(57)【要約】  本組成物および本方法は、グロメレラ・グラミニコラ（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）由来のベータ−グルコシダーゼ、そのベータ−グルコシダーゼをコードするポリヌクレオチド、ならびに、その作製方法および／またはその使用に関する。ベータ−グルコシダーゼを含む製剤は、リグノセルロース系バイオマス基質の加水分解での使用に好適であり得る。【選択図】図７
2017532967.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも７５％同じアミノ酸配列を含む組み換えポリペプチドであって、ベータ−グルコシダーゼ活性を有する組み換えポリペプチド。
【請求項２】
前記組み換えポリペプチドとトリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）Ｂｇｌ１をリグノセルロース系バイオマス基質の加水分解に使用したとき、前記ポリペプチドが前記トリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）Ｂｇｌ１と比べてより高いベータ−グルコシダーゼ活性を有する請求項１に記載の組み換えポリペプチド。
【請求項３】
前記より高いベータ−グルコシダーゼ活性は、セロビオース活性の増大、または同じ糖化条件下でのリグノセルロース系バイオマスからのグルコース収量の増大である請求項１または２に記載の組み換えポリペプチド。
【請求項４】
配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０％同じアミノ酸配列を含む請求項１〜３のいずれか一項に記載の組み換えポリペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の組み換えポリペプチドを含み、さらに、１種以上の他のベータ−グルコシダーゼ、１種以上のセロビオヒドラーゼおよび１種以上のエンドグルカナーゼを含む組成物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の組み換えポリペプチドを含み、さらに、１種以上のキシラナーゼ、１種以上のベータ−キシロシダーゼおよび１種以上のＬ−アラビノフラノシダーゼから選ばれる１種以上のヘミセルラーゼを含む組成物。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の組み換えポリペプチドをコードする単離核酸。
【請求項８】
前記ペプチドは異種シグナルペプチド配列をさらに含む請求項７に記載の単離核酸。
【請求項９】
前記シグナルペプチド配列は、配列番号１１〜４０からなる群から選択される請求項８に記載の単離核酸。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれか一項に記載の単離核酸を、制御配列を作動可能に組み合わされて含む発現ベクター。
【請求項１１】
請求項１０の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１２】
細菌細胞または真菌細胞である請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１１または１２の宿主細胞、および培地を含む組成物。
【請求項１４】
請求項１１または１２の宿主細胞を、安定した条件下、培地で培養して、ベータ−グルコシダーゼを製造することを含むベータ−グルコシダーゼの製造方法。
【請求項１５】
前記培地の上清中に、請求項１４に記載の方法にしたがって製造されたベータ−グルコシダーゼを含む組成物。
【請求項１６】
リグノセルロース系バイオマスを請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド、または請求項５、６または１５に記載の組成物と接触させて、グルコースまたは他の糖を得るリグノセルロース系バイオマス基質の加水分解方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年１０月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／０６９，１２０号明細書の利益を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本組成物および本方法は、グロメレラ・グラミニコラ（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）から得られるベータ−グルコシダーゼポリペプチド、ベータ−グルコシダーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに、その製造方法および使用方法に関する。ベータ−グルコシダーゼポリペプチドを含む製剤および組成物は、例えば、リグノセルロース系バイオマスの分解または加水分解に有用であり得る。
【０００３】
電子的に提出された配列リストの参照
本出願と同時にＡＳＣＩＩテキストファイルで電子的に提出された配列リスト（名称：ＮＢ４０７５１ＷＯＰＣＴ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ；サイズ：７８，６０６バイト、および作成日：２０１５年１０月２２日）の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
セルロース及びヘミセルロースは光合成により産生される最も豊富な植物性原料である。これらは、高分子基質を単糖へと加水分解することのできる細胞外酵素を産生する多数の微生物（例えば、細菌、酵母および真菌）により分解して、エネルギー源として使用することができる（Ａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６：２４３０９−２４３１４，２００１）。再生不能資源の制限が近付くにつれて、セルロースが主要な再生可能なエネルギー源になる可能性は非常に高い（Ｋｒｉｓｈｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈ．，７７：１９３−１９６，２００１）。生物学的過程を介してセルロースを有効利用することは、食物不足、食餌不足および燃料不足を克服する１つのアプローチになる（Ｏｈｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｇｅｎ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒ  Ｒｅｖ．，１４：３６５−４１４，１９９７）。
【０００５】
セルラーゼはセルロース（ベータ−１，４−グルカンまたはベータＤ−グルコシド結合を含む）を加水分解して、グルコース、セロビオース、セロオリゴ糖などを産生する酵素である。セルラーゼは、慣習的に３つの主要な部類：エンドグルカナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．４）（「ＥＧ」）、エキソグルカナーゼまたはセロビオヒドロラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．９１）（「ＣＢＨ」）、ならびにベータ−グルコシダーゼ（［ｂｅｔａ］−Ｄ−グルコシドグルコヒドロラーゼ；ＥＣ  ３．２．１．２１）（「ＢＧ」）に分類されている（Ｋｎｏｗｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＴＩＢＴＥＣＨ  ５：２５５−２６１，１９８７；  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１６０：２３４−２４３，１９８８）。エンドグルカナーゼが主にセルロース繊維の非晶質部に作用する一方で、セロビオヒドロラーゼは結晶質セルロースも分解することができる（Ｎｅｖａｌａｉｎｅｎ  ａｎｄ  Ｐｅｎｔｔｉｌａ，Ｍｙｃｏｔａ，３０３−３１９，１９９５）。したがって、結晶質セルロースを効率的に可溶化するには、セルラーゼ系にセロビオヒドロラーゼを存在させることが必要である（Ｓｕｕｒｎａｋｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ，７：１８９−２０９，２０００）。ベータ−グルコシダーゼは、セロビオース、セロオリゴ糖、および他のグルコシドからＤ−グルコース単位を遊離させるよう作用する（Ｆｒｅｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：９３３７−９３４２，１９９３）。
【０００６】
セルラーゼが、多数の細菌、酵母および真菌により産生されることは知られている。特定の真菌は、結晶質形態のセルロースを分解することができる完全セルラーゼ系を産生する。これらの真菌は、発酵により一連のセルラーゼまたはセルラーゼ混合物を産生することができる。同真菌および他の真菌はまた、特定のセルラーゼを産生または過剰産生して、異なる型のセルラーゼを含む、または異なる割合でセルラーゼを含むセルラーゼの混合物を産生するよう遺伝子操作することができる。これらの真菌はまた、発酵により様々なセルラーゼを大量に産生するよう遺伝子操作することができる。多くの酵母、例えばサッカロミケス・ケレヴィシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、天然状態ではセルロースに対する加水分解能を欠くことから、糸状菌は特別の役割を果たす（例えば、Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１６０：８７−１１６，１９８８を参照）。
【０００７】
ＣＢＨ、ＥＧおよびＢＧの真菌セルラーゼ分類は、それぞれに分類される多数の成分を包含するようさらに拡大することができる。例えば、２つのＣＢＨ、すなわちＣＢＨ  Ｉ（「ＣＢＨ１」）およびＣＢＨ  ＩＩ（「ＣＢＨ２」）、少なくとも８つのＥＧ、すなわち、ＥＧ  Ｉ、ＥＧ  ＩＩ、ＥＧ  ＩＩＩ、ＥＧＩＶ、ＥＧＶ、ＥＧＶＩ、ＥＧＶＩＩおよびＥＧＶＩＩＩ、ならびに少なくとも５つのＢＧ、すなわちＢＧ１、ＢＧ２、ＢＧ３、ＢＧ４、ＢＧ５およびＢＧ７に関する既知の遺伝子を含有する、トリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）（ヒポクレア・ジェコリナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｊｅｃｏｒｉｎａ）とも呼ばれる）などの様々な真菌源より、多数のＣＢＨ、ＥＧおよびＢＧが単離されている（Ｆｏｒｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（３４）：３１９８８−３１９９７）。ＥＧＩＶ、ＥＧＶＩおよびＥＧＶＩＩＩはまたキシログルカナーゼ活性も有する。
【０００８】
結晶質セルロースを効率的にグルコースへと変換させるためには、結晶質セルロースの加水分解活性が低い成分を単離するために、ＣＢＨ、ＥＧおよびＢＧのそれぞれの部類の成分を含む、完全セルラーゼ系が必要である（（Ｆｉｌｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４２：１−５，１９９６）。エンド−１，４−ベータ−グルカナーゼ（ＥＧ）およびエキソ−セロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ）は、セルロースのセロオリゴ糖（主生成物はセロビオース）への加水分解を触媒し、一方、ベータ−グルコシダーゼ（ＢＧＬ）はオリゴ糖をグルコースへと変換する。異なる分類に由来するセルラーゼ成分間の相乗的な関係が観察されている。特に、ＥＧ型セルラーゼおよびＣＢＨ型セルラーゼは、相乗的に作用してセルロースを効率的に分解する。ベータ−グルコシダーゼは、セロビオースなどのセロオリゴ糖に由来するグルコースを遊離するのに有用な役割を果たし、それは、糖を発酵させてエタノールに変えるために使用される微生物、例えば、酵母などに対し毒性があり、また、それは、エンドグルカナーゼおよびセロビオヒドラーゼの活性を抑制し、それらの結晶質セルロースのさらなる加水分解を無効にする。
【０００９】
セルロース材料の分解または変換に果たすベーターグルコシダーゼの重要な役割を考慮すると、セルロース原料に対する加水分解効率または加水分解能が向上したベーターグルコシダーゼホモログの発見、特性評価、製造および適用が要望され、かつ有益でもある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
グロメレラ・グラミニコラ（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）から得られるベータ−グルコシダーゼおよびその使用
セルロースの酵素加水分解は依然として、リグノセルロース系バイオマス原料からの物質（これは、セルロース糖および／または下流生成物であり得る）の生物学的生産の主な律速工程の一つである。ベーターグルコシダーゼは、そのようなプロセスの最後の工程を触媒し、抑制セロビオースからグルコースを放出するのに重要な役割を果たしており、したがって、その活性および有効性は、リグノセルロース系バイオマスの酵素変換の全体的な有効性に直接寄与し、ひいては、酵素溶液の使用に伴う費用に寄与する。したがって、新規で、かつより有効なベータ−グルコシダーゼを見出し、製造し、かつ使用することに大きな関心が集まっている。
【００１１】
トリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）またはヒポクレア・ジェコリナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｊｅｃｏｒｉｎａ）由来のベータ−グルコシダーゼ、Ｂｇｌ１、Ｂｇｌ３、Ｂｇｌ５，Ｂｇｌ７Ｂｉｏｆｕｅｌｓ  ３：３−３（２０１０））フミコーラ・グリセア変種セルモイデア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ  ｖａｒ．ｔｈｅｒｍｏｉｄｅａ）由来のベータ−グルコシダーゼ；（Ｎａｓｃｉｍｅｎｔｏ，Ｃ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４８，５３−６２（２０１０））スポロトリウム・プルウェルレンツム（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｐｕｌｖｅｒｕｌｅｎｔｕｍ）由来のベータ−グルコシダーゼ；（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ  Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１６０：４１５−４２４（１９８８））；アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）のベータ−グルコシダーゼ（Ｆｕｋｕｄａ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７６：１０２７−１０３３（２００７）；タラロミケス・テルモフィルス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＢＳ  ２３６．５８由来のベータ−グルコシダーゼ（Ｎａｋｋｈａｒａｔ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１２３：３０４−３１３（２００６））；タラロマイセス・エメルソニイイ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）由来のベータ−グルコシダーゼ（Ｍｕｒｒａｙ  Ｐ．，ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．３８：２４８−２５７（２００４））など、多くのベータ−グルコシダーゼが知られているが、これまでのところ、トリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ベータ−グルコシダーゼＢｇｌ１、およびアスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ベータ−グルコシダーゼＳＰ１８８が、他のベータ−グルコシダーゼの活性および性能を評価する上で、基準のベータ−グルコシダーゼと見なされている。トリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）Ｂｇｌ１がアスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ベータ−グルコシダーゼＳＰ１８８より高い比活性を有するが、分泌が少ないことがあり、一方、後者はグルコース抑制に対する感受性がより高いことが報告されている（Ｃｈａｕｖｅ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｆｕｅｌｓ，３（１）：３（２０１０））。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の組成物および方法の一態様は、リグノセルロース系バイオマス基質を加水分解する、真菌種グロメレラ・グラミニコラ（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）（アナモルフ：コレトトリクム・グラミニコラ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ））から単離された高活性ベータ−グルコシダーゼの適用もしくは使用である。トウモロコシの炭疽菌茎腐病や葉枯病の原因物質であるグロメレラ・グラミニコラ（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）のゲノムの塩基配列が、コレトトリクム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）配列決定プロジェクト、Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｈａｒｖａｒｄ  ａｎｄ  ＭＩＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／）によって決定された。本明細書に記載の配列番号２の配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＮＣＢＩ）により、アクセッション番号ＥＦＱ３２８０３．１を付して発表され、ＧＨ３ファミリーのベータ−グルコシダーゼに指定された。
【００１３】
この酵素はこれまで遺伝子組換え形態で作られておらず、またリグノセルロース系バイオマス基質の加水分解に有用な酵素組成物に含まれていない。また、酵素も、そのような酵素を含む組成物も、リグノセルロース系バイオマス基質に対し、そのような基質を酵素により加水分化するのに適した方法では適用されていない。さらに、グロメレラ・グラミニコラ（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）のベータ−グルコシダーゼは、これまで遺伝子組換えによる微生物によっては発現されていない。またそれは、１種以上のセルラーゼ遺伝子および／または１種以上のヘミセルラーゼ遺伝子で同時発現されていない。何年にも亘る開発を通して、遺伝的手段の蓄積の助けを得て、異種タンパク質および異種酵素を非常に効果的に、かつ効率よく産生するものとなった好適な微生物で発現させることにより、非遺伝子組換え微生物において内因的に発現するより、または植物で発現するより、実質的により大量にこれらの有用なベータ−グルコシダーゼを発現させることが可能になる。
【００１４】
全てではないまでも、殆どのベータ−グルコシダーゼが好適な条件下でセロビオースの加水分解を触媒することができるとはいえ、ベータ−グルコシダーゼとして分類される酵素は、その由来だけでなく、リグノセルロース基質に対する活性も様々である。例えば、セロビオースだけでなく長鎖のオリゴ糖にも活性を有するものがある一方、セロビオースにのみ活性を示すものもある。類似の基質選択性を有するベータ−グルコシダーゼであるとしても、なかには、それらの触媒活性および触媒効率をより高め、したがって、酵素を触媒とした加水分解に長くとも数日を超える日数をかけるわけにはいかない工業用途での有用性をより高める酵素動力学的プロファイルを有するものがある。
【００１５】
さらに、リグノセルロース系バイオマスの酵素加水分解から得られたセルロース性糖を変換することができる発酵性微生物またはエタノール生産微生物で、ここでのＧｇｒ３Ａポリペプチドなどのグロメレラ・グラミニコラ（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）由来のベーターグルコシダーゼを発現するように遺伝子操作されたものはない。エタノール生産微生物におけるベータ−グルコシダーゼの発現は、酵素による糖化によって完全には変換されていない残ったセロビオースからＤ−グルコースをさらに遊離させる重要な機会を提供する。そこでは、こうして生成されたＤ−グルコースは直ちに消費されるか、またはエタノール生産微生物によってジャストインタイムで発酵され得る。
【００１６】
本発明の組成物および方法の一態様は、グロメレラ・グラミニコラ（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）由来のグリコシルヒドロダーゼファミリー３のベーターグルコシダーゼポリペプチド（本明細書中、「Ｇｇｒ３Ａ」または「Ｇｇｒ３Ａポリペプチド」と呼ぶ）、それをコードする核酸、それを含む組成物、ならびに、そのベータ−グルコシダーゼポリペプチド、およびそれを含む組成物を、製造する方法、およびリグノセルロース系バイオマスの可溶性の発酵性糖への加水分解または変換に適用する方法に関する。そうした発酵性糖は、その後、セルロース性エタノール、燃料、ならびに他の生化学物質および有用な製品に変換することができる。ある特定の実施形態においては、Ｇｇｒ３Ａベータ−グルコシダーゼポリペプチドは、既知の高フィデリティベータ−グルコシダーゼである基準のトリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）Ｂｇｌ１と比較して、より高いベータ−グルコシダーゼ活性を有し、かつ／または所与のリグノセルロース系バイオマス基質に対しより高い加水分解能を示す。（Ｃｈａｕｖｅ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｆｕｅｌｓ，３（１）：３（２０１０））．
【００１７】
いくつかの実施形態では、好適なバイオマス基質を加水分解または分解するため、Ｇｇｒ３Ａポリペプチドは、酵素組成物中に１種以上の他のセルダーゼとともに、またはその存在下で適用される。１種以上の他のセルダーゼは、例えば、他のベーターグルコシダーゼ、セロビオヒドロラーゼ、および／またはエンドグルカナーゼであり得る。例えば、酵素組成物は、Ｇｇｒ３Ａポリペプチド、セロビオヒドロラーゼおよびエンドグルカナーゼを含み得る。いくつかの実施形態では、Ｇｇｒ３Ａポリペプチドは、酵素組成物中に１種以上の他のヘミセルダーゼとともに、またはその存在下で適用される。１種以上の他のヘミセルダーゼは、例えば、キシラナーゼ、ベータ−キシロシダーゼおよび／またはＬ−アラビノフラノシダーゼであり得る。さらなる実施形態においては、Ｇｇｒ３Ａポリペプチドは、酵素組成物中に１種以上のセルダーゼおよび１種以上のヘミセルダーゼとともに、またはそれらの存在下で適用される。例えば、酵素組成物は、Ｇｇｒ３Ａポリペプチド、０、１もしくは２種の他のベーターグルコシダーゼ、１種以上のセロビオヒドロラーゼ、および１種以上のエンドグルカナーゼと；任意選択的に、０もしくは１種以上のキシラナーゼ、０もしくは１種以上のベータ−キシロシダーゼ、および０もしくは１種以上のＬ−アラビノフラノシダーゼとを含む。
【００１８】
ある特定の実施形態では、Ｇｇｒ３Ａポリペプチド、またはＧｇｒ３Ａポリペプチドを含む組成物は、リグノセルロース系バイオマス基質を酵素により加水分解することによって生成される可溶性の発酵性糖を代謝し、そのような糖をエタノール、生化学物質、または他の有用な物質に変換することができるエタノール産生微生物の存在下で、リグノセルロース系バイオマス基質、または一部加水分解されたリグノセルロース系バイオマス基質に対し適用される。そのようなプロセスは、加水分解工程が発酵工程前に起こる完全な逐次プロセスであり得る。あるいは、そのようなプロセスは、加水分解工程がまず始まるが、ある期間は、その後に開始する発酵工程と重なるハイブリッドプロセスであり得る。さらなる代替として、そのようなプロセスは、バイオマス基質の酵素加水分解が起こり、同時にその酵素加水分解によって生成した糖のエタノロゲン（ｅｔｈａｎｏｌｏｇｅｎ）による発酵が進む、加水分解・発酵同時プロセスであり得る。
【００１９】
例えば、Ｇｇｒ３Ａポリペプチドは、酵素組成物の一部であり得、酵素加水分解プロセスおよびセロビオースなどのオリゴ糖からのＤ−グルコースの遊離に寄与する。ある特定の実施形態では、Ｇｇｒ３Ａポリペプチドは、一般に、エタノール産生微生物がそのようなベーターグルコシダーゼ活性を発現および／または分泌するように、エタノロゲン中で発現するよう遺伝子操作し得る。さらに、Ｇｇｒ３Ａポリペプチドは、酵素組成物の一部であり、同時にまた、エタノロゲンによって発現および／または分泌され、それによって、加水分解性酵素組成物によるリグノセルロース系バイオマス基質の加水分解によって生成した可溶性の発酵性糖が、Ｇｇｒ３Ａポリペプチドもまた発現および／または分泌するエタノール産生微生物によってエタノールへ代謝および／または変換される。加水分解酵素組成物は、１種以上の他のセルラーゼおよび／または１種以上のヘミセルラーゼに加えて、Ｇｇｒ３Ａポリペプチドを含み得る。エタノロゲンは、Ｇｇｒ３Ａポリペプチド、１種以上の他のセルラーゼ、１種以上の他のヘミセルラーゼ、またはこれらの酵素の組み合わせが発現するように遺伝子操作することができる。１種以上のベーターグルコシダーゼが、加水分解酵素組成物中に含まれ、エタノロゲンによって発現および／または分泌され得る。例えば、リグノセルロース系バイオマス基質の加水分解は、Ｇｇｒ３Ａポリペプチドを含む酵素組成物を用いて行うことができ、その後、加水分解で生成した糖を、Ｇｇｒ３Ａポリペプチドを発現するよう遺伝子操作された微生物で発酵させることができる。あるいは、第１のベーターグルコシダーゼを含む酵素組成物が加水分解工程に関与し、第１のベーターグルコシダーゼと異なる第２のベーターグルコシダーゼがエタノロゲンによってによって発現および／または分泌される。例えば、リグノセルロース系バイオマス基質の加水分解を、トリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）Ｂｇｌ１を含む加水分解酵素組成物を用いて行い、加水分解によって生じた発酵性糖を、Ｇｇｒ３Ａポリペプチドを発現および／または分泌するエタノール産生微生物によって発酵させることができ、その逆もまた同様である。
【００２０】
本明細書に示したように、Ｇｇｒ３Ａポリペプチド、およびＧｇｒ３Ａポリペプチドを含む組成物は、リグノセルロース系バイオマスの糖化および分解が起こる条件での効果を増大させた。Ｇｇｒ３Ａポリペプチドを含む酵素組成物の効果の増大は、所与のバイオマス基質に対する加水分解能を、他の方法で比較可能なトリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）Ｂｇｌ１を含む酵素組成物との比較で示される。
【００２１】
ある特定の実施形態においては、ベーターグルコシダーゼ活性の改善もしくは増大は、Ｇｇｒ３Ａポリペプチドのセロビアーゼ活性の改善もしくは増大に反映される。セロビアーゼ活性は、基質としてセロビオースを用い、約３０℃〜約６５℃の温度（例えば、約３５℃〜約６０℃、約４０℃〜約５５℃、約４５℃〜約５５℃、約４８℃〜約５２℃、約４０℃、約４５℃、約５０℃および約５５℃など）で測定される。いくつかの実施形態では、トリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）Ｂｇｌ１と比較したときのＧｇｒ３Ａポリペプチドのベーターグルコシダーゼ活性の増大は、リン酸膨張セルロース（ＰＡＳＣ）、例えば、Ｗａｌｓｅｔｈ，ＴＡＰＰＩ  １９７１，３５：２２８およびＷｏｏｄ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９７１，１２１：３５３−３６２の採用したプロトコルを用いて前処理を行った、前処理済みのＡｖｉｃｅｌの加水分解に、ベーターグルコシダーゼポリペプチドを使用することによって観察される。いくつかの実施形態では、トリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）Ｂｇｌ１と比較したときのＧｇｒ３Ａポリペプチドのベーターグルコシダーゼ活性の増大は、希アンモニア水で前処理したトウモロコシ茎葉、例えば、国際公開された特許出願：国際公開第２００６／１１０８９１号パンフレット、同２００６／１１０８９９号パンフレット、同２００６／１１０９００号パンフレット、同第２００６／１１０９０１号パンフレットおよび同第２００６／１１０９０２号パンフレット；米国特許第７，９９８，７１３号明細書、同第７，９３２，０６３号明細書に記載のものの加水分解に、ベーターグルコシダーゼポリペプチドを使用することによって観察される。
【００２２】
いくつかの態様においては、Ｇｇｒ３Ａポリペプチド、および／またはリグノセルロース系バイオマス基質を加水分解する酵素組成物もしくは方法において適用されるＧｇｒ３Ａポリペプチドは、（ａ）グロメレラ・グラミニコラ（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）から誘導され、得られ、もしくは産生され；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７５％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）一致しているアミノ酸配列を含む組み換えポリペプチドであり；（ｃ）配列番号３の触媒ドメイン、すなわちアミノ酸残基２０〜８７６と少なくとも７５％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）一致しているアミノ酸配列を含む組み換えポリペプチドである；（ｄ）配列番号３のアミノ酸配列の成熟形態、すなわち配列番号２のアミノ酸残基２０〜８７６と少なくとも７５％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）一致しているアミノ酸配列を含む組み換えポリペプチドであり；または（ｅ）ベーターグルコシダーゼ活性を有する（ａ）、（ｂ）、（ｃ）もしくは（ｄ）のフラグメントである。ある特定の実施形態では、配列番号２または配列番号３の１個以上のアミノ酸残基の置換、除去および／または挿入を含む、ベーターグルコシダーゼ活性を有する変異ポリペプチドが提供される。
【００２３】
いくつかの態様においては、Ｇｇｒ３Ａポリペプチド、および／またはリグノセルロース系バイオマス基質を加水分解する酵素組成物または方法において適用されるＧｇｒ３Ａポリペプチドは、（ａ）配列番号１に対し少なくとも７５％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列相同性を有する核酸配列によってコードされるポリペプチド、あるいは（ｂ）配列番号１、少なくとも１００個の連続するヌクレオチドからなる配列番号１の部分列、またはその相補的配列に、中程度のストリンジェンシー条件、高いストリンジェンシー条件または非常に高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするもの（但し、ポリペプチドはベーターグルコシダーゼ活性を有する）である。いくつかの実施形態では、Ｇｇｒ３Ａポリペプチド、および／またはリグノセルロース系バイオマス基質を加水分解する酵素組成物または方法において適用されるＧｇｒ３Ａポリペプチドは、遺伝子コードの縮重により、配列番号１、または少なくとも１００個の連続するヌクレオチドからなる配列番号１の部分列に、中程度のストリンジェンシー条件、高いストリンジェンシー条件または非常に高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズしないが、それにもかかわらず、ベーターグルコシダーゼを有するポリペプチドをコードし、かつ配列番号２、または配列番号３の成熟ベーターグルコシダーゼ配列と少なくとも７５％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）一致しているアミノ酸配列を含むものである。核酸配列は合成されたものであってよく、必ずしもグロメレラ・グラミニコラ由来のものである必要はないが、核酸配列はベーターグルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、かつ配列番号２または配列番号３と少なくとも７５％一致しているアミノ酸配列を含む。
【００２４】
いくつかの好ましい実施形態においては、Ｇｇｒ３Ａポリペプチド、またはＧｇｒ３Ａポリペプチドを含む組成物は、野生型トリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）Ｂｇｌ１（配列番号４）、またはトリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）Ｂｇｌ１を含む酵素組成物に比べ、高いベーターグルコシダーゼ活性を有する。例えば、本明細書に記載の組成物および方法のＧｇｒ３Ａポリペプチドのベーターグルコシダーゼ活性は、セロビオース加水分解アッセイによる測定で、トリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）Ｂｇｌ１より、少なくとも約１０％高い（例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、例えば、少なくとも約８７％高い）。セロビオース加水分解アッセイは、本明細書の実施例３に記載されている。
【００２５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法のＧｇｒ３Ａポリペプチドは、実質的に高い（例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、例えば、少なくとも約８７％高い）セロビオース加水分解活性を有する。
【００２６】
ある特定の態様では、本発明のＧｇｒ３Ａポリペプチド、およびＧｇｒ３Ａポリペプチドを含む組成物は、野生型トリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）Ｂｇｌ１（配列番号４）に比べ、リグノセルロース系バイオマス基質に対し、より高い加水分解能を有する。いくつかの実施形態では、Ｇｇｒ３ＡポリペプチドまたはＧｇｒ３Ａポリペプチドを含む組成物の加水分解能の向上は、ある特定の方法で前処理した所与のリグノセルロース系バイオマス基質から生成されるグルコースの量が、トリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）Ｂｇｌ１、またはトリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）Ｂｇｌ１を含む同じ酵素組成物によって生成されるグルコースの量より多いことによって観察することができる。例えば、バイオマス基質中のグルカン１ｇを加水分解するために、０〜１０ｍｇ（例えば、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約３ｍｇ、約４ｍｇ、約５ｍｇ、約６ｍｇ、約７ｍｇ、約８ｍｇ、約９ｍｇ、約１０ｍｇ）のベーターグルコシダーゼ（Ｇｇｒ３Ａポリペプチドまたはトリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）Ｂｇｌ１）を使用した場合、Ｇｇｒ３Ａポリペプチド、またはＧｇｒ３Ａポリペプチドを含む酵素組成物によって生成されるグルコース量は、（Ｇｇｒ３Ａポリペプチドでなく）トリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）Ｂｇｌ１、またはトリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）Ｂｇｌ１を含む他の同一酵素組成物によって生成されるグルコースの量より、少なくとも約５％（例えば、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％または少なくとも約２５％）多い。
【００２７】
いくつかの態様では、Ｇｇｒ３Ａポリペプチド、またはＧｇｒ３Ａポリペプチドを含む組成物の加水分解能の向上は、ある特定の方法で前処理した所与のリグノセルロース系バイオマス基質のグルカン転換率％が、同じ糖化条件下で、同じ方法で前処理した同じバイオマス基質の、トリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）Ｂｇｌ１、またはトリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）Ｂｇｌ１を含む他の同じ酵素組成物によるグルカン転換率％と比較して増大することによって観察することができる。例えば、バイオマス基質中のグルカン１ｇを加水分解するために、０〜１０ｍｇ（例えば、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約３ｍｇ、約４ｍｇ、約５ｍｇ、約６ｍｇ、約７ｍｇ、約８ｍｇ、約９ｍｇ、約１０ｍｇ）のベーターグルコシダーゼ（Ｇｇｒ３Ａポリペプチドまたはトリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）Ｂｇｌ１）を使用した場合、Ｇｇｒ３Ａポリペプチド、またはＧｇｒ３Ａポリペプチドを含む酵素組成物によるグルカン変換率％は、（Ｇｇｒ３Ａポリペプチドでなく）トリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）Ｂｇｌ１、またはトリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）Ｂｇｌ１を含む他の同一酵素組成物によるグルカン変換率％より、少なくとも約５％（例えば、少なくとも約５％、少なくとも約１０％または少なくとも約１５％）高い。
【００２８】
Ｇｇｒ３Ａポリペプチド、およびＧｇｒ３Ａポリペプチドを含む組成物の加水分解能の向上は、ある特定の方法で前処理した所与のリグノセルロース系バイオマス基質の加水分解におけるセロビアーゼ活性の増大、および／または生成混合物中のセロビオース残存量の減少（同じバイオマス基質を、同じ糖化条件下で、トリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）Ｂｇｌ１、またはトリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）Ｂｇｌ１を含む他の同じ酵素組成物によって加水分解したときのセロビオース残存量との比較において）によって観察することができる。例えば、ある特定の方法で前処理した所与のリグノセルロース系バイオマス基質の、Ｇｇｒ３Ａポリペプチド、またはＧｇｒ３Ａポリペプチドを含む組成物による加水分解によって生成した生成混合物中のセロビオース残存量が、同じ方法で前処理した同じバイオマス基質に対し、同じ糖化条件で、トリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）Ｂｇｌ１、またはトリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）Ｂｇｌ１を含む他の同じ酵素組成物により加水分解することによって生成した生成混合物中のセロビオース残存量より、少なくとも約５％（例えば、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、またはさらに少なくとも約２０％）少ない。これは、バイオマス基質中のグルカン１ｇを加水分解するために、０〜１０ｍｇ（例えば、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約３ｍｇ、約４ｍｇ、約５ｍｇ、約６ｍｇ、約７ｍｇ、約８ｍｇ、約９ｍｇ、約１０ｍｇ）のベーターグルコシダーゼ（例えば、Ｇｇｒ３Ａポリペプチドまたはトリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）Ｂｇｌ１）を使用した場合である。
【００２９】
本発明の組成物および方法の態様は、上で詳述したような組み換えＧｇｒ３Ａポリペプチドおよびリグノセルロース系バイオマスを含む組成物を含む。好適なリグノセルロース系バイオマスは、例えば、農産物、食物もしくは食餌生産の副生物、リグノセルロース廃棄物、例えば草残渣などの植物残渣、または廃棄紙もしくは廃棄紙製品由来のものであり得る。ある特定の実施形態では、リグノセルロース系バイオマスに対し、キシラン、ヘミセルロース、セルロースおよび／またはリグニン物質の酵素への到達性、または酵素に対する感受性を高め、それによって酵素加水分解をより受けやすくするために、１工程以上の前処理工程が施された。好適な前処理方法としては、例えば、反応容器内で、強酸の希釈溶液および金属塩を含む触媒にバイオマス材料をさらす方法がある。例えば、米国特許第６，６６０，５０６号明細書、同第６，４２３，１４５号明細書を参照されたい。あるいは、好適な前処理方法として、例えば、米国特許第５，５３６，３２５号明細書に記載の多段プロセスがある。ある特定の実施形態では、バイオマス材料に対し、米国特許第６，４０９，８４１号明細書の開示にしたがい、一段以上の、約０．４％〜約２％の強酸を用いる希酸による加水分解が行われ得る。前処理方法のさらなる実施形態としては、例えば、米国特許第５，７０５，３６９号明細書；Ｇｏｕｌｄ，Ｂｉｏｔｅｃｈ．＆  Ｂｉｏｅｎｇｒ．，２６：４６−５２（１９８４）；  ｉｎ  Ｔｅｉｘｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  ＆  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，７７−７９：１９−３４（１９９９）；国際公開された特許出願、国際公開第２００４／０８１１８５号パンフレット、または米国特許出願公開第２００７／０３１９１８号明細書、もしくは、国際公開された特許出願、国際公開第０６／１１０９０１号パンフレットに記載の方法が挙げられる。
【００３０】
本発明はまた、ベーターグルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドであって、
（１）配列番号２または配列番号３と少なくとも７５％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド；
（２）配列番号１と少なくとも７５％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の相同性を有するか、または配列番号１、もしくはその相補的配列に、中程度のストリンジェンシー条件、高いストリンジェンシー条件または非常に高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする単離ポリヌクレオチドから選択される単離ポリヌクレオチドに関する。
【００３１】
本組成物および本方法の態様は、配列番号２のアミノ酸配列または配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも７５％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）アミノ酸配列を含む組み換えポリペプチドをコードする単離核酸配列を用いて、べーターグルコシダーゼ活性を有するＧｇｒ３Ａポリペプチドを製造または産生する方法を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、さらに、産生されるＧｇｒ３Ａポリペプチドが宿主微生物によって分泌されるように、天然または非天然シグナルペプチドを含み、例えば、シグナルペプチドは配列番号１１（トリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）Ｂｇｌ１のシグナル配列）と少なくとも９０％一致している配列を含む。ある特定の実施形態では、単離核酸は、配列番号１と少なくとも７５％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）一致している配列を含む。ある特定の実施形態では、単離核酸は、さらに、シグナルペプチド配列をコードする核酸配列を含む。ある特定の実施形態では、シグナルペプチド配列は配列番号１１〜４０から選ばれる１つであり得る。ある特定の実施形態では、配列番号１１のシグナルペプチド配列をコードする核酸配列は、トリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）においてＧｇｒ３Ａポリペプチドを発現させるために使用される。
【００３２】
本組成物および本方法の態様は、上記のような単離核酸を、制御配列と作動可能に組み合わされて含む。
【００３３】
本組成物および本方法の態様は、発現ベクターを含む宿主細胞を含む。ある特定の実施形態では、宿主細胞は細菌細胞または真菌細胞である。ある特定の実施形態では、発現ベクターを含む宿主細胞は、リグノセルロース系バイオマスの加水分解（この加水分解は化学プロセスおよび／または酵素プロセスの結果である）によって生成された可溶性の糖を代謝することができるエタノール産生微生物である。
【００３４】
本組成物および本方法の態様は、上記宿主細胞および培地を含む組成物を含む。本組成物および本方法の態様は、ベーターグルコシダーゼの産生に好適な条件下で、上記宿主細胞を培地で培養することを含む、Ｇｇｒ３Ａポリペプチドの産生方法を含む。
【００３５】
本組成物および本方法の態様は、上記のようなベーターグルコシダーゼを産生する方法にしたがって産生された培地の上清中のＧｇｒ３Ａポリペプチドを含む組成物を含む。
【００３６】
いくつかの態様では、本発明は、上記およびここに記載の、核酸構成物、組み換え発現ベクター、上記およびここに記載のベーターグルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリペプチドを含む遺伝子操作された宿主細胞に関する。さらなる態様では、本発明は、本発明のベーターグルコシダーゼポリペプチド、またはそのようなベーターグルコシダーゼポリペプチドを、核酸構成物、組み換え発現ベクター、および／または遺伝子操作された宿主細胞を用いて調製または産生する方法に関する。特に、本発明は、例えば、配列番号２または配列番号３の成熟配列と少なくとも７５％一致しているか、あるいは配列番号１と少なくとも７５％一致しているポリヌクレオチドでコードされるベーターグルコシダーゼの成熟配列に操作可能に結合した好適なシグナルペプチドを含む核酸構成物、単離ポリヌクレオチド、核酸構成物、組み換え発現ベクター、またはそのような核酸構成物を含む遺伝子操作された宿主細胞に関する。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドおよびベーターグルコシダーゼの配列は、異なる微生物から誘導される。
【００３７】
単離核酸を、制御配列と操作可能に組み合わされて含む発現ベクターもまた提供される。さらに、そのような発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。さらに他の実施形態においては、宿主細胞および培地を含む組成物が提供される。
【００３８】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は細菌細胞または真菌細胞である。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、リグノセルロース系バイオマス基質の加水分解によって生成された可溶性糖を代謝することができるエタノール産生微生物であり、その加水分解は、化学的加水分解、酵素加水分解、またはこれらのプロセスの組み合わせによるものであり得るが、宿主細胞はまた、異種酵素もまた発現することができる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、サッカロミケス・ケレヴィシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞またはジイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）細胞であり、それらは、本発明のＧｇｒ３Ａポリペプチドなどの異種ポリペプチドを発現することができるだけでなく、糖をエタノールおよび／または下流生成物へ発酵させることができる。ある特定の実施形態では、ベーターグルコシダーゼを発現するサッカロミケス・ケレヴィシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞またはジイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）細胞は、１種以上のベーターグルコシダーゼを含む酵素組成物によりリグノセルロース系バイオマスから製造された糖を発酵させることができる。１種以上のベーターグルコシダーゼを含む酵素組成物は、同種のベーターグルコシダーゼを含んでもよく、１種以上の異種のベーターグルコシダーゼを含んでもよい。ある特定の実施形態では、１種以上のベーターグルコシダーゼを含む酵素組成物は、遺伝子操作された宿主細胞によって産生された酵素混合物であり得、その遺伝子操作された宿主細胞は、細菌細胞または真菌細胞であり得る。サッカロミケス・ケレヴィシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞またはジイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）細胞が本開示のＧｇｒ３Ａポリペプチドを発現する場合、Ｇｇｒ３Ａポリペプチドは発現されるが、分泌はされない。したがって、ベーターグルコシダーゼＧｇｒ３ＡポリペプチドにＤ−グルコース遊離を触媒させるためには、そのような宿主細胞にセロビオースを導入、または「トランスポート」する必要がある。したがって、ある特定の実施形態では、サッカロミケス・ケレヴィシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞またはジイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）細胞を、Ｇｇｒ３Ａポリペプチドをコードする遺伝子に加え、セロビオーストランスポータ遺伝子でトランスフォームする。例えば、  Ｈａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，１０８（２）：５０４−５０９（２０１１）サッカロミケス・ケレヴィシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａ）において、生成された微生物がセロビオースを発酵できるように、セロビオーストランスポータおよびベーターグルコシダーゼが発現している。例えば、米国特許出願公開第２０１１／０２６２９８３号明細書では、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）酵母において、他のセロビオーストランスポータが発現している。例えば、Ｓｅｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，７８（５）：１６１１−１６１４（２０���２）では、セロビオーストランスポータがエケリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）へ導入されている。
【００３９】
さらなる実施形態においては、宿主細胞によって、Ｇｇｒ３Ａポリペプチドが異種発現される。例えば、グロメレラ・グラミニコラ（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）ではない遺伝子操作された微生物によって、Ｇｇｒ３Ａポリペプチドが発現される。いくつかの実施形態においては、１種以上の異なるセルラーゼ遺伝子によりＧｇｒ３Ａポリペプチドが共発現される。いくつかの実施形態においては、１種以上のヘミセルラーゼ遺伝子によりＧｇｒ３Ａポリペプチドが共発現される。
【００４０】
いくつかの態様においては、前段落の組み換えＧｇｒ３Ａポリペプチドを含む組成物、およびそのような組成物を調製する方法が提供される。いくつかの実施形態においては、組成物は、１種以上の他のセルラーゼを含み、その場合、１種以上の他のセルラーゼがＧｇｒ３Ａポリペプチドと共に宿主細胞によって共発現される。例えば、１種以上の他のセルラーゼは、０もしくは１種以上の他のベータ−グルコシダーゼ、１種以上のセロビオヒドラーゼ、および／または１種以上のエンドグルカナーゼから選択することができる。そのような他のベータ−グルコシダーゼ、セロビオヒドラーゼ、および／またはエンドグルカナーゼが含まれる場合、それらは、単一の宿主細胞によって、Ｇｇｒ３Ａポリペプチドと共発現され得る。２種以上のセルラーゼの少なくとも２つは、互いに異種であってもよく、異なる有機体由来のものであってもよい。例えば、組成物は、第１のベータ−グルコシダーゼがＧｇｒ３Ａポリペプチドで、第２のベータ−グルコシダーゼがグロメレラ・グラミニコラ（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）由来のものではない、２種のベータ−グルコシダーゼを含んでいてもよい。例えば、組成物は、少なくとも１種のセロビオヒドラーゼ、１種のエンドグルカナーゼ、またはグロメレラ・グラミニコラ（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）由来のものではない１種のベータ−グルコシダーゼを含んでいてもよい。いくつかの実施形態においては、１種以上のセルラーゼは宿主細胞に内在的であるが、宿主細胞で天然に発生するレベルとは異なるレベルで過剰発現または発現する。１種以上のセルラーゼは、例えば、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ＣＢＨ１および／またはＣＢＨ２であり得る。それらは、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）宿主細胞で天然に産生されるが、それらがトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）宿主細胞でＧｇｒ３Ａポリペプチドと共発現する場合は、ＣＢＨ１およびＣＢＨ２のいずれか、またはその両方が、過剰または過少発現する。
【００４１】
ある特定の実施形態においては、組み換えＧｇｒ３Ａポリペプチドを含む組成物は１種以上のヘミセルラーゼをさらに含み得、その場合、１種以上のヘミセルラーゼは宿主細胞によりＧｇｒ３Ａポリペプチドと共発現する。例えば、１種以上のヘミセルラーゼは、１種以上のキシラナーゼ、１種以上のベータ−キシロシダーゼおよび／または１種以上のＬ−アラビノフラノシダーゼから選択され得る。そのような他のキシラナーゼ、ベータ−キシロシダーゼおよびＬ−アラビノフラノシダーゼが含まれる場合、それらは、単一の宿主細胞によって、Ｇｇｒ３Ａポリペプチドと共発現され得る。いくつかの実施形態においては、組成物は、少なくとも１種の、グロメレラ・グラミニコラ（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）由来のものではないベータ−キシロシダーゼ、キシラナーゼまたはアラビノフラノシダーゼを含み得る。
【００４２】
さらなる態様においては、組み換えＧｇｒ３Ａポリペプチドを含む組成物は、１種以上の他のセルラーゼおよび１種以上のヘミセルラーゼをさらに含み得、その場合、１種以上の他のセルラーゼおよび／または１種以上のヘミセルラーゼは宿主細胞によりＧｇｒ３Ａポリペプチドと共発現する。例えば、Ｇｇｒ３Ａポリペプチドは、同じ宿主細胞中に、他の非セルダーゼ、非ヘミセルラーゼの酵素またはタンパク質に加えて、１種以上の他のベータ−グルコシダーゼ、１種以上のセロビオヒドラーゼ、１種以上のエンドグルカナーゼ、１種以上のエンド−キシラナーゼ、１種以上のベータ−キシロシダーゼおよび１種以上のＬ−アラビノフラノシダーゼと共発現させ得る。したがって、本組成物および本方法の態様は、Ｇｇｒ３Ａポリペプチドおよび培地に加えて、多くの酵素を共発現する上記宿主細胞を含む組成物を含む。したがって、本組成物および本方法の態様は、Ｇｇｒ３Ａ含有酵素組成物を製造する方法であって、培地中、好適な条件下で、上記の多くの酵素をＧｇｒ３Ａポリペプチドと共発現する宿主細胞を培養して、Ｇｇｒ３Ａおよび他の酵素を産生させることを含む方法を含む。また、本明細書に記載の方法にしたがって産生されたＧｇｒ３Ａポリペプチドおよび他の酵素を培地の上清中に含む組成物を提供する。そのような培地の上清は、そのまま、最小限の製造後処理を行うか、または製造後処理を行わずに使用することができる。そのような処理には、通常、細胞片を除去するための濾過、細胞死滅処理、および／あるいは限外濾過または含有酵素を富化もしくは濃縮する他の手段が含まれる。そのような上清は「全培養液」または「全セルラーゼ培養液」と呼ばれる。
【００４３】
さらなる態様においては、本発明は、セルロース材料の分解または変換に、またセルロース材料から物質を製造するのに適した条件下で、上記組成物を適用または使用する方法に関する。
【００４４】
さらなる態様においては、セルロース材料を発酵性糖へと分解または変換する方法であって、セルロース材料、好ましくは、既に１工程以上の前処理工程が行われたセルロース材料を、Ｇｇｒ３Ａポリペプチド、または先の段落の１つに記載された、そのようなポリペプチドを含む組成物と接触させて、発酵性糖を得ることを含む方法が提供される。
【００４５】
Ｇｇｒ３Ａポリペプチドおよび方法のこれらの態様および他の態様は、以下の説明により明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１は、ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ−Ｂｇｌ１（９４３／９４２）プラスミドのマップを示す。
【図２】図２は、ｐＴｒｅｘ３ｇ９４３／９４２プラスミドのマップを示す。
【図３】図３は、ｐＴＴＴ−ｐｙｒ２プラスミド（配列番号４１）のマップを示す。
【図４】図４は、ｐＴＴＴ−ｐｙｒ２−Ｇｇｒ３Ａプラスミド（配列番号４２）のマップを示す。
【図５】図５は、ｐＳＣ１１プラスミドのマップを示す。
【図６】図６は、ｐＺＣ１１プラスミドのマップを示す。
【図７】図７は、いずれもＳｐｅｚｙｍｅ  ＣＰ酵素をバックグラウンドとした、ＰＡＳＣ基質に対する、Ｇｇｒ３Ａ対トリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）Ｂｇｌ１の用量曲線の比較である。左側のパネルは酵素用量の変化に対するグルコース収量を示し、一方、右側のパネルは酵素用量の変化に対するセロビオースの残量濃度を示す。
【図８】図８は、実施例８にしたがってセロビオース１００ｍＭ濃度の基質で測定した、Ｇｇｒ３Ａ対トリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）Ｂｇｌ１のセロビオース加水分解動態の比較である。
【図９Ａ−９Ｂ】図９Ａ〜９Ｂは、いずれもＳｐｅｚｙｍｅ  ＣＰ酵素をバックグラウンドとした、ｗｈＰＣＳ基質に対する、Ｇｇｒ３Ａ対トリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）Ｂｇｌ１の用量曲線の比較を示す。図９Ａは、基質からのグルコース収量の用量曲線を示す。図９Ｂは、セロビオース残量濃度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
グロメレラ・グラミニコラ（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）由来のグリコシルヒドラーゼファミリー３に属する組換えベータ−グルコシダーゼに関する組成物および方法がここに記載されている。本組成物および本方法は、一つには、組み換えＧｇｒ３Ａポリペプチドが、例えば、既知の基準の高フィデリティベータ−グルコシダーゼであるトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）Ｂｇｌ１より、より高いセルラーゼ活性を有し、かつ組成物がリグノセルロース系バイオマス材料または原料の加水分解に使用された場合に、酵素組成物としてより安定しているという観察に基づいている。Ｇｇｒ３Ａポリペプチドのこれらの特徴が、Ｇｇｒ３Ａポリペプチドまたはその変異体を、多くのプロセス、例えば、リグノセルロース系バイオマス原料の変換または加水分解などでの使用に適したものにしている。
【００４８】
本組成物および本方法をより詳細に説明する前に、本組成物および本方法が、それらの特定の実施形態に限定されないことは、そうした実施形態は当然ながら変わり得るため、理解されなければならない。また、本組成物および本方法の範囲が添付の特許請求に範囲によってのみ限定されることから、本明細書で使用されている用語が、特定の実施形態を説明することを単に目的としたものであって、限定することを意図したものでないことも理解されなければならない。
【００４９】
数値範囲が示されている場合、それぞれ、その範囲の上限と下限の間にある、明らかに別段の規定がされていない限り、下限値の単位の１０分の１までの数値、およびその記載された範囲の他に示されるか、その間にある任意の数値は本組成物および本方法に包含されると理解される。これらの狭い範囲の上限値および下限値は、独立して、この狭い範囲に含まれ、また、この示された範囲において特に除外された限界値の存在を前提として、本組成物および本方法に包含される。示された範囲が１方の限界または両方の限界を含む場合、それらの含まれた限界の一方または両方を除く範囲もまた本組成物および本方法に包含される。
【００５０】
本明細書中においては、ある特定の範囲が、「約」という用語が前に付された数値で示されている。「約」という用語は、本明細書中では、それが前に付されている数そのものに対し、文字上のサポート、およびその用語が先行する数に近いか略同じ数を提供するために使用されている。ある数が特定した数に近いか否か、または略同じであるか否かの決定においては、その近いか略同じと記載されていない数が、それが示されている文脈において、その特定の数と実質的に等価なものを提供する数であり得る。例えば、数値に関して、「約」という用語は、別段の定義がされていない限り、その数値の−１０％〜＋１０％の範囲を指す。他の例では、「約６のｐＨ値」という句は、ｐＨ値が別段特に定義されていなければ、５．４〜６．６のｐＨ値を指す。
【００５１】
本組成物および本方法の各種態様または実施形態を限定するものではない。したがって、以下で直接定義されている用語は、明細書全体を参照することにより、より十分に定義される。
【００５２】
本明細書は読みやすくするために数多くの項で構成されている。しかしながら、読者は１つの項での記載が他の項にも適用されることは認識していよう。このように、開示の異なる項で使用されている項目は、限定するものとして解釈されるべきではない。
【００５３】
本組成物および本方法が属する技術分野において通常の技術を有する者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載のものに類似しているかまたは同じである方法および材料もまた、本組成物および本方法の実施または試験に使用することができるが、代表的な事例的方法および材料を以下に記載する。
【００５４】
本明細書に引用されている全ての刊行物および特許は、個々の刊行物または特許が、具体的にかつ個別に、参照により組み込まれ、それらの刊行物が関連して引用している方法および／または材料を開示し記載するよう指示されているごとく、参照により本明細書に組み込まれる。あらゆる刊行物の引用は、出願日前の開示のためであり、先行発明のために、本組成物および本方法がその公開に先行する権利がないと認めたものであると解釈されるべきではない。さらに、示された公開日は、実際の公開日と異なる可能性があり、それらは独立して確認する必要があり得る。
【００５５】
この詳細な説明においては、以下の略語および定義が適用される。明らかに別段の記載がされていない限り、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、複数の対象を包含することに留意されたい。したがって、例えば、「酵素（ａｎ  ｅｎｚｙｍｅ）」との言及は、複数の酵素を含み、「用量（ｔｈｅ  ｄｏｓａｇｅ）」との言及は、１種以上の用量および当業者に知られたその同等物を含む。
【００５６】
さらに、特許請求の範囲が任意選択による要素を排除することを選択し得ることに留意されたい。したがって、この記述は、請求項の構成要素の列挙に関連した「唯一（ｓｏｌｅｌｙ）」、「ただ〜のみ（ｏｎｌｙ）」などの排他的用語を使用するための、または「負」の限定を使用するための先行文として機能することが意図されている。
【００５７】
「組み換え」という用語は、対象細胞、核酸、ポリペプチド／酵素、またはベクターに関連して使用する場合、対象が天然の状態から改変されていることを示している。したがって、例えば、組み換え細胞は、天然（非組み換え）の形態の細胞にはない遺伝子を発現するか、あるいは、天然とは異なる量または条件下で天然遺伝子を発現する。組み換え核酸は、１つ以上のヌクレオチドにより天然の配列と異なっており、かつ／またはベクター中に、異種配列、例えば異種プロモーター、分泌を可能にするシグナル配列などに操作可能に結合していることがあり得る。組み換えポリペプチド／酵素は、１つ以上のアミノ酸により天然の配列と異なっており、かつ／または異種配列と融合していることがあり得る。ベータ−グルコシダーゼをコードする核酸を含むベクターは、組み換えベクターであり得る。
【００５８】
さらに、「実質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という用語は、本明細書で使用されるとき、その用語の後の成分が、組成物の全重量の３０重量％未満の量で他の既知の成分の存在下で含まれ、その成分の作用または活性に寄与または阻害することがない組成物を指すことに留意されたい。
【００５９】
さらに、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、本明細書で使用されるとき、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語の後の成分を含むが、それに限定されないことを意味することに留意されたい。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語の後の成分は、必要または必須であるが、その成分を含む組成物は、他の非必須成分または任意選択の成分をさらに含んでもよい。
【００６０】
また、「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語は、本明細書で使用されるとき、「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語の後の成分を含み、かつそれに限定されることを意味することに留意されたい。「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語の後の成分は、したがって、必要または必須であり、かつ組成物中に他の成分は含まれない。
【００６１】
この開示を読んだ際、当業者なら明らかであろうが、本明細書に記載され説明されている個々の実施形態はそれぞれ個別の成分および特徴を有し、それらは、本明細書に記載の本組成物および本方法の範囲または精神から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴と容易に分離または組み合わせることができる。ここに挙げられた方法はいずれも、挙げられた事項の順で、論理的に可能な他の任意の順序で実施することができる。
【００６２】
「ベータ−グルコシダーゼ」は、Ｅ．Ｃ．３．２．１．２１のベータ−グルコシド  グルコヒドラーゼを指す。したがって、「ベータ−グルコシダーゼ」という用語は、ベータ−Ｄ−グルコースまたはセロビオースの加水分解を触媒してＤ−グルコースを遊離する能力を指す。ベータ−グルコシダーゼ活性は、例えば、本開示の実施例２Ｃに記載されるような、セロビオース基質の加水分解を触媒してＤ−グルコースを得る酵素の能力を測定するセロビアーゼアッセイにより測定することができる。
【００６３】
本明細書で使用されるとき、「Ｇｇｒ３Ａ」または「Ｇｇｒ３Ａポリペプチド」は、基準のベータ−グルコシダーゼである、配列番号４のアミノ酸配列を有する野生型トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）Ｂｇｌ１ポリペプチドと比較して、リグノセルロース系バイオマス基質に対する加水分解能がより高い、グロメレラ・グラミニコラ（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）由来のグリコシルヒドロダーゼファミリー３に属するベーターグルコシダーゼ（例えば、組み換えベータ−グルコシダーゼ）を指す。本組成物および本方法の態様においては、Ｇｇｒ３Ａポリペプチドは、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、および、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号２の成熟配列、または配列番号２の少なくとも１００個の残基からなるフラグメントに少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列相同性を有する誘導体または変異体ポリペプチドを含み、それらのＧｇｒ３Ａポリペプチドは、ベータ−グルコシダーゼ活性を有し、かつセロビオースのＤ−グルコースへの変換を触媒することができるだけでなく、セロビオースのＤ−グルコースへの変換を触媒する能力がトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）Ｂｇｌ１より高い。
【００６４】
本開示の組成物および方法で使用されるＧｇｒ３Ａポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列のポリペプチド、配列番号２の残基２０〜８７６からなるポリペプチド、または配列番号３の成熟配列の少なくとも５％、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、より一層好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、より一層好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％、より一層好ましくは少なくとも１００％もしくはそれ以上のベータ−グルコシダーゼ活性を有する。
【００６５】
「ファミリー３グリコシルヒドラーゼ」または「ＧＨ３」は、Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８０：３０９−３１６（１９９１），ａｎｄ  ｂｙ  Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ  ＆  Ｃａｉｒｏｃｈ，Ｂｉｏｃｈｅｍによる分類のグリコシルヒドラーゼファミリー３のポリペプチドを指す。Ｊ．，３１６：６９５−６９６（１９９６）．
【００６６】
本組成物および本方法のＧｇｒ３Ａポリペプチドは、単離または精製される。生成または単離とは、天然で関連する、天然で存在する構成要素のうちのいくつかまたはすべてからそのＧｇｒ３Ａを分離することによって、Ｇｇｒ３Ａポリペプチドを天然状態から改変することをいう。そのような単離または精製は、当該技術分野において認められている分離技術、例えば、全細胞、細胞片、不純物、外来タンパク質、または最終組成物中に不要な酵素を除去するためのイオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、疎水性分離、透析、プロテアーゼ処理、硫安沈澱もしくは他のタンパク質塩沈澱、サイズ排除クロマトグラフィー、濾過、精密濾過、ゲル電気泳動または勾配分離などによって行われる。さらに、その後、Ｇｇｒ３Ａ含有組成物に、さらなる有益な効果を付与する成分、例えば、活性化剤、抗阻害剤、望ましいイオン、ｐＨを調節する化合物、または他の酵素もしくは化学物質を加えることも可能である。
【００６７】
本明細書で使用されるとき、「微生物」は、細菌、真菌、ウイルス、原生動物、および他の微少な生物を指す。
【００６８】
本明細書で使用されるとき、ポリペプチドの「誘導体」または「変異体」は、Ｃ−末端およびＮ−末端のいずれかもしくは両方への１つ以上のアミノ酸の付加、アミノ酸配列内の１ヶ所もしくは複数ヶ所の部位での１つ以上のアミノ酸の置換、ポリペプチドの末端のいずれか一方もしくは両方、またはアミノ酸配列内の１ヶ所以上の部位での１つ以上のアミノ酸の欠失、あるいはアミノ酸配列内の１ヶ所以上の部位での１つ以上のアミノ酸の挿入から誘導されるポリペプチドを指す。Ｇｇｒ３Ａ誘導体または変異体は、任意の都合の良い方法、例えば、天然ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の改変、そうしたＤＮＡ配列の好適な宿主へのトランスフォーム、および改変したＤＮＡ配列を発現させて、誘導体／変異体Ｇｇｒ３Ａを生成することによって調製することができる。誘導体または変異体は、化学的な改変、例えばグリコシル化、またはＧｇｒ３Ａポリペプチドの特性の変化などが行われたＧｇｒ３Ａポリペプチドを含むことができる。Ｇｇｒ３Ａの誘導体および変異体が本組成物および本方法に包含される一方、そのような誘導体および変異体は、同じリグノセルロース系バイオマス基質に対する加水分解条件下での、配列番号４の野生型トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）Ｂｇｌ１との比較で、より高いベータ−グルコシダーゼ活性を示す。
【００６９】
ある特定の態様においては、本明細書中の組成物および方法のＧｇｒ３Ａポリペプチドはまた、親ポリペプチドから誘導される、ベータ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドの機能的フラグメントまたはポリペプチドフラグメントを包含する。親ポリペプチドは、配列番号２を含むか、配列番号２からなる、または配列番号３を含むか、配列番号３からなる成熟配列を含むか、そのような成熟配列からなる完全長のポリペプチドであり得る。機能的ポリペプチドは、Ｎ−末端領域およびＣ−末端領域のいずれかの領域、または両領域が切断されて、親ポリペプチドのフラグメントが生成されていてもよい。本開示の目的のためには、機能的フラグメントは、親ポリペプチドの少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、４０％。５０％、好ましくは、少なくとも６０％、７０％、８０％、より一層好ましくは、少なくとも９０％のベータ−グルコシダーゼ活性を有していなければならない。
【００７０】
ある特定の態様においては、Ｇｇｒ３Ａ誘導体／変異体は、常に、配列番号２のアミノ酸配列または配列番号３の成熟配列と７５％〜９９％（もしくはそれ以上）、例えば、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列相同性を有している。いくつかの実施形態においては、アミノ酸置換は、１つのアミノ酸が１つの他の生物学的に類似したアミノ酸で置換される、Ｌ−アミノ酸による「保存的アミノ酸置換」である。保存的アミノ酸置換は、全体の電荷、疎水性／親水性、および／または置換されるアミノ酸の立体容積を保存する置換である。保存的置換の例として、以下の群の間の置換が挙げられる：Ｇｌｙ／Ａｌａ，Ｖａｌ／Ｉｌｅ／Ｌｅｕ，Ｌｙｓ／Ａｒｇ，Ａｓｎ／Ｇｌｎ，Ｇｌｕ／Ａｓｐ，Ｓｅｒ／Ｃｙｓ／Ｔｈｒ，ａｎｄ  Ｐｈｅ／Ｔｒｐ／Ｔｙｒ。例えば、誘導体は、１〜１０個のアミノ酸残基、例えば、６〜１０個、５個、４個、３個、２個、または、１個のアミノ酸残基が異なり得る。いくつかの実施形態では、Ｇｇｒ３Ａ誘導体は、Ｎ−末端および／またはＣ−末端の欠失を有し得る。この欠失した末端部分を除いたＧｇｒ３Ａ誘導体は、配列番号２または配列番号３の連続する部分領域と一致している。
【００７１】
本明細書で使用されるとき、本明細書で特定されているアミノ酸配列またはヌクレオチド配列に関する「〜パーセント（％）の配列相同性」とは、配列同一性の最大パーセントを得るため、必要ならば、配列および導入ギャップを整列させた後の、Ｇｇｒ３Ａ配列中のアミノ酸残基またはヌクレオチドと一致している候補配列中のアミノ酸残基またはヌクレオチドの割合と定義され、保存的置換は配列相同性の一部とは見なさない。
【００７２】
「ホモログ」は、対象のアミノ酸配列および対象のヌクレオチド配列と特定の割合の相同性を持った実在物である。相同配列は、従来の配列アライメントツール（例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ、ＢＬＡＳＴなど）で、対象配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％一致しているアミノ酸配列を含むとされている。一般に、ホモログは、別に指定されていない限り、同じ活性部位残基を含む。
【００７３】
配列アライメントを行い、配列相同性を決定する方法は、当業者には知られており、不要な実験をせずに行うことができ、相同性値を明確に算出することができる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １９（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；およびＡＬＩＧＮプログラム（Ｄａｙｈｏｆｆ（１９７８）ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５：Ｓｕｐｐｌ．３（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）を参照されたい。配列をアライメントし、配列相同性を決定する多くのアルゴリズムが入手可能であり、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３のホモロジーアライメントアルゴリズム；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２のローカルホモロジーアルゴリズム；Ｐｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４の類似性検索法；Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７０：１７３−１８７（１９９７）；ならびに、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズム、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴＸアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０を参照）が挙げられる。
【００７４】
これらのアルゴリズムを用いたコンピュータープログラムもまた入手可能であり、限定はされないが、ＡＬＩＧＮもしくはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア、またはＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．，２６６：４６０−４８０（１９９６））；あるいはＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）パッケージ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８として入手可能、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）；ならびにＩｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣａｌｉｆｏｒｎｉａによるＰＣ／ＧｅｎｅプログラムのＣＬＵＳＴＡＬが挙げられる。当業者であれば、比較される配列の全長に亘る最大アライメントに必要なアルゴリズムを含む、アライメントの測定に適したパラメーターを決定することができる。配列相同性は、プログラムにより決定されたデフォルトパラメーターを使用して測定することが好ましい。具体的には、配列相同性は、以下のデフォルトパラメータを有するＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０）を用いて求めることができる。
Ｇａｐ  ｏｐｅｎｉｎｇ  ｐｅｎａｌｔｙ：１０．０
Ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ：０．０５
Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＳＵＭ  ｓｅｒｉｅｓ
ＤＮＡ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍａｔｒｉｘ：ＩＵＢ
Ｄｅｌａｙ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ％：４０
Ｇａｐ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｄｉｓｔａｎｃｅ：８
ＤＮＡ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ  ｗｅｉｇｈｔ：０．５０
Ｌｉｓｔ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ：ＧＰＳＮＤＱＥＫＲ
Ｕｓｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｍａｔｒｉｘ：ＯＦＦ
Ｔｏｇｇｌｅ  Ｒｅｓｉｄｕｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｅｎａｌｔｉｅｓ：ＯＮ
Ｔｏｇｇｌｅ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｐｅｎａｌｔｉｅｓ：ＯＮ
Ｔｏｇｇｌｅ  ｅｎｄ  ｇａｐ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙＯＦＦ
【００７５】
「発現ベクター」は、好適な宿主内でのＤＮＡ発現に影響を及ぼし得る好適な制御配列に操作可能に結合するＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構成物を意味する。そのような制御配列としては、転写に影響するプロモーター、転写を制御する任意選択のオペレーター配列、ｍＲＮＡのリボソーム結合部位をコードする配列、および転写および翻訳の終了を制御する配列を挙げ得る。異なる発現ベクターを有する異なる細胞型を使用し得る。バチルス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）で使用されるプロモーターの例はＡｐｒＥプロモーターであり、ストレプトミケス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）で使用されるプロモーターの例はＡ４プロモーター（アスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来）であり；エケリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）で使用されるプロモーターの例はＬａｃプロモーターであり：サッカロミケス・ケレヴィシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）で使用されるプロモーターの例はＰＧＫ１であり、アスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）で使用されるプロモーターの例はｇｌａＡであり、そしてトリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）のプロモーターの例はｃｂｈＩである。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、または単に潜在的なゲノムの挿入であってよい。好適な宿主にトランスフォームされたなら、ベクターは宿主ゲノムからは独立して複製し機能するか、または、好適な条件下では、ゲノム自身と一体化する。本明細書においては、プラスミドまたはベクターは、時に互換的に使用される。しかしながら、本組成物および本方法は、同等の機能を持ち、かつ、当該技術分野で知られているか、または知られるようになる他の形態の発現ベクターを含むことが意図されている。したがって、多種多様な宿主／発現ベクターが、本明細書に記載のＤＮＡ配列の発現に使用され得る。有用な発現ベクターは、例えば、ＳＶ４０の既知の各種誘導体および既知の各種細菌のプラスミド（例えば、ｃｏｌ  Ｅ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭｂ９、ｐＵＣ  １９、それらの誘導体などのＥ．ｃｏｌｉ由来のプラスミド、広宿主域プラスミド、例えば、ＲＰ４、ファージＤＮＡ、例えば、ファージλの多くの誘導体（例えば、ＮＭ９８９）、および他のＤＮＡファージ（例えば、Ｍ１３および線状１本鎖ＤＮＡファージ）、酵母プラスミド、例えば、２μプラスミドまたはその誘導体、真核細胞に有用なベクター、例えば、動物に有用なベクター、ならびに、プラスミドおよびファージＤＮＡの組合せから誘導されるベクター、例えば、ファージＤＮＡまたは他の発現制御配列を使用するために改変されたプラスミドなどの、染色体配列、非染色体配列および合成ＤＮＡ配列のセグメントからなり得る。本組成物および本方法の発現ベクターによる発現手法は、当該技術分野では知られており、概ね、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載されている。そのような本明細書���記載のＤＮＡ配列を含む発現ベクターは、多くの場合、組込みイベントを介した特定の種のゲノムへの直接挿入によって単細胞の宿主へトランスフォームされる（例えば、Ｂｅｎｎｅｔｔ  ＆  Ｌａｓｕｒｅ，Ｍｏｒｅ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｇｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ｐｐ．７０−７６（１９９１）および、真菌宿主における対象ゲノムの挿入が記載されている、本明細書に引用された論文を参照）。
【００７６】
本明細書で使用されるとき、「宿主株」または「宿主細胞」は、本組成物および本方法のＤＮＡを含む発現ベクターに好適な宿主を意味する。本組成物および本方法に有用な宿主細胞は、一般に、原核生物宿主または真核生物宿主であり、例えば、発現を行わせることができるトランスフォーム可能な微生物が挙げられる。具体的には、宿主株は、バチルス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトミケス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）、エケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、トリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、サッカロミケス・ケレヴィシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはアスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）であり得る。ある特定の実施形態においては、宿主細胞はエタノール産生微生物であり得、エタノール産生微生物は、例えば、サッカロミケス・ケレヴィシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母、またはジイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）などの細菌エタノロゲンであり得る。サッカロミケス・ケレヴィシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはジイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）が宿主細胞として使用され、かつベータ−グルコシダーゼ遺伝子が宿主細胞から分泌するよう作られておらず、細胞内で発現するなら、細胞内で発現したベータ−グルコシダーゼがセロビオース基質に作用し、グルコースを遊離するよう、宿主細胞にセロビオーストランスポータ遺伝子を導入することができる。グルコースは、その後直ちに、または時間を経て、微生物によって代謝され、エタノールに変換される。
【００７７】
宿主細胞は、組み換えＤＮＡ技術によって作られたベクターによりトランスフォームまたはトランスフェクトされる。そのようなトランスフォームされた宿主細胞は、Ｇｇｒ３Ａ（および、その誘導体または変異体（ｖａｒｉａｎｔ）（変異体（ｍｕｔａｎｔ）））をコードするベクターの複製、および所望のペプチド生成物の発現の一方または両方を行い得る。本組成物および本方法の特定の実施形態では、「宿主細胞」は、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞から作られた細胞およびプロトプラストの両方を意味する。
【００７８】
細胞に関して使用される「トランスフォームされた」「安定にトランスフォームされた」および「遺伝子導入の」という用語は、細胞が、ゲノムに組み込まれるか、または複数の世代に亘って保持されるエピソームとして導入された非天然の（例えば、異種の）核酸配列を含むこと意味する。
【００７９】
「導入された」という用語は、当業者に知られているような「トランスフェクト」、「トランスフォーム」または「トランスダクト」を意味する。
【００８０】
「宿主株」または「宿主細胞」は、対象とするポリペプチド（例えば、ベータ−グルコシダーゼ）をコードするポリヌクレオチドを含む、発現ベクター、ファージ、ウイルスまたは他のＤＮＡ構成物が導入された有機体である。宿主株の例としては、対象とするポリペプチドを発現することができる微生物細胞（例えば、細菌、糸状菌および酵母）がある。「宿主細胞」という用語には、細胞から作られたプロトプラストが含まれる。
【００８１】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに関連した「異種の」という用語は、宿主細胞において天然には産生しないポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。
【００８２】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに関連した「内在の」という用語は、宿主細胞において天然に産生するポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。
【００８３】
「発現」という用語は、ポリペプチドが核酸配列に基づいて生成されるプロセスを指す。このプロセスには、転写および翻訳の両方が含まれる。
【００８４】
したがって、リグノセルロース系バイオマス基質をエタノールに変換するプロセスは、いくつかの実施形態においては、２つのベータ−グルコシダーゼ活性を有する。例えば、第１のベータ−グルコシダーゼ活性は、糖化または加水分解の工程中、リグノセルロース系バイオマス基質に適用され、第２のベータ−グルコシダーゼ活性は、糖化または加水分解工程によって生成された単糖または発酵性糖を代謝する発酵工程において、エタノール産生微生物の一部として適用され得る。第１および第２のベータ−グルコシダーゼ活性は、いくつかの実施形態においては、同じベータ−グルコシダーゼポリペプチドの存在から生じる。例えば、糖化における第１のベータ−グルコシダーゼ活性が本発明のＧｇｒ３Ａポリペプチドの存在から生じ、一方、第２のベータ−グルコシダーゼ活性が、エタノール産生微生物による異なるベータ−グルコシダーゼの発現から生じる。他の例では、第１および第２のベータ−グルコシダーゼ活性が、糖化または加水分解工程および発酵工程において、同じポリペプチドの存在から生じ得る。例えば、いくつかの実施形態においては、同じ本発明のＧｇｒ３Ａポリペプチドが、加水分解または糖化工程と発酵工程の両方でベータ−グルコシダーゼ活性を示す。
【００８５】
ある特定の他の実施形態では、リグノセルロース系バイオマス基質のエタノールへの変換プロセスは、２つのベータ−グルコシダーゼ活性を含むが、糖化または加水分解工程と発酵工程は同時に、例えば同じタンクで起こる。２種以上のベータ−グルコシダーゼポリペプチドが、ベータ−グルコシダーゼ活性に寄与してもよく、その中の１種が本発明のＧｇｒ３Ａポリペプチドであってよい。
【００８６】
ある特定のさらなる実施形態では、リグノセルロース系バイオマスをエタノールに変換するプロセスは、単一のベータ−グルコシダーゼ活性を含み得るが、糖化または加水分解工程と発酵工程のいずれか（両工程ではない）にはベータ−グルコシダーゼが関与する。例えば、本発明のＧｇｒ３Ａポリペプチド、またはＧｇｒ３Ａポリペプチドを含む組成物は、糖化工程で使用させることができる。他の例では、リグノセルロース系バイオマス基質の加水分解に使用される酵素組成物はベータ−グルコシダーゼ活性を含まないが、エタノール産生微生物はベータ−グルコシダーゼポリペプチド、例えば、本発明のＧｇｒ３Ａポリペプチドを発現する。
【００８７】
本明細書で使用されるとき、「シグナル配列」は、ポリペプチドのＮ−末端部に結合し、細胞外のそのポリペプチドの成熟形態の分泌を促進するアミノ酸配列を意味する。シグナル配列のこの定義は、機能的定義である。細胞外ポリペプチドの成熟形態はシグナル配列を欠失しており、それは分泌プロセス中に切除される。Ｇｇｒ３Ａの天然シグナル配列は、本組成物および本方法の態様において使用され得る一方、他の非天然シグナル配列も使用され得る（例えば、配列番号１１）。本明細書において、ポリペプチドに関するときの「成熟した」という用語は、翻訳および翻訳後の改変を行った後の最終形態のポリペプチドを意味する。例えば、本発明のＧｇｒ３Ａポリペプチドは、１つ以上の成熟形態を有し、その少なくとも１つは配列番号３のアミノ酸配列を有する。
【００８８】
本発明のベータ−グルコシダーゼポリペプチドは、「前駆体」、「未成熟の」または「完全長の」と表現され得、その場合、それらにはシグナル配列が含まれ、あるいは、それらは「成熟の」と表現され得、その場合、それらにはシグナル配列が含まれ、あるいは、それらはそれらにはシグナル配列が欠失している。ポリペプチドの成熟形態が、一般に、最も有用である。別に規定されていない限り、本明細書で使用されるアミノ酸残基の計数は、それぞれのアミラーゼのポリペプチドの成熟形態を指す。本発明のベータ−グルコシダーゼポリペプチドはまた、得られるポリペプチドにベータ−グルコシダーゼ活性が残っている限り、Ｎ−末端またはＣ−末端を切除してもよい。
【００８９】
本発明のベータ−グルコシダーゼポリペプチドはまた、第１のベータ−グルコシダーゼポリペプチドの少なくとも一部と、第２のベータ−グルコシダーゼポリペプチドの少なくとも一部とを含む、「キメラの」または「ハイブリッドの」ポリペプチドであってもよい（そのようなキメラベータ−グルコシダーゼポリペプチドは、例えば、第１および第２のベータ−グルコシダーゼから、各ベータ−グルコシダーゼ上のドメインを交換するなどの既知の技術を用いて誘導することができる）。本発明のベータ−グルコシダーゼポリペプチドは、さらに、異種のシグナル配列、トラッキングまたは精製を可能にするエピトープなどを含んでもよい。「異種の」という用語がシグナル配列、対象とするポリペプチドの発現に使用されるシグナル配列に関連して使用されている場合、それは、シグナル配列が、例えば、対象のポリペプチドと異なる微生物に由来したものであることを意味する。本発明のＧｇｒ３Ａポリペプチドを発現する好適な異種シグナル配列の例としては、例えば、トリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）由来のもの、例えば、配列番号１１、１２、１３、１４または１５のいずれか１つを挙げることができる。
【００９０】
本明細書で使用されるとき、「機能的に付いた」または「操作可能に結合した」は、既知の、または所望する活性を有する制御領域または機能ドメイン、例えば、プロモーター、ターミネーター、シグナル配列またはエンハンサー領域がターゲット（例えば、遺伝子またはポリペプチド）に、制御領域または機能ドメインが、その既知のまたは所望の活性により、ターゲットの発現、分泌または機能を調節するように付くか、または結合することを意味する。
【００９１】
本明細書で使用されるとき、「ポリペプチド」および「酵素」という用語は互換的に使用され、ペプチド結合によって結合したアミノ酸残基を含む任意の長さのポリマーを指す。本明細書においては、アミノ酸残基に対し、従来の１文字コードまたは３文字コードが使用される。ポリマーは、直鎖状であっても分岐状であってもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、また、非アミノ酸で中断されていてもよい。これらの用語はまた、天然に、または介入により、例えば、ジスルフィド結合生成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または他の任意の操作もしくは改質、例えば標識成分の結合などにより、改質されたアミノ酸ポリマーを包含する。また、定義には、例えば、アミノ酸の１種以上のアナログ（例えば、非天然アミノ酸などが挙げられる）を含むポリペプチドや、当該技術分野で知られる他の改質が含まれる
【００９２】
本明細書で使用されるとき、「野生型」および「天然」の遺伝子、酵素または株は、天然に見出されるものである。
【００９３】
ポリペプチドに関連した「野生型」、「親」または「参照」という用語は、１つ以上のアミノ酸の位置での人の手による置換、挿入または欠失を含まない、天然に発生したポリペプチドを指す。同様に、ポリヌクレオチドに関連した「野生型」、「親」または「参照」という用語は、人の手によるヌクレオシドの変化を含まない、天然に発生したポリヌクレオチドを指す。しかしながら、野生型、親または参照のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、天然に発生したポリヌクレオチドに限らず、むしろ、野生型、親または参照のポリペプチドをコードする任意のポリヌクレオチドを包含する。
【００９４】
本明細書で使用されるとき、「変異体ポリペプチド」は、１つ以上のアミノ酸の置換、付加または欠失によって（通常、組み換えＤＮＡ技術による）、親（参照）ポリペプチドから誘導されるポリペプチドを指す。変異体ポリペプチドは、少数のアミノ酸残基が親ポリペプチドと異なるものであってよい。それらは、アミノ酸の一次配列の親ポリペプチドとの同一性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）／相同性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）のレベルによって定義することができる。好適には、変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列相同性を有する。
【００９５】
本明細書で使用されるとき、「変異体ポリヌクレオチド」は、変異体ポリペプチドをコードするか、親ポリヌクレオチドと所定の割合の相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）／相同性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有するか、または、親ポリヌクレオチドもしくはその相補体と、厳しい条件下で、ハイブリダイズする。好適には、変異体ポリヌクレオチドは、親ポリヌクレオチドまたは親ポリヌクレオチドの相補体と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のヌクレオチド配列相同性を有する。相同性パーセントを決定する方法は、当該技術分野で知られており、上述されている。
【００９６】
「〜から誘導される（ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ）」という用語は、「〜から起こる（ｏｒｉｇｉｎａｔｅｄ  ｆｒｏｍ）」、「〜から得られる（ｏｂｔａｉｎｅｄ  ｆｒｏｍ）」、「〜から得ることができる（ｏｂｔａｉｎａｂｌｅ  ｆｒｏｍ）」、「〜から単離される（ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ）」および「〜から作られる（ｃｒｅａｔｅｄ  ｆｒｏｍ）」という用語を包含し、一般に、１つの特定の物質の起源が他の特定の物質にあるか、またはその他の特定の物質に関して記載し得る特徴を有することを示している。
【００９７】
本明細書で使用されるとき、「ハイブリダイズ条件」という用語は、ハイブリダイズ反応が行われる条件を指す。これらの条件は、通常、条件の「ストリンジェンシー」の程度によって分類される。ストリンジェンシーの程度は、例えば、核酸結合複合体またはプローブの融点（Ｔｍ）を基準にすることができる。例えば、「最大ストリンジェンシー」は、通常、約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍ下、５℃）；「高ストリンジェンシー」は、Ｔｍ下、約５〜１０℃；「中程度ストリンジェンシー」は、プローブのＴｍ下、約１０〜２０℃；および「低ストリンジェンシー」は、Ｔｍ下、約２０〜２５℃で起こる。あるいは、またはさらに、ハイブリダイズ条件は、ハイブリダイズの塩もしくはイオン強度条件を基準に、および／または１回以上の厳密な洗浄を基準に（例えば、６×ＳＳＣ＝非常に低いストリンジェンシー；３×ＳＳＣ＝低〜中程度のストリンジェンシー；１×ＳＳＣ＝中程度のストリンジェンシー；および０．５×ＳＳＣ＝高いストリンジェンシー）することができる。機能的には、最大ストリンジェンシー条件は、ハイブリダイゼーションプローブと厳密な相同性を有するか、または厳密に近い相同性を有する核酸配列の同定に使用され得るが、高ストリンジェンシー条件は、プローブと約８０％以上の配列相同性を有する核酸配列の同定に使用される。高い選択性が要求される用途では、一般に、比較的高いストリンジェンシー条件を使用して、ハイブリッドを形成することが望ましい（例えば、比較的低濃度の塩および／または高い温度の条件が使用される）。
【００９８】
本明細書で使用されるとき、「ハイブリダイゼーション」という用語は、当該技術分野で知られているように、核酸鎖がその相補鎖と塩基対を形成するによって結合するプロセスを指す。より具体的には、「ハイブリダイゼーション」は、ブロットハイブリダイゼーション技術およびＰＣＲ技術で起こるような、核酸の一本鎖が、相補鎖と二本鎖、すなわち塩基対を形成するプロセスを指す。核酸配列と参照核酸配列の２つの配列が中程度から高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件および洗浄条件で特異的に互いにハイブリダイズするなら、核酸配列は参照核酸配列と「選択的にハイブリダイズすることができる」と見なされる。ハイブリダイゼーション条件は、核酸結合複合体またはプローブの融点（Ｔｍ）に基づく。例えば、「最大ストリンジェンシー」は、通常、約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍ下、５℃）；「高ストリンジェンシー」は、Ｔｍ下、約５〜１０℃；「中程度ストリンジェンシー」は、プローブのＴｍ下、約１０〜２０℃；および「低ストリンジェンシー」は、Ｔｍ下、約２０〜２５℃で起こる。機能的には、最大ストリンジェンシー条件は、ハイブリダイゼーションプローブと厳密な相同性を有するか、または厳密に近い相同性を有する配列の同定に使用され得るが、中程度ストリンジェンシーまたは低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチド配列ホモログの同定または検出に使用され得る。
【００９９】
中程度ストリンジェンシーおよび高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、当該技術分野ではよく知られている。例えば、中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１５ｍＭ  クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ  ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％デキストラン硫酸および２０ｍｇ／ｍｌ変性した断片処理済みサケ精子ＤＮＡを含む溶液中、３７℃で終夜インキュベーションし、次いで、約３７〜５０℃でフィルターを１×ＳＳＣ中で洗浄することによって行うことができる。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、６５℃および０．１×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，０．０１５Ｍ  クエン酸Ｎａ３  ｐＨ  ７．０）によるハイブリダイゼーションであり得る。あるいは、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％  ＳＤＳ、および１００μｇ／ｍｌの変性した断片処理済みサケ精子ＤＮＡ中、４２℃で、次いで、室温で２×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳにより２回洗浄し、さらに、４２℃で０．１×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳにより２回洗浄することによって行うことができる。また、非常に高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、６８℃および０．１×ＳＳＣによるハイブリダイゼーションであり得る。当業者は、プローブの長さなどの因子を適合させるため、必用に応じて温度、イオン強度などを調節する方法を知っている。
【０１００】
変異体ベータ−グルコシダーゼをコードする核酸は、配列番号１のヌクレオチドとそれと相同の相補体間で形成される２本鎖に比べ、１℃〜３℃もしくはそれ以上低いＴｍを有し得る。
【０１０１】
少なくとも２つの核酸またはポリペプチドに関連した「実質的に類似した」または「実質的に同一の」という句は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、親または参照配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％一致した配列を含むことを意味するか、または、機能を加えることなく、この記載を回避するためにのみなされるアミノ酸の置換、挿入または修飾を含まないことを意味する。
【０１０２】
本明細書で使用されるとき、「発現ベクター」は、特定のポリペプチドをコードするか、または、好適な宿主内でポリペプチドを発現させることができる好適な制御配列に操作可能に結合しているＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構成物を指す。そのような制御配列は、転写を行わせるプロモーター、そのような転写を制御する任意選択のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡのリボソーム結合部位をコードする配列、および／または転写および翻訳の終了を制御する配列を含み得る。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、または潜在的なゲノムの挿入であってよい。好適な宿主にトランスフォームされたなら、ベクターは宿主ゲノムからは独立して複製し機能するか、または、いくつかの例では、宿主ゲノムへ統合される。
【０１０３】
「組み換え」という用語は、例えば、コード配列を変異させて改変ポリペプチドを産生させる、コード配列を他の遺伝子のそれに融合させる、異なるプロモーターの制御下に遺伝子を置く、異種微生物内で遺伝子を発現させる、遺伝子の発現レベルを増大または減少させる、条件的に、または構成的に天然の発現プロファイルと異なる方法で遺伝子を発現させるなどの方法で改質して、その配列または発現特性を変化させた遺伝子材料（すなわち、核酸、それらがコードするポリペプチド、ならびに、ベクターおよびそのようなポリヌクレオチドを含む細胞）を指す。一般に、組み換え核酸、組み換えポリペプチド、およびそれに基づく組み換え細胞は、天然に見出される関連する核酸、ポリペプチドおよび細胞と同じにならないよう人によって操作されてきている。
【０１０４】
「シグナル配列」は、ポリペプチドのＮ−末端部に結合したアミノ酸配列を指し、それは、ポリペプチドの成熟形態の細胞からの分泌を促進する。細胞外ポリペプチドの成熟形態はシグナル配列を欠失しており、それは分泌プロセス中に切除される。
【０１０５】
「選択マーカー」または「選択可能なマーカー」という用語は、導入された核酸またはベクターを含む宿主の選択を容易にする、宿主細胞内で発現することができる遺伝子を指す。選択可能なマーカーの例としては、限定はされないが、抗微生物物質（例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、またはクロラムフェニコール）および／または宿主細胞に栄養上の有利性などの代謝の有利性を与える遺伝子が挙げられる。
【０１０６】
「調節エレメント」という用語は、核酸配列発現の態様を調節する遺伝子要素を指す。例えば、プロモーターは、操作可能に結合したコード領域の転写の開始を促進する。さらなる調節エレメントとしては、スプライシングシグナル、ポリアデ二ル化シグナル、およびターミネーションシグナルが挙げられる。
【０１０７】
本明細書で使用されるとき、「宿主細胞」は、一般に、当該技術分野で知られている組み換えＤＮＡ技術により作られたベクターでトランスフォームまたはトランスフェクトされる原核生物宿主または真核生物宿主の細胞である。トランスフォームされた宿主細胞は、ポリペプチド変異体をコードするベクター、または所望のポリペプチド変異体を発現させるベクターを複製することができる。ポリペプチド変異体のプレ形態またはプロ形態をコードするベクターの場合、そのような変異体は、通常、宿主細胞から宿主細胞培地へ分泌される。
【０１０８】
核酸配列の細胞への挿入に関連する「導入された」という用語は、トランスフォーメーション、トランスダクション、またはトランスフェクションを意味する。トランスフォーメーションの手段としては、当該技術分野で知られているプロトプラストトランスフォーメーション法、塩化カルシウム沈澱法、エレクトロポレーション法、ネイキッドＤＮＡ法などが挙げられる。（Ｃｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６８：１１１−１１５，１９７９；  Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５１：６３４，１９８６；  およびハリウッドのＦｅｒｒａｒｉらによる総説論文Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ｐｐ．５７−７２，１９８９を参照）。
【０１０９】
「融合」ポリペプチド配列は、２つの対象ポリペプチド配列間がペプチド結合により接続、すなわち、操作可能に結合されている。
【０１１０】
「糸状菌」という用語は、エウミコチナ（Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ）亜門の全ての糸状形態、特に、ペジゾミコチナ（Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ）種を指す。
【０１１１】
「エタノール産生微生物」は、糖またはオリゴ糖をエタノールに変換する能力を有する微生物を指す。
【０１１２】
他の技術分野において通常の技術を有する者により一般に理解される意味と技術用語および科学用語は、本開示が関係する技術分野において通常の技術を有する者により一般に理解される意味と同じ意味を有する（例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，ＮＹ  １９９４；  ａｎｄ  Ｈａｌｅ  ａｎｄ  Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，ＮＹ  １９９１を参照）。
【０１１３】
ベータ−グルコシダーゼポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクターおよび宿主細胞
Ｇｇｒ３Ａポリペプチド
一態様において、本組成物および本方法は、ベータ−グルコシダーゼ活性を有する、組み換えＧｇｒ３Ａベータ−グルコシダーゼポリペプチド、そのフラグメント、またはその変異体。組み換えベータ−グルコシダーゼポリペプチドの一例は、グロメレラ・グラミニコラ（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）から単離された。成熟Ｇｇｒ３Ａポリペプチドは、配列番号３に示したアミノ酸配列を有する。（予想されるシグナル配列を配列番号４５に示す。）同様に、実質的に類似したＧｇｒ３Ａポリペプチドが天然に、例えば、グロメレラ・グラミニコラ（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）の他の株または分離株で生じる。これらの、および他の組み換えＧｇｒ３Ａポリペプチドは、本組成物および本方法に包含される。
【０１１４】
いくつかの実施形態においては、組み換えＧｇｒ３Ａポリペプチドは、例示したＧｇｒ３Ａポリペプチドと特定の割合のアミノ酸配列相同性を有する、例えば、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号３の成熟配列と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも９９％の配列相同性を有する変異体Ｇｇｒ３Ａポリペプチドである。配列相同性は、アミノ酸配列アライメントにより、例えば、本明細書に記載したようなＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、またはＣＬＵＳＴＡＬなどのプログラムを使用して決定することができる。
【０１１５】
ある特定の実施形態では、組み換えＧｇｒ３Ａポリペプチドは、微生物、例えば、細菌または真菌宿主有機体において組み換えで生成されるが、他の例では、Ｇｇｒ３Ａポリペプチドは合成により生成され、または、天然源（例えば、グロメレラ・グラミニコラ（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ））から精製される。
【０１１６】
ある特定の実施形態では、組み換えＧｇｒ３Ａポリペプチドは、ポリペプチドの構造および／または機能に実質的に影響を及ぼさない置換を含む。これらの置換の例としては、表１に要約したような保護的変異が挙げられる。
【０１１７】
【表１】
2017532967.tif 000003
【０１１８】
アミノ酸の天然の発生を含む置換は、一般に、組み換えＧｇｒ３Ａポリペプチドをコードする核酸の突然変異、およびその後の微生物中の変異体ポリペプチドの発現によってなされる。アミノ酸の非天然の発生、すなわちアミノ酸への化学的修飾を含む置換は、一般に、Ｇｇｒ３Ａポリペプチドが微生物中で合成された後、それを化学的に修飾することによってなされる。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、変異体組み換えＧｇｒ３Ａポリペプチドは配列番号２または配列番号３と実質的に相同であるが、これは、変異体組み換えＧｇｒ３Ａポリペプチドが、ポリペプチドの構造、機能または発現に大きく影響しないアミノ酸の置換、挿入または欠失を含んでいないことを意味する。そのような変異体組み換えＧｇｒ３Ａポリペプチドは、本開示を回避するように設計されたポリペプチドを含むであろう。いくつかの実施形態では、変異体組み換えＧｇｒ３Ａポリペプチド、これらの変異体を含む組成物および方法は、配列番号２または配列番号３と実質的に相同ではなく、配列番号２または配列番号３のポリペプチドと比較して、例えば、リグノセルロース基質の加水分解に対する特異的活性の改善、望ましい宿主有機体における発現の改善、熱安定性の改善、ｐＨ安定性などの特性の改善を達成できるように、ある環境下で本明細書に記載のポリペプチドの構造、機能または発現に実質的に影響を及ぼすようなアミノ酸の置換、挿入または欠失をむしろ含んでいる。
【０１２０】
いくつかの実施形態においては、組み換えＧｇｒ３Ａポリペプチド（その変異体を含む）はベータ−グルコシダーゼ活性を有する。ベータ−グルコシダーゼ活性は、本明細書に記載のアッセイ、例えば、実施例２に記載のアッセイにより、または当該技術分野で知られている他のアッセイにより、決定し測定することができる。
【０１２１】
組み換えＧｇｒ３Ａポリペプチドは、ベータ−グルコシダーゼ活性が保持されている、「完全長」Ｇｇｒ３Ａポリペプチドのフラグメントを含む。好ましくは、それらの機能的フラグメント（すなわち、ベータ−グルコシダーゼ活性が保持されているフラグメント）は、少なくとも１００個のアミノ酸残基長（例えば、少なくとも１００個のアミノ酸残基長、少なくとも１２０個のアミノ酸残基長、少なくとも１４０個のアミノ酸残基長、少なくとも１６０個のアミノ酸残基長、少なくとも１８０個のアミノ酸残基長、少なくとも２００個のアミノ酸残基長、少なくとも２５０個のアミノ酸残基長、少なくとも３０００個のアミノ酸残基長、少なくとも３５０個のアミノ酸残基長、少なくとも４００個のアミノ酸残基長、少なくとも４５０個のアミノ酸残基長、少なくとも５００個のアミノ酸残基長、または少なくとも６００個のアミノ酸残基長もしくはそれ以上）を有する。そのようなフラグメントは、完全長のプレカーサ―ポリペプチドまたは完全長の成熟ポリペプチドの活性部位を保持していることが好適であるが、重要ではないアミノ酸残基の欠失があってもよい。フラグメントの活性は、本明細書に記載のアッセイ、例えば、実施例２に記載のアッセイにより、または当該技術分野で知られている他のアッセイにより、容易に決定することができる。
【０１２２】
いくつかの実施形態においては、Ｇｇｒ３Ａアミノ酸配列およびその誘導体は、例えば、抽出、検出および／または精製を助けるため、ならびに／あるいはＧｇｒ３Ａポリペプチドに機能特性を付加するため、Ｎ−末端および／またはＣ末端融合タンパク質として生成される。融合タンパク質のパートナーの例としては、限定はされないが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６ＸＨｉｓ、ＧＡＬ４（ＤＮＡ結合および／または転写活性ドメイン）、ＦＬＡＧ−タグ、ＭＹＣ−タグまたは当該技術分野で知られている他のタグが挙げられる。いくつかの実施形態においては、融合配列を除去するため、融合タンパク質パートナーと対象のポリペプチド配列との間にタンパク質分解切断部位を設ける。融合タンパク質は組み換えＧｇｒ３Ａポリペプチドの活性を阻害しないことが好ましい。いくつかの実施形態においては、組み換えＧｇｒ３Ａポリペプチドはリーダーペプチド、プロペプチド、結合ドメインおよび／または触媒ドメインを含む機能ドメインに融合される。融合タンパク質は、任意選択により、Ｇｇｒ３Ａポリペプチドと融合ドメインとをそれらのいずれの要素の特性に対しても大きな影響を及ぼさずに接合するリンカー配列によって、組み換えＧｇｒ３Ａポリペプチドに結合される。リンカーは、任意選択により、所期の用途に機能的に寄与する。
【０１２３】
本開示は、本開示の１種以上のＧｇｒ３Ａポリペプチドを発現するよう改変された宿主細胞を提供する。好適な宿主細胞としては、任意の微生物細胞（例えば、細菌、原生生物、藻、真菌（例えば、酵母、糸状菌）または他の微生物の細胞）が挙げられ、好ましくは、細菌、酵母または糸状菌の細胞である。
【０１２４】
細菌属の好適な宿主細胞としては、限定はされないが、エケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、プセウドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）およびストレプトミケス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の細胞が挙げられる。細菌種の好適な細胞としては、限定はされないが、エケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、バチルス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、プセウドモナス・アエルノギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）およびストレプトミケス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）の細胞が挙げられる。
【０１２５】
酵母属の好適な宿主細胞としては、限定はされないが、サッカロミケス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミケス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、クルイウェロミケス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）およびパフィア（Ｐｈａｆｆｉａ）の細胞が挙げられる。酵母種の好適な細胞としては、限定はされないが、サッカロミケス・ケレヴィシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミケス・ポムベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、ハンセヌラ・ポリモルパ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・カナデンシス（Ｐ．ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、クルイウェロミケス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）およびパフィア・ロドジイマ（Ｐｈａｆｆｉａ  ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）の細胞が挙げられる。
【０１２６】
糸状菌類の好適な宿主細胞としては、エウミコチナ（Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ）亜門の中の糸状形態のもの全てが挙げられる。糸状菌属の好適な細胞としては、限定はされないが、アクレモモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ビィエルカンデラ（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ）、ケリポリオプシシ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、クリソポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｐｏｒｉｕｍ）コプリヌス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、コリオルス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）、コリナスクス（Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ）、カエルトミウム（Ｃｈａｅｒｔｏｍｉｕｍ）クリプトコックス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィロバシジウム（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ギベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ，）、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、ミケリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、ネオカリマスティックス（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ネイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、パエキロミケス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ファネロカエテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、フレビア（Ｐｈｌｅｂｉａ）、ピロミケス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、プレウロツス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、スキタルジウム（Ｓｃｙｔａｌｄｉｕｍ）、スキゾフィルム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、スポロトリクム（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ）、タラロミケス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、テルモアスクス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ，）、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、トラメテス（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）およびトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の細胞が挙げられる。
【０１２７】
糸状菌種の好適な細胞としては、限定はされないが、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・フォエチドゥス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ヤポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、クリソスポリウム・ラックノウエンセ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フサリウム・バクトリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フサリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フサリウム・クルックウェレンス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フサリウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フサリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フサリウム・グラミヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フサリウム・ヘテロスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フサリウム・ネグンジ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｎｅｇｕｎｄｉ）、フサリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フサリウム・レティクラツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フサリウム・ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、フサリウム・サムブキヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フサリウム・サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フサリウム・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フサリウム・トルロスム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フサリウム・トリコテシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フサリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、ブエルカンデラ・アデュスタ（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ  ａｄｕｓｔａ）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ａｎｅｉｒｉｎａ）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ａｎｅｉｒｉｎａ）、セリポリオプシス・カレギエア（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｃａｒｅｇｉｅａ）、セリポリオプシス・ギルベスセンス（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｇｉｌｖｅｓｃｅｎｓ）、セリポリオプシス・パノシンタ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｐａｎｎｏｃｉｎｔａ）、セリポリオプシス・リブロサ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｒｉｖｕｌｏｓａ）、セリポリオプシス・スブルファ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｓｕｂｒｕｆａ）、セリポリオプシス・スブベルミスポラ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｓｕｂｖｅｒｍｉｓｐｏｒａ）、コプリヌス・キネレウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｃｉｎｅｒｅｕｓ）、コリオルス・ヒルスツス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｈｉｒｓｕｔｕｓ）、フミコラ・インソレンス（Ｈ���ｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、ミケリオフトラ・テルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ネウロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、ネウロスポラ・インテルメディア（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、ペニシリウム・プルプロゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ペニシリウム・カネセンス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃａｎｅｓｃｅｎｓ）、ペニシリウム・ソリツム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｏｌｉｔｕｍ）、ペニシリウム・フニクロスム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）、ファネロカエテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フレビア・ラジアーテ（Ｐｈｌｅｂｉａ  ｒａｄｉａｔｅ）、プレウロツス・エリンギイ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｅｒｙｎｇｉｉ）、タラロミケス・フラブス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｌａｖｕｓ）、チエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トラメテス・ビロサ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｖｉｌｌｏｓａ）、トラメテス・ベルシコロル（Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、トリコデルマ・ハルジアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアツム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）およびトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）の細胞が挙げられる。
【０１２８】
核酸をこれらの有機体トランスフォームする方法は、当該技術分野で知られている。例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主細胞にトランスフォームする好適な手順は、欧州特許第２３８０２３号明細書に記載されている。
【０１２９】
いくつかの実施形態においては、組み換えＧｇｒ３Ａポリペプチドはシグナルペプチドに融合されて、例えば、組み換えＧｇｒ３Ａポリペプチドの細胞外分泌を促進する。例えば、ある特定の実施形態においては、シグナルペプチドは、配列番号１１〜４０から選択される配列によってコードされる。特定の実施形態においては、組み換えＧｇｒ３Ａポリペプチドは、異種有機体内で分泌ポリペプチドとして発現する。本明細書に記載の組成物および方法は、したがって、Ｇｇｒ３Ａポリペプチドを異種有機体内で分泌ポリペプチドとして発現させる方法を包含する。いくつかの実施形態においては、組み換えＧｇｒ３Ａポリ例えば、異種有機体がサッカロミケス・ケレヴィシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはジイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）などのエタノール産生微生物の場合、組み換えＧｇｒ３Ａポリペプチドは異種有機体の細胞内で発現する。その場合、Ｇｇｒ３Ａポリペプチドが有機体内でセロビオース基質に作用して、セロビオースをＤ−グルコースに変換するように、遺伝子工学ツールを用いて、セロビオーストランスポータ遺伝子を有機体に導入することができる。Ｄ−グルコースはその後代謝されるか、または有機体によってエタノールに変換される。
【０１３０】
本開示はまた、上記核酸を含む発現カセットおよび／またはベクターを提供する。好適には、Ｇｇｒ３Ａポリペプチドをコードする核酸をプロモーターに操作可能に結合させる。プロモーターは、当該技術分野ではよく知られている。宿主細胞内で機能するプロモーターはいずれも、ベータ−グルコシダーゼおよび／または本開示の他の任意の核酸の発現に使用することができる。ベータ−グルコシダーゼ、核酸および／または本開示の他の核酸の様々な宿主細胞での発現の駆動に有用である開始制御領域またはプロモーターは数多くあり、当業者にはよく知られている（国際公開第２００４／０３３６４６号パンフレットおよび底に引用されている参考文献を参照）。事実上、これらの核酸を駆動可能なプロモーターは全て使用することができる。
【０１３１】
具体的には、糸状菌宿主内での組み換え発現が望ましい場合、プロモーターは、糸状菌のプロモーターであり得る。核酸は、例えば、異種プロモーターの制御下に置くことができる。核酸はまた、構成型または誘導型プロモーターの生後下で発現させることができる。使用可能なプロモーターの例としては、限定はされないが、セルラーゼプロモーター、キシラナーゼプロモーター、１８１８プロモーター（以前に、ＥＳＴマッピングトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）から高度に発現したタンパク質と認定されている）が挙げられる。例えば、プロモーターは、好適には、セロビオヒドロラーゼプロモーター、エンドグルカナーゼプロモーター、またはベータ−グルコシダーゼプロモーターであり得る。特に好適なプロモーターは、例えば、トリコデルマ・レーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）のセロビオヒドロラーゼプロモーター、エンドグルカナーゼプロモーター、またはベータ−グルコシダーゼプロモーターであり得る。例えば、プロモーターは、セロビオヒドロラーゼＩ（ｃｂｈ１）プロモーターである。プロモーターの非限定的な例としては、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、ｅｇｌ２、ｅｇｌ３、ｅｇｌ４、ｅｇｌ５、ｐｋｉ１、ｇｐｄ１、ｘｙｎ１、またはｘｙｎ２プロモーターが挙げられる。プロモーターのさらなる非限定的な例としては、トリコデルマ・レーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）のｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、ｅｇｌ２、ｅｇｌ３、ｅｇｌ４、ｅｇｌ５、ｐｋｉ１、ｇｐｄ１、ｘｙｎ１、またはｘｙｎ２プロモーターが挙げられる。
【０１３２】
本明細書に記載のＧｇｒ３Ａポリペプチドをコードする核酸は、ベクターに含まれ得る。いくつかの態様では、ベクターは、発現制御配列の制御下、Ｇｇｒ３Ａポリペプチドをコードする核酸配列を含む。いくつかの態様では、発現制御配列は、天然発現制御配列である。いくつかの態様では、発現制御配列は、非天然発現制御配列である。いくつかの態様では、ベクターは選択マーカーまたは選択可能なマーカーを含む。いくつかの態様では、Ｇｇｒ３Ａポリペプチドをコードする核酸配列は、選択マーカーなしで宿主細胞の染色体に統合される。
【０１３３】
好適なベクターは、使用する宿主細胞に適合するベクターである。好適なベクターは、細菌、ウイルス（バクテリオファージＴ７またはＭ−１３誘導ファージなど）、コスミド、酵母または植物にから誘導することができる。好適なベクターは、宿主細胞内で少数の、中程度のまたは多数のコピー数で維持することができる。そのようなベクターを得るためのプロトコル、および使用するためのプロトコルは、当業者には知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８９を参照）。
【０１３４】
いくつかの態様では、発現ベクターはまた、ターミネーション配列を含む。ターミネーション制御領域はまた、宿主細胞が天然に有する各種遺伝子から誘導することができる。いくつかの態様では、ターミネーション配列およびプロモーター配列は、同じ供給源から誘導される。
【０１３５】
Ｇｇｒ３Ａポリペプチドをコードする核酸配列は、発現ベクターなどのベクターに標準的な手法を用いて導入することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８２）。
【０１３６】
いくつかの態様では、Ｇｇｒ３Ａポリペプチドおよび／または１種以上の本開示に記載の他の任意の核酸を、天然発生細胞で現在見出されるよりはるかに高レベルで過剰発現させることが望ましい場合がある。いくつかの実施形態では、内在するベータ−グルコシダーゼおよび／または１種以上の本開示に記載の他の任意の核酸を、天然発生細胞で現在見出されるよりはるかに低レベルで過少発現させることが望ましい場合がある。
【０１３７】
ｇｇｒ３ａポリヌクレオチド
本明細書に記載の組成物および方法の他の態様は、ベータ−グルコシダーゼ活性を有する組み換えＧｇｒ３Ａポリペプチド（その変異体およびフラグメントを含む）をコードするポリヌクレオチドまたは核酸配列である。いくつかの実施形態においては、ポリヌクレオチドは、本明細書で特定されたもののような、異種有機体内でＧｇｒ３Ａポリペプチドを発現する発現ベクターとの関連で提供される。組み換えＧｇｒ３Ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、制御エレメント（例えば、プロモーター、ターミネーター、エンハンサーなど）に操作可能に結合して、コードされたポリペプチドの発現を促進させることができる。
【０１３８】
組み換えＧｇｒ３Ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の一例は、配列番号１のヌクレオチド配列を有する。組み換えＧｇｒ３Ａポリペプチドおよび変異体コードする類似の（実質的な相同を含む）ポリヌクレオチドは、天然に、例えば、グロメレラ・グラミニコラ（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）の他の株もしくは分離株、またはグロメレラ（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ）種で発生し得る。遺伝子コードの縮退を考慮すると、異なるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドが同じＧｇｒ３Ａポリペプチド、変異体またはフラグメントをコードし得ることがわかるであろう。
【０１３９】
いくつかの実施形態においては、組み換えＧｇｒ３Ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、Ｇｇｒ３Ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの例示と、特定の割合のアミノ酸配列相同性を、例えば、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列相同性を有する。相同性は、アミノ酸配列アライメントにより、例えば、本明細書に記載したようなＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、またはＣＬＵＳＴＡＬなどのプログラムを使用して決定することができる。
【０１４０】
いくつかの実施形態においては、組み換えＧｇｒ３Ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、組み換えＧｇｒ３Ａポリペプチドの細胞外分泌を指示するシグナルペプチドの後（すなわち、下流）でインフレーム融合される。本明細書に記載のように、「異種の」という用語は、対象のポリペプチドを発現させるために使用されるシグナル配列に関して使用されるとき、シグナル配列と対象ポリペプチドが異なる有機体に由来していることを意味する。異種シグナル配列としては、例えば、配列番号１１のトリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）Ｂｇｌ１のシグナル配列などの他の真菌セルラーゼ遺伝子からのものが挙げられる。組み換えＧｇｒ３Ａポリペプチドを発現させるのに好適な、または発現ベクターを好適な宿主細胞に導入する前に、発現ベクターを増殖させるのに好適な異種宿主細胞に、発現ベクターを供給し得る。いくつかの実施形態においては、組み換えＧｇｒ３Ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、特定のハイブリダイゼーション条件下、配列番号１のポリヌクレオチド（または、その相補体）にハイブリダイズする。条件としては、本明細書に記載の、中程度のストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件および非常にストリンジェンシー条件が例示される。
【０１４１】
ポリヌクレオチドは、天然または合成で（すなわち、人工的に）生成し、異なる宿主で発現させるためにコドンを最適化し、変異させてクローニング部位に導入するか、または改変して機能を加えることができる。
【０１４２】
Ｇｇｒ３Ａベクターおよび宿主細胞
開示した組み換えＧｇｒ３Ａポリペプチドを産生するために、ポリペプチドをコードするＤＮＡを公表されている配列から化学的に合成するか、または遺伝子を持つ宿主細胞から直接得ることができる（例えば、ｃＤＮＡライブラリースクリーニングまたはＰＣＲ増幅により）。いくつかの実施形態においては、ｇｇｒ３ａポリヌクレオチドは、発現カセットに含まれ、かつ／または標準的な分子クローニング技術によって好適な発現ベクターに導入する。そのような発現カセットまたはベクターは転写の開始および終了を助ける配列（例えば、プロモーターおよびターミネーター）を含み、また、一般に、１つ以上の選択マーカーを含み得る。
【０１４３】
発現カセットまたはベクターは、好適な宿主細胞に導入され、宿主細胞は、その後、対応するｇｇｒ３ａポリヌクレオチドを発現する。好適な発現宿主は、細菌または真菌微生物であり得る。細菌発現宿主は、例えば、エケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）（例えば、エケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ））、プセウドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（例えば、プセウドモナス・フルオレセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）またはプセウドモナス・スツッツェリ（Ｐ．ｓｔｕｔｚｅｒｅｉ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）（例えば、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ））、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）（例えば、ラルストニア・エウトロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ））、ストレプトミケス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、スタフィロコックス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、スタフィロコックス・カルノスス（Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ））、ラクトコックス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、ラクトコックス・ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ））またはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（例えば、バチルス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）など）であり得る。真菌発現宿主は、例えば、酵母があり、それはエタノロゲンとしても作用することができる。酵母発現宿主は、例えば、サッカロミケス・ケレヴィシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミケス・ポムベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ヤロウィア・リポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、ハンセヌラ・ポリモルパ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クルイウェロミケス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）またはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）であり得る。真菌発現宿主は、また、例えば、アスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、クリソスポリウム・ラックノウエンセ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、ミケリオフトラ・テルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（例えば、アスペルギルス・オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）など）またはトリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）などの糸状菌宿主細胞であり得る。マウス（例えば、ＮＳ０）細胞株、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、またはベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞株などの哺乳動物発現宿主もまた適している。昆虫細胞またはウイルス発現系（例えば、Ｍ１３、Ｔ７ファージもしくはラムダなどのバクテリオファージ、またはバキュロウイルスなどのウイルス）などの他の真核宿主もまたＧｇｒ３Ａポリペプチドの産生に適している。
【０１４４】
対象の特定の宿主の分泌タンパク質に関係するプロモーターおよび／またはシグナル配列は、その宿主または他の宿主における異種産生および分泌で使用する候補である。糸状菌系の一例としては、セロビオヒドラーゼＩ（ｃｂｈ１）、グルコアミラーゼＡ（ｇｌａＡ）、ＴＡＫＡ−アミラーゼ（ａｍｙＡ）、キシラナーゼ（ｅｘｌＡ）、ｇｐｄ−プロモーター  ｃｂｈ１、ｃｂｈｌｌ、エンドグルカナーゼ遺伝子ｅｇ１−ｅｇ５、Ｃｅｌ６１Ｂ、Ｃｅｌ７４Ａ、ｇｐｄ  プロモーター、Ｐｇｋ１、ｐｋｉ１、ＥＦ−１アルファ、ｔｅｆ１、ｃＤＮＡ１およびｈｅｘ１の遺伝子を駆動させるプロモーターが適しており、多くの異なる有機体（例えば、アスペルギルス・ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、トリコデルマ・レーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ））から誘導することができる。
【０１４５】
いくつかの実施形態においては、ｇｇｒ３ａポリヌクレオチドは、組み換えＧｇｒ３Ａポリペプチドを細胞外（または周辺質）腔へ分泌させ、それにより、細胞の上清（または周辺質腔もしくはライセート）での酵素活性の直接検出を可能にする、好適な相同または異種のシグナル配列をコードするポリペプチドと組み換えで関連している。エケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、他のグラム陰性菌および当該技術分野で知られている他の有機体に好適なシグナル配列としては、ＨｌｙＡ、ＤｓｂＡ、Ｐｂｐ、ＰｈｏＡ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ、ＯｍｐＴまたはＭ１３ファージＧｉｌｌ遺伝子の発現を駆動するものが挙げられる。さらに、バチルス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、グラム陽性菌および当該技術分野で知られている他の有機体に好適なシグナル配列としては、ＡｐｒＥ、ＮｐｒＢ、Ｍｐｒ、ＡｍｙＡ、ＡｍｙＥ、Ｂｌａｃ、ＳａｃＢが挙げられ、また、サッカロミケス・ケレヴィシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）または他の酵母では、キラートキシン、Ｂａｒ１、Ｓｕｃ２、Ｍａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ａｌｐｈａ、Ｉｎｕ１ＡまたはＧｇｐｌｐシグナル配列が挙げられる。シグナル配列は、多くのシグナルペプチダーゼによって切断し、それにより、発現タンパク質の残部からそれらの配列を除去することができる。真菌発現シグナル配列は、例えば、本明細書中の配列番号１３〜３７から選択されるものであり得る。酵母発現シグナル配列は、例えば、配列番号３６〜３８から選択されるものであり得る。ジイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）において本発明のＧｇｒ３Ａポリペプチドの発現の使用に適したシグナル配列は、例えば、配列番号３９〜４０から選択されるものが挙げられる（それぞれ、配列番号４３〜４４でコードされる；Ｌｉｎｇｅｒ  Ｊ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７６（１９）：６３６０−６３６９（２０１０））。
【０１４６】
いくつかの実施形態においては、組み換えＧｇｒ３Ａポリペプチドは、単独で、またはＮ−末端またはＣ−末端に位置する他のペプチド、タグまたはタンパク質（例えば、６ＸＨｉｓ、ＨＡまたはＦＬＡＧタグ）と融合して発現する。好適な融合体としては、親和性精製または検出を促進するタグ、ペプチドまたはタンパク質（例えば、６ＸＨｉｓ、ＨＡ、キチン結合タンパク質、チオレドキシンまたはＦＬＡＧタグ）、および標的ベータ−グルコシダーゼの発現、分泌または処理を促進するものが挙げられる。好適な処理部位としては、インビボもしくはインビトロで切断する、エンテロキナーゼ、ＳＴＥ１３、Ｋｅｘ２または他のプロテアーゼによる切断部位が挙げられる。
【０１４７】
Ｇｇｒ３ａ  ポリヌクレオチドは、多くの形質転換法、例えば、限定はされないが、エレクトロポレーション、脂質アシストトランスフォーメーションもしくはトランスフェクション（「リポフェクション」）、化学的に媒介したトランスフォーメーション（例えば、ＣａＣｌおよび／またはＣａＰ）、酢酸リチウム媒介トランスフォーメーション（例えば、宿主細胞プロトプラストの）、微粒子銃「遺伝子銃」トランスフォーメーション、ＰＥＧ媒介トランスフォーメーション（例えば、宿主細胞プロトプラストの）、プロトプラスト融合（例えば、細菌プロトプラストまたは真核プロトプラストによる）、リポソーム媒介トランスフォーメーション、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、アデノウィルスまたは他のウイルスもしくはファージトランスフォーメーションもしくはトランスダクションによって、発現宿主細胞に導入される。
【０１４８】
細胞培地
一般に、微生物は、本明細書に記載のＧｇｒ３Ａポリペプチドの産生に好適な培地で培養される。培養は、炭素および窒素源と、無機塩とを含む好適な栄養培地で、当該技術分野で知られている手法およびその変法によって行われる。増殖およびセルラーゼの産生に好適な培地、温度範囲、およびその他の条件は、当該技術分野で知られている。非限定的な例として、トリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）によるセルラーゼ産生の温度範囲は、通常、２４℃〜３７℃、例えば、２５℃〜３０℃である。
【０１４９】
細胞培養条件
真菌培養の維持および増殖に好適な材料および方法は、当該技術分野で知られている。いくつかの態様では、細胞は、宿主細胞に挿入された核酸によって発現したコードされた１種以上のベータ−グルコシダーゼポリペプチドを発現させる条件下の培地で培養される。標準的な細胞培養条件を、細胞の培養に使用することができる。いくつかの態様では、細胞は、適切な温度、気体混合物およびｐＨで増殖され維持される。いくつかの態様では、細胞は、適切な細胞培地で増殖される。
【０１５０】
Ｇｇｒ３Ａの活性
本明細書に開示の組み換えＧｇｒ３Ａポリペプチドは、ベータ−グルコシダーゼ活性、またはセロビオースを加水分解し、それからＤ−グルコースを遊離する能力を有する。高フィデリティベータ−グルコシダーゼであるトリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）Ｂｇｌ１より、より高いベータ−グルコシダーゼ活性と、より改善もしくは増大したセロビオースからのＤ−グルコースの遊離能力を有すし得る。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載のＧｇｒ３Ａポリペプチドは、他の基準のベータ−グルコシダーゼのアスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）Ｂ−ｇｌｕ  Ｙより、より高いベータ−グルコシダーゼ活性、および／またはより改善もしくは増大したセロビオースからのＤ−グルコースの遊離能力を有し得る。
【０１５１】
本明細書に開示の組み換えＧｇｒ３Ａポリペプチドは、トリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）Ｂｇｌ１と比べて劇的に改善または増大した、例えば、少なくとも約２０％高い、より好ましくは少なくとも約２５％高い、好ましくは少なくとも約３０％高い、より好ましくは少なくとも約３５％高い、より好ましくは少なくとも約４０％高い、より一層好ましくは少なくとも約４５％高い、好ましくは少なくとも約５０％高い、より好ましくは少なくとも約５５％高い、最も好ましくは少なくとも約６０％高いセロビアーゼ活性を有し得る。このセロビアーゼ活性は、セロビオースの加水分解し、Ｄ−グルコースを遊離する酵素の触媒能を測定するものである。いくつかの実施形態においては、組み換えＧｇｒ３Ａポリペプチドは、約１／２、約１／３、約１／４、約１／５、または約１／６の、セロビオースを加水分解し、Ｄ−グルコースを遊離する触媒能を有する。
【０１５２】
実施例６に示すように、組み換えＧｇｒ３Ａポリペプチドは、トリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）Ｂｇｌ１と比較して、リン酸膨張セルロース基質からより多くのグルコースを産生する一方、より低レベルの残留セロビオースを達成し（しかし、可溶性糖の総量はほぼ同じである）、これにより、同じ基質の可溶性糖へのバイオマス加水分解／変換を同程度とするのに必要なバックグラウンドセルラーゼ酵素混合物Ｓｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＣＰ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）上のタンパク質用量は全体としてより少ない結果となった。
【０１５３】
実施例７に示すように、組み換えＧｇｒ３Ａポリペプチドの、バッファーで測定した見かけのＴｍは、トリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）Ｂｇｌ１と比較して、より低かった。
【０１５４】
実施例８に示すように、組み換えＧｇｒ３Ａポリペプチドのセロビオース加水分解動態を、トリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）Ｂｇｌ１と比較した。組み換えＧｇｒ３Ａポリペプチドが、高温糖化のストレスに対する耐性が、トリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）Ｂｇｌ１に比べ、明らかに著しく乏しいことがわかった。
【０１５５】
実施例９に示すように、組み換えＧｇｒ３Ａポリペプチドはまた、トリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）Ｂｇｌ１と比較して、希酸で前処理したトウモロコシ茎葉基質からより多くのグルコースを産生する一方、より低レベルの残留セロビオースを達成し（しかし、可溶性糖の総量はほぼ同じである）、これにより、同じ基質の可溶性糖へのバイオマス加水分解／変換を同程度とするのに必要なバックグラウンドセルラーゼ酵素混合物Ｓｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＣＰ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）上のタンパク質用量は全体としてより少ない結果となった。
【０１５６】
組み換えベータ−グルコシダーゼＧｇｒ３Ａポリペプチドを含む組成物
本開示は、組み換えＧｇｒ３Ａポリペプチド．遺伝子工学的酵素組成物（例えば、セルラーゼ組成物）、または組み換えＧｇｒ３Ａポリペプチドを豊富に含む発酵培養液を提供する。いくつかの態様では、組成物はセルダーゼ組成物である。セルダーゼ組成物は、例えば、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）セルラーゼ組成物などの糸状菌セルダーゼ組成物であり得る。いくつかの態様では、組成物は、１種以上のセルラーゼポリペプチドをコードする１種以上の核酸を含む細胞である。いくつかの態様では、組成物は、セルダーゼ活性を含む発酵培養液であって、バイオマスサンプルに含まれるセルロースの約５０重量％超を糖に変換することができる培養液である。本明細書で使用されるとき、「発酵培養液」および「全培養液」という用語は、発酵後の回復および／または精製を全く受けないか最小である遺伝子操作された微生物の発酵によって産生した酵素調製物を指す。発酵培養液は、糸状菌の発酵培養液、例えば、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ネウロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）、アクリャ（Ａｃｈｌｙａ）、ポドスポラ（Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ）、エンドチア（Ｅｎｄｏｔｈｉａ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、コクリオボルス（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ）、ピリクラリア（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ）、ミケリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）またはクリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）の発酵培養液であり得る。特に、発酵培養液は、トリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）などのトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属の培養液、またはペニシリウム・フニクロスム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）などのペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属の培養液であり得る。培養液はまた、細胞を含まない発酵培養液であり得る。一態様では、本発明のセルラーゼ、細胞または発酵培養液組成物は、さらに、１種以上のヘミセルラーゼを含み得る。
【０１５７】
いくつかの態様では、全培養液組成物は、トリコデルマ・レーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）またはその遺伝子操作株において発現する。トリコデルマ・レーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）宿主細胞のゲノムに組み込まれた、トリコデルマ・レーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）の組込み型の菌株で発現する。いくつかの態様では、組み込み型トリコデルマ・レーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株において発現したポリペプチドの１種以上の要素は除かれている。
【０１５８】
いくつかの態様では、全培養液組成物はアスペルギルス・ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）またはその遺伝子操作株において発現する。
【０１５９】
あるいは、組み換えＧｇｒ３Ａポリペプチドは細胞内で発現し得る。任意選択により、酵素変異体の細胞内発現、または上述したようなシグナル配列による周辺質腔への分泌を、上清への組み換えＧｇｒ３Ａポリペプチドの放出に使用することができる。超音波、加圧処理（フレンチプレス）、キャビテーションなどの機械的手段によって、またはリゾチームなどの膜消化酵素もしくは酵素混合物の使用によって、膜障壁の破壊が行われる。この実施形態の変形には、エタノール産生微生物の細胞内における組み換えＧｇｒ３Ａポリペプチドの発現が含まれる。例えば、リグノセルロース系バイオマスの加水分解から生じたセロビオースがエタノール産生微生物にトランスポートされ、そこで加水分解されてＤ−グルコースに変わるように、セロビオーストランスポータを遺伝子操作によって同じエタノール産生微生物に導入することができる。Ｄ−グルコースは次いでエタノロゲンによって代謝され得る。
【０１６０】
いくつかの態様では、組み換えＧｇｒ３Ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、好適な細胞非含有の発現系により発現される。細胞非含有系では、対象のポリヌクレオチドが、通常、プロモーターによって転写されるが、環状発現ベクターを形成するライゲーションは任意選択である。いくつかの実施形態においては、ＲＮＡが、外因的に転写によらずに添加もしくは生成され、細胞非含有系で翻訳される。
【０１６１】
リグノセルロース系バイオマス基質を加水分解するためのＧｇｒ３Ａポリペプチドの使用
いくつかの態様では、リグノセルロース系バイオマスを糖に変換させる方法であって、バイオマス基質を、バイオマス基質を発酵性糖に変換するのに有効な量のＧｇｒ３Ａポリペプチドを含む本明細書に記載の組成物と接触させることを含む方法が本明細書において提供される。いくつかの態様では、この方法は、バイオマスを酸および／もしくは塩基で、ならびに／または機械的もしくは他の物理的手段によって前処理することをさらに含む。いくつかの態様では、リン酸を含む。いくつかの態様では、塩基は、水酸化ナトリウムまたはアンモニアを含む。いくつかの態様では、機械的手段は、例えば、引張り、加圧、圧砕、粉砕、その他のリグノセルロース系バイオマスをより細かい物理的形態に物理的に破壊する手段を含み得る。他の物理的手段には、また、例えば、酵素のセルロースおよびヘミセルロースへの到達度を高めるため、リグノセルロース系バイオマスを「ほぐす」ような、水蒸気、または他の加圧ガスもしくは加圧蒸気が含まれ得る。ある特定の実施形態においては、前処理方法はまた、バイオマスを加水分解する酵素組成物の酵素のセルロースおよびヘミセルロースへの到達度を高めるように、リグノセルロース系バイオマス基質のリグニンを分解することができる酵素を含み得る。
【０１６２】
バイオマス：本開示は、Ｇｇｒ３Ａポリペプチドを含む本開示の酵素組成物を使用してバイオマスを糖化する方法およびプロセスを提供する。本明細書で使用されるとき、「バイオマス」という用語は、セルロースおよび／またはヘミセルロース（任意選択により、また、リグノセルロース系バイオマス中のリグニン）を含む組成物を指す。本明細書で使用されるとき、バイオマスとしては、限定はされないが、種子、穀類、塊茎、廃棄植物（例えば、ヤシの空の果房、もしくはヤシの線維廃棄物）、または食品加工もしくは工業加工の副産物（例えば、柄）、トウモロコシ（例えば、穂軸、マグサなどを）、草（例えば、ソルガストルム・ヌタンス（Ｓｏｒｇｈａｓｔｒｕｍ  ｎｕｔａｎｓ）などのベアグラス、またはスイッチグラス、例えば、パニクム・ウィルガツム（Ｐａｎｉｃｕｍ  ｖｉｒｇａｔｕｍ）などのパニクム（Ｐａｎｉｃｕｍ）種）、ペレニアルケイン（ｐｅｒｅｎｎｉａｌ  ｃａｎｅ）（例えば、ダンチク）、木（例えば、ウッドチップ、加工廃棄物など）、紙、パルプ、およびリサイクル紙（例えば、新聞紙、印刷紙など）が挙げられる。他のバイオマス材料としては、限定はされないが、ジャガイモ、ダイズ（例えば、菜種）、大麦、ライ麦、カラス麦、小麦、ビート、およびサトウキビバガスが挙げられる。
【０１６３】
したがって、本開示は、バイオマス材料、例えば、キシラン、ヘミセルロース、セルロースおよび／または発酵性糖を含む材料を含む組成物を、本開示のＧｇｒ３Ａポリペプチド、または本開示の核酸またはポリヌクレオチドによってコードされたＧｇｒ３Ａポリペプチド、あるいは、Ｇｇｒ３Ａポリペプチドを含むセルラーゼもしくは非天然生成ヘミセルラーゼ組成物、または本開示の製造物のいずれか１つと接触させることを含む糖化方法を提供する。
【０１６４】
糖化バイオマス（例えば、本開示の酵素で処理したセルロース材料）は、例えば、微生物発酵および／または化学合成などの加工を経て、多くのバイオ製品を作ることができる。本明細書で使用されるとき、「微生物発酵」は、好適な条件下、発酵微生物を増殖させ、かつ生産するプロセスを指す。発酵微生物は、バイオ製品を製造するための所望の発酵プロセスでの使用に適した任意の微生物であり得る。好適な発酵微生物としては、限定はされないが、糸状菌、酵母および細菌が挙げられる。例えば、糖化バイオマスは、燃料（例えば、バイオエタノール、バイオブタノール、バイオメタノール、バイオプロパノール、バイオディーゼル、ジェット燃料などのバイオ燃料）を作ることができる。糖化バイオマスはまた、それから、発酵および／または化学合成により、例えば、コモディティケミカル（例えば、アスコルビン酸、イソプレン、１，３−プロパンジオール）、脂質、アミノ酸、ポリペプチドおよび酵素を作ることができる。
【０１６５】
前処理：糖化もしくは酵素加水分解、および／または糖化により得られた発酵性糖の発酵を行う前に、キシラン、ヘミセルロース、セルロースおよび／またはリグニン物質の、酵素組成物（例えば、Ｇｇｒ３Ａポリペプチドを含む本発明の酵素組成物）中の酵素への到達性、または酵素に対する感受性を高め、それによって酵素および／または酵素組成物による加水分解をより受けやすくするために、バイオマス（例えば、リグノセルロース材料）に、１工程以上の前処理工程を行うことが好ましい。
【０１６６】
いくつかの態様では、好適な前処理方法は、例えば、反応容器内で、強酸の希釈溶液および金属塩を含む触媒にバイオマス材料をさらすことを含む。バイオマス材料は、例えば、生の材料または乾燥した材料であり得る。この前処理により、セルロース加水分解の活性エネルギーまたは温度を低下させ、ひいては発酵性糖の収量を高めることができる。例えば、米国特許第６，６６０，５０６号明細書、同第６，４２３，１４５号明細書を参照されたい。
【０１６７】
いくつかの態様では、好適な前処理方法は、バイオマス材料に、水性媒体中、ヘミセルロースの一次脱重合が起こり、セルロースのグルコースへの脱重合が大きく進むことがないように選択された温度および圧力で第１の加水分解工程に供することを含み得る。この工程で、液状の水相に、ヘミセルロースから生じた単糖類を溶解した状態で含むスラリーと、セルロースおよびリグニンを含む固相とが得られる。スラリーに対し、その後、セルロースの主要部を脱重合させ、セルロースの溶解した／可溶性の脱重合生成物を含む液状の水相が得られるような条件下、第２の加水分解工程を行う。例えば、米国特許第５，５３６，３２５号明細書を参照されたい。
【０１６８】
さらなる態様では、好適な前処理方法は、バイオマス材料に、約０．４％〜約２％の強酸を用いて、１段以上の希酸加水分解処理を行い、次いで、酸加水分解処理した材料の未反応の固体リグノセルロース成分に対し、アルカリによる脱リグニン処理を行うことを含み得る。例えば、米国特許第６，４０９，８４１号明細書を参照されたい。
【０１６９】
さらなる態様では、好適な前処理方法は、予備加水分解容器においてバイオマス（例えば、リグノセルロース材料）に予備加水分解処理を行い；酸性液を固体リグノセルロース材料に加えて混合物とし；この混合物を反応温度にまで加熱し；リグノセルロース材料を、リグノセルロース材料由来のリグニンの少なくとも約２０％含む可溶化部分と、セルロースを含む固体フラクションとに分画し得るだけの十分な時間、その反応温度を維持し；反応温度固体フラクションから可溶化部分を分離して、その可溶化部分を除き、その間、反応温度またはその近傍の温度を維持し、そして、その可溶化部分を回収することを含み得る。固体フラクションのセルロースは、酵素により、より消化されやすくなる。例えば、米国特許第５，７０５，３６９号明細書を参照されたい。この態様の変形においては、予備加水分解に代えて、あるいは予備加水分解に加えて、例えば、リグノセルロース系バイオマス材料のリグニンを分解することができる酵素を使用するして予備加水分解を含むことができる。
【０１７０】
またさらなる態様においては、好適な前処理は、過酸化水素Ｈ２Ｏ２の使用を含み得る。Ｇｏｕｌｄ，１９８４，Ｂｉｏｔｅｃｈ，ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｒ．２６：４６−５２を参照されたい。
【０１７１】
他の態様においては、前処理はまた、バイオマス材料を、化学量論量の非常に低濃度の水酸化ナトリウムおよび水酸化アンモニウムと接触させることを含み得る。Ｔｅｉｘｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．７７−７９：１９−３４を参照されたい。
【０１７２】
いくつかの実施形態においては、前処理は、リグノセルロースを、ｐＨ約９〜約１４の化学物質（例えば、炭酸ナトリウムまたは水酸化カリウムなどの塩基）と、穏やかな温度、圧力およびｐＨで接触させることを含み得る。公開された国際出願、国際公開第２００４／０８１１８５号パンフレットを参照されたい。好ましい前処理法では、例えば、アンモニアが使用される。そのような前処理方法は、バイオマス材料を、高固体条件下、低濃度のアンモニアに曝露することを含む。例えば、米国特許出願公開第２００７／００３１９１８号明細書、および公開された国際出願、国際公開第０６／１１０９０１号パンフレットを参照されたい。
【０１７３】
糖化方法
いくつかの態様では、バイオマスを、ポリペプチドを含む酵素組成物で処理することを含む糖化方法であって、ポリペプチドがベータ−グルコシダーゼ活性を有し、かつババイオマスを発酵性糖へ少なくとも約５０重量％（例えば、少なくとも、約５５重量％、６０重量％、６５重量％、７０重量％、７５重量％または８０重量％）変換させる方法が、ここで提供される。いくつかの態様では、バイオマスはリグニンを含む。いくつかの態様では、バイオマスはセルロースを含む。いくつかの態様では、バイオマスはヘミセルロースを含む。いくつかの態様では、セルロースを含むバイオますは、キシラン、ガラクタンまたはアラビナンの１種以上を含む。いくつかの態様では、バイオマスは、限定はされないが、種子、穀類、塊茎、廃棄植物（例えば、ヤシの空の果房、もしくはヤシの線維廃棄物）、または食品加工もしくは工業加工の副産物（例えば、柄）、トウモロコシ（例えば、穂軸、マグサなどを）、草（例えば、ソルガストルム・ヌタンス（Ｓｏｒｇｈａｓｔｒｕｍ  ｎｕｔａｎｓ）などのベアグラス、またはスイッチグラス、例えば、パニクム・ウィルガツム（Ｐａｎｉｃｕｍ  ｖｉｒｇａｔｕｍ）などのパニクム（Ｐａｎｉｃｕｍ）種）、ペレニアルケイン（ｐｅｒｅｎｎｉａｌ  ｃａｎｅ）（例えば、ダンチク）、木（例えば、ウッドチップ、加工廃棄物など）、紙、パルプ、およびリサイクル紙（例えば、新聞紙、印刷紙など）、ジャガイモ、ダイズ（例えば、菜種）、大麦、ライ麦、カラス麦、小麦、ビート、およびサトウキビバガスが挙げられる。いくつかの態様では、バイオマスを含む材料に対し、ポリペプチドにより処理に先立って、１つ以上の前処理方法／工程が行われる。いくつかの態様では、糖化または酵素加水分解は、さらに、バイオマスを本発明のＧｇｒ３Ａポリペプチドを含む酵素組成物で処理することを含む。例えば、酵素組成物は、Ｇｇｒ３Ａポリペプチドに加えて、１種以上の他のセルラーゼを含み得る。あるいは、酵素組成物は、１種以上の他のヘミセルラーゼを含み得る。ある特定の実施形態においては、酵素組成物は、本発明のＧｇｒ３Ａポリペプチド、１種以上の他のセルラーゼ、１種以上の他のヘミセルラーゼを含む。いくつかの実施形態においては、酵素組成物は、全培養液組成物である。
【０１７４】
いくつかの態様では、リグノセルロース系バイオマス材料を、ポリペプチドを含む組成物で処理する糖化方法であって、ポリペプチドは配列番号２と少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列相同性を有し、かつバイオマスを発酵性糖へと少なくとも約５０重量％（例えば、少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％）変換させる方法が提供される。いくつかの態様では、リグノセルロース系バイオマス材料に対し、本明細書に記載の前処理方法／工程が１つ以上行われる。
【０１７５】
本組成物および本方法の他の態様および実施形態は、ここまでの説明と、以下の実施例から明らかであろう。
【実施例】
【０１７６】
本開示の好ましい実施形態および態様を示し、説明するために以下の実施例を提示するが、限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１７７】
実施例１
基準のトリコデルマ・レーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）Ｂｇｌ１およびグロメレラ・グラミニコラ（Ｇ．ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）Ｇｇｒ３Ａの遺伝子発現のクローニングおよび発現
Ａ．トリコデルマ・レーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｂｇｌ１発現ベクターの構築
天然のトリコデルマ・レーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）グルコシダーゼ遺伝子β−ｂｇｌ１のＮ−末端部のコドンを最適化した（ＤＮＡ  ２．０、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）。この合成部は、この酵素のコドン領域の最初の４４７塩基を含んだ。次いで、このフラグメントを、プライマーＳＫ９４３およびＳＫ９４１（下記）を用いてＰＣＲにより増幅した。天然ｂｇｌ１遺伝子の残りの領域を、トリコデルマ・レーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＲＬ−Ｐ３７株（Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ，Ｇ  ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９８４，２０：４６−５３）から抽出したゲノムＤＮＡサンプルから、プライマーＳＫ９４０およびＳＫ９４２（下記）を用いて、ＰＣＲにより増幅した。これらの２種のｂｇｌ１遺伝子のＰＣＲフラグメントを、プライマーＳＫ９４３およびＳＫ９４２を用いて、融合ＰＣＲ反応により融合した。
フォワードプライマーＳＫ９４３：（５’-  ＣＡＣＣＡＴＧＡＧＡＴＡＴＡＧＡＡＣＡＧＣＴＧＣＣＧＣＴ−３’）（配列番号５）
リバースプライマーＳＫ９４１：（５’−ＣＧＡＣＣＧＣＣＣＴＧＣＧＧＡＧＴＣＴＴＧＣＣＣＡＧＴＧＧＴＣＣＣＧＣＧＡＣＡＧ−３’）（配列番号６）
フォワードプライマー（ＳＫ９４０）：（５’−ＣＴＧＴＣＧＣＧＧＧＡＣＣＡＣＴＧＧＧＣＡＡＧＡＣＴＣＣＧＣＡＧＧＧＣＧＧＴＣＧ−３’）（配列番号７）
リバースプライマー（ＳＫ９４２）：（５’-  ＣＣＴＡＣＧＣＴＡＣＣＧＡＣＡＧＡＧＴＧ−３’）（配列番号８）
【０１７８】
得られた融合ＰＣＲフラグメントをＧａｔｅｗａｙ（登録商標）Ｅｎｔｒｙ  ベクターｐＥＮＴＲ（商標）／Ｄ−ＴＯＰＯ（登録商標）にクローン化し、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフォームして、中間体ベクターｐＥＮＴＲ  ＴＯＰＯ−Ｂｇｌ１（９４３／９４２）（図１）を得た。挿入されたＤＮＡのヌクレオチド配列を決定した。正しいｂｇｌ１配列を含むｐＥＮＴＲ−９４３／９４２ベクターを、ＬＲ  ｃｌｏｎａｓｅ（登録商標）反応を用いてｐＴｒｅｘ３ｇと組み換えた（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより概説されたプロトコルを参照）。ＬＲ  ｃｌｏｎａｓｅ反応混合物をＥ．ｃｏｌｉ  Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へトランスフォームして、発現ベクターｐＴｒｅｘ３ｇ  ９４３／９４２（図２）を得た。ベクターはまた、ａｃｅｔａｍｉｄａｓｅをコードするアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）ａｍｄＳ遺伝子を、トリコデルマ・レーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）のトランスフォーメーションの選択可能なマーカーとして含んだ。発現カセットをプライマーＳＫ７４５およびＳＫ７７１を用いてＰＣＲにより増幅してトランスフォーメーション用産生物を生成した。
フォワードプライマー  ＳＫ７７１：（５’  -  ＧＴＣＴＡＧＡＣＴＧＧＡＡＡＣＧＣＡＡＣ  −３’）（配列番号９）
ＳＫ７４５：リバースプライ（５’  -  ＧＡＧＴＴＧＴＧＡＡＧＴＣＧＧＴＡＡＴＣＣ  −３’）（配列番号１０）
【０１７９】
Ｂ．ｇｇｒ３ａ発現ベクターの構築
オープンリーディングフレームをＢｉｏｎｅｘｕｓにより合成し、ｐＴＴＴ−ｐｙｒ２ベクター（図３、配列番号４１）へＧａｔｅｗａｙテクノロジーを用いてクローン化した。Ｇｇｒ３Ａコード配列はＣＢＨＩプロモーターおよびＣＢＨＩターミネーターで挟まれ、選択マーカーとしてａｃｅｔａｍｉｄａｓｅ（ａｍｄＳ）を有した。得られたベクターｐＴＴＴ−ｐｙｒ２−Ｇｇｒ３Ａ（図４、配列番号４２）をトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）のトランスフォーメーションに使用した。
【０１８０】
国際公開第２０１０／１４１７７９号パンフレットに基づいて、Δ（ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、ｅｇｌ２、ｅｇｌ３、ｅｇｌ４、ｅｇｌ５、ｅｇｌ６、ｍａｎ１、ｂｇｌ１Ａ）が欠失したトリコデルマ・レーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株を発現ベクターまたは発現カセットのＰＣＲ産生物でトランスフォームした。
【０１８１】
トランスフォーメーションは、下記に示すように僅かに改変したＰＥＧ媒介プロトプラスト法により行った。プロトプラストを作成するために、２０ｇ／Ｌのグルコース、１５ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ  ４．５、５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．６ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．６ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１ｍＬの１０００×トリコデルマ・レーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）微量元素溶液（５ｇ／ＬＦｅＳＯ４７Ｈ２Ｏ、１．４ｇ／ＬＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．６ｇ／ＬＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、３．７ｇ／ＬＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏを含有）を含むトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）最少培地ＭＭ中、２４℃で、培地を１５０ｒｐｍで浸透させながら、芽胞を１６〜２４時間増殖させた。増殖した芽胞を遠心分離で集め、５０ｍｇ／ｍＬのＧｌｕｃａｎｅｘ  Ｇ２００（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  ＡＧ）溶液で処理して、真菌細胞壁を溶解した。さらに、Ｐｅｎｔｔｉｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  ６１（１９８７）１５５−１６４に記載の方法にしたがってプロトプラストを作成した。全体積２００μＬ中に１μｇのＤＮＡおよび１〜５×１０７個のプロトプラストを含有するトランスフォーメーション混合物をそれぞれ、２ｍＬの２５％  ＰＥＧ溶液で処理し、１．２Ｍソルビトール／１０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１０ｍＭＣａＣｌ２の２体積で希釈し、５ｍＭのウリジンおよび２０ｍＭのアセトアミドを含有する３％選択トップアガロースＭＭを混合した。得られた混合物を、ウリジンおよびアセトアミドを含有する２％選択アガロースプレートに注いだ。プレートをさらに２８℃で７日間インキュベートし、その後、単一のトランスフォーマントをウリジンおよびアセトアミドを含有する新しいＭＭプレートに採取した。独立したクローンから採取した芽胞を振盪フラスコ内の発酵培地に植菌した。
【０１８２】
発酵培地は、２５０ｍＬ  Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｕｌｔｒａ  Ｙｉｅｌｄフラスコ（Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．，Ｏｃｅａｎｓｉｄｅ，ＣＡ）に入れた２ｇ／Ｌのウリジン（６．０ｇ／Ｌグリシン；４．７ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４；５．０ｇ／ＬＫＨ２ＰＯ４；１．０ｇ／ＬＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；３３．０ｇ／ＬＰＩＰＰＳ；ｐＨ  ５．５）で、炭素源として約２％の１０ｍＬ／Ｌの１００ｇ／ＬのＣａＣｌグルコース／２、２．５ｍＬ／Ｌのトリコデルマ・レーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）微量元素（４００×）：１７５ｇ／Ｌの無水クエン酸；２００ｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；１６ｇ／Ｌ  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；３．２ｇ／ＬＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ；１．４ｇ／ＬＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ；０．８ｇ／ＬＨ３ＢＯ３の無菌後添加を伴う培地であった。
【０１８３】
Ｃ．酵母シャトルベクターｐＳＣ１１（Ｐｒｏｐｈｅｔｉｃ）の構築
酵母シャトルベクターは、図５のベクターマップにしたがって構築することができる。このベクターは、サッカロミケス・ケレヴィシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の細胞内において、Ｇｇｒ３Ａポリペプチドを発現させるために使用することができる。例えば、Ｈａ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  ＰＮＡＳ，１０８（２）：５０４−５０９（２０１１）に記載されるような既知の方法を用いて、セロビオーストランスポータを同じシャトルベクターまたは異なるシャトルベクターで、サッカロミケス・ケレヴィシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に導入することができる。
【０１８４】
発現カセットのトランスフォーメーションは、酵母ＥＺ−トランスフォーメーションキットを用いて行うことができる。トランスフォーマントは、２０ｇ／Ｌのセロビオースを含むＹＳＣ培地を用いて選択することができる。発現カセットの酵母への導入が良好に行われるかは、特異的プライマーを用いるコロニーＰＣＲによって確認することができる。
【０１８５】
酵母株は、既知の方法およびプロトコルによって培養することができる。例えば、酵母種は、グルコースを加えたＹＰ培地（１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２０ｇ／Ｌバクトペプトン）中、３０℃で培養することができる。アミノ酸栄養要求性マーカーを用いてトランスフォーマントを選択するために、６．７ｇ／Ｌのｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｐｌｕｓ、２０ｇ／Ｌのグルコース、２０ｇ／Ｌの寒天、および核酸およびアミノ酸を供給するＣＳＭ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｕｒａ  ｇｌｕｃｏｓｅを含むＹＳＣ（ｙｅａｓｔ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ）培地を使用することができる。
【０１８６】
Ｄ．ジイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）組込み型ベクターｐＺＣ１１の構築（Ｐｒｏｐｈｅｔｉｃ）
ジイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）組込み型ベクターｐＺＣ１１は、図６のベクターマップにしたがって構築することができる。このベクターは、ジイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）の細胞内において、Ｇｇｒ３Ａポリペプチドを発現させるために使用することができる。例えば、Ｓｅｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２２  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２０１１）に記載されるセロビオーストランスポータを同じ組込み型シャトルベクターまたは異なる組込み型ベクターで、ジイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）に導入することができる。
【０１８７】
セロビオーストランスポータ遺伝子の導入が良好に行われるかは、既知の種々の方法、例えば、この目的のために特に設計された確認プライマーを用いるＰＣＲによって確認することができる。
【０１８８】
ジイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）株は、既知の方法、例えば、米国特許第７，７４１，１１９号明細書に記載の方法にしたがって培養し発酵させることができる。
【０１８９】
実施例２
方法
Ａ．ＵＰＬＣにより測定したタンパク質濃度
Ｗａｔｅｒｓ社製ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  Ｃ４ＢＥＨ３００カラム（１．７μｍ、１×５０ｍｍ）を用い、ＡＧＩＬＥＮＴ社製ＨＰＬＣ１２９０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ｓｙｓｔｅｍを使用した。アセトニトリル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の５％から３３％への初期勾配で０．５分間、続いて３３％から４８％への勾配で４．５分間、その後９０％アセトニトリルへの階段状勾配で行う６分間のプログラムを使用した。Ｇｇｒ３Ａポリペプチドの定量には、精製トリコデルマ・レーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）Ｂｇｌ１に基づくタンパク質標準曲線を使用した。
【０１９０】
Ｂ．トリコデルマ・レーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）Ｂｇｌ１およびＧｇｒ３Ａの精製
トリコデルマ・レーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）Ｂｇｌ１は、トリコデルマ・レーセイ宿主株の醗酵培養液中で過剰発現させ、その醗酵培養液から精製した（例えば、国際公開第２０１０／１４１７７９号パンフレットを参照）。濃縮培養液をＧ２５  ＳＥＣカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｓｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に流し、ｐＨ５．０の５０ｍＭ酢酸ナトリウムに対してバッファー交換を行った。その後、バッファー交換したトリコデルマ・レーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）Ｂｇｌ１を、アミノベンジル−Ｓ−グルコピラノシルセファロースアフィニティマトリックスを充填した２５ｍＬのカラムに流した。２５０ｍＭ塩化ナトリウムの５０ｍＭ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．０）により十分に洗浄すると、１００ｍＭグルコースとともに結合画分が５０ｍＭ酢酸ナトリウムおよび２５０ｍＭ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ５．０）中に溶出した。クロロ−ニトロ−フェニルグルコシド（ＣＮＰＧ）活性に対して試験結果が陽性の溶出画分は、プールして濃縮した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでトリコデルマ・レーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）Ｂｇｌ１の分子量（これは質量分析法により確認されている）に対応する単一バンドが現れたことは、溶出Ｂｇｌ１の純度を実証するものであった。最終のストック濃度は、２８０ｎｍでの吸収により２．２ｍｇ／ｍＬと決定された。
【０１９１】
上記トリコデルマ・レーセイにより発現させ、醗酵培養液から精製した。Ｇｇｒ３Ａの培養液をｐＨ５．５の５０ｍＭ酢酸ナトリウムで１０倍に希釈し、その後、硫酸アンモニウム濃度が１Ｍとなるよう硫酸アンモニウムと混合した。この試料を平衡化（ｐＨ５．５の５０ｍＭ酢酸ナトリウム、１Ｍ硫酸アンモニウムバッファーにより）フェニルセファロースカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ部品番号１７−１０８６−０１）に流し、この同じバッファーで洗浄した。標的タンパク質は、ｐＨ５．５の５０ｍＭ酢酸ナトリウム、１Ｍ硫酸アンモニウムバッファーから５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５バッファーへの勾配を用いて溶出させた。その後、タンパク質をプールし、脱塩して１０ｍＭ、ｐＨ８．０のＴｒｉｓバッファーに加え、平衡化Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ部品番号１７−０９４７−０１）に流した。一度、カラムに流し１０ｍＭ、ｐＨ８．０のＴｒｉｓバッファーで洗浄すると、その後、標的タンパク質は１０ｍＭ、ｐＨ８．０のＴｒｉｓからｐＨ５の５０ｍＭ酢酸ナトリウムおよび１Ｍ塩化ナトリウムバッファーへの勾配で溶出した。その後、Ｇｇｒ３Ａ含有画分をプールし、濃縮し、バッファー交換して、試験のためにｐＨ６．０、５０ｍＭのＭＥＳ、１００ｍＭ塩化ナトリウムバッファーに加えた。２８０ナノメートルの吸収測定により、全タンパク質濃度を決定した。
【０１９２】
Ｃ．グルコース測定のためのＡＢＴＳ法
酵素試料と同じバッファー中で一連のグルコース標準溶液を調製した。ＡＢＴＳ法にかける前に、グルコース標準を等容量のグリシンクエンチバッファーに加えた。２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジ−アンモニウム塩（ＡＢＴＳ）を２．８８ｍｇ／Ｌで、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を０．１１Ｕ／ｍＬで、およびグルコースオキシダーゼ（ＯｘｙＧＯ  ＨＰ  ５０００Ｌ、Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳ，Ｉｎｃ）を１．０５Ｕ／ｍＬで含むＡＢＴＳストック溶液を水中で調製した。９５（９５）ＬのＡＢＴＳストック溶液をピペットに取り、分離した３つのＣｏｓｔａｒ平底マイクロタイタープレートのウェルに加えた。クエンチしたセロビオース活性プレートから５（５）μＬをピペットに取り、ＡＢＴＳ溶液を含む反応プレートに加えた。読み取り間隔を９秒、遅延時間を６０秒とする、４０５ｎｍにおける３分間の速度論的読み取りのために、プレートを分光光度計装置にかけた。混合とウェル中の気泡を除去するために、速度論インキュベーションの前に、素早い５秒間の振盪工程を加えた。同梱のグルコース標準曲線を使用して各プレートについてＡＢＴＳの全反応を解析し、グルコースの生成を計算した。
【０１９３】
Ｄ．リン酸膨張セルロース（ＰＡＳＣ）の調製
Ｗａｌｓｅｔｈ，ＴＡＰＰＩ  １９７１，３５：２２８  ａｎｄ  Ｗｏｏｄ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９７１，１２１：３５３−３６２により適用された手順を用いて、Ａｖｉｃｅｌからリン酸膨張セルロース（ＰＡＳＣ）を調製した。手短に言えば、Ａｖｉｃｅｌ  ＰＨ−１０１を濃リン酸中で可溶化し、その後、冷脱イオン水を用いて沈殿させた。セルロースを回収しｐＨを中和するためにより多くの水で洗浄した。ｐＨ５、５０ｍＭの酢酸ナトリウム中、固形分１％にまで希釈した。
【０１９４】
Ｅ．希釈酸で前処理したトウモロコシ茎葉基質の調製（ｗｈＰＣＳ）
Ｓｃｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１０５：６９−８６，２００３に記載の方法にしたがって、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＮＲＥＬ，Ｇｏｌｄｅｎ，ＣＯ）により希釈酸前処理トウモロコシ茎葉が調製された。
【０１９５】
２０ｇのｗｈＰＣＳ（固形分３２．７％）にｐＨ５．０の５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー４０ｍＬを加えることにより基質を希釈した。液体は少量の一定分量で加えられ、完全に混合するよう手で撹拌した。５％のアジ化ナトリウム６０（６０）μＬを抗菌剤として加えた。基質にカバーをかけ、終夜、室温で穏やかに撹拌して平衡化した。その後、１Ｍ水酸化ナトリウム溶液により基質のｐＨをｐＨ５に調節した。最終の固形分は１０．２％であった。
【０１９６】
実施例３
セロビオース（または、セロトリオースもしくはソホロース）加水分解法
Ｇｈｏｓｅ，Ｔ．Ｋ．Ｐｕｒｅ＆Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８７，５９（２），２５７−２６８の方法に基づき、５０℃でセロビオース（または、セロトリオースもしくはソホロース）加水分解活性を決定した。８．３３ｍＭセロビオース（または、セロトリオースもしくはソホロース）ストック溶液は検定バッファー（５０ｍＭ  Ｎａ−クエン酸塩バッファー、ｐＨ５．３＋０．００５％Ｔｗｅｅｎ−８０）。この検定法は、９６穴マイクロタイターフォーマットで行った。セロビオースストック（９０μＬ）をピペットに取り、Ｃｏｓｔａｒ平底マイクロタイタープレートに加えた。
【０１９７】
酵素希釈シリーズを調製し、ピペットに取り（１０μＬ）、セロビオース溶液を含む３つの反応プレートに加えた。プレートをアルミニウム封止剤で封止し（Ｎｕｎｃ）、５０℃で振盪（１１５０ｒｐｍ、ｉＥＭＳインキュベーター）しながら３０分間インキュベートした。反応プレートはｐＨ１０．０で１００μＬの１００ｍＭグリシンバッファーによりクエンチした。グルコース濃度は、ＡＢＴＳ法を用いて決定した。セロビオース単位（Ｇｈｏｓｅに記載の通りに導いた）は、０．０９２６を、検定条件下で０．１ｍｇのグルコースを放出させるのに必要な酵素の量で除した値として定義される。セロビオース法の標準誤差は１０％と決定された。セロビオース活性法は、投与量曲線を作成するために、５種の酵素希釈水準で３通り実施した。
【０１９８】
データの両軸逆数プロットにおいて、１５％未満および８５％超のものを切り捨てると直線関係が得られ、Ｒ２値は試験した全ての酵素について０．９９より大であった。トリコデルマ・レーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）Ｂｇｌ１（コントロール）の傾きを試料のそれで除すことにより、所与の試料の性能指数（ＰＩ）を計算した。
【０１９９】
セロトリオースおよびソホロースのＰＩは、単一濃度の酵素に基づくものとした（これは全ての酵素を非逆数セロビオース投与量／応答曲線の直線部分に配置させるような共通の希釈度を用いて得られた）。これらのＰＩは、（変異体に対する比活性）／（トリコデルマ・レーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）Ｂｇｌ１に対する比活性）として計算され、（比活性）は（生成物への基質のモル基準転換率％）／（ＵＰＬＣで決定された変異体の濃度）である。
【０２００】
Ｂｇｌ１に対するＧｇｒ３ＡのＰＩは、セロビオース、セロトリオースおよびソホロースに対して＞１であり、３種の全基質に対しより高い活性を有することを示唆した（表２）。
【０２０１】
【表２】
2017532967.tif 000004
【０２０２】
実施例４
セロビオース熱活性法
セロビオース法（上記実施例３のような）を実施し、ＡＢＴＳ法を用いてグルコースを決定した。
【０２０３】
ＡＢＴＳ反応のＶｍａｘをｍＭグルコースに変換し、グルコースの理論収率で除すことにより、収率パーセントを決定した。
【０２０４】
収率パーセントを反応中の酵素のｐｐｍで除すことにより比収率を決定した。Ｇｇｒ３Ａによるセロビオースの加水分解は、試験した温度全てでＴｒ  Ｂｇｌ１より大であった。２種のベータ−グルコシダーゼの活性の差は５０℃で最大であり、６９℃で最小であった（表３）。
【０２０５】
【表３】
2017532967.tif 000005
【０２０６】
実施例５
セロビオース残留活性（熱ストレス）
ストレスプレートを調製するために、ＢｉｏＲａｄハードシェル９６穴ＰＣＲプレートに適量の酵素を分注し、シリコーンマットで封止した。６５℃で３分間、次いでランプ状に２５℃まで下げるようプログラムしたサーモサイクラーにプレートを入れた。
【０２０７】
ストレスを加えていない酵素試料と平行に、ストレスを加えた酵素試料をセロビオース活性法（本明細書の実施例３に記載）で検定し、熱ストレス後の残留活性を決定した。結果は、これらの条件下で、トリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）Ｂｇｌ１の残留活性５７．４％と比較して、Ｇｇｒ３Ａは４２．８％の残留活性を有すること、見かけＴｍを示した（実施例７のように）。この高温ストレス耐性が明らかにより低いことから見ると、リグノセルロース系バイオマス基質の加水分解が、本明細書で提示しているように、比較的低いＧｇｒ３Ａ投与量しか要求しないことはやや驚きである。
【０２０８】
実施例６
ＰＡＳＣ活性の投与量応答
基質中のｍｇタンパク質／ｇグルカン基準で精製酵素を加えた。酵素の希釈は、ｐＨ５．０の５０ｍＭ酢酸ナトリウムに加えることで行った。検定プレートの１ウェル当たり２０Ｌの酵素溶液に、固形分０．５％の冷ＰＡＳＣ１５０（１５０）μＬを加えた。検定における最終の固形分水準は０．４４％であった。
【０２０９】
アルミニウムプレート封止剤でプレートにカバーをかけ、１分間、激しく混合し、５０℃、２００ｒｐｍのＩｎｎｏｖａインキュベータ／振盪器内に２時間置いた。ｐＨ１０の１００ｍＭグリシン１００μＬで反応をクエンチし、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅフィルタープレートに移した。フィルタープレートをＡｇｉｌｅｎｔ製ＨＰＬＣプレートの上にサンドイッチ状に乗せ、５分間遠心分離して分離体を回収した。その後、Ａｇｉｌｅｎｔ製ＨＰＬＣプレート中の１００μＬのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ水に２０（２０）μＬの分離体を加えた。ＨＰＬＣにより可溶性の糖類が測定された。
【０２１０】
グルカン転換率パーセントは、（ｍｇグルコース＋ｍｇセロビオース）／ｍｇ基質中セルロースで定義される。結果を図７に示す。
【０２１１】
実施例７
見かけのＴｍ測定
精製酵素試料をｐＨ５．０の５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーに加えて１００ｐｐｍに希釈した。ＳＹＰＲＯオレンジ染料を同じバッファーに加えて１０００倍に希釈した。１００ｐｐｍの酵素２５（２５）μＬおよび希釈ＳＹＰＲＯ  オレンジ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、＃Ｓ６６５０）８μＬをＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０  ９６穴プレートに加えた。液体の全てがウェルの底に来るようプレートを短時間回転させ、その後、ベンチトップ振盪機で混合した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０  Ｒｏｃｈｅ）の中でプレートを反応させた。
【０２１２】
プログラムは３７℃における５分間のプレインキュベートおよびランプ速度４．４℃／ｓで開始された。溶融曲線のターゲットはランプ速度０．２℃／ｓで９７℃であった。検出フォーマット「Ｂｏｄｉｐｙ」を選択（４９８〜５８０ｎｍの蛍光）し、収集モードは連続とした。
【０２１３】
結果を下記表４に示す。
【０２１４】
【表４】
2017532967.tif 000006
【０２１５】
実施例８
セロビオース加水分解の速度論
精製トリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）Ｂｇｌ１およびＧｇｒ３Ａを開始セロビアーゼ活性と同じに希釈し、その後、連続的に８回希釈した。
【０２１６】
１００ｍＭセロビオース溶液を調製し、３つの非結合検定プレート（Ｃｏｓｔａｒ  ＃３６４１）の最上段列に加えた。その後、マイクロタイタープレートの下方に向かって基質を連続的に希釈し、８種の異なる基質濃度とした。その後、検定プレート中の５０μＬの基質溶液に酵素溶液５０（５０）μＬを加えた。検定プレートにカバーをかけ、５０℃、２００ｒｐｍのＩｎｎｏｖａ４４インキュベーター／振盪機中に（１）３０分間、（２）６０分間または（３）９０分間置いた。ｐＨ１０のバッファーである１００ｍＭグリシン１００μＬで各プレートをクエンチした。若干変更を加えたＡＢＴＳ法（９６穴ＭＴＰ中の１００μＬのＡＢＴＳ＋１０μＬの試料、混合し、プレートリーダーに５分間セットした。速度論的な読み取りを４２０ｎｍで実施した）を用いてグルコース濃度を測定した。
【０２１７】
結果を図８にプロットした。これらのプロットの縦軸は放出されたグルコースであり、検出された最大グルコースに合わせて目盛りが付けられている。横軸は酵素濃度とインキュベーション時間の積である。この横軸の使用により、同一プロット上の両酵素に対して、全ての時刻と投与値の直接比較が可能になる。反応に使用した各セロビオース濃度に対する別のプロットが示されている。ベータ−グルコシダーゼトリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）Ｂｇｌ１を含む反応は黒丸で、示されておりＧｇｒ３Ａを含む反応は、
【０２１８】
実施例９
希釈酸で調製したトウモロコシ茎葉（ｗｈＰＣＳ）の糖化
精製ベータ−グルコシダーゼトリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）Ｂｇｌ１およびＧｇｒ３Ａを、全タンパク質１％でＳｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＣＰセルラーゼ混合物（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）とブレンドした。
【０２１９】
酵素混合物に０〜２０ｍｇタンパク質／ｇグルカンを加え、９６穴ＭＴＰ（Ｎｕｎｃ、＃２６９７８７）中でｐＨ５．０、固形分７％を含む、５０ｍＭ酢酸バッファー中のｗｈＰＣＳを５０℃で２日間かけて糖化するために使用した。各酵素ブレンド体について４つの検定複製物を作った。１ｍＬのエッペンドルフチップを有するリピーターピペットを用いて基質を検定プレートに加えた。最終全固形分を７％とするために、７０ｍｇの基質に、１ウェル当たりの固形分１０％で酵素溶液３０（３０）μＬを加えた。アルミニウムプレート封止剤（Ｅ＆Ｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＃ＥＫ−４６９０９）でプレートをカバーし、１分間混合して５０℃、２００ｒｐｍのＩｎｎｏｖａ  ４４インキュベーター／振盪機内に２日間置いた。
【０２２０】
反応をクエンチし、マルチチャンネルピペットを用いてフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、＃ＭＡＨＶＮ４５５０）に移した。ＨＰＬＣプレート（Ａｇｉｌｅｎｔ、＃５０４２−１３８５）の上にフィルタープレートをサンドイッチ状に乗せ、遠心分離機内で５分間回転させて濾過した。Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣプレート中のＭｉｌｌｉｐｏｒｅ水１００μＬに上澄み液１０（１０）μＬを加えた。ＨＰＬＣにより可溶性糖類が測定された。
【０２２１】
グルカン転換パーセントは、（ｍｇグルコース＋ｍｇセロビオース）／ｍｇ基質中セルロースで定義される。
【０２２２】
結果を図９Ａ〜９Ｂに示す。
【０２２３】
Ｇｇｒ３Ａはより多くのグルコースを生成し、トリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）Ｂｇｌ１より残留セロビオースが少ないので、同じ基質をほぼ同程度に加水分解するために要求される全体のタンパク質投与量は１．４×減少することになる。
【図１】
2017532967.tif 000007
【図２】
2017532967.tif 000008
【図３】
2017532967.tif 000009
【図４】
2017532967.tif 000010
【図５】
2017532967.tif 000011
【図６】
2017532967.tif 000012
【図７】
2017532967.tif 000013
【図８】
2017532967.tif 000014
【図９Ａ】
2017532967.tif 000015
【図９Ｂ】
2017532967.tif 000016
【手続補正書】
【提出日】平成29年7月31日(2017.7.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2017532967000001.app
【国際調査報告】
2017532967.tif 000017
2017532967.tif 000018
2017532967.tif 000019