(57)【要約】  本発明はインビトロで幹細胞を培養する方法に関し、幹細胞を含む試料を提供するステップと、試料に第一期間の処理を受けさせることにより培養するステップを備える。この方法は規定の温度と規定の雰囲気を有する低温条件下で処理が施されることを特徴とし、気温は１５℃を越えず、雰囲気の酸素含量は２１％（ｖ／ｖ）を越えない。このため、第一期間は４日〜４週間である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロにおいて幹細胞を培養および富化する方法であって、
●幹細胞を含む試料を提供するステップと、
●第一期間の間、試料に処理を受けさせることにより幹細胞を培養するステップを備え      、
処理は規定の温度と規定の雰囲気を有する低温条件下で実施され、温度は１５℃を越えず、雰囲気は２１％（ｖ／ｖ）を越えない酸素含量を有し、第一期間が４日間から４週間であることを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、幹細胞が衛星細胞、筋幹細胞（ＭｕＳＣｓ）、平滑筋（ＳＭ）細胞の前駆細胞、筋芽細胞、メソアンジオブラスト、周皮細胞／骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣｓ）、サイドポピュレーション幹細胞（ＳＰ細胞）、ＣＤ１３３+細胞、人工多能性幹細胞（ＩＰＳ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）、ＰＷ１間質細胞からなる集団から選択されることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、幹細胞が筋衛星細胞であることを特徴とする方法。
【請求項４】
先行の請求項のいずれかに記載の方法であって、試料が分離された組織試料であることを特徴とする方法。
【請求項５】
先行の請求項のいずれかに記載の方法であって、試料が分離された筋線維断片であることを特徴とする方法。
【請求項６】
先行の請求項のいずれかに記載の方法であって、幹細胞が細胞懸濁液において培養されていないことを特徴とする方法。
【請求項７】
先行の請求項のいずれかに記載の方法であって、幹細胞が結束細胞構造において培養されることを特徴とする方法。
【請求項８】
先行の請求項のいずれかに記載の方法であって、哺乳動物、ヒト科、ヒト、非ヒト哺乳動物、齧歯動物からなる集団に属する生物から試料が得られることを特徴とする方法。
【請求項９】
先行の請求項のいずれかに記載の方法であって、温度が１０℃を越えず、酸素含量が１０％（ｖ／ｖ）を越えないことを特徴とする方法。
【請求項１０】
先行の請求項のいずれかに記載の方法であって、第一期間の経過後の試料におけるすべての生細胞の７０〜１００％が培養幹細胞であることを特徴とする方法。
【請求項１１】
培養幹細胞であって、先行の請求項のいずれかに記載の方法により得られる細胞。
【請求項１２】
細胞コロニーであって、請求項１１に記載の培養幹細胞からなるコロニー。
【請求項１３】
分離されたヒト筋線維断片であって、請求項５〜１０のいずれかに記載の方法を実施した後に得られる断片。
【請求項１４】
遺伝子組み換えされた幹細胞をインビトロで製造する方法であって、
●請求項１〜１０のいずれかに記載の方法により得られる培養幹細胞を提供するステッ      プと、
●培養幹細胞に遺伝情報を挿入するステップを備える方法。
【請求項１５】
遺伝子組み換え幹細胞であって、請求項１４に記載の方法により得られる細胞。
【請求項１６】
請求項１１に記載の培養幹細胞または請求項１５に記載の遺伝子組み換え幹細胞であって、培養幹細胞または遺伝子組み換え幹細胞を必要な対象に投与することにより疾患の治療に用いる細胞。
【請求項１７】
請求項１６に記載の使用のための、請求項１１に記載の培養幹細胞または請求項１５に記載の遺伝子組み換え幹細胞であって、疾患が筋ジストロフィーまたは筋萎縮症であることを特徴とする細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
明細書
本発明は、請求項１の前文のインビトロで幹細胞を培養および富化する方法と、請求項１１の前文のインビトロで培養される幹細胞と、請求項１４の前文のインビトロで遺伝子組み換え幹細胞を生産する方法とに関する。
【背景技術】
【０００２】
先行技術によれば、生きた状態を維持しつつも分化し始めないようにインビトロで幹細胞を培養することは難題である。分化は幹細胞の全能性や多能性の消失を伴う。
【０００３】
またこれも従来技術から知られていることであるが、低温処理は細胞にストレスを与え、生存能力を著しく低下させる。レスベラトロールなどいくつかの化合物を加えることにより、そのストレスを減少させる試みがなされた（Ｃｏｒｗｉｎ他：Characterizationand modulation of human mesenchymal stem cell stress pathway response followinghypothermic storage, Cryobiology 68(2014), 215-226）。
【０００４】
ＷＯ２００９／１２１００２Ａ１には全血の低温採取の方法が記載されている。保存溶液を加える場合、１〜３日の間は血液を冷却することにより保存ができるということが示されている。
【０００５】
幹細胞はインビトロまたはインビボにおける組織の初期成長に用いることができる。
【０００６】
本発明は、幹細胞が幹細胞自身の全能性や多能性を保持し、インビトロで幹細胞を培養および富化する方法を提供することを目的としている。
【０００７】
この目的は請求項１の特徴を有する方法により達成される。インビトロで幹細胞を培養および富化するこのような方法は次のステップを有する。すなわち、幹細胞を含む試料を提供するステップと、第一期間の間この試料に処理を受けさせることにより幹細胞を培養するステップとを含む。この方法は既定の温度と既定の雰囲気を有する低温状況下にて処理が施される点を特徴とし、温度は１５℃を越えず、雰囲気の酸素含有量（以下では％（ｖ／ｖ）と示される）は２１％を越えない。そのため、第一期間は４日間〜４週間である。これらの状況下で培養することで、驚くべきことに試料中の幹細胞に富化をもたらし、第一期間後には試料中のすべての生存細胞の約７０〜１００％が培養細胞かまたは培養細胞由来の誘導体となる。
【０００８】
先行技術ではそのような富化が可能であることを全く提案していない。すなわち請求項に記載の発明の処理条件によって、幹細胞を選択的に培養し、それゆえに細胞培養において富化することが可能である。ある者は幹細胞が低温にうまく耐えられないのではなく、むしろ低温が幹細胞にとってストレスであるのではないかとも疑った。さらに驚くべきことに、４日より短いインキュベート期間では著しい富化は起こらなかった。
【０００９】
培養は培養される幹細胞に適するかまたは適合された培地を用いて行われた。
【００１０】
一実施例として、温度は１４℃を超えない温度で、特に１３℃、特に１２℃、特に１１℃、特に１０℃、特に９℃、特に８℃、特に７℃、特に６℃、特に５℃、特に４℃、特に３℃、特に２℃、特に１℃、特に０℃を超過しない。一実施例として、温度は０℃〜１５℃の範囲で、特に１℃〜１４℃、特に２℃〜１３℃、特に３℃〜１２℃、特に４℃〜１１℃、特に５℃〜１０℃、特に６℃〜９℃、特に７℃〜８℃の範囲の温度である。
【００１１】
一実施例として、雰囲気は酸素含有量が２０％を越えず、特に１９％（ｖ／ｖ）、特に１８％（ｖ／ｖ）、特に１７％（ｖ／ｖ）、特に１６％（ｖ／ｖ）、特に１５％（ｖ／ｖ）、特に１４％（ｖ／ｖ）、特に１３％（ｖ／ｖ）、特に１２％（ｖ／ｖ）、特に１１％（ｖ／ｖ）、特に１０％（ｖ／ｖ）、特に９％（ｖ／ｖ）、特に８％（ｖ／ｖ）、特に７％（ｖ／ｖ）、特に６％（ｖ／ｖ）、特に５％（ｖ／ｖ）、特に４％（ｖ／ｖ）、特に３％（ｖ／ｖ）、特に２％（ｖ／ｖ）、特に１％（ｖ／ｖ）を越えず、特に前述した酸素含有量のいずれをも超えない。
【００１２】
酸素含有量が２０％（ｖ／ｖ）未満の雰囲気は低酸素条件と言われることも多い。
【００１３】
一実施例として、雰囲気の酸素含有量は１％（ｖ／ｖ）〜２１％（ｖ／ｖ）の範囲であり、特に２％（ｖ／ｖ）〜２０％（ｖ／ｖ）、特に３％（ｖ／ｖ）〜１９％（ｖ／ｖ）、特に４％（ｖ／ｖ）〜１８％（ｖ／ｖ）、特に５％（ｖ／ｖ）〜１７％（ｖ／ｖ）、特に６％（ｖ／ｖ）〜１６％（ｖ／ｖ）、特に７％（ｖ／ｖ）〜１５％（ｖ／ｖ）、特に８％（ｖ／ｖ）〜１４％（ｖ／ｖ）、特に９％（ｖ／ｖ）〜１３％（ｖ／ｖ）、特に１０％（ｖ／ｖ）〜１２％（ｖ／ｖ）、特に３％（ｖ／ｖ）〜１１％（ｖ／ｖ）の範囲にある。
【００１４】
上記した温度と酸素含有量のいかなる組み合わせもここに明白に開示されている。
【００１５】
また他の一実施例として、雰囲気の酸素含有量が３０容積％を越えず、特に２９％（ｖ／ｖ）、特に２８％（ｖ／ｖ）、特に２７％（ｖ／ｖ）、特に２６％（ｖ／ｖ）、特に２５％（ｖ／ｖ）、特に２４％（ｖ／ｖ）、特に２３％（ｖ／ｖ）、特に２２％（ｖ／ｖ）、特に２１％（ｖ／ｖ）を越えない。
【００１６】
一実施例として、温度は０℃〜１０℃の範囲にあり酸素含有量は０％（ｖ／ｖ）〜８％（ｖ／ｖ）の範囲にある。一実施例として、温度は２℃〜５℃の範囲にあり酸素含有量は２％（ｖ／ｖ）〜５％（ｖ／ｖ）の範囲にある。一実施例として、温度が３℃〜４℃の範囲にあり酸素含有量が３％（ｖ／ｖ）〜４％（ｖ／ｖ）の範囲にある。
【００１７】
特に明白な断りがない限り、たとえ（ｖ／ｖ）が抜け落ちていたとしても、すべての割合は流体含量や流体比を％（ｖ／ｖ）の単位で示されている。
【００１８】
一実施例として、第一期間は１週間〜４週間、特に２週間〜３週間である。
【００１９】
５日間〜２週間の第一期間、特に６日間〜１週間、特に１週間の持続がとりわけ幹細胞の培養および富化に適しているということがわかった。
【００２０】
一実施例として、幹細胞は衛星細胞、筋幹細胞（ＭｕＳＣｓ）、平滑筋（ＳＭ）細胞の前駆細胞、筋芽細胞、メソアンジオブラスト、周皮細胞／骨髄由来免疫抑制細胞(ＭＤＳＣｓ)、サイドポピュレーション幹細胞（ＳＰ細胞）、ＣＤ１３３+細胞、人工多能性幹細胞（ＩＰＳ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）、ＰＷ１間質細胞からなる集団から選ばれる。
【００２１】
衛星細胞がとりわけ適している。
【００２２】
一実施例として、この方法は胚性幹細胞を明確に利用せず、特にヒト胚性幹細胞を利用しない。
【００２３】
他の一実施例として、胚や胚になり得る多細胞体を破壊することなく得られたものであるという条件であれば、幹細胞は胚性幹細胞である。
【００２４】
一実施例として、幹細胞は筋衛星細胞（Ｐａｘ７+細胞）である。筋衛星細胞は筋再生に必要である。
【００２５】
一実施例として、試料は組織試料から分離される。試料は被験者から生検などの標準的な方法により分離することができる。血液試料も適切な組織試料である。
【００２６】
一実施例として、試料は筋線維断片から分離される。ヒト筋線維断片（ＨＭＦＦｓ）は特に適しており、筋生検により容易に採取できる。
【００２７】
一実施例として、幹細胞は細胞浮遊方式では培養されず、すなわち本実施例において細胞は支持構造物なしで培地に懸濁させる典型的な細胞培養方式では培養されない。
【００２８】
一実施例として、幹細胞は結束細胞構造（ｕｎｉｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）内で培養される。これは結束細胞構造を可能にする支持構造により最も良く実現され得る。一実施例として、この支持構造は体内で細胞が成長する自然な構造であり（例えばＨＭＦＦは衛星細胞を培養する本発明の状況に非常に適している）。他の一実施例として、この支持構造は体内で細胞が成長する自然な構造を模すかまたは良く似せた人工的な構造である。
【００２９】
一実施例として、試料は哺乳動物、ヒト科、ヒト、ヒト以外の哺乳動物や齧歯動物からなる集団に属する生物から得られる。ヒトが特に適している。
【００３０】
一実施例として、温度は１０℃を越えず、酸素含有量は８％（ｖ／ｖ）を越えない。
【００３１】
一実施例として、第一期間の経過後の試料中におけるすべての生細胞のうち７０〜１００％（特に７５〜９９％、特に８０〜９５％、特に８５〜９０％）は培養幹細胞である。一例を挙げるとすれば、培養したすべての筋原細胞（ｄｅｓｍｉｎ+）中のＰａｘ７+細胞（真の筋幹細胞、衛星細胞とも呼ばれる）の割合は低温処理なしでおよそ４０〜５０％変化する。しかしながら一実験において、数週間の低温処理後のその割合は８５％まで上昇し、その高さで安定した。
【００３２】
一実施例として、幹細胞が培養されている培地に増殖因子が加えられる。一実施例として、幹細胞が２週間以上培養される場合、特に４℃で２週間以上培養される場合にのみ増殖因子が加えられる。特に、試料および衛星細胞が培養されるときのＨＭＦＦの場合、低血清量の培地が適している。よく適した培地としては、例えばライフテクノロジー社から入手可能なＯｐｔｉＭＥＭなどの血清を低減させて最適化された最小必須培地がある。
【００３３】
一実施例として、より短い培養期間の場合（特に第一期間が４〜１４日間の範囲である場合）、培地に増殖因子は加えられない。これらの短い培養期間には、グルコース含有の緩衝塩溶液を培地として適切に用いることができる。よく適した培地は３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｄ−グルコース、３．２μＭ  フェノールレッド（ｐＨ７．６）である。培養中に異種血清をできる限り避けるべきである場合、このような培地は特に臨床の現場で筋幹細胞を培養するのに適している。
【００３４】
本発明は前の説明の方法により得られる培養幹細胞にも関連する。このような培養幹細胞は通常、非培養幹細胞とは異なる分子的・代謝的特性を示すため、非培養幹細胞と区別することができる。しかしながら、それら培養幹細胞は全能性や多能性に関する通常の性質は保持している。
【００３５】
例示的な実施例に関してより詳細に説明されるように、低温条件下で培養した幹細胞により形成される細胞コロニーは、インビボまたは他のインキュベート条件下で観察される幹細胞の細胞コロニーとはそれらの構造や構成に関して異なる。一例を挙げれば、低温処理した衛星細胞のコロニーは最大１００％の筋原細胞からなる。したがって、線維芽細胞などの非筋原細胞は低温処理に耐える。このような細胞コロニーは典型的（低温処理されていない）な細胞コロニーのその後の扱い方で異なる増殖特性を示す。低温処理したヒト筋線維断片についても同じことが言える。
【００３６】
一側面として、本発明はすなわち先の説明の方法により得られる培養幹細胞を含む細胞コロニーにも関する。一側面として、さらに本発明は先の説明の方法を実施した後に得られる分離されたヒト筋線維断片に関する。
【００３７】
また本発明はインビトロで遺伝子組み換え幹細胞を製造する方法にも関連し、次のステップを含む。すなわち先のいずれかの説明の方法により得られる培養幹細胞を提供するステップと、遺伝情報を培養幹細胞に挿入するステップとを含む。
【００３８】
一側面として、本発明はインビトロで遺伝子組み換え幹細胞を製造するそのような方法により得られる、遺伝子組み換えされた幹細胞にも関する。
【００３９】
一側面として、また本発明は培養幹細胞や遺伝子組み換え幹細胞の医学的利用に関する。すなわち培養幹細胞や遺伝子組み換え幹細胞が必要な対象に投与されて疾患の治療に用いられることが意図されている。
【００４０】
一実施例として、疾患は例えばデュシェンヌ型筋ジストロフィーや膀胱ジストロフィーなどの筋ジストロフィーである。一実施例として、疾患は局所性または全身性筋萎縮症などの筋萎縮症である。
【００４１】
ここに、培養幹細胞を必要な対象に移植する方法が開示されており、この方法は上で概説したように培養された幹細胞を対象に投与するステップを備える。幹細胞は治療される対象を起源とするか（自家移植）あるいは異なる対象を起源とする（同種移植）ことができる。先ほど説明したように幹細胞は遺伝子組み換えされてもよい。
【００４２】
ここに、筋ジストロフィーや筋萎縮症に苦しむ被験者を治療する方法が開示され、その方法は上に概説したように培養された（さらに必要に応じて遺伝子組み換えされた）筋幹細胞を被験者に投与するステップを含む。一実施例として筋幹細胞は衛星細胞である。一実施例として幹細胞は、幹細胞の培養に関して特許請求の範囲に概説したように処理された組織系の状態で、特に適切に処理された筋線維断片の状態で、さらに言えば特にＨＭＦＦの状態で投与される。
【００４３】
開示した方法のうちの一つに関して記載した実施例は、その他明細書に記載したかまたは特許請求の範囲に記載したいずれの方法や細胞にも同様に応用することができる。
【００４４】
本発明の側面は例示的な実施例と図に関する次の事項において説明される。
【００４５】
図１は筋生検試料２が採取されたドナー１を示す。この筋生検試料２はその後、細胞培養３に移される。上記した培養方法を用いることにより、衛星細胞４を増殖させることができる。これらの増殖した衛星細胞４の遺伝コードは遺伝子修復ステップ５において、欠陥遺伝情報を望ましい遺伝情報６に置換するかまたは他の遺伝情報と置換せずに望ましい遺伝情報６を導入することにより組み換えられる。
【００４６】
遺伝子修復ステップ５を経て遺伝的に修正された幹細胞７が生じる。その後これらの遺伝的に修正された幹細胞７をドナー１に投与（移植）することができ、したがってこのドナー１はアクセプターともなり得る。
【００４７】
例示的実施例：ヒト衛星細胞は再生能を有し遺伝子操作が可能である
この例示的実施例はJournal of Clinical Investigation 124(10)の４２５７〜４２６５頁（以下では「論文」とする）に発表された。この論文は次のリンク（http://dx.doi.org/10.1172%2FJCI63992）を通して自由にアクセス可能である。この論文は補足試料を含んでおり、特にその図面および図面の説明に関して参照によりその全体を本明細書に援用する。これは本発明の開示の一部を形成する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００４８】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００９／１２１００２Ａ１
【非特許文献】
【００４９】
【非特許文献１】Ｃｏｒｗｉｎ他、”Characterizationand modulation of human mesenchymal stem cell stress pathway response followinghypothermic storage”, Cryobiology 68(2014), 215-226
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００５０】
概要
筋衛星細胞は再生を促進し、筋ジストロフィーを治療するための遺伝子導入を改善することができる。ヒト衛星細胞はわずかしかなく、それゆえ臨床試験が制限されている。発明者は２０〜８０歳の成人のドナーから骨格筋生検の試料を得た。線維断片は手作業で解剖され、培養され、筋形成制御因子ＰＡＸ７の発現を評価された。ＰＡＸ７+衛星細胞は活性化され、培養下で効率的に増殖した。ドナーの年齢を問わず、わずか２〜４個のＰＡＸ７+衛星細胞から数千の筋芽細胞を発生させた。ヒト筋線維断片を免疫不全マウスの放射線照射された筋肉に移植したところ強固に生着し、筋再生し、幹細胞ニッチにヒトＰＡＸ７+衛星細胞が適切にホーミングする結果となった。さらに発明者はヒト筋線維断片を低温処理することにより、ＰＡＸ７+細胞の培養をうまく富化させ、かつ移植と筋再生の効率を改善できることを確認した。最終的に発明者は培養したヒトＰＡＸ７+衛星細胞における遺伝子発現を、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンを介した非ウイルス性の遺伝子導入により変化させることに成功し、遺伝子治療における用途に関してこのシステムの可能性を浮き彫りにしている。同時にこれらの結果はヒト組織特異的な幹細胞の希少な集団（ｒａｒｅ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）を培養および操作する能力を実証し、これらのＰＡＸ７+衛星細胞が筋ジストロフィーにおける遺伝子機能を回復させる可能性を有することを示唆している。
【００５１】
導入
衛星細胞は成人の骨格筋特有の幹細胞である。他の幹細胞型と同様に、これらの細胞は非常に長期にわたり保持される（１，２）。早くも１９６１年にはそれらの特性評価がなされたにも関わらず、最近になってようやく衛星細胞が筋再生にとって必須であると認識されるに留まっている（３〜５）。衛星細胞は存在量が少なく、骨格筋の基底膜と筋鞘との間にある特定の幹細胞ニッチに分散して存在しているため、研究が困難なことで有名である。近年の動物実験により衛星細胞の機能と制御機構についてより深く洞察できるようになった（２，６〜９）。この研究により衛星細胞には自己再生に関する非常に大きな可能性および筋再生に関する素晴らしい可能性があるということが示された。しかしながら、治療目的でのヒト衛星細胞の増殖はこれまで成功していない。したがって治療志向の研究では、ＣＤ１３３+細胞、周皮細胞、誘導幹細胞、メソアンジオブラスト、ＰＷ１細胞などの筋原性ポテンシャルを有する他の細胞集団の利用を奨励してきた（１０〜１４）。これらの細胞は豊富に存在し、より入手しやすく、血管を横断する。
【００５２】
しかしながら衛星細胞と比べ、そのような代替となる細胞型は筋幹細胞（衛星細胞）を形成したり筋組織を再生したりする能力に限界がある。衛星細胞は発生の間に現れ、それらの分化および生存はペアードボックス（Ｐａｉｒｅｄ  ｂｏｘ）タンパク質ＰＡＸ３とＰＡＸ７に依存する（２）。ＰＡＸ３が胚性の衛星細胞の発生において鍵となる役割を果たす一方で、ＰＡＸ７は主に発生後の生存を管理する（１５，１６）。ＰＡＸ７は発生後に発現される、信頼性のある衛星細胞マーカーである（１７）。ＣＤ５６（ＮＣＡＭ）、ＣＤ３４、ＣＸＣＲ４、ｍ−カドヘリン、ＭＥＴ、シンデカン−３、シンデカン−４などの付加的なマーカーはマウス筋衛星細胞を特徴づけるが（１８〜２２）、それらのヒト衛星細胞の同定に関する妥当性はこれまで確立されていない。骨格筋が損傷した後、休止状態の衛星細胞が活性化し、自己再生するかまたは合胞体の筋線維に融合する分化のプログラムに入るかのどちらか一方となる。細胞外マトリックスや全身性ソースによって提供される未だはっきりしない要因と同様に、筋原性制御因子（例えばＭＹＦ５、ＭＹＯＤ、ミオゲニン等）やシグナル系（例えばＷＮＴ、ＮＯＴＣＨ等）を含むいくつかの要因および経路が、この複雑なカスケードを進行させている（参考文献２３に概説されている）。
【００５３】
初期の移植研究により、デュシェンヌ型筋ジストロフィーのｍｄｘマウスモデルにおいて、宿主線維の再生に対するマウス筋芽細胞の寄与が期待できるということが実証された（２４）。その後まもなく臨床実験が行われ、この実験は培養された発生後のヒト筋芽細胞をデュシェンヌ型筋ジストロフィーの患者の筋肉への注入に基づくものであった。残念ながら、移植された筋芽細胞はほとんど生き残らず、遊走能力は低く、線維再生にほとんど寄与しなかった（２５〜２７）。本発明の側面は筋再生の研究および筋ジストロフィーなどの筋消耗疾患における遺伝子治療のために、ヒト筋幹細胞を扱いやすくするための道具の開発を目的とした。
【００５４】
結果
新鮮分離されたヒト筋線維断片におけるＰＡＸ７+衛星細胞
発明者は、正当な同意と書面、インフォームドコンセントの後に成人の被験者（２０〜８０歳、３４名の女性、３５名の男性のドナー）から６９の異なる新鮮な筋組織の試料を得た。ヒト筋線維断片（ＨＭＦＦｓ）は手作業で解剖され、酵素処理はしていない（論文の図１および補足図１を参照）。次の表１に示すように、発明者は１〜８線維を含む８８４の断片を分離し解析した。
【００５５】
【表１】
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【００５６】
発明者は新鮮分離されたＨＭＦＦｓにおけるヒト衛星細胞を同定するために、あらかじめマウスで特性評価された様々な抗原を用いた。ＰＡＸ７と神経細胞接着分子であるＮＣＡＭ（ＣＤ５６）（論文の図１Ｂ参照）を共免疫染色することによりヒト線維と融合する細胞を確実に同定した。これらの大多数（８０％）はＰＡＸ７とＮＣＡＭに関して二重陽性であったが、ＰＡＸ７のみまたはＮＣＡＭのみの、どちらか一方でのみ観察される細胞染色の割合も似ていた。まれに、ＭＹＦ５+／ＰＡＸ７+細胞が発見された（論文の図１Ｂを参照）。骨格筋線維におけるすべての核のうち２％〜４％はＰＡＸ７+であった。発明者は、異なる年齢グループにおける線維と融合するＰＡＸ７+核の大きさに目立った違いはないということに気がついた。
【００５７】
発明者は例えばＭＥＴ、ＣＸＣＲ４、ＣＤ３４などの他のマーカーも同様に試した。ＭＥＴ+細胞は生後３か月の子どもから得られた骨格筋の生検試料に豊富に存在していたが、成人ドナー由来の筋切片には存在しなかった。発明者は時折、ＣＤ３４+細胞やＣＸＣＲ４+細胞を成人の筋試料または筋線維標本において同定することもあったが、これらはＰＡＸ７を共染色せず、衛星細胞ニッチにはなかった。したがって、これらのマーカーはヒトにおける衛星細胞の同定にはそれ以上用いられなかった（論文の補足図２参照）。続いてヒト衛星細胞としてのＰＡＸ７+細胞について言及する。
【００５８】
ＨＭＦＦｓの培養
次に、ＨＭＦＦｓにおける衛星細胞に生存能力があるかどうか、そして培養可能かどうかを試験した。培養したＨＭＦＦｓにおいて細胞は１０日間までの間、運動性を維持していた（論文の補足ビデオ１を参照）。培養初日、衛星細胞は線維と融合したままで培養皿では生育しなかった。その代わりに、衛星細胞は線維断片の足場と融合し、線維内部にあり、そこに密集していた。５〜１０日後、細胞は線維を出て培養皿上で最初のコロニーを形成した。
【００５９】
ＰＡＸ７+細胞が培養線維と融合したままの間（５〜１０日間）、その数は著しく増加し、新しく調整した断片量に比べて量的に２０〜５０倍まで増加したと発明者は見積もった（論文の図２参照）。そのような細胞の大多数はｄｅｓｍｉｎ+で、そして多くはＭＹＦ５+／ｄｅｓｍｉｎ+であり（論文の図２Ａと２Ｂ参照）、それらが活性化した衛星細胞に対応することを示している。ＰＡＸ７+およびｄｅｓｍｉｎ+細胞の大きなグループの外観により評価すると、ドナーの年齢とは関係なく、衛星細胞の活性化は培養ＨＭＦＦｓの１００％で観察された。培養の３週間後、ＨＭＦＦｓと融合したＰＡＸ７+（ただしｄｅｓｍｉｎ+ではない）細胞の数は減少したが、これは筋原細胞が分化し始めたことを示している（論文の図２Ａを参照）。基底膜が培養下のＨＭＦＦｓに対して外側の鞘を提供した（論文の図２Ｃを参照）。
【００６０】
また発明者は、もはや線維と融合せずに培養皿上にコロニー形成した細胞を解析した（論文の図３Ａ上段参照）。ＨＭＦＦを培養して２週後、そのような細胞数は常に多く、およそ１０００〜２０００細胞を含むコロニーが観察された。
【００６１】
これらのコロニーの細胞は不均一で、すなわち通常はほとんどがｄｅｓｍｉｎ+であった。筋管に融合するものがいくらかあり、例え同じドナーからＨＭＦＦｓを得た場合であってもＰＡＸ７+細胞の割合は変化（１０％〜５０％）した（論文の図３Ａ中段を参照）。ＢｒｄＵでパルスラベリング（２２時間）することによりコロニー中の多くの細胞（５０％）が増殖していることを確認した（論文の図３Ａ下段を参照）。コロニー中の非筋細胞（ｄｅｓｍｉｎ陰性細胞）の断片は５％と２５％の間で変化し、ごく稀に７０％程度に達した。しかしながら、高齢のドナー由来のＨＭＦＦ培養においてはその割合は高くはなかった。
【００６２】
成長因子と基質の剛性が衛星細胞の維持および増殖にとって重要である（２８）。マトリゲルには基質タンパク質と成長因子の混合物が含まれており、マトリゲルで覆われた基質はマウス筋芽細胞の培養によく用いられる。発明者はプラスチックの培養皿を用いてマトリゲルを加えたものと加えていないもので７〜１４日間、ＨＭＦＦｓの培養を比較し、線維の外側のコロニー形成やコロニーの大きさに明確な差異がないことを観察した（論文の補足図３を参照）。したがって、衛星細胞の最初の活性化および増殖に刺激を与えるのには線維自体により提供される足場で十分であり、マトリゲルにより提供される外部因子とは無関係である。マトリゲルなどの添加物を加えない培養条件は、患者に再移植する細胞の実験に特に適する。
【００６３】
Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙに基づく遺伝子導入はＨＭＦＦ衛星細胞に応用可能である
その後、培養したＨＭＦＦｓにおける衛星細胞で遺伝子導入が実現可能かどうかを試験した。筋線維断片は２日間培養し、そのあと蛍光タンパク質Ｖｅｎｕｓ（ｐＴ２−ＣＡＧＧＳ−Ｖｅｎｕｓ）をコードするＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンに基づいたベクターと、ＣＭＶ−ＳＢ１００Ｘトランスポザーゼをコードする第二発現プラスミドとを共導入した。Ｖｅｎｕｓ+の衛星細胞は導入の１日後に肉眼で確認できた。これらの細胞を培養皿に移した後、Ｖｅｎｕｓ+筋芽細胞は３５日間まで存在した（論文の図３Ｂを参照）。
【００６４】
ＨＭＦＦｓ由来の衛星細胞がマウスへの生着後に筋再生に寄与する
次に、ＨＭＦＦｓがＮＯＧマウス（ｎ＝３３）の前脛骨筋に移植された。移植用に、５〜７日間培養したＨＭＦＦｓ、すなわちまだ線維から離れていない活性化された衛星細胞を含む線維が用いられた。次の表２に示したように６人のドナー（４４〜６４歳）から得られた生検試料由来のＨＭＦＦｓが移植された（実験グループＡ〜Ｄ）。
【００６５】
【表２】
2017526365.tif 000004
【００６６】
Ａ：年齢と性別、Ｂ：移植された前脛骨筋の総数ごとのヒト細胞移植、Ｃ：低温切片ごとのヒト核の数、ｆ：女性、ｍ：男性、ｎ．ｔ．：未試験、ｈｔ：低温処理
【００６７】
放射線照射されていない筋肉または９Ｇｙで放射線照射した筋肉に線維が移植された場合、抗ヒト特異的ラミンＡ／Ｃ抗体により検出されるヒトラミンＡ／Ｃ抗体の存在により評価されるとき、移植後３週間または８週間はわずかなヒト核が存在していた。ほとんどすべてのラミンＡ／Ｃ+核は間質にあり、筋線維に組み込まれていなかった（論文の図４を参照）。筋肉に１８Ｇｙで局所放射線照射後、移植して３週間後または７週間後、ヒト筋芽細胞の生着が容易に確認された（論文の図４を参照）。早い時点からヒト核を含む筋管および筋原線維が検出可能であったが、移植して７週間後の筋線維にはさらに多くのヒト核が存在していた。ときどき、マウス核とヒト核がハイブリッド筋線維に存在していた（論文の図５Ｂを参照）。ヒト核の最大の播種の大きさは８００×４００×４００μｍであった。
【００６８】
ＨＭＦＦｓの低温処理により筋原細胞の培養を富化し移植効率を改善
次に、衛星細胞の源として用いられるＨＭＦＦｓの貯蔵が利くかどうか試験したが、これは自家移植および遺伝子修復の実験にとって有益となる。グルコース含有の緩衝塩溶液（溶液Ａ）では筋幹細胞は生き残らなかった。しかしながら酸素供給をせずに低血清（ＯｐｔｉＭＥＭ）培地中に４℃で保って（低温処理）３５日間、続いて３７℃で２１％の酸素（論文の図１Ａと図３Ｃの実験計画ＩＩＩを参照）で培養され、線維を成長させる衛星細胞のコロニーが検出された。低温処理により培養皿でのコロニー形成に遅れが生じた。すなわち最初のコロニーがＨＭＦＦを培養して２週間後に観察され、６週間後になってようやくいくつかのコロニーが出現した。意外なことに、低温処理されたＨＭＦＦｓ由来のコロニーは１００％の筋原細胞（ｄｅｓｍｉｎ+細胞）を含んでいた（論文の図３Ｄを参照）。このように、線維芽細胞などの非筋原細胞は低温処理の条件下での長期貯蔵で生き残らなかった。コロニーは筋原細胞のみから構成されていたが、それらは異成分からなっており、ＰＡＸ７+細胞を（２０％〜６０％の間の割合で）含み、ＭＹＦ５とＭＹＯＤを発現する細胞で、しばしば筋管に融合する（論文の図３Ｄを参照）。ＢｒｄＵラベリングの後、低温処理したＨＭＦＦｓ由来のコロニーおよび新たに得られたＨＭＦＦｓは同様のラベリング指標（ｉｎｄｉｃｅｓ）を示した。
【００６９】
新鮮分離されたＨＭＦＦｓは常にコロニーに生じるが、低温処理後は増殖がより変化しやすく、筋芽細胞はＨＭＦＦｓの５０％からのみ生育した。低温と低酸素の後のコロニー形成はドナーの年齢とは相関しなかった。低温がＮＯＴＣＨシグナリングを活性化することは知られており、またＮＯＴＣＨが衛星細胞の維持に重要であることも知られている（２９〜３１）。γ―セクレターゼとＮＯＴＣＨシグナリングの阻害剤であるＤＡＰＴの存在により、低温処理中は衛星細胞の生存を阻害せず、また４℃で保存している間は阻害剤が存在しているか非存在かに関わらず、ＨＭＦＦの培養においてＰＡＸ７+細胞の同程度のコロニーの大きさおよびコロニー数が観察された（論文の図３Ｄを参照）。
【００７０】
次いで、低温／低酸素処理後のＨＭＦＦｓをうまく移植できるかどうか試験した。ＨＭＦＦｓは３週間４℃に保たれ、２週間は３７℃の組織培養に入れ、マウス前脛骨筋に移植された。移植して３週間後の解析によれば、この移植は低温処理なしのＨＭＦＦｓよりも効率的に筋再生に関与したことが明らかとなった。移植した筋線維はより多くかつ多核のヒト核を含んでいた（論文の図４と図５Ａを参照）。
【００７１】
さらに、ＰＡＸ７を共発現したヒトラミンＡ／Ｃ+細胞がラミナの下の衛星細胞の位置で検出された（論文の図５Ｂを参照）。一移植の一切片においてヒト核の４分の１はＰＡＸ７+であった。ごくわずかなヒト核のみが間質において検出された。線維芽細胞などの非筋原細胞の欠如がこの違いの説明となるかもしれない。
【００７２】
考察
発明者は、筋線維（ＨＭＦＦ培養）と融合したままのヒト衛星細胞の性質と成長特性を明らかにするため長期にわたる組織培養モデルを研究した。幹細胞ニッチにある休止衛星細胞から始まり、それに続く活性化、遊走、そして分化、といった詳細な特性評価が提供される。衛星細胞の富化と増殖は実現可能であり、培養ヒト線維断片を移植することができ、培養ヒト線維断片が筋再生に寄与することを示し、またそれらが衛星細胞ニッチに正確に戻るヒト衛星細胞を生み出すということを示すことができた。さらに、トランスポゾンを介したゲノムへの遺伝子挿入（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙシステム）を用いることにより、培養線維の衛星細胞において遺伝子導入が成し遂げられた。
【００７３】
培養における衛星細胞の単純な増殖は急速な分化につながり、自己再生および再生能力を有する細胞集団が急速に失われてしまう（３２）。他の者は移植実験において、ヒト初代培養衛星細胞（筋芽細胞）の懸濁液を用いているが、そのようにして移植された細胞は生存率が低く、線維に寄与しない。
【００７４】
発明者は培養および移植されたＨＭＦＦｓが筋線維に融合して内在性の幹細胞プールに関与できることを示すことができたが、このことは線維培養により以前の培養ヒト初代衛星細胞（筋芽細胞）の限界を克服することを示している。
【００７５】
最近の研究により衛星細胞生物学に重要な洞察が提供され、そのような幹細胞を増殖および維持するのに役立つ可能性のある分子メカニズムを明らかにしている。例えば、硬いプラスチックよりもむしろ柔らかいハイドロゲル基質上でマウス衛星細胞を培養することで、再生効果（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ）を改善するとともに、自己再生する幹細胞集団の培養を富化する（２８）。ここで紹介したＨＭＦＦ培養システムにより、柔らかいマトリックスを用いた３次元環境を提供すること、そして再生の間は生体内における衛星細胞も損傷を受けた線維を足場として用いることを示している。
【００７６】
衛星細胞に加えて、ＨＭＦＦｓは線維芽細胞などの他の細胞型を含む。したがって、新鮮培養したＨＭＦＦｓ由来のコロニーも非筋原細胞を含むが、培養前にＨＭＦＦｓを４℃で長期間保存すると、そのような非筋原細胞はもはや観察されない。休止状態の幹細胞は、例えば死後組織（３３）や低酸素の微小環境などの極限状態下を生き延びる（文献２９に概説されている）。休止状態の衛星細胞の代謝要求は活性化した幹細胞や線維芽細胞などの他の細胞型とは区別がつくように思われる。これにより数週間の間、筋線維を保存する選択肢を当然含むことになるため、衛星細胞が長期にわたり生存することと、それらを富化することは細胞置換または遺伝子治療のアプローチにおいて有益となる。
【００７７】
発明者は、ＨＭＦＦｓと融合した培養衛星細胞に遺伝子導入をうまく応用できるということを発見した。発明者はＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンシステムを利用するＶｅｎｕｓ  ｃＤＮＡ遺伝子の導入を実証した。トランスポゾンは自然な遺伝子導入の乗り物を代表するものと考えられる。トランスポゾンに基づく道具は多用途であり、遺伝子治療に用いることができる（３４，３５）。ＳＢ１００Ｘを媒介した遺伝子導入により、広範なｃＤＮＡサイズにわたる様々な初代細胞、幹細胞、機能における安定かつ長期的な遺伝子発現を可能とする。このように、トランスポゾンに基づく遺伝子導入は、例えば非常に大きな筋肉タンパク質をコードする全長のディスファーリンやジストロフィンなどの導入遺伝子を、骨格筋に移植される細胞に導入するのに適する可能性がある。
【００７８】
筋再生において移植した細胞の生着および関与には、局所的な放射線照射が必須である。受取人の健康な筋肉に内在する幹細胞はこの処置により傷つけられるが、これは内在性の幹細胞が傷つけられたときに、移植された細胞が再生のために貢献するのみであることを示している。他のプロトコルとは対照的に、ＨＭＦＦｓ断片を入れるための筋肉への小さな切り込みは別として、凍結外傷（ｆｒｅｅｚｅ  ｔｒａｕｍａ）やカルディオトキシンなどによるさらなる損傷を与えずに済む。
【００７９】
なお、観察された最も効率的な移植における特筆事項として、損傷を受けた全ての線維および再生領域はヒト核を含んでいたということである。筋ジストロフィーの治療には遺伝子活性を１０％回復させるだけで十分である可能性があり、ここで観察された移植細胞の関与が既に役に立つかもしれない。
【００８０】
ヒト衛星細胞はわずかしかなく、今のところＦＡＣＳによって分離することができない。例え適切な表面マーカーが入手できたとしても、実際にはＨＭＦＦｓにおける少数の衛星細胞は選別できない。衛星細胞を含む培養ＨＭＦＦｓは筋ジストロフィーを治療するための自家細胞移植に必要な物質の供給を開始しているかもしれず、これにより効率的な遺伝子導入が実現されている可能性がある。発明者はここで解析した全ての成人から得たＨＭＦＦｓには培養下で増殖する可能性のあるヒト衛星細胞が含まれることに気が付いた。自家衛星細胞は組織の入手に伴う困難を回避し、同種移植後は生涯にわたり免疫抑制剤が必要となる難点を回避しており、非自家細胞源（例えばヒトの死体から得られた衛星細胞など。文献３３を参照）よりも進歩している。
【００８１】
病気の原因となる変異を修正した後のＨＭＦＦｓの自家移植では、例えば特定の筋群（例えば横隔膜など）への直接的アクセスの欠落や、別の輸送ルートの欠落など、導入された細胞が血管を越えて遊走できないことにより妨げられる、よく知られたすべての筋芽細胞移植の欠点を克服できない可能性がある。実際に、ＨＭＦＦｓの筋移植後の挿入部位からのヒト細胞の遊走が制限されているのが観察されている。この現状は、移植細胞の分散が制限されていることに似ており、このことは異なる衛星細胞や筋芽細胞の供給源および移植プロトコルを用いて行われた以前の実験で説明されている。なお、例えば血管を通って遊走する能力のあるＣＤ１３３+細胞などの他の細胞型の静脈内適用と合わせたヒト自家衛星細胞の局所適用は可能であり、これは筋ジストロフィーの治療へのさらなる効率的な道筋を提供する。
【００８２】
方法
患者と材料
ＨＭＦＦｓは、神経筋疾患のない個人から股関節手術時に入手したかまたは診断目的で入手した筋試料から調整した（倫理的承認  ＥＡ１／２０３／０８，Charite）。合計で６９の被験者由来の１１５６の線維束が解析された。ドナーの年齢は２０〜８０歳、３４名は男性で３５名は女性であった。凍結切片の解析には許諾を得たのちに診断目的で採取した追加の筋生検試料（３か月経過）を含めた。
【００８３】
単体ＨＭＦＦ培養の調整
生検後すぐに筋試料を溶液Ａに移した。この溶液Ａは３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ｄ−グルコース、３．２μＭ  フェノールレッド（ｐＨ７．６）を含む。単一線維断片の解剖は実体顕微鏡（ライカ  マイクロシステムズ）の下、小型鉗子を用いて機械的に行われた。二次的な束は筋周囲の筋膜を切って解剖したが、これは同じ方法による一次的な束の解剖に続いて行われた。一次的な束は単一の線維を得るために注意深く緩められた。さらに結合組織から２〜３ｍｍの単一線維の断片を機械的にはずした。ＨＭＦＦｓはマトリゲル（ＢＤ  バイオサイエンス）に覆われたカバースリップに置くかまたは通常のプラスチックの皿で培養された。ＨＭＦＦｓは１０％ＦＣＳ、グルタマックス（Ｇｌｕｔａｍａｘ）、ゲンタマイシンを補った骨格筋生育培地（ＳＭＧＭ，ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社）で培養され、５％の二酸化炭素を含む加湿雰囲気中において３７℃で培養された。
【００８４】
新鮮な単一線維の特性評価のため、機械的な解剖の後すぐに４％のＰＢＳ緩衝ホルムアルデヒドにおいて分離した線維断片を固定した。新しく調整した筋線維の染色は筋生検が行われてから４５分以内に開始した。ＨＭＦＦ培養は筋生検後の２時間以内にセットされるか、または低温処理された。低温処理において、筋試料は溶液Ａまたは低血清の最適化最小必須培地（ＯｐｔｉＭＥＭ，ライフテクノロジーズ）に入れられ、３５日間まで４℃に置かれた。保存した筋は特には通気されなかった。
【００８５】
Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙに基づくＨＭＦＦｓへの遺伝子導入
遺伝子導入の研究は高活性のＳｌｅｅｐｉｎｇ  ＢｅａｕｔｙトランスポザーゼＳＢ１００Ｘを用いて行われた（３２）。ＳＭＧＭにおいて分離してから２日後、蛍光タンパク質Ｖｅｎｕｓ（ｐＴ２−ＣＡＧＧＳ−Ｖｅｎｕｓ）をコードするＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙを基にしたベクターと、ＣＭＶ−ＳＢ１００Ｘトランスポザーゼ用の発現プラスミドとをＨＭＦＦｓへ共導入した。４００ｎｇのｐＴ２−ＣＡＧＧＳ−Ｖｅｎｕｓベクターと２０ｎｇのＳＢ１００Ｘを７５μｌのｊｅｔＰＲＩＭＥ緩衝液（ポリプラス共導入  ＳＡ）で希釈し、２μｌのｊｅｔＰＲＩＭＥ試薬（ポリプラス共導入  ＳＡ）と混合して室温で１５分間インキュベートし、線維培養に加えた。共導入の１２時間後、培地を新鮮なＳＭＧＭと交換した。解析は共導入後の１〜３５日の間に行われた。
【００８６】
免疫組織化学
免疫組織化学的な染色のため、筋低温切片（６μｍ）は３．７％ホルムアルデヒドで固定された。ＨＭＦＦｓおよび培養した筋芽細胞は０．２％トリトンＸ−１００で１０分間の透過化処理をし、１％ＢＳＡ／ＰＢＳにおいて４５分間インキュベートした。凍結切片は５％の正常ヤギ血清／ＰＢＳにおいて４５分間インキュベートした。補足表２に記載されたものと同様の一次抗体が用いられ、４℃で４〜１６時間インキュベートされた。洗浄後、試料は二次抗体（Ｃｙ３で標識された抗ウサギ抗体，  Ｃｙ３で標識された抗ラット抗体，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８で標識された抗マウス抗体，それぞれ１：１０００）とＨｏｅｃｈｓｔ  １（：１０００）とともに１％ＢＳＡ／ＰＢＳにおいて室温で４５分間インキュベートした。別の方法として、ＵＥＡ（１：１００、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ社）が毛細血管の内皮層の染色に用いられた。ＰＡＸ７の染色のため、予熱した抗原賦活化ベクター緩衝液（８０℃，Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ社）において筋切片を１５分間インキュベートし、ザンボニ固定液（ＰＦＡ／ピクリン酸，ｐＨ７．３）で２０分間固定し、さらに洗浄した後、ブロッキング緩衝液（１０％ウマ血清，０．５％ブロッキング試薬[パーキンエルマー社]、０．１％トリトンＸ−１００  ＰＢＳ溶液）内でインキュベートした。続いて、切片を抗ＰＡＸ７ハイブリドーマの上清で１２時間インキュベートした。切片をＰＢＳ／０．１％トリトンＸ−１００で洗浄し、蛍光標識された二次抗体とともに３０分間インキュベートした。
【００８７】
試料はライカ  ＤＭＩ  ６０００（ライカ  マイクロシステムズ）またはＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ７００共焦点顕微鏡（カールツァイス  マイクロイメージング社）で撮像した。画像はＰｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ（アドビ）またはＣｏｒｅｌＤＲＡＷ  Ｘ５で構成および編集した。Ｚスタックの三次元映像化はＡｍｉｒａ（Ｖｉｓａｇｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ社）で行われた。概して、全ての修正は全体画像に対して適用された。継時的な顕微鏡検査法はライカ  ＤＭＩ  ６０００で３７℃、二酸化炭素が５％の加湿雰囲気中で行われた。すべての抗体および希釈は次の表３に列挙されている。
【００８８】
【表３】
2017526365.tif 000005
【００８９】
前脛骨筋の焦点照射
雌の６週齢のＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄｌｌ２ｒｇｔｍ１Ｓｕｇ／ＪｉｃＴａｃマウス（ここではＮＯＧマウスと呼ぶ）（Ｔａｃｏｎｉｃ社）は、ＰＢＳ中のケタミン―キシラジン（９ｍｇ／ｍｌ  ケタミン，１．２ｍｇ／ｍｌ  キサラジン）を１６０μｌ／２０ｇの用量で腹腔内に投与されて麻酔がかけられた。マウスにとって再現性のある位置を提供するため、表面に位置合わせマーカーをつけたアクリルガラスのブロックが組み立てられた。デジタル再構成放射線写真（ＤＲＲｓ）の演算に関しては、処理計画、コンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャンと同様に、０．７５ｍｍのスライス厚で、専用のＣＴスキャナー（Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｅｍｏｔｉｏｎ）で行った。このＣＴデータセットは、選択されたマウスのすべての脚および筋肉が類似しているものと仮定して、ＤＲＲｓの演算、トラッキングおよび線量分布に関する例示的な基準として提供した。ＣＴボリュームデータセットはリスク臓器としてマウスの体を描写することを目的に用いた。処方用量は前にＢｏｌｄｒｉｎら（３６）によって提案されたものと同様の１８Ｇｙとした。線量分布の固有の不均質性のために、９０％の等線量線で対象領域を完全に取り囲みつつ、対象の脚における最大１９．５Ｇｙを許容した。
【００９０】
すべてのマウスは画像誘導ロボットシステム（サイバーナイフ  放射線外科システム，アキュレイ社）を用いて１８Ｇｙの分割照射法で処理した（論文の補足図４を参照）。マウスは付属の標準マーカーでカスタマイズされたアクリル製の骨組みに入れた。付属の標準マーカー（ｆｉｄｕｃｉａｌ  ｍａｒｋｅｒ）は処理手順の間、あらかじめ計算されたＸ線写真とライブ映像の位置画像とを重ね合わせるのに用いられた。三次元補正値はロボット処理カウチにより用いられた。処理手順自体は５分以内で行うことができた。
【００９１】
ＨＭＦＦｓのマウス前脛骨筋への移植
マウスはケタミン―キシラジン（９ｍｇ／ｍｌ  ケタミン，１．２ｍｇ／ｍｌ  キサラジン）を１６０μｌ／２０ｇの用量で用いて麻酔にかけた。脛骨筋は長手方向に切られ、ＨＭＦＦｓ（４〜８筋線維）はマウスの線維の方向と平行に筋肉内部に収められた。前脛筋は縫合をせずに閉じられた。覆っている皮膚はポリグリコール酸の糸（ＭＡＲＬＩＮ  ｖｉｏｌｅｔｔ  ＨＲ２２，  ＵＳＰ  ４／０，  ＥＰ  １．５  糸；  Ｃａｔｇｕｔ社）を用いて閉じた。移植の評価に関して、前脛骨筋は中間で横に切り、筋肉の１０セクションをそれぞれ上部と下部に切りわけてヒトラミンＡ／Ｃおよびｄｅｓｍｉｎで染色した。
【００９２】
研究の承認
Charite倫理審査委員会は本研究を承認し、同意書およびインフォームドコンセントはすべての参加者から入手した（ＥＡ１／２０３／０８およびＥＡ２／０４１／１０）。動物実験はライセンスＧ００１６／１３の下で行われた。
【００９３】
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【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】図１は培養幹細胞の適切な利用の概略図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００９５】
例示的な実施例：  低温処理後のＨＭＦＦの成長
ヒト筋線維断片（ＨＭＦＦｓ）は７日間および１２日間、異なる培地において４℃で培養された。方法の詳細に関しては、調整と培養のステップを同じ方法で行うので、前の例示的な実施例を参照しなければならない。
【００９６】
ＯｐｔｉＭＥＭにおける低温処理の７日後、衛星細胞はＨＭＦＦｓの８３％から増殖した。この数字はＯｐｔｉＭＥＭにおける１２日間の全体的な低温処理の後、２８％まで減少する。低温処理がさらに延長されたとしても、成長する衛星細胞の数はゼロに向かう傾向がある。
【００９７】
この実験により、ＯｐｔｉＭＥＭにおいて７日間低温処理した後に検査した培養の８８％（すなわち２４のＨＭＦＦ培養のうち２１培養）には非筋原細胞が存在しないということも示すことができた。他の言葉で表現すれば、培養した衛星細胞はこれらの培養において非常に富化されている。インキュベーションの期間を７日未満に減らすと、非筋原細胞の相対量は劇的に増加する。インキュベーションの期間が４日未満であれば、基本的に筋原細胞の富化は観察することができない。
【００９８】
したがって、少なくとも衛星細胞の場合、５日間から４週間（２８日間）にわたって、特に７日間から４週間（２８日間）にわたって、特に７日間から３週間（２１日間）にわたって、特に７日間から２週間（１４日間）にわたって、特に５日間から２週間（１４日間）にわたって、特に５日間から１週間（７日間）にわたって、特におよそまたはちょうど１週間（７日間）にわたって低温処理を実施するのが望ましい。
【００９９】
前に論じた実験を次の表４にまとめた。
【０１００】
【表４】
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【０１０１】
ＳｏｌＡにおける低温処理の７日後（この培地の組成に関しては上記参照）、衛星細胞はＨＭＦＦｓの４５％から増殖したが、同じドナーを用いたＯｐｔｉＭＥＭでの対照実験においては、５１％の増殖率を観察することができた。試験したすべての培養には筋原細胞は存在しなかった。
【０１０２】
前に論じた実験を次の表５にまとめた。
【０１０３】
【表５】
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【図１】
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【国際調査報告】
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