(57)【要約】  診断アッセイ、及びサンプル中のＲＧＭａ断片を検出し、定量化するための前記診断アッセイの使用方法を提供する。前記方法は、神経変性疾患における薬物治療及び薬物治療の有効性をモニターするためにＲＧＭａ断片を検出するために使用され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片を検出し、定量化する方法であって、
（ａ）被験者から少なくとも１個のＲＧＭａ断片を含むサンプルを得るステップと、
（ｂ）前記サンプルをキャプチャー結合タンパク質と接触させるステップと、ここで、前記キャプチャー結合タンパク質は前記少なくとも１個のＲＧＭａ断片に結合して、キャプチャー結合タンパク質−ＲＧＭａ断片複合体を形成する、
（ｃ）前記サンプルを検出結合タンパク質と接触させるステップと、ここで、前記検出結合タンパク質は前記キャプチャー結合タンパク質と相互作用して、検出結合タンパク質−キャプチャー結合タンパク質ＲＧＭａ断片複合体を形成する、
（ｄ）前記サンプル中の前記少なくとも１個のＲＧＭａ断片を検出し、定量化するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記少なくとも１個のＲＧＭａ断片は約１ｋＤａ〜約６５ｋＤａのサイズを有するＲＧＭａ断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＲＧＭａ断片は、１０ｋＤａ、１８ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、５０ｋＤまたは６５ｋＤａのサイズを有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＲＧＭａ断片は、１８ｋＤａのＲＧＭａ断片、３０ｋＤａのＲＧＭａ断片及び４０ｋＤａのＲＧＭａ断片からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｂ）の前に、ゲル電気泳動を用いて、前記少なくとも１個のＲＧＭａ断片を分離する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｂ）の前に、前記少なくとも１個のＲＧＭａ断片を膜に固定化してウェスタンブロッティング膜を作成させるステップと；ステップ（ｂ）において前記ウェスタンブロッティング膜を前記キャプチャー結合タンパク質と接触させるステップと、ここで、前記キャプチャー結合タンパク質は前記ウェスタンブロッティング膜上に固定化した前記少なくとも１個のＲＧＭａ断片に結合して、キャプチャー結合タンパク質−ＲＧＭａ断片複合体を形成する；ステップ（ｃ）において前記ウェスタンブロッティング膜を検出結合タンパク質と接触させるステップと、ここで、前記検出結合タンパク質は前記キャプチャー結合タンパク質と相互作用して、検出結合タンパク質−キャプチャー結合タンパク質ＲＧＭａ断片複合体を形成する、をさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも２個のＲＧＭａ断片を検出する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも２個のＲＧＭａ断片は、３０ｋＤａ及び４０ｋＤａのサイズを有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも３個のＲＧＭａ断片を検出する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも３個のＲＧＭａ断片は、１８ｋＤａ、３０ｋＤａ及び４０ｋＤａのサイズを有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１個のＲＧＭａ断片は、可溶性ＲＧＭａ断片である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｂ）においてゲル上で前記サンプル中の前記タンパク質と同時にＲＧＭａタンパク質標準を分離するステップと；（ｇ）前記少なくとも１個のＲＧＭａ断片を前記分離したＲＧＭａタンパク質標準と比較して前記断片を定量化するステップとをさらに含む、請求項５〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＲＧＭａタンパク質は、組換えＲＧＭａ断片の勾配である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記勾配は、ＲＧＭａタンパク質標準１０、２５、５０、１００及び２００ｐｇ／ｍＬを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＲＧＭａ断片のサイズをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＳＤＳ  ＰＡＧＥは４〜１５％である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記膜は、ニトロセルロース膜である、請求項６〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記キャプチャー結合タンパク質は、ＲＧＭａ選択的抗体である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗体は、ビオチン化ＲＧＭａ選択的抗体である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記検出結合タンパク質は、四価アビジンであり、前記検出可能標識は、ビオチン化ホースラディッシュペルオキシダーゼである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ペルオキシダーゼ染色キットを用いて、前記少なくとも１個のＲＧＭａ断片を検出する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
神経変性疾患に対する治療の必要な被験者における、神経変性疾患に対する治療の有効性の判定方法であって、
（ａ）前記被験者からのサンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片のレベルを、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法を用いて測定するステップと；
（ｂ）前記被験者からのサンプル中の前記少なくとも１個のＲＧＭａ断片のレベルを、前記少なくとも１個のＲＧＭａ断片の対照レベルと比較するステップと、ここで、前記少なくとも１個の断片のレベルが前記対照レベルと比較して高い場合、前記治療は神経変性疾患の治療に無効であると判定され、前記少なくとも１個の断片のレベルが前記対照レベルと比較して同一であるかまたは低い場合、前記治療は神経変性疾患の治療に有効であると判定される；
を含む、方法。
【請求項２３】
神経変性疾患に対する治療の必要な前記被験者に対して、神経変性疾患の治療に有効であると判定された治療を施行し続けることをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記少なくとも１個のＲＧＭａ断片の対照レベルは、神経変性疾患にかかっているが、神経変性疾患に対する治療を受けたことがない被験者中の前記少なくとも１個のＲＧＭａ断片のレベルである、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
神経変性疾患を患っている被験者の治療に対する応答性の予測方法であって、
（ａ）前記被験者からのサンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片のレベルを、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法を用いて測定するステップと；
（ｂ）前記被験者からのサンプル中の前記少なくとも１個のＲＧＭａ断片のレベルを前記少なくとも１個のＲＧＭａ断片の対照レベルと比較するステップと；
（ｃ）サンプル中の前記少なくとも１個のＲＧＭａ断片のレベルが前記対照レベルと比較して低い場合、前記被験者の治療に対する応答性の予測を与えるステップと；
を含む、方法。
【請求項２６】
前記治療に応答すると予測された被験者に対して、該治療を施行することをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
神経変性疾患を患っている被験者の治療方法であって、
（ａ）前記被験者からのサンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片のレベルを、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法を用いて測定するステップと；
（ｂ）前記被験者からのサンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片のレベルを、少なくとも１個のＲＧＭａ断片の対照レベルと比較するステップと；
（ｃ）前記断片のレベルが対照レベルと比較して高い場合、前記被験者に対して治療レジメンを投与するステップと；
を含む、方法。
【請求項２８】
前記治療は、神経回復薬、神経保護薬、または神経再生薬を含む、請求項２２〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記治療は、トリアムシノロンアセトニド（ＴＣＡ）、テクフィデラ／ＢＧ−１２（フマル酸ジメチル）、ジレニア（フィンゴリモド）、ラキニモド、β−インターフェロン、コパキソン、ダクリズマブ、アレムツズマブ、リツキシマブ、またはその組合せの少なくとも１つを含む、請求項２２〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記治療は、トリアムシノロンアセトニド（ＴＣＡ）を含む、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
神経変性疾患を患っている被験者に対する治療レジメンの最適化方法であって、
（ａ）被験者から得られた第１サンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第１レベルを、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法を用いて測定するステップと、ここで、前記第１サンプルは、前記被験者が治療レジメンを始める前またはその間の時点で前記被験者から採取される；
（ｂ）ステップ（ａ）より後の時点で前記被験者から得られた第２サンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第２レベルを測定するステップと、ここで、前記少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第１レベルと比較した前記少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第２レベルの低下は該治療レジメンが神経変性疾患に対して治療効果を有していることを示し；
（ｃ）前記被験者からの第１サンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片のレベルを、請求項１に記載の方法を用いて測定するステップと；
（ｄ）前記被験者からのサンプル中の前記少なくとも１個のＲＧＭａ断片のレベルを、前記少なくとも１個のＲＧＭａ断片の対照レベルと比較するステップと；
（ｅ）サンプル中の前記少なくとも１個のＲＧＭａ断片のレベルが前記対照レベルと比較して低い場合、前記被験者の治療に対する応答性の予測を与えるステップと；
を含む、方法。
【請求項３２】
前記治療レジメンは、神経回復治療レジメンである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記神経回復治療レジメンの成功率を向上させる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記治療レジメンは、神経保護治療レジメンである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記神経保護治療レジメンの成功率を向上させる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
神経変性疾患を患っている被験者の再生促進薬物治療のモニタリング方法であって、
（ａ）被験者から得られた第１サンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第１レベルを請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法を用いて測定するステップと、ここで、第１サンプルは、前記被験者が薬物治療を始める前またはその間の時点で前記被験者から採取される；
（ｂ）ステップ（ａ）より後の時点で前記被験者から得られた第２サンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第２レベルを測定するステップと、ここで、前記少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第１レベルと比較した前記少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第２レベルの低下は、該薬物治療レジメンが神経変性疾患に対して治療効果を有していることを示し、前記少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第１レベルと比較した前記少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第２レベルの上昇は、該薬物治療レジメンが神経変性疾患に対して治療効果を有していないことを示し；
（ｃ）前記薬物治療レジメンが神経変性疾患に対して治療効果を有していない場合、前記被験者に対して別の薬物治療を施行するステップと；
を含む、方法。
【請求項３７】
神経変性疾患に対する治療効果についての化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）細胞を含むサンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第１レベルを請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法を用いて測定するステップと；
（ｂ）前記サンプルを化合物と接触させるステップと；
（ｃ）ステップ（ｂ）より後の時点で前記被験者から得られた第２サンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第２レベルを測定するステップと、ここで、前記少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第１レベルと比較した前記少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第２レベルの低下は、該化合物が神経変性疾患に対して治療効果を有していることを示し、前記少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第１レベルと比較した前記少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第２レベルの上昇は、該化合物が神経変性疾患に対して治療効果を有していないことを示し；
（ｄ）治療効果を有すると同定された化合物を選択するステップと；
を含む、方法。
【請求項３８】
少なくとも２個のＲＧＭａ断片を検出する、請求項２２〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記少なくとも２個のＲＧＭａ断片は、３０ｋＤａ及び４０ｋＤａのサイズを有する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
少なくとも３個のＲＧＭａ断片を検出する、請求項２２〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記少なくとも３個のＲＧＭａ断片は１８ｋＤａ、３０ｋＤａ及び４０ｋＤａのサイズを有する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
神経変性疾患または障害は、多発性硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、テイ−サックス病、ニーマン−ピック病、ゴーシェ病、ハーラー症候群、ハンチントン病、筋萎縮性側策硬化症、特発性炎症性脱髄疾患、ビタミンＢ１２欠乏症、橋中心髄鞘崩壊症、脊髄ろう、横断性脊髄炎、デビック病、進行性多巣性白質脳症、視神経炎、脊髄損傷、外傷性脳損傷、卒中、緑内障、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性、または白質ジストロフィーである、請求項２２〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
神経変性疾患または障害は、多発性硬化症である、請求項２２〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＲＧＭａ断片は、ヒトＲＧＭａ断片である、請求項１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記サンプルは、脳脊髄液、血液、血清または血漿を含む、請求項１〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプル中のＲＧＭａ断片を検出し、測定するためのアッセイ、及び神経変性疾患を患っている被験者の治療の判定、最適化、予測及びモニタリングにおける前記アッセイの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
多発性硬化症（ＭＳ）は中枢神経系の慢性炎症性疾患である。ガドリニウムを適用する現在利用されているＭＲＩ技術は疾患過程で生ずる各種病巣を可視化し、生物学的マーカーとして役立つ。しかしながら、脳脊髄液（ＣＳＦ）及びタンパク質の研究は疾患の進行、慢性炎症、及び髄腔内遅放性ステロイド適用のような治療に対する応答の相互作用に対する更なる洞察を与え得る。
【０００３】
軸索再生のプロセスは多発性硬化症の臨床成果を改善する。ミエリン及びグリア構造中の幾つかの再生インヒビター、すなわちミエリン結合糖タンパク質、ＮｏｇｏＡ、ＯＭｇｐ（希突起膠細胞ミエリン糖タンパク質）の存在が公知である。１つの更なるインヒビターは反発性誘導分子Ａ（ＲＧＭａ）であり、これはニューロン再生及び機能回復をも妨げる。ＲＧＭａは、神経突起伸張の強力なインヒビターであり、ＣＮＳ外傷または炎症後のニューロン再生及び機能回復を阻害する重要な因子として現れるグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー型糖タンパク質である。ＲＧＭａは膜結合型可溶性形態で存在し、これらは神経突起伸長を阻害する。ＲＧＭａは外傷性脳損傷または虚血性卒中を患っているヒトのＣＮＳミエリン、新鮮病巣及び成熟瘢痕組織に局在化している。
【０００４】
脳及び脊髄中に存在しているＲＧＭａ及びその断片は神経変性を促進し、神経再生を阻害し得る。ＲＧＭａは神経線維の再生及びニューロンの変性に影響を与える。ＥＬＩＳＡベースアッセイが再生活性の阻害を同定すべくＲＧＭａ種を検出するために使用されてきた。しかしながら、これらのアッセイはサイズの異なるＲＧＭａ断片を区別することができず、通常各種ＲＧＭａ断片を検出するために必要な高感度のレベルを示さない。加えて、ＥＬＩＳＡベースアッセイは体液中のタンパク質量が少ないためにＲＧＭａを検出することができない。より高い感度を有し、ＲＧＭａ断片を検出し、区別することができ、ＲＧＭａ断片をＭＳまたは他の神経変性疾患を患っている患者における高い機能回復及び再生と相関させることができる診断アッセイが必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、サンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片を検出し、定量化する方法に関する。この方法は、（ａ）被験者から少なくとも１個のＲＧＭａ断片を含むサンプルを得るステップと、（ｂ）サンプルをキャプチャー結合タンパク質と接触させるステップと、ここで、キャプチャー結合タンパク質は、少なくとも１個のＲＧＭａ断片に結合して、キャプチャー結合タンパク質−ＲＧＭａ断片複合体を形成する、（ｃ）サンプルを検出結合タンパク質と接触させるステップと、ここで、検出結合タンパク質は、キャプチャー結合タンパク質と相互作用して、検出結合タンパク質−キャプチャー結合タンパク質ＲＧＭａ断片複合体を形成する、（ｄ）サンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片を検出し、定量化するステップとを含む。少なくとも１個のＲＧＭａ断片は、約１ｋＤａ〜約６５ｋＤａのサイズを有するＲＧＭａ断片であり得る。ＲＧＭａ断片は、１０ｋＤａ、１８ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、５０ｋＤａまたは６５ｋＤａのサイズを有し得る。ＲＧＭａ断片は、１８ｋＤａのＲＧＭａ断片、３０ｋＤａのＲＧＭａ断片及び４０ｋＤａのＲＧＭａ断片からなる群から選択され得る。ステップ（ｂ）の前に、ゲル電気泳動を用いて、少なくとも１個のＲＧＭａ断片を分離してもよい。少なくとも２個のＲＧＭａ断片を検出し得る。少なくとも２個のＲＧＭａ断片は、３０ｋＤａ及び４０ｋＤａのサイズを有し得る。少なくとも３個のＲＧＭａ断片を検出し得る。少なくとも３個のＲＧＭａ断片は、１８ｋＤａ、３０ｋＤａ及び４０ｋＤａのサイズを有し得る。少なくとも１個のＲＧＭａ断片は、可溶性ＲＧＭａ断片であり得る。ＲＧＭａ断片のサイズはＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定され得る。ＳＤＳ  ＰＡＧＥは４〜１５％であり得る。キャプチャー結合タンパク質は、ＲＧＭａ選択的抗体であり得る。抗体は、ビオチン化ＲＧＭａ選択的抗体であり得る。検出結合タンパク質は、四価アビジンであり、検出可能標識は、ビオチン化ホースラディッシュペルオキシダーゼであり得る。少なくとも１個のＲＧＭａ断片は、ペルオキシダーゼ染色キットを用いて検出され得る。ＲＧＭａ断片は、ヒトＲＧＭａ断片であり得る。方法サンプルは脳脊髄液、血液、血清、または血漿を含み得る。
【０００６】
本発明は、サンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片を検出し、定量化する方法に関する。この方法は、（ａ）被験者から少なくとも１個のＲＧＭａ断片を含むサンプルを得るステップと、（ｂ）サンプルをキャプチャー結合タンパク質と接触させるステップと、ここで、キャプチャー結合タンパク質は、少なくとも１個のＲＧＭａ断片に結合して、キャプチャー結合タンパク質−ＲＧＭａ断片複合体を形成する、（ｃ）サンプルを検出結合タンパク質と接触させるステップと、ここで、検出結合タンパク質は、キャプチャー結合タンパク質と相互作用して、検出結合タンパク質−キャプチャー結合タンパク質ＲＧＭａ断片複合体を形成する、（ｄ）サンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片を検出し、定量化するステップとを含む。少なくとも１個のＲＧＭａ断片は約１ｋＤａ〜約６５ｋＤａのサイズを有するＲＧＭａ断片であり得る。ＲＧＭａ断片は１０ｋＤａ、１８ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、５０ｋＤａまたは６５ｋＤａのサイズを有し得る。ＲＧＭａ断片は１８ｋＤａのＲＧＭａ断片、３０ｋＤａのＲＧＭａ断片及び４０ｋＤａのＲＧＭａ断片からなる群から選択され得る。ステップ（ｂ）の前に、ゲル電気泳動を用いて、少なくとも１個のＲＧＭａ断片を分離してもよい。方法は更に、ステップ（ｂ）の前に、少なくとも１個のＲＧＭａ断片を膜に固定化してウェスタンブロッティング膜を生成し；ステップ（ｂ）においてウェスタンブロッティング膜をキャプチャー結合タンパク質と接触させるステップと、ここで、キャプチャー結合タンパク質は、ウェスタンブロッティング膜上に固定化した少なくとも１個のＲＧＭａ断片に結合して、キャプチャー結合タンパク質−ＲＧＭａ断片複合体を形成するステップ（ｃ）においてウェスタンブロッティング膜を検出結合タンパク質と接触させるステップと、ここで、検出結合タンパク質は、キャプチャー結合タンパク質と相互作用して、検出結合タンパク質−キャプチャー結合タンパク質ＲＧＭａ断片複合体を形成することを含む。少なくとも２個のＲＧＭａ断片を検出し得る。少なくとも２個のＲＧＭａ断片は、３０ｋＤａ及び４０ｋＤａのサイズを有し得る。少なくとも３個のＲＧＭａ断片を検出し得る。少なくとも３個のＲＧＭａ断片は１８ｋＤａ、３０ｋＤａ及び４０ｋＤａのサイズを有し得る。少なくとも１個のＲＧＭａ断片は可溶性ＲＧＭａ断片であり得る。ＲＧＭａ断片のサイズはＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定され得る。ＳＤＳ  ＰＡＧＥは４〜１５％であり得る。膜は、ニトロセルロース膜であり得る。キャプチャー結合タンパク質は、ＲＧＭａ選択的抗体であり得る。抗体は、ビオチン化ＲＧＭａ選択的抗体であり得る。検出結合タンパク質は、四価アビジンであり、検出可能標識は、ビオチン化ホースラディッシュペルオキシダーゼであり得る。ペルオキシダーゼ染色キットを用いて、少なくとも１個のＲＧＭａ断片が検出され得る。ＲＧＭａ断片は、ヒトＲＧＭａ断片であり得る。方法サンプルは脳脊髄液、血液、血清、または血漿を含み得る。
【０００７】
本発明は、サンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片を検出し、定量化する方法に関する。この方法は、（ａ）被験者から少なくとも１個のＲＧＭａ断片を含むサンプルを得るステップと、（ｂ）サンプルをキャプチャー結合タンパク質と接触させるステップと、ここで、キャプチャー結合タンパク質は、少なくとも１個のＲＧＭａ断片に結合して、キャプチャー結合タンパク質−ＲＧＭａ断片複合体を形成する、（ｃ）サンプルを検出結合タンパク質と接触させるステップと、ここで、検出結合タンパク質は、キャプチャー結合タンパク質と相互作用して、検出結合タンパク質−キャプチャー結合タンパク質ＲＧＭａ断片複合体を形成する、（ｄ）サンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片を検出し、定量化するステップとを含む。少なくとも１個のＲＧＭａ断片は約１ｋＤａ〜約６５ｋＤａのサイズを有するＲＧＭａ断片であり得る。ＲＧＭａ断片は１０ｋＤａ、１８ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、５０ｋＤａまたは６５ｋＤａのサイズを有し得る。ＲＧＭａ断片は１８ｋＤａのＲＧＭａ断片、３０ｋＤａのＲＧＭａ断片及び４０ｋＤａのＲＧＭａ断片からなる群から選択され得る。ステップ（ｂ）の前に、ゲル電気泳動を用いて、少なくとも１個のＲＧＭａ断片を分離してもよい。方法は、ステップ（ｂ）の前に、少なくとも１個のＲＧＭａ断片を膜に固定化してウェスタンブロッティング膜を作成させるステップと、ステップ（ｂ）においてウェスタンブロッティング膜をキャプチャー結合タンパク質と接触させるステップと、ここで、キャプチャー結合タンパク質は、ウェスタンブロッティング膜上に固定化した少なくとも１個のＲＧＭａ断片に結合して、キャプチャー結合タンパク質−ＲＧＭａ断片複合体を形成する、ステップ（ｃ）においてウェスタンブロッティング膜を検出結合タンパク質と接触させるステップと、ここで、検出結合タンパク質は、キャプチャー結合タンパク質と相互作用して、検出結合タンパク質−キャプチャー結合タンパク質ＲＧＭａ断片複合体を形成するステップとをさらに含む。少なくとも２個のＲＧＭａ断片を検出し得る。少なくとも２個のＲＧＭａ断片は、３０ｋＤａ及び４０ｋＤａのサイズを有し得る。少なくとも３個のＲＧＭａ断片を検出し得る。少なくとも３個のＲＧＭａ断片は１８ｋＤａ、３０ｋＤａ及び４０ｋＤａのサイズを有し得る。少なくとも１個のＲＧＭａ断片は可溶性ＲＧＭａ断片であり得る。方法は、ステップ（ｂ）においてゲル上でサンプル中のタンパク質と同時にＲＧＭａタンパク質標準を分離するステップと、（ｇ）少なくとも１個のＲＧＭａ断片を分離したＲＧＭａタンパク質標準と比較して、断片を定量化するステップとをさらに含む。ＲＧＭａタンパク質標準は組換えＲＧＭａ断片の勾配であり得る。勾配は、ＲＧＭａタンパク質標準１０、２５、５０、１００及び２００ｐｇ／ｍＬを含み得る。ＲＧＭａ断片のサイズはＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定され得る。ＳＤＳ  ＰＡＧＥは４〜１５％であり得る。膜は、ニトロセルロース膜であり得る。キャプチャー結合タンパク質は、ＲＧＭａ選択的抗体であり得る。抗体は、ビオチン化ＲＧＭａ選択的抗体であり得る。検出結合タンパク質は、四価アビジンであり、検出可能標識は���ビオチン化ホースラディッシュペルオキシダーゼであり得る。ペルオキシダーゼ染色キットを用いて、少なくとも１個のＲＧＭａ断片が検出され得る。ＲＧＭａ断片は、ヒトＲＧＭａ断片であり得る。方法サンプルは脳脊髄液、血液、血清、または血漿を含み得る。
【０００８】
本発明は、神経変性疾患に対する治療が必要な被験者における神経変性疾患に対する治療の有効性の判定方法に関する。この方法は、（ａ）被験者からのサンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片のレベルを、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法を用いて測定するステップと、（ｂ）被験者からのサンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片のレベルを少なくとも１個のＲＧＭａ断片の対照レベルと比較するステップと、ここで、少なくとも１個の断片のレベルが対照レベルと比較して高い場合、治療は、神経変性疾患の治療において無効であると判定され、少なくとも１個の断片のレベルが対照レベルと比較して同一であるかまたは低い場合、治療は、神経変性疾患の治療において有効であると判定されることを含み得る。少なくとも１個のＲＧＭａ断片の対照レベルは、神経変性疾患にかかっているが、神経変性疾患に対する治療を受けたことがない被験者中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片のレベルであり得る。治療は、神経回復薬、神経保護薬、または神経再生薬を含み得る。治療は、トリアムシノロンアセトニド（ＴＣＡ）、テクフィデラ／ＢＧ−１２（フマル酸ジメチル）、ジレニア（フィンゴリモド）、ラキニモド、β−インターフェロン、コパキソン、ダクリズマブ、アレムツズマブ、リツキシマブ、またはその組合せの少なくとも１つを含み得る。治療は、トリアムシノロンアセトニド（ＴＣＡ）を含み得る。少なくとも２個のＲＧＭａ断片を検出し得る。少なくとも２個のＲＧＭａ断片は、３０ｋＤａ及び４０ｋＤａのサイズを有し得る。少なくとも３個のＲＧＭａ断片を検出し得る。少なくとも３個のＲＧＭａ断片は１８ｋＤａ、３０ｋＤａ及び４０ｋＤａのサイズを有し得る。神経変性疾患または障害は、多発性硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、テイ−サックス病、ニーマン−ピック病、ゴーシェ病、ハーラー症候群、ハンチントン病、筋萎縮性側策硬化症、特発性炎症性脱髄疾患、ビタミンＢ１２欠乏症、橋中心髄鞘崩壊症、脊髄ろう、横断性脊髄炎、デビック病、進行性多巣性白質脳症、視神経炎、脊髄損傷、外傷性脳損傷、卒中、緑内障、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性、または白質ジストロフィーであり得る。神経変性疾患または障害は、多発性硬化症であり得る。ＲＧＭａ断片は、ヒトＲＧＭａ断片であり得る。方法サンプルは脳脊髄液、血液、血清、または血漿を含み得る。
【０００９】
本発明は、神経変性疾患に対する治療が必要な被験者における、神経変性疾患に対する治療の有効性の判定方法に関する。この方法は、（ａ）被験者からのサンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片のレベルを、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法を用いて測定するステップと、（ｂ）被験者からのサンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片のレベルを、少なくとも１個のＲＧＭａ断片の対照レベルと比較するステップとを含み、ここで、少なくとも１個の断片のレベルを対照レベルと比較して高い場合、治療は神経変性疾患の治療において無効であると判定され、少なくとも１個の断片のレベルが対照レベルと比較して同一であるかまたは低い場合、治療は神経変性疾患の治療において有効であると判定される。方法は神経変性疾患の治療が必要な被験者に対して、神経変性疾患の治療に有効であると判定された治療を施行し続けることをさらに含む。少なくとも１個のＲＧＭａ断片の対照レベルは、神経変性疾患にかかっているが、神経変性疾患に対する治療を受けたことがない被験者中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片のレベルであり得る。治療は、神経回復薬、神経保護薬、または神経再生薬を含み得る。治療はトリアムシノロンアセトニド（ＴＣＡ）、テクフィデラ／ＢＧ−１２（フマル酸ジメチル）、ジレニア（フィンゴリモド）、ラキニモド、β−インターフェロン、コパキソン、ダクリズマブ、アレムツズマブ、リツキシマブ、またはその組合せの少なくとも１つを含み得る。治療はトリアムシノロンアセトニド（ＴＣＡ）を含み得る。少なくとも２個のＲＧＭａ断片を検出し得る。少なくとも２個のＲＧＭａ断片は、３０ｋＤａ及び４０ｋＤａのサイズを有し得る。少なくとも３個のＲＧＭａ断片を検出し得る、少なくとも３個のＲＧＭａ断片は１８ｋＤａ、３０ｋＤａ及び４０ｋＤａのサイズを有し得る。神経変性疾患または障害は、多発性硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、テイ−サックス病、ニーマン−ピック病、ゴーシェ病、ハーラー症候群、ハンチントン病、筋萎縮性側策硬化症、特発性炎症性脱髄疾患、ビタミンＢ１２欠乏症、橋中心髄鞘崩壊症、脊髄ろう、横断性脊髄炎、デビック病、進行性多巣性白質脳症、視神経炎、脊髄損傷、外傷性脳損傷、卒中、緑内障、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性、または白質ジストロフィーであり得る。神経変性疾患または障害は、多発性硬化症であり得る。ＲＧＭａ断片は、ヒトＲＧＭａ断片であり得る。方法サンプルは脳脊髄液、血液、血清、または血漿を含み得る。
【００１０】
本発明は、神経変性疾患を患っている被験者の治療に対する応答性の予測方法に関する。この方法は、（ａ）被験者からのサンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片のレベルを、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法を用いて測定するステップと、（ｂ）被験者からのサンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片のレベルを少なくとも１個のＲＧＭａ断片の対照レベルと比較するステップと；（ｃ）サンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片のレベルが対照レベルと比較して低い場合、被験者の治療に対する応答性の予測を与えるステップとを含む。治療は神経回復薬、神経保護薬、または神経再生薬を含み得る。治療はトリアムシノロンアセトニド（ＴＣＡ）、テクフィデラ／ＢＧ−１２（フマル酸ジメチル）、ジレニア（フィンゴリモド）、ラキニモド、β−インターフェロン、コパキソン、ダクリズマブ、アレムツズマブ、リツキシマブ、またはその組合せの少なくとも１つを含み得る。治療はトリアムシノロンアセトニド（ＴＣＡ）を含み得る。少なくとも２個のＲＧＭａ断片を検出し得る。少なくとも２個のＲＧＭａ断片は、３０ｋＤａ及び４０ｋＤａのサイズを有し得る。少なくとも３個のＲＧＭａ断片を検出し得る。少なくとも３個のＲＧＭａ断片は１８ｋＤａ、３０ｋＤａ及び４０ｋＤａのサイズを有し得る。神経変性疾患または障害は、多発性硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、テイ−サックス病、ニーマン−ピック病、ゴーシェ病、ハーラー症候群、ハンチントン病、筋萎縮性側策硬化症、特発性炎症性脱髄疾患、ビタミンＢ１２欠乏症、橋中心髄鞘崩壊症、脊髄ろう、横断性脊髄炎、デビック病、進行性多巣性白質脳症、視神経炎、脊髄損傷、外傷性脳損傷、卒中、緑内障、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性、または白質ジストロフィーであり得る。神経変性疾患または障害は、多発性硬化症であり得る。ＲＧＭａ断片は、ヒトＲＧＭａ断片であり得る。方法サンプルは脳脊髄液、血液、血清、または血漿を含み得る。
【００１１】
本発明は、神経変性疾患を患っている被験者の治療に対する応答性の予測方法に関する。この方法は、（ａ）被験者からのサンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片のレベルを、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法を用いて測定するステップと（ｂ）被験者からのサンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片のレベルを少なくとも１個のＲＧＭａ断片の対照レベルと比較するステップと；（ｃ）サンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片のレベルを対照レベルと比較して低い場合、被験者の治療に対する応答性の予測を与えるステップとを含む。方法は治療に対して応答すると予測された被験者に対して治療を施行することをさらに含む。治療は、神経回復薬、神経保護薬、または神経再生薬を含み得る。治療はトリアムシノロンアセトニド（ＴＣＡ）、テクフィデラ／ＢＧ−１２（フマル酸ジメチル）、ジレニア（フィンゴリモド）、ラキニモド、β−インターフェロン、コパキソン、ダクリズマブ、アレムツズマブ、リツキシマブ、またはその組合せの少なくとも１つを含み得る。治療はトリアムシノロンアセトニド（ＴＣＡ）を含み得る。少なくとも２個のＲＧＭａ断片を検出し得る。少なくとも２個のＲＧＭａ断片は、３０ｋＤａ及び４０ｋＤａのサイズを有し得る。少なくとも３個のＲＧＭａ断片を検出し得る。少なくとも３個のＲＧＭａ断片は１８ｋＤａ、３０ｋＤａ及び４０ｋＤａのサイズを有し得る。神経変性疾患または障害は、多発性硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、テイ−サックス病、ニーマン−ピック病、ゴーシェ病、ハーラー症候群、ハンチントン病、筋萎縮性側策硬化症、特発性炎症性脱髄疾患、ビタミンＢ１２欠乏症、橋中心髄鞘崩壊症、脊髄ろう、横断性脊髄炎、デビック病、進行性多巣性白質脳症、視神経炎、脊髄損傷、外傷性脳損傷、卒中、緑内障、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性、または白質ジストロフィーであり得る。神経変性疾患または障害は、多発性硬化症であり得る。ＲＧＭａ断片は、ヒトＲＧＭａ断片であり得る。方法サンプルは脳脊髄液、血液、血清、または血漿を含み得る。
【００１２】
本発明は、神経変性疾患を患っている被験者の治療方法に関する。この方法は、（ａ）被験者からのサンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片のレベルを、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法を用いて測定するステップと、（ｂ）被験者からのサンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片のレベルを少なくとも１個のＲＧＭａ断片の対照レベルと比較するステップと；（ｃ）断片のレベルが対照レベルと比較して高い場合、被験者に対して治療レジメンを投与するステップとを含む。治療は神経回復薬、神経保護薬、または神経再生薬を含み得る。治療はトリアムシノロンアセトニド（ＴＣＡ）、テクフィデラ／ＢＧ−１２（フマル酸ジメチル）、ジレニア（フィンゴリモド）、ラキニモド、β−インターフェロン、コパキソン、ダクリズマブ、アレムツズマブ、リツキシマブ、またはその組合せの少なくとも１つを含み得る。治療はトリアムシノロンアセトニド（ＴＣＡ）を含み得る。少なくとも２個のＲＧＭａ断片を検出し得る。少なくとも２個のＲＧＭａ断片は、３０ｋＤａ及び４０ｋＤａのサイズを有し得る。少なくとも３個のＲＧＭａ断片を検出し得る。少なくとも３個のＲＧＭａ断片は１８ｋＤａ、３０ｋＤａ及び４０ｋＤａのサイズを有し得る。神経変性疾患または障害は、多発性硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、テイ−サックス病、ニーマン−ピック病、ゴーシェ病、ハーラー症候群、ハンチントン病、筋萎縮性側策硬化症、特発性炎症性脱髄疾患、ビタミンＢ１２欠乏症、橋中心髄鞘崩壊症、脊髄ろう、横断性脊髄炎、デビック病、進行性多巣性白質脳症、視神経炎、脊髄損傷、外傷性脳損傷、卒中、緑内障、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性、または白質ジストロフィーであり得る。神経変性疾患または障害は、多発性硬化症であり得る。ＲＧＭａ断片は、ヒトＲＧＭａ断片であり得る。方法サンプルは脳脊髄液、血液、血清、または血漿を含み得る。
【００１３】
本発明は、神経変性疾患を患っている被験者に対する治療レジメンの最適化方法に関する。この方法は、（ａ）被験者から得られた第１サンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第１レベルを請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法を用いて測定するステップと、ここで、第１サンプルは、被験者が治療レジメンを始める前またはその間の時点で被験者から採取される；（ｂ）ステップ（ａ）より後の時点で被験者から得られた第２サンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第２レベルを測定するステップと、ここで、少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第２レベルが少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第１レベルと比較して低いことは当該治療レジメンが神経変性疾患に対して治療効果を有していることを示し；（ｃ）被験者からの第１サンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片のレベルを請求項１に記載の方法を用いて測定するステップと、（ｄ）被験者からのサンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片のレベルを、少なくとも１個のＲＧＭａ断片の対照レベルと比較するステップと；（ｅ）サンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片のレベルが対照レベルと比較して低い場合、被験者の治療に対する応答性の予測を与えるステップとを含む。治療レジメンは、神経回復治療レジメンであり得る。神経回復治療レジメンの成功率を向上させ得る。治療レジメンは、神経保護治療レジメンであり得る。神経保護治療レジメンの成功率を向上させ得る。少なくとも２個のＲＧＭａ断片を検出し得る。少なくとも２個のＲＧＭａ断片は、３０ｋＤａ及び４０ｋＤａのサイズを有し得る。少なくとも３個のＲＧＭａ断片を検出し得る。少なくとも３個のＲＧＭａ断片は１８ｋＤａ、３０ｋＤａ及び４０ｋＤａのサイズを有し得る。神経変性疾患または障害は、多発性硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、テイ−サックス病、ニーマン−ピック病、ゴーシェ病、ハーラー症候群、ハンチントン病、筋萎縮性側策硬化症、特発性炎症性脱髄疾患、ビタミンＢ１２欠乏症、橋中心髄鞘崩壊症、脊髄ろう、横断性脊髄炎、デビック病、進行性多巣性白質脳症、視神経炎、脊髄損傷、外傷性脳損傷、卒中、緑内障、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性、または白質ジストロフィーであり得る。神経変性疾患または障害は、多発性硬化症であり得る。ＲＧＭａ断片は、ヒトＲＧＭａ断片であり得る。方法サンプルは脳脊髄液、血液、血清、または血漿を含み得る。
【００１４】
本発明は、神経変性疾患を患っている被験者の再生促進薬物治療のモニタリング方法に関する。この方法は、（ａ）被験者から得られた第１サンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第１レベルを請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法を用いて測定するステップと、ここで、第一サンプルは、被験者が薬物治療を始める前またはその間の時点で被験者から採取される、（ｂ）ステップ（ａ）の後の時点で被験者から得られた第２サンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第２レベルを測定するステップと、ここで、少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第２レベルが少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第１レベルと比較して低いことは薬物治療レジメンが神経変性疾患に対して治療効果を有していることを示し、少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第２レベルが少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第１レベルと比較して高いことは薬物治療レジメンが神経変性疾患に対して治療効果を有していないことを示し；（ｃ）薬物治療レジメンが神経変性疾患に対して治療効果を有していない場合、別の治療を被験者に対して施行するステップとを含む。少なくとも２個のＲＧＭａ断片を検出し得る。少なくとも２個のＲＧＭａ断片は、３０ｋＤａ及び４０ｋＤａのサイズを有し得る。少なくとも３個のＲＧＭａ断片を検出し得る。少なくとも３個のＲＧＭａ断片は１８ｋＤａ、３０ｋＤａ及び４０ｋＤａのサイズを有し得る。神経変性疾患または障害は、多発性硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、テイ−サックス病、ニーマン−ピック病、ゴーシェ病、ハーラー症候群、ハンチントン病、筋萎縮性側策硬化症、特発性炎症性脱髄疾患、ビタミンＢ１２欠乏症、橋中心髄鞘崩壊症、脊髄ろう、横断性脊髄炎、デビック病、進行性多巣性白質脳症、視神経炎、脊髄損傷、外傷性脳損傷、卒中、緑内障、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性、または白質ジストロフィーであり得る。神経変性疾患または障害は、多発性硬化症であり得る。ＲＧＭａ断片は、ヒトＲＧＭａ断片であり得る。方法サンプルは脳脊髄液、血液、血清、または血漿を含み得る。
【００１５】
本発明は、神経変性疾患に対する治療効果についての化合物のスクリーニング方法に関する。この方法は、（ａ）細胞を含むサンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第１レベルを請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法を用いて測定するステップと、（ｂ）サンプルを化合物と接触させるステップと；（ｃ）ステップ（ｂ）より後の時点で被験者から得られた第２サンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第２レベルを測定するステップと、ここで、少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第２レベルが少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第１レベルと比較して低いことは該化合物が神経変性疾患に対して治療効果を有していることを示し、少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第２レベルが少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第１レベルと比較して高いことは該化合物が神経変性疾患に対して治療効果を有していないことを示し；（ｄ）治療効果を有するとして同定された化合物を選択するステップとを含む。少なくとも２個のＲＧＭａ断片を検出し得る。少なくとも２個のＲＧＭａ断片は、３０ｋＤａ及び４０ｋＤａのサイズを有し得る。少なくとも３個のＲＧＭａ断片を検出し得る。少なくとも３個のＲＧＭａ断片は１８ｋＤａ、３０ｋＤａ及び４０ｋＤａのサイズを有し得る。神経変性疾患または障害は、多発性硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、テイ−サックス病、ニーマン−ピック病、ゴーシェ病、ハーラー症候群、ハンチントン病、筋萎縮性側策硬化症、特発性炎症性脱髄疾患、ビタミンＢ１２欠乏症、橋中心髄鞘崩壊症、脊髄ろう、横断性脊髄炎、デビック病、進行性多巣性白質脳症、視神経炎、脊髄損傷、外傷性脳損傷、卒中、緑内障、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性、または白質ジストロフィーであり得る。神経変性疾患または障害は、多発性硬化症であり得る。ＲＧＭａ断片は、ヒトＲＧＭａ断片であり得る。方法サンプルは脳脊髄液、血液、血清、または血漿を含み得る。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】１８、３０及び４０ｋＤａの断片（ａ，ｂ，ｃ，実線の矢印）を生成するプロタンパク質変換酵素ＳＫＩ−１及びフーリンによるＲＧＭａの切断を示す。
【図２】進行性ＭＳ患者のＣＳＦ中に存在するＲＧＭａ断片を示す。
【図３Ａ】ＴＣＡ治療中に即時応答した１７人の患者の臨床データを改善されたＥＤＳＳで示す。データはすべて平均値±ＳＥＭ（平均値の標準誤差）として示す；＊＝ｐ＜０．０５；＊＊＝ｐ＜０．０１；＊＊＊＝ｐ＜０．００１；＊＝事後解析からのｐ値の有意差レベル；Ｉ＝第１回ＴＣＡ投与前のベースライン；ＩＩ＝第２回ＴＣＡ投与前；ＩＩＩ＝第３回ＴＣＡ投与前；ＩＶ＝第４回ＴＣＡ投与前；Ｖ＝第５回ＴＣＡ投与前；ＶＩ＝第６回ＴＣＡ投与前。
【図３Ｂ】ＴＣＡ治療中に即時応答した１７人の患者の臨床データを改善された歩行距離で示す。データはすべて平均値±ＳＥＭ（平均値の標準誤差）として示す；＊＝ｐ＜０．０５；＊＊＝ｐ＜０．０１；＊＊＊＝ｐ＜０．００１；＊＝事後解析からのｐ値の有意差レベル；Ｉ＝第１回ＴＣＡ投与前のベースライン；ＩＩ＝第２回ＴＣＡ投与前；ＩＩＩ＝第３回ＴＣＡ投与前；ＩＶ＝第４回ＴＣＡ投与前；Ｖ＝第５回ＴＣＡ投与前；ＶＩ＝第６回ＴＣＡ投与前。
【図３Ｃ】ＴＣＡ治療中に即時応答した１７人の患者の臨床データを改善された歩行速度で示す。データはすべて平均値±ＳＥＭ（平均値の標準誤差）として示す；＊＝ｐ＜０．０５；＊＊＝ｐ＜０．０１；＊＊＊＝ｐ＜０．００１；＊＝事後解析からのｐ値の有意差レベル；Ｉ＝第１回ＴＣＡ投与前のベースライン；ＩＩ＝第２回ＴＣＡ投与前；ＩＩＩ＝第３回ＴＣＡ投与前；ＩＶ＝第４回ＴＣＡ投与前；Ｖ＝第５回ＴＣＡ投与前；ＶＩ＝第６回ＴＣＡ投与前。
【図４Ａ】ＴＣＡ適用の反復に対して即時応答しない８人の患者の臨床データを改善のないＥＤＳＳで示す。データはすべて平均値±ＳＥＭ（平均値の標準誤差）として示す。Ｉ＝第１回ＴＣＡ投与前のベースライン；ＩＩ＝第２回ＴＣＡ投与前；ＩＩＩ＝第３回ＴＣＡ投与前；ＩＶ＝第４回ＴＣＡ投与前；Ｖ＝第5回ＴＣＡ投与前。
【図４Ｂ】ＴＣＡ適用の反復に対して即時応答しない８人の患者の臨床データを改善のない歩行距離で示す。データはすべて平均値±ＳＥＭ（平均値の標準誤差）として示す。Ｉ＝第１回ＴＣＡ投与前のベースライン；ＩＩ＝第２回ＴＣＡ投与前；ＩＩＩ＝第３回ＴＣＡ投与前；ＩＶ＝第４回ＴＣＡ投与前；Ｖ＝第5回ＴＣＡ投与前。
【図４Ｃ】ＴＣＡ適用の反復に対して即時応答しない８人の患者の臨床データを改善のない歩行速度（図４Ｃ）で示す。データはすべて平均値±ＳＥＭ（平均値の標準誤差）として示す。Ｉ＝第１回ＴＣＡ投与前のベースライン；ＩＩ＝第２回ＴＣＡ投与前；ＩＩＩ＝第３回ＴＣＡ投与前；ＩＶ＝第４回ＴＣＡ投与前；Ｖ＝第5回ＴＣＡ投与前。
【図５Ａ】ＴＣＡ治療に対する即時応答者の脳脊髄液中のＲＧＭａ濃度（４０ｋＤａ）の変化を示す。データはすべて平均値±ＳＥＭとして示す；＊＝ｐ＜０．０５；＊＊＝ｐ＜０．０１；＊＊＊＝ｐ＜０．００１；＊＝事後解析からのｐ値の有意差レベル；Ｉ＝第１回ＴＣＡ投与前のベースライン；ＩＩ＝第２回ＴＣＡ投与前；ＩＩＩ＝第３回ＴＣＡ投与前；ＩＶ＝第４回ＴＣＡ投与前。
【図５Ｂ】ＴＣＡ治療に対する即時応答者の脳脊髄液中のＲＧＭａ濃度（３０ｋＤａ）の変化を示す。データはすべて平均値±ＳＥＭとして示す；＊＝ｐ＜０．０５；＊＊＝ｐ＜０．０１；＊＊＊＝ｐ＜０．００１；＊＝事後解析からのｐ値の有意差レベル；Ｉ＝第１回ＴＣＡ投与前のベースライン；ＩＩ＝第２回ＴＣＡ投与前；ＩＩＩ＝第３回ＴＣＡ投与前；ＩＶ＝第４回ＴＣＡ投与前。
【図５Ｃ】ＴＣＡ治療に対する即時応答者の脳脊髄液中のタンパク質濃度の変化を示す。データはすべて平均値±ＳＥＭとして示す；＊＝ｐ＜０．０５；＊＊＝ｐ＜０．０１；＊＊＊＝ｐ＜０．００１；＊＝事後解析からのｐ値の有意差レベル；Ｉ＝第１回ＴＣＡ投与前のベースライン；ＩＩ＝第２回ＴＣＡ投与前；ＩＩＩ＝第３回ＴＣＡ投与前；ＩＶ＝第４回ＴＣＡ投与前。
【図６】ＴＣＡ適用に対して即時応答した１７人の患者から採取したＲＧＭａ  ＣＳＦレベルのデンシトメトリー分析についての３つの代表的ウェスタンブロットをヒストグラムで示す。
【図７Ａ】ＴＣＡ治療に対して即時応答しないＭＳ患者の脳脊髄液中のＲＧＭａ濃度（４０ｋＤａ）を示す。データはすべて平均値±ＳＥＭとして示す；＊＝ｐ＜０．０５；＊＊＝ｐ＜０．０１；＊＊＊＝ｐ＜０．００１；＊＝事後解析からのｐ値の有意差レベル；Ｉ＝第１回ＴＣＡ投与前のベースライン；ＩＩ＝第２回ＴＣＡ投与前；ＩＩＩ＝第３回ＴＣＡ投与前；ＩＶ＝第４回ＴＣＡ投与前。
【図７Ｂ】ＴＣＡ治療に対して即時応答しないＭＳ患者の脳脊髄液中のＲＧＭａ濃度（３０ｋＤａ）を示す。データはすべて平均値±ＳＥＭとして示す；＊＝ｐ＜０．０５；＊＊＝ｐ＜０．０１；＊＊＊＝ｐ＜０．００１；＊＝事後解析からのｐ値の有意差レベル；Ｉ＝第１回ＴＣＡ投与前のベースライン；ＩＩ＝第２回ＴＣＡ投与前；ＩＩＩ＝第３回ＴＣＡ投与前；ＩＶ＝第４回ＴＣＡ投与前。
【図７Ｃ】ＴＣＡ治療に対して即時応答しないＭＳ患者の脳脊髄液中のタンパク質濃度を示す。データはすべて平均値±ＳＥＭとして示す；＊＝ｐ＜０．０５；＊＊＝ｐ＜０．０１；＊＊＊＝ｐ＜０．００１；＊＝事後解析からのｐ値の有意差レベル；Ｉ＝第１回ＴＣＡ投与前のベースライン；ＩＩ＝第２回ＴＣＡ投与前；ＩＩＩ＝第３回ＴＣＡ投与前；ＩＶ＝第４回ＴＣＡ投与前。
【図８】ＴＣＡ適用に対して即時応答しない８人の患者から採取したＲＧＭａ  ＣＳＦレベルのデンシトメトリー分析についての３つの代表的ウェスタンブロットをヒストグラムで示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、ＲＧＭａ断片のレベルを分析し、被験者の神経変性疾患に対する治療レジメンが必要な被験者における、神経変性疾患に対する治療レジメンを判定し、最適化し、予測し、モニターするためのアッセイに関する。ＲＧＭａ断片ベース診断アッセイは具体的サイズの特定ＲＧＭａ断片を検出するために使用され得る。内因性及び組換えＲＧＭａ断片の免疫検出は、神経変性疾患を患っているかまたはその症状を呈している被験者における治療を判定し、最適化し、予測し、モニターするために使用され得る。ＲＧＭａ断片ベース診断アッセイは、ＣＳＦ、血液、血清及び血漿のようなヒト体液中に存在している可溶性再生抑制ＲＧＭａ断片の濃度を少量用いて定量的に測定する。この診断アッセイは高感度（ヒト材料中の低ピコグラム（ｐｇ）量のＲＧＭａを検出）を与え、ＲＧＭａタンパク質標準と組み合わせて多発性硬化症のような神経変性疾患を患っている患者の体液中のＲＧＭａ濃度を同定するための定量ツールである。加えて、このアッセイはＲＧＭａの別の断片を区別し、疾患の進行中にこれらの断片のパターンシフトをモニターすることができる。従って、神経回復薬物トライアルにおける患者層化のための手段、再生促進薬に対して積極的に応答し得る患者を追跡するための手段、前記トライアルにおける非応答者を同定するための手段、神経回復治療作戦を最適化するための手段、及び神経回復薬アプローチの成功率を向上させるための手段を与えるので、この方法は全ＲＧＭタンパク質のみを調べる現在のテクノロジーに比して優れている。
【００１８】
本セクションで使用されているセクションの見出し及びこの中の全開示内容は系統立ての目的のみであり、限定的と意図されない。
【００１９】
１．定義
別段の定めがない限り、本明細書中で使用されているすべての技術用語及び科学用語は、当業者が通常理解しているのと同じ意味を有する。矛盾する場合、定義を含めた本明細書が支配する。好ましい方法及び材料が以下に記載されているが、本明細書中に記載されているものと類似または均等の方法及び材料が本発明の実施または試験の際に使用され得る。本明細書中に挙げられているすべての刊行物、特許出願明細書、特許文献及び他の文献は全文を参照により組み入れる。本明細書中に開示されている材料、方法及び例は例示に過ぎず、限定的と意図されない。
【００２０】
本明細書中で使用されている単数形“ａ”、“ａｎ”及び“ｔｈｅ”は文脈上そうでないとする明確な指示がない限り、複数形を含む。本明細書中の数値の範囲を列挙する場合もその間にある各数値は同一の精度で明示的に意図される。例えば、範囲６〜９の場合には６及び９に加えて数値７及び８が考えられ、範囲６．０〜７．０の場合には数値６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９及び７．０が明示的に意図される。
【００２１】
「または」の使用は、特に言及のない限り「及び／または」を意味する。更に、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、並びにこれらの用語の他の形、例えば“ｉｎｃｌｕｄｅｓ”、“ｉｎｃｌｕｄｅｄ”、“ｈａｓ”及び“ｈａｖｅ”は限定的でない。
【００２２】
明細書及び特許請求の範囲中で使用されている場合、次の用語は以下の意味を有する：
本明細書中で使用されている用語「対照被験者」は健康な被験者、すなわち多発性硬化症（ＭＳ）のような神経変性疾患の臨床兆候または症状を有していない被験者を意味する。対照被験者は、ＭＳの兆候または症状が他の方法で不検出であると臨床的に評価されており、その評価にはルーチンの身体検査及び／または臨床検査が含まれ得る。本明細書中で使用されている「対照群」は対照被験者または健康被験者の群、すなわちＭＳのような神経変性疾患の臨床兆候または症状を持たない被験者の群を指す。
【００２３】
本明細書中で使用されている「サンプル」、「生体サンプル」、「試験サンプル」、「標本」、「被験者からのサンプル」及び「患者サンプル」は互換可能に使用され得、血液、組織、尿、血清、血漿、羊水、脳脊髄液、胎盤細胞または組織、内皮細胞、白血球または単球のサンプルであり得る。サンプルは患者から入手したまま直接使用しても、または本明細書中で検討されているかまたは当業界で公知である幾つかの方法でサンプルの特徴を修飾するために、例えば濾過、蒸留、抽出、濃縮、遠心、干渉成分の不活化、試薬の添加等により前処理してもよい。
【００２４】
本明細書中で使用されている用語「被験者」、「患者」または「方法における被験者」は互換可能に脊椎動物を意味し、脊椎動物には哺乳動物（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、家兔、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット及びマウス）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザルまたはアカゲザルのようなサル、チンパンジー）、及びヒトが含まれるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、被験者はヒトまたは非ヒトであり得る。幾つかの実施形態では、被験者はＭＳのような神経変性疾患を発症するリスクがあるかまたはそのリスクがあると疑われている、または既に発症しているヒト被験者であり得る。
【００２５】
本明細書中で使用されている用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療した（ｔｒｅａｔｅｄ）」、または「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、対象者が望ましくない生理的状態、障害または疾患を鈍化させる（緩和する）、または有利なまたは望ましい臨床結果を得る治療を指す。本発明の目的のために、有利なまたは望ましい臨床結果には、症状の緩和；状態、障害または疾患の程度の減少；状態、障害または疾患の状態の安定化（すなわち、悪化せず）；状態、障害または疾患の発症の遅れまたは進行の遅延；状態、障害または疾患状態の緩和；及び検出できるかまたは検出できない（部分的または全体的）寛解、或いは状態、障害または疾患の強化または改善が含まれるが、これらに限定されない。治療には、治療を受けていない場合の予想される生存と比較して延長した生存も含まれる。
【００２６】
本明細書中に別段の定めがない限り、本開示に関連して使用されている科学及び技術用語は当業者が通常理解している意味を有する。例えば、本明細書中に記載されている細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、タンパク質及び核酸化学、及びハイブリダイゼーションに関連して使用されている専門用語及び技術は当業界で公知であり、通常使用されているものである。用語の意味及び範囲は明確でなければならない。しかしながら、潜在的な曖昧さがある場合には、本明細書中に記載されている定義が辞書または外部の定義に優先する。更に、文脈上別段の指定がない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含む。
【００２７】
２．ＲＧＭａ断片ベース診断アッセイ
本発明は、サンプル中のＲＧＭａ断片を定量化し、検出するための診断アッセイに関する。ＲＧＭａはＲＧＭａ断片であり得る。診断アッセイは少なくとも１個のＲＧＭａ断片を定量化し、検出し得る。ＲＧＭａは、４７アミノ酸（ａａ）シグナル配列、１２１ａａ  Ｎ末端プロセグメント、２５６成熟領域及び２６ａａ  Ｃ末端プロセグメントを含む４５０ａａ  プレプロタンパク質として合成される。Ｎ末端プロセグメントはＲＧＤトリペプチド及び分子のたった２個の可能性あるＮ連結グリコシル化部位を含む。成熟セグメントはフォン・ビルブランド因子ドメインに対して構造相同性を有する省略短縮ドメインを示す。タンパク質分解プロセッシングがアスパラギン酸−プロリン結合で起こり、予測３２ｋＤａ成熟領域が生ずる。ＧＰＩアンカーＲＧＭａタンパク質は、フーリン及びプロタンパク質変換酵素ＳＫＩ−１により多数の膜結合型可溶性断片にプロセッシングされ、このブロセッシングはその適切なインビボ機能のために必要である。
【００２８】
ＲＧＭａに対する受容体はネオゲニンであると報告されている。ＲＧＭ−Ａは骨形成タンパク質補助受容体であり、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５及びＢＭＰ−６に結合し得ることも判明している。ＲＧＭａの幾つかの異なる断片は、そのニューロン受容体ネオゲニンに結合することにより神経突起伸長抑制機能を発揮する。ネオゲニンは免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、４個のＮ末端免疫グロブリン様ドメイン（Ｉｇ）、６個のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮＩＩＩ）ドメイン、貫膜ドメイン及びＣ末端内部ドメインからなる。２個の異なるＲＧＭａ断片のＮ末端（３０ｋＤａ）及びＣ末端断片（４０ｋＤａ）は、配列相同性を欠くにもかかわらずネオゲニンの同一ＦＮＩＩＩドメイン（ドメイン３−４）に結合する。ＲＧＭａ断片はインビトロで神経突起伸長を抑制することが判明している。脊髄損傷モデルにおいてＲＧＭａ活性をポリクローナルＲＧＭａ抗体で中和すると長距離軸索再生が生じ、機能回復が改善された。脳卒中モデルでは、ＲＧＭａをダウンレギュレーションすると、神経保護が生じ、軸索誘導及び細胞分化における基本的役割のために公知であるネオゲニンを介して作用する機能回復が強化された。ヒトＣＳＦ中の２個の再生抑制性ＲＧＭａ断片（３０及び４０ｋＤａ）の存在から、これらのタンパク質が進行性ＭＳ患者における再生失敗及び神経変性に寄与することが示唆される。ＭＳ患者では、ＲＧＭａは脳及び脊髄中で未熟及び成熟樹状細胞により発現する。ＲＧＭａはＣＤ６８陽性マクロファージ及びＣＤ４陽性Ｔリンパ球上で発現するので、免疫系において、例えばミクログリア細胞上またはＴ細胞応答の調節においても役割を有し得る。脳では、活性化ミクログリア細胞はその表面上でＲＧＭａを発現し、ミクログリアＲＧＭａ発現が低下するとインビトロ及びインビボの両方で軸索成長が高まる。加えて、ＲＧＭａ遺伝子はＭＳ患者及び実験的自己免疫脳脊髄炎で誘導したあるラットの緊張で疾患関連遺伝子として同定された。
【００２９】
診断アッセイは、被験者から少なくとも１個のＲＧＭａ断片を含むサンプルを入手し；サンプルをキャプチャー結合タンパク質と接触させ、ここで、キャプチャー結合タンパク質は、少なくとも１個のＲＧＭａ断片と結合して、キャプチャー結合タンパク質−ＲＧＭａ断片複合体を形成する、サンプルを検出結合タンパク質と接触させ、ここで、検出結合タンパク質は、キャプチャー結合タンパク質と相互作用して、検出結合タンパク質−キャプチャー結合タンパク質ＲＧＭａ断片複合体を形成する、サンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片を検出し、定量化することを含む。少なくとも１個のＲＧＭａ断片は約１ｋＤａ〜約６５ｋＤａのサイズを有し得る。少なくとも１個のＲＧＭａ断片は約１０ｋＤａ、約１８ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約３０ｋＤａ、約４０ｋＤａ、約５０ｋＤａまたは約６５ｋＤａのサイズを有し得る。少なくとも１個のＲＭＧａ断片は１８ｋＤａのＲＧＭａ断片、３０ｋＤａのＲＧＭａ断片及び４０ｋＤａのＲＧＭａ断片からなる群から選択され得る。少なくとも１個のＲＧＭａ断片はサンプルの他の成分、例えば異なるサイズを有する他のＲＧＭａ断片から分離され得る。幾つかの実施形態では、アッセイはゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィーや質量分光法のような分離技術を用いてサイズに応じて断片を分離することを含む。
【００３０】
ａ．ＲＧＭａ断片
ＲＧＭａを診断アッセイにより検出する。ＲＧＭａはＲＧＭａ断片であり得る。アッセイは少なくとも１個のＲＧＭａ断片を検出し得る。
【００３１】
ＲＧＭａは、Ｎ末端アミノ酸１６８でＮ末端ドメイン内で２個のプロテアーゼのプロタンパク質変換酵素ＳＫＩ−１及びフーリンにより切断されて、機能的に活性なタンパク質及び１８、３０及び４０ｋＤａの活性断片が生ずる（図１）。３０ｋＤａ断片はジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ）を介して膜結合型Ｃ末端４０ｋＤａ断片にリンクしている。Ｃ末端（矢印，シェディング）ＧＰＩアンカードメイン内で切断すると、ＲＧＭａの可溶性形態を形成する３個の断片が遊離する。切断がＣ末端でシェダーゼ及びＧＰＩアンカーを切断する酵素により起こると、これらの断片の可溶性形態が生ずる。膜アンカー形態のように、これら３個の可溶性断片（１８ｋＤａ＝末端切断型Ｎ末端ドメイン，３０ｋＤａ＝Ｎ末端ドメイン，４０ｋＤａ＝Ｃ末端ドメイン）はすべて神経突起伸長及び再生インヒビターとして活性である。
【００３２】
ＲＧＭａ断片ベース診断アッセイは、約１ｋＤａ〜約６５ｋＤａのサイズを有する少なくとも１個のＲＧＭａ断片を検出し得る。ＲＧＭａ断片は約１ｋＤａ、約２ｋＤａ、約３ｋＤａ、約４ｋＤａ、約５ｋＤａ、約６ｋＤａ、約７ｋＤａ、約８ｋＤａ、約９ｋＤａ、約１０ｋＤａ、約１１ｋＤａ、約１２ｋＤａ、約１３ｋＤａ、約１４ｋＤａ、約１５ｋＤａ、約１６ｋＤａ、約１７ｋＤａ、約１８ｋＤａ、約１９ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約２１ｋＤａ、約２２ｋＤａ、約２３ｋＤａ、約２４ｋＤａ、約２５ｋＤａ、約２６ｋＤａ、約２７ｋＤａ、約２８ｋＤａ、約２９ｋＤａ、約３０ｋＤａ、約３１ｋＤａ、約３２ｋＤａ、約３３ｋＤａ、約３４ｋＤａ、約３５ｋＤａ、約３６ｋＤａ、約３７ｋＤａ、約３８ｋＤａ、約３９ｋＤａ、約４０ｋＤａ、約４１ｋＤａ、約４２ｋＤａ、約４３ｋＤａ、約４４ｋＤａ、約４５ｋＤａ、約４ｋＤａ、約４７ｋＤａ、約４８ｋＤａ、約４９ｋＤａ、約５０ｋＤａ、約５１ｋＤａ、約５２ｋＤａ、約５３ｋＤａ、約５４ｋＤａ、約５５ｋＤａ、約５６ｋＤａ、約５７ｋＤａ、約５８ｋＤａ、約５９ｋＤａ、約６０ｋＤａ、約６１ｋＤａ、約６２ｋＤａ、約６３ｋＤａ、約６４ｋＤａ、約６５ｋＤａ、またはその組合せであり得る。
【００３３】
ＲＧＭａ断片ベース診断アッセイは、少なくとも１個のＲＧＭａ断片、少なくとも２個のＲＧＭａ断片、少なくとも３個のＲＧＭａ断片、少なくとも４個のＲＧＭａ断片、少なくとも５個のＲＧＭａ断片、少なくとも６個のＲＧＭａ断片、または少なくとも７個のＲＧＭａ断片を検出し得る。ＲＧＭａ断片ベース診断アッセイは、１０ｋＤａのＲＧＭａ断片、１８ｋＤａのＲＧＭａ断片、２０ｋＤａのＲＧＭａ断片、３０ｋＤａのＲＧＭａ断片、４０ｋＤａのＲＧＭａ断片、５０ｋＤａのＲＧＭａ断片、６５ｋＤａのＲＧＭａ断片、またはその組合せを検出し得る。例えば、ＲＧＭａ断片ベース診断アッセイは、１０ｋＤａのＲＧＭａ断片；１８ｋＤａのＲＧＭａ断片；２０ｋＤａのＲＧＭａ断片；３０ｋＤａのＲＧＭａ断片；４０ｋＤａのＲＧＭａ断片；５０ｋＤａのＲＧＭａ断片；６５ｋＤａのＲＧＭａ断片；１０ｋＤａのＲＭＧａ断片及び１８ｋＤａのＲＧＭａ断片；１０ｋＤａのＲＭＧａ断片及び２０ｋＤａのＲＧＭａ断片；１０ｋＤａのＲＭＧａ断片及び３０ｋＤａのＲＧＭａ断片；１０ｋＤａのＲＭＧａ断片及び４０ｋＤａのＲＧＭａ断片；１０ｋＤａのＲＭＧａ断片及び５０ｋＤａのＲＧＭａ断片；１０ｋＤａのＲＭＧａ断片及び６０ｋＤａのＲＧＭａ断片；１８ｋＤａのＲＭＧａ断片及び２０ｋＤａのＲＧＭａ断片；１８ｋＤａのＲＭＧａ断片及び３０ｋＤａのＲＧＭａ断片；１８ｋＤａのＲＭＧａ断片及び４０ｋＤａのＲＧＭａ断片；１８ｋＤａのＲＭＧａ断片及び５０ｋＤａのＲＧＭａ断片；１８ｋＤａのＲＭＧａ断片及び６０ｋＤａのＲＧＭａ断片；２０ｋＤａのＲＭＧａ断片及び３０ｋＤａのＲＧＭａ断片；２０ｋＤａのＲＭＧａ断片及び４０ｋＤａのＲＧＭａ断片；２０ｋＤａのＲＭＧａ断片及び５０ｋＤａのＲＧＭａ断片；２０ｋＤａのＲＭＧａ断片及び６０ｋＤａのＲＧＭａ断片；３０ｋＤａのＲＭＧａ断片及び４０ｋＤａのＲＧＭａ断片；３０ｋＤａのＲＭＧａ断片及び５０ｋＤａのＲＧＭａ断片；３０ｋＤａのＲＭＧａ断片及び６０ｋＤａのＲＧＭａ断片；４０ｋＤａのＲＭＧａ断片及び５０ｋＤａのＲＧＭａ断片；４０ｋＤａのＲＭＧａ断片及び６０ｋＤａのＲＧＭａ断片；５０ｋＤａのＲＭＧａ断片及び６０ｋＤａのＲＧＭａ断片；１０ｋＤａのＲＧＭａ断片及び少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、または少なくとも６個の１８ｋＤａのＲＧＭａ断片、２０ｋＤａのＲＧＭａ断片、３０ｋＤａのＲＧＭａ断片、４０ｋＤａのＲＧＭａ断片、５０ｋＤａのＲＧＭａ断片または６５ｋＤａのＲＧＭａ断片；１８ｋＤａのＲＧＭａ断片及び少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、または少なくとも６個の１０ｋＤａのＲＧＭａ断片、２０ｋＤａのＲＧＭａ断片、３０ｋＤａのＲＧＭａ断片、４０ｋＤａのＲＧＭａ断片、５０ｋＤａのＲＧＭａ断片または６５ｋＤａのＲＧＭａ断片；２０ｋＤａのＲＧＭａ断片及び少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、または少なくとも６個の１０ｋＤａのＲＧＭａ断片、１８ｋＤａのＲＧＭａ断片、３０ｋＤａのＲＧＭａ断片、４０ｋＤａのＲＧＭａ断片、５０ｋＤａのＲＧＭａ断片または６５ｋＤａのＲＧＭａ断片；３０ｋＤａのＲＧＭａ断片及び少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、または少なくとも６個の１０ｋＤａのＲＧＭａ断片、１８ｋＤａのＲＧＭａ断片、２０ｋＤａのＲＧＭａ断片、４０ｋＤａのＲＧＭａ断片、５０ｋＤａのＲＧＭａ断片または６５ｋＤａのＲＧＭａ断片；４０ｋＤａのＲＧＭａ断片及び少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、または少なくとも６個の１０ｋＤａのＲＧＭａ断片、１８ｋＤａのＲＧＭａ断片、２０ｋＤａのＲＧＭａ断片、３０ｋＤａのＲＧＭａ断片、５０ｋＤａのＲＧＭａ断片または６５ｋＤａのＲＧＭａ断片；５０ｋＤａのＲＧＭａ断片及び少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、または少なくとも６個の１０ｋＤａのＲＧＭａ断片、１８ｋＤａのＲＧＭａ断片、２０ｋＤａのＲＧＭａ断片、３０ｋＤａのＲＧＭａ断片、４０ｋＤａのＲＧＭａ断片または６５ｋＤａのＲＧＭａ断片；６５ｋＤａのＲＧＭａ断片及び少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、または少なくとも６個の１０ｋＤａのＲＧＭａ断片、１８ｋＤａのＲＧＭａ断片、２０ｋＤａのＲＧＭａ断片、３０ｋＤａのＲＧＭａ断片、４０ｋＤａのＲＧＭａ断片または５０ｋＤａのＲＧＭａ断片を検出し得る。ＲＧＭａ断片ベース診断アッセイは、１８ｋＤａのＲＧＭａ断片、３０ｋＤａのＲＧＭａ断片及び４０ｋＤａのＲＧＭａ断片が以下に検討する抗ＲＧＭａ抗体のようなキャプチャー結合タンパク質に対する結合エピトーブ部位を保持している限り、これら３個の断片を検出し得る。
【００３４】
ｂ．断片検出
被験者からのサンプル中のＲＧＭａ断片は、該断片を分離し、その断片のサイズを測定するための各種手段により検出され、定量化され得る。断片は、ＲＧＭａ断片に特異的に結合するキャプチャー結合タンパク質、例えば抗ＲＧＭａ抗体のようなＲＧＭａ断片結合タンパク質を用いて検出され得る。キャプチャー結合タンパク質は、検出可能標識を有し得、または検出可能標識を有する検出結合タンパク質により認識される。検出可能標識によりＲＧＭａ断片を同定できる。
【００３５】
幾つかの実施形態では、ＲＧＭａ断片はＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウェスタンブロッティング分析を用いて同定、サイズ分け及び定量化され得る。幾つかの実施形態では、ＲＧＭａ断片はカラムクロマトグラフィー技術を用いて同定、サイズ分け及び定量化され得る。幾つかの実施形態では、ＲＧＭａ断片は質量分析法を用いて同定、サイズ分け及び定量化され得る。
【００３６】
キャプチャー結合タンパク質は、抗ＲＧＭａ抗体、例えばビオチン化ＲＧＭａ選択的抗体（ＢＡＦ２４５９  Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、または米国特許出願公開Ｎｏｓ．２００４／０１０２３７６、２０１０／００２８３４０、２０１１／０１３５６６４、２０１３／０３３０３４７及び２０１４／００２３６５９に記載されているＲＧＭａ抗体であり得る。ＲＧＭａ断片に結合する抗体は、ＡＢＣペルオキシダーゼ染色キット（Ｐｉｅｒｃｅ；３２０２０）または高感度ＥＣＬ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，３４０９４）とインキュベートした後可視化され、ＶｅｒｓａＤｏｃイメージャー（ＢｉｏＲａｄ）を用いてスキャンされ得る。体液中の組換えＲＧＭａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，２４５９−ＲＭ−０５０）及び１個のＲＧＭａ断片のバンド強度を定量化するためにＱｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．６．９（ＢｉｏＲａｄ）が使用され得る。
【００３７】
（１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウェスタンブロッティング
ＲＧＭａ断片ベース診断アッセイは、少なくとも１個のＲＧＭａ断片を膜に固定化してウェスタンブロッティング膜を作成させるステップと、ウェスタンブロッティング膜をキャプチャー結合タンパク質と接触させるステップと、ここで、キャプチャー結合タンパク質は、ウェスタンブロッティング膜上に固定化した少なくとも１個のＲＧＭａ断片に結合して、キャプチャー結合タンパク質−ＲＧＭａ断片複合体を形成する、ウェスタンブロッティング膜を検出結合タンパク質と接触させるステップと、ここで、検出結合タンパク質は、キャプチャー結合タンパク質と相互作用して、検出結合タンパク質−キャプチャー結合タンパク質ＲＧＭａ断片複合体を形成するステップとをさらに含み得る。
【００３８】
ＲＧＭａタンパク質標準マーカーを使用し、サンプルと同時にＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離し得る。少なくとも１個のＲＧＭａ断片結合強度をＲＧＭａタンパク質標準マーカーと比較して、ＲＧＭａ断片のサイズを測定し、及び／または少なくとも１個のＲＧＭａ断片の量を定量化する。ＲＧＭａタンパク質標準は組換えＲＧＭａ断片の勾配であり得る。幾つかの実施形態では、組換えＲＧＭａ断片の勾配は、１０、２５、５０、１００及び２００ｐｇ／ｍＬを含む。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは５％〜２５％  アクリルアミドを有し得る。幾つかの実施形態では、ＳＤＳ−ＰＡＧＥは４〜１５％  アクリルアミド勾配ゲルであり得る。膜は、ニトロセルロースまたはＰＶＤＦ膜であり得る。
【００３９】
３．ＲＧＭａ断片ベース診断アッセイの使用方法−診断、予測、または治療／予防治療の効果の評価
本発明では、ＲＧＭａ断片ベース診断アッセイの使用方法も提供する。方法は、その必要がある被験者からサンプルを入手することを含む。方法は、被験者から得たサンプル中の少なくとも１個の上記ＲＧＭａ断片の存在及び／またはレベルを検出するためにＲＧＭａ断片ベース診断アッセイを利用する。被験者は神経変性疾患を患っているかそのリスクを有し得る。
【００４０】
方法は、神経変性疾患に対する治療または治療レジメンの有効性を判定するためにＲＧＭａ断片ベース診断アッセイを利用する。他の実施形態では、方法は、神経変性疾患を患っている被験者の治療または治療レジメンに対する応答性を予測するためにＲＧＭａ断片ベース診断アッセイを利用する。幾つかの実施形態では、方法は、治療または治療レジメンを被験者に投与すべきかを判定するためにＲＧＭａ断片ベース診断アッセイを利用する。もっと他の実施形態では、方法は、神経変性疾患を患っている被験者に対する治療または治療レジメンを最適化するためにＲＧＭａ断片ベース診断アッセイを利用する。幾つかの実施形態では、方法は、神経変性疾患を患っている被験者の治療または治療レジメンをモニターするためにＲＧＭａ断片ベース診断アッセイを使用し得る。他の実施形態では、方法は、神経変性疾患に対して治療上有効である化合物をスクリーニングするためにＲＧＭａ断片ベース診断アッセイを利用する。
【００４１】
ａ．神経変性疾患
ＲＧＭａは、慢性疾患の神経変性及び進行と再生の間の相互作用のモジュレーターとして役割を発揮し得る。神経変性疾患はＲＧＭａの存在が疾患に関係している、すなわちＲＧＭａ活性が有害である疾患であり得る。例えば、ＲＧＭａは虚血損傷ヒト脳組織中、外傷性脳損傷を患っているヒトの病巣中、ＡＤ患者のプラーク領域中、パーキンソン病患者の黒質中、及びＭＳ患者中に見られた。神経変性疾患または障害は、多発性硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、テイ−サックス病、ニーマン−ピック病、ゴーシェ病、ハーラー症候群、ハンチントン病、筋萎縮性側策硬化症、特発性炎症性脱髄疾患、ビタミンＢ１２欠乏症、橋中心髄鞘崩壊症、脊髄ろう、横断性脊髄炎、デビック病、進行性多巣性白質脳症、視神経炎、脊髄損傷のようなＣＮＳに対する外傷性損傷、外傷性脳損傷、虚血性脳卒中のような卒中、緑内障、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性及び白質ジストロフィーであり得る。
【００４２】
（１）多発性硬化症
多発性硬化症（ＭＳ）は、脳内及び脳と身体間の情報の流れを分断する中枢神経系の身体障害性疾患である。ＭＳは、身体の免疫系の異常応答が脳、脊髄、網膜及び視神経から構成される中枢神経系（ＣＮＳ）に向けられている免疫媒介プロセスを伴う。この疾患は、その進行、及び炎症病巣のその顕著な大脳及び脊髄局在に関して各種サブタイプにより特徴づけられる。前記サブタイプには、再発寛解型ＭＳ（ＲＲＭＳ）、二次性進行型ＭＳ（ＳＰＭＳ）、一次性進行型ＭＳ（ＰＰＭＳ）及び進行再発型ＭＳ（ＰＲＭＳ）が含まれる。
【００４３】
ＲＲＭＳは、しばしば再発、再燃または憎悪と呼ばれる悪化する神経機能の明確に規定された発作の後、その間に症状が部分的または完全に改善され、疾患の明らかな進行がない部分的または完全回復期間（寛解）により特徴づけられる。ＳＰＭＳはＭＳの二次相として特徴づけられ、当初ＲＲＭＳ疾患経過を有していた個人で生ずる。ＳＰＭＳにかかっている個人は、疾患が次第にＲＲＭＳで見られる炎症プロセスから神経損傷または損失により特徴づけられるより着実に進行する相に徐々に変化するので、炎症に起因する再発を経験し続けることも、しないこともある。ＰＰＭＳは明確な再発または寛解期間なく神経機能の着実な悪化により特徴づけられる。ＰＰＭＳにかかっている個人はたまの停滞期または一時的な回復があるが、進行は続いている長期間にわたって変わり得る進行速度を有している。ＰＲＭＳは、ＰＲＭＳにかかっている個人がＲＲＭＳにかかっている人が経験するようなたまの回復に加えて、非常に初期から神経機能の着実な悪化を経験する点でＰＰＭＳに類似している。
【００４４】
用語「最初の臨床症状」（ＣＩＳ）は、少なくとも２４時間続き、中枢神経系の１つ以上の部位における炎症及び脱髄に起因している神経症状の第１エピソードを表すために使用される。ＣＩＳは、人が１つの病巣に起因する１つの神経兆候または症状を経験する単発性、または人が２つ以上の場所の病巣に起因する２つ以上の兆候または症状を経験する多発性であり得る。ＣＩＳを経験した人はＭＳを発症することも、しないこともある。長期間には、多くの患者は最後には神経変性を有する進行性くすぶり型慢性炎症性プロセスに至る。
【００４５】
ＭＳを患っているかまたは患っていると疑われる被験者は総合障害度評価スコア（ＥＤＳＳ）及び／または最大歩行距離及び／または歩行速度の評価を用いて評価または診断され得る。幾つかの実施形態では、低いＥＤＳＳスコア、増加した歩行距離及び／または低下した歩行速度を有する被験者は治療または治療レジメンが該被験者に対して有効であることを示し得る。
【００４６】
例えば、被験者のＥＤＳＳスコアが治療前の被験者のＥＤＳＳスコアと比較して少なくとも約０．１、少なくとも約０．２、少なくとも約０．３、少なくとも約０．４、少なくとも約０．５、少なくとも約０．６、少なくとも約０．７、少なくとも約０．８、少なくとも約０．９、少なくとも約１．０、少なくとも約２．０、少なくとも約３．０、少なくとも約４．０、少なくとも約５．０、または少なくとも約６．０低いことは、治療または治療レジメンが神経変性疾患に有効であることを示す。
【００４７】
例えば、被験者の歩行距離が約７０ｍ〜約１５０ｍ、約７０ｍ〜約１４５ｍ、約７０ｍ〜約１４０ｍ、約７０ｍ〜約１３５ｍ、約７０ｍ〜約１３０ｍ、約７０ｍ〜約１２５ｍ、約７０ｍ〜約１２０ｍ、約７０ｍ〜約１１５ｍ、約７０ｍ〜約１１０ｍ、約７０ｍ〜約１０５ｍ、約７０ｍ〜約１００ｍ、約７０ｍ〜約９５ｍ、約７０ｍ〜約９０ｍ、約７０ｍ〜約８５ｍ、約７０ｍ〜約８０ｍ、約７０ｍ〜約７５ｍ、約７５ｍ〜約１５０ｍ、約７５ｍ〜約１４５ｍ、約７５ｍ〜約１４０ｍ、約７５ｍ〜約１３５ｍ、約７５ｍ〜約１３０ｍ、約７５ｍ〜約１２５ｍ、約７５ｍ〜約１２０ｍ、約７５ｍ〜約１１５ｍ、約７５ｍ〜約１１０ｍ、約７５ｍ〜約１０５ｍ、約７５ｍ〜約１００ｍ、約７５ｍ〜約９５ｍ、約７５ｍ〜約９０ｍ、約７５ｍ〜約８５ｍ、約７５ｍ〜約８０ｍ、約８０ｍ〜約１５０ｍ、約８０ｍ〜約１４５ｍ、約８０ｍ〜約１４０ｍ、約８０ｍ〜約１３５ｍ、約８０ｍ〜約１３０ｍ、約８０ｍ〜約１２５ｍ、約８０ｍ〜約１２０ｍ、約８０ｍ〜約１１５ｍ、約８０ｍ〜約１１０ｍ、約８０ｍ〜約１０５ｍ、約８０ｍ〜約１００ｍ、約８０ｍ〜約９５ｍ、約８０ｍ〜約９０ｍ、約８０ｍ〜約８５ｍ、約８５ｍ〜約１５０ｍ、約８５ｍ〜約１４５ｍ、約８５ｍ〜約１４０ｍ、約８５ｍ〜約１３５ｍ、約８５ｍ〜約１３０ｍ、約８５ｍ〜約１２５ｍ、約８５ｍ〜約１２０ｍ、約８５ｍ〜約１１５ｍ、約８５ｍ〜約１１０ｍ、約８５ｍ〜約１０５ｍ、約８５ｍ〜約１００ｍ、約８５ｍ〜約９５ｍ、約８５ｍ〜約９０ｍ、約９０ｍ〜約１５０ｍ、約９０ｍ〜約１４５ｍ、約９０ｍ〜約１４０ｍ、約９０ｍ〜約１３５ｍ、約９０ｍ〜約１３０ｍ、約９０ｍ〜約１２５ｍ、約９０ｍ〜約１２０ｍ、約９０ｍ〜約１１５ｍ、約９０ｍ〜約１１０ｍ、約９０ｍ〜約１０５ｍ、約９０ｍ〜約１００ｍ、約９０ｍ〜約９５ｍ、約９５ｍ〜約１５０ｍ、約９５ｍ〜約１４５ｍ、約９５ｍ〜約１４０ｍ、約９５ｍ〜約１３５ｍ、約９５ｍ〜約１３０ｍ、約９５ｍ〜約１２５ｍ、約９５ｍ〜約１２０ｍ、約９５ｍ〜約１１５ｍ、約９５ｍ〜約１１０ｍ、約９５ｍ〜約１０５ｍ、約９５ｍ〜約１００ｍ、約１００ｍ〜約１５０ｍ、約１００ｍ〜約１４５ｍ、約１００ｍ〜約１４０ｍ、約１００ｍ〜約１３５ｍ、約１００ｍ〜約１３０ｍ、約１００ｍ〜約１２５ｍ、約１００ｍ〜約１２０ｍ、約１００ｍ〜約１１５ｍ、約１００ｍ〜約１１０ｍ、約１００ｍ〜約１０５ｍ、約１０５ｍ〜約１５０ｍ、約１０５ｍ〜約１４５ｍ、約１０５ｍ〜約１４０ｍ、約１０５ｍ〜約１３５ｍ、約１０５ｍ〜約１３０ｍ、約１０５ｍ〜約１２５ｍ、約１０５ｍ〜約１２０ｍ、約１０５ｍ〜約１１５ｍ、約１０５ｍ〜約１１０ｍ、約１１０ｍ〜約１５０ｍ、約１１０ｍ〜約１４５ｍ、約１１０ｍ〜約１４０ｍ、約１１０ｍ〜約１３５ｍ、約１１０ｍ〜約１３０ｍ、約１１０ｍ〜約１２５ｍ、約１１０ｍ〜約１２０ｍ、約１１０ｍ〜約１１５ｍ、約１１５ｍ〜約１５０ｍ、約１１５ｍ〜約１４５ｍ、約１１５ｍ〜約１４０ｍ、約１１５ｍ〜約１３５ｍ、約１１５ｍ〜約１３０ｍ、約１１５ｍ〜約１２５ｍ、約１１５ｍ〜約１２０ｍ、約１２０ｍ〜約１５０ｍ、約１２０ｍ〜約１４５ｍ、約１２０ｍ〜約１４０ｍ、約１２０ｍ〜約１３５ｍ、約１２０ｍ〜約１３０ｍ、約１２０ｍ〜約１２５ｍ、約２５０ｍ〜約７５０ｍ、約２５０ｍ〜約７００ｍ、約２５０ｍ〜約６５０ｍ、約２５０ｍ〜約６００ｍ、約２５０ｍ〜約５５０ｍ、約２５０ｍ〜約５００ｍ、約２５０ｍ〜約４５０ｍ、約２５０ｍ〜約４００ｍ、約２５０ｍ〜約３５０ｍ、約２５０ｍ〜約３００ｍ、約３００ｍ〜約７５０ｍ、約３００ｍ〜約７００ｍ、約３００ｍ〜約６５０ｍ、約３００ｍ〜約６００ｍ、約３００ｍ〜約５５０ｍ、約３００ｍ〜約５００ｍ、約３００ｍ〜約４５０ｍ、約３００ｍ〜約４００ｍ、約３００ｍ〜約３５０ｍ、約３５０ｍ〜約７５０ｍ、約３５０ｍ〜約７００ｍ、約３５０ｍ〜約６５０ｍ、約３５０ｍ〜約６００ｍ、約３５０ｍ〜約５５０ｍ、約３５０ｍ〜約５００ｍ、約３５０ｍ〜約４５０ｍ、約３５０ｍ〜約４００ｍ、約４００ｍ〜約７５０ｍ、約４００ｍ〜約７００ｍ、約４００ｍ〜約６５０ｍ、約４００ｍ〜約６００ｍ、約４００ｍ〜約５５０ｍ、約４００ｍ〜約５００ｍ、約４００ｍ〜約４５０ｍ、約４５０ｍ〜約７５０ｍ、約４５０ｍ〜約７００ｍ、約４５０ｍ〜約６５０ｍ、約４５０ｍ〜約６００ｍ、約４５０ｍ〜約５５０ｍ、約４５０ｍ〜約５００ｍ、約５００ｍ〜約７５０ｍ、約５００ｍ〜約７００ｍ、約５００ｍ〜約６５０ｍ、約５００ｍ〜約６００ｍ、約５００ｍ〜約５５０ｍ、約５５０ｍ〜約７５０ｍ、約５５０ｍ〜約７００ｍ、約５５０ｍ〜約６５０ｍ、約５５０ｍ〜約６００ｍ、約６００ｍ〜約７５０ｍ、約６００ｍ〜約７００ｍ、約６００ｍ〜約６５０ｍ、約６５０ｍ〜約７５０ｍ、または約６５０ｍ〜約７００ｍ増加したことは、治療または治療レジメンが被験者における神経変性疾患に有効であることを示す。被験者の歩行距離が少なくとも約１ｍ、少なくとも約２ｍ、少なくとも約３ｍ、少なくとも約４ｍ、少なくとも約５ｍ、少なくとも約１０ｍ、少なくとも約１５ｍ、少なくとも約２０ｍ、少なくとも約２５ｍ、少なくとも約３０ｍ、少なくとも約３５ｍ、少なくとも約４０ｍ、少なくとも約４５ｍ、少なくとも約５０ｍ、少なくとも約５５ｍ、少なくとも約６０ｍ、少なくとも約６５ｍ、少なくとも約７０ｍ、少なくとも約７５ｍ、少なくとも約８０ｍ、少なくとも約８５ｍ、少なくとも約９０ｍ、少なくとも約９５ｍ、少なくとも約１００ｍ、少なくとも約１０５ｍ、少なくとも約１１０ｍ、少なくとも約１１５ｍ、少なくとも約１２０ｍ、少なくとも約１２５ｍ、少なくとも約１３０ｍ、少なくとも約１３５ｍ、少なくとも約１４０ｍ、少なくとも約１４５ｍ、少なくとも約１５０ｍ、少なくとも約１５５ｍ、少なくとも約１６０ｍ、少なくとも約１６５ｍ、少なくとも約１７０ｍ、少なくとも約１７５ｍ、少なくとも約１８０ｍ、少なくとも約１８５ｍ、少なくとも約１９０ｍ、少なくとも約１９５ｍ、または少なくとも約２００ｍ増加したことは、治療または治療レジメンが被験者における神経変性疾患に有効であることを示す。
【００４８】
例えば、被験者の歩行速度（ｓ／８ｍ）が少なくとも約３０ｓ／８ｍ〜少なくとも約１０ｓ／８ｍ、少なくとも約２５ｓ／８ｍ〜少なくとも約１０ｓ／８ｍ、少なくとも約２０ｓ／８ｍ〜少なくとも約１０ｓ／８ｍ、少なくとも約１５ｓ／８ｍ〜少なくとも約１０ｓ／８ｍ、少なくとも約３０ｓ／８ｍ〜少なくとも約１５ｓ／８ｍ、少なくとも約２５ｓ／８ｍ〜少なくとも約１５ｓ／８ｍ、少なくとも約２０ｓ／８ｍ〜少なくとも約１５ｓ／８ｍ、少なくとも約３０ｓ／８ｍ〜少なくとも約２０ｓ／８ｍ、少なくとも約２５ｓ／８ｍ〜少なくとも約２０ｓ／８ｍ、または少なくとも約３０ｓ／８ｍ〜少なくとも約２５ｓ／８ｍ増加したことは、治療または治療レジメンが被験者における神経変性疾患に有効であることを示す。被験者が約３０．０ｓ／８ｍ未満、約２５．０ｓ／８ｍ未満、約２０．０ｓ／８ｍ未満、約１５．０ｓ／８ｍ未満、約１４．５ｓ／８ｍ未満、約１４．０ｓ／８ｍ未満、約１３．５ｓ／８ｍ未満、約１３．０ｓ／８ｍ未満、約１２．９ｓ／８ｍ未満、約１２．８ｓ／８ｍ未満、約１２．７ｓ／８ｍ未満、約１２．６ｓ／８ｍ未満、約１２．５ｓ／８ｍ未満、約１２．４ｓ／８ｍ未満、約１２．３ｓ／８ｍ未満、約１２．２ｓ／８ｍ未満、約１２．１ｓ／８ｍ未満、約１２．０ｓ／８ｍ未満、約１１．９ｓ／８ｍ未満、約１１．８ｓ／８ｍ未満、約１１．７ｓ／８ｍ未満、約１１．６ｓ／８ｍ未満、約１１．５ｓ／８ｍ未満、約１１．４ｓ／８ｍ未満、約１１．３ｓ／８ｍ未満、約１１．２ｓ／８ｍ未満、約１１．１ｓ／８ｍ未満、約１１．０ｓ／８ｍ未満、約１０．５ｓ／８ｍ未満、約１０．０ｓ／８ｍ未満、約９．５ｓ／８ｍ未満、約９．０ｓ／８ｍ未満、約８．５ｓ／８ｍ未満、または約８．０ｓ／８ｍ未満の歩行速度を有していることは、治療または治療レジメンが被験者の神経変性疾患に有効であることを示す。
【００４９】
例えば、被験者が８ｍ歩行するのに要する時間が少なくとも約０．５秒、少なくとも約１秒、少なくとも約２秒、少なくとも約３秒、少なくとも約４秒、少なくとも約５秒、少なくとも約６秒、少なくとも約７秒、少なくとも約８秒、少なくとも約９秒、少なくとも約１０秒、少なくとも約１１秒、少なくとも約１２秒、少なくとも約１３秒、少なくとも約１４秒、少なくとも約１５秒、少なくとも約１６秒、少なくとも約１７秒、少なくとも約１８秒、少なくとも約１９秒、少なくとも約２０秒、少なくとも約２１秒、少なくとも約２２秒、少なくとも約２３秒、少なくとも約２４秒、または少なくとも約２５秒だけ短いことは、治療または治療レジメンが被験者における神経変性疾患に有効であることを示す。
【００５０】
ｂ．対照／基準レベル
対照サンプルを含めることが望ましいことがある。対照サンプルは上記した被験者からのサンプルと同時に分析され得る。被験者サンプルから得た結果は対照サンプルから得た結果と比較し得る。標準曲線を用意し得、これと生体サンプルについてのアッセイ結果を比較し得る。標準曲線は、アッセイ単位、すなわち化学発光標識を使用する場合、化学発光シグナル強度の関数としてマーカーレベルを与える。複数のドナーから採取したサンプルを用いて、標準曲線は正常健康組織または治療を受けたことのないＭＳ組織中のＲＧＭａ断片の対照レベルに対して用意され得る。
【００５１】
よって、上記にてらして、試験サンプル中のＲＧＭａ断片の存在、量または濃度の測定方法を提供する。方法は、（１）ＲＧＭａ断片について試験サンプルをウェスタンブロット分析により、例えばＲＧＭａ断片上のエピトープに結合する少なくとも１つのキャプチャー抗体、及びキャプチャー抗体またはキャプチャー抗体に対するエピトープとは異なるＲＧＭａ断片上のエピトープに結合し、場合により検出可能標識を含む少なくとも１つの検出抗体を使用することによりアッセイすることを含む。方法は更に、（２）試験サンプル中のＲＧＭａ断片の存在、量または濃度の直接または間接指標として検出可能標識より生じたシグナルをキャリブレーター中のＲＧＭａ断片の存在、量または濃度の直接または間接指標として生じたシグナルと比較することを含む。キャリブレーターは場合により、キャリブレーターの各々が一連の他のキャリブレーターとＲＧＭａ断片の濃度だけ異なる一連のキャリブレーターの一部であり、そうであることが好ましい。
【００５２】
（１）基準レベル
本明細書中に記載されている方法は、（１）神経変性疾患を患っている被験者に対する治療または治療レジメンの有効性を同定し、判定する；（２）神経変性疾患を患っている被験者の治療または治療レジメンに対する応答性を予測する；（３）神経変性疾患を患っている被験者に対して治療または治療レジメンを与える；（４）神経変性疾患を患っている被験者に対する治療または治療レジメンを最適化する；（５）神経変性疾患を患っている被験者に対する再生促進薬物治療または治療レジメンをモニターする；及び（６）化合物を神経変性疾患に対する治療効果についてスクリーニングするために被験者のＲＧＭａ断片の基準レベルを使用する。
【００５３】
通常、所定または基準レベルがベンチマークとして使用され得、このベンチマークに対して試験サンプルをＲＧＭａ断片（例えば、１８ｋＤａのＲＧＭａ断片、３０ｋＤａのＲＧＭａ断片及び／または４０ｋＤａのＲＧＭａ断片）についてアッセイしたときに得られる結果を評価する。通常、比較する際、所定レベルはアナライトの存在、量または濃度を具体的指標を有するＭＳの特定段階またはエンドポイントと連係または関連させ得るように特定のアッセイを適切な条件で十分な回数実施することにより得られる。典型的には、所定レベルは基準被験者（または、被験者の集団）のアッセイで得られる。基準被験者は神経疾患にかかっていない正常または健康被験者のような対照被験者、またはＭＳ被験者のような神経疾患にかかっている被験者であり得る。ＭＳ被験者は、ＭＳに対する治療を受けているかまたは受けていないＭＳの特定段階または前段階（すなわち、ＲＲＭＳ、ＳＰＭＳ、ＰＰＭＳ、ＰＲＭＳまたはＣＩＳ）を有する被験者である。基準群の基準集団は対照群またはＭＳ群であり得る。ＭＳ群には、ＭＳの特定段階または前段階（すなわち、ＲＲＭＳ、ＳＰＭＳ、ＰＰＭＳ、ＰＲＭＳまたはＣＩＳ）を有するＭＳ被験者、及び／またはＭＳにかかっているが、ＭＳに対する治療を受けていない被験者が含まれ得る。基準レベルは治療または治療レジメンを被験者に投与する前の被験者のＲＧＭａ断片レベルであり得る。
【００５４】
特に、治療応答性について使用される所定レベルに関して、上記したＲＧＭａ断片の量または濃度は「変化なし」、「有利」（または、「有利に変化した」）、または「不利」（または、「不利に変化した」）であり得る。「高い」または「上昇した」は、試験サンプル中の量または濃度が典型的または正常レベルまたは範囲（例えば、所定レベル）、例えば対照群またはＭＳ群で見られる典型的または正常レベルよりも高いかまたは大きいこと、または別の基準レベルまたは範囲（例えば、前のまたはベースラインサンプル）よりも高いかまたは大きいことを指す。「高い」または「上昇した」は、試験サンプル中の量または濃度が治療を開始する前の被験者で見られるレベルまたは範囲よりも高いかまたは大きいことをも指し得る。用語「低い」または「減少した」は、試験サンプル中の量または濃度が典型的または正常レベルまたは範囲（例えば、所定レベル）、例えば対照群またはＭＳ群で見られる典型的または正常レベル以下またはそれ未満であること、または別の基準レベルまたは範囲（例えば、前のまたはベースラインサンプル）以下またはそれ未満であることを指す。用語「低い」または「減少した」は、試験サンプル中の量または濃度が治療を開始する前の被験者で見られるレベルまたは範囲以下またはそれ未満であることをも指す。用語「変化した」は、サンプル中の量または濃度が典型的または正常レベルまたは範囲（例えば、所定レベル）、例えば対照群またはＭＳ群で見られる典型的または正常レベルに比べて、または別の基準レベルまたは範囲（例えば、前のまたはベースラインサンプル）に比べて変化していることを指す。
【００５５】
上記したＲＧＭａ断片についての典型的または正常レベルまたは範囲、または別の基準レベルまたは範囲（例えば、前のまたはベースラインサンプル）は標準プラクティスに従って規定される。所謂変化したレベルまたは変化は、典型的または正常レベルまたは範囲、または基準レベルまたは範囲と比較して、実験誤差またはサンプル分散により説明することができない正味変化があるときに生じると見なされ得る。幾つかの実施形態では、具体的サンプルで測定されたレベルを所謂正常被験者、すなわち対照被験者からの類似サンプルで測定したレベルまたはレベルの範囲と比較する。これに関連して、「正常な」（時に「対照」または「健康な」）被験者はＭＳ不検出の個人であり、「正常な」患者または集団は例えば検出できないＭＳを示すものである。「見かけ正常な被験者」はＲＧＭａ断片（例えば、１８ｋＤａのＲＧＭａ断片、３０ｋＤａのＲＧＭａ断片及び／または４０ｋＤａのＲＧＭａ断片）をまだ評価していないか評価しているものである。アナライトのレベルは、アナライトが通常不検出である（例えば、正常レベルは０、または正常集団の約２５〜約７５パ―センタイルの範囲内である）が、試験サンプル中で検出されるときに、及びアナライトが試験サンプル中に正常レベルよりも多く存在しているときに「高い」と言われる。幾つかの実施形態では、具体的サンプルで測定されたレベルをＭＳ被験者からの類似サンプル、または治療を開始する前の被験者から採取した前のまたはベースラインサンプル中で測定したレベルまたはレベルの範囲と比較する。
【００５６】
幾つかの実施形態では、基準レベルがＭＳに対する治療を受けたかまたは受けていないＭＳ被験者におけるＲＧＭａ断片レベルである場合、ＲＧＭａ断片（例えば、１８ｋＤａのＲＧＭａ断片、３０ｋＤａのＲＧＭａ断片及び／または４０ｋＤａのＲＧＭａ断片）の基準レベルより高いレベルは被験者が治療または治療レジメンに応答しないと同定し、治療がＭＳの治療のために有効でないと同定する。ＲＧＭａ断片（例えば、１８ｋＤａのＲＧＭａ断片、３０ｋＤａのＲＧＭａ断片及び／または４０ｋＤａのＲＧＭａ断片）の基準レベルと同等またはそれ以下のレベルは被験者が治療または治療レジメンに対して応答すると同定し、または治療がＭＳの治療のために有効であると同定する。
【００５７】
幾つかの実施形態では、対照、ベースライン、または前のレベルまたは範囲と比較したサンプル中の相対的ＲＧＭａ断片レベルの変化は、被験者が治療または治療レジメンに応答すると同定し、または治療がＭＳの治療のために有効であると同定する。幾つかの実施形態では、被験者から採取したサンプル中の相対的ＲＧＭａ断片レベルが対照、前のまたはベースラインサンプル中のＲＧＭａ断片レベルと比較して約１００％未満、約９５％未満、約８５％未満、約８０％未満、約７５％未満、約７０％未満、約６５％未満、約５５％未満、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、または約５％未満であることは、被験者が治療または治療レジメンに応答するかまたは応答すると予測されると同定し、または治療がＭＳの治療のために有効であると同定する。
【００５８】
ｃ．サンプル
ＲＧＭａ断片ベース診断アッセイの方法は被験者から１つ以上のサンプルを得ることを含み得る。１つ以上のサンプルは脳脊髄液（ＣＳＦ）サンプルであり得る。他の実施形態では、１つ以上のサンプルは任意のソース、例えば組織、血液、血漿、唾液、つば、粘液、汗、尿、尿道スワブ、頸管スワブ、尿生殖器または肛門スワブ、結膜スワブ、眼液(ｏｃｕｌａｒ  ｌｅｎｓ  ｆｌｕｉｄ)、または脳脊髄液から採取し得る。１つ以上のサンプルは、（ｉ）被験者から得たまま直接、または（ｉｉ）１つ以上のサンプルの特性を修飾するために前処理した後使用し得る。よって、１つ以上のサンプルは、例えば血液からの血漿または血清の調製、細胞の破壊、固体材料からの液体材料の調製、粘性流体の希釈、液体の濾過、試薬の添加、核酸の精製、タンパク質の精製等により前処理され得る。
【００５９】
サンプルは治療または治療レジメンを被験者に投与する前またはその後の各種時点で採取され得る。例えば、サンプルは治療または治療レジメンの被験者への投与の１日前、０日前、１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、７日後、８日後、９日後、または１０日後に採取され得る。
【００６０】
ｄ．他のバイオマーカーとの組合せ
本明細書中に記載されている方法は、（１）神経変性疾患を患っている被験者に対する治療または治療レジメンの有効性を同定し、判定する；（２）神経変性疾患を患っている被験者の治療または治療レジメンに対する応答性を予測する；（３）神経変性疾患を患っている被験者に対して治療または治療レジメンを与える；（４）神経変性疾患を患っている被験者に対する治療または治療レジメンを最適化する；（５）神経変性疾患を患っている被験者に対する再生促進薬物治療または治療レジメンをモニターする；及び（６）化合物を神経変性疾患に対する治療効果についてスクリーニングするために、ＲＧＭａ断片ベース診断アッセイを別のバイオマーカーと組み合わせて使用することを含み得る。幾つかの実施形態では、バイオマーカーはＭＳのバイオマーカー、例えばＮＯＧＯ  Ａ、Ｎｏｇｏ受容体（ＮｇＲ）に対するリガンド、ＮＯＧＯ受容体、希突起膠細胞ミエリン糖タンパク質（ＯＭｇｐ）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ニューロフィラメント（Ｎｆ）、成長関連タンパク質３（ＧＡＰ−４３）；オステオポンチン；インターロイキン１７、インターロイキン６、インターフェロンγ及びＴＮＦ−αであり得る。幾つかの実施形態では、ＲＧＭａ断片のレベルの変化と共にＭＳのバイオマーカーのレベルの変化、すなわち上昇または低下は治療または治療レジメンが有効であるかを示す。
【００６１】
ｅ．治療レジメン
ＲＧＭａ断片ベース診断アッセイの使用方法は、神経変性疾患に対する治療または治療レジメンにおいて使用され得る。治療または治療レジメンには、神経再生薬、神経保護薬、またはその組合せを含めた神経回復薬が含まれ得る。神経回復は、シナプス強度の変化、シナプス活性のシフト、サイレストシナプスの活性化、抑制性シナプスのサイレンシングによる機能不全ニューロンネットワークの補正を包含する。神経回復は神経再生プロセスを含む。神経再生は、損傷線維の再成長により、損傷線維路または健康な隣接非損傷路の側枝発芽、再成長後の新しいシナプスの形成、及び後の新しいミエリンシートのもっと後の形成による損傷されたニューロンネットワークの修復である。神経保護は、ニューロンの損失を停止または少なくとも遅らすことによる疾患の進行及び二次的損傷を予防または遅延するためのニューロン構造及び／または機能の相対的保存である。
【００６２】
治療または治療レジメンには、コルチコステロイド、例えばトリアムシノロンアセトニド（ＴＣＡ）；テクフィデラ／ＢＧ−１２（フマル酸ジメチル）、ジレニア（フィンゴリモド）、ラキニモド、ダクリズマブ、アレムツズマブ、リツキシマブ、プレドニゾロン；メチルプレドニゾロン；アザチオプリン；シクロホスファミド；シクロスポリン；メトトレキサート；４−アミノピリジン；チザニジン；インターフェロンβ１ａ（ＡＶＯＮＥＸ；Ｂｉｏｇｅｎ）；インターフェロンβ１ｂ（ＢＥＴＡＳＥＲＯＮ；Ｃｈｉｒｏｎ／Ｂｅｒｌｅｘ）；インターフェロンα−ｎ３（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｆｕｊｉｍｏｔｏ）、インターフェロンα（Ａｌｆａ  Ｗａｓｓｅｒｍａｎｎ／Ｊ＆Ｊ）、インターフェロンβ１Ａ−ＩＦ（Ｓｅｒｏｎｏ／Ｉｎｈａｌｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ペグインターフェロンα２ｂ（Ｅｎｚｏｎ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ）、コポリマー１（Ｃｏｐ−１；コパキソン；Ｔｅｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）；高圧酸素；静注用免疫グロブリン；クラドリビン；他のヒトサイトカイン、または増殖因子及びその受容体、例えばＴＮＦ、ＬＴ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−２３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１８、ＥＭＡＰ−１１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＧＦ及びＰＤＧＦに対する抗体またはアンタゴニスト；細胞表面分子、例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤＳ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９０、またはそのリガンドに対する抗体、ナタリズマブ、物質、例えばメトトレキサート、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイトン、ミコフェノール酸モフェチル、テリフルノミド、レフルノミド、グラチラマー酢酸塩、ジレニア（フィンゴリモド）、ミトキサントロン、ペグインターフェロンβ−１ａ、フマル酸ジメチル、ＮＳＡＩＤ、例えばイブプロフェン、コルチコステロイド、例えばプレドニゾロン、ホスホジエステラーゼ阻害剤、アデノシンアゴニスト、抗血栓薬、補体阻害剤、アドレナリン作用薬、炎症性サイトカイン、例えばＴＮＦαまたはＩＬ−１によるシグナリングと干渉する物質（例えば、ＩＲＡＫ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ｐ３８またはＭＡＰキナーゼ阻害剤）、ＩＬ−１β変換酵素阻害剤、ＴＡＣＥ阻害剤、Ｔ細胞シグナリング阻害剤、例えばキナーゼ阻害剤、メタロプロテアーゼ阻害剤、スルファサラジン、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、可溶性サイトカイン受容体及びその誘導体（例えば、可溶性ｐ５５またはｐ７５  ＴＮＦ受容体、ｓｉＬ−ｌＲＩ、ｓｉＬ−ｌＲＩＩ、ｓｉＬ−６Ｒ）、抗炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３及びＴＧＦβ）、またはその組合せが含まれ得る。治療または治療レジメンには、プロ再生性ＲＧＭａ抗体が含まれ得る。プロ再生性ＲＧＭａ抗体は、米国特許出願公開Ｎｏｓ．２００４／０１０２３７６、２０１０／００２８３４０、２０１１／０１３５６６４、２０１３／０３３０３４７及び２０１４／００２３６５９に記載されている。
【００６３】
治療には、更に治療薬、造影剤、細胞傷害性物質、血管形成抑制剤；キナーゼ阻害剤；共刺激分子ブロッカー；細胞接着分子ブロッカー；抗サイトカイン抗体またはその機能性断片；メトトレキサート；シクロスポリン；ラパマイシン；ＦＫ５０６；検出可能標識またはリポーター；ＴＮＦアンタゴニスト；抗リウマチ薬；筋弛緩薬、睡眠薬、非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛薬、麻酔薬、鎮静薬、局所麻酔薬、神経筋ブロッカー、抗微生物薬、抗乾癬薬、コルチコステロイド、蛋白同化ステロイド、エリスロポエチン、免疫治療薬、免疫グロブリン、免疫抑制薬、成長ホルモン、ホルモン補充薬、放射性医薬品、抗うつ薬、抗精神薬、刺激薬、喘息治療薬、β−アゴニスト、吸入用ステロイド、エピネフリンまたはアナログ、サイトカイン、サイトカインアンタゴニスト、抗酸化剤のような神経保護薬、ラジカルスカベンジャー、フェニトインのような抗痙攣薬、貧血治療薬エリスロポエチン、またはその組合せが含まれ得る。
【００６４】
（１）ＴＣＡ
神経変性疾患の治療または治療レジメンは、トリアムシノロンアセトニド治療であり得る。トリアムシノロンアセトニド（ＴＣＡ＝ＶＯＬＯＮ  Ａ）と呼ばれるデポ剤コルチコステロイドの髄腔内適用がＭＳ患者で使用され得る。多数のＴＣＡ研究は、治療患者において低下したＥＤＳＳ（総合障害度評価スコア）、増加した歩行距離及び低下した歩行速度で有意な改善を示した。しかしながら、ＭＳ患者のこの改善された機能回復についての根本的な分子メカニズムは完全に不明であった。
【００６５】
前の非盲検観察トライアルは、原発性及び続発性進行性ＭＳ患者において、特に脊髄症状を被っているときの徐放性ステロイドのトリアムシノロンアセトニド（ＴＣＡ）の繰返し髄腔内適用効果を記載していた。臨床的に、ＴＣＡ治療に対して３種の応答：（Ｉ）患者は４〜６回のＴＣＡの一連の適用中に即時の改善を報告し得る；（ＩＩ）数回ＴＣＡ注射後に疾患症状が遅れて改善；または（ＩＩＩ）効果なしがある。ＴＣＡ治療に対するこれら３つの挙動応答パターンの生化学的及び薬理学的理由は詳細に知られていない。上肢及び下肢機能の明らかな即時強化を有する患者ではフリーラジカルのＣＳＦ合成が少ないことが判明した。通常、フリーラジカルは組織破壊を媒介し、各種ＣＳＦタンパク質の産生を調節する能力を有している。徐放性ステロイドのトリアムシノロンアセトニドの反復髄腔適用は進行性多発性硬化症患者において有利であり得る。
【００６６】
ｆ．神経変性疾患に対する治療有効性の判定方法
ＲＧＭａ断片ベース診断アッセイの使用方法は、神経変性疾患に対する治療の必要な被験者における、神経変性疾患に対する治療または治療レジメンの有効性を判定するための方法において使用され得る。判定方法は、被験者から得たサンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片のレベルの測定を含み得る。判定は、サンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片の存在及び／またはレベルを検出または測定するためにＲＧＭａ断片ベース診断アッセイを使用することを含み得る。
【００６７】
判定方法は、少なくとも１個のＲＧＭａ断片のレベルを少なくとも１個のＲＧＭａ断片の対照レベルと比較することを含み得る。少なくとも１個のＲＧＭａ断片のレベルが少なくとも１個のＲＧＭａ断片の対照レベルと比較して高い場合、治療または治療レジメンは、神経変性疾患の治療において無効であると判定され得る。治療または治療レジメンが神経変性疾患の治療において無効である判定されたときには、方法は無効の治療または治療レジメンとは異なる治療または治療レジメンを被験者に対して施行することをも含み得る。
【００６８】
少なくとも１個のＲＧＭａ断片のレベルが少なくとも１個のＲＧＭａ断片の対照レベルと比較して低い場合、治療または治療レジメンは、神経変性疾患において有効であると判定され得る。治療または治療レジメンが神経変性疾患の治療において有効である判定されたときには、方法は有効な治療または治療レジメンを被験者に対して投与し続けることをも含み得る。
【００６９】
ｇ．神経変性疾患を患っている被験者の治療に対する応答性の予測方法
ＲＧＭａ断片ベース診断アッセイの使用方法は、神経変性疾患を患っている被験者の治療に対する応答性を予測する方法において使用され得る。方法は、被験者から得たサンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片のレベルを測定することを含み得る。測定は、サンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片の存在及び／またはレベルを検出または測定するためにＲＧＭａ断片ベース診断アッセイを使用することを含み得る。
【００７０】
予測方法は、少なくとも１個のＲＧＭａ断片のレベルを少なくとも１個のＲＧＭａ断片の対照レベルと比較することをも含み得る。予測方法は更に、少なくとも１個のＲＧＭａ断片のレベルがＲＧＭａ断片の対照レベルと比較して低い場合、被験者の治療または治療レジメンに対する応答性の予測を与えることをも含み得る。応答性の予測を与える場合、予測方法は被験者に対して治療または治療レジメンを投与することをも含み得る。
【００７１】
ｈ．神経変性疾患を患っている被験者の治療方法
ＲＧＭａ断片ベース診断アッセイの使用方法は、神経変性疾患を患っている被験者の治療方法において使用され得る。方法は、被験者から得たサンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片のレベルを測定することを含み得る。測定は、サンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片の存在及び／またはレベルを検出または測定するためにＲＧＭａ断片ベース診断アッセイを使用することを含み得る。
【００７２】
方法は、少なくとも１個のＲＧＭａ断片のレベルを少なくとも１個のＲＧＭａ断片の対照レベルと比較することをも含み得る。方法は更に、少なくとも１個のＲＧＭａ断片のレベルがＲＧＭａ断片の対照レベルと比較して高い場合、治療または治療レジメンを被験者に対して投与することを含み得る。
【００７３】
ｉ．神経変性疾患を患っている被験者に対する治療レジメンの最適化方法
ＲＧＭａ断片ベース診断アッセイの使用方法は、神経変性疾患を患っている被験者に対する治療または治療レジメンの最適化方法において使用され得る。方法は、被験者から得られた第１サンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第１レベルを測定することを含み得る。第１サンプルは、被験者が治療または治療レジメンを始める前またはその間の時点で採取し得る。方法は、被験者から得られた第２サンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第２レベルを測定することをも含み得る。第２サンプルは第１時点より後の時点で被験者から得られ得る。第２サンプルは、第１サンプルを採取してから少なくとも約１時間後、少なくとも約２時間後、少なくとも約３時間後、少なくとも約４時間後、少なくとも約５時間後、少なくとも約６時間後、少なくとも約７時間後、少なくとも約８時間後、少なくとも約９時間後、少なくとも約１０時間後、少なくとも約１２時間後、少なくとも約２４時間後、少なくとも約２日後、少なくとも約３日後、少なくとも約４日後、少なくとも約５日後、少なくとも約４日後、少なくとも約５日後、少なくとも約２週間後、少なくとも約１ヶ月後、または少なくとも約１年後に採取し得る。第１及び第２レベルの測定は、それぞれのサンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片の存在及び／またはレベルを検出または測定するためにＲＧＭａ断片ベース診断アッセイを使用することを含み得る。
【００７４】
少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第２レベルが少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第１レベル未満の場合、治療または治療レジメンは、神経変性疾患に対して有効であり得、治療レジメンを変更しない。少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第２レベルが少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第１レベルと同等またはそれ以上の場合、治療または治療レジメンは、神経変性疾患に対して有効でないことがあり、治療レジメンを変更する。
【００７５】
ｊ．神経変性疾患を患っている被験者の再生促進薬物治療のモニタリング方法
ＲＧＭａ断片ベース診断アッセイの使用方法は、神経変性疾患を患っている被験者の再生促進薬物治療のモニタリング方法において使用され得る。方法は、被験者から得た第１サンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第１レベルを測定することを含み得る。第１サンプルは、被験者が治療または治療レジメンを始める前またはその間の時点で採取し得る。方法は、被験者から得た第２サンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第２レベルを測定することをも含み得る。第２サンプルは、第１時点よりも後の時点で被験者から得られ得る。第２サンプルは、第１サンプルを採取してから少なくとも約１時間後、少なくとも約２時間後、少なくとも約３時間後、少なくとも約４時間後、少なくとも約５時間後、少なくとも約６時間後、少なくとも約７時間後、少なくとも約８時間後、少なくとも約９時間後、少なくとも約１０時間後、少なくとも約１２時間後、少なくとも約２４時間後、少なくとも約２日後、少なくとも約３日後、少なくとも約４日後、少なくとも約５日後、少なくとも約４日後、少なくとも約５日後、少なくとも約２週間後、少なくとも約１ヶ月後、または少なくとも約１年後に採取し得る。第１及び第２レベルの測定は、それぞれのサンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片の存在及び／またはレベルを検出または測定するためにＲＧＭａ断片ベース診断アッセイを使用することを含み得る。
【００７６】
少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第２レベルが少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第１レベルと比較して低いことは治療または治療レジメンが神経変性疾患に対して治療効果を有することを示し得る。治療または治療レジメンが神経変性疾患に対して治療上有効であると判定される場合、モニタリング方法は治療上有効な治療または治療レジメンを被験者に対して投与し続けることを含み得る。
【００７７】
少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第２レベルが少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第１レベルと比較して高いことは治療または治療レジメンが神経変性疾患に対して治療効果を有さないことを示し得る。治療または治療レジメンが神経変性疾患に対して治療上有効ではないと判定される場合、モニタリング方法は治療上無効な治療または治療レジメンとは異なる治療または治療レジメンを被験者に投与することを含み得る。
【００７８】
ｋ．神経変性疾患に対する治療効果についての化合物のスクリーニング方法
ＲＧＭａ断片ベース診断アッセイの使用方法は、神経変性疾患に対して治療効果を有する化合物のスクリーニング方法において使用され得る。例えば、ＲＧＭａ断片ベース診断アッセイは神経再生性臨床薬候補、神経可塑性を強化する臨床薬候補、または髄鞘再生を促進する臨床薬候補を評価するために使用され得る。方法は、細胞を含むサンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第１レベルを測定することを含み得る。方法は、サンプルを化合物と接触させることをも含み得る。方法は更に、サンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第２レベルを測定することを含み得る。第２レベルは、サンプルを化合物と接触させてから少なくとも約１時間後、少なくとも約２時間後、少なくとも約３時間後、少なくとも約４時間後、少なくとも約５時間後、少なくとも約６時間後、少なくとも約７時間後、少なくとも約８時間後、少なくとも約９時間後、少なくとも約１０時間後、少なくとも約１２時間後、少なくとも約２４時間後、少なくとも約２日後、少なくとも約３日後、少なくとも約４日後、少なくとも約５日後、少なくとも約４日後、少なくとも約５日後、少なくとも約２週間後、少なくとも約１ヶ月後、または少なくとも約１年後に測定され得る。第１及び第２レベルの測定は、それぞれのサンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片の存在及び／またはレベルを検出または測定するためにＲＧＭａ断片ベース診断アッセイを使用することを含み得る。
【００７９】
少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第２レベルが少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第１レベルと比較して低いことは化合物が神経変性疾患に対して治療効果を有することを示し得る。少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第２レベルが少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第１レベルと比較して高いことは化合物が神経変性疾患に対して治療効果を有さないことを示し得る。
【００８０】
４．方法を実施するためのキット
本発明は、上記した方法を実施するために使用され得るキットを提供する。キットは、（１）被験者から単離した生体サンプル中のＲＧＭａ断片、例えば１８ｋＤａのＲＧＭａ断片、３０ｋＤａのＲＧＭａ断片及び／または４０ｋＤａのＲＧＭａ断片の各々のレベルを定量化するためにＲＧＭａ断片のいずれか、例えば１８ｋＤａのＲＧＭａ断片、３０ｋＤａのＲＧＭａ断片及び／または４０ｋＤａのＲＧＭａ断片の各々に特異的に結合し得る試薬、及び（２）ＲＧＭａ断片、例えば１８ｋＤａのＲＧＭａ断片、３０ｋＤａのＲＧＭａ断片及び／または４０ｋＤａのＲＧＭａ断片の各々の基準レベルを示す基準標準を含み得、少なくとも１個の試薬は適当なマーカーに特異的に結合し得る少なくとも１つの抗体を含む。キットは、少なくとも１個のＲＧＭａ断片に特異的に結合し得る試薬、生体サンプル中の各バイオマーカーの濃度を定量化するための試薬、及び生体サンプル中のＲＧＭａ断片（すなわち、１８ｋＤａのＲＧＭａ断片、３０ｋＤａのＲＧＭａ断片及び／または４０ｋＤａのＲＧＭａ断片）の基準レベルを示す基準標準を含み得る。キット、ＭＳの少なくとも１個の追加バイオマーカー、例えばＮＯＧＯ  Ａ、ＮＯＧＯ受容体、ＯＭｇｐ、ＭＢＰ、Ｎｆ、ＧＡＰ−４３、オステオポンチン、インターロイキン１７、インターロイキン６、インターフェロンγ及びＴＮＦ−αに特異的に結合し得る少なくとも１つの試薬（すなわち、抗体）、及び存在する場合、ＭＳの少なくとも１つの追加バイオマーカーの基準レベルを示す基準標準をさらに、含み得る。
【００８１】
キットは抗体及び該抗体を投与するための手段を含み得る。キットは、キットを使用し、分析、モニタリングまたは治療を実施するための指示書をさらに含み得る。
【００８２】
キットは１つ以上の容器、例えばバイアルまたはボトルをも含み得、各容器は別々の試薬を含有している。キットは、分析、モニタリング、治療、または本明細書中に記載されている方法をどのように実施または解釈するかを記載している説明書をさらに含み得る。
【００８３】
例えば、キットは、試験サンプルを１８ｋＤａのＲＧＭａ断片、３０ｋＤａのＲＧＭａ断片及び／または４０ｋＤａのＲＧＭａ断片についてウェスタンブロット分析によりアッセイするための指示書を含み得る。指示書は紙の形態、またはコンピューター読み取り可能な形態、例えばディスク、ＣＤ、ＤＶＤ等の形態であり得る。抗体は、１８ｋＤａのＲＧＭａ断片、３０ｋＤａのＲＧＭａ断片及び／または４０ｋＤａのＲＧＭａ断片キャプチャー抗体、及び／または１８ｋＤａのＲＧＭａ断片、３０ｋＤａのＲＧＭａ断片及び／または４０ｋＤａのＲＧＭａ断片検出抗体（検出可能標識で標識されている抗体を意味する）であり得る。例えば、キットは少なくとも１個のＲＧＭａ断片に特異的に結合する少なくとも１つのキャプチャー抗体を含み得る。キットはキャプチャー抗体に対するコンジュゲート抗体（例えば、検出可能標識で標識されている抗体）（すなわち、１８ｋＤａのＲＧＭａ断片、３０ｋＤａのＲＧＭａ断片及び／または４０ｋＤａのＲＧＭａ断片に特異的に結合するキャプチャー抗体に対するコンジュゲート抗体）をも含み得る。代替的または追加的に、キットは、例えば精製されており、場合により凍結乾燥されているキャリブレーターまたは対照（例えば、１８ｋＤａのＲＧＭａ断片、３０ｋＤａのＲＧＭａ断片及び／または４０ｋＤａのＲＧＭａ断片）、及び／またはアッセイを実施するための少なくとも１つの容器（例えば、既に抗−１８ｋＤａのＲＧＭａ断片、３０ｋＤａのＲＧＭａ断片及び／または４０ｋＤａのＲＧＭａ断片モノクローナル抗体で被覆されていてもよいチューブ、マイクロタイタープレートまたはストリップ）、及び／またはバッファー、例えば濃厚溶液、検出可能標識（例えば、酵素標識）に対する基質溶液、またはストップ溶液として用意され得るアッセイバッファーまたは洗浄バッファーを含み得る。好ましくは、キットは、アッセイを実施するために必要なすべての成分、すなわち試薬、標準、バッファー、希釈剤等を含む。指示書は１８ｋＤａのＲＧＭａ断片、３０ｋＤａのＲＧＭａ断片及び／または４０ｋＤａのＲＧＭａ断片を定量化する目的で標準曲線または基準標準を作成するための指示書をも含み得る。
【００８４】
前に示唆したように、キット中に用意されている抗体、例えば１８ｋＤａのＲＧＭａ断片、３０ｋＤａのＲＧＭａ断片及び／または４０ｋＤａのＲＧＭａ断片に対して特異的な組換え抗体は、検出可能標識、例えば蛍光体、放射活性部分、酵素、ビオチン／アビジン標識、発色団、化学発光標識等を配合し得る。または、キットは抗体または抗体を検出するための試薬（例えば、検出抗体）を標識するための試薬、及び／またはアナライトまたはアナライトを検出するための試薬を標識するための試薬を含み得る。抗体、キャリブレーター及び／または対照を別々の容器中に用意するか、または適切なアッセイフォーマット、例えばマイクロタイタープレートに予め分配してもよい。
【００８５】
場合により、キットは品質管理成分（例えば、感度パネル、キャリブレーター、及びポジティブ対照）を含む。品質管理試薬の作成は当業界で公知であり、各種免疫診断製品のインサートシートに記載されている。感度パネル部材は場合によりアッセイ性能特性を確認するために使用され、更に場合によりウェスタンブロットキット試薬及びアッセイの標準化の完全性の有用な指標である。
【００８６】
キットは場合により、診断アッセイを実施し、または品質管理評価を容易にするために必要な他の試薬、例えばバッファー、塩、酵素、酵素補因子、基質、検出試薬等をも含み得る。他の成分、例えばバッファー及び試験サンプルの単離及び／または処理のための溶液（例えば、前処理試薬）をキットに配合することもできる。キットは更に１つ以上の他の対照を配合し得る。キットの１つ以上の成分が凍結乾燥されていてもよく、この場合キットは更に凍結成分を再構成するのに適している試薬を含み得る。
【００８７】
場合により、キットの各種成分は必要に応じて適当な容器、例えばマイクロタイタープレート中に用意されている。キットは、サンプルを保持または保存するための容器（例えば、血液サンプルのための容器またはカートリッジ）をさらに含み得る。適切な場合には、キットは場合により、試薬または試験サンプルの作成を容易にする反応容器、混合容器、及び他の成分をも含み得る。キットは試験サンプルの入手を助ける１つ以上の器具、例えば針、ピペット、鉗子、計量スプーン等をも含み得る。
【００８８】
検出可能標識が少なくとも１つのアクリニジウム化合物である場合、キットは少なくとも１つのアクリジニウム−９−カルボキサミド、少なくとも１つのアクリジニウム−９−カルボキシレートアリールエステル、またはその組合せを含み得る。検出可能標識が少なくとも１つのアクリジニウム化合物である場合、キットは過酸化水素源、例えばバッファー、溶液及び／または少なくとも１つの塩基性溶液をも含み得る。
【００８９】
所望により、キットは固相、たとえは磁気粒子、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、セル、膜、足場分子、フィルム、濾紙、石英結晶、ディスクまたはチップを含み得る。キットは、検出抗体として機能する抗体のような抗体であり得るかまたは抗体にコンジュゲートされる検出可能標識をも含み得る。検出可能標識は、例えば酵素、オリゴヌクレオチド、ナノ粒子、化学発光物質、蛍光団、蛍光クエンチャー、化学発光クエンチャー、またはビオチンであり得る直接標識であり得る。キットは場合により標識を検出するために必要な追加試薬を含み得る。
【００９０】
所望により、キットは更に、別のアナライトについて試験サンプルをアッセイするために１つ以上の成分を単独で、または指示書と組み合わせて含み得、前記アナライトはバイオマーカー、例えばＮＯＧＯ  Ａ、ＮＯＧＯ受容体、ＯＭｇｐ、ＭＢＰ、Ｎｆ、ＧＡＰ−４３、オステオポンチン；インターロイキン１７、インターロイキン６、インターフェロンγ及びＴＮＦ−αのようなＭＳのバイオマーカーであり得る、アナライトの例には、１８ｋＤａのＲＧＭａ断片、３０ｋＤａのＲＧＭａ断片及び／または４０ｋＤａのＲＧＭａ断片、並びに本明細書中で検討されているかまたは当業界で公知の他のアナライト及びバイオマーカーが含まれるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、１８ｋＤａのＲＧＭａ断片、３０ｋＤａのＲＧＭａ断片及び／または４０ｋＤａのＲＧＭａ断片について試験サンプルをアッセイするための１つ以上の成分により、１８ｋＤａのＲＧＭａ断片、３０ｋＤａのＲＧＭａ断片及び／または４０ｋＤａのＲＧＭａ断片の存在、量または濃度を測定することができる。サンプル、例えば血清サンプルは１８ｋＤａのＲＧＭａ断片、３０ｋＤａのＲＧＭａ断片及び／または４０ｋＤａのＲＧＭａ断片についてＴＯＦ−ＭＳ及び内部標準を用いてアッセイされ得る。
【００９１】
本明細書中に開示されている本発明の方法の他の適当な修飾及び改変は容易に適用され且つ自明であり、本発明の範囲、または本明細書中に開示されている態様及び実施形態を逸脱することなく適当な均等物を用いてなされ得ることは当業者にとって容易に分かるであろう。本発明を詳細に説明してきたが、本発明は本発明の幾つかの態様及び実施形態を例示するためにのみ意図されている以下の実施例を参照することにより明白に理解され、発明の範囲を限定するものと見なすべきではない。本明細書中に挙げられているすべての雑誌論文、米国特許及び公開明細書の開示内容はその全文を参照により本明細書に組み入れる。
【実施例】
【００９２】
本発明は以下の非限定的実施例により説明される複数の態様を有する。
【００９３】
［実施例１］
材料及び方法
被験者  ２５人のＭＳ患者（年齢：５０±１．６４［平均値±ＳＥＭ，才］を研究した。平均ＭＳ期間は１４．０２±１．７１［年］であった。被験者には、１４人の女性及び１１人の男性を含めた。被験者には、１３人の二次性進行性［８人の女性、５人の男性］及び１２人の原発性進行性［６人の女性、６人の男性］）を含めた。除外基準は、憎悪の急性発症または症状の最近明らかに高まった進行であった。
【００９４】
計画  ＴＣＡ適用後、ＣＳＦ及び脊髄中のＴＣＡの拡散を助け、容易にするために少なくとも６時間ベッドに止まるように命じられた。腰椎穿刺を非外傷性スプロット針を用いて実施した。既存の免疫系調節性薬物治療は安定した状態を保っていた。痙縮抑制治療は変えなかった。総合障害度評価スコア（ＥＤＳＳ）評点、最大歩行距離及び歩行速度評価をベースライン時、及び１０ｍｌの食塩液に溶解させた４０ｍｇのトリアムシノロンアセトニド（ＴＣＡ）を投与後毎日、最長第４回ＴＣＡ適用まで実施した。
【００９５】
ＣＳＦサンプリング及びＣＳＦ分析  髄腔内ＴＣＡ適用前にＣＳＦを採取した。約１ｍｌのＣＳＦのアリコートを滅菌エッペンドルフチューブ中に集め、直ちに凍結し、−２０℃で保存した。ＲＧＭａ測定を第１回ＴＣＡ適用前のベースライン時（モーメントＩ）、及びＴＣＡ注射後毎日（モーメントＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ及びＶ）実施した。タンパク質濃度はＮａｎｏＤｒｏｐアナライザー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いる測定により調べた。
【００９６】
ウェスタンブロット分析  ＣＳＦ  ＲＧＭａレベルをウェスタンブロッティング及び免疫検出（Ｓｃｈａｆｆａｒら，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，１０７：４１８−４３１（２００８））により分析した。簡単に説明すると、１０μｌの各ＣＳＦサンプルを１０μｌのＳＤＳ充填染料（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と混合し、９５℃で１０分間インキュベートした。これらのサンプルの１０μｌをＳＤＳ−ＰＡ−Ｇｅｌｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて分離し、ニトロセルロース膜に移した。抗ＲＧＭａ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＢＡＦ２４５９）及び二次試薬の超高感度ＡＢＣペルオキシダーゼ染色キット（Ｐｉｅｒｃｅ，３２０５０）を用いて免疫染色した後、膜を発光試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，３４０９４）とインキュベートした。
【００９７】
バンド強度分析  バンド強度をＱｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．６．９（ＢｉｏＲａｄ）を用いて測定した。簡単に説明すると、バンド分析クイックガイド中の“Ｆｒａｍｅ  ｌａｎｅｓ…”を選択し、レーンの数を選んだ。最後に、レーンを“Ａｄｄ／Ａｄｊｕｓｔ  Ａｎｃｈｏｒｓ”ツールを用いて調節し、当該バンドを“Ｄｅｔｅｃｔ  Ｂａｎｄｓ…”ツールを用いて手動で検出した。“Ａｌｌ  Ｌａｎｅ  Ｒｅｐｏｒｔ”を用いて、トレース強度ｘ  ｍｍを検出し、分析のために使用した。患者毎に、モーメントＩを１００％として計算し、モーメントＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶをモーメントＩに対するパーセントで関連づけた。これらのパーセントの平均をグラフにプロットし、統計解析をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５においてＡＮＯＶＡとボンフェローニ多重比較検定を用いて行った。
【００９８】
検査結果の統計評価の手順：２５人の患者すべてのＣＳＦを臨床スコアとは独立してＲＧＭａ発現についてウェスタンブロッティングにより分析した。等量のＣＳＦを同一容量中のＲＧＭａレベルを比較するためにウェスタンブロッティングによる分析のために充填した。この群の２５人の患者すべてのＣＳＦ中の３０ｋＤａ及び４０ｋＤａバンドをデンシトメーター測定により分析した。臨床データを観察インターバル中即時応答者及び非即時非応答者に分類した。
【００９９】
統計  このパイロットトライアルの探索的解析のために反復測定デザインのＡＮＣＯＶＡを使用した。共変量はＭＳ期間、ＭＳタイプ、性別及び年齢であった。事後解析はベースラインに対するテューキー多重比較検定を用いて行った。統計解析はＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５ソフトウェアを用いて実施しした。
【０１００】
［実施例２］
ＭＳ患者の脳脊髄液中のＲＧＭａ
ＲＧＭａ断片がＭＳを患っている患者の脳脊髄液中に存在しているかを調べるために、ヒトＣＳＦサンプルのゲル電気泳動、ウェスタンブロット、及びＲＧＭａ特異的抗体を用いる免疫検出を実施例２に記載されているように実施した。図１は、ヒトＣＳＦ中の上記したＲＧＭａ断片すべての存在を示す（Ｋｅｙ  ａｎｄ  Ｌａｈ，Ｃｅｌｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  ＆  Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ６：２，８５−９０（２０１２）から改変）。ＲＧＭａ特異的抗体を用いて免疫検出すると、約４０、３０及び１８ｋＤａのサイズを有する３つの断片が検出された。ＴＣＡ＝進行性ＭＳ患者の髄腔内治療のために使用したデポ剤コルチコステロイドのトリアムシノロンアセトニド。Ｉ〜ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖはそれぞれ第１回、第２回、第３回、第４回及び第５回ＴＣＡ治療前。
【０１０１】
［実施例３］
多発性硬化症患者におけるトリアムシノロンアセトニドの効果
多くの一般的な薬物はＭＳの疾患進行を遅らすが、ＭＳ患者の機能回復を高めない。実験は、脳脊髄液中のＲＧＭａレベルと共に、１日おきの４回のトリアムシノロン適用の効果を立証するために実施した。２５人の進行性多発性硬化症患者において臨床評価をベースライン時及びトリアムシノロン投与後毎日実施した。ＴＣＡを患者に投与する前に、ＣＳＦの１〜２ｍｌアリコートを採取した。各トリアムシノロン適用前にＲＧＭａ濃度をウェスタンブロット分析により測定し、定量化した。患者は、疾患活動性に応じて通常ＴＣＡの４〜６回適用を受けた。
【０１０２】
応答者の臨床データ  １７人の患者（１０人の男性，７人の女性；年齢：５２．１８±２．０４，ＭＳ期間：１５．７４±１．９２）は治療後改善した。これらの患者のＥＤＳＳスコア（Ｆ＝８．５５；ｐ＜０．００９［図３Ａ］）は低下し、最大歩行距離は増加し（Ｆ＝３．６４；ｐ＝０．０１［図３Ｂ］）、歩行速度は向上した（Ｆ＝３．４２；ｐ＜０．０１［図３Ｃ］）。３人の患者は車椅子に束縛されており、彼らのデータは歩行能力の解析に含めなかった。
【０１０３】
即時応答しなかった患者の臨床データ  ８人の患者（１人の男性，７人の女性；年齢：４５．３８±２．０４；ＭＳ期間：１０．３８±３．２４）は観察期間中即時応答しなかった。ＥＤＳＳスコア（Ｆ＝１；ｎｓ［図４Ａ］）、最大歩行距離（Ｆ＝１．５２；ｎｓ［図４Ｂ］）及び歩行速度（Ｆ＝０．０２１；ｎｓ［図４Ｃ］）に有意な変化はなかった。６人の患者はＴＣＡ適用から３週間以内に遅れた改善を報告した。
【０１０４】
通常、すべての参加者で重篤な副作用は現れなかった。全分析で共変数の影響は見られなかった。
【０１０５】
検査結果  応答者  このコホートではＲＧＭａレベルが低下した。低下は、４０ｋＤａ形態（Ｆ＝９．１２；ｐ＜０．０００１［図５Ａ］）よりも３０ｋＤａ（Ｆ＝３．８２；ｐ＜０．０５［図５Ｂ］）であまりはっきりしなかった。タンパク質ＣＳＦ濃度の有意な変化はなかった（Ｆ＝２．７７；ｎｓ［図５Ｃ］）。図６は３つの代表的ウェスタンブロットを示す。
【０１０６】
即時応答しない患者  ＣＳＦ中のＲＧＭａの両形態（３０ｋＤａ：Ｆ＝２．９８；ｎｓ［図７Ｂ］；４０ｋＤａ：Ｆ＝０．８４；ｎｓ［図７Ａ］）及びタンパク質含量（Ｆ＝２．８６；ｎｓ［図７Ｃ］）に有意な変化は見られなかった。図８はこの群の３つの代表的ウェスタンブロットを示す。
【０１０７】
１７人の患者では、多発性硬化症の臨床スコアが改善し、最大歩行距離及び歩行速度が改善した。これらの応答者ではＲＧＭａレベルが低下した。残りの患者は迅速な臨床効果も、ＲＧＭａ濃度の低下も示さなかった。ＲＧＭａの低下は進行性多発性硬化症患者におけるトリアムシノロンによる再生及び機能回復を反映し得る。タンパク質濃度は応答者と非応答者の間で異なっていなかった。両コホートにおいてそれぞれ両者間のＣＳＦ中の細胞数の相対的変化はなかった。
【０１０８】
ＴＣＡ適用を反復すると、調べたＲＧＭａ断片のすべての濃度の低下が引き起こされた。驚くことに、ＣＳＦ中の可溶性ＲＧＭａ断片のＴＣＡに起因する減少は機能改善を示した患者で観察され、ＲＧＭａ断片がＭＳ患者の成果を評価するために使用され得ることを示している。このことは、ＴＣＡで治療したＭＳ患者の別の群はＲＧＭａ断片ＣＳＦ濃度の低下を示さず、機能も回復しなかったという第２の観察によりさらに補強される。
【０１０９】
上記した詳細説明及び添付の実施例は単なる例示であり、添付の特許請求の範囲によってのみ規定される発明の範囲及びその均等物に対する限定としてとられるべきではないと理解されたい。
【０１１０】
開示されている実施形態の各種改変及び修飾は当業者に自明であろう。このような改変及び修飾には、非限定的に本発明の化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成、組成物、製剤または使用方法が含まれるが、これらは発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく加え得る。
【０１１１】
網羅のために、本発明の各種態様を以下の番号を付した条項に記載する：
条項１．  サンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片を検出し、定量化する方法であって、前記方法は、（ａ）被験者から少なくとも１個のＲＧＭａ断片を含むサンプルを得るステップと、（ｂ）サンプルをキャプチャー結合タンパク質と接触させるステップと、ここで、キャプチャー結合タンパク質は、少なくとも１個のＲＧＭａ断片に結合して、キャプチャー結合タンパク質−ＲＧＭａ断片複合体を形成する、（ｃ）サンプルを検出結合タンパク質と接触させるステップと、ここで、検出結合タンパク質は、キャプチャー結合タンパク質と相互作用して、検出結合タンパク質−キャプチャー結合タンパク質ＲＧＭａ断片複合体を形成する、（ｄ）サンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片を検出し、定量化するステップとを含む前記方法。
【０１１２】
条項２．  少なくとも１個のＲＧＭａ断片は約１ｋＤａ〜約６５ｋＤａのサイズを有するＲＧＭａ断片である、条項１に記載の方法。
【０１１３】
条項３．  ＲＧＭａ断片は、１０ｋＤａ、１８ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、５０ｋＤまたは６５ｋＤａのサイズを有する、条項１または２に記載の方法。
【０１１４】
条項４．  ＲＧＭａ断片は１８ｋＤａのＲＧＭａ断片、３０ｋＤａのＲＧＭａ断片及び４０ｋＤａのＲＧＭａ断片からなる群から選択される、条項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【０１１５】
条項５．  ステップ（ｂ）の前に、電気泳動を用いて、少なくとも１個のＲＧＭａ断片をゲル分離する、条項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【０１１６】
条項６．  ステップ（ｂ）の前に、少なくとも１個のＲＧＭａ断片を膜に固定化してウェスタンブロッティング膜を作成させるステップと、ステップ（ｂ）においてウェスタンブロッティング膜をキャプチャー結合タンパク質と接触させるステップと、ここで、キャプチャー結合タンパク質は、ウェスタンブロッティング膜上に固定化した少なくとも１個のＲＧＭａ断片に結合して、キャプチャー結合タンパク質−ＲＧＭａ断片複合体を形成する、ステップ（ｃ）においてウェスタンブロッティング膜を検出結合タンパク質と接触させるステップと、ここで、検出結合タンパク質は、キャプチャー結合タンパク質と相互作用して、検出結合タンパク質−キャプチャー結合タンパク質ＲＧＭａ断片複合体を形成するステップをさらに含む、条項５に記載の方法。
【０１１７】
条項７．  少なくとも２個のＲＧＭａ断片を検出する、条項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【０１１８】
条項８．  少なくとも２個のＲＧＭａ断片は、３０ｋＤａ及び４０ｋＤａのサイズを有する、条項７に記載の方法。
【０１１９】
条項９．  少なくとも３個のＲＧＭａ断片を検出する、条項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【０１２０】
条項１０．  少なくとも３個のＲＧＭａ断片は、１８ｋＤａ、３０ｋＤａ及び４０ｋＤａのサイズを有する、条項９に記載の方法。
【０１２１】
条項１１．  少なくとも１個のＲＧＭａ断片は、可溶性ＲＧＭａ断片である、条項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【０１２２】
条項１２．  ステップ（ｂ）においてゲル上でサンプル中のタンパク質と同時にＲＧＭａタンパク質標準を分離するステップと、（ｇ）少なくとも１個のＲＧＭａ断片を分離したＲＧＭａタンパク質標準と比較して断片を定量化するステップとをさらに含む、条項５〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【０１２３】
条項１３．  ＲＧＭａタンパク質標準は組換えＲＧＭａ断片の勾配である、条項１２に記載の方法。
【０１２４】
条項１４．  勾配は、ＲＧＭａタンパク質標準１０、２５、５０、１００及び２００ｐｇ／ｍＬを含む、条項１３に記載の方法。
【０１２５】
条項１５．  ＲＧＭａ断片のサイズをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定する、条項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【０１２６】
条項１６．  ＳＤＳ  ＰＡＧＥは４〜１５％である、条項１５に記載の方法。
【０１２７】
条項１７．  膜は、ニトロセルロース膜である、条項６〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【０１２８】
条項１８．  キャプチャー結合タンパク質は、ＲＧＭａ選択的抗体である、条項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【０１２９】
条項１９．  抗体は、ビオチン化ＲＧＭａ選択的抗体である、条項１８に記載の方法。
【０１３０】
条項２０．  検出結合タンパク質は、四価アビジンであり、検出可能標識は、ビオチン化ホースラディッシュペルオキシダーゼである、条項１９に記載の方法。
【０１３１】
条項２１．  ペルオキシダーゼ染色キットを用いて、少なくとも１個のＲＧＭａ断片を検出する、条項２０に記載の方法。
【０１３２】
条項２２．  神経変性疾患に対する治療の必要な被験者における、神経変性疾患に対する治療の有効性の判定方法であって、前記方法は、（ａ）被験者からのサンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片のレベルを条項１〜２１のいずれか１項に記載の方法を用いて測定するステップと、（ｂ）被験者からのサンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片のレベルを少なくとも１個のＲＧＭａ断片の対照レベルと比較するステップと、ここで、少なくとも１個の断片のレベルが対照レベルと比較して高い場合、治療は神経変性疾患の治療に無効であると判定され、少なくとも１個の断片のレベルが対照レベルと比較して同一であるかまたは低い場合、治療は神経変性疾患の治療に有効であると判定されることを含む前記方法。
【０１３３】
条項２３．  神経変性疾患に対する治療の必要な被験者に対して神経変性疾患の治療に有効であると判定された治療を施行し続けることをさらに含む、条項２２に記載の方法。
【０１３４】
条項２４．  少なくとも１個のＲＧＭａ断片の対照レベルは神経変性疾患にかかっているが、神経変性疾患に対する治療を受けたことがない被験者中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片のレベルである、条項２２または２３に記載の方法。
【０１３５】
条項２５．  神経変性疾患を患っている被験者の治療に対する応答性の予測方法であって、前記方法は、（ａ）被験者からのサンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片のレベルを、条項１〜２１のいずれか１項に記載の方法を用いて測定するステップ、（ｂ）被験者からのサンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片のレベルを少なくとも１個のＲＧＭａ断片の対照レベルと比較するステップと；（ｃ）サンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片のレベルが対照レベルと比較して低い場合、被験者の治療に対する応答性の予測を与えるステップとを含む、前記方法。
【０１３６】
条項２６．  治療に応答すると予測された被験者に対して該治療を施行することをさらに含む、条項２５に記載の方法。
【０１３７】
条項２７．  神経変性疾患を患っている被験者の治療方法であって、前記方法は、（ａ）被験者からのサンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片のレベルを、条項１〜２１のいずれか１項に記載の方法を用いて測定するステップと、（ｂ）被験者からのサンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片のレベルを少なくとも１個のＲＧＭａ断片の対照レベルと比較するステップと；（ｃ）断片のレベルが対照レベルと比較して高い場合、被験者に対して治療レジメンを投与するステップとを含む前記方法。
【０１３８】
条項２８．  治療は、神経回復薬、神経保護薬、または神経再生薬を含む、条項２２〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【０１３９】
条項２９．  治療は、トリアムシノロンアセトニド（ＴＣＡ）、テクフィデラ／ＢＧ−１２（フマル酸ジメチル）、ジレニア（フィンゴリモド）、ラキニモド、β−インターフェロン、コパキソン、ダクリズマブ、アレムツズマブ、リツキシマブ、またはその組合せの少なくとも１つを含む、条項２２〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【０１４０】
条項３０．  治療は、トリアムシノロンアセトニド（ＴＣＡ）を含む、条項２６〜２９のいずれか１つに記載の方法。
【０１４１】
条項３１．  神経変性疾患を患っている被験者に対する治療レジメンの最適化方法であって、（ａ）被験者から得られた第１サンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第１レベルを、条項１〜２０のいずれか１項に記載の方法を用いて測定するステップ、ここで、第一サンプルは、被験者が治療レジメンを始める前またはその間の時点で被験者から採取される、（ｂ）ステップ（ａ）より後の時点で被験者から得られた第２サンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第２レベルを測定するステップと、ここで、少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第１レベルと比較した少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第２レベルの低下は該治療レジメンが神経変性疾患に対して治療効果を有していることを示し；（ｃ）被験者からの第１サンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片のレベルを条項１に記載の方法を用いて測定するステップと、（ｄ）被験者からのサンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片のレベルを、少なくとも１個のＲＧＭａ断片の対照レベルと比較するステップと；（ｅ）サンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片のレベルが対照レベルと比較して低い場合、被験者の治療に対する応答性の予測を与えるステップとを含む前記方法。
【０１４２】
条項３２．  治療レジメンは、神経回復治療レジメンである、条項３１に記載の方法。
【０１４３】
条項３３．  神経回復治療レジメンの成功率を向上させる、条項３２に記載の方法。
【０１４４】
条項３４．  治療レジメンは、神経保護治療レジメンである、条項３１に記載の方法。
【０１４５】
条項３５．  神経保護治療レジメンの成功率を向上させる、条項３４に記載の方法。
【０１４６】
条項３６．  神経変性疾患を患っている被験者の再生促進薬物治療のモニタリング方法であって、（ａ）被験者から得られた第１サンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第１レベルを条項１〜２１のいずれか１項に記載の方法を用いて測定するステップと、ここで、第１サンプルは、被験者が薬物治療を始める前またはその間の時点で被験者から採取される（ｂ）ステップ（ａ）より後の時点で被験者から得られた第２サンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第２レベルを測定するステップと、ここで、少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第１レベルと比較した少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第２レベルの低下は、該薬物治療レジメンが神経変性疾患に対して治療効果を有していることを示し、少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第１レベルと比較した少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第２レベルの上昇は、該薬物治療レジメンが神経変性疾患に対して治療効果を有していないことを示し；（ｃ）薬物治療レジメンが神経変性疾患に対して治療効果を有していない場合、被験者に対して別の薬物治療を施行するステップとを含む前記方法。
【０１４７】
条項３７．  神経変性疾患に対する治療効果についての化合物のスクリーニング方法であって、前記方法は、（ａ）細胞を含むサンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第１レベルを条項１〜２１のいずれか１項に記載の方法を用いて測定するステップと、（ｂ）サンプルを化合物と接触させるステップと；（ｃ）ステップ（ｂ）より後の時点で被験者から得られた第２サンプル中の少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第２レベルを測定するステップと、ここで、少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第１レベルと比較した少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第２レベルの低下は、該化合物が神経変性疾患に対して治療効果を有していることを示し、少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第１レベルと比較した少なくとも１個のＲＧＭａ断片の第２レベルの上昇は、該化合物が神経変性疾患に対して治療効果を有していないことを示し；（ｄ）治療効果を有すると同定された化合物を選択するステップとを含む前記方法。
【０１４８】
条項３８．  少なくとも２個のＲＧＭａ断片を検出する、条項２２〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【０１４９】
条項３９．  少なくとも２個のＲＧＭａ断片は、３０ｋＤａ及び４０ｋＤａのサイズを有する、条項３８に記載の方法。
【０１５０】
条項４０．  少なくとも３個のＲＧＭａ断片を検出する、条項２２〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【０１５１】
条項４１．  少なくとも３個のＲＧＭａ断片は１８ｋＤａ、３０ｋＤａ及び４０ｋＤａのサイズを有する、条項４０に記載の方法。
【０１５２】
条項４２．  神経変性疾患または障害は、多発性硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、テイ−サックス病、ニーマン−ピック病、ゴーシェ病、ハーラー症候群、ハンチントン病、筋萎縮性側策硬化症、特発性炎症性脱髄疾患、ビタミンＢ１２欠乏症、橋中心髄鞘崩壊症、脊髄ろう、横断性脊髄炎、デビック病、進行性多巣性白質脳症、視神経炎、脊髄損傷、外傷性脳損傷、卒中、緑内障、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性、または白質ジストロフィーである、条項２２〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【０１５３】
条項４３．  神経変性疾患または障害は、多発性硬化症である、条項２２〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【０１５４】
条項４４．  ＲＧＭａ断片はヒトＲＧＭａ断片である、条項１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【０１５５】
条項４５．  サンプルは脳脊髄液、血液、血清または血漿からなる、条項１〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
2017526930.tif 000010
【図５Ｂ】
2017526930.tif 000011
【図５Ｃ】
2017526930.tif 000012
【図６】
2017526930.tif 000013
【図７Ａ】
2017526930.tif 000014
【図７Ｂ】
2017526930.tif 000015
【図７Ｃ】
2017526930.tif 000016
【図８】
2017526930.tif 000017
【国際調査報告】
2017526930.tif 000018
2017526930.tif 000019
2017526930.tif 000020