(57)【要約】  本発明は、ヒトＮＫＧ２Ａに特異的に結合し、それを阻害する抗体を使用する、疾患とりわけ癌を治療する方法に関する。抗ＮＫＧ２Ａ抗体の有効性の向上を実現する治療計画が含まれる。
2017538660.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体の疾患の治療に使用されるＮＫＧ２Ａに結合し、かつその阻害活性を中和する抗体であって、前記治療が、前記個体に前記抗体を少なくとも１回の投与サイクルの間、投与することを含み、前記抗ＮＫＧ２Ａ抗体が、前記抗ＮＫＧ２Ａ抗体の２回の相継ぐ投与間で少なくとも１０μｇ／ｍＬの抗ＮＫＧ２Ａ抗体の血中濃度を達成かつ／または維持するために少なくとも２回、その達成かつ／または維持に有効な量で投与される、抗体。
【請求項２】
前記抗ＮＫＧ２Ａ抗体が、前記投与サイクル全体を通じて前記抗ＮＫＧ２Ａ抗体の少なくとも１０μｇ／ｍＬの持続血中濃度を維持するために少なくとも２回、その維持に有効な量で投与される、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体が、前記投与サイクル全体を通じて少なくとも１０μｇ／ｍＬ、場合によっては１０〜１００、１０〜８０、または１０〜５０μｇ／ｍＬの抗ＮＫＧ２Ａ抗体の持続血中濃度を維持するように投与される、請求項１または２のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体が、投与時に少なくとも４０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、または１００μｇ／ｍＬの抗ＮＫＧ２Ａ抗体のピーク血中濃度を達成するように投与される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体が、前記抗ＮＫＧ２Ａ抗体の投与後、少なくとも１週間、場合によっては２週間にわたって、少なくとも約４０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、または１００μｇ／ｍＬの前記抗ＮＫＧ２Ａ抗体の持続（最小）血中濃度をもたらすのに有効な量で投与される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体が、前記抗ＮＫＧ２Ａ抗体の２回の相継ぐ投与間で少なくとも約１００μｇ／ｍＬの前記抗ＮＫＧ２Ａ抗体の持続（最小）血中濃度を維持するように投与される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体が、前記抗ＮＫＧ２Ａ抗体の２回の相継ぐ投与間で、場合によっては前記投与サイクル全体を通じて、少なくとも１００μｇ／ｍＬの、場合によっては１００〜２００μｇ／ｍＬの間の前記抗ＮＫＧ２Ａ抗体の持続血中濃度を維持するように投与される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体が、前記抗ＮＫＧ２Ａ抗体の２回の相継ぐ投与間で少なくとも４０μｇ／ｍＬの抗ＮＫＧ２Ａ抗体の持続血中濃度を維持するのに有効な量で投与される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項９】
前記抗体が、１ヶ月当たり２回投与される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１０】
前記抗体が、静脈内に１ヶ月当たり２回投与され、かつ投与される前記抗ＮＫＧ２Ａ抗体の少なくとも２回の相継ぐ投与間の少なくとも１０μｇ／ｍＬの抗ＮＫＧ２Ａ抗体の前記量が、体重１ｋｇ当たり２〜１０ｍｇ、場合によっては２〜６ｍｇ、場合によっては２〜８ｍｇ、または場合によっては２〜４ｍｇの間である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１１】
前記抗体が、静脈内に１ヶ月当たり２回投与され、かつ投与される前記抗ＮＫＧ２Ａ抗体の少なくとも２回の相継ぐ投与間の少なくとも１００μｇ／ｍＬの抗ＮＫＧ２Ａ抗体の前記量が、体重１ｋｇ当たり４〜１０ｍｇ、場合によっては４〜６ｍｇ、場合によっては４〜８ｍｇ、場合によっては約４ｍｇ、場合によっては約６ｍｇ、場合によっては約８ｍｇ、または場合によっては約１０ｍｇの間である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１２】
前記治療が、負荷期間とその後に続く維持期間とを含み、前記負荷期間において前記抗体が、前記抗ＮＫＧ２Ａ抗体の次の相継ぐ投与まで少なくとも１００μｇ／ｍＬの血中濃度を維持するのに有効な初期用量で少なくとも１回投与され、前記維持期間において前記抗体が、前記抗ＮＫＧ２Ａ抗体の相継ぐ投与間で少なくとも１００μｇ／ｍＬの前記抗ＮＫＧ２Ａ抗体の持続血中濃度を維持するのに有効な第二の用量および頻度で少なくとも２回投与される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１３】
前記抗体が、静脈内に投与され、かつ前記負荷期間が、前記抗体を体重１ｋｇ当たり８〜１０ｍｇの間の、場合によっては約１０ｍｇの用量で１回投与することを含み、かつ前記維持期間が、前記抗体を体重１ｋｇ当たり２〜６ｍｇの間、場合によっては２〜５ｍｇの間、場合によっては２〜４ｍｇの間、場合によっては約２ｍｇ、場合によっては約３ｍｇ、場合によっては約４ｍｇ、または場合によっては約６ｍｇの用量で約２週間の間隔で少なくとも２回投与することを含む、請求項１２に記載の抗体。
【請求項１４】
個体の治療に使用されるＮＫＧ２Ａに結合し、かつその阻害活性を中和する抗体であって、前記治療が、前記個体に前記抗体を少なくとも１回の投与サイクルの間、投与することを含み、前記抗ＮＫＧ２Ａ抗体が、体重１ｋｇ当たり４〜１０ｍｇ、場合によっては４〜６ｍｇ、場合によっては４〜８ｍｇの間、場合によっては約４ｍｇ、場合によっては約６ｍｇ、場合によっては約８ｍｇ、または場合によっては約１０ｍｇの用量で投与される、抗体。
【請求項１５】
個体の治療に使用されるＮＫＧ２Ａに結合し、かつその阻害活性を中和する抗体であって、前記治療が、前記個体に前記抗体を少なくとも１回の投与サイクルの間、投与することを含み、その方法が、
ａ）抗体が、体重１ｋｇ当たり８〜１０ｍｇの間、場合によっては約１０ｍｇの初期投与量で静脈内に少なくとも１回投与される負荷期間と、
ｂ）前記抗体が、体重１ｋｇ当たり２〜６ｍｇ、場合によっては２〜５ｍｇの間、場合によっては２〜４ｍｇの間、場合によっては約２ｍｇ、場合によっては約３ｍｇ、場合によっては約４ｍｇ、または場合によっては約６ｍｇの用量で静脈内に２週間ごとに少なくとも２回投与される維持期間とを含み、場合によっては前記維持期間内の最初の投与が前記初期投与量の２週間以内に行われる、抗体。
【請求項１６】
前記抗体が、前記投与サイクル全体を通じて少なくとも１０μｇ／ｍＬ、場合によっては少なくとも４０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、または１００μｇ／ｍＬの前記抗ＮＫＧ２Ａ抗体の持続血中濃度を維持するのに有効な頻度および量で投与される、請求項１５に記載の抗体。
【請求項１７】
前記投与サイクルが、８週間または少なくとも８週間である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１８】
前記投与サイクルが、前記抗ＮＫＧ２Ａ抗体の少なくとも４回の投与を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１９】
前記個体が癌を有する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２０】
前記個体が血液腫瘍を有する、請求項１９に記載の抗体。
【請求項２１】
前記個体が充実性腫瘍を有する、請求項１〜２または請求項４〜１９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２２】
前記個体がＨＮＳＣＣを有する、請求項２１に記載の抗体。
【請求項２３】
前記個体が充実性腫瘍を有し、かつ前記腫瘍を取り除くための外科手術に先立って前記抗ＮＫＧ２Ａ抗体で治療される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２４】
前記個体が、前記腫瘍を取り除く外科手術に先立って前記抗ＮＫＧ２Ａ抗体の完全投与サイクルで治療される、請求項２３に記載の抗体。
【請求項２５】
抗体が、ＮＫＧ２Ａとの結合に関してＨＬＡ−Ｅと競合する、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２６】
抗体が、ＮＫＧ２Ａ発現細胞との結合に関して１〜１０ｎｇ／ｍＬの間のＥＣ５０を有する、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２７】
抗体が、組み換え可溶性ＮＫＧ２Ａポリペプチドとの結合に関して１０−１０Ｍ〜１０−１２Ｍの間のＫＤを有する、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２８】
前記抗体が、ヒトＩｇＧ４定常領域を含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２９】
前記抗体が、ヒトＦｃγ受容体との結合を減少させるアミノ酸修飾を含むＦｃを遺伝子的に操作された定常領域を含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３０】
前記抗体が抗体のフラグメントである、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３１】
前記抗体のフラグメントがＦｃドメインを欠いている、請求項３０に記載の抗体。
【請求項３２】
前記抗体のフラグメントが、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、重鎖Ｉｇ（ラマまたはラクダＩｇ）、ＶＨＨフラグメント、単一ドメインＦＶ、および単鎖抗体フラグメントからなる群から選択されるものである、請求項３０または３１に記載の抗体。
【請求項３３】
前記抗体が、ヒトＮＫＧ２Ａとの結合に関して、配列番号２〜６のいずれかのアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号７の軽鎖配列を有する抗体と競合する、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３４】
前記抗体が、配列番号２で記述される配列を有する重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメインと、配列番号３で記述される配列を有する軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメインを含む、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３５】
前記抗体が、配列番号２〜６のいずれかのアミノ酸配列を含む重鎖のＶＨ  ＣＤＲと、配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖のＶＬ  ＣＤＲとをそれぞれ含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３６】
前記抗ＮＫＧ２Ａ抗体が、前記抗ＮＫＧ２Ａ抗体の治療に有効な量を含む薬学的に許容できる組成物として投与される、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３７】
前記組成物が、他のいかなる薬学的に活性な物質も含まない、請求項３６に記載の抗体。
【請求項３８】
個体中の癌の治療または予防に使用されるＮＫＧ２Ａに結合し、その阻害活性を中和する抗体であって、
ａ）癌を有する前記個体内の悪性細胞のＨＬＡ−Ｅポリペプチドの状況を判定すること、および
ｂ）患者が悪性細胞の表面に顕著に発現したＨＬＡ−Ｅポリペプチドを有するという判定に基づいて、前記個体に、前記抗体をＮＫＧ２Ａ＋ＮＫ細胞の応答の少なくともＥＣ５０、場合によってはＥＣ１００に相当する抗ＮＫＧ２Ａ抗体の血中（血清）濃度を達成するのに有効な量で投与することを含む、抗体。
【請求項３９】
ステップａ）におけるＨＬＡ−Ｅポリペプチドの状況の判定が、生体試料中の悪性細胞のＨＬＡ−Ｅ核酸またはポリペプチドの発現のレベルを判定すること、および前記レベルを基準レベルと比較することを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記抗体が、ＮＫＧ２Ａ＋ＮＫ細胞の応答の少なくともＥＣ５０、場合によってはＥＣ１００に相当する抗ＮＫＧ２Ａの血管外組織の濃度を達成するのに有効な量で投与される、請求項３８〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
ＮＫＧ２Ａ＋ＮＫ細胞の応答の前記ＥＣ５０が、約４μｇ／ｍＬである、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
ＮＫＧ２Ａ＋ＮＫ細胞の応答の前記ＥＣ１００が、約１０μｇ／ｍＬである、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
抗体が、ＮＫＧ２Ａとの結合に関してＨＬＡ−Ｅと競合する、請求項３８〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
個体の疾患の治療に使用されるＮＫＧ２Ａに結合し、その阻害活性を中和する抗体であって、前記治療が、前記個体に前記抗体をＮＫＧ２Ａ＋ＮＫ細胞の応答の少なくともＥＣ５０、場合によってはＥＣ１００に相当する血中濃度を達成するのに有効な量で投与することを含む、抗体。
【請求項４５】
ＮＫＧ２Ａ＋ＮＫ細胞の応答の前記ＥＣ５０が、約４μｇ／ｍＬである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
ＮＫＧ２Ａ＋ＮＫ細胞の応答の前記ＥＣ１００が、約１０μｇ／ｍＬである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
抗体が、ＮＫＧ２Ａとの結合に関してＨＬＡ−Ｅと競合する、請求項４４〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
ＮＫＧ２Ａ＋ＮＫ細胞の応答が、ＨＬＡ−Ｅを発現する標的細胞に対するＮＫＧ２Ａ＋ＮＫ細胞の応答である、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年９月１６日出願の米国仮特許出願第６２／０５０，９４８号明細書、２０１４年１０月２３日出願の米国仮特許出願第６２／０６７，６４２号明細書、２０１４年１１月２５日出願の米国仮特許出願第６２／０８３，９２９号明細書、２０１４年１２月１７日出願の米国仮特許出願第６２／０９３，１４１号明細書、および２０１４年１２月１７日出願の米国仮特許出願第６２／０９３，１２４号明細書に関する特典を請求し、これらのすべては図面を含めたそれらの全体が参照により本明細書中に援用される。
【０００２】
配列表の参照
本出願は、電子形式の配列表とともに出願される。配列表は、２０１５年９月１５日に作成され、サイズ２６ＫＢの「ＮＫＧ２Ａ−ＳＴ２５」という名称のファイルとして提供される。この配列表の電子形式の情報は、その全体が参照により本明細書中に援用される。
【０００３】
本発明は、治療、とりわけ癌の治療のための抗ＮＫＧ２Ａ抗体の使用法に関する。
【背景技術】
【０００４】
ＮＫ細胞の活性は、活性化シグナルと阻害シグナルの両方と関係する複雑なメカニズムによって調節される。ＮＫ細胞が仲介するＨＬＡクラスＩ欠失標的細胞の認識および致死において重要な役割を演じる幾つかの異なるＮＫ特異的受容体が同定されている。天然の細胞障害性受容体（ＮＣＲ）とは、ＮＫ細胞中で特異的に発現する活性化受容体タンパク質のクラスおよびそれらを発現させる遺伝子を指す。ＮＣＲの例には、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、およびＮＫｐ４６が挙げられる（例えば、（非特許文献１）、（非特許文献２）、（非特許文献３）、（非特許文献４）、（非特許文献５）、（非特許文献６）を参照されたい。これらの全開示内容は参照により本明細書中で援用される）。これらの受容体はＩｇスーパーファミリーのメンバーであり、特異的ｍＡｂｓによって誘導されるそれらの架橋は、高い細胞内Ｃａ＋＋レベル、細胞障害の誘発、およびリンホカインの放出をもたらす強いＮＫ細胞活性化と、多くの型の標的細胞に対するＮＫ細胞毒性の活性化とを引き起こす。
【０００５】
ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａは、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）、およびＴ細胞（α／βおよびγ／δ）のサブセット上で見出される障害性受容体である。ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａは、ＣＤ９４／ＮＫＧ２ＡのリガンドであるＨＬＡ−Ｅを発現させる細胞に向けての上記リンパ球のサイトカインの放出および細胞障害応答を制限する（例えば、（特許文献１）参照）。またＨＬＡ−Ｅは、幾種類かの腫瘍細胞（（非特許文献７））によって、また活性化された内皮細胞（（非特許文献８））によって可溶な形態で分泌することが分かっている。ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａのシグナル伝達（ウィルス感染細胞に対するＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ陽性ＮＫ細胞の応答の感応などの）を阻害する抗体は、ＨＬＡ−Ｅ陽性の標的細胞に向けてのリンパ球のサイトカイン放出および細胞溶解活性を増すことができる。したがってＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを阻害するが、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現細胞の致死を引き起こさない治療用抗体（すなわち非枯渇性抗体）は、癌患者における腫瘍成長の制御を誘導することができる。これに加えて自己免疫性または炎症性疾患の治療用の抗ＮＫＧ２Ａ抗体もまた、提案されている（例えば（特許文献２）、（特許文献３）参照）。
【０００６】
当技術分野ではＮＫＧ２Ａに対する様々な抗体が開示されている。（特許文献３）および（特許文献４）（（特許文献５）もまた参照されたい）は、抗ＮＫＧ２Ａ抗体Ｚ２７０について述べており、一方、（特許文献６）は、ヒト化抗ＮＫＧ２Ａ抗体Ｚ１９９について述べている。（非特許文献９）は、ラットの抗マウスＮＫＧ２抗体２０Ｄ５（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５０５１８、米国）によって現在市販されている）に言及しており、また（特許文献２）はマウス抗体３Ｓ９について述べている。抗体Ｚ２７０は、活性化受容体ＮＫＧ２ＣおよびＮＫＧ２Ｅを中和することなく障害性受容体ＮＫＧ２Ａに結合し、中和する。抗体Ｚ１９９、２０Ｄ５、および３Ｓ９はすべて、ＮＫＧ２Ａに加えて活性化ＮＫＧ２ファミリーのメンバーであるＮＫＧ２ＣおよびＮＫＧ２Ｅに結合する。抗体Ｚ２７０は、ＨＬＡ−ＥのＮＫＧ２Ａとの結合を遮断し、一方、抗体Ｚ１９９は、ＮＫＧ２ＡのＨＬＡ−Ｅとの結合を妨げることなくＮＫＧ２Ａを中和する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第９９／２８７４８号パンフレット
【特許文献２】米国特許出願公開第２００３００９５９６５号明細書
【特許文献３】国際公開第２００６０７０２８６号パンフレット
【特許文献４】米国特許第８，２０６，７０９号明細書
【特許文献５】国際公開２００８／００９５４５号パンフレット
【特許文献６】国際公開第２００９／０９２８０５号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｌａｎｉｅｒ（２００１）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２：２３〜２７
【非特許文献２】Ｐｅｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１９０：１５０５〜１５１６
【非特許文献３】Ｃａｎｔｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１８９：７８７〜７９６
【非特許文献４】Ｓｉｖｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：１１２９〜１１３６
【非特許文献５】Ｐｅｓｓｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１８８（５）：９５３〜６０
【非特許文献６】Ｍａｎｄｅｌｂｏｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：１０５５〜１０６０
【非特許文献７】Ｄｅｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００６；１７７：３１００〜７）
【非特許文献８】Ｃｏｕｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２００７；１０９：２８０６〜１４
【非特許文献９】Ｖａｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９９９；１９０：１８０１〜１２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、リンパ球上のＮＫＧ２Ａ受容体を完全に占拠する抗ＮＫＧ２Ａ抗体の用量および濃度が、ｉｎ  ｖｉｖｏのＨＬＡ−Ｅ発現標的細胞の存在下ではＮＫＧ２Ａ受容体の最大限の中和を生じないことを発見した。具体的には、ＮＫＧ２Ａ＋リンパ球を使用した結合アッセイにおいてＮＫＧ２Ａ受容体を完全に占拠するには、ＨＬＡ−Ｅ発現標的細胞の存在下でのＮＫ細胞上のＮＫＧ２Ａ受容体の完全な中和に必要な抗ＮＫＧ２Ａ抗体の濃度は、観察される濃度の１００倍である。同時に、抗ＮＫＧ２Ａの抗腫瘍効果は、腫瘍細胞上でのＨＬＡ−Ｅのより高い発現に応じて増加することが分かる。
【００１０】
本明細書中で示すＮＫＧ２Ａ＋ＮＫおよびＣＤ８＋Ｔリンパ球は、循環血液中だけでなく腫瘍環境内にも存在し、さらにＮＫＧ２Ａ＋ＣＤ８  Ｔ細胞は、腫瘍所属リンパ節（ｔｕｍｏｒ  ｄｒａｉｎｉｎｇ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅｓ）および脾臓中のＣＤ８＋Ｔ細胞と比較して腫瘍浸潤サブセット内では著しく高い頻度で見出すことができる。したがって本発明の治療計画はさらに、抗ＮＫＧ２Ａ抗体を使用して腫瘍環境内のリンパ球を調節することによる充実性腫瘍を治療するための有利な方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
一実施形態では個体における疾患（例えば癌、充実性腫瘍、血液腫瘍）の治療または予防の方法を提供し、この方法は疾患（例えば癌、充実性腫瘍）を有する個体に、ヒトＮＫＧ２Ａポリペプチドの阻害活性を中和する抗体を投与することを含み、この抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、ＮＫＧ２Ａ＋ＮＫ細胞の応答の少なくともＥＣ５０、場合によってはＥＣ１００に相当する抗ＮＫＧ２Ａ抗体の血中（血清）濃度を達成するのに有効な量で投与される。一実施形態ではその量は、ＮＫＧ２Ａ＋ＮＫ細胞の応答の少なくともＥＣ５０、場合によってはＥＣ１００に相当する抗ＮＫＧ２Ａ抗体の血管外組織（例えば腫瘍組織）中の濃度を達成するのに有効である。一実施形態ではＮＫＧ２Ａ＋ＮＫ細胞の応答は、ＨＬＡ−Ｅ発現標的細胞に対するＮＫＧ２Ａ発現ＮＫ細胞の細胞毒性活性の検定法を使用して評価される。
【００１２】
一実施形態では個体の疾患（例えば癌、充実性腫瘍、血液腫瘍）の治療または予防の方法を提供し、この方法は疾患（例えば癌、充実性腫瘍）を有する個体に、ヒトＮＫＧ２Ａポリペプチドの阻害活性を中和する抗体を投与することを含み、この抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、少なくとも１０μｇ／ｍＬ（あるいは場合によっては少なくとも２０、３０、４０、５０、８０、または１００μｇ／ｍＬ）の抗ＮＫＧ２Ａ抗体の血中（血清）濃度を達成するのに有効な（かつ／または指定された期間または２回の相継ぐ投与の間でそれを維持するのに有効な）量である。
【００１３】
したがって一実施形態では個体の疾患（例えば癌、充実性腫瘍、血液腫瘍）の治療または予防の方法を提供し、この方法は個体に、ＮＫＧ２Ａに結合し、かつヒトＮＫＧ２Ａポリペプチドの阻害活性を中和する抗体を少なくとも１投与サイクルの間投与することを含み、この投与サイクルは、抗ＮＫＧ２Ａ抗体の少なくとも第１回および第２回（また場合によっては第３回、第４回、第５回、第６回、第７回、および／または第８回、またはそれ以上）の投与を含み、その抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、抗ＮＫＧ２Ａ抗体の血中濃度を達成するのに、かつ／または２回の相継ぐ（例えば、上記第１回と第２回、また場合によってはそれ以上）投与の間の抗ＮＫＧ２Ａ抗体の血中濃度を維持するのに有効な量で投与され、その濃度は、ＮＫＧ２Ａ＋細胞の表面のＮＫＧ２Ａ受容体（例えば、ＰＢＭＣ中のＮＫＧ２Ａ発現細胞上の抗ＮＫＧ２Ａ抗体を滴定することによって算定される）を実質上完全に（例えば９０％、９５％）占拠（飽和）するのに必要な最小濃度の少なくとも１０倍（例えば、１０〜２０倍、１０〜５０倍、１０〜１００倍、２０〜５０倍、２０〜１００倍、３０〜１００倍、５０〜１００倍）、場合によっては少なくとも５０倍、６０倍、８０倍、または１００倍である。一実施形態ではその抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、ヒトＮＫＧ２Ａとの結合に関してＨＬＡ−Ｅと競合する。
【００１４】
一実施形態では個体の疾患（例えば癌、充実性腫瘍、血液腫瘍）の治療または予防の方法を提供し、この方法は疾患（例えば癌、充実性腫瘍）を有する個体に、ヒトＮＫＧ２Ａポリペプチドの阻害活性を中和する抗体を少なくとも１投与サイクルの間投与することを含み、この投与サイクルは抗ＮＫＧ２Ａ抗体の少なくとも第１回および第２回（また場合によっては第３回、第４回、第５回、第６回、第７回、および／または第８回、またはそれ以上）の投与を含み、その抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、少なくとも１０μｇ／ｍＬ（あるいは場合によっては少なくとも２０、３０、４０、または５０μｇ／ｍＬ）の抗ＮＫＧ２Ａ抗体の血中（血清）濃度を達成するのに、または２回の相継ぐ投与の間でそれを維持するのに有効な量で投与される。一実施形態では指定された持続血中濃度が維持され、その血中濃度は、その指定された期間（例えば抗体の２回の投与の間、すなわち複数週間の間）の継続期間の間、その指定された血中濃度未満には実質上降下しない。すなわち血中濃度は指定された期間の間で変動することができるが、その維持される指定された維持血中濃度は最小または「底値」濃度を示す。一実施形態では抗ＮＫＧ２Ａ抗体の治療に有効な量は、抗体の投与後、少なくとも約１週間、約２週間、または約１ヶ月の期間にわたってＮＫＧ２Ａ＋ＮＫ細胞の応答の血中かつ／または組織中の（少なくとも）ＥＣ５０濃度、場合によっては実質上ＥＣ１００濃度をもたらすことができる、そのような抗体の量である。一実施形態ではその抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、少なくとも１０μｇ／ｍＬ（あるいは場合によっては少なくとも２０、３０、４０、または５０μｇ／ｍＬ）の抗ＮＫＧ２Ａ抗体の血中（血清）濃度を達成するのに有効な、かつ２回の相継ぐ投与（相継ぐ投与は、例えば１ヶ月、２ヶ月、またはそれ以上離れてもよい）の間に顕著な「不飽和化」を可能にする量で少なくとも約１週間、約２週間の期間にわたって投与される。一実施形態では抗ＮＫＧ２Ａ抗体の治療に有効な量は、抗体の投与後、少なくとも約１週間または少なくとも約２週間の期間にわたってＮＫＧ２Ａ＋ＮＫ細胞の応答に関して組織中の（少なくとも）ＥＣ５０濃度、場合によっては実質上ＥＣ１００濃度をもたらすことができ、かつその後２回の相継ぐ投与（場合によってはこの抗体は約１ヶ月ごとに１回、または２ヶ月ごとに約１回の投与頻度で投与される）の間に顕著な「不飽和化」を可能にするそのような抗体の量である。不飽和化の期間中の抗ＮＫＧ２Ａ抗体の血中濃度は、初期の期間（例えば１週間、２週間など）中に達成されるべき指定された濃度を下回る。例えば、不飽和化の期間中の血液および／または組織の抗ＮＫＧ２Ａ抗体濃度は、ＮＫＧ２Ａ＋ＮＫ細胞の応答のＥＣ１００を下回る、場合によってはＥＣ５０を下回るように指定することができる。
【００１５】
一実施形態では、特に血管外組織中のＮＫＧ２Ａ＋Ｔ細胞またはＮＫ細胞を、例えば充実性腫瘍の治療用に調節することを意図する場合、その抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、ピーク濃度を達成するのに、あるいは投与時（例えば、投与の１または２日以内に）に少なくとも約４０、５０、６０、７０、または８０μｇ／ｍＬ、場合によっては少なくとも約１００μｇ／ｍＬの血中濃度を維持するのに有効な量で投与される。一実施形態ではＮＫＧ２Ａ抗体は、その抗ＮＫＧ２Ａ抗体の投与後、少なくとも１週間、場合によっては少なくとも２週間の間、指定された血中濃度を維持するのに有効な量で投与される。一実施形態では、特に血管外組織中のＮＫＧ２Ａ＋ＴまたはＮＫ細胞を、例えば充実性腫瘍の治療用に調節することを意図する場合、その抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、第１回と第２回（また場合によってはそれ以上）の投与の間で抗ＮＫＧ２Ａ抗体の約または少なくとも約５０、６０、７０、または８０μｇ／ｍＬ、場合によっては少なくとも約１００μｇ／ｍＬの持続（最小）血中濃度を達成または維持するのに有効な量で投与される。一実施形態では相継ぐ投与（例えば、上記第１回および第２回の投与）は、時間的に少なくとも１週間、場合によっては約２週間離される。この抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、場合によっては、投与サイクルの全継続期間にわたって指定された血中濃度を達成または維持するのに有効な量および頻度に従って投与することができる。
【００１６】
一実施形態では個体の充実性腫瘍を治療または予防する方法を提供し、この方法は、充実性腫瘍を有する個体に、ヒトＮＫＧ２Ａポリペプチドの阻害活性を中和する抗体を少なくとも１回の投与サイクルの間、投与することを含み、その投与サイクルはこの抗ＮＫＧ２Ａ抗体の少なくとも２回の投与を含み、この抗ＮＫＧ２Ａ抗体は２回の相継ぐ投与の間で少なくとも４μｇ／ｍＬ、場合によっては少なくとも１０μｇ／ｍＬの血管外組織中（例えば腫瘍環境中）の（最小）濃度を達成または維持するのに有効な量で投与される。場合によっては、この抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、投与サイクルの全継続期間にわたって少なくとも４μｇ／ｍＬ、場合によっては少なくとも１０μｇ／ｍＬの血管外組織中（例えば腫瘍環境中）の（最小）濃度を達成または維持するのに有効な量で投与される。一実施形態ではこの抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、２回の相継ぐ投与の間で、または投与サイクルの継続期間にわたって抗ＮＫＧ２Ａ抗体の少なくとも４０μｇ／ｍＬ、場合によっては少なくとも１００μｇ／ｍＬの持続血中濃度を維持するのに有効な量で投与される。一実施形態ではこの抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、投与時（例えば、投与してから少なくとも１週間、少なくとも２週間にわたって）に、続いて２回の相継ぐ投与の間の循環血液中のＮＫＧ２Ａ発現細胞の顕著な「不飽和化」を可能にする期間（ここで、抗ＮＫＧ２Ａ抗体の血中濃度は、不飽和化の期間の間上記少なくとも４０μｇ／ｍＬまたは少なくとも１００μｇ／ｍＬ未満である）に、抗ＮＫＧ２Ａ抗体の少なくとも４０μｇ／ｍＬ、場合によっては少なくとも１００μｇ／ｍＬの血中濃度を達成するのに有効な量で投与される。
【００１７】
一実施形態では個体の血液腫瘍を治療または予防する方法を提供し、この方法は、血液腫瘍を有する個体に、ヒトＮＫＧ２Ａポリペプチドの阻害活性を中和する抗体を少なくとも１回の投与サイクルの間投与することを含み、その投与サイクルはこの抗ＮＫＧ２Ａ抗体の少なくとも２回の投与を含み、この抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、２回の相継ぐ投与の間で少なくとも１０μｇ／ｍＬの抗ＮＫＧ２Ａ抗体の持続（最小）血中濃度を達成または維持するのに有効な量が投与される。場合によっては抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、投与サイクルの全継続期間にわたって少なくとも１０μｇ／ｍＬの抗ＮＫＧ２Ａ抗体の持続（最小）血中濃度を達成または維持するのに有効な量で投与される。
【００１８】
一実施形態では抗体は、投与時に（例えば、投与の日、投与の２４または４８時間以内）に少なくとも約４０μｇ／ｍＬ、場合によっては約または少なくとも約１００μｇ／ｍＬのピーク血中濃度を達成するように投与される。
【００１９】
一実施形態では４０μｇ／ｍＬの血中濃度は、血管外組織中のＮＫＧ２Ａ＋ＮＫ細胞の応答のＥＣ５０濃度をもたらすことができる。一実施形態では１００μｇ／ｍＬの血中濃度は、ＮＫＧ２Ａ＋ＮＫ細胞の応答の組織中（血管系の外側、例えば腫瘍環境中）のＥＣ１００濃度をもたらすことができる。
【００２０】
一実施形態では治療方法は、（ａ）抗ＮＫＧ２Ａ抗体の第一の用量が、抗ＮＫＧ２Ａ抗体の最初の投与と後続の投与の間で少なくとも約４０μｇ／ｍＬ、場合によっては少なくとも約１００μｇ／ｍＬの持続（最小）血中濃度を達成または維持するために投与される誘導（すなわち負荷）期間と、（ｂ）抗ＮＫＧ２Ａ抗体の第二のより低い用量が、抗ＮＫＧ２Ａ抗体の次の投与まで抗ＮＫＧ２Ａ抗体の少なくとも約４０μｇ／ｍＬ、場合によっては少なくとも約１００μｇ／ｍＬの持続（最小）血中濃度を達成または維持する（例えば、全治療サイクルの間）のに十分な量で投与される維持期間とを有する治療サイクルを施すことを含む。この維持期間は誘導期間に続く。一実施形態では維持期間は、抗ＮＫＧ２Ａ抗体の少なくとも２回の投与を含む。一実施形態では維持期間は、２回の投与の間で抗ＮＫＧ２Ａ抗体の少なくとも約４０μｇ／ｍＬ、場合によっては少なくとも約１００μｇ／ｍＬの持続血中濃度をもたらす用量および頻度での少なくとも２回の投与を含む。
【００２１】
任意の実施形態において血中濃度は血清濃度であることを指定することができる。
【００２２】
一実施形態では抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、ヒトの患者（ｉｎ  ｖｉｖｏ）におけるヒトＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａの阻害活性を循環血液中のまたは血管外組織中のＮＫＧ２Ａ陽性リンパ球上で約１週間にわたってまたは約２週間にわたって実質上完全に中和する。
【００２３】
一実施形態では癌（例えば充実性腫瘍）を有する個体の治療方法を提供し、この方法は個体に、ＮＫＧ２Ａに結合しかつその阻害活性を中和する抗体を、少なくとも１回の投与サイクルの間投与することを含み、その抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、体重１ｋｇ当たり４〜１０ｍｇの間、場合によっては４〜６ｍｇの間、場合によっては４〜８ｍｇの間、場合によっては約４ｍｇ、場合によっては約６ｍｇ、場合によっては約８ｍｇ、または場合によっては約１０ｍｇの用量で静脈内に１ヶ月当たり２回投与される。
【００２４】
一実施形態では癌（例えば充実性腫瘍）を有する個体の治療方法を提供し、この方法は個体に、ＮＫＧ２Ａに結合しかつその阻害活性を中和する抗体を、少なくとも１回の投与サイクルの間投与することを含み、その方法は、
ａ．抗体を体重１ｋｇ当たり８〜１０ｍｇの間、場合によっては約１０ｍｇの初期用量で静脈内に少なくとも１回投与する負荷期間、および
ｂ．その抗体を体重１ｋｇ当たり２〜６ｍｇ、場合によっては２〜５ｍｇの間、場合によっては２〜４ｍｇの間、場合によっては約２ｍｇ、場合によっては約３ｍｇ、場合によっては約４ｍｇ、または場合によっては約６ｍｇの用量で静脈内に２週間ごとに少なくとも２回投与する維持期間を含み、場合によっては維持期間内の最初の投与は初期用量の２週間以内に行われる。
【００２５】
一実施形態では本明細書中で述べる治療計画は、癌を有する個体が癌細胞を取り除く外科手術を受ける前にその個体に施される。すなわち抗ＮＫＧ２Ａ抗体の投薬計画は手術前治療として使用される。
【００２６】
一実施形態では、血管外腫瘍環境でのＮＫＧ２Ａ＋ＮＫ細胞の応答の少なくともＥＣ５０、場合によってはＥＣ１００に相当する抗ＮＫＧ２Ａ抗体の濃度を達成するように設計される治療計画または治療過程が、癌を有する個体に、癌細胞を取り除く外科手術に先立って、すなわち手術前治療として施される。
【００２７】
一実施形態では抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、その細胞表面でＨＬＡ−Ｅを発現させる癌細胞を有する個体に投与される。場合によっては抗ＮＫＧ２Ａ抗体による治療に先立って癌のＨＬＡ−Ｅの状況を評価することができる。一実施形態ではＨＬＡ−Ｅ＋腫瘍を有する患者を識別するためにＨＬＡ−Ｅ検出のステップを組み合わせた方法が提供される。その後、それらの患者を本明細書中で述べる治療方法に従って抗ＮＫＧ２Ａ抗体で治療することができる。
【００２８】
本明細書中の治療用途あるいは癌の治療または予防方法のいずれかの一実施形態において個体の癌の治療および予防は、
ａ）癌を有する個体内の悪性細胞のＨＬＡ−Ｅポリペプチドの状況を判定すること、および
ｂ）患者が悪性細胞の表面で顕著に発現したＨＬＡ−Ｅポリペプチドを有するという判定に基づいて、その個体に、ＮＫＧ２Ａに結合しかつその阻害活性を中和する抗ＮＫＧ２Ａ抗体を、例えば本明細書中で述べた治療方法のいずれかに従って投与すること
を含む。場合によってはその抗体は、ＨＬＡ−ＥによるＮＫＧ２Ａの結合を妨げる。
【００２９】
本明細書中の治療用途あるいは癌の治療または予防方法のいずれかの一実施形態において個体の癌の治療および予防は、
ａ）癌を有する個体内の悪性細胞のＨＬＡ−Ｅ核酸またはポリペプチドの発現のレベルを判定すること、および
ｂ）悪性細胞がＨＬＡ−Ｅ核酸またはポリペプチドを高い、場合によっては基準レベルと比べて高いレベル（例えば高い数値、強い表面染色など）で発現させるという判定に基づいて、その個体に、ＮＫＧ２Ａに結合しかつその阻害活性を中和する抗ＮＫＧ２Ａ抗体を、例えば本明細書中で述べた治療方法のいずれかに従って投与すること
を含む。場合によってはその抗体は、ＨＬＡ−ＥによるＮＫＧ２Ａの結合を妨げる。
【００３０】
これら方法のいずれかの一実施形態では、ステップａ）においてＨＬＡ−Ｅポリペプチドの状況を判定すること、または発現のレベルを判定することは、生体試料中の悪性細胞のＨＬＡ−Ｅ核酸またはポリペプチドの発現のレベルを判定すること、およびそのレベルを基準レベル（例えば数値、弱い細胞表面染色など）と比較することを含む。基準レベルは、例えば健康な個体に、抗ＮＫＧ２Ａ抗体による治療から得られる臨床的利益が全くない／低い個体に、あるいは抗ＮＫＧ２Ａ抗体による治療からかなりの臨床的利益を得る個体に対応することができる。生体試料が、高いレベル（例えば高い数値、強い表面染色、抗ＮＫＧ２Ａ抗体による治療から得られる臨床的利益が全くない／低い個体に対応するレベルよりも高いレベルなど）でＨＬＡ−Ｅ核酸またはポリペプチドを発現させるという判定は、その個体が抗ＮＫＧ２Ａ抗体により、例えば本明細書中で述べる治療方法に従って治療することができる癌を有することを表す。
【００３１】
一実施形態では抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、単剤療法として投与される。一実施形態では抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、１種類または複数種類の他の抗癌剤との併用療法で投与される。
【００３２】
本明細書中の治療用途あるいは治療または予防方法のいずれかの一実施形態においてその方法はさらに、第二の抗癌剤の治療に有効な量を個体に投与することを含む。一実施形態ではその癌は充実性腫瘍である。一実施形態ではその第二の抗癌剤は、ＡＤＣＣを仲介することができる抗体（例えば、そのＦｃドメインを介してＣＤ１６などのヒトＦｃγ受容体と結合する）である。一実施形態ではＡＤＣＣを仲介するこの抗体は、その第二の抗癌剤が向けられるポリペプチドを発現させるヒト患者中のヒト腫瘍細胞（ｉｎ  ｖｉｖｏ）に対して抗体依存性細胞障害を誘発させる有効量が投与される。
【００３３】
一実施形態では第二の抗癌剤は、抗ＥＧＦＲ抗体である。一実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体と併用して本発明の治療計画に従って抗ＮＫＧ２Ａ抗体で治療される患者は、抗ＥＧＦＲ抗体による前治療に対して応答が不十分である（例えば非応答者であるか、進行性疾患を有する）か、抗ＥＧＦＲ抗体による治療（抗ＮＫＧ２Ａによる治療の不在下）に対する応答に関して好ましくない予後を有する。
【００３４】
一態様においてこの併用は、特定の臨床的投薬計画、とりわけ特定の投与量に従って、または特定の投与スケジュールに従って（例えば本明細書中で提供される投与量および／または特定の投与スケジュールに従って）施される（または施されるためのものである）。
【００３５】
ＮＫＧ２Ａポリペプチド（抗ＮＫＧ２Ａ物質）の阻害活性を中和する抗体は、ＮＫＧ２Ａ発現ＮＫおよび／またはＴ細胞がＨＬＡ−Ｅ発現細胞の死を引き起こす能力を高める抗体である。
【００３６】
一実施形態では抗ＮＫＧ２Ａ物質は、そのリガンドであるＨＬＡ−Ｅの結合を遮断することによってＮＫＧ２Ａの阻害活性を低減させる。すなわち抗ＮＫＧ２Ａ物質は、ＨＬＡ−ＥによるＮＫＧ２Ａの結合を妨げる。配列番号２〜６のいずれか一つの重鎖および配列番号７の軽鎖をそれぞれ有する抗体は、このような抗体の例である。
【００３７】
一実施形態では抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、１種類または複数種類の活性化ＮＫＧ２受容体よりもＮＫＧ２Ａとずっと高い親和性で結合する抗体である。例えば一実施形態では抗体は、ＮＫＧ２ＣよりもＮＫＧ２Ａとずっと高い親和性で結合する。追加または代替の実施形態において抗体は、ＮＫＧ２ＥよりもＮＫＧ２Ａとずっと高い親和性で結合する。追加または代替の実施形態では抗体は、ＮＫＧ２ＨよりもＮＫＧ２Ａとずっと高い親和性で結合する。配列番号２〜６のいずれか一つの重鎖および配列番号７の軽鎖を有する抗体は、実質上ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、またはＮＫＧ２Ｈと結合することなくＮＫＧ２Ａに結合する。
【００３８】
追加または代替の実施形態において抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、ＮＫＧ２Ａ上で同じエピトープに結合する、かつ／またはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａとの結合に関して配列番号２〜６のいずれか一つの重鎖および配列番号７の軽鎖を有する抗体と競合する。抗体は、例えばヒトまたはヒト化抗ＮＫＧ２Ａ抗体であることができる。
【００３９】
一実施形態では抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、配列番号２〜６の重鎖配列のいずれか一つの重鎖ＣＤＲおよび配列番号７の軽鎖配列の軽鎖ＣＤＲを有するヒト化抗体である。例えばより低い抗原性などの特性が改良されている、抗原結合または他の機能特性などの特性が改良されている、かつ／または例えばより良好な安定性などの物理化学的性質が改良されている、そのようなヒト化抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基または配列、および／またはフレームワーク領域（ＦＲ）中のアミノ酸置換の部位の実例が提供される。
【００４０】
他の実施形態では医薬組成物およびキットと、それらの使用方法が提供される。
【００４１】
これらの態様は、本明細書中で提供される「発明を実施するための形態」の中でより完全に記述され、また追加の態様、特徴、および利点が、本明細書中で提供されるこの「発明を実施するための形態」から明らかになるはずである。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】ｘ軸上に列挙された様々な濃度（ｎｇ／ｍＬ）における抗ＮＫＧ２Ａ抗体（またＩＰＨ２２０１とも呼ばれるｈｕｍＺ２７０）のヒト血液中の受容体占拠を示す図である。受容体結合のＭＥＳＦシグナルがｙ軸上に示される。この抗体は、ＮＫＧ２Ａ＋細胞に関して約４ｎｇ／ｍＬの結合親和性（ＥＣ５０）を有した（ＫＤ約４ｎｇ／ｍＬ）。このＫＤは、他の検定法、とりわけビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）検定法におけるＰＢＭＣとの結合に対する親和性および組換えＮＫＧ２Ａに対する親和性において観察されるＫＤ値と一致する。完全受容体占拠（ＥＣ１００）に対するＫＤは、約１００ｎｇ／ｍＬであった。
【図２】患者９２人の第Ｉ相臨床試験においてｈｕｍＺ２７０の単回投与で治療されたヒト患者に基づく抗ＮＫＧ２Ａ抗体の予想される受容体占拠率を示す図である。２週間ごとに０．０３ｍｇ／ｋｇを投与することによってＮＫＧ２Ａ＋細胞の実質上完全（少なくとも９０％）な受容体の飽和を達成することができる。受容体飽和率は用量を増すとともに大きくなり、最も低い受容体飽和率を有する図中の描画線は、最も低い用量（０．０１ｍｇ／ｋｇ）に対応する。それぞれ漸進的により高い用量レベルは、その次に高い受容体飽和率を有する描画線に対応し、最も高い用量（１０ｍｇ／ｋｇ）に対応する線は、最も高い受容体飽和率を有する。ＮＫＧ２Ａの実質上完全な飽和を維持するためには４週間ごとに０．１ｍｇ／ｋｇの用量を投与することができる。
【図３Ａ】有効性（そのＨＬＡ−Ｅリガンドを発現させる細胞の存在下でのＮＫＧ２Ａの遮断）にとって必要な抗ＮＫＧ２Ａの濃度が、完全受容体飽和をもたらす濃度の１００倍であることを示す自家細胞検定法からの結果を示す図である。ＣＤ１０７可動化アッセイにおけるＥＣ５０濃度（最高の５０％を実現する量）は約４００ｎｇ／ｍＬであると判定され、またＥＣ１００は約１０，０００ｎｇ／ｍＬ（１０μｇ／ｍＬ）であった。
【図３Ｂ】ＩＰＨ２２０１（抗ＮＫＧ２Ａ）の第Ｉ相臨床試験からの予備ＰＫデータおよびＮＣＡ分析に基づく２週間に１度のｉ．ｖ．注射後の予想ＩＰＨ２２０１血中濃度を示す図である。２週間ごとのｉ．ｖ．注射によって投与された様々な用量により様々な血中濃度に達した。ＩＰＨ２２０１濃度は、用量を増すとともに高くなり、最も低い血中濃度を有する図中の描画線は、最も低い用量（０．０１ｍｇ／ｋｇ）に対応する。それぞれ漸進的により高い用量レベルは、その次に高い血中濃度を示す描画線に対応し、最も高い用量（１０ｍｇ／ｋｇ）に対応する線は最も高い血中濃度を表す。４ｍｇ／ｋｇの用量は、約１００μｇ／ｍＬ、すなわち組織中の有効性のほぼＥＣ１００の初期（ピーク）血中濃度と、２週の時点まで３０μｇ／ｍＬを超える持続（最小）血中濃度、または４回目の投与の時点で約１００μｇ／ｍＬの持続（最小）血中濃度とを示した。１０ｍｇ／ｋｇの用量は、約１００μｇ／ｍＬの持続（最小）血中濃度をもたらした。
【図３Ｃ】体重１ｋｇ当たり１０ｍｇの負荷用量、続いて体重１ｋｇ当たり４ｍｇの維持用量による２週間に１度のｉ．ｖ．注射後の予想ＩＰＨ２２０１血中濃度（上側の線として示される）を示す図である。これは、約１００μｇ／ｍＬの初期および持続血中濃度をもたらす。比較のために、２週間の時点で少なくとも３０μｇ／ｍＬの持続（または最小の）血中濃度をもたらす４ｍｇ／ｋｇの一定用量を示す（図中の下側の線）。
【図４Ａ−４Ｂ】ＮＫ細胞によるＨＮＳＣＣ細胞株の認識を向上させる抗ＮＫＧ２Ａの能力を示す図である。表示された標的ＨＮＳＣＣ細胞株の存在下での、また１０μｇ／ｍＬの濃度の抗ＮＫＧ２Ａの存在または不在下でのＮＫＧ２Ａ−ＮＫ上（左側）またはＮＫＧ２Ａ＋ＮＫ細胞（右側）上のＣＤ１０７（上側）およびＣＤ１３７（下側）のＦＡＣＳの読み出しを示す。この細胞株は、ＨＬＡ−Ｅの表面発現のレベルに従って左から右へ配列される。各点は、健康なボランティア由来のＰＢＭＣを表す。図４Ａは、対照と、低または高レベルの表面ＨＬＡ−Ｅを有するＫ５６２標的とを示し、図４Ｂは、抗ＮＫＧ２Ａが内因性ＨＬＡ−Ｅの発現によるＮＨＳＣＣの溶解を回復させることができることを実証する。この効果は、ＮＫＧ２Ａ陽性ＮＫ細胞上でのみ見られ、ＨＬＡ−Ｅの発現のレベルに左右される。
【図５】ＨＮＳＣＣ  ＦａＤｕ細胞に向かうＮＫ細胞が抗ＥＧＦＲであるセツキシマブ（ｃｔｘ）の最適以下の用量によって誘発されることにより、抗ＮＫＧ２Ａの最適用量がＡＤＣＣを高めたことを示す図である。
【図６Ａ−６Ｂ】抗ＮＫＧ２Ａの用量の増量および抗ＥＧＦＲ（セツキシマブ）の用量の増量の効果を示す図である。図３Ａは、標的無しおよびＫ５６２−ＨＬＡ−Ｅトランスフェクタント有りの対照上のＣＤ１０７の読み出しを示す。健康なボランティアはそれぞれ異なる記号、四角および丸によって表される。クロスオープン記号は、抗ＮＫＧ２Ａが、０．１μｇ／ｍＬのセツキシマブと共にコインキュベートされた１０μｇ／ｍＬのｈＩｇＧ４アイソタイプ対照によって置き換えられた条件に対応する。図６Ｂは、ＨＮＳＣＣ細胞株上のＣＤ１０７の読み出しを示す。セツキシマブの各濃度について抗ＮＫＧ２Ａの各濃度についての記号（丸の四角）は、左から右へ０μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、および１０μｇ／ｍＬに対応する。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
定義
本明細書中で使用される「或る（ａまたはａｎ）」は、１または複数を意味することができる。本発明の特許請求の範囲中で使用されるとき、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｇ）」と一緒に使用される場合、単語「或る（ａまたはａｎ）」は１または２以上を意味する場合がある。本明細書中で使用される「別の」は、少なくとも第二、またはそれ以降を意味することができる。
【００４４】
「（全体として）含む」が使用される場合、それは、場合によっては「実質上〜からなる」によって、または「〜からなる」によって置き換えることができる。
【００４５】
ＮＫＧ２Ａ（ＯＭＩＭ  １６１５５５、この全開示内容は参照により本明細書中に援用される）は、ＮＫＧ２の転写産物のグループのメンバーである（Ｈｏｕｃｈｉｎｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１０１７〜１０２０）。ＮＫＧ２Ａは、幾つかの選択的スプライシングを示す２５ｋｂに及ぶ７個のエキソンによってコードされる。ＣＤ９４と一緒にＮＫＧ２Ａはヘテロ二量体の障害性受容体ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを形成し、ＮＫ細胞、α／βＴ細胞、γ／δＴ細胞、およびＮＫＴ細胞のサブセットの表面に見出される。障害性ＫＩＲ受容体と同様に、それはその細胞質ドメイン中にＩＴＩＭを所有する。本明細書中で使用される「ＮＫＧ２Ａ」は、ＮＫＧ２Ａの遺伝子またはコード化タンパク質の任意のバリアント、誘導体、またはイソ型タンパク質を指す。野生型完全長ＮＫＧ２Ａと１つまたは複数の生物学的特性または機能を共有する、また少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはより高いヌクレオチドまたはアミノ酸の同一性をそれと共有する任意の核酸またはタンパク質配列もまた包含される。ヒトＮＫＧ２Ａは、３つのドメイン中に下記の配列の２３３個のアミノ酸を含む。細胞質ドメインは残基１〜７０番を含み、トランスメンブレン領域は残基７１〜９３番を含み、また細胞外領域は残基９４〜２３３番を含む。
【化１】
2017538660.tif 000003
【００４６】
ＮＫＧ２Ｃ（ＯＭＩＭ  ６０２８９１、この全開示内容は参照により本明細書中に援用される）およびＮＫＧ２Ｅ（ＯＭＩＭ  ６０２８９２、この全開示内容は参照により本明細書中に援用される）は、ＮＫＧ２の転写産物のグループの２つの他のメンバーである（Ｇｉｌｅｎｋｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８），Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４８：１６３〜１７３）。ＣＤ９４／ＮＫＧ２ＣおよびＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｅ受容体は、ＮＫ細胞およびＴ細胞などのリンパ球のサブセットの表面に見出される活性化受容体である。
【００４７】
ＨＬＡ−Ｅ（ＯＭＩＭ  １４３０１０、この全開示内容は参照により本明細書中に援用される）は、細胞表面で発現し、ペプチドの結合によって調節される非古典的ＭＨＣ分子、例えば他のＭＨＣクラスＩ分子のシグナル配列から誘導されるフラグメントなどである。ＨＬＡ−Ｅの可溶性バージョンもまた同定されている。そのＴ細胞受容体結合特性に加え、ＨＬＡ−Ｅは、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ、およびＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃと特異的に結合することによってナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）、およびＴ細胞（α／βおよびγ／δ）のサブセットに結合する（例えば、Ｂｒａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：７９５〜７９９参照、この全開示内容は参照により本明細書中に援用される）。ＨＬＡ−Ｅの表面発現は、標的細胞をＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ＋ＮＫ、Ｔ、またはＮＫＴ細胞クローンによる溶解から守る。本明細書中で使用される「ＨＬＡ−Ｅ」とは、ＨＬＡ−Ｅの遺伝子またはコード化タンパク質の任意のバリアント、誘導体、またはイソ型タンパク質を指す。野生型完全長ＨＬＡ−Ｅと１つまたは複数の生物学的特性または機能を共有する、また少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはより高いヌクレオチドまたはアミノ酸の同一性をそれと共有する任意の核酸またはタンパク質配列もまた包含される。
【００４８】
本発明の脈絡において「ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ陽性リンパ球」とは、細胞表面でＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを発現させるリンパ球系の細胞（例えばＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、およびＴ細胞）を指す。これは、例えばＣＤ９４およびＮＫＧ２Ａ上の複合エピトープおよび／または単独ＮＫＧ２Ａ上のエピトープを特異的に認識する抗体を使用するフローサイトメトリーによって検出することができる。「ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ陽性リンパ球」にはまた、リンパ球由来の不死の細胞株（例えばＮＫＬ、ＮＫ−９２）が挙げられる。
【００４９】
本発明の脈絡においては「ＮＫＧ２Ａの阻害活性を低減する」、「ＮＫＧ２Ａを中和する」、または「ＮＫＧ２Ａの阻害活性を中和する」とは、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａが、サイトカイン放出および細胞障害性応答などのリンパ球の応答につながる細胞内過程に悪影響を与えるその能力に関して阻害される過程を指す。これは、例えばＮＫ細胞またはＴ細胞を用いた細胞障害性分析において測定することができる。この分析では、治療用化合物がＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ陽性リンパ球によるＨＬＡ−Ｅ陽性細胞の致死を促進させる能力を測定する。一実施形態では抗体製剤は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを限定するリンパ球の細胞毒性の少なくとも１０％の増強、好ましくはリンパ球の細胞毒性の少なくとも４０％または５０％の増強、あるいはより好ましくはＮＫ細胞毒性の少なくとも７０％の増強を引き起こす。またこれは上記細胞障害性分析を指す。抗ＮＫＧ２Ａ抗体が、ＣＤ９４／ＮＫＧ２ＡのＨＬＡ−Ｅとの相互作用を減少または遮断する場合、それはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを限定するリンパ球の細胞毒性を増加させることができる。これは、例えばＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを発現させるＮＫ細胞およびＨＬＡ−Ｅを発現させる標的細胞を使用する、例えば標準的な４時間のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞障害性分析で評価することができる。このようなＮＫ細胞は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａがリンパ球に仲介される細胞溶解を妨げる阻害シグナルの伝達の開始および伝播を引き起こすＨＬＡ−Ｅを認識することが原因で、ＨＬＡ−Ｅを発現させる標的を効率的には殺さない。このようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞障害性分析は、例えばＣｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９９２、１９９３）中に記載されているような当技術分野でよく知られている標準的な方法によって行うことができる。リンパ球を刺激して標的細胞、例えばＰ８１５細胞、Ｋ５６２細胞、または適切な腫瘍細胞を殺すその抗体の能力を評価するためのクロムの放出および／または他のパラメータがまた、Ｓｉｖｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９７；１８６：１１２９〜１１３６、Ｖｉｔａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９８；１８７：２０６５〜２０７２、Ｐｅｓｓｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９８；１８８：９５３〜９６０、Ｎｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎ．２００１；８：１１３１〜１１３５、Ｐｅｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９９；１９０：１５０５〜１５１６中で開示されており、これらのそれぞれの全開示内容は、参照により本明細書中で援用される。標的細胞は、ＮＫ細胞の付加に先立って５１Ｃｒで標識され、次いでその致死は、致死の結果としての５１Ｃｒの細胞から培地中への放出に比例するものとして推定される。ＣＤ９４／ＮＫＧ２ＡがＨＬＡ−Ｅと結合するのを妨げる抗体の付加は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを介する阻害シグナル伝達の開始および伝播の阻止を引き起こす。したがって、そのような物質の付加は、リンパ球が仲介する標的細胞の致死の増加を引き起こす。それによってこのステップは、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａに誘発される負のシグナル伝達を、例えばリガンドの結合を遮断することにより阻止する物質を識別する。特定の５１Ｃｒ放出細胞障害性分析ではＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ発現ＮＫエフェクター細胞は、ＨＬＡ−Ｅ陰性ＬＣＬ  ７２１．２２１標的細胞を殺すことができるが、ＨＬＡ−Ｅ発現ＬＣＬ  ７２１．２２１−Ｃｗ３対照細胞をあまり殺さない。これとは対照的にＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを欠くＹＴＳエフェクター細胞は、両方の細胞株を効率的に殺す。したがってＮＫエフェクター細胞は、ＨＬＡ−Ｅに誘発されるＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを介する阻害シグナルの伝達のせいでＨＬＡ−Ｅ＋ＬＣＬ  ７２１．２２１−Ｃｗ３細胞をあまり効率的には殺さない。ＮＫ細胞が、このような５１Ｃｒ放出細胞障害性分析において本発明に従って遮断抗ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ抗体と共にプレインキュベートされる場合、ＨＬＡ−Ｅ発現ＬＣＬ  ７２１．２２１−Ｃｗ３細胞は、より効率的に抗体濃度依存的に殺される。抗ＮＫＧ２Ａ抗体の阻害活性（すなわち細胞毒性を高める可能性）はまた、複数の他の方法のいずれかで、例えばＳｉｖｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９７；１８６：１１２９〜１１３６（この開示内容は参照により本明細書中で援用される）中に記載されているように、例えば細胞内の遊離カルシウムに与えるその効果によって評価することもできる。ＮＫ細胞の細胞毒性の活性化は、例えばサイトカイン産生（例えばＩＦＮ−γの産生）または細胞毒性マーカー（例えばＣＤ１０７またはＣＤ１３７可動化）の増加を測定することによって評価することができる。典型的なプロトコルではＰＢＭＣからのＩＦＮ−γの産生が、細胞表面および細胞質内の染色と、培養液中で４日後のフローサイトメトリーによる分析とにより評価される。簡潔に言えば培養の最後の４時間にわたってブレフェルジンＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を５μｇ／ｍＬの最終濃度で加える。次いでこの細胞を抗ＣＤ３および抗ＣＤ５６ｍＡｂと一緒にインキュベートしてから透過性にし（ＩｎｔｒａＰｒｅｐＴＭ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）、ＰＥ−抗ＩＦＮ−γまたはＰＥ−ＩｇＧ１（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色する。ポリクローナルで活性化したＮＫ細胞からのＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−γの産生を、ＥＬＩＳＡ（ＧＭ−ＣＳＦ：ＤｕｏＳｅｔ  Ｅｌｉｓａ，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ、ＩＦＮ−γ：ＯｐｔＥＩＡセット，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用して上清中で測定する。
【００５０】
本明細書全体で「癌の治療」または同様のものが抗ＮＫＧ２Ａ結合物質（例えば抗体）に関連して言及される場合はいつでも、（ａ）抗ＮＫＧ２Ａ結合物質（好ましくは薬学的に許容できる担体材料中の）を癌の治療を必要とする個体、哺乳動物、とりわけヒトにそのような治療を可能にする用量（治療に有効な量）で、好ましくは本明細書中で指定する用量（量）で投与する（少なくとも１回の治療に対して）ステップを含む癌の治療方法か、（ｂ）癌の治療のための抗ＮＫＧ２Ａ結合物質の、または上記治療に（とりわけ人に）使用される抗ＮＫＧ２Ａ結合物質の使用法か、（ｃ）癌の治療用の医薬製剤の製造のための抗ＮＫＧ２Ａ結合物質の使用法、抗ＮＫＧ２Ａ結合物質を薬学的に許容できる担体と混ぜ合わせることを含む癌の治療用の医薬製剤の製造のための抗ＮＫＧ２Ａ結合物質の使用方法、または癌の治療に適した抗ＮＫＧ２Ａ結合物質の有効な用量を含む医薬製剤か、（ｄ）本願が出願される国における特許権の取得のために許容される保護対象に応じてａ）、ｂ）、およびｃ）の任意の組合せを意味する。
【００５１】
本明細書中で使用される用語「生検」は、例えば診断を立証するために検査の目的で組織を取り出すことと定義される。生検の種類の例には、吸引の適用、例えばシリンジに取り付けた針を介するもの、道具による組織の断片の切除によるもの、適切な道具による内視鏡を介しての切除によるもの、例えば病巣全体の外科的切除によるものなどが挙げられる。
【００５２】
本明細書中で使用される用語「抗体」とは、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を指す。重鎖中の定常ドメインの型に応じて抗体は、５種類の主要なクラス、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭのうちの１つに指定される。これらのうちの幾つかは、さらにサブクラスまたはアイソタイプ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４などに分類される。免疫グロブリン（抗体）の構造単位の典型的な例は、四量体を含む。各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一の対から構成され、各対は１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のＮ末端は、主として抗原の認識に関与する約１００〜１１０個、またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を定める。可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）という用語は、それぞれそれらの軽鎖および重鎖を指す。免疫グロブリンの様々なクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ「α」、「δ」、「ε」、「γ」、および「μ」と呼ばれる。免疫グロブリンの様々なクラスのサブユニット構造および三次元配置はよく知られている。ＩｇＧは、それらがその生理的状況において最も一般的な抗体であるために、またそれらが実験室の設定において最も容易に作製されるために本明細書中で採用される抗体のクラスの実例である。場合によってはこの抗体はモノクローナル抗体である。抗体の特定の例は、ヒト化抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、あるいはヒトに適合する抗体である。「抗体」にはまた、本明細書中で述べる抗体のいずれかの任意のフラグメントまたは誘導体が含まれる。
【００５３】
用語「〜と特異的に結合する」とは、好ましくは競合的結合試験において、抗体が、タンパク質の組換え型、その中のエピトープ、または単離された標的細胞の表面に存在する天然タンパク質のいずれかを使用して評価される結合の相手、例えばＮＫＧ２Ａと結合することができることを意味する。競合的結合試験および特異的結合を測定するための他の方法は、当技術分野でよく知られている。例えば結合は、放射能標識、質量分析などの物理的方法、あるいは、例えば細胞蛍光分析（例えばＦＡＣＳｃａｎ）を使用して検出される直接または間接蛍光標識を介して検出することができる。対照で見られる量を超えて結合する場合、非特異的な物質は、その物質が標的と結合することを示す。ＮＫＧ２Ａに特異的に結合する物質は、単独でＮＫＧ２Ａに、または二量体としてのＮＫＧ２ＡにＣＤ９４と一緒に結合させることができる。
【００５４】
抗体が特定のモノクローナル抗体と「競合する」と言われる場合、それは組換え分子（例えばＮＫＧ２Ａ）または表面で発現する分子（例えばＮＫＧ２Ａ）のどちらかを使用した結合試験において、抗体がモノクローナル抗体と競合することを意味する。例えばテスト抗体が、結合試験において配列番号２〜６のいずれか１つの重鎖および配列番号７の軽鎖を有する抗体のＮＫＧ２ＡポリペプチドまたはＮＫＧ２Ａ発現細胞との結合を低減させる場合、その抗体はそのような抗体とそれぞれ「競合する」と言われる。
【００５５】
本明細書中で使用される用語「親和性」とは、抗体のエピトープとの結合の強さを意味する。抗体の親和性は、［Ａｂ］×［Ａｇ］／［Ａｂ−Ａｇ］（ここで、［Ａｂ−Ａｇ］は抗体−抗原複合体の分子濃度であり、［Ａｂ］は結合していない抗体の分子濃度であり、また［Ａｇ］は結合していない抗原の分子濃度である）として定義される解離定数Ｋｄによって与えられる。親和定数Ｋａは１／Ｋｄによって定義される。ｍＡｂｓの親和性を決定するための方法は、Ｈａｒｌｏｗ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８），Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９９２，１９９３）、およびＭｕｌｌｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９２：５８９〜６０１（１９８３）中に見出すことができ、これらの参考文献は全体が参照により本明細書中に援用される。ｍＡｂｓの親和性を決定するための当技術分野でよく知られている一つの標準的な方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）スクリーニング（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭＳＰＲ分析装置による）の使用である。
【００５６】
本明細書の脈絡中で「決定子」とは、ポリペプチド上の相互作用または結合の部位を意味する。
【００５７】
用語「エピトープ」は、抗原決定子を指し、抗体が結合する抗原上の部位または領域である。タンパク質エピトープは、結合に直接に関与するアミノ酸残基と、特異的抗原が抗体またはペプチドに結合することよって効率的に遮断されるアミノ酸残基、すなわち抗体の「フットプリント」内のアミノ酸残基とを含むことができる。それは、例えば抗体または受容体と結合することができる複合抗原分子の最も単純な形態または最も小さな構造部位である。エピトープは、線状または立体配座／構造的であることができる。用語「線状エピトープ」は、アミノ酸の線状配列上で連続的（一次構造）であるアミノ酸残基から構成されるエピトープと定義される。用語「立体配座または構造的エピトープ」は、すべてが連続的とは限らない、したがって分子の折り畳み（二次、三次、および／または四次構造）によって互いに近接してもたらされるアミノ酸の線状配列の離ればなれになった部分を表すアミノ酸残基から構成されるエピトープと定義される。立体配座エピトープは、その三次元構造によって決まる。したがって用語「立体配座」は多くの場合、「構造的」と区別なく使用される。
【００５８】
用語「物質」は、本明細書中では化合物、化合物の混合物、生体高分子、または生物材料から作られる抽出物を指すために使用される。用語「治療薬」とは、生物活性を有する物質を指す。
【００５９】
本明細書における目的では「ヒト化」または「ヒト」抗体は、１種類または複数種類のヒト免疫グロブリンの定常および可変フレームワーク領域が、動物の免疫グロブリンの結合領域、例えばＣＤＲと融合している抗体を指す。このような抗体は、その結合領域が由来する非ヒト抗体の結合特異性を維持するように、しかしその非ヒト抗体に対する免疫応答を回避するように設計される。このような抗体は、抗原攻撃に応答して特異的ヒト抗体を産生するように「遺伝子的に操作された」トランスジェニックマウスまたは他の動物から得ることができる（例えばＧｒｅｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４），Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ  ７：１３、Ｌｏｎｂｅｒｇ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４），Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６、Ｔａｙｌｏｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４），Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６：５７９参照。これらの全教示内容は参照により本明細書中に援用される）。完全ヒト抗体はまた、遺伝子または染色体トランスフェクション法およびファージディスプレイ技術によって構築することもでき、これらのすべてが当技術分野で知られている（例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０），Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２〜５５３参照）。ヒト抗体はまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化させたＢ細胞によって作製することもできる（例えば、米国特許第５，５６７，６１０号明細書および同第５，２２９，２７５号明細書参照。これらはその全体が参照により援用される）。
【００６０】
「キメラ抗体」は、（ａ）抗原結合部位（可変領域）が、異なるまたは改変されたクラス（エフェクター機能）および／または種の定常領域、あるいはそのキメラ抗体に新しい特性を賦与する全く異なる分子、例えば酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬物などに連結するように、定常領域またはその部分が改変、置換、または交換されるか、（ｂ）可変領域またはその部分が、異なるまたは改変された抗体特異性を有する可変領域に改変、置換、または交換される抗体分子である。
【００６１】
用語「Ｆｃドメイン」、「Ｆｃ部分」、および「Ｆｃ領域」とは、抗体の重鎖、例えばヒトのγ（ガンマ）重鎖のおよそアミノ酸（ａａ）２３０番からおよそａａ４５０番までの、または他の種類の抗体重鎖（例えば、ヒト抗体のα、δ、ε、およびμ）ではその相手方の配列のＣ末端フラグメント、あるいはその天然に存在するアロタイプのＣ末端フラグメントを指す。別段の指定がない限り、免疫グロブリンに対して一般に認められたＫａｂａｔのアミノ酸の番号付けが本開示の全体を通じて使用される（Ｋａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１），Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  ｅｄ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ参照）。
【００６２】
用語「単離された」、「精製された」、または「生物学的に純粋な」とは、その自然な状態で見出されるような、通常はそれに付随する成分を実質上または本質的に含まない物質を指す。純度および均質性は、一般にはポリアクリルアミドゲル電気泳動または高性能液体クロマトグラフィーなどの分析化学技術を使用して測定される。製剤中に存在する支配的な種であるタンパク質は、実質上精製される。
【００６３】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書中では区別なく使用される。これら用語は、１個または複数個のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工の化学的模倣物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸に適用される。
【００６４】
例えば細胞、あるいは核酸、タンパク質、またはベクターに関して使用される場合、用語「組換え型」とは、その細胞、核酸、タンパク質、またはベクターが、異種核酸またはタンパク質の導入、あるいは天然の核酸またはタンパク質の改変によって修飾されていること、もしくはその細胞がそのように修飾された細胞に由来することを表す。したがって、例えばそれら組換え細胞は、その細胞の天然（非組換え）型の内部では見出されない遺伝子を発現させるか、そうではなくて異常発現する、低発現する、または全く発現しない天然の遺伝子を発現させる。
【００６５】
本明細書の脈絡の範囲内では、ポリペプチドまたはエピトープに「結合する」抗体という用語は、上記特異性および／または親和性を有する決定子に結合する抗体を指す。
【００６６】
２個以上のポリペプチドの配列間の関係において使用される場合、用語「同一性」または「同一」は、２つ以上のアミノ酸残基の文字列間の一致の数によって決められるポリペプチド間の配列近縁性の度合を指す。「同一性」は、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち「アルゴリズム」）によって処理されるギャップアライメント（もしあれば）を有する小さい方の２つ以上の配列間の完全な一致のパーセントを測定する。関連したポリペプチドの同一性は、既知の方法によって簡単に計算することができる。そのような方法には、これらに限定されないが、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  ｙｏｒｋ，１９８８と、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３と、Ｇｒｉｆｆｉｎ  Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  １，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４と、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７と、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１と、Ｃａｒｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．４８，１０７３（１９８８）に記載されているものが挙げられる。
【００６７】
同一性を決定するための方法は、テストされる配列間で最大の一致を与えるように設計される。同一性を決定する方法は、公開されているコンピュータプログラムに記載されている。２つの配列間の同一性を決定するためのコンピュータプログラム方法には、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１２，３８７（１９８４）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３〜４１０（１９９０））を含めたＧＣＧプログラムパッケージが挙げられる。このＢＬＡＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）および他の情報源（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ：Ａｌｔｓｃｈｕｌ等、ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４、；Ａｌｔｓｃｈｕｌ等、前掲）から公開されている。よく知られているＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムもまた、同一性を求めるために使用することができる。
【００６８】
抗体の産生
抗ＮＫＧ２Ａ物質は、ヒトＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ受容体の細胞外部分に結合し、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ陽性リンパ球の表面で発現するヒトＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ受容体の阻害活性を低減させる。一実施形態ではこの物質は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａとの結合においてＨＬＡ−Ｅと競合する。すなわちこの物質はＣＤ９４／ＮＫＧ２ＡとそのリガンドであるＨＬＡ−Ｅの間の相互作用を妨害し、低減させる。この抗体は、ＣＤ９４およびＮＫＧ２Ａ上で複合エピトープに、または単独のＮＫＧ２Ａ上でエピトープに結合することができる。一実施形態ではこの抗体は、ＨＬＡ−Ｅ結合部位と少なくとも部分的に重なり合うＮＫＧ２Ａ上でエピトープに結合する。
【００６９】
一態様において抗ＮＫＧ２Ａ物質は、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、およびキメラ抗体から選択される抗体である。一態様においてこの物質は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体由来の定常ドメインを含む。一態様においてこの物質は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、およびＩｇＭ抗体から選択される抗体のフラグメントである。一態様においてこの物質は、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、重鎖Ｉｇ（ラマまたはラクダＩｇ）、ＶＨＨフラグメント、単一ドメインＦＶ、および単鎖抗体フラグメントから選択される抗体フラグメントである。一態様においてこの物質は、ｓｃＦＶ、ｄｓＦＶ、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、κボディ、ＩｇＮＡＲ、および多重特異的抗体から選択される合成または半合成抗体由来の分子である。
【００７０】
好ましくは抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、Ｆｃγ受容体、例えばＣＤ１６との実質的な特異的結合を示さない。このような抗体は、Ｆｃ受容体に結合しないことが知られている様々な重鎖の定常領域を含むことができる。一つのこのような例は、ヒトＩｇＧ４の定常領域である。一実施形態ではＩｇＧ４抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのハーフ抗体（ｆａｂアーム交換）の形成を妨げる修飾を含む。例えばこの抗体は、ＥＵインデックス（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」，５ｔｈ  ｅｄ，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＬ，１９９１）による２２８番に対応する２４１番残基中のセリンからプロリンへの変異を含むＩｇＧ４重鎖を含む。このような修飾されたＩｇＧ４抗体は、結合親和性を変えることができる一価でそれらがＮＫＧ２Ａと結合するようにｉｎ  ｖｉｖｏでｆａｂアーム交換を受けることになる天然のＩｇＧ４とは対照的に、ｉｎ  ｖｉｖｏではそのままの状態であり、ＮＫＧ２Ａと二価（高親和性）結合を維持することになる。別法では、１個または複数個の定常領域を含まない抗体フラグメント、例えばＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントを使用してＦｃ受容体の結合を回避することができる。Ｆｃ受容体の結合は、例えばビアコア検定法で抗体のＦｃ受容体タンパク質との結合をテストすることを含めた当技術分野で知られている方法に従って評価することができる。また、Ｆｃ部分がＦｃ受容体との結合を最少にするまたは排除するように修飾された任意のヒト抗体の型（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）を使用することもできる（例えば、国際公開第０３１０１４８５号パンフレット参照。この開示内容は参照により本明細書中で援用される）。Ｆｃ受容体結合を評価するための、例えば細胞を用いたアッセイなどの検定法が当技術分野でよく知られており、例えば国際公開第０３１０１４８５号パンフレットに記載されている。
【００７１】
抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、有利なことにＮＫＧ２Ｃとの結合のＫＤの少なくとも１００分の１のＫＤでＮＫＧ２Ａの細胞外部分と結合することができる。一態様においてこの抗体は、ＮＫＧ２Ｃとの結合のＫＤの少なくとも１５０分の１、２００分の１、３００分の１、４００分の１、または１０，０００分の１のＫＤでＮＫＧ２Ａの細胞外部分と結合する。別の態様において抗体は、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、および／またはＮＫＧ２Ｈ分子と結合するためのＫＤの少なくとも１００分の１のＫＤでＮＫＧ２Ａの細胞外部分と結合する。さらなる態様においてこの抗体は、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｃ、および／またはＮＫＧ２Ｈ分子との結合のＫＤの少なくとも１５０分の１、２００分の１、３００分の１、４００分の１、または１０，０００分の１のＫＤでＮＫＧ２Ａの細胞外部分と結合する。これは、例えばビアコア実験において測定される。この実験では、物質の固定化ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ（例えば、ＣＤ９４／ＮＫＧ２発現細胞から精製される、または生物系中で産生される）の細胞外部分と結合する能力を測定し、それら物質を同じ測定法で同様に産生されたＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃおよび／または他のＣＤ９４１／ＮＫＧ２バリアントと比較する。別法では、抗体の、自然発現または過剰発現（例えば一過性または安定なトランスフェクション後の）させるいずれかの細胞との結合を測定し、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃおよび／または他のＮＫＧ２バリアントを発現させる細胞の結合と比較することもできる。抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、場合によっては、ＣＤ９４と共に障害性受容体を形成するＮＫＧ２ＡスプライスバリアントであるＮＫＧ２Ｂに結合することができる。一実施形態では親和性は、米国特許第８，２０６，７０９号明細書に開示されている方法を使用して、例えば米国特許第８，２０６，７０９号明細書（この開示内容は参照により本明細書中で援用される）の実施例８中に示されているようにビアコアにより、共有結合で固定化されたＮＫＧ２Ａ−ＣＤ９４−Ｆｃ融合タンパク質との結合を評価することによって測定することができる。
【００７２】
例えばこの抗体は、ＮＫＧ２Ａ発現細胞との結合（高親和性）の、０．５〜１０ｎｇ／ｍＬ、場合によっては１〜５ｎｇ／ｍＬ、場合によっては１〜１０ｎｇ／ｍＬ、場合によっては１〜２０ｎｇ／ｍＬの間、例えば約４ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０を有することができる。このＮＫＧ２Ａ発現細胞は、例えばヒトＰＢＭＣ中のＮＫＧ２Ａ発現細胞であることができる。一実施形態ではこのＮＫＧ２Ａ発現細胞は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを発現させるように作製された細胞、例えば米国特許第８，２０６，７０９号明細書の実施例１３（この開示内容は参照により援用される）中に示されているＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを安定して過剰発現させるＢａ／Ｆ３細胞である。一実施形態ではこの抗体は、１０−９Ｍ未満、場合によっては１０−１０Ｍ未満、または場合によっては１０−１１Ｍ未満、場合によっては１０−１０Ｍ〜１０−１２Ｍの間、場合によっては１０−１０Ｍ〜１０−１１Ｍの間のヒトＮＫＧ２Ａポリペプチドに対する結合親和性（ＫＤ）（場合によっては結合親和性は二価である）を有する。親和性を、例えば米国特許第７，９３２，０５５号明細書（この開示内容は参照により援用される）に記載にされている単鎖ＮＫＧ２Ａ−ＣＤ９４−ｍＦｃ構築物との結合に関して評価することができる。
【００７３】
この抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、例えばＶＨ１＿１８、ＶＨ５＿ａ、ＶＨ５＿５１、ＶＨ１＿ｆ、およびＶＨ１＿４６、ならびにＪＨ６  Ｊセグメントから選択されるヒト受容体配列由来のＶＨヒト受容体フレームワーク、または当技術分野で知られている他のヒト生殖細胞株のＶＨフレームワークを含む、例えばヒトまたはヒト化抗体であることができる。ＶＬ領域ヒト受容体配列は、例えばＶＬＩ＿Ｏ２／ＪＫ４であることができる。
【００７４】
一実施形態ではこの抗体は、抗体Ｚ２７０に基づくヒト化抗体である。様々なヒト化Ｚ２７０ＶＨ鎖が、配列番号２〜６（下線を引かれた可変領域ドメインのアミノ酸）に示される。ヒト化Ｚ２７０ＶＨ軽鎖は、配列番号７に示される。ｈｕｍＺ２７０抗体はまた、米国特許第８，２０６，７０９号明細書（この開示内容は参照により本明細書中で援用される）中に開示されている。ｈｕｍＺ２７０ＶＨ６（配列番号２）はＶＨ５＿５１に基づき、ｈｕｍＺ２７０ＶＨ１（配列番号３）はＶＨ１＿１８に基づき、ｈｕｍＺ２７０ＶＨ５（配列番号４）はＶＨ５＿ａに基づき、ｈｕｍＺ２７０ＶＨ７（配列番号５）はＶＨ１＿ｆに基づき、またｈｕｍＺ２７０ＶＨ８（配列番号６）はＶＨ１＿４６に基づく。これらすべてがＪＨ６  Ｊセグメントを有する。これらの抗体のそれぞれがＮＫＧ２Ｃとの高い親和性結合を保持する。これは、ヒト化構築物のそれぞれのＫａｂａｔのＣＤＲ−Ｈ２の６個のＣ末端アミノ酸残基がヒト受容体フレームワークと同一であるので、抗体に対する宿主の免疫応答の可能性が低い。アライメントプログラムＶｅｃｔｏｒＮＴＩを使用してｈｕｍＺ２７０ＶＨ１と、ｈｕｍＺ２７０ＶＨ５、ｈｕｍＺ２７０ＶＨ６、ｈｕｍＺ２７０ＶＨ７、およびｈｕｍＺ２７０ＶＨ８の間の配列同一性、７８．２％（ＶＨ１対ＶＨ５）、７９．０％（ＶＨ１対ＶＨ６）、８８．７％（ＶＨ１対ＶＨ７）、および９６．０％（ＶＨ１対ＶＨ８）を得た。
【００７５】
一態様においてこの物質は、（ｉ）配列番号２〜６のいずれかの重鎖可変領域、あるいはそれと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列、および（ｉｉ）配列番号７の軽鎖可変領域、あるいはそれと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含む。一態様においてこの物質は、（ｉ）配列番号２〜６のいずれかのアミノ酸配列、あるいはそれと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列、および（ｉｉ）配列番号７の軽鎖可変領域、あるいはそれと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含む重鎖、および（ｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列、あるいはそれと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。配列番号２〜６のいずれかの配列を含む重鎖および配列番号７の配列を含む軽鎖を有する抗体は、ＮＫＧ２Ａの阻害活性を中和するが、活性化受容体ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧＥ、またはＮＫＧ２Ｈに実質上結合しない。この抗体はさらに、細胞表面でのＮＫＧ２Ａとの結合に関してＨＬＡ−Ｅと競合する。一態様においてこの物質は、配列番号２〜６のいずれかのアミノ酸配列を有する重鎖由来のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、および／またはＨＣＤＲ３の配列を含む。本発明の一態様においてこの物質は、配列番号７のアミノ酸配列を有する軽鎖由来のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、および／またはＨＣＤＲ３の配列を含む。
【００７６】
重鎖（可変領域は下線が引かれている）
【化２】
2017538660.tif 000004
【化３】
2017538660.tif 000005
【００７７】
軽鎖
【化４】
2017538660.tif 000006
【００７８】
一態様において抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、配列番号２〜６のいずれかの残基３１〜３５番に対応するＣＤＲ−Ｈ１（アミノ酸配列ＳＹＷＭＮ（配列番号８））と、配列番号２〜６のいずれかの残基５０〜６０番に対応するＣＤＲ−Ｈ２（アミノ酸配列ＲＩＤＰＹＤＳＥＴＨＹ（配列番号９））（場合によっては、ヒト由来の６個の末端アミノ酸、すなわちＶＨ６重鎖の配列ＲＩＤＰＹＤＳＥＴＨＹＳＰＳＦＱＧ（配列番号１０）、ＶＨ１重鎖の配列ＲＩＤＰＹＤＳＥＴＨＹＡＱＫＬＱＧ（配列番号１１）などを含む場合は、５０〜６６番）と、配列番号２〜６のいずれかの残基９９〜１１４番（Ｋａｂａｔによれば９５〜１０２番）に対応するＣＤＲ−Ｈ３（アミノ酸配列ＧＧＹＤＦＤＶＧＴＬＹＷＦＦＤＶ（配列番号１２））とを含む抗体である。一実施形態ではＣＤＲ−Ｈ２は、配列番号２〜６のいずれかの残基５０〜６６番に対応する。場合によってはＣＤＲは、１個、２個、３個、４個、またはそれ以上のアミノ酸置換基を含むことができる。
【００７９】
一態様において抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、配列番号７の残基２４〜３４番に対応するＣＤＲ−Ｌ１（アミノ酸配列ＲＡＳＥＮＩＹＳＹＬＡ（配列番号１３））と、配列番号７の残基５０〜５６番に対応するＣＤＲ−Ｌ２（アミノ酸配列ＮＡＫＴＬＡＥ（配列番号１４））と、配列番号７の残基８９〜９７番に対応するＣＤＲ−Ｌ３（アミノ酸配列ＱＨＨＹＧＴＰＲＴ（配列番号１５））とを含む抗体である。場合によってはＣＤＲは、１個、２個、３個、４個、またはそれ以上のアミノ酸置換基を含むことができる。
【００８０】
一態様において抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、配列番号２〜６のいずれかの残基３１〜３５番に対応するＣＤＲ−Ｈ１と、配列番号２〜６のいずれかの残基５０〜６０番（場合によっては５０〜６６番）に対応するＣＤＲ−Ｈ２と、配列番号２〜６のいずれかの残基９９〜１１４番（Ｋａｂａｔによれば９５〜１０２番）に対応するＣＤＲ−Ｈ３と、配列番号７の残基５０〜５６番に対応するＣＤＲ−Ｌ２と、配列番号７の残基８９〜９７番に対応するＣＤＲ−Ｌ３とを含む抗体である。
【００８１】
一態様においてその物質は、前述の抗体のいずれかが結合するＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａエピトープに対して産生された完全ヒト抗体である。
【００８２】
前述の抗体を使用することができるが、他の抗体を調製することもできることを理解されたい。例えば、ＮＫＧ２Ａ（好ましいが、ヒトＮＫＧ２Ａだけには限らない）の任意のフラグメントまたはＮＫＧ２Ａフラグメントの任意の組合せは、抗体を産生させるために免疫原として使用することができ、またそれら抗体が本明細書中で述べるＮＫＧ２Ａ発現ＮＫ細胞上でエピトープを認識することができる限り、それらはＮＫＧ２Ａポリペプチド内の任意の場所でそうすることができる。最も好ましくはこのエピトープは、配列番号２〜６のいずれかの重鎖および配列番号７の軽鎖を有する抗体によって特異的に認識されるエピトープである。
【００８３】
一態様においてこの物質は、ヒトＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａの細胞外部分との結合において米国特許第８，２０６，７０９号明細書（この開示内容は参照により本明細書中で援用される）中で開示されているｈｕｍＺ２７０抗体と競合する。競合的結合は、物質の能力をｈｕｍＺ２７０で飽和した固定化ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ受容体（例えば、ＣＤ９４／ＮＫＧ２発現細胞から精製される、または生物系で産生される）の細胞外部分との結合について測定する、例えばビアコア実験において測定することができる。別法では、その物質の、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ受容体を自然発現または過剰発現（例えば一過性または安定したトランスフェクション後の）させる、かつＺ２７０の飽和用量と一緒にプレインキュベートした細胞との結合を測定する。一実施形態では競合的結合は、米国特許第８，２０６，７０９号明細書中に開示されている方法を使用して、例えば、米国特許第８，２０６，７０９号明細書の実施例１５（この開示内容は参照により本明細書中で援用される）中に示されているフローサイトメトリーによりＢａ／Ｆ３−ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ細胞との結合を評価することによって測定することができる。
【００８４】
抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、医薬製剤中に組み込むことができ、１ｍｇ／ｍＬ〜５００ｍｇ／ｍＬの濃度で含む（上記製剤は２．０〜１０．０のｐＨを有する）。この製剤はさらに、緩衝系、保存料、等張化剤、キレート剤、安定剤、および界面活性剤を含むことができる。一実施形態ではこの医薬製剤は、水性製剤、すなわち水を含む製剤である。このような製剤は、一般に溶液または懸濁液である。さらなる実施形態ではこの医薬製剤は水溶液である。用語「水性製剤」は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む製剤と定義される。同様に、用語「水溶液」は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む溶液と定義され、また用語「水性懸濁液」は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む懸濁液と定義される。
【００８５】
別の実施形態ではこの医薬製剤は凍結乾燥製剤であり、医師または患者は使用に先立ってそれに溶剤および／または希釈剤を加える。
【００８６】
別の実施形態ではこの医薬製剤は、事前に溶解することなしに使える状態の乾燥製剤（例えば凍結乾燥または噴霧乾燥された）である。
【００８７】
さらなる態様においてこの医薬製剤は、このような抗体と緩衝剤の水溶液を含み、その抗体は、１ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で存在し、また上記製剤は、約２．０〜約１０．０のｐＨを有する。
【００８８】
別の実施形態では製剤のｐＨは、約２．０〜約１０．０、約３．０〜約９．０、約４．０〜約８．５、約５．０〜約８．０、および約５．５〜約７．５からなるリストから選択される範囲にある。
【００８９】
さらなる実施形態では緩衝剤は、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸塩、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リシン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム、およびトリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン、ビシン、トリシン、リンゴ酸、コハク酸塩、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸、またはこれらの混合物からなる群から選択される。これらの特定の緩衝剤のそれぞれ一つが、本発明の代替実施形態を構成する。
【００９０】
さらなる実施形態では製剤は、薬学的に許容できる保存料をさらに含む。さらなる実施形態では製剤は、等張剤をさらに含む。さらなる実施形態では製剤はまた、キレート剤を含む。本発明の更なる実施形態では製剤は、安定剤をさらに含む。さらなる実施形態では製剤は、界面活性剤をさらに含む。便利にはＲｅｍｉｎｇｔｏｎの著：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，１９ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５が参照される。
【００９１】
他の成分が、本発明のこのペプチド医薬製剤中に存在することもできる。そのような追加の成分には、湿潤剤、乳化剤、酸化防止剤、充填剤、張度調整剤、キレート剤、金属イオン、油性媒体、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン、ゼラチン、またはタンパク質）、および双性イオン（例えば、ベタイン、タウリン、アルギニン、グリシン、リシン、およびヒスチジンなどのアミノ酸）を挙げることができる。勿論、このような追加の成分は、本発明の医薬製剤の全体的な安定性に悪影響を与えてはならない。
【００９２】
抗体を含有する医薬組成物は、そのような治療を必要とする患者に対して幾つかの部位、例えば局所部位（例えば、皮膚および粘膜の部位）、吸収を回避する部位（例えば、動脈、静脈、心臓中の投与）、および吸収と関係する部位（例えば、皮膚、皮下、筋肉、または腹部中の投与）に投与することができる。医薬組成物の投与は、幾つかの投与経路、例えばそのような治療を必要とする患者への皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、舌、舌下、口腔内、口内、経口、胃および腸内、鼻、肺（例えば気管支および肺胞、またはその組合せを介して）、表皮、皮膚、経皮、膣、直腸、眼（例えば結膜を介して）、尿管、および腸管外の投与によることができる。
【００９３】
悪性腫瘍の診断および治療
個体における癌の診断、予後、監視、治療、および予防に役立つ方法を述べる。本明細書中で述べる方法は充実性腫瘍の治療に特に役立つが、本明細書中で述べる治療計画はまた、様々な血液癌だけでなく感染性疾患、炎症性疾患、および自己免疫疾患に対して使用することができる。本発明の方法および組成物は、これらに限定されないが、例えば癌腫（扁平上皮細胞の癌腫を含めた膀胱、乳房、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、前立腺、膵臓、胃、子宮頚、甲状腺、および皮膚の癌腫）、リンパ系統の造血器腫瘍（白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、有毛細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、および多発性骨髄腫を含む）、脊髄系統の造血器腫瘍（急性および慢性骨髄性白血病、前骨髄球性白血病、および骨髄異形成症候群を含む）、間葉由来の腫瘍（線維肉腫および横紋筋肉腫を含む）、他の腫瘍（黒色腫、精上皮腫、奇形癌、神経芽細胞腫、および神経膠腫を含む）、中枢および末梢神経系の腫瘍（星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、および神経鞘腫を含む）、間葉由来の腫瘍（線維肉腫、横紋筋肉腫、および骨肉腫を含む）、および他の腫瘍（黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、精上皮腫、甲状腺濾胞癌、および奇形癌を含む）を含めた様々な癌および他の増殖性疾患の治療に使用される。
【００９４】
リンパ系統の造血器腫瘍の例には、これには限定されないが、例えばＴ前リンパ球性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）（小細胞および脳回転様細胞型のものを含む）、好ましくはＴ細胞型の大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＬ）、セザリー症候群（ＳＳ）、成人Ｔ細胞白血病リンパ腫（ＡＴＬＬ）、Ｔ−ＮＨＬ脾肝リンパ腫、末梢／成熟Ｔ細胞リンパ腫（多形性および免疫芽細胞サブタイプ）、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、血管中心性（鼻）Ｔ細胞リンパ腫、未分化（Ｋｉ  １＋）大細胞リンパ腫、腸Ｔ細胞リンパ腫、Ｔリンパ芽球性リンパ腫／白血病（Ｔ−Ｌｂｌｙ／Ｔ−ＡＬＬ）、多発性骨髄腫などのＴ細胞の障害を含めたＴ細胞およびＢ細胞の腫瘍が挙げられる。
【００９５】
一実施形態では癌は、頭部および頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）である。一実施形態ではこのＨＮＳＣＣは、口腔咽頭癌、咽頭癌、口腔の腫瘍、または下咽頭の腫瘍である。一実施形態ではこのＨＮＳＣＣは、口腔ＳＣＣ（ＯＣＳＣＣ）である。ＯＣＳＣＣは、口唇、舌の前方２／３、口腔底、頬粘膜、歯齦、硬口蓋、および臼歯後三角の扁平上皮癌を含む。一実施形態ではこのＨＮＳＣＣは転移性癌である。
【００９６】
充実性腫瘍を有する個体を治療する場合、ヒトＮＫＧ２Ａポリペプチドの阻害活性を中和する化合物（例えば抗体）は有利には、癌細胞を取り除く外科手術を受けたことがない、または当期にそのような外科手術を受けていない癌を有する個体に本明細書中で述べる治療計画に従って投与することができる。しかしながらこの化合物はまた、癌細胞を取り除く外科手術を受けたことがある、または受けようとしている患者に投与することもできることを理解されたい。抗ＮＫＧ２Ａ化合物が、癌細胞を取り除く（例えばＨＮＳＣＣ細胞を取り除く）外科的介入を受けたことがない個体に投与される場合、ＮＫＧ２Ａ結合化合物は、例えば外科手術の約１〜８週間前に投与することができる。一実施形態では抗ＮＫＧ２Ａ化合物による治療の少なくとも１回（例えば１回、２回、３回、またはそれ以上）の完全投与サイクルが、外科手術に先立って施される。一実施形態ではこの投与は、２週間〜８週間の間である。
【００９７】
一実施形態では本明細書中で開示される方法で治療される癌は、ＨＬＡ−Ｅを発現する癌である。
【００９８】
癌を有する患者は、腫瘍細胞の表面でのＨＬＡ−Ｅの発現を評価する事前検出のステップの有無にかかわらず抗ＮＫＧ２Ａ物質で治療することができる。有利にはこの治療方法は、個体からの腫瘍の生体試料中のＨＬＡ−Ｅ核酸またはポリペプチド（例えば腫瘍細胞上の）を検出するステップを含むことができる。生体試料の例には、任意の適切な生体体液（例えば血清、リンパ液、血液）、細胞試料、または組織試料が挙げられる。例えば組織試料は、腫瘍組織または腫瘍に隣接する組織であることができる。場合によってはＨＬＡ−Ｅポリペプチドは、悪性細胞の表面で検出される。生体試料がＨＬＡ−Ｅを発現させる（例えば、基準と比較して、抗ＨＬＡ−Ｅ抗体を著しく発現させる、高レベルで発現させる、ＨＬＡ−Ｅで高強度に染色する）という判定は、その個体が、ＮＫＧ２Ａを阻害する物質による治療からの強い恩恵を受けることができる癌を有することを示す。一実施形態ではこの方法は、生体試料中のＨＬＡ−Ｅ核酸またはポリペプチドの発現のレベルを判定すること、およびそのレベルを健康な個体に対応する基準レベル（例えば、数値、細胞表面の弱い染色など）と比較することを含む。生体試料が基準レベルと比較して高いレベルでＨＬＡ−Ｅ核酸またはポリペプチドを発現させるという判定は、その個体が、ＮＫＧ２Ｃを阻害する物質で治療することができる癌を有することを示す。
【００９９】
一実施形態では、生体試料（例えば、腫瘍細胞、腫瘍組織、および／または腫瘍に隣接する組織を含む試料）が、ＨＬＡ−Ｅ核酸またはポリペプチドを著しく発現させるという判定は、その個体が、ＮＫＧ２Ａを阻害する物質で治療することができる癌を有することを示す。ＨＬＡ−Ｅポリペプチドを指す場合、「著しく発現している」とは、そのＨＬＡ−Ｅポリペプチドが、所与の個体から採取された相当な数の腫瘍細胞中で発現していることを意味する。用語「著しく発現している」の定義は、正確なパーセント値に縛られないが、幾つかの例では「著しく発現している」と言われる受容体は、患者から採取された腫瘍細胞の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、またはそれ以上に存在することになる。
【０１００】
個体が、ＨＬＡ−Ｅポリペプチドを発現させる癌細胞を有するかどうかの判定は、例えば、癌細胞を含む個体から生体試料を得る（例えば、生検を実施することによって）ステップ、上記細胞を、ＨＬＡ−Ｅポリペプチドに結合する抗体と接触させるステップ、およびそれらの表面でその細胞がＨＬＡ−Ｅを発現させるかどうかを検出するステップを含む。場合によっては、個体がＨＬＡ−Ｅを発現させる癌細胞を有するかどうかの判定は、免疫組織化学試験を行うステップを含む。場合によっては、個体がＨＬＡ−Ｅを発現させる癌細胞を有するかどうかの判定は、フローサイトメトリー試験を行うステップを含む。
【０１０１】
一つの例示的態様においては、検出可能なレベルの癌細胞を有する哺乳動物の宿主（例えば、ヒトの患者）における癌の進行を緩和させる方法が提供され、この方法は、抗ＮＫＧ２Ａ抗体を、その宿主中の癌の進行を検出可能に緩和させるのに十分な投与量および頻度（本開示による）で投与することを含む。
【０１０２】
一実施形態では、個体における疾患（例えば、血液癌、炎症性または自己免疫疾患、感染症）を治療または予防するための方法が提供され、この方法は、疾患を有する個体に、ヒトＮＫＧ２Ａポリペプチドの阻害活性を中和する抗体を、実質上完全（例えば９０％、９５％）な受容体の飽和に必要な濃度（例えばＰＢＭＣ中のＮＫＧ２Ａ発現細胞上の抗ＮＫＧ２Ａ抗体を、例えば滴定することによって評価される）の少なくとも１０、２０、３０、または５０倍の循環血液中の濃度を達成する量で投与することを含む。この抗体は、例えば、ヒトＰＢＭＣ中で、０．５〜１０ｎｇ／ｍＬ、場合によっては１〜１０ｎｇ／ｍＬ、場合によっては１〜２０ｎｇ／ｍＬの間、例えば約４ｎｇ／ｍＬのＮＫＧ２Ａ発現細胞との結合のＥＣ５０を有することができる。
【０１０３】
一実施形態では個体における疾患（例えば、充実性腫瘍、炎症性または自己免疫疾患、発明）を治療または予防するための方法が提供され、この方法は、疾患を有する個体に、ヒトＮＫＧ２Ａポリペプチドの阻害活性を中和する抗体を、実質上完全（例えば９０％、９５％）な受容体の飽和に必要な濃度（例えばＰＢＭＣ中のＮＫＧ２Ａ発現細胞上の抗ＮＫＧ２Ａ抗体を、例えば滴定することによって評価される）の少なくとも１０、２０、３０、または５０倍の問題の血管外組織（例えば腫瘍または腫瘍環境）中の濃度を達成する量で投与することを含む。
【０１０４】
遮断抗ＮＫＧ２Ａ抗体ｈｕｍＺ２７０のＮＫＧ２Ａ＋ＮＫ細胞応答のＥＣ５０は約４μｇ／ｍＬであり、したがってこの抗ＮＫＧ２Ａ抗体の量が、少なくとも約４μｇ／ｍＬの血中濃度を達成かつ／または維持するように投与される。有利には抗ＮＫＧ２Ａ抗体の量は、少なくとも約１０μｇ／ｍＬ（ＮＫＧ２Ａ＋ＮＫ細胞の応答のＥＣ５０）の個体中の血中濃度を達成かつ／または維持するように個体に投与される。例えば、達成かつ／または維持される血中濃度は、１０〜１２μｇ／ｍＬの間、１０〜１５μｇ／ｍＬの間、１０〜２０μｇ／ｍＬの間、１０〜３０μｇ／ｍＬの間、１０〜４０μｇ／ｍＬの間、１０〜５０μｇ／ｍＬの間、１０〜７０μｇ／ｍＬの間、１０〜１００μｇ／ｍＬの間、１０〜１５０μｇ／ｍＬの間、または１０〜２００μｇ／ｍＬの間であることができる。一実施形態では抗ＮＫＧ２Ａ抗体の量は、少なくとも約４μｇ／ｍＬ（ＮＫＧ２Ａ＋ＮＫ細胞の応答のＥＣ５０）、または場合によっては少なくとも約１０μｇ／ｍＬ（ＮＫＧ２Ａ＋ＮＫ細胞の応答のＥＣ１００）の個体中の組織濃度を達成かつ／または維持するように個体に投与される。血管系の外側の組織が標的にされる（例えば、充実性腫瘍の治療において）場合、抗ＮＫＧ２Ａ抗体の量は、少なくとも約１０μｇ／ｍＬの組織濃度を達成かつ／または維持するように投与される。例えば、少なくとも約１００μｇ／ｍＬの血中濃度を達成する抗ＮＫＧ２Ａ抗体の量を投与することにより、少なくとも１０μｇ／ｍＬの血管外組織（例えば腫瘍組織）の濃度が達成されることが予想される。例えば、組織中で１０μｇ／ｍＬを達成／維持するために達成かつ／または維持されるべき血中濃度は、１００〜１１０μｇ／ｍＬの間、１００〜１２０μｇ／ｍＬの間、１００〜１３０μｇ／ｍＬの間、１００〜１４０μｇ／ｍＬの間、１００〜１５０μｇ／ｍＬの間、１００〜２００μｇ／ｍＬの間、１００〜２５０μｇ／ｍＬの間、または１００〜３００μｇ／ｍＬの間であることができる。
【０１０５】
幾つかの実施形態では抗ＮＫＧ抗体の量は、ＮＫＧ２Ａ＋ＮＫ細胞の応答の少なくともＥＣ５０、場合によっては約または少なくとも約ＥＣ１００に相当する血中（血清）濃度を得るように投与される。ＮＫＧ２Ａ＋ＮＫ細胞の応答は、ＨＬＡ−Ｅ発現標的細胞に対するＮＫＧ２Ａ発現ＮＫ細胞の細胞毒性活性の適切な検定法を使用して評価することができる。例には、ＮＫ細胞活性化のマーカー、例えば本明細書の実施例中で示すＣＤ１０７またはＣＤ１３７発現に基づく検定法が挙げられる。ＮＫＧ２Ａ＋ＮＫ細胞の応答に関する「ＥＣ５０」とは、そのようなＮＫＧ２Ａ＋ＮＫ細胞の応答に関するその最大の応答または効果の５０％を生み出す抗ＮＫＧ２Ａ抗体の有効濃度を指す。ＮＫＧ２Ａ＋ＮＫ細胞の応答の「ＥＣ１００」とは、そのようなＮＫＧ２Ａ＋ＮＫ細胞の応答に関してその実質的に最大の応答または効果を生み出す抗ＮＫＧ２Ａ抗体の有効濃度を指す。幾つかの実施形態では、特に充実性腫瘍の治療の場合、その達成される濃度は、ＮＫＧ２Ａ＋ＮＫ細胞の応答の少なくともＥＣ５０、場合によっては約または少なくとも約ＥＣ１００に相当する組織中（血管系の外側、例えば腫瘍または腫瘍環境中）の濃度を生じさせるように設計される。
【０１０６】
ヒトを治療するための適切な治療プロトコルは、例えばその患者に抗ＮＫＧ２Ａ抗体の有効量を投与することを含み、その方法は、その抗ＮＫＧ２Ａ抗体の少なくとも１回の用量が体重１ｋｇ当たり２〜１０ｍｇ、場合によっては４〜１０ｍｇ、場合によっては６〜１０ｍｇ、場合によっては８〜１０ｍｇ、場合によっては２〜４ｍｇ、場合によっては４〜６ｍｇ、場合によっては４〜８ｍｇ、場合によっては６〜８ｍｇの用量で投与される少なくとも１回の投与サイクルを含む。場合によっては抗ＮＫＧ２Ａ抗体の少なくとも２、３、４、５、６、７、または８用量が投与される。一実施形態では投与サイクルは、２週間〜８週間の間である。一実施形態では投与サイクルは８週間である。一実施形態では投与サイクルは８週間であり、２週間ごとにこの抗ＮＫＧ２Ａ抗体の１用量（合計４用量）を投与することを含む。
【０１０７】
本明細書中の実施形態のいずれかのうちの一態様ではこの抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、およそ２週間ごとに１回投与される。
【０１０８】
ヒトを治療するための適切な治療プロトコルは、例えばその患者に抗ＮＫＧ２Ａ抗体の有効量を投与することを含み、その抗体は１ヶ月当たり２回投与され、その抗ＮＫＧ２Ａ抗体の少なくとも２回の相継ぐ投与間で抗ＮＫＧ２Ａ抗体の少なくとも１０μｇ／ｍＬの持続血中濃度を維持するのに有効な量は、体重１ｋｇ当たり２〜１０ｍｇの間、場合によっては２〜６ｍｇの間、場合によっては２〜８ｍｇの間、場合によっては２〜４ｍｇの間、場合によっては２〜３ｍｇの間、あるいは場合によっては約２、３、または４ｍｇである。これらの用量は、場合によっては、治療サイクル全体を通じて抗ＮＫＧ２Ａ抗体の少なくとも１０μｇ／ｍＬの持続血中濃度をもたらすように選択することができる。抗ＮＫＧ２Ａ抗体の１０μｇ／ｍＬの血中濃度を達成することは、ヒト化Ｚ２７０などの抗体のＥＣ１００に相当する。
【０１０９】
ヒトを治療するためのさらに適切な治療プロトコルは、例えばその患者に抗ＮＫＧ２Ａ抗体の有効量を投与することを含み、その抗体は１ヶ月当たり２回投与され、その抗ＮＫＧ２Ａ抗体の少なくとも２回の相継ぐ投与間で抗ＮＫＧ２Ａ抗体の少なくとも４０μｇ／ｍＬの持続血中濃度を維持するのに有効な量は、体重１ｋｇ当たり２〜１０ｍｇの間、場合によっては２〜８ｍｇの間、場合によっては２〜６ｍｇの間、場合によっては２〜４ｍｇの間、場合によっては２〜３ｍｇの間、あるいは場合によっては約２、３、または４ｍｇである。これらの用量は、場合によっては、治療サイクル全体を通じて抗ＮＫＧ２Ａ抗体の少なくとも４０μｇ／ｍＬの持続血中濃度をもたらすように投与することができる。４０μｇ／ｍＬの抗ＮＫＧ２Ａ抗体の血中濃度を達成することは、約４μｇ／ｍＬの、そしてまたヒト化Ｚ２７０などの抗体に対するＮＫＧ２Ａ＋ＮＫ細胞の応答のＥＣ５０に相当する組織（例えば血管外組織、充実性腫瘍の腫瘍環境）濃度をもたらすと予想される。
【０１１０】
ヒトを治療するためのさらに有利な適切な治療プロトコルは、例えばその患者に抗ＮＫＧ２Ａ抗体の有効量を投与することを含み、その抗体は１ヶ月当たり２回投与され、その抗ＮＫＧ２Ａ抗体の少なくとも２回の相継ぐ投与間で抗ＮＫＧ２Ａ抗体の少なくとも１００μｇ／ｍＬの持続血中濃度を維持するのに有効な量は、体重１ｋｇ当たり４〜１０ｍｇの間、場合によっては４〜６ｍｇの間、場合によっては４〜８ｍｇの間、場合によっては約４ｍｇ、場合によっては約６ｍｇ、場合によっては約８ｍｇ、または場合によっては約１０ｍｇである。これらの用量は、場合によっては、治療サイクル全体を通じて抗ＮＫＧ２Ａ抗体の少なくとも１００μｇ／ｍＬの持続血中濃度をもたらすように投与することができる。抗ＮＫＧ２Ａ抗体の１００μｇ／ｍＬの血中濃度を達成することは、約１０μｇ／ｍＬの、そしてまたヒト化Ｚ２７０などの抗体のＥＣ１００に相当する組織（例えば血管外の腫瘍環境）濃度をもたらすと予想される。
【０１１１】
癌を有するヒトを治療するためのさらに有利な適切な治療プロトコルは、より高い用量による負荷期間、続いて維持期間を使用する投薬計画を含む。例えば負荷期間は、その患者に抗ＮＫＧ２Ａ抗体の有効量を投与することを含むことができ、その抗体は、その維持投薬計画における抗ＮＫＧ２Ａ抗体の最初の投与まで、抗ＮＫＧ２Ａ抗体の少なくとも１００μｇ／ｍＬの持続血中濃度を維持するのに有効な量が１回または複数回投与される。例えば１回投与される場合、抗ＮＫＧ２Ａ抗体の１０ｍｇ／ｋｇの負荷用量を投与することができ、その維持投薬計画内の抗ＮＫＧ２Ａ抗体の最初の投与は、この負荷用量の約２週間（またはそれ以下）後に行われる。次いで維持投薬計画は、その維持投薬計画内の相継ぐ投与間で抗ＮＫＧ２Ａ抗体の少なくとも１００μｇ／ｍＬの持続血中濃度を維持するために、より低い用量および／またはより低い頻度の投与を使用することができる。例えば維持投薬計画は、２週間ごとに抗ＮＫＧ２Ａ抗体を、体重１ｋｇ当たり２〜１０ｍｇの間、場合によっては４〜１０ｍｇの間、場合によっては２〜４ｍｇの間、場合によっては４〜６ｍｇの間、場合によっては４〜８ｍｇの間、場合によっては約４ｍｇ、場合によっては約６ｍｇ、場合によっては約８ｍｇの用量で投与することを含む。
【０１１２】
一態様において抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、その抗ＮＫＧ２Ａ抗体の少なくとも２回の相継ぐ投与間の循環血液中の細胞上でのＮＫＧ２Ａの顕著な「不飽和化」なしに、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間の期間にわたってＮＫＧ２Ａ＋ＮＫ細胞の応答の少なくともＥＣ５０、場合によってはおよそまたは少なくともおよそＥＣ１００に相当する血（血清）中および／または組織（例えば腫瘍組織）中の濃度を得るような量で投薬される。別の態様において抗体は、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間の期間にわたってＮＫＧ２Ａ＋ＮＫ細胞の応答の少なくともＥＣ５０、場合によってはおよそまたは少なくともおよそＥＣ１００に相当し、かつその抗ＮＫＧ２Ａ抗体の２回の相継ぐ投与間（または各投与の間の）に循環血液中の細胞上でのＮＫＧ２Ａの顕著な「不飽和化」を可能にする血中（血清）および／または組織（例えば腫瘍組織）中の濃度を得るような量で投薬される。例えば、この抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、治療期間中、例えばその抗ＮＫＧ２Ａ抗体の少なくとも２回の相継ぐ投与間で循環血液中の細胞上でＮＫＧ２Ａの少なくとも５０％の不飽和化を引き起こすことができる量および頻度で投与することができる。一例では、循環血液中の細胞上のＮＫＧ２Ａの顕著な「不飽和化」を可能にする量は、ＮＫＧ２Ａ＋ＮＫ細胞の応答のＥＣ５０未満、場合によってはＮＫＧ２Ａ＋ＮＫ細胞の応答のＥＣ２０未満の血中濃度をもたらす量である。
【０１１３】
ヒトを治療するための有利な適切な治療計画は、例えばその患者に抗ＮＫＧ２Ａ抗体の有効量を投与することを含み、その抗体は、少なくとも約１週間、または少なくとも２週間の期間にわたって、抗ＮＫＧ２Ａ抗体の少なくとも１０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、または１００μｇ／ｍＬの血中濃度を達成するのに有効な、かつその抗ＮＫＧ２Ａ抗体の２回の相継ぐ投与間（または各投与の間）の循環血液中の細胞上でのＮＫＧ２Ａの顕著な「不飽和化」を可能にする（例えば、その後に不飽和化する）量で投与される。
【０１１４】
例えばその場合、その抗体は１ヶ月当たりわずか１回（または約２ヶ月ごとにわずか１回投与）投与され、かつ少なくとも約１週間、または少なくとも約２週間の期間にわたって抗ＮＫＧ２Ａ抗体の少なくとも１０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、または１００μｇ／ｍＬの血中濃度を達成するのに有効な量は、体重１ｋｇ当たり２〜１０ｍｇの間、場合によっては２〜８ｍｇの間、場合によっては２〜６ｍｇの間、場合によっては２〜４ｍｇの間、場合によっては２〜３ｍｇの間、または場合によっては約２、３、または４ｍｇである。
【０１１５】
循環血液中の細胞上のＮＫＧ２Ａの飽和（および不飽和化）は、末梢血試料を取得し、受容体占拠を評価するための標準的な方法を使用して評価することができる。
【０１１６】
別の態様では、癌の進行のリスクを減らす、開始を経た細胞集団におけるさらなる癌の進行のリスクを減らす、かつ／またはヒト患者における癌の進行を緩和するための治療計画を提供する方法が提供され、この方法は、その患者に応答（部分的または完全な応答）を達成するのに十分な量および投薬計画で１回または複数回の最初の治療（例えば、化学療法剤などの導入療法）を施し、次いでその患者に抗ＮＫＧ２Ａ抗体の量を本開示による用量および頻度で投与することを含む。
【０１１７】
さらなる態様では、ヒト患者などの個体中の癌の寛解を促進させる方法が提供され、この方法は、その個体に、この個体中の癌の寛解を促進させるように抗ＮＫＧ２Ａ抗体を含む組成物を本開示による用量および頻度で投与することを含む。さらなる態様では、ヒト患者などの個体中において、先行する抗癌治療後の寛解中に癌が再発するのを防止する方法が提供され、この方法は、この個体中の癌の寛解を促進させるように、その個体に抗ＮＫＧ２Ａ抗体を含む組成物を本開示による用量および頻度で投与することを含む。
【０１１８】
さらなる態様では、癌を発現するリスクを減らす、癌症状の発症までの時間を短くするリスクを減らす、かつ／または癌の重症度が初期の段階であると診断されるリスクを減らす方法が提供され、この方法は、望ましい生理学的効果を達成するように予防に有効な抗ＮＫＧ２Ａ抗体の量を個体に本開示による用量および頻度で投与することを含む。
【０１１９】
さらなる態様では、癌と診断されたヒト患者が妥当な期間を超えて生存する可能性を増す方法が提供される。別の態様では、癌患者の生活の質を改善する方法が提供され、この方法は、その生活の質を改善するのに有効な量で組成物をこの患者に投与することを含む。さらなる態様では、本明細書中で述べる方法を適用して脊椎動物の宿主中の癌細胞の数を、例えば癌細胞の総数を著しく減らすことができる。関連する意味で脊椎動物、例えばヒトの癌患者中の癌細胞を殺す（例えば、直接的または間接的のどちらかでその死を引き起こす）方法が提供される。
【０１２０】
この抗ＮＫＧ２Ａ抗体は、単剤療法として、あるいは第二の治療剤、例えば抗ＥＧＦＲ抗体との補助的または併用投与（同時投与）により投与することができる。補助的または併用投与には、それら化合物の同一または異なる投与形態での同時投与、あるいはそれら化合物の別々の投与（例えば、逐次投与）が挙げられる。したがってこの抗ＮＫＧ２Ａ抗体および第二の治療剤は、単一製剤として同時に投与することができる。別法では、この抗ＮＫＧ２Ａ抗体および第二の治療剤は、別々に投与するように製剤化することもでき、それらは同時または順次投与される。この第二の治療剤は通常は、治療されている特定の疾患または状態のための単一療法においてその物質に対して一般に使用される量および治療計画で投与されることになる。
【実施例】
【０１２１】
実施例１：ヒト化Ｚ２７０のビアコア分析
ヒト化Ｚ２７０（ｈｕｍＺ２７０）は、米国特許第８，２０６，７０９号明細書（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）に記載されており、その開示内容は参照により本明細書中で援用される。米国特許第８，２０６，７０９号明細書に記載されているように、ｈｕｍ２７０  ＶＫＩ＿Ｏ２／ＪＫ４軽鎖および様々な重鎖の受容体フレームワークが、ヒトＩｇＧ４抗体として産生された。重鎖フレームワークは、ＶＨ１＿１８／ＪＨ６に基づく「ＶＨ１」、ＶＨ５＿ａに基づく「ＶＨ５」、ＶＨ５＿５１に基づく「ＶＨ６」、ＶＨ１＿ｆに基づく「ＶＨ７」、およびＶＨ１＿４６に基づく「ＶＨ８」を含み、すべてがＪＨ６  Ｊセグメントを有する。抗原結合特性は、ビアコアＴ１００（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｅｄｅｎ）で分析された。この抗原は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を使用してアミン基を介してセンサーＣＭ５チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｅｄｅｎ）上に共有結合により固定化された単鎖ＮＫＧ２Ａ−ＣＤ９４−ｍＦｃ構築物の形態であった。固定化レベルは３００ＲＵを目標にした。Ｚ２７０抗体バリアントは、ランニング緩衝液ＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％（ｖ／ｖ）トゥイーン−２０）で濃度系列（０．１５７、０．３１３、０．６２５、１．２５、２．５ｎＭ）に希釈された。次いですべての試料を、その固定化された抗原上に４０μＬ／分の流量で２分間注入した。続いて、抗体の解離分析のためにランニング緩衝液を４０μＬ／分で３分間注入した。各作業の後、再生緩衝液（１０ｍＭ  ＮａＯＨ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ）を注入（３０秒、１０μＬ／分）して残留している抗体を完全に抗原から取り除いた。データをビアコアＴ１００評価ソフトウェアで評価した。
【０１２２】
ヒト化Ｚ２７０  ＶＨ１の親和性は６７ｐＭであると判定された。ＶＨ５、ＶＨ６、ＶＨ７、およびＶＨ８の親和性は同程度であった。
【０１２３】
【表１】
2017538660.tif 000007
【０１２４】
実施例２：ｈｕｍＺ２７０は競合的ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａアンタゴニストである
米国特許第８，２０６，７０９号明細書に記載のように、ｈｕｍＺ２７０がリガンド（すなわちＨＬＡ−Ｅ）のＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａとの結合を阻止するかどうかをテストするために、ＨＬＡ−Ｅ四量体がＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ過剰発現Ｂａ／Ｆ３細胞（Ｂａ／Ｆ３−ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ）と結合するのを阻止する能力についてｈｕｍＺ２７０をテストした。それぞれ配列番号３および７の重鎖および軽鎖を有するｈｕｍＺ２７０ＶＬ１／ＮＨ１がこの実施例において使用され、特に反対の記載がない限りこの抗体はまた、下記のすべての他の実施例についてｈｕｍＺ２７０であるとして使用された。この場合、Ｂａ／Ｆ３−ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａは、１）様々な濃度のｈｕｍＺ２７０と共にインキュベートされるか、２）最初に飽和濃度のＨＬＡ−Ｅ四量体（４．７μｇ／ｍＬ）と共にインキュベートされ、次いで様々な濃度のｈｕｍＺ２７０と共にインキュベートされた。すべてのインキュベーションは、氷上の２％ＦＣＳを含有する組織培地中で行われた。続いて細胞をマウスＡｂ’ｓに対して特異的なＡＰＣ接合二次抗体と共にインキュベートし、ＢＤ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  ＦＡＣＳａｒｒａｙを使用したフローサイトメトリーによって分析した。
【０１２５】
ｈｕｍＺ２７０は、濃度依存的にＢａ／Ｆ３−ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ細胞に効率的に結合する（ダイヤモンド）。しかしながら、細胞がＨＬＡ−Ｅ四量体と共にプレインキュベートされた場合、ｈｕｍＺ２７０は、Ｂａ／Ｆ３−ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ細胞との結合を阻止された。したがってｈｕｍＺ２７０およびＨＬＡ−Ｅは、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ上でエピトープとオーバーラップして結合する。したがってＮＫ細胞障害性分析におけるｈｕｍＺ２７０のＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ阻害効果は、ＨＬＡ−ＥがＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを介して細胞障害性リンパ球に対する負のシグナルを誘発する能力を阻止する結果であるらしい。したがってｈｕｍＺ２７０は、競合的ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａアンタゴニストとみなすことができる。
【０１２６】
実施例３：ＮＫＧ２Ａの発現に基づくｒｍａ−ｒａｅ１腫瘍を有するＣ５７／ｂＩ６マウス中のＮＫおよびＴ細胞のサブセットの分布
腫瘍の設定においてＮＫＧ２Ａの発現をさらに調べるために、ＮＫＧ２Ａの分布をマウス中のＮＫおよびＴ細胞サブセットに関して検討した。リンパ球を、脾臓から、腫瘍所属リンパ節から、また充実性腫瘍内部から採取した。
【０１２７】
Ｃ５７／ＢＬ６マウスにＲＭＡ−Ｒａｅクローン６（２００万個の細胞）を移植（ｓｃ）した。これらの腫瘍細胞は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２ＡリガンドＱａ−１を発現させる。マウスは１２日目に犠牲にされ、平均腫瘍体積：７２３ｍｍ３、ＳＤ：１６１ｍｍ３、ｎ＝４であった。脾臓、ＬＮ、および腫瘍から細胞懸濁液を調製した後、細胞を染色した。すなわち、ＣＤ３ｅ：ＰｅｒＣＰ  ＣＹ５．５、ＮＫＰ４６：Ａｌｅｘａ  ６４７、ＮＫＧ２Ａ／Ｃ／Ｅ：ＦＩＴＣ、ＣＤ８：パシフィックブルー。
【０１２８】
表１〜３に示す結果は、ＮＫＧ２Ａ発現ＮＫおよびＣＤ８＋Ｔリンパ球が、腫瘍環境内で有意なパーセンテージで見出され、またＮＫＧ２Ａ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞が、脾臓または腫瘍所属リンパ節中ではなく腫瘍環境中に高いパーセンテージで存在することを明らかにした。このＮＫ細胞サブセットにおいて所属リンパ節および脾臓の両方の細胞は、約半分がＮＫＧ２Ａ陽性、半分がＮＫＧ２Ａ陰性であった。このＴ細胞サブセットにおいて大部分の細胞は、ＮＫＧ２Ａ陰性であった（リンパ節の１．１％および脾臓の４．７％のみがＮＫＧ２Ａ＋である）。このＣＤ８  Ｔ細胞サブセットにおいて大部分の細胞はＮＫＧ２Ａ陰性であった（リンパ節の１．６％および脾臓の３．９％のみがＮＫＧ２Ａ＋である）。しかしながら、腫瘍の外側のＣＤ８  Ｔ細胞はほとんどＮＫＧ２Ａを発現しないが、腫瘍浸潤ＣＤ８  Ｔ細胞サブセットは２６．３％のＮＫＧ２Ａ＋陽性細胞の平均値を有した。ＣＤ８−Ｔ細胞サブセットのうちでＴＩＬｓと脾臓またはリンパ節細胞との間で観察されるＮＫＧ２Ａ発現の違いはほとんどなく、腫瘍中のＣＤ８−Ｔ細胞のわずか５．１％がＮＫＧ２Ａを発現したに過ぎなかった。
【０１２９】
【表２】
2017538660.tif 000008
【０１３０】
【表３】
2017538660.tif 000009
【０１３１】
【表４】
2017538660.tif 000010
【０１３２】
実施例４：ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受容体の飽和、すなわち全血中でのヒト化抗ＮＫＧ２Ａ抗体ＩＰＨ２２０１のＮＫＧ２Ａ＋ＮＫ細胞との結合
抗ＮＫＧ２Ａの受容体占拠をヒト血液中でｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価した。これは、ヒト患者における抗ＮＫＧ２Ａの薬物動態の予測を提供する。この検討は、全血中でのｈｕｍＺ２７０の細胞親和性と、全血の１μＬ当たりの、かつまたヒトの細胞１個当たりの利用可能なＮＫＧ２Ａ受容体の絶対数とをｅｘ  ｖｉｖｏで推定することを目的とした。受容体の親和性および総数は、ヒト中のｍＡｂの薬物動態（ＰＫ）と薬力学（ＰＤ）の両方に影響を与える可能性がある。これらのデータは、最初のヒト用量試験を設計するために使用されることになるＰＫ／ＰＤモデルに対するインプットとして使用されることになる。ヒトの全血を各ドナーから収集し、直ちに処理した。ｈｕｍＺ２７０の滴定を８人のボランティア由来の全血中で行った（ｍＡｂは室温（ＲＴ）で３０分間インキュベートされた）。最大結合の０〜１００％の間の全範囲の結合に及ぶように１５種類のｍＡｂ濃度がテストされ、これは９０μｇ／ｍＬから０．００００１９μｇ／ｍＬまで（１／３段階希釈、１５ポイントおよび０）に相当する。試料は、赤血球を除去し、細胞を固定するために処理され、血球計算機上で獲得された。キャリブレーションビーズを使用して、ＭＦＩ結果をＭＥＳＦ（可溶性蛍光分子数（Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｏｆ  Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅ））に変換した。通門は、ＮＫＧ２Ａを発現させるＣＤ４５＋リンパ球上で行われた。
【０１３３】
３本のチューブを、血液中に加えられたフローカウントビーズを使用するリンパ球サブセットの絶対計数に専念させた。最初に、滴定がｈｕｍＺ２７０を使用して行われ、結合したｈｕｍＺ２７０がＰＥ共役型抗ｈＩｇＧ４二次抗体を使用して検出された。滴定はまた、ＰＥ共役型ｈｕｍＺ２７０でも行われ、それを結合したｈｕｍＺ２７０で行った滴定と比較して、ｈｕｍＺ２７０の薬理学的特性に及ぼすＰＥとの共役の影響を検討し、またｈｕｍＺ２７０の飽和濃度に対する受容体の総数を評価した。
【０１３４】
分析は、ＮＫＧ２Ａ＋細胞サブセット、すなわちＮＫ細胞およびＴ細胞に重点を置いた。リンパ球のこれらのサブセットは、すべてがＮＫＧ２Ａを発現させるとは限らず、したがって問題にしている各集団のＮＫＧ２Ａ−サブセットが検討され、ＮＫＧ２Ａ＋サブセットと比較された。これら細胞集団は、下記のように定義される。
−  リンパ球：それらの粒度とサイズ、およびＣＤ４５の発現に従ってＣＤ４５／ＳＳＣプロット上で画定される。
−  ヒトＮＫリンパ球：リンパ球のうちのＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞。
−  ＣＤ８  Ｔ細胞：リンパ球のうちのＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞。
−  ＮＫＧ２Ａ＋リンパ球：リンパ球のうちのＮＫＧ２Ａ＋細胞。
【０１３５】
全体の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を各集団について記録した。キャリブレーションビーズが、ＰＥチャンネル中で蛍光を発現させるためにＭＥＳＦとして使用された。この検討において問題にしている主要な集団は、主としてＮＫ細胞を含むＮＫＧ２Ａ＋リンパ球である。
【０１３６】
結果は、ヒト抗ＮＫＧ２Ａ  ｍＡｂ（ｈｕｍＺ２７０）が、末梢血リンパ球の２つのサブセット、ＮＫ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞と結合することを示した。
【０１３７】
結果を図１にまとめる。ｈｕｍＺ２７０（ＩＰＨ２２０１とも呼ばれる）をｘ軸上に記入される様々な濃度（ｎｇ／ｍＬ）で示し、また受容体結合のＭＥＳＦシグナルをｙ軸上に示す。抗体は、ＮＫＧ２Ａ＋細胞に対して約４ｎｇ／ｍＬの結合親和性（ＥＣ５０）を有した（ＫＤ〜４ｎｇ／ｍＬ）。このＫＤは、他のアッセイにおいて、とりわけビアコア検定おけるＰＢＭＣとの結合に対する親和性および組換えＮＫＧ２Ａに対する親和性で観察されたＫＤ値と一致する。完全受容体占拠（ＥＣ１００）に対するＫＤは、約１００ｎｇ／ｍＬであった。
【０１３８】
実施例５：関節リウマチのヒト第Ｉ相臨床試験におけるＩＰＨ２２０１の受容体飽和
ｈｕｍＺ２７０、すなわちヒトＩｇＧ４抗体を、ｉｎ  ｖｉｖｏでの高親和性の二価結合を維持するように、ＥＵインデックスによる２２８番に対応する重鎖の２４１番残基のセリンからプロリンへの変異（Ｓ２４１Ｐ変異）を有する重鎖により産生させた。ｈｕｍＺ２７０（ＩＰＨ２２０１）の安全性プロフィールが、安定しかつ管理された関節リウマチを有する９２人の患者で二重盲検、プラセボ比較、用量増加の第Ｉ相臨床試験において検討された。この３つで武装された第Ｉ相臨床試験ではＺ２７０またはプラセボが、１０ｍｇ／ｋｇまでの単回投与（ｉ．ｖ．）として、あるいは４ｍｇ／ｋｇまでの単回投与（ｓ．ｃ．）または反復投与（ｓ．ｃ．）（２週間の間隔で与えられる４回の投与）として投与された。ｉ．ｖ．による単回投与としてテストされる用量は、０．０００２ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０２５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、３．５ｍｇ／ｋｇ、および１０ｍｇ／ｋｇであった。すべての患者が、最低１２週間にわたって追跡調査された。この安全性プロフィールは、きわめて順調であった。ＭＴＤには達しなかった。ＳＵＳＡＲもなく、薬物関連の重大な有害事象もなく、注入に関連した反作用もなく、また免疫に関連した有害事象もなかった。鼻咽頭炎および頭痛が、２つの最も頻繁に報告された有害事象であった。
【０１３９】
受容体の飽和は、ｈｕｍＺ２７０抗体を捕獲するために使用されるマウスＦｃヒトＮＫＧ２Ａ融合タンパク質による通常のサンドイッチＥＬＩＳＡのフォーマットを使用して評価された。ｈｕｍＺ２７０抗体を含有する血清試料と一緒にインキュベートした後、結合した抗体（この検討における検体）は、ビオチン化マウス抗ヒトＩｇＧ４を使用して検出される。ＨＲＰで標識したアビジンを加えて固相結合ビオチン化抗ヒトＩｇＧ４にタグを付け、発色ＨＲＰ基質（ＴＭＢ）をエンドポイントの検出のために使用する。臨床試験で使用され、実質上完全な受容体飽和をもたらすことになる、抗ＮＫＧ２Ａ（ＩＰＨ２２０１）用量レベルに対する最適用量および投与頻度が、薬物動態ソフトウェアパッケージ（ＷｉｎＮｏｎＬｉｎ  ６．３．０３９５、Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して開発されたＰＫ／ＰＤモデル、すなわちＲＡ患者のＩＰＨ２２０１の第Ｉ相臨床試験からの臨床データに基づくモデルを使用して予測された。ＩＰＨ２２０１を使用する臨床治療での投与頻度は、飽和に必要な定常状態の血漿濃度と、ＩＰＨ２２０１分布のクリアランスおよび量によって決まる。
【０１４０】
ＩＰＨ２２０１第Ｉ相臨床試験（ｉ．ｖ．注射）の予備ＰＫデータおよびＮＣＡ分析は、本発明者らがＰＫモデルのＰＫパラメータを見積もることを可能にした。公称時間が使用された。一次除去と、ミカエリス・メンテン動力学によってモデル化した非線形標的介在性薬物消滅（ｎｏｎ  Ｌｉｎｅａｒ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）とによる標準的な２コンパートメントモデルが選択された。用量依存的クリアランスがＮＣＡ分析で観察され、このモデルに適用された。クリアランスは、０．４ｍｇ／ｋｇ未満では用量の増加と共に減少し、次いでより高い用量では一定のままである。この予備ＰＫモデルは、用量依存性が標的受容体（低用量では）の飽和およびＦｃＲｎ受容体（高用量）の飽和を反映するＩｇＧに関する既知のＰＫ特性と矛盾しない（Ｂｒａｍｂｅｌｌ）。
【０１４１】
母集団ＰＤのモデル化を、進行中の第Ｉ相臨床試験から入手できる予備ＮＫＧ２Ａ占拠データに基づいて行った。
【０１４２】
シグモイドＥｍａｘモデルを使用して血漿濃度−効果の関係に当てはめた。このモデルは、Ｅｍａｘの５０％、すなわちここではＮＫＧ２Ａ占拠率の５０％に達する血清薬物濃度として定義されるＥＣ５０によって特徴付けられた。
【０１４３】
しかしながら、ＰＤデータをＰＫデータに対してプロットした場合、投与後の時間が増すにつれて、最も高いＩＰＨ２２０１濃度について得られる最大ＮＫＧ２Ａ占拠率（Ｅｍａｘ）は、時間依存的に直線的に低下し、用量の影響は全くないことが観察された。同様にＥＣ５０は、時間と共に直線的に増加するように見えた。ＮＫＧ２Ａ占拠プロフィールでのこの観察結果をモデル化するために、経時的なＥｍａｘの減少およびＥＣ５０の増加が、ＮＫＧ２Ａ占拠データを記述するために盛り込まれた。
【０１４４】
ＮＫＧ２Ａ占拠率％＝（Ｅｍａｘ（ＥｍａｘＦａｌｌ×ＴＳＬＤ））×Ｃγ／（（ＥＣ５０＋ＥＣ５０ｉｎｃ×ＴＳＬＤ）γ＋Ｃγ）
式中、ＴＳＬＤ＝最後の投与からの時間（Ｔｉｍｅ  Ｓｉｎｃｅ  Ｌａｓｔ  Ｄｏｓｅ）、Ｅｍａｘ＝１００％、ＥｍａｘＦａｌｌ＝経時的なＥｍａｘの減少の速度、ＥＣ５０ｉｎｃ＝ＥＣ５０の増加の速度。
【０１４５】
モデル化の結果を図２に示す。ＮＫＧ２Ａ＋細胞の事実上完全（少なくとも９０％）な受容体の飽和は、２週間ごとに０．０３ｍｇ／ｋｇを投与することによって達成することができる。ＮＫＧ２Ａの事実上完全飽和を維持するために０．１ｍｇ／ｋｇの用量を４週間ごとに投与することができる。血管外組織（例えば充実性腫瘍）における飽和が望ましい場合、約１０倍の用量が必要であると考えられ、これは２週間ごとに約０．４ｍｇ／ｋｇ、４週間ごとに１ｍｇ／ｋｇの用量に言い換えられる。
【０１４６】
このヒト臨床試験からのＮＫＧ２Ａ受容体の飽和に関する結果は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで求められた完全受容体占拠（ＥＣ１００）に必要とされる抗ＮＫＧ２Ａの濃度と一致する（実施例４参照）。
【０１４７】
実施例６：ＩＰＨ２２０１を使用するＮＫＧ２Ａ遮断に対するＣＤ１０７の応答
サイトカインで活性化される精製ＮＫ細胞（エフェクター細胞）によって仲介される致死を評価するために、エフェクター細胞および標的細胞を使用した自家ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験を１２人のヒト個体で行った。３人のドナーについてはＣＤ１０７可動化および占拠の評価を並行して行った。この標的細胞は自己ＳＥＢ芽球であった。この致死は、ＮＫ細胞によって仲介されると考えられる。またそれはＨＬＡ−Ｅからの阻害シグナルを打ち消すことが予想されるので、抗ＮＫＧ２Ａ抗体によって特異的に増加することができる。抗体ｈｕｍＺ２７０に関する濃度域の応答が、４時間の細胞毒性試験で行われた。精製ＮＫ細胞と、生み出される実験結果に基づくＣＤ１０７可動化アッセイの使用とが選択された。最初に、このＦＡＣＳを用いたＣＤ１０７アッセイが、ＮＫＧ２Ａを発現させるＮＫ細胞の細胞毒性応答を具体的に検討すること、およびＮＫＧ２Ａを発現させないＮＫ細胞と比較することを可能にする。クロム放出アッセイなどの代替のプロトコルは、ＮＫＧ２Ａ＋細胞のパーセンテージが低いドナーにおいて問題となるＮＫＧ２Ａの発現に左右される効果を区別することを可能にしていない。
【０１４８】
自己ＳＥＢ芽球が、凍結ＰＢＭＣを２００ＩＵ／ｍＬの組換えヒトＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）および１００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ  Ｂ，Ｓｉｇｍａ）と共に完全培地（ＲＰＭＩ、１０％ＦＣＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン）中で４日間インキュベートすることによって作製された。次いで、「Ｓｔｅｍｓｅｐ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｔｉｏｎ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ４  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｋｉｔ」（商品番号＃１４０５２Ａ）を使用することによってＣＤ４  Ｔ細胞をネガティブセレクションした。純度をＦＡＣＳによって評価し、またＨＬＡ−Ｅの発現をＰＥ接合抗ＨＬＡ−Ｅクローン３Ｄ１２（Ｅ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で測定する。Ｔ  ＣＤ４  ＳＥＢ芽球は、自己反応性Ｔ  ＣＤ４＋細胞を模倣して自己細胞を生み出すためのすぐれたモデルと考えられる。
【０１４９】
精製ＮＫ細胞は凍結ＰＢＭＣから調製した。すなわち、Ｓｔｅｍ  ＳｅｐシステムによりヒトＮＫを精製し、１０ＩＵ／ｍＬの組換えＩＬ−２を補った完全培地中でＯ／Ｎ培養した。ＰＢＭＣは、収集した血液から調製した。血液は輸血の資格を与えられており、したがってドナーは匿名であり、また多分健康であった。ＰＢＭＣを調製し、等分し、検討の前に窒素槽中に保管した。
【０１５０】
受容体飽和のＫｄおよびＣＤ１０７可動化のＥＣ５０の計算は、４つのパラメータに関する非線形回帰当てはめを使用するＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアで行った。抗ＮＫＧ２Ａ（ＩＰＨ２２０１）の精製ＮＫ細胞との結合の滴定曲線からの親和定数Ｋｄを推定するために、３０および９０μｇ／ｍＬについての値は、それらの濃度で幾つかの不自然な結果が観察されたので除外した。
【０１５１】
結果を図３Ａにまとめる。驚くべきことに有効性（遮断）にとって必要とされる抗ＮＫＧ２Ａの濃度は、完全な受容体飽和をもたらす濃度の１００倍である。ＣＤ１０７可動化アッセイでのＥＣ５０濃度（最大の５０％を与える量）は、約４００ｎｇ／ｍＬであると決定され、またＥＣ１００は、約１０，０００ｎｇ／ｍＬ（１０μｇ／ｍＬ）であった。これとは対照的に、実施例４に示すように受容体飽和のＥＣ５０濃度は約４ｎｇ／ｍＬ、またそのＥＣ１００は約１００ｎｇ／ｍＬであり、第Ｉ相臨床試験からのデータによってもまた裏付けられる濃度であった（実施例５参照）。
【０１５２】
ＣＤ１０７可動化および占拠の並行評価に関する３人のドナーの場合、ＣＤ１０７の個々のＥＣ５０値は、受容体飽和の個々のＫｄの約１００倍であった。すべてのデータを評価した場合、同じの比率が観察された（受容体飽和のＫｄの中央値は０．００５μｇ／ｍＬ、ｎ＝５、ＣＤ１０７可動化のＥＣ５０の中央値は０．４０μｇ／ｍＬ、ｎ＝９）。これは、それらドナーが総じてＩＰＨ２２０１に対して同程度の受容体親和性を有すること、および受容体飽和と生物学的活性の関係は似ていることを示唆する。
【０１５３】
実施例７：ＮＫＧ２Ａ遮断に対するＣＤ１０７の応答に与えるＨＬＡ−Ｅ発現レベルの影響
受容体飽和について得られるＫｄとＣＤ１０７可動化のＥＣの間のこの１００倍の差は、高い結合活性でＮＫ細胞上のＮＫＧ２Ａに結合させるＣＤ１０７アッセイ（これは、ＨＬＡ−Ｅが関与しない受容体飽和実験と比較して受容体の機能的飽和に達するためにより多量のＩＰＨ２２０１を必要とする）における標的細胞上の膜結合性ＨＬＡ−Ｅによって、説明することができる可能性がある。
【０１５４】
この可能性を調べるために、実施例６における自己ＳＥＢ芽球の生物学的効果について観察されるＥＣを、様々なレベルのＨＬＡ−Ｅの発現を有する細胞のＥＣと比較した。ＨＬＡ−ＥでトランスフェクトされたヒトＫ５６２細胞が、高ＨＬＡ−Ｅ発現細胞として選択された。実施例６で述べた精製ＮＫ細胞を使用してＦＡＣＳを用いたＣＤ１０７アッセイを行った。
【０１５５】
各実験では、ＰＥ共役型抗ＨＬＡ−Ｅ  ｍＡｂ、３Ｄ１２を使用して、自己のＣＤ４＋ＳＥＢ芽球および選択されたＫ５６２−ＨＬＡ−ＥクローンをＨＬＡ−Ｅの発現についてテストした。Ｋ５６２−ＨＬＡ−Ｅトランスファクタント上のＨＬＡ−Ｅ発現は、自己ＳＥＢ芽球上で観察される恒常的なＨＬＡ−Ｅ発現の少なくとも２０倍であった。このＳＥＢ芽球の純度は、９６％±０．８１８（ＳＤ、ｎ＝１２、範囲９４．６％〜９７．１％）。Ｔ  ＣＤ４  ＳＥＢ芽球およびＫ５６２−ＨＬＡ−Ｅ上のＨＬＡ−Ｅの発現は、すべてのドナー間で似ていた。
【０１５６】
受容体飽和について得られるＫｄとＣＤ１０７可動化のＥＣの間の１００倍の差のこの観察結果の確証により、Ｋ５６２−ＨＬＡ−ＥトランスファクタントのＥＣ５０（中央値４．１μｇ／ｍＬ）と比較して、ＳＥＢ芽球の生物学的効果について観察されるこのより低いＥＣ（中央値０．４０μｇ／ｍＬ）は、細胞表面でのＨＬＡ−Ｅ発現の少なくとも２０倍の差によって説明することができる。この場合、ＨＬＡ−Ｅは、Ｋ５６２−ＨＬＡ−Ｅトランスファクタント上ではより高い密度で発現するので、自己ＳＥＢ芽球と比べた場合、ＨＬＡ−Ｅと競合するためには、より高い量のＩＰＨ２２０１が必要である。
【０１５７】
実施例８：ＩＰＨ２２０１の繰返し注射についての薬物動態モデルの予測
実施例７の自己（ＳＥＢ）細胞で観察されるＣＤ１０７可動化のＥＣに基づき、かつ実施例５で述べた第Ｉ相臨床試験からの血中濃度の結果を取り込むことにより、この臨床試験において使用され、有効性を与える抗ＮＫＧ２Ａ（ＩＰＨ２２０１）の用量レベルに対する最適投与頻度を決めるためのモデル化を行った。
【０１５８】
この臨床試験において使用される抗ＮＫＧ２Ａ（ＩＰＨ２２０１）の用量レベルに対する最適の用量および投与頻度を、薬物動態ソフトウェアパッケージ（ＷｉｎＮｏｎＬｉｎ  ６．３．０．３９５、Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して開発されたＰＫ／ＰＤモデル、すなわちＲＡ患者でのＩＰＨ２２０１第Ｉ相臨床試験からの臨床データに基づくモデルを使用して予測した。ＩＰＨ２２０１を使用する臨床治療における投与頻度は、必要とされる定常状態血漿濃度と、ＩＰＨ２２０１の分布のクリアランスおよび量によって決まる。
【０１５９】
ＩＰＨ２２０１第Ｉ相臨床試験（ｉ．ｖ．注射）のための予備ＰＫデータおよびＮＣＡ分析は、本発明者らがＰＫモデルのＰＫパラメータを見積もることを可能にした。公称時間が使用された。一次除去と、ミカエリス・メンテン動力学によってモデル化した非線形標的介在性薬物消滅とによる標準的な２コンパートメントモデルが選択された。用量依存的クリアランスがＮＣＡ分析で観察され、このモデルに適用された。クリアランスは、０．４ｍｇ／ｋｇ未満では用量の増加と共に減少し、次いでより高い用量については一定のままである。この予備ＰＫモデルは、用量依存性が標的受容体（低用量では）の飽和およびＦｃＲｎ受容体（高用量）の飽和を反映するＩｇＧに関する既知のＰＫ特性と矛盾しない（Ｂｒａｍｂｅｌｌ）。
【０１６０】
第Ｉ相臨床試験からの予備ＰＫおよびＰＤデータに基づく下記のＰＫおよびＰＤパラメータが観察されたデータにベストフィットした。
【０１６１】
【表５】
2017538660.tif 000011
【０１６２】
図３Ｂは、２週間ごとにｉ．ｖ．によって投与された様々な用量で到達した様々な血中濃度を示す。用量レベルは、体重１ｋｇ当たり０．０１ｍｇ、０．０２ｍｇ、０．０３ｍｇ、０．０４ｍｇ、０．２ｍｇ、０．４ｍｇ、２ｍｇ、４ｍｇ、および１０ｍｇであった。図３Ｂ中の線は、下部から上部へＩＰＨ２２０１の用量の増加に対応し、最も低い用量はグラフの下部の最も低い線に、最も高い用量はグラフの上部の最も高い線に対応する。０．０１ｍｇ／ｋｇの用量は、約０．２μｇ／ｍＬの初期（ピーク）血中濃度をもたらした。０．０４ｍｇ／ｋｇの用量は、約１μｇ／ｍＬの、すなわち４００ｎｇ／ｍＬの有効性のＥＣ５０を超える初期（ピーク）血中濃度をもたらしたが、２週間後にはそのＥＣ５０を下回った。０．４ｍｇ／ｋｇの用量は、約１０μｇ／ｍＬの、すなわち循環血液中の有効性のほぼＥＣ１００の初期（ピーク）血中濃度および２週間の時点まで３μｇ／ｍＬを超える持続血中濃度をもたらした。４ｍｇ／ｋｇの用量は、約１００μｇ／ｍＬの、すなわち組織中の有効性のほぼＥＣ１００の初期（ピーク）血中濃度および２週間の時点まで３０μｇ／ｍＬを超える持続血中濃度をもたらした。しかしながら、４ｍｇ／ｋｇの用量を繰返し投与で投与する場合、４回目の用量は、約１００μｇ／ｍＬの持続血中濃度をもたらす。１０ｍｇ／ｋｇの用量は、約１００μｇ／ｍＬの持続血中濃度をもたらした。
【０１６３】
図３Ｃは、負荷用量と維持用量が使用される場合の２週間ごとにｉ．ｖ．によって投与された様々な用量で到達した様々な血中濃度を示す。２週間の投与頻度において体重１ｋｇ当たり１０ｍｇの負荷用量、続いて体重１ｋｇ当たり４ｍｇの維持用量（図３Ｃ中の上側の線）は、約１００μｇ／ｍＬの初期および持続血中濃度をもたらした。比較のために４ｍｇ／ｋｇの一定用量を図３Ｃ中の下側の線として示す。この一定用量は、２週間で最初と後続の注射の間の少なくとも３０μｇ／ｍＬの持続（または最小）血中濃度、２回目の注射後の２週間で少なくとも５０μｇ／ｍＬの持続（または最小または残留）血中濃度、３回目の注射後の２週間で少なくとも６０〜７０μｇ／ｍＬの持続（または最小または残留）血中濃度をもたらす。
【０１６４】
実施例９：ＮＫ細胞活性化に与える抗ＮＫＧ２Ａの用量応答の影響
ＨＮＳＣＣに対する免疫療法の手法は、ＨＮＳＣＣによって誘導される深刻な免疫抑制（これは免疫刺激効果の有効性を低減させる可能性がある）によって特に複雑になる（例えば、Ｄｕｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０），Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０：１〜１５参照）。この実験の目的は、ＮＫＧ２Ａを標的にする抗ＮＫＧ２Ａ抗体がＨＮＳＣＣ細胞を除去することができるかどうかを検討することであった。
【０１６５】
ＮＫ細胞活性化に与える抗ＮＫＧ２Ａの用量応答の影響をＣＤ１０７およびＣＤ１３７の発現の分析によって調べた。４時間の時点のＣＤ１０７可動化は、ＮＫ細胞による溶解性顆粒の放出のマーカーである（Ａｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４），Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２９４（１〜２）：１５〜２２）。２４時間の時点のＣＤ１３７の発現の増加は、ＮＫ細胞を含めた幾種類かのリンパ球の活性化と相関関係がある（Ｋｏｈｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１），Ｂｌｏｏｄ  １１７（８）：２４２３〜２４３２）。ＣＤ１０７およびＣＤ１３７の発現の分析は、ＮＫＧ２Ａを発現させるまたは発現させないＮＫ細胞（それぞれ、ＮＫＧ２Ａ＋ＮＫ細胞またはＮＫＧ２Ａ−ＮＫ細胞）上で行った。抗体はＮＫＧ２Ａを標的にしているので、その影響はＮＫＧ２Ａ＋ＮＫ細胞上でのみ見られることが予想され、したがってＮＫＧ２Ａ−ＮＫ細胞は、これら実験における内部対照とみなすことができる。
【０１６６】
使用されるエフェクター細胞は、健康なボランティア由来の新たに単離されたＰＢＭＣであり、また標的細胞は、ＨＬＡ−ＥをトランスフェクトされたＨＮＳＣＣ細胞株か、Ｋ５６２細胞株のクローンであった。細胞を数え、完全培地中で２日間ごとに継代培養した。生存率が測定され、９０％を超えているはずであった。それらを培地液中で１２継代まで維持した。実験の前日、細胞の数を数え、１００，０００細胞／ウェルに調整した。生存率が測定され、９０％を超えているはずであった。
【０１６７】
Ｋ５６２細胞株は、Ｋ５６２クローンＥ６（ＨＬＡ−Ｅ陽性、ＣＤ３２ｌｏｗ）およびＫ５６２クローンＦ７（ＨＬＡ−Ｅ陰性／ｌｏｗ、ＣＤ３２ｌｏｗ）であった。ヒトの頭部および頸部癌の細胞株をＨＬＡ−Ｅの発現に関してフローサイトメトリーによって選別した（下記の表Ｃ参照）。３種類の細胞株、ＦａＤｕ（ＡＴＣＣ  ＃ＨＴＢ−４３）、Ｈ−Ｎ（ＤＳＭＺ  ＃ＡＣＣ  ４１７）、およびＣＡＬ−２７（ＤＳＭＺ  ＃ＡＣＣ  ４４６）を機能試験のために選択した。
【０１６８】
【表６】
2017538660.tif 000012
【０１６９】
使用されるエフェクター細胞は、健康なボランティア由来の新たに単離されたＰＢＭＣであった。標的細胞は、Ｅ：Ｔ比２．５／１としてのＨＮＳＣＣ細胞株（ＦａＤｕ、Ｈ−Ｎ、およびＣＡＬ−２７）およびＨＬＡ−ＥをトランスフェクトされたＫ５６２細胞株のクローン（クローンＥ６＝ＨＬＡ−Ｅ＋、クローンＦ７＝ＨＬＡ−Ｅ−）であった。読み出しは、４時間の時点におけるＣＤ１０７対２４時間の時点におけるＣＤ１３７であった。７人のドナー（ＦａＤｕおよびＨ−Ｎ）および２人のドナー（ＣＡＬ−２７）がテストされた。重鎖アミノ酸配列が配列番号３で示され、軽鎖アミノ酸配列が配列番号７で示される抗ＮＫＧ２Ａ抗体ｈｕｍＺ２７０  ＶＨ１を１０μｇ／ｍＬの最終濃度で使用した。
【０１７０】
図４Ａおよび４Ｂは、対照または表示された標的細胞株の存在下での、また１０μｇ／ｍＬの濃度の抗ＮＫＧ２Ａの存在または不在下でのＮＫＧ２Ａ−ＮＫ上（左側）またはＮＫＧ２Ａ＋ＮＫ細胞（右側）上のＣＤ１０７（上側）およびＣＤ１３７（下側）のＦＡＣＳの読み出しを示す。細胞株は、ＨＬＡ−Ｅの表面の発現のレベルに従って左から右へ配列される。各点は、健康なボランティア由来のＰＢＭＣを表す。図４Ｂは、ＨＮＳＣＣ細胞株を示し、また抗ＮＫＧ２Ａが内因性ＨＬＡ−Ｅの発現によるＨＮＳＣＣの溶解、またはＨＬＡ−ＥをトランスフェクトされたＫ５６２の溶解を回復させることができることを実証する。この効果は、ＮＫＧ２Ａ陽性ＮＫ細胞上でのみ見られ、ＨＬＡ−Ｅの発現のレベルに左右される。実際には抗ＮＫＧ２Ａの効果は、中〜高のＨＬＡ−Ｅの発現レベルを有する細胞株上で見られる。
【０１７１】
抗ＮＫＧ２Ａは、障害性受容体ＮＫＧ２ＡのＨＬＡ−Ｅとの相互作用を遮断することによってＨＬＡ−Ｅ発現細胞株のＮＫに仲介される溶解を誘発することができる。この効果は、ＨＬＡ−ＥをトランスフェクトされたＫ５６２細胞株上で観察されるが、より重要なことにはＦａＤｕおよびＣＡＬ−２７細胞株などの内因性のＨＬＡ−Ｅの発現を伴うＨＮＳＣＣ細胞株上で観察される。抗ＮＫＧ２Ａの効果の程度は、標的細胞の細胞表面におけるＨＬＡ−Ｅの発現のレベルに左右される。
【０１７２】
実施例１０：最適用量の抗ＮＫＧ２Ａと最適以下の用量のセツキシマブの併用効果
上皮細胞増殖因子（ＥＧＦＲ）（またＥｒｂＢ−１、ヒトのＨＥＲ１）は、受容体チロシンキナーゼのＥｒｂＢ／ＨＥＲファミリー中で遍在的に発現される膜貫通型糖タンパク質である。ＥＧＦＲの高い発現は、ＨＮＳＣＣを含めた大部分の上皮悪性腫瘍で起こり、予後不良と関係がある。天然のリガンドによるその活性化は、腫瘍成長を駆動する細胞増殖、浸潤、血管形成、および転移の活性化を調節する細胞内シグナル伝達経路の開始につながる。
【０１７３】
抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体セツキシマブは、ＥＧＦ受容体経路の腫瘍シグナル伝達の遮断を介して、またＦｃγ受容体に仲介される抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）を誘発することによって作用すると考えられる。しかしながら、ＨＮＳＣＣにおいてＡＤＣＣは、誘発される深刻な免疫抑制の影響を受ける可能性がある。同時に、ＥＧＦ受容体経路の腫瘍シグナル伝達の遮断は、ＮＫ細胞上およびＴ細胞のサブセット上で活性化受容体ＮＫＧ２Ｄによって認識されるＭＩＣＡ／ＢおよびＵＬＢＰタンパク質ファミリーの主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩに関係した抗原の腫瘍細胞における転写後調節を引き起こす。具体的には、ＮＫＧ２Ａの天然リガンドであるこれらのストレスに関係した抗原の腫瘍細胞による発現は、臨床的ＥＧＦＲ阻害剤によって減少し、こうして腫瘍細胞がＮＫおよびＴ細胞に認識される度合を減少させる可能性がある（Ｖａｎｔｏｕｒｏｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．６：２３１ｒａ４９（２０１４））。
【０１７４】
この実験は、抗ＮＫＧ２Ａ抗体がＨＮＳＣＣ中でＮＫ細胞を活性化させる能力に与えるＥＧＦＲ阻害抗体の効果を調べるために設計された。ＮＫ細胞活性化に与えるセツキシマブの用量応答の影響が、エフェクター細胞として健康なボランティアから新たに単離されたＰＢＭＣを、また標的細胞としてＨＮＳＣＣ細胞株（ＦａＤｕおよびＨ−Ｎ）をＥ：Ｔ比２．５／１で使用したＣＤ１０７およびＣＤ１３７の分析によって判定された。読み出しは、３人のドナー（４時間でのＣＤ１０７の読み出し）および４人のドナー（２４時間でのＣＤ１０７の読み出し）を使用した４時間の時点のＣＤ１０７対２４時間の時点でＣＤ１３７であった。セツキシマブは、用量応答を１０μｇ／ｍＬから開始する１／１０段階希釈でテストされた。一人の健康なボランティアについてはＮＫ細胞は、ＮＫＧ２Ａ＋およびＮＫＧ２Ａ−のサブセットにさらに分けられた。抗ＮＫＧ２Ａ抗体がＨＮＳＣＣ中のＮＫ細胞を活性化させる能力に与えるＥＧＦＲ阻害抗体の影響を調べるさらなるテストのために最適以下の用量のセツキシマブが選択された。０．００１μｇ／ｍＬ（１ｎｇ／ｍＬ）の用量が、ＣＤ１０７およびＣＤ１３７の両方の読み出しで観察されるセツキシマブ効果の出発点である。０．００１μｇ／ｍＬ（１０ｎｇ／ｍＬ）の用量は、セツキシマブ効果のほぼＥＣ５０である。
【０１７５】
抗ＮＫＧ２Ａと最適以下の用量のＥＧＦＲ阻害剤の併用効果が、エフェクター細胞として健康なボランティアから新たに単離されたＰＢＭＣと、標的細胞としてＨＮＳＣＣ細胞株（ＦａＤｕ、Ｈ−Ｎ、およびＣＡＬ−２７）およびＨＬＡ−ＥをトランスフェクトされたＫ５６２細胞株のクローン（クローンＥ６＝ＨＬＡ−Ｅ＋、クローンＦ７＝ＨＬＡ−Ｅ−）とをＥ：Ｔ比２．５／１で使用したＣＤ１０７およびＣＤ１３７発現の分析によって評価された。読み出しは、７人のドナー（ＦａＤｕおよびＨ−Ｎ）および２人のドナー（ＣＡＬ−２７）を使用した４時間の時点のＣＤ１０７対２４時間の時点でのＣＤ１３７であった。
【０１７６】
重鎖アミノ酸配列が配列番号３で示され、軽鎖アミノ酸配列が配列番号７で示される抗ＮＫＧ２Ａ抗体が、完全機能活性に対応する１０μｇ／ｍＬの最終濃度で使用され、またＥＧＦＲ阻害剤セツキシマブが、０．００１μｇ／ｍＬまたは０．０１μｇ／ｍＬの２つの最適以下の用量で使用された。
【０１７７】
抗ＮＫＧ２Ａの完全活性化濃度は、最適以下の用量のセツキシマブによって誘導されるＨＮＳＣＣ細胞株に対するＡＤＣＣを高めた。Ｋ５６２をトランスフェクトされた細胞株上では、それらがＥＧＦ−Ｒを発現させないのでセツキシマブ依存的なＡＤＣＣは観察されなかった。抗ＮＫＧ２Ａ効果は、ＮＫＧ２Ａ陽性ＮＫ細胞上でのみ見られ、ＨＬＡ−Ｅの発現のレベルに左右される。実際には抗ＮＫＧ２Ａ効果は、中〜高レベルの発現を有する細胞株（ＦａＤｕ、ＣＡＬ−２７、およびＫ５６２−ＨＬＡ−ＥクローンＥ６）上で見られる。図５は、ＦａＤｕ細胞で見られる代表例である。抗ＮＫＧ２Ａの完全活性化用量が、最適以下の用量のセツキシマブ（ｃｔｘ）によって誘導されるＨＮＳＣＣ細胞株のＡＤＣＣを高めることを図５に見ることができる。
【０１７８】
実施例１１：セツキシマブの用量の増加を伴う抗ＮＫＧ２Ａの用量増加の複合効果
ＥＧＦＲ阻害抗体の用量の増加と抗ＮＫＧ２Ａの用量の増加の組合せ効果を、ＨＮＳＣＣ標的細胞に向けられるＮＫ細胞を活性化する能力に関して評価した。これら実験は、抗ＮＫＧ２Ａ治療がセツキシマブを飽和用量で使用する場合に、まだＡＤＣＣを高めることができるかどうか、またその抗ＮＫＧ２Ａ効果が用量依存的であるかどうかを評価することを狙った。
【０１７９】
簡潔に言えば、これら使用されるエフェクター細胞は、健康なボランティアから新たに単離されたＰＢＭＣであり、また標的細胞は、ＨＮＳＣＣ細胞株（ＦａＤｕ、Ｈ−Ｎ、およびＣＡＬ−２７）およびＨＬＡ−ＥをトランスフェクトされたＫ５６２細胞株のクローン（クローンＥ６＝ＨＬＡ−Ｅ＋、クローンＦ７＝ＨＬＡ−Ｅ−）であり、それらのＥ：Ｔ比は２．５／１であった。読み出しは、２人のドナーを使用した４時間の時点のＣＤ１０７対２４時間の時点のＣＤ１３７であった。重鎖アミノ酸配列が配列番号３で示され、軽鎖アミノ酸配列が配列番号７で示される抗ＮＫＧ２Ａ抗体が、０．１および１μｇ／ｍＬの２つの最適以下の用量および１０μｇ／ｍＬの飽和用量で使用された。これらの実験の設定においてセツキシマブは、０．００１μｇ／ｍＬおよび０．０１μｇ／ｍＬの２つの最適以下の用量（約ＥＣ５０）と、０．１μｇ／ｍＬの飽和用量で使用された。
【０１８０】
結果を図６Ａおよび６Ｂに示す。図６Ａは、標的を伴わない対照およびＫ５６２−ＨＬＡ−Ｅトランスファクタントを伴う対照上でのＣＤ１０７の読み出しを示す。各健康なボランティアは、異なる記号、すなわち四角または丸によって表される。クロスオープン記号は、抗ＮＫＧ２Ａが０．１μｇ／ｍＬのセツキシマブと共にコインキュベートされた１０μｇ／ｍＬのｈＩｇＧ４アイソタイプ対照によって置き換えられた条件に対応する。抗ＮＫＧ２Ａの効果は用量依存的であり、ＨＬＡ−Ｅの発現レベルに左右され、また高レベルでＨＬＡ−Ｅを発現させるクローンＥ６では０．１μｇ／ｍＬの飽和用量のセツキシマブでもまだ観察されることが分かる。クローンＦ７（低いＨＬＡ−Ｅ発現レベル）においては抗ＮＫＧ２Ａの効果は限定され、また高用量（例えば、完全活性化用量）の抗ＮＫＧ２Ａが効果をさらに増大させることはなかった。
【０１８１】
図６Ｂは、ＨＮＳＣＣ細胞株上でのＣＤ１０７の読み出しを示す。各健康なボランティアは、異なる記号、すなわち四角または丸によって表される。クロスオープン記号は、抗ＮＫＧ２Ａが、０．１μｇ／ｍＬのセツキシマブと共にコインキュベートされた１０μｇ／ｍＬのｈＩｇＧ４アイソタイプ対照によって置き換えられた条件に対応する。抗ＮＫＧ２Ａの効果は用量依存的であり、ＨＬＡ−Ｅの発現レベルに左右され、また高いレベルで発現させる／ＨＬＡ−Ｅを強く染色するＦａＤｕまたはＣＡＬ−２７では０．１μｇ／ｍＬの飽和用量のセツキシマブでもまだ観察されることが分かる。
【０１８２】
抗ＮＫＧ２Ａの効果は、用量依存的であり、ＨＬＡ−Ｅの発現レベルに左右され、また０．１μｇ／ｍＬの飽和用量のセツキシマブでもまだ観察される。
【０１８３】
実施例１２：ヒト化Ｚ２７０の単剤としての繰返し注射による癌の治療に関するヒト臨床試験
この臨床試験の第一の目的は、口腔の手術可能な扁平上皮癌を有する患者における手術前ＩＰＨ２２０１（Ｓ２４１Ｐ変異を含むヒト化Ｚ２７０）の抗腫瘍活性を評価することである。第二の目的は、腫瘍内バイオマーカーを含めてＩＰＨ２２０１の安全性と、薬物動態と、抗原性と、薬力学を評価することである。
【０１８４】
臨床試験の設計
この臨床試験は、部分的な試行を含めた、単一中心、非盲検、単一群による第Ｉｂ〜ＩＩ相試験である。測定できる臨床的に中または高リスクのステージＩＩＩまたはＩＶａの口腔の扁平上皮癌を有する以前に治療されていない患者が、１時間をかけた静脈内経路（ｉ．ｖ．）による４回投与の２週間ごと（ｑ２ｗ）の単剤ＩＰＨ２２０１のｉ．ｖ．で治療されることになる。第一の６人の患者は、４ｍｇ／ｋｇ  ｑ２ｗ×４の用量のＩＰＨ２２０１を受けることになる。４ｍｇ／ｋｇで治療される３人の第一の患者に対するＩＰＨ２２０１の最初の各投与間には１週間の最低限の間隔が順守されることになる。後続の患者は、１０ｍｇ／ｋｇ  ｑ２ｗ×４の用量で治療されることになり、その用量の増加は、４ｍｇ／ｋｇで治療される最後の患者の最初の投与後、４週間の最低限のフォローアップの後に安全委員会によって認可される。病理組織学的リスク因子に応じて外科手術、続いて補助療法（放射線療法（ＲＴ）または放射線化学療法（ＲＣＴ））による標準的な局所領域の治療が、ＩＰＨ２２０１の最後の投与後に開始されることになる。もし腫瘍が進行している場合、局所領域の治療は直ちに開始されることになる。
【０１８５】
抗腫瘍活性が、外科手術に先立ってＩＰＨ２２０１の３回目の投与の前、ＩＰＨ２２０１の最後の投与の２週間後に臨床的にかつ放射線医学的に評価されることになる。腫瘍の測定値は、ＲＥＣＩＳＴ  １．１基準に従って標的病変部で得られることになる。同様のイメージング技術が、ベースラインでの、また手術前の期間中の効果の評価のために、プライマリーエンドポイントのかつ／または手術後の評価のために、また起こり得る再発の監視のために使用されることになる。治験責任医師の裁量で適切なイメージング技術（コンピュータ断面（ＣＴ）撮影法および／または核磁気共鳴映像法（ＭＲＩ））と、接近可能な腫瘍病変部の写真による評価が、すべての患者で行われることになる。
【０１８６】
新鮮な腫瘍の試料は、ベースラインでの生検によって得られることになり、また切除される試験片は、手術時に収集されることになる。薬理学（ＰＫ／ＰＤ）およびバイオマーカーの検討は、術前および術後に行われることになる。
【０１８７】
患者は、投与の最初のサイクルの１年後までフォローされることになる。治験通院が終わった後、再発および生存が、治験の後にさらに２年の間、現地の慣行に従って記録されることになる。
【０１８８】
本明細書中で引用される刊行物、特許出願、および特許を含めたすべての参考文献は、本明細書以外で作成された特定の文献の別個に提供されるいずれの援用とも関係なく、各参考文献が個々にまた具体的に表示されて参照により援用されているものとして、かつその全体が本明細書中に示されているものとして（法律によって認められている最大の程度まで）、それらの全体がこれにより参照により援用される。
【０１８９】
本発明を記述する脈絡における用語「或る（ａ、ａｎ）」と「その（ｔｈｅ）」、および類似の指示対象の使用は、本明細書中で別段の指定がない限り、または脈絡によって明確に否定されない限り単数と複数の両方を包含するものと解釈されたい。
【０１９０】
別段の注記がない限り、本明細書中で提供される正確な数値は、対応する概略の数値（例えば、特定の係数または測定値に関して提供されるすべての例示的な数値は、必要に応じて「約」によって修飾される対応する概略の測定値もまた提供するとみなすことができる）を代表している。「約」が数と共に使用される場合、それはその指定された数の＋／−１０％に相当する数値を含むものと指定することができる。
【０１９１】
要素または複数要素に関して「（全体として）含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する」、「（一部分として）含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、または「含有する」などの用語を使用した本発明の任意の態様または実施形態の本明細書中での記述は、本明細書中で別段の注記がない限り、または脈絡によって明確に否定されない限り、その特定の要素または複数要素「からなる」、「本質的にからなる」、または「実質的に（全体として）含む」本発明の類似の態様または実施形態に対する支持を与えることを意図している（例えば、特定の要素または複数要素を含むものとして本明細書中で記述される組成物は、別段の注記がない限り、または脈絡によって明確に否定されない限り、その要素からなる組成物もまた記述するものと理解されたい）。
【０１９２】
本明細書中で提供される幾つかのまたは全ての実施例、あるいは例示的言語（例えば、「など」）は、単に本発明にいっそう良く光を当てることを意図しており、別段の要求がない限り本発明の範囲に限定をもたらすものではない。本明細書中のいかなる言語も、本発明の実施にとって絶対必要な任意の非請求の要素を示すものと解釈されるべきではない。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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