(57)【要約】【課題】【解決手段】レット症候群の治療における、一般式Ｉによって表される擬似三糖類アミノグリコシド類またはそれの医薬として許容される塩［式中、Ｒ１は、アルキル、シクロアルキルおよびアリールからなる群から選択され；他の全ての可変要素および特徴は明細書中で記載の通りである。］の化合物、方法および使用が開示される。    【化１】2017516835.tif 000024【選択図】図７
2017516835.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象者に、治療上有効量の下記式Ｉによって表される化合物または該化合物の医薬として許容される塩を投与することを含む、処置を必要とする対象者でのレット症候群の治療方法。
【化１】
2017516835.tif 000020
［式中、
Ｒ１は、アルキル、シクロアルキルおよびアリールからなる群から選択され；
Ｒ２は、水素または（Ｓ）−４−アミノ−２−ヒドロキシブチリル（ＡＨＢ）であり；
Ｒ３は、水素、アルキル、シクロアルキルおよびアリールからなる群から選択され；
６′位および５″位のそれぞれの立体配置は独立に、Ｒ配置またはＳ配置である。］
【請求項２】
処置を必要とする対象者におけるレット症候群治療で使用される、下記式Ｉによって表される化合物または該化合物の医薬として許容される塩。
【化２】
2017516835.tif 000021
［式中、
Ｒ１は、アルキル、シクロアルキルおよびアリールからなる群から選択され；
Ｒ２は、水素または（Ｓ）−４−アミノ−２−ヒドロキシブチリル（ＡＨＢ）であり；
Ｒ３は、水素、アルキル、シクロアルキルおよびアリールからなる群から選択され；
６′位および５″位のそれぞれの立体配置は独立に、Ｒ配置またはＳ配置である。］
【請求項３】
処置を必要とする対象者でのレット症候群の治療のための医薬製造における、下記式Ｉによって表される化合物または該化合物の医薬として許容される塩の使用。
【化３】
2017516835.tif 000022
［式中、
Ｒ１は、アルキル、シクロアルキルおよびアリールからなる群から選択され；
Ｒ２は、水素または（Ｓ）−４−アミノ−２−ヒドロキシブチリル（ＡＨＢ）であり；
Ｒ３は、水素、アルキル、シクロアルキルおよびアリールからなる群から選択され；
６′位および５″位のそれぞれの立体配置は独立に、Ｒ配置またはＳ配置である。］
【請求項４】
レット症候群の治療で使用される、包装材料中に包装され、当該包装材料中もしくはその上に印字で識別されている、下記式Ｉによって表される化合物または該化合物の医薬として許容される塩：
【化４】
2017516835.tif 000023
［式中、
Ｒ１は、アルキル、シクロアルキルおよびアリールからなる群から選択され；
Ｒ２は、水素または（Ｓ）−４−アミノ−２−ヒドロキシブチリル（ＡＨＢ）であり；
Ｒ３は、水素、アルキル、シクロアルキルおよびアリールからなる群から選択され；
６′位および５″位のそれぞれの立体配置は独立に、Ｒ配置またはＳ配置である。］
および医薬として許容される担体
を含む医薬組成物。
【請求項５】
Ｒ１がアルキルである請求項１に記載の方法、請求項２に記載の化合物、請求項３に記載の使用、または請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記アルキルがメチルである請求項５に記載の方法、化合物、使用または組成物。
【請求項７】
Ｒ２およびＲ３がそれぞれ水素である、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法、化合物、使用または組成物。
【請求項８】
Ｒ２がＡＨＢであり、Ｒ３が水素である請求項１から６のいずれか１項に記載の方法、化合物、使用または組成物。
【請求項９】
Ｒ２が水素であり、Ｒ３がアルキルである請求項１から６のいずれか１項に記載の方法、化合物、使用または組成物。
【請求項１０】
Ｒ２がＡＨＢであり、Ｒ３がアルキルである請求項１から６のいずれか１項に記載の方法、化合物、使用または組成物。
【請求項１１】
前記アルキルがメチルである請求項９および１０のいずれか１項に記載の方法、化合物、使用または組成物。
【請求項１２】
前記化合物が、化合物ＮＢ１１８、ＮＢ１１９、ＮＢ１２２、ＮＢ１２３、ＮＢ１２４、ＮＢ１２５、ＮＢ１２７およびＮＢ１２８からなる群から選択される請求項１に記載の方法、請求項２に記載の化合物、請求項３に記載の使用、または請求項４に記載の組成物。
【請求項１３】
前記化合物が、化合物ＮＢ１２２、ＮＢ１２３、ＮＢ１２４、ＮＢ１２７およびＮＢ１２８からなる群から選択される請求項１に記載の方法、請求項２に記載の化合物、請求項３に記載の使用、または請求項４に記載の組成物。
【請求項１４】
前記化合物がＮＢ１２２である請求項１に記載の方法、請求項２に記載の化合物、請求項３に記載の使用、または請求項４に記載の組成物。
【請求項１５】
前記化合物がＮＢ１２４である請求項１に記載の方法、請求項２に記載の化合物、請求項３に記載の使用、または請求項４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記化合物がＮＢ１２７である請求項１に記載の方法、請求項２に記載の化合物、請求項３に記載の使用、または請求項４に記載の組成物。
【請求項１７】
ＭＥＣＰ２早期終止コドン突然変異に関連する、請求項１から１６のいずれか１項に記載の方法、化合物、使用または組成物。
【請求項１８】
前記突然変異がナンセンス突然変異である請求項１７に記載の方法、化合物、使用または組成物。
【請求項１９】
前記ＭＥＣＰ２ナンセンス突然変異が、Ｒ１６８Ｘ、Ｒ２５５Ｘ、Ｒ２７０ＸおよびＲ２９４Ｘからなる群から選択される請求項１８に記載の方法、化合物、使用または組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、それのいくつかの実施形態において、治療法、詳細には、組成物ならびにレット症候群の治療でアミノグリコシド類縁体を利用する方法（これらに限定されるものではない）に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
レット症候群（ＲＴＴ、ＭＩＭ３１２７５０）は、主として女児で起こるＸ染色体性出生後神経発達障害であり、その世界的発生率は女性誕生数１万から１．５万人当たり１一人である。正常な発達の後、最初の６から１８ヶ月中に、発達停滞とそれに続く退行が生じる。退行期中、意図的な手の使用および言語は失われるが、粗大運動機能は比較的保存される。退行期後、臨床像は長年にわたって安定なままである。
【０００３】
ＲＴＴの主要な原因要素は、Ｘｑ２８でのＸ染色体性メチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）の欠乏であり、そこにおいては、古典的および非定型ＲＴＴ患者では２００を超える突然変異がこれまでに確認されている。ＲＴＴの原因となる突然変異の大半において、ほとんどがデノボで父系生殖細胞系に由来する、ミスセンス、ナンセンスおよびフレームシフト突然変異を生じるＣｐＧホットスポットでのＣ．Ｔ転移が関与する。ＲＴＴにおける表現型異質性は、ほとんどの場合、ＭＥＣＰ２突然変異型および局所化、ならびにＸ染色体不活性化（ＸＣＩ）パターンに関係していた。
【０００４】
ＭＥＣＰ２遺伝子は、エキソン１での選択的開始およびエキソン２のスプライシングの２種類のアイソフォームＭｅＣＰ２＿ｅ１およびＭｅＣＰ２＿ｅ２産物をコードし、それらはいずれも核内であり、メチル化ヘテロクロマチンと共存する。研究により、ＭｅＣＰ２が、非常に多数の遺伝子の抑制および活性化の両方で、ＲＮＡスプライシングの調節で示唆されており、神経ゲノム全体に影響を与える全体的クロマチン構造に影響することが示唆されていることから、ニューロンにおけるＭｅＣＰ２の役割は柔軟かつ複雑であることが明らかになっている。
【０００５】
ＲＴＴマウスモデルを用いて実施された試験で、成熟神経細胞でのＭｅＣＰ２機能障害がＲＴＴ症状の原因であること、そしてＲＴＴ発症後であってもＣＮＳでのＭｅＣＰ２欠乏の出生後回復によって神経症状の好転が生じ得ることが明らかになっている。これらの知見により、それでもなお正しいＭｅＣＰ２用量の重要性を考慮して、ＭｅＣＰ２欠乏神経細胞においてＭｅＣＰ２上昇を誘発し得る薬理処置によってＲＴＴレスキューが達成され得るという考えに至っている。
【０００６】
ＭＥＣＰ２ナンセンス突然変異によって、古典的ＲＴＴの割合が大きくなり（４０％まで）、早期翻訳終了に至り、短縮タンパク質産物が生じる。最も一般的なＲＴＴナンセンス突然変異Ｒ１６８Ｘ、Ｒ２５５Ｘ、Ｒ２７０ＸおよびＲ２９４Ｘを有する組換えＭｅＣＰ２構築物を用いる試験により、ゲンタマイシンおよびジェネテシンが、ナンセンス突然変異のヌクレオチド文脈に応じて１０から２２％までＭｅＣＰ２読み取り効率を回復し得ることが明らかになった[Brendel et al. (2009) Pediatr Res 65:520-523;Brendel et al., J Mol Med(2011)89:389-398]。さらに、回復されたＭｅＣＰ２タンパク質は細胞核にトレースされ、ゲンタマイシンがそれの核局在化を妨害しないことが示唆された。
【０００７】
しかしながら、ゲンタマイシンファミリーのアミノグリコシド類の臨床的適用性は、血液脳関門を通過する限られた透過率[Keeling KM、Bedwell DM (2005) Current Pharmacogenomics 3:259-269]に加えて、長期投与および準毒性用量での抑制効率低下に関連する並行する強い毒性の所見によって損なわれてきた[Kerem E (2004) Curr Opin Pulm Med 10:547-552]。
【０００８】
【化１】
2017516835.tif 000003
【０００９】
いくつかの最近開発された合成アミノグリコシド類は、ＲＴＴモデルでの大幅に高い抑制およびイン・ビトロでの急性毒性低下で明らかな、ゲンタマイシンと比較して有意に改善した効果を示している[Kandasamy et al. J Med Chem 2012;55:10630-43;Vecsler et al. PLoS One 2011;6:e20733]。
【００１０】
本発明者らの一部によるＷＯ２００７／１１３８４１（参照によって、あたかも全体が本明細書に記載されているかのように組み込まれる）には、哺乳動物細胞での低細胞毒性および低い抗微生物活性を発揮しながら、高い早期終止コドン突然変異リードスルー活性を特異的に示すよう設計されていることから、遺伝病の治療で用いることができるパロモマイシン由来アミノグリコシド類が記載されている。この種類のパロモマイシン由来アミノグリコシド類は、リードスルー活性を高め、毒性および抗微生物活性を低下させるパロマミン核（コア）のある種の操作を導入することで設計されたものである。それらの操作は、パロマミン核のいくつかの位置で行われた。
【００１１】
【化２】
2017516835.tif 000004
【００１２】
ＷＯ２００７／１１３８４１に記載されているパロマミン核のそのような操作の一つは、アミノグリコシド核の６′位のヒドロキシル基の有用な役割の決定である（例えば、下記のＮＢ３０およびＮＢ５４参照）。
【００１３】
【化３】
2017516835.tif 000005
【００１４】
ＷＯ２００７／１１３８４１で定義され、示されたパロマミン核の別の操作は、アミノグリコシド核の３′位、５位および／または６位での１以上の単糖部分または一つのオリゴ糖部分の導入である。この操作は、本明細書上記で示した例示化合物ＮＢ３０およびＮＢ５４における「環ＩＩＩ］として反映されている。
【００１５】
ＷＯ２００７／１１３８４１出て意義され、示されたパロマミン核の別の操作は、パロマミン核の１位での（Ｓ）−４−アミノ−２−ヒドロキシブチリル（ＡＨＢ）部分の導入である。この操作は、本明細書上記で示した例示化合物ＮＢ５４において反映されている。そのようなＡＨＢ部分導入によって、リードスルー活性の強化および毒性低下が生じることが示されている。
【００１６】
ＷＯ２００７／１１３８４１に記載されているパロマミン核の別の操作は、６′位での水素のメチル置換基などのアルキルによる置換である。この操作は、それぞれＮＢ７４およびＮＢ８４と称される、化合物ＮＢ３０およびＮＢ５４の誘導体で例示されている。
【００１７】
【化４】
2017516835.tif 000006
【００１８】
Ｖｅｃｓｌｅｒら[Vecsler et al. (2011) PLoS ONE 6(6): e20733]は、ＷＯ２００７／１１３８４１（ＮＢ５４）に開示の化合物の一つが５０ｍｇ／ｍＬという低い濃度で明らかであったゲンタマイシンより効率的に、ＭＥＣＰ２ナンセンス突然変異の用量依存的抑制を誘発することを示している。リードスルー活性は突然変異特異的であり、Ｒ１６８Ｘ（３８％）、Ｒ２７０Ｘ（２７％）およびＲ２９４Ｘ（１８％）で最大全長ＭｅＣＰ２回復があった。さらに、回復されたＭｅＣＰ２は細胞核に転座し、最も重要なＭｅＣＰ２下流エフェクターの一つである脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の並行する増加を生じた。
【００１９】
Ｂｒｅｎｄｅｌら[Brendel et al (2011), supra]は、ＭＥＣＰ２遺伝子にＲ１６８Ｘ突然変異を有するマウスモデルで実施した試験について記述している。変異ＭｅＣＰ２融合タンパク質を発現するトランスフェクトＨｅＬａ細胞およびマウスモデルから単離されたマウス耳線維芽細胞を、ゲンタマイシンおよびＷＯ２００７／１１３８４１に記載のアミノグリコシド類縁体の一部（ＮＢ３０、ＮＢ５４およびＮＢ８４）で処理した。ゲンタマイシンを用いるマウス耳線維芽細胞におけるＲ１６８Ｘ突然変異のリードスルーが検出されたが、ＨｅＬａ細胞の場合より低いレベルであり、リードスルー産物である全長Ｍｅｃｐ２タンパク質が核にあった。ＮＢ５４およびＮＢ８４により、ゲンタマイシンより効率的にリードスルーを誘発し、ナンセンス突然変異のリードスルーがトランスフェクトＨｅＬａ細胞だけでなく、発生したＭｅｃｐ２Ｒ１６８Ｘマウスモデルの線維芽細胞でも達成された。
【００２０】
本発明者らの一部による国際特許出願公開番号ＷＯ２０１２／０６６５４６（参照によって、あたかもそれが本明細書において完全に記載されているかのように組み込まれる）には、パロマミン核のさらなる操作が記載されており、それにより環ＩＩＩ上の５″位におけるアルキル付加を有するパロモマイシンの環Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩに基づく核構造を特徴とする、擬似三糖類アミノグリコシドを生じる。ＷＯ２０１２／０６６５４６に開示の例示的アミノグリコシド類の化学構造は、背景技術の図１に提供されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２１】
【特許文献１】ＷＯ２００７／１１３８４１
【特許文献２】ＷＯ２０１２／０６６５４６
【非特許文献】
【００２２】
【非特許文献１】Brendel et al. (2009) Pediatr Res 65:520-523
【非特許文献２】Brendel et al., J Mol Med(2011)89:389-398
【非特許文献３】Keeling KM、Bedwell DM (2005) Current Pharmacogenomics 3:259-269
【非特許文献４】Kerem E (2004) Curr Opin Pulm Med 10:547-552
【非特許文献５】Kandasamy et al. J Med Chem 2012;55:10630-43;
【非特許文献６】Vecsler et al. PLoS One 2011;6:e20733
【発明の概要】
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態の１態様によれば、個々の実施形態のいずれか一つにおける治療上有効量の本明細書に記載の式Ｉによって表される化合物を対象者に投与することを含む、処置を必要とする対象者でのレット症候群の治療方法が提供される。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態の１態様によれば、処置を必要とする対象者でのレット症候群の治療で使用される、個々の実施形態のいずれか一つにおける本明細書に記載の式Ｉによって表される化合物が提供される。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態の１態様によれば、処置を必要とする対象者でのレット症候群の治療用の医薬製造における、個々の実施形態のいずれか一つでの本明細書に記載の式Ｉによって表される化合物の使用が提供される。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態の１態様によれば、レット症候群の治療で使用される、包装材料に包装され、当該包装材料内もしくはその上での印字で識別される、個々の実施形態のいずれか一つにおける本明細書に記載の式Ｉによって表される化合物および医薬として許容される担体を含む医薬組成物が提供される。
【００２７】
本発明の実施形態によれば、化合物は、下記のように式Ｉによって表されるか、それの医薬として許容される塩である。
【００２８】
【化５】
2017516835.tif 000007
【００２９】
式中、
Ｒ１は、アルキル、シクロアルキルおよびアリールからなる群から選択され；
Ｒ２は、水素または（Ｓ）−４−アミノ−２−ヒドロキシブチリル（ＡＨＢ）であり；
Ｒ３は、水素、アルキル、シクロアルキルおよびアリールからなる群から選択され；
６′位および５″位のそれぞれの立体配置が独立にＲ配置またはＳ配置である。
【００３０】
本明細書に記載の実施形態のいずれかの一部によれば、Ｒ１はアルキルである。
【００３１】
本明細書に記載の実施形態のいずれかの一部によれば、アルキルはメチルである。
【００３２】
本明細書に記載の実施形態のいずれかの一部によれば、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ水素である。
【００３３】
本明細書に記載の実施形態のいずれかの一部によれば、Ｒ２はＡＨＢであり、Ｒ３は水素である。
【００３４】
本明細書に記載の実施形態のいずれかの一部によれば、Ｒ２は水素であり、Ｒ３はアルキルである。
【００３５】
本明細書に記載の実施形態のいずれかの一部によれば、Ｒ２はＡＨＢであり、Ｒ３はアルキルである。
【００３６】
本明細書に記載の実施形態のいずれかの一部によれば、アルキルはメチルである。
【００３７】
本明細書に記載の実施形態のいずれかの一部によれば、当該化合物は、化合物ＮＢ１１８、ＮＢ１１９、ＮＢ１２２、ＮＢ１２３、ＮＢ１２４、ＮＢ１２５、ＮＢ１２７およびＮＢ１２８からなる群から選択される。
【００３８】
本明細書に記載の実施形態のいずれかの一部によれば、当該化合物は、化合物ＮＢ１２２、ＮＢ１２３、ＮＢ１２４、ＮＢ１２７およびＮＢ１２８からなる群から選択される。
【００３９】
本明細書に記載の実施形態のいずれかの一部によれば、当該化合物はＮＢ１２２である。
【００４０】
本明細書に記載の実施形態のいずれかの一部によれば、当該化合物はＮＢ１２４である。
【００４１】
本明細書に記載の実施形態のいずれかの一部によれば、当該化合物はＮＢ１２７である。
【００４２】
本明細書に記載の実施形態のいずれかの一部によれば、レット症候群は、ＭＥＣＰ２早期終止コドン突然変異に関連する。
【００４３】
本明細書に記載の実施形態のいずれかの一部によれば、突然変異はナンセンス突然変異である。
【００４４】
本明細書に記載の実施形態のいずれかの一部によれば、ＭＥＣＰ２ナンセンス突然変異は、Ｒ１６８Ｘ、Ｒ２５５Ｘ、Ｒ２７０ＸおよびＲ２９４Ｘからなる群から選択される。
【００４５】
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および／または科学用語は、本発明が関係する業界の当業者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様もしくは等価な方法および材料が本発明の実施形態の実施もしくは試験で使用可能であるが、例示的な方法および／または材料について、下記で説明する。矛盾がある場合、定義を含む特許明細書が優先する。さらに、材料、方法および実施例は説明のみを目的とするものであり、必ずしも限定的なわけではない。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】非処理細胞と比較した、ＮＢ１２４の３日間にわたって４００μｇ／ｍＬで処理したヒトＲ２９４Ｘレット症候群男性および女性患者由来の線維芽細胞について得られたハイコンテントスクリーニング自動顕微鏡写真である。
【図２Ａ】自動アルゴリズムを用いて計算した、未処理または各種濃度のＮＢ１２４で処理したヒトＲ２９４Ｘレット症候群男性患者由来の線維芽細胞におけるＭＥＣＰ２陽性細胞の数を表す棒グラフである。
【図２Ｂ】自動アルゴリズムを用いて計算した、未処理または各種濃度のＮＢ１２４で処理したヒトＲ２９４Ｘレット症候群女性患者由来の線維芽細胞におけるＭＥＣＰ２陽性細胞の数を表す棒グラフである。
【図３】アミノグリコシド類のリードスルー活性を求めるための、例示的なＲＴＴナンセンス突然変異を特徴とする核酸構築物を用いて実施したアッセイの図である。
【図４】実施例４に記載のモデルで使用した全てのＤＡＰＩ標識細胞からの細胞核でのＭｅＣＰ２で染色された細胞の割合を示す棒グラフである。
【図５−１】図５Ａはレット症候群患者のヒト線維芽細胞におけるＭｅＣＰ２発現レベルを示すグラフである。
【図５−２】図５Ｂはレット症候群患者のヒト線維芽細胞におけるＭｅＣＰ２発現レベルを示すグラフである。図５Ｃはレット症候群患者のヒト線維芽細胞におけるＭｅＣＰ２発現レベルを示すグラフである。
【図６】図６Ａは男性レット症候群患者のヒト線維芽細胞でのＭｅＣＰ２染色細胞のパーセントを示す比較プロットである。図６Ｂは男性レット症候群患者のヒト線維芽細胞でのＭｅＣＰ２染色細胞のパーセントを示す比較プロットである。
【図７】ＮＢ１２２、ＮＢ１２４、ＮＢ１２７もしくはＧ４１８による処理の３日後のレット症候群男性患者のヒト線維芽細胞でのＤＡＰＩにおける陽性染色細胞の数を示す比較プロットである。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
本明細書では、添付の図面を参照しながら、本発明の一部の実施形態について説明するが、これらは例としてのみのものである。ここで、図面について詳細に具体的参照を行うと、強調すべき点として、示されている特定のものは、例示的なものであって、本発明の実施形態についての説明を目的としたものである。これに関しては、図面を用いて行われる説明によって、本発明の実施形態を実施する方法が当業者には明らかになる。
【００４８】
図面において、
図１は、非処理細胞と比較した、ＮＢ１２４の３日間にわたって４００μｇ／ｍＬで処理したヒトＲ２９４Ｘレット症候群男性および女性患者由来の線維芽細胞について得られたハイコンテントスクリーニング自動顕微鏡写真を提供する。ＭｅＣＰ２タンパク質の局在を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ  Ｉｍａｇｅｘｐｒｅｓｓ  ｍｉｃｒｏ  ｘｌによって肉眼観察した。
【００４９】
図２ＡからＢは、自動アルゴリズムを用いて計算した、未処理または各種濃度のＮＢ１２４で処理したヒトＲ２９４Ｘレット症候群男性（図２Ａ）および女性（図２Ｂ）患者由来の線維芽細胞におけるＭＥＣＰ２陽性細胞の数を表す棒グラフである。
【００５０】
図３は、アミノグリコシド類のリードスルー活性を求めるための、例示的なＲＴＴナンセンス突然変異を特徴とする核酸構築物を用いて実施したアッセイを提供する。
【００５１】
図４は、実施例４に記載のモデルで使用した全てのＤＡＰＩ標識細胞からの細胞核でのＭｅＣＰ２で染色された細胞の割合を示す棒グラフである。
【００５２】
図５ＡからＣは、レット症候群患者のヒト線維芽細胞におけるＭｅＣＰ２発現レベルを示す棒グラフである。未処理Ｒ１６８Ｘ女性およびＲ２９４Ｘ男性（図５Ａ）、Ｒ２９４Ｘ男性に対する未処理または０．１７から１．６７ｍＭのＮＢ１２２、ＮＢ１２４、ＮＢ１２７処理（図５Ｂ）、ならびにＲ２９４Ｘ男性に対する未処理または０．３から１ｍＭゲンタマイシンもしくはＧ４１８処理（図５Ｃ）の３日後のレット症候群患者からのヒト線維芽細胞の細胞核での積分ＭｅＣＰ２染色強度（２領域）。０．５ｍＭ用量のＮＢ１２２、ＮＢ１２４およびＮＢ１２７に関しては、単一データのみを考慮する。
【００５３】
図６ＡからＢは、男性レット症候群患者のヒト線維芽細胞でのＭｅＣＰ２染色細胞のパーセントを示す比較プロットを提供する。未処理または０．１７から１．６７ｍＭのＮＢ１２２、ＮＢ１２４もしくはＮＢ１２７処理（図６Ａ）、および未処理または０．３から１ｍＭゲンタマイシンもしくはＧ４１８処理（図６Ｂ）の３日後のＤＡＰＩにおける総陽性染色細胞のＲ２９４Ｘ突然変異を有する男性レット症候群患者からのヒト線維芽細胞の細胞核でＭｅＣＰ２について染色された細胞の数。０．５ｍＭ用量のＮＢ１２２、ＮＢ１２４およびＮＢ１２７に関しては、単一データのみを考慮する。
【００５４】
図７は、ＮＢ１２２、ＮＢ１２４、ＮＢ１２７もしくはＧ４１８による処理の３日後のレット症候群男性患者のヒト線維芽細胞でのＤＡＰＩにおける陽性染色細胞の数を示す比較プロットを提供する。
発明の特定の実施形態の説明
本発明は、それのいくつかの実施形態において、治療法、詳細には組成物およびレット症候群の治療でアミノグリコシド類縁体を用いる方法に関するものであるが、これらに限定されるものではない。
【００５５】
本発明の少なくとも一つの実施形態を詳細に説明する前に、理解すべき点として、本発明は、それの応用において、下記の説明に記載され、実施例によって例示される詳細に必ずしも限定されるものではない。本発明は、他の実施形態であることができるか、多様な形態で実施もしくは実行することができる。
【００５６】
本発明者らは、イン・ビトロおよびイン・ビボの両方の試験で、トランスジェニックマウスモデルおよびヒト線維芽細胞を用いて、ＷＯ２０１２／０６６５４６および本明細書の個々の実施形態のいずれか一つで開示の環ＩＩＩ上の５″位にアルキルの付加を有するパロモマイシンの環Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩに基づく核構造を特徴とする擬似三糖アミノグリコシドが、レット症候群関連の切断変異の高抑制活性、すなわちレット症候群関連の早期終止コドン突然変異のリードスルー誘発における高活性を有することを明らかにした。
【００５７】
下記の実施例セクションに示したように、本明細書で提供の化合物は、切断変異抑制活性、すなわちレット症候群関連の各種例示的早期終止コドン突然変異のリードスルーを誘発する能力を有することが明らかになった。そのような活性によって、これらの化合物は、レット症候群、例えば切断変異（早期終止コドン突然変異）、例えばナンセンス切断変異を特徴とするレット症候群の治療のための治療活性薬剤としての使用に非常に好適なものとなる。
【００５８】
従って、本発明の１態様によれば、処置を必要とする対象者でのレット症候群の治療方法が提供される。その方法は、本発明のこの態様によれば、治療上有効量の１以上の本明細書で式Ｉによって表される化合物（それの実施形態のいずれか一つを含む）を対象者に投与することによって実行される。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「治療する」という用語は、ある状態の抑止、実質的阻害、遅延または進行逆転、ある状態の臨床的もしくは美容的症状の実質的改善、またはある状態の臨床的もしくは美容的症状の出現の実質的予防を含む。
【００６０】
本明細書で使用される場合、「治療上有効量」という表現は、治療される状態の１以上の症状をある程度軽減する、投与されるポリマーの量を説明するものである。
【００６１】
本発明のいくつかの実施形態の１態様によれば、処置を必要とする対象者でのレット症候群の治療で使用される、本発明の実施形態のいずれか一つに記載の式Ｉによって表される化合物が提供される。
【００６２】
本発明のいくつかの実施形態の１態様によれば、処置を必要とする対象者でのレット症候群の治療のための医薬製造における、本発明の実施形態のいずれか一つに記載の式Ｉによって表される化合物の使用が提供される。
【００６３】
本発明のいくつかの実施形態の１態様によれば、処置を必要とする対象者でのレット症候群の治療で使用されることが確認されている、医薬として許容される担体および本発明の実施形態のいずれか一つに記載の式Ｉによって表される化合物を含む医薬組成物が提供される。
【００６４】
本発明の実施形態のいずれか一つにおいて、「レット症候群」という表現は、本明細書において、表現ＲＴＴおよびＭＩＭ３１２７５０と互換的に使用され、当業界で広く知られているＸ染色体性出生後神経発達障害を説明するものである。レット症候群は代表的には、当業界で知られている症状の出現で診断され（その一部は、本明細書で上記の背景セクションに挙げてある）、それは当該障害の原因となる遺伝子変異の存在（および／または種類）を確認するための臨床検査によって裏付けることもできる。本明細書においては、定型、非定型および先天性レット症候群が包含される。
【００６５】
本発明の一部の実施形態において、定型レット症候群は、メチル−ＣｐＧ結合タンパク質−２、ＭｅＣＰ２をコードするメチルＣｐＧ結合タンパク質２、すなわちＭＥＣＰ２遺伝子における突然変異に関連する。ＭＥＣＰ２遺伝子は、Ｘｑ２８のＸ染色体の長鎖の末端近くに認められる。
【００６６】
乳児痙攣または早発性癲癇を特徴とする例示的な非定型ＲＴＴは、サイクリン依存性キナーゼ様５（ＣＤＫＬ５）をコードする遺伝子に対する突然変異によって引き起こされると仮定される。
【００６７】
一部の実施形態において、本明細書に記載の突然変異のいずれかについて、突然変異はデノボ突然変異であり、それは遺伝されず、対象者の両親は、ＭＥＣＰ２突然変異またはレット症候群関連のいずれか他の突然変異以外は遺伝型的に正常である。
【００６８】
他の実施形態において、本明細書に記載の突然変異のいずれかについて、突然変異は遺伝によるものである。これらの実施形態の一部において、その突然変異はＸ染色体の男性コピー由来である。これらの実施形態の一部において、その突然変異は、ＭｅＣＰ２をコードする遺伝子における生殖細胞変異を有する表現型的に正常な母親から遺伝されたものである。
【００６９】
本明細書に記載の実施形態のいずれか一つの一部において、レット症候群は、切断変異または早期終止コドン突然変異に関連している。
【００７０】
本明細書に記載の実施形態のいずれか一つの一部において、レット症候群は、本明細書においてＭＥＣＰ２早期終止コドン突然変異とも称されるＭｅＣＰ２（それの両方のアイソフォームを含む）をコードする遺伝子における切断変異または早期終止コドン突然変異に関連する。
【００７１】
一部の実施形態において、突然変異、例えばＭＥＣＰ２早期終止コドン突然変異は、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異またはフレームシフト突然変異であることができる。
【００７２】
一部の実施形態において、突然変異、例えばＭＥＣＰ２早期終止コドン突然変異はナンセンス突然変異である。
【００７３】
本明細書に記載の実施形態のいずれか一つの一部において、レット症候群は、当業界で公知のＭＥＣＰ２突然変異（約２００が現在知られている）の１以上に関連している。
【００７４】
一部の実施形態において、レット症候群は、当業界で公知のように、ＭＥＣＰ２ナンセンス突然変異：Ｒ１６８Ｘ、Ｒ２５５Ｘ、Ｒ２７０ＸおよびＲ２９４Ｘの１以上に関連している。
【００７５】
本明細書に記載の方法および使用のいずれかにおいて、本明細書に記載の化合物はそれ自体で用いることができるか、医薬として許容される担体をさらに含む医薬組成物の一部を形成することができる。
【００７６】
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」は、本明細書で提供の化合物と医薬として許容される好適な担体および賦形剤などの他の化学成分の製剤を指す。医薬組成物の目的は、化合物の生物への投与を行いやすくすることである。
【００７７】
以下、「医薬として許容される担体」という用語は、生物に対してあまり刺激を起こさず、投与された化合物の生理活性および特性を抑制する担体または希釈剤を指す。担体の例には、プロピレングリコール、生理食塩水、乳濁液および有機溶媒と水との混合物、ならびに固体（例えば、粉末）および気体担体があるが、これらに限定されるものではない。
【００７８】
本明細書において、「賦形剤」という用語は、化合物の投与をさらに行いやすくするために医薬組成物に加える不活性物質を指す。賦形剤の例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、各種糖および各種デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコール類などがあるが、これらに限定されるものではない。
【００７９】
薬剤の製剤および投与の技術は、″Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ″  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ（最新版）（参照によって本明細書に組み込まれる）にある。
【００８０】
本発明の医薬組成物は、当業界で公知の方法により、例えば従来の混和、溶解、造粒、糖衣錠形成、すりつぶし、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥プロセスによって製造することができる。
【００８１】
従って、本発明による使用のための医薬組成物は、本明細書で提供される化合物を医薬として使用可能な製剤に加工するのを容易にする賦形剤および補助剤を含む１以上の医薬として許容される担体を用いて、従来の方法で製剤することができる。適切な製剤は、選択される投与経路によって決まる。
【００８２】
一部の実施形態によれば、投与は経口で行う。経口投与の場合、本発明で提供される化合物は、当該化合物を当業界で公知の医薬として許容される担体を組み合わせることで容易に製剤することができる。そのような担体によって、本明細書で提供の化合物を、患者による経口摂取用の錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などに製剤することができる。経口使用のための薬理製剤は、固体賦形剤を用い、適宜に得られた混合物を粉砕し、所望に応じて好適な補助剤を加えた後に顆粒混合物を加工して、錠剤もしくは糖衣錠核を得て製造することができる。好適な賦形剤は特には、糖類、例えば乳糖、ショ糖、マンニトールもしくはソルビトールなどの充填剤；例えばトウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、ナトリウムカルボメチルセルロースなどのセルロース調製品；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理的に許容されるポリマーがある。所望に応じて、架橋ポリビニルピロリドン、寒天もしくはアルギン酸またはアルギン酸ナトリウムなどのそれの塩などの崩壊剤を加えることができる。
【００８３】
経口的に用いることができる医薬組成物には、ゼラチン製の押し込み式カプセルならびにゼラチンおよびグリセリンもしくはソルビトールなどの可塑剤製の軟密閉カプセルなどがある。押し込み式カプセルは、乳糖などの充填剤、デンプン類などの結合剤、タルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、適宜に安定剤と混合して有効成分を含むことができる。軟カプセルでは、本明細書で提供の化合物を、脂肪油、液体パラフィンまたは液体ポリエチレングリコール類などの好適な液体に溶解もしくは懸濁させることができる。さらに、安定剤を加えることができる。経口投与用の全ての製剤が、選択される投与経路に好適な製剤でなければならない。
【００８４】
注射用には、本明細書で提供の化合物は、水溶液、好ましくはプロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどの有機溶媒を含むもしくは含まないハンクス液、リンゲル液、または生理食塩水緩衝液などの生理的に適合性の緩衝液で製剤することができる。
【００８５】
経粘膜投与の場合、浸透剤を製剤で用いる。そのような浸透剤は通常は当業界で公知である。
【００８６】
糖衣錠核は、好適なコーティングで提供される。そのためには、アラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液および好適な有機溶媒もしくは溶媒混合物を含んでいても良い濃縮糖溶液を用いることができる。色素または顔料を錠剤もしくは糖衣錠コーティングに加えることで識別できるようにするか、活性アミノグリコシド化合物用量の異なる組み合わせを特性決定することができる。
【００８７】
口腔投与の場合、組成物は従来法で製剤された錠剤またはロゼンジ剤の形態を取ることができる。
【００８８】
吸入による投与の場合、本明細書で提供の化合物は、好適な推進剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロ−テトラフルオロエタンもしくは二酸化炭素を用いる加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提供の形態（代表的には粉末、液化および／または気体担体などがある）で簡便に送達される。加圧エアロゾルの場合、用量単位は、計量された量を送達するためのバルブを提供することで決定することができる。例えば吸入器または注入器で使用するためのゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、本明細書で提供の化合物および乳糖もしくはデンプンなど（それらに限定されるものではない）の好適な粉末の粉末混合物を含んで製剤することができる。
【００８９】
本明細書で提供の化合物は、例えばボラス注射および連続注入による非経口投与用に製剤することができる。注射用製剤は、単位投与剤形(単位製剤)で、例えば適宜に保存剤を添加したアンプルもしくは多用量容器で提供され得る。その組成物は、油系もしくは水系媒体中の懸濁液剤、液剤もしくは乳濁液剤であることができ、懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤を含むことができる。
【００９０】
非経口投与用の医薬組成物には、水溶性形態での化合物調製物の水溶液などがある。さらに、本明細書で提供される化合物の懸濁液剤は、適切な油状注射懸濁液剤および乳濁液剤（例えば、油中水型、水中油型または油中水／油乳濁液）として製剤することができる。好適な親油性溶媒もしくは媒体には、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルなどの合成脂肪酸エステル、トリグリセリド類もしくはリポソーム類などがある。水系注射用懸濁液は、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどの懸濁液の粘度を高める物質を含むことができる。適宜に、懸濁液剤は、安定化剤または本明細書で提供の化合物の溶解度を高めて高濃縮溶液の調製を可能とする薬剤を含むこともできる。
【００９１】
あるいは、本明細書で提供の化合物は、使用前に好適な媒体、例えば無菌のパイロジェンフリー水で再構成（再生）する粉剤（粉末型）であることができる。
【００９２】
本明細書で提供の化合物は、例えばココアバターまたは他のグリセリド類などの従来の坐剤基剤を用いて、坐剤または停留かん腸などの直腸組成物に製剤することもできる。
【００９３】
本明細書に記載の医薬組成物は、ゲル相担体または賦形剤の好適なゲルを含むこともできる。そのような担体または賦形剤の例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、各種糖類、デンプン類、セルロース誘導体、ゼラチンおよびポリエチレングリコール類などのポリマーなどがあるが、これらに限定されるものではない。
【００９４】
本発明の文脈で使用するのに好適な医薬組成物には、所期の目的を達成する上で有効な量で有効成分を含む組成物などがある。より具体的には、治療上有効量は、障害の症状を予防、緩和もしくは改善するか、治療される対象者の生存を延長する上で有効な本明細書で提供の化合物の量を意味する。
【００９５】
治療上有効量の決定は、特に本明細書で提供の詳細な開示を考慮すれば、当業者の能力の範囲内である。
【００９６】
本実施形態の方法で使用される本明細書で提供の化合物において、治療上有効な量もしくは用量を、最初に動物での活性アッセイから推定することができる。例えば、１用量を動物モデルで製剤して、活性アッセイによって求められる突然変異抑制レベル（例えば、レット症候群関連の切断変異の実質的リードスルーを達成する試験化合物の濃度）を含む循環濃度範囲を達成することができる。そのような情報を用いて、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。
【００９７】
本明細書で提供の化合物の毒性および治療効力は、実験動物での標準的な製薬手順により、例えば対象化合物についてのＥＣ５０（最大効果の５０％が観察される化合物濃度）およびＬＤ５０（試験動物の５０％で死亡を生じる致死量）を求めることで決定することができる。これらの活性アッセイおよび動物試験から得られるデータを、ヒトで使用するための用量範囲を製剤するのに用いることができる。
【００９８】
用量は、使用される製剤および用いられる投与経路に応じて変動し得る。実際の製剤、投与経路および用量は、患者の状態を効力して個々の医師が選択することができる（例えばFingl et al., 1975, ″The Pharmacological Basis of Therapeutics″, Ch. 1 p.1参照）。
【００９９】
投薬量および投与間隔を個別に調節して、最小有効濃度（ＭＥＣ）と称される所望の効果を維持するのに十分な本明細書で提供の化合物の血漿レベルを提供することができる。ＭＥＣは、各製剤で変動するが、イン・ビトロデータ、例えば、切断変異を有する遺伝子全体の５０％から９０％発現を達成するのに必要な化合物の濃度、すなわち突然変異コドンのリードスルーから推定することができる。ＭＥＣを達成するのに必要な用量は、個体の特徴および投与経路によって決まる。ＨＰＬＣアッセイおよびバイオアッセイを用いて、血漿濃度を求めることができる。
【０１００】
ＭＥＣ値を用いて、投与間隔を決定することもできる。製剤は、１０％から９０％、好ましくは３０％から９０％、最も好ましくは５０％から９０％の時間にわたりＭＥＣより高い血漿レベルを維持する投与法を用いて投与すべきである。
【０１０１】
治療される慢性状態の重度および応答性に応じて、投与は上記で記載の徐放組成物の単一の定期的投与であることもでき、定期的治療の経過は数日から数週間または定期的治療中に十分な緩和が得られるまで、もしくは障害状態の大幅な軽減が定期的治療にわたって達成されるまで続く。
【０１０２】
投与される組成物の量は、当然のことながら、治療される対象者、苦痛の重度、投与方法、処方医の判断などによって決まる。
【０１０３】
本発明の組成物は所望に応じて、有効成分を含む１以上の単位の製剤を含むことができるＦＤＡ（米国食品医薬品局）承認キットなどのパックもしくはディスペンサー機器で提供することができる。パックは例えば、ブリスタパックもしくは加圧容器（吸入用）など（これらに限定されるものではない）の金属もしくはプラスチックホイルを含むことができる。そのパックまたはディスペンサー機器には、投与説明書が入っていても良い。パックおよびディスペンサーには、医薬の製造、使用もしくは販売を規制する政府当局が規定する書式で容器に添付の通知書が入っていても良く、その通知書はヒトもしくは動物投与のための組成物の形態についての当局の承認を反映するものである。そのような通知書は例えば、処方薬について米国食品医薬品局が承認したラベル表示または承認製品添付文書のものであることができる。適合する医薬担体で製造した本発明の実施形態による化合物を含む組成物を、本明細書に記載の実施形態のいずれか一つおよびそれらのいずれかの組み合わせに従って、調製し、適切な容器に入れ、レット症候群治療用にラベル表示することもできる。
【０１０４】
本明細書に記載の組成物、方法および使用のいずれにおいても、当該化合物を、遺伝障害の治療における他の薬剤と組み合わせて用いることができる。
【０１０５】
主として慢性である遺伝障害の治療に向けたものであることから、本明細書で提供の化合物またはそれを含む医薬組成物は、治療を受ける対象者の生涯を通じて、または少なくとも対象者の生涯のかなり部分にわたって投与されると予想される。従って、当該化合物を含む医薬組成物の投与形態は、容易であり、好ましくは自己投与により、投与に適したものであるようなものであるべきであり、患者の幸福および生涯に対して与える影響が最小限となるようなものでなければならない。
【０１０６】
本明細書で提供の化合物またはそれを含む医薬組成物の繰り返しおよび定期的投与は、例えば１日単位で、すなわち１日１回行うことができ、より好ましくは投与は、週単位で、すなわち１週間に１回行い、より好ましくは投与は月単位で、すなわち月１回行い、最も好ましくは投与は数ヶ月に１回（例えば、１．５ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、または６ヶ月ごと）行う。
【０１０７】
上記で記載のように、切断変異リードスルー薬として現在知られているアミノグリコシド類を用いることの制限のいくつかは、それらが主として抗細菌性であること（抗生剤として使用される）と関連している。抗細菌剤の慢性使用は、炎症性腸疾患の増悪などの他の医学的状態を引き起こしたり悪化させ得る、そして一部の病的微生物株における抵抗性出現を引き起こし得る腸内微生物叢を変えることから、全く保証のないものであり、生命の危険すらある。
【０１０８】
一部の実施形態において、本明細書で提供の化合物は実質的に抗細菌活性を持たない。「抗細菌活性がない」ということは、ある特定の菌株についてのそれの最小阻害濃度（ＭＩＣ）が、その菌株に関して抗生物質と考えられる化合物の濃度よりかなり高いことを意味する。さらに、これらの化合物のＭＩＣは、切断変異抑制活性を発揮するのに必要な濃度より顕著に高い。
【０１０９】
実質的に非殺細菌性であることから、本明細書で提供の化合物は上記の有害効果を発揮しないことから、標的とされないことから保存が必要ですらあり得る良性および／または有益な微生物を含み得る吸収経路によって投与することができる。本明細書で提供の化合物のこの特徴により、繰り返しおよび生涯にわたって投与可能であり、細菌関連の有害な累積効果を引き起こすことがなく、さらには経口もしくは直腸投与可能であり、すなわち消化管投与可能であり、それは慢性障害の治療を目的とする薬剤についての非常に有益かつ重要な特徴であることから、これら化合物はレット症候群に対して特に有効な薬剤となる。
【０１１０】
いずれかの実施形態およびそれら実施形態のいずれかの組み合わせを含む本明細書に記載の方法、使用および組成物のいずれかにおいて、レット症候群の治療で有用な化合物は、下記式Ｉによって集合的に表される化合物の１以上またはそれの医薬として許容される塩である。
【０１１１】
【化６】
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【０１１２】
式中、
Ｒ１は、アルキル、シクロアルキルおよびアリールからなる群から選択され、好ましくはアルキルであり；
Ｒ２は水素もしくは（Ｓ）−４−アミノ−２−ヒドロキシブチリル（ＡＨＢ）、または下記に記載のＡＨＢに対する代替物であり；
Ｒ３は、水素、アルキル、シクロアルキルまたはアリールからなる群から選択され、好ましくは水素またはアルキルであり；
６′位および５″位のそれぞれの立体配置は、独立にＲ配置またはＳ配置である。
【０１１３】
本発明の実施形態はさらに、式Ｉのように環ＩおよびＩＩを特徴とする化合物を包含し、式Ｉに描いた環ＩＩＩは環ＩＩ上のＯ５以外の位置であり、例えば環ＩＩ上のＯ６位および／または環Ｉ上の３′位および４′位の１以上にある。これらの実施形態の一部において、当該化合物は、環ＩまたはＩＩの一つの位置に結合した本明細書で描かれた環ＩＩＩを有する三糖類である。
【０１１４】
本明細書で使用される「ヒドロキシル」または「ヒドロキシ」という用語は、−ＯＨ基を指す。
【０１１５】
本明細書で使用される場合、「アミン」という用語は、−ＮＲ′Ｒ″基を記述するものであり、Ｒ′およびＲ″のそれぞれは独立に水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロ脂環式、アリールまたはヘテロアリールであり、これらの用語は本明細書で定義されている。
【０１１６】
本明細書で使用される場合、「アルキル」という用語は、直鎖基および分岐基を含む脂肪族炭化水素を記述するものである。アルキルは、１から２０個の炭素原子または１から１０個の炭素原子を有することができ、分岐または未分岐であることができる。本発明の一部の実施形態によれば、アルキルは、１から４個の炭素原子を有する低級アルキルである（すなわち、メチル、エチル、プロピルおよびブチル）。
【０１１７】
「シクロアルキル」という用語は、３以上の炭素原子を含む全て炭素の単環式環もしくは縮合環（すなわち、隣接する炭素原子対を共有する複数の環）の分岐もしくは未分岐基を指し、環のうちの１以上が完全に共役したπ原子系を有さず、さらには置換されているか置換されていないことができる。シクロアルキル基の例には、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルまたはシクロドデシルなどがある。
【０１１８】
本明細書において数字範囲、例えば「１から１０」が記載されている場合は必ず、それによって、基、この場合はアルキル基は１個の炭素原子、２個の炭素原子、３個の炭素原子など、１０個までの炭素原子を含むことができることが示唆される。一部の実施形態において、アルキルは、１から６個または１から４個の炭素原子を含む低級アルキルである。アルキルは、置換されているか置換されていないものであることができる。置換されている場合、その置換基は、例えば、アルキル（分岐アルキルを形成）、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシおよびヒドロキシアルキルであることができ、これらの用語は下記で定義されている。本明細書で使用される「アルキル」という用語は、飽和もしくは不飽和炭化水素も包含することから、この用語はさらにアルケニルおよびアルキニルを包含する。
【０１１９】
「アルケニル」という用語は、少なくとも２個の炭素原子および少なくとも１個の炭素−炭素二重結合を有する本明細書で定義の不飽和アルキルを記述するものであり、例えばアリル、ビニル、３−ブテニル、２−ブテニル、２−ヘキセニルおよびｉ−プロペニルなどがある。アルケニルは、上記で記載のように１以上の置換基によって置換されていることができるか、置換されていないものであることができる。
【０１２０】
本明細書で定義の「アルキニル」という用語は、少なくとも２個の炭素原子および少なくとも１個の炭素−炭素三重結合を有する不飽和アルキルである。アルキニルは、上記で記載のように１以上の置換基によって置換されていることができるか、置換されていないものであることができる。
【０１２１】
「アリール」という用語は、完全に共役したπ原子系を有する全て炭素の単環式環もしくは縮合環多環式（すなわち、隣接する炭素原子対を共有する複数の環）基を記述するものである。アリール基は、上記で記載のように１以上の置換基によって置換されていることができるか、置換されていないものであることができる。
【０１２２】
「ヘテロアリール」という用語は、環に１以上の例えば窒素、酸素および硫黄などの原子を有し、さらに完全に共役したπ電子系を有する単環式もしくは縮合環式（すなわち、隣接する炭素原子対を共有する複数の環）基を記述するものである。ヘテロアリール基の例には、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピリミジン、キノリン、イソキノリンおよびプリンなどがあるが、これらに限定されるものではない。ヘテロアリール基は、上記で記載のように１以上の置換基によって置換されていることができるか、置換されていないものであることができる。代表例には、チアジアゾール、ピリジン、ピロール、オキサゾール、インドール、プリンなどがある。
【０１２３】
本明細書で使用される「ヘテロ脂環式」という用語は、環において１以上の窒素、酸素および硫黄などの原子を有する単環式もしくは縮合環式基を記述するものである。それらの環は１以上の二重結合を有していても良い。しかしながら、それらの環は、完全共役π電子系を持たない。ヘテロ脂環式は置換されているか置換されていないものであることができる。置換されたヘテロ脂環式は１以上の置換基を有することができ、それにより、各置換基は独立に、例えばアルキルシクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリールおよびヘテロ脂環式であることができる。代表例は、モルホリン、ピペリジン、ピペラジン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピランなどである。
【０１２４】
本明細書で使用される「ハライド」という用語は、ハロゲン原子のアニオン、すなわちＦ−、Ｃｌ−、Ｂｒ−およびＩ−を指す。
【０１２５】
「ハロ」という用語は、置換基としてのＦ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩ原子を指す。
【０１２６】
「アルコキシ」という用語は、Ｒ′−Ｏ−アニオンを指し、Ｒ′は上記で定義の通りである。
【０１２７】
本明細書で使用される「ヒドロキシアルキル」という用語は、１個のヒドロキシ基で置換されているアルキル基、例えばヒドロキシメチル、ｐ−ｐヒドロキシエチルおよび４−ヒドロキシペンチルを指す。
【０１２８】
本明細書で使用される「アルコキシアルキル」という用語は、１個のアルコキシ基で置換されたアルキル基を指し、例えばメトキシメチル、２−メトキシエチル、４−エトキシブチル、ｎ−プロポキシエチルおよびｔ−ブチルエチルである。
【０１２９】
部分（Ｓ）−４−アミノ−２−ヒドロキシブチリルは、本明細書において、ＡＨＢとも称される。
【０１３０】
本発明の一部の実施形態によれば、ＡＨＢ部分への代替部分は、α−ヒドロキシ−β−アミノプロピオニル（ＡＨＰ）部分であることができる。これらのいわゆる側鎖または任意の部分は、標的部位へのアミノグリコシド修飾酵素の接近を妨害すると考えられている。さらに、ＡＨＢまたはＡＨＰは、ホスホジエステルおよび１６ＳｒＲＮＡのＡ部位のグアノシンのフーグスティーン塩基表面に結合する１，３−または１，２−ヒドロキシルアミン部分を含む。ここで留意すべき点として、本発明の一部の実施形態によれば、いずれかの立体化学を示す低級アルキルに沿ったカルボニル、ヒドロキシルおよびアミノ基の組み合わせが関与する他の部分は、ＡＨＢおよび／またはＡＨＰに代わる適宜の置換基であると想定される。例えば、２−アミノ−３−ヒドロキシブチリル、３−アミノ−２−ヒドロキシペンタノイル、５−アミノ−３−ヒドロキシヘキサノイルなどである。
【０１３１】
本明細書において、理解すべき点として、ＡＨＢについて言及する場合は必ず、本明細書に記載の均等基（例えば、ＡＨＰ）も包含される。
【０１３２】
本明細書で使用される場合、「部分」という表現は、化学反応を受けて、別の分子体に共有結合的に連結されている分子または基などの化学体の一部および好ましくは主要部分を記述するものである。この用語は本明細書において、化合物の骨格の個々の位置を置換する指定の基の遊離基を定義するのに用いられる。
【０１３３】
本発明の一部の実施形態によれば、Ｒ１はアルキルである。一部の実施形態によれば、Ｒ１は本明細書で定義の低級アルキルであり、メチル、エチル、プロピル、ブチルおよびイソプロピルなどがあるが、これらに限定されるものではない。一部の実施形態によれば、Ｒ１はメチルである。
【０１３４】
あるいは、Ｒ１はシクロアルキルであり、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルおよびシクロヘキシルなどがあるが、これらに限定されるものではない。
【０１３５】
さらに別形態として、Ｒ１はアリールであり、例えば置換されたもしくは置換されていないフェニルである。例としては、フェニルおよびトルエンなどがあるが、これらに限定されるものではない。
【０１３６】
本発明の一部の実施形態において、Ｒ１は本明細書に記載のアルキルであり、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ水素である。
【０１３７】
位置Ｒ２およびＲ３で水素を示すアミノグリコシド化合物の例には、下記のものなどがある。
【０１３８】
【化７】
2017516835.tif 000009
【０１３９】
これらは環ＩＩＩの５″位のキラル中心の立体配置において互いに異なっている。
【０１４０】
場合により、Ｒ１は本明細書で記載のシクロアルキルであり、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ水素である。そのような化合物は、環ＩＩＩの５″位でキラル中心のＲまたはＳ立体配置を有することができる。
【０１４１】
場合により、Ｒ１は本明細書で記載のアリールであり、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ水素である。そのような化合物は、環ＩＩＩの５″位でキラル中心のＲまたはＳ立体配置を有することができる。
【０１４２】
本発明の一部の実施形態において、Ｒ１は本明細書で記載のアルキルであり、Ｒ２はＡＨＢであり、Ｒ３は水素原子である。
【０１４３】
Ｒ２位にＡＨＢ部分およびＲ３に水素を有するアミノグリコシド化合物の例には、下記のものなどがある。
【０１４４】
【化８】
2017516835.tif 000010
【０１４５】
これらは環ＩＩＩの５″位のキラル中心の立体配置において互いに異なっている。
【０１４６】
場合により、Ｒ１は本明細書で記載のシクロアルキルであり、Ｒ２はＡＨＢであり、Ｒ３は水素原子である。そのような化合物は、環ＩＩＩの５″位でキラル中心のＲまたはＳ立体配置を有することができる。
【０１４７】
場合により、Ｒ１は本明細書で記載のアリールであり、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ水素である。そのような化合物は、環ＩＩＩの５″位でキラル中心のＲまたはＳ立体配置を有することができる。
【０１４８】
本発明の一部の実施形態において、Ｒ１は本明細書で記載のアルキルであり、Ｒ２は水素であり、Ｒ３はアルキルである。そのような化合物は、環ＩＩＩの５″位でキラル中心のＲまたはＳ立体配置を有することができる。
【０１４９】
場合により、Ｒ１は本明細書で記載のシクロアルキルであり、Ｒ２は水素であり、Ｒ３はアルキルである。そのような化合物は、環ＩＩＩの５″位でキラル中心のＲまたはＳ立体配置を有することができる。
【０１５０】
場合により、Ｒ１は本明細書で記載のアリールであり、Ｒ２は水素であり、Ｒ３はアルキルである。そのような化合物は、環ＩＩＩの５″位でキラル中心のＲまたはＳ立体配置を有することができる。
【０１５１】
本発明の一部の実施形態によれば、Ｒ３がアルキルである上記実施形態のいずれかにおいて、Ｒ３は本明細書で定義の低級アルキルである。これらの実施形態によれば、Ｒ３はメチルである。
【０１５２】
場合により、Ｒ１は本明細書で記載のアルキルであり、Ｒ２は水素であり、Ｒ３はシクロアルキルである。そのような化合物は、環ＩＩＩの５″位でキラル中心のＲまたはＳ立体配置を有することができる。
【０１５３】
場合により、Ｒ１は本明細書で記載のシクロアルキルであり、Ｒ２は水素であり、Ｒ３はシクロアルキルである。そのような化合物は、環ＩＩＩの５″位でキラル中心のＲまたはＳ立体配置を有することができる。
【０１５４】
場合により、Ｒ１は、本明細書で記載のアリールであり、Ｒ２は水素であり、Ｒ３はシクロアルキルである。そのような化合物は、環ＩＩＩの５″位でキラル中心のＲまたはＳ立体配置を有することができる。
【０１５５】
場合により、Ｒ１は、本明細書で記載のアルキルであり、Ｒ２は水素であり、Ｒ３はアリールである。そのような化合物は、環ＩＩＩの５″位でキラル中心のＲまたはＳ立体配置を有することができる。
【０１５６】
場合により、Ｒ１は、本明細書で記載のシクロアルキルであり、Ｒ２は水素であり、Ｒ３はアリールである。そのような化合物は、環ＩＩＩの５″位でキラル中心のＲまたはＳ立体配置を有することができる。
【０１５７】
場合により、Ｒ１は本明細書で記載のアリールであり、Ｒ２は水素であり、Ｒ３はアリールである。そのような化合物は、環ＩＩＩの５″位でキラル中心のＲまたはＳ立体配置を有することができる。
【０１５８】
Ｒ２位に水素およびＲ３位にアルキルを示すアミノグリコシド化合物の例には、下記のものなどがある。
【０１５９】
【化９】
2017516835.tif 000011
【０１６０】
これらは環ＩＩＩの５″位のキラル中心の立体配置において互いに異なっている。
【０１６１】
本発明の一部の実施形態において、Ｒ２はＡＨＢであり、Ｒ３はアルキルである。Ｒ２がＡＨＢであり、Ｒ３がアルキルであるアミノグリコシド化合物の例には、下記のものなどがある。
【０１６２】
【化１０】
2017516835.tif 000012
【０１６３】
これらは環ＩＩＩの５″位のキラル中心の立体配置において互いに異なっている。
【０１６４】
場合により、Ｒ１は本明細書で記載のシクロアルキルであり、Ｒ２はＡＨＢであり、Ｒ３はアルキルである。そのような化合物は、環ＩＩＩの５″位でキラル中心のＲまたはＳ立体配置を有することができる。
【０１６５】
場合により、Ｒ１は本明細書で記載のアリールであり、Ｒ２はＡＨＢであり、Ｒ３はアルキルである。そのような化合物は、環ＩＩＩの５″位でキラル中心のＲまたはＳ立体配置を有することができる。
【０１６６】
本発明の一部の実施形態によれば、Ｒ３がアルキルである上記実施形態のいずれかにおいて、Ｒ３は本明細書で定義の低級アルキルである。これらの実施形態によれば、Ｒ３はメチルである。
【０１６７】
場合により、Ｒ１は本明細書で記載のアルキルであり、Ｒ２はＡＨＢであり、Ｒ３はシクロアルキルである。そのような化合物は、環ＩＩＩの５″位でキラル中心のＲまたはＳ立体配置を有することができる。
【０１６８】
場合により、Ｒ１は本明細書で記載のシクロアルキルであり、Ｒ２はＡＨＢであり、Ｒ３はシクロアルキルである。そのような化合物は、環ＩＩＩの５″位でキラル中心のＲまたはＳ立体配置を有することができる。
【０１６９】
場合により、Ｒ１は本明細書で記載のアリールであり、Ｒ２はＡＨＢであり、Ｒ３はシクロアルキルである。そのような化合物は、環ＩＩＩの５″位でキラル中心のＲまたはＳ立体配置を有することができる。
【０１７０】
場合により、Ｒ１は本明細書で記載のアルキルであり、Ｒ２はＡＨＢであり、Ｒ３はアリールである。そのような化合物は、環ＩＩＩの５″位でキラル中心のＲまたはＳ立体配置を有することができる。
【０１７１】
場合により、Ｒ１は本明細書で記載のシクロアルキルであり、Ｒ２はＡＨＢであり、Ｒ３はアリールである。そのような化合物は、環ＩＩＩの５″位でキラル中心のＲまたはＳ立体配置を有することができる。
【０１７２】
場合により、Ｒ１は本明細書で記載のアリールであり、Ｒ２はＡＨＢであり、Ｒ３はアリールである。そのような化合物は、環ＩＩＩの５″位でキラル中心のＲまたはＳ立体配置を有することができる。
【０１７３】
本実施形態は、本明細書に記載の化合物のエナンチオマー、ジアステレオマー、プロドラッグ、溶媒和物、水和物および／または医薬として許容される塩をさらに包含する。
【０１７４】
本明細書で使用される場合、「エナンチオマー」という用語は、互いの完全な反転／鏡映（鏡像）によってのみそれの対応物に関して重ね合わせ可能な化合物の立体異性体を指す。エナンチオマーは、それらが互いに右手および左手のように言われることから、「掌性」を有すると言われる。エナンチオマーは、全ての生体系などのそれ自体で掌性を有する環境に存在する場合を除き、同一の化学特性および物理特性を有する。本実施形態の文脈において、化合物は１以上のキラル中心を示すことができ、そのそれぞれはＲ配置もしくはＳ配置またはそれらの組み合わせを示し、本発明の一部の実施形態による化合物は、Ｒ配置またはＳ配置を示すキラル中心を有することができる。
【０１７５】
本明細書で使用される「ジアステレオマー」という用語は、互いにエナンチオマーではない立体異性体を指す。ジアステレオマー性は、化合物の２以上の立体異性体が、１以上であるが全てではない等価な（関係のある）立体中心で異なる立体配置を有し、互いに鏡像体ではない場合に生じる。二つのジアステレオマーが一つの立体中心のみで互いに異なる場合、それらはエピマーである。各立体中心（キラル中心）により、二つの異なる立体配置が生じ、従って二つの異なる立体異性体が生じる。本発明の文脈において、本発明の実施形態は、立体配置のいずれかの組み合わせで生じる複数のキラル中心を有する化合物、すなわちジアステレオマーを包含する。
【０１７６】
「プロドラッグ」という用語は、イン・ビボで活性化合物（活性親薬剤）に変換される薬剤を指す。プロドラッグは代表的には、親薬剤の投与を容易にするのに有用である。それらは例えば、経口投与によって生物学的に利用可能であるが、親薬剤はそうではない。プロドラッグは、医薬組成物において、親薬剤と比較して改善された溶解度を有する可能性もある。プロドラッグは、多くの場合、イン・ビボでの活性化合物の徐放を行うのにも用いられる。プロドラッグの例には、エステルとして投与される、１以上のカルボン酸部分を有する本発明の化合物（「プロドラッグ」）があると考えられるが、それに限定されるものではない。そのようなプロドラッグはイン・ビボで加水分解されることで、遊離化合物（親薬剤）を提供する。選択されるエステルは、プロドラッグの溶解度特性と加水分解速度の両方に影響を与え得る。
【０１７７】
「溶媒和物」という用語は、溶質（本発明の化合物）および溶媒によって形成される化学量論可変の錯体（例えば、２、３、４、５、６など）を指し、それによって溶媒は溶質の生理活性を妨害しない。好適な溶媒には、例えば、エタノール、酢酸などがある。
【０１７８】
「水和物」という用語は、溶媒が水である上記で定義の溶媒和物を指す。
【０１７９】
「医薬として許容される塩」という表現は、親化合物の帯電種およびそれの対イオンを指し、それは代表的には、投与される化合物の生理活性および特性を抑止することなく、親化合物の溶解度特性を変え、および／または親化合物による生物への重大な刺激を軽減するのに用いられる。医薬として許容される塩の例には、ヒドロキシルアニオン（Ｏ−）およびアンモニウム、ナトリウム、カリウムなど（これらに限定されるものではない）のカチオンであると考えられるが、それに限定されるものではない。医薬として許容される塩の別の例は、アンモニウムカチオンおよびおれの酸付加塩であると考えられるが、それに限定されるものではない。酸付加塩の例には、塩酸付加塩、硫酸付加塩（硫酸塩）、酢酸付加塩、アスコルビン酸付加塩、ベンゼンスルホン酸付加塩、カンファースルホン酸付加塩、クエン酸付加塩、マレイン酸付加塩、メタンスルホン酸付加塩、ナフタレンスルホン酸付加塩、シュウ酸付加塩、リン酸付加塩、コハク酸付加塩、硫酸付加塩、酒石酸付加塩、およびトルエンスルホン酸付加塩などがあるが、これらに限定されるものではない。
【０１８０】
本発明の一部の実施形態によれば、酸付加塩は硫酸塩である。
【０１８１】
一部の実施形態によれば、本明細書で提供の化合物は、原核細胞と比較して真核細胞翻訳系に対して選択的であり、すなわち当該化合物は、細菌の細胞などの原核細胞における活性と比較して、哺乳動物（ヒト）の細胞などの真核細胞でより高い活性を示す。特定の理論に拘束されるものではないが、１６ＳリボソームＲＮＡのＡ部位に結合することで作用することが知られており、リボソームが遺伝子の翻訳に関与する本明細書で提供の化合物が、真核生物リボソームＡ部位に対して相対的に高いアフィニティを有するか、あるいは原核生物リポソームＡ部位と比較して真核生物Ａ部位に対して、ならびに原核生物対応物に似たミトコンドリアリボソームＡ部位に対して選択的であると仮定される。
【０１８２】
本発明の一部の実施形態において、本明細書に記載の化合物は、ＷＯ２０１２／０６６５４６に開示の化合物のいずれか一つを含む。
【０１８３】
本明細書に記載の化合物のいずれか一つは、ＷＯ２０１２／０６６５４６に記載の方法を用いて製造することができる。
【０１８４】
本願から作られる特許の期間中、多くの関連するレット症候群関連の突然変異、特には早期終止コドン突然変異が明らかにされると予想されるが、レット症候群という表現の範囲は、先験的にそのような突然変異全てを包含するものとする。
【０１８５】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、±１０％を指す。
【０１８６】
「含む」、「含有」、「包含する」、「包含」、「有する」という用語およびそれらの複合型は、「を含むが、それに限定されるものではない」を意味する。
【０１８７】
「からなる」という用語は、「包含し、それに限定される」を意味する。
【０１８８】
「本質的にからなる」という用語は、組成物、方法または構造が別の成分、段階および／または部分を含み得るが、その別の成分、段階および／または部分が特許請求の組成物、方法もしくは構造の基本的かつ新規な特性をほとんど変えることがない場合にのみであることを意味する。
【０１８９】
本明細書で使用される場合、単数形「一つの」、「１個の」および「その」は、文脈が明瞭に別の意味を表さない限り、複数形を含む。例えば、「化合物」または「少なくとも一つの化合物」という用語は、混合物などの複数の化合物を含み得る。
【０１９０】
本願を通じて、本発明の各種実施形態は、範囲形式で提供され得る。理解すべき点として、範囲形式での記述は単に簡便さおよび簡潔さを目的としたものであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない制限と解釈されるべきではない。従って、範囲の記述は、全ての可能な下位範囲ならびにその範囲内の個々の数値を具体的に開示したと考えるべきである。例えば、１から６などの範囲の記述は、１から３、１から４、１から５、２から４、２から６、３から６などの下位範囲、ならびにその範囲内の個々の数字、例えば、１、２、３、４、５および６を具体的に開示しているものと考えるべきである。これは、範囲の幅と無関係に適用されるものである。
【０１９１】
本明細書において数字範囲が示されている場合は必ず、それは指定範囲内のいずれか引用の数字（分数または整数）を含むことを意味する。第１の指定数と第２の指定数「の間の範囲の／範囲」および第１の指定数から第２の指定数「まで」の「範囲の／範囲」という表現は、本明細書において互換的に使用され、前記第１および第２の指定数ならびにその間の全ての分数および整数を含むことを意味するものである。
【０１９２】
本明細書で使用される場合、「方法」という用語は、化学、薬理、生物学、生化学および医学分野の実務者に公知であるか、その実務者によって公知の方法、手段、技術および手順から容易に開発される方法、手段、技術および手順など（これらに限定されるものではない）の所定の作業を実行するための方法、手段、技術および手順を指す。
【０１９３】
明瞭を期して、別個の実施形態の文脈で記載されている本発明のある種の特徴は、単一の実施形態で組み合わせて提供される可能性もあることは明らかである。逆に、簡潔のために、単一の実施形態の文脈で記載されている本発明の各種特徴は、別個に、またはいずれか好適な下位組み合わせで、または本発明のいずれか他の記載の実施形態で好適なものとして提供もされ得る。各種実施形態の文脈で記載されているある種の特徴は、実施形態がそれら要素なしには機能しないのでなければ、それら実施形態の本質的特徴とみなすべきではない。
【０１９４】
下記の実施例で、上記で説明し、下記の特許請求の範囲で特許請求された本発明の各種実施形態および態様についての実験的裏付けが提供される。
（実施例）
以下、実施例について説明するが、それらは上記の説明と相まって、非限定的に本発明の一部の実施形態を説明するものである。
【０１９５】
材料および方法
本明細書においてＮＢ１１８、ＮＢ１１９、ＮＢ１２２、ＮＢ１２３、ＮＢ１２４、ＮＢ１２５、ＮＢ１２６、ＮＢ１２７およびＮＢ１２８と称される本発明の一部の実施形態による例示的化合物を、ＷＯ２０１２／０６６５４６に記載の方法に従って、硫酸塩として製造した。
【０１９６】
他の試薬はいずれも、別段の断りがない限り、既知の業者から入手したものであった。
【０１９７】
ＭｅＣＰ２のＣ末端に対する一次抗体を、Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇから得た。
【０１９８】
ヒトＲ２９４Ｘレット症候群男性および女性患者由来の線維芽細胞は、Ｐｒｏｆ．  Ｂｒｕｒｉａ  Ｂｅｎ  Ｚｅｅｖ，  Ｅｄｍｏｎｄ  ａｎｄ  Ｌｉｌｌｙ  Ｓａｆｒａ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，  Ｓｈｅｂａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ，  Ｔｅｌ  Ｈａｓｈｏｍｅｒ，  Ｉｓｒａｅｌから入手した。
【０１９９】
Ｒｅｔｔ  Ｒ１６８Ｘ、Ｒ２７０ＸおよびＲ２９４Ｘ突然変異を有する核酸構築物は、ＰｒｏＧｅｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＆  Ｇｅｎｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ｉｓｒａｅｌから入手した。
【０２００】
ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ  ２．０ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いながら、顕微鏡およびＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓＭｉｃｒｏＸＬ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，  Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，  ＣＡ）を用いて、ハイコンテントスクリーニングアッセイを行った。
【０２０１】
二重ルシフェラーゼレポーターアッセイは、Ｐｒｏｍｅｇａから入手した。
【０２０２】
ＨＥＫ−２９３（ヒト胎児腎臓）細胞は、ＡＴＣＣから入手した。
【０２０３】
実施例１
ＲｅｔｔヒトＲ２９４Ｘ細胞におけるＭＥＣＰ２リードスルー
ヒトＲ２９４Ｘレット症候群男性および女性患者由来の線維芽細胞を、７５０細胞／ウェルで３８４黒色透明底プレートに蒔いた。細胞を、１００、２００および４００μｇ／ｍＬのＮＢ１２４で３日間処理した。内在性ＭｅＣＰ２タンパク質の局在化を、そのタンパク質のＣ末端部分を検出する特異的ＭｅＣＰ２抗体を用い、免疫蛍光顕微鏡法を用いることで肉眼観察した。
【０２０４】
図１は、非処理細胞と比較した、４００μｇ／ｍＬのＮＢ１２４で処理した細胞について得られたハイコンテントスクリーニング自動顕微鏡写真を提供するものであり、全ての試験サンプルでのＭＥＣＰ２核局在化および翻訳、処理サンプルでのＭＥＣＰ２翻訳強化を示している。
【０２０５】
細胞の核におけるＭＥＣＰ２の局在は、残留タンパク質が機能性であり、血漿から核へ戻ることができたことを示している。
【０２０６】
ＭＥＣＰ２陽性細胞の数を、自動アルゴリズムを用いて計算し、得られたデータを図２ＡからＢに提供している。図で示したように、男性細胞および女性細胞の両方で、ＭＥＣＰ２は用量依存的に翻訳された。すなわち、４００μｇ／ｍＬのＮＢ１２４で処理された男性細胞の４０％が処理後にＭＥＣＰ２に関して陽性であることが認められ、２００μｇ／ｍＬまたは４００μｇ／ｍＬのＮＢ１２４で処理された女性細胞の６０％超が処理後にＭＥＣＰ２に関して陽性であることが認められた。
【０２０７】
実施例２
リードスルー効力のイン・ビトロ試験
図３に描いたように、ＴＮＴ網状赤血球溶血液（イン・ビトロ）および調べたナンセンス突然変異についての核酸構築物：Ｒｅｔｔ  Ｒ１６８Ｘ、Ｒ２７０ＸおよびＲ２９４Ｘを用いてリードスルー活性のアッセイを行った。
【０２０８】
０から５０μＭの被験アミノグリコシド存在下での得られたプラスミドを、ＴＮＴ網状赤血球溶血液急速結合転写／翻訳系を用いて転写および翻訳した。二重ルシフェラーゼレポーターアッセイ系を用い、３０℃でのインキュベーションから９０分後にルシフェラーゼ活性を求め、下記式に示したようにリードスルーを計算した。
【０２０９】
【数１】
2017516835.tif 000013
【０２１０】
得られたデータを下記の表１で提供している。
【０２１１】
【表１】
2017516835.tif 000014
【０２１２】
さらなるイン・ビトロアッセイで、１．４μＭの被験アミノグリコシド存在下に上記プラスミドを用い、上記で提供の式に従ってリードスルー活性を計算して、上記の系を各種アミノグリコシドについて試験した。
【０２１３】
リードスルー活性について得られた値（ＲＴ％）を、下記の表２に提供している。
【０２１４】
【表２】
2017516835.tif 000015
【０２１５】
実施例３
エクス・ビボリードスルー効力および毒性アッセイ
Ｒｅｔｔ  Ｒ１６８Ｘ、Ｒ２７０ＸおよびＲ２９４Ｘ突然変異を有する核酸構築物を、リン酸カルシウム法を用いてＨＥＫ−２９３（ヒト胎児腎臓）細胞に挿入した。トランスフェクションから６時間後、被験アミノグリコシドを濃度０．３または１ｍＭで加えた。自然型溶解緩衝液（ｐａｓｓｉｖｅ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）を用いて、被験アミノグリコシド類とともに１６時間インキュベートした後に細胞を回収した。リードスルー活性を、上記で記載の方法に従って計算した（実施例２参照）。
【０２１６】
細胞毒性アッセイのため、ＨＥＫ−２９３細胞を９６ウェルプレートで増殖させ、次に各種濃度の被験合成アミノグリコシド類を加え（１０μＬ／ウェル）、細胞をさらに２４時間インキュベートした。細胞増殖アッセイ（ｗｓｔ−１に基づく比色分析）、を、３時間インキュベーションを用いることで実施した。ＥＬＩＳＡプレート読取装置を用いて光学密度を測定した。
【０２１７】
得られたデータは、表３（リードスルー活性）および表４（毒性）に提供している。
【０２１８】
これらの表で示したように、本発明の実施形態のアミノグリコシド類は、Ｇ４１８と比較して、向上していないとしても少なくとも同等のリードスルー効力を示すが、毒性はかなり低い。
【０２１９】
【表３】
2017516835.tif 000016
【０２２０】
【表４】
2017516835.tif 000017
【０２２１】
実施例４
リードスルー効力のイン・ビトロ試験（用量増加）
ＮＢ１２２、ＮＢ１２４、ＮＢ１２７および従来のアミノグリコシド類ゲンタマイシンおよびＧ４１８処理のリードスルー効果の比較試験を、用量を増加させながら、ナンセンス突然変異を有するレット症候群患者から得られたヒト線維芽細胞で行った。これら初代線維芽細胞における全長のＭｅＣＰ２翻訳および核局在化を、ハイコンテントスクリーニングアッセイを用いて分析した。
【０２２２】
材料および方法：
線維芽細胞を、男性レット症候群患者（Ｒ２９４Ｘ）皮膚生検から増殖させ、５％ＣＯ２を含む加湿インキュベータにおいて３７℃で、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび１００単位／ｍＬペニシリン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，  Ｉｓｒａｅｌ）中にて培養した。
【０２２３】
Ｒ１６８Ｘ突然変異を有する女性レット症候群患者からのヒト線維芽細胞をＭｅＣＰ２発現についての基準として用い、Ｒ２９４Ｘの男性線維芽細胞と同じ条件下に培養した。
【０２２４】
すなわち、３８４ヘッドオフラインＰｉｎｔｏｏｌシステム（ＧＮＦ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ，  ＵＳＡ；３０μＬ／ウェル）を用い、３８４ウェル黒色／透明底プレートを、ポリ−Ｌ−リジン（Ｓｉｇｍａ；１：５ＰＢＳ中溶液）でコーティングした。３０分後にポリ−Ｌ−リジンを吸引し、層流フード中で２０分間乾燥させた。その後、ヒト線維芽細胞を、プレートをマッピングしながらＭｕｌｔｉｄｒｏｐ  ３８４（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｗａｌｔｈａｍ，  ＭＡ）を用いて７００細胞／ウェルで蒔いた。
【０２２５】
Ｇ４１８硫酸塩（Ｓｉｇｍａ）、ゲンタマイシン硫酸塩（Ｓｉｇｍａ）またはＮＢ１２２、ＮＢ１２４およびＮＢ１２７の硫酸塩を、３日間にわたり、プレート培地に四連で１日１回加えた。
【０２２６】
処理終了後、ロボットウェルプレート（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）および自動液体ディスペンサー（ＥＬ４０６，  ＢｉｏＴｅｋ）を用い、細胞を、４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳで３０分間固定した。透過化では、０．２％［Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／２％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）］／ＰＢＳと５分間インキュベーションし、次に室温で２％ＢＳＡ／ＰＢＳで５分間洗浄した。
【０２２７】
次に、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２％ＢＳＡ／ＰＢＳでの１：２００希釈で、２から８℃でＭｅＣＰ２のＣ末端に対する一次抗体（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）とともに、細胞を終夜インキュベートした。翌日、ロボットウェルプレートおよび自動液体ディスペンサーを用いて、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。
【０２２８】
次に、細胞を二次抗体（Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ヤギ抗ウサギ；１：１０００）および４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ；Ｓｉｇｍａ；１：１００００）によって処理し、２％ＢＳＡ／ＰＢＳで１時間希釈し、次にロボットウェルプレートおよび自動液体ディスペンサーを用いてＰＢＳで４回洗浄した。
【０２２９】
顕微鏡およびＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓＭｉｃｒｏＸＬ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，  Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，  ＣＡ）を用いるハイコンテントアッセイ方法を用いて細胞画像を得て、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ  ２．０ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いることで画像分析を行った。
【０２３０】
以下のパラメータを評価した：
＝核におけるＭＥＣＰ２の発現強度：抗ＭｅＣＰ２  Ｃ末端抗体による免疫染色レベルによる検出、
＝陽性細胞のパーセント：核におけるＭｅＣＰ２発現を提供する細胞の数を、ＤＡＰＩによって染色される細胞の総数の割合として求める。
【０２３１】
上記パラメータでのアミノグリコシドＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）および非線形回帰（単相結合）モデルを用いて計算した。
【０２３２】
結果：
Ｒ２９４Ｘ突然変異を有するレット症候群男性患者の一次ヒト線維芽細胞を、１００から８００μｇ／ｍＬ（０．１７から１．６７ｍＭ）の範囲で濃度を増加させながら、３日間にわたり合成（ＮＢ１２２、ＮＢ１２４およびＮＢ１２７）または天然（ゲンタマイシンおよびＧ４１８）アミノグリコシドで処理した。さらに、Ｒ１６８Ｘ突然変異を有するレット症候群女性患者のヒト線維芽細胞を、同じプレートで培養したが、処理は行わなかった。全長ＭｅＣＰ２の発現レベルを、抗ＭｅＣＰ２  Ｃ末端抗体を用いて評価した。ＭｅＣＰ２リードスルー効率を、７０％の細胞で正常なＭｅＣＰ２を発現するヒト女性Ｒ１６８Ｘ変異体と比較して評価した（図４参照）。
【０２３３】
図５ＡからＣは、Ｒ２９４ＸまたはＲ１６８Ｘナンセンス突然変異を有するレット症候群患者からの線維芽細胞での全長ＭｅＣＰ２発現レベルの程度を示している。男性Ｒ２９４Ｘからの未処理線維芽細胞は核におけるＭｅＣＰ２タンパク質のごくわずかな発現レベルしか示さなかったが、女性Ｒ１６８ＸはかなりのＭｅＣＰ２レベルを提供した（図５Ａ）。ＮＢ１２２、ＮＢ１２４およびＮＢ１２７の３日間にわたる繰り返し投与によって、ＭｅＣＰ２レベルに有意な増加が生じ（図５Ｂ）、それはこれら合成アミノグリコシドのＭｅＣＰ２リードスルー効力を示すものであった。Ｇ４１８投与後のＭｅＣＰ２染色にかなりの増加があったが、ＭＥＣＰ２染色はゲンタマイシン処理後は無視できる量しかなかった（図５Ｃ）。
【０２３４】
男性レット症候群患者からのヒト線維芽細胞の細胞核における積算ＭｅＣＰ２染色強度から誘導されるリードスルー効力の相当するＥＣ５０値を計算し、表５に提供してある。これらの値は、全ての被験合成アミノグリコシド類の同等のリードスルー効力を示しているが（４００から６００μＭ）、Ｇ４１８についてのＥＣ５０はかなり低いことが示された（６０μＭ）。
【０２３５】
【表５】
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【０２３６】
図６ＡからＢに示したように、男性レット症候群からの未処理ヒト線維芽細胞（Ｒ２９４Ｘ）における抗ＭｅＣＰ２  Ｃ末端抗体を有する全長ＭｅＣＰ２の免疫蛍光局在化は４％であると測定されたが（図４参照）、０．８ｍＭ以上の用量のＮＢ１２２、ＮＢ１２４およびＮＢ１２７による３日間の処理後には、それはＤＡＰＩ染色細胞の９０％超に達した（図６Ａ）。ゲンタマイシン処理では、ＭＥＣＰ２について男性レット症候群からの陽性染色ヒト線維芽細胞の量はごく非常に限られたものであった（２％；図６Ｂ）。
【０２３７】
男性レット症候群患者からのヒト線維芽細胞におけるＤＡＰＩについての総陽性染色細胞のうちのＭｅＣＰ２染色細胞の％からのＥＣ５０計算値を表６に提供しており、それは合成アミノグリコシド間でやや同等のリードスルー効力を示している（４００から６００μＭより高い）。
【０２３８】
【表６】
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【０２３９】
図５Ｃおよび６Ｂで示したように、Ｇ４１８で３日間処理した男性レット症候群患者線維芽細胞では、最も低い処理用量群（０．１５ｍＭ）で安定的リードスルー効力ならびにＤＡＰＩ染色細胞の８０％から１００％ＭＥＣＰ２発現細胞が達成された。しかしながら、図７に示したように、この濃度では、ＤＡＰＩ染色細胞の有意な減少も明らかになった。この減少は、これら線維芽細胞に対するＧ４１８細胞毒性効果に関連し得る。逆に、図７にさらに示したように、最大１０倍用量（１．５ｍＭ）での３日間にわたるＮＢ１２２、ＮＢ１２４およびＮＢ１２７による処理は良好に耐容された。
【０２４０】
要約すると、本試験によって、男性レット症候群線維芽細胞でのＭｅＣＰ２染色に対するＮＢ１２２、ＮＢ１２４およびＮＢ１２７の効果が２００μＭより低いＥＣ５０値を示したこと、そしてこれらの処理によってＤＡＰＩ標識細胞の９０％を超えるまでの陽性染色ＭｅＣＰ２細胞が生じた（用量８００μＭ以上で）ことが示された。
【０２４１】
本試験によってさらに、男性レット症候群線維芽細胞への３日間にわたる１日１回ゲンタマイシン処置（１．７ｍＭ以下で）がＭｅＣＰ２発現に影響しないことが示された。同様の知見が、同様の実験設定を用いるＢｒｅｎｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  ｉｎ  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．  （Ｂｅｒｌ）  （２０１１）  ８９：３８９−９８によってすでに発表されている。男性レット症候群線維芽細胞に対するＧ４１８処置の効果は有意であり、ＥＣ５０  ＭｅＣＰ２染色が３００μＭよりかなり低く、６０μＭでＥＣ５０積算ＭｅＣＰ２染色強度であった。
【０２４２】
提供のレット症候群モデルを用いるＧ４１８についての安全域は、約５から１０倍［６０μＭのＥＣ５０および３００から６００μＭのＬＣ５０］と計算された。
【０２４３】
記載のレット症候群モデルにおけるゲンタマイシンの安全域は、効力が無視できるものであったことから計算できなかった。ゲンタマイシンについて、本試験では有意な細胞毒性は示されず、それは上記実施例３で提供のＨＥＫ２９３細胞でのこのアミノグリコシドのＬＣ５０と一致している。
【０２４４】
被験ＮＢ１２２、ＮＢ１２４およびＮＢ１２７について、本明細書では、有意な細胞毒性は示されなかった。
【０２４５】
提供のレット症候群モデルを用いる細胞毒性、上記ｗｓｔ−１試験およびｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅシステムによって求められる細胞毒性に関する本明細書に記載の化合物（例えば、ＮＢ１２２、ＮＢ１２４およびＮＢ１２７）についての安全性領域は、４４から１６７倍の範囲であり、Ｇ４１８と比較して高い安全性領域を示唆するものである。
【０２４６】
実施例５
ナンセンス突然変異を有するレット症候群患者に関するマウスモデル
例えばＷｅｇｅｎｅｒら［ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ２０１４；９（１２）：ｅ１１５４４４］に記載のレット症候群に関するＭｅＣＰ２Ｒ１６８Ｘノックインマウスモデル；または例えばＰｉｔｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ［Ｈｕｍ．  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２０１５；２４（９）：２６６２−７２］に記載のＭｅＣＰ２Ｒ２５５Ｘノックインマウスモデル、もしくはナンセンス突然変異を有するレット症候群の同様のマウスモデルで、本明細書に記載の化合物をさらに調べる。本明細書に記載の化合物をノックインマウスに非経口投与し、相当する変異対立遺伝子からの全長ＭｅＣＰ２の発現を求める。動物寿命および動物モデル表現型（例えば、運動能力障害、不整脈の発生率、活性低下、運動協調性機能障害および不安様行動低下、無呼吸および回数が減った不規則呼吸、運動能力低下）に陽性の影響がある。
【０２４７】
以上、本発明について、それの具体的実施形態との関連で説明したが、多くの変更、修正および改変形が当業者には明らかであることは明白である。従って、それは、添付の特許請求の範囲の精神および広い範囲に包含される全てのそのような変更、修正および改変形を包含するものである。
【０２４８】
本明細書で言及の全ての刊行物、特許および特許出願は、あたかも各個々の刊行物、特許および特許出願が参照によって本明細書に組み込まれていることが具体的かつ個別に示されているかのように同程度に、参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれる。さらに、本願における参考文献の引用および確認は、そのような参考文献が本発明に対する先行技術として利用可能であることを承認するものと解釈すべきではない。セクションの表題を用いる限りにおいて、それらは必ず限定的であると解釈すべきではない。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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