(57)【要約】  本発明は、ＨＢＶ（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ）の表面抗原ｐｒｅＳ１に特異的に結合する抗体、前記抗体をコーディングするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び前記発現ベクターを含む形質転換体、前記抗体のＨＢＶ感染の予防または治療用途、及び前記抗体のＨＢＶ検出用途を提供するものである。
2017538445.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＢＶ（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ）の表面抗原ｐｒｅＳ１に特異的に結合する抗体。
【請求項２】
前記抗体は、配列番号２と記載された重鎖ＣＤＲ１；配列番号２４と記載された重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号２１と記載された重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号９と記載された軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２７と記載された軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号１３と記載された軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むものである、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体は、配列番号３０と記載された重鎖可変領域、及び配列番号３１と記載された軽鎖可変領域を含むものである、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体は、配列番号２３と記載された重鎖可変領域、及び配列番号３１と記載された軽鎖可変領域を含むものである、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体はヒト化抗体である、請求項１ないし請求項４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項６】
請求項１ないし請求項４のいずれか一項の抗体をコーディングするポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項８】
請求項７の発現ベクターを含む、ヒトを除いた形質転換体。
【請求項９】
請求項１ないし請求項４のいずれか一項の抗体を含む、ＨＢＶ（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ）感染に対する予防または治療用薬学的組成物。
【請求項１０】
前記組成物は、Ｂ型肝炎の予防または治療のためのものである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
請求項１ないし請求項４のいずれか一項の抗体を利用して、ＨＢＶ（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ）感染が疑われる個体から分離された生物学的試料に存在するｐｒｅＳ１タンパク質を抗原−抗体反応を通じて検出する段階を含む、ＨＢＶ（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ）感染を診断するための情報の提供方法。
【請求項１２】
前記方法は、Ｂ型肝炎を診断するための情報を提供するための、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１ないし請求項４のいずれか一項の抗体を含む、ＨＢＶ（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ）検出用組成物。
【請求項１４】
前記組成物は、Ｂ型肝炎診断用のものである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
請求項１３の組成物を含む、ＨＢＶ（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ）検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＢＶ（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ）の表面抗原ＰｒｅＳ１（ｐｒｅＳ１）に特異的に結合する抗体、前記抗体をコーディングするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び前記発現ベクターを含む形質転換体、前記抗体のＨＢＶ感染の予防または治療用途、及び前記抗体のＨＢＶ検出用途を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＨＢＶは、２億４千名が慢性的に感染され、慢性的での慢性保菌者に影響を与える、全世界的に公衆保健問題を引き起こすウイルスである。ＨＢＶの外皮は、３つの係った表面糖タンパク質、具体的にＬ（ｌａｒｇｅ）タンパク質、Ｍ（ｍｉｄｄｌｅ）タンパク質、及びＳ（ｓｍａｌｌ）タンパク質を含む。このようなタンパク質は、ｐｒｅＳ１、ｐｒｅＳ２及びＳ部位に分けられる、一つのＯＲＦ（open reading frame）の産物である。Ｓタンパク質はＳ部位でエンコーディングされるし、Ｍタンパク質はｐｒｅＳ及びＳ抗原を含む。また、Ｌタンパク質は、ｐｒｅＳ１、ｐｒｅＳ２及びＳ抗原を含む。前記３つの抗原は、ウイルス中和抗体を引き起こすものとして知られている。特に、Ｌタンパク質のｐｒｅＳ１及びＳ抗原の a決定因子（determinant）は、ウイルス感染に必須的役割をするものと報告されている。より具体的に記述すれば、最近、肝細胞のＨＢＶ受容体が糾明された。タウロコール酸ナトリウムトランスポーター（sodium taurocholate transporter、ＮＴＣＰ）と呼ばれるタンパク質は、高親和性・機能性受容体（high−affinity functional receptor）として、ＨＢＶｐｒｅＳ１に結合することが明らかになった（Yan、H., et al., Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus．Elife，２０１２．１：p．e０００４９）。また、ヘパラン硫酸プロテオリカン（heparin sulfate proteoglycan、ＨＳＰＧ）は、低親和性受容体（low−affinity receptor）としてＳ抗原の a決定因子に結合することが明らかになった（Sureau、C．and J．Salisse，A conformational heparan sulfate binding site essential to infectivity overlaps with the conserved hepatitis B virus a−determinant．Hepatology，２０１３．５７（３）：p．９８５−９４）。前記ＮＴＣＰに結合するｐｒｅＳ１の領域は、ayw subtypeである場合、２番目から４７番目までのアミノ酸残基であり、adr subtypeである場合、１３番目から５８番目までのアミノ酸残基である。この結果は、ｐｒｅＳ１の受容体結合部位に結合する抗体がＨＢＶ感染の抑制に非常に効果的に作用することを示唆する。
【０００３】
ＨＢＶ感染の免疫学的予防のために、ヒト抗−ＨＢｓＡｇ血漿から製造された、ＨＢＩＧ（hepatitis B immune globulin）をＨＢｓＡｇ−ＨＢｅＡｇ陽性母体から生まれた乳児、感染性ＨＢＶ含有物質に急性露出された敏感個体、慢性ＨＢＶ−関連の肝疾患を持つ肝移植患者に投与する。しかし、ＨＢＩＧは限られた入手可能性及び特異的活性が低いため、抗体の理想的源泉とは見られない。このような状況において、ｐｒｅＳ１及びＳ抗原に対するウイルス中和モノクローナル抗体は、ＨＢＶ肝炎の免疫学的予防に対する効果的な代替剤になれる。このような背景下、本発明者らは、adr subtypeのＨＢＶｐｒｅＳ１の３７番目ないし４５番目のアミノ酸残基（NSNNPDWDF）（この配列は、ayw subtypeの２６番目ないし３４番目のアミノ酸残基に当たる）を認識するマウスモノクローナル抗体であるＫＲ１２７及びＣＤＲ移植を通じるヒト化抗体を開発したことがある（韓国登録特許第１０−０３４５４６３号）。しかし、前記ヒト化抗体は、抗原結合親和度が比較的に低い方で、マウス由来のアミノ酸残基を相当含んでいるので、ｐｒｅＳ１抗原に対する効果的な中和反応誘導効果を奏しながらも、ヒトに対するより低い免疫原性を表す抗体の開発が依然として要求されてきた。
【０００４】
最近３０年間、抗体工学技術の進歩により、モノクローナル抗体（mAbs）は強力なヒト治療剤として浮び上がった。非ヒト抗体は、ヒトで免疫反応を引き起こすことがあるため、これの治療的使用が制限されてきた。このような問題を解決するために、マウス抗体のＣＤＲ（complementarity−determining region）をヒトフレームワーク部位（ＦＲ）に移植するＣＤＲ移植技術を使ってヒト化抗体を製造してきた。しかし、いくつかのＦＲ残基は、直接抗原に接触したり、ＣＤＲループ構造を支持する役割を行うので、単純なＣＤＲ移植はしばしば親和度を減少した。よって、ヒト化抗体は、大概ＣＤＲ移植の他にも一部マウスＦＲ残基を維持するように製造しなければならない。しかし、このようなヒト化抗体は、一般的にキメラ抗体に比べてヒトで免疫反応を誘発する度合が低いが、ＣＤＲはヒト由来ではないので、相変らず免疫原性を有する。したがって、抗原に対する親和度は維持しつつ、ヒト化抗体の免疫原性を最小化できる抗体の開発が必要となる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、ＨＢＶのｐｒｅＳ１タンパク質に対する結合能が優れ、なお、人体で免疫原性の低い抗体を開発するために鋭意努力した結果、既存のｐｒｅＳ１に対する抗体に比べてＨＢＶ中和活性が高くて、免疫原性が低い２種の抗体を開発し、これをＨＢＶに対する抗体治療剤として使うことができるし、ＨＢＶ感染の免疫学的予防分野で使えることを確認し、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一つの目的は、ＨＢＶ（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ）の表面抗原ｐｒｅＳ１に特異的に結合する、抗体を提供することである。
【０００７】
本発明の別の目的は、前記抗体をコーディングするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び前記発現ベクターを含む形質転換体を提供することである。
【０００８】
本発明のまた別の目的は、前記抗体を含む組成物を提供することである。
【０００９】
本発明のまた別の目的は、前記抗体を含むＨＢＶ感染の予防または治療用薬学的組成物を提供することである。
【００１０】
本発明のまた別の目的は、前記抗体をＨＢＶ感染が疑われる個体に投与する段階を含む、ＨＢＶ感染の予防または治療方法を提供することである。
【００１１】
本発明のまた別の目的は、前記抗体をＨＢＶ感染の予防または治療のための医薬品製造に使うための用途を提供することである。
【００１２】
本発明のまた別の目的は、前記抗体を利用してＨＢＶ感染が疑われる個体から分離した生物学的試料のｐｒｅＳ１タンパク質を抗原−抗体反応を通じて検出する段階を含む、ＨＢＶ（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ）感染を診断するための情報提供方法又は診断方法を提供することである。
【００１３】
本発明のまた別の目的は、前記抗体を含むＨＢＶ検出用組成物を提供することである。
【００１４】
本発明のまた別の目的は、前記検出用組成物を含むＨＢＶ検出用キットを提供することである。
【００１５】
本発明のまた別の目的は、前記抗体をＨＢＶ検出のための組成物製造に使うための用途として提供することである。
【発明の効果】
【００１６】
本発明による抗体は、ｐｒｅＳ１に対する高い親和度を示しながらも、人体では低い免疫原性を表すので、これをＨＢＶの中和が必要な分野で有用に使うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】マウス抗体のＫＲ１２７抗体及びヒト化抗体（ＨｚＫＲ１２７、ＨｚＫＲ１２７−３、ＨｚＫＲ１２７−３．１及びＨｚＫＲ１２７−３．２）のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列を示したものである（Ａ−ＶＨ、Ｂ−ＶＬ）。ＤＰ７及び ＤＰＫ１２は、それぞれヒトＩｇＶＨ及びＶκ germline segmentである。「−」は同じアミノ酸残基を示す。ＫＲ１２７抗体の重鎖可変領域の配列を配列番号１５に、軽鎖可変領域の配列は配列番号１６に記載し、重鎖ＦＲ１は配列番号１、重鎖ＣＤＲ１は配列番号２、重鎖ＦＲ２は配列番号３、重鎖ＣＤＲ２は配列番号４、重鎖ＦＲ３は配列番号５、重鎖ＣＤＲ３は配列番号６、重鎖ＦＲ４は配列番号７、軽鎖ＦＲ１は配列番号８、軽鎖ＣＤＲ１は配列番号９、軽鎖ＦＲ２は配列番号１０、軽鎖ＣＤＲ２は配列番号１１、軽鎖ＦＲ３は配列番号１２、軽鎖ＣＤＲ３は配列番号１３、軽鎖ＦＲ４は配列番号１４にそれぞれ示した。
【図２】競争的ＥＬＩＳＡ方法で抗体の親和度を決めた結果を示す図面。
【図３】ａないしｄは、ＫＲ１２７、ＨｚＫＲ１２７−３、ＨｚＫＲ１２７−３．１及びＨｚＫＲ１２７−３．２抗体の親和度をOctet Redで決めた結果を示すもの。
【図４】ＨｚＫＲ１２７−３．２のエピトープ特異性（Ａ）及びオフターゲット活性（Ｂ）を確認した結果を示すもの。（Ａ）野生型ＧＳＴ−ｐｒｅＳ１（アミノ酸１−５６）タンパク質及びこれのアラニン置換突然変異体を大腸菌で発現させた後、これを１２％SDS−PAGEに適用し、ＫＲ１２７、ＨｚＫＲ１２７−３．１、またはＨｚＫＲ１２７−３．２でウェスタンブロッティングした。ＧＳＴ−ｐｒｅＳ１に対応されるタンパク質バンドを示した。（Ｂ）ｐｒｅＳ１を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞（２９３Ｔ−Ｓ１−Ｌ１）及びｐｒｅＳ１陰性細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ、ＳＣＫ−Ｌ１、ＡＣＨＮ、Ｂ１６Ｆ１、及びＣＨＯ）を使って、ＨｚＫＲ１２７−３．２を流細胞分析に適用した結果を示したもの。
【図５】ＨＢＶのayw（Ａ）及びadr（Ｂ）サブタイプに対するＨｚＫＲ１２７−３．２のＩｎ ｖｉｔｒｏ ＨＢＶ中和活性を測定した結果を示したものである。細胞培養上澄液のＨＢｓＡｇは、感染後１０日となる時点でＥＬＩＳＡで定量化し、これを対照群と比べてパーセントで示した。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
前記の目的を果たすための本発明の一つの様態は、ＨＢＶ（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ）の表面抗原ｐｒｅＳ１に特異的に結合する抗体である。
【００１９】
本発明で用語、「ＨＢＶ（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ）の表面抗原ｐｒｅＳ１に特異的に結合する抗体」は、ＨＢＶの表面抗原であるｐｒｅＳ１に結合してＨＢＶに対する中和活性を表すことができる抗体を言う。
【００２０】
具体的に、前記抗体は、配列番号２と記載された重鎖ＣＤＲ１；配列番号２４と記載された重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号２１と記載された重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号９と記載された軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２７と記載された軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号１３と記載された軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、ＨＢＶの表面抗原ｐｒｅＳ１に特異的に結合する抗体であり得る。より具体的に、前記抗体は、配列番号３０に記載された重鎖可変領域及び配列番号３１に記載された軽鎖可変領域を含むものであり得る。
【００２１】
本発明の一具現例では、前記配列を含む抗体をＨｚＫＲ１２７−３．２と命名した。本発明ではＨｚＫＲ１２７−３のＨＣＤＲ２に位置したＡｓｎ５８残基をセリンに、ＨＣＤＲ３に位置したＡｓｐ９７残基をアラニンに変異させた場合、たった二つのアミノ酸を変異させたにもかかわらずｐｒｅＳ１に対する親和度が著しく増加した結果を表した。具体的に、前記抗体がＫＲ１２７に比べてもｐｒｅＳ１に対する２．５倍以上の高い親和度を示すだけでなく、ＨＢＶadr及びaywサブタイプの全てに対する優れたin vitroウイルス中和活性を見せることを確認した。また、前記in vitroウイルス中和活性が前記抗体の抗原に対する高い結合速度に起因することを糾明した。前記ＨｚＫＲ１２７−３．２抗体は、ＫＲ１２７抗体に比べて潜在的免疫原性が顕著に減少した特性を有するので、ヒトに投与した時、免疫原性誘発可能性が低いながらもＨＢＶに対する優れた中和活性を示すことができる（図２ないし５）。
【００２２】
また、具体的に、前記抗体は配列番号２３と記載された重鎖可変領域、及び配列番号３１と記載された軽鎖可変領域を含む抗体であり得る。
【００２３】
本発明の一具現例では、前記配列を含む抗体をＨｚＫＲ１２７−３．１と命名した。前記ＨｚＫＲ１２７−３．１は、ＫＲ１２７抗体のＦＲ残基をはじめとする多数の残基をヒトの残基に取り替え、ＫＲ１２７抗体に比べてヒトにとって低い免疫原性を表すことがでありながら、母抗体であるＫＲ１２７及びＨｚＫＲ１２７−３に比べて抗原に対する高い親和度を示す（図２及び３）。
【００２４】
このような本発明のｐｒｅＳ１結合抗体は、既存の抗体に比べて高い親和度及び低い免疫原性を提供してＨＢＶに対する優れた中和活性を表すことができるので、本発明の抗体をｐｒｅＳ１に対する抗原を認識するために有用に使える任意の適用に使うことができる。
【００２５】
本発明における用語「抗体」は、免疫学的に特定抗原と反応性を持つ兔疫グロブリン分子を含む、抗原を特異的に認識する受容体の役割をするタンパク質分子を意味し、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、全（ｗｈｏｌｅ）抗体、及び抗体断片を全て含む。また、前記用語は、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体及び２価（bivalent）または二重特異性分子（例えば、二重特異性抗体）、ジアボディ、トリアボディー及びテトラボディーを含む。前記用語は、さらにＦｃＲｎに対する結合機能を有する一本鎖抗体、スキャブ、抗体不変領域の誘導体、及びタンパク質スキャフォールドに基づく人工抗体を含む。抗体全体は、２個の全体長さの軽鎖及び２個の全体長さの重鎖を持つ構造であり、各々の軽鎖は重鎖とジスルフィド結合で連結されている。前記全体抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ及びＩｇＧを含み、ＩｇＧは亜類型（subtype）としてＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む。前記抗体断片は、抗原結合機能を保有する断片を意味し、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２及びＦｖなどを含む。前記Ｆｄは、Ｆａｂ断片に含まれている重鎖部分を意味する。前記Ｆａｂは、軽鎖及び重鎖の可変領域と軽鎖の不変領域及び重鎖の一番目不変領域（ＣＨ１ ドメイン）を持つ構造で、１個の抗原結合部位を有する。Ｆａｂ'は重鎖ＣＨ１ ドメインのＣ末端に一つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（hinge region）を有する点でＦａｂと相違する。Ｆ（ａｂ'）２抗体は、Ｆａｂ'のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合をなして生成される。Ｆｖ（variable fragment）は、重鎖可変部位及び軽鎖可変部位のみを持つ最小の抗体の欠片を意味する。二重ジスルフィドＦｖ（ｄｓＦｖ）は、ジスルフィド結合で重鎖可変部位と軽鎖可変部位が連結されていて、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、一般的にペプチドリンカーを通じて重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域が共有結合で連結されている。このような抗体断片は、タンパク質の加水分解酵素を利用して得られるし（例えば、全体抗体をパパインで制限して切断することでＦａｂを得ることができるし、ペプシンで切断すればＦ（ａｂ'）２断片を得られる）、望ましくは遺伝子組み換え技術を通じて製作することができる。
【００２６】
本発明における用語「モノクローナル抗体」は、実質的に同一な抗体集団で得た単一分子組成の抗体分子を称し、このようなモノクローナル抗体は特定のエピトープに対して単一結合の特異性及び親和度を表す。
【００２７】
本発明における用語「キメラ性抗体（chimeric antibody）」は、ＤＮＡ組み換え技術によってマウス抗体の可変領域とヒト抗体の不変領域を組み換えた形態の抗体であり、前記キメラ性抗体の免疫反応はマウス抗体に比べて大きく改善されるので、臨床的に使われる。
【００２８】
典型的に、兔疫グロブリンは重鎖及び軽鎖を持ち、各々の重鎖及び軽鎖は不変領域及び可変領域（前記部位はドメインとしても知られている）を含む。軽鎖及び重鎖の可変領域は、相補性決定領域（complementarity−determining region、以下「ＣＤＲ」という）と呼ばれる３個の多変可能領域及び４個の構造領域（framework region）を含む。前記ＣＤＲは、主に抗原のエピトープ（epitope）に結合する役割をする。それぞれの鎖のＣＤＲは、典型的にＮ−末端から順次にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と呼ばれ、また前記ＣＤＲは、重鎖に位置した場合、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３と、軽鎖に位置した場合、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３と呼ばれる。
【００２９】
また、前記のような本発明の抗体が不変領域を含む場合、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ由来、またはこれらの組み合わせ（combination）またはこれらの混成（hybrid）による不変領域を含むむことができる。
【００３０】
本発明における用語「組み合わせ（combination）」とは、二量体または多量体を形成するとき、同一起源の一本鎖兔疫グロブリン不変領域を暗号化するポリペプチッドが相違する起源の一本鎖ポリペプチッドと結合することを意味する。その例として、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭの不変領域からなるグループから選択された２個以上の不変領域より二量体または多量体を形成することができる。
【００３１】
本発明における用語「混成（hybrid）による不変領域」とは、一本鎖免疫グロブリンの重鎖不変領域が２種類以上の兔疫グロブリン重鎖不変領域、具体的にＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭから選択された２以上の兔疫グロブリン重鎖不変領域で由来された配列をいずれも含むことを意味する。
【００３２】
その例として、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４からなるグループから選択される１個ないし４個のドメインからなるドメインのハイブリッドが可能となる。
【００３３】
特に制限はされないが、本発明における前記抗体は、望ましくはヒト化抗体であってもよい。
【００３４】
本発明における用語「ヒト化抗体（humanized antibody）」は、マウスモノクローナル抗体のＣＤＲ配列の全部または一部をヒト抗体に移植した形態の抗体を意味し、その例としてマウスモノクローナル抗体のＣＤＲsをヒト抗体由来のＦＲと組み換えてヒト化可変領域を製造し、これを望ましいヒト抗体の不変領域と組み換えて製造することができるが、これに制限されない。また、前記マウス由来のＣＤＲsのみを移植する場合、ヒト化抗体の親和度が低下することがあるので、ＦＲアミノ酸残基をマウス抗体のアミノ酸に置換して親和度を増進させることもできるが、これに制限されない。
【００３５】
本発明のまた別の様態は、前記抗体をコーディングするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び前記発現ベクターを含む、ヒトを除いた形質転換体である。
【００３６】
前記抗体に対しては前記の説明のとおりである。
【００３７】
本発明で提供する前記抗体をコーディングするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、特にこれに制限されないが、哺乳類細胞（例えば、ヒト、猿、兎、ラット、ハムスター、マウス細胞など）、植物細胞、酵母細胞、昆虫細胞またはバクテリア細胞（例えば、大腸菌など）を含む真核または原核細胞で前記ポリヌクレオチドを複製及び／または発現できるベクターになれるし、望ましくは宿主細胞で前記ヌクレオチドが発現されるように適切なプロモーターに作動できるように連結されるし、少なくとも一つの選別マーカーを含むベクターになれる。その例として、ファージ、プラスミド、コスミド、ミニ−染色体、ウイルスまたはレトロウイルスベクターなどに前記ポリヌクレオチドが導入された形態となれる。
【００３８】
前記抗体をコーディングするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、前記抗体の重鎖または軽鎖をコーディングするポリヌクレオチドをそれぞれ含む発現ベクター、または重鎖または軽鎖をコーディングするポリヌクレオチドを何れも含む発現ベクターであってもよい。
【００３９】
本発明で提供する前記発現ベクターが導入された形質転換体は、特にこれに制限されないが、前記発現ベクターが導入されて形質転換された大腸菌、ストレプトマイセス、ネズミチフス菌などのバクテリア細胞；酵母細胞；ピキア酵母などの菌類細胞；ジョウジョウバエ、ハスモンヨトウＳｆ９細胞などの昆虫細胞；ＣＨＯ（チャイニーズハムスターの卵巣細胞、chinese hamster ovary cells）、ＳＰ２／０（マウス骨髓種）、ヒトリンパ芽球（human lymphoblastoid）、ＣＯＳ、ＮＳＯ（マウス骨髓種）、２９３Ｔ、ボウメラノーマ細胞、ＨＴ−１０８０、ＢＨＫ（ベービハムスター腎臓細胞、baby hamster kidney cells）、ＨＥＫ（ヒト胚芽由来腎臓細胞、human embryonic kidney cells）、ＰＥＲＣ．６（ヒト網膜細胞）などの動物細胞；または植物細胞になってもよい。
【００４０】
本発明における用語「導入」は、前記抗体をコーディングするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞に伝達する方法を意味する。このような導入は、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈法、ＤＥＡＥ−デキストラン−媒介トランスフェクション法、ポリブレン−媒介形質感染法、電気衝撃法、微細針法、リポソーム融合法、リポフェクタミン及び原形質体融合法などの当分野に公知された多様な方法によって行われる。また、形質導入は、感染（infection）を手段とし、ウイルス粒子を使って目的物を細胞内に伝達することを意味する。同時に、遺伝子衝撃などによってベクターを宿主細胞内に導入することができる。本発明における導入は、形質転換と混用して使われてもよい。
【００４１】
本発明のもう一つの様態は、前記抗体を含む組成物である。
【００４２】
前記抗体に対しては前述したとおりである。
【００４３】
具体的に、前記組成物は薬学的組成物の形態であってもよい。
【００４４】
より具体的に、前記組成物は、前記抗体を含むＨＢＶ感染の予防または治療用薬学的組成物であってもよく、前記組成物は、Ｂ型肝炎の予防または治療に使われてもよい。
【００４５】
本発明における用語「Ｂ型肝炎」は、ＨＢＶに感染した場合、これによる免疫反応によって肝に炎症が生じる疾患を言う。本発明の抗体は、ＨＢＶに対する優れた中和能を表すので、これをＢ型肝炎の予防または治療に使うことができる。
【００４６】
本発明における用語「予防」とは、前記組成物の投与によってＨＢＶ感染の発病を抑制したり遅延するすべての行為を意味し、前記「治療」とは、前記組成物の投与によってＨＢＶ感染による症状が好転したり、よい方向へ変更する全ての行為を意味する。
【００４７】
前記薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含むことができる。
【００４８】
本発明における用語「薬学的に許容可能な担体」とは、生物体を刺激せずに投与化合物の生物学的活性及び特性を阻害しない担体または希釈剤をいう。液状溶液で製剤化される組成物において許容される薬学的担体としては、滅菌及び生体に適するものであって、食塩水、滅菌数、リンガー液、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、ブドウ糖溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール及びこれらの成分のうち、１成分以上を混合して使うことができるし、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤を付加的に添加することで、水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。
【００４９】
前記薬学的組成物は、経口または非経口の様々な剤形であってもよい。製剤化する場合は、普通使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使って調剤する。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は一つ以上の化合物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース（sucrose）またはラクトース（lactose）、ゼラチンなどを混ぜて調剤される。また、単純な賦形剤の他にステアリン酸マグネシウム、タルクなどのような潤滑剤も使われる。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、耐溶剤、エマルジョン、シロップ剤などが該当するが、よく使われる単純希釈剤の水、リキッドパラフィン以外に様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれてもよい。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、エマルジョン、凍結乾燥製剤、座剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁溶剤としては、プロピレングリコール（propylene glycol）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが使われてもよい。座剤の基剤としては、ウィテップゾール（witepsol）、マクロゴ−ル、ツイーン（tween）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使われてもよい。
【００５０】
前記薬学的組成物は、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、耐溶剤、エマルジョン、シロップ制、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、エマルジョン、凍結乾燥製剤及び座剤からなる群から選択されるいずれか一つの剤形を有してもよい。
【００５１】
前記本発明の組成物は、薬学的に有効な量で投与する。
【００５２】
本発明における用語「薬学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的受恵／危険の割合で疾患を治療するために十分な量を意味し、有効用量の水準は個体種類及び重症度、年齢、性別、ガンの種類、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出割合、治療期間、同時に使われる薬物を含む要素、及びその他の医学分野でよく知られている要素によって定められてもよい。本発明の組成物は、個別治療剤で投与したり、他の治療剤と併用して投与されることがあり、従来の治療剤とは順次または同時に投与されてもよい。そして、単一または多重投与されてもよい。前記要素を全て考慮することで、副作用なしに最小限の量で最大の効果を得られる量を投与することが重要であり、当業者によって容易に決められる。
【００５３】
また、具体的に、前記組成物はＨＢＶ検出用組成物であってもよい。前記組成物は、また Ｂ型肝炎診断用組成物として使われてもよい。
【００５４】
本発明のもう一つの様態は、前記抗体をＨＢＶ感染が疑われる個体に投与する段階を含むＨＢＶ感染の予防または治療方法である。前記方法はまたＢ型肝炎の予防または治療に使われてもよい。
【００５５】
前記方法は、抗体及び薬学的に許容可能な担体をさらに含む薬学的組成物をＨＢＶが感染されたり感染された個体に投与する段階を含むＨＢＶ感染を予防または治療する方法であってもよく、前記薬学的に許容可能な担体は前記で説明したとおりである。
【００５６】
前記個体は、牛、豚、羊、ニワトリ、犬、ヒトなどを含む哺乳動物、鳥流などを含み、本発明の前記組成物の投与によってＨＢＶ感染が治る個体は制限せずに含まれる。
【００５７】
このとき、前記抗体は薬学的に有効な量で単一または多重投与されてもよい。このとき、抗体は液剤、散剤、エアロゾール、カプセル剤、腸溶皮錠剤またはカプセル剤または座剤の形態で投与することができる。投与経路は腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下内投与、内皮投与、経口投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与、直腸内投与などを含むが、これに制限されない。しかし、経口投与の際に、タンパク質またはペプチドは消化されるので、経口用組成物は活性薬剤をコーティングしたり、胃での分解から保護されるように剤形化することができる。また、製薬組成物は、活性物質が標的細胞へと移動できる任意の装置によって投与されてもよい。
【００５８】
本発明のもう一つの様態は、前記抗体をＨＢＶ感染の予防または治療のための医薬品の製造に使うための用途である。前記医薬品は、またＢ型肝炎の予防または治療に使われる。
【００５９】
前記抗体及びＨＢＶ感染の予防または治療に対しては、前述したとおりである。
【００６０】
本発明のもう一つの様態は、前記抗体を利用してＨＢＶ感染が疑われる個体から分離された生物学的試料に存在するｐｒｅＳ１タンパク質を抗原−抗体反応を通じて検出する段階を含む、ＨＢＶ感染の診断のための情報提供方法である。また、前記方法はＨＢＶ感染の診断方法である。
【００６１】
前記抗体、ＨＢＶに対しては前述したとおりである。
【００６２】
また、前記方法はＢ型肝炎の診断のために使われてもよい。
【００６３】
前記ＨＢＶ診断のための情報の提供方法は、本発明のｐｒｅＳ１に特異的な抗体を、ＨＢＶ感染が疑われる個体から分離された生物学的試料と反応させて抗原−抗体複合体形成を検出することでｐｒｅＳ１タンパク質を検出することができ、これを通じてＨＢＶ感染の診断のための情報を提供することができる。
【００６４】
具体的に、（a）前記抗体をＨＢＶ感染が疑われる個体から分離された生物学的試料で処理し、ｐｒｅＳ１タンパク質を抗原−抗体反応を通じて検出する段階；（b）前記（a）で検出されたｐｒｅＳ１タンパク質の水準を対照群と比較し、対照群に比べてｐｒｅＳ１タンパク質の水準が高ければＨＢＶ感染患者と判定する段階を含む方法である。
【００６５】
本発明における用語「生物学的試料」とは、組織、細胞、全血、血清、血漿、組織剖検試料（脳、肌、リンパ節、脊髓など）、細胞培養上澄液、破裂した真核細胞及び細菌発現系などを挙げられるが、これに制限されることはない。これら生物学的試料を操作したり、操作しない状態で本発明の抗体と反応させ、ｐｒｅＳ１タンパク質の存在またはＨＢＶの感染有無を確認することができる。
【００６６】
本発明における用語「抗原−抗体複合体」とは、試料中のｐｒｅＳ１タンパク質抗原と、これを認知する本発明による抗体の結合物を意味し、このような抗原−抗体複合体の形成は比色法（colormetric method）、電気化学法（electrochemical method）、蛍光法（fluorimetric method）、発光法（luminometry）、粒子計数法（particle counting method）、肉眼測定法（visual assessment）及び閃光計数法（scintillation counting method）からなる群から選択される任意の方法で検出することができる。しかし、必ずこれらにのみ制限されず、多様な応用と適用が可能である。
【００６７】
本発明では、抗原−抗体複合体を検出するためのものとして様々な標識体を使うことができる。具体例としては、酵素、蛍光物、リガンド、発光物、微細粒子、放射性同位元素からなるグループの中で選択されてもよく、必ずしもこれらにのみ限定されることはない。
【００６８】
検出標識体として使われる酵素としては、アセチルコリンエステラーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ラクタマーゼなどを含み、蛍光物としては、フルオレセイン、Ｅｕ３+、Ｅｕ３+ キレートまたはクリプタートなどを含み、リガンドとしては、ビオチン誘導体などを含み、発光物としてはアクリジニウムエステル、イソルミノール誘導体などを含み、微細粒子としてはコロイド金、着色されたラテックなどを含み、放射性同位元素としては５７Co、３H、１２５I、１２５I−ボントン（Bonton）ハンター（Hunter）試薬などを含む。
【００６９】
望ましくは、抗原−抗体複合体を酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）を利用して検出することができる。酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）には、固体支持体に付着した抗原を認知する標識された抗体を利用する直接的ＥＬＩＳＡ、固体支持体に付着した抗原を認知する抗体の複合体で捕獲抗体を認知する標識された二次抗体を利用する間接的ＥＬＩＳＡ、固体支持体に付着した抗体と抗原の複合体で抗原を認知する標識された別の抗体を利用する直接的サンドイッチＥＬＩＳＡ、固体支持体に付着した抗体と抗原の複合体で抗原を認知する別の抗体と反応させた後、この抗体を認知する標識された２次抗体を利用する間接的サンドイッチＥＬＩＳＡなど多様なＥＬＩＳＡ方法を含む。
【００７０】
前記抗体は、検出標識を持つことができ、検出標識を持たない場合は、これらのモノクローナル抗体を捕獲することができるし、検出標識を持つ別の抗体を処理して確認することができる。
【００７１】
本発明のもう一つの様態は、前記ＨＢＶ検出用組成物を含む、ＨＢＶ検出用キットである。前記キットは、またＢ型肝炎診断キットの形態であってもよい。
【００７２】
前記組成物及びＢ型肝炎、診断に対しては前述したとおりである。
【００７３】
本発明のもう一つの様態は、前記抗体をＨＢＶ検出のための組成物製造に使うための用途である。
【００７４】
前記抗体及びＨＢＶに対しては前述したとおりである。
【００７５】
以下、本発明を下記の例によって詳しく説明する。ただし、下記の例は本発明を例示するためのものであって、下記の例によって本発明の範囲が制限されることはない。
【００７６】
実施例１：実験方法
（１）細胞培養
ＨＥＫ２９３Ｔ、ＡＣＨＮ、Ｂ１６Ｆ１、及びＳＣＫ−Ｌ１細胞は、１０％ＦＢＳ（fetal bovine serum）が補われたＤＭＥＭ（インビトロジェン）培地で培養した。ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞は、ヒポキサンチン（hypoxanthine、１０mg／l）、チミジン（thymidine、１０mg／l）、グリシン（glycine、５０mg／l）、グルタミン（glutamine、５８７ mg／l）、グルコース（４．５ mg／l）、１０％ＦＢＳ及び抗生剤−抗真菌剤（GIBCO／BRL）を含む DMEM／F１２（インビトロジェン）培地で培養した。ＨｅｐａＲＧ細胞は、Gripon、P et al.（Proc Natl Acad Sci USA．２００２ Nov ２６；９９（２４）：１５６５５−６０.）に記述された方法によって培養して分化させ、５％牛胎児血清、２％ＤＭＳＯ、５ mg／Ｌインシュリン、５×１０−６ Ｍヒドロコルチゾン（hydrocortisone）、５μg／Ｌ亜セレン酸ナトリウム（sodium selenite）、２０,０００ ＵＩ／Ｌペニシリン、及び２０mg／Ｌストレプトマイシンが補われたWilliam's E培地（Gibco Life technologies）を含む９６−ウェルプレートで５％ＣＯ２、３７℃のインキュベーターで培養して維持させた。
【００７７】
（２）ヒト化抗体の製作、発現及び錠剤
ヒト化ＶＨ及びＶＬ遺伝子は、GeneArt（ドイツ）に依頼して合成した、これをヒトCγ１及びCκを含むpdCMV−dhfrC−cA１０A３のEcoRI−ApaI及びHindIII−BsiWI位置のそれぞれに順次にサブクローニングした。製造された発現ベクターは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にリポフェクタミン（インビトロジェン）を使って導入した。細胞培養上澄液は、タンパク質−Ａセファロースコラム（ミリポア）を使用した親和度クロマトグラフィーに適用し、タンパク質の濃度はモル吸収係数に基づいてNanoDrop（Thermo Scientific）で決定した。錠剤されたタンパク質が完全であるか否かはSDS−PAGEを使って分析した。
【００７８】
（３）親和度決定
親和度決定は、競争的ＥＬＩＳＡを使って分析し、具体的分析方法は次のとおりである（Oh MS et al.，A new epitope tag from hepatitis B virus preS1 for immunodetection、localization and affinity purification of recombinant proteins、JImmunol Methods．２００３ Dec；２８３（１−２）：７７−８９．）。
【００７９】
５−１０ngの抗体を含む溶液を多様な濃度のＧＳＴ−ｐｒｅＳ１抗原（１０−１０−１０−６M、競争的抗原）と３７℃の温度で３時間インキュベーションし、これを１００ngのＧＳＴ−ｐｒｅＳ１抗原がコーティングされた各ウェルに添加した。３７℃で１時間インキュベーションした後、goat anti−mouse IgG（Fc−specific）−HRP conjugate（１：５０００ v／v、Pierce、IL）を添加し、３０分間インキュベーションした。洗浄後、０．０４％OPD（ortho−phenylenediamine−dihydrochloride）及び０．０１２％H２O２を含む０．２Ｍクエン酸塩（citrate）−PO４緩衝液（pH５．０）を各ウェルに添加した。反応は２．５Ｍ H２SO４で中止し、吸光度（Ａ）は４９２nmでＥＬＩＳＡリーダー機（SOFTmaxPRO、Moleclar Devices、USA）で測定した。分離平衡定数（Kd）は、Klotzプロットで分析した。
【００８０】
Octet Redによる親和度決定のためには、抗−ヒトＦｃがコーティングされたバイオセンサチップ（ForteBio、１８−００１５）は９６−ウェルマイクロプレート（Greiner bio−one、６５５２０９）を１００rpmで撹拌しながら０．１％w／vで牛血清アルブミンを含む ＰＢＳ（０．１％ＰＢＡ）で２０分間活性化し、その後２μｇ／mLの抗体で１０分間飽和させた。これは、一般的に１nmのキャプチャー水準をもたらす。ＧＳＴ−ｐｒｅＳ１は、０．１％ＰＢＡで２倍段階的希釈（６．２５、１２．５、２５、５０、及び１００ｎＭ）して製造し、これを抗体が結合されたチップにそれぞれインキュベーションした。結合及び分離速度をそれぞれ１５分及び３０分間測定した。すべての測定は、ランニング緩衝液にのみ露出した対照群センサーを抜くことで、ベースライン上昇（baseline drift）を正した。作動温度は３０℃と維持した。データはForteBioデータ分析ソフトウェア７．０を持つ１：１相互作用モデル（fitting global、Rmax unlinked by sensor）を使って分析した。
【００８１】
（４）ウェスタンブロット分析
ＧＳＴ−ｐｒｅＳ１（amino acids １−５６）及びｐｒｅＳ１（amino acids ３７−４７）のアラニン置換突然変異タンパク質は、それぞれE．coli DH５α細胞で発現した。タンパク質抽出液は、１２％SDS−PAGE及びＫＲ１２７抗体またはヒト化されたＫＲ１２７抗体（１μｇ／ml）を使ったウェスタンブロットに適用し、抗−マウスまたはヒトＩｇＧ（Fc−specific）ＨＲＰ複合変化（１：５０００v／v、Thermo Scientific）で分析した。
【００８２】
（５）流細胞分析機分析
１μｇの抗体を含む１００μｌのＰＢＡで、６０分間４℃で細胞をインキュベーションした。ＰＢＡで３回洗浄した後、細胞をfluorescein isothiocyanate−conjugated anti−hFc抗体（BD Pharmingen）で４℃で３０分間インキュベーションした。抗体結合分析のために、PI（Propidium iodide）陰性細胞をFACSCalibur（Becton Dickinson）で分析した。
【００８３】
（６）Ｉｎ ｖｉｔｒｏ中和アッセイ
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＨＢＶ感染及び中和アッセイは、分化されたＨｅｐａＲＧ細胞を使用して行った。分化されたＨｅｐａＲＧ細胞は、ウェル（１００μｌの細胞培養培地を含み）当たり６×１０４細胞数の密度で分柱し、adrまたはaywサブタイプのＨＢＶウイルス粒子（約 １０６ viral genomic equivalent）で６日後感染させた。中和アッセイのために、ウイルス粒子は、表示された濃度の抗体で常温で３０分間の全−インキュベーションをし、培養培地１００μｌで覆われた、培養されたＨｅｐａＲＧ細胞で２４時間再度インキュベーションした。感染された細胞は、前記培養液で再び洗浄し、さらに１０日間インキュベーションし、このときの培地は二日ごとに取り替えた。感染して１０日後、細胞培養上澄液は５０倍まで希釈し、ＨＢｓＡｇ濃度はＥＬＩＳＡキット（Bio−Rad）で測定した。
【００８４】
実施例２：ＨＢＶのｐｒｅＳ１に対する抗体の製造
（１）ＨｚＫＲ１２７−３の製造
マウス抗体であるＫＲ１２７及びＫＲ１２７のＣＤＲを移植したヒト化抗体のＨｚＫＲ１２７のアミノ酸配列は、図１に図示した（図１のＡは重鎖可変領域（ＶＨ）、図１のＢは軽鎖可変領域（ＶＬ））。前記ＨｚＫＲ１２７抗体に比べて改善された抗体を開発するために位置−特異的突然変異を実施した。
【００８５】
ＶＨでは、ＫＲ１２７の９個のＦＲ残基（Val１２、Ala２８、Ser３０、Ile４８、Lys６６、Ala６７、Leu６９、Ala７８、及び Phe９１、kabat numberingと示す）を図１に示したように、ヒトのアミノ酸残基に置換した。ただし、ＫＲ１２７の二つのＦＲ３残基（Ala７１及びLys７３）は維持させた。
【００８６】
ＶＬでは、ＫＲ１２７の３個のＦＲ残基（Leu３、Ser４３、及びLys４５）は、ヒトのアミノ酸残基に置換した。しかし、ＫＲ１２７の２個のＦＲ２残基（Leu３６及びArg４６）は維持した。Leu３６を維持させることにより、抗原結合ポケットの形態を維持しつつ、抗原に対する最適結合をもたらすことができる。４６番目のアミノ酸残基は、ＨＣＤＲ３の形態を安定化させることを確認し、これを維持させた。
【００８７】
前記ＦＲ残基の他にも、２個のＬＣＤＲ２残基（Lys５３及びLeu５４）をヒト配列に置換した。
【００８８】
前記のように考案されたヒト化されたＶＨ及びＶＬ配列を合成し、これをヒトCγ１及びCκにそれぞれ合わせ、発現プラスミドのpdCMV−dhfrC−ＨｚＫＲ１２７−３を製造した。前記プラスミドＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入し、前記細胞培養上澄液から製造したヒト化抗体のＨｚＫＲ１２７−３を錠剤した。競争的ＥＬＩＳＡを利用してＧＳＴ−ｐｒｅＳ１に対するＨｚＫＲ１２７−３の親和度を決めて、その結果、母抗体であるＫＲ１２７に比べてやや低い親和度を表した（図２）。Octet Redを利用して親和度を決めて、ＨｚＫＲ１２７−３はＫＲ１２７に比べて３倍ほど低い親和度（KD）を示した。このような減少は、主に解離速度の増加によるものとして分析された（表１、図２、図３a及び図３b）。
【００８９】
【表１】
2017538445.tif 000003
【００９０】
（２）ＨｚＫＲ１２７−３．１及びＨｚＫＲ１２７−３．２の製造
前記ＨｚＫＲ１２７−３は、ＫＲ１２７に比べてやや低い親和度を表したため、親和度を高めるためにＨｚＫＲ１２７−３の配列で位置−特異的突然変異を行った。
【００９１】
具体的に、Ａｓｐ９７番目のアミノ酸残基をアラニンに置換し、ＨｚＫＲ１２７−３．１と命名される抗体を製造した。その後、これをＨＥＫ２９３Ｔ細胞で一時的に発現させ、錠剤した後、競争的ＥＬＩＳＡ及びOctet Redで順次に親和度を検証した。その結果、ＨｚＫＲ１２７−３．１の親和度は８．１３×１０−１０Ｍを示し、ＨｚＫＲ１２７−３（３．９７×１０−９Ｍ）に比べて４．９倍ほど高い値を示した。また、分析した結果、このような親和度上昇は、主に解離速度の減少から起因したと分析された（表１、図２及び図３c）。
【００９２】
前記ＨｚＫＲ１２７−３．１で親和度を一層増進させるために、ＨｚＫＲ１２７−３．１のＨＣＤＲ２に位置したＡｓｎ５８アミノ酸残基をセリンに置換し、ＨｚＫＲ１２７−３．２と命名される抗体を製造した。その後、これを細胞で一時的に発現させ、錠剤した後、親和度を決定した。
【００９３】
その結果、ＨｚＫＲ１２７−３．２の親和度は４．９３×１０−１０Ｍを示し、ＨｚＫＲ１２７−３．１に比べて１．６倍ほど高い値を示した。また、分析した結果、このような親和度上昇は、主に結合速度の増加に起因したものと分析された（表１、図２及び図３d）。
【００９４】
実施例３：ＨｚＫＲ１２７−３．２の潜在的免疫原性分析
ＨｚＫＲ１２７及びＨｚＫＲ１２７−３．２のＶＨ及びＶＬ配列を分析し、MHCII 分子（HLA−DR）に結合する潜在的Ｔ細胞エピトープが存在するか否かを分析した。ペプチド−MHCII 複合体は、補助Ｔ細胞によって認知され、補助Ｔ細胞の分化を促進して免疫反応を促進するので、潜在的免疫原性を低めるために潜在的Ｔ細胞エピトープの存在可否を確認し、その結果を下記表２に示す。
【００９５】
その結果、下記表２に示したように、潜在的Ｔ細胞エピトープは、ＨｚＫＲ１２７のＨＣＤＲ２及びＦＲ３の間の分岐点（ＨＣＤＲ２／ＦＲ３）、ＶＬのＦＲ２及びＦＲ２及びＬＣＤＲ２の分岐点（ＦＲ２／LＣＤＲ２）に位置するが、ＨＣＤＲ２／ＦＲ３及びＶＬのＦＲ２の場合、本発明によるＨｚＫＲ１２７−３．２抗体ではこのような潜在的Ｔ細胞エピトープが全て除去されていたし、ＦＲ２／ＬＣＤＲ２でも大方除去された結果を示し、ＨｚＫＲ１２７に比べて免疫原性が顕著に減少されることを示唆した。
【００９６】
【表２】
2017538445.tif 000004
【００９７】
実施例４：ＨｚＫＲ１２７−３．２の特異度分析
ＨｚＫＲ１２７−３．２の抗原−結合特異性を確認するために、ｐｒｅＳ１エピトープの各位置にアラニン置換突然変異を持つ一連のＧＳＴ−ｐｒｅＳ１（アミノ酸１ないし５６）タンパク質をE.coliで発現させ、これをＫＲ１２７またはＨｚＫＲ１２７−３．２とともにウェスタンブロット分析に適用した。
【００９８】
その結果、図４のＡに示したように、ＨｚＫＲ１２７−３．２はＫＲ１２７と同じエピトープ特異性を表すことを確認した。
【００９９】
また、ＨｚＫＲ１２７−３．２がオフターゲット（off−target）活性を表すか否かを決定するために、流細胞分析を行った。ｐｒｅＳ１発現細胞（２９３Ｔ−Ｓ１−Ｌ１）を陽性対照群で製造するために、ｐｒｅＳ１（アミノ酸３７−４７）をＬ１ＣＡＭ（Ｌ１ cell adhesion molecule）タンパク質のＮ−末端に融合した。その後、前記融合タンパク質をＨＥＫ２９３Ｔ細胞に一時的に発現させた。
【０１００】
その結果、図４のＢに示したように、ＨｚＫＲ１２７−３．２はｐｒｅＳ１陽性細胞である２９３Ｔ−Ｓ１−Ｌ１細胞の表面に結合したが、ｐｒｅＳ１陰性細胞であるＨＥＫ２９３Ｔ、Ｌ１ＣＡＭ−過発現ヒト胆管癌細胞であるＳＣＫ−Ｌ１、ヒト腎臓癌細胞であるＡＣＨＮ、マウス黒色腫細胞であるＢ１６Ｆ１、及びチャイニーズハムスター卵巣細胞であるＣＨＯ細胞には結合しない結果を示した。
【０１０１】
実施例５：ＨｚＫＲ１２７−３．２のＨＢＶ中和活性確認
ＨｚＫＲ１２７−３．２は、ＫＲ１２７に比べてｐｒｅＳ１抗原に対するより高い親和度を示すので、in vitroＨＢＶ中和アッセイを通じてウイルス中和活性を比べた。各抗体をそれぞれ異なる濃度（０．２−２００μｇ／ml）で前処理したＨｅｐａＲＧ細胞にadrまたはaywサブタイプであるＨＢＶ粒子を感染させた。感染された細胞を１０日間培養し、培養培地は ２日ごとに取り替えた。感染後１０日、感染された細胞から分泌されたＨＢｓＡｇの水準をＥＬＩＳＡで測定し、その結果を図５に示す。
【０１０２】
その結果、ＨＢｓＡｇの分泌速度は、抗体の濃度増加に依存的に減少し、これは本発明によるＨｚＫＲ１２７−３．２抗体の中和特異性を示すものであり、また、ＫＲ１２７に比べてadr及びaywサブタイプのいずれに対する強化されたウイルス−中和活性を示唆する。
【０１０３】
以上の説明により、本発明が属する技術分野における当業者は、本発明がその技術的思想や必須的特徴を変更しなくても別の具体形態で実施されることを理解することができる。これに係り、以上で記述した実施例は、いずれの面において例示的なもので、限定的なものではないと理解しなければならない。本発明の範囲は、前記詳細な説明よりは後述する特許請求範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から想到しえる全ての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものとして解釈しなければならない。
【図１】
2017538445.tif 000005
【図２】
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【図３ａ】
2017538445.tif 000007
【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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