(57)【要約】本発明は、細菌感染およびインフルエンザウイルス感染を含む重感染、または細菌感染のみを予防および/または治療するための方法における使用のための、MEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤に関する。また、細菌感染およびインフルエンザウイルス感染を含む重感染、または細菌感染のみの予防および/または治療における使用のためのそのような阻害剤を含む組成物も提供される。加えて、インフルエンザウイルスおよび細菌に感染した培養細胞または細菌のみに感染した培養細胞を含む、インビトロの試験システムが提供される。2017515910.tif 000010
2017515910.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌感染およびインフルエンザウイルス感染を含む重感染を予防および/または治療するための方法における使用のための、MEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤。
【請求項２】
細菌感染を予防および/または治療するための方法における使用のための、MEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤。
【請求項３】
細菌感染が、スタフィロコッカス科(Staphylococcaceae)、連鎖球菌科(Streptococcaceae)、レジオネラ科(Legionellaceae)、シュードモナス科(Pseudomonadaceae)、クラミジア科(Chlamydiaceae)、マイコプラズマ科(Mycoplasmataceae)、腸内細菌科(Enterobacteriaceae)、シュードモナス目(Pseudomonadales)、および/またはパスツレラ科(Pasteurellaceae)からなる群より選択される細菌によって媒介される、請求項1または2記載の使用のためのMEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤。
【請求項４】
インフルエンザウイルス感染がインフルエンザA型ウイルスまたはインフルエンザB型ウイルスによって媒介される、請求項1または3のいずれか一項記載の使用のためのMEK阻害剤、p38阻害剤および/またはNFκB阻害剤。
【請求項５】
インフルエンザA型ウイルスが、H1N1、H2N2、H3N2、H6N1、H7N7、H7N9、H9N2 H10N7、H10N8、またはH5N1、好ましくはH3N2、H5N1、H1N1、およびH7N9である、請求項4記載の使用のためのMEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤。
【請求項６】
MEK阻害剤が、U0126、PLX-4032、AZD6244、AZD8330、AS-703026、GSK-1120212、RDEA-119、RO-5126766、RO-4987655、CI-1040、PD-0325901、GDC-0973、TAK-733、PD98059、ARRY-438162、PF-3644022、およびPD184352、好ましくはAZD8330、GSK-1120212、U0126、GDC-0973、CI-1040、PD0325901、ARRY-438162、PF-3644022、およびAZD6244からなる群より選択される、請求項1〜5のいずれか一項記載の使用のためのMEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤。
【請求項７】
p38阻害剤が、SB202190、LY2228820、CAY10571、SB 203580、Tie2キナーゼ阻害剤、2-(4-クロロフェニル)-4-(フルオロフェニル)-5-ピリジン-4-イル-1,2-ジヒドロピラゾール-3-オン、CGH 2466、SB220025、抗生物質LL Z1640-2、TAK 715、SB202190塩酸塩、SKF 86002、AMG548、CMPD-1、EO 1428、JX 401、ML 3403、RWJ 67657、SB 202190、SB 203580、SB 203580塩酸塩、SB 239063、SCIO 469、SX 011、TAK 715、パマピモド、ロスマピモド(GW856553)、ディルマピモド(SB681323)、VX 702、VX 745、ドラマピモド(BIRB 796)、BMS-582949、ARRY-797、PH797804、好ましくはVX-702、SB202190、パマピモド、ロスマピモド(GW856553)、ディルマピモド(SB681323)、ドラマピモド(BIRB 796)、BMS-582949、ARRY-797、PH797804、およびSCIO-469からなる群より選択される、請求項1〜6のいずれか一項記載の使用のためのMEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤。
【請求項８】
NFκB阻害剤が、LASAG、SC75741、MG 132、TPCA-1、PCTC、IMD 0354、ルテオリン、カフェイン酸フェネチルエステル、カルダモニン、PF 184、IKK 16、SC 514、ウィザフェリンA、アルクチゲニン、Bay 11-7085、PSI、PR 39、Ro 106-9920、Bay 11-7821、ML-130、セラストロール、タンシノンIIA、HU 211、グリオトキシン、CID 2858522、ホノキオール、アンドログラフォライド、10Z-ヒメニアルジシン、ACHP、プリスチメリン、スルファサラジン、ML 120B二塩酸塩、アンレキサノクス、9-メチルストレプトイミドン、N-ステアロイルフィトスフィンゴシン、2-(1,8-ナフチリジン-2-イル)-フェノール、5-アミノサリチル酸、BAY 11-7085、3,4-ジヒドロキシ桂皮酸エチル、ヘレナリン(Helanalin)、NF-κB活性化阻害剤II、JSH-23、グルココルチコイド受容体調節因子、CpdA、PPM-18、ASA、ピロリジンジチオカルバミン酸アンモニウム塩、(R)-MG132、SC75741、ロカグラミド、サリチル酸ナトリウム、QNZ、PS-1145、CAY10512、ボルテゾミブ、サルサレート、レスベラトロール、デオキシスペルグアリン、スリンダク、サリドマイド、AGRO-100、CHS 828、および/またはクルクミン、好ましくはボルテゾミブ、クルクミン、ASA、サルサレート、レスベラトロール、サリチル酸ナトリウム、LASAG、SC75741、デオキシスペルグアリン、スリンダク、サリドマイド、AGRO-100、および/またはCHS 828からなる群より選択される、請求項1〜7のいずれか一項記載の使用のためのMEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤。
【請求項９】
MEK阻害剤が別のMEK阻害剤、p38阻害剤、および/もしくはNFκB阻害剤と組み合わされ、p38阻害剤が別のp38阻害剤、MEK阻害剤、および/もしくはNFκB阻害剤と組み合わされ、またはNFκB阻害剤が別のNFκB阻害剤、p38阻害剤、および/もしくはMEK阻害剤と組み合わされる、請求項1〜8のいずれか一項記載の使用のためのMEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤。
【請求項１０】
インフルエンザウイルスおよび/または細菌を標的とする1つまたは複数の阻害剤と組み合わされる、請求項1、3〜9のいずれか一項記載の使用のためのMEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤。
【請求項１１】
細菌を標的とする1つまたは複数の阻害剤と組み合わされる、請求項1〜10のいずれか一項記載の使用のためのMEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤。
【請求項１２】
インフルエンザウイルスおよび/または細菌を標的とする1つまたは複数の阻害剤と同時に、その前にまたはその後に投与される、請求項10記載の使用のためのMEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤。
【請求項１３】
インフルエンザウイルスを標的とする1つまたは複数の阻害剤が、ノイラミニダーゼ阻害剤、好ましくはリン酸オセルタミビル、ザナミビル、オセルタミビル、またはペラミビルである、請求項10または12記載の使用のためのMEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤。
【請求項１４】
インフルエンザウイルスを標的とする1つまたは複数の阻害剤が、イオンチャネルタンパク質(M2)を標的とする化合物、好ましくはアマンタジン、および/またはリマンタジンである、請求項10または12記載の使用のためのMEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤。
【請求項１５】
インフルエンザウイルスを標的とする1つまたは複数の阻害剤が、ウイルスポリメラーゼ複合体の成分PB1、PB2、PA、またはNPと干渉することによってポリメラーゼ活性またはエンドヌクレアーゼ活性を標的とする化合物、好ましくはNP遮断薬ヌクレオジンまたはポリメラーゼ阻害剤T-705である、請求項10または12記載の使用のためのMEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤。
【請求項１６】
細菌を標的とする1つまたは複数の阻害剤が、抗生物質、好ましくはゲンタマイシン、リファンピシン、リゾスタフィン、エリスロマイシン、レボフロキサシン、バンコマイシン、テイコプラニン、ペニシリン、およびオキサシリンである、請求項10〜15記載の使用のためのMEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤。
【請求項１７】
対象、好ましくは脊椎動物における請求項1〜16のいずれか一項記載の使用のためのMEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤。
【請求項１８】
MEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤を、
a) インフルエンザウイルスおよび
b) 細菌
に感染した培養細胞を含むインビトロの試験システムに接触させた場合に、接触前のインビトロの試験システムと比較してウイルス感染および細菌感染の両方を低減する、請求項1、3〜17のいずれか一項記載の使用のためのMEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤。
【請求項１９】
ウイルス感染の低減がプラーク形成単位(pfu)/mlの低減であり、かつ細菌感染の低減がコロニー形成単位(CFU)/mlの低減である、請求項18記載の使用のためのMEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤。
【請求項２０】
細菌感染およびインフルエンザウイルス感染を含む重感染を予防および/または治療するための方法における使用のための、MEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤を含む、組成物。
【請求項２１】
細菌感染を予防および/または治療するための方法における使用のための、MEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤を含む、組成物。
【請求項２２】
細菌感染およびインフルエンザウイルス感染を含む重感染を予防および/または治療するための方法における使用のための、MEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤、ならびにインフルエンザウイルスおよび/または細菌を標的とする1つまたは複数の阻害剤を含む、組成物。
【請求項２３】
細菌感染を予防および/または治療するための方法における使用のための、MEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤、ならびに細菌を標的とする1つまたは複数の阻害剤を含む、組成物。
【請求項２４】
a) インフルエンザウイルスおよび
b) 細菌
に感染した培養細胞を含む、インビトロの試験システム。
【請求項２５】
細菌感染およびインフルエンザウイルス感染を含む重感染を低減するのに有効な阻害剤の判定のための請求項24記載のインビトロの試験システムの使用。
【請求項２６】
接触前のインビトロの試験システムと比較してウイルス感染および細菌感染の両方を低減する関心対象の化合物を、請求項24記載のインビトロの試験システムに接触させる段階を含む、細菌感染およびインフルエンザウイルス感染を含む重感染を予防および/または治療するのに有効な分子を検出するための方法。
【請求項２７】
ウイルス感染の低減がプラーク形成単位(pfu)/mlの低減であり、かつ細菌感染の低減がコロニー形成単位(CFU)/mlの低減である、請求項25記載の使用または請求項26記載の方法。
【請求項２８】
細菌に感染した培養細胞を含む、インビトロの試験システム。
【請求項２９】
シグナル伝達のレベル、結果として生じるサイトカインおよびケモカイン発現、アポトーシスおよびネクローシスの誘導、ならびに/または健康状態および疾患を調節する酸化還元ホメオスタシスの検査を任意で含む、先天性宿主細胞応答の検査のための請求項24記載のおよび請求項28記載のインビトロの試験システムの使用。
【請求項３０】
細菌感染を低減するのに有効な阻害剤の判定のための請求項29記載のインビトロの試験システムの使用。
【請求項３１】
接触前のインビトロの試験システムと比較して細菌感染を低減する関心対象の化合物を、請求項29記載のインビトロの試験システムに接触させる段階を含む、細菌感染を予防および/または治療するのに有効な分子を検出するための方法。
【請求項３２】
インフルエンザウイルスおよび細菌に感染した培養細胞。
【請求項３３】
細菌に感染した培養細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、細菌感染およびインフルエンザウイルス感染を含む重感染を、または細菌感染のみを予防および/または治療するための方法における使用のためのMEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤に関する。また、細菌感染およびインフルエンザウイルス感染を含む重感染の、または細菌感染のみの予防および/または治療における使用のためのそのような阻害剤を含む組成物も提供される。加えて、インフルエンザウイルスおよび細菌に感染した培養細胞または細菌のみに感染した培養細胞を含む、インビトロの試験システムが提供される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
インフルエンザA型ウイルスは、かなりの罹患率および死亡率をもたらす重症呼吸器疾患の原因病原体である。インフルエンザウイルス(IV)感染の経過中の致死的症例の大部分は、実際には、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus (S. aureus))、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)、およびインフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)のような異なる細菌によって引き起こされる二次性肺炎の結果である(Morens et al., 2008, Chertow et al., 2013)。細菌重感染の最も顕著な問題は、病原性の突然増加であり(Iwao et al., 2012, Paddock et al., 2012, Parker et al., 2012)、異なる病原菌に対する強力な抗感染薬の蓄えが限られていることである。インフルエンザウイルスの高い変動性および新しい菌株の継続的な出現(Neumann et al., 2009, Taubenberger et al., 2010, Parry, 2013)、細菌株に固有の特徴(Grundmann et al., 2006, Moran et al., 2006, Gillet et al., 2007, Shilo et al., 2011)、ならびに利用可能な薬物/抗生物質に対しての、インフルエンザウイルス(Hayden et al., 1992, Bright et al., 2006, Pinto et al., 2006, De Clercq et al., 2007, Pinto et al., 2007)および細菌(Grundmann et al., 2006, Moran et al., 2006, Shilo et al., 2011)の両方の急速な耐性発現が、不十分な治療選択肢の主因である。さらに、これまで、インフルエンザウイルスおよび細菌の重感染の治療が単一の化合物で可能ではないことは付帯的な事柄である。本発明は、単一薬物を用いることによるIVおよび黄色ブドウ球菌の重感染に対する新規の抗感染戦略を提案するという点でこの問題を解決する。さらに、本発明は、細菌自体よりもむしろ細胞因子を標的とする薬物を提供することによって、細菌の急速な耐性発現の問題を解決する。
【発明の概要】
【０００３】
技術的な問題は、添付の特許請求の範囲に反映された態様、説明に記述された態様、ならびに実施例および図面において例示された態様により解決される。
【０００４】
上記の通り、本発明は、細菌感染およびインフルエンザウイルス感染を含む重感染を予防および/または治療するための方法における使用のための、MEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤に関する。
【０００５】
加えて、本発明は、細菌感染を予防および/または治療するための方法における使用のための、MEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤に関する。
【０００６】
前世紀における徹底した研究にもかかわらず、IVは依然として人類にとって重大な脅威となっている。高齢者および免疫不全の者にとって特に危険な季節的流行は、インフルエンザA型またはB型ウイルスの感染によるものである。
【０００７】
過去数十年以内に、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌株の発生率が増加しており、IVに同時に感染した幼児および小児においてとりわけ問題を引き起こしている(Iverson et al., 2011, Thorburn et al., 2012)。細菌重感染時に起こる1つの大きな問題は、急激かつ高度に病原性が高まることであり、これはおそらく、組織損傷にもつながる急速なサイトカイン発現によって引き起こされる。特に、パントン-バレンタインロイコシジン(PVL)発現性の黄色ブドウ球菌の重感染時には、PVL媒介性の好中球死滅後にプロテアーゼが無制御に放出されるため、重度の肺上皮損傷が観察される(Gillet et al., 2007, Niemann et al., 2012)。細菌重感染は、通常、IV感染の最初の6日以内に発生し、さらに劇症性の疾病、肺炎およびより高い死亡率をもたらす(Iverson et al., 2011, Chertow et al., 2013)。しかし、症例によっては、ウイルス感染が既に治っていると思われる時点で、細菌の重感染が現れる。ウイルス/細菌重感染の治療については、限られた可能性しか存在しない。
【０００８】
インフルエンザと戦うための有望な抗ウイルス戦略の1つは、細胞内病原体としてのIVが細胞シグナル伝達機構に強く依存しているという事実に基づいている(Gong et al., 2009, Ludwig, 2009)。IVは、それ自身のために細胞因子をハイジャックする能力を獲得した(Ludwig et al.,2003)。さらに、IVは、その宿主の先天性免疫応答を抑制することができる。これらの依存性を考慮すると、細胞のウイルス支持機能は、新規な抗ウイルス介入の最も有望な候補である(Ludwig et al., 2003, Ludwig, 2011, Planz, 2013)。過去数年の間に、本発明者らおよび他者らは、抗ウイルスアプローチのための適当な標的として、Raf/MEK/ERK分裂促進因子キナーゼカスケード(Pleschka et al., 2001, Ludwig et al., 2004, Olschlager et al., 2004, Marjuki et al., 2006, Ludwig, 2009, Droebner et al., 2011)、IKK/NFκBモジュール(Pleschka et al., 2001, Wurzer et al., 2004, Marjuki et al., 2006, Mazur et al., 2007, Ludwig et al., 2008, Dudek et al., 2010, Droebner et al., 2011, Ehrhardt et al., 2013, Haasbach et al., 2013)、p38シグナル伝達(Borgeling et al., 2014)および同様にPI3Kシグナル伝達(Ehrhardt et al., 2006, Ehrhardt et al., 2007a, Ehrhardt et al., 2007b, Ehrhardt et al., 2009, Eierhoff et al., 2010)経路を同定した。
【０００９】
ウイルス因子ではなく細胞因子を標的とすることは、病原体が、欠損した細胞機能を差し替えることができないので、耐性の問題を防ぐ。いくつかの細胞因子に関しては、化合物が入手可能であり、初期段階ではあるが、それらのうちのいくつかは臨床試験に入っているか、または既に認可さえされている。
【００１０】
IVの複製とは対照的に、黄色ブドウ球菌の分裂は宿主細胞非依存性である。新規の抗菌代替手段では、病原体によって産生された必須遺伝子産物を標的にしないが、細菌を死滅させたりまたは宿主免疫を増強したりせずに黄色ブドウ球菌の感染中に毒性因子を阻害する(Park et al., 2012)。他の戦略は、ヒト宿主における黄色ブドウ球菌のコロニー形成を妨げる(Park et al., 2012)。これらの化合物はまた、耐性を誘導する可能性がより低い。最近、黄色ブドウ球菌もまた、感染の間にそれ自身の利益のために細胞シグナル伝達を用いるという証拠が蓄積されている(Oviedo-Boyso et al., 2011)が、このような細菌支持性の細胞因子は、抗菌治療の標的として詳細にはまだ特徴付けられていない。
【００１１】
本発明者らは、驚くべきことに、抗インフルエンザ活性を有することが以前に示されたNFκB、MEK、またはp38 MAPキナーゼのような、細胞内シグナル伝達因子に対する薬物も、抗黄色ブドウ球菌活性を示し、重感染のシナリオにおいてウイルス力価および細菌力価の両方を低減することを見出した。したがって、これらのシグナル伝達阻害剤は、IVまたは黄色ブドウ球菌感染のみの治療のための最も有望な候補であるばかりか、最も重要なことには、細菌の重感染を伴う重度インフルエンザに対してもそうである。
【００１２】
1つの態様において、MEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤は、細菌感染が、スタフィロコッカス科(Staphylococcaceae)、連鎖球菌科(Streptococcaceae)、レジオネラ科(Legionellaceae)、シュードモナス科(Pseudomonadaceae)、クラミジア科(Chlamydiaceae)、マイコプラズマ科(Mycoplasmataceae)、腸内細菌科(Enterobacteriaceae)、シュードモナス目(Pseudomonadales)、および/またはパスツレラ科(Pasteurellaceae)からなる群より選択される細菌によって媒介される、本発明の重感染または細菌感染を予防および/または治療するための方法における使用のためのものである。
【００１３】
別の態様において、MEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤は、インフルエンザウイルス感染がインフルエンザA型ウイルスまたはインフルエンザB型ウイルスによって媒介され、好ましくはインフルエンザA型ウイルスが、H1N1、H2N2、H3N2、H6N1、H7N7、H7N9、H9N2 H10N7、H10N8、またはH5N1である、本発明の重感染を予防および/または治療するための方法における使用のためのものである。1つの態様において、インフルエンザA型ウイルスはH1N1である。他の態様において、インフルエンザA型ウイルスはH3N2、H5N1、およびH7N9である。さらなる態様において、インフルエンザA型ウイルスはH3N2、H5N1、H1N1、およびH7N9である。
【００１４】
さらなる態様において、MEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤は、MEK阻害剤が、U0126、PLX-4032、AZD6244、AZD8330、AS-703026、GSK-1120212、RDEA-119、RO-5126766、RO-4987655、CI-1040、PD-0325901、GDC-0973、TAK-733、PD98059、ARRY-438162、PF-3644022、およびPD184352、好ましくはAZD8330、GSK-1120212、U0126、GDC-0973、CI-1040、PD0325901、ARRY-438162、PF-3644022、およびAZD6244、最も好ましくはU0126、GDC-0973、CI-1040、AZD8330、およびGSK-1120212からなる群より選択される、本発明の重感染または細菌感染を予防および/または治療するための方法における使用のためのものである。
【００１５】
別の態様において、MEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤は、p38阻害剤が、SB202190、LY2228820、CAY10571、SB 203580、Tie2キナーゼ阻害剤、2-(4-クロロフェニル)-4-(フルオロフェニル)-5-ピリジン-4-イル-1,2-ジヒドロピラゾール-3-オン、CGH 2466、SB220025、抗生物質LL Z1640-2、TAK 715、SB202190塩酸塩、SKF 86002、AMG548、CMPD-1、EO 1428、JX 401、ML 3403、RWJ 67657、SB 202190、SB 203580、SB 203580塩酸塩、SB 239063、SCIO 469、SX 011、TAK 715、パマピモド、ロスマピモド(GW856553)、ディルマピモド(SB681323)、VX 702、VX 745、ドラマピモド(BIRB 796)、BMS-582949、ARRY-797、PH797804、好ましくはVX-702、SB202190、パマピモド、ロスマピモド(GW856553)、ディルマピモド(SB681323)、ドラマピモド(BIRB 796)、BMS-582949、ARRY-797、PH797804、およびSCIO-469からなる群より選択される、本発明の重感染または細菌感染を予防および/または治療するための方法における使用のためのものである。
【００１６】
別の態様において、MEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤は、NFκB阻害剤が、LASAG (LG-ASAとも呼ばれる)、SC75741、MG 132、TPCA-1、PCTC、IMD 0354、ルテオリン、カフェイン酸フェネチルエステル、カルダモニン、PF 184、IKK 16、SC 514、ウィザフェリンA、アルクチゲニン、Bay 11-7085、PSI、PR 39、Ro 106-9920、Bay 11-7821、ML-130、セラストロール、タンシノンIIA、HU 211、グリオトキシン、CID 2858522、ホノキオール、アンドログラフォライド、10Z-ヒメニアルジシン、ACHP、プリスチメリン、スルファサラジン、ML 120B二塩酸塩、アンレキサノクス、9-メチルストレプトイミドン、N-ステアロイルフィトスフィンゴシン、2-(1,8-ナフチリジン-2-イル)-フェノール、5-アミノサリチル酸、BAY 11-7085、3,4-ジヒドロキシ桂皮酸エチル、ヘレナリン(Helanalin)、NF-κB活性化阻害剤II、JSH-23、グルココルチコイド受容体調節因子、CpdA、PPM-18、アスピリン(ASA)、ピロリジンジチオカルバミン酸アンモニウム塩、(R)-MG132、SC75741、ロカグラミド、サリチル酸ナトリウム、QNZ、PS-1145、CAY10512、ボルテゾミブ、サルサレート、レスベラトロール、デオキシスペルグアリン、スリンダク、サリドマイド、AGRO-100、CHS 828、および/またはクルクミン、好ましくはボルテゾミブ、クルクミン、アスピリン(ASA)、サルサレート、レスベラトロール、サリチル酸ナトリウム、LASAG (LG-ASAとも呼ばれる)、デオキシスペルグアリン、スリンダク、サリドマイド、AGRO-100、CHS 828、さらにより好ましくはSC75741、ASA、およびLASAG (LG-ASAとも呼ばれる)、最も好ましくはLASAG (LG-ASAとも呼ばれる)からなる群より選択される、本発明の重感染または細菌感染を予防および/または治療するための方法における使用のためのものである。
【００１７】
別の態様において、MEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤は、MEK阻害剤が別のMEK阻害剤、p38阻害剤、および/もしくはNFκB阻害剤と組み合わされ; p38阻害剤が別のp38阻害剤、MEK阻害剤、および/もしくはNFκB阻害剤と組み合わされ、またはNFκB阻害剤が別のNFκB阻害剤、p38阻害剤、および/もしくはMEK阻害剤と組み合わされる、本発明の重感染または細菌感染を予防および/または治療するための方法における使用のためのものである。
【００１８】
さらなる態様において、MEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤は、MEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤が、インフルエンザウイルスおよび/または細菌を標的とする1つまたは複数の阻害剤と組み合わされる、本発明の重感染を予防および/または治療するための方法における使用のためのものである。1つの態様において、MEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤は、インフルエンザウイルスおよび/または細菌を標的とする1つまたは複数の阻害剤と同時に、その前にまたはその後に投与される。したがって、MEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤は、インフルエンザウイルスを標的とする1、2、3、4、5、6、7、または8つの阻害剤と組み合わせることができる。同様に、MEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤は、細菌を標的とする1、2、3、4、5、6、7、または8つの阻害剤と組み合わせることができる。1つの態様において、インフルエンザウイルスを標的とする1つまたは複数の阻害剤は、ノイラミニダーゼ阻害剤、好ましくはリン酸オセルタミビル、ザナミビル、オセルタミビル、またはペラミビルである。別の態様において、インフルエンザウイルスを標的とする1つまたは複数の阻害剤は、イオンチャネルタンパク質(M2)を標的とする化合物、好ましくはアマンタジンおよび/またはリマンタジンである。さらなる態様において、インフルエンザウイルスを標的とする1つまたは複数の阻害剤は、ウイルスポリメラーゼ複合体の成分PB1、PB2、PA、またはNPと干渉することによってポリメラーゼ活性またはエンドヌクレアーゼ活性を標的とする化合物、好ましくはNP遮断薬ヌクレオジンまたはポリメラーゼ阻害剤T-705である。
【００１９】
さらなる態様において、MEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤は、MEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤が、細菌を標的とする1つまたは複数の阻害剤と組み合わされる、本発明の細菌感染を予防および/または治療するための方法における使用のためのものである。
【００２０】
別の態様において、MEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤は、本発明の重感染または細菌感染を予防および/または治療するための方法における使用のためのものであり、細菌を標的とする1つまたは複数の阻害剤は、抗生物質、好ましくはゲンタマイシン、リファンピシン、リゾスタフィン、エリスロマイシン、レボフロキサシン、バンコマイシン、テイコプラニン、ペニシリン、およびオキサシリンである。
【００２１】
さらなる態様において、MEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤は、対象、好ましくは脊椎動物における本発明の重感染または細菌感染を予防および/または治療するための方法における使用のためのものである。
【００２２】
また、本発明により、細菌感染およびインフルエンザウイルス感染を含む重感染を予防および/または治療するための方法における使用のための、MEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤を含む、組成物が提供される。好ましくは、組成物は担体をさらに含む。
【００２３】
本発明はまた、細菌感染を予防および/または治療するための方法における使用のための、MEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤を含む、組成物に関する。好ましくは、組成物は担体をさらに含む。
【００２４】
また、本発明により、細菌感染およびインフルエンザウイルス感染を含む重感染を予防および/または治療するための方法における使用のための、MEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤、ならびにインフルエンザウイルスおよび/または細菌を標的とする1つまたは複数の阻害剤を含む、組成物が提供される。好ましくは、組成物は担体をさらに含む。
【００２５】
本発明はまた、細菌感染を予防および/または治療するための方法における使用のための、MEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤、ならびに細菌を標的とする1つまたは複数の阻害剤を含む、組成物に関する。好ましくは、組成物は担体をさらに含む。
【００２６】
さらなる態様において、MEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤は、本発明の重感染を予防および/または治療するための方法における使用のためのものであり、MEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤を、
a) インフルエンザウイルスおよび
b) 細菌
に感染した培養細胞を含むインビトロの試験システムに接触させた場合に、MEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤は、接触前のインビトロの試験システムと比較してウイルス感染および細菌感染の両方を低減する。
【００２７】
1つの態様において、ウイルス感染の低減はプラーク形成単位(pfu)/mlの低減であり、かつ細菌感染の低減はコロニー形成単位(CFU)/mlの低減である。
【００２８】
別の態様において、MEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤は、本発明の細菌感染を予防および/または治療するための方法における使用のためのものであり、MEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤を、細菌に感染した培養細胞を含むインビトロの試験システムに接触させた場合に、MEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤が、接触前のインビトロの試験システムと比較して細菌感染を低減する。
【００２９】
本発明はまた、
a) インフルエンザウイルスおよび
b) 細菌
に感染した培養細胞を含む、インビトロの試験システムに関する。
【００３０】
本発明はまた、細菌感染およびインフルエンザウイルス感染を含む重感染を低減するのに有効な阻害剤の判定のための本発明のインビトロの試験システムの使用を提供する。1つの態様において、ウイルス感染の低減はプラーク形成単位(pfu)/mlの低減であり、かつ細菌感染の低減はコロニー形成単位(CFU)/mlの低減である。
【００３１】
加えて、本発明は、接触前のインビトロの試験システムと比較してウイルス感染および細菌感染の両方を低減する関心対象の化合物を、本発明のインビトロの試験システムに接触させる段階を含む、細菌感染およびインフルエンザウイルス感染を含む重感染を予防および/または治療するのに有効な分子を検出するための方法に関する。
【００３２】
本発明はまた、細菌に感染した培養細胞を含む、インビトロの試験システムを提供する。
【００３３】
本発明は、加えて、細菌感染を低減するのに有効な阻害剤の判定のための本発明のインビトロの試験システムの使用に関する。
【００３４】
さらに、本発明は、シグナル伝達のレベル、結果的に起こるサイトカインおよびケモカイン発現、アポトーシスおよびネクローシスの誘導、ならびに/または健康状態および疾患を調節する酸化還元ホメオスタシスの検査を任意で含む、先天性宿主細胞応答の検査のための本発明のインビトロの試験システムの使用に関する。
【００３５】
また、本発明により、接触前のインビトロの試験システムと比較して細菌感染を低減する関心対象の化合物を、本発明のインビトロの試験システムに接触させる段階を含む、細菌感染の予防および/または治療において有効な分子を検出するための方法も提供される。
【００３６】
本発明はさらに、インフルエンザウイルスおよび細菌に感染した培養細胞に関する。
【００３７】
また、細菌に感染した培養細胞も提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
図面は以下を示す。
【００３９】
【図１】重感染手順の時間尺度。細胞に30分間IVを感染させた。黄色ブドウ球菌6850による重感染を行うか、または細胞をモック処理した。細菌感染から3時間後に抗生物質処理によって細胞外細菌を溶解し、除去した。PBS洗浄後、細胞に新鮮培地(DMEM/INV)を補充し、ウイルス感染から最大18時間インキュベートした。
【図２】MEK阻害剤U0126は重感染状況においてさえ、IV力価(A/Puerto Rico/8/34)および黄色ブドウ球菌負荷を低減する。ヒト肺上皮細胞をDMEM [10% FCS] 2 ml中で、6ウェルプレートに播種した(細胞8×105個/ウェル)。播種から16〜20時間後に、細胞をすすぎ、PBS/BA [0.2%ウシ血清アルブミン(BSA)、1 mM MgCl2、0.9 mM CaCl2、100 U/mlペニシリン、0.1 mg/mlストレプトマイシン] (500 μl/6ウェル)またはインフルエンザウイルスA/Puerto Rico/8/34を感染多重度(MOI=0.1)で含有するPBS/BAとともに37℃でインキュベートした。30分のインキュベーション後に、ウイルス希釈液を吸引し、細胞をPBSですすぎ、50 μM U0126またはDMSO (溶媒対照)の存在下、黄色ブドウ球菌6850 (MOI=0.5)を含むまたは含まない浸潤用培地DMEM/INV [1%ヒト血清アルブミン、25 nmol/l HEPES] (2 ml/6ウェル)を補充した。細菌感染から3時間後に、細胞を抗生物質で処理して、細胞外細菌を除去した。そこで、細胞をPBSですすぎ、その後、37℃で20分間DMEM/INV抗生物質[2 μg/mlのリゾスタフィン(Sigma)] (1 ml/6ウェル)とともにインキュベートした。PBSによるさらなる洗浄後、50 μM U0126またはDMSO、および0.333 μg/mlのトリプシン(Invitrogen)を含有するDMEM/INVを、細胞に補充した。37℃でさらに14時間のインキュベーション時間の後、IV力価および細胞内細菌を(Hrincius et al., 2010, Tuchscherr et al., 2011)に記述されているように判定した。IV力価はプラーク形成単位(pfu)/mlとして示されており(A、C)、黄色ブドウ球菌力価はコロニー形成単位(CFU)/mlとして示されている(B、D)。データは、2つの生体サンプルを用いた3回の独立した実験の平均±SDを表す。統計的有意性を両側2標本t検定により評価した(＊p < 0.05; ＊＊ p < 0.01; ＊＊＊ p < 0.001)。(E) 50 μM U0126の存在下の黄色ブドウ球菌は、DMSO処理細菌と比較して18時間のインキュベーション後に細菌力価の低減を引き起こす。規定量の黄色ブドウ球菌6850懸濁培養物を、50 μM U0126またはDMSOを補充したDMEM/INV中に希釈し、18時間37℃でインキュベートした。細菌を希釈し、寒天プレート上での連続希釈により判定した。データは、2つの生体サンプルを用いた3回の独立した実験の平均±SDを表す。統計的有意性を両側2標本t検定により評価した(＊p < 0.05; ＊＊ p < 0.01; ＊＊＊ p < 0.001)。
【図３】MEK阻害剤U0126は重感染状況においても、IV力価(A/FPV/Bratislava/79)および黄色ブドウ球菌負荷を低減する。ヒト肺上皮細胞をDMEM [10% FCS] 2 ml中で、6ウェルプレート(細胞8×105個/ウェル)に播種した。播種から16〜20時間後に、細胞をすすぎ、PBS/BA [0.2%ウシ血清アルブミン(BSA)、1 mM MgCl2、0.9 mM CaCl2、100 U/mlペニシリン、0.1 mg/mlストレプトマイシン] (500 μl/6ウェル)またはインフルエンザウイルスA/FPV/Bratislava/79を感染多重度(MOI=0.001)で含有するPBS/BAとともに37℃でインキュベートした。30分のインキュベーション後に、ウイルス希釈液を吸引し、細胞をPBSですすぎ、50 μM U0126またはDMSO (溶媒対照)の存在下、黄色ブドウ球菌6850 (MOI=0.5)を含むまたは含まない浸潤用培地DMEM/INV [1%ヒト血清アルブミン、25 nmol/l HEPES] (2 ml/6ウェル)を補充した。細菌感染から3時間後に、細胞を抗生物質で処理して、細胞外細菌を除去した。そこで、細胞をPBSですすぎ、その後、37℃で20分間DMEM/INV抗生物質[2 μg/mlのリゾスタフィン(Sigma)] (1 ml/6ウェル)とともにインキュベートした。PBSによるさらなる洗浄後、50 μM U0126またはDMSOを含有するDMEM/INVを、細胞に補充した。37℃でさらに14時間のインキュベーション時間の後、IV力価および細胞内細菌を(Hrincius et al., 2010; Tuchscherr et al., 2011)に記述されているように判定した。IV力価はプラーク形成単位(pfu)/mlとして示されており(A、C)、黄色ブドウ球菌力価はコロニー形成単位(CFU)/mlとして示されている(B、D)。データは、2つの生体サンプルを用いた2回の独立した実験の平均±SDを表す。統計的有意性を両側2標本t検定により評価した(＊p < 0.05; ＊＊ p < 0.01; ＊＊＊ p < 0.001)。
【図４】p38阻害剤SB202190は重感染状況においても、IV力価および黄色ブドウ球菌負荷を低減する。ヒト肺上皮細胞をDMEM [10% FCS] 2 ml中で、6ウェルプレート(細胞8×105個/ウェル)に播種した。播種から16〜20時間後に、細胞をすすぎ、PBS/BA [0.2%ウシ血清アルブミン(BSA)、1 mM MgCl2、0.9 mM CaCl2、100 U/mlペニシリン、0.1 mg/mlストレプトマイシン] (500 μl/6ウェル)またはインフルエンザウイルスA/Puerto Rico/8/34を感染多重度(MOI=0.1)で含有するPBS/BAとともに37℃でインキュベートした。30分のインキュベーション後に、ウイルス希釈液を吸引し、細胞をPBSですすぎ、10 μM SB202190またはDMSO (溶媒対照)の存在下、黄色ブドウ球菌6850 (MOI=0.5)を含むまたは含まない浸潤用培地DMEM/INV [1%ヒト血清アルブミン、25 nmol/l HEPES] (2 ml/6ウェル)を補充した。細菌感染から3時間後に、細胞を抗生物質で処理して、細胞外細菌を除去した。そこで、細胞をPBSですすぎ、その後、37℃で20分間DMEM/INV抗生物質[2 μg/mlのリゾスタフィン(Sigma)] (1 ml/6ウェル)とともにインキュベートした。PBSによるさらなる洗浄後、10 μM SB202190またはDMSO、および0.333 μg/mlのトリプシン(Invitrogen)を含有するDMEM/INVを、細胞に補充した。37℃でさらに14時間のインキュベーション時間の後、IV力価および細胞内細菌を(Hrincius et al., 2010; Tuchscherr et al., 2011)に記述されているように判定した。IV力価はプラーク形成単位(pfu)/mlとして示されており(A、C)、黄色ブドウ球菌力価はコロニー形成単位(CFU)/mlとして示されている(B、D)。データは、2つの生体サンプルを用いた3回の独立した実験の平均±SDを表す。統計的有意性を両側2標本t検定により評価した(＊p < 0.05; ＊＊ p < 0.01; ＊＊＊ p < 0.001)。
【図５】NF-カッパB (NFκB)阻害剤LG-ASAは重感染状況においても、IV力価および黄色ブドウ球菌負荷を低減する。ヒト肺上皮細胞をDMEM [10% FCS] 2 ml中で、6ウェルプレート(細胞8×105個/ウェル)に播種した。播種から16〜20時間後に、細胞をすすぎ、PBS/BA [0.2%ウシ血清アルブミン(BSA)、1 mM MgCl2、0.9 mM CaCl2、100 U/mlペニシリン、0.1 mg/mlストレプトマイシン] (500 μl/6ウェル)またはインフルエンザウイルスA/Puerto Rico/8/34を感染多重度(MOI=0.1)で含有するPBS/BAとともに37℃でインキュベートした。30分のインキュベーション後に、ウイルス希釈液を吸引し、細胞をPBSですすぎ、5 mM LG-ASAの存在下、黄色ブドウ球菌6850 (MOI=0.5)を含むまたは含まない浸潤用培地DMEM/INV [1%ヒト血清アルブミン、25 nmol/l HEPES] (2 ml/6ウェル)を補充した。水を溶媒対照として用いた。細菌感染から3時間後に、細胞を抗生物質で処理して、細胞外細菌を除去した。そこで、細胞をPBSですすぎ、その後、37℃で20分間DMEM/INV抗生物質[10% FBS、2 μg/mlのリゾスタフィン(Sigma)] (1 ml/6ウェル)とともにインキュベートした。PBSによるさらなる洗浄後、5 mM LG-ASAまたは水、および0.333 μg/mlのトリプシン(Invitrogen)を含有するDMEM/INVを、細胞に補充した。37℃でさらに14時間のインキュベーション時間の後、IV力価および細胞内細菌を(Hrincius et al., 2010, Tuchscherr et al., 2011)に記述されているように判定した。IV力価はプラーク形成単位(pfu)/mlとして示されており(A、C)、黄色ブドウ球菌力価はコロニー形成単位(CFU)/mlとして示されている(B、D)。データは、2つの生体サンプルを用いた2回の独立した実験(ウイルス力価)および3回の独立した実験(細菌力価)の平均±SDを表す。統計的有意性を両側2標本t検定により評価した(＊p < 0.05; ＊＊ p < 0.01; ＊＊＊ p < 0.001)。
【図６】ウイルスノイラミニダーゼ阻害剤タミフルは、IV複製を低減するが、しかし黄色ブドウ球菌負荷を増強する。ヒト肺上皮細胞をDMEM [10% FCS] 2 ml中で、6ウェルプレート(細胞8×105個/ウェル)に播種した。播種から16〜20時間後に、細胞をすすぎ、PBS/BA [0.2%ウシ血清アルブミン(BSA)、1 mM MgCl2、0.9 mM CaCl2、100 U/mlペニシリン、0.1 mg/mlストレプトマイシン] (500 μl/6ウェル)またはインフルエンザウイルスA/FPV/Bratislava/79を感染多重度(MOI=0.001)で含有するPBS/BAとともに37℃でインキュベートした。30分のインキュベーション後に、ウイルス希釈液を吸引し、細胞をPBSですすぎ、2 μMタミフルまたはHepes (溶媒対照)の存在下、黄色ブドウ球菌6850 (MOI=0.5)を含むまたは含まない浸潤用培地DMEM/INV [1%ヒト血清アルブミン、25 nmol/l HEPES] (2 ml/6ウェル)を補充した。細菌感染から3時間後に、細胞を抗生物質で処理して、細胞外細菌を除去した。そこで、細胞をPBSですすぎ、その後、37℃で20分間DMEM/INV抗生物質[2 μg/mlのリゾスタフィン(Sigma)] (1 ml/6ウェル)とともにインキュベートした。PBSによるさらなる洗浄後、2 μMタミフルまたはHepesを含有するDMEM/INVを、細胞に補充した。37℃でさらに14時間のインキュベーション時間の後、IV力価および細胞内細菌を(Hrincius et al., 2010; Tuchscherr et al., 2011)に記述されているように判定した。
【図７】細胞内黄色ブドウ球菌6850の力価は、LG-ASA処理によって低減される。ヒト肺上皮細胞(A549)に表示した量のLG-ASAの存在下(A、C)および非存在下(B、D)で3時間0.5 MOIの黄色ブドウ球菌6850 DMEM/INV [1%ヒト血清アルブミン、25 nmol/l HEPES]を感染させた。感染から3時間後、DMEM/INV抗生物質[2 μg/mlのリゾスタフィン(Sigma)]を用いた抗生物質洗浄を含めて、内部移行していない細菌を除去し、その後、表示した量のLG-ASAを含有するDMEM/INVを細胞に補充した。細胞形態を光学顕微鏡検査によってモニターし(A、B)、内部移行した細菌の量を感染から18時間後の寒天プレート上での連続希釈によって判定した(C、D)。
【図８】表2: p38阻害剤。
【図９】表3: NFκB阻害剤。
【図１０】表4: NFκB阻害剤。
【図１１】表5: 抗生物質。
【図１２】インビトロでの重感染手順の時間尺度。ヒト肺上皮細胞(A549)に37℃で、PBS/BA [0.2%ウシ血清アルブミン、1 mM MgCl2、0.9 mM CaCl2、100 U/mlペニシリン、0.1 mg/mlストレプトマイシン]に溶解された、インフルエンザA型ウイルス(IAV)を30分間、表示した感染多重度(MOI)にて感染させた。30分のインキュベーション後に、ウイルス希釈液を吸引し、細胞をPBSですすいだ。その後、黄色ブドウ球菌6850 (S. aureus)による細菌感染を行うか、または細胞をモック処理した。そこで、細胞に、表示した量の阻害剤(U0126もしくはCI-1040)または溶媒対照に加えて黄色ブドウ球菌を含むまたは含まない浸潤用培地DMEM/INV [1%ヒト血清アルブミン、25 nmol/l HEPES]を補充した。細菌感染から3時間後に、抗生物質洗浄[DMEM、10%FBS、2 μg/mlリゾスタフィンまたは100 μg/mlゲンタマイシン、20分]を導入して、内部移行していない細菌を除去した。さらなるPBS洗浄の後、細胞に阻害剤の存在下または非存在下で、感染用培地DMEM (0.2% BA、1 mM MgCl2、0.9 mM CaCl2、100 U/mlペニシリン、0.1 mg/mlストレプトマイシン)を補充し、ウイルス感染後最大18時間、37℃でインキュベートした。
【図１３】MEK/ERKシグナル伝達の阻害により、単独感染および重感染後の細胞生存の増強が引き起こされる。ヒト肺上皮細胞(A549)に37℃で鳥類インフルエンザウイルス菌株A/FPV/Bratislava/79 (H7N7) (FPV)またはヒトインフルエンザウイルス菌株A/Wisconsin/67/2005 (H3N2)を感染多重度(MOI=0.01) (H7N7)または(MOI=0.5) (H3N2)にて感染させた。30分後、ウイルス希釈液を除去し、細胞をPBSですすぎ、50 μM U0126または溶媒対照の存在下、黄色ブドウ球菌6850 (MOI=0.1)を含むまたは含まない浸潤用培地DMEM/INV (1%ヒト血清アルブミン、25 nM HEPESを含有)を補充した。細菌感染から3時間後に、細胞を20分間、10% FBS、2 μg/mlリゾスタフィンを含有するDMEM/FBSで処理して、内部移行していない細菌を除去した。PBSによるさらなる洗浄の後、細胞に、50 μM U0126または溶媒を含有する感染用培地DMEM/BA (0.2% BA、1 mM MgCl2、0.9 mM CaCl2、100 U/mlペニシリン、0.1 mg/mlストレプトマイシン)を補充した。37℃における18時間のインキュベーション時間の後、細胞形態を光学顕微鏡検査によってモニターした。
【図１４】MEK/ERKシグナル伝達の阻害により、単独ウイルス感染および重感染中のウイルス力価の低減が引き起こされる。ヒト肺上皮細胞(A549)に37℃で鳥類インフルエンザウイルス菌株A/FPV/Bratislava/79 (H7N7) (A、C)またはヒトインフルエンザウイルス菌株A/Wisconsin/67/2005 (H3N2) (B、D)を感染多重度(MOI=0.01) (A、C)、(MOI=0.5) (B、D)にて感染させた。30分後、ウイルス希釈液を除去し、細胞をPBSですすぎ、50 μM U0126または溶媒対照の存在下、黄色ブドウ球菌6850 (MOI=0.1)を含むまたは含まない浸潤用培地DMEM/INV (1%ヒト血清アルブミン、25 nM HEPESを含有)を補充した。細菌感染から3時間後に、細胞を20分間、10% FBS、2 μg/mlリゾスタフィンを含有するDMEM/FBSで処理して、細胞外細菌を除去した。PBSによるさらなる洗浄の後、細胞に、50 μM U0126または溶媒を含有する感染用培地DMEM/BA (0.2% BA、1 mM MgCl2、0.9 mM CaCl2、100 U/mlペニシリン、0.1 mg/mlストレプトマイシン)を補充した。37℃における18時間のインキュベーション時間の後、標準的なプラークアッセイ法によりウイルス力価を判定した。ウイルス力価はプラーク形成単位/ml (PFU/ml)として均等目盛り(A、B)または対数目盛り(C、D)で示されている。データは、2つの生体サンプルを用いた4回の独立した実験の平均±SDを表す。統計的有意性を両側1標本t検定により評価した(＊p < 0.05; ＊＊ p < 0.01)。
【図１５】U0126の投与によるMEK阻害は、細菌増殖の低減をもたらす。ヒト肺上皮細胞(A549)に37℃で鳥類インフルエンザウイルス菌株A/FPV/Bratislava/79 (H7N7)またはヒトインフルエンザウイルス菌株A/Wisconsin/67/2005 (H3N2) (A、C)を感染多重度(MOI=0.01) (H7N7)または(MOI=0.5) (H3N2)にて感染させた。30分後、ウイルス希釈液を除去し、細胞をPBSですすぎ、50 μM U0126または溶媒対照の存在下、黄色ブドウ球菌6850 (MOI=0.1)有りまたは無し(A)の浸潤用培地DMEM/INV (1%ヒト血清アルブミン、25 nM HEPESを含有)を補充した。細菌感染から3時間後に、細胞を20分間(A、C)、10% FBS、2 μg/mlリゾスタフィンを含有するDMEM/FBSで処理して、内部移行していない細菌を除去した。PBSによるさらなる洗浄の後、細胞に、50 μM U0126または溶媒を含有する感染用培地DMEM/BA (0.2% BA、1 mM MgCl2、0.9 mM CaCl2、100 U/mlペニシリン、0.1 mg/mlストレプトマイシン)を補充した。感染から18時間後、内部移行した細菌の量を寒天プレート上での細胞溶解物の連続希釈によって判定した(A、C)。細菌増殖に及ぼすU0126の影響を、黄色ブドウ球菌6850 (100 CFU/ml)の終夜培養物に対してU0126を表示される通り投与することによって分析した。16時間後、連続希釈液をBHI寒天上にプレーティングした(B、D)。細菌力価はコロニー形成単位/ml (CFU/ml)として均等目盛り(A、B)または対数目盛り(C、D)で示されている。データは、2つの生体サンプルを用いた4回(A、C)または3回(B、D)の独立した実験の平均±SDを表す。統計的有意性を両側2標本t検定により評価した(＊＊＊ p < 0.001)。
【図１６】MEK/ERKシグナル伝達の阻害は、ウイルスタンパク質および炎症促進性ケモカインの低減につながる。ヒト肺上皮細胞(A549)に37℃でヒトインフルエンザウイルス菌株A/Wisconsin/67/2005 (H3N2)を感染多重度(MOI=5)にて感染させた。30分後、ウイルス希釈液を除去し、細胞をPBSですすぎ、50 μM U0126または溶媒対照の存在下、黄色ブドウ球菌6850 (MOI=50)を含むまたは含まない浸潤用培地DMEM/INV (1%ヒト血清アルブミン、25 nM HEPESを含有)を補充した。細菌感染から3時間後に、細胞を30分間、10% FBS、100 μg/mlゲンタマイシンを含有するDMEM/FBSで処理して、細胞外細菌を除去した。PBSによるさらなる洗浄の後、細胞に、50 μM U0126または溶媒を含有する感染用培地DMEM/BA (0.2% BA、1 mM MgCl2、0.9 mM CaCl2、100 U/mlペニシリン、0.1 mg/mlストレプトマイシン)を補充した。37℃における8時間のインキュベーション時間の後、CCL3およびCCL5のmRNAレベルを、特異的プライマーを用いたqRT-PCRにより分析した(A、B)。ウイルスタンパク質発現(PB-1)およびERK-1/2リン酸化のレベル、ならびに細菌細胞壁成分(PGN)をウエスタンブロット分析(C)によって判定した。データは、1つの実験内での3つの生体サンプルおよび2つの技術的複製の予備結果を表す。
【図１７】U0126の投与はウイルス力価と無関係にインビボでの細菌力価の低減につながる。12週齢のBalb/Cマウスに0日目(イソフルレンで麻酔された(anesthesized))に50 PFUのインフルエンザウイルス菌株A/Puerto Rico/8/34 (PR8、H1N1)を感染させた。1日目から始めて、マウスを30 mg/kg/日のU0126または溶媒対照(10% DMSO、30% Cremophor EL、60% PBS)のi.p.注射で毎日処置した。3日目に、マウスにイソフルレンによる麻酔下で5＊107 CFUの黄色ブドウ球菌6850を感染させ、U0126または溶媒対照で直接処置した。4日目に、肺を切除し、PBS中(PBS 1000 μlあたり0.1 g)でホモジナイズした。細菌力価の計算のため、ホモジネートの連続希釈液をBHI寒天上にプレーティングした。ウイルス力価の判定のため、標準的なプラークアッセイ法を行った。統計分析をマンホイットニーU検定により行った(＊ p < 0,05)。
【図１８】特異的MEK阻害剤CI-1040は、単独感染および重感染においてウイルス力価を低減する。ヒト肺上皮細胞(A549)に、37℃で鳥類インフルエンザウイルス菌株A/FPV/Bratislava/79 (H7N7) (A、C)またはヒトインフルエンザウイルス菌株A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) (B、D)を感染多重度(MOI=0.01)にて感染させた。30分後、ウイルス希釈液を除去し、細胞をPBSですすぎ、10 μM CI-1040または溶媒対照の存在下、黄色ブドウ球菌6850 (MOI=0.1)を含むまたは含まない浸潤用培地DMEM/INV (1%ヒト血清アルブミン、25 nM HEPESを含有)を補充した。細菌感染から3時間後に、細胞を20分間、10% FBS、2 μg/mlリゾスタフィンを含有するDMEM/FBSで処理して、細胞外細菌を除去した。PBSによるさらなる洗浄の後、細胞に、10 μM CI-1040または溶媒を含有する感染用培地DMEM/BA (0.2% BA、1 mM MgCl2、0.9 mM CaCl2、100 U/mlペニシリン、0.1 mg/mlストレプトマイシン)を補充した。37℃で18時間のインキュベーション時間の後、標準的なプラークアッセイ法によりウイルス力価を判定した。ウイルス力価はプラーク形成単位/ml (PFU/ml)として均等目盛り(A、B)または対数目盛り(C、D)で示されている。データは、2つの生体サンプルを用いた2回の独立した実験の平均を表す。
【図１９】CI-1040の投与はインビトロで細菌増殖に阻害効果を及ぼす。細菌増殖に及ぼすCI-1040の影響を、黄色ブドウ球菌6850 (100 CFU/ml)の終夜培養物に対する異なる濃度(表示の通り)のCI-1040を投与することによって分析した。16時間後、連続希釈液をBHI寒天上にプレーティングした(A、B)。細菌力価はコロニー形成単位/ml (CFU/ml)として均等目盛り(A)または対数目盛り(B)で示されている。データは、2つの生体サンプルを用いた予備データを表す。
【図２０】特異的MEK阻害剤コビメチニブ(GDC-0973)による処置は、インビボで病原体負荷を低減する。8週齢のBalb/Cマウス(1群あたり5匹)に0日目(イソフルレンで麻酔された)に50 PFUのインフルエンザウイルス菌株A/Puerto Rico/8/34 (PR8、H1N1)を感染させた。ウイルス感染から6時間後に、マウスを10 mg/kg/日のコビメチニブまたは溶媒対照(10% DMSO、5% Tween 20、85% PBS)の経口投与で処置した。その後、処置を毎日行った。3日目に、マウスにイソフルレンによる麻酔下で5＊107 CFUの黄色ブドウ球菌6850を感染させ、これを6時間後にコビメチニブまたは溶媒対照で処置した。4日目に、肺を切除し、PBS中(PBS 1000 μlあたり0.1 g)でホモジナイズした。細菌力価の計算のため、ホモジネートの連続希釈液をBHI寒天上にプレーティングした。ウイルス力価の判定のため、標準的なプラークアッセイ法を行った。統計分析をマンホイットニーU検定により行った。
【図２１】LG-ASAはインフルエンザA型ウイルス(IAV)および/または黄色ブドウ球菌(S. aureus)の感染時の細胞形態を改善する。ヒト肺上皮細胞(A549)に37℃で、PBS/BA [0.2%ウシ血清アルブミン、1 mM MgCl2、0.9 mM CaCl2、100 U/mlペニシリン、0.1 mg/mlストレプトマイシン]に溶解された、感染多重度(MOI=0.1)のインフルエンザウイルス菌株A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)を感染させた。30分のインキュベーション後、ウイルス希釈液を吸引し、細胞をPBSですすぎ、5 mM LG-ASAまたは溶媒対照の存在下、黄色ブドウ球菌SH1000 (MOI=0.1)を含むまたは含まない浸潤用培地DMEM/INV [1%ヒト血清アルブミン、25 nmol/l HEPES]を補充した。細菌感染から3時間後に、細胞を抗生物質[DMEM、10% FBS、2 μg/mlリゾスタフィン、20分]で処理して、細胞外細菌を除去した。PBSによるさらなる洗浄の後、細胞に、5 mM LG-ASAまたは溶媒を含有するDMEM/INVを補充した。37℃における18時間のインキュベーション時間の後、細胞形態を光学顕微鏡検査によってモニターした。
【図２２】NFκB阻害剤LG-ASAは、インフルエンザウイルス力価および黄色ブドウ球菌負荷を低減する。ヒト肺上皮細胞(A549)に37℃で、PBS/BA [0.2%ウシ血清アルブミン、1 mM MgCl2、0.9 mM CaCl2、100 U/mlペニシリン、0.1 mg/mlストレプトマイシン]に溶解された、感染多重度(MOI=0.1)のインフルエンザウイルス菌株A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)を感染させた(A〜H)。30分のインキュベーション後、ウイルス希釈液を吸引し、細胞をPBSですすぎ、5 mM LG-ASAまたは溶媒対照の存在下、黄色ブドウ球菌SH1000 (MOI=50) (A、B)、(MOI=0.01) (C-D)、黄色ブドウ球菌6850 (MOI=50) (E、F)、(MOI=0.1) (G、H)を含むまたは含まない浸潤用培地DMEM/INV [1%ヒト血清アルブミン、25 nmol/l HEPES]を補充した。細菌感染から3時間後に、細胞を抗生物質[DMEM、10% FBS、2 μg/mlリゾスタフィン、20分]で処理して、細胞外細菌を除去した。PBSによるさらなる洗浄の後、細胞に、5 mM LG-ASAまたは溶媒を含有するDMEM/INVを補充した。37℃で8時間(A、B、E、F)または18時間(C、D、G、H)のインキュベーション時間の後、標準的なプラークアッセイ法によりIAV力価(A、C、E、G)を判定した。細胞を低浸透圧ショックにより溶解させ、内部移行した細菌の量(B、D、F、H)を寒天プレート上での連続希釈によって判定した。データは、2つの生体サンプルを用いた3回の平均±SD (A〜H)を表す。統計的有意性を両側1標本t検定により評価した(＊p < 0.05; ＊＊ p < 0.01)。
【図２３】NFκB阻害剤LG-ASAはインフルエンザウイルス力価および黄色ブドウ球菌負荷を低減する。この図は、図22にあるように得られたデータを違った方法で提示する。具体的には、各実験の未処置対照を任意に100%として設定し、その後、平均を算出した。統計的有意性を両側1標本t検定により評価した(＊p < 0.05; ＊＊ p < 0.01)。
【図２４】NFκBシグナル伝達の阻害は細菌内部移行の低減をもたらす。ヒト肺上皮細胞(A549)を、4時間5 mM (A〜D)および10 mM (C、D)のLG-ASAとともにプレインキュベートし、その後、これにDMEM/INV [1%ヒト血清アルブミン、25 nmol/l HEPES]に溶解した表示された量のLG-ASAの存在下および非存在下で30〜120分間黄色ブドウ球菌6850 (MOI=50) (A、B)および120分間USA 300 (MOI=5) (C、D)を感染させた。感染から30〜120分後に、抗生物質洗浄液[DMEM、10%FBS、2 μg/mlリゾスタフィン、20分]を含めて、内部移行していない細菌を除去した。細胞を3回PBSで洗浄し、低浸透圧ショックにより溶解させた。内部移行した細菌の量を寒天プレート上での連続希釈によって判定した(A〜D)。データ(A、C)は、2つの生体サンプルを用いた3回の独立した実験の平均±SDを表す。図24B、Dにおいて、各実験の未処置対照を任意に100%として設定し、その後、平均を算出した。統計的有意性を両側1標本t検定により評価した(＊ p < 0.05; ＊＊ p < 0.01; ＊＊＊ p < 0.001)。
【図２５】NFκBシグナル伝達の刺激は細菌内部移行の増強をもたらす。ヒト肺上皮細胞(A549)を、4時間5 mM LG-ASAおよび2.5 ng/ml TNF-アルファとともにプレインキュベートし、その後、DMEM/INV [1%ヒト血清アルブミン、25 nmol/l HEPES]に溶解した表示された量のLG-ASAおよびTNF-アルファの存在下および非存在下で120分間、(A) 黄色ブドウ球菌6850または(B) 黄色ブドウ球菌USA300 (MOI=5)を感染させた(A)。感染から120分後に、抗生物質洗浄[DMEM、10%FBS、2 μg/mlリゾスタフィン、20分]を含めて、内部移行していない細菌を除去した。細胞を3回PBSで洗浄し、低浸透圧ショックにより溶解した。内部移行した細菌の量を感染から120分後に寒天プレート上での連続希釈によって判定した(A)。(A) データは、2つの生体サンプルを用いた4回の独立した実験の平均±SDを表す。統計的有意性を一元配置ANOVA、引き続いて多重比較検定により評価した(＊ p < 0.05; ＊＊ p < 0.01; ＊＊＊ p < 0.001)。(B) データは、3つの生体サンプルを用いた3回の独立した実験の平均±SDを表し、それによって各実験の未処置対照を任意に100%として設定し、その後、平均を算出した。
【図２６】IAV/黄色ブドウ球菌に重感染したマウスをLG-ASAで処置することで、生存の増強および体重減少の低減が引き起こされる。(A) BALB/cマウス(1群あたりマウス4匹)に0日目に50 PFUのインフルエンザウイルスA/Puerto Rico/8/34を感染させた。インフルエンザウイルス感染後6日目に、マウスに108 CFUの黄色ブドウ球菌6850をさらに感染させた。インフルエンザウイルス感染後7日目に、重感染マウスを吸入によりLG-ASA (1 M、10分)で1日1回処置した。生存を14日間モニターした。(4/4) (黒線)未処置の重感染マウスは重感染から1日後に死んだが、(2/4) LG-ASAで処置した重感染マウスは生存した(灰色線)。(B) 2回の独立した実験が示されている。9週齢のBalb/Cマウス(1群あたりマウス4匹)に0日目(イソフルレンで麻酔された)午前中に50 PFUのインフルエンザウイルスA/Puerto Rico/8/34を感染させた。ウイルス感染から6時間後に、マウスを秤量し、エアロゾルH2Oまたは1 M LG-ASAにより吸入チャンバ内で10分間処置した。この処置を0日目に加えて1、2および3日目にも行った。3日目午前中にマウスにイソフルレンによる麻酔下で5＊107 CFUの黄色ブドウ球菌6850を感染させた。4日目に、マウスを最後に秤量した。統計分析をマンホイットニーU検定により行った(＊ p < 0.05)。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
発明の詳細な説明/優先的な態様の詳細な説明
下記は、本発明を理解する際に有用でありうる情報を含む。本明細書において提供される情報のいずれも、本明細書で主張する発明に対する先行技術であること、もしくはそれらに関連することを自認するものではなく、または具体的もしくは非明示的に参照されるいずれの刊行物も先行技術であると自認するものではない。
【００４１】
上記の通り、本発明は、細菌感染およびインフルエンザウイルス感染を含む重感染を予防および/または治療するための方法における使用のための、MEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤に関する。
【００４２】
加えて、本発明は、細菌感染を予防および/または治療するための方法における使用のための、MEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤に関する。
【００４３】
本明細書において用いられる場合、「MEK阻害剤」は、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ(MAPK)キナーゼ阻害剤とも表されうる。MAPK経路において、MAPKキナーゼキナーゼ(MAPKKK)はMAPKキナーゼ(MAPKK)を活性化し、これが今度はMAPKを活性化し、これがシグナルを、例えば、転写因子もしくは他のキナーゼまたはエフェクタ/シグナル伝達タンパク質に伝達することが知られている; 例えば、Fremin and Meloche ( Fremin and Meloche (2010), J. Hematol. Oncol. 11;3:8)の図1を参照されたい。本発明のMEK阻害剤は、好ましくは、本明細書において記述されるように哺乳類または鳥類等の対象のMEK1/2を阻害する。しかしながら、本発明のMEK阻害剤はMEK、好ましくはMEK1/2だけでなく、その上流のキナーゼ(すなわちMAPKKK)も阻害し、それによって二重阻害を及ぼす可能性がある。理論に拘束されるわけではないが、PLX-4032はそのような二重阻害剤でありうる。ゆえに、本発明のMEK阻害剤は、好ましい局面において、二重阻害剤によるものであり、それによってMEK、好ましくはMEK1/2および対応する上流のMAPKKKを阻害しうる。MEK1/2はRas/Raf経路においてMAPKKであり、それによってRas/RafはMAPKKKとして作用し、ERK1/2はMAPKとして作用する。
【００４４】
MEK阻害剤は、小分子、大分子、ペプチド、オリゴヌクレオチドなどでありうる。MEK阻害剤は、タンパク質もしくはその断片または核酸分子であってもよい。また、MEK阻害剤という用語には、MEK阻害剤の薬学的に許容される塩も含まれる。
【００４５】
化合物がMEK阻害剤であるかどうかの判定は、当業者の技術の範囲内である。1つの態様において、MEK阻害剤は、表1に挙げられた化合物/阻害剤からなる群より選択される。
【００４６】
本発明のMEK阻害剤は、U0126、PLX-4032、AZD6244、AZD8330、AS-703026、GSK-1120212、RDEA-119、RO-5126766、RO-4987655、CI-1040、PD-0325901、GDC-0973、TAK-733、PD98059、PD184352 ARRY-438162、およびPF-3644022、好ましくはAZD8330、GSK-1120212、U0126、GDC-0973、CI-1040、PD0325901、ARRY-438162、PF-3644022、およびAZD6244ならびに最も好ましくはU0126、CI-1040、GDC-0973 (コビメチニブ)、AZD8330、GSK-1120212、最も好ましくはU0126、GDC-0973、CI-1040、AZD8330、およびGSK-1120212から好ましくは選択される。
【００４７】
これらの阻害剤のいくつかは、下記表1にさらに記載されている。
【００４８】
（表１）MEK阻害剤
2017515910.tif 000003
2017515910.tif 000004
2017515910.tif 000005
【００４９】
また、PLX-4032、AZD6244、AZD8330、GDC-0973、RDEA119、GSK1120212、RO51267766、RO4987655、TAK-733、およびAS703026からの選択が好ましい。さらにより好ましくは、それらはAZD6244、AZD8330、GSK1120212、およびPLX-4032からまたはPD-0325901、AZD-6244、AZD-8330、およびRDEA-119から選択される。これらのMEK阻害剤は、当技術分野において公知であり、例えば、Fremin and Meloche (2010), J. Hematol. Oncol. 11;3:8の表1に記載されている。
【００５０】
これらの阻害剤のいくつかに関するさらなる情報はArthur and Ley (2013) Mitogen-activated protein kinases in innate immunity; Nature Reviews Immunology 13,679-692(2013)から得ることもできる。
【００５１】
実際、添付の実施例において実証されるように、本明細書において開示されるMEK阻害剤U0126およびCI-1040は、重感染シナリオにおいておよび単独の細菌感染に対して効果を示す。
【００５２】
また、p38阻害剤が、本発明の重感染または細菌感染を予防および/または治療するための方法における使用のために提供される。「p38 MAPキナーゼ阻害剤」は当技術分野において周知である。「p38阻害剤」、「p38キナーゼ阻害剤」および「p38 MAPキナーゼ阻害剤」という用語は、本明細書において互換的に用いられる。本発明の文脈において、p38 MAPキナーゼ阻害剤はp38 MAPキナーゼを阻害する。好ましくは、p38 MAPキナーゼ阻害剤はp38 MAPキナーゼのアイソフォームの1つ、好ましくはα-アイソフォームが好ましいp38 MAPキナーゼの4つのアイソフォーム(α、β、γ、またはδ)の1つを阻害し、より好ましくは、p38 MAPキナーゼ阻害剤はp38 MAPキナーゼの2つのアイソフォームの任意の組み合わせを阻害し、さらにより好ましくは、p38 MAPキナーゼ阻害剤はp38 MAPキナーゼの3つのアイソフォームの任意の組み合わせを阻害し、最も好ましくは、p38 MAPキナーゼ阻害剤はp38 MAPキナーゼの全てのアイソフォームまたはα、β、γ、およびδアイソフォームを阻害する。いくつかの態様において、p38 MAPキナーゼ阻害剤は、炎症性疾患、自己免疫疾患、破壊性骨障害、増殖性障害、感染性疾患、ウイルス性疾患、または神経変性疾患に関与するp38のアイソフォームを阻害する。p38 MAPキナーゼのα-アイソフォームは炎症、増殖、分化、およびアポトーシスに関与しているが、p38β、p38δ、およびp38γの生物学的機能はまだ完全には理解されていないことが報告されている。したがって、p38 MAPキナーゼ阻害剤はα-アイソフォームを阻害することが本明細書において好ましい。
【００５３】
p38 MAPキナーゼ阻害剤は、小分子、大分子、ペプチド、オリゴヌクレオチドなどであり得る。p38 MAPキナーゼ阻害剤は、タンパク質もしくはその断片または核酸分子であってもよい。また、p38阻害剤という用語には、p38阻害剤の薬学的に許容される塩も含まれる。
【００５４】
化合物がp38キナーゼ阻害剤であるかどうかの判定は、当業者の技術の範囲内である。
【００５５】
当技術分野においてp38阻害剤の多くの例がある。米国特許第5,965,583号、同第6,040,320号、同第6,147,096号、同第6,214,830号、同第6,469,174号、同第6,521,655号には、p38阻害剤である化合物が開示されている。また、米国特許第6,410,540号、同第6,476,031号および同第6,448,257号には、p38阻害剤である化合物が開示されている。同様に、米国特許第6,410,540号、同第6,479,507号および同第6,509,361号には、p38阻害剤であると主張されている化合物が開示されている。米国特許出願公開第20020198214号および同第20020132843号には、p38阻害剤であるといわれている化合物が開示されている。別のp38 MAPキナーゼ阻害剤は、BIRB 796 BS (1-(5-tert-ブチル-2-p-トリル-2H-ピラゾール-3-イル)-3-[4-(2-モルホリン-4-イル-エトキシ)-ナフタレン-1-イル]-尿素)である; さらなるp39 MAPキナーゼ阻害剤についてはBranger (2002), J. Immunol. 168:4070-4077または米国特許第6,319,921号を参照されたい。
【００５６】
他のp38 MAPキナーゼ阻害剤は、AMG 548 (Amgen)、BIRB 796 (Boehringer Ingelheim)、VX 702 (Vertex/Kissei)、SCIO 469、SCIO 323 (Scios Inc.)、SB 681323 (GlaxoSmithKline)、PH-797804 (Pfizer)、およびOrg-48762-0 (Organon NV)である; 例えば、Lee and Dominguez in Curr Med Chem. 2005;12(25):2979-2994およびDominguez in Curr Opin Drug Discov Devel. 2005 Jul;8(4):421-430を参照されたい。
【００５７】
本発明によれば、阻害剤はp38 MAPキナーゼの上流もしくは下流に、またはp38 MAPキナーゼに対して直接的に、その調節効果を示しうるが、後者の作用様式が好ましい。阻害剤により調節されるp38 MAPキナーゼ活性の例としては、阻害剤がp38 MAPキナーゼの転写および/もしくは翻訳を低減し、p38 MAPキナーゼの翻訳後修飾および/もしくは細胞輸送を低減しもしくは阻害し、またはp38 MAPキナーゼの半減期を短縮しうるものが挙げられる。阻害剤はまた、p38 MAPキナーゼに可逆的もしくは不可逆的に結合し、p38 MAPキナーゼの活性化を阻害し、その酵素活性を不活性化し、またはその他の方法で下流の基質とのその相互作用を妨害しうる。
【００５８】
p38 MAPキナーゼの4つのアイソフォームは、高レベルの配列相同性を共有する。p38 MAPキナーゼのαおよびβアイソフォームは密接に関連しているが、γおよびδアイソフォームはより多様である。高度の構造類似性を考慮すると、1つのp38 MAPキナーゼアイソフォームを阻害する能力を有する特定の化合物がMAPキナーゼの他のアイソフォームを多くの場合、阻害しうることは驚くべきことではない。したがって、いくつかの態様において、キナーゼのα-アイソフォームに特異的なp38 MAPキナーゼの阻害剤は、アイソフォーム特異的な阻害を可能とするために理論化された構造的特徴の少なくとも3つの部類を有する。
【００５９】
候補p38 MAPキナーゼ阻害剤の選択的結合は、種々の方法によって判定することができる。p38 MAPキナーゼのさまざまなアイソフォームの遺伝子は、当技術分野において公知である。当業者は、キナーゼのさまざまなアイソフォームを容易にクローニングして発現させ、それらを精製し、次いでアイソフォーム結合特性を判定するために候補化合物との結合研究を行うことができる。この一連の実験は、p38 MAPキナーゼのα-アイソフォームについて行われており、米国特許第6,617,324 B1号に提供されている。
【００６０】
別のキナーゼ選択性アッセイ法は、Mihara (2008), Br. J. Pharmacol. 154(1):153-164に記述されている。本明細書のいくつかの態様において、p38 MAPキナーゼ阻害剤はp38 MAPキナーゼの4つのアイソフォームの1つを阻害し、より好ましくは、p38 MAPキナーゼ阻害剤はp38 MAPキナーゼの2つのアイソフォームの任意の組み合わせを阻害し、さらにより好ましくは、p38 MAPキナーゼ阻害剤はp38 MAPキナーゼの3つのアイソフォームの任意の組み合わせ、例えば、p38-α(MAPK14)、-β(MAPK11)、-γ(MAPK12またはERK6)を阻害する。あるいは、でも好ましくは、p38 MAPキナーゼ阻害剤はp38 MAPキナーゼの4つのアイソフォームの全てを阻害する。
【００６１】
1つの態様において、p38阻害剤は、表2に挙げられた阻害剤からなる群より選択される(図8)。別の態様において、p38阻害剤は、SB202190、LY2228820、CAY10571、SB 203580、Tie2キナーゼ阻害剤、2-(4-クロロフェニル)-4-(フルオロフェニル)-5-ピリジン-4-イル-1,2-ジヒドロピラゾール-3-オン、CGH 2466、SB220025、抗生物質LL Z1640-2、TAK 715、SB202190塩酸塩、SKF 86002、AMG548、CMPD-1、EO 1428、JX 401、ML 3403、RWJ 67657、SB 202190、SB 203580、SB 203580塩酸塩、SB 239063、SCIO 469、SX 011、TAK 715、パマピモド、ロスマピモド(GW856553)、ディルマピモド(SB681323)、VX 702、VX 745、ドラマピモド(BIRB 796)、BMS-582949、ARRY-797、PH797804、SCIO-469、好ましくはVX-702、SB202190、パマピモド、ロスマピモド(GW856553)、ディルマピモド(SB681323)、ドラマピモド(BIRB 796)、BMS-582949、ARRY-797、PH797804、およびSCIO-469からなる群より選択される。
【００６２】
これらの阻害剤のいくつかに関するさらなる情報はArthur and Ley (2013) Mitogen-activated protein kinases in innate immunity; Nature Reviews Immunology 13,679-692(2013)から得ることもできる。
【００６３】
MEK阻害剤およびp38阻害剤に加えて、本発明はまた、本発明の重感染または細菌感染を予防および/または治療するための方法における使用のためのNFκB (NFκB/NFカッパB)阻害剤を対象とする。化合物がNFκB阻害剤であるかどうかの判定は、当業者の技術の範囲内である。
【００６４】
NF-κB(活性化B細胞の核因子κ軽鎖エンハンサー)は、DNAの転写を制御するタンパク質複合体である。NF-κBは、ほぼ全ての動物細胞型において見出され、ストレス、サイトカイン、遊離基、紫外線照射、酸化LDL、および細菌またはウイルス抗原のような刺激に対する細胞応答に関与する。脊椎動物NFκB転写複合体は、サブユニットp50 (NFκB1)、p52 (NFκB2)、c-Rel、RelA (p65)およびRelBによって形成される種々のホモおよびヘテロ二量体のいずれかであり得る(Gilmore TD. (2006) Oncogene 25: 6680-6684)。これらの複合体は、一般に特異的標的遺伝子発現を活性化するために、κB部位と呼ばれるDNA調節部位に結合する。ほとんどの細胞型において、NF-κB二量体は、いくつかのIκB阻害タンパク質(IκBα、β、ε、γ、p105、およびp100)のいずれかとの会合を通じて不活性形態で細胞質内に位置している。幅広い刺激に応答して、IκBは急速にリン酸化され、ユビキチン化され、プロテアソームによって分解される。次いで、遊離したNF-κB二量体は核に移動し、そこで特定の遺伝子発現を調節することができる。
【００６５】
IκBのリン酸化および分解は、2つのキナーゼサブユニットIKKαおよびIKKβ、ならびにNEMO (別名IKKγ)と呼ばれる関連する足場様調節タンパク質を含むIκBキナーゼ(IKK)複合体によって媒介されるNFκB複合体の調節に重要である(Gilmore and Herscovich (2006) Inhibitors of NF-κB signaling: 785 and counting Oncogene. 25, 6887-6899)。注目すべきことに、例えば本発明の実施例3に示されるように、NF-κBシグナル伝達はまた、細菌(黄色ブドウ球菌(S. aureus)等)の細胞への内部移行にとって重要である。
【００６６】
本発明によれば、阻害剤はNFκBの上流もしくは下流に、またはNFκBに対して直接的に、その調節効果を示しうるが、後者の作用様式が好ましい。NFκB活性を調節する阻害剤の例としては、阻害剤がNFκBの転写および/もしくは翻訳を減らし、またはNFκBの半減期を短縮しうるものが挙げられる。阻害剤はまた、NFκBに可逆的もしくは不可逆的に結合し、その活性化を阻害し、その活性を不活性化し、またはその他の方法で、遺伝子上の標的のような下流の標的とNFκBとの相互作用を妨害しうる。また、例えばIKK阻害によりIkBaリン酸化を阻害する分子のようなNFκB阻害剤はタンパク質キナーゼを阻害することができる。そのような活性を有する化合物は、参照化合物として役立ちうるSC-893、BMS-345541である。また、NFκB阻害剤は、タンパク質ホスファターゼを阻害し、またはプロテアソームもしくはユビキチン化を阻害しうる。参照化合物としても役立ちうる、そのようなNFκB阻害剤の例としては、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤、ボロネート、ボルテゾミブ、NPI-0052が挙げられる。あるいは、NFκB阻害剤は、NFκBの核移行、またはDNAへのその結合を遮断しうる。そのような阻害剤の例としては、SN50、デヒドロキシメチルエポキシキノマイシンおよびNFκBデコイODNが挙げられ、これらは参照化合物としても役立ちうる。NFκBの阻害剤に関するさらなる情報は、Guptaら(2010) (Gupta et al. (2010) Inhibiting NFκB activation by small molecules as a therapeutic strategy. Biochim Biophys Acta. 1799(10-12): 775-787)から得ることができる。
【００６７】
NFκB阻害剤は、小分子、大分子、ペプチド、オリゴヌクレオチドなどであり得る。NFκB阻害剤は、タンパク質もしくはその断片または核酸分子であってもよい。また、NFκB阻害剤という用語には、NFκB阻害剤の薬学的に許容される塩も含まれる。1つの態様において、NFκB阻害剤は、図9および10における表3および4に挙げられている阻害剤/分子からなる群より選択される。別の態様において、NFκB阻害剤は、図9における表3に挙げられている阻害剤/分子からなる群より選択される。別の態様において、NFκB阻害剤は、図10における表4に挙げられている阻害剤/分子からなる群より選択される。
【００６８】
別の態様において、NFκB阻害剤は、LASAG、SC75741 (および誘導体)、MG 132、TPCA-1、PCTC、IMD 0354、ルテオリン、カフェイン酸フェネチルエステル、カルダモニン、PF 184、IKK 16、SC 514、ウィザフェリンA、アルクチゲニン、Bay 11-7085、PSI、PR 39、Ro 106-9920、Bay 11-7821、ML-130、セラストロール、タンシノンIIA、HU 211、グリオトキシン、CID 2858522、ホノキオール、アンドログラフォライド、10Z-ヒメニアルジシン、ACHP、プリスチメリン、スルファサラジン、ML 120B二塩酸塩、アンレキサノクス、9-メチルストレプトイミドン、N-ステアロイルフィトスフィンゴシン、2-(1,8-ナフチリジン-2-イル)-フェノール、5-アミノサリチル酸、BAY 11-7085、3,4-ジヒドロキシ桂皮酸エチル、ヘレナリン(Helanalin)、NF-κB活性化阻害剤II、JSH-23、グルココルチコイド受容体調節因子、CpdA、PPM-18、アスピリン(ASA)、ピロリジンジチオカルバミン酸アンモニウム塩、(R)-MG132、SC75741 (および誘導体)、ロカグラミド、サリチル酸ナトリウム、QNZ、PS-1145、CAY10512、ボルテゾミブ、サルサレート、レスベラトロール、LASAG、デオキシスペルグアリン、スリンダク、サリドマイド、AGRO-100、CHS 828、および/またはクルクミン、好ましくはボルテゾミブ、クルクミン、サルサレート、レスベラトロール、サリチル酸ナトリウム、LASAG、ASA、デオキシスペルグアリン、スリンダク、サリドマイド、AGRO-100、CHS 828、さらにより好ましくはSC75741 (および誘導体) ASAおよびLASAG、最も好ましくはLASAGからなる群より選択される。
【００６９】
SC75741に加えて「SC75741」または「SC75741 (および誘導体)」という用語により、SC75741の誘導体も本発明により想定される。
【００７０】
一般に、当業者は、化合物がMEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤であるかどうかを明らかにする方法を知っている。化合物がMEK阻害剤および/またはp38阻害剤であるかどうかを判定できうる方法のさらなる例は、MEKおよび/またはp38 NFκBタンパク質を単離することであろう。タンパク質は、MEKおよび/もしくはp38タンパク質が天然に発現される細胞から、またはMEKおよび/もしくはp38タンパク質の発現を指令するウイルスによる感染もしくはオリゴヌクレオチドのトランスフェクションによって過剰発現された細胞から単離することができる。あるいは、MEKおよび/またはp38タンパク質はまた、組み換えにより発現されてもよい。タンパク質を単離すれば、当業者は、潜在的なMEKおよび/またはp38阻害剤の存在下または非存在下でキナーゼの活性を測定することができる。キナーゼ活性が、阻害剤とされるものの存在下で、その非存在下でよりも低いなら、その阻害剤は、それぞれMEKおよび/またはp38阻害剤である。
【００７１】
MEKおよび/またはp38に直接作用するなら、阻害剤は約5 μMまたはそれ以下、好ましくは500 nmまたはそれ以下、より好ましくは100 nmまたはそれ以下のIC50値を示すはずである。関連する態様において、阻害剤はp38-αアイソフォームに対して、同一の阻害剤が同一のまたは同等のアッセイ法において他のp38 MAPキナーゼアイソフォームに対して試験される場合に観察されるものよりも、好ましくは少なくとも10倍低いIC50値を示すはずである。IC50値はアッセイに左右され、判定ごとに変化しうることに留意すべきである。厳密な値そのものではなく、化合物のIC50値の相対的な関係を調べることがいっそう重要である。
【００７２】
IC50は、阻害剤の非存在下で測定された活性の50%まで酵素を阻害する化合物の濃度である。
【００７３】
IC50値は、対照と比較して50%の減少を引き起こす阻害剤の濃度を用いて計算される。IC50値はアッセイに左右され、判定ごとに異なるであろう。したがって、IC50値は相対値である。特定の阻害剤に割り当てられた値は、絶対的な基準ではなく一般的に比較されるべきである。
【００７４】
潜在的な活性化因子、阻害剤、または調節因子で処理されたMAPおよび/またはMAPKキナーゼを含むサンプルまたはアッセイ物を、阻害剤、活性化因子、または調節因子なしの対照サンプルと比較して、阻害の程度を調べる。対照サンプル(阻害剤で未処理)には、100%のMAPおよび/またはMAPKキナーゼ相対活性値を割り当てることができる。MAPおよび/またはMAPKキナーゼの阻害は、対照に対するMAPおよび/またはMAPKキナーゼ活性値が約80%、任意で50%または25〜0%である場合に達成される。MAPおよび/またはMAPKキナーゼの活性化は、対照に対するMAPキナーゼ活性値が110%、任意で150%、任意で200〜500%、または1000〜3000%高い場合に達成される。本発明の例示的なMAPキナーゼ結合活性アッセイ法は、MAPおよび/またはMAPKキナーゼリガンドブロットアッセイ法(Aymerich et al., Invest Opthalmol Vis Sci. 42:3287-93, 2001); MAPおよび/またはMAPKキナーゼ親和性カラムクロマトグラフィーアッセイ法(Alberdi et al., J Biol Chem. 274:31605-12, 1999)、ならびにMAPおよび/またはMAPKキナーゼリガンド結合アッセイ法(Alberdi et al., J Biol Chem. 274:31605-12, 1999)である。それぞれ参照によりその全体が組み入れられる。
【００７５】
また、阻害剤の選択性は、Mihara (2008), Br. J. Pharmacol. 154(1):153-164に記述されているキナーゼ選択性アッセイ法によって測定されうる。
【００７６】
NFκB阻害剤の場合、例えば、未処理対照細胞におけるNFκBの標的遺伝子の遺伝子産物(タンパク質)を測定し、これらの標的遺伝子産物の発現を、NFκB阻害剤で処理された細胞と比較することができる。いくつかの標的遺伝子は、Oeckinghaus and Ghosh (2009) The NF-κB Family of Transcription Factors and Its Regulation. Cold Spring Harb Perspect Biol. Oct 2009; 1(4): a000034に記述されている。
【００７７】
細胞を阻害剤で処理した場合、発現レベルは低減する。他の戦略は、p-p65蓄積およびNFκBの核移行とともにIkBa分解をウエスタンブロットにより検出することであってもよい。また、阻害剤で処理された細胞と比較して、阻害剤で処理されていない細胞のDNAとのNFκBの相互作用は、電気泳動移動度シフトアッセイ法(EMSA)を用いることによって分析されうる。
【００７８】
分子の阻害特性はまた、その作用を参照化合物と比較することによって分析することができる。本明細書において言及される「参照化合物」は、分子がMEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤特性を有するかどうかを判定するための陽性対照として用いられうる化合物を意味する。したがってまた、本明細書において列挙される阻害剤のいずれも、そのような参照化合物として用いられうる。可能性のある試験は、例えば、MEK、p38、およびまたはNFκB経路を活性化するように刺激されている細胞を、参照化合物により、および並行して例えば異なるウェルにおいて関心対象の化合物により、処理するものでありうる。
【００７９】
本発明の阻害剤は治療および/または予防のための方法において用いることができる。したがって、「治療する」または「治療」という用語は、症状を寛解または改善させる目的で、細菌感染およびインフルエンザウイルス感染を含む重感染に罹患している対象にMEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤を、好ましくは医薬の形態で、投与することを含む。症状を寛解または改善させる目的で、細菌感染に罹患している対象にMEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤を、好ましくは医薬の形態で、投与することが同様に含まれる。
【００８０】
さらに、本明細書において用いられる「予防」という用語は、疾患を予防することを目的とする任意の医療手順または公衆衛生手順をいう。本明細書において用いられる場合、「予防する」、「予防」および「予防すること」という用語は、所与の状態、すなわちインフルエンザウイルス感染および細菌感染を含む重感染または細菌感染のみを獲得または発症する危険性の低減をいう。また「予防」とは、対象におけるインフルエンザウイルス感染および細菌感染を含む重感染または細菌感染のみの再発の低減または阻害も意味する。
【００８１】
本発明の阻害剤は、重感染の治療に有効である。本明細書において用いられる「重感染」は、インフルエンザウイルス感染および細菌感染を含む。そのような重感染は、細菌およびインフルエンザウイルスが、宿主、例えば対象および/または単一細胞に同時感染することによって起こりうる。それはまた、宿主、例えば対象および/または細胞が1つまたは複数のウイルス粒子および1つまたは複数の細菌に同時に感染していることでもありうる。しかしながら、そのような重感染は連続的に起こりうることもある。そのような場合には、最初に1つまたは複数のウイルス粒子に感染し、時間的にその後で、同じ宿主および/または細胞が1つまたは複数の細菌に感染するか、またはその逆になる。2つの感染の間の期間は、長くとも14日、13日、12日、11日、10日、9日、8日、7日、6日、5日、4日、3日、2日、1日、12時間、6時間、3時間、1.5時間または最短でも30分の期間でありうる。
【００８２】
そのような状況はまた、特に、第1の感染に対して用いられた処置に耐性である外因性または内因性由来の異なる微生物因子による第2の感染が、前の感染に重なって起こる重複感染でありうる。
【００８３】
重感染のなかで、インフルエンザウイルス感染はインフルエンザA型ウイルスまたはインフルエンザB型ウイルスによって媒介され得、好ましくはインフルエンザA型ウイルスは、H1N1、H2N2、H3N2、H6N1、H7N7、H7N9、H9N2 H10N7、H10N8、またはH5N1である。1つの態様において、インフルエンザA型ウイルスはH1N1である。他の態様において、インフルエンザA型ウイルスはH3N2、H5N1、およびH7N9である。さらなる態様において、インフルエンザA型ウイルスはH3N2、H5N1、H1N1、およびH7N9である。
【００８４】
本発明はまた、上記の重感染の状況で起こりうるか、または宿主、例えば対象および/もしくは細胞に存在する唯一の感染として起こりうる「細菌感染」に関する。細菌感染は、任意の細菌によって媒介され得、好ましくはスタフィロコッカス科、連鎖球菌科、レジオネラ科、シュードモナス科、クラミジア科、マイコプラズマ科、腸内細菌科、シュードモナス目および/またはパスツレラ科からなる群より選択される細菌によって媒介される。
【００８５】
他の態様において、細菌感染は、ブドウ球菌(Staphylococcus)、好ましくは黄色ブドウ球菌、メチシリン感受性およびメチシリン耐性黄色ブドウ球菌、パントン-バレンタインロイコシジン(PVL)発現性の黄色ブドウ球菌および/または連鎖球菌科、好ましくはストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)もしくは肺炎連鎖球菌、レジオネラ菌(Legionella)、好ましくはレジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)、シュードモナス菌(Pseudomonas)、好ましくは緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、クラミドフィラ(Chlamydophila)、好ましくは肺炎クラミジア(Chlamydophila pneumonia)、マイコプラズマ(Mycoplasma)、好ましくはマイコプラズマ肺炎(Mycoplasma pneumonia)、クレブシエラ菌(Klebsiella)、好ましくは肺炎桿菌(Klebsiella pneumonia)、モラクセラ(Moraxella)、好ましくはカタラリス菌(Moraxella catarrhalis)および/またはヘモフィルス(Haemophilus)、好ましくはインフルエンザ菌からなる群より選択される細菌によって媒介される。好ましくは、細菌は、黄色ブドウ球菌、肺炎連鎖球菌またはインフルエンザ菌からなる群より選択される。最も好ましくは、細菌は黄色ブドウ球菌である。
【００８６】
本発明により、阻害剤は互いに組み合わされ得ることも想定される。したがって、1つの態様において、MEK阻害剤は、別のMEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤と組み合わされる。さらなる態様において、p38阻害剤は別のp38阻害剤、MEK阻害剤、および/またはNFκB阻害剤と組み合わされる。別の態様において、NFκB阻害剤は別のNFκB阻害剤、p38阻害剤、および/またはMEK阻害剤と組み合わされる。上記に関して、「別の阻害剤」という用語は、例えば、1つのMEK阻害剤を別のMEK阻害剤と組み合わせることもできるが、これらの2つのMEK阻害剤は同じものではないことを明確にするために用いられる。例えば、MEK阻害剤CI-1040をMEK阻害剤GDC-0973と組み合わせることができる。このことは、p38およびNFκB阻害剤に等しく関連する。
【００８７】
1つの態様において、MEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤は、インフルエンザウイルスおよび細菌を標的とする1つまたは複数のさらなる阻害剤と同時に、その前にまたはその後に投与される。
【００８８】
さらなる態様において、MEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤は、MEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤が、インフルエンザウイルスおよび/または細菌を標的とする1つまたは複数の阻害剤と組み合わされる、本発明の重感染を予防および/または治療するための方法における使用のためのものである。1つの態様において、MEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤は、インフルエンザウイルスおよび/または細菌を標的とする1つまたは複数の阻害剤と同時に、その前にまたはその後に投与される。
【００８９】
一般に、インフルエンザウイルスを標的とする阻害剤は、インフルエンザ治療に有効な任意の阻害剤または医薬である。様々な物質が、インフルエンザ感染を低減するのに有効であることが知られている。それらの中には、例えば、ノイラミニダーゼ阻害剤、イオンチャネルタンパク質(M2)を標的とする化合物、およびウイルスポリメラーゼ複合体の成分PB1、PB2、PAまたはNPと干渉することによってポリメラーゼ活性またはエンドヌクレアーゼ活性を標的とする化合物がある。本発明により、これらの阻害剤の薬学的に許容される塩も想定される。
【００９０】
「ノイラミニダーゼ阻害剤」は、インフルエンザウイルスを標的とする抗ウイルス薬であり、これは、ウイルスノイラミニダーゼタンパク質の機能を遮断し、それによりウイルスが、感染しようと狙っている細胞に結合するのを防ぐことにより、および/または新たに生成されたウイルスが複製した細胞から出芽できないために、宿主細胞からの出芽によってウイルスが増殖するのを防ぐことにより機能する。また、ノイラミニダーゼ阻害剤の薬学的に許容される塩も含まれる。好ましいノイラミニダーゼ阻害剤は、オセルタミビル、ザナミビル、ペラミビル、またはこれらの物質のいずれかの薬学的に許容される塩、例えばリン酸オセルタミビル、カルボン酸オセルタミビルなどである。最も好ましいノイラミニダーゼ阻害剤は、リン酸オセルタミビル、ザナミビル、オセルタミビル、またはペラミビルである。
【００９１】
イオンチャネルタンパク質(M2)を標的とする化合物は、例えば、アマンタジンおよび/またはリマンタジンであるが、ウイルスポリメラーゼ複合体の成分PB1、PB2、PA、またはNPと干渉することによってポリメラーゼ活性またはエンドヌクレアーゼ活性を標的とする化合物は、例えば、NP遮断薬ヌクレオジンまたはポリメラーゼ阻害剤T-705である。
【００９２】
あるいはまたはさらに、MEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤は、細菌を標的とする1つまたは複数の阻害剤と組み合わせることができる。細菌を標的とする阻害剤は、細菌感染を低減するのに有効な任意の阻害剤であり得る。当業者に周知の好ましい阻害剤は、抗生物質である。好ましい抗生物質は、表5 (図11)から得ることができる。したがって、1つの態様において、抗生物質は、表5 (図11)に挙げられている抗生物質からなる群より選択される。さらなる態様において、抗生物質は、表5 (図11)に挙げられている抗生物質のクラスからなる群より選択される。別の態様において、抗生物質は、表5 (図11)に挙げられている抗生物質の一般名からなる群より選択される。より好ましいのは、ゲンタマイシン、リファンピシン、リゾスタフィン、エリスロマイシン、レボフロキサシン、バンコマイシン、テイコプラニン、ペニシリン、およびオキサシリンから選択される抗生物質である。
【００９３】
本発明の阻害剤または阻害剤の組み合わせによって治療されうる「対象」は、好ましくは、脊椎動物である。本発明の文脈において、「対象」という用語は、重感染または細菌感染のみの治療を必要とする個体を意味する。好ましくは、対象は、重感染もしくは細菌感染のみに罹患している患者またはその危険性のある患者である。好ましくは、患者は脊椎動物、より好ましくは哺乳動物である。哺乳動物には、家畜、スポーツ動物、ペット、霊長類、マウス、およびラットが含まれるが、これらに限定されることはない。好ましくは、哺乳動物は、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、マウス、ラットなどであり、特に好ましくは、ヒトである。いくつかの態様において、対象はヒト対象であり、これは任意で1歳超かつ14歳未満; 50歳から65歳の間、または年齢65歳超であってもよい。他の態様において、対象はヒト対象であり、これは、少なくとも50歳である対象、長期療養施設に居住する対象、肺または心血管系の慢性障害を有する対象、慢性代謝性疾患、腎機能障害、異常ヘモグロビン症または免疫抑制のために、前年中に定期的な医学的経過観察または入院を必要とした対象、年齢14歳未満の対象、長期アスピリン療法を受けている年齢6ヶ月〜18歳の対象、およびインフルエンザ流行期の間に妊娠第2期または第3期にあろう女性からなる群より選択される。
【００９４】
本発明の方法において、MEK阻害剤、p38阻害剤、またはNFκB阻害剤ならびにインフルエンザウイルスを標的とする阻害剤および細菌を標的とする阻害剤は、経口的に、静脈内に、胸腔内に、筋肉内に、局所に、または吸入によって投与されうる。好ましくは、MEK阻害剤は、経鼻吸入によってまたは経口的に投与される。
【００９５】
本発明はまた、様々な組成物を想定する。本発明は、細菌感染およびインフルエンザウイルス感染を含む重感染を予防および/または治療するための方法における使用のための、MEK阻害剤、p38阻害剤および/またはNFκB阻害剤を含む組成物に関する。本発明は同様に、細菌感染を予防および/または治療するための方法における使用のための、MEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤を含む組成物に関する。また、本発明により細菌感染およびインフルエンザウイルス感染を含む重感染を予防および/または治療するための方法における使用のための、MEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤、ならびにインフルエンザウイルスおよび/または細菌を標的とする1つまたは複数の阻害剤を含む組成物も提供される。加えて、本発明は、細菌感染を予防および/または治療するための方法における使用のための、MEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤、ならびに細菌を標的とする1つまたは複数の阻害剤を含む組成物に関する。
【００９６】
MEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤、ならびに細菌を標的とする1つもしくは複数の阻害剤および/またはインフルエンザウイルスを標的とする1つもしくは複数の阻害剤を最終的にさらに含む組成物は、薬学的組成物でありうる。好ましくは、そのような組成物は、担体、好ましくは薬学的に許容される担体をさらに含む。組成物は、経口投与可能な懸濁液もしくは錠剤; 鼻腔用スプレイ、滅菌注射用調製物(静脈内、胸膜内、筋肉内)、例えば滅菌注射用水性もしくは油性懸濁液または坐剤の形態であり得る。懸濁液として経口投与される場合、これらの組成物は、薬学的処方の分野において利用可能な技法により調製され、増量剤としての微結晶性セルロース、懸濁化剤としてのアルギン酸またはアルギン酸ナトリウム、増粘剤としてのメチルセルロース、および当技術分野において公知の甘味料/着香剤を含有しうる。これらの組成物は、即放性錠剤として、微結晶性セルロース、第二リン酸カルシウム、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、およびラクトース、ならびに/または当技術分野において公知の他の賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、希釈剤、および滑沢剤を含有しうる。注射可能な溶液または懸濁液は、マンニトール、1,3-ブタンジオール、水、リンゲル液もしくは等張塩化ナトリウム溶液などの、適当な無毒性の非経口的に許容される希釈剤もしくは溶媒、または合成モノグリセリドもしくはジグリセリドを含む滅菌無刺激の固定油、およびオレイン酸を含む脂肪酸などの、適当な分散剤もしくは湿潤剤および懸濁化剤を用いて、既知の技術により処方されうる。
【００９７】
阻害剤は、好ましくは、治療的有効量で投与される。本発明の使用に向けた、かつMEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤、ならびに任意でインフルエンザウイルスを標的とする1つもしくは複数の阻害剤および/または細菌を標的とする1つもしくは複数の阻害剤を含む薬学的組成物は、哺乳類または鳥類である患者に投与される。適当な哺乳類の例としては、マウス、ラット、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、ウマ、モルモット、イヌ科動物、ハムスター、ミンク、アザラシ、クジラ、ラクダ、チンパンジー、アカゲザル、およびヒトが挙げられるが、これらに限定されることはなく、ヒトが好ましい。適当な鳥類の例としては、例を挙げれば、七面鳥、ニワトリ、ガチョウ、カモ、コガモ、マガモ、ムクドリ、オナガガモ、カモメ、ハクチョウ、ホロホロチョウまたは水鳥が挙げられるが、これらに限定されることはない。ヒト患者は、本発明の特定の態様である。
【００９８】
当業者には明らかであるように、各活性化合物/阻害剤の「治療的有効量」は、使用される化合物の活性、患者の体内での活性化合物の安定性、軽減させたい状態の重篤度、処置される患者の総体重、投与経路、身体による活性化合物の吸収、分配および排出の容易性、処置される患者の年齢および感受性、有害事象などを含むが、これらに限定されない、要因によって変化しうる。投与量は、さまざまな要因が経時変化するのに合わせて調整することができる。
【００９９】
本明細書において記述される阻害剤、方法、および使用は、ヒトの治療および獣医用途の両方に適用可能である。所望の治療活性を有する、本明細書において記述される化合物、特にMEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤、ならびに任意でインフルエンザウイルスを標的とする1つもしくは複数の阻害剤および/または細菌を標的とする1つもしくは複数の阻害剤は、本明細書において記述されるように、対象に生理学的に許容される担体中で投与されうる。導入の様式に依って、化合物は、以下に議論されるように種々の方法で処方されうる。処方物中の治療的に活性な化合物の濃度は、約0.1〜100重量%まで変化しうる。薬剤は、単独でまたは他の処置との組み合わせで投与されうる。
【０１００】
本発明の方法における薬学的化合物は、任意の適当な単位投与剤形で投与することができる。適当な経口処方物は、錠剤、カプセル剤、懸濁液、シロップ剤、チューインガム、オブラート、エリキシル剤などの形態であり得る。結合剤、賦形剤、滑沢剤、および甘味剤または着香剤のような薬学的に許容される担体を、経口薬学的組成物に含めることができる。望ましいなら、特別な剤形の味、色、および形状を改変するために従来の薬剤を含めることもできる。
【０１０１】
注射用処方物の場合、薬学的組成物は、適当なバイアルまたはチューブ中で適当な賦形剤と混合される凍結乾燥された粉末であり得る。診療所で使用する前に、凍結乾燥された粉末を適当な溶媒系に溶解することにより薬物を再構成して、静脈内または筋肉内注射に適した組成物を形成させてもよい。
【０１０２】
本発明の別の態様によれば、MEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤の治療的有効量、ならびにオセルタミビル、リン酸オセルタミビル、ザナミビル、およびペラミビルの群より選択されるノイラミニダーゼ阻害剤の治療的有効量を含む、薬学的組成物が提供される。
【０１０３】
1つの態様において、組成物は、上記のように、MEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤の治療的有効量(例えば、0.1 mgから2000 mg、0.1 mgから1000 mg、0.1から500 mg、0.1から200 mg、30から300 mg、0.1から75 mg、0.1から30 mg)、ならびにノイラミニダーゼ阻害剤の治療的有効量(例えば、0.1 mgから2000 mg、0.1 mgから1000 mg、0.1から500 mg、0.1から200 mg、30から300 mg、0.1から75 mg、0.1から30 mg)を有する経口投与可能な剤形(例えば、錠剤またはカプセル剤またはシロップ剤など)であり得る。
【０１０４】
さらなる態様において、MEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤は、本発明の重感染を予防および/または治療するための方法における使用のためのものであり、MEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤を、
a) インフルエンザウイルスおよび
b) 細菌
に感染した培養細胞を含むインビトロの試験システムに接触させた場合に、MEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤は、接触前のインビトロの試験システムと比較してウイルス感染および細菌感染の両方を低減する。別の態様において、MEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤は、本発明の細菌感染を予防および/または治療するための方法における使用のためのものであり、MEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤を、細菌に感染した培養細胞を含むインビトロの試験システムに接触させた場合に、MEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤は、接触前のインビトロの試験システムと比較して細菌感染を低減する。
【０１０５】
したがって、本発明はまた、
a) インフルエンザウイルスおよび
b) 細菌
に感染した培養細胞を含む、インビトロの試験システムに関する。
【０１０６】
この考え方に沿って、本発明はまた、細菌に感染した培養細胞を含む、インビトロの試験システムを提供する。
【０１０７】
インビトロの試験システムがウイルス感染および細菌感染を含む場合には、先と同様、これらの感染は連続的にまたは同時に行われ得る。
【０１０８】
「培養細胞」は、その自然環境に、例えば植物または動物内に存在しない、細胞である。むしろ、培養細胞は、その自然環境から単離された細胞を含む初代細胞培養物、または細胞株でありうる。好ましくは、培養細胞はヒト肺上皮細胞である。好ましくは、培養細胞は、DMEMのような培地0.5 ml、1 ml、1.5 ml、2 ml、2.5 ml、3 ml、3.5 ml、4 ml中に約1×105、2×105、3×105、4×105、5×105、6×105、7×105、8×105、9×105、10×105、11×105、最も好ましくは8×105個の細胞の密度で播種される。最も好ましいのは、DMEM 2 ml中に8×105個の細胞の密度である。
【０１０９】
そのような培養細胞は、ウイルスおよび細菌に感染し、または他の態様において細菌のみに感染する。既に上述したように、重感染は、連続的または同時的な形で起こりうる。例えば、培養細胞は、最初にインフルエンザウイルスに感染し、30分後に細菌に感染しうる。3時間後に抗生物質を培養液に追加して細胞外細菌を除去することも可能である。そのようなシナリオでは、その後、抗生物質(antibioticum)は再び洗い流されよう。他の態様において、細胞は細菌に感染するのみである。
【０１１０】
本明細書において用いられる「接触させる」という用語は、インフルエンザウイルスおよび細菌を含む細胞を空間的にMEK阻害剤、p38阻害剤、および/またはNFκB阻害剤に近接させることをいう。
【０１１１】
これは、例えば、培養細胞が注射器を介して配置されている培地に阻害剤を適用することを意味し得る。
【０１１２】
接触によりその後、阻害剤が活性であれば、ウイルス感染および細菌感染が低減される。いくつかの態様において、かさねて、本発明の阻害剤は、ウイルス感染の影響がない場合は細菌感染のみを低減するために用いられる。
【０１１３】
1つの態様において、ウイルス感染の低減はプラーク形成単位(pfu)/mlの低減であり、細菌感染の低減はコロニー形成単位(CFU)/mlの低減である。「プラーク形成単位(pfu)/ml」は、ウイルス粒子のような、単位体積当たりのプラークを形成できる粒子の数の尺度である。これは、粒子の絶対量の測定ではなく、機能的な測定である: 欠陥のあるウイルス粒子またはその標的細胞に感染しないウイルス粒子は、プラークを生成せず、したがって計数されない。例えば、1,000 PFU/μlの濃度を有するインフルエンザウイルスの溶液は、溶液1 μlが細胞単層中に1000個の感染性プラークを生成するのに十分なウイルス粒子を含有することを示す。本発明の場合、阻害剤で処理した細胞培養物は、本発明の阻害剤で処理する前の培養物と比較して、処理後の培養物中のプラーク形成単位の数の低減を示す。
【０１１４】
生じうる「プラーク形成単位(pfu)/mlの低減」は、以下の方法で分析される。最初に、インフルエンザウイルスおよび細菌に重感染している培養細胞を、プラーク形成単位(pfu)/mlを生成するその能力について、例えばペトリ皿からいくつかの細胞を吸い取り、形成される細菌プラークの計数のためにプレーティングすることにより分析する。次いで、この結果を、阻害剤が適用された後の同じ培養物の細胞によって生成されたプラーク形成単位(pfu)/mlの数と比較する。阻害剤での処理後にプラーク形成単位(pfu)/mlの数が、阻害剤の適用前に生成された数と比較して低減するなら、プラーク形成単位の低減が認められる。
【０１１５】
「コロニー形成単位(CFU)/ml」は、サンプル中の生存細菌の数を推定する。異なる方法が存在する。例えば、コロニー形成単位を生成するために、サンプル(例えば、少量の培養細胞)を栄養寒天プレートの表面に広げ、計数のためのインキュベーションの前に乾燥させる。生存可能な細菌は、制御された条件下で二分裂を介して増殖する能力として定義される。細胞培養物中のコロニーが視認できるためには、著しい増殖が必要とされる−コロニーを計数する場合、コロニーが1つの細胞または1,000個の細胞から生じたかどうかは不明である。それゆえ、結果は、この不明であることを反映するように(細胞/mlまたは細胞/gではなく)液体についてはCFU/ml (コロニー形成単位/ミリリットル)、および固体についてはCFU/g (コロニー形成単位/グラム)として報告される。
【０１１６】
「コロニー形成単位(CFU)/ml」は、以下の方法で分析することができる。最初に、インフルエンザウイルスおよび細菌に重感染している、または細菌のみに感染している培養細胞を、コロニー形成単位(CFU)/mlを生成するその能力について、例えばペトリ皿からいくつかの細胞を吸い取り、計数のためにプレーティングすることにより分析する。次いで、この結果を、阻害剤が適用された後の同じ培養物の細胞によって生成されたコロニー形成単位(CFU)/mlの数と比較する。コロニー形成単位(CFU)/mlの数が、阻害剤の適用前に生成された数まで低減するなら、低減が認められる。
【０１１７】
一般に、当業者は、細菌感染およびウイルス感染を分析するこれらの周知の技法を知っている。プラーク形成単位(pfu)/mlおよびコロニー形成単位(CFU)/mlを測定できる方法は、文献(Tuchscherr, L. et al. (2011). Staphylococcus aureus phenotype switching: an effective bacterial strategy to escape host immune response and establish a chronic infection (EMBO molecular medicine 3, 129-141およびHrincius, E.R et al. (2010) CRK adaptor protein expression is required for efficient replication of avian influenza A viruses and controls JNK mediated apoptotic responses. Cellular microbiology 12, 831-843)にさらに記述されている。
【０１１８】
加えて、本発明は、以下の項目に関する。
【０１１９】
項目1.
本発明はまた、細菌感染およびインフルエンザウイルス感染を含む重感染を低減するのに有効な阻害剤の判定のための本発明のインビトロの試験システムの使用を提供する。1つの態様において、ウイルス感染の低減はプラーク形成単位(pfu)/mlの低減であり、細菌感染の低減はコロニー形成単位(CFU)/mlの低減である。
【０１２０】
項目2.
加えて、本発明は、接触前のインビトロの試験システムと比較してウイルス感染および細菌感染の両方を低減する関心対象の化合物を、本発明のインビトロの試験システムに接触させる段階を含む、細菌感染およびインフルエンザウイルス感染を含む重感染を予防および/または治療するのに有効な分子を検出するための方法に関する。1つの態様において、ウイルス感染の低減はプラーク形成単位(pfu)/mlの低減であり、細菌感染の低減はコロニー形成単位(CFU)/mlの低減である。
【０１２１】
項目3.
本発明は、加えて、細菌感染を低減するのに有効な阻害剤の判定のための本発明のインビトロの試験システムの使用に関する。
【０１２２】
項目4.
さらに、本発明は、シグナル伝達のレベル、結果的に起こるサイトカインおよびケモカイン発現、アポトーシスおよびネクローシスの誘導、ならびに/または健康状態および疾患を調節する酸化還元ホメオスタシスの検査を任意で含んでもよい、先天性宿主細胞応答の検査のための本発明のインビトロの試験システムの使用に関する。
【０１２３】
項目5.
また、本発明により、接触前のインビトロの試験システムと比較して細菌感染を低減する関心対象の化合物を、本発明のインビトロの試験システムに接触させる段階を含む、細菌感染を予防および/または治療するのに有効な分子を検出するための方法も提供される。
【０１２４】
項目6.
本発明はさらに、インフルエンザウイルスおよび細菌に感染した培養細胞に関する。
【０１２５】
項目7.
また、細菌に感染した培養細胞も提供される。
【０１２６】
項目8.
本発明はまた、本発明のMEK阻害剤、p38阻害剤、および/もしくはNFκB阻害剤または本発明の薬学的組成物の治療的有効量を対象に投与する段階を含む、対象における細菌感染およびインフルエンザウイルス感染を含む重感染を予防および/または治療するための方法に関する。
【０１２７】
項目9.
また、本発明は、医薬の調製のための本発明のMEK阻害剤、p38阻害剤、および/もしくはNFκB阻害剤または本発明の組成物の使用を提供する。
【０１２８】
項目10.
加えて、本発明は、細菌感染およびインフルエンザウイルス感染を含む重感染を予防および/または治療するための、本発明のMEK阻害剤、p38阻害剤、および/もしくはNFκB阻害剤、または本発明の組成物の使用に関する。
【０１２９】
項目11.
同様に、本発明はまた、本発明のMEK阻害剤、p38阻害剤、および/もしくはNFκB阻害剤、または本発明の薬学的組成物の治療的有効量を対象に投与する段階を含む、対象における細菌感染を予防および/または治療するための方法を提供する。
【０１３０】
項目12.
加えて、本発明は、細菌感染を予防および/または治療するための、本発明のMEK阻害剤、p38阻害剤、および/もしくはNFκB阻害剤、または本発明の組成物の使用に関する。
【０１３１】
本明細書において用いられる場合、「1つの」、「ある」および「その」という単数形は、文脈上明らかにそうでないことが示されない限り、複数の指示対象を含むことに注意しなければならない。したがって、例えば、「試薬」に対する言及は、そのような異なる試薬の1つまたは複数を含み、「方法」に対する言及は、変更できる、または本明細書において記述される方法の代わりに用いることができる当業者に公知の同等の段階および方法に対する言及を含む。
【０１３２】
本開示において引用されている全ての刊行物および特許は、参照によりその全体が組み入れられる。参照により組み入れられる資料が本明細書と矛盾するか、または合致しない限りにおいて、本明細書がそのようないずれの資料にも優先する。
【０１３３】
特に示されていない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、その一連のものにおける各要素を指すものと理解されるべきである。当業者は、本明細書において記述される本発明の具体的な態様に対する多くの等価物を認識するか、または単なる通常の実験を用いてその等価物を確認できるであろう。そのような等価物は本発明によって包含されるものと意図される。
【０１３４】
本明細書およびそれに続く特許請求の範囲の全体において、特に文脈上必要ない限り、「含む(comprise)」という語、ならびに「含む(comprises)」および「含んでいる(comprising)」のような変化形は、記載される整数もしくは段階または整数もしくは段階の群の包含を示唆するが、しかし他のいずれの整数もしくは段階または整数もしくは段階の群の除外を示唆するものではないと理解されるであろう。本明細書において用いられる場合、「含む」という用語は、「含有する」という用語で置き換えることができ、または本明細書において用いられる場合には「有する」という用語で置き換えることもできる。
【０１３５】
本明細書において用いられる場合、「からなる」は、特許請求の範囲の要素において特定されていない任意の要素、段階または成分を除外する。本明細書において用いられる場合、「から本質的になる」は、特許請求の範囲の基本的かつ新規な特徴に著しく影響を及ぼさない材料または段階を排除するものではない。本明細書における各事例において、「含む」、「から本質的になる」および「からなる」という用語のいずれも、他の2つの用語のいずれかと置き換えられうる。
【０１３６】
本明細書の本文全体を通じていくつかの文書が引用される。本明細書において引用される文書(全ての特許、特許出願、科学刊行物、製造元の仕様書、説明書などを含む)の各々は、上記または下記にかかわらず、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。先行発明を理由として本発明がそのような開示に先行する資格がないことの自認であると解釈すべきものは、本明細書にはない。
【実施例】
【０１３７】
以下の実施例は本発明を例示する。これらの実施例は本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。実施例は例示の目的で含まれており、本発明は特許請求の範囲によってのみ限定される。
【０１３８】
実施例1
ここ数年以内に、ワクチン接種またはIVに対する従来の抗ウイルス薬(ノイラミニダーゼおよびM2遮断薬)ならびに黄色ブドウ球菌に対する従来の抗生物質による治療とは別の追加的および代替的な治療戦略の必要性が着実に増した。その一方で、抗ウイルス治療介入のために、いくつかの細胞因子が潜在的な標的として同定されている。全く対照的に、細菌感染中の、特に細菌量および/または急速なサイトカイン発現の発生を低減することによる抗細菌治療の標的としての、お決まりの(rote)細胞因子に関する知識は、IV重感染の存在下ではさらにいっそう、あまり理解されていない。
【０１３９】
本発明者らは、IVおよび黄色ブドウ球菌重感染時に潜在的な抗感染薬の存在下または非存在下において(1) 子孫ウイルス力価および(2) 細胞内細菌の力価ならびに(3) 宿主防御機構の変化の判定を可能にする感染プロトコルを確立した。最初のアプローチにおいて、本発明者らは、単独感染または重感染の状況においてIVおよび黄色ブドウ球菌感染に対する、MEK阻害剤(U0126 = 50 μM)、p38阻害剤(SB202190 = 10 μM)およびNFκB阻害剤(LASAG = 5 mM)の効果を溶媒対照と比較して調べた。対照として、ウイルスノイラミニダーゼ阻害剤オセルタミビル(タミフル) (2 μm)をHepesと比較して用いた。ウイルス感染のため、本発明者らはヒトインフルエンザウイルスA/Puerto Rico/8134 (H1N1)または鳥類インフルエンザウイルスA/FPV/Bratislava/79 (H7N7)を用い、細菌感染のため、本発明者らは黄色ブドウ球菌株6850を用いた。
【０１４０】
感染の手順(図1):
ヒト肺上皮細胞をDMEM [10% FCS] 2 ml中で、6ウェルプレート(細胞8×105個/ウェル)に播種した。播種から16〜20時間後に、細胞をすすぎ、PBS/BA [0.2%ウシ血清アルブミン(BSA)、1 mM MgCl2、0.9 mM CaCl2、100 U/mlペニシリン、0.1 mg/mlストレプトマイシン] (500 μl/6ウェル)または表示した感染多重度(MOI)のウイルスを含有するPBS/BAとともに37℃でインキュベートした。30分のインキュベーション後に、ウイルス希釈液を吸引し、細胞をPBSですすぎ、試験化合物の存在下または非存在下、表示したMOIの細菌を含むまたは含まない浸潤用培地DMEM/INV [1%ヒト血清アルブミン、25 nmol/l HEPES] (2 ml/6ウェル)を補充した。細菌感染から3時間後に、細胞を抗生物質で処理して、細胞外細菌を除去した。そこで、細胞をPBSですすぎ、その後、37℃で20分間DMEM/INV抗生物質[2 μg/mlのリゾスタフィン(Sigma)] (1 ml/6ウェル)とともにインキュベートした。PBSによるさらなる洗浄後、試験物質を含有するDMEM/INVを、細胞に補充し、これを、表示した時間37℃でインキュベートした。A/Puerto Rico/8/34に関して、DMEM/INVに0.333 μg/mlのトリプシン(Invitrogen)をさらに補充した。IV力価および細胞内細菌の判定を(Hrincius et al., 2010, Tuchscherr et al., 2011)に記述されているように行った。
【０１４１】
IV力価はプラーク形成単位(pfu)/mlとして示されており、黄色ブドウ球菌力価はコロニー形成単位(CFU)/mlとして示されている。データは、2つの生体サンプルを用いた2〜3回の独立した実験の平均±SDを表す。統計的有意性を両側2標本t検定により評価した(＊p < 0.05; ＊＊ p < 0.01; ＊＊＊ p < 0.001)。
【０１４２】
重感染の状況では、先天性免疫応答の変化ならびに自食作用およびアポトーシスの機構の変化のために、それぞれ、黄色ブドウ球菌の存在がIV複製に影響を与え、IVの存在が細胞内の黄色ブドウ球菌量レベルに影響を与えた。それにもかかわらず、予想通り、本発明者らはIV複製に及ぼすU0126 (図2、3)、SB202190 (図4)およびLG-ASA (図5)の阻害効果を観察した。興味深いことに、黄色ブドウ球菌の存在下においてこれらの阻害剤で処理するとウイルス力価も低減された。さらに、細胞内の黄色ブドウ球菌量がIVの有無とは無関係にU0126、SB202190またはLG-ASAの存在下で低減された際に、本発明者らは快い驚きを味わった。別の、驚くほどの所見は、U0126 (50 μM)の存在下での細菌複製に関係していた。黄色ブドウ球菌を、生細胞のないDMEM/INV中37℃で終夜培養した場合に、細菌力価は既に低減していたが、しかし細胞の感染時と同程度に低減していたことから、細胞因子からの細菌の依存性を示唆していた(図2E)。
【０１４３】
対照として、本発明者らは、ウイルスノイラミニダーゼ阻害剤オセルタミビル(タミフル)の適用時にウイルス力価および細胞内細菌量を調べた(図6)。黄色ブドウ球菌の非存在下または存在下でIV力価は有意に低減したが、細胞内細菌量はむしろ増加した。この結果は、病原体そのものに対する物質ではなく、細胞因子を標的化する物質が、IVおよび黄色ブドウ球菌の重感染に対する抗感染薬として大きな可能性を有することを示している。
【０１４４】
実施例2
さらなる実験において、単独感染または重感染の状況におけるインフルエンザA型ウイルス(IAV)および黄色ブドウ球菌6850感染に対する溶媒対照と比較したMEK阻害剤U0126、CI-1040およびコビメチニブ(GDC-0973)の効果を調べた。
【０１４５】
重感染手順を図12に示す。本発明者らの実験的設定におけるヒト肺上皮細胞の生存性を調べるために、細胞形態を光学顕微鏡検査により感染18時間でモニターし(図13)、その時点で病原体負荷を判定した(図14)。
【０１４６】
図13に見られるように、黄色ブドウ球菌6850 (6850)、インフルエンザウイルス株A/FPV/Bratislava/79 (H7N7) (FPV)またはA/Wisconsin/67/2005 (H3N2)による単独感染、および重感染はわずかな、しかし明瞭に検出可能な細胞損傷を引き起こした。U0126 (50 μM)の存在下で、細胞層は損傷がはるかに少ないように見えた。
【０１４７】
溶媒対照と比較してインフルエンザウイルス複製A/FPV/Bratislava/79 (H7N7) (FPV)またはA/Wisconsin/67/2005 (H3N2)に対するMEK阻害剤U0126 (50 μM)の効果を、単独感染または重感染の状況でヒト肺上皮細胞において判定した(図14)。
【０１４８】
MEK/ERKシグナル伝達の阻害は、単独感染の状況においてIAVサブタイプH7N7およびH3N2による感染時にウイルス力価の有意な低減を引き起こした(図14)。ウイルス力価は、U0126の存在下における重感染の状況においても、H7N7/黄色ブドウ球菌重感染細胞において有意なレベルまで低減された(図14)。
【０１４９】
さらに、内部移行した黄色ブドウ球菌6850に対するMEK阻害剤U0126 (50 μM)の効果を分析した(図15A、C)。この実験的設定において、細菌力価は、阻害剤の存在下でわずかにしか減少しなかった。
【０１５０】
一般に細菌増殖に及ぼすU0126の効果をさらに調べるため、黄色ブドウ球菌6850の無細胞終夜培養物に、異なる量のU0126 (10 μMおよび50 μM)または溶媒を補充した(図15B、D)。細菌増殖は、溶媒対照と比較して、濃度依存的にU0126の存在下で阻害された(図15B、D)。
【０１５１】
炎症促進性サイトカインおよびケモカイン発現は重度の炎症および組織損傷に寄与するため、マクロファージ炎症性タンパク質1α(MIP1α)としても知られているCCL3、およびRANTESとしても知られているCCL5のような、各ケモカインのmRNA合成をU0126 (50 μM)の存在下または非存在下、感染実験においてqRT-PCRにより分析した(図16A、B)。黄色ブドウ球菌6850の存在下で増加したIAV誘導性のCCL3 mRNA合成は、U0126の存在下で低減した。同様に、黄色ブドウ球菌の存在下で低減された、IAV誘導性のCCL5 mRNA合成は、U0126 (50 μM)の存在下でさらに低減された。
【０１５２】
ウエスタンブロット分析において、MEK/ERKシグナル伝達に及ぼすU0126の阻害効果をリン酸化特異的ERK1/2抗体の使用によって検証した(図16C)。さらに、MEK/ERKシグナル伝達の阻害の存在下でウイルスタンパク質合成(PB1)の低減が観察された。
【０１５３】
インビボマウスモデルにおけるU0126の抗病原体潜在性を検証するために、インフルエンザウイルス感染マウスを未処置のままにしておくか、または毎日U0126で処置して、黄色ブドウ球菌6850に重複感染させた(図17)。U0126の投与は、ウイルス力価とは無関係にインビボでの細菌力価の低減を引き起こした。ウイルス力価の低減の失敗は、感染経過においてウイルス力価が既に減少している時点でのU0126の遅発投与によって説明される可能性がある。以前の実験から、インフルエンザウイルス感染前に与えられた場合、阻害剤がより高い阻害効果を有することが示唆されている。それにもかかわらず、細菌力価は、U0126の適用によって有意に低減された。
【０１５４】
他のアプローチのなかで、溶媒対照と比較してインフルエンザウイルス複製A/FPV/Bratislava/79 (H7N7) (FPV)またはA/Puerto Rico/8/34 (H1N1)に対するMEK阻害剤CI-1040 (10 μM)の効果を、単独感染または重感染の状況でヒト肺上皮細胞において判定した(図18)。
【０１５５】
CI-1040によるMEK/ERKシグナル伝達の阻害は、単独感染および重感染の状況でIAVサブタイプH7N7およびH1N1による感染の際にウイルス力価の低減を引き起こした(図18)。
【０１５６】
一般に細菌増殖に及ぼすCI-1040の効果をさらに調べるため、黄色ブドウ球菌6850の無細胞終夜培養物に、異なる量のCI-1040 (1 μMおよび10 μM)または溶媒を補充した(図19A、B)。細菌増殖は溶媒対照と比較して、濃度依存的にCI-1040の存在下でわずかに阻害された(図19A、B)。
【０１５７】
別のMEK阻害剤の抗病原体潜在性を検証するために、コビメチニブをインビボマウスモデルにおいて試験し、インフルエンザウイルス感染マウスを未処置のままにしておくか、または毎日コビメチニブで処置して、黄色ブドウ球菌6850に重複感染させた(図20)。コビメチニブの投与は、インビボでウイルス力価および細菌力価のわずかな、しかし明瞭に検出可能な低減につながった。最近になって、コビメチニブの最大耐量は30 mg/kg/日であることが示されているため、阻害効果は、最大耐量よりもずっと低かった、本実験において用いられた(10 mg/kg/日)よりも高い投与量によっては改善された可能性がある。
【０１５８】
結論として、この結果から、潜在的な抗IAV/黄色ブドウ球菌物質としての、さまざまなMEK阻害剤が明らかである。
【０１５９】
実施例3
さらなる実験において、単独感染または重感染の状況におけるインフルエンザA型ウイルス(IAV)および黄色ブドウ球菌6850感染に対するNFκB阻害剤LG-ASA (LASAG)の効果を調べた。
【０１６０】
重感染手順を図21に示す(上部)。LG-ASA (5 mM)の非存在下および存在下における感染時のヒト肺上皮細胞の生存性を調べるために、細胞形態を光学顕微鏡検査により感染後18時間でモニターした(図21)。LG-ASAの非存在下(左パネル)におけるIAVおよび/または黄色ブドウ球菌の感染は細胞破壊を引き起こすが、細胞形態はLG-ASAの存在下(右パネル)においては改善された。
【０１６１】
インフルエンザウイルス複製A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)に対するNFκB阻害剤LG-ASA (5 mM)の効果を、感染から8時間(図22/23A、B、E、F)および18時間(図22/23 C、D、G、H)後に単独感染または重感染の状況(図22/23)でヒト肺上皮細胞において判定した。異なる2つの黄色ブドウ球菌株(a) 黄色ブドウ球菌SH1000 (図22/23 A〜D)および(b) 黄色ブドウ球菌6850 (図22/23 E〜H)を感染に用いた。
【０１６２】
IAV複製は感染後8時間および18時間にLG-ASAの存在下で低減されたが、細菌力価の低減は感染18時間後に目に見えただけであった。図22において、結果は均等目盛りで示されている。LG-ASAの病原体阻害効果をよりよく視覚化するために、3つの独立した実験の未処置対照を任意に100%として設定し、平均を提示した(図23)。
【０１６３】
LG-ASAは細菌感染の間に直接添加されたので、これらの結果から、進行中の放出および新しい細菌内部移行の間に増強する、細菌内部移行に対する非常に早期の効果が示唆される。
【０１６４】
ごく最近、単球による黄色ブドウ球菌の食作用にNFκBが必要であることが示されている(Zhu et al., 2014; Exp. Cell Res. 1;327(2):256-63)。これらの知見および本発明者らの所見に基づき、本発明者らは、LG-ASAが細菌の取込みを防ぐかどうか知ることを欲した。本発明者らは、細菌感染の4時間前にヒト肺上皮細胞を前処理し、感染後2時間までに内部移行した細菌を判定した。内部移行した細菌だけが検出されることを確実とするため、細胞溶解前に抗生物質洗浄によって内部移行していない細菌を除去した。データから、LG-ASAの存在下において遮断される、黄色ブドウ球菌6850の時間依存的な取込みが示唆される(図24A、B)。LG-ASAの濃度依存的な阻害効果を、細菌株の黄色ブドウ球菌USA300に対してさらに実証することができた(図24C、D)。図24A、Cにおいて見て取れる、LG-ASAの病原体阻害効果をよりよく視覚化するために、3つの独立した実験の未処置対照を任意に100%として設定し、平均を示した(図24B、D)。
【０１６５】
黄色ブドウ球菌の内部移行に対するNFκB媒介性シグナル伝達の重要性を検証するために、細菌感染の4時間前にTNF-α刺激によってNFκBを誘導した。NFκBの活性化は、黄色ブドウ球菌6850および黄色ブドウ球菌USA300の取込みの増強を引き起こした。対照として、TNF-α誘発性の活性化はLG-ASAにより同時に遮断され、これは、予想通り、TNF-αによって促進される細菌取込みの阻害を引き起こした(図25)。
【０１６６】
インビボマウスモデルにおけるLG-ASAの抗病原体潜在性を検証するために、LG-ASAの存在下および非存在下での異なる重感染の設定について試験した。
【０１６７】
図26に見られるように、LG-ASAによるIAV/黄色ブドウ球菌重感染マウスの処置は、生存の増強(図26A)および体重減少の低減(図26B)を引き起こす。
【０１６８】
結論として、本発明者らの結果は、LG-ASAのようなNFκB阻害剤がインビトロおよびインビボで抗IAV/黄色ブドウ球菌物質として作用することを示している。
【０１６９】
参考文献
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図９−５】
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【図９−６】
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【図９−７】
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【図９−８】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１０−５】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２２Ｅ】
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【図２２Ｆ】
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【図２２Ｇ】
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【図２２Ｈ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２３Ｅ】
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【図２３Ｆ】
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【図２３Ｇ】
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【図２３Ｈ】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２５】
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【図２６】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年1月17日(2017.1.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2017515910000001.app
【国際調査報告】
2017515910.tif 000096
2017515910.tif 000097
2017515910.tif 000098
2017515910.tif 000099
2017515910.tif 000100
2017515910.tif 000101