(57)【要約】本発明は、概して、天然ＴＧＦαタンパク質と比較して驚くべき優れた、または有益である、または異なる特徴を有する新規ＴＧＦαタンパク質変異体に関する。本発明は、神経学的障害の治療のための方法およびキットにおける新規ＴＧＦαタンパク質変異体の使用にさらに関する。
2017532067.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離ＴＧＦα変異タンパク質であって、表３のアミノ酸位置に対応するもう１つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含む、単離ＴＧＦα変異タンパク質。
【請求項２】
野生型ＴＧＦαタンパク質のアミノ酸位置１４、１７、２７、３６、４１、４５および５０に対応するもう１つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含む、請求項１に記載の単離ＴＧＦα変異タンパク質。
【請求項３】
表２に示される配列または図１６に列記される配列から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離ＴＧＦα変異タンパク質。
【請求項４】
配列番号２〜配列番号１４３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離ＴＧＦα変異タンパク質。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離ＴＧＦαタンパク質のバリアントであって、野生型ＴＧＦαタンパク質のアミノ酸位置１４、１７、２７、３６、４１、４５および５０に対応するもう１つのアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含み、前記バリアントの全配列は、野生型ＴＧＦαタンパク質と少なくとも８５％同一である、バリアント。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のＴＧＦα変異タンパク質または請求項５に記載のバリアントをコードする単離核酸分子。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離ＴＧＦα変異タンパク質または請求項５に記載のバリアント、および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離ＴＧＦα変異タンパク質または請求項５に記載のバリアントを含むキット。
【請求項９】
神経学的疾患または神経学的損傷を有する個体を治療する方法であって、薬学的に許容可能な担体中で請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離ＴＧＦα変異タンパク質または請求項５に記載のバリアントを治療有効量で含む組成物を前記個体に投与し、それにより前記疾患または損傷に起因する行動欠陥を改善することを含む方法。
【請求項１０】
神経学的損傷または損害を有する対象の中枢神経系中の神経学的損傷または損害の部位への前駆細胞またはその子孫の遊走を誘導する方法であって、
（ａ）前記中枢神経系の外側であり、かつ前記神経学的損傷または損害の部位から離隔した投与部位において、治療有効量の請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離ＴＧＦα変異タンパク質または請求項５に記載のバリアントを含む組成物を前記対象に投与すること；
（ｂ）前記前駆細胞またはその子孫の増殖を誘導して増殖細胞を得ること；
（ｃ）前記神経学的損傷または損害の部位に指向される前記増殖細胞の遊走を誘導すること；および
（ｄ）前記損傷または損害の部位またはその近傍において機能ニューロンの神経新生を得ること
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野は、中枢および末梢神経系の障害である。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物における神経新生は、生後期間の早期に完了する。成体哺乳動物中枢神経系（ＣＮＳ：ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ）の細胞は、有糸分裂を経て新たなニューロンを生成する能力をほとんど有さないか、または有さない。したがって、成体霊長類における新たなＣＮＳニューロンの生成は通常生じない。ほとんどの哺乳動物（特に霊長類）において新たな神経細胞を産生するこうした不能性は、長期記憶維持に有利であり得るものの、損傷または疾患に起因して損失した神経細胞を置き換える必要が生じる場合においては明らかに不利である。
【０００３】
ＣＮＳ障害は、多くの病気、例えば、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病およびパーキンソン病）、急性脳損傷（例えば、卒中、頭部損傷、脳性麻痺）および多数のＣＮＳ機能不全（例えば、鬱病、不安症、てんかんおよび統合失調症）を包含する。大脳基底核として公知の脳領域中の変性は、その厳密な位置に応じて、種々の認知および運動症状を有する疾患をもたらし得る。他の形態の神経学的損害は、神経変性、例えば、脳性麻痺の結果として、またはＣＮＳ外傷、例えば、卒中およびてんかんの結果として生じ得る。アルツハイマー病の症例では、前脳および大脳皮質の重度の細胞変性が存在する。パーキンソン病の症例では、黒質緻密部中に変性が見られる。この区域は、通常、ドーパミン作動性連結物を、運動調節において重要な線条体に送る（非特許文献１、非特許文献２）。ドーパミンは、運動の制御において特に重要なカテコールアミン神経伝達物質である。脳内ドーパミンの大多数が線条体中で見出され、脳幹の核、黒質から生じるニューロン中に含有される。これらの細胞の死滅は、結果的にドーパミンの損失を伴い、パーキンソン病の症状の原因になる。脳幹の他のドーパミン作動性ニューロンは、辺縁系および皮質を支配し、それらの系の異常が統合失調症に関与する。パーキンソン病の治療法は、医薬化合物および／または神経栄養因子の使用を介してこの回路に対するドーパミン作動性活性の回復に集中している。
【０００４】
ドーパミンは、気分、認知、記憶（例えば、作業記憶、エピソード記憶、意味記憶、手続き記憶、知覚的表象記憶など）、学習およびルール適用において重要であることも示されている（非特許文献２）。さらに、ドーパミン作動性経路の欠陥は、障害、例えば、気分の落ち込み、認知機能低下、記憶機能低下、不安症および鬱病などに関与することが示されている。このような障害を治療する多くの古典的な方法は、種々の神経伝達物質の再取り込みを阻害することにより神経伝達物質レベルの増大を目的とする合成化合物の投与を含む。このような治療の例は、全てが参照により全体として本明細書に組み込まれる特許文献１、特許文献２、および特許文献３に開示されている。
【０００５】
神経栄養因子は、神経細胞の生存、増殖、分化、サイズ、および機能を種々サポートするペプチドである（概要については、非特許文献３参照）。同定される栄養因子または成長因子の数は常に増加しているが、ほとんどがそれらの構造または結合親和性に基づき１つまたは別の確立されたファミリーに割り当てることができる。種々のファミリー、例として、上皮成長因子（ＥＧＦ：ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）ファミリーからの成長因子は、黒質線条体系のドーパミン作動性ニューロンをサポートすることが実証されている（概要については、非特許文献４、非特許文献５参照）。ＥＧＦは、発生中の成体前脳の区域および中脳の区域、例えば、淡蒼球、腹側淡蒼球、脚内核、黒質、およびカレジャ島に局在していることが分かっている。ＥＧＦ受容体は、免疫組織化学
により、ラット脳中の星状膠細胞ならびに皮質および小脳ニューロンの亜集団に局在し、ヒト解剖脳検体中のニューロンに局在していることが分かった。
【０００６】
トランスフォーミング成長因子−アルファ（ＴＧＦ−α：Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ）は、ＥＧＦ受容体に結合し、受容体のチロシンキナーゼ活性を刺激し、広範な細胞タイプ中で類似の有糸分裂応答を誘発することが示されているＥＧＦファミリーのメンバーである。ＴＧＦ−αは、分離された細胞培養物中の中脳ドーパミンニューロンの生存もサポートし、培養される中枢ニューロンの生存をサポートする。実際、ＴＧＦ−α遺伝子のヌル変異は、黒質中の中脳ドーパミン作動性ニューロンを低減させることが示されている（非特許文献６）。
【０００７】
ＣＮＳ障害の治療は、栄養因子の投与だけでなく、自然細胞死、損傷、または疾患により損失したそれらの神経細胞を置き換えるための幹細胞の投与にも焦点を当てられてきた。例えば、ニューロンおよびグリアに分化する子孫を産生し得る多能性神経幹細胞は、成体哺乳動物神経組織中に存在する。さらに、近年の研究は、成体骨髄に由来する細胞から神経組織を生成し得ることを示す。これらの研究は、移植される成体骨髄幹細胞が神経組織に分化し得ることを実証する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第８，３７２，４５１号明細書
【特許文献２】米国特許第８，４６１，３８９号明細書
【特許文献３】米国特許第８，７９６，３３７号明細書
【特許文献４】米国特許第７，７９０，６６９号明細書
【特許文献５】米国特許第７，７９５，２０２号明細書
【特許文献６】米国特許第８，１５８，５７８号明細書
【特許文献７】米国特許出願公開第２００１／０００７６５７号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】クーパ（Ｃｏｏｐｅｒ）およびアイザクソン（Ｉｓａｃｓｏｎ）著、ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．）、２００４年、１０月１３日、第２４巻（第４１号）、ｐ．８９２４〜８９３１
【非特許文献２】アシュビー（Ａｓｈｂｙ）ら著、神経精神病および治療（Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）、２０１５年、第１１巻、ｐ．１８５９〜１８７５
【非特許文献３】ローリン（Ｌｏｕｇｈｌｉｎ）およびファロン（Ｆａｌｌｏｎ）、「神経栄養因子（Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｆａｃｔｏｒｓ）」、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、サンディエゴ、カリフォルニア、１９９３年
【非特許文献４】ヘフティ（Ｈｅｆｔｉ）著、ジャーナル・オブ・ニューロバイオロジ（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．）、第２５巻、ｐ．１４１８〜１４３５、１９９４年
【非特許文献５】アンサイッカー（Ｕｎｓｉｃｋｅｒ）著、プログレス・イン・グロース・ファクタ・リサーチ（Ｐｒｏｇ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｓ．）、第５巻、ｐ．７３〜８７、１９９４年
【非特許文献６】ブラム（Ｂｌｕｍ）著、ネイチャー・ニューロサイエンス（Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．）、１９９８年、９月、第１巻（第５号）：ｐ．３７４〜３７７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
神経学的欠損の治療の近年の進歩にかかわらず、ほとんどの治療は依然として、そのような治療が必要とされる対象のＣＮＳ中の損傷もしくは損害の部位に対する栄養因子の直
接適用または幹細胞の注入を必要とする。特許文献４、特許文献５、特許文献６、および、特許文献７は、ＥＧＦファミリーのメンバー、例えば、ＥＧＦおよびＴＧＦαを使用して神経学的疾患について対象を治療する方法を考察し、本明細書に明示的に組み込まれる。しかしながら、追加の治療方法が依然として必要とされている。本発明は、そのような必要性に対処する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、天然ヒトＴＧＦαタンパク質と比較して驚くべき優れた活性を有する新規ＴＧＦαタンパク質変異体の開発および使用に関する。ＴＧＦα変異体は、優れた特性、例えば、天然タンパク質と比較して、増大したＥＧＦＲ結合親和性および／または増大したＥＧＦＲリン酸化活性を有し、疎水性、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中の可溶性発現および等電点などの特徴における相違も示す。本発明は、そのような変異体をコードする核酸分子にさらに関する。本発明は、中枢神経系の疾患、障害または病態を有する対象を治療するための方法および組成物における新規ＴＧＦα変異体の使用にさらに関する。本方法は、前駆細胞または幹細胞の増殖、遊走および／または分化の刺激において有用な新規ＴＧＦα変異体、その関連ポリペプチド、断片および模倣体の１つ以上を投与することを含む。
【００１２】
本明細書において引用される全ての刊行物、ジェンバンク配列、特許および特許出願は、全ての目的のために参照により本明細書に明示的に組み込まれる。本明細書において挙げられる全ての刊行物、特許および特許出願、ジェンバンク配列は、目下記載される本発明に関連して使用することができる刊行物に記載される細胞系、ベクター、および方法を記載および開示する目的のために参照により完全に本明細書に組み込まれる。上記および本文全体にわたり考察される刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示のために提供されるにすぎない。本明細書において、本発明者らが先行発明に関してそのような開示に先行する権利を有さないことを自認すると解釈すべきでない。
【００１３】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、添付図面および以下の詳細な説明に記載される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、詳細な説明および図面から、ならびに特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】ｈＴＧＦα発現を計測するための定量ＥＬＩＳＡアッセイであって、１Ａ）は、定量ＥＬＩＳＡアッセイのためのレイアウト。
【図１Ｂ】ｈＴＧＦα発現を計測するための定量ＥＬＩＳＡアッセイであって、１Ｂ）は、標準化されたアッセイから得られたＯＤ４５０値。
【図１Ｃ】ｈＴＧＦα発現を計測するための定量ＥＬＩＳＡアッセイを示し、１Ｃ）は、図１Ｂの表からのＯＤ４５０値を使用して作成された標準曲線。Ｙ軸はＯＤ４５０値である。Ｘ軸はｈＴＧＦαの濃度（ｎｇ／ｍｌ）である。
【図２Ａ】ＥＧＦＲに対するｈＴＧＦαの結合活性を測定するための親和性ＥＬＩＳＡアッセイを示し、２Ａ）は、親和性ＥＬＩＳＡアッセイのレイアウト。
【図２Ｂ】ＥＧＦＲに対するｈＴＧＦαの結合活性を測定するための親和性ＥＬＩＳＡアッセイを示し、２Ｂ）は、アッセイから得られたＯＤ４５０値。
【図２Ｃ】ＥＧＦＲに対するｈＴＧＦαの結合活性を測定するための親和性ＥＬＩＳＡアッセイを示し、２Ｃ）は、図２Ｂの表からのＯＤ４５０値を使用して作成された標準曲線。Ｙ軸はＯＤ４５０値である。Ｘ軸はｈＴＧＦαの濃度（ｎｇ／ｍｌ）である。
【図３Ａ】ＥＧＦＲに対するｈＴＧＦαの結合活性を測定するための細胞ベースＥＬＩＳＡアッセイを示し、３Ａ）は、アッセイレイアウトを示す図。
【図３Ｂ】ＥＧＦＲに対するｈＴＧＦαの結合活性を測定するための細胞ベースＥＬＩＳＡアッセイを示し、３Ｂ）は、細胞ベースアッセイから得られたＯＤ４５０値を示す図。
【図３Ｃ】ＥＧＦＲに対するｈＴＧＦαの結合活性を測定するための細胞ベースＥＬＩＳＡアッセイを示し、３Ｃ）は、図３Ｂの表からのＯＤ４５０値を使用して作成された標準曲線を示す図。Ｙ軸はＯＤ４５０値である。Ｘ軸はｈＴＧＦαの濃度（ｎｇ／ｍｌ）である。
【図４Ａ】ＥＧＦＲに対するｈＴＧＦαの結合活性を測定するためのＦＡＣＳ分析を示し、４Ａ）は、アッセイレイアウト。
【図４Ｂ】ＥＧＦＲに対するｈＴＧＦαの結合活性を測定するためのＦＡＣＳ分析を示し、４Ｂ）は、ｈＴＧＦαに結合したＡ４３１細胞の割合。
【図４Ｃ】ＥＧＦＲに対するｈＴＧＦαの結合活性を測定するためのＦＡＣＳ分析を示し、４Ｃ）は、ｈＴＧＦαに結合したＡ４３１細胞のＦＡＣＳプロファイル。Ｙ軸は分析細胞数を示す。Ｘ軸は蛍光値を示す。
【図５Ａ】ｈＴＧＦαによるＥＧＦＲリン酸化の誘導を示し、５Ａ）は、アッセイレイアウト。
【図５Ｂ】ｈＴＧＦαによるＥＧＦＲリン酸化の誘導を示し、５Ｂ）は、処理細胞中に存在したリン酸化ＥＧＦＲのレベル。Ｙ軸：リン酸化ＥＧＦＲのＯＤ４５０ｎｍ値  Ｘ軸：アッセイにおいて使用されたＥＧＦ（白色バー）またはＴＧＦα（縞状バー）の濃度。
【図５Ｃ】ｈＴＧＦαによるＥＧＦＲリン酸化の誘導を示し、５Ｃ）は、総ＥＧＦＲアッセイ結果：処理細胞中に存在した総ＥＧＦＲのレベル。Ｙ軸：リン酸化ＥＧＦＲのＯＤ４５０ｎｍ値。Ｘ軸：アッセイにおいて使用されたＥＧＦ（白色バー）またはｈＴＧＦα（縞状バー）の濃度。
【図５Ｄ】ｈＴＧＦαによるＥＧＦＲリン酸化の誘導を示し、５Ｄ）は、正規化リン酸化ＥＧＦＲアッセイ結果。Ｙ軸：総ＥＧＦＲのＯＤ４５０ｎｍ値５（Ｃ）によりリン酸化ＥＧＦＲのＯＤ４５０ｎｍ値（５Ｂ）を割り、１００を乗じたもの。Ｘ軸：アッセイにおいて使用されたＥＧＦ（白色バー）またはｈＴＧＦα（縞状バー）の濃度。
【図６】ＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析による細菌発現ｈＴＧＦαの発現レベル。１ｍＭのＩＰＴＧの３７℃における３時間（レーン３および４）、３０℃における６時間（レーン５および６）または２５℃における一晩（レーン７および８）の添加時に発現されたタンパク質。レーン１および２は、非誘導培養物から上清（レーン１）またはペレット（レーン２）を含有する。矢印は、ｈＴＧＦαを示す。
【図７Ａ】定量ＥＬＩＳＡによる細菌発現ｈＴＧＦαの発現レベルを示し、７Ａ）は、アッセイレイアウト。
【図７Ｂ】定量ＥＬＩＳＡによる細菌発現ｈＴＧＦαの発現レベルを示し、７Ｂ）は、アッセイから得られたＯＤ４５０ｎｍ値。
【図７Ｃ】定量ＥＬＩＳＡによる細菌発現ｈＴＧＦαの発現レベルを示し、７Ｃ）は、標準曲線：Ｙ軸：ＯＤ４５０ｎｍ値。Ｘ軸：ＴＧＦαの濃度（ｎｇ／ｍｌ）。
【図７Ｄ】定量ＥＬＩＳＡによる細菌発現ｈＴＧＦαの発現レベルを示し、７Ｄ：標準曲線を使用して推定されたＢＬ２１またはＣＨＯ細胞中で発現されたｈＴＧＦαの濃度（ｎｇ／ｍｌ）。
【図８Ａ】細胞ベースＥＬＩＳＡによる細菌発現ｈＴＧＦαの結合活性を示し、８Ａ）は、アッセイレイアウト。
【図８Ｂ】細胞ベースＥＬＩＳＡによる細菌発現ｈＴＧＦαの結合活性を示し、図８Ｂ）は、ＯＤ４５０ｎｍ値。
【図８Ｃ】細胞ベースＥＬＩＳＡによる細菌発現ｈＴＧＦαの結合活性を示し、図８Ｃ）は、標準曲線。Ｙ軸：ＯＤ４５０ｎｍ値。Ｘ軸：ｈＴＧＦαの濃度（ｎｇ／ｍｌ）。
【図９Ａ】ＦＡＣＳ分析による細菌発現ｈＴＧＦαの結合活性を示し、９Ａ）は、アッセイレイアウト。
【図９Ｂ】ＦＡＣＳ分析による細菌発現ｈＴＧＦαの結合活性を示し、図９Ｂ）は、ｈＴＧＦαに結合したＡ４３１細胞の割合。
【図１０Ａ】細菌発現ｈＴＧＦαによるＥＧＦＲリン酸化の誘導を示し、１０Ａ）は、アッセイレイアウト。
【図１０Ｂ】細菌発現ｈＴＧＦαによるＥＧＦＲリン酸化の誘導を示し、１０Ｂ）は、リン酸化ＥＧＦＲアッセイ結果：リン酸化ＥＧＦＲのＯＤ４５０ｎｍ値。処理細胞中に存在するリン酸化ＥＧＦＲのレベルを測定するためにセルシグナリング（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）キット＃７２４０を使用した。
【図１０Ｃ】細菌発現ｈＴＧＦαによるＥＧＦＲリン酸化の誘導を示し、１０Ｃ）は、総ＥＧＦＲアッセイ結果：細胞中に存在した総ＥＧＦＲのＯＤ４５０ｎｍ値。処理細胞中に存在する総ＥＧＦＲのレベルを測定するためにセルシグナリング（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）キット＃７２５０を使用した。
【図１０Ｄ】細菌発現ｈＴＧＦαによるＥＧＦＲリン酸化の誘導を示し、１０Ｄ）は、正規化リン酸化ＥＧＦＲ。
【図１１Ａ−１】本発明のＣＰＥ（商標）変異体の物理的および機能的特徴を列記しており、１１Ａ）は、それぞれのＣＰＥ（商標）変異体中で作製された変更ならびにプライマリーおよび第１の確認スクリーンについての関連親和性データ。
【図１１Ａ−２】同上
【図１１Ａ−３】同上
【図１１Ａ−４】同上
【図１１Ａ−５】同上
【図１１Ａ−６】同上
【図１１Ａ−７】同上
【図１１Ａ−８】同上
【図１１Ａ−９】同上
【図１１Ａ−１０】同上
【図１１Ａ−１１】同上
【図１１Ａ−１２】同上
【図１１Ａ−１３】同上
【図１１Ａ−１４】同上
【図１１Ａ−１５】同上
【図１１Ａ−１６】同上
【図１１Ａ−１７】同上
【図１１Ａ−１８】同上
【図１１Ｂ−１】本発明のＣＰＥ（商標）変異体の物理的および機能的特徴を列記しており、１１Ｂ）は、構築されたＣＰＥ（商標）変異体のそれぞれについての機能データ。
【図１１Ｂ−２】同上
【図１１Ｂ−３】同上
【図１１Ｂ−４】同上
【図１１Ｂ−５】同上
【図１１Ｂ−６】同上
【図１１Ｂ−７】同上
【図１１Ｂ−８】同上
【図１１Ｂ−９】同上
【図１１Ｂ−１０】同上
【図１１Ｂ−１１】同上
【図１１Ｂ−１２】同上
【図１１Ｂ−１３】同上
【図１１Ｂ−１４】同上
【図１１Ｂ−１５】同上
【図１１Ｂ−１６】同上
【図１１Ｂ−１７】同上
【図１１Ｂ−１８】同上
【図１２Ａ】選択されたＣＰＥ（商標）変異体の結合活性（細胞ベース親和性ＥＬＩＳＡを使用）およびＥＧＦＲリン酸化活性を示し、１２Ａ）は、細胞ベース親和性ＥＬＩＳＡ。Ｘ軸：ＣＰＥ（商標）変異体ＩＤ。Ｙ軸：正規化ＥＬＩＳＡ値：野生型ｈＴＧＦαのＯＤ４５０ｎｍ値によりＣＰＥ（商標）変異体のＯＤ４５０ｎｍ値を割ったもの。野生型ｈＴＧＦαについての正規化ＥＬＩＳＡ値は１である（黒色横線）。白色バー：第１の確認からのＥＬＩＳＡデータ。黒色バー：第２の確認からのＥＬＩＳＡデータ。
【図１２Ｂ】選択されたＣＰＥ（商標）変異体の結合活性（細胞ベース親和性ＥＬＩＳＡを使用）およびＥＧＦＲリン酸化活性を示し、１２Ｂ）は、ＥＧＦＲリン酸化。Ｘ軸：ＣＰＥ（商標）変異体ＩＤ。Ｙ軸：正規化リン酸化ＥＧＦＲアッセイ結果：総ＥＧＦＲのＯＤ４５０ｎｍ値（Ｃ）によりリン酸化ＥＧＦＲのＯＤ４５０ｎｍ値（Ｂ）を割り、１００を乗じたもの。
【図１３】細胞ベース親和性ＥＬＩＳＡを使用する組換え発現ＣＰＳ（商標）変異体の結合活性。モレキュラーデバイススペクトラマックスプラス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ  ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ  Ｐｌｕｓ）プレートリーダにより反応物のＯＤ４５０ｎｍ値を計測した。＊注釈：ＣＰＳ（商標）変異体の一部は、２５ｎｇ／ｍｌ未満を使用して試験した（ＣＰＳ（商標）マップ、図１６参照）。Ｘ軸：ＣＰＳ（商標）変異体。Ｙ軸：ＥＬＩＳＡ反応物のＯＤ４５０ｎｍ値。
【図１４】ＣＰＳ（商標）変異体のＥＧＦＲリン酸化活性。Ｘ軸：ＣＰＳ（商標）変異体。Ｙ軸：正規化リン酸化ＥＧＦＲアッセイ結果：総ＥＧＦＲのＯＤ４５０ｎｍ値によりリン酸化ＥＧＦＲのＯＤ４５０ｎｍ値を割り、１００を乗じたもの。
【図１５】細胞ベースタイトレーション親和性ＥＬＩＳＡを使用する選択ＣＰＳ（商標）変異体の結合活性。Ｘ軸：示される濃度におけるＣＰＳ（商標）変異体ＩＤまたは野生型ｈＴＧＦα。Ｙ軸：ＥＬＩＳＡ反応物のＯＤ４５０ｎｍ値。
【図１６−１】本発明のＣＰＳ（商標）変異体のアミノ酸配列を示す。これは、ＣＰＳ（商標）変異体のいくつかの物理的特徴も示す。
【図１６−２】同上
【図１６−３】同上
【図１７−１】本発明のＣＰＳ（商標）変異体の物理的および機能的特徴を示す。
【図１７−２】同上
【発明を実施するための形態】
【００１５】
天然ＴＧＦαタンパク質と比較して驚くべき優れた、または有益である、または異なる特徴を有する新規ＴＧＦαタンパク質変異体またはバリアントが本明細書に記載される。新規変異体の開発、調製および特徴付けは、以下の実施例に詳細に記載される。本明細書に記載の新規ＴＧＦα変異体は、野生型ＴＧＦαと比較して等しいまたはより大きいＥＧＦＲに対する結合親和性および／またはＥＧＦＲリン酸化活性を示す。さらに、新規変異体は、野生型ＴＧＦαと比較して異なる特徴、例えば、疎水性、等電点および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中の可溶性発現を示し得る。
【００１６】
実施例２に詳細に記載されるとおり、ＢＡＰ０６０−ｈＴＧＦα−Ｂ（配列番号１４５により表されるアミノ酸配列）の包括的位置進化（Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）（ＣＰＥ（商標））ライブラリーが、１４個のアミノ酸バリアントを有する３０位を除く各位置で作出された１５個のアミノ酸バリアントを用いて構築した。ＣＰＥ（商標）ライブラリーは、６６０個のＢＡＰ０６０−ｈＴＧＦα−Ｂ変異体を含有した。変異体を発現させ、実施例１に記載のアッセイを使用してそれらの活性を計測した。これらのうち、野生型ｈＴＧＦαと比較したそれらの優れたまたは異なる特徴に基づき７つのＣＰＥ（商標）ヒットが同定され、７つのＣＰＥ（商標）変異の全ての考えられる組合せを含有するコンビナトリアルタンパク質合成（Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）（ＣＰＳ（商標））ライブラリー
を構築した。これらの変異体を発現させ、野生型ＴＧＦαと比較して優れたまたは異なる特徴を有するものを同定した。
【００１７】
したがって、本発明は、野生型ＴＧＦαと比較して優れた、または有益である、または異なる特徴を有する新規ＴＧＦα変異タンパク質、およびその関連ポリペプチド、断片および模倣体、ならびにそれらのアミノ酸配列を提供する。本発明はまた、新規ＴＧＦα変異タンパク質をコードする核酸分子およびそれらの核酸配列を提供する。本発明は、新規ＴＧＦα変異タンパク質を発現する発現系、例として、限定されるものではないが、プラスミド、ベクター、組換えウイルスまたは細胞をさらに提供する。
【００１８】
本発明は、インビトロもしくはインビボで神経組織およびそれらの機能を生成するか、または再生するか、またはモジュレートするための治療方法、および神経学的欠損、例として、限定されるものではないが、遺伝性障害、外傷、感染、自己免疫疾患など、を改善するための治療方法における、新規ＴＧＦα変異体の使用をさらに提供する。
【００１９】
本発明の新規ＴＧＦα変異体は、損傷の部位への栄養因子の直接投与もしくは治療される対象中への幹細胞の導入を要求しないＣＮＳの損傷もしくは損害を治療する方法において；および／または栄養因子の末梢投与を介して損傷、損害もしくは疾患中枢神経系（ＣＮＳ）組織の神経新生を促進し、もしくは神経活性をモジュレートする方法において、使用することができる。
【００２０】
本発明は、ＴＧＦ−α変異体、またはその関連ポリペプチド、機能断片、または模倣体を対象に投与して神経新生または神経活性をモジュレートまたは促進することを含む方法を提供する。内在性前駆細胞から新たなグリアおよび神経細胞を生成する種々の手法を提供することにより、本発明はまた、組織および神経学的機能の再生を誘導する方法を提供する。本発明は、治療有効量のＴＧＦ−α変異体、またはその関連ポリペプチド、機能断片、または模倣体を対象に末梢投与することにより、対象の中枢神経系中の損傷または損害の部位に前駆細胞またはその子孫を誘引する方法を提供する。したがって、本発明は、インビボで神経組織およびそれらの機能を生成するか、または再生するか、またはモジュレートする方法および神経学的欠損、例として、遺伝性障害、外傷、感染、自己免疫疾患などを改善する方法を対象とする。
【００２１】
一態様において、本発明は、治療有効量のＴＧＦ−α変異体、またはその関連ポリペプチド、機能断片、または模倣体を対象に末梢投与することにより、対象の中枢神経系中の損傷または損害の部位における神経新生をモジュレートする方法を提供する。本発明は、任意の特定の作用機序には限定されないものの、投与は、中枢神経系中の損傷または損害の部位への細胞、例えば、前駆細胞またはその子孫の増殖、遊走、分化（脱分化または再分化を含む）を誘導し得る。代替的な態様において、投与は、中枢神経系中の損傷または損害の部位またはその近傍における細胞、例えば、前駆細胞またはその子孫の増殖、遊走、または分化（脱分化または再分化を含む）を誘導する。代替的態様において、前駆細胞、および／またはその子孫は、ＣＤ３４＋、Ｓｃａ−１＋、またはＣＤ１１７＋（ｃ−ｋｉｔ＋）ポリペプチドを含むポリペプチドを発現する。代替的態様において、本方法は、細胞の分化、または脱分化を誘導し、得られる細胞は、ＣＤ３４＋、Ｓｃａ−１＋、またはＣＤ１１７＋（ｃ−ｋｉｔ＋）ポリペプチドを含むポリペプチドを発現する。
【００２２】
本発明の方法の代替的態様において、前駆細胞は、プレ造血幹細胞、造血幹細胞、内皮細胞および血管周囲細胞である。しかしながら、前駆細胞は、本発明の方法に応答して分化、例えば、脱分化または再分化する発生または分化の任意のレベルにおける任意の細胞であり得る。本発明の方法の代替的態様において、中枢神経系損傷または損害は、神経変性疾患、外傷性損傷、神経毒性損傷、虚血（例えば、虚血性イベントから）、発達障害、
視覚に影響する障害、脊髄の損傷または疾患、脱髄疾患、自己免疫疾患、感染および炎症疾患である。しかしながら、内在性前駆細胞またはその子孫を誘導して中枢神経系中の損害神経組織の再増殖を直接または間接的にもたらす栄養因子の末梢投与により利益を受ける任意の神経学的障害が本発明により包含されることが理解される。一態様において、視覚に影響する障害は、網膜に生じ、または網膜に関する。代替的態様において、神経変性疾患は、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ：ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）およびパーキンソン病である。一態様において、損傷または損害は、新生物病変から生じる。一態様において、損傷または損害は、中枢神経系の放射線または化学療法の治療から生じる。
【００２３】
本発明の方法の代替的態様において、末梢投与は、皮下投与、静脈内投与、皮内投与、筋肉内注射、局所投与および経口投与を含む。一態様において、本方法は、ＣＮＳ中の組織を機械的に破壊し、それにより前駆細胞またはその子孫のトランスロケーションを指向することをさらに含む。一態様において、本方法は、中枢神経系中の細胞の活性を神経化学的に遮断し、それにより前駆細胞またはその子孫の遊走を指向することをさらに含む。
【００２４】
本発明は、ＴＧＦ−α変異体、またはその関連ポリペプチド、機能断片、または模倣体をコードするヌクレオチド配列を含む治療有効量の核酸を末梢投与することにより、対象における中枢神経系中の損傷または損害の部位における神経新生または神経活性をモジュレートする方法をさらに提供する。一態様において、核酸配列は、発現ベクター、例として、例えば、ネイキッドＤＮＡ、プラスミド、組換えウイルスなど中に存在する。一態様において、核酸配列は、発現制御配列、例として、例えば、プロモータ、エンハンサーなどに作動可能に結合している。一態様において、発現は、対象における神経新生または神経活性のモジュレーションをもたらす、損傷または損害の部位中への、その部位での、またはその近傍における、前駆細胞またはその子孫の増殖、遊走、または分化を誘導する。一態様において、本方法は、ＣＮＳ中の細胞の活性を神経化学的に遮断し、それにより前駆細胞またはその子孫の遊走を指向することをさらに含む。
【００２５】
本発明は、組織損傷または損害の前、同時、またはその後に、損傷の部位またはその近傍における前駆細胞の増殖、遊走、または分化を誘導するために有効な量のＴＧＦ−α変異体、またはその関連ポリペプチド、機能断片、または模倣体に組織を接触させ、それにより中枢神経系組織を治療するか、再生するか、または修復することによりインビボで対象の中枢神経系組織を治療するか、再生するか、または修復する方法をさらに提供する。本発明は、中枢神経系中の損傷または損害の部位に前駆細胞（例えば、造血前駆細胞、血管内皮もしくは血管周囲組織中の前駆細胞、または骨髄もしくは他の器官からの前駆細胞）またはその子孫を誘引する方法であって、損傷または損害の部位に関連しない部位に、その部位に細胞を誘引するために十分である薬学的に許容可能な担体中のＴＧＦ−α変異体、またはそれらの関連ポリペプチド、機能断片、または模倣体を投与することを含む方法をさらに提供する。代替的態様において、前駆細胞は、非神経前駆細胞、プレ造血幹細胞、造血幹細胞、内皮細胞であり、または、血管内皮および血管周囲細胞に由来する。
【００２６】
本発明は、対象における神経学的欠損を改善する（例えば、神経学的欠損を有する対象を治療する）方法であって、ＴＧＦ−α変異体、またはその関連ポリペプチド、機能断片、または模倣体とインビボで対象の前駆細胞を接触させることを含み、接触は、患者の中枢神経系の領域に前駆細胞またはその子孫を動員するために十分なシグナル伝達をもたらし、前駆細胞は、神経学的欠損を改善（例えば、軽減）するために十分な方式で神経細胞および機能に分化する方法をさらに提供する。一態様において、前駆細胞は、ＣＤ３４＋、Ｓｃａ−１＋、またはＣＤ１１７＋（ｃ−ｋｉｔ＋）ポリペプチドを含むポリペプチドを発現する。
【００２７】
本発明は、前駆細胞を拡張する方法であって、インビボで前駆細胞の増殖を促進するために有効な量のＴＧＦ−α変異体、またはその関連ポリペプチド、機能断片、または模倣体とインビボで細胞を接触させることを含む方法をさらに提供する。本発明は、対象における内在性前駆細胞の分化を指向する方法であって、ＴＧＦ−α変異体、またはその関連ポリペプチド、機能断片、または模倣体と前駆細胞を接触させ、それにより前駆細胞が神経組織の損害または損傷の部位またはその近傍において分化し、細胞は、神経組織の分化細胞の表現型特徴を獲得することを含む方法をさらに提供する。
【００２８】
本発明は、対象の中枢神経系または末梢神経系における損傷の影響を予防的に改善する方法であって、有効量のＴＧＦ−αポリペプチドを対象に末梢投与し、それにより対象の中枢神経系または末梢神経系における損傷の影響を予防的に改善することを含む方法を提供する。
【００２９】
本明細書において引用される全ての刊行物、ジェンバンク配列、特許および特許出願は、全ての目的のために参照により本明細書に明示的に組み込まれる。本明細書において挙げられる全ての刊行物、特許および特許出願、ジェンバンク配列は、目下記載される本発明に関連して使用することができる刊行物に記載される細胞系、ベクター、および方法を記載および開示する目的のために参照により完全に本明細書に組み込まれる。上記および本文全体にわたり考察される刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示のために提供されるにすぎない。本明細書において、本発明者らが先行発明に関してそのような開示に先行する権利を有さないことを自認すると解釈すべきでない。本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、添付図面および以下の詳細な説明に記載される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、詳細な説明および図面から、ならびに特許請求の範囲から明らかである。
【００３０】
本明細書において使用される「内皮」または「内皮細胞」は、心臓の腔ならびに血管およびリンパ管の腔ならびに体内の漿膜腔を裏打ちする細胞の層を構成し、中胚葉から生じる。血管を裏打ちする内皮細胞は、閉鎖結合により横方向に互いに結合している。閉鎖結合は、浸透性障壁（閉鎖帯）を作出して細胞を一体に保持するための連続帯を形成するか、あるいは、一部の場合には不連続なスポット様接触部（接着斑）を形成して細胞間のいくらかの漏出を許容する。内皮細胞は、この態様により連結された細胞間の協調を促進するギャップ（連絡）結合により、互いにも結合しているとともに、他の血管外細胞に結合していることが多い。内皮は、重要な代謝機能を有し、種々の酵素系が内皮細胞内または表面に局在している。例えば、血管内皮細胞は、血管新生のプロセスにおいて要求される。血管新生は組織再生の間に生じ、既存の内皮の遊走および増殖により、ならびに結合組織前駆細胞、例えば、多能性間葉系幹細胞などの分化により促進される。
【００３１】
本明細書において使用される「ＳＶＺ前駆細胞」は、脳の脳室下帯（ＳＶＺ：ｓｕｂｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｚｏｎｅ）中で生じる多能性幹細胞である。本明細書において使用される「血管周囲」細胞は、血管の周辺に位置する細胞である。血管周囲細胞は、血管壁の構造に近接し、それ自体が、血管の内腔から開始されて血管の壁を介して伝達される化学シグナルを受容し得る。したがって、通常、血液脳関門（ＢＢＢ：ｂｌｏｏｄ  ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ）を横断しないＴＧＦ−αなどの末梢投与される栄養因子は、ＳＶＺ前駆細胞または血管周囲細胞などの脳血管近傍に位置する細胞に作用することにより、依然として神経組織の生成に影響し得る。本明細書において使用される「末梢」投与される栄養因子は、ＣＮＳ中の治療すべき損傷にも損害にも直接関連しない部位において投与される。本発明の方法は、損傷または損害神経組織との栄養因子の直接接触を要求しない。したがって、末梢投与される栄養因子は、シグナル伝達を介して血液脳関門（ＢＢＢ）を横断させる必要なく対象の中枢神経系中の損傷または損害の部位における神経新生または神経活性をモジュレートし得る。
【００３２】
本明細書において使用される「前駆細胞」は、任意の非最終分化細胞、例えば、幹細胞、例として、成体幹細胞などを含む。前駆細胞は、特異的な生化学的特性を有し、分裂してもしなくてもよく、異なる分化状態であるが必ずしも完全分化状態でない状態を取るように、特異的発生シグナルに応答することによってトリガーされ得る。低分化細胞に脱分化して、目下、多能性を有する細胞が、「前駆細胞」の定義内に包含される。本研究は、脳血管に関連する細胞、例として、内皮細胞、血管周囲細胞、循環ＨＳＣおよび／またはＳＶＺ前駆細胞が多能性を有することを想定する。このような細胞は、本発明の方法による神経組織の生成のために好適な方式で、ＴＧＦ−αと、除神経ニューロンおよび／またはそれらの支持細胞（星状膠細胞、オリゴデンドロサイト、およびミクログリア）により生産されるシグナルとの両方により生成される微小環境シグナルに応答し得る。
【００３３】
用語「前駆細胞」および「幹細胞」は、本明細書において交換可能に使用されることが多い。ＴＧＦ−αポリペプチド、ＴＧＦ−α活性を有するその関連ポリペプチド、模倣体、または機能断片により接触させた場合にインビボで刺激されて増殖、遊走および／または分化させることができる幹細胞または前駆細胞としては、成体幹細胞および前駆細胞が挙げられる。このような幹細胞および前駆細胞としては、例えば、造血組織、神経組織、血管周囲組織の細胞および内皮細胞が挙げられる。
【００３４】
造血幹細胞（ＨＳＣ：Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）は、特異的タイプの造血または血液細胞、例えば、赤血球、リンパ球、マクロファージ、および巨核球に分化し得る、とりわけ骨髄および末梢血中で見出されるフォーマティブ多能性芽細胞である。ある因子、例えば、Ｇ−ＣＳＦおよびＷ−ＣＳＦの投与による骨髄からのＨＳＣ動員ならびに後続の末梢血の回収後、ＨＳＣは、末梢血前駆細胞（ＰＢＰＣ：ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）とも称されるようになる。
【００３５】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ：Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）は、生物活性因子、例えば、サイトカインからの種々の影響に応じて特に２つ以上の特異的タイプの間葉または結合組織（例えば、脂肪、骨、間質、軟骨、弾性、および線維性結合組織）に分化し得る、とりわけ骨髄、血液、皮膚および骨膜中で見出されるフォーマティブ多能性芽細胞である。骨芽細胞および軟骨細胞などの細胞に分化する潜在性は、単離および培地での拡張後において保持されており、こうした細胞が特異的条件下のインビトロで誘導される場合、またはインビボで損害組織の部位もしくはその近傍に配置される場合に、分化が生じる。
【００３６】
造血幹細胞に加え、骨髄は、非造血細胞、例えば、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞および筋芽細胞のための幹様前駆体を含有する（オーウェン（Ｏｗｅｎ）ら著、１９８８年、「脊椎動物硬組織の細胞および分子生物学（Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  Ｈａｒｄ  Ｔｉｓｓｕｅｓ）」、シバ財団シンポジウム（Ｃｉｂａ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ）、第１３６巻、チチェスター、英国、ｐ．４２〜６０；カプラン（Ｃａｐｌａｎ）著、１９９１年、ジャーナル・オブ・オルトペディック・リサーチ（Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．）、第９巻、ｐ．６４１〜６５０；プロッコップ（Ｐｒｏｃｋｏｐ）著、１９９７年、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）第２７６巻、ｐ．７１〜７４）。骨髄の非造血前駆体は、コロニー形成単位線維芽細胞、間葉系幹細胞、および骨髄間質細胞（ＭＳＣ：ｍａｒｒｏｗ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ）と種々に称されている。本明細書において使用される「間質細胞」、「コロニー形成線維芽細胞」、「骨髄間質細胞」、「接着細胞」および「ＭＳＣ」は、交換可能に使用され、骨芽細胞、軟骨細胞、および脂肪細胞の幹細胞様前駆体として機能し得る骨髄中のごくわずかな細胞を指すことを意味する。
【００３７】
本明細書において使用される「多能性細胞」は、インビボまたはインビトロで少なくと
も２つの異なる細胞タイプに分化するように誘導することができる細胞である。これらの細胞タイプは、それら自体、多能性であり得、順次、さらなる細胞タイプに分化し得、またはそれらは、最終的に分化し得、すなわち、それらの実際の状態を超えて分化し得ない。
【００３８】
多能性細胞としては、任意の選択発生経路に沿って分化し得る全能性細胞が挙げられる。例えば、胚性幹細胞（トマソン（Ｔｈｏｍｓｏｎ）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２８２巻、ｐ．１１４５、１９９８年）は、全能性幹細胞である。多能性細胞としては、他の組織特異的幹細胞、例えば、造血幹細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞、神経外肺葉細胞、外肺葉細胞、および内胚葉細胞、例えば、腸管内胚葉細胞ならびに筋または骨格成分、皮膚成分、例えば、皮膚または毛髪、血液細胞などを与える能力を有する中胚葉幹細胞も挙げられる。「発生経路」は、特定の前駆細胞から追跡することができる共通の細胞運命を指す。前駆細胞は、より原始的であり、すなわち、間葉系幹細胞または造血幹細胞よりも特定の発生経路にそれほど運命付けられない。
【００３９】
「部分的に方向付けされた」細胞は、もはや全能性でないが、多能性のままである細胞タイプである。例えば、ＳＶＺ幹細胞は、部分分化しているが、依然として種々の神経組織タイプにさらに分化し得る。同様に、非最終分化内皮細胞は、神経組織に分化するように刺激することができる。
【００４０】
多能性前駆細胞は、細胞増殖モジュレーティング剤に応答性であり得る。本明細書において使用される「細胞増殖モジュレーティング剤」は、細胞成長または分化を促進または阻害し得る任意の薬剤である。
【００４１】
本明細書において使用される用語「栄養因子」は、それらの標的細胞の増殖、分化、遊走、および生存（死滅であることもある）を促進および／もしくは制御し、ならびに／または損傷からそれらを保護する栄養作用を有する化合物を指す。このような因子としては、サイトカイン、ニューロトロフィン、上皮成長因子、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、インスリン様成長因子、毛様体神経栄養因子および関連分子、グリア由来成長因子および関連分子、シュワン細胞腫由来成長因子、グリア成長因子、線条体由来神経栄養因子、血小板由来成長因子、肝細胞成長因子、分散因子（ＨＧＦ−ＳＦ：ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ，ｓｃａｔｔｅｒ  ｆａｃｔｏｒ）、トランスフォーミング成長因子−ベータおよび関連分子、神経伝達物質、ならびにホルモンが挙げられる。当業者は、本発明において用いることができる追加の栄養因子を容易に認識する（例えば、レンファント（Ｌｅｎｆａｎｔ）ら著、「血管および神経系の成長因子：機能特徴付けおよびバイオテクノロジー：成長のバイオテクノロジーに関する国際シンポジウム（Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ：Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｇｒｏｗ）」（Ｓ．カルゲル・パブリッシング（Ｓ．Ｋａｒｇｅｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）、１９９２年）参照）。
【００４２】
本明細書において使用される用語「成長因子」は、成長刺激因子（マイトジェン）として、または成長インヒビター（負の成長因子と称されることもある）として機能する分子を含む。成長因子は、細胞遊走を刺激し（例えば、マイトジェンサイトカイン）、走化性物質として機能し、腫瘍細胞の細胞遊走または浸潤を阻害し、細胞の分化機能をモジュレートし、アポトーシスに関与し、細胞の生存を促進することも公知である。このような因子は、拡散因子として分泌され得、膜固定形態でも存在し得る。したがって、これらは、自己分泌、傍分泌、接触分泌、または逆分泌（ｒｅｔｒｏｃｒｉｎｅ）方式で作用し得る。サイトカインは、成長因子の１つのタイプである。「サイトカイン」は、ナノからピコ
モル濃度において体液性調節因子として作用し、正常または病理学的条件下のいずれでも個々の細胞および組織の機能活性をモジュレートし得るポリペプチドである。サイトカインは、細胞間の相互作用を直接媒介し得、および／または細胞外環境中で生じるプロセスを調節し得る。サイトカインは、種々の他のタンパク質に加え、インターロイキン、リンホカイン、モノカイン、インターフェロン、コロニー刺激因子、およびケモカインを含む。
【００４３】
成長因子としては、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ：ｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ：ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ：ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ：ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｈ  ｆａｃｔｏｒ）、造血成長因子（ＨｅＧＦ：ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）、血小板由来内皮細胞成長因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ：ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ：ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、インターロイキン−８、成長ホルモン、アンジオポエチン、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ：ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、酸性および塩基性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、トランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦ−αまたはＴＧＦ−α）、およびＣＹＲ６１（バビック（Ｂａｂｉｃ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、第９５巻、ｐ．６３５５、１９９８年；キレエバ（Ｋｉｒｅｅｖａ）ら著、モレキュラー・オブ・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）、第１６巻、ｐ．１３２６、１９９６年）がさらに挙げられる。このような因子としては、インスリン、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、神経成長因子、ＮＧＦ受容体、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＥＧＦ受容体、ｎｅｕ、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、インヒビンα、インヒビンβ、ミュラー管阻害因子、ＴＮＦ−α／β、ＴＮＦ受容体（１型）、ＴＮＦ受容体（２型）、ＰＤＧＦ  Ａ鎖、ＰＤＧＦ  Ｂ鎖、ＰＤＧＦ受容体α、ＰＤＧＦ受容体β、ａ−ＦＧＦ、ｂ−ＦＧＦ、ｗｎｔ−２、ｈｓｔ／ｋｓ３、肝細胞成長因子、ＨＧＦ受容体（ｃ−ｍｅｔ）、ＩＬ−１α／β、（α鎖）ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２Ａ（ｐ３５）、ＩＬ−１２Ｂ（ｐ４０）、インターロイキン１（１型）、インターロイキン−２α、インターロイキン−２β、インターロイキン−４、インターロイキン−５α、インターロイキン−６、インターロイキン−７、Ｍ−ＣＳＦ（ＣＳＦ−１とも呼ばれる）、Ｍ−ＣＳＦ受容体（ｃ−ｆｍｓ）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ受容体α、ＧＭ−ＣＳＦ受容体β、Ｇ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ受容体、幹細胞因子、ＳＣＦ受容体（ｃ−ｋｉｔ）、エリスロポエチン（ｅｐｏ）、ｅｐｏ受容体、および白血病阻害因子がさらに挙げられる。これらの分子のそれぞれは、インビボで細胞増殖、細胞成長または分化を誘導することが示されている。活性をモジュレートする細胞成長または分化を示す他の類似の分子は、ヘパリン結合成長因子（ＨＢＧＦ：ｈｅｐａｒｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）である。
【００４４】
「ポリペプチド」またはタンパク質は、アミド結合を介して結合されているモノマーがアミノ酸残基であるポリマーを指す。アミノ酸がα−アミノ酸である場合、Ｌ−光学異性体またはＤ−光学異性体のいずれかを使用することができ、Ｌ−異性体が典型的である。ＴＧＦ−α変異体、その関連ポリペプチド、模倣体、または機能断片は、変異ＴＧＦ−α活性を示す、糖タンパク質などの改変配列を含むアミノ酸配列を包含するものとする。本発明の分子（例えば、ポリペプチド）は、ＴＧＦ−α変異体ならびにＴＧＦ−α変異体の構造および／または機能的特徴を有するポリペプチドのアミノ酸配列を包含する。本発明の方法において使用されるポリペプチドは、実質的に精製された天然存在タンパク質、ならびに組換え合成、半合成により合成、または合成により合成されたものを包含するもの
とする。
【００４５】
用語「ＴＧＦα」は、任意の公知のＴＧＦαポリペプチド；ＴＧＦ−αポリペプチドの断片；公知ＴＧＦαポリペプチドのバリアント；ＴＧＦαポリペプチドを含む融合ポリペプチド；およびＴＧＦα模倣体を含む。バリアントとしては、公知ＴＧＦαポリペプチドに対する実質的なアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド；公知のＴＧＦαポリペプチドと比較して１つ以上の保存的アミノ酸変化を含むポリペプチドなどが挙げられる。公知ＴＧＦαポリペプチドの例としては、ジェンバンク受託番号Ｐ０１１３５に提供されるアミノ酸配列のアミノ酸１７〜６６を有するＴＧＦαポリペプチド；およびジェンバンク受託番号Ｐ０１１３４に提供されるアミノ酸配列のアミノ酸１６〜６５を有するＴＧＦαポリペプチドが挙げられる。本発明の方法における使用のため、ＴＧＦαポリペプチドは、生物学的に活性であり、例えば、それは、ＣＮＳ中の損傷または損害の部位中への前駆細胞の分化および／または遊走および／または増殖を誘導する能力を保持する。ＴＧＦαポリペプチドがＣＮＳ中の損傷または損害部位中への前駆細胞の分化および／または遊走および／または増殖を誘導するか否かは、本明細書に記載の方法、および国際公開第９９／０６０６０号に記載の方法を使用して決定することができる。さらにＴＧＦ−αまたは関連ポリペプチドは、少なくとも２つの異なる立体構造で生じ得る。これら両方の立体構造は、同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有するものの、ＴＧＦ−αに関連する生物学的活性を有する限りで異なる３次元構造を有する。ＴＧＦ−αのポリペプチドまたはタンパク質断片を使用する方法も本発明により包含される。断片は、天然存在タンパク質と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有し得る。実質的に同一の配列を有するポリペプチドまたはペプチドとは、完全にではないがその大部分のアミノ酸配列が同一であり、関連する配列の機能活性を保持することを意味する。
【００４６】
一般に、本発明の方法において有用なポリペプチドとしては、対応する部分にわたり元のタンパク質に対する約５０％〜約７０％、約７０％〜約８０％、約８０％〜約９０％、約９０％〜約９５％、約９５％〜約９８％、またはより高いアミノ酸配列同一性を依然として有するタンパク質骨格中への置換、欠失、または挿入を含有するペプチド、または全長タンパク質が挙げられる。より大きい程度の同一性からの逸脱は、類似アミノ酸、すなわち、保存的アミノ酸置換が配列の変化としてカウントされない場合に許容される。ＴＧＦ−αポリペプチド断片は、ＴＧＦ−αに関連する生物学的活性を保持する。
【００４７】
ＴＧＦ−αポリペプチドに対する配列同一性（相同性）は、ポリペプチドが本発明の方法において使用される組成物であるか否かを決定するために使用することができ；それは、標準的な配列分析ソフトウェア（例えば、ウイスコンシン大学バイオテクノロジーセンタ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ）、１７１０、大学通り、マディソン、ウイスコンシン、５３７０５の遺伝学コンピュータグループ（ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）の配列分析ソフトウェアパッケージ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ）；オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら前掲も参照）を使用して計測することができる。このような手順およびアルゴリズムとしては、例えば、ＢＬＡＳＴプログラム（国立生物工学情報センターにおけるベーシックローカルアラインメントサーチツール（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ））、ＡＬＩＧＮ、ＡＭＡＳ（多重アライン配列の分析（Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉｐｌｙ  Ａｌｉｇｎｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ））、ＡＭＰＳ（タンパク質多重配列アラインメント（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ））、ＡＳＳＥＴ（アラインセグメント統計的評価ツール（Ａｌｉｇｎｅｄ  Ｓｅｇｍｅｎｔ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｔｏｏｌ））、ＢＡＮＤＳ、ＢＥＳＴＳＣＯＲ、ＢＩＯＳＣＡＮ（生物配列比較分析ノード（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｎｏｄｅ））、ＢＬ
ＩＭＰＳ（ブロックスインプルーブドサーチャ（ＢＬｏｃｋｓ  ＩＭＰｒｏｖｅｄ  Ｓｅａｒｃｈｅｒ））、ＦＡＳＴＡ、インターバルズアンドポインツ（Ｉｎｔｅｒｖａｌｓ＆Ｐｏｉｎｔｓ）、ＢＭＢ、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｖ、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ、ＣＯＮＳＥＮＳＵＳ、ＬＣＯＮＳＥＮＳＵＳ、ＷＣＯＮＳＥＮＳＵＳ、スミス・ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）アルゴリズム、ＤＡＲＷＩＮ、ラスベガス（Ｌａｓ  Ｖｅｇａｓ）アルゴリズム、ＦＮＡＴ（強制ヌクレオチドアラインメントツール（Ｆｏｒｃｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｔｏｏｌ））、フレームアライン（Ｆｒａｍｅａｌｉｇｎ）、フレームサーチ（Ｆｒａｍｅｓｅａｒｃｈ）、ＤＹＮＡＭＩＣ、ＦＩＬＴＥＲ、ＦＳＡＰ（フリステンスキー配列分析パッケージ（Ｆｒｉｓｔｅｎｓｋｙ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ））、ＧＡＰ（グローバルアラインメントプログラム（Ｇｌｏｂａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ））、ＧＥＮＡＬ、ＧＩＢＢＳ、ジェンクエスト（ＧｅｎＱｕｅｓｔ）、ＩＳＳＣ（高感度配列比較（Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ））、ＬＡＬＩＧＮ（ローカル配列アラインメント（Ｌｏｃａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ））、ＬＣＰ（ローカルコンテントプログラム（Ｌｏｃａｌ  Ｃｏｎｔｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ））、ＭＡＣＡＷ（多重アラインメント構築および分析ワークベンチ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ＆Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ））、ＭＡＰ（多重アラインメントプログラム（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ
Ｐｒｏｇｒａｍ））、ＭＢＬＫＰ、ＭＢＬＫＮ、ＰＩＭＡ（パターン誘導多重配列アラインメント（Ｐａｔｔｅｒｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｍｕｌｔｉ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ））、ＳＡＧＡ（遺伝アルゴリズムによる配列アラインメント（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｂｙ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ））およびＷＨＡＴ−ＩＦが挙げられる。
【００４８】
ポリペプチドは、保存的変異を別にして実質的に関連し得、このようなポリペプチドは本発明により包含される。保存的変異は、アミノ酸残基の、別の生物学的に類似の残基による置き換えを示す。保存的変異の例としては、ある疎水性残基、例えば、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンの別のものによる置換、またはある極性残基の別のものによる置換、例えば、アルギニンのリジンによる置換、グルタミン酸のアスパラギン酸による置換、またはグルタミンのアスパラギンによる置換などが挙げられる。保存的置換の他の説明的な例としては、アラニンのセリンへの変化；アルギニンのリジンへの変化；アスパラギンのグルタミンまたはヒスチジンへの変化；アスパラギン酸のグルタミン酸への変化；システインのセリンへの変化；グルタミンのアスパラギンへの変化；グルタミン酸のアスパラギン酸への変化；グリシンのプロリンへの変化；ヒスチジンのアスパラギンまたはグルタミンへの変化；イソロイシンのロイシンまたはバリンへの変化；ロイシンのバリンまたはイソロイシンへの変化；リジンのアルギニン、グルタミン、またはグルタミン酸への変化；メチオニンのロイシンまたはイソロイシンへの変化；フェニルアラニンのチロシン、ロイシンまたはメチオニンへの変化；セリンのトレオニンへの変化；トレオニンのセリンへの変化；トリプトファンのチロシンへの変化；チロシンのトリプトファンまたはフェニルアラニンへの変化；バリンのイソロイシンへの、ロイシンへの変化が挙げられる。用語「保存的変異」は、置換ポリペプチドに対して生じる抗体が非置換ポリペプチドとの免疫反応性も示すのであれば、非置換親アミノ酸に代えての置換アミノ酸の使用も含む。
【００４９】
改変および置換は、アミノ酸の置き換えに限定されない。種々の目的、例えば、増大した安定性、溶解度、または立体構成上の懸念のため、当業者は他の改変を（欠失、置き換え、または付加により）導入する必要性を認識する。このような他の改変の例としては、希少アミノ酸、右旋性（Ｄ）−アミノ酸、グリコシル化部位、特異的ジスルフィド架橋形成のためのシトシンの取り込みが挙げられる。改変ペプチドは、化学合成することができ、または単離遺伝子は、部位特異的変異誘発することができ、または合成遺伝子は、合成
し、神経学的欠損が治療されるように対象中で発現させることができる。
【００５０】
固相化学ペプチド合成法もまた、本方法において使用され得るポリペプチドまたはポリペプチドの断片を合成するために使用することができる。このような合成法は、当技術分野において１９６０年代初頭から公知であり（メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ），Ｒ．Ｂ．、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティ（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）、第８５巻、ｐ．２１４９〜２１５４、１９６３年（スチュアート（Ｓｔｅｗａｒｔ），Ｊ．Ｍ．およびヤング（Ｙｏｕｎｇ），Ｊ．Ｄ．、「固相ペプチド合成（Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、第２版、ピエース・ケミカル社（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、ロックフォード、イリノイ、ｐ．１１〜１２）も参照）、近年、市販の実験室ペプチド設計および合成キット（ケンブリッジリサーチバイオケミカルズ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））において用いられている。このような市販の実験室キットは、一般に、Ｈ．Ｍ．ガイゼン（Ｇｅｙｓｅｎ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ）、第８１巻、ｐ．３９９８、１９８４年の教示を利用しており、全てが単一プレートに連結されている多数の「ロッド」またはＣ６ピン」のチップ上でのペプチド合成を提供する。このような系を利用する場合、ロッドまたはピンのプレートを反転させ、適切なアミノ酸をピンまたはロッドのチップに付着させ、または固定するための溶液を含有する対応するウェルまたは容器の第２のプレート中に挿入する。このようなプロセスステップを繰り返すことにより、すなわち、適切な溶液中にロッドおよびピンチップを反転および挿入することにより、所望のペプチドにアミノ酸を構築する。さらに、多数の利用可能なＦＭＯＣペプチド合成系が利用可能である。例えば、ポリペプチドまたは断片のアセンブリは、アプライド・バイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）モデル４３  １  Ａ自動ペプチド合成装置を使用して固体支持体上で実施することができる。
【００５１】
一態様において、本発明は、野生型ＴＧＦαタンパク質と比較して優れた、または有益である、または異なる特徴を有する新規変異ＴＧＦαタンパク質を提供する。本発明によれば、このような変異体は、合成物であり、すなわち、それらは人工的に作製される。変異タンパク質が野生型ＴＧＦαタンパク質と比較して優れた、有益である、異なる特徴を有する限り、野生型ＴＧＦαタンパク質配列に対して任意の変異を作製することができる。好ましい変異は本明細書に開示され、そのような変異を作製する位置も開示される。一態様において、本発明の変異ＴＧＦαタンパク質は、本明細書に開示される、変異が作製され得る１つ以上の位置における変異を含む。有用な変異の一例は、置換変異である。一態様において、本発明の変異ＴＧＦαタンパク質は、本明細書に開示される、変異が作製され得る１つ以上の位置における置換変異を含む。一態様において、本発明の変異ＴＧＦαタンパク質は、本明細書に開示される変異の１つ以上を含む。一態様において、本発明の変異ＴＧＦαタンパク質は、表３に列記されるアミノ酸位置に対応する１つ以上のアミノ酸位置におけるアミノ酸変異を含む。一態様において、本発明の変異ＴＧＦαタンパク質は、野生型ＴＧＦαのアミノ酸位置１４、１７、２７、３６、４１、４５および５０に対応する１つ以上のアミノ酸位置におけるアミノ酸変異を含む。一態様において、本発明の変異ＴＧＦαタンパク質は、表２に示される配列または図１６に列記される配列から選択されるアミノ酸配列を含む。一態様において、本発明の変異ＴＧＦαタンパク質は、配列番号２〜配列番号１４３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００５２】
本発明はまた、本明細書に開示される新規変異ＴＧＦαタンパク質のバリアントを提供する。本発明によれば、本発明の変異ＴＧＦαタンパク質のバリアントは、配列がさらに改変された、本明細書に開示される変異ＴＧＦαタンパク質である。好ましい実施形態において、本発明の変異ＴＧＦαタンパク質のバリアントは、出発変異ＴＧＦαタンパク質の変異（例えば、表３に列記されるアミノ酸位置（例えば、野生型ＴＧＦαのアミノ酸位
置１４、１７、２７、３６、４１、４５および５０）に対応する１つ以上のアミノ酸位置における変異）を含む。しかしながら、残りのアミノ酸配列（すなわち、野生型ＴＧＦαのアミノ酸位置１４、１７、２７、３６、４１、４５および５０に対応する位置におけるアミノ酸以外の変異ＴＧＦαタンパク質中のアミノ酸）は、改善された活性または特徴を有する最終バリアントを生成するようにさらに変異される。一実施形態において、残りのアミノ酸配列は、それらが出発変異ＴＧＦαタンパク質中の対応する配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％または少なくとも９７％同一であるように変異される。好ましい実施形態において、バリアント変異ＴＧＦαタンパク質は、出発変異ＴＧＦαタンパク質と比較して等しいまたは改善された活性（例えば、結合親和性、リン酸化の誘導など）、または特徴（例えば、溶解度、安定性など）を有する。バリアントにより意味されるものをさらに説明するため、出発変異ＴＧＦαタンパク質は、例えば、１４、１７、２７および４１位における変異を有する配列番号１２５を含み得る。次いで、この出発変異ＴＧＦαタンパク質は、１４、１７、２７または４１位以外の位置においてさらに変異され、改善された活性または特徴について試験される。一実施形態において、本発明の変異ＴＧＦαタンパク質のバリアントは、配列番号２〜配列番号１４３からなる群から選択される配列からの１つ以上の変異を含み、バリアント中の残りの配列は、出発変異ＴＧＦαタンパク質中の対応する配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％または少なくとも９７％同一である。
【００５３】
ＴＧＦαは、神経学的欠損中の部位または病巣への神経起源の幹細胞の分化および／または増殖および／または遊走を刺激する。例えば、パーキンソン病は、休止時振戦、硬直、運動開始不能（無動）および運動の緩慢性（動作緩慢）を特徴とする。運動欠陥は、側坐核に対するドーパミン作動性神経支配の進行性変性ならびに青斑のノルアドレナリン作動性細胞および縫線のセロトニン作動性ニューロンの変性に伴う。黒質ドーパミンニューロンの最大８０％が、顕著な運動欠陥が顕在する前に消失し得る。ＴＧＦ−αは、ラット脳中に経時的に注入される場合（例えば、数日または数週間）、神経変性障害の治療に有用である。１８日間の期間にわたるＴＧＦ−αの脳室内（ＩＣＶ：Ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）または線条体内注入は、神経幹細胞増殖を誘導したが、変性、損傷またはそうでなければ異常な細胞が存在しており、関連する神経学的欠損からの回復に影響を与えるために十分な規模での損傷部位への神経幹細胞の遊走を促進した（参照により全体として本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開国際公開第９９／０６０６０号および国際公開第０１／１２１２７号参照）。前脳神経幹細胞は遊走し、神経学的欠損障害、例として、例えば、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病などからの治療および回復に影響する。
【００５４】
従来の研究は、米国特許第７，７９５，２０２号明細書において、末梢経路により投与されるＴＧＦ−αが、中枢神経系（ＣＮＳ）の神経新生を促進し、パーキンソン病の動物モデルにおける異常な運動行動を改善する証拠を提供した。ＴＧＦ−α注入動物の脳の分析は、前脳および中脳の複数の区域中の新たに生成されたニューロンの存在を明らかにし、それらのいくつかはドーパミン（ＤＡ：ｄｏｐａｍｉｎｅ）産生ニューロンへの最終分化を示す。既に記載されるとおり、ＴＧＦ−αは、ＢＢＢを横断し得ず、典型的には、脳血管系内に蓄積する。ＳＮ中でＤＡ細胞死を誘導するために本研究において使用される６−ＯＨＤＡは、ＢＢＢを破壊するが、この破壊がより吻側の区域ではなく穿刺経路付近の中脳区域および大脳皮質に限定されることが報告されている。したがって、ＴＧＦ−αが６−ＯＨＤＡにより引き起こされるＢＢＢの中脳破壊を介してより吻側の脳実質に接近する可能性は低いと考えられる。例えば、先行の研究において、ＴＧＦ−αは、末梢源から血管内経路を介して送達された。したがって、全ての脳血管が均等に潅流されることにより、注入カニューレの頭蓋内配置による一方向への影響の負荷の可能性が減少する。したがって、除神経区域中でのみ血管周辺に新たに生成される細胞のクラスタ化が、化学誘因
または血管内成長因子に対するトロピック応答を表す可能性は低い。なぜなら、それは全ての脳血管周辺にそのような細胞のより拡散した分布をもたらすと考えられるためである。
【００５５】
本明細書において使用される「核酸」（用語「ポリヌクレオチド」と交換可能に使用される）は、ヌクレオチドのポリマー形態を指す。一部の例において、ポリヌクレオチドは、それが由来する生物の天然存在ゲノム中のそれが直接連続するコード配列（５’末端上のものおよび３’末端上のもの）のいずれとも直接連続しない配列を指す。したがって、この用語は、例えば、ベクター中に；自己複製プラスミドもしくはウイルス中に；または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに取り込まれる組換えＤＮＡ、もしくは他の配列と独立して別個の分子として存在する組換えＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）を含む。本発明の方法における使用に好適な核酸は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはいずれかのヌクレオチドの改変形態であり得る。さらに、ポリペプチド鎖の産生に関与するポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド配列源に応じてコード領域の前および後の領域（リーダおよびトレイラ）ならびに個々のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含み得る。用語「ポリヌクレオチド」は、一般に、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを指し、それらは非改変ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは改変ＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る。したがって、例えば、本明細書において使用されるポリヌクレオチドは、とりわけ、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖またはより典型的には二本鎖または一本鎖および二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子を指す。融合タンパク質（例えば、ＴＧＦ−αポリペプチドおよび別のポリペプチド、例えば、標的化配列）をコードする核酸を作出することができ、発現制御配列に作動可能に結合させることができる。「作動的に結合」は、そのように記載される構成要素が、それらの意図される方式でそれらが機能することを可能とする関係にある並置を指す。例えば、ＲＮＡポリメラーゼが２つのコード配列を単一ｍＲＮＡに転写し、次いでそれが両方のコード配列に由来するアミノ酸を有する単一ポリペプチドに翻訳される場合、コード配列は別のコード配列に「作動可能に結合している」。コード配列は、発現される配列が最終的にプロセシングを受けて所望のタンパク質を産生する限り、互いに連続的であることを必要としない。コード配列に作動可能に結合している発現制御配列は、その発現制御配列と適合性である条件下でコード配列の発現が達成されるようにライゲーションされる。本明細書において使用される用語「発現制御配列」は、それが作動可能に結合している核酸配列の発現を調節する核酸配列を指す。発現制御配列が核酸配列の転写および適宜、翻訳を制御および調節する場合、発現制御配列は核酸配列に作動可能に結合している。したがって、発現制御配列は、適切なプロモータ、エンハンサー、転写ターミネータ、タンパク質コード遺伝子前の開始コドン（すなわち、ＡＴＧ）、イントロンのためのスプライシングシグナル、ｍＲＮＡの適切な翻訳を可能とするためのその遺伝子の正確なリーディングフレームの維持、���よび停止コドンを含み得る。用語「制御配列」は、少なくとも存在が発現に影響し得る構成要素を含むものとし、存在が有利な追加の構成要素、例えば、リーダ配列および融合パートナ配列も含み得る。
【００５６】
「プロモータ」は、転写を指向するために十分な最小配列を意味する。プロモータ依存的遺伝子発現を細胞タイプ特異的、組織特異的に制御可能とし、または外的シグナルもしくは薬剤による誘導性とするために十分なプロモータエレメントも本発明に含まれ；そのようなエレメントは、ポリヌクレオチド配列の５’または３’領域中に局在し得る。構成的および誘導性プロモータの両方が、本発明に含まれる（例えば、ビター（Ｂｉｔｔｅｒ）ら著、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第１５３巻、ｐ．５１６〜５４４、１９８７年参照）。例えば、哺乳動物細胞系中でクローニングする場合、哺乳動物細胞のゲノム（例えば、メタロチオネインプロモー
タ）または哺乳動物ウイルス（例えば、レトロウイルス、ロングターミナルリピート；アデノウイルス後期プロモータ；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモータ）に由来するプロモータを使用することができる。本発明の核酸配列の転写を提供するために組換えＤＮＡまたは合成技術により産生されるプロモータを使用することもできる。組織特異的調節エレメント、例として、例えば、異なる組織中で示差的に発現される遺伝子またはウイルスからの調節エレメントを使用することができる。組織特異的調節エレメントの例としては、組織特異的プロモータ、例えば、乳特異的（ホエイ）、膵臓（インスリンまたはエラスターゼ）、平滑筋細胞中のアクチンプロモータまたは神経細胞（ミエリン塩基性タンパク質）プロモータ、例えば、ＧＦＡＰ（グリア細胞に特異的；米国特許第６，０６６，７２６０号明細書も参照）が挙げられる。組織特異的プロモータとしては、ベータ−グロビン、エラスターゼ、α−フェトプロテイン、α−Ａクリスタリン、赤血球特異的転写エレメントおよびインスリン遺伝子の５’または３’フランキング配列が挙げられる（イェエ（Ｙｅｅ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．）、第８６巻、ｐ．５８７３〜５８７７、１９８９年；スウィフト（Ｓｗｉｆｔ）ら著、セル（Ｃｅｌｌ）、第３８巻、ｐ．６３９、１９８４年；ストーブ（Ｓｔｏｒｂ）ら著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）（ロンドン）、第３１０巻、ｐ．２３８；グロシェデル（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｌｄｌ）ら著、セル（Ｃｅｌｌ）第４１巻、ｐ．８８５、１９８５年；シャニ（Ｓｈａｎｉ）著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）（ロンドン）、第３１４巻、ｐ．２３８、１９８５年；およびチャダ（Ｃｈａｄａ）ら著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）（ロンドン）、１９８５年）。
【００５７】
組換え発現ベクターは、ＴＧＦ−αポリペプチド、その関連ポリペプチド、断片または模倣体をコードするポリヌクレオチド配列を含む。発現ベクターは、典型的には、複製起源、プロモータ、ならびに形質転換細胞の表現型選択を可能とする特異的遺伝子を含有する。本発明における使用に好適なベクターとしては、限定されるものではないが、哺乳動物細胞中の発現用のｐＭＳＸＮＤ発現ベクター（リー（Ｌｅｅ）およびナタンズ（Ｎａｔｈａｎｓ）著、ジャーナル・オブ・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、第２６３巻、ｐ．３５２１、１９８８年）が挙げられる。組換えウイルスまたはウイルスエレメントを利用して発現を指向する哺乳動物細胞系は、遺伝子操作されてもよい。例えば、アデノウイルス発現ベクターを使用する場合、ＴＧＦ−αポリペプチド、ＴＧＦ−α関連ポリペプチド、模倣体、またはＴＧＦ−α活性を有する断片をコードするポリヌクレオチドは、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば、後期プロモータおよびトリパルタイトリーダ配列にライゲーションすることができる。次いで、このキメラ配列は、インビトロまたはインビボ組換えによりアデノウイルスゲノム中に挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）中での挿入は、生存可能であり、感染宿主中でＴＧＦ−αポリペプチドまたはその断片を発現し得る組換えウイルスをもたらす。直接インビボ遺伝子導入は、リポソーム（レドリー（Ｌｅｄｌｅｙ）ら著、ジャーナル・オブ・ペディアトリクス（Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ）、第Ｉ１０巻、ｐ．１、１９８７年）；またはウイルスエンベロープ受容体タンパク質を含有するプロテオリポソーム（ニコラウ（Ｎｉｃｏｌａｕ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）、ＢＤ、ｐ．１０６８、１９８３年）中で捕捉されたＤＮＡの配合物；およびポリリジン−糖タンパク質担体複合体に結合しているＤＮＡを用いて試みられた。さらに、細胞中への遺伝子送達のために「遺伝子銃」が、使用されている（オーストラリア特許第９０６８３８９号明細書）。ネイキッドＤＮＡ、またはリポソームと会合しているＤＮＡは、細胞中へのＤＮＡの移入のための間質腔中への注射用の液体担体溶液中に配合することができる（フェルナー（Ｆｅｌｇｎｅｒ）著、国際公開第９０／１１０９２号）。
【００５８】
ＴＧＦ−α変異体または機能ペプチド断片または模倣体をコードするポリヌクレオチド配列は、発現のための宿主細胞への送達に好適なベクター中にクローニングすることがで
きる。特に、本発明のポリペプチドを含有するレトロウイルスベクターが、遺伝子療法のための細胞へのポリヌクレオチドの送達に特に好適である。遺伝子療法についての現在の方針は、開示が本明細書に組み込まれる「ヒト遺伝子療法の発達（Ｔｈｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）」、セオドア・フリードマン（Ｔｈｅｏｄｏｒｅ  Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ）編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９９９年に概説されている。
【００５９】
目的ポリヌクレオチドの送達は、典型的には、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、または頭蓋内注入）による個々の対象へのベクターの投与によりインビボで達成することができる。あるいは、ベクターは、エクスビボ細胞、例えば、個々の患者から外植された細胞（例えば、腫瘍浸潤リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検物）またはユニバーサルドナー造血幹細胞にポリヌクレオチドを送達し、次いで通常はポリヌクレオチドを取り込んだ細胞の選択後に患者に細胞を再移植するために使用することができる。
【００６０】
栄養因子をコードする核酸を含むベクターは、種々の細胞および組織、例として、ミエロイド細胞、骨髄細胞、リンパ球、肝細胞、線維芽細胞、肺細胞、上皮細胞および筋細胞中に導入することができる。例えば、ＴＧＦ−αポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、幹細胞に移入（導入）することができる。
【００６１】
別の態様において、栄養因子は、栄養因子を発現するように遺伝子改変された細胞を介して送達することができる。したがって、本発明はまた、ＴＧＦ−α変異体が発現されるように細胞を使用してＴＧＦ−α変異体を対象中に導入する遺伝子療法を包含する。このような遺伝子療法は、神経変性に伴う病態を治療および／または予防するために使用することができる。例えば、病理学的障害の治療に有益なＴＧＦ−αポリペプチドを発現するように細胞が改変されるように、ベクターを使用して栄養因子、例えば、ＴＧＦ−α変異体をコードする遺伝子エレメントを細胞中に移入することができる。
【００６２】
「ベクター」は、本発明の適切な宿主細胞中への導入時にプレ間葉、プレ造血幹細胞の改変をもたらす組換えＤＮＡまたはＲＮＡ構築物、例えば、プラスミド、ファージ、組換えウイルス、または他のベクターを指す。適切な発現ベクターは、当業者に周知であり、それとしては、真核および／もしくは原核細胞中で複製可能であるものならびにエピソーマルのままであるものまたは宿主細胞ゲノム中に統合するものが挙げられる。
【００６３】
単離プラスミドまたはＤＮＡ断片は、要求されるプラスミドを生成するために所望される形態で開裂、調整、および再度ライゲーションされる。必要に応じて、構築されたプラスミド中の正確な配列を確認するための分析を公知の方式で実施する。発現ベクターを構築し、インビトロ転写物を調製し、宿主細胞中にＤＮＡを導入し、遺伝子発現および機能を評価するための分析を実施する好適な方法は、当業者に公知である。遺伝子の存在、増幅、および／または発現は、例えば、本明細書に提供される配列をベースとし得る適切な標識プローブを使用する慣用のサザンブロッティング、ｍＲＮＡ転写を定量するためのノザンブロッティング、ドットブロッティング（ＤＮＡまたはＲＮＡ分析）、またはインサイチューハイブリダイゼーションにより試料中で直接計測することができる。当業者は、それらの方法を必要に応じて改変することができる方法を容易に想定する。
【００６４】
本発明は、前駆細胞が神経学的損害または損傷の部位においてまたは部位中に増殖、および／または遊走および／または分化するように誘導されるように対象中に有効量の栄養因子を導入することにより、前駆細胞の増殖、および／または遊走、および／または分化をモジュレートする方法を提供する。ＴＧＦ−α変異体の末梢投与は、神経学的欠損に伴う多数の疾患および障害を治療する有効な方法を提供する。
【００６５】
本方法は、例えば、神経学的欠損および／または神経精神障害を引き起こすドーパミン作動性経路の機能障害により影響を受ける任意の病態を治療するために使用することができる。本方法を使用して治療することができる神経学的欠損としては、限定されるものではないが、変性疾患、例えば、アルツハイマー病（ＡＤ：Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ‘ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ）、パーキンソン病（ＰＤ：Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ）、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病（ＨＤ：Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ）、ピック病、進行性核上麻痺、線条体黒質変性症、大脳皮質基底核変性症、オリーブ橋小脳変性、リー病、小児壊死脳脊髄障害、ハンター病、ムコ多糖症、種々の大脳白質萎縮症（例えば、クラッベ病、ペリツェウス・メルツバッハー病など）、黒色障性（家族性）白痴、クッフス病、シュピールマイヤー・フォークト病、テイ・サックス病、バッテン病、ヤンスキー・ビールショースキー病、ライ病、大脳性運動失調症、慢性アルコール依存症、脚気、ハレルフォルデン・スパッツ症候群、小脳変性症などが挙げられる。さらに、本明細書に開示される方法は、例えば、気分を改善し、不安症を軽減し、鬱病を治療し、認知を改善し、記憶を改善し、および学習を改善するために使用することができる。
【００６６】
例えば、ドーパミン作動性細胞は、多数の脱髄神経変性疾患、例えば、パーキンソン病に伴って消失することが公知である。大脳皮質において、ニューロンおよびグリアは、血栓または塞栓により引き起こされる虚血性エピソード後に消失する。脊髄において、運動ニューロンは、外傷性損傷に起因する損害を特に受けやすい。組織は、物理的力（例えば、ニューロンの除去もしくは切除、または神経細胞体から伸びる突起の１つ以上の切断）により、または化学物質、例えば、毒素もしくは神経毒素（例えば、リシンまたは６−ＯＨＤＡ）、腐食性化学物質（例えば、酸性または塩基性溶液）、アポトーシスを誘導する化合物（例えば、リーベット（Ｌｅａｖｉｔｔ）ら著、ソサエティ・ニューロサイエンス・アブストラクツ（Ｓｏｃ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ａｂｓｔｒ．）第２２巻、ｐ．５０５、１９９６年参照）、脱髄を誘導する化合物（例えば、ラシャペル（Ｌａｃｈａｐｅｌｌｅ）ら著、ソサエティ・ニューロサイエンス・アブストラクツ（Ｓｏｃ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ａｂｓｔｒ．）第２３巻、ｐ．１６８９、１９９７年参照）、もしくは細胞の活性を阻害し得る化合物、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、細胞の主要神経伝達物質をコードする遺伝子の転写を阻害するオリゴヌクレオチド）、抗体もしくはポリペプチドの適用により破壊され得る。多くのそのような化合物は、当業者に公知であり、それとしては、例えばグルタミン酸により通常は結合される代謝調節型受容体などの細胞表面上の受容体に結合はするものの活性化し得ない化合物が挙げられる。さらに、神経組織は、ＣＮＳの新生物病変を治療するために必要な化学療法剤、例えば、放射線または化学組成物の投与により破壊され得る。したがって、本発明は、ＣＮＳへの化学療法剤の投与の前、その間またはその後における、必要な医療措置により損害を受けた神経組織を再生する目的のためのＴＧＦ−α変異体の末梢投与を包含する。医療措置としては、例えば、ＣＮＳの組織を破壊する外科的処置を挙げることができる。
【００６７】
したがって、一実施形態において、ＴＧＦ−α変異ポリペプチド、断片または模倣体は、神経学的損傷を有する組織または対象を治療、修復または再生するために使用することができる。一実施形態において、本発明は、損傷の部位（例えば、損傷部位の上流の静脈または門脈）へのＴＧＦ−α変異ポリペプチド、断片または模倣体の送達を可能とする損傷の部位周囲または部位における、ＴＧＦ−α変異ポリペプチド、ＴＧＦ−α変異体活性を有するその関連ポリペプチド、模倣体、または機能断片の連続または断続的注入を提供する。損傷の部位に送達されるＴＧＦ−α変異ポリペプチド、本発明のＴＧＦ−α変異体活性を有するその関連ポリペプチド、模倣体、または機能断片は、損傷の部位に局在し、または損傷の部位近傍の血管内腔中で循環し、または損傷の部位近傍の血管壁中に局在する前駆細胞を増殖、および／または遊走、および／または分化を促進し、したがって、組
織修復および再生を促進する。
【００６８】
別の実施形態において、対象へのＴＧＦ−α変異ポリペプチド、ＴＧＦ−α変異体活性を有するその関連ポリペプチド、模倣体、または機能断片の損傷の部位末梢への投与、または損傷の部位へのＴＧＦ−α変異ポリペプチド、断片もしくは模倣体の送達を可能とする部位（例えば、損傷部位の上流の静脈または門脈）における投与、および神経細胞に分化し得る前駆細胞の位置への投与である。例えば、本発明は、ＣＮＳ損害の部位における内在性前駆細胞の遊走および／または神経細胞への分化を誘導するための機序を提供する。前駆細胞は、例えば、ＣＮＳ損害の部位もしくはその近傍に局在し、または損害の部位から遠位に局在する造血前駆細胞であり得る。このような細胞は、一般に骨髄組織中に滞留するが、対象の全体にわたって循環しているだけでなく損傷または損害の部位またはその近傍における血管中で静止することもあり得る。したがって、損傷の部位に送達されるＴＧＦ−α変異ポリペプチド、本発明のＴＧＦ−α変異体活性を有するその関連ポリペプチド、ＴＧＦ−α模倣体、または機能断片は、損傷の部位に局在し、または損傷の部位近傍の血管内腔中で循環しており、または損傷の部位近傍の血管壁中に局在する前駆細胞の増殖、遊走、および／または分化を促進し、したがって、組織修復および再生を促進する。
【００６９】
さらに、本発明の機能ポリペプチドおよび模倣体により、神経機能の消失を引き起こす損傷（外傷または神経毒性）を治療することができる。
レイド（Ｒｅｉｄ）らは、損傷後の脳組織中へのＴＧＦ−αの連続注入を記載している（参照により全体として本明細書に組み込まれる国際公開第９９／０６０６０号、および米国特許出願第０９／１２９，０２８号明細書参照）。本発明は、組織損傷の前、その前、それと同時、またはその後のいずれかのＴＧＦ−α変異ポリペプチド、ＴＧＦ−α変異体活性を有する関連ポリペプチド、模倣体、または断片の末梢投与が、損害組織もしくはその近傍または損害もしくは損傷組織から遠位における前駆細胞を刺激して増殖、遊走および分化させて損傷部位における細胞を置き換えるか、または修復し、そのような損害の効果を改善し得る方法を記載する。
【００７０】
用語「改善する」は、治療法を受ける患者における疾患誘導応答の有害効果の低下を示す。用語「治療すること」、「治療」などは、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを意味するために本明細書において使用される。効果は、障害もしくはその徴候もしくは症状を完全もしくは部分的に予防することに関して予防的であり得、ならびに／または障害および／もしくは障害に起因する有害効果の部分もしくは完全治癒に関して治療的であり得る。
【００７１】
一般に、用語「治療すること」、「治療」などは、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得るように対象、組織または細胞に影響を与えることを意味するために本明細書において使用される。効果は、疾患もしくは障害もしくはその徴候もしくは症状を完全もしくは部分的に予防することに関して予防的であり得、ならびに／または障害もしくは疾患および／もしくは障害もしくは疾患に起因する有害効果の部分もしくは完全治癒に関して治療的であり得る。本明細書において使用される「治療すること」は、対象における障害または疾患の任意の治療、またはその予防、またはその阻害を包含する。対象は、無脊椎動物、脊椎動物、哺乳動物、特にヒトであり得、その例としては、（ａ）疾患もしくは障害の素因を有し得るが、依然としてそれを有すると診断されていない対象における疾患もしくは障害の発症を予防すること；（ｂ）疾患もしくは障害を阻害すること、すなわち、その進行を停止させること；または（ｃ）疾患もしくは障害を緩和もしくは改善すること、すなわち、退行を引き起こすことが挙げられる。したがって、本明細書において使用される治療することとしては、例えば、損傷の部位における損害もしくは損傷組織もしくは細胞の修復および再生や、損害を予防するための、例えば化学療法前における予防的
治療が挙げられる。
【００７２】
本発明は、ＴＧＦ−α変異ポリペプチド、ＴＧＦ−α変異体活性を有するその関連ポリペプチド、模倣体、または機能断片の末梢投与を提供する。ＴＧＦα変異体の末梢投与は、単回用量、もしくは複数回用量、または連続（例えば、連続注入）としての投与であり得る。複数回用量は、部分的には、損傷または損害の重症度、治療に対する個体の応答性などに応じて毎時間、毎日、毎週、または毎月投与することができる。
【００７３】
単回、複数回、または連続用量の末梢注射は、組織損害または損傷後の数分以内（例えば、約５〜約１２０分以内）、数時間以内（例えば、約２時間〜約３６時間以内）、数日以内（例えば、約２日〜約１４日以内）、または数週間以内（例えば、約２週間〜約８週間以内）に投与することができる。
【００７４】
これらの化合物の投与は、神経活性または神経新生のモジュレーションを誘導し、すなわち、投与は、神経新生または神経活性をモジュレートする。本明細書において使用される用語「モジュレートすること」または「モジュレーション」は、神経活性の任意の変化または任意の神経新生を含め、それとしては、限定されるものではないが、ニューロン、神経幹細胞または任意の他の細胞、例として、前駆細胞または幹細胞の分化（再分化または脱分化を含む）、遊走、および増殖が挙げられる。
【００７５】
一態様において、神経活性または神経新生のモジュレーションにおける初期イベントとしては、内皮からまたはＣＮＳ中の血管周囲細胞からＣＮＳへの細胞の遊走および／または分化が挙げられる。あるいは、神経活性または神経新生のモジュレーションにおける初期イベントとしては、非ＣＮＳ組織コンパートメント、例えば、骨髄、血液、脾臓、リンパ節などからＣＮＳへの細胞の遊走および／または分化が挙げられる。神経活性または神経新生のモジュレーションとしては、対象のＣＮＳ中の損傷または損害の部位における細胞の遊走および／または分化も挙げることができる。モジュレーションとしては、限定されるものではないが、内在性前駆細胞などの細胞の前駆細胞（またはその子孫）の増殖、遊走、分化（脱分化または再分化を含む）が挙げられる。このような細胞は、例えば血管内皮中など損傷の部位から遠位に血管周囲的に局在し、あるいは、骨髄または脾臓などの任意の組織もしくは細胞リザーバのためにＣＮＳに補充され得る。あるいは、このような細胞は、組織損傷の部位またはその近傍に局在し得る。
【００７６】
組成物（例えば、単回単位投与量送達として）は、損傷の部位に直接隣接して投与することもでき、または例えば、損傷の部位に流出または流動する管（血管またはリンパ管）に投与することができる。
【００７７】
投与の方法としては、限定されるものではないが、皮下、局所、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、血管内（例えば、静脈内）、皮下、鼻腔内、および硬膜外経路が挙げられる。本発明の細胞は、任意の簡便な経路により、例えば、注入またはボーラス注射により、上皮または皮膚粘膜ライニングを介する吸収（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）により投与することができ、他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与することができる。投与は、全身または局所であり得る。
【００７８】
代替的な態様において、栄養因子は、例えば、限定されるものではないが、術中の注入、注射、カテーテル手段、またはインプラント手段（インプラントは、多孔性、非多孔性、またはゼラチン性材料、例として、膜、例えば、シアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜、または繊維のものである）によりそのような治療が必要とされる対象に末梢投与される。あるいは、栄養因子は、損害神経組織と直接接触させるのではなく近接して位置させ、それによりそのような組織の再生を促進することができる制御放出マトリックス中
に含めることができる。用語「制御放出マトリックス」は、その中で混合または混和される栄養因子の徐放を可能とする任意の組成物を意味する。マトリックスは、生物活性物質を含有する固体組成物、多孔性材料、または半固体、ゲルもしくは液体懸濁液であり得る。
【００７９】
本発明の方法により治療可能な損傷としては、例えば、銃創、鈍力により引き起こされる損傷、穿通損傷、外科的処置（例えば、腫瘍除去、膿瘍除去、てんかん病巣除去）により引き起こされる損傷、中毒（例えば、一酸化炭素）、揺さぶられっ子症候群、医薬に対する副反応、薬物過剰摂取、および外傷後脳障害が挙げられる。虚血は、ニューロンおよびグリア細胞を殺傷または損傷し得る血流または酸素送達の破壊に起因してさらにＣＮＳ損傷を引き起こし得る。このような損傷は、ＴＧＦ−α変異ポリペプチドの投与により治療することができ、それとしては、例えば、卒中、無酸素症、低酸素症、部分溺水（ｐａｒｔｉａｌ  ｄｒｏｗｎｉｎｇ）、間代性筋痙攣、重度の煙吸入、ジストニア、および後天性水頭症により引き起こされる損傷が挙げられる。機能ペプチドにより治療することができる発達障害としては、例えば、統合失調症、ある形態の重度精神遅滞、脳性麻痺、先天性水頭症、重度自閉症、ダウン症候群、ＬＨＲＨ／視床下部障害、および脊椎披裂が挙げられる。本方法は、網膜細胞消失または機能不全により引き起こされる視覚に影響する障害を治療するためにさらに使用することができ、それとしては、例えば、糖尿病性網膜症、重症の網膜剥離（緑内障に伴う）、網膜の外傷性損傷、網膜血管閉塞、黄斑変性、視神経萎縮および他の網膜変性疾患が挙げられる。例えば、ヤング（Ｙｏｕｎｇ）ら著、モレキュラー・アンド・セルラー・ニューロサイエンス（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）第１６巻、ｐ．１９７、２０００年は、成体神経幹細胞が網膜の劣化に起因する盲目の治療において有用であり得ることを見出した。
【００８０】
脊髄および付随する神経節の損傷は、本発明の方法により治療することができる。脊髄損傷の例は、ポリオ後症候群、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、外傷性損傷、外科的損傷、および麻痺疾患である。脱髄自己免疫障害は、機能ペプチドの投与により治療することができ、それとしては、例えば、多発性硬化症が挙げられる。機能ペプチドは、炎症疾患、例として、例えば、クロイツフェルト・ヤコブ病およびＣＮＳの他の遅発性ウイルス感染疾患、ＡＩＤＳ脳障害、脳炎後パーキンソン病、ウイルス脳炎、細菌性髄膜炎の感染および感染疾患の他のＣＮＳ効果により引き起こされる神経学的欠損を治療するために使用することもできる。
【００８１】
本発明は、本発明の方法において有用なポリペプチド、ペプチドまたは模倣体の送達または投与に有用な種々の医薬組成物を含む。一実施形態において、医薬組成物は、対象における神経組織損害および細胞再生の管理または治療において有用である。本発明による医薬組成物は、担体、賦形剤および添加剤または助剤を使用してＴＧＦ−α変異体のポリペプチドまたはペプチド誘導体を対象への投与に好適な形態にすることにより調製される。高頻度で使用される担体または助剤としては、炭酸マグネシウム、二酸化チタン、ラクトース、マンニトールおよび他の糖、タルク、乳タンパク質、ゼラチン、デンプン、ビタミン、セルロースおよびその誘導体、動物および植物油、ポリエチレングリコールおよび溶媒、例えば、滅菌水、アルコール、グリセロールおよび多価アルコールが挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、液体および栄養補給剤が挙げられる。保存剤としては、抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤および不活性ガスが挙げられる。
【００８２】
他の薬学的に許容可能な担体としては、例えば、内容が参照により本明細書に組み込まれるレミントン（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ）著「製薬科学（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、第１５版、イーストン、マック・パブリッシング社（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．）、ｐ．１４０５〜１４１２、ｐ．１４６１〜１４８７、１９７５年および「国民医薬品集１４（Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ
ＸＩＶ」、第１４版、ワシントン、米国製薬協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）、１９７５年に記載の水溶液、非毒性賦形剤、例として、塩、保存剤、緩衝剤などが挙げられる。医薬組成物の種々の成分のｐＨおよび正確な濃度は、当技術分野における定型的な技能により調整される。グッドマン（Ｇｏｏｄｍａｎ）およびギルマン（Ｇｉｌｍａｎ）著「治療学のための薬理学的基礎（Ｔｈｅ
Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）」、第７版を参照されたい。
【００８３】
一部の実施形態において、医薬組成物は、用量単位で調製および投与される。固体用量単位は、錠剤、カプセル剤および坐剤であり、それとしては、例えば、アルギン酸塩ベースｐＨ依存性放出ゲルキャップが挙げられる。対象の治療のため、化合物の活性、投与方式、障害の性質および重症度、対象の年齢および体重に応じて、異なる１日用量が必要である。しかしながら、ある状況下では、より高いまたはより低い１日用量が適切であり得る。１日用量の投与は、個々の用量単位の形態の単回投与により、またはいくつかのより小さい用量単位により、および、規定の間隔における細分化用量の複数回投与によっても実施することができる。
【００８４】
本発明による医薬組成物は、治療有効用量で全身投与することができる。この使用に有効な量は、当然のことながら、疾患の重症度ならびに対象の体重および全身健康状態に依存する。典型的には、インビトロにおいて使用される投与量は、医薬組成物のインサイチュー投与に有用な量の有用な指針を提供し得、特定の障害の治療に有効な投与量を決定するために動物モデルを使用することができる。種々の検討事項が、例えば、それぞれが参照により本明細書に組み込まれるランガー（Ｌａｎｇｅｒ）著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２４９巻、ｐ．１５２７、１９９０年；ギルマン（Ｇｉｌｍａｎ）ら編、１９９０年に記載されている。本明細書において使用される、神経再生を促進する栄養因子を含有する組成物の「治療有効」量は、栄養因子の末梢投与に続く対象の中枢神経系中の損傷または損害の部位におけるまたはその部位中への前駆細胞またはその子孫の増殖、遊走、または分化の誘導において有効な量である。本明細書において使用される用語「誘導する」または「誘導」は、本明細書に記載の組織、修復プロセスまたは発生のいずれかの形成に必要な細胞機序またはプロセスの活性化、刺激、向上、開始およびまたは維持を指す。
【００８５】
本発明の医薬組成物を「投与すること」は、当業者に公知の任意の手段により達成することができる。「対象」は、哺乳動物、例えば、ヒトを指す。ＴＧＦ−α変異ポリペプチドまたは機能断片は、非経口投与、経腸投与、注射、急速注入、鼻咽頭吸収、皮膚吸収による投与、直腸および経口投与することができる。非経口投与のための薬学的に許容可能な担体調製物としては、無菌または水性もしくは非水性溶液、懸濁液、およびエマルジョンが挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えば、オリーブ油、および注射用有機エステル、例えば、オレイン酸エチルである。
【００８６】
閉鎖包帯用の担体は、皮膚浸透性を増大させ、吸収を向上させるために使用することができる。経口投与用の液体剤形は、一般に、液体剤形を含有するリポソーム溶液を含み得る。好適な固体または液体医薬製剤形は、例えば、顆粒剤、散剤、錠剤、糖衣錠、マイクロカプセル、坐剤、シロップ剤、エマルジョン、懸濁液、クリーム剤、エアロゾル、滴剤またはアンプル形態の注射液剤ならびにさらには活性化合物の徐放を示す製剤であり、その製剤中には、賦形剤および添加剤および／または助剤、例えば、崩壊剤、結合剤、コーティング剤、膨張剤、滑沢剤、香料、甘味料および当技術分野において一般に使用される不活性希釈剤、例えば、純水を含有するエリキシル剤である。
【００８７】
無菌注射液剤は、適切な溶媒中で要求量（例えば、約１０μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ）の活性薬剤（例えば、ＴＧＦ−α変異タンパク質）を取り込み、次いで例えば、滅菌濾過により滅菌することにより調製することができる。さらに、散剤は、標準的技術、例えば、凍結乾燥または真空乾燥により調製することができる。
【００８８】
別の実施形態において、活性薬剤は、長期の活性薬剤放出特徴を示す目的の活性部位への移植による対象または標的器官中のいずれかの徐放のために徐放特徴を有する生分解性担体を用いて調製される。生分解性ポリマーとしては、例えば、エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ酢酸が挙げられる。リポソーム製剤も使用することができる。
【００８９】
キット
本発明は、本方法の実施において使用される、栄養因子を含む医薬組成物を含有するキットを提供する。キットは、方法、例えば、ＴＧＦ−α変異ポリペプチド（またはその関連ポリペプチド、機能断片、または模倣体）製剤を末梢投与する方法を教示する説明書を含有し得る。医薬製剤を含有するキットとしては、適応症、投与量、投与経路および方法などに関する指示書を含み得る。
【００９０】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される単数形「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎｄ）」および「その（ｔｈｅ）」は、そうでないことを文脈が明示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「標的細胞」への言及は、複数のそのような細胞を含み、「発現ベクター」への言及は、１つ以上の形質転換ベクターおよび当業者に公知のその均等物への言及などを含む。
【００９１】
特に定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解される意味と同一の意味を有する。本発明の実施または試験において、本明細書に記載のものと類似のまたは均等な任意の方法、細胞および遺伝子を使用することができる。
【００９２】
さらなる精密化なく、当業者は、上記の詳細な説明を使用して本発明をその最も完全な程度に利用し得ることが考えられる。以下の実施例は、説明のためのものであると考慮すべきであり、したがって、決して本開示の残部を一切限定するものではない。
【００９３】
（実施例）
材料：以下の実施例において以下の材料を使用した。
ヒトＴＧＦα発現クローン（インビボジェン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）、＃ｐＯＲＦ９−ｈＴＧＦＡ）
ヒトＴＧＦα、２００ｕｇ（シノバイオロジカル（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、＃１１２５２−ＨＮＡＥ）
ヒトＥＧＦＲ  ＥＣＤ、１００ｕｇ（シノバイオロジカル（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、＃１０００１−Ｈ０２Ｈ）
ヒトＴＧＦαビオチン化抗体、５０ｕｇ（Ｒ＆Ｄシステム（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）、＃ＢＡＦ２３９）
ヒトＴＧＦα抗体、１００ｕｇ（Ｒ＆Ｄシステム（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）、＃ＡＦ−２３９−ＮＡ）
パススキャン（ＰａｔｈＳｃａｎ）総ＥＧＦ受容体サンドイッチＥＬＩＳＡキット（セルシグナリング（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、＃７２５０Ｓ）
パススキャン（ＰａｔｈＳｃａｎ）ホスホ−ＥＧＦ受容体（ｔｙｒ１０６８）サンドイッチＥＬＩＳＡキット（セルシグナリング（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、＃７２４０Ｓ）
実施例１  ｈＴＧＦαのクローニングおよび発現ならびにアッセイ実行。
【００９４】
アッセイ実行：ＴＧＦαの濃度を計測するための定量サンドイッチＥＬＩＳＡを設定した。ＴＧＦαの活性を測定するために親和性ＥＬＩＳＡ、細胞ベースＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ分析および細胞ベースＥＧＦＲリン酸化アッセイを設定した。
【００９５】
１．ヒトＴＧＦαの発現を測定するための定量ＥＬＩＳＡの確立
ヒトＴＧＦα（ｈＴＧＦα）の濃度を測定するために定量サンドイッチＥＬＩＳＡプロトコルを確立した。抗ｈＴＧＦα（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、＃ＡＦ−２３９−ＮＡ）により９６ウェルプレートのウェルをコーティングした。ヒトＴＧＦα（ｈＴＧＦα）の２０ｎｇ／ｍｌ溶液の２倍段階希釈物を作製し、それぞれの試料からのアリコートをウェルに添加し（図１Ａ）、プレートをインキュベートして結合させた。ビオチン化抗ｈＴＧＦαおよび（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）＃ＢＡＦ２３９）およびＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジンを使用して結合ｈＴＧＦαを検出した。ウェルにＴＭＢ基質を添加し、１分後に反応を停止させ、モレキュラーデバイススペクトラマックスプラス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ  ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ
Ｐｌｕｓ）を使用して試料のＯＤ４５０ｎｍ値を計測した（図１Ｂ）。次いで、ＯＤ４５０ｎｍ値に基づきソフトマックス（Ｓｏｆｔｍａｘ）を使用して標準曲線を作成した（図１Ｃ）。結果は、細菌溶解物中またはＣＨＯ形質移入上清中に存在するｈＴＧＦαの濃度を測定するために定量的サンドイッチＥＬＩＳＡを使用し得ることを示した。
【００９６】
２．ｈＴＧＦαの活性を計測するための親和性ＥＬＩＳＡ、細胞ベースＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ分析および細胞ベースＥＧＦリン酸化アッセイの確立
ａ．親和性ＥＬＩＳＡ
ＥＧＦＲへのｈＴＧＦαの結合活性を測定するための親和性ＥＬＩＳＡプロトコルを開発した。簡潔に述べると、９６ウェルプレートのウェル中でＥＧＦＲ細胞外ドメイン（ＥＧＦＲ  ＥＣＤ）（シノバイオロジカル（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、＃１０００１−Ｈ０２０Ｈ）を固定化した。１０００ｎｇ／ｍｌのヒトＴＧＦα（ｈＴＧＦα）の溶液の２倍段階希釈物を作製し、それぞれの試料のアリコートをウェルに添加し、プレートをインキュベートして結合を生じさせた（図２Ａ）。ビオチン化抗ｈＴＧＦα抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）＃ＢＡＦ２３９）およびＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジンを使用して結合ＴＧＦαを検出した。ウェルにＴＭＢ基質を添加し、１分後に反応を停止させ、モレキュラーデバイススペクトラマックスプラス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ  ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ  Ｐｌｕｓ）を使用して試料のＯＤ４５０ｎｍ値を計測した（図２Ｂ）。次いで、ＯＤ４５０ｎｍ値に基づきソフトマックス（Ｓｏｆｔｍａｘ）を使用して標準曲線を作成した（図２Ｃ）。結果は、親和性ＥＬＩＳＡのダイナミックレンジが、細菌溶解物中またはＣＨＯ形質移入上清中のいずれかの野生型と比較して改善されたＣＰＥ（商標）およびＣＰＳ（商標）変異体の親和性を計測するために十分であることを示した。
【００９７】
ｂ．細胞ベースＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳ分析
細胞表面上で高レベルのＥＧＦＲを発現することが公知のＡ４３１細胞を使用する細胞ベースＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳ分析によっても、ＥＧＦＲへのｈＴＧＦαの結合活性を確認した。細胞ベースアッセイについては、９６ウェルプレートのウェル中にＡ４３１細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１５５５）を播種した。ヒトＴＧＦα（ｈＴＧＦα）の１０００ｎｇ／ｍｌ溶液を段階希釈し（２倍希釈）、それぞれの希釈物のアリコートを固定化細胞に添加し、プレートをインキュベートして結合させた（図３Ａ）。洗浄後、ビオチン化抗ｈＴＧＦα（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）＃ＢＡＦ２３９）およびＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジンを使用して結合ｈＴＧＦαを検出した。それぞれのウェルにＴＭＢを添加し、４分後に反応を停止させ、段落ａ）に上記のとおり試料を読み取
った（図３Ｂ）。ソフトマックス（Ｓｏｆｔｍａｘ）を使用して標準曲線を作成した（図３Ｃ）。
【００９８】
ＦＡＣＳ分析については、ｈＴＧＦαの１０ｕｇ／ｍｌ溶液の２倍段階希釈物を作製し、それぞれの希釈物のアリコートをＡ４３１細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１５５５）とインキュベートした（図４Ａ）。ビオチン化抗ｈＴＧＦα（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、＃ＢＡＦ２３９）およびＦＩＴＣコンジュゲートストレプトアビジンを使用して結合ｈＴＧＦαを検出した。ＢＤアクリ（ＢＤ  Ａｃｃｕｒｉ）Ｃ６ＦＡＣＳアナライザーにより細胞を分析してｈＴＧＦαにより結合された細胞のパーセントを測定した（図４Ｂおよび図４Ｃ）。結果は、細胞ベースＥＬＩＳＡのダイナミックレンジが、細菌溶解物中またはＣＨＯ形質移入上清中のいずれかで発現された野生型と比較して改善されたＣＰＥ（商標）およびＣＰＳ（商標）変異体の親和性を計測するために十分であることを示した。結果は、ＣＰＥ（商標）およびＣＰＳ（商標）変異体のハイスルースクリーニングに細胞ベースＥＬＩＳＡを使用し得ることも示す。ＦＡＣＳ分析のダイナミックレンジは、親和性ＥＬＩＳＡまたは細胞ベースＥＬＩＳＡのダイナミックレンジほど広くないが、それは改善された結合活性を有する変異体の結合活性を確認するために使用することができる。
【００９９】
ｃ．細胞ベースＥＧＦＲリン酸化アッセイ
機能アッセイを使用してＥＧＦＲへのｈＴＧＦαの結合活性を測定するための細胞ベースＥＧＦＲリン酸化アッセイを設定した。９６ウェルフォーマット中でＡ４３１細胞を播種し、一晩血清飢餓状態にした。血清不含培地中で細胞を洗浄し、５０ｕｌの０、５０、１００または２００ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ（図５Ａ、列１）またはｈＴＧＦα（図５Ａ、列２）とＤＭＥＭ中で３７℃において１０分間インキュベートした。次いでＰＢＳにより細胞を洗浄し、溶解させた。細胞溶解物の半分を使用してセルシグナリング（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）キット＃７２５０を使用して総ＥＧＦＲのレベルを測定し（図５Ｃ）、細胞溶解物の他の半分を使用してセルシグナリング（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）キット＃７２４０を販売業者のプロトコルに従って使用してリン酸化ＥＧＦＲのレベルを測定した（図５Ｂ）。結果は、細胞表面上のＥＧＦＲに結合し、それを活性化させるＣＰＥ（商標）およびＣＰＳ（商標）変異体の能力を確認するために細胞ベースＥＧＦＲリン酸化アッセイを使用し得ることを示した。
【０１００】
ｈＴＧＦαのクローニング／発現：ＢｉｏＡｔｌａ製細菌および哺乳動物発現ベクター中にｈＴＧＦαをクローニングした。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞中でｈＴＧＦα細菌発現構築物を発現させ、ＳＤＳ／ＰＡＧＥおよび定量ＥＬＩＳＡの両方を使用して発現レベルを測定した。
【０１０１】
ＣＨＯ細胞中でｈＴＧＦα哺乳動物発現構築物を発現させ、定量ＥＬＩＳＡを使用してｈＴＧＦαの発現レベルを測定した。上記の細胞ベースＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ分析および細胞ベースＥＧＦＲリン酸化アッセイを使用して細菌中およびＣＨＯ細胞中で発現されたｈＴＧＦαの活性を確認した。
【０１０２】
１．ｈＴＧＦα発現プラスミドの構築
ｈＴＧＦα哺乳動物発現および細菌発現プラスミドを構築した。プロおよび成熟ｈＴＧＦα（配列番号１４８および配列番号１４６）の両方を、哺乳動物発現プラスミド中へのクローニング（ＢＡＰ０６０−ｈＴＧＦα−Ｍ、ＢＡＰ０６０−ｍｈＴＧＦα−Ｍ）のためのテンプレートとして使用し、成熟ｈＴＧＦα（配列番号１４４）を、細菌ペリプラズム発現プラスミド中へのクローニング（ＢＡＰ０６０−ｈＴＧＦα−Ｂ）のためのテンプレートとして使用した。ｈＴＧＦα発現構築物は、シーケンシングにより確認されており、表１に列記する。
【０１０３】
【表１】
2017532067.tif 000003
２．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞中のｈＴＧＦαの発現および活性の測定
ＢＡＰ０６０−ｈＴＧＦα−Ｂにより大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１細胞を形質転換し、それぞれの培養物への１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）の添加によりタンパク質発現を誘導した。１４ｍｌのチューブ中で３７℃において３時間（図６、レーン３および４）、３０℃において６時間（図６、レーン５および６）または２５℃において一晩（図６、レーン７および８）培養物をインキュベートした。非誘導培養物も含めた（レーン１および２）。ペリプラズムおよび不溶性分画を回収した。ＤＮアーゼ、ＲＮアーゼおよびリゾチームを有するＯＳ緩衝液（２００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２０％のスクロース、１ｍＭのＥＤＴＡ）中で細胞をインキュベートすることにより、ペリプラズムタンパク質を調製した。ＯＳ緩衝液中の細胞に溶解緩衝液（１０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、５０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡおよび０．１％のデオキシコール酸ナトリウム）を添加した後、細胞を遠心分離した。ペリプラズム分画を含有する上清（レーン１、３、５、７）を別のマイクロ遠心チューブに移した。１００μｌのＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルローディング緩衝液中で細胞ペレット（レーン２、４、６、８）を再懸濁させた。１５％のＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で１５μｌの上清およびペレットを分離し、クーマシーブルーにより可視化した。１７ｋＤａおよび１０ｋＤａ分子量標準を示す。結果は図６に示される。矢印はｈＴＧＦαを示す。
【０１０４】
定量ＥＬＩＳＡによっても発現レベルを計測した。プレートに固定化された抗ＴＦＧα（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、＃ＡＦ−２３９−ＮＡ）と、２０ｎｇ／ｍｌから出発する２倍段階希釈ｈＴＧＦα標準（列１および２）、１：５または１：２０希釈された細菌発現ｈＴＧＦα（列３）、および２倍段階希釈された哺乳動物発現ｈＴＦＧα（ＢＡＰ０６０−ｍｈＴＦＧα−Ｍにより形質移入されたＣＨＯ細胞、列４、またはＢＡＰ０６０−ｈＴＦＧα−Ｍにより形質移入されたＣＨＯ細胞、図７Ａ、列５）をインキュベートした。ビオチン化抗ＴＦＧα（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、＃ＢＡＦ２３９）およびＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジンを使用して結合ＴＦＧαを検出した。それぞれのウェルにＴＭＢを添加し、３分後に反応を停止させ、モレキュラーデバイススペクトラマックスプラス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ  ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ  Ｐｌｕｓ）を使用してウェルのＯＤ４５０ｎｍ値を計測した。次いで、ソフトマックス（Ｓｏｆｔｍａｘ）を使用して標準曲線を作成し、標準曲線に基づき組換えタンパク質のレベルを測定した。結果は図７Ｂ〜７Ｄに示される。
【０１０５】
大多数のｈＴＧＦαは不溶性ペレット分画中に存在するが、ある割合のｈＴＧＦαは、ペリプラズム分画中に存在した。３つ全ての温度において誘導されたｈＴＧＦαの発現レ
ベルは同等であり；したがって、誘導条件として３７℃を３時間使用することが決定された。
【０１０６】
細胞ベースＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳ分析を使用して３７℃におけるＢＬ２１細胞のペリプラズム分画中で発現されたｈＴＧＦαの活性を計測した。組換えｈＴＧＦαの発現およびペリプラズム分画の調製は、上記のとおり実施した。細菌発現ｈＴＧＦαは両方のアッセイにおいて活性であり、その活性は市販のｈＴＧＦαと同等であった（図８Ａ〜Ｃならびに９ＡおよびＢ）。さらに、細胞ベースＥＧＦＲリン酸化アッセイを使用してＢＬ２１細胞中で発現されたｈＴＧＦαの活性を試験してＥＧＦＲへのｈＴＧＦαの結合活性を測定した。結果は、細菌発現ｈＴＧＦαが細胞表面上のＥＧＦＲに結合し、それを活性化させ得ることを示した（図１０Ａ〜Ｄ）。
【０１０７】
３．ＣＨＯ細胞中のｈＴＧＦαの発現および活性の測定
９６ウェルプレート中にＣＨＯ細胞を播種し、リポフェクタミン２０００（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を使用して構築物ＢＡＰ０６０−ｈＴＧＦα−ＭおよびＢＡＰ０６０−ｍｈＴＧＦα−Ｍ（表１参照）により形質移入し、ＣＤ−ＣＨＯ血清不含培地中で３７℃において培養した。形質移入４８時間後に上清を回収した。プレート上で固定化された抗ＴＧＦα（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、＃ＡＦ−２３９−ＮＡ）と、２０ｎｇ／ｍｌにおいて出発する２倍段階希釈されたｈＴＧＦα標準（図７Ａ、列１および２）、１：５または１：２０希釈された細菌発現ｈＴＧＦα（図７Ａ、列３）および２倍段階希釈された哺乳動物発現ｈＴＧＦα（ＢＡＰ０６０  ｍｈＴＧＦα−Ｍにより形質移入されたＣＨＯ細胞、図７Ａ、列４、またはＢＡＰ０６０−ｈＴＧＦα−Ｍにより形質移入されたＣＨＯ細胞、図７Ａ、列５）をインキュベートした。ビオチン化抗ＴＧＦα（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ
Ｓｙｓｔｅｍｓ）、＃ＢＡＦ２３９）およびＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジンにより結合ＴＧＦαを検出した。ウェルにＴＭＢを添加して３分後に反応を停止させ、直ちに読み取った。モレキュラーデバイススペクトラマックスプラス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｄｅｖｉｃｅ  ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ  Ｐｌｕｓ）により反応物のＯＤ４５０ｎｍ値を計測した。ソフトマックス（Ｓｏｆｔｍａｘ）を使用して標準曲線を作成した。
【０１０８】
結果は、ｈＴＧＦα構築物がＣＨＯ細胞中で発現され、正確にプロセシングされ、培地中に分泌されるが、細菌発現ｈＴＧＦαと比較して低レベルであることを示す（図７Ｂ）。細胞ベースＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳ分析を使用してＣＨＯ細胞中で発現されたｈＴＧＦαの活性を計測した。哺乳動物発現ｈＴＧＦαは活性であり、その活性は市販のｈＴＧＦαと同等であった（図８Ａ〜Ｃならびに９ＡおよびＢ）。さらに、細胞ベースＥＧＦＲリン酸化アッセイも使用してＣＨＯ細胞中で発現されたｈＴＧＦαの活性を試験してＥＧＦＲへのｈＴＧＦαの結合活性を測定した。結果は、哺乳動物発現ｈＴＧＦαが細胞表面上のＥＧＦＲに結合し、それを活性化させ得ることを示した（図１０Ａ〜Ｄ）。
【０１０９】
４．ハイスループットスクリーニングのための９６ウェルフォーマットへのＢＬ２１中のｈＴＧＦα発現プロセスの適合
細菌中の可溶性ｈＴＧＦαの発現レベルがＣＨＯ細胞中のｈＴＧＦαの発現レベルよりも高いため、ＣＰＥ（商標）プロセスのためのテンプレートとして細菌発現ｈＴＧＦα構築物を使用した。さらに、細菌発現ｈＴＧＦαは機能的であり、市販のｈＴＧＦαと比較して同等の結合活性を有する。９６ウェルフォーマットにおいて細菌中の発現プロセスを適合させ、定量ＥＬＩＳＡにより計測して９６ウェルブロック中で調製されたｈＴＧＦαの発現レベルが１４ｍｌのチューブ中で調製されたｈＴＧＦαの発現レベルと同等であることが裏付けられた。最後に、細胞ベースＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ分析およびＥＧＦＲリン酸化アッセイにより９６ウェルフォーマット中で発現されたｈＴＧＦαの活性を計測し、９６ウェルフォーマット中で発現されたｈＴＧＦαの活性は、１４ｍｌのチューブフォー
マット中で発現されたｈＴＧＦαの活性と同等であることが見出された（データ示さず）。
【０１１０】
実施例２  本実施例は新規ＴＧＦα変異体の構築を記載する。
ＣＰＥ（商標）によるｈＴＧＦα進化
１．ヒトＴＧＦαのＣＰＥ（商標）ライブラリーの構築
１４個のアミノ酸バリアントを有する３０位を除き、１５個のアミノ酸バリアントを各位置に有するＢＡＰ０６０−ｈＴＧＦα−Ｂ（配列番号１４５）の包括的位置進化（Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）（ＣＰＥ（商標））ライブラリーを構築した。以下に示されるアミノ酸配列は、成熟ヒトＴＧＦα配列であり、番号付けはＣＰＥ（商標）残基に使用される番号付けを反映する。
【０１１１】
【化１】
2017532067.tif 000004
８、１６、２１、３２、３４および４３（それぞれ下線）位におけるシステイン残基を除き、上記列記されるアミノ酸の全てをＣＰＥ（商標）プロセスに含めた。これらの残基は、構造的に重要なジスルフィド結合を形成する。最終ＣＰＥ（商標）ライブラリーは、９６ウェルフォーマット中でアレイされた６６０個のＢＡＰ０６０−ｈＴＧＦα−Ｂ変異体を含有する。それぞれの変異体中の変異に関する詳細は、図１１Ａに示される。
【０１１２】
２．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞中のｈＴＧＦα  ＣＰＥ（商標）変異体の発現および結合活性の測定
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞中にＢＡＰ０６０−ｈＴＧＦα−Ｂ（成熟ｈＴＧＦα、アミノ酸４０〜８９、ＰｅｌＢシグナル配列を有する）野生型およびＣＰＥ（商標）変異体を形質転換し、９６ウェルフォーマット（第１の確認）または１４ｍｌのチューブ（第２の確認）中の３７℃における３時間の１ｍＭのＩＰＴＧの添加により組換えタンパク質発現を誘導した。３時間後、細胞を回収し、ＤＮアーゼ、ＲＮアーゼおよびリゾチームを有するＯＳ緩衝液（２００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２０％のスクロース、１ｍＭのＥＤＴＡ）中で細胞をインキュベートすることによりペリプラズムタンパク質を調製した。ＯＳ緩衝液中の細胞に溶解緩衝液（１０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、５０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡおよび０．１％のデオキシコール酸Ｎａ）を添加した後、細胞を遠心分離し、マイクロ遠心チューブにペリプラズム分画を含有する上清を移した。定量ＥＬＩＳＡによりｈＴＧＦαの濃度を測定し、２５ｎｇ／ｍｌのｈＴＧＦαをプレート上で固定化されたＡ４３１細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１５５５）とインキュベートした。ビオチン化抗ｈＴＧＦα（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、＃ＢＡＦ２３９）およびＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジンにより結合ｈＴＧＦαを検出した。ウェルにＴＭＢを添加した後にＨＣｌを添加することにより反応を停止させ、直ちに読み取った。モレキュラーデバイススペクトラマックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ  ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ）により反応物のＯＤ４５０ｎｍ値を計測した。この初回スクリーンの結果は図１１Ａに示される。
【０１１３】
初回スクリーンは、プライマリースクリーニングにおける野生型ＴＧＦαと比較して１．５倍高い結合活性を有する９４個のＣＰＥ（商標）変異体を同定した。これらのＣＰＥ（商標）変異体の配列は以下の表２に示される一方、ＣＰＥ（商標）変異体の全てについての選択特徴は図１１Ａに見出すことができる。
【０１１４】
【表２−１】
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【０１１５】
【表２−２】
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【０１１６】
【表２−３】
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【０１１７】
【表２−４】
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【０１１８】
【表２−５】
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【０１１９】
【表２−６】
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【０１２０】
【表２−７】
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第１の確認は、９４個のＣＰＥ（商標）変異体を含有するプラスミドにより大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１細胞を再形質転換することにより実施し、ＩＰＴＧ誘導後にペリプラズム分画を回収し、定量ＥＬＩＳＡおよび細胞ベースＥＬＩＳＡを実施した。第１の確認の結果は図１１Ａに示される。この第１の確認は、野生型ＴＧＦαと比較して高い結合活性を有する３７個のＣＰＥ（商標）変異体を同定した。これらを第２の確認について試験し、その結果は図１１Ｂおよび図１２Ａに示される。第２の確認は、野生型ＴＧＦαと比較して高い結合活性を常に有する２７個のＣＰＥ（商標）推定ヒットを同定した。次いで、これらの２７個のＣＰＥ（商標）変異体を細胞ベースＥＧＦＲリン酸化アッセイにおいて試験してＣＰＥ（商標）変異体の機能活性を確認した（図１１Ｂおよび１２Ｂ）。
【０１２１】
ＥＧＦＲリン酸化。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞中にＢＡＰ０６０−ｈＴＧＦα−Ｂ（成熟ｈＴＧＦα、アミノ酸４０〜８９、ＰＥｌＢシグナル配列を有する）を形質転換した。１４ｍｌのチューブ中の３７℃における３時間の１ｍＭのＩＰＴＧの添加時にタンパク質を発現させた。ベクターのみにより形質転換されたＢＬ２１培地も含めた。誘導後に細胞を回収した。ＤＮアーゼ、ＲＮアーゼおよびリゾチームを有するＯＳ緩衝液（２００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２０％のスクロース、１ｍＭのＥＤＴＡ）中で細胞をインキュベートすることにより、ペリプラズムタンパク質を調製した。ＯＳ緩衝液中の細胞に溶解緩衝液（１０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、５０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡおよび０．１％のデオキシコール酸Ｎａ）を添加した後
、細胞を遠心分離した。別のマイクロ遠心チューブにペリプラズム分画を含有する上清を移した。９６ウェルプレート中でＡ４３１細胞を播種し、一晩血清飢餓状態にした。血清不含培地中で細胞を洗浄し、１２．５ｎｇ／ｍｌから出発し、６．２５ｎｇ／ｍｌまたは３．１２５ｎｇ／ｍｌの５０ｕｌのｈＴＧＦαと３７℃において１０分間インキュベートした。次いで、ＰＢＳにより細胞を洗浄し、溶解させた。細胞溶解物の半分を使用してセルシグナリング（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）キット＃７２５０を使用して総ＥＧＦＲのレベルを測定し、細胞溶解物の他の半分を使用してセルシグナリング（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）キット＃７２４０を販売業者のプロトコルに従って使用してリン酸化ＥＧＦＲのレベルを測定した。結果は図１２Ｂに示される。
【０１２２】
上記参照される方法は、野生型ＴＧＦαと比較して細胞ベースＥＬＩＳＡにおける高い結合活性および細胞ベースＥＧＦＲリン酸化アッセイにおけるＥＧＦＲのリン酸化を誘導する増大した能力を有する１９個のＣＰＥ（商標）変異体を同定した（図１１Ｂ、図１２ＡおよびＢ）。
【０１２３】
ＣＰＳ（商標）によるｈＴＧＦα進化
１．ヒトＴＧＦαのＣＰＳ（商標）ライブラリーの構築
野生型ｈＴＧＦαと比較して優れたまたは異なる特徴：ｈＴＧＦαへの結合活性、Ａ４３１細胞中でＥＧＦＲリン酸化を誘導する能力、疎水性、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中の可溶性発現および等電点に基づき７つのＣＰＥ（商標）変異体を選択した。これらの変異体中の変異の位置および性質は、表３に示される。
【０１２４】
【表３】
2017532067.tif 000012
選択された７つのＣＰＥ（商標）変異体中の全ての考えられる変異の組合せを含有するＢＡＰ０６０−ｈＴＧＦα−Ｂ変異体のコンビナトリアルタンパク質合成（Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）（ＣＰＳ（商標））ライブラリーを作製した。得られた４９個のＣＰＳ（商標）変異ｈＴＧＦαタンパク質をシーケンシングし、９６ウェルフォーマットでアレイした。これらの新たな変異体の配列は、表２および図１６に示される。
【０１２５】
２．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞中のＢＡＰ０６０−ｈＴＧＦα−Ｂ  ＣＰＳ（商標）変異体の発現および結合活性の測定
ＢＡＰ０６０−ｈＴＧＦα−Ｂ  ＣＰＳ（商標）変異体により大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）
ＢＬ２１細胞を形質転換し、３７℃においてＩＰＴＧにより誘導した。ＩＰＴＧ誘導後にペリプラズム分画を回収し、上記のとおり定量ＥＬＩＳＡによりｈＴＧＦαの発現レベルを測定した。これから、野生型ｈＴＧＦαと比較して少なくとも２倍高い結合活性およびさらにほとんどのＣＰＥ（商標）変異体よりも高い結合活性を有するものとして４６個のＣＰＳ（商標）変異体（最大７つの変異を含有）を同定した（図１３）。細胞ベースＥＧＦＲリン酸化アッセイによってもこれらの４６個のＣＰＳ（商標）変異体を試験してそれらの機能活性を測定した。簡潔に述べると、９６ウェルフォーマット中で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞中にＢＡＰ０６０−ｈＴＧＦα−Ｂ（成熟ｈＴＧＦα、アミノ酸４０〜８９、ＰＥｌＢシグナル配列を有する）またはＣＰＳ（商標）変異体を形質転換した。１４ｍｌのチューブ中の３７℃における３時間の１ｍＭのＩＰＴＧの添加時にタンパク質を発現させた。ベクターのみにより形質転換されたＢＬ２１培養物も含めた。誘導後に細胞を回収し、ＤＮアーゼ、ＲＮアーゼおよびリゾチームを有するＯＳ緩衝液中で細胞をインキュベートすることにより、ペリプラズムタンパク質を調製した。ＯＳ緩衝液中の細胞に溶解緩衝液を添加した後、細胞を遠心分離し、マイクロ遠心チューブのクリーンセットにペリプラズム分画を含有する上清を移した。９６ウェルプレート中でＡ４３１細胞を播種し、一晩血清飢餓状態にした。血清不含培地中で細胞を洗浄し、５０ｎｇ／ｍｌから出発し、２５ｎｇ／ｍｌおよび１２．５ｎｇ／ｍｌの５０ｕｌの野生型ｈＴＧＦα（黒色バー）または１２．５ｎｇ／ｍｌのＣＰＳ（商標）変異体（白色バー）と３７℃において１０分間インキュベートした。次いで、ＰＢＳにより細胞を洗浄し、溶解させた。細胞溶解物の半分を使用してセルシグナリング（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）キット＃７２５０を使用して総ＥＧＦＲのレベルを測定し、細胞溶解物の他の半分を使用してセルシグナリング（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）キット＃７２４０を販売業者のプロトコルに従って使用してリン酸化ＥＧＦＲのレベルを測定した。結果のＲＧＦＲリン酸化結果は、図１４に示される。
【０１２６】
さらに、細胞ベースタイトレーションＥＬＩＳＡのために野生型ｈＴＧＦαに対してＥＧＦＲのリン酸化を誘導する増大した能力を有する１５個のＣＰＳ（商標）変異体（最大５つの変異を含有）（図１４）を選択してそれらの結合活性を確認した（図１５）。簡潔に述べると、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞中にＢＡＰ０６０−ｈＴＧＦα−Ｂ（成熟ｈＴＧＦα、アミノ酸４０〜８９、ＰｅｌＢシグナル配列を有する）野生型およびＣＰＳ（商標）変異体を形質転換した。９６ウェルフォーマット中の１ｍＭのＩＰＴＧの３７℃における３時間の添加時にタンパク質を発現させた。誘導後に細胞を回収し、ＤＮアーゼ、ＲＮアーゼおよびリゾチームを有するＯＳ緩衝液中で細胞をインキュベートすることによりペリプラズムタンパク質を調製した。ＯＳ緩衝液中の細胞に溶解緩衝液を添加し、細胞を遠心分離し、マイクロ遠心チューブのクリーンセットにペリプラズム分画を含有する上清を移した。定量ＥＬＩＳＡによりそれぞれの試料中のｈＴＧＦαの濃度を測定した。プレート上で固定化されたＡ４３１細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１５５５）と、３．１２５ｎｇ／ｍｌ、１．５６ｎｇ／ｍｌ、０．７８ｎｇ／ｍｌ、または０．３４ｎｇ／ｍｌの野生型ｈＴＧＦαまたはＣＰＳ（商標）変異ｈＴＧＦαをインキュベートした。さらに、対照として１００ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、１２．５ｎｇ／ｍｌ、６．２５ｎｇ／ｍｌ、３．１２５ｎｇ／ｍｌ、１．５６ｎｇ／ｍｌ、または０．７８ｎｇ／ｍｌの野生型ｈＴＧＦａを含めた。ビオチン化抗ｈＴＧＦα（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、＃ＢＡＦ２３９）およびＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジンにより結合ｈＴＧＦαを検出した。ウェルにＴＭＢを添加した後にＨＣｌを添加することにより反応を停止させ、直ちに読み取った。モレキュラーデバイススペクトラマックスプラス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ  ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ  Ｐｌｕｓ）プレートリーダにより反応物のＯＤ４５０ｎｍ値を計測した。このアッセイの結果は図１５に示される。
【０１２７】
まとめると、上記に開示される方法は、野生型ｈＴＧＦαと比較して異なる物理的特徴
、例えば、疎水性および等電点を有するｈＴＧＦα変異タンパク質を生じさせた（図１６）。本方法は、細胞表面ＥＧＦＲへの結合において、および細胞中のＥＧＦＲのリン酸化の誘導において野生型ｈＴＧＦαと同様にまたはそれよりも良好に機能するｈＴＧＦα変異タンパク質も生じさせた（図１７）。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ−１】
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【図１１Ａ−２】
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【図１１Ａ−３】
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【図１１Ａ−４】
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【図１１Ａ−５】
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【図１１Ａ−６】
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【図１１Ａ−７】
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【図１１Ａ−８】
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【図１１Ａ−９】
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【図１１Ａ−１０】
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【図１１Ａ−１１】
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【図１１Ａ−１２】
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【図１１Ａ−１３】
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【図１１Ａ−１４】
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【図１１Ａ−１５】
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【図１１Ａ−１６】
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【図１１Ａ−１７】
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【図１１Ａ−１８】
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【図１１Ｂ−１】
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【図１１Ｂ−２】
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【図１１Ｂ−３】
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【図１１Ｂ−４】
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【図１１Ｂ−５】
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【図１１Ｂ−６】
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【図１１Ｂ−７】
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【図１１Ｂ−８】
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【図１１Ｂ−９】
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【図１１Ｂ−１０】
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【図１１Ｂ−１１】
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【図１１Ｂ−１２】
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【図１１Ｂ−１３】
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【図１１Ｂ−１４】
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【図１１Ｂ−１５】
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【図１１Ｂ−１６】
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【図１１Ｂ−１７】
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【図１１Ｂ−１８】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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