(57)【要約】今日、手術、放射線療法、および化学療法などの組み合わせ療法の現在の進歩にもかかわらず、悪性度の高い癌は致死性のままである。癌幹細胞様細胞（CSC）が、化学療法耐性の原因であり、したがって、有望な治療標的に相当する可能性がある。この状況において、本発明者らは、CSCの自己複製および生存を支持する不可欠な細胞内経路を同定した。より正確には、本発明者らは、サイトカイン共受容体GP130が、アペリン/APJシグナル伝達のための共受容体として作用すること、ならびに、アペリンとAPJ/GP130との相互作用が、Akt/mTORおよびSTAT3転写因子を含む二つのシグナル伝達経路を活性化し、それによりCSCの生存および自己複製を促進することを示した。その結果、本発明者らは、神経膠芽腫などのCSCを含有する腫瘍に罹患している患者を治療するために、これらの経路を遮断することを提案する。別の局面において、本発明は、神経膠芽腫に罹患している対象の生存率を評定するためのアペリン発現レベルの使用に関連する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、癌幹細胞（CSC）特性を阻害することができる化合物を同定するための方法：
（a）共受容体APJおよびGP130を発現する細胞を、アペリンポリペプチドおよび候補化合物と接触させる工程、
（b）工程（a）で得られた細胞におけるアペリン依存性シグナル伝達経路の活性化レベルを検出する工程、
（c）該活性化レベルを、アペリンポリペプチドとのみ接触させた該細胞の活性化レベルと比較する工程。
【請求項２】
候補化合物が、該化合物の存在下でアペリン依存性シグナル伝達経路の活性化レベルが減弱する場合に選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
検出する工程（b）が、APJ依存性シグナル伝達経路の活性化レベルの検出および／または測定を含む、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
APJ受容体の活性化が、好ましくは生物発光共鳴エネルギー移動（BRET）により、APJへのβ-アレスチン2の動員を調査することによって評価される、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
前記APJ依存性シグナル伝達経路が、Akt/mTORシグナル伝達経路である、請求項3に記載の方法。
【請求項６】
検出する工程（b）が、GP130依存性シグナル伝達経路の活性化レベルの検出および／または測定を含む、請求項1または2に記載の方法。
【請求項７】
検出する工程（b）が、共受容体APJおよびGP130の相互作用の検出を含む、請求項1または2に記載の方法。
【請求項８】
検出する工程（b）が、
（b1）アペリン依存的なGP130依存性シグナル伝達経路の活性化レベルを測定する工程、および
（b2）これらの細胞におけるアペリン依存的なAPJ依存性シグナル伝達経路の活性化レベルを測定する工程
を含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
検出する工程（b）が、
（b1）前記細胞におけるアペリン依存的なSTAT3シグナル伝達経路の活性化レベルを測定する工程、および
（b2）前記細胞におけるアペリン依存的なAPJへのβ-アレスチン2の動員を測定する工程
を含む、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記CSC特性が、分化能、自己複製、および生存である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
CSC特性を阻害するためのインビトロの方法であって、これらの細胞を、
（a）アペリンのその共受容体APJおよび／もしくはGP130に対する相互作用を阻害する、または
（b）共受容体APJおよびGP130の相互作用を阻害する、または
（c）mTORシグナル伝達経路およびSTAT3シグナル伝達経路を同時に阻害する
ことができる化合物と接触させる工程を含む、前記方法。
【請求項１２】
前記化合物が、アンチセンス核酸、デコイ受容体、アプタマー、抗体、および低分子アンタゴニストからなる群より選択される、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
CSC特性、および好ましくはGSC特性の阻害による癌の治療のための使用のための、
（a）アペリンのその共受容体APJおよび／もしくはGP130に対する相互作用を阻害する、または
（b）共受容体APJおよびGP130の相互作用を阻害する、または
（c）mTORシグナル伝達経路およびSTAT3シグナル伝達経路を同時に阻害する
ことができる、化合物。
【請求項１４】
アンチセンス核酸、デコイ受容体、アプタマー、抗体、および低分子アンタゴニストからなる群より選択される、請求項13に記載の使用のための化合物。
【請求項１５】
神経膠芽腫に罹患している対象の生存率を評定するための、アペリン発現レベルの使用。
【請求項１６】
前記発現レベルが、前記腫瘍の生検材料において測定される、請求項15に記載の使用。
【請求項１７】
以下の工程を含む、神経膠芽腫に罹患している対象の生存率を予測するためのインビトロの方法：
（a）腫瘍の生物学的試料におけるアペリンの発現レベルを決定する工程、
（b）該発現レベルを参照値と比較する工程、
（c）該比較から、該対象が高い生存率または低い生存率を有することを結論づける工程。
【請求項１８】
試験試料におけるアペリンの発現レベルが参照値よりも有意に高い場合に、高い生存率が予測されることになる、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
前記参照値が、非腫瘍脳組織におけるアペリンの基底発現レベルに相当する、請求項17または18に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
初期癌の発生は、この疾患を開始して持続することができる癌幹細胞（CSC）（「腫瘍開始細胞」または「腫瘍サイドポピュレーション」または「癌幹細胞様細胞（cancer stem-like cell）」としても公知である）と称される細胞の希少な集団によることが、増大する証拠によって示唆されている。これらの細胞は、実際に、腫瘍形成、癌転移、および特定の癌における癌再発を担っていることが実証されている。癌幹細胞は、自己複製能力を有し、複数の細胞タイプに分化することができるが、自己複製と分化能との間の平衡が自己複製の増強に向かってシフトして分化能力が限定されている。
【０００２】
従来の化学療法および放射線療法は、腫瘍の大部分を形成する（が、腫瘍を再生することはできない）、分化した細胞または分化している細胞を殺傷することが公知である。しかし、癌幹細胞の集団は、前記治療によって影響を受けないままであり、多くの場合疾患の回帰を引き起こす。
【０００３】
この状況において、抗癌療法は、優先的にCSCに影響を及ぼす戦略を含むことが不可避である。実際のところ、癌幹細胞を標的とすることによって、悪性度が高く切除不可能な腫瘍を有する患者を治療すること、ならびに腫瘍の転移および再発を予防することが可能であろう。
【０００４】
さらに、選択的な様式で、すなわち、非癌性または正常の幹細胞を温存しながらCSCを標的とする分子の同定が、副作用をほとんど有さない新たな抗癌薬物を提供するために重大である。
【０００５】
したがって、癌幹細胞の自己複製および生存に選択的に関係している経路を同定して検証することが重要である。しかし、胚幹細胞または成体幹細胞の特性の基となる複数の経路が既に解明されてきているが、癌幹細胞の自己複製および生存については、ほとんどの経路が同定されていない。
【０００６】
多形性神経膠芽腫（GBM）は、成人における中枢神経系の最も頻繁なかつ悪性の原発腫瘍である（欧州および米国において60 000症例／年）。GBM腫瘍は、神経膠芽腫幹細胞様細胞（GSC）と呼ばれる、腫瘍を自己複製して維持する排他的な能力を有する、自己持続細胞の貯蔵所を構成する細胞の小さな画分に由来することが、提唱されている（Singh et al, 2003）。脳腫瘍の個体発生にもかかわらず、GSCは、放射線療法に対する耐性に関与し、腫瘍の回帰および高悪性度に寄与する可能性がある（Bao et al, 2006）。さらに、GSCレベルの変化は、神経膠腫の実験モデルにおいて腫瘍成長に影響を及ぼす（Piccirillo et al, 2006）。この疾患には非常に少ない治療プロトコルしか存在せず、大きな臨床努力にもかかわらず、診断時からの中央生存率は12〜15か月の間の範囲であり、患者の3％より少しが、5年より長く生存する（Fisher et al, 2007）。
【発明の概要】
【０００７】
このような状況において、本発明者らは、CSC（特にGSC）の自己複製および生存を特異的に調節する経路を同定した。本発明者らは、次に、これらの経路を特異的に遮断できる化合物をスクリーニングすることを提案し、該化合物は、軽微な副作用を伴って、悪性度の高い腫瘍を有する患者を治療するために効率的である。
【０００８】
より正確には、本発明者らは、GSCなどの癌幹細胞様細胞の自己複製および生存におけるAkt/mTORシグナル伝達経路とSTAT3シグナル伝達経路との間の不可欠な相互作用を、初めて強調する。これらの経路は、APJおよびGP130膜共受容体を通して作用する、内皮から産生されたアペリンによって活性化される。以下の結果により、アペリン/APJ/Gp130シグナル伝達の結びつきが、腫瘍の発生および進行を持続させるニッチ特異的シグナルとして作用することが示され、アペリンが神経膠芽腫において薬物となる可能性がある（druggable）パラクライン因子であることが示唆される。実際のところ、GSCにおいてアペリンのその共受容体APJ/GP130に対するタンパク質相互作用を減弱させる（それによりAkt/mTor経路およびSTAT3経路を阻害する）化合物は、それらのアポトーシスをもたらし、かくして腫瘍の進行および再発を抑制する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】セクレトーム内容物の解析。
【図２−１】内皮によるアペリンの産生はGSCの完全性を調節する。Ａ．脳内皮細胞（EC）および患者由来GSC#1から調製したmRNAにおける、アペリンおよび対照としてのアクチンについてのRT-PCR。Ｂ．陽性および陰性の鋳型（それぞれ、C+およびC-）における、ならびに、HEK-293T（293T）、EC、およびGSC#1（TG1）の培養上清（CM）におけるアペリン分泌をELISAにより測定した。Ｃ．完全培地（NS34もしくはC）、欠乏培地（SF）、または特定されていない限り1μMの組み換えアペリンを補給したSF（アペリン）において増殖させたGSC#1の、視野あたりのニューロスフェア形成（NS/FOV）の定量。
【図２−２】内皮によるアペリンの産生はGSCの完全性を調節する。Ｄ．完全培地（NS34もしくはC）、欠乏培地（SF）、または特定されていない限り1μMの組み換えアペリンを補給したSF（アペリン）において増殖させたGSC#1の、視野あたりのニューロスフェア形成（NS/FOV）の定量。Ｅ．非サイレンシングsiRNA（sic）またはアペリンを標的とするsiRNAをECに受けさせ、3日後にRT-PCRによりアペリンmRNAレベルをチェックした。Ｆ．非サイレンシングshRNA（shC）またはアペリンを標的とするshRNAのいずれかを発現する安定なECを用いて、培養上清を調製し、分泌されたアペリンレベルをELISAにより概算した。Ｇ．対照またはアペリンを標的とするshRNAのいずれかを受けたECから調製したCMにおいて増殖させたGSC#1の、視野あたりのニューロスフェア形成（NS/FOV）の定量。
【図３】APJの発現プロファイル。Ａ．mRNAレベルを、RT-PCRにより16種のGSCにおいて、APJ、GP130、Sox2、ネスチン、Oct4、およびアクチンについて解析した。Ｂ．mRNAレベルを、RT-PCRにより、ニューロスフェアとして増殖させたか（NS）または分化を誘導させたか（分化）のいずれかのGSC#10において、APJ、GP130、Sox2、ネスチン、Oct4、およびアクチンについて解析した。Ｃ．APJ発現を、間接免疫蛍光法およびフローサイトメトリーにより、GSC NS（緑色）または分化（#、ピンク色）において測定した。アイソタイプ対照を青色で示す。Ｄ〜Ｆ．mRNAレベルを、示されたプライマーについてのRT-PCRにより、GBM細胞株（U87、U138、U251、およびLN229）、mockまたはAPJ-HAをトランスフェクトしたHEK-293T細胞（293T）、NSまたは分化のいずれかとして増殖させた、GBM、乳癌、肝臓癌から単離した癌幹細胞様細胞、ヒト正常造血幹細胞（HSC）およびヒト胎児星状細胞（F 星状）において解析した。
【図４−１】内皮アペリンは、mTORへのAPJシグナル伝達を通してGSCの完全性を維持する。Ａ〜Ｂ．示された時間、完全培地（NS34）、欠乏培地（SF）、内皮細胞培養上清（EC-CM）、またはアペリンを補給したSF（1μM、APLN）で処置したGSC#1における、Ser 473がリン酸化されたAkt（pAkt Ser）、pS6、全Akt、全S6、およびチューブリンについてのウエスタンブロット解析。あるいは、GSC#1に、非サイレンシングshRNA（shC）またはアペリンを標的とするshRNAから調製されたEC-CMを受けさせた。Ｃ〜Ｄ．GSC#1に、非サイレンシングsiRNA（siC）またはAPJを標的とするsiRNAを受けさせた。ノックダウン効率を、間接免疫蛍光法およびフローサイトメトリーにより概算し（C）、GSC#1を、示された時間、結果として生じたEC-CMと培養して、示された抗体を用いたウエスタンブロットにより解析した（D）。Ｅ．GSC#1を、EC-CMまたはアペリンでの刺激の45分前に、APJアンタゴニストで前処置し、タンパク質溶解物をウエスタンブロットにより解析した。Ｆ．（D）と同じsiRNAまたは（E）と同じ薬理学的APJ阻害剤で処置したGSC#1においてニューロスフェアアッセイを実施し、視野あたりのニューロスフェア数（NS/FOV）を定量した。データは、n＝3の実験についての平均＋標準誤差を表す。T-検定：＊P＜0.05；＊＊P＜0.01。
【図４−２】内皮アペリンは、mTORへのAPJシグナル伝達を通してGSCの完全性を維持する。Ｇ．（D）と同じsiRNAまたは（E）と同じ薬理学的APJ阻害剤で処置したGSC#1においてニューロスフェアアッセイを実施し、視野あたりの腫瘍塊形成（TS/FOV）およびトリパンブルー排除（生細胞％）を定量した。Ｈ〜Ｉ．GSCに、非標的化shRNA（shC）、ならびにAPJを標的とする2種のshRNA（shAPJ1およびshAPJ2）を安定にトランスフェクトし、ヌードマウスに移植した。触知可能な腫瘍の出現を、示された時間にスコア化した（H）。結果として生じた腫瘍由来の凍結切片を、血管（PECAM）、またはネスチンおよび核（DAPI）について染色した。両方の染色の定量を示す（I）。スケールバー：40μm。データは、n＝3の実験についての平均＋標準誤差を表す。T-検定：＊P＜0.05；＊＊P＜0.01。
【図５】内皮アペリンはGP130/STAT3活性化を誘発する。Ａ．示された時間、完全培地（NS34）、欠乏培地（SF）、内皮細胞培養上清（EC-CM）、またはアペリン（1μM）を補給したSFで処置したGSC#1における、pY-STAT3、pS-STAT3、および全STAT3についてのウエスタンブロット解析。Ｂ．GSC#1に、非サイレンシングsiRNA（sic）またはAPJを標的とするsiRNAを受けさせた。GSC#1を、EC-CMで処置して、示された抗体を用いたウエスタンブロットにより解析した（上のパネル）。あるいは、GSC#1に、非サイレンシングshRNA（shC）またはアペリンを標的とするshRNAから調製されたEC-CMを受けさせた（下のパネル）。Ｃ．非サイレンシングsiRNA（siC）またはGP130を標的とするsiRNAを受けたGSC#1を、3日後にEC-CMで刺激し、タンパク質溶解物を、示された抗体を用いたウエスタンブロットにより解析した。Ｄ．GSC#1を、EC-CMまたはアペリンでの刺激の45分前に、GP130遮断抗体で前処置し、タンパク質溶解物をウエスタンブロットにより解析した。Ｅ．（C）と同じsiRNAまたは（D）と同じGP130遮断抗体で処置したGSC#1においてニューロスフェアアッセイを実施した。
【図６Ａ】アペリンはGP130およびAPJを取り込む。mock、APJ発現プラスミド、GP130発現プラスミド、および両方をトランスフェクトしたHEK-293T細胞におけるSTAT3レポーター活性を、ルシフェラーゼベースのアッセイによって測定した。細胞は、ビヒクル（対照）、APJ阻害剤、またはGP130遮断抗体での45分の前処置に続いて、刺激しなかった（無刺激）か、またはアペリン（1μM）で6時間処置した。
【図６Ｂ】アペリンはGP130およびAPJを取り込む。mock、APJ発現プラスミド、GP130発現プラスミド、および両方をトランスフェクトしたHEK-293T細胞においてBRET解析を実施した。細胞には、示された時間、アペリン（1μM）を受けさせ、データを、1つの代表的な実験についてのΔmBRETとして示す。
【図６Ｃ】アペリンはGP130およびAPJを取り込む。APJ発現プラスミド、またはAPJ発現プラスミドおよびGP130発現プラスミドのいずれかをトランスフェクトしたHEK-293T細胞における、材料および方法に記載したような結合実験。
【図６Ｄ】アペリンはGP130およびAPJを取り込む。膜調製物（表面）または全溶解物のGSC#1における、材料および方法に記載したような結合実験。
【図６Ｅ】アペリンはGP130およびAPJを取り込む。GSCの皮下注射によって取得し、次いでPBSまたはAPJアンタゴニスト（MM54）のいずれかで処置した、神経膠芽腫異種移植マウスモデルの腫瘍体積の漸進的な変化。
【図７】CSC特性に関与するシグナル伝達経路の略図。本発明者らは、内皮から産生されたアペリンが、APJおよびGP130膜受容体を通じて作用し、その後、Akt/mTORおよびSTAT3細胞内シグナル伝達経路を活性化することを同定した。この分子ネットワークは、癌幹細胞様細胞において機能的であり、自己複製および生存を促進して、究極的にそれらの完全性を維持する。
【図８ａ】アペリン発現はヒト神経膠芽腫において上昇している。National Cancer InstituteのRepository for Molecular Brain Neoplasia Data（REMBRANDT）データベースに由来する、対照（非腫瘍）脳組織、星状細胞腫（世界保健機関[WHO]グレードII〜III）、および神経膠芽腫（GBM；WHOグレードIV）におけるアペリンmRNAレベル（APLN発現）を示す箱髭図。
【図８ｂ】アペリン発現はヒト神経膠芽腫において上昇している。間葉（mes）または前神経（proN）サブタイプのGBMにおけるアペリンmRNAレベルを示す箱髭図。
【図８ｃ】アペリン発現はヒト神経膠芽腫において上昇している。間葉（mes）または前神経（proN）サブタイプのGBMにおけるアペリンmRNAレベルを示す箱髭図。
【図８ｄ】アペリン発現はヒト神経膠芽腫において上昇している。GBM患者のみを含むREMBRANDTデータベース由来の患者サブグループに基づく、カプラン・マイヤー生存プロット。グラフ中、患者試料は、APLN低発現腫瘍（下方制御されているもの）およびAPLN高発現腫瘍（上方制御されているもの）に分けられている。プロットについて、すべてのGBMを見ることができる。
【図８ｅ】アペリン発現はヒト神経膠芽腫において上昇している。GBM患者のみを含むREMBRANDTデータベース由来の患者サブグループに基づく、カプラン・マイヤー生存プロット。グラフ中、患者試料は、APLNのコピー数に関して分けられている。プロットについて、すべてのGBMを見ることができる。
【図９ａ】APJの薬理学的阻害は腫瘍成長を減弱させる。GSCを、EC-CMまたはアペリン（Apln、1μmol.l-1、7分）の45分前に、APJアンタゴニスト（MM54、2μmol.l-1）で前処置し、タンパク質溶解物を、示された抗体でのウエスタンブロットにより解析した。対照は、完全培地（NS）およびマイトジェンフリー培地（MF）で増殖させたGSCを含む。
【図９ｂ】APJの薬理学的阻害は腫瘍成長を減弱させる。STAT3レポーター活性を、mock、APJ、Gp130、およびAPJ＋Gp130をトランスフェクトしたHEK-293Tにおいて、DMSOまたはMM54のいずれかとともにMFおよびAplnに6時間曝露して、測定した。データは、n＝3の実験についての平均＋標準誤差を表す。二元配置分散分析：＊P＜0.05；＊＊P＜0.01。
【図９ｃ】APJの薬理学的阻害は腫瘍成長を減弱させる。GSCを、DMSOまたはMM54の存在下でNS、EC-CM、およびAplnに曝露した。視野あたりの腫瘍塊形成（TS/FOV）もまた定量した。データは、n＝3の実験についての平均＋標準誤差を表す。二元配置分散分析：＊P＜0.05；＊＊P＜0.01。
【図９ｄ】APJの薬理学的阻害は腫瘍成長を減弱させる。ヌードマウスにGSCを異種移植し、ビヒクル（PBS）またはAPJアンタゴニスト（MM54、20μmol.l-1）の週2回の腹腔内投与を、4週目（矢印）に開始した。腫瘍体積を毎週、7週間にわたって測定した。データは、n＝3の実験についての平均＋標準誤差を表す。二元配置分散分析：＊P＜0.05；＊＊P＜0.01。
【図９ｅ】APJの薬理学的阻害は腫瘍成長を減弱させる。ビヒクルまたはMM54のいずれかで処置したGSC異種移植腫瘍由来の凍結切片を、Ki67（増殖マーカー）またはネスチンおよび核のいずれかとともに、血管（PECAM）について染色した。死細胞のパーセンテージを、TUNELによって概算した。両方の染色の定量を示す。データは、n＝3の実験についての平均＋標準誤差を表す。二元配置分散分析：＊P＜0.05；＊＊P＜0.01。
【図１０−１】Gp130はAPJシグナル伝達のための共受容体として作用する。ａ．Gp130およびAPJの発現を、GSC全細胞溶解物（TCL）または免疫沈降（IP）画分において抗APJ抗体を用いて評定した。免疫グロブリン（Ig）を対照として用いた。ｂ．Gp130およびAPJの会合を、抗APJ抗体および抗Gp130抗体を用いてDuoLinkを通して可視化した（赤色の点）。一次抗体の非存在下での染色（抗体なし）を示す。核をDAPIで染色した。スケールバー：40 um。ｃ．BRET解析を、mock、APJ、Gp130、およびAPJ＋Gp130をトランスフェクトして、アペリン（Apln、1μmol1、7分）で処置したHEK-293T細胞において実施した。方法に記載したように、データをΔmBRETとして表す。ｄ．GSCに、マイトジェンフリー培地（MF）、内皮細胞培養上清（EC-CM、示された時間）、またはAPLN（7分）での刺激の前に、非サイレンシングRNA（siC）またはGp130標的siRNA（siGp130）のいずれかを受けさせた。タンパク質溶解物を、示された抗体を用いたウエスタンブロットにより解析した。ｅ．あるいは、GSCを、EC-CMまたはAPLNの刺激（7分）の45分前に、抗Gp130遮断抗体（GP130 mAb）で前処置した。データは、n＝3の実験についての平均＋標準誤差を表す。T-検定：＊P＜0.05；＊＊P＜0.01；＊＊＊P＜0.001。
【図１０−２】Gp130はAPJシグナル伝達のための共受容体として作用する。ｆ〜ｈ．mock、APJ、Gp130、およびAPJ＋Gp130をトランスフェクトしたHEK-293T細胞におけるSTAT3レポーター活性を、ルシフェラーゼベースのアッセイによって測定した（g、i）。細胞を、MFまたはAplnで6時間処置した（f）。mockおよびAPJ＋Gp130をトランスフェクトしたHEK-293T細胞を、対照またはAplnが枯渇したEC-CMに曝露した（g）。あるいは、細胞を、抗Gp130遮断抗体または対照Igで前処置した（h）。データは、n＝3の実験についての平均＋標準誤差を表す。T-検定：＊P＜0.05；＊＊P＜0.01；＊＊＊P＜0.001。
【図１０−３】Gp130はAPJシグナル伝達のための共受容体として作用する。ｉ．siC、siAPJ、およびsiGp130を受けたGSCにおける、全Gp130および表面APJの発現のフローサイトメトリー解析。
【図１０−４】Gp130はAPJシグナル伝達のための共受容体として作用する。ｊ〜ｋ．siC GSCおよびsiGp130 GSCを、NS、EC-CM、およびAplnに曝露した（j、k）。細胞を、ネスチン（緑色）、Sox2（赤色）、および核（青色）の共焦点解析のために処理した。スケールバー：40 um（j）。視野あたりの腫瘍塊形成（TS/FOV）およびトリパンブルー排除（生細胞％）も定量した（k）。データは、n＝3の実験についての平均＋標準誤差を表す。T-検定：＊P＜0.05；＊＊P＜0.01；＊＊＊P＜0.001。
【図１０−５】Gp130はAPJシグナル伝達のための共受容体として作用する。ｌ〜ｍ．siC GSCおよびsiGp130 GSCを、IgおよびGp130 mAbで処置した（l、m）。細胞を、ネスチン（緑色）、Sox2（赤色）、および核（青色）の共焦点解析のために処理した。スケールバー：40 um（l）。視野あたりの腫瘍塊形成（TS/FOV）およびトリパンブルー排除（生細胞％）もまた定量した（m）。データは、n＝3の実験についての平均＋標準誤差を表す。T-検定：＊P＜0.05；＊＊P＜0.01；＊＊＊P＜0.001。
【図１１−１】内皮アペリンはGSCの生存を調節する。ａ．陽性鋳型（C＋）、マイトジェンフリー培地（MF）、ヒト脳内皮細胞（EC）およびGSCの培養上清（CM）におけるアペリン分泌をEIAにより測定した。アペリンおよびアクチンのRT-PCRもまた、ECおよびGSCについて示す。ｂ．完全培地（NS）、MF、EC-CM、または組み換えアペリンのみを含有するMF（Apln、1μmol.l-1）において増殖させたGSCにおける、ネスチン（緑色）、Sox2（赤色）、および核（DAPI、青色）の共焦点解析。スケールバー：40 um。ｃ〜ｄ．GSC #1〜16を、MFまたはAplnにおいて培養した。視野あたりの腫瘍塊の定量（TS/FOV）（c）およびトリパンブルー排除定量（生細胞％）（d）を行った。データは、n＝3の実験についての平均＋標準誤差を表す。T-検定：＊P＜0.05；＊＊P＜0.01；＊＊＊P＜0.001。
【図１１−２】内皮アペリンはGSCの生存を調節する。ｅ．ECに、非サイレンシングRNA（siC）またはApln標的siRNA（siApln）を受けさせた。Aplnの消失を、RT-PCRおよび酵素免疫アッセイによりチェックした。ｆ．GSCを、（e）において調製されるようなsiCおよびsiAplnのEC-CMで培養した。共焦点解析を、ネスチン（緑色）、Sox2（赤色）、およびDAPI（青色）の共染色について行った。スケールバー：40μm。ｇ．siCまたはsiAplnのEC-CMで処置したGSCを、（c）と同様に分析した。データは、n＝3の実験についての平均＋標準誤差を表す。T-検定：＊P＜0.05；＊＊P＜0.01；＊＊＊P＜0.001。
【図１１−３】内皮アペリンはGSCの生存を調節する。ｈ．siCまたはsiAplnのEC-CMで処置したGSCを、（d）と同様に分析した。ｉ．GSCを、NS、MF、siCEC-CM、およびsiAplnEC-CMの単独またはプラスAplnで培養した。位相写真を示す（i）。スケールバー：25μm。データは、n＝3の実験についての平均＋標準誤差を表す。T-検定：＊P＜0.05；＊＊P＜0.01；＊＊＊P＜0.001。
【図１１−４】内皮アペリンはGSCの生存を調節する。ｊ〜ｋ．GSCを、NS、MF、siCEC-CM、およびsiAplnEC-CMの単独またはプラスAplnで培養した。TS/FOVおよび生細胞を解析した（j、k）。データは、n＝3の実験についての平均＋標準誤差を表す。T-検定：＊P＜0.05；＊＊P＜0.01；＊＊＊P＜0.001。
【図１２】ａ．アペリン用量応用。NS、MF、および示されたアペリン濃度を補給したMFでのGSC培養における、TS/FOV数を伴う、Sox2（赤色）、ネスチン（緑色）、および核（青色）についての共焦点解析。
【図１３】ML233 APJアゴニストはAPJ/GP130を通してGSCの生存を促進する。ａ〜ｂ．GSC1をML233（1 mmol.l-1、7分）で処置し、示された抗体についてのウエスタンブロット（a）および表面APJ発現のフローサイトメトリー解析（b）を行った。ｃ〜ｄ．GSC1に、非サイレンシングRNA（siC）、またはAPJもしくはGP130を標的とするsiRNAをトランスフェクトし、さらに、完全培地（NS）、マイトジェンフリー（MF）単独、またはML233（1 mmol.l-1）を補給したものに4日間曝露した。視野あたりの腫瘍塊形成（TS/FOV）（c）およびトリパンブルー排除（生細胞％）（c）を定量した。データは、n＝3の実験についての平均＋標準誤差を表す。T-検定：＊P＜0.05；＊＊＊P＜0.001。
【図１４−１】Gp130の発現およびAPJとの相互作用。ａ．対照IgGまたはAPJの免疫沈降画分を、示された抗体を用いたウエスタンブロットにより解析した。インプットも示す。ｂ．GSC#1〜16におけるGP130発現をフローサイトメトリーにより評定し、GP130発現細胞の％を示す。線は中央値を表す。ｃ．NS培地において増殖させたGSC1における、APJ（緑色）およびGP130（赤色）の共焦点解析。Huygensソフトウェアで解析した受容体の共局在化を示す。
【図１４−２】Gp130の発現およびAPJとの相互作用。ｄ．ヒトGBM凍結切片を、ネスチンおよびGP130について染色した。
【図１５】APJ阻害の抗腫瘍効果。ヌードマウスにGSC #9（105細胞）を同所移植し、16日目（矢印）に開始して、週3回、ビヒクル（PBS）またはAPJアンタゴニスト（MM54、20μmol.l-1、4 mg/kg）の腹腔内注射で処置した。神経学的症状の出現（a）および屠殺時の体重（b）をモニターした。GSC #9を有するマウスのカプラン・マイヤー生存曲線を示す（c）。データは、n＝3の実験の平均＋標準誤差を表す。二元配置分散分析：＊P＜0.05；＊＊P＜0.01。
【図１６】MM54処置は明らかな毒性効果を発揮しない。ａ．7週間にわたって週2回の処置を受けた異所性腫瘍を有するマウスにおいて、体重増加を測定した。ｂ−ｄ．雌のヌードマウスに、PBSの頭蓋内移植（偽手術）を施し、次いで、PBS移植の17日後に、DMSOおよびMM54を受けさせた。体重を、実験にわたってモニターした（b）。心臓重量／体重の比を、屠殺日に算出した（c）。マッソン三色染色法を用いた、DMSOおよびMM54で処置したマウス由来の心臓の一般解剖学（d）。
【図１７−１】APLN発現はヒト神経膠芽腫において上昇している。ａ．2つの独立した試料コホート（National Cancer InstituteのRepository for Molecular Brain Neoplasia Data、REMBRANDTおよびGSE16011 GRAVENDEEL）について、対照（非腫瘍）および神経膠芽腫（GBM；WHOグレードIV）におけるAPLN mRNAレベルを示す箱髭図。ｂ．ａと同じデータセットに由来する前神経（PN）または間葉（MES）サブタイプのGBMにおけるAPLN mRNAレベルを示す箱髭図。ｃ〜ｄ．GRAVENDEELデータセットから、PECAM1およびVWFのmRNAレベル解析をａと同様に行った。両方の内皮因子のAPLNとの相関を示す。r＝ピアソンの相関。ａ〜ｃでは、中央値を箱内の実線によって表し；箱はmRNAレベルの25〜75パーセンタイル範囲を示し、最大値および最小値を垂直バーで示し、点はすべての患者を象徴する。有意性を、多重検定のための補正を伴う、群レベル間の対比較で算出した（ボンフェローニ補正でのp値）。＊＊P＜0.01；＊＊＊P＜0.005。
【図１７−２】APLN発現はヒト神経膠芽腫において上昇している。G-CIMPおよびIDH変異体を除外してGBM患者のみを含む、REMBRANDTデータベースおよびGRAVENDEELデータベース由来の患者部分群に基づくカプラン・マイヤー生存プロット。各グラフにおいて、患者試料を、中央値を用いてAPLN低発現腫瘍（示されているように、下方制御されている）およびAPLN高発現腫瘍（示されているように、上方制御されている）に分けている。生存の差を、ログランク解析により比較した。
【図１８】APJおよびGP130の発現は患者の生存と相関しない。REMBRANDT（a、c）およびGRAVENDEEL（b、d）データベースを用いて、図17と同様に分析した、GBM患者における、APJおよびGP130のmRNAレベルを示す箱髭図ならびにカプラン・マイヤー生存プロット。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
発明の詳細な説明
アペリンは、心臓血管系および神経内分泌系におけるその役割が公知の、13アミノ酸ペプチドである。アペリンは、種々の臓器（例えば、心臓、脳、腎臓、肺など）および多種多様の腫瘍タイプの内皮細胞によって発現している、「APJ」または「APLNR」と呼ばれるGタンパク質共役受容体を通して作用することが報告されている（Rayalam S. et al, 2011）。癌幹細胞様細胞に関与するアペリン/APJ系の機能および下流の分子機構は、まだ記載されていない。本発明者らは、驚くべきことに、サイトカイン共受容体GP130が、アペリン/APJシグナル伝達のための共受容体として作用すること、ならびに、アペリンとAPJ/GP130との相互作用が、Akt/mTOR経路およびSTAT3転写因子を含む二つのシグナル伝達経路を活性化し、それによりGSCの生存および自己複製を促進することを示した。それらの結果により、アペリン/APJ/GP130軸を減弱させることは、ECに対するアペリンの血管形成活性とは独立して、GSCの生存および自己複製を阻害することが示唆される。
【００１１】
したがって、アペリン/APJ/GP130を含む分子軸は、CSCの生存、特にGSCの生存を妨害するのに適した標的である。本発明は、CSCを標的とし、したがって効率的な抗癌治療であるアペリン/APJ/GP130経路阻害剤のスクリーニングのための方法を提案する。本発明は、将来の医学的応用のために非常に興味深い。
【００１２】
重要なことに、CSCのみが、アペリン/APJ/GP130経路ならびに下流のmTORおよびSTAT3の活性化に依存するため、本発明のスクリーニング法によって同定された化合物は、これらの細胞に特異的に影響を及ぼすと考えられる。
【００１３】
第1の局面において、本発明は、自己複製および生存などの癌幹細胞（CSC）特性を阻害することができる化合物を同定するためのスクリーニング法に関する。本方法は、
（a）共受容体APJおよびGP130を発現する細胞を、アペリンポリペプチドおよび候補化合物と接触させる工程、
（b）工程（a）で得られた細胞におけるアペリン依存性シグナル伝達経路の活性化レベルを検出する工程、
（c）該活性化レベルを、アペリンポリペプチドとのみ接触させた該細胞の活性化レベルと比較する工程
を含む。
【００１４】
好ましい態様において、化合物は、該化合物の存在下でアペリン依存性シグナル伝達経路の活性化レベルが減弱する場合に選択される。換言すると、化合物は、アペリン依存性シグナル伝達経路の活性化レベルが、アペリン単独の存在下で測定された同じアペリン依存性シグナル伝達経路の活性化レベルと比較した際に、該化合物およびアペリンと接触させた細胞において減少している場合に選択される。
【００１５】
本発明の文脈において有用な代替的なスクリーニング法は、近接ライゲーションアッセイ（PLA）によるAPJ/GP130相互作用の測定を含む。この特定の態様において、方法は、
（a）PLA標識したAPJおよびGP130を有する細胞を、アペリンポリペプチドおよび候補化合物と接触させる工程、
（b）工程（a）で得られたPLAシグナルを検出する工程、
（c）候補化合物の存在下で得られたPLAシグナルを、アペリンポリペプチドのみで得られたPLAシグナルと比較する工程
を含む。
【００１６】
好ましい態様において、化合物は、該化合物の存在下でPLAシグナルが減弱する場合に選択される。換言すると、化合物は、PLAシグナルが、アペリン単独の存在下で測定されたPLAシグナルと比較した際に、該化合物が添加される時に減少している場合に選択される。
【００１７】
PLA技術は、すぐ近く（＜40nm）の分子に対して相互作用するタンパク質の検出を可能にすることが公知である。これは、当業者によって広く使用されている。DUOLINKキット（Sigma）が、この目的で使用されてもよい。PLAシグナルは、好ましくは蛍光シグナルである（図10Bを参照されたい）。
【００１８】
アペリンポリペプチドおよびその受容体APJ
アペリン遺伝子（APLN、APJ内在性リガンド、APEL、およびXNPEP2としても公知である）は、N末端領域にシグナルペプチドを含有する77アミノ酸のプレプロタンパク質をコードする。小胞体中への移行およびシグナルペプチドの切断後に、55アミノ酸のプロタンパク質は、いくつかの活性断片：配列42-77に対応する36アミノ酸ペプチド（アペリン36）、配列61-77に対応する17アミノ酸ペプチド（アペリン17）、および配列65-77に対応する13アミノ酸ペプチド（アペリン13）を生成する。ヒトにおいて、プロタンパク質アペリンは、例えばSEQ ID NO:1（NP_059109）を有する。
【００１９】
本明細書において使用される際、「アペリンポリペプチド」または「アペリン」という用語は、アペリンプロタンパク質のC末端13アミノ酸を含むポリペプチド（すなわち、NP_059109のアミノ酸65-77に対応する、SEQ ID NO:2のポリペプチド）、またはアペリンプロタンパク質の配列42-77に対応するポリペプチド（アペリン36）（すなわち、SEQ ID NO:3のポリペプチド）を指すように意図される。好ましくは、それは、（NP_059109のアミノ酸65-77に対応する）SEQ ID NO:2からなる。
【００２０】
本発明の方法において使用されるアペリンポリペプチドは、任意の従来の手段によって取得することができる。例えば、生化学分子の供給業者（Santa Cruz、Cayman、Sigma Aldrichなど）から取得することができる。また、標準的なペプチド合成技術によって化学的に合成することもできる。本発明の目的で、化学的に合成される場合、アペリン-13ペプチドは、N末端位にグルタミン酸残基ではなくピログルタメートを含んでもよい。標準的なペプチド合成の代替として、アペリンポリペプチドを、標準的な組み換えDNA技術を用いて産生することができる。例えば、ポリペプチドをコードする核酸分子を発現ベクター中にクローニングすることができ、発現ベクターを宿主細胞内に導入することができ、アペリンポリペプチドを宿主細胞において発現させることができる。次いで、アペリンポリペプチドを、標準的なポリペプチド精製技術を用いて、適切な精製計画により細胞から単離することができる。
【００２１】
アペリンポリペプチドは、その受容体であるAPJの細胞局在に応じて、いくつかの生理学的機能に関与している。これらには、心臓血管調節、体液恒常性、脂肪-膵島軸（adipoinsular axis）の調整、およびインビトロでのHIV共受容体機能が含まれる（Pitkin et al, 2010）。アペリンは、血管形成誘発因子として癌に関係しているが、その正確な役割は、依然として議論が交わされている（Rayalam S. et al, 2011およびKidoya H., 2012）。アペリン/APJシグナル伝達は、mTor経路を活性化することが公知である（Masri B. et al, 2004）。
【００２２】
APJ（アペリン受容体、AR、アンジオテンシン受容体様1、Gタンパク質共役受容体APJ、APLNR、AGTRL、APJ、APJR、およびHG11としても公知である）は、アペリンに対する同族受容体である（Lee DK. et al）。これは、Gタンパク質共役受容体ファミリーに属し、細胞表面に位置している。APJは、アンジオテンシンII受容体に関連し、HIV-1神経病因、心臓血管および神経内分泌機能の媒介に関与する共受容体として記載されている（Pitkin et al, Pharmacological Review, 2010）。ヒトにおいて、APJは、例えばSEQ ID NO:4（NP_005152）を有し、SEQ ID NO:5（NM_005161）によってコードされている。
【００２３】
GP130共受容体
GP130タンパク質（糖タンパク質130、IL6ST、IL6-β、インターロイキン-6受容体サブユニットβ、IL-6受容体サブユニットβ、IL-6Rサブユニットβ、IL-6R-β、IL-6RB、IL6RB、CDw130、インターロイキン-6シグナルトランスデューサー、膜糖タンパク質130、オンコスタチン-M受容体サブユニットα、またはCD130としても公知である）は、膜貫通タンパク質サイトカイン受容体である。より具体的に、GP130は、IL-6、EPO、およびLIFによって誘導されるものなどのサイトカイン駆動シグナル伝達を亢進することが公知である。これは、内因性のチロシンキナーゼ活性を有さない。代わりに、他のタンパク質と複合体化した後にチロシン残基がリン酸化される。このリン酸化により、JAK/Tykチロシンキナーゼ、およびSTAT-3などのSTATタンパク質転写因子との会合がもたらされる。GP130は、構造的に、その細胞外部分が5個のフィブロネクチンタイプIIIドメインおよび1個の免疫グロブリン様C2タイプドメインから構成される。ヒトにおいて、それは、配列SEQ ID NO:6（Gene Bank番号：P40189.2）を有し、SEQ ID NO:7（NM_000565.3）によってコードされている。
【００２４】
Gp130は、STAT3経路を活性化することが公知である。この経路は、細胞増殖、遊走、および生存に関係しており、さらに、癌幹細胞様細胞において（Chautard E. et al, 2010）、最近ではGSCにおいて（Kim E. et al, 2013）活性化されていることが報告されている。しかし、本発明者らは、APJ/GP130とアペリンとの間の機能的相互作用を最初に記載する。
【００２５】
より正確には、本発明者らは、GP130が、APJを形質膜に維持して、GSCにおいてアペリン/APJシグナル伝達を整理することを、本明細書中で示す（図10を参照されたい）。
【００２６】
APJおよびGP130受容体を発現する細胞
本発明のスクリーニング法は、その膜に共受容体APJおよびGP130を発現する任意の細胞を使用してもよい。これらの共受容体の発現は、内在性または外来性であることができる。好ましい態様において、本発明のスクリーニング法は、その膜に高レベルの前記受容体を発現する細胞を使用する。初代細胞を使用することは除外されないが、しかし、従来の細胞株由来の培養細胞が好ましく、なぜなら、その挙動が完全に特徴決定されており、外来性ポリペプチドを発現するように容易にトランスフェクトすることができるためである。
【００２７】
より好ましい態様において、本発明の方法は、共受容体APJおよびGP130を発現する外来性のヌクレオチドベクターをトランスフェクトしている従来の細胞株から生じた組み換え細胞を使用する。さらにより好ましい態様において、これらの細胞は、GSCにおけるアペリン依存性活性化が、2つの共受容体APJおよびGP130の存在を必要とし、それらの1つのみの存在を必要としないことを確実にするために、共受容体APJおよびGP130を内在性に発現しない。
【００２８】
これらの従来の細胞株は、例えば、HEK293T細胞、HeLa細胞、COS-7細胞、CHO細胞、U87-MG、およびLN229細胞である。
【００２９】
関心対象の特定の細胞株は、例えば、Chem-5宿主において作製され、細胞表面上に高レベルの組み換えAPJ発現を支持する、MilliporeのAPJ発現細胞株である。この細胞株は、有利に、受容体をカルシウムシグナル伝達経路と共役させるのに最適化されたレベルの雑多な組み換えGタンパク質を含有する。
【００３０】
APJおよびGP130を発現する組み換え細胞を生成する方法は、当技術分野において周知である。例えば、従来の分子生物学、微生物学、および組み換えDNA技術を使用することができる［Sambrook, Fitsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)を参照されたい］。
【００３１】
特に、APJおよびGP130共受容体を発現するヌクレオチドベクターは、任意の「トランスフェクション」システムによって（例えば、リポフェクションにより、感染により、リン酸カルシウム-DNA沈殿により、またはエレクトロポレーションにより）細胞にトランスフェクトされてもよく、該共受容体をコードするポリヌクレオチドの翻訳が誘導される。
【００３２】
本明細書において使用される「ベクター」という用語は、別の核酸を運ぶことができる核酸分子を指すように意図される。ベクターの1つのタイプは「プラスミド」であり、これは、その中へ追加のDNAセグメントがライゲーションされ得る環状二本鎖DNAループを指す。ベクターの別のタイプは、追加のDNAセグメントがウイルスゲノム中にライゲーションされ得るウイルスベクターである。ある特定のベクターは、それらが中に導入される宿主細胞における自律複製が可能である（例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクターおよびエピソーマル哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーマル哺乳類ベクター）は、宿主細胞内への導入時に、宿主細胞のゲノム中に統合されることができ、それにより宿主ゲノムとともに複製される。
【００３３】
ある特定のベクターは、それらが機能的に連結される遺伝子の発現を方向づけることができる。そのようなベクターを、本明細書において「組み換え発現ベクター」（または単純に、「発現ベクター」）と呼ぶ。概して、組み換えDNA技術において役立つ発現ベクターは、プラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」と「ベクター」とは互換的に使用されてもよく、なぜなら、プラスミドがベクターの最も一般的に使用される形態であるためである。しかし、本発明は、そのような形態の発現ベクター、例えば、細菌プラスミド、YAC、コスミド、レトロウイルス、EBV由来エピソーム、ならびに、共受容体GP130およびAPJの発現を確実にするために好都合であることを当業者が知っているであろうすべての他のベクターを含むように意図される。
【００３４】
これらのベクターでの細胞の形質転換は、ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入するための任意の公知の方法によって実施することができる。そのような方法は、当業者に周知であり、例えば、デキストラン媒介性形質転換、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ポリヌクレオチドのリポソーム中へのカプセル化、微粒子銃注入、およびDNAの核中への直接マイクロ注入を含む。
【００３５】
特定の態様において、本発明の方法において使用される細胞は、それぞれSEQ ID NO:4および6のAPJおよびGP130共受容体を安定に発現するHEK-293Tである。HEK-293Tに、例えば、これらのポリペプチドをコードするプラスミドを、Turbofectシステムを使用して製造業者の推奨を用いて、トランスフェクトすることができる（詳細な説明については、下記の実施例を参照されたい）。
【００３６】
本発明の方法は、「共受容体APJおよびGP130を発現する細胞を、アペリンポリペプチドおよび候補化合物と接触させる工程」の第1の工程を含む。アペリンポリペプチドは、候補化合物の後に、同時に、または前に添加されてもよい。
【００３７】
好ましい態様において、共受容体APJおよびGP130を発現する組み換え細胞を、候補化合物と接触させた後に、アペリンポリペプチドと接触させる。試験される化合物は、選択される場合、例えば、APJ/GP130共受容体上のその結合部位に対するアペリンの結合を減弱させることができるか、または、APJもしくはGP130の発現を下方制御することができると考えられる。
【００３８】
別の好ましい態様において、共受容体APJおよびGP130を発現する組み換え細胞を、候補化合物と接触させた後に、アペリンポリペプチドと接触させる。試験される化合物は、選択される場合、例えば、これらの共受容体を活性化することなく、APJ/GP130上のアペリンの結合部位をマスクすることができる（そのため、アペリンのアンタゴニストとして作用する）と考えられる。
【００３９】
アペリンおよび候補化合物を、APJ/GP130を発現する細胞と同時に接触させる場合は、両方の現象が起こる可能性が高い。
【００４０】
癌幹細胞（CSC）およびCSC特性
本明細書において使用される際、「癌幹細胞」または「CSC」という用語は、正常幹細胞の特性、具体的には、複数の細胞タイプへ分化する能力（分化能）、および未分化状態に維持しながら細胞分裂の多数のサイクルを経る能力（自己複製）を有する癌細胞を指す。
【００４１】
これらの特性は、単一細胞を分化および自己複製する能力について評価する、クローン原性アッセイまたはスフェアアッセイなどの種々の方法によって試験してもよい（Thomson SP, Cancer Research, 1982）。また、クローン細胞移植システム（Nakauchi et al, Ann N Y Acad Sci. 2001）、およびインビボで腫瘍形成を開始する能力を使用することができる。
【００４２】
CSCは、種々の手段によって同定することができる。例えば、CD133（PROM1としても公知である）、CD44、CD24、EpCAM（上皮細胞接着分子、上皮特異抗原ESAとしても公知である）、THY1、およびATP結合カセットB5（ABCB5）を含む細胞表面マーカーの特有のセットを用いることによってそれらを同定することが可能である（Al-Hajj et al, PNAS 2003）。あるいは、血清の非存在下で、および培養プレートへの接着なしでそれらを増殖させることによって、CSCを同定することが可能である（分化した細胞は、同じ条件下で生き延びることができない）。また、それらの特徴的な遅いサイクリングおよび静止特性によって、CSCを同定することもできる（Horan PK, Methods Cell Biol. 1990）。
【００４３】
好ましい態様において、本発明の化合物が標的とする癌幹細胞は、乳癌、頭頸部癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、肉腫、脳腫瘍、腎癌、黒色腫および皮膚癌、前立腺癌、胃癌、多発性骨髄腫、白血病およびリンパ腫に存在するものである。
【００４４】
特に好ましい態様において、本発明の化合物が標的とする癌幹細胞は、神経膠芽腫幹細胞（GSC）である。神経膠芽腫幹細胞は、脳腫瘍に存在するCSCである。GSCのバイオマーカーは、例えば、CD133、ポドプラニン、CD15、A2B5、フィラメントマーカー（ネスチン）、RNA結合タンパク質（Musashi-1）、ならびに転写因子（BMI1、SOX2、Id1、およびOct-4）である（総説については、Dahlrot RH. et al, Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2013を参照されたい）。
【００４５】
試験されるべき化合物
本発明の方法において試験されるべき化合物は、任意の種類のものである。好ましい態様において、それは、アンチセンス核酸、デコイ受容体、アプタマー、抗体、および低分子アンタゴニストからなる群より選択される。
【００４６】
本明細書において使用される際、「アンチセンス核酸」という用語は、アペリン、GP130、もしくはAPJポリペプチドをコードする配列、またはそれらの配列のうちの1つの一部に特異的であるポリヌクレオチドを指す。これらのタンパク質をコードする核酸配列は、本明細書に記載されている（SEQ ID NO:5および7）。これらの配列は、さらに、NCBIにより運営されているGenBankデータベースなどの公的データベース上で入手可能である。
【００４７】
当業者は、過度の実験なしで、これらの配列に基づいて、適したアンチセンス分子を設計、作製、および使用することができるであろう。アンチセンス核酸は、例えば、オリゴヌクレオチド、または、発現制御配列に機能的に連結されているアンチセンス配列を含む核酸であってもよい。細胞において特定のタンパク質の発現を下方制御するためのアンチセンス核酸の使用は、当技術分野において周知である。アンチセンス核酸分子は、別の核酸分子のコード鎖（例えば、mRNA配列）、またはその一部に対して相補的であり、したがって、もう一方の核酸分子のコード鎖に水素結合することができるヌクレオチド配列を含んでもよい。あるいは、アンチセンス配列は、mRNAの5'もしくは3'非翻訳領域、またはコード領域と非翻訳領域とを橋渡しする領域（例えば、5'非翻訳領域とコード領域との接合部）に見出される配列に相補的であることができる。アンチセンス核酸は、mRNAをコードする遺伝子の調節領域、例えば、転写開始配列もしくは調節エレメント、またはスプライス部位に対して配列が相補的であることができる。1つの態様において、アンチセンス核酸は、コード鎖上の開始コドンに先行するかもしくは及ぶ領域に対して、またはmRNAの3'非翻訳領域において相補的であるように設計される。
【００４８】
本発明のアンチセンス核酸は、好ましくは、RNA、例えば、低分子干渉RNA（siRNA）、二本鎖RNA（dsRNA）、マイクロRNA（miRNA）、短ヘアピンRNA（shRNA）である。
【００４９】
本明細書において使用される際、「デコイ受容体」という用語は、アペリンポリペプチドに結合し、アペリンポリペプチドがその天然のシグナル伝達経路に参加するのを阻止することになる分子を指す。デコイ受容体は、アペリンに結合し、アペリンがその天然のシグナル伝達経路を通してシグナル伝達するのを阻害することができる、アペリンに対する可溶性受容体（またはその断片）を包含するように意図される。
【００５０】
本明細書において使用される際、「アプタマー」という用語は、特異的な標的分子に特異的に結合するオリゴ核酸またはペプチド分子に関する。それは、好ましくはオリゴ核酸を指す。アプタマーは、ランダム配列オリゴマーの非常に大きな集団から、SELEXプロセスによってインビトロで選択することができる（Ellington et Szostak, Nature 1990）。この十分に確立された方法論は、特異的な標的分子に対するその親和性に基づいてアプタマーを選択する。
【００５１】
より好ましい態様において、この試験される化合物は、アペリンとGP130およびAPJとの相互作用を減弱させる抗体または機能的抗体断片である。前記抗体またはその機能的断片は、好ましくは、アペリン、GP130、またはAPJに結合することができる。
【００５２】
本明細書において使用される「抗体」という用語は、特異抗原に対して結合特異性を呈するポリペプチドを指し示す。より特に、抗体（または「免疫グロブリン」）は、ジスルフィド結合によって相互連結された少なくとも2つの重（H）鎖および2つの軽（L）鎖を含む糖タンパク質からなる。各重鎖は、重鎖可変領域（またはドメイン）（本明細書においてVHと省略される）および重鎖定常領域（以下CH）を含む。重鎖は、γ、μ、α、δ、またはεとして分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれIgG、IgM、IgA、IgD、およびIgEとして定義する。免疫グロブリンIgG、IgD、およびIgA（それぞれγ、δ、およびα鎖）のCH領域は、3つのドメイン（CH1、CH2、およびCH3）ならびに可撓性付加のためのヒンジ領域を含み、他方、免疫グロブリンIgMおよびIgEのCH領域は、4ドメイン（CH1、CH2、CH3、およびCH4）を含有する。「エピトープ」とは、それに対して抗体が結合する抗原上の部位である。これは、隣接残基によって、または抗原タンパク質のフォールディングによりきわめて近接してもたらされる非隣接残基によって形成され得る。
【００５３】
本明細書において使用される際、「抗体断片」という用語は、Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、dsFv、ds-scFv、二量体、ミニボディ、ダイアボディ、およびそれらの多量体、ならびに二重特異性抗体断片を指し示すように意図する。抗体は、従来の技術を用いて断片化することができる。例えば、F(ab')2断片は、抗体をペプシンで処理することによって生成することができる。結果として生じたF(ab')2断片を、ジスルフィド架橋を還元するように処理して、Fab'断片を産生することができる。パパイン消化は、Fab断片の形成をもたらすことができる。Fab、Fab'およびF(ab')2、scFv、dsFv、ds-scFv、二量体、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体断片、ならびに他の断片はまた、組み換え技術によって合成することもできる。
【００５４】
抗体の「機能的断片」とは、特に、親抗体と同じ結合活性を有する、上記で定義されたような抗体断片を意味する。
【００５５】
本発明の文脈において、抗体は、規定の配列を有するペプチドに対して、106 M-1より高い、好ましくは107 M-1より高い、より好ましくは108 M-1より高い親和定数Ka（解離定数の逆数、すなわち1/Kd）を有する場合、該ペプチドを「認識する」または「結合する」と言われる。また、本発明の文脈において、抗体は、ペプチドに対して107 M-1より高い、好ましくは108 M-1より高い、より好ましくは109 M-1より高い、およびさらにより好ましくは該ペプチドに対して1010 M-1より高い親和定数Kaを有し、かつ他のペプチドのすべてに対して105 M-1より低い親和定数Kaを有する場合、該ペプチドに「特異的に結合する」または「特異的に認識する」と言われる。
【００５６】
ペプチドまたは抗原（Ag）に対する抗体（Ab）の結合を特徴決定するために使用される親和定数は、以下のように定義される解離定数の逆数である。
2017516490.tif 000002
【００５７】
この親和性は、例えば、平衡透析または蛍光消光によって測定することができ、両方の技術は、当技術分野において日常的に使用されている。
【００５８】
試験される化合物は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であってもよい。この抗体は、（例えば）マウス、ラット、ウサギ、ウマ、もしくはヒトを含む任意の起源の種のものであってもよく、またはキメラ抗体であってもよい。
【００５９】
本明細書において使用される「ポリクローナル抗体」とは、様々なB細胞から取得される抗体を指す。これは、標準的な抗体産生法によって、例えば、公知の手順にしたがう、（i）適した動物（例えば、ウサギ、ヤギなど）を本発明のリン酸化タンパク質または免疫原性ペプチドで免疫化する工程、（ii）動物から免疫血清を収集する工程、および（iii）免疫血清からポリクローナル抗体を分離する工程によって産生されてもよい。
【００６０】
本明細書において使用される「モノクローナル抗体」とは、ほぼ均質の抗体集団から生じる抗体を意味する。換言すると、モノクローナル抗体は、単一細胞クローン（例えば、ハイブリドーマ、均質の抗体をコードするDNA分子をトランスフェクトした真核生物宿主細胞、均質の抗体をコードするDNA分子をトランスフェクトした原核生物宿主細胞など）の増殖から生じる均質の抗体からなり、1つのおよび1つのみのアイソタイプおよびサブタイプの重鎖、ならびに1つのみのタイプの軽鎖を特徴とする。本発明のモノクローナル抗体は、Kohler and Milstein, Nature 1975；Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol. (1976)の周知の技術にしたがって、ハイブリドーマ細胞株において産生され得る；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel et al. (1989)もまた、参照されたい。
【００６１】
好ましい態様において、本発明の化合物は、アペリンのその共受容体APJおよびGP130に対する相互作用を遮断することができる。別の好ましい態様において、前記化合物は、GP130のAPJとのアペリン誘導性相互作用を遮断することができる。
【００６２】
「相互作用を遮断する」により、該相互作用が本発明の化合物の存在下で物理的に起こり得ないことが、本明細書において好ましくは意味される。
【００６３】
別の好ましい態様において、本発明の化合物は、mTORシグナル伝達経路およびSTAT3シグナル伝達経路の両方を遮断することができる。
【００６４】
「シグナル伝達経路を遮断する」により、該シグナル伝達経路が本発明の化合物の存在下で活性化され得ないことが、本明細書において意味される。
【００６５】
これらの相互作用および／またはシグナル伝達経路を遮断することによって、本発明の化合物は、CSC特性（例えば、CSCの分化能、自己複製、および生存）を阻害することができ、その結果、CSCの増殖および癌の進行を減弱させることになる。
【００６６】
好ましい態様において、試験される化合物は、APJとアペリンとの間の相互作用を阻害することが公知である低分子である。この低分子は、例えば、GSCにおいてアペリン誘導性シグナル伝達および自己複製を遮断する、MM54（Macaluso NJ et al., 2011, ChemMedChem, 6 (6): 1017-23）である。Macaluso NJ et al., 2011およびMacaluso NJ et al., 2010に記載されているような、ALX40-4C、[CRPRLC]-A-[CRPRLC]、[CRPRLC]-AA-[CRPRLC]、[CRPRLC]-GG-[CRPRLC]、[CRPRLC]-HK-[CRPRLC]、[CRPRLC]-KH-[CRPRLC]、シクロ(1-6)QRPRLS、またはシクロ(1-7)QRPRLSHなどの任意の他のAPJアンタゴニストが、使用されてもよい。
【００６７】
別の好ましい態様において、試験される化合物は、siRNAまたはshRNAなどのアンチセンス核酸であり、該化合物は以下の配列を有する。
APJに特異的なsiRNA：
2017516490.tif 000003
アペリンに特異的なsiRNA：
2017516490.tif 000004
アペリンに特異的なshRNA：
2017516490.tif 000005
GP130に特異的なsiRNA：
2017516490.tif 000006
【００６８】
別の好ましい態様において、試験される化合物は、APJとアペリンとの間の相互作用を阻害することが公知の抗体である。
【００６９】
アペリン依存性シグナル伝達経路
本発明の方法は、少なくとも1つの「アペリン依存性シグナル伝達経路」の活性化レベルを検出する工程（工程b）を含む。
【００７０】
本明細書において「アペリン依存性シグナル伝達経路」は、その活性化がアペリンによって誘導されるシグナル伝達経路を意味する。本発明の文脈において、このシグナル伝達経路は、好ましくは、アペリンの膜受容体APJおよびGP130との相互作用によって活性化される。
【００７１】
好ましい態様において、検出する工程（b）は、APJ受容体の活性化レベルの検出および／または測定を含む。この活性化レベルは、任意の従来の手段によって評価することができる。
【００７２】
例えば、APJ膜貫通受容体の活性化レベルは、タンパク質G受容体と共役したAPJを発現する細胞におけるカルシウム流入の測定によって（Millipore由来のChemiscreen（登録商標）、Life Technologies由来のFluo4NW）、または、リン酸化された細胞外シグナル調節キナーゼ（pERK）もしくはAkt（pAkt）の含量の測定によって、評価することができる（Scimia MC, Nature letters 2012）。
【００７３】
あるいは、APJ受容体の活性化を、足場分子β-アレスチン2のAPJへの動員の研究によって評価することができる。前記動員は、任意の従来の手段によって検出することができる。好ましくは、それは、免疫蛍光法および顕微鏡解析、共免疫沈降、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）によって、または生物発光共鳴エネルギー移動（BRET）によって測定される。これらの技術は、当技術分野において周知である。
【００７４】
β-アレスチン2は、GPCR活性化時に動員される足場タンパク質であり、GPCRの輸送およびシグナル伝達を調整するのに関与している（Shenoy SK et al., 2011）。β-アレスチン2は、膜受容体APJの活性化時に形質膜に動員される。APJ結合が包括的なコンフォメーション変化を誘導し、これは、2つのアレスチンドメインの移動、ならびにクラスリンおよびAP2結合部位を含有するそのC末端尾部の放出を含む。このコンフォメーション変化は、（i）生物発光レニラ（Renilla）ルシフェラーゼ（RLUC）、（ii）SEQ ID NO:8（P32121.2）のβ-アレスチン2タンパク質、および（iii）黄色を発光するGFP変異体であるYFPを発現するベクターの使用による、生物発光共鳴エネルギー移動（BRET）によって反映され得る。実際のところ、RLUCの発光スペクトルは、YFPの良好な励起を提供するのに十分広い。
【００７５】
本発明の方法の具体的態様において、APJおよびGP130を共発現する細胞に、RLuc-βアレスチン2-YFPをトランスフェクトし、その後、試験される化合物の存在下または非存在下で、アペリンで刺激する。発光を、従来の手段を用いて検出する（RLUCについては460-500 nm、およびYFPについては510-550 nm）。次いで、そのAPJへの動員によるβ-アレスチンのコンフォメーション変化を測定するBRETシグナルを、RLUCにより放出される光に対するYFPにより放出される光の比として決定する。これらの値を、好ましくは、RLUC-β-アレスチン-YFPが単独で発現している際に検出されるバックグラウンドのBRET RLUCシグナルを差し引くことによって補正する。
【００７６】
この具体的態様において、アペリン依存的なAPJ受容体の活性化は、BRETシグナルが、アペリンポリペプチドのない対照試料と比較した際にアペリンの存在下で有意に増大している場合に、検出される。したがって、試験される化合物は、比較工程（c）において、アペリンの存在下で観察されるBRETシグナルが、該化合物が添加された際に有意に減少している場合に、選択されることになる。
【００７７】
1つの態様において、APJ受容体の活性化を、APJ依存性シグナル伝達経路の活性化状態を評価することによって評価する。このAPJ依存性シグナル伝達経路は、例えば、Akt/mTORおよびERKシグナル伝達経路、カルシウム流入、ならびにSTAT3活性化である。
【００７８】
本発明の文脈において、「APJ依存性シグナル伝達経路」は、APJ受容体自体、および／または、この受容体の下流に誘導されるシグナル伝達経路（例えば、Akt/mTORシグナル伝達経路）を包含する。
【００７９】
ラパマイシンの哺乳類標的（mTOR）は、2つの別個の複合体であるmTOR複合体1およびmTOR複合体2に存在している異型セリン／スレオニンキナーゼである。mTOR複合体1（mTORC1）は、mTOR、Raptor、GβL（mLST8）、およびDeptorから構成され、ラパマイシンによって部分的に阻害される。mTORC1は、増殖因子、栄養分、またはエネルギーの利用可能性を反映する複数のシグナルを統合して、条件が好ましい際の細胞増殖、またはストレス中もしくは条件が好ましくない際の異化プロセスのいずれかを促進する。増殖因子およびホルモン（例えば、インスリン）は、TSC2を不活性化してmTORC1の阻害を阻止するAktを介して、mTORC1にシグナル伝達する。あるいは、低いATPレベルが、TSC2のAMPK依存性活性化およびraptorのリン酸化をもたらして、mTORC1シグナル伝達を低減させる。アミノ酸の利用可能性は、RagおよびRagulator（LAMTOR1-3）タンパク質を含む経路を介して、mTORC1にシグナル伝達される。活性mTORC1は、下流標的（4E-BP1およびp70 S6キナーゼ）のリン酸化を介したmRNAの翻訳、自食作用（Atg13、ULK1）の抑制、リボソーム生合成、およびミトコンドリアの代謝または脂肪生成をもたらす転写の活性化を含む、多数の下流の生物学的効果を有する。他方、mTOR複合体2（mTORC2）は、mTOR、Rictor、GβL、Sin1、PRR5/Protor-1、およびDeptorから構成され、Aktを活性化することによって細胞の生存を促進する。mTORC2はまた、PKCδを活性化することによって細胞骨格動態を調節し、かつSGK1リン酸化を介してイオン輸送および増殖を調節する。
【００８０】
複数のアイソフォームとして存在するAktは、ホスホイノシチド3−キナーゼ（PI3K）によって活性化される主要なキナーゼの1つである。PI3Kの活性化により、ホスファチジルイノシトール(3,4,5)-トリホスファート（PIP3）の生成が結果として生じる。これらの脂質二次メッセンジャーは、Aktのプレクストリン相同ドメインに結合して、それぞれPDK1およびmTORC2複合体によるThr308およびSer473のリン酸化を介した活性化のために、形質膜へのその移行を促進する。これらの部位の両方でのリン酸化は、Akt Ser/Thrキナーゼ活性の完全な活性化のために必要とされる。Aktは、GSK3b、p70S6K、4EBP1、AS160、PRAS40、TSC 1、TCS 2、Raf-1、Bad、FOXOファミリーの転写因子、およびPFK2を含む、50種を超える公知の基質をリン酸化する。
【００８１】
本発明の文脈において、Akt/mTORシグナル伝達経路は、例えば、AktまたはmTORキナーゼのいずれかの公知の基質（GSK3b、p70S6K、4EBP1、AS160、PRAS40、TSC 1、TCS 2、Raf-1、Bad、FOXOファミリーの転写因子、およびPFK2など）が、キットの製造業者により提供される対照試料と比較した際に、実質的にリン酸化されている場合に、活性化されていると言われる。あるいは、Akt/mTOR経路は、例えば、AktがThr308およびSer473の両方をリン酸化されている場合、mTORがリン酸化されている場合、または、p70S6Kの基質であるS6がリン酸化されている場合に、活性化されていると言われる。
【００８２】
Aktの活性化を、好ましくは、ELISAまたはウエスタンブロットなどの従来のアッセイによって評価する。この目的で、市販のキット、例えば、Affymetrix eBioscience由来のAkt経路活性化Profile InstantOne（商標）、PerkinElmer由来のAlphascreen（登録商標）アッセイが利用可能である。抗リン酸化Akt抗体もまた、利用可能である（Cell Signaling technology）。
【００８３】
mTorの活性化を、好ましくは、ELISAまたはウエスタンブロットによって評価する。それは、さらに、抗ホスホmTOR抗体（Pierce）を用いた細胞ベースの画像化法、またはpAktもしくはpS6についてのフローサイトメトリー（Cell Signaling Technology）によって測定することができる。
【００８４】
別の態様において、本発明の方法の検出する工程（b）は、GP130受容体の活性化レベルの検出および／または測定を含む。GP130の活性化レベルは、従来の手段によって、例えば、GP130のSer782がリン酸化された形態を特異的に認識する抗体（Santa Cruz）を用いたELISAまたはウエスタンブロットによって、直接測定することができる。
【００８５】
好ましい態様において、GP130活性化レベルを、GP130依存性シグナル伝達経路の活性化レベルを測定することによって評価する。このGP130依存性シグナル伝達経路は、例えば、JAK/STAT3シグナル伝達経路である。追加的に、MAPKおよびPI3Kが活性化され得る。
【００８６】
本発明の文脈において、「GP130依存性シグナル伝達経路」は、GP130受容体自体、および／または、この受容体の下流に誘導されるシグナル伝達経路（例えば、STAT3シグナル伝達経路）を包含する。
【００８７】
STAT3シグナル伝達経路の活性化レベルは、任意の従来の手段によって測定することができる。Flowcellect（商標）（Millipore）などの市販のキットを、この目的で利用可能である。また、当業者は、Tyr705およびSer727がリン酸化されたSTAT3に特異的である抗体（例えば、Cell Signaling Technologyにより供給されている）を用いたウエスタンブロットまたはELISAによって、STAT3活性化レベルを検出してもよい。
【００８８】
具体的態様において、STAT3シグナル伝達経路の活性化レベルを、その発現がSEQ ID NO:9のSTAT3プロモーターに機能的に連結されているレポータータンパク質（例えば、発光または蛍光レポータータンパク質）の発現レベルを測定することによって検出する。当業者は、このアッセイのために使用されるべき具体的な条件を十分に承知している。それにもかかわらず、特定の条件を、下記の実験部分において正確に開示する。簡潔に言うと、STAT3プロモーターの下流にホタルルシフェラーゼ構築物を発現するプラスミドを、GP130およびAPJを共発現する細胞にトランスフェクトすることができ、これらの細胞を、アペリンで（好ましくはトランスフェクションの24時間後に）処置することができる。候補化合物を添加したら、STAT3依存性ルシフェラーゼシグナルを測定することができる。ホタルルシフェラーゼシグナルは、アペリン、APJ、およびGP130の間の機能的相互作用の存在下でのみ観察されるはずである。
【００８９】
この具体的態様において、GP130受容体の活性化は、アペリンの存在下で、STAT3経路の活性化レベル、特に、STAT3プロモーターの制御下に置かれたレポータータンパク質の発現レベルが、アペリンポリペプチドのない対照試料と比較した際に有意に増大している場合に、検出される。したがって、試験される化合物は、比較工程（c）において、アペリンの存在下で観察されるSTAT3プロモーターの制御下のレポータータンパク質の発現が、該化合物が添加された際に有意に減少している場合に、選択されることになる。
【００９０】
別の態様において、本発明の方法の検出する工程（b）は、共受容体APJおよびGP130の間の物理的相互作用の検出および／または測定を含む。検出は、画像および／または生化学に基づくアプローチを通して達成することができる。
【００９１】
好ましい態様において、本発明の方法の検出する工程（b）は、（i）GP130依存性シグナル伝達経路の（例えば、GP130受容体のまたはSTAT3シグナル伝達経路の）検出および／または測定、ならびに（ii）APJ依存性シグナル伝達経路の（例えば、APJ受容体のまたはAkt/mTORシグナル伝達経路の）活性化レベルの検出および／または測定を含む。これらの活性化レベルは、以前に述べたように、任意の従来の方法によって評価することができる。
【００９２】
この好ましい態様において、試験される化合物は、比較工程（c）において、（i）GP130受容体のまたはGP130依存性シグナル伝達経路の、アペリンの存在下での活性化レベル、および、（ii）APJ受容体のまたはAPJ依存性シグナル伝達経路の、アペリンの存在下での活性化レベルが、該化合物が添加された際に有意に減少している場合に、選択されることになる。
【００９３】
この具体的態様において、本発明の方法の工程（b）は、APJ依存性シグナル伝達経路およびGP130依存性シグナル伝達経路の両方が評価されるという条件で、これらのアッセイの任意の組み合わせを含有してもよい。特に、APJおよびGP130を共発現する細胞において、アペリンポリペプチドおよび任意で試験される化合物の存在下で、
（i）GP130受容体の活性化レベル、およびAPJ受容体の活性化レベル、
（ii）GP130受容体の活性化レベル、およびAPJ依存性シグナル伝達経路の（例えば、Akt/mTORシグナル伝達経路の）活性化レベル、または
（iii）GP130依存性シグナル伝達経路の（例えば、STAT3シグナル伝達経路の）活性化レベル、およびAPJ受容体の活性化レベル、または
（iv）GP130依存性シグナル伝達経路の（例えば、STAT3シグナル伝達経路の）活性化レベル、およびAPJ依存性シグナル伝達経路の（例えば、Akt/mTORシグナル伝達経路の）活性化レベル
のいずれかを測定することが可能である。
【００９４】
本発明の方法において、2つのシグナル伝達経路の活性化状態の評価は、任意の順序で、または同時に行ってもよい。換言すると、GP130のまたはGP130依存性シグナル伝達経路の活性化レベルの評価は、APJのまたはAPJ依存性シグナル伝達経路の活性化レベルを評価するのと同時に、前または後に、行うことができる。
【００９５】
さらに、好ましい態様において、GP130のまたはGP130依存性シグナル伝達経路の活性化レベルの評価は、APJのまたはAPJ依存性シグナル伝達経路の活性化レベルを評価する前に行う。
【００９６】
別の好ましい態様において、APJのまたはAPJ依存性シグナル伝達経路の活性化レベルの測定は、試験される化合物が、GP130のまたはアペリン依存的なGP130依存性シグナル伝達経路の活性化を有意に減少させる場合にのみ行う。
【００９７】
実際には、2つのシグナル伝達経路の活性化状態を、独立して行ってもよい。その結果、当業者は、2つの異なるシグナル伝達経路を評価するために異なる細胞を、それらがGP130およびAPJを発現するという条件で、使用してもよい。あるいは、2つのシグナル伝達経路の活性化を、同じ細胞上で評価してもよい。
【００９８】
好ましい態様において、本発明の方法の検出する工程（b）は、APJおよびGP130を共発現する細胞における、アペリンポリペプチドおよび任意で試験される化合物の存在下での、
（b1）STAT3シグナル伝達経路の活性化レベル、および
（b2）APJへのβ-アレスチン2の動員
の検出および／または測定を含む。
【００９９】
より正確には、本発明の方法の検出する工程（b）は、
（b1）APJおよびGP130を共発現する細胞において、アペリンポリペプチドおよび任意で試験される化合物の存在下で、その発現がSEQ ID NO:9のSTAT3プロモーターに機能的に連結されているレポータータンパク質の発現を測定する工程、ならびに
（b2）APJおよびGP130を共発現する細胞において、アペリンポリペプチドおよび任意で試験される化合物の存在下で、アペリン依存的なAPJへのβ-アレスチン2の動員を、好ましくはBRETにより測定する工程
を含む。
【０１００】
好ましい態様において、2つの工程（b1）および（b2）を、この順序で行う（b2がb1に続く）。より正確には、試験される化合物が、工程（b1）において測定されるレポータータンパク質発現のアペリン依存的な活性化のレベルを有意に減少させる場合にのみ、工程（b2）を行う。実際のところ、STAT3経路は、試験されるシグナル伝達経路のすべてを統合する。このため、化合物がアペリン依存的なSTAT3の活性化を遮断しない場合、この化合物は、APJ依存性ERK活性化に影響を及ぼすのには効率的であり得るが、GSC特性に影響を及ぼす可能性は低い。
【０１０１】
本発明の文脈において、受容体のまたはそれに依存するシグナル伝達経路の活性化レベルは、GP130およびAPJを発現する組み換え細胞においてアペリンの存在下で、工程（b）、（b1）、または（b2）で測定される値が、これらの細胞においてアペリンの非存在下で（および試験される化合物の非存在下で）測定される値よりも2倍上、好ましくは4倍、より好ましくは6倍高い場合に、アペリンの存在下で（および試験される化合物の非存在下で）「有意に増大している」ことが意味される。
【０１０２】
逆に、受容体のまたはそれに依存するシグナル伝達経路の活性化レベルは、GP130およびAPJを発現する組み換え細胞においてアペリンの存在下で、工程（b）、（b1）、または（b2）で測定される値が、これらの細胞において試験される化合物の非存在下で（しかしアペリンの存在下で）得られる値よりも2倍、好ましくは4倍、より好ましくは6倍小さい場合に、試験される化合物の存在下で「有意に減少している」ことが意味される。
【０１０３】
選択された化合物の治療用途
別の局面において、本発明は、CSC特性（例えば、CSCの分化能、自己複製、および生存）を阻害する方法であって、これらの細胞を、
（a）アペリンのその共受容体APJおよびGP130に対する物理的相互作用を阻害する、または
（b）共受容体APJおよびGP130の物理的相互作用を阻害する、または
（c）mTORシグナル伝達経路およびSTAT3シグナル伝達経路を同時に阻害する
ことができる化合物と接触させる工程を含む方法に関する。
【０１０４】
好ましくは、前記化合物は、PTENではないし、いかなるPTEN関連分子でもない。実際のところ、CSCの生存に対するmTORの効果は、PTENとは独立している（Galan-Moya et al., 2011）。
【０１０５】
本方法は、インビトロまたはインビボで行うことができる。
【０１０６】
本化合物は、好ましくは、アンチセンス核酸、化学低分子、または抗体である。
【０１０７】
好ましい態様において、本化合物は、GSCにおいてアペリン誘導性シグナル伝達および自己複製を遮断する、低分子MM54、またはシクロ(1-6)CRPRLC-KH-シクロ(9-14)CRPRLCである（Macaluso NJ et al., 2011）。
【０１０８】
本化合物は、実際に、ひとたび開始された腫瘍成長をインビボで阻害することができる（図6Eおよび図9の結果を参照されたい）。本発明者らにより観察されたように（図9を参照されたい）、この効果は、少なくとも部分的に、その抗血管形成効果、その抗増殖効果、またはそのGSC生存に対する負の効果による可能性がある。
【０１０９】
さらに、本発明者らは、APJが（2種の異なるshRNA抗APJによって）下方制御されているGSCの移植が阻止されることを観察した（図4H）。
【０１１０】
Macaluso NJ et al., 2011およびMacaluso NJ et al., 2010に記載されているような、ALX40-4C、[CRPRLC]-A-[CRPRLC]、[CRPRLC]-AA-[CRPRLC]、[CRPRLC]-GG-[CRPRLC]、[CRPRLC]-HK-[CRPRLC]、[CRPRLC]-KH-[CRPRLC]、シクロ(1-6)QRPRLS、またはシクロ(1-7)QRPRLSHなどの任意の他のAPJアンタゴニストが、使用されてもよい。
【０１１１】
本発明の化合物、特にMM54化合物は、したがって、CSC、特にGSCを含む癌を予防および／または治療するために使用されてもよい。
【０１１２】
好ましい態様において、本発明の化合物、特にMM54は、癌に関連する血管形成を阻害するために使用されてもよい。
【０１１３】
別の好ましい態様において、試験される化合物は、siRNAまたはshRNAなどのアンチセンス核酸であり、該化合物は以下の配列を有する。
APJに特異的なsiRNA：
2017516490.tif 000007
アペリンに特異的なsiRNA：
2017516490.tif 000008
アペリンに特異的なshRNA：
2017516490.tif 000009
GP130に特異的なsiRNA：
2017516490.tif 000010
【０１１４】
別の好ましい態様において、試験される化合物は、APJとアペリンとの間の相互作用を阻害することが公知の抗体である。
【０１１５】
腫瘍の血管形成におけるAPJ/アペリンシグナル伝達経路の役割は、依然として議論が交わされていることが、注目されるべきである。いくつかの研究は、アペリンが腫瘍の血管形成を誘導することを明らかにした（Rayalam S. et al, 2011）が、他の研究は、アペリンが血管の正常化を誘導し、究極的に抗腫瘍効果を誘導することを実証した（Kidoya et al., 2012）。さらに、いかなる研究もこれまでに、本発明がするように、CSCの生存に対するAPJ/アペリン経路の役割を開示してはいない。要するに、これは、当業者が、CSC特性を減弱させるためにアペリン経路の阻害剤を用いることを奨励されていなかったことを意味する。
【０１１６】
本化合物を、以下、「本発明の化合物」と呼ぶ。
【０１１７】
重要なことに、本発明の化合物は、癌幹細胞を選択的に標的とする（正常幹細胞を標的としない）と考えられ、なぜなら、これらの細胞のみが、APJ/GP130経路への、ならびに、Akt/mTORおよびSTAT3経路の下流の活性化への耽溺を発達させているためである。さらに、アペリン/APJ/GP130シグナル伝達を遮断することは、分化した細胞（正常細胞または癌性細胞のいずれか）を標的としないと考えられ、なぜなら、APJはそれらの分化時に失われるためである。その結果、本発明の化合物は、健康な幹細胞および分化した細胞を温存しながらCSCを選択的に標的とすることになり、そのため副作用をほとんど有さないと考えられる。
【０１１８】
したがって、本発明の化合物は、癌患者、好ましくは、CSCを含むことが公知である、乳癌、頭頸部癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、肉腫、脳腫瘍、腎癌、前立腺癌、黒色腫および皮膚癌、胃癌、多発性骨髄腫、白血病またはリンパ腫に罹患している患者を予防および／または治療するために使用することができる。好ましい態様において、本化合物は、神経膠芽腫を予防および／または治療するために使用される。
【０１１９】
本化合物は、幹細胞ではない癌細胞には影響を及ぼし得ないため、DNA損傷剤、抗有糸分裂剤、および／または代謝拮抗剤などの、少なくとも1つの伝統的な化学療法薬と組み合わせて、有利に使用することができる。
【０１２０】
前記DNA損傷剤は、アルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤、および／またはDNAインターカレーターであることができる。前記アルキル化剤は、好ましくは、以下からなる群より選択される：クロラムブシル、シクロホスファミド、イホスファミド、メクロレタミン、メルファラン、ウラシルマスタード、チオテパ、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、カルボプラチン、シスプラチン、サトラプラチン、オキサリプラチン、アルトレタミン、ET-743、XLl 19（ベカテカリン）、ダカルバジン、クロルメチン、ベンダムスチン、トロホスファミド、ウラムスチン、フォテムスチン、ミムスチン、プレドニムスチン、ラニムスチン、セムスチン、ネダプラチン、四硝酸トリプラチン、マンノスルファン、トレオスルファン、テモゾロミド、カルボクオン、トリアジクオン、トリエチレンメラミン、およびプロカルバジン。前記トポイソメラーゼ阻害剤は、好ましくは、以下からなる群より選択される：ドキソルビシン（doxil）、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、アントラセンジオン（ノバントロン）、ミトキサントロン、マイトマイシンC、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、プリカトマイシン（plicatomycin）、イリノテカン（camptosar）、カンプトテシン、ルビテカン、ベロテカン、エトポシド、テニポシド、およびトポテカン（hycamptin）。前記DNAインターカレーターは、好ましくは、プロフラビン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、およびサリドマイドからなる群より選択される。
【０１２１】
前記抗有糸分裂剤は、好ましくは、以下からなる群より選択される：パクリタキセル（abraxane）／taxol、ドセタキセル（taxotere）、BMS-275183、xyotax、tocosal、ビノルレビン（vinorlebine）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビンゾリジン、エトポシド（VP-16）、テニポシド（VM-26）、イキサベピロン、ラロタキセル、オルタタキセル、テセタキセル、およびイスピネシブ。
【０１２２】
前記代謝拮抗剤は、好ましくは、以下からなる群より選択される：フルオロウラシル（5-FU）、フロクスウリジン（5-FUdR）、メトトレキサート、xeloda、arranon、ロイコボリン、ヒドロキシ尿素、チオグアニン（6-TG）、メルカプトプリン（6-MP）、シタラビン、ペントスタチン、リン酸フルダラビン、クラドリビン（2-CDA）、アスパラギナーゼ、ゲムシタビン、ペメトレキセド、ボルテゾミブ、アミノプテリン、ラルチトレキセド、クロファラビン、エノシタビン、サパシタビン、およびアザシチジン。
【０１２３】
さらなる抗癌化学療法、および適した治療プロトコルの例は、両方ともLippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa., U.S.A.の、Cancer Chemotherapy and Biotherapy: Principles and Practice, 3rd ed. (2001), Chabner and Longo, eds.およびHandbook of Cancer Chemotherapy, 6th ed. (2003), Skeet, ed.などの本において見出され得；さらに、抗癌療法、特に化学療法のためのレジメンは、ウェブサイト上に、例えば、National Cancer Institute (www.cancer.gov)、American Society for Clinical Oncology (www.asco.org)、およびNational Comprehensive Cancer Network (www.nccn.org)によって維持されているものに見出され得る。本発明の化合物の、例えば抗血管形成分子（ベバジクマブ（bevazicumab）など）との関連が、好ましく考慮される。
【０１２４】
別の局面において、本発明は、癌幹細胞（CSC）特性を阻害することによって癌を予防および／または治療するための方法であって、必要とする対象において本発明の化合物の有効量を投与する工程を含む方法に関する。本化合物は、1つまたは複数の伝統的な化学療法薬（例えば、上記で開示されたような、DNA損傷剤、抗有糸分裂剤、および／または代謝拮抗剤）の前に、同時に、または後に、有利に投与される。
【０１２５】
本明細書において使用される際、「対象」という用語は、特定の治療のレシピエントであるべき、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類などを含む（がこれらに限定されない）、任意の動物（例えば、哺乳類）を指す。典型的に、「対象」および「患者」という用語は、ヒト対象に関して互換的に使用される。
【０１２６】
さらに別の局面において、本発明は、本発明の化合物および薬学的に許容される担体を含有する薬学的組成物に関する。本薬学的組成物は、好ましくは、必要とする対象において癌を予防および／または治療するために使用される。
【０１２７】
「薬学的に許容される担体」という用語は、適切なように、動物、またはヒトに投与された際に、いかなる有害反応、アレルギー性反応、または他の不適当な反応も生じない分子実体および組成物を指す。獣医学的用途が、本発明内に同等に含まれ、「薬学的に許容される」製剤は、臨床用途および／または獣医学的用途の両方のための製剤を含む。本明細書において使用される際、「薬学的に許容される担体」は、任意のおよびすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。薬学的活性物質のためのそのような媒質および作用物質の使用は、当技術分野において周知である。
【０１２８】
これらの方法に関して本明細書において使用される際、「投与する」という用語は、組成物を対象または患者の中に導入する種々の手段を指す。それは、皮下注射、静脈内注射、眼内注射、頭蓋内注射または移植、皮内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、気管内投与、硬膜外投与、吸入、鼻内投与、経口投与、舌下投与、頬投与、直腸投与、膣投与、および局所投与を含む（がこれらに限定されない）ように意図される。
【０１２９】
本明細書において使用される際、「有効量」という用語は、望ましい結果をもたらすと考えられる量を指し、当業者によって容易に決定され得る。本発明の組成物は、種々の投与の手段のために製剤化され得る。これらの手段は、当技術分野において周知であり、例えば、注射；経口投与のための錠剤、丸剤、カプセル剤、または他の固形物；鼻溶液またはスプレー；エアロゾル、吸入剤；局所製剤；リポソーム形態などを含み得る。
【０１３０】
アペリンの予後予測用途
神経膠腫は、細胞タイプ、グレード、および場所によって分類され得る。様々な細胞タイプの中で、星状細胞腫は、大脳における星状細胞と呼ばれる星形の脳細胞から生じる。このタイプの腫瘍は通常、脳および脊髄の外側には広がらず、通常、他の臓器には影響を及ぼさない。星状細胞腫は、最も一般的な神経膠腫であり、脳の大部分において、および時には脊髄において起こる可能性がある。それは、世界保健機関（WHO）によってグレードIIの低グレード神経膠腫として分類されている。神経膠芽腫などの高グレード［WHOグレードIII〜IV］神経膠腫は、未分化または退生であり；これらは悪性で、より悪い予後を有する。
【０１３１】
本発明者らの結果により、アペリン発現は、非腫瘍脳組織と比較した際に、グレードII〜IVの神経膠腫試料において有意に上昇していることが判明した（図8参照）。著しく、アペリンは、グレードIVの中でより悪い予後およびより高い耐性のものである、間葉サブタイプにおいてより豊富に見出された（図17参照）。これと一致して、上方制御されたアペリン発現または増幅されたコピー数を有する患者は、有意により低い生存率を呈する（図8および図17参照）。要するに、これらの結果により、高いアペリンレベルは、より不良の予後および低減した患者生存と関連していることが示唆される。
【０１３２】
別の局面において、本発明は、神経膠芽腫に罹患している対象の生存率を評定するためのアペリン発現レベルの使用に関する。
【０１３３】
アペリンの発現は、任意の従来の手段（ウエスタンブロット、ノーザンブロット、免疫組織化学など）によって、核酸レベル（mRNA）またはタンパク質レベルのいずれかで決定され得る。この発現レベルは、好ましくは、例えば生検によって得られた前記腫瘍の生物学的試料において測定される。
【０１３４】
好ましい態様において、本発明は、神経膠芽腫に罹患している対象の生存率を予測するためのインビトロの方法であって、
（a）腫瘍の生物学的試料におけるアペリンの発現レベルを決定する工程、
（b）該発現レベルを参照値と比較する工程、
（c）該比較から、該対象が高い生存率または低い生存率を有することを結論づける工程
を含む方法に関する。
【０１３５】
本発明の文脈において、「参照値」は、工程（a）において使用されるであろう技術（ウエスタンブロット、ノーザンブロット、免疫組織化学など）によって評価されるような、非腫瘍脳組織におけるアペリンの基底発現レベルに相当する。
【０１３６】
好ましくは、試験試料におけるアペリンの発現レベルが前記参照値よりも有意に高い場合に、高い生存率が予測されることになる。逆に、試験試料におけるアペリンの発現レベルが前記参照値よりも有意に低い場合に、低い生存率が予測されることになる。
【０１３７】
アペリンの発現レベルと参照値との間の比が、1.5、好ましくは2、より好ましくは5よりも厳密に大きい場合に、アペリンの発現レベルは参照値よりも「有意に高い」と考えられることになる。
【０１３８】
逆に、アペリンの発現レベルと参照値との間の比が、0.75、好ましくは0.5、より好ましくは0.2よりも厳密に小さい場合に、アペリンの発現レベルは参照値よりも「有意に低い」と考えられることになる。
【０１３９】
本明細書における「高い生存率」とは、試験された対象が、試料が収集された後に、300日、好ましくは400日よりも長い可能性が高い平均生存期間を有するであろうことを意味する。
【０１４０】
本明細書における「低い生存率」とは、試験された対象が、試料が収集された後に、300日、好ましくは200日よりも短い可能性が高い平均生存期間を有するであろうことを意味する。
【実施例】
【０１４１】
I．材料および方法
細胞培養、培養上清調製、およびアペリン分泌
患者由来のGSC #1〜4は、（Patru et al, 2010）に以前に記載されており、GSC #5〜17は、Hospital Laennec, Nantes, Franceから取得した。簡潔に言うと、腫瘍を、gentleMACs Dissociator（Miltenyi）を用いて、製造業者の説明書にしたがって解離させた。GSC #1〜17を、N2、G5、およびB27（Life Technologies）を加えたDMEM/F12中で維持した。不死化したヒト脳微小血管内皮細胞（hCMEC/D3）を、以前に記載されているように（Weksler et al, 2005）培養し、HEK-293Tを、抗生物質（Invitrogen）を加えたDMEM 10％ FBS中で培養した。hCMEC/D3由来の培養上清（EC-CM）およびHEK-293T由来の培養上清（293T-CM）を、無血清EBM2（Lonza）中の72時間齢の単層から取得した。CM中のアペリンの濃度を、ヒトアペリンEIAキット発色キット（Phoenix Pharmaceutical）を用いて、製造業者の指示にしたがって定量した。
【０１４２】
プラスミド、試薬、およびトランスフェクション
HA-APJ構築物は、L.Zheng博士（Chun et al., 2008）より快く供給され、pORF-GP130は、InvivoGen由来であった。トランスフェクションを、Turbofect（Thermo Scientific）を用いてHEK-293Tにおいて行った。組み換えアペリンは、Sigma-Aldrich由来であった。APJアンタゴニストであるMM54、シクロ(1-6)CRPRLC-KH-シクロ(9-14)CRPRLCは、Robert Glenn博士（Macaluso NJ et al., 2011）より快く供給された。ステルス非サイレンシング対照ならびにヒトアペリン、APJ、およびGP130について選択されたsiRNAは、InvitrogenおよびSigma由来であった：APJに特異的なsiRNA
2017516490.tif 000011
アペリンに特異的なsiRNA
2017516490.tif 000012
；GP130に特異的なsiRNA
2017516490.tif 000013
。トランスフェクションは、RNAiMAX lipofectamine（Invitrogen）を用いて行った。GIPZ Lentiviral shRNAアペリン
2017516490.tif 000014
を、Thermo Scientificから購入した。レンチウイルスの産生を、以前に記載されているように行った（Galan et al 2011b）。感染の48時間後に、ピューロマイシン選択を開始した（Sigma、1.5 mg/ml）。
【０１４３】
二次ニューロスフェア形成
GSCを、上下のピペッティングによって解離させ、48ウェルプレート形式で培養した。細胞を、マイトジェン欠乏後の1日目および2日目に再び解離させ、次いで、3日目まで維持した。NS計数を、5つのランダムな視野（fov）について盲目的に行い、ニューロスフェア/fovの平均を、3回の独立した実験から算出した。統計学的解析を、2方向のスチューデントの検定（Excel Microsoft Office）を用いて行った。
【０１４４】
RNA抽出およびRT-PCR
RNAを、Qiagen RNeasy Mini Kitを用いて、製造業者の指示にしたがって抽出した。等量のRNAを、Superscript III RTキット（Invitrogen）を用いて逆転写し、結果として生じたcDNAを使用して、Red Taq DNAポリメラーゼ（Sigma）の存在下で遺伝子特異的プライマーセット（表1）を用いたPCRにより、APJ、Gp130、Sox2、ネスチン、およびOct4 mRNAを増幅した。ヒトβ-アクチンもまた、インプットについての対照として増幅した。PCR産物を、SYBR greenを含有するアガロースゲル（Invitrogen）上で電気泳動により分離し、DNAを、UV照明（Appligene）により可視化した。
【０１４５】
ウエスタンブロットおよび抗体
タンパク質を、プロテアーゼ阻害剤（Sigma）、200 mM NaF、および0.1 mM Na3VO4を加えたTNT緩衝液（10 mMトリス-HCl pH 7.5、150 mM NaCl、1％ TritonX100、2mM EDTA）中に収集した。等量のタンパク質（microBCAキット、Pierce）を、4-12％ Nupageゲル（Invitrogen）で分離し、PVDF膜（Thermo Fisher Scientific）上に転写した。Alexa680コンジュゲート二次抗体（Invitrogen）を使用し、Odyssey infrared imaging system（Licor）を用いて膜をスキャンした。以下の抗体を使用した：ホスホ(p)-S-Akt、pT-Akt、p-S6、全Akt、p-Y-STAT3、p-S-STAT3、STAT3（Cell Signaling）、APC-APJ、対照Ig、および非コンジュゲートAPJ（Millipore）、GP130（Abcam）。
【０１４６】
共免疫沈降
共免疫沈降実験のために、細胞を、プロテアーゼ阻害剤（Sigma）、200 mM NaF、および0.1 mM Na3VO4を加えたHNTG緩衝液（20 mM Hepes pH 7.5、150 mM NaCl、0.1％ Triton X-100、10％グリセロール）中で溶解した。清澄化前の核除去上清（pre-clear post-nuclei supernatant）を、抗APJ抗体（2μg/試料、Millipore）とインキュベートした。プロテインGアガロース（gamma Bind Sepharose, Sigma）を、最後の45分間添加した。
【０１４７】
等量のタンパク質（microBCAキット、Pierce）を、4-12％ Nupageゲル（Life Technologies）で分離し、PVDF膜（Thermo Scientific）上に転写した。Alexa680コンジュゲート二次抗体（Life Technologies）を使用し、Odyssey infrared imaging system（Licor）を用いて膜をスキャンした。
【０１４８】
以下の抗体を使用した：ホスホ(p)S-Akt、p-S6、全Akt、pS-STAT3、STAT3（Cell Signaling）、Gp130（Santa Cruz）、ならびにAPJ、Sox2、およびネスチン（Millipore）。チューブリン（Santa Cruz）を、内部ローディング対照として使用した。スキャンは、3回の独立した実験を代表する。
【０１４９】
ルシフェラーゼアッセイ
HEK-293T細胞に、HA-APJ、GP130、STAT3ルシフェラーゼレポーターベクター（Affymetrix）、およびレニラ（Promega）を共トランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後に、細胞を、示された薬物で前処置し、1時間後、アペリンに6時間曝露した。次いで、細胞を溶解し、STAT3ルシフェラーゼ活性を、Dual-Luciferase Reporter Assay（Promega）を用いて測定した。
【０１５０】
フローサイトメトリー
細胞表面発現解析のために、細胞を、コンジュゲート抗体とともに1時間インキュベートし、次いで、冷たいPBSで2回洗浄した。フローサイトメトリー解析を、Accuriサイトメーター（BD Biosciences, CYBIO facility, Institut Cochin）で行い、CFlow plusソフトウェア（BD Biosciences）を用いて分析した。
【０１５１】
BRET解析
RLuc-βアレスチン2-YFP（M. Scott博士より快く提供されたもの）とともに、APJ、GP130を発現するかまたは両方の受容体を共発現するHEK-293T細胞を、トランスフェクションの24時間後に、ポリリジンでコーティングされた96ウェル白色マイクロプレート中に分配した。次いで、細胞を、PBSで2回洗浄し、セレンテラジンh（ハンクス溶液中、50 nMの最終濃度）と10分間インキュベートした。その後、細胞を、示された時間アペリン（1μM）で刺激し、マルチラベルリーダー（Mithras LB 940；Berthold Technologies）を用いて発光を検出した（Lucについては460-500 nm、およびYFPについては510-550 nm）。その動員によるβ-アレスチンのコンフォメーション変化を測定するBRETシグナルを、Lucにより放出された光に対するYFPにより放出された光の比として決定した。値を、RLuc-βアレスチン-YFPが単独で発現している際に検出されるバックグラウンドBRET RLucシグナルを差し引くことによって補正した。
【０１５２】
膜調製物を用いた放射活性結合アッセイ
膜画分の調製のために、HEK-293T細胞およびGSC細胞を溶解し（5 mMトリス pH7.4および2 mM EDTA）、ultrathorax（IKA-Labortechnik, Germany）を用いて4×5秒ホモジェナイズした。ホモジェネートを、3000 rpmでの5分の遠心分離によって清澄化した。次いで、細胞を、結合緩衝液（50 nM Hepes、5 mM MgCl2
、および1％ BSA）中に再懸濁し、超遠心分離して細胞膜を取得した。次いで、膜を、100μlの結合緩衝液において[125I][<Glu65,Nle75,Tyr77]アペリン-13（Perkin Elmer）と室温で90分間インキュベートした。非特異的結合の量を決定するために、非標識[<Glu65,Nle75,Tyr77]アペリン-13（Sigma）を同時に添加した。インキュベーション後、結合した放射活性と遊離の放射活性とを、セルハーベスター（Packard）のガラス繊維フィルターユニット（GF/C, Packard Instrument Co.）を用いた急速濾過を通して分離した。フィルターユニットを完全に乾燥させ、Microcinti O（Packard）を各ウェルに添加した。各ウェルの放射活性を、TopCount液体シンチレーションカウンター（Packard）でカウントした。解離定数（Kd）および結合部位の数（B max）を、スキャッチャード法によって決定した。
【０１５３】
インタクトな細胞を用いた受容体結合アッセイ
結合実験に先立って、2×106個のGSCを、DMEM/F12で3回洗浄し、結合緩衝液（DMEM/F12、40 mM HEPES、1％ BSA）中に再懸濁した。非特異的結合の量を決定するために、1μMの非標識[<Glu65,Nle75,Tyr77]アペリン-13を添加した。示された際には、細胞をGP130遮断抗体（2μg/ml）とプレインキュベートした。次いで、細胞を、400 pM[125I][<Glu65,Nle75,Tyr77]アペリン-13とともに、撹拌しながら6時間、4℃でインキュベートし、放射活性をガンマカウンター（Beckman）で測定した。
【０１５４】
動物、組織学、ならびに、腫瘍の発生および進行
すべての動物研究は、European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for Experimental and other Scientific Purposes (ETS 123)に準拠した、フランスの省が承認したプロトコル（承諾番号#00754.02）にしたがって実施した。6週齢の雌のBALB/cヌードマウス（Janvier）に、100μlの1:1のPBSおよび増殖因子フリーマトリゲル（Corning）中の1＊106細胞を、皮下注射した。腫瘍の発生については（図9）、マウスを、腫瘍を探索して毎週検査し、移植の7週間後に屠殺した。薬理学的研究のために（図6）、腫瘍が検出されたら（移植後4週間）、マウスを、1週間に2回、PBS（100μl）中に希釈したMM54またはビヒクル（DMSO）で処置した（7週間にわたる腹腔内注射）。
【０１５５】
屠殺時に、腫瘍を摘出し、バイオモールド（biomould）においてOCT（Tissue Tek）に包埋し、ドライアイスで冷却したイソペンタンに1分間浸漬することにより凍結し、さらなる解析のために-80℃で保存した。
【０１５６】
免疫染色のために、包埋したOCT腫瘍を、CM350S Leicaクリオスタット（Histology platform, Institut Cochin, Paris）を用いて7μmの切片に切った。予め温めた凍結切片（30分、RT）を、30分間PBS-パラホルムアルデヒド4％中で固定化し、2時間のブロッキング工程（PBS中3％ BSA）に先立って、透過処理（PBS-Triton 0.5％、15分）した。一次抗体（BD由来のPECAM、ならびにMillipore由来のKi67およびネスチン）を、一晩4℃で、ブロッキング緩衝液中でインキュベートした。切片を、PBS中で大々的にリンスし、適した種特異的Alexa Fluor結合二次抗体（Life Technologies）とともに1時間、RTでインキュベートした。スライドを、DAPIマウント培地においてマウントした。細胞死を、製造業者の指示にしたがい、Tunelアッセイキット（TACS 2 TdT-Fluor In situ 検出キット、Trevigen）を通して概算した。
【０１５７】
少なくとも5つの異なる視野（fov）を各々有する、条件あたり最低で3枚の腫瘍切片を使用した。血管表面解析のために、PECAMピクセル強度を各fovにおいて算出し、全fovの平均＋標準誤差を表した。細胞増殖を、DAPIにおいて細胞の全細胞数に正規化した、Ki67陽性細胞のパーセンテージを通して評価した。ネスチン陽性細胞を、fovあたりで計数した。
【０１５８】
画像の獲得
画像の獲得を、それぞれ、TCS/SP4 Leica共焦点顕微鏡（Institut A. Lwoff, Villejuif, France）およびSpinning Disk Leica顕微鏡（Institut Cochin, Paris, France）上でLeica Application Software (LAS)およびMetamorphを用いて、行った。Image Jソフトウェアを使用して、輝度、コントラスト、および写真サイズを調整した（Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2014）。
【０１５９】
統計学的解析
データは、少なくとも3回の独立した実験を代表する。統計学的解析を、図の説明において特定したように、二元配置分散分析（ANOVA）および対応のない両側t検定（スチューデントのt検定）を用いて、GraphPad Prism6またはMicroscoft Office Excelソフトウェアで行った。カプラン・マイヤー生存曲線において、差をログランク解析により比較した。
【０１６０】
結果
内皮分泌アペリンはGSCの幹細胞性を持続する
多くの他のタンパク質に混ざって13アミノ酸ペプチドのアペリンが内皮細胞培養上清（EC-CM）中に放出されていることが見出された（図1、図2A〜図2B）。興味深いことに、二次ニューロスフェア形成およびSox2/ネスチン発現によって証明されるように、組み換えアペリンは、16患者由来のGSCのパネルにおいて自己複製を支持するのに十分であった（図2C〜図2D）。逆に、アペリンが枯渇したEC-CMは、GSCの自己複製を維持することができなかった（図2G）。
【０１６１】
アペリンがGSCサブセットを維持するパラクラインシグナルとして作用することができるかどうかを調査するために、組み換えアペリンを、マイトジェンフリー（MF）培地中のGSCに適用した（図11a）。ネスチンおよびSox2の発現は、マイトジェン含有培地（NS）においては容易に検出されたが、マイトジェン停止時（MF条件）のGSCにおいては消滅し、これは、二次腫瘍塊形成の有意な低下を伴っていた（図11b〜図11c）。逆に、細胞死が増加した（図11d）。しかし、これらの自己複製マーカーは、アペリンの存在下で維持されていた（図11b〜図11cおよび図12）。これと合わせて、アペリンはまた、マイトジェン欠乏が誘導する細胞死も妨げた（図11d）。次いで、RNA干渉を用いて、内皮細胞においてアペリンをノックダウンした。アペリンがサイレンシングされた内皮細胞由来の培養上清（CM）は、16患者由来のGSCのパネルにおいて細胞生存を支持できなかったことが見出された（図11e〜図11H）。枯渇した内皮細胞由来培地中への外来性アペリンの添加により、EC-CMが持続する自己複製および生存率が回復した（図11i〜図11k）。アペリンとは対照的に、代替的なAPJリガンドとして最近同定されたToddler/Elabelaは、GSCに対するアペリンの効果を繰り返さなかった（示されていない）。このように、アペリンは、GSCの維持および生存に必要とされる不可欠な内皮因子である。他のAPJアゴニスト（すなわち、ML233、アペリン13、およびアペリン36）は、APJ/GP130およびmTOR経路を通してGSCの生存を促進することが示されている（図13参照）。
【０１６２】
重要なことに、図11（d、h、k）に提示された結果は、アペリンがGSCの（増殖だけではなく）生存に対して効果を有することを示している。
【０１６３】
ヒトGBMにおけるアペリンの役割を探索するために、その発現の遡及的解析を、National Cancer InstituteのRepository for Molecular Brain Neoplasia Data (REMBRANDT)を用いて実施した。これにより、アペリン発現は、非腫瘍脳組織と比較した際に、神経膠腫試料（グレードII〜IV）において有意に上昇していることが判明した（図8Aを参照されたい）。著しく、アペリンは、グレードIVの中でより悪い予後およびより高い耐性を提示するものである、間葉サブタイプにおいてより豊富に見出された（Yan et al, 2013；Verhaak et al., 2010）（図8b〜図8c）。これと一致して、上方制御された遺伝子発現または増幅されたコピー数を有する患者は、有意により低い生存率を呈する（図8d〜図8eを参照されたい）。著しく、APLNは、グレードIVの中でより悪い予後およびより高い耐性を提示するものである、間葉サブタイプにおいてより豊富に見出された（図17参照）。したがって、このデータのセットにより、GBMは、より不良の予後および低減した患者生存と関連する、高くなったアペリンレベルを提示することが示された。
【０１６４】
アペリンは、mTORへのAPJシグナル伝達を通してニューロスフェアの完全性を維持する
アペリンに対する同族受容体であるAPJは、Gタンパク質共役受容体ファミリーに属する。APJは、アンジオテンシンII受容体に関連し、HIV-1神経病因、心臓血管および神経内分泌機能の媒介に関与する共受容体として記載されている。APJ発現は、RNAおよびタンパク質レベルで、患者由来の自己複製GSCにおいて検出されたが、それらの分化時には検出されなかった（図3A〜図3C）。APJは、神経膠芽腫細胞株から目に見えて欠如していた（図3D）。さらに、癌幹細胞様細胞はAPJを発現しているが、様々な組織由来の正常幹細胞は発現していない（図3E〜図3F）。本発明者らは、以前に、GSC特性にとってのAkt/mTor経路の重要性を実証した。これと一致して、組み換えアペリンは、EC-CMと同様の程度にこの経路を活性化することができた（図4A）。より興味深いことに、アペリンを枯渇したEC-CMはそのようにすることができず（図4B）、アペリンがEC媒介性Akt/mTor経路活性化のための鍵となる因子であり得ることを示唆した。さらに、RNA干渉を通したAPJ発現の低減は、EC-CMおよび組み換えアペリンの両方によって誘発されるmTor活性化を、有効に妨害した（図4C〜図4D）。同様に、APJの薬理学的阻害は、EC-CMおよびアペリンによって誘導されるAkt/mTor活性化の両方を低減させることができた（図4E）。最終的に、GSCをEC-CMと培養した際、siRNAまたは薬理学的アンタゴニストのいずれかを通したAPJの標的化は、Sox2/ネスチンの減少とともに、ニューロスフェアの数およびサイズを劇的に減少させた（図4F）。
【０１６５】
アペリンはGP130を取り込んでAPJ依存性mTOR経路を完全に活性化する
mTORは、STAT3をリン酸化することが公知である。したがって、EC-CMおよび組み換えアペリンの両方に応答するSTAT3シグナル伝達を評定することを決定した。興味深いことに、組み換えアペリンおよび内皮由来のアペリンの両方が、このシグナル伝達経路を活性化することができた（図5A）。さらに、GSCにおけるAPJの妨害または内皮細胞におけるアペリンの妨害は、STAT3リン酸化を低減させるのに十分であった（図5B）。
【０１６６】
GP130は、LIFRおよびCNTFRなどの、幹細胞性に関与する多くのサイトカイン受容体のためのシグナルトランスデューサーとして機能できることが、十分に記載されている。そのため、GP130がアペリン/APJシグナル伝達において同様に役割を果たすことができるかどうかを調査した。siRNAを通してGP130発現を干渉することにより、GP130がEC-CM媒介性Akt/mTor経路活性化に厳密に必要とされることが示された（図5C）。さらに、GP130遮断抗体はまた、EC-CMおよび組み換えアペリンの両方に応答するAkt/mTor経路活性化も、効率的に遮断した（図5D）。本発明者らは、同様のアプローチを用いて、GSCの幹細胞性に対するGP130遮断の影響を評定した。顕著に、GP130を干渉することは、対照培地中で増殖するGSCのものにはほとんど影響を及ぼさなかったが、EC-CMと培養したニューロスフェアの数およびサイズを劇的に減少させた（図5E）。
【０１６７】
このデータのセットは、APJ/アペリン軸におけるシグナルトランスデューサーとしてのGP130の役割を強調する。このように、組み換えアペリンは、Akt、S6、およびSTAT3のリン酸化によって例証されるようなmTorシグナル伝達カスケードの活性化を、EC-CMおよびNSがするように、任意の他の外来性マイトジェンの非存在下で誘発した。逆に、アペリンが枯渇した細胞由来のEC-CMは、そのようにすることができなかった。同様に、ラパマイシンで薬理学的に、またはRNA干渉により遺伝学的にmTorを遮断することは、GSCに対するアペリン保護効果を危険に曝し（示されていない）、内皮媒介性mTor活性化においてアペリンが中心であるという考えを強化する。アペリンで誘発されるAPJのシグナル伝達下流を、患者由来のGSCにおいて検討した。APJ遺伝子発現の低減は、EC-CMおよび組み換えアペリンで誘発されるS6、Akt、およびSTAT3リン酸化を抑えた。機能的に、内皮媒介性の細胞の生存および自己複製は、APJ発現に依拠した（図4G）。注目すべきことに、増殖培地中に含有された外来性マイトジェンは、アペリン-APJ依存性を迂回するのに十分であった（NS条件、図4G）。最後に、インビボでの腫瘍発生に対するAPJサイレンシングの影響を、APJに対する低分子干渉RNAをレトロウイルスで感染させたGSCをマウスに移植することによって解析した。GSCにおいてAPJレベルを低減させることは、APJ発現GSCと比較した際に腫瘍の出現を顕著に減少させた（図4H）。結果として生じたわずかな腫瘍は、弱いネスチン染色およびより低い血管新生指標を示した（図4I）。集合的に、これらのデータにより、内皮放出アペリンは、GSCの完全性を持続し、mTor経路を通したそれらの生存の不可欠な媒介物質であることが実証される。
【０１６８】
APJとGP130との間の相互作用
次いで、本発明者らは、アペリン刺激に応答するAPJとGP130との間の相互作用を解読した。最初に、GP130が、それぞれ、ルシフェラーゼベースのレポーターおよびBRETアッセイによって証明されるように、アペリン媒介性のSTAT3およびAPJの活性化のために厳密に必要とされることを観察した（図6A〜図6B）。興味深いことに、内在性のAPJおよびGP130は、GSCニューロスフェアにおいて共局在する（示されていない）。GP130は、APJに対するアペリン結合に必要とされなかったが（図6C）、遮断抗体での処置は、アペリンの結合を阻止した（図6D）。興味深いことに、フローサイトメトリー解析により、GP130がAPJの表面利用可能性を調節したことが判明した（示されていない）。より正確には、GP130がサイレンシングされた細胞において、APJの全レベルは不変のままであったが、APJ発現は細胞表面で有意に減少していた（示されていない）。逆に、HEK-293T細胞において、過剰発現したGP130は、細胞表面でのAPJ利用可能性を増強した。これらの観察により、形質膜でのAPJの局在におけるGP130の役割に対する支持が提供される。
【０１６９】
その一方で、内在性GP130の発現は、アゴニスト誘導性のAPJの内部移行を変更しなかった（示されていない）。
【０１７０】
さらに、内皮細胞により産生されるかまたは精製ペプチドとして提供されるかいずれかの、アペリン含有培地中で培養した際に、GP130を標的とすることは、APJを干渉した場合に観察されるものに非常に類似した様式で、GSCの持続可能性を妨害したことが見出された（図10j〜図10m）。そのような効果は、非ペプチドAPJアゴニストであるML233を用いて繰り返された（示されていない）。このように、GP130は、APJを形質膜に維持して、GSCにおいてアペリン/APJシグナル伝達を整理する。
【０１７１】
APJとGP130との間の物理的相互作用
GSCとの関連においてAPJに対する新たなパートナーを同定するために、本発明者らは、膜タンパク質に重点を置いて一連の共免疫沈降実験を行った。この実験により、APJインタラクトームの一部としてGp130が同定された（図10a）。この一回貫通型糖タンパク質は、多くの場合、LIF（白血病阻害因子）、IL-6（インターロイキン6）、およびEPO（エリスロポエチン）サイトカイン受容体のための共受容体として作用し、STAT3シグナル伝達と緊密に関連する。その発現は、患者由来のGSCにおいて均質であった。APJとGp130との間の会合もまた、Duolink技術アッセイにおいて細胞内で直接可視化され、それらがきわめて近接していること（2つの受容体間の距離は＜40 nm）をさらに強調した（図10b）。加えて、生物発光共鳴エネルギー移動（BRET）アッセイにより、Gp130とAPJは共同してβ-アレスチン活性化を促進することが判明し（図10c）、HEK-293T細胞で過剰発現した際、機能的なGタンパク質共役受容体を完全に繰り返すのにAPJ単独では十分でなかったことが示唆された。したがって、Gp130のノックダウンまたは抗体によるGp130活性の遮断は、内皮およびアペリンにより媒介されるmTor活性化およびその後のSTAT3プロモーター活性化を鈍くした（図10d〜図10e）。Gp130がサイレンシングされた細胞において、APJの全レベルは一様のままであったが、細胞表面での発現は有意に減少していた（図10i）。HEK-293T細胞において、過剰発現したGp130は、細胞表面でのAPJ利用可能性を増強した。これらの観察により、形質膜でのAPJの局在におけるGp130の役割に対する支持が提供される。最終的に、本発明者らは、Gp130を標的とすることは、内皮細胞により産生されるかまたは組み換えタンパク質として提供されるかいずれかの、アペリン含有培地中で培養した際に、APJを干渉した場合に観察されるものに非常に類似した様式で、GSCの持続可能性を妨害したことを見出した（図10j〜図10m）。このように、Gp130は、APJを形質膜に維持して、GSCにおけるアペリン/APJシグナル伝達を整える。
【０１７２】
腫瘍成長の阻害
最後に、腫瘍の発生および進行におけるアペリンシグナル伝達の効果を、ヒトGSCを免疫無防備状態マウスの側腹部中に移植した異種移植モデルを用いて、インビボで評価した（図6E）。ビヒクル処置マウスは、経時的な腫瘍体積の増大を示すが、APJアンタゴニストであるMM54の腹腔内注射は、腫瘍の成長および拡大を制止する。APJ阻害剤が腫瘍形成を抑える正確な機構（すなわち、抗血管形成作用および／または抗腫瘍形成作用）は解読されていないが、これらの結果により、APJシグナル伝達がGSCの腫瘍発生特性のために必要とされることが示唆された。
【０１７３】
MM54は、GSCにおけるmTOR活性化に対する、アペリンおよび内皮により支配される効果を緩和した（図9a）。MM54はまた、APJおよびGp130を共発現したHEK-293Tにおいて、アペリン媒介性STAT3活性化を低減させた（図9b）。加えて、MM54チャレンジは、内皮アペリン依存性のGSCの自己複製および生存を減弱させた（図9c）。その抗腫瘍能をさらに調査するために、本発明者らは、GSCを皮下移植したマウスに週に2回、APJ阻害剤を腹腔内投与した。MM54処置は、インビボで腫瘍成長を強く妨げ、ネスチンでスコア化されるGSC数、ならびに残りの腫瘍における全体の細胞増殖および生存率を減少させた（図9e）。これには、腫瘍血管新生の低減が伴った（図9e）。
【０１７４】
MM54化合物の治療的潜在性へのさらなる洞察を得るために、GSCを頭蓋内移植したマウスを、1週間に3回、腹腔内投与で処置した。際立って、MM54処置は、神経学的症状を有意に廃すること、および腫瘍進行に伴う体重減少を救うことの両方に十分であった（図15a〜図15b）。腫瘍を有するマウスの全体の生存は、MM54投与時に劇的に増大し、腫瘍サイズは低減した（図15c、図15d）。重要なことに、MM54処置は、いずれの明らかな毒性効果も発揮しないことが観察された（図16参照）。
【０１７５】
このように、これらのデータにより、APJアンタゴニストはGBM進行を妨害するのに適した薬物標的であり得ることが示唆される。
【０１７６】
要約すると、本明細書において、周囲の血管内皮によって補給され得る、神経膠腫形成のために不可欠な幹細胞ニッチ因子としてのアペリンの役割が提供される。本発明者らの結果により、GSCは内皮アペリンを常用していることが明らかになり、神経膠芽腫において薬物となる可能性がある標的としてのアペリン/APJ/Gp130の結びつきが同定される。抗血管形成抗体であるベバシズマブおよびアルキル化剤であるテモゾロミドの耐性および有害効果を含む、現在の化学療法レジメンについての懸念を考慮すると、アペリンを標的とすることは、これらの悪性度の高い腫瘍の治療における将来の治療用途の新たな可能性をもたらす。
【０１７７】
本発明のスクリーニングアッセイ
本発明者らは、3種の異なる手段によりAPJ-GP130の機能的相互作用を強調した。
‐ アペリン、APJ、およびGP130は、HEK-293T細胞においてSTAT3シグナル伝達のために必要である（ルシフェラーゼSTAT3レポーターアッセイ）。この活性化は、抗GP130抗体またはAPJの薬理学的アンタゴニストを用いて遮断される。
‐ GP130は、HEK-293T細胞においてアペリン依存的なAPJ（Gタンパク質共役受容体）活性化のために必要である（BRETアッセイ）。
‐ GP130は、GSCにおけるAPJへのアペリンの結合のために必要であるが、全APJに対するアペリンの親和性には影響を及ぼさない（GP130-siRNAおよび抗GP130抗体を用いた放射活性結合アッセイ）。
【０１７８】
APJは、ヒト胎児神経幹細胞、マウス胚幹細胞、およびヒト成体造血幹細胞においては発現していないため、この相互作用は、非癌性幹細胞においては起きない（図3D〜図3E）。
【０１７９】
既に述べたように、GSC腫瘍集団の完全性、およびそれによる神経膠芽腫の進行を妨害するために、アペリン/APJ/GP130シグナル伝達軸を阻害することが興味深いと考えられる。
【０１８０】
本発明者らは、ハイスループットスクリーニングにおいてアペリン/APJ/GP130経路阻害剤を同定するための実験条件を設定している。このスクリーニングは、有利には、以下の2つの独立した工程を必要とする。
【０１８１】
1．STAT3経路阻害活性に基づく一次スクリーニング：STAT3レポーター
白色96ウェルプレートにおいて、APJおよびGP130を発現していないHEK-293T細胞に、STAT3プロモーターの下流のホタルルシフェラーゼ構築物およびレニラルシフェラーゼ対照プラスミドとともに、APJおよびGP130のcDNAを最初にトランスフェクトした。次いで、これらの細胞を、24時間後にアペリンで処置した。分子候補を添加し、STAT3依存性ルシフェラーゼシグナルを測定した。
【０１８２】
重要なことに、STAT3経路の活性化は、アペリン/APJ/GP130経路に特異的であり、上流mTorシグナルを統合した。その結果、この最初の工程において、ホタルルシフェラーゼシグナルは、アペリン、APJ、およびGP130の間の機能的相互作用の存在下でのみ観察された。
【０１８３】
2．APJ Gタンパク質共役受容体活性化に基づく二次スクリーニング：BRETレポーターアッセイ
白色96ウェルプレートにおいて、HEK-293T細胞に、RLuc-β-アレスチン2-YFPプラスミドとともに、mock、APJ、および／またはGP130 cDNAをトランスフェクトした。次いで、これらの細胞を、24時間後にアペリンで処置した。分子候補を添加し、BRETシグナルを測定した。BRETシグナルは有意に増大し、したがってAPJは、アペリン、APJ、およびGP130の間の機能的相互作用の存在下でのみ活性化されたことが示された。
【０１８４】
（表１）hCMEC/D3セクレトーム由来のペプチドームおよびプロテオームの解析
MS/MS解析を、hCMEC/D3セクレトームに対して行い、HEK-293T細胞のものと比較した。共有されたヒットを、リストから除去した。MSスコアおよびヒットの数を、22種の同定されたタンパク質の各々について示す。
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【０１８５】
参照文献
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【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【図８ｄ】
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【図８ｅ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図９ｄ】
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【図９ｅ】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１０−５】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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