(57)【要約】本発明は、妊娠中の女性対象または前記対象の出生前の胎児における出生前疾患または状態を診断、予後予測、リスク評価、リスク層別化および／または治療管理するための方法に関する。この方法は、（ｉ）前記対象の体液試料を準備する工程；（ｉｉ）前記試料に含まれている初期胎盤インスリン様ペプチド（プロ−ＥＰＩＬ）またはその断片のレベルを決定する工程；（ｉｉｉ）前記試料について決定されたレベルを、前記出生前疾患または状態のない対象由来の対照レベルと比較する工程を含み；ここで、前記対照レベルからの逸脱が、前記対象における前記出生前疾患または状態の指標となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
妊娠中の女性対象または前記対象の出生前の胎児における出生前疾患または状態を診断、予後予測、リスク評価、リスク層別化および／または治療管理するための方法であって、
ｉ）前記対象の体液試料を準備する工程、
ｉｉ）前記試料に含まれている初期胎盤インスリン様ペプチド（プロ−ＥＰＩＬ）またはその断片のレベルを決定する工程、
ｉｉｉ）前記試料について決定されたレベルを、前記出生前疾患または状態のない対象由来の対照レベルと比較する工程；
を含み、
ここで、前記対象由来の前記試料におけるレベルが前記対照レベルより高いことが前記出生前疾患または状態の指標となる、方法。
【請求項２】
前記対象の試料におけるプロ−ＥＰＩＬのレベルの中央値の倍数（ＭｏＭ）が、前記対照レベルと比較したときに１．２を上回ることが、前記出生前疾患または状態の指標となる、および／または前記対象または胎児が前記出生前疾患または状態を獲得するリスクが高いことの指標となる、および／または前記出生前疾患または状態が悪化する可能性の高いことの指標となる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記妊娠中の女性対象の出生前の胎児における前記出生前疾患または状態が、１３番染色体トリソミー、１８番染色体トリソミーおよび２１番染色体トリソミー、好ましくは２１番染色体トリソミーから選択される、請求項１または２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
前記対象が妊娠第１または第２三半期である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記対象の試料において、胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）、ＰＡＰＰ−Ａ、ｓＦｌｔ１、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、遊離β−ｈＣＧ、インヒビンＡ、アクチビンＡ、短い（ｓｈｏｒｔ）エンドグリン（ｓＥｎｇ）、ｈＣＧ、非結合型エストリオール３および細胞を含まない胎児ＤＮＡから選択される１つ以上のバイオマーカーのレベルを追加で決定する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記対象の試料において、胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）、ＰＡＰＰ−Ａおよび遊離β−ｈＣＧから選択されるバイオマーカーのうちの１つ以上、好ましくは全てのレベルを追加で決定する、請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
超音波マーカー、好ましくは頂部浮腫を追加で決定する、請求項３〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
請求項３〜７のいずれか１項に記載の方法であって、
ｉ）プロ−ＥＰＩＬ、遊離β−ｈＣＧおよびＰｌＧＦのレベル、または
ｉｉ）プロ−ＥＰＩＬ、遊離β−ｈＣＧ、ＰＡＰＰ−ＡおよびＰｌＧＦのレベル、または
ｉｉｉ）プロ−ＥＰＩＬ、遊離β−ｈＣＧ、ＰｌＧＦおよび超音波マーカー、好ましくは頂部浮腫のレベル、または
ｉｖ）プロ−ＥＰＩＬ、遊離β−ｈＣＧ、ＰＡＰＰ−Ａ、ＰｌＧＦおよび超音波マーカー、好ましくは頂部浮腫のレベル、
を決定する、方法。
【請求項９】
前記バイオマーカーおよび／または前記超音波マーカーのレベルに基づく尤度比のセットを決定する、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、
ａ）出生前の胎児の、１３番染色体トリソミー、１８番染色体トリソミーおよび２１番染色体トリソミーに関する前記妊娠中の女性の事前リスク、および
ｂ）前記尤度比のセット、
に基づく最終リスクを決定する、方法。
【請求項１１】
前記尤度比を決定するためにガウス解析を行う、請求項９または１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
胎児における染色体異常、好ましくは２１番染色体トリソミー、１８番染色体トリソミー、１３番染色体トリソミーのリスクを決定するための方法であって、
ａ）妊娠中の女性対象から採取した１つ以上血液試料における、初期胎盤インスリン様ペプチド（プロ−ＥＰＩＬ）、胎盤成長因子（Ｐ１ＧＦ）および遊離ヒト絨毛ゴナドトロピン（遊離β−ｈＣＧ）のレベルを決定する工程；
ｂ）必要に応じて、前記胎児の超音波マーカー、好ましくは頂部浮腫を決定する工程、および
ｃ）プロ−ＥＰＩＬ、Ｐ１ＧＦおよび遊離β−ｈＣＧの測定レベルを使って、前記胎児における染色体異常リスクを決定する工程、
を含む方法。
【請求項１３】
前記リスクを決定する工程が、染色体異常が発生する前記事前リスクとプロ−ＥＰＩＬ、Ｐ１ＧＦ、および遊離β−ｈＣＧの前記レベルに基づく尤度比のセットに基づいて最終リスクを算出する工程を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１２に記載の方法であって、
ａ）妊娠中の女性対象から採取した１つ以上の血液試料における、初期胎盤インスリン様ペプチド（プロ−ＥＰＩＬ）、胎盤成長因子（Ｐ１ＧＦ）、妊娠関連血漿プロテインＡ（ＰＡＰＰ−Ａ）および遊離ヒト絨毛ゴナドトロピン（遊離β−ｈＣＧ）のレベルを決定する工程；
ｂ）必要に応じて、前記胎児の超音波マーカー、好ましくは頂部浮腫を決定する工程、および
ｃ）プロ−ＥＰＩＬ、Ｐ１ＧＦ、ＰＡＰＰ−Ａ、および遊離β−ｈＣＧの該測定レベルを使って、前記胎児における染色体異常リスクを決定する工程、
を含む方法。
【請求項１５】
前記リスクを決定する工程が、染色体異常が発生する前記事前リスクとプロ−ＥＰＩＬ、Ｐ１ＧＦ、ＰＡＰＰ−Ａ、および遊離β−ｈＣＧの前記レベルに基づく尤度比のセットに基づいて最終リスクを算出する工程を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
妊娠中の女性対象または前記対象の出生前の胎児における出生前疾患または状態を診断、予後予測、リスク評価、リスク層別化および／または治療管理するための方法であって、
ｉ）前記対象の体液試料を準備する工程、
ｉｉ）前記試料に含まれている初期胎盤インスリン様ペプチド（プロ−ＥＰＩＬ）またはその断片のレベルを決定する工程、
ｉｉｉ）前記試料について決定されたレベルを、前記出生前疾患または状態のない対象由来の対照レベルと比較する工程を含み、
ここで、前記対象由来の試料におけるレベルが前記対照レベルより低いことが前記出生前疾患または状態の指標となる、方法。
【請求項１７】
前記対象の試料におけるプロ−ＥＰＩＬのレベルの中央値の倍数（ＭｏＭ）が、対照レベルと比較したときに０．８未満であることが、前記出生前疾患または状態の指標となる、および／または前記対象または胎児が前記出生前疾患または状態を獲得するリスクが高いことの指標となる、および／または前記出生前疾患または状態が悪化する可能性の高いことの指標となる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記妊娠中の女性対象における前記出生前疾患または状態が、妊娠糖尿病、早産、胎児発育不全、在胎週数より大きい新生児を出産するリスクおよび妊娠子癇、好ましくは妊娠糖尿病、から選択される、請求項１６または１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記出生前疾患または状態が胎児発育不全であり、かつ、前記対象の試料における胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）のレベルを追加で決定する、請求項１６または１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記対象が妊娠第２または第３三半期である、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
世界中では１年間で、少なくとも１億３０００万人の女性が出産している。そしてそのうちの約１５％が妊娠に関連した合併症または病気を経験している。
【０００２】
妊娠糖尿病（ＧＤＭ）について見ると、米国では３〜７％の妊婦が（ベルグＣ．Ｊ．ら、産科婦人科学雑誌（Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏ）、２００９、１１３（５）：１０７５−８１）、欧州では２〜６％の妊婦が（バックレイＢＳ．ら、糖尿病治療薬（Ｄｉａｂｅｔ  Ｍｅｄ）、２０１２年７月；２９（７）：８４４−５４）ＧＤＭに苦しんでおり、また、ＧＤＭは、巨大児、肩甲難産、帝王切開、および新生児低血糖症などの好ましくない周産期アウトカムに関連している（ＡＣＯＧ実践的紀要（Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ）、第３０号、２００１年９月（１９９４、１２月、技術公報（Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ）第２００号の後を引き継いだ）。妊娠糖尿病（Ｇｅｓｔａｔｉｏｎａｌ  ｄｉａｂｅｔｅｓ）、産科婦人科学雑誌、２００１、９８（３）：５２５−３８）。何より、ＧＤＭの治療が周産期アウトカムを改善することが分かっている（クローサーＣら、ＮＥＪＭ、２００５、３５２：２４７７−２４８６）。しかし現時点では、ＧＤＭを予測するための試験は存在しない。早期診断、つまり臨床症状が発症する前に診断することができれば、臨床医はリスクを有する患者をより注意深く監視することができ、また、対応する食事、運動および／またはこの集団に有効であることが分かっているインスリンやメトホルミンなどの物質の投与を特徴とする治療を提供することができる（ＨＡＰＯ共同研究グループ（Ｓｔｕｄｙ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐ）、ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディシン、２００８、３５８：１９９１−０２；ロワンら、ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディシン、２００８、３５８：２００３−２０１５）。
【０００３】
米国と欧州のいくつかの国では、ＧＤＭは慣習的に、妊娠２４〜２８週の時点で、統一されたスクリーニング手法によって検出される。現在、ＧＤＭを検出するための世界的に認められた代表的な試験というものはない。米国糖尿病学会（ＡＤＡ）、カナダ産婦人科協会（Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｉａｎｓ  ａｎｄ  Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｓｔｓ、ＳＯＧＣ）、および米国産婦人科学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ、ＡＣＯＧ）は、妊婦は妊娠約２８週の時点で、空腹状況にかかわらず、無作為５０ｇブドウ糖負荷試験（ＧＣＴ）によるＧＤＭのスクリーニングを受け、そしてスクリーニングが陽性であった場合には、１時間後に血中グルコースの検査を、次いで、１００ｇ３時間の空腹時経口ブドウ糖耐性試験（ＯＧＴＴ）による診断を受けることを推奨している。これら試験の信頼性は１００％ではなく、ＧＣＴ陽性の女性の２０％超がＯＧＴＴでも陽性となる（偽陽性の率が高い）。
【０００４】
多くの国で、出生前合併症および／または胎児異常のリスクを決定するためのスクリーニング法は、妊婦の治療およびアドバイスの実施を支援するための日常業務となっている。例えば欧州では、医療提供者は通常、母体の血液中に含まれている生化学的マーカーを使って、胎児の染色体異常をスクリーニングする。母体年齢、血清マーカーである妊娠関連血漿プロテインＡ（ＰＡＰＰ−Ａ）および遊離−βヒト絨毛ゴナドトロピン（遊離β−ｈＣＧ）ならびに超音波マーカーである頂部浮腫（ＮＴ）の厚みを組み合わせることで、１１+0〜１３+6週の時点で、約８２〜９０％のダウン症候群が偽陽性率５％で検出できることが分かっている（マロンら、２００５、ＮＥＪＭ  ３５３（１９）：２００１−２０１０；ビンドラら、２００２、超音波産科婦人科学雑誌  ２０：２１９−２２５）。このようなスクリーニングはかなり高いリスクを有する女性、つまり、侵襲的で胎児にリスクを及ぼす可能性のある、さらなる診断試験を受けるのが良いとされる女性を同定するのに有用である。しかしながら、このスクリーニングでは、ダウン症候群の例のうちの相当数と他の異数性を発症している妊娠を検出することができず、また、診断の５％が偽陽性である。
【０００５】
胎児発育不全（ＦＧＲ）とは、規定の成長能に達していないことと定義される。現在、胎児が「小さいこと」の診断は、超音波測定による胎児の推定体重（ＥＦＷ）が所定の閾値、通常１０パーセンタイル、に満たないことに基づいて行われる（フィグエラスら、２０１４、胎児の診断と治療（Ｆｅｔａｌ  Ｄｉａｇｎ  Ｔｈｅｒ））。現時点では、母体試料を使ってＦＧＲを早期に検出する慣習的なスクリーニングは行われていない。この命を脅かす可能性のある妊娠障害の発症を予測する、またはその検出の手助けとなる非侵襲性のバイオマーカーが現在でも強く求められている。胎児発育不全のリスクがより早く検出できれば、重篤度の軽減や回復さえも含む、より良いアウトカムが多くの例で実現可能になるだろう。妊娠中に、特に妊娠の初期または後期に、「在胎期間に対して小さい」新生児を出産するまたは子宮内発育不全の有無を評価する、信頼性の高いリスク評価方法があれば、乳児の成長への悪影響を小さくできる可能性がある。
多くの研究で、母体の既往歴ならびに生化学的マーカーおよび生物物理学的マーカーなどの種々の変数の組み合わせを使った、第１三半期におけるＦＧＲのスクリーニングの性能が評価されてきた。しかしながら、それらで達成された検出率は十分には高くない（フィグエラスら、２０１１、米国産科婦人科学雑誌２０４（４）：２８８−３００）。
【０００６】
従って、出生前合併症および／または胎児異常の正確なスクリーニング方法へのニーズが存在する。
【０００７】
ヒトの胎盤は、胎児母体間適応反応において活性な複数のタンパク質およびペプチドの供給源である（ペトラグリアら、１９９６、内分泌批評（Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｖ）１７：１５６−８６）。これら胎盤因子が妊娠の生理学的な障害および病理学的な障害に影響を及ぼしていることが広く知られている。あるポリペプチドファミリーに属しているインスリンおよびインスリン様成長因子は、エネルギー代謝、細胞増殖、発生および分化などの生理学的な過程を正常に調節するのに必須である。
【０００８】
ＥＰＩＬペプチドは、インスリン様４遺伝子（ＩＮＳＬ４）にコードされている。この遺伝子は、第１三半期のヒト胎盤のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングによって同定されたものである。ＩＮＳＬ４は初期の胎盤で発現量が高く、正常な子宮組織でかすかに発現することを除けば、ＩＮＳＬ４転写物の発現は、これまでに試験した他の正常な組織では、いずれにおいても検出されなかった（チャシンら１９９５。遺伝学（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）２９：４６５−７０）。インスリン様４遺伝子によってコードされている初期胎盤インスリン様ペプチド（ＥＰＩＬ）は、インスリン、リラキシン（ＲＬＸ）、インスリン様成長因子１および２（ＩＧＦＩ  ＩおよびＩＧＦＩＩ）、ＩＮＳＬ３遺伝子によってコードされているライディッヒ・インスリン様ペプチド（ＬＥＹ  Ｉ−Ｌ）ならびにＩＮＳＬ５およびＩＮＳＬ６遺伝子にコードされているペプチドを含む、インスリン関連遺伝子ファミリーのメンバーである。
【０００９】
ＥＰＩＬは、１３９アミノ酸のポリペプチドで、これは、シグナルペプチド（下線）、Ｂ鎖（斜体）、連結しているＣペプチド（太字）および末端にあるＡ鎖（配列番号１）を特徴とするプレプロホルモンによって合成される。胎盤では、栄養膜細胞がＩＮＳＬ４のｍＲＮＡを、Ｂ−、Ｃ−およびＡ−鎖を含む免疫反応性のプロ−ＥＰＩＬペプチドに翻訳することが分かっている（ベレットら、１９９７、臨床内分泌学・代謝学雑誌（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ）８２：３１６９−７２）。プロ−ＥＰＩＬペプチドが最初、正常な妊娠中の羊水および母体血清から検出され、また、プロ−ＥＰＩＬの排泄パターンが遊離β−ｈＣＧのパターンと同様であったことから、これらに共通する制御経路の存在が示唆された（モックら、１９９９、臨床内分泌学・代謝学雑誌  ８４：２２５３−６）。一研究から、異数性の妊娠がプロ−ＥＰＩＬの羊水濃度の変化によって特徴付けられるが、母体血清中の濃度は変化しないことが報告されている（モックら、２０００、臨床内分泌学・代謝学雑誌  ８５：３９４１−４）。ブルーニらは、ＦＧＲ妊娠の試料では、プロ−ＥＰＩＬのレベルが対照試料のレベルよりも高いと記載している（ブルーニら２００７。米国産科婦人科学雑誌（Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ）２００７、１９７：６０６．ｅ１−６０６．ｅ４）。
【００１０】
本発明者らは驚くべきことに、母体血清中のプロ−ＥＰＩＬのレベルが、出生前合併症および／または胎児異常を正確にスクリーニングする方法のための有用なツールとなることを見い出した。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、妊娠中の女性対象または前記対象の出生前の胎児における出生前疾患または状態を診断、予後予測、リスク評価、リスク層別化および／または治療管理するための方法に関し、この方法は、
ｉ）前記対象の体液試料を準備する工程、
ｉｉ）前記試料に含まれている初期胎盤インスリン様ペプチド（プロ−ＥＰＩＬ）またはその断片のレベルを決定する工程、
ｉｉｉ）前記試料について決定されたレベルを、前記出生前疾患または状態のない対象由来の対照レベルと比較する工程、を含み、
ここで、前記対照レベルからの相当な逸脱が、前記対象における前記出生前疾患または状態の指標となる。
【００１２】
本発明はさらに一側面において、胎児における染色体異常、好ましくは異数性、より好ましくは２１番染色体トリソミー、１８番染色体トリソミー、１３番染色体トリソミー、最も好ましくは２１番染色体トリソミーのリスクを決定するための方法に関し、この方法は、
ａ）妊娠中の女性対象から採取した１つ以上の血液試料における、初期胎盤インスリン様ペプチド（プロ−ＥＰＩＬ）、胎盤成長因子（Ｐ１ＧＦ）、（および必要に応じて妊娠関連血漿プロテインＡ（ＰＡＰＰ−Ａ））ならびに遊離ヒト絨毛ゴナドトロピン（遊離β−ｈＣＧ）のレベル決定する工程；
ｂ）必要に応じて前記胎児の超音波マーカーを決定する工程、および
ｃ）プロ−ＥＰＩＬ、Ｐ１ＧＦ、（必要に応じてＰＡＰＰ−Ａ）、および遊離β−ｈＣＧの測定レベルを使って、前記胎児における染色体異常のリスクを決定する工程、を含む。
前記胎児の１つまたは１つ以上の超音波マーカーを追加で決定し、前記胎児のプロ−ＥＰＩＬ、Ｐ１ＧＦ、（必要に応じてＰＡＰＰ−Ａ）、遊離β−ｈＣＧのレベル、および１つ以上の超音波マーカーを使って、前記胎児における染色体異常のリスクを決定することが好ましい。
【００１３】
さらに本発明は、さらなる側面において、妊娠中の女性対象または前記対象の出生前の胎児における出生前疾患または状態を診断、予後予測、リスク評価、リスク層別化および／または治療管理するための方法に関し、この方法は、
ｉ）前記対象の体液試料を準備する工程、
ｉｉ）前記試料に含まれている初期胎盤インスリン様ペプチド（プロ−ＥＰＩＬ）またはその断片のレベルを決定する工程、
ｉｉｉ）前記試料について決定されたレベルを、前記出生前疾患または状態のない対象由来の対照レベルと比較する工程、を含み、
ここで、前記対象由来の前記試料におけるレベルが前記対照レベルより低いことが前記出生前疾患または状態の指標となる。
妊娠中の女性対象における出生前疾患または状態とは、例えば、妊娠糖尿病、早産、胎児発育不全、在胎週数より大きい新生児を出産するリスクおよび妊娠子癇、好ましくは妊娠糖尿病から選択され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、実施例２および３の、時間分解増幅クリプテート発光（Ｔｉｍｅ  Ｒｅｓｏｌｖｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｃｒｙｐｔａｔｅ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ、ＴＲＡＣＥ）技術を利用したプロ−ＥＰＩＬの均一サンドイッチ蛍光免疫測定法の用量反応曲線を示している。
【図２】図２は、正常妊娠の女性におけるプロ−ＥＰＩＬ濃度の箱ひげ図を示している。
【図３】図３は、正常妊娠および２１番染色体トリソミー妊娠の女性におけるプロ−ＥＰＩＬの中央値の倍数（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｏｆ  ｍｅｄｉａｎ、ＭｏＭ）の箱ひげ図を示している。
【図４】図４は、正常妊娠および妊娠糖尿病の女性におけるプロ−ＥＰＩＬの中央値の倍数（ＭｏＭ）の箱ひげ図を示している。
【図５】図５は、正常妊娠の女性および胎児発育不全（ＦＧＲ）群におけるプロ−ＥＰＩＬの中央値の倍数（ＭｏＭ）の箱ひげ図を示している。
【図６】図６は、第２三半期の正常妊娠および２１番染色体トリソミー妊娠の女性におけるプロ−ＥＰＩＬの中央値の倍数（ＭｏＭ）の箱ひげ図を示している。
【００１５】
以下の実施例および図は、本発明を詳述するのに用いられるものであるが、本発明は前記実施例および図に限定されるものではない。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、妊娠中の女性対象または前記対象の出生前の胎児における出生前疾患または状態を診断、予後予測、リスク評価、リスク層別化および／または治療管理するための方法に関する。この方法は、妊娠中の女性対象の体液試料における、初期胎盤インスリン様ペプチド（プロ−ＥＰＩＬ）またはその断片のレベルを決定することを含む。プロ−ＥＰＩＬの対照レベルからの逸脱が、妊娠中の女性対象または前記対象の出生前の胎児における出生前疾患または状態（つまり、妊娠中の女性における出生前合併症および／または胎児異常）の指標となる。試料中のプロ−ＥＰＩＬレベルが対照レベルと比較して高い場合および低い場合のいずれもが、特定の出生前疾患または状態に応じて、出生前疾患または状態の指標となる可能性がある。対照レベルは、正常妊娠の女性、つまり前記出生前疾患または状態のない対象由来の試料におけるプロ−ＥＰＩＬレベルから、好ましくは正常妊娠の女性の集団から導き出したものである。そのため、診断対象由来の試料におけるプロ−ＥＰＩＬレベルを、正常妊娠女性のコホートと、好ましくは診断対象の女性と同じ妊娠三半期の妊娠女性のコホートと、比較する。
【００１７】
従って本発明は、妊娠中の女性対象または前記対象の出生前の胎児における出生前疾患または状態を診断、予後予測、リスク評価、リスク層別化および／または治療管理するための方法に関し、この方法は、
ｉ）前記対象の体液試料を準備する工程、
ｉｉ）前記試料に含まれている初期胎盤インスリン様ペプチド（プロ−ＥＰＩＬ）またはその断片のレベルを決定する工程、
ｉｉｉ）前記試料について決定されたレベルを、前記出生前疾患または状態のない対象由来の対照レベルと比較する工程、を含み、
ここで前記対照レベルからの相当な逸脱が、前記対象における前記出生前疾患または状態の指標となる。
本明細書中において、相当な逸脱とは、対照レベルから少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％の逸脱である。
【００１８】
本発明は一側面においてさらに、妊娠中の女性対象または前記対象の出生前の胎児における出生前疾患または状態を診断、予後予測、リスク評価、リスク層別化および／または治療管理するための方法に関し、この方法は、
ｉ）前記対象の体液試料を準備する工程、
ｉｉ）前記試料に含まれている初期胎盤インスリン様ペプチド（プロ−ＥＰＩＬ）またはその断片のレベルを決定する工程、
ｉｉｉ）前記試料について決定されたレベルを、前記出生前疾患または状態のない対象由来の対照レベルと比較する工程、を含み、
ここで、前記対象由来の前記試料におけるレベルが前記対照レベルより低いことが、前記出生前疾患または状態の指標となる。
【００１９】
同様に、本発明はまた、妊娠中の女性対象または前記対象の出生前の胎児における出生前疾患または状態を診断、予後予測、リスク評価、リスク層別化および／または治療管理するための方法に関し、この方法は、
ｉ）前記対象の体液試料を準備する工程、
ｉｉ）前記試料に含まれている初期胎盤インスリン様ペプチド（プロ−ＥＰＩＬ）またはその断片のレベルを決定する工程、
ｉｉｉ）前記試料について決定されたレベルを、前記出生前疾患または状態のない対象由来の対照レベルと比較する工程、を含み、
ここで、前記対象由来の試料におけるレベルが前記対照レベルより高いことが前記出生前疾患または状態の指標となる。
【００２０】
本発明においては、好ましくは、対照レベルとは、前記出生前疾患または状態のない対象におけるレベルの中央値であり、前記中央値からの２０％を超える逸脱が出生前疾患または状態の指標となる。
【００２１】
そのため本発明はさらに、妊娠中の女性対象または前記対象の胎児における出生前疾患または状態を診断するための方法に関し、ここで、診断対象由来の試料における初期胎盤インスリン様ペプチド（プロ−ＥＰＩＬ）のレベルが決定され、プロ−ＥＰＩＬのレベルが、対照群の「中央値の倍数」（ＭｏＭ）と比較したときに０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３または０．２を下回ることが、出生前疾患または状態の指標となる。本発明はまた、妊娠中の女性対象または前記対象の胎児における出生前疾患または状態を診断するための方法に関し、ここで、診断対象由来の試料における初期胎盤インスリン様ペプチド（プロ−ＥＰＩＬ）のレベルが決定され、プロ−ＥＰＩＬのレベルが、対照群の「中央値の倍数」（ＭｏＭ）と比較したときに１．２、１．７、２．０、２．５を上回ることが出生前疾患または状態の指標となる。中央値の倍数（ＭｏＭ）は、各対象の試験結果が、対照群の中央値からどの程度逸脱しているかの指標である。ＭｏＭは一般的に、医学的なスクリーニング試験、特に各対象の試験結果の変動が大きい試験の結果を報告するのに使用されている。出生前スクリーニングにおける分析物の濃度は、妊娠期間を通じて絶えず変化している。例えば、母体血清中のＡＦＰ濃度は、開放性神経管欠損を検出するのに最も適した期間中（妊娠第１５〜２０週）、１週間におよそ１５％も上昇する。これらの値を妊娠期間特異的な中央値（ＭｏＭ）に変換することで、この妊娠期間の効果を正規化する。そのため検査室は最初に、慣習的に得られた、例えば３００〜５００人の女性から得られた血清についての測定値を得てもよい。測定値はまず、質量単位（例えば、ｎｇ／ｍｌ）または国際単位（例えば、ＩＵ／ｍｌ）で表される。重み付け対数線形回帰分析を使って、妊娠期間中のそれぞれの週における、問題となっている分析物の中央値レベルを決定するための式を導き出す。次に、各女性の測定値を適した妊娠期間の中央値で割り、中央値の倍数（ＭｏＭ）を求める。定義によれば、ある女性集団における全体的な中央値は１．００ＭｏＭである。「中央値の倍数」は、中央値に適用される計数を示す。例えば、０．９０とは、中央値の９０％であることを意味する。以降で、例示的な閾値について議論する。しかしながら、所望の特異度および／または感度または対照群によって、他の閾値を使うこともできる。例えば、第１および第２三半期の妊娠糖尿病における好適な閾値はそれぞれ、５．３ｎｇ／ｍｌ（０．３１のＭｏＭに対応する）および７．４ｎｇ／ｍｌ（０．２２のＭｏＭに対応する）である。３４．４ｎｇ／ｍｌを超える値（１．７１のＭｏＭに対応する）は２１番染色体トリソミーの指標となり得る。第２および第３三半期の胎児発育不全妊娠における好適な閾値はそれぞれ、１９．４ｎｇ／ｍｌ（０．６６のＭｏＭに対応する）および４７．５ｎｇ／ｍｌ（０．６３のＭｏＭに対応する）である。
【００２２】
出生前疾患または状態とは、妊娠中の女性対象またはこの対象の胎児における障害または状態であってよい。例えば、出生前疾患または状態は、妊娠中の女性対象における妊娠糖尿病および関連する疾患であり得る。前記関連する疾患は、妊娠中の女性対象または胎児において顕在化している場合がある。前記妊娠中の女性関連疾患は、妊娠高血圧症候群、妊娠子癇、早産、心血管疾患、メタボリックシンドロームおよび２型糖尿病から選択される疾患のうちの１つ以上であってよい。前記胎児関連疾患は、死産、巨大児、低血糖、高ビリルビン血症、呼吸促迫症候群、肩甲難産、出生時仮死、腕神経叢損傷および早産児から選択される疾患のうちの１つ以上であってよい。また出生前疾患または状態は、有害な妊娠アウトカムまたは、胎児発育不全もしくは「妊娠期間に対して大きい」などの胎児発達に関連していてもよい。出生前疾患または状態はまた、妊娠高血圧腎症または、女性対象における早産に至るリスクなどの有害な妊娠アウトカムに関連していてもよい。さらに出生前疾患または状態は、染色体異常を特徴とする遺伝障害、例えば、１３番染色体トリソミー、１８番染色体トリソミーおよび２１番染色体トリソミーなどの異数性に関連していてもよい。
【００２３】
妊娠糖尿病とは、妊娠期間中に生じる高血糖性の状態を指す。グルコースレベルが高いと、妊娠後期の胎児に影響がおよび、巨大児となる可能性がある。
【００２４】
早産とは、胎児が妊娠３７週未満で生まれることを指す。
【００２５】
胎児発育不全とは、規定の大きさに達していない、子宮内発育不全の胎児を指す。胎児の体重は１０パーセンタイル未満である。
【００２６】
在胎週数より大きいとは、胎児の体重がその妊娠期間の９０パーセンタイルを超えている胎児を指す。
【００２７】
「妊娠高血圧腎症」という用語には、高血圧および蛋白尿を特徴とする、妊娠中の女性における高血圧性の多臓器疾患が含まれる。妊娠高血圧腎症に最もよく見られる症状は、高血圧、尿中のタンパク質増加、および手や顔面のむくみまたは浮腫である。本発明の特定の態様では、妊娠高血圧腎症は、高血圧（収縮期血圧および拡張期血圧がそれぞれ１４０および９０ｍｍＨｇを上回ること）で、かつ、蛋白尿（２４時間尿に含まれるタンパク質の排泄が３００ｍｇを上回るかまたは尿試験紙によるタンパク質の排泄が２＋を上回ること）と定義される。
【００２８】
本発明における「診断」とは、対象における疾患または臨床上の症状を認識し、かつ、（早期に）検出することに関し、診断には識別診断も含まれ得る。特定の態様では、疾患または臨床上の症状の重篤度を評価することも「診断」という用語に包含され得る。
【００２９】
「予後予測」とは、特定の疾患または臨床症状に罹患している対象に関し、アウトカムまたは特定のリスクを予測することに関する。これには、前記対象に関し、回復する可能性または有害事象の可能性を評価することも含まれ得る。
【００３０】
本発明において「リスク評価」および「リスク層別化」という用語は、今後の予後予測に従って、対象を異なるリスク群に分類することに関する。リスク層別化はまた、予防的手段および／または治療的手段を適用するための層別化に関する。
【００３１】
本発明における治療管理という用語は、前記患者の治療を監視および／または調整することを指す。
【００３２】
本発明における「スクリーニング」という用語は、特定のマーカー（単数又は複数）と既定のカットオフレベルを利用してある集団を調査し、その集団の中で、特定の疾患に対してより高いリスクを有する個人を同定する過程を指す。スクリーニングは集団に対して適用可能であり、診断は個々の患者レベルで適用するものである。
【００３３】
プロ−ＥＰＩＬレベルが低いことと関連のある出生前疾患または状態については、前記対象の試料におけるプロ−ＥＰＩＬのレベルの中央値の倍数（ＭｏＭ）が、対照レベルと比較したときに０．８未満であることが、出生前疾患または状態の指標となる、および／または対象または胎児が出生前疾患または状態を獲得するリスクが高い、および／または出生前疾患または状態が悪化する可能性の高いことの指標となる。同様に、プロ−ＥＰＩＬレベルが高いことと関連のある出生前疾患または状態については、前記対象の試料におけるプロ−ＥＰＩＬのレベルの中央値の倍数（ＭｏＭ）が対照レベルと比較したときに１．２を上回ることが、出生前疾患または状態の指標となる、および／または対象または胎児が、出生前疾患または状態を獲得するリスクが高い、および／または出生前疾患または状態が悪化する可能性の高いことの指標となる。
【００３４】
プロ−ＥＰＩＬレベルが低いことと関連のある、妊娠中の女性における妊娠性の疾患または状態には、例えば、妊娠糖尿病、早産、胎児発育不全、在胎週数相当の胎児よりも大きな新生児が生まれるリスクおよび妊娠子癇がある。本発明の特に好ましい態様では、妊娠中の女性対象における出生前疾患または状態は妊娠糖尿病（ＧＤＭ）である。別の特に好ましい態様における出生前疾患または状態は胎児発育不全（ＦＧＲ）である。
【００３５】
妊娠中の女性の胎児における妊娠性の疾患または状態としては、例えば、染色体異常、例えば、１３番染色体トリソミー、１８番染色体トリソミー、２１番染色体トリソミー、ターナー症候群および三倍性などの異数性が挙げられる。本発明の特に好ましい態様では、出生前疾患または状態は１３番染色体トリソミー、１８番染色体トリソミーまたは２１番染色体トリソミーであり、好ましくは２１番染色体トリソミーである。
【００３６】
本発明の診断、予後予測およびリスク評価法においては、プロ−ＥＰＩＬのレベルに加えて、さらなる決定的なパラメーターを決定してもよい。例えば、年齢、体重および／または肥満度指数（ＢＭＩ）に関する情報を追加して評価することもできる。さらなるパラメーターとしては、対象に他の疾患または状態があること、またはこれまでに他の疾患または状態があったことが挙げられる。さらに、試料に含まれている他の関連のあるバイオマーカーを決定することもできる。そのためプロ−ＥＰＩＬは、本発明の診断、予後予測およびリスク評価法に用いられるマーカーパネルの一部とも言える。例えば、疾患または状態が妊娠性糖尿病の場合、さらなるパラメーターは、血中グルコースおよびグルコース負荷試験または経口グルコース負荷試験の実施であってよい。例えば、疾患または状態が異数性の場合、さらなるパラメーターは、妊娠関連血漿プロテインＡ（ＰＡＰＰ−Ａ）、遊離β−ｈＣＧ、頂部浮腫（ＮＴ）、母体年齢、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）、胎児鼻骨、胎児児頭大横径／鼻骨比、ヒト絨毛ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、インヒビンＡ、非結合型エストリオール３および細胞を含まない胎児ＤＮＡからなる群より選択されるうちの１つ以上であってよい。例えば、疾患または状態が胎児発育不全の場合、さらなるパラメーターは、ＰＡＰＰ−Ａ、母体の既往歴、ＰｌＧＦ、可溶性ｆｍｓ様チロシンキナーゼ１（ｓＦｌｔ１）、ＡＦＰ、遊離β−ｈＣＧ、インヒビンＡ、アクチビンＡ、短い（ｓｈｏｒｔ）エンドグリン（ｓＥｎｇ）、子宮底長、胎児の生体計測、頭囲、胎児児頭大横径、腹囲、超音波マーカー（例えば、パルスインデックス（ｐｕｌｓａｔｉｌｅ−ｉｎｄｅｘ、ＰＩ）、ドップラー臍帯動脈血流、ドップラー中大脳動脈血流、ドップラー胎児静脈血流(Ｄｕｃｔｕｓ ｖｅｎｏｓｕｓ Ｄｏｐｐｌｅｒ)）からなる群より選択されるうちの１つ以上であってよい。
【００３７】
本明細書では、ＰｌＧＦには、遊離ＰｌＧＦおよび多量体複合体に結合したＰｌＧＦの両方が含まれる。そのためＰｌＧＦには、そうでないことが明らか出ない限り、全てのＰｌＧＦイソ型が含まれる。
【００３８】
「バイオマーカー」（生物学的マーカー）という用語は、健康および身体に関連する評価、例えば疾患リスク、精神医学的疾患、環境暴露およびその影響、疾患の診断、代謝過程、物質乱用、妊娠、細胞株の発達、疫学的研究などのパラメーターとして役立つ、測定可能かつ定量可能な生物学的指標（例えば、特定の酵素濃度、特定のホルモン濃度、集団における特定の遺伝子の表現型分布、生物学的な物質の有無）に関する。さらにバイオマーカーは、正常な生物学的過程、病原性の過程、または治療的介入に対する薬理学的な反応の指標として、客観的に測定され、評価される特徴として定義されている。バイオマーカーは、生体試料について測定される場合（血液、尿、または組織試験として）、ある人物から得られた記録である場合（血圧、ＥＣＧ、またはホルター）、または画像試験である場合（子宮胎盤ドップラー超音波検査または胎児頂部浮腫測定（コンデ−アグデロら、２００４、産科婦人科学雑誌（Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ）１０４：１３６７−１３９１；ビンドラら、２００２、産婦人科における超音波測定（Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ）２０：２１９−２２５））がある。バイオマーカーは、様々な健康または疾患の特徴（環境要因への暴露のレベルもしくは型など）、遺伝子感受性、暴露に対する遺伝的な応答、無症状または臨床疾患のバイオマーカー、または治療への反応に関する指標などを表す可能性がある。従って単純に考えるとバイオマーカーとは、疾患体質（リスク因子またはリスクバイオマーカー）、疾患の状態（前臨床または臨床）、または疾患速度（進行）の指標である。従ってバイオマーカーを、前駆バイオマーカー（病気が発症するリスクを同定する）、スクリーニングバイオマーカー（無症状の疾患をスクリーニングするため）、診断的バイオマーカー（顕性疾患を認知する）、段階分けバイオマーカー（疾患重篤度を分類する）、または予後バイオマーカー（再発、治療への反応などの以降の疾患経過を予測する、および治療効果の監視）に分類することができる。バイオマーカーは、代替エンドポイントとしても役立つ可能性がある。代替エンドポイントとは、治験において治療の安全性と効果を評価するために、真に目的とするアウトカムを測定する代わりに用いることができるアウトカムである。代替エンドポイントトラックにおける変更が、目的のアウトカムにおける変化と密接な相関関係にあることが基本的な原則である。代替エンドポイントは、罹病率や死亡率など、評価に大規模な治験を必要とするエンドポイントよりも、短期間に安価で収集でき得る項目として利点がある。代替エンドポイントのその他の価値としては、代替エンドポイントの方が目的の暴露／介入とより密接な関連があるという事実、および代替エンドポイントの方が必然的に、測定するまでに時間的な間隔のあく臨床イベントよりも関連づけが容易であろうということが挙げられる。代替エンドポイントの重要な欠点としては、目的のエンドポイントが数多くの要因（代替エンドポイントに加えて）の影響を受ける場合、残差交絡によって代替エンドポイントの妥当性が損なわれる可能性があることが挙げられる。代替エンドポイントの妥当性は、代替エンドポイントによって、目的のアウトカムに対する暴露または介入の効果の少なくとも５０％が説明できる場合により大きいことが示唆されている。例えば、バイオマーカーはタンパク質、ペプチドまたは核酸分子であってよい。
【００３９】
本発明の方法では、様々な型の追加的なパラメーターを、以下のように区別する場合がある：（ａ）グルコースなどの「低分子量」バイオマーカー、（ｂ）「生化学的な」バイオマーカー、つまり、ポリペプチド、タンパク質および核酸（特にＤＮＡ）などの、試料中に含まれている生体分子、（ｃ）「生物物理学的な」パラメーター、例えば、超音波法などの画像検査法から得られた情報、（ｄ）母体年齢または母体の既往歴などの、この他の情報。
【００４０】
追加的な「生化学的な」バイオマーカー、好ましくは、本発明による「生化学的な」バイオマーカーは、ＰＡＰＰ−Ａ、ＰｌＧＦ、ｓＦｌｔ１、ＡＦＰ、遊離β−ｈＣＧ、インヒビンＡ、アクチビンＡ、ｓＥｎｇ、ｈＣＧおよび細胞を含まない胎児ＤＮＡである。
【００４１】
追加的な「生物物理学的な」パラメーター、好ましくは、本発明に含まれる「生物物理学的な」指標は、胎児子宮底長、胎児の生体計測、胎児頭囲、胎児胎児児頭大横径、胎児腹囲、超音波マーカー（例えば、パルスインデックス（ＰＩ）、ドップラー臍帯動脈血流、ドップラー中大脳動脈血流、ドップラー胎児静脈血流から選択される）、頂部浮腫（ＮＴ）、胎児鼻骨、胎児胎児児頭大横径／鼻骨比である。
【００４２】
本明細書において「試料」という用語は生体試料のことである。本明細書で使用する場合「試料」とは、目的の対象（例えば患者）の診断、予後予測、または評価を目的とした体液試料を指す。本発明の目的に関する「患者」または「対象」は、ヒトおよび他の動物、特に哺乳動物、ならびに他の生物のいずれも含む。従ってこの方法は、ヒトの診断および獣医学的な使用の両方に応用可能である。好ましい態様において患者は哺乳動物であり、最も好ましい態様では、患者または対象はヒトである。
【００４３】
本明細書において試料は、妊娠中の女性対象の体液試料である。好ましい試験試料としては、血液、血清、血漿、脳脊髄液、羊水、尿、唾液、痰、および胸水が挙げられる。加えて、当業者であれば、いくつかの試験試料は、分画および精製過程の後、例えば、全血を血清と血漿成分に分けた後、より速やかに分析できることが分かるだろう。
【００４４】
従って、本発明の好ましい態様において試料は、血液試料、血清試料、血漿試料、髄液試料、唾液試料および尿試料または前述した試料いずれかの抽出物を含んでいる群から選択される。好ましくは、試料は血液試料であり、より好ましくは血清試料または血漿試料である。本発明では血清試料が最も好ましい試料である。
【００４５】
「基準試料」という用語は、疾患または障害をもたず、かつ、疾患または障害を発症していない対象または対象群から得られた試料に関する。前記対象または対象群は、試験対象と同じ性別および種である。「対照レベル」は１つ以上の「基準試料」から導き出されるもので、出生前疾患または状態のない対象に由来するものであることが好ましい。本明細書では、「対照群」は妊娠の同じ三半期のものであるかまたは同じ妊娠期間のもの（例えば妊娠週数が同じ）でさえあることが好ましい。例えば、対象が妊娠２２〜２４週の場合、対照群も妊娠２２〜２４週であってよい。
【００４６】
本発明において「血漿」とは、遠心分離した後に得られる、抗凝固剤を含んでいる血液の実質的に細胞を含まない上清である。抗凝固剤の例としては、ＥＤＴＡまたはクエン酸塩などのカルシウムイオン結合化合物およびヘパリナート（ｈｅｐａｒｉｎａｔｅ）またはヒルジンなどのトロンビン阻害剤が挙げられる。細胞を含まない血漿は、抗凝固剤を加えた血液（例えばクエン酸、ＥＤＴＡまたはヘパリンを加えた血液）を２０００〜３０００ｇで少なくとも１５分間遠心分離することで得られる。
【００４７】
「血清」とは、血液を凝固させた後に回収される、全血のうちの液体画分である。凝固した血液（塊になった血液）を遠心分離すると、血清が上清として得られる。上清にはフィブリノゲンが含まれないが、いくつかの凝固因子は含まれたままである。
【００４８】
本明細書で使用する場合「対象」という用語は、生きている、ヒトまたはヒトではない、女性（メス）の生物を指す。本明細書において対象は、好ましくは第１から第３三半期のヒト対象であり、より好ましくは、第１三半期のヒト対象である。例えば、対象は、妊娠１１〜１３である。本明細書において「胎児」とは、胎生期を過ぎて生まれる前までの、発育中の哺乳動物を指す。ヒトの胎児期は、妊娠９週目の初日から始まるとされる。
【００４９】
妊娠の齢は「妊娠期間」と呼ばれる。「妊娠期間」（例えば、妊娠の三半期または週数に関する期間）を計算するために用いられる妊娠初日とは、典型的には、その女性の正常な最終月経の第１日目を指す。妊娠期間は通常、３つの期間に分けられる、これは三半期と呼ばれている。一般的な定義によると、第１三半期は１〜１３週、第２三半期は１４〜２６週、および第３三半期は２７週から出産までを含む。本発明の方法は、原理的には、妊娠の三半期間中のいつでも実施することができる。しかしながら、特定の疾患に関しては、この方法を妊娠の特定の期間の間に実施することが好ましい。例えば、２１番染色体トリソミーの診断は、第１三半期の間に、最も好ましくは１０〜１３週の間に実施することが好ましい。一方で、本発明の方法を用いた胎児発育不全（ＦＧＲ）の診断は、第２および第３三半期に行うことが好ましい。
【００５０】
「断片」という用語は、より大きなタンパク質またはペプチドから誘導可能な、従って、より大きなタンパク質またはペプチドの部分配列を含んでいる、より小さいタンパク質またはペプチドを指す。前記断片は、より大きなタンパク質またはペプチドに含まれているペプチド結合を１つ以上けん化することによって、より大きなタンパク質またはペプチドから誘導することができる。
【００５１】
本発明において「レベル」という用語は、患者の試料に由来するマーカーペプチドの濃度（好ましくは、重量／体積（ｗ／ｖ）で表される）を指す。
【００５２】
初期胎盤インスリン様ペプチド（プロ−ＥＰＩＬ）またはその断片ならびに他のポリペプチドに基づくバイオマーカー（例えばＰｌＧＦ、ＰＡＰＰ−Ａ、遊離β−ｈＣＧおよびｓＦｌｔ１）のレベルを決定する工程は、本明細書では、検出方法および／または診断的アッセイを用いて実施される。
【００５３】
好ましい検出方法には、様々な形式の免疫測定、例えば放射免疫測定（ＲＩＡ）、化学発光免疫測定および蛍光免疫測定、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、酵素結合免疫測定（ＥＬＩＳＡ）、ルミネックスを使用したビーズアレイ、タンパク質マイクロアレイ検定、結果が早く出る形式の検定（例えば免疫クロマトグラフ試験紙など）ならびに選択／多重反応モニタリング（ＳＲＭ／ＭＲＭ）が含まれる。
【００５４】
アッセイは、均一なアッセイでも不均一なアッセイであっても、競合型のアッセイであっても非競合型のアッセイであってもよい。特に好ましい態様では、アッセイは、非競合型の免疫アッセイ法であるサンドイッチアッセイの形式であり、この場合、検出される分子および／または定量される分子は、第一の抗体と第二の抗体に結合している。第一の抗体は固相、例えばビーズ、ウェルもしくは他の容器の表面、チップまたは試験紙に結合していてもよく、第二の抗体は、例えば色素、放射性同位元素、または反応性もしくは触媒性の活性部分で標識された抗体である。その後、分析物に結合した標識抗体の量を、適切な方法で測定する。「サンドイッチアッセイ」に関連する一般的な組成および手法は十分に確立されており、当業者に知られている（免疫アッセイハンドブック（Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ）、デビッド・ワイルド編、エルゼビア社、オックスフォード；第三版（２００５年５月）、ＩＳＢＮ−１３：９７８−００８０４４５２６７；ハルトシグＣら、化学生物学に関する最新の知見（Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ）２００６  ２月；１０（１）：４−１０．ＰＭＩＤ：１６３７６１３４、参照することにより本明細書に組み入れられる）。
【００５５】
特に好ましい態様では、アッセイには、液体反応混合物中にいずれも分散して存在する２つの補足分子、好ましくは抗体が含まれ、ここで、第一の標識成分は第一の補足分子に結合しており、前記第一の標識成分は蛍光または化学発光の消光または増幅に基づく標識システムの一部であり、かつ、前記標識システムの第二の標識成分は第二の補足分子に結合しているため、両方の補足分子が分析物に結合すると、試料を含んでいる溶液中で形成されたサンドイッチ複合体の検出を可能にする測定可能なシグナルが生成される。
【００５６】
より好ましくは、前記標識システムは、蛍光色素または化学発光色素、特にシアニン色素と共に、希土類のクリプテートまたは希土類のキレートを含む。
【００５７】
本発明においては、蛍光に基づくアッセイは色素の使用を含み、そのような色素は、例えば、ＦＡＭ（５−もしくは６−カルボキシフルオレセイン）、ＶＩＣ、ＮＥＤ、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ＩＲＤ−７００／８００、シアニン色素（例えばＣＹ３、ＣＹ５、ＣＹ３．５、ＣＹ５．５、Ｃｙ７）、キサンテン、６−カルボキシ−２'、４'、７'、４、７−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、ＴＥＴ、６−カルボキシ−４'、５'−ジクロロ−２'、７'−ジメトジフルオレセイン（ｄｉｍｅｔｈｏｄｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）（ＪＯＥ）、Ｎ、Ｎ、Ｎ'、Ｎ'−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、５−カルボキシローダミン−６Ｇ（Ｒ６Ｇ５）、６−カルボキシローダミン−６Ｇ（ＲＧ６）、ローダミン、ローダミングリーン、ローダミンレッド、ローダミン１１０、ボディピィ（ＢＯＤＩＰＹ）色素（例えばＢＯＤＩＰＹＴＭＲ）、オレゴングリーン、クマリン類（例えばウンベリフェロン）、ベンズイミド（例えばヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）３３２５８）、フェナントリジン（例えばテキサスレッド）、ヤキマイエロー、アレクサ・フルオロ、ＰＥＴ、エチジウムブロマイド、アクリジニウム色素、カルバゾール色素、フェノキサジン色素、ポルフィリン色素、ポリメチン色素などを含む群から選択される。
【００５８】
本発明では、化学発光に基づくアッセイには、化学発光物質に関して説明された自然原理に基づく色素の使用が含まれる（カーク−オスマー、化学技術大辞典（Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）第四版、Ｊ．Ｉ．クロスビッツ編集長；Ｍ．ホウ−グラント編、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ、１９９３、１５号、５１８−５６２頁、５５１〜５６２頁を引用すると共に、参照することにより本明細書に組み入れられる）。好ましい化学発光色素はアクリジニウムエステルである。プロ−ＥＰＩＬを、例えば、Ｂ．Ｒ．Ａ．Ｈ．Ｍ．Ｓ  ＫＲＹＰＴＯＲコンパクトＰＬＵＳ装置（サーモ・サイエンティフィクＢ．Ｒ．Ａ．Ｈ．Ｍ．Ｓ  ＧｍｂＨ、ヘニッヒスドルフ／ベルリン、ドイツ）を使った全自動のサンドイッチ免疫アッセイシステムで検出してもよい。この無作為アクセス分析器は、２つの蛍光標識試薬間の非放射性転移に基づいた高感度な時間分解増幅クリプテート発光（Ｔｉｍｅ  Ｒｅｓｏｌｖｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｃｒｙｐｔａｔｅ  Ｅｍｍｉｓｓｉｏｎ、ＴＲＡＣＥ）技術を利用するものである。
【００５９】
診断および／または予後予測試験の感度および特異度は、その試験の分析的な「質」だけでなく、何を異常な結果とするかの定義にも依存する。実際には、通常、変数の値に対して「正常」集団（つまり、出生前診断で疾患または状態を持っていなかった健康な見た目の対象）および「疾患」集団をプロットすることで、受診者動作特性曲線（ＲＯＣ曲線）を算出する。任意の特定のマーカーでは、疾患を有している対象と疾患を有していない対象のマーカーレベルの分布はほぼ一致する。このような条件では、試験によって、正常と疾患とを１００％の正確性で間違いなく区別することはできず、また、重なっている範囲は、試験を行ってもその範囲では正常と疾患とを区別できないことを示している。それより下では試験が正常に機能せず、それより上では試験が正常に機能する閾値を選択する。ＲＯＣ曲線下面積は、受信した測定値が状態の正しい判定を促すであろう確率の指標である。ＲＯＣ曲線は、試験結果が正確な数を示す必要がない場合にも使用することができる。結果を順位付けることができれば、ＲＯＣ曲線を作成することができる。例えば、「疾患」試料に対する試験結果は、その程度に従って順位付けされるだろう（例えば１＝軽度、２＝中等度、および３＝重篤）。この順位付けを、「正常」集団の結果や、作成したＲＯＣ曲線と関連づけることができる。これらの方法は、当該分野ではよく知られている。例えば、ハンリーら、１９８２、北米放射線医学会誌（Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ）１４３：２９−３６を参照のこと。閾値は、好ましくは、ＲＯＣ曲線面積が約０．５より大きくなるように、より好ましくは約０．７より大きくなるように、さらにより好ましくは約０．８より大きくなるように、その上さらにより好ましくは約０．８５より大きくなるように、最も好ましくは約０．９より大きくなるように選択される。本明細書中において「約」という用語は、所与の測定値の＋／−５％を指す。
【００６０】
ＲＯＣ曲線の横軸は（１−特異度）を表し、大きくなるほど偽陽性の割合が高くなる。曲線の縦軸は感度を表し、高くなるほど、真陽性の割合が高くなる。従って、選択された特定のカットオフ値に対して（１−特異度）の値を決定することができ、対応する感受性を得ることができる。ＲＯＣ曲線下面積は、測定されたマーカーレベルによって、疾患または状態を正確に判定することのできる確率の指標である。従って、ＲＯＣ曲線下面積は、その試験の有効性を決定するのに使用することができる。
【００６１】
他の態様では、陽性尤度比、陰性尤度比、オッズ比、またはハザード比を、その試験がリスクを予測する、または疾患もしくは状態（「疾患群」）を診断する能力の指標として用いる。陽性尤度比の場合には、１の値は、陽性の結果が「疾患」群と「対照」群の両方の対象において同程度で現れることを意味し；１よりも大きい値は、陽性の結果が疾患群でより多く現れることを意味し；１未満の値は、陽性の結果が対照群でより多く現れることを意味している。陰性尤度比の場合には、１の値は、陰性の結果が「疾患」群と「対照」群の両方の対象において同程度で現れることを意味し；１よりも大きい値は、陽性の結果が試験群でより多く現れることを意味し；１未満の値は、陰性の結果が対照群でより多く現れることを意味している。
【００６２】
オッズ比の場合には、１の値は、陽性の結果が「疾患」群と「対照」群の両方の対象において同程度で現れることを意味し；１よりも大きい値は、陽性の結果が疾患群でより多く現れることを意味し；１未満の値は、陽性の結果が対照群でより多く現れることを意味している。
【００６３】
ハザード比の場合には、１の値は、あるエンドポイント（例えば死亡）の相対リスクが「疾患」群と「対照」群の両方で等しいことを意味し；１よりも大きい値は、リスクが疾患群でより高いことを意味し；１未満の値は、リスクが対照群でより高いことを意味している。
【００６４】
診断または予後予測の指標と、診断または今後の臨床転帰の予後リスクとの関連づけが統計分析であることを、当該分野の専門家は理解するだろう。例えば、マーカーレベルがＸを下回ることは、統計的有意差のレベルから判定されるように、その患者が、マーカーレベルがＸを上回るかまたはＸと同等の患者よりも、有害転帰を被る可能性が高いことのシグナルとなり得る。さらに、マーカー濃度の基準レベルからの変化は、患者の予後を反映するものである可能性があり、また、マーカーレベルの変化の度合いは、有害事象の重篤度に関連するものである可能性がある。統計的有意差は、２つ以上の集団を比較すること、および信頼区間および／またはｐ値を決定することで決定されることが多い。例えば、ドウディーおよびウェアデン、研究のための統計学（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ、ニューヨーク、１９８３を参照のこと。本発明の好ましい信頼区間は９０％、９５％、９７．５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％および９９．９９％であり、好ましいｐ値は０．１、０．０５、０．０２５、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、および０．０００１である。
【００６５】
特定の態様では、本発明の方法を、異数性、例えば２１番染色体トリソミーの胎児を身ごもっている妊娠中の対象のリスク評価に使用する。このリスク評価は、プロ−ＥＰＩＬのレベルと、ＰｌＧＦ、ＰＡＰＰ−Ａおよび遊離ヒト絨毛ゴナドトロピン（遊離β−ｈＣＧ）のレベルから選択される少なくとも１つのさらなるパラメーターを決定することによって実施してもよい。母体年齢、頂部浮腫（ＮＴ）などの追加的な他のパラメーターおよび／またはさらに追加的な生化学的、生物物理学的なパラメーターならびに母体の既往歴のパラメーターも含めることができる。
【００６６】
本発明においては、プロ−ＥＰＩＬおよび他のバイオマーカーならびに頂部浮腫（ＮＴ）などの生物物理学的なマーカーおよび母体年齢などの追加的な情報を含む、種々のパラメーターの組み合わせが好ましい。これらのパラメーターを、妊娠中の対象または出生前の胎児における出生前疾患または状態の見込みを予想するスコアまたはアルゴリズムに合算することができる。２種類以上のバイオマーカーを使うリスク評価では、各バイオマーカーに関するそれぞれの尤度比（ＬＲ）を決定し、掛け合わせることが好ましい場合がある。さらに、それらパラメーター間の相関関係を表す相関係数（ｒ）を算出することが都合よい。実施例３では、２１番染色体トリソミーなどの異数性のリスク評価に非常に有用で、かつ好ましいパラメーター間の相関を表すｒ値を示している。同様に、他の組み合わせおよび／または疾患／状態に関するＬＲおよび相関係数を算出することもできる。
【００６７】
実施例３の態様で説明する通り臨床集団の統計分析から、異数性の胎児を身ごもっている妊娠中の対象のリスク評価については、好ましくは、プロ−ＥＰＩＬ、ＰｌＧＦ、ＰＡＰＰ−Ａ、遊離β−ｈＣＧを組み合わせた測定と母体年齢の決定を行ってもよく、頂部浮腫（ＮＴ）などの追加的な生物物理学的パラメーターの決定は行ってもまたは行わなくても良い場合があることが示された。母体年齢、プロ−ＥＰＩＬ、ＰｌＧＦ、ＰＡＰＰ−Ａ、遊離β−ｈＣＧおよび頂部浮腫を使った２１番染色体トリソミーなどの異数性のリスク評価を算出する具体的な方法については、実施例３を参照しながら、以降で説明する。
【００６８】
母体年齢は固有の確率を有し、また、事前リスクの主因である（スナイジャーズら、１９９９、超音波産科婦人科学雑誌３（３）：１６７−７０）。所与のリスクはオッズとして表され、さらに、２１番染色体トリソミー妊娠および健常妊娠におけるプロ−ＥＰＩＬのＬＲ（対数ガウス分布から求める）と掛け合わされる。健常な分布パラメーターはＳＤ＝０．２４１１であるが、２１番染色体トリソミーの平均およびＳＤは、プロ−ＥＰＩＬ  ＭｏＭの平均対数＝０．２２９であり、ＳＤ＝０．１７７である。最終的なオッズをリスクへと変換し直す。プロ−ＥＰＩＬと、ＰｌＧＦ、ＰＡＰＰ−Ａおよび遊離β−ｈＣＧを組み合わせた場合の決定については、２１番染色体トリソミー妊娠とその健常妊娠における対数ＭｏＭ値間の相関係数を算出する。健常妊娠の相関係数は、ＰｌＧＦを使った場合は０．１９５、ＰＡＰＰ−Ａを使った場合は０．０９８、遊離β−ｈＣＧを使った場合は０．３９２である。２１番染色体トリソミー妊娠の相関係数は、ＰｌＧＦを使った場合は−０．０９１、ＰＡＰＰ−Ａを使った場合は０．１３１、遊離β−ｈＣＧを使った場合は−０．０９０である。
１３番染色体トリソミーおよび１８番染色体トリソミーなどの異数性を含む他の疾患／状態についても同様の計算を行うことができる。
【００６９】
実施例３で説明し、表１ａおよび１ｂに示すように、臨床集団の統計分析から、プロ−ＥＰＩＬ、ＰｌＧＦ、ＰＡＰＰ−Ａ、遊離β−ｈＣＧを組み合わせて測定することと合わせて、母体年齢の決定すること、頂部浮腫などの生物物理学的なパラメーターは決定してもしなくてもよいが、は異数性の胎児を身ごもっている妊娠中の対象のリスク評価の算定に有用なツールであることが示された。例えば、母体年齢、遊離β−ｈＣＧ、ＰｌＧＦ、プロ−ＥＰＩＬおよび頂部浮腫（ＮＴ）を決定すると、検出率は１００％で、偽陽性率をわずか２．７％（カットオフを２５０分の１とした場合）に押さえることができた。生物物理学的なパラメーター（つまり、この実施例ではＮＴ）を使わなかった場合、母体年齢、ＰＡＰＰ−Ａ、遊離β−ｈＣＧ、ＰｌＧＦおよびプロ−ＥＰＩＬを決定することで、検出率は９６．３％、偽陽性率は９．６％となった（２５０分の１でカットオフ）。
【００７０】
本発明において「検出率」という用語は、正の結果を示し、実際に罹患している対象のパーセンテージである。「偽陽性率」は、正の結果を示したが健常である対象のパーセンテージである。
【００７１】
胎児発育不全（ＦＧＲ）の診断
本発明は一側面において、妊娠中の女性対象における胎児発育不全（ＦＧＲ）を診断するための方法に関する。従って本発明は、好ましい態様において、妊娠中の女性対象における胎児発育不全（ＦＧＲ）を診断するための方法に関し、この方法は、
ｉ）前記対象の体液試料を準備する工程、
ｉｉ）前記試料に含まれている初期胎盤インスリン様ペプチド（プロ−ＥＰＩＬ）またはその断片のレベルを決定する工程、
ｉｉｉ）前記試料について決定されたレベルを、ＦＧＲでない対象由来の対照レベルと比較する工程、を含み、
ここで、前記対象由来の前記試料におけるレベルが前記対照レベルより低いことがＦＧＲの指標となる。
本発明のこの側面においては、加えて、前記対象の前記試料における胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）のレベルを決定することが好ましい。この試料に含まれるＰｌＧＦのレベルが対照レベルよりも低いことがＦＧＲの指標となる。本発明のこの側面では、ｓＦｌｔ１を一層さらに別の追加的なマーカーとして、そのレベルを決定してもよく、試料におけるｓＦｌｔ１レベルが対照レベルよりも高いことがＦＧＲの指標となる。この側面の方法は、妊娠の第２または第３三半期に実施することが好ましい。
この側面の方法で使用することができるＦＧＲを診断するための追加的なマーカーおよびパラメーターとしては、例えば、ＰＡＰＰ−Ａ、母体の既往歴、ＡＦＰ、遊離β−ｈＣＧ、ｈＣＧ、インヒビン−Ａ、アクチビンＡ、ｓＥｎｇ、子宮底長（ＳＦＨ）、胎児の生体計測（大腿骨長（ＦＬ）、頭囲（ＨＣ）、胎児児頭大横径（ＢＰＤ）、腹囲（ＡＣ））および超音波マーカー（パルスインデックス、ドップラー臍帯動脈血流、ドップラー中大脳動脈血流、ドップラー胎児静脈血流）が挙げられる。
【００７２】
妊娠糖尿病（ＧＤＭ）の診断
本発明は別の側面において、妊娠中の女性対象における妊娠糖尿病（ＧＤＭ）を診断するための方法に関する。従って本発明は、好ましい態様において、妊娠中の女性対象における妊娠糖尿病（ＧＤＭ）を診断、予後予測、リスク評価、リスク層別化および／または治療管理するための方法に関し、この方法は、
ｉ）前記対象の体液試料を準備する工程、
ｉｉ）前記試料に含まれている初期胎盤インスリン様ペプチド（プロ−ＥＰＩＬ）またはその断片のレベルを決定する工程、
ｉｉｉ）前記試料について決定されたレベルを、ＧＤＭではない対象由来の対照レベルと比較する工程、を含み、
ここで、前記対象由来の前記試料におけるレベルが前記対照レベルより低いことがＧＤＭの指標となる。
この側面の方法において使用することができるＧＤＭを診断するための追加的なマーカーおよびパラメーターとしては、例えば、フォリスタチン様３（ＦＳＴＬ３）、性ホルモン結合グロブリン（ＳＨＢＧ）、アディポネクチン、レプチン、レジスチン、グリコシル化フィブロネクチン、胎盤性ラクトゲン、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、アクチビン、ミオスタチン、特定のサイトカイン、ｓＦｌｔ−１、および／またはＰ１ＧＦが挙げられる。特定のサイトカインとは、例えば、免疫／ヘマトポエチン、インターフェロン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連分子またはケモカインであってよい。例としては、インターロイキン（ＩＬ）−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１ベータ、単球走化性タンパク質（ＭＣＰ）−ＩもしくはＴＮＦ−アルファ、またはこれらの任意の組み合わせも挙げられる。
【００７３】
異数性の診断
本発明は一層さらに別の側面において、妊娠中の女性対象の出生前の胎児における異数性、例えば１３、１８および２１番染色体トリソミー（好ましくは２１番染色体トリソミー）を診断および／またはリスク層別化するための方法に関する。従って本発明は好ましい態様において、前記対象の出生前の胎児における異数性、好ましくは１３、１８および２１番染色体トリソミー、最も好ましくは２１番染色体トリソミーを診断および／またはリスク層別化するための方法に関し、この方法は、
ｉ）前記対象の体液試料を準備する工程、
ｉｉ）前記試料に含まれている初期胎盤インスリン様ペプチド（プロ−ＥＰＩＬ）またはその断片のレベルを決定する工程、
ｉｉｉ）前記試料について決定されたレベルを、前記異数性のない対象由来の対照レベルと比較する工程、を含み、
ここで、前記対象由来の前記試料におけるレベルが前記対照レベルより高いことが異数性の指標となる。
この側面の方法においては、対象が妊娠の第１または第２三半期であることが好ましく、第１三半期であることが最も好ましい。さらに本発明のこの側面では、評価に母体年齢を含めることが好ましい。母体年齢は、胎児異数性（特に２１番染色体トリソミー）のリスク因子であることが知られている。妊娠している女性の年齢が高いほど、胎児は異数性（特に２１番染色体トリソミー）になりやすい（Ｓｎｉｊｄｅｒｓら１９９９、超音波産科婦人科学雑誌３（３）：１６７−７０）。
本発明のこの側面においては、生化学的マーカーおよび／または生物物理学的マーカーに加えて、プロ−ＥＰＩＬを決定することがさらに好ましい。例えば、前記対象の試料における、胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）、ＰＡＰＰ−Ａ、ｓＦｌｔ１、ＡＦＰ、遊離β−ｈＣＧ、インヒビンＡ、アクチビンＡ、ｓＥｎｇ、ｈＣＧ、非結合型エストリオール３および細胞を含まない胎児ＤＮＡから選択される１つ以上のバイオマーカーのレベルを決定する。好ましくは、プロ−ＥＰＩＬのレベルに加えて、さらに、前記対象の試料における胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）、ＰＡＰＰ−Ａおよび遊離β−ｈＣＧから選択される１つ以上のバイオマーカーのレベルを、より好ましくは、前記対象の試料における胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）、ＰＡＰＰ−Ａおよび遊離β−ｈＣＧから選択される２つ以上のバイオマーカーのレベルをさらに決定する。従って、参照マーカーパネルには、
ａ）ＰＡＰＰ−Ａおよびプロ−ＥＰＩＬ
ｂ）遊離β−ｈＣＧおよびプロ−ＥＰＩＬ
ｃ）ＰｌＧＦおよびプロ−ＥＰＩＬ
ｄ）ＰＡＰＰ−Ａおよび遊離β−ｈＣＧおよびプロ−ＥＰＩＬ
ｅ）ＰＡＰＰ−ＡおよびＰｌＧＦおよびプロ−ＥＰＩＬ
ｆ）遊離β−ｈＣＧおよびＰｌＧＦおよびプロ−ＥＰＩＬ
ｇ）ＰＡＰＰ−Ａおよび遊離β−ｈＣＧおよびＰｌＧＦおよびプロ−ＥＰＩＬ、が含まれる。ＰＡＰＰ−Ａおよび遊離β−ｈＣＧおよびＰｌＧＦおよびプロ−ＥＰＩＬの組み合わせが好ましい。２１番染色体トリソミーの場合には、プロ−ＥＰＩＬおよび遊離β−ｈＣＧが対照レベルよりも高く、かつ、ＰＡＰＰ−ＡおよびＰｌＧＦが対照レベルよりも低い。
プロ−ＥＰＩＬ（好ましくはこれに加えて母体年齢）または上述したマーカーパネル（好ましくはこれに加えて母体年齢）に加えて、生物物理学的なパラメーター、好ましくは、頂部浮腫（ＮＴ）などの超音波マーカーも診断／リスク評価に含まれる。胎児ＮＴの厚みは、２１番染色体トリソミーや他の胎児異数性のリスクと関連がある（ニコライデスＫ、２０１１、親の診断（Ｐｒｅｎａｔ  Ｄｉａｇｎ）３１：７−１５）。本発明のこの側面の特に好ましい態様では、ＰＡＰＰ−Ａおよび遊離β−ｈＣＧおよびＰｌＧＦおよびプロ−ＥＰＩＬのレベルを決定し、対照レベルや母体年齢および胎児ＮＴ厚由来の情報と比較することが、異数性、好ましくは２１番染色体トリソミーの診断／評価に含まれる。
この側面の方法においては、少なくとも
ｉ）プロ−ＥＰＩＬ、遊離β−ｈＣＧおよびＰｌＧＦのレベル、もしくは
ｉｉ）プロ−ＥＰＩＬ、遊離β−ｈＣＧ、ＰＡＰＰ−ＡおよびＰｌＧＦのレベル、もしくは
ｉｉｉ）プロ−ＥＰＩＬ、遊離β−ｈＣＧ、ＰｌＧＦのレベルおよび超音波マーカー、好ましくは頂部浮腫、もしくは
ｉｖ）プロ−ＥＰＩＬ、遊離β−ｈＣＧ、ＰＡＰＰ−Ａ、ＰｌＧＦのレベルおよび超音波マーカー、好ましくは頂部浮腫、
を決定することが好ましい。
この側面では、バイオマーカーおよび／または該超音波マーカーのレベルに基づく尤度比のセットを決定することが好ましい。尤度比を決定するためにはガウス解析を行うことが好ましい。
さらに、
ａ）出生前の胎児の、１３番染色体トリソミー、１８番染色体トリソミーおよび２１番染色体トリソミーに関する妊娠中の女性の事前リスク、
ｂ）前記尤度比のセット
に基づく最終リスクを決定してもよい。
事前リスクは、母体年齢などの母体の既往歴に関する情報に基づくものであってもよい。そのため事前リスク（例えば、オッズで表される）は、例えば、母体年齢に固有の確率から導き出してもよく、その後、疾患のある妊娠および健常妊娠における生化学的マーカー（場合によっては他のマーカー）の対数ガウス分布から求めた尤度比（ＬＲ）と掛け合わせる。
【００７４】
本発明はさらに、一側面において、胎児における染色体異常、好ましくは異数性、より好ましくは２１番染色体トリソミー、１８番染色体トリソミー、１３番染色体トリソミー、最も好ましくは２１番染色体トリソミーのリスクを決定する方法に関し、この方法は、
ａ）妊娠中の女性対象から採取した１つ以上の血液試料における初期胎盤インスリン様ペプチド（プロ−ＥＰＩＬ）、胎盤成長因子（Ｐ１ＧＦ）、（および必要に応じて妊娠関連血漿プロテインＡ（ＰＡＰＰ−Ａ））および遊離ヒト絨毛ゴナドトロピン（遊離β−ｈＣＧ）のレベルを決定すること；
ｂ）必要に応じて前記胎児の超音波マーカーを決定すること、および
ｃ）プロ−ＥＰＩＬ、Ｐ１ＧＦ、（必要に応じてＰＡＰＰ−Ａ）、および遊離β−ｈＣＧの測定レベルを使って前記胎児における染色体異常のリスクを決定すること、を含む。
好ましくは、加えて、胎児の超音波マーカーを１つまたは１つ以上決定し、プロ−ＥＰＩＬ、Ｐ１ＧＦ、（必要に応じてＰＡＰＰ−Ａ）、遊離β−ｈＣＧのレベル、および１つ以上の胎児超音波マーカーを使って、染色体異常のリスクを決定する。超音波マーカーは好ましくは頂部浮腫である。本明細書中においては、ＰＡＰＰ−Ａを追加で決定することが好ましい。
この側面の方法では、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、インヒビンＡ、ｈＣＧ、非結合型エストリオール３および細胞を含まない胎児ＤＮＡから選択される、少なくとも１つのさらなる生化学的マーカーのレベルを決定し、プロ−ＥＰＩＬ、Ｐ１ＧＦ、ＰＡＰＰ−Ａ、遊離β−ｈＣＧのレベルおよび少なくとも１つの追加的な生化学的マーカーのレベルを使って、胎児における染色体異常のリスクを決定してもよい。
この側面では、好ましくは、妊娠第１三半期または第２三半期（好ましくは第１三半期）の妊娠中の対象から１つ以上の生物学的試料を採取する。好ましくは妊娠１０〜１９週の妊娠中の対象から、より好ましくは妊娠１１〜１３週の対象から１つ以上の生物学的試料を採取する。
この側面の一態様においてリスクの決定には、胎児に染色体異常が発生する女性対象の事前リスクと、プロ−ＥＰＩＬ、Ｐ１ＧＦ、ＰＡＰＰ−Ａ、および遊離β−ｈＣＧの量に基づく尤度比のセットに基づいて最終リスクを算出決定することが含まれる。尤度比の決定には多変量ガウス解析を行うことが好ましい。この方法ではさらに、１つ以上の母体既往歴パラメーター、少なくとも好ましくは母体年齢、に関する尤度比を使用してもよい。
【００７５】
本明細書でこれまでに概要を示してきたように、本発明の方法は、生化学的マーカーおよび生物物理学的マーカーのレベルに基づいて、妊娠中の対象が身ごもっている胎児が染色体異常をもっているリスクの決定に使用することができる。
【００７６】
本発明はまた、妊娠中の女性対象または前記対象の出生前の胎児における出生前疾患または状態を、好ましくは胎児における染色体異常のリスクを決定するための装置に関し、この装置は、
妊娠中の対象から得られた１つ以上の血液試料に含まれているプロ−ＥＰＩＬ、Ｐ１ＧＦ、ＰＡＰＰ−Ａ、および遊離β−ｈＣＧの量を入力するためのデータ入力手段；および、これらプロ−ＥＰＩＬ、Ｐ１ＧＦ、ＰＡＰＰ−Ａ、および遊離β−ｈＣＧの量を使って胎児における染色体異常のリスクを決定するための計算手段、を含む。
好ましくは、この装置はさらに、妊娠中の対象から得られた１つ以上の血液試料に含まれているアルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、インヒビンＡ、ｈＣＧ、非結合型エストリオール３および細胞を含まない胎児ＤＮＡの量のうちの少なくとも１つを入力するためのデータ入力手段；および、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、インヒビンＡ、ｈＣＧ、非結合型エストリオール３および細胞を含まない胎児ＤＮＡの量のうちの少なくとも１つと、プロ−ＥＰＩＬ、Ｐ１ＧＦ、ＰＡＰＰ−Ａ、および遊離β−ｈＣＧの量を使って、胎児における染色体異常のリスクを決定するための計算手段を含む。
【００７７】
本発明はまた、本発明の方法に基づく、妊娠中の対象の詳細な既往歴にも関する。例えば本発明は、妊娠中の女性対象の詳細な既往歴に関し、詳細な既往歴には、胎児における染色体異常の決定に関する情報が含まれ、ここで情報には、妊娠中の対象から得られた１つ以上の血液試料に含まれているプロ−ＥＰＩＬ、Ｐ１ＧＦ、ＰＡＰＰ−Ａ、および遊離β−ｈＣＧのレベルが含まれ、かつ、詳細な既往歴はコンピューターで読み取り可能な媒体に保存される。
【００７８】
本発明はまた、本発明の任意の方法における、抗プロ−ＥＰＩＬ抗体の使用に関する。
【００７９】
添付の実施例および図は、本発明をより詳細に説明するための使用されるものであり、本発明は前記実施例および図に限定されるものではない。
【００８０】
本明細書で引用した全ての特許文献および非特許文献は、参照することにより、その全体が本明細書に組み入れられる。
配列
【００８１】
配列番号１：プロ−ＥＰＩＬの配列（ユニプロットＫＢ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ）／スイスプロット（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ）受入番号Ｑ１４６４１）。
2017516119.tif 000002
【実施例】
【００８２】
抗体の標識
アッセイでは、ＥＰＩＬ  Ｃ鎖の９８〜１０８領域を標的とするモノクローナル抗体ＥＰＩＬ  １５（国際公開第２００９／１３３０８８号Ａ１）およびＥＰＩＬ  Ａ鎖の１２５〜１３７領域を標的とするモノクローナル抗体ＥＰＩＬ０２（国際公開第２００９／１３３０８８号Ａ１）をそれぞれ、シアニン５．５（ＧＥヘルスケアＵＫ有限会社）およびルミ（Ｌｕｍｉ）４（登録商標）−Ｔｂ（ルミフォア（Ｌｕｍｉｐｈｏｒｅ）社、リッチモンド、カナダ）に結合させた。結合反応は、製造業者が規定した結合手法に従って行った。
【００８３】
実施例１：２つのモノクローナル抗体を使ったプロ−ＥＰＩＬアッセイの開発
プロ−ＥＰＩＬを検出するために、時間分解増幅クリプテート発光（Ｔｉｍｅ  Ｒｅｓｏｌｖｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｃｒｙｐｔａｔｅ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ、ＴＲＡＣＥ）技術（マティス、１９９３。臨床化学（Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ）３９（９）：１９５３−９）を使った均一サンドイッチ蛍光免疫測定法を開発した。
【００８４】
ルミ４（登録商標）−Ｔｂ結合抗体とシアニン５．５結合抗体溶液は使用する前に、アッセイ緩衝液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７）、０．１％  ウシ胎仔血清（プロテアーゼを含まない）、０．２ｍｇ／ｍＬ  マウスＩｇＧ）を使い、それぞれ０．３μｇ／ｍＬおよび５μｇ／ｍＬに希釈した。組換えヒトプロ−ＥＰＩＬ（アブノバ（Ａｂｎｏｖａ）、台湾、参照番号Ｈ００００３６４１−Ｐ０１）を正常ヒト血清で希釈し、プロ−ＥＰＩＬの標準物質とした。免疫アッセイは、５０μＬの試料／検量用試料、５０μＬのシアニン５．５結合抗体溶液および５０μＬのルミ４（登録商標）−Ｔｂ結合抗体溶液を３７℃で、Ｂ．Ｒ．Ａ．Ｈ．Ｍ．Ｓ  ＫＲＹＰＴＯＲコンパクトＰＬＵＳ装置（サーモサイエンティフィック  Ｂ．Ｒ．Ａ．Ｈ．Ｍ．Ｓ  ＧｍｂＨ、ヘニヒスドルフ／ベルリン、ドイツ）を使い、製造業者の説明に従ってインキュベートすることによって行った。アッセイの反応時間は５９分とした。Ｂ．Ｒ．Ａ．Ｈ．Ｍ．Ｓ  ＫＲＹＰＴＯＲコンパクトＰＬＵＳ装置を使い、７０７および６２０ｎｍの同時二波長測定により特定の蛍光（ＲＦＵ）を測定した。
【００８５】
実施例２：アッセイの用量反応曲線
前述したように、組換えプロ−ＥＰＩＬを標準物質として使い、モノクローナル免疫アッセイの用量反応曲線を作成することができた。典型的な用量反応曲線を図１に示す。
【００８６】
実施例３：出生前疾患におけるプロ−ＥＰＩＬ
研究対象集団
プロ−ＥＰＩＬが病的な妊娠の有用なマーカーであるか否かを判断するために、上述した、プロ−ＥＰＩＬに関する均一サンドイッチ蛍光免疫測定法を用い、正常妊娠の女性１９８人（第１、第２および第３三半期）、妊娠糖尿病（ＧＤＭ）に罹っている１１人の妊婦、２１番染色体トリソミーを発症している２７人の妊婦、および子宮内発育不全の状態にある４３人の妊婦（第１、第２および第３三半期）の血清試料におけるプロ−ＥＰＩＬを評価した。特定のプロ−ＥＰＩＬアッセイは、組換えヒトプロ−ＥＰＩＬを使って較正した。
【００８７】
試料は、第１、第２および第３三半期の妊婦が検診のために病院を訪れたときに慣習的に採取した。妊娠中の女性は全員、書面による同意書に署名し、複数の病院検査室倫理委員会による認可を受けた。
【００８８】
測定
プロ−ＥＰＩＬをＢ．Ｒ．Ａ．Ｈ．Ｍ．Ｓ  ＫＲＹＰＴＯＲコンパクトＰＬＵＳ装置（サーモ・サイエンティフィクＢ．Ｒ．Ａ．Ｈ．Ｍ．Ｓ  ＧｍｂＨ、ヘニッヒスドルフ／ベルリン、ドイツ）を使った全自動のサンドイッチ免疫アッセイシステムで検出した。この無作為アクセス分析器は、２つの蛍光標識試薬間の非放射性転移に基づいた高感度な時間分解増幅クリプテート発光（Ｔｉｍｅ  Ｒｅｓｏｌｖｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｃｒｙｐｔａｔｅ  Ｅｍｍｉｓｓｉｏｎ、ＴＲＡＣＥ）技術を利用するものである。完全自動化サンドイッチ免疫アッセイシステムで検出した。プロ−ＥＰＩＬを検出するための全自動アッセイは本質的に、前述したＥＰＩＬのＣ鎖およびＥＰＩＬのＡ鎖に特異的に結合する２つのモノクローナル抗体を使用するサンドイッチ蛍光アッセイに基づくものである。特定のプロ−ＥＰＩＬアッセイを組換えヒトプロ−ＥＰＩＬで較正した。ＢＲＡＨＭＳプロ−ＥＰＩＬ  ＫＲＹＰＴＯＲアッセイの測定範囲は２〜８３５ｎｇ／ｍＬであった（図１）。定量の限界（機能感度）は４ｎｇ／ｍＬであった。プロ−ＥＰＩＬの濃度が２５．５ｎｇ／ｍＬの場合、アッセイ内でのおよびアッセイ間での変動はそれぞれ、１．２％および５．７％であった。
【００８９】
妊娠糖尿病のリスクを決定するために、第１および第２三半期の妊婦から採取した試料におけるプロ−ＥＰＩＬを測定した。
【００９０】
胎児の染色体異常のリスクを決定するために、第１三半期の妊婦から採取した試料を使い、以下のパラメーターを測定した：（ｉ）ＰＡＰＰ−Ａ、遊離β−ｈＣＧ、（ｉｉ）ＰＡＰＰ−Ａ、遊離β−ｈＣＧ、ＰｌＧＦ（ｉｉｉ）ＰＡＰＰ−Ａ、遊離β−ｈＣＧ、プロ−ＥＰＩＬ。検出率および偽陽性率は、これらのバイオマーカーを組み合わせるアルゴリズムによって決定した。
【００９１】
妊娠中の女性に胎児発育不全が発症するリスク評価を分析するためには、前記対象から第１、第２および第３三半期の間に採取した試料における以下のパラメーター、つまりＰｌＧＦおよびプロ−ＥＰＩＬを測定した。検出率および偽陽性率は、これらのバイオマーカーを組み合わせるアルゴリズムによって決定した。
【００９２】
統計分析
健常な集団と各胎児異数性の集団の中央値を決定することによって、胎児異数性のリスクを決定するための数学的アルゴリズムを算出する。その知見を標準化するために、ＰＡＰＰ−Ａ、遊離β−ｈＣＧ、ＰｌＧＦおよびプロ−ＥＰＩＬはＭｏＭで表す。症例および対照についてのプロ−ＥＰＩＬのＭｏＭの箱ひげ図を作成した。次いで回帰分析を行い、プロ−ＥＰＩＬのＭｏＭと遊離β−ｈＣＧのＭｏＭ、ＰＡＰＰ−ＡのＭｏＭとＰｌＧＦのＭｏＭとの間の関連の有意差を決定した。同様に、ＮＴの測定値は、予想される妊娠の正規平均からの差（デルタ値）として表し、次いで、回帰分析を行って、プロ−ＥＰＩＬのＭｏＭとデルタＮＴとの間の関連の有意差を決定した。
【００９３】
プロ−ＥＰＩＬ、ＰｌＧＦ、ＰＡＰＰ−Ａ、および／または遊離β−ｈＣＧのＭｏＭ測定値は、生化学的マーカー（プロ−ＥＰＩＬ、ＰｌＧＦ、ＰＡＰＰ−Ａ、または遊離β−ｈＣＧなど）のＭｏＭ測定値を、同じ人種の健常妊娠の妊娠中の女性群から得られた各マーカーの中央値で割ることで、それぞれの人種について補正することができる。必要に応じて、生化学的マーカー（プロ−ＥＰＩＬ、ＰｌＧＦ、ＰＡＰＰ−Ａ、または遊離β−ｈＣＧなど）のＭｏＭ測定値を、喫煙している健常妊娠の妊娠中の女性群から得られた各マーカーの中央値で割ることで、プロ−ＥＰＩＬ、ＰｌＧＦ、ＰＡＰＰ−Ａ、および／または遊離β−ｈＣＧのＭｏＭ測定値を喫煙に関して補正する。
事前リスク（オッズで表される）は母体年齢に固有の確率から導き出され、そして、疾患のある妊娠および健常妊娠における生化学的マーカーの対数ガウス分布から求めた尤度比（ＬＲ）と掛け合わせる。ＰＡＰＰ−Ａ、遊離β−ｈＣＧ、ＰｌＧＦおよびプロ−ＥＰＩＬの組み合わせについては、疾患のある妊娠と健常妊娠との対数ＭｏＭ値間の相関係数を決定する。
リスク評価を実施するための統計処理は、健常妊娠ならびにＧＤＭ群およびＦＧＲ群の中央値を決定することによって計算される。各生化学的ＭｏＭについて計算する。その後、多変量ガウス解析を実施して尤度比を決定する。
マン・ホイットニーのＵ検定を行い、各アウトカム群の中央ＭｏＭ値の対照からの有意差を決定する。
【００９４】
結果
正常妊娠の女性では、プロ−ＥＰＩＬ濃度と妊娠期間との間に相関関係があった（ｒ＝０．８１；ｐ＜０．０００１）。測定した血清プロ−ＥＰＩＬ濃度の中央値は、第１、第２および第３三半期のそれぞれで、１６．２、３２．４および７６．２ｎｇ／ｍｌであった（図２）。
【００９５】
健常群では、プロ−ＥＰＩＬ  ＭｏＭの平均対数は−０．００１で、標準偏差（ＳＤ）は０．２４１であった。プロ−ＥＰＩＬ  ＭｏＭの対数と遊離β−ｈＣＧ  ＭｏＭの対数との間には有意な関連があったが（ｒ＝０．３９２、ｐ＜０．０００６）、ＰＡＰＰ−Ａ  ＭｏＭの対数（ｐ＝０．４０７）、ＰｌＧＦ  ＭｏＭの対数（ｐ＝０．０９９）およびデルタＮＴ（ｐ＝０．８５５）との間には関連性は認められなかった。
【００９６】
２１番染色体トリソミーの群では、プロ−ＥＰＩＬの中央値のＭｏＭ（１．７１ＭｏＭ）は、対照群よりも有意に高かった（ｐ＜０．０００１）（図３）。
【００９７】
２１番染色体トリソミー妊娠では、プロ−ＥＰＩＬ  ＭｏＭの平均対数は０．２２９で、ＳＤは０．１７７であった。プロ−ＥＰＩＬ  ＭｏＭの対数と遊離β−ｈＣＧ  ＭｏＭの対数（ｐ＝０．６２３）、ＰＡＰＰ−Ａ  ＭｏＭの対数（ｐ＝０．４９０）、ＰｌＧＦ  ＭｏＭの対数（ｐ＝０．６５２）およびデルタＮＴ（ｐ＝０．０８１）との間に有意な関連性はなかった。
【００９８】
２１番染色体トリソミーのリスクを評価するための多パラメーター解析（リスクに関するカットオフは２５０分の１とした）を表１ａおよび１ｂに示す。リスクの算出にプロ−ＥＰＩＬを含めると、検出率および偽陽性率の両方に影響が及んだ。第１三半期の生化学的パラメーターにプロ−ＥＰＩＬを加えるとＦＰＲが改善した（ＦＰＲ：９．６％およびＤＲ：９６．３％）（表１ａ）。さらに、組み合わせ試験でＰＡＰＰ−Ａをプロ−ＥＰＩＬに置き換えると、ＤＲは１００パーセントに達した（ＦＰＲ：２．７％およびＤＲ：１００％）（表１ｂ）。
【００９９】
第１および第２三半期のＧＤＭ群では、プロ−ＥＰＩＬの中央値のＭｏＭは（それぞれ０．３１および０．２２ＭｏＭ）、健常妊娠群のＭｏＭ（０．９５および１．０７ＭｏＭ）よりも有意に低かった（ｐ＝０．００１７およびｐ＝０．０００５）（図４）。
【０１００】
第２および第３三半期のＦＧＲ群では、プロ−ＥＰＩＬの中央値のＭｏＭ（それぞれ０．６６および０．６３ＭｏＭ）は、対照群（１．０７および１．０５ＭｏＭ）と比較して有意に低かった（ｐ＝０．００１８およびｐ＝０．００２８）（図５）。
【０１０１】
ＦＧＲのリスクを評価するための多パラメーター解析から、第２および第３三半期にＰｌＧＦおよびプロ−ＥＰＩＬを決定することで検出率（ＤＲ）がそれぞれ５７％および６７％と最も高くなるという特徴を示すことが分かった（表２）。対して、ＰｌＧＦだけを測定した場合のＤＲはそれぞれ３３％および４７％、プロ−ＥＰＩＬだけを測定した場合のＤＲはそれぞれ３８％および３３％だった。
【表１ａ】
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【表１ｂ】
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【表２】
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【０１０２】
実施例４：出生前疾患におけるプロ−ＥＰＩＬ
実施例３の研究を以下の通りに展開した。
研究対象集団
【０１０３】
プロ−ＥＰＩＬが病的な妊娠の有用なマーカーであるか否かを判断するために、上述した、プロ−ＥＰＩＬに関する均一サンドイッチ蛍光免疫測定法をつかって、正常妊娠の女性２６７人（第１、第２および第３三半期）、妊娠糖尿病（ＧＤＭ）に罹っている１１人の妊婦（第１、および第２三半期）、２１番染色体トリソミーを発症している４７人の妊婦（第１、および第２三半期）、および子宮内発育不全の状態にある４３人の妊婦（第１、第２および第３三半期）の血清試料におけるプロ−ＥＰＩＬを評価した。特定のプロ−ＥＰＩＬアッセイは、組換えヒトプロ−ＥＰＩＬを使って較正した。
【０１０４】
結果
正常妊娠の女性では、プロ−ＥＰＩＬ濃度と妊娠期間との間に相関関係があった（ｒ＝０．８１；ｐ＜０．０００１）。測定した血清プロ−ＥＰＩＬ濃度の中央値は、第１、第２および第３三半期のそれぞれで、１６．２、３２．４および７６．２ｎｇ／ｍｌであった（図２）。
【０１０５】
第１三半期の健常群では、プロ−ＥＰＩＬ  ＭｏＭの平均対数は−０．００１で、標準偏差（ＳＤ）は０．２４１であった。プロ−ＥＰＩＬ  ＭｏＭの対数と遊離−ｈＣＧ  ＭｏＭの対数との間には有意な関連があったが（ｒ＝０．３９２、ｐ＜０．０００６）、ＰＡＰＰ−Ａ  ＭｏＭの対数（ｐ＝０．４０７）、ＰｌＧＦ  ＭｏＭの対数（ｐ＝０．０９９）およびデルタＮＴ（ｐ＝０．８５５）との間には関連性は認められなかった。
【０１０６】
第１三半期の２１番染色体トリソミーの群では、プロ−ＥＰＩＬの中央値のＭｏＭ（１．７１ＭｏＭ）は、対照群よりも有意に高かった（ｐ＜０．０００１）（図３）。
【０１０７】
２１番染色体トリソミー妊娠では、プロ−ＥＰＩＬ  ＭｏＭの平均対数は０．２２９で、ＳＤは０．１７７であった。プロ−ＥＰＩＬ  ＭｏＭの対数と遊離β−ｈＣＧ  ＭｏＭの対数（ｐ＝０．６２３）、ＰＡＰＰ−Ａ  ＭｏＭの対数（ｐ＝０．４９０）、ＰｌＧＦ  ＭｏＭの対数（ｐ＝０．６５２）およびデルタＮＴ（ｐ＝０．０８１）との間に有意な関連性はなかった。
【０１０８】
２１番染色体トリソミーのリスクを評価するための多パラメーター解析（リスクに関するカットオフは２５０分の１とした）を表１ａおよび１ｂに示す。リスクの算出にプロ−ＥＰＩＬを含めると、検出率および偽陽性率の両方に影響が及んだ。第１三半期の生化学的パラメーターにプロ−ＥＰＩＬを加えるとＦＰＲが改善した（ＦＰＲ：９．６％およびＤＲ：９６．３％）（表１ａ）。さらに、組み合わせ試験でＰＡＰＰ−Ａをプロ−ＥＰＩＬに置き換えると、ＤＲは１００パーセントに達した（ＦＰＲ：２．７％およびＤＲ：１００％）（表１ｂ）。
【０１０９】
第２三半期の２１番染色体トリソミーの群では、プロ−ＥＰＩＬの中央値のＭｏＭ（１．６２ＭｏＭ）は、正常妊娠群のＭｏＭ（１．０７ＭｏＭ）よりも有意に高かった（ｐ＝０．０００７）（図６）。
【０１１０】
第１および第２三半期のＧＤＭ群では、プロ−ＥＰＩＬの中央値のＭｏＭは（それぞれ０．３１および０．２２ＭｏＭ）、健常妊娠群のＭｏＭ（０．９５および１．０７ＭｏＭ）よりも有意に低かった（ｐ＝０．００１７およびｐ＝０．０００５）（図４）。
【０１１１】
第２および第３三半期のＦＧＲ群では、プロ−ＥＰＩＬの中央値のＭｏＭ（それぞれ０．６６および０．６３ＭｏＭ）は、対照群（１．０７および１．０５ＭｏＭ）と比較して有意に低かった（ｐ＝０．００１８およびｐ＝０．００２８）（図５）。
【０１１２】
ＦＧＲのリスクを評価するための多パラメーター解析から、第２および第３三半期にＰｌＧＦおよびプロ−ＥＰＩＬを決定することで検出率（ＤＲ）がそれぞれ５７％および６７％と最も高くなるという特徴を示すことが分かった（表２）。対して、ＰｌＧＦだけを測定した場合のＤＲはそれぞれ３３％および４７％、プロ−ＥＰＩＬだけを測定した場合のＤＲはそれぞれ３８％および３３％だった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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