(57)【要約】  合成ガスからアミノヘキサン酸及び／又はアミノヘキサン酸エステルを製造する方法であって、Ａ．前記合成ガスを、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路及び／又はエタノール−カルボキシレート発酵を実施することができる少なくとも１種の細菌と接触させてヘキサン酸を製造する工程と、Ｂ．前記ヘキサン酸を遺伝子組み換え細胞と接触させてアミノヘキサン酸及び／又はアミノヘキサン酸エステルを製造する工程と、を含み、前記遺伝子組み換え細胞は、その野生型と比較して、アルカンモノオキシゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ及びω−トランスアミナーゼに関して高い活性を有することを特徴とする方法を提供する。
2017516470.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
合成ガスからアミノヘキサン酸及び／又はアミノヘキサン酸エステルを製造する方法であって、
Ａ．前記合成ガスを、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路及び／又はエタノール−カルボキシレート発酵を実施することができる少なくとも１種の細菌と接触させてヘキサン酸を製造する工程と、
Ｂ．前記ヘキサン酸を遺伝子組み換え細胞と接触させてアミノヘキサン酸及び／又はアミノヘキサン酸エステルを製造する工程と、
を含み、
前記遺伝子組み換え細胞は、その野生型と比較して、アルカンモノオキシゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ及びω−トランスアミナーゼに関して高い活性を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記工程Ａで得られたヘキサン酸のエステル化を行ってＣ１−Ｃ４ヘキサン酸エステルを製造する工程をさらに含み、前記Ｃ１−Ｃ４ヘキサン酸エステルを前記工程Ｂにおいて前記遺伝子組み換え細胞と接触させることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記エステル化を行う工程が、前記工程Ａで得られたヘキサン酸を少なくとも１種のＣ１−Ｃ４アルコールと接触させてＣ１−Ｃ４ヘキサン酸エステルを生成することを含むことを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記エステル化を行う工程を、少なくとも１種のエステル化細菌によって触媒させることを特徴とする、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記工程Ｂにおいて使用する前記遺伝子組み換え細胞内において、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａに由来するＡｌｋＢＧＴ遺伝子によって前記アルカンモノオキシゲナーゼがコードされており、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａに由来するＡｌｋＪ遺伝子によって前記アルコールデヒドロゲナーゼがコードされており、及び／又は、前記ω−トランスアミナーゼが、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍ  ＤＳＭ３０１９１に由来するω−トランスアミナーゼＣＶ２０２５であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記アミノヘキサン酸エステルをアミノヘキサン酸に転化させる工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記アミノヘキサン酸エステルからアミノヘキサン酸への転化を、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓに由来するリパーゼＬｉｐＡ（Ｑ７６Ｄ２６）によって触媒させることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記工程Ｂにおいて使用する細胞が、遺伝子組み換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細胞、遺伝子組み換えＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞及び遺伝子組み換えＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ細胞からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記工程Ａにおいて使用する、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を実施することができる細菌が、Ａｃｅｔｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ  ｎｏｔｅｒａ（ＡＴＣＣ  ３５１９９）、Ａｃｅｔｏｎｅｍａ  ｌｏｎｇｕｍ（ＤＳＭ  ６５４０）、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃａｒｂｉｎｏｌｉｃｕｍ（ＤＳＭ  ２９２５）、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍａｌｉｃｕｍ（ＤＳＭ  ４１３２）、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｎｏ．４４６、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｗｉｅｒｉｎｇａｅ（ＤＳＭ  １９１１）、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ（ＤＳＭ  １０３０）、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ  ｂａｃｃｈｉ（ＤＳＭ  ２２１１２）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ（ＤＳＭ  ４３０４）、Ｂｌａｕｔｉａ  ｐｒｏｄｕｃｔａ（ＤＳＭ  ２９５０）、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（ＤＳＭ  ３４６８）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｉｃｕｍ（ＤＳＭ  １４９６）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ（ＤＳＭ  １００６１、ＤＳＭ  １９６３０及びＤＳＭ  ２３６９３）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ（ＤＳＭ  １５２４３）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｏｓｋａｔｉｉ（ＡＴＣＣ  ｎｏ．ＰＴＡ−１０５２２）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｒａｋｅｉ（ＡＴＣＣ  ＢＡ−６２３）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ（ＤＳＭ  ９２）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｇｌｙｃｏｌｉｃｕｍ（ＤＳＭ  １２８８）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ（ＤＳＭ  １３５２８）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ  Ｃ−０１（ＡＴＣＣ  ５５９８８）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ  ＥＲＩ−２（ＡＴＣＣ  ５５３８０）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ  Ｏ−５２（ＡＴＣＣ  ５５９８９）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｍａｙｏｍｂｅｉ（ＤＳＭ  ６５３９）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｏｖｏｒａｎｓ（ＤＳＭ  １２１８２）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ（ＤＳＭ  １５２４８）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ（ＤＳＭ  ７５７）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ＡＴＣＣ  ２９７９７、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｋｕｚｎｅｔｓｏｖｉｉ（ＤＳＭ  ６１１５）、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｂｅｚｏｉｃｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（ＤＳＭ  １４０５５）、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｍｏｓｕｍ（ＤＳＭ  ２０５４３）、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ  Ｃ２Ａ（ＤＳＭ  ２８３４）、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｓｐ．  ＨＵＣ２２−１、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ（ＤＳＭ  ５２１）、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ（ＤＳＭ  １９７４）、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ  ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ（ＤＳＭ  ３２２）、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ａｅｒｉｖｏｒａｎｓ（ＤＳＭ  １３３２６）、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｏｖａｔａ（ＤＳＭ  ２６６２）、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ（ＤＳＭ  １０６６９）、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ（ＤＳＭ  ２８７５）、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｔｅｒｍｉｔｉｄａ（ＤＳＭ  ４４４０）及びＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｋｉｖｕｉ（ＤＳＭ  ２０３０）からなる群から選択される酢酸生成細菌であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
エタノール−カルボキシレート発酵を実施することができる前記細菌が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ及びＣ．Ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｃ１−Ｃ４アルコールがメタノールであることを特徴とする、請求項３〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記合成ガスから製造されたヘキサン酸を、前記Ｃ１−Ｃ４アルコールと接触させる前に抽出することを特徴とする、請求項３〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞が、前記工程Ｂにおいてアミン供与体として機能するアミノ酸を含む培地に含まれることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
触媒作用によって前記アミノヘキサン酸からナイロンを形成することを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ナイロンが、ナイロン６，６、ナイロン６、ナイロン６，９、ナイロン６，１０及びナイロン６，１２からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、合成ガスをヘキサン酸に転化させた後、ヘキサン酸メチルに化学的に転化させ、ヘキサン酸メチルをアミノヘキサン酸及び／又はそのエステルに転化させる細胞と接触させる、合成ガスからのポリアミド（特にナイロン）の生物工学的製造に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリアミドは、繰り返し単位（モノマー）がアミド基を有することを特徴とする合成ポリマーである。「ポリアミド」という名称は、通常は商業的に利用可能な合成熱可塑性ポリマーに使用され、化学的に関連するタンパク質とは区別される。重要なポリアミドのほとんどは、「−ＣＯ−ＮＨ−」で表される官能基を繰返し単位中に含む第一級アミンに由来する。また、第二級アミン（−ＣＯ−ＮＲ−（式中、Ｒは有機残基である。））からなるポリアミドも知られている。ポリアミドを製造するためのモノマーとしては、アミノカルボン酸、ラクタム及び／又はジアミン並びにジカルボン酸が使用されている。
【０００３】
アミド結合間の繰り返し単位が実質的に脂肪族である場合には、ナイロンと呼ばれるポリアミドが形成される。ナイロンは、ジアミンと二酸との間の縮合反応によって生成することが知られている。ナイロンは優れた特性を有しており、最も広く使用されているポリマーの１つである。具体的には、ナイロンは高い弾性及び耐久性を有する。そのため、ナイロン繊維は、衣服用生地、包装紙、カーペット、楽器の弦、配管、ロープ、機械部品等を含む多くの用途で使用されている。
【０００４】
一般に入手可能なナイロンポリマーとしては、例えば、ナイロン６，６、ナイロン６、ナイロン１１、ナイロン１２、ナイロン４，６、ナイロン６，１２、ナイロン６，１０等が挙げられる。これらのうち、ナイロン６，６及びナイロン６は、より一般的に使用されているポリマーである。ナイロンは、逐次重合又は連鎖重合によって製造することができる。ジアミン及び二酸又はアミノ酸からナイロンを製造する場合には逐次重合を使用し、ラクタムからナイロンを製造する場合には通常は連鎖重合を使用する。連鎖重合はモノマーから開始するため、モノマーは迅速に高分子量のポリマーを形成し、重合プロセスはより効率的となる。また、中間的な二量体、三量体及びその他のオリゴマーの形成が減少する。そのため、連鎖重合は逐次重合よりも好ましい。
【０００５】
カプロラクタムは、連鎖重合を使用してナイロン６を製造する際の原料である。通常、カプロラクタムを製造する場合には、シクロヘキサノンをヒドロキシルアミンの硫酸水素塩又は塩酸塩と反応させてシクロヘキサノンオキシムを生成する。次に、通常は濃硫酸を触媒として使用し、シクロヘキサノンオキシムをＢｅｃｋｍａｎｎ転位によって転化させてカプロラクタムを得る。通常、原料であるシクロヘキサノンは、シクロヘキサンを大気中の酸素で接触酸化させて製造し、シクロヘキサンは、ベンゼンの水素化によって得られる。
【０００６】
現在利用可能なナイロンの製造方法にはいくつかの欠点がある。オキシムのＢｅｃｋｍａｎｎ転位によってラクタムを製造する際の欠点としては、大量の塩（例えば、硫酸ナトリウム）が副生成物として生成するために処理が必要となることが挙げられる。その他の公知のラクタムの製造方法として、特許文献１には、ジニトリルからラクタムを製造する方法であって、ジニトリルを水素化してアミノニトリルを得、アミノニトリルを環化加水分解によって転化させてラクタムを得る方法が開示されている。環化加水分解のための触媒としては、酸性ゼオライト、硅酸塩及び非ゼオライト系モレキュラーシーブ等のモレキュラーシーブ、金属リン酸塩、金属酸化物又は複合金属酸化物を使用する。この方法には、環化加水分解によるアミノニトリルの転化選択性がかなり低く、大量の副生成物が生成するという欠点がある。
【０００７】
また、石油系中間体を使用してナイロンを製造することも知られている。例えば、シクロヘキサンを使用してアジピン酸及びカプロラクタムを製造する。ブタジエン及び天然ガスは、へキサメチレンジアミンを製造するための重要な原料である。また、ナイロン１２もブタジエンを原料として製造する。そのため、従来のラクタムの製造方法のほとんどでは、環境に悪影響を与えるガソリン又は石油の分解によって得られるベンゼン又はブタジエン等の炭化水素を使用している。また、これらの出発材料のコストは石油価格に応じて変化する。石油価格が将来的に上昇することが予想されているため、ナイロン価格は原油価格の上昇に応じて上昇する可能性がある。
【０００８】
従って、ナイロンを製造するための出発材料として、より持続可能であって、環境に与える影響が少ない、純粋な石油系原料以外の原料が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】欧州特許第０７４８７９７号
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、合成ガスからアミノヘキサン酸及び／又はアミノヘキサン酸エステルを製造する方法であって、
Ａ．前記合成ガスを少なくとも１種の酢酸生成細菌及び／又は水素酸化細菌と接触させてヘキサン酸を製造する工程と、
Ｂ．前記ヘキサン酸を遺伝子組み換え細胞と接触させてアミノヘキサン酸及び／又はアミノヘキサン酸エステルを製造する工程と、
を含み、
前記遺伝子組み換え細胞は、その野生型と比較して、アルカンモノオキシゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ及びω−トランスアミナーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素に関して高い活性を有することを特徴とする方法を提供する。
【００１１】
具体的には、本発明の一態様は、合成ガスからアミノヘキサン酸及び／又はアミノヘキサン酸エステルを製造する方法であって、
Ａ．前記合成ガスを、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路及び／又はエタノール−カルボキシレート発酵を実施することができる少なくとも１種の細菌と接触させてヘキサン酸を製造する工程と、
Ｂ．前記ヘキサン酸を遺伝子組み換え細胞と接触させてアミノヘキサン酸及び／又はアミノヘキサン酸エステルを製造する工程と、
を含み、
前記遺伝子組み換え細胞は、その野生型と比較して、アルカンモノオキシゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ及びω−トランスアミナーゼに関して高い活性を有することを特徴とする方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、アルカンモノオキシゲナーゼ（ＡｌｋＢＧＴ）のための発現ベクターｐＢＴ１０（Ａ）（Ｓｃｈｒｅｗｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）及びアルコールデヒドロゲナーゼＡｌｋＪのための発現ベクターＰＪ１０（Ｂ）を示す。
【図２】図２は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０１（ｐＢＴ１０）を使用したヘキサン酸からヘキサン酸メチルへの全細胞反応（水酸化）を示すグラフである（ヘキサン酸メチル、６−ヒドロキシヘキサン酸メチル（６−ヒドロキシヘキサン酸メチルエステル）及びオキソヘキサン酸メチル（６−オキソヘキサン酸メチルエステル）の総濃度を測定）。細胞集団濃度：０．６８±０．０２ｇＣＤＷＬ−１（１％（ｗ／ｖ）グルコースを含むＫＰｉ緩衝液（ｐＨ：７．４））。データは、２回の生物学的反復実験で測定。
【図３】図３は、全細胞反応における特異的活性を示すグラフである（第１の工程は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０１（ｐＢＴ１０）を使用したヘキサン酸からヘキサン酸メチルへの水酸化であり、第２の工程は、アルコール酸化工程である）。細胞集団濃度：０．６８±０．０２ｇＣＤＷＬ−１（１％（ｗ／ｖ）グルコースを含むＫＰｉ緩衝液（ｐＨ：７．４））。データは、２回の生物学的反復実験で測定。
【図４】図４は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０１（ｐＢＴ１０）を使用した６−ヒドロキシヘキサン酸メチルからオキソヘキサン酸メチルへの全細胞反応を示すグラフである（６−ヒドロキシヘキサン酸メチル（６−ヒドロキシヘキサン酸メチルエステル）及びオキソヘキサン酸メチル（６−オキソヘキサン酸メチルエステル）の総濃度を測定）。細胞集団濃度：０．８６ｇＣＤＷＬ−１（１％（ｗ／ｖ）グルコースを含むＫＰｉ緩衝液（ｐＨ：７．４））。データは、２回の生物学的反復実験で測定。
【図５】図５は、アルコール酸化工程（６−ヒドロキシヘキサン酸メチル（６−ヒドロキシヘキサン酸メチルエステル）及びオキソヘキサン酸メチル（６−オキソヘキサン酸メチルエステル））の全細胞反応における特異的活性を示すグラフである。細胞集団濃度：０．８６ｇＣＤＷＬ−１（１％（ｗ／ｖ）グルコースを含むＫＰｉ緩衝液（ｐＨ：７．４））。データは、２回の生物学的反復実験で測定。
【図６】図６は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０１（ｐＪ１０）を使用した６−ヒドロキシヘキサン酸メチルからオキソヘキサン酸メチルへの全細胞反応を示すグラフである（６−ヒドロキシヘキサン酸メチル（６−ヒドロキシヘキサン酸メチルエステル）及びオキソヘキサン酸メチル（６−オキソヘキサン酸メチルエステル）の総濃度を測定）。細胞集団濃度：０．９１ｇＣＤＷＬ−１（１％（ｗ／ｖ）グルコースを含むＫＰｉ緩衝液（ｐＨ：７．４））。データは、２回の生物学的反復実験で測定。
【図７】図７は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０１（ｐＪ１０）を使用した６−ヒドロキシヘキサン酸メチルからオキソヘキサン酸メチルへの水酸化の全細胞反応における特異的活性を示すグラフである。細胞集団濃度：０．９１ｇＣＤＷＬ−１（１％（ｗ／ｖ）グルコースを含むＫＰｉ緩衝液（ｐＨ：７．４））。データは、２回の生物学的反復実験で測定。
【図８】図８は、ａｌｋＢＧＴＳの増幅のためのテンプレートとして使用したプラスミドｐＧＥｃ４７を示す。
【図９】図９は、使用したプライマー及び得られたＰＣＲ産物ａｌｋＢＦＧ及びａｌｋＴを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
通常、生成物の収率を最適化すると共にタールの生成を回避するために、ガス化プロセスによって得られた合成ガスの一部を最初に処理する。合成ガス中の望ましくないタール及びＣＯの分解は、石灰及び／又はドロマイトを使用して行うことができる。このようなプロセスは、例えば、Ｒｅｅｄ，１９８１に詳細に記載されている。
【００１４】
合成ガスは、少なくとも１種の酢酸生成細菌及び／又は水素酸化細菌の存在下においてヘキサン酸に転化させることができる。この場合、公知の任意の方法を使用することができる。ヘキサン酸は、少なくとも１種の原核生物によって合成ガスから製造することができる。具体的には、原核生物は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ等のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属菌；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ等のＣｌｏｓｔｒｉｄｉａ属菌；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ等のＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ属菌；Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ及びＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ等のＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属菌；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅａｖｏｒａｎｓ等のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属菌；Ｄｅｌｆｔｉａ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ等のＤｅｌｆｔｉａ属菌；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ等のＢａｃｉｌｌｕｓ属菌；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ等のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属菌；及びＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ等のＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属菌からなる群から選択されてもよい。
【００１５】
あるいは、ヘキサン酸は、少なくとも１種の真核生物によって合成ガスから製造することができる。本発明の方法において使用する真核生物は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ等のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属菌；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属菌；Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ等のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属菌；Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ等のＹａｒｒｏｗｉａ属菌；Ｉｓｓａｔｈｅｎｋｉａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ等のＩｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ属菌；Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉｉ等のＤｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ属菌；Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｏｉｎｉｖｏｒａｎｓ等のＡｒｘｕｌａ属菌；及びＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ等のＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属菌からなる群から選択されてもよい。
【００１６】
より具体的には、ヘキサン酸は、Ｓｔｅｉｎｂｕｓｃｈ，２０１１、Ｚｈａｎｇ，２０１３、ｖａｎ  Ｅｅｒｔｅｎ−Ｊａｎｓｅｎ，Ｍ．Ｃ．Ａ．Ａ，２０１３、Ｄｉｎｇ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，２０１０、Ｂａｒｋｅｒ  Ｈ．Ａ．，１９４９、Ｓｔａｄｔｍａｎ  Ｅ．Ｒ．，１９５０、Ｂｏｒｎｓｔｅｉｎ  Ｂ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，１９４８等に開示されている方法によって合成ガスから製造することができる。さらに具体的には、ヘキサン酸は、少なくともＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉの存在下において合成ガスから製造することができる。
【００１７】
本願明細書において使用する「酢酸生成細菌」という用語は、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路によってＣＯ、ＣＯ２及び／又は水素を酢酸塩に転化させることができる微生物を意味する。これらの微生物には、野生型ではＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を有していないが、遺伝子組み換えによってＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を有するようになる微生物も含まれる。そのような微生物としては、例えば、Ｅ．  ｃｏｌｉ細胞が挙げられる。また、これらの微生物は、カルボキシ栄養細菌（ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ）としても知られている。現在、２１種類の酢酸生成細菌が知られており（Ｄｒａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）、クロストリジウム属細菌も含まれる場合がある（Ｄｒａｋｅ  ＆  Ｋｕｓｅｌ，２００５）。これらの細菌は、炭素源として二酸化炭素又は一酸化炭素を使用し、エネルギー源として水素を使用することができる（Ｗｏｏｄ，１９９１）。また、アルコール、アルデヒド、カルボン酸及び多くのヘキソースも炭素源として使用することができる（Ｄｒａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。酢酸塩を生成する還元経路は、アセチル−ＣｏＡ又はＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路と呼ばれる。酢酸生成細菌は、Ａｃｅｔｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ  ｎｏｔｅｒａ（ＡＴＣＣ  ３５１９９）、Ａｃｅｔｏｎｅｍａ  ｌｏｎｇｕｍ（ＤＳＭ  ６５４０）、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃａｒｂｉｎｏｌｉｃｕｍ（ＤＳＭ  ２９２５）、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍａｌｉｃｕｍ（ＤＳＭ  ４１３２）、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｎｏ．４４６（Ｍｏｒｉｎａｇａ  ｅｔ  ａｌ．、１９９０、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、Ｖｏｌ．１４、ｐ．１８７−１９４）、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｗｉｅｒｉｎｇａｅ（ＤＳＭ  １９１１）、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ（ＤＳＭ  １０３０）、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ  ｂａｃｃｈｉ（ＤＳＭ  ２２１１２）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ（ＤＳＭ  ４３０４）、Ｂｌａｕｔｉａ  ｐｒｏｄｕｃｔａ（ＤＳＭ  ２９５０、（旧称：Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｕｓ）（旧称：Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｕｓ））、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（ＤＳＭ  ３４６８）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｉｃｕｍ（ＤＳＭ  １４９６）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ（ＤＳＭ  １００６１、ＤＳＭ  １９６３０及びＤＳＭ  ２３６９３）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ（ＤＳＭ  １５２４３）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｏｓｋａｔｉｉ（ＡＴＣＣ  ｎｏ．ＰＴＡ−１０５２２）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｒａｋｅｉ（ＡＴＣＣ  ＢＡ−６２３）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ（ＤＳＭ  ９２）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｇｌｙｃｏｌｉｃｕｍ（ＤＳＭ  １２８８）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ（ＤＳＭ  １３５２８）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ  Ｃ−０１（ＡＴＣＣ  ５５９８８）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ  ＥＲＩ−２（ＡＴＣＣ  ５５３８０）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ  Ｏ−５２（ＡＴＣＣ  ５５９８９）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｍａｙｏｍｂｅｉ（ＤＳＭ  ６５３９）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｏｖｏｒａｎｓ（ＤＳＭ  １２１８２）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ（ＤＳＭ  １５２４８）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ（ＤＳＭ  ７５７）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ＡＴＣＣ  ２９７９７（Ｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．、１９８６、Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｃｏｍｍｕｎ．、Ｖｏｌ．４５、ｐ．６１−７３）、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｋｕｚｎｅｔｓｏｖｉｉ（ＤＳＭ  ６１１５）、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｂｅｚｏｉｃｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（ＤＳＭ  １４０５５）、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｍｏｓｕｍ（ＤＳＭ  ２０５４３）、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ  Ｃ２Ａ（ＤＳＭ  ２８３４）、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｓｐ．  ＨＵＣ２２−１（Ｓａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．、２００４、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔ．、Ｖｏｌ．２９、ｐ．１６０７−１６１２）、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ（ＤＳＭ  ５２１、（旧称：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃｕｍ））、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ（ＤＳＭ  １９７４）、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ  ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ（ＤＳＭ  ３２２）、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ａｅｒｉｖｏｒａｎｓ（ＤＳＭ  １３３２６）、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｏｖａｔａ（ＤＳＭ  ２６６２）、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ（ＤＳＭ  １０６６９）、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ（ＤＳＭ  ２８７５）、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｔｅｒｍｉｔｉｄａ（ＤＳＭ  ４４４０）及びＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｋｉｖｕｉ（ＤＳＭ  ２０３０、（旧称：Ａｃｅｔｏｇｅｎｉｕｍ  ｋｉｖｕｉ））からなる群から選択されてもよい。
【００１８】
より具体的には、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓのＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６２４株を使用することができる。さらに具体的には、例えば、米国特許出願公開第２００７／０２７５４４７号及び米国特許出願公開第２００８／００５７５５４号に記載されている、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓの「Ｐ７」及び「Ｐ１１」株を使用することができる。
【００１９】
また、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉも特に好適な微生物である。具体的には、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ  ＰＥＴＣ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ  ＥＲＩ２、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ  ＣＯＬ及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ  Ｏ−５２からなる群から選択される株を、合成ガスからヘキサン酸への転化に使用することができる。これらの株は、例えば、国際公開第９８／００５５８号、国際公開第００／６８４０７号、ＡＴＣＣ  ４９５８７、ＡＴＣＣ  ５５９８８及びＡＴＣＣ  ５５９８９に記載されている。
【００２０】
酢酸生成細菌は、水素酸化細菌と共に使用することができる。例えば、酢酸生成細菌と水素酸化細菌の両方を使用して合成ガスからヘキサン酸を製造することができる。あるいは、酢酸生成細菌のみを使用して合成ガスの代謝を行って合成ガスからヘキサン酸を製造することができる。あるいは、水素酸化細菌のみを上記反応に使用することができる。
【００２１】
水素酸化細菌は、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ、Ａｎａｂｅｎａ、Ａｑｕｉｆｅｘ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ、Ｄｅｒｘｉａ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｕｌｕｍ、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈａｇａ，、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｔｈｅｒｍｕｓ、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｖｉｂｒｉｏ、Ｉｄｅｏｎｅｌｌａ  ｓｐ．  Ｏ１、Ｋｙｒｐｉｄｉａ、Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ、Ｍｙｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ｏｌｉｇｏｔｒｏｐｈａ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ、Ｐｅｌｏｍｏｎａｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｉｏｃａｐｓａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ，Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ、Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ及びＷａｕｔｅｒｓｉａからなる群から選択されてもよい。
【００２２】
合成ガスからのヘキサン酸の製造では、細菌の組み合わせを使用することができる。２種以上の酢酸生成細菌を１種以上の水素酸化細菌と組み合わせて使用することができる。あるいは、２種以上の酢酸生成細菌のみを使用することができる。あるいは、２種以上の水素酸化細菌のみを使用することができる。カプロン酸とも呼ばれるヘキサン酸は、一般式：Ｃ５Ｈ１１ＣＯＯＨで表される。
【００２３】
本発明の各態様に係る方法は、前記工程Ａで得られたヘキサン酸のエステル化を行ってＣ１−Ｃ４ヘキサン酸エステルを製造する工程をさらに含むことができ、前記Ｃ１−Ｃ４ヘキサン酸エステルは前記工程Ｂにおいて前記遺伝子組み換え細胞と接触させる。エステル化では、工程Ａで得られたヘキサン酸を少なくとも１種のＣ１−Ｃ４アルコールと接触させてＣ１−Ｃ４ヘキサン酸エステルを生成する。
【００２４】
あるいは、合成ガスからのヘキサン酸の製造では、酢酸生成細菌を、ヘキサン酸を生成することができ、エタノール−カルボキシレート発酵を使用する細菌と共に使用することができる。例えば、酢酸生成細菌と水素酸化細菌の両方を使用して合成ガスからヘキサン酸を製造することができる。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉをＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉと共に使用することができる。あるいは、酢酸生成細菌のみを使用して合成ガスの代謝を行って合成ガスからヘキサン酸を製造することができる。この場合、酢酸生成細菌は、エタノール−カルボキシレート発酵経路とＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路の両方を実施することができるものであってもよい。例えば、酢酸生成細菌は、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路とエタノール−カルボキシレート発酵経路の両方を行うことができるＣ．ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓであってもよい。
【００２５】
エタノール−カルボキシレート発酵経路については、少なくともＳｅｅｄｏｒｆ，Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，２００８に詳細に記載されている。微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｃ．Ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ等からなる群から選択されてもよい。これらの微生物には、野生型ではエタノール−カルボキシレート発酵経路を有していないが、遺伝子組み換えによってエタノール−カルボキシレート発酵経路を有するようになる微生物も含まれる。具体的には、微生物はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉであってもよい。
【００２６】
例えば、本発明の各態様に係る工程Ａを実施する際に使用する細胞は、遺伝子組み換え微生物であってもよい。遺伝子組み換え細胞又は微生物は、野生型細胞又は微生物と遺伝子的に異なるものであってもよい。本発明の各態様に係る遺伝子組み換え微生物と野生型微生物との遺伝子的差異は、野生型微生物には存在していない場合がある、遺伝子組み換え微生物における完全な遺伝子、アミノ酸、ヌクレオチド等の存在であってもよい。例えば、本発明の各態様に係る遺伝子組み換え微生物は、微生物がヘキサン酸を生成することを可能とする酵素を含むことができる。野生型微生物は、本発明の遺伝子組み換え微生物と比較して、遺伝子組み換え微生物がヘキサン酸を生成することを可能とする酵素の検出可能な活性が見られないものであってもよい。本願明細書において、「遺伝子組み換え微生物」という用語は、「遺伝子組み換え細胞」という用語と同義で使用する。本発明の各態様に係る遺伝子組み換えは、微生物の細胞に対して行うことができる。
【００２７】
例えば、微生物は、Ｅ１〜Ｅ１０（ここで、Ｅ１は、アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈ）であり、Ｅ２は、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｌｄ）であり、Ｅ３は、アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ（ｔｈｌ）であり、Ｅ４は、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ｈｂｄ）であり、Ｅ５は、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ｃｒｔ）であり、Ｅ６は、ブチリル−ＣｏＡ  デヒドロゲナーゼ（ｂｃｄ）であり、Ｅ７は、電子伝達フラビンタンパク質サブユニット（ｅｔｆ）であり、Ｅ８は、補酵素Ａ転移酵素（ｃａｔ）であり、Ｅ９は、酢酸キナーゼ（ａｃｋ）であり、Ｅ１０は、ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）である）から選択される少なくとも１種の酵素を発現する野生型微生物であってもよい。具体的には、本発明の各態様に係る野生型微生物は、少なくともＥ２、Ｅ３及びＥ４を発現する微生物であってもよい。より具体的には、本発明の各態様に係る野生型微生物は、少なくともＥ４を発現する微生物であってもよい。
【００２８】
あるいは、本発明の各態様に係る微生物は、野生型微生物と比較して、Ｅ１〜Ｅ１０（ここで、Ｅ１は、アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈ）であり、Ｅ２は、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｌｄ）であり、Ｅ３は、アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ（ｔｈｌ）であり、Ｅ４は、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ｈｂｄ）であり、Ｅ５は、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ｃｒｔ）であり、Ｅ６は、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ｂｃｄ）であり、Ｅ７は、電子伝達フラビンタンパク質サブユニット（ｅｔｆ）であり、Ｅ８は、補酵素Ａ転移酵素（ｃａｔ）であり、Ｅ９は、酢酸キナーゼ（ａｃｋ）であり、Ｅ１０は、ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）である）から選択される少なくとも１種の酵素を高発現する遺伝子組み換え微生物であってもよい。具体的には、本発明の各態様に係る遺伝子組み換え微生物は、少なくともＥ２、Ｅ３及びＥ４を発現する微生物であってもよい。より具体的には、本発明の各態様に係る遺伝子組み換え微生物は、少なくともＥ４を発現する微生物であってもよい。酵素Ｅ１〜Ｅ１０は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉから単離されてもよい。
【００２９】
本発明の各態様によれば、Ｅ１はエタノールデヒドロゲナーゼであってもよい。具体的には、Ｅ１は、アルコールデヒドロゲナーゼ１、アルコールデヒドロゲナーゼ２、アルコールデヒドロゲナーゼ３、アルコールデヒドロゲナーゼＢ及びそれらの組み合わせからなる群から選択されてもよい。より具体的には、Ｅ１は、ＣＫＬ＿１０７５、ＣＫＬ＿１０７７、ＣＫＬ＿１０７８、ＣＫＬ＿１０６７、ＣＫＬ＿２９６７、ＣＫＬ＿２９７８、ＣＫＬ＿３０００、ＣＫＬ＿３４２５及びＣＫＬ＿２０６５からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも５０％の配列相同性を有していてもよい。さらに具体的には、Ｅ１は、ＣＫＬ＿１０７５、ＣＫＬ＿１０７７、ＣＫＬ＿１０７８及びＣＫＬ＿１０６７からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９４、９５、９８又は１００％の配列相同性を有していてもよい。
【００３０】
本発明の各態様によれば、Ｅ２はアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼであってもよい。具体的には、Ｅ２は、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ１、アルコールデヒドロゲナーゼ２及びそれらの組み合わせからなる群から選択されてもよい。より具体的には、Ｅ２は、ＣＫＬ＿１０７４、ＣＫＬ＿１０７６等からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも５０％の配列相同性を有していてもよい。さらに具体的には、Ｅ２は、ＣＫＬ＿１０７４及びＣＫＬ＿１０７６からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９４、９５、９８又は１００％の配列相同性を有していてもよい。
【００３１】
本発明の各態様によれば、Ｅ３は、アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼＡ１、アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼＡ２、アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼＡ３及びそれらの組み合わせからなる群から選択されてもよい。より具体的には、Ｅ３は、ＣＫＬ＿３６９６、ＣＫＬ＿３６９７、ＣＫＬ＿３６９８等からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも５０％の配列相同性を有していてもよい。さらに具体的には、Ｅ３は、ＣＫＬ＿３６９６、ＣＫＬ＿３６９７及びＣＫＬ＿３６９８からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９４、９５、９８又は１００％の配列相同性を有していてもよい。
【００３２】
本発明の各態様によれば、Ｅ４は、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ１、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ２等であってもよい。より具体的には、Ｅ４は、ポリペプチドＣＫＬ＿０４５８、ＣＫＬ＿２７９５等に対して少なくとも５０％の配列相同性を有していてもよい。さらに具体的には、Ｅ４は、ポリペプチドＣＫＬ＿０４５８又はＣＫＬ＿２７９５に対して少なくとも５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９４、９５、９８又は１００％の配列相同性を有していてもよい。
【００３３】
本発明の各態様によれば、Ｅ５は、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ１、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ２又はそれらの組み合わせであってもよい。より具体的には、Ｅ５は、ＣＫＬ＿０４５４、ＣＫＬ＿２５２７等からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも５０％の配列相同性を有していてもよい。さらに具体的には、Ｅ５は、ＣＫＬ＿０４５４及びＣＫＬ＿２５２７からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９４、９５、９８又は１００％の配列相同性を有していてもよい。
【００３４】
本発明の各態様によれば、Ｅ６は、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ１、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ２等からなる群から選択されてもよい。より具体的には、Ｅ６は、ＣＫＬ＿０４５５、ＣＫＬ＿０６３３等からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも５０％の配列相同性を有していてもよい。さらに具体的には、Ｅ６は、ＣＫＬ＿０４５５及びＣＫＬ＿０６３３からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９４、９５、９８又は１００％の配列相同性を有していてもよい。
【００３５】
本発明の各態様によれば、Ｅ７は、電子伝達フラビンタンパク質αサブユニット１、電子伝達フラビンタンパク質αサブユニット２、電子伝達フラビンタンパク質βサブユニット１及び電子伝達フラビンタンパク質βサブユニット２からなる群から選択されてもよい。具体的には、Ｅ７は、ＣＫＬ＿３５１６、ＣＫＬ＿３５１７、ＣＫＬ＿０４５６、ＣＫＬ＿０４５７等からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも５０％の配列相同性を有していてもよい。さらに具体的には、Ｅ７は、ＣＫＬ＿３５１６、ＣＫＬ＿３５１７、ＣＫＬ＿０４５６及びＣＫＬ＿０４５７からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９４、９５、９８又は１００％の配列相同性を有していてもよい。
【００３６】
本発明の各態様によれば、Ｅ８は補酵素トランスフェラーゼ（ｃａｔ）であってもよい。具体的には、Ｅ８は、ブチリル−ＣｏＡ：酢酸ＣｏＡトランスフェラーゼ、スクシニル−ＣｏＡ：補酵素Ａ転移酵素、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ：補酵素Ａ転移酵素等からなる群から選択されてもよい。より具体的には、Ｅ８は、ＣＫＬ＿３５９５、ＣＫＬ＿３０１６、ＣＫＬ＿３０１８等からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも５０％の配列相同性を有していてもよい。さらに具体的には、Ｅ８は、ＣＫＬ＿３５９５、ＣＫＬ＿３０１６及びＣＫＬ＿３０１８からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９４、９５、９８又は１００％の配列相同性を有していてもよい。
【００３７】
本発明の各態様によれば、Ｅ９は酢酸キナーゼＡ（ａｃｋ  Ａ）であってもよい。具体的には、Ｅ９は、ＣＫＬ＿１３９１等のポリペプチド配列に対して少なくとも５０％の配列相同性を有していてもよい。さらに具体的には、Ｅ９は、ＣＫＬ＿１３９１のポリペプチドに対して少なくとも５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９４、９５、９８又は１００％の配列相同性を有していてもよい。
【００３８】
本発明の各態様によれば、Ｅ１０はホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）であってもよい。具体的には、Ｅ１０は、ＣＫＬ＿１３９０等のポリペプチド配列に対して少なくとも５０％の配列相同性を有していてもよい。さらに具体的には、Ｅ１０は、ＣＫＬ＿１３９０のポリペプチドに対して少なくとも５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９４、９５、９８又は１００％の配列相同性を有していてもよい。
【００３９】
例えば、野生型又は遺伝子組み換え微生物はＥ１〜Ｅ１０を発現する。具体的には、本発明の各態様に係る微生物は、野生型微生物と比較して、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７、Ｅ８、Ｅ９、Ｅ１０又はそれらの組み合わせを高発現する微生物であってもよい。例えば、遺伝子組み換え微生物は、野生型微生物と比較して、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７、Ｅ８、Ｅ９及びＥ１０を高発現する。より具体的には、微生物には任意の酵素Ｅ１〜Ｅ１０の組み合わせが存在し、少なくとも１種のカルボン酸を生成することができるものであってもよい。例えば、本発明の各態様において使用する遺伝子組み換え微生物は、微生物が少なくとも１種又は２又は３種のカルボン酸を（同時に）生成することを可能とする任意の酵素Ｅ１〜Ｅ１０の組み合わせを含むことができる。例えば、微生物は、ヘキサン酸、酪酸及び／又は酢酸を同時に生成することができるものであってもよい。同様に、微生物は、１種又は２種以上のカルボン酸を生成することを可能とする酵素Ｅ１〜Ｅ１０の組み合わせを発現するように遺伝子組み換えされていてもよい。いずれの場合にも、微生物は野生型又は遺伝子組み換え微生物のいずれであってもよい。
【００４０】
例えば、本発明の各態様に係る遺伝子組み換え微生物は、野生型微生物と比較して、ヒドロゲナーゼ成熟化タンパク質及び／又は電子伝達複合タンパク質を高発現する。具体的には、ヒドロゲナーゼ成熟化タンパク質（ｈｙｄ）は、ｈｙｄＥ、ｈｙｄＦ及びｈｙｄＧからなる群から選択されてもよい。より具体的には、ヒドロゲナーゼ成熟化タンパク質（ｈｙｄ）は、ＣＫＬ＿０６０５、ＣＫＬ＿２３３０、ＣＫＬ＿３８２９等からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも５０％の配列相同性を有していてもよい。さらに具体的には、本発明の各態様に係るヒドロゲナーゼ成熟化タンパク質（ｈｙｄ）は、ＣＫＬ＿０６０５、ＣＫＬ＿２３３０及びＣＫＬ＿３８２９からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９４、９５、９８又は１００％の配列相同性を有していてもよい。
【００４１】
本願明細書において、データベースコードは、特記しない限りにおいて、ＮＣＢＩデータベースから入手可能な配列、より具体的には２０１４年６月１２日のオンラインバージョンを意味し、配列がヌクレオチド配列である場合には、ヌクレオチド配列を翻訳することによって得られたポリペプチド配列を含む。
【００４２】
本発明の各態様に係る方法は、前記工程Ａで得られたヘキサン酸のエステル化を行ってＣ１−Ｃ４ヘキサン酸エステルを製造する工程をさらに含むことができ、前記Ｃ１−Ｃ４ヘキサン酸エステルは前記工程Ｂにおいて前記遺伝子組み換え細胞と接触させる。
【００４３】
例えば、エステル化は化学的プロセスによって行うことができる。公知の任意の化学反応を使用してヘキサン酸をＣ１−Ｃ４アルコールヘキサン酸エステルに転化させることができる。より具体的には、ヘキサン酸をアルコールと反応させる。ヘキサン酸を少なくとも１種の短鎖アルコールと接触させてヘキサン酸エステルを生成することができる。具体的には、短鎖アルコールはＣ１−Ｃ４アルコールであってもよい。短鎖アルコールは、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール及び／又はブチルアルコールであってもよい。具体的には、アルコールは、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール及び／又はブチルアルコールからなる群から選択され、ヘキサン酸メチル、エチル、プロピル又はブチルを生成することができる。この反応は、少なくとも１種の触媒の存在下で実施することができる。触媒は、通常は、スルホン酸等の酸性触媒、水酸化アルカリ又はアルカリアルコラート等の塩基、金属酸化物又は金属アルキレートである。具体的には、ヘキサン酸を代謝させてＣ１−Ｃ４アルコールヘキサン酸エステルを生成することができる。触媒は、ＺｒＯＣｌ２・８Ｈ２Ｏであってもよい。
【００４４】
例えば、ＺｒＯＣｌ２・８Ｈ２Ｏの存在下でヘキサン酸をメタノールと反応させてヘキサン酸メチルを生成する。
【００４５】
本発明の各態様に係る方法は、合成ガスから製造されたヘキサン酸を、少なくとも１種のＣ１−Ｃ４アルコールと接触させる前に抽出する工程を含むことができる。ヘキサン酸は、公知の任意の方法を使用して抽出することができる。例えば、ヘキサン酸の抽出方法は、Ｂｙｏｕｎｇ，Ｓ．Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３のセクション２．３に記載されている。別の抽出方法としては、Ｋｉｅｕｎ  Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１３の「Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｍｏｄｅｌ」に記載されている方法が挙げられる。
【００４６】
あるいは、エステル化は生化学的プロセスによって行うことができる。この場合、少なくとも１種の酵素によってエステル化プロセスを促進することができる。エステル化のための酵素は、チオエステラーゼ酵素、アシル−ＣｏＡシンテターゼ酵素、エステルシンターゼ酵素及びリパーゼからなる群から選択されてもよい。これらの酵素の少なくとも１種を、本発明の方法の工程Ａの細菌によって発現させてもよい。例えば、酢酸生成細菌及び／又は水素酸化細菌が、ヘキサン酸のエステル化に使用することができるエステル化酵素を過剰発現してもよい。あるいは、エステル化酵素を発現する細胞を本発明の方法の工程Ａの後に使用してヘキサン酸をヘキサン酸エステルにエステル化してもよい。
【００４７】
本発明の方法の工程Ａで得られたヘキサン酸は、アミノヘキサン酸及び／又はアミノヘキサン酸エステルに直接的に転化させることができる。あるいは、本発明の方法の工程Ａで得られたヘキサン酸は、化学的又は生化学的にヘキサン酸エステルにエステル化させてもよい。得られたヘキサン酸エステルを、本発明の方法の工程Ｂで使用する遺伝子組み換え細胞と接触させる。例えば、化学的プロセスと生化学的プロセスを順次又は同時に組み合わせてヘキサン酸をエステル化する。
【００４８】
次に、Ｃ１−Ｃ４アルコールヘキサン酸エステルを遺伝子組み換え細胞と接触させてアミノヘキサン酸及び／又はアミノヘキサン酸エステルを生成する。遺伝子組み換え細胞は、その野生型と比較して、アルカンモノオキシゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ及びω−トランスアミナーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素に関して高い活性を有する。
【００４９】
本発明の各態様に係る細胞は、その野生型と比較して、Ｃ１−Ｃ４アルコールヘキサン酸エステルからより多くのアミノヘキサン酸及び／又はアミノヘキサン酸エステルを生成することができるように遺伝子組み換えされている。そのような細胞を使用して、Ｃ１−Ｃ４アルコールヘキサン酸エステルからの発酵によってアミノヘキサン酸及び／又はアミノヘキサン酸エステルを生成することができる。
【００５０】
「その野生型と比較して、Ｃ１−Ｃ４アルコールヘキサン酸エステルからより多くのアミノヘキサン酸及び／又はアミノヘキサン酸エステルを生成することができる」とは、遺伝子組み換え細胞の野生型細胞がアミノヘキサン酸及び／又はアミノヘキサン酸エステルを生成することができない場合も含む。また、遺伝子組み換え細胞の野生型細胞がアミノヘキサン酸及び／又はアミノヘキサン酸エステルを少なくとも検出可能な量で生成することができない場合であって、野生型細胞の遺伝子組み換えによって、アミノヘキサン酸及び／又はアミノヘキサン酸エステルを検出可能な量で生成することができる、本発明の方法で使用する細胞が得られる場合も含む。
【００５１】
本願明細書において細胞に関連して使用する「野生型」という用語は、天然に見られる型であるゲノムを有する細胞を意味する。「野生型」という用語は、細胞全体及び各遺伝子の両方に使用する。従って、「野生型」という用語は、遺伝子組み換え法を使用して遺伝子配列が少なくとも部分的に人為的に変更された細胞又は遺伝子には適用されない。
【００５２】
具体的には、遺伝子組み換え細胞は、所定の時間、例えば２時間、特に８時間、特に２４時間以内に、野生型細胞と比較して、少なくとも２倍、特に少なくとも１０倍、特に少なくとも１００倍、１，０００倍又は１０，０００倍のアミノヘキサン酸及び／又はアミノヘキサン酸エステルを生成するように遺伝子組み換えされていてもよい。生成物の生成量の増加は、例えば、本発明の方法において使用する細胞及びその野生型細胞を、適当な培地内において、同一の条件（同一の細胞密度、栄養培地及び培養条件）で所定の時間にわたって培養し、培地中における目的生成物（アミノヘキサン酸及び／又はアミノヘキサン酸エステル）の量を測定することによって測定することができる。
【００５３】
本発明の方法において使用する細胞は、原核生物又は真核生物であってもよい。本発明の方法において使用する細胞は、哺乳動物の細胞（ヒト細胞又は非ヒト細胞等）、植物細胞又は酵母、菌類又は細菌等の微生物であってもよい。微生物は細菌であってもよい。より具体的には、微生物は酵母であってもよい。
【００５４】
適当な細菌、酵母又は菌類としては、細菌、酵母又は菌類株としてＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ａｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ））に寄託されている細菌、酵母又は菌類が挙げられる。本発明の方法において使用することができる適当な細菌としては、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｓｍｚ．ｄｅ／ｓｐｅｃｉｅｓ／ｂａｃｔｅｒｉａ．ｈｔｍに記載されている属に属する細菌が挙げられる。本発明の方法において使用することができる適当な酵母としては、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｓｍｚ．ｄｅ／ｓｐｅｃｉｅｓ／ｙｅａｓｔｓ．ｈｔｍに記載されている属に属する酵母が挙げられる。本発明の方法において使用することができる適当な菌類としては、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｓｍｚ．ｄｅ／ｓｐｅｃｉｅｓ／ｆｕｎｇｉ．ｈｔｍに記載されている属に属する菌類が挙げられる。
【００５５】
具体的には、本発明の方法において使用することができる遺伝子組み換えされていてもよい細胞は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属から選択されてもよい。より具体的には、本発明の方法において使用することができる細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａからなる群から選択されてもよい。さらに具体的には、本発明の方法において使用することができる細胞はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉであってもよい。Ｅ．ｃｏｌｉとしては、公知の任意の株を使用することができる。特に、ＪＭ１０１株を使用することができる。
【００５６】
具体的には、本発明の方法に係る遺伝子組み換え細胞は、その野生型と比較して、以下の酵素の少なくとも１種に関して高い活性を示すものであってもよい：
ｉ）カルボン酸又はカルボン酸エステルから対応するω−ヒドロキシカルボン酸及び／又はω−ヒドロキシカルボン酸エステルへの転化を促進するアルカンモノオキシゲナーゼ；
ｉｉ）ω−ヒドロキシカルボン酸及び／又はω−ヒドロキシカルボン酸エステルから対応するω−オキソカルボン酸又はω−オキソカルボン酸エステルへの転化を促進するアルコールデヒドロゲナーゼ；及び／又は
ｉｉｉ）ω−オキソカルボン酸又はω−オキソカルボン酸エステルから対応するω−アミノカルボン酸又はω−アミノカルボン酸エステルへの転化を促進するω−トランスアミナーゼ。
【００５７】
本願明細書において使用する「酵素に関して高い活性を示す」とは、当該酵素に関して高い細胞内活性を示すことを意味する。基本的に、酵素活性は、強力なプロモーターを使用するか、高い活性を有する酵素をコードする遺伝子又は対立遺伝子を使用するか、これらの手段を組み合わせることにより、酵素をコードする遺伝子配列のコピー数を増加させることによって高めることができる。本発明に係る方法に使用する遺伝子組み換え細胞は、例えば、所望の遺伝子、所望の遺伝子の対立遺伝子又はその一部を含むベクター及び遺伝子の発現を可能とするベクターを使用した形質転換、形質導入、接合又はこれらの組み合わせによって得ることができる。異種発現は、遺伝子又は対立遺伝子を、細胞の染色体又は染色体外複製ベクターに導入することによって達成される。
【００５８】
本発明の各態様に係る細胞は、公知の任意の方法によって遺伝子的に形質転換する。具体的には、細胞は、国際公開第２００９／０７７４６１号に開示されている方法によって得ることができる。
【００５９】
本願明細書において、「遺伝子組み換え細胞は、その野生型と比較して、酵素に関して高い活性を示す」とは、各酵素の活性が、少なくとも２倍、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１，０００倍又は少なくとも１０，０００倍高められていることを意味する。
【００６０】
本発明の各態様によれば、細胞は、アルカンモノヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、ω−トランスアミナーゼ又はそれらの組み合わせに関して高い活性を有していてもよい。具体的には、細胞は、アルカンモノヒドロゲナーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼ又はアルカンモノヒドロゲナーゼ及びω−トランスアミナーゼ又はアルコールデヒドロゲナーゼ及びω−トランスアミナーゼに関して高い活性を有していてもよい。より具体的には、細胞は、アルカンモノヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ及びω−トランスアミナーゼに関して高い活性を有していてもよい。
【００６１】
アルカンモノオキシゲナーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＧＰＯ１のＡｌｋＢＧＴ遺伝子によってコードされていてもよい。ＡｌｋＢＧＴ遺伝子配列の単離については、例えば、ｖａｎ  Ｂｅｉｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２に記載されている。また、チトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ、特にＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ等のＣａｎｄｉｄａ又はヒヨコマメ（Ｃｉｃｅｒ  ａｒｉｅｔｉｎｕｍ  Ｌ．）等の植物に由来するチトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼをアルカンモノオキシゲナーゼとして使用することもできる。例えば、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓに由来する適当なチトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼの遺伝子配列は国際公開第００／２０５６６号に開示されており、ヒヨコマメに由来する適当なチトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼの遺伝子配列はＢａｒｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０００に記載されている。ＡｌｋＢ遺伝子のその他の同族体は、ｖａｎ  Ｂｅｉｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３に記載されている。キシレンモノオキシゲナーゼのための適当な遺伝子としては、例えば、ｘｙｌＭ又はｘｙｌＡ遺伝子が挙げられ、これらの遺伝子を含むプラスミドはＧＥＮＢＡＮＫに寄託されている（受託番号Ｍ３７４８０）。アルカンモノオキシゲナーゼをコードする遺伝子配列はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓに由来する遺伝子配列であってもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（表１）で表される配列を含むか、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で表される配列であってもよい。
【００６２】
アルコールデヒドロゲナーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＧＰＯ１、Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ  ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ及びＲｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓのＡｌｋＪ遺伝子（ＥＣ  １．１．９９−２）によってコードされていてもよい。具体的には、ＡｌｋＪ遺伝子はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓによってコードされていてもよい。ＡｌｋＪ遺伝子によってコードされたアルコールデヒドロゲナーゼの遺伝子配列は、例えば、ＫＥＧＧ遺伝子データバンクに寄託されている。ＡｌｋＪ遺伝子をコードする遺伝子配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２（表１）で表される配列を含むか、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で表される配列であってもよい。
【００６３】
ω−トランスアミナーゼは、米国特許出願公開第２００７／００９２９５７号の配列番号２４８、２５０、２５２及び２５４によって特徴付けられるω−トランスアミナーゼから選択されてもよい。
【００６４】
あるいは、ω−トランスアミナーゼは植物から単離してもよい。植物に由来するω−トランスアミナーゼは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ、Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ、Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ、Ｌｏｔｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ、Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ、Ｔｒａｅｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ、Ｚｅａ  ｍａｙｓ、Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａ、Ａｒｕｍ  ｍａｃｕｌａｔｕｍ、Ｍｅｒｃｕｒｉａｌｉｓ  ｐｅｒｅｎｎｉｓ及びＵｒｔｉｃａ  ｄｉｏｉｃａからなる群から選択される植物に由来するものであってもよい。
【００６５】
具体的には、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍ  ＤＳＭ３０１９１に由来するω−トランスアミナーゼＣＶ２０２５を本発明の方法において使用する遺伝子組み換え細胞に使用することができる。より具体的には、ω−トランスアミナーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３（表１）の遺伝子配列によってコードされたＣｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍ  ＤＳＭ３０１９１（Ｋａｕｌｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）に由来するω−トランスアミナーゼである。
【００６６】
【表１】
2017516470.tif 000003
【００６７】
【表２】
2017516470.tif 000004
【００６８】
【表３】
2017516470.tif 000005
【００６９】
【表４】
2017516470.tif 000006
【００７０】
【表５】
2017516470.tif 000007
【００７１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、２及び３で表される配列に対して、９０％、９５％、９９％又は１００％の配列相同性を有する核酸によってコードされた酵素が本発明の方法に適している。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３に対するヌクレオチド相同性は、公知の方法によって決定することができる。通常、特殊な要件を考慮して、アルゴリズムを有する特別なコンピュータプログラムを使用する。相同性を決定するために使用することができる方法では、比較する配列間の最大の一致を判定する。相同性を決定するためのコンピュータプログラムは、例えば、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｏｙ，Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，１９８４）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）等のＧＣＧソフトウェアパッケージを含むことができる。ＢＬＡＳＴプログラムは、全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ））及びその他の供給元（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）から入手することができる。
【００７２】
また、周知のＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用してヌクレオチド相同性を決定することもできる。
【００７３】
ヌクレオチド比較のためのパラメータは、以下のパラメータを含むことができる。
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０
比較マトリックス
マッチ＝＋１０
ミスマッチ＝０
ギャップペナルティ＝５０
ギャップ長ペナルティ＝３
【００７４】
また、ＧＡＰプログラムも上記パラメータとの使用に適している。これらのパラメータは、通常はヌクレオチド配列比較におけるデフォルトパラメータである。
【００７５】
また、β−Ａｌａ：ピルビン酸トランスアミナーゼのサブグループに由来する酵素も適している。β−Ａｌａ：ピルビン酸トランスアミナーゼのサブグループとしては、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  Ｗ６１９（ｇｉ：１１９８６０７０７，ｇｉ：１１９８５５８５７，ｇｉ：１１９８５６２７８）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０（ｇｉ：２４９８４３９１）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡ０１（ｇｉ：１５５９５３３０，ｇｉ：１５６００５０６，ｇｉ：１５５９５４１８，ｇｉ：９９５１０７２）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）（ｇｉ：３３１９７３１）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＭＡ  ４６８０（ｇｉ：２９８３１０９４，ｇｉ：２９８２９１５４）及びＣｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍ  ＡＴＣＣ  １２４７２（ｇｉ  ３４１０２７４７）に由来するトランスアミナーゼが挙げられる。本願明細書において、データベースコードは、特記しない限りにおいて、ＮＣＢＩデータベースから入手可能な配列、より具体的には２０１４年２月２０日のオンラインバージョンを意味し、配列がヌクレオチド配列である場合には、ヌクレオチド配列を翻訳することによって得られたポリペプチド配列を含む。
【００７６】
本発明の各態様に係る方法は、アミノヘキサン酸エステルをアミノヘキサン酸に転化させる工程をさらに含むことができる。具体的には、ω−アミノヘキサン酸エステルを対応するω−アミノヘキサン酸に転化させる。本発明の方法に係る遺伝子組み換え細胞は、ω−アミノヘキサン酸エステルから対応するω−アミノヘキサン酸への転化を触媒する酵素の活性を高めることができるものであってもよく、酵素は、細胞によって分泌されるエステラーゼであってもよい。細胞によるエステラーゼの分泌には、エステル結合が細胞外においてのみ切断されるという利点がある。ω−アミノヘキサン酸エステルの膜透過性はω−アミノヘキサン酸よりも高いため、ω−アミノヘキサン酸エステルは細胞から細胞を取り囲む培養液に入ることができる。細胞外のエステラーゼは、ω−アミノヘキサン酸エステルからω−アミノヘキサン酸への転化をより効率的に触媒する。
【００７７】
具体的には、使用するエステラーゼはリパーゼであってもよい。例えば、適当なリパーゼとしては、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＨＵ３８０（ＡＣＣ  Ｃｏｄｅ  Ｑ７６Ｄ２６、Ｋｏｊｉｍａ  ａｎｄ  Ｓｈｉｍｉｚｕ，２００３）に由来するリパーゼＬｉｐＡが挙げられる。エステラーゼは確実に細胞から分泌されるように、エステラーゼには、分泌を行わせる対応するシグナル配列を組み込むことができる。例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＨＵ３８０に由来するリパーゼＬｉｐＡをＥ．ｃｏｌｉ内において過剰発現させる場合には、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの細胞表面に自然に生じるエステラーゼ（ＥｓｔＡ）に由来するシグナル配列を組み込むことが有利である（Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。その他の適当な酵素としては、Ｃ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａ、Ｍ．ｍｉｅｈｅｉ及びＰ．ｃｅｐａｃｉａに由来するリパーゼが挙げられる（Ｖａｙｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。
【００７８】
あるいは、けん化（水酸化物（水酸化ナトリウム等）の水溶液を使用したω−アミノヘキサン酸エステルの加水分解）によって分泌されたω−アミノヘキサン酸エステルを開裂させてω−アミノヘキサン酸を得ることもできる。
【００７９】
例えば、ω−アミノヘキサン酸をラクタムに転化させることができる。ラクタムは、ポリアミドを製造するために使用することができる環状アミドである。具体的には、ラクタムの開環重合によってナイロンを製造することができる。より具体的には、６−ヘキサノラクタムを重合させてナイロン−６を製造することができる。
【００８０】
ω−アミノヘキサン酸、ω−アミノヘキサン酸エステル又はω−アミノヘキサン酸に由来するラクタムの製造では、以下の工程を実施する。
Ｉ）本発明の各態様に係る細胞を、細胞がω−アミノヘキサン酸、ω−アミノヘキサン酸エステル及び／又はω−アミノヘキサン酸又はＣ１−Ｃ４ヘキサン酸エステルに由来するラクタムを生成することができる条件下において、Ｃ１−Ｃ４ヘキサン酸エステルを含む培地又はＣ１−Ｃ４ヘキサン酸エステルを含む有機相に隣接する培地と接触させる；及び／又は
ＩＩ）得られたω−アミノヘキサン酸、ω−アミノヘキサン酸エステル及び／又はω−アミノヘキサン酸に由来するラクタムを単離する。
【００８１】
本発明の方法において使用する遺伝子組み換え細胞は、ω−アミノヘキサン酸又はω−アミノヘキサン酸に由来するラクタムを製造するために、回分処理又は反復流加培養処理によって連続的又は非連続的に培養液を接触させる（培養する）ことができる。半連続処理も使用することができる（英国特許出願公開第１００９３７０Ａ号を参照）。Ｃｈｍｉｅｌ’ｓ  ｔｅｘｔｂｏｏｋ，１９９１又はＳｔｏｒｈａｓ  １９９４に公知の培養方法が記載されている
【００８２】
使用する培地は、各株に関する要件を適切に満たしていなければならない。様々な微生物に使用する培地については、「Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」に記載されている。
【００８３】
窒素源としては、ペプトン等の有機含窒素化合物、酵母抽出物、肉抽出物、麦芽抽出物、コーンスティープリカー、大豆粉、尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウム等の無機化合物を使用することができる。これらの窒素源は、１種単独又は混合物として使用することができる。
【００８４】
例えば、本発明の各態様において、少なくともω−アミノヘキサン酸、ω−アミノヘキサン酸エステル及び／又はω−アミノヘキサン酸に由来するラクタムを生成する際に、工程Ｉ）において使用する培地は、ω−オキソヘキサン酸及び／又はω−オキソヘキサン酸エステルから対応するω−アミノヘキサン酸及び／又はω−アミノヘキサン酸エステルへのトランスアミナーゼ触媒転化においてアミン供与体として機能するアミノ基供与体（例えば、アンモニア又はアンモニウムイオン又はアミノ酸（アラニン又はアスパラギン酸塩）を含む。
【００８５】
リン源としては、リン酸、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム及び対応するナトリウム含有塩を使用することができる。培地は、増殖に必要な金属の塩（例えば、硫酸マグネシウム及び／又は硫酸鉄）をさらに含むことができる。上述した物質に加えて、増殖に必須の物質、例えば、アミノ酸及び／又はビタミンを使用することもできる。また、適当な前駆体を培地に添加することもできる。上述した物質は、培地に同時に添加するか、培養時に適当な方法で添加することができる。
【００８６】
培養物のｐＨを制御するために、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア及びアンモニア水等の塩基性化合物又はリン酸又は硫酸等の酸性化合物を適当な方法で使用することができる。発泡を制御するために消泡剤（例えば、脂肪酸ポリグリコールエステル）を使用することができる。適当な抗生物質を培地に添加することによってプラスミド安定性を維持することができる。好気性条件を維持するために、酸素又は含酸素気体混合物（空気等）を培養物に導入することができる。培養物の温度は、２０〜４５℃又は２５〜４０℃である。
【００８７】
例えば、ω−アミノヘキサン酸、ω−アミノヘキサン酸エステル及び／又はω−アミノヘキサン酸に由来するラクタムを製造するための本発明に係る方法では、Ｅ．ｃｏｌｉに由来する遺伝子組み換え細胞を、アンピシリン、クロラムフェニコール及びカナマイシンを添加した鉱物塩培地において使用する（Ｒｉｅｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。
【００８８】
例えば、本発明に係る方法では、細胞集団（ｂｉｏｍａｓｓ）を形成するために、細胞をＣ１−Ｃ４ヘキサン酸エステルを含まない培養液内において培養する。細胞集団が得られた後に、Ｃ１−Ｃ４ヘキサン酸エステルを培養液に添加及び／又は細胞をＣ１−Ｃ４ヘキサン酸エステルを含む新たな培養液に接触させる。ω−アミノヘキサン酸、ω−アミノヘキサン酸エステル及び／又はω−アミノヘキサン酸に由来するラクタムの製造時におけるＣ１−Ｃ４ヘキサン酸エステルの量は、１〜２００ｇ／Ｌ、特に２０〜２００ｇ／Ｌである。
【００８９】
本発明の一実施形態によれば、本発明に係る方法は、水相及び有機相を含む二相系において実施する。工程Ｉ）における遺伝子組み換え細胞によるω−アミノヘキサン酸、ω−アミノヘキサン酸エステル又はω−アミノヘキサン酸に由来するラクタムの生成は水相において生じる。生成したω−アミノヘキサン酸、ω−アミノヘキサン酸エステル及び／又はω−アミノヘキサン酸に由来するラクタムは有機相に蓄積する。これにより、生成したω−アミノヘキサン酸、ω−アミノヘキサン酸エステル及び／又はω−アミノヘキサン酸に由来するラクタムをｉｎ  ｓｉｔｕで抽出することができる。
【００９０】
有機相としては、中程度の分子鎖長を有し、ｌｏｇＰ値が＞４（気泡形成が少ない）のアルカン又は物理的に類似した芳香族化合物又は芳香族エステルを使用することができる。
【００９１】
本発明に係る方法の工程ＩＩ）では、生成したω−アミノヘキサン酸、ω−アミノヘキサン酸エステル及び／又はω−アミノヘキサン酸に由来するラクタムを必要に応じて単離する。単離は、以下の工程を含む２段階精製工程によって行うことができる。
ａ）ω−アミノヘキサン酸、ω−アミノヘキサン酸エステル及び／又はω−アミノヘキサン酸に由来するラクタムを培地から抽出する抽出工程。
ｂ）工程ａ）で得られた抽出物を、蒸留処理又は選択的結晶化によって精製して少なくとも９９．８％の純度を有するω−アミノヘキサン酸相、ω−アミノヘキサン酸エステル相及び／又はラクタム相を得る精密精製工程。
【００９２】
工程ａ）における抽出は、ω−アミノヘキサン酸、ω−アミノヘキサン酸エステル及び／又はω−アミノヘキサン酸に由来するラクタムを製造するための本発明に係る方法の工程Ｉ）及びＩＩ）を同時に実施する「ｉｎ  ｓｉｔｕ」抽出として設計することができる。
【００９３】
工程ＩＩ）における精密精製は、例えば、蒸留又は結晶化によって実施することができる。
【００９４】
例えば、公知の化学的に類似した処理を使用してアミノヘキサン酸エステルをアミノヘキサン酸に転化させることができる。
【００９５】
別の酵素によってω−アミノカルボン酸から対応するラクタムへの転化を触媒させることができる。この場合も、当該酵素が細胞によって分泌される場合には有利である。これにより、細胞によって直接形成されたω−アミノカルボン酸又はω−アミノカルボン酸エステルの細胞外性開裂後に形成されたω−アミノカルボン酸を対応するラクタムに転化させ、必要に応じて目的物を容易に精製することができる。
【００９６】
あるいは、アミノヘキサン酸に対する直接的な触媒作用によってナイロンをすることができる。「ナイロン」という用語は、脂肪族ポリアミドについて一般に使用される用語である。ナイロン６、ナイロン６，６及びナイロン６，１０等の一般的な脂肪族ポリアミドは、高い機械的強度、靱性及び耐薬品性を示し、延伸によって高強度繊維を形成することができる。ナイロンは、ナイロン６，６、ナイロン６、ナイロン６，９、ナイロン６，１０及びナイロン６，１２からなる群から選択されてもよい。具体的には、ナイロンは、ナイロン６，６、ナイロン６、ナイロン６，９、ナイロン６，１０又はナイロン６，１２であってもよい。より具体的には、ナイロンはナイロン６であってもよい。例えば、反応によって２種以上のナイロンを製造することができる。
【００９７】
ナイロンは、公知の任意の方法を使用して、アミノヘキサン酸及び／又はアミノヘキサン酸エステルから製造することができる。例えば、ナイロンは、ω−アミノヘキサン酸に由来するラクタムから製造することができる。
【００９８】
ラクタムからのポリアミドの製造は、例えば、ドイツ特許第１４９５１９８号、ドイツ特許第２５５８４８０号、欧州特許第０１２９１９６号又は「Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ」，１９７７に記載されているような周知の方法によって行うことができる。
【００９９】
あるいは、ナイロンは、ω−アミノヘキサン酸及び／又はω−アミノヘキサン酸に由来するラクタムの重縮合によって直接製造することができる。
【０１００】
具体的には、ナイロンは、少なくとも１０重量％、少なくとも２５重量％、少なくとも５０重量％又は少なくとも７５重量％が、ω−アミノヘキサン酸、ω−アミノヘキサン酸エステル及び／又はω−アミノヘキサン酸に由来するラクタムからなるものであってもよい。
【０１０１】
本発明の別の態様は、本発明の方法によって得られるアミノヘキサン酸及び／又はアミノヘキサン酸エステルを提供する。また、本発明の方法によって製造されるアミノヘキサン酸に由来するラクタムを提供する。
【０１０２】
本発明の一態様は、アミノヘキサン酸及び／又はアミノヘキサン酸エステルからなるナイロンの製造方法であって、本発明の各態様に係る方法によってアミノヘキサン酸及び／又はアミノヘキサン酸エステルを製造することと、前記アミノヘキサン酸及び／又はアミノヘキサン酸エステルを重合させてナイロンを得ることと、を含む方法を提供する。
【０１０３】
本発明の別の態様は、本発明の各態様に係る方法によって得られるナイロンを提供する。
【実施例】
【０１０４】
好適な実施形態について説明したが、好適な実施形態について、請求項の範囲から逸脱することなく、設計、構成又は操作に関して様々な変更又は変形を行うことができる。これらの変更又は変形も請求項の範囲に含まれる。
【０１０５】
実施例１
合成ガスからのエタノール及び酢酸塩の製造
【０１０６】
合成ガス（６６％のＨ２、３３％のＣＯ２）を生体内変化させてエタノール及び酢酸塩を製造するために、細菌であるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉを使用した。培養工程は、ブチルゴム製栓によって気密的に密閉可能な耐圧ガラス瓶内において嫌気的条件下で実施した。
【０１０７】
Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉを細胞培養するために、５ｍＬの凍結培養物を、５０ｍＬのＡＴＣＣ１７５４培地（ｐＨ：６．０、２０ｇ／ＬのＭＥＳ、１ｇ／Ｌの酵母抽出物、０．８ｇ／ＬのＮａＣｌ、１ｇ／ＬのＮＨ４Ｃｌ、０．１ｇ／ＬのＫＣｌ、０．１ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、０．２ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０２ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、２０ｍｇ／Ｌのニトリロ三酢酸、１０ｍｇ／ＬのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、８ｍｇ／Ｌの（ＮＨ４）２Ｆｅ（ＳＯ４）２・６Ｈ２Ｏ、２ｍｇ／ＬのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、２ｍｇ／ＬのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２ｍｇ／ＬのＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．２ｍｇ／ＬのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．２ｍｇ／ＬのＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．２ｍｇ／ＬのＮａ２ＳｅＯ４、０．２ｍｇ／ＬのＮａ２ＷＯ４・２Ｈ２Ｏ、２０ｇ／Ｌのｄ−ビオチン、２０μｇ／Ｌの葉酸、１００μｇ／ＬのピリドキシンＨＣｌ、５０μｇ／Ｌのチアミン−ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ、５０ｇ／Ｌのリボフラビン、５０ｇ／Ｌのニコチン酸、５０ｇ／Ｌのパントテン酸カルシウム、１ｇ／ＬのビタミンＢ１２、５０ｇ／Ｌのｐ−アミノ安息香酸、５０μｇ／Ｌのリポ酸、約６７．５ｍｇ／ＬのＮａＯＨ、４００ｍｇ／ＬのＬ−システイン塩酸塩、４００ｍｇ／ＬのＮａ２Ｓ・９Ｈ２Ｏ、５ｇ／Ｌのフルクトース）内で嫌気的に成長させた。１０ｍＬの培養物を採取し、１００ｍＬのＡＴＣＣ１７５４培地に播種して培養を開始した。培養は３５℃で３日間行った。
【０１０８】
製造段階では、培養物から細胞を採取し、製造培地（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ）で洗浄した。次に、細胞ペレットを、不燃性無菌ガラス瓶（容量：２５０ｍＬ）に入れた７５ｍＬの製造培地（ＤＭ４培地、ｐＨ：５．８、１５ｍｇ／ＬのＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、２ｇ／Ｌの（ＮＨ４）Ｈ２ＰＯ４、０，２ｇ／ＬのＮａＣｌ、０．１５ｇ／ＬのＫＣｌ、０．５ｍｇ／Ｌのリザズリン、３ｍｇ／ＬのＨ３ＢＯ３、２ｍｇ／ＬのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ，１ｍｇ／ＬのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３００μｇ／ＬのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、３００μｇ／ＬのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、２００μｇ／ＬのＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１００μｇ／ＬのＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１００μｇ／ＬのＮａ２ＳｅＯ３、１０６μｇ／Ｌのｄ−ビオチン、５μｇ／Ｌの葉酸、２．５μｇ／Ｌのピリドキシン−ＨＣｌ、２６６μｇ／Ｌのチアミン−ＨＣｌ、１２．５μｇ／Ｌのリボフラビン、１２．５μｇ／Ｌのニコチン酸、４１３μｇ／ＬのＣａ−パントテン酸塩、１２．５μｇ／ＬのビタミンＢ１２、１２．５μｇ／Ｌのｐ−アミノ安息香酸、１５．０μｇ／Ｌのリポ酸、０．５ｇ／ＬのＭｇＣｌ２・７Ｈ２Ｏ、０．２ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ）に再懸濁させ、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉの製造段階を開始した。合成ガス（６６％のＨ２、３３％のＣＯ２、１．８バール）を入れた状態でブチルゴム製栓でキャップし、１１３．７５時間放置し、３５℃で培養を行い、１００ｒｐｍで振盪した。培養時には、気相を毎日取り替え、サンプルを毎日採取して光学濃度及びＮＭＲ分析物を測定した。その結果、生成した酢酸塩の量は０．０２ｇ／Ｌから１．２ｇ／Ｌに増加し、生成したエタノールの量は０．０１ｇ／Ｌから０．１ｇ／Ｌに増加した。ヘキサン酸及び酪酸を検出されなかった。
【０１０９】
実施例２
合成ガスからの酪酸及びヘキサン酸の製造
【０１１０】
合成ガスを生体内変化させて酪酸及びヘキサン酸を製造するために、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉの共培養物を製造段階で使用した。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉにより、雰囲気中のＨ２及びＣＯ２を酢酸塩及びエタノールに転化させた。水相から生成物を取り出し、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉによって酪酸及びヘキサン酸に転化させた。
【０１１１】
培養工程は、ブチルゴム製栓によって気密的に密閉可能な耐圧ガラス瓶内において嫌気的条件下で実施した。
【０１１２】
Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉを細胞培養するために、１０ｍＬの凍結培養物を、１００ｍＬのＡＴＣＣ１７５４培地（ｐＨ：６．０、２０ｇ／ＬのＭＥＳ、１ｇ／Ｌの酵母抽出物、０．８ｇ／ＬのＮａＣｌ、１ｇ／ＬのＮＨ４Ｃｌ、０．１ｇ／ＬのＫＣｌ、０．１ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、０．２ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０２ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、２０ｍｇ／Ｌのニトリロ三酢酸、１０ｍｇ／ＬのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、８ｍｇ／Ｌの（ＮＨ４）２Ｆｅ（ＳＯ４）２・６Ｈ２Ｏ、２ｍｇ／ＬのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、２ｍｇ／ＬのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２ｍｇ／ＬのＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．２ｍｇ／ＬのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．２ｍｇ／ＬのＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．２ｍｇ／ＬのＮａ２ＳｅＯ４、０．２ｍｇ／ＬのＮａ２ＷＯ４・２Ｈ２Ｏ、２０ｇ／Ｌのｄ−ビオチン、２０μｇ／Ｌの葉酸、１００μｇ／ＬのピリドキシンＨＣｌ、５０μｇ／Ｌのチアミン−ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ、５０ｇ／Ｌのリボフラビン、５０ｇ／Ｌのニコチン酸、５０ｇ／Ｌのパントテン酸カルシウム、１ｇ／ＬのビタミンＢ１２、５０ｇ／Ｌのｐ−アミノ安息香酸、５０μｇ／Ｌのリポ酸、約６７．５ｍｇ／ＬのＮａＯＨ、４００ｍｇ／ＬのＬ−システイン塩酸塩、４００ｍｇ／ＬのＮａ２Ｓ・９Ｈ２Ｏ、５ｇ／Ｌのフルクトース）内で嫌気的に成長させた。培養は３５℃で２日間行った。
【０１１３】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉを細胞培養するために、１０ｍＬのＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ連続培養物を、１００ｍＬのＤＭＳＺ５２培地（ｐＨ：６．９８、１０ｇ／ＬのＣＨ３ＣＯＯＫ、０．３１ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、０．２３ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、０．２５ｇ／ＬのＮＨ４Ｃｌ、０．２０ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１ｇ／Ｌの酵母抽出物、０．５０ｍｇ／Ｌのリザズリン、１０μＬ／ＬのＨＣｌ（２５％、７．７Ｍ）、１．５ｍｇ／ＬのＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、７０ｇ／ＬのＺｎＣｌ２・７Ｈ２Ｏ、１００ｇ／ＬのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、６ｇ／ＬのＨ３ＢＯ３、１９０μｇ／ＬのＣＯＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、２ｇ／ＬのＣｕＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、２４ｇ／ＬのＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、３６ｇ／ＬのＮａ２ＭＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．５ｍｇ／ＬのＮａＯＨ、３ｇ／ＬのＮａ２ＳｅＯ３・５Ｈ２Ｏ、４μｇ／ＬのＮａ２ＷＯ４・２Ｈ２Ｏ、１００ｇ／ＬのビタミンＢ１２、８０ｇ／Ｌのｐ−アミノ安息香酸、２０ｇ／ＬのＤ（＋）−ビオチン、２００μｇ／Ｌのニコチン酸、１００ｇ／ＬのＤ−Ｃａ−パントテン酸塩、３００μｇ／Ｌの塩酸ピリドキシン、２００μＬ／Ｌのチアミン−ＨＣｌ・２Ｈ２Ｏ、２０ｍＬ／Ｌのエタノール、２．５ｇ／ＬのＮａＨＣＯ３、０．２５ｇ／Ｌのシステイン−ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ、０．２５ｇ／ＬのＮａ２Ｓ・９Ｈ２Ｏ）内で成長させた。培養は３５℃で２日間行った。
【０１１４】
製造段階では、各培養物から細胞を採取し、製造培地（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ）で洗浄した。次に、細胞ペレットを、不燃性無菌ガラス瓶（容量：２５０ｍＬ）に入れた３５ｍＬの製造培地（ＰＥＴＣ培地、ｐＨ：６．０、１０ｇ／ＬのＭＥＳ、２．４ｇ／ＬのＮａＣｌ、３ｇ／ＬのＮＨ４Ｃｌ、０．３ｇ／ＬのＫＣｌ、０．３ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、０．６ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１２ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、２０ｍｇ／Ｌのニトリロ三酢酸、１０ｍｇ／ＬのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、８ｍｇ／Ｌの（ＮＨ４）２Ｆｅ（ＳＯ４）２・６Ｈ２Ｏ、２ｍｇ／ＬのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、２ｍｇ／ＬのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２ｍｇ／ＬのＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．２ｍｇ／ＬのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．２ｍｇ／ＬのＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．２ｍｇ／ＬのＮａ２ＳｅＯ４、０．２ｍｇ／ＬのＮａ２ＷＯ４・２Ｈ２Ｏ、２ｇ／Ｌのｄ−ビオチン、２ｇ／Ｌの葉酸、１０ｇ／ＬのピリドキシンＨＣｌ、５ｇ／Ｌのチアミン−ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ、５ｇ／Ｌのリボフラビン、５ｇ／Ｌのニコチン酸、５ｇ／ＬのＣａ−パントテン酸塩、５μｇ／ＬのビタミンＢ１２、５ｇ／Ｌのｐ−アミノ安息香酸、５μｇ／Ｌのリポ酸、１０ｇ／ＬのＭＥＳＮＡ、約６７．５ｍｇ／ＬのＮａＯＨ、３００ｍｇ／Ｌのシステイン−ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ、３００ｍｇ／ＬのＮａ２Ｓ・９Ｈ２Ｏ）に再懸濁させた。合成ガス（６６％のＨ２、３３％の１３Ｃ標識ＣＯ２、１．８バール）を入れた状態でブチルゴム製栓でキャップし、１９１時間放置し、３５℃で培養を行い、１００ｒｐｍで振盪した。培養時には、気相を毎日取り替え、サンプルを毎日採取して光学濃度及びＮＭＲ分析物を測定した。
【０１１５】
生成物の量は、混合製造による無菌濾過上清の準定量式１Ｈ−ＮＭＲ分光法を使用して測定した。サンプルはリン酸緩衝液で希釈し（Ｄ２Ｏ）、水を抑制した状態で測定した。測定は、１３Ｃカップリングを抑制した状態及び１３Ｃカップリングを抑制しない状態で行った。内部定量化標準としては、トリメチルシリルプロピオン酸ナトリウム（ＴＳＰ）を使用した。
【０１１６】
その結果、生成した酢酸塩の量は０．０５ｇ／Ｌから１．７ｇ／Ｌに増加し（生成した酢酸塩の総量の９３ｍｏｌ％は１３Ｃ標識）、生成したエタノールの量は０．０５ｇ／Ｌから０．１２ｇ／Ｌに増加した（生成したエタノールの総量の９２ｍｏｌ％は１３Ｃ標識）。また、ヘキサン酸の濃度は０．０２ｇ／Ｌから０．１３ｇ／Ｌに増加し（生成したヘキサン酸の総量の６３ｍｏｌ％は１３Ｃ標識）、酪酸の濃度は０．０１ｇ／Ｌから０．０７ｇ／Ｌに増加した（生成した酪酸の総量の６３ｍｏｌ％は１３Ｃ標識）。これにより、生成したヘキサン酸及び酪酸の多くが合成ガスのＣ供給源に由来することが確認された。
【０１１７】
実施例３
エタノール及び酢酸塩からのヘキサン酸及び酪酸の製造
【０１１８】
エタノール及び酢酸塩を生体内変化させてヘキサン酸及び酪酸を製造するために、細菌であるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉを使用した。培養工程は、ブチルゴム製栓によって気密的に密閉可能な耐圧ガラス瓶内において嫌気的条件下で実施した。
【０１１９】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍの凍結培養物を含む５ｍＬのＤＭＳＺ５２培地（ｐＨ：６．９８、１０ｇ／ＬのＣＨ３ＣＯＯＫ、０．３１ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、０．２３ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、０．２５ｇ／ＬのＮＨ４Ｃｌ、０．２０ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１ｇ／Ｌの酵母抽出物、０．５０ｍｇ／Ｌのリザズリン、１０μＬ／ＬのＨＣｌ（２５％、７．７Ｍ）、１．５ｍｇ／ＬのＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、７０μｇ／ＬのＺｎＣｌ２・７Ｈ２Ｏ、１００μｇ／ＬのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、６μｇ／ＬのＨ３ＢＯ３、１９０μｇ／ＬのＣＯＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、２μｇ／ＬのＣｕＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、２４μｇ／ＬのＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、３６μｇ／ＬのＮａ２ＭＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．５ｍｇ／ＬのＮａＯＨ、３μｇ／ＬのＮａ２ＳｅＯ３・５Ｈ２Ｏ、４μｇ／ＬのＮａ２ＷＯ４・２Ｈ２Ｏ、１００ｇ／ＬのビタミンＢ１２、８０ｇ／Ｌのｐ−アミノ安息香酸、２０ｇ／ＬのＤ（＋）−ビオチン、２００μｇ／Ｌのニコチン酸、１００μｇ／ＬのＤ−Ｃａ−パントテン酸塩、３００μｇ／Ｌの塩酸ピリドキシン、２００μＬ／Ｌのチアミン−ＨＣｌ・２Ｈ２Ｏ、２０ｍＬ／Ｌのエタノール、２．５ｇ／ＬのＮａＨＣＯ３、０．２５ｇ／Ｌのシステイン−ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ、０．２５ｇ／ＬのＮａ２Ｓ・９Ｈ２Ｏ）を２５０ｍＬの瓶に入れ、５０ｍＬのＤＳＭＺ５２培地を添加した。培養は３５℃で３日間行った。次に、１０ｍＬの培養物を１００ｍＬのＤＳＭＺ５２培地に播種して予備培養物を得た。予備培養物を３５℃で３日間培養した。本培養物の製造では、５００ｍＬの瓶内において、予備培養物の細胞の５％を２００ｍＬのＤＳＭＺ５２培地に播種した。ブチルゴム製栓でキャップし、３５℃で９８時間培養を行った。培養期間の最初と最後にサンプルを採取し、光学濃度及びＮＭＲ分析物を測定した。ＯＤ６００は、０．０１以下から最大で０．３５〜０．３７に増加した。酢酸塩の量は４．９ｇ／Ｌから２．４ｇ／Ｌに減少し、エタノールの量は１２．５ｇ／Ｌから９．２ｇ／Ｌに減少した。また、ヘキサン酸の量は０．１ｇ／Ｌから６．８５ｇ／Ｌに増加し、酪酸の量は０．１ｇ／Ｌから２．９ｇ／Ｌに増加した。
【０１２０】
実施例４
Ｃ．ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓを使用した合成ガスからのヘキサン酸の製造
【０１２１】
野生株Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ（受託番号：ＤＳＭ１５２４３）を、ＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ）から入手し、独立栄養培養して合成ガスからヘキサン酸を製造した。培養工程は、ブチルゴム製栓によって気密的に密閉可能な耐圧ガラス瓶内において嫌気的条件下で実施した。
【０１２２】
細胞は、複合培地を使用して培養した。複合培地としては、３ｇ／ＬのＮＨ４Ｃｌ、０．３ｇ／ＬのＫＣｌ、０．６ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．３ｇ／ＬのＮａＣｌ、０．３ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１２０ｍｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１０ｇ／ＬのＭＥＳ、１ｇ／Ｌの酵母抽出物、０．４ｇ／ＬのＬ−システイン−ＨＣｌ、２０ｍｇ／Ｌのニトリロ三酢酸、１０ｍｇ／ＬのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、８ｍｇ／Ｌの（ＮＨ４）２Ｆｅ（ＳＯ４）２・６Ｈ２Ｏ、２ｍｇ／ＬのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、２ｍｇ／ＬのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２ｍｇ／ＬのＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．２ｍｇ／ＬのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．２ｍｇ／ＬのＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．２ｍｇ／ＬのＮａ２ＳｅＯ４、０．２ｍｇ／ＬのＮａ２ＷＯ４・２Ｈ２Ｏ、２０μｇ／Ｌのｄ−ビオチン、２０μｇ／Ｌの葉酸、１００μｇ／Ｌのピリドキシン−ＨＣｌ、５０μｇ／Ｌのチアミン−ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ、５０μｇ／Ｌのリボフラビン、５０μｇ／Ｌのニコチン酸、５０μｇ／ＬのＣａ−パントテン酸、５０μｇ／ＬのビタミンＢ１２、５０μｇ／Ｌのｐ−アミノベンゾエート、５０μｇ／Ｌのリポ酸及び１００μｇ／ＬのＭＥＳＮＡを含む培地（ｐＨ：６．０）を使用した。
【０１２３】
独立栄養培養は、５００ｍＬの複合培地とＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ株を入れた１Ｌのセプタム付き瓶内で行った。培養は、開放水浴振盪機（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製「Ｉｎｎｏｖａ３１００」）（振盪周波数：１００ｍｉｎ−１）を使用して３７℃で行った。培地にトラップされた気体を１０μｍの細孔径を有するスパージャー（反応器の中央に配置）によって除去した。培養は、ｐＨを制御せずに行った。反応器は、大気圧において、スパージャーを使用して６７％のＨ２及び３３％のＣＯ２からなる混合気体混合物でパージした（通気速度：３Ｌ／ｈ（０．１ｖｖｍ））。
【０１２４】
フルクトースによって従属栄養性としてグリセリン（１０％）に播種した５ｍＬのＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓの凍結培養物を、上記複合培地内において、Ｏ２が存在しない状態で培養した。培養は、３５℃で４６時間行った。
【０１２５】
５ｍＬの各サンプルを採取してＯＤ６００、ｐＨ及び生成物のスペクトルを測定した。生成物の濃度は、準定量式１Ｈ−ＮＭＲ分光法を使用して測定した。内部定量化標準としては、トリメチルシリルプロピオン酸ナトリウム（Ｔ（Ｍ）ＳＰ）を使用した。
【０１２６】
その結果、ＯＤ６００は０．０１から０．１８に増加し、ｐＨは５．７５から５．５１に減少した。また、酢酸塩の濃度は７ｍｇ／Ｌから０．８ｇ／Ｌに増加し、エタノールの濃度は０ｇ／Ｌから０．１６ｇ／Ｌに増加し、酪酸塩の濃度は０ｇ／Ｌから０．１９ｇ／Ｌに増加した。また、上記期間に６３ｍｇ／Ｌのヘキサン酸が生成した。
【０１２７】
実施例５
ヘキサン酸メチル及び／又はヒドロキシヘキサン酸メチルの酸化のための全細胞触媒（ｗｈｏｌｅ  ｃｅｌｌ  ｃａｔａｌｙｓｔ）としてのＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０１（ｐＢＴ１０）
【０１２８】
Ｓｃｈｒｅｗｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１及び国際公開第２００９／０７７４６１Ａ１号に従って、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａに由来する３種類の遺伝子であるアルカンヒドロキシラーゼ（ＡｌｋＢ）、ルブレドキシン（ＡｌｋＧ）及びルブレドキシンレダクターゼ（ＡｌｋＴ）を発現するプラスミドｐＢＴ１０（図１Ａ）を導入した組み換えＥ．ｃｏｌｉ株ＪＭ１０１細胞を作成した。
【０１２９】
簡単に説明すると、以下の工程を行った。
【０１３０】
ａｌｋＢＧＴ発現ベクターの構築
アルデヒドへの酸化に必要なＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａに由来するアルカンヒドロキシラーゼ（ＡｌｋＢ）、ルブレドキシン（ＡｌｋＧ）及びルブレドキシンレダクターゼ（ＡｌｋＴ）を含むコンストラクトｐＢＴ１０（図１Ａ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）をｐＣＯＭ系を使用して作成した（Ｓｍｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。これらの３種類の遺伝子の発現のために、ａｌｋＢＦＧ遺伝子配列をａｌｋＢ−プロモーターによって制御し、ａｌｋＴ遺伝子をａｌｋＳ−プロモーター（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）によって制御した。
【０１３１】
クローニング方法
ａｌｋＢ及びａｌｋＧのクローニングを簡略化するために、ａｌｋＢとａｌｋＧの間に位置する遺伝子ａｌｋＦを増幅し、ａｌｋＢ及びａｌｋＧと共にクローニングした。ＡｌｋＦは、触媒する反応には重要ではない。
【０１３２】
ａｌｋＢの上流のＮｄｅＩ切断部位及びａｌｋＧの下流のＳａｌＩ切断部位により、フラグメントａｌｋＢＦＧ＝２５２４ｂｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２（ａｌｋＢ）及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３（ａｌｋＧ）を参照）のＰＣＲ増幅を行った。プライマーの配列を表２に示す。
【０１３３】
【表６】
2017516470.tif 000008
【０１３４】
フラグメントａｌｋＢＦＧ及びａｌｋＴのＰＣＲ増幅を行った。プラスミドｐＧＥｃ４７（図８）（Ｅｇｇｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７））をテンプレートとして使用した。
【０１３５】
クローニングは、線形化され、平滑末端を有し、各平滑末端ＰＣＲ産物（図９）でリゲートされたサブクローニングベクターｐＳＭＡＲＴＲ  ＨＣＫａｎ（Ｌｕｃｉｇｅｎ社製）を使用して行った。
【０１３６】
次に、制限酵素ＮｄｅＩ及びＳａｌＩを有するａｌｋＢＦＧフラグメント及び制限酵素ＰａｃＩ及びＸｈｏＩを有するａｌｋＴフラグメントをサブクローニングベクターから切断した。フラグメントをアガロースゲル（１％）内で分離し、アガロースゲルから取り出し、ゲル抽出キットを使用して単離した。
【０１３７】
フラグメントを順番にリゲートしてベクターｐＣＯＭ１０とした（Ｓｍｉｔｓ，Ｔ．Ｈ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。第１の工程では、切断部位ＮｄｅＩ及びＳａｌＩを介してａｌｋＢＦＧをｐＣＯＭ１０に挿入し、第２の工程では、切断部位ＰａｃＩ及びＸｈｏＩを介してａｌｋＴをクローニングした。
【０１３８】
組み換えプラスミドをＥ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ５αに形質転換した。プラスミド含有クローンは、カナマイシン含有ＬＢ培地上で選択した。単離したプラスミドを切断解析（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ）及び配列解析によって調べた。このプラスミドをｐＢＴ１０（図１Ａ）という。生体内変化（ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のために、プラスミドｐＢＴ１０を化学的能力を有するＥ．ｃｏｌｉ株ＪＭ１０１内において、４２℃で２分間にわたって熱刺激によって形質転換した。
【０１３９】
全ての細胞アッセイは、以下の条件を使用して行った。
【０１４０】
Ｅ．ｃｏｌｉ株ＪＭ１０１細胞は、Ｍ９培地（６．８ｇ／ＬのＮａ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、２．４ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、０．４ｇ／ＬのＮａＣｌ、１．６ｇ／ＬのＮＨ４Ｃｌ、０．５ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１ｍＬの微量元素溶液ＵＳ３（３６．５ｇ／Ｌの３７％塩酸、１．９１ｇ／ＬのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、１．８７ｇ／ＬのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．８４ｇ／ＬのＮａ−ＥＤＴＡ・２Ｈ２Ｏ、０．３ｇ／ＬのＨ３ＢＯ３、０．２５ｇ／ＬのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、４．７ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１７．３ｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１５ｇ／ＬのＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ））内において３０℃で成長させた。ＯＤ４５０＝０．２の時に播種した。細胞を成長させ、ＯＤ４５０が０．５に達した時に、０．０２５％（ｖ／ｖ）ジシクロプロピルケトン（ＤＣＰＫ）（アルカンヒドロキシラーゼ活性の強力な無償性誘導物質）を使用して遺伝子発現を誘導した。細胞をさらに４時間培養した。次に、細胞を遠心分離によって採取し、細胞ペレットを５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ＫＰｉ、ｐＨ：７．４、１％（ｗ／ｖ）グルコースを含む）に再懸濁させ、バイオリアクターに入れた。４０μＬの１０％（ｖ／ｖ）過塩素酸によって成長を停止させ、エーテルによる反応混合物の抽出が可能となるように、得られた酸へのプロトン化を生じさせた。
【０１４１】
次に、ジエチルエーテルによって反応混合物の抽出を行い、ガスクロマトグラフィーによって基質と生成物濃度の測定を行った。各遺伝子組み換え細胞を静止細胞アッセイにおいてヘキサン酸メチルと接触させ、長期間にわたってサンプルを採取した。
【０１４２】
静止状態のＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０１（ｐＢＴ１０）は、ヘキサン酸メチルからヒドロキシヘキサン酸メチルへの転化を効率的に触媒した（図２及び図３を参照）。ヒドロキシヘキサン酸メチルからオキソヘキサン酸メチルへのＡｌｋＢＧＴ触媒酸化がわずかに生じた。
【０１４３】
表３に示すように、水酸化反応（第１の工程）の最大特異的活性は約９０ＵｇＣＤＷであり、アルコール酸化工程（第２の工程）の最大特異的活性は約６ＵｇＣＤＷだった。
【０１４４】
ヒドロキシヘキサン酸メチルをＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０１（ｐＢＴ１０）の基質として使用した場合には、アルコールヒドロキシヘキサン酸メチルからオキソヘキサン酸メチルへの転化は遅く、非効率的だった。ヒドロキシヘキサン酸メチルをＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０１（ｐＢＴ１０）の基質として使用した場合にも同様な挙動が観察された（図４及び図５を参照）。ヒドロキシヘキサン酸メチルの最大酸化率は２５ＵｇＣＤＷであり、かなりの量の基質が存在していたが、オキソヘキサン酸メチルの蓄積は１５分後に終了した。これは、ＡｌｋＢＧＴは、アルコールヒドロキシヘキサン酸メチルからオキソヘキサン酸メチルへの酸化には効率的ではないことを示している。
【０１４５】
実施例６
ヒドロキシヘキサン酸メチルの酸化のための全細胞触媒としてのＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０１（ｐＪ１０）
【０１４６】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＧＰｏ１に由来するアルカンヒドロキシラーゼ系ａｌｋＢＧＴを使用してヘキサン酸又はヘキサン酸メチルの水酸化を行った。アルデヒドを得る第２の工程は、アルコールデヒドロゲナーゼａｌｋＪによって触媒した。
【０１４７】
Ｐ．ｐｕｔｉｄａ（図１Ｂ）に由来するアルコールデヒドロゲナーゼＡｌｋＪをコードする遺伝子を発現するプラスミドｐＪ１０を含有する第２の組み換えＥ．ｃｏｌｉ株ＪＭ１０１細胞を作成した。
【０１４８】
アルコールデヒドロゲナーゼＡｌｋＪをＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０１に導入することにより、ヒドロキシヘキサン酸メチルのより効率的な酸化が達成された。ＡｌｋＪ含有Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０１（ｐＪ１０）の酸化能を静止細胞アッセイにおいて調べた。ヒドロキシヘキサン酸メチルを基質として使用した場合の結果を図６及び図７に示す。表３に示すように、ヒドロキシヘキサン酸メチルの酸化は２００ＵｇＣＤＷを超えていた。これは、ＡｌｋＪはアルコールの酸化を触媒し、上記反応の触媒に関してＡｌｋＢＧＴよりも効率的であることを示している。従って、ＡｌｋＪは、６−オキソアミノヘキサン酸メチルエステルを介した６−アミノヘキサン酸メチルエステルの製造のための全細胞触媒の開発において重要な成分である。
【０１４９】
【表７】
2017516470.tif 000009
【０１５０】
アルコールからアルデヒドへの効率的な酸化のためには、ＡｌｋＪの存在が必要であると思われる。      
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【図１】
2017516470.tif 000010
【図２】
2017516470.tif 000011
【図３】
2017516470.tif 000012
【図４】
2017516470.tif 000013
【図５】
2017516470.tif 000014
【図６】
2017516470.tif 000015
【図７】
2017516470.tif 000016
【図８】
2017516470.tif 000017
【図９】
2017516470.tif 000018
【配列表】
2017516470000001.app
【国際調査報告】
2017516470.tif 000019
2017516470.tif 000020
2017516470.tif 000021