、エタノールの存在下では、富化留分のｐＨは、約４、例えば、４〜５とすべきである。したがって、ｐＨ約４〜５は、図６中に示す、本発明によるプロセスにおける工程（ｖ）に最適であり、図６では、低ｐＨ（ｐＨ２．７以下）ではエチルエステルの形成が生じる一方、高ｐＨ（ｐＨ１２）では、５−ＣＱＡの加水分解によりカフェー酸及びキナ酸の形成が生じることを見てとれる。これに加え、アルカリ条件は、３−ＣＱＡ及び４−ＣＱＡの出現により観察されるとおり、５−ＣＱＡの異性化に都合がよい。
【０１０９】
温度
次の工程で温度の影響を評価した。最悪の条件を模倣するべく、ｐＨ１を選択した。このｐＨは、これまでの実験においてまさしく最も過酷なｐＨであり、目下のところ生成プロトコール条件を反映する。２時間後、５−ＣＱＡの分解を３とおりの温度、すなわち、周囲温度（ＲＴ）、５０℃及び８０℃で維持し、ＬＣ／ＭＳ−ＤＡＤにより定期検査した（図７）。温度試験により以下のことが示される：
室温では、ごく少量の５−ＣＱＡがそのエチルエステルに変換される。
５０℃ではエステル加速度が増加する。天然の５−ＣＱＡと比較したときに、最大で４０％のエステルが検出可能である。
８０℃では、５−ＣＱＡのそのエチルエステルへのエステル化は、更に促進され、結果として５−ＣＱＡと同量のエステルが生じる。
【０１１０】
結論として、エタノールの存在下では、コーヒー抽出物及び富化留分の温度を低くすべきであり、特に、酸性条件下では低くすべきである。
【０１１１】
時間
ｐＨ及び温度は精製の設定規模とは独立することから、滞留時間は、規模の拡大とともに明らかに増大する。したがって、次の試験では、所定のｐＨ及び温度にて、５−ＣＱＡの、そのエチルエステルへのエステル化動態を評価した。この試験は、室温及び５０℃の両方で、ｐＨ１で実施した（図８）。時間試験により以下のことが示される：
５０℃では、５−ＣＱＡは、最初の３時間のうちに着実にそのエチルエステルに変換される。スケールアップしたプロトコールの、現在の脱離時間に相当する時間の経過後には、３０％のエステルが形成される。
室温では５−ＣＱＡの安定性ははるかに高い。３時間後までに形成されるエステルはわずか３％である。３６時間後に最大１４％に上昇する。
【０１１２】
結論として、エチルエステル類の形成は、脱離工程のｐＨ及び温度に依存する。
【０１１３】
実施例９−精製前後の脱カフェイン処理コーヒー組成物−実験室規模
実施例６における実験室規模での研究結果から、ＣＧＡを分解させずに富化留分を大量に製造するため、最適化したプロトコール（図９）の規模を拡大した。本発明の実施例において、以下の条件を適用した：
脱カフェイン処理したコーヒー生豆抽出物を出発材料として使用した。
１ｍのカラムにより、ポリフェノール富化留分の製造を行った。
【０１１４】
精製プロセスの再現性を評価するため、５バッチを製造した。
【０１１５】
脱カフェイン留分の完全な特性評価を行った。その結果を図１０に示す。
脱カフェイン処理したコーヒーの富化留分のＣＧＡ含有量は、３３％から６３％に上昇する。
精製による組成物の変化は、実験室規模での調製中に観察されたものと同様である（実施例６を参照のこと）。
実験室規模での製造と比較して、他の化合物群は富化の程度が少ない（９．４％対１８．８％）。
カフェインの富化は、実験室規模と比較して少ない（０．８％対１．２％）。
【０１１６】
ＣＧＡの詳細な組成を図１１に示す。
【０１１７】
実験室規模の条件下で既に見られたとおり、ＣＧＡバランスは、極めて良好に維持されている（実施例６）。
ＣＧＡのほとんどの極性化合物は精製後にはその量を減じているため、主要な変化は３−ＣＱＡに関係している。
対象的に、無極性のｄｉ−ＣＱＡとＦＱＡとが精製においてより富化される。
更に、新しいプロトコールでは（図９）、その性能について評価した。
最終的な回収率は２４％であった。
ＣＧＡの回収率は４６％であった。
ＣＧＡは、初期量と比較して１．９倍に富化された。
【０１１８】
更に、ＨＰＬＣ−ＵＶ／ＭＳによる、最終生成物中のＣＧＡ及びそのエステルの分析により、次のことが明らかとなった：
エチルエステルへの変換は劇的に減少した。
エステルの最終濃度は、もとのＣＧＡの１％を超過しなかった。
【０１１９】
したがって、脱カフェイン処理した組成物に関し、実際に、ポリフェノール類のバランスに大幅な影響を与えることなく、あるいは大量のエチルエステル類を生成することなく、工業的に応用可能な規模で、本発明のプロセスを実施することができる。
【０１２０】
実施例１０−精製前後のカフェイン入りコーヒー組成物−実験室規模
カフェイン入りコーヒーのポリフェノール富化留分にも、以下の条件で新しいプロトコール（図９）を適用した：
カフェイン入りのコーヒー生豆を出発材料として使用した。
滞留時間を削減するため、２本の６０ｃｍカラムを平行に使用して、ポリフェノール富化留分の製造を行った。
精製プロセスの再現性を評価するため、１０バッチを製造した。
【０１２１】
カフェイン入りコーヒーの留分の完全な特性評価を行った。この結果は図１２において利用できる。
カフェイン入りコーヒーの富化留分のＣＧＡ含有量は、３３％から５３％に上昇する。
カフェインの量は、９．７％から１９．９％へと２倍超になる。
炭化水素及び有機酸は、それらが高極性であることから、大幅に減少する。
その他の化合物類は、わずかに増加した。
この変化は、脱カフェイン処理コーヒーの富化留分について観察されるものと同様である。
【０１２２】
カフェイン入りコーヒーの富化留分におけるＣＧＡの詳細な組成を図１３に示す。
脱カフェイン処理コーヒーの富化留分とは対照的に、３−ＣＱＡ濃度はほとんど未変化のままであった。
主要な変化は、精製後にその量を減じている５−ＣＱＡに関係している。
組成物における最終的な変化は、脱カフェイン処理コーヒーの富化留分のものほど顕著ではなく、プロファイルは、もとのコーヒーのものと非常に近いままである。
【０１２３】
カフェイン入りコーヒーの富化留分に関し、バッチ同士での性能評価をするため、１０のバッチを別個に分析した。
最終的な回収率が３４％であったことが判明したため、したがって脱カフェイン処理コーヒーの富化留分よりも高かった（２４％）。
ＣＧＡの回収率は、脱カフェイン処理コーヒーの富化留分の４６％と比較して、５５％である。
ＣＧＡは、脱カフェイン処理コーヒーの１．９倍と比較して１．６倍に富化された。
富化したカフェイン入りコーヒーの留分中のＣＧＡ及びそのエステルの含有量を制御するため、ＨＰＬＣ−ＵＶ／ＭＳも実施した。データは非掲載である。
エステルの最終濃度はもとのＣＧＡの１％を超過しない。
脱カフェイン処理コーヒーの富化留分について既に見られるとおり、形成を完全に回避することはできない。
【０１２４】
したがって、カフェイン入りコーヒーの組成物に関し、実際に、ポリフェノール類のバランスに大幅な影響を与えることなく、あるいは大量のエチルエステル類を生成することなく、工業的に応用可能な規模で、本発明のプロセスを実施することができる。
【０１２５】
実施例１１−富化した、脱カフェイン入りコーヒー留分及びカフェイン入りコーヒー留分の調製についての性能の比較
【０１２６】
結論：
図９に示すプロトコールで、脱カフェイン処理コーヒーについては純度６３％、カフェイン入りコーヒーについては５３％の留分を得ることができた。
脱カフェイン処理コーヒーの留分での性能が良好であるのは、カフェインの存在／非存在によるものであろう。カフェインが２倍に富化されることで、カフェイン入りコーヒーの留分はほとんど２０％もの濃度にまで達し、それと同時にＣＧＡの相対濃度が減じる。
精製により、他の化合物類に関しては、脱カフェインコーヒーの留分とカフェイン入りコーヒーの留分との間に特異的な差はないことが観察される。
３−ＣＱＡ、４−ＣＱＡ、及び５−ＣＱＡの割合は、脱カフェインコーヒーの留分と、カフェイン入りコーヒーの留分とで異なる。これは、脱カフェインプロセス中に既に生じている異性化に起因する。この精製プロセスが初期の分布と比較して富化留分中のＣＧＡ組成に与える影響はごくわずかであり、ひいては、ポリフェノール類の異性体バランスはプロセスを通して維持されている。
いずれの場合においても、エステルの濃度は、もとのＣＧＡの１％を超過しない。
プロセス中には多量のＣＧＡ及びエタノールが存在することから、エステルの形成は、プロトコールを完全に変更しない限り回避できない。したがって、１％未満のエステル量は、ＣＧＡ富化留分を食品等級で製造するにあたり、技術的に不可避であるとみなすべきである。
バッチ間の再現性は非常に良好であり、相対標準偏差は１０％未満である。したがって、プロトコールは、あるバッチから、他のＣＧＡ富化留分に、特定量のＣＧＡと、周知のバランスの単一の異性体とを移すのに適する。
【０１２７】
実施例１２−エタノール濃度の最適化
これまでの実施例において、コーヒーポリフェノール類を疎水性樹脂に吸着させてコーヒーポリフェノール類を精製するための、食品等級のプロトコールを記載してきた。９０％エタノール水溶液を使用して、アイソクラチック条件下で吸着を実施した。最終富化留分において、ポリフェノール純度は６０〜７０％である。
【０１２８】
手順をポリフェノール生成物に特異的なものにするという観点で、精製したコーヒーポリフェノール異性体の調製を調査した。この目的のため、極性を減少させた溶媒（すなわち、２０／８０、５０／５０、８０／２０エタノール水溶液）を用い、一連の脱離工程を行った。
【０１２９】
脱離混合物におけるエタノールの割合を増加させながら、３回の連続する工程で脱離を実施した。プロトコールは図１４に示す。３とおりの精製富化留分は以下のとおりに得た：
工程１−エタノール／水／ＫＯＨ  ２０／７０／１０（ｖ／ｖ／ｖ）による脱離；
工程２−エタノール／水／ＫＯＨ  ５０／４０／１０（ｖ／ｖ／ｖ）による脱離；
工程３−エタノール／水／ＫＯＨ  ８０／１０／１０（ｖ／ｖ／ｖ）による脱離。
【０１３０】
食品等級の樹脂から脱離させるための勾配をかけることにより、３とおりの異なる富化留分を得た。次に、これらの富化留分のクロロゲン酸組成をＨＰＬＣ−ＵＶにより評価した。図１５は、主要な３種のＣＧＡの相対分布を示す。図１６は、３とおりの異なる富化留分のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【０１３１】
主な結果は次のとおり：
これまでに示したとおり、すべての富化留分は、初期抽出物と比較して約２倍超のポリフェノール類を含む（すなわち、６５〜８５％対３３％）。
２０％エタノールでの脱離により、クロロゲン酸類を７０．７％含む富化留分が得られる。かかるクロロゲン酸類のうち、９７％はモノＣＱＡ類であり、２．４％はモノＦＱＡ類である。したがって、低エタノール比（すなわち、２０／８０）で、ほとんど独占的にＣＱＡを含む富化留分が得られる。
５０％エタノールでの脱離により、クロロゲン酸類を８５．７％含む富化留分が得られる。そのプロファイルは、もとのコーヒー生豆抽出物のものと近い。したがって、中間のエタノール比（すなわち、５０／５０）では、ＣＱＡ、ＦＱＡ及びｄｉＣＱＡの混合組成を含む富化留分が得られる。
８０％エタノールでの脱離により、クロロゲン酸類を６５．１％含む富化留分が得られる。かかるクロロゲン酸類のうち、６５％はより極性の低いｄｉ−ＣＱＡ類である。したがって、高エタノール比（すなわち、（８０／２０）では、無極性のｄｉＣＧＡの富化留分が得られる。
【０１３２】
この勾配の利用は、様々な形態のクロロゲン酸化合物類の脱離を向上させることが望ましい条件で役立ち得るものである。その後、コーヒーのもとのＣＧＡ異性体バランスと同様のＣＧＡの異性体バランスを提供するため、富化留分を合わせることもできる。勾配脱離は、より特異的な組成物が必要とされる場合にも有用であり得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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