(57)【要約】本発明は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の処置法に関する。具体的には、本発明は、ヒトＳＯＤ１プレｍＲＮＡ内で選択的スプライシングを起こして、その結果、細胞の機能によりスキッピングされたｍＲＮＡの破壊をもたらすように適合されたアンチセンス配列の使用を実現するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＳＯＤ１プレｍＲＮＡに標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは該プレｍＲＮＡ内でエキソンスキッピングを誘発するように適合されている、該アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記プレｍＲＮＡ内でエキソン２、３又は４のスキッピングを誘発するように適合されている、請求項１記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
エキソン２のスキッピングを誘発するように適合されている、請求項１又は２記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドがフレームシフト突然変異を誘発し、これにより得られたヒトＳＯＤ１ｍＲＮＡ内に中途終止コドンが出現する、請求項１〜３のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
中途終止コドンが、エキソンスキッピングの結果として生じたｍＲＮＡのエキソン４内に得られる、請求項１〜４のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
全身毒性のＳＯＤ１の低減を誘発するように適合されている、請求項１〜５のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、Ｕ７核内低分子ＲＮＡなどの核内低分子ＲＮＡにより改変されている、請求項１〜６のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを送達するためのベクター。
【請求項９】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドをコードしているウイルスベクターである、請求項８記載のベクター。
【請求項１０】
前記ウイルスベクターがＡＡＶベクター、特にＡＡＶ９又はＡＡＶ１０ベクターである、請求項９記載のベクター。
【請求項１１】
前記ベクターが、ヒトＳＯＤ１プレｍＲＮＡを標的とする、Ｕ７により改変されたアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードしているＡＡＶ９又はＡＡＶ１０ベクターであり、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、該プレｍＲＮＡ内でエキソンスキッピングを誘発するように、特に該プレｍＲＮＡ内でエキソン２のスキッピングを誘発するように適合されている、請求項８又は９記載のベクター。
【請求項１２】
前記ベクターはさらに、ヒトＳＯＤ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有している発現カセットを含み、該ヌクレオチド配列は、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが該ヌクレオチド配列によってコードされるプレｍＲＮＡ内でエキソンスキッピングを誘発することができないように設計されている、請求項８〜１１のいずれか一項記載のベクター。
【請求項１３】
筋萎縮性側索硬化症の処置法に使用するための、請求項１〜７のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は請求項８〜１２のいずれか一項記載のベクター。
【請求項１４】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチド又は前記ベクターが、静脈内及び／又は脳室内経路を介しての投与用である、請求項１３記載の使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド又はベクター。
【請求項１５】
配列番号１１又は１２に示されているような配列を含む核酸配列。
【請求項１６】
請求項１５の核酸配列を含む発現カセット。
【請求項１７】
請求項１５の核酸配列又は請求項１６の発現カセットを含むベクター。
【請求項１８】
前記ベクターがプラスミド又はウイルスベクターである、請求項１７記載のベクター。
【請求項１９】
請求項１８記載のベクターを用いて形質転換された宿主細胞。
【請求項２０】
前記細胞が真核細胞又は原核細胞である、請求項１９記載の宿主細胞。
【請求項２１】
哺乳動物細胞、ヒト細胞、又は非ヒト細胞である、請求項１９記載の宿主細胞。
【請求項２２】
前記細胞がヒト細胞である場合、該細胞はヒト胚性幹細胞ではない、請求項２１記載の宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の処置法に関する。具体的には、本発明は、ヒトＳＯＤ１プレｍＲＮＡ内で選択的スプライシングを起こして、その結果、細胞機構によりスキッピングされたｍＲＮＡの破壊をもたらすように適合されているアンチセンス配列の使用を実行する。
【０００２】
発明の背景
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は疫学上、孤発性病型（９０％〜９５％）と家族性病型（５％〜１０％）に分類される（Rosen et al., 1993）。家族性病型（ｆＡＬＳ）の２０％が、スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）遺伝子の突然変異によって引き起こされる。ＳＯＤ１金属酵素の機能は、ミトコンドリア酸化的リン酸化の毒性副産物であるスーパーオキシドを、分子状酸素又は過酸化水素へと変換することである。突然変異体ＳＯＤ１は、疾患の発症機構に関与している神経毒性特性を有する（毒性機能獲得）。実際に、突然変異型のヒトＳＯＤ１遺伝子を過剰発現しているトランスジェニックマウス（例えばＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウス）はＡＬＳの大半の病理学的特徴を再現し、これはＡＬＳ前臨床試験に広く使用されている（Gurney et al., 1994）。したがって、ＳＯＤ１蓄積の低減は、ＳＯＤ１に関連したｆＡＬＳの病型を処置する論理的な戦略として出現した。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）（Crooke, 2004）又はｓｉＲＮＡ（Dorn et al., 2004）若しくは合成マイクロＲＮＡ（Boudreau et al., 2011）のいずれかを用いてのＲＮＡ干渉の使用に主に基づいて、中枢神経系（ＣＮＳ）内のほぼ全ての遺伝子をダウンレギュレートする魅力的な分子アプローチが開発された。
【０００３】
ｓｉＲＮＡを使用した突然変異体ＳＯＤ１発現の抑制は初めて、ＳＯＤ１関連ＡＬＳマウスにおいて有意な治療効力を証明した。Raoul et al.は、ヒトＳＯＤ１に対する低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードしているレンチウイルスベクターの脊髄内注射が、ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスにおける疾患の発症及び進行を遅延させたことを示した（Raoul et al., 2005）。それとは独立して、Ralph et al.は、ヒトＳＯＤ１に対するＲＮＡｉの発現を媒介するレンチウイルスの筋肉内注射が、同じＡＬＳマウスモデルにおいて神経変性を予防しかつ生存期間を延長し、これにより、最大で７７％生存期間が延長されたことを実証した（Ralph et al., 2005）。
【０００４】
酵素により媒介される分解を誘発するＡＯＮの脳室内連続注入も、脳及び脊髄全体におけるＳＯＤ１のｍＲＮＡレベル及びタンパク質レベルの両方を効果的かつ幅広く低減させることを可能とし、ＳＯＤ１Ｇ９３Ａ突然変異によって引き起こされたＡＬＳラットモデルにおける疾患の進行を有意に緩徐化させることが報告された（Smith et al., 2006）。
【０００５】
しかしながら、この方法は、浸透圧ポンプに接続された、頭蓋骨を通しての、カテーテルの手術による埋め込みを必要とし、その治療効力は限られていた（６５歳で処置を開始して９．１％の生存期間の延長）（Smith et al., 2006）。この発見に基づいて、ＡＬＳの患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）へのＡＯＮの注入の多施設臨床試験がアイシス・ファーマシューティカルズ（Isis Pharmaceuticals）によって開始され、処置の実現可能性と有害作用がないことが示された（Miller et al., 2013）。より最近になって、野生型マウスのＣＮＳ内のマウスＳｏｄ１レベルを低減させる代替的な方法として、立体障害を起こすＡＯＮも使用することにより、異常なエキソンスキッピング（及び中途終止コドンを含有しているｍＲＮＡの生成）が促進された（Ward et al., 2014）。しかしながら、マウスＳｏｄ１プレｍＲＮＡに標的化する２’−ＭＯＥ ＡＯＮの脳室内（ＩＣＶ）注射は、脳及び脊髄内のＳｏｄ１エキソン２及びエキソン３の弱いスキッピングしか引き起こさず、これにより、Ｓｏｄ１レベルは２５〜５０％減少し、これはＳＯＤ１Ｇ９３Ａラットにおいて同じ用量の以前に使用されたＲＮａｓｅＨ依存性２’−ＭＯＥギャップマーＡＯＮを用いて達成されたレベルと似ていた（Smith et al., 2006）。これらの結果から、生存期間の改善は、ＲＮＡｉ又はギャップマー戦略などの酵素により媒介される戦略を用いて得られるものとせいぜい同等であると予想されただろう。
【０００６】
さらに、ＳＯＤ１抑制に基づいたｆＡＬＳ療法に直面している差し当たっての難問は、全ての罹患細胞へのサイレンシング指示の広範囲におよぶ送達である。２００７年には、本発明者らは、血液脳関門にも関わらず、血清型９の自己相補性アデノ随伴ウイルスベクター（ｓｃＡＡＶ９）の全身送達が、マウス及びネコのＣＮＳ及び末梢細胞の両方（ＡＬＳを発症していることが疑われる細胞型を含む）（神経、星状膠細胞、及び筋肉細胞）の形質導入を可能としたことを発見した（Duque et al., 2009）（欧州特許第２２１２４２４号）。より最近になって、ｒｈ１０血清型（ＡＡＶ１０）もまた、マウス及びマーモセットへの静脈内注射後のＣＮＳ及び末梢組織の全身性形質導入にとって効率的であることが判明した（Hu et al., 2010; Yang et al., 2014; Zhang et al., 2011）。
【０００７】
最近になって、ＡＬＳに対するＡＡＶに基づいた遺伝子療法戦略の効率が、ＳＯＤ１レベルを低減させるＲＮＡ干渉を使用する２つの試験において実証された。Foust et al.は初めて、ＳＯＤ１を標的化するＡＡＶ９−ｓｈＲＮＡを新生仔に静脈内（ＩＶ）注射した後に、ＡＬＳマウスにおいて３８％の生存期間の延長を得た（Foust et al., 2013）。さらに、症候発生後の５５日令のＳＯＤ１マウスへのＡＡＶ１０−ｓｈＲＮＡ−ＳＯＤ１のくも膜下腔内（ＩＴ）注射により、ＡＬＳマウスの生存期間は２２％延長された（Wang et al., 2013）。
【０００８】
これらの以前の研究で報告された僅かな治療成果を考慮すると、ＡＬＳ生物療法のための技術的改善が依然として必要とされる。
【０００９】
発明の要約
本発明は、ヒトＳＯＤ１プレｍＲＮＡ内でエキソンスキッピングを誘発するように適合されているアンチセンスオリゴヌクレオチドをマウスに投与した場合に、ＡＬＳマウスモデルの生存期間が、先行技術のＡＬＳ治療戦略と比較して、大きく改善され得るという予想外の発見から始まる。
【００１０】
Ward et al.（上記に引用）は、エキソンスキッピング戦略を使用したＳＯＤ１の発現の低減が、ギャップマー、すなわち、ナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解機構によってではなくＲＮａｓｅＨ機構を通してＳＯＤ１のレベルを低減させるアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて得られた低減とせいぜい同等であろうと報告した。Ward et al.に報告されたＳＯＤ１のｍＲＮＡ及びタンパク質のレベルの低減も、ＲＩＳＣ機構の関与する戦略（例えばＲＮＡｉ及びｓｈＲＮＡを使用する戦略）を用いて得られたものと同等であった。したがって、当業者は、ＳＯＤ１エキソンスキッピング戦略を使用して得られる生存期間の改善は、以前の研究で報告されたのと同等であろうと予想したであろう。本発明者らは予想外にも、最大１３４％及びさらにそれ以上の生存期間の延長が、ヒトＳＯＤ１プレｍＲＮＡ内でエキソンスキッピングを誘発するように適合されているアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与からもたらされ得ることを示した。この生存期間の延長は、ＳＯＤ１関連ＡＬＳマウスにおいて現在までに報告されているものの中で最高であり、以前のＳＯＤ１サイレンシング戦略（最大で３８％の生存期間の延長と報告されている）よりもはるかにより効率的であり、この分子アプローチの独創性及び卓越性を示し、これは以前に報告された研究からは予想されなかった。
【００１１】
したがって、本明細書に開示されるのは、ヒトＳＯＤ１プレｍＲＮＡ内でエキソンスキッピングを誘発するように適合されているアンチセンスオリゴヌクレオチドをそれを必要とする被験者に投与し、これにより生じたスキッピングされたヒトＳＯＤ１コーディングｍＲＮＡの分解が誘発される工程を含む、ＡＬＳの処置法である。
【００１２】
本明細書に開示された別の対象は、ヒトＳＯＤ１プレｍＲＮＡ配列に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、該プレｍＲＮＡ内でエキソンのスキッピングを誘発するように適合されている。
【００１３】
本明細書に開示された別の対象は、ＡＬＳの処置法に使用するためのヒトＳＯＤ１プレｍＲＮＡ配列に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、該プレｍＲＮＡ内でエキソンのスキッピングを誘発するように適合されている。
【００１４】
発明の詳細な説明
本発明は、ＡＬＳを患っているヒト被験者を処置するのに有用であるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）に関する。被験者は、ＳＯＤ１遺伝子又は他のＡＬＳ関連遺伝子、例えばＳＯＤ１ｍＲＮＡレベルの上昇をもたらすＡＬＳ関連遺伝子の突然変異によって引き起こされた孤発性又は家族性の病型のＡＬＳを患う（ＡＬＳオンラインデータベースＡＬＳｏＤ、http://alsod.iop.kcl.ac.uk, April 2014）。被験者は、疾患の症候発生前であっても、症候性段階であってもよい。
【００１５】
本出願における「アンチセンスオリゴヌクレオチド」すなわち「ＡＯＮ」は、ＳＯＤ１タンパク質をコードしているプレｍＲＮＡの一部に相補的である、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれかの一本鎖核酸配列を示す（Chan et al., 2006）。特に、本発明のＡＯＮは、スプライスアクセプター（ＳＡ）部位、及び／又はエキソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）、及び／又はＳＯＤ１プレｍＲＮＡ内の分岐点、及び／又はプレｍＲＮＡスプライシングを調節することのできる任意の配列を遮断するように設計され、すなわち、それはＳＡ、ＥＳＥ、分岐点配列、又はプレｍＲＮＡスプライシングを調節することのできる任意の配列を含むＳＯＤ１プレｍＲＮＡの一部に対して相補的であるように設計されている（Cartegni et al., 2002; Reed and Maniatis, 1988）。
【００１６】
ＡＯＮは、ＳＯＤ１プレｍＲＮＡ内でエキソンスキッピングを誘発するために使用され、これにより、フレームシフトが起こり、これにより生じたｍＲＮＡ内に中途終止コドンを含有している切断短縮されたｃＤＮＡが生成される。したがって、この戦略は、ＡＬＳの発症機構に関与するさもなくば神経毒性のあるタンパク質のレベルの低減を可能とする。
【００１７】
ヒトＳＯＤ１遺伝子（ｈＳＯＤ１）は十分に特徴付けられている。その配列は（遺伝子ＩＤ：６６４７；ＮＣＢＩ参照配列、アクセッション番号ＮＭ＿０００４５４．４；配列番号１０）に報告されている。
【００１８】
本発明に記載のＡＯＮは、ヒトＳＯＤ１プレｍＲＮＡ内でエキソンスキッピングを誘発する種類のものである。例えば、実行されたＡＯＮは、エキソン２、エキソン３、又はエキソン４のスキッピングを特異的に誘発するように設計され得る。特定の実施態様では、本発明のＡＯＮは、ヒトＳＯＤ１ｍＲＮＡ内への中途終止コドンの包含を誘発することができる。好ましくは、ＡＯＮは、エキソン２のスキッピングを誘発するように適合されている。実施例に提供されているように、エキソン２のスキッピングはフレームシフトを誘発し、これによりエキソン４内に中途終止コドンがもたらされる。
【００１９】
関心対象のプレｍＲＮＡ内のＳＡ、ＥＳＥ、及び分岐点の配列を同定するためのツールが利用可能である。当業者には周知であるように、ＳＡは保存配列であり、それらはイントロンの３’末端にあり、ほぼ不変なＡＧ配列でイントロンを終結させる。さらに、ＥＳＥｆｉｎｄｅｒソフトウェアツール（http://rulai.cshl.edu/cgi-bin/tools/ESE3/esefinder.cgi?process=home）を使用して、スキッピングしようとするエキソン配列上のＥＳＥモチーフを予測し得る。その後、ＡＯＮの設計は、Aartsma-Rus et al.（Aartsma-Rus et al., 2009）に公表されている原則に従って行なわれ得る。
【００２０】
本発明のＡＯＮは、標的化エキソンの正しいスプライシングに必要とされるヒトＳＯＤ１（ｈＳＯＤ１）プレｍＲＮＡ内の適切な配列に対して相補的となるように設計され、これにより、標的化エキソンを成熟ｍＲＮＡに組み込むであろうスプライシング反応は遮断される。
【００２１】
本発明のＡＯＮは、任意の適切な種類であってもよい。代表的なＡＯＮの種類としては、オリゴデオキシリボヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド、モルホリノ、トリシクロ−ＤＮＡ−アンチセンスオリゴヌクレオチド、トリシクロ−ホスホロチオエートＤＮＡオリゴヌクレオチド、ＬＮＡ、核内低分子ＲＮＡにより改変された、例えばＵ７、Ｕ１、若しくはＵ６を用いて改変されたＡＯＮ（又は他のＵｓｎＲＮＰ）、又はそのコンジュゲート産物、例えばペプチドにコンジュゲートしたＡＯＮ若しくはナノ粒子と複合体を形成したＡＯＮが挙げられる。
【００２２】
本発明の実施に使用されたＡＯＮは、一般的に、約１０〜約３０ヌクレオチド長であり、ヒトＳＯＤ１プレｍＲＮＡ内の標的化配列及びＡＯＮの化学に依存して、例えば、約１０、又は約１５、又は約２０、又は約３０、又は約４０若しくはそれ以上のヌクレオチド長であり得る。
【００２３】
本発明の実施のための代表的なＡＯＮを表１に列挙する：
【００２４】
【表１】
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【００２５】
特定の実施態様では、本発明の実施のためのＡＯＮは、配列番号１及び４から選択される。さらなる実施態様では、配列番号１及び４に示された両方の配列が、本発明のＡＯＮに含まれる。
【００２６】
インビボでの使用のために、ＡＯＮを、例えばリン酸骨格の改変を介して安定化させることができる。例えば、本発明の安定化したＡＯＮは、改変された骨格を有し得、例えばホスホロチオエート結合を有する。他の可能な安定化させる改変としては、ホスホジエステル改変、ホスホジエステル及びホスホロチオエートの改変の組合せ、メチルホスホネート、メチルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ｐ−エトキシ、及びその組合せが挙げられる。化学的に安定化した改変型のＡＯＮとしてはまた、「モルホリノ」（ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー、ＰＭＯ）、２’−Ｏ−メチルオリゴマー、トリシクロ−ＤＮＡ、トリシクロ−ＤＮＡ−ホスホロチオエートＡＯＮ分子（国際公開公報第２０１３／０５３９２８号）、又はＵ核内低分子（ｓｎ）ＲＮＡが挙げられる。この趣旨で使用され得る後者の型のＡＯＮを、特に、レンチウイルス、レトロウイルス、又はアデノ随伴ウイルスに基づくがこれらに限定されないウイルス導入法と組み合わせて、Ｕ１、Ｕ６、又はＵ７（又は他のＵｓｎＲＮＰ）などの核内低分子ＲＮＡに結合させることができる。特定の実施態様では、本発明に使用されるＡＯＮは、配列番号１及び配列番号４の両方の配列を含む。さらに、さらに特定の実施態様では、ＡＯＮは、核内低分子、例えばＵ１、Ｕ６、又はＵ７（又は他のＵｓｎＲＮＰ）、特にＵ７を含み、かつ配列番号１及び配列番号４に示された配列を含む。このようなＡＯＮは配列番号９に示されている。
【００２７】
特に血液脳関門を通した、安定かつ効率的なインビボでの送達のために、ＡＯＮはまた、任意の細胞透過性ペプチド及びタンパク質分泌を媒介するシグナルペプチドと融合させても、又はそれらと共投与してもよい。細胞透過性ペプチドは、ＲＶＧペプチド（Kumar et al., 2007）、ＰｉＰ（Betts et al., 2012）、Ｐ２８（Yamada et al., 2013）、又はＴＡＴのようなタンパク質形質導入ドメイン（Malhotra et al., 2013）、又はＶＰ２２（Lundberg et al., 2003）であり得る。
【００２８】
本発明のアンチセンス配列は、インビボで単独で又はベクターと会合させて送達され得る。その最も広義な意味において、「ベクター」は、細胞、好ましくはＳＯＤ１を発現している細胞への、アンチセンス配列の導入を促進することのできる任意のビヒクルである。好ましくは、該ベクターは、ベクターの非存在下で生じるであろう分解度と比較して低減した分解度で細胞にアンチセンス配列を輸送する。一般的に、本発明において有用なベクターとしては、ＡＯＮ配列の挿入若しくは組込みによって操作された、プラスミド、ファージミド、ウイルス、及びウイルス源若しくは細菌源に由来する他のビヒクルが挙げられるがこれらに限定されない。ウイルスベクターが好ましい種類のベクターであり、これは、以下のウイルスに由来する核酸配列を含むがこれらに限定されない：レンチウイルス、例えばＨＩＶ−１、レトロウイルス、例えばモロニーマウス白血病ウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）；ＳＶ４０型ウイルス；ヘルペスウイルス、例えばＨＳＶ−１及びワクシニアウイルス。命名されていないが当技術分野において公知である他のベクターも容易に使用することができる。臨床適用のために検証されかつアンチセンス配列を送達するのに使用することのできるベクターの中で、レンチウイルス、レトロウイルス、及びＡＡＶが、エキソンスキッピング戦略に対するより大きな可能性を示した。
【００２９】
複製欠損である（すなわち、所望のＡＯＮの合成を指令することはできるが、感染性粒子を生成することはできない）レトロウイルスに基づいた及びレンチウイルスに基づいたベクターが、ヒト遺伝子療法試験に承認された。それらは、標的細胞ゲノムに組み込む特性を有し、したがって、標的細胞及びその子孫における持続的な導入遺伝子の発現を可能とする。
【００３０】
好ましい実施態様では、ＡＯＮは、ＡＡＶベクターを使用して送達される。ヒトパルボウイルスアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、感染細胞のゲノムに組み込んで潜伏感染を確立することのできる天然的に複製欠損であるディペンドウイルスである。最後の特性は、哺乳動物ウイルスの中でも独特のようである。なぜなら、組込みが、第１９番染色体（１９ｑ１３．３−ｑｔｅｒ）に位置する、ＡＡＶＳ１と呼ばれるヒトゲノム内の特定の部位で起こるからである。ＡＡＶに基づいた組換えベクターはＲｅｐタンパク質を欠失し、低い効率で組込み、標的細胞内で数か月間及びおそらく数年間存続することのできる安定な環状エピソームとして主に存在する。それ故、ＡＡＶは、ヒト遺伝子療法のための有望なベクターとしてかなりの関心を集めた。ウイルスの好ましい特性の中には、あらゆるヒト疾患を併発しないこと、及び、様々な組織に由来する幅広い細胞株に感染することができることである。実際に１２個のＡＡＶ血清型（ＡＡＶ１〜１２）及び最大で１２０個の変異体が公知であり（Gao et al., 2004; Gao et al., 2002）、各々が異なる組織指向性を有する。したがって、本発明は、ヒトＳＯＤ１プレｍＲＮＡに標的化しかつ該ヒトＳＯＤ１プレｍＲＮＡ内でエキソンスキッピングを誘発するように適合されている、上記のＡＯＮを含むＡＡＶベクターに関する。特定の実施態様によると、ＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０（例えばカニクイザルＡＡＶ１０又はアカゲザルＡＡＶｒｈ１０）、１１、又は１２血清型に由来する。好ましい実施態様では、ＡＡＶキャプシドは、ＡＡＶ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０（例えばカニクイザルＡＡＶ１０又はＡＡＶｒｈ１０）、１１、１２血清型、又はＡＡＶ変異体に由来する。さらなる特定の実施態様では、ＡＡＶベクターはシュードタイプ化ベクターであり、すなわち、そのゲノム及びキャプシドは、血清型の異なるＡＡＶに由来する。例えば、シュードタイプ化ＡＡＶベクターは、そのゲノムがＡＡＶ２血清型に由来し、そのキャプシドがＡＡＶ１、３、４、５、６、７、８、９、１０（例えばカニクイザルＡＡＶ１０又はＡＡＶｒｈ１０）、１１、１２血清型又はＡＡＶ変異体に由来するベクターであり得る。さらに、ＡＡＶベクターのゲノムは、一本鎖又は自己相補的二本鎖ゲノムのいずれかであり得る（McCarty et al., 2001）。自己相補的二本鎖ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ末端反復配列の１つから末端分離部位（terminal resolution site）（ｔｒｓ）を欠失させることによって生成される。その複製ゲノムの長さが野生型ＡＡＶゲノムの半分である、これらの改変されたベクターは、ＤＮＡ二量体をパッケージングする傾向を有する。
【００３１】
好ましくは、本発明の実施に実行されるＡＡＶベクターは、ＣＮＳ神経（脳、脳幹、及び脊髄内の運動神経及びグリア細胞を含む）及び筋肉細胞を標的化するベクターである（Ilieva et al., 2009）。好ましい実施態様では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ３９、ＡＡＶｒｈ４３、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、又はＡＡＶ１０キャプシドを有し、このベクターは場合によりシュードタイプ化されている。特定の実施態様では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ９又はＡＡＶ１０（例えばカニクイザルＡＡＶ１０又はＡＡＶｒｈ１０）キャプシドを有し、これは場合によりシュードタイプ化されている。
【００３２】
特定の実施態様では、上記のようなＡＯＮは、核内低分子ＲＮＡ、例えばＵ１、Ｕ２、Ｕ６、Ｕ７若しくは任意の他の核内低分子ＲＮＡ、又はキメラ核内低分子ＲＮＡに連結される（Cazzella et al., 2012; De Angelis et al., 2002）。Ｕ７による改変に関する情報は特に、Goyenvalle, et al.（Goyenvalle et al., 2004）；国際公開公報第１１１１３８８９号；及び国際公開公報第０６０２１７２４号に見られ得る。特定の実施態様では、D. Schumperliによって記載されたＵ７カセットが使用される（Schumperli and Pillai, 2004）。それは天然のＵ７プロモーター（−２６７位から＋１位）、Ｕ７ｓｍＯｐｔ ｓｎＲＮＡ、及び１１６位に至るまでの下流配列を含む。Ｕ７ｓｍＯｐｔ内のヒストンプレｍＲＮＡに対して相補的な１８塩基の天然配列を、例えば、すでに記載（Goyenvalle et al., 2004）されているようなＰＣＲ媒介突然変異誘発を使用して、１つ若しくは２つ（同じ配列を２回使用するか、又は２つの異なる配列を使用するかのいずれか）又はそれ以上繰り返される選択されたＡＯＮ配列によって置き換える。
【００３３】
特定の実施態様では、核内低分子ＲＮＡにより改変されたＡＯＮ、特にＵ７により改変されたＡＯＮは、ウイルスベクター、より特定するとＡＡＶベクターにベクター化される。
【００３４】
典型的には、前記ベクターはまた、コードされたＡＯＮの発現を可能とする調節配列、例えばプロモーター、エンハンサー内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）をコードする配列などを含んでいてもよい。これに関して、該ベクターは最も好ましくは、ＡＯＮの発現を引き起こすか又は改善させる、コード配列に作動可能に連結された、プロモーター領域を含む。このようなプロモーターは、遍在性、組織特異性、強力、弱い、調節性、キメラなどであり得、これにより、ＡＯＮの効率的かつ適切な生成が可能となる。該プロモーターは、細胞性、ウイルス性、真菌性、植物性、又は合成プロモーターであり得る。本発明に使用するのに最も好ましいプロモーターは、神経細胞及び筋肉細胞において、より好ましくは運動神経及びグリア細胞において機能するものであろう。プロモーターは、核内低分子ＲＮＡプロモーター、例えばＵ１、Ｕ２、Ｕ６、Ｕ７、若しくは他の核内低分子ＲＮＡプロモーター、又はキメラ核内低分子ＲＮＡプロモーターから選択され得る。他の代表的なプロモーターとしては、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ依存性プロモーター、例えばＨ１プロモーター、又はＲＮＡポリメラーゼＩＩ依存性プロモーターが挙げられる。調節性プロモーターの例としては、Ｔｅｔオン／オフ配列含有プロモーター、ラパマイシン誘発性プロモーター、及びメタロチオネインプロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。運動神経に対して特異的なプロモーターの例としては、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）、又はホメオボックス９（ＨＢ９）のプロモーターが挙げられる。運動神経において機能的な他のプロモーターとしては、神経特異的プロモーター、例えば神経特異的エノラーゼプロモーター（ＮＳＥ）、シナプシンプロモーター、又は遍在性プロモーター、例えば神経特異的サイレンサー配列（ＮＲＳＥ）が挙げられる。グリア細胞に特異的なプロモーター、例えばグリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターも使用することができる。遍在性プロモーターの例としては、ウイルスプロモーター、特にＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ハイブリッドＣＢＡ（ニワトリβアクチン／ＣＭＶ）プロモーターなど、及び細胞性プロモーター、例えばＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）又はＥＦ１α（伸張因子１α）プロモーターが挙げられる。
【００３５】
特定の実施態様では、本発明に使用されるＡＯＮは、ウイルスベクター、特にＡＡＶベクター、より特定するとＡＡＶ９又はＡＡＶ１０（例えばカニクイザルＡＡＶ１０又はＡＡＶｒｈ１０）ベクターにベクター化され、そして配列番号１及び配列番号４の両方の配列を含む。さらに、さらなる特定の実施態様では、ベクター化ＡＯＮは、核内低分子、例えばＵ１、Ｕ６又はＵ７（又は他のＵｓｎＲＮＰ）、特にＵ７を含み、そして配列番号１及び配列番号４に示される配列を含む。このようなＡＯＮは配列番号９に示される。
【００３６】
以下の実験章で「消去−置換」と称される、本発明の特定の実施態様では、上記のＡＯＮは、野生型ＳＯＤ１タンパク質、特にヒトＳＯＤ１タンパク質をコードしている遺伝子を含有している発現カセットと会合させて投与するためのものである。ＳＯＤ１タンパク質の外因性発現を与えることにより、突然変異型のヒトＳＯＤ１ｍＲＮＡを特異的に標的としないで野生型タンパク質のサイレンシングを誘発する可能性があるＡＯＮの送達から生じる、内因性野生型ＳＯＤ１ｍＲＮＡの欠失を場合により補うことができる。この実施態様では、野生型ＳＯＤ１タンパク質（優先的には野生型ヒトタンパク質）をコードしている遺伝子は、対応するｍＲＮＡへの該ＡＯＮのハイブリダイゼーションを損ない、これにより、該外因性ＳＯＤ１ｍＲＮＡ内でのエキソンスキッピングを回避するであろうサイレント突然変異（すなわち、ＳＯＤ１タンパク質のアミノ酸一次配列に影響を及ぼさない突然変異）を含むように設計されている。それ故、その態様の１つにおいて、本発明は、この遺伝子によってコードされるｍＲＮＡに対する本発明のＡＯＮのハイブリダイゼーションを損なうサイレント突然変異を含むように設計された、野生型ＳＯＤ１タンパク質、例えばヒト野生型ＳＯＤ１タンパク質をコードしている遺伝子に関する。特定の実施態様では、野生型ＳＯＤ１タンパク質をコードしている遺伝子は、上記に提供されているようなサイレント突然変異を用いて改変されているヒトＳＯＤ１配列である配列番号１１に示される配列を含む（特に、この配列は開始コドン及び終止コドンを含まない）。配列番号１１の配列はさらに、配列番号１２に示される配列におけるような開始コドン及び終止コドンを含んでいてもよい。さらに、該遺伝子は、タグ化野生型ＳＯＤ１タンパク質、例えばＦｌａｇでタグ化されたＳＯＤ１タンパク質をコードしていてもよく、該タグは、ＳＯＤ１タンパク質のＮ末端又はＣ末端のいずれかに与えられる。Ｆｌａｇ−ｈＳＯＤ１又はｈＳＯＤ１−Ｆｌａｇをコードしているこのような遺伝子を配列番号１３及び１４に示す。発現カセットは、コードされた外因性ＳＯＤ１タンパク質の発現を可能とする調節配列、例えばプロモーター、エンハンサー内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）をコードしている配列などを含んでいてもよい。これに関して、該ベクターは最も好ましくは、タンパク質の発現を引き起こすか又は改善させる、コード配列に作動可能に連結された、プロモーター領域を含む。このようなプロモーターは、遍在性、組織特異性、強力、弱い、調節性、キメラなどであり得、これにより、タンパク質の効率的かつ適切な生成が可能となる。該プロモーターは、細胞性、ウイルス性、真菌性、植物性、又は合成プロモーターであり得る。本発明に使用するのに最も好ましいプロモーターは、神経細胞及び筋肉細胞において、より好ましくは運動神経及びグリア細胞において機能するものであろう。調節性プロモーターの例としては、Ｔｅｔオン／オフ配列含有プロモーター、ラパマイシン誘発性プロモーター、及びメタロチオネインプロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。運動神経に対して特異的なプロモーターの例としては、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）、又はホメオボックス９（ＨＢ９）のプロモーターが挙げられる。運動神経において機能的な他のプロモーターとしては、神経特異的プロモーター、例えば神経特異的エノラーゼプロモーター（ＮＳＥ）、シナプシンプロモーター、又は遍在性プロモーター、例えば神経特異的サイレンサー配列（ＮＲＳＥ）が挙げられる。グリア細胞に特異的なプロモーター、例えばグリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターも使用することができる。遍在性プロモーターの例としては、ウイルスプロモーター、特にＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ハイブリッドＣＢＡ（ニワトリβアクチン／ＣＭＶ）プロモーターなど、及び細胞性プロモーター、例えばＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）又はＥＦ１α（伸張因子１α）プロモーターが挙げられる。発現カセットは、上記のベクターなどの適切なベクターに含められ得る。特定の実施態様では、発現カセットを含有しているベクターは、ウイルスベクター、特に、上記のような運動神経及び筋肉細胞を形質導入することのできるウイルスベクター、特に例えばＡＡＶベクター、特にＡＡＶ９又はＡＡＶ１０（例えばカニクイザルＡＡＶ１０又はＡＡＶｒｈ１０）キャプシドを含むＡＡＶベクターである。この実施態様の変化形において、ＡＯＮ及び外因性ＳＯＤ１遺伝子、特にヒトＳＯＤ１をコードしているカセットは、両方共、同じベクターに、特にウイルスベクターに、特に上記のような運動神経及び筋肉細胞を形質導入することができるウイルスベクターに、特に例えばＡＡＶベクターに、特にＡＡＶ９又はＡＡＶ１０（例えばカニクイザルＡＡＶ１０又はＡＡＶｒｈ１０）キャプシドを含むＡＡＶベクターに含有される。
【００３７】
本発明はまた、ＡＯＮ若しくはそれを含むベクター、及び／又は外因性ＳＯＤ１ｃＤＮＡ若しくは上記のような外因性ＳＯＤ１タンパク質をコードしている発現カセットを含むベクターを、薬学的に許容される担体に含む組成物に関する。ＡＯＮ又はベクターの他に、本発明の医薬組成物はまた、薬学的に又は生理学的に許容される担体、例えば食塩水、リン酸ナトリウムなどを含み得る。該組成物は一般的に液体の形状であるが、これは常にそうである必要はない。適切な担体、賦形剤、及び希釈剤としては、乳糖、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水性シロップ、メチルセルロース、メチル及びプロピルヒドロキシベンゾエート、鉱油などが挙げられる。製剤はまた、潤滑剤、湿潤剤、乳化剤、保存剤、緩衝化剤などを含み得る。特に、本発明はＡＯＮの投与を含み、したがって遺伝子療法に幾分似ている。当業者は、核酸がしばしば脂質（例えば陽イオン性脂質又は中性脂質、又はこれらの混合物）と併せて、頻繁にはリポソーム又は他の適切なマイクロ若しくはナノ構造の物質（例えばミセル、リポ複合体、デンドリマー、エマルション、立法相など）の形態で送達される。
【００３８】
本発明の組成物は一般的に、経腸又は非経口経路を介して、例えば静脈内（i.v.）、動脈内、皮下、筋肉内（i.m.）、脳内、脳室内（i.c.v.）、くも膜下腔内（i.t.）、腹腔内（i.p.）で投与されるが、他の種類の投与も除外されない（例えば吸入、鼻腔内、局所、経口、直腸、骨内、点眼薬、又は点耳薬の投与などを介して）。
【００３９】
特定の実施態様では、本発明のＡＡＶベクターは、国際公開公報第２０１３／１９００５９号に記載されているように、患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）内への投与と血中への投与を組み合わせることによって投与される。この実施態様の特定の変化形において、哺乳動物のＣＳＦ内へのウイルスベクターの投与は、脳室内（i.c.v.すなわちＩＣＶ）注射、くも膜下腔内（i.t.すなわちＩＴ）注射、又は大槽内注射によって行なわれ、血中への投与は好ましくは、非経口送達、例えば静脈内（すなわちＩＶ）注射、筋肉内注射、動脈内注射、腹腔内注射、皮下注射、皮内注射、鼻腔内送達、経皮送達（例えばパッチ）、又は腸への送達（経口又は経腸）によって行なわれる。特定の実施態様では、ＡＡＶベクターは、脳室内（又はくも膜下腔内）経路及び静脈内（又は筋肉内）経路の両方を介して投与される。
【００４０】
注射製剤、例えば無菌注射水性又は油性懸濁液は、適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁化剤を使用して公知の技術に従って製剤化され得る。無菌注射製剤はまた、無毒性の非経口的に許容される希釈剤又は溶媒中の、例えば１，３−ブタンジオール溶液としての、無菌注射溶液又は懸濁液であり得る。送達が局所的（すなわちインサイツ、筋肉組織などの組織に直接）又は全身性のいずれかであり得る場合、通常、送達は、罹患した筋肉組織、例えば骨格筋、平滑筋、心筋などに局所的であろう。投与されるＡＯＮの剤形及び標的化される組織又は細胞型に依存して、電気穿孔法、ソノポレーション、「遺伝子銃」（核酸でコーティングされた金粒子を送達）などの技術が使用され得る。
【００４１】
当業者は、投与しようとするＡＯＮ、又はＡＯＮ及び／若しくは外因性ＳＯＤ１タンパク質を含有若しくは発現しているベクターの量は、望ましくないＡＬＳの症状の寛解を誘発するのに十分な量であろうことを認識しているだろう。このような量は、とりわけ、患者の性別、年齢、体重、全般的な身体状態などの因子に依存して変更され得、個々の場合に応じて決定され得る。量はまた、処置プロトコールの他の要素（例えば他の薬物の投与など）に応じても変更され得る。一般的に、適切な用量は、約１mg/kgから約１００mg/kg、より通常では約２mg/kg/日から約１０mg/kgの範囲内である。ウイルスに基づいたＡＯＮの送達が選択される場合、適切な用量は、使用されるウイルス、送達経路（筋肉内、静脈内、動脈内、又はその他）などの様々な因子に依存するであろうが、典型的には１０９から１０１５個のウイルス粒子/kgの範囲であり得る。当業者は、このようなパラメーターが通常、臨床試験中にうまくいくことを認識しているだろう。さらに、当業者は、疾患の症状が、本明細書に記載の処置によって完全に軽減される可能性があるが、完全に軽減される必要はないことを認識しているだろう。症状の部分的又は断続的な緩和さえも、レシピエントにとって非常に有益であり得る。さらに、患者の処置は１回の事象（改変されたＡＯＮ又はＡＡＶベクターを用いての）であってもよいか、又は患者はＡＯＮを複数回投与され、それは得られる結果に応じて、数日間間隔を置いて、数週間間隔を置いて、又は数か月間間隔を置いて、又はさらには数年間間隔を置いてもよい。
【００４２】
本発明の方法は、いくつかの異なる方法のいずれかで実行され得る。例えば、本発明のＡＯＮは、他のエキソンを除去するように設計されたＡＯＮ、又はｓｉＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡと一緒に投与されてもよい（例えば、１つの混合物中で、又は別々の混合物であるが、時間間隔をあまりおかずに、例えば一方を他方の直後に任意の順番で、僅か数分間又は数時間の投与間隔で投与する）。それらはまた、上記のように、外因性ＳＯＤ１タンパク質、優先的にはヒトＳＯＤ１タンパク質をコードしているベクターと一緒に投与されてもよく、そのコード配列は、そのコードされるｍＲＮＡが、ＡＯＮにより誘発されるエキソンスキッピングに抵抗性となるように設計されている。
【００４３】
さらなる態様では、本発明は、細胞分裂阻害療法において同時に、別々に、又は順次使用するための、
−本発明のＡＯＮ、又は上記のような該ＡＯＮをコードしているベクター；及び
−野生型ＳＯＤ１タンパク質をコードしているベクター（例えば野生型ヒトＳＯＤ１タンパク質、そのコード配列は、そのコードされるｍＲＮＡが、ＡＯＮにより誘発されるエキソンスキッピングに抵抗性となるように設計されている）
を含む、部品キットに関する。
【００４４】
本発明のさらなる態様及び利点は以下の実験章に開示され、これは単なる説明と考えられ、本出願の範囲を制限するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】ＥＳＥｆｉｎｄｅｒによって予測されるエキソン２−ｈＳＯＤ１内の有望なＥＳＥモチーフのグラフ表示。閾値はソフトウェアによって規定されるデフォールトである。ＳＲＦ１（ＳＦ２／ＡＳＦ）：１．９５６；ＳＲＦ１（ＩｇＭ−ＢＲＣＡ１）：１．８６７；ＳＲＦ２（ＳＣ３５）：２．３８２；ＳＲＦ５（ＳＲｐ４０）：２．６７；ＳＲＦ６（ＳＲｐ５５）：２．６７６。
【図２】ＡＯＮでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞に関するＲＴ−ＰＣＲ。
【図３】スキッピング形のシークエンス。
【図４】トランスフェクトされた細胞における完全長ｈＳＯＤ１ｍＲＮＡの発現。未処置細胞と比較した、各々のＡＯＮのｈＳＯＤ１低減率：ＡＯＮ１：８５％；ＡＯＮ２：５５％；ＡＯＮ３：７５％；ＡＯＮ４：８１％。データは平均値＋／−標準偏差（ｎ＝３）である。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００５、未処置細胞と比較してスチューデントｔ検定によって決定。
【図５】脊髄（ＳＣ）に４．７×１０１２vg/kgのＡＡＶ１０−Ｕ７−ｈＳＯＤ１又はＡＡＶ１０−Ｕ７−ＣＴＲを直接注射されたＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスの脊髄（ＳＣ）抽出物に関するＲＴ−ＰＣＲ。
【図６】ＳＣに直接注射されたＳＯＤ１Ｇ９３ＡマウスのＳＣ抽出物中の完全長ｈＳＯＤ１ｍＲＮＡに関するＱ−ＲＴ−ＰＣＲ。２匹のマウスに４．７×１０１２vg/kgのＡＡＶ１０−Ｕ７−ＣＴＲを注射した：２番及び５番；３匹のマウスに同じ用量のＡＡＶ１０−Ｕ７−ｈＳＯＤ１を注射した：６番、８番、及び９番。
【図７】（ａ）ＳＣに４．７×１０１２vg/kgのＡＡＶ１０−Ｕ７−ｈＳＯＤ１（ｎ＝３）及び同じ用量のＡＡＶ１０−Ｕ７−ＣＴＲ（ｎ＝３）を注射されたＳＯＤ１Ｇ９３ＡマウスにおけるｈＳＯＤ１タンパク質発現のウェスタンブロット分析。αチューブリンをローディング対照として使用した。（ｂ）タンパク質レベルの濃度測定分析。データは平均値＋／−標準偏差（ｎ＝３）である。＊＊Ｐ＜０．０１、ＡＡＶ１０−Ｕ７−ＣＴＲに感染させた脊髄と比較してスチューデントｔ検定によって決定。
【図８】生誕時に側脳室（ＩＣＶ）及び側頭静脈（ＩＶ）に６×１０１４vg/kgのＡＡＶ１０−Ｕ７−ｈＳＯＤ１を注射されたＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスの代表的な写真。年齢相応の（１９１日令）野生型（ＷＴ）マウスが対照として示されている。
【図９】（ａ）Ｕ７−ｈＳＯＤ１アンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｕ７プロモーター制御下）と、Ｆｌａｇ−ｈＳＯＤ１ｏｐｔ又はｈＳＯＤ１ｏｐｔ−Ｆｌａｇ（ＰＧＫプロモーター制御下）とを同時に発現している「消去−置換」ＡＡＶベクターの図解：ＡＡＶ−Ｕ７−ｈＳＯＤ１−Ｆｌａｇ−ｈＳＯＤ１ｏｐｔ又はＡＡＶ−Ｕ７−ｈＳＯＤ１−ｈＳＯＤ１ｏｐｔ−Ｆｌａｇ。（ｂ）ＡＡＶ−Ｕ７−ｈＳＯＤ１−ＧＦＰ対照ベクターでトランスフェクトしてから４８時間後のＧＦＰ免疫蛍光による処置された代表的なＨＥＫ−２９３Ｔ培養細胞（右）。左パネルは、細胞の位相差画像を示す。（ｃ）ＡＡＶ−Ｕ７−ＣＴＲ−Ｆｌａｇ−ｈＳＯＤ１ｏｐｔ、ＡＡＶ−Ｕ７−ｈＳＯＤ１−Ｆｌａｇ−ｈＳＯＤ１ｏｐｔ、又は対照ＡＡＶ−Ｕ７−ｈＳＯＤ１−ＧＦＰ対照ベクターを用いてトランスフェクトしてから４８時間後のＨＥＫ−２９３細胞、及び非トランスフェクト細胞における、Ｆｌａｇタグのウェスタンブロット分析。アクチンをローディング対照として使用した。
【００４６】
実施例
実施例１：ＡＬＳマウスにおけるｈＳＯＤ１のサイレンシング及び生存期間の改善
材料及び方法
マウス株（動物）、インビボでの電気穿孔、及びアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）
動物の管理は、欧州の実験動物の管理と使用に関する指針に従った。高コピーＳＯＤ１Ｇ９３ＡマウスのＢ６ＳＪＬ−Ｔｇ（ＳＯＤ１＊Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ/Ｊ（ＪＡＣＫＳＯＮ番号ＳＮ２７２６）はJackson Laboratories（バーハーバー、メイン州）から購入した。
【００４７】
細胞
ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）と１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有しているダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、３７℃で、５％ＣＯ２中で培養した。２’−Ｏ−メチルホスホロチオエート（２’ＯＭｅＰＳ）ＡＯＮはEurogentecから購入し、最終濃度１μg/μlでＨ２ＯＲＮａｓｅフリー水に再懸濁した。各々のＡＯＮ ５μgを、製造業者の説明書に従ってオリゴフェクトアミン（Invitrogen）を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後、細胞をＲＮＡ抽出のために収集した。
【００４８】
ＲＮＡ抽出、逆転写、ＲＴ−ＰＣＲ、及びｑＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡを細胞から又は新しく凍結させた脊髄からＲＮＡ抽出キットNucleoSpin RNAII（Macherey-Nagel）を用いて製造業者のプロトコールにより抽出した。iScript cDNA合成キットプロトコール（Biorad）に従って、オリゴ（ｄＴ）プライマー及びランダムヘキサマープライマーを使用して、全ＲＮＡ １μgからｃＤＮＡを合成した。ヒトＳＯＤ１ｍＲＮＡ内のエキソン２の存在を調べるために、ＲＴ−ＰＣＲ分析を、以下のプライマーを使用して、ｃＤＮＡ ２００ngから行なった：
正方向プライマー１、ヒトＳＯＤ１エキソン１に一致：5’-CTAGCGAGTTATGGCGAC-3’（配列番号５）；逆方向プライマー４／５、ヒトＳＯＤ１（エキソン４とエキソン５の境界）に一致：5’-GCCAATGATGCAATGGTCTC-3’（配列番号６）。
【００４９】
TaqmanリアルタイムＰＣＲ（Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ）を、DNA Engine Opticon 2システム（Biorad）を使用して行なった。ｃＤＮＡ １００ngを、Taqman Universal PCR Master Mix 2X（Life technologies）１０μl中で、ヒトＳＯＤ１ FAM Taqman Gene expression assay（Hs00533490m1, Life technologies）１μl及びヒトＧＡＰＤＨ VIC Taqman Gene expression assay（Hs03929097_g1, Life technologies）１μl、又はインビボ分析では内因性対照としてのマウスＩｐｏ８（Mm01255158_m1, Life Technologies）を用いて増幅した。反応液を６０℃で１分間、９５℃で１０分間インキュベートし、その後、９５℃で１５分間と６０℃で１分間のサイクルを３９回行なった。ｈＳＯＤ１コピー数を、デルタＣｔ／デルタＣｔ法を使用して計算した。分析は、DNA Engine Opticon（登録商標）2 システム（Biorad）を用いて行なわれた。
【００５０】
ベクター
最も出来栄えの良い２つのＡＯＮに相当するＤＮＡ配列を、すでに記載されているように（Goyenvalle et al., 2004）、ＰＣＲ媒介突然変異誘発を使用して、pAAVsc_U7DTex23（親切にもGENETHON、イブリー、フランスによって提供された）にクローニングした。ウイルス粒子のｓｃＡＡＶ血清型１０を、Dominguez et al.（Dominguez et al., 2011）に以前に記載されているように、トリトランスフェクション法を使用して生成した。ベクター力価をＩＴＲのＱ−ＲＴ−ＰＣＲによって決定し；力価はウイルスゲノム（vg）/mlとして表現した。
【００５１】
注射
成体マウスの脊髄への注射のために、５０日令のマウスを使用した。マウスを、ケタミン／キシラジン混合物の腹腔内注射（１００mg/kgのケタミン、１６mg/kgのキシラジン；体重１０ｇあたり０．１ml）を用いて麻酔した。注射はRaoul et al. 2005（Raoul et al., 2005）に報告されているように行なわれた。各ベクターを９．５×１０１０vg（４．７×１０１２vg/Kg）含有している総容量１０μl（一部位あたり５μl）を各マウスに注射した。
【００５２】
新生仔マウスへの注射のために、生後１日目の仔を使用した。注射は、脳室内注射（ＩＣＶ）と静脈内注射（ＩＶ）を組み合わせることによって行なわれた（Barkats, Voit、国際公開公報第２０１３１９００５９（Ａ１）号−２０１３年１２月２７日の特許に記載の通り）。７．６×１０１１vg（６×１０１４vg/kg）を含有している総容量８０μlを各マウスに注射した。ウイルス溶液 １０μlを側脳室に直接注射し、７０μlを前頭側頭静脈に送達した。
【００５３】
ウェスタンブロット分析
新しく凍結させた脊髄をホモジナイズし、プロテアーゼ阻害剤混液（Complete Mini, Roche Diagnostics）を供給された溶解緩衝液（１５０mM ＮａＣｌ、５０mMトリス−ＨＣｌ、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、１％ＮＰ４０、１％ＳＤＳ）を使用して、タンパク質溶解液を調製した。タンパク質抽出物をＤＣタンパク質アッセイ（BioRad）によって定量した。３０μgを、１２％ポリアクリルアミドゲル（Criterion XT 10%ビス−トリス、Biorad）上で分離し、以下の抗体を用いてウェスタンブロットによって分析した：抗α−チューブリン抗体（Ｔ５１６８、Sigma Aldrich）；抗ヒトＳＯＤ１抗体（ｓｃ−８６３６、Santa Cruz Biotechnology）。マウス及びウサギＩｇに対するペルオキシダーゼにコンジュゲートさせた抗血清はAmersham Pharmacia Biotechから購入した。ウェスタンブロットを、SuperSignal West Duraキット（Thermoscientific）を使用して展開した。濃度測定分析を、ImageJソフトウェアを使用して行なった。
【００５４】
結果
１）ＡＯＮ設計
ヒトＳＯＤ１遺伝子内でのエキソンスキッピングを誘発するために、本発明者らは、ヒトＳＯＤ１プレｍＲＮＡのスプライスアクセプター部位（ＳＡ）と又はエキソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）配列とに干渉するＲＮＡ−ＡＯＮを設計した。ヒトＳＯＤ１遺伝子は５つのエキソンから構成され、本発明者らは、エキソン２のスキッピングの誘発を計画した。実際に、ＳＯＤ１プレｍＲＮＡからエキソン２をスキッピングすると、フレームシフトが誘発され、これにより切断短縮されたｃＤＮＡが生成され、これによりエキソン４内に中途終止コドン（ＴＧＡ）が生じる。エキソン２のスキッピングを最適化するために、本発明者らは、イントロン１内のＳＡ配列に標的化するＡＯＮ配列を設計し、そしてＥＳＥ配列の標的化は、ＳＡを上回る利点を示す可能性があることが報告されていたので（Goyenvalle et al., 2004）、本発明者らはまた、エキソン２のＥＳＥ配列を標的化するＡＯＮも設計した。ＥＳＥは、Ｓｅｒ−Ａｒｇ−リッチ（ＳＲ）タンパク質に結合することによってスプライシングを促進するエキソン内部配列である（Cartegni et al., 2002）。これらの配列を決定するために、本発明者らは、４つの最も豊富なＳＲタンパク質（ＳＦ２／ＡＳＦ、ＳＣ３５、ＳＲｐ４０、及びＳＲｐ５５）に対する結合部位を予測するＥＳＥｆｉｎｄｅｒソフトウェアを使用した。図１に、エキソン２内の有望なＥＳＥ配列が示されている。
【００５５】
推定標的配列が一旦同定されると、本発明者らは、Aartsma-Rus et al.（Aartsma-Rus et al., 2009）によって公表された特殊な原則に従って、ヒトＳＯＤ１エキソン２を特異的にスキップする４つのＡＯＮを設計した。したがって、各ＡＯＮ（表１）は２０ヌクレオチド長となるように設計され、本発明者らは、最も高いＴｍを有するＡＯＮを選択し、本発明者らは、ＲＮＡstructure 5.3ソフトウェアを使用して、ＡＯＮと標的化エキソンの両方の予測される二次構造の自由エネルギーを評価した。本発明者らはまた、陰性対照（ＡＯＮ−ＣＴＲ）としての混合ＡＯＮ配列も選択した。配列対照：5’ GCUCAUUCGCUUUCAUUCUU 3’（配列番号７）。
【００５６】
２）インビトロでのＡＯＮの選択
本発明者らは、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞へのトランスフェクション後、ｈＳＯＤ１ｍＲＮＡレベルを低減させるその効力に基づいて最適なＡＯＮを選択した。細胞トランスフェクションを最適化するために、本発明者らは、化学的に改変された２’−Ｏ−メチルホスホロチオエート（２’ＯＭｅＰＳ）ＡＯＮ（Eurogentec）を使用した。なぜなら、この改変は、ヌクレアーゼ及びＲＮａｓｅＨによる分解に対するかなりの抵抗性を付与するからである（Aartsma-Rus et al., 2009）。対照として本発明者らは、各実験でトランスフェクション効率の対照としても使用されていた、混合した蛍光（ＦＡＭ）標識されたＡＯＮを使用した。ＲＴ−ＰＣＲ分析後、本発明者らは、全試料においてヒトＳＯＤ１ｍＲＮＡ完全長（３５５ｂｐ）に相当する、ＰＣＲ産物を観察した。ＳＯＤ１−ＡＯＮでトランスフェクトされた細胞において、本発明者らは、スキッピングされたエキソン２の形態に相当する、追加の２５８ｂｐの産物を観察した（図２）。ＰＣＲ産物をシークエンスした後、本発明者らは、小さな２５８ｂｐのバンドに相当する、ヒトＳＯＤ１−ｍＲＮＡ内でのエキソン２のスキッピングと（図３）、エキソン４の中途終止コドンの発生を確認した。本発明者らは、選択されたＡＯＮが、ヒトＳＯＤ１エキソン２のスキッピングを誘発することができたと結論付けた。
【００５７】
ヒトＳＯＤ１ｍＲＮＡレベルの低減に関して最も効果的な配列を同定するために、完全長ＳＯＤ１ｍＲＮＡの発現を、Ｔａｑｍａｎ法を使用してリアルタイムＰＣＲによって定量した（図４）。
【００５８】
ＡＯＮ１及びＡＯＮ４は、ヒトＳＯＤ１ｍＲＮＡ低減に関して最も高い効率を示した（それぞれ８５％及び８１％）。したがって、本発明者らは、これらの２つのＡＯＮを選択して、Ｕ７ｓｎＲＮＡ配列と融合させて一緒にｓｃＡＡＶ骨格へとクローニングした。Ｕ７プロモーターに付加された配列は、CCCACACCTTCACTGGTCCACCATGCAGGCCTTCAGTCAG（配列番号８）である。
【００５９】
Ｕ７＋アンチセンスの完全配列は：
【表２】
2017527276.tif 000003
である。
【００６０】
３）ｓｃＡＡＶ１０−Ｕ７−ｈＳＯＤ１の生成
Ｕ７ｓｎＲＮＡは、通常、ヒストンプレｍＲＮＡ３’末端プロセシングに関与しているが、これをＳｍ／Ｌｓｍタンパク質の結合部位（Ｕ７ ｓｍＯｐｔ）における小さな変化によるスプラシング調節のための万能ツールへと変換することができる（Schumperli and Pillai, 2004）。それ故、ｓｎＲＮＰ粒子に包埋されたアンチセンス配列は分解から保護され、核内に蓄積し、そこでスプライシングが起こる。ＳＯＤ１Ｇ９３ＡマウスにＡＯＮを送達するために、本発明者らは、D.Schumperli（Schumperli and Pillai, 2004）によって記載されたＵ７カセットを使用した。それは、天然Ｕ７プロモーター（−２６７位から＋１位）、Ｕ７ ｓｍＯｐｔ ｓｎＲＮＡ、及び１１６位に至るまでの下流配列からなる。このカセットをｓｃＡＡＶ骨格の逆位末端配列（ＩＴＲ）間に配置し、Ｕ７ｓｍＯｐｔ内のヒストンプレｍＲＮＡに対して相補的な１８塩基の天然配列を、２つの選択された２０塩基のＡＯＮ配列（及び対照配列、ＣＴＲ；Pietri-Rouxel, 2009 et al.によって記載）によって置き換え、本発明者らは対応するウイルス粒子（すなわち、ＡＡＶ１０−Ｕ７−ＣＴＲ及びＡＡＶ１０−Ｕ７−ｈＳＯＤ１）を作製した。
【００６１】
４）インビボでのＳＯＤ１Ｇ９３ＡマウスにおけるｈＳＯＤ１エキソンのスキッピング
ｈＳＯＤ１ ＲＮＡレベルを低減させるその効力を分析するために、ＡＡＶ１０−Ｕ７−ＣＴＬ及びＡＡＶ１０−Ｕ７−ｈＳＯＤ１を、５０日令のＳＯＤＧ９３Ａマウスの脊髄に直接注射した（ＡＡＶ１０−Ｕ７−ｈＳＯＤ１ではｎ＝３、ＡＡＶ１０−Ｕ７−ＣＴＲではｎ＝２）。注射から４週間後、脊髄を取り出し、ＳＯＤｍＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲを使用してエキソン２のスキッピングについて分析した（図５）。ヒトＳＯＤ１発現もまた、以前のインビトロでの実験に記載されているようにリアルタイムＰＣＲ分析によって評価した（図６）。予想された通り、エキソン２のスキッピングされた形態が、ＡＡＶ１０−Ｕ７−ｈＳＯＤ１を注射された動物の脊髄においてのみ観察され（図５）、完全長のｈＳＯＤ１ｍＲＮＡは８０％超低減した（図６）。
【００６２】
ＲＮＡ分析と同様に、エキソン２のスキッピングの効果をさらに、ＳＯＤＧ９３Ａマウスの脊髄への対照及びＵ７−ｈＳＯＤ１ ＡＡＶベクターの注射から１か月後にタンパク質レベルで分析した（各群においてｎ＝３）。ウェスタンブロット分析は、３匹のＡＡＶ１０−Ｕ７−ｈＳＯＤ１の注射されたマウスの脊髄において、対照と比較して、ｈＳＯＤ１タンパク質の７０％の低減を示した（図７）。
【００６３】
その後、ＡＬＳマウスにおけるＡＡＶ１０−Ｕ７−ｈＳＯＤ１ベクターの有望な治療効果を、中枢性及び全身性のｈＳＯＤ１の低減の両方を達成するために、症候発生前のＳＯＤＧ９３Ａマウスへの静脈内注射（ＩＶ）と脳室内注射（ＩＣＶ）の併用によって調べた（Ｐ１での注射；ｎ＝４は６×１０１４vg/kgのＡＡＶ１０−Ｕ７−ｈＳＯＤ１を用いて、ｎ＝３は同じ用量のＡＡＶ１０−Ｕ７−ＣＴＲを用いる）。
【００６４】
４匹のＡＡＶ１０−Ｕ７−ｈＳＯＤ１を注射されたマウスの生存期間は、対照を注射されたマウスと比較して有意に延長され、平均生存期間は２６０日間であり、これに対して注射されていない対照では１２８日間であった（図７）。この生存期間の延長（最大１３４％）は、ＳＯＤ１関連ＡＬＳマウスにおいて現在までに報告されている中で最も高く、このことは本発明者らの分子アプローチの独創性及び卓越性を示唆する。
【００６５】
結論
本研究は、家族性筋萎縮性側索硬化症のための非常に効果的な遺伝子療法処置を同定することを目指した橋渡しプロジェクトである。血流及びＣＮＳへのｓｃＡＡＶ１０の共送達（Ｃｏ−ＩＶ／ＩＣＶ）は、広範な脊髄及び全身への遺伝子送達のための強力なアプローチである。Ｃｏ−ＩＶ／ＩＣＶ ＡＡＶ１０遺伝子導入と効果的なエキソンスキッピング戦略の組合せは、ｈＳＯＤ１の強力なサイレンシングを可能とし、そしてＡＬＳげっ歯類において現在までに報告されている中で最も高い生存期間の延長を媒介する。比較すると、ＡＳＯの脳灌流を使用したクリーブランド／アイシス臨床試験は、ラット生存期間の９．１％の延長に基づき（Smith et al., 2006）、３８％の生存期間の延長が近年、ＡＡＶ９−ｓｈＲＮＡを使用してKasparのチームによって公表された（Foust et al., 2013）。
【００６６】
これらの予備調査結果は、ＡＬＳマウス生存期間をさらにもっと延長させるための新たな現実的な場所を開拓し、次の将来における臨床開発へと直接橋渡しされ得る。
【００６７】
実施例１に提示された結果は、ＡＡＶ１０−Ｕ７−ｈＳＯＤ１の注射が、ｈＳＯＤ１をサイレンス状態とすることによってＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスにかなりの治療利点を提供することを示した。
【００６８】
実施例２：「消去−置換」戦略
ＡＡＶ１０−Ｕ７−ｈＳＯＤ１送達の治療利点を、野生型ｈＳＯＤ１タンパク質のさらなる発現によって改善することができる。実際に、突然変異型のヒトＳＯＤ１ｍＲＮＡに特異的に標的化しないＡＡＶ１０−Ｕ７−ｈＳＯＤ１の送達は、内因性野生型ＳＯＤ１タンパク質のサイレンシングも誘発する可能性があり、これにより、副作用がトリガーされる可能性がある。ＡＡＶ１０−Ｕ７−ｈＳＯＤ１による内因性野生型ＳＯＤ１のサイレンシングは、このベクターに、エキソンのスキッピングを回避するための「サイレント」突然変異を含む野生型ＳＯＤ１配列を導入することによって補うことができる。
【００６９】
以下の章は、これに関するデータを提示する。
【００７０】
材料及び方法
ベクター
Ｎ末端又はＣ末端にｆｌａｇタグを有するｈＳＯＤ１ｏｐｔをコードしているＤＮＡ配列をGene Art（Life technologies）によって合成し、そしてまず、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、キメラβグロビンイントロン、独特な制限酵素部位ＮｈｅＩ、及びサルウイルス４０（ＳＶ４０）転写終結シグナルを有する、本発明者らの研究室で入手できる、空のｐＡＡＶベクターに酵素的消化によってクローニングした。ＰＧＫプロモーター制御下にあるｈＳＯＤ１ｏｐｔを含有しているカセットを、ＰＣＲによって、ｐＡＡＶ−Ｕ７−ＳＯＤ１ベクター又はｐＡＡＶ−Ｕ７−ＣＴＲに、Ｕ７プロモーターの前にそして２つの方向でクローニングした。同じ方法を用いて、研究室で入手可能なプラスミドから増幅させたＰＧＫ−ＧＦＰを、対照として、各々のｐＡＡＶ−Ｕ７に挿入した。
【００７１】
ベクターの命名法は以下の表に提供されている：
【００７２】
【表３】
2017527276.tif 000004
【００７３】
細胞
各プラスミド ２μgを、ＦＢＳを含まないＯＰＴＩＭＥＭ（Life technologies）培地中でリポフェクトアミン及びPlus試薬（Life technologies）を用いてトランスフェクトした（製造業者の説明書に従って）。３７℃で５％ＣＯ２中で３時間後、トランスフェクションを、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭの添加により停止した。
【００７４】
ウェスタンブロット分析
細胞をトランスフェクションから４８時間後に収集した；タンパク質溶解液を実施例１に記載のように調製した。ウェスタンブロットを、以下の抗体を用いて行なった：抗Ｆｌａｇ Ｍ２抗体（Sigma）及び抗アクチン抗体（Sigma）。マウス及びウサギＩｇに対するペルオキシダーゼにコンジュゲートさせた抗血清はAmersham Pharmacia Biotechから購入した。ウェスタンブロットを、SuperSignal West Duraキット（Thermoscientific）を使用して展開した。
【００７５】
結果
毒性を有する突然変異型のｈＳＯＤ１の抑制及び機能的ｈＳＯＤ１タンパク質の発現の両方を得るために、本発明者らは、「消去−置換」戦略を考え、ここではサイレンシング用のｐＡＡＶ−Ｕ７−ｈＳＯＤ１ベクターを、野生型ＳＯＤ１発現のための外因性ｈＳＯＤ１ｃＤＮＡと共に提供した。野生型ｈＳＯＤ１コード配列（ｈＳＯＤ１ｏｐｔ）は、Ｕ７アンチセンス作用に対して不応性とするためにアンチセンス配列に対して最大数のミスマッチを有するように設計された（GeneArt, Life technologies）。外因性ｈＳＯＤ１タンパク質の同定を可能とするために、Ｆｌａｇ−タグペプチドをｃＤＮＡに融合させた。ＦｌａｇのＣ末端又はＮ末端の位置は、ｈＳＯＤ１ｏｐｔ発現及び／又は機能に対して影響を及ぼす可能性があるので、これをタンパク質のＮ末端（Ｆｌａｇ−ｈＳＯＤ１ｏｐｔ）又はＣ末端（ｈＳＯＤ１ｏｐｔ−Ｆｌａｇ）のいずれかに付加した。配列をホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターの制御下に、Ｕ７プロモーターと同じ方向に又は逆の方向に配置した。最後の治療用ＡＡＶベクターのＡＡＶ−Ｕ７−ｈＳＯＤ１−Ｆｌａｇ−ｈＳＯＤ１ｏｐｔ及びＡＡＶ−Ｕ７−ｈＳＯＤ１−Ｆｌａｇを図９に示す。ＰＧＫプロモーターの制御下に置かれた緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードしている配列も、対照としてのｐＡＡＶ−Ｕ７ベクターに挿入した（ｐＡＡＶ−Ｕ７−ｈＳＯＤ１−ＧＦＰ）。
【００７６】
これらの新規なＡＡＶ−Ｕ７サイレンシングベクターがｈＳＯＤ１の発現を同時に誘発することができるかどうかを調べるために、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ−２９３Ｔ）細胞をまず、ｐＡＡＶ−Ｕ７−ｈＳＯＤ１−ＧＦＰを用いてトランスフェクトし、ＧＦＰの発現を４８時間後に落射蛍光顕微鏡を用いてのライブイメージングによって調べた（図９ｂ）。ＧＦＰ蛍光の結果は、Ｕ７分子（Ｕ７−ＳＯＤ１又はＵ７−ＣＴＲ）とＧＦＰ発現カセットの両方を有する２つのベクターが、タンパク質の生成にとって効率的であることを示した。さらに、ｈＳＯＤ１ｏｐｔの発現を、トランスフェクションから４８時間後に細胞溶解液中でｆｌａｇタグについてウェスタンブロット分析によって評価し（図９ｃ）、これによりタグ化されたｈＳＯＤ１ｏｐｔタンパク質の効率的な合成が判明した。
【００７７】
要するに、これらのデータは、突然変異型のｈＳＯＤ１ｍＲＮＡ内でのエキソンスキッピングを誘発するＡＯＮは、ｈＳＯＤ１タンパク質レベルを強く低減させるように設計され得、外因性ｈＳＯＤ１タンパク質の同時発現は、最適化コード配列を使用して行なうことができることを示した。
【００７８】
参考文献
【表４】
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2017527276.tif 000008
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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