(57)【要約】  多細胞チューモロイドを形成する組成物および方法を記載する。また、多細胞チューモロイドの使用方法を記載する。
2017516499.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍細胞（ＴＣ）、癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）、および上皮細胞（ＥＣ）を細胞培養培地で共培養する工程を含み、ここでＴＣ対ＣＡＦ対ＥＣの数の比が５対１対１であり、前記細胞培養培地がある量の間葉系幹細胞培養上清を含有する、多細胞チューモロイドを形成する方法。
【請求項２】
前記腫瘍細胞が乳癌細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記乳癌細胞が対象者の腫瘍に由来する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記間葉系幹細胞培養上清が、前記細胞培養培地の総量の少なくとも約２０％存在する、請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記間葉系幹細胞培養上清が、前記細胞培養培地の総量の少なくとも約２０％〜約５０％存在する、請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記間葉系幹細胞培養上清がＶＥＧＦを少なくとも約８００ｐｇ／ｍＬ含有する、請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記間葉系幹細胞培養上清がＩＬ−６を少なくとも約１００ｐｇ／ｍＬ含有する、請求項１〜請求項６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記間葉系幹細胞培養上清がＴＧＦ−β１を少なくとも約１２００ｐｇ／ｍＬ含有する、請求項１〜請求項７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞培養培地が約５％〜約１０％マトリゲルをさらに含む、請求項１〜請求項８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＴＣ、ＣＡＦ、およびＥＣが三次元足場で共培養される、請求項１〜請求項９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記三次元足場が繊維状誘導スマートスキャフォールドである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
腫瘍細胞（ＴＣ）、癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）、および上皮細胞（ＥＣ）を細胞培養培地で共培養することを含み、ここでＴＣ対ＣＡＦ対ＥＣの数の比が５対１対１であり、前記細胞培養培地がある量の間葉系幹細胞培養上清を含有する、多細胞チューモロイドを形成させる工程と、
前記多細胞チューモロイドをある量の抗癌剤に曝露させる工程と、
を含む、抗癌剤の有効性を決定する方法。
【請求項１３】
前記腫瘍細胞が乳癌細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記乳癌細胞が  対象者の腫瘍に由来する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記乳癌細胞が標準的な乳癌細胞系由来である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記間葉系幹細胞培養上清が、前記細胞培養培地の総量の少なくとも約２０％存在する、請求項１２〜請求項１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記間葉系幹細胞培養上清が、前記細胞培養培地の総量の少なくとも約２０％〜約５０％存在する、請求項１２〜請求項１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記間葉系幹細胞培養上清が、ＶＥＧＦを少なくとも約８００ｐｇ／ｍＬ、ＩＬ−６を少なくとも約１００ｐｇ／ｍＬ、およびＴＧＦ−β１を少なくとも約１２００ｐｇ／ｍＬ含有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記量の前記抗癌剤に曝露後の前記多細胞チューモロイドにおけるＫｉ−６７の発現を測定する工程をさらに含む、請求項１２〜請求項１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記量の前記抗癌剤に曝露後の前記培養培地に存在するＶＥＧＦまたはＩＬ−６の量を測定する工程をさらに含む、請求項１２〜請求項１９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１５年５月１９日に出願された「抗癌剤創薬の方法」の名称を有する米国仮出願第６２／０００，０８１号の利益を主張するものであり、該仮出願の全体は参照により本明細書に組み込まれる。
［連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載］
本発明は、米国国立衛生研究所により与えられた助成金番号第ＨＨＳＮ２６１２０１３０００４４Ｃ号の下での政府の支援により行われた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
臨床開発に入っている潜在的抗癌剤は、高騰する新薬開発費（約８億ドル）にもかかわらず、損耗レベルが高い（約９５％）。そのような高い損耗率は、二次元（２Ｄ）細胞培養アッセイおよびインビボ動物モデルでの抗癌剤創薬、有効性試験、および医薬品開発に使用される現在のアプローチに起因している。そのため、抗癌剤創薬、有効性試験、および医薬品開発のための改善されたツールおよび技法に対する喫緊の満たされていない需要が存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本明細書に記載されるのは、多細胞チューモロイド（ｔｕｍｏｒｏｉｄ）を形成する方法である。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
幾つかの態様において前記方法は、腫瘍細胞（ＴＣ）、癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）、および上皮細胞（ＥＣ）を細胞培養培地で共培養する工程を含んでもよく、ここでＴＣ対ＣＡＦ対ＥＣの数の比は５対１対１であり、細胞培養培地はある量の間葉系幹細胞培養上清（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉａ）を含有する。腫瘍細胞は乳癌細胞であってもよい。腫瘍細胞は対象者に由来してもよい。幾つかの実施形態において、乳癌細胞は対象者の腫瘍に由来する。幾つかの態様において間葉系幹細胞培養上清は、細胞培養培地の総量の少なくとも約２０％存在する。さらなる態様において間葉系幹細胞培養上清は、細胞培養培地の総量の少なくとも約２０％〜約５０％存在する。間葉系幹細胞培養上清は、ＶＥＧＦを少なくとも約８００ｐｇ／ｍＬ含有してもよい。間葉系幹細胞培養上清は、ＩＬ−６を少なくとも約１００ｐｇ／ｍＬ含有してもよい。間葉系幹細胞培養上清間葉系幹細胞培養上清は、ＴＧＦ−β１を少なくとも約１２００ｐｇ／ｍＬ含有する。ＴＧＦ−β１を少なくとも約１２００ｐｇ／ｍＬ。間葉系幹細胞培養上清は、ＶＥＧＦを少なくとも約８００ｐｇ／ｍＬ、ＩＬ−６を少なくとも約１００ｐｇ／ｍＬ、およびＴＧＦ−β１を少なくとも約１２００ｐｇ／ｍＬ含有してもよい。さらなる態様において細胞培養培地は、約％〜約１０％マトリゲルをさらに含有してもよい。幾つかの態様においてＴＣ、ＣＡＦ、およびＥＣは、三次元足場で共培養される。三次元足場は、繊維状誘導スマートスキャフォールド（ｆｉｂｒｏｕｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｍａｒｔ  ｓｃａｆｆｏｌｄ）であってもよい。
【０００５】
また、腫瘍細胞（ＴＣ）、癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）、および上皮細胞（ＥＣ）を細胞培養培地で共培養することを含み、ここでＴＣ対ＣＡＦ対ＥＣの数の比が５対１対１であり、細胞培養培地がある量の間葉系幹細胞培養上清を含有する、多細胞チューモロイドを形成する工程と、多細胞チューモロイドをある量の抗癌剤に曝露させる工程と、を含む、抗癌剤の有効性を決定する方法も記載される。幾つかの態様において、腫瘍細胞は乳癌細胞である。乳癌細胞は対象者の腫瘍に由来してもよい。乳癌細胞は、標準的な乳癌細胞系由来であってもよい。間葉系幹細胞培養上清は、細胞培養培地の総量の少なくとも約２０％存在してもよい。間葉系幹細胞培養上清は、細胞培養培地の総量の少なくとも約２０％〜約５０％存在してもよい。間葉系幹細胞培養上清は、ＶＥＧＦを少なくとも約８００ｐｇ／ｍＬ、ＩＬ−６を少なくとも約１００ｐｇ／ｍＬ、およびＴＧＦ−β１を少なくとも約１２００ｐｇ／ｍＬ含有してもよい。抗癌剤の有効性を決定する方法は、ある量の抗癌剤に曝露後の多細胞チューモロイドにおけるＫｉ−６７の発現を測定する工程をさらに含んでもよい。抗癌剤の有効性を決定する方法はまた、該量の抗癌剤に曝露後の培養培地に存在するＶＥＧＦまたはＩＬ−６の量を測定する工程を含むこともできる。
【０００６】
本開示のさらなる態様は、以下に記載された様々な実施形態の詳細な記載を、添付図面と併せて参照することで容易に理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１Ａ〜１Ｂは、癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）および内皮細胞（ＥＣ）と共に（図１Ｂ）、または該細胞なしで（図１Ａ）培養した約５日後の、ＢＴ４７４乳癌細胞由来チューモロイドの増殖を示す代表的な蛍光顕微鏡画像を示した図である。
【図２】図２は、ＥＶ（ｖＷＦ、緑色の細胞）およびＣＡＦ（ＳＭＡ陽性、赤い細胞）および核（ＤＡＰＩ、青）を示す、ＢＴ４７４乳癌共培養チューモロイドの共焦点顕微鏡画像（合成ｚスタック画像）を示した図である。
【図３】図３は、ＥＬＩＳＡにより測定された図１Ａ〜１Ｂおよび２の培養細胞の上清中のＶＥＧＦの量を示すグラフを示した図である。培養細胞により産生されたＶＥＧＦの量を決定する前に、細胞を５日間培養した。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）および内皮細胞（ＥＣ）と共に（図４Ｂ）、または該細胞なしで（図４Ａ）培養した約５日後のＨＣＣ１５６９乳癌細胞由来チューモロイドの増殖を示す代表的な蛍光顕微鏡画像を示した図である。示されている結果は、３つのうち１つの代表的な実験からである。
【図５】図５Ａ〜５Ｃは、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）培養上清（ＣＭ）に存在するＶＥＧＦ（図５Ａ）、ＩＬ−６（図５Ｂ）、および活性ＴＧＦ−β１（図５Ｃ）を示すグラフを示した図である。ヒトＭＳＣは、アルファＭＥＭおよび１５％血清中で培養した。各継代約４８時間後に継代（ｐ）ｐ２〜ｐ６の培養上清を回収した。回収した培養上清を遠心分離し、濾過し（０．４５μｍフィルターを用いて）、使用まで−８０℃で保管した。ｐ２〜ｐ６のＣＭにおける増殖因子の発現をＥＬＩＳＡにより調べた。ＶＥＧＦの特異度を示すためにＶＥＧＦ抗体の中和を使用した。＊ｐ＜０．０５。
【図６】図６Ａ〜６Ｈは、生細胞（緑）および死細胞（赤）を検出するためにカルセインＡＭ／ＥｔｈＤ−１により染色した、ＢＴ４７４乳癌細胞の単独培養（図６Ａ〜６Ｄ）またはＢＴ４７４乳癌細胞およびＥＣ＋ＣＡＦの共培養（図６Ｅ〜６Ｈ）の代表的な蛍光顕微鏡画像を示した図である。倍率：１００×。標準的な増殖培地（ＧＭ）対ＣＭ（ＧＭ：ＣＭ）の比は、約１００：０から約５０：５０に及んだ。
【図７】図７は、図６Ａ〜６Ｈに示されたチューモロイドのチューモロイド直径を示した図である。チューモロイド直径はＩｍａｇｅ  Ｊを用いて測定した。３足場／群および１０チューモロイド／足場を調べた。＊ｐ＜０．０５。
【図８】図８Ａから８Ｂは、生細胞を緑色、死細胞を赤色に染色するカルセインＡＭ／ＥｔｈＤ−１で染色したＢＴ４７４チューモロイド培養物（図８Ａ）、および３Ｄ足場におけるＢＴ４７４の単独培養物に関するＫｉ−６７染色（図８Ｂ）を示した図である。
【図９】図９Ａおよび１９Ｂは、単独培養または共培養で増殖したＢＴ４７４（図９Ａ）およびＨＣＣ１５６９（図９Ｂ）チューモロイドにおけるラパチニブに対する反応差を示すグラフを示した図である。培養２日後、示された濃度（μＭ）のラパチニブで約７２時間、細胞を処理した。細胞生存率をＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ（登録商標）アッセイにより測定した。
【図１０】１０Ａおよび１０Ｂは、ラパチニブ処理ＢＴ４７４（図１０Ａ）共培養チューモロイド、または対照非処理チューモロイド（図１０Ｂ）におけるＫｉ−６７発現を示す代表的な画像を示した図である。共培養２日後、２．５μＭのラパチニブで７２時間、細胞を処理し、対照およびラパチニブ処理培養物におけるＫｉ−６７発現を免疫組織化学により決定した。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｃは、３Ｄ足場での単独培養物またはＣＡＦおよびＥＣとの共培養ＢＴ４７４細胞に由来するＢＴ４７４チューモロイドにおけるＶＥＧＦ（図１１Ａ）、ＩＬ−６（図１１Ｂ）、およびＴＧＦ−β１（図１１Ｃ）に対するラパチニブの影響を示すグラフを示した図である。ＢＴ４７４チューモロイドを、ラパチニブ（２．５〜１０μＭ）の存在下または非存在下で単独培養または共培養し、５日目の培養上清中のＶＥＧＦ、ＩＬ−６、およびＴＧＦ−β１のレベルをＥＬＩＳＡにより決定した。＊ｐ＜０．０５。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｄは、ＦｉＳＳで培養した場合にＳＣＴを形成する乳癌細胞を示した図である。細胞（１０×１０３）をＦｉＳＳにおいて約５日間培養した。形成されたチューモロイドを、生細胞を緑色、死細胞を赤色に染色するカルセインＡＭ／ＥｔｈＤ−１で染色した。
【図１３】図１３は、ＦｉＳＳにおける乳癌細胞の増殖を示すグラフを示した図である。細胞（１０×１０３）をＦｉＳＳにおいて９日間、該足場で３通り培養した。チューモロイドサイズをＩｍａｇｅ  Ｊ分析により測定した。
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｄは、ＦｉＳＳにおいてＣＡＦおよび／またはＥＣと共培養した乳癌細胞の増殖を示した図である。５日目のＭＣＦ−７またはＨＣＣ−１５６９チューモロイドを、ＥＣもしくはＣＡＦ（５×１０３）またはＥＣおよびＣＡＦ（それぞれ２．５×１０３）の組み合わせとＦｉＳＳでさらに４日間、３通り培養した。９日目のＭＣＴを、生細胞を緑色、死細胞を赤色に染色するカルセインＡＭ／ＥｔｈＤ−１で染色した。
【図１５】図１５は、ＦｉＳＳにおいてＣＡＦおよび／またはＥＣと共培養した乳癌細胞の増殖を評価するＰｒｅｓｔｏ  Ｂｌｕｅアッセイの結果を示すグラフを示した図である。ＭＣＴの増殖を、９日目にＰｒｅｓｔｏ  Ｂｌｕｅアッセイを用いてモニターした。
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｆは、ＭＣＦ７（図１６Ａおよび１６Ｄ）、ＨＣＣ１５６９（図１６Ｂおよび１６Ｆ）、およびＢＴ４７４（図１６Ｃおよび１６Ｆ）乳癌細胞系に由来するカルセイン染色ＳＣＴ（図１６Ａ〜１６Ｃ）およびＭＣＴ（図１６Ｄ〜１６Ｆ）を示した図である。腫瘍細胞をＦｉＳＳにおいて単独培養（上段）またはＣＡＦおよびＥＣと共培養し、生細胞を緑色、死細胞を赤色に染色するカルセインＡＭ／ＥｔｈＤ−１で染色した。ＭＣＦ７、ＨＣＣ１５６９およびＢＴ４７４に由来する５日目のＳＣＴおよびＭＣＴが示されている。
【図１７】図１７Ａ〜１７Ｆは、ＶＷＦおよびＳＭＡについて免疫染色し、ＤＡＰＩにより対比染色した固定チューモロイドの代表的な画像を示した図である。ＥＣ（ｖＷＦ、緑色の細胞）、ＣＡＦ（ＳＭＡ陽性、赤い細胞）およびＤＡＰＩ（全ての細胞核）を示すＭＣＴの代表的な蛍光画像（図１７Ａ〜１７Ｃ）および共焦点顕微鏡画像（合成ｚスタック画像）（図１７Ｄ〜１７Ｆ）が示されている。
【図１８】図１８Ａ〜１８Ｄは、ＦｉＳＳ誘導ＳＣＴとマトリゲルベースの３Ｄ培養により形成されたコロニーとの比較の代表的な画像を示した図である。細胞（３×１０３）は１０％マトリゲルを補充した増殖培地の存在下、マトリゲル被覆プレートの層で培養した。細胞を５日間培養し、スフェロイドをカルセインＡＭで染色し、蛍光顕微鏡により調べた。図１８Ａおよび１８Ｃはマトリゲルで形成されたコロニーを示し、図１８Ｂおよび１８ＤはＦｉＳＳで形成されたＳＣＴを示す。図１９Ａ〜１９ＢはＭＣＦ７細胞からの結果を示し、図１８Ｃ〜１８ＤはＢＴ４７４細胞からの結果を示す。
【図１９】図１９は、ＭＣＦ７−ＳＣＴおよび−ＭＣＴにおけるＶＥＧＦ発現を示すグラフを示した図である。ＭＣＦ７チューモロイドを５日間培養し、５日目の培養上清中のＶＥＧＦのレベルをＥＬＩＳＡにより決定した。
【図２０】図２０は、アレイ１およびアレイ２のシグナル強度を示すスキャンデータの画像を示した図である。パネル１〜８は、標準曲線のための様々な標準を有する対照を含有した。パネル９〜１２はＳＣＴ試料を含有した。パネル１３〜１６はＭＣＴ試料を含有した。
【図２１】図２１は、図２０のアレイに使用された抗体のリストを含む表を示した図である。
【図２２】図２２Ａ〜２２Ｃは、ＳＣＴおよびＭＣＴチューモロイドにより産生されたＩＬ−６（図２２Ａ）、ＩＬ−８（図２２Ｂ）、およびＭＣＰ−１（図２２Ｃ）のタンパク質発現を示すグラフを示した図である。ＢＴ４７４チューモロイド（ＳＣＴ、青いバー、およびＭＣＴ、赤いバー）を図９Ａ〜９Ｂのようにラパチニブ（０．５〜１２．５μＭ）の存在下または非存在下で培養し、５日目の培養上清中のＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１のレベルをサンドイッチＥＬＩＳＡにより決定した（図２０〜２１）。＊ｐ＜０．０５。
【図２３】図２５Ａ〜２５Ｃは、ＳＣＴおよびＭＣＴチューモロイドにより産生されたＰＤＧＦ−ＢＢ（図２５Ａ）、ＤＫＫ−１（図２５Ｂ）、およびＯＰＧ（図２５Ｃ）のタンパク質発現を示すグラフを示した図である。ＢＴ４７４チューモロイド（ＳＣＴ、青いバー、およびＭＣＴ、赤いバー）を図９Ａ〜９Ｂのようにラパチニブ（０．５〜１２．５μＭ）の存在下または非存在下で培養し、５日目の培養上清中のＰＤＧＦ−ＢＢ、ＤＫＫ−１、ＯＰＧのレベルをサンドイッチＥＬＩＳＡにより決定した（図２０〜２１）。＊ｐ＜０．０５。
【図２４】図２４は、ＳＣＴおよびＭＣＴチューモロイドにより産生されたＭＭＰ−３のタンパク質発現を示すグラフを示した図である。ＢＴ４７４チューモロイド（ＳＣＴ、青いバー、およびＭＣＴ、赤いバー）を図９Ａ〜９Ｂのようにラパチニブ（０．５〜１２．５μＭ）の存在下または非存在下で培養し、５日目の培養上清中のＭＭＰ−３のレベルをサンドイッチＥＬＩＳＡにより決定した（図２０〜２１）。＊ｐ＜０．０５。
【図２５】図２５は、化合物の臨床有効性を決定または予測するのに使用することができる様々なバイオマーカーを記載した図である。
【図２６】図２６Ａ〜２６Ｄは、ＦｉＳＳ誘導ＳＣＴとマトリゲルベースの３Ｄ培養とのラパチニブ応答の比較を示す、カルセインＡＭ染色チューモロイドの代表的な画像を示した図である。細胞（３×１０３）は１０％マトリゲルを補充した増殖培地の存在下、マトリゲル被覆プレートの層で培養した。培養３日後、細胞をラパチニブの示された濃度で処理し、７２時間後に調べた。スフェロイドをカルセインＡＭで染色し、蛍光顕微鏡により調べた。
【図２７】図２７Ａ〜２７Ｂは、マトリゲル（図２７Ａ）またはＦｉＳＳ（図２７Ｂ）で培養したチューモロイドの細胞生存率を決定するＰｒｅｓｔｏ  Ｂｌｕｅ（登録商標）アッセイからの結果を示すグラフを示した図である。
【図２８】図２８Ａ〜２８Ｄは、Ｏｐｅｒｅｔｔａを用いたＨＣＡを示す代表的なＺスタック画像を示した図である。Ｚスタック画像はＯｐｅｒｅｔｔａ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて取得し、Ｉｍａｇｅ  Ｊ（図２８Ａ〜２８Ｂ）、およびｉｍａｇｅ  Ｊ閾値分析（図２８Ｃおよび２８Ｄ）に供した。ＤＡＰＩおよびＫｉ６７の平均強度を決定した。
【図２９】図２９は、ラパチニブの存在下または非存在下で約７２時間、ＢＴ４７４チューモロイドを培養し、チューモロイドを固定し、Ｋｉ−６７についてチューモロイドを免疫染色した結果を示すグラフを示した図である。免疫染色の定量は、Ｏｐｅｒｅｔｔａを用いて完了した。相対Ｋｉ−６７強度を示す。
【図３０】図３０Ａ〜３０Ｂは、ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅアッセイを用いたチューモロイド培養におけるＺ’因子分析を示した図である。ＦｉＳＳを予め加えた９６ウェルプレートにＬＬＣ１細胞を５０００細胞／ウェルで播種した。４８時間後、１０％ＤＭＳＯ（ビヒクル）を含有する１００μｌの新鮮培地をウェルに補充した。７２時間後、ウェルをＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ試薬とインキュベートし、蛍光を測定した（ＢｉｏＴｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙプレートリーダー）。
【図３１】図３１は、完全なＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬浸透を示す代表的なＳＣＴの共焦点画像を示した図である。
【図３２】図３２は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  ２．０アッセイを用いて決定したＢＴ４７４細胞の生存率（４ウェル／群の複製物における）を示すグラフを示した図である。発光は、ＢｉｏＴｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙプレートリーダーを用いて測定した。データは平均±ＳＤを表す。
【図３３】図３３Ａ〜３３Ｂは、製造したＦｉＳＳ−９６ウェルマイクロプレートで培養したＭＣＦ７（図３３Ａ）、およびＢＴ−４７４（図３３Ｂ）チューモロイドの最小ウェル間変動を示すグラフを示した図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本開示がより詳細に記載される以前に、この開示は記載された特定の実施形態に限定されず、そのため当然ながら当該形態と異なり得ることが理解されるべきである。本明細書に使用される用語は、特定の実施形態のみを記載する目的のためであり、限定することが意図されていないことも理解されるべきである。
【０００９】
値の範囲が示される場合、その範囲の上限と下限の間の、文脈が特に明確に指示しない限り下限の単位の１０分の１までの介在値、およびその範囲内の任意の他の記載された値または介在値は、本開示内に包含されることが理解される。これらのより小さな範囲の上限および下限は、より小さな範囲に独立に含まれてもよく、同様に、記載された範囲内の任意の特に除外された限界値に従って本開示内に包含される。記載された範囲が限界値の一方または両方を含む場合、それらの含まれた限界値のどちらか一方または両方を除外する範囲もまた本開示に含まれる。
【００１０】
特に規定のない限り、本明細書に使用される全ての技術用語および科学用語は、この開示が属する技術分野の当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似したまたは同等の任意の方法および材料を本開示の実施または試験において使用することもできるが、好ましい方法および材料がこれより記載される。
【００１１】
この明細書に引用された全ての刊行物および特許は、個々の刊行物または特許が、参照により組み込まれると具体的および個別に示されているかのように参照により本明細書に組み込まれ、ならびに刊行物が引用された関連における方法および／または材料を開示および記載するために参照により本明細書に組み込まれる。いかなる刊行物の引用も、出願日前のその開示のためであり、先行開示を理由に、本開示がそのような刊行物に先行する権利を有さないことの承認として解釈されるべきではない。さらに、示された公開日は実際の公開日と異なる可能性があり、個別に確認する必要があり得る。
【００１２】
この開示を読めば当業者に明らかとなるように、本明細書に記載および例示された個々の実施形態は、本開示の範囲または趣旨を逸脱することなく、他の幾つかの実施形態のいずれかの特徴から容易に区別または組み合わせることができる個別の構成要素および特徴を有する。いずれの列挙された方法も、列挙された事象の順番、または論理的に可能な任意の他の順番で実施することができる。
【００１３】
本開示の実施形態は、特に指示のない限り、当業者の技能の範囲内である分子生物学、微生物学、ナノテクノロジー、有機化学、生化学、植物学等の技法を使用する。そのような技法は、文献に十分に説明されている。
【００１４】
定義
本明細書において「チューモロイド」は、腫瘍細胞の微小転移性の密集した凝集体を指す。チューモロイドは、細胞外マトリックスにおいて腫瘍進行を駆動するのと同じ生化学的、ナノトポグラフィー的、および機械的要因に応答することができる。
【００１５】
本明細書で使用される用語「癌」、「癌細胞」、「新生物細胞」、「新生物」、「腫瘍」、および「腫瘍細胞」（互換的に使用される）は、比較的自律性の増殖を示す結果、細胞増殖の制御の著しい喪失（すなわち、細胞分裂の脱制御）を特徴とする異常な増殖表現型を示す細胞を指す。新生物細胞は、悪性または良性であってもよい。転移性細胞または組織は、該細胞が隣接する身体構造に侵入し、該構造を破壊し得ることを意味する。癌は、星状細胞腫、副腎皮質癌、虫垂癌、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳癌、脳幹神経膠腫、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、腺管癌、子宮内膜癌、上衣腫、ユーイング肉腫、食道癌、眼癌、胆嚢癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、消化管癌、胚細胞腫瘍、神経膠腫、肝細胞癌、組織球増殖症、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼内黒色腫、カポジ肉腫、腎臓癌、咽頭癌、白血病、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、マクログロブリン血症、黒色腫、中皮腫、口腔癌、多発性骨髄腫、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌（ｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、下垂体癌、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、網膜芽腫、横紋筋肉腫、肉腫、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、扁平細胞癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、咽頭癌（ｔｈｒｏａｔ  ｃａｎｃｅｒ）、胸腺腫、甲状腺癌、栄養膜腫瘍、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、およびウィルムス腫瘍から選択され得る。幾つかの実施形態において、癌は前立腺癌である。
【００１６】
用語「細胞」、「細胞系」、および「細胞培養物」には、その子孫が含まれる。全ての子孫は、故意または偶然の変異のためにＤＮＡ含量が正確に同一でない場合があることも理解される。最初に形質転換された細胞について選別されたのと同じ機能または生物学的特性を有するバリアント子孫が含まれる。本発明において使用される「宿主細胞」は、一般的には原核細胞または真核細胞宿主である。
【００１７】
本明細書において「足場」は、（１）細胞−生体材料相互作用、細胞接着、および細胞外マトリックス沈着を促し、（２）細胞生存、増殖、および／もしくは分化を可能にするガス、栄養素、および／もしくは調節因子の十分な輸送を可能にし、（３）目的とする培養条件下、組織再生の速度に近い制御可能な速度で生物分解し、ならびに／または（４）インビボで導入される場合、最小程度の炎症もしくは毒性を誘発し得る三次元多孔性固体生体材料を指す。
【００１８】
本明細書において「幹細胞性」は、他の分化した細胞タイプと幹細胞を区別する特性、特徴（構造的または機能的）、および分子サインを指す。
【００１９】
本明細書において「幹細胞性因子」は、幹細胞自己再生または幹細胞に固有の他の特性もしくは特徴に必要とされるまたは関与する、ＯＣＴ−４、ＳＳＥＡ、ＣＤ１３３、ＡＢＣＧ２、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｓｏｘ２、Ｎａｏｎｇ、ＣＤ４４、ＥｐＣＡＭ（ＥＳＡ、ＴＲＯＰ１）、ＣＤ２４（ＨＳＡ）、ＣＤ９０、ＣＤ２００、およびＡＬＤＨを含むがこれらに限定されない遺伝子またはタンパク質を指す場合がある。
【００２０】
本明細書において「繊維状足場」は、ランダムに配向された繊維により形成される三次元構造を指す。幾つかの実施形態において、エレクトロスピニング法がランダムに配向された繊維構造物を得るために使用される。
【００２１】
本明細書において互換的に使用される「対象者」、「個体」、または「患者」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指す。哺乳動物には、マウス、サル、ヒト、家畜、競技用動物、および愛玩動物が含まれるが、これらに限定されない。
【００２２】
本明細書において、「組成物」は、活性剤および、不活性（例えば、検出可能な薬剤または標識）または活性な（アジュバントなどの）別の化合物または組成物の組み合わせを指す。
【００２３】
本明細書において「対照」は、比較目的で実験に使用される代替の対象者または試料であり、独立変数以外の変数の影響を最小限にするまたは区別するために含まれる。
【００２４】
本明細書において「陽性対照」は、全ての試薬が適切に機能していること、および実験が適切に行われることを条件として、所望の結果をもたらすように設計された「対照」を指す。
【００２５】
本明細書において「陰性対照」は、全ての試薬が適切に機能していること、および実験が適切に行われることを条件として、効果または結果をもたらさないように設計された「対照」を指す。「陰性対照」と互換可能な他の用語には、「偽（ｓｈａｍ）」、「プラセボ」、および「模擬（ｍｏｃｋ）」が含まれる。
【００２６】
本明細書において「培養」は、細胞が細胞集団として増殖し老化を回避できる条件下で細胞を維持することを指す。「培養」には、細胞がさらに分化もする条件、または、細胞が分化をする条件も含まれ得る。
【００２７】
本明細書において、細胞の文脈における「増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）」または「増殖された（ｅｘｐａｎｄｅｄ）」は、同一であってもなくてもよい最初の細胞集団由来の特徴的な細胞タイプ（複数可）の数の増加を指す。増殖に使用される最初の細胞は、増殖から生成された細胞と同じである必要はない。例えば、増殖細胞は、最初の細胞集団のエクスビボまたはインビトロでの増殖および分化により作製されてもよい。
【００２８】
本明細書において「発現」は、ポリヌクレオチドがＲＮＡ転写物に転写される過程を指す。ｍＲＮＡおよび他の翻訳されたＲＮＡ種の文脈において、「発現」は、転写されたＲＮＡがその後にペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳される過程（複数可）も指す。
【００２９】
本明細書において「濃縮された」は、容積当たりの分子の濃度または数が自然発生の対応物より大きいという点で、自然発生の対応物と区別できるポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはそれらの断片を含むがこれらに限定されない分子を指す。
【００３０】
本明細書において「希釈された」は、容積当たりの分子の濃度または数が自然発生の対応物より小さいという点で、自然発生の対応物と区別できるポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはそれらの断片を含むがこれらに限定されない分子を指す。
【００３１】
本明細書において「間葉系幹細胞」または「ＭＳＣ」は、脂肪、骨、軟骨、および筋肉組織を構成する細胞に分化することができる多能性細胞を本明細書では指す。
【００３２】
本明細書において「生体適合性の」または「生体適合性」は、健常者または対照患者における宿主応答と比較して、材料またはその誘導体に対して代謝産物などの有害なまたはさもなければ不適切な宿主応答を患者において誘発することなく、患者により使用される材料の能力を指す。
【００３３】
本明細書において「生分解性の」は、細菌もしくは他の生体または有機的過程により分解される材料または化合物の能力を指す。
【００３４】
本明細書において「幹細胞」は、複数の細胞タイプに分化することができる、任意の自己再生する、分化全能性（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ）、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）細胞、多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）細胞、前駆細胞または前駆体細胞を指す。
【００３５】
考察
販売承認を受ける薬物は、臨床開発に入る薬物の推定９％にすぎない。新たな薬物の失敗率が高い理由の幾つかは、臨床的有効性の欠如をもたらすヒト疾患の背後の生物学の理解の乏しさ、薬物毒性、および副作用にある。臨床開発に入っている潜在的抗癌剤は、高騰する新薬開発費（約８億ドル）にもかかわらず、約９５％の損耗率を有する。この高い損耗率は、二次元（２Ｄ）細胞培養アッセイおよびインビボ動物モデルを用いた抗癌剤創薬、癌細胞応答試験、および医薬品開発に使用されるアプローチに起因し得る。
【００３６】
２Ｄ細胞培養系は、（１）２Ｄ細胞培養系における細胞が不自然な形態を示すこと、（２）２Ｄ細胞培養系における細胞はより低い生存能および乏しい分化能力を有すること、（３）２Ｄ細胞培養系における細胞は、インビボで発現される場合、同じ遺伝子およびタンパク質のプロフィールとは実質的に異なる遺伝子およびタンパク質発現プロフィールの変化を有すること、（４）２Ｄ細胞培養系における細胞は人工的代謝を示すこと、ならびに（５）新薬が臨床試験においてどれほどよく効くかを正確に予測できないことを含む、腫瘍生物学に関する幾つかのデメリットを有する。
【００３７】
三次元細胞培養系および腫瘍モデルは、２Ｄ系の欠陥の多くを克服することができる。一般的に３Ｄ系は、２Ｄインビトロ細胞培養系およびモデルと比べて、シグナル伝達分子の生理、構造、濃度勾配、ならびに細胞外マトリックスの組成、構造、および機械力を含む、インビボでの腫瘍微小環境の模倣が改善され得る。３Ｄインビトロ腫瘍モデル系が記載されているが、現在の３Ｄインビトロ腫瘍モデル系は限界がないわけではない。
【００３８】
多細胞腫瘍スフェロイド（ＭＴＳ）モデルは、現在、最もよく確証された３Ｄモデル系と考えられている。ＭＴＳモデルは、ハイドロゲル、フィルム、または足場の形態で、様々な生体基質、天然基質、および合成基質を用いて実施されている。さらに、液体オーバーレイ、スピナーフラスコ、旋動回転およびハンギングドロップ法を含む幾つかの異なる技法が、スフェロイドを増殖させるのに使用されている。進歩があるにもかかわらず、ＭＴＳモデルはまだ幅広く採用されていない。実際、３Ｄ細胞培養の採用の中央値のレベルは、全ての細胞培養作業の約２５％未満であった。生物学的関連性、幅広い適用性／汎用性、ハイスループット、およびスケーラビリティ／自動化を低コストで有するモデルが産業上求められている。現在のＭＴＳモデルを含む現在の３Ｄモデルは、それらが長い培養時間を必要とし、サイズ分布が幅広いスフェロイドを形成し、機械的利用が難しいため、これらの要求を満たしていない。固形腫瘍またはその相互作用を模倣する能力に関連した、現在のＭＴＳモデルの生物学的関連性はほとんど理解されていない。さらに、生物学的関連性に関する問題を克服するために動物またはヒト起源の足場を使用するＭＴＳモデルは、疾患伝播のリスクおよび乏しい再現性に悩まされ、候補薬化合物の臨床有効性の決定における使用可能性が大幅に限定されている。
【００３９】
３Ｄ培養用の生体模倣足場を開発する上で、多くの努力が払われてきた。現在最もよく開発された足場は、ポリスチレンまたはＰＣＬから構築されたものであり、これらは、生体適合性ではあるが人工の表面における細胞の増殖を可能にする。これらの足場の１つの重大な限界は、培養中に足場からスフェロイドを取り出すためにトリプシンへのより長時間の曝露が必要であり、これが細胞にストレスを加え、任意の実験または有効性テストから得られた結果を、良く言っても解釈しにくくすることである。ＲＧＤ修飾ＰＥＧハイドロゲルなどの完全合成足場は、人工的な細胞−細胞または細胞−マトリックス相互作用を作り出し、腫瘍−間質相互作用を標的にする薬物のスクリーニングを困難にする可能性がある。
【００４０】
ハンギングドロップおよび磁気ナノ３Ｄ技術などの非足場ベースのアプローチが存在するが、限界がないわけではない。ハンギングドロップ法では、中心部の細胞が餓死し、不安定になり、死滅することから、スフェロイドの増殖は直径５００μｍに限定される。さらに、ハンギングドロップスフェロイドは単一腫瘍細胞から現れるため、その生物学的関連性が問題となる。磁気ナノ３Ｄ系は非常に高価であり、このように生成されたスフェロイドも、ハンギングドロップ法により製造されたものと同じ中心の壊死に悩まされる。どちらの場合も、観察される腫瘍微小環境は、腫瘍細胞および間質細胞に不均質性が存在するインビボでの腫瘍微小環境とは極めて異なる可能性がある。
【００４１】
現在のモデルの欠陥を考慮して、本明細書に記載されるのは、臨床および医薬品開発状況において薬物有効性試験を容易にすることができるチューモロイドモデル系の３Ｄ培養のため組成物、方法、および系である。本明細書に記載された３Ｄ培養方法および系、ならびに本開示の他の組成物、化合物、方法、特徴、および利点は、以下の図面、発明を実施するための形態、および例を吟味すれば当業者に明らかであり、または明らかになるであろう。そのようなさらなる組成物、化合物、方法、特徴、および利点は全てこの記載内に含まれ、本開示の範囲内であることが意図される。
【００４２】
多細胞チューモロイドを形成する方法
ここで記載されるのは、多細胞チューモロイドを形成する方法である。形成されたチューモロイドの細胞集団は、異種であってもよい（すなわち異なる細胞タイプを含む）。該方法は、インビボでの腫瘍微小環境を模倣する大型のチューモロイド（直径約５００μｍ超）をもたらすことができる。幾つかの実施形態において該方法は、腫瘍細胞（ＴＣ）、癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）、および上皮細胞（ＥＣ）を細胞培養培地で共培養する工程を含んでもよい。幾つかの実施形態において、共培養はマクロファージを含むこともできる。幾つかの実施形態において、細胞共培養体（ｃｅｌｌ  ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ）はＴＣ、ＣＡＦ、およびＥＣのみを含有する。他の実施形態において、細胞共培養体はＴＣ、ＣＡＦ、ＥＣ、およびマクロファージのみを含有する。細胞培養は、所望のサイズのチューモロイドが形成されるまで、細胞の１回または複数回の継代を通じて継続することができる。形成されたチューモロイドは、直径約１μｍ〜約５００μｍ、５００μｍ超、または５００μＭ〜約１，０００μＭであってもよい。任意の培養において、チューモロイドサイズは実質的に均一であってもよい。
【００４３】
細胞培養培地は、ある量の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）培養上清を含有することもできる。幾つかの実施形態において、細胞の共培養は３Ｄ足場で培養される。３Ｄ足場は繊維状誘導スマートスキャフォールド（ＦｉＳＳ）であってもよい。本明細書において、用語ＦｉＳＳは、その全体が表示されているのと同様に参照により本明細書に組み込まれるＧｉｒａｒｄら（２０１３）ＰｌｏｓＯＮＥ  ８（１０）ｅ７５３４５に記載された３Ｄ繊維状足場（３Ｐ足場とも呼ばれる）を指す。
【００４４】
細胞の共培養
ＴＣ、ＣＡＦ、ＥＣ、およびマクロファージは、本明細書に記載されているように共培養することができる。幾つかの実施形態において、ＴＣ対ＣＡＦ対ＥＣの比は約５対約１対約１であってもよい。言い換えれば、培養でのＴＣ、ＣＡＦ、およびＥＣそれぞれの総数の比は、約５対約１対約１の比で存在してもよい。ＴＣ対ＣＡＦ対ＥＣの比は、約１〜約１０：約１〜約１０：約１〜約１０の範囲であってもよい。ＴＣ対ＣＡＦ対ＥＣ対マクロファージの比は、５：１：１：１の範囲であってもよい。ＴＣ対ＣＡＦ対ＥＣ対マクロファージの比は、約１〜約１０：約１〜約１０：約１〜約１０：約１〜約１０の範囲であってもよい。ＴＣ、ＣＡＦ、ＥＣ、およびマクロファージは、自己由来、異種、またはその組み合わせであってもよい。
【００４５】
ＴＣ：共培養は、腫瘍細胞を含んでもよい。幾つかの実施形態において、腫瘍細胞は乳癌細胞を含んでもよい。他の実施形態において、腫瘍細胞は乳癌細胞のみであってもよい。幾つかの実施形態において、腫瘍細胞は肺癌細胞を含んでもよい。他の実施形態において、腫瘍細胞は乳癌細胞のみである。ＴＣは、腫瘍の生検によるなど対象者に由来してもよい。幾つかの実施形態において、生検はＴＣ源として直接（すなわち、生検を共培養で直接培養して）使用される。他の実施形態において、生検はインビトロで培養されてもよく、インビトロでの生検培養由来のＴＣ子孫細胞がＴＣ源として使用されてもよい。ＴＣは、臨床有効性試験に使用される標準的な細胞系であってもよく、または市販の他の細胞系であってもよい。ＴＣは、１：１から１０：１〜１：１０のＴＣ対マクロファージの比で存在してもよい。ＴＣは、１：１から１０：１〜１：１０のＴＣ対ＥＣの比で存在してもよい。ＴＣは、１：１から１０：１〜１：１０のＴＣ対ＣＡＦの比で存在してもよい。
【００４６】
ＣＡＦ：共培養はＣＡＦを含むことができる。インビボでＣＡＦは、固有の腫瘍微小環境を提供することにより腫瘍細胞の増殖および浸潤に積極的に関与する。ＣＡＦは、腫瘍微小環境内の静止常在性線維芽細胞または周皮細胞の、間葉間葉移行（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）による分化転換から生じてもよい。ＣＡＦは、骨髄間葉系幹細胞、正常上皮細胞もしくは上皮から間葉への移行による形質転換上皮細胞、および／または内皮から間葉筋アクチン（ＳＭＡ）による内皮細胞に由来してもよい。
【００４７】
腫瘍進行には、ＣＡＦと腫瘍細胞の間の正のおよび相互のフィードバックが必要である。癌細胞は、線維芽細胞活性表現型を誘導および維持し得、これが今度は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）リモデリング、細胞増殖、血管新生の促進、幹細胞性の維持、炎症の制御、免疫応答の制御、快適な代謝環境および上皮−間葉移行の促進により腫瘍進行を持続する一連の増殖因子およびサイトカインを産生し得る。そのような増殖因子には、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、間質由来因子１（ＳＤＦ−１）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂ−ＦＧＦ）、および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）が含まれ得る。間接的には、ＣＡＦは、プラスミノーゲン活性化因子およびマトリックスメタロプロテアーゼなどのタンパク質分解およびＥＣＭの分解に関与するプロテアーゼおよび他の分子を分泌して、腫瘍進行を促進および維持することができる。これは、腫瘍進行を持続することができる、既述の増殖因子およびサイトカインの放出をもたらし得る。ＣＡＦは、免疫細胞において多面的機能も有し得る。既述のように、ＣＡＦにより分泌される増殖因子、サイトカイン、およびケモカインの多様性は、強炎症性だが免疫抑制性である環境をもたらす可能性がある。
【００４８】
ＣＡＦは、腫瘍の生検によるなど対象者に由来してもよい。幾つかの実施形態において、生検はＣＡＦ源として直接使用される。他の実施形態において、生検はインビトロで培養されてもよく、インビトロでの生検培養由来の子孫ＣＡＦがＣＡＦの源として使用されてもよい。ＣＡＦは、臨床有効性試験に使用される標準的な細胞系であってもよく、または市販の他のＣＡＦ細胞系であってもよい。ＣＡＦは、１：１から１０：１〜１：１０のＣＡＦ対マクロファージの比で存在してもよい。ＣＡＦは、１：１から１０：１〜１：１０のＣＡＦ対ＥＣの比で存在してもよい。ＣＡＦは、１：１から１０：１〜１：１０のＣＡＦ対ＴＣの比で存在してもよい。
【００４９】
ＥＣ：共培養はＥＣを含有することができる。ＥＣは、１：１から１０：１〜１：１０のＥＣ対マクロファージの比で存在してもよい。ＥＣは、１：１から１０：１〜１：１０のＥＣ対ＣＡＦの比で存在してもよい。ＥＣは、１：１から１０：１〜１：１０のＥＣ対ＴＣの比で存在してもよい。
【００５０】
マクロファージ：幾つかの実施形態において、共培養はマクロファージも含有することができる。マクロファージは、１：１から１０：１〜１：１０のＴＣ対マクロファージの比で存在してもよい。マクロファージは、１：１から１０：１〜１：１０のＥＣ対マクロファージの比で存在してもよい。マクロファージは、１：１から１０：１〜１：１０のＣＡＦ対マクロファージの比で存在してもよい。マクロファージは、特に血管新生の促進を通じて腫瘍発症を促進することができる。ＣＡＦは、免疫細胞の動員および機能を制御することができる。ＣＡＦは、腫瘍微小環境においてマクロファージ動員を誘導し、ＭＣＰ／ＣＣＬ２、ＩＬ１−βＩＬ−６、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ５、およびＣＣＬ３の発現および／または分泌により刺激されたＳＤＦ−１を介して、マクロファージにおける免疫抑制表現型を誘導することが実証されている。
【００５１】
３Ｄ培養足場：上述の細胞は、３Ｄ足場で一定時間共培養することができる。３Ｄ足場は、繊維状誘導スマートスキャフォールド（ＦｉＳＳ）であってもよい。本明細書において、用語ＦｉＳＳは、その全体が表示されているのと同様に参照により本明細書に組み込まれるＧｉｒａｒｄら（２０１３）ＰｌｏｓＯＮＥ  ８（１０）ｅ７５３４５に記載された３Ｄ繊維状足場（３Ｐ足場とも呼ばれる）を指す。
【００５２】
足場は、任意の適切な技法または方法により製造することができる。そのような技法および方法には、電界紡糸、溶液流延／ソルトリーチング、氷粒リーチング（ｉｃｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｌｅａｃｈｉｎｇ）、ガスフォーミング／ソルトリーチング、溶媒蒸発、凍結乾燥、熱誘起相分離、マイクロモールディング、フォトリソグラフィ、マイクロフルイディクス、乳化、脱細胞化プロセス、自己組織化、極細繊維湿式紡糸（ｍｉｃｒｏｆｉｂｅｒ  ｗｅｔ  ｓｐｉｎｎｉｎｇ）、メルトブロー加工、スポンジ複製法、単純なリン酸カルシウム被覆法、インクジェット印刷、メルトベースラピッドプロトタイピング処理、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。当業者は、足場製造に使用される技法（複数可）または方法（複数可）が、特に足場に存在する成分に応じて異なることを理解するであろう。
【００５３】
足場材料は、合成、生物由来、またはその組み合わせであってもよい。足場材料は、分解性または非分解性であってもよい。足場材料は生体適合性であってもよい。合成足場材料には、ＰＬＡ、ＰＬＧ、ＰＬＧＡ、およびＰＨＡ、ＰＬＬＡ、ＰＧＡ、ＰＣＬ、ＰＤＬＬＡ、ＰＥＯに基づくＰＥＥ、およびＰＢＴが含まれ得るが、これらに限定されない。
【００５４】
細胞培養培地：細胞の共培養は培養培地で培養される。培養培地は、チューモロイド形成の時間経過と共に変更し得る。例えば、細胞培養培地は培養中に交換されてもよく（細胞を継代するときなどに）、または補充されてもよい。交換培地は前の培地と同じ処方であってもよく、または異なる処方を有してもよい。他の培地成分は、培養中に培地に補充されてもとく、これは培地処方の変化をもたらし得る。
【００５５】
細胞培養培地は、これらに限定されないが増殖因子、栄養素（例えば窒素、ブドウ糖、アミノ酸）、抗真菌剤、抗生物質、イオン、血清、および／またはそれらの組み合わせを場合により補充することができる適切な標準基本培地であってもよい。適切な基本培地には、ＤＭＥＭ、ＤＭＥ、ＲＭＰＩ−１６４０、およびＭＥＭが含まれるが、これらに限定されない。他のものは、当業者により理解されよう。
【００５６】
幾つかの実施形態において、培養培地は約５〜約１０％のマトリゲルを補充される。細胞培養培地は、ＶＥＧＦ、ＩＬ６、ＴＧＦ−β１、またはそれらの組み合わせを補充されてもよい。幾つかの実施形態において、ＶＥＧＦの量は、少なくとも８００ｐｇ／ｍＬであってもよく、約１〜約１２００ｐｇ／ｍＬ、約１００ｐｇ／ｍＬ〜約１２００ｐｇ／ｍＬ、または約８００ｐｇ／ｍＬ〜約１２００ｐｇ／ｍＬの範囲であってもよい。幾つかの実施形態において、ＩＬ６の量は、少なくとも１００ｐｇ／ｍＬであってもよく、約１〜約５００ｐｇ／ｍＬ、約１００ｐｇ／ｍＬ〜約５００ｐｇ／ｍＬ、または約２００ｐｇ／ｍＬ〜約５００ｐｇ／ｍＬの範囲であってもよい。幾つかの実施形態において、ＴＧＦ−β１の量は、少なくとも１２００ｐｇ／ｍＬであってもよく、約１〜約１８００ｐｇ／ｍＬ、約９００ｐｇ／ｍＬ〜約１８００ｐｇ／ｍＬ、または約１２００ｐｇ／ｍＬ〜約１８００ｐｇ／ｍＬの範囲であってもよい。
【００５７】
幾つかの実施形態において細胞培養培地は、チューモロイドの増殖を促進するように構成された増殖培地および培養上清で作られる。増殖培地の処方は、当業者により理解されよう。培養上清は、培養培地合計の約１％〜約９９％の濃度で存在してもよい。幾つかの実施形態において培養上清は、培養培地合計の少なくとも２０％である。さらなる実施形態において、培養上清は、細胞培養培地合計の約２０％〜約５０％であってもよい。
【００５８】
培養上清は、ヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）培養上清であってもよい。ＭＳＣ培養上清は、１つまたは複数の継代にわたってヒトＭＳＣ細胞を培養し、ＭＳＣ細胞が培養された培地を回収して得ることができる。幾つかの実施形態において、ＭＳＣ培養上清は、継代５回目および／または継代６回目で回収された細胞培養培地から得られる。ＭＳＣ培養上清は、ＭＳＣ細胞により分泌された分子および他の化合物を含有することができる。幾つかの実施形態においてＭＳＣ培地は、ＶＥＧＦ、ＩＬ６、ＴＧＦ−β１、またはそれらの組み合わせを含有してもよい。幾つかの実施形態において、ＭＳＣ培養上清中のＶＥＧＦの量は少なくとも８００ｐｇ／ｍＬであってもよく、約１〜約１２００ｐｇ／ｍＬ、約１００ｐｇ／ｍＬ〜約１２００ｐｇ／ｍＬ、または約８００ｐｇ／ｍＬ〜約１２００ｐｇ／ｍＬの範囲であってもよい。幾つかの実施形態において、ＭＳＣ培養上清中のＩＬ６の量は少なくとも１００ｐｇ／ｍＬであってもよく、約１〜約５００ｐｇ／ｍＬ、約１００ｐｇ／ｍＬ〜約５００ｐｇ／ｍＬ、または約２００ｐｇ／ｍＬ〜約５００ｐｇ／ｍＬの範囲であってもよい。幾つかの実施形態において、ＭＳＣ培養上清中のＴＧＦ−β１の量は少なくとも１２００ｐｇ／ｍＬであってもよく、約１〜約１８００ｐｇ／ｍＬ、約９００ｐｇ／ｍＬ〜約１８００ｐｇ／ｍＬ、または約１２００ｐｇ／ｍＬ〜約１８００ｐｇ／ｍＬの範囲であってもよい。
【００５９】
多細胞チューモロイドの使用方法
本明細書に記載されているように形成されたチューモロイドは、抗癌剤または医薬品を含む薬物などの化合物または組成物の有効性および／または効果を決定するのに使用することができる。そのため、本明細書に記載された方法およびチューモロイドは、臨床試験および創薬のモデル系として有用であり得る。チューモロイドが対象者自身の腫瘍から形成される実施形態において、特定の治療レジメンの有効性が調べられてもよい。幾つかの実施形態において、本明細書に記載されたチューモロイドおよび培養方法は、癌幹細胞のインビトロ集団を増殖するのに使用することができる。
【００６０】
抗癌剤などの化合物または組成物の有効性および／または効果を決定する方法は、多細胞チューモロイドを形成する工程、および、多細胞チューモロイドを抗癌剤などのある量の化合物または組成物に曝露させる工程を含んでもよい。ここで、チューモロイドを形成する工程が本明細書のどこかに記載されている。チューモロイドを形成する工程は、ＴＣ対ＣＡＦ対ＥＣの数の比が５対１対１であり、細胞培養培地がある量の間葉系幹細胞培養上清を含有する条件において、ＴＣ、ＥＣＳ、およびＣＡＦを細胞培養培地で共培養する工程を含んでもよい。細胞共培養体は、マクロファージを場合により含むこともできる。幾つかの実施形態において、細胞共培養体はＴＣ、ＣＡＦ、およびＥＣのみを含む。他の実施形態において、細胞共培養体はＴＣ、ＣＡＦ、ＥＣ、およびマクロファージのみを含む。
【００６１】
抗癌剤などの化合物または組成物の有効性および／または効果を決定する方法は、腫瘍増殖または幹細胞性を示すバイオマーカーの発現または存在の量を測定する工程、および該発現または存在を適切な対照の発現または存在と比較する工程を場合により含んでもよい。被験試料におけるバイオマーカーの発現または存在の量の変化（量の増加または減少のいずれか）は、癌に対する化合物または組成物の有効性または無効性を示すことができる。バイオマーカーは、チューモロイド自体またはチューモロイドが存在する培養培地において測定されてもよい。幾つかの実施形態において前記方法は、チューモロイドにおけるＫｉ−６７の発現を測定する工程、および該発現を適切な対照と比較する工程をさらに含む。対照と比較してＫｉ−６７の発現および／または存在の減少は、被験化合物または被験組成物が癌に対して有効であることを示すことができる。他の実施形態において前記方法は、培養物に存在するＶＥＧＦおよび／またはＩＬ−６の量を測定する工程、ならびに該発現または存在を適切な対照と比較する工程をさらに含んでもよい。対照と比較してＶＥＧＦおよび／またはＩＬ−６の発現および／または存在の減少は、被験化合物または被験組成物が癌に対して有効であることを示すことができる。
【実施例】
【００６２】
本開示の実施形態を一般的に記載してきたところ、以下の実施例は、本開示の幾つかのさらなる実施形態を記載するものである。本開示の実施形態は、以下の例ならびに対応する文章および図に関連して記載されるが、本開示の実施形態をこの記載に限定することは意図されておらず、むしろ、本開示の実施形態の趣旨および範囲内に含まれる全ての代替物、変更例、および同等物を包含することが意図されている。
【００６３】
実施例１：チューモロイドアッセイ（Ｚ因子分析）の最適化
３Ｄ細胞培養においては、ハイスループット系スクリーニングへの該培養の組み込みにおいて重要である再現性に主な障害があった。チューモロイドアッセイにおけるウェル間の変動を決定するために、ｎ＝８ウェル／群、異なる濃度のＦｉＳＳにおけるＭＣＦ−７細胞を、ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ（登録商標）アッセイにより播種５日後に腫瘍形成性を測定した。統計上の効果量の尺度であるＺ因子を、方程式１を用いて決定した。
【００６４】
【数１】
2017516499.tif 000003
【００６５】
アッセイ結果は、Ｚ因子約０．７５５の小さなウェル間変動を示した。これは良好な範囲にあり、ハイスループットスクリーニングに対する本明細書に記載されたチューモロイドアッセイの即応性を示唆するものである。
【００６６】
実施例２：チューモロイド共培養の特徴付け
ＢＴ４７４またはＨＣＣ１５６９細胞を、ＥＣおよびＣＡＦと共培養した。共培養における腫瘍細胞（ＢＴ４７４またはＨＣＣ１５６９）対ＥＣ対ＣＡＦの比は、５：１：１（腫瘍細胞：ＥＣ：ＣＡＦ）であった。図２Ａ〜５Ｂに示されているように、ＥＣおよびＣＡＦとの共培養は、増加した増殖能および高いＶＥＧＦ発現を有する頑強なチューモロイドを誘導した（図３）。図１Ａ〜１Ｂは、癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）および内皮細胞（ＥＣ）と共に（図１Ｂ）、または無しで（図１Ａ）約５日培養した後のＢＴ４７４乳癌細胞由来チューモロイドの増殖を示す代表的な蛍光顕微鏡画像を示す。
【００６７】
多細胞チューモロイドにおけるＣＡＦおよびＥＣの存在を、それぞれ、ＣＡＦおよびＥＣに対する抗平滑筋アクチン（ＳＭＡ）抗体および抗フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）抗体を用いたＩＨＣと、それに続く共焦点顕微鏡法により確認した。図２は、ＥＶ（ｖＷＦ、緑色の細胞）およびＣＡＦ（ＳＭＡ陽性、赤い細胞）および核（ＤＡＰＩ、青）を示すＢＴ４７４乳癌共培養チューモロイドの共焦点顕微鏡画像（合成ｚスタック画像）を示す。チューモロイド免疫染色形態ＣＡＦ（赤、抗ＳＭＡ陽性）およびＥＣ（緑、抗ｖＷＦ陽性）の合成ｚスタック画像を、図２に示す。共培養後５日目でＣＡＦがチューモロイド全体に分散しているのが見出されたのに対し、ＥＣは大部分が多細胞チューモロイドの端で見出された。
【００６８】
図３は、ＥＬＩＳＡにより測定した図１Ａ〜１Ｂおよび図２の培養細胞の上清中のＶＥＧＦの量を示すグラフを示す。培養細胞により産生されたＶＥＧＦの量を決定する前に、細胞を５日間培養した。チューモロイドの上清中のＶＧＥＦレベルの比較で、ＢＴ４７４＋ＣＡＦ＋ＥＣ誘導チューモロイドに比べてＢＴ４７４チューモロイドのＶＧＥＦが少ないことが示される（図３）。図４Ａ〜４Ｂに示されるように、ＨＣ１５９６９を用いた共培養でも、ＢＴ４７４で観察されたと同じようなチューモロイドの数および直径の増加がもたらされた。
【００６９】
実施例３：増殖因子の送達および対照
本明細書に記載された共培養においてチューモロイド増殖を増進させることが可能な増殖因子を調べるための、培養中のチューモロイド増殖に対する漸増血清濃度の影響。結果（示されていない）は、血清濃度の増加がチューモロイド増殖に著しい影響を与えるものでないことを示唆するものである。増殖培地へのマトリゲル（約５％〜約１０％）の添加により、ＦｉＳＳで培養した場合のＨＣＣ１５６９細胞のチューモロイド発生が高まった。これは、約５％〜約１０％マトリゲルによる増殖培地（ＧＭ）の補充によって、他のタイプの乳癌細胞由来のチューモロイドの増殖を増進させられることを示唆している。
【００７０】
チューモロイド増殖に影響を与える因子をテストするために、チューモロイド増殖に対するｈＭＳＣ  ＣＭの影響を調べた。ｈＭＳＣにより放出される増殖因子を調べた。この目的のために、継代２、３、５および６などの異なる継代のｈＭＳＣのＣＭを回収し、ＶＥＧＦ、ＩＬ−６、およびＴＧＦ−βのレベル。図５Ａ〜５Ｃは、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）培養上清（ＣＭ）に存在するＶＥＧＦ（図５Ａ）、ＩＬ−６（図５Ｂ）、および活性ＴＧＦ−β１（図５Ｃ）を示すグラフを示す。ヒトＭＳＣは、アルファＭＥＭおよび１５％血清中で培養した。各継代約４８時間後に継代（ｐ）ｐ２〜ｐ６の培養上清を回収した。回収した培養上清を遠心分離し、濾過し、使用まで保管した。ｐ２〜ｐ６のＣＭにおける増殖因子の発現をＥＬＩＳＡにより調べた。ＶＥＧＦの特異度を示すためにＶＥＧＦ抗体の中和を使用した。＊ｐ＜０．０５。図５Ａ〜５Ｃに示されたデータは、ｈＭＳＣ−ｐ２およびｈＭＳＣ−ｐ３と比べてｈＭＳＣ−ｐ５およびｈＭＳＣ−ｐ６のＣＭにおいて、有意に高いレベル（約１ｎｇ／ｍＬ）のＶＥＧＦ（図５Ａ）およびＩＬ−６（約２５０〜４５０ｐｇ／ｍＬ）（図５Ｂ）が見出されたことを示している。ＣＭに存在しているものの、ｈＭＳＣ継代のＣＭ間でＴＧＦ−β１のレベルの有意な差は観察されなかった（図５Ｃ）。
【００７１】
ＢＴ４７４チューモロイドは、ｈＭＳＣに由来する様々な濃度のＣＭの存在下、ＢＴ４７４細胞から培養した。ｐ５−ｈＭＳＣ  ＣＭがＶＥＧＦ、ＩＬ−６、およびＴＧＦ−β１の最大の産生を示す限りにおいて、ＢＴ４７４  ＧＭに様々な濃度のｐ５−ｈＭＳＣ  ＣＭを補充し、ＢＴ４７４細胞のみ（単独培養）またはＣＡＦおよびＥＣの存在下（共培養）で培養し、チューモロイド増殖を調べた。図６Ａ〜６Ｈは、生細胞（緑）および死細胞（赤）を検出するためにカルセインＡＭ／ＥｔｈＤ−１により染色した、ＢＴ４７４乳癌細胞の単独培養（図６Ａ〜６Ｄ）またはＢＴ４７４乳癌細胞およびＥＣ＋ＣＡＦの共培養（図６Ｅ〜６Ｈ）の代表的な蛍光顕微鏡画像を示す。倍率：１００×。標準的な増殖培地（ＧＭ）対ＣＭ（ＧＭ：ＣＭ）の比は、約１００：０から約５０：５０に及んだ。図６Ａ〜７に示されたデータは、ＣＭを約２０％、約４０％、または約５０％で添加すると、単独培養および共培養の両方においてチューモロイド直径が増加したことを示している。ＧＭ：ＣＭ（約５０％）を添加すると、単独培養および共培養チューモロイド下で産生されたチューモロイドの両方について、チューモロイド直径が有意に増加した。
【００７２】
実施例４：臨床的有効性を決定するためのバイオマーカー
チューモロイドの臨床バイオマーカーとしてのＫｉ６７。臨床試験は、臨床的有効性のマーカーとしてＫｉ６７を利用する。Ｋｉ６７がチューモロイドにおいて発現されるかどうかを決定するために、ＢＴ４７４細胞（１０４）をＦｉＳＳで５日間培養した。形成されたチューモロイドを固定し、抗Ｋｉ６７抗体を用いて免疫染色した。図８Ａから８Ｂは、生細胞を緑色、死細胞を赤色に染色するカルセインＡＭ／ＥｔｈＤ−１で染色したＢＴ４７４チューモロイド培養物（図８Ａ）、および３Ｄ足場におけるＢＴ４７４の単独培養物に関するＫｉ−６７染色（図８Ｂ）を示す。
【００７３】
チューモロイドのバイオマーカーとしてのＶＥＧＦおよびＩＬ６。単独培養チューモロイドおよび共培養チューモロイドは、培養培地に放出された有意な量のＶＥＧＦおよびＩＬ−６を産生した。共培養では、培養培地に放出されるＶＧＥＦおよびＩＬ−６の量が２倍増加した。共培養において産生されたＶＧＥＦおよびＩＬ−６のレベルの上昇は、これらの増殖因子が共培養で観察された細胞の増殖およびチューモロイドの増殖の増加に関与し得ることを示唆している。したがって、当データは、これらの２つのタンパク質が臨床的有効性のバイオマーカーとして機能し得ることを示唆している。
【００７４】
実施例５：ハーセプチンおよびラパチニブを用いたチューモロイドによる臨床有効性の予測
ＢＴ４７４およびＨＣＣ１５６９の単独培養または共培養に由来するチューモロイドの、ラパチニブに対する感受性を調べた。ラパチニブは、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２を標的にする二重低分子チロシンキナーゼ阻害剤である。図９Ａ〜９Ｂに示されたデータに示されているように、チューモロイドはラパチニブ処理に対し様々な反応性を有した。ＢＴ４７４細胞は、２ＤまたはＦｉＳＳのいずれで培養した場合も、ラパチニブに対して感受性であることが観察された（ＩＣ５０＜２．５μＭ）が、ＥＣおよびＣＡＦの存在下でＭＴ４７４−ＭＣＴは、ラプチニブ（Ｌａｐｔｉｎｉｂ）に対して有意により高い耐性を有することが観察された（ＩＣ５０＞１０μＭ）。ＨＣＣ１５６９も、ＥＣおよびＣＡＦの存在下で培養した場合、ラパチニブに対する耐性の増加を示した。確立されたチューモロイドをラパチニブで処理した場合、類似の結果が観察された。
【００７５】
実施例６：臨床的有効性のバイオマーカー
Ｋｉ−６７は、癌治験における臨床有効性の代理マーカーとして使用することができる。Ｋｉ−６７の発現。単独培養チューモロイドおよび共培養チューモロイドを、ラパチニブを漸増濃度として（０〜１０μＭ）処理した。チューモロイドを固定し、Ｋｉ−６６７について免疫染色した。ラパチニブ（２．５ｍＭ）による処理が、Ｋｉ−６７の発現に影響を与えるかどうかをテストした。結果は、ラパチニブ処理がチューモロイド形成を阻害するだけでなく、Ｋｉ−６７染色を完全に抑制することを示し、腫瘍細胞の増殖の完全な阻害を示唆した（図１０Ａおよび１０Ｂ）。
【００７６】
臨床的有効性のバイオマーカーを同定および評価するために、単独培養および共培養チューモロイドを両方とも漸増濃度のラパチニブ（約０から約１０μＭ）で処理した。培養５日後、培養物の上清をＶＥＧＦ、ＩＬ−６、およびＴＧＦ−βのレベルについてテストした。図１１Ａ〜１１Ｃは、３Ｄ足場での単独培養物またはＣＡＦおよびＥＣとの共培養ＢＴ４７４細胞に由来するＢＴ４７４チューモロイドにおけるＶＥＧＦ（図１１Ａ）、ＩＬ−６（図１１Ｂ）、およびＴＧＦ−β１（図１１Ｃ）に対するラパチニブの影響を示すグラフを示す。ＢＴ４７４チューモロイドを、ラパチニブ（２．５〜１０μＭ）の存在下または非存在下で単独培養または共培養し、５日目の培養上清中のＶＥＧＦ、ＩＬ−６、およびＴＧＦ−β１のレベルをＥＬＩＳＡにより決定した。＊ｐ＜０．０５。データは、単独培養および共培養チューモロイドが両方とも相当量のＶＥＧＦ、ＩＬ−６、およびＴＧＦ−βを分泌したことを示している。ラパチニブ処理（約２．５μＭ〜５μＭ）は、共培養チューモロイドにおけるＶＥＧＦ、ＩＬ−６、およびＴＧＦ−βの分泌を有意に減少させた。データは、Ｋｉ６７に加えてこれらの因子が、共培養チューモロイドにおける抗癌剤の臨床有効性のバイオマーカーとして機能し得ることを示している。
【００７７】
実施例７：乳癌腫瘍細胞と間質細胞との共培養およびＴＳＩの評価
チューモロイド培養の確立：条件をチューモロイド発生のために最適化した。ＨＣＣ１５６９を除いて、乳房腫瘍細胞系ＭＣＦ７、ＢＴ−４７４およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１は全て、播種密度３，０００から１０，０００細胞／９６ウェル当たりでチューモロイドを形成した（ここでは単一細胞チューモロイド（ＳＣＴ）と呼ばれる）。ＨＣＣ１５６９の細胞系はゆるく接着しており、単層で培養した場合、細胞の約５０％が浮遊物として残ったことが観察された。この細胞系によるチューモロイド形成を最適化する間に、ＨＣＣ−１５６９細胞は、培養培地に１０％マトリゲルを補充すると、他の細胞系と同じ頻度でチューモロイドを容易に発生させることが、思いがけなく観察された。図１２Ａ〜１２Ｄは、４細胞系全てが５日目にＳＣＴを容易に発生させたことを示している。チューモロイド増殖を９日目までモニターし、５日目および９日目のＳＣＴのサイズを測定した（図１３）。各細胞タイプのチューモロイドは、サイズが３〜２０％差次的に増殖した。
【００７８】
実施例８：チューモロイド共培養の確立および特徴付け
乳癌細胞とＣＡＦおよびＥＣなどの間質細胞との共培養が、インビボでの腫瘍を模倣できる多細胞チューモロイド（ＭＣＴ）を形成するかどうかを調べるために、共培養試験を行った。５日目のＭＣＦ−７チューモロイドとＥＣまたはＣＡＦのどちらかとの共培養では、共培養３〜５日後に識別可能なＭＣＴが誘導された（図１４Ａ〜１４Ｄ）が、細胞の正味の増殖は低減した（図１５）。しかし、ＭＣＦ−７細胞とＥＣおよびＣＡＦの両方との共培養は、チューモロイドサイズおよび数を有意に増加させただけでなく（図１４Ａ〜１４Ｄ）、細胞増殖も回復させた（図１５）。同様に、ＨＣＣ−１５６９細胞系では、ＣＡＦおよびＥＣと同時に共培養した場合、チューモロイドサイズおよび数が有意に増加した（図１４Ａ〜１４Ｄ）。共培養条件を最適化し、ＥＣ（１０３）およびＣＡＦ（１０３）との共培養腫瘍細胞（３〜５×１０３）は、若干増加した増殖能を有する頑強なＭＣＴを誘導したことが観察された（図１６Ａ〜１６Ｆ）。ＭＣＴにおけるＣＡＦおよびＥＣの存在を、それぞれ、ＣＡＦおよびＥＣに特異的な抗平滑筋アクチン（ＳＭＡ）抗体および抗フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）抗体を用いたＩＨＣと、それに続く共焦点顕微鏡法により確認した。ＣＡＦ（赤、抗ＳＭＡ陽性）およびＥＣ（緑、抗ｖＷＦ陽性）について免疫染色したＭＣＴの代表的な蛍光画像および合成ｚスタック画像を観察した。共培養後５日目でＣＡＦがチューモロイド全体に分散しているのが見出されたのに対し、ＥＣは大部分がＭＣＴの端で見出された（図１７Ａ〜１７Ｆ）。実験の別のセットにおいて、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＥＣの共培養もチューモロイド発生を示したが、正味の細胞増殖は低減した。まとめると、これらの結果は、チューモロイドと間質細胞との共培養が有意にチューモロイド発生を増加させることを示している。
【００７９】
実施例９：ＦｉＳＳ培養とマトリゲルベースの３Ｄ培養との比較
ＦｉＳＳチューモロイドの性能を他の３Ｄベースの培養プラットフォームと比較するために、増殖因子低減マトリゲルを用いた２つの乳癌細胞系、ＭＣＦ７およびＢＴ４７４におけるスフェロイド形成を評価した。比較のために、同数の細胞をＦｉＳＳにプレーティングし、調べた。細胞を５日間培養し、スフェロイドをカルセインＡＭで染色し、蛍光顕微鏡により調べた。図１８Ａ〜１８Ｄに示された結果は、ＭＣＦ７（図１８Ａ〜１８Ｂ）においてマトリゲル培養がＦｉＳＳと類似したスフェロイドの数およびサイズを誘導したのに対し、ＢＴ４７４（図１８Ｃ〜１８Ｄ）ではマトリゲル培養はＦｉＳＳよりまとまりのないコロニーを形成したことを示している。しかし、さらに、マトリゲルの内部に組み込まれているマトリゲル培養のコロニーはほとんどないことが見出された。
【００８０】
実施例１０：チューモロイドにおける細胞−細胞または細胞−ＥＣＭ接着の評価
ＳＣＴおよびＭＣＴ培養におけるバイオマーカーの特徴付けに向けて、チューモロイドの培養上清に分泌される因子を調べた。チューモロイドの上清中のＶＧＥＦレベルの比較により、ＭＣＦ７−ＭＣＴと比べてＭＣＦ７−ＳＣＴはＶＧＥＦが少ないことが示された（図１９）。さらに、図１１Ａ〜１１Ｃに示されているように、ＢＴ４７４−ＳＣＴおよび−ＭＣＴは両方とも有意な量のＶＥＧＦおよびＩＬ−６を産生した。興味深いことに共培養は、培養培地に放出されるＶＧＥＦおよびＩＬ−６の量の２倍の増加を示した。共培養で産生されたＶＧＥＦおよびＩＬ−６のレベルのこの増加は、共培養で見られる細胞の増殖およびチューモロイドの増殖の増加に重要であり得ることを示唆するものであり、したがって、これらの２つのタンパク質は臨床的有効性のマーカーとして機能する可能性がある。
【００８１】
さらに、ＳＣＴおよびＭＣＴ培養において放出される因子および分子を特徴付けするために、マルチプレックスサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを利用し、複数のタンパク質／因子の検出を同時に可能にするヒトＱｕａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｒｒａｙ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）を使用した。図２０は、アレイ１および２、パネル１〜８のシグナル強度を示すスキャンデータを示している。図２１の表２にリストされた幾つかの因子を含有するヒト骨代謝アレイを選択した。このリストには、接着分子（Ｅ−セレクチン、ＩＣＡＭ−１、Ｐ−カドヘリン、ＶＥ−カドヘリン）、増殖因子（ａＦＧＦ、アクチビンＡ、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、ｂＦＧＦ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−９、ｄｉｃｋｋｏｐｆ−１（ＤＫＫ−１）、ＩＧＦ−１、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）、オステオポンチン（ＯＰＮ）、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３）、ケモカイン（単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１））、マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）−１α、ＶＣＡＭ−１）、サイトカイン（ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１１、ＩＬ−１７、Ｍ−ＣＳＦ）、ＮＦｋＢの受容体活性化因子（ＲＡＮＫ）、オステオアクチビン、ＳＤＦ−１α、ＴＮＦ関連活性化誘導サイトカイン（ＴＲＡＮＣＥ））、およびＭＭＰ−２、−３、−９、−１３などのマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）が含まれる。
【００８２】
これらの因子のいずれかがＳＣＴおよびＭＣＴで発現されるかどうかを決定するために、本発明者らは、ＱＡＨ−ＢＭＡ−１０００アレイをＢＴ４７４−ＳＣＴおよびＭＣＴの培養上清のプールと４通りインキュベートした。実験は製造者のプロトコルを用いて行った。適切な陽性対照を使用してシグナル強度を正規化した。生データの結果が図２０に示されている。このデータの分析は、ＳＣＴと比較してＭＣＴで４１因子のうち７つが有意に変化して見出されたことを示した。これらには、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＯＰＧおよびＤＫＫ−１などの増殖因子、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６およびＩＬ−８などのケモカイン、ならびにプロテアーゼＭＭＰ−３（例えば図２３Ａ〜２５参照）が含まれる。
【００８３】
実施例１１：ＥＬＩＳＡを用いたラパチニブ処理チューモロイドにおける増殖因子の決定
これらの結果をさらに確証するために、図２０〜２１に記載されたｑｕａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｒｒａｙを用いてＳＣＴおよびＭＣＴの培養上清を調べた。ラパチニブ処理培養物を、ＳＣＴと比較してＭＣＴで差次的に発現が見られる因子について調べた。図２２Ａ〜２４は、結果を示すグラフを示した図である。結果は、ＭＣＴの培養上清がＩＬ−６およびＩＬ−８における＞７倍の増加を示し、用量依存的にラパチニブ処理すると基礎レベルまで低減したことを示した（図２２Ａ〜２２Ｂ）。対照的に、単球走化性タンパク質（ＭＣＰ−１）発現は、ＭＣＴにおいて変わらないままであった。しかし、ラパチニブ処理は、ＭＣＰ−１発現をＳＣＴにおいて完全に消失させたが、ＭＣＴでは中程度（１２．５ｕＭラパチニブの存在下で高々５０％）に消失させた。これは、ＭＣＴにおけるラパチニブに対する耐性が、持続的ＭＣＰ−１に起因する可能性があることを示唆するものである（図２２Ｃ）。
【００８４】
増殖因子のうちＰＤＧＦ−ＢＢ（図２３Ａ）は、ＳＣＴおよびＭＣＴの両方で発現が見られたが、ラパチニブ処理はいずれのチューモロイドでもその発現を変えなかった。対照的に、Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤である発現ＤＫＫ−１（図２３Ｂ）および骨再形成の負の調節因子であるＯＰＧ（図２３Ｃ）が、ＭＣＴで唯一発現が見られたが、ＳＣＴでは見られなかった。ＤＫＫ−１の発現のみが、ラパチニブ処理により有意に低減した（図２３Ｂ）。他のＭＭＰではなくＭＭＰ−３の発現が、ＳＣＴと比較してＭＣＴで＞２０倍増加して見出され、ラパチニブ処理でごくわずかに低減することも見出された（図２４）。図２５は、乳癌患者におけるＭＣＴで見出されたこれらのマーカーの臨床的関連性を記載する表を示す。
【００８５】
実施例１２：薬物応答の予測に関する３Ｄ  ＦｉＳＳとマトリゲルとの比較
臨床的有効性の予測に関して、マトリゲルベースの３Ｄ培養と比較してＦｉＳＳチューモロイドを評価するために、３日齢ＢＴ−４７４  ＳＣＴ（マトリゲルまたはＦｉＳＳで培養）をラパチニブで処理し、チューモロイド形成（図２６Ａ〜２６Ｄ）および細胞生存率（図２７Ａ〜２７Ｂ）を調べた。マトリゲルは、ＦｉＳＳチューモロイドと比較して多数のより小さなサイズのチューモロイドを誘導したが、それらのラパチニブに対する応答は図２７Ａ〜２７Ｂに示されているように類似していた。
【００８６】
実施例１３：試料の高含量スクリーニングで使用するためのＦｉＳＳプラットフォームの実現可能性の決定
チューモロイド培養物の自動イメージングおよび定量
高含量分析（ＨＣＡ）は、蛍光顕微鏡法および定量的画像分析を行うための自動プラットフォームであり、マイクロタイタープレートに固定され染色された細胞を分析するのに使用されており、リン酸化、転移、細胞１個当たりベースのタンパク質の存在量、および細胞学的変化を含む多くの細胞変化を（ソフトウェアにより）定量化することができる。ＨＣＡ分析を行うためにＯｐｅｒｅｔｔａ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）におけるＦｉＳＳチューモロイドのデータ取得を開始した。
【００８７】
ＢＴ４７４に関する高含量イメージングの定量を最適化するために、チューモロイドを７２時間インキュベートし、次いで２０×対物レンズを備えるＯｐｅｒｅｔｔａ  ＨＣＩ  Ｓｙｓｔｅｍで撮像した。足場におけるＢＴ４７４チューモロイドの単一平面ｚスタック画像をＤＡＰＩで染色し、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ製のＯｐｅｒｅｔｔａ高含量イメージングシステムを用いて画像を取得した。代表的なフィールドを２０×倍率で選択し、各ｚ平面間、２ｕｍの間隔でこれらのフィールドのｚスタックを取得した。Ｚスタックを、画像処理ソフトウェアＩｍａｇｅ  Ｊ（ＮＩＨ）を用いて分析した。図２８Ａ〜２８Ｄに示される結果は、Ｉｍａｇｅ  Ｊ分析がＯｐｅｒｅｔｔａ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて取得したチューモロイドのｚスタック画像データを定量化するのに使用できることを示している。ＨＣＡを用いて本発明者らは、異なる濃度のラパチニブで処理したＢＴ４７４チューモロイドにおけるＫｉ−６７発現の変化を定量化した。結果は、ラパチニブ処理ＢＴ４７４チューモロイド培養物における用量依存的Ｋｉ−６７発現を示すものである（図２９）。
【００８８】
チューモロイドアッセイの最適化：（Ｚ因子分析）
３Ｄ細胞培養においては、ハイスループット系スクリーニング（ＨＴＳ）への該培養の組み込みに重要な再現性に主な障害があった。以前の試験において、レザズリン（青）からレゾルフィン（高蛍光性の赤）への変換により細胞代謝および生存率のリアルタイムモニタリングを可能にするＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅアッセイの実現可能性が実証されていた。変換は代謝的に活性な細胞の数に比例し、故に定量的に測定することができる。ＬＬＣ１チューモロイドに関するＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅアッセイ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＮＹ）の精度を実証するために、ＦｉＳＳを予め加えた９６ウェルプレートでＬＬＣ１細胞を培養した。バックグラウンド蛍光を考慮するために、一部のウェルは、ＬＬＣ１チューモロイドなしでＦｉＳＳおよび培地のみを含有した。７２時間後、ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅアッセイを行った。スクリーニングアプリケーションとしての該アッセイの適合性を評価するために、Ｚ’因子を計算した。Ｚ’因子は０．６３および０．７２で計算し、ＨＴＳ即応性に優れていると見なされた（図３０Ａ〜３０Ｂ）。結果は、９６ウェルプレートにおいてＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅアッセイは、チューモロイド培養の最小ウェル間変動を示し、反復実験における標準偏差（ＳＤ）は１２％および１０％以内であることが見出されたことを示している。
【００８９】
生存率アッセイには数時間のインキュベーションが必要であるため、ＨＴＳでは、アッセイ試薬の添加が細胞を直ちに破壊し、これにより試薬を生存細胞集団とインキュベーションするという要件を取り除くＡＴＰベースのアッセイ、例えばＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＭＤ）が好まれる。細胞増殖阻害が、添加した化合物の細胞毒性であるのか、それとも細胞静止作用によるものかであるのかを判別するために、死細胞の細胞死関連パラメーター、例えば、膜完全性（ＤＮＡへの色素の結合）、カスパーゼ３／７活性（後期アポトーシス）、プロテアーゼ活性の変化が測定される。３Ｄチューモロイド培養に関するＡＴＰベースのアッセイの実現可能性をテストするために、細胞代謝の包括的な指標であるＡＴＰを測定するためルシフェラーゼ反応を使用する発光生存率アッセイである、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  ２．０の潜在能力を調べた。Ｍｇ２＋およびＡＴＰの存在下、ルシフェラーゼはルシフェリンをオキシルシフェリンに変換し、発光の形態でエネルギーを同時に放出する。シグナル強度は、代謝活性と相関する存在するＡＴＰの量に正比例する。このアッセイは、早ければ試薬添加１０分後にデータを記録することができ、発光シグナルは極めて安定的である（半減期＞５時間）ため、ＨＴＳにとって理想的である可能性がある。パイロット試験において、本発明者らは、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬がチューモロイドに浸透できるかどうかを評価した。５日目のＢＴ４７４−ＳＣＴの培地へのＣｅｌｌＴｏｘ  Ｇｒｅｅｎ（２×）の添加と、それに続くルシフェリン試薬との１０分間および２０分間のインキュベーションは、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬がチューモロイド溶解の２０分以内にＳＣＴ（直径：１８０ｕＭ）に浸透したことを示した（図３１）。
【００９０】
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏアッセイを使用して、ＢＴ４７４乳癌細胞系に由来するチューモロイドの増殖を阻害する上で６つの化合物の潜在能力を評価した。このパイロット試験からの結果は、例えば、Ｄ４化合物はＢＴ４７４増殖を１：１０００用量で阻害する（＞７０％）が、１：１０，０００用量では阻害しないことを示した（図３２）。
【００９１】
ＦｉＳＳの大容量製造の自動化
足場の大規模製造の質を向上する試みにおいて、電界紡糸技術を可能にし、様々なポリマー、化学製品、および生物製剤に適合する世界初の統合機器である、適合Ｓｐｒａｙｂａｓｅシステムを使用した。Ｓｐｒａｙｂａｓｅは、ＦｉＳＳ技術に必要とされる使いやすさ、安全性、柔軟性、およびスケーラビリティ（ｓｃａｌａｂｉｌｉｔｙ）を提供する。Ｓｐｒａｙｂａｓｅは、我々のニーズに応じて様々なサイズの繊維を形成するのに使用することができる。ローラードラムと組み合わせたＳｐｒａｙｂａｓｅは、チューモロイド技術用の大容量のＦｉＳＳマットを製造するための最良のアプローチを提供する。抗癌剤のハイスループットスクリーニングおよび高含量イメージングのための９６および３８４マイクロウェルＦｉＳＳプレートの両方を製造可能なこのプロセスのさらなる自動化を発展させる努力も払われている。チューモロイド形成を調べるのに、製造した９６ウェルＦｉＳＳマイクロプレートの潜在能力を用いて、Ｚ’因子を計算した。Ｚ因子は、スクリーニングアプリケーションとしてのプレートの適合性を評価するのに使用した。結果は、製造した９６ウェルマイクロプレートで培養したＭＣＦ７およびＢＴ４７４細胞が、それぞれＺ’因子、０．８７および０．８４６、Ｚ因子、０．８１２および０．５０１でチューモロイドを形成することを示した。これらの結果は、ＦｉＳＳ−製造した製造９６ウェルマイクロプレートがチューモロイド培養のウェル間変動が最小限であり、故に抗癌剤のＨＴＳに優れていると見なされたことを示している（図３３Ａ〜３３Ｂ）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【国際調査報告】
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