(57)【要約】  本発明は、組換えヒトコラーゲンＩＶタンパク質を必要とする患者にそれを投与することによりアルポート症候群を治療するための薬学的組成物、製剤、及び方法を提供する。【選択図】図９
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えコラーゲンＩＶタンパク質と、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤と、を含む、薬学的組成物。
【請求項２】
前記組換えコラーゲンＩＶタンパク質が、コラーゲンＩＶプロトマー、二量体、四量体、多量体、及び／またはこれらの混合物である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
前記組換えコラーゲンＩＶタンパク質が、コラーゲンＩＶプロトマーである、請求項２に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
前記コラーゲンＩＶプロトマーが、α３（ＩＶ）、α４（ＩＶ）、及びα５（ＩＶ）鎖ポリペプチドからなる群から選択される３つのα（ＩＶ）ポリペプチドからなるヘテロ三量体である、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記コラーゲンＩＶプロトマーが、配列番号３のアミノ酸配列及びそのバリアントを含む１つのα３（ＩＶ）鎖ポリペプチド、配列番号４のアミノ酸配列及びそのバリアントを含む１つのα４（ＩＶ）鎖ポリペプチド、ならびに配列番号５のアミノ酸配列及びそのバリアントを含む１つのα５（ＩＶ）鎖ポリペプチドからなるヘテロ三量体である、請求項４に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
前記コラーゲンＩＶプロトマーが、１つ、２つ、または３つのキメラα３（ＩＶ）、α４（ＩＶ）、及びα５（ＩＶ）鎖ポリペプチドを含むヘテロ三量体であり、前記キメラα３（ＩＶ）鎖ポリペプチドは、前記α３（ＩＶ）鎖のＮＣ１ドメインの全てまたは一部がα１（ＩＶ）もしくはα２（ＩＶ）鎖のＮＣ１ドメインの全てまたは一部に置き換えられるキメラペプチドであり、前記キメラα４（ＩＶ）鎖ポリペプチドは、前記α４（ＩＶ）鎖のＮＣ１ドメインの全てまたは一部がα１（ＩＶ）もしくはα２（ＩＶ）鎖のＮＣ１ドメインの全てまたは一部に置き換えられるキメラペプチドであり、前記キメラα５（ＩＶ）鎖ポリペプチドは、α５（ＩＶ）鎖のＮＣ１ドメインの全てまたは一部がα１（ＩＶ）もしくはα２（ＩＶ）鎖のＮＣ１ドメインの全てまたは一部に置き換えられるキメラペプチドである、請求項４に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
前記コラーゲンＩＶプロトマーは、前記α３（ＩＶ）鎖のＮＣ１ドメインの全てまたは一部がα１（ＩＶ）もしくはα２（ＩＶ）鎖のＮＣ１ドメインの全てまたは一部に置き換えられる１つのキメラα３（ＩＶ）鎖ポリペプチド、前記α４（ＩＶ）鎖のＮＣ１ドメインの全てまたは一部がα１（ＩＶ）もしくはα２（ＩＶ）鎖のＮＣ１ドメインの全てまたは一部に置き換えられる１つのキメラα４（ＩＶ）鎖ポリペプチド、及び前記α５（ＩＶ）鎖のＮＣ１ドメインの全てまたは一部がα１（ＩＶ）もしくはα２（ＩＶ）鎖のＮＣ１ドメインの全てまたは一部に置き換えられる１つのキメラα５（ＩＶ）鎖ポリペプチドからなるヘテロ三量体である、請求項６に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
α１（ＩＶ）、α２（ＩＶ）、α３（ＩＶ）、α４（ＩＶ）、α５（ＩＶ）の前記ＮＣ１ドメインが、それぞれ、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、及び配列番号１１のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
前記組換えコラーゲンＩＶタンパク質が、コラーゲンＩＶ二量体であり、前記二量体が、請求項４〜８に記載のいずれか１つから選択される２つのプロトマーを含む、請求項２に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
前記組換えコラーゲンＩＶタンパク質が、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン及び／またはヒドロキシリジン残基を含有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
前記組換えコラーゲンＩＶタンパク質が、約０．３％〜１．６％の３−ヒドロキシプロリン残基、及び約６．５％〜１４％の４−ヒドロキシプロリン残基を含む、請求項１０に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
前記組換えコラーゲンＩＶタンパク質が、非天然アミノ酸及び／または他のアミノ酸置換基を更に含む、請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
前記１つ以上の薬学的に許容される賦形剤が、１つ以上の酸化防止剤、１つ以上の等張化剤、及び／または１つ以上のキレート剤を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組換えコラーゲンＩＶタンパク質を含む、アルポート症候群の患者における糸球体構造及び機能を改善するための薬学的組成物。
【請求項１５】
コラーゲンＩＶタンパク質のうちの１つ以上の欠乏によって特徴付けられる状態の治療を必要とする対象において治療を行うための方法であって、前記対象に有効量の請求項１〜１４のいずれか一項に記載の薬学的組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項１６】
前記状態が、α３（ＩＶ）鎖の１つ以上の欠乏、α４（ＩＶ）鎖の１つ以上の欠乏、及びα５（ＩＶ）鎖の１つ以上の欠乏からなる群から選択される１つ以上の欠乏によって特徴付けられる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記α３（ＩＶ）鎖の１つ以上の欠乏がＣＯＬ４Ａ３遺伝子における突然変異に起因し、前記α４（ＩＶ）鎖の１つ以上の欠乏がＣＯＬ４Ａ４遺伝子における突然変異に起因し、前記α５（ＩＶ）鎖の１つ以上の欠乏がＣＯＬ４Ａ５遺伝子における突然変異に起因する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記状態が、菲薄基底膜腎症（ＴＢＭＮ）、アルポート症候群、家族性血尿、末期腎疾患（ＥＳＲＤ）、進行性腎不全、糸球体性血尿、蛋白尿、周産期脳出血及び孔脳症、ならびに出血性卒中を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記状態が、アルポート症候群である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
アルポート症候群が、Ｘ連鎖性アルポート症候群、常染色体劣性アルポート症候群、及び常染色体優性アルポート症候群からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記対象が男性であり、前記アルポート症候群がＸ連鎖性アルポート症候群である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記対象が女性であり、前記アルポート症候群がＸ連鎖性アルポート症候群である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記対象が、男性または女性であり、前記アルポート症候群が常染色体劣性アルポート症候群である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記対象が、男性または女性であり、前記アルポート症候群が常染色体優性アルポート症候群である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
アルポート症候群が家族歴により診断される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記対象に１つ以上の予防薬を共投与する工程を更に含み、前記予防薬が、抗血栓薬及び／または抗炎症薬を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗血栓薬が、アスピリン、トリフルサル、クロピドグレル、プラスグレル、チカグレロル、チクロピジン、シロスタゾール、アブシキシマブ、エプチフィバチド、チロフィバン、ジピリダモール、トロンボキサンシンターゼ阻害剤、トロンボキサン受容体拮抗薬、テルトロバン、ワルファリン、ヘパリン、アセノクマロール、アトロメンチン、ブロディファコウム、フェニンジオン、アルテプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼ、アニストレプラーゼ、ストレプトキナーゼ、及びウロキナーゼからなる群から選択される抗血小板薬、抗凝固薬、または血栓溶解薬である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗炎症薬が、ＮＳＡＩＤｓ、アセトアミノフェン、ヘパリン、クマジン、コルチコステロイド、抗ヒスタミン、及び／または補体カスケードに対する抗体からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記対象への投与が、静脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、髄腔内注射、脳室内投与、頭蓋内送達、眼内送達、耳内送達により、及び／または短期もしくは長期的に設置されたカテーテルにより送達される、請求項１５に記載の方法。
【請求項３０】
前記患者への投与が静脈内注射により送達される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記有効量が、約１００ｎｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
哺乳動物における１つ以上の異常を反転させる、寛解させる、緩徐化させる、停止させる、改善する、または予防するための方法であって、前記哺乳動物に、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の薬学的組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項３３】
前記１つ以上の異常が、糸球体基底膜（ＧＢＭ）の菲薄化及び分裂、重度の蛋白尿、軽度の蛋白尿、血尿、腎不全、末期腎疾患への進行、聴覚機能障害、眼異常、孔脳症、出血を伴う脳小血管疾患、アクセンフェルト・リーガー異常を伴う脳小血管疾患、腎障害、動脈瘤、及び筋肉を伴う遺伝性血管障害、ならびに／または脳内出血を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記哺乳動物が、マウス、ラット、イヌ、またはヒトである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
組換えコラーゲンＩＶタンパク質を生産するための方法であって、３−ヒドロキシプロリン及び／または４−ヒドロキシプロリンを生成するためにプロリン残基を修飾する工程を含む、方法。
【請求項３６】
組換えコラーゲンＩＶタンパク質を生産するための細胞系であって、遺伝子操作される、細胞系。
【請求項３７】
前記細胞系は、ペルオキシダジン、リジルオキシターゼ、未変性コラーゲンＩＶタンパク質、及び／もしくは他のコラーゲンが欠乏するように、かつ／またはプロリル４−ヒドロキシラーゼ及び／もしくはプロリル３−ヒドロキシラーゼ、ならびにリジンヒドロキシラーゼを発現するように遺伝子操作される、請求項３６に記載の細胞系。
【請求項３８】
キメラα（ＩＶ）鎖ポリペプチドを発現させるためのキメラｃＤＮＡ構築物であって、前記キメラα（ＩＶ）鎖ポリペプチドが、キメラα３（ＩＶ）、α４（ＩＶ）、及びα５（ＩＶ）鎖ポリペプチドからなる群から選択される、キメラｃＤＮＡ構築物。
【請求項３９】
前記キメラα３（ＩＶ）、α４（ＩＶ）、及びα５（ＩＶ）鎖ポリペプチドは、前記α３（ＩＶ）、α４（ＩＶ）、及びα５（ＩＶ）鎖ポリペプチドのそれぞれのＮＣ１ドメインの全てまたは一部がα１（ＩＶ）及び／もしくはα２（ＩＶ）鎖のＮＣ１ドメインの全てまたは一部に置き換えられる、キメラペプチドである、請求項３８に記載のキメラｃＤＮＡ構築物。
【請求項４０】
α１（ＩＶ）、α２（ＩＶ）、α３（ＩＶ）、α４（ＩＶ）、α５（ＩＶ）のＮＣ１ドメインが、それぞれ、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、及び配列番号１１のアミノ酸配列を含む、請求項３９に記載のキメラｃＤＮＡ構築物。
【請求項４１】
キメラα（ＩＶ）ポリペプチドを生産するための発現系であって、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載のキメラｃＤＮＡを含有する、発現系。
【請求項４２】
基底膜における組換えコラーゲンＩＶタンパク質を検出するためのアッセイであって、受容体結合アッセイ、細胞遊走、分化及び／もしくは接着アッセイ、ならびに／またはバイオマーカー測定から選択される、アッセイ。
【請求項４３】
前記コラーゲンＩＶプロトマーが、α１（ＩＶ）鎖ポリペプチドの２つの複製物及びα２（ＩＶ）鎖ポリペプチドの１つの複製物からなるヘテロ三量体である、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項４４】
前記コラーゲンＩＶプロトマーが、配列番号１のアミノ酸配列及びそのバリアントを含む前記α１（ＩＶ）鎖ポリペプチドの２つの複製物、配列番号２のアミノ酸配列及びそのバリアントを含む前記α２（ＩＶ）鎖ポリペプチドの１つの複製物からなるヘテロ三量体である、請求項４３に記載の薬学的組成物。
【請求項４５】
コラーゲンＩＶタンパク質のうちの１つ以上の欠乏によって特徴付けられる状態の治療を必要とする対象において治療を行うための方法であって、前記対象に有効量の請求項４３〜４４のいずれか一項に記載の薬学的組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項４６】
前記状態がアルポート症候群である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記有効量が約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇである、請求項３１に記載の方法。
【請求項４８】
前記有効量が約５ｍｇ／ｋｇである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記コラーゲンＩＶプロトマーが、α１（ＩＶ）鎖ポリペプチドの２つの複製物及びα２（ＩＶ）鎖ポリペプチドからなるヘテロ三量体である、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項５０】
前記コラーゲンＩＶプロトマーは、それぞれが配列番号１のアミノ酸配列及びそのバリアントを含むα１（ＩＶ）鎖ポリペプチドの２つの複製物、ならびに配列番号２のアミノ酸配列及びそのバリアントを含む１つのα２（ＩＶ）鎖ポリペプチドからなるヘテロ三量体である、請求項４９に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互関連
本出願は、２０１５年３月５日に出願された米国仮出願第６２／１２８，７２９号、２０１４年１０月３０日に出願された米国仮出願第６２／０７２，４９０号、及び２０１４年７月２５日に出願された米国仮出願第６２／０２９，１３５号の優先権を主張し、これらのそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表に対する参照
本出願は、電子形式の配列表と共に出願される。配列表は、２０７２１００４ＰＣＴＳＥＱＬＳＴ．ｔｘｔという名の、２０１５年７月２３日に作成された、サイズが１００，５０７バイトであるファイルとして提供される。配列表の電子形式の情報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本発明は、コラーゲン関連疾患、特にコラーゲンＩＶアルポート症候群を治療するためのコラーゲンの置き換えに関する。アルポート症候群などのコラーゲンＩＶ関連障害を治療するための組換えコラーゲンＩＶ分子、薬学的組成物、及び方法が提供される。
【背景技術】
【０００４】
アルポート症候群は、主に、血液から老廃物を濾過する腎臓の毛細管の小さい房である糸球体に影響を及ぼす遺伝性疾患である。この疾患の最も初期の症状は尿中の血液（血尿）である。患者は、聴力損失及び／または眼合併症も示す場合が多い。５０パーセントのアルポート患者が２０歳までに末期腎疾患（ＥＳＲＤ）を発症し、死亡時期の中央値は２５歳であり、４５歳までには９０パーセントとなる。介入なしでは、ＥＳＲＤへの進行を免れない。アルポート症候群は、特定の地域に限定されることなく世界的に報告されてきた。有病率は、米国において、５０００人の新生児に約１人であると推定される。ＵＫにおいて、１００万人に約４０人（疾患保有者を含む）の個人がアルポート症候群を患い、アルポート症候群は、腎臓移植療法の患者の約１％を占める。アルポート症候群の発生率は、フィンランドでは１：５３，０００、及びスウェーデン南部では１：１７，０００であることが分かった（Ｐａｊａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｐａｅｄｉａｔｒ，１９９６，８５，１３００−１３０６、及びＰｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｎｅｐｈｒｏｌ，２００５，６４，８５−９０）。
【０００５】
糸球体基底膜（ＧＢＭ）はアルポート病変の部位である。アルポート症候群の患者における特徴的なＧＢＭ超微細構造の変化は、ＧＢＭの不規則な肥厚化及び「バスケット織り」パターンを形成する緻密層の多層状構造である。これらの変化は、疾患の初期段階では最小であるが、成人患者においては広範囲に及ぶ。ＧＢＭの広範囲に及ぶ変化は、進行性疾患経過に向かう傾向を示す。ＧＢＭの不規則な肥厚化の重症度と臨床経過との間の有力な相関関係が報告されている（Ｂａｓｔａ−Ｊｏｖａｎｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｋｉｄ  Ｄｉｓ，１９９０，１６，５１−５６）。若年患者は療法に最も適している可能性が高い。
【０００６】
アルポート症候群は、正常な構造及び糸球体基底膜の機能に重要なタンパク質であるＩＶ型コラーゲンに影響を及ぼす遺伝子における変化（突然変異）によって引き起こされる。この疾患は、主に、コラーゲンＩＶのα３、α４、及びα５鎖をコードするコラーゲンＩＶ遺伝子（ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ４Ａ４、またはＣＯＬ４Ａ５）における劣性突然変異に起因する。ＣＯＬ４Ａ５はＸ連鎖性であるため、男性における１つの欠陥遺伝子が疾患をもたらすのに十分である。コラーゲンＩＶのα３−α４−α５は、腎臓における糸球体基底膜の重要な構成要素である。
【０００７】
アルポート症候群の診断は、患者の家族歴と共に、患者の徴候及び症状の慎重な評価に依存する。時折、聴力及び視力が検査される。評価は、アルポート症候群を判断するために、血液検査、尿検査、及び腎臓の生検も含み得る。遺伝子検査は、アルポート症候群の診断を確認し、その遺伝子型を判断するのに役立ち得る。
【０００８】
現在、腎臓移植を除き、ＡＣＥ阻害剤が唯一の療法であり、これらはＥＳＲＤを遅延することができる。アルポート患者は、医療システムに大きな負担を課し、腎臓移植を必要とするヨーロッパの全ＥＳＲＤ患者の１〜２％及び米国の全患者の２〜３％を構成する。更に、移植は、移植した同種移植片の免疫拒絶反応をもたらすことが多い。したがって、この深刻で命にかかわる稀な障害に対する新規療法を開発する、未だ満たされていない医学的必要性が存在する。
【０００９】
医学研究者は、アルポート症候群の個人がなぜ腎不全を発症するかを理解し、腎不全の発症を緩徐または予防できる治療を開発することに非常に関心がある。コラーゲンＩＶ組織化を媒介する酵素の阻害剤及び幹細胞療法を含む、いくつかの治療がアルポート症候群に等しい状態の動物において試験されている。コラーゲンＩＶタンパク質がＧＢＭの主な構成成分であり、アルポートＧＢＭにおいて欠乏しているという事実を踏まえて、本発明は、機能性組換えヒトコラーゲンＩＶ（ｒｈＣｏｌ４）タンパク質が罹患したＧＢＭに送達し戻される、アルポート症候群に対する新規治療を開発する。本発明によると、意外にも、組換えヒトコラーゲンが脈管構造を容易に脱出し、罹患したＧＢＭに埋め込まれるだろうことが示される。このようなコラーゲンＩＶの置き換えは、腎臓における糸球体の濾過機能を回復させ、したがって、アルポート症候群を治療することが可能である。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、コラーゲン関連疾患、特にコラーゲンＩＶアルポート症候群を治療するためのコラーゲンの置き換えに関する。アルポート症候群などのコラーゲンＩＶ関連障害を治療するための組換えコラーゲンＩＶタンパク質、薬学的組成物、及び方法が提供される。
【００１１】
いくつかの実施形態では、本発明は、組換えコラーゲンＩＶタンパク質、ならびにコラーゲンＩＶの安定性、送達、浸透、及び／または機能性を促進する１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物及び製剤を提供する。組換えコラーゲンＩＶタンパク質は、コラーゲンＩＶプロトマー、二量体、四量体、多量体、及び／またはこれらの混合物であり得る。コラーゲンＩＶプロトマーは、α１（ＩＶ）、α２（ＩＶ）、α３（ＩＶ）、α４（ＩＶ）、α５（ＩＶ）、及びα６（ＩＶ）鎖ポリペプチドからなる群から選択される３つのポリペプチドを含有し得る。
【００１２】
いくつかの実施形態では、コラーゲンＩＶプロトマーは、α３（ＩＶ）鎖ポリペプチド、α４（ＩＶ）鎖ポリペプチド、及びα５（ＩＶ）鎖ポリペプチドを含むヘテロ三量体であり、α３（ＩＶ）鎖ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列及びそのバリアントを含み、α４（ＩＶ）鎖ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列及びそのバリアントを含み、α５（ＩＶ）鎖ポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列及びそのバリアントを含む。
【００１３】
他の実施形態では、コラーゲンＩＶプロトマーは、α１（ＩＶ）鎖ポリペプチドの２つの複製物及び１つのα２（ＩＶ）鎖ポリペプチドを含むヘテロ三量体であり、α１（ＩＶ）鎖ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列及びそのバリアントを含み、α２（ＩＶ）鎖ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列及びそのバリアントを含む。
【００１４】
免疫拒絶反応を駆動できる特定のＴ細胞エピトープは、α（ＩＶ）鎖のＮＣ１ドメインに見出されるため、他の実施形態では、該コラーゲンＩＶプロトマーは、キメラα３（ＩＶ）、α４（ＶＩ）、及びα５（ＩＶ）ポリペプチドから選択される、１つ、２つ、または３つのキメラコラーゲンＩＶ  αポリペプチドを含むヘテロ三量体である。本発明に開示されるように、キメラα３（ＩＶ）鎖ポリペプチドは、α３（ＩＶ）鎖のＮＣ１ドメインの全てまたは一部がα１（ＩＶ）及び／もしくはα２（ＩＶ）鎖のＮＣ１ドメインの全てまたは一部に置き換えられるキメラポリペプチドである。キメラα４（ＩＶ）鎖ポリペプチドは、α４（ＩＶ）鎖のＮＣ１ドメインの全てまたは一部がα１（ＩＶ）及び／もしくはα２（ＩＶ）鎖のＮＣ１ドメインの全てまたは一部に置き換えられるキメラポリペプチドである。キメラα５（ＩＶ）鎖ポリペプチドは、α５（ＩＶ）鎖のＮＣ１ドメインの全てまたは一部がα１（ＩＶ）及び／もしくはα２（ＩＶ）鎖のＮＣ１ドメインの全てまたは一部に置き換えられるキメラポリペプチドである。
【００１５】
キメラα（ＩＶ）ポリペプチドを含有する組換えコラーゲンＩＶプロトマーの例として、コラーゲンＩＶヘテロ三量体プロトマーは、α３（ＩＶ）鎖のＮＣ１ドメインの全てまたは一部がα１（ＩＶ）もしくはα２（ＩＶ）鎖のＮＣ１ドメインの全てまたは一部に置き換えられる１つのキメラα３（ＩＶ）鎖ポリペプチド、α４（ＩＶ）鎖のＮＣ１ドメインの全てまたは一部がα１（ＩＶ）もしくはα２（ＩＶ）鎖のＮＣ１ドメインの全てまたは一部に置き換えられる１つのキメラα４（ＩＶ）鎖ポリペプチド、ならびにα５（ＩＶ）鎖のＮＣ１ドメインの全てまたは一部がα１（ＩＶ）もしくはα２（ＩＶ）鎖のＮＣ１ドメインの全てまたは一部に置き換えられる１つのキメラα５（ＩＶ）鎖ポリペプチドからなってもよい。
【００１６】
いくつかの態様では、α１（ＩＶ）、α２（ＩＶ）、α３（ＩＶ）、α４（ＩＶ）、α５（ＩＶ）のＮＣ１ドメインは、それぞれ、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、及び配列番号１１のアミノ酸配列を含む。
【００１７】
他の実施形態では、該組換えコラーゲンＩＶタンパク質は、非共有結合的にまたは共有結合的に二量体化される２つのプロトマーを含むコラーゲンＩＶ二量体の形態であり、このプロトマーは、ヘテロ三量体α３（ＩＶ）−α４（ＩＶ）−α５（ＩＶ）、またはキメラα３（ＩＶ）、α４（ＩＶ）、及び／もしくはα５（ＩＶ）鎖を含むヘテロ三量体であり得る。
【００１８】
いくつかの実施形態では、該組換えコラーゲンＩＶは、組換えヒトコラーゲンＩＶ、特にヒトコラーゲンＩＶ  α３−α４−α５である。
【００１９】
本発明によると、コラーゲンＩＶタンパク質は、コラーゲンＩＶ含有組織及び臓器からのヒト天然コラーゲンＩＶの抽出及び精製により、または哺乳類細胞系、昆虫、植物細胞、ならびに／または細菌及び酵母における組換えコラーゲンＩＶタンパク質の発現を通して生産され得る。いくつかの態様では、コラーゲンＩＶタンパク質は、天然に生じるコラーゲンＩＶタンパク質と比較したとき、特定の率の３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、及び／またはヒドロキシリジンを達成するように更に修飾される。例えば、本発明のコラーゲンＩＶタンパク質は、約６．５％〜約１４％の４−ヒドロキシプロリン（すなわち、６５〜１４０個の３−ヒドロキシプロリン残基／１０００ＡＡ）、及び／または約０．２％〜約１．６％の３−ヒドロキシプロリン（すなわち、６〜１６個の３−ヒドロキシプロリン残基／１０００ＡＡ）を含有する。
【００２０】
更なる態様では、本発明において試験されたとき、本発明において使用されたコラーゲンＩＶタンパク質は、修飾されたアミノ酸及び／または他のアミノ酸置換を含有し得る。このような修飾及び置換は、コラーゲンＩＶタンパク質の機能性を変更しないだろうが、安定性の増加及び免疫反応性の減少などのコラーゲンＩＶタンパク質のある程度の化学的及び物理的特徴を改善し得る。
【００２１】
一実施形態では、組換えヒトコラーゲンＩＶタンパク質を含む薬学的組成物は、アルポート症候群の患者における糸球体構造及び機能を改善するために使用され得、この組換えヒトコラーゲンＩＶタンパク質は、コラーゲンＩＶタンパク質プロトマー、二量体、四量体、多量体、及び／またはこれらの混合物、ならびに１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含み、該コラーゲンＩＶタンパク質プロトマー、二量体、多量体は、α３（ＩＶ）、α４（ＩＶ）、及びα５（ＩＶ）鎖ポリペプチドからなる群から選択される３つのα鎖ポリペプチドからなる。
【００２２】
本発明によると、薬学的に許容される賦形剤は、１つ以上の酸化防止剤、１つ以上の等張化剤、１つ以上のキレート剤、及び臭素などの糸球体部位においてコラーゲンＩＶの組織化を補助できる薬剤を含む。
【００２３】
本発明において提供されるものには、本発明の正常な、キメラコラーゲンＩＶ  αポリペプチドを生産するための方法、ベクター、キメラｃＤＮＡ構築物、細胞系、及び機能アッセイも含まれる。いくつかの態様では、宿主細胞は、プロリル３−ヒドロキシラーゼ及び／またはプロリル４−ヒドロキシラーゼを発現するように遺伝子操作され得る。他の態様では、宿主細胞は、ペルオキシダジン、リジルオキシダーゼ、及び／または未変性コラーゲンＩＶタンパク質もしくは未変性コラーゲンＩＶ以外のコラーゲンが更に欠乏している場合がある。
【００２４】
いくつかの実施形態では、本発明は、組換えコラーゲンＩＶタンパク質を含む薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することにより、コラーゲンＩＶタンパク質のうちの１つ以上の欠乏によって特徴付けられる状態の治療を必要とする対象においてそれを行うための方法を特徴とする。該状態は、α３（ＩＶ）鎖ポリペプチドの１つ以上欠乏、α４（ＩＶ）鎖ポリペプチドの１つ以上の欠乏、及び／またはα５（ＩＶ）鎖ポリペプチドの１つ以上の欠乏を特徴とし得る。特に、このような欠乏は、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ４Ａ４、及び／またはＣＯＬ４Ａ５遺伝子における遺伝子突然変異に起因する。
【００２５】
いくつかの態様では、コラーゲンＩＶタンパク質の欠乏によって特徴付けられる状態は、アルポート症候群、菲薄基底膜腎症（ＴＢＭＮ）、家族性血尿、末期腎疾患（ＥＳＲＤ）、進行性腎不全、糸球体性血尿、蛋白尿、遺伝性腎炎、糖尿病性腎症、周産期脳出血及び孔脳症、出血性卒中、ならびにコラーゲンＩＶタンパク質の欠損を伴うあらゆる疾患または障害から選択される。
【００２６】
好ましい実施形態では、疾患はアルポート症候群である。アルポート症候群は、Ｘ連鎖性アルポート症候群、常染色体劣性アルポート症候群、または常染色体優性アルポート症候群であり得る。Ｘ連鎖性アルポート症候群は、α５（ＩＶ）鎖ポリペプチドをコードするＣＯＬ４Ａ５遺伝子におけるあらゆる突然変異に起因し得る。常染色体劣性アルポート症候群は、それぞれ、α４（ＩＶ）鎖ポリペプチド及びα５（ＩＶ）鎖ポリペプチドをコードするＣＯＬ４Ａ３及び／またはＣＯＬ４Ａ４遺伝子におけるあらゆる突然変異によって引き起こされ得る。常染色体優性アルポート症候群は、それぞれ、α４（ＩＶ）鎖ポリペプチド及びα５（ＩＶ）鎖ポリペプチドをコードするＣＯＬ４Ａ３及び／またはＣＯＬ４Ａ４遺伝子におけるあらゆる突然変異によって引き起こされる。
【００２７】
他の態様では、アルポート症候群の患者は、家族歴または遺伝子検査により診断される、腎機能障害所見のない患者であり得る。
【００２８】
いくつかの実施形態では、本方法において使用される薬学的組成物は、組換えコラーゲンＩＶプロトマー、二量体、四量体、多量体、及びこれらの混合物を含む。いくつかの態様では、組換えコラーゲンＩＶはプロトマーからなる。コラーゲンＩＶプロトマーは、１本のα３（ＩＶ）鎖、１本のα４（ＩＶ）鎖、及び１本のα５（ＩＶ）鎖からなるヘテロ三量体であり、この３本の鎖は３重らせんを形成し、かつα３（ＩＶ）鎖は配列番号３のアミノ酸配列を含み、α４（ＩＶ）鎖は配列番号４のアミノ酸配列を含み、α５（ＩＶ）鎖は配列番号５のアミノ酸配列を含む。
【００２９】
他の態様では、組換えコラーゲンＩＶプロトマーは、キメラα３（ＩＶ）、α４（ＩＶ）、α５（ＩＶ）鎖から選択される１本、２本または３本のキメラα（ＩＶ）鎖を含むヘテロ三量体であり、α３（ＩＶ）鎖は、α３（ＩＶ）鎖のＮＣ１ドメインの全てまたは一部がα１（ＩＶ）もしくはα２（ＩＶ）鎖のＮＣ１ドメインの全てまたは一部に置き換えられるキメラポリペプチドを含み、キメラα４（ＩＶ）鎖は、α４（ＩＶ）鎖のＮＣ１ドメインの全てまたは一部がα１（ＩＶ）もしくはα２（ＩＶ）鎖のＮＣ１ドメインの全てまたは一部に置き換えられるキメラポリペプチドを含み、キメラα５（ＩＶ）鎖は、α５（ＩＶ）鎖のＮＣ１ドメインの全てまたは一部がα１（ＩＶ）もしくはα２（ＩＶ）鎖のＮＣ１ドメインの全てまたは一部に置き換えられるキメラポリペプチドを含む。
【００３０】
他の実施形態では、該組換えコラーゲンＩＶはコラーゲンＩＶ二量体の形態であり、該二量体は、本明細書に開示される、組換えコラーゲンＩＶ  α３−α４−α５及び／またはキメラコラーゲンＩＶであり得る２つのコラーゲンＩＶプロトマーを含む。いくつかの態様では、該コラーゲンＩＶ二量体は、必要とする対象に投与する前に、インビトロで酵素的または化学的に二量体化される。
【００３１】
いくつかの実施形態では、コラーゲンＩＶタンパク質は、静脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、髄腔内注射、脳室内投与、頭蓋内送達、眼内送達、耳内送達により、及び／または短期もしくは長期的に設置されたカテーテルにより、それを必要とする対象に投与される。好ましい実施形態では、コラーゲンＩＶタンパク質は、静脈内注射により、それを必要とする対象に投与される。
【００３２】
いくつかの実施形態では、有効量は、約１００ｎｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇである。いくつかの態様では、有効量は、約１００ｎｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇである。他の態様では、有効量は、１μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇである。更に他の態様では、有効量は、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇである。一実施形態では、有効量は約５ｍｇ／ｋｇである。
【００３３】
１つ以上の予防薬は、必要とする対象にコラーゲンＩＶタンパク質組成物と共投与され得、該予防薬は、抗血栓薬及び／または抗炎症薬であり得る。
【００３４】
抗血栓薬は、組換えコラーゲンＩＶの置き換えにより誘導された即時的血栓形成を一次予防する、または二次予防するために使用され得る。抗血栓薬は、抗血小板薬、抗凝固薬、または血栓溶解薬であり得る。抗血小板薬は、アスピリン及びトリフルサルなどの不可逆的シクロオキシゲナーゼ阻害剤；クロピドグレル、プラスグレル、チカグレロル、及びチクロピジンなどのアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）受容体阻害剤；シロスタゾールなどのホスホジエステラーゼ阻害剤；アブシキシマブ、エプチフィバチド、及びチロフィバンなどの糖タンパク質ＩＩＢ／ＩＩＩＡ阻害剤；ジピリダモールなどのアデノシン再取り込み阻害剤；トロンボキサンシンターゼ阻害剤などのトロンボキサン阻害剤；トロンボキサン受容体拮抗薬、ならびにテルトロバン（ｔｅｒｕｔｈｒｏｂａｎ）を含み得るが、これらに限定されない。抗凝固薬は、ワルファリン、ヘパリン、アセノクマロール、アトロメンチン、ブロディファコウム、及びフェニンジオンを含み得るが、これらに限定されない。血栓溶解薬は、アルテプラーゼ、レテプラーゼ、及びテネクテプラーゼなどの組織プラスミノーゲン活性化因子ｔ−ＰＡ；アニストレプラーゼ；ストレプトキナーゼ、及びウロキナーゼを含み得るが、これらに限定されない。
【００３５】
抗炎症薬は、アスピリン、イブプロフェン、ナプロキセンなどのＮＳＡＩＤｓ（非ステロイド系抗炎症薬）；アセトアミノフェン；及びＩｍＳＡＩＤｓ（免疫選択的抗炎症薬）を含み得るが、これらに限定されない。
【００３６】
いくつかの実施形態では、本発明は、コラーゲンＩＶタンパク質の投与が対象の表現型による帰結を予防、寛解、緩徐、停止、及び／または改善するように、組換えコラーゲンＩＶタンパク質を含む薬学的組成物を投与することにより、糸球体基底膜（ＧＢＭ）の菲薄化及び分裂、重度の蛋白尿、軽度の蛋白尿、血尿、腎不全（ｒｅｎａｌ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）、末期腎疾患への進行、聴覚機能障害、眼異常、孔脳症、出血を伴う脳小血管疾患、アクセンフェルト・リーガー異常を伴う脳小血管疾患、腎障害、動脈瘤、及び筋肉を伴う遺伝性血管障害、ならびに／または脳内出血を含む１つ以上の異常の予防、寛解、反転、緩徐、停止、及び／または改善を必要とする対象において、それらを行うための方法を特徴とする。
【００３７】
コラーゲンＩＶタンパク質は哺乳動物に投与され得る。哺乳動物は、マウス、ラット、イヌ、またはヒトであり得る。
【００３８】
加えて、基底膜における組換えコラーゲンＩＶを検出するために使用され得るアッセイが本発明において提供される。該アッセイは、受容体結合、細胞遊走、分化及び／または接着、ならびにバイオマーカー測定を含み得る。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】抗Ｃｏｌ４抗体：ｓｃ７０２４６（１：１００）（レーン４〜７）、ａｂ６５８６（１：１０００）（レーン８〜１１）、及びａｂ１９８０８（１：１０００）（レーン１２〜１５）で免疫ブロットされるＣｏｌ４（α１（２）α２）タンパク質の代表的な変性／非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル画像である。レーン１及び２は、Ｎｏｖｅｘからの分子量マーカーである。各抗体に関して、異なる量のＣｏｌ４（α１（２）α２）タンパク質（２５０ｎｇ、１２５ｎｇ、２５ｎｇ、１２．５ｎｇ）がロードされた。バンド：個々のα（ＩＶ）鎖（Ｉ）、プロトマー（Ｐ）、二量体（Ｄ）、及び四量体（Ｔ）は、ＨＲＰ複合抗ＩｇＧ二次抗体（１：２０，０００希釈）で可視化された。
【図２ａ】ジスルフィド還元して、または還元せずにＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜１５％ゲル）を変性した際のＣｏｌ４（α１（２）α２）種を示す。図２ａは、ジスルフィド還元しなかったＣｏｌ４（α１（２）α２）調製物の代表的な変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル画像である。図２ｂは、ジスルフィド還元したＣｏｌ４（α１（２）α２）調製物の代表的な変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル画像である。図２ａ及び２ｂのレーン１３、１４、及び１５は、ＬＡＭ−１１１を完全に還元し、ＬＡＭ−１１１のガンマ１鎖のみがガンマ１特異的抗体（カタログ番号ｓｃ５５８４）によりアッセイされる。
【図２ｂ】ジスルフィド還元して、または還元せずにＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜１５％ゲル）を変性した際のＣｏｌ４（α１（２）α２）種を示す。図２ｂは、ジスルフィド還元したＣｏｌ４（α１（２）α２）調製物の代表的な変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル画像である。図２ａ及び２ｂのレーン１３、１４、及び１５は、ＬＡＭ−１１１を完全に還元し、ＬＡＭ−１１１のガンマ１鎖のみがガンマ１特異的抗体（カタログ番号ｓｃ５５８４）によりアッセイされる。
【図３】ダイレクトレッド８０染料を使用した、電荷シフトを伴うＣｏｌ４（α１（２）α２）タンパク質の代表的な未変性ＰＡＧＥゲル画像である。ＬＡＭ−１１１は、独立した分子量マーカーとして使用された。
【図４】様々な抗ＦＩＴＣ抗体を使用した、ＦＩＴＣ−Ｃｏｌ４（α１（２）α２）複合体検出のためのＥＬＩＳＡアッセイのヒストグラムである。
【図５ａ】ＦＩＴＣ標識された、及び未標識のＣｏｌ４（α１（２）α２）の検出を示す代表的なゲル画像である。Ｃｏｌ４（α１（２）α２）は、レーンＡ〜Ｃでは還元され、レーンＤ〜Ｆでは還元されない。同量のタンパク質が各レーンにロードされた。レーンＡ及びＤは未標識のＣｏｌ４（α１（２）α２）でロードされ、レーンＢ及びＥはＦＩＴＣ標識されたＣｏｌ４（α１（２）α２）でロードされたが、サイズ排除カラムで精製されず、レーンＣ及びＦはＦＩＴＣ標識されたＣｏｌ４（α１（２）α２）でロードされ、サイズ排除カラムで精製された。
【図５ｂ】ＦＩＴＣ−Ｃｏｌ４（α１（２）α２）の検出のための、抗ＦＩＴＣ抗体（ａｂ１９４９２、１：２０，０００希釈）を使用した免疫ブロットの代表的なゲル画像である。
【図６ａ】様々な抗ＦＩＴＣ抗体を使用したＦＩＴＣ−ＬＡＭ−１１１複合体検出のためのＥＬＩＳＡアッセイのヒストグラムである。
【図６ｂ】ＦＩＴＣ標識された、及び未標識のＬＡＭ−１１１の検出を示す代表的なゲル画像である。ＬＡＭ−１１１は、レーンＡ〜Ｂでは還元され、レーンＤ〜Ｆでは還元されない。同量のタンパク質が各レーンにロードされた。レーンＡ及びＤは未標識のＬＡＭ−１１１でロードされ、レーンＢ及びＥはＦＩＴＣ標識されたＬＡＭ−１１１でロードされたが、サイズ排除カラムで精製されず、レーンＣ及びＦはＦＩＴＣ標識されたＬＡＭ−１１１でロードされ、サイズ排除カラムで精製された。
【図６ｃ】ＦＩＴＣ−ＬＡＭ−１１１の検出のための、抗ＦＩＴＣ抗体（ａｂ１９４９２、１：２０，０００希釈）を使用した免疫ブロットの代表的なゲル画像である。
【図７】静脈内注射を６回投与した後の糸球体基底膜（ＧＢＭ）におけるＦＩＴＣ−Ｃｏｌ４（α１（２）α２）及びＦＩＴＣ−ＬＡＭ−１１１の局在化を示す。図７ａ及び７ｂは、未注射のヘテロ接合（Ｃｏｌ４＋／−（ハイブリッド））マウス（図７ａ）、及びＦＩＴＣ−Ｃｏｌ４（α１（２）α２）を６回注射されるアルポート（Ｃｏｌ４−／−（ハイブリッド））マウス（図７ｂ）の腎臓の代表的な共焦点蛍光顕微鏡画像である。上部パネルは抗ＦＩＴＣ抗体染色の画像であり、中央のパネルは抗アグリン染色の画像であり、底部パネルはＤＮＡマーカーＤＡＰＩ染色を使用した抗ＦＩＴＣと抗アグリン染色のオーバーラップ画像である。図７ｃ及び７ｄは、未注射のヘテロ接合（Ｃｏｌ４＋／−（Ｂ６））マウス（図７ｃ）、及びＦＩＴＣ−ＬＡＭ−１１１を６回注射されるアルポート（Ｃｏｌ４−／−（Ｂ６））マウス（図７ｄ）の腎臓の代表的な共焦点蛍光顕微鏡画像である。上部パネルは抗ＦＩＴＣ抗体染色の画像であり、中央のパネルは抗アグリン染色の画像であり、底部パネルはＤＮＡマーカーＤＡＰＩ染色を使用した抗ＦＩＴＣと抗アグリン染色のオーバーラップ画像である。
【図８】図８のａは、未注射のアルポートマウス（Ｃｏｌ４−／−７５日齢）における糸球体形態の代表的な画像を示す。図８のｂは、Ｃｏｌ４−（α１（２）α２）投与されたアルポートマウス（Ｃｏｌ４−／−、８８日齢）における糸球体形態の代表的な画像を示す。
【図９】Ｃｏｌ４−（α１（２）α２）（Ｎ＝５）で処置されたか、もしくは未処置（Ｎ＝４）のいずれか、または対照ビヒクルのみ（Ｎ＝３）で処置されたアルポートマウス（Ｃｏｌ４−／−）における糸球体硬化のヒストグラムである。生後７０日の各マウスから少なくとも１００の糸球体が数えられ、その率は、各コホートにおける非硬化糸球体の平均数を示す。バーは各コホートにおける値の範囲を表す。未Ｃｏｌ４（Ｎ＝７）は、未注射、及びビヒクル注射されたアルポートマウスからの複合データを表す。
【図１０】糸球体毛細管の代表的な電子顕微鏡画像を示す。図１０ａは、ビヒクルのみを注射されたヘテロ接合マウス（Ｃｏｌ４＋／−）の代表的な画像である（７０日目）。図１０ｂは、ビヒクルを注射されたアルポートマウス（Ｃｏｌ４−／−）の代表的な画像である（７０日目）。図１０ｃは、Ｃｏｌ４−（α１（２）α２）タンパク質を注射されたアルポートマウス（Ｃｏｌ４−／−）の代表的な画像である（７０日目）。
【図１１】Ｃｏｌ４−（α１（２）α２）を投与されたアルポートマウス（上）及び未処置／ビヒクル処置されたアルポートマウス（下）における血中尿素窒素（ＢＵＮ）測定値である。
【図１２】Ｃｏｌ４−（α１（２）α２）投与されたアルポートマウス（上）及び未処置／ビヒクル処置されたアルポートマウス（下）の尿中アルブミン／クレアチニン比である。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、以下の添付の説明に記載される。本明細書に記載されるものに類似するまたは同等のあらゆる材料及び方法が本発明の実践及び試験に使用され得るが、好ましい材料及び方法がここに記載される。本発明の他の特徴、目的、及び利点は説明から明らかであろう。この説明において、文脈が明確に別様を示さない限り、単数形は複数形も含む。別様に定義されない限り、本明細書に使用される全ての技術用語及び科学用語は、この発明が属する当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合、本説明に従う。
【００４１】
本発明は、コラーゲン関連疾患、特にコラーゲンＩＶ  α３、α４、及びα５鎖ポリペプチドをコードするＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ４Ａ４、及びＣＯＬ４Ａ５遺伝子における遺伝子突然変異に起因するアルポート症候群などの、コラーゲンＩＶタンパク質のうちの１つ以上の欠乏によって特徴付けられる疾患を治療するための薬学的組成物、薬剤、及び方法に関する。本発明は、コラーゲンＩＶに基づく構造的支持及び他の生理学的機能を回復させるために患部に機能性コラーゲンＩＶタンパク質を輸送し戻すことを目的とする。
【００４２】
コラーゲンは哺乳動物の主な構造構成成分である。多くの疾患及び状態は、組織におけるコラーゲンの過剰な蓄積、コラーゲンα鎖の突然変異、異常な組織化、翻訳後修飾の増加／減少、及び／または他の構造タンパク質とのコラーゲン相互作用の中断と関連する。コラーゲンα鎖ポリペプチドのいずれかにおける突然変異は、組織及び臓器に支持を提供する、発達のためにシグナルを提示する、ならびに／または生理学的機能を支持する正しいコラーゲン構造の不在に起因する、様々な稀な疾患をもたらす。例えば、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ４Ａ４、及びＣＯＬ４Ａ５遺伝子における突然変異に起因するコラーゲンＩＶの不在は、後に腎不全をもたらす場合がある糸球体基底膜を損なう。
【００４３】
コラーゲン媒介障害の治療のために、不在または異常なコラーゲンをどのように回復させるかの問題は未だ対処されていない。本発明は、コラーゲン媒介障害、特にコラーゲンＩＶ媒介障害であるアルポート症候群を治療するための新規薬学的組成物、薬剤、及び方法を提供する。アルポート症候群を治療する、及び／または腎不全の過程を予防、緩徐するための方法も本明細書において提供される。
【００４４】
コラーゲンＩＶ  α３、α４、及びα５鎖（ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ４Ａ４、及びＣＯＬ４Ａ５）をコードする遺伝子における突然変異は、糸球体腎炎、末期腎疾患、聴力損失、及び眼合併症によって特徴付けられるアルポート症候群をもたらし得る。現在、アルポート症候群に対する特定の治療はない。高血圧及び腎疾患の他の症状を有する個人に使用される同じ治療がアルポート症候群の個人に使用される。腎臓移植は通常、アルポート症候群の個人において非常に成功しており、末期腎不全が近づいているときの最良の治療と考えられる。しかしながら、多くの患者は、抗糸球体基底膜疾患の侵攻性形態であるアルポート移植後腎炎（ＡＰＴＮ）を発症する。
【００４５】
本発明の原理は、糸球体基底膜などの患部に組換えヒトコラーゲンＩＶタンパク質を輸送し戻して、その正常な構造、したがってその濾過機能を回復させることである。以前に、いくつかの研究が、大きいタンパク質が糸球体基底膜内に浸透できることを示してきた。内皮窓は約１００〜１５０ｎｍであり、フェリチンなどの大きいタンパク質の通過を可能にするのに十分に大きいが、コラーゲンＩＶプロトマーなどの細長い分子、または更に細長いコラーゲンＩＶ二量体がＧＢＭ内に浸透可能であるかは知られていない。ネフローゼ糸球体基底膜は、通常の糸球体基底膜よりもフェリチンに透過性である。したがって、本発明は、静脈内注射により、罹患した患者に組換えコラーゲンＩＶタンパク質、特にコラーゲンＩＶプロトマー、二量体、四量体、または多量体を投与することにより、アルポート症候群を治療するための薬学的組成物及び方法を開発する。我々は、コラーゲンＩＶプロトマー、二量体、四量体、または多量体が腎臓の糸球体基底膜内に浸透し、他の構成成分と共に細胞外マトリックスネットワーク内に埋め込まれる新規発見を開示する。
【００４６】
加えて、組換えコラーゲンＩＶを含む薬学的組成物は、再生薬剤の一部としても使用され得る。非限定的な例として、本発明からの組換えコラーゲンＩＶは、人工足場及び／もしくは天然の脱細胞化足場に組み込むことができる、他の細胞外マトリックスタンパク質と混合され得る、幹細胞のインビボ、エクスビボ、及び／もしくはインビトロ成長、分化、及び選択のための基材として採用され得る、または短期創傷対の血栓症強化パッチとして採用され得る。
定義  
【００４７】
別様に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、この発明が属する当業者によって通常理解される意味を有する。以下の用語は、別様に指定されない限り、付与された意味を有する。また、定義は、本明細書に記述される本発明を理解するのに役立つ。
【００４８】
本明細書で使用されるとき、用語「プロトマー」は、大きい巨大分子（すなわち、オリゴマータンパク質）の分子構造のサブユニットを指す。コラーゲンの文脈において、コラーゲンプロトマー自体は、３つのα鎖ポリペプチドからなる三量体である。例えば、コラーゲンＩＶプロトマーは、３つのα鎖ポリペプチドのヘテロ三量体である。コラーゲンプロトマーは、二量体、四量体、オリゴマー、及び多量体を形成する。
【００４９】
本明細書で使用されるとき、用語「基底膜」は、「基底層」とも称され、原線維の薄い広がりを意味する。基底膜は、いくつかの特定の種類のコラーゲン（例えば、ＩＶ型及びＩ〜Ｖ型）、ラミニン、及び様々な種類の細胞接着分子（ＣＡＭ）、プロテオグリカン、及びフィブロネクチンを含む、少なくともいくつかの確認されたタンパク質及びペプチド誘導体から構成される。基底膜は、様々な組織（例えば皮膚）の細胞の根底にある線維の薄いシートを形成する。基底膜は主に、細胞を下の結合組織に結合する細胞の係留系として機能するか、または異物もしくは悪性細胞に対する保護バリアを提供するか、または腎臓の糸球体を通して血液を濾過する。
【００５０】
本明細書で使用されるとき、用語「糸球体基底膜（ＧＢＭ）」は、糸球体濾過バリアの細胞外マトリックス構成成分として機能する、腎臓における糸球体の基底膜を指す。これは有足細胞及び糸球体内皮細胞層と隣接している。主なＧＢＭの構成成分は、ラミニン−５２１、コラーゲンα３−α４−α５（ＩＶ）、ナイドジェン、及びヘパラン硫酸プロテオグリカンアグリンである。
【００５１】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、本明細書において、アミノ酸残基のポリマーを指すように互換的に使用され、特定の長さのポリマーを指さない。よって、ペプチド、オリゴペプチド、及びタンパク質断片は、ポリペプチドの定義内に含まれる。本用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に生じるアミノ酸の類似体もしくは模倣物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に生じるアミノ酸ポリマーに適用される。ポリペプチドは、例えば、糖タンパク質を形成するために炭水化物残基を付加することにより修飾され得る。翻訳後修飾の別の例は、多くのコラーゲンポリペプチドにおけるプロリン及びリジンのヒドロキシル化である。用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、糖タンパク質ならびに非糖タンパク質を含む。
【００５２】
本明細書で使用されるとき、用語「治療する」または「治療」は、予防及び／または治療目的のための、薬学的組成物、例えば、コラーゲンＩＶタンパク質を含む本発明の組成物を投与することを指す。「疾患を予防する」ことは、まだ病気ではないが、特定の疾患に感受性を示す、またはさもなければそれを発症する危険性がある患者の予防的治療を指す。例えば、患者は、遺伝子検査により、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ４Ａ４、及び／またはＣＯＬ４Ａ５遺伝子に突然変異を有する。「疾患を治療する」ことは、既に疾患に罹患している患者に、疾患を寛解させ、患者の状態、例えば腎機能を改善するために投与することを指す。
【００５３】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲において論じられる。
コラーゲン
【００５４】
コラーゲンは哺乳動物において最も豊富なタンパク質であり、総タンパク質の約２５％を構成する。コラーゲンは、皮膚、骨、腱、軟骨、及び歯周組織の主な線維構成成分である。典型的なコラーゲン分子は、３本鎖らせんの、長く、棒状の剛構造である。コラーゲンは、更に架橋されて、原線維、シート、及びフィラメントなどの高分子コラーゲン構造／ネットワークを形成する。タンパク質のコラーゲンスーパーファミリーは、様々な組織の一体性を維持する祭に主要な役割を担い、またいくつかの他の重要な機能も有する。
【００５５】
コラーゲン分子は身体全体にわたって見られるが、それらの種類及び編成は、コラーゲンが特定の臓器／組織において担う構造的役割により決定される。一部の臓器では、コラーゲンは、細胞外マトリックスまたは眼の様々な体液にあるような、構造を支持するゲルとして分散され得る。他の臓器では、コラーゲンは、腱にあるような、多大な強度を提供する密接した平行線維に束ねられ得る。骨のコラーゲン線維は、特に機械的攻撃に抵抗するように配置され得る。
コラーゲンの型
【００５６】
コラーゲンは、高度に編成された超分子組織化を形成する２５超のコラーゲン型（表１を参照）、ならびにコラーゲン様ドメインを有する追加のタンパク質を含む、大きなファミリーの高度に発達した繊維性タンパク質である。多くの遺伝学的、化学的、及び免疫学的に異なる型のコラーゲンも特定されている。コラーゲンの変種は、塩基性ポリペプチド鎖の組織化における相違、異なる長さのらせん、らせんにおける様々な中断、らせんドメインの終結における相違、及び／または非コラーゲンドメインの切断に起因し得る。
【００５７】
コラーゲンは、身体におけるそれらの位置及び機能に基づいて、いくつかのグループに分類される。コラーゲンＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｖ型、及びＸＩ型は、原線維形成コラーゲンであり、これらは、原線維における個々のコラーゲン分子の規則的なジグザグ状の詰め込みを示す特徴的な縞模様を有する原線維の線状ポリマーを形成する。コラーゲンＩＸ型、ＸＩＩ型、ＸＩＶ型、及びＸＶＩ型は、これらの原線維を互いに、及び／または細胞外マトリックスの他の構成成分に連結する、コラーゲン原線維の表面に結合する原線維会合コラーゲンである。コラーゲンＩＶ型、ＶＩＩＩ型、及びＸ型は、ネットワーク形成コラーゲンであり、これらは原線維ではない３次元の網目を形成する。コラーゲンＩＶ型分子は、基底膜の主な部分を構成するシートに組織化される。第４グループのコラーゲンには、コラーゲンＶＩ型（数珠状原線維形成コラーゲン）及びＶＩＩ型（係留線維）などの全ての他のコラーゲンが含まれる。
コラーゲンの構造的特徴
【００５８】
全てのコラーゲン分子は、α鎖と称される３つのポリペプチドからなり、このα鎖は、それらの長さの少なくとも一部に対して互いに巻きついて３重αらせんを形成する。３重らせんを形成しないコラーゲンの部分は、非コラーゲンまたは「ＮＣ」ドメインと呼ばれ、例えば、ＮＣ１、ＮＣ２など、各コラーゲン内で番号付けされる。個々のα鎖ポリペプチドは、小さいＮ及びＣ末端グローバルドメイン（すなわち、非コラーゲンドメイン）に隣接している、多くのＧｌｙ−Ｘ−Ｙ反復を有するドメイン（すなわち、コラーゲンドメイン）を形成する大きな中央３重らせんを含有する、類似したドメイン構成を有する。３重らせんコラーゲンプロトマーのいくつかの型は、ホモ三量体を形成する３本の遺伝学的に同一のα鎖を含有し、一方で、他は、ヘテロ三量体を形成する２本または３本の異なるα鎖を含有する。
【００５９】
Ｈ結合：３つのα鎖ポリペプチドは、一緒に保持され、それらの間の水素結合により安定化される。より一般的なαらせんとは異なり、コラーゲンらせんは鎖内水素結合を有しない。
【００６０】
アミノ酸配列：コラーゲンらせんドメインは、３重らせんの形成に重要である特定のアミノ酸（グリシン、プロリン、及びヒドロキシプロリン）を含有する。これらのアミノ酸は、各α鎖ポリペプチドにおいて規則的な配置を有する。配列は、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ（式中、Ｘは頻繁にプロリンであり、Ｙはヒドロキシプロリンであることが多い（ヒドロキシリジンでもあり得る））のパターンに従うことが多い。よって、α鎖のらせん部分の大半は、その配列が（−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−）ｎとして表され得るポリトリペプチドと見なされ得る。プロリンまたはヒドロキシプロリンは、全配列の約１／６を構成し、グリシンは配列の１／３を占める。プロリンは、その環構造がペプチド鎖において「ねじれ」をもたらすため、各α鎖のらせん配向の形成を促進する。グリシンは３重反復の３番目の位置毎に見られる。グリシンは一番小さく、側鎖を有しない非極性アミノ酸であるため、線維構造タンパク質において独特の役割を担う。グリシンの側鎖は水素原子であり、このような小さい側鎖は、他のアミノ酸が収まらない場所に容易に収まることができる。例えば、グリシンのみがコラーゲンらせんの内部アミノ酸内にあることができる。
【００６１】
コラーゲンは、酵素及び輸送タンパク質のような化学的に反応性の側基を含有しない。
【００６２】
３重らせん構造：コンパクトな構造に折り畳まれる大半の球状タンパク質とは異なり、繊維性タンパク質であるコラーゲンは、そのアミノ酸側鎖の多くを３重らせん分子上に置く、細長い３重らせん構造を有する。各α鎖は左巻きらせんを形成し、一緒に整合されて３重右巻きらせんプロトマーを形成する。α鎖のそれぞれは、豊富なグリシンと共にそれらの幾何学的に制約されたカルボキシル及び（二級）アミノ基を伴って、高いプロリン及びヒドロキシプロリン環含有量のため、左巻き対称に成形される。左巻きらせんはいずれの鎖内水素結合なしに形成される。３重らせんは連続ストレッチであり得るか、または非コラーゲン要素により中断され得る。
【００６３】
ヒドロキシプロリン及びヒドロキシリジン：コラーゲンは、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）及びヒドロキシリジン（Ｈｙｌ）を含有し、これらは大半の他のタンパク質には存在しない。これらの残基は、プロリン及びリジン残基の一部の翻訳後ヒドロキシル化から生じる。ヒドロキシル化反応は酵素（ヒドロキシラーゼ）により触媒され、アスコルビン酸（ビタミンＣ）を必要とする。ヒドロキシプロリンは、鎖間水素結合の形成を最大にするため、コラーゲンの３重らせん構造を安定化させる際に重要である。
【００６４】
グリコシル化：いくつかの場合では、コラーゲンのヒドロキシリジン残基のヒドロキシル基は、酵素学的にグリコシル化され得、コラーゲンを糖タンパク質にする。最も一般的には、グルコース及びガラクトースは、３重らせん形成前にポリペプチドに順に結合される。
【００６５】
架橋：コラーゲンの引っ張り強度は、個々のタンパク質サブユニット間の共有結合分子間架橋の形成に依存する。高等脊椎動物における原線維含有コラーゲン（例えば、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｖ型、及びＸＩ型）は、リジルオキシダーゼにより、リジン（またはヒドロキシリジン）側鎖から酵素学的に生成されたアルデヒドの反応に基づいた機序を通して架橋される。ある特定の他のコラーゲン型（例えば、軟骨のコラーゲンＩＸ）もリジンオキシダーゼ機序により架橋される。
コラーゲンの生合成
【００６６】
コラーゲン分子のポリペプチド前駆体の合成の主な部位は、線維芽細胞、軟骨細胞（軟骨の）、骨芽細胞（骨の）、象牙芽細胞、及びセメント芽細胞を含む、間葉系細胞、ならびにそれらの類似体である。他の細胞は、上皮細胞、内皮細胞、筋細胞、及びシュワン細胞を含み得るが、これらに限定されない。
【００６７】
前駆体ポリペプチドは、特定のｍＲＮＡからのプレプロ−α鎖の翻訳、シグナルペプチド（プロ−α鎖）の切断、プロリンのヒドロキシル化、リジンのヒドロキシル化、ヒドロキシリジンのグリコシル化、及びＣ末端ペプチドの会合／ジスルフィド結合形成／Ｃ末端プロペプチド（プロコラーゲン分子）の組み込みを含む、順に起こる事象を通して細胞の内部で形成される。コラーゲン分子は、次に、細胞外マトリックス中に分泌される。酵素修飾後、成熟したコラーゲン単量体が凝集し、架橋となりコラーゲン線維を形成する。
【００６８】
プロα鎖の形成：排出／分泌のために生産された大半のタンパク質と同様に、α鎖（プレプロ−α鎖）の新しく合成されたポリペプチド前駆体は、それらのＮ末端側に特別なシグナル配列を含有する。シグナル配列は、リボソームの粗面小胞体（ＲＥＲ）への結合を促進し、プレプロ−α鎖の、ＲＥＲの管腔内への通路を指向する。シグナル配列はＲＥＲにおいて迅速に切断されて、プロ−α鎖と呼ばれるコラーゲンの前駆体をもたらす。
【００６９】
翻訳後修飾：プロ−α鎖は、ＲＥＲの管腔内のいくつかの酵素によって処理されるが、ポリペプチドは尚も合成される。−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ−配列のＹ位置に見られるプロリン及びリジン残基は、ヒドロキシル化されてヒドロキシプロリン及びヒドロキシリジン残基を形成する。これらのヒドロキシル化反応は、分子の酸素Ｆｅ２＋、及び還元剤のアスコルビン酸（ビタミンＣ）を必要とする。プロリルヒドロキシラーゼ及びリジルヒドロキシラーゼの２つのヒドロキシル化酵素が通常関与する。プロリル及びリジルヒドロキシル化の欠落は、安定した３重らせんの形成のような鎖間のＨ結合の形成を損なう。加えて、コラーゲン原線維は架橋されることができず（以下を参照）、組織化された線維の引っ張り強度を大幅に減少させる。ヒドロキシプロリンは、温度変化においてコラーゲン原線維の変性も妨げる場合がある。非ヒドロキシル化３重らせんは３７℃より低い温度で変性を受けることが示されている。いくつかのヒドロキシリジン残基は、グルコースまたはグルコシル−ガラクトースとのグリコシル化により修飾される。
【００７０】
３重らせん組織化：ヒドロキシル化及びグリコシル化の後、３本のプロ−α鎖は、プロペプチドと呼ばれる非らせんＮ及びＣ末端ドメインに隣接する３重らせんの中央コラーゲン領域を有するプロコラーゲン分子（プロトマー）を形成する。
【００７１】
プロコラーゲン分子の形成は、中間のコラーゲンドメインを通して３重らせん形成の核生成のための正しい整合をもたらす、３本のプロα鎖のＣ末端非コラーゲンドメイン間の一連の非共有結合相互作用で始まる。Ｃ末端ポリペプチドのこの最初の認識は、プロコラーゲン組織化のための特定の鎖を選択する。例えば、プロコラーゲンＩ型及びＩＩＩ型は、両方とも皮膚の線維芽細胞において合成され、またそれらのプロコラーゲンα鎖配列において高レベルの同一性を有するにもかかわらず、型特異的様式で組織化される。コラーゲンＩは２本のプロα１（Ｉ）鎖及び１本のプロα２（Ｉ）鎖のヘテロ三量体として存在するが、コラーゲンＩＩＩは３本のプロα１（ＩＩＩ）鎖を含む絶対ホモ三量体である。
【００７２】
分泌：プロコラーゲン分子は、分泌小胞にパッケージされるゴルジ装置を通って移動する。小胞は細胞膜と融合し、プロコラーゲン分子の細胞外空間への放出をもたらす。
【００７３】
順に起こる生合成事象は、プロコラーゲンが成熟コラーゲンに処理される細胞外空間において生じる。このような事象は、Ｎ末端及びＣ末端ドメイン（プロペプチド）切断（Ｎ−及びＣ−プロテイナーゼ）、微小線維（リジン／ヒドロキシリジン末端ＮＨ２酸化（Ｃｕ２＋含有リジルオキシダーゼ））を形成するコラーゲン分子の整合、及び最終原線維形成（還元性架橋形成及び架橋の成熟）を含む。原線維は未成熟であり、強度を欠く。これらの未成熟原線維は架橋され、徐々に成熟コラーゲン原線維を形成する。架橋は緩慢なプロセスであり、コラーゲンの引っ張り強度は線維の成長及び再編成を介して長期間にわたって着実に増加する。
【００７４】
プロペプチドの細胞外切断：大半のプロコラーゲン分子に関して、末端非コラーゲンドメイン（プロペプチド）は、細胞外空間へのそれらの放出後、Ｎ−及びＣ−プロコラーゲンペプチダーゼにより切断される。切断されたトロポコラーゲンは互いに架橋してコラーゲン線維または他の構造を形成する。
【００７５】
これらのプロペプチドの多くは、コラーゲンドメインとは異なる重要な機能を有する。例えば、コラーゲンＸＶＩＩＩ型から放出された断片であるエンドスタチンは、血管新生及び腫瘍成長を強く阻害する。
【００７６】
コラーゲン線維の形成：個々のトロポコラーゲン分子は、自然発生的に会合してコラーゲン原線維を形成する。これらはジグザグ状のパターンに配置された隣接したコラーゲン分子と規則的でオーバーラップする平行なアレイを形成し、それぞれが分子のおよそ４分の３の長さその隣にオーバーラップする。本明細書で使用されるとき、用語「トロポコラーゲン」は、Ｎ末端及びＣ末端プロペプチドが切断されるコラーゲンサブユニットを指す。
【００７７】
架橋：架橋は細胞外酵素のリジルオキシダーゼにより触媒される。このＣｕ２＋含有細胞外酵素は、コラーゲンにおけるリジル及びヒドロキシリジル残基のいくつかを酸化的に脱アミノ化する。生じる（アリシン及びヒドロキシアリシン）反応性アルデヒドは、隣のコラーゲン分子のリジルまたはヒドロキシリジル残基と縮合して共有結合性架橋を形成し、よってコラーゲン線維を成熟させ、次に、反応性アルデヒドはコラーゲン残基と組み合わさって架橋を形成する。
コラーゲンの分解
【００７８】
正常なコラーゲンは、高度に安定しており、数年もの半減期を有する。しかしながら、コラーゲンの分解は、形態形成及び成長を受けるあらゆる正常な組織の主要な構成要素である。結合組織は動的であり、例えば組織の損傷に応答して常に再構築される。このプロセスが厳密な制御下に置かれることが重要となる。コラーゲンの破壊は、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）という大きいファミリーの一部であるコラゲナーゼにより主に媒介される。コラゲナーゼは、３重らせん構造が一般的なプロテイナーゼの大半に耐性であるため、コラーゲンを特異的に加水分解するように進化した特殊な酵素である。例えば、コラーゲンＩの切断部位は限定されており、４分の３及び４分の１の長さの断片を生成する。これらの断片は、他のマトリックスプロテイナーゼにより、それらの成分のアミノ酸に分解される。
【００７９】
コラーゲンの生合成は、細胞及び組織特異的様式で、正常な発達及び恒常性の間に厳密に調節される。様々な成長因子及びサイトカインが、発達、炎症、創傷治癒、及び他の生理学的状態中のコラーゲン生産を調節することが示された（例えば、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−ベータ、ＦＧＦ、及びＩＧＦ、ＩＬ−１、ＩＦＮ−ガンマ、ＴＨＦ−アルファ、ならびにグルココルチコイド）。これらの翻訳後修飾酵素のいくつかは、多くの線維性疾患におけるコラーゲン蓄積を治療するための薬物の開発に魅力的な標的であり得る。
コラーゲン病
【００８０】
結合組織の主な構成成分として、コラーゲンタンパク質の欠損が中枢神経系から筋骨格及び心血管系まで、ヒトの身体の多くの系に影響を及ぼし得ることは回避できない。広範な疾患は、約２２のコラーゲン遺伝子において特定された１０００超の突然変異に起因する。これらの突然変異は、欠失、小さい挿入、ＲＮＡスプライシング突然変異、ナンセンス突然変異、及び／またはミスセンス突然変異を含む。コラーゲン疾患のいくつかの例としては、骨形成不全症、多くの軟骨異形成、エーラース・ダンロス症候群のいくつかの亜型、アルポート症候群、ベスレムミオパチー、表皮水疱症のある特定の亜型、ノブロック症候群、及び同様にいくつかの場合の骨粗鬆症、動脈瘤、変形性関節症、及び椎間板疾患が挙げられる（表１を参照）。更なるコラーゲン遺伝子における突然変異の特徴はおそらく更なる疾患をこのリストに追加する。
【００８１】
表１．コラーゲン及び疾患
【００８２】
【表１−１】
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【００８３】
【表１−２】
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【００８４】
【表１−３】
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【００８５】
【表１−４】
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【００８６】
【表１−５】
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【００８７】
コラーゲンポリペプチドをコードする遺伝子における遺伝子突然変異に起因するコラーゲン欠乏の疾患に加えて、多くの自己免疫障害は、血管疾患など、免疫系がコラーゲンに影響を及ぼすときに生じる。コラーゲン血管疾患は、強直性脊椎炎、皮膚筋炎、結節性多発動脈炎、乾癬性関節炎、関節リウマチ、強皮症、及び全身性エリテマトーデスを含むが、これらに限定されない。
【００８８】
更に、コラーゲン線維合成における多くの工程のうちのいずれか１つにおける欠損（例えば、コラーゲン修飾酵素欠損）は、コラーゲンが線維を適切に形成し、よって、コラーゲンにより通常提供される必要とされる引っ張り強度を有する組織を提供する能力がない遺伝性疾患をもたらす場合がある。
コラーゲンの医療用途
【００８９】
コラーゲンは医療分野において広く使用されている。コラーゲンの最も一般的な使用は、美容外科において、及び火傷患者における創傷治癒の補助としての使用である。コラーゲンは、重度の火傷の対応に使用される人工皮膚代替物の構築に使用され得る。コラーゲンは、骨の再構築として、ならびに多種多様な歯科、整形外科及び外科目的のために広く使用される。他の用途は、創傷包帯及び組織成長のためのマトリックスとしての使用を含む。
【００９０】
コラーゲンの生化学的な特徴のため、コラーゲンは、細胞培養（細胞付着のため、細胞の挙動及び細胞外環境との細胞相互作用の研究など）における用途、バリアフィルム／シートとして、コラーゲンヒドロゲル、コラーゲン−リポソーム、コラーゲンナノ粒子／ナノ球体などの薬物送達のため、及びコラーゲン錠剤／ペレット、生分解性材料、及び代替物など、多くの他の分野において使用されている。
【００９１】
コラーゲンの医療用途は、薬物送達のためのコラーゲンスポンジ（例えば、米国特許第３，１５７，５２４号、同第４，４１２，９４７号、及び同第５，５１２，３０１号を参照）；コラーゲンフィルム（例えば、米国特許第３，０１４，０２４号を参照）；コラーゲンヒドロゲル（例えば、米国特許第５，１０８，４２４号、同第５，２１３，７０１号を参照）；創傷治癒剤としてのコラーゲン（例えば、米国特許第３，８１０，４７３号、同第４，８４１，９６２号、同第４，８３７，２８５号、同第４，９２５，９２４号、同第５，０８１，１０６号、及び同第５，７６６，６３１号を参照）；コンタクトレンズの作製（例えば、米国特許第４，２６８，１３１号を参照）；コラーゲンナノ粒子（例えば、米国特許第５，９３２，２４５号及び第８，６６８，９２６号ならびに米国特許公開第２０１３０３２３３１１号を参照）；神経修復（例えば、米国特許公開第２０１１０２７６０６６号を参照）；軟骨修復、補綴、整形外科用グラフト、腱置き換え用インプラント、軟組織及び骨インプラントのためのインプラントなどの様々な目的のためのコラーゲンインプラント（例えば、米国特許第３，２７２，２０４号、同第４，４２４，２０８号、同第５，１７１，２７３号、同第５，５２３，２９１号、同第６，０８０，１９４号、同第７，５４４，２１２号、及び同第７，５９５，０６２号、ならびに米国特許公開第２００８０３０５５１７号、同第２０１０１０８９４５号、及び同第２０１１０２６４２３７号を参照）、治療及び診断用途のための修飾されたコラーゲン（例えば、米国特許第７，１８３，３８３号及び第８，２８３，４１４号ならびに米国特許公開第２０１３０１１６４０５号を参照）など、当該技術分野において広く論じられている。
コラーゲン生産
【００９２】
医療目的に使用されるコラーゲンの大半は、認証されたＢＳＥ（牛海綿状脳症）を有しないウシからのウシコラーゲンである。他に一般に使用されるものはブタ組織及びウマ組織を含む。いくつかの場合では、ヒト患者自身の脂肪、ヒアルロン酸、またはポリアクリルアミドゲルも使用される。ヒトコラーゲンは、ドナー屍体、胎盤、及び免疫反応の可能性が低い中絶胎児から抽出され得る。
【００９３】
多くの組換え技術は、組換えコラーゲンタンパク質を生産するために開発されてきた。生物工学により組換えコラーゲンタンパク質を生産するためのこれらの方法は当業者に周知である。いくつかの例示的な方法は、遺伝子導入動物の乳におけるヒト組換えコラーゲンの生産（例えば、米国特許第５，６６７，８３９号、同第５，８９５，８３３号、同第５，９６２，６４８号、及び同第６，１１１，１６５号を参照）、植物細胞における哺乳動物組換えコラーゲンの生産（例えば、米国特許第６，６１７，４３１号、同第７，２３２，８８６号を参照）、哺乳類細胞、昆虫、ならびに細菌及び酵母などの微生物における哺乳動物組換えコラーゲンの生産（例えば、米国特許第６，１５０，０８１号、同第７，９３２，３５３号、同第８，０８４，５７９号、同第８，１８８，２３０号、及び米国特許公開第２００２０１４２３９１号、同第２０１４０１０７０３６号を参照）、組換えキメラ３重らせんコラーゲンの生産（例えば、ＰＣＴ特許公開第ＷＯ２０１００７１９３８号を参照）、３つのα鎖ポリペプチドとの融合タンパク質（例えば、米国特許公開第２０１３０２３７４８６号を参照）、ならびに未変性コラーゲンタンパク質を発現させるための線維芽細胞の刺激（例えば、米国特許公開第２０１００２３９５５６号を参照）を含む。
コラーゲン関連疾患の動物モデル
【００９４】
遺伝子操作されたコラーゲン突然変異を有するマウスは、様々なコラーゲンの機能を定義するため、ならびにコラーゲンの関連疾患及び生理学的機能の多くの態様を研究するために有用であることを証明してきた。例えば、ＣＯＬ４Ａ３ノックアウトマウスは、アルポート症候群のモデルとして使用される（Ｃｏｓｇｒｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１９９６，１０，１４０３−１４１３）。
【００９５】
本発明によると、研究は、コラーゲンＩＶ含有組織から抽出されるか、または組換え方法により生産されるかのいずれかのコラーゲンＩＶを、静脈内または他の適切な送達経路により、アルポート症候群のマウスモデルに注射するように設計される。糸球体基底膜（ＧＢＭ）内へのコラーゲンＩＶ組み込み、ＧＢＭの組織学的な特徴、コラーゲンＩＶ受容体結合、他のＧＢＭ構成成分との相互作用、細胞遊走及び分化、ならびに／またはバイオマーカー測定などの他のコラーゲンＩＶ機能アッセイの網羅的分析は、アルポート様症候群を有するマウスにコラーゲンＩＶを投与した後に行われる。投与後、コラーゲンＩＶの置き換えで処置されたマウスは、血尿、蛋白尿、アルブミン対クレアチニン比、または推定糸球体濾過量の尿分析など、腎機能に関して分析される。
コラーゲンＩＶ
【００９６】
コラーゲンＩＶは、細胞外基底膜に見られる最も豊富なタンパク質である。ＣＯＬ４Ａ１からＣＯＬ４Ａ６までの６つの遺伝子によりコードされるα１〜α６の６つの遺伝学的に異なるコラーゲンＩＶ  α鎖が存在し、これらは組織化されて３つの異なるヘテロ三量体（プロトマーと称される）：α１−α１−α２、α３−α４−α５、及びα５−α５−α６を形成する。各α鎖ポリペプチドのアミノ酸配列は、それらのＵｎｉＰｒｏｔ受入番号を含む表２に列記される（２つ以上のイソ型が既知である場合、イソ型１が示される）。代表的な配列が実質的に各ポリペプチドを変更しない任意のバリアント及び誘導体も含むことを当業者は理解する。各コラーゲンＩＶアルファ鎖は、３つのドメイン：７Ｓドメイン（小さい非コラーゲンＮ末端ドメイン）、中間領域における主なコラーゲンドメイン（約１４００個のアミノ酸残基）、及びＮＣ１ドメイン（Ｃ末端ドメインを構成する非コラーゲン球状ドメイン（約２３０個の残基））に分類され得る。
【００９７】
全てのコラーゲン鎖のように、コラーゲンＩＶ鎖のコラーゲンドメインは、多くのＧｌｙ−Ｘ−Ｙアミノ酸三塩基反復を含有し、プロリン及びヒドロキシプロリンは頻繁に、位置Ｘ及びＹに位置する。３番目毎のアミノ酸としてのグリシンの存在も、コラーゲンタンパク質の３重らせんの中央に収まるのに十分に小さい唯一のアミノ酸であるため、必須である。しかしながら、骨及び軟骨の原線維形成コラーゲンとは異なり、コラーゲンＩＶのＧｌｙ−Ｘ−Ｙ反復領域は、複数の中断を示し（すなわち、約２０の短い非コラーゲン配列）、コラーゲンＩＶプロトマー及びそれが基底膜に形成されるネットワークに柔軟性を付与する。
【００９８】
コラーゲンＩＶプロトマーの３本のα鎖は、７Ｓ及び主なコラーゲンドメインにおいて３重らせん体に編成されるが、ＮＣ１ドメインにおいて、各鎖は球状構造に折り畳まれ、鎖内ジスルフィド結合により安定化される。ヘテロ三量体の組織化中に、ＮＣ１ドメインは３本のα鎖間の分子相互作用を開始し、そしてプロトマーの三量体化、次いでＣ末端側からジッパー様形式に進み、完全に組織化されたプロトマーをもたらす。２つのコラーゲンＩＶプロトマーは、ＮＣ１六量体を形成するそれらのＣ末端ＮＣ１ドメインを通して端−端二量体を形成し、次に、４つのプロトマーがＮ末端７Ｓドメインの十二量体相互作用を通して四量体を形成し、複雑なコラーゲンＩＶネットワークに重合される。これらは、隣接する３重らせんプロトマーの界面でメチオニン及びヒドロキシリジン残基を架橋する通常とは異なる共有結合スルフィルイミン（Ｓ＝Ｎ）化学結合であるジスルフィド結合、及びリジルオキシダーゼ媒介架橋を介して過度に連結される（Ｂｏｒｚａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，２０１４，１１１（１），３３１−３３６）。
【００９９】
コラーゲン型の中でも、コラーゲンＩＶは、独自にスルフィルイミン結合（Ｓ＝Ｎ）を含有し（Ｆｉｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１４，１１１（１），３３１−３３６）、このスルフィルイミン結合は細胞外マトリックス関連ペルオキシダーゼであるペルオキシダジンにより触媒される。スルフイミン結合は、三量体ＮＣ１ドメインの対の間に位置し、コラーゲンＩＶネットワークの形成を促進する（Ｖａｎａｃｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００９，３２５，１２３０−１２３４）。ヒトにおいて、ペルオキシダジンは、内皮において最も高度に発現される。
【０１００】
表２．コラーゲンＩＶ  α鎖及び配列
【０１０１】
【表２−１】
2017532365.tif 000008
【０１０２】
【表２−２】
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【０１０３】
【表２−３】
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【０１０４】
【表２−４】
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【０１０５】
【表２−５】
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【０１０６】
【表２−６】
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【０１０７】
【表２−７】
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【０１０８】
【表２−８】
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【０１０９】
【表２−９】
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【０１１０】
【表２−１０】
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【０１１１】
【表２−１１】
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【０１１２】
翻訳後修飾
他のコラーゲン型に類似して、コラーゲンＩＶ分子は、分泌前に広範な翻訳後修飾を受け、この修飾は、適切なプロリン及びリジン残基のヒドロキシル化、及びある特定のヒドロキシリジン残基の、ガラクトシルヒドロキシリジン及びグルコシルガラクトシルヒドロキシリジンへのグリコシル化からなる（Ｂｏｒｎｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｓａｇｅ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８０，４９，９５７−１００４において概説される）。コラーゲンＩＶ分子は、アスパラギン連結オリゴ糖側鎖の付加によっても修飾され得る（Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１及びＫｕｒｋｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２）。コラーゲンＩＶにおける細胞内修飾の程度は、全てのコラーゲン型の中で最も高い。コラーゲンＩＶの異常な修飾は、コラーゲンＩＶの分泌に影響を及ぼす場合がある（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，１９８９，２６４，１５５５６−１５５６４）。
【０１１３】
コラーゲンＩＶ修飾に必要な酵素は、プロリル−４ヒドロキシラーゼ、プロリル−３−ヒドロキシラーゼ、リジルヒドロキシラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、グルコシルガラクトシルトランスフェラーゼ、及びアスパラギン連結グルコシル化機構を含む。修飾の程度におけるバリアントは、コラーゲンＩＶ分子の同じ型内で、異なる組織から、または更には多くの生理学的及び病理学的状態における同じ組織からも見出すことができる（Ｋｉｖｉｒｉｋｋｏ  ａｎｄ  Ｍｙｌｌｙｌａ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９８２，８２，２４５−３０４）。
【０１１４】
適切に修飾されたコラーゲンＩＶは、細胞分化（Ｆ９幹細胞など）に重要である（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，１９８９，２６４，１５５５６−１５５６４）。
【０１１５】
コラーゲンＩＶにおける３−ヒドロキシプロリンの範囲は、１０００個のアミノ酸当たり６〜１６個の３−ヒドロキシプロリン残基（すなわち、約０．３％〜１．６％）であると推定される。コラーゲンＩＶにおける４−ヒドロキシプロリンの範囲は、１０００個のアミノ酸当たり６５〜１４０個の４−ヒドロキシプロリン残基（すなわち、約６．５〜１４％）であると推定される（例えば、Ｐｏｋｉｄｙｓｈｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１４，１１１（１），１６１−１６６、Ｔｉａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００８，２８３（２８），１９４３２−１９４３９、Ｐｒｉｃｅ  ａｎｄ  Ｓｐｉｒｏ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，１９７７，２５２（２３），８６９７−９６０２、及びＳｃｈｕｐｐｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．１９８４，２２０（１），２２７−２３３を参照）。４−ヒドロキシプロリン（４Ｈｙｐ）、３−ヒドロキシプロリン（３Ｈｙｐ）、及びヒドロキシリジン残基の含有量はコラーゲンＩＶの特徴に影響を及ぼす可能性がある。４−ヒドロキシプロリン残基が水架橋分子内水素結合を通してコラーゲン３重らせんを安定させることは十分に確立されている（Ｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９７３，５２，１１５−１２０）。しかしながら、３−ヒドロキシプロリン残基は４−ヒドロキシプロリン残基と比較したとき、大幅に少ない。コラーゲンＩ型及びＩＩ型において、３Ｈｙｐの１〜２個の残基のみが１鎖当たり生じ、コラーゲンＶ型及びＸＩ型において、３〜６個の残基が１鎖当たり生じる。含有量は全ヒドロキシプロリンの１０％が３Ｈｙｐであり得る基底膜のＩＶ型コラーゲンにおいて最も高い（Ｇｒｙｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９７５，２５０，２４７０−２４７４）。３Ｈｙｐ残基が３重らせん間水素結合を通してコラーゲン３重らせん体の微調整に関与している可能性があることも推測される。コラーゲンＩＶにおける十分な３−ヒドロキシプロリン化は血小板の凝集を減少させ得る。
基底膜（ＢＭ）
【０１１６】
コラーゲンＩＶの非線維状組織化は、ラミニン、ナイドジェン、及びパールカンのサブタイプ、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（Ｂｒｅｉｔｋｒｅｕｔｚ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ  Ｉｎｔ，２０１３，ｅ１７９７８４）を含む他のマトリックス分子と共に薄いシートのような基底膜を形成するための、ならびに細胞付着のための足場として機能する。コラーゲンＩＶ  α３−α４−α５は、主に、腎臓、内耳、及び眼の基底膜に見られる。コラーゲンＩＶ  α１−α１−α２は、ある特定の組織の基底膜の主な巨大分子である。
【０１１７】
基底膜の主な構造要素として、ラミニン及びコラーゲンＩＶは、モノーまたはオリゴマーナイドジェン及びパールカンにより非共有結合的に相互接続となる異なるネットワークを形成する。コラーゲンＩＶ分子は、それらの非コラーゲンＣ及び球状Ｎ末端を介してジスルフィド架橋により共有結合的に連結され、ＢＭの機械的強度を主に決定する高化学耐性の非常に安定した「金網」のような網目構造をもたらす。構造的な特徴に加えて、基底膜は、細胞挙動、組織の区分化、組織のリモデリング、及び形態形成の重要な調節因子でもある。基底膜は、皮膚、筋肉、眼、血管、神経組織、及び腎臓内の細胞外マトリックスに広く分布される。
【０１１８】
コラーゲンＩＶは、主に、環境影響に対するバリアを形成する皮膚の基底膜（ＢＭ）において見られる。皮膚において、コラーゲンＩＶは、表皮ケラチノサイト及び真皮線維芽細胞の両方により合成される。表皮基底膜において、コラーゲンＩＶ  α１−α２−α２及びコラーゲンＩＶ  α５−α５−α６ヘテロ三量体のみが見られる（Ｈａｓｅｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｈｉｓｔｏｌ．Ｃｙｔｏｌ．２００７，７０，２５５−２６５）。ＣＯＬ４Ａ１及びＣＯＬ４Ａ２の不活性化も生命を脅かすが、妊娠の後期段階でのみである。
【０１１９】
コラーゲンＩＶは、神経血管束及び他の歯周組織細胞の基底膜においても見られる。歯肉の脈管構造の弾性系を維持する役割も担う。例えば、内皮細胞は血管新生のためにコラーゲンＩＶを発現する。
【０１２０】
糸球体基底膜（ＧＢＭ）：腎臓において、ＧＢＭは、内皮細胞及び有足細胞（独特な上皮細胞）の２つの細胞構成成分間に位置する糸球体濾過関門（ＧＦＢ）の中心の非細胞層である。ＧＢＭは、主に、内皮細胞及び有足細胞により分泌される、ラミニン−５２１、コラーゲンＩＶ  α３−α４−α５、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（主にアグリン）、及びナイドジェンの４つの細胞外マトリックス巨大分子から構成される。ＧＢＭにおけるこれらの細胞外マトリックスタンパク質は、サイズ及び電荷の両方の選択特性を付与すると考えられる織り合わされた網目構造を生産する。
【０１２１】
哺乳類の腎臓発達中、発達しているＧＢＭに存在するコラーゲンＩＶの胚形態であるコラーゲンＩＶ  α１−α１−α２は一般に、コラーゲンＩＶ  α３−α４−α５により成人の成熟ＧＢＭにおいて置き換えられる。このイソ型置換は、ＧＢＭにおけるラミニン鎖の遷移と同時に生じる。α３−α４−α５  ＩＶ型コラーゲンは、α１−α１−α２  ＩＶ型コラーゲンネットワークと比較して、より過度に架橋された、及びよりプロテアーゼ耐性のネットワークをもたらすため、コラーゲンＩＶ遷移は、成人における血圧の増加に対処するために必要とされる可能性があると仮定される。
【０１２２】
顕微鏡技術（例えばＳＴＯＲＭ）の向上による最近の研究は、ＧＢＭの微細構造及び腎臓ＧＢＭにおけるコラーゲンＩＶのタンパク質の分布を解明した。ＧＢＭのコラーゲンＩＶ（α３−α４−α５）は有足細胞によりのみ分泌され（Ａｂｒａｈａｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ，２００９，２０，１４７１−１４７９及びＡｂｒａｈａｎｓｏｎ  ＤＲ，Ｓｅｍｉｎ  Ｎｅｐｈｒｏｌ，２０１２，３２（４），３４２−３４９）、このコラーゲンＩＶは最終的には、有足細胞から離れてＧＢＭの中央に位置し（Ｓｕｌｅｉｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｌｉｆｅ，２０１３，ｅ０１１４９）、ＧＢＭが有足細胞からＧＢＭの中央へのコラーゲンＩＶプロトマーの遊走に透過性であることを示唆する。内皮窓は約１００〜１５０ｎｍであり、約１２ｎｍの直径を有する棒のようなヘテロ三量体であるコラーゲンＩＶプロトマーなどの大きいタンパク質の輸送を促進するのに十分に大きい。他の研究は、ＧＢＭがフェリチン及び大きい抗原−抗体複合体などの４００ｋＤａよりも大きい他の大きい分子に透過性であることを更に示した（Ｆａｒｑｕｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．，１９６１，１１３，４７−６６、Ｖｏｇｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．１９８２，２２（１）：２７−３５、及びＦｕｊｉｇａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  ｐａｔｈｏｌ．，１９９３，１４２（３），８３１−８４２）。しかしながら、外因性コラーゲンタンパク質（組換えコラーゲンＩＶ分子など）がインビボ送達を介して腎臓のＧＢＭに良好に輸送され得るという証拠は報告されていない。更に、このような外因性コラーゲンＩＶ分子がＧＢＭに組み込まれ、ＧＢＭの他の構成成分と正しい基底ネットワークを形成できることは予想外である。したがって、本発明は、組換えコラーゲンＩＶタンパク質、特にコラーゲンＩＶプロトマー、二量体、四量体、または多量体を、コラーゲンＩＶの欠乏により損なわれるＧＢＭに全身または局所送達を介して投与する。次いで、コラーゲンＩＶプロトマー、二量体、四量体、または多量体は、欠損ＧＢＭ内に埋め込まれ、腎臓のＧＢＭにおける正常なマトリックスタンパク質を回復する。
【０１２３】
ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ４Ａ４、及び／またはＣＯＬ４Ａ５遺伝子における突然変異に起因する、α３−α４−α５  ＩＶ型コラーゲンネットワークの不在などのコラーゲンＩＶの欠乏は基底膜（例えばＧＢＭ）を損なうことが多く、アルポート症候群、ならびに後天性表皮水疱症などのいくつかのリウマチ性疾患及び皮膚病、ならびに糖尿病における腎症及び網膜症の血管合併症を含む多くの疾患をもたらす。同様に、ＧＢＭの他の構成成分（例えば、ラミニン及びアグリン）の欠乏は、基底膜を損なう場合があり、ネフローゼ疾患をもたらす。例えば、ラミニンベータ２遺伝子（ＬＡＭＢ２）における突然変異は、ネフローゼ症候群及びびまん性メサンギウム硬化症からの腎不全によって特徴付けられる稀な常染色体劣性疾患であるピアソン症候群をもたらす（Ｂｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．，２０１４，２３３（１），１８−２６）。ラミニンβ２は、成熟ＧＢＭにおいて主要なラミニンヘテロ三量体である、ヘテロ三量体ＬＡＭ−５２１（α５β２γ１）の３本の鎖のうちの１本である。
アルポート症候群（ＡＳ）
【０１２４】
アルポート症候群は、糸球体腎炎に起因する進行性腎不全をもたらす糸球体基底膜の遺伝性障害である。アルポート症候群は典型的には、聴力損失及び眼機能不全と関連し得る血尿または蛋白尿として幼少期に生じ、この疾患は成人期に腎不全（腎疾患の末期（ＥＳＲＤ）など）に徐々に進行する。患者の腎臓の腎生検検査は、コラーゲンＩＶアルファ鎖の不在、ならびにＧＢＭの病理学的変化を確認する。聴力損失及びＥＳＲＤはほぼ一致して進行し、各症状の段階の時期は遺伝子型−表現型相関関係ごとにわずかに変動する（例えば、Ｋａｓｈｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔ．，１９９９，７８，１０３５−１０４４を参照）。一部の患者において、聴力損失は腎病理と関連する。Ｂｕｒｋｅら（Ｂｕｒｋｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｏｐｈｔｈａｌ．，１９９１，６９：５５５−５５７）は、アルポート症候群における両側性角膜上皮びらんを説明した。患者は感音性聴力損失を発症する場合がある。
【０１２５】
眼異常は一部のアルポート症候群患者において観察された。典型的な眼関連は、およそ８５％の罹患成人男性に生じる点及び斑点網膜症（ｄｏｔ−ａｎｄ−ｆｌｅｃｋ  ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）、およそ２５％に生じる前部円錐水晶体、及び後部多形性角膜ジストロフィーである。Ｇｏｖａｎらは、アルポート症候群における特徴的な眼部所見としてその前部円錐水晶体（水晶体の異常な形状）ならびに筋肉及び中周辺網膜における網膜の斑点を説明した（Ｇｏｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌ．，１９８３，６７：４９３−５０３）。眼の症状はアルポート症候群のＸ連鎖性及び常染色体形態において同じである。これらの異常はコラーゲンＩＶ分子における欠損と相関する。
【０１２６】
アルポート症候群の診断である腎臓生検の微細構造の特徴は、（ｉ）糸球体基底膜（ＧＢＭ）の不規則な肥厚化及び菲薄化、（ｉｉ）ＧＢＭの分裂または薄層形成、（ｉｉｉ）ＧＢＭの「バスケット織り」、ならびに（ｉｖ）異常なＧＢＭの領域における足突起融合からなる。更に、アルポート症候群における早期微細構造の所見は、時折、女児または女性が菲薄基底膜腎症（ＴＢＭＮ）と誤診されるＧＢＭのびまん性菲薄化である。コラーゲンＩＶ  α３、α４、及びα５鎖は、アルポート症候群の患者のＧＢＭから生化学的に不在である。
【０１２７】
アルポート症候群において、ＧＢＭ胚性コラーゲン  ＩＶ  α１−α１−α２は存在し続け、疾患の進行を遅延すると考えられるが、ＧＢＭにおけるこれらの胎児イソ型の異常な持続は、コラゲナーゼ及びカテプシンによるタンパク質分解攻撃に対する感受性の増加を生じさせると仮定される。コラーゲンＩＶ  α３−α４−α５は、六量体のより硬いジスルフィドネットワークを形成し、糸球体濾過の部位でタンパク質分解性の分解に対してより耐性である。アルポート症候群患者からのＧＢＭにおけるこれらの潜在的に保護的なコラーゲンＩＶイソ型の不在は、進行する基底膜の分裂、及びこれらの患者における腎臓悪化としての損傷の増加を説明し得る。
【０１２８】
アルポート症候群は、遺伝学的に異質性であり、コラーゲンＩＶのα３、α４、またはα５鎖をコードする遺子（ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ４Ａ４、及び／またはＣＯＬ４Ａ５）における突然変異に起因する。ＣＯＬ４Ａ３及びＣＯＬ４Ａ４における突然変異は、〜１５％のアルポート症候群を占める常染色体劣性アルポート症候群の原因となり、一方、ＣＯＬ４Ａ５突然変異は残りの８５％を占めるＸ連鎖性アルポート症候群の原因となる。常染色体優性遺伝は稀である。アルポート症候群の原因となるＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ４Ａ４、及びＣＯＬ４Ａ５における突然変異のいくつかの例は表３に列記される。ＣＯＬ４Ａ５における更なる突然変異はＣＯＬ４Ａ５データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｒｕｐ．ｕｔａｈ．ｅｄｕ／ｄａｔａｂａｓｅ／ＡＬＰＯＲＴ／ＡＬＰＯＲＴ＿ｄｉｓｐｌａｙ．ｐｈｐ）に見出すことができる。
【０１２９】
他の家族成員における腎不全のリスクを適切に評価するために、Ｘ連鎖性と常染色体劣性遺伝とを区別することが重要である。常染色体劣性遺伝は、疾患が単一世代で生じ、女性及び男性の個人が等しい頻度かつ重度で罹患する。分子検査は臨床診断を確認するために採用されることが多い。
【０１３０】
アルポート症候群は、ＣＯＬ４Ａ５遺伝子を伴う遺伝子欠失に起因する２つの他の障害：アルポート症候群及び平滑筋腫症、ならびにアルポート症候群、精神遅滞、顔面中部低形成、及び楕円赤血球症の特徴でもある。
【０１３１】
Ｘ連鎖性アルポート症候群（ＸＬＡＳ）：８５パーセントのアルポート症候群は、コラーゲンＩＶのα５鎖をコードするＸ連結性のＣＯＬ４Ａ５遺伝子における突然変異から生じ、血尿、眼異常、及び高調感音性聴力損失と関連する。ほぼ全ての罹患している男性が早ければ１０代に末期腎疾患（ＥＳＲＤ）をもたらす腎機能の減少を有する。罹患している女性もネフローゼ症候群、腎機能の減少、及びＥＳＲＤを発症する危険性がある。一時的な黄斑菲薄化（ｍａｃｕｌａｒ  ｔｈｉｎｎｉｎｇ）もＸＬＡＳと関連する（Ａｈｍｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＡＭＡ  ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２０１３，１３１（６），７７７−７８２）。
【０１３２】
ＧＢＭの層状構造は通常、ＸＬＡＳの男性に起こる。ＧＢＭは、最初は、男児において菲薄化するが、経時的に更に広範囲に及ぶ限局性層状構造がある。
【０１３３】
コラーゲンＩＶのα３、α４、及びα５鎖の免疫染色は、本質的にＸＬＡＳの全ての男性において、ＧＢＭ、遠位尿細管基底膜（ｄＴＢＭ）、及びボーマン嚢におけるこれらのコラーゲン鎖の完全な不在を示し、一方で、ＸＬＡＳのヘテロ接合保有者である女性は、可変なＸ染色体不活性化による部分的または「モザイク状の」不在を示す。これらの免疫組織学的な特徴は、ＸＬＡＳを常染色体劣性ＡＳ（ＡＲＡＳ）と区別するのに役立ち、免疫染色によるコラーゲンＩＶのα５鎖の発現は、ＧＢＭにおいて陰性であるが、ｄＴＢＭ及びボーマン嚢において陽性である。皮膚の上皮膜もα５（ＩＶ）鎖を有しない。
【０１３４】
突然変異は、Ｘ連鎖性アルポート症候群の各ファミリーにおいて異なり、７００を超えるバリアントが記載されている（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｒｅｎａｄａ．ｌｕｍｃ．ｎｌ／ＬＯＶＤ２／ＣＯＬ４Ａ／ｈｏｍｅ．ｐｈｐ？ｓｅｌｅｃｔ＿ｄｂ＝ＣＯＬ４Ａ５）。約５０％は直接または下流のいずれかで終止コドンをもたらし、４０％の突然変異がミスセンスである。大きい欠失／挿入、再配置、ナンセンス突然変異、及び他の遺伝子変化も報告されている。特定された突然変異のいくつかの例は、ミスセンス突然変異（Ｇ１２３Ｅ，Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐ．２０１４，４１９６，３６３１−３６３５）；Ｇ１２０５Ｖ）、ナンセンス突然変異（Ｑ３７９Ｘ）、ＣＯＬ４Ａ５のコラーゲンドメインにおけるミスセンス突然変異、ハイポモルフ突然変異（Ｇ６２４Ｄ、Ｐ６２８Ｌ；Ｐｉｅｒｉｄｅｓ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｉｐｐｏｋｒａｔｉａ，２０１３，１７（３），２０７−２１３）、ＣＯＬ４Ａ５遺伝子における複合体欠失／挿入突然変異（ｃ．３５９＿３６３ｄｅｌＧＴＡＴＴｉｎｓＡＴＡＣ）（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，２０１３，５１２（２），４８２−４８５）、スプライス部位での突然変異、及びＣＯＬ４Ａ５遺伝子における深部イントロン（  ｄｅｅｐ  ｉｎｔｒｏｎｉｃ）突然変異（Ｋｉｎｇ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔ．２００２，１１１，５４８−５５４）を含む。
【０１３５】
常染色体劣性アルポート症候群（ＡＲＡＳ）：約１５パーセントのアルポート症候群は、ＣＯＬ４Ａ３またはＣＯＬ４Ａ４遺伝子の両複製物（トランスで）における常染色体劣性ホモ接合または化合物ヘテロ接合突然変異から生じる（Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９４，８，７７−８１）。ＣＯＬ４Ａ３またはＣＯＬ４Ａ４遺伝子における突然変異は、ミスセンス変化、フレームシフト変化、小さい欠失／挿入、重複、イントロンバリアント、スプライシング突然変異、及びナンセンス突然変異を含む。
【０１３６】
表３．コラーゲンＩＶ突然変異及びアルポート症候群の例
【０１３７】
【表３】
2017532365.tif 000019
【０１３８】
常染色体優性アルポート症候群：ヘテロ接合ＣＯＬ４Ａ３またはＣＯＬ４Ａ４バリアントから生じる常染色体優性遺伝は非常に稀である（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌｏｏｐ  ＦＴ  ｅｔ  ａｌ．，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．，２０００，５８，１８７０−１８７５．）。
アルポート症候群の現在の治療
【０１３９】
アルポート症候群に利用可能な満足のいく治癒的な治療はない。末期腎不全（ＥＳＲＤ）を発症する患者は、血液透析により、及び腎臓移植によっても治療される。しかしながら、約５％の移植を受けた男性がアルポート移植後抗ＧＢＭ腎炎を発症し、移植した腎臓を失う。多くの研究は、腎不全の発症を緩徐化または予防できる新規治療の開発に焦点を当ててきた。
【０１４０】
現時点のアルポート症候群患者の治療は、主に、シクロスポリンによるカルシニューリン阻害を含む蛋白尿（例えば、Ｓｉｇｍｕｎｄｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｕｒｏｌ  Ｎｅｐｈｒｏｌ，２００６，４０，５２２−５２５を参照）、ならびにアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、アンギオテンシン受容体遮断薬（ＡＲＢ）、及びアルドステロン阻害剤によるレニン−アンギオテンシンアルドステロン系（ＲＡＡＳ）の遮断を含む蛋白尿に対処する。最近の証拠は、腎置き換え療法及びＥＳＲＤの開始時期を大幅に遅らせることができることを示した（例えば、Ｎｏｏｎｅ  ａｎｄ  Ｌｉｃｈｔ，Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．２０１３，２８，１０２５−１０３６を参照）。
【０１４１】
アルポート症候群患者を治療するために使用されてきたＡＣＥ阻害剤は、エナラプリル、ホシノプリル、リシノプリル、キナプリルを含むが、これらに限定されない。ＡＣＥ阻害剤は、大半の個人に比較的よく忍容される。それでも、これらは副作用がないわけではなく、一部の患者はＡＣＥ阻害剤を使用するべきではない。最も一般的な副作用は、咳、血中カリウムレベルの上昇、低血圧、めまい、頭痛、眠気、脱力感、味覚異常（金属味または塩味）、及び発疹である。稀だが、ＡＣＥ阻害剤の最も重篤な副作用は、腎不全、アレルギー反応、白血球の減少、及び組織の腫脹（血管浮腫）である。
【０１４２】
アルポート症候群患者を治療するために使用されてきたＡＲＢは、ロサルタン及びカンデサルタンを含むが、これらに限定されない。
【０１４３】
アルポートマウスモデルにおけるいくつかの研究は、バソペプチダーゼ阻害剤（例えばＡＶＥ６８８）及び３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素（ＨＭＧ−ＣｏＡ）レダクターゼ阻害剤がＣＯＬ４Ａ３−／−マウスにおいて大幅な改善を示したことを示唆する（Ｋａｔａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ  ｆｏｒ  ａ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ａｌｐｏｒｔ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｕｓｉｎｇ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌｓ，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｎｅｐｈｒｏｌ，２０１４，３（４）：２３０−２３６により概説される）。
【０１４４】
病的蛋白尿の下流作用は、近位尿細管上皮細胞（ＰＴＥＣ）の完全な活性化と共に、炎症及び線維症を介して尿細管間質伝播をもたらすことが多いため、これらのプロセスを阻害しようとする治療戦略は、上述の抗蛋白尿療法と組み合わせて、アルポート症候群における疾患の進行を制限するためにも採用される。これらの治療は、ＣＣＲ１（ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体１）拮抗薬（例えばＢＸ４７１）などのケモカイン受容体拮抗薬を含み得る。
【０１４５】
研究者は、アルポート症候群の新規治療の開発に焦点を当ててきた。このような新しい治療は、遺伝子療法（例えばＴｒｙｇｇｖａｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ．，１９９７，５１，１４９３−１４９９による概説を参照）、マクロＲＮＡ調節（例えば、米国特許公開第２０１４０１００２６３号、Ｇｏｍｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉ−ｍｉｃｒｏＲＮＡ−２１  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｐｒｅｖｅｎｔ  Ａｌｐｏｒｔ  ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｐａｔｈｗａｙｓ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２０１５，１２５（１）：１４１−１５６を参照）、幹細胞（例えば、米国特許公開第２００９０２１４４８８号を参照）、コラーゲンメタロプロテアーゼ阻害剤（例えば、米国特許公開第２００８０１８７５０８号、同第２００９０３１８５１１号、同第２０１１０１１２０７６号、及び同第２０１１００１４１８６号を参照）、ＲＡＣ１／ＣＤＣ４２阻害剤などの標的療法（例えば、ＰＣＴ特許公開第２０１４０２８０５９号を参照）、及びコラーゲンＩＶ受容体インテグリン阻害剤（例えば、米国特許第６，４９２，３２５号を参照）を含み、これらのそれぞれの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０１４６】
最も最近では、細胞または遺伝子のいずれかに基づく療法により、ＧＢＭにおいて正常なコラーゲンα３−α４−α５（ＩＶ）ネットワークを回復するための戦略が提案されている（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  ｎｅｐｈｒｏｌ．，２０１４，２５（４），６８７−６９２）。
コラーゲンＩＶ及び他の疾患
【０１４７】
最近の研究は、コラーゲンＩＶタンパク質の欠乏が多くの他の疾患と関連することを示した。ＣＯＬ４Ａ１における突然変異は、周産期脳出血及び孔脳症（Ｇｏｕｌｄ  ＤＢ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００５，３０８（５７２５），１１６７−１１７１）ならびに筋眼脳症（ＭＥＢ）及びウォーカー・ワールブルク症候群（ＷＷＳ）（Ｌａｂｅｌｌｅ−Ｄｕｍａｉｓ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌｏｓ  Ｇｅｎｅｔ．２０１１，７（５），ｅ１００２０６２）を引き起こす。ＭＥＢ／ＷＷＳは、眼異形成、神経細胞移動欠損、及び先天性筋ジストロフィーによって特徴付けられる常染色体劣性疾患のスペクトルに属する。
【０１４８】
ＣＯＬ４Ａ２における突然変異は、脳内出血及び白質脳症（出血性卒中）（Ｇｕｎｄａ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ．，２０１４，２６１（３），５００−５０３）ならびに家族性孔脳症及び小血管疾患（Ｖｅｒｂｅｅｋ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．  Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，２０１２，２０（８），８４４−８５１）を引き起こす。ＣＯＬ４Ａ５及びＣＯＬ４Ａ６における突然変異は、食道平滑筋腫症を伴うアルポート症候群を引き起こす。
【０１４９】
機能性コラーゲンＩＶタンパク質、特にα３、α４、及びα５鎖におけるいくつかの欠損は、限定されないが、菲薄基底膜を伴う家族性顕微鏡的血尿、顕微鏡的血尿、菲薄基底膜腎症（ＴＢＭＮ）、ネフローゼ域の蛋白尿、進行性腎不全、糸球体性血尿、重度または軽度の蛋白尿、及び糖尿病性腎症（ＤＮ）とも関連し得る。
【０１５０】
グッドパスチャー症候群と呼ばれる稀な自己免疫腎疾患（抗糸球体基底抗体疾患としても知られる）は、α３（ＩＶ）鎖のＮＣ１ドメインに対する自己抗体により媒介される。自己抗体の結合は通常、迅速な進行性糸球体腎炎を引き起こす（Ｏｌａｒｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１３，１９０，１４２４−１４３２）。
【０１５１】
ＧＢＭにおけるコラーゲンＩＶの重要な役割及び様々な疾患とのその密接な関連は、疾患を治療するためのコラーゲンＩＶを使用する可能性を提起する。例えば、米国特許第７，１８３，３８３号は、腎上皮細胞傷害（例えば、毒素誘導傷害、及び薬物誘導傷害）後の細胞機能（例えば、Ｎａ＋／Ｋ＋  ＡＴＰａｓｅ活性、酸素消費、及び基底膜へのインテグリン局在化）を回復させるためのコラーゲンＩＶタンパク質の使用を開示している。この方法は、傷害細胞を有効量のコラーゲンＩＶタンパク質と直接接触させる工程を含む。
ネフローゼＧＢＭの透過性
【０１５２】
更なる研究は、ネフローゼＧＢＭが正常なＧＢＭよりも大きい分子により透過性であることを示す（Ｆａｒｑｕｈａｒ  ａｎｄ  Ｐａｌａｄｅ，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．，１０６１，１１４，６９９−７１６）。例えば、ある研究（Ｓｃｈｎｅｅｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．，１９７４，１３９（５），１２８３−１３０２）は、血液中のガンマグロブリン、注射された西洋ワサビペルオキシダーゼ及びカタラーゼ（約２４０ｋＤａ）、ならびにフェリチン（４８０ｋＤａ）が自己免疫複合体（ＡＩＣ）腎炎のラットモデルにおいて腎糸球体内に浸透できることを示した。フジガキは、フェリチン抗フェリチン免疫複合体が腎炎ラットのＧＢＭを移動できることも示した（Ｆｕｊｉｇａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  ｐａｔｈｏｌ．，１９９３，１４２（３），８３１−８４２）。浸透したフェリチンがＧＢＭに約３日間保持され得ることも更に示される。ＧＢＭの透過性の増加は、ＧＢＭを通した大きい分子の浸透を強化し得る。コラーゲンＩＶ（α３−α４−α５）プロトマーは約４８０ＫＤａであり、このサイズくらいの分子はアルポート症候群における障害性ＧＢＭなどのネフローゼＧＢＭに容易に侵入することができると考えられる。本発明によると、組換えコラーゲンＩＶ分子は、アルポート症候群と等しい欠損ＧＢＭを有する患者に全身または局所送達される。組換えコラーゲンＩＶは、それらが正しいネットワークを形成し、ＧＢＭの他の構成成分と相互作用するＧＢＭに輸送され、腎臓におけるＧＢＭの構造及び実質的にＧＢＭの濾過機能を回復させることができる。
【０１５３】
本明細書に論じられるように、本発明は、組換えコラーゲンＩＶタンパク質を身体、特に腎臓の糸球体基底膜に再び戻すことにより、１つ以上のコラーゲンＩＶ欠乏によって特徴付けられる疾患を治療するための方法を提供する。コラーゲンＩＶの置き換えは、罹患したＧＢＭに埋め込まれ、それらの機能を回復させる。特に、本発明は、α３（ＩＶ）、α４（ＩＶ）、及びα５（ＩＶ）鎖ポリペプチドをコードするＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ４Ａ４、及びＣＯＬ４Ａ５遺伝子における突然変異によって引き起こされるアルポート症候群に関する。本発明の文脈において、組換えコラーゲンＩＶタンパク質は、プロトマー、二量体、四量体、及び多量体、ならびにこれらの混合物であり得る。本発明によるコラーゲンＩＶプロトマーは、主に糸球体基底膜に見られるヘテロ三量体である、コラーゲンＩＶ  α３−α４  −α５のヘテロ三量体である。加えて、コラーゲンＩＶプロトマーは、キメラα３（ＩＶ）、α４（ＩＶ）、及びα５（ＩＶ）鎖のヘテロ三量体であり得、これらの鎖のそれぞれにおけるＮＣ１ドメインの全てまたは一部が、α１（ＩＶ）及びα２（ＩＶ）鎖のＮＣ１ドメインの全てまたは一部に置き換えられる。
【０１５４】
いくつかの態様では、本発明の組換えコラーゲンＩＶタンパク質は、他の好適な賦形剤と共に薬学的組成物として製剤化され得る。このような薬学的組成物は以下に論じられる。特に、組換えコラーゲンＩＶは組換えヒトコラーゲンＩＶである。
薬学的組成物
【０１５５】
組換えコラーゲンＩＶプロトマー、二量体、四量体、多量体、及び／またはこれらの混合物、ならびに薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物が本明細書において提供される。このような薬学的組成物は、それを必要とするヒト患者に投与及び／または注射するのに好適である。このような組成物は、活性成分（すなわち、組換えコラーゲンＩＶ）を有効にさせるように製剤化されることが多く、この組成物は、製剤が投与されるであろう対象に毒性である追加の構成成分を含有しない。
コラーゲンＩＶタンパク質
【０１５６】
いくつかの実施形態では、活性成分は、コラーゲンＩＶプロトマー、二量体、四量体、多量体、及び／またはこれらの混合物である。いくつかの態様では、コラーゲンＩＶは、α１（ＩＶ）、α２（ＩＶ）、α３（ＩＶ）、α４（ＩＶ）、α５（ＩＶ）、及びα６（ＩＶ）からなる群から選択される３つのα鎖ポリペプチドを含むプロコラーゲンであり、各α鎖は遺伝子ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ４Ａ２、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ４Ａ４、ＣＯＬ４Ａ５、及びＣＯＬ４Ａ６によりコードされる。
【０１５７】
いくつかの態様では、該コラーゲンＩＶプロトマーは、１つのα３（ＩＶ）鎖ポリペプチド、１つのα４（ＩＶ）鎖ポリペプチド、及び１つのα５（ＩＶ）鎖ポリペプチドのヘテロ三量体であり、α３（ＩＶ）鎖ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列及び／またはそのバリアントを含み、α４（ＩＶ）鎖ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列及び／またはそのバリアントを含み、α５（ＩＶ）鎖ポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列及び／またはそのバリアントを含む。
【０１５８】
本発明のいくつかの実施形態では、組換えコラーゲンＩＶは、キメラα（ＩＶ）ポリペプチド、特にキメラα３（ＩＶ）、α４（ＩＶ）、及びα（５）ポリペプチドを含み得る。アルポート症候群を伴う移植を受けた患者の同種移植片を標的とする抗糸球体基底膜疾患の活動的な形態であるアルポート移植後腎炎（ＡＰＴＮ）において、患者の同種抗体は、α３（ＩＶ）鎖のＮＣ１ドメイン内の同種エピトープ、及び／またはコラーゲンＩＶ  α３−α４−αプロトマーのＮＣ１六量体の４次構造に依存する同種エピトープを標的とすることが示されている（Ｏｌａｒｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．２０１３，２４（６），８８９−８９５）。更に、コラーゲン  ＩＶ  α３−α４−α５のＮＣ１ドメインは、肺出血を伴う迅速に進行する腎疾患である、グッドパスチャー症候群において主要な同種抗原である。α３（ＩＶ）、α４（ＩＶ）、及び／またはα（５）鎖のＮＣ１ドメインの置換は組換えコラーゲンＩＶの投与により誘導される自己免疫反応を減少させると予想される。
【０１５９】
他の実施形態では、該コラーゲンＩＶプロトマーは、キメラα３（ＩＶ）、α４（ＶＩ）、及びα５（ＩＶ）ポリペプチドから選択される１つ、２つ、または３つのキメラコラーゲンＩＶ  αポリペプチドを含むヘテロ三量体である。本発明に開示されるように、キメラα３（ＩＶ）鎖ポリペプチドは、α３（ＩＶ）鎖のＮＣ１ドメインの全てまたは一部がα１（ＩＶ）及び／もしくはα２（ＩＶ）鎖のＮＣ１ドメインの全てまたは一部に置き換えられるキメラポリペプチドである。キメラα４（ＩＶ）鎖ポリペプチドは、α４（ＩＶ）鎖のＮＣ１ドメインの全てまたは一部がα１（ＩＶ）及び／もしくはα２（ＩＶ）鎖のＮＣ１ドメインの全てまたは一部に置き換えられるキメラポリペプチドである。Ａキメラα５（ＩＶ）鎖ポリペプチドは、α５（ＩＶ）鎖のＮＣ１ドメインの全てまたは一部がα１（ＩＶ）及び／もしくはα２（ＩＶ）鎖のＮＣ１ドメインの全てまたは一部に置き換えられるキメラポリペプチドである。
【０１６０】
非限定的な例として、組換えヒトコラーゲンＩＶプロトマーは、α３（ＩＶ）鎖のＮＣ１ドメインの全てまたは一部がα１（ＩＶ）鎖ポリペプチドのＮＣ１ドメインの全てまたは一部で置き換えられる１つのキメラα３（ＩＶ）鎖ポリペプチド、１つのα４（ＩＶ）鎖ポリペプチド、及び１つのα５（ＩＶ）鎖ポリペプチドを含み、この３つのポリペプチドが３重らせんを形成する。別の非限定的な例として、組換えコラーゲンＩＶプロトマーは、α３（ＩＶ）鎖のＮＣ１ドメインの全てまたは一部がα１（ＩＶ）鎖ポリペプチドのＮＣ１ドメインの全てまたは一部で置き換えられる１つのキメラα３（ＩＶ）鎖ポリペプチド、α４（ＩＶ）鎖のＮＣ１ドメインの全てまたは一部がα２（ＩＶ）鎖ポリペプチドのＮＣ１ドメインの全てまたは一部で置き換えられる１つのキメラα４（ＩＶ）鎖ポリペプチド、ならびにα５（ＩＶ）鎖のＮＣ１ドメインの全てまたは一部がα１（ＩＶ）鎖ポリペプチドのＮＣ１ドメインの全てまたは一部で置き換えられる１つのキメラα５（ＩＶ）鎖ポリペプチドを含み得、この３つのポリペプチドが３重らせんを形成する。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、本発明の該コラーゲンＩＶタンパク質は、上記に開示される２つのコラーゲンＩＶプロトマーを含む二量体であり得る。いくつかの態様では、本発明に開示される２つのコラーゲンＩＶプロトマーは、酵素及び／もしくは化学二量体化を介して、または非共有結合会合を通して二量体化され得る。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、本発明に使用されるコラーゲンＩＶタンパク質は、ある特定の率の３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、及び／またはリジルヒドロキシリジン残基を含有し得る。いくつかの態様では、コラーゲンＩＶタンパク質は、約６．５％〜約１４％の４−ヒドロキシプロリン（すなわち、６５〜１４０個の４−ヒドロキシプロリン残基／１０００ＡＡ）、及び／または約０．３％〜約１．６％の３−ヒドロキシプロリン（すなわち、６〜１６個の３−ヒドロキシプロリン残基／１０００ＡＡ）を含有し得る。
【０１６３】
他の態様では、該コラーゲンＩＶタンパク質はヒトコラーゲンＩＶタンパク質である。治療／置き換えに使用されるコラーゲンＩＶは、コラーゲンＩＶを含有する組織（例えば、ヒト及び他の哺乳動物）からの抽出及び精製を含む、様々な供給源から得ることができる。コラーゲンＩＶは、組換えコラーゲンＩＶ、特にヒト組換えコラーゲンＩＶなど、遺伝子操作を介しても生産され得る。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、コラーゲンＩＶ  α３−α４−α５ならびに／またはキメラコラーゲンＩＶプロトマー、二量体、四量体、多量体、及び／もしくはこれらの混合物を含むコラーゲンＩＶタンパク質は、薬学的組成物として製剤化される。組換えコラーゲンＩＶを含む該薬学的組成物は、アルポート症候群患者など、それを必要とする対象に投与するのに好適である。
コラーゲンＩＶの精製
【０１６５】
コラーゲンＩＶプロトマー、二量体、多量体、及び／またはこれらの混合物は、基底膜、胎盤、眼水晶体など、コラーゲンＩＶ含有組織から抽出され得る。基本的に、コラーゲンの調製方法は、希釈した有機酸による抽出、塩による沈殿、任意のゲル化及び／または凍結乾燥、タンジェント濾過、ならびに精製などを伴う（例えば、米国特許第４，１４８，６６４号、同第５，０２８，６９５号、同第５，６７０，３６９号、同第５，８１４，３２８号、同第７，９６４，７０４号を参照、これらのそれぞれの内容は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。異なるコラーゲン型は、異なるイオン強度及びｐＨの溶液におけるそれらの可溶性に対して抽出及び分離され得ることは当該技術分野において既知である。コラーゲンＩＶを抽出するための多くの方法は、ペプシン加水分解によるコラーゲンの可溶化を伴うＳａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９７９，２５４（１９），９８９３−９９００）の方法に従う。日本特許公開第１１−１７１８９８（１９９９）（その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、コラーゲンＩＶのポリマー画分を単離する技術を開示している。
【０１６６】
本明細書で使用されるとき、「コラーゲンＩＶ含有組織」は、腱、皮膚、角膜、骨、軟骨、歯、椎間板、胎児皮膚、心血管系、基底膜、胎盤、眼水晶体、及びいずれの上皮下の係留線維を含むが、これらに限定されない、コラーゲンＩＶを含有するあらゆる組織を指す。コラーゲンＩＶは、上皮及び内皮基底層、糸球体基底膜、胎膜、血管、胎盤基底膜において最も豊富である。他の組織においても少量含まれている。
【０１６７】
米国特許第５，４３６，１３５号は、ヒト及び／または動物の胎盤からのコラーゲンＩＶの抽出プロセスを説明している。該方法は、酵素消化（例えばペプシン）と酸ｐＨ処理を組み合わせ、非常に効率よく汚染されていないコラーゲンＩＶ型を抽出することができる。この特許の内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１６８】
米国特許第７，３９６，９１２号は、発酵を使用して組織からコラーゲンを抽出するための方法を説明している。組織を発酵させるために、細菌、酵母などの微生物がコラーゲン含有組織に提供される。発酵を介して抽出されたコラーゲンは、純度が増し、大半が良く保存された、本来の立体構造を有するコラーゲン単量体を含む。この特許の内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１６９】
米国特許第７，７４１，４４１号は、他のタンパク質による汚染なく、また分解もしくは変性なく、水晶体包からコラーゲンＩＶを抽出するための方法を説明している。このような方法は、酵素処理を使用することなく水晶体包からコラーゲンＩＶ内容物を抽出するために、水性酸溶液を使用することを伴う。この特許の内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、線維芽細胞などのコラーゲン生産細胞はコラーゲンＩＶを発現させるために使用され得る。コラーゲン生産細胞（例えば線維芽細胞）は、コラーゲンＩＶを含むコラーゲンの発現／合成を増加させるために、異なる薬剤で刺激され得ることが当該技術分野において論じられている。例えば、ＰＣＴ特許公開第ＷＯ１９９５０３１４７３号、同第ＷＯ２００８０７０８９３号、及び同第ＷＯ２００８０７０８９２号を参照（これらのそれぞれの内容は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１７１】
当該技術分野における多くの参考文献は、あるものはコラーゲンＩＶを含む、様々な供給源から他の型のコラーゲンを抽出及び精製するための他の方法を開示している。このような方法は、必要に応じて採用され得る（例えば、米国特許第２，９７９，４３８号、同第５，０６４，９４１号、同第５，４３６，１３５号、同第５，８１４，３２８号、同第７，９６４，７０４号、ならびに米国特許公開第２０１４０１４７４００号及び第２０１３０１２３４６８号を参照）。線維芽細胞からのコラーゲン（コラーゲンＩＶを含む）の生産を刺激する他の方法も必要に応じて使用され得る（例えば、米国特許公開第２０１００２３９５５６号及び第２００８０３０６００１号を参照）。
組換えコラーゲンＩＶの生産
【０１７２】
組換え技術は組換えヒトコラーゲンＩＶを生産するためにも使用され得る。組換えコラーゲンＩＶは、これをコードする組換えＤＮＡを発現させるために好適な宿主細胞を培養することにより生産され得、この組換えコラーゲンＩＶは、コラーゲンＩＶが細胞の外に分泌されるため、培養培地から精製され得る。哺乳類の分泌経路は生物学的に活性なタンパク質の組織化及び折り畳みを促進することが知られているため、組換えコラーゲンＩＶを発現させるために様々な哺乳類の細胞系が採用され得る。酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞、及び／または細菌などの他の宿主も本発明の組換えコラーゲンＩＶタンパク質を生産するために使用され得る。
【０１７３】
培養上清内に放出される分泌されたコラーゲンＩＶを生産するために、コラーゲンＩＶの天然のシグナルペプチドが使用されるか、または例えば、特定の発現系において効率的である別の分泌されたタンパク質に由来するシグナルペプチドが使用されるかのいずれかである。このような組換えコラーゲンタンパク質の例は、米国特許第８，４７０，５５５号（その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）において論じられており、ヒトコレクチンのシグナルペプチドを含むコラーゲン３重らせん構造を有する組換えコラーゲンタンパク質を教示している。
【０１７４】
本発明の内容において、従来の分子生物学、組換えＤＮＡ技術、及びタンパク質生化学は当該技術分野内である。このような技術は、文献、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．３ｒｄ  ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．（２００５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．：Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ、Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．（２００５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ、及びＣｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．（２００５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．：Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪに十分に説明されている。
【０１７５】
コラーゲンＩＶ  α鎖ポリペプチドをコードする核酸は、タンパク質の発現に好適ないずれの発現ベクター内にクローン化され得る。ベクターの一般的な性質は、本発明によると、コラーゲンＩＶの生産に重要ではない。一般に、好適な発現ベクター及び発現構築物は当業者には明らかである。好適な発現ベクターは、宿主特異的であるか、または関心の他の宿主用に操作されるかのいずれかであり得るプラスミド及びファージに基づき得る。他の好適なベクターは、コスミド、レトロウイルス、及び多くの他のビヒクルを含み得る。プロモーター、オペレーター、誘導因子、ターミネーター、及び他の配列などの他の制御及び調節配列は当業者に明らかである。組換えコラーゲンＩＶを生産するためのベクター及び構築物は、いずれの好適な方法で修飾及び／または操作され得る。好適なベクターは、当然のことながら、所望の発現系に従い、当業者により選択され得る。
【０１７６】
当該技術分野において周知の多くの方法が本発明のコラーゲンＩＶ  α鎖ポリペプチドを生産するために使用され得る。非限定的な例として、簡単な方法の１つは、コラーゲンＩＶ  α鎖ポリペプチドをコードする核酸を得、それらを好適な発現ベクター（例えばプラスミド）内に挿入し、好適な宿主（例えば哺乳類の細胞系）を形質転換し、形質転換した宿主を培養し、断片化及び遠心分離などのいずれの好適な手段により本発明のポリペプチドを得る工程を含み得る。
【０１７７】
いくつかの態様では、該３つのコラーゲンＩＶ  α鎖ポリペプチドは共通のベクター内に挿入され得る。他の態様では、該３つのコラーゲンＩＶ  α鎖ポリペプチドは、ベクターを分離するために挿入され、次に同時に発現させるために宿主に同時形質転換され得る。
【０１７８】
他の好適なクローン化方法は当業者には明らかである。
【０１７９】
本発明によると、組換えコラーゲンＩＶは、哺乳類細胞及び糖鎖操作された酵母細胞を含む真核発現系において生産され得る。非限定的な例として、ＣＨＯ細胞系は、それらが高レベルのタンパク質発現を促進する十分に特徴付けされ、選択可能であり、かつ増幅可能な遺伝子発現系を提供するため、最適である。加えて、これらの細胞は、接着または懸濁培養物として操作することが容易であり、比較的良好な遺伝的安定性を呈する。ＣＨＯ細胞及びそれらにおいて発現された組換えタンパク質は広範に特徴付けされ、規制当局により臨床製造における使用が承認されている。
【０１８０】
他の細胞系は、ヒト胚性腎臓細胞系２９３（ＨＥＫ２９３細胞）、ヒト線維芽細胞を含み得る。例えば、ＨＥＫ２９３細胞は、α３（ＩＶ）、α４（ＩＶ）、及びα５（ＩＶ）鎖ポリペプチドを発現するベクターで安定してトランスフェクトされ得る。これらのトランスフェクトされた細胞の細胞抽出物及び培養培地は、例えば、α３（ＩＶ）、α４（ＩＶ）、及びα５（ＩＶ）鎖ポリペプチドの免疫共沈降を介して、コラーゲンヘテロ三量体の組織化を検出するために使用され得る（例えば、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ．，２００３，６４（６），１９８６−１９９６、及びＫｏｂａｙａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｕｃｈｉｙａｍａ，Ｂｉｏｍｅｄ  Ｒｅｓ．，２０１０，３１（６），３７１−３７７）。
【０１８１】
ビタミンＣを含まない培地において培養された細胞がＩＶ型コラーゲンタンパク質よりも非常に多い量で単鎖コラーゲンＩＶ  αポリペプチドを生産することが示された（Ｙｏｓｈｉｋａｗａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００１，１２９，９２９−９３６を参照）。本発明のいくつかの態様では、細胞は、α３鎖などの単一α鎖ポリペプチドを含む単一構築物でトランスフェクトされ、α３鎖ポリペプチドのみを生産するためにビタミンＣを含まない培地で培養され得る。このようなα３鎖は、同じ方法で生産された他の２つのα鎖ポリペプチドまたはキメラポリペプチド（すなわち、α４及びα５）と混合されて、コラーゲンＩＶヘテロ三量体を形成し得る。
【０１８２】
いずれの生細胞に好適な培養は本発明の培養に有用であり得る。培養系は、原核発現系（例えば大腸菌細胞）から真核発現系（例えばＣＨＯ細胞及びＨＥＫ２９３細胞）まで様々であり得る。
【０１８３】
大腸菌はヒドロキシル化ヒトコラーゲンＩＶの組換え発現を発現させるために使用され得る。巨大ウイルスであるミミウイルスによりコードされる新しいプロリル及びリジルヒドロキシラーゼ遺伝子の特徴付けは、ヒドロキシル化コラーゲンの生産のための方法を明らかにする。大腸菌におけるミミウイルスのプロリル及びリジルヒドロキシラーゼとのヒトコラーゲンＩＶ型構築物の同時発現は、ヒドロキシル化コラーゲンＩＶを生産し得る。プロリル及びリジルヒドロキシル化のそれぞれのレベルは、未変性ヒトコラーゲンＩＶ型のヒドロキシル化レベルに類似し得る。組換えコラーゲンＩＶに沿ったヒドロキシプロリン及びヒドロキシリジンの分布も、質量分光分析により決定されるとき、未変性コラーゲンのものと類似し得る。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、人工的にまたは天然のいずれかで、未変性コラーゲンＩＶ発現または他のコラーゲンの発現が欠損している宿主細胞は、本発明の組換えコラーゲンＩＶを生産するために使用され得る。
【０１８５】
コラーゲンＩＶの合成は、それぞれ、−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−、−Ｐｒｏ−４Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−、及び−Ｘ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−配列における４−ヒドロキシプロリン、３−ヒドロキシプロリン、及びヒドロキシリジンの形成を含む、上述の多くの異常な同時翻訳及び翻訳後修飾を伴う。いくつかの実施形態では、組換えコラーゲンＩＶタンパク質を生産するために使用される細胞は、コラーゲンプロリル４−ヒドロキシラーゼ（Ｐ４Ｈｓ）、プロリル３−ヒドロキシラーゼ（Ｐ３Ｈｓ）、及び／またはリジルヒドロキシラーゼ（ＬＨｓ）を発現するように操作され得る。
【０１８６】
いくつかの態様では、組換えコラーゲンＩＶを生産するために使用される細胞は、それぞれ、プロリルｌ−３ヒドロキシラーゼ（Ｐ３Ｈ）及び組換えコラーゲンＩＶ  α鎖をコードする核酸配列を含有する構築物と同時にトランスフェクトされ得る。Ｐ３Ｈは、組換えコラーゲンＩＶの３−ヒドロキシプロリンの含有量を増加させ、この組換えコラーゲンＩＶの高い数の３−ヒドロキシプロリン残基は、血小板誘導凝集を減少させることができる。他の態様では、組換えコラーゲンＩＶを生産するために使用される細胞は、それぞれ、プロリル−４ヒドロキシラーゼ（Ｐ４Ｈ）及び組換えコラーゲンＩＶ  α鎖をコードする核酸配列を含有する構築物と同時にトランスフェクトされ得る。Ｐ４Ｈは、組換えコラーゲンＩＶの４−ヒドロキシプロリンの含有量を増加させ、この組換えコラーゲンＩＶの４−ヒドロキシプロリン残基の高い含有量は、コラーゲンの熱安定性を増加させ、かつ／またはタンパク質分解による消化に対する感受性を減少させる。
【０１８７】
また他の態様では、組換えコラーゲンＩＶを生産するために使用される細胞は、それぞれ、リジルヒドロキシラーゼ（ＬＨ）及び組換えコラーゲンＩＶ  α鎖をコードする核酸配列を含有する構築物と同時にトランスフェクトされ得る。ＬＨは、組換えコラーゲンＩＶのリジルヒドロキシリジンの含有量を増加させ、この組換えコラーゲンＩＶのリジルヒドロキシリジン残基の高い含有量は、安定性を更に増加させ、グリコシル化修飾のための部位を提供する。
【０１８８】
コラーゲンＩＶは、コラーゲンＩＶのネットワークを強化し得る、メチオニン硫黄とヒドロキシリジン窒素との間に独特なスルフィルイミン（Ｓ＝Ｎ）結合を含有する。基底膜に見られる酵素であるペルオキシダジンは、スルフィルイミン結合の形成を触媒する（Ｂｈａｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２０１２，８，７８４−７９０）。本発明によると、コラーゲンＩＶプロトマーは、その比較的小さいサイズを考えると、薬学的組成物の活性成分として使用され得る。この文脈において、組換えコラーゲンＩＶを生産するために使用される細胞は、ペルオキシダジンを枯渇させるように操作され、したがって、コラーゲンＩＶプロトマーの二量体化を妨げることができる。他の態様では、ペルオキシダジン阻害剤は、組換えコラーゲンＩＶプロトマー合成中のスルフィルイミン結合の形成を妨げるために宿主細胞に適用され得る。ペルオキシダジン阻害剤は、ペルオキシダジンの合成を阻害するｓｉＲＮＡまたはアンチセンス核酸などの核酸、ペルオキシダジンに特異的に結合する抗体、ペルオキシダジンまたはペルオキシダジン基質の断片であるペプチド、小分子、及び／またはヨウ化物もしくはチオシアネートなどのアニオンであり得る。ペルオキシダジンの阻害は、培養した細胞における臭化物の除去により、またはタウリンなどの次亜塩素酸及び／または次亜臭素酸の中和剤の適用によっても生じ得る。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、このような細胞系は、キメラα３（ＩＶ）、α４（ＶＩ）、及びα５（ＩＶ）ポリペプチドから選択されるキメラα（ＩＶ）鎖ポリペプチドを生産するために使用され得る。キメラα３（ＩＶ）鎖ポリペプチドは、α３（ＩＶ）鎖のＮＣ１ドメインの全てまたは一部のアミノ酸配列をコードする核酸配列がα１（ＩＶ）及び／もしくはα２（ＩＶ）鎖のＮＣ１ドメインの全てまたは一部のアミノ酸配列をコードする核酸配列に置き換えられる、キメラｃＤＮＡによりコードされ得る。キメラα４（ＩＶ）鎖ポリペプチドは、α４（ＩＶ）鎖のＮＣ１ドメインの全てまたは一部のアミノ酸配列をコードする核酸配列がα１（ＩＶ）及び／もしくはα２（ＩＶ）鎖のＮＣ１ドメインの全てまたは一部のアミノ酸配列をコードする核酸配列に置き換えられる、キメラｃＤＮＡによりコードされ得る。キメラα５（ＩＶ）鎖ポリペプチドは、α５（ＩＶ）鎖のＮＣ１ドメインの全てまたは一部のアミノ酸配列をコードする核酸配列がα１（ＩＶ）及び／もしくはα２（ＩＶ）鎖のＮＣ１ドメインの全てまたは一部のアミノ酸配列をコードする核酸配列に置き換えられる、キメラｃＤＮＡによりコードされ得る。
【０１９０】
他の態様では、キメラα（ＩＶ）ポリペプチドをコードする該キメラｃＤＮＡｓは、哺乳類細胞、細菌、昆虫、植物細胞、及び／または酵母における発現のためにコドン最適化され得る。組換えポリペプチドの発現を最適化するためのコドン最適化は当該技術分野において周知である。
【０１９１】
該キメラｃＤＮＡｓは、キメラα（ＩＶ）ポリペプチドを生産するために、哺乳類細胞、細菌、昆虫細胞、植物細胞、及び／または酵母内にトランスフェクトされ得る。キメラα（ＩＶ）ポリペプチドをコードするキメラｃＤＮＡを含有する、形質転換された宿主細胞、細菌、昆虫、植物細胞、及び／または酵母も本発明において提供される。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、本発明の組換えコラーゲンＩＶタンパク質は、ポリペプチドの安定性を強化し得るものなど、非天然アミノ酸及び／または他のアミノ酸置換を更に含有し得る。
薬学的に許容される賦形剤
【０１９３】
いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物は、他の薬学的に許容される賦形剤を更に含み得る。
【０１９４】
用語「薬学的に許容される賦形剤」は、薬学的製品の製剤化に使用される緩衝液、溶媒、等張化剤、安定剤、酸化防止剤、界面活性剤、またはポリマーなど、治療活性を有さず、また許容される毒性を有するあらゆる成分を指す。これらは一般的に、米国食品医薬品局により公布されるものを含む、確立された政府標準規格に従う、ヒトへの投与に安全である。
【０１９５】
緩衝液：本明細書で使用されるとき、用語「緩衝液」は、溶液のｐＨを許容可能な範囲に維持するそれらの薬剤を包含する。緩衝液は、弱酸及びその共役塩基または弱塩基及びその共役酸の混合物からなる水溶液である。そのｐＨは、少量の強酸または塩基が添加されたときにほとんど変化せず、よって、溶液のｐＨにおけるあらゆる変化を防止するために使用される。緩衝溶液は、狭いｐＨ範囲内にタンパク質を安定して維持する手段としてコラーゲンＩＶタンパク質製剤に使用される。
【０１９６】
緩衝液は、薬学的組成物のｐＨを安定させることができる。好適な緩衝液は当該技術分野において周知であり、文献に見出すことができる。好ましい薬学的に許容される緩衝液は、ヒスチジン緩衝液、アルギニン緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、酢酸緩衝液、及びリン酸緩衝液、またはこれらの混合物を含むが、これらに限定されない。最も好ましい緩衝液は、クエン酸、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、またはＬ−ヒスチジンとＬ−ヒスチジン塩酸塩の混合物を含む。他の好ましい緩衝液は酢酸緩衝液である。使用される緩衝液とは関係なく、ｐＨは、当該技術分野において既知の酸または塩基、例えば、塩酸、酢酸、リン酸、硫酸、及びクエン酸、水酸化ナトリウム及び水酸化カリウムで調節され得る。ｐＨは、許容可能な安定性を提供するため、コラーゲンＩＶプロトマー、二量体、四量体、及び／または多量体の可溶性及びインスリン分泌活性を維持するため、ならびに非経口投与に容認される範囲に調節される。ｐＨは、約ｐＨ５、約ｐＨ５．５、約ｐＨ６、約ｐＨ６．５、または約ｐＨ７．０など、約ｐＨ４〜約ｐＨ７．０、または約ｐＨ５〜約ｐＨ６であり得る。
【０１９７】
等張化剤：本明細書で使用されるとき、用語「等張化剤」は、薬学的組成物及び製剤の張度を調節するために使用される薬学的に許容される賦形剤を列挙する。張度は一般に、通常ヒトの血清に対する溶液の浸透圧を指す。浸透圧は、半透膜にわたって水の内方向の流れを防止するために、溶液に提供されなければならない圧力である。溶質のみが浸透圧をもたらすため、浸透圧及び張度は膜を横断できない溶質によってのみ影響を受ける。製剤は、低張性、等張性、または高張性であり得るが、典型的に、好ましくは等張性である。等張性製剤は、液体または固体形態から、例えば凍結乾燥形態から再構築された液体であり、生理学的塩溶液及び血清など、比較されるある他の溶液と同じ等張性を有する溶液を示す。
【０１９８】
等張化剤賦形剤は、適用部位での浸透圧ショックを防止することによって局所刺激を減少させるために、注射可能な眼または鼻腔内調製物に添加される。投与中の快適性のために、多くの注射可能剤形は、身体の正常な細胞及び血液と同じ塩（等張性）濃度を有さなければならない。
【０１９９】
好適な等張化剤は、糖類、塩類、及びアミノ酸を含む。等張化剤のいくつかの例としては、コーンシロップ、含水デキストロース、無水デキストロース、トレハロース、スクロース、グリセリン、アルギニン、マンニトール、塩化カリウム、及び塩化ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２００】
本明細書で使用されるとき、用語「糖」は、水溶性である単糖またはオリゴ糖を示す。単糖は、単純糖及びそれらの誘導体を含む、酸によって加水分解可能ではない単量体炭水化物である。単糖の例としては、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、ソルボース、リボース、デオキシリボース、ノイラミン酸が挙げられる。オリゴ糖は、分枝状または鎖のいずれかのグリコシド結合（複数可）を介して結合される２つ以上の単量体糖単位からなる炭水化物である。オリゴ糖内の単量体糖単位は、同一または異なり得る。オリゴ糖の例としては、スクロース、トレハロース、ラクトース、マルトース、及びラフィノースが挙げられる。
【０２０１】
等張化剤または安定剤の文脈において、用語「アミノ酸」は、カルボキシル基に対してα位置に位置するアミノ部分を有する薬学的に許容される有機分子を指す。アミノ酸の例としては、アルギニン、グリシン、オルニチン、リジン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、イソロイシン、ロイシン、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、セリン、プロリンが挙げられる。等張化剤または安定剤の文脈において、好ましいアミノ酸は、アルギニン、トリプトファン、メチオニン、ヒスチジン、またはグリシンである。例えば、アルギニンはタンパク質可溶化剤であり、コラーゲンＩＶの凝集を減少させる安定剤でもある。
【０２０２】
無機塩は、有効な等張化剤であり、一般に、タンパク質安定剤としても使用される。無機塩は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）、チオシアン酸ナトリウム（ＮａＳＣＮ）、塩化マグネシウ（ＭｇＣｌ２）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）、チオシアン酸アンモニウム（ＮＨ４ＳＣＮ）、硫酸アンモニウ（（ＮＨ４）２ＳＯ４）、塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、硫酸カルシウム（ＣａＳＯ４）、塩化亜鉛（ＺｎＣｌ２）など、及びこれらの組み合わせを含み得るが、これらに限定されない。
【０２０３】
製剤がタンパク質を安定させるために高濃度の１つ以上の糖類を必要とする場合、無機塩濃度は、注射通が投与時に低減されるように製剤の浸透圧を維持するために、ゼロであるか、または非常に低く保たれるべきであることは周知である。いくつかの実施形態では、コラーゲンＩＶ製剤は、無機塩が本明細書に記載される製剤への添加から実質的に除外される無塩製剤である。これらの無塩製剤は、沈殿または凝集など、安定性が増加し、相変化が減少して、コラーゲンＩＶ製剤の浸透圧を維持することができる。ｐＨ調節により導入される本開示の製剤内の無機塩の存在は、無機塩の添加とは見なされないことを当業者は理解するだろう。
【０２０４】
他の実施形態では、高濃度のコラーゲンＩＶタンパク質が所望されない場合、コラーゲンＩＶタンパク質を含む薬学的組成物は、様々な生理学的に許容される塩の形態のいずれかであり、かつ／または許容される薬学的担体及び／もしくは添加剤を伴い得る。薬学的に許容される塩は、例えば、酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、重酒石酸塩、臭化物、エデト酸カルシウム、カンシラート、炭酸塩、塩化物、クエン酸塩、二塩酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エストレート、エシレート、フマル酸塩、グルセプテート、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコリルアルサニレート（ｇｌｙｃｏｌｌｙｌａｒｓａｎｉｌａｔｅ）、ヘキシルレソルシネート（ｈｅｘｙｌｒｅｓｏｒｃｉｎａｔｅ）、ヒドラバミン、ヒドロ臭化物、塩酸塩、ヒドロキシナフトエート、ヨウ化物、イセチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩ト、臭化メチル、硝酸メチル、硫酸メチル、ムケート（ｍｕｃａｔｅ）、ナプシレート（ｎａｐｓｙｌａｔｅ）、硝酸塩、パモ酸塩（エンボネート）、パントテン酸塩、リン酸塩／ジスリン酸塩（ｄｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ポリガラクツロ酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、次酢酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、及びテオクレート（ｔｅｏｃｌａｔｅ）／トリエチオジド（ｔｒｉｅｔｈｉｏｄｉｄｅ）アニオン；ベンザチン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン、及びプロカイン（有機）カチオン；ならびにアルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、及び亜鉛（金属）カチオンを含む。薬学的に許容される塩は、例えば、Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１９７７，６６，１−１９に記載されるそれらの塩も含む。
【０２０５】
本発明のいくつかの実施形態では、コラーゲンＩＶ組成物は、等張化剤としてマンニトールを更に含み得る。マンニトール濃度は、約３．０〜約６．３％ｗ／ｖの範囲である。
【０２０６】
界面活性剤：界面活性剤は、コラーゲンＩＶタンパク質の変性をもたらすことなく、攪拌及び剪断のような機械的応力に対してタンパク質製剤を保護するため、ならびに処理及び保管中の表面への吸着を減少させるために使用され得る。界面活性剤は、ポロキサマー、ポリソルベート、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ）、アルキルフェニルポリオキシエチレンエーテル（トリトン−Ｘ）またはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含み得るが、これらに限定されない。好ましい界面活性剤はポリソルベート及びポロキサマーである。
【０２０７】
ポリソルベートは、ソルビトールのオレイン酸エステル及びその無水物であり、典型的にはエチレンオキシドと共重合される。ポリソルベート２０（ポリ（エチレンオキシド）（２０）モノラウリン酸ソルビタン、Ｔｗｅｅｎ２０）またはポリソルベート８０（ポリ（エチレンオキシド）（８０）モノラウリン酸ソルビタン、Ｔｗｅｅｎ８０）を含む一般的に使用されるポリソルベート及びＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ポリオールは、界面相互作用を減少させることにより処理及び保管中のタンパク質を安定させ、タンパク質の吸着を防止することができる。
【０２０８】
本発明のいくつかの実施形態では、コラーゲンＩＶ組成物は、可溶化剤及び／または安定剤としてポリソルベート−８０を更に含み得る。ポリソルベート−８０の濃度は、約０．０１〜０．０５％（ｗ／ｖ）（またはｍｇ／ｍｌを単位として表される、約０．１〜０．５ｍｇ／ｍＬ）の範囲である。ポリソルベート−８０のこの濃度は、可溶性凝集体及び不溶性粒子の形成を最小にするために、コラーゲンＩＶタンパク質及びマンニトールの組み合わせで決定される。
【０２０９】
ポロキサマーは、ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）の２本の親水性鎖に隣接するポリプロピレンオキシド）（ＰＰＯ）の中央疎水性鎖から構成される非イオン性トリブロックコポリマーを意味し、各ＰＰＯまたはＰＥＯ鎖は異なる分子量のものであってもよい。
【０２１０】
安定した高濃度のコラーゲンＩＶ製剤を提供するのに有効な界面活性剤の量は通常、約５０ｐｐｍ〜約２００ｐｐｍの範囲である。本発明のコラーゲンＩＶ製剤は、例えば、ポリソルベート２０もしくは８０などの１つ以上のポリソルベート（複数可）、ポロキサマー１８４もしくは１８８などの１つ以上のポロキサマー、１つ以上のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ポリオール（複数可）、及び／または１つ以上エチレン／ポリプロピレンブロックポリマー（複数可）を含む、１つ以上の非イオン性界面活性剤（複数可）を有する製剤を含むが、これに限定されない。ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０）またはポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）などのポリソルベートを有する製剤が本明細書において例示される。
【０２１１】
酸化防止剤：酸化防止剤は、活性薬学的成分、特に組換えコラーゲンＩＶタンパク質の酸化を防止するために使用され得る。これは、キレート剤、反応性脱酸素剤、及び鎖ターミネーターを含む。酸化防止剤は、ＥＤＴＡ、クエン酸、アスコルビン酸、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、亜硫酸ナトリウム、ｐ−アミノ安息香酸、グルタチオン、没食子酸プロピル、システイン、メチオニン、エタノール、及びＮ−アセチルシステインを含むが、これらに限定されない。特に、ＥＤＴＡ、ＡＬＡ、ＢＡＰＴＡ、ＥＧＴＡ、ＤＴＰＡ、及びＤＭＳＡなどの金属キレート剤は、コラーゲンＩＶプロトマー、二量体、及び／または多量体の間のリジルオキシダーゼ媒介コラーゲンＩＶ架橋を阻害するために使用され得る。
【０２１２】
コラーゲンＩＶタンパク質は、溶液及び注入に好適な粉末として生産されるか、またはこのようなコラーゲンＩＶタンパク質の注射及び他の投与経路に好適な溶液として製剤化され得る。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物は、組換えタンパク質の安定性を損失することなく、高濃度のコラーゲンＩＶタンパク質を含有し得る。
【０２１４】
標準的な薬学的製剤技術は当業者に周知である（例えば、２００５，Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（登録商標），Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ：Ｍｏｎｔｖａｌｅ，ＮＪ，２００４、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  ｅｄ．，Ｇｅｎｎａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，２０００を参照）。好適な薬学的添加剤は、上記に論じられるもの、例えば、マンニトール、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、米、粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどを含む。組成物は、ｐＨ緩衝試薬及び湿潤剤または乳化剤も含有し得る。組成物は、保存剤を含んでも含まなくてもよい。
【０２１５】
薬学的組成物の製剤は、意図される投与形態及び他のパラメータにより変動し得る（例えば、Ｒｏｗｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，４ｔｈ  ｅｄ．，ＡＰｈＡ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２００３を参照）。いくつかの実施形態では、組成物は、注射用に減菌水で再構築したときに静脈内注射により投与されるように、減菌非発熱性の白からオフホワイトの凍結乾燥ケーキまたは粉末であり得る。他の実施形態では、製剤自体が減菌非発熱性溶液であり得る。
【０２１６】
凍結乾燥製剤：いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物は、凍結乾燥防止剤の存在下で凍結乾燥された混合物として製剤化され得る。
【０２１７】
他の実施形態では、本発明の薬学的組成物は、生分解性ポリマーに封入され得る。
【０２１８】
水性製剤：本明細書で使用されるとき、「水性製剤」は、好適な溶媒に溶解された１つ以上の賦形剤（例えば、化学添加剤）と組み合わせて、コラーゲンＩＶタンパク質を含有する溶液または液体調製物を指す。いくつかの実施形態では、コラーゲンＩＶ組成物は、有効量の可溶性コラーゲンＩＶタンパク質、所望のｐＨを有するクエン酸−リン酸緩衝液もしくはクエン酸緩衝液、スクロースもしくはトレハロース、塩化ナトリウム、及びＬ−ヒスチジンもしくはＬ−アスパラギン酸のいずれかを含む、安定した水性製剤として製剤化され得る。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、コラーゲンＩＶタンパク質の製剤は、特に、吸着を阻害し、酸化を防止し、ｐＨを維持し、コラーゲンＩＶタンパク質を安定させ、かつ薬学的組成物の浸透圧を制御する賦形剤を含有し得る。一般に、コラーゲンＩＶを安定させる賦形剤は、それらが製造プロセス中、特定の保存条件下、または特定の投与モードと関連して生じ得る様々な化学的及び物理的応力に対してタンパク質を安定させる機序に基づき選択され得る。
【０２２０】
製剤に使用される賦形剤の濃度または量は、例えば、製剤に含まれるコラーゲンＩＶタンパク質の量、所望の製剤に含まれる他の賦形剤の量、製剤中の他の構成成分の量または容量、及び達成されることが望まれる所望の張度または浸透圧により変動する。様々な実施形態では、異なる種類の賦形剤が単一製剤において混合され得る。したがって、単一製剤は、１つの賦形剤、２つ、３つ以上の異なる種類の賦形剤を含有し得る。液体製剤における賦形剤の使用は、例えば、製造中、輸送中、保管中、使用前調製中、または投与中に生じ得る応力に起因する分解または凝集プロセスに対してタンパク質を安定させるための確立された慣習である。実際に、製剤における特定の賦形剤の存在は、２つ以上の効果または目的を有し得る。
【０２２１】
様々な刊行物及び概説、例えば、Ａｒａｋａｗａ，ｅｔ  ａｌ，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１９９１，８（３），２８５−９１（１９９１）、Ｋｅｎｄｒｉｃｋ，ｅｔ  ａｌ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００２，１３，６１−８４、及びＲａｎｄｏｌｐｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００２，１３，１５９−１７５（これらのそれぞれの内容は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）がタンパク質の安定化について利用可能である。
【０２２２】
したがって、当該技術分野における様々な参考文献が薬学的な目的のためのタンパク質製剤について論じており、例えば、米国特許第６，８２１，５１５号、同第６，６８５，９４０号、同第８，４２０，０８１号、及び同第８，６１３，９１９号、ならびに米国特許公開第２０１２０２９４８６６号及び第２０１３０１５６７６０号、ならびＰＣＴ特許公開第ＷＯ２０１３０９６７９１号（これらのそれぞれの内容は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）を参照。
【０２２３】
一実施形態では、本発明のコラーゲンＩＶタンパク質製剤は、コラーゲンＩＶプロトマー、二量体、四量体、多量体、及び／またはこれらの混合物を含み、コラーゲンＩＶプロトマーは、コラーゲンＩＶ  α１、α２、α３、α４、α５、及びα６鎖から選択される３つのα鎖ポリペプチドを含むヘテロ三量体である。好ましい実施形態では、該コラーゲンＩＶプロトマーは、１つのα３鎖、１つのα４鎖、及び１つのα５鎖ポリペプチドからなるヘテロ三量体である。
【０２２４】
いくつかの態様では、コラーゲンＩＶ製剤は、配列番号３のアミノ酸配列及び／またはそのバリアントを含むα３（ＩＶ）鎖ポリペプチド、配列番号４のアミノ酸配列及び／またはそのバリアントを含むα４（ＩＶ）鎖ポリペプチド、配列番号５のアミノ酸配列及び／またはそのバリアントを含むα５（ＩＶ）鎖ポリペプチドを含む、組換えコラーゲンＩＶタンパク質を含有する。他の態様では、コラーゲンＩＶ製剤は、キメラα３（ＩＶ）鎖ポリペプチド、キメラα４（ＩＶ）鎖ポリペプチド、及びキメラα５（ＩＶ）鎖ポリペプチドから選択されるキメラα（ＩＶ）鎖ポリペプチドを含むコラーゲンＩＶタンパク質を含有する。
【０２２５】
非限定的な例として、本発明によるコラーゲンＩＶタンパク質製剤は、薬学的有効量のコラーゲンＩＶタンパク質（例えば、組換えヒトコラーゲンＩＶタンパク質）、好適な濃度の非イオン性界面活性剤、ヒスチジン、アルギニン、リジン、グリシン、及びアラニンから選択される１つ以上のアミノ酸、ポリソルベート−８０、ならびに／またはマンニトール、デキストロース、グルコース、トレハロース、及びスクロースから選択される１つ以上の糖類を含有し得、コラーゲンＩＶタンパク質の濃度は約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌであり、該コラーゲンＩＶタンパク質製剤はｐＨ４．５〜ｐＨ６．５のｐＨを有し、該コラーゲンＩＶタンパク質製剤は実質的に無機塩を含有しない。
【０２２６】
更なる実施形態では、コラーゲンＩＶ製剤は、コラーゲンＩＶプロトマー、二量体、単量体、及びこれらの混合物の架橋を阻害するために、ＥＤＴＡなどの金属キレート剤を更に含み得る。
投与及び投薬量
【０２２７】
本発明によると、組換えヒトコラーゲンＩＶタンパク質、コラーゲンＩＶタンパク質を含む薬学的組成物、またはコラーゲンＩＶタンパク質製剤は、静脈内注射、ならびに／または筋肉内、皮下、脳内、脳室内、頭蓋内、眼内、耳内送達、及び短期もしくは長期的に設置されたカテーテルによる送達などの他の全身もしくは局所投与により、それを必要とする患者に投与され得る。
【０２２８】
本発明の薬学的組成物の投与経路は、好ましくは、静脈内、皮下、腹腔内、及び筋肉内経路を含む非経口経路である。静脈内投与が好ましい。注射に加えて、移植片及び経皮パッチが使用され得るか、または活性化合物が、マイクロカプセル送達系を含む放出制御調製物を使用して調製され得る（Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８を参照）。エチレン酢酸ビニル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、またはポリ乳酸などの生分解性または生適合性ポリマーが使用され得る。
【０２２９】
薬学的組成物の剤形には特に制限はない。薬学的薬剤は、例えば、液体、半固体、及び固体のいずれかの剤形である。この具体的な例としては、溶液（例えば、注射可能な溶液及び不溶性溶液）、分散液、懸濁液、錠剤、ピル、粉末、リポソーム、及びナノ粒子が挙げられる。
【０２３０】
剤形は、投与経路または効能により適切に選択される。注射可能な剤形が好ましい。注射可能な剤形の好ましい組成物の例としては、注射可能な溶液または不溶性溶液の剤形が挙げられ、具体的には、静脈内、皮下、及び筋肉内注射、好ましくは静脈内注射に好適なものを含む。
【０２３１】
加えて、本発明の薬学的組成物は、薬学的薬剤が減菌であり、生産及び保管条件下で安定している限り、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム形態、及びナノ粒子のいずれか、ならびに投与に好適な他の形態であり得るが、これらに限定されない。コラーゲンＩＶプロトマー、二量体、四量体、多量体、及び／またはこれらの混合物は、必要な場合、上に列記される成分のうちの１つ以上の組み合わせと共に、必要な量の適切な溶媒に組み込まれる。その後、混合物は注射可能な減菌溶液を調製するために濾過により減菌され得る。
【０２３２】
一般に、薬学的組成物は、分散液を調製するために、基本の分散培地及び上に列記される必要な追加成分（複数可）を含有する減菌培地に組み込まれる。注射可能な減菌溶液を調製するための減菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥及び凍結乾燥により、濾過により既に減菌された溶液からの適宜所望の追加成分を有する活性成分の粉末を得ることを伴う。例えば、分散に必要な粒子サイズは、レシチンなどのコーティング剤の使用により維持することができ、一方で、溶液の適切な流動性は、界面活性剤の使用により維持することができる。モノステアレート及びゼラチンなどの吸収遅延剤は組成物中に含有され得、それにより注射可能な組成物の持続的吸収が達成される。
【０２３３】
投与の単回用量は、特に限定されず、目的により適切に選択され得る。単回用量は、通常、約１０ｎｇ／ｋｇ〜約２５０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約１０ｎｇ／ｋｇ〜約１μｇ／ｋｇ、または約１００ｎｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ、または約１μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、または約１０ｎｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、または約１０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、特に好ましくはおよそ約５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、単回用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約３．５ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、または約２０ｍｇ／ｋｇである。本明細書で使用されるとき、用語「約」は、薬剤の用量などの測定可能な値を指すとき、変動が開示される組成物に適切であるように、指定された量から±２０％または±１０％、より好ましくは±５％、更により好ましくは±１％、及び尚より好ましくは±０．１％の変動を包含することを意味する。用量は、治療される症状により各投与に関して調節され得る。あるいは、この範囲外となる用量は、患者の症状、一般的な状態、投与経路などを考慮して適用することができる。
【０２３４】
薬学的組成物の投与スケジュールは、単回用量投与及び継続投与のいずれかであり得る。
【０２３５】
本発明の薬学的組成物は、１つ以上の追加の薬学的薬物と組み合わせて使用され得る。薬学的組成物と組み合わされる薬学的薬物は、症状または有害反応を考慮して適切に選択される。本発明において、このような組み合わせ使用は、本発明の薬学的薬物を同時に投与する、または追加の薬学的薬物、ならびに追加の薬学的薬物と共に本発明の薬学的薬物の製剤をほぼ同時に投与することも含む。
【０２３６】
本発明の薬学的組成物と組み合わせることができる薬学的薬物は、症状により適切に選択される。薬物の例としては、抗血栓薬、抗炎症薬、及び／またはヒスタミン拮抗薬が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３７】
予防のための薬学的薬剤または薬学的組成物として使用される薬学定薬物の剤形、投与経路、用量、及び投与スケジュールは、治療に使用される場合と同じである。
【０２３８】
例えば、インビトロアッセイ及び動物研究から得られたデータは、ヒトに使用するための投薬量の範囲を製剤化する際に使用され得る。このような組成物の投薬量は、好ましくは毒性が低い、ほとんどない、または全くない、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内である。投薬量は、採用される剤形及び利用される投与経路によりこの範囲内で変動し得る。薬学的組成物の治療有効量は、最初に、インビトロアッセイから推定され得る。用量は、症状の最大阻害の半分を達成するために必要とされる範囲を含む循環血漿濃度範囲を達成するように、マウスモデルにおいて製剤化され得る。血漿中のタンパク質レベルは、例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫ブロット、質量分光法などにより測定され得る。任意の特定の投薬量の効果は、エンドポイントの好適なバイオアッセイにより監視され得る。
【０２３９】
別途記載のない限り、本発明の薬学的組成物は、症状の重症度、及び腎病理の進行により、およそ約１．０ｎｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇの用量で投与され得る。非限定的な例として、薬学的組成物は、外来状況で、例えば、１、２、３、４、５日以上ごとに、緩徐な静脈内注入により、または例えば毎週、隔週、毎月、または隔月の投与により投与され得る。化合物の適切な治療有効量は、およそ約１ｎｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約１ｎｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１ｎｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ、約１００μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、及び約５００μｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。いくつかの実施形態では、適切な治療用量は、例えば、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．２５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．７５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇ、及び約１００ｍｇ／ｋｇから選択される。
【０２４０】
いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物は、例えば、１０、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、または３３ｍｇ／時間以下の注入速度で、２週間毎または４週間毎に、例えば、１．０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で静脈内注射により投与され得る。別の例では、コラーゲンＩＶタンパク質を含む薬学的組成物は、およそ約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０時間にわたって、２または４週間毎に、例えば、２０ｍｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内注射により投与され得る。
アルポート症候群を治療するための方法
【０２４１】
いくつかの実施形態では、本発明は、薬学的有効量の組換えコラーゲンＩＶタンパク質を含有する薬学的組成物を対象に投与することにより、コラーゲンＩＶタンパク質の１つ以上の欠乏によって特徴付けられる疾患状態の治療を必要とする対象においてそれを行うための方法を提供する。この状態は、α１、α２、α３、α４、α５、及びα６鎖から選択されるコラーゲンＩＶ  α鎖ポリペプチドのうちのいずれか１つにおけるいずれかの欠乏と関連し得る。好ましくは、この欠乏は、コラーゲンＩＶ  α３、α４、及びα５鎖に関連する。
【０２４２】
いくつかの態様では、コラーゲンＩＶタンパク質の欠乏によって特徴付けられる状態は、アルポート症候群、菲薄基底膜腎症（ＴＢＭＮ）、家族性血尿、末期腎疾患（ＥＳＲＤ）、進行性腎不全、糸球体性血尿、蛋白尿、遺伝性腎炎、糖尿病性腎症、周産期脳出血及び孔脳症、出血性卒中、ならびにコラーゲンＩＶタンパク質の欠損を伴うあらゆる疾患もしくは障害、ならびに／またはコラーゲンＩＶタンパク質の欠損を伴うあらゆる疾患もしくは障害から選択される。
【０２４３】
好ましい実施形態では、疾患はアルポート症候群である。アルポート症候群は、Ｘ連鎖性アルポート症候群、常染色体劣性アルポート症候群、または常染色体優性アルポート症候群であり得る。Ｘ連鎖性アルポート症候群は、α５（ＩＶ）鎖ポリペプチドをコードするＣＯＬ４Ａ５遺伝子におけるあらゆる突然変異によって引き起こされ得る。常染色体劣性アルポート症候群は、α４（ＩＶ）鎖ポリペプチド及びα５（ＩＶ）鎖ポリペプチドをコードするＣＯＬ４Ａ３及び／またはＣＯＬ４Ａ４遺伝子におけるあらゆる突然変異によって引き起こされ得る。常染色体優性アルポート症候群は、α４（ＩＶ）鎖ポリペプチド及びα５（ＩＶ）鎖ポリペプチドをコードするＣＯＬ４Ａ３及び／またはＣＯＬ４Ａ４遺伝子におけるあらゆる突然変異によって引き起こされ得る。
【０２４４】
一実施形態では、アルポート症候群の対象は、重度の蛋白尿を伴うアルポート症候群、軽度の蛋白尿を伴うアルポート症候群、血尿のみを伴うアルポート症候群、家族歴及び遺伝子スクリーニングにより診断される腎不全所見がないアルポート症候群、Ｘ連鎖性アルポート症候群、常染色体劣性アルポート症候群、または常染色体優性アルポート症候群と診断される。
【０２４５】
別の実施形態では、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ４Ａ４、及びＣＯＬ４Ａ５遺伝子における１つ以上の欠乏によって特徴付けられる状態は、聴覚機能障害、眼機能障害、出血を伴う脳小血管疾患、アクセンフェルト・リーガー異常を伴う脳小血管疾患、または脳内出血を更に含む。
【０２４６】
いくつかの実施形態では、本方法に使用される薬学的組成物は、組換えコラーゲンＩＶプロトマー、二量体、四量体、多量体、及び／またはこれらの混合物を含む。いくつかの態様では、組成物は、組換えコラーゲンＩＶプロトマーを含み、プロトマーは、α３（ＩＶ）、α４（ＩＶ）、及びα５（ＩＶ）鎖からなる群から選択される３本のα（ＩＶ）鎖を含むヘテロ三量体であり、この３本の鎖は３重らせんを形成する。好ましい実施形態では、組成物は、１本のα３（ＩＶ）鎖、１本のα４（ＩＶ）鎖、及び１本のα５（ＩＶ）鎖を有する組換えコラーゲンＩＶヘテロ三量体を含み、α３（ＩＶ）鎖は、配列番号３のアミノ酸配列及びそのバリアントを含み、α４（ＩＶ）鎖は、配列番号４のアミノ酸配列及びそのバリアントを含み、α５（ＩＶ）鎖は、配列番号５のアミノ酸配列及びそのバリアントを含む。
【０２４７】
他の実施形態では、コラーゲンＩＶプロトマーは、キメラα３（ＩＶ）、α４（ＩＶ）、及びα５（ＩＶ）鎖から選択される１本、２本、または３本のキメラα鎖を含むヘテロ三量体であってもよく、キメラα３（ＩＶ）鎖は、α３（ＩＶ）鎖のＮＣ１ドメインの全てまたは一部がα１（ＩＶ）もしくはα２（ＩＶ）鎖のＮＣ１ドメインの全てまたは一部に置き換えられるキメラポリペプチドを含み、キメラα４（ＩＶ）鎖は、α４（ＩＶ）鎖のＮＣ１ドメインの全てまたは一部がα１（ＩＶ）もしくはα２（ＩＶ）鎖のＮＣ１ドメインの全てまたは一部に置き換えられるキメラポリペプチドを含み、キメラα５（ＩＶ）鎖は、α５（ＩＶ）鎖のＮＣ１ドメインの全てまたは一部がα１（ＩＶ）もしくはα２（ＩＶ）鎖のＮＣ１ドメインの全てまたは一部に置き換えられるキメラポリペプチドを含む。
【０２４８】
いくつかの場合では、組成物は組換えコラーゲンＩＶ二量体を含み、該二量体は、本明細書に開示される、組換えコラーゲンＩＶ  α３−α４−α５及び／またはキメラコラーゲンＩＶであり得る２つのコラーゲンＩＶプロトマーを含む。いくつかの態様では、コラーゲンＩＶ二量体は、それを必要とする対象に投与される前に、インビトロで酵素的または化学的に二量体化される。
【０２４９】
いくつかの実施形態では、コラーゲンＩＶタンパク質を含む薬学的組成物は、それを必要とする対象に、静脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、髄腔内注射、脳室内投与、頭蓋内送達、眼内送達、耳内送達により、及び／または短期もしくは長期的に設置されたカテーテルにより投与される。好ましい実施形態では、組換えコラーゲンＩＶタンパク質は、それを必要とする対象に、静脈内注射により投与される。
【０２５０】
いくつかの実施形態では、コラーゲンＩＶタンパク質を含む薬学的組成物は、血栓症及び炎症、ならびに／または組換えコラーゲンＩＶタンパク質を対象に投与することにより誘導される他のアナフィラキシー反応を回避するために、１つ以上の予防薬と共に、それを必要とする対象に共投与され得る。このような予防薬は抗血栓薬及び／または抗炎症薬を含み得る。抗血栓薬は、血栓形成を減少させる薬剤である。本明細書に記載されるように、抗血栓薬は、コラーゲンＩＶの置き換えにより誘導された短期血栓形成を一次予防する、または二次予防するために使用され得る。抗血栓薬は、血小板の凝集を制限する抗血小板薬、血液が凝固する能力を制限する抗凝固薬、または血餅が形成された後に血餅を溶解するように作用する血栓溶解薬であり得る。抗血小板薬は、アスピリン及びトリフルサルなどの不可逆的シクロオキシゲナーゼ阻害剤；クロピドグレル、プラスグレル、チカグレロル、及びチクロピジンなどのアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）受容体阻害剤；シロスタゾールなどのホスホジエステラーゼ阻害剤；アブシキシマブ、エプチフィバチド、及びチロフィバンなどの糖タンパク質ＩＩＢ／ＩＩＩＡ阻害剤；ジピリダモールなどのアデノシン再取り込み阻害剤；トロンボキサンシンターゼ阻害剤などのトロンボキサン阻害剤；トロンボキサン受容体拮抗薬、ならびにテルトロバン（ｔｅｒｕｔｈｒｏｂａｎ）を含み得るが、これらに限定されない。抗凝固薬は、ワルファリン、ヘパリン、アセノクマロール、アトロメンチン、ブロディファコウム、及びフェニンジオンを含み得るが、これらに限定されない。血栓溶解薬は、アルテプラーゼ、レテプラーゼ、及びテネクテプラーゼなどの組織プラスミノーゲン活性化因子ｔ−ＰＡ；アニストレプラーゼ；ストレプトキナーゼ、及びウロキナーゼを含み得るが、これらに限定されない。
【０２５１】
いくつかの実施形態では、コラーゲンＩＶタンパク質を含む薬学的組成物は、それを必要とする対象に、１つ以上の抗炎症薬と共投与され得る。抗炎症薬は、アスピリン、イブプロフェン、ナプロキセンなどのＮＳＡＩＤｓ（非ステロイド系抗炎症薬）；アセトアミノフェン；ＩｍＳＡＩＤｓ（免疫選択的抗炎症薬）；リン酸化デンドリマー（例えば、米国特許出願公開第２０１００１７３８７１号を参照）を含み得るが、これらに限定されない。多くの他のＮＳＡＩＤｓは、米国特許第５，３８５，９４１号、同第５，３７３，０２２号、同第６，７３０，６９６号、同第７，１７３，０１８号、同第７，４１７，０３５号、同第７，７４１，３５９号、同第８，３１４，１４０号、及び同第８，５４１，３９８号に開示されており、これらのそれぞれの内容は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０２５２】
医薬品に加えて、抗炎症であるいくつかの健康／食物サプリメント、例えば、抗炎症プロスタグランジン（ＰＧＥ１及びＰＧＥ３）を作り出す食物も、本発明の薬学的組成物と共に使用され得る。抗炎症質を有するハーブ及び健康サプリメントは、ショウガ、ウコン、アルニカ・モンタナ、柳樹皮、緑茶、パイナップルブロメライン、及びインドオリバナムを含み得る。
【０２５３】
いくつかの実施形態では、抗血栓薬及び／または抗炎症薬は、それを必要とする対象に、本発明の組換えヒトコラーゲンＩＶタンパク質と同時に、実質的に同時に、または順次に、実質的に順次に投与され得る。
【０２５４】
タンパク質系薬品は、対象に投与されるとき、先天性免疫応答を誘導することが多いことは当該技術分野において既知である。いくつかの実施形態では、免疫応答を減少させることができる他の薬剤がコラーゲンＩＶタンパク質を含む本薬学的組成物と共に使用され得る。非限定的な例として、このような薬剤は、ステロイド（例えば、コルチコステロイド）、抗ヒスタミン、補体カスケードに対する抗体、及び／または米国特許第３，１６７，４７５号、同第４，８２９，０７７号、及び同第４，９０２，６８８号に論じられるものであり得る。
【０２５５】
いくつかの実施形態では、コラーゲンＩＶ欠乏を治療するための方法は、静脈内血管外漏出を促進する１つ以上の薬剤を必要とする対象にそれを投与する工程を更に含み、該薬剤はヒアルロニダーゼ及びヒスタミン作動薬を含む。
【０２５６】
最近の研究では、臭化物はイオン臭化物（Ｂｒ−）として動物において遍在的に存在し、スルフィルイミン架橋のペルオキシダジン触媒形成、組織発達に必須の翻訳後修飾、及び基底膜（ＢＭ）のコラーゲンＩＶ足場内に見られる構造のための必要な補因子であることが示された。次亜臭素酸に変換される臭化物は、ＢＭ組織化及び組織発達に重要な事象であるコラーゲンＩＶ内でのスルフィルイミン形成のためにエネルギー的に選択するブロモスルホニウム−イオン中間体を形成する（ＭｃＣａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１４，１５７（６），１３８０−１３９２）。臭素は、動物にとって必須の微量元素であり、臭素食品サプリメントはＧＢＭにおけるコラーゲンＩＶネットワークの形成を促進することができる。
【０２５７】
本発明のいくつかの実施形態によると、ペルオキシダジンのうちの１つ以上の補因子は、組換えヒトコラーゲンＩＶプロトマーの投与後、または実質的に投与後に対象に投与され得る。例えば、患者は臭素を含有する特殊な食事を取ることができる。
【０２５８】
いくつかの実施形態では、本発明は、コラーゲンＩＶタンパク質の投与が対象の表現型による帰結を予防及び／または寛解させるように、コラーゲンＩＶタンパク質を含む薬学的組成物の投与を必要とする対象においてそれらを行うことにより、糸球体基底膜（ＧＢＭ）の菲薄化及び分裂、重度の蛋白尿、軽度の蛋白尿、血尿、腎不全、末期腎疾患への進行、聴覚機能障害、眼異常、孔脳症、出血を伴う脳小血管疾患、アクセンフェルト・リーガー異常を伴う脳小血管疾患、腎障害、動脈瘤、及び筋肉を伴う遺伝性血管障害、ならびに／または脳内出血を含む１つ以上の異常を予防、寛解させるための方法を特徴とする。
【０２５９】
コラーゲンＩＶタンパク質は哺乳動物に投与され得る。哺乳動物は、マウス、ラット、イヌ、またはヒトであり得る。
【０２６０】
いくつかの更なる実施形態では、キメラα（ＩＶ）ポリペプチド及び／またはキメラα（ＩＶ）ポリペプチドをコードするキメラｃＤＮＡ構築物を発現する宿主細胞が本方法において使用され得る。該キメラα（ＩＶ）ポリペプチドは、α３（ＩＶ）、α４（ＩＶ）、及びα５（ＩＶ）ポリペプチドのそれぞれのＮＣ１ドメインの全てまたは一部がα１（ＩＶ）及び／またはα２（ＩＶ）ポリペプチドのＮＣ１ドメインの全てまたは一部に置き換えられるキメラα３（ＩＶ）、α４（ＩＶ）、及びα５（ＩＶ）ポリペプチドから選択され得る。
ＥＬＩＳＡアッセイ
【０２６１】
ＥＬＩＳＡは、血清または組織における組換えコラーゲンＩＶの濃度を検査するために使用される。血清または組織におけるコラーゲンＩＶレベルは、多くの条件において変化する。血清コラーゲンＩＶは、組織におけるコラーゲンＩＶの分解を示す場合があり、ＧＢＭを含む基底膜におけるコラーゲンＩＶと相関し得る。コラーゲンＩＶの定量測定は、組換えコラーゲンＩＶ治療の効果を監視するのに役立ち得る。エシュロンのコラーゲンＩＶ  ＥＬＩＳＡキットなどのＥＬＩＳＡ分析がこの目的のために使用され得る。製造者の提案に従い、ユーザは、単純に、提供された標準曲線及びそれらの試料をコラーゲンＩＶ捕捉プレートに添加し、インキュベーション及びプレートの洗浄後、ＨＲＰ標識された検出試薬を添加する。更なるインキュベーション及びプレート洗浄後、ＴＭＢ基質をプレートに添加し、１Ｎ硫酸の添加により比色反応を停止させる。４５０ｎｍでの吸光度を測定し、標準曲線との比較により試料の濃度を決定する。
バイオマーカーアッセイ
【０２６２】
本発明によると、血液、組織、及び尿内に存在する内因性分子は、コラーゲンＩＶの置き換え効果を測定するために使用され得る。特に、組換えヒトコラーゲンＩＶで治療された患者から得た血液及び尿試料が、アルブミン、免疫グロブリンＡ、Ｅ、Ｇ、及びＭ、ＤＢＰ、ＲＢＰ、α１ミクログロブリン、β２ミクログロプリン、キューブリン（ｃｕｂｕｌｉｎ）、アポリポタンパク質Ａ−１、及びメガリンなどのバイオマーカーの存在ならびに／または濃度を検査するために使用される。
コラーゲンＩＶ受容体結合アッセイ
【０２６３】
インテグリンは、コラーゲンを含む細胞外マトリックスタンパク質の主要な受容体である。インテグリン受容体は、非共有結合されるα及びβ膜貫通サブユニットから構成されるヘテロ二量体である。コラーゲン結合は、主に、インテグリンα１β１、α２β１、α１０β１、及びα１１β１により提供される。インテグリンα１０β１は優先的にコラーゲンＩＶに結合するが、コラーゲンＶＩ及びＩＩにも結合する。細胞は、ジスコイジンドメイン受容体１型（ＤＤＲ１）、ジスコイジンドメイン受容体２型（ＤＤＲ２）、糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）、及び／またはマンノース受容体などの他のコラーゲン受容体も発現し得る。細胞は、当該技術分野において周知のあらゆる技術を用いて、コラーゲンＩＶ受容体インテグリン（例えば、インテグリンα１０β１）を提示するように操作される。異なる濃度のコラーゲンＩＶタンパク質をインテグリン陽性細胞の培養培地に添加し、インテグリン−コラーゲンＩＶ結合動態、細胞遊走、処置した細胞の接着形態、及び分化を分析する。
血液細胞アッセイ
【０２６４】
いくつかの実施形態では、組換えコラーゲンＩＶで治療された対象から得た血液細胞は、焦点接着キナーゼ（ＦＡＫ）細胞アッセイなどの細胞接着アッセイにも使用され得る。いくつかの実施形態では、ヒト肺線維芽細胞を含む他の細胞が細胞接着アッセイに使用され得る。例えば、ヒト肺線維芽細胞を、コラーゲンＩＶインテグリン受容体を発現するベクターでトランスフェクトし、コラーゲンＩＶ事前コーティングされた４８ウェルプレートにおいて培養する。細胞を、所望の時間期間の間、事前コーティングされたウェルにおいて培養し、次に未結合細胞を洗い流し、接着した細胞を固定して染色し、その後染色した細胞から上清への色素溶出をもたらす抽出工程が続く。よって、細胞接着は５９５ｎｍで比色ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて定量することができる。
【０２６５】
コラーゲンＩＶタンパク質を検出するために、コラーゲンＩＶに対してモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）が使用され得る。ｍＡｂｓなどは米国特許第５，７４１，６５２号に開示されるものを含み得る。米国特許第８，４２０，３３１号に開示されるコラーゲンＩＶ免疫反応性ペプチドもコラーゲンＩＶを検出するために使用され得る。
シグナル伝達経路アッセイ
【０２６６】
血液細胞は、組換えコラーゲンＩＶタンパク質で治療された対象から得ることができる。コラーゲンＩＶ相互作用に関する細胞内シグナル伝達カスケード、及びコラーゲンＩＶタンパク質により誘導される遺伝子発現は、基底膜におけるコラーゲンＩＶの組み込みを試験するために使用され得る。
無細胞系におけるタンパク質相互作用
【０２６７】
コラーゲンＩＶがラミニン−１１１、コラーゲンＶＩ、及びバイグリカンなどの他の基底膜構成成分に結合する能力は、インビトロ結合アッセイにおいて試験される。
【０２６８】
このようなアッセイは、ラミニン−１１１、コラーゲンＶＩ、及びバイグリカンをプレート上にコーティングし、その後組換えコラーゲンＩＶのインキュベーションが続き、その後ＨＲＰまたは他のレポーター分子に化学的に接合される抗コラーゲンＩＶ抗体を用いてコラーゲンＩＶの検出が続く、ＥＬＩＳＡに基づいた方法を含み得る。ＢｉａＣｏｒｅなどの他のアッセイは、組換えコラーゲンＩＶに対するラミニン−１１１、コラーゲンＶＩ、及びバイグリカンの親和性を測定することができる。
【実施例】
【０２６９】
実施例１：コラーゲンＩＶ欠乏動物モデルへのコラーゲンＩＶタンパク質の投与
動物モデル（ＣＯＬ４Ａ３／ＣＯＬ４Ａ４ノックアウトモデル
【０２７０】
Ｃｏｓｇｒｏｖｅらは、ＣＯＬ４Ａ３ノックアウトによりアルポート症候群の常染色体形態のマウスモデルを生産した（Ｃｏｓｇｒｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１９９６，１０，２９８１−２９９２）。マウスは微小血尿及び蛋白尿を伴う進行性糸球体腎炎を発症した。末期腎疾患は約１４週齢で発症した。腎病理発達中の糸球体基底膜（ＧＢＭ）の透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）は、４週で外部毛細管ループにおいて始まり、８週までにＧＢＭ全体に広がった巣状の多重積層化された肥厚化及び菲薄化を明らかにした。１４週までに、糸球体の半分は線維化し、崩壊した毛細管を伴う。ＧＢＭの免疫蛍光分析は、通常メサンギウムマトリックスに局在化される、ＩＶ型コラーゲンα３、α４、及びα５鎖の不在、ならびにα１及びα２鎖の存続を示した。コラーゲン鎖に特異的なプローブを用いたノーザンブロット分析は、ノックアウトにおけるＣＯＬ４Ａ３の不在を示し、一方で、残りの鎖のｍＲＮＡは未変化であった。アルポート腎疾患の進行は、罹患した動物のＧＢＭにおけるフィブロネクチン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ラミニン−１、及びエンタクチンの蓄積と時間及び空間において相関した。
【０２７１】
ＣＯＬ４Ａ３欠乏マウスは、糸球体基底膜における顕著な構造欠損にもかかわらず、生後４週までに有足細胞及び細隙膜関連タンパク質の正常な発現を有した。５週目で、細隙膜内での変化、有足細胞の消失、及び細隙膜関連タンパク質であるネフリンの発現の変化があった。これらの所見は、糸球体基底膜タンパク質における欠損が潜行性の血漿タンパク質の漏出をもたらし、一方で、細隙膜の破壊は急激な血漿タンパク質の漏出をもたらすことを示唆する（Ｈａｍａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００２，２７７，３１１５４−３１１６２）。
【０２７２】
最近、別のマウスアルポート症候群モデルがＣＯＬ４Ａ４における突然変異により特定され、これらのマウスは、糸球体硬化、間質性腎炎、及び尿細管萎縮と関連する低年齢での尿中アルブミンの急速な増加を呈する（Ｋｏｒｓｔａｎｊｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，２０１４，８５，１４６１−１４６８）。
【０２７３】
一実験では、野生型のコラーゲンＩＶ  α３鎖ノックアウトマウス（ＣＯＬ４Ａ３−／−）及び／またはコラーゲンＩＶ  α４鎖ノックアウトマウス（ＣＯＬ４Ａ４−／−）を得、標準的な条件下で維持し、自由に標準的なマウス固形飼料及び水を摂取させた。ＣＯＬ４Ａ３遺伝子のホモ接合欠失は、前述のようにＰＣＲ反応により確認される（Ｃｏｓｇｒｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１９９６，１０，２９８１−２９９２）。尿検査が蛋白尿の進行減少、安定した蛋白尿、もしくは蛋白尿の減少を示すまで、または動物の寿命が維持される限り、マウス（野生型、ＣＯＬ４Ａ３＋／−、ＣＯＬ４Ａ３−／−）に、１ｎｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの様々な濃度で、毎日、１日おき、毎週、または隔週、コラーゲンＩＶを静脈内注射した。
動物モデル（ＣＯＬ４Ａ５モデル）
【０２７４】
イヌのＸ連鎖性遺伝性腎炎は、α５（ＩＶ）鎖ポリペプチドにおける未成熟の終止コドンの存在によって特徴付けられるヒトＸ連鎖性アルポート症候群の動物モデルである（Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９４，９１，３９８９−３９９３）。腎臓におけるイヌのコラーゲンＩＶ型遺伝子の発現は、大幅に減少したレベルのＣＯＬ４Ａ５遺伝子発現（通常のおよそ１０％）に加えて、ＣＯＬ４Ａ３及びＣＯＬ４Ａ４遺伝子の発現も、それぞれ、１４〜２３％及び１１〜１７％に減少したことを示す。これらの所見は、これら３つの基底膜タンパク質の発現を調整する機序を提案した（Ｔｈｏｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９６，２７１，１３８２１−１３８２８）。同様に、イヌのＸ連鎖性アルポート症候群及び対照動物を購入し、尿検査が蛋白尿の進行減少、安定した蛋白尿、もしくは蛋白尿の減少を示すまで、または動物の寿命が維持される限り、１ｎｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの様々な濃度で、毎日、１日おき、毎週、または隔週、コラーゲンＩＶを静脈内注射した。
コラーゲンＩＶタンパク質の静脈内投与後のマウス表現型測定
【０２７５】
尿中アルブミン及びクレアチニン濃度は、市販されているアッセイキット（例えば、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用して、比色アッセイを用いて推定される。尿中アルブミン排出は、前述のように、尿中アルブミン及び尿中クレアチニンの指数として推定される（Ｓｕｇｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｌａｂ  Ａｎａｌ．，２００３，１７（２），３７−４３）。
腎組織の組織学的評価
【０２７６】
腎臓の組織を固定し、ヘマトキシリン−エオジン（Ｈ＆Ｅ）で染色する。腎病理の程度は、前述のように、糸球体疾患、尿細管萎縮、及び間質線維化の形態計測により評価される。糸球体基底膜の構造を検査するために、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）及び走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）を使用する。蛋白尿における改善は、ＧＢＭの分裂の減少もしくは肥厚化の減少、または有足細胞の足突起の再構築など、ＧＢＭの構造及び形態の正常化と一致しないが、アルポート症候群におけるこのような形態学的表現型の寛解は有効性の測定を提供すると想定される。組換えコラーゲンＩＶを用いたアルポート症候群の早期治療はＧＢＭ構造の正常化をもたらすと想定される。
免疫組織化学（コラーゲンＩＶ発現）
【０２７７】
免疫蛍光染色は前述のように行われる（Ｃｏｓｇｒｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１９９６，１０，２９８１−２９９２）。α３（ＩＶ）、α４（ＩＶ）、またはα５（ＩＶ）鎖のいずれかに特異的な抗体が、コラーゲンＩＶを投与されたマウスにおけるコラーゲンＩＶタンパク質を染色するために使用される。臓器を採取する前に、２％ＰＢＳ緩衝ホルマリンでマウスを灌流する。凍結切片した組織試験片を、α３（ＩＶ）、α４（ＩＶ）、またはα５（ＩＶ）鎖のいずれかに対して一次抗体で、室温で１時間染色し、切片を蛍光（例えば、ＦＩＴＣ、ＧＦＰ）複合二次抗体と反応させる。ＧＢＭに存在する組換えコラーゲンＩＶタンパク質が蛍光標識され、分析される。
実施例２：アルポートマウスモデルへの（α１）２／α２（ＩＶ）コラーゲンの投与
【０２７８】
本明細書に記載されるように、ＧＢＭにおける主要なコラーゲンイソ型α３／４／５（ＩＶ）に加えて、コラーゲンイソ型（α１）２／α２（ＩＶ）ネットワークは、ＧＢＭの内皮下領域に存在し、ＧＢＭの発達及び機能に重要な役割を担う。アルポートＧＢＭにおける欠損はコラーゲンネットワークの必要な安定性をもたらすのに十分なイソ型（α１）２／α２（ＩＶ）が存在しないためであると仮定される。イソ型（α１）２／α２（ＩＶ）の静脈内注入がＧＢＭにおけるコラーゲン（α１）２／α２（ＩＶ）レベルを増加させ、病変の更なる発達及び進行を阻止し、腎不全に進行する腎疾患を大幅に緩徐化することができるという仮説を試験するために、実験が設計される。
【０２７９】
野生型のコラーゲンＩＶ  α３鎖ノックアウトマウス（ＣＯＬ４Ａ３−／−）及び／またはコラーゲンＩＶ  α４鎖ノックアウトマウス（ＣＯＬ４Ａ４−／−）を得、標準的な条件下で維持し、自由に標準的なマウス固形飼料及び水を摂取させた。加えて、マウスは１２９Ｓ１／ＳｖＩｍＪ株背景、またはＢ６背景、または１２９Ｓ１／Ｂ６ハイブリッド背景のいずれかであり得る。腎機能不全は１２９Ｓ１背景では迅速に進行し（約１０週）、Ｂ６背景ではゆっくりであり（約８ヶ月）、１２９Ｓ１／Ｂ６ハイブリッド背景では中程度であった（約４ヶ月）。
【０２８０】
一実験では、１２９Ｓ１／ＳｖＩｍＪ株背景のＣｏｌ４ａ３−／−アルポートマウスを、各群７〜１０匹のマウスの３つの処置群に分ける。各群を、それぞれ、ビヒクルのみ、低用量のコラーゲンイソ型（α１）２／α２（ＩＶ）、及び高用量のコラーゲンイソ型（α１）２／α２（ＩＶ）で、静脈内注射により処置した。処置を３〜４週齢で開始し、少なくとも１０週齢まで毎週続けるか、または処置が腎疾患の進行を緩徐化させるのに有効であると証明された場合、それ以上続けられる。
【０２８１】
実施例１と同様に、コラーゲンイソ型（α１）２／α２（ＩＶ）の投与後に、ＧＢＭの形態、コラーゲン組み込み、及び腎機能が分析される。低用量または高用量のいずれかで標識されたコラーゲンイソ型（α１）２／α２（ＩＶ）を注射された数匹のマウスを様々な週齢で屠殺して、標識がＧＢＭに集中したかを決定する。
【０２８２】
尿は、タンパク質及びクレアチニンに関して１〜２週毎に分析される（４週齢で開始する）。体重損失が腎不全の前に生じるため、総合的な健康の一般的な測定として、動物の体重を７〜１０日毎に決定する（６週齢で開始する）。処置したマウスを、様々な週齢で（尿及び体重分析の結果により）、または腎臓の組織像及び糸球体微細構造を検証することができ、また線維形成及び糸球体基底膜構造に対する処置の効果を決定することができるように、腎不全の時に屠殺する。
【０２８３】
分析の結果は、静脈内コラーゲンイソ型（α１）２／α２（ＩＶ）処置が腎疾患の進行の緩徐化に有益であるかの決定を可能にする。更に、最も有効な用量が実験により決定される。
実施例３：マウスＣｏｌ４（α１（２）α２）調製物の特徴
【０２８４】
マウス組織からコラーゲンＩＶ型タンパク質（Ｃｏｌ４（α１（２）α２））を精製し、調製した。Ｃｏｌ４（α１（２）α２）調製物内の種、ならびにプロトマー、二量体、四量体、及び凝集物の相対比を試験するために、変性及び未変性ゲル電気泳動を使用し、各バンドのサイズを分析した。
【０２８５】
Ｃｏｌ４（α１（２）α２）タンパク質に結合するそれらの能力に関して、いくつかの市販の抗体を評価し、抗体は、ヒトコラーゲンＩＶ型α２鎖の内部エピトープを認識するウサギポリクローナル抗体を含む抗体（カタログ番号ｓｃ７０２４６，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ，ＵＳＡ）、ヒト胎盤からのヒトコラーゲンＩＶ  ａａ１−１６６９に対応する完全長の未変性の精製されたタンパク質の免疫原を使用して産生されるウサギポリクローナル抗体（カタログ番号ａｂ６５８６，Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）、及びマウスＥＨＳの腫瘍組織から抽出及び精製された、完全長の未変性コラーゲンＩＶの免疫原を使用して産生されるウサギポリクローナル抗体（カタログ番号ａｂ１９８０８，Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）を含む。
【０２８６】
マウスからの精製したＣｏｌ４（α１（２）α２）タンパク質（カタログ番号ｓｃ−２９０１０，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ，ＵＳＡ）は、変性／非還元ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を使用して分離され、それぞれ、ｓｃ−７０２４６（１：１００希釈）、ａｂ６５８６（１：１０００希釈）、及びａｂ１９８０８（１：１０００希釈）で免疫ブロットされた。ＨＲＰ複合抗ウサギＩｇＧ二次抗体（１：２０，０００希釈）は、バンドを可視化するために使用された。図１に示されるように、マウスＣｏｌ４（α１（２）α２）タンパク質は、天然に、個々のα１及びα２鎖（Ｉ）（約１８０ＫＤａ）、プロトマー（Ｐ）（約４８０ＫＤａ）、二量体（Ｄ）（約９００ＫＤａ）、及び四量体（Ｔ）（９００ＫＤａより大きい）を含むＣｏｌ４（α１（２）α２）の４つの主要な種を含有する。精製及び調製により完全長のポリヌクレオチド及びタンパク質を確保し、非常に少ない分解産物を有するタンパク質がＣｏｌ４（α１（２）α２）調製物において観察された。試験された３つ全ての抗Ｃｏｌ４抗体の中で、Ａｂｃａｍからの抗体ａｂ６５８６がＣｏｌ４（α１（２）α２）タンパク質の検出において最も感受性である。
【０２８７】
上述のように、コラーゲンＩＶタンパク質はジスルフィド結合を介して連結され、安定される。ジスルフィド還元がＣｏｌ４（α１（２）α２）種を個々のアルファ鎖、プロトマー、二量体、及び四量体に分解するかを試験するために、サイズの特徴付けが更に分析された。ジスルフィド還元して、または還元せずにＳＤＳ−ＰＡＧＥの変性を行い、比較した。ジスルフィドを選択的に還元するために、ＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）を使用した。図２Ａ及び２Ｂの代表的なゲル画像に示されるように、ジスルフィド還元しないＰＡＧＥの変性は、Ｃｏｌ４（α１（２）α２）種を個々のアルファ鎖（Ｉ）、プロトマー（Ｐ）、二量体（Ｄ）、及び四量体（Ｔ）（図２Ａ）に分解する（図２Ａ）。ジスルフィド還元によるＰＡＧＥの変性は、Ｃｏｌ４（α１（２）α２）種を、ほぼある程度のプロトマー（Ｐ）、二量体（Ｄ）、及び四量体（Ｔ）を有して個々のアルファ鎖（Ｉ）に分解する（図２Ｂ）。この結果は、未変性Ｃｏｌ４（α１（２）α２）タンパク質がジスルフィド結合及び非ジスルフィド結合種の混合物を含有し、この大多数が個々のアルファ鎖に還元され得ることを示唆する。ＧＢＭの別の構造タンパク質であるＬＡＭ−１１１（カタログ番号２３０１７−０１５，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）は、Ｃｏｌ４（α１（２）α２）の個々のアルファ鎖と比較するために正確な分子量標準として平行して試験された。
【０２８８】
ｐＨ条件は、Ｃｏｌ４（α１（２）α２）プロトマー、二量体、及び四量体の形成に対するその作用のために試験された。Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ（カタログ番号ｓｃ−２９０１０）からのＣｏｌ４（α１（２）α２）タンパク質を、それぞれ、酸性溶液（５０ｍＭ  ＨＣｌ，ｐＨ〜２．０）、中性ＴＢＳ（２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ及び５００ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ〜７．５）、及び塩基性トリス−ＨＣｌ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ〜９．０）に希釈し、ジスルフィド還元して、または還元せずにＳＤＳ−ＰＡＧＥを変性することにより分析した。全ての調製物は、ローディング試料緩衝液を添加する前に、室温で１７分間組織化された。別々のバンドは、銀染色または抗体ｓｃ６５８６を使用した免疫ブロットにより可視化された。ジスルフィド還元して、または還元しない３つ全て（酸性、中性、塩基性）の条件において、全くまたは非常に少ししか凝集は観察されなかった。３つ全てのｐＨ条件において、ジスルフィド還元処理は、高分子量の二量体（Ｄ）及び四量体（Ｔ）からプロトマー（Ｐ）及び個々のアルファ鎖（Ｉ）にほぼ完全に還元される（データ示さず）。この結果は、個々のアルファ鎖、プロトマー、二量体、及び四量体の間での自己触媒ジスルフィド形成がｐＨ依存プロセスであり、可逆的であることを示唆する。
【０２８９】
アルファポリヌクレオチド鎖上の異なる電荷はコラーゲンＩＶ組織化に影響を及ぼす可能性がある。我々は、ダイレクトレッド８０電荷がＣｏｌ４（α１（２）α２）種の比率をシフトさせることができるかを試験した。Ｃｏｌ４（α１（２）α２）調製物及びＬＡＭ−１１１を酸性緩衝液（５０ｍＭ  ＨＣｌ）に希釈し、０．０１％ダイレクトレッド８０染料（カタログ番号３６５５４８，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するゲル試料緩衝液にロードし、ジスルフィド還元して、または還元せずに、０．０１％ダイレクトレッド８０染色を含有する酸性化泳動用緩衝液を使用して、未変性ＰＡＧＥにより分析した。未変性ＰＡＧＥ分離は、変性ＳＤＳ  ＰＡＧＥに類似するＣｏｌ４バンドを生成する。ダイレクトレッド８０がＣｏｌ４を電荷シフトさせ、未変性ＰＡＧＥによりＣｏｌ４（α１（２）α２）調製物を分離できることが示された。７０℃でのＣｏｌ４（α１（２）α２）調製物のジスルフィド還元は、プロトマー（Ｐ）、二量体（Ｄ）、及び四量体（Ｔ）を分離することができる。非還元Ｃｏｌ４（α１（２）α２）未変性調製物において、プロトマー（Ｐ）、二量体（Ｄ）、及び四量体（Ｔ）は明らかであるが、２ＭＤより大きい凝集はない（図３）。
【０２９０】
まとめると、これらの結果は、Ｃｏｌ４−α１（２）α２がインビトロにおいて二量体化及び四量体化することができることを示す。
実施例４：インビトロにおける血小板凝集
休止血小板の調製
【０２９１】
マウスの血小板豊富血漿（ＰＲＰ）を、前述のように調製した（Ｈｏｆｆｍｅｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ｔｈｅ  ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｃｈｉｌｌｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｐｌａｔｅｌｅｔｓ．Ｃｅｌｌ  ２００３；１０（１）：８７−９７）。血小板の活性化を防止するために、全ての遠心分離工程はプロスタグランジンＥ１を含んだ。マウス染色ＣＤ−１が休止血小板の調製に使用された。
【０２９２】
０．１容量のＡｓｔｅｒ−Ｊａｎｄｌ抗凝固薬に採取した、健康なボランティアからのヒト血液を、１００ｇで１０分間遠心分離した。いずれのボランティアも、血液採取の少なくとも１０日前に、アスピリンまたは他の非ステロイド系抗炎症薬を摂取しなかった。単離した血小板豊富血漿懸濁液を３７℃で最大１時間インキュベートした。
休止血小板の活性化
【０２９３】
ヒト血液から調製した休止血小板を、異なる濃度のＣｏｌ４（α１（２）α２）タンパク質と共に５〜１０分間インキュベートし（表４）、８ｕＭトロンビン受容体活性化ペプチド（ＴＲＡＰ）（カタログ番号Ｔ１５７３，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）を使用して活性化させた。
【０２９４】
マウスから調製した休止血小板を、最初に４μｌのＣｏｌ４（α１（２）α２）タンパク質、次に更に４０μｌのＣｏｌ４（α１（２）α２）タンパク質と共に５〜１０分間インキュベートし、２５ｕＭ  ＡＤＰ（カタログ番号１０１３１２，ＢＩＯ／ＤＡＴＡ  Ｃｏｒｐ．  ＵＳＡ）を使用して活性化させた。
【０２９５】
血小板の凝集は、活性化数分後に始まり、ＧＰＩＩａ／ｂ受容体の作動の結果として生じ、これはこれらの受容体がフォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）またはフィブリノーゲンに結合することを可能にする。血小板の活性化は、湾曲した形状から直線にそれらの形状を変化させ、このような活性化は、血小板凝集計（ＢＩＯ／ＤＡＴＡ  Ｃｏｒｐ．Ｈｏｒｓｈａｍ，ＰＡ，ＵＳＡ）を使用して検出することができる。
【０２９６】
表４．血小板凝集アッセイ
【０２９７】
【表４】
2017532365.tif 000020
【０２９８】
結果は、Ｃｏｌ４（α１（２）α２）が血小板を活性化しなかったか、または凝集を誘導しなかったことを示す。更に、Ｃｏｌ４（α１（２）α２）調製物は、作動薬ＴＲＡＰまたはＡＤＰにより誘導された血小板凝集を阻害しなかった。
実施例５：Ｃｏｌ４（α１（２）α２）及びＬＡＭ−１１１のインビトロ標識
【０２９９】
α２
注射したＣｏｌ４（α１（２）α２）、特にインビボのＧＢＭにおける高分子量種のＣｏｌ４（α１（２）α２）（約９００ＫＤａ）の堆積を可視化するために、Ｃｏｌ４（α１（２）α２）及びＬＡＭ−１１１タンパク質を最初にフルオロセイン（ＦＩＴＣ）で標識した。この実験では、ヘキサン酸スペーサーを含有する混合イソ型（カタログ番号Ｆ２１８１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）の５（６）−ＳＦＸ（６−（フルオロセイン−５−（及び−６）−カルボキサミド）ヘキサン酸、スクシンイミジルエステル）を、Ｃｏｌ４（α１（２）α２）及びＬＡＭ−１１１を標識するために使用した。１０ｍｇ／ｍｌの５（６）−ＳＦＸを１ｍｌの無水ジメチルホルムアミド（１０ｍｇ／ｍｌ）に溶解した。２．５ｍｇのＣｏｌ４（α１（２）α２）及び１．２ｍｇのＬＡＭ−１１１は、ＺｅｂａＳｐｉｎ脱塩２ｍｌカラム（カタログ番号８９８９０，Ｔｈｅｒｍｏ，ＵＳＡ）を使用して、最初に０．２Ｍカーボネート（ｐＨ８．３）に緩衝液交換された。次いで、５（６）−ＳＦＸ溶液を１０％（容量／容量）に添加し、反応のために混合物を室温で１時間攪拌した。次いで、混合物は、ＺｅｂａＳｐｉｎ脱塩２ｍｌカラムを使用して１×ＰＢＳに緩衝液交換された。
【０３００】
ＦＩＴＣ標識されたＣｏｌ４（α１（２）α２）及びＦＩＴＣ−ＬＡＭ−１１１複合体は、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、安定性に関して試験された。ＦＩＴＣ−Ｃｏｌ４（α１（２）α２）及びＦＩＴＣ−ＬＡＭ−１１１複合体を検出するために、ウサギまたはヤギのポリクローナル抗ＦＩＴＣ−ＨＲＰ抗体を使用し、一方、ＦＩＴＣ−Ｃｏｌ４（α１（２）α２）複合体及び未標識Ｃｏｌ４（α１（２）α２）の両方を検出するために、抗ウサギＨＲＰ二次抗体と共にウサギ抗Ｃｏｌ４（α１（２）α２）抗体を使用した。図４は、Ａｂｃａｍからの試験した抗ＦＩＴＣ抗体ａｂ１９４９２（ウサギ）及びａｂ６６５６（ヤギ）がＦＩＴＣ−Ｃｏｌ４（α１（２）α２）複合体のみを検出することを図示する。抗ＦＩＴＣ及び抗Ｃｏｌ４（α１（２）α２）抗体の染色の比較は、ＦＩＴＣ標識されたＣｏｌ４（α１（２）α２）が減少したことを示し、広範なＦＩＴＣ標識がＣｏｌ４（α１（２）α２）エピトープを覆ったか、またはＣｏｌ４（α１（２）α２）の安定性を減少させたかのいずれかの可能性があることを示唆する。
【０３０１】
ＦＩＴＣ−Ｃｏｌ４（α１（２）α２）複合体の質はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析された。代表的なゲル画像を図５ａに示す。ＥＬＩＳＡアッセイの結果と一致して、バンドサイズ分析は、ＦＩＴＣ−Ｃｏｌ４（α１（２）α２）の検出が大幅に減少することを示し、広範なＦＩＴＣ標識がＣｏｌ４エピトープを覆ったか、またはその安定性を減少させたかのいずれかの可能性があることを示唆する。しかしながら、ａｂ１９４９２（１：２０，０００希釈）での抗ＦＩＴＣ免疫ブロットは、圧倒的に二量体及び個々の鎖であるＦＩＴＣ−  Ｃｏｌ４（α１（２）α２）の高感度の検出を明らかにした（図５ｂに示される）。これらの結果は、タンパク質濃度の定量及び注射される量が推定及び調節される場合、ＦＩＴＣ−  Ｃｏｌ４（α１（２）α２）複合体が注射に好適であることを示唆する。
【０３０２】
ＦＩＴＣ−ＬＡＭ−１１１複合体は、ＥＬＩＳＡアッセイ及び免疫ブロットにより試験したとき、ＦＩＴＣ−Ｃｏｌ４（α１（２）α２）複合体に類似する（図６ａ〜６ｃ）。
実施例６：Ｃｏｌ４−α１（２）α２のインビボ投与及びＧＢＭにおける検出
【０３０３】
前の実施例において記載されるように調製されたＦＩＴＣ−Ｃｏｌ４（α１（２）α２）及びＦＩＴＣ−ＬＡＭ−１１１複合体を、野生型、ヘテロ接合、及びアルポートマウスに全身投与し、腎臓のＧＢＭにおけるＦＩＴＣ−Ｃｏｌ４（α１（２）α２）及びＦＩＴＣ−ＬＡＭ−１１１複合体の局在化を検査した。
【０３０４】
Ｂ６もしくは１２９Ｓのいずれか、またはハイブリッド背景のＣｏｌ４＋／−及びＣｏｌ４−／−マウスに、それぞれ、ＦＩＴＣ−Ｃｏｌ４（α１（２）α２）またはＦＩＴＣ−ＬＡＭ−１１１複合体を１回または６回静脈内注射した。マウスを観察し、あらゆる異常を記録し、研究の終わりに、または投薬の合間中のいずれかに、組織試料を採取した。投薬スケジュール及び時間間隔は表５に列記される。
【０３０５】
免疫蛍光（ＩＦ）染色の技術分野において記載される標準的な手順に従い、採取した組織サンプルを処理した。抗アグリン抗体ＬＧ１１２３（Ｓｃｈｌｏｔｚｅｒ−Ｓｃｈｒｅｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．，２００７，８５（６）：８４５−８６０）及び抗ＦＩＴＣ−ＨＲＰ抗体ａｂ６６５６（Ａｂｃａｍ）を２重染色のために使用した。染色した試料を検査し、共焦点顕微鏡を使用して染色画像を撮り、分析した。各染色に関して、腎臓の切片を、対照として抗アグリン抗体ＬＧ１１２３のみで染色し、ＦＩＴＣシグナルを検査した。ＦＩＴＣシグナルは糸球体において全く観察されないか、または非常に弱く、ＦＩＴＣ−Ｃｏｌ４−α１（２）α２及びＦＩＴＣ−ＬＡＭ−１１１複合体を注射した組織試料に見られたＦＩＴＣシグナルがこれらのＦＩＴＣ複合体に特異的であることを示す。各マウスからの糸球体におけるＦＩＴＣ−Ｃｏｌ４−α１（２）α２タンパク質の染色パターンも表５に要約された。
【０３０６】
これらの結果は、全身投与されたＦＩＴＣ−Ｃｏｌ４−α１（２）α２及びＦＩＴＣ−ＬＡＭ−１１１複合体（例えば、静脈内注射）が腎臓に送達され、マウス腎臓のＧＢＭ内に浸透できることを示す。ＧＢＭ内へのＦＩＴＣ−Ｃｏｌ４−α１（２）α２の堆積が強く現れることも示唆する。
【０３０７】
興味深いことに、共焦点画像（図７ａ〜７ｄ）は、検出されたＦＩＴＣ−Ｃｏｌ４シグナルは主にアグリンシグナルとオーバーラップするが、ＦＩＴＣ−ＬＡＭ−１１１シグナルの一部分のみがアグリンシグナルとオーバーラップすることを示す。つまり、ＦＩＴＣ−Ｃｏｌ４−α１（２）α２注射された腎臓は、ＦＩＴＣ−ＬＡＭ−１１１注射された腎臓よりもＧＢＭへのＦＩＴＣシグナルの局在化が多いことを示す。
【０３０８】
３日間にわたって投与された最大６回の注射後、毒性は観察されなかった。データは、全身送達後、Ｃｏｌ４産物ならびにＬＡＭ−１１１対照薬（それぞれが高分子量タンパク質である）がマウスＧＢＭ内に堆積可能であることを示す。
【０３０９】
ＧＢＭにおけるＦＩＴＣ−Ｃｏｌ４−α１（２）α２及びＦＩＴＣ−ＬＡＭ−１１１のこのような堆積は、堆積したＣｏｌ４−α１（２）α２タンパク質がＧＢＭにおけるコラーゲンネットワーク内に組み込まれ、アルポートＧＢＭの機能性を復旧させることができるかを試験するために更に検証され得る。実施例１及び２に記載されるものなど、Ｃｏｌ４−α１（２）α２の長期反復投薬がアルポートマウスモデルにおいて治療的であるかの評価が研究される。
【０３１０】
加えて、ＦＩＴＣ−ＬＡＭ−１１１のＧＢＭへの堆積は、ＬＡＭ−５２１などの他のラミニンイソ型がピアソン症候群などの他の腎疾患に治療的であり得ることを示す。
【０３１１】
表５．ＦＩＴＣ標識されたＣｏｌ４−α１（２）α２及びＬＡＭ−１１１の系統的投与
【０３１２】
【表５−１】
2017532365.tif 000021
【０３１３】
【表５−２】
2017532365.tif 000022
【０３１４】
【表５−３】
2017532365.tif 000023
【０３１５】
【表５−４】
2017532365.tif 000024
【０３１６】
実施例７：Ｃｏｌ４−α１（２）α２の長期反復投薬及びアルポートマウスにおける治療効果
コラーゲンＩＶの置き換えの治療有効性がアルポートマウスを使用して試験された。アルポート及び対照マウスは、ある時間期間にわたって５ｍｇ／ｋｇの用量で、Ｃｏｌ４−α１（２）α２タンパク質を反復投薬された。注射溶液は、１３０μｌのＦＩＴＣ−Ｃｏｌ４−α１（２）α２（０．５ｍｇ／ｍｌ）及び１４．５μｌの１０Ｘトリス緩衝生理食塩水を混合することにより調製された。表６に図示されるように、６匹のマウスに、生後２８日（ｐ２８）で開始して少なくとも６週間の間、週に２回投薬し、試験動物の寿命が維持される場合、投薬を継続した。各動物の一般的な健康を監視し、毎日寿命を記録した。各処置された動物からの尿試料を規則的に採取し、更に分析した。
【０３１７】
表６：長期反復投薬の有効性研究
【０３１８】
【表６】
2017532365.tif 000025
【０３１９】
結果
Ｃｏｌ４−α１（２）α２タンパク質堆積
少なくとも６週間のＣｏｌ４−α１（２）α２または対照ビヒクルの反復投薬後、マウスの腎臓における既知のＧＢＭタンパク質であるＣｏｌ４−α１（２）α２及びアグリン２重免疫蛍光免疫染色により、類似する染色を行った。前の観察（実施例６に論じられ、図７ａ〜７ｄに示されるように）と一致して、Ｃｏｌ４−α１（２）α２タンパク質は腎臓における糸球体内に堆積し、ＧＢＭの他のタンパク質（例えばアグリン）と共局在化する。
糸球体の形態  
【０３２０】
実験マウスの糸球体の形態も検査された。対照（すなわち、注射なしまたはビヒクル注射された）アルポートマウス（Ｃｏｌ４−／−）と比較して、Ｃｏｌ４−α１（２）α２注射されたアルポートマウス（Ｃｏｌ４−／−）はＧＢＭの毛細管ループの開口及び鮮明な線状染色を維持し（図８のａ及びｂ）、硬化糸球体が少なく、炎症が減少していることを示す。図８に示されるように、Ｃｏｌ４−α１（２）α２投薬の６週間後（生後７０日）の各マウスから少なくとも１００の糸球体を数え、統計的に分析した。統計的データは、Ｃｏｌ４−α１（２）α２処置されたアルポートマウス（Ｃｏｌ４−／−）が６１％の非硬化糸球体を有し、一方、未処置のアルポートマウス（ｃｏｌ４−／−）及びビヒクル処置されたアルポートマウス（Ｃｏｌ４−／−）が、それぞれ、３６％及び２９％の非硬化糸球体を有することを示す。
寿命
【０３２１】
生存データは、Ｃｏｌ４−α１（２）α２で処置されたアルポートマウス（Ｃｏｌ４−／−）がビヒクル処置されたアルポートマウス（Ｃｏｌ４−／−）よりも長く生存したことを示す。アルポートマウスの寿命は、マウスの体重がそのピーク体重の１５％降下したために人道的に殺処分されなければならない日である。Ｃｏｌ４−α１（２）α２で処置された７匹のアルポートマウスのうち、２匹が９７日及び１０５日生存し、ビヒクル処置されたアルポートマウスの〜９０日の寿命をだいぶ超える（表９）。ＣＯＬ４の胚性イソ型であるＣｏｌ４−α１（２）α２は成体アルポート腎臓内にすでに発現されているが、Ｃｏｌ４−α３／α２／α５よりもタンパク質分解による消化により感受性であることが知られる（（Ｋａｌｌｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９（１０），１９９７，２４７０−２４７８、及びＧｕｎｗａｒ，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３（１５），１９９８，８７６７−８７７５）。したがって、外因性Ｃｏｌ４−α１（２）α２の糸球体内への投与及び堆積は、既存のＣｏｌ４−α１（２）α２と共に、糸球体基底膜を維持し、糸球体の硬化を遅延するように思えた。Ｃｏｌ４−α３／α２／α５のタンパク質分解による消化に対する耐性を考えると、ＣＯＬ４−３４５によるアルポートマウスの処置は、処置が早期に開始される場合、Ｃｏｌ４−α１（２）α２よりも大きな有効性及び長い寿命をもたらすことが期待される。加えて、処置されたアルポートマウスにおいて毒性の徴候は観察されず、高用量のＣｏｌ４−α１（２）α２の長期的な反復投薬が安全であることを示唆する。
糸球体毛細管
【０３２２】
アルポートマウスにおける糸球体毛細管の詳細が電子顕微鏡により更に分析された。ビヒクル処置及びＣｏｌ４−α１（２）α２処置されたアルポートマウス（Ｃｏｌ４−／−）における毛細管のネットワークは類似したパターンを共有する。糸球体基底膜における教訓は、ビヒクル注射されたアルポートマウス（図９ｂ）と比較したとき、Ｃｏｌ４−α１（２）α２注射されたアルポートマウスにおいて顕著な相違を示さず（図９ｃ）、両方とも対照マウス（ヘテロ接合Ｃｏｌ４＋／−マウス）（図９ａ）とは顕著に異なる。
血中尿素窒素（ＢＵＮ）分析
【０３２３】
アルポートマウス（Ｃｏｌ４−（α１（２）α２を注射されたＣｏｌ４−／−）において、顕著な相違は糸球体毛細管において観察されなかったが、血中尿素窒素（ＢＵＮ）検査は、図１１に示されるように、一部の処置されたアルポートマウスにおいて外因性コラーゲンＩＶタンパク質の利益を示す。表７は、反復投薬中の異なる時間点でのそれぞれの処置されたアルポートマウスにおけるＢＵＮ測定値を列記する。 
【０３２４】
表７：それぞれの処置されたアルポートマウスにおけるＢＵＮ測定値
【０３２５】
【表７−１】
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【０３２６】
【表７−２】
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【０３２７】
【表７−３】
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【０３２８】
【表７−４】
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【０３２９】
尿中アルブミン対クレアチニン比（ＵＡＣＲ）分析
同様に、ビヒクルを注射されたアルポートマウス（Ｃｏｌ４−／−）と比較したとき、Ｃｏｌ４−（α１（２）α２）を注射されたアルポートマウス（Ｃｏｌ４−／−）の尿中アルブミン及びクレアチニン比は、外因性コラーゲンＩＶ処置の利益を示唆する（図１２）。表８は、反復投薬中の異なる時間点でのそれぞれの処置されたアルポートマウスにおける尿中アルブミン／クレアチニン比を列記する。
【０３３０】
表８：それぞれの処置されたアルポートマウスの尿中アルブミン／クレアチニン比
【０３３１】
【表８−１】
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【０３３２】
【表８−２】
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【０３３３】
【表８−３】
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【０３３４】
表９に要約されるように、アルポート（Ｃｏｌ４−／−）マウスにおける外因性コラーゲンＩＶタンパク質の置き換えは、この症候群に対する顕著な利益を示唆する。
【０３３５】
表９：アルポート（Ｃｏｌ４−／−）マウスにおけるＣｏｌ４−（α１（２）α２置き換えの効果
【０３３６】
【表９】
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【０３３７】
均等物及び範囲
当業者は、日常的以上の実験をすることなく、本明細書に記載される発明による特定の実施形態に対する多くの均等物を認識するか、または把握することができるだろう。本発明の範囲は、上記の説明を限定することを意図するのではなく、むしろ添付の特許請求の範囲に記載される通りである。
【０３３８】
特許請求の範囲において、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」などの冠詞は、反対が示されない限り、または別様に文脈から明らかでない限り、１つまたは２つ以上を意味し得る。群の１つ以上の成員の間で「ｏｒ」を含む特許請求の範囲または説明は、反対が示されない限り、または別様に文脈から明らかでない限り、群の成員のうちの１つ、２つ以上、または全てが所与の製品またはプロセスに存在する、採用される、または別様に適切である場合に満たされると考えられる。本発明は、群のうちの正確に１つの成員が所与の製品またはプロセスに存在する、採用される、または別様に適切である実施形態を含む。本発明は、２つ以上または全ての群の成員が所与の製品またはプロセスに存在する、採用される、または別様に適切である実施形態を含む。
【０３３９】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、非限定的かつ許可であることが意図されるが、追加的な要素または工程の包含を必要としないことにも留意する。用語「含む」が本明細書で使用されるとき、用語「からなる」もしたがって包含され、開示される。
【０３４０】
範囲が与えられる場合、端点が含まれる。更に、別途記載のない限り、または別様に文脈から明らかでない限り、及び当業者が理解するように、範囲として表される値は、文脈が明確に別様を示さない限り、その範囲の下限の単位の１０分の１まで、本発明の異なる実施形態における規定範囲内の任意の特定の値または小範囲を取ることができることを理解されたい。
【０３４１】
加えて、先行技術内に入る本発明の任意の特定の実施形態は特許請求の範囲の任意の１つ以上から明示的に除外されることを理解されたい。このような実施形態は当業者に既知であると認められるため、それらは、除外されることが本明細書に明示的に記載されなくても除外され得る。本発明の組成物の任意の特定の実施形態（例えば、任意の抗生物質、治療薬、または活性成分、任意の生産方法、任意の使用方法など）は、先行技術の存在に関連するか否かにかかわらず、いかなる理由であれ、任意の１つ以上の特許請求の範囲から除外され得る。
【０３４２】
使用されてきた用語は限定ではなく説明の用語であり、その広義の態様において本発明の真の範囲及び趣旨から逸脱することなく、添付の特許請求の範囲の範囲内で変更がなされ得ることを理解されたい。
【０３４３】
本発明はいくつかの記載される実施形態に関してある程度十分かつある程度詳細に説明されてきたが、任意のこのような詳細または実施形態もしくは任意の特定の実施形態に限定されるべきであることを意図しないが、先行技術を考慮してこのような特許請求の範囲の広い可能な解釈を提供し、したがって、本発明の意図される範囲を効果的に包含するように、添付の特許請求の範囲を参照にして解釈される。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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