(57)【要約】  本発明は、免疫療法の分野に関する。より具体的には、本発明は、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）誘導免疫抑制を軽減し、その結果、癌、感染症、ワクチン接種、外傷、自己免疫疾患、慢性炎症疾患および移植での適切な免疫応答を可能にするために、ＳＩＲＰａとＣＤ４７との間の相互作用を遮断する化合物を、それを必要とする患者に投与することによって、ＭＤＳＣを非抑制細胞に分化させる方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）の非抑制細胞への分化によって改善または予防できる任意の病態の治療に使用するための、シグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰａ）とそのリガンドのうちの少なくとも１つとの間の相互作用を遮断する化合物。
【請求項２】
前記化合物がＳＩＲＰａとＣＤ４７との間の相互作用を遮断する、請求項１に記載の使用のための請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記化合物がポリペプチドである、請求項１に記載の使用のための請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
前記化合物がペプチド拮抗剤である、請求項１に記載の使用のための請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５】
前記化合物が抗体である、請求項１に記載の使用のための請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項６】
前記化合物が抗ＳＩＲＰａ抗体である、請求項１に記載の使用のための請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項７】
前記ＭＤＳＣが単球ＭＤＳＣ（Ｍｏ−ＭＤＳＣ）である、請求項１に記載の使用のための請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項８】
前記非抑制細胞が非抑制リンパ系細胞である、請求項１または７に記載の使用のための請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項９】
前記非抑制細胞が、ＭＨＣクラスＩＩに陰性で、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の少なくとも１つのマーカーに陽性である、請求項１、７または８に記載の使用のための請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１０】
前記非抑制細胞が、エフェクターリンパ系細胞である、請求項１および７〜９のいずれか１項に記載の使用のための請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１１】
前記病態が癌、感染症、外傷、自己免疫疾患、ワクチン接種、慢性炎症疾患または移植片機能障害である、請求項１および７〜１０のいずれか１項に記載の使用のための請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１２】
前記病態が固形癌である、請求項１および７〜１１のいずれか１項に記載の使用のための請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１３】
前記病態が転移癌である、請求項１および７〜１２のいずれか１項に記載の使用のための請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１４】
前記化合物が第２治療薬に併用される、請求項１および７〜１３のいずれか１項に記載の使用のための請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１５】
前記第２治療薬が化学療法剤、放射線療法、手術、免疫療法剤、抗生物質およびプロバイオティックスから成る群から選択される、請求項１４に記載の使用のための請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１６】
前記第２治療薬が治療ワクチンおよび免疫チェックポイント遮断剤または賦活剤から成る群から選択される免疫療法剤である、請求項１５に記載の使用のための請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１７】
前記第２治療薬が抗ＰＤＬ１、抗ＰＤ１、抗ＣＴＬＡ４および抗ＣＤ１３７から成る群から選択される免疫チェックポイント遮断剤または賦活剤である、請求項１６に記載の使用のための請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物による治療効果を決定する方法であって、前記化合物によって治療される患者からのサンプル中で、ＣＤ１６１に陽性であり、ＨＬＡ−ＤＲに陰性である非抑制細胞の存在を測定することを含む、方法。
【請求項１９】
前記サンプルが血液サンプル、組織サンプル、腫瘍からのサンプル、または滑液サンプルである、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫療法の分野に関する。より具体的には、本発明は、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）誘導の免疫抑制を軽減し、その結果、癌、感染症、ワクチン接種、外傷、自己免疫疾患、慢性炎症疾患および移植での適切な免疫応答を可能にするために、ＭＤＳＣを非抑制細胞に分化させる方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）は、未成熟造血骨髄性細胞の前駆細胞の異種細胞群であり、免疫抑制機能を発揮するため、免疫応答を負に制御する（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ  ａｎｄ  Ｎａｇａｒａｊ，２００９；Ｔａｌｍａｄｇｅ  ａｎｄ  Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ，２０１３）。ＭＤＳＣは、多くの病的状態で蓄積され、多くの冗長なメカニズムを利用して、自然免疫応答および適応免疫応答の両方に影響を与えることが認められた（Ｄｉｌｅｋ  ｅｔ  ａｌ，２０１０；Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。ＭＤＳＣは、特に栄養素（例、Ｌ−アルギニンおよびＬ−システイン）の枯渇メカニズム、活性酸素種（ＲＯＳ）および活性窒素種（ＲＮＳ）の産生、Ｔ−リンパ球輸送の混乱（例、Ｌ−セレクチン発現の減少および異常ケモカイン放出）、アポトーシスの誘導（ガレクチン９経由）およびＩＬ−１β産生からのＴｈ−１７応答へのＴ−リンパ球分化の偏りによるＴ−およびＢ−リンパ球の活性化、増殖および応答の強力な抑制細胞である（Ｂｒｕｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２０１３）。ＭＤＳＣは、抗原特異性ナチュラル調節Ｔ−細胞（ｎＴｒｅｇ）を増殖させ、ナイーブＴ−細胞の誘導Ｔｒｅｇ（ｉＴｒｅｇ）細胞への変換を促進し、炎症部位、感染部位または腫瘍部位でのＴｒｅｇ浸潤を促進する極めて高い能力も有する。ＭＤＳＣは、特に膜結合ＴＧＦβによりＮＫ細胞数を減少させ、その機能を抑制するとも説明された。さらに、ＭＤＳＣは、Ｔ細胞応答において誘導する免疫の偏りと同様に、ＩＬ−１２のマクロファージ産生を抑制することによって、マクロファージをＭ２表現型（非炎症性マクロファージ）に偏らせる。同様に、ＭＤＳＣは、ＩＬ−１０を産生することによって樹状細胞（ＤＣ）機能を損ない、さらに、加えてＤＣによるＩＬ−１２産生を抑制し、ＤＣのＴ−細胞活性化能を減少させる。最後に、ＭＤＳＣは、非造血細胞に作用し、また、特に、腫瘍の血管形成、腫瘍の拡大、腫瘍細胞の浸潤および転移を促進することが広く認識されている（Ｋｅｓｋｉｎｏｖ  ａｎｄ  Ｓｈｕｒｉｎ，２０１４；Ｙｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【０００３】
生理的状態では、造血幹細胞は、共通リンパ系前駆細胞（ＣＬＰ）または共通骨髄性前駆細胞（ＣＭＰ）に分化する。その後、これらの前駆細胞は、我々の免疫系の２種類の異なるタイプの細胞を発生させる。すなわち、ＣＬＰは、リンパ球またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に分化するが、ＣＭＰは、未成熟骨髄性細胞（ＩＭＣ）に分化する。正常な場合、ＩＭＣは、各種の末梢臓器まで移動し、そこで、もっぱら樹状細胞およびマクロファージまたは多形核細胞（顆粒球とも称される）に分化する。しかし、多くの病的状態で産生される複数の因子（例、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＩＬ−１３、Ｓ１００Ａ８／Ａ９など）は、ＩＭＣの蓄積を促進し、それらの分化を防ぎ、それらの活性化を誘導する。これらの細胞は、活性化後、免疫抑制機能を発揮し、２００７年にＭＤＳＣと名付けられた（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。これまでのところ、３種類の主要ＭＤＳＣ群が表現型および機能について特徴付けられている。すなわち、前骨髄球性または単球性ＭＤＳＣ（Ｍ−ＭＤＳＣまたはＭｏ−ＭＤＳＣ）および多形核（顆粒球性とも呼ばれる）ＭＤＳＣ（ＰＭＮ−ＭＤＳＣまたはＧ−ＭＤＳＣ）である。Ｍｏ−ＭＤＳＣは、マウスのＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｃ＋Ｌｙ６Ｇ−表現型、ヒトのＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３３＋ＨＬＡ−ＤＲ−／ｌｏｗＣＤ１４＋表現型を特徴とし、最も強力な免疫抑制ＭＤＳＣ群であり、少なくとも酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）およびアルギナーゼ（ＡＲＧ１）酵素を発現することによって機能し、腫瘍微小環境に豊富に存在する。前骨髄球性ＭＤＳＣは、Ｍｏ−ＭＤＳＣに似ているが、ＣＤ１４マーカーを発現せず、Ｍｏ−ＭＤＳＣに比べてさらに未成熟な状態であることが示唆される（Ｄｉａｚ−Ｍｏｎｔｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。ＰＭＮ−ＭＤＳＣは、マウスのＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６ＣｌｏｗＬｙ６Ｇ＋表現型、ヒトのＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３３＋ＨＬＡ−ＤＲ−ＣＤ１５＋表現型を特徴とし、末梢およびリンパ器官でより顕著で、主に活性酸素種（ＲＯＳ）を産生することによって機能する（Ｓｏｌｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。ＭＤＳＣは、一部の病的状態において分化が遮断されるマクロファージ、樹状細胞または顆粒球の前駆体であるが、それらは、依然、「正常な」分化経路をたどる可能性を有する。事実、炎症性または腫瘍由来可溶性因子を伴わないＭｏ−ＭＤＳＣの培養、ならびに、健康なナイーブ宿主への移行が、これらの細胞をマクロファージまたは樹状細胞に分化させる。さらに、低酸素状態（腫瘍微小環境など）が、免疫抑制Ｍ２様腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）へのそれらの分化を促す場合がある。同様に、ＰＭＮ−ＭＤＳＣは、炎症性または腫瘍由来可溶性因子無添加での２４時間の培養後、表現型、機能が成熟顆粒球に似る（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。さらに、Ｍｏ−ＭＤＳＣよりも比較的短い寿命と低い増殖能を有するＰＭＮ−ＭＤＳＣは、病的状況ではＭｏ−ＭＤＳＣからの補充が可能である（Ｙｏｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。
【０００４】
現在、ＭＤＳＣは、病的状況で増殖し、適切な免疫応答を阻止する非常に重要な細胞と考えられており、重大な罹病や多数の疾患との併存症と関連する。第１に、ＭＤＳＣレベルは、癌病期重症度、転移と相関し、多様な癌、すなわち乳癌、大腸癌、メラノーマ、肺癌、肝臓癌、胃癌、腎臓癌、膵臓癌、膀胱癌、前立腺癌、卵巣癌、食道癌、肉腫、神経膠芽腫、頭頸部癌、ならびに、リンパ腫、白血病、および、骨髄腫、血液癌、を発症した患者における全生存期間を個別に予知する、と実証した研究が増加している（Ｄｉａｚ−Ｍｏｎｔｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｇａｂｉｔａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｉｄｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｋａｌａｔｈｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｋｈａｌｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｋｉｔａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｓｏｌｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｗｅｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。ＭＤＳＣは、多発性癌の予後に明らかに重要であり、新たなデータが、癌免疫療法の予測バイオマーカーとして、また、進行性固形腫瘍患者の全身化学療法への臨床応答を予測するための早期リーディングマーカーとして循環ＭＤＳＣの有用性を裏付けている（Ｋｉｔａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｗｅｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。これらの臨床研究および多数の前臨床報告に基づいて、癌免疫療法、化学療法との併用または個別に転移プロセスを抑制するためのアプローチの一貫としてＭＤＳＣを対象とするのは、明らかに臨床上非常に有望な戦略である（Ｄｉａｚ−Ｍｏｎｔｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。
【０００５】
ＭＤＳＣの蓄積は、癌以外の状況でも報告されている。持続性および慢性感染症の定着に病原体が用いる宿主免疫を回避することは、腫瘍回避のメカニズムと極めて似ている。したがって、ＭＤＳＣは、細菌感染症（例、シュードモナス・アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、細菌性肺炎、寄生虫感染症（例、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ））、真菌感染症（例、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ））、ウイルス感染症（ＢおよびＣ型肝炎、ＨＩＶ、インフルエンザ、ヘルペス）を含めた様々な感染症で報告されており、慢性感染症の持続と関連付けられていた（Ｃａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｇｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｖａｎ  Ｇｉｎｄｅｒａｃｈｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｖｏｌｌｂｒｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。事実、感染症急性期に産生される炎症性サイトカイン、および、トル様受容体（ＴＬＲ）の病原体由来粒子賦活剤がＭＤＳＣを誘導し、増殖させ、適切な免疫応答を抑制し、慢性感染症の共同原因である、と説明された。さらに、多くのウイルスは、発癌性もあり、合わせて、局所的に腫瘍のそれと同様の機能障害環境を誘発するので、ウイルス感染中に生じるＭＤＳＣは、特に興味深い。
【０００６】
ＭＤＳＣは、感染症や癌と同様に、ワクチン接種でも病原体または腫瘍抗原の両方に対して非常に有害な役割も果たす。例えば、一方で、ＨＩＶワクチン組成物に使用される抗原、ならびに、アジュバントは、ＭＤＳＣを活性化し、増殖させる（Ｇａｒｇ  ａｎｄ  Ｓｐｅｃｔｏｒ，２０１４；Ｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。他方、患者へのサルモネラワクチン後の防御免疫は、ＭＤＳＣ増殖の減少と直接相関し（Ｈｅｉｔｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．２００８）、ＭＤＳＣの枯渇は、治療的ワクチン接種後の抗腫瘍免疫を著しく増加させる（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２ａ，２０１２ｂ）。高レベルＭＤＳＣは、外傷、損傷または火傷患者でも報告されており、高レベルのこれらの未成熟骨髄性細胞は、特に敗血症を原因とする高罹病リスクと顕著に関連した（Ｃｈｅｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｃｕｅｎｃａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｊａｎｏｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｍａｋａｒｅｎｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｖｅｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。最後に、ＭＤＳＣは、病因や生理とは無関係に、ほぼすべての炎症状態で普遍的に増殖するため、細胞、組織または臓器の移植後（Ｄｉｌｅｋ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１０；Ｏｃｈａｎｄｏ  ａｎｄ  Ｃｈｅｎ  ２０１２）、ならびに、多発性硬化症、炎症性腸疾患、関節リウマチ、１型糖尿病または自己免疫肝炎などの自己免疫および慢性炎症疾患（Ｂａｎｉｙａｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｃｒｉｐｐｓ  ａｎｄ  Ｇｏｒｈａｍ  ２０１１；Ｋｕｒｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｓｅｒａｆｉｎｉ  ２０１３；Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  ２０１４；Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ−Ｌａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）でも蓄積することが認められている。げっ歯類実験モデルでの複数の研究は、これらの前述の疾患において免疫応答を抑えるためのこれらの免疫抑制細胞の重要性を実証している。これの急激過ぎる解釈は、移植、自己免疫または慢性炎症疾患で望ましくない免疫応答をコントロールするために、ＭＤＳＣ蓄積を促進し、および／または、それらの成熟細胞への分化を阻止する治療戦略を用いるという考えに至る。しかし、最近、相反する結果が浮上した。すなわち、急性炎症期中に誘導されるＭＤＳＣは、明らかに有益である（実験げっ歯類モデルで検討されたＭＤＳＣ）が、慢性炎症期に検出されるＭＤＳＣは、同様の特徴を共有しないと考えられるのである。事実、自己免疫または慢性炎症環境から単離されたＭＤＳＣは、明らかに、癌、損傷または感染環境とは対照的に、エクスビボでＴ−細胞を抑制せず、むしろ、炎症およびＭＤＳＣ動員を増加させる（Ｃｒｉｐｐｓ  ａｎｄ  Ｇｏｒｈａｍ  ２０１１）。同様に、慢性炎症性腸疾患の場合、結腸に認められるＭＤＳＣは、有害なＴｈ１７に偏った細胞傷害性免疫応答を促進する大量のＩＬ−１βおよびＩＬ−６を放出した（Ｋｕｒｍａｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。固形臓器移植では、ＭＤＳＣは、様々な移植片寛容誘導段階で重要な役割を果たす。臨床転帰を改善するためには、いくつかの段階で移植片に移行するＭＤＳＣ、特にＭｏ−ＭＤＳＣの存在を低減させることが有用��あると考えられる（Ｈｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。
【０００７】
病因および生理とは無関係に、これらの多数の臨床関連性と、これらの多様な病的状態におけるＭＤＳＣが果たす重要な役割に基づいて、その蓄積を阻止または促進するためにＭＤＳＣを調節する薬学的手法が、現在、増加している関心分野である。しかし、現在まで、二次的有害作用を伴わずに効率的なＭＤＳＣの調節を可能にする治療法はない。事実、大半の他の細胞群に反して、ヒトのＭＤＳＣは、特異的マーカーを発現せず、これらの細胞の直接および特異的標的化を可能にするだけである。最近、ゲムシタビン、５−フルオロウラシル、ドセタキセルまたは２−ヒドロキシアセトフェングリシネートなどの化学療法剤が、実際にＭＤＳＣのアポトーシスを誘発できることが発見された（Ａｐｅｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．２０１１；Ｖｉｎｃｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）。しかし、それらのＭＤＳＣ排除効果は、限定的で、かかる薬物は、他の細胞の望ましくないアポトーシスを誘発するため、既知の毒性と関連する。さらに、この方法は、炎症がＭＤＳＣにアポトーシス耐性を付与するという問題に直面する（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．２０１３；Ｏｓｔｒａｎｄ−Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【０００８】
ＭＤＳＣの免疫抑制機能をコントロールするための開発戦略は、複雑な抑制的作用メカニズム（ｉＮｏｓ、Ａｒｇ１、ＲＯＳ、ＲＮＳ、栄養欠乏、Ｆａｓ誘導細胞死、免疫抑制サイトカイン分泌、免疫偏向、Ｔｒｅｇの誘導・・・）により困難である。さらに、これらのメカニズムは、ＭＤＳＣのタイプ（前骨髄球性、Ｍｏ−ＭＤＳＣまたはＰＭＮ−ＭＤＳＣ）に応じて異なる。効果を示すメカニズムも、標的とする免疫細胞（Ｔ−リンパ球およびＢ−リンパ球、ＮＫ細胞、マクロファージ、樹状細胞）または非免疫細胞（例、血管新生増加時は血管細胞、および、転移促進時は癌細胞）のタイプに依存する。ＭＤＳＣの腫瘍部位への移動の阻止（Ｈｉｇｈｆｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）が試みられた（例、ＣＸＣＲ２拮抗剤）が、ＭＤＳＣは、依然として、末梢に対する非特異的全身免疫抑制機能を発揮し続けている。さらに、ＣＸＣＲ２は、Ｍｏ−ＭＤＳＣではなく、ＰＭＮ−ＭＤＳＣのみによって発現されるので、この方法は、より強力な抑制ＭＤＳＣであり、上記のようにＰＭＮ−ＭＤＳＣを補充すると記述されたこれらのＭｏ−ＭＤＳＣを損なわない。ＭＤＳＣの誘導および生成を阻止するために、ＭＤＳＣの誘導因子として同定された腫瘍または炎症による因子の放出を遮断する試みがなされた。一例は、プロスタグランジン−Ｅ２（ＰＥＧ２）拮抗剤である（Ｍａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。しかし、これらの戦略は、ＭＤＳＣ誘導を司る多数の他因子（例、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＩＬ−１３、Ｓ１００Ａ８／Ａ９など）に向き合うことになる。
【０００９】
別の概念は、ＭＤＳＣを標的にし、それらの成熟細胞への変換を誘導する、というものである。これは、有害な未成熟細胞（ＭＤＳＣ）をエフェクター細胞（Ｍｏ−ＭＤＳＣがマクロファージおよび樹状細胞、ＰＭＮ−ＭＤＳＣが顆粒球）に変換するという利点がある。例えば、ビタミンＡの代謝産物オール−トランス−レチノイン酸（ＡＴＲＡ）は、高ＲＯＳ産生を中和することができ、ＭＤＳＣを成熟顆粒球に変換する能力を有する（Ｎｅｆｅｄｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。ＡＴＲＡは、ＧＭ−ＣＳＦと共同で、マクロファージや樹状細胞を誘導する（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。しかし、これらの研究は、マウスで実施されたもので、ヒトで評価する場合、ＡＴＲＡは、ヒトそれぞれ異質の吸収およびクリアランスを有し、成熟骨髄性細胞の表現型や機能に作用しなかった（Ｍｉｒｚａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。同様に、ビタミンＤ３は、インビトロで未成熟骨髄性細胞レベルを低下させ、それらの成熟を誘導することが立証されている。しかし、その作用は、ＡＴＲＡよりも温和である。非メチル化デオキシシトシン−デオキシグアニンジヌクレオチド（ＣｐＧ）モチーフを高頻度で含有するＤＮＡ断片は、Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）を介して免疫細胞を刺激することができる。マウス、例えば腫瘍へのＣＰＧの局所投与は、ＰＭＮ−ＭＤＳＣ（Ｍｏ−ＭＤＳＣではなく）を減少させ、それらの表現型をわずかに変化させ、それらの抑制機能を無効にするのではなく、軽減すると説明された（Ｊａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。しかし、ある以前の研究は、ＣｐＧが骨髄前駆体のＭＤＳＣへの分化を誘導し、そのため、インビボでＭＤＳＣレベル低減能を制限することを証明した（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。
【００１０】
本明細書が説明したように、本発明者は、ＭＤＳＣが、マクロファージ、樹状細胞または顆粒球とは異なる、細胞傷害性ＮＫ細胞表現型を有する新規、予想外の非抑制リンパ系細胞群に分化し得ることを見出した。本発明者は、シグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰａ）が、このこれまで未確認であったＭＤＳＣの分化経路を緊密にコントロールすることも確認した。この新規分化経路の促進を狙った治療組成物は、確かに、多様な病的状況で、ＭＤＳＣ蓄積と関連する免疫抑制／免疫修飾によってもたらされる医学的問題を解決する可能性を有する。かかる治療組成物は、病原性の蓄積ＭＤＳＣを減少させ、ＭＤＳＣを非抑制的エフェクター細胞に分化させることによって、熟達した免疫応答、特にＮＫ機能を必要とする現行の免疫療法、化学療法およびワクチン接種戦略と相乗効果を発揮する高い可能性を有する。
【００１１】
シグナル調節タンパク質アルファ、すなわちＳＩＲＰａ（ＣＤ１７２ａまたはＳＨＰＳ−１とも呼ばれる）は、Ｓｒｃ相同領域２（ＳＨ２）ドメイン含有ホスファターゼ−ＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２と関連する、主にマクロファージおよび骨髄性細胞上に存在する膜タンパク質として初めて同定された。ＳＩＲＰａは、近縁のＳＩＲＰタンパク質のＳＩＲＰ対受容体ファミリーのプロトタイプメンバーである。ＣＤ４７によるＳＩＲＰａの会合は、宿主細胞の貪食作用を抑制する下方調節シグナルを提供し、そのため、ＣＤ４７は、「ｄｏｎ’ｔ−ｅａｔ−ｍｅ」シグナルとして機能する。
【００１２】
ＳＩＲＰａは、単球上、組織マクロファージの最多小群上、顆粒球上、（リンパ系）組織樹状細胞（ＤＣ）サブセット上、一部の骨髄前駆細胞上、および、様々なレベルで、ニューロン上に発現され、極めて顕著な発現は、脳の富シナプス領域、例えば小脳顆粒層および海馬に見られる（Ｓｅｉｆｆｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｍｉｌｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【００１３】
ＳＩＲＰａのＣＤ４７との相互作用は、ほぼ説明されており、宿主細胞の貪食作用を抑制する下方調節シグナルを提供する（レビューＢａｒｃｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０１４参照）。ＣＤ４７も、ＳＩＲＰａも、共に、他の相互作用に会合する。研究者らは、肺のサーファクタントタンパク質ＳＰ−ＡおよびＳＰ−Ｄが、ＳＩＲＰａとの相互作用を介して肺の炎症応答をコントロールする、と示唆している（Ｊａｎｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。
【００１４】
ＣＤ４７−ＳＩＲＰａ相互作用の最も特徴的な生理的機能の１つは、造血細胞、特に、赤血球および血小板のホメオスタシスにおける役割である。ＣＤ４７は、ｄｏｎ’ｔ−ｅａｔ−ｍｅシグナルとして働き、それ自体、マクロファージによる宿主細胞の貪食作用の重要な決定因子であるので、癌細胞クリアランスにおけるＣＤ４７−ＳＩＲＰａ相互作用の寄与の可能性が、近年、集中的に検討されている。
【００１５】
今日、ＳＩＲＰａ／ＣＤ４７経路は、マクロファージ貪食作用を増強するための様々な医薬品開発にも利用されている。事実、癌細胞は、被感染細胞同様、未知のタンパク質や異常レベルの正常タンパク質などの異常カーゴを保持し、しかも、これらの細胞は、免疫調節分子を同時に過剰発現することによって、先天性免疫コントロールメカニズムを頻繁に妨害する。かかるメカニズムの１つが、正常細胞によって自己発現されるタンパク質であるＣＤ４７に関与することが次第に明らかになっている（Ｂａｒｃｌａｙ  ａｎｄ  Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ，２０１４）。ＣＤ４７は、ＳＩＲＰａと相互作用する。これにより、貪食マクロファージにｄｏｎ’ｔ−ｅａｔ−ｍｅシグナルが伝達され、マクロファージは、その後、標的細胞に影響を与えずにおく（Ｏｌｄｅｎｂｏｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。癌細胞によるＣＤ４７の過剰発現は、癌細胞を治療抗体でコーティングした場合でさえ、癌細胞をマクロファージ耐性にし（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）、多数の固形および血液癌の臨床転帰不良と相関する（Ｍａｊｅｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｗｉｌｌｉｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。実験モデル、特に免疫不全マウスのヒト腫瘍異種移植モデルでは、ＣＤ４７／ＳＩＲＰａ経路の遮断は、マクロファージによる腫瘍排除の促進に、また、癌細胞播種および転移形成の減少に非常に有効であった（Ｃｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｅｄｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｕｌｃｋａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。これらの研究では、ＭＤＳＣの機能や表現型は検討されなかった。マクロファージでの抗体依存性貪食作用を増強することによるＣＤ４７／ＳＩＲＰａ経路の遮断は、トラスツズマブ（抗Ｈｅｒ２）、セツキシマブ（抗ＥＧＦＲ）、リツキシマブ（抗ＣＤ２０）およびアレムツズマブ（抗ＣＤ５２）などの治療抗癌抗体の枯渇と相乗効果を示すと説明されている（Ｗｅｉｓｋｏｐｆ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。
【００１６】
次第にあいまいになりつつある一連の区分は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびＮＫ−Ｔ細胞の間の区分である。これらのサブセットは、Ｃ型レクチンＣＤ１６１を含めた特異的分子の共通発現を共有する。この表面分子は、元は、げっ歯類のＮＫ細胞上に発現されたＮＫＲＰ１糖タンパク質のヒト相同体として同定され、そのげっ歯類の同等物と４６〜４７％の相同性が認められた。ヒトＮＫＲＰ１Ａ、すなわちＣＤ１６１は、約４０ｋＤａサブユニットのジスルフィド結合ホモダイマーから成る。これは、γδおよびαβＴＣＲ両発現サブセット（Ｍａｇｇｉｅｔａｌ，２０１０）およびＮＫ−Ｔ細胞を含めて、大半のＮＫ細胞と約２４％の末梢Ｔ細胞（Ｌａｎｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）によって発現される。ＮＫ−Ｔ細胞は、ヒト末梢血Ｔ細胞の１％未満を含む（Ｇｕｍｐｅｒｚｅｔａｌ  ２００２）ので、ＣＤ１６１＋Ｔ細胞は、特異なＴリンパ球系統であるに違いない（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。
【００１７】
上記のように、ＳＩＲＰａは、骨髄性細胞の貪食機能、樹状細胞の抗原提示およびサイトカイン分泌、および、成熟顆粒球の輸送を調節する、と説明されている。しかし、ＭＤＳＣの抑制機能に対するＳＩＲＰａの機能は、開示されていない。Ｄｕｇａｓｔら（２００８）が、初めて同種移植腎モデルにおけるラットＭＤＳＣ上のＳＩＲＰａの発現を立証した。しかし、彼らは、ＭＤＳＣ生物学におけるＣＤ４７／ＳＩＲＰａ経路の役割を特定せず、抗ＳＩＲＰａ抗体の使用による抑制活性も報告しなかった。したがって、この文書は、本明細書で開示しているような、ＭＤＳＣでのＳＩＲＰａ経路抑制が、ＭＤＳＣ細胞を非抑制細胞に分化できることを立証も示唆もしていない。
【００１８】
国際公開第２０１０／１３００５３号は、ヒトＳＩＲＰａとＣＤ４７との間の相互作用の調節を含む血液癌の治療法を開示した。この文書は、ＳＩＲＰａ−ＣＤ４７の遮断が貪食作用経路を経由する先天性免疫系の活性化を誘導することを認めたものである。この特許出願で使用されたヒト白血病骨髄性細胞の移植モデルでは、動物にＣＤ４７拮抗剤を投与すると、移植片は拒絶された。この結果は、抗ＣＤ４７投与時の貪食作用の増加であって、ＭＤＳＣの抑制活性の抑制および／またはＭＤＳＣの非抑制細胞への分化でないことを示唆している。
【００１９】
抗炎症および抗腫瘍療法での使用のための細胞機能の抑制法が、国際公開第００６６１５９号に説明されている。この方法は、ＳＩＲＰの細胞外ドメインを特異的に認識し、病的骨髄性細胞の機能を抑制する物質を含む薬剤の投与を含む。骨髄性細胞の例がマクロファージであるとすると、文書で説明されている抗ＳＩＲＰａの大半は、マクロファージ活性化のブロックと貪食作用の抑制を目指す。この方法は、正常骨髄性細胞、より具体的にはＭＤＳＣへの抗ＳＩＲＰａ分子の有利な作用を提言していない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２０】
したがって、本発明の第１の態様は、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）の非抑制細胞への分化によって改善または予防できる任意の病態の治療を目的とした、シグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰａ）とそのリガンドのうちの少なくとも１つとの間の相互作用、特に、ＳＩＲＰａとＣＤ４７との間の相互作用を遮断する化合物の使用である。
【００２１】
本発明に従って使用可能な化合物の中でも、低化学分子、ポリペプチド（ＳＩＲＰａ／ＣＤ４７受容体／リガンド系のドミナント−ネガティブ突然変異体、例えば、国際公開第２０１３１０９７５２Ａ１号で説明のされている抗ＳＩＲＰ試薬など）、拮抗剤ペプチド、抗体およびその断片、特に下述の実験で使用されるものなどの抗ＳＩＲＰ抗体、あるいは、多くの市販抗ＳＩＲＰａ抗体から選択されるいずれかの他の遮断抗体、抗体断片、ＳＩＲＰａを標的にするアプタマーなどを挙げることができる。
【００２２】
本テキストでは、「シグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰａ）とそのリガンドのうちの少なくとも１つとの間の相互作用を遮断する化合物」という用語は、シグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰａ）とそのリガンドのうちの少なくとも１つとの間の相互作用を遮断できるポリペプチドをコード化しており、細胞によるかかるポリペプチドの発現に至らしめる核酸（ｍＲＮＡまたはＤＮＡ）も包含する。核酸をシグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰａ）とそのリガンドのうちの少なくとも１つとの間の相互作用を遮断する化合物として使用する場合、当業者は、いずれかの調節エレメント、ならびに、いずれかのベクター（ポリマー、カチオンおよび／またはリポソームなどの脂質ベクター、またはアデノウイルス、レンチウイルス、アデノ関連ウイルス（ａａｖ））を有する発現カセットを自由に選択し、適切な多数の患者の細胞での適切なレベルでの抗ＳＩＲＰａ化合物の発現を得る。
【００２３】
上記の方法の特定の実施の形態によれば、ＳＩＲＰａとそのリガンドのうちの少なくとも１つとの間の相互作用を遮断する化合物は、単球ＭＤＳＣ（Ｍｏ−ＭＤＳＣ）の非抑制細胞への分化に使用される。
【００２４】
上記の方法の別の特定の実施の形態によれば、ＳＩＲＰａとそのリガンドのうちの少なくとも１つとの間の相互作用を遮断する化合物は、ＭＤＳＣの非抑制リンパ系細胞、好ましくはエフェクターリンパ系細胞への分化に使用される。
【００２５】
ＳＩＲＰａとそのリガンドのうちの少なくとも１つとの間の相互作用を遮断する化合物は、好ましくは、ＭＤＳＣの分化によって得られる非抑制細胞が、ＭＨＣクラスＩＩに陰性、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の少なくとも１つのマーカーに陽性であるように選択される。ＮＫ細胞マーカーの無制限リストを次表で提供する。
【表１】
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【発明の効果】
【００２６】
上記のように、ＭＤＳＣ誘導免疫抑制は、多くの疾患および病態において重要で、有害な役割を果たす。骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）の非抑制細胞への分化によって改善または予防できる病態の中でも、固形および血液癌、ウイルス感染症、細菌、寄生虫および真菌感染症、外傷、重度火傷、抗感染症および抗腫瘍ワクチン接種、ワクチンアジュバント、自己免疫疾患、臓器、組織または細胞の移植、移植片機能障害、および慢性炎症疾患を挙げることができる。
【００２７】
好ましい実施の形態によれば、ＳＩＲＰａとそのリガンドのうちの少なくとも１つとの間の相互作用を遮断する化合物は、癌患者の治療に使用される。本明細書で使用する場合、「癌」は、あらゆるタイプの癌を意味する。特に、癌は、固形または非固形癌であることができる。癌の制限のない例は、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、肺癌、膵臓癌または大腸癌、肉腫、リンパ腫、メラノーマ、白血病、胚細胞癌および芽細胞腫などのカルジノーマまたは腺癌である。本明細書で使用する場合、「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」および「治療している（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、癌、特に固形癌の進行、重症度および／または罹病期間のいずれかの軽減または改善を指し、例えば、乳癌では、１種類超の治療薬の投与から生じる１種類超の症状の軽減を指す。ＳＩＲＰａとそのリガンドのうちの少なくとも１つとの間の相互作用を遮断する化合物による治療は、手術、化学療法剤、生物学的療法剤、免疫療法剤などのいずれかの他の抗悪性腫瘍剤と合わせて投与することができる。同時投与の場合、前記化合物を用いることなく従来より得られる抗悪性腫瘍治療薬の効果と併用療法の効果を比較することによって、ＳＩＲＰａとそのリガンドのうちの少なくとも１つとの間の相互作用を遮断する化合物の有益効果を評価する。
【００２８】
本発明に従った方法の特定の実施の形態によれば、ＳＩＲＰａとそのリガンドのうちの少なくとも１つとの間の相互作用を遮断する化合物は、固形癌の治療に使用される。
【００２９】
本発明に従った方法の特定の実施の形態によれば、ＳＩＲＰａとそのリガンドのうちの少なくとも１つとの間の相互作用を遮断する化合物は、転移癌の治療に使用される。
【００３０】
本発明に従った方法のなおも別の実施の形態によれば、ＳＩＲＰａとそのリガンドのうちの少なくとも１つとの間の相互作用を遮断する化合物は、感染症の治療に使用される。
【００３１】
このように、本発明の別の態様は、第２治療薬と併用した、治療を必要とする者、特に癌患者の治療へのＳＩＲＰａとそのリガンドのうちの少なくとも１つとの間の相互作用を遮断する化合物の使用である。本発明のこの態様の好ましい実施の形態によれば、前記第２治療薬は、化学療法剤、放射線療法、手術、免疫療法剤、抗生物質およびプロバイオティクスから成る群から選択される。
【００３２】
特に、有利な点として、第２治療薬は、治療ワクチンおよび免疫チェックポイント遮断剤または賦活剤、例えば抗ＰＤＬ１、抗ＰＤ１、抗ＣＴＬＡ４および抗ＣＤ１３７などから成る群から選択できる。以下の実験の部で例証するように、これらの併用は、相乗効果を生じる。
【００３３】
本発明は、ＳＩＲＰａとそのリガンドのうちの少なくとも１つとの間の相互作用を遮断する化合物による治療効果を決定する方法にも関するもので、本方法は、該化合物によって治療される患者からのサンプル中で、ＭＨＣクラスＩＩに陰性であり、ＣＤ１６１、ＣＤ４９ｂ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６およびＣＤ５６から成る群から選択されるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の少なくとも１つに陽性である非抑制細胞の存在を測定することを含む。
【００３４】
当業者は、状況に応じて、このフォローアップ法を実施するための適切なサンプルを選択する。例えば、前記治療薬を固形癌患者に投与する場合、該腫瘍からのサンプルを使用するのが有利である。同じ状況で、また、他の状況でも、組織サンプル、滑液サンプルなどに加えて、血液サンプルも使用できる。
【００３５】
本発明の他の特徴は、発明の範囲を制限することなく、本発明の枠内で実施され、必要な実験のサポートを提供する実験および生物学的アッセイをたどる説明の過程でも明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
図の説明
【図１】マウスおよびヒトＭＤＳＣはＳＩＲＰａを発現する。  Ａ／マウスの新鮮単離脾臓細胞を、蛍光抗マウスＳＩＲＰａモノクロナール抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。以下の表現型に従って細胞を細分割した：ＣＤ１１ｂ−細胞（灰色の棒グラフ）、ＣＤ１１ｂ＋ＭＨＣクラスＩＩ＋細胞（実線）、ＣＤ１１ｂ＋ＭＨＣクラスＩＩ−Ｌｙ６ＣｈｉｇｈＬｙ６Ｇ−細胞（Ｍｏ−ＭＤＳＣ；破線）およびＣＤ１１ｂ＋ＭＨＣクラスＩＩ−Ｌｙ６Ｃ＋Ｌｙ６Ｇ＋細胞（ＰＭＮ−ＭＤＳＣ；点線）。Ｂ／健康なボランティアから得たヒト新鮮単離末梢血単核細胞を蛍光抗ヒトＳＩＲＰａモノクロナール抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。以下の表現型に従って細胞を細分割した：ＣＤ１１ｂ−細胞（灰色の棒グラフ）、ＣＤ１１ｂ＋ＨＬＡ−ＤＲ＋細胞（実線）、ＣＤ１１ｂ＋ＨＬＡ−ＤＲ−／ｌｏｗＣＤ３３＋ＣＤ１４＋ＣＤ１５−細胞（Ｍｏ−ＭＤＳＣ；破線）、Ｄ１１ｂ＋ＭＨＣＨＬＡ−ＤＲ−ＣＤ３３＋ＣＤ１４−ＣＤ１５＋細胞（ＰＭＮ−ＭＤＳＣ；点線）。
【図２】抗ＳＩＲＰａ  ｍＡｂは、２日間の培養後、ヒトＭｏ−ＭＤＳＣ表現型の変化を誘導する。  フローサイトメトリーの分類（左）直後、または、無関連対照モノクロナール抗体または抗ＳＩＲＰａモノクロナール抗体との２日間の培養後のＣＤ１６１およびＣＤ１１ｃ発現に対するヒトＭｏ−ＭＤＳＣ（ＣＤ１１ｂ＋ＨＬＡ−ＤＲ−／ｌｏｗＣＤ３３＋ＣＤ１４＋ＣＤ１５−細胞）の表現型。
【図３】抗ＳＩＲＰａ  ｍＡｂは、２日間の培養後、ラットＭＤＳＣ表現型の変化を誘導する。  フローサオトメトリーの分類直後（灰色の棒グラフ）、または、無関連対照モノクロナール抗体（点線）または抗ＳＩＲＰａモノクロナール抗体（実線）との２日間の培養後の指示マーカーに対するＭＤＳＣ（ＣＤ１１ｂ＋ＭＨＣクラスＩＩ−ＮＫＲＰ１ｌｏｗ脾臓細胞）の表現型。
【図４】抗ＳＩＲＰａ  ｍＡｂ−誘導による分化は、ＧＭ−ＣＳＦ−誘導分化を圧倒する。  ＧＭ−ＣＳＦ添加および無添加での無関連対照モノクロナール抗体（点線）または抗ＳＩＲＰａモノクロナール抗体（実線）との２日間の培養後のＭＨＣクラスＩＩおよびＣＤ１０３（最上位）またはＣＤ１１ｂおよびＣＤ８０（最下位）に対するラットＭＤＳＣ（ＣＤ１１ｂ＋ＭＨＣクラスＩＩ−ＮＫＲＰ１ｌｏｗ脾臓細胞）の表現型。
【図５】抗ＳＩＲＰａ  ｍＡｂ−誘導による分化ＭＤＳＣは免疫抑制機能を失う。  Ａ／指定比率の新鮮精製ＭＤＳＣ（非分化）および無関連対照モノクロナール抗体（白色バー）または抗ＳＩＲＰａモノクロマール抗体（黒色バー）の存在下でのＴ−リンパ球の増殖。Ｂ／無関連対照モノクロナール抗体（白色バー）または抗ＳＩＲＰａモノクロマール抗体（黒色バー）と指定比率で２日間培養したＭＤＳＣの存在下でのＴ−リンパ球の増殖。分化したＭＤＳＣでの増殖アッセイ中、他の抗体は添加しなかった。
【図６】抗ＳＩＲＰａ  ｍＡｂ投与は、ＭＤＳＣ依存性免疫寛容を無効化する。  無関連対照抗体（白丸、ｎ＝４）または抗ＳＩＲＰａモノクロナール抗体（黒四角、ｎ＝４）を投与した、ラットの寛容誘導同種移植腎レシピエントの０日から２００日までのクレアチニン血症（Ａ）および尿毒症（Ｂ）およびＣ／無拒絶生存期間の変動パーセンテージ。ＡおよびＢの点線は、変動閾値３０％を表し、それよりも上では、動物は拒絶反応を有すると見なした。
【図７】抗ＳＩＲＰａ  ｍＡｂ治療は、末梢でＭＤＳＣを減少させ、ＮＫ細胞を増加させる。  無関連対照抗体（白丸）または抗ＳＩＲＰａモノクロナール抗体（黒四角）で平均１０日間治療した後の寛容誘導同種移植腎レシピエントとナイーブラットの骨髄性細胞中ＭＤＳＣ（Ａ）または総白血球（Ｂ）の０日からの変動パーセンテージ。Ｃ／総白血球中のＮＫ細胞（ＣＤ１６１ｈｉｇｈ）の０日からの変動パーセンテージについては、Ｂと同様である。
【図８】抗ＳＩＲＰａ  ｍＡｂ治療は、ＮＫ細胞およびマクロファージの浸潤を誘導する。  無関連対照抗体（左）または抗ＳＩＲＰａモノクロナール抗体（右）で治療した寛容誘導同種移植腎レシピエントのＴリンパ球（ＴＣＲαβ＋）、ＮＫ細胞（ＣＤ１６１＋）、マクロファージ（ＣＤ６８＋）および骨髄性細胞（ＣＤ１１ｂ／ｃ＋）の移植片免疫組織染色。
【図９】抗ＳＩＲＰａ  ｍＡｂ治療は、調節性Ｔ細胞の浸潤を軽減する。  無関連対照抗体（左）または抗ＳＩＲＰａモノクロナール抗体（右）で治療した寛容誘導同種移植腎レシピエントのＴリンパ球（ＴＣＲαβ＋）および調節性Ｔ細胞（ＴＣＲαβ＋Ｆｏｘ３＋）の移植片免疫組織染色。
【図１０】肝細胞癌モデルにおいて、抗ＳＩＲＰａ  ｍＡｂ治療は生存期間を延長する。  Ｈｅｐａ１−６マウスヘパトーマ細胞２．５ｘ１０６個を門脈から接種され、無関連対照抗体（点線）または抗ＳＩＲＰａモノクロナール抗体（実線）の週３回治療、または、標準的ケア管理としてのソラフェニブの経口胃管投与（破線）を毎日受けたマウスの総生存率。
【図１１】肝細胞癌モデルにおいて抗ＳＩＲＰａ  ｍＡｂは、腫瘍の白血球動員を誘導する一方で、ＭＤＳＣを減少させる。  Ｈｅｐａ１−６腫瘍細胞２．５ｘ１０６個を門脈から接種されたマウスを腫瘍接種から２週間後に屠殺した。肝臓の非実質細胞（ＮＰＣ）を抽出し、フローサイトメトリーでカウント、分析した。Ａ／肝臓抽出ＮＰＣ数、Ｂ／肝臓ＮＰＣ中のＴ−リンパ球（ＣＤ３＋）およびＣ／無関連対照抗体（白色バー、ｎ＝７）または抗ＳＩＲＰａモノクロナール抗体（黒色バー、ｎ＝７）で週３回治療されたマウスのＣＤ１１ｂ＋骨髄性細胞中のＭｏ−ＭＤＳＣ（ＣＤ１１ｂ＋ＭＨＣクラスＩＩ−Ｌｙ６ＣｈｉｇｈＬｙ６Ｇ−）のパーセンテージ。
【図１２】肝細胞癌モデルにおいて抗ＳＩＲＰａ  ｍＡｂは、成熟ＮＫ細胞の蓄積を誘導する。  Ｈｅｐａ１−６腫瘍細胞２．５ｘ１０６個を門脈から接種されたマウスを腫瘍接種から２週間目に屠殺した。肝臓の非実質細胞（ＮＰＣ）を抽出し、フローサイトメトリーでカウント、分析した。Ａ／無関連対照抗体（白色バー、ｎ＝７）または抗ＳＩＲＰａモノクロナール抗体（黒色バー、ｎ＝７）で週３回治療されたマウスから抽出した肝臓ＮＰＣ中のＮＫ細胞（ＣＤ１６１＋）数。Ｂ／肝臓ＮＰＣ  ＮＫ細胞のＣＤ２７（未成熟ＮＫマーカー）およびＣＤ１１ｂ（成熟ＮＫマーカー）発現。
【図１３】抗ＳＩＲＰａ  ｍＡｂは、肝細胞癌モデルにおいて成熟ＮＫ細胞の蓄積を誘導する。  Ｈｅｐａ１−６腫瘍細胞２．５ｘ１０６個を門脈から接種されたマウスを腫瘍接種から２週間目に屠殺した。肝臓の非実質細胞（ＮＰＣ）を抽出し、フローサイトメトリーでカウント、分析した。肝臓ＮＰＣ中のＮＫ細胞小群数は次の通りである：ＣＤ１１ｂおよびＣＤ２７（ｐＮＫ：前駆ＮＫ）に二重陰性（ＤＮ）；ＣＤ２７単独（ＣＤ２７ＳＰ）陽性（ｉＮＫ：未成熟ＮＫ）；ＣＤ２７およびＣＤ１１ｂに二重陽性（ｅＮＫ：エフェクターＮＫ）；ＣＤ１１単独（ＣＤ１１ｂＳＰ）陽性（ｍＮＫ：成熟ＮＫ）；ＬＹ６Ｃ＋ＮＫ細胞。
【図１４】抗ＳＩＲＰａ  ｍＡｂは、メラノーマモデルにおいて、ＭＤＳＣ数を減少させ、腫瘍への腫瘍浸潤ＮＫ細胞を増加させる。  Ｂ１６メラノーマ細胞２ｘ１０６個を皮下注射され、無関連対照抗体（最上位）または抗ＳＩＲＰａモノクロナール抗体（最下位）で週３回治療されたマウスを腫瘍接種から２週間目に屠殺した。腫瘍の白血球浸潤細胞を抽出し、（Ａ）ＭＤＳＣ（ＣＤ１１ｂ＋クラスＩＩ−Ｌｙ６Ｃｈｉｇｈ）の割合と（Ｂ）ＮＫ細胞（ＣＤ１６１＋）の割合をフローサイトメトリーで分析した。結果は、各条件でのマウス５匹の代表値である。
【図１５】インビボメラノーマモデルにおいて、抗ＳＩＲＰａ  ｍＡｂは、抗ＰＤＬ１抗体で同時治療されたマウスの生存率を有意に増加させ、Ｍｏ−ＭＤＳＣ数を減少させる。  腫瘍接種と同時に、同位体対照抗体（Ｉｓｏ  ｃｔｒｌ：星印：ｎ＝５）または抗Ｓｉｒｐα抗体（ｐ８４クローン：四角；ｎ＝５）または抗ＰＤ−Ｌ１抗体（１０Ｆ−９Ｇ２  ｍＡｂ：三角；ｎ＝８）または複合抗体（抗Ｓｉｒｐα＋抗ＰＤ−Ｌ１：丸；ｎ＝５）で治療した。Ａ．次に総生存率を分析した。Ｂ．最初の接種後２週間目に一部のマウスを屠殺し、無関連抗体で治療された動物を、抗ＳＩＲＰａ抗体投与マウスと比較した。腫瘍の白血球浸潤細胞を抽出し、ＣＤ１１ｂ＋クラスＩＩ−Ｌｙ６Ｃｈｉｇｈを使って、Ｍｏ−ＭＤＳＣマーカーの割合をＦＡＣＳによって分析した。
【図１６】ラット腎移植モデルにおいて、抗ＳＩＲＰａ投与は、免疫寛容無効化後の浸潤細胞表面マーカーのｍＲＮＡ発現を改変する。  ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＩＬ１２ｐ４０、ＣＤ１０３、ＮＫＲＰ１、ＭＨＣＩＩのｍＲＮＡ発現量を測定すると、免疫寛容対照に比較して、抗ＳＩＲＰａ治療後増加した。
【図１７】インビボ肝癌モデルに対する単一抗Ｓｉｒｐα投与または複合免疫調節治療の効果。  腫瘍接種から１週間後、動物に週３回、Ａ．同位体対照抗体（Ｉｓｏ  ｃｔｒｌ：黒四角：ｎ＝３３）または抗Ｓｉｒｐα抗体（ｐ８４クローン：灰色四角；ｎ＝３３）または抗ＣＤ１３７抗体（４−１ＢＢ  ｍＡｂ：黒三角；ｎ＝８）または複合抗体（抗Ｓｉｒｐα＋抗ＣＤ１３７：灰色ひし形；ｎ＝８）で４週間治療した。次に総生存率を分析した。Ｂ．動物に週２回、同位体対照抗体（Ｉｓｏ  ｃｔｒｌ：黒四角：ｎ＝５）または抗Ｓｉｒｐα抗体（ｐ８４クローン：灰色四角；ｎ＝５）または抗ＰＤ−Ｌ１抗体（１０Ｆ−９Ｇ２  ｍＡｂ：黒三角；ｎ＝８）または複合抗体（抗Ｓｉｒｐα＋抗ＰＤ−Ｌ１：灰色ひし形；ｎ＝５）で４週間治療した。次に総生存率を分析した。
【実施例】
【００３７】
１．材料および方法
ＭＤＳＣ表現型
ヒト血中ＭＤＳＣを、次のように、フローサイトメトリーにより特徴付け、分類した。すなわち、Ｍｏ−ＭＤＳＣがＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３３＋ＨＬＡ−ＤＲｌｏｗ／−ＣＤ１４＋ＣＤ１５−、および、ＰＭＮーＭＤＳＣがＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３３＋ＨＬＡ−ＤＲ−ＣＤ１４−ＣＤ１５＋であった。ラットの血中および脾臓ＭＤＳＣを、フローサイトメトリーによりＣＤ１１ｂ＋ＭＨＣクラスＩＩ−ＮＫＲＰ１ｉｎｔとして（Ｍｏ−ＭＤＳＣ、ＰＭＮ−ＭＤＳＣは共に、この表現型に含まれる）特徴付け、分類した。マウスＭＤＳＣは、次のように特徴付けた。すなわち、Ｍｏ−ＭＤＳＣがＣＤ１１ｂ＋ＭＨＣクラスＩＩ−Ｌｙ６ＣｈｉｇｈＬｙ６Ｇ−、および、ＰＭＮーＭＤＳＣがＣＤ１１ｂ＋ＭＨＣクラスＩＩ−Ｌｙ６Ｃ＋Ｌｙ６Ｇ＋であった。
【００３８】
ＭＤＳＣの精製および培養
ＭＤＳＣを前述の表現型に従って、フローサイトメトリーにより精製した。フローサイトメトリーにより分類した細胞の純度は、９９％超であった。次に、新鮮精製ＭＤＳＣを、９６ウェル平底マイクロタイタープレートに細胞５０ｘ１０３個／ウェルで播種し、ＲＰＭＩ−１６４０培地（２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン、１０％熱不活性化ウシ胎児血清、１％非必須アミノ酸、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび１μＭ  ２−メルカプトエタノールを補充）中、無関連対照抗体または１０μｇ／ｍＬの抗ＳＩＲＰａモノクロナール抗体（ヒトＭＤＳＣ用クローンＳＥ７Ｃ２（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）およびＳＥ５Ａ５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）またはラットＭＤＳＣ用クローンＥＤ９（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ））と共に２日間培養した。別の状況で、組換えＧＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）も添加し、強制的にマクロファージ／樹状細胞を分化させた。２日後、上清を採取し、３７℃で２ｍＭ  ＥＤＴＡと共に５分間インキュベートして、細胞を取り出した。次に、細胞を蛍光抗体で染色し、フローサイトメトリーによりそれらの表現型を特徴付けた。併行して、細胞を培養培地に再懸濁し、Ｔ−リンパ球増殖に対するそれらの免疫抑制機能を評価した。
【００３９】
ＭＤＳＣ免疫抑制機能アッセイ
平底９６−ウェルプレートを、抗ＣＤ３抗体でコーティングした（０．５μｇ／ｍＬ；３７℃で２時間）。３回繰返しで、ラットの脾臓細胞を細胞５０ｘ１０３個／ウェルで播種し、ＲＰＭＩ−１６４０培地（２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン、１０％熱不活性化ウシ胎児血清、１％非必須アミノ酸、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび１μＭ  ２−メルカプトエタノールを補充）中、２μｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８モノクロナール抗体と共に３日間培養した。培養０日に、異なる比率の新鮮単離ＭＤＳＣをこれらのポリクロナール活性化Ｔリンパ球培養液に添加した。培養０日から、対照抗体または抗ＳＩＲＰａ抗体（ＳＥ７Ｃ２、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（登録商標）ｉｎｃ．またはＳＥ５Ａ５、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（登録商標）を１０μｇ／ｍＬで添加した。他のプレートでは、対照または抗ＳＩＲＰａ抗体の存在下で４８時間維持したＭｏ−ＭＤＳＣを洗浄し、抗体を取り出し、新たな抗体を添加せずに、同様の抑制アッセイで異なる比率で添加した。３日目に、０．５μＣｉ［３Ｈ］チミジン／ウェルを添加して増殖を測定した。
【００４０】
同種移植腎免疫寛容ラットモデル
７〜９週令の雄Ｌｅｗｉｓ１Ｗ（ＲＴ１ｕ）およびＬｅｗｉｓ１Ａ（ＲＴ１ａ）コンジェニックラットを、Ｊａｎｖｉｅｒ（Ｓａｖｉｇｎｙ／ｏｒｇｅｓ，仏）から入手し、施設内のガイドラインに従って、特定の無病原体条件下の当方の動物施設で飼育した。既述（Ｄｕｇａｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）のとおり、腎臓同種移植を実施した。一方の自然Ｌｅｗｉｓ１Ｗ腎（右側）をＬＥＷ１Ａで置換した。７日後、ドナー同種移植と対側腎切除を実施し、その後、レシピエントの生存は、前記同種移植片の適正な機能に頼った。これらのラットに、抗ＣＤ２８抗体（ハイブリドーマＪＪ３１９）の０．３ｍｇ／日での７日間の腹腔内投与で治療し、これを移植当日に開始した。治療なしでは、移植から１１日後に、移植片は拒絶された。１００日以内に拒絶反応が起こらない場合、ラットは、免疫寛容ありと考えられた。次に、１５０日目に、免疫寛容レシピエントに、抗ＳＩＲＰａ抗体（クローンＥＤ９、ＡｂＤＳｅｒｏｔｅｃ）５００μｇまたは無関連対照抗体（クロン３Ｇ８）を腹腔内投与した後、３００μｇを２回／週、２１日間投与した。フローサイトメトリー分析用に血液サンプルを抜き取った。血清でクレアチニン血症および尿毒症をモニターした。クレアチニン血症または尿毒症いずれかが０日から２倍増加することで移植腎の機能障害が明らかになった時点で、ラットを屠殺した。
【００４１】
免疫組織化学染色
腎臓生検標本から凍結切片（１０ｍｍ）を調製した。室温でアセトン固定を１０分間行う前に、スライドを室温で１時間風乾した。切片を飽和溶液（５％ラット血清、２％正常ヤギ血清および４％ＢＳＡ含有ＰＢＳ）中で飽和し、必要な場合（すなわち、Ｆｏｘｐ３染色）には、０．５％サポニンで透過処理した。切片を一次抗体と共に、続いて、蛍光二次抗体またはビオチニル化二次抗体により４℃で一晩インキュベートし、ＡＢＣ  Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）およびジアミノベンジリジン（ＤＡＢ）で着色した後、エオジン−ヘマトキシリン染色した。標準または蛍光顕微鏡およびＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ画像ソフト（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｌｅ  Ｐｅｃｑ，仏）を使ってスライドを分析した。
【００４２】
使用した一次抗体は、抗ラットＴＣＲαβ（クローンＲ７３）、ＣＤ１６１（クローン３．２．３）、ＣＤ６８（クローンＥＤ１）、ＣＤ１１ｂ／ｃ（クローンＯＸ４２）およびＦｏｘｐ３（クローンＦＪＫ−１６ｓ）であった。
【００４３】
定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）
ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎおよびＴａｑＭａｎ  ＰＣＲコア試薬を使ったＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｖｉｉａ７システムで定量的リアルタイムＰＣＲを実施した。ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ試薬中、腎臓組織均質液から抽出し、ＤＮＡおよびタンパク質からクロロホルムで分離し、イソプロパノールで沈殿させ、エタノールで洗浄し、乾燥後、無ＲＮａｓｅ水に再懸濁した。ＤＮＡｓｅ処理後、ＲＮＡを逆転写し、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を得た。ハウスキーピング遺伝子ＨＰＲＴと比較して、２（−ｄＣｔ）法で相対遺伝子発現量を算出した。全サンプルを２回繰返しで分析した。対象遺伝子の発現量は、対照抗体（３Ｇ８）または抗ＳＩＲＰａ抗体（ＥＤ９）で治療された免疫寛容動物の間で比較した。
【表２】
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【表３】
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【００４４】
肝細胞癌マウスモデル
既述（Ｇａｕｔｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）のとおり、８週令Ｃ５７Ｂ１／６Ｊ雄マウスが、腫瘍接種から４日および８日後、マウスに、ラット抗ＣＤ１３７  ｍＡｂ（４−１ＢＢ  ｍＡｂ）１００μｇまたは抗マウスＳＩＲＰａモノクロナール抗体（クローンＰ８４、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）３００μｇ、または、両抗体、または、無関連対照抗体（クローン３Ｇ８）を３回／週、４週間（図１７Ａ）、または、抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ（クローン１０Ｆ−９Ｇ２、ＢｉｏＸｃｅｌｌ）２００μｇの腹腔内注射を行い、もしくは、両抗体（抗Ｓｉｒｐａ＋抗ＰＤＬ１）を４週間与えた（図１７Ｂ）。ソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ−Ｂａｙｅｒ）投与の治療マウスは、０日から２８日まで、４０ｍｇ／ｋｇの強制経口投与１００μＬを毎日受けた（図１０）。総生存率を分析した。白血球腫瘍浸潤を定量するため、また、ＰｅｒｃｏｌｌグラジェントおよびＦＡＣＳ分析により肝臓の非実質細胞を単離して特徴付けるために、腫瘍接種から１４日後に、一部のマウスを屠殺した。
【００４５】
メラノーママウスモデル
８週令Ｃ５７Ｂ１／６Ｊ雄マウスが２ｘ１０６個のＢ１６−Ｏｖａマウスメラノーマ細胞の脇腹への皮下注射を受けた。マウスは、腫瘍接種後０日から、３００μｇの無関連対照抗体（クローン３Ｇ８）または抗マウスＳＩＲＰａモノクロナール抗体（クローンＰ８４）を３回／週、または、２００μｇの抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ（クローン１０Ｆ−９Ｇ２、ＢｉｏＸＣｅｌｌ）の２回／週腹腔内投与を受け、または、両抗体（抗Ｓｉｒｐａおよび抗ＰＤ−Ｌ１抗体）を４週間受けた。一部のマウスを、腫瘍接種から２週間目に屠殺し、フローサイトメトリーで腫瘍白血球浸潤を特徴付けた。総生存率を分析した。
【００４６】
２．結果
ＭＤＳＣは、ＳＩＲＰａを発現する。
本発明者は、先に、ラットＭＤＳＣ（単球および顆粒球）がその表面に高レベルのＳＩＲＰａを発現する、と述べた（Ｄｕｇａｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。ここで、図１は、マウスＭｏ−ＭＤＳＣおよびＰＭＮ−ＭＤＳＣも、成熟骨髄性細胞（ＣＤ１１ｂ＋クラスＩＩ＋）と同様のレベルで、その表面にＳＩＲＰａを発現することを示している。対照的に、ヒトでは、ＳＩＲＰａは、Ｍｏ−ＭＤＳＣだけに成熟骨髄性細胞（ＣＤ１１ｂ＋ＨＬＡ−ＤＲ＋）と同様のレベルで発現されるが、ＰＭＮ−ＭＤＳＣは、ＳＩＲＰａを発現しない。
【００４７】
ＳＩＲＰａは、Ｍｏ−ＭＤＳＣのＮＫ−様表現型を有する非抑制細胞への分化をコントロールする。
ＳＩＲＰａが標的となり、そのＣＤ４７との相互作用に拮抗するモノクロナール抗体が、インビトロで、４８時間に亘ってＭｏ−ＭＤＳＣの生存に影響しないことを、我々は初めて観察した。対照的に、Ｍｏ−ＭＤＳＣは、新鮮単離Ｍｏ−ＭＤＳＣや対照抗体と４８時間の間培養したＭｏ−ＭＤＳＣと比較してその表現型を改変した（図２および３）。ＭＤＳＣは、これまでに、マクロファージや腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）、樹状細胞または顆粒球に分化すると述べられているが、ここでは、我々は、抗ＳＩＲＰａ  ｍＡｂ分化Ｍｏ−ＭＤＳＣがこれらの表現型を示さないことを観察した。対照的に、ＧＭ−ＣＳＦの存在下でのインキュベーションは、既述の表現型への分化を誘導した（図４）。明らかに、ラット種では、抗ＳＩＲＰａ処理ＭＤＳＣは、高レベルのＭＨＣクラスＩＩ分子もＣＤ６８も獲得せず、代わりに、ＣＤ４マーカーの獲得を失った。ヒトでは、これらの細胞は、ＣＤ１１ｃ発現を失い、ＨＬＡ−ＤＲを獲得しなかった。予想外なことに、我々は、これらの細胞が高レベルのＮＫ−特異性マーカー、特にＣＤ１６１およびＣＤ４９ｂ、ならびに、成熟細胞（ＣＤ４４ｈ，ＣＤ１０３，ＣＤ８０，ＣＤ８６）のマーカーを発現することを観察した。それらは、リンパ系の他のマーカー（ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ２）も発現し、これらの細胞が抗ＳＩＲＰａモノクロナール抗体によって（非骨髄性）成熟リンパ系細胞に分化されていることが確認された。さらに、抗ＳＩＲＰａが非骨髄性細胞において分化を誘導することを確認するため、ＭＤＳＣをＧＭ−ＣＳＦおよび抗ＳＩＲＰａモノクロナール抗体の両方と共に培養した。ＧＭ−ＣＳＦ単独は、成熟ＭＨＣクラスＩＩ＋骨髄性細胞（すなわち、樹状細胞およびマクロファージ）においてＭＤＳＣの分化を誘導するが、我々は、ＧＭ−ＣＳＦが、抗ＳＩＲＰａ抗体と結合すると、効果を示さず、抗ＳＩＲＰａ抗体が誘導する新規の分化経路を阻止しないことを観察した（図４）。これらの結果は、抗ＳＩＲＰａモノクロナール抗体が、エフェクターＮＫ様（ＣＤ１６１＋）表現型を有する細胞へのＭＤＳＣの分化を誘導すること、これが、それらの従来の分化経路を圧倒することを実証した。最後に、抗ＳＩＲＰａモノクロナール抗体の作用メカニズムを確認するために、初めに、ＭＤＳＣの免疫抑制機能の無効化能を評価した。抗ＳＩＲＰａモノクロナール抗体は、新鮮単離ＭＤＳＣの抑制機能を改変しなかったが、我々は、ＭＤＳＣが、インビトロで抗ＳＩＲＰａ抗体によって分化されたＭＤＳＣが、Ｔ−リンパ球増殖の抑制能を喪失してしまうことを認めた（図５）。要約すると、抗ＳＩＲＰａモノクロナール抗体は、Ｍｏ−ＭＤＳＣの非抑制エフェクターＮＫ様リンパ系細胞への分化を誘導した。
【００４８】
抗ＳＩＲＰａモノクロナール抗体は、インビボでＭＤＳＣ依存性免疫寛容を無効化する。
我々は、先に、ラットにおいて抗ＣＤ２８モノクロナール投与により誘導された同種移植腎が、Ｍｏ−ＭＤＳＣの蓄積によって維持される、と述べた（Ｄｉｌｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｄｕｇａｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。抗ＳＩＲＰａモノクロナール抗体が、マクロファージ貪食作用の改善によるその腫瘍除去への効果とは無関係に、ＭＤＳＣ持続性免疫抑制を無効化できることを確認するために、免疫寛容同種移植腎レシピエントを抗ＳＩＲＰａモノクロナール抗体または無関連対照抗体で治療した。免疫寛容レシピエントが抗ＳＩＲＰａ投与から２〜３ヶ月以内に同種移植片を拒絶することを認めたが、対照抗体によると、移植片の機能は安定を保った（図６）。これらの動物の末梢血免疫表現型決定を分析すると、我々のインビトロの観察が確認された。平均１０日間の抗ＳＩＲＰａ抗体での治療後、ＭＤＳＣの有意な減少を我々は観察したので、これらの動物の末梢血免疫表現型決定分析は、我々のインビトロ観察を確認した。同様に、ＮＫ細胞は、ＳＩＲＰａを発現しなかったが、平均１０日間の抗ＳＩＲＰａ抗体での治療後、ＮＫ系（ＣＤ１６１＋）細胞の有意な増加を認めた。外植片の組織検査は、Ｔ−リンパ球介在の予想される急性細胞拒絶反応を認めなかった。対照的に、免疫寛容レシピエントの移植片に元々存在するＴ−リンパ球浸潤が、抗ＳＩＲＰａ抗体投与後、拒絶反応動物の移植片ではるかに顕著でなくなることを、我々は認めた（図８）。このモデルの末梢ＭＤＳＣ蓄積が、移植片調節性Ｔ細胞の蓄積と関連することを、我々は先に述べた（Ｄｉｌｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。本明細書に、我々は、調節性Ｔ細胞は抗ＳＩＲＰａ投与レシピエントの移植片ではほとんど検出不能であるので、抗ＳＩＲＰａ抗体治療がこれらの細胞を間接的にも調節する、と述べた（図９）。さらに、骨髄性（ＣＤ１１ｂ／ｃ）細胞浸潤は、群間で同様であったが、マクロファージなどの成熟骨髄性細胞は、抗ＳＩＲＰａ投与レシピエントの移植片で一層豊富であった。さらに重要な点として、ＮＫ（ＣＤ１６１＋）細胞は、免疫寛容レシピエントの移植片ではほとんど検出不能であったが、我々は、抗ＳＩＲＰａ投与レシピエントに有意な移植片浸潤を観察し、インビトロ試験およびインビボの末梢観察において、抗ＳＩＲＰａ抗体がＭＤＳＣとＮＫ細胞の両方を調節することを確認した。
【００４９】
抗ＳＩＲＰａモノクロナール抗体治療は、癌モデルにおいて、腫瘍−浸潤ＭＤＳＣおよびＮＫ細胞を調節し、死亡を防止した。
肝細胞癌およびメラノーマのマウスモデルに抗ＳＩＲＰａモノクロナール抗体を投与した。肝細胞癌マウスモデル（Ｈｅｐａ１．６）は、肝臓への腫瘍細胞系接種から２週間以内に死亡を誘導する侵襲性癌モデルである。このモデルでは、承認済みケアの化学療法標準品（例、ソラフェニブ）は、マウスの平均６０％を救済した（図１０）。この厳密なモデルで、単剤療法における抗ＳＩＲＰａモノクロナール抗体治療は、マウスを著しく保護し、ソラフェニブと同様な効果を有した。興味深いことに、２週間の抗ＳＩＲＰａ抗体による治療後、腫瘍浸潤が著しく増強された（特にＴ−リンパ球）が、我々は、骨髄性細胞内でのＭＤＳＣの有意な減少を認めた（図１１ｃ）。さらに、対照マウス（図１２）に比較して、これらの腫瘍へのＮＫ（ＣＤ１６１＋）細胞浸潤、特に成熟ＮＫ細胞（ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ２７−）の蓄積の有意な増加も認めた（図１３）。事実、ＣＤ２７＋ＣＤ１１ｂ−表現型が細胞を傷害できず、低レベルサイトカインを産生する未成熟ＮＫ細胞に相当し、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ２７＋表現型がサイトカインを産生するが、細胞傷害性が低いエフェクターＮＫ細胞に相当し、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ２７−表現型が成熟した、細胞傷害性の高いＮＫ細胞に相当することは既述された（Ｄｅｓｂｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。別の腫瘍モデルでこれらの結果を確認するために、Ｂ１６メラノーママウスモデルを使用した。同様に、抗ＳＩＲＰａモノクロナール抗体で２週間治療されたマウスの腫瘍から抽出した白血球もＭｏ−ＭＤＳＣの腫瘍内減少（図１５Ｂ）およびＮＫ（ＣＤ１６１＋）細胞の蓄積も示した（無関連抗体条件の細胞の４．２３％から抗Ｓｉｒｐａ治療動物の１２．４％（図１４））。図１５Ａは、４週間の間、メラノーマを接種され、抗ＰＤ−Ｌ１で治療された、または、抗ＳＩＲＰａで治療された、または、両方で治療された動物の総生存率を表す。単一分子の治療に比較して、複合抗体は、相乗効果を示した。
【００５０】
肝臓癌インビボモデルにおけるＳＩＲＰａ遮断の効果
図１７Ａは、肝臓癌を接種され、４週間の間、抗ＣＤ１３７、抗Ｓｉｒｐａまたは両方で治療された動物の総生存率を表す。抗Ｓｉｒｐａ治療動物の３０％は、接種後２０日超生存した。この結果は、動物が抗ＣＤ１３７抗体を受けた場合に得られた結果に匹敵する。興味深いことに、抗Ｓｉｒｐ＋抗ＣＤ１３７の複合抗体を受けた動物は１００％が生存した。これは、各分子単独で得られる結果に比較して、２分子の強力な相乗効果を示すものである。
【００５１】
図１７Ｂは、肝臓癌を接種され、４週間の間、抗ＰＤ−Ｌ１、抗Ｓｉｒｐａまたはその両方で治療された動物の総生存期間を表す。先に観察されたように、抗Ｓｉｒｐａ治療動物の２０％超は、接種後２０日超の間生存した。それぞれ単独投与に比べて、両分子で動物を治療した場合、結果は、非常に興味深い生存率を示した。この結果は、癌モデルで抗Ｓｉｒｐａ抗体の抗ＰＤ−Ｌ１抗体との相乗効果を示している。
【００５２】
２種類の異なる癌モデルについてのインビボ実験は、ＳＩＲＰａが単剤療法として、さらには、他の免疫療法または化学療法と併用した場合でも、癌治療の興味深い対象であることを認めた。これらの結果は、ＳＩＲＰａが、腫瘍への非抑制細胞を誘導する狙いを遮断するために重要な新しいチェックポイントであることを実証するものである。
【００５３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年8月2日(2017.8.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰａ）の細胞外ドメインに特異的に結合し、シグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰａ）とそのリガンドのうちの少なくとも１つとの間の相互作用を遮断する化合物であって、
該病態が、癌、感染症、外傷、自己免疫疾患、ワクチン接種、慢性炎症疾患及び移植片機能障害からなる群から選択され、かつ
該病態が、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）の非抑制細胞への分化によって改善または予防され、
該骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）が、単球ＭＤＳＣ（Ｍｏ−ＭＤＳＣ）である、上記化合物を含む、
骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）の存在及び／又はＭＤＳＣの蓄積によって免疫抑制が誘導される任意の病態の治療又は予防のための医薬組成物。
【請求項２】
前記化合物がＳＩＲＰａとＣＤ４７との間の相互作用を遮断する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記化合物がポリペプチドである、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記化合物がペプチド拮抗剤である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記化合物が抗体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記非抑制細胞が、成熟細胞のマーカーＣＤ８０及びＣＤ８６を発現する、非抑制リンパ系細胞である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記非抑制細胞が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の少なくとも１つのマーカーに陽性である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記病態が固形癌である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記病態が転移癌である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記化合物が第２治療薬に併用される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記第２治療薬が化学療法剤、放射線療法剤、免疫療法剤、抗生物質およびプロバイオティックスから成る群から選択される、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
前記第２治療薬が治療ワクチンおよび免疫チェックポイント遮断剤または賦活剤から成る群から選択される免疫療法剤である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記第２治療薬が抗ＰＤＬ１、抗ＰＤ１、抗ＣＴＬＡ４および抗ＣＤ１３７から成る群から選択される免疫チェックポイント遮断剤または賦活剤である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の医薬組成物による治療効果を決定する方法であって、前記医薬組成物によって治療される患者からのサンプル中で成熟細胞のマーカーＣＤ８０及びＣＤ８６を発現する非抑制細胞の存在を測定することを含み、前記非抑制細胞の存在が増加した時治療が効果的である、上記方法。
【請求項１５】
前記サンプルが血液サンプル、組織サンプル、腫瘍からのサンプル、または滑液サンプルである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記非抑制細胞が、ＣＤ１０３細胞マーカー陽性及びＣＤ１１ｂ細胞マーカー陽性である非抑制リンパ系細胞である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
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