(57)【要約】  本発明は、フィロウイルス感染症に対する組換え改変ワクシニアウイルスアンカラ系（ＭＶＡ系）ワクチンを含む、改善されたフィロウイルスワクチン、および関連する製品、方法および使用に関する。特に、本発明は、マールブルグウイルス（ＭＡＲＶ）またはエボラウイルスグリコプロテインの抗原決定基をコードする少なくとも１個の異種ヌクレオチド配列を含む遺伝子操作された（組み換え）ＭＶＡおよびＦＰＶベクターに関する。特に、本発明は、エボラウイルスグリコプロテインおよびビリオンタンパク質４０を含む組み換えＭＶＡに関する。本発明は、例えば、対象に防御免疫反応を誘発するのに適したＭＶＡ及び遺伝子操作された（組み換え）ＦＰＶの製品、方法および使用、ならびにプライム−ブースト投薬計画にも関する。
2017527557.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）医薬的に許容される担体と共に、少なくとも１個のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを、免疫学的に有効な量で含む第１の組成物、および
（ｂ）医薬的に許容される担体と共に、第１のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含む鶏痘ベクターを、免疫学的に有効な量で含む第２の組成物
を含み、
前記組成物の一方はプライミング組成物であり、他方の組成物はブースティング組成物である混合ワクチン。
【請求項２】
（ａ）医薬的に許容される担体と共に、少なくとも２個のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを、免疫学的に有効な量で含む第１の組成物、および
（ｂ）医薬的に許容される担体と共に、第１のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを、免疫学的に有効な量で含む第２の組成物
を含み、
前記組成物の一方はプライミング組成物であり、他方の組成物はブースティング組成物である混合ワクチン。
【請求項３】
前記第１の組成物が、第２のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを含む、請求項１に記載の混合ワクチン。
【請求項４】
前記第１の組成物が、第３のフィロウイルスサブタイプまたは第４のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを含む、請求項２〜３に記載の混合ワクチン。
【請求項５】
前記フィロウイルスサブタイプが、エボラウイルス（ＥＢＯＶ）またはマールブルグウイルス（ＭＡＲＶ）から選択される、請求項１〜４に記載の混合ワクチン。
【請求項６】
前記ＥＢＯＶタンパク質の抗原決定基が、ザイールエボラウイルス（ＺＥＢＯＶ）、スーダンエボラウイルス（ＳＥＢＯＶ）、コートジボワールエボラウイルス（ＥＢＯＶ−Ｃｄｌ）、レストンエボラウイルス（ＥＢＯＶ−Ｒｅｓｔｏｎ）およびブンディブギョエボラウイルス（ＢＥＢＯＶ）からなる群から選択される１個またはそれ以上のＥＢＯＶサブタイプに由来する、請求項１〜５に記載の混合ワクチン。
【請求項７】
前記フィロウイルスタンパク質の抗原決定基が、エンベロープグリコプロテイン（ＧＰ）、核タンパク質（ＮＰ）、ビリオンタンパク質３５（ＶＰ３５），ビリオンタンパク質４０（ＶＰ４０），ビリオンタンパク質３０（ＶＰ３０），ビリオンタンパク質２４（ＶＰ２４）およびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼタンパク質（Ｌ）からなる群から選択される、請求項１〜６に記載の混合ワクチン。
【請求項８】
前記第１の組成物中の前記ＭＶＡベクターが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２０、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３４および配列番号３７からなる群から選択される抗原タンパク質をコードする核酸を含む、請求項１〜７に記載の混合ワクチン。
【請求項９】
前記第１の組成物中のＭＶＡベクターが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２０、配列番号２９および配列番号３１を有する群から選択される４個の異なるフィロウイルスサブタイプに由来する抗原タンパク質をコードする核酸を含む、請求項１〜８に記載の混合ワクチン。
【請求項１０】
前記第１の組成物中のＭＶＡベクターが、配列番号６、配列番号２０、配列番号２９および配列番号３１を有する群から選択される４個の異なるフィロウイルスサブタイプに由来する抗原タンパク質をコードする核酸を含む、請求項１〜９に記載の混合ワクチン。
【請求項１１】
少なくとも１個のフィロウイルスサブタイプに対して防御免疫反応を引き起こすのに使用する請求項１〜１０に記載の混合ワクチンであって、前記第１の組成物を前記免疫反応をプライミングするのに使用し、前記第２の組成物を前記免疫反応をブースティングするのに使用する、前記混合ワクチン。
【請求項１２】
少なくとも１個のフィロウイルスサブタイプに対して防御免疫反応を引き起こすのに使用する請求項１〜１０に記載の混合ワクチンであって、前記第２の組成物を前記免疫反応をプライミングするのに使用し、前記第１の組成物を前記免疫反応をブースティングするのに使用する、前記混合ワクチン。
【請求項１３】
前記ブースティング組成物が、前記ブースティング組成物のベクターの２回またはそれ以上の投与量を含む、請求項１〜１２に記載の混合ワクチン。
【請求項１４】
（ａ）医薬的に許容される担体と共に、少なくとも１個のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを、免疫学的に有効な量で含む第１の組成物、および
（ｂ）医薬的に許容される担体と共に、第１のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含む鶏痘ベクターを、免疫学的に有効な量で含む第２の組成物
を含み、
前記組成物の一方はプライミング組成物であり、他方の組成物はブースティング組成物であるキット。
【請求項１５】
（ａ）医薬的に許容される担体と共に、少なくとも２個のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを、免疫学的に有効な量で含む第１の組成物、および
（ｂ）医薬的に許容される担体と共に、第１のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを、免疫学的に有効な量で含む第２の組成物
を含み、
前記組成物の一方はプライミング組成物であり、他方の組成物はブースティング組成物であるキット。
【請求項１６】
前記第１の組成物が、第２のフィロウイルスサブタイプ、第３のフィロウイルスサブタイプまたは少なくとも４個のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを含む、請求項１４〜１５に記載の混合ワクチン。
【請求項１７】
前記第１の組成物中の前記ＭＶＡベクターが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２０、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３４および配列番号３７からなる群から選択される抗原タンパク質をコードする核酸を含む、請求項１４〜１６に記載のキット。
【請求項１８】
前記第１の組成物中の前記ＭＶＡベクターが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２０、配列番号２９および配列番号３１を有する群から選択される抗原タンパク質をコードする核酸を含む、請求項１４〜１６に記載のキット。
【請求項１９】
前記第１の組成物中の前記ＭＶＡベクターが、配列番号６、配列番号２０、配列番号２９および配列番号３１を有する群から選択される抗原タンパク質をコードする核酸を含む、請求項１４〜１６に記載のキット。
【請求項２０】
少なくとも１個のフィロウイルスサブタイプに対して防御免疫反応を引き起こすのに使用する請求項１４〜１９に記載のキットであって、前記第１の組成物を、前記免疫反応をプライミングするのに使用し、前記第２の組成物を前記免疫反応をブースティングするのに使用する、前記キット。
【請求項２１】
少なくとも１個のフィロウイルスサブタイプに対して防御免疫反応を引き起こすのに使用する請求項１４〜１９に記載のキットであって、前記第２の組成物を、前記免疫反応をプライミングするのに使用し、前記第１の組成物を前記免疫反応をブースティングするのに使用する、前記キット。
【請求項２２】
前記ブースティング組成物が、前記ブースティング組成物のベクターの２回またはそれ以上の投与量を含む、請求項１４〜２１に記載のキット。
【請求項２３】
フィロウイルスに起因する病気の治療および／または予防における使用のためのフィロウイルスタンパク質の２個またはそれ以上の抗原決定基をコードするヌクレオチド配列を含む組み換え改変ワクシニアウイルス（ＭＶＡ）ベクター。
【請求項２４】
前記フィロウイルスが、エボラウイルス（ＥＢＯＶ）またはマールブルグウイルス（ＭＡＲＶ）から選択される、請求項２３に記載の使用のための組み換えＭＶＡベクター。
【請求項２５】
前記ＥＢＯＶタンパク質の前記抗原決定基が、ザイールエボラウイルス（ＺＥＢＯＶ）、スーダンエボラウイルス（ＳＥＢＯＶ）、コートジボワールエボラウイルス（ＥＢＯＶ−ＣｄＩ）、レストンエボラウイルス（ＥＢＯＶ−Ｒｅｓｔｏｎ）およびブンディブギョエボラウイルス（ＢＥＢＯＶ）からなる群から選択される１個またはそれ以上のＥＢＯＶサブタイプに由来する、請求項２３または２４に記載の使用のための混合ワクチン。
【請求項２６】
前記フィロウイルスタンパク質の抗原決定基が、エンベロープグリコプロテイン（ＧＰ）である、請求項２３〜２５に記載の使用のための組み換えＭＶＡベクター。
【請求項２７】
２個またはそれ以上のエボラサブタイプの抗原決定基をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項２３〜２６に記載の使用のための組み換えＭＶＡベクター。
【請求項２８】
。
前記フィロウイルスタンパク質の前記抗原決定基が、エンベロープグリコプロテイン（ＧＰ）、核タンパク質（ＮＰ）、ビリオンタンパク質３５（ＶＰ３５），ビリオンタンパク質４０（ＶＰ４０），ビリオンタンパク質３０（ＶＰ３０），ビリオンタンパク質２４（ＶＰ２４）およびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼタンパク質（Ｌ）からなる群から選択される、請求項２３〜２７に記載の組み換えＭＶＡベクター。
【請求項２９】
前記フィロウイルスタンパク質の前記抗原決定基が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２０、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３４および配列番号３７からなる群から選択される、請求項２３〜２８に記載の使用のための組み換えＭＶＡベクター。
【請求項３０】
前記フィロウイルスタンパク質の前記抗原決定基が、配列番号２９および／または配列番号６、配列番号２０および配列番号３１を含む、請求項２３〜２８に記載の使用のための組み換えＭＶＡベクター。
【請求項３１】
前記抗原決定基をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号２８および／または配列番号５、配列番号１９および配列番号３０を含む、請求項２３〜２８に記載の使用のための組み換えＭＶＡベクター。
【請求項３２】
フィロウイルスに起因する病気の治療および／または予防における使用のための、フィロウイルスグリコプロテインの抗原タンパク質をコードし、さらにフィロウイルスビリオンタンパク質４０（ＶＰ４０）をコードするヌクレオチド配列を含む組み換えＭＶＡベクター。
【請求項３３】
前記フィロウイルスビリオンタンパク質４０（ＶＰ４０）の抗原タンパク質をコードするヌクレオチド配列が配列番号３３を含む、請求項３２の使用のための組み換えＭＶＡベクター。
【請求項３４】
（ａ）配列番号５、配列番号１９および配列番号３０、（ｂ）配列番号５、配列番号１９、配列番号２８および配列番号３０、ならびに（ｃ）配列番号１９および配列番号３３からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む組み換えＭＶＡベクター。
【請求項３５】
前記組み換えウイルスを作るのに使用した前記ＭＶＡは、ＭＶＡ−ＢＮウイルス、または鶏胚線維芽（ＣＥＦ）細胞においてインビトロで生殖複製する能力を有するが、ヒトケラチン生成細胞株ＨａＣａｔ、ヒト骨肉腫細胞株１４３Ｂ，ヒト胚腎臓細胞株２９３、およびヒト頸部腺がん細胞株ＨｅＬａにおいては生殖複製する能力を有しない誘導体である、請求項１〜１３に記載の混合ワクチン、請求項２３〜３３に記載の使用のための組み換えＭＶＡベクターまたは請求項３４の組み換えＭＶＡベクター。
【請求項３６】
前記組み換えウイルスを作るのに使用した前記ＭＶＡは、欧州動物細胞培養コレクション（ＥＣＡＣＣ）に受入番号Ｖ０００８３００８として預託されている、ＭＶＡ−ＢＮである、請求項１〜１３に記載の混合ワクチン、請求項２３〜３３に記載の使用のための組み換えＭＶＡベクターまたは請求項３４の組み換えＭＶＡベクター。
【請求項３７】
同時刺激分子をコードする核酸を含む、請求項２３〜３３、３５、または３６に記載の使用のための組み換えＭＶＡベクター。
【請求項３８】
対象の免疫反応に作用するための、請求項２３〜３７に記載の組み換えＭＶＡベクター。
【請求項３９】
薬剤またはワクチンとして使用するための、請求項２３〜３７に記載の組み換えＭＶＡベクター。
【請求項４０】
請求項２３〜３７に記載の前記組み換えＭＶＡベクターを含むワクチン、組成物または細胞。
【請求項４１】
前記組み換えＭＶＡベクターを、１回、２回、３回または４回投与する、請求項２３〜３３または３５〜３９に記載の使用のための前記組み換えＭＶＡ。
【請求項４２】
フィロウイルス感染症に対して強化された免疫反応を誘発する薬剤またはワクチンとして使用するための、請求項３２〜３３の組み換えＭＶＡであって、前記ＭＶＡは、処置する対象において、フィロウイルス様粒子を生成する能力を有する、前記組み換えＭＶＡ。
【請求項４３】
第１の投与（プライミング）のための第１のバイアルまたは容器、および第２の投与（ブースティング）のための第２のバイアルまたは容器に入った、請求項２３〜３３または３５〜３９に記載の組み換えＭＶＡベクターを含むキット。
【請求項４４】
３個目、４個目またはさらなるバイアルまたは容器に入った、３回目、４回目またはさらなる投与のための前記組み換えＭＶＡベクターを含む、請求項４３に記載のキット。
【請求項４５】
フィロウイルスに起因する病気の治療および／または予防のための薬剤を製造のための、請求項１〜１１の前記混合ワクチンまたは請求項２３〜３６の前記組み換えＭＶＡベクターの使用。
【請求項４６】
請求項２３〜３６のいずれかのＭＶＡベクターおよび医薬的に許容される担体、希釈剤および／または添加剤を含む薬剤組成物。
【請求項４７】
配列番号２６を有するＦＰＶ−４０Ｋプロモーターの制御下にあるフィロウイルスタンパク質の少なくとも１個の抗原決定基をコードするヌクレオチド配列を含む組み換えＦＰＶベクター。
【請求項４８】
前記フィロウイルスが、エボラウイルス（ＥＢＯＶ）またはマールブルグウイルス（ＭＡＲＶ）から選択される、請求項４７の組み換えＦＰＶベクター。
【請求項４９】
前記ＥＢＯＶタンパク質の前記抗原決定基が、ザイールエボラウイルス（ＺＥＢＯＶ）、スーダンエボラウイルス（ＳＥＢＯＶ）、コートジボワールエボラウイルス（ＥＢＯＶ−ＣｄＩ）、レストンエボラウイルス（ＥＢＯＶ−Ｒｅｓｔｏｎ）およびブンディブギョエボラウイルス（ＢＥＢＯＶ）からなる群から選択される１個またはそれ以上のＥＢＯＶサブタイプに由来する、請求項４８に記載の組み換えＦＰＶベクター。
【請求項５０】
前記フィロウイルスタンパク質の前記抗原決定基が、エンベロープグリコプロテイン（ＧＰ）、核タンパク質（ＮＰ）、ビリオンタンパク質３５（ＶＰ３５），ビリオンタンパク質４０（ＶＰ４０），ビリオンタンパク質３０（ＶＰ３０），ビリオンタンパク質２４（ＶＰ２４）およびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼタンパク質（Ｌ）からなる群から選択される、請求項４７〜４９に記載の組み換えＦＰＶ。
【請求項５１】
前記フィロウイルスタンパク質の前記抗原決定基が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２０、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３４および配列番号３７の群から選択される抗原タンパク質をコードする、請求項５０に記載の組み換えＦＰＶベクター。
【請求項５２】
フィロウイルスに起因する病気の治療および／または予防で使用するための、請求項４７〜５１に記載の組み換えＦＰＶ。
【請求項５３】
フィロウイルスに対する免疫反応をプライミングまたはブースティングするために使用する、請求項４７〜５１に記載の組み換えＦＰＶ。
【請求項５４】
前記組み換えＦＰＶベクターを、１回、２回、３回または４回投与する、請求項５２または５３に記載の使用のための組み換えＦＰＶ。
【請求項５５】
フィロウイルスに起因する病気の治療および／または予防のための薬剤またはワクチンを製造するための、請求項４７〜５１の前記組み換えＦＰＶの使用。
【請求項５６】
対象にいて、フィロウイルスに対して免疫反応を誘発する方法であって、対象に、
（ａ）医薬的に許容される担体と共に、少なくとも１個のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを、免疫学的に有効な量で含む第１の組成物、および
（ｂ）医薬的に許容される担体と共に、第１のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含む鶏痘ベクターを、免疫学的に有効な量で含む第２の組成物
を投与すること含み、
前記組成物の一方はプライミング組成物であり、他方の組成物はブースティング組成物である、前記方法。
【請求項５７】
対象において、フィロウイルスに対して免疫反応を誘発する方法であって、対象に、
（ａ）医薬的に許容される担体と共に、少なくとも２個のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを、免疫学的に有効な量で含む第１の組成物、および
（ｂ）医薬的に許容される担体と共に、第１のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを、免疫学的に有効な量で含む第２の組成物
を投与することを含み、
前記組成物の一方はプライミング組成物であり、他方の組成物はブースティング組成物である、前記方法。
【請求項５８】
前記第１の組成物が、第２のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記第１の組成物が、第３のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記第１の組成物中の前記ＭＶＡベクターが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２０、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３４および配列番号３７からなる群から選択される抗原タンパク質をコードする核酸を含む、請求項５６〜５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記第１の組成物中の前記ＭＶＡベクターが、少なくとも４個のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含む、請求項５６〜５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記第１の組成物中の前記ＭＶＡベクターが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２０、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３４および配列番号３７を有する４個の異なるフィロウイルスサブタイプに由来する抗原タンパク質をコードする核酸を含む、請求項５６〜６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記ブースティング組成物を、前記プライミング組成物を投与した２〜１２週後に投与する、請求項５６〜６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記ブースティング組成物を前記対象に２回またはそれ以上投与する請求項５６〜６３に記載の方法。
【請求項６５】
対象者の免疫反応に作用する方法であって、請求項２３〜３９に記載の組み換えＭＶＡベクターを前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項６６】
フィロウイルスに起因する病気の治療および／または予防で使用するための組み換えＭＶＡベクターを生成する方法であって、
（ａ）ＭＶＡウイルスを用いて宿主細胞を感染させるステップ、
（ｂ）請求項２３〜３７中いずれかのフィロウイルスタンパク質の抗原決定基をコードする少なくとも１個のヌクレオチド配列を含む組み換えベクターを用いて、前記感染した細胞に核酸を導入するステップであって、前記核酸配列が、少なくとも１個の前記ヌクレオチド配列をＭＶＡウイルスゲノムの中に融合させることを指示できるゲノムＭＶＡウイルス配列をさらに含むステップ、および
（ｃ）前記生成した組み換えＭＶＡウイルスを特定し、分離し、および任意に精製するステップ
を含み、
好ましくは、ステップ（ａ）とステップ（ｂ）の順序は、ステップ（ｂ）が１番目のステップで、ステップ（ａ）が２番目のステップとなるように変更できる、前記方法。
【請求項６７】
フィロウイルスに起因する病気の治療および／または予防で使用するための組み換えＦＰＶベクターを生成する方法であって、
（ａ）ＦＰＶウイルスを用いて宿主細胞を感染させるステップ、
（ｂ）請求項４７〜５１のいずれかのフィロウイルスタンパク質の抗原決定基をコードする少なくとも１個のヌクレオチド配列を含む組み換えベクターを用いて、前記感染した細胞に核酸を導入するステップであって、前記核酸配列が、少なくとも１個の前記ヌクレオチド配列をＦＰＶウイルスゲノムの中に融合させることを指示できるゲノムＦＰＶウイルス配列をさらに含むステップ、および
（ｃ）生成された組み換えＦＰＶウイルスを特定し、分離し、および任意に精製するステップ
を含み、
好ましくは、ステップ（ａ）とステップ（ｂ）の順序は、ステップ（ｂ）が１番目のステップで、ステップ（ａ）が２番目のステップとなるように変更できる、前記方法。
【請求項６８】
対象において、フィロウイルスに対して免疫反応を誘発する方法であって、対象に、
（ａ）フィロウイルスタンパク質の少なくとも１個の抗原決定基をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを、免疫学的に有効な量で含む第１の組成物、および
（ｂ）フィロウイルスタンパク質の少なくとも１個の抗原決定基をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを、免疫学的に有効な量で含む第２の組成物
を投与することを含み、
または
（ｃ）フィロウイルスタンパク質の少なくとも１個の抗原決定基をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを、免疫学的に有効な量で含む第１の組成物、および
（ｄ）フィロウイルスタンパク質の少なくとも１個の抗原決定基をコードする核酸を含むＦＰＶクターを、免疫学的に有効な量で含む第２の組成物
を投与することを含み、
前記組成物の一方はプライミング組成物であり、他方の組成物はブースティング組成物である、前記方法。
【請求項６９】
前記抗原決定基が、ＥＢＯＶグリコプロテイン、好ましくは、ザイールエボラウイルス（ＺＥＢＯＶ）、スーダンエボラウイルス（ＳＥＢＯＶ）、コートジボワールエボラウイルス（ＥＢＯＶ−ＣｄＩ）レストンエボラウイルス（ＥＢＯＶ−Ｒｅｓｔｏｎ）およびブンディブギョエボラウイルス（ＢＥＢＯＶ）からなる群から選択されるＥＢＯＶグリコプロテインである、請求項６８の方法。。
【請求項７０】
前記フィロウイルスタンパク質の前記抗原決定基が、エンベロープグリコプロテイン（ＧＰ）、核タンパク質（ＮＰ）、ビリオンタンパク質３５（ＶＰ３５），ビリオンタンパク質４０（ＶＰ４０），ビリオンタンパク質３０（ＶＰ３０），ビリオンタンパク質２４（ＶＰ２４）およびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼタンパク質からなる群から選択される、請求項６８の方法。
【請求項７１】
前記フィロウイルスタンパク質の前記抗原決定基が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２０、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３４および配列番号３７からなる群から選択される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
対象において、防御免疫力または防御免疫反応を提供する方法であって、対象に、
（ａ）医薬的に許容される担体と共に、少なくとも１個のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを、免疫学的に有効な量で含む第１の組成物、および
（ｂ）医薬的に許容される担体と共に、第１のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含む鶏痘ベクターを、免疫学的に有効な量で含む第２の組成物
を投与すること含み、
前記組成物の一方はプライミング組成物であり、他方の組成物はブースティング組成物である、前記方法。
【請求項７３】
対象において、防御免疫力または防御免疫反応を提供する方法であって、対象に、
（ａ）医薬的に許容される担体と共に、少なくとも２個のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを、免疫学的に有効な量で含む第１の組成物、および
（ｂ）医薬的に許容される担体と共に、第１のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを、免疫学的に有効な量で含む第２の組成物
を投与することを含み、
前記組成物の一方はプライミング組成物であり、他方の組成物はブースティング組成物である、前記方法。
【請求項７４】
前記第１の組成物が、第２のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
前記第１の組成物が、第３のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記第１の組成物中の前記ＭＶＡベクターが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２０、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３４および配列番号３７からなる群から選択される抗原タンパク質をコードする核酸を含む、請求項７２〜７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記第１の組成物中の前記ＭＶＡベクターが、少なくとも４個のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含む、請求項７２〜７５に記載の方法。
【請求項７８】
前記第１の組成物中の前記ＭＶＡベクターが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２０、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３４および配列番号３７を有する４個の異なるフィロウイルスサブタイプに由来する抗原タンパク質をコードする核酸を含む、請求項７２〜７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記ブースティング組成物を、前記プライミング組成物を投与した２−１２週後に投与する、請求項７２〜７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記ブースティング組成物を対象に２回またはそれ以上投与する請求項７２〜７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記第１の組成物が、第２のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項８２】
前記第１の組成物が、第３のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを含む、請求項７２または７３に記載の方法。
【請求項８３】
前記第１の組成物中の前記ＭＶＡベクターが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２０、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３４および配列番号３７からなる群から選択される抗原タンパク質をコードする核酸を含む、請求項７２〜８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記第１の組成物中の前記ＭＶＡベクターが、少なくとも４個のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含む、請求項７２〜８２に記載の方法。
【請求項８５】
前記第１の組成物中の前記ＭＶＡベクターが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２０、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３４および配列番号３７を有する４個の異なるフィロウイルスサブタイプに由来する抗原タンパク質をコードする核酸を含む、請求項７２〜８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記ブースティング組成物を、前記プライミング組成物を投与した２−１２週後に投与する、請求項８４〜８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記ブースティング組成物を対象に２回またはそれ以上投与する請求項７２〜８６に記載の方法。
【請求項８８】
対象において、フィロウイルス様粒子を生成する方法であって、対象に、
（ａ）医薬的に許容される担体と共に、少なくとも１個のフィロウイルスグリコプロテインおよびフィロウイルスビリオンタンパク質４０（ＶＰ４０）の抗原タンパク質をコードする核酸を含む、免疫学的に有効な量のＭＶＡベクター、および
（ｂ）医薬的に許容される担体と共に、第１のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含む、免疫学的に有効な量の鶏痘ベクターまたはＭＶＡベクター
を投与することを含み、
前記ベクターの一方はプライミングワクチンであり、他方のベクターはブースティングワクチンである、前記方法。
【請求項８９】
対象において、フィロウイルス様粒子を生成する方法であって、対象に、
（ａ）医薬的に許容される担体と共に、少なくとも１個のフィロウイルスグリコプロテインおよびフィロウイルスビリオンタンパク質４０（ＶＰ４０）の抗原タンパク質をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを、免疫学的に有効な量で含む第１の組成物、および
（ｂ）医薬的に許容される担体と共に、第１のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含む鶏痘ベクターまたはＭＶＡベクターを、免疫学的に有効な量で含む第２の組成物
を投与すること含み、
前記組成物の一方はプライミング組成物であり、他方の組成物はブースティング組成物である方法。
【請求項９０】
対象において、フィロウイルスに対して強化した免疫反応を誘発する方法であって、この方法は対象に：
（ａ）医薬的に許容される担体と共に、少なくとも１個のフィロウイルスグリコプロテインおよびフィロウイルスビリオンタンパク質４０（ＶＰ４０）の抗原タンパク質をコードする核酸を含む、免疫学的に有効な量のＭＶＡベクター、および
（ｂ）医薬的に許容される担体と共に、第１のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含む、免疫学的に有効な量の鶏痘ベクターまたはＭＶＡベクター
を投与すること含み、
前記ベクターの一方はプライミングワクチンであり、他方のベクターはブースティングワクチンである、前記方法。
【請求項９１】
対象において、フィロウイルスに対して強化した免疫反応を誘発する方法であって、対象に、
（ａ）医薬的に許容される担体と共に、少なくとも１個のフィロウイルスグリコプロテインおよびフィロウイルスビリオンタンパク質４０（ＶＰ４０）の抗原タンパク質をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを、免疫学的に有効な量で含む第１の組成物、および
（ｂ）医薬的に許容される担体と共に、第１のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含む鶏痘ベクターまたはＭＶＡベクターを、免疫学的に有効な量で含む第２の組成物
を投与すること含み、
前記組成物の一方はプライミング組成物であり、他方の組成物はブースティング組成物である、前記方法。
【請求項９２】
前記フィロウイルスＶＰ４０が、ザイールエボラウイルス（ＺＥＢＯＶ）、スーダンエボラウイルス（ＳＥＢＯＶ）、コートジボワールエボラウイルス（ＥＢＯＶ−ＣｄＩ）、レストンエボラウイルス（ＥＢＯＶ−Ｒｅｓｔｏｎ）およびブンディブギョエボラウイルス（ＢＥＢＯＶ）からなる群から選択される、請求項８８から９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記フィロウイルスＶＰ４０が、ＺＥＢＯＶ、ＳＥＢＯＶおよびＭＡＲＶの１個またはそれ以上から選択される、請求項８８から９１に記載の方法。
【請求項９４】
前記フィロウイルスＶＰ４０が、ザイールメイインガまたはマールブルグムソケの群から選択される、請求項８８から９１に記載の方法。
【請求項９５】
前記フィロウイルスグリコプロテインおよび前記フィロウイルスＶＰ４０が同じフィロウイルス株から選択される、請求項８８から９１に記載の方法。
【請求項９６】
前記ＭＶＡベクターが、フィロウイルス核タンパク質（ＮＰ）をコードする核酸をさらに含み、好ましくは、前記フィロウイルス核タンパク質および前記フィロウイルスＶＰ４０が同じフィロウイルス株から由来する、請求項８８から９１に記載の方法。
【請求項９７】
前記フィロウイルス株が、ザイールメイインガ、ザイールキクウィト、ザイールガボン、コートジボワールエボラウイルス、スーダンボニフェス、スーダンマリオ、スーダングル、マールブルグラブン、マールブルグオゾリン、マールブルグラタイチャク、マールブルグムソケ、マールブルグアンゴラ、好ましくは、ザイールメイインガまたはコートジボワールエボラウイルスの群から選択される、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記フィロウイルスＶＰ４０が、配列番号３４のタンパク質配列をコードする核酸を含む、請求項８８から９６に記載の方法。
【請求項９９】
前記フィロウイルスＶＰ４０の抗原タンパク質をコードする核酸が配列番号３３を含む、請求項８８から９６に記載の方法。
【請求項１００】
前記組み換え鶏痘ベクターを、１回、２回、３回または４回投与する、請求項８８から９９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フィロウイルス疾患に対する組み換え改変ワクシニアウイルスアンカラ系（ＭＶＡ系）ワクチンを含む改善されたフィロウイルスワクチン、ならびにそれに関連する製品、方法および使用に関する。特に、本発明は、フィロウイルスタンパク質の抗原決定基をコードする異種ヌクレオチド配列を含む遺伝子操作（組み換え）されたＭＶＡベクターに関する。本発明は、さらに、ワクチン接種の方法、特に、２個のウイルス性ベクター組成物を用いる同種および異種のプライム−ブーストワクチン投与法に関する。さらに詳しくは、本発明は、同種のプライム−ブーストワクチン投与法で使用する組み換えＭＶＡ、または異種のプライム−ブーストワクチン投与法で使用する組み換えＭＶＡおよび／または組み換え鶏痘ウイルス（ＦＰＶ）に関する。本発明は、さらに、例えば、対象に防御免疫反応を誘導するのに適する、これらの生産物、方法および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
フィロウイルスは、フィロウイルス科に属するエンベロープを持った、非分節マイナス鎖ＲＮＡウイルスである。これまでのところ、このウイルス科には２個のメンバーが確認されている。マールブルグウイルス（ＭＡＲＶ）およびエボラウイルス（ＥＢＯＶ）である。フィロウイルスは、非常に毒性が強く、人から人へ容易に伝染し、そして並外れて致死率が高く、ヒトおよび非ヒト霊長類に重症の出血熱を引き起こす。フィロウイルス感染症は、ヒトにおいて、２３％から９０％もの範囲の致死率を有する。しかしながら、この伝染性および致死率にもかかわらず、承認された治療法や予防ワクチンはない。
【０００３】
流行の間、患者の隔離および防御服の使用および消毒措置（合わせてウイルス性出血熱（ＶＨＦ）隔離予防措置または障壁看病という）は、マールブルグまたはエボラウイルスのさらなる伝染を食い止め、そして流行を制御し終焉させるのに十分であった。フィロウイルスによって引き起こされる出血熱の有効な治療法は知られていないので、ＶＨＦ隔離予防措置を適用して伝染を予防することは、現在のところ、フィロウイルスの流行を制御するために利用できる唯一の手段である。
【０００４】
フィロウイルスは、最初に、１９６７年にアフリカミドリザルの組織を処理していたドイツとユーゴスラビアの数人の研究所の職員が重症の出血熱を発症した時に認識された。これらの流行によって、合計３１例と７人の死亡が引き起こされた。このウイルスは、流行の１つが起こった場所であるドイツ、マールブルグにちなんでマールブルグウイルス（ＭＡＲＶ）と名付けられた。この最初の流行の後、このウイルスは消え去り、１９７５年まで再出現しなかった。その時、おそらくはジンバブエで感染した１人の旅行者が南アフリカのヨハネスブルクで発病し、この旅行者の同行者と１人の看護師も感染した。この時以来、マールブルグ出血熱（ＭＨＦ）は数例、散発的に確認されたが、この疾患は比較的稀にとどまっている。
【０００５】
第２のフィロウイルスであるエボラウイルス（ＥＢＯＶ）は、最初に、１９７６年にザイール（現在のコンゴ民主共和国）北部およびスーダン南部の２か所でエボラ出血熱（ＥＨＦ）の流行が起こった時に確認された。これらの流行は、エボラウイルスの２個の異なる種であることが後に証明されたウイルスによって引き起こされた。これらの２個の種は、それぞれが発見された国にちなんで名付けられた。両方のウイルスは共に非常に致死率が高く、ザイールでは９０％、スーダンでは５０％の患者が死亡した。１９７６年以来、エボラウイルスは散発的にアフリカで出現しており、１９７６年から１９７９年の間にいくつかの小規模から中規模の流行が確認され、１９９４年から１９９６年の間に再びガボンで確認された。より大規模なエボラ出血熱の流行は、１９９５年にザイールのキクウィト、および２０００年にウガンダのグルで起こった。
【０００６】
フィロウイルスは、１個またはそれ以上の非ヒト動物の継続中のライフサイクルからヒトへ伝染するように思われる。エボラおよびマールブルグウイルスの自然界の保有宿主（複数を含む）を見つけようとする多くの試みにもかかわらず、それらの起源は謎のままである。その結果、一体どのようにしてこのウイルスが自然界の保有宿主からヒトへ伝染するのかも不明のままである。しかし、一旦ヒトが感染すると、ヒトからヒトへの伝染によってさらなる感染が引き起こされる。特に、伝染は、感染した個人または彼らの体液と、別の人間との親密な個人的接触によって引き起こされる。フィロウイルス感染によって引き起こされる出血熱の記録に残る流行の間、感染した個人の世話をし（つまり、食事を与え、体を洗い、投薬した）、またはとても身近で働いた人々は、彼ら自身が感染する特に大きなリスクがあった。感染した体液との接触を通じた（つまり、これらの体液で汚染された、消毒していない注射器、針その他の医療器具の再利用を通じた）院内（病院）感染もまた、疾患の蔓延にとって重要な要因であった。感染していない人と感染した患者との親密な接触を最小限に抑えることは、通常、流行の間に、新たなフィロウイルス感染の数を減少させる。フィロウイルスは、実験室では、小さな浮遊粒子を通じて感染するある程度の能力を示したが、ヒトの間の空気伝播は明確には実証されていない。
【０００７】
これまでのところ、エボラウイルスの５つの株が確認されており、それらの最初の出現場所にちなんで名付けられている。ブンディブギョ（ＢＥＢＯＶ）、象牙海岸（ＥＢＯＶ−ＣｄＩ、タイフォレストウイルスまたはＴＡＦＶとも云われる）、レストン（ＥＢＯＶ−Ｒｅｓｔｏｎ）、スーダン（ＳＥＢＯＶ）、およびザイール（ＺＥＢＯＶ）であり、ザイール、スーダン、およびブンディブギョ株は、一般的に、ヒトの疾病および死亡を引き起こす。エボラ−レストンは、ヒトに重症の疾患を引き起こさない唯一の知られたフィロウイルスであるが、サルでは致命的になりえる。マールブルグウイルスのいくつかの株が現在までのところ確認されており、ムソク株が最も高い致死率を有する。図１を参照照。
【０００８】
構造上は、フィロウイルスビリオンは、いくつかの形で出現しうる。長い、時には枝分かれしたフィラメント状のもの、さらには、「６」、文字「Ｕ」または円の形をしたより短いフィラメント状のものを含む。ウイルスのフィラメントは、最大で１４ミクロン（μｍ）までの長さのものがあり、８０ナノメーター（ｎｍ）の一定の直径を有し、そして脂質の膜でエンベロープされている。それぞれのビリオンは、約１９キロ塩基対（ｋｂ）の長さの１個の一本鎖、マイナスセンスＲＮＡ分子を含み、それは核タンパク質（ＮＰ）、ビリオンタンパク質３５（ＶＰ３５）、ビリオンタンパク質４０（ＶＰ４０）、エンベロープグリコプロテイン（ＧＰ）、ビリオンタンパク質３０（ＶＰ３０）、ビリオンタンパク質２４（ＶＰ２４）、およびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼタンパク質（Ｌ）の順序で連続して配列された７個の遺伝子を含む。宿主細胞の細胞質に入ると、このＲＮＡは転写されて、このたんぱく質をコードするポリアデニル化されたサブゲノムｍＲＮＡ種を生成する。転写および翻訳は、それぞれ異なるフィロウイルスについて推定される同一の機能をもった、７個の構造ポリペプチドの合成を引き起こす。４個のタンパク質（ＮＰ、ＶＰ３０，ＶＰ３５およびＬ）が、ヌクレオカプシド複合体中のウイルスゲノムＲＮＡと関連している。残りの３個の構造タンパク質は、膜結合性である。ＧＰは、タイプＩの膜透過タンパク質であり、一方、ＶＰ２４およびＶＰ４０はおそらくはこの膜の内側に位置している。エンベロープグリコプロテイン（ＧＰ）は、３個のヘテロ二量体のコピーを含むホモ三量体（「ペプロマー」とも云われる）としてウイルスエンベロープに現れる。このヘテロ二量体は、フューリン開裂によって作られる「ＧＰ１」および「ＧＰ２」として知られる完全長ＧＰ前駆体（「ＧＰ０」と云われる）の２個の断片を含む。ＧＰ１およびＧＰ２は、ジスルフィド結合によって結合する。非構造的な、分泌されたグリコプロテイン（ｓＧＰ）がＭＡＲＶではなく、ＥＢＯＶによって発現される（Ｈ．Ｆｅｌｄｍａｎｎ  ＆  Ｍ．Ｐ．Ｋｉｌｅｙ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３５：１−２１（１９９９））。新しいウイルス粒子が、宿主細胞の表面から発芽することによって作られる（以下、参照）。
【０００９】
フィロウイルスのライフサイクルは、特定の細胞表面受容体にビリオンが付着して始まり、次いでビリオンエンベロープが細胞膜と融合し、ウイルスヌクレオカプシドが細胞質ゾル中に放出される。ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ，または「Ｌ」タンパク質としても知られている）は、ヌクレオカプシドを部分的に脱殻し、遺伝子をプラス鎖ｍＲＮＡの中に転写し、次いでそれらは構造的および非構造的タンパク質の中へ翻訳される。図２を参照。このＲＮＡＰは、ゲノムの３’末端に位置する単一プロモーターに結合する。転写は、遺伝子の後で終了するか、または次の遺伝子へ下流に続行する、つまりゲノムの３’末端に近い遺伝子は最大限転写される一方、５’末端に向かう遺伝子は転写される可能性が最も低い。従って、遺伝子順序は、簡単だが有効な転写調節の形である。生成される最も豊富なタンパク質は、核タンパク質（ＮＰ）であり、その細胞濃度は、いつＲＮＡＰが遺伝子転写からゲノム複製へと転換するかを決定する。複製は、それ自身がマイナス鎖ウイルス子孫ゲノムのコピーへと転写される、完全長プラス鎖抗ゲノムをもたらす。新たに合成された構造タンパク質およびゲノムは、細胞膜の内部の近くで自己組織化し蓄積する。ウイルス粒子は、感染した宿主細胞から発芽し、成熟した感染ビリオンを生成しながらエンベロープされる。
【００１０】
従前のワクチン開発
１つまたはそれ以上のフィロウイルス種による感染に対する防御免疫力を誘導できる、安全な免疫原性ワクチンを開発しようと試みた間に、多くの戦略が評価され、明らかに一致しない結果をもたらした。その概要は、Ｍａｒｚｉ  ａｎｄ  Ｆｅｌｄｍａｎｎ（Ａ．Ｍａｒｚｉ  ａｎｄ  Ｈ．Ｆｅｌｄｍａｎｎ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  １３（４）：５２１−５３１（２０１４））にまとめられている。例えば、３個のＤＮＡプラスミド、つまり１つ目はＺＥＢＯＶからエンベロープグリコプロテインを発現しているもの、２つ目はＳＥＢＯＶからエンベロープグリコプロテインを発現しているもの、３つ目はＺＥＢＯＶから核タンパク質を発現しているもの、の混合物を含む３価のＤＮＡワクチンは安全で、免疫原性で、そしてヒトの３個の抗原の少なくとも１個に対して抗体反応を誘導することができた。しかしＣＤ８＋  Ｔ細胞反応は、ワクチン接種をした個体群の３分の１未満で検出された（Ｊ．Ｅ．Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３（１１）：１２６７−１２７７（２００６））。同様に、ＺＥＢＯＶ、ＳＥＢＯＶ、マールブルグ  Ｃｉ６７（ラタイツァク株）、マールブルグムソケおよびマールブルグラブンからのエンベロープグリコプロテイン、さらにはＺＥＢＯＶおよびマールブルグムソケからの核タンパク質を発現している４個の異なる組み換えアデノウイルスの混合物を含む５価アデノウイルス系「汎フィロウイルス」ワクチンである複合体は、ＺＥＢＯＶまたはＭＡＲＶの攻撃から非ヒト霊長類を防御し、両タイプのウイルスに対して抗体反応を誘導したが、このワクチンがＣＤ８＋  Ｔ細胞反応を誘導したかどうかは不明のままである（Ｄ．Ｌ．Ｓｗｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５（３）：４６０−４６７（２００８））。
【００１１】
ＺＥＢＯＶに由来する、エンベロープグリコプロテイン、またはエンベロープグリコプロテインおよび核タンパク質の両者を発現しているヒトパラインフルエンザウイルス血清型３（ＨＰＩＶ３）である組み換えパラミクソウイルスの鼻腔内投与は、以後のＥＢＯＶの攻撃からモルモットを防御した。げっ歯動物モデルは、しばしば霊長類では結果の予測が困難であり、げっ歯動物では有効であった以前の多くのＥＢＯＶワクチン候補が、非ヒト霊長類では完全に失敗した（Ａ．Ｂｕｋｒｅｙｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８０（５）：２２６７−２２７９（２００６））。ＺＥＢＯＶ由来の、エンベロープグリコプロテイン、またはエンベロープグリコプロテインおよび核タンパク質の両者を発現している組み換えＨＰＩＶ３をアカゲザルに鼻腔内投与すると、エンベロープグリコプロテインを発現しているいかなる構成物も適度に免疫原性を示し、ワクチン接種後のＺＥＢＯＶの攻撃に対して８０％を超える動物を疾患から防御した（Ａ．Ｂｕｋｒｅｙｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８１（１２）：６３７９ー６３８８（２００７））。最後に、水胞性口炎ウイルス（ＶＳＶ）グリコプロテインをＺＥＢＯＶエンベロープグリコプロテインで置き換えた組み換えＶＳＶは、治療しなければ一様に死に致る感染後２４時間も経った治療によって、モルモットの５０％、マウスの１００％を防御した。エボラウイルス感染に対する暴露後の治療選択肢を与え、暴露から２０から３０分後に治療を行った場合、８匹中４匹のアカゲザル（５０％）が防御された（Ｈ．Ｆｅｌｄｍａｎｎ，ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇｅｎ  ３（１）：５４−６１（２００７））。
【００１２】
Ｇｅｉｓｂｅｒｔらは、非ヒト霊長類における致死的なＥＢＯＶ感染からマウスやモルモットを防御したワクチン戦略の効果を評価した。彼らは、ＥＢＯＶグリコプロテインおよび核タンパク質を発現しているベネズエラウマウイルス（ＶＥＥＶ）、ＥＢＯＶグリコプロテイン、脂質Ａを含むリポソームおよび不活性化ＥＢＯＶを発現している組み換えワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）、ならびに濃縮した不活性化全ビリオン調合液の弱毒化した株に由来するＲＮＡレプリコン粒子を使用した。彼らは，これらの戦略のいずれもがＥＢＯＶの頑強な攻撃から非ヒト霊長類を防御することに成功しなかったことがわかった（Ｔ．Ｈ  Ｇｅｉｓｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ８（３）：５０３−５０７（２００２））。
【００１３】
別の者たちは、抗体反応を誘導するために、非複製サブユニットワクチンとして、哺乳類、バクテリア、植物または昆虫の細胞で発現したウイルス様粒子（ＶＬＰ）を使用した（Ｄ．Ｌ．Ｓｗｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２３：３０３３−３０４２（２００５）；Ｋ．Ｌ．Ｗａｒｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＩＤ  １９６（２）：４３０−４３７（２００７），Ｎ．Ｋｕｓｈｎｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  ３１（１）：５８−８３（２０１２），Ｋ．Ｌ．Ｗａｒｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬＯＳ  ＯＮＥ  １０（３）：ｅ０１１８８８１（２０１５），Ｋ．Ｌ．Ｗａｒｆｉｅｌｄ  ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．Ａｍａｎ  ＪＩＤ  ２０４：１０５３−１０５９（２０１１），Ｖ．Ｍ．Ｗａｈｌ  Ｊｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７９（１６）：１０４４２−１０４５０（２００５），ＷＯ２００３／０３９４７７，ＷＯ２００６／０４６９６３，ＷＯ２００６／０７３４２２，ＷＯ２００４／０４２００１，ＵＳ８，９００，５９５，ＵＳ７，２１１，３７８）。しかし、フィロウイルスＶＬＰは、大きなコストがかかる困難な生成プロセスが必要で、長時間室温で保存しなければならない。
【００１４】
このようにして、かなりの時間と労力を使った後に、いくつかの有望なワクチン候補が前臨床段階で現れたが、現在までのところ、利用できる承認された予防ワクチンはない。フィロウイルス感染症の伝染性と致死性を考えると、有効なワクチンの緊急の必要がある。
【発明の概要】
【００１５】
本発明においては、複製欠損の種々のプライム―ブーストの組み合わせ、および複製能力のないベクターが、フィロウイルス感染症に対して効果的な免疫保護を引き起こすことが発見された。
【００１６】
したがって、本発明の１つの一般的な態様は、
（ａ）医薬的に許容される担体と共に、少なくとも１個のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを、免疫学的に有効な量で含む第１の組成物、および
（ｂ）医薬的に許容される担体と共に、第１のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含む鶏痘ベクターを、免疫学的に有効な量で含む第２の組成物を含み、
前記組成物の一方はプライミング組成物であり、他方の組成物はブースティング組成物である混合ワクチンに関する。
【００１７】
さらなる態様において、本発明は、
（ａ）医薬的に許容される担体と共に、少なくとも２個のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを、免疫学的に有効な量で含む第１の組成物、および
（ｂ）医薬的に許容される担体と共に、第１のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを、免疫学的に有効な量で含む第２の組成物
を投与すること含み、
前記組成物の一方はプライミング組成物であり、他方の組成物はブースティング組成物である混合ワクチンに関する。
【００１８】
さらなる態様において、本発明は、
（ａ）医薬的に許容される担体と共に、少なくとも１個のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを、免疫学的に有効な量で含む第１の組成物、および
（ｂ）医薬的に許容される担体と共に、第１のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含む鶏痘ベクターを、免疫学的に有効な量で含む第２の組成物
を含み、
前記組成物の一方はプライミング組成物であり、他方の組成物はブースティング組成物であるキットに関する。
【００１９】
さらなる態様において、本発明は、
（ａ）医薬的に許容される担体と共に、少なくとも２個のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを、免疫学的に有効な量で含む第１の組成物、および
（ｂ）医薬的に許容される担体と共に、第１のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを、免疫学的に有効な量で含む第２の組成物
を含み、
前記組成物の一方はプライミング組成物であり、他方の組成物はブースティング組成物であるキットに関する。
【００２０】
さらなる態様において、本発明は、フィロウイルスに起因する疾患の治療および／または予防で使用するためのフィロウイルスタンパク質の２個またはそれ以上の抗原決定基をコードするヌクレオチド配列を含む組み換え改変ワクシニアウイルス（ＭＶＡ）ベクターに関する。さらに別の態様において、本発明は、フィロウイルスに起因する疾患の治療および／または予防で使用するための、フィロウイルグリコプロテインの抗原タンパク質をコードし、さらにフィロウイルスビリオンタンパク質４０（ＶＰ４０）をコードするヌクレオチド配列を含む組み換えＭＶＡベクターに関する。別の実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号５、配列番号１９および配列番号３０、（ｂ）配列番号５、配列番号１９、配列番号２８および配列番号３０、ならびに（ｃ）配列番号１９および配列番号３３からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む組み換えＭＶＡベクターに関する。ある特定の態様において、本発明は、前記組み換えＭＶＡベクターを含む組成物、前記組み換えＭＶＡベクターを含むワクチン、前記組み換えＭＶＡベクターおよび薬剤の担体、希釈剤および／または添加剤を含む薬剤、ならびに前記組み換えＭＶＡベクターを含む細胞に関する。ある特定の態様において、本発明は、フィロウイルスに起因する対象の疾患の治療および／または予防のための薬剤またはワクチンとして使用する前記組み換えＭＶＡベクター、および前記組み換えＭＶＡベクターを対象に投与することを含む、対象の免疫反応に作用する方法に関する。さらなる態様において、本発明は、第１の投与（プライミング）のための第１のバイアルまたは容器に入った前記組み換えＭＶＡベクター、および第２の投与（ブースティング）のための第２のバイアルまたは容器に入った前記組み換えＭＶＡベクターを含むキットに関する。
【００２１】
本発明はさらに、配列番号２６を有するＦＰＶ−４０Ｋプロモーターの制御の下で、フィロウイルスタンパク質（例えば、上記または下記のいずれのフィロウイルスタンパク質、好ましくはフィロウイルスエンベロープグリコプロテイン）の少なくとも１個の抗原決定基をコードするヌクレオチド配列を含む組み換えＦＰＶベクターに関する。さらなる態様において、本発明は、フィロウイルスに起因する疾患の治療および／または予防で使用するためのフィロウイルスタンパク質の２個またはそれ以上の抗原決定基をコードするヌクレオチド配列を含む組み換え鶏痘ウイルス（ＦＰＶ）ベクターに関する。ある特定の態様において、本発明は、前記組み換えＦＰＶベクターを含む組成物、前記組み換えＦＰＶベクターを含むワクチン、前記組み換えＦＰＶベクターおよび薬剤の担体、希釈剤および／または添加剤を含む薬剤、ならびに前記組み換えＦＰＶベクターを含む細胞に関する。ある特定の態様において、本発明は、フィロウイルスに起因する対象の疾患の治療および／または予防のための薬剤またはワクチンとして使用する前記組み換えＦＰＶベクター、および前記組み換えＦＰＶベクターを対象に投与することを含む、対象の免疫反応に作用する方法に関する。
【００２２】
さらなる態様において、本発明は、
（ａ）医薬的に許容される担体と共に、少なくとも２個のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含む免疫学的に有効な量のＭＶＡベクター、および
（ｂ）医薬的に許容される担体と共に、第１のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含む免疫学的に有効な量の鶏痘ベクター
を含み、
前記ベクターの一方はプライミングワクチンであり、他方のベクターはブースティングワクチンである混合ワクチンに関する。
【００２３】
さらなる態様において、本発明は、
（ａ）医薬的に許容される担体と共に、少なくとも２個のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含む免疫学的に有効な量のＭＶＡベクター、および
（ｂ）医薬的に許容される担体と共に、第１のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含む免疫学的に有効な量の１個またはそれ以上の追加のＭＶＡベクターを含み、
前記ＭＶＡベクターの一方はプライミングワクチンであり、他方のＭＶＡベクターはブースティングワクチンである混合ワクチンに関する。
【００２４】
さらなる態様において、本発明は、
（ａ）フィロウイルスタンパク質の少なくとも１個の抗原決定基をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを、免疫学的に有効な量で含む第１の組成物、および
（ｂ）フィロウイルスタンパク質の少なくとも１個の抗原決定基をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを、免疫学的に有効な量で含む第２の組成物、
または、
（ｃ）フィロウイルスタンパク質の少なくとも１個の抗原決定基をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを、免疫学的に有効な量で含む第１の組成物、および
（ｄ）フィロウイルスタンパク質の少なくとも１個の抗原決定基をコードする核酸を含むＦＰＶベクターを、免疫学的に有効な量で含む第２の組成物
を含み、
前記組成物の一方はプライミング組成物であり、他方の組成物はブースティング組成物である混合ワクチンに関する。
【００２５】
さらなる態様において、本発明は、対象のフィロウイルスに対して免疫反応を誘導する方法であって、この方法は対象に、
（ａ）医薬的に許容される担体と共に、少なくとも１個のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを、免疫学的に有効な量で含む第１の組成物、および
（ｂ）医薬的に許容される担体と共に、第１のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含む鶏痘ベクターを、免疫学的に有効な量で含む第２の組成物
を投与することを含み、
前記組成物の一方はプライミング組成物であり、他方の組成物はブースティング組成物である方法に関する。
【００２６】
さらなる態様において、本発明は、対象のフィロウイルスに対して免疫反応を誘導する方法であって、この方法は対象に、
（ａ）医薬的に許容される担体と共に、少なくとも２個のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを、免疫学的に有効な量で含む第１の組成物、および
（ｂ）医薬的に許容される担体と共に、第１のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを、免疫学的に有効な量で含む第２の組成物
を投与することを含み、
前記組成物の一方はプライミング組成物であり、他方の組成物はブースティング組成物である方法に関する。
【００２７】
本発明は、さらに、フィロウイルスに起因する疾患の治療および／または予防において使用するための組み換えＭＶＡベクターを生成する方法を対象にし、この方法は、
（ａ）ＭＶＡウイルスを用いて宿主細胞を感染させるステップ、
（ｂ）本発明のいずれかの実施形態のいずれかのフィロウイルスタンパク質の抗原決定基をコードする少なくとも１個のヌクレオチド配列を含む組み換えベクターを用いて、前記感染した細胞に核酸を導入するステップであって、前記核酸配列が、少なくとも１個の前記ヌクレオチド配列をＭＶＡウイルスゲノムの中に組み込ませることを指示できるゲノムＭＶＡウイルス配列をさらに含むステップ、および
（ｃ）生成した組み換えＭＶＡウイルスを特定し、分離し、および任意に精製するステップを含む。
【００２８】
別の実施形態においては、上記のいずれの実施形態の組み換えＭＶＡベクターを生成する方法におけるステップ（ａ）および（ｂ）の順序も、ステップ（ｂ）が１番目のステップで、ステップ（ａ）が２番目のステップとなるよう変更できる。
【００２９】
本発明は、さらに、フィロウイルスに起因する疾患の治療および／または予防において使用するための組み換えＦＰＶベクターを生成する方法を対象にし、この方法は、
（ａ）ＦＰＶウイルスを用いて宿主細胞を感染させるステップ、
（ｂ）本発明の任意の実施形態のいずれのフィロウイルスタンパク質の抗原決定基をコードする少なくとも１個のヌクレオチド配列を含む組み換えベクターを用いて、前記感染した細胞に核酸を導入するステップであって、前記核酸配列が、少なくとも１個の前記ヌクレオチド配列をＦＰＶウイルスゲノムの中に組み込ませることを指示できるゲノムＦＰＶウイルス配列をさらに含むステップ、および
（ｃ）生成した組み換えＦＰＶウイルスを特定し、分離し、および任意に精製するステップを含む。
【００３０】
別の実施形態においては、上記のいずれの実施形態の組み換えＦＰＶベクターを生成する方法におけるステップ（ａ）および（ｂ）の順序も、ステップ（ｂ）が１番目のステップで、ステップ（ａ）が２番目のステップとなるよう変更できる。
【００３１】
さらなる態様において、本発明は、フィロウイルスに対する免疫反応を対象において誘導する方法であって、この方法は対象に、
（ａ）フィロウイルスタンパク質の少なくとも１個の抗原決定基をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを、免疫学的に有効な量で含む第１の組成物、および
（ｂ）フィロウイルスタンパク質の少なくとも１個の抗原決定基をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを、免疫学的に有効な量で含む第２の組成物、
または、
（ｃ）フィロウイルスタンパク質の少なくとも１個の抗原決定基をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを、免疫学的に有効な量で含む第１の組成物、および
（ｄ）フィロウイルスタンパク質の少なくとも１個の抗原決定基をコードする核酸を含むＦＰＶベクターを、免疫学的に有効な量で含む第２の組成物
を投与することを含み、
前記組成物の一方はプライミング組成物であり、他方の組成物はブースティング組成物である方法に関する。
【００３２】
さらなる態様において、本発明は、対象に防御免疫力または防御免疫反応を提供する方法であって、この方法は対象に、
（ａ）医薬的に許容される担体と共に、少なくとも１個のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを、免疫学的に有効な量で含む第１の組成物、および
（ｂ）医薬的に許容される担体と共に、第１のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含む鶏痘ベクターを、免疫学的に有効な量で含む第２の組成物
を投与することを含み、
前記組成物の一方はプライミング組成物であり、他方の組成物はブースティング組成物である方法に関する。
【００３３】
さらなる態様において、本発明は、対象に防御免疫力または防御免疫反応を提供する方法であって、この方法は対象に、
（ａ）医薬的に許容される担体と共に、少なくとも２個のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを、免疫学的に有効な量で含む第１の組成物、および
（ｂ）医薬的に許容される担体と共に、第１のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを、免疫学的に有効な量で含む第２の組成物
を投与することを含み、
前記組成物の一方はプライミング組成物であり、他方の組成物はブースティング組成物である方法に関する。
【００３４】
さらなる態様において、本発明は、対象にフィロウイルス様粒子を生成する方法であって、この方法は対象に、
（ａ）医薬的に許容される担体と共に、少なくとも１個のフィロウイルスグリコプロテインおよびフィロウイルスビリオンタンパク質４０（ＶＰ４０）の抗原タンパク質をコードする核酸を含む免疫学的に有効な量のＭＶＡベクター、および
（ｂ）医薬的に許容される担体と共に、第１のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含む免疫学的に有効な量の鶏痘ベクターまたはＭＶＡベクター
を投与して、対象にフィロウイルス様粒子を生成することを含み、
前記ベクターの一方はプライミングワクチンであり、他方のベクターはブースティングワクチンである方法に関する。
【００３５】
さらなる態様において、本発明は、対象にフィロウイルス様粒子を生成する方法であって、この方法は対象に、
（ａ）医薬的に許容される担体と共に、少なくとも１個のフィロウイルスグリコプロテインおよびフィロウイルスビリオンタンパク質４０（ＶＰ４０）の抗原タンパク質をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを、免疫学的に有効な量で含むＭＶＡベクターを、免疫学的に有効な量で含む第１の組成物、および
（ｂ）医薬的に許容される担体と共に、第１のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含む鶏痘ベクターまたはＭＶＡベクターを、免疫学的に有効な量で含む第２の組成物
を投与して、対象にフィロウイルス様粒子を生成することを含み、
前記組成物の一方はプライミング組成物であり、他方の組成物はブースティング組成物である方法に関する。
【００３６】
さらなる態様において、本発明は、対象のフィロウイルスに対して強化された免疫反応を誘導する方法であって、この方法は対象に、
（ａ）医薬的に許容される担体と共に、少なくとも１個のフィロウイルスグリコプロテインおよびフィロウイルスビリオンタンパク質４０（ＶＰ４０）の抗原タンパク質をコードする核酸を含む免疫学的に有効な量のＭＶＡベクター、および
（ｂ）医薬的に許容される担体と共に、第１のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含む免疫学的に有効な量の鶏痘ベクターまたはＭＶＡベクター
を投与して、対象にフィロウイルス様粒子を生成することを含み、
前記ベクターの一方はプライミングワクチンであり、他方のベクターはブースティングワクチンである方法に関する。
【００３７】
さらなる態様において、本発明は、対象のフィロウイルスに対して強化された免疫反応を誘導する方法であって、この方法は対象に、
（ａ）医薬的に許容される担体と共に、少なくとも１個のフィロウイルスグリコプロテインおよびフィロウイルスビリオンタンパク質４０（ＶＰ４０）の抗原タンパク質をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを、免疫学的に有効な量で含むＭＶＡベクターを、免疫学的に有効な量で含む第１の組成物、および
（ｂ）医薬的に許容される担体と共に、第１のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含む鶏痘ベクターまたはＭＶＡベクターを、免疫学的に有効な量で含む第２の組成物
を投与して、対象にフィロウイルス様粒子を生成することを含み、
前記組成物の一方はプライミング組成物であり、他方の組成物はブースティング組成物である方法に関する。
【００３８】
本明細書に組み込まれ、その一部を構成する付属の図面は、本発明のいくつかの実施形態を説明し、さらに説明文と共に、本発明の原理を説明するのに役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】種々の確認されたフィロウイルス株間の関係を描く系統樹を示す。この系統樹は、エンベロープグリコプロテイン（ＧＰ）遺伝子のコード領域および最大節約法を使用して作成した。マールブルグウイルスのラブンおよびラタイチャク株の両者は、２３％の致死率を有し、一方ムソケおよびアンゴラ株は５０％から８８％の範囲の致死率を有した。スーダン株は４１〜６５％の致死率を有し、ザイール株は５７〜９０％の致死率を有した。コートジボワールおよびレストン株の両者は、いまだ人類に疾患を引き起こしていないが、レストンはブタに疾患を引き起こしている。
【図２】フィロウイルスゲノムの構造および遺伝子組織を示す。
【図３Ａ】ＭＶＡ−ｍＢＮ２５２Ｂの構造および遺伝子組織を示す。
【図３Ｂ】ＭＶＡ−ｍＢＮ２２６Ｂの構造および遺伝子組織を示す。
【図３Ｃ】選択マーカーを含むＭＶＡ−ｍＢＮ２５４Ａの構造および遺伝子組織を示す。
【図３Ｄ】選択マーカーを含むＭＶＡ−ｍＢＮ３６８Ａの構造および遺伝子組織を示す。
【図４Ａ】プラスミドｐＢＮＸ１８６の構造および遺伝子組織を示す。ｆｌａｎｋ１（Ｆ１  ＩＧＲ  ８８／８９）およびｆｌａｎｋ２（Ｆ２  ＩＧＲ  ８８／８９）は、ＩＧＲ  ８８／８９を囲むＭＶＡ−ＢＮ配列である。Ｆ１  ＩＧＲ  ８８／８９、およびＦ２  ＩＧＲ  ８８／８９は、同種の組み換え現象において、発現カセットおよび選択カセット（ＮＰＴ  ＩＩおよびｅＧＦＰ）をＭＶＡ−ＢＮの中に挿入するために使用する。組み換えウイルスの選択ができるように、大腸菌薬剤選択遺伝子ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ  ＩＩ）、および強化緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）が、内部リボソーム導入部位（ＩＲＥＳ）を介して結合し、強力合成ポックスウイルスプロモーター（ＰｒＳ）の制御の下で挿入した。ＩＧＲ  ８８／８９のＦ２およびＦ２ー反復配列が、選択カセットの側面に位置し、選択的圧力が存在しない中で、同種の組み換えを介して選択カセット選択カセットの除去を可能にする。
【図４Ｂ】プラスミドプラスミドｐＢＮＸ１９７の構造および遺伝子組織を示す。ｆｌａｎｋ１（Ｆ１  ＩＧＲ  １４８／１４９）、およびｆｌａｎｋ２（Ｆ２  ＩＧＲ  １４８／１４９）は、ＩＧＲ  １４８／１４９を囲むＭＶＡ−ＢＮ配列である。Ｆ１  ＩＧＲ  １４８／１４９、およびＦ２  ＩＧＲ  １４８／１４９は、同種の組み換え現象において、発現カセットおよび選択カセット（ＧＰＴおよびＲＦＰ）をＭＶＡ−ＢＮの中に挿入するために使用する。組み換えウイルスの選択ができるように、大腸菌グアニン―キサンチン―ホスホリボシル―トランスフェラーゼ薬剤選択遺伝子（ＧＰＴ）、および赤色蛍光タンパク質遺伝子（ＲＦＰ）を、融合遺伝子として、強力合成ポックスウイルスプロモーター（ＰｒＳ）の制御の下で挿入した。ＬｏｘＰ配列が、選択カセットの側面に位置し、Ｃｒｅリコンビナーゼを介した選択カセットの除去を可能にする。
【図４Ｃ】Ｃｒｅリコンビナーゼを発現しているプラスミドｐＢＮ２７４の構造および遺伝子組織を示す。
【図４Ｄ】プラスミドｐＢＮＸ２２１の構造および遺伝子組織を示す。ｆｌａｎｋ１（Ｆ１  ＩＧＲ  ＢａｍＨＩ  Ｊ鶏痘）、およびｆｌａｎｋ２（Ｆ２  ＩＧＲ  ＢａｍＨＩＪ鶏痘）は、挿入部位ＢａｍＨＩ  Ｊを囲むＦＰＶ配列である。Ｆ１  ＩＧＲ  ＢａｍＨＩ  Ｊ鶏痘、およびＦ２  ＩＧＲ  ＢａｍＨＩ  Ｊ鶏痘は、同種の組み換え現象において、発現カセットおよび選択カセット（ＧＰＴおよびＲＦＰ）をＦＰＶの中に挿入するために使用する。組み換えウイルスの選択ができるように、大腸菌グアニン−キサンチン−ホスホリボシル−トランスフェラーゼ薬剤選択遺伝子（ＧＰＴ）、および赤色蛍光タンパク質遺伝子（ＲＦＰ）を、融合遺伝子として、強力合成ポックスウイルスプロモーター（ＰｒＳ）の制御の下で挿入した。ＬｏｘＰ配列が、選択カセットの側面に位置し、Ｃｒｅリコンビナーゼを介した選択カセットの除去を可能にする。
【図４Ｅ】プラスミドｐＢＮＸ２１４の構造および遺伝子組織を示す。ｆｌａｎｋ１（Ｆ１  ＩＧＲ  １４８／１４９）、およびｆｌａｎｋ２（Ｆ２  ＩＧＲ  １４８／１４９）は、ＩＧＲ  １４８／１４９を囲むＭＶＡ−ＢＮ配列である。Ｆ１  ＩＧＲ  １４８／１４９、およびＦ２  ＩＧＲ  １４８／１４９は、同種の組み換え現象において、発現カセットおよび選択カセット（ＧＰＴおよびＲＦＰ）をＭＶＡ−ＢＮの中に挿入するために使用する。ｐＢＮＸ２１４は、導入遺伝子の発現のためのＰｒＳ５Ｅプロモーターをすでに含む。組み換えウイルスの選択ができるように、大腸菌グアニン−キサンチン−ホスホリボシル−トランスフェラーゼ薬剤選択遺伝子（ＧＰＴ）、および赤色蛍光タンパク質遺伝子（ＲＦＰ）を、融合遺伝子として、強力合成ポックスウイルスプロモーター（ＰｒＳ）の制御の下で挿入した。ＬｏｘＰ配列が、選択カセットの側面に位置し、Ｃｒｅリコンビナーゼを介した選択カセットの除去を可能にする。
【図５Ａ】プラスミドｐＢＮ４３３の構造および遺伝子組織を示す。ＧＰ−ＭＡＲＶ−ムソケを、プロモーターＰｒＳの制御の下で、ｐＢＮＸ１９７のＢｓｐＥＩ／ＮｈｅＩ部位の中に挿入する。さらには、このプラスミドは、ＭＶＡ−ＢＮゲノムのＩＧＲ  １４８／１４９の側面に位置するＭＶＡ−ＢＮ  ＤＮＡ配列およびｌｏｘＰによって側面に位置する選択カセットも含む。ｌｏｘＰ部位は、Ｃｒｅリコンビナーゼを介した組み換えによって選択カセットを後に除去できる。
【図５Ｂ】プラスミドｐＢＮ３８４の構造および遺伝子組織を示す。エボラウイルスザイールメイインガ（ＧＰ−ＺＥＢＯＶ−メイインガ）、およびマールブルグウイルスムソケ（ＧＰ−ＭＡＲＶ−ムソケ）を、プロモーターＰｒ７．５の制御の下で，ｐＢＮＸ１９７のＭｌｕＩ／ＮｈｅＩ部位の中に挿入した。さらには、このプラスミドは、ＭＶＡ−ＢＮゲノムのＩＧＲ  １４８／１４９の側面に位置するＭＶＡ−ＢＮ  ＤＮＡ配列、およびｌｏｘＰによって側面に位置した選択カセットも含む。ｌｏｘＰ部位は、ＣＲＥリコンビナーゼを介した組み換えによって選択カセットを後に除去できる。
【図５Ｃ】プラスミドｐＢＮ３８５の構造および遺伝子組織を示す。エボラウイルススーダン（ＧＰ−ＳＥＢＯＶ）、およびエボラウイルスアイボリーコースト（ＮＰ−ＥＢＯＶ−ＣｄＩ）のグリコプロテイン遺伝子を、合成プロモーターＰｒＳおよびＰｒＬＥ１の制御の下で，ｐＢＮＸ１８６のＭｌｕＩ／ＮｈｅＩ部位の中に挿入した。さらには、選択的圧力が存在しない中で、同種の組み換えを介して選択カセットを後に除去することができるようにするために、このプラスミドは、ＭＶＡ−ＢＮゲノムのＩＧＲ  １４８／１４９の側面に位置するＭＶＡ−ＢＮ  ＤＮＡ配列、ならびにＦ２およびＦ２ｒｐｔによって側面に位置した選択カセットも含む。
【図５Ｄ】プラスミドｐＢＮ４３６の構造および遺伝子組織を示す。エボラウイルスザイールメイインガ（ＧＰ−ＺＥＢＯＶ−メイインガ）のグリコプロテイン遺伝子を、ＰｒＳ５Ｅプロモーターの制御の下で、ｐＢＮＸ２１４のＢｓｐＥＩ／ＮｏｔＩ部位の中に挿入した。さらには、このプラスミドは、ＭＶＡ−ＢＮゲノムのＩＧＲ  １４８／１４９の側面に位置するＭＶＡ−ＢＮ  ＤＮＡ配列、およびｌｏｘＰによって側面に位置した選択カセットも含む。ｌｏｘＰ部位は、Ｃｒｅリコンビナーゼを介した組み換えによって選択カセットを後に除去できる。
【図５Ｅ】プラスミドｐＢＮ５５５の構造および遺伝子組織を示す。エボラウイルスザイールメイインガ（ＧＰ−ＺＥＢＯＶ−メイインガ）のグリコプロテイン遺伝子を、ＦＰＶ−４０Ｋプロモーターの制御の下で、ｐＢＮＸ２２１のＭｌｕＩ／ＮｏｔＩ部位の中に挿入した。さらには、このプラスミドは、ＦＰＶゲノムの挿入部位ＢａｍＨＩ  Ｊの側面に位置するＦＰＶ  ＤＮＡ配列、およびｌｏｘＰによって側面に位置する選択カセットも含む。ｌｏｘＰ部位は、Ｃｒｅリコンビナーゼを介した組み換えによって選択カセットを後に除去できる。
【図６】ＭＶＡ−ＢＮ−Ｆｉｌｏ（ＭＶＡ−ｍＢＮ２２６Ｂ）によるワクチン接種後の、カニクイザルーマカクのＧＰに対する抗体のレベルを、ＥＬＩＳＡ法によって測定した結果を示す。動物に、ＭＶＡ−ＢＮ−Ｆｉｌｏを、４週間の間隔を置いて２回（−４２日と−１４日）ワクチン接種し、そしてＥＬＩＳＡ法による分析のために間隔を置いて血液を採取した。採取は、ワクチン接種の前（−４２日、赤線（１））、第１回目のワクチン接種の後で、第２回目のワクチン接種の前（−１４日、緑線（２））、および第２回目のワクチン接種の後（−５日、オレンジ線（３））に行った。左のグラフは血清中のマールブルグＧＰに特異的な抗体を示し、中間のグラフは血清中のエボラザイールＧＰに特定的な抗体を示し、右のグラフは血清中のエボラスーダンＧＰに特異定な抗体を示す。各ＥＬＩＳＡでは、マールブルグアンゴラＧＰ（左のグラフ）、エボラザイールＧＰ（中間のグラフ）、またはエボラスーダンＧＰ（右のグラフ）のいずれかによって免疫性を与えたカニクイザルーマカクから採取した高度免疫血清を、陽性対象として使用した。
【図７Ａ】ＭＡＲＶ−ムソケを投与した後に、ＭＶＡ−ＢＮ−Ｆｉｌｏ（ＭＶＡ−ｍＢＮ２２６Ｂ）によるワクチン接種の結果を示す。図７Ａは、ＭＶＡ−ＢＮ−Ｆｉｌｏによるワクチン接種が、動物をＭＡＲＶ−ムソケの投与から、１００％防御したことを示す。
【図７Ｂ】ＭＡＲＶ−ムソケを投与した後に、ＭＶＡ−ＢＮ−Ｆｉｌｏ（ＭＶＡ−ｍＢＮ２２６Ｂ）によるワクチン接種の結果を示す。図７Ｂは、投与後の臨床スコアを示す。ＭＡＲＶ−ムソケを投与した、ワクチン接種をした動物は、出血熱に伴う症状または組織学的変化をまったく示さず、肝臓、脾臓、副腎、リンパ節または肺にウイルスをまったく保有していなかった。
【図８Ａ】異種のＭＶＡまたはＦＰＶ免疫付与後の抗体およびＣＤ８  Ｔ細胞反応を示す。Ｈ−２Ｋｋ＋  Ｂ６ＣＢＡ  Ｆ１マウスを、５×１０７ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ−ＺＥＢＯＶ−ＧＰ（ＭＶＡ；ＭＶＡ−ｍＢＮ３５４Ａ，図３Ｃ参照）、またはＦＰＶ−ＺＥＢＯＶ−ＧＰ（ＦＰＶ；ＦＰＶｍＢＮ３６８Ａ、図３Ｄ参照）によって、０日目および２１日目に皮下免疫付与した。（ａ）マウスは、２１日目および４１日目に、抗体分析のために血液採取した。ここに、ＺＥＢＯＶ−ＧＰに固有の抗体＋／−ＳＥＭの平均濃度を示す。
【図８Ｂ】異種のＭＶＡまたはＦＰＶ免疫付与後の抗体およびＣＤ８  Ｔ細胞反応を示す。Ｈ−２Ｋｋ＋  Ｂ６ＣＢＡ  Ｆ１マウスを、５×１０７ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ−ＺＥＢＯＶ−ＧＰ（ＭＶＡ；ＭＶＡ−ｍＢＮ３５４Ａ，図３Ｃ参照）、またはＦＰＶ−ＺＥＢＯＶ−ＧＰ（ＦＰＶ；ＦＰＶｍＢＮ３６８Ａ、図３Ｄ参照）によって、０日目および２１日目に皮下免疫付与した。（ｂ）４１日目に、マウスを死なせ、それらの脾臓を、ＧＰ５７７−５８４ペプチドで再刺激した後、フローサイトメトリー分析を行った。ここに、脾臓１個当たりのＣＤ１０７ａ＋、ＩＦＮ−γ＋およびＴＮＦ−α＋ＣＤ８  Ｔ細胞  ×  １０４＋／−ＳＥＭの絶対値を示す。ｒＭＶＡ＝組み換えＭＶＡ−ＺＥＢＯＶ−ＧＰ（ＭＶＡ  ｍＢＮ２５４、ｒＦＰＶ＝組み換えＦＰＶ−ＺＥＢＯＶ−ＧＰ（ＦＰＶ−ｍＢＮ３６８）。
【図９】ＭＶＡまたはＦＰＶによってマウスを皮下免疫付与した後のＺＥＢＯＶ−ＧＰに特異的なＣＤ８  Ｔ細胞反応を示す。ここに、ここに、脾臓１個当たりのＣＤ１０７ａ＋、ＩＦＮ−γ＋およびＴＮＦ−α＋ＣＤ８  Ｔ細胞  ×  １０４＋／−標準誤差の絶対値を示す。１：ＭＶＡ−ｍＢＮ２５４またはＦＰＶ  ｍＢＮ３６８、２：ＭＶＡ  ｍＢＮ２２６またはＦＰＶ  ｍＢＮ３６８、３：ＭＶＡ−ｍＢＮ２５５またはＦＰＶ  ｍＢＮ３６８。
【図１０】実施例６に従い、試験の０日目および２８日目に、投与量５×１０８ＴＣＩＤ５０（ｎ＝３）のＭＶＡ−ＢＮ−ＺＥＢＯＶ／ＧＰ（ＭＶＡ−ｍＢＮ２５４）、投与量５×１０８ＴＣＩＤ５０（ｎ＝３）のＭＶＡ−ＢＮ−ＺＥＢＯＶ／ＧＰ−ＶＰ４０（ＭＶＡ−ｍＢＮ２５５）を投与したカニクイザルーマカクのＺＥＢＯＶ−ＧＰに特異的な抗体を示す。結果は、平均値の標準誤差（ＳＥＭ）と共に、幾何平均濃度（ｎｇ／ｍｌ）として提供する。
【図１１】試験の０日目および２８日目に、投与量５×１０８ＴＣＩＤ５０（ｎ＝２）のＭＶＡ−ＢＮ−ＺＥＢＯＶ／ＧＰ、またはＭＶＡ−ＢＮ−ＺＥＢＯＶ／ＧＰ−ＶＰ４０（５×１０８ＴＣＩＤ５０、ｎ＝２）で３回ワクチン接種したカニクイザル−マカクの中和抗体反応を示す。追加の動物（ｎ＝２）に、試験の０日目および５６日目に、陰性対象としてＴＢＳを投与した。血清をＺＥＢＯＶ−ＧＰ固有の疑似ビリオン中和アッセイで分析した。結果は、ＶＳＶを発現しているＺＥＢＯＶ−ＧＰの８０％を中和する個々の抗体力価として提供する。
【図１２】図１２ＡおよびＢは、ＭＶＡ−ＢＮ−ＺＥＢＯＶ／ＧＰ−ＶＰ４０（ＭＶＡ−ｍＢＮ２５５）で感染したＨｅＬａ細胞中のフィロウイルス様粒子の形成を示す。（Ａ、Ｂ）ＭＶＡ−ＢＮ−ＺＥＢＯＶ／ＧＰ−ＶＰ４０（ＶＬＰ）、およびＭＶＡ  ｗｔに感染したＨｅＬａ細胞の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による分析。ＨｅＬａ細胞を、１０のＭＯＩでＭＶＡ−ＢＮ−ＺＥＢＯＶ／ＧＰ−ＶＰ４０（Ａ），またはＢＡＣ由来のＭＶＡ−ｗｔ（Ｂ）によって感染させ、薄い切片を作り、そしてＴＥＭのために処理した。矢印  ＭＶＡ−ＢＮ−ＺＥＢＯＶ／ＧＰ−ＶＰ４０によって生成したＶＬＰの横断面。Ｃは、ＨｅＬａ細胞のＧＰおよびＶＰ４０の発現または同時発現の免疫ブロット分析を示す。Ｄは、１０のＭＯＩで２日間、ＭＶＡ−ＢＮ−ＺＥＢＯＶ／ＧＰ−ＶＰ４０によって感染させた（Ｃで示すものと同じ上清のアリコートの）ＨｅＬａ細胞の上清から得た免疫沈降物の免疫ブロットを示す。ＶＰ４０およびＧＰは、完全なままのＶＬＰ中に含まれる場合にだけ共沈殿され得るが、ＶＬＰがトリトン−Ｘ  １００（１％）によって攪乱した後ではそれはできない。１６６：ＭＶＡ  ｍＢＮ１６６，２５４：ＭＶＡ−ｍＢＮ２５４，２５５：ＭＶＡ−ｍＢＮ２５５。
【図１３】は、ある組み換えＭＶＡ／ＦＰＶ構成物の構造を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本発明者は、マールブルグウイルス（ＭＡＲＶ）グリコプロテイン（ＧＰ）の抗原決定基をコードする異種ヌクレオチド配列を含む組み換え改変ワク
シニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）を含むワクチンが、マールブルグウイルスならびに天然痘に対しても防御免疫力を付与するのに十分な、細胞的および体液的の両者の反応を誘導することができるフィロウイルスワクチンを提供することを発見した。エボラウイルスザイール（ＺＥＢＯＶ）グリコプロテイン（ＧＰ）、エボラウイルススーダン（ＳＥＢＯＶ）グリコプロテイン（ＧＰ）、またはＥＢＯＶ核タンパク質（ＮＰ）の少なくとも１個の抗原決定基をコードする追加の異種ヌクレオチド配列を、組み換えＭＶＡに挿入することによって、例えば、エボラ出血熱の致死的形態に関連する２つのタイプであるスーダンエボラウイルス（ＳＥＢＯＶ）およびザイールエボラウイルス（ＺＥＢＯＶ）のような、ＭＡＲＶおよびＥＢＯＶの両者、さらにはＭＡＲＶおよび／またはＥＢＯＶの多数の株に対してさえ免疫反応を誘導することができる多価ワクチンを作り出す。したがって、エボラＧＰの抗原決定基をコードするヌクレオチド配列を含む組み換えＭＶＡベクターは、エボラ株に対して非常に良い免疫反応を見せる。さらには、ＭＶＡおよびその誘導体（例えば、ＭＶＡ−ＢＮ）の優れた安全性プロフィール、さらには、複数の異種ヌクレオチド配列を提供するそれらの能力は、安全な単一成分多価パンーフィロウイルスワクチンの生産を可能にする。このことは、開発の初期段階におけるいくつかの多成分ワクチンと大きく異なっている（以下、参照）。
【００４１】
フィロウイルスに対する、特に非ヒト霊長類におけるＭＡＲＶおよびＥＢＯＶに対する免疫反応を発生させる先行技術の試みが失敗したことを考えると、本発明は驚きであった。先行技術が教えたこと、および成し遂げたことからは、ＭＶＡ系ワクチンが、フィロウイルス感染、特にＭＡＲＶに対して、非ヒト霊長類を防御する免疫反応を発生させるということは期待できなかった。もちろん、本発明者が作成したデータおよび彼らの観察からは、このＭＶＡ系ワクチンがヒトにおいても免疫反応を誘導すると結論付けることは大いに合理的であり、もっともである。実際、ＦＤＡは、これらの非ヒト霊長類を防御するワクチンが、同様にヒトにも適していることの証明として、この非ヒト霊長類モデルを承認している。
【００４２】
本発明者は、さらに、例えば、スーダンエボラウイルス（ＳＥＢＯＶ）および／またはザイールエボラウイルス（ＺＥＢＯＶ）のようなＥＢＯＶの抗原決定基をコードする異種ヌクレオチド配列を含む組み換え改変ＦＰＶと混合して、例えば、スーダンエボラウイルス（ＳＥＢＯＶ）および／またはザイールエボラウイルス（ＺＥＢＯＶ）のようなＥＢＯＶの抗原決定基をコードする異種ヌクレオチド配列を含む組み換え改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）を含むワクチン投与法が、防御免疫力を付与するのに十分な細胞性および体液性の両者の反応を誘導することができるフィロウイルスワクチンを提供することを発見した。
【００４３】
本発明の基礎にある研究において、さらに、異種プライムおよびブーストとして、少なくとも１個のフィロウイルスサブタイプ、特にフィロウイルスグリコプロテインの抗原タンパク質をコードする核酸を含むＭＶＡベクター、および第１のフィロウイルスグリコプロテインの抗原タンパク質をコードする少なくとも１個の核酸を含むサブタイプ鶏痘ベクターが、特にＭＶＡベクターが少なくとも１個のプライム組成物として、および鶏痘が強化組成物として使用された場合には、高レベルの抗体反応および最大で５倍まで高い細胞傷害性ＣＤ８  Ｔ細胞反応を誘導してフィロウイルス免疫原に対して防御免疫反応を発生させることを発見した。
【００４４】
この組み換えＭＶＡおよび／またはＦＰＶは、１価、つまりＥＢＯＶの抗原決定基をコードするたった１個の異種配列を含むか、または多価、つまりＥＢＯＶの抗原決定基をコードする少なくとも２個の異種配列を含むかのいずれかでありえる。
【００４５】
したがって、本発明は、少なくとも２個のフィロウイルスサブタイプ、特にマールブルグウイルスおよび／またはエボラウイルス−サブタイプによる感染に対して二重の防御または交差の防御を付与する免疫反応を発生させるのに使用するワクチンまたは混合ワクチン、および少なくとも２個のフィロウイルスサブタイプ、特にマールブルグウイルスおよび／またはエボラウイルスーサブタイプに対するワクチンを製剤するために使用できるワクチンまたは混合ワクチンを提供する。したがって、エボラザイールメイインガおよびザイールキクウィトおよび／またはマールブルグムソケおよびマールブルグアンゴラのようなフィロウイルスに対する交差防御のためのワクチンを提供できる。さらには、フィロウイルス、特にＺＥＢＯＶの少なくとも１個の表面グリコプロテインをコードする別の異種ヌクレオチド配列と共に、ＺＥＢＯＶのＶＰ４０タンパク質のようなある種の抗原を発現しているＭＶＡベクターを用いた免疫付与が、フィロウイルス様粒子、例えば、表面にフィロウイルスグリコプロテインを含むエボラウイルス様粒子を生成することができるということも今回、初めて発見された。このことは予想外であった。なぜなら、フィロウイルスのＧＰを細胞の表面へ移送することはＭＶＡによって大きく阻害されるものと報告されていたからである（Ｓａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．８１，２９−３５（２００１））。しかし、フィロウイルス粒子の発芽は細胞表面で起こるので（Ｎｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ．２（９）：ｅ９９（２００６））、表面移送はＧＰを含むフィロウイルス−ＶＬＰの形成に必要である。本発明の基礎にある研究において、フィロウイルスビリオンタンパク質４０（（ＶＰ４０）およびグリコプロテイン、例えば、ＶＬＰを生成することができるＧＰ−ＺＥＢＯＶ−メイインガを発現している組み換えＭＶＡは、種々のプライム−ブーストの組み合わせによって強化された免疫反応を誘導し、フィロウイルス感染に対して非ヒト霊長類を防御した。行われたこの研究は、さらに、フィロウイルスグリコプロテインを発現している組み換えＭＶＡにのみに基づいている同種プライム−ブーストおよびフィロウイルスビリオンタンパク質４０（ＶＰ４０）が、フィロウイルス感染に対して非ヒト霊長類を防御したことを示すことができた。
【００４６】
少なくとも１個のフィロウイルスサブタイプの抗原グリコプロテイン、特にマールブルグウイルスおよび／またはエボラウイルスのグリコプロテインをコードする核酸、および第１のフィロウイルスグリコプロテインの抗原タンパク質をコードする少なくとも１個の核酸を含む鶏痘ベクターをもった異種プライム−ブーストとしてのビリオンタンパク質４０（ＶＰ４０）の抗原タンパク質をコードする核酸を含むＭＶＡベクターの使用は、強化されたＣＤ８  Ｔ細胞反応を発生させることがさらに発見された。少なくとも１個のフィロウイルスサブタイプの抗原グリコプロテイン、特にエボラウイルスのグリコプロテインをコードする核酸、およびビリオンタンパク質４０（ＶＰ４０）の抗原タンパク質をコードする核酸を含むＭＶＡベクターの使用は、例えば、すでにプライミング後である非ヒト霊長類に、ブースティング後にさらに改善した、より高度の中和抗体反応を誘導し、そして、そのようにして、１個またはそれ以上のフィロウイルス感染、特にザイールメイインガおよびザイールキクウィトに対して免疫反応を発生させることをさらに発見した。フィロウイルスグリコプロテインと共に、フィロウイルスビリオンタンパク質４０（ＶＰ４０）のようなある種の抗原を発現しているＭＶＡベクターを用いた免疫付与は、完全なままのフィロウイルスビリオンに似ているＶＬＰの表面全体を覆うフィロウイルスエンベロープグリコプロテインを発現するＶＰＬを生成することができることも示された。このようにして、フィロウイルスＶＰ４０タンパク質をＭＶＡベクターの中へコードする核酸を組み込むことによって、抗原タンパク質またはタンパク質、特にＭＶＡベクターを発現しているウイルス性ベクターの免疫反応が強化されることが示された。
【００４７】
以後、本発明の典型的な実施形態を詳細に説明し、本発明の実施例を付属の図面中で説明する。
【００４８】
組み換えＭＶＡウイルス
【００４９】
１つの態様において、本発明は、フィロウイルスグリコプロテイン（ＧＰ）、特にエンベロープグリコプロテインの抗原決定基をコードするヌクレオチド配列を含む組み換え改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）を提供する。別の態様において、本発明は、フィロウイルスグリコプロテイン、特にエンベロープグリコプロテインの抗原決定基をコードする異種ヌクレオチド配列、およびさらに別のフィロウイルスタンパク質の抗原決定基をコードする異種ヌクレオチド配列を含む組み換えＭＶＡベクターを提供する。ＭＶＡは、皮膚ワクシニア株アンカラの鶏胚線維芽細胞に５７０回を超える連続継代を行うことによって生成されている（漿尿膜ワクシニアウイルスアンカラウイルス、ＣＶＡ；検討するには  Ｍａｙｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７５），Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ３：６ー１４を参照）。これは、トルコ、アンカラにあるＶａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに何年も保有されて、ヒトのワクチン接種の主成分として使用されている。しかし、ワクシニアウイルスに伴う重症のワクチン接種後の合併症のために、より弱毒化した、安全な天然痘ワクチンを生成するいくつかの試みがなされた。
【００５０】
１９６０年から１９７４年の期間中に、Ａｎｔｏｎ  Ｍａｙｒ教授が、ＣＥＦ細胞に５７０回の連続継代を行うことによってＣＶＡを弱毒化することに成功した（Ｍａｙｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７５））。生成したＭＶＡが無発病性であることが、種々の動物モデルで示された（Ｍａｙｒ，Ａ．＆  Ｄａｎｎｅｒ，Ｋ（１９７８），Ｄｅｖ．  Ｂｉｏ．  Ｓｔａｎｄ．４１：２２５−２３４）。プレ天然痘ワクチンとしてのＭＶＡの初期開発の一部として、ワクシニアによる副作用のリスクをもつ対象に対して、Ｌｉｓｔｅｒ  Ｅｌｓｔｒｅｅと合成して、ＭＶＡー５１７を使用する臨床試験が行われた（Ｓｔｉｃｋｌ（１９７４），Ｐｒｅｖ．  Ｍｅｄ．３：９７−１０１；Ｓｔｉｃｋｌ  ａｎｄ  Ｈｏｃｈｓｔｅｉｎ−Ｍｉｎｔｚｅｌ（１９７１），Ｍｕｎｃｈ．Ｍｅｄ．Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ．１１３：１１４９−１１５３）。１９７６年に、（５７１回目の継代に相当する）ＭＶＡ−５７１原種由来のＭＶＡが、ドイツで、２段階の非経口天然痘ワクチン接種プログラムの中で、プライマーワクチンとして登録された。続いて、ＭＶＡ−５７２が、対象の多くはワクシニアに伴う合併症の高いリスクをもった群に属していたが、多数が１歳から３歳までの、重症の副作用の報告がない子供であった約１２０，０００人の白人に対して使用された（Ｍａｙｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７８），Ｚｅｎｔｒａｌｂｌ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（Ｂ）１６７：３７５−３９０）。ＭＶＡー５７２は、欧州動物細胞培養コレクションにＥＣＡＣＣ  Ｖ９４０１２７０７として寄託されている。
【００５１】
ＭＶＡを弱毒化するために使用された継代の結果として、ＣＥＦ細胞で行われた継代の数によって決まる、いくつかの異なる株または分離株がある。例えば、ＭＶＡ−５７２は、ドイツで、天然痘撲滅プログラムの間、プレ−ワクチンとして小さい投与量で使用され、ＭＶＡ−５７５は家畜ワクチンとして広範に使用された。ＭＶＡ、さらにはＭＶＡ−ＢＮは、祖先のＣＶＡウイルスと比較して、ゲノムの約１３％（６個の部位から２６．６ｋｂ）を欠いている。この欠失は、いくつかの病原性および宿主範囲遺伝子、さらにはＡタイプ封入体遺伝子に影響する。ＭＶＡ−５７５は、２０００年１２月７日に、欧州動物細胞培養コレクション（ＥＣＡＣＣ）に、受入番号Ｖ００１２０７０７として寄託された。この弱毒化したＣＶＡウイルスＭＶＡ（改変ワクシニアウイルスアンカラ）は、原発鶏胚線維芽細胞に、ＣＶＡの連続的増殖（５７０回を超える継代）を行って得た。
【００５２】
１９７０年代にＭａｙｒ  ｅｔ  ａｌ．が、ＭＶＡがヒトおよび哺乳動物において非常に弱毒化し、さらに無発病性であることを実証したが、ある研究者達はＭＶＡが哺乳類およびヒトの細胞株において完全には弱毒化していないと報告してきた。なぜならば、残存複製がこれらの細胞で起きるかもしれないからである（Ｂｌａｎｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８），Ｊ．Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．７９：１１５９ー１１６７；Ｃａｒｒｏｌｌ  ＆  Ｍｏｓｓ（１９９７），Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２３８：１９８ー２１１；Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，１８５，１４６；Ａｍｂｒｏｓｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９），Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．５５：５６９）。これらの出版物で報告された結果は、種々の知られたＭＶＡの株から得られたものであると想定される。なぜなら、使用されたウイルスは、本質的に特性、特に種々の細胞株における成長行動が異なっているからである。このような残存複製は、ヒトに使用する場合における安全性への懸念を含む、種々の理由によって望ましくないものである。
【００５３】
より安全なワクチンまたは薬剤のような生産物の開発のための強化された安全性プロフィールを有するＭＶＡの株が、Ｂａｖａｒｉａｎ  Ｎｏｒｄｉｃ社によって開発されている。ＭＶＡは、Ｂａｖａｒｉａｎ  Ｎｏｒｄｉｃ社がさらに継代し、ＭＶＡ−ＢＮと命名した。ＭＶＡ−ＢＮの代表例および好ましいサンプルは、２０００年８月３０日に、欧州細胞培養コレクション（ＥＣＡＣＣ）に、受入番号Ｖ０００８３００８として寄託された。ＭＶＡ−ＢＮはさらに、ＷＯ  ０２／４２４８０（ＵＳ  ２００３／０２０６９２６）、およびＷＯ  ０３／０４８１８４（ＵＳ  ２００６／０１５９６９９）に記載されており、両者は参照することによって本明細書に組み込まれる。
【００５４】
ＭＶＡ−ＢＮは、ウイルスのようにコードされた遺伝子が非常に効率的に発現しているヒト細胞に付着し、入ることができる。ＭＶＡ−ＢＮは、原発鶏胚線維芽細胞（ＣＥＦ）に強く順応し、ヒト細胞において複製しない。ヒト細胞においては、ウイルス性遺伝子は発現し、感染性ウイルスは生成されない。ＭＶＡ−ＢＮは、米国の疾病対策予防センターによると、バイオセーフティレベル１の有機体に分類されている。ＭＶＡ−ＢＮおよびその誘導体の調製物は、多くのタイプの動物、および免疫不全の人々を含む２０００人を超えるヒトの対象に対して投与されている。すべてのワクチンは、一般的に安全で良好な耐容性を有することが証明された。その高い弱毒性および減少した病原性にもかかわらず、前臨床研究では、ＭＶＡ−ＢＮは、ワクシニアに対して、さらにＭＶＡゲノムの中にクローンされた遺伝子によってコードされた異種遺伝子生産物に対して、体液性および細胞性の両者の免疫反応を引き起こすことが示された（Ｅ．Ｈａｒｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００５），Ａｎｔｉｖｉｒ．  Ｔｈｅｒ．  １０（２）：２８５−３００；Ａ  Ｃｏｓｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３），Ｖａｃｃｉｎｅ  ２２（１）：２１−９；Ｍ．Ｄｉ  Ｎｉｃｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３），Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１４（１４）：１３４７−１３６０；Ｍ．Ｄｉ  Ｎｉｃｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２００４），Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１０（１６）：５３８１−５３９０）。
【００５５】
ＭＶＡの「誘導体」または「変異体」とは、本明細書で記載されているように、本質的にＭＶＡと同じ複製特性を示すが、それらのゲノムの１個またはそれ以上の部分で違いを示すウイルスを指す。ＭＶＡ−ＢＮ、さらにはＭＶＡ−ＢＮの誘導体または変異体は、ヒトおよびマウス、そして強く免疫を抑制したマウスでさえも、インビボで生殖的に複製できない。より具体的にいえば、ＭＶＡ−ＢＮ、またはＭＶＡ−ＢＮの誘導体もしくは変異体は、鶏胚線維芽細胞（ＣＥＦ）において生殖的複製の能力も、好ましく有しているが、ヒトケラチン生成細胞細胞株ＨａＣａＴ（Ｂｏｕｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８），Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０６：７６１−７７１），ヒト骨肉腫細胞株１４３Ｂ（ＥＣＡＣＣ寄託番号９１１１２５０２）ヒト胚腎臓細胞株２９３（ＥＣＡＣＣ寄託番号８５１２０６０２）、およびヒト頸腺がん細胞株ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ−２）においては生殖的複製の能力を有しない。さらには、ＭＶＡ−ＢＮの誘導体または変異体は、ＨｅＬａ細胞およびＨａＣａＴ細胞株のＭＶＡ−５７５よりも、少なくとも２倍少ない、より好ましくは３倍少ないウイルス増幅比率を有する。ＭＶＡ変異体のこれらの特性のための試験およびアッセイは、ＷＯ  ０２／４２４８０（ＵＳ  ２００３／０２０６９２６）およびＷＯ  ０３／０４８１８４（ＵＳ  ２００６／０１５９６９９）に記載されている。
【００５６】
「生殖的複製ができない」または「生殖的複製の能力がない」という用語は、例えば、ＷＯ  ０２／４２４８０に記載されており、これには上記した望ましい特性を有するＭＶＡをどのようにして得るのかが教示されている。この用語は、ＷＯ  ０２／４２４８０またはＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．６，７６１，８９３に記載されたアッセイを用いて、感染４日後のウイルス増幅比率が１よりも小さいウイルスに適用される。
【００５７】
「生殖的複製ができない」という用語は、感染４日後のウイルス増幅比率が１よりも小さいウイルスを指す。ＷＯ  ０２／４２４８０またはＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．６，７６１，８９３に記載されたアッセイは、ウイルス増幅比率の決定に適用できる。
【００５８】
ウイルスのこの増幅または複製は、通常、増幅比率といわれる、感染した細胞から生成したウイルス（アウトプット）の、まず第１に細胞を感染させるのに最初に使用した量（インプット）に対する比率で表現される。増幅比率１は、感染した細胞から生成したウイルスの量が、細胞を感染させるのに最初に使用した量と同じ増幅状態を示し、このことは感染した細胞がウイルス感染および生殖にとって許容状態にあることを意味する。対象的に、増幅比率が１よりも小さいこと、つまり、インプットのレベルと比較して、アウトプットが減少したことは、生殖的複製が不足していること、したがってウイルスの弱毒化を示す。
【００５９】
ＭＶＡ系ワクチンの長所は、それらの安全性プロフィール、さらには大規模なワクチン生産が可能なことを含む。前臨床試験は、ＭＶＡ−ＢＮが、他のＭＶＡ株と比較して優れた弱毒性および効能を示すことを明らかにした（ＷＯ  ０２／４２４８０）。ＭＶＡ−ＢＮ株のさらなる特性は、ＤＮＡプライムワクシニアウイルスブースト投与法と比較したとき、ワクシニアウイルスプライム／ワクシニアウイルスブースト投与法におけるのと実質的に同じレベルの免疫力を誘導する能力である。
【００６０】
本明細書における最も好ましい実施形態である組み換えＭＶＡ−ＢＮウイルスは、哺乳類細胞における独特な複製欠損および確立した無発病性の故に安全だと考えられる。さらには、その効能に加えて、産業規模の製造の実現可能性は有益である。さらには、ＭＶＡ系ワクチンは、複数の異種抗原を輸送し、そして体液性および細胞性免疫力の同時誘導を可能にする。
【００６１】
好ましい実施形態においては、組み換えウイルスを発生させるために使用するいずれの実施形態の組み換えＭＶＡベクターは、鶏胚線維芽（ＣＥＦ）細胞をインビトロで生殖的複製をする能力を有するＭＶＡ−ＢＮウイルスまたは誘導体であるが、ヒトケラチン生成細胞細胞株ＨａＣａＴ、ヒト骨肉腫細胞株１４３Ｂ、ヒト胚腎臓細胞株２９３、およびヒト頸腺がん細胞株ＨｅＬａにおいて生殖的複製をする能力は有しない。
【００６２】
別の実施形態においては、組み換えウイルスを発生させるために使用するいずれの実施形態の組み換えＭＶＡベクターも、欧州動物細胞培養コレクション（ＥＣＡＣＣ）に受入番号Ｖ０００８３００８として寄託されているＭＶＡ−ＢＮである。
【００６３】
本発明にとって有益なＭＶＡベクターは、両者とも本明細書に参照することによって組み込まれているＷＯ  ０２／０４２４８０およびＷＯ  ０２／２４２２４に記載されているような当該技術分野で周知の方法を使用して調製できる。
【００６４】
別の態様においては、組み換えウイルスを発生させるのに適するＭＶＡウイルス株は、ＭＶＡ−５７２株、ＭＶＡ−５７５株または同様に弱毒化したいずれのＭＶＡ株でありうる。さらに適するものは、欠失漿尿膜ワクシニアウイルスアンカラ（ｄＣＶＡ）のような突然変異体ＭＶＡでありうる。ｄＣＶＡは、ＭＶＡゲノムのｄｅｌ  Ｉ，ｄｅｌ  ＩＩ，ｄｅｌ  ＩＩＩ，ｄｅｌ  ＩＶ，ｄｅｌ  Ｖ，およびｄｅｌ  ＶＩ欠失部位を含む。この部位は、複数の異種配列の挿入のために特に有益である。ｄＣＶＡは、（ヒト２９３，１４３Ｂ，およびＭＲＣー５細胞株のような）ヒト細胞株において、（増幅比率が１０を超えて）生殖的複製することができ、そして、このことがウイルス系ワクチン接種戦略のために有益なさらなる突然変異によって最適化することを可能にする（ＷＯ  ２０１１／０９２０２９参照）。
【００６５】
組み換えＦＰＶ
【００６６】
１つの態様において、本発明は、フィロウイルスグリコプロテイン（ＧＰ）、特にエンベロープグリコプロテインの抗原決定基をコードするヌクレオチド配列を含む組み換えＦＰＶを提供する。別の態様においては、本発明は、フィロウイルスグリコプロテイン、特にエンベロープグリコプロテインの抗原決定基をコードする異種ヌクレオチド配列、およびさらに別のフィロウイルスタンパク質の抗原決定基をコードする異種ヌクレオチド配列を含む組み換えＦＰＶを提供する。
【００６７】
本発明によるＦＰＶは、アビポックスウイルス属中の原型種である。多数のＦＰＶ株が、説明され、例えば、ＣＥＶＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｙｎａｍｉｄ  Ｗｅｂｓｔｅｒ，  Ｆｏｒｔ  Ｄｏｄｇｅ，  Ｉｎｔｅｒｃｏｎｔｉｎｅｎｔａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｔｅｒｖｅｔ  （ＮＯＢＩＬＩＳ  ＶＡＲＩＯＬＥ），  Ｍｅｒｉａｌ  （ＤＩＦＴＯＳＥＣ  ＣＴ  ｓｔｒａｉｎ），  Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ，  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｓｏｌｖａｙ，  Ｓｙｎｔｒｏ−Ｚｅｏｎ  ａｎｄ  Ｖｉｎｅｌａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手できる。ＦＰ１は、生まれて１日の鶏にワクチンとして使用できるように改変したＤｕｖｅｔｔｅ株である。この株は、１９８０年１０月に、０ＤＣＥＰ  ２５／ＣＥＰ６７／２３０９と命名された市販の鶏痘ウイルスワクチン株であり、ＩｎｓｔｉｔｕｔｅＭｅｒｉｅｕｘ，Ｉｎｃ．から入手できる。ＦＰ５は、鶏胚由来の市販の鶏痘ウイルスワクチン株であり、米国ウィスコンシン州マディソンにあるＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．の一部門）、獣医免許番号：１６５、連番：３０３２１から入手できる。オーストラリアのＣｙａｎａｍｉｄ  Ｗｅｂｓｔｅｒｓ  ＰｔＹ，  Ｌｔｄから入手できるＦＰＶＭ（弱ワクチン株）およびＦＰＶ  Ｓ（標準ワクチン株）のような鶏痘ウイルスの弱毒化した種々の株が知られている。米国農務省（ＵＳＤＡ）のチャレンジ株が、Ｃ．Ｌ．Ａｆｏｎｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．７４（８）：３８１５−３８３１（２０００）、７４（８）：３８１５−３８３１（２０００）によってさらに説明されている。ＦＰ９は、ＩＡＨ  Ｈｏｕｇｈｔｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  （英国、セントーアイブス）のＴｏｍｅｌｅｙ、Ｂｉｎｎｓ、ＢｏｕｒｓｎｅｌｌおよびＢｒｏｗｎによって、１９８０年代の終わりに得られた、ワクチン目的に使用された鶏痘株である。それは、ＨＰ１からの鶏胚胚線維芽細胞（ＣＥＦ）培養中で、継代を４３８回行ったウイルスのプラーク精製から誘導された（Ａ．Ｍａｙｒ  ＆  Ｋ．Ｍａｌｉｃｋｉ（１９６６）、Ｚｅｎｔｒａｌｂｌ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｍｅｄ（Ｂ）１３：１-１３、Ｓｋｉｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｓ．  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ４（１）：６３−７６）。他の弱毒化した株は、Ｓ．Ｊｅｎｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）、Ａｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ７（１２）：９９１：９９８に記載されているような  ＰＯＸＶＡＣ−ＴＣ  である。寄託され株は、例えば、鶏痘ウイルスＡＴＣＣ（登録商標）ＶＲ−２２９（１９２８年以前にニュージャージー州の鶏のとさかからの典型的な鶏痘疥癬）、および鶏痘ウイルスＡＴＣＣ（登録商標）ＶＲ−２５０（１９５０年ケンタッキー州の鶏）を包含する。
【００６８】
別の態様においては、組み換えウイルスを発生させるのに適するＦＰＶウイルス株は、上記のいずれの株、またはいずれの類似のＦＰＶ株でもありうる。別の態様においては、ＦＰＶは、ＦＰ１、ＦＰ５、ＦＰ９、ＦＰＶ  Ｍ、ＦＰＶ  Ｓ、ＡＴＣＣ（登録商標）ＶＲ−２２９、ＡＴＣＣ（登録商標）ＶＲ−２５０、ＵＳＤＡ株、およびＰＯＸＶＡＣ−ＴＣの群から選択される。さらに別の実施形態においては、いずれの実施形態のＦＰＶも、弱毒化したＦＰＶである。
【００６９】
ＦＰＶの長所は、このウイルスが鳥類だけに疾患を引き起こすことであるが、ワクシニアウイルスとは免疫学的に非交差反応的であり、したがって天然痘を体験したヒトの既存の免疫力を免れることができる一方、哺乳類細胞に侵入し、導入遺伝子を発現することができる。
【００７０】
組み換えＦＰＶを発生させるために適する組み換えＦＰＶベクターは、確立した方法で作成することができる。生きた弱毒化した鶏痘ウイルスは、鳥の細胞のウイルスを複数回継代して生成しうる。ＦＰＶベクターの調製は、例えば、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｊ．Ｐ．Ｌａｗｍａｎ  ａｎｄ  Ｐａｔｒｉｃｉａ  Ｄ．Ｌａｗｍａｎ  （ｅｄｓ）Ｃａｎｃｅｒ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ：  Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｖｏｌ．１１３９，  Ｃｈａｐｔｅｒ  ３２  Ｐａｕｌ  Ｍ．  Ｈｏｗｌｅｙ，  Ｋｅｒｒｉｌｙｎ  Ｒ．  Ｄｉｅｎｅｒ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｄ．Ｈａｙｂａｌｌ  ｐ．４０７−４２７に記載されている。ウイルス系ワクチン接種戦略に有益な組み換えＦＰＶの生成は、ＥＰ  ０  ２８４  ４１６  Ｂ１、ＷＯ８８／０２０２２、ＷＯ８９／０３４２９、ＷＯ８９／０３８７９、ＷＯ８９／０７６４４、ＷＯ８９／１２６８４、ＷＯ９０／０２１９１、ＷＯ９１／０２０７２、ＷＯ８９／０３８７９  および  ＷＯ９４／０１９０１４にも記載されている。ゲノム配列およびゲノム組織は、Ａｆｏｎｓｏ  ｅｔ  ａｌ．  ａｎｄ  Ｌａｉｄｌａｗ  ａｎｄ  Ｓｋｉｎｎｅｒ  （Ｃ．Ｌ．  Ａｆｏｎｓｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００），Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．７４（８）：３８１５ー３８３１，Ｓ．Ｍ．Ｌａｉｄｌａｗ  ａｎｄ  Ｍ．Ａ．Ｓｋｉｎｎｅｒ  （２００４），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８５：３０５−３２２）に記載されている。ＦＰＶの例示のゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋ  受入番号  ＡＦ１９８１００．１に見出すことができる。
【００７１】
抗原決定基
【００７２】
抗原決定基という用語は、細胞性反応または体液性反応を問わず、抗原固有の免疫反応を引き起こすために宿主の免疫システムを刺激するいずれの分子を指す。抗原決定基は、宿主に免疫反応をいまだに引き起こすタンパク質、ポリペプチド、抗原性タンパク質断片、抗原およびエピトープを含み、そして  例えば、グリコシル化されたタンパク質、ポリペプチド、抗原性タンパク質断片、抗原およびエピトープ、ならびにこのような分子をコードするヌクレオチド配列を含む抗原、タンパク質の相同体または変異体、ポリペプチド、および抗原タンパク質断片、抗原およびエピトープの一部を形成しうる。このように、タンパク質、ポリペプチド、抗原タンパク質断片、抗原とエピトープは、特定の天然ヌクレオチドまたはアミノ酸配列に限定されず、天然配列と同一の配列、さらには欠失、追加、挿入および置換のような天然配列に対する修飾を包含する。
【００７３】
「エピトープ」という用語は、Ｂ細胞及び／またはＴ細胞が、単独または、例えば、主要な組織適合複合体（「ＭＨＣ」）タンパク質またはＴ細胞受容体のような別のタンパク質と共にして反応する抗原上の部位をいう。エピトープは、隣接アミノ酸、またタンパク質の第２または第３の少なくとも一方の折り畳みによって並列したは非隣接アミノ酸の両者から形成されうる。隣接アミノ酸から形成されたアミノ酸は、変性溶媒に暴露されると典型的には保持されるが、第３の折り畳みによって形成されたエピトープは、変性溶媒で処理されると典型的には失われる。エピトープは、典型的には、少なくとも５，６，７，８，９，１０個またはそれ以上のアミノ酸を含むが、一般的には２０個未満のアミノ酸を含み、それらは独特の空間的な構造を有する。エピトープの空間的な構造を決定する方法は、例えば、Ｘ線結晶構造解析および２次元核磁気共鳴を含む。例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６，Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．  Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ（１９９６）の「Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」を参照。
【００７４】
好ましくは、相同体または変異体は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列のレベルにおいて、言及したタンパク質、ポリペプチド、抗原タンパク質断片、抗原およびエピトープと、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％または６５％、少なくとも約７０％または７５％、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％、より典型的には、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％そして、さらにより典型的には、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％、最も典型的には、少なくとも約９９％の同一性を有する。
【００７５】
核酸とアミノ酸間の配列の同一性を決定する技術は、当該技術分野で周知である。２個またはそれ以上の配列が、それらの「同一性パーセント」を決定することで比較できる。核酸またはアミノ酸配列の２つの配列の同一性パーセントは、整列させた２個の配列間の完全な一致数を、より短い配列の長さで除したものに１００を乗じた数である。
【００７６】
本明細書に記載するタンパク質、ポリペプチド、抗原タンパク質断片、抗原およびエピトープに関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列同一性の一部として保存的置換置換を考慮しないで、配列を整列させ、最大の配列同一性パーセントを達成するために必要ならばギャップ導入した後の、基準配列（つまり、それがそこから誘導されたタンパク質、ポリペプチド、抗原タンパク質断片、抗原またはエピトープ）中のアミノ酸残留物と同一の候補配列中のアミノ酸残留物のパーセントとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のための整列は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトのような公開されているコンピューターソフトを使用するなど、当該技術分野の技術の範囲内の種々の方法で達成できる。当業者は、比較する配列の全長にわたり最大の整列を達成するために必要ないずれかのアルゴリズムを含む、整列を測定するための適切なパラメータを決定できる。
【００７７】
同じことは、必要な変更を加えた上で、ヌクレオチド配列同一性パーセント（％）にも適用される。
【００７８】
例えば、核酸配列の適切な整列は、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，（１９８１），Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９記載の局所相同アルゴリズムによって提供されている。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ，  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｍ．  Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｄ．，５  ｓｕｐｐｌ．３：３５３−３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡ，ａｎｄ  ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  ｂｙ  Ｇｒｉｂｓｋｏｖ（１９８６），Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １４（６）：６７４５ー６７６３が開発したスコアリングマトリックスを使用してアミノ酸配列に適用できる。Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １４（６）：６７４５−６７６３。配列の同一性パーセントを決定するこのアルゴリズムの典型的な実施は、ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  （Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓ．）の  「ＢｅｓｔＦｉｔ」  という実用新案によって提供されている。この方法のデフォルトーパラメータは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  （１９９５）（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．から入手可能）に説明されている。本発明の文脈における同一性パーセントを確立する好ましい方法は、（エディンバラ大学が著作権を有し、Ｊｏｈｎ  Ｆ．  ＣｏｌｌｉｎｓおよびＳｈａｎｅ  Ｓ．  Ｓｔｕｒｒｏｋが開発し、そしてＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州、マウンテンビュー）が販売する）ＭＰＳＲＣＨ  ｐａｃｋａｇｅ  ｏｆ  ｐｒｏｇｒａｍｓを使用することである。このパッケージ一式から、デフォルトーパラメータをスコアリングーテーブル（例えば、ギャップオープニングペナルティー  １２、ギャップエキステンションペナルティ１、およびギャップ６）のために使用する、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いることができる。生成したデータから、「一致」値が「配列同一性」を反映する。同一性パーセントまたは配列間の類似性を計算するための他の適切なプログラムは、本技術分野において一般的に周知である。例えば、他の整列プログラムは、デフォルト−パラメータを使用するＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰが、次のデフォルト−パラメータをつかって使用できる。ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ＝ｓｔａｎｄａｒｄ；ｆｉｌｔｅｒ＝ｎｏｎｅ；ｓｔｒａｎｄ＝ｂｏｔｈ；ｃｕｔｏｆｆ＝６０；ｅｘｐｅｃｔ＝１０；Ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ＝５０  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ；ｓｏｒｔ  ｂｙ＝ＨＩＧＨ  ＳＣＯＲＥ；Ｄａｔａｂａｓｅｓ＝ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ，  ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋  ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋Ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、次のインターネットーアドレスで見つけることができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｖｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ
【００７９】
本明細書のいくつかの実施形態においては、異種核酸が、抗原タンパク質全体ではなく、抗原ドメインまたは抗原タンパク質断片をコードする。これらの断片は、抗原性または免疫原性を有するのに十分ないずれかの長さを有する。断片は、少なくとも８個のアミノ酸の長さ、好ましくは１０−２０個アミノ酸の長さだが、より長いこともありうる。例えば、少なくとも、５０，１００，２００，５００，６００，８００，１０００，１２００，１６００，２０００個のアミノ酸の長さ、またはこれらの間のいずれかの長さである。
【００８０】
いくつかの実施形態においては、抗原タンパク質断片またはその免疫原性ポリペプチドをコードする少なくとも１個の核酸断片が、本発明のウイルス性ベクターの中に挿入される。別の実施形態においては、異なる抗原タンパク質をコードする約２−６個の異なる核酸が、１個またはそれ以上のこのウイルス性ベクターの中に挿入される。いくつかの実施形態においては、種々のタンパク質の免疫原性断片またはサブユニットを使用できる。例えば、単一のタンパク質の異なる部位から、または同じ株の異なるタンパク質から、または異なる株からのタンパク質相同分子種からのいくつかの異なるエピトープが、このベクターから発現されうる。
【００８１】
定義
【００８２】
本明細書で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明  らか  に別の意味を示していない限り、複数形の意味を含むことに留意しなければならない。従って、例えば、「抗原決定基」に言及する場合は、１個またはそれ以上の抗原決定基を含み、「該方法」に言及する場合は、本明細書が記載する方法を修正または代替しうる、当業者に知られた同等のステップおよび方法への言及を含む。
【００８３】
他に別の指示がない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、この一連の要素のすべての要素に言及するものと解する。当業者は、本明細書に記載されている発明の特定の実施形態のおおくの均等物を認識し、または単なる日常的な実験を用いるだけで確認できるであろう。このような均等物は、本発明に包含されるものとする。
【００８４】
本明細書およびそれに続く特許請求の範囲を通じて、文脈上他に解されない限り、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」という単語、ならびに「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（含む）」および「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」のような変形は、記載された完全体もしくはステップまたは完全体もしくはステップの群の包含を意味するが、他のいずれの完全体もしくはステップまたは完全体もしくはステップの群の除外は意味しないものと解する。本明細書で用いる場合、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」という用語は、「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ（含む）」または「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む）」または、本明細書で用いる場合に、時に「ｈａｖｉｎｇ（有する）」という用語で置き換えることができる。前記の用語（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）、ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ（含む）、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む）、ｈａｖｉｎｇ（有する））のいずれも、本明細書において、発明の態様または実施形態の文脈で用いる場合、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ  （から成る）」の用語で置き換えることができるが、あまり好ましくはない。
【００８５】
本明細書で用いる場合、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ  （から成る）」は、請求項の要素の中で特定されていないいずれの要素、ステップ、または成分をも除外する。本明細書で用いる場合、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ（本質的に〜から成る）」は、請求項の基本的かつ新規な特性に実質的に影響しない材料またはステップを除外しない。
【００８６】
本明細書で用いる場合、複数の引用要素間の接続用語「および／または」個々のおよび複合の両者の選択肢を包含するものと解する。例えば、「および／または」によって２個の要素が結合する場合、第１の選択肢は、第２の要素なしで第１の要素を適用できることを指す。第２の選択肢は、第１の要素なしで第２の要素を適用できることを指す。第３の選択肢は、第１および第２の要素を合わせてて適用できることを指す。これらの選択肢のいずれもが、この用語の意味の範囲に含まれ、したがって、本明細書で用いる「および／または」という用語の要件を満たすものと解する。これらの選択肢の２個以上の同時適用可能性、この用語の意味の範囲に含まれ、したがって、「および／または」という用語の要件を満たすものと解する。
【００８７】
この明細書の本文を通じて、いくつかの文献が引用されている。本明細書が以上または以下で引用する（すべての特許、特許出願、科学的出版物、製造者の仕様書、指示書等を含む）それぞれの文献は、その全体が参照することにより本明細書に組み込まれる。参照することによって組み込まれた内容がこの明細書と矛盾し、またはこの明細書と一貫性がない場合、本明細書がこのようないかなる内容にも優先するものとする。本明細書のいかなる開示も、本発明が先行発明を理由としてかかる開示に先行することはできないことを承認するものと解されてはならない。
【００８８】
本発明のフィロウイルス抗原タンパク質の文脈における「実質的に類似する」という用語は、ポリペプチドが、１０〜２０個のアミノ酸の比較ウインドウにわたり、基準配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性のある配列を含むことを示す。配列同一性パーセントは、比較ウインドウにわたり、２個の最適に整列させた配列を比較して決定する。この場合、比較ウインドウのポリヌクレオチド配列の一部は、この２個の配列の最適な整列のための（追加または欠失を含まない）基準配列と比較した場合に、追加または欠失（つまりギャップ）を含みうる。このパーセントは、一致した位置の数を出すために同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列で起きる位置の数を決定し、その一致した位置の数を比較ウインドウの中の位置の数の合計で除し、その結果に１００を乗じて配列同一性パーセントを算出する。
【００８９】
本明細書で用いる「サブタイプ」という用語は、「種」によって置き換えることができる。それは、マールブルグまたはエボラウイルスのようないずれのフィロウイルスの株、分離株、分岐群または変異体を含む。「株」、「分岐群」、「分離株」という用語は、微生物の分類法に言及する専門家に周知の技術用語である。分類法のシステムは、これまでに特徴付けられたすべての微生物を、科、属、種、株の階層的順序に分類する（Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｅｄ．ｂｙ  Ｆｉｅｌｄｓ  Ｂ．Ｎ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ  ２００１）。科のメンバーの基準はそれらの系統発生的関係であるが、属は共通の特性を共有するすべてのメンバーを含み、そして種は複製する系統を構成し、そして特定の生態的地位を占める多元的分類として定義される。「株」または「分岐群」という用語は、微生物、つまり基本的な形態またはゲノム構造および組織のような共通の特性を共有するが、宿主範囲、組織親和性、地理的分布、弱毒性または病原性のような生物学的特性において異なるウイルスを表す。例えば、５個のエボラウイルスのサブタイプが知られている。それらは、ザイールエボラウイルス、スーダンエボラウイルス、レストンエボラウイルス、ブンディブギョエボラウイルスおよびアイボリーコーストエボラウイルスである。ザイールエボラウイルス株は、例えば、ザイールメイインガ、ザイールキクウィト、ザイールガボン（１９９４）、ザイールガボン（１９９６年２月）、ザイールガボン（１９９６年１０月）である。マールブルグウイルスのサブタイプまたは種はたった１個しかない。つまり、マールブルグムソケおよびマールブルグアンゴラを含む株としてこれまで知られていたビクトリア湖マールブルグウイルスである。さらなる株または分離株については、図１も参照。
【００９０】
「ＴＣＩＤ５０」という用語は、「組織培養感染性投与量」の略であり、接種された細胞培養の５０％に病理学的変化を発生させる病原性物質の量であって、ＴＣＩＤ５０／ｍｌとして表現される。ＴＣＩＤ５０を決定する方法は当業者に周知である。それは、例えば、ＷＯ  ０３／０５３４６３の実施例２に記載されている。
【００９１】
本明細書で用いられる「対象」という用語は、例えば、ヒト、非ヒト哺乳動物および（非ヒト）霊長類を含む、生きている多細胞脊椎動物有機体である。本明細書においては、「対象」という用語は、「動物」という用語と同義に用いられうる。
【００９２】
任意の実施形態において言及される「フィロウイルスに起因する疾患」という用語は、本明細書に記載される任意のフィロウイルスの株、分離株または変異体、または（以上または以下の任意の場所において、および／または以上または以下の任意の実施形態において記載された）いずれのフィロウイルスの株、分離株または変異体の組み合わせの感染に起因するいずれの疾患でもありうる。
【００９３】
本明細書で用いられる「強化された」という用語は、（例えば、抗原固有の抗体反応またはＺＥＢＯＶ−ＧＰ固有の抗体反応を中和する）抗体反応、サイトカイン反応またはＣＤ８  Ｔ細胞反応（例えば、免疫優勢ＣＤ８  Ｔ細胞反応）のような、フィロウイルスに対する免疫反応に関して用いられる場合、ＭＶＡベクター（ＭＶＡベクターはフィロウイルスビリオンタンパク質４０をまったく発現しない）の同種のプライム―ブースト混合ワクチンを投与した動物から観察される対応する免疫と比較した、ＭＶＡの同種のプライム−ブースト混合ワクチンを投与した動物における免疫反応の増加を指すか、または、本発明によるＭＶＡ（ＭＶＡベクターはフィロウイルスビリオンタンパク質４０をまったく発現しない）およびＦＰＶベクターの異種のプライム−ブースト混合ワクチンを投与した動物から観察される対応する免疫反応と比較した、本発明によるＭＶＡおよびＦＰＶベクターの異種のプライム−ブースト混合ワクチンを投与した動物における免疫反応の増加を指す。好ましくは、「強化された」という用語は、例えば、中和抗体反応のような抗体反応、サイトカイン反応またはＣＤ８  Ｔ細胞反応等の免疫反応に関して用いられる場合、同じプライム−ブーストのインターバルを用いて、ＦＰＶベクターはプライムとして提供され、ＭＶＡベクターは免疫反応をブーストするために提供される、逆のプライム−ブースト混合ワクチンを投与した動物から観察される対応する免疫反応と比較した、本発明による、プライムとしてのＭＶＡおよびブーストとしてのＦＰＶベクターの異種のプライム−ブースト混合ワクチンを投与した動物における免疫反応の増加を指す。
【００９４】
本発明の文脈において、「免疫優勢ＣＤ８  Ｔ細胞反応」とは、ＭＶＡおよび／またはＦＰＶベクターによってコードされた組み換え抗原に対する宿主の主要なＣＤ８  Ｔ細胞反応を意味する。したがって、組み換えＭＶＡの同種プライム−ブースト、または組み換えＭＶＡおよびＦＰＶの異種のプライム−ブーストによってコードされた組み換え抗原に対する免疫優勢ＣＤ８  Ｔ細胞反応は、この組み換えＭＶＡまたはＦＰＶのいずれの組み換え抗原に対するＣＤ８  Ｔ細胞反応よりも大きく発生させることができる。この場合、このＭＶＡベクターは、フィロウイルスビリオンタンパク質４０をまったく発現しない。
【００９５】
ＣＤ８  Ｔ細胞反応のレベルは、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（例えば、インターフェロンーガンマ（ＩＦＮ−γ）ＥＬＩＳＰＯＴ）のような、しかしこれに限定されない、本技術分野で周知に方法によって決定できる。手順は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎ，Ｉｎｃ．（１９９４）（例えば、Ｃｈａｐｔｅｒ  ６，Ｓｅｃｔｉｏｎ  １９：ＥＬＩＳＰＯＰＴ  Ａｓｓａｙ  ｔｏ  Ｄｅｔｅｃｔ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  Ｍｕｒｉｎｅ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌｓ，  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １０）、または、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．４：３９７-４０２（１９９８））、および、例えば、本発明の特定のウイルスについては実施例に記載の技術によって説明されている。他の適切なアッセイは、ＣＤ８  Ｔ細胞活性のための細胞内サイトカインのレベルを分析するＩＣＳアッセイを含む。例えば、このＣＤ８  Ｔ細胞反応は、動物の対象に抗原固有のＴ細胞反応全体の５１％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％のような５０％を超える抗原固有のＣＤ８  Ｔ細胞反応を含みうる。好ましくは、ＣＤ８  Ｔ細胞反応は、さらに、この動物の対象におけるサイトカイン反応全体の０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、またはそれ以上といった、その０．１％またはそれ以上を示す。いくつかの実施形態においては、第２回または第３回のブーストの後、本発明による組み換えウイルスベクターは、ＣＤ８  Ｔ細胞コンパートメント全体の少なくとも０．５％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、または３０％であるコードされた抗原に対するＣＤ８  Ｔ細胞反応を宿主に誘導する。
【００９６】
抗体反応のレベルは、本技術分野で知られた方法によって決定できる。任意の適するプラーク減少中和滴定量（ＰＲＮＴ）アッセイを、ポリペプチド（または、このようなポリペプチドを発現しているポリヌクレオチド）が、１個またはそれ以上のフィロウイルスサブタイプの１個またはそれ以上のフィロウイルス抗原に対して１個またはそれ以上の中和抗体を誘導するか否かを決定するために使用することができる。フィロウイルスに対する典型的なプラーク減少中和滴定量アッセイが、実施例に記載されている。他のＰＲＮＴ方法および形式は当業者に周知である。
【００９７】
フィロウイルスタンパク質
【００９８】
本明細書で交互に用いられているように、「グリコプロテイン遺伝子」または「ＧＰ遺伝子」という用語は、任意のフィロウイルス株または分離株において、グリコプロテイン、特に膜透過エンベロープグリコプロテインをコードする遺伝子、またはこの遺伝子の相同体または変異体を指すが、このグリコプロテイン遺伝子の正確な配列および／または遺伝子位置は、株または分離株間で異なりうる。例えば、ＳＥＢＯＶのマレオ株（ＳＥＢＯＶ−マレオ）では、グリコプロテイン遺伝子（ＧＰ−ＳＥＢＯＶ−マレオ遺伝子）は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｕ２３０６９．１で付番されているところに従い、ヌクレオチド１２０〜１００４および１００４〜２１４９（終点を含む）を含む。ＥＢＯＶ転写産物は、いくつかのヌクレオチドが２回読まれるように、転写の間に編集を受ける。ＧＰ−ＳＥＢＯＶ−マレオ遺伝子は、さらに、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｕ２３０６９．１で付番されているところに従い、ヌクレオチド１２０〜１００４および１００４〜２１４９（終点を含む）に広がるオープンーリーディングーフレーム（ＯＲＦ）をコードするタンパク質を含む。ＧＰ−ＳＥＢＯＶ−マレオ遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号１（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｕ２３０６９．１）に記載されている。
【００９９】
本明細書で用いられる場合には、「相同体」または「変異体」は、好ましくは、参照した遺伝子、タンパク質、ポリペプチド、抗原タンパク質断片、抗原およびエピトープと、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％または６５％、少なくとも約７０％または７５％、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％、より典型的には、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％そして、さらにより典型的には、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％、最も典型的には、少なくとも約９９％のヌクレオチド配列同一性を有する。「相同体」または「変異体」という用語は、さらに、それぞれ遺伝子およびタンパク質の欠失した、切断された、その他突然変異した型を包含する。例として、例えば、シグナル−ペプチド、さらには完全長ＧＰ−ＥＢＯＶまたはＧＰ−ＭＡＲＶタンパク質の膜透過および／または細胞質ドメインを欠くＧＰ−ＥＢＯＶまたはＧＰ−ＭＡＲＶタンパク質の可溶性形態が包含される。
【０１００】
本明細書で交互に用いられる、「グリコプロテイン」または「ＧＰ」という用語は、グリコプロテイン、特に膜透過エンベロープグリコプロテイン、またはグリコプロテインの相同体または変異体を指す。
【０１０１】
ＧＰ−ＥＢＯＶ−マレオのアミノ酸配列が、配列番号２（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｕ２３０６９．１のアミノ酸配列）に記載されている。ＧＰ−ＳＥＢＯＶ−マレオタンパク質は、シグナル−ペプチド、細胞外ドメイン、膜透過ドメイン、および細胞質ドメインを含む（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｑ６６７９８参照）。ＧＰ−ＳＥＢＯＶ−マレオタンパク質のシグナル−ペプチドは配列番号２のアミノ酸１〜３２から成り、ＧＰ−ＳＥＢＯＶ−マレオタンパク質の細胞外ドメインは配列番号２のアミノ酸３３〜６５０または配列番号２のアミノ酸１〜６５０から成り、ＧＰ−ＳＥＢＯＶ−マレオタンパク質の膜透過ドメインは配列番号２のアミノ酸６５１〜６７１から成り、そしてＧＰ−ＳＥＢＯＶ−マレオタンパク質の細胞質ドメインは配列番号２のアミノ酸６７２〜６７６から成る。
【０１０２】
ＧＰ−ＺＥＢＯＶ−メイインガのアミノ酸配列をコードする核酸は、配列番号１９に記載されている。ＧＰ−ＺＥＢＯＶ−メイインガは、配列番号２０（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＢＸ７５３６７．１）に記載されているタンパク質を含む。
【０１０３】
同様に、本明細書で同義に用いられる、「グリコプロテイン遺伝子」または「ＮＰ遺伝子」という用語は、いずれのフィロウイルス株または分離株において、核タンパク質をコードする遺伝子、またはこの遺伝子の相同体または変異体を指すが、この核タンパク質遺伝子の正確な配列および／または遺伝子位置も、株または分離株間で異なりうる。例えば、ＳＥＢＯＶのボニフェス株（ＳＥＢＯＶ−ボニフェス）では、核タンパク質遺伝子（ＮＰ−ＳＥＢＯＶ−ボニフェス遺伝子）は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ１７３８３６．１で付番されているところに従い、ヌクレオチド３８３〜２５９９（終点を含む）を含む。ＮＰ−ＳＥＢＯＶ−ボニフェス遺伝子は、さらに、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ１７３８３６．１で付番されているところに従い、ヌクレオチド３８３〜２５９９（終点を含む）に渡るオープン−リーディング−フレーム（ＯＲＦ）をコードするタンパク質を含む。このＮＰ−ＳＥＢＯＶ−ボニフェス遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号３（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ１７３８３６．１）に記載されている。
【０１０４】
ＮＰ−ＥＢＯＶ−ボニフェスのアミノ酸配列が、配列番号４（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ１７３８３６．１のアミノ酸配列）に記載されている。ＮＰ−ＳＥＢＯＶ−ボニフェスタンパク質は、コイルされたコイル−ドメインを含む（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｑ９ＱＰ７７参照）。ＮＰ−ＳＥＢＯＶ−ボニフェスタンパク質のコイルされたコイル−ドメインは、配列番号４のアミノ酸３３４〜３６３から成る。
【０１０５】
ある特定の実施形態においては、抗原決定基をコードする核酸、好ましくは抗原タンパク質、より好ましくは上記または下記のいずれのタンパク質は、完全長タンパク質である。
【０１０６】
組み換えＭＶＡおよびＦＰＶ
【０１０７】
本明細書に記載されているのは、ポックスウイルス（例えば、ＭＶＡまたはＭＶＡ−ＢＮまたはＦＰＶ）ゲノムの種々の挿入部位に組み込まれたＥＢＯＶおよび／またはＭＡＲＶに由来する異種または異質の核酸配列を含む組み換えポックスウイルス（例えば、ＭＶＡまたはＭＶＡ−ＢＮまたはＦＰＶ）である。この異種の核酸は、例えば、ウイルス抗原を含む、１個またはそれ以上の異質のタンパク質および／または異質の抗原をコードしうる。
【０１０８】
一般的に、本明細書に記載される「組み換え」ＭＶＡまたはＦＰＶは、標準的な遺伝子工学的方法、つまり本発明のＭＶＡまたはＦＰＶによって生成され、したがって遺伝子操作され、または遺伝子改変されたＭＶＡまたはＦＰＶであるＭＶＡまたはＦＰＶをいう。したがって、「組み換えＭＶＡまたはＦＰＶ」という用語は、組み換え核酸を安定的にそれらのゲノムに、好ましくは転写単位の形態で、組み込まれたＭＶＡ／ＦＰＶを含む。転写単位は、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターおよび／またはサイレンサーを含みうる。本発明の組み換えＭＶＡ／ＦＰＶは、調節要素の誘導の際に、異種抗原決定基、ポリペプチドまたはタンパク質（抗原）を発現しうる。本発明の任意の実施形態の文脈における「ＭＶＡ／ＦＰＶ」という用語は、ＭＶＡ、ＦＰＶ、またはＭＶＡおよびＦＰＶの個々の、または複合の選択肢の両者を包含する。
【０１０９】
本明細書で用いられる場合、「異種の」遺伝子、核酸、抗原またはタンパク質は、野生型ポックスウイルスゲノム（例えば、ＭＶＡまたはＭＶＡ−ＢＮまたはＦＰＶ）中に存在しない核酸またはアミノ酸配列であると解される。当業者は、「異種遺伝子」は、ＭＶＡまたはＭＶＡ−ＢＮまたはＦＰＶのようなポックスウイルス中に存在する場合、組み換えポックスウイルスを宿主細胞に投与した後に、それが、対応する異種遺伝子生産物として、つまり「異種抗原」および／または「異種タンパク質」として発現するように、このポックスウイルスゲノムの中へ組み込まれるべきことを理解している。発現は、通常、異種遺伝子を、ポックスウイルスに感染している細胞の中で発現することを可能にする調節要素に操作して結合することによって達成する。好ましくは、この調節要素は、天然または合成ポックスウイルスプロモーターを含む。
【０１１０】
１つの態様においては、本発明の組み換えＭＶＡ／ＦＰＶベクターは、エボラウイルス（ＥＢＯＶ）および／またはマールブルグウイルス（ＭＡＲＶ）から選択されるフィロウイルスタンパク質の抗原決定基をコードする異種ヌクレオチド配列を含む。別の実施形態においては、本発明の組み換えＭＶＡ／ＦＰＶベクターは、ザイールエボラウイルス（ＺＥＢＯＶ）、スーダンエボラウイルス（ＳＥＢＯＶ）、コートジボワールエボラウイルス（ＥＢＯＶ−ＣｄＩ、またはタイフォレストウイルスまたはＴＡＦＶとも呼ばれる）、レストンエボラウイルス（ＲＥＢＯＶ）およびブンディブギョエボラウイルス（ＢＥＢＯＶ）からなる群から選択される１個またはそれ以上のＥＢＯＶ−サブタイプから選択されるフィロウイルスタンパク質（例えば、ＥＢＯＶタンパク質）の１個またはそれ以上の抗原決定基の抗原決定基をコードする異種ヌクレオチド配列を含む。
【０１１１】
別の実施形態によれば、本発明の組み換えＭＶＡ／ＦＰＶベクターは、ザイールメイインガ、ザイールキクウィト、ザイールガボン、コートジボワールエボラウイルス、スーダンボニフェス、スーダンマレオ、スーダングル、マールブルグラブン、マールブルグオゾリン、マールブルグラタイチャク、マールブルグムソケ、マールブルグアンゴラの群から選択されるフィロウイルスタンパク質、好ましくはＥＢＯＶタンパク質、ＭＡＲＶタンパク質またはこれらの完全長タンパク質の１個またはそれ以上の抗原決定基を含む。
【０１１２】
好ましくは、（例えば、ザイールメイインガ、ザイールキクウィト、ザイールガボン、コートジボワールエボラウイルス、スーダンボニフェス、スーダンマレオ、スーダングル、マールブルグラブン、マールブルグオゾリン、マールブルグラタイチャク、マールブルグムソケ、マールブルグアンゴラの群から選択される）このフィロウイルスタンパク質の抗原決定基は、エンベロープグリコプロテイン（ＧＰ）、核タンパク質（ＮＰ）、ビリオンタンパク質３５（ＶＰ３５）、ビリオンタンパク質４０（ＶＰ４０）、ビリオンタンパク質３０（ＶＰ３０）、ビリオンタンパク質２４（ＶＰ２４）、およびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼタンパク質（Ｌ）からなる群から選択される。
【０１１３】
別の実施形態においては、このフィロウイルスタンパク質の抗原決定基は、エンベロープグリコプロテイン（ＧＰ）、好ましくは、少なくともエンベロープグリコプロテイン（ＧＰ）およびビリオンタンパク質４０（ＶＰ４０）である。
【０１１４】
別の実施形態においては、このフィロウイルスタンパク質の抗原決定基は、ＺＥＶＯＶおよびＳＥＢＯＶ、好ましくは、少なくともエンベロープグリコプロテイン（ＧＰ）およびビリオンタンパク質４０（ＶＰ４０）の群から選択されるエンベロープグリコプロテイン（ＧＰ）であり、ＧＰおよびＶＰ４０は同じ株に由来し、好ましくは、この同じ株はＺＥＢＯＶおよびＳＥＢＯＶの群から選択される。
【０１１５】
別の実施形態においては、このフィロウイルスタンパク質の抗原決定基は、少なくともエンベロープグリコプロテイン（ＧＰ）およびビリオンタンパク質４０（ＶＰ４０）であり、ＧＰおよびＶＰ４０は異なる分離株または同じ分離株に由来する。好ましくは、この異なる、または同じ分離株は、ザイールメイインガ、ザイールキクウィト、ザイールガボン、コートジボワールエボラウイルス、スーダンボニフェス、スーダンマレオ、スーダングル、マールブルグラブン、マールブルグオゾリン、マールブルグラタイチャク、マールブルグムソケおよびマールブルグアンゴラの群から選択され、好ましくは、この分離株は、ザイールメイインガ、スーダングル、マールブルグムソケおよびマールブルグアンゴラの群から選択され、最も好ましくは、この分離株は、ザイールメイインガ、スーダングル、およびマールブルグムソケの群から選択される。別の好ましい実施形態においては、本発明の組み換えＭＶＡ／ＦＰＶベクターは、２個，３個、４個またはそれ以上のエボラおよび／またはマールブルグ−サブタイプの抗原決定基をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１１６】
別の好ましい実施形態は、本発明いずれかの実施形態の組み換えＭＶＡ／ＦＰＶベクターを対象にし、このベクターは、エンベロープグリコプロテイン（ＧＰ）、核タンパク質（ＮＰ）、ビリオンタンパク質３５（ＶＰ３５）、ビリオンタンパク質４０（ＶＰ４０）、ビリオンタンパク質３０（ＶＰ３０）、ビリオンタンパク質２４（ＶＰ２４）、およびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼタンパク質（Ｌ）からなる群から選択される２個、３個、４個またはそれ以上のフィロウイルスタンパク質の抗原決定基を含む。
【０１１７】
好ましい実施形態においては、本発明の任意の実施形態の組み換えＭＶＡ／ＦＰＶベクターは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２０、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３４および配列番号３７からなる群から選択される１個、２個、３個、４個またはそれ以上のフィロウイルスタンパク質の抗原決定基を含む。
【０１１８】
好ましい実施形態においては、本発明の任意の実施形態の組み換えＭＶＡ／ＦＰＶベクターは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２０、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３４および配列番号３７からなる群から選択されるフィロウイルスタンパク質の抗原決定基を含む。
【０１１９】
別の実施形態においては、本発明の任意の実施形態の組み換えＭＶＡ／ＦＰＶベクターは、配列番号２０からなるフィロウイルスタンパク質の抗原決定基を含む。
【０１２０】
別の実施形態においては、本発明の任意の実施形態の組み換えＭＶＡ／ＦＰＶベクターは、配列番号２０および配列番号３４からなる群から選択されるフィロウイルスタンパク質の抗原決定基を含む。
【０１２１】
別の実施形態においては、本発明の任意の実施形態の組み換えＭＶＡ／ＦＰＶベクターは、配列番号６、配列番号２０、配列番号３１および配列番号３４からなる群から選択されるフィロウイルスタンパク質の抗原決定基を含む。
【０１２２】
別の実施形態においては、本発明の任意の実施形態の組み換えＭＶＡ／ＦＰＶベクターは、配列番号６、配列番号２０、配列番号２９、配列番号３１および配列番号３４からなる群から選択されるフィロウイルスタンパク質の抗原決定基を含む。
【０１２３】
別の好ましい実施形態においては、本発明の任意の実施形態の組み換えＭＶＡ／ＦＰＶベクターは、配列番号６、配列番号２０、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３４および配列番号３７からなる群から選択されるフィロウイルスタンパク質の抗原決定基を含む。
【０１２４】
別の好ましい実施形態においては、本発明の任意の実施形態のＭＶＡベクターは、配列番号２９および／または配列番号６、配列番号２０、配列番号３１からなるフィロウイルスタンパク質の抗原決定基をコードする異種ヌクレオチド配列を含む。
【０１２５】
別の好ましい実施形態においては、本発明の任意の実施形態のＭＶＡベクターは、配列番号２８および／または配列番号５、配列番号１９、配列番号３０を含むヌクレオチド配列を含む。
【０１２６】
別の好ましい実施形態においては、本発明の任意の実施形態のＭＶＡベクターは、配列番号３３を含むフィロウイルスビリオンタンパク質４０（ＶＰ４０）の抗原タンパク質をコードするヌクレオチド配列、または配列番号３４を含むタンパク質配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１２７】
別の好ましい実施形態においては、本発明の任意の実施形態の組み換えＭＶＡベクターは、（ａ）配列番号５、配列番号１９および配列番号３０、（ｂ）配列番号５、配列番号１９、配列番号２８および配列番号３０、ならびに（ｃ）配列番号１９および配列番号３３からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【０１２８】
別の態様において、本発明は、フィロウイルスグリコプロテイン、特にフィロウイルスエンベロープグリコプロテインの抗原決定基をコードする異種ヌクレオチド配列を含む組み換えＭＶＡベクターまたはＦＰＶベクターを含む。
【０１２９】
フィロウイルスグリコプロテインは、ＧＰ−ＭＡＲＶまたはＧＰ−ＥＢＯＶをコードしうる。
【０１３０】
本明細書が記載する実施形態のために、ＭＡＲＶのグリコプロテインを、ＭＡＲＶ−ムソケ、好ましくは完全長ＭＡＲＶ−ムソケから誘導でき、ＭＡＲＶ−ムソケはビクトリア湖株またはＭＡＲＶ−ムソケの分離株から誘導できる。ＧＰ−ＭＡＲＶが、ＭＡＲＶ−ラブン  ＭＡＲＶ−オゾリン、ＭＡＲＶ−ラタイチャクまたはＭＡＲＶ−アンゴラからも誘導できる。完全長ＧＰ−ＭＡＲＶ−ムソケをコードするヌクレオチド配列が、配列番号６のアミノ酸１−６８１または１９−６８１をコードする配列番号５に示されている。好ましい実施形態においては、ＧＰ−ＭＡＲＶ−ムソケは、好ましくは配列番号６のタンパク質をコードする配列番号５のヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態においては、ＧＰ−ＭＡＲＶ−ムソケは切断されており、切断ＧＰ−ＭＡＲＶ−ムソケは配列番号６のアミノ酸１−６４８またはアミノ酸１９−６４８（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＢＡ８７１２７．１）を含むエンベロープグリコプロテインの細胞外ドメインドメインのみを含みうる。本明細書に記載される別の実施形態においては、ＭＡＲＶのグリコプロテインは、ＭＡＲＶ−アンゴラ、好ましくは完全長ＧＰ−ＭＡＲＶ−アンゴラから誘導できる。好ましい実施形態においては、ＧＰ−ＭＡＲＶ−アンゴラは、配列番号３７のアミノ酸をコードする配列番号３６のヌクレオチド配列を含む。
【０１３１】
ＥＢＯＶのグリコプロテインは、ＧＰ−ＳＥＢＯＶであるか、またはＧＰ−ＺＥＢＯＶ、特にＧＰ−ＺＥＢＯＶのメイインガ株（ＧＰ−ＺＥＢＯＶ−メイインガ）から誘導できる  完全長ＧＰ−ＺＥＢＯＶ−メイインガは、配列番号２０のアミノ酸配列をコードする配列番号１９のヌクレオチド配列を含む。好ましい実施形態においては、ＧＰ−ＺＥＢＯＶ−メイインガは、配列番号２０のタンパク質を好ましくコードする配列番号１９のヌクレオチド配列を含む。ＧＰ−ＥＢＯＶは、ＧＰ−ＢＥＢＯＶ、ＧＰ−ＥＢＯＶ−ＣｄＩまたはＧＰ−ＥＢＯＶ−レストンでもありうる。ＧＰ−ＺＥＢＯＶは、切断されていることがあり、そして配列番号２０のアミノ酸１〜６３６をコードするために改変した、または配列番号２０のアミノ酸３１４〜４６４に渡るムチンドメインを欠失するために改変した配列番号１９のヌクレオチド配列を含みうる。
【０１３２】
ＧＰ−ＳＥＢＯＶは、ＧＰ−ＳＥＢＯＶのグル株（ＧＰ−ＳＥＢＯＶ−グル）から誘導しうる。本発明のある特定の実施形態においては、ＧＰ−ＳＥＢＯＶは、配列番号３１のアミノ酸配列を好ましくコードする配列番号３０のヌクレオチド配列を含む。
【０１３３】
本発明による組み換えＭＶＡ／ＦＰＶは、さらに、破傷風トキソイド断片Ｃ配列も含みうる。好ましい実施形態においては、ＧＰ−ＭＡＲＶ−ムソケ、特に完全長ＭＡＲＶ−ムソケ−ＧＰは、さらに破傷風トキソイド断片Ｃを含む。破傷風トキソイド断片Ｃは、配列番号８のアミノ酸配列をコードする配列番号７のヌクレオチド配列を含みうる  ある特定の実施形態においては、切断ＧＰ−ＭＡＲＶ−ムソケは、さらに、配列番号８のアミノ酸配列のアミノ酸７６０〜１２１３をコードする配列番号７のヌクレオチド配列のヌクレオチド２２８１〜３６４２を含みうる破傷風トキソイド断片Ｃ（ＴＣＣ）を含む。
【０１３４】
本発明の組み換えＭＶＡ／ＦＰＶベクターは、免疫刺激または共刺激分子をさらに含みうる。好ましい実施形態においては、ＧＰ−ＭＡＲＶ−ムソケの抗原決定基をコードする異種ヌクレオチド配列は、さらに１個またはそれ以上の免疫刺激分子を含む。ある特定の実施形態においては、この１個またはそれ以上の免疫刺激分子は、配列番号１０のアミノ酸配列をコードする配列番号９を含みうるヒトＣＤ４０配位子（ｈＣＤ４０Ｌ）である。ある特定の実施形態においては、１個またはそれ以上のこの免疫刺激分子は、配列番号１２のアミノ酸配列をコードする配列番号１１を含みうるヒトインターロイキン−１５受容体（ｈＩＬ  １５Ｒ−スシ）のスシドメインを含む融合タンパク質である。
【０１３５】
１個またはそれ以上の免疫刺激分子は、共刺激分子の三つ組み（つまり、ＴＲＩＣＯＭ）として集合的に知られる、リンパ球機能関連抗原３（ＬＦＡ−３，またはＣＤ５８）、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１，またはＣＤ５４）およびＢ７．１（ＣＤ８０）でありうる。本明細書で用いられる「ＴＲＩＣＯＭ」は、抗原固有の免疫反応を増加させるために特定の抗原を発現している組み換えウイルスベクター（例えば、ポックスウイルスベクター）に含まれる、（ＣＤ８０としても知られている）Ｂ７ー１、細胞内接着分子−１（ＣＤ５４としても知られているＩＣＡＭ−１）およびリンパ球機能関連抗原−３（ＣＤ５８としても知られているＬＦＡ−３）から成るＴｒｉａｄ  ｏｆ  ＣＯｓｔｉｍｌａｔｏｒｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓの省略である。ＴＲＩＣＯＭの個々の成分は、同じまたは異なるプロモーターの制御の下にあることができ、そして特定の抗原をもった同じベクターに、または別のベクターに提供することができる。典型的なベクターは、例えば、Ｈｏｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ａ  Ｔｒｉａｄ  ｏｆ  Ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  Ｓｙｎｅｒｇｉｚｅ  ｔｏ  Ａｍｐｌｉｆｙ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，”  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：５８００−５８０７  （１９９９）および  Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．７，２１１，４３２  Ｂ２に開示されており、両者は参照することにより本明細書に組み込まれている。ＬＦＡ−３は、配列番号１４のアミノ酸配列をコードする配列番号１３のヌクレオチド配列を含むことができ、ＩＣＡＭ−１は、配列番号１６のアミノ酸配列をコードする配列番号１５のヌクレオチド配列を含むことができ、そしてＢ７．１は、配列番号１８のアミノ酸配列をコードする配列番号１７のヌクレオチド配列を含むことができる。
【０１３６】
本発明の組み換えＭＶＡ／ＦＰＶは、配列番号２２のアミノ酸配列をコードする配列番号２１のヌクレオチド配列を含むワクシニアウイルス遺伝子Ｂ５ｍのような膜アンカー配列をさらに含むこともできる。特に、本明細書に記載された抗原決定基は、このＢ５ｍのような膜アンカーに好ましく動作可能に結合することができる。したがって、組み換えＭＶＡ／ＦＰＶが膜アンカー配列を含むものと本明細書でいう場合、組み換えＭＶＡ／ＦＰＶが含む抗原決定基が、膜アンカーに好ましく動作可能に結合することを意味する。膜アンカーは、細胞膜の外側の表面に異種ポリペプチドを固定することができるいずれのポリペプチドを指す。好ましくは、膜アンカーは、本明細書で「Ｂ５Ｒアンカー」または「Ｂ５ｍ」と名付けた、ワクシニアウイルスＢ５Ｒタンパク質の細胞質および膜透過ドメインを含む。定義したように、Ｂ５Ｒアンカーは、例えば、ＷＲ株のような任意のタイプのワクシニアウイルスからのＢ５Ｒタンパク質の４２アミノ酸のＣー末端断片（（Ｋａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７１（４）：３１７８−８７（１９９７））、または、より好ましくはＭＶＡを指す。さらには、参照Ｂ５Ｒアンカー配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％のような、例えば少なくとも９０％、または少なくとも９５％、少なくとも９８％のような配列同一性を有するＢ５Ｒアンカー変異体も、本発明に含まれる。好ましいアンカー配列が、配列番号２１に示され、その翻訳生産物も配列番号２２に示されている。
【０１３７】
好ましい実施形態においては、完全長および／または切断ＧＰ−ＺＥＢＯＶは、さらにワクシニアウイルス遺伝子Ｂ５ｍを含む。
【０１３８】
別の態様において、本発明は、上記のような、フィロウイルスグリコプロテインの抗原決定基をコードする異種ヌクレオチド配列を含む組み換えＭＶＡ／ＦＰＶベクターを含み、さらにウイルス様粒子（ＶＬＰ）を形成するのに必要な追加のフィロウイルスタンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列を含む。１つの実施形態においては、このＶＬＰを形成するのに必要なフィロウイルスタンパク質をコードする追加の異種ヌクレオチド配列は、ＶＰ４０でありうる。ある特定の実施形態においては、ウイルス様粒子を形成し、またはＶＬＰの形成を増進するために必要な追加のフィロウイルスタンパク質は、ＮＰ−ＥＢＯＶおよびＶＰ４０−ＥＢＯＶであり、これらのタンパク質は、上に示したような株から誘導することができる。好ましくは、フィロウイルス核タンパク質（例えば、ＮＰ−ＥＢＯＶ）およびフィロウイルスビリオンタンパク質４０（例えば、ＶＰ４０−ＥＢＯＶ）は、同じフィロウイルス株から誘導される。ＧＰおよびＶＰ４０（追加で、またはＮＰの発現なしで）を発現している、さらには感染している細胞からＧＰを含むＥＢＯＶ−ＶＬＰを発生させることができる、組み換えＭＶＡを用いて非ヒト霊長類にワクチン接種することによって、本発明者は、非ヒト霊長類にフィロウイルスの攻撃に対する防御を実現することができた。ワクチン接種をした動物にウイルス様粒子を生成することは、真正なフィロウイルス感染に存在するウイルス粒子を綿密に模倣する追加のワクチンモダリティを作る。そのような組み換えＭＶＡフィロＶＬＰワクチン接種は、体液性および細胞性免疫反応の両者を刺激し、したがってフィロウイルスの攻撃を防御した。フィロウイルスＶＬＰを提供する弱毒化したＭＶＡウイルスを用いたワクチン接種のさらなる長所は、接種のためのウイルス様粒子の精製、および追加のＭＶＡを介した免疫刺激の必要を回避することである。同じ株から誘導したフィロウイルス核タンパク質（例えば、ＮＰ−ＥＢＯＶ）およびフィロウイルスビリオンタンパク質４０（例えば、ＶＰ４０−ＥＢＯＶ）の使用は、ＶＬＰの形成を増進するするために、好ましくは、綿密にウイルス粒子を模倣して、フィロウイルス感染に対する防御を改善するために、均一の半径をもった同種ＧＰスパイク修飾ＶＬＰを発生させるために有利である。
【０１３９】
本発明は、フィロウイルスグリコプロテインの抗原決定基をコードする異種ヌクレオチド配列、およびさらに別のフィロウイルスタンパク質の抗原決定基をコードする異種ヌクレオチド配列を含む組み換えＭＶＡ／ＦＰＶベクターにも関する。さらなるフィロウイルスタンパク質の抗原決定基をコードするヌクレオチド配列は、核タンパク質（ＮＰ）、ビリオンタンパク質３５（ＶＰ３５）、ビリオンタンパク質４０（ＶＰ４０）、ビリオンタンパク質３０（ＶＰ３０）、ビリオンタンパク質２４（ＶＰ２４）、およびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼタンパク質（Ｌ）からなる群から選択される１個またはそれ以上のフィロウイルスタンパク質をコードしうる。前記遺伝子およびタンパク質のそれぞれは、上記した１個またはそれ以上のフィロウイルス株から得ることができる。ある特定の実施形態のＮＰ−ＥＢＯＶ−ＣｄＩは，配列番号２９のアミノ酸配列をコードする配列番号２８のヌクレオチド配列を含む。
【０１４０】
ある特定の実施形態においては、ＶＰ４０はＭＡＲＶまたはＥＢＯＶから選択され、好ましくは、ＶＰ４０はザイールエボラウイルス（ＺＥＢＯＶ）、スーダンエボラウイルス（ＳＥＢＯＶ）、コートジボワールエボラウイルス（ＥＢＯＶ−ＣｄＩ、またはタイフォレストウイルスまたはＴＡＦＶとも呼ばれる）、レストンエボラウイルス（ＥＢＯＶ−レストン）およびブンディブギョエボラウイルス（ＢＥＢＯＶ）からなる群から選択される１個またはそれ以上のＥＢＯＶ−サブタイプから選択される。好ましい実施形態においては、ＶＰ４０は、ＺＥＢＯＶ、ＳＥＢＯＶおよびＭＡＲＶの１個またはそれ以上から選択される。ある特定の実施形態においては、フィロウイルスグリコプロテインおよびフィロウイルスＶＰ４０は、同じフィロウイルス株から選択される。さらに好ましい実施形態
においては、ＶＰ４０および／またはフィロウイルスグリコプロテインは、ザイールメイインガ、ザイールキクウィト、ザイールガボン、コートジボワールエボラウイルス、スーダンボニフェス、スーダンマレオ、スーダングル、マールブルグラブン、マールブルグオゾリン、マールブルグラタイチャク、マールブルグムソケおよびマールブルグアンゴラの１個またはそれ以上から選択され、より好ましくは、ザイールメイインガ（ＶＰ４０−ＺＥＢＯＶ−メイインガ）、スーダングル（ＶＰ４０−ＳＥＢＯＶ−グル）、マールブルグムソケ（ＶＰ４０−ＭＡＲＶ−ムソケ）およびマールブルグアンゴラ（ＶＰ４０−ＭＡＲＶ−アンゴラ）の１個またはそれ以上から選択される。さらなる実施形態においては、任意の実施形態のＭＶＡベクターは、さらに、フィロウイルス核タンパク質（ＮＰ）を含み、好ましくは、このフィロウイルス核タンパク質およびフィロウイルスＶＰ４０は同じフィロウイルス株から誘導される。さらなる実施形態においては、ＶＰ４０は、ＶＰ４０−ＺＥＢＯＶ−メイインガまたはＶＰ４０−ＭＡＲＶ−ムソケをコードする核酸配列  を含む。別の実施形態においては、フィロウイルスＶＰ４０は、配列番号３３のヌクレオチド配列を含む。さらなる実施形態においては、ＶＰ４０は、配列番号３４のタンパク質配列をコードする核酸を含む。さらに好ましい実施形態においては、ＶＰ４０は、配列番号３４のアミノ酸配列をコードする配列番号３３のヌクレオチド配列を含む。
【０１４１】
さらに好ましい実施形態においては、この組み換えＭＶＡ／ＦＰＶベクターは、フィロウイルスエンベロープグリコプロテインの抗原決定基をコードする２個の異種ヌクレオチド配列、およびさらに別のフィロウイルスタンパク質の抗原決定基をコードする少なくとも１個の異種ヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態においては、フィロウイルスエンベロープグリコプロテインの抗原決定基をコードする第１の異種ヌクレオチド配列がＧＰ−ＭＡＲＶをコードし、フィロウイルスエンベロープグリコプロテインの抗原決定基をコードする第２の異種ヌクレオチド配列がＧＰ−ＥＢＯＶをコードする。本発明によるさらに好ましい実施形態においては、組み換えＭＶＡ／ＦＰＶベクターは、フィロウイルスエンベロープグリコプロテインの抗原決定基をコードする３個の異種ヌクレオチド配列、およびさらに別のフィロウイルスタンパク質の抗原決定基をコードする少なくとも１個の異種ヌクレオチド配列を含む。好ましくは、フィロウイルスエンベロープグリコプロテインの抗原決定基をコードする第１の異種ヌクレオチド配列がＧＰ−ＭＡＲＶをコードし、フィロウイルスエンベロープグリコプロテインの抗原決定基をコードする第２の異種ヌクレオチド配列がＧＰ−ＥＢＯＶをコードし、そしてフィロウイルスエンベロープグリコプロテインの抗原決定基をコードする第３の異種ヌクレオチド配列が、第２の異種ヌクレオチド配列によってコードされたＧＰ−ＥＢＯＶとは異なる、ＥＢＯＶ株または分離株から誘導したＧＰ−ＥＢＯＶをコードする。したがって、フィロウイルスエンベロープグリコプロテインの抗原決定基をコードする１個の異種ヌクレオチド配列は、ＧＰ−ＳＥＢＯＶーグルおよび他の１個のＧＰ−ＺＥＢＯＶ−メイインガをコードしうる。
【０１４２】
別の実施形態においては、組み換えＭＶＡ／ＦＰＶベクターは、ＥＢＯＶ株または分離株からのＧＰ−ＥＢＯＶの抗原決定基をコードする２個の異種ヌクレオチド配列、およびＭＡＲＶ株または分離株からのＧＰ−ＭＡＲＶの抗原決定基をコードする２個の異種ヌクレオチド配列を含み、好ましくは、ＭＡＲＶ株はＭＡＲＶ−アンゴラおよびＭＡＲＶ−ムソケであり、このＥＢＯＶ株はＺＥＢＯＶおよび／またはＳＥＢＯＶ、好ましくはＺＥＢＯＶ−メイインガおよびＳＥＢＯＶ−グルである。もちろん、すでに上述のように、さらに別のフィロウイルスタンパク質の抗原決定基をコードするこのさらに別のヌクレオチド配列は、核タンパク質（ＮＰ）、ビリオンタンパク質３５（ＶＰ３５）、ビリオンタンパク質４０（ＶＰ４０）、ビリオンタンパク質３０（ＶＰ３０）、ビリオンタンパク質２４（ＶＰ２４）、およびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼタンパク質（Ｌ）からなる群から選択されるフィロウイルスタンパク質もコードでき、すでに上で示したように、このフィロウイルスタンパク質はこれらの異なる株からも誘導しうる。
【０１４３】
本発明のさらに好ましい実施形態による、組み換えＭＶＡ／ＦＰＶベクターは、ＧＰ−ＭＡＲＶおよびＧＰ−ＥＢＯＶのフィロウイルスエンベロープグリコプロテインの抗原決定基をコードする２個の異種ヌクレオチド配列、およびＶＰ４０の抗原決定基をコードする第３の異種ヌクレオチド配列を含む。そのようなＶＰ４０は、以上または以下で説明したような、いずれのＶＰ４０でもありうる。したがって、フィロウイルスエンベロープグリコプロテインの抗原決定基をコードする１個の異種ヌクレオチド配列は、ＧＰ−ＳＥＢＯＶ−グルをコードでき、他方の１個のＧＰ−ＺＥＢＯＶ−メイインガおよび第３の異種ヌクレオチド配列は、フィロウイルスタンパク質ＶＰ４０−ＺＥＢＯＶ、ＶＰ４０−ＳＥＢＯＶまたはＶＰ４０−ＭＡＲＶ、好ましくはＶＰ４０−ＺＥＢＯＶ−メイインガまたはＶＰ４０−ＭＡＲＶ−ムソケの抗原決定基をコードしうる。
【０１４４】
さらに好ましい実施形態においては、組み換えＭＶＡ／ＦＰＶベクターは、フィロウイルスエンベロープグリコプロテインであるＧＰ−ＥＢＯＶ、好ましくはＧＰ−ＺＥＢＯＶおよび／またはＧＰ−ＳＥＢＯＶ、より好ましくはＧＰ−ＺＥＢＯＶ−メイインガおよびＧＰ−ＳＥＢＯＶ−グル、ＧＰ−ＭＡＲＶの１個のフィロウイルスエンベロープグリコプロテイン、好ましくはＧＰ−ＭＡＲＶ−ムソケまたはＧＰ−ＭＡＲＶ−アンゴラおよびＮＰ−ＥＢＯＶ−ＣｄＩ、ＮＰ−ＺＥＢＯＶおよびＮＰ−ＭＡＲＶ、好ましくはＮＰ−ＭＡＲＶ−ムソケまたはＮＰ−ＭＡＲＶ−アンゴラの群から好ましく選択される少なくとも１個のフィロウイルス核タンパク質、の抗原決定基をコードする２個の異種ヌクレオチド配列を含む。
【０１４５】
ＭＶＡまたはＦＰＶへの組み込み部位
【０１４６】
さらに別のフィロウイルスタンパク質をコードする少なくとも１個の異種ヌクレオチド配列を任意に、さらに含むフィロウイルスグリコプロテインの抗原決定基をコードする異種ヌクレオチド配列は、ＭＶＡの１個またはそれ以上の遺伝子間領域（ＩＧＲ）の中へ挿入しうる。ある特定の実施形態においては、このＩＧＲは、ＩＧＲ０７／０８、ＩＧＲ４４／４５、ＩＧＲ６４／６５、ＩＧＲ８８／８９、ＩＧＲ１３６／１３７、およびＩＧＲ１４８／１４９から選択される。ある特定の実施形態においては、組み換えＭＶＡの５個未満、４個未満、３個未満、または２個未満のＩＧＲが、フィロウイルスエンベロープグリコプロテインおよび／またはさらに別のフィロウイルスタンパク質の抗原決定基をコードする異種ヌクレオチド配列を含む。異種ヌクレオチド配列は、自然に生じる１個またはそれ以上の欠失部位の中へ、特にＭＶＡゲノムの主たる欠失部位Ｉ，ＩＩ，ＩＩＩ，ＩＶ，Ｖ，またはＶＩの中へ追加的または代替的に挿入されうる。ある特定の実施形態においては、組み換えＭＶＡの５個未満、４個未満、３個未満、または２個未満の少ない自然に生じる欠失部位は、フィロウイルスエンベロープグリコプロテインおよび／またはさらに別のフィロウイルスタンパク質の抗原決定基をコードする異種ヌクレオチド配列を含む。
【０１４７】
フィロウイルスタンパク質の抗原決定基をコードする異種ヌクレオチド配列を含むＭＶＡの挿入部位の数は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、またはそれ以上でありうる。ある特定の実施形態においては、この異種ヌクレオチド配列は、４個、３個、２個、またはそれよりも少ない挿入部位に挿入される。好ましくは、２個の挿入部位を使用する。ある特定の実施形態においては、３個の挿入部位を使用する。好ましくは、この組み換えＭＶＡは、２個または３個の挿入部位に挿入された、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、または７個の遺伝子を含む。
【０１４８】
さらに別のフィロウイルスタンパク質をコードする少なくとも１個の異種ヌクレオチド配列を任意に、さらに含むフィロウイルスグリコプロテインの抗原決定基をコードする異種ヌクレオチド配列は、ＦＰＶの１個またはそれ以上の遺伝子間領域（ＩＧＲ）の中へ挿入しうる。好ましい実施形態においては、ＩＧＲは、ゲノムの１．３−ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ断片のＯＲＦ７および９の間に位置している（Ｄｒｉｌｌｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６０：２０３−２０９（１９８７）（ＵＳ５，１８０，６７５）および  Ｓｐｅｈｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．  ６４：５２７−５３３（１９９０）参照）。ある特定の実施形態においては、異種ヌクレオチド配列は、本明細書に参照することによって組み込まれるＥＰ  ０  ５３８  ４９６  Ａ１およびＷＯ  ０５／０４８９５７に記載されているような、鶏痘の挿入部位に挿入することができる。本発明のさらに好ましい鶏痘挿入部位は、ＬＵＳ挿入部位，ＦＰ１４挿入部位，および４３Ｋ挿入部位である。これらの挿入部位は、時に、ＦＰＮ００６／ＦＰＮ００７（ＬＵＳ挿入部位），ＦＰＮ２５４／ＦＰＮ２５５（ＬＵＳ挿入部位），ＦＰＶ０６０／ＦＰＶ０６１（ＦＰ１４挿入部位），およびＦＰＶ１０７／ＦＰＶ１０８（４３Ｋ挿入部位）ともいわれる。
【０１４９】
１つの好ましい実施形態においては、鶏痘の挿入部位はＬＵＳ挿入部位である。鶏痘ウイルスゲノムのそれぞれの末端には、２本の長い独特な配列（ＬＵＳ）があり（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号：ＡＦ  １９８１００．１）、したがって、それぞれのゲノムには２個のＬＵＳ挿入部位がある。このゲノムの左の末端のＬＵＳ挿入部位は、ＦＰＶ００６の３’およびＦＰＶ００７  １２５Ｌの５’にあり、好ましくは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ  １９８１００．１に注釈がされているように、鶏痘ゲノム配列中の７４７０位と７４７５位の間である。このゲノムの右の末端のＬＵＳ挿入部位は、ＦＰＶ２５４の３’およびＦＰＶ２５５の５’にあり、好ましくは、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ  １９８１００．１の鶏痘ゲノム配列中の２８１０６５位と２８１０７０位の間である。１つの実施形態においては、この異種ヌクレオチド配列は、ヌクレオチド２８１０６５位と２８１０７０位内のいずれの位置にも挿入できる。
【０１５０】
別の好ましい実施形態においては、鶏痘の挿入部位はＦＰ１４挿入部位である。この部位は、鶏痘ゲノム配列ゲノムのＦＰＶ０６０の３’およびＦＰＶ０６１の５’にあり、好ましくは、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ  １９８１００．１の鶏痘ゲノムの６７０８０位と６７０９７位の間である。１つの実施形態においては、ＤＮＡ配列の６７０８０位と６７０９７位の間のヌクレオチドは、組み換えウイルス中で欠失され、そして興味のある配列を示す定義された挿入遺伝子と置き換える。１つの実施形態においては、ＦＰ１４挿入部位は、ＦＰＶ０６０遺伝子の相同分子種と、例えば、ＡＦ  １９８１００．１のＦＰＶ０６１の相同分子種の間にある。「ＦＰＶ０６０、ＦＰＶ０６１、ＦＰＶ２５４」等の用語は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ  １９８１００．１で注釈されているように、５’から３’まで番号が付されたそれぞれの遺伝子の対応するコード配列（つまり、ＣＤＳ）の位置を指す。好ましい実施形態においては、ＦＰ１４挿入部位は、（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ  １９８１００．１で注釈されているように、ＩＧＲ６０／６１挿入部位としても言及される）鶏痘ゲノム配列中の６７０９１位および６７０９２位の間にある。
【０１５１】
別の好ましい実施形態においては、鶏痘の挿入部位は４３Ｋ挿入部位と命名されている。この部位は、ＦＰＶ１０７の３’およびＦＰＶ１０８の５’、好ましくは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ  １９８１００．１に注釈がされているように、鶏痘ゲノム配列の１２８１７８位にある。
【０１５２】
好ましい実施形態においては、この組み込み部位はＦＰ１４（ＩＧＲ６０／６１）および／またはＢａｍＨＩ  Ｊ領域である。ＢａｍＨＩ  Ｊ領域は、本明細書に参照することによって組み込まれる、Ｊｅｎｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１），Ａｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ７（１２）：９９１：９９８にさらに記載されている。
【０１５３】
ある特定の実施形態においては、このＩＧＲはＩＧＲ  ＢａｍＨＩ  Ｊ  ＦＰＶである。
【０１５４】
フィロウイルスタンパク質の抗原決定基をコードする異種ヌクレオチド配列を含むＦＰＶの挿入部位の数は、１個または２個でありうる。好ましくは、２個の挿入部位を使用する。別の好ましい実施形態においては、この組み換えＦＰＶは、１個または２個の挿入部位に挿入された、少なくとも１個、２個、３個、４個または５個の遺伝子を含む。
【０１５５】
本明細書で提供される組み換えＭＶＡ／ＦＰＶウイルスは、当該技術分野で周知の日常的な方法によって発生させることができる。組み換えポックスウイルスを得る、または外因性コード配列をポックスウイルスゲノムに挿入する方法は、当業者に周知である。例えば、ＤＮＡのクローン作成、ＤＮＡおよびＲＮＡの単離、ウエスタンブロット分析、ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲ増幅の諸技術のような標準的な分子生物学の技術の方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （２ｎｄ  Ｅｄ．）  （Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９））に記載されており、そしてウイルスの取り扱いおよび操作の技術は、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ（Ｂ．Ｗ．Ｊ．  Ｍａｈｙ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９６）に記載されている。同様に、ＭＶＡの取り扱い、操作および遺伝子工学の技術およびノウハウは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （Ａ．Ｊ．  Ｄａｖｉｓｏｎ  ＆  Ｒ．Ｍ．  Ｅｌｌｉｏｔｔ  （Ｅｄｓ．），  Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  ＵＫ  （１９９３）（例えば、Ｃｈａｐｔｅｒ  ９：  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｂｙ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ））、およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎ，  Ｉｎｃ．  （１９９８）  （例えば、Ｃｈａｐｔｅｒ  １６，  Ｓｅｃｔｉｏｎ  ＩＶ：  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ参照））に記載されている。
【０１５６】
本明細書で開示される種々の組み換えＭＶＡ／ＦＰＶの生成のためには、様々な方法を適用しうる。ウイルスの中に挿入するＤＮＡ配列は、ＭＶＡまたはＦＰＶのＤＮＡの切片と同種のＤＮＡが挿入された大腸菌プラスミド構成体の中に置くことができる。これとは別に、挿入されるＤＮＡ配列はプロモーターに結合させることができる。このプロモーターと遺伝子の結合は、このプロモーターと遺伝子の結合が、非本質的な遺伝子座を含むＭＶＡまたはＦＰＶ  ＤＮＡの領域の側面に位置するＤＮＡ配列と同種のＤＮＡによって両末端が側面に位置するように、このプラスミド構成体の中に配置できる。結果として生じるプラスミド構成体は、大腸菌バクテリアの中で増殖によって増幅させ、そして単離できる。挿入するＤＮＡ遺伝子配列を含む単離したプラスミドは、培養がＭＶＡで感染するのと同時に、例えば、鶏胚線維芽細胞（ＣＥＦ）の細胞培養ｎの中へ遺伝子導入できる。プラスミド中の同種のＭＶＡ  ＤＮＡとウイルスゲノムのそれぞれの間の組み換えは、異質のＤＮＡ配列の存在によって改変したＭＶＡを発生させることができる。
【０１５７】
好ましい実施形態によれば、例えば、ＣＥＦ細胞のような適切な細胞培養は、ポックスウイルスを用いて感染させることができる。この感染した細胞は、次に、好ましくは、ポックスウイルス発現制御要素の転写制御の下で、異質のまたは異種の１個または複数の遺伝子を含む第１のプラスミドベクターを用いて遺伝子導入できる。上で説明したように、このプラスミドベクターは、また、外因性配列をポックスウイルスゲノムの選択した部分に挿入することを導くことができる配列を含む。任意で、このプラスミドベクターは、また、ポックスウイルスプロモーターに動作可能に結合させたマーカーおよび／または選択遺伝子を含むカセットを含む。適切なマーカーまたは選択遺伝子は、例えば、緑色蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、ネオマイシン−ホスホリボシルトランスフェラーゼまたはその他のマーカーをコードする遺伝子である。選択またはマーカーカセットの使用は、発生した組み換えポックスウイルスの特定および単離を簡素化する。しかし、組み換えポックスウイルスは、ＰＣＲ技術によっても特定できる。次に、さらに別の細胞を、上記のように、得られた組み換えポックスウイルスを用いて感染させ、第２の異質または異種の１個または複数の遺伝子を含む第２のベクターを用いて遺伝子導入することができる。この遺伝子をポックスウイルスゲノムの異なる挿入部位に導入する場合、第２のベクターもポックスウイルス同種配列で異なり、この第２の異質の１個または複数の遺伝子をポックスウイルスのゲノムの中へ組み込むことを導く。同種の組み換えが起こった後、２個またはそれ以上の異質または異種の遺伝子を含む組み換えウイルスを単離することができる。追加の異質の遺伝子を組み換えウイルスの中へ導入するためには、感染のために以前のステップで単離した組み換えウイルスを使用し、および遺伝子導入のためのさらに別の異質の１個または複数の遺伝子を含むさらに別のベクターを使用して、感染および遺伝子導入のステップを繰り返すことができる。
【０１５８】
あるいは、上で説明した感染および遺伝子導入のステップは取り換え可能である。つまり、適切な細胞は、異質の遺伝子を含むプラスミドベクターによって最初に遺伝子導入され、その後、ポックスウイルスを用いて感染させうる。さらなる代案として、それぞれの異質の遺伝子を異なるウイルスに導入し、得られたすべての組み換えウイルスを用いて細胞を共感染させ、そしてすべての異質の遺伝子を含む組み換え体をスクリーニングすることも可能である。第３の代案は、インビトロでのＤＮＡゲノムと異質の配列との連結反応、およびヘルパーウイルスを使用した再結合したワクシニアウイルスＤＮＡゲノムの再構成である。第４の代案は、細菌性の人工染色体（ＢＡＣ）としてクローンされたワクシニアウイルスゲノムと、このワクシニアウイルスゲノムの望ましい組み込み部位の側面にある配列と同種のＤＮＡ配列が側面にある線形異質配列との間の大腸菌または別の細菌の種の同種の組み換えである。
【０１５９】
異種フィロウイルス遺伝子の発現
【０１６０】
フィロウイルスタンパク質の抗原決定基をコードする異種ヌクレオチド配列は、単一の転写単位として発現できる。例えば、フィロウイルスタンパク質の抗原決定基をコードする異種ヌクレオチド配列は、ポックスウイルス、例えば、ワクシニアウイルスプロモーターに操作して結合させ、および／またはポックスウイルス、例えば、ワクシニアウイルス転写ターミネーターに結合させることができる。
【０１６１】
ある特定の実施形態においては、「転写単位」は、ＭＶＡまたはＦＰＶゲノムの挿入部位の中へそれ自体が挿入される。ある特定の実施形態においては、「転写単位」は、ＭＶＡまたはＦＰＶゲノムの挿入部位の中へ１個または複数の他の転写単位と共に挿入される。「転写単位」は、ＭＶＡまたはＦＰＶゲノムの中で自然には存在せず（つまり、それは異種、外因性または異質である）、感染した細胞で転写をすることができる。
【０１６２】
好ましくは、組み換えＭＶＡ／ＦＰＶは、ＭＶＡまたはＦＰＶゲノムの中へ挿入された１個、２個、３個、４個、５個またはそれ以上の転写単位を含む。ある特定の実施形態においては、この組み換えＭＶＡ／ＦＰＶは、１個、２個、３個、４個、５個またはそれ以上の転写単位によってコードされたフィロウイルスタンパク質の抗原決定基をコードする異種ヌクレオチド配列を安定的に発現する。ある特定の実施形態においては、組み換えＭＶＡ／ＦＰＶは、ＭＶＡ／ＦＰＶゲノムの１個、２個、３個、またはそれ以上の挿入部位で、ＭＶＡ／ＦＰＶゲノムの中へ挿入された２個、３個、４個、５個、またはそれ以上の転写単位を含む。
【０１６３】
ある特定の実施形態においては、フィロウイルスタンパク質の抗原決定基をコードする異種ヌクレオチド配列の１個、それ以上、またはすべての発現は、１個またはそれ以上のポックスウイルスプロモーターの制御の下にある。ある特定の実施形態においては、ポックスウイルスプロモーターは、Ｐｒ７．５プロモーター、ハイブリッド初期／後期プロモーター、ＰｒＳプロモーター、ＰｒＳ５Ｅプロモーター、合成または天然の初期または後期プロモーター、または牛痘ウイルスＡＴＩプロモーターである。適切なプロモーターは、参照することによって完全に本明細書に組み込まれる、ＷＯ  ２０１０／０６０６３２、ＷＯ  ２０１０／１０２８２２、ＷＯ  ２０１３／１８９６１１およびＷＯ  ２０１４／０６３８３２にさらに記載されている。ある特定の実施形態においては、ポックスウイルスプロモーターは、ＰｒＳプロモーター（配列番号２３）、ＰｒＳ５Ｅプロモーター（配列番号２４）、Ｐｒ７．５（配列番号２５）、ＰｒＬＥ１プロモーター（配列番号２７）、Ｐｒ１３．５長プロモーター（配列番号３５）およびＦＰＶー４０Ｋプロモーター（配列番号２６）からなる群から選択され、より好ましくは、ＰｒＳプロモーター（配列番号２３）、ＰｒＳ５Ｅプロモーター（配列番号２４）、Ｐｒ７．５（配列番号２５）およびＰｒＬＥ１プロモーター（配列番号２７）からなる群から選択される。
【０１６４】
ある特定の実施形態においては、フィロウイルスタンパク質の抗原決定基をコードするヌクレオチド配列、好ましくはＺＥＢＯＶ、ＳＥＢＯＶ、ＥＢＯＶ−ＣｄＩ，ＭＡＲＶおよびＮＰ−ＺＥＢＯＶタンパク質、より好ましくはＧＰ−ＺＥＢＯＶ−メイインガ、ＧＰ−ＳＥＢＯＶ−グル、ＧＰ−ＭＡＲＶおよびＮＰ−ＺＥＢＯＶ、最も好ましくはＧＰ−ＭＡＲＶ−ムソケまたはＧＰ−ＭＡＲＶ−アンゴラは、ＰｒＳ、ＰｒＬＥ１およびＰｒ７．５からなる群から選択されるプロモーターの制御の下にある。好ましい実施形態においては、フィロウイルスタンパク質の抗原決定基をコードするヌクレオチド配列のＧＰ−ＳＥＢＯＶおよびＧＰ−ＭＡＲＶ−ムソケはＰｒＳプロモーター（例えば、配列番号２３）の制御の下で発現し、ＮＰ−ＥＢＯＶ−ＣｄＩはＰｒＬＥ１または改変ＰｒＬＥ１プロモーター（例えば、配列番号２７および配列番号３２）の制御の下で発現し、そしてＧＰ−ＺＥＢＯＶ−メイインガはＰｒ７．５プロモーター（例えば、配列番号２５）の制御の下で発現する。
【０１６５】
別の好ましい実施形態においては、任意の実施形態のＦＰＶのフィロウイルスタンパク質の抗原決定基をコードするヌクレオチド配列は、好ましくは配列番号２６を含む、または有するプロモーターの制御の下にある。
【０１６６】
フィロウイルスワクチンおよび薬剤組成物
【０１６７】
本明細書に記載された組み換えＭＶＡウイルスは、非常に複製が制限されており、したがって非常に弱毒化されているので、これらはヒト、さらには免疫力が低下したヒトさえも含む広範な哺乳動物の治療のための理想的な候補である。したがって、本明細書は、ヒトを含む生きた動物の体に免疫反応を誘導するための薬剤組成物およびワクチンを提供する。本明細書はさらに、フィロウイルスに起因する疾患の治療および／または予防に使用するためのフィロウイルスグリコプロテインの抗原決定基をコードするヌクレオチド配列を含む組み換えＭＶＡベクターを提供する。
【０１６８】
ワクチンは、本明細書に記載された、１０４から１０９ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０５から５×１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０６から１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、または１０７から１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌの濃度範囲の溶液中で製剤された、いずれかの組み換えＭＶＡウイルスを好ましく含む。ヒトに対する好ましいワクチンの投与量は、１０６ＴＣＩＤ５０、１０７ＴＣＩＤ５０、または１０８ＴＣＩＤ５０の投与量を含む、１０６から１０９ＴＣＩＤ５０の間で含む。
【０１６９】
本明細書が提供する薬剤組成物は、一般的に、１個またはそれ以上の医薬的に許容されるおよび／または承認される担体を含む。このような補助物質は、水、食塩水、グリセロール、エタノール、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質等でありうる。適切な担体は、典型的には、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグルコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸共重合体、脂質凝集体などのような大きな、ゆっくりと代謝する分子である。
【０１７０】
ワクチンの製剤のために、本明細書が提供する組み換えＭＶＡウイルスは、生理学的に許容できる形態に変換することができる。これは、Ｈ．Ｓｔｉｃｋｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｔｓｃｈ．  ｍｅｄ．Ｗｓｃｈｒ．９９：２３８６−２３９２（１９７４）に記載されているように、天然痘に対するワクチン接種のために使用されたポックスウイルスワクチンの製剤において、経験に基づいて行うことができる。
【０１７１】
例えば、精製されたウイルスは、約１０ｍＭトリス、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４中で製剤され、力価５×１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌで、−８０℃で保存できる。ワクチン注射の製剤のために、例えば、このウイルスの１０２〜１０８または１０２〜１０９個の粒子を、アンプル、好ましくはガラスのアンプル中で、２％のペプトンおよび１％のヒトアルブミンの存在下、１００ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で、凍結乾燥することができる。あるいは、このワクチン注射は、製剤中で、ウイルスの段階的凍結乾燥によって生成することができる。この製剤は、マンニトール、デキストラン、砂糖、グリシン、ラクトースまたはポリビニルピロリドンのような追加の添加剤、または酸化防止剤もしくは不活性ガス、安定剤もしくはインビボで投与するのに適した組み換えタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）のような他の補助剤を含みうる。次に、ガラスのアンプルを密閉し、数が月の間、４℃と室温の間で保存できる。しかし、必要がない限り、このアンプルを、好ましくは−２０℃  よりも低い温度で保存する。
【０１７２】
ワクチン接種または治療のために、この凍結乾燥物は、水溶液、好ましくは生理的食塩水またはトリス緩衝剤に溶解し、そして全身的または局所的のいずれによっても、つまり非経口、皮下、静脈内、筋肉内、鼻腔内その他熟練者に知られたいずれの投与経路によっても投与できる。投与の方法、投与量および投与回数は、知られた方法によって当業者により最適化できる。しかし、最も一般的には、患者は第１回目のワクチン注射の約１か月から６週間の後に、第２回目の注射でワクチン接種する。
【０１７３】
同種または異種プライム−ブーストを使用する混合ワクチン投薬計画
【０１７４】
本明細書に記載された混合ワクチンおよび方法は、同種プライム−ブースト投薬計画の一部としても使用しうる。同種プライム−ブーストでは、第１回のプライミングワクチン接種の後、１回またはそれ以上の後続のブースティングワクチン接種を行う。ブースティングワクチン接種は、第１回のワクチン接種で使用したのと同じ組み換えポックスウイルスを投与して、第１回のワクチン接種によって発生した免疫反応を強化するように構成されている。
【０１７５】
１つの典型的な実施形態においては、同種プライム−ブースト投薬計画を採用でき、そこでは、本明細書において定義されたＭＶＡウイルスベクターを第１回の投与で投与する。本明細書で定義されるＭＶＡウイルスベクターの１回またはそれ以上の後続の投与は、第１回の投与が提供する免疫反応を強化するために行われうる。好ましくは、この１回またはそれ以上の抗原決定基は、第１回の投与の抗原決定基と同じまたは類似している。
【０１７６】
本発明によるＭＶＡおよびＦＰＶ組み換えウイルスベクターは、異種プライム−ブースト投薬計画においても使用できる。そこでは、１回またはそれ以上の初期のプライムワクチン接種は、本明細書で定義されるように、ＭＶＡまたはＦＰＶベクターのいずれかを用いて行われ、そして１回またはそれ以上の後続のブースティングワクチン接種は、プライムワクチン接種で使用しないポックスウイルスベクターを用いて行われる。例えば、本明細書で定義されるＭＶＡベクターがプライム−ブーストで投与された場合は、後続のブースティングワクチン接種はＦＰＶベクターによることになり、逆もまた同様である。
【０１７７】
好ましい実施形態においては、プライムワクチン接種はＭＶＡベクターを用いて行い、そしてブースティングワクチン接種はＦＰＶベクターを用いて行う。したがって、本発明の１つの態様は、
（ａ）医薬的に許容される担体と共に、少なくとも１個のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを、免疫学的に有効な量で含む第１の組成物、および
（ｂ）医薬的に許容される担体と共に、第１のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含む鶏痘ベクターを、免疫学的に有効な量で含む第２の組成物
を含み、
前記第１の組成物はプライミング組成物であり、前記第２の組成物はブースティング組成物であり、好ましくは、前記ブースティング組成物は前記ブースティング組成物のベクターの２回またはそれ以上の投与量を含む混合ワクチンに関する。
【０１７８】
組み換えＭＶＡおよびＦＰＶウイルスを含むワクチンおよびキット
【０１７９】
本明細書は、本明細書に記載されている１個またはそれ以上のいずれの組み換えＦＰＶおよび／またはＭＶＡを含むワクチンおよびキットも提供する。キットは、フィロウイルス感染の危険がある対象に対する組み換えＭＶＡおよびＦＰＶの投与に関する使用説明書と共に、組み換えＭＶＡまたはＦＰＶの１個または複数の容器またはバイアルを含みうる。ある特定の実施形態においては、対象はヒトである。ある特定の実施形態においては、使用説明書は、組み換えＭＶＡを対象に対して１回の投与、または複数（つまり、２回、３回、４回等）の投与で投与することを示す。ある特定の実施形態においては、この使用説明書は、この組み換えＭＶＡまたはＦＰＶウイルスを、このウイルスの投薬を受けていない、または受けている対象に対して、第１回の（プライミング）および第２回の（ブースティング）投与として投与することを示す。好ましくは、キットは、本明細書で記載されているように、第１のバイアル／容器には第１回の接種（プライミング接種）のための組み換えＭＶＡを、そして第２および／またはさらなるバイアル／容器には少なくとも第２および／または第３および／またはさらなる接種（ブースティング接種）のための組み換えＭＶＡを含むプライム−ブースト免疫付与のための少なくとも２個のバイアルを含む。
【０１８０】
好ましい実施形態においては、本明細書が提供するワクチンおよびキットは、第２のフィロウイルスサブタイプ、第３のフィロウイルスサブタイプまたは少なくとも４個のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを含む第１の組成物を含む。
【０１８１】
好ましい実施形態においては、本明細書が提供するワクチンおよびキットは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２０、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３４および配列番号３７からなる群から選択される抗原タンパク質をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを第１の組成物中に含む。
【０１８２】
さらなる実施形態においては、本明細書が提供するワクチンおよびキットは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２０、配列番号２９および配列番号３１、好ましくは配列番号６、配列番号２０、配列番号２９および配列番号３１を有する群から選択される抗原タンパク質をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを第１の組成物中に含む。
【０１８３】
さらなる実施形態においては、本明細書が提供するワクチンおよびキットは、少なくとの４個のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを含む第１の組成物を含み、好ましくは、この４個の異なるフィロウイルスサブタイプは配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２０、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３４および配列番号３７を有する群から選択される。
【０１８４】
さらに好ましい実施形態においては、本明細書が提供するワクチンおよびキットは、少なくとも１個のフィロウイルスサブタイプに対して防御免疫反応を発生させるのに使用され、第１の組成物は前記免疫反応をプライミングするのに使用され、第２の組成物は前記免疫反応をブースティングするのに使用され、または少なくとも１個のフィロウイルスサブタイプに対して防御免疫反応を発生させるのに使用され、第２の組成物は前記免疫反応をプライミングするのに使用され、そして第１の組成物は前記免疫反応をブースティングするのに使用される。本明細書が提供するワクチンおよびキットのいずれにおいても、ブースティング組成物は、ブースティング組成物のベクターの２回またはそれ以上の投与量を含むことができる。
【０１８５】
前に、上で説明したように、本発明は、さらに、２個の異なる非複製ウイルスベクターを使用した異種ワクチン接種投与法に関する。
【０１８６】
異種ワクチンプログラムのために、本発明は、混合ワクチン混合ワクチンおよび／またはワクチン接種キットを提供し、キットは、
（ａ）医薬的に許容される担体と共に、少なくとも２個のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを、免疫学的に有効な量で含む第１の組成物、および
（ｂ）医薬的に許容される担体と共に、第１のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含む鶏痘ベクターを、免疫学的に有効な量で含む第２の組成物
を含み、
前記組成物の一方はプライミング組成物であり、他方の組成物はブースティング組成物である。
【０１８７】
本発明は、さらに、混合ワクチンおよび／またはワクチン接種キットを提供し、そのキットは、
（ａ）医薬的に許容される担体と共に、少なくとも２個のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを、免疫学的に有効な量で含む第１の組成物、および
（ｂ）医薬的に許容される担体と共に、第１のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを、免疫学的に有効な量で含む第２の組成物
を含み、
前記組成物の一方はプライミング組成物であり、他方の組成物はブースティング組成物である。
【０１８８】
この実施形態においては、この混合ワクチンおよび／またはキットは、本明細書で記載されているように、第１のバイアルまたは容器には第１回の接種（プライミング接種）のための組み換えＭＶＡ／ＦＰＶを、そして第２および／またはさらなるバイアルまたは容器には少なくとも第２および／または第３および／またはさらなる接種（ブースティング接種）のための組み換えＭＶＡ／ＦＰＶを含むプライム−ブースト免疫付与のための少なくとも２個のバイアルを含む。
【０１８９】
混合ワクチンおよび／またはキットは、フィロウイルス感染の危険がある対象に対する組み換えＭＶＡおよびＦＰＶの投与に関する使用説明書と共に、組み換えＭＶＡまたはＦＰＶの複数の容器またはバイアルを含みうる。ある特定の実施形態においては、対象はヒトである。ある特定の実施形態においては、使用説明書は、組み換えＭＶＡ／ＦＰＶを対象に対して１回の投与、または複数（つまり、２回、３回、４回等）の投与で投与することを示す。ある特定の実施形態においては、使用説明書は、この組み換えＭＶＡ／ＦＰＶウイルスを、このウイルスの投薬を受けていない、または受けている対象に対して、第１回の（プライミング）および第２回の（ブースティング）投与として投与することを示す。
【０１９０】
本発明のいずれの混合ワクチン、ワクチン接種キットおよび／またはいずれの異種ワクチンプログラムの第１および／または第２の組成物、またはＭＶＡおよび／またはＦＰＶも、本明細書が記載する、または「組み換えＭＶＡおよびＦＰＶ」としてさらに定義する、いずれのＭＶＡおよび／またはＦＰＶベクター、およびこれらのいずれの組み合わせを含むことができる。
【０１９１】
好ましい実施形態においては、本明細書が提供する混合ワクチンは、第２のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質、第３のフィロウイルスサブタイプの抗原決定基、４個のフィロウイルスサブタイプの抗原決定基、または少なくとも４個のフィロウイルスサブタイプの抗原決定基をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを含む第１の組成物を含む。
【０１９２】
別の実施形態においては、本明細書が提供するこの混合ワクチンは、エボラウイルス（ＥＢＯＶ）またはマールブルグウイルス（ＭＡＲＶ）から選択されるフィロウイルスサブタイプを含む。
【０１９３】
別の実施形態においては、本明細書が提供するこの混合ワクチンは、ザイールエボラウイルス（ＺＥＢＯＶ）、スーダンエボラウイルス（ＳＥＢＯＶ）、コートジボワールエボラウイルス（ＥＢＯＶ−ＣｄＩ）、レストンエボラウイルス（ＥＢＯＶ−Ｒｅｓｔｏｎ）およびブンディブギョエボラウイルス（ＢＥＢＯＶ）からなる群から選択される１個またはそれ以上のＥＢＯＶ−サブタイプからの抗原決定基を含む。
【０１９４】
別の実施形態においては、本明細書で記載される混合ワクチンは、フィロウイルスタンパク質の抗原決定基を含み、エンベロープグリコプロテイン（ＧＰ）、核タンパク質（ＮＰ）、ビリオンタンパク質３５（ＶＰ３５）、ビリオンタンパク質４０（ＶＰ４０）、ビリオンタンパク質３０（ＶＰ３０）、ビリオンタンパク質２４（ＶＰ２４）、およびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼタンパク質（Ｌ）からなる群から選択される。
【０１９５】
さらに好ましい実施形態においては、本明細書が提供する混合ワクチンは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２０、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３４および配列番号３７からなる群から選択される抗原タンパク質をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを第１の組成物中に含む。
【０１９６】
さらなる実施形態においては、本明細書が提供する混合ワクチンは、少なくとの４個のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを含む第１の組成物を含み、好ましくは、この４個の異なるフィロウイルスサブタイプは配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２０、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３４および配列番号３７を有する群から選択される。
【０１９７】
さらに好ましい実施形態においては、本明細書が提供する混合ワクチンは、配列番号６、配列番号２０、配列番号２９および配列番号３１を有する群から選択される４個の異なるフィロウイルスサブタイプからの抗原タンパク質をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを含む第１の組成物を含む。
【０１９８】
別の実施形態においては、本明細書が提供するこの混合ワクチンは、少なくとも１個のフィロウイルスサブタイプ、好ましくは少なくとも２個、より好ましくは少なくとも４個のフィロウイルスサブタイプに対して防御免疫反応を発生させるために使用される。
【０１９９】
別の実施形態においては、本発明は、防御免疫反応を発生させるための薬剤またはワクチンとしての使用のための、または少なくとも１個のフィロウイルスサブタイプ、少なくとも２個のフィロウイルスサブタイプ、少なくとも３個または少なくとも４個のフィロウイルスサブタイプに対して強化された免疫反応を誘導するための、いずれかの実施形態の混合ワクチンまたは組み換えＭＶＡに関する。ＭＶＡは、治療する対象にフィロウイルス様粒子を生成することができ、好ましくは、ＭＶＡは、治療する対象にフィロウイルス様粒子を生成している。
【０２００】
組み換えＭＶＡまたはＦＰＶウイルスの方法および使用
【０２０１】
本明細書は、さらに、対象動物に免疫を付与する方法として使用するための、または対象の免疫反応に影響を及ぼすための方法および／または本明細書が記載するいずれの組み換えＭＶＡまたはＦＰＶを提供する。本明細書はさらには、対象動物に免疫を付与するための医薬または薬剤の製剤のための、特に、対象のフィロウイルスに起因する病気の治療および／または予防のための医薬またはワクチンの製剤のための組み換えＭＶＡまたはＦＰＶの使用を取り扱う。本明細書は、さらに、フィロウイルスに対して免疫反応をプライミングまたはブースティングするのに使用する、本明細書のいずれの実施形態の組み換えＭＶＡまたはＦＰＶを提供し、好ましくは、この組み換えＭＶＡおよび／または組み換えＦＰＶは、１回、２回、３回または４回投与される。
【０２０２】
さらには、本明細書は、フィロウイルス感染に対する強化された免疫反応を誘導するための医薬またはワクチンとして使用するいずれの実施形態に記載の混合ワクチンまたは組み換えＭＶＡを取り扱い、このＭＶＡは治療される対象にフィロウイルス様粒子を生成することができ、好ましくは、ＭＶＡは治療される対象にフィロウイルス様粒子を生成している。さらには、本明細書は、フィロウイルス病の治療および／または予防のための医薬またはワクチンとして使用するいずれの実施形態に記載の混合ワクチンまたは組み換えＭＶＡを取り扱い、このＭＶＡは治療される対象にフィロウイルス様粒子を生成することができ、好ましくは、ＭＶＡは治療される対象にフィロウイルス様粒子を生成している。
【０２０３】
したがって、１つの実施形態においては、本発明は、対象において、フィロウイルスに対して免疫反応を誘発する方法を提供するが、この方法は対象に、
（ａ）医薬的に許容される担体と共に、少なくとも２個のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを、免疫学的に有効な量で含む第１の組成物、および
（ｂ）医薬的に許容される担体と共に、第１のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含む鶏痘ベクターを、免疫学的に有効な量で含む第２の組成物
を投与することを含み、
前記組成物の一方はプライミング組成物であり、他方の組成物はブースティング組成物である。
【０２０４】
別の実施形態においては、本発明は、対象において、フィロウイルスに対して免疫反応を誘発する方法を提供するが、この方法は対象に、
（ａ）医薬的に許容される担体と共に、少なくとも２個のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを、免疫学的に有効な量で含む第１の組成物、および
（ｂ）医薬的に許容される担体と共に、第１のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを、免疫学的に有効な量で含む第２の組成物
を投与することを含み、
前記組成物の一方はプライミング組成物であり、他方の組成物はブースティング組成物である。
【０２０５】
別の実施形態においては、フィロウイルスに対して免疫反応を誘導する方法、対象動物に免疫を付与するための医薬の製剤のための、特に対象のフィロウイルスに起因する病気の治療および／または予防のための医薬またはワクチン、または本明細書に記載されたフィロウイルス感染に対する防御免疫反応を提供するために使用するいずれの実施形態の混合ワクチンの製剤のための、本明細書に記載された組み換えＭＶＡ／ＦＰＶの使用は、第２のフィロウイルスサブタイプ、第３のフィロウイルスサブタイプ、または少なくとも４個のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを含む第１の組成物を含む。
【０２０６】
別の実施形態においては、フィロウイルスに対して免疫反応を誘導する方法、対象動物に免疫を付与するための医薬の製剤のための、特に対象のフィロウイルスに起因する病気の治療および／または予防のための医薬またはワクチン、または本明細書に記載されたフィロウイルス感染に対する防御免疫反応を提供するために使用するいずれかの実施形態の混合ワクチンの製剤のための、本明細書に記載された組み換えＭＶＡ／ＦＰＶの使用は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２０、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３４および配列番号３７からなる群から選択される抗原タンパク質をコードする核酸を含む第１の組成物中のＭＶＡベクターを含む。
【０２０７】
さらなる実施形態においては、フィロウイルスに対して免疫反応を誘導する方法、対象動物に免疫を付与するための医薬の製剤のための、特に対象のフィロウイルスに起因する病気の治療および／または予防のための医薬またはワクチン、または本明細書に記載されたフィロウイルス感染に対する防御免疫反応を提供するために使用するいずれかの実施形態の混合ワクチンの製剤のための、本明細書に記載された組み換えＭＶＡ／ＦＰＶの使用は、少なくとも４個のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを含む第１の組成物を含み、この４個の異なるフィロウイルスサブタイプは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２０、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３４および配列番号３７を有する群から選択される。
【０２０８】
別の実施形態においては、本発明は、対象のフィロウイルス感染に対して防御免疫力および／または防御免疫反応を提供する方法を提供する。別の実施形態においては、本発明は、対象のフィロウイルス感染に対して防御免疫力および／または防御免疫反応を提供する方法を提供し、
（ａ）医薬的に許容される担体と共に、少なくとも２個のフィロウイルスサブタイプ、好ましくは、少なくとも３個または少なくとも４個の異なるフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを、免疫学的に有効な量で含む第１の組成物、および
（ｂ）医薬的に許容される担体と共に、第１のフィロウイルスサブタイプの抗原タンパク質をコードする核酸を含むＦＰＶベクターを、免疫学的に有効な量で含む第２の組成物、
前記組成物の一方はプライミング組成物であり、他方の組成物はブースティング組成物であり、好ましくは、第２の組成物がブースティング組成物であり、好ましくは、１回、２回、３回、または４回投与される。
【０２０９】
別の実施形態においては、いずれかの実施形態のフィロウイルス感染に対して防御免疫力および／または防御免疫反応を提供する方法は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２０、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３４および配列番号３７からなる群から選択される抗原タンパク質をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを第１の組成物中に含む。
【０２１０】
別の実施形態においては、いずれかの実施形態のフィロウイルス感染に対して防御免疫力および／または防御免疫反応を提供する方法は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２０、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３４および配列番号３７を有する４個の異なるフィロウイルスサブタイプからの抗原タンパク質をコードする核酸を含むＭＶＡベクターを第１の組成物中に含む。
【０２１１】
別の実施形態においては、本発明は、対象に、フィロウイルス様粒子を生成する方法、またはフィロウイルスに対して強化された免疫反応を誘導する方法を提供する。この方法は、いずれの実施形態の対象にフィロウイルス様粒子を生成することを含み、フィロウイルスＶＰ４０はザイールエボラウイルス（ＺＥＢＯＶ）、スーダンエボラウイルス（ＳＥＢＯＶ）、コートジボワールエボラウイルス（ＥＢＯＶ−ＣｄＩ）、レストンエボラウイルス（ＥＢＯＶ−レストン）およびブンディブギョエボラウイルス（ＢＥＢＯＶ）からなる群から選択され、このフィロウイルスＶＰ４０は１個またはそれ以上のＺＥＢＯＶ、ＳＥＢＯＶおよびＭＡＲＶから選択される。
【０２１２】
別の実施形態においては、本発明は、対象に、フィロウイルス様粒子を生成する方法、またはフィロウイルスに対して強化された免疫反応を誘導する方法を提供する。この方法は、いずれかの実施形態の対象においてフィロウイルス様粒子を生成することを含み、このフィロウイルスグリコプロテインおよびこのフィロウイルスＶＰ４０は同じフィロウイルス株から選択される。
【０２１３】
本発明の別の実施形態においては、本発明は、対象において、フィロウイルス様粒子を生成する方法、またはフィロウイルスに対して強化された免疫反応を誘導する方法を提供する。この方法は、いずれかの実施形態の対象においてフィロウイルス様粒子を生成することを含み、ＭＶＡベクターは、フィロウイルス核タンパク質（ＮＰ）をコードする核酸をさらに含み、好ましくは、このフィロウイルス核タンパク質およびこのフィロウイルスＶＰ４０は同じフィロウイルス株から誘導される。
【０２１４】
別の実施形態においては、上記のいずれの方法のフィロウイルス株も、ザイールメイインガ、ザイールキクウィト、ザイールガボン、コートジボワールエボラウイルス、スーダンボニフェス、スーダンマレオ、スーダングル、マールブルグラブン、マールブルグオゾリン、マールブルグラタイチャク、マールブルグムソケ、マールブルグアンゴラ、好ましくは、ザイールメイインガまたはコートジボワールエボラウイルスの群から選択される。好ましくは、このフィロウイルスＶＰ４０はザイールメイインガまたはマールブルグムソケの群から選択され、より好ましくは、このフィロウイルスＶＰ４０は配列番号３４のタンパク質配列をコードする核酸を含み、またはこのフィロウイルスＶＰ４０の抗原タンパク質をコードする核酸は配列番号３３を含む。
【０２１５】
本明細書で用いられる場合、「防御免疫力」または「防御免疫反応」という用語は、ワクチン接種をした対象が、それに対してワクチン接種を行った病原体を用いて感染を制御できることを意味する。通常、「防御免疫反応」を発現した対象は、ただの軽度から中程度の臨床的症状を発症するか、またはまったく症状を発症しないかである。通常、ある病原体に対して「防御免疫反応」または「防御免疫力」を有する対象は、この病原体の感染の結果として死ぬことはない。ある特定の実施形態においては、対象動物は哺乳動物である。この哺乳動物は、成牛、仔牛、特に幼牛、ネズミ、うさぎ、ぶた、マウスでありうるが、好ましくはヒトであり、この方法は、本明細書で記載される１個またはそれ以上の組み換えＭＶＡ／ＦＰＶの一服を対象に投与することを含む。
【０２１６】
ある特定の実施形態においては、この対象はヒトである。ある特定の実施形態においては、この対象は成人である。本発明のある特定の実施形態においては、成人は免疫力が低下している。ある特定の実施形態においては、成人は１０歳、１５歳、２０歳、２５歳、３０歳、２５歳、４０歳、４５歳、５０歳、５５歳、６０歳、６５歳、７０歳、７５歳、８０歳、または８５歳を超える年齢である。ある特定の実施形態においては、対象の年齢は、５歳未満、３歳未満、２歳未満、１５か月未満、１２か月未満、９か月未満、６か月未満、または３か月未満である。ある特定の実施形態においては、対象の年齢は、０〜３か月、３〜６か月、６〜９か月、９〜１２か月、１〜２年、または２〜５年である。
【０２１７】
本明細書で提供されるいずれの組み換えＭＶＡまたはＦＰＶも、対象に対して、１０６から１０１０ＴＣＩＤ５０、好ましくは、１０６から１０９ＴＣＩＤ５０の投与量、例えば、１０６から１０９ＴＣＩＤ５０、１０６から５×１０８ＴＣＩＤ５０、１０７から１０８ＴＣＩＤ５０、５×１０７ＴＣＩＤ５０から５×１０８ＴＣＩＤ５０、１０７ＴＣＩＤ５０または１０８ＴＣＩＤ５０の投与量を投与しうる。ある特定の実施形態においては、この組み換えＭＶＡまたはＦＰＶベクターは、１×１０８ＴＣＩＤ５０から１×１０１０ＴＣＩＤ５０の量で投与される。別の実施形態においては、この組み換えＭＶＡまたはＦＰＶは、１×１０８ＴＣＩＤ５０から５×１０９の量で、好ましくは、５×１０８ＴＣＩＤ５０から６×１０９の量で投与される。ある特定の実施形態においては、本明細書で提供されるいずれの組み換えＭＶＡも、ヒトの対象に対して、１０７ＴＣＩＤ５０または１０８ＴＣＩＤ５０または５×１０８ＴＣＩＤ５０の投与量で投与される。ある特定の実施形態においては、本明細書で提供されるいずれの組み換えＦＰＶも、ヒトの対象に対して、５×１０８、６．３×１０８または１×１０９ＴＣＩＤ５０の投与量で投与される。
【０２１８】
別の実施形態においては、本明細書で提供される組み換えＭＶＡは、ヒトの対象に対して、組み換えＦＰＶよりも少ない投与量で投与される。ある特定の実施形態においては、本明細書で提供されるいずれの組み換えＭＶＡ／ＦＰＶは、対象に対して、フィロウイルスへの暴露の前に、本明細書で提供されるいずれかの投与量で投与される。例えば、フィロウイルスへの暴露の１，２，３、もしくは４週間または１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１、もしくは１２か月前に投与される。ある特定の実施形態においては、本明細書で提供されるいずれの組み換えＭＶＡまたはＦＰＶも、対象に対して、フィロウイルスへの暴露の後に、本明細書で提供されるいずれかの投与量で投与される。例えば、フィロウイルスへの暴露の１，２，３、４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，もしくは２４時間または１，２，３，４，５，６，もしくは７日，８，９，１０，１１、もしくは１２か月後に投与される。
【０２１９】
ある特定の実施形態においては、本明細書で提供される組み換えＭＶＡ／ＦＰＶは、対象に対して、１回の投与、または複数（つまり、２回、３回、４回等）の投与で投与される。ある特定の実施形態においては、本明細書で提供される組み換えＭＶＡ／ＦＰＶは、第１回（プライミング）および第２回（ブースティング）投与で投与される。第１回の投与量は組み換えＭＶＡまたはＦＰＶウイルスの１０７から１０８ＴＣＩＤ５０を含み、第２回の投与量は組み換えＭＶＡまたはＦＰＶウイルスの１０７から１０８ＴＣＩＤ５０を含みうる。
【０２２０】
ブースティング組成物は、一般的に、プライミング組成物の投与の数週間または数か月後に、１回または複数回投与される。例えば、約１または２週間または３週間、または４週間、または６週間、または８週間、または１６週間、または２０週間、または２４週間、または２８週間、または３２週間または１〜２年後である。
【０２２１】
好ましくは、最初のブースティング接種はプライミングの１〜１２週間または２〜１２週間後、より好ましくは、プライミングの１，２，４、または８週間後に投与する。好ましい実施形態においては、この最初のブースティング接種は、プライミングの４または８週間後に投与する。追加の好ましい実施形態においては、この最初のブースティングは、プライミングの少なくとも２週間または少なくとも４週間後に行う。さらに別の好ましい実施形態においては、この最初のブースティングは、プライミングの４〜１２週間または４〜８週間後に行う。
【０２２２】
本明細書で提供される組み換えＭＶＡ／ＦＰＶは、全身的または局所的に投与できる。ある特定の実施形態においては、組み換えＭＶＡ／ＦＰＶは、非経口で、皮下、静脈内、筋肉内、または鼻腔内に、特に皮下に投与する。好ましくは、組み換えＭＶＡ／ＦＰＶは、鼻腔内に投与する。別の実施形態においては、組み換えＭＶＡ／ＦＰＶは、熟練者に知られる他のいずれの投与経路によって投与する。さらに好ましい実施形態においては、組み換えＭＶＡ／ＦＰＶは筋肉内に投与し、好ましくは、組み換えＭＶＡ／ＦＰＶは約１００μｌから約１０ｍｌの間の範囲の体積で、例えば、約１０４から１０１０のウイルス粒子／ｍｌの濃度を好ましくは含んで、筋肉内に投与する。好ましくは、この組み換えＭＶＡ／ＦＰＶベクターは、０．２５および１．０ｍｌの間の範囲の体積で投与する。さらに好ましくは、この組み換えＭＶＡまたはＦＰＶベクターは、０．５ｍｌの体積で投与する。
【０２２３】
組み換えＭＶＡまたはＦＰＶベクターを生成する方法
【０２２４】
さらなる実施形態は、本発明の任意の実施形態の組み換えＭＶＡベクター、または前記組み換えＭＶＡベクターのゲノムから発現した抗原決定基を生成する方法を含み、その方法は、
（ａ）好ましくは、ＭＶＡウイルス粒子の生成のためのヘルパーウイルスの添加を用いて、いずれかの実施形態の組み換えＭＶＡウイルスを用いて宿主細胞を感染させ、またはいずれかの実施形態の組み換えＭＶＡウイルスの組み換えＤＮＡを用いてこの細胞に遺伝子導入するステップ、
（ｂ）感染または遺伝子導入した細胞を培養するステップ、および
（ｃ）前記細胞からこのＭＶＡウイルスおよび／または抗原決定基を単離するステップ
を含む。
【０２２５】
別の実施形態においては、本発明は、組み換えＭＶＡウイルスおよび／または組み換えベクターを生成するための方法から得られた抗原決定基に関する。
【０２２６】
さらなる実施形態は、本発明の任意の実施形態の組み換えＦＰＶベクター、または前記組み換えＦＰＶベクターのゲノムから発現した抗原決定基を生成する方法を含み、その方法は、
（ａ）好ましくは、ＦＰＶウイルス粒子の生成のためのヘルパーウイルスの添加を用いて、いずれかの実施形態の組み換えＦＰＶウイルスを用いて宿主細胞を感染させ、またはいずれかの実施形態の組み換えＦＰＶウイルスの組み換えＤＮＡを用いてこの細胞に遺伝子導入するステップ、
（ｂ）感染または遺伝子導入した細胞を培養するステップ、および
（ｃ）前記細胞からこのＦＰＶウイルスおよび／または抗原決定基を単離するステップ
を含む。
【０２２７】
別の実施形態においては、本発明は、組み換えＦＰＶウイルスおよび／または組み換えベクターを生成するための方法から得られた抗原決定基に関する。
【０２２８】
別の実施形態においては、本発明は組み換えＭＶＡベクターを生成する方法に関し、この方法は、
（ａ）ＭＶＡウイルスを用いて宿主細胞を感染させるステップ、
（ｂ）いずれかのタンパク質の抗原決定基をコードする少なくとも１個のヌクレオチド配列を含む組み換えベクターを用いて、感染した細胞に遺伝子導入するステップであって、前記核酸配列が、少なくとも１個のヌクレオチド配列をＭＶＡウイルスゲノムの中に組み込むことを指示できるゲノムＭＶＡウイルス配列をさらに含むステップ、および
（ｃ）生成した組み換えＭＶＡウイルスを特定し、単離し、および任意に精製するステップ
を含む。
【０２２９】
別の実施形態においては、本発明は組み換えＦＰＶベクターを生成する方法に関し、この方法は、
（ａ）ＦＰＶウイルスを用いて宿主細胞を感染させるステップ、
（ｂ）いずれかのタンパク質の抗原決定基をコードする少なくとも１個のヌクレオチド配列を含む組み換えベクターを用いて、この感染した細胞に遺伝子導入するステップであって、前記核酸配列が、少なくとも１個のヌクレオチド配列をＦＰＶウイルスゲノムの中に組み込むことを指示できるゲノムＦＰＶウイルス配列をさらに含むステップ、および
（ｃ）生成した組み換えＦＰＶウイルスを特定し、単離し、および任意に精製するステップ
を含む。
【０２３０】
本発明の他の実施形態は、本明細書が開示する発明の明細書および実施を考慮して、当業者に明白になるであろう。本明細書および実施例は説明のみのためであり、本発明の真の範囲および精神は添付の特許請求の範囲に示されていることが意図される。
【実施例】
【０２３１】
以下の詳細な実施例は、本発明をより良く理解することに役立つことを意図している。しかし、本発明はこの実施例によって制限されない。本発明の他の実施形態は、本明細書が開示する発明の明細書および実施を考慮して、当業者に明白になるであろう。
【０２３２】
実施例１：組み換えＭＶＡの構築
以下のセクションは、フィロウイルスエンベロープグリコプロテインおよび／またはさらなるフィロウイルスタンパク質の抗原決定基を発現している１個またはそれ以上の異種核酸を含む組み換えＭＶＡの構築を記載する。本明細書で記載する他のすべての構築物は同様の方法で作られた。
【０２３３】
ＭＶＡ−ｍＢＮ２５２Ｂ（ＰｒＳ−ＧＰ−ＭＡＲＶ−ムソケ）の構築
天然に存在するＧＰ−ＭＡＲＶ−ムソケ遺伝子（ビクトリア湖単離株）の完全長ＤＮＡ配列は、ＭＡＲＶワクチン候補のＭＶＡ−ｍＢＮ２５２Ｂの構築のための基準配列としての機能を果たした。完全長ＧＰ−ＭＡＲＶ−ムソケをコードするヌクレオチド配列を、コドンの使用をヒトにおける発現に対して、及び内部同種組み換え現象を最小化または防止するように最適化して、Ｇｅｎｅａｒｔ  ＡＧ（ドイツ、レーゲンスブルク）によって合成した。コドン最適化は、野生型ＤＮＡ配列を変化させたが、コドン最適化された配列は野生型ＧＰ−ＭＡＲＶ−ムソケ（配列番号６；ＮＣＢＬ受入番号  ＡＢＡ８７１２７．１）と同一のアミノ酸配列をコードする。ＧＰ−ＭＡＲＶ−ムソケの発現は、ワクシニアウイルスプロモーターの初期および後期のエレメントから設計された合成プロモーターであるプロモーターＰｒＳによって引き起こされる（配列番号２３；Ｓ．  Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｏｍｐａｃｔ，  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｅａｒｌｙ／Ｌａｔｅ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３（６）：１０９４−１０９７（１９９７）も参照）。コドン最適化されたＧＰ−ＭＡＲＶ−ムソケ遺伝子を、欠失部位または遺伝子間の（非コード）領域（ＩＧＲ）を含むＭＶＡ−ＢＮゲノムの異なる特定の領域を標的にした、いくつかのカスタマイズされた組み換えプラスミドの１個を使用した標準的な方法（下記参照）によってＭＶＡ−ＢＮゲノムの中へ挿入した。
【０２３４】
このコドン最適化されたＧＰ−ＭＡＲＶ−ムソケ遺伝子をＭＶＡ−ＢＮＭＶＡ−ＢＮゲノムの中へ挿入するために、鶏胚線維芽細胞（ＣＥＦ細胞）をＭＶＡ−ＢＮで感染させ、そして次にこの組み換えプラスミドｐＢＮ４３３（図５Ａ）で遺伝子導入した。ｐＢＮ４３３は、ＢｓｐＥｌ／Ｎｈｅｌ制限によってプラスミドｐＢＮＸ１９７の中へ挿入された合成ＰｒＳプロモーターの制御の下で、このコドン最適化されたＧＰ−ＭＡＲＶ−ムソケ遺伝子（配列番号６（アミノ酸）をコードしている配列番号５（ＤＮＡ））を含んでいた（図４Ｂ）。プラスミドｐＢＮ４３３は、さらに、ＭＶＡ−ＢＮゲノム中のＩＧＲ  １４８／１４９の側面に位置するＭＶＡ−ＢＮ  ＤＮＡ配列、およびｌｏｘＰが側面に位置する選択カセットを含む。ｌｏｘＰは、Ｃｒｅリコンビナーゼによって介される組み換えによる、この選択カセットの後の除去を可能にする。プラスミド中の側面に位置する配列とＭＶＡ−ＢＮゲノム（つまり、ＩＧＲ  １４８／１４９）中の望ましい挿入部位における同種配列の間の同種組み換えに続いて、プラスミドのコード部分がＭＶＡ−ＢＮゲノムの望ましい部位の中へ挿入された。
【０２３５】
増幅およびプラーク精製（継代９回、そのうちプラーク精製３回を含む）の後、選択的条件の下（ミコフェノール酸／キサンチンおよびヒポキサンチン）で、ＧＰ−ＭＡＲＶ−ムソケの遺伝子を含む、ＭＶＡ−ｍＢＮ２５２Ａ（ＰｒｅＭａｓｔｅｒ  Ａ）と命名されたこの組み換えＭＶＡ−ＢＮ生産物が得られた。組み換えＭＶＡ−ｍＢＮ２５２Ａ  ＰｒｅＭａｓｔｅｒウイルス株を、ＭＶＡ−ＢＮ（親ウイルス、データなし）の除去について、（異質遺伝子が挿入されたＭＶＡ−ＢＮゲノム配列に固有のプライマーを使用して遺伝子に固有のＰＣＲによって（データなし））領域の側面に挿入するとともに、挿入された遺伝子の正確な配列について、細菌の不存在について（無菌テスト（データなし））、および（配列を決定して（データなし））挿入体の存在および正確なサイズについて検査した。ＭＶＡ−ｍＢＮ２５２Ａ  ＰｒｅＭａｓｔｅｒウイルス株の力価も決定された。
【０２３６】
挿入された配列中の選択カセットの存在は、培養中の組み換えＭＶＡ−ＢＮウイルスのポジティブ選択を可能にする。最終的な組み換えＭＶＡ−ｍＢＮ２５２Ｂを発生させるために、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ系を使用して、この選択カセットを、ＭＶＡ−ｍＢＮ２５２Ａ  ＰｒｅＭａｓｔｅｒウイルス株から取り除いた、選択カセットを取り除くために、プラスミドｐＢＮ４３３（つまり、ＰｒＳプロモーターの制御の下にあるＧＰ−ＭＡＲＶ−ムソケ、プラスｌｏｘＰ部位が側面にある選択カセット）の挿入体を含む組み換えＭＶＡ−ＢＮによって感染させたＣＥＦ細胞に、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードしている発現プラスミドであるｐＢＮ２７４をさらに遺伝子導入した（図４Ｃ）。部位固有のＣｒｅリコンビナーゼは、標的ｌｏｘＰ配列の側面にある選択カセットＤＮＡ配列の正確な除去を促進し、選択カセットを完全に除去した。その結果生じたウイルスは、非選択的条件（継代２７回、そのうちプラーク精製を９回含む）の下でプラーク精製し、選択カセットを欠く組み換え体ウイルスＭＶＡ−ｍＢＮ２５２Ｂが単離されたた。選択カセットの完全な除去を、ネステッドＰＣＲによって確認した（データは示さず）。最後に、組み換えＭＶＡ−ｍＢＮ２５２ＢによるＧＰ−ＭＡＲＶ−ムソケの発現は、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ（データなし））によって確認された。
【０２３７】
ＭＶＡ−ｍＢＮ２２６Ｂ（多抗原ＭＶＡ−Ｆｉｌｏ）の構築
ＭＶＡ−ｍＢＮ２２６Ｂからのすべての導入遺伝子発現については、天然に存在する遺伝子の完全長ＤＮＡ配列が、基準配列としての機能を果たした。これらは、コドン使用を、ヒトにおける発現のために、及び内部同種組み換え現象を最小化または防止するように最適化して、Ｇｅｎｅａｒｔ  ＡＧ（ドイツ、レーゲンスブルク）によって合成された。コドン最適化は、アミノ酸配列を変更しないで野生型ＤＮＡ配列を変更した。ＭＶＡ−ｍＢＮ２２６Ｂは以下のフィロウイルス遺伝子を含む：ＧＰ−ＳＥＢＯＶ（配列番号３０）；ＮＰ−ＥＢＯＶ−ＣｄＩ（配列番号２８）；ＧＰ−ＺＥＢＯＶ、メイインガ株（ＧＰ−ＺＥＢＯＶ−メイインガ、配列番号１９）およびＧＰ−ＭＡＲＶ−ムソケ（配列番号５）。ＧＰ−ＳＥＢＯＶおよびＧＰ−ＭＡＲＶ−ムソケはＰｒＳプロモーター（配列番号２３）の制御の下で発現し、ＮＰ−ＥＢＯＶ−ＣｄＩはＰｒＬＥ１または改変ＰｒＬＥ１プロモーター（配列番号２７および配列番号３２）の制御の下で発現し、そしてＧＰ−ＺＥＢＯＶ−メイインガはＰｒ７．５プロモーター（配列番号２５）の制御の下で発現する。
【０２３８】
ＰｒＳプロモーターは、ワクシニアウイルスプロモーターの初期および後期エレメントから設計された合成プロモーターであり、それは遺伝子発現の初期および後期の両段階の間、導入遺伝子発現を確保する。同様に、ワクシニアウイルス７．５ｋＤａ遺伝子からのＰｒ７．５プロモーターは、強力な初期および後期プロモーターである。つまり、その制御下にある導入遺伝子は、遺伝子発現の初期および後期の両段階の間も発現することを意味する（配列番号２５；Ｍ．Ａ．  Ｃｏｃｈｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．“Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｒｅｇｉｏｎ  ｆｏｒ  ａ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｅ：  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｔａｎｄｅｍ  ｅａｒｌｙ  ａｎｄ  ｌａｔｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｉｇｎａｌｓ”，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ５４（１）：３０−３７  （１９８５）も参照）。プロモーターＰｒＬＥ１は、Ｐｒ７．５に由来する５個の最適化された初期エレメントに融合した牛痘ウイルス（ＡＴＩ）のＡタイプ封入プロモーターから成る合成プロモーターである（配列番号２７；  Ｋ．  Ｂａｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−Ｅａｒｌｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｙ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ｖｉｒｕｓ  Ａｎｋａｒａ  Ｂｒｅａｋｓ  ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｔｒｏｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｂ８Ｒ  Ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎ  Ａｃｕｔｅ  ａｎｄ  Ｍｅｍｏｒｙ  ＣＤ８  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ”，Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．８４（１７）：８７４３−８７５２（２０１０）も参照）。したがって、ＮＰ−ＥＢＯＶ−ＣｄＩは、発現の初期および後期の両局面の間、発現している。さらには、ＰｒＬＥ１は、特に強力な細胞媒介免疫反応を誘導することが示された。ＭＶＡ−ｍＢＮ２２６Ｂの継代の間、Ｐｒ７．５に由来する５個の初期エレメントの１個は、おそらくは同種の組み換えによって失われた。しかし、分析によると、ＮＰ−ＥＢＯＶ−ＣｄＩの十分な発現レベルを示した（データはなし）ので、改変ＰｒＬＥ１プロモーターを置き換えないで改変構築体が使用された。
【０２３９】
ＭＶＡ−ＢＮゲノムの中へ異質の遺伝子を挿入することについては、このＭＶＡ−ＢＮゲノムの異なる欠失および遺伝子間領域（ＩＧＲ）を標的にするいくつかの組み換えプラスミドが発生した。組み換えＭＶＡ−ＢＮ生産物を発生させるためには、一般的に入手できる制限酵素および従来の分子生物学の技術を使って、興味のある異質配列を、これらのいずれの基本的なベクター、例えば、ＩＧＲ  ８８／８９を標的にするｐＢＮＸ１８６（図４Ａ参照）またはＩＧＲ  １４８／１４９を標的にするｐＢＮＸ１９７（図４Ｂ参照）の中へ挿入することができる。望ましい導入遺伝子を発現している組み換えＭＶＡ−ＢＮ単離株を生成するために、ＣＥＦ細胞をまずＭＶＡ−ＢＮで感染させ、次に、１個または複数の望ましい導入遺伝子を発現し、および組み換えウイルスにポジティブ選択を可能にする選択カセットを含む、１個またはそれ以上の組み換えプラスミドを用いて遺伝子導入する。同種の組み換えの間、プラスミドを側面に有する配列が、ＭＶＡ−ＢＮウイルスゲノムの挿入部位の同種配列と組み換えをする。これは、ＭＶＡ−ＢＮゲノムの出発物質（例えば、ＩＧＲ  １４８／１４９、ＩＧＲ  ８８／８９等）として使用される基底ベクターによって標的とされる部位の中へプラスミド配列を挿入する。ｐＢＮＸ１９７は、ＩＧＲ  １４８／１４９を標的にし（図４Ｂ）、そして最終組み換えプラスミドｐＢＮ３８４の構築のための出発プラスミドとして使用された（図５Ｂ）。  プラスミドｐＢＮ３８４は、ＧＰ−ＺＥＢＯＶ−メイインガおよびＧＰ−ＭＡＲＶ−ムソケを発現する。ｐＢＮＸ１８６は、ＩＧＲ  ８８／８９を標的にし（図４Ａ）、そして最終組み換えプラスミドｐＢＮ３８５の構築のための出発プラスミドとして使用された（図５Ｃ）。プラスミドｐＢＮ３８５はＧＰ−ＳＥＢＯＶおよびＮＰ−ＥＢＯＶ−ＣｄＩを発現する。
【０２４０】
ＧＰ−ＳＥＢＯＶ、ＮＰ−ＥＢＯＶ−ＣｄＩ、ＧＰ−ＺＥＢＯＶ−メイインガ、およびＧＰ−ＭＡＲＶ−ムソケ導入遺伝子をＭＶＡ−ＢＮの中へ挿入するために、ＣＥＦ細胞をＭＶＡ−ＢＮで感染させ、次いで、組み換えプラスミドｐＢＮ３８４およびｐＢＮ３８５を用いて遺伝子導入した。  増幅およびプラーク精製（継代１０回、そのうち３回はプラーク精製を含む）の後、二重の選択的条件の下（ミコフェノール酸／キサンチンおよびヒポキサンチン、さらにはゲンチシン）で、３個のグリコプロテイン、１個の核タンパク質および２個の選択カセットの遺伝子を含む、ＭＶＡ−ｍＢＮ２２６Ａ（中間ＰｒｅＭａｓｔｅｒ）と命名されたこの組み換えＭＶＡ−ＢＮ生産物が得られた。組み換えＭＶＡ−ｍＢＮ２２６Ａ  ＰｒｅＭａｓｔｅｒウイルス株を、ＭＶＡ−ＢＮ（親ウイルス、データなし）の除去について、（異質遺伝子が挿入されたＭＶＡ−ＢＮゲノム配列に固有のプライマーを使用して遺伝子に固有のＰＣＲによる（データなし））挿入隣接領域とともに、挿入された遺伝子の正確な配列について、細菌の不存在について（無菌テスト（データなし））、および（配列を決定して（データなし））挿入体の存在および正確なサイズについて検査した。ＭＶＡ−ｍＢＮ２５２Ａ  ＰｒｅＭａｓｔｅｒウイルス株の力価も、決定された。
【０２４１】
非選択的条件（継代２０回、そのうちプラーク精製を６回含む）の下での、さらなる増幅、選択カセットの除去およびプラーク精製の後、選択カセットを欠く組み換え体ウイルスＭＶＡ−ｍＢＮ２２６Ｂを単離した。選択カセットの完全な除去を、ネステッドＰＣＲによって確認した（データなし）。最後に、組み換えＭＶＡ−ｍＢＮ２２６Ｂによる導入遺伝子の発現を、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ（データなし））によって確認した。
【０２４２】
ＭＶＡ−ｍＢＮ２５４Ａ（ＭＶＡ−ＧＰ−ＺＥＢＯＶ）の構築
ＭＶＡ−ｍＢＮ２５４Ａから発現したＧＰ−ＺＥＢＯＶ導入遺伝子については、この天然に存在する遺伝子の完全長ＤＮＡ配列が、基準配列としての機能を果たした。上記「ＭＶＡ−ｍＢＮ２２６Ｂの構築」で記載さているように、ＧＰ−ＺＥＢＯＶ遺伝子は、コドン使用を、ヒトにおける発現のために、及び内部同種組み換え現象を最小化または防止すように最適化して、Ｇｅｎｅａｒｔ  ＡＧ（ドイツ、レーゲンスブルク）によって合成された。コドン最適化は、アミノ酸配列を変更しないで野生型ＤＮＡ配列を変更した。ＧＰ−ＺＥＢＯＶ−メイインガは、ＰｒＳ５Ｅプロモーター（配列番号２４）の制御の下で発現する。
【０２４３】
このＰｒＳ５Ｅ（配列番号２４）は、合成初期および後期プロモーターから設計した合成強力初期および後期プロモーター（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）であり、ワクシニアウイルス７．５ｋＤａ遺伝子からのＰｒ７．５プロモーターの５個の初期エレメントがその後に続く（配列番号２５；Ｍ．Ａ．  Ｃｏｃｈｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｒｅｇｉｏｎ  ｆｏｒ  ａ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｅ：  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｔａｎｄｅｍ  ｅａｒｌｙ  ａｎｄ  ｌａｔｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｉｇｎａｌｓ  ”，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ５４（１）：３０−３７  （１９８５）も参照）。このＰｒＳ５Ｅプロモーターは、特許出願ＷＯ  ２０１３／１８９６１１Ａ１に、より詳細に記載されている。
【０２４４】
ＭＶＡ−ＢＮゲノムの中へ異質の遺伝子を挿入することについては、このＭＶＡ−ＢＮゲノムの異なる欠失および遺伝子間領域（ＩＧＲ）を標的にするいくつかの組み換えプラスミドが構築された。組み換えＭＶＡ−ＢＮ生産物を発生させるために、一般的に入手できる制限酵素および従来の分子生物学の技術を使って、対象とする異質配列を、これらのいずれの基底ベクター、例えば、ＩＧＲ  １４８／１４９を標的にするｐＢＮＸ１９７（図４Ｂ参照）の中へ挿入することができる。望ましい導入遺伝子を発現している組み換えＭＶＡ−ＢＮ単離株を生成するために、ＣＥＦ細胞をまずＭＶＡ−ＢＮで感染させ、次に、１個または複数の望ましい導入遺伝子を発現し、および組み換えウイルスにポジティブ選択を可能にする選択カセットを含む、１個またはそれ以上の組み換えプラスミドを用いて遺伝子導入する。同種の組み換えの間、プラスミドに隣接する配列が、ＭＶＡ−ＢＮウイルスゲノムの挿入部位の同種配列と組み換えをする。これは、ＭＶＡ−ＢＮゲノムの出発物質（例えば、ＩＧＲ  １４８／１４９）として使用される基底ベクターによって標的とされる部位の中へ標的配列を挿入する。ｐＢＮＸ１９７は、ＩＧＲ  １４８／１４９を標的にし（図４Ｂ）、そして最終組み換えプラスミドｐＢＮ４３６の構築のための出発プラスミドとして使用された（図５Ｄ）。プラスミドｐＢＮ４３６は、ＧＰ−ＺＥＢＯＶ−メイインガを含む。
【０２４５】
ＧＰ−ＺＥＢＯＶ−メイインガ導入遺伝子をＭＶＡ−ＢＮに挿入するために、ＣＥＦ細胞をＭＶＡ−ＢＮで感染させ、次いで、組み換えプラスミドｐＢＮ４３６を用いて遺伝子導入した（図５Ｄ）。増幅およびプラーク精製（継代９回、そのうちプラーク精製３回を含む）の後、選択的条件の下（ミコフェノール酸／キサンチンおよびヒポキサンチン）で、ＧＰ−ＺＥＢＯＶ−メイインガの遺伝子および選択マーカー  ＧＰＴ−ＲＦＰ融合遺伝子を含む、ＭＶＡ−ｍＢＮ２５４Ａ（ＰｒｅＭａｓｔｅｒ）と命名された組み換えＭＶＡ−ＢＮ生産物が得られた（図３Ｃ）。組み換えＭＶＡ−ｍＢＮ２５４Ａ  ＰｒｅＭａｓｔｅｒウイルス株を、ＭＶＡ−ＢＮ（親ウイルス、データなし）の除去について、（異質遺伝子が挿入されたＭＶＡ−ＢＮゲノム配列に特異的なプライマーを使用して遺伝子に固有のＰＣＲによる（データなし））挿入隣接領域とともに、挿入された遺伝子の正確な配列について、細菌の不存在について（無菌テスト（データなし））、および（配列を決定して（データなし））挿入体の存在および正確なサイズについて検査した。ＭＶＡ−ｍＢＮ２５４Ａ  ＰｒｅＭａｓｔｅｒウイルス株の力価も、決定された。最後に、組み換えＭＶＡ−ｍＢＮ２５４Ａによる導入遺伝子の発現を、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ（データなし））によって確認した。
【０２４６】
他の構築物を上に従って生成した。特に、ＭＶＡ−ｍＢＮ２５５は、ＩＧＲ  ８８／８９に組み込まれたＰｒＳプロモーターの制御の下でＮＰ−ＥＢＯＶ−ＣｄＩ（配列番号２８）を、ＩＧＲ  １３６／１３７に組み込まれたＰｒＳプロモーターの制御の下でＶＰ４０・ＺＥＢＯＶ（配列番号３３）を、およびＩＧＲ  １４８／１４９に組み込まれたＰｒＳ５Ｅプロモーターの制御の下でＧＰ−ＺＥＢＯＶ（配列番号１９）を、発現した（図１３）。
【０２４７】
ＦＰＶ−ｍＢＮ３６８Ａ（ＦＰＶ−ＧＰ−ＺＥＢＯＶ）およびＦＰＶ−ｍＢＮ３９１（ＦＰＶ−マルチ−ｆｉｌｏ）の構築
ＦＰＶ−ｍＢＮ３６８Ａから発現したＧＰ−ＺＥＢＯＶ導入遺伝子については、天然に存在する遺伝子の完全長ＤＮＡ配列が、基準配列としての機能を果たした。ＧＰ−ＺＥＢＯＶ遺伝子は、「ＭＶＡ−ｍＢＮ２２６Ｂの構築」で記載されているように、コドン使用をヒトにおける発現のために最適化して、Ｇｅｎｅａｒｔ  ＡＧ（ドイツ、レーゲンスブルク）によって合成された。コドン最適化は、アミノ酸配列を変更しないで野生型ＤＮＡ配列を変更した。ＧＰ−ＺＥＢＯＶ−メイインガは、ＦＰＶ−４０Ｋプロモーター（配列番号２６）の制御の下で発現する。このＦＰＶ−４０Ｋプロモーターは、ＦＰＶの配列をコードしている４０Ｋタンパク質のＦＰＶプロモーター配列である。
【０２４８】
ＦＰＶゲノムの中へ異質の遺伝子を挿入することについては、ＦＰＶゲノムの中へ、異なる組み込み部位を標的にするいくつかの組み換えプラスミドが構築された。組み換えＦＰＶ生産物を発生させるために、一般的に入手できる制限酵素および従来の分子生物学の技術を用いて、対象とする異質配列を、これらのいずれかの基底ベクター、例えば、挿入部位ＢａｍＨＩ  Ｊを標的にするｐＢＮＸ２２１（図４Ｄ参照）、の中へ挿入することができる。望ましい導入遺伝子を発現している組み換えＦＰＶ単離株を生成するために、ＣＥＦ細胞をまずＦＰＶで感染させ、次に、１個または複数の望ましい導入遺伝子を発現し、および組み換えウイルスにポジティブ選択を可能にする選択カセットを含む、１個またはそれ以上の組み換えプラスミドを用いて遺伝子導入する。同種の組み換えの間、プラスミドに隣接する配列は、ＦＰＶウイルスゲノムの挿入部位の同種配列を用いて組み換えをする。これは、ＦＰＶゲノムの出発物質（例えば、挿入部位ＢａｍＨＩ  Ｊ）として使用される基底ベクターによって標的とされる部位の中へ標的配列を挿入する。ｐＢＮＸ２２１は、挿入部位ＢａｍＨＩ  Ｊを標的にし（図４Ｄ）、そして最終組み換えプラスミドｐＢＮ５５５の構築のための出発プラスミドとして使用された（図５Ｅ）。プラスミドｐＢＮ５５５は、ＦＰＶ−４０Ｋプロモーターの制御の下でＧＰ−ＺＥＢＯＶ−メイインガを含む。
【０２４９】
ＧＰ−ＺＥＢＯＶ−メイインガ導入遺伝子をＦＰＶに挿入するために、ＣＥＦ細胞をＦＰＶで感染させ、次いで、組み換えプラスミドｐＢＮ５５５を用いて遺伝子導入した（図５Ｅ）。増幅およびプラーク精製（継代１３回、そのうちプラーク精製４回を含む）の後、選択的条件の下（ミコフェノール酸／キサンチンおよびヒポキサンチン）で、ＧＰ−ＺＥＢＯＶ−メイインガの遺伝子および選択マーカー  ＧＰＴ−ＲＦＰ融合遺伝子を含む、ＦＰＶ−ｍＢＮ３６８Ａ（ＰｒｅＭａｓｔｅｒ）と命名されたこの組み換えＭＶＡ−ＢＮ生産物が得られた（図３Ｄ）。組み換えＦＰＶ−ｍＢＮ３６８Ａ  ＰｒｅＭａｓｔｅｒウイルス株を、ＦＰＶ（親ウイルス、データなし）の除去について、（異質遺伝子が挿入されたＦＰＶゲノム隣接配列に固有のプライマーを使用して遺伝子に固有のＰＣＲによって（データなし））挿入隣接領域とともに、挿入された遺伝子の正確な配列について、細菌の不存在について（無菌テスト（データなし））、および（配列を決定して（データなし））挿入体の存在および正確なサイズについて検査した。ＦＰＶ−ｍＢＮ３６８Ａ  ＰｒｅＭａｓｔｅｒウイルス株の力価も、決定された。最後に、組み換えＦＰＶ−ｍＢＮ３６８Ａによる導入遺伝子の発現を、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ（データなし））によって確認した。
【０２５０】
さらに別の鶏痘構築物を、上記の方法による組み込みのために、ＦＰ１４（ＩＧＲ  ６０／６１）およびＢａｍＨＩ  Ｊ領域を使用して生成した、ＦＰＶ−ｍＢＮ３９１は、共にＦＰ１４部位にあるＦＰＶ−４０Ｋプロモーター（配列番号２６）の制御の下にあるＧＰ−ＺＥＢＯＶ（配列番号１９および２０）およびＰｒＳプロモーター（配列番号２３）の制御の下にあるＧＰ−ＭＡＲＶ−ムソケ（配列番号５および６）、ならびにＰｒ１３．５長プロモーター（配列番号３５）の制御の下にあるＧＰ・ＭＡＲＶ・アンゴラ（配列番号３６および３７）およびＦＰＶ−４０Ｋプロモーターの制御の下にあるＧＰ−ＳＥＢＯＶ（配列番号３０および３１）ならびにＰｒＬＥ１プロモーター（配列番号２７）の制御の下にあるＮＰ−ＥＢＯＶ−ＣｄＩ（配列番号２８および２９）を発現し、この３個すべては、この記載の順番でＢａｍＨＩ  Ｊ領域に挿入された。
【０２５１】
実施例２：非ヒト霊長類におけるＭＶＡ−ＢＮ−Ｆｉｌｏ（ＭＶＡ−ｍＢＮ２２６Ｂ）
ＭＶＡ−ＢＮ−Ｆｉｌｏ（ＭＶＡ−ｍＢＮ２２６Ｂ）の、カニクイザル−マカクにおける免疫原性および防御効能を、エボラおよびマールブルグの攻撃モデルで分析した。サルは、研究用動物の世話および給餌に対する適切な組織ガイドラインを遵守して収容し、給餌した。
【０２５２】
実験計画は以下の表１に記載されている。
【０２５３】
【表１】
2017527557.tif 000003
【０２５４】
溶媒対照群およびワクチン接種群の両方について、投与量は０．５ｍｌであった；すべてのワクチン接種は皮下注射によって与えた。最初のワクチン接種日を０日目と指定する。すべての動物に、４２日目に、筋肉内注射による、１、０００ｐｆｕのＺＥＢＯＶ（１群および３群）またはＭＡＲＶ−ムソケ（２群または４群）の攻撃投与を行った。すべての生き残った動物は、６３日目に安楽死させた。
【０２５５】
ＧＰに特異的な抗体をＥＬＩＳＡ法によって測定した。予期した通り、ＭＡＲＶ−ムソケで攻撃された非ワクチン接種対照動物は、攻撃以前のいずれの時点においてもＧＰ−ＭＡＲＶに特異的な抗体を検出せず（つまり、０日目、および２８日目、３６日目（データなし））、そして疾患で死んだ。対照的に、ＭＶＡ−ＢＮ−Ｆｉｌｏでワクチン接種をした３匹中の２匹の動物（動物番号３０７６６および３０７６８）は、第１回のワクチン接種の２８日後（第１回ワクチン接種後、図６も参照）、低いＧＰ−ＭＡＲＶ抗体力価を示し、そして、ワクチン接種をした３匹すべての動物は、第２回のワクチン接種の８日後（ブースターワクチン接種後、図６参照）、明白なブースト反応を示した。３匹すべての動物は、ワクチン接種をしなければ致死的であってＭＡＲＶ−ムソケの筋肉内攻撃から生き延びた。
【０２５６】
同様に、ＺＥＢＯＶで攻撃された非ワクチン接種対照動物は、試験したすべての時点においてＧＰ−ＺＥＢＯＶに特異的な抗体について陰性であった（データなし）。この対照動物、さらにはすべてのワクチン接種をした動物も、筋肉内注射によるＺＥＢＯＶの攻撃の後に、感染で死んだ。驚くべきことに、ワクチン接種をした３匹すべての動物は、攻撃以前にＧＰ−ＺＥＢＯＶ固有の抗体を、ＺＥＢＯＶ−ＧＰのワクチン接種によって非ヒト霊長類において発生し、高度免疫血清中で測定された抗体よりも大きいレベルで、発生した。１０％の中和緩衝化したホルマリン中で収集した、死亡時の組織に対して完全な解剖を行った。組織の切片を日常的な方法で処理し、組織学的に評価するために、５μｍの薄片にし、そしてヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。調査結果を、以下の表２に要約する。
【０２５７】
【表２】
2017527557.tif 000004
【０２５８】
分析によれば、ＭＡＲＶ−ムソケに攻撃された非ワクチン接種対照動物、さらにはすべてのＺＥＢＯＶに攻撃された動物においても出血熱の典型的な症状を確認したが、ＭＡＲＶ−ムソケに攻撃されたワクチン接種をした動物は、攻撃後免疫反応およびＢ−細胞過形成と一貫する脾臓過形成以外は、組織学的変化はあまり示さなかった。
【０２５９】
実験の結果を、図７に要約する。図７Ａは、ＭＶＡ−ＢＮ−Ｆｉｌｏによるワクチン接種が、動物をＭＡＲＶ−ムソケの攻撃から１００％防御したことを示す。図７Ｂは、攻撃後の臨床スコアを示す。ＭＡＲＶ−ムソケで攻撃された、ワクチン接種をした動物は、出血熱に伴う症状または組織学的変化をまったく示さず、肝臓、脾臓、副腎、リンパ節または肺にウイルスをまったく保有していなかった。
【０２６０】
実施例３：非ヒト霊長類におけるＭＶＡ−ＢＮ−Ｆｉｌｏ
この実験は、実施例２に記載されているのと同様の研究手順の下で、非ヒト霊長類のＭＶＡ−ＢＮ−Ｆｉｌｏを試験したが、実施例２のマールブルグムソケの代わりに、別のマールブルグウイルス株、つまりマールブルグアンゴラで攻撃を行った。
【０２６１】
【表３】
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【０２６２】
表３は、マールブルグウイルスのアンゴラ株に対して、非ヒト霊長類を完全に防御したことを示す。対照的に、５群の非ワクチン接種動物は、感染で死んだ。表３は、さらに、防御効能は投与量に依存することを示す、なぜなら、マールブルグウイルスのＧＰをもコードしているＭＶＡ−ＢＮ−ＭＡＲＶを使用した５分の１の投与量は、共刺激分子としてＣＤ４０Ｌを同時発現しない限り、単に部分的に防御するだけだからである。表４に概要を示すように、すべてのワクチン候補は、ＭＶＡベクターに特異的な抗体（ワクシニア特異抗体）、さらにはＭＡＲＶ  ＧＰ挿入体に特異的な抗体を生成する。
【０２６３】
【表４】
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【０２６４】
実施例４：異種プライム／ブースト
この実験は、プライム／ブースト免疫付与における組み換えＭＶＡおよび組み換え鶏痘ＦＰＶの混合を試験した。
【０２６５】
Ｈ−２Ｋｋ＋  Ｂ６ＣＢＡ  Ｆ１マウス（フランス、Ｊａｎｖｉｅｒ  Ｌａｂｓ）を、５×１０７ＴＣＩＤ５０  ＭＶＡ−ＺＥＢＯＶ−ＧＰ（ＭＶＡ；ＭＶＡ−ｍＢＮ２５４Ａ、図３Ｃ）またはＦＰＶ−ＺＥＢＯＶ−ＧＰ（ＦＰＶ；ＦＰＶｍＢＮ３６８Ａ、図３Ｄ）を用いて、皮下で（ｓ．ｃ．）免疫付与した。ウイルス投与は、一方の脇腹当たり１００μｌの合計量で、両方の脇腹に注射した。
【０２６６】
ＺＥＢＯＶ−ＧＰ特異のＩｇＧを検出するために、９６穴プレート（米国、メリーランド州、コーニング）を、１晩、４℃でＺＥＢＯＶ  ＧＰ抗原（米国、メリーランド州、ＩＢＴ  Ｂｉｏｓｅｒｖｉｃｅｓ）を用いてコートした。２倍で希釈した血清の複製を、洗浄し、ブロックしたプレートに添加し、ヒツジ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（英国、ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）を、抗体を検出するために使用した。ＴＭＢ基質を室温で３０分間添加し、そして反応を１モルのＨ２ＳＯ４を添加して終了させた。吸収度は、４５０ｎｍで測定された。ネズミ科の単クローン抗体１３Ｆ６を、ＺＥＢＯＶ−ＧＰ  ＩｇＧの血清濃度を計算するために、標準として使用した。
【０２６７】
マウスリンパ球を、組織を優しく砕き、７０μｍのセルストレーナー（米国、カリフォルニア州、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に通して、脾臓から新たに単離した。赤血球溶解の後、細胞を、１０μｇ／ｍｌのブレフェルジンＡおよびＣＤ１０７ａ−ＦＩＴＣの存在下で、５μｇ／ｍｌ  ＺＥＢＯＶ−ＧＰ５７７−５８４ペプチド（ＴＥＬＲＴＦＳＩ）（米国、ニュージャージー州、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）を用いて、３７℃で６時間、完全なＲＰＭＩ中で培養した。生きているか、死んでいるかを区別するために、細胞をＺｏｍｂｉｅ  ＡｑｕａＴＭＦｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙキット（米国、カリフォルニア州、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用して染色した。ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの細胞内染色を、ＣＤ４−ＢＶ６０５，  ＣＤ８α−ＢＶ４２１（米国、カリフォルニア州、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）  およびＣＤ４４−ＡＰＣ−ｅＦｌｕｏｒ７８０（米国、カリフォルニア州、ｅＢｉｓｏｃｉｅｎｃｅ）を用いた表面染色、ならびに製造者の指示書（ＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ，  ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に従い固定化／透過化をした後に、行った。すべての細胞は、デジタルフロー血球計算器（米国、カリフォルニア州、ＬＳＲ  ＩＩ，  ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して獲得し、そしてデータはＦｌｏｗＪｏソフトウエア（米国、オレゴン州、ＦｌｏｗＪｏ）を用いて分析した。
【０２６８】
組み換えＭＶＡおよびＦＰＶ  プライム／ブースト免疫付与の４個の可能な組み合わせを、Ｈ−２Ｋｋ＋  ＣＢＡＢ６  Ｆ１マウスで試験した。なぜなら、ザイールエボラウイルス（ＺＥＢＯＶ）グリコプロテイン（ＧＰ）からの強力なＣＤ８  Ｔ細胞がこのＭＨＣクラスＩハプロタイプ、つまりＧＰ５７７−５８４（ＴＥＬＲＴＦＳＩ）についての記載があったからである（Ｒａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  １７（２３−２４）：２９９１−８  （１９９９））。ＺＥＢＯＶ−ＧＰ固有のＩｇＧの血清濃度は、０日目および２１日目の皮下免疫付与の後、２１日目および４１日目に分析した。２１日目には、ＭＶＡで免疫付与されたすべてのマウスは頑強なＩｇＧ力価を有していたが、ＦＰＶで免疫付与されたマウスのわずか２０％が抗体陽転した。第２回目の免疫付与の後、すべての動物は、ＺＥＢＯＶ−ＧＰに特異的なＩｇＧに対して血清陽性であった。最も低い力価は、ＦＰＶを用いて同種免疫付与を行った後に観察しされた。ＭＶＡで２回免疫付与した動物と、ＦＰＶでプライムし、ＭＶＡでブーストした動物の間では、ＧＰに特異的なＩｇＧの濃度の違いは、４１日目には検出できなかった。しかし、ＭＶＡでプライムし、ＦＰＶでブーストしたマウスは、４１日目には、他のすべての群よりも多少高い力価を有していた（図８Ａ）。
【０２６９】
興味深いことに、最も強い抗体反応を生じた同じ組み合わせが、最も強いＣＤ８  Ｔ細胞反応をも誘導した。繰り返すと、ＦＰＶを用いた同種免疫付与は、最も弱いＣＴＬ反応、およびそれに続くＭＶＡ−ＭＶＡおよびＦＰＶ−ＭＶＡ免疫付与を生じた。ＭＶＡを用いたプライミング、およびそれに続くＦＰＶを用いたブーストは、ＭＶＡ−ＭＶＡの同種組み合わせよりも、約５倍多い細胞傷害性ＣＤ８  Ｔ細胞を誘導した（図８Ｂ）。
【０２７０】
これらを考え合わせると、高度に機能するＣＤ８  Ｔ細胞の存在によって示されるように、これらのデータは、１回目にＭＶＡ、２回目にＦＰＶを用いた異種免疫付与が、最も強いＺＥＢＯＶ−ＧＰ固有の抗体反応、および最も強いＣＴＬ反応をも誘導することを意味している。
【０２７１】
実施例５：強化されたＺＥＢＯＶ−ＧＰに特異的なＣＤ８  Ｔ細胞反応
Ｈ−２Ｋｋ＋  ＣＢＡマウスを、０日目および２１日目に５×１０７ＴＣＩＤ５０  ＭＶＡまたはＦＰＶを用いて、皮下免疫付与した。マウス（各群に５匹）を、脾臓細胞の細胞内サイトカイン染色によるＴ細胞分析のために、４２日目に犠牲にした。以下のプライム／ブースト投薬計画を使用した。１：ＭＶＡ−ＺＥＢＯＶ−ＧＰ（ｍＢＮ２５４）／ＦＰＶ−ＺＥＢＯＶ−ＧＰ（ｍＢＮ３６８），２：ＭＶＡ−マルチ−ｆｉｌｏ（ＭＶＡ−ｍＢＮ２２６）／ＦＰＶ−ＺＥＢＯＶ−ＧＰ（ｍＢＮ３６８）、３：ＭＶＡ−ＺＥＢＯＶ−ＧＰ−ＶＰ４０（ｍＢＮ２５５）／ＦＰＶ−ＺＥＢＯＶ−ＧＰ（ｍＢＮ３６８）。データを、図９に要約する。
【０２７２】
４２日目に、脾臓ＣＤ８  Ｔ細胞反応を、１０μｇ／ｍｌブレフェルジンおよび抗ＣＤ１０７ａ−ＦＩＴＣの存在下で、５μｇ／ｍｌ  ＺＥＢＯＶ−ＧＰ５７７−５８４ペプチド（ＴＥＬＲＴＦＳＩ）を用いて、インビトロで標準の６時間、再刺激した後に分析した。細胞を、抗ＣＤ４−ＢＶ６０５，抗ＣＤ８−ＢＶ４２１，  ＣＤ４４−ＡＰＣ−ｅＦｌｕｏｒ７８０を用いて表面染色し、そして抗ＩＦＮ−γ  −ＰＥＣｙ７および抗ＴＮＦ−α−ＰｅｒＣＰ−ｅＦｌｕｏｒ７１０  を用いて細胞内染色した。生きているか、死んでいるかの区別を、製造者の指示書（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にしたがい、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）Ｆｉｘａｂｌｅ  Ａｑｕａ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔによって行った。棒グラフは、ＣＤ１０７ａ＋，ＩＦＮ−γ＋およびＴＮＦ−α＋  ＣＤ８  Ｔ細胞を示す。５マウス／群からの平均±ＳＥＭを示す。ＺＥＢＯＶ−ＧＰ由来のペプチド  ＴＥＬＦＲＴＳＩに対するＣＤ８  Ｔ細胞反応は、ＭＶＡ−ＢＮ−ＺＥＢＯＶ／ＧＰ−ＶＰ４０がＭＶＡ−ＦＰＶ異種プライム−ブースト投薬計画でプライミング構築物として使用された場合は、プライミング構築物としてのＭＶＡ−ＺＥＢＯＶ−ＧＰ（ｍＢＮ２５４）またはＭＶＡ−マルチ−ｆｉｌｏ（ＭＶＡ−ｍＢＮ２２６）と比較して、約２倍強化された（図９）。
【０２７３】
実施例６：ＭＶＡ−ＧＰ−ＶＰ４０を用いたワクチン接種の後のＺＥＢＯＶに対するＮＨＰの強化された防御
カニクイザル−マカク（カニクイザル）に、皮下に２回（０日目および２８日目）、５×１０８ＴＣＩＤ５０の投与量のＭＶＡ−ＢＮ−ＺＥＢＯＶ／ＧＰ（ｎ＝３）、もしくはＭＶＡ−ＢＮ−ＺＥＢＯＶ／ＧＰ−ＶＰ４０（ｎ＝３）でワクチン接種、またはトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）を陰性対照（プラセボ群、ｎ＝２）として投与した。免疫付与の前、および攻撃の週単位の前（７日目、１４日目、２１日目、２８日目、３５日目および４０日目）に、エボラウイルスザイールグリコプロテイン（ＧＰ）に特異的な、およびＭＶＡ−主鎖に特異的なＥＬＩＳＡ法による分析のために血清を収集した。ブースターによるワクチン接種の４週間後、エボラウイルスザイール（キクウィト株）を用いて、動物を約１０００ｐｆｕの筋肉内投与によって攻撃した。
【０２７４】
【表５】
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【０２７５】
ザイールエボラウイルス（ＺＥＢＯＶ）特異的ＥＬＩＳＡ法
ＥＬＩＳＡを、組み換えＺＥＢＯＶ／ＧＰによって固定され、そしてＮＨＰ  ＩｇＧに対する西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を結合した抗体によって検出される、ＺＥＢＯＶ／ＧＰに特異的な抗体を決定するために行った。ＨＲＰ標識の結合した抗体の量は、基質反応の後、４５０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）値として測定した。抗体の濃度を、４パラメータ回帰分析にしたがい、そして単クローンマウス抗体を使用した標準曲線に基づいて計算した。
【０２７６】
ＥＬＩＳＡ法による結果が、図１０に描かれている。ＭＶＡ−ＢＮ−ＺＥＢＯＶ／ＧＰまたはＭＶＡ−ＢＮ−ＺＥＢＯＶ／ＧＰ−ＶＰ４０構築物を用いてワクチン接種をしたすべての動物は、すでにプライムワクチン接種および第２回のワクチン接種によって抗体反応がブーストした後、検出できる主鎖およびＺＥＢＯＶに特異定な抗体を有した。
【０２７７】
第２の試験において、カニクイザル−マカク（カニクイザル）に、皮下に３回（０日目、２８日目および５６日目）５×１０８ＴＣＩＤ５０の投与量のＭＶＡ−ＢＮ−マルチ−ｆｉｌｏ（ＭＶＡ−ｍＢＮ２２６、ｎ＝２）またはＭＶＡ−ＢＮ−ＺＥＢＯＶ／ＧＰ−ＶＰ４０（ＭＶＡ−ｍＢＮ２５５、ｎ＝２）でワクチン接種、または陰性対照（プラセボ群、ｎ＝２）としてトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）を投与した。免疫付与の前、および攻撃の前に毎週（０日目、２７日目、４１日目、５５日目、３５日目、および６７日目）、エボラウイルスザイールグリコプロテイン（ＧＰ）に特異的な中和アッセイによる分析のために血清を収集した（図１１）。最後のワクチン接種の４週間後、動物に約１００ｐｆｕの筋肉内投与によるエボラウイルスザイール（キクウィト株）を用いた攻撃をした。
【０２７８】
【表６】
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【０２７９】
ＭＶＡ−ＢＮ−ＺＥＢＯＶ／ＧＰ−ＶＰ４０を用いたワクチン接種は、プライムワクチン接種後に、すでに検出できた抗体を中和する結果を生じたが、一方ＭＶＡ−ＢＮ−マルチ−ｆｉｌｏは、２７日目のプライムワクチン接種後に、検出できるレベルの中和抗体を誘導しなかった（図１１）。ＭＶＡ−ＢＮ−ＺＥＢＯＶ／ＧＰ−ＶＰ４０を用いてワクチン接種をした動物は、分析のすべての時点を通じて、ＭＶＡ−ＢＮ−マルチ−ｆｉｌｏでワクチン接種をした動物よりも高い中和抗体力価を有した。ＺＥＢＯＶの攻撃後、ＭＶＡ−ＢＮ−マルチ−ｆｉｌｏは、攻撃後７日目までに死んだが、他方ＭＶＡ−ＢＮ−ＺＥＢＯＶ／ＧＰ−ＶＰ４０でワクチン接種をした動物は、症状または一時的発熱の発現なしで生き延びた。
【０２８０】
実施例７：ＧＰおよびＶＰ４０のＶＬＰ形成およびタンパク質発現
ＨｅＬａ細胞を、１０のＭＯＩで示されたウイルスを用いて感染させた。感染２日後、上清を採取し、次いで、清澄化した上清（ＳＮ）中のＶＬＰを超遠心分離法（ＵＣ−ＳＮ）による２０％のスクロースクッションを通じてペレットとした。細胞溶解物を、１×Ｌａｅｍｍｌｉバッファー中で、細胞の直接溶解によって調製した。細胞溶解物を、免疫ブロット分析のためのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離の前に、１：５に希釈した。ＵＣ−ＳＮは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの前には希釈しなかった。ＺＥＢＯＶ−ＧＰをＵＳＡＭＲＩＩＤから、単クローンマウス抗体（クローン６Ｄ８）を使用して検出し、そしてＺＥＢＯＶ−ＶＰ４０をＩＢＴ  Ｂｉｏｓｅｒｖｉｃｅｓの精製したウサギポリクローナル抗体を使用して検出した。
【０２８１】
ＧＰおよびＶＰ４０の発現を、免疫ブロット法による新鮮な調合液中で確認した。両方のタンパク質が、細胞溶解物中に存在し、ＵＣ−ＳＮ中で濃縮もされた（図１２Ｃ）。基質タンパク質ＶＰ４０の発現は、ＶＬＰの形成にとって十分であることが知られており、ＶＰ４０とＧＰタンパク質の直接的な相互作用は報告されていない。ＧＰが実際ＶＰ４０  ＧＰと共にＶＬＰの中に組み込まれることを示すことは、感染細胞のＳＮから免疫沈降した。この目的のために、ＨｅＬａ細胞をＭＶＡ−ＺＥＢＯＶ／ＧＰ−ＶＰ４０で感染させ、対照細胞をＭＶＡ−ＺＥＢＯＶ／ＧＰおよびＢＡＣに由来するＭＶＡ−ｗｔで感染させた。ＢＡＣに由来するＭＶＡ−ｗｔは、以前、Ｍｅｉｓｉｎｇｅｒ−Ｈｅｎｓｃｈｅｌら（Ｍｅｉｓｉｎｇｅｒ−Ｈｅｎｓｃｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０），  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ８４（１９）：９９０７−９９１９）に記載されている。感染細胞からのＳＮは、抗ＧＰ特異抗体を使用して免疫沈降（ＩＰ）された。ＳＮのアリコートは、免疫沈降の前、３０分の間、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  （ＴＸ−１００）を用いて処理し、これは以前、ネズミ科の白血病ウイルスの成熟したエンベロープＶＬＰの大半を破壊したと示されていた（Ｄａｖｉｄｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２），  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４３３（２）：４０１−４０９）。
【０２８２】
このＩＰ−複合体を、次に、免疫ブロット法によって、ＧＰおよび共沈殿したＶＰ４０が存在するかどうかについて分析した。免疫沈降（ＩＰ）のために、清澄化したＳＮを１晩、４℃で、タンパク質  Ｇ−アガロース（１０μｌ）と共に、抗ＺＥＢＯＶ−ＧＰ（クローン６Ｄ８，ＵＳＡＭＲＩＩＤ）抗体を用いて培養した。免疫沈降物の免疫ブロットを、次に、ＺＥＢＯＶ−ＧＰ（単クローン抗体６Ｄ８）および（ＩＢＴからの）ＺＥＢＯＶ−ＶＰ４０に対する抗体をとともに培養した。ＧＰタンパク質は、ＶＰ４０の存在から独立して、ＧＰ（図１２Ｄ，上のパネル）のみを発現している細胞のＳＮから効率的に免疫沈降した。重要なことに、ＶＰ４０は、ＴＸ−１００（図１２Ｄ、下のパネル、２レーン）が存在しない場合に限り、ＭＶＡ−ＺＥＢＯＶ／ＧＰ−ＶＰ４０に感染した細胞の上清からのＧＰとともに共免疫沈降し、これはＧＰが実際にＶＬＰに取り込まれていることを示す。ＴＸ−１００はＶＬＰを攪乱することが予期されており、そして直接的なＧＰ−ＶＰ４０の相互作用は存在しないので、ＴＸ−１００で処理したサンプル中でＶＰ４０は共沈殿することはできない（図１２Ｄ、下のパネル、４レーン）。従って、実際にＶＬＰを提示するＧＰが、組み換えＭＶＡによる感染時に生成された。
【０２８３】
実施例８：２９３Ｔ／１７におけるＶＬＰ形成  
細胞を感染させた後、より高いＶＬＰ濃度をできるだけ得るために、新鮮なＶＬＰの調合のための２９３Ｔ／１７細胞。調合液のタンパク質成分を、ＧＰおよびＶＰ４０について、ウエスタンブロットによって分析した。
【０２８４】
Ｔ１７５培養皿中の２９３Ｔ／１７細胞を、１０のＭＯＩを有する指示されたウイルスを用いて感染させた。上清を、感染２４時間後に収集し、３×ローディングバッファー（粗ＳＮ）と直接混合するか、または２０％のスクロースクッション（ＵＺ−ｐｒｅｐ）上に濃縮した。細胞溶解物（ＣＬ）を、１×ローディングバッファー中で調製した。タンパク質を、変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、サイズに従い分離した。免疫ブロットを、抗ＧＰ抗体（クローン６Ｄ８、１：２５００、ＵＳＡＭＲＩＩＤ）または抗ＶＰ４０抗体（ポリクローナル、１：１０００、ＩＢＴ）を用いて培養し、そして化学発光基質を使用して発育させた。
【０２８５】
ＥＢＯＶグリコプロテイン（ＧＰ）の発現は、感染細胞からの細胞溶解物（ＣＬ）および上清（ＳＮ）の両者におけるＭＶＡ−ｆｉｌｏ−ＶＬＰの感染後の、ＭＶＡ−ＺＥＢＯＶ／ＧＰおよびＭＶＡ−ＺＥＢＯＶ／ＧＰ−ＶＰ４０（ＭＶＡ−ｆｉｌｏ−ＶＬＰ）、ＶＰ４０を用いた細胞の感染後には、容易に検出できた。驚くべきことに、ＭＶＡ−ＺＥＢＯＶ／ＧＰで感染した細胞は、ＭＶＡ−ｆｉｌｏ−ＶＬＰを用いて感染させた細胞と比較すると、より多くのＧＰを発現するように思われるが、一方ＭＶＡ−ｆｉｌｏ−ＶＬＰを用いた場合は、ＳＮにより多くのＧＰが発見された。このことは、おそらく、ＭＶＡ−ｆｉｌｏ−ＶＬＰを用いた場合は、ＧＰおよびＶＰ４０の同時発現が感染細胞からの（ＶＬＰの形態での）ＧＰの放出を高めるという事実を反映している。ＧＰおよびＶＰ４０の両タンパク質は、ＵＺ−ｐｒｅｐ中に存在しており、これはＧＰおよびＶＰ４０がＵＺによって収集されたことを示している。いくらかのＧＰおよびＶＰ４０も、ＵＺの後、ＳＮに未だ存在していた。ただし粗ＳＮと比較したときはその量は少なかった、特にこのことはＶＰ４０について当てはまる。したがって、主としてＶＬＰの形態で存在しているＶＰ４０は、ＧＰと共に、ＳＮから大きく減少しているが、ＧＰプール（おそらくは、多形性粒子の形態で）の部分は、ＵＺ後にＳＮ中に残る。
【０２８６】
２９３Ｔ／１７細胞からのＶＬＰの透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）および免疫電子顕微鏡分析  は、それぞれのＭＶＡ組み換えによって生成したＭＶＡ−ｆｉｌｏ−ＶＬＰが、ｆｉｌｏ−ＶＬＰの全表面を覆うＧＰ、ＧＰスパイクを用いて密に修飾されていることを示した。さらには、ＭＶＡ−ｗｔまたはＭＶＡ−ＺＥＢＯＶ／ＧＰを用いて感染させた細胞からの調製物を、免疫ＥＭによって分析した。これらのサンプルにおいて、ＶＬＰは検出されなかった。
【０２８７】
実施例９：ＮＨＰにおける異種プライム−ブースト免疫付与の免疫原性
４匹のカニクイザル−マカクに、０日目および２８日目に（皮下）ワクチン接種をした。２匹の動物は、０日目にプライムとして５×１０８ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ−ｍＢＮ２２６を、２８日目にブーストとして１×１０９ＴＣＩＤ５０のＦＰＶ−ｍＢＮ３６８を受けた。１匹の動物は、０日目にプライムとして１×１０９ＴＣＩＤ５０のＦＰＶ−ｍＢＮ３６８およびブーストとして５×１０８ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ−ｍＢＮ２２６を受けた。１匹の対照動物はＴＢＳのみを受けた。０日目、７日目、２８日目、３５日目および４９日目に、ＰＢＭＣを単離した。０日目、２８日目および４９日目に、それぞれ、血液学、臨床化学、凝固パラメータ、ＰＢＭＣの単離またはＴ細胞および抗体反応の分析のための血清のために、ならびにウイルス量分析のために、血液を収集した。血清試料を、ＥＬＩＳＡ法およびＦＲＮＴによって、エボラに特異的な体液性反応について分析した。ＧＰおよびワクシニアに特異的なＴ細胞を、ワクシニアワイエスを用いた、ＺＥＢＯＶ／ＧＰペプチドライブラリーを用いた、インビトロでのＰＢＭＣの再刺激によって分析し、次いで、ＥＬＩＳＰＯＴによってＩＦＮ−γ分泌細胞を検出した。すべての動物は、５６日目に、ＥＢＯＶ  キクウィト−９５１０６２１の筋肉内攻撃（１００ｐｆｕ）を受けた。ＭＶＡおよびＦＰＶを用いた異種プライム・ブーストを受けた３匹のすべての動物は、生き残った。完全なセロコンバージョン  は、プライムの後にすでに得たが、それはブーストによってさらに改善した。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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