(57)【要約】グラム陰性菌に対して殺活性を有する、アシネトバクター溶解素ポリペプチド及び変異ペプチド。アシントバクター（Ａｃｉｎｔｏｂａｃｔｅｒ）溶解素ポリペプチドを使用する、細菌感染または細菌コロニー形成の治療方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、もしくは配列番号２１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、または前記ポリペプチドの断片であって、前記ポリペプチドまたは断片は抗菌活性を有する、前記ポリペプチドまたは断片。
【請求項２】
前記ポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、もしくは配列番号２１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または前記ポリペプチドの断片からなり、前記ポリペプチドまたは断片は抗菌活性を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、もしくは配列番号２１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、または前記ポリペプチドの断片であって、前記ポリペプチドまたは断片は抗菌ペプチドにコンジュゲートされてコンジュゲートポリペプチドが得られ、前記コンジュゲートポリペプチドは抗菌活性を有する、前記ポリペプチドまたは断片。
【請求項４】
前記ポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、もしくは配列番号２１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸、または前記ポリペプチドの断片からなり、前記ポリペプチドまたは断片は抗菌ペプチドにコンジュゲートされてコンジュゲートポリペプチドが得られ、前記コンジュゲートポリペプチドは抗菌活性を有する、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記ポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、もしくは配列番号２１を有するアミノ酸、または前記ポリペプチドの断片からなり、前記ポリペプチドまたは断片は抗菌ペプチドにコンジュゲートされてコンジュゲートポリペプチドが得られ、前記コンジュゲートポリペプチドは抗菌活性を有する、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記抗菌ペプチドは８個のアミノ酸Ｃ、Ｓ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｅ及びＳを任意の順序で含む、請求項３、４または５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記抗菌ペプチドはアミノ酸配列ＳＱＳＲＥＳＱＣ（配列番号４４）またはＣＳＱＲＱＳＥＳ（配列番号５０）を有する、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記ポリペプチドは、配列番号４５または配列番号５１のアミノ酸配列を含む、請求項３、４または５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記ポリペプチドまたは断片のＣ末端は前記抗菌ペプチドにコンジュゲートされている、請求項３〜８のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは断片。
【請求項１０】
前記ポリペプチドまたは断片のＣ末端は、ペプチド結合を介して前記抗菌ペプチドのＮ末端にコンジュゲートされている、請求項９に記載のポリペプチドまたは断片。
【請求項１１】
前記ポリペプチドまたは断片のＮ末端は前記抗菌ペプチドにコンジュゲートされている、請求項３、４、６、または８のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは断片。
【請求項１２】
前記ポリペプチドまたは断片のＮ末端は、ペプチド結合を介して前記抗菌ペプチドのＣ末端にコンジュゲートされている、請求項１１に記載のポリペプチドまたは断片。
【請求項１３】
前記ポリペプチドまたは断片はグラム陰性菌に対して抗菌活性を有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは断片。
【請求項１４】
前記細菌はアシネトバクター属のものである、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記細菌はＥ．ｃｏｌｉ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａまたはＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉである、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記ポリペプチドまたは断片はグラム陽性菌に対して抗菌活性を有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは断片。
【請求項１７】
前記細菌はＳ．ａｕｒｅｕｓまたはＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓである、請求項１６に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記ポリペプチドは凍結乾燥されている、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の１つ以上のポリペプチドを含む組成物。
【請求項２０】
前記組成物は製薬上許容できる担体、緩衝剤、または防腐剤を含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記組成物は局所投与、皮下送達、静脈内送達または経口送達用に配合される、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記組成物は抗生物質または凝固剤を更に含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２３】
前記組成物は凍結乾燥されている、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
治療を必要とする対象の治療方法であって、前記対象に、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の１つ以上のポリペプチド、及び製薬上許容できる担体、緩衝剤、または防腐剤を含む組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項２５】
前記対象は細菌感染を有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２６】
前記細菌感染は他の治療様式に反応しない、請求項２６に記載の方法。
【請求項２７】
前記組成物は抗生物質と組み合わせて投与される、請求項２５または請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗生物質はアモキシシリン、オーグメンチン、アモキシシリン、アンピシリン、アズロシリン、フルクロキサシリン、メズロシリン、メチシリン、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、セファレキシン、セファゼドン、セフロキシム、ロラカルベフ、セメタゾール（ｃｅｍｅｔａｚｏｌｅ）、セフォテタン、セフォキシチン、シプロフロキサシン、レバキン（ｌｅｖａｑｕｉｎ）、及びフロキサシン（ｆｌｏｘａｃｉｎ）、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、またはミノサイクリン、ゲンタマイシン、アミカシン、及びトブラマイシン、クラリスロマイシン、アジスロマイシン、エリスロマイシン、ダプトマイシン、ネオマイシン、カナマイシン、またはストレプトマイシンである、請求項２８に記載の方法。
【請求項２９】
前記細菌感染は創感染である、請求項２５〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記組成物は局所投与、皮下投与、静脈内注射、または経口投与される、請求項２５〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記組成物は単位剤形である、請求項２５〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記組成物はクリーム、軟膏剤、軟膏、ゲル、トローチ剤、スプレー、またはエアゾールの形態である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
細菌バイオフィルムの形成を阻害するか、またはそれを破壊することであって、治療を必要とする対象に、前記バイオフィルム内の細菌を殺傷するのに有効な量の、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む組成物を投与することを含む、前記阻害することまたは破壊することを含む細菌感染の治療方法。
【請求項３４】
物品の消毒方法であって、前記物品を、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む組成物と接触させることを含む、前記方法。
【請求項３５】
前記物品は硬い表面を有する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３６】
物品において、細菌バイオフィルムの形成を阻害するかまたはそれを破壊する方法であって、前記物品を、前記バイオフィルム内の細菌を殺傷するのに有効な量の、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のペプチドと接触させることを含む、前記方法。
【請求項３７】
前記物品はカウンタートップ、キーボード、手術器具、または医療デバイスである、請求項３５〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む組成物を含有する製品。
【請求項３９】
前記組成物は、担体、緩衝剤または防腐剤を更に含む組成物である、請求項３９に記載の製品。
【請求項４０】
前記製品はバイアル瓶または送達デバイスである、請求項４０に記載の製品。
【請求項４１】
前記組成物は凍結乾燥されている、請求項４０または４１に記載の製品。
【請求項４２】
手術創を有する対象の治療方法であって、前記傷を、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のポリペプチド、及び製薬上許容できる担体、緩衝剤、または防腐剤を含む組成物で洗浄することを含む、前記方法。
【請求項４３】
前記手術創は、前記傷を手術により閉じる前に洗浄される、請求項４３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本ＰＣＴ出願は、米国仮特許出願第６２／０１７，６１８号（２０１４年６月２６日出願）に対する優先権を主張し、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０００２】
配列表
本出願には、２０１５年６月２４日に作成され、本出願と共に電子的に出願された「２３５９３２−３７３３９９＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５」という題の配列表（５７ＫＢ）全体が参照として組み込まれている。
【０００３】
アシネトバクターに対して特異的なバクテリオファージ溶解酵素を含む組成物、及びアシネトバクター感染症の処理方法。
【背景技術】
【０００４】
Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ−ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ複合体、及び本種の他の要素は頻繁に、悪影響を及ぼさずにヒトの皮膚にコロニーを形成する。しかし、掻爬、外傷または手術による皮膚の損傷は、外傷、血液、軟組織、及び中枢神経系へのアシネトバクター感染をもたらし得る。アシネトバクター属の８０％超が多剤耐性（ＭＤＲ）（少なくとも抗生物質の３分類）であることを考えると、これらの感染症は、高い割合の罹患率及び死亡率、入院の延長、並びに多大な医療費を含む不都合な臨床的アウトカムをもたらす場合がある。軍人及びアスリートは、アシネトバクター属による感染症にかかりやすい（皮膚の擦り傷から深刻な外傷に至るまでの）負傷のリスクが増大しているため、これらの負傷を速やかかつ効果的に取り除く方法が、下流合併症を減少させるか、またはそれを取り除くであろう。ＭＤＲアシネトバクターに起因する感染爆発は、世界中の病院で報告されている。更に近年では、これらの感染爆発は軍事医療施設内で深刻な問題となっている。ＭＤＲのために、アシネトバクター感染症は治療することが困難であり、それ故、これらの生命体による感染は通常、アウトカム不良をもたらす。したがって、この病原体を制御するための新規かつよりよい方法が必要とされている。
【０００５】
あらゆる既知の抗生物質に対して耐性を有するＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ株が現在報告されている。この新規の耐性プロファイルと相乗的に作用するのは、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉの、病院環境におけるより長い期間生残するという異常な能力であり、そのために、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉの院内感染能力が増強される。この生命体は一般に、皮膚の完全性及び気道保護が損なわれた重病の入院対象者を標的とする。そのために、院内肺炎が、依然としてＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉに起因する最も一般的な感染症となっている。しかし近年では、中枢神経系、皮膚及び軟組織、並びに骨に関係する感染症が、一定の機関に対して非常に問題となって現れている。この耐性問題のために、これらの病原体を制御するための新規の方法が開発されなければならない。
【０００６】
バクテリオファージによりコードされた溶解素として知られる抗菌剤類がこれまで確認されている。バクテリオファージは細菌に感染するウイルスであり、１０６種類の異なるバクテリオファージ種が存在すると推定されている。バクテリオファージ溶解素は通常、属特異的または種特異的である。即ち、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓファージ溶解素はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのみに対して活性を有し得、標的化治療アプローチを提供する。場合によっては、溶解素は幾つかの属または種に対して活性を有し得る。
【０００７】
バクテリオファージはその宿主細菌に感染し、より多くのウイルス粒子を作製する。増殖サイクルの最後において、バクテリオファージは、細菌内に閉じ込められた後代ファージをどのように放出するか、という問題に直面する。バクテリオファージは、感染した細菌の細胞壁を分解して後代ファージを放出する「溶解素」と呼ばれる酵素を作製することにより本問題を解決する。溶解システムは、ホリン、及び細菌細胞壁を分解可能な少なくとも１つのペプチドグリカン加水分解酵素、即ち溶解素からなる。通常、ホリンは、細胞膜内で孔を形成するファージ感染の後段階で発現し、溶解素（複数可）が細胞壁ペプチドグリカンに接近し、後代ファージの放出をもたらすことを可能にする。重大なことには、ホリンの不存在下で外来的に添加された溶解素は、健康で未感染の細胞の細胞壁を溶解する場合があり、「外因性溶菌（ｌｙｓｉｓ  ｆｒｏｍ  ｗｉｔｈｏｕｔ）」として知られる現象を生み出す。
【発明の概要】
【０００８】
我々は最近、アシネトバクター細菌を特異的に攻撃する幾つかのファージ溶解素を識別、精製、及び特性決定した。大部分の溶解素はグラム陽性細菌に対してのみ抗菌活性を有するため、このことは大きな進歩である。本発明の精製ファージ溶解素は、細菌感染治療、及び消毒等の多様な用途に適している。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ】Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ株１７９０から誘導したファージを示す負染色電子顕微鏡写真。
【図１Ｂ】Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ株１７９４から誘導したファージを示す負染色電子顕微鏡写真。
【図１Ｃ】Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ株１７９６から誘導したファージを示す負染色電子顕微鏡写真。
【図２】寒天に埋め込んだ生残Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉを取り除く溶解素クローン活性の代表的画像。
【図３】溶解作用の４種類：ｉ）グリコシルヒドラーゼファミリー、ｉｉ）ファージベースプレートリゾチーム、ｉｉｉ）リゾチーム自己溶解素、及びｉｖ）溶解素を示す、クローン溶解素のアミノ酸配列の概略図。
【図４】クローン溶解素に対するヌクレオチド配列のアラインメント。
【図５】クローン溶解素のアミノ酸配列のアラインメント。
【図６】１３種類の異なるＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ臨床分離株に対する、２１種類のクローン構築物の溶解作用を示すグラフである。
【図７】図７Ａ及び７Ｂは、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ細胞からの細胞質基質内容物を含む細胞質膜の小疱形成が、Ｆ３０７による処理の後観察される（矢印）。
【図８】Ｆ３０７ポリペプチドによる処理の前後での、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ株１７９１の３日でのバイオフィルムの走査型電子顕微鏡写真。
【図９】Ｆ３０７ポリペプチドによる処理後の、アシネトバクターバイオフィルムを有する全カテーテル片の細菌数の減少を示すグラフである。
【図１０】Ｆ３０７ポリペプチドで処理したＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉに感染したマウスと対照の生残を示すグラフである。
【図１１】短伸長を有しないかまたは有する、Ｆ３０７、Ｐ３０７ポリペプチドの配列（Ｐ３０７Ｅｘ）。
【図１２】図１２Ａは、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ株＃１７９１、Ｓ５及びＡＴＣＣ１７９７８に対する、Ｐ３０７、Ｐ３０７ＳＱ−８Ｃ及びＰ３０７ＡＥ−８のｉｎ  ｖｉｔｒｏ殺菌活性を比較したグラフである。図１２Ｂは、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ株＃１７９１及びＳ５に対するＰ３０７、Ｐ３０７ＳＱ−８Ｃ、及びＰ３０７ＣＳ−８のｉｎ  ｖｉｖｏ殺菌活性の比較を示す。図１２Ｃは、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ株＃１７９１、Ｓ５及びＡＴＣＣ１７９７８に対する、Ｐ３０７ＳＱ−８Ｃ及びＰ３０７ＣＳ−８の比較ｉｎ  ｖｉｖｏ殺菌活性の比較を示す。
【図１３】ｐＨ最適条件（１３Ａ）及びＮａＣｌ最適条件（１３Ｂ）を調査するための、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ株＃１７９１に対するＰ３０７及びＰ３０７ＳＱ−８Ｃのｉｎ  ｖｉｔｒｏ殺菌活性。変数を除いて同一の条件を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）と共に用いて、濃度最適条件（１３Ｃ）及び殺傷速度（１３Ｄ）を測定した。エラーバーは標準偏差を示し、黒の水平線は検出限界を示す。
【図１４】Ｐ３０７及びＰ３０７ＳＱ−８Ｃに対する、異なる細菌種の感度を示すグラフである。エラーバーは標準偏差を示し、黒の水平線は検出限界を示す。
【図１５】図１５Ａ及び１５Ｂは、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ株＃１７９１（１５Ａ）の対数期及び静止期、並びにバイオフィルム期（１５Ｂ）に対するＰ３０７及びＰ３０７ＳＱ−８Ｃの殺菌活性を示すグラフである。
【図１６】図１６は、Ｂ細胞生残（１６Ａ）及び溶血（１６Ｂ）により測定した、Ｐ３０７及びＰ３０７ＳＱ−８Ｃの細胞毒性効果を示す。
【図１７】図１７Ａは、Ｐ３０７及びＰ３０７ＳＱ−８Ｃの活性における、０、０．１及び１ｍＭのＤＴＴの効果を示す。図１７Ｂは、Ｐ３０７ＳＱ−８Ｃの末端システイン残基の、アラニン（Ｐ３０７ＳＱ−８Ａ）との置換効果を示す。
【図１８】対照ペプチド及びＰ３０７についてのシフトを示す、ＤＮＡシフトゲルである。
【図１９】図７Ａ〜Ｃは、未処理対照（１９Ａ）、３００μｇ／ｍＬのＰ３０７ＳＱ−８Ｃで５分間（１９Ｂ）及び２時間（１９Ｃ）処理したＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ株＃１７９１の例示的な透過型電子顕微鏡画像を示す。倍率は×２６００（左側、スケールバー＝２μｍ）、並びに×５０００（右側上及び下、スケールバー＝０．５μｍ）。図７Ｄは、ｐＨ７．５及び８．８における、グラム陰性菌Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及びＥ．ｃｏｌｉでのＰ３０７ＳＱ−８Ｃの殺菌活性を示す。
【図２０】Ｐ３０７及びＰ３０７ＳＱ−８Ｃで処理したＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ株＃１７９１及びＳ５の膜透過性を示す。
【図２１】ヒドロキシルラジカルスカベンジャー、チオ尿素及び嫌気性条件による、Ｐ３０７またはＰ３０７ＳＱ−８Ｃの殺菌活性の阻害を示す。
【図２２】ポリミキシンＢ及びＰ３０７ＳＱ−８Ｃによる、皮膚感染症の治療効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、抗菌活性を有するポリペプチド、及び開示するポリペプチドの使用方法を提供する。本明細書で使用する場合、文脈で明確に別様が示されない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は複数の指示対象を含む。
【００１１】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」「含んだ（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」等の用語は、米国特許法に属する意味を有し、これらは包含的であるまたは制限がないものであり、追加の引用されていない要素または方法のステップを除外しない。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」及び「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」等の用語は、米国特許法に属する意味を有し、これらは、特許請求された発明の基本的かつ新規の特徴に実質的に影響を及ぼさない追加の成分またはステップの包含を可能にする。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ）」及び「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語は、米国特許法においてこれらに属する意味を有する、即ち、これらの用語は制限のあるものである。
【００１２】
第１の態様では、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、もしくは配列番号２１に対して少なくとも９０％、もしくは少なくとも９１％、もしくは少なくとも９２％、もしくは少なくとも９３％、もしくは少なくとも９４％、もしくは少なくとも９５％、もしくは少なくとも９６％、もしくは少なくとも９７％、もしくは少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％、もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはポリペプチドの断片を提供し、ポリペプチドまたは断片は抗菌活性を有する。
【００１３】
第１の態様の別の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、もしくは配列番号２１に対して少なくとも９５％、もしくは少なくとも９６％、もしくは少なくとも９７％、もしくは少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％、もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、またはポリペプチドの断片、ポリペプチドまたは断片は抗菌活性を有する。
【００１４】
第１の態様の更に別の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、もしくは配列番号２１に対して１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、またはポリペプチドの断片、ポリペプチドまたは断片は抗菌活性を有する。
【００１５】
第２の態様では、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、もしくは配列番号２１に対して少なくとも９０％、もしくは少なくとも９１％、もしくは少なくとも９２％、もしくは少なくとも９３％、もしくは少なくとも９４％、もしくは少なくとも９５％、もしくは少なくとも９６％、もしくは少なくとも９７％、もしくは少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％、もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、またはポリペプチドの断片を提供し、ポリペプチドまたは断片は抗菌活性を有する。
【００１６】
第２の態様の別の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、もしくは配列番号２１に対して少なくとも９５％、もしくは少なくとも９６％、もしくは少なくとも９７％、もしくは少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％、もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、またはポリペプチドの断片、ポリペプチドまたは断片は抗菌活性を有する。
【００１７】
第２の態様の更に別の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、もしくは配列番号２１に対して１００％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、またはポリペプチドの断片、ポリペプチドまたは断片は抗菌活性を有する。
【００１８】
第３の態様では、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、もしくは配列番号２１に対して少なくとも少なくとも８０％、もしくは少なくとも８５％、もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも９１％。もしくは少なくとも９２％、もしくは少なくとも９３％、もしくは少なくとも９４％、もしくは少なくとも９５％、もしくは少なくとも９６％、もしくは少なくとも９７％、もしくは少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％、もしくは１００％を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはポリペプチドの断片を提供し、ポリペプチドまたは断片は抗菌ペプチドにコンジュゲートされてコンジュゲートポリペプチドが得られ、コンジュゲートポリペプチドは抗菌活性を有する。
【００１９】
第３の態様の一実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、もしくは配列番号２１に対して少なくとも９０％、もしくは少なくとも９２％、もしくは少なくとも９４％、もしくは少なくとも９５％、もしくは少なくとも９６％、もしくは少なくとも９７％、もしくは少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％、もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、またはポリペプチドの断片、ポリペプチドまたは断片は抗菌ペプチドにコンジュゲートされてコンジュゲートポリペプチドが得られ、コンジュゲートポリペプチドは抗菌活性を有する。
【００２０】
第４の態様では、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、もしくは配列番号２１に対して少なくとも少なくとも８０％、もしくは少なくとも８５％、もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも９１％、もしくは少なくとも９２％、もしくは少なくとも９３％、もしくは少なくとも９４％、もしくは少なくとも９５％、もしくは少なくとも９６％、もしくは少なくとも９７％、もしくは少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％、もしくは１００を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、またはポリペプチドの断片を提供し、ポリペプチドまたは断片は抗菌ペプチドにコンジュゲートされてコンジュゲートポリペプチドが得られ、コンジュゲートポリペプチドは抗菌活性を有する。
【００２１】
第４の態様の一実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、もしくは配列番号２１に対して少なくとも９０％、もしくは少なくとも９２％、もしくは少なくとも９４％、もしくは少なくとも９５％、もしくは少なくとも９６％、もしくは少なくとも９７％、もしくは少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％、もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、またはポリペプチドの断片、ポリペプチドまたは断片は抗菌ペプチドにコンジュゲートされてコンジュゲートポリペプチドが得られ、コンジュゲートポリペプチドは抗菌活性を有する。
【００２２】
第３または第４の態様の幾つかの実施形態では、抗菌ペプチドはアミノ酸配列ＳＱＳＲＥＳＱＣ（配列番号４４）を含み、少なくとも１つのアミノはシステインであり、抗菌ペプチドの０、１、２、３、４、５、６、または７個のアミノ酸は保存的置換が行われている。抗菌ペプチドの０、１、２、３、４、５、６、または７個のアミノ酸は保存的置換が行われている。第３または第４の態様の他の実施形態では、抗菌ペプチドは、アミノ酸配列ＳＱＳＲＥＳＱＣ（配列番号４４）を含む。第３または第４の態様の更にその他の実施形態では、抗菌ペプチドはアミノ酸配列ＳＱＳＲＥＳＱＣ（配列番号４４）を含み、抗菌ペプチドの０、１、２、３、４、５、６、または７個のアミノ酸は保存的置換が行われており、抗菌ペプチドは８個のアミノ酸からなる。第３または第４の態様の更に他の実施形態では、抗菌ペプチドはアミノ酸配列ＳＱＳＲＥＳＱＣ（配列番号４４）からなる。
【００２３】
第３または第４の態様の幾つかの実施形態では、抗菌ペプチドはアミノ酸配列ＣＳＱＲＱＳＥＳ（配列番号５０）を含み、少なくとも１つのアミノはシステインであり、抗菌ペプチドの０、１、２、３、４、５、６、または７個のアミノ酸は保存的置換が行われている。第３または第４の態様の他の実施形態では、抗菌ペプチドはアミノ酸配列ＣＳＱＲＱＳＥＳ（配列番号５０）を含む。第３または第４の態様の更にその他の実施形態では、抗菌ペプチドはアミノ酸配列ＣＳＱＲＱＳＥＳ（配列番号５０）を含み、抗菌ペプチドの０、１、２、３、４、５、６、または７個のアミノ酸は保存的置換が行われており、抗菌ペプチドは８個のアミノ酸からなる。第３または第４の態様の更に他の実施形態では、抗菌ペプチドはアミノ酸配列ＣＳＱＲＱＳＥＳ（配列番号５０）からなる。
【００２４】
第３または第４の態様の幾つかの実施形態では、ポリペプチドまたは断片のＣ末端は抗菌ペプチドにコンジュゲートされている。第３または第４の態様の他の実施形態では、ポリペプチドまたは断片のＣ末端は抗菌ペプチドのＮ末端にコンジュゲートされている。第３または第４の態様の更にその他の実施形態では、ポリペプチドまたは断片のＮ末端は抗菌ペプチドにコンジュゲートされている。第３または第４の態様の更に他の実施形態では、ポリペプチドまたは断片のＮ末端は抗菌ペプチドのＣ末端にコンジュゲートされている。第３または第４の態様の任意の実施形態に関して、抗菌ペプチドはペプチド結合を介して、ポリペプチドまたは断片にコンジュゲートすることができる。
【００２５】
本開示のペプチドの別の実施形態は、アミノ酸配列ＮＡＫＤＹＫＧＡＡＡＥＦＰＫＷＮＫＡＧＧＲＶＬＡＧＬＶＫＲＲＫＳＱＳＲＥＳＱＡ（配列番号４５）を有するペプチドである。別の実施形態は、アミノ酸配列ＮＡＫＤＹＫＧＡＡＡＥＦＰＫＷＮＫＡＧＧＲＶＬＡＧＬＶＫＲＲＫＣＳＱＲＱＳＥＳ（配列番号５１）を有するペプチドである。
【００２６】
幾つかの実施形態において、ポリペプチド、ポリペプチド断片またはコンジュゲートポリペプチドは、グラム陰性菌に対する抗菌活性を有する。幾つかの実施形態において、グラム陰性菌はアシネトバクター属のものである。
【００２７】
幾つかの実施形態において、ポリペプチド、ポリペプチド断片またはコンジュゲートポリペプチドはＥ．ｃｏｌｉ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａまたはＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉに対して抗菌活性を有する。
【００２８】
幾つかの実施形態において、ポリペプチド、ポリペプチド断片またはコンジュゲートポリペプチドはグラム陽性菌に対して抗菌活性を有する。幾つかの実施形態において、グラム陽性菌はＳ．ａｕｒｅｕｓまたはＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓである。
【００２９】
幾つかの実施形態において、ポリペプチドは凍結乾燥されている。
【００３０】
本発明のポリペプチドの特定の実施形態を表１に提供する。
【表１】
2017526627.tif 000002
【００３１】
Ｐ３０７ＳＱ−８Ｃ及びＰ３０７Ｅｘは、本明細書では同じ意味で用いられる。
【００３２】
本発明は、本発明のポリペプチド、ポリペプチド断片またはコンジュゲートポリペプチドを含む医薬組成物もまた提供する。幾つかの実施形態において、組成物は、製薬上許容できる担体、緩衝剤、または防腐剤を含む医薬組成物である。
【００３３】
幾つかの実施形態では、医薬組成物は局所投与用に配合される。その他の実施形態では、医薬組成物は皮下送達用に配合される。更にその他の実施形態では、医薬組成物は静脈内送達用に配合される。更に他の実施形態では、医薬組成物は経口送達用に配合される。
【００３４】
幾つかの実施形態では、組成物は抗生物質を更に含む。好適な抗生物質の例としては、アモキシシリン、オーグメンチン、アモキシシリン、アンピシリン、アズロシリン、フルクロキサシリン、メズロシリン、メチシリン、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、セファレキシン、セファゼドン、セフロキシム、ロラカルベフ、セメタゾール（ｃｅｍｅｔａｚｏｌｅ）、セフォテタン、セフォキシチン、シプロフロキサシン、レバキン（ｌｅｖａｑｕｉｎ）、及びフロキサシン（ｆｌｏｘａｃｉｎ）、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、またはミノサイクリン、ゲンタマイシン、アミカシン、及びトブラマイシン、クラリスロマイシン、アジスロマイシン、エリスロマイシン、ダプトマイシン、ネオマイシン、カナマイシン、またはストレプトマイシンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３５】
幾つかの実施形態では、医薬組成物は凝固剤を更に含む。
【００３６】
幾つかの実施形態では、医薬組成物は凍結乾燥されている。
【００３７】
本発明はまた、治療を必要とする対象の治療方法であって、本発明のポリペプチド、ポリペプチド断片またはコンジュゲートポリペプチド、及び製薬上許容できる担体、緩衝剤、または防腐剤を含む医薬組成物を上記対象に投与することを含む、上記治療方法も提供する。
【００３８】
一実施形態では、本方法は、治療を必要とする対象の治療方法であって、本発明のポリペプチド、及び製薬上許容できる担体、緩衝剤、または防腐剤を含む医薬組成物を上記対象に投与することを含む、上記治療方法である。
【００３９】
別の実施形態では、本方法は、治療を必要とする対象の治療方法であって、本発明のポリペプチド断片、及び製薬上許容できる担体、緩衝剤、または防腐剤を含む医薬組成物を上記対象に投与することを含む、上記治療方法である。
【００４０】
一実施形態では、本方法は、治療を必要とする対象の治療方法であって、本発明のコンジュゲートポリペプチド、及び製薬上許容できる担体、緩衝剤、または防腐剤を含む医薬組成物を上記対象に投与することを含む、上記治療方法である。
【００４１】
一実施形態では、本方法は、細菌感染を有することの治療方法であり、治療は、本発明のコンジュゲートポリペプチド、及び製薬上許容できる担体、緩衝剤、または防腐剤を含む医薬組成物を対象に投与することを含む治療処置である。幾つかの実施形態では、対象は、他の治療様式に反応しない細菌感染を有する。例えば、細菌感染症は１つ以上の抗生物質に耐性を有してよい。一実施形態では、細菌感染は創感染である。
【００４２】
一実施形態では、本方法は、治療を必要とする対象の予防的治療方法であって、本発明のコンジュゲートポリペプチド、及び製薬上許容できる担体、緩衝剤、または防腐剤を含む医薬組成物を上記対象に投与することを含む、上記予防的治療方法である。幾つかの実施形態では、対象は手術を受けたか、または受けている最中であり、手術創は本発明の医薬組成物と接触させられる。ある特定の実施形態において、手術創は、傷を塞ぐ前に医薬組成物により洗浄される。他の実施形態では、医薬組成物は、塞いだ後に外傷に塗布され、例えば、医薬組成物は外傷の縫合またはステープル留め領域に塗布される。
【００４３】
幾つかの実施形態では、本方法は、抗生物質と組み合わせて本発明の医薬組成物を投与することを含む。幾つかの実施形態では、本方法は、本発明の医薬組成物を局所投与することを含む。他の実施形態では、本方法は、本発明の医薬組成物を皮下投与することを含む。更にその他の実施形態では、本方法は、本発明の医薬組成物を静脈内注射により投与することを含む。更に他の実施形態では、本方法は、本発明の医薬組成物を経口投与することを含む。
【００４４】
幾つかの実施形態では、医薬組成物は単位剤形である。他の実施形態では、医薬組成物は、クリーム、軟膏剤、軟膏、ゲル、トローチ剤、スプレー、またはエアゾールの形態である。
【００４５】
バイオフィルム内の細菌を殺傷するのに有効な量の、本発明のポリペプチド、ポリペプチド断片またはコンジュゲートポリペプチドを含む組成物を、治療を必要とする対象に投与することを含む、細菌バイオフィルム形成の阻害、またはその破壊を含む細菌感染の治療方法もまた、提供する。
【００４６】
物品の消毒方法であって、上記物品を、本発明のポリペプチド、ポリペプチド断片またはコンジュゲートポリペプチドを含む組成物に、上記物品を消毒するのに十分な時間上記物品と接触させることを含む、上記物品の消毒方法の方法もまた、更に提供する。幾つかの実施形態では、物品は硬い表面を有する。幾つかの実施形態では、物品はカウンタートップ、キーボード、手術器具、または医療デバイスである。
【００４７】
物品上での細菌バイオフィルム形成の阻害方法、またはその破壊方法であって、上記物品を、上記バイオフィルム内の細菌を殺傷するのに有効な量の本発明のポリペプチド、ポリペプチド断片またはコンジュゲートポリペプチドと接触させることを含む、上記方法を更に提供する。
【００４８】
本発明のポリペプチド、ポリペプチド断片またはコンジュゲートポリペプチドを含む組成物を含有する製品もまた提供する。幾つかの実施形態では、製品は、本発明のポリペプチド、ポリペプチド断片またはコンジュゲートポリペプチドを含有するスプレーボトルである。
【００４９】
幾つかの実施形態では、製品は、本発明のポリペプチド、ポリペプチド断片またはコンジュゲートポリペプチド、及び担体、緩衝剤または防腐剤を含む医薬組成物を含有する。幾つかの実施形態では、製品はバイアル瓶である。幾つかの実施形態では、製品は送達デバイスである。幾つかの実施形態では、製品に含有される組成物は凍結乾燥されている。
【００５０】
本開示のポリペプチドの構造において改変及び変更を行うことが可能であり、依然としてポリペプチドとしての類似の性質（例えば、保存的アミノ酸置換）を有する分子が得られる。例えば、配列内で、ある種のアミノ酸を、測定可能な活性の喪失なしに他のアミノ酸に置換することができる。ポリペプチドの相互作用能力及び性質がそのポリペプチドの生物学的機能活性を規定するものであるため、ある種のアミノ酸配列置換をポリペプチド配列内で行うことができ、置換にもかかわらず、同様の性質を有するポリペプチドが得られる。
【００５１】
かかるアミノ酸置換は通常、アミノ酸の側鎖置換基の相対的類似性、例えば疎水性、親水性、電荷、サイズ等に基づく。種々の前述の特徴を考慮に入れた例示的置換は当業者には周知であり、（Ａｌａ：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ）、（Ａｒｇ：Ｌｙｓ）、（Ａｓｎ：Ｇｌｎ、Ｈｉｓ）、（Ａｓｐ：Ｇｌｕ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ）、（Ｇｌｎ：Ａｓｎ）、（Ｇｌｕ：Ａｓｐ）、（Ｇｌｙ：Ａｌａ）、（Ｈｉｓ：Ａｓｎ、Ｇｌｎ）、（Ｉｌｅ：Ｌｅｕ、Ｖａｌ）、（Ｌｅｕ：Ｉｌｅ、Ｖａｌ）、（Ｌｙｓ：Ａｒｇ）、（Ｍｅｔ：Ｌｅｕ、Ｔｙｒ）、（Ｓｅｒ：Ｔｈｒ）、（Ｔｈｒ：Ｓｅｒ）、（Ｔｉｐ：Ｔｙｒ）、（Ｔｙｒ：Ｔｒｐ、Ｐｈｅ）、及び（Ｖａｌ：Ｉｌｅ、Ｌｅｕ）が挙げられる（元の残基：例示的置換）。したがって、本開示の実施形態は、上述のポリペプチドの機能的または生物学的等価物を企図する。特に、ポリペプチドの実施形態は、対象ポリペプチドに対して約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、及び９５％の配列同一性を有する変異体を含むことができる。
【００５２】
当技術分野において既知の通り、「同一性」とは、２つ以上のポリペプチド配列間の、配列を比較することにより測定される関係である。「同一性」は当該技術分野において周知のアルゴリズムにより速やかに計算することができる。同一性を測定する好ましい方法は、試験する配列間での最大の一致を与えるように設計される。同一性を測定する方法は、一般に入手可能なコンピュータプログラムに体系化されている。２つの配列間の同一性％は、Ｎｅｅｄｅｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３−４５３，１９７０）アルゴリズムを組み込んだ解析ソフトウェア（即ち、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ  Ｗｉｓ．のＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ）（例えば、ＮＢＬＡＳＴ、及びＸＢＬＡＳＴ）を使用して測定することができる。
【００５３】
同一性は「局所同一性」または「全体同一性」として測定することができる。局所同一性とは、一連のかかる配列の間の一致により測定される、ポリペプチド間の配列関係性の程度を意味する。全体同一性とは、参照ポリペプチドの完全長と比較した、ポリペプチドの配列関係性の程度を意味する。別段定めがない限り、本明細書で使用する時、同一性は全体同一性を意味する。本明細書における全体同一性のパーセンテージは、（局所及び全体同一性の両方に対して）ソフトウェアＭａｃＶｅｃｔｏｒを用いたＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを使用し、デフォルト設定を使用して計算される。
【００５４】
ポリペプチドの作製
任意の既知の方法により、本発明のポリペプチドを作製することができる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉが挙げられるがこれらに限定されない細菌、または、ポリペプチドに関する他の既存のシステム（例えばＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、ショウジョウバエＳｆ９細胞を用いたバキュロウイルス発現系、酵母菌または糸状菌発現系、哺乳動物細胞発現系）内で、ポリペプチドを作製することができるか、またはこれらは化学合成することができる。
【００５５】
ポリペプチドが細菌、例えばＥ．ｃｏｌｉ内で作製される場合、ペプチドをコードする核酸分子もまた、細胞からの成熟ペプチドの分泌を可能にするリーダー配列をコードすることができる。したがって、ペプチドをコードする配列は、例えば天然の細菌のＳＴペプチドのプレ配列及びプロ配列を含むことができる。分泌された成熟ペプチドは培地から精製することができる。
【００５６】
本明細書で記載されるペプチドをコードする配列は、細菌細胞内で核酸分子を送達及び維持可能なベクター内に挿入することができる。ＤＮＡ分子は自己複製ベクター（好適なベクターとしては例えば、ｐＧＥＭ３Ｚ及びｐｃＤＮＡ３、並びにこれらの誘導体が挙げられる）内に挿入されてよい。ベクターは、細菌ベクターもしくはバクテリオファージλまたはＭ１３等のバクテリオファージＤＮＡベクターまたはこれらの誘導体であってよい。本明細書で記載される核酸を含有するベクターの構築の後には、細菌等の宿主細胞の形質転換を行うことができる。好適な細菌宿主としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、シュードモナス、サルモネラ菌が挙げられるが、これらに限定されない。遺伝子構築物にはコードする核酸分子に加えて、発現を可能にする要素、例えばプロモーター及び調節配列もまた含まれる。発現ベクターは、転写開始を制御する転写制御配列、例えばプロモーター、エンハンサー、オペレーター、及びリプレッサー配列を含有してよい。種々の転写制御配列は当業者によく知られている。発現ベクターは、翻訳制御配列（例えば非翻訳５’配列、非翻訳３’配列、または内部リボソーム侵入部位）もまた含むことができる。ベクターは自己複製が可能であってよいか、または宿主ＤＮＡ内に組み込まれて、ペプチド作製中の安定性を確保することができる。
【００５７】
本発明にかかる核酸の一実施形態は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、もしくは配列番号４５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはポリペプチドの断片をコードする核酸であり、ポリペプチドまたは断片は抗菌活性を有する。
【００５８】
別の実施形態において、核酸は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、もしくは配列番号４５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはポリペプチドの断片をコードし、ポリペプチドまたは断片は抗菌活性を有する。
【００５９】
更に別の実施形態では、核酸は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、もしくは配列番号４５のアミノ酸配列核酸からなるポリペプチド、またはポリペプチドの断片をコードし、ポリペプチドまたは断片は抗菌活性を有する。
【００６０】
更に別の実施形態において、核酸は、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、または配列番号４２のヌクレオチド配列を含む。
【００６１】
更に別の実施形態において、核酸は、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、または配列番号４２のヌクレオチド配列からなる。
【００６２】
別の実施形態は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、もしくは配列番号４５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはポリペプチドの断片をコードする核酸を含む発現ベクターであり、ポリペプチドまたは断片は抗菌活性を有する。
【００６３】
別の実施形態において、発現ベクターは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、もしくは配列番号４５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはポリペプチドの断片をコードする核酸を含み、ポリペプチドまたは断片は抗菌活性を有する。
【００６４】
更に別の実施形態において、発現ベクターは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、もしくは配列番号４５のアミノ酸配列核酸からなるポリペプチド、またはポリペプチドの断片をコードする核酸を含み、ポリペプチドまたは断片は抗菌活性を有する。
【００６５】
更に別の実施形態において、発現ベクターは、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、または配列番号４２のヌクレオチド配列を含む核酸を含む。
【００６６】
更に別の実施形態において、発現ベクターは、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、または配列番号４２のヌクレオチド配列からなる核酸を含む。
【００６７】
表２は、核酸がコードするポリペプチドに対応するヌクレオチド配列番号を示す、本発明の核酸の特定の実施形態を示す。
【表２】
2017526627.tif 000003
【００６８】
本明細書で記載されるポリペプチドをコードする核酸はまた、精製を促進するために、ペプチド親和性タグ、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、プロテインＡ、ＦＬＡＧタグ、ヘキサヒスチジン、ｍｙｃタグ、またはインフルエンザＨＡタグをコードする核酸に融合することができる。親和性タグまたはレポーター融合は、対象のペプチドのリーディングフレームを、翻訳融合が生成されるように、親和性タグをコードする遺伝子のリーディングフレームに結合する。融合遺伝子の発現は、対象のペプチド及び親和性タグの両方を含む単一ペプチドの翻訳をもたらす。親和性タグが用いられる場合においては、プロテアーゼ認識部位をコードするＤＮＡ配列が、親和性タグのリーディングフレームと対象のペプチドとの間で融合される。
【００６９】
細菌以外のタンパク質発現系における、本明細書で記載されるポリペプチド及び変異体の未熟及び成熟形態の作製に好適で当業者に周知の遺伝子構築物及び方法を用いても、生物学的系内でポリペプチドを作製することができる。
【００７０】
ポリペプチド、及びその変異体は、自動ペプチドシンセサイザーを用いた固相法により合成することができる。例えば、ペプチドは、ダブルカップリングプログラムを用いてＣｙｃ（４−ＣＨ２  Ｂｘｌ）−ＯＣＨ２−４−（オキシメチル）−フェニルアセトアミドメチル上で合成することができる。ペプチドはまた、従来のＦＭＯＣ保護（即ち、ＤＣＣ−ＨＯＢｔとのカップリング、及びＤＭＦ中でのピペリジンによる脱保護）を用いて、固相合成を含む他の多くの方法により合成することができる。
【００７１】
治療用及び予防用組成物、並びにこれらの使用
本発明は、有効量の本発明のポリペプチドを、治療を必要とする対象に投与することを含む治療方法を提供する。対象は、ヒト、並びに、サル及びチンパンジー等の霊長類；ウシ、ブタ、ウマまたはトリ等の家畜動物；並びにイヌ、ネコ、及び齧歯類等のコンパニオンアニマルを含むがこれらに限定されない他の動物である。特定の実施形態においては、対象はヒトである。別の特定の実施形態において、対象は非ヒト哺乳類である。一実施形態において、ポリペプチドは単独の抗菌剤として投与される。別の実施形態において、ポリペプチドは１つ以上の他の抗菌剤と組み合わせて投与される。
【００７２】
開示した医薬組成物の投与方法は経口または非経口とすることができ、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、関節内、滑液包内、皮下、経鼻、硬膜外、局所及び経口経路が挙げられるが、これらに限定されない。化合物は、例えば、注入またはボーラス注射、上皮内層または粘膜皮膚層（例えば口腔粘膜、直腸及び腸粘膜等）を通した吸収による、任意の便利な経路により投与されてよく、かつ、他の生物学的活性剤と共に投与されてよい。投与は全身的または局所的とすることができる。更に、心室内及び髄腔内注射を含む任意の好適な経路により、本発明の医薬組成物を中枢神経系に導入するのが望ましい場合がある。心室内注射は、例えばオンマヤリザーバー等のリザーバーに取り付けられた心室内カテーテルにより行われてよい。経肺投与もまた、例えば、吸入器またはネブライザ、及びエアゾール化剤との配合を使用することにより、用いることができる。特定の実施形態では、本発明の医薬組成物を、治療が必要な領域に局所的に、例えば皮膚上に局所使用で投与するのが望ましい場合があり、当業者に既知の任意の好適な方法を用いてよい。
【００７３】
本発明の一態様では、細菌感染の治療用または予防用治療のための、本開示のポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。本発明の一実施形態は、局所治療用に配合された医薬組成物である。本発明の別の実施形態は、全身感染に対して配合された医薬組成物である。
【００７４】
かかる組成物は、治療に有効な量の本発明のポリペプチド、及び製薬上許容できる担体、緩衝剤、または防腐剤を含む。本明細書で使用する場合、「製薬上許容できる担体」という用語としては、所望の特定の剤形に適した、溶媒、希釈剤、または他の液状ビヒクル、分散液もしくは懸濁液助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤もしくは乳化剤、固体結合剤、潤滑剤等が挙げられるが、これらに限定されない。かかる医薬担体は、水、並びに石油、動物、植物、または合成由来のものを含む油類（ピーナッツオイル、大豆油、鉱油、ゴマ油等）等の滅菌した液体であることができる。食塩水及びデキストロース水溶液及びグリセロール水溶液もまた、液状担体として、特に注射可能な溶液として用いることができる。好適な医薬品賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、胡粉、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が挙げられる。組成物はまた、湿潤剤もしくは乳化剤、防腐剤、またはｐＨ緩衝剤を含有することもできる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルション、錠剤、丸薬、トローチ剤、カプセル、粉末、局所投与用のパッチ等の形態をとることができる。局所投与に関して、製薬上許容できる組成物は、１つ以上の担体に懸濁または溶解した活性成分を含有する、好適な軟膏剤、ローションまたはクリームに配合されてよい。局所投与用の担体としては、鉱油、流動ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン化合物、乳化蝋、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリアルコール（ｃｅｔｅａｒｙ  ａｌｃｏｈｏｌ）、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール及び水が挙げられるが、これらに限定されない。組成物は、トリグリセリド等の従来の結合剤及び担体との座薬として配合することができる。経口製剤は、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウム等の標準的な担体を含むことができる。当業者は、治療薬の配合を熟知している。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｈｉｔｅ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．（２０００）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９５）を参照のこと。
【００７５】
本発明はまた、１つ以上の本発明の医薬組成物の成分で満たされた１つ以上の容器を含む薬剤パックまたはキットも提供する。かかる容器（複数可）に所望により関係することは、薬剤または生物学的製品の製造、使用、または販売を規制する政府機関により規定される形態の通知であり、この通知は、（ａ）ヒト投与のための製造、使用もしくは販売の上述の機関による認可、（ｂ）使用指示、またはこれらの両方を反映する。
【実施例】
【００７６】
以下の実施例は、本明細書で記載されるポリペプチドの作製及び使用方法について、当業者に追加情報を提供するために示されており、発明者らが自身の発明と考えるものの範囲を限定することを目的とはしていない。使用した数（例えば量、温度等）に関しては正確性を確保するよう努めたが、幾つかの実験エラー及び誤差は考慮されなければならない。特に指示がない限り、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏温度である。
【００７７】
実施例１
抗菌活性を有するポリペプチドの識別。
【００７８】
Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉの１５個の臨床分離株をニューヨーク病院から入手した。Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉの株を単離し、マイトマイシンＣで処理してプロファージ誘発を引き起こした。上清を収集し、ポリエチレングリコールファージをポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で沈殿させた。３つのＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ単離体からの上清を負染色ＥＭにより調査し、ファージの画像を撮影した（図１Ａ、１Ｂ、及び１Ｃ）。
【００７９】
アガロースゲル電気泳動、及び高分子量ＤＮＡの抽出により、ファージＤＮＡを共沈殿化合物から分離した。このＤＮＡから、発現可能なリンカーショットガンライブラリー（Ｅ−ＬＡＳＬ）を上述したように構築した（Ｓｃｈｍｉｔｚ  ＪＥ．ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７４：１６４９−１６５２）。簡潔にいうと、１００ｎｇのＤＮＡを制限酵素ＴＳＰ５０９Ｉ（コンセンサス配列ＡＡＴＴ）を用いて断片化した。フェノール−クロロホルム抽出及びエタノール沈殿の後、ＤＮＡを、相補５’オーバハング（［ＡＡＴＴ］ＣＧＧＣＴＣＧＡＧ、オーバハングには下線が引かれている[訳者注：上記で[  ]で囲まれている配列箇所はＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３７９６２では、下線が引かれた文字である](配列番号４６）を有する４０ｎｇのリンカー配列にライゲーションした。リンカー標的化プライマーＣＣＡＴＧＡＣＴＣＧＡＧＣＣＧＡＡＴＴ（配列番号４７）を用いたＴａｑベースのＰＣＲ用鋳型として、ライゲーション混合物を使用した。
【００８０】
メーカーの指示通りにｐＢＡＤ  ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡ発現キット；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎを使用して、増幅インサートをアラビノース誘発性ｐＢＡＤプラスミド内にライゲーションした。組み換えベクターを適格なＥ．ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内に形質転換した。どのクローンが溶解作用を有するかを測定するために、Ｅ．ｃｏｌｉを、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン、及び５％のヒツジ脱線維血を補充したＬＢ寒天上にプレーティングした。３７℃で一晩増殖させた後、市販のネブライザの放出口に取り付けた密閉容器内にプレートを配置した。霧状のアラビノースを容器内に、１時間連続してポンプで送り込んだ。プレートを３７℃に戻し、周囲の血液寒天内で溶血領域を発達させたコロニーを識別した。選択したクローンを、別のＬＢ−アンピシリンプレート（アラビノースを欠く）上でストリーキングし、発現誘導することなく増殖させた。（Ｓｃｈｍｉｔｚ  ＪＥ，ｅｔ  ａｌ．，２０１０  Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７６：７１８１−７１８７）
【００８１】
Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉに対する殺活性を測定するために、基本的にＳｃｈｍｉｔｚ  ＪＥ，ｅｔ  ａｌ．，２０１０  Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７６：７１８１−７１８７に記載されている通りに、第２のスクリーニングを実施した。０．２％アラビノースを補充したＬＢ−アンピシリンプレート上で、ヒットを約１ｃｍ〜２ｃｍパッチでストリーキングした。３７℃で一晩インキュベーションした後、プレートをクロロホルム蒸気に曝して、依然として生存していたあらゆるＥ．ｃｏｌｉを死滅させて、透過化処理を行った。次に、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉを含有する溶解した軟質寒天をパッチに被せ、透明帯を観察した。クローン周辺に透明帯を示した２１個の陽性クローンを識別した。図２は、寒天内に埋め込まれた、生残Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉを排除する溶解素クローン活性の例示的画面を示す。
【００８２】
陽性クローンのインサートを配列決定し、ＮＣＢＩタンパク質データベース内の配列と比較した。アラインメントは、２１個のクローンの中で、４種類の溶解作用が存在する：ｉ）９つがグリコシルヒドラーゼファミリー内にあり、ｉｉ）７つがファージベースプレートリゾチームであり、ｉｉｉ）２つがリゾチーム自己溶解素であり、ｉｖ）３つが溶解素であることを示した（図３）。本明細書での参照を容易にするために、種類に関係なく、これらの配列によりコードされたポリペプチドを「溶解素」と称する。図４は、２１個のクローンをコードするヌクレオチド配列の類似性に基づく配列アラインメントを示す。図５は、２１個のクローンのポリペプチド配列の類似性に基づく配列アラインメントを示す。
【００８３】
実施例２
陽性クローンの活性。
【００８４】
１３種類の異なるＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ臨床分離株に対する活性に関して、２１種類の異なる構築物をスクリーニングした。構築物はＥ．ｃｏｌｉ内で組み換えにより発現した。細胞を３０℃、２００ｒｐｍで増殖させ、対数増殖中期に到達した時に、０．２％アラビノースを加えることで細胞を誘発した。誘発は一晩続けた。朝に細胞を遠心沈殿させ、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で３回洗浄した後、Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘホモジナイザーで均質化した。細胞片を遠心分離（１６０００ｇ、４５分）で取り除き、溶解物を０．２２ｕｍ滅菌フィルターに通して粗溶解物を生成した。
【００８５】
ＴＳＢ内で一晩増殖したＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉを５０℃の軟質寒天ＴＳＢと混合し、ＴＳＢ寒天プレートに上部寒天層として注いだ。プレートを室温で固化させた。粗溶解物（１０ｕｌ）を、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉを含む軟質寒天プレートに加え、毎日室温で２時間インキュベーションし、残りの時間は４℃に保った。透明帯が目視できるようになるまで（４〜５日）プレートをインキュベーションした。粗溶解物の元の斑点よりも大きい透明帯をスコアリングした。各溶解素の上の数は、その溶解素が最も効率的であった株の数を示す。
【００８６】
結果を図６に示す。溶解素構築物をｘ軸に示し、溶解したアシネトバクター株の割合（％）をｙ軸に示す。各棒の上の数は、溶解素が最も効率的であった株の数を示し、数がないものは、１つの株を示す。確認できるように、溶解素Ｆ３０７は、試験した株の約９０％を溶解し、７つの株に対して最も活性であった。
【００８７】
実施例３
Ｆ３０７によるＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉの溶解。
【００８８】
図７は、Ｆ３０７ポリペプチドによる処理後の、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ株１７９１細胞の例示的な透過型電子顕微鏡写真を示す。顕微鏡写真は、Ｆ３０７が、細胞質膜を細胞の外側に押出すことにより溶解を引き起こしたことを示す（図７の矢印を参照）。Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ株１７９１の２つの１００ｍＬの培養をＢＨＩ培地で開始し、５００ｍＬフラスコ内で１．５時間、３７℃、２００ｒｐｍで増殖させた。次いで、細胞を遠心分離にかけ、１ｘＰＢＳ緩衝液で一度洗浄した。これらを次に、１ｘＰＢＳ（１．２ｍＬ）内に再懸濁した。最終濃度が２５０μＭのＥＤＴＡを各試料に加えた。実験試料に、溶解素３００μＬ（最終濃度は約１．２ｍｇ）を加え、対照（ＥＤＴＡのみ）及び実験試料（ＥＴＤＡ＋Ｆ３０７溶解素）を２５℃にてインキュベーションした。時点は、０．５、１、５、１０、１５、及び３０分とした。反応をクエンチし、ＣＡＣ緩衝液（１０ｍｍのカコジル酸ナトリウム、０．１ｍのＣａＣｌ２、ｐＨ６．５）中２．５％グルテルアルデヒド（Ｇｌｕｔｅｒａｌｄｈｙｄｅ）を用いて細胞を固定した。
【００８９】
実施例４
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの、カテーテル上のＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉバイオフィルムへのＦ３０７ポリペプチドの効果。
【００９０】
カテーテルに付着したＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ１７９１のＦ３０７溶解素によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ処理
【００９１】
滅菌メスを使用して、カテーテル管（ＣａｒｅＦｕｓｉｏｎ  参照番号７２０２３Ｅ）を３インチ長の切片に切断した。Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ１７９１の一晩培養を用いて、５０ｍＬのＴＳＢ  ０．２％グルコース（約１ｘ１０５ＣＦＵ／ｍＬ）を１：１０００で接種した。３インチ長の管にそれぞれ、１：１０００の希釈培養液３００〜３５０μＬを播種した。次にカテーテルをクランプで固定し、３７℃インキュベーター内のプラスチック容器に３日間配置し、バイオフィルム形成を発生させた。３日後、カテーテルをＰＢＳまたはリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）のいずれかで２回洗浄し、続いて、Ｆ３０７（３００〜３５０μＬ）を管に加えた（最終濃度は約１ｍｇ）。次にカテーテルをクランプで固定した。０、１５分、３０分、及び１時間の時点でカテーテルを取り出した。カテーテルを５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）で２回洗浄し、小片に切断した。これらを１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに入れ、５００μＬのＮａｐ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）を加えた。チューブを２０分間超音波処理し、１分間ボルテックス処理した。次に試料を連続希釈し、２０μＬをＢＨＩ寒天プレートの四半分に配置し、３７℃で一晩インキュベーションした。ＣＦＵを翌朝計算した。
【００９２】
処理の３０分後、コロニー形成単位（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉのＣＦＵ）数の約４対数減少が観察された。表３はＣＦＵ数を示す。図８は、２５０μｇのＦ３０７ポリペプチドでの処理前後における、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ株１７９１の、３日でのバイオフィルムの走査型電子顕微鏡写真を示す。
【表３】
2017526627.tif 000004
【００９３】
実施例５
マウスカテーテルモデル：カテーテル管の幾つかの３インチ切片にＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ株１７９１を播種した（１：１０００）。Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉバイオフィルムが上述の通りに形成された。２０匹のＢＡＬＢ／Ｃマウスの背中を剃り、その背中を殺菌した後切り込みを作り、既に形成されたバイオフィルムを有する１インチ切片のカテーテルを背中の真皮下に配置した。次に切り込みをステープルで閉じた。２４時間後、２５０μＬのＦ３０７（１ｍｇ）（ｎ＝１０）、または２５０μＬの対照ビヒクル（ｎ＝１０）を、マウスの真皮下にあるカテーテル内に直接注射した。４時間後に処理を繰り返した。３時間後、カテーテルをマウスから取り外し、実験４で記載した通りにアッセイした。図９は、対照と比較した、Ｆ３０７ポリペプチドで処理したマウスにおける、約２対数の細菌数の減少を示す。
【００９４】
実施例６
Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉの致死量注射の後、Ｆ３０７ポリペプチドはマウスを死から救う。
【００９５】
２２匹のＣ５７ＢＬ／６マウスに、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ株（１０８  ＣＦＵ）を腹腔内（ＩＰ）投与した。２時間後、２匹のマウスを安楽死させて上述の通りに臓器を調査し、１０匹のマウスには１ｍｇのＦ３０７をＩＰ注射し、１０匹のマウスには対照ビヒクルをＩＰ注射した。注射の１４日後に、処理した動物はこの投与量の溶解素で５０％生残を示したが、対照マウスは１０％生残しか示さなかった（図１０）。
【００９６】
注射後に安楽死させた２匹のマウスの臓器を調査し、臓器はＦ３０７ポリペプチドでの処理時にＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉに感染していたことを確認した。肝臓、脾臓、腎臓及び心臓をマウスから解剖した。次に、臓器を１ｘＰＢＳ（５００μＬ）で均質化した。希釈液を作製し、ブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）プレート上に配置した。プレートを３７℃で一晩インキュベーションした。コロニー形成単位の数を数えた。対照マウスを２時間の時点で屠殺し、調査した全ての臓器でアシネトバクターが見つかり、このことは、処理の時点で臓器がＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉに感染していたことを示す。
【００９７】
実施例７
Ｐ３０７ポリペプチド（配列番号４３）を、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ株の１８個の臨床分離株に対して２連で試験をした。Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ株をオン培養し（ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ＯＮ）、静止期に到達させた。細胞を２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）で３回洗浄し、同じ緩衝液中に再懸濁し、約０．７の光学密度（ＯＤ：５９５ｎｍ）とした。これらの細胞に、Ｐ３０７（２５０μｇ／ｍｌ）、または対応する体積の緩衝液を加え、混合物を室温で６０分インキュベーションした。混合物の希釈液を作製し、後続のコロニー形成単位の計数のために、ＴＳＢ寒天プレートに配置した。
【００９８】
２５０μｇのＰ３０７による６０分間のインキュベーションの後でのＰ３０７ポリペプチド処理により、対照に対して、細菌生存能の１〜８対数減少がもたらされた。結果を表４に示す。Ｐ３０７を完全長Ｆ３０７ポリペプチド（配列番号１）と比較した場合、Ｐ３０７ポリペプチドがより高い活性を有した。
【表４】
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【００９９】
実施例８
短い伸長ペプチドを加えることで、Ｐ３０７の抗菌活性の増加がもたらされた。
【０１００】
ペプチドＳＱＳＲＥＳＱＣ（配列番号４４）はＣ型肝炎ウイルスに由来し、グラム陽性及びグラム陰性菌に対して抗菌活性を有することが示されている。我々はこの配列をＰ３０７にコンジュゲートし（Ｐ３０７Ｅｘ）、活性の効果を測定した。Ｆ３０７、ｐ３０７及びＰ３０７Ｅｘ（それぞれ配列番号１、４３及び４５）を図１１に提供する。ここでは、Ｆ３０７の配列の一部に下線が引かれており、Ｐ３０７の位置を示し、Ｐ３０７の配列の一部には二重線が引かれており、抗菌性配列の位置を示す。
【０１０１】
Ｐ３０７及びＰ３０７Ｅｘを６つの細菌の株に対して２連でアッセイした。抗菌酸性度は実施例５に記載の通りに測定した。Ｐ３０７Ｅｘによる処理では、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ１７９１の３．２対数減少をもたらしたが、Ｐ３０７による処理では２．９対数減少をもたらし、抗菌ペプチドを加えることで、Ｐ３０７の活性が増大したことを示している。結果を表５に示す。
【表５】
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【０１０２】
Ｐ３０７及びＰ３０７Ｅｘを、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ株１７９１、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ株ＰＡＯ１、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株ＲＮ４２２０、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株８３２５及びＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓに対する活性について試験を行った。表６に示す通り、Ｐ３０７及びＰ３０７はＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ及びＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓに対して最も活性を有した。
【表６】
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【０１０３】
実施例９
Ｐ３０７はＢ細胞または赤血球に無毒性である。
【０１０４】
Ｐ３０７を赤血球と混合し、溶解を引き起こすか否かを測定した。２００μｇのＰ３０７では、溶解は観測されなかった。Ｐ３０７をＢ細胞株の溶解について試験した際、２４時間後に、細胞数に僅かな影響しか与えないことが見出された。結果を表７に示す。
【表７】
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【０１０５】
実施例１０〜２０で使用したペプチドは化学合成した。
【０１０６】
予めカップリングしたＷａｎｇ（ｐ−アルコキシ−ベンジルアルコール）樹脂（Ｂａｃｈｅｍ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）上でＰｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｓｙｍｐｈｏｎｙ（商標）ペプチドシンセサイザー（ＰＴＩ  Ｔｕｃｓｏｎ，Ａｒｉｚｏｎａ，ＵＳＡ）を使用してペプチドを作製した。反応槽に２５μＭを入れ、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸（Ａｎａｓｐｅｃ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用してペプチドを伸長した（１９９７．Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｆｍｏｃ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．２８９：４４−６７）。アミンの脱保護を、ＮＭＰ（Ｎ−メチルピロリジノン）中２０％ピペリジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）により達成した。０．６ＭのＨＡＴＵ／Ｃｌ−ＨＯＢＴ（アザベンゾトリアゾールテトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート／６−クロロ−１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）（Ｐ３  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｈｅｌｂｙｖｉｌｌｅ，ＫＹ，ＵＳＡ）、及びＮＭＰ（ＥＭＤ）を一次溶媒として用いる０．４ＭのＮＭＭ（Ｎ−メチルモルホリン）を使用して反復型カップリング反応を行った（１９８９．Ｎｅｗ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：１９２７−１９３０）。１００ｍｌの丸底フラスコに移し、４．０ｍｌの配列決定グレードの濃縮トリフルオロ酢酸（Ｆｉｓｈｅｒ）と、トリイソプロピルシラン（Ｆｌｕｋａ）、脱気水、及び３，６−ジオキサ−１，８−オクタンジチオール（ＤＯＤＴ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（９５：２：２：１の比率）を６時間の時間枠で反応させることにより樹脂切断及び側鎖脱保護を達成した。この後に、カラム濾過により５０ｍｌの丸底フラスコに移し、ロータリーエバポレーターを使用してＴＦＡの体積を２ｍｌまで低下させた。４０ｍｌの冷却ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する５０ｍｌのファルコンチューブに移すことにより、個々のペプチドに標準的なエーテル沈殿を実施した。試料を氷浴に２時間配置して沈殿を補助し、続いて遠心分離（３３００ｒｐｍ、５分）によりペレット形成を行った。過剰のエーテルを真空吸引により取り除き、ペプチドペレットを換気フード内で一晩乾燥させた。乾燥したペプチドペレットを２０％のアセトニトリル及び１０ｍｌのＨＰＬＣグレード水に溶解させ、ＬＣ／ＭＳのために副標本を取り、凍結乾燥した。その後、粗生成物を全て、Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８カラムを用いた逆相Ａｑｕｉｔｙ（商標）ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）により分析した。ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ  ＬＴＱ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）分光計システムを用いたタンデムエレクトロスプレー質量分析により、個々のペプチドの完全性を確認した。Ｗａｔｅｒｓ  ６００  Ｐｒｅｐ  ＨＰＬＣ上のＶｙｄａｃ  Ｃ１８  ＲＰ分取カラムで、分取クロマトグラフィーを完了した。個々の画分を３０秒間隔で収集して、ＬＣ／ＭＳを使用して特性決定し、所望の生成物を含有する画分を凍結乾燥した。種々のアッセイ用のオートクレーブＭｉｌｌｉ−Ｑ水中で再懸濁するまで、これらを−２０℃で保存した。次に、原液を４℃で保存した。ペプチドのアミノ酸配列、等電点（ｐＩ）及び分子量（ＭＷ）について、表８に一覧でまとめている。
【表８】
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【０１０７】
実施例１０
本開示のペプチドの、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ殺菌活性の比較。
【０１０８】
ペプチドＰ３０７、Ｐ３０７ＡＥ−８、Ｐ３０７ＳＱ−８Ｃ、及びＰ３０７ＣＳ−８のｉｎ  ｖｉｔｒｏ殺菌活性を測定するために、細菌を室温で２時間、ペプチドで処理した。生残細胞を連続希釈し、ＴＳＢ寒天プレートに配置して活性を測定した。
【０１０９】
ペプチドＰ３０７、Ｐ３０７ＡＥ−８及びＰ３０７ＳＱ−８Ｃ（５０μｇ／ｍＬ）の殺菌活性を、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ株＃１７９１、Ｓ５及びＡＴＣＣ１７９７８を処理することにより比較した。Ｐ３０７ＳＱ−８Ｃが最も活性であり、約１０６ｃｆｕ／ｍＬの細菌を検出限界未満（＜１０ｃｆｕ／ｍＬ）まで低下させた。Ｐ３０７はＰ３０７ＡＥ−８よりも僅かに活性であったが、両方のペプチドは、生存細菌内で約３．８対数単位の減少を誘発した（図２Ａ）。８つのアミノ酸（ＳＱＳＲＥＳＱＣ）がＰ３０７ＳＱ−８Ｃのより高い活性にどのように貢献したかを調査するために、５０μｇ／ｍＬのＰ３０７としての同一モル濃度のペプチドＳＱＳＲＥＳＱＣをそれ自体で、またはＰ３０７と組み合わせてＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ株＃１７９１及びＳ５に加えた。活性を５０μｇ／ｍＬのＰ３０７及びＰ３０７ＳＱ−８Ｃと比較した。組み合わせはＰ３０７と同様なだけ活性であったが、ＳＱＳＲＥＳＱＣペプチドのみでは活性を有しなかった（図２Ｂ）。したがって、Ｐ３０７ＳＱ−８Ｃの高い殺菌活性には結合が不可欠である。次に、我々は配列及び組成物の重要性を調査した。Ｐ３０７ＳＱ−８Ｃ内での最後の８つのアミノ酸を混ぜることにより、我々は、Ｐ３０７のＣ末端にＣＳＱＲＱＳＥＳを加えたＰ３０７ＣＳ−８を合成した。Ｐ３０７ＳＱ−８Ｃ及びＰ３０７ＣＳ−８の活性は類似していた（図２Ｃ）。エラーバーは標準偏差を示し、黒の水平線は検出限界を示す。したがって、我々は、Ｐ３０７ＳＱ−８Ｃの優れた活性は、最後の８個のアミノ酸の順序に関係なく、最後の８個のアミノ酸の組成に由来するという結論を下した。更なる調査のために、我々は、最も活性であるためＰ３０７ＳＱ−８Ｃを使用し、Ｐ３０７とその活性を比較した。
【０１１０】
実施例１１
Ｐ３０７及びＰ３０７ＳＱ−８Ｃの殺菌活性
【０１１１】
Ｐ３０７及びＰ３０７ＳＱ−８Ｃのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性における、ｐＨ及びＮａＣｌの影響を調査した。Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ株１７９１を５０μｇ／ｍＬのペプチドで処理し、各条件を試験した。２つの緩衝系（リン酸ナトリウム及びＴｒｉｓ−ＨＣｌ）を使用して、ｐＨ６．８、７．５、８．０及び８．８で試験した。ペプチドはＴｒｉｓ−ＨＣｌ中で一層活性であり、ｐＨが高ければ、良好な殺傷を誘発した（図１３Ａ）。したがって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５、およそ生理的ｐＨ）で続けることを選択した。両方のペプチドの活性はＮａＣｌの濃度に反比例した（図１３Ｂ）。次に、Ｐ３０７の滴定、並びにＰ３０７及びＰ３０７ＳＱ−８Ｃの殺傷速度を、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ株１７９１を処理することにより調査した。Ｐ３０７の活性は濃度依存性であり、これは４μｇ／ｍＬから開始した（図１３Ｃ）。Ｐ３０７ＳＱ−８ＣはＰ３０７よりも速く作用し、５分の時点で既に、約３．２対数単位の減少が得られた（図１３Ｄ）。室温または３７℃において、いずれかのペプチドの活性に差はなかった（データは示さない）。これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏ特性決定実験から、我々は、最適の実験条件は、特に断りのない限り５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０μｇ／ｍＬのペプチド、及び室温（２２〜２５℃）で２時間と決定した。
【０１１２】
実施例１２
次に、我々は、異なる細菌種のＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ（株番号１７７５、１７７６、１７７７、１７８８、１７８９、１７９０、１７９１、１７９２、１７９３、１７９４、１７９６、１７９７、１７９８、１７９９、ＡＴＣＣ  １７９７８及びＳ１、Ｓ３、Ｄ５）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ（ΔＳｔｅｒｎｅ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ＤＨ５α）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＰＡ０１）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＲＮ４２２０）、並びにクレブシエラ肺炎の２株（ＡＴＣＣ  ７００６０３及びＡＴＣＣ１００３１）に対するＰ３０７及びＰ３０７ＳＱ−８Ｃのｉｎ  ｖｉｔｒｏ殺菌スペクトルを調査した。これらの細菌種を、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中５０μｇ／ｍＬのＰ３０７またはＰ３０７ＳＱ−８Ｃで、室温にて２時間処理し、ペプチドの特異性を調査した。試験した細菌の中で、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ株がペプチドに対して連続して最も感度が高く、Ｐ３０７及びＰ３０７ＳＱ−８Ｃに関して、それぞれ平均２．７及び６．２対数単位の減少を示した。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓは適度に感度が高い。Ｐ３０７及びＰ３０７ＳＱ−８Ｃは、これらの細菌に対してそれぞれ、約１．３及び２．９対数単位の減少を生み出した。しかし、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ及びＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは両方のペプチドに対して耐性を有している（図１４）。
【０１１３】
実施例１３
更に、異なる増殖期における、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉに対するペプチドの活性を調査するために、我々は対数期、静止期及びバイオフィルム状態において、株＃１７９１の感度を比較した。対数期（播種の３時間後、新鮮な培地内で１：１００で一晩培養）及び静止期（一晩培養）の細菌を、５０μｇ／ｍＬのＰ３０７またはＰ３０７ＳＱ−８Ｃで、室温で２時間処理した。生残細胞を連続希釈し、ＴＳＢ寒天プレートに配置しｃｆｕ／ｍＬを測定した（図１５Ａ）。約２．５ｃｍ長のカテーテル内に、０．２％グルコースを含む、ＴＳＢ中の株＃１７９１（約１０５ｃｆｕ／ｍＬ）を３７℃で７２時間インキュベーションすることにより、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉバイオフィルムを確立した。次に、カテーテルを洗浄して浮遊細胞を取り除き、２５０μｇ／ｍＬのＰ３０７またはＰ３０７ＳＱ−８Ｃで処理した。室温で２時間及び２４時間後に、バイオフィルムを完全に破壊し、生残細胞を再懸濁させてプレートに配置し、計数し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏバイオフィルムに対するペプチドの致死効率を測定した（図１５Ｂ）。対数期の生命体は、静止期よりもＰ３０７に対して僅かに高い感度を有した（約３．７対２．４対数単位の減少）。Ｐ３０７ＳＱ−８Ｃとは、かかる差がないように思われる（図１５Ａ）。バイオフィルムは全ての増殖期で最も耐性が高かった。バイオフィルムを２５０μｇ／ｍＬのＰ３０７またはＰ３０７ＳＱ−８Ｃで、２または２４時間処理した。２時間後、Ｐ３０７及びＰ３０７ＳＱ−８Ｃについてそれぞれ、ｃｆｕ／ｍＬで約３及び４対数単位の減少が観察された。２４時間後、Ｐ３０７は更に約１．３対数単位の減少を生み出したが、Ｐ３０７ＳＱ−８Ｃは生み出さなかった（図１５Ｂ）。
【０１１４】
実施例１４
臨床的に用いられる幾つかの抗生物質と、ペプチドＰ３０７及びＰ３０７ＳＱ−８Ｃの効率を比較するために、我々は、２つのＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ株＃１７９１及びＡＴＣＣ１７９７８に関して、最少阻害濃度アッセイを実施した。マイクロタイター希釈法を使用して、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ株＃１７９１、＃１７９８、Ｓ５及びＡＴＣＣ１７９７８に対する、レボフロキサシン、セフタジジム、ポリミキシンＢ、Ｐ３０７及びＰ３０７ＳＱ−８ＣのＭＩＣを測定した。抗生物質に関して、Ｅｔｅｓｔ  Ｌｏｏｄ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．，（２０１５  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．５９：１９８３−１９９１）により測定された、１．５〜２倍の連続希釈（３つは低く、３つは高く）のＭＩＣを含めた。ペプチドに関して、２倍の連続希釈（５００−３１．２５μｇ／ｍＬ）を試験した。一晩培養した液をＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ液体培地（ｐＨ７．９）内で再懸濁し、ＯＤ６００を０．００１（約１０５ｃｆｕ／ｍＬ）とした。抗生物質またはペプチドを加え、各希釈液を最終的に１００μＬとした。細菌を、３７℃で２４時間、２２０ｒｐｍで増殖させた。次に、５９５ｎｍにおける吸光度をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で読み取った。細菌増殖を完全に阻害する抗菌剤の最低濃度として、ＭＩＣを測定した。Ａｌａｍａｒ（登録商標）Ｂｌｕｅを使用して、ＯＤ５９５から得たデータを確認した。実験を２連で、少なくとも２回実施した。
【０１１５】
株は、全ての抗菌剤に対して種々の感度を示した（表９）。
【表９】
2017526627.tif 000010
【０１１６】
Ｐ３０７ＳＱ−８ＣはＰ３０７よりも低いＭＩＣを有し、これはｉｎ  ｖｉｔｒｏ殺活性に一致する（図２及び３）。
【０１１７】
実施例１５
Ｂ細胞生残及び溶血により測定した、Ｐ３０７及びＰ３０７ＳＱ−８Ｃの細胞毒性効果。
【０１１８】
ロックフェラー大学病院のリウマチ熱患者から入手したヒトＢ細胞を、１０％ウシ血清、ペニシリン及びストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ培地内で増殖させた。細胞を低速遠心分離で収集し、培地内で一度洗浄し、予熱した培地内で、トリパンブルー排除試験により測定されたように、１０７細胞／ｍｌの濃度に再懸濁した。ペプチド（Ｐ３０７、Ｐ３０７ＳＱ−８Ｃ及びメリチン）を培養培地内で連続希釈し（８０−０．３１２５μＭ）、５ｘ１０４個の生細胞に加えた。細胞を、加湿した５％  ＣＯ２雰囲気で、３７℃で１時間インキュベーションし、この後、メーカーの取扱説明書に従いこれらを染色した（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６非放射性細胞増殖アッセイ；Ｐｒｏｍｅｇａ）。試料を更に４時間インキュベーションし、その後、可溶化／停止液を加え、一晩インキュベーションした。５７０ｎｍでの吸光度をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で測定した。反応を３連で２回実施し、代表的なデータを平均±標準偏差として示す。
【０１１９】
健全な個体からのヒト血液をＥＤＴＡチューブ内に集め、赤血球（ＲＢＣ）を低速遠心分離により収集した。細胞をＰＢＳ内で洗浄し、１０％のＲＢＣ溶液に再懸濁した。Ｐ３０７及びＰ３０７ＳＱ−８ＣをＰＢＳ内で連続希釈した（８０−０．３１２５μＭ）。ＰＢＳ、及び１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を、それぞれ陰性及び陽性対照として使用した。試料を混合し、３７℃で１時間インキュベーションした。上清を収集し、４０５ｎｍにおける吸光度をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で記録した。反応を３連で２回実施し、代表的なデータを平均±標準偏差として示す。
【０１２０】
ペプチドの連続希釈液を、加湿した５％  ＣＯ２雰囲気で、３７℃で１時間、約５×１０４個の生きたＢ細胞とインキュベーションし、メリチンを陽性対照として使用した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）非放射性細胞増殖アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、メーカーのプロトコールに従って実施し、Ｂ細胞の生残を定量化した。赤血球（ＲＢＣ）をペプチドの連続希釈液と共にインキュベーションし、ヘモグロビンの上清への放出をＯＤ４０５で測定し、溶血を測定した。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を陽性対照として使用した。エラーバーは標準偏差を示す。
【０１２１】
ヒトＢ細胞及び赤血球（ＲＢＣ）を使用して、ペプチドの細胞毒性について試験した。メリチン陽性対照とは対照的に、Ｂ細胞の膜はＰ３０７またはＰ３０７ＳＱ−８Ｃのいずれからも影響を受けなかった。試験した最大濃度（８０μＭ）でも、細胞の生存能は緩衝液対照と同一のままである（図１６Ａ）。同様に、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００陽性対照と比較して、ＲＢＣの完全性はいずれのペプチドからも影響を受けない（図１６Ｂ）。
【０１２２】
実施例１６
Ｐ３０７ＳＱ−８Ｃ（約２５％）の一部は、４．３ｋＤのＰ３０７ＳＱ−８Ａと比較して、理論分子量で２倍である（データは示さず）。高活性のＰ３０７ＳＱ−８Ｃに対するジスルフィド結合形成の重要性を測定するために、Ｐ３０７及びＰ３０７ＳＱ−８Ｃの殺菌活性を、０、０．１及び１ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）の存在下で比較した。Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ株１７９１を、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中、５０μｇ／ｍＬのＰ３０７、または１０μｇ／ｍＬのＰ３０７ＳＱ−８Ｃで、室温で２時間処理した。生残細胞を連続希釈して、ＴＳＢ寒天上に配置した。Ｐ３０７ＳＱ−８Ｃはより高いＤＴＴ濃度で活性が下がるが、Ｐ３０７の活性は僅かに増加する（図１７Ａ）。Ｐ３０７ＳＱ−８Ｃ活性に関するジスルフィド形成の重要性を更に確認するために、我々は、末端のシステインをアラニンに変更したＰ３０７ＳＱ−８Ａを合成した。Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ株＃１７９１及びＡＴＣＣ１７９７８を、１０μｇ／ｍＬの各ペプチドで処理した。Ｐ３０７ＳＱ−８Ｃ及びＰ３０７ＳＱ−８Ａの殺菌アッセイは、前者が後者より僅かに活性が高いことを示した（図１７Ｂ）。これらの結果全体から、Ｐ３０７ＳＱ−８Ｃの優れた活性の一部は、２分子間でのジスルフィド結合形成に由来することが示された。
【０１２３】
実施例１７
次に我々は、ペプチドの正電荷を考慮して（実効電荷は＋７）、Ｐ３０７がＤＮＡに結合するか否かを調査した。ペプチドＰ３０７をＤＮＡと異なるペプチド：ＤＮＡ比（０：１〜１５：１）で混合し、１時間インキュベーションした後アガロースゲル上で分析した。陽性対照ペプチドと比較して、試験したペプチド：ＤＮＡのいかなる比においても、Ｐ３０７については分子量の変化が観察されなかった（図１８）。
【０１２４】
実施例１８
ペプチドが、ＤＮＡと相互作用することで細菌を殺傷しないようであったため、我々は、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて、ペプチドが細菌膜に影響を及ぼすか否かを調査した。Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ株１７９１を緩衝液（対照）、または３００μｇ／ｍＬのＰ３０７ＳＱ−８Ｃで５分間または２時間処理した。試料のＴＥＭ画像を比較することにより、内膜の破壊、及び細胞内密度の変化が明らかとなる（図１９Ａ、Ｂ及びＣ）。更に我々は、Ｅ．ｃｏｌｉ及びＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを含む、ｐＨ７．５における耐性細菌（図３）は、ｐＨ８．８でＰ３０７に対して感度が高いことを発見した（図１９Ｄ）。ペプチドの電荷は、ｐＨが７．５から８．８に変化する時に変化しないため、我々は、変化は細菌膜上で発生すると考えた。より高いｐＨにおいて、細菌膜はより負に荷電し、正に荷電したペプチドがより強力なイオン相互作用をすることを可能にする。
【０１２５】
実施例１９
理論に束縛されるものではないが、我々は、以下の作用機序を仮定する。Ｐ３０７ＳＱ−８Ｃは細菌膜と相互作用して細胞内に入り込み、そのプロセス中に、細胞質膜を破壊する。ペプチドが二量体化されている時に膜透過性はより効率的となる。破壊は、ヒドロキシルラジカル等の活性酸素種の産生を誘発し、これが細胞内の内容物を破壊する。この仮定を調査するために、我々はＳＹＴＯＸ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ取り込みアッセイを使用して膜破壊を測定した。
【０１２６】
細菌を一晩培養した液を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で洗浄し、再懸濁してＯＤ６００を０．３とした（約１０７ｃｆｕ／ｍｌ）。Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼ（２５Ｕ／ｍＬ）（Ｎｏｖａｇｅｎ）及びＳＹＴＯＸ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ（１μＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を細菌細胞に加え、暗室内で室温で１５分間インキュベーションした。ペプチドを加え（５０μｇ／ｍｌ：１４．７μＭのＰ３０７、及び１１．６μＭのＰ３０７ＳＱ−８Ｃ）、メリチン（１４．７μＭ）（Ｓｉｇｍａ）を対照として使用した。相対蛍光単位（ＲＦＵ）をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓ  ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）により、室温で２時間測定した（ｅｘ：４８５ｎｍ、ｅｍ：５２０ｎｍ）。反応を２連で２回実施し、例示的なデータを平均±標準偏差として示す。
【０１２７】
両方のペプチドが感受性細菌の膜を透過し、細胞内ＤＮＡに結合するため、ＳＹＴＯＸ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ染料の蛍光シグナルの増加を引き起こす（図２０）。ヒドロキシルラジカルスカベンジャーであるチオ尿素の存在下においてＰ３０７及びＰ３０７ＳＱ−８Ｃにより細菌を処理することによりヒドロキシルラジカルの形成を調査した。ポリミキシンＢの殺菌活性は、部分的にヒドロキシルラジカルの死経路に依存していると報告されているため、ポリミキシンＢを対照として含めた。チオ尿素（３００ｍＭ）はＰ３０７及びＰ３０７ＳＱ−８Ｃの活性を完全に阻害する（図２１Ａ）。しかし、チオ尿素が他の経路により活性に影響を及ぼすことは無視できない。したがって、殺菌活性を好気性条件及び嫌気性条件下でもまた比較した。Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉは厳格な好気性細菌であるため、Ｅ．ｃｏｌｉを、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）による殺菌アッセイに使用した。両方のペプチドの活性は、嫌気性条件により完全に阻害された（図２１Ｂ）。酸素依存の輸送機序への影響といった他の可能性は除外できないが、現在の結果は、ヒドロキシルラジカル形成に関する我々の仮説を支持する。
【０１２８】
実施例２０
皮膚感染はＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉによる病気の一般的経路であるため、マウス皮膚モデルを使用して、Ｐ３０７ＳＱ−８Ｃのｉｎ  ｖｉｖｏ活性を調査した。４０匹のメスＣＤ−１マウス（６〜８週齢；Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の背中を電気かみそりで剃った。Ｎａｉｒ（商標）（体及び脚用の脱毛ローション、アロエ及びラノリン）を、剃った領域に塗布して残っている毛を全て取り除いた。次にこの領域をアルコールワイプスで消毒し、テープストリッピングにより皮膚剥削を引き起こした。次に、テープストリッピングした約１ｃｍ２の領域を標識し、約１０８ｃｆｕ／ｍＬのＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ株＃１７９１（１０μＬ）で感染させた。細菌を１６〜１８時間コロニー形成させた後、感染した領域を未処理とするか、または２００μｇのＰ３０７ＳＱ−８Ｃもしくは２μｇのポリミキシンＢで２時間処理した。皮膚上の残存細菌を回収するために、マウスを屠殺し、感染した皮膚を、マイクロバッグ（Ｓｅｗａｒｄ  Ｌｔｄ．，ＵＫ）を使用してＳｔｏｍａｃｈｅｒ（登録商標）８０  Ｂｉｏｍａｓｔｅｒ内で１分間、５００μＬのＰＢＳで処理した。溶液を連続希釈し、選択用に４μｇ／ｍＬのレボフロキサシン、及び１２μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ寒天上に配置した。各動物から得られるｃｆｕ／ｍＬを点として示し、水平棒は平均を表す。両方の処理が、細菌担持を著しく低下させた（ｐ値＝０．００２３、通常一元配置分散分析）（図２２）。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図３−６】
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【図３−７】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図４−６】
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【図４−７】
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【図４−８】
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【図４−９】
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【図４−１０】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年3月21日(2017.3.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
本開示のペプチドの別の実施形態は、アミノ酸配列ＮＡＫＤＹＫＧＡＡＡＥＦＰＫＷＮＫＡＧＧＲＶＬＡＧＬＶＫＲＲＫＳＱＳＲＥＳＱＡ（配列番号５３）を有するペプチドである。別の実施形態は、アミノ酸配列ＮＡＫＤＹＫＧＡＡＡＥＦＰＫＷＮＫＡＧＧＲＶＬＡＧＬＶＫＲＲＫＣＳＱＲＱＳＥＳ（配列番号５１）を有するペプチドである。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、もしくは配列番号２１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、または前記ポリペプチドの断片であって、前記ポリペプチドまたは断片は抗菌活性を有する、前記ポリペプチドまたは断片。
【請求項２】
前記ポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、もしくは配列番号２１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または前記ポリペプチドの断片からなり、前記ポリペプチドまたは断片は抗菌活性を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、もしくは配列番号２１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、または前記ポリペプチドの断片であって、前記ポリペプチドまたは断片は抗菌ペプチドにコンジュゲートされてコンジュゲートポリペプチドが得られ、前記コンジュゲートポリペプチドは抗菌活性を有する、前記ポリペプチドまたは断片。
【請求項４】
前記ポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、もしくは配列番号２１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸、または前記ポリペプチドの断片からなり、前記ポリペプチドまたは断片は抗菌ペプチドにコンジュゲートされてコンジュゲートポリペプチドが得られ、前記コンジュゲートポリペプチドは抗菌活性を有する、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記ポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、もしくは配列番号２１を有するアミノ酸、または前記ポリペプチドの断片からなり、前記ポリペプチドまたは断片は抗菌ペプチドにコンジュゲートされてコンジュゲートポリペプチドが得られ、前記コンジュゲートポリペプチドは抗菌活性を有する、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記抗菌ペプチドは８個のアミノ酸Ｃ、Ｓ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｅ及びＳを任意の順序で含む、請求項３、４または５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記抗菌ペプチドはアミノ酸配列ＳＱＳＲＥＳＱＣ（配列番号４４）またはＣＳＱＲＱＳＥＳ（配列番号５０）を有する、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記ポリペプチドは、配列番号４５または配列番号５１のアミノ酸配列を含む、請求項３、４または５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記ポリペプチドまたは断片のＣ末端は前記抗菌ペプチドにコンジュゲートされている、請求項３〜８のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは断片。
【請求項１０】
前記ポリペプチドまたは断片のＣ末端は、ペプチド結合を介して前記抗菌ペプチドのＮ末端にコンジュゲートされている、請求項９に記載のポリペプチドまたは断片。
【請求項１１】
前記ポリペプチドまたは断片のＮ末端は前記抗菌ペプチドにコンジュゲートされている、請求項３、４、６、または８のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは断片。
【請求項１２】
前記ポリペプチドまたは断片のＮ末端は、ペプチド結合を介して前記抗菌ペプチドのＣ末端にコンジュゲートされている、請求項１１に記載のポリペプチドまたは断片。
【請求項１３】
前記ポリペプチドまたは断片はグラム陰性菌に対して抗菌活性を有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは断片。
【請求項１４】
前記細菌はアシネトバクター属のものである、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記細菌はＥ．ｃｏｌｉ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａまたはＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉである、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記ポリペプチドまたは断片はグラム陽性菌に対して抗菌活性を有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは断片。
【請求項１７】
前記細菌はＳ．ａｕｒｅｕｓまたはＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓである、請求項１６に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記ポリペプチドは凍結乾燥されている、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の１つ以上のポリペプチドを含む組成物。
【請求項２０】
前記組成物は製薬上許容できる担体、緩衝剤、または防腐剤を含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記組成物は局所投与、皮下送達、静脈内送達または経口送達用に配合される、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記組成物は抗生物質または凝固剤を更に含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２３】
前記組成物は凍結乾燥されている、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
治療を必要とする対象の治療方法であって、前記対象に、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の１つ以上のポリペプチド、及び製薬上許容できる担体、緩衝剤、または防腐剤を含む組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項２５】
前記対象は細菌感染を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記細菌感染は他の治療様式に反応しない、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記組成物は抗生物質と組み合わせて投与される、請求項２４または請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗生物質はアモキシシリン、オーグメンチン、アモキシシリン、アンピシリン、アズロシリン、フルクロキサシリン、メズロシリン、メチシリン、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、セファレキシン、セファゼドン、セフロキシム、ロラカルベフ、セメタゾール（ｃｅｍｅｔａｚｏｌｅ）、セフォテタン、セフォキシチン、シプロフロキサシン、レバキン（ｌｅｖａｑｕｉｎ）、及びフロキサシン（ｆｌｏｘａｃｉｎ）、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、またはミノサイクリン、ゲンタマイシン、アミカシン、及びトブラマイシン、クラリスロマイシン、アジスロマイシン、エリスロマイシン、ダプトマイシン、ネオマイシン、カナマイシン、またはストレプトマイシンである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記細菌感染は創感染である、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記組成物は局所投与、皮下投与、静脈内注射、または経口投与される、請求項２４〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記組成物は単位剤形である、請求項２４〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記組成物はクリーム、軟膏剤、軟膏、ゲル、トローチ剤、スプレー、またはエアゾールの形態である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３３】
細菌バイオフィルムの形成を阻害するか、またはそれを破壊することであって、治療を必要とする対象に、前記バイオフィルム内の細菌を殺傷するのに有効な量の、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む組成物を投与することを含む、前記阻害することまたは破壊することを含む細菌感染の治療方法。
【請求項３４】
物品の消毒方法であって、前記物品を、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む組成物と接触させることを含む、前記方法。
【請求項３５】
前記物品は硬い表面を有する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
物品において、細菌バイオフィルムの形成を阻害するかまたはそれを破壊する方法であって、前記物品を、前記バイオフィルム内の細菌を殺傷するのに有効な量の、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のペプチドと接触させることを含む、前記方法。
【請求項３７】
前記物品はカウンタートップ、キーボード、手術器具、または医療デバイスである、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む組成物を含有する製品。
【請求項３９】
前記組成物は、担体、緩衝剤または防腐剤を更に含む組成物である、請求項３８に記載の製品。
【請求項４０】
前記製品はバイアル瓶または送達デバイスである、請求項３９に記載の製品。
【請求項４１】
前記組成物は凍結乾燥されている、請求項３９または４０に記載の製品。
【請求項４２】
手術創を有する対象の治療方法であって、前記傷を、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のポリペプチド、及び製薬上許容できる担体、緩衝剤、または防腐剤を含む組成物で洗浄することを含む、前記方法。
【請求項４３】
前記手術創は、前記傷を手術により閉じる前に洗浄される、請求項４２に記載の方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2017526627000001.app
【国際調査報告】
2017526627.tif 000054
2017526627.tif 000055
2017526627.tif 000056