(57)【要約】  本発明は、疼痛の治療のために有用な新規の鎮痛薬に関する。BLT2アゴニストは、感覚ニューロンにおけるTRPV1媒介性シグナル伝達を減感することが判明した。したがって本発明は、新規の疼痛治療薬としてのBLT2アゴニストを提供する。本発明の更なる態様は、対象における疼痛の治療のための、BLT2アゴニストとBLT1アンタゴニストとの組合せ物に関する。本発明の新規の鎮痛薬を含む医薬組成物及びキットが更に提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において、一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーVメンバー1（TRPV1）の活性化によって媒介される神経学的感覚の抑制、疼痛の予防又は治療における使用のためのロイコトリエンB4受容体2（BLT2）アゴニスト。
【請求項２】
CAY10583である、請求項1に記載の使用のためのBLT2アゴニスト。
【請求項３】
TRPV1感作を抑制する少なくとも1種の付加的な化合物と組み合わせて使用される、請求項1又は2に記載の、使用のためのBLT2アゴニスト。
【請求項４】
前記の対象における神経学的感覚の抑制は、BLT2アゴニストを、神経学的感覚が疑われる対象又は該神経学的感覚を経験している対象に投与することを含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載のBLT2アゴニスト。
【請求項５】
前記疼痛の予防又は治療は、疼痛を患うと疑われる対象又は疼痛を患う対象に、TRPV1感作を抑制する少なくとも1種の付加的な化合物を投与することを更に含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載のBLT2アゴニスト。
【請求項６】
TRPV1感作を抑制する前記少なくとも1種の付加的な化合物は、ロイコトリエンB4受容体1（BLT1）アンタゴニスト又はインヒビターである、請求項3又は5に記載の、使用のためのBLT2アゴニスト。
【請求項７】
BLT2アゴニスト及びBLT1アンタゴニスト又はインヒビターを含む、疼痛の予防又は治療における使用のための組合せ物。
【請求項８】
前記TRPV1に媒介される感覚は、味覚、皮膚の痒み、灼熱感又は痛覚である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の、使用のためのBLT2アゴニスト又は請求項7に記載の使用のための組合せ物。
【請求項９】
前記疼痛が炎症性疼痛、炎症性痛覚過敏、痛覚過敏、神経障害性疼痛、偏頭痛、癌性疼痛、内臓痛、骨関節炎による疼痛、慢性疼痛又は術後疼痛である、請求項8に記載の、使用のためのBLT2アゴニスト、又は使用のための組合せ物。
【請求項１０】
請求項1〜6のいずれか一項に記載のBLT2アゴニスト又は請求項8に記載の組合せ物を含む、疼痛の予防又は治療における使用のための医薬組成物。
【請求項１１】
医薬品に許容可能な担体及び／又は賦形剤を更に含む、請求項10に記載の、使用のための医薬組成物。
【請求項１２】
BLT2を活性化する工程を含む、細胞におけるTRPV1の脱感作のためのin-vitro方法。
【請求項１３】
前記細胞におけるBLT2の活性化は、該細胞を有効量のBLT2アゴニストと接触させることによって作用される、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞は、ニューロン細胞若しくは末梢ニューロン細胞である、請求項12又は13に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疼痛の治療に有用な新規の鎮痛薬に関する。BLT2アゴニストは、感覚ニューロンにおけるTRPV1媒介性シグナル伝達を減感することが判明した。したがって本発明は、新規の疼痛治療薬としてのBLT2アゴニストを提供する。本発明の更なる態様は、対象における疼痛の治療のための、BLT2アゴニストとBLT1アンタゴニストとの組合せ物に関する。本発明の新規の鎮痛薬を含む医薬組成物及びキットが更に提供される。
【背景技術】
【０００２】
疼痛は、実質的又は潜在的な組織損傷を反映する複雑な主観的感覚であり、該組織損傷に対する情動的応答である。急性疼痛は、潜在的又は実際の損傷を知らせる生理学的シグナルである。慢性疼痛は、身体因性（somatogenetic）（器質性）又は心因性のいずれかであり得る。慢性疼痛は、しばしば、自立神経徴候を伴うか、又は慢性疼痛に続いて自律神経徴候が起こり、その自律神経徴候は、たびたび鬱病を引き起こす。慢性疼痛は、個人の苦しみを引き起こすとともに、ものすごい規模の社会経済的費用をもたらす。現存する薬理学的な疼痛治療薬は、効力と安全性との両方の点でとても満足のいくものではない。身体因性疼痛は、侵害受容性起源であるか、炎症性であるか、又は神経障害性であることがある。侵害受容性疼痛は、体性痛覚又は内臓痛覚を司る神経線維の継続的な活性化に比例すると考えられている。神経障害性疼痛は、末梢神経系での異常な体性感覚的過程が及ぼす神経系の機能不全の結果として生ずる。
【０００３】
神経障害性疼痛は、神経系、末梢神経、後根神経節、後根、又は中枢神経系への損傷の結果として生じ得る持続性又は慢性疼痛症候群である。神経障害性疼痛症候群には、異痛症、様々な神経痛、例えばヘルペス後神経痛及び三叉神経痛、幻影痛並びに複合性局所疼痛症候群、例えば反射性交感神経性ジストロフィー及びカウザルギーが含まれる。カウザルギーは、しばしば、痛覚過敏症及び異痛症と組み合わされた自発性灼熱痛によって特徴付けられる。悲しいことに、現在の神経障害性疼痛の治療法は、経験する痛みを減らすか又は取り除くものではなく、心理療法又は作業療法を通じて患者が立ち向かうことの手助けをすることが単に試みられるだけであり、確立された神経障害性疼痛を、適切に、予想通りに、かつ特異的に治療する方法は存在しない。神経障害性疼痛又は慢性疼痛の治療は、医師及び患者にとっては一つの挑戦である。それというのも、その状態を特異的に標的とする薬物療法は存在せず、また現在用いられる薬物療法は、ほんの僅かな緩和をもたらすにすぎず、それらの急性疼痛状態での効力を基礎としているか、又は不安及び鬱病のような二次的影響の軽減に対するそれらの効力を基礎としているからである。慢性疼痛の発生率は、社会において増え続けており、その社会への負担は、健康管理及び生産性の損失の両者においてかなり大きい。現在でも、慢性疼痛を緩和するために科学的に検証された療法は存在しない。その結果、保健業界は、クオリティーオブライフの多少の改善をもたらすという希望をもって、多様な療法を併用する「疼痛マネジメント」に的を絞っている。このように、慢性疼痛を緩和し得る薬物が緊急に必要とされている。
【０００４】
最近の研究により、オキサリプラチン誘発神経障害及びパクリタキセル誘発神経障害の間の機械的異痛症及び冷感異痛症の両方の原因として、イオンチャネルの一過性受容体電位ファミリーのメンバー（TRPV1、TRPA1及びTRPV4）が特定された。TRPV1及びTRPA1の活性化又は感作は、両者とも神経原性炎症及びT細胞の動員を引き起こすことができるCGRP及びサブスタンスPの放出の増大に導くことができる。
【０００５】
カプサイシンは、一過性受容体電位バニロイド1受容体（TRPV1、かつてはバニロイド受容体1（VR1）として知られていた）、すなわち小径の感覚ニューロン、特に痛みの感覚又は不快な感覚を検知するのに特化したこれらのC線維で優先的に発現される、リガンド開口型の非選択的カチオンチャネルに対する高選択的アゴニストである。TRPV1は、カプサイシン、熱及び細胞外酸性化を含む侵害刺激に応答し、これらの刺激に対する同時の曝露を相和することになる。TRPV1発現型（カプサイシン感受性）侵害受容器の活性化の初期効果は、灼熱感、痛覚過敏、異痛症及び紅斑である。しかしながら、低濃度のカプサイシンへの長期曝露又は高濃度のカプサイシン若しくは他のTRPV1アゴニストへの単回曝露の後に、小径の感覚軸索は、カプサイシン又は熱刺激を含む様々な刺激に対して殆ど感受性が無くなる。この長期曝露は、疼痛応答を低下させるという特徴もある。これらのカプサイシンの後期効果は、しばしば「脱感作」と呼ばれ、様々な疼痛症候群及び他の状態の治療のための局所用カプサイシン製剤の開発のための基本原理である。
【０００６】
今まで、疼痛の治療のためには主に、2つのクラスの鎮痛薬、すなわち非オピオイド鎮痛薬、主としてアセトアミノフェン及びNSAID類（非ステロイド性抗炎症薬類）と、オピオイド（麻薬様）アゴニスト（ここで、「オピオイド」とは、CNS中の特異的オピオイド受容体に結合して、アゴニスト作用を生ずる天然物質又は合成物質の総称である）とが使用されている。あいにく、両方の鎮痛薬のクラス、すなわちオピオイド類も非オピオイド類も、幾つかの望ましくない副作用を有する。オピオイド類の最も深刻な副作用は、呼吸器系の抑制の可能性があることと、長期治療の後に依存症の可能性があることとである。非オピオイド類の主要なクラスであるNSAID類は、他方で、潰瘍及び出血のような様々な消化器系合併症を誘発し得るが、腎障害も誘発し得る（非特許文献1）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Scholich andGeisslinger, 2006
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、未だに神経障害性疼痛のための特異的な療法は得られていない。本発明は、オピオイド類及びNSAID類に付随する課題を克服する新規の鎮痛薬を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題は、第一の態様においては、対象において、一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーVメンバー1（TRPV1）の活性化によって媒介される神経学的感覚の抑制における使用のためのロイコトリエンB4受容体2（BLT2）アゴニストによって解決される。
【００１０】
ロイコトリエン（LT）B4は、疼痛を誘発することが知られており、好中性顆粒球のための強力な走化剤であって、それにより炎症を促進して疼痛を誘発することが知られている。2種のGタンパク質結合受容体BLT1及びBLT2は、LTB4によって活性化されることが分かっている。以前から、BLT1は、LTB4の走化性効果及び疼痛刺激効果を媒介することは分かっていた。
【００１１】
ここで、驚くべきことに、BLT2アゴニストの使用は、LTB4、PGE2受容体（EP4）リガンド及びブラジキニン誘発性のプロテインキナーゼA（PKA）活性化のような様々な刺激によって誘発されるTRPV1感作（侵害受容の主要な媒介要因）を減らすことが見出された。本発明者らは、感覚ニューロンのTRPV1媒介性活性化を減らす新規のツールを開発し、したがって鎮痛薬として有用である新規化合物を提供した。
【００１２】
本明細書で使用される場合に、用語「BLT2アゴニスト」は、BLT2発現又は活性の量又は速度の増大に影響を及ぼす物質を意味する。そのような物質は、例えばBLT2に結合して、BLT2発現又は活性の量又は速度を増大することによって、直接的に作用することができる。またBLT2アゴニストは、例えばBLT2に、BLT2とBLT2リガンドとの相互作用を増強又は促進するように結合することによってBLT2発現又は活性の量又は速度を増大することもでき、BLT2活性化は、BLT2へと結合してそれを改変することによって、例えば構造変化の誘導によって、又は或る部分の除去若しくは付加によって、かつBLT2へと結合してその安定性を高めることによって影響を及ぼすことができる。またBLT2アゴニストは、例えば調節分子又は遺伝子領域に結合することで、調節タンパク質又は遺伝子領域の機能を調節して、BLT2発現又は活性の量又は速度の増大に影響を及ぼすことによって、間接的に作用することもできる。このように、BLT2アゴニストは、BLT2発現又は活性の量又は速度に増大をもたらす何らかの機構によって作用することができる。
【００１３】
BLT2アゴニストは、例えば天然に存在する又は天然に存在しない巨大分子、例えばポリペプチド、ペプチド、ペプチドミメティック、核酸、炭水化物又は脂質であってよい。さらに、BLT2アゴニストは、抗体又はその抗原結合フラグメント、例えばモノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ミニボディ、二価抗体、単鎖抗体（scFv）、可変領域フラグメント（Fv又はFd）、Fab又はF(ab)2であってよい。BLT2アゴニストは、BLT2に特異的なポリクローナル抗体であってもよい。さらに、BLT2アゴニストは、天然に存在する巨大分子又は小さい有機分子若しくは無機分子の部分的に又は完全に合成の誘導体、類似体又はミメティックであってよい。
【００１４】
抗体であるBLT2アゴニストは、例えばBLT2に結合して、リガンド結合を模擬することによって受容体シグナル伝達を活性化する抗体、又はBLT2発現若しくは活性を、BLT2発現若しくは活性の量若しくは速度が高められるように調節する分子の活性を改変する抗体であってよい。本発明の方法において有用な抗体は、モノクローナル若しくはポリクローナル抗体又はそれらのフラグメントを含む天然に存在する抗体であってもよいし、限定されるものではないが、単鎖抗体、キメラ抗体、二価抗体、相補性決定領域移植（CDR移植）抗体及びヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントを含む天然に存在しない抗体であってもよい。
【００１５】
また本発明によるBLT2アゴニストは、BLT2タンパク質又はそれらの機能的フラグメントを発現する発現構築物である。用語「発現構築物」とは、RNAを転写するように設計された任意の二本鎖DNA又は二本鎖RNA、例えば下流遺伝子又は対象のコーディング領域（例えば、タンパク質又は対象の任意のRNAをコードするcDNA又はゲノムDNAフラグメント）、特にBLT2遺伝子又はそのフラグメントに作動的に結合された少なくとも1つのプロモーターを含む構築物を意味する。発現構築物の受容細胞へのトランスフェクション又は形質転換は、該細胞が該発現構築物によってコードされるRNA又はタンパク質を発現することを可能にする。発現構築物は、遺伝子操作されたプラスミド、ウイルス又は例えばバクテリオファージ、アデノウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス若しくはヘルペスウイルスから誘導された人工染色体、又は以下に「発現ベクター」として記載される更なる実施の形態であってよい。発現構築物は、生細胞中で複製され得るか、又は合成により製造することができる。本出願では、用語「発現構築物」、「発現ベクター」、「ベクター」及び「プラスミド」は、一般的な例証的な意味で本出願を説明するために互換的に使用され、本発明を特定の種類の発現構築物に限定することを意図するものではない。さらに、発現構築物又はベクターという用語は、アッセイのために利用される細胞が既に内生的にそのようなDNA配列を含む場合も包含することを意図している。特に好ましいのは、BLT2発現を感覚ニューロン中で特異的に可能にする発現構築物である。
【００１６】
本明細書で使用される場合に、「発現」には、ポリヌクレオチドがmRNAへと転写され、そしてペプチド、ポリペプチド又はタンパク質へと翻訳される過程が含まれる。ポリヌクレオチドがゲノムDNAから誘導されるのであれば、適切な真核性宿主が選択される場合に、発現には、mRNAのスプライシングが含まれ得る。発現に必要とされる調節エレメントは、RNAポリメラーゼを結合するプロモーター配列及びリボソーム結合のための転写開始配列を含む。例えば、細菌性発現ベクターは、プロモーター、例えばlacプロモーターと、転写開始のためにシャインダルガーノ配列と、開始コドンAUGとを含む（Sambrook, J.,Fritsh, E. F., and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd,ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, N.Y., 1989）。同様に、真核性発現ベクターは、RNAポリメラーゼIIのための異種又は同種のプロモーターと、下流のポリアデニル化シグナルと、開始コドンAUGと、リボソームの解離のための終止コドンとを含む。そのようなベクターは、商業的に入手することができるか、又は記載される配列によって、当該技術分野でよく知られる方法、例えば一般的にベクターを構築することについて以下に記載される方法において作製することができる。
【００１７】
幾つかの実施の形態においては、BLT2アゴニストは、末梢ニューロンと接触したときに、LTB4又はPKAを介してTRPV1感作を減らすことができる化合物である。例えば、この化合物は、本明細書で以下に記載される実施例3及び実施例4で提供される実験構成で試験することができる。簡単に言えば、DRGニューロンは、候補となるBLT2アゴニストと共にLTB4又はPKAのアクチベーター、例えばONOae329と一緒にインキュベートされる。カプサイシンで刺激すると、細胞内カルシウム増大が測定される。候補となるBLT2アゴニストと一緒にインキュベートすることで、対照化合物と比較して細胞内カルシウム増大が低下したら、その候補化合物は、本発明によるBLT2アゴニストである。
【００１８】
本発明の好ましい実施の形態においては、BLT2アゴニストは、BLT1アゴニストではなく、好ましくは、BLT2アゴニストは、選択的なBLT2アゴニストであるか、又は更により好ましくは、BLT1アンタゴニストでもあるBLT2アゴニストである。
【００１９】
本発明の好ましいBLT2アゴニストは、4'-[[(1-オキソペンチル)フェニルアミノ]メチル]-[1,1'-ビフェニル]-2-カルボン酸（CAY10583）、並びにこの化合物の誘導体、類似体及び塩である。
【００２０】
BLT2アゴニストは、国際公開第2005/102388号に開示されている任意のBLT2アゴニストから選択することができる。
【００２１】
本発明の好ましい実施の形態においては、TRPV1活性化によって媒介される神経学的感覚は、あらゆる種類の疼痛である。
【００２２】
本明細書で使用される用語「疼痛」は、不快な感覚を指す。例えば、対象は、不快、苦悩又は苦しみを経験する。当業者には、様々な疼痛状態を、大まかに相反するカテゴリーか、又はその他の有用なカテゴリーに従って分類することができることは知られている。相反するカテゴリーの例には、侵害受容性疼痛対非侵害受容性疼痛及び急性疼痛対慢性疼痛が含まれる。当業者によって使用される他の通常の疼痛のカテゴリーの例には、神経障害性疼痛及び幻影痛が含まれる。
【００２３】
本明細書で使用される用語「侵害受容」とは、有害な刺激又は害になる可能性のある刺激を感覚へと変換することを指す。
【００２４】
本明細書で使用される用語「侵害受容性疼痛」とは、末梢神経系における一次痛覚線維における活性によって引き起こされる疼痛を指す。有害な刺激又は痛みの刺激に典型的に応答する末梢神経系におけるニューロンは、侵害受容器又は侵害受容性ニューロンと一般的に呼ばれる。またさらに、侵害受容性経路は、体性感覚皮質にまで延びている。
【００２５】
本明細書で使用される用語「非侵害受容性疼痛」とは、中枢神経系におけるニューロンにおける活性によって引き起こされる疼痛を指す。非侵害受容性疼痛を引き起こし得る中枢神経系におけるニューロンの例には、脊髄の後角におけるニューロン、例えば介在ニューロン及び投射ニューロン、又は痛覚に関与することが知られる脳の部分、例えば吻側延髄腹内側部（RVM）及び中脳水道周囲灰白質（PAG）におけるニューロンが含まれる。
【００２６】
本明細書で使用される用語「急性疼痛」とは、一過性の性質の疼痛、又は1ヶ月未満継続する疼痛を指す。急性疼痛は通例、直接的な損傷過程、例えば軟部組織損傷、感染又は炎症と関連しており、動物に損傷状態を知らせ、こうして更なる損傷の治療及び予防を可能にする目的を果たす。
【００２７】
本明細書で使用される用語「慢性疼痛」とは、1ヶ月より長期に若しくは急性組織損傷の消退を越えて持続する疼痛、又は繰り返す疼痛、又は継続若しくは進行すると予測される組織損傷及び／又は慢性疾患と関連している疼痛を指す。継続又は進行が予測される慢性疾患の例として、癌、関節炎、炎症性疾患、慢性創傷、心血管発作、脊髄障害、中枢神経系障害又は手術からの回復を挙げることができる。
【００２８】
本明細書で使用される用語「神経障害」とは、神経系の正常機能に悪影響を及ぼすあらゆる状態を指す。神経障害は、中枢神経系又は末梢神経系のどこでも発生し得るが、一部の場合にのみ、これが神経障害性疼痛を引き起こす。
【００２９】
本明細書で使用される用語「神経障害性疼痛」とは、神経系自体への損傷又は神経系自体の異常な機能に起因する疼痛を指す。その疼痛は、神経系の外側のあらゆる形の組織損傷とは無関係に現れ得る。神経障害性疼痛を引き起こし得る状態の例としては、疾患（例えばHIV、ヘルペス、糖尿病、癌、自己免疫障害）、急性外傷（手術、損傷、電気ショック）、及び慢性外傷（反復運動による障害、アルコール、化学療法又は重金属等の化学毒性）が挙げられる。
【００３０】
本明細書で使用される用語「幻影痛」とは、切断術によりもはや物理的に存在しないか、又は全末梢神経破壊により完全に無感覚であることが分かっている身体の一部に患者が痛みを感じる状態を指す。
【００３１】
本明細書で使用される用語「感覚過敏」とは、侵害受容性の刺激又は痛みの刺激への感受性の増加を指す。本明細書で使用される用語「異痛症」は、通常は有害でない刺激が痛みとして知覚される状態を言う。感覚過敏及び異痛症の両方とも、一次及び二次のカテゴリー又は状態に分けることができる。一次感覚過敏／異痛症は、組織損傷を受けた身体の領域における痛みの刺激及び今まで無痛であった刺激に対する感受性の増加である。二次感覚過敏／異痛症は、痛覚感受性の全体的な増加であり、脳内の様々な痛みを処理する中枢から末梢へと入力が減少していく必要がある。
【００３２】
さらに、本発明のもう一つの実施の形態は、TRPV1感作を抑制する少なくとも1種の付加的な化合物と組み合わせて使用される、上述のBLT2アゴニストの使用に関する。
【００３３】
本発明による疼痛の予防又は治療に関して、BLT2アゴニストは、疼痛を患うことが疑われる対象又は疼痛を患う対象に投与される。さらに、疼痛を患うことが疑われる対象又は疼痛を患う対象に、TRPV1感作を抑制する少なくとも1種の付加的な化合物を更に投与することが好ましい。
【００３４】
本明細書に開示される発明の文脈においては、TRPV1感作を抑制する少なくとも1種の付加的な化合物は、好ましくはロイコトリエンB4受容体1（BLT1）アンタゴニスト又はインヒビターである。
【００３５】
さらに、疼痛治療の先行技術の課題は、（i）本明細書で先に定義されたBLT2アゴニストと、（ii）TRPV1感作を抑制する少なくとも1種の付加的な化合物とを含む、疼痛の予防又は治療における使用のための組合せ物によって解決される。好ましくは、上記TRPV1感作を抑制する少なくとも1種の付加的な化合物は、BLT1アンタゴニスト又はインヒビター（上記参照）である。最も好ましくは、上記組合せ物は、BLT2アゴニストとBLT1アンタゴニストとを含む。
【００３６】
用語「組合せ物」は、この文脈においては、1つの製剤における2種以上の作用物質の作用物質組合せ物を意味するとともに、治療処置において互いに特定の間隔をあけて投与される作用物質の個別の製剤という意味での組合せ物としての意味も有する。このように、用語「組合せ物」は、本発明の文脈に記載される場合には、2種以上の治療的に有効な化合物を同時投与するという臨床的現実を含むものとする。
【００３７】
同時投与：本出願の文脈においては、2種以上の化合物の同時投与は、2種以上の化合物を患者へと1年以内に投与することとして定義され、その投与には、上記化合物の1つをそれぞれ含む2つ以上の医薬品を別々に投与することだけでなく、2種以上の化合物が1つの製剤中で組み合わされるか否か、又はそれらの化合物が2つ以上の別々の製剤中にあるか否かにかかわらず同時に投与することが含まれる。
【００３８】
本発明の組合せ物は、一実施の形態においては、（i）及び（ii）が、上記予防又は治療の間に対象に逐次に又は並行して投与することによって組み合わされ、好ましくは上記予防又は治療の間にアンタゴニスト及び化学療法薬が並行して投与されることを含む。
【００３９】
本明細書で使用される場合に、用語「BLT1アンタゴニスト」は、BLT1発現又は活性の量又は速度の減少に影響を及ぼす物質を意味する。そのような物質は、例えばBLT1に結合して、BLT1発現又は活性の量又は速度を減少することによって、直接的に作用することができる。またBLT1アンタゴニストは、例えばBLT1に、BLT1とBLT1リガンドとの相互作用を低減又は阻止するように結合することによって、BLT1へと結合してそれを改変することによって、例えば或る部分の除去若しくは付加によって、かつBLT1へと結合してその安定性を減じることによってBLT1発現又は活性の量又は速度を減少することもできる。またBLT1アンタゴニストは、例えば調節分子又は遺伝子領域に結合することで、調節タンパク質又は遺伝子領域の機能を調節して、BLT1発現又は活性の量又は速度の減少に影響を及ぼすことによって、間接的に作用することもできる。このように、BLT1アンタゴニストは、BLT1発現又は活性の量又は速度に減少をもたらす何らかの機構によって作用することができる。
【００４０】
BLT1アンタゴニストは、例えば天然に存在する又は天然に存在しない巨大分子、例えばポリペプチド、ペプチド、ペプチドミメティック、核酸、炭水化物又は脂質であってよい。さらに、BLT1アンタゴニストは、抗体又はその抗原結合フラグメント、例えばモノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ミニボディ、二価抗体、単鎖抗体（scFv）、可変領域フラグメント（Fv又はFd）、Fab又はF(ab)2であってよい。BLT1アンタゴニストは、BLT1に特異的なポリクローナル抗体であってもよい。さらに、BLT1アンタゴニストは、天然に存在する巨大分子又は小さい有機分子若しくは無機分子の部分的に又は完全に合成の誘導体、類似体又はミメティックであってよい。
【００４１】
抗体であるBLT1アンタゴニストは、例えばBLT1に結合して、BLT1リガンドへの結合を抑制する抗体、又はBLT1発現若しくは活性を、BLT1発現若しくは活性の量若しくは速度が減じられるように調節する分子の活性を改変する抗体であってよい。本発明の方法において有用な抗体は、モノクローナル若しくはポリクローナル抗体又はそれらのフラグメントを含む天然に存在する抗体であってもよいし、限定されるものではないが、単鎖抗体、キメラ抗体、二価抗体、相補性決定領域移植（CDR移植）抗体及びヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントを含む天然に存在しない抗体であってもよい。
【００４２】
核酸であるBLT1アンタゴニストは、例えばアンチセンスヌクレオチド配列、RNA分子又はアプタマー配列であってよい。アンチセンスヌクレオチド配列は、細胞内のヌクレオチド配列に結合することができ、かつBLT1、BLT1リガンドの発現のレベルを調節することができ、又はBLT1の発現若しくは活性を制御する別の遺伝子の発現を調節することができる。同様に、RNA分子、例えば触媒性リボザイムは、BLT1遺伝子又はBLT1の発現若しくは活性を制御する他の遺伝子に結合し、そして該遺伝子の発現を改変することができる。アプタマーは、分子ターゲットへと結合することができる三次元構造を有する核酸配列である。
【００４３】
核酸であるBLT1アンタゴニストは、RNA干渉法で使用するための二本鎖RNA分子であってもよい。RNA干渉（RNAi）は、転写後RNA分解による配列特異的な遺伝子サイレンシングの過程であって、サイレンシングされる遺伝子に対して配列的に相同である二本鎖RNA（dsRNA）によって開始される過程である。RNAiのために適した二本鎖RNA（dsRNA）は、ターゲティングされるべき遺伝子に相当する約21個の連続したヌクレオチドのセンス鎖及びアンチセンス鎖であって、それぞれの3'末端の2個のヌクレオチドのオーバーハングを差し引いて19個のRNA塩基対をなす鎖を含む（Elbashir et al., Nature 411:494-498 (2001)、Bass,Nature 411:428-429 (2001)、Zamore, Nat. Struct. Biol.8:746-750 (2001)）。約25個〜30個のヌクレオチドのdsRNAも、RNAiのために効果的に使用されている（Karabinos et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:7863-7868 (2001)）。dsRNAは、in vitroで合成することができ、かつ当該技術分野で知られている方法によって細胞中に導入することができる。
【００４４】
本発明による好ましいBLT1アンタゴニストは、6-(6-(3R-ヒドロキシ-1E,5Z-ウンデカジエン-1-イル)-2-ピリジニル)-1,5S-ヘキサンジオール（U75302）である。本発明の文脈において有用な他のBLT1及び／又はLTB4アンタゴニスト（又はインヒビター）は、化合物LY293111、ONO4057、CP195543、CGS25019C、Biomed 101、BIIL284BS、DW1350、LY255283及び上述のいずれかの類似体である。
【００４５】
本発明によれば、代替的な実施の形態は、味覚、皮膚の痒み、灼熱感、又は侵害受容性（疼痛）感覚であるTRPV1媒介性の感覚にも関係する。上記で既述のように、疼痛は炎症性疼痛、炎症性痛覚過敏、痛覚過敏、神経障害性疼痛、偏頭痛、癌性疼痛、内臓痛、骨関節炎による疼痛、慢性疼痛及び術後疼痛から選択することができる。しかしながら、神経障害性疼痛が最も好ましい。
【００４６】
神経障害性疼痛は末梢神経障害性疼痛症候群、化学療法誘発性神経障害、複合性局所疼痛症候群、HIV感覚性神経障害、腫瘍浸潤に続発する神経障害、有痛性糖尿病性神経障害、幻肢痛、帯状疱疹後神経痛、乳房切除後の疼痛、三叉神経痛、中枢神経障害性疼痛症候群、中枢性卒中後痛、多発性硬化症による疼痛、パーキンソン病による疼痛、又は脊髄損傷による疼痛から選択することができる。
【００４７】
本発明は、更なる一つの態様においては、疼痛の予防又は治療における使用のための医薬組成物であって、本明細書に定義されるBLT2アゴニスト又は本明細書で先に定義された化合物の組合せ物を含む、医薬組成物を提供する。該医薬組成物は、医薬品に許容可能な担体及び／又は賦形剤を更に含んでよい。
【００４８】
疼痛を治療又は予防するための医薬組成物及びキットは、本発明の一部をなす。一実施の形態においては、該組成物は、上記のBLT2アゴニストを含む。
【００４９】
本明細書において使用される場合、「医薬品に許容可能な担体」という語は、医薬投与に適合したあらゆる溶媒、可溶化剤、充填剤、安定化剤、結合剤、吸収剤、基剤、緩衝剤、滑沢剤、制御放出ビヒクル、希釈剤、乳化剤、保湿剤、滑沢剤、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤又は抗真菌剤、等張性吸収遅延剤等を含むことを意図する。医薬品作用物質用のそのような媒体及び作用剤の使用は、当該技術分野でよく知られている。何らかの慣例的な媒体又は作用剤が活性化合物と非相容性である場合を除き、組成物中ではその使用が検討される。補助剤を該組成物中に導入することもできる。或る特定の実施の形態においては、医薬品に許容可能な担体は、血清アルブミンを含む。
【００５０】
本発明の医薬組成物は、意図される投与経路と適合するように製剤化される。投与経路の例には、非経口投与、例えば髄腔内投与、動脈内投与、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、経口投与、経皮的（局所的）投与及び経粘膜的投与が含まれる。
【００５１】
非経口、皮内又は皮下適用のために使用される溶液又は懸濁液は、以下の成分：滅菌希釈液、例えば注射用水、生理食塩溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン；プロピレングリコール又は他の合成溶媒；抗菌剤、例えばベンジルアルコール又はメチルパラベン；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸又は硫酸水素ナトリウム；キレート化剤、例えばエチレンジアミン四酢酸；緩衝液、例えば酢酸、クエン酸又はリン酸、及び等張性を調整するための物質、例えば塩化ナトリウム又はデキストロースを含み得る。pHは、酸又は塩基、例えば塩酸又は水酸化ナトリウムで調整することができる。非経口用調剤は、ガラス又はプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器又は複数回投与用バイアル中に密封されていてよい。
【００５２】
注射用途のために適した医薬組成物には、滅菌水溶液（水溶性の場合）又は分散液及び滅菌注射用溶液又は分散液の即時調製物のための滅菌粉末が含まれる。静脈内投与のために、適切な担体には、生理食塩水、制菌水、Cremophor EL（商標）（BASF（ニュージャージー州パルシッパニー））又はリン酸緩衝生理食塩水（PBS）が含まれる。全ての場合において、注射用組成物は、滅菌されているべきであり、かつ簡単に注射可能である程度に流動性であるべきである。該組成物は、製造及び貯蔵の条件下で安定でなければならず、かつ細菌及び真菌類のような微生物の汚染作用に対して保護されねばならない。上記担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール等）及びそれらの適切な混合物を含有する溶剤又は分散媒であってよい。適切な流動性は、例えばレシチンのようなコーティングを使用することによって、分散液の場合に必要とされる（required）粒度を維持することによって、そして界面活性剤を使用することによって維持することができる。微生物の作用の抑制は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン類、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等によって達成することができる。多くの場合において、等張剤、例えば糖類、多価アルコール類、例えばマンニトール、ソルビトール及び塩化ナトリウムが上記組成物中に含まれることが好ましいであろう。注射用組成物の持続的吸収は、該組成物中に吸収を遅延させる作用剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含めることによって引き起こすことができる。
【００５３】
滅菌注射用溶液は、活性化合物（例えばニューレグリン）を必要とされる量で適切な溶剤中に先に列挙された成分の1つ又はその組合せと一緒に導入し、所望であれば引き続き濾過滅菌することによって製造することができる。一般的に、分散液は、活性化合物を、基礎分散媒及び先に列挙された成分からの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に導入することによって製造される。滅菌注射用溶液の製造のための滅菌粉末の場合に、好ましい製造方法は、真空乾燥及び凍結乾燥であり、該乾燥により、事前に滅菌濾過されたその溶液から、有効成分と任意の付加的な所望の成分との粉末が得られる。
【００５４】
経口用組成物は、一般的に不活性希釈剤又は可食性担体を含む。経口用組成物は、ゼラチンカプセル中に封入されてよく、又は錠剤へと圧縮されてよい。経口治療的投与のために、活性化合物は、賦形剤と一緒に導入することができ、かつ錠剤、トローチ又はカプセルの形で使用することができる。経口用組成物は、マウスウォッシュとして使用するための流動性担体を使用して製造することもでき、その際、流動性担体中の化合物は、経口で適用されて、濯いで吐き出されるか、又は飲み込まれる。医薬品に適合性の結合剤及び／又はアジュバント材料は、上記組成物の一部として含まれてよい。錠剤、丸薬、カプセル、トローチ等は、以下の成分のいずれか又は類似の性質の化合物を含有することができる：微晶質セルロース、トラガカントガム若しくはゼラチン等の結合剤；デンプン若しくはラクトース等の賦形剤、アルギン酸、プリモゲル（Primogel）若しくはコーンスターチ等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム若しくはステーテス（Stertes）等の滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素等の滑剤；スクロース若しくはサッカリン等の甘味剤；又はペパーミント、サリチル酸メチル、若しくはオレンジ風味剤等の着香剤。
【００５５】
吸入による投与のためには、上記化合物は、加圧容器又は適切な噴射剤、例えば二酸化炭素のようなガスを含むディスペンサー又はネブライザーからエアロゾルスプレーの形で送達される。
【００５６】
全身性投与は、経粘膜手段又は経皮手段によるものであってもよい。経粘膜投与又は経皮投与のために、浸透するべき障壁に適切な浸透剤が製剤中で使用される。そのような浸透剤は、当該技術分野において一般的に知られており、例えば経粘膜投与のためには、界面活性剤(detergent)、胆汁酸塩及びフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、鼻内スプレー又は坐剤を使用することによって実現することができる。経皮投与のためには、医薬組成物は、当該技術分野で一般的に知られる軟膏剤、膏薬、ゲル剤又はクリーム剤へと製剤化される。
【００５７】
或る特定の実施の形態においては、医薬組成物は、有効成分の持続放出又は制御放出のために製剤化される。生分解性の生体適合性のポリマー、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル類及びポリ乳酸を使用することができる。そのような製剤の製造方法は、当業者には明らかであろう。それらの材料は、例えばAlza Corporation及びNova Pharmaceuticals, Inc.から商業的に入手することもできる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を有する感染細胞を標的とするリポソームを含む）は、医薬品に許容可能な担体として使用することもできる。これらは、当業者に既知の方法に従って製造することができる。
【００５８】
経口用組成物又は非経口用組成物を、投与を容易にし、かつ投与量を均一にするための投与単位形で製剤化することが特に有利である。本明細書で使用される投与単位形は、治療される対象のための単位投与量として適した物理的に別々の単位を含み、それぞれの単位は、必要とされる医薬用担体と共同して所望の治療効果をもたらすように計算された活性化合物の予め決められた量を含む。本発明の投与単位形のための使用は、活性化合物の特有の特性及び達成されるべき具体的な治療効果並びにそのような活性化合物の個体の治療のための配合分野に固有な制約によって決まり、それらに直接的に依存している。
【００５９】
このような化合物の毒性及び治療効力は、細胞培養物又は実験動物における、例えばLD50（集団の50 %までの致死用量）及びED50（集団の50 %に治療的に有効な用量）の測定のための標準的な製剤的手法によって測定することができる。毒性と治療効果との間の用量比は、治療係数であり、LD50/ED50の比率として表現することができる。大きな治療係数を示す化合物が好ましい。毒性の副作用を示す化合物を使用し得る場合に、未感染細胞への損傷の可能性を最小限にすることで副作用を減らすように、そのような化合物を罹患組織の位置に向ける送達系を設計することに留意すべきである。
【００６０】
細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータは、ヒトにおいて使用するための投与量の範囲を考えるにあたり使用することができる。そのような化合物の投与量は、好ましくは、殆ど毒性が無いか又は全く毒性が無いED50を含む血中濃度の範囲内にある。投与量は、この範囲内で、使用される剤形及び利用される投与経路に応じて様々であってよい。本発明の方法で使用されるあらゆる化合物について、治療的に有効な用量は、まずは細胞培養アッセイから推定することができる。用量は、動物モデルにおいて、細胞培養で測定されたIC50（すなわち、症状の半最大抑制を達成する試験化合物の濃度）を含む血中血漿濃度範囲に達するように考えることができる。そのような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に測定するために使用することができる。上記医薬組成物は、投与のための使用説明書と一緒に容器、包装又はディスペンサー中に含まれていてよい。
【００６１】
さらに、本発明の上記課題は、BLT2の活性化の工程を含む、細胞におけるTRPV1の脱感作のための方法によって解決される。細胞におけるBLT2の活性化は、好ましくは、該細胞と有効量のBLT2アゴニストとの接触によって作用される。
【００６２】
この文脈において、「細胞」は、好ましくはBLT2発現細胞であり、好ましくは、該細胞は、ニューロン、好ましくは末梢ニューロン、より好ましくは後根神経節（DRG）のニューロンである。
【００６３】
幾つかの実施の形態は、ex vivo法又はin vitro法である上記方法に関する。
【００６４】
さらに、本明細書に記載される発明のもう一つの態様は、TRPV1の脱感作をそのような治療を必要とする対象において行うための方法であって、上記対象に有効量のBLT2アゴニストを投与する工程を含む、方法に関する。該脱感作は、TRPV1媒介性の感覚であって、好ましくは痒み、灼熱、味覚又は痛みから選択される感覚の脱感作である。
【００６５】
この態様の幾つかの実施の形態においては、上記方法は、対象における疼痛の治療又は予防における使用のための方法である。
【００６６】
好ましくは、上記方法は、上記対象に治療的に有効な量のTRPV1アンタゴニスト及び／又はBLT1アンタゴニストを投与することを更に含む。
【００６７】
本発明の文脈においては、用語「対象」は、好ましくは哺乳動物、好ましくはヒトを指す。本発明の対象は、疼痛を患う危険性のある対象又は疼痛を患う対象であってよく、ここで該疼痛は、本明細書で先に定義したものである。
【００６８】
本明細書に記載される発明のアンタゴニストは、好ましくは、阻害性RNA、阻害性抗体若しくはそれらのフラグメント、及び／又は小分子からなる化合物の群から選択される。
【００６９】
本発明の文脈においては、疼痛に有効な少なくとも1種の付加的な治療薬、例えばモルヒネ、オピオイド鎮痛薬若しくは非オピオイド鎮痛薬又は他の鎮痛薬を上記対象に投与することも好ましい。
【００７０】
本発明のもう一つの態様においては、対象における疼痛の予防又は治療のための方法であって、上記対象に、治療的に有効な量の本発明によるBLT2アゴニストを投与する工程を含む、方法が提供される。
【００７１】
上記方法の文脈において治療可能な疾患は、本明細書で先に記載されている。
【００７２】
治療又は予防の間に、疼痛に有効な少なくとも1種の付加的な治療薬、例えば他の鎮痛薬、例えばオピオイド鎮痛薬又は非オピオイド鎮痛薬を、上記患者に投与することが好ましい。
【００７３】
さらに、本発明の更なる態様は、対象における一過性受容体電位バニロイド1（TRPV1）の感受性の減少のための方法であって、上記対象に治療的に有効な量のBLT2アゴニストを投与することを含む、方法に関する。
【００７４】
ここで本発明を以下の実施例において、添付の図面及び配列を考慮しつつ更に説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。本発明の目的のために、本明細書で引用される全ての参考文献は、引用することによりそれらの全体が本明細書の一部をなす。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】LTB4は、DRGニューロンにおいてTRPV1を用量依存的に感作することを示す図である。（A）DRGニューロンをカプサイシンで二回刺激し（それぞれ200 nM、15秒間）、そして2回目のカプサイシン刺激の前に、ビヒクル又はLTB4（100 nM）と一緒に2分間にわたりインキュベートした。（B）（A）に記載されるのと同じプロトコルを使用した1回目のカプサイシン応答と2回目のカプサイシン応答との間の比率の用量に依存した差。データは、以下の数のニューロン（n=20〜86）の平均±SEMを表す；ANOVA  クルスカル−ウォリスの検定；ダンの多重比較検定*p<0.05、****p<0.0001スチューデントのt検定。
【図２】BLT1及びBLT2は、末梢感覚ニューロンで同時発現される。調製1日後の培養されたDRGニューロンからのMELC分析の代表図である。BLT1、BLT2、レクチンIB4及びCGRPに関する図が、偽色彩で示されている。白いバーは、xx μmを表している。BLT1又はBLT2を発現するIB4陽性ニューロン（n=179）又はCGRP陽性ニューロン（n=111）の百分率。
【図３】BLT1はTRPV1感作を媒介し、かつBLT2は、LTB4によるTRPV1脱感作を媒介することを示す図である。（A）DRGニューロンをカプサイシンで二回刺激し（それぞれ200 nM、15秒間）、そして2回目のカプサイシン刺激の前に、ビヒクル又は指示される化合物と一緒に2分間にわたりインキュベートした。LTB4（100 nM又は1 μM）によるTRPV1感作は、BLT1アンタゴニスト（U73502、1μM）又はBLT2アゴニスト（CAY10583、400 nM）と一緒にプレインキュベートすることによって低下させることができるが、BLT2アンタゴニスト（LY2552833、10 μM）は、TRPV1感作を増大させる。データは、20〜105の細胞の平均±SEMを表す。ANOVA  クルスカル−ウォリスの検定；ダンの多重比較検定；*p<0.05、**p<0.01、****p<0.0001  スチューデントのt検定；n.s.有意差なし。
【図４】BLT2活性は、EP4及びブラジキニンによるTRPV1脱感作を抑制することを示す図である。（A）DRGニューロンをカプサイシンで二回刺激し（それぞれ200 nM、15秒間）、そして2回目のカプサイシン刺激の前に、EP4アゴニストのONOae329（500 nM）と一緒か、又はONOae329及びCAY10583（400nM）と一緒に2分間にわたりインキュベートした。（B）パネルAに記載されるのと同じプロトコルを使用した1回目のカプサイシン応答と2回目のカプサイシン応答との間の比率の差。データは、以下の数のニューロンの平均±SEMを表す：52（ビヒクル）、109（ONOae329）、106（ONOae329+CAY10583）；一元配置ANOVA、ダンの多重比較検定；**p<0.0096。（C+D）パネルA及びBと同じであるが、但し、TRPV1感作のために500 nMのブラジキニンを使用した。データは、以下の数のニューロンの平均±SEMを表す：33（ビヒクル）、83（ブラジキニン）、93（ブラジキニン+CAY10583）；一元配置ANOVA、ホルム−シダックの多重比較検定；*p=0.0126。
【図５】BLT2活性化は、マウスにおいて熱痛覚閾値を低下させることを示す図である。CAY10583（10 μl、5 μΜ）又はビヒクルを、足底内で投与した。熱閾値を、指示された時点で測定した。データは、6匹の動物の平均±S.E.M.として表される。二元配置ANOVA/ボンフェローニ；*P<0.05、**P<0.005、****P<0.0005。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００７６】
材料及び方法
動物：
全ての動物実験は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針における推奨に従って行い、かつ動物研究のための地方倫理委員会（ダルムシュタット）によって承認された。全ての行動実験について、民間の繁殖会社（Charles River（ドイツ、ズルツフェルト）、Janvier（フランス、ル  ジュネスト＝サン＝ティスル））から購入した6週齢〜12週齢の雄のC57BL/6Nマウスだけを使用した。機械的閾値を比較するために、対照として齢及び性の一致した同腹仔を使用した。
【００７７】
行動試験：
機械的異痛症又は熱感覚過敏症の判定のために、マウスを、適応させるために少なくとも2時間にわたって試験ケージ内で持ち上げられたグリッド上に留めた。ベースライン測定は、熱閾値の測定のための機械的刺激の後に後肢の退避反応潜時を検知するハーグリーブス装置（Ugo Basile、イタリア、ヴァレーゼ、コメーリオ）を使用して行い、マウスは、適応させるために初日に少なくとも2時間にわたって試験ケージ内で温められたガラス板（32 ℃）上に留めた。次いで、肢の足底中央領域を、高強度プロジェクターランプからなる輻射加熱器で退避反応が起こるまで刺激した。注射されていない肢及び注射した肢を、5分〜10分の間隔で交互に測定した。全ての行動試験につき、調査者は、マウスの処置又は遺伝型について伏せられていた。10 μlのLTB4（5 μM）、CAY10583（5 μM）又はビヒクルが、足底内で注射された。
【００７８】
後根神経節（DRG）の初代培養物：
マウスのDRGを、脊髄分節から切り出し、CaCl2及びMgCl2を有する氷冷HBSS（Invitrogen（米国、カリフォルニア州カールスバッド））に直接移した。次に、単離したDRGを、コラゲナーゼ／ディスパーゼ（500 U/mlコラゲナーゼ；2.5 U/mlディスパーゼ）と一緒に、L-グルタミン［2 mM］、ペニシリン（100 U/ml）、ストレプトマイシン（100 μg/ml）、B-27及びゲンタマイシン（50μg/ml）を含有するNeurobasal培地（全て、Invitrogen（米国、カリフォルニア州カールスバッド）社製）中で37 ℃で75分間にわたりインキュベートした。コラゲナーゼ／ディスパーゼ溶液を除去した後に、細胞を10%のFCSを含有するNeurobasal培地で2回洗浄し、そして0.05 %トリプシン（Invitrogen（米国、カリフォルニア州カールスバッド））で10分間にわたりインキュベートした。洗浄工程を繰り返し、そして細胞同士を1 mlのGilson社のピペットを用いて機械的に解離させた。最後に、それらのニューロンを、ポリ-l-リジン（Sigma（ドイツ、ダイゼンホーフェン））でコートされたカバーガラス上に置き、そしてL-グルタミン［2 mM］、ペニシリン（100 U/ml）、ストレプトマイシン（100 μg/ml）、B-27及びゲンタマイシン（50 μg/ml）を含有するNeurobasal培地と一緒に、カルシウムイメージングにより評価するまで一晩インキュベートした。
【００７９】
カルシウムイメージング実験：
カルシウムイメージング実験は、従来発表されている通りに実施した。簡単に言えば、DFC360 FX（CCD）カメラ、Fura-2フィルタ及びN-Plan 10x/0.25 Ph1対物レンズを備えたLeica DMI 4000 b倒立顕微鏡からなるLeicaカルシウムイメージング装置を使用した（全て、LeicaMicrosystems（ドイツ、ヴェッツラー）社製）。2秒ごとに画像を撮影し、LAS AFソフトウェアで処理した。各々の実験につき、細胞数が多い領域を選び、40〜110の細胞を同時にモニタリングした。カルシウムイメージング実験は、調製24時間〜48時間後にDRGニューロンを使用して行った。細胞に5 μMのfura-2-AM-エステル及び0.02 %のPluronic F-127（両者とも、Biotium（カリフォルニア州ヘイワード））を加え、そして該細胞を37 ℃で30分〜60分にわたってインキュベートした。次いで、該細胞を外液（以下のものをmMで含有する：NaCl［145］、CaCl2［1.25］、MgCl2［1］、KCl［5］、D-グルコース［10］、HEPES［10］；pH7.3に調整した）で洗浄した。ベースライン測定は、外液中で1 ml/分〜2 ml/分の流速で行った。ニューロンの刺激は、カプサイシン（200 nM）で行った。特に記載がない限り、LTB4（100 nM〜1000 nM）、BLT2アゴニストのCAY10583（400 nM）、BLT2アンタゴニストのLY2552833（10 μΜ）又はBLT1アンタゴニストのU75302（1 μΜ）（全て、Cayman Chem.（ミシシッピ州アナーバー））による2分間の前処理を行った。
【００８０】
マルチエピトープリガンドカルトグラフィー（MELC）：
MELC技術は、以前より記述されている（Pierre et al., 2008、Pierre, 2010）。10 μlのLTB4、CAY10583又はビヒクルを、後肢中に注射した。それらの動物を、指示された時点で屠殺した。足浮腫を、組織凍結媒体（Leica microsystems（ドイツ、ヌスロッホ））中に包埋し、10 μm厚の凍結切片を、Leica CM 3050Sクリオスタット（-20 ℃；Leica（ドイツ、ヴェッツラー））を使用しつつスライスし、シランコートされたカバーガラス上に載せた。組織を、PBS中4 %のパラホルムアルデヒド中で固定化し、PBS中0.1 %のTritonで透過処理し、そしてPBS中3 %のBSAを用いて室温で1時間にわたりブロッキングした。試料を、倒立型広視野蛍光顕微鏡（Leica DMIRE2；x63オイルレンズNA 1.32）のステージ上に置いた。抗体の施与前に写真を撮影した。ロボット作業によって、まず切片を、予め決められた蛍光標識された抗体（補足データ1）と一緒に15分間にわたりインキュベートし、そしてPBSですすいだ。その後に、位相差シグナル及び蛍光シグナルを、冷却された電荷結合素子カメラ（Apogee KX4；Apogee Instruments（カリフォルニア州ローズビル）、2xビニングにより、1024x1024ピクセルの画像が得られる；最終ピクセルサイズは、286x286 nm2であった）によってイメージングした。後続の添加前の抗体の特異的な信号を消すために、ブリーチング工程を行った。ブリーチング後の画像を記録し、データ解析の間に以下の蛍光タグ画像から減算した。相応する位相差画像を使用して、各々の抗体によって生成された蛍光画像を、ピクセル単位で整列させた。画像の照明ムラを、フラットフィールドコレクションを使用して補正した。
【００８１】
データ解析及び統計学：
全てのデータは、平均±S.E.M.として表される。全ての行動実験において統計学的有意差を決定するためには、繰り返しの測定について分散分析（ANOVA）を使用し、引き続き、事後のボンフェローニ補正をGraphPad Prismを使用して行った。2つだけの群を比較するin vitro実験のために、スチューデントのt検定を行った。P<0.05を統計学的に有意とみなした。
【００８２】
実施例1：LTB4濃度の増大は、LTB4媒介性TRPV1感作を減らす
LTB4は、高濃度でTRPV1を活性化することが示された。ここで、LTB4がより低濃度でTRPV1活性化を感作することができるか否かを調査した。したがって、マウスDRGニューロンの初代培養物を、選択的TRPV1アゴニストであるカプサイシンで2回刺激し、そして細胞を2回目の刺激の前にLTB4濃度を高めつつインキュベートした。100 nMのLTB4と一緒にプレインキュベートすることにより、カプサイシンに誘発される細胞内カルシウム増大が二倍となることを見出した（図1A、図1B）。驚くべきことに、LTB4に対する高められた応答は、より高いLTB4濃度（200 nM〜1000 nM；図1B）を使用した場合に低下した。
【００８３】
LTB4誘発性のTRPV1感作のための狭い濃度範囲により、両方のLTB4受容体、すなわち高親和性受容体BLT1及び低親和性受容体BLT2が、TRPV1感作に対して反対の効果を媒介するという仮説が導かれた。このように、低いLTB4濃度（100 nM）で見られた感作は、高親和性のLTB4受容体BLT1によって媒介されるかもしれない。LTB4濃度を高めると、低親和性のLTB4受容体BLT2は活性化されることになり、TPV1感作を低下させるかもしれない。
【００８４】
実施例2：感覚ニューロンにおけるBLT2の発現
次の工程で、DRGニューロンでのBLT1及びBLT2の発現を測定した。MELCシステムを使用した連続的な免疫組織化学により、BLT1及びBLT2がマウスDRGニューロンに共局在化されることが分かった（図2）。BLT1及びBLT2を発現するニューロンは感覚ニューロンである。それというのも、それらのニューロンは、カルシトニン遺伝子関連タンパク質（CGRP）、ペプチド作動性感覚ニューロンのためのマーカー、又はイソレクチンB4（IB4）、非ペプチド作動性感覚ニューロンのためのマーカーも発現したからである（図2）。全てのIB4及びCGRP発現ニューロンの全体で約40 %はBLT1及びBLT2をも発現していた。
【００８５】
実施例3：BLT2アゴニストCAY10583は、LTB4媒介性のTRPV1感作を無くす
BLT1がTRPV1感作を媒介するか否かを調査するために、LTB4誘発性TRPV1感作に対するBLT1アンタゴニストのU75302の効果を試験した。実際にU75302は、100 nMのLTB4により誘発されるTRPV1感作を無くすことができた（図3）。次に、TRPV1感作に対するBLT2アンタゴニストのLY2552833の効果を研究した。BLT2がTRPV1感作を減らすという見解によれば、LY2552833は、100 nMのLTB4によるTRPV1感作に対して有意な効果は示さないが、1000 nMのLTB4によるTRPV1感作を高めた（図3）。最後に、BLT2アゴニストのCAY10583自身は、カプサイシン誘発性TRPV1活性化に効果を有さないが、100 nMのLTB4によるTRPV1感作を無くした（図3）。
【００８６】
実施例4：BLT2アゴニストCAY10583は、ONOae329及びPKC媒介性TRPV1感作を無くす
次に、TRPV1を感作することが知られるシグナル伝達経路を活性化する受容体によるTRPV1感作に対するBLT2アゴニストのCAY10583の効果を研究した。したがって、TRPV1を、PGE2受容体4（EP4）のリガンドONOae329を使用して感作させた。ここで、感作は、高められたcAMP合成、引き続いてのプロテインキナーゼA（PKA）活性化、そしてTRPV1リン酸化を通じて達成される（Bhave et al, 2002）。マウスDRGニューロンのONOae329での前処理は、BLT2アゴニストのCAY10583の存在下で無くされたカプサイシンに対するTRPV1応答の強力な感作を誘発した（図4A、図4B）。同様に、ブラジキニン誘発性リン酸化及びTRPV1のPKCによる感作は、CAY10583の存在下に有意に減少した（図4C、図4D）。
【００８７】
実施例5：BLT2アゴニストCAY10583は、ラットにおける痛覚を減らす
BLT2活性化の潜在的な鎮痛効果を研究するために、BLT2アゴニストのCAY10583又はビヒクルを、マウスの後肢に注射し、そして熱疼痛閾値を測定した。in vitroでTRPV1感作の減少を裏付ける本発明者らのデータによれば、CAY10583は、ビヒクルだけを与えたマウスと比べて熱疼痛閾値を有意に高めることができた（図5）。
【００８８】
参考文献
Andoh T, Kuraishi Y(2005) Expression of BLTl leukotriene B4 receptor on the dorsal root ganglionneurons in mice. Brain research Molecular brain research 137:263-266.
Bhave G, Zhu W, Wang H,Brasier DJ, Oxford GS, Gereau RWt (2002) cAMP-dependent protein kinaseregulates desensitization of the capsaicin receptor (VR1) by directphosphorylation. Neuron 35:721-731.
Hwang SW, Cho H, Kwak J,Lee SY, Kang CJ, Jung J, Cho S, Min KH, Suh YG, Kim D, Oh U (2000) Directactivation of capsaicin receptors by products of lipoxygenases: endogenouscapsaicin-like substances. Proc Natl Acad Sci U S A 97:6155-6160.
Iizuka Y, Yokomizo T,Terawaki K, Komine M, Tamaki K, Shimizu T (2005) Characterization of a mousesecond leukotriene B4 receptor, mBLT2: BLT2-dependent ERK activation and cellmigration of primary mouse keratinocytes. J Biol Chem 280:24816-24823.
Okubo M, Yamanaka H,Kobayashi K, Fukuoka T, Dai Y, Noguchi K (2010) Expression of leukotrienereceptors in the rat dorsal root ganglion and the effects on pain behaviors.Mol Pain 6:57.
Pierre S, Maeurer C,Coste O, Becker W, Schmidtko A, Holland S, Wittpoth C, Geisslinger G, ScholichK (2008) Toponomics analysis of functional interactions of the ubiquitin ligasePAM (Protein Associated with Myc) during spinal nociceptive processing. MolCell Proteomics 7:2475-2485.
Pierre S, and Scholich,K. (2010) Toponomics: Studying protein-protein interactions and proteinnetworks in intact tissue. Molecular BioSystems 6:641-647.
Scholich K, Geisslinger G(2006) Is mPGES-1 a promising target for pain therapy? Trends Pharmacol Sci27:399-401.
Sisignano M, Park CK,Angioni C, Zhang DD, von Hehn C, Cobos EJ, Ghasemlou N, Xu ZZ, Kumaran V, Lu R,Grant A, Fischer MJ, Schmidtko A, Reeh P, Ji RR, Woolf CJ, Geisslinger G,Scholich K, Brenneis C (2012) 5,6-EET Is Released upon Neuronal Activity andInduces Mechanical Pain Hypersensitivity via TRPAl on Central AfferentTerminals. J Neurosci 32:6364-6372.
Yokomizo T, Izumi T,Chang K, Takuwa Y, Shimizu T (1997) A G-protein-coupled receptor forleukotriene B4 that mediates chemotaxis. Nature 387:620-624.
Yokomizo T, Kato K,Terawaki K, Izumi T, Shimizu T (2000) A second leukotriene B(4) receptor, BLT2.A new therapeutic target in inflammation and immunological disorders. J Exp Med192:421-432.
【符号の説明】
【００８９】
図1
Δratio  Δ比率
図2
% of IB4 or CGRP positive cells  IB4又はCGRP陽性細胞の%
図3
Δratio  Δ比率
Antagonist  アンタゴニスト
Agonist  アゴニスト
図4
Time [s]  時間［秒］
Agonist  アゴニスト
Δratio  Δ比率
Caps.  カプサイシン
Bradykinin  ブラジキニン
図5
Vehicle  ビヒクル
Agonist  アゴニスト
Time [min]  時間［分］
【図１】
2017532324.tif 000002
【図２】
2017532324.tif 000003
【図３】
2017532324.tif 000004
【図４】
2017532324.tif 000005
【図５】
2017532324.tif 000006
【国際調査報告】
2017532324.tif 000007
2017532324.tif 000008
2017532324.tif 000009
2017532324.tif 000010