(57)【要約】本発明は、慢性B型肝炎の処置用の治療的免疫化のための組成物および方法の発見に関連する。本発明の方法は、進化した高力価ハイブリッドB型肝炎ウイルス（HBV）ベクターを生じさせる方法、HBVを処置および／または予防する方法、ならびに、それにより産生されるVLV組成物を投与した対象においてHBV感染症に対するメモリーT細胞およびB細胞の免疫応答を誘導する方法を含む。さらに、本発明は、対象にワクチン接種して、HBVの感染から対象を防御するための薬学的組成物を包含する。2017515508.tif 000011
2017515508.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
セムリキ森林ウイルス（SFV）非構造タンパク質ヌクレオチド配列をコードするDNA配列に機能的に連結されているプロモーター配列を含み、該DNA配列が、SFVサブゲノムRNAプロモーターに機能的に連結され、それが、HBV抗原またはその断片をコードするDNAに機能的に連結され、それが、2Aペプチドをコードする2A DNAに機能的に連結され、次にそれが、水疱性口内炎ウイルス（VSV）Gタンパク質をコードするVSV G DNAに機能的に連結されている、DNA配列を含む、高力価ハイブリッドB型肝炎ウイルス（HBV）ベクターであって、
該SFV非構造タンパク質ヌクレオチド配列が、G-4700-A、A-5424-G、G-5434-A、T-5825-C、T-5930-C、A-6047-G、G-6783-A、G-6963-A、G-7834-A、T-8859-A、T-8864-C、G-9211-A、A-10427-G、G-11560-A、A-11871-G、およびT-11978-Cからなる群より選択される変異のうちの少なくとも2つを含み、
該ベクターが、SFV構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列を欠いており、
さらに、該ベクターを細胞培養において増やす際に、少なくとも1 mlあたり107プラーク形成単位（pfu）の力価のウイルス様ベシクル（VLV）が得られる、
高力価ハイブリッドHBVベクター。
【請求項２】
プロモーター配列が構成性プロモーターを含む、請求項1記載の高力価ハイブリッドHBVベクター。
【請求項３】
プロモーター配列がサイトメガロウイルス前初期プロモーターを含む、請求項2記載の高力価ハイブリッドHBVベクター。
【請求項４】
少なくとも5×107 pfu/mlの力価のVLVが得られる、請求項1記載の高力価ハイブリッドHBVベクター。
【請求項５】
少なくとも1×108 pfu/mlの力価のVLVが得られる、請求項4記載の高力価ハイブリッドHBVベクター。
【請求項６】
HBV抗原またはその断片が、B型肝炎表面抗原（HBsAg）、B型肝炎コア抗原（HBcAg）、B型肝炎e抗原（HBeAg）、B型肝炎ウイルスタンパク質X（HBx）、B型肝炎ウイルスDNAポリメラーゼ、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項1記載の高力価ハイブリッドHBVベクター。
【請求項７】
B型肝炎表面抗原（HBsAg）がミドルB型肝炎表面（MHBs）タンパク質である、請求項6記載のHBV抗原。
【請求項８】
請求項1記載の高力価ハイブリッドウイルスベクターにより産生されるウイルス様ベシクル（VLV）を含む、組成物。
【請求項９】
HBV抗原またはその断片が、B型肝炎表面抗原（HBsAg）、B型肝炎コア抗原（HBcAg）、B型肝炎e抗原（HBeAg）、B型肝炎ウイルスタンパク質X（HBx）、B型肝炎ウイルスDNAポリメラーゼ、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項8記載の組成物。
【請求項１０】
B型肝炎表面抗原（HBsAg）がミドルB型肝炎表面（MHBs）タンパク質である、請求項9記載のHBV抗原。
【請求項１１】
HBV抗原がB型肝炎ウイルス（HBV）感染症と関連している、請求項8記載の組成物。
【請求項１２】
HBV感染症に対する免疫性を対象に与える方法であって、少なくとも107 pfu/mlの請求項8記載のVLVを含む組成物を該対象に投与する工程を含み、HBV抗原の発現が該対象において免疫応答を誘導する、方法。
【請求項１３】
HBV抗原またはその断片が、B型肝炎表面抗原（HBsAg）、B型肝炎コア抗原（HBcAg）、B型肝炎e抗原（HBeAg）、B型肝炎ウイルスタンパク質X（HBx）、B型肝炎ウイルスDNAポリメラーゼ、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
対象において疾患を処置および／または予防する方法であって、治療的有効量の請求項8記載の組成物を、そのような処置を必要とする対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項１５】
疾患がB型肝炎ウイルス（HBV）感染症である、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
HBV感染症が慢性感染症である、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
対象にワクチン接種する方法であって、薬学的に許容される量の請求項8記載の組成物を該対象に投与する工程を含み、該組成物の投与が該対象において免疫応答を誘発する、方法。
【請求項１８】
組成物が予防用ワクチンである、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
組成物が治療用ワクチンである、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
組成物がアジュバントと組み合わせて投与される、請求項17記載の方法。
【請求項２１】
アジュバントが、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、Quil A、Detox、ISCOM、およびスクアレンからなる群より選択される、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
対象においてHBV抗原またはその断片に対するメモリーT細胞免疫応答を生じさせる方法であって、（a）請求項8記載の組成物を対象に、該対象において免疫応答を誘発するのに有効な量で投与する工程；（b）第2のその後の時期に、第2の有効量の請求項8記載の組成物を投与する工程を含み、該HBV抗原またはその断片に対するTメモリー細胞が該対象において生じる、方法。
【請求項２３】
対象においてHBV抗原またはその断片に対する適応B細胞免疫応答を生じさせる方法であって、（a）請求項8記載の組成物を対象に、該対象において免疫応答を誘発するのに有効な量で投与する工程；（b）第2のその後の時期に、第2の有効量の請求項8記載の組成物を投与する工程を含み、該HBV抗原またはその断片に対するBメモリー細胞が該対象において生じる、方法。
【請求項２４】
対象が哺乳動物である、請求項12、14、17、22、および23のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
哺乳動物がヒトである、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
アルファウイルス非構造タンパク質ヌクレオチド配列をコードするDNA配列に機能的に連結されているプロモーター配列を含み、該DNA配列が、アルファウイルスサブゲノムRNAプロモーターに機能的に連結され、それが、HBV抗原またはその断片をコードするDNAに機能的に連結され、それが、2Aペプチドをコードする2A DNAに機能的に連結され、次にそれが、水疱性口内炎ウイルス（VSV）Gタンパク質をコードするVSV G DNAに機能的に連結されている、DNA配列を含む、高力価ハイブリッドB型肝炎ウイルス（HBV）ベクターであって、
該アルファウイルス非構造タンパク質ヌクレオチド配列が、G-4700-A、A-5424-G、G-5434-A、T-5825-C、T-5930-C、A-6047-G, G-6783-A、G-6963-A、G-7834-A、T-8859-A、T-8864-C、G-9211-A、A-10427-G、G-11560-A、A-11871-G、およびT-11978-Cからなる群より選択される変異のうちの少なくとも2つを含み、
該ベクターが、アルファウイルス構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列を欠いており、
さらに、該ベクターを細胞培養において増やす際に、少なくとも1 mlあたり107プラーク形成単位（pfu）の力価のウイルス様ベシクル（VLV）が得られる、
高力価ハイブリッドHBVベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2014年5月16日に出願された米国特許仮出願第61/994,166号に対して米国特許法第119条(e)の下で優先権を主張し、その出願はこれによってその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
連邦支援の研究開発に関する陳述
本発明は、National Institute of Healthにより授与された助成金R37 AI040357およびR01 AI45510の下で、政府の援助でなされた。政府は、本発明においてある一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
肝炎は、「肝臓の炎症」を意味する一般用語であり、主としてウイルス起源からの数多くの原因を有する。B型肝炎は、世界において最も一般的な重症の肝臓感染症である。それは、血液および体液を通して伝達されるB型肝炎ウイルス（HBV）によって引き起こされる。感染は、直接の血液間接触、無防護性交、汚染された針の使用を通して、および、分娩過程中に感染した女性から彼女の新生児へ起こり得る。
【０００４】
HBVは、ヘパドナウイルス科（Hepadnaviridae family）に属する肝臓指向性DNAウイルスである。ウイルス粒子であるビリオンは、外側脂質エンベロープ、およびタンパク質から構成される正二十面体のヌクレオキャプシドコアからなる。ヌクレオキャプシドは、ウイルスDNA、およびレトロウイルスと同様の逆転写酵素活性を有するDNAポリメラーゼを封入している（Locarnini S, 2004. Semin. Liver Dis. 24 (Suppl 1): 3-10（非特許文献1））。外側エンベロープは、感受性細胞におけるウイルス結合および侵入に関与する、埋め込まれたタンパク質を含有する。ウイルスゲノムの完全長は約3.2 kbであり、表面抗原（「S遺伝子」）、コア抗原（「C遺伝子」）、DNAポリメラーゼ（「P遺伝子」）、および「X遺伝子」と呼ばれる未決定の機能の遺伝子を含む、4種のオープンリーディングフレーム（ORF）を有する（Guo et al., 2009. Hbpd Int 8 (1): 59-64（非特許文献2））。
【０００５】
HBVの感染は、急性または慢性の肝炎につながり得る。概して、6か月間よりも長くB型肝炎ウイルスが陽性と判定された人々は、肝不全、肝癌、または肝硬変につながり得る慢性感染症を有すると診断される（Wolfram, Virol J. 2013; 10: 239（非特許文献3）およびDienstag JL. Hepatitis B virus infection. N Engl J Med. 2008;359:1486-1500（非特許文献4））。
【０００６】
慢性B型肝炎感染症を発症するリスクは、人がウイルスに感染する年齢に直接関連している。乳児および幼い子供は、B型肝炎ウイルスに曝露された場合に慢性的に感染するリスクが最も大きい。例えば、曝露された乳児の90％が慢性感染症を発症し、曝露された子供の30〜50％が慢性感染症を発症し、曝露された成人の10％が慢性感染症を発症すると考えられる。慢性HBV感染症を有する人は、慢性HBV感染症を有さない人よりも最大300倍高い、肝細胞癌を発症するリスクを有する。地球規模で、HBVは、世界の原発肝癌の60〜80％を引き起こす。毎年、世界中で約100万人の人々が、慢性活動性肝炎、肝硬変、またはHBV誘導性肝癌で死亡する。結果として、HBVは、公知のヒト発癌性物質としてタバコに次いで2番目にランクしている（www.cdc.gov/hepatitis/HBV（非特許文献5）、 およびwww.mayoclinic.org/diseases-conditions/hepatitis-b/（非特許文献6））。
【０００７】
HBVに対するワクチンが数十年間、広く使用されているが、集団におけるHBV有病率は、依然として高いままである。慢性HBV感染症に対する現在の療法は、ウイルスRNAおよびタンパク質発現に対し限定された阻害効果のみを有しており、典型的に、ウイルスを抑制するが排除しない。例えば、一般的に使用されるヌクレオシド逆転写酵素阻害剤であるエンテカビルまたはテノホビルは、慢性HBV患者においてHBV複製を抑制するが、療法を停止した場合に効果は可逆的である。その上、慢性HBVの処置における治療的免疫化の有望性にもかかわらず、現在のHBVワクチンは、治療用ワクチン接種に有効ではない。現在のワクチンは、感染を予防する強い中和抗体応答を誘発するが、感染後にウイルスを排除するために必要とされるCD8+ T細胞を誘導しない。現在のワクチンはまた、すべての個体を防御するわけではなく、抗体応答は経時的に衰え、長続きする免疫のために複数回投与が必要とされるため、世界のエンデミックな発生地域における広範な予防用ワクチン接種にも最適ではない。単一用量において長期の免疫を提供する改善された予防用ワクチン、または、慢性HBVを治癒する有効な治療用ワクチンは、HBV関連慢性肝臓疾患の予防に対して大きな影響を及ぼすと考えられる。
【０００８】
これらの理由で、予防的用途および治療的用途の両方について有効なHBVワクチンが、当技術分野において依然として必要とされている。本発明は、この必要性に対処する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Locarnini S, 2004. Semin. Liver Dis. 24 (Suppl 1): 3-10
【非特許文献２】Guo et al., 2009. Hbpd Int 8 (1): 59-64
【非特許文献３】Wolfram, Virol J. 2013; 10: 239
【非特許文献４】Dienstag JL. Hepatitis B virus infection. N Engl J Med. 2008;359:1486-1500
【非特許文献５】www.cdc.gov/hepatitis/HBV
【非特許文献６】www.mayoclinic.org/diseases-conditions/hepatitis-b/
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、セムリキ森林ウイルス（SFV）非構造タンパク質ヌクレオチド配列をコードするDNA配列に機能的に連結されているプロモーター配列を含み、該DNA配列が、SFVサブゲノムRNAプロモーターに機能的に連結され、それが、HBV抗原またはその断片をコードするDNAに機能的に連結され、それが、2Aペプチドをコードする2A DNAに機能的に連結され、次にそれが、水疱性口内炎ウイルス（VSV）Gタンパク質をコードするVSV G DNAに機能的に連結されている、DNA配列を含む、高力価ハイブリッドB型肝炎ウイルス（HBV）ベクターの組成物および使用法を提供する。本発明の高力価HBVベクターのSFV非構造タンパク質ヌクレオチド配列は、G-4700-A、A-5424-G、G-5434-A、T-5825-C、T-5930-C、A-6047-G、G-6783-A、G-6963-A、G-7834-A、T-8859-A、T-8864-C、G-9211-A、A-10427-G、G-11560-A、A-11871-G、およびT-11978-Cからなる群より選択される変異のうちの少なくとも2つを含み、本発明のベクターは、SFV構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列を欠いている。さらに、ベクターを細胞培養において増やす際には、少なくとも1 mlあたり107プラーク形成単位（pfu）の力価のウイルス様ベシクル（VLV）が得られる。
【００１１】
別の局面において、本発明は、アルファウイルス非構造タンパク質ヌクレオチド配列をコードするDNA配列に機能的に連結されているプロモーター配列を含み、該DNA配列が、アルファウイルスサブゲノムRNAプロモーターに機能的に連結され、それが、HBV抗原またはその断片をコードするDNAに機能的に連結され、それが、2Aペプチドをコードする2A DNAに機能的に連結され、次にそれが、水疱性口内炎ウイルス（VSV）Gタンパク質をコードするVSV G DNAに機能的に連結されている、DNA配列を含む、高力価ハイブリッドB型肝炎ウイルス（HBV）ベクターの組成物および使用法を提供する。本発明の高力価HBVベクターのアルファウイルス非構造タンパク質ヌクレオチド配列は、G-4700-A、A-5424-G、G-5434-A、T-5825-C、T-5930-C、A-6047-G、G-6783-A、G-6963-A、G-7834-A、T-8859-A、T-8864-C、G-9211-A、A-10427-G、G-11560-A、A-11871-G、およびT-11978-Cからなる群より選択される変異のうちの少なくとも2つを含み、本発明のベクターは、アルファウイルス構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列を欠いている。さらに、ベクターを細胞培養において増やす際には、少なくとも1 mlあたり107プラーク形成単位（pfu）の力価のウイルス様ベシクル（VLV）が得られる。
【００１２】
本発明はまた、HBV感染症に対する免疫性を対象に与える方法も含む。その方法は、少なくとも107 pfu/mlの、本発明の高力価HBVベクターにより産生されるVLVを含む組成物を対象に投与する工程を含み、HBV抗原の発現が、該対象において免疫応答を誘導する。
【００１３】
別の局面において、本発明は、対象において疾患を処置および／または予防する方法を提供する。その方法は、治療的有効量の、本発明の高力価HBVベクターにより産生される組成物を、そのような処置を必要とする対象に投与する工程を含む。
【００１４】
本発明はまた、対象にワクチン接種する方法であって、薬学的に許容される量の、本発明の高力価HBVベクターにより産生される組成物を該対象に投与する工程を含み、該組成物の投与が該対象において免疫応答を誘発する、方法も提供する。
【００１５】
さらなる局面において、本発明は、対象においてHBV抗原またはその断片に対するメモリーT細胞免疫応答を生じさせる方法を提供する。その方法は、本発明の高力価HBVベクターにより産生される組成物を対象に、該対象において免疫応答を誘発するのに有効な量で投与する工程、および、第2のその後の時期に、第2の有効量の本発明の組成物を投与する工程を含み、HBV抗原またはその断片に対するTメモリー細胞が、該対象において生じる。
【００１６】
本発明は、さらに、対象においてHBV抗原またはその断片に対する適応B細胞免疫応答を生じさせる方法を提供する。その方法は、本発明の高力価HBVベクターにより産生される組成物を対象に、該対象において免疫応答を誘発するのに有効な量で投与する工程、および、第2のその後の時期に、第2の有効量の本発明の組成物を投与する工程を含み、HBV抗原またはその断片に対するBメモリー細胞が、該対象において生じる。
【００１７】
いくつかの態様において、高力価HBVベクターのプロモーター配列は、構成性プロモーターである。他の態様において、プロモーター配列は、サイトメガロウイルス前初期プロモーターである。いくつかの態様において、少なくとも5×107 pfu/mlの力価のVLVが得られる。他の態様において、少なくとも1×108 pfu/mlの力価のVLVが得られる。
【００１８】
いくつかの態様において、HBV抗原またはその断片は、B型肝炎表面抗原（HBsAg）、B型肝炎コア抗原（HBcAg）、B型肝炎e抗原（HBeAg）、B型肝炎ウイルスタンパク質X（HBx）、B型肝炎ウイルスDNAポリメラーゼ、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。他の態様において、B型肝炎表面抗原（HBsAg）は、ミドルB型肝炎表面（MHBs）タンパク質である。
【００１９】
いくつかの態様において、本発明の高力価HBVベクターにより産生されるウイルス様ベシクル（VLV）を含む組成物。他の態様において、HBV抗原またはその断片は、B型肝炎表面抗原（HBsAg）、B型肝炎コア抗原（HBcAg）、B型肝炎e抗原（HBeAg）、B型肝炎ウイルスタンパク質X（HBx）、B型肝炎ウイルスDNAポリメラーゼ、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。他の態様において、B型肝炎表面抗原（HBsAg）は、ミドルB型肝炎表面（MHBs）タンパク質である。さらに他の態様において、HBV抗原は、B型肝炎ウイルス（HBV）感染症と関連している。
【００２０】
いくつかの態様において、本発明の組成物および方法により処置および／または予防される疾患は、B型肝炎ウイルス（HBV）感染症である。他の態様において、HBV感染症は慢性感染症である。
【００２１】
いくつかの態様において、対象において免疫応答を誘発する組成物は予防用ワクチンである。他の態様において、組成物は治療用ワクチンである。さらに他の態様において、組成物は、アジュバントと組み合わせて投与される。さらなる態様において、アジュバントは、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、Quil A、Detox、ISCOM、およびスクアレンからなる群より選択される。
【００２２】
いくつかの態様において、対象は哺乳動物である。他の態様において、哺乳動物はヒトである。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
本発明を例証する目的で、本発明のある特定の態様を図面に示す。しかし、本発明は、図面に示されている態様の正確な配置および手段に限定されない。
【００２４】
【図１Ａ】VLV DNA構築物を示す一連の図である。CMVプロモーターを有するDNAベクター中に再構築したp50 RNAゲノム：pCMV-SFVG-p50Rのマップ。
【図１Ｂ】VLV DNA構築物を示す一連の図である。高力価の進化したVLVにおける欠失および11種のアミノ酸変化を示す。
【図２Ａ】表面抗原：ミドルB型肝炎表面（MHBs）タンパク質およびコア抗原B型肝炎抗原（HBcAg）タンパク質のVLVからの発現を示す、一連の図および画像である。VLV構築物の図。
【図２Ｂ】表面抗原：ミドルB型肝炎表面（MHBs）タンパク質およびコア抗原B型肝炎抗原（HBcAg）タンパク質のVLVからの発現を示す、一連の図および画像である。タンパク質発現のウエスタンブロット。
【図２Ｃ】表面抗原：ミドルB型肝炎表面（MHBs）タンパク質およびコア抗原B型肝炎抗原（HBcAg）タンパク質のVLVからの発現を示す、一連の図および画像である。タンパク質発現の免疫蛍光法。
【図３】HBVタンパク質を発現するVLVがHBV特異的免疫応答を誘導することを示す、一連の柱状図である。図3A：マウスを、筋肉内への、MHBsまたはHBcAgのいずれかを発現する1×107 IFUのVLVで免疫化した。MHBsまたはHBcAgに対するCD8 T細胞応答を、免疫化の7日後にIFN-γELISPOTアッセイにより測定した。n＝10。図3B：マウスを、筋肉内への、MHBsまたはHBcAgのいずれかを発現する1×107 IFUのVLVまたは1×107 PFUのVSVで免疫化し、循環抗体応答を、免疫化の30日後にELISAにより判定した。n＝5。*p＜0.01。
【図４Ａ】VLV-MHBs免疫化マウスがHBVの流体力学的抗原投与から防御されることを実証する、一連のグラフおよび画像である。マウスを、107 IFUのVLV-HBcAgもしくはVLV-MHBs、または107 PFUのVSV-MHBsもしくはVSV-HBcAgで免疫化した。次いで、免疫化の6週間後に、HBV 1.3プラスミド（10μg）の流体力学的注射により、HBV複製を誘導した。血清HBeAgレベルを、抗原投与後の1、4、および7日目にELISAにより決定した（n≧4）。1日目のレベルに対するパーセントを示す。
【図４Ｂ】VLV-MHBs免疫化マウスがHBVの流体力学的抗原投与から防御されることを実証する、一連のグラフおよび画像である。マウスを、107 IFUのVLV-HBcAgもしくはVLV-MHBs、または107 PFUのVSV-MHBsもしくはVSV-HBcAgで免疫化した。次いで、免疫化の6週間後に、HBV 1.3プラスミド（10μg）の流体力学的注射により、HBV複製を誘導した。肝臓におけるHBcAg発現を、抗原投与後の7日目に、免疫組織化学により判定した。定量化は、100×視野あたりのHBcAg陽性細胞の平均数（試料あたり5視野を計数してn＝3）を表す。代表的な画像を示す。
【図４Ｃ】VLV-MHBs免疫化マウスがHBVの流体力学的抗原投与から防御されることを実証する、一連のグラフおよび画像である。マウスを、107 IFUのVLV-HBcAgもしくはVLV-MHBs、または107 PFUのVSV-MHBsもしくはVSV-HBcAgで免疫化した。次いで、免疫化の6週間後に、HBV 1.3プラスミド（10μg）の流体力学的注射により、HBV複製を誘導した。抗原投与後の7日目に、ノーザンブロット（NB）およびサザンブロット（SB）解析を用いて、それぞれ肝臓関連HBV RNAおよびDNAレベルを決定した（n≧3）。代表的な試料を示す。RC＝弛緩型環状DNA、SS＝一本鎖DNA。
【図４Ｄ】VLV-MHBs免疫化マウスがHBVの流体力学的抗原投与から防御されることを実証する、一連のグラフおよび画像である。マウスを、107 IFUのVLV-HBcAgもしくはVLV-MHBs、または107 PFUのVSV-MHBsもしくはVSV-HBcAgで免疫化した。次いで、免疫化の6週間後に、HBV 1.3プラスミド（10μg）の流体力学的注射により、HBV複製を誘導した。T細胞リコール応答を、抗原投与後の7日目にIFN-γELISPOTアッセイにより、脾細胞（n≧4）において測定した。Un＝未免疫化。
【図４Ｅ】VLV-MHBs免疫化マウスがHBVの流体力学的抗原投与から防御されることを実証する、一連のグラフおよび画像である。マウスを、107 IFUのVLV-HBcAgもしくはVLV-MHBs、または107 PFUのVSV-MHBsもしくはVSV-HBcAgで免疫化した。次いで、免疫化の6週間後に、HBV 1.3プラスミド（10μg）の流体力学的注射により、HBV複製を誘導した。T細胞リコール応答を、抗原投与後の7日目にIFN-γELISPOTアッセイにより、肝臓内白血球（2匹以上のマウスからプールした試料）において測定した。Un＝未免疫化。
【図５】免疫化プロトコルの概略図を示す画像である。
【図６】VLV-MHBsがDNAまたはタンパク質と比較して優れたCD8 T細胞応答を誘導することを示す、柱状図である。マウスを、筋肉内への、50μgのHBsを発現する組み換えDNA（pCMV-S2.S）、10μgの組み換えHBsAg、または107 IFUのVLV-MHBsで免疫化し、CD8 T細胞応答を、免疫化の7日後にIFN-γELISPOTアッセイにより判定した（n≧4）。
【図７】VLVを用いたプライム・ブーストプロトコルがHBV特異的CD8 T細胞応答を改善することを実証する、一連の図および柱状図である。図7A：VLVNJ-MHBs構築物の図。発現される糖タンパク質は、ニュージャージーセロタイプVSVに由来する。図7B〜7C：指定されているMHBs発現ワクチンでプライミングおよびブーストしたマウス由来の、ブーストの1週間後に行ったIFN-γELISPOTアッセイ。値は各群の平均であり（n≧5）、エラーバーはS.E.を表す。VLV＝VLV-MHBs、VLVNJ＝VLVNJ-MHBs、VSV＝VSV-MHBs、DNA＝pCMV-S2.S。
【図８】VLV-MHBsを用いたプライム・ブーストプロトコルがHBVトランスジェニックマウスにおいてCD8 T細胞応答を誘導することを示す、一連のグラフである。HBV 1.3トランスジェニックマウスを、HBeAg発現についてスクリーニングし、HBeAg低（OD450＜0.1）群またはHBeAg高（OD450＞0.3）群に分離した。すべてのマウスを、50μgのpCMV-S2.Sでプライミングし、4週間後にDMEM（n＝3）または107 IFUのVLV-MHBs（n≧4）でブーストした。IFN-γELISPOTアッセイを、ブーストの1週間後に行った。値を、スポットの平均数／各群の106細胞として提示し、エラーバーはS.E.を表す。*p＜0.05。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
発明の詳細な説明
本発明は、慢性B型肝炎の処置用の治療的免疫化のための組成物および方法の発見に関連する。本明細書に記載されている種々の態様において、本発明の方法は、高力価のウイルス様ベシクル（VLV）を産生する、B型肝炎ウイルス（HBV）構造タンパク質を発現する進化したハイブリッドウイルスワクチンベクターを生じさせる工程を含む。加えて、本発明は、HBVを発現する本発明のVLVを投与した対象において、HBVを処置および／もしくは予防する、またはそれに対する免疫性を与える方法、ならびに、HBV感染症に対するメモリーT細胞およびB細胞の免疫応答を生じさせる方法を含む。
【００２６】
定義
別途定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと同様または同等の任意の方法および材料が、本発明の試験の実施において使用され得るが、好ましい材料および方法が、本明細書に記載されている。本発明を説明および特許請求する中で、以下の用語法を使用することになる。
【００２７】
本明細書において使用される用語法は、特定の態様を説明するだけの目的であり、限定するようには意図されないこともまた、理解されるべきである。
【００２８】
本明細書において使用される際、「a」および「an」という冠詞は、冠詞の文法上の目的語の1つまたは1つより多く（すなわち、少なくとも1つ）を指すように使用される。例として、「要素」は、1つの要素または1つより多い要素を意味する。
【００２９】
本明細書において使用される際、量、時間的継続期間などのような測定可能な値を指す場合に、「約」という用語は、特定された値から、±20％または±10％、より好ましくは±5％、さらにより好ましくは±1％、なおより好ましくは±0.1％の変動を、そのような変動が開示される方法を行うのに適切である際に、包含するように意味される。
【００３０】
本明細書において使用される際、「より大きい」とは、対照よりも、少なくとも10％もしくはそれより多く、例えば、20％、30％、40％、もしくは50％、60％、70％、80％、90％高いかまたはそれよりも高い、ならびに／または、1.1倍、1.2倍、1.4倍、1.6倍、1.8倍、2.0倍高いかまたはそれよりも高い、ならびに、それらの間の任意のおよびすべての全増分または部分的増分である、発現レベルを指す。
【００３１】
本明細書において使用される際、「対照」または「参照」という用語は、互換的に使用され、比較の標準として使用される値を指す。
【００３２】
本明細書において使用される「対象」または「患者」は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物であり得る。非ヒト哺乳動物は、例えば、ヒツジ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、およびマウスの哺乳動物などの、家畜およびペットを含む。好ましくは、対象はヒトである。
【００３３】
本明細書において使用される際、「B型肝炎ウイルス」または「HBV」は、アヒルHBVを含む鳥類、ウッドチャックおよびヒトを含む哺乳動物を含むがこれらに限定されない、B型肝炎ウイルスを意味する。ウイルスは、そのエンベロープタンパク質上に提示される抗原性エピトープに基づいて4種の主要なセロタイプ（adr、adw、ayr、ayw）、およびゲノムの全ヌクレオチド配列の変動にしたがって定義される8種のゲノタイプ（A〜H）に分類される。したがって、「HBV」という用語は、B型肝炎ウイルスの地理学的ゲノタイプ、および、B型肝炎ウイルスの地理学的ゲノタイプのバリアント株を包含する。特に、ヒトB型肝炎ウイルスは、以下のヒト地理学的ゲノタイプのいずれかであり得る：A（北西ヨーロッパ、北アメリカ、中央アメリカ）；B（インドネシア、中国、ベトナム）；C（東アジア、韓国、中国、日本、ポリネシア、ベトナム）；D（地中海地域、中東、インド）；E（アフリカ）；F（アメリカ先住民、ポリネシア）；G（米国、フランス）；またはH（中央アメリカ）。
【００３４】
本明細書において使用される「慢性B型肝炎ウイルス（HBV）」または「慢性HBV感染症」は、HBVに感染しており、ある一定の期間（すなわち、6か月）後にその感染症を消散できない対象を含む。HBVの急性感染症後の6か月より長いHBsAgの持続が、慢性HBV感染症の顕著な特徴である。抗ウイルスT細胞応答の欠陥もまた、慢性HBV感染症を有するヒト対象において記録されている（Boni et al., 1998, J. Clin. Invest., 102 (5): 968-975）。これらの対象は、持続的にHBVに感染したままである可能性があり、急性感染症後にウイルスを一掃することができる個体と比較した際に、いくつかのHBV抗原に対する多特異的なポリクローナル免疫応答を誘発することができないように見られる。活動性感染症を呈する慢性的に感染した患者において、ウイルスは肝臓の中で複製し、疾患は大部分が免疫応答により媒介される。「HBV抗原」と「HBVタンパク質」とは、本明細書において互換的に使用される。
【００３５】
本明細書において使用される際、「トランスフェクション」という用語は、核酸配列が細胞中に送達される、当業者に公知である任意の手段を含む。核酸を細胞中にトランスフェクトする方法は、例えば、Sambrook et al. "Molecular Cloning", A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Volumes 1-3, 2001 (ISBN-0879695773)に記載されている。典型的なトランスフェクション法は、エレクトロポレーションおよび脂質またはリン酸カルシウムの使用を含む。
【００３６】
本明細書において使用される「変異」とは、その天然の状態からの変更を結果としてもたらす、DNA配列における変化である。変異は、プリン（アデニンおよび／もしくはチミン）ならびに／またはピリミジン（グアニンおよび／もしくはシトシン）などの少なくとも1つのデオキシリボ核酸塩基の欠失および／または挿入および／または重複および／または置換を含むことができる。変異は、生物（対象）の観察可能な特徴（表現型）において識別可能な変化をもたらしてもよいし、またはもたらさなくてもよい。
【００３７】
本明細書において使用される「進化した」または「進化する」という用語は、継続的な世代にわたる生物学的集団の遺伝形質における変化（すなわち、進化）を指す。進化的プロセスは、種、個々の生物、ならびにDNAおよびタンパク質などの分子を含む、生物学的組織のあらゆるレベルで、多様性を生じさせる（Hall and Hallgrimsson, eds. 2008, Strickberger's Evolution (4th ed.), Jones & Bartlett）。本発明の文脈において、「進化した」ハイブリッドウイルスは、有益な変異を蓄積し、培養の50継代後に、元のハイブリッドウイルスよりも1000倍高い力価を有するVLVを産生した。
【００３８】
「ワクチン接種」とは、抗原が関係している疾患または障害を予防または処置する手助けをする免疫応答を対象において誘発するために、対象に抗原を接種するプロセスを指す。「免疫化」という用語は、本明細書においてワクチン接種と互換的に使用される。
【００３９】
本明細書において使用される「免疫原性」という用語は、抗原または生物が動物に投与された際に動物において免疫応答を誘発する、抗原または生物の生得的能力を指す。したがって、「免疫原性を増強すること」は、抗原または生物が動物に投与された際に動物において免疫応答を誘発する、抗原または生物の能力を増大させることを指す。免疫応答を誘発する抗原または生物の能力の増大は、中でも、抗原または生物に結合する抗体のより多くの数、抗原または生物に対する抗体のより大きな多様性、抗原または生物に特異的なT細胞のより多くの数、抗原または生物に対する、より大きな細胞傷害性T細胞またはヘルパーT細胞の応答、抗原に応答したサイトカインのより多くの発現などによって測定することができる。
【００４０】
本明細書において使用される「活性化」という用語は、注目に値する生化学的または形態学的変化を誘導する、十分な細胞表面部分の連結後の細胞の状態を指す。T細胞の文脈内で、そのような活性化は、細胞増殖を誘導するように十分に刺激されているT細胞の状態を指す。T細胞の活性化はまた、サイトカイン産生、および制御性または細胞溶解性のエフェクター機能の遂行も誘導し得る。他の細胞の文脈内で、この用語は、特定の物理化学的プロセスの上方制御または下方制御のいずれかを暗示する。「活性化T細胞」という用語は、細胞分裂、サイトカイン産生、制御性もしくは細胞溶解性のエフェクター機能の遂行を現在経験しており、かつ／または「活性化」のプロセスを最近経験したT細胞を示す。
【００４１】
「体液性免疫」または「体液性免疫応答」は、両方とも、B細胞媒介性免疫を指し、Bリンパ球（B細胞）により産生および分泌される高度に特異的な抗体によって媒介される。
【００４２】
「予防」とは、障害に対するワクチン接種のための薬学的組成物の使用を指す。
【００４３】
「アジュバント」とは、抗原の免疫原性を強化することができる物質を指す。アジュバントは、1つの物質または物質の混合物であることができ、免疫系に直接作用することによって、または抗原の徐放を提供することによって機能する。アジュバントの例は、アルミニウム塩、ポリアニオン、細菌糖ペプチド、およびフロイント不完全のような徐放剤である。「送達ビヒクル」とは、抗原を特異的な細胞に標的化し、かつ、免疫系による抗原の有効な認識を促進する手助けをする組成物を指す。最もよく知られた送達ビヒクルは、リポソーム、ウィロソーム、マイクロスフェアおよびナノスフェアを含むマイクロ粒子、ポリマー、細菌ゴースト、細菌多糖類、弱毒化細菌、ウイルス様粒子、弱毒化ウイルス、およびISCOMである。
【００４４】
「の中に組み込まれる」または「にカプセル化される」とは、マイクロ粒子、細菌ゴースト、弱毒化細菌、ウイルス様粒子、弱毒化ウイルス、ISCOM、リポソーム、および好ましくはウィロソームなどの送達ビヒクル内にある抗原性ペプチドを指す。
【００４５】
本明細書において使用される際、「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は、互換的に使用され、ペプチド結合により共有結合で連結されたアミノ酸残基から構成される化合物を指す。タンパク質またはペプチドは、少なくとも2個のアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質またはペプチドの配列を含み得るアミノ酸の最大数に制限は設けられていない。ポリペプチドは、ペプチド結合により互いに接続された2個以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質を含む。本明細書において使用される際、用語は、当技術分野において、例えば、ペプチド、オリゴペプチド、およびオリゴマーとも一般的に呼ばれる短い鎖、ならびに、多くのタイプが存在する、当技術分野においてタンパク質と概して呼ばれるより長い鎖の両方を指す。「ポリペプチド」は、中でも、例えば、生物学的活性断片、実質的に相同のポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドのバリアント、改変ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質を含む。ポリペプチドは、天然ペプチド、組み換えペプチド、合成ペプチド、またはこれらの組み合わせを含む。
【００４６】
本発明の文脈において、一般的に存在する核酸塩基について以下の略語を使用する。「A」はアデノシンを指し、「C」はシトシンを指し、「G」はグアノシンを指し、「T」はチミジンを指し、および「U」はウリジンを指す。
【００４７】
本明細書において使用される「RNA」という用語は、リボ核酸として定義される。
【００４８】
「形質転換する」、「形質転換すること」、および「形質転換」は、単離された核酸を生物の内部中に導入するプロセスを指すように、本明細書において使用される。
【００４９】
本発明の文脈内で使用される「処置」という用語は、疾患または障害のための治療的処置、および予防的もしくは抑制的措置を含むように意味される。本明細書において使用される際、「処置」という用語、ならびに「処置する」および「処置すること」などの関連用語は、疾患状態またはその少なくとも1つの症状の進行、重症度、および／または継続期間の低減を意味する。したがって、「処置」という用語は、対象のためになることができる任意のレジメンを指す。処置は、現状に関してでもよいし、または予防的（予防的処置）であってもよい。処置は、治癒的、緩和的、または予防的効果を含み得る。「治療的」および「予防的」処置に対する本明細書における言及は、その最も広い文脈において考慮されるべきである。「治療的」という用語は、対象が完全回復まで処置されることを、必ずしも意味しない。同様に、「予防的」とは、対象が最終的に疾患状態にかからないであろうことを、必ずしも意味しない。したがって、例えば、処置という用語は、それにより疾患または障害のすべての徴候を予防または除去する、疾患または障害の発症の前または後の作用物質の投与を含む。別の例として、疾患の症状と戦うための疾患の臨床症状発現後の作用物質の投与は、疾患の「処置」を含む。
【００５０】
「生物学的試料」という用語は、生物から、または生物の構成要素（例えば、細胞）から得られた試料を指す。試料は、任意の生物学的組織または体液であり得る。しばしば、試料は、患者に由来する試料である「臨床試料」であると考えられる。そのような試料は、骨髄、心臓組織、痰、血液、リンパ液、血液細胞（例えば、白血球）、組織もしくは細針生検試料、尿、腹水、および胸水、またはそれら由来の細胞を含むが、これらに限定されない。生物学的試料はまた、組織学的目的で取得された凍結切片などの、組織の切片も含む。
【００５１】
ヌクレオチド配列に関して使用される場合の「同等」という用語は、機能的に同等のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を指すように理解される。同等のヌクレオチド配列は、1個または複数のヌクレオチドの置換、付加、または欠失により異なる配列、例えば対立遺伝子バリアントを含むことになり；したがって、遺伝コードの縮重のために本明細書に記載されている核酸のヌクレオチド配列とは異なる配列を含む。
【００５２】
「ハイブリダイゼーション」とは、核酸の鎖が塩基対形成を通して相補鎖と結合する任意のプロセスを指す。二本の一本鎖核酸は、二本鎖の二重鎖を形成する場合に「ハイブリダイズする」。二本鎖性の領域は、一本鎖核酸の一方もしくは両方の完全長、または一方の一本鎖核酸のすべておよびもう一方の一本鎖核酸の部分配列を含むことができるか、または、二本鎖性の領域は、各核酸の部分配列を含むことができる。ハイブリダイゼーションはまた、二本の鎖が依然として二本鎖ヘリックスを形成しているという条件で、ある一定のミスマッチを含有する二重鎖の形成も含む。「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」とは、本質的に特異的なハイブリダイゼーションを結果としてもたらすハイブリダイゼーション条件を指す。鋳型核酸の標的部位に対するプローブの「特異的ハイブリダイゼーション」という用語は、ハイブリダイゼーションシグナルが明らかにとらえられるような、主に標的に対するプローブのハイブリダイゼーションを指す。本明細書にさらに記載されているように、特異的ハイブリダイゼーションを結果としてもたらすそのような条件は、相同性の領域の長さ、領域のGC含量、ハイブリッドの融解温度「Tm」に応じて変動する。したがって、ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション溶液および洗浄液の塩含量、酸性度、および温度において変動することになる。
【００５３】
DNAまたはRNAなどの核酸について、本明細書において使用される「単離された」という用語は、巨大分子の天然供給源に存在している、それぞれ、他のDNAまたはRNAから分離されている分子を指す。本明細書において使用される単離されたという用語はまた、組み換えDNA技術により産生された場合には細胞材料、ウイルス材料、もしくは培養培地を、または、化学的に合成された場合には化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない、核酸またはペプチドも指す。その上、「単離された核酸」とは、断片として天然に存在せず、天然の状態においては見出されないであろう核酸断片を含むように意味される。「単離された」という用語はまた、他の細胞タンパク質から単離されているポリペプチドを指すように、本明細書において使用され、精製ポリペプチドおよび組み換えポリペプチドの両方を包含するように意味される。「単離された細胞」または「単離された細胞の集団」とは、その天然の環境には存在しない細胞または細胞の集団である。
【００５４】
本明細書において使用される際、「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（DNA）、および、適切な場合は、リボ核酸（RNA）などのポリヌクレオチドを指す。用語はまた、同等物として、ヌクレオチド類似体から作製されたRNAまたはDNAのいずれかの類似体、ならびに、記載されている態様に適用可能な際に、一本鎖（センスまたはアンチセンス）および二本鎖のポリヌクレオチドを含むようにも理解されるべきである。EST、染色体、cDNA、mRNA、およびrRNAは、核酸と呼ばれ得る分子の代表的な例である。
【００５５】
ポリヌクレオチド配列の文脈において使用される際の「バリアント」という用語は、遺伝子またはそのコード配列のものに関連するポリヌクレオチド配列を包含し得る。この定義はまた、例えば、「対立遺伝子」、「スプライシング」、「種」、または「多型」バリアントも含み得る。ポリペプチドは、概して、互いに対して有意なアミノ酸同一性を有することになる。多型バリアントとは、所定の種の個体間での、特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列における変動である。多型バリアントは、ポリヌクレオチド配列が一塩基変わっている「一塩基多型」（SNP）を包含し得る。SNPの存在は、例えば、ある特定の集団、疾患状態、または疾患状態の性向を示し得る。
【００５６】
「改善すること」または「処置すること」という用語は、疾患と関連する臨床徴候および／または症状が、行われた作用の結果として少なくなることを意味する。モニターされるべき徴候または症状は、熟練した臨床医に周知であろう。
【００５７】
本明細書において使用される際、「併用療法」により、第1の作用物質が別の作用物質と共に投与されることが意味される。「と共に」または「と組み合わせて」とは、1つの処置様式の別の処置様式に加えた投与を指す。そのように、「と共に」または「と組み合わせて」とは、個体に対する、1つの処置様式の、他の処置様式の送達の前、その間、またはその後の投与を指す。そのような組み合わせは、単一処置レジメンまたはレジメの一部であると考えられる。
【００５８】
範囲：本開示を通して、本発明の種々の局面を、範囲形式で示すことができる。範囲形式での記載は、単に利便性および簡潔性のためであり、本発明の範囲に対する融通のきかない限定と解釈されるべきではないことが、理解されるべきである。したがって、範囲の記載は、具体的に開示されているすべての可能な部分範囲、ならびにその範囲内の個々の数値を有すると考えられるべきである。例えば、1〜6などの範囲の記載は、具体的に開示されている、1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6などのような部分範囲、ならびに、その範囲内の個々の数、例えば、1、2、2.7、3、4、5、5.3、および6を有すると考えられるべきである。これは、範囲の広さにかかわらずあてはまる。
【００５９】
「力価」とは、参照試料と比較したウイルスまたはウイルスベクターの濃度の数値的測定単位であり、濃度は、ウイルスの活性、または単位体積の緩衝液中のウイルスの数の測定のいずれかにより決定される。ウイルスストックの力価は、例えば、ウイルスの1つの溶液または複数の溶液（典型的には連続希釈液）の、例えば軟寒天法を用いたHeLa細胞に対する感染性の測定（Graham & Van Der eb (1973) Virology 52:456-467を参照されたい）により、または細胞に与えられる耐性、例えば、ウイルスもしくはベクターによってコードされるG418耐性のモニタリングにより、またはUV分光光度法によるウイルスの定量（Chardonnet & Dales (1970) Virology 40:462-477を参照されたい）により、決定される。
【００６０】
本明細書において使用される際、「同時投与」という用語は、併用療法における第1の療法の投与および第2の療法の投与が、互いとオーバーラップすることを意味する。
【００６１】
本明細書において使用される際、「薬学的組成物」という用語は、本発明内で有用な少なくとも1つの化合物と、担体、安定剤、希釈剤、アジュバント、分散剤、懸濁剤、濃化剤、および／または賦形剤などの他の化学的構成要素との混合物を指す。薬学的組成物は、化合物の生物への投与を促進する。静脈内、経口、エアロゾル、非経口、眼、肺、および局所投与を含むがこれらに限定されない、化合物を投与する複数の技術が、当技術分野に存在する。
【００６２】
「薬学的に許容される担体」という言語は、本発明の化合物を、それがその意図される機能を果たし得るように対象内でまたは対象へ運搬または輸送することに関与する、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される材料、組成物、または担体、例えば、液体もしくは固体充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、またはカプセル化材料を含む。典型的に、そのような化合物は、身体の1つの器官または部分から、身体の別の器官または部分へと運搬または輸送される。各々の塩または担体は、製剤の他の成分と適合性であり、かつ対象に有害ではない意味で「許容され」なければならない。薬学的に許容される担体として働き得る材料のいくつかの例は、以下を含む：ラクトース、グルコース、およびスクロースなどの糖；コーンスターチおよびバレイショデンプンなどのデンプン；セルロース、ならびに、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロースなどのその誘導体；トラガント末；麦芽；ゼラチン；タルク；ココアバターおよび坐剤ワックスなどの賦形剤；落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、および大豆油などの油；プロピレングリコールなどのグリコール；グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコールなどのポリオール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；発熱物質を含まない水；等張生理食塩水；リンガー溶液；エチルアルコール；リン酸緩衝溶液；希釈剤；顆粒化剤；潤滑剤；結合剤；崩壊剤；湿潤剤；乳化剤；着色剤；放出剤；コーティング剤；甘味剤；着香剤；芳香剤；保存剤；抗酸化剤；可塑剤；ゲル化剤；濃化剤；硬膜剤；硬化剤；懸濁剤；界面活性剤；保湿剤；担体；安定剤；ならびに薬学的製剤において使用される他の非毒性適合性物質、またはこれらの任意の組み合わせ。本明細書において使用される際、「薬学的に許容される担体」はまた、化合物の活性と適合性であり、かつ対象に生理学的に許容される、任意のおよびすべてのコーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、ならびに吸収遅延剤なども含む。補足的な活性化合物もまた、組成物中に組み入れられ得る。
【００６３】
本明細書において使用される「抗体」または「Ab」という用語は、抗原上の特異的なエピトープに特異的に結合する免疫グロブリン分子に由来するタンパク質、またはポリペプチド配列を指す。抗体は、天然供給源または組み換え供給源に由来するインタクトな免疫グロブリンであることができ、および、インタクトな免疫グロブリンの免疫反応部分であることができる。本発明において有用な抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、細胞内抗体（「イントラボディ」）、Fv、FabおよびF(ab)2、ならびに一本鎖抗体（scFv）およびヒト化抗体を含む、様々な形態で存在し得る（Harlow et al., 1998, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY；Harlow et al., 1989, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York；Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883；Bird et al., 1988, Science 242:423-426）。抗体は、天然供給源または組み換え供給源に由来し得る。抗体は、典型的に、免疫グロブリン分子の四量体である。
【００６４】
本明細書において使用される「抗原」または「Ag」という用語は、免疫応答を惹起する分子として定義される。この免疫応答は、抗体産生、もしくは特異的な免疫適格細胞の活性化のいずれか、または両方を含み得る。当業者は、事実上すべてのタンパク質またはペプチドを含む任意の巨大分子が、抗原として働けることを理解するであろう。さらに、抗原は、組み換えまたはゲノムDNAに由来することができる。当業者は、免疫応答を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分的ヌクレオチド配列を含む任意のDNAが、したがって、その用語が本明細書において使用されるような「抗原」をコードすることを理解するであろう。さらに、当業者は、抗原が、遺伝子の完全長ヌクレオチド配列により単独でコードされる必要はないことを理解するであろう。本発明が、1つより多い遺伝子の部分的ヌクレオチド配列の使用を含むが、これに限定されないこと、および、これらのヌクレオチド配列が、望ましい免疫応答を誘発するように種々の組み合わせで配置されることが、容易に明らかである。その上、当業者は、抗原が、「遺伝子」によりコードされる必要は全くないことを理解するであろう。抗原は、合成で生成でき、または生物学的試料に由来できることが、容易に明らかである。そのような生物学的試料は、組織試料、腫瘍試料、細胞、または生物学的体液を含むことができるが、これらに限定されない。
【００６５】
本明細書において使用される「異種抗原」とは、抗原を含むかまたは発現する生物にとって内因性ではない抗原を指す。例として、ウイルス抗原または腫瘍抗原を含むかまたは発現するウイルスワクチンベクターは、異種抗原を含む。
【００６６】
本明細書において使用される「融合タンパク質」とは、ペプチド結合または他の化学結合によって互いに連結された2つ以上のタンパク質を含む、タンパク質を指す。タンパク質は、ペプチド結合もしくは他の化学結合によって直接、または、本明細書においてスペーサーと呼ばれる、2つ以上のタンパク質の間の1つまたは複数のアミノ酸を伴って、互いに連結することができる。
【００６７】
本明細書において定義される際、「アルファウイルス」は、ウイルスの第IV群トガウイルス科（Togaviridae family）のメンバーである。アルファウイルスは、アウラウイルス、ババンキウイルス（Babanki virus）、バーマ森林ウイルス、ベバルウイルス、カバソウウイルス（Cabassou virus）、チクングンヤウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、エバーグレーズウイルス（Everglades virus）、フォートモーガンウイルス（Fort Morgan virus）、ゲタウイルス、ハイランズウイルス（Highlands virus）、キジラガチウイルス（Kyzylagach virus）、マヤロウイルス、メトリウイルス（Me Tri virus）、ミデルブルグウイルス（Middelburg virus）、モッソダスペドラスウイルス（Mosso das Pedras virus）、ムカンボウイルス、ヌドゥムウイルス、オニョンニョンウイルス、ピクスナウイルス、リオネグロウイルス、ロスリバーウイルス、サギアマウイルス（Sagiama virus）、サケ膵臓病ウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、ミナミゾウアザラシウイルス、トナテウイルス（Tonate virus）、トロカラウイルス（Trocara virus）、ウナウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、およびワタロアウイルスを含むが、これらに限定されない。
【００６８】
本明細書において定義される際、「アルファウイルス非構造タンパク質」は、nsp1、nsp2、nsp3、およびnsp4からなる群より選択することができる。
【００６９】
本明細書において定義される際、「アルファウイルス構造タンパク質」は、アルファウイルスキャプシドタンパク質、および少なくとも1つのスパイクタンパク質からなる群より選択することができる。
【００７０】
「特異的に結合する」、「選択的に結合する」、または「結合特異性」という用語は、本発明のヒト化抗体または結合化合物の、非標的エピトープに結合した場合に結果として生じるものよりも高い親和性でVSV上に存在する標的エピトープに結合する能力を指す。ある特定の態様において、特異的結合とは、非標的エピトープに対する親和性よりも少なくとも10、50、100、250、500、または1000倍高い親和性での、標的への結合を指す。
【００７１】
本明細書において使用される際、「有効量」または「治療的有効量」という用語は、特定の疾患状態を予防するために必要とされる、または、疾患状態もしくはその少なくとも1つの症状もしくはそれと関連する状態の重症度を低減させるか、および／または改善する、本発明のベクターから生じたウイルス様ベシクルの量を意味する。
【００７２】
本明細書において使用される「プロモーター」という用語は、細胞の合成機構、または導入された合成機構によって認識され、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始するために必要とされるDNA配列として定義される。
【００７３】
本明細書において使用される際、「プロモーター／制御配列」という用語は、プロモーター／制御配列に機能的に連結されている遺伝子産物の発現に必要とされる核酸配列を意味する。いくつかの事例において、この配列は、コアプロモーター配列であり得、他の事例において、この配列はまた、遺伝子産物の発現に必要とされるエンハンサー配列および他の制御エレメントも含み得る。プロモーター／制御配列は、例えば、組織特異的様式で遺伝子産物を発現するものであり得る。
【００７４】
「構成性」プロモーターとは、遺伝子産物をコードまたは特定するポリヌクレオチドと機能的に連結されている場合に、遺伝子産物が細胞において細胞の大部分またはすべての生理学的条件下で産生されるようにする、ヌクレオチド配列である。
【００７５】
「誘導性」プロモーターとは、遺伝子産物をコードまたは特定するポリヌクレオチドと機能的に連結されている場合に、遺伝子産物が細胞において、実質的に、プロモーターに対応する誘導物質が細胞に存在する時にのみ産生されるようにする、ヌクレオチド配列である。
【００７６】
「ベクター」とは、単離された核酸を含み、細胞の内部に単離された核酸を送達するために使用することができる物体の組成物である。直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と会合したポリヌクレオチド、プラスミド、およびウイルスを含むがこれらに限定されない、多数のベクターが、当技術分野において公知である。本開示において、「ベクター」という用語は、自己複製ウイルスを含む。
【００７７】
「2A」または「2Aペプチド」または「2A様ペプチド」という用語は、自己プロセシングウイルスペプチドである。2Aペプチドは、単一のORF転写単位において異なるタンパク質をコードする配列を分離することができる（Ryan et al., 1991, J Gen Virol 72:2727-2732）。「自己切断」ペプチドまたはプロテアーゼ部位と呼ばれるが、2A配列が1つの転写物から2つのタンパク質を生成する機序は、正常なペプチド結合が2Aで損なわれ、1つの翻訳事象から2つの不連続のタンパク質断片を結果として生じさせるリボソームスキッピングにより起こる。2Aペプチド配列との連結により、単一のORFに由来する複数の別個のタンパク質（本質的に等モル量）の細胞発現が、結果として生じる（de Felipe et al., 2006, Trends Biotechnol 24:68-75）。
【００７８】
説明
組成物
本発明は、図1A〜図1Bに示されている高力価ハイブリッドウイルスベクターの発見に、一部基づく。ベクターは、表2に示されているような、G-4700-A、A-5424-G、G-5434-A、T-5825-C、T-5930-C、A-6047-G、G-6783-A、G-6963-A、G-7834-A、T-8859-A、T-8864-C、G-9211-A、A-10427-G、G-11560-A、A-11871-G、およびT-11978-Cからなる群より選択される変異のうちの少なくとも2つを含む、セムリキ森林ウイルス（SFV）非構造タンパク質ヌクレオチド配列をコードするDNA配列に機能的に連結されている第1のプロモーター配列を含む、DNA配列を含む。これらの配列は、SFVサブゲノムRNAプロモーターに対応する第2のプロモーター配列を特定するDNAに機能的に連結されている。この配列は、次に、水疱性口内炎ウイルス（VSV）Gタンパク質をコードするDNAに機能的に連結されている。ベクターは、SFV構造タンパク質をコードする機能的なヌクレオチド配列を欠いている。ベクターを細胞培養において増やす際には、高力価のウイルス様ベシクル（VLV）が得られ、例えば、少なくとも1 mlあたり107プラーク形成単位（pfu）の力価が得られる。
【００７９】
いくつかの態様において、本発明のベクターは、表2に示されているような、G-4700-A、A-5424-G、G-5434-A、T-5825-C、T-5930-C、A-6047-G、G-6783-A、G-6963-A、G-7834-A、T-8859-A、T-8864-C、G-9211-A、A-10427-G、G-11560-A、A-11871-G、およびT-11978-Cからなる群より選択される変異のうちの少なくとも2つを含む、アルファウイルス非構造タンパク質ヌクレオチド配列をコードするDNA配列に機能的に連結されている第1のプロモーター配列を含む、DNA配列を含む。これらの配列は、アルファウイルスサブゲノムRNAプロモーターに対応する第2のプロモーター配列を特定するDNAに機能的に連結されている。この配列は、次に、水疱性口内炎ウイルス（VSV）Gタンパク質をコードするDNAに機能的に連結されている。ベクターは、SFV構造タンパク質をコードする機能的なヌクレオチド配列を欠いている。ベクターを細胞培養において増やす際には、高力価のウイルス様ベシクル（VLV）が得られ、例えば、少なくとも1 mlあたり107プラーク形成単位（pfu）の力価が得られる。
【００８０】
本発明の高力価ハイブリッドウイルスベクターを作製する方法は、本明細書中の実験実施例のセクションにおいて詳細に説明されている。
【００８１】
1つの局面において、VSV Gタンパク質をコードするVSVは、当技術分野において公知である任意のVSVセロタイプ由来であることができる。VSVセロタイプの非限定的な例は、インディアナ（IND-VSV）セロタイプおよびニュージャージー（NJ-VSV）セロタイプを含む。
【００８２】
1つの局面において、サイトメガロウイルス前初期プロモーターが本明細書中で例証されているが、本発明は、このプロモーター配列に限定されるように解釈されるべきではない。本発明において有用であるプロモーター配列は、高レベルの遺伝子発現を誘導する任意のプロモーターを含む。そのようなプロモーターは、本明細書中の他の場所で開示されているものを含み得るが、これらに限定されない。
【００８３】
本発明の別の局面において、ハイブリッドウイルスベクターは、細胞培養において増やす際に、少なくとも5×107 pfu/ml、少なくとも1×108 pfu/ml、またはそれより大きい力価を達成し得る。
【００８４】
本発明の組成物のさらなる局面において、HBVタンパク質をコードするDNAは、サブゲノムSFVプロモーターとVSV Gタンパク質をコードするDNAとの間に挿入され、この異種タンパク質をコードするDNAは、次にVSV Gタンパク質をコードするDNAに機能的に連結されている、ゾセア・アシグナ（Thosea asigna）ウイルス由来のT2AペプチドをコードするDNAに機能的に連結されている（Szymczak et al.,  2004. Nature Biotechnology 22:589-594）。このように、結果として生じる本発明のVLVにおけるHBVタンパク質の発現は、VSV Gタンパク質の発現に実際上結びつけられており、VSV Gタンパク質は、ベクターの複製のために不可欠である。したがって、HBVタンパク質の発現は安定化され、ハイブリッドベクターにおけるこのタンパク質を発現する遺伝子の連続した存在が保証される。
【００８５】
いくつかの態様において、2Aペプチドは、ウマ鼻炎Aウイルス（E2A）、口蹄疫ウイルス（F2A）、ブタテッショウウイルス-1（P2A）、ゾセア・アシグナウイルス（T2A）、および当技術分野において公知である任意の2Aペプチドまたはその断片からなる群より選択される。さらなる態様において、2Aペプチドは、T2Aペプチド、または当技術分野において公知であるその任意のT2A断片である。
【００８６】
ある特定の態様において、HBV遺伝子は、必ずしもSFVサブゲノムプロモーター配列でなくてもよいRNAウイルスプロモーター配列の支配下にあることができる。異種プロモーター配列の発現を駆動するRNAプロモーター配列のそのような改変および変動は、当業者が本発明を実施する際に彼らに明らかになるであろう。ベクターはまた、本発明により産生されたハイブリッドウイルスベクターに感染した細胞において、その転写、翻訳、および／または発現を可能にする様式でHBV遺伝子に機能的に連結されている、従来の調節エレメントも含み得る。
【００８７】
このように、HBVタンパク質／抗原またはその断片の発現は、VSV Gタンパク質の発現に実際上結びつけられており、VSV Gタンパク質は、ベクターの複製のために不可欠である。したがって、HBV抗原またはその断片の発現は安定化され、ハイブリッドベクターにおけるこのタンパク質を発現する遺伝子の連続した存在が保証される。そのような高力価ハイブリッドウイルスベクターは、「高力価ハイブリッドHBVベクター」と本明細書において呼ばれる。
【００８８】
ある特定の態様において、HBV抗原またはその断片をコードするDNAは、構成性プロモーターの支配下にある。他の態様において、必要とされる構成要素は、誘導性プロモーターの支配下にあり得る。適している誘導性プロモーターおよび構成性プロモーターの例は、本明細書中の他の場所で提供され、当技術分野において周知である。
【００８９】
ベクターはまた、本発明により産生されたハイブリッドウイルスベクターに感染した細胞において、その転写、翻訳、および／または発現を可能にする様式で異種遺伝子に機能的に連結されている、従来の調節エレメントも含み得る。
【００９０】
本明細書において使用される際、「機能的に連結されている」配列は、関心対象の遺伝子と隣接している発現調節配列、および、関心対象の遺伝子を調節するためにトランスでまたはある距離を置いて作用する発現調節配列の両方を含む。発現調節配列は、適切な転写開始、終結、プロモーター、およびエンハンサー配列；スプライシングシグナルおよびポリアデニル化（ポリA）シグナルなどの効率的なRNAプロセシングシグナル；細胞質mRNAを安定化する配列；翻訳効率を増強する配列（すなわち、Kozakコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を増強する配列；ならびに、望ましい場合には、コードされる産物の分泌を増強する配列を含む。天然、構成性、誘導性、および／または組織特異的であるプロモーターを含む、多数の発現調節配列が存在し、本発明の組成物中で使用され得る当技術分野において公知である。「機能的に連結されている」とは、DNAの発現および調節配列に加えて、RNAの発現および調節配列を含むように解釈されるべきである。
【００９１】
追加のプロモーターエレメント、例えばエンハンサーが、転写開始の頻度を制御する。典型的に、これらは、開始部位の30〜110 bp上流の領域に位置するが、数多くのプロモーターが、同様に開始部位の下流に機能的エレメントを含有することが、最近示されている。エレメントが逆であるか、または互いに対して移動されている場合にプロモーター機能が保存されているように、プロモーターエレメント間の間隔は、しばしば柔軟である。チミジンキナーゼ（tk）プロモーターにおいて、プロモーターエレメント間の間隔は、活性が低下し始める前に50 bp離れた状態まで増大させることができる。プロモーターに応じて、個々のエレメントは、転写を活性化するために、協力的にまたは独立的にのいずれかで機能し得る。
【００９２】
1つの態様において、適しているプロモーターは、前初期サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに機能的に連結されている任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動することができる、強い構成性プロモーター配列である。適しているプロモーターの別の例は、伸長成長因子-1α（EF-1α）である。しかし、シミアンウイルス40（SV40）初期プロモーター、マウス乳癌ウイルス（MMTV）、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）の長い末端反復（LTR）プロモーター、MoMuLVプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびに、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、およびクレアチンキナーゼプロモーターなどであるがこれらに限定されないヒト遺伝子プロモーターを含むが、これらに限定されない、他の構成性プロモーター配列もまた使用され得る。さらに、本発明は、構成性プロモーターの使用に限定されるべきではない。誘導性プロモーターもまた、本発明の一部として企図される。誘導性プロモーターの使用により、そのような発現が望ましい場合には、それが機能的に連結されているポリヌクレオチド配列の発現をオンにし、または、発現が望ましくない場合には発現をオフにすることができる、分子スイッチが提供される。誘導性プロモーターの例は、メタロチオニン（metallothionine）プロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、およびテトラサイクリンプロモーターを含むが、これらに限定されない。本発明は、さらに、1つまたは複数の特異的な細胞のタイプにおいて所定の異種遺伝子の発現を駆動する組織特異的プロモーター（例えば、デスミンプロモーター、ミオグロビンプロモーター、筋肉クレアチンキナーゼプロモーター、哺乳動物トロポニン1プロモーター、および骨格α-アクチンプロモーター）の使用を含む。さらに、当技術分野において公知である任意の人工合成プロモーターを、これらのプロモーターが異種遺伝子にとって最適な効率および安定性を提供できる際に、本発明の中で使用することができる。加えて、エンハンサー配列が、ベクター内に含有されている遺伝子の発現を制御する。典型的に、エンハンサーは、タンパク質因子と結合して、遺伝子の転写を増強する。エンハンサーは、それが制御する遺伝子の上流または下流に位置し得る。エンハンサーはまた、特異的な細胞または組織タイプにおいて転写を増強するために組織特異的であってもよい。
【００９３】
HBV抗原をコードするDNAの発現を評価するために、細胞中に導入されるべき発現ベクターはまた、ハイブリッドウイルスベクターを通して感染させようとした細胞の集団からの発現細胞の特定および選択を促進するために、選択可能なマーカー遺伝子もしくはレポーター遺伝子、または両方を含有することもできる。他の局面において、選択可能なマーカーは、分離したDNA片上で運搬され、共感染／トランスフェクション手順において使用されてもよい。選択可能なマーカーおよびレポーター遺伝子の両方は、宿主細胞における発現を可能にするのに適切な制御配列と隣接していてもよい。有用な選択可能なマーカーは、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子などのような抗生物質耐性遺伝子を含む。
【００９４】
レポーター遺伝子は、潜在的に感染した細胞を特定するため、および制御配列の機能性を評定するために使用される。概して、レポーター遺伝子は、レシピエントの生物または組織に存在しないか、またはそれらにより発現されておらず、かつ、その発現がいくつかの容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性により明示されるポリペプチドをコードする遺伝子である。適しているレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼ、または緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子を含み得る（例えば、Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82）。
【００９５】
本発明の高力価ハイブリッドHBVベクターにおいて有用なHBV抗原は、B型肝炎表面抗原（HBsAg）、B型肝炎コア抗原（HBcAg）、B型肝炎e抗原（HBeAg）、B型肝炎ウイルスタンパク質X（HBx）、およびB型肝炎ウイルスDNAポリメラーゼを含む。ある特定の局面において、抗原は、HBsAgペプチドの任意の組み合わせ：ラージ、ミドル、および／またはスモール（プレS1＋プレS2＋S、プレS2＋S、またはS）であることができる。さらなる局面において、HBVは、本明細書中の他の場所で記載されているような、当技術分野において公知である任意のセロタイプおよびゲノタイプ由来であることができよう。またさらなる局面において、HBV抗原は、HBV抗原（すなわち、2種、3種、もしくはそれより多く）またはその断片の組み合わせを包含することができよう。いくつかの局面において、これらのHBV抗原またはHBV抗原の断片を、当技術分野で利用可能な技術を使用し、集合させて融合タンパク質にすることができる。
【００９６】
本発明の別の局面において、ハイブリッドHBVベクターは、VLVを細胞培養において産生させる際に、少なくとも5×107 pfu/ml、少なくとも1×108 pfu/ml、またはそれより高い力価で、HBVを発現するVLVを産生し得る。
【００９７】
発明の方法
本発明は、HBVの感染に対する免疫性を対象に与える方法を含む。方法は、高力価ハイブリッドウイルスベクターにより産生されるウイルス様ベシクル（VLV）を含む組成物を対象に投与する工程を含み、該高力価ハイブリッドウイルスベクターは、HBV遺伝子またはその断片をコードするDNAを含む。異種遺伝子の発現は、対象において、それによりコードされるHBVタンパク質またはその断片に対する免疫応答を誘導する。1つの局面において、本発明は、対象においてHBVタンパク質またはその断片に対するメモリーT細胞免疫応答を生じさせる方法を含む。別の局面において、対象においてHBVタンパク質またはその断片に対する適応B細胞免疫応答を生じる。
【００９８】
本発明は、さらに、必要とする対象を処置する方法であって、本発明の高力価ハイブリッドウイルスベクターにより産生されるウイルス様ベシクル（VLV）を含む組成物を該対象に投与する工程を含み、該高力価ハイブリッドウイルスベクターがHBV遺伝子またはその断片をコードするDNAを含み、該HBV遺伝子またはその断片の発現が該対象に有益性を提供する、方法を含む。
【００９９】
加えて、対象が疾患を発症するであろうリスクを減少させる方法が、本発明に含まれる。方法は、本発明の高力価ハイブリッドウイルスベクターにより産生されるウイルス様ベシクル（VLV）を含む組成物を対象に投与する工程を含み、該高力価ハイブリッドウイルスベクターは、HBV遺伝子またはその断片をコードするDNAを含む。HBV遺伝子またはその断片の発現は、対象において、それによりコードされるHBVタンパク質またはその断片に対する免疫応答を誘導し、それにより対象がHBVを発症するであろうリスクを減少させる。
【０１００】
本発明の方法において有用なHBV抗原は、B型肝炎表面抗原（HBsAg）またはその断片、B型肝炎コア抗原（HBcAg）またはその断片、B型肝炎e抗原（HBeAg）またはその断片、B型肝炎ウイルスタンパク質X（HBx）、B型肝炎ウイルスDNAポリメラーゼまたはその断片、および抗原または抗原断片の任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない。いくつかの局面において、HBV抗原の組み合わせを、集合させて融合タンパク質構築物にすることができる。
【０１０１】
本発明のある特定の局面において、抗ウイルス療法およびHBeAg血清変換時に、HBVウイルス負荷および抗原の低減と、活性化T細胞の負の制御因子である阻害性受容体プログラム死-1（PD-1；PDCD1としても公知である）のT細胞による発現の低下との間には、正の相関がある（Evans et al (2008) Hepatology 48:759）。
【０１０２】
本発明の別の局面において、HBVのバリアントの使用が企図され、該バリアントは、HBV  DNAポリメラーゼ、表面抗原、および1つ／または2つのオープンリーディングフレームのうちの少なくとも1つをコードする遺伝子中にヌクレオチド変異を含む。変異は、変異したHBVタンパク質の少なくとも1個のアミノ酸付加、置換、および／または欠失を結果としてもたらす。
【０１０３】
いくつかの態様において、ワクチンは、短期および長期の免疫応答を生じさせる。骨髄樹状細胞によるHBsAgの内部移行は、共刺激分子（すなわち、B7）の上方制御を阻害し、T細胞刺激能力を阻害して（den Brouw et al (2008) Immunology 126:280）、慢性的に感染した患者由来の樹状細胞もまた、HBsAgの存在下で、共刺激分子の発現、IL-12の分泌、およびT細胞の刺激の欠損を示す（Zheng et al., 2004, J. Viral Hepatitis 11:217）。
【０１０４】
ある特定の態様において、化合物または組成物を、第1の作用物質として指定する。ある特定の態様において、方法は、第1の作用物質および1つまたは複数の第2の作用物質を投与する工程を含む。ある特定の態様において、方法は、第1の作用物質および1つまたは複数の第2の作用物質を投与する工程を含む。ある特定の態様において、第1の作用物質および1つまたは複数の第2の作用物質は、共投与される。ある特定の態様において、第1の作用物質および1つまたは複数の第2の作用物質は、逐次的にまたは同時に共投与される。
【０１０５】
ある特定の態様において、1つまたは複数の第2の作用物質もまた、本明細書に記載されている化合物または組成物である。ある特定の態様において、1つまたは複数の第2の作用物質は、本明細書に記載されている化合物または組成物とは異なる。1つまたは複数の第2の作用物質の例は、抗炎症剤、化学療法剤、または抗感染症剤を含むが、これらに限定されない。
【０１０６】
他の関連する態様において、追加の治療剤は、抗HBV剤、抗HCV剤、化学療法剤、抗生物質、鎮痛薬、非ステロイド性抗炎症（NSAID）剤、抗真菌剤、抗寄生虫剤、抗嘔吐剤、抗下痢剤、または免疫抑制剤であり得る。
【０１０７】
ある特定の態様において、1つまたは複数の第2の作用物質は、抗HBV剤である。ある特定の態様において、抗HBV剤は、インターフェロンα-2b、インターフェロンα-2a、およびインターフェロンアルファコン-1（ペグ化および非ペグ化）、リバビリン；HBV RNA合成阻害剤；HBVキャプシド集合阻害剤；第2アンチセンスオリゴマー；HBV治療用ワクチン；HBV予防用ワクチン；ラミブジン（3TC）；エンテカビル（ETV）；フマル酸テノホビルジソプロキシル（TDF）；テルビブジン（LdT）；アデホビル；またはHBV抗体療法（モノクローナルもしくはポリクローナル）を含むことができるが、これらに限定されない。
【０１０８】
ある特定の態様において、1つまたは複数の第2の作用物質は、抗炎症剤（すなわち、炎症低下療法）である。ある特定の態様において、炎症低下療法は、治療的生活様式変化、ステロイド、NSAID、またはDMARDを含むことができるが、これらに限定されない。ステロイドは、コルチコステロイドであることができる。NSAIDは、アスピリン、アセトアミノフェン、イブプロフェン、ナプロキセン、COX阻害剤、インドメタシンなどであることができる。DMARDは、TNF阻害剤、プリン合成阻害剤、カルシニューリン阻害剤、ピリミジン合成阻害剤、スルファサラジン、メトトレキサートなどであることができる。
【０１０９】
ある特定の態様において、1つまたは複数の第2の作用物質は、化学療法剤（すなわち、癌処置剤）である。化学療法剤は、ダウノルビシン、ダウノマイシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、エソルビシン、ブレオマイシン、マホスファミド、イホスファミド、シトシンアラビノシド、ビス-クロロエチルニトロソ尿素、ブスルファン、マイトマイシンC、アクチノマイシンD、ミトラマイシン、プレドニゾン、ヒドロキシプロゲステロン、テストステロン、タモキシフェン、ダカルバジン、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン、ミトキサントロン、アムサクリン、クロラムブシル、メチルシクロヘキシルニトロソ尿素、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、シクロホスファミド、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン（CA）、5-アザシチジン、ヒドロキシ尿素、デオキシコホルマイシン、4-ヒドロキシペルオキシシクロホスホラミド、5-フルオロウラシル（5-FU）、5-フルオロデオキシウリジン（5-FUdR）、メトトレキサート（MTX）、コルヒチン、taxol、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、トリメトレキサート、テニポシド、シスプラチン、ゲムシタビン、およびジエチルスチルベストロール（DES）を含むことができるが、これらに限定されない。
【０１１０】
ある特定の態様において、1つまたは複数の第2の作用物質は、抗感染症剤である。抗感染症剤の例は、抗生物質、抗真菌薬、および抗ウイルス薬を含むが、これらに限定されない。
【０１１１】
1つの態様において、B型肝炎ウイルスに感染した哺乳動物においてHBV mRNA、DNA、タンパク質の量、および／またはHBV抗原の量を低減させるための方法が提供される。方法は、処置前の哺乳動物におけるHBV mRNA、タンパク質の量、およびHBV抗原の量と比較して、B型肝炎ウイルス感染症およびB型肝炎抗原を低減させるために、治療的有効量の、上記のようなウイルス様ベシクル（VLV）を含む組成物を、必要とする哺乳動物に投与する工程を含む。
【０１１２】
薬学的組成物および製剤
本発明の高力価ハイブリッドHBVベクターは、薬学的組成物として製剤化され得る。
【０１１３】
そのような薬学的組成物は、対象への投与に適している形態であってもよく、または、薬学的組成物は、1つもしくは複数の薬学的に許容される担体、1つもしくは複数の追加の成分、またはこれらのいくつかの組み合わせをさらに含んでよい。薬学的組成物の種々の構成要素は、当技術分野において周知であるように、生理学的に許容される塩の形態で、例えば、生理学的に許容されるカチオンまたはアニオンとの組み合わせで、存在してもよい。
【０１１４】
ある態様において、本発明の方法を実施するのに有用な薬学的組成物は、免疫化あたり105〜109の間のPFUの用量を送達するように投与されてもよい。複数の用量が、毎週、毎月、または当業者により決定される任意の組み合わせで投与されてもよい。
【０１１５】
1つの態様において、本発明の方法を実施するのに有用な薬学的組成物は、アジュバントを含み得る。本発明により企図される、適しているアジュバントは、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、Quil A、Detox、ISCOM、またはスクアレンを含むが、これらに限定されない。本発明の方法において有用である薬学的組成物は、吸入、経口、直腸、膣、非経口、局所、経皮、肺、鼻内、頬、眼、クモ膜下腔内、静脈内、または別の経路の投与のために適切に開発され得る。他の企図される製剤は、計画されたナノ粒子、リポソーム調製物、活性成分を含有する再密封された赤血球、および免疫学に基づく製剤を含む。投与の経路は、当業者に容易に明らかであり、処置される疾患のタイプおよび重症度、処置される獣医学的対象またはヒト対象のタイプおよび齢などを含む、任意の数の要因に依存する。
【０１１６】
本明細書において提供される薬学的組成物の説明は、ヒトへの倫理的な投与に適している薬学的組成物を主に対象にしているが、そのような組成物は、概して、すべての種類の動物への投与に適していることが、当業者により理解される。組成物を種々の動物への投与に適するようにするための、ヒトへの投与に適している薬学的組成物の改変は、十分に理解されており、通常の熟練した獣医薬理学者は、そのような改変を、もしあるとしても単に通常の実験法で、設計および実施することができる。本発明の薬学的組成物の投与が企図される対象は、ヒト、他の霊長類、ならびに、ニワトリ、ブタ、リス、およびウッドチャックを含む哺乳動物を含むが、これらに限定されない。
【０１１７】
本発明の組成物は、組成物の総重量により約0.005％〜2.0％の保存剤を含み得る。保存剤は、環境中の汚染物質に曝露された場合に腐敗を予防するために使用される。
【０１１８】
投与／投薬
投与のレジメンは、有効量を構成するものに影響を及ぼし得る。例えば、本発明の高力価ハイブリッドウイルスベクターは、単一用量で、いくつかの分割された投薬量で、対象に投与されてもよく、および、時差的な投薬量が、毎日もしくは逐次的に投与されてもよく、または、用量は、継続的に注入されてもよく、もしくはボーラス注射であってもよい。さらに、投薬量は、治療的または予防的状況の緊急性によって示されるように、比例して増大または減少させてもよい。
【０１１９】
対象、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトへの本発明の組成物の投与は、公知の手順を使用し、対象において疾患を処置するのに有効な投薬量かつ期間で、実施され得る。意図される結果を達成するのに必要な組成物の有効量は、変動することになり、処置または予防されるべき疾患、処置される対象の年齢、性別、体重、状態、全身の健康、および事前の病歴などの要因、ならびに医学技術分野において周知である同様の要因に依存することになる。特定の態様において、投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、組成物を単位剤形において製剤化することが、特に有利である。本明細書において使用される単位剤形とは、処置されるべき対象のための単位投薬量として適した物理的に別個の単位を指し；各単位は、必要とされる薬学的ビヒクルと関連して望ましい治療効果を生じさせるように計算された、あらかじめ決定された量の治療用化合物を含有する。本発明の単位剤形は、組成物および発現されるべき異種タンパク質の独自の特徴、ならびに達成されるべき特定の治療効果によって規定され、かつそれに直接依存する。
【０１２０】
投与の経路
1つより多い経路を投与のために使用することができるが、特定の経路が、別の経路よりも即時のかつ有効な反応を提供できることを、当業者は認識しているであろう。本発明の組成物のいずれかの投与の経路は、吸入、経口、鼻、直腸、非経口、舌下、経皮、経粘膜（例えば、舌下、舌、（経）頬、（経）尿道、膣（例えば、経膣的および膣周囲的）、鼻（内）、および（経）直腸）、膀胱内、肺内、十二指腸内、胃内、クモ膜下腔内、皮下、筋肉内、皮内、動脈内、静脈内、気管支内、吸入、ならびに局所投与を含む。
【０１２１】
キット
いくつかの態様において、本明細書に記載されているような、HBV関連疾患、障害、もしくは状態、またはその症状を処置、予防、または改善するためのキットであって、a）本明細書に記載されているような化合物または組成物；および任意でb）本明細書に記載されているような追加の作用物質または療法を含むキットが、提供される。キットは、HBV関連疾患、障害、または状態を処置、予防、または改善するようにキットを使用するための説明書または標識を、さらに含むことができる。さらなる態様において、本発明は、バリアントHBVについてのアッセイのためのキットである。そのようなキットは、例えば、PCRもしくは他の核酸ハイブリダイゼーション技術（マイクロアレイ）由来の試薬、または免疫学に基づく検出技術（ELISpot、ELISA）用の試薬を含有し得る。
【実施例】
【０１２２】
本発明を次に、以下の実施例に関して説明する。これらの実施例は、例証の目的だけで提供され、本発明は、決してこれらの実施例に限定されるように解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書において提供される教示の結果として明確になる任意のおよびすべての変形物を包含するように解釈されるべきである。
【０１２３】
さらなる説明なしで、当業者は、前述の説明および以下の例証となる実施例を用いて、本発明の化合物を作製および利用でき、かつ特許請求される方法を実施できることが、確信される。したがって、以下の実施例は、本発明の好ましい態様を具体的に指摘し、決して本開示の残りの部分を限定するように解釈されるべきではない。
【０１２４】
本明細書中で開示される実験において使用される材料および方法を、次に説明する。
【０１２５】
材料および方法
細胞株、ハイブリッド水疱性口内炎ウイルス／セムリキ森林ウイルスワクチンベクター（VLV）の生成
ハムスターBHK-21（BHK）上皮細胞を、10％ウシ胎児血清、50 U/mlペニシリン、および2 mM L-グルタミンを補給したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）において維持した。
【０１２６】
HBcAgおよびMHBsのオープンリーディングフレームを、pHBV2プラスミド（セロタイプayw）からPCR増幅して、ディレクショナルクローニング用の上流のPac1部位および下流のSbf1部位を導入した。使用したプライマーは、以下を含む：HBcAg（コア）について、
2017515508.tif 000003
酵素Pac1およびSbf1での消化後に、PCR産物をプラスミドpCMV-SFVT2AG中にクローニングして、それぞれpCMV-SFVHBcT2AGおよびpCMV-SFVmST2AGを作製した。pCMV-SFVT2AGは、SFVサブゲノムRNAプロモーターの下流にPac1-Sbf1クローニング部位を有するように操作されている、pCMV-SFVG-p50Rベクター（SEQ ID NO: 5、本明細書中の他の場所で実施例セクションの終わりに提供されている）に由来するプラスミドである。このプラスミドはまた、クローニング部位の下流であるがインディアナセロタイプVSV糖タンパク質（VSV G）の上流に、リボソームT2Aスキッピング部位もコードする。ニュージャージーセロタイプVSV糖タンパク質をコードする同様のプラスミド（pCMV-SFVT2AGNJ）もまた、HBVタンパク質および代替糖タンパク質を発現するウイルス様ベシクル（VLV）を産生するために、クローニングに使用した。VLV-MHBs（インディアナセロタイプ）、VLV-HBcAg、またはVLVNJ-MHBsを、それぞれ、プラスミドpCMV-SFVmST2AG、pCMV-SFVHBcT2AG、またはpCMV-SFVmST2AGNJをBHK細胞にトランスフェクトすることによって回収した。VLVの回収のためには、10 cmディッシュ中のBHK-21細胞（2×106細胞）に、Lipofectamine（Invitrogen）およびOpti-MEM培地を用いて製造業者のプロトコルにしたがい、10μgのプラスミドをトランスフェクトした。5時間後に、トランスフェクション培地を、5％FBSを加えた10 mLのダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で置換した。次いで、細胞を37℃、5％CO2で48時間インキュベートした。次いで、上清を収集した。いくつかの場合には、VLVを、100 kDa Amicron（登録商標）Ultra filter（EMD Millipore Corporation）を通した遠心分離により濃縮した。アリコートを、-80℃で保存した。
【０１２７】
間接免疫蛍光法
VLVストックの力価を、以前に記載されているように決定した（Rose et al., 2008, PNAS 105:5839-43）。簡潔に言うと、ストックを連続希釈し、カバーガラス上に播種したBHK-21細胞に21時間感染させるために使用した。次いで、細胞を、3％パラホルムアルデヒドで固定し、VSV糖タンパク質に対する一次抗体、およびその後のAlexa Fluor 488ヤギ抗マウスIgG(H+L)（Invitrogen）で染色した。次いで、感染細胞の蛍光プラークを計数し、力価を計算した。HBVタンパク質の免疫蛍光法については、細胞に、SFVG41-MHBsまたはSFVG41-HBcAgをトランスフェクトして、3％パラホルムアルデヒドで固定し、次いで、HBVコアに対する抗体（Dako）またはプレS2に対する抗体（Santa Cruz Biotechnology）で染色した。適切な二次抗体を使用し、CoolSnap EZデジタルカメラを装備したNikon Eclipse 80i顕微鏡を用いて、細胞を画像化した。
【０１２８】
免疫組織化学
肝臓組織を収集して、10％緩衝リン酸ホルマリン（Fisher Scientific）中で固定した。パラフィン包埋後に、HBVコアを、抗コアポリクローナルウサギ抗体（Dako）を用いてYale University Research Histologyにより行われた免疫組織化学染色によって検出した。
【０１２９】
ウエスタンブロット
BHK-21細胞を、VLV-MHBsまたはVLV-HBcAg（10のMOI）に24時間感染させた。次いで、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し、2×SDS試料緩衝液で溶解した。試料を、10％SDSゲル上で泳動し、ニトロセルロース膜に転写して、抗プレS2（Santa Cruz Biotechnology）、抗コア（Dako）、抗VSV、または抗アクチン（Santa Cruz Biotechnology）抗体のいずれかをプローブとし、次いで、化学発光を用いて二次抗体で検出した。
【０１３０】
T細胞アッセイ
ガンマインターフェロン（IFN-γ）酵素結合免疫スポット（ELISPOT）セット（BD Biosciences）を用いて、製造業者のプロトコルにしたがい、HBV特異的T細胞応答を定量した。簡潔に言うと、免疫化／抗原投与後の7日目に、マウスを安楽死させて、脾臓を収集した。脾細胞を、70μmストレーナー（BD Falcon）の通過およびACK溶解緩衝液（Lonza）での処置によって精製した。細胞を、ハンクス平衡塩溶液（HBSS；Invitrogen）で洗浄し、10％ウシ胎児血清、100μg/mlペニシリン、および2 mM l-グルタミンを補給したDMEMに懸濁して、精製抗マウスIFN-γ抗体（1:200）でコーティングした96ウェルプレートに2×105細胞／ウェルで播種した。次いで、細胞を、一晩、37℃で、10μg/mlの濃度のHBV特異的ペプチド（MHBsおよびHBcAg、下記の表1）で刺激した。細胞を、PBS-Tween（0.05％［体積／体積］）を用いてプレートから洗浄し、提供されたビオチン化抗マウスIFN-γ抗体（1:250）を、10％ウシ胎児血清、100μg/mlペニシリン、および2 mM L-グルタミンを補給したDMEMを用いて2時間、25℃で添加した。洗浄後に、ストレプトアビジン-セイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP）（1:100）をウェルに添加し、1時間、25℃でインキュベートした。最終的な洗浄後に、3-アミノ-9-エチル-カルバゾール（AEC）色素体基質（BD Biosciences）をウェルに添加して、25℃で20〜40分間顕色させた。蒸留水を添加して反応を停止し、プレートを風乾させた後、スポット形成細胞（SFC）を数えた。
【０１３１】
（表１）HBVのエンベロープおよびコアCD8 T細胞エピトープ
2017515508.tif 000004
【０１３２】
マウス
6〜8週齢のC57BL/6×Balb/c F1（CB6F1J）マウスを、Jackson Labs（Farmington, CT）から入手した。トランスジェニック（Tg）マウス実験のために、1.3.32 HBV Tgマウス（15）とBalb/cマウス（Charles River; Wilmington, MA）とを一世代交配して、HBV.CB6F1マウスを入手した。導入遺伝子発現の測定単位として血清HBeAgレベルについて、マウスを5〜6週間でスクリーニングした。
【０１３３】
免疫化および抗原投与プロトコル
マウスを、筋肉内への107免疫蛍光単位（IFU）のVLV-MHBsもしくはVLV-HBcAg、107 PFUのVSV-MHBs、または50μgの pCMV-S2.Sで免疫化した。いくつかの場合には、免疫化の4週間後、マウスに、107 PFUのVSV-MHBs、VLV-MHBs、またはVLVNJ-MHBsのいずれかをブーストした。
【０１３４】
抗原投与研究のために、免疫化マウスを6週間飼育し、次いで、その体重の9％と同等の体積のPBSにおける10μgのpHBV1.3のマウス尾静脈中への注射を含む、流体力学的トランスフェクションプロトコルを用いて抗原投与した（Yang et al., 2002）。抗原投与後の1、4、および7日目に、血清を収集して、HBeAg ELISA（International Immuno-Diagnostics）によりHBeAgレベルをモニターするために使用した。
【０１３５】
ELISA
MHBsおよびHBcAgに対する抗体応答、ならびに血清HBeAgレベルを検出するために、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA、International Immunodiagnostics）を、製造業者のプロトコルにしたがい、血清試料をFBSにおいて1:50に希釈して行った。
【０１３６】
肝臓内白血球の単離
肝臓内白血球を、以前に記載されているように単離した（Cobleigh et al., 2010, Journal of virology 84:7513-7522）。簡潔に言うと、肝臓片を70μm孔のストレーナーに通過させ、結果として生じた懸濁液を、37℃で30分間、0.5 mg/mLコラゲナーゼD（Roche）で処置した。次いで、細胞をHBSSで洗浄し、HBSS中の44％ Percoll（体積／体積）に再懸濁して、PBS中の56％ Percoll（体積／体積）の上に重層化した。850×gで30分間、勾配を遠心分離した後、相間の細胞を収集した。次いで、細胞をHBSSで洗浄し、さらなる解析のためにDMEMに再懸濁した。
【０１３７】
HBV RNAおよびDNAの解析
抗原投与後に、HBV RNAおよびDNAを、ノーザンブロット解析およびサザンブロット解析によって検出した。肝臓由来の全ゲノムDNAを、以前に記載されているように精製した（Guidotti et al., 1995）。次いで、サザンブロット解析を、30μgの全肝臓DNAをHindIIIで消化し、アガロースゲル上で分離することによって行った。ノーザンブロット解析のためには、全肝臓RNAを、RNeasy minikit（Qiagen）を用いて製造業者のプロトコルにしたがい、単離した。変性したRNA（20μg）を、（5％ホルムアルデヒドを含有する）アガロースゲル電気泳動によって分離した。10×SSC（0.015 Mクエン酸ナトリウムを含む0.15 M NaCl）でのキャピラリートランスファー法を用いて、核酸を、ナイロン膜に一晩転写した。次いで、核酸を、UV照射によって膜に架橋させ、32P標識dCTPおよびRoche random-primed DNA labeling kitで3.2-kb HBV DNAから調製したプローブにハイブリダイズさせた。シグナルを、PhosophorImager（Fuji）を用いて検出した。
【０１３８】
統計学的データ解析
スチューデントのt-検定を用いて、正常マウスおよびトランスジェニックマウスにおけるCD8 T細胞応答の有意な差を決定した。0.05未満のp値を、統計学的に有意とみなした。
【０１３９】
MHBSおよびHBcAg DNAのヌクレオチド配列を下記に列挙する。
2017515508.tif 000005
【０１４０】
MHBSおよびHBcAgタンパク質のアミノ酸配列を下記に列挙する。
2017515508.tif 000006
【０１４１】
実験の結果を、次に、以下の実施例において説明する。
【０１４２】
実施例1：大規模な継代は高力価VLVを生じさせる
組織培養における大規模な継代を通して、進化後に高力価になるVLVを生じさせるために、図1A〜図1Bに図示した出発DNA構築物を使用した。この構築物を用いて生じさせたSFVレプリコンは、第1のサブゲノムプロモーターからVSV Gを、および第2のプロモーターからSFVキャプシドタンパク質を発現する。この構築物から感染性粒子が導き出され、VLVに典型的な低力価（約105感染単位/ml）を呈することが見出された。より高い力価になるであろう粒子を進化させることが可能であるかどうかを判定するために、BHK細胞上でのVLVの継代を1年の期間にわたって追跡した。最初の継代において、細胞変性効果（CPE）を示す細胞由来の培地の5％を、6 cmディッシュ上の新鮮なBHK細胞の上に移し、次いで、強いCPEが3〜5日までに発生した。SFVキャプシドタンパク質の発現は、継代8までに完全に失われ、その発現が粒子産生を阻害していたことが示唆された。連続した継代に伴って、粒子力価の増大、および24時間未満でのずっとより急速なCPE発生が認められた。継代50までに、VLVは、5×107 i.u./mlより高い力価に達するように進化し、2日後にBHK細胞上に変動するサイズの目に見えるプラークを形成した。この時点で、大きなプラークを選択し、その後「p50 VLV」と呼ばれることになるクローン化したVLVストックを生じさせるために使用した。このp50 VLVは、出発ベクターをおよそ1000倍上回る増大である、およそ5×108 pfu/mlの力価になる。
【０１４３】
実施例2：p50 VLVゲノムの配列
p50 VLVゲノムのコンセンサス配列を決定するために、逆転写およびPCRを行って、ゲノム全体をカバーする、オーバーラップするDNA断片を生じ、次いで、これらの断片を配列決定した。アセンブルした配列は、（ヌクレオチド13333と13334との間に位置するベクター欠失において）1672ヌクレオチドの大きな欠失を示し、これにより、第2のSFVプロモーター、キャプシド遺伝子全体、および、ポリ(A)の前のSFV配列の187ヌクレオチド以外のすべてが除去されていた（図1A〜図1B）。
【０１４４】
この欠失に加えて、下記の表2に列挙する16種の一塩基変化があった。これらのうちの10種は、SFV非構造タンパク質の4つすべてにおいてアミノ酸を変化させ、1種はVSV Gにおいてアミノ酸を変化させ、4種の変異はサイレントであった（図1A〜図1B、表2）。
【０１４５】
（表２）p50 VLVにおけるヌクレオチドおよびアミノ酸の変化
2017515508.tif 000007
*アミノ酸は、SFV nsP1〜4ポリタンパク質において、またはVSV Gタンパク質において番号づけされている。太字で下線のテキストは、変化したアミノ酸を示す。
【０１４６】
高力価ハイブリッドウイルスベクター：pCMV-SFVG-p50Rのヌクレオチド配列（SEQ ID NO: 5と呼ばれる）を、本明細書中の他の場所（実施例セクションの終わり）で提供する。
【０１４７】
実施例3：VLVの構築および発現
HBV（aywセロタイプ）コア抗原（HBcAg）およびミドルバージョンのHBVエンベロープタンパク質（MHBs）のオープンリーディングフレームを、PCRを用いて増幅し、それぞれ5'端および3'端にPac1およびSbf1用のクローニング部位を付加した。次いで、遺伝子を、プラスミドpCMV-SFVT2AG中にクローニングして、それぞれpCMV-SFVHBcT2AGおよびpCMV-SFVmST2AGを作製した。pCMV-SFVT2AGは、SFVサブゲノムRNAプロモーターの下流にPac1-Sbf1クローニング部位を有するように操作されている、pCMV-SFVG-P50Rに由来するプラスミドである。このプラスミドはまた、クローニング部位の下流であるがインディアナセロタイプVSV糖タンパク質（VSV G）の上流に、リボソームT2Aスキッピング部位（Doronina et al., 2008, Molecular and cellular biology 28:4227-4239）もコードする（図2A）。ニュージャージーセロタイプVSV糖タンパク質をコードする同様のプラスミド（pCMV-SFVT2AGNJ）もまた、HBVタンパク質および代替糖タンパク質を発現するウイルス様ベシクル（VLV）を産生するために、クローニングに使用した。
【０１４８】
VLVベクターバックボーン中へのクローニング後に、VLVを回収して、HBVタンパク質の発現を判定した。VLVプラスミドの最初のトランスフェクション後に、間接免疫蛍光法を行って、タンパク質が発現したかどうかを判定した。実際に、VLVプラスミドのトランスフェクションは、MHBsまたはHBcAgの発現につながる（図2C）。次に、回収したVLVが、感染後にHBVタンパク質を発現できたかどうかを判定した。トランスフェクションデータと一貫して、HBcAgおよびMHBsの複数のグリコシル化形態は両方とも（図2B）、容易に検出された。加えて、生じさせたVLVの感染後のVSV糖タンパク質の強い発現もまた、観察された（図1C）。VLVは、典型的に、108 IFU/mLを上回る力価で回収された。
【０１４９】
実施例4：ベクターの生成および免疫化
ミドルB型肝炎表面（MHBs）タンパク質を発現するVLVベクター（VLV-MHBs）またはコア抗原B型肝炎抗原（HBcAg）タンパク質を発現するVLVベクターのいずれかを生じさせた（図2）。HBV抗原特異的なCD8 T細胞応答を誘導するこれらのベクターの能力を、マウスにおいて検討した。動物を、筋肉内への1×107プラーク形成単位（PFU）のVLV-MHBsまたはVLV-HBcAgで免疫化し、CD8 T細胞応答を、公知のMHBsまたはHBcAg CD8 T細胞エピトープに対応するペプチドを用いて、IFN-γELISpotアッセイにより7日後に測定した（図3A）。CD8 T細胞応答は、VLV-MHBs免疫化マウスにおいて、4種のMHBsエピトープに対して特異的に誘発された（図3A）。対照的に、このアッセイにより測定可能な応答は、VLV-HBcAg免疫化マウスにおいてHBcAgに対して生じなかった。
【０１５０】
HBVに対する抗体応答が、有効な治療用ワクチンにとって必要であるかどうかは不明瞭であるが、抗HBV応答は、潜在的に、遊離ウイルスを中和し、したがって宿主肝細胞の感染または再感染を予防する役割を果たすことができた。VLVワクチンがHBV特異的抗体応答を誘発することができるかどうかを判定するために、マウスを上記のように免疫化した。免疫化の30日後に、血清HBsおよびHBcAbレベルを、ELISAにより検討した。T細胞応答と対照的に、VLV-MHBs免疫化は、検出可能なHBsAb応答を誘発しなかった（図3B）。対照的に、VLV-HBcAgでの免疫化は、HBcAgに特異的な抗体を誘発したが、これらの応答は、HBcAgを発現するVSVベクター（VSV-HBcAg；図3B）ほど高くはなかった。まとめると、これらのデータにより、VLVワクチンプラットホームは、HBV特異的免疫応答を誘発できるHBVタンパク質を発現できることが示される。
【０１５１】
実施例5：VLV-MHBsにより誘発されるCD8 T細胞は急性HBV感染症のモデルにおいて防御的である
VLV-MHBsにより誘導されるCD8 T細胞が防御的であるかどうかを判定するために、急性HBV感染症のモデルとなるHBV流体力学的注射プロトコル（Yang et al., 2002, PNAS 99:13825-13830）を使用した。このモデルは、マウスの体重の9％とほぼ同等の体積におけるHBV1.3ゲノム長DNA発現プラスミドのマウスの尾静脈中への注射を含む。この体積過剰負荷は、マウスの肝細胞による当該DNAの取り込みを強要し、したがって、HBVタンパク質および複製中間体の発現を結果としてもたらす。このプロトコルにはウイルス侵入工程が存在しないため、防御は、HBV感染症を一掃するT細胞媒介性の機序に依存する。マウスを、DMEM、107 IFUのVLV-MHBs もしくはVLV-HBcAg、または107 PFUのVSV-MHBsもしくはVSV-HBcAgで免疫化した。免疫化の6週間後に、流体力学的注射を行って、HBV複製についてマウスをモニターした。
【０１５２】
抗原投与後のHBVタンパク質発現を検討するために、血清中のHBeAg発現および肝臓中のHBcAg発現を検討した。すべてのマウスにおいて、血清HBeAgレベルは、抗原投与後の1日目までに有意に増大した。未免疫化のままかまたはVLV-HBcAgで免疫化したマウスにおいて、HBeAgは、抗原投与後4日目に増大し続け、次いで、7日目に横ばい状態になる。しかし、VLV-MHBsで免疫化したマウスにおいては、血清HBeAgが、抗原投与後4日目に減少し、7日目にはほとんど検出不可能になる（図4A）。肝臓中のHBcAgレベルを、抗原投与後7日目に、免疫組織化学により決定した。検出されたHBeAgレベルと一貫して、HBcAg発現肝細胞の数は、未免疫化またはVLV-HBcAg免疫化マウスと比較した場合に、VLV-MHBsで免疫化したマウスにおいて有意に低減していた（図4B）。
【０１５３】
次に、肝臓におけるHBV RNAおよびDNAのレベルを、それぞれノーザンブロットおよびサザンブロットにより検討した。これらの解析により、VLV-MHBsは、HBV複製からマウスを完全に防御することが実証された（図4C）。興味深いことに、VLV-MHBs免疫化により実証された防御のレベルは、非常に強いHBV特異的免疫応答を誘導するベクターであるVSV-MHBsについて観察されたものと同様であった。T細胞応答を誘導できないことと一致して、VLV-HBcAgベクターおよびVSV-HBcAgベクターは、マウスを抗原投与から防御しなかった（図4C）。
【０１５４】
最後に、CD8 T細胞がこのモデルにおいてクリアランスを担う可能性が高いため、脾細胞（図4D）および肝臓内白血球（図4E）の両方に対して抗原投与の7日後にIFN-γELISPOTアッセイを行うことにより、T細胞リコール応答を測定した。結果により、試験した4エピトープのうちの少なくとも2種に対する強いCD8 T細胞応答が実証される。重要なことに、これらの応答は、一次免疫化後に誘導された応答よりもおよそ5倍大きい（図4Dを図3Aと比較されたい）。これらの結果により、VLV-MHBs粒子は、HBV抗原投与の間にリコールされ、かつ拡大され得るメモリーT細胞を誘導することが示唆される。さらに、これらの結果により、VLV-MHBsによって誘導されるT細胞は、このモデルにおいて検出可能な抗体の非存在下でHBV感染症を調節できることが実証される。
【０１５５】
実施例7：CD8 T細胞はVLV-MHBs、VLV-rDNA、またはVLV-rHBsAgでの免疫化後に4種のMHBsエピトープに対する応答を媒介する
CD8 T細胞応答を、VLV-MHBsで免疫化したマウスと、MHBsを発現する組み換えDNA（rDNA）または組み換えHBsAgタンパク質（rHBsAg）で免疫化したマウスにおいて、MHBsの間で比較した（図6）。マウスを、筋肉内への1×107 PFUのVLV-MHBs、50μgのrDNA、または10μgのrHBsAgで免疫化し、4種のMHBsエピトープに対するCD8 T細胞応答を7日後に測定した。対照PBSまたはrDNAで免疫化したマウスは、測定可能な応答を誘発しなかった。マウスのあるサブセットはHBsAgタンパク質免疫化に応答したが、VLV-MHBs免疫化によって誘導されたCD8 T細胞応答は、概して、規模がより大きく、かつ特異性がより広かった。したがって、マウスにおいてVLV-MHBsによって生じたCD8 T細胞応答は、rDNAまたはrHBsAgと比較して、より一貫して検出可能であり、かつ概してより強かった。さらに、応答が検出されたマウスの中で、応答は、VLV-MHBsで免疫化したマウスにおいてより多くのエピトープに対して向けられていた（図6）。これらのデータにより、VLV-MHBs免疫化は、他の試験した免疫化戦略よりも良好なCD8 T細胞応答を誘発することが示される。
【０１５６】
実施例8：プライム・ブーストプロトコルにおける組み合わせ免疫化戦略はHBV特異的免疫応答を改善する
VLV-MHBs粒子は、単一用量で防御的T細胞応答を誘発するが、慢性感染症の間の免疫寛容の克服は、複数回の免疫化を必要とし得る。重要なことに、VSV Gタンパク質に対する抗体は、同じセロタイプのVLVブーストベクターを中和する可能性が高いであろう。したがって、VLVワクチンプラットホームを用いてプライム・ブースト戦略を調査するために、追加のVLV構築物を最初に生成した。この構築物もまた、MHBsを発現するが、VSV Gタンパク質（インディアナセロタイプ）を、ニュージャージーセロタイプVSV Gで置換させた（VLVNJ-MHBs；図7A）。VLVNJ-MHBsを構築した後、VLV-MHBsまたは50μgのMHBsを発現するDNAプラスミド（pCMV-S2.S）で筋肉内にプライミングして、プライム・ブースト実験を行った。次いで、マウスを、4週間後に、VLV-HBcAg、VLV-MHBs、またはVLVNJ-MHBsでブーストした。ブーストの7日後に、IFN-γELISPOTアッセイを行うことによってCD8 T細胞応答を解析した。VLV-HBcAgまたはVLV-MHBsでのブーストは、期待されたように、測定可能な応答を誘導しなかった（図7B）。VLVNJ-MHBsでのブーストは、測定可能なHBV特異的応答をもたらした；しかし、観察された応答は、VLV-MHBs免疫化で観察された一次応答より大きくはなく、ブーストが無効であったことを示唆した。DNAでのプライミング、およびその後のVLV-MHBsでのブーストは、一次免疫化単独で観察されたものよりも大きい応答をもたらす傾向があった（図7B）。これらの結果により、組み合わせ免疫戦略は、VLV単独を用いるよりも強いT細胞応答を誘導し得ることが示唆される。
【０１５７】
異種プライム・ブースト戦略をさらに調査するために、VLVワクチン接種とVSVワクチン接種とを組み合わせるプライム・ブースト実験を行った。この実験において、マウスを、種々の組み合わせのVLV-MHBs、VLVNJ-MHBs、またはVSV-MHBsでプライムおよびブーストした（図7C）。VLVNJ-MHBs免疫化とVSV-MHBs免疫化とを組み合わせることは、HBV特異的T細胞の有意な増加につながった。重要なことに、VLVNJ-MHBsプライム、およびその後のVSV-MHBsブーストを行うことは、他の免疫化プロトコルのいずれよりも3倍より大きいT細胞応答をもたらした。合わせて、これらのデータにより、プライム・ブーストプロトコルにおいて異種免疫化戦略を組み合わせることは、HBV特異的CD8 T細胞応答における有意な改善につながり得ることが示される。
【０１５８】
実施例9：VLV-MHBs免疫化は慢性感染症のモデルにおいてCD8 T細胞応答を誘導する
VLV-MHBs免疫化の治療的潜在能力を試験するために、1.3.32HBVトランスジェニックマウスを慢性感染症のモデルとして使用した。これらのマウスは、変動するレベルのHBV導入遺伝子を発現し、これは血清HBeAgレベルによって測定することができる（Guidotti et al., 1995, Journal of virology 69:6158-6169）。HBV治療用ワクチン接種は、抗ウイルス薬または他の免疫調節薬などの他の処置様式と組み合わせて使用できる可能性が高い。長期の抗ウイルス療法を受けている人に存在し得る、より低い抗原負荷のモデルとするために、HBeAg低マウスを免疫化した。VLV-MHBsでの単一の免疫化は、いかなるHBV特異的免疫応答も誘導しなかった。しかし、DNAでのプライミングおよびその後のVLV-MHBsでのブーストは、少なくとも1つのエピトープに対するT細胞応答を誘導した（図8）。免疫応答がHBeAg低マウスにおいて検出されたが、VLV-MHBsワクチン接種は、HBeAg高マウスにおいてT細胞応答を誘発しなかった。これらの結果により、VLVワクチン接種とより低い抗原血症に対する他の処置戦略との組み合わせは、HBV免疫療法のための新規アプローチになり得ることが示唆される。
【０１５９】
実施例10：VLVベースのワクチンの利点
VLVベースのワクチンは、現在利用可能なHBVワクチンまたは他の可能性のあるウイルスベースのワクチンベクターと比較して、数多くの利点を有する。これらは、a）単一用量において長続きする免疫を誘導する潜在能力；b）ヒト集団において、ベクター構成要素に対する既存の免疫がないこと；c）組み換えタンパク質またはDNAワクチンと比較して増大したT細胞生成の効力；d）他のウイルスワクチンベクターと比較して増大した安全性；およびe）産生の相対的な容易さを含むが、これらに限定されない。
【０１６０】
HBV流体力学的抗原投与の間に、VLV-MHBsで免疫化したマウスにおけるHBV複製の顕著な低減が観察された。しかし、VSV-MHBsで免疫化したマウスとは異なり、注射によって誘導されたものを超えるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）レベルの有意な上昇は、観察されなかった。組織病理学の欠如と組み合わせたこの結果により、非細胞溶解性の機序がクリアランスにおいて有意な役割を果たし得ることが示唆される。非細胞溶解性の方法がHBVクリアランスの重要な様式であること、および、T細胞の細胞溶解性機能が、多くの場合、疾患の病因を媒介し得ることを考慮すると（Guidotti et al., 1996, Immunity 4:25-36；Thimme et al., 2003, Journal of virology 77:68-76）、VLV-MHBs免疫化マウスにおける観察可能な肝臓疾患の欠如により、このワクチンは過度に病原性の免疫応答を誘導しないことが示唆される。
【０１６１】
ブースト戦略の目的は、特定の抗原に対するメモリーT細胞プールを拡大することである。概して、ブースト中に、一次応答よりも大きな二次応答を観察することができる。しかし、予想外に、セロタイプスイッチVLV構築物でのブーストは、VLV-MHBsに対する一次応答と同様の規模のCD8 T細胞応答を結果としてもたらした（図8）。この結果についての1つの可能性は、VLV-MHBsでの単一の免疫化は、ブーストすることができるメモリー応答を誘導しないということである。しかし、免疫化の6週間後に防御およびT細胞拡大が観察されたため、VLV-MHBsは耐久性のあるメモリー応答を誘導する可能性が高い。それにもかかわらず、メモリー発生の速度論が、免疫化の4週間後に最適なブーストを可能にし得ない可能性がある。実際に、メモリーT細胞の発生に影響を及ぼすことができる要因である、VLV接種後にどれだけ長く抗原が持続するかは、知られていない（Kaech et al., 2002, Nature reviews, Immunology 2:251-262）。あるいは、二次拡大の速度論は、ブーストの1週間後の解析がピーク応答を正確に反映していなかったようであり得る。最終的に、より弱いVLV（VLVNJ-MHBs）でのプライミングおよびより大きい免疫原性のVLV-MHBsでのブーストが、より少ない免疫原性のワクチンを送達するこの概念として応答を改善し得、これは、プライミングが、プライム・ブーストワクチン接種アプローチを概して強くするためである。これらの要因のさらなる解析は、ブースト後のCD8 T細胞応答を改善し得るか、またはそれをより正確に反映し得る。
【０１６２】
簡潔なまとめ：
全体的に、本発明のMHBsを発現するVLVワクチンは、ウイルスワクチンシステムが、他のワクチン戦略と組み合わせて、有効なHBV治療法につながり得ることを実証する。さらなる最適化がこのワクチン戦略に有益性を与え得るが、他の前臨床モデルにおける調査は、VLVシステムの潜在能力を強調し得る。さらに、トランスジェニックマウスの寛容原性環境において応答を誘導するVLVシステムの能力により、当該システムは、他の病原体に対するワクチンを設計する場合に有用である可能性が高いことが示唆される。実際に、VLVは、HIV分野における有望性を既に示している（Rose et al., 2008, PNAS 105:5839-5843；Schell et al., 2011, Journal of virology 85:5764-5772）。他の病原体および疾患に対するワクチンへのさらなる調査により、VLVワクチンシステムの融通性および有用性が強調され得る。
【０１６３】
本明細書において引用されている各々のおよびあらゆる特許、特許出願、および刊行物の開示は、これによってその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１６４】
本発明が具体的態様に関連して開示されているが、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、本発明の他の態様および変形物が当業者により考案され得ることが、明らかである。添付の特許請求の範囲は、すべてのそのような態様および同等の変形物を含むと解釈されるように意図される。
【０１６５】
高力価ハイブリッドウイルスベクター：pCMV-SFVG-p50Rのヌクレオチド配列（5'-3'）（SEQ ID NO: 5）
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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