(57)【要約】  本開示は、ＰＥＧ化ステルスリポソームから実質的になる最小抗原送達系を提供し、該リポソームは免疫原性ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラス拘束性ペプチドでローディングされており、標的細胞への該リポソームの結合およびインターナリゼーションを媒介する細胞標的化ペプチドで表面修飾されている。更に、麻疹ウイルスヘマグルチニンペプチドＨ２５０であるＨＬＡクラス１拘束性ペプチド、および癌細胞を標的化するためのＨ１２９９．３である細胞標的化ペプチドを開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＥＧ化ステルスリポソームから実質的になる最小抗原送達系であって、
該リポソームは免疫原性ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラス拘束性ペプチドでローディングされており、且つ、標的細胞への該リポソームの結合およびインターナリゼーションを媒介する細胞標的化ペプチドで表面修飾されている、最小抗原送達系。
【請求項２】
前記ＨＬＡクラス１拘束性ペプチドが、麻疹ウイルスヘマグルチニンペプチドＨ２５０である、請求項１記載の系。
【請求項３】
前記細胞標的化ペプチドが、Ｈ１２９９．３である癌細胞標的化ペプチドである、請求項１記載の系。
【請求項４】
前記ＨＬＡクラス１拘束性ペプチドが、麻疹ウイルスヘマグルチニンペプチドＨ２５０であり、
前記細胞標的化ペプチドが、Ｈ１２９９．３である癌細胞標的化ペプチドである、請求項１記載の系。
【請求項５】
ＨＬＡクラス拘束性ペプチドでローディングされたＰＥＧ化ステルスリポソームを、その表面に細胞標的化ペプチドを結合させることにより表面修飾する工程を含む、請求項１記載の抗原送達系の製造方法。
【請求項６】
前記ＰＥＧ化ステルスリポソームを、クラス拘束性ペプチドの存在下で該リポソームを形成させることによりローディングする工程、および、
前記ＨＬＡクラス拘束性ペプチドでローディングされたＰＥＧ化ステルスリポソームを、その表面に細胞標的化ペプチドを結合させることにより表面修飾する工程
を含む、請求項１記載の抗原送達系の製造方法。
【請求項７】
前記抗原送達系を、それを要する宿主内に導入する工程を含む、請求項１記載の抗原送達系の使用方法。
【請求項８】
前記抗原送達系を、それを要する宿主内に導入する工程、および
生じた免疫応答または標的細胞の抑制を検出する工程
を含む、請求項１記載の抗原送達系の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗原送達系（抗原デリバリーシステム）に関する。
【０００２】
本出願は、２０１４年１２月１７日付け出願の米国特許出願第６２／０９３，２８５号に基づく優先権を主張するものである。
【０００３】
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈにより授与された助成第Ｒ０１ＣＡ１６４４４７号およびＮａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｇｒａｄｕａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｅｌｌｏｗｓｈｉｐにより授与された助成第１４６３３９号の米国政府の援助によりなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
癌治療のための細胞性（ＣＭ）免疫療法は、悪性増殖に対する身体の適応免疫応答を活性化するように設計される（１，２）。一般に、ＣＭ応答の目的は、腫瘍に対する細胞傷害性Ｔ細胞応答を活性化して癌細胞を排除することである。これらの治療の原理は単純であるが、腫瘍微小環境の複雑性を研究している現在の研究（２，３）や、腫瘍抗原に対するＴ細胞を直接活性化することを試みる方法を研究している現在の研究（４〜６）は、腫瘍に対する免疫応答の生成に関連した困難さを示している。
【０００５】
現在、幾つかのＣＭ癌免疫療法が存在し、それらには、ＰＤ−１インヒビター、腫瘍内への生ウイルスまたはウイルス粒子の注射、および養子Ｔ細胞療法が含まれる（１，６〜８）。しかし、有効性、安全性および／またはコストに関する懸念がこれらの治療の多くの使用を制限している。これらの懸念に対処するために、本発明者らは、生ウイルス、ウイルスサブユニットまたは生物学的に誘導された物質を使用することなく、癌細胞上で特異的にヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩ拘束性免疫原性ペプチドの提示を促進する完全合成最小送達系の開発に基づく新規治療法を開発しようと努めた。
【０００６】
これらの要求に基づき、本発明者らは、合成製造免疫原性ＨＬＡクラスＩ拘束性ペプチドを封入した中性ステルスリポソームからなる、リポソームに基づく物質を開発した。また、該リポソームは、癌細胞内で特異的に蓄積し、且つ、ＨＬＡクラスＩ分子における免疫原性ペプチドの提示を促進する外部表面上の標的化ペプチドを有する。したがって、この治療は、腫瘍に対して特異的に二次ＣＭ免疫応答を生成するように設計される。
【発明の概要】
【０００７】
発明の概括
本発明は、癌細胞において特異的に免疫原性麻疹抗原の提示を促進するナノ粒子送達系を提供する。該送達系はウイルス粒子、毒素または生物学的に誘導された物質を含有しない。この系での治療は癌細胞に対する二次免疫応答の活性化を促進して、腫瘍関連抗原を特定する必要性または一次免疫応答により免疫系を教育する必要性を回避する。該送達系は、外部表面上に癌特異的標的化ペプチドを提示し免疫原性ヒト白血病抗原クラスＩ拘束性ペプチドを封入したステルスリポソームのみを要する三部構成モジュールビヒクルである。この標的化ナノ粒子は主要組織適合複合体クラスＩ分子における該ペプチドの提示を促進する。活性化は標的化ペプチド、過去の抗原曝露に左右され、新規オートファジー媒介性メカニズムを利用する。このリポソームでの処理（治療）は、ワクチン接種されたＣ５７ＢＬ／６マウスにおける高悪性度ＬＬＣ１モデルを使用した場合の腫瘍成長の有意な低減をもたらす。本発明者らは、スケーラブルであり、生物学的に誘導された物質を含有せず、有効な癌療法である新規細胞性免疫療法の原理証明を示す。
【０００８】
本発明は、ＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｅｄ）ステルス（ｓｔｅａｌｔｈ）リポソームから実質的になる最小抗原送達系を提供し、該リポソームは免疫原性ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラス拘束性ペプチドでローディング（充填）されており、標的細胞への該リポソームの結合およびインターナリゼーションを媒介する細胞標的化ペプチドで表面修飾されている。したがって、該系は、僅か３つの列挙成分、すなわち、ステルスリポソーム、標的化ペプチドおよびＨＬＡクラス１拘束性ペプチドからなる又はそれらから実質的になる（該系の基本的および新規な実施可能性および機能に実質的に影響を及ぼす任意の追加的成分は除外される）および／またはそれらを要する、またはそれらに機能的に依存する、またはそれらを含む。
【０００９】
該系はモジュール式であり、代替的標的化および／または免疫原性ペプチドに適用可能である。多種多様な細胞標的化ペプチドが当技術分野で公知であり、種々の細胞型のいずれかを標的化するための適当なペプチドが、例えば本明細書に記載されているとおりに容易に選択され、この場合、好ましい標的細胞は、例えば癌細胞のように病原性である。同様に、多種多様な免疫原性ペプチドが当技術分野で公知であり、代替的ＨＬＡ型および免疫／ワクチン接種依存性の適当なペプチドが、例えば本明細書に記載されているように容易に選択される。ＨＬＡ型判別は診療において標準化されており、代替的免疫化（自然またはワクチン接種）集団が容易に特定可能であり、例えば、本発明者らは、天然痘ウイルスに由来する抗原（Ｈ−２Ｋｄ拘束性ワクシニア特異的ペプチド、Ａ５２７５−８３、ＶＡＣＶ−Ａ５２）を同様に試験し、検証している。
【００１０】
例示されている実施形態において、ＨＬＡクラス１拘束性ペプチドは麻疹ウイルスヘマグルチニンペプチドＨ２５０であり、および／または、細胞標的化ペプチドはＨ１２９９．３である癌細胞標的化ペプチドである。
【００１１】
本発明はまた、ＰＥＧ化ステルスリポソームを、クラス１拘束性ペプチドの存在下で該ペプチドを形成させることによりローディングする工程、および／または、該ＨＬＡクラス拘束性ペプチドでローディングされたＰＥＧ化ステルスリポソームを、その表面に細胞標的化ペプチドを結合させることにより表面修飾する工程を含む、該抗原送達系の製造方法を提供する。
【００１２】
本発明はまた、該抗原送達系を、それを要する宿主内に導入する工程、および／または、生じた免疫応答もしくは標的細胞の抑制を検出する工程を含む、該抗原送達系の使用方法を提供する。
【００１３】
本発明は、特に、挙げられている実施形態の全ての組合せを、それぞれが個々に詳細に記載されている場合と同様に提供する。
【００１４】
本発明の特定の実施形態および実施例の詳細な説明
この原理証明研究において、本発明者らは、麻疹ヘマグルチニンタンパク質から特定された免疫原性ＨＬＡクラス１拘束性ペプチドであるＨ２５０（１）を封入したリポソームを合成した。該リポソームは、標的化ペプチドＨ１２９９．３を外部表面上に提示することにより（１０）、癌細胞において特異的にインターナリゼーションされるように設計される。Ｈ１２９９．３は、エンドサイトーシスの明白なメカニズムにより癌細胞において優先的にインターナリゼーションされる癌特異的標的化ペプチドの選択を可能にする新規ファージ提示技術を用いて特定された２０マーの癌特異的標的化ペプチドである。このペプチドをリジンコア上で二量体化した。それはファージ粒子の環境の外部において完全に機能的である。Ｈ１２９９．３ペプチドは、エンドサイトーシスのクラスリン依存的メカニズムにより、正常気管支上皮細胞対照細胞系と比較して非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞系のパネルにおいて特異的に蓄積する。この研究において、本発明者らは、ＣＤ８＋特異的インターフェロン（ＩＦＮ）γ分泌により示されるとおり、Ｈ１２９９．３が主要組織適合複合体（ＭＨＣ）およびＨＬＡクラスＩ分子の両方における免疫原性抗原の機能的提示を促進することを示している。また、Ｈ１２９９．３により促進される提示はオートファジー依存的メカニズムを利用している。最後に、Ｈ２５０を含有するＨ１２９９．３標的化リポソームでの処理は、ビヒクル対照での処理と比較して、ワクチン接種Ｃ５７ＢＬ／６マウスに移植された皮下ＬＬＣ１腫瘍の成長速度を実質的に低下させる。
【００１５】
癌細胞における特異的ウイルス抗原提示のための標的化リポソームの作製。この研究の第１の目的は、癌細胞内への抗原積荷（抗原カーゴ）の特異的送達に適した合成送達系を創製することである。ＨＬＡクラスＩ分子における提示はアミノ酸残基のサイズおよび位置によって拘束されるため（１１）、該ビヒクルは高い負荷（ペイロード）容量を有すること、および修飾を伴うことなく免疫原性ペプチド負荷を保護することを要する。したがって、本発明者らは、リポソームを利用することを決定した。リポソームは合成物から容易に製造され、合成ペプチドで容易にローディングされ、標的リガンドでの修飾に適している（１２）。更に、リポソームは、透過性および保持効果の増強に基づいて腫瘍内に受動的に蓄積して、治療の特異性を潜在的に増強する（１３）。本発明者らは、約６０％のローディング効率を有する、合成的に製造された９マーの免疫原性ペプチドＨ２５０を封入した１００ｎｍのステルスリポソームを製造した。マレイミドで修飾されたＤＳＰＥ  ＰＥＧ２０００は脂質製剤内に取り込まれて、該リポソームへのチオール含有標的化リガンドの結合を可能にする（１２）。
【００１６】
Ｈ１２９９．３標的化リガンドは癌において特異的に蓄積し、ＨＬＡクラスＩの提示を促進する。Ｈ２５０免疫原性ペプチドの提示を促進する該リポソーム製剤の能力を定量するためには、本発明者らは、まず、ＨＬＡクラスＩ分子の裂溝部にＨ２５０が存在するかどうかを判定するための系を開発することが必要であった。Ｈ２５０は、麻疹感染後にＨＬＡ  Ａ＊０２０１分子内に存在するペプチドの配列決定から特定された免疫原性ペプチドである（１）。したがって、ＨＬＡ  Ａ＊０２陽性である匿名ドナーからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を特定し、遊離Ｈ２５０ペプチドと共にドナーのＰＢＭＣを培養し、ＩＦＮγ分泌を測定することにより、これらのドナーが麻疹に対してワクチン接種されたかどうかを判定した。ＨＬＡ  Ａ＊０２陽性であり、麻疹ウイルスに対して既にワクチン接種されていた２名のドナーを成功裏に特定した。ＨＬＡクラス１の提示を促進しうる癌特異的標的化ペプチドを特定し、特徴づけるために、これらの２名のドナー（Ｄ４およびＤ９）からのＰＢＭＣを後続アッセイにおいて使用した。同様に、抗原提示細胞として使用するための適当な癌細胞系が必要であった。このためには、ＨＬＡ  Ａ＊０２陽性であると本発明者らが判定したヒトＮＳＣＬＣ細胞系Ｈ１９９３を使用した。
【００１７】
つぎに、細胞の外部表面上のＨＬＡクラスＩにおける標的化リポソーム製剤からのＨ２５０の提示を促進しうる標的化ペプチドを特定するために、公知癌特異的標的化ペプチドをスクリーニングした。癌標的化ペプチドのパネルが本発明者らのグループなどにより特定されている。したがって、本発明者らは、Ｈ１９９３内にインターナリゼーションされる、既に公開されている３つの異なる癌特異的標的化ペプチド：Ｈ１２９９．２、Ｈ２００９．１およびＨ１２９９．３を特定した。これらのペプチドのそれぞれは、正常気管支上皮細胞と比較して、ＮＳＣＬＣ細胞系内に特異的にインターナリゼーションされる（１４）。リポソーム上のマレイミドへの標的化ペプチド上の単一スルフヒドリル基のマイケル付加から生じるチオール−エステル結合により、ペプチドをリポソームの表面に結合（コンジュゲート）させた。対照として、Ｈ１９９３細胞内にインターナリゼーションされないペプチドであるＨ４６０．１を使用した（１４）。
【００１８】
各標的化ペプチドをスクリーニングするために、Ｈ１９９３細胞を、Ｈ２５０を含有するＨ１２９９．２、Ｈ２００９．１、Ｈ４６０．１またはＨ１２９９．３標的化リポソームで３時間処理した。ついで該細胞を、インターナリゼーション／結合されていないリポソームを除去するために洗浄し、ついでドナーＰＢＭＣと共に７２時間にわたって共培養した。細胞培養上清を集め、Ｔ細胞活性化の尺度として、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）によりＩＦＮγ分泌に関して分析した。遊離Ｈ２５０ペプチドをこのアッセイにおける陽性対照として使用した。Ｈ２５０を含有するＨ１２９９．３標的化リポソームのみがＩＦＮγの有意な増加をもたらし（Ｑｕｅｎｃｈ）、Ｈ２５０を含有するＨ１２９９．３標的化リポソーム（Ｈ１２９９．３）と比較された。処理されたＨ１９９３細胞を前記のとおりにドナーＰＢＭＣと共に共培養した。再び、Ｈ２５０を含有するＨ１２９９．３標的化リポソームのみがＩＦＮγ分泌の有意な増加をもたらした。これらのデータは、提示がＨ２５０抗原ペプチドおよびＨ１２９９．３標的化ペプチドの両方に依存的であるという更なる裏づけを示している。これらの結果は、第２のＰＢＭＣドナーであるＤ９を用いた場合に再現され、このことは、提示が患者特異的ではないことを示している。ＰＢＭＣ培養からのＣＤ８＋  Ｔ細胞の枯渇は両方のヒトサンプルにおいてＩＦＮγ分泌の喪失をもたらす。これらのデータは、Ｈ２５０がＨＬＡクラスＩ分子内に存在すること、およびＨ２５０を含有するＨ１２９９．３標的化リポソームが、麻疹に対して既にワクチン接種されている個体においてＣＤ８＋  記憶Ｔ細胞応答の活性化を促進することを示している。
【００１９】
この処理により生成する免疫応答を更に特徴づけるために、共培養上清中の分泌ＴＮＦαのレベルを定量した。前記データと同様に、両方のヒトドナーにおいて、ブランクリポソームで処理されたＨ１９９３細胞と比較して、Ｈ２５０を含有するＨ１２９９．３標的化リポソームで処理されたＨ１９９３細胞においては、ＴＮＦα分泌の有意な増加が認められた。ＣＤ８＋枯渇に際して、Ｈ２５０を含有するＨ１２９９．３標的化リポソームでのＨ１９９３細胞の処理の後でＴＮＦα分泌の減少が認められる。
【００２０】
これらの研究の幅を広げるために、本発明者らは、Ｈ１２９９．３標的化ペプチドをインターナリゼーションするＣ５７ＢＬ／６マウス・ルイス肺癌１（ＬＬＣ１）に由来するマウス肺癌細胞系を特定した。ついで、Ｈ２５０の拡張形態でＣ５７ＢＬ／６マウスをワクチン接種し、ついでＣＤ８＋  Ｔ細胞源としてのリンパ球を集めることにより、Ｈ２５０負荷ＭＨＣクラスＩを認識するＴＣＲ（１）を含有するマウスＣＤ８＋  Ｔ細胞を作製した。ＬＬＣ１細胞を、Ｈ２５０を含有するＨ１２９９．３標的化リポソームまたは対照で処理し、洗浄し、ついでインキュベートした。ヒトのデータと同様に、リンパ球プールからのＣＤ８＋  Ｔ細胞の枯渇はＩＦＮγ分泌の有意な喪失をもたらした。したがって、Ｈ１２９９．３標的化リポソーム系はＭＨＣおよびＨＬＡクラスＩ分子の両方における機能的提示のためにＨ２５０を送達しうる。
【００２１】
Ｈ１２９９．３により促進されるＨＬＡクラスＩ提示はオートファジーを要する。Ｈ１２９９．３がＨＬＡクラスＩ分子におけるＨ２５０の提示を促進するメカニズムを決定するために、Ｈ１２９９．３ペプチドの細胞内蓄積を特徴づけした。これまでのデータは、新たに特定されたＨ１２９９．３ペプチドはＬａｍｐ−１と共局在する一方で（１０）、その他の癌特異的標的化リガンドであるＨ１２９９．２およびＨ２００９．１は核周囲領域内に蓄積すること（１４）を示した。したがって、本発明者らは、該細胞内輸送パターンがＨ１２９９．３促進性提示に決定的に重要であると推論した（１４）。これまでの結果と同様に、Ｈ１２９９．３およびＬａｍｐ−１は、生細胞レーザ走査型共焦点顕微鏡検査による判定で、Ｈ１９９３およびＬＬＣ１細胞系の両方において共局在する。しかし、これらのデータは提示のメカニズムに関する明らかな説明を与えていない。Ｌａｍｐ１はリソソームおよびオートリソソームの両方のマーカーであり（１５）、このことは、オートファジーがこの過程において何らかの役割を果たしている可能性を提起している。この仮説を検証するために、オートファゴソームのマーカーであるＧＦＰ−ＬＣ３Ｂ構築物を含有するＬＬＣ１およびＨ１９９３細胞を使用してイメージング実験を繰返した。両方の細胞系においてＬＣ３Ｂ小集団（ｐｕｎｃｔｉ）との明らかな共局在が認められ、このことは、Ｈ１２９９．３がオートリソソームを蓄積することを示している。重要なことに、Ｈ１２９９．３のスクランブル配列形態での対応細胞の処理は有意なペプチドのインターナリゼーションを全く引き起こさず、したがって、Ｌａｍｐ−１またはＬＣ３Ｂのいずれとの共局在をも引き起こさない。総合すると、これらのデータはオートファゴソームにおけるＨ１２９９．３ペプチドの配列依存的共局在を示している。
【００２２】
Ｈ１２９９．３がオートファジー小胞内に蓄積する場合には、Ｈ１２９９．３標的化リポソームでの処理の後、オートファジーの攪乱はＭＨＣクラスＩ分子におけるＨ２５０提示の喪失を引き起こす。前記のヒト共培養アッセイに類似した方法で、マウスリンパ球と共にインヒビターであるクロロキンの存在下、Ｈ２５０を含有するＨ１２９９．３標的化リポソームでＬＬＣ１細胞を処理した。ヒトのデータと同様に、Ｈ２５０を含有するＨ１２９９．３標的化リポソームでの処理は、対照であるクロルプロマジン、ナイスタチンおよびワートマニンと比較して、ＩＦＮγ分泌の有意な増加をもたらした。該ペプチドの輸送を生じさせた後、ＬＬＣ１細胞を固定し、前記のとおりにリンパ球と共培養した。ワートマニンおよびクロロキンを含むオートファジーの公知インヒビターでの処理は、対照と比較して、ＩＦＮγ分泌の有意な減少をもたらした。クラスリン媒介性エンドサイトーシスのインヒビターであるクロルプロマジンは提示を低減した。これは、Ｈ１２９９．３ペプチドがクラスリン媒介性メカニズムによってインターナリゼーションされ、該ペプチドの細胞取り込みがクロルプロマジンの存在下で低減することを示している本発明者らのこれまでの結果（１０）と合致している。コレステロール依存性エンドサイトーシスのインヒビターであるナイスタチンは全く効果を示さない。
【００２３】
Ｈ１２９９．３促進性提示におけるオートファジーの役割を更に検証するために、ＬＬＣ１細胞をｓｉＲＮＡ標的化オートファジー関連タンパク質７（ＡＴＧ７）で処理した。ｓｉＲＮＡによるＬＬＣ１細胞におけるＡＴＧ７特異的ノックダウンは、ローディング対照としてβ−アクチンを使用するウエスタンブロットにより定量される。ＡＴＧ７特異的オリゴでの処理はＡＴＧ７タンパク質レベルにおける〜８０％の低下をもたらした。一方、対照ｓｉＲＮＡヘアピンを使用した場合にＡＴＧ７レベルの最小減少が認められる（１６）。Ｈ２５０を含有するＨ１２９９．３標的化リポソームと共にインキュベートされたＬＬＣ１細胞においては、ｓｉＲＮＡで処理されていないＬＬＣ１細胞または対照ｓｉＲＮＡで処理されたＬＬＣ１細胞の場合と比較して、ＡＴＧ７のノックダウンはＩＦＮγ分泌を有意に減少させた。Ｈ１９９３細胞においてＡＴＧ７ノックダウンアッセイを繰返した。ＬＬＣ１細胞と同様に、ＡＴＧ７を標的化するｓｉＲＮＡオリゴで処理されたＨ１９９３細胞においては、ＡＴＧ７タンパク質レベルにおける〜８０％の減少がウエスタンブロットによって認められた。対照ｓｉＲＮＡでの処理はＡＴＧ７レベルに影響を及ぼさなかった。Ｈ１９９３細胞におけるＡＴＧ７ノックダウンは、Ｈ２５０を含有するＨ１２９９．３標的化リポソームでの処理およびＤ９  ＰＢＭＣとの共培養の後、対照と比較してＩＦＮγ分泌の有意な減少をもたらした。したがって、顕微鏡検査および表現型データは、Ｈ１２９９．３がオートファジー依存的メカニズムによりＨ２５０の提示を促進することを示唆している。
【００２４】
Ｈ２５０を封入したＨ１２９９．３標的化リポソームはインビボの腫瘍負荷を低減する。つぎに本発明者らは、ＣＭ免疫療法としてのこのプラットフォームの有効性を判定するために、Ｈ２５０を含有するＨ１２９９．３標的化リポソームをマウスモデルにおいて使用した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＨ２５０に対してワクチン接種し、ついでＬＬＣ１細胞を後部脇腹内に皮下移植した。ＬＬＣ１腫瘍を、触知可能となる（〜１５０ｍｍ３）まで成長させ、その時点でマウスを、Ｈ２５０を含有するＨ１２９９．３標的化リポソーム、またはＨ２５０免疫原性ペプチドを欠くビヒクルで静脈内（Ｉ．Ｖ．）に６回処理した。処理群においては３回目の処理の後、ＬＬＣ１腫瘍成長速度の有意な減少が認められた。該腫瘍を外植した後、腫瘍の重量および体積における２倍を超える減少が認められた。
【００２５】
該腫瘍有効性研究中、動物の体重における有意な相違は群間で認められず、動物は体重減少を示していない。総合すると、これらのデータは、動物が該処理からの顕著な毒性を被っていないことを示している。それでも、リポソームは肝臓を介して除去され、このことは肝毒性の可能性を提起している。したがって、Ｈ２５０を含有するＨ１２９９．３標的化リポソームまたはビヒクル対照での３回の処理の後、皮下ＬＬＣ１腫瘍を含有する未ワクチン接種マウスにおいてＡＳＴおよびＡＬＴの血清レベルを定量した。全ての値は正常範囲内であり、このことは、肝毒性が限られたものであることを示している。更に、肝臓、腎臓、心臓および肺組織を集め、切片化し、Ｈ＆Ｅで染色した。これらの器官からの切片は、処理群またはビヒクル群のいずれにおいても、顕著な異常を示さなかった。
【００２６】
最後に、インビトロデータをインビボデータと関連づけるために、腫瘍を切片化し、ＣＤ８＋  細胞に関して染色した。Ｈ１２９９．３標的化リポソームで処理された腫瘍においては、ビヒクル処理腫瘍と比較して、ＣＤ８＋  細胞の、１０倍の増加が認められ、これは、ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を示しているインビトロデータと合致している。Ｈ１２９９．３標的化リポソームがＨ２５０をインビボで送達することを更に裏付けるために、皮下ＬＬＣ１腫瘍を含有する未ワクチン接種マウスを、Ｈ２５０を含有するＨ１２９９．３標的化リポソームまたはビヒクル対照で３回処理した。ついで、これらのマウスからの腫瘍および肝臓組織を集め、腫瘍細胞および肝細胞の単個細胞浮遊液を作製した。これらの初代細胞を、ワクチン接種されたＣ５７ＢＬ／６マウスからのリンパ球を使用する前記の共培養アッセイにおいて抗原提示細胞（ＡＰＣ）として直接使用した。Ｈ２５０を含有するＨ１２９９．３標的化リポソームで処理された腫瘍細胞は、ビヒクル処理腫瘍細胞と比較して、ＩＦＮγ分泌の有意な増加を誘導した。したがって、該Ｈ１２９９．３リポソーム製剤はＨ２５０を腫瘍へ送達することが可能であり、Ｈ２５０ペプチドはインビボで腫瘍上のＭＨＣクラスＩ分子において提示される。これと比較して、ＡＰＣとして肝細胞を使用した場合には、いずれの群においてもＩＦＮγ分泌レベルにおける相違は見られなかった。したがって、リポソームが肝臓内で蓄積したとしても、肝細胞に対して生成するＣＭ免疫応答の欠如により測定されるとおり、Ｈ２５０はＭＨＣクラスＩにおいて提示されない。要約すると、これらのデータは、Ｈ２５０を含有するＨ１２９９．３標的化リポソームでの処理が無毒性であり、Ｈ１２９９．３がインビボで腫瘍において優先的にＨ２５０の提示を促進しうることを示唆している。
【００２７】
本発明者らは、腫瘍に対する二次免疫応答を引き起こす、癌細胞におけるＨＬＡクラス１拘束性免疫原性ペプチドの提示を促進するための最小送達系の開発に基づく新規癌免疫療法を提供する。このアプローチは、腫瘍関連抗原を特定する必要性または腫瘍に対する一次免疫応答を生成させる必要性を回避する。これらの必要性は癌ワクチンの開発における大きな障害である。免疫モジュレーターとは異なり、本発明者らのリポソーム送達アプローチにより生成する免疫応答は抗原特異的であり、免疫応答の全体的な総活性化を含まない。これは自己免疫およびオフターゲット効果の問題を最小にする。また、このプロトコールは、ウイルスに基づく現在の免疫療法とは異なる。なぜなら、ウイルス産物または生ウイルスは使用されず、これらのタイプの療法に伴う安全性の懸念が軽減されるからである。本発明者らのアプローチの潜在的な欠点は、ウイルス感染で生じる炎症状態が生じるとは考えにくく、このことは免疫応答の効力を低減する可能性がある。部分的には、この問題は、免疫応答を生成するために炎症入力をそれほど要しない二次免疫応答を利用することにより軽減される。更に、腫瘍微小環境は炎症状態を示すという証拠が存在し、その場合、本発明者らの療法はサイトカイン入力のためにこの状態を利用可能である。
【００２８】
ＨＬＡクラスＩ提示を促進するために送達リガンドを使用することは、クラス１拘束性免疫原性ペプチドに融合したコレラ毒素または志賀毒素を使用して既に達成されている（１７〜１９）。しかし、これらの毒素は細胞において無差別に蓄積し、癌細胞に特異的に標的化されない。Ｈ１２９９．３は癌細胞において選択的に蓄積し、正常ヒト気管支上皮細胞への限られた結合しか示さず、したがって、より大きな治療ウィンドウをもたらす可能性がある（２０，２１）。
【００２９】
更に、コレラ毒素または志賀毒素の製造は生物学的合成を要し、毒素担体の免疫原性に関する懸念が尚も存在する。また、この研究は、標的化物質がハプテンを細胞表面へ送達して抗体リクルートメントを引き起こす、ハプテン・ペインティング（ｐａｉｎｔｉｎｇ）または抗体リクルート法とは異なる。本明細書において提供される療法は、細胞表面上のハプテン固定化から抗体依存性細胞傷害を生成させるのではなく、インターナリゼーションメカニズムによる癌細胞におけるＨＬＡクラスＩ拘束性抗原の特異的提示により、Ｔ細胞を直接活性化するように設計される（２２，２３）。
【００３０】
Ｈ１２９９．３は、免疫原性ペプチドの提示を促進するためにオートファジー依存的メカニズムを利用する。これまでのデータと組合せると、Ｈ１２９９．３はクラスリン媒介性エンドサイトーシスによりインターナリゼーションされ、リソソームまたはオートリソソームへ輸送されるらしい。オートファジーは古典的クラスＩＩ提示に関与していると理解されているが、クラスＩ抗原提示おけるその役割がようやく明るみに出つつあるところである。本明細書における本発明者らのデータは、最近の報告と共に、オートファジーがクラスＩ提示にも関与しうることを示している（２４，２５）。本発明者らは、Ｈ２５０ペプチドがオートリソソームの内容物と共にサイトゾル内へと再びリサイクルされ、それにより、ＥＲ内へのＴＡＰによる輸送および後続の提示が可能になると仮定している（１５，２６）。
【００３１】
複数の細胞内位置が、サイトゾル、小胞体および分泌ネットワークを含むＨＬＡクラスＩ経路内に供給される。注目すべきことは、既に挙げられているコレラ毒素Ｂ提示法がゴルジ分泌ネットワークを利用していることである（２０，２７）。このことは、複数の細胞内位置へ輸送されるリガンドがこのＣＭ免疫療法における使用に適している可能性があることを示唆している。しかし、免疫原性ペプチドは、有効となるためには、ＨＬＡクラスＩ提示経路内に供給される必要があることを、本発明者らのデータは示している。適例としては、Ｈ１９９３細胞に結合し該細胞内にインターナリゼーションされる他のＮＳＣＬＣ標的化ペプチドは提示を促進しなかった（１４）。
【００３２】
これらのペプチドは核周囲区画内に蓄積し、隔離されたままとなる。したがって、該抗原性ペプチドの細胞内送達は該抗原の提示を必ずしももたらさない。この治療は、腫瘍に対する、より迅速で且つ潜在的に有効な免疫応答を可能にする二次免疫応答を惹起するように設計される。しかし、それは、該療法がＨＬＡ型およびワクチン接種状態の両方に依存することを余儀なくさせる（１，２８）。ＨＬＡ型判定は診療において標準化されているが、種々のＨＬＡ型に結合する免疫原性ペプチドが特定されることが必要となろう。また、米国人の９５％までが麻疹に対してワクチン接種しているが、数年前にワクチン接種された可能性のある多数の患者に関しては、有効な治療のためには麻疹ウイルスに対する免疫応答を定量する必要性が示唆されている（２９）。この治療は幾つかの変数に左右されるが、それはまた、本質的にモジュラー式であり、代替的標的化および／または免疫原性ペプチドに適用されうる。
【００３３】
Ｈ２５０を含有するＨ１２９９．３標的化リポソームでのワクチン接種マウスの処理は、Ｈ２５０を欠くＨ１２９９．３標的化リポソームの場合と比較して、ＬＬＣ１皮下腫瘍成長の有意な低減をもたらした。これは高悪性度癌株であり、このことは、有効な療法の、強い可能性を示している。Ｈ２５０を含有するＨ１２９９．３標的化リポソームで処理されたマウスからのＡＰＣを使用した場合のＣＤ８＋  Ｔ細胞のエクスビボ活性化および腫瘍切片内に存在するＣＤ８＋  Ｔ細胞の増加は、この治療が、インビボでＬＬＣ１腫瘍細胞に対する細胞傷害性Ｔ細胞応答を生成することにより働くことを示唆しており、示されているインビトロのマウスおよびヒトでのデータと合致している。Ｔｈ１様応答を生成し、ＣＤ８＋  浸潤物のレベルを増加させる他のＣＭ療法は動物およびヒトの両方の治験において有効性を示している（４，６，７，３０）。したがって、本発明で提供する療法は、現在のＣＭ療法と比較して、より安全で費用対効果の高い様態で、同様の有益な免疫活性化を達成する。
【００３４】
結論としては、本研究は、偽感染（ｐｓｅｕｄｏｉｎｆｅｃｔｅｄ）癌細胞を作製するための最小送達プラットフォームの開発に基づく新規癌免疫療法を提供する。本発明者らは、免疫原性ペプチドを含有する標的化リポソームがＨＬＡクラス１分子における提示を促進可能であり、この治療が新規癌免疫療法として有効でありうるという原理証明を示している。
【００３５】
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本発明は、列挙される特定の及び好ましい実施形態の全ての組合せを含む。本明細書に記載されている実施例（具体例）および実施形態は例示を目的としたものであるに過ぎず、それを考慮して、種々の修飾または変更が当業者に示唆され、本出願の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれるべきであると理解される。本出願において引用されている全ての刊行物、特許および特許出願（それらにおける引用を含む）の全体を、あらゆる目的で、参照により本明細書に組み込まれることとする。
【国際調査報告】
2017538754.tif 000002
2017538754.tif 000003
2017538754.tif 000004
2017538754.tif 000005
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