(57)【要約】  本発明は、ＣｓｇＧの変異型に関する。本発明は、ＣｓｇＧを使用する分析物の検出および特徴づけにも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
位置Ｔｙｒ５１、Ａｓｎ５５およびＰｈｅ５６のうちの１つまたは複数に修飾を含む、少なくとも１つの修飾ＣｓｇＧモノマー。
【請求項２】
請求項１に記載の少なくとも１つのＣｓｇＧモノマーを含む修飾生体ポア。
【請求項３】
少なくとも１つのＣｓｇＧモノマーを含む修飾ＣｓｇＧ生体ポアであって、０．５ｎｍ〜１．５ｎｍの範囲の直径を有するチャネル狭窄を１つしか有さない修飾ＣｓｇＧ生体ポア。
【請求項４】
前記修飾が、前記ＣｓｇＧモノマーのポリペプチド配列の３８〜６３位にある、請求項３に記載の修飾ポア。
【請求項５】
前記修飾が、Ｔｙｒ５１、Ａｓｎ５５およびＰｈｅ５６から選択される位置にある、請求項４に記載の修飾ポア。
【請求項６】
前記修飾が、位置Ｔｙｒ５１に、または位置Ａｓｎ５５およびＰｈｅ５６の両方にある、請求項５に記載の修飾ポア。
【請求項７】
前記ＣｓｇＧモノマーに対する修飾が、天然に存在するアミノ酸の置換、天然に存在するアミノ酸の欠失、および天然に存在するアミノ酸側鎖の修飾からなる群から選択される、請求項３から６のいずれかに記載の修飾ポア。
【請求項８】
前記修飾が、未修飾アミノ酸の立体障害を低減または除去する、請求項３から７に記載の修飾ポア。
【請求項９】
前記修飾ポアの前記少なくとも１つのＣｓｇＧモノマーが、配列番号４〜３８８による３８〜６３位のポリペプチド配列を有する、請求項３から８のいずれかに記載の修飾ポア。
【請求項１０】
請求項３から９のいずれかに記載の修飾ＣｓｇＧ生体ポアの少なくとも１つのＣｓｇＧモノマーをコードする単離されたポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１０に記載の単離されたポリペプチドをコードする単離された核酸。
【請求項１２】
ａ）絶縁層と、
ｂ）前記絶縁層内のＣｓｇＧ生体ポアと、
ｃ）前記生体ポアを通る電流を測定するための装置と
を含むバイオセンサー。
【請求項１３】
前記ＣｓｇＧ生体ポアが、請求項３から９のいずれかに記載の修飾ＣｓｇＧ生体ポアである、請求項１２に記載のバイオセンサー。
【請求項１４】
分析物検出または核酸シークエンシングである生体センシング用途のための、ＣｓｇＧ生体ポアの使用。
【請求項１５】
前記核酸シークエンシングが、ＤＮＡシークエンシングまたはＲＮＡシークエンシングである、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
分子センシングのための方法であって、
ａ）少なくとも１つのＣｓｇＧモノマーで形成されるＣｓｇＧ生体ポアを絶縁層内に設けるステップ、
ｂ）前記ＣｓｇＧ生体ポアを試験基質と相互作用させるステップ、および
ｃ）前記相互作用中に１回または複数回の測定を行うステップ
を含む方法。
【請求項１７】
ａ）少なくとも１つのＣｓｇＧモノマーで形成されるＣｓｇＧ生体ポアを絶縁層内に設けるステップ、
ｂ）前記絶縁層を介して電気的電位を印加し、それによって前記生体ポアを通る電流の流れを確立するステップ、
ｃ）前記ＣｓｇＧ生体ポアを試験基質と接触させるステップ、および
ｄ）前記生体ポアを通る電流の流れを測定するステップ
を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記絶縁層が膜である、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記膜が、脂質二重層である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ポアを通る電流が、前記絶縁層の第１の側面から前記絶縁層の第２の側面への可溶性イオンの流れによって搬送される、請求項１７から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記分子センシングが、分析物検出である、請求項１６から２０に記載の方法。
【請求項２２】
ステップ（ｄ）の後に、前記試験基質が不在である場合の前記生体ポアを通る電流と比較して前記生体ポアを通る電流が低減することによって前記試験基質の存在を判定するさらなるステップを含む、請求項１７から２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記分子センシングが、核酸シークエンシングである、請求項１６から２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記方法によってシークエンシングされる核酸のタイプがＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＣｓｇＧ生体ポアが、さらなるアクセサリータンパク質に順応するように適合される、請求項２３または請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記さらなるアクセサリータンパク質が、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼ、イソメラーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレース、テロメラーゼ、エキソヌクレアーゼ、およびヘリカーゼからなる群から選択される核酸プロセシング酵素である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＣｓｇＧ生体ポアが、修飾ＣｓｇＧポアであり、前記修飾ＣｓｇＧポアが、前記ＣｓｇＧポアを形成する前記ＣｓｇＧモノマーの少なくとも１つにおいてモノマー野生型大腸菌（E-coli）ＣｓｇＧポリペプチド配列に少なくとも１つの修飾を有する、請求項１６から２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
同じ修飾が、前記ＣｓｇＧポアを形成する前記ＣｓｇＧモノマーすべてに施される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記修飾ＣｓｇＧモノマーが、配列番号４〜３８８による３８〜６３位のポリペプチド配列を有する、請求項２７または請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
配列番号３９０で示される配列のバリアントを含む変異体ＣｓｇＧモノマーであって、前記バリアントが、位置Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６のうちの１つまたは複数に変異を含む、変異体ＣｓｇＧモノマー。
【請求項３１】
配列番号３９０で示される配列のバリアントを含む変異体ＣｓｇＧモノマーであって、前記バリアントが、（ｉ）位置Ｎ４０、Ｄ４３、Ｅ４４、Ｓ５４、Ｓ５７、Ｑ６２、Ｒ９７、Ｅ１０１、Ｅ１２４、Ｅ１３１、Ｒ１４２、Ｔ１５０およびＲ１９２における１つまたは複数の変異、（ｉｉ）Ｙ５１／Ｎ５５、Ｙ５１／Ｆ５６、Ｎ５５／Ｆ５６またはＹ５１／Ｎ５５／Ｆ５６における変異、（ｉｉｉ）Ｑ４２ＲまたはＱ４２Ｋ、（ｉｖ）Ｋ４９Ｒ、（ｖ）Ｎ１０２Ｒ、Ｎ１０２Ｆ、Ｎ１０２ＹまたはＮ１０２Ｗ、（ｖｉ）Ｄ１４９Ｎ、Ｄ１４９ＱまたはＤ１４９Ｒ、（ｖｉｉ）Ｅ１８５Ｎ、Ｅ１８５ＱまたはＥ１８５Ｒ、（ｖｉｉｉ）Ｄ１９５Ｎ、Ｄ１９５ＱまたはＤ１９５Ｒ、（ｉｘ）Ｅ２０１Ｎ、Ｅ２０１ＱまたはＥ２０１Ｒ、（ｘ）Ｅ２０３Ｎ、Ｅ２０３ＱまたはＥ２０３Ｒ、ならびに（ｘｉ）位置Ｆ４８、Ｋ４９、Ｐ５０、Ｙ５１、Ｐ５２、Ａ５３、Ｓ５４、Ｎ５５、Ｆ５６およびＳ５７のうちの１つまたは複数の欠失のうちの１つまたは複数を含む、変異体ＣｓｇＧモノマー。
【請求項３２】
（ａ）前記バリアントが、（ｉ）において、置換Ｎ４０Ｒ、Ｎ４０Ｋ、Ｄ４３Ｎ、Ｄ４３Ｑ、Ｄ４３Ｒ、Ｄ４３Ｋ、Ｅ４４Ｎ、Ｅ４４Ｑ、Ｅ４４Ｒ、Ｅ４４Ｋ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ５７Ｐ、Ｑ６２Ｒ、Ｑ６２Ｋ、Ｒ９７Ｎ、Ｒ９７Ｇ、Ｒ９７Ｌ、Ｅ１０１Ｎ、Ｅ１０１Ｑ、Ｅ１０１Ｒ、Ｅ１０１Ｋ、Ｅ１０１Ｆ、Ｅ１０１Ｙ、Ｅ１０１Ｗ、Ｅ１２４Ｎ、Ｅ１２４Ｑ、Ｅ１２４Ｒ、Ｅ１２４Ｋ、Ｅ１２４Ｆ、Ｅ１２４Ｙ、Ｅ１２４Ｗ、Ｅ１３１Ｄ、Ｒ１４２Ｅ、Ｒ１４２Ｎ、Ｔ１５０Ｉ、Ｒ１９２ＥおよびＲ１９２Ｎのうちの１つもしくは複数を含む、
（ｂ）前記バリアントが、（ｉｉ）において、
【化７−１】
2017527284.tif 000039
【化７−２】
2017527284.tif 000040
【化７−３】
2017527284.tif 000041
を含む、ならびに／または
（ｃ）前記バリアントが、（ｘｉ）において、Ｙ５１／Ｐ５２の欠失、Ｙ５１／Ｐ５２／Ａ５３の欠失、Ｐ５０〜Ｐ５２の欠失、Ｐ５０〜Ａ５３の欠失、Ｋ４９〜Ｙ５１の欠失、Ｋ４９〜Ａ５３の欠失および単一のプロリン（Ｐ）での置換、Ｋ４９〜Ｓ５４の欠失および単一のＰでの置換、Ｙ５１〜Ａ５３の欠失、Ｙ５１〜Ｓ５４の欠失、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失、Ｎ５５〜Ｓ５７の欠失、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一のＰでの置換、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一のグリシン（Ｇ）での置換、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一のアラニン（Ａ）での置換、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一のＰでの置換およびＹ５１Ｎ、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一のＰでの置換およびＹ５１Ｑ、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一のＰでの置換およびＹ５１Ｓ、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一のＧでの置換およびＹ５１Ｎ、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一のＧでの置換およびＹ５１Ｑ、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一のＧでの置換およびＹ５１Ｓ、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一のＡでの置換およびＹ５１Ｎ、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一のＡでの置換／Ｙ５１Ｑ、もしくはＮ５５／Ｆ５６の欠失および単一のＡでの置換およびＹ５１Ｓを含む、
請求項３１に記載の変異体モノマー。
【請求項３３】
前記バリアントが、
【化８−１】
2017527284.tif 000042
【化８−２】
2017527284.tif 000043
を含む、請求項３１または３２に記載の変異体。
【請求項３４】
前記バリアントが、Ｔ１５０に変異を含む、請求項３１に記載の変異体モノマー。
【請求項３５】
２つ以上の共有結合ＣｓｇＧモノマーを含む構築物であって、前記モノマーの少なくとも１つが、前記請求項のいずれか一項に記載の変異体モノマーである、構築物。
【請求項３６】
前記２つ以上の変異体モノマーが同じである、または異なる、請求項３５に記載の構築物。
【請求項３７】
前記２つ以上の変異体モノマーが、遺伝子的に融合されている、請求項３５または３６に記載の構築物。
【請求項３８】
前記２つ以上の変異体モノマーが、１つまたは複数のリンカーによって結合されている、請求項３５から３７のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項３９】
請求項３１から３４のいずれか一項に記載の２つの変異体モノマーを含む、請求項３５から３８のいずれか一項に記載の構築物。
【請求項４０】
請求項３１から３４のいずれか一項に記載の変異体モノマーまたは請求項３７に記載の構築物をコードするポリヌクレオチド。
【請求項４１】
請求項３１から３４のいずれか一項に記載の同一の変異体モノマーまたは請求項３５から３９のいずれか一項に記載の同一の構築物を含む、ＣｓｇＧに由来するホモオリゴマーポア。
【請求項４２】
請求項３１から３４のいずれか一項に記載の９つの同一の変異体モノマーを含む、請求項４１に記載のホモオリゴマーポア。
【請求項４３】
請求項３１から３４のいずれか一項に記載の少なくとも１つの変異体モノマーまたは請求項３５から３９のいずれか一項に記載の少なくとも１つの構築物を含む、ＣｓｇＧに由来するヘテロオリゴマーポア。
【請求項４４】
（ａ）請求項３１から３４のいずれか一項に記載の９つの変異体モノマーを含み、それらの少なくとも１つが他と異なる、または（ｂ）請求項３１から３４のいずれか一項に記載の１つもしくは複数の変異体モノマーと配列番号３９０を含む十分なさらなるモノマーとを含む、請求項４３に記載のヘテロオリゴマーポア。
【請求項４５】
標的分析物の存在、不在または１つもしくは複数の特徴を判定する方法であって、
ａ．前記標的分析物をＣｓｇＧポアまたはその変異体と、前記標的分析物が前記ポアに対して移動するように接触させるステップ、および
ｂ．前記分析物が前記ポアに対して移動しているときに１回または複数回の測定を行い、それによって前記分析物の存在、不在または１つもしくは複数の特徴を判定するステップ
を含む方法。
【請求項４６】
前記ＣｓｇＧ変異体が９つのモノマーを含み、前記モノマーの少なくとも１つが配列番号３９０のバリアントであり、前記バリアントが、（ａ）位置Ｎ４０、Ｑ４２、Ｄ４３、Ｅ４４、Ｋ４９、Ｙ５１、Ｓ５４、Ｎ５５、Ｆ５６、Ｓ５７、Ｑ６２、Ｅ１０１、Ｎ１０２、Ｅ１２４、Ｅ１３１、Ｒ１４２、Ｄ１４９、Ｔ１５０、Ｅ１８５、Ｒ１９２、Ｄ１９５、Ｅ２０１およびＥ２０３のうちの１つもしくは複数における変異、ならびに／または（ｂ）位置Ｆ４８、Ｋ４９、Ｐ５０、Ｙ５１、Ｐ５２、Ａ５３、Ｓ５４、Ｎ５５、Ｆ５６およびＳ５７のうちの１つもしくは複数の欠失を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記バリアントが、置換（ａ）Ｆ５６Ｎ、Ｆ５６Ｑ、Ｆ５６Ｒ、Ｆ５６Ｓ、Ｆ５６Ｇ、Ｆ５６ＡまたはＦ５６ＫまたはＦ５６Ａ、Ｆ５６Ｐ、Ｆ５６Ｒ、Ｆ５６Ｈ、Ｆ５６Ｓ、Ｆ５６Ｑ、Ｆ５６Ｉ、Ｆ５６Ｌ、Ｆ５６ＴまたはＦ５６Ｇ、（ｂ）Ｎ５５Ｑ、Ｎ５５Ｒ、Ｎ５５Ｋ、Ｎ５５Ｓ、Ｎ５５Ｇ、Ｎ５５ＡまたはＮ５５Ｔ、（ｃ）Ｙ５１Ｌ、Ｙ５１Ｖ、Ｙ５１Ａ、Ｙ５１Ｎ、Ｙ５１Ｑ、Ｙ５１ＳまたはＹ５１Ｇ、（ｄ）Ｔ１５０Ｉ、（ｅ）Ｓ５４Ｐ、および（ｆ）Ｓ５７Ｐのうちの１つまたは複数を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記バリアントが、請求項３１から３４に記載の変異／置換の組合せのいずれかを含む、請求項４６または４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記ポアが、請求項３１から３４のいずれか一項に記載のポアである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記標的分析物が、金属イオン、無機塩、ポリマー、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、色素、漂白剤、医薬品、診断剤、レクリエーショナルドラッグ、爆発物または環境汚染物質である、請求項４５から４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記標的分析物が、標的ポリヌクレオチドである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
標的ポリヌクレオチドを特徴づけるための方法であって、
ａ）前記ポリヌクレオチドを前記ポアと、前記ポリヌクレオチドが前記ポアに対して移動するように接触させるステップ、および
ｂ）前記ポリヌクレオチドが前記ポアに対して移動しているときに１回または複数回の測定を行い、前記測定が前記ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特徴を示し、それによって前記標的ポリヌクレオチドを特徴づけるステップ
を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記１つまたは複数の特徴が、（ｉ）前記ポリヌクレオチドの長さ、（ｉｉ）前記ポリヌクレオチドの同一性、（ｉｉｉ）前記ポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）前記ポリヌクレオチドの二次構造、および（ｖ）前記ポリヌクレオチドが修飾されているか否かから選択される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特徴が、電気的測定および／または光学的測定によって測定される、請求項５２または５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記電気的測定が、電流測定、インピーダンス測定、トンネル効果測定または電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）測定である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
ステップａ）が、前記ポリヌクレオチドをポリヌクレオチド結合タンパク質と、前記タンパク質が前記ポアを通る前記ポリヌクレオチドの移動を制御するように接触させることをさらに含む、請求項５２から５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
ａ）前記ポリヌクレオチドを前記ポアおよび前記ポリヌクレオチド結合タンパク質と、前記タンパク質が前記ポアに対する前記ポリヌクレオチドの移動を制御するように接触させるステップ、ならびに
ｂ）前記ポリヌクレオチドが前記ポアに対して移動しているときに前記ポアを通過する電流を測定し、前記電流が前記ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特徴を示し、それによって前記標的ポリヌクレオチドを特徴づけるステップ
を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記ポリヌクレオチド結合タンパク質がヘリカーゼである、またはヘリカーゼに由来する、請求項５６または５７に記載の方法。
【請求項５９】
標的ポリヌクレオチドを特徴づけるための方法であって、
ａ）前記ポリヌクレオチドをＣｓｇＧポアまたはその変異体およびエキソヌクレアーゼと、前記エキソヌクレアーゼが前記標的ポリヌクレオチドの一方の末端から個々のヌクレオチドを消化し、前記個々のヌクレオチドが前記ポアに対して移動するように接触させるステップ、ならびに
ｂ）前記個々のヌクレオチドが前記ポアに対して移動しているときに１回または複数回の測定を行い、前記測定が前記個々のヌクレオチドの１つまたは複数の特徴を示し、それによって前記標的ポリヌクレオチドを特徴づけるステップ
を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項６０】
前記ポアが、膜内にある、請求項４５から４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記膜が、両親媒性層である、または固体層を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記標的分析物を、前記ポアと接触させる前に前記膜とカップリングさせる、請求項６０または６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記標的分析物を、前記分析物を前記膜の方に送達する微粒子に結合させる、請求項６０から６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
標的ポリヌクレオチドを特徴づけるためのセンサーを形成する方法であって、ＣｓｇＧポアまたはその変異体とポリヌクレオチド結合タンパク質との複合体を形成し、それによって前記標的ポリヌクレオチドを特徴づけるためのセンサーを形成するステップを含む方法。
【請求項６５】
前記複合体が、（ａ）前記標的ポリヌクレオチドの存在下で前記ポアを前記ポリヌクレオチド結合タンパク質と接触させること、および（ａ）前記ポアを介して電位を印加することによって形成される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記電位が、電圧電位または化学的電位である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記複合体が、前記ポアを前記タンパク質に共有結合させることによって形成される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６８】
標的ポリヌクレオチドを特徴づけるためのセンサーであって、ＣｓｇＧポアまたはその変異体とポリヌクレオチド結合タンパク質との複合体を含むセンサー。
【請求項６９】
標的分析物の存在、不在または１つもしくは複数の特徴を判定するための、ＣｓｇＧポアまたはその変異体の使用。
【請求項７０】
標的分析物を特徴づけるためのキットであって、（ａ）ＣｓｇＧポアまたはその変異体と（ｂ）膜の成分とを含むキット。
【請求項７１】
試料中の標的分析物を特徴づけるための装置であって、（ａ）複数のＣｓｇＧポアまたはそれらの変異体と（ｂ）複数の膜とを含む装置。
【請求項７２】
前記複数のポアおよび膜を支持することができるセンサーデバイスであって、前記ポアおよび膜を使用して分析物の特徴づけを行うために操作可能であるセンサーデバイスと、
前記特徴づけを行うための材料を送達するための少なくとも１つのポートと
を含む、請求項７１に記載の装置。
【請求項７３】
前記複数のポアおよび膜を支持することができるセンサーデバイスであって、前記ポアおよび膜を使用して分析物の特徴づけを行うために操作可能であるセンサーデバイスと、
前記特徴づけを行うための材料を保持するための少なくとも１つのリザーバーと
を含む、請求項７２に記載の装置。
【請求項７４】
材料を前記少なくとも１つのリザーバーから前記センサーデバイスに制御可能に供給するように構成されている流体工学システムと、
それぞれの試料を受けるための複数の容器と
をさらに含み、前記流体工学システムが、前記試料を前記容器から前記センサーデバイスに選択的に供給するように構成されている、請求項７２または７３に記載の装置。
【請求項７５】
標的ポリヌクレオチドを特徴づける方法であって、
ａ）前記ポリヌクレオチドをＣｓｇＧポアまたはその変異体、ポリメラーゼおよび標識ヌクレオチドと、各ヌクレオチドに特異的な標識を含有するリン酸標識分子種が前記ポリメラーゼによって前記標的ポリヌクレオチドに逐次的に付加されるように接触させるステップ、ならびに
ｂ）前記ポアを使用して前記リン酸標識分子種を検出し、それによって前記ポリヌクレオチドを特徴づけるステップ
を含む方法。
【請求項７６】
請求項３１から３４のいずれか一項に記載の変異体モノマーまたは請求項３７に記載の構築物を産生する方法であって、好適な宿主細胞において請求項４０に記載のポリヌクレオチドを発現させ、それによって請求項３１から３４のいずれか一項に記載の変異体モノマーまたは請求項３７に記載の構築物を産生するステップを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規タンパク質ポアおよびそれらの使用に関する。詳細には、本発明は、核酸シークエンシング用途および分子センシングにおける生体ナノポアに関する。
【０００２】
本発明は、ＣｓｇＧの変異型に関する。本発明は、ＣｓｇＧを使用する分析物の検出および特徴づけにも関する。
【背景技術】
【０００３】
タンパク質ポアは、膜貫通ポリペプチドであり、その膜内でイオンおよびある特定の分子が通過しうるチャネルを形成している複合体である。このチャネルの最小直径は、通常はナノメートル（１０−９メートル）範囲であり、したがって、これらのポリペプチドの一部は「ナノポア」と名づけられている。
【０００４】
ナノポアには、生体センサーとしての大きな可能性がある。膜結合ナノポアを介して電気的電位を印加すると、イオンがチャネルを通って流れる。イオンのこの流れを電流として測定することができる。単一チャネル記録機器を使用する好適な電気的測定技術は、例えば、国際公開第２０００／２８３１２号パンフレットおよびD. Stoddart et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 2010, 106, 7702-7に記載されている。多チャネル記録技術は、例えば、国際公開第２００９／０７７７３４号パンフレットに記載されている。
【０００５】
ポアによって翻訳するまたはポア内もしくは付近に結合する分子は、チャネルを通るイオン流を妨げることによってそのイオン流を低減させるように作用する。電流の低減によって測定されるイオン流の低減の程度は、ポア内のまたはポアの付近の妨害の大きさを示す。したがって、測定される電流をチャネルに対する妨害の大きさおよび程度の測度として使用することができる。電流の変化は、分子または分子の一部がポアにもしくは付近に結合したことの同定（分子センシング）に使用することができ、またはある特定のシステムでは、ポア内に存在する分子の正体のそのサイズに基づく判定（核酸シークエンシング）に使用することができる。
【０００６】
生体ナノポアを使用して核酸をシークエンシングする「鎖シークエンシング」法は公知である。１本のポリヌクレオチド鎖をナノポアに通過させることで、個々のヌクレオチド上の塩基を、それらがナノポアのチャネルを一時的に通過するときに測定される電流の変化によって判定する。この方法は、核酸シークエンシングの旧来の方法に比べて有意な時間およびコスト節約をもたらす。
【０００７】
以前に報告されたタンパク質ナノポア、例えば、変異体ＭｓｐＡ（Manrao et al., Nature Biotechnology, 2012, 30(4), 349-353）およびアルファ溶血素ナノポア（Nat. Nanotechnol., 2009, 4(4), 265-70）は、「鎖シークエンシング」アプローチを使用する核酸シークエンシングに使用されている。同様に、タンパク質センシングに他のポア、例えば、アルファ溶血素（J Am Chem Soc, 2012, 134(5), 2781-7）およびＣｌｙＡ（Am. Chem. Soc. Nano. 2014, 8(12), 12826-35）（J. Am. Chem. Soc, 2013, 135(36), 13456-63）も適応されている。
【０００８】
先行技術の不足、特に、分子センシング用途および例えば核酸シークエンシング用途のためのポアの寸法および特徴の最適化の点での先行技術の不足を克服する新規ナノポアが依然として必要とされている。
【０００９】
ナノポアセンシングは、分析物分子と受容体との個々の結合または相互作用事象の観察に依存するセンシングへのアプローチである。ナノポアセンサーは、ナノメートル寸法の単一ポアを絶縁膜内に配置し、そのポアを通る電圧依存性イオン輸送を分析物分子の存在下で測定することによって、作り出すことができる。分析物の正体は、その特有の電流兆候、特に、電流遮断の継続時間および程度ならびに電流レベルの変動によって明らかにされる。
【００１０】
迅速で安価な核酸（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）シークエンシング技術が、現今、幅広い用途にわたって必要とされている。既存の技術は、時間がかかり、費用がかかり、その主な理由は、それらの技術が、大量の核酸の産生を増幅技術に頼り、シグナル検出に多量の専門蛍光化学物質を必要とすることにある。ナノポアセンシングには、要求ヌクレオチドおよび試薬量を低減させることによって迅速で安価な核酸シークエンシングを提供する可能性がある。
【００１１】
ナノポアセンシングを使用する核酸のシークエンシングの必須要素のうちの２つは、（１）ポアを通る核酸の移動の制御および（２）ポアを通って核酸ポリマーを移動させながらのヌクレオチドの識別である。従来、ヌクレオチド識別を果たすために、核酸を溶血素の変異体に通してきた。これによって電流兆候が得られており、そのような電流兆候は、配列依存性であることが証明されている。溶血素ポアを使用すると多数のヌクレオチドが観測電流に寄与して、観測電流とポリヌクレオチドとの直接的関連を困難にすることも証明されている。
【００１２】
ヌクレオチド識別のための電流範囲は、溶血素ポアの変異によって改善されたが、ヌクレオチド間の電流の違いをさらに改善することができればシークエンシングシステムはより高い性能を有することになる。加えて、ポアを通って核酸を移動させたとき、一部の電流状態はより大きな変動を示すことが観測されている。一部の変異体溶血素ポアが他のものより大きい変動を示すことも証明されている。これらの状態の変動は配列特異的情報を有することもあるが、システムを単純にするために変動が小さいポアを生じさせることが望ましい。観測電流に寄与するヌクレオチドの数を低減させることも望ましい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明者らは、細菌アミロイド分泌チャネルＣｓｇＧの構造を同定した。ＣｓｇＧチャネルは、おおよそ０．９ｎｍの最小直径を有するチャネルを形成する膜貫通オリゴマータンパク質である。ＣｓｇＧナノポアのこの構造のため、ＣｓｇＧナノポアは、タンパク質センシング用途、特に、核酸センシングにおける使用に好適である。ＣｓｇＧポリペプチドの修飾バージョンは、そのような特定の用途に対するそのチャネルの適合性をさらに向上させるのに役立つことができる。
【００１４】
ＣｓｇＧポアは、その構造がＤＮＡセンシング用途に好都合である点でＣｌｙＡまたはアルファ溶血素などの既存のタンパク質ポアより有利である。ＣｓｇＧポアは、ＣｌｙＡより有利なアスペクト比を有し、その結果、ＣｌｙＡより短い膜貫通チャネルを含む。ＣｓｇＧポアは、アルファ溶血素ポアと比較して広いチャネル開口部も有する。これは、ある特定の用途、例えば、核酸シークエンシング用途のための酵素の結合を助長することができる。これらの実施形態では、それは、酵素と読み取りヘッド（最も狭いポア部分と定義する）の間に位置する核酸鎖部分の長さを最小化し、その結果、読み出しシグナルを向上させることもできる。ＣｓｇＧポアのチャネルの狭い内部狭窄は、核酸シークエンシングを含む本発明の実施形態では、一本鎖ＤＮＡの移行も助長する。この狭窄は、隣接タンパク質モノマーにおける５１位のチロシン残基（Ｔｙｒ５１）の並置ならびにまた５６および５５位のそれぞれフェニルアラニンおよびアスパラギン残基（Ｐｈｅ５６およびＡｓｎ５５）によって形成される２つの輪状の環で作られる。この狭窄の寸法を変更することができる。ＣｌｙＡは、現在はシークエンシングに使用されない二本鎖ＤＮＡの通過を可能にする、はるかに広い内部狭窄を有する。アルファ溶血素ポアは、１つの１．３ｎｍ幅内部狭窄を有するが、さらなる読み取りヘッドを特徴とする２ｎｍ幅ベータバレルも有する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
第１の態様では、本発明は、分子センシングのための方法であって、
ａ）少なくとも１つのＣｓｇＧモノマーで形成されるＣｓｇＧ生体ポアを絶縁層内に設けるステップ、
ｂ）絶縁層を介して電気的電位を印加し、それによって生体ポアを通る電流の流れを確立するステップ、
ｃ）ＣｓｇＧ生体ポアを試験基質と接触させるステップ、および
ｄ）生体ポアを通る電流の流れを測定するステップ
を含む方法に関する。
【００１６】
通常、絶縁層は、脂質二重層などの膜である。実施形態では、ポアを通る電流は、絶縁層の第１の側面から絶縁層の第２の側面への可溶性イオンの流れによって搬送される。
【００１７】
本発明の実施形態では、分子センシングは、分析物検出である。特定の実施形態では、分析物を検出するための方法は、ステップ（ｄ）の後に、試験基質が不在であるときに生体ポアを通る電流と比較して生体ポアを通る電流を低減させることによって試験基質の存在を判定するさらなるステップを含む。
【００１８】
本発明の代替実施形態では、分子センシングは、核酸シークエンシングである。通常は、前記方法によってシークエンシングされる核酸のタイプは、ＤＮＡまたはＲＮＡである。本発明の特異的実施形態では、ＣｓｇＧ生体ポアは、さらなるアクセサリータンパク質に順応するように適合される。通常は、さらなるアクセサリータンパク質は、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼ、イソメラーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレース、テロメラーゼ、エキソヌクレアーゼ、およびヘリカーゼからなる群から選択される、核酸プロセシング酵素である。
【００１９】
本発明の実施形態では、ＣｓｇＧ生体ポアは、修飾ＣｓｇＧポアであり、修飾ＣｓｇＧポアは、ＣｓｇＧポアを形成するＣｓｇＧモノマーの少なくとも１つにおけるモノマー野生型大腸菌（E-coli）ＣｓｇＧポリペプチド配列に少なくとも１つの修飾を有する。通常は、ＣｓｇＧポアを形成するＣｓｇＧモノマーすべてに同じ修飾が施される。本発明の特定の実施形態では、修飾ＣｓｇＧモノマーは、配列番号４〜３８８による３８〜６３位のポリペプチド配列を有する。
【００２０】
第２の態様では、本発明は、少なくとも１つのＣｓｇＧモノマーを含む修飾ＣｓｇＧ生体ポアであって、０．５ｎｍ〜１．５ｎｍの範囲の直径を有するチャネル狭窄を１つしか有さない修飾ＣｓｇＧ生体ポアに関する。通常は、ＣｓｇＧモノマーのポリペプチド配列の３８〜６３位に修飾がある。好適には、Ｔｙｒ５１、Ａｓｎ５５およびＰｈｅ５６から選択される位置に修飾がある。特定の実施形態では、位置Ｔｙｒ５１に修飾があるか、位置Ａｓｎ５５とＰｈｅ５６の両方に修飾がある。
【００２１】
本発明の実施形態では、ＣｓｇＧモノマーへの修飾は、天然に存在するアミノ酸の置換、天然に存在するアミノ酸の欠失、および天然に存在するアミノ酸側鎖の修飾からなる群から選択される。好適には、修飾によって未修飾アミノ酸の立体障害が低減または除去される。特異的実施形態では、ポアの少なくとも１つのＣｓｇＧモノマーは、配列番号４〜３８８による３８〜６３位のポリペプチド配列を有する。
【００２２】
第３の態様では、本発明は、本発明の第２の態様の修飾ＣｓｇＧ生体ポアの少なくとも１つのＣｓｇＧモノマーをコードする単離されたポリペプチドに関する。
【００２３】
第４の態様では、本発明は、本発明の第３の態様の単離されたポリペプチドをコードする単離された核酸に関する。
【００２４】
第５の態様では、本発明は、
ａ）絶縁層と、
ｂ）絶縁層内のＣｓｇＧ生体ポアと、
ｃ）生体ポアを通る電流を測定するための装置と
を含むバイオセンサーに関する。
【００２５】
特定の実施形態では、バイオセンサー内のＣｓｇＧ生体ポアは、本発明の第２の態様による修飾ＣｓｇＧ生体ポアである。
【００２６】
第６の態様では、本発明は、生体センシング用途のためのＣｓｇＧ生体ポアの使用に関し、生体センシング用途は、分析物検出または核酸シークエンシングである。本発明の第６の態様の実施形態では、核酸シークエンシングは、ＤＮＡシークエンシングまたはＲＮＡシークエンシングである。
【００２７】
本発明者らは、驚くべきことに、ＣｓｇＧおよびその新規変異体をポリヌクレオチドなどの分析物の特徴づけに使用することができる可能性があることを立証した。本発明は、変異体ＣｓｇＧモノマーであって、ポリヌクレオチドなどの分析物と相互作用するそのモノマーの能力を向上させるために１つまたは複数の修飾が施された変異体ＣｓｇＧモノマーに関する。本発明者らは、驚くべきことに、新規変異体モノマーを含むポアは、ポリヌクレオチドなどの分析物との相互作用能力が向上されており、したがって、ポリヌクレオチドの配列などの分析物の特徴を推定する特性の向上を示すことも立証した。変異体ポアは、ヌクレオチド識別の向上を驚くほど示した。詳細には、変異体ポアは、異なるヌクレオチド間の識別をより容易にする電流範囲の増加、およびシグナル対ノイズ比を増加させる状態変動の低減を、驚くほど示した。加えて、ポアを通ってポリヌクレオチドが移動しているときに電流に寄与するヌクレオチドの数が減少される。これは、ポアを通ってポリヌクレオチドが移動しているときに観測される電流とポリヌクレオチドとの直接的関連の同定をより容易にする。加えて、変異体ポアは、スループット増加を示すこともあり、すなわち、ポリヌクレオチドなどの分析物と相互作用する可能性がより高い。これは、ポアを使用する分析物の特徴づけをより容易にする。変異体ポアは、より容易に膜に入ることができる。
【００２８】
したがって、本発明は、配列番号３９０で示される配列のバリアントを含む変異体ＣｓｇＧモノマーであって、バリアントが位置Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６のうちの１つもしくは複数に修飾を含む、変異体ＣｓｇＧモノマーを提供する。
【００２９】
したがって、本発明は、配列番号３９０で示される配列のバリアントを含む変異体ＣｓｇＧモノマーであって、バリアントが以下の１つまたは複数を含む、変異体ＣｓｇＧモノマーを提供する：（ｉ）次の位置における１つもしくは複数の変異（すなわち、次の位置の１つもしくは複数における変異）：Ｎ４０、Ｄ４３、Ｅ４４、Ｓ５４、Ｓ５７、Ｑ６２、Ｒ９７、Ｅ１０１、Ｅ１２４、Ｅ１３１、Ｒ１４２、Ｔ１５０およびＲ１９２、（ｉｉ）Ｙ５１／Ｎ５５、Ｙ５１／Ｆ５６、Ｎ５５／Ｆ５６もしくはＹ５１／Ｎ５５／Ｆ５６における変異、（ｉｉｉ）Ｑ４２ＲもしくはＱ４２Ｋ、（ｉｖ）Ｋ４９Ｒ、（ｖ）Ｎ１０２Ｒ、Ｎ１０２Ｆ、Ｎ１０２ＹもしくはＮ１０２Ｗ、（ｖｉ）Ｄ１４９Ｎ、Ｄ１４９ＱもしくはＤ１４９Ｒ、（ｖｉｉ）Ｅ１８５Ｎ、Ｅ１８５ＱもしくはＥ１８５Ｒ、（ｖｉｉｉ）Ｄ１９５Ｎ、Ｄ１９５ＱもしくはＤ１９５Ｒ、（ｉｘ）Ｅ２０１Ｎ、Ｅ２０１ＱもしくはＥ２０１Ｒ、（ｘ）Ｅ２０３Ｎ、Ｅ２０３ＱもしくはＥ２０３Ｒ、ならびに（ｘｉ）位置Ｆ４８、Ｋ４９、Ｐ５０、Ｙ５１、Ｐ５２、Ａ５３、Ｓ５４、Ｎ５５、Ｆ５６およびＳ５７の１つもしくは複数の欠失。
【００３０】
本発明は、
−  共有結合している２つ以上のＣｓｇＧモノマーを含む構築物であって、モノマーの少なくとも１つが本発明の変異体モノマーである、構築物、
−  本発明の変異体モノマーまたは本発明の構築物をコードするポリヌクレオチド、
−  本発明の同一の変異体モノマーまたは本発明の同一の構築物を含むＣｓｇＧに由来するホモオリゴマーポア、
−  本発明の少なくとも１つの変異体モノマーまたは本発明の少なくとも１つの構築物を含むＣｓｇＧに由来するヘテロオリゴマーポア、
−  標的分析物の存在、不在または１つもしくは複数の特徴を判定する方法であって、
ａ）標的分析物をＣｓｇＧポアまたはその変異体と、標的分析物がポアに対して移動するように接触させるステップ、および
ｂ）分析物がポアに対して移動しているときに１回または複数回測定を行い、それによって分析物の存在、不在または１つもしくは複数の特徴を判定するステップ
を含む方法、
−  標的ポリヌクレオチドを特徴づけるためのセンサーを形成する方法であって、ＣｓｇＧポアまたはその変異体とポリヌクレオチド結合タンパク質との複合体を形成し、それによって、標的ポリヌクレオチドを特徴づけるためのセンサーを形成するステップを含む方法、
−  標的ポリヌクレオチドを特徴づけるためのセンサーであって、ＣｓｇＧポアまたはその変異体とポリヌクレオチド結合タンパク質との複合体を含むセンサー、
−  標的分析物の存在、不在または１つもしくは複数の特徴を判定するためのＣｓｇＧポアまたはその変異体の使用、
−  標的分析物を特徴づけるためのキットであって、（ａ）ＣｓｇＧポアまたはその変異体と（ｂ）膜の成分とを含むキット、
−  試料中の標的分析物を特徴づけるための装置であって、（ａ）複数のＣｓｇＧポアまたはそれらの変異体と（ｂ）複数の膜とを含む装置、
−  標的ポリヌクレオチドを特徴づける方法であって、
ａ）ポリヌクレオチドをＣｓｇＧポアまたはその変異体、ポリメラーゼおよび標識ヌクレオチドと、リン酸塩標識化学種がポリメラーゼによって標的ポリヌクレオチドに逐次的に付加されるように接触させ、リン酸塩化学種が各ヌクレオチドに特異的な標的を含有するものであるステップ、および
ｂ）ポアを使用してリン酸塩標識化学種を検出し、それによってポリヌクレオチドを特徴づけるステップ
を含む方法、ならびに
−  本発明の変異体モノマーまたは本発明の構築物を産生する方法であって、好適な宿主細胞において本発明のポリヌクレオチドを発現させ、それによって本発明の変異体モノマーまたは構築物を産生するステップを含む方法
も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】リボン表示および表面表示でのＣｓｇＧノナマーのそのチャネルコンフォメーションの構造を示す側面断面図である。
【図２】ＣｓｇＧチャネル狭窄（すなわち、ナノポアセンシング用途の状況でのポアの読み取りヘッド）および関連する直径の測定を示す断面図である。
【図３】スタックされた３つの同心円の側鎖層：Ｔｙｒ５１、Ａｓｎ５５、およびＰｈｅ５６を含む、ポア狭窄に寄与する構造モチーフ図である。
【図４】ＣｓｇＧ様タンパク質（配列番号４４２〜配列番号４４８）の多重配列アライメントを含む、ＣｓｇＧホモログの配列相同性を示す図である。選択された配列は、ＣｓｇＧ様配列の系統樹（示していない）全体の単系統クレードから選択され、配列多様性の代表的な図を示す。β−ストランドまたはα−ヘリックスの二次構造エレメントをそれぞれ、矢印またはバーとして示し、これらは大腸菌（E.coli）ＣｓｇＧの結晶構造に基づく。重要であることから、大腸菌（E.coli）のＴｈｒ５１、Ａｓｎ５５およびＰｈｅ５６と同等の残基を矢印で強調する。これらの残基は、ポアの内部狭窄、すなわち、ナノポアセンシング用途の状況でのポアの読み取りヘッドを形成する。
【図５】平面リン脂質二重層に再構成され、＋５０ｍＶ（ｎ＝３３）または−５０ｍＶ（ｎ＝１３）の電場で測定したＣｓｇＧの代表的な単一チャネル電流記録（ａ）およびコンダクタンスのヒストグラム（ｂ）を示すグラフ図である。
【図６】ＰＰＢ再構成ＣｓｇＧの＋５０ｍＶまたは−５０ｍＶでの、ならびにＣｓｇＥの増加濃度を補充した場合の単一チャネル電流記録を示すグラフ図である。水平方向のスケールバーは０ｐＡに存在する。
【図７】ａ、Ｃ８Ｅ４／ＬＤＡＯ可溶化ＣｓｇＧの未加工のネガティブ染色ＥＭ画像を示す図である。矢印は、ｇに示されるサイズ排除プロファイルに表示される異なる粒子集団を示し、（Ｉ）ＣｓｇＧノナマーの凝集体、（ＩＩ）ＣｓｇＧオクタデカマー、および（ＩＩＩ）ＣｓｇＧノナマーである。スケールバー、２０ｎｍ。ｂ、表記のオリゴマー化状態の上面図および側面図の代表的なクラス平均画像。ｃ、９回の対称性を示す、上面図のＬＤＡＯ可溶化ＣｓｇＧの回転方向の自己相関関数グラフ。ｄ、ＣｓｇＧＣ１Ｓの未加工のネガティブ染色ＥＭ画像。矢印は、ｇのサイズ排除クロマトグラフィーで観察されたヘキサデカマー（ＩＶ）およびオクタマー（Ｖ）粒子を示す。ｅ、ＣｓｇＧＣ１Ｓオリゴマーの側面図の代表的なクラス平均画像。この構築物に関して上面図は観察されなかった。ｆ、ｇで示されるサイズ排除クロマトグラフィーで観察されたＣｓｇＧＣ１ＳおよびＣｓｇＧ粒子の溶出体積（ＥＶ）、計算分子量（ＭＷｃａｌｃ）、ＣｓｇＧのオリゴマー化状態（ＣｓｇＧｎ）に対応する予想分子量（ＭＷＣｓｇＧ）、ならびにネガティブ染色ＥＭおよびＸ線結晶学で観察された粒子の対称性の表。ｇ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００  ＧＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で実行したＣｓｇＧＣ１Ｓ（黒色）およびＣ８Ｅ４／ＬＤＡＯ可溶化ＣｓｇＧ（灰色）のサイズ排除クロマトグラム。ｈ、ｉ、結晶化オリゴマーのリボン表示の上面図および側面図であり、ＣｓｇＧＣ１ＳのＤ８ヘキサデカマー（ｈ）、および膜抽出ＣｓｇＧのＤ９オクタデカマー（ｉ）を示す。１つのプロトマーをＮ末端（青色）からＣ末端（赤色）にかけて虹色で示す。結晶に捕捉されるテール−テールダイマーを形成する２つのＣ８オクタマー（ＣｇＧＣ１Ｓ）またはＣ９ノナマー（ＣｓｇＧ）を青色と黄褐色で示す。ｒおよびθはそれぞれ、半径およびプロトマー間回転を示す。
【図８】ＮＣＳにより平均化して密度を修正した実験的ＳＡＤ相を使用して計算し、１．５σの等高線で表示するＣｓｇＧＣ１Ｓの２．８Åでの電子密度マップを示す図である。マップは、チャネル構築領域（ＣＬ：単一のプロトマーを表示する）を示し、最終の精密化モデルに重ね合わせている。ＣｓｇＧＣ１Ｓは、成熟ＣｓｇＧ配列のＮ−末端Ｃｙｓ、すなわちＣｙｓ１がＳｅｒに置換され、それによって大腸菌（E.coli）ＬＯＬ経路による脂質修飾が欠如している変異体ＣｓｇＧである。これによって、ネイティブの脂質修飾ＣｓｇＧによって形成される膜標的化ホモノナマーポアとは反対のプレポアコンフォメーションで存在する（図４２を参照されたい）可溶性のホモオクタマーオリゴマーが得られる（図４３）。
【図９】Ｃ−末端からＮ−末端方向に示す、細長いコンフォメーションのチャネルの中を貫通するポリアラニン鎖によるＣｓｇＧ狭窄モデルの上面図（図９ａ）および側面図（図９ｂ）を示す図である。図９ｂに存在するポリアラニン鎖のモデル溶媒和を、明確にするためにＣ−ループを除去して図９ｃに示す（ポリアラニン鎖全体の１０Å以内の溶媒分子を示す）。
【図１０】大腸菌（E.coli）からのＣｓｇＧを示す図である。
【図１１】ＣｓｇＧの寸法を示す図である。
【図１２】１０Å／ナノ秒での１Ｇ転位を示す図である。グアニンがＣｓｇＧ−ＥｃｏのＦ５６環に入るためには大きい障壁が存在する。＊＝ＧはＦ５６環に入る。Ａ＝Ｇは５６環との相互作用を中止する。Ｂ＝Ｇは、５５環との相互作用を中止する。Ｃ＝Ｇは５１環との相互作用を中止する。
【図１３】１００Å／ナノ秒でのｓｓＤＮＡ転位を示す図である。ＤＮＡをＣｓｇＧ−Ｅｃｏの狭窄の中に引っ張るにはより大きい力が必要である。
【図１４】１０Å／ナノ秒でのｓｓＤＮＡ転位を示す図である。ＣｓｇＧ−Ｆ５６Ａ−Ｎ５５ＳおよびＣｓＧ−Ｆ５６Ａ−Ｎ５５Ｓ−Ｙ５１Ａ変異体はいずれも、ｓｓＤＮＡ転位の障壁がより低い。
【図１５】野生型（ＷＴ）と比較して範囲の増加を示す変異体ポアを示すグラフ図である。
【図１６】野生型（ＷＴ）と比較して範囲の増加を示す変異体ポアを示すグラフ図である。
【図１７】野生型（ＷＴ）と比較して範囲の増加を示す変異体ポアを示すグラフ図である。
【図１８】野生型（ＷＴ）と比較してスループットの増加を示す変異体ポアを示すグラフ図である。
【図１９】野生型（ＷＴ）と比較してスループットの増加を示す変異体ポアを示すグラフ図である。
【図２０】野生型（ＷＴ）と比較して挿入の増加を示す変異体ポアを示すグラフ図である。
【図２１】野生型（ＷＴ）と比較して挿入の増加を示す変異体ポアを示すグラフ図である。
【図２２】実施例１８で使用したＤＮＡ構築物Ｘを示す図である。１と表示される領域は、３０個のＳｐＣ３スペーサーに対応した。２と表示される領域は配列番号４１５に対応した。３と表示される領域は、４個のｉＳｐ１８スペーサーに対応した。４と表示される領域は、配列番号４１６に対応した。５と表示される部分は、４個の５−ニトロインドールに対応した。６と表示される領域は、配列番号４１７に対応した。７と表示される領域は配列番号４１８に対応した。８と表示される領域は、４個のｉＳｐ１８スペーサー（９と表示される領域）が配列番号４１９の３‘末端に結合している配列番号４１９に対応した。ｉＳｐ１８スペーサーの反対側の末端は、３’コレステロールテザーであった（１０と表示される）。１１と表示される領域は４個のＳｐＣ３スペーサーに対応した。
【図２３】ＣｓｇＧタンパク質のＳｔｒｅｐ  ｔｒａｐ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）精製の一例としてのクロマトグラフィートレースを示すグラフ図である（ｘ軸の表示＝溶出体積（ｍＬ）、Ｙ軸の表示＝吸光度（ｍＡｕ））。２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０１％ＤＤＭ中の試料をロードして、１０ｍＭデスチオビオチンによって溶出させた。ＣｓｇＧタンパク質が溶出する溶出ピークをＥ１と表示する。
【図２４】最初のＳｔｒｅｐ精製後のＣｓｇＧタンパク質の典型的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ可視化の例を示す写真である。４〜２０％ＴＧＸゲル（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）を１×ＴＧＳ緩衝液中、３００Ｖで２２分間泳動（run）させた。ゲルをＳｙｐｒｏ  Ｒｕｂｙ染色で染色した。レーン１〜３は、矢印で示されるＣｓｇＧタンパク質を含有する主な溶出ピーク（図２３においてＥ１と表示）を示す。レーン４〜６は混入物質を含有する主要な溶出ピーク（図２３においてＥ１と表示）のテールの溶出分画に対応した。Ｍは、使用した分子量マーカーを示し、これはＮｏｖｅｘ  Ｓｈａｒｐ  Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ（単位＝ｋＤ）であった。
【図２５】ＣｓｇＧタンパク質のサイズ排除クロマトグラム（ＳＥＣ）の一例を示すグラフ図である（１２０ｍＬ  Ｓ２００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ｘ軸の表示＝溶出体積（ｍＬ）、ｙ軸の表示＝吸光度（ｍＡｕ））。ＳＥＣは、Ｓｔｒｅｐ精製後でタンパク質試料の加熱後に実施した。ＳＥＣのランニング緩衝液は、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０１％ＤＤＭ、０．１％ＳＤＳ、ｐＨ８．０であり、カラムを１ｍＬ／分の速度で溶出させた。Ｘと表示されるトレースは、２２０ｎｍでの吸光度を示し、Ｙと表示されるトレースは、２８０ｎｍでの吸光度を示す。星印で表示されるピークを収集した。
【図２６】ＳＥＣ後のＣｓｇＧタンパク質の典型的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ可視化の一例を示す写真である。４〜２０％ＴＧＸゲル（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）を、１×ＴＧＳ緩衝液中、３００Ｖで２２分間泳動させた後、ゲルをＳｙｐｒｏ  Ｒｕｂｙ染色で染色した。レーン１は、Ｓｔｒｅｐ精製後で加熱後であるがＳＥＣの前のＣｓｇＧタンパク質試料を示す。レーン２〜８は、図２５において星で表示される、図２５のおおよそ４８ｍＬ〜６０ｍＬ（ピークの中心＝５５ｍＬ）に溶出するピーク全体を収集した分画を示す。Ｍは、使用した分子量マーカーを示し、これはＮｏｖｅｘ  Ｓｈａｒｐ  Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ（単位＝ｋＤ）であった。ＣｓｇＧ−Ｅｃｏポアに対応するバーを矢印で示す。
【図２７】野生型（ＷＴ）と比較して範囲の増加を示す変異体ポアを示すグラフ図である。
【図２８】野生型（ＷＴ）と比較して範囲の増加を示す変異体ポアを示すグラフ図である。
【図２９】野生型（ＷＴ）と比較して範囲の増加を示す変異体ポアを示すグラフ図である。
【図３０】野生型（ＷＴ）と比較して範囲の増加を示す変異体ポアを示すグラフ図である。
【図３１】野生型（ＷＴ）と比較して範囲の増加を示す変異体ポアを示すグラフ図である。
【図３２】野生型（ＷＴ）と比較して範囲の増加を示す変異体ポアを示すグラフ図である。
【図３３】野生型（ＷＴ）と比較して範囲の増加を示す変異体ポアを示すグラフ図である。
【図３４】野生型（ＷＴ）と比較して範囲の増加を示す変異体ポアを示すグラフ図である。
【図３５】野生型（ＷＴ）と比較して範囲の増加を示す変異体ポアを示すグラフ図である。
【図３６】野生型（ＷＴ）と比較して範囲の増加を示す変異体ポアを示すグラフ図である。
【図３７】野生型（ＷＴ）と比較して範囲の増加を示す変異体ポアを示すグラフ図である。
【図３８】野生型（ＷＴ）と比較して範囲の増加を示す変異体ポアを示すグラフ図である。
【図３９】野生型（ＷＴ）と比較して範囲の増加を示す変異体ポアを示すグラフ図である。
【図４０】シミュレーション（実験１から３）において０および２０ナノ秒で撮影したポア（ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ）−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑを有し、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端ポア変異体番号２０に結合する配列番号３９０）上の酵素（Ｔ４  Ｄｄａ−（Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ）（変異Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃおよび次に（ΔＭ１）Ｇ１Ｇ２を有する配列番号４１２）を示すスナップショット写真である。
【図４１】シミュレーション（実験１から３）において３０および４０ナノ秒で撮影したポア（ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ）−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑを有し、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端ポア変異体番号２０に結合する配列番号３９０）上の酵素（Ｔ４  Ｄｄａ−（Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ）（変異Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃおよび次に（ΔＭ１）Ｇ１Ｇ２を有する配列番号４１２）を示すスナップショット写真である。
【図４２】プレポアコンフォメーションのＣｓｇＧＣ１ＳのＸ線構造を示す図である。ａ、Ｎ−末端からＣ−末端にかけて青色から赤色への虹色で表示するＣｓｇＧＣ１Ｓモノマーのリボン図。二次構造エレメントをＡＢＤ様の折り畳みに従って表示し、さらなるＮ−末端およびＣ−末端α−ヘリックス、ならびにβ１とα１とを接続する細長いループをそれぞれ、αＮ、αＣ、およびＣ−ループ（ＣＬ）と表示する。ｂ、ＣｓｇＧＣ１ＳＣ８オクタマーの側面図であり、複数のサブユニットを色で識別するが、１つのサブユニットの方向および色はａと同じである。
【図４３】ＣｓｇＧのそのチャネルコンフォメーションの構造を示す図である。ａ、ＣｓｇＧＣ１Ｓ（青色）および膜抽出ＣｓｇＧ（赤色）のＡＴＲ−ＦＴＩＲスペクトルのアミドＩ領域（１，７００〜１，６００ｃｍ−１）。ｂ、ＴＭ１およびＴＭ２配列（配列番号４４９および配列番号４５０）（青色で示される二重層に面する残基）、ならびに野生型ｃｓｇＧ（ＷＴ）で補完される大腸菌（E.coli）ＢＷ２５１４１ΔｃｓｇＧ、空のベクター、またはＴＭ１もしくはＴＭ２の下線の断片を欠如するｃｓｇＧのコンゴーレッド結合。データは、３回の生物学的反復実験の代表である。ｃ、プレポア（水色；ＴＭ１はピンク色、ＴＭ２は紫色）とチャネルコンフォメーション（黄褐色；ＴＭ１は緑色、ＴＭ２はオレンジ色）のＣｓｇＧモノマーとの重ね合わせ。ＣＬ、Ｃ−ループ。ｄ、ｅ、リボン表示および表面表示でのＣｓｇＧノナマーの側面図（ｄ）および断面図（ｅ）；ヘリックス２、コアドメイン、およびＴＭヘアピンをそれぞれ、青色、水色、および黄褐色で示す。単一のプロトマーを図４２ａと同じ色で表示する。マゼンタ色の球は、Ｌｅｕ２の位置を示す。ＯＭ、外膜。
【図４４】ＣｓｇＧチャネル狭窄を示す図である。ａ、ＣｓｇＧチャネル狭窄の断面図およびその溶媒を除いた直径。ｂ、狭窄は、スタックされた３個の同心円の側鎖層で構成される：周辺質側からＰｈｅ４８の後にＴｙｒ５１、Ａｓｎ５５、およびＰｈｅ５６。ｃ、ＣｓｇＧチャネルの位相学。ｄ、ｃｓｇＧ（ＷＴ）で補完される大腸菌（E.coli）ＢＷ２５１４１ΔｃｓｇＧ、空のベクター、または表記の狭窄変異体を有するｃｓｇＧのコンゴーレッド結合。データは、６回の生物学的反復実験の代表である。ｅ、ｆ、平面リン脂質二重層に再構成され、＋５０ｍＶ（ｎ＝３３）または−５０ｍＶ（ｎ＝１３）の電場で測定したＣｓｇＧの代表的な単一チャネル電流記録（ｅ）およびコンダクタンスヒストグラム（ｆ）。
【図４５】ＣｓｇＧ輸送メカニズムのモデル図である。ａ、ＣｓｇＥ（Ｅ）、ＣｓｇＧ（Ｇ）、および過剰のＣｓｇＥを補充したＣｓｇＧ（Ｅ＋Ｇ）のネイティブＰＡＧＥは、ＣｓｇＧ−ＣｓｇＥ複合体（Ｅ−Ｇ＊）の形成を示す。データは、４つのタンパク質バッチを含む７回の実験の代表である。ｂ、ネイティブＰＡＧＥから回収したＣｓｇＥ（Ｅ）、ＣｓｇＧ（Ｇ）、およびＥ−Ｇ＊複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。データは、２回の繰り返し実験の代表である。Ｍ、分子量マーカー、ｃ、ＣｓｇＧ−ＣｓｇＥ粒子の選択されたクラス平均画像。左から右に：クライオ−ＥＭによって可視化された上面図および側面図、ならびにネガティブ染色側面図とＣｓｇＧノナマーとの比較。ｄ、上面図および斜め側面図のＣｓｇＥ粒子のクライオ−ＥＭ平均画像。回転方向の自己相関は、９回の対称性を示す。ｅ、ＣｓｇＧ−ＣｓｇＥの三次元再構築（分解能２４Å、１，２２１個の単粒子）は、ＣｓｇＧを含むノナマー粒子（青色）およびＣｓｇＥノナマーとして割付されるさらなる密度（オレンジ色）を示す。ｆ、＋５０ｍＶまたは−５０ｍＶで、ＣｓｇＥの増加濃度を補充したＰＰＢ再構成ＣｓｇＧの単一チャネル電流記録。水平尺度のバーは０ｐＡに存在する。ｇ、推定されるＣｓｇＧ媒介タンパク質分泌モデル。ＣｓｇＧおよびＣｓｇＥは、ＣｓｇＡを捕捉する分泌複合体を形成すると提唱されており（図５４に考察）、チャネルの上にエントロピー電位を生成する。チャネル狭窄でのＣｓｇＡの捕捉後、ＤＳ調整ブラウン拡散は、外膜を超えてのポリペプチドの進行性の転位を促進する。
【図４６】大腸菌（E.coli）におけるＣｕｒｌｉ生合成経路を示す図である。ｃｕｒｌｉ大サブユニットＣｓｇＡ（明るい緑色）は、可溶性のモノマータンパク質として細胞から分泌される。ｃｕｒｌｉ小サブユニットＣｓｇＢ（暗い緑色）は、外膜（ＯＭ）に会合し、ＣｓｇＡを可溶性タンパク質からアミロイド沈着物に変換するための核剤として作用する。ＣｓｇＧ（オレンジ色）は外膜におけるオリゴマーｃｕｒｌｉ特異的転位チャネルにアセンブルする。ＣｓｇＥ（紫色）およびＣｓｇＦ（水色）は、生産的なＣｓｇＡおよびＣｓｇＢの輸送ならびに沈着にとって必要な可溶性のアクセサリタンパク質を形成する。ＣｓｇＣは、機能不明の推定オキシドレダクターゼを形成する。全てのｃｕｒｌｉタンパク質は、細胞質（内）膜（ＩＭ）を超えて輸送するために、推定Ｓｅｃシグナル配列を有する。
【図４７】サイズ排除クロマトグラフィーおよびネガティブ染色電子顕微鏡によって分析したＣｓｇＧおよびＣｓｇＧＣ１Ｓの溶液中のオリゴマー化状態を示す図である。ａ、Ｃ８Ｅ４／ＬＤＡＯ可溶化ＣｓｇＧの未加工のネガティブ染色ＥＭ画像。矢印は、ｇに示されるサイズ排除プロファイルに表示される異なる粒子集団を示し、（Ｉ）ＣｓｇＧノナマーの凝集体、（ＩＩ）ＣｓｇＧオクタデカマー、および（ＩＩＩ）ＣｓｇＧノナマーである。スケールバー、２０ｎｍ。ｂ、表記のオリゴマー化状態の上面図および側面図の代表的なクラス平均画像。ｃ、９回の対称性を示す、上面図のＬＤＡＯ可溶化ＣｓｇＧの回転方向の自己相関関数グラフ。ｄ、ＣｓｇＧＣ１Ｓの未加工のネガティブ染色ＥＭ画像。矢印は、ｇに示されるサイズ排除クロマトグラフィーで観察されたヘキサデカマー（ＩＶ）およびオクタマー（Ｖ）粒子を示す。ｅ、ＣｓｇＧＣ１Ｓオリゴマーの側面図の代表的なクラス平均画像。上面図はこの構築物に関して観察されなかった。ｆ、ｇに示されるサイズ排除クロマトグラフィーで観察されたＣｓｇＧＣ１ＳおよびＣｓｇＧ粒子の溶出体積（ＥＶ）、計算分子量（ＭＷｃａｌｃ）、ＣｓｇＧオリゴマー化状態（ＣｓｇＧｎ）に対応する予想分子量（ＭＷＣｓｇＧ）、ならびにネガティブ染色ＥＭおよびＸ線結晶学で観察された粒子の対称性の表。ｇ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００  ＧＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で実行したＣｓｇＧＣ１Ｓ（黒色）およびＣ８Ｅ４／ＬＤＡＯ可溶化ＣｓｇＧ（灰色）のサイズ排除クロマトグラム。ｈ、ｉ、結晶化オリゴマーのリボン表示の上面図および側面図であり、ＣｓｇＧＣ１ＳのＤ８ヘキサデカマー（ｈ）および膜抽出ＣｓｇＧのＤ９オクタデカマー（ｉ）を示す。１つのプロトマーをＮ末端（青色）からＣ末端（赤色）にかけて虹色で示す。結晶に捕捉されるテール−テールダイマーを形成する２つのＣ８オクタマー（ＣｇＧＣ１Ｓ）またはＣ９ノナマー（ＣｓｇＧ）を青色と黄褐色で示す。ｒおよびｈはそれぞれ、半径およびプロトマー間回転を示す。
【図４８】ＣｓｇＧと構造ホモログの比較およびＣｓｇＧにおけるプロトマー間接触を示す図である。ａ、ｂ、いずれもＮ−末端（青色）からＣ末端（赤色）にかけて虹色を示す、ＣｓｇＧＣ１Ｓモノマー（例えば、プレポアコンフォメーションのＣｓｇＧ）（ａ）およびＴｏｌＢのヌクレオチド結合ドメイン様ドメイン（ｂ）（ＰＤＢ２ｈｑｓ）のリボン図。共通の二次構造エレメントを同等に表示する。ｃ、左から右に、キサントモナス・カンペストリス（Xanthomonas campestris）のまれなリポタンパク質Ｂ（ＰＤＢ  ２ｒ７６、ピンク色)、シュワネラ・オネイデンシス（Shewanella oneidensis）仮想リポタンパク質ＤＵＦ３３０（ＰＤＢ  ２ｉｑｉ、ピンク色)、大腸菌（Escherichia coli）ＴｏｌＢ（ＰＤＢ  ２ｈｑｓ、Ｎ末端およびｂ−プロペラドメインに関してそれぞれ、ピンク色および黄色で表示)と重ね合わせたＣｓｇＧＣ１Ｓ（灰色）。ＣｓｇＧ特異的構造エレメントを、左上のパネルのように表示して色付けした。ｄ、ｅ、オリゴマーの外部（ｃ）または内部（ｄ）のいずれかから二重層平面に沿って見たＣｓｇＧ構造において見出される２つの隣接するプロトマーのリボン図。１つのプロトマーをＮ末端からＣ末端にかけて虹色（暗い青色から赤色）で示す。第二のプロトマーを水色（コアドメイン）、青色（ヘリックス２）、および黄褐色（ＴＭドメイン）で示す。４つの主なオリゴマー化境界面が明白である：ｂ−バレル内のｂ６−ｂ３９の主鎖相互作用、狭窄ループ（ＣＬ）、ｂ１−ｂ３−ｂ４−ｂ５に対するヘリックス１（α１）の側鎖パッキング、およびヘリックス２（α２）のヘリックス−ヘリックスパッキング。脂質アンカー（マゼンタの球はＬｅｕ２におけるＣａの位置を示す）とＮ−末端ヘリックス（αＮ）とを接続する１８残基のＮ末端ループも同様に、隣接する２つのプロトマーの上を包むように見える。脂質アンカーの突出した位置は、＋２プロトマーのＴＭ１およびＴＭ２ヘアピンに反して存在すると予想される（明確にするために示していない）。
【図４９】ＣｓｇＧオリゴマーにおける選択された表面残基のＣｙｓのアクセス可能性アッセイを示す。ａ〜ｃ、周辺質（ａ）、側面（ｂ）、および細胞外の図で示すＣｓｇＧノナマーのリボン表示。１つのプロトマーをＮ末端（青色）からＣ末端（赤色）にかけて虹色で示す。システイン置換を表示して、Ｓ原子の同等の位置を球として示し、大腸菌（E.coli）外膜におけるＭＡＬ−ＰＥＧ（５，０００Ｄａ）標識に対するアクセス可能性に従って色付けした。ｄ、導入されたシステインのＭＡＬＰＥＧ結合により５ｋＤａの増加を示す、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析したＭＡＬ−ＰＥＧ反応試料のウェスタンブロット。アクセス可能（１１および１１１）、中等度にアクセス可能（１）、およびアクセス不能（２）部位をそれぞれ、ａ〜ｅにおいて緑色、オレンジ色、および赤色で表示する。Ａｒｇ９７およびＡｒｇ１１０では、４４ｋＤａで第二の化学種が存在し、これは、導入されたシステインとネイティブシステインの両方が標識されるようになるタンパク質の分画に対応する。データは、生物学的反復実験からの４回の独立した実験の代表である。ｅ、Ｘ線構造に存在するＤ９オクタデカマーにおけるダイマー形成境界面の側面図。ダイマー形成界面またはＤ９粒子の管腔内部に導入されたシステインを標識する。膜結合ＣｓｇＧにおいて、これらの残基は、ＭＡＬ−ＰＥＧにアクセス可能であり、Ｄ９粒子が、膜抽出ＣｓｇＧの濃縮溶液のアーチファクトであること、およびＣ９複合体が生理的に関連する化学種を形成することを証明している。Ｃ−末端ヘリックスの残基（ａＣ；Ｌｙｓ２４２、Ａｓｐ２４８、およびＨｉｓ２５５）は、アクセス不能であるかまたはアクセス不良であることが見出され、ａＣが大腸菌（E.coli）細胞エンベロープ、おそらくペプチドグリカン層とのさらなる接触を形成しうることを示している。
【図５０】モデルポリアラニン鎖によるＣｓｇＧ狭窄の分子動力学シミュレーションを示す図である。ａ、ｂ、Ｃ−末端からＮ−末端方向に示す、細長いコンフォメーションのチャネルの中を貫通するポリアラニン鎖によってモデル化したＣｓｇＧ狭窄の上面図（ａ）および側面図（ｂ）。ＣｓｇＧトランスポーター内の基質の通過は、それ自身配列特異的ではない参考文献１６、２３。明確にするために、ポリアラニン鎖を、通過するポリペプチド鎖の推定の相互作用をモデル化するために使用した。モデル領域は、それぞれが４７〜５８残基を含む９個の同心円ＣｓｇＧ  Ｃ−ループで構成される。狭窄の内側に並ぶ側鎖をスティック表示で示し、それぞれ、Ｐｈｅ５１をくすんだ青色、Ａｓｎ５５（アミドクランプ）をシアン、ならびにＰｈｅ４８およびＰｈｅ５６（Φ−クランプ）を明るいおよび暗いオレンジ色で示す。Ｎ、Ｏ、およびＨ原子（ヒドロキシルまたは側鎖アミドＨ原子のみを示す）をそれぞれ、青色、赤色、および白色で示す。ポリアラニン鎖のＣ、Ｎ、Ｏ、およびＨ原子をそれぞれ、緑色、青色、赤色、および白色で示す。狭窄（１１〜１５と表示される残基）内のポリアラニン残基の１０Å内の溶媒分子（水）を赤色の点で示す。ｃ、ｂと同様に位置する、明確にするためにＣ−ループを除去した、ポリアラニン鎖のモデル溶媒和（ポリアラニン鎖全体の１０Å以内の溶媒分子を示す）。アミド−クランプおよびΦ−クランプの最高点では、ポリアラニン鎖の溶媒和は、ペプチド骨格とアミド−クランプ側鎖とをつなぐ単一の水シェルに低減される。Ｔｙｒ５１環におけるほとんどの側鎖は、ＣｓｇＧ（およびＣｓｇＧＣ１Ｓ）Ｘ線構造で観察されるその内向きの中心を向く位置と比較して溶媒に向かって回転している。モデルは、ＡＭＢＥＲ９９ＳＢ−ＩＬＤＮ５４力場を使用し、Ｃ−ループの末端残基（Ｇｌｎ４７およびＴｈｒ５８）のＣα原子の位置を制限した、ＧＲＯＭＡＣＳ参考文献５３による４０ナノ秒の全ての原子の明白な溶媒分子動力学シミュレーションの結果である。
【図５１】ＣｓｇＧホモログにおける配列の保存を示す図である。ａ、配列類似性に従って色付けし（保存スコアの低から高へ、黄色から青色に色付け）、周辺質（一番左側）、側面（左中央）、細胞外環境（右中央）、または断面側面（一番右）から見たＣｓｇＧノナマーの表面表示を示す。図は、最高の配列保存領域が、周辺質前庭の入口、狭窄ループの前庭側面、およびＴＭドメインの管腔表面にマップされることを示している。ｂ、ＣｓｇＧ様リポタンパク質の多重配列アライメント。選択される配列は、配列多様性の代表的な図を提供するために、ＣｓｇＧ様配列の系統発生樹（示していない）全体の単系統クレードから選択した。大腸菌（E.coli）のＣｓｇＧ結晶構造に基づいて、二次構造エレメントをβ−ストランドまたはα−ヘリックスに関してそれぞれ、矢印またはバーとして示す。ｃ、ｄ、二次構造表示のＣｓｇＧプロトマー（ｃ）および表面表示でのＣｓｇＧノナマーの断面側面図（ｄ）をいずれも灰色で示し、高い配列保存を有する３つの連続ブロックを赤色（ＨＣＲ１）、青色（ＨＣＲ２）および黄色（ＨＣＲ３）で示した。ＨＣＲ１およびＨＣＲ２は、狭窄ループの前庭側面を形成する。ＨＣＲ３は、周辺質前庭の入口に存在するヘリックス２に対応する。狭窄内で、Ｐｈｅ５６は１００％保存されるが、Ａｓｎ５５はＳｅｒまたはＴｈｒに、例えば水素結合ドナー／アクセプターとして作用することができる小さい極性側鎖に保存的に置換することができる。狭窄の出口での同心円の側鎖環（Ｔｙｒ５１）は、保存されない。狭窄の入口でのＰｈｅ環の存在は、ポリペプチドの捕捉および通過を触媒することが示されている炭疽菌保護抗原ＰＡ６３参考文献２０のＰｈｅ４２７環（Φ−クランプと呼ばれる）と位相的に類似である。ｔｏｘＢスーパーファミリータンパク質のＭＳＴにより、Ｐｈｅ環の最高点での保存されたモチーフＤ（Ｄ／Ｑ）（Ｆ）（Ｓ／Ｎ）Ｓが明らかとなる。これは、ｃｕｒｌｉ様トランスポーターで見られるＳ（Ｑ／Ｎ／Ｔ）（Ｆ）ＳＴモチーフと類似である。ポアコンフォメーションのＰＡ６３の原子分解構造は、まだ利用可能ではないが、利用可能な構造から、Ｐｈｅ環の後に同様に、保存された水素結合ドナー／アクセプター（Ｓｅｒ／Ａｓｎ４２８）が転位チャネルにおけるその後の同心円の環として続きうることが示唆されている（エレメントの方向は両方のトランスポーターで逆であることに注意されたい）。
【図５２】ＣｓｇＧおよびＣｓｇＧ：ＣｓｇＥポアの単一チャネル電流分析を示すグラフ図である。ａ、陰性電場電位の下では、ＣｓｇＧポアは２つのコンダクタンス状態を示す。左上および右上のパネルはそれぞれ、正常（＋５０、０、および−５０ｍＶで測定）および低コンダクタンス型（０、＋５０、および−５０ｍＶで測定）の代表的な単一チャネル電流トレースを示す。全観察時間（ｎ＝２２）の間に２つの状態の間での変換は観察されず、コンダクタンス状態が、長い寿命（数秒から数分の時間尺度）を有することを示している。左下のパネルは、＋５０および−５０ｍＶ（ｎ＝３３）で獲得したＣｓｇＧポアの正常および低コンダクタンス型の電流ヒストグラムを示す。通常および低コンダクタンスを有するＣｓｇＧポアのＩ−Ｖ曲線を右下のパネルに示す。データは、少なくとも４回の独立した記録からの平均値および標準偏差を表す。低コンダクタンス型の性質または生理的存在は不明である。ｂ、アクセサリ因子ＣｓｇＥで滴定したＣｓｇＧチャネルの電気生理学。プロットは、ＣｓｇＥ濃度の関数としての開状態、中間状態、および閉状態のチャネルの分画を示す。ＣｓｇＧの開状態および閉状態を図４５ｆに図示する。ＣｓｇＥ濃度を１０ｎＭ超に増加させると、ＣｓｇＧポアは閉鎖する。この効果は、＋５０ｍＶ（左）および−５０ｍＶ（右）で起こり、ポアの遮断がＣｓｇＥ（計算ｐＩ４．７）のＣｓｇＧポアへの電気泳動によって引き起こされる可能性を除外する。頻度の低い（，５％）中間状態は、開状態のチャネルのコンダクタンスのほぼ半分を有する。これは、ＣｓｇＥによって誘導されるＣｓｇＧチャネルの不完全な閉鎖を表しうる。あるいは、これは電解質溶液の残留ＣｓｇＧモノマーが膜に埋もれたポアに結合することによって引き起こされるＣｓｇＧダイマーの一時的な形成を表しうる。３つの状態の分画は、単一チャネル電流トレースの全ての時点のヒストグラム分析から得られた。ヒストグラムから、最大３つの状態のピーク面積が得られ、所定の状態の分画は、対応するピーク面積を、記録における他の全ての状態の合計で除することによって得られた。陰性電場電位の下では、２つの開コンダクタンス状態は、ＣｓｇＧに関する知見と同様に識別される（ａを参照されたい）。開状態のチャネルの変化形はいずれも、より高いＣｓｇＥ濃度によって遮断されることから、ｂの「開状態の」トレースは、両方のコンダクタンス型を合わせたものである。プロットのデータは、３回の独立した記録からの平均値および標準偏差を表す。ｃ、結晶構造、サイズ排除クロマトグラフィー、およびＥＭは、洗浄剤抽出ＣｓｇＧポアが、より高いタンパク質濃度で非ネイティブのテール−テールスタックダイマー（例えば、Ｄ９粒子としての２つのノナマー、図４７）を形成することを示している。これらのダイマーはまた、単一チャネル記録でも観察することができる。上のパネルは、＋５０、０および−５０ｍＶ（左から右）でスタックされたＣｓｇＧポアの単一チャネル電流トレースを示す。左下のパネルは、＋５０ｍＶおよび−５０ｍＶで記録されたダイマーＣｓｇＧポアの電流ヒストグラムを示す。＋５０ｍＶおよび−５０ｍＶでの実験的コンダクタンス＋１６．２±１．８およ���−１６．０±３．０ｐＡ（ｎ＝１５）はそれぞれ、理論的計算値２３ｐＡに近い。右下のパネルは、スタックされたＣｓｇＧポアのＩ−Ｖ曲線を示す。データは、６回の独立した記録からの平均値および標準偏差を表す。ｄ、ＣｓｇＥがスタックされたＣｓｇＧポアに結合して遮断する能力を電気生理学によって試験した。＋５０ｍＶ（上）および−５０ｍＶ（下）で１０または１００ｎＭ  ＣｓｇＥの存在下でスタックされたＣｓｇＧポアの単一チャネル電流トレースを示す。電流トレースは、そうでなければ飽和濃度のＣｓｇＥによってスタックされたＣｓｇＧダイマーのポア閉鎖が起こらないことを示している。これらの知見は、ＥＭおよび部位特異的変異誘発によって識別されるように、ＣｓｇＧ−ＣｓｇＥ接触域がヘリックス２およびＣｓｇＧ周辺質キャビティの口部分にマッピングされることと良好に一致する（図４５および図５２）。
【図５３】ＣｓｇＥオリゴマーおよびＣｓｇＧ−ＣｓｇＥ複合体を示す図である。ａ、ＣｓｇＥのサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６、１６／６００；ランニング緩衝液２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５％グリセロール）は、２つのオリゴマー状態１および２の平衡を示し、見かけの分子質量比は９．１６：１である。ピーク１のネガティブ染色ＥＭを調べたところ、ＣｓｇＥの９コピーとサイズが適合する別個のＣｓｇＥ粒子（５つの代表的なクラス平均画像を、傾斜角の増加順に挿入図に示す）が示される。ｂ、クライオ−ＥＭの上面図で観察されたＣｓｇＥオリゴマーの選択されたクラス平均画像およびその回転方向の自己相関は、Ｃ９対称性の存在を示す。ｃ、ＣｓｇＧ−ＣｓｇＥクライオ−ＥＭモデルのＦＳＣ分析。三次元再構築により、１，２２１個の粒子に対応する１２５のクラスを使用して、ＦＳＣによって０．５の相関の閾値で決定した場合に２４Åの分解能が達成された。ｄ、ＣｓｇＧ−ＣｓｇＥクライオ−ＥＭ密度とＸ線構造で観察されたＣｓｇＧノナマーの重ね合わせ。半透明密度として（左）または断面図として側面から見た重ね合わせを示す。ｅ、野生型ｃｓｇＧ（ＷＴ）で補完された大腸菌（E.coli）ＢＷ２５１４１ΔｃｓｇＧ、空のベクター（ΔｃｓｇＧ）、またはｃｓｇＧヘリックス２変異体（一文字コードで表示される１アミノ酸置換）のコンゴーレッド結合。データは、４回の生物学的反復実験の代表である。ｆ、ｃｓｇＧ（ＷＴ）で補完された大腸菌（E.coli）ＬＳＲ１２に及ぼす、または（１）ｃｓｇＥで補完されたもしくは補完されない（２）異なるヘリックス２変異を有するｃｓｇＧに及ぼす胆汁酸塩毒性の効果。細菌１０７個から開始する連続１０倍希釈液をＭｃＣｏｎｋｅｙアガープレートにスポットした。外膜におけるＣｓｇＧポアの発現によって、胆汁酸塩感受性の増加が起こるが、これはＣｓｇＥの同時発現によって遮断することができる（ｎ＝６、３回の生物学的反復実験、各２回の反復）。ｇ、分子表面表示でのＣｓｇＧのＸ線構造の断面図。コンゴーレッド結合または毒性に対して効果を示さないＣｓｇＧ変異体を青色で示し、胆汁酸塩感受性のＣｓｇＥによる救出を妨害する変異体を赤色で示す。
【図５４】ＣｓｇＧ分泌複合体の集合および基質動員を示す図である。ｃｕｒｌｉトランスポーターＣｓｇＧおよび可溶性の分泌補因子ＣｓｇＥは、２４，０００Å３の小室を格納する９：９の化学量論を有する分泌複合体を形成し、これはＣｓｇＡ基質を捕捉して、外膜（ＯＭ；本文および図４５を参照されたい）を超えてのそのエントロピー駆動性の拡散を促進すると提唱されている。理論的見地から、分泌複合体の基質動員および集合に関して３つの推定の経路（ａ〜ｃ）を想像することができる。ａ、「キャッチアンドキャップ」メカニズムは、ＣｓｇＡのａｐｏＣｓｇＧ転位チャネルに対する結合（１）を伴い、ａｐｏＣｓｇＧ転位チャネルのコンフォメーションの変化により、ＣｓｇＥ結合のための高親和性結合プラットフォームを露出する（２）。ＣｓｇＥの結合によって基質ケージのキャッピングが起こる。ＣｓｇＡが分泌されると、ＣｓｇＧは、その低親和性コンフォメーションへと戻り、新たな分泌サイクルのために分泌チャネルのＣｓｇＥの解離および放出が起こる。ｂ、「ドックアンドトラップ」メカニズムにおいて、周辺質ＣｓｇＡは、ＣｓｇＥによって最初に捕捉されて（１）、ＣｓｇＥは、ＣｓｇＧ転位ポアにドックする高親和性複合体となり（２）、分泌複合体の中にＣｓｇＡを閉じ込める。ＣｓｇＡの結合は、ＣｓｇＥオリゴマーまたはＣｓｇＥモノマーに対して直接でありえて、ＣｓｇＥモノマーはその後オリゴマー化されてＣｓｇＧに結合する。ＣｓｇＡが分泌されると、ＣｓｇＥは、その低親和性コンフォメーションへと戻り、分泌チャネルから解離する。ｃ、ＣｓｇＧおよびＣｓｇＥは、構成的複合体を形成し、ＣｓｇＥコンフォメーション動力学は、ＣｓｇＡの動員および分泌の際に開形態と閉形態との間でサイクルする。現在公表されているまたは利用可能なデータでは、これらの推定の動員モードもしくはその派生モードを識別することができないか、またはそれらの１つを提唱することができない。
【図５５】ＣｓｇＧＣ１ＳおよびＣｓｇＧのデータ収集統計値および電子密度マップを示す図である。ａ、ＣｓｇＧＣ１ＳおよびＣｓｇＧのＸ線構造のデータ収集統計値。ｂ、ＮＣＳ平均および密度修正実験的ＳＡＤ位相を使用して計算し、１．５σの等高線で表示したＣｓｇＧＣ１Ｓに関する２．８Åでの電子密度マップ。マップは、チャネル構築領域（ＣＬ；単一プロトマーを表示する）を示し、最終的な精密化モデルに重ね合わせる。ｃ、ＮＣＳ平均および密度修正分子置換位相から計算した（ＴＭループはインプットモデルに存在しなかった）ＣｓｇＧ  ＴＭドメイン領域における電子密度マップ（逆格子ベクトルａ＊、ｂ＊、およびｃ＊に沿ってそれぞれ、分解能３．６、３．７、および３．８Å）；Ｂ因子を−２０Å２で鮮明化して１．０σの等高線で表示した。図は、最終の精密化モデルと重ね合わせた１つのＣｓｇＧプロトマーのＴＭ１（Ｌｙｓ１３５〜Ｌｅｕ１５４）およびＴＭ２（Ｌｅｕ１８２〜Ａｓｎ２０９）領域を示す。
【図５６】一本鎖ＤＮＡオーバーハングを有するＤＮＡヘアピンと相互作用するＣｓｇＧ  ＷＴタンパク質の単一チャネル電流トレース（左）とその拡大領域（右）を示すグラフ図である。トレースは、＋５０ｍＶまたは−５０ｍＶの間隔（矢印で示す）で測定した電位に応答して変化する電流を示す。最後の＋５０ｍＶセグメントでの下向き電流の遮断は、ポア管腔内のヘアピン二重鎖のロッジングと、内部ポア構築への一本鎖ヘアピン末端の貫通が同時に起こり、ほぼ完全な電流の遮断が起こることを表している。電場を−５０ｍＶに反転させると、ポアの電気泳動の遮断解除が起こる。新たな＋５０ｍＶエピソードにより、再度ＤＮＡヘアピンロッジング／貫通およびポア遮断が起こる。＋５０ｍＶセグメント上では、ヘアピン構造のアンフォールディングによって、電流遮断の逆転によって示される電流遮断の終了が起こりうる。配列３’  ＧＣＧＧＧＧＡ  ＧＣＧＴＡＴＴ  ＡＧＡＧＴＴＧ  ＧＡＴＣＧＧＡＴＧＣＡ  ＧＣＴＧＧＣＴＡＣＴＧＡＣＧＴＣＡ  ＴＧＡＣＧＴＣＡＧＴＡＧＣＣＡＧＣＡＴＧＣＡＴＣＣＧＡＴＣ−５’を有するヘアピンを、最終濃度１０ｎＭで小室のシス側に添加した。
【図５７】ＰＹＰＡ配列（残基５０〜５３）の狭窄残基Ｙ５１がＧＧに変異している変異体ＣｓｇＧポアであるＣｓｇＧ−ΔＰＹＰＡの精製およびチャネル特性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
配列表の説明
配列番号１は、シグナル配列を含む野生型大腸菌（E. coli）ＣｓｇＧのアミノ酸配列（Ｕｎｉｐｒｏｔ寄託番号Ｐ０ＡＥＡ２）を示す。
【００３３】
配列番号２は、シグナル配列を含む野生型大腸菌（E. coli）ＣｓｇＧのポリヌクレオチド配列（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：１２９３２５３８）を示す。
【００３４】
配列番号３は、配列番号２の５３〜７７位の野生型大腸菌（E. coli）ＣｓｇＧのアミノ酸配列を示す。これは、成熟野生型大腸菌（E. coli）ＣｓｇＧモノマー（すなわち、シグナル配列を欠いている）の３８〜６３位のアミノ酸配列に対応する。
【００３５】
配列番号４〜３８８は、シグナル配列を欠いているＣｓｇＧの修飾モノマーの３８〜６３位のアミノ酸配列を示す。
【００３６】
配列番号３８９は、大腸菌Ｋ−１２株ＭＣ４１００亜株（Escherchia coli Str. K-12 substr. MC4100）からの野生型ＣｓｇＧモノマーをコードする、コドン最適化ポリヌクレオチド配列を示す。このモノマーは、シグナル配列を欠いている。
【００３７】
配列番号３９０は、大腸菌Ｋ−１２株ＭＣ４１００亜株（Escherchia coli Str. K-12 substr. MC4100）からの野生型ＣｓｇＧモノマーの成熟形態のアミノ酸配列を示す。このモノマーは、シグナル配列を欠いている。このＣｓｇＧに使用される略語＝ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ。
【００３８】
配列番号３９１は、ＹＰ＿００１４５３５９４．１：仮想タンパク質ＣＫＯ＿０２０３２［シトロバクター・コセリ（[Citrobacter koseri）ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−８９５］の１〜２４８のアミノ酸配列を示し、これは配列番号３９０と９９％同一である。
【００３９】
配列番号３９２は、ＷＰ＿００１７８７１２８．１：部分的、ｃｕｒｌｉ産生集合体（curli production assembly）／輸送成分ＣｓｇＧ［サルモネラ菌（Salmonella enterica）］の１６〜２３８のアミノ酸配列を示し、これは配列番号３９０と９８％同一である。
【００４０】
配列番号３９３は、ＫＥＹ４４９７８．１｜：ｃｕｒｌｉ産生集合体／輸送タンパク質ＣｓｇＧ［シトロバクター・アマロナティカス（Citrobacter amalonaticus）］の１６〜２７７のアミノ酸配列を示し、これは配列番号３９０と９８％同一である。
【００４１】
配列番号３９４は、ＹＰ＿００３３６４６９９．１：ｃｕｒｌｉ産生集合体／輸送成分［シトロバクター・ローデンチウム（Citrobacter rodentium）ＩＣＣ１６８］の１６〜２７７のアミノ酸配列を示し、これは配列番号３９０と９７％同一である。
【００４２】
配列番号３９５は、ＹＰ＿００４８２８０９９．１：ｃｕｒｌｉ産生集合体／輸送成分［エンテロバクター・アズブリア（Enterobacter asburiae）ＬＦ７ａ］の１６〜２７７のアミノ酸配列を示し、これは配列番号３９０と９４％同一である。
【００４３】
配列番号３９６は、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を示す。
【００４４】
配列番号３９７は、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を示す。
【００４５】
配列番号３９８は、大腸菌（E. coli）からのｓｂｃＢ遺伝子に由来するコドン最適化ポリヌクレオチド配列を示す。これは、大腸菌（E. coli）からのエキソヌクレアーゼＩ酵素（ＥｃｏＥｘｏ  Ｉ）をコードする。
【００４６】
配列番号３９９は、大腸菌（E. coli）からのエキソヌクレアーゼＩ酵素（ＥｃｏＥｘｏ  Ｉ）のアミノ酸配列を示す。
【００４７】
配列番号４００は、大腸菌（E. coli）からのｘｔｈＡ遺伝子に由来するコドン最適化ポリヌクレオチド配列を示す。これは、大腸菌（E. coli）からのエキソヌクレアーゼＩＩＩ酵素をコードする。
【００４８】
配列番号４０１は、大腸菌（E. coli）からのエキソヌクレアーゼＩＩＩ酵素のアミノ酸配列を示す。この酵素は、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の一方の鎖からの５’一リン酸ヌクレオシドの３’−５’方向での分配性消化を行う。鎖上の酵素開始は、おおよそ４ヌクレオチドの５’オーバーハングを必要とする。
【００４９】
配列番号４０２は、高度好熱菌（T. thermophilus）からのｒｅｃＪ遺伝子に由来するコドン最適化ポリヌクレオチド配列を示す。これは、高度好熱菌（T. thermophilus）からのＲｅｃＪ酵素（ＴｔｈＲｅｃＪ−ｃｄ）をコードする。
【００５０】
配列番号４０３は、高度好熱菌（T. thermophilus）からのＲｅｃＪ酵素（ＴｔｈＲｅｃＪ−ｃｄ）のアミノ酸配列を示す。この酵素は、ｓｓＤＮＡからの５’一リン酸ヌクレオシドの５’−３’方向での前進性消化を行う。鎖上の酵素開始は、少なくとも４ヌクレオチドを必要とする。
【００５１】
配列番号４０４は、バクテリオファージラムダエキソ（ｒｅｄＸ）遺伝子に由来するコドン最適化ポリヌクレオチド配列を示す。これは、バクテリオファージラムダエキソヌクレアーゼをコードする。
【００５２】
配列番号４０５は、バクテリオファージラムダエキソヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。この配列は、集合してトリマーを構築する３つの同一のサブユニットの１つである。この酵素は、ｄｓＤＮＡの一方の鎖からのヌクレオチドの５’−３’方向での高前進性消化を行う（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｎｅｂｅｃｏｍｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｐｒｏｄｕｃｔＭ０２６２．ａｓｐ）。鎖上の酵素開始は、５’リン酸を有するおおよそ４ヌクレオチドの５’オーバーハングを優先的に必要とする。
【００５３】
配列番号４０６は、Ｈｅｌ３０８  Ｍｂｕのアミノ酸配列を示す。
【００５４】
配列番号４０７は、Ｈｅｌ３０８  Ｃｓｙのアミノ酸配列を示す。
【００５５】
配列番号４０８は、Ｈｅｌ３０８  Ｔｇａのアミノ酸配列を示す。
【００５６】
配列番号４０９は、Ｈｅｌ３０８  Ｍｈｕのアミノ酸配列を示す。
【００５７】
配列番号４１０は、Ｔｒａｌ  Ｅｃｏのアミノ酸配列を示す。
【００５８】
配列番号４１１は、ＸＰＤ  Ｍｂｕのアミノ酸配列を示す。
【００５９】
配列番号４１２は、Ｄｄａ  １９９３のアミノ酸配列を示す。
【００６０】
配列番号４１３は、Ｔｒｗｃ  Ｃｂａのアミノ酸配列を示す。
【００６１】
配列番号４１４は、ＷＰ＿００６８１９４１８．１：輸送体［ヨケネラ・レンゲスブルゲイ（Yokenella regensburgei）］の１９〜２８０のアミノ酸配列を示し、これは配列番号３９０と９１％同一である。
【００６２】
配列番号４１５は、ＷＰ＿０２４５５６６５４．１：ｃｕｒｌｉ産生集合体／輸送タンパク質ＣｓｇＧ［クロノバクター・プルベリス（Cronobacter pulveris）］の１６〜２７７のアミノ酸配列を示し、これは配列番号３９０と８９％同一である。
【００６３】
配列番号４１６は、ＹＰ＿００５４００９１６．１：ｃｕｒｌｉ産生集合体／輸送タンパク質ＣｓｇＧ［ラーネラ・アクアティリス（Rahnella aquatilis）ＨＸ２］の１６〜２７７のアミノ酸配列を示し、これは配列番号３９０と８４％同一である。
【００６４】
配列番号４１７は、ＫＦＣ９９２９７．１：ＣｓｇＧファミリーｃｕｒｌｉ産生集合体／輸送成分［クライベラ・アスコルバータ（Kluyvera ascorbata）ＡＴＣＣ３３４３３］の２０〜２７８のアミノ酸配列を示し、これは配列番号３９０と８２％同一である。
【００６５】
配列番号４１８は、ＫＦＣ８６７１６．１｜：ＣｓｇＧファミリーｃｕｒｌｉ産生集合体／輸送成分［ハフニア・アルベイ（Hafnia alvei）ＡＴＣＣ１３３３７］の１６〜２７４のアミノ酸配列を示し、これは配列番号３９０と８１％同一である。
【００６６】
配列番号４１９は、ＹＰ＿００７３４０８４５．１｜：ｃｕｒｌｉポリマーの形成に関与する特徴づけされていないタンパク質［腸内細菌科（Enterobacteriaceae）細菌株ＦＧＩ  ５７］の１６〜２７０のアミノ酸配列を示し、これは配列番号３９０と７６％同一である。
【００６７】
配列番号４２０は、ＷＰ＿０１０８６１７４０．１：ｃｕｒｌｉ産生集合体／輸送タンパク質ＣｓｇＧ［プレジオモナス・シゲロイデス（Plesiomonas shigelloides）］の１７〜２７４のアミノ酸配列を示し、これは、配列番号３９０と７０％同一である。
【００６８】
配列番号４２１は、ＹＰ＿２０５７８８．１：ｃｕｒｌｉ産生集合体／輸送外膜リポタンパク質成分ＣｓｇＧ［ビブリオ・フィシェリ（Vibrio fischeri）ＥＳ１１４］の２３〜２７０のアミノ酸配列を示し、これは、配列番号３９０と６０％同一である。
【００６９】
配列番号４２２は、ＷＰ＿０１７０２３４７９．１：ｃｕｒｌｉ産生集合体タンパク質ＣｓｇＧ［アリイビブリオ・ロゲイ（Aliivibrio logei）］の２３〜２７０のアミノ酸配列を示し、これは、配列番号３９０と５９％同一である。
【００７０】
配列番号４２３は、ＷＰ＿００７４７０３９８．１：Ｃｕｒｌｉ産生集合体／輸送成分ＣｓｇＧ［フォトバクテリウム属種（Photobacterium sp.）ＡＫ１５］の２２〜２７５のアミノ酸配列を示し、これは、配列番号３９０と５７％同一である。
【００７１】
配列番号４２４は、ＷＰ＿０２１２３１６３８．１：ｃｕｒｌｉ産生集合体タンパク質ＣｓｇＧ［エロモナス・ベロニ（Aeromonas veronii）］の１７〜２７７のアミノ酸配列を示し、これは、配列番号３９０と５６％同一である。
【００７２】
配列番号４２５は、ＷＰ＿０３３５３８２６７．１：ｃｕｒｌｉ産生集合体／輸送タンパク質ＣｓｇＧ［シュワネラ属種（Shewanella sp.）ＥＣＳＭＢ１４１０１］の２７〜２６５のアミノ酸配列を示し、これは、配列番号３９０と５６％同一である。
【００７３】
配列番号４２６は、ＷＰ＿００３２４７９７２．１：ｃｕｒｌｉ産生集合体タンパク質ＣｓｇＧ［プチダ菌（Pseudomonas putida）］の３０〜２６２のアミノ酸配列を示し、これは、配列番号３９０と５４％同一である。
【００７４】
配列番号４２７は、ＹＰ＿００３５５７４３８．１：ｃｕｒｌｉ産生集合体／輸送成分ＣｓｇＧ［シュワネラ・ビオラセア（Shewanella violacea）ＤＳＳ１２］の１〜２３４のアミノ酸配列を示し、これは、配列番号３９０と５３％同一である。
【００７５】
配列番号４２８は、ＷＰ＿０２７８５９０６６．１：ｃｕｒｌｉ産生集合体／輸送タンパク質ＣｓｇＧ［マリノバクテリウム・ジャナスキイ（Marinobacterium jannaschii）］の３６〜２８０のアミノ酸配列を示し、これは、配列番号３９０と５３％同一である。
【００７６】
配列番号４２９は、ＣＥＪ７０２２２．１：Ｃｕｒｌｉ産生集合体／輸送成分ＣｓｇＧ［クリセオバクテリウム・オラニメンセ（Chryseobacterium oranimense）Ｇ３１１］の２９〜２６２のアミノ酸配列を示し、これは、配列番号３９０と５０％同一である。
【００７７】
配列番号４３０は、実施例１８で使用するポリヌクレオチド配列を示す。
【００７８】
配列番号４３１は、実施例１８で使用するポリヌクレオチド配列を示す。
【００７９】
配列番号４３２は、実施例１８で使用するポリヌクレオチド配列を示す。
【００８０】
配列番号４３３は、実施例１８で使用するポリヌクレオチド配列を示す。
【００８１】
配列番号４３４は、実施例１８で使用するポリヌクレオチド配列を示す。配列番号４３４の３’末端に結合されているのは、６つのｉＳｐ１８スペーサー（反対側の末端が２つのチミンに結合されている）および３’コレステロールＴＥＧである。
【００８２】
配列番号４３５は、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）のアミノ酸配列を示す。
【００８３】
配列番号４３６は、Ｐｒｏのアミノ酸配列を示す。
【００８４】
配列番号４３７〜４４０は、実施例１からのプライマーを示す。
【００８５】
配列番号４４１は、実施例２１からのヘアピンを示す。
【００８６】
配列番号４４２〜４４８は、図４からの配列を示す。
【００８７】
配列番号４４９および４５０は、図４３からの配列を示す。
【００８８】
発明の詳細な説明
別段の指示がない限り、本発明の実施は、当業者の能力の範囲内である化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術および化学的方法の従来の技法を利用する。そのような技法は、文献、例えば、M. R. Green, J. Sambrook, 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Fourth Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY；Ausubel, F. M. et al., (1995 and periodic supplements、Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N. Y.)；B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons；J. M. Polak and James O'D. McGee, 1990, In Situ Hybridisation: Principles and Practice, Oxford University Press；M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press；およびD. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Pressでも説明されている。これらの一般テキストの各々が参照により本明細書に組み入れられている。
【００８９】
本発明を説明する前に、本発明の理解を助けることになる多数の定義を提供する。本明細書において言及するすべての参考文献は、それら全体が参照により本明細書に組み入れられている。別段の定義がない限り、本明細書で用いるすべての専門および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。
【００９０】
本明細書で使用する場合、用語「〜を含む（comprising）」は、言及する要素のいずれかを必ず含み（include）、場合により、他の要素も含む（include）ことがあることを意味する。「〜から本質的になる」は、言及するあらゆる要素を必ず含み、列挙する要素の基本的および新規の特徴に実質的な影響を及ぼすことになる要素を除外し、場合により、他の要素を含むことがあることを意味する。「〜からなる」は、列挙するもの以外のすべての要素を除外することを意味する。これらの用語の各々によって定義される実施形態は、本発明の範囲内である。
【００９１】
本明細書で使用する場合の用語「核酸」は、各ヌクレオチドの３’および５’末端がホスホジエステル結合によって連結されている、ヌクレオチドの一本鎖または二本鎖共有結合配列である。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド塩基で構成されていることもあり、またはリボヌクレオチド塩基で構成されていることもある。核酸としてはＤＮＡおよびＲＮＡを挙げることができる。核酸は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成的に製造されることもあり、または天然源から単離されることもある。核酸としては、修飾ＤＮＡまたはＲＮＡ、例えば、メチル化されたＤＮＡもしくはＲＮＡ、または翻訳後修飾、例えば、７−メチルグアノシンでの５’キャッピング、切断およびポリアデニル化などの３’プロセシング、ならびにスプライシングに付されたＲＮＡをさらに挙げることができる。核酸としては、合成核酸（ＸＮＡ）、例えば、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）およびペプチド核酸（ＰＮＡ）も挙げることができる。本明細書では「ポリヌクレオチド」とも呼ばれる核酸のサイズは、通常は、二本鎖ポリヌクレオチドについては塩基対（ｂｐ）の数として、または一本鎖ポリヌクレオチドの場合はヌクレオチド（ｎｔ）の数として表される。１０００ｂｐまたはｎｔは、キロベース（ｋｂ）に等しい。長さ約４０ヌクレオチド未満のポリヌクレオチドは、通常は「オリゴヌクレオチド」と呼ばれ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるものなどのＤＮＡの操作に使用するためのプライマーを含むこともある。
【００９２】
本発明に関して、用語「アミノ酸」は、その最も広い意味で使用しており、天然に存在するＬ  α−アミノ鎖または残基を含むことを意図したものである。天然に存在するアミノ酸について一般に使用される１および３文字略号を本明細書でも使用する：Ａ＝Ａｌａ、Ｃ＝Ｃｙｓ、Ｄ＝Ａｓｐ、Ｅ＝Ｇｌｕ、Ｆ＝Ｐｈｅ、Ｇ＝Ｇｌｙ、Ｈ＝Ｈｉｓ、ｌ＝ｌｌｅ、Ｋ＝Ｌｙｓ、Ｌ＝Ｌｅｕ、Ｍ＝Ｍｅｔ、Ｎ＝Ａｓｎ、Ｐ＝Ｐｒｏ、Ｑ＝Ｇｌｎ、Ｒ＝Ａｒｇ、Ｓ＝Ｓｅｒ、Ｔ＝Ｔｈｒ、Ｖ＝Ｖａｌ、Ｗ＝Ｔｒｐ、およびＹ＝Ｔｙｒ（Lehninger, A. L, (1975) Biochemistry, 2d ed., pp. 71-92, Worth Publishers, New York）。一般用語「アミノ酸」は、さらに、Ｄ−アミノ酸、レトロ−インベルソアミノ酸はもちろん、化学的に修飾されたアミノ酸、例えばアミノ酸類似体、タンパク質に通常は組み込まれていない天然に存在するアミノ酸、例えばノルロイシン、およびアミノ酸に特有であることが当技術分野において公知の特性を有する化学的に合成された化合物、例えばβ−アミノ酸も含む。例えば、ペプチド化合物に対する天然ＰｈｅまたはＰｒｏと同じ配座制限を可能にする、フェニルアラニンまたはプロリンの類似体または模倣物は、アミノ酸の定義に含まれる。そのような類似体および模倣物を本明細書ではそれぞれのアミノ酸の「機能的等価物」と呼ぶ。アミノ酸の他の例は、Roberts and Vellaccio, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Gross and Meiehofer, eds., Vol. 5 p. 341, Academic Press, Inc., N. Y. 1983に収載されており、この参考文献は、参照により本明細書に組み入れられている。
【００９３】
「ポリペプチド」は、天然に産生されるか、合成手段によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生されるかを問わず、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基のポリマーである。長さ約１２アミノ酸残基未満のポリペプチドは、通常は「ペプチド」と呼ばれ、長さ約１２〜約３０アミノ酸残基のものは、「オリゴペプチド」と呼ばれることがある。用語「ポリペプチド」は、本明細書で使用する場合、天然に存在するポリペプチド、前駆形態またはプロタンパク質の生成物を示す。ポリペプチドは、変異または翻訳後修飾プロセスを経ることもでき、そのようなプロセスとしては、これらに限定されるものではないが、グリコシル化、タンパク質切断、脂質化、シグナルペプチド切断、プロペプチド切断、リン酸化などを挙げることができる。用語「タンパク質」は、１本または複数のポリペプチド鎖を含む高分子を指すために本明細書では使用する。
【００９４】
「生体ポア」は、膜の一方の側から他方への分子およびイオンの移行を可能にするチャネルまたは穴を規定する膜貫通タンパク質構造である。このポアを通るイオン化学種の移行は、そのポアの両側に印加される電気的電位の差によって駆動されうる。「ナノポア」は、分子またはイオンが通過するチャネルの最小直径がナノメートル（１０−９メートル）程度である生体ポアである。
【００９５】
本発明のすべての態様および実施形態について、ポリヌクレオチドは、配列番号２で示される野生型大腸菌（E. coli）ＣｓｇＧとの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％完全配列同一性を有するポリヌクレオチドを含むことができる。同様に、ポリペプチドは、配列番号１で示される野生型大腸菌（E. coli）ＣｓｇＧとの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％完全配列同一性を有するポリペプチドを含むことができる。ポリペプチドは、ＣｓｇＧ様タンパク質の特徴であるＰＦＡＭドメインＰＦ０３７８３を含有するポリペプチドを含むことができる。現在公知のＣｓｇＧ相同体およびＣｓｇＧ構造のリストは、ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｘｆａｍ．Ｏｒｇ／／ｆａｍｉｌｙ／ＰＦ０３７８３で見つけることができる。例えば、配列同一性は、完全長ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの断片または一部分との配列同一性であることもある。したがって、配列は、本発明の配列との５０％全配列同一性しか有さないことがあっても、特定の領域、ドメインまたはサブユニットは、本発明の配列と８０％、９０％、または９９％ほどもの配列同一性を共有することがありうる。本発明によると、配列番号２の核酸配列との相同性は、単に配列同一性に限定されない。多くの核酸配列は、一見低い配列同一性を有するにもかかわらず互いに生物学的に有意な相同性を示すことができる。本発明では、相同核酸配列は、低ストリンジェンシー条件下で互いにハイブリダイズすることになるものであると考える（M. R. Green, J. Sambrook, 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Fourth Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY）。
【００９６】
用語「ベクター」は、適切なサイズの別の核酸（通常はＤＮＡ）配列断片を組み込むことができる、直鎖状または環状であるＤＮＡ分子を示すように使用される。そのようなＤＮＡ断片は、そのＤＮＡ配列断片によってコードされた遺伝子の転写をもたらす、さらなるセグメントを含むことができる。さらなるセグメントは、プロモーター、転写ターミネーター、エンハンサー、配列内リボソーム進入部位、非翻訳領域、ポリアデニル化シグナル、選択マーカー、複製起点などを含むことができるが、これらに限定されない。原核生物宿主のための様々な好適なプロモーター（例えば、大腸菌（E. coli）のための、［ベータ］−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ｌａｃ、ｔａｃ、Ｔ３、Ｔ７プロモーター）および真核生物宿主のための様々な好適なプロモーター（例えば、シミアンウイルス４０初期または後期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス末端反復配列プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ＥＧ−１ａプロモーター）が利用可能である。発現ベクターは、プラスミド、コスミド、ウイルスベクターおよび酵母人工染色体に由来することが多く、ベクターは、いくつかの源からのＤＮＡ配列を含有する組換え分子であることが多い。本発明の特異的実施形態は、本明細書に記載の野生型または修飾ＣｓｇＧポリペプチドをコードする発現ベクターを提供する。用語「作動可能に連結された」は、ＤＮＡ配列、例えば、上述のものなどの核酸ベクターにおけるＤＮＡ配列に適用される場合、該配列が、それらの所期の目的を果たす（すなわち、プロモーター配列が、関連コード配列を通って終結配列のところまで進む転写を開始させる）ために、協同的に機能するように配置されていることを示す。
【００９７】
生体ポアの膜貫通タンパク質構造は、実際はモノマー状またはオリゴマー状でありうる。通常は、ポアは、複数のポリペプチドサブユニットであって、中心軸の周りに配置されており、その結果、ナノポア残基が存在する膜に略垂直に伸びる、タンパク質で裏打ちされたチャネルを形成している、ポリペプチドサブユニットを含む。ポリペプチドサブユニットの数は限定されない。通常は、サブユニットの数は５から３０まであり、好適には、サブユニットの数は６〜１０である。あるいは、サブユニットの数は、パーフリンゴリジンまたは関連大型膜ポアの場合のように、定義されない。タンパク質で裏打ちさたチャネルを形成する、ナノポア内のタンパク質サブユニットの部分は、１つまたは複数の膜貫通β−バレル、および／またはα−ヘリックス部分を含むことがある、二次構造を通常は含む。
【００９８】
開示する生成物および方法の様々な適用が当技術分野における具体的な要求に合わせて調整されうることは、理解されるはずである。本明細書において使用する用語法が本発明の特定の実施形態の説明を目的にしたものに過ぎず、限定を意図したものでないことも、理解されるはずである。
【００９９】
加えて、本明細書および添付の特許請求の範囲において使用する場合、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」および「その（the）」は、文脈による別段の明白な指図がない限り、複数の言及対象も含む。したがって、例えば、「ポリヌクレオチド（a polynucleotide）」への言及は、２つ以上のポリヌクレオチドを含み、「ポリヌクレオチド結合タンパク質（a polynucleotide binding protein）」への言及は、２つ以上のそのようなタンパク質を含み、「ヘリカーゼ（a helicase）」への言及は、２つ以上のヘリカーゼを含み、「モノマー（a monomer）」への言及は、２つ以上のモノマーを含み、「ポア（a pore）」への言及は、２つ以上のポアを含むなど。
【０１００】
上文または下文を問わず、本明細書の中で引用するすべての出版物、特許および特許出願は、それら全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０１０１】
本発明は、一部は、細菌アミロイド分泌チャネル（ＣｓｇＧ）、その製造方法、および核酸シークエンシング用途および分子センシングにおけるその使用に関する。
【０１０２】
ＣｓｇＧは、大腸菌（E. coli）の外膜に存在する膜リポタンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔ寄託番号Ｐ０ＡＥＡ２；Ｇｅｎｅ  ＩＤ：１２９３２５３８）である。この外側脂質膜の中で、ＣｓｇＧは、９つのＣｓｇＧモノマーサブユニットのオリゴマー複合体を含むナノポアを形成する。ＩＩ型（リポタンパク質）シグナル配列のために、ＣｓｇＧタンパク質前駆体は、ＳＥＣトランスロコンを介して移行され、その後、成熟ＣｓｇＧ（すなわち、ＩＩ型シグナル配列が切断されたＣｓｇＧ）のＮ末端Ｃｙｓ残基においてトリアセチル化される。トリアセチル化された、または「脂質化された」ＣｓｇＧは、グラム陰性宿主の外膜に輸送され、そこでノナマーポアとしてその二重層に入る。脂質化されていない形態のＣｓｇＧ、例えばＣｓｇＧＣ１Ｓ、は、プレポア立体構造で可溶性タンパク質としてペリプラズムに存在する（図４２）。
【０１０３】
野生型ＣｓｇＧナノポアのＸ線構造（Goyal et al., Nature, 2014, 516(7530), 250-3）は、それが１２０Åの幅および８５Åの高さを有することを示す（本明細書では以降、ナノポアの「幅」という用語は、膜表面と平行のその寸法に関するものとし、ナノポアの「高さ」という用語は、膜に対して垂直なその寸法に関するものとする）。ＣｓｇＧポア複合体は、３６本鎖β−バレルによって膜を貫通して内径４０Åのチャネルをもたらす（図１）。ＣｓｇＧチャネルの集合モノマー各々が、保存された１２残基ループ（Ｃループ、「ＣＬ」、図２）を有し、このループが協同してチャネル内におおよそ９．０Åの直径への狭窄を作り出す（図１および２）。野生型ＣｓｇＧナノポアの狭窄は、ＣｓｇＧオリゴマー中に存在する各々のＣｓｇＧモノマーのアミノ酸残基Ｔｙｒ５１、Ａｓｎ５５およびＰｈｅ５６の側鎖によって形成される３つの積み重なった同心環で作られる（図３）。残基のこのナンバリングは、Ｎ末端のネイティブ１５アミノの酸シグナル配列を欠いている成熟タンパク質に基づく。したがって、成熟タンパク質は、配列番号１の残基１６〜２７７に対応する。Ｔｙｒ５１は、配列番号１の６６位にあり、Ａｓｎは、配列番号１の７０位にあり、Ｐｈｅ５６は、配列番号１の７１位にある。
【０１０４】
狭窄は、イオンおよび他の分子のＣｓｇＧチャネル通過を制限するように作用する。平面リン脂質二重層内に再構成されたＣｓｇＧの単一チャネル電流記録は、標準電解質条件および＋５０ｍＶまたは−５０ｍＶの電位を使用して、それぞれ、４３．１±４．５ｐＡ（ｎ＝３３）または−４５．１±４．０ｐＡ（ｎ＝１３）の定常電流となった（図５）。
【０１０５】
ＣｓｇＧチャネルを通る電流の流れは、化学量論量のペリプラズム因子ＣｓｇＥ（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号ＰＯＡＥ９５）の付加によって有効に遮断することができる（実施例１０〜１２）。理論によって拘束されることを望むものではないが、電流の痕跡は、ＣｓｇＥがＣｓｇＧポアと複合体を形成してチャネルの一方の末端をキャップするように作用する機序を強く示唆する。ＣｓｇＧチャネルを通るイオンの流れの有意な低減を、標準単一チャネル記録技術を使用して測定することができる（実施例１２および１３、図６）。本発明者らは、電流の流れについての測定パラメータ（最大電流、および電流変動をモニターする能力）が、ナノポアを本発明の一実施形態による核酸シークエンシングおよび分子センシングでの使用に好適なものにすることを見出した。
【０１０６】
したがって、本発明は、一部は、ナノポアを通って流れる電流の電気的測定値の変動に基づく核酸シークエンシングの方法およびそのような核酸シークエンシングにおけるＣｓｇＧナノポアタンパク質複合体の使用に関する。
【０１０７】
核酸は、ナノポアシークエンシングに特に好適である。ＤＮＡおよびＲＮＡ中に天然に存在する核酸塩基を、それらの物理的サイズによって区別することができる。核酸分子または個々の塩基がナノポアのチャネルを通過すると、それらの塩基間のサイズ差に起因して、チャネルを通るイオン流の直接相関する低減が生ずる。イオン流の変動を記録することができる。イオン流変動を記録する好適な電気的測定技術は、例えば、国際公開第２０００／２８３１２号パンフレットおよびD. Stoddart et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 2010, 106, pp 7702-7（単一チャネル記録機器）に、ならびに例えば国際公開第２００９／０７７７３４号パンフレット（多チャネル記録技術）に記載されている。適切な較正により、イオン流の特徴的低減を使用して、チャネルを横断する特定のヌクレオチドおよび関連塩基をリアルタイムで同定することができる。
【０１０８】
膜貫通チャネルの最も狭い狭窄のサイズは、概して、核酸シークエンシング用途に対するナノポアの適合性を判定する上で重要な因子である。狭窄が小さすぎると、シークエンシングされる分子は通過できないことになる。しかし、チャネルを通るイオン流に対する最大効果を達成するには、その最も狭い位置で（すなわち、狭窄箇所で）チャネルが大きすぎてはならない。理想的には、いずれの狭窄も直径が通過する塩基のサイズに可能な限り近くあるべきである。核酸および核酸塩基のシークエンシングに好適な狭窄の直径は、ナノメートル範囲（１０−９メートル範囲）である。好適には、直径は、ほぼ０．５〜１．５ｎｍであるべきであり、通常は、直径は、ほぼ０．７〜１．２ｎｍである。野生型大腸菌（E. coli）ＣｓｇＧ内の狭窄は、おおよそ９Å（０．９ｎｍ）の直径を有する。本発明者らは、ＣｓｇＧチャネル内の狭窄のサイズおよび立体配置が核酸シークエンシングに好適であると演繹した。
【０１０９】
核酸シークエンシングに関する用途のためのＣｓｇＧナノポアは、野生型形態で使用されることもあり、または使用中のナノポアの所望の特性をさらに向上させるように、例えば特定のアミノ酸残基の定方向突然変異誘発によって、さらに修飾されることもある。例えば、本発明の実施形態では、変異は、チャネル内の狭窄の数、サイズ、形状、配置または配向を変更することを企図したものである。修飾変異体ＣｓｇＧナノポア複合体は、ポリペプチド配列内の特異的標的アミノ酸残基の挿入、置換および／または欠失をもたらす公知遺伝子工学技術によって調製することができる。オリゴマーＣｓｇＧナノポアの場合、変異をモノマーのポリペプチドサブユニット各々において生じさることもあり、またはモノマーのいずれか１つにおいて生じさせることもあり、またはモノマーのすべてにおいて生じさせることもある。好適には、本発明の一実施形態では、記載の変異をオリゴマータンパク質構造内のモノマーのポリペプチドすべてに生じさせる。
【０１１０】
本発明の実施形態によると、ポア内のチャネル狭窄数が低減されている修飾変異体ＣｓｇＧナノポアを提供する。
【０１１１】
野生型大腸菌（E. coli）ＣｓｇＧポアは、２カ所のチャネル狭窄を含む（図１を参照されたい）。これらは、５４位からの５３位への追加のアミノ酸を含むより広い構造の一部としての（ｉ）アミノ酸残基Ｐｈｅ５６およびＡｓｎ５５と（ｉｉ）アミノ酸残基Ｔｙｒ５１、ならびにＣループモチーフによって形成される（図２および３）。
【０１１２】
典型的ナノポア核酸シークエンシングでは、目的の核酸配列の個々のヌクレオチドがナノポアのチャネルを逐次的に通過すると、ヌクレオチドによるチャネルの部分的閉塞のため、開口チャネルイオン流が低減される。上に記載した好適な記録技術を使用してイオン流のこの低減が測定される。イオン流の低減を、チャネルを通る既知ヌクレオチドについて測定されるイオン流の低減に対応させてもよく、これは、結果的に、どのヌクレオチドがチャネルを通過しているのかを判定する手段、したがって、逐次的に行った場合にはナノポアを通過する核酸のヌクレオチド配列を判定する方法となる。個々のヌクレオチドの正確な判定のために、チャネルを通るイオン流の低減を、単一の狭窄（すなわち「読み取りヘッド」）を通過する個々のヌクレオチドのサイズに直接相関させる必要があることが一般的になっている。ポアを例えば関連ポリメラーゼの作用によって「通り抜け」させるインタクト核酸ポリマーに関してシークエンシングを行うことができるということは理解されるであろう。あるいは、ポアに近接している標的核酸から逐次的に除去されたヌクレオチド三リン酸塩基の通過によって配列を判定することができる（例えば国際公開２０１４／１８７９２４パンフレットを参照されたい）。
【０１１３】
２カ所以上の狭窄が存在し、相互に隔たっている場合、各狭窄は相互作用することがあり、または核酸鎖内の別々のヌクレオチドを同時に「読み取る」ことがある。この状況で、チャネルを通るイオン流の低減は、ヌクレオチドを含有するすべての狭窄箇所の流れの総合制限の結果である。したがって、場合によっては、二重狭窄が１つの複合電流シグナルをもたらすこともある。ある特定の状況では、１カ所の狭窄、すなわち１つの「読み取りヘッド」、の電流読み出しを、２つのそのような読み取りヘッドが存在する場合、個別に判定することができないことがある。
【０１１４】
ＣｓｇＧの野生型ポア構造は、組換え遺伝子技術によって２カ所の狭窄の一方を広げるように、変更するように、または除去するように再操作して、チャネル内に単一箇所の狭窄を残し、かくして単一の読み取りヘッドを規定することができる。ＣｓｇＧオリゴマーポア内の狭窄モチーフは、モノマー野生型大腸菌（E. coli）ＣｓｇＧのポリペプチド内の３８〜６３位のアミノ酸残基に位置する。この領域の野生型アミノ酸配列を配列番号３として提供する。この領域を考慮する上で、アミノ酸残基位置５０〜５３、５４〜５６および５８〜５９のいずれかにおける変異が本発明の権限の範囲内に企図されると考えられる。ＣｓｇＧ相同体との配列類似性（図４）に基づいて、アミノ酸残基位置３８〜４９、５３、５７、および６１〜６３は、高度に保存されると考えられ、したがって、置換または他の修飾にあまり適していない。野生型ＣｓｇＧ構造のチャネル内のＴｙｒ５１、Ａｓｎ５５およびＰｈｅ５６の側鎖の重要な位置設定のため、これらの位置における変異は、読み取りヘッドの特徴を修飾または変更するのに有利でありうる。
【０１１５】
ＣｓｇＧタンパク質モノマーの所与の位置における変異は、その位置の野生型アミノ酸の他のいずれかの天然または非天然アミノ酸での置換をもたらすことがある。本発明の一実施形態では、狭窄を広げるまたは除去することが望ましく、好適には、修飾ＣｓｇＧタンパク質中のアミノ酸側鎖は、それが置換する野生型構造内のアミノ酸側鎖より立体的妨害が少なくなるように選択されることになる。所与の位置の置換アミノ酸残基は、同様の静電特性を有することもあり、または異なる静電特性を有することもある。好適には、置換アミノ酸側鎖は、チャネルの二次構造または特性に対する破壊を最小にするために、それが置換する野生型構造内のアミノ酸側鎖と同様の静電電荷を有することになる。
【０１１６】
置換アミノ酸の選択は、大規模多重配列アラインメントに基づいてアミノ酸が別のアミノ酸を置換する尤度を算出するための標準方法論を提供する、ＢＬＯＳＵＭ６２行列に基づくこともある。ＢＬＯＳＵＭ６２行列の例を当業者はインターネット上で自由に入手できる。例えば、米国国立生物学情報センター（National Center for Biotechnology Information）のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｃｌａｓｓ／Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ａａ／ａａ＿ｅｘｐｌｏｒｅｒ．ｃｇｉ）を参照されたい。
【０１１７】
ＣｓｇＧチャネル内の第１の狭窄を形成するように作用する野生型ＣｓｇＧ構造内のＴｙｒ５１に対して、任意のアミノ酸での置換が施される。特に、本発明のある特定の実施形態では、Ｔｙｒ５１は、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、アスパラギン、グルタミンおよびフェニルアラニンで置換されることがある（配列番号３９〜３１８）。本発明の実施形態では、アラニンまたはグリシンでのＴｙｒ５１の置換が特に好適である（配列番号３９〜１０８）。実施形態では、残基５０〜５３（野生型配列中のＰＹＰＡ）は、グリシン−グリシン（ＧＧ）で置換されることがある（配列番号３５４〜３８８）。
【０１１８】
ＣｓｇＧチャネル内の第２の狭窄に寄与するＡｓｎ５５に対して、任意のアミノ酸での置換が施される。特に、本発明のある特定の実施形態では、Ａｓｎ５５は、アラニン、グリシン、バリン、セリンまたはトレオニンで置換されることがある（配列番号９〜３３、４４〜６８、７９〜１０３、１１４〜１３８、１４９〜１７３、１８４〜２０８、２１９〜２４３、２５４〜２７８、２８９〜３１３および３２４〜３４８）。
【０１１９】
ＣｓｇＧチャネル内の第２の狭窄の一部を形成するＰｈｅ５６に対して、任意のアミノ酸での置換が施される。特に、本発明のある特定の実施形態では、Ｐｈｅ５６は、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、アスパラギンおよびグルタミンで置換されることがある（配列番号５〜１３、１５〜１８、２０〜２３、２５〜２８、３０〜３３、４０〜４３、４５〜４８、５０〜５３、５５〜５８、６０〜６３、６５〜６８、７５〜７８、８０〜８３、８５〜８８、９０〜９３、９５〜９８、１００〜１０３、１１０〜１１３、１１５〜１１８、１２０〜１２３、１２５〜１２８、１３０〜１３３、１３５〜１３８、１４５〜１４８、１５０〜１５３、１５５〜１５８、１６０〜１６３、１６５〜１６８、１７０〜１７３、１８０〜１８３、１８５〜１８８、１９０〜１９３、１９５〜１９８、２００〜２０３、２０５〜２０８、２１５〜２１８、２２０〜２２３、２２５〜２２８、２３０〜２３３、２３５〜２３８、２４０〜２４３、２５０〜２５３、２５５〜２５８、２６０〜２６３、２６５〜２６８、２７０〜２７３、２７５〜５７８、２８５〜２８８、２９０〜２９３、２９５〜２９８、３００〜３０３、３０５〜３０８、３１０〜３１３、３２０〜３２３、３２５〜３２８、３３０〜３３３、３３５〜３３８、３４０〜３４３および３４５〜３４８）。本発明の実施形態では、アラニンおよびグリシンでのＰｈｅ５６の置換が特に好適である（配列番号５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、６、１１、１６、２１、２６、３１、３６、４１、４６、５１、５６、６１、６６、７１、７６、８１、８６、９１、９６、１０１、１０６、１１１、１１６、１２１、１２６、１３１、１３６、１４１、１４６、１５１、１５６、１６１、１６６、１７１、１７６、１８１、１８６、１９１、１９６、２０１、２０６、２１１、２１６、２２１、２２６、２３１、２３６、２４１、２４６、２５１、２５６、２６１、２６６、２７１、２７６、２８１、２８６、２９１、２９６、３０１、３０６、３１１、３１６、３２１、３２６、３３１、３３６、３４１  ３４６、３５１、３５６、３６１、３６６、３７１、３７６、３８１および３８６）。
【０１２０】
所与の変異体ＣｓｇＧタンパク質において、Ｔｙｒ５１の置換は、５５および５６位のどちらか一方と同時に行われることもあり（配列番号４４、４９、５４、５９、６４、７９、８４、８９、９４、９９、１１４、１１９、１２４、１２９、１３４、１４９、１５４、１５９、１６４、１６９、１８４、１８９、１９４、１９９、２０４、２１９、２２４、２２９、２３４、２３９、２５４、２５９、２６４、２６９、２７４、２８９、２９４、２９９、３０４、３０９、３５９、３６４、３６９、３７４、３７９、４０、４１、４２、７５、７６  ７７、１１０、１１１、１１２、１４５、１４６、１４７、１８０、１８１、１８２、２１５、２１６、２１７、２５０、２５１、２５２、２８５、２８６および２８７）、この場合、チャネル内の好適な寸法の少なくとも１カ所の狭窄が維持される。あるいは、Ｔｙｒ５１の置換は、位置Ａｓｎ５５およびＰｈｅ５６の両方における置換に対して相互排他的である（配列番号３９、７４、１０９、１４４、１７９、２１４、２４９、２８４、３５４、１０、１１、１２、１５、１６、１７、２０、２１、２２、２５、２６、２７、３０、３１および３２）。
【０１２１】
あるいは、野生型ＣｓｇＧタンパク質中のＴｙｒ５１、Ａｓｎ５５またはＰｈｅ５６の１つまたは複数が欠失されることもある（配列番号３１９〜３５３、３４〜３８、６９〜７３、１０４〜１０８、１３９〜１４３、１７４〜１７８、２０９〜２１３、２４４〜２４８、２７９〜２８３、３１４〜３１８、３８４〜３８８、８、１３、１８、２３、２８、３３、４３、４８、５３、５８、６３、６８、７８、８３、８８、９３、９８、１０３、１１３、１１８、１２３、１２８、１３３、１３８、１４８、１５３、１５８、１６３、１６８、１７３、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１８、２２３、２２８、２３３、２３８、２４３、２５３、２５８、２６３、２６８、２７３、２７８、２８８、２９３、２９８、３０３、３０８および３１３）。チャネル内の少なくとも１カ所の狭窄を維持するために、所与の実施形態では、アミノ酸残基Ｔｙｒ５１の欠失は、アミノ酸残基Ａｓｎ５５およびＰｈｅ５６両方の欠失に対して相互排他的である（配列番号３１９〜３２２、３２４〜３２７、３２９〜３３２、３３４〜３３７、３３９〜３４２、３４４〜３４７、３８、７３、１０８、１４３、１７８、２１３、２４８、２８３および３１８）。５３位と５４位および４８位と４９位におけるある特定の隣接アミノ酸残基も欠失されることがある。
【０１２２】
本発明は、上記修飾が孤立して行われることもあり、あらゆる組合せで行われることもある実施形態を提供するものであることは、理解されるはずである。
【０１２３】
Ｔｙｒ５１における狭窄またはＡｓｎ５５／Ｔｙｒ５６における狭窄のどちらか一方の除去の結果、ＣｓｇＧチャネル内の狭窄は単一箇所になる。理論によって拘束されることを望むものではないが、Ａｓｎ５５／Ｔｙｒ５６における狭窄は、望ましいこともあるＴｙｒ５１における狭窄より高い配座安定性を有することになると想定される。しかし、Ａｓｎ５５／Ｔｙｒ５６狭窄がヌクレオチドと比較して（中心ポア軸に沿って測定して）高すぎることもある。これは、移行中のＤＮＡ鎖内の個々の塩基対の分解能不良につながることがある。
【０１２４】
反対のことがＴｙｒ５１狭窄について言える可能性が高い。Ａｓｎ５５／Ｔｙｒ５６狭窄の除去後、そのオリゴマー中のＴｙｒ５１残基の残存する環は、ネイティブ構造の場合より配座安定性が低いことがある。しかし、Ｔｙｒ５１狭窄のほうが、（中心ポア軸に沿って測定して）短く、個々の塩基を区別しうる狭窄をチャネル内に設けることができる可能性が高い。
【０１２５】
どちらの実施形態においても、（中心軸に沿って測定して）単一箇所の狭い狭窄の存在は、ポアを核酸シークエンシング用途に利用するときに電流読み取りの複雑さを低減させる可能性が高い。したがって、ポアを通って核酸が移行している間に発生する観測電流の変調は、別個のヌクレオチドの単一の狭窄、すなわち「読み取りヘッド」、の通過をもっぱら反映することになる。
【０１２６】
１カ所の狭窄の有効な除去は、そのポアバリアントの開口チャネル電流も増加させることができる。開口チャネル電流の増加は、より高いバックグラウンドコンダクタンスとして有利であり、異なる核酸塩基対シグナルについての電流遮断レベルのより良好な分解につながる。このように、読み取りヘッドに対する修飾は、核酸シークエンシングおよび他の分子センシング用途の両方に対する生体ポアの適合性を向上させることができる。
【０１２７】
代替実施形態として、または上記の配列修飾に加えて、Ａｓｎ５５／Ｐｈｅ５６狭窄が（中心ポア軸に沿って測定したときの）その高さの調整にさらに適応されうることも条件とする。Ａｓｎ５５／Ｐｈｅ５６狭窄のそのようなさらなる適応形態は、ＣｓｇＧチャネル内のＴｙｒ５１もしくは他の位置の変異を伴うこともあり、または伴わないこともある。好適には、Ａｓｎ５５／Ｐｈｅ５６狭窄のさらなる適応形態は、Ｔｙｒ５１残基によって形成される狭窄を広げるまたは除去する変異の一部として企図される。
【０１２８】
野生型形態の場合、Ａｓｎ５５／Ｐｈｅ５６チャネル狭窄は、互いに垂直に方向に隣接して位置する２つのアミノ酸環で作られる。結果として、狭窄は、１ｎｍより長い長さを有する。１ｎｍ長の狭窄は、イオン流から発生する電気シグナルを移行中の核酸鎖内の別個の塩基に分解することを可能とすることができない。通常は、核酸シークエンシングに使用される公知ナノポアの狭窄は、１ｎｍ未満の長さを概して有する。例えば、ＤＮＡシークエンシングに使用されるＭｓｐＡナノポアは、（中心ポア軸に沿って測定して）０．６ｎｍの狭窄高を有する（Manrao et al., Nature Biotechnology, 2012, 30(4), 349-353）。
【０１２９】
Ａｓｎ５５／Ｐｈｅ５６狭窄の（中心ポア軸に沿って測定したときの）高さを低減させるために、２つの残基のどちらか一方を置換してまたは欠失させて狭窄の頂部または底部を広げてもよい。
【０１３０】
ＣｓｇＧチャネル内の第２の狭窄の一部を形成するＡｓｎ５５に対して、任意のアミノ酸での置換が企図される。特に、アラニン、グリシン、バリン、セリンまたはトレオニンでの置換（配列番号９〜３３、４４〜６８、７９〜１０３、１１４〜１３８、１４９〜１７３、１８４〜２０８、２１９〜２４３、２５４〜２７８、２８９〜３１３および３２４〜３４８）。
【０１３１】
ＣｓｇＧチャネル内の第２の狭窄の一部を形成するＰｈｅ５６に対して、任意のアミノ酸での置換が企図される。特に、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、アスパラギンおよびグルタミンでの置換（配列番号５〜１３、１５〜１８、２０〜２３、２５〜２８、３０〜３３、４０〜４３、４５〜４８、５０〜５３、５５〜５８、６０〜６３、６５〜６８、７５〜７８、８０〜８３、８５〜８８、９０〜９３、９５〜９８、１００〜１０３、１１０〜１１３、１１５〜１１８、１２０〜１２３、１２５〜１２８、１３０〜１３３、１３５〜１３８、１４５〜１４８、１５０〜１５３、１５５〜１５８、１６０〜１６３、１６５〜１６８、１７０〜１７３、１８０〜１８３、１８５〜１８８、１９０〜１９３、１９５〜１９８、２００〜２０３、２０５〜２０８、２１５〜２１８、２２０〜２２３、２２５〜２２８、２３０〜２３３、２３５〜２３８、２４０〜２４３、２５０〜２５３、２５５〜２５８、２６０〜２６３、２６５〜２６８、２７０〜２７３、２７５〜５７８、２８５〜２８８、２９０〜２９３、２９５〜２９８、３００〜３０３、３０５〜３０８、３１０〜３１３、３２０〜３２３、３２５〜３２８、３３０〜３３３、３３５〜３３８、３４０〜３４３および３４５〜３４８）。本発明の実施形態では、アラニンおよびグリシンでのＰｈｅ５６の置換が特に好適である（配列番号５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、６、１１、１６、２１、２６、３１、３６、４１、４６、５１、５６、６１、６６、７１、７６、８１、８６、９１、９６、１０１、１０６、１１１、１１６、１２１、１２６、１３１、１３６、１４１、１４６、１５１、１５６、１６１、１６６、１７１、１７６、１８１、１８６、１９１、１９６、２０１、２０６、２１１、２１６、２２１、２２６、２３１、２３６、２４１、２４６、２５１、２５６、２６１、２６６、２７１、２７６、２８１、２８６、２９１、２９６、３０１、３０６、３１１、３１６、３２１、３２６、３３１、３３６、３４１  ３４６、３５１、３５６、３６１、３６６、３７１、３７６、３８１および３８６）。
【０１３２】
野生型ＣｓｇＧポアの狭窄の最小直径を調整するための修飾も企図される。ＣｓｇＧポア内の両方の狭窄の最小直径は、おおよそ０．９ｎｍ（９Å）であり、これは、ＤＮＡシークエンシングに対する有用性を示す公知ＭｓｐＡナノポア内の狭窄についての直径１．２ｎｍ（Manrao et al., Nature Biotechnology, 2012, 30(4), 349-353）より小さい。０．５〜１．５ｎｍの最小直径を有する修飾ＣｓｇＧポア内の残存狭窄をもたらす上記のいずれかの変異が好適であるであろう。
【０１３３】
上に列挙した修飾のいずれかは、狭窄箇所のアミノ酸の親水性および電荷分布を有益に変更して、移行中の核酸鎖に関して通過および非共有結合性相互作用を向上させて電流読み出しを向上させることができる。上に列挙した変異のいずれかは、チャネル狭窄近くの親水性および電荷分布を有益に変更して、その狭窄を通る電解質イオンの流れを最適化すること、および移行中の核酸鎖の通過中のヌクレオチド間のより良好な識別を果たすこともできる。
【０１３４】
チャネル内腔内の表面電荷分布を変化させる結果となりうるＣｓｇＧタンパク質のさらなる修飾が企図される。本発明の一実施形態では、これらの修飾は、移行中の核酸のチャネル壁への望ましくない静電吸着を回避するために施される。核酸は負電荷を有し、ＣｓｇＧチャネル内腔は多少の正電荷を有する（図１）ので、静電相互作用が核酸シークエンシング中に通り抜けまたは移行に干渉しうると想定される。好適には、正電荷を有するアミノ酸残基、例えばリシン、ヒスチジンおよびアルギニンを中性または負電荷を有する側鎖で置換して、ポアを通る核酸移行の効率およびしたがって電流読み出しの明確さをさらに向上させることができる。
【０１３５】
核酸鎖（または個々のヌクレオチド）のポア狭窄内の移行または通り抜けを助長するための、野生型大腸菌（E. coli）ＣｓｇＧまたは変異体ＣｓｇＧのチャネル内腔の修飾も、本発明の実施形態によって提供する。内部狭窄を有するＣｓｇＧの膜貫通部分は、中心の穴を特徴とする蓋を伴うバレルに似ている。バレルと蓋に最も近いポア内腔に追加のループを加えることによって通り抜けを助長することができる。
【０１３６】
本発明の特異的実施形態は、ＣｓｇＧポアが、共有結合している１つまたは複数のモノマー、ダイマーまたはオリゴマーからなりうることを条件とする。非限定的な例として、モノマーは、任意の立体配置で、例えばそれらの末端アミノ酸によって、遺伝子的に融合されていることがある。この場合、１つのモノマーのアミノ末端が別のモノマーのカルボキシ末端に融合されていることもある。
【０１３７】
本発明の実施形態によると、ＣｓｇＧポアが、分子のそのポアの通過に有益な特性を有しうるさらなるアクセサリータンパク質に順応するように適合されうることも条件とする。ポアへの適合は、核酸プロセシング酵素の固定化を助長することができる。核酸プロセシング酵素としては、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼ、イソメラーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレース、テロメラーゼ、およびヘリカーゼを挙げることができる。これらの酵素の１つまたは複数をナノポアと会合させることで、核酸によるポアの通り抜け増進に関して、および核酸鎖がポアによって翻訳される速度を制御する点で恩恵にあずかることができる（Manrao et al., Nature Biotechnology, 2012, 30(4), 349-353）。ポアを通る核酸鎖の移行速度の制御には、イオン流の電流測定に関して、読み出しにより好適であり、より均一である、向上した応答をもたらすという利点がある。
【０１３８】
本発明の実施形態では、ナノポアの膜外領域における修飾は、１つまたは複数の結合／固定化部位を設けることによってチャネルの内腔の内部にまたは内腔に隣接してＤＮＡポリメラーゼなどの好適な核酸プロセシング酵素をドッキングさせることを助長するのに役立つことができると予想される。好適な固定化部位は、酵素の静電結合のための静電パッチ、共有結合性カップリングを可能にするための１つもしくは複数のシステイン残基、および／または立体アンカーを設けるための膜貫通チャネル部分の内部幅変更を含むことがある。
【０１３９】
下でより詳細に述べる特異的実施形態では、本発明は、核酸シークエンシングで使用するためのＣｓｇＧ野生型ポアのさらなる適応形態を提供する。
【０１４０】
本発明の実施形態では、ＣｓｇＧポアの膜外領域（図１に示す下の部分）は、チャネル内腔の反対側に核酸鎖の退出を助長するために短縮または除去されることがある。膜外領域の短縮または除去は、チャネルのイオン流からの電気シグナルの電流分解能を向上させることもできる。後者の利点は、膜外領域によるイオン流に対して生じた抵抗を低下することによってもたらされる。本ＣｓｇＧポアの場合、膜貫通チャネル、内部狭窄およびキャップ領域が、直列に存在する３つの抵抗領域に相当する。これらのうちの１つの寄与を除去することまたは低下させることは、開口チャネル電流を増加させることになり、したがって、電流分解能を向上させることになる。そのような変更は、α−ヘリックス２（α２）、Ｃ末端ａ−ヘリックス（αＣ）（図１）および／またはこれらの組合せの欠失を含むことができる。
【０１４１】
本発明のさらなる実施形態では、野生型大腸菌（E. coli）ＣｓｇＧポアの外面の膜対向アミノ酸は、その膜へのポアの挿入を助長するように修飾することができる。ある特定の実施形態では、単一アミノ酸置換によって野生型残基がより疎水性の高い好適な類似体で置換されうることを条件とする。例えば、残基Ｓｅｒ１３６、Ｇｌｙ１３８、Ｇｌｙ１４０、Ａｌａ１４８、Ａｌａ１８８またはＧｌｙ２０２の１つまたは複数をＡｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＩｌｅに変化させることができる。加えて、チロシンまたはトリプトファンなどの芳香族残基は、疎水性膜と親水性溶媒の界面に位置するように適切な野生型アミノ酸を置換することができる。例えば、残基Ｌｅｕ１５４またはＬｅｕ１８２の１つまたは複数をＴｙｒ、ＰｈｅまたはＴｒｐによって置換することができる。
【０１４２】
本発明の実施形態では、タンパク質ポアの熱安定性を増加させることができる。この結果、シークエンシングデバイス内でのナノポアの有効期限が有利に増されることになる。実施形態では、タンパク質ポアの熱安定性の増加は、ベータ・ターン配列の修飾によってまたはタンパク質表面での静電相互作用の向上によって達成される。一実施形態では、膜貫通領域のβ−ヘアピンを、隣接β−ヘアピン内または間の２本の隣接β鎖にわたる共有結合性ジスルフィドの形成によって安定させることができる。そのような交差鎖システイン対の例は、Ｖａｌ１３９−Ａｓｐ２０３、Ｇｌｙ１３９−Ｇｌｙ２０５、Ｌｙｓ１３５−Ｔｈｒ２０７、Ｇｌｕ２０１−Ａｌａ１４１、Ｇｌｙ１４７−Ｇｌｙ１８９、Ａｓｐ１４９−Ｇｌｎ１８７、Ｇｌｎ１５１−Ｇｌｕ１８５、Ｔｈｒ２０７−Ｇｌｕ１８５、Ｇｌｙ２０５−Ｇｌｎ１８７、Ａｓｐ２０３−Ｇｌｙ１８９、Ａｌａ１５３−Ｌｙｓ１３５、Ｇｌｙ１３７−Ｇｌｎ１５１、Ｖａｌ１３９−Ａｓｐ１４９またはＡｌａ１４１−Ｇｌｙ１４７でありうる。
【０１４３】
本発明のさらなる実施形態では、ポリペプチド配列のコドン使用頻度を、Biotechnol. J., 2011, 6(6), 650-659に記載されている方法に従って、ＣｓｇＧタンパク質の高レベルかつ低エラー率での発現を可能にするように修飾することができる。この修飾は、ｍＲＮＡのあらゆる二次構造も標的にすることができる。
【０１４４】
本発明は、タンパク質配列の、そのプロテアーゼ安定性を向上させるための変更も、提供する。これは、可撓性ループ領域の除去、例えば、α−ヘリックス２（α２）、Ｃ末端ａ−ヘリックス（αＣ）（図１）および／またはこれらの組合せの欠失によって果たすことができる。
【０１４５】
本発明の実施形態では、ＣｓｇＧポリペプチド配列／発現系は、起こりうるタンパク質凝集を回避するように変更される。
【０１４６】
本発明は、タンパク質のフォールディング効率を向上させるためのポリペプチド配列の変更も提供する。好適な技術は、Biotechnol. J., 2011, 6(6), 650-659に提供されている。
【０１４７】
本発明の一実施形態は、ＣｓｇＧタンパク質の精製を助長するためのバイオアフィニティータグの置換または付加をさらに提供する。発表されているＣｓｇＧポア構造は、ＳｔｒｅｐＩＩタグを含有する（Goyal et al., Nature, 2014, 516(7530), 250-3）。本発明の実施形態は、金属キレートアフィニティークロマトグラフィーによる精製を助長するためのヒスチジンタグなどの、他のバイオアフィニティータグを含む。本発明の代替実施形態では、タグは、ＦＬＡＧタグまたはエピトープタグ、例えばＭｙｃタグもしくはＨＡタグを含むことがある。本発明のさらなる実施形態では、ナノポアをビオチンまたはその類似体（例えばデスチオビオチン）でのビオチン化によって修飾することにより、ストレプトアビジンとの相互作用によって精製を助長することもある。
【０１４８】
本発明の実施形態では、ポリペプチドの正味電荷を増加させ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動の際のタンパク質の泳動を助長するために、タンパク質末端に負電荷を付加させることがある。これは、ＣｓｇＧのヘテロオリゴマーの、これらの化学種が目的の化学種である場合、分離向上をもたらすことができる（Howorka et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 2001, 98(23), 12996-13001を参照されたい）。ヘテロオリゴマーは、ポア１つにつき１つだけのシステイン残基の導入に有用でありえ、この導入は、上記のＤＮＡ−ポリメラーゼなどの好適な核酸プロセシング酵素の結合を助長するのに有利でありうる。
【０１４９】
本発明は、一部は、ナノポアを通って流れる電流の電気的測定値の変動に基づく分子センシング用途における野生型または修飾ＣｓｇＧナノポアの使用に関する。
【０１５０】
ＣｓｇＧポアのチャネル内でのまたはチャネルのどちらか一方の開口部付近での分子の結合は、ポアを通る開口チャネルイオン流に対して影響を及ぼすことになる。上に記載した核酸シークエンシング用途と同様に、好適な測定技術を使用して電流の変化によって開口チャネルイオン流の変動を測定することができる（例えば、国際公開第２０００／２８３１２号パンフレットおよびD. Stoddart et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 2010, 106, 7702-7、または国際公開第２００９／０７７７３４号パンフレット）。電流の低減によって測定されるようなイオン流の低減の程度は、ポア内のまたはポアの付近の妨害の大きさに関係づけられる。したがって、ポア内のまたはポア付近の目的の分子（分析物とも呼ぶ）の結合は、検出可能かつ測定可能な事象をもたらすことによって、生体センサーの基礎を成す。ナノポアセンシングに好適な分子としては、核酸、タンパク質、ペプチド、および小分子、例えば医薬、毒素またはサイトカインが挙げられる。
【０１５１】
生体分子の存在の検出は、個別化創薬、医学、診断学、生命科学研究、環境モニタリングに、ならびに警備および／または防衛産業に応用される。
【０１５２】
本発明の実施形態では、本明細書において開示する野生型もしくは修飾大腸菌（E. coli）ＣｓｇＧナノポアまたはその相同体は、分子センサーとして役立つことができる。分析物検出の手順は、Howorka et al., Nature Biotechnology (2012) Jun 7; 30(6):506-7に記載されている。検出されることになる分析物分子は、チャネルのどちらかの面に結合することもあり、チャネル自体の内腔内に結合することもある。結合位置は、センシングされる分子のサイズによって決まりうる。野生型ＣｓｇＧポアは、センサーとして作用することがあり、または本発明の実施形態では、ＣｓｇＧポアは、組換え法もしくは化学的方法によって、センシングされる分子の結合の強度、結合の位置もしくは結合特異性を増加させるように修飾される。典型的な修飾としては、センシングされる分子の構造に相補的な特異的結合部分の付加が挙げられる。分析物分子が核酸を含む場合、この結合部分は、シクロデキストリンまたはオリゴヌクレオチドを含むことがあり；小分子については、これは、公知相補性結合領域、例えば、抗体のもしくは非抗体分子の抗原結合部分（一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）領域、もしくはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）からの抗原認識ドメインを含む）であることがあり；またはタンパク質については、それは、標的タンパク質の公知リガンドであることがある。このように、野生型または修飾大腸菌（E. coli）ＣｓｇＧナノポアまたはその相同体を試料中の好適な抗原（エピトープを含む）の存在を検出する分子センサーとして作用できるようすることができ、そのような好適な抗原としては、細胞表面抗原（受容体、固形腫瘍または血液がん細胞（例えばリンパ腫または白血病）のマーカーを含む）、ウイルス抗原、細菌抗原、原生動物抗原、アレルゲン、アレルギー関連分子、アルブミン（例えば、ヒト、齧歯動物またはウシ）、蛍光分子（フルオレセインを含む）、血液型抗原、小分子、薬物、酵素、酵素または酵素基質の触媒部位、および酵素基質の遷移状態類似体を挙げることができる。
【０１５３】
修飾は、公知の遺伝子工学および組換えＤＮＡ技術を使用して果たすことができる。いずれの適応形態の位置設定も、センシングされる分子の性質、例えば、サイズ、三次元構造およびその生化学的性質に依存することになる。適応させる構造の選択にはコンピュータ構造設計を使用することができる。各々が予定されるセンシング用途に特に適応している一連の特注ＣｓｇＧナノポアが構想される。タンパク質−タンパク質相互作用またはタンパク質−小分子相互作用の判定および最適化は、表面プラズモン共鳴を使用して分子相互作用を検出するＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）（BIAcore, Inc.、Piscataway、NJ；ｗｗｗ．ｂｉａｃｏｒｅ．ｃｏｍも参照されたい）などの技術を使用して調査することができる。
【０１５４】
実施形態では、ＣｓｇＧポアは、タンパク質Ｎ末端の脂質化を防止するためにＮ末端Ｃｙｓ残基が代替アミノ酸によって置換されている水溶性オクタマー形態のものであることができる。代替実施形態では、細菌脂質化経路によるプロセシングを回避するためにＮ末端リーダー配列を除去することによってタンパク質を細胞質において発現させることができる。
【０１５５】
ＣｓｇＧモノマー可溶性タンパク質、オクタマー可溶性タンパク質およびオリゴマー脂質化ＣｓｇＧポアの製造方法は、参照によって本明細書に組み入れられているGoyal ef al.（Nature, 2014; 516(7530): 250-3）に記載されており、ならびにそのような製造方法を実施例１および２に記載する。
【０１５６】
変異体ＣｓｇＧモノマー
本発明は、変異体ＣｓｇＧモノマーを提供する。それらの変異体ＣｓｇＧモノマーを使用して、本発明のポアを形成することができる。変異体ＣｓｇＧモノマーは、配列が野生型ＣｓｇＧモノマーのものとは異なるモノマーであって、ポアを形成する能力を保持するモノマーである。ポアを形成する変異体モノマーの能力を確認する方法は当技術分野において周知であり、そのような方法を下でより詳細に論じる。
【０１５７】
変異体モノマーは、ポリヌクレオチド読み出し特性が向上している、すなわち、ポリヌクレオチド捕捉およびヌクレオチド識別の向上を示す。詳細には、変異体モノマーから構築されるポアは、野生型より容易にヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを捕捉する。加えて、変異体モノマーから構築されるポアは、異なるヌクレオチド間の識別をより容易にする電流範囲の増加、およびシグナル対ノイズ比を増加させる状態変動の低減を示す。加えて、ポリヌクレオチドが変異体から構築されるポアを通って移動するときの電流に寄与するヌクレオチドの数が減少される。これは、ポリヌクレオチドがポアを通って移動しているときに観測される電流とポリヌクレオチド配列との直接的関連の同定をより容易にする。加えて、変異体モノマーから構築されるポアは、スループット増加を示すこともあり、すなわち、ポリヌクレオチドなどの分析物と相互作用する可能性がより高い。これは、ポアを使用する分析物の特徴づけをより容易にする。変異体モノマーから構築されるポアは、より容易に膜に入ることができる。
【０１５８】
本発明の変異体モノマーは、配列番号３９０で示される配列のバリアントを含む。配列番号３９０は、大腸菌Ｋ１２株ＭＣ４１００亜株（Escherichia coli Str. K-12 substr. MC4100）からの野生型ＣｓｇＧモノマーである。配列番号３９０のバリアントは、配列番号３９０のものとは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、ポアを形成するその能力を保持するポリペプチドである。ポアを形成するバリアントの能力は、当技術分野において公知の任意の方法を使用してアッセイすることができる。例えば、バリアントを両親媒性層に他の適切なサブユニットとともに挿入してもよく、オリゴマー化してポアを形成するその能力を判定してもよい。両親媒性層などの膜にサブユニットを挿入する方法は、当技術分野において公知である。例えば、サブユニットを精製形態でトリブロックコポリマー膜を含有する溶液に懸濁させてもよく、その結果、サブユニットは膜に分散し、膜と結合することによって膜に挿入され、集合して機能性状態になる。
【０１５９】
本明細書での論述のすべてにおいて、アミノ酸の標準１文字表記を使用する。これらは、次の通りである：アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、システイン（Ｃ）、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、リシン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）およびバリン（Ｖ）。標準置換表記法も使用する。すなわちＱ４２Ｒは、４２位のＱがＲで置換されていることを意味する。
【０１６０】
一実施形態では、本発明の変異体モノマーは、次のうちの１つまたは複数を含む配列３９０のバリアントを含む：（ｉ）次の位置における１つまたは複数の変異（すなわち、次の位置の１つもしくは複数における変異）：Ｎ４０、Ｄ４３、Ｅ４４、Ｓ５４、Ｓ５７、Ｑ６２、Ｒ９７、Ｅ１０１、Ｅ１２４、Ｅ１３１、Ｒ１４２、Ｔ１５０およびＲ１９２、例えば、次の位置における１つまたは複数の変異（すなわち、次の位置の１つもしくは複数における変異）：Ｎ４０、Ｄ４３、Ｅ４４、Ｓ５４、Ｓ５７、Ｑ６２、Ｅ１０１、Ｅ１３１およびＴ１５０、またはＮ４０、Ｄ４３、Ｅ４４、Ｅ１０１およびＥ１３１、（ｉｉ）Ｙ５１／Ｎ５５、Ｙ５１／Ｆ５６、Ｎ５５／Ｆ５６またはＹ５１／Ｎ５５／Ｆ５６における変異、（ｉｉｉ）Ｑ４２ＲまたはＱ４２Ｋ、（ｉｖ）Ｋ４９Ｒ、（ｖ）Ｎ１０２Ｒ、Ｎ１０２Ｆ、Ｎ１０２ＹまたはＮ１０２Ｗ、（ｖｉ）Ｄ１４９Ｎ、Ｄ１４９ＱまたはＤ１４９Ｒ、（ｖｉｉ）Ｅ１８５Ｎ、Ｅ１８５ＱまたはＥ１８５Ｒ、（ｖｉｉｉ）Ｄ１９５Ｎ、Ｄ１９５ＱまたはＤ１９５Ｒ、（ｉｘ）Ｅ２０１Ｎ、Ｅ２０１ＱまたはＥ２０１Ｒ、（ｘ）Ｅ２０３Ｎ、Ｅ２０３ＱまたはＥ２０３Ｒ、ならびに（ｘｉ）次の位置の１つもしくは複数の欠失：Ｆ４８、Ｋ４９、Ｐ５０、Ｙ５１、Ｐ５２、Ａ５３、Ｓ５４、Ｎ５５、Ｆ５６およびＳ５７。バリアントは、（ｉ）〜（ｘｉ）の任意の組合せを含むことがある。特に、バリアントは、
【０１６１】
【化１−１】
2017527284.tif 000002
【０１６２】
【化１−２】
2017527284.tif 000003
【０１６３】
【化１−３】
2017527284.tif 000004
【０１６４】
【化１−４】
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【０１６５】
【化１−５】
2017527284.tif 000006
【０１６６】
【化１−６】
2017527284.tif 000007
【０１６７】
【化１−７】
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【０１６８】
【化１−８】
2017527284.tif 000009
を含むことがある。
【０１６９】
バリアントは、（ｉ）および（ｉｉｉ）〜（ｘｉ）のいずれか１つを含む場合、Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６の１つもしくは複数、例えば、Ｙ５１、Ｎ５５、Ｆ５６、Ｙ５１／Ｎ５５、Ｙ５１／Ｆ５６、Ｎ５５／Ｆ５６またはＹ５１／Ｎ５５／Ｆ５６における変異をさらに含むことがある。
【０１７０】
（ｉ）において、バリアントは、Ｎ４０、Ｄ４３、Ｅ４４、Ｓ５４、Ｓ５７、Ｑ６２、Ｒ９７、Ｅ１０１、Ｅ１２４、Ｅ１３１、Ｒ１４２、Ｔ１５０およびＲ１９２のあらゆる数および組合せでの変異を含むことがある。（ｉ）において、バリアントは、好ましくは、次の位置における１つまたは複数の変異（すなわち、次の位置の１つもしくは複数における変異）を含む：Ｎ４０、Ｄ４３、Ｅ４４、Ｓ５４、Ｓ５７、Ｑ６２、Ｅ１０１、Ｅ１３１およびＴ１５０。（ｉ）において、バリアントは、好ましくは、次の位置における１つまたは複数の変異（すなわち、次の位置の１つもしくは複数における変異）を含む：Ｎ４０、Ｄ４３、Ｅ４４、Ｅ１０１およびＥ１３１。（ｉ）において、バリアントは、好ましくは、Ｓ５４および／またはＳ５７における変異を含む。（ｉ）において、バリアントは、より好ましくは、（ａ）Ｓ５４および／またはＳ５７ならびに（ｂ）Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６の１つもしくは複数、例えば、Ｙ５１、Ｎ５５、Ｆ５６、Ｙ５１／Ｎ５５、Ｙ５１／Ｆ５６、Ｎ５５／Ｆ５６またはＹ５１／Ｎ５５／Ｆ５６における変異を含む。（ｘｉ）でＳ５４および／またはＳ５７が欠失されている場合、それ／それらは（ｉ）における変異を受けることができず、逆もまた同様である。（ｉ）において、バリアントは、好ましくは、Ｔ１５０における変異、例えばＴ１５０Ｉを含む。あるいは、バリアントは、好ましくは、（ａ）Ｔ１５０ならびに（ｂ）Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６の１つもしくは複数、例えば、Ｙ５１、Ｎ５５、Ｆ５６、Ｙ５１／Ｎ５５、Ｙ５１／Ｆ５６、Ｎ５５／Ｆ５６またはＹ５１／Ｎ５５／Ｆ５６における変異を含む。（ｉ）において、バリアントは、好ましくは、Ｑ６２における変異、例えばＱ６２ＲまたはＱ６２Ｋを含む。あるいは、バリアントは、好ましくは、（ａ）Ｑ６２ならびに（ｂ）Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６の１つもしくは複数、例えば、Ｙ５１、Ｎ５５、Ｆ５６、Ｙ５１／Ｎ５５、Ｙ５１／Ｆ５６、Ｎ５５／Ｆ５６またはＹ５１／Ｎ５５／Ｆ５６における変異を含む。バリアントは、Ｄ４３、Ｅ４４、Ｑ６２またはこれらの任意の組合せ、例えば、Ｄ４３、Ｅ４４、Ｑ６２、Ｄ４３／Ｅ４４、Ｄ４３／Ｑ６２、Ｅ４４／Ｑ６２またはＤ４３／Ｅ４４／Ｑ６２における変異を含むことがある。あるいは、バリアントは、好ましくは、（ａ）Ｄ４３、Ｅ４４、Ｑ６２、Ｄ４３／Ｅ４４、Ｄ４３／Ｑ６２、Ｅ４４／Ｑ６２またはＤ４３／Ｅ４４／Ｑ６２ならびに（ｂ）Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６の１つもしくは複数、例えば、Ｙ５１、Ｎ５５、Ｆ５６、Ｙ５１／Ｎ５５、Ｙ５１／Ｆ５６、Ｎ５５／Ｆ５６またはＹ５１／Ｎ５５／Ｆ５６における変異を含む。
【０１７１】
本出願における（ｉｉ）および他の箇所での／という記号は「および」を意味し、したがってＹ５１／Ｎ５５は、Ｙ５１およびＮ５５である。（ｉｉ）において、バリアントは、好ましくは、Ｙ５１／Ｎ５５における変異を含む。ＣｓｇＧ内の狭窄は、残基Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６の側鎖によって形成される３つの積み重なった同心環で作られると提唱されている（Goyal et al., 2014, Nature, 516, 250-253）。したがって、（ｉｉ）においてのこれらの残基の変異は、ポリヌクレオチドがポアを通って移動しているときに電流に寄与するヌクレオチドの数を減少させることによって、（ポリヌクレオチドがポアを通って移動しているときの）観測電流とポリヌクレオチドとの直接的関連の同定をより容易にすることができる。本発明の方法に有用なバリアントおよびポアに関して下で論じる方法のいずれかでＹ５６を変異させてもよい。
【０１７２】
（ｖ）において、バリアントは、Ｎ１０２Ｒ、Ｎ１０２Ｆ、Ｎ１０２ＹまたはＮ１０２Ｗを含むことがある。バリアントは、好ましくは、（ａ）Ｎ１０２Ｒ、Ｎ１０２Ｆ、Ｎ１０２ＹまたはＮ１０２Ｗ、ならびに（ｂ）Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６の１つもしくは複数、例えば、Ｙ５１、Ｎ５５、Ｆ５６、Ｙ５１／Ｎ５５、Ｙ５１／Ｆ５６、Ｎ５５／Ｆ５６またはＹ５１／Ｎ５５／Ｆ５６における変異を含む。
【０１７３】
（ｘｉ）において、Ｋ４９、Ｐ５０、Ｙ５１、Ｐ５２、Ａ５３、Ｓ５４、Ｎ５５、Ｆ５６およびＳ５７のあらゆる数および組合せが、欠失されていることがある。好ましくは、Ｋ４９、Ｐ５０、Ｙ５１、Ｐ５２、Ａ５３、Ｓ５４、Ｎ５５およびＳ５７の１つもしくは複数が、欠失されていることがある。（ｘｉ）でＹ５１、Ｎ５５およびＦ５６のいずれかが欠失されている場合、それ／それらは（ｉｉ）における変異を受けることができず、逆もまた同様である。
【０１７４】
（ｉ）において、バリアントは、好ましくは、次の置換：Ｎ４０Ｒ、Ｎ４０Ｋ、Ｄ４３Ｎ、Ｄ４３Ｑ、Ｄ４３Ｒ、Ｄ４３Ｋ、Ｅ４４Ｎ、Ｅ４４Ｑ、Ｅ４４Ｒ、Ｅ４４Ｋ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ５７Ｐ、Ｑ６２Ｒ、Ｑ６２Ｋ、Ｒ９７Ｎ、Ｒ９７Ｇ、Ｒ９７Ｌ、Ｅ１０１Ｎ、Ｅ１０１Ｑ、Ｅ１０１Ｒ、Ｅ１０１Ｋ、Ｅ１０１Ｆ、Ｅ１０１Ｙ、Ｅ１０１Ｗ、Ｅ１２４Ｎ、Ｅ１２４Ｑ、Ｅ１２４Ｒ、Ｅ１２４Ｋ、Ｅ１２４Ｆ、Ｅ１２４Ｙ、Ｅ１２４Ｗ、Ｅ１３１Ｄ、Ｒ１４２Ｅ、Ｒ１４２Ｎ、Ｔ１５０Ｉ、Ｒ１９２ＥおよびＲ１９２Ｎの１つまたは複数、例えば、Ｎ４０Ｒ、Ｎ４０Ｋ、Ｄ４３Ｎ、Ｄ４３Ｑ、Ｄ４３Ｒ、Ｄ４３Ｋ、Ｅ４４Ｎ、Ｅ４４Ｑ、Ｅ４４Ｒ、Ｅ４４Ｋ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ５７Ｐ、Ｑ６２Ｒ、Ｑ６２Ｋ、Ｅ１０１Ｎ、Ｅ１０１Ｑ、Ｅ１０１Ｒ、Ｅ１０１Ｋ、Ｅ１０１Ｆ、Ｅ１０１Ｙ、Ｅ１０１Ｗ、Ｅ１３１ＤおよびＴ１５０Ｉの１つもしくは複数、またはＮ４０Ｒ、Ｎ４０Ｋ、Ｄ４３Ｎ、Ｄ４３Ｑ、Ｄ４３Ｒ、Ｄ４３Ｋ、Ｅ４４Ｎ、Ｅ４４Ｑ、Ｅ４４Ｒ、Ｅ４４Ｋ、Ｅ１０１Ｎ、Ｅ１０１Ｑ、Ｅ１０１Ｒ、Ｅ１０１Ｋ、Ｅ１０１Ｆ、Ｅ１０１Ｙ、Ｅ１０１ＷおよびＥ１３１Ｄの１つもしくは複数を含む。バリアントは、これらの置換のあらゆる数および組合せを含むことがある。（ｉ）において、バリアントは、好ましくは、Ｓ５４Ｐおよび／またはＳ５７Ｐを含む。（ｉ）において、バリアントは、好ましくは、（ａ）Ｓ５４Ｐおよび／またはＳ５７Ｐ、ならびに（ｂ）Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６の１つもしくは複数、例えば、Ｙ５１、Ｎ５５、Ｆ５６、Ｙ５１／Ｎ５５、Ｙ５１／Ｆ５６、Ｎ５５／Ｆ５６またはＹ５１／Ｎ５５／Ｆ５６における変異を含む。Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６の１つもしくは複数における変異は、下で論じるもののいずれであってもよい。（ｉ）において、バリアントは、好ましくは、Ｆ５６Ａ／Ｓ５７ＰまたはＳ５４Ｐ／Ｆ５６Ａを含む。バリアントは、好ましくは、Ｔ１５０Ｉを含む。あるいは、バリアントは、好ましくは、（ａ）Ｔ１５０Ｉならびに（ｂ）Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６の１つもしくは複数、例えば、Ｙ５１、Ｎ５５、Ｆ５６、Ｙ５１／Ｎ５５、Ｙ５１／Ｆ５６、Ｎ５５／Ｆ５６またはＹ５１／Ｎ５５／Ｆ５６における変異を含む。
【０１７５】
（ｉ）において、バリアントは、好ましくは、Ｑ６２ＲまたはＱ６２Ｋを含む。あるいは、バリアントは、好ましくは、（ａ）Ｑ６２ＲまたはＱ６２Ｋ、ならびに（ｂ）Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６の１つもしくは複数、例えば、Ｙ５１、Ｎ５５、Ｆ５６、Ｙ５１／Ｎ５５、Ｙ５１／Ｆ５６、Ｎ５５／Ｆ５６またはＹ５１／Ｎ５５／Ｆ５６における変異を含む。バリアントは、Ｄ４３Ｎ、Ｅ４４Ｎ、Ｑ６２ＲもしくはＱ６２Ｋまたはこれらのあらゆる組合せ、例えば、Ｄ４３Ｎ、Ｅ４４Ｎ、Ｑ６２Ｒ、Ｑ６２Ｋ、Ｄ４３Ｎ／Ｅ４４Ｎ、Ｄ４３Ｎ／Ｑ６２Ｒ、Ｄ４３Ｎ／Ｑ６２Ｋ、Ｅ４４Ｎ／Ｑ６２Ｒ、Ｅ４４Ｎ／Ｑ６２Ｋ、Ｄ４３Ｎ／Ｅ４４Ｎ／Ｑ６２ＲまたはＤ４３Ｎ／Ｅ４４Ｎ／Ｑ６２Ｋを含むことがある。あるいは、バリアントは、好ましくは、（ａ）Ｄ４３Ｎ、Ｅ４４Ｎ、Ｑ６２Ｒ、Ｑ６２Ｋ、Ｄ４３Ｎ／Ｅ４４Ｎ、Ｄ４３Ｎ／Ｑ６２Ｒ、Ｄ４３Ｎ／Ｑ６２Ｋ、Ｅ４４Ｎ／Ｑ６２Ｒ、Ｅ４４Ｎ／Ｑ６２Ｋ、Ｄ４３Ｎ／Ｅ４４Ｎ／Ｑ６２ＲまたはＤ４３Ｎ／Ｅ４４Ｎ／Ｑ６２Ｋ、ならびに（ｂ）Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６の１つもしくは複数、例えば、Ｙ５１、Ｎ５５、Ｆ５６、Ｙ５１／Ｎ５５、Ｙ５１／Ｆ５６、Ｎ５５／Ｆ５６またはＹ５１／Ｎ５５／Ｆ５６における変異を含む。
【０１７６】
（ｉ）において、バリアントは、好ましくは、Ｄ４３Ｎを含む。
【０１７７】
（ｉ）において、バリアントは、好ましくは、Ｅ１０１Ｒ、Ｅ１０１Ｓ、Ｅ１０１ＦまたはＥ１０１Ｎを含む。
【０１７８】
（ｉ）において、バリアントは、好ましくは、Ｅ１２４Ｎ、Ｅ１２４Ｑ、Ｅ１２４Ｒ、Ｅ１２４Ｋ、Ｅ１２４Ｆ、Ｅ１２４Ｙ、Ｅ１２４ＷまたはＥ１２４Ｄ、例えばＥ１２４Ｎを含む。
【０１７９】
（ｉ）において、バリアントは、好ましくは、Ｒ１４２ＥおよびＲ１４２Ｎを含む。
【０１８０】
（ｉ）において、バリアントは、好ましくは、Ｒ９７Ｎ、Ｒ９７ＧまたはＲ９７Ｌを含む。
【０１８１】
（ｉ）において、バリアントは、好ましくは、Ｒ１９２ＥおよびＲ１９２Ｎを含む。
【０１８２】
（ｉｉ）において、バリアントは、好ましくは、
【０１８３】
【化２−１】
2017527284.tif 000010
【０１８４】
【化２−２】
2017527284.tif 000011
【０１８５】
【化２−３】
2017527284.tif 000012
を含む。
【０１８６】
（ｉｉ）において、バリアントは、好ましくは、Ｙ５１Ｒ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｎ／Ｆ５６Ｎ、Ｙ５１Ｍ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｌ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｉ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｖ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｐ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｇ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｃ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｑ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｎ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｓ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｅ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｄ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｋ／Ｆ５６ＱまたはＹ５１Ｈ／Ｆ５６Ｑを含む。
【０１８７】
（ｉｉ）において、バリアントは、好ましくは、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｑ／Ｆ５６ＱまたはＹ５１Ａ／Ｆ５６Ｑを含む。
【０１８８】
（ｉｉ）において、バリアントは、好ましくは、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｆ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｍ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｌ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｉ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｖ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｐ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｇ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｃ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｎ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｔ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｓ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｅ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｄ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｋ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６ＨまたはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｒを含む。
【０１８９】
（ｉｉ）において、バリアントは、好ましくは、Ｙ５１Ｔ／Ｎ５５Ｑ、Ｙ５１Ｔ／Ｎ５５ＳまたはＹ５１Ｔ／Ｎ５５Ａを含む。
【０１９０】
（ｉｉ）において、バリアントは、好ましくは、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｆ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｌ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｉ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｖ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｐ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｇ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｃ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｎ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｔ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｓ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｅ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｄ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｋ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６ＨまたはＹ５１Ａ／Ｆ５６Ｒを含む。
【０１９１】
（ｉｉ）において、バリアントは、好ましくは、Ｙ５１Ｃ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｅ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｄ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｋ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｈ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｑ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｎ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｓ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｐ／Ｆ５６ＡまたはＹ５１Ｖ／Ｆ５６Ａを含む。
【０１９２】
（ｘｉ）において、バリアントは、好ましくは、Ｙ５１／Ｐ５２の欠失、Ｙ５１／Ｐ５２／Ａ５３の欠失、Ｐ５０〜Ｐ５２の欠失、Ｐ５０〜Ａ５３の欠失、Ｋ４９〜Ｙ５１の欠失、Ｋ４９〜Ａ５３の欠失および単一のプロリン（Ｐ）での置換、Ｋ４９〜Ｓ５４の欠失および単一のＰでの置換、Ｙ５１〜Ａ５３の欠失、Ｙ５１〜Ｓ５４の欠失、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失、Ｎ５５〜Ｓ５７の欠失、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一のＰでの置換、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一のグリシン（Ｇ）での置換、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一のアラニン（Ａ）での置換、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一のＰでの置換およびＹ５１Ｎ、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一のＰでの置換およびＹ５１Ｑ、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一のＰでの置換およびＹ５１Ｓ、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一のＧでの置換およびＹ５１Ｎ、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一のＧでの置換およびＹ５１Ｑ、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一のＧでの置換およびＹ５１Ｓ、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一のＡでの置換およびＹ５１Ｎ、Ｎ５５／Ｆ５６の欠失および単一のＡでの置換／Ｙ５１Ｑ、もしくはＮ５５／Ｆ５６の欠失および単一のＡでの置換およびＹ５１Ｓを含む。
【０１９３】
バリアントは、より好ましくは、
【０１９４】
【化３−１】
2017527284.tif 000013
【０１９５】
【化３−２】
2017527284.tif 000014
を含む。
【０１９６】
ポリヌクレオチドがポアを通って移動しているときの電流により少ないヌクレオチドが寄与するポアを形成する本発明の好ましいバリアントは、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｎ、Ｙ５１Ｉ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｌ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｉ／Ｆ５６Ｎ、Ｙ５１Ｌ／Ｆ５６ＮもしくはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｎ、またはより好ましくはＹ５１Ｉ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｌ／Ｆ５６ＡもしくはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ａを含む。上で論じたように、これは、（ポリヌクレオチドがポアを通って移動しているときに）観測される電流とポリヌクレオチドとの直接的関連の同定をより容易にする。
【０１９７】
範囲増加を示すポアを形成する好ましいバリアントは、次の位置における変異を含む：
Ｙ５１、Ｆ５６、Ｄ１４９、Ｅ１８５、Ｅ２０１およびＥ２０３、
Ｎ５５およびＦ５６、
Ｙ５１およびＦ５６、
Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６、または
Ｆ５６およびＮ１０２。
【０１９８】
範囲増加を示すポアを形成する好ましいバリアントは、以下を含む：
Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ａ、Ｄ１４９Ｎ、Ｅ１８５Ｒ、Ｅ２０１ＮおよびＥ２０３Ｎ、
Ｎ５５ＳおよびＦ５６Ｑ、
Ｙ５１ＡおよびＦ５６Ａ、
Ｙ５１ＡおよびＦ５６Ｎ、
Ｙ５１ＩおよびＦ５６Ａ、
Ｙ５１ＬおよびＦ５６Ａ、
Ｙ５１ＴおよびＦ５６Ａ、
Ｙ５１ＩおよびＦ５６Ｎ、
Ｙ５１ＬおよびＦ５６Ｎ、
Ｙ５１ＴおよびＦ５６Ｎ、
Ｙ５１ＴおよびＦ５６Ｑ、
Ｙ５１Ａ、Ｎ５５ＳおよびＦ５６Ａ、
Ｙ５１Ａ、Ｎ５５ＳおよびＦ５６Ｎ、
Ｙ５１Ｔ、Ｎ５５ＳおよびＦ５６Ｑ、または
Ｆ５６ＱおよびＮ１０２Ｒ。
【０１９９】
ポリヌクレオチドがポアを通って移動しているときの電流により少ないヌクレオチドが寄与するポアを形成する好ましいバリアントは、
位置Ｎ５５およびＦ５６における変異、例えば、Ｎ５５ＸおよびＦ５６Ｑ（ここでＸは任意のアミノ酸である）、または
位置Ｙ５１およびＦ５６における変異、例えば、Ｙ５１ＸおよびＦ５６Ｑ（ここでＸは任意のアミノ酸である）
を含む。
【０２００】
スループット増加を示すポアを形成する好ましいバリアントは、次の位置における変異を含む：
Ｄ１４９、Ｅ１８５およびＥ２０３、
Ｄ１４９、Ｅ１８５、Ｅ２０１およびＥ２０３、または
Ｄ１４９、Ｅ１８５、Ｄ１９５、Ｅ２０１およびＥ２０３。
【０２０１】
スループット増加を示すポアを形成する好ましいバリアントは、以下を含む：
Ｄ１４９Ｎ、Ｅ１８５ＮおよびＥ２０３Ｎ、
Ｄ１４９Ｎ、Ｅ１８５Ｎ、Ｅ２０１ＮおよびＥ２０３Ｎ、
Ｄ１４９Ｎ、Ｅ１８５Ｒ、Ｄ１９５Ｎ、Ｅ２０１ＮおよびＥ２０３Ｎ、または
Ｄ１４９Ｎ、Ｅ１８５Ｒ、Ｄ１９５Ｎ、Ｅ２０１ＲおよびＥ２０３Ｎ。
【０２０２】
ポリヌクレオチドの捕捉が増加されるポアを形成する好ましいバリアントは、次の変異を含む：
Ｄ４３Ｎ／Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ、
Ｅ４４Ｎ／Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ、
Ｄ４３Ｎ／Ｅ４４Ｎ／Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ、
Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｑ６２Ｒ、
Ｄ４３Ｎ／Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｑ６２Ｒ、
Ｅ４４Ｎ／Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｑ６２Ｒ、または
Ｄ４３Ｎ／Ｅ４４Ｎ／Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｑ６２Ｒ。
【０２０３】
好ましいバリアントは、次の変異を含む：
Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｒ／Ｅ２０１Ｒ／Ｅ２０３ＲもしくはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｄ１４９Ｒ／Ｅ１８５Ｒ／Ｅ２０１Ｒ／Ｅ２０３Ｒ、
Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３ＮもしくはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎ、
Ｅ２０１Ｒ／Ｅ２０３ＲもしくはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｅ２０１Ｒ／Ｅ２０３Ｒ、
Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３ＲもしくはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｒ、
Ｅ２０３ＲもしくはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｅ２０３Ｒ、
Ｅ２０３ＮもしくはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｅ２０３Ｎ、
Ｅ２０１ＲもしくはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｅ２０１Ｒ、
Ｅ２０１ＮもしくはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｅ２０１Ｎ、
Ｅ１８５ＲもしくはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｅ１８５Ｒ、
Ｅ１８５ＮもしくはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｅ１８５Ｎ、
Ｄ１４９ＲもしくはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｄ１４９Ｒ、
Ｄ１４９ＮもしくはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｄ１４９Ｎ、
Ｒ１４２ＥもしくはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ１４２Ｅ、
Ｒ１４２ＮもしくはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ１４２Ｎ、
Ｒ１９２ＥもしくはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ１９２Ｅ、または
Ｒ１９２ＮもしくはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ１９２Ｎ。
【０２０４】
好ましいバリアントは、次の変異を含む：
Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｅ１０１Ｎ／Ｎ１０２Ｒ、
Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｎ／Ｎ１０２Ｇ、
Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｎ／Ｎ１０２Ｒ、
Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｎ、
Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｇ、
Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｒ９７Ｌ、
Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｎ１０２Ｒ、
Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｎ１０２Ｆ、
Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｎ１０２Ｇ、
Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｅ１０１Ｒ、
Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｅ１０１Ｆ、
Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｅ１０１Ｎ、または
Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ／Ｅ１０１Ｇ。
【０２０５】
本発明は、配列３９０で示される配列のバリアントを含む変異体ＣｓｇＧモノマーであって、バリアントがＴ１５０における変異を含む、変異体ＣｓｇＧモノマーも提供する。挿入増加を示すポアを形成する好ましいバリアントは、Ｔ１５０Ｉを含む。Ｔ１５０における変異、例えばＴ１５０Ｉは、上で論じた変異または変異の組合せのいずれかと、組み合わせることができる。
【０２０６】
本発明は、実施例において開示するバリアント中に存在する変異の組合せを含む配列３９０で示される配列のバリアントを含む変異体ＣｓｇＧモノマーも提供する。
【０２０７】
天然に存在するアミノ酸を導入または置換する方法は、当技術分野において周知である。例えば、メチオニン（Ｍ）は、変異体モノマーをコードするポリヌクレオチド中の適切な位置のメチオニンのコドン（ＡＴＧ）をアルギニンのコドン（ＣＧＴ）で置き換えることによって、アルギニン（Ｒ）で置換することができる。その後、そのポリヌクレオチドを下で論じるように発現させることができる。
【０２０８】
天然に存在しないアミノ酸を導入または置換する方法も当技術分野において周知である。例えば、変異体モノマーを発現させるために使用されるＩＶＴＴ系に合成アミノアシル−ｔＲＮＡを含めることによって、天然に存在しないアミノ酸を導入することができる。あるいは、特異的アミノ酸に対して栄養要求性である大腸菌（E. coli）においてそれらの特異的アミノ酸の合成（すなわち天然に存在しない）類似体の存在下で変異体モノマーを発現させることによって、天然に存在しないアミノ酸を導入することができる。部分ペプチド合成を使用して変異体モノマーを導入する場合、ネイキッドライゲーション（naked ligation）によって、天然に存在しないアミノ酸を導入することもできる。
【０２０９】
本発明の他のモノマー
別の実施形態では、本発明は、配列番号３９０で示される配列のバリアントを含む変異体ＣｓｇＧモノマーであって、バリアントが位置Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６の１つもしくは複数における変異を含む、変異体ＣｓｇＧモノマーを提供する。バリアントは、Ｙ５１、Ｎ５５、Ｆ５６、Ｙ５１／Ｎ５５、Ｙ５１／Ｆ５６、Ｎ５５／Ｆ５６、またはＹ５１／Ｎ５５／Ｆ５６における変異を含むことがある。バリアントは、好ましくは、Ｙ５１、Ｎ５５またはＦ５６における変異を含む。バリアントは、上で論じた位置Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６の１つもしくは複数における、およびあらゆる組合せでの、特異的変異のいずれかを含むことがある。Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６の１つもしくは複数がいずれのアミノ酸で置換されていることもある。Ｙ５１は、Ｆ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ａ、Ｐ、Ｇ、Ｃ、Ｑ、Ｎ、Ｔ、Ｓ、Ｅ、Ｄ、Ｋ、ＨまたはＲ、例えば、Ａ、Ｓ、Ｔ、ＮまたはＱで置換されていることがある。Ｎ５５は、Ｆ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ａ、Ｐ、Ｇ、Ｃ、Ｑ、Ｔ、Ｓ、Ｅ、Ｄ、Ｋ、ＨまたはＲ、例えば、Ａ、Ｓ、ＴまたはＱで置換されていることがある。Ｆ５６は、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ａ、Ｐ、Ｇ、Ｃ、Ｑ、Ｎ、Ｔ、Ｓ、Ｅ、Ｄ、Ｋ、ＨまたはＲ、例えば、Ａ、Ｓ、Ｔ、ＮまたはＱで置換されていることがある。
【０２１０】
バリアントは、以下の１つまたは複数をさらに含むことがある：（ｉ）次の位置における１つまたは複数の変異（すなわち、次の位置の１つもしくは複数における変異）（ｉ）Ｎ４０、Ｄ４３、Ｅ４４、Ｓ５４、Ｓ５７、Ｑ６２、Ｒ９７、Ｅ１０１、Ｅ１２４、Ｅ１３１、Ｒ１４２、Ｔ１５０およびＲ１９２；（ｉｉｉ）Ｑ４２ＲまたはＱ４２Ｋ；（ｉｖ）Ｋ４９Ｒ；（ｖ）Ｎ１０２Ｒ、Ｎ１０２Ｆ、Ｎ１０２ＹまたはＮ１０２Ｗ；（ｖｉ）Ｄ１４９Ｎ、Ｄ１４９ＱまたはＤ１４９Ｒ；（ｖｉｉ）Ｅ１８５Ｎ、Ｅ１８５ＱまたはＥ１８５Ｒ；（ｖｉｉｉ）Ｄ１９５Ｎ、Ｄ１９５ＱまたはＤ１９５Ｒ；（ｉｘ）Ｅ２０１Ｎ、Ｅ２０１ＱまたはＥ２０１Ｒ；（ｘ）Ｅ２０３Ｎ、Ｅ２０３ＱまたはＥ２０３Ｒ；ならびに（ｘｉ）次の位置の１つもしくは複数の欠失：Ｆ４８、Ｋ４９、Ｐ５０、Ｙ５１、Ｐ５２、Ａ５３、Ｓ５４、Ｎ５５、Ｆ５６およびＳ５７。バリアントは、上で論じた（ｉ）および（ｉｉｉ）〜（ｘｉ）の組合せのいずれかを含むことがある。バリアントは、（ｉ）および（ｉｉｉ）〜（ｘｉ）について上で論じた実施形態のいずれかを含むことがある。
【０２１１】
バリアント
上で論じた特異的変異に加えて、バリアントは、他の変異を含むことがある。配列番号３９０のアミノ酸配列の全長にわたって、バリアントは、好ましくは、アミノ酸同一性に基づいてその配列と少なくとも５０％相同であることになる。より好ましくは、バリアントは、アミノ酸同一性に基づいて、配列全体にわたって配列番号３９０のアミノ酸配列と少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同であることがある。連続する１００以上、例えば１２５、１５０、１７５または２００以上、のアミノ酸のストレッチにわたって、少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％または９５％アミノ酸同一性（「堅い相同性（hard homology）」）があることもある。
【０２１２】
当技術分野における標準的方法を使用して相同性を判定することができる。例えば、ＵＷＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅは、相同性を算出するために使用することができ、例えばそのデフォルト設定で使用される、ＢＥＳＴＦＩＴプラグラムを提供している（Devereux et al., (1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395）。例えば、Altschul S. F. (1993) J Mol Evol 36:290-300；Altschul, S. F et al., (1990) J Mol Biol 215:403-10に記載されているように、ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して、相同性を算出し、配列を並べる（例えば、等価の残基または対応する配列を（通常はそれらのデフォルト設定で）同定する）ことができる。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、米国国立生物学情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）で公的に入手できる。
【０２１３】
配列番号３９０は、大腸菌Ｋ１２株ＭＣ４１００亜株（Escherichia coli Str. K-12 substr. MC4100）からの野生型ＣｓｇＧモノマーである。配列番号３９０のバリアントは、別のＣｓｇＧ相同体中に存在する置換のいずれかを含むことがある。好ましいＣｓｇＧ相同体は、配列番号３９１〜３９５および４１４〜４２９で示される。バリアントは、配列番号３９０と比較して配列番号３９１〜３９５および４１４〜４２９に存在する置換の１つまたは複数についての組合せを含むことがある。
【０２１４】
上で論じたものに加えて、アミノ酸置換、例えば１、２、３、４、５、１０、２０または３０以下の置換が、配列番号３９０のアミノ酸配列に施されることもある。保存的置換は、アミノ酸を類似の化学構造、類似の化学的特性または類似の側鎖体積の他のアミノ酸で置換する。導入されるアミノ酸は、それらが置換するアミノ酸と同様の極性、親水性、疎水性、塩基性、酸性、中性または電荷を有することができる。あるいは、保存的置換は、既存の芳香族または脂肪族アミノ酸の代わりに、芳香族または脂肪族である別のアミノ酸を導入することもある。保存的アミノ酸変化は当技術分野において周知であり、下の表１において定義するような２０の主要アミノ酸の特性に従ってそのような変化を選択することができる。アミノ酸が同様の極性を有する場合、このことも、表２中のアミノ酸側鎖についてのハイドロパシースケールを参照することによって判定することができる。
【０２１５】
【表１】
2017527284.tif 000015
【０２１６】
【表２】
2017527284.tif 000016
【０２１７】
配列番号３９０のアミノ酸配列の１つまたは複数のアミノ酸残基が、上記のポリペプチドからさらに欠失されることもある。１、２、３、４、５、１０、２０または３０以上までの残基が欠失されることがある。
【０２１８】
バリアントは、配列番号３９０の断片を含むこともある。そのような断片は、ポア形成活性を保持する。断片は、長さ少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００または少なくとも２５０アミノ酸であることがある。そのような断片を、ポアを生成するために使用してもよい。断片は、好ましくは、配列番号３９０の膜貫通ドメイン、すなわち、Ｋ１３５〜Ｑ１５３およびＳ１８３〜Ｓ２０８を含む。
【０２１９】
１つまたは複数のアミノ酸が上記のポリペプチドに代替的にまたはさらに付加されることもある。配列番号３９０のアミノ酸配列またはそのポリペプチドバリアントもしくは断片のアミノ末端またはカルボキシ末端に伸長部が設けられることもある。伸長部は、かなり短いことがあり、例えば、長さ１〜１０アミノ酸であることがある。あるいは、伸長部は、より長いこともあり、例えば、５０または１００アミノ酸以下であることもある。担体タンパク質が本発明によるアミノ酸配列に融合されることもある。他の融合タンパク質は、下でより詳細に論じる。
【０２２０】
上で論じたように、バリアントは、配列番号３９０のものとは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、ポアを形成するその能力を保持するポリペプチドである。バリアントは、ポア形成に関与している配列番号３９０の領域を通常は含有する。β−バレルを含有するＣｓｇＧのポア形成能力は、各サブユニット内のβ−シートによってもたらされる。配列番号３９０のバリアントは、β−シートを形成する配列番号３９０内の領域、すなわち、Ｋ１３５〜Ｑ１５３およびＳ１８３〜Ｓ２０８を通常は含む。結果として生じるバリアントが、ポアを形成するその能力を保持するのであれば、β−シートを形成する配列番号３９０の領域に１つまたは複数の修飾を施すことができる。配列番号３９０のバリアントは、好ましくは、１つまたは複数の修飾、例えば置換、付加または欠失、をそのα−ヘリックスおよび／またはループ領域内に含む。
【０２２１】
ＣｓｇＧに由来するモノマーは、それらの同定または精製を支援するように、例えば、ストレプトアビジンタグの付加によって、または細胞からのそれらの分泌を促進するためのシグナル配列の付加（モノマーがそのような配列を天然に含有しない場合）によって、修飾されることがある。他の好適なタグは、下でより詳細に論じる。モノマーは、顕現標識で標識されることがある。顕現標識は、モノマーを検出できるようにするいずれの好適な標識であってもよい。好適な標識は、下で説明する。
【０２２２】
ＣｓｇＧに由来するモノマーは、Ｄ−アミノ酸を使用して産生されることもある。例えば、ＣｓｇＧに由来するモノマーは、Ｌ−アミノ酸とＤ−アミノ酸の混合物を含むことがある。これは、そのようなタンパク質またはペプチドの産生に関する技術分野では当たり前のことである。
【０２２３】
ＣｓｇＧに由来するモノマーは、ヌクレオチド識別を助長するために１つまたは複数の特異的修飾を有する。ＣｓｇＧに由来するモノマーは、他の非特異的修飾も、そのような修飾がポア形成に干渉しないのであれば、有することができる。多数の非特異的側鎖修飾が当技術分野において公知であり、そのような修飾をＣｓｇＧに由来するモノマーの側鎖に施すことができる。そのような修飾としては、例えば、アルデヒドとの反応、その後のＮａＢＨ４での還元による、還元アルキル化、アセトイミド酸メチルでのアミド化、または無水酢酸でのアシル化が挙げられる。
【０２２４】
ＣｓｇＧに由来するモノマーは、当技術分野において公知の標準的方法を使用して産生することができる。ＣｓｇＧに由来するモノマーは、合成的に作製されることもあり、または組換え手段によって作製されることもある。例えば、モノマーをｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳および転写（ＩＶＴＴ）によって合成してもよい。ポアおよびモノマーの好適な産生方法は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６９０号明細書（国際公開第２０１０／００４２７３号パンフレットとして公開）、同第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号明細書（国際公開第２０１０／００４２６５号パンフレットとして公開）または同第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号明細書（国際公開第２０１０／０８６６０３号パンフレットとして公開）において論じられている。膜へのポアの挿入方法が論じられている。
【０２２５】
一部の実施形態では、変異体モノマーは、化学的に修飾される。変異体モノマーを任意の方法で、任意の部位で、化学的に修飾することができる。変異体モノマーは、好ましくは、１つもしくは複数のシステインへの分子の結合（システイン結合）、１つもしくは複数のリシンへの分子の結合、１つもしくは複数の非天然アミノ酸への分子の結合、エピトープの酵素修飾、または末端の修飾によって化学的に修飾される。そのような修飾の好適な実施方法は、当技術分野において周知である。いずれの分子の結合によって変異体モノマーを化学的に修飾してもよい。例えば、変異体モノマーを色素またはフルオロフォアの結合によって化学的に修飾してもよい。
【０２２６】
一部の実施形態では、変異体モノマーは、該モノマーを含むポアと標的ヌクレオチドまたは標的ポリヌクレオチド配列との相互作用を助長する分子アダプターで化学的に修飾される。アダプターの存在は、ポアとヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列とのホスト・ゲストケミストリーを向上させることによって、変異体モノマーから形成されるポアのシークエンシング能力を向上させる。ホスト・ゲストケミストリーの原理は当技術分野において周知である。アダプターは、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列とのその相互作用を向上させるポアの物理的または化学的特性に対して影響を及ぼす。アダプターは、ポアのバレルもしくはチャネルの電荷を変更することによって、またはヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド配列と特異的に相互作用もしくは結合することによって、ポアとのその相互作用を助長することができる。
【０２２７】
分子アダプターは、好ましくは、環状分子、シクロデキストリン、ハイブリダイゼーションできる化学種、ＤＮＡ結合剤もしくは挿入剤、ペプチドもしくはペプチド類似体、合成ポリマー、芳香族平面分子、正電荷を有する小分子、または水素結合できる小分子である。
【０２２８】
アダプターは、環状であることがある。環状アダプターは、好ましくは、ポアと同じ対称性を有する。ＣｓｇＧは中心軸の周囲に８または９個のサブユニットを通常は有するので、アダプターは好ましくは８回または９回対称性である。このことは、下でより詳細に論じる。
【０２２９】
アダプターは、通常は、ホスト・ゲストケミストリーによってヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列と相互作用する。アダプターは、通常は、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列と相互作用することができる。アダプターは、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列と相互作用することができる１つまたは複数の化学基を含む。１つまたは複数の化学基は、好ましくは、非共有結合性相互作用、例えば、疎水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、π−カチオン相互作用および／または静電力によって、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列と相互作用する。ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列と相互作用することができる１つまたは複数の化学基は、好ましくは、正電荷を有する。ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列と相互作用することができる１つまたは複数の化学基は、より好ましくは、アミノ基を含む。アミノ基を第１級、第２級または第３級炭素原子に結合させることができる。アダプターは、よりいっそう好ましくは、アミノ基の環、例えば、アミノ基６、７または８個の環を含む。アダプターは、最も好ましくは、アミノ基８個の環を含む。プロトン化アミノ基の環は、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列中の負電荷を有するリン酸基と相互作用することができる。
【０２３０】
ポア内のアダプターの正しい位置設定を、アダプターと変異体モノマーを含むポアとのホスト・ゲストケミストリーによって助長することができる。アダプターは、好ましくは、ポア内の１つまたは複数のアミノ酸と相互作用することができる１つまたは複数の化学基を含む。アダプターは、好ましくは、非共有結合性相互作用、例えば、疎水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、π−カチオン相互作用および／または静電力によってポア内の１つまたは複数のアミノ酸と相互作用することができる１つまたは複数の化学基を含む。ポア内の１つまたは複数のアミノ酸と相互作用することができる化学基は、通常はヒドロキシルまたはアミンである。ヒドロキシル基を第１級、第２級または第３級炭素原子に結合させることができる。ヒドロキシル基は、ポア内の非荷電アミノ酸と水素結合を形成することができる。ポアとヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列との相互作用を助長するあらゆるアダプターを使用することができる。
【０２３１】
好適なアダプターとしては、シクロデキストリン、環状ペプチドおよびククルビツリルが挙げられるが、これらに限定されない。アダプターは、好ましくは、シクロデキストリンまたはその誘導体である。シクロデキストリンまたはその誘導体は、Eliseev, A. V., and Schneider, H-J. (1994) J. Am. Chem. Soc. 116, 6081-6088に開示されているもののいずれかであってもよい。アダプターは、より好ましくは、ヘプタキス−６−アミノ−β−シクロデキストリン（ａｍ７−βＣＤ）、６−モノデオキシ−６−モノアミノ−β−シクロデキストリン（ａｍ１−βＣＤ）またはヘプタキス−（６−デオキシ−６−グアニジノ）−シクロデキストリン（ｇｕ７−βＣＤ）である。ｇｕ７−βＣＤ中のグアニジノ基は、ａｍ７−βＣＤ中の第１級アミンよりはるかに高いｐＫａを有し、そのためより大きい正電荷を有する。このｇｕ７−βＣＤアダプターは、ポア内のヌクレオチドの滞留時間を増加させるために、測定される残留電流の精度を増すために、ならびに高温および低いデータ収集率で塩基検出率を増加させるために使用することができる。
【０２３２】
下でより詳細に論じるように３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸スクシンイミジル（ＳＰＤＰ）架橋剤を使用する場合、アダプターは、好ましくは、ヘプタキス（６−デオキシ−６−アミノ）−６−Ｎ−モノ（２−ピリジル）ジチオプロパノイル−β−シクロデキストリン（ａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤ）である。
【０２３３】
より好適なアダプターとしては、９糖単位を含む（したがって９回対称性を有する）γ−シクロデキストリンが挙げられる。γ−シクロデキストリンは、リンカー分子を含有することがあり、または上で論じたβ−シクロデキストリンの例に使用される修飾糖単位のすべて乃至はそれより多くを含むように修飾されることもある。
【０２３４】
分子アダプターは、好ましくは、変異体モノマーに共有結合される。当技術分野において公知の任意の方法を使用してアダプターをポアに共有結合させることができる。アダプターは、通常は化学結合によって結合される。分子アダプターが、システイン結合によって結合される場合、１つまたは複数のシステインが変異体に、例えばバレル内に、置換によって導入されているほうが好ましい。変異体モノマーは、該変異体モノマー中の１つまたは複数のシステインへの分子アダプターの結合によって、化学的に修飾されることがある。１つまたは複数のシステインは、天然に存在することがあり、すなわち、配列番号３９０の１位および／または２１５位にあることがある。あるいは、変異体モノマーは、他の位置に導入された１つまたは複数のシステインへの分子の結合によって、化学的に修飾されることもある。２１５位のシステインは、分子アダプターが１位のシステインまたは別の位置に導入されたシステインではなくその位置に結合しないことを確実にするために、例えば置換によって除去されることがある。
【０２３５】
システイン残基の反応性が隣接残基の修飾によって向上されることもある。例えば、隣接するアルギニン、ヒスチジンまたはリシン残基の塩基性基は、システインのチオール基のｐＫａをより反応性の高いＳ−基のｐＫａへと変化させることになる。システイン残基の反応性がｄＴＮＢなどのチオール保護基によって保護されることもある。リンカーを結合させる前に変異体モノマーの１つまたは複数のシステイン残基とこれらの保護基を反応させることができる。分子が変異体モノマーに直接結合されることもある。分子は、好ましくは、化学的架橋剤またはペプチドリンカーなどのリンカーを使用して変異体分子に結合される。
【０２３６】
好適な化学的架橋剤は、当技術分野において周知である。好ましい架橋剤としては、３−（ピリジン−２−イルジスルファニル）プロパン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル、４−（ピリジン−２−イルジスルファニル）ブタン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル、および８−（ピリジン−２−イルジスルファニル）オクタン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イルが挙げられる。最も好ましい架橋剤は、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸スクシンイミジル（ＳＰＤＰ）である。通常は、分子を二官能性架橋剤に共有結合させた後、その分子／架橋剤複合体を変異体モノマーに共有結合させるが、二官能性架橋剤をモノマーに共有結合させた後、その二官能性架橋剤／モノマー複合体を分子に結合させることも可能である。
【０２３７】
リンカーは、好ましくは、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）に耐性である。好適なリンカーとしては、ヨードアセトアミド系およびマレイミド系リンカーが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３８】
他の実施形態では、モノマーは、ポリヌクレオチド結合タンパク質に結合されることがある。これによって、本発明のシークエンシング方法で使用されうるモジュラーシークエンシングシステムが形成される。ポリヌクレオチド結合タンパク質は、下で論じる。
【０２３９】
ポリヌクレオチド結合タンパク質は、好ましくは、変異体モノマーに共有結合される。当技術分野において公知の任意の方法を使用してタンパク質をモノマーに共有結合させることができる。モノマーおよびタンパク質は、化学的に融合されることもあり、または遺伝子的に融合されることもある。構築物全体を単一のポリヌクレオチド配列から発現される場合、モノマーおよびタンパク質を遺伝子的に融合させる。モノマーのポリヌクレオチド結合タンパク質への遺伝子的融合は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号明細書（国際公開第２０１０／００４２６５号パンフレットとして公開）において論じられている。
【０２４０】
ポリヌクレオチド結合タンパク質がシステイン結合によって結合される場合、１つまたは複数のシステインが置換によって変異体に導入されているほうが好ましい。１つまたは複数のシステインは、好ましくは、相同体の中で保存が低度である（これは変異または挿入が許容されうることを示す）ループ領域に導入される。したがって、それらの領域は、ポリヌクレオチド結合タンパク質の結合に好適である。そのような実施形態では、２５１位に天然に存在するシステインが除去されることがある。システイン残基の反応性は、上記の修飾によって向上させることができる。
【０２４１】
ポリヌクレオチド結合タンパク質は、変異体モノマーに直接結合されることもあり、または１つもしくは複数のリンカーを介して結合されることもある。国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３２号明細書（国際公開第２０１０／０８６６０２号パンフレットとして公開）に記載されているハイブリダイゼーションリンカーを使用して分子を変異体モノマーに結合させてもよい。あるいは、ペプチドリンカーを使用してもよい。ペプチドリンカーは、アミノ酸配列である。ペプチドリンカーの長さ、可撓性、および親水性は、通常は、そのペプチドリンカーがモノマーおよび分子の機能を妨げないように設計される。好ましい可撓性リンカーは、セリンおよび／またはグリシンアミノ酸２〜２０個、例えば４、６、８、１０または１６個のストレッチである。より好ましい可撓性リンカーとしては、（ＳＧ）１、（ＳＧ）２、（ＳＧ）３、（ＳＧ）４、（ＳＧ）５および（ＳＧ）８が挙げられ、この場合のＳはセリンであり、Ｇはグリシンである。好ましい剛性リンカーは、プロリンアミノ酸２〜３０個、例えば４、６、８、１６または２４個のストレッチである。より好ましい剛性リンカーとしては、（Ｐ）１２が挙げられ、この場合のＰはプロリンである。
【０２４２】
変異体モノマーは、分子アダプターおよびポリヌクレオチド結合タンパク質で化学的に修飾されることがある。
【０２４３】
分子（モノマーを化学的に修飾する分子）は、モノマーに直接結合されることもあり、または国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６９０号明細書（国際公開第２０１０／００４２７３号パンフレットとして公開）、同第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号明細書（国際公開第２０１０／００４２６５号パンフレットとして公開）もしくは同第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号明細書（国際公開第２０１０／０８６６０３号パンフレットとして公開）に開示されているようなリンカーを介して結合されることもある。
【０２４４】
本発明の変異体モノマーおよびポアなどの、本明細書に記載するタンパク質のいずれかは、それらの同定または精製を支援するように、例えば、ヒスチジン残基（ｈｉｓタグ）、アスパラギン酸残基（ａｓｐタグ）、ストレプトアビジンタグ、ｆｌａｇタグ、ＳＵＭＯタグ、ＧＳＴタグもしくはＭＢＰタグの付加によって、または細胞からのそれらの分泌を促進するためのシグナル配列の付加（ポリペプチドがそのような配列を天然に含有しない場合）によって、修飾されることがある。遺伝子タグを導入するための代替法は、タグをタンパク質上のネイティブ位置または工学的に操作された位置に化学反応させる方法である。この方法の例は、タンパク質の外側の工学的に操作されたシステインにゲルシフト試薬を反応させる方法であろう。この方法は、溶血素ヘテロオリゴマーを分離する方法として立証されている（Chem Biol. 1997 Jul;4(7):497-505）。
【０２４５】
本発明の変異体モノマーおよびポアなどの、本明細書に記載するタンパク質のいずれかは、顕現標識で標識されることがある。顕現標識は、タンパク質を検出できるようにするいずれの好適な標識であってもよい。好適な標識としては、蛍光分子、放射性同位元素、例えば、１２５Ｉ、３５Ｓ、酵素、抗体、抗原、ポリヌクレオチドおよびリガンド、例えばビオチンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４６】
本発明のモノマーまたはポアなどの、本明細書に記載するタンパク質のいずれかは、合成的に作製されることがあり、または組換え手段によって作製されることもある。例えば、タンパク質は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳および転写（ＩＶＴＴ）によって合成されることがある。タンパク質のアミノ酸配列は、天然に存在しないアミノ酸を含むように修飾されることもあり、またはタンパク質の安定性を増すように修飾されることもある。タンパク質が合成手段によって産生される場合、そのようなアミノ酸を産生中に導入することができる。タンパク質は、合成的産生または組み換え産生のどちらか一方の後に改変されることもある。
【０２４７】
タンパク質は、Ｄ−アミノ酸を使用して産生されることもある。例えば、タンパク質は、Ｌ−アミノ酸とＤ−アミノ酸の混合物を含むことがある。これは、そのようなタンパク質またはペプチドの産生に関する技術分野では当たり前のことである。
【０２４８】
タンパク質は、他の非特異的修飾も、それらのタンパク質の機能に干渉しないのであれば、有することができる。多数の非特異的側鎖修飾が当技術分野において公知であり、そのような修飾をタンパク質の側鎖に施すことができる。そのような修飾としては、例えば、アルデヒドとの反応、その後のＮａＢＨ４での還元による、アミノ酸の還元アルキル化、アセトイミド酸メチルでのアミド化、または無水酢酸でのアシル化が挙げられる。
【０２４９】
本発明のモノマーおよびポアを含む、本明細書に記載するタンパク質のいずれかは、当技術分野において公知の標準的方法を使用して産生することができる。タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、当技術分野における標準的方法を使用して誘導および複製することができる。タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、当技術分野における標準技術を使用して細菌宿主細胞において発現させることができる。タンパク質は、組換え発現ベクターからのポリペプチドのインサイチュ発現によって細胞において産生されることもある。発現ベクターは、ポリペプチドの発現を制御するための誘導性プロモーターを場合により有する。これらの方法は、Sambrook, J. and Russell, D. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYに記載されている。
【０２５０】
タンパク質は、任意のタンパク質液体クロマトグラフィーシステムによるタンパク質産生生物からの精製後、または組換え発現後、大規模に産生することができる。典型的なタンパク質液体クロマトグラフィーシステムとしては、ＦＰＬＣ、ＡＫＴＡシステム、Ｂｉｏ−Ｃａｄシステム、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＢｉｏＬｏｇｉｃシステムおよびＧｉｌｓｏｎ  ＨＰＬＣシステムが挙げられる。
【０２５１】
構築物
本発明は、共有結合している２つ以上のＣｓｇＧモノマーを含む構築物であって、モノマーの少なくとも１つが本発明の変異体モノマーである、構築物も提供する。本発明の構築物は、ポアを形成するその能力を保持する。このことは、上で論じたようにして判定することができる。本発明の１つまたは複数の構築物を使用して、ポリヌクレオチドを特徴づける、例えばシークエンシングするためのポアを形成することができる。構築物は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたは少なくとも１０のモノマーを含むことがある。構築物は、好ましくは２つのモノマーを含む。２つ以上のモノマーは、同じであることもあり、または異なることもある。
【０２５２】
構築物中の少なくとも１つのモノマーは、本発明の変異体モノマーである。構築物中の２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上または１０以上のモノマーが本発明の変異体モノマーであることもある。好ましくは、構築物中のすべてのモノマーが、本発明の変異体モノマーである。変異体モノマーは、同じであることもあり、または異なることもある。好ましい実施形態では、構築物は、本発明の２つの変異体モノマーを含む。
【０２５３】
構築物中の本発明の変異体モノマーは、好ましくはほぼ同じ長さである、または同じ長さである。構築物中の本発明の変異体モノマーのバレルは、好ましくはほぼ同じ長さである、または同じ長さである。長さは、アミノ酸の数および／または長さの単位で測定することができる。
【０２５４】
構築物は、本発明の変異体モノマーでない１つまたは複数のモノマーを含むことがある。本発明の非変異体モノマーでないＣｓｇＧ変異体モノマーとしては、上で論じたいずれのアミノ酸／位置も変異されていない配列番号３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８もしくは４２９または配列番号３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８もしくは４２９の比較バリアントを含むモノマーが挙げられる。構築物中の少なくとも１つのモノマーは、配列番号３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８もしくは４２９を含むことがあり、または配列番号３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８もしくは４２９で示される配列の比較バリアントを含むことがある。配列番号３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８または４２９の比較バリアントは、アミノ酸同一性に基づいて、その全配列にわたって３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８または４２９、４０または４１と少なくとも５０％相同である。より好ましくは、比較バリアントは、アミノ酸同一性に基づいて、配列全体にわたって配列番号３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８または４２９のアミノ酸配列と少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同であることがある。
【０２５５】
構築物中のモノマーは、好ましくは遺伝子的に融合されている。モノマーは、構築物全体が単一のポリヌクレオチド配列から発現される場合、遺伝子的に融合されている。構築物をコードする単一のポリヌクレオチド配列を形成するためにモノマーのコード配列をいかなる形で組み合わせてもよい。
【０２５６】
モノマーは、いかなる立体配置で遺伝子的に融合されていてもよい。モノマーは、それらの末端アミノ酸によって融合されていることもある。例えば、１つのモノマーのアミノ末端が別のモノマーのカルボキシ末端に融合されていることもある。構築物中の（アミノからカルボキシ方向に）第２のおよび後続のモノマーは、それらのアミノ末端にメチオニンを含むことがある（末端の各々が前のモノマーのカルボキシ末端に融合されている）。例えば、Ｍが（アミノ末端メチオニンを伴わない）モノマーであり、ｍＭが、アミノ末端メチオニンを伴うモノマーである場合、構築物は、配列Ｍ−ｍＭ、Ｍ−ｍＭ−ｍＭ、またはＭ−ｍＭ−ｍＭ−ｍＭを含むことがある。これらのメチオニンの存在は、通常は、全構築物をコードするポリヌクレオチド中の第２のまたは後続のモノマーをコードするポリヌクレオチドの５’末端の開始コドン（すなわちＡＴＧ）の発現の結果として生ずる。構築物中の（アミノからカルボキシ方向に）第１のモノマーもメチオニンを含むことがある（例えば、ｍＭ−ｍＭ、ｍＭ−ｍＭ−ｍＭ、またはｍＭ−ｍＭ−ｍＭ−ｍＭ）。
【０２５７】
２つ以上のモノマーが、互いに、直接、遺伝子的に融合されていることもある。モノマーは、好ましくは、リンカーを使用して遺伝子的に融合されている。モノマーの移動性を制限するようにリンカーを設計してもよい。好ましいリンカーは、アミノ酸配列（すなわち、ペプチドリンカー）である。上で論じたペプチドリンカーのいずれかを使用してもよい。
【０２５８】
別の好ましい実施形態では、モノマーは、化学的に融合されている。２つのモノマーは、２つの部分が化学的に結合されている、例えば化学的架橋剤によって結合されている場合、化学的に融合されている。上で論じた化学的架橋剤のいずれかを使用してもよい。リンカーは、本発明の変異体モノマーに導入された１つまたは複数のシステイン残基に結合されることもある。あるいは、リンカーは、構築物中のモノマーのうちの１つの末端に結合されることもある。
【０２５９】
構築物が様々なモノマーを含有する場合、大過剰のモノマー中のリンカーの濃度を保持することによってモノマー同士の架橋を防止することができる。あるいは、２つのリンカーが使用される「鍵と鍵穴」配置を使用してもよい。各リンカーの一方の末端のみが互いに反応してより長いリンカーを形成することができる。そのリンカーの他方の末端は、各々が様々なモノマーと反応する。そのようなリンカーは、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３２号明細書（国際公開第２０１０／０８６６０２号パンフレットとして公開）に記載されている。
【０２６０】
ポリヌクレオチド
本発明は、本発明の変異体モノマーをコードするポリヌクレオチド配列も提供する。変異体モノマーは、上で論じたもののいずれかであってもよい。ポリヌクレオチド配列は、ヌクレオチド同一性に基づいて、全配列にわたって配列番号３８９と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％相同の配列を好ましくは含む。連続する３００以上、例えば３７５、４５０、５２５または６００以上のヌクレオチドのストレッチにわたって、少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％または９５％ヌクレオチド同一性（「堅い相同性」）があることもある。相同性は、上で説明したように算出することができる。ポリヌクレオチド配列は、遺伝コードの縮重に基づいて配列番号３８９とは異なる配列を含むことがある。
【０２６１】
本発明は、本発明の遺伝子融合構築物のいずれかをコードするポリヌクレオチド配列も提供する。ポリヌクレオチドは、好ましくは、配列番号３８９で示される配列の２つ以上のバリアントを含む。ポリヌクレオチド配列は、ヌクレオチド同一性に基づいて、全配列にわたって配列番号３８９と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の相同性を有する２つ以上の配列を好ましくは含む。連続する６００以上、例えば７５０、９００、１０５０または１２００以上のヌクレオチドのストレッチにわたって、少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％または９５％ヌクレオチド同一性（「堅い相同性」）があることもある。相同性は、上で説明したように算出することができる。
【０２６２】
ポリヌクレオチド配列は、当技術分野における標準的方法を使用して誘導および複製することができる。野生型ＣｓｇＧをコードする染色体ＤＮＡを大腸菌（Escherichia coli）などのポア産生生物から抽出することができる。特異的プライマーを伴うＰＣＲを使用して、ポアサブユニットをコードする遺伝子を増幅することもできる。その後、その増幅された配列は定方向突然変異誘発されることがある。好適な定方向突然変異誘発方法は当技術分野において公知であり、連鎖反応を含む、例えば併用する。本発明の構築物をコードするポリヌクレオチドは、周知の技術、例えば、Sambrook, J. and Russell, D. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYに記載されている技術を使用して、作製することができる。
【０２６３】
その後、その得られたポリヌクレオチド配列をクローニングベクターなどの複製可能な組換えベクターに組み込むことができる。そのベクターを使用して、適合性宿主細胞においてポリヌクレオチドを複製することができる。このように、ポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチドを複製可能なベクターに導入すること、適合性宿主にベクターを導入すること、およびベクターの複製を起こさせる条件下で宿主細胞を増殖させることによって作製することができる。ベクターを宿主細胞から回収することができる。ポリヌクレオチドのクローニングに好適な宿主細胞は当技術分野において公知であり、そのような宿主細胞は、下でより詳細に説明する。
【０２６４】
ポリヌクレオチド配列を好適な発現ベクターにクローニングすることができる。発現ベクター中のポリヌクレオチド配列は、通常は、宿主細胞によるコード配列の発現をもたらすことができる制御配列に作動可能に連結されている。そのような発現ベクターを使用してポアサブユニットを発現させることができる。
【０２６５】
用語「作動可能に連結された」は、記載する成分がそれらの所期の様式で機能することを可能にする関係にある、並置を指す。コード配列に「作動可能に連結された」制御配列は、コード配列の発現が制御配列と適合する条件下で達成されるようにライゲーションされている。同じまたは異なるポリヌクレオチド配列の複数のコピーがベクターに導入されることもある。
【０２６６】
その後、その発現ベクターを好適な宿主細胞に導入することができる。このように、本発明の変異体モノマーまたは構築物は、ポリヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入すること、ベクターを適合性細菌宿主細胞に導入すること、およびポリヌクレオチド配列の発現を起こさせる条件下で宿主細胞を増殖させることによって産生することができる。これらの組換え発現モノマーまたは構築物は、宿主細胞膜内で自己集合してポアを構築することができる。あるいは、このようにして産生された組換えポアを宿主細胞から除去し、別の膜に挿入することができる。少なくとも２つの異なるモノマーまたは構築物を含むポアを産生する場合、それらの異なるモノマーまたは構築物を、上記の異なる宿主細胞で別々に発現させ、宿主細胞から除去し、別の膜、例えばウサギ細胞膜または合成膜の中でポアに組立てることができる。
【０２６７】
ベクターは、例えば、複製起点、場合によっては前記ポリヌクレオチド配列の発現のためのプロモーター、および場合によってはプロモーターの制御因子を備えている、プラスミド、ウイルスまたはファージベクターでありうる。ベクターは、１つまたは複数の選択マーカー遺伝子、例えば、テトラサイクリン耐性遺伝子を含有することがある。プロモーターおよび他の発現調節シグナルは、発現ベクターが設計される宿主細胞と適合するように選択することができる。Ｔ７、ｔｒｃ、ｌａｃ、ａｒａまたはλＬプロモーターが通常は使用される。
【０２６８】
宿主細胞は、通常は、モノマーまたは構築物を高レベルで発現する。ポリヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、その細胞を形質転換するために使用された発現ベクターと適合するように選択されることになる。宿主細胞は、通常は細菌細胞、好ましくは大腸菌（Escherichia coli）細胞である。λＤＥ３溶原菌、例えば、Ｃ４１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＪＭ１０９（ＤＥ３）、Ｂ８３４（ＤＥ３）、ＴＵＮＥＲ、ＯｒｉｇａｍｉおよびＯｒｉｇａｍｉ  Ｂを有するあらゆる細胞が、Ｔ７プロモーターを含むベクターを発現することができる。上に列挙した条件に加えて、Cao et al., 2014, PNAS, Structure of the nonameric bacterial amyloid secretion channel, doi - 1411942111およびGoyal et al., 2014, Nature, 516, 250-253 structural and mechanistic insights into the bacterial amyloid secretion channel CsgGにおいて言及されている方法のいずれかを使用してＣｓｇＧタンパク質を発現させることができる。
【０２６９】
本発明は、本発明の変異体モノマーまたは本発明の構築物を産生する方法も含む。この方法は、好適な宿主細胞において本発明のポリヌクレオチドを発現させるステップを含む。ポリヌクレオチドは、好ましくはベクターの一部であり、好ましくはプロモーターに作動可能に連結されている。
【０２７０】
ポア
本発明は、様々なポアも提供する。本発明のポアは、高い感度で異なるヌクレオチドを識別することができるため、ポリヌクレオチド配列の特徴づけ、例えばシークエンシングに理想的である。ポアは、ＤＮＡおよびＲＮＡ中の４ヌクレオチドを驚くほど区別することができる。本発明のポアは、メチル化ヌクレオチドと非メチル化ヌクレオチドを区別することさえできる。本発明のポアの塩基分解能は、驚くほど高い。ポアは、４つすべてのＤＮＡヌクレオチドのほぼ完全な分離を示す。さらに、ポアは、ポア内での滞留時間およびポアを通って流れる電流に基づいて、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）とメチル−ｄＣＭＰとを識別する。
【０２７１】
本発明のポアは、広範な条件下で異なるヌクレオチド間の識別をすることもできる。特に、ポアは、核酸の特徴づけ、例えばシークエンシングに好都合である条件下で、ヌクレオチド間の識別をすることになる。本発明のポアが異なるヌクレオチド間の識別をすることができる程度は、印加する電位、塩濃度、緩衝液、温度、ならびに添加剤、例えば尿素、ベタインおよびＤＴＴ、の存在を変更することによって制御することができる。このことによって、特にシークエンシングの際、ポアの機能を微調整することが可能になる。このことは、下でより詳細に論じる。本発明のポアを使用して、ヌクレオチドごとにではなく、１つまたは複数のモノマーとの相互作用からポリヌクレオチドポリマーを同定することもできる。
【０２７２】
本発明のポアは、単離されていることもあり、実質的に単離されていることもあり、精製されていることもあり、または実質的に精製されていることもある。本発明のポアは、脂質または他のポアなどのいずれの他の成分も完全にない場合、単離または精製されている。ポアは、その所期の使用に干渉しないであろう担体または希釈剤と混合されている場合、実質的に単離されている。例えば、ポアは、１０％未満、５％未満、２％未満または１％未満の他の成分、例えばトリブロックコポリマー、脂質または他のポア、を含む形態で存在する場合、実質的に単離または実質的に精製されている。あるいは、本発明のポアは、膜内に存在することもある。好適な膜は、下で論じる。
【０２７３】
本発明のポアは、個別のまたは単一のポアとして存在することがある。あるいは、本発明のポアは、２つ以上のポアの均質なまたは不均質な集団で存在することもある。
【０２７４】
ホモオリゴマーポア
本発明は、本発明の同一の変異体モノマーを含むＣｓｇＧに由来するホモオリゴマーポアも提供する。ホモオリゴマーポアは、本発明の変異体のいずれかを含むことがある。本発明のホモオリゴマーポアは、ポリヌクレオチドの特徴づけ、例えばシークエンシングに理想的である。本発明のホモオリゴマーポアは、上で論じた利点のいずれかを有することができる。
【０２７５】
ホモオリゴマーポアは、あらゆる数の変異体モノマーを含有することがある。ポアは、通常は、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたは少なくとも１０の同一の変異体モノマー、例えば、７つ、８つ、９つまたは１０の変異体モノマーを含む。ポアは、好ましくは、８つまたは９つの同一の変異体モノマーを含む。１つまたは複数、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたは１０の変異体モノマーは、好ましくは、上で論じたように化学的に修飾される。
【０２７６】
ポアを作製する方法は、下でより詳細に論じる。
【０２７７】
ヘテロオリゴマーポア
本発明は、本発明の少なくとも１つの変異体モノマーを含むＣｓｇＧに由来するヘテロオリゴマーポアも提供する。本発明のヘテロオリゴマーポアは、ポリヌクレオチドの特徴づけ、例えばシークエンシングに理想的である。ヘテロオリゴマーポアは、当技術分野において公知の方法（例えば、Protein Sci. 2002 Jul; 11 (7): 1813-24）を使用して作製することができる。
【０２７８】
ヘテロオリゴマーポアは、そのポアを形成するために十分なモノマーを含有する。それらのモノマーは、いかなるタイプのものであってもよい。ポアは、通常は、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたは少なくとも１０のモノマー、例えば、７つ、８つ、９つまたは１０のモノマーを含む。ポアは、好ましくは、８つまたは９つのモノマーを含む。
【０２７９】
好ましい実施形態では、モノマーのすべて（例えば、モノマーのうちの１０、９、８または７つ）が本発明の変異体モノマーであり、それらのうちの少なくとも１つは、他と異なる。より好ましい実施形態では、ポアは、本発明の８つまたは９つの変異体モノマーを含み、それらのうちの少なくとも１つは、他と異なる。それらは、すべてが互いに異なることもある。
【０２８０】
ポア中の本発明の変異体モノマーは、好ましくはほぼ同じ長さである、または同じ長さである。ポア中の本発明の変異体モノマーのバレルは、好ましくはほぼ同じ長さである、または同じ長さである。長さは、アミノ酸の数および／または長さの単位で測定することができる。
【０２８１】
別の好ましい実施形態では、変異体モノマーの少なくとも１つは、本発明の変異体モノマーではない。この実施形態での残りのモノマーは、好ましくは、本発明の変異体モノマーである。したがって、ポアは、本発明の９つ、８つ、７つ、６つ、５つ、４つ、３つ、２つまたは１つの変異体モノマーを含むことがある。ポア内のいかなる数のモノマーが本発明の変異体モノマーでなくてもよい。ポアは、好ましくは、本発明の７つまたは８つの変異体モノマーと、本発明のモノマーでないモノマーとを含む。本発明の変異体モノマーは、同じであることもあり、または異なることもある。
【０２８２】
構築物中の本発明の変異体モノマーは、好ましくはほぼ同じ長さである、または同じ長さである。構築物中の本発明の変異体モノマーのバレルは、好ましくはほぼ同じ長さである、または同じ長さである。長さは、アミノ酸の数および／または長さの単位で測定することができる。
【０２８３】
ポアは、本発明の変異体モノマーでない１つまたは複数のモノマーを含むことがある。本発明の変異体モノマーでないＣｓｇＧモノマーとしては、上で論じたいずれのアミノ酸／位置も変異／置換されていない配列番号３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８もしくは４２９または配列番号３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８もしくは４２９の比較バリアントを含むモノマーが挙げられる。配列番号３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８または４２９の比較バリアントは、アミノ酸同一性に基づいて、その全配列にわたって配列番号３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８または４２９と通常は少なくとも５０％相同である。より好ましくは、比較バリアントは、アミノ酸同一性に基づいて、配列全体にわたって配列番号３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８または４２９のアミノ酸配列と少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同であることがある。
【０２８４】
上で論じたすべての実施形態では、変異体モノマーの１つまたは複数、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたは１０が、好ましくは、上で論じたように化学的に修飾される。
【０２８５】
ポアを作製する方法は、下でより詳細に論じる。
【０２８６】
構築物含有ポア
本発明は、本発明の少なくとも１つの構築物を含むポアも提供する。本発明の構築物は、ＣｓｇＧに由来する共有結合している２つ以上のモノマーを含み、モノマーの少なくとも１つは本発明の変異体モノマーである。言い換えると、構築物は、１つより多くのモノマーを含有しなければならない。ポアは、そのポアを形成するために十分な構築物および、必要に応じて、モノマーを含有する。例えば、オクタマーポアは、（ａ）各々が２つの構築物を含む４つの構築物を含むこともあり、（ｂ）各々が４つのモノマーを含む２つの構築物を含むこともあり、または（ｂ）２つのモノマーを含む１つの構築物と、構築物の一部を形成しない６つのモノマーとを含むこともある。例えば、ナノマーポアは、（ａ）各々が２つの構築物を含む４つの構築物と、構築物の一部を形成しない１つのモノマーとを含むこともあり、（ｂ）各々が４つのモノマーを含む２つの構築物と、構築物の一部を形成しないモノマーとを含むこともあり、または（ｂ）２つのモノマーを含む１つの構築物と、構築物の一部を形成しない７つのモノマーとを含むこともある。構築物とモノマーの他の組合せを当業者は予想することができる。
【０２８７】
ポア中のモノマーの少なくとも２つは、本発明の構築物の形態のものである。構築物およびしたがってポアは、本発明の少なくとも１つの変異体モノマーを含む。ポアは、合計で、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたは少なくとも１０のモノマー、例えば、７つ、８つ、９つまたは１０のモノマーを通常は含む（モノマーの少なくとも２つは、構築物中になければならない）。ポアは、好ましくは、８つまたは９つのモノマーを含む（モノマーの少なくとも２つは、構築物中になければならない）。
【０２８８】
構築物含有ポアは、ホモオリゴマーである（すなわち、同一の構築物を含む）こともあり、またはヘテロオリゴマー（すなわち、少なくとも１つの構築物が他と異なる場合）であることもある。
【０２８９】
ポアは、通常は、（ａ）２つのモノマーを含む１つの構築物および（ｂ）５つ、６つ、７つまたは８つのモノマーを含有する。構築物は、上で論じたもののいずれかであってもよい。モノマーは、本発明の変異体モノマー、配列番号３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８または４２９を含むモノマー、および上で論じた通りの配列番号３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８または４２９の比較バリアントを含む変異体モノマーを含む、上で論じたもののいずれかであってもよい。
【０２９０】
別の典型的なポアは、本発明の１つより多くの構築物、例えば、本発明の２つ、３つまたは４つの構築物を含む。必要に応じて、そのようなポアは、そのポアを形成するために十分なさらなるモノマーまたは構築物をさらに含む。さらなるモノマーは、本発明の変異体モノマー、配列番号３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８または４２９を含むモノマー、および上で論じた通りの配列番号３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８または４２９の比較バリアントを含む変異体モノマーを含む、上で論じたもののいずれかであってもよい。さらなる構築物は、上で論じたもののいずれであってもよく、あるいは上で論じた配列番号３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８もしくは４２９を含むモノマーまたは配列番号３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８または４２９の比較バリアントを各々が含む、共有結合している２つ以上のＣｓｇＧモノマーを含む構築物であってもよい。
【０２９１】
本発明のさらなるポアは、２つのモノマーを含む構築物のみを含み、例えば、ポアは、２つのモノマーを含む４つ、５つ、６つ、７つまたは８つの構築物を含むことがある。少なくとも１つの構築物は、本発明の構築物であり、すなわち、少なくとも１つの構築物中の少なくとも１つのモノマー、好ましくは、少なくとも１つの構築物中の各モノマーは、本発明の変異体モノマーである。２つのモノマーを含む構築物のすべてが本発明の構築物であることもある。
【０２９２】
本発明による特異的ポアは、２つのモノマーを各々が含む本発明の４つの構築物であって、各構築物中の少なくとも１つのモノマー、好ましくは各構築物中の各モノマーが本発明の変異体モノマーである、４つの構築物を含む。構築物はオリゴマー化して、各構築物の１つだけのモノマーがポアのチャネルに寄与するような構造を有するポアにすることもできる。通常は、構築物の他のモノマーは、ポアのチャネルの外側にあることになる。例えば、本発明のポアは、２つのモノマーを含む７つ、８つ、９つまたは１０の構築物であって、チャネルが７つ、８つ、９つまたは１０のモノマーを含む、構築物を含むことがある。
【０２９３】
上記の構築物に変異を導入することができる。変異は、交互であることもある。すなわち、２つのモノマー構築物内の各モノマーの変異が異なり、構築物がホモオリゴマーとして組立てられ、その結果、交互修飾となる。言い換えると、ＭｕｔＡおよびＭｕｔＢを含むモノマーが融合され、Ａ−Ｂ：Ａ−Ｂ：Ａ−Ｂ：Ａ−Ｂポアを形成するように組立てられる。あるいは、変異は、隣接していることもある。すなわち、同一の変異が構築物中の２つのモノマーに導入され、ついでこの構築物が、異なる変異体モノマーまたは構築物を用いてオリゴマー化される。言い換えると、ＭｕｔＡを含むモノマーが融合され、その後、ＭｕｔＢ含有モノマーを用いてＡ−Ａ：Ｂ：Ｂ：Ｂ：Ｂ：Ｂ；Ｂを形成するようにオリゴマー化される。
【０２９４】
構築物含有ポア中の本発明のモノマーの１つまたは複数が、上で論じたように化学的に修飾されることもある。
【０２９５】
分析物特徴づけ
本発明は、標的分析物の存在、不在または１つもしくは複数の特徴を判定する方法を提供する。この方法は、標的分析物とＣｓｇＧポアまたはその変異体、例えば本発明のポアとを、標的分析物がポアに対して、例えばポアを通って、移動するように接触させるステップ、および分析物がポアに対して移動しているときに１回または複数回の測定を行うことによって分析物の存在、不在または１つもしくは複数の特徴を判定するステップを含む。標的分析物をテンプレート分析物または目的の分析物と呼ぶこともある。
【０２９６】
方法は、標的分析物とＣｓｇＧポアまたはその変異体、例えば本発明のポアとを、標的分析物がポアを通って移動するように接触させるステップを含む。ポアは、通常は、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたは少なくとも１０のモノマー、例えば、７つ、８つ、９つまたは１０のモノマーを含む。ポアは、好ましくは、８つまたは９つの同一のモノマーを含む。好ましくは、１つまたは複数、例えば２、３、４、５、６、７、８、９または１０、のモノマーが、上で論じたように化学的に修飾される。
【０２９７】
ＣｓｇＧポアは、いずれの生物に由来してもよい。ＣｓｇＧポアは、配列番号３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８または４２９で示される配列を含むモノマーを含むことがある。ＣｓｇＧポアは、配列番号３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８または４２９で示される配列を各々が含む、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたは少なくとも１０のモノマー、例えば、７つ、８つ、９つまたは１０のモノマーを含むことがある（すなわち、ポアは、同じ生物からの同一のモノマーを含むホモオリゴマーである）。ＣｓｇＧは、配列番号３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８または４２９で示される配列を各々が含む、モノマーの任意の組合せを含むこともある。例えば、ポアは、配列番号３９０で示される配列を含む７つのモノマーと、配列番号３９１で示される配列を含む２つのモノマーとを含むことがある。
【０２９８】
ＣｓｇＧ変異体は、あらゆる数の変異体モノマー、例えば、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたは少なくとも１０のモノマー、例えば、７つ、８つ、９つまたは１０のモノマーを含むことがある。変異体モノマーは、配列番号３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８または４２９で示される配列の比較バリアントを含むこともある。比較バリアントは、上で論じている。比較バリアントは、ポアを形成することができなければならず、本発明のポアに関して上で論じた相同性％のいずれかを有することがある。
【０２９９】
ＣｓｇＧ変異体は、好ましくは９つのモノマーを含み、それらのモノマーの少なくとも１つは、配列番号３９０で示される配列のバリアントであって、（ａ）次の位置の１つもしくは複数における変異：Ｎ４０、Ｑ４２、Ｄ４３、Ｅ４４、Ｋ４９、Ｙ５１、Ｓ５４、Ｎ５５、Ｆ５６、Ｓ５７、Ｑ６２、Ｅ１０１、Ｎ１０２、Ｅ１２４、Ｅ１３１、Ｒ１４２、Ｄ１４９、Ｔ１５０、Ｅ１８５、Ｒ１９２、Ｄ１９５、Ｅ２０１およびＥ２０３、例えば、次の位置の１つもしくは複数における変異：Ｎ４０、Ｑ４２、Ｄ４３、Ｅ４４、Ｋ４９、Ｙ５１、Ｓ５４、Ｎ５５、Ｆ５６、Ｓ５７、Ｑ６２、Ｅ１０１、Ｎ１０２、Ｅ１３１、Ｄ１４９、Ｔ１５０、Ｅ１８５、Ｄ１９５、Ｅ２０１およびＥ２０３、または次の位置の１つもしくは複数における１つもしくは複数の変異：Ｎ４０、Ｑ４２、Ｄ４３、Ｅ４４、Ｋ４９、Ｙ５１、Ｎ５５、Ｆ５６、Ｅ１０１、Ｎ１０２、Ｅ１３１、Ｄ１４９、Ｔ１５０、Ｅ１８５、Ｄ１９５、Ｅ２０１およびＥ２０３、ならびに／あるいは（ｂ）次の位置の１つもしくは複数の欠失：Ｆ４８、Ｋ４９、Ｐ５０、Ｙ５１、Ｐ５２、Ａ５３、Ｓ５４、Ｎ５５、Ｆ５６およびＳ５７、を含むバリアントである。バリアントは、（ａ）を含むこともあり、（ｂ）を含むこともあり、または（ａ）と（ｂ）を含むこともある。（ａ）において、位置Ｎ４０、Ｑ４２、Ｄ４３、Ｅ４４、Ｋ４９、Ｙ５１、Ｓ５４、Ｎ５５、Ｆ５６、Ｓ５７、Ｑ６２、Ｅ１０１、Ｎ１０２、Ｒ１２４、Ｅ１３１、Ｒ１４２、Ｄ１４９、Ｅ１８５、Ｒ１９２、Ｄ１９５、Ｅ２０１およびＥ２０３のあらゆる数および組合せが、変異されていることがある。上で論じたように、Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６の１つまたは複数の変異は、ポリヌクレオチドがポアを通って移動するときの電流に寄与するヌクレオチドの数を減少させることによって、ポリヌクレオチドがポアを通って移動しているときの観測電流とポリヌクレオチドとの直接的関連の同定をより容易にすることができる。
【０３００】
（ｂ）において、Ｆ４８、Ｋ４９、Ｐ５０、Ｙ５１、Ｐ５２、Ａ５３、Ｓ５４、Ｎ５５、Ｆ５６およびＳ５７のあらゆる数および組合せが、欠失されていることがある。バリアントは、本発明の変異体モノマーに関して上で論じた特異的変異／置換またはそれらの組合せのいずれかを含むことがある。
【０３０１】
本発明の方法での使用に好ましいバリアントは、次の置換の１つまたは複数を含む：（ａ）Ｆ５６Ｎ、Ｆ５６Ｑ、Ｆ５６Ｒ、Ｆ５６Ｓ、Ｆ５６Ｇ、Ｆ５６ＡまたはＦ５６ＫまたはＦ５６Ａ、Ｆ５６Ｐ、Ｆ５６Ｒ、Ｆ５６Ｈ、Ｆ５６Ｓ、Ｆ５６Ｑ、Ｆ５６Ｉ、Ｆ５６Ｌ、Ｆ５６ＴまたはＦ５６Ｇ、（ｂ）Ｎ５５Ｑ、Ｎ５５Ｒ、Ｎ５５Ｋ、Ｎ５５Ｓ、Ｎ５５Ｇ、Ｎ５５ＡまたはＮ５５Ｔ、（ｃ）Ｙ５１Ｌ、Ｙ５１Ｖ、Ｙ５１Ａ、Ｙ５１Ｎ、Ｙ５１Ｑ、Ｙ５１ＳまたはＹ５１Ｇ、（ｄ）Ｔ１５０Ｉ、（ｅ）Ｓ５４Ｐ、および（ｆ）Ｓ５７Ｐ。バリアントは、（ａ）〜（ｆ）のあらゆる数および組合せを含むことがある。
【０３０２】
本発明の方法での使用に好ましいバリアントは、Ｑ６２ＲまたはＱ６２Ｋを含む。
【０３０３】
本発明の方法での使用に好ましいバリアントは、Ｄ４３、Ｅ４４、Ｑ６２またはこれらの任意の組合せ、例えば、Ｄ４３、Ｅ４４、Ｑ６２、Ｄ４３／Ｅ４４、Ｄ４３／Ｑ６２、Ｅ４４／Ｑ６２またはＤ４３／Ｅ４４／Ｑ６２における変異を含む。
【０３０４】
バリアントは、
位置Ｙ５１、Ｆ５６、Ｄ１４９、Ｅ１８５、Ｅ２０１およびＥ２０３における変異、例えば、Ｙ５１Ｎ、Ｆ５６Ａ、Ｄ１４９Ｎ、Ｅ１８５Ｒ、Ｅ２０１ＮおよびＥ２０３Ｎ、
位置Ｎ５５における変異、例えば、Ｎ５５ＡまたはＮ５５Ｓ、
位置Ｙ５１における変異、例えば、Ｙ５１ＮまたはＹ５１Ｔ、
位置Ｓ５４における変異、例えば、Ｓ５４Ｐ、
位置Ｓ５７における変異、例えば、Ｓ５７Ｐ、
位置Ｆ５６における変異、例えば、Ｆ５６Ｎ、Ｆ５６Ｑ、Ｆ５６Ｒ、Ｆ５６Ｓ、Ｆ５６Ｇ、Ｆ５６ＡもしくはＦ５６ＫもしくはＦ５６Ａ、Ｆ５６Ｐ、Ｆ５６Ｒ、Ｆ５６Ｈ、Ｆ５６Ｓ、Ｆ５６Ｑ、Ｆ５６Ｉ、Ｆ５６Ｌ、Ｆ５６ＴもしくはＦ５６Ｇ、
位置Ｙ５１およびＦ５６における変異、例えば、Ｙ５１ＡおよびＦ５６Ａ、Ｙ５１ＡおよびＦ５６Ｎ、Ｙ５１ＩおよびＦ５６Ａ、Ｙ５１ＬおよびＦ５６Ａ、Ｙ５１ＴおよびＦ５６Ａ、Ｙ５１ＴおよびＦ５６Ｑ、Ｙ５１ＩおよびＦ５６Ｎ、Ｙ５１ＬおよびＦ５６Ｎ、もしくはＹ５１ＴおよびＦ５６Ｎ、好ましくはＹ５１ＩおよびＦ５６Ａ、Ｙ５１ＬおよびＦ５６Ａ、もしくはＹ５１ＴおよびＦ５６Ａ、より好ましくはＹ５１ＴおよびＦ５６Ｑ、もしくはより好ましくはＹ５１ＸおよびＦ５６Ｑ（ここでＸは任意のアミノ酸である）、
位置Ｎ５５およびＦ５６における変異、例えば、Ｎ５５ＸおよびＦ５６Ｑ（ここでＸは任意のアミノ酸である）、
位置Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６における変異、例えば、Ｙ５１Ａ、Ｎ５５ＳおよびＦ５６Ａ、Ｙ５１Ａ、Ｎ５５ＳおよびＦ５６Ｎ、もしくはＹ５１Ｔ、Ｎ５５ＳおよびＦ５６Ｑ、
位置Ｓ５４およびＦ５６における変異、例えば、Ｓ５４ＰおよびＦ５６Ａ、もしくはＳ５４ＰおよびＦ５６Ｎ、
位置Ｆ５６およびＳ５７における変異、例えば、Ｆ５６ＡおよびＳ５７Ｐ、もしくはＦ５６ＮおよびＳ５７Ｐ、
位置Ｄ１４９、Ｅ１８５およびＥ２０３における変異、例えば、Ｄ１４９Ｎ、Ｅ１８５ＮおよびＥ２０３Ｎ、
位置Ｄ１４９、Ｅ１８５、Ｅ２０１およびＥ２０３における変異、例えば、Ｄ１４９Ｎ、Ｅ１８５Ｎ、Ｅ２０１ＮおよびＥ２０３Ｎ、
位置Ｄ１４９、Ｅ１８５、Ｄ１９５、Ｅ２０１およびＥ２０３における変異、例えば、Ｄ１４９Ｎ、Ｅ１８５Ｒ、Ｄ１９５Ｎ、Ｅ２０１ＮおよびＥ２０３Ｎ、もしくはＤ１４９Ｎ、Ｅ１８５Ｒ、Ｄ１９５Ｎ、Ｅ２０１ＲおよびＥ２０３Ｎ、
位置Ｆ５６およびＮ１０２における変異、例えば、Ｆ５６ＱおよびＮ１０２Ｒ、
（ａ）位置Ｑ６２における変異、例えば、Ｑ６２ＲもしくはＱ６２Ｋ、および（ｂ）位置Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６の１つもしくは複数、例えば、位置Ｙ５１、Ｎ５５、Ｆ５６、Ｙ５１／Ｎ５５、Ｙ５１／Ｆ５６、Ｎ５５／Ｆ５６もしくはＹ５１／Ｎ５５／Ｆ５６における変異、例えば、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｑ６２Ｒ、
（ｉ）位置Ｄ４３、Ｅ４４、Ｑ６２もしくはこれらの任意の組合せ、例えば、位置Ｄ４３、Ｅ４４、Ｑ６２、Ｄ４３／Ｅ４４、Ｄ４３／Ｑ６２、Ｅ４４／Ｑ６２もしくはＤ４３／Ｅ４４／Ｑ６２における変異、および（ｉｉ）位置Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６の１つもしくは複数、例えば、位置Ｙ５１、Ｎ５５、Ｆ５６、Ｙ５１／Ｎ５５、Ｙ５１／Ｆ５６、Ｎ５５／Ｆ５６もしくはＹ５１／Ｎ５５／Ｆ５６における変異、例えば、Ｄ４３Ｎ／Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ、Ｅ４４Ｎ／Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ、Ｄ４３Ｎ／Ｅ４４Ｎ／Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ、Ｄ４３Ｎ／Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｑ６２Ｒ、Ｅ４４Ｎ／Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｑ６２Ｒ、もしくはＤ４３Ｎ／Ｅ４４Ｎ／Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ／Ｑ６２Ｒ、または
位置Ｔ１５０における変異、例えば、Ｔ１５０Ｉ
を含むことがある。
【０３０５】
本発明の方法での使用に好ましいポアは、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたは少なくとも１０のモノマー、例えば、７つ、８つ、９つまたは１０のモノマーを含み、モノマーの各々が、次の置換（ａ）Ｆ５６Ｎ、Ｆ５６Ｑ、Ｆ５６Ｒ、Ｆ５６Ｓ、Ｆ５６Ｇ、Ｆ５６ＡまたはＦ５６ＫまたはＦ５６Ａ、Ｆ５６Ｐ、Ｆ５６Ｒ、Ｆ５６Ｈ、Ｆ５６Ｓ、Ｆ５６Ｑ、Ｆ５６Ｉ、Ｆ５６Ｌ、Ｆ５６ＴまたはＦ５６Ｇ、（ｂ）Ｎ５５Ｑ、Ｎ５５Ｒ、Ｎ５５Ｋ、Ｎ５５Ｓ、Ｎ５５Ｇ、Ｎ５５ＡまたはＮ５５Ｔ、（ｃ）Ｙ５１Ｌ、Ｙ５１Ｖ、Ｙ５１Ａ、Ｙ５１Ｎ、Ｙ５１Ｑ、Ｙ５１ＳまたはＹ５１Ｇ、（ｄ）Ｔ１５０Ｉ、（ｅ）Ｓ５４Ｐ、および（ｆ）Ｓ５７Ｐのうちの１つまたは複数を含む、配列番号３９０のバリアントを含む。バリアントは、（ａ）〜（ｆ）のあらゆる数および組合せを含むことがある。これらの好ましいポア中のモノマーは、好ましくは同一である。
【０３０６】
本発明の方法での使用に好ましいポアは、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたは少なくとも１０のモノマー、例えば、７つ、８つ、９つまたは１０のモノマーを含み、モノマーの各々が、
【０３０７】
【化４】
2017527284.tif 000017
を含む、配列番号３９０のバリアントを含む。
【０３０８】
本発明で使用するためのＣｓｇＧ変異体は、好ましくは９つのモノマーを含み、それらのモノマーの少なくとも１つは、位置Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６の１つもしくは複数に変異を含む、配列番号３９０で示される配列のバリアントである。本発明の方法での使用に好ましいポアは、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたは少なくとも１０のモノマー、例えば、７つ、８つ、９つまたは１０のモノマーを含み、モノマーの各々が、位置Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６の１つもしくは複数に変異を含む、配列番号３９０のバリアントを含む。これらの好ましいポア中のモノマーは、好ましくは同一である。バリアントは、Ｙ５１、Ｎ５５、Ｆ５６、Ｙ５１／Ｎ５５、Ｙ５１／Ｆ５６、Ｎ５５／Ｆ５６、またはＹ５１／Ｎ５５／Ｆ５６における変異を含むことがある。バリアントは、上で論じた位置Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６の１つもしくは複数における、およびあらゆる組合せでの、特異的変異のいずれかを含むことがある。Ｙ５１、Ｎ５５およびＦ５６の１つもしくは複数がいかなるアミノ酸で置換されていてもよい。Ｙ５１は、Ｆ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ａ、Ｐ、Ｇ、Ｃ、Ｑ、Ｎ、Ｔ、Ｓ、Ｅ、Ｄ、Ｋ、ＨまたはＲ、例えば、Ａ、Ｓ、Ｔ、ＮまたはＱで置換されていることがある。Ｎ５５は、Ｆ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ａ、Ｐ、Ｇ、Ｃ、Ｑ、Ｔ、Ｓ、Ｅ、Ｄ、Ｋ、ＨまたはＲ、例えば、Ａ、Ｓ、ＴまたはＱで置換されていることがある。Ｆ５６は、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ａ、Ｐ、Ｇ、Ｃ、Ｑ、Ｎ、Ｔ、Ｓ、Ｅ、Ｄ、Ｋ、ＨまたはＲ、例えば、Ａ、Ｓ、Ｔ、ＮまたはＱで置換されていることがある。バリアントは、以下の１つまたは複数をさらに含むことがある：（ｉ）次の位置における１つまたは複数の変異（すなわち、次の位置の１つもしくは複数における変異）（ｉ）Ｎ４０、Ｄ４３、Ｅ４４、Ｓ５４、Ｓ５７、Ｑ６２、Ｒ９７、Ｅ１０１、Ｅ１２４、Ｅ１３１、Ｒ１４２、Ｔ１５０およびＲ１９２；（ｉｉｉ）Ｑ４２ＲまたはＱ４２Ｋ；（ｉｖ）Ｋ４９Ｒ；（ｖ）Ｎ１０２Ｒ、Ｎ１０２Ｆ、Ｎ１０２ＹまたはＮ１０２Ｗ；（ｖｉ）Ｄ１４９Ｎ、Ｄ１４９ＱまたはＤ１４９Ｒ；（ｖｉｉ）Ｅ１８５Ｎ、Ｅ１８５ＱまたはＥ１８５Ｒ；（ｖｉｉｉ）Ｄ１９５Ｎ、Ｄ１９５ＱまたはＤ１９５Ｒ；（ｉｘ）Ｅ２０１Ｎ、Ｅ２０１ＱまたはＥ２０１Ｒ；（ｘ）Ｅ２０３Ｎ、Ｅ２０３ＱまたはＥ２０３Ｒ；ならびに（ｘｉ）次の位置の１つもしくは複数の欠失：Ｆ４８、Ｋ４９、Ｐ５０、Ｙ５１、Ｐ５２、Ａ５３、Ｓ５４、Ｎ５５、Ｆ５６およびＳ５７。バリアントは、上で論じた（ｉ）および（ｉｉｉ）〜（ｘｉ）の組合せのいずれかを含むことがある。バリアントは、（ｉ）および（ｉｉｉ）〜（ｘｉ）について上で論じた実施形態のいずれかを含むことがある。
【０３０９】
（１）本発明の方法での使用に好ましいバリアントは、または（２）本発明の方法での使用に好ましいポアは、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたは少なくとも１０のモノマー、例えば、７つ、８つ、９つまたは１０のモノマーを含み、モノマーの各々が、Ｙ５１Ｒ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｎ／Ｆ５６Ｎ、Ｙ５１Ｍ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｌ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｉ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｖ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｐ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｇ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｃ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｑ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｎ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｓ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｅ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｄ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｋ／Ｆ５６Ｑ、またはＹ５１Ｈ／Ｆ５６Ｑを含む、配列番号３９０のバリアントを含む。
【０３１０】
（１）本発明の方法での使用に好ましいバリアントは、または（２）本発明の方法での使用に好ましいポアは、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたは少なくとも１０のモノマー、例えば、７つ、８つ、９つまたは１０のモノマーを含み、モノマーの各々が、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｑ／Ｆ５６Ｑ、またはＹ５１Ａ／Ｆ５６Ｑを含む、配列番号３９０のバリアントを含む。
【０３１１】
（１）本発明の方法での使用に好ましいバリアントは、または（２）本発明の方法での使用に好ましいポアは、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたは少なくとも１０のモノマー、例えば、７つ、８つ、９つまたは１０のモノマーを含み、モノマーの各々が、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｆ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｍ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｌ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｉ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｖ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｐ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｇ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｃ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｎ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｔ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｓ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｅ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｄ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｋ、Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｈ、またはＹ５１Ｔ／Ｆ５６Ｒを含む、配列番号３９０のバリアントを含む。
【０３１２】
（１）本発明の方法での使用に好ましいバリアントは、または（２）本発明の方法での使用に好ましいポアは、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたは少なくとも１０のモノマー、例えば、７つ、８つ、９つまたは１０のモノマーを含み、モノマーの各々が、Ｙ５１Ｔ／Ｎ５５Ｑ、Ｙ５１Ｔ／Ｎ５５Ｓ、またはＹ５１Ｔ／Ｎ５５Ａを含む、配列番号３９０のバリアントを含む。
【０３１３】
（１）本発明の方法での使用に好ましいバリアントは、または（２）本発明の方法での使用に好ましいポアは、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたは少なくとも１０のモノマー、例えば、７つ、８つ、９つまたは１０のモノマーを含み、モノマーの各々が、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｆ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｌ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｉ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｖ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｐ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｇ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｃ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｎ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｔ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｓ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｅ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｄ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｋ、Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｈ、またはＹ５１Ａ／Ｆ５６Ｒを含む、配列番号３９０のバリアントを含む。
【０３１４】
（１）本発明の方法での使用に好ましいバリアントは、または（２）本発明の方法での使用に好ましいポアは、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたは少なくとも１０のモノマー、例えば、７つ、８つ、９つまたは１０のモノマーを含み、モノマーの各々が、Ｙ５１Ｃ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｅ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｄ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｋ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｈ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｑ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｎ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｓ／Ｆ５６Ａ、Ｙ５１Ｐ／Ｆ５６Ａ、またはＹ５１Ｖ／Ｆ５６Ａを含む、配列番号３９０のバリアントを含む。
【０３１５】
（１）本発明の方法での使用に好ましいバリアントは、または（２）本発明の方法での使用に好ましいポアは、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたは少なくとも１０のモノマー、例えば、７つ、８つ、９つまたは１０のモノマーを含み、モノマーの各々が、
【０３１６】
【化５】
2017527284.tif 000018
を含む、配列番号３９０のバリアントを含む。
【０３１７】
（１）本発明の方法での使用に好ましいバリアントは、または（２）本発明の方法での使用に好ましいポアは、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたは少なくとも１０のモノマー、例えば、７つ、８つ、９つまたは１０のモノマーを含み、モノマーの各々が、
【０３１８】
【化６】
2017527284.tif 000019
を含む、配列番号３９０のバリアントを含む。
【０３１９】
これらの好ましいポア中のモノマーは、好ましくは同一である。
【０３２０】
本発明の方法での使用に好ましいポアは、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたは少なくとも１０のモノマー、例えば、７つ、８つ、９つまたは１０のモノマーを含み、モノマーの各々が、Ｆ５６Ａ、Ｆ５６Ｐ、Ｆ５６Ｒ、Ｆ５６Ｈ、Ｆ５６Ｓ、Ｆ５６Ｑ、Ｆ５６Ｉ、Ｆ５６Ｌ、Ｆ５６ＴまたはＦ５６Ｇを含む、配列番号３９０のバリアントを含む。これらの好ましいポア中のモノマーは、好ましくは同一である。
【０３２１】
ＣｓｇＧ変異体は、本実施例において開示する配列番号３９０のバリアントのいずれかを含むことがあり、または本実施例において開示するポアのいずれかを含むことがある。
【０３２２】
ＣｓｇＧ変異体は、最も好ましくは本発明のポアである。
【０３２３】
ステップ（ａ）および（ｂ）は、好ましくは、膜を介して印加される電位を用いて行われる。下でより詳細に論じるように、印加される電位によって、通常は、ポアとポリヌクレオチド結合タンパク質との複合体が形成される結果となる。印加される電位は、電圧電位であることがある。あるいは、印加される電位は、化学的電位であることもある。これについての一例は、両親媒性層を横断する塩勾配の使用である。塩勾配は、Holden et al., J Am Chem Soc. 2007 Jul 11; 129(27):8650-5に開示されている。
【０３２４】
方法は、標的分析物の存在、不在または１つもしくは複数の特徴を判定する方法である。方法は、少なくとも１つの標的分析物の存在、不在または１つもしくは複数の特徴を判定する方法であることがある。方法は、２つ以上の標的分析物の存在、不在または１つもしくは複数の特徴の判定に関することがある。方法は、あらゆる数の分析物、例えば、２、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、１００以上の分析物の存在、不在または１つもしくは複数の特徴の判定を含むことができる。１つまたは複数の分析物のあらゆる数の特徴、例えば、１、２、３、４、５、１０以上の特徴を判定することができる。
【０３２５】
標的分析物は、好ましくは、金属イオン、無機塩、ポリマー、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、色素、漂白剤、医薬品、診断剤、レクリエーショナルドラッグ、爆発物または環境汚染物質である。方法は、同じタイプの２つ以上の分析物、例えば、２つ以上のタンパク質、２つ以上のヌクレオチドまたは２つ以上の医薬品の存在、不在または１つもしくは複数の特徴の判定に関することもある。あるいは、方法は、異なるタイプの２つ以上の分析物、例えば、１つもしくは複数のタンパク質、１つもしくは複数のヌクレオチドおよび１つもしくは複数の医薬品の存在、不在または１つもしくは複数の特徴の判定に関することもある。
【０３２６】
標的分析物を細胞から分泌することができる。あるいは、標的分析物は、細胞内に存在する分析物であることもあり、したがって、本発明を行う前に該分析物を細胞から抽出しなければならない。
【０３２７】
分析物は、好ましくは、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチドおよび／またはタンパク質である。アミノ酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、天然に存在することもあり、または天然に存在しないこともある。ポリペプチドまたはタンパク質は、合成または修飾アミノ酸を含有することができる。アミノ酸に対する多数の異なるタイプの修飾が当技術分野において公知である。好適なアミノ酸およびそれらの修飾は、上記である。本発明の目的について、標的分析物を当技術分野において利用できる任意の方法によって修飾することができると解されたい。
【０３２８】
タンパク質は、酵素、抗体、ホルモン、増殖因子または増殖調節タンパク質、例えばサイトカインであることができる。サイトカインは、インターロイキン、好ましくはＩＦＮ−１、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２およびＩＬ−１３、インターフェロン、好ましくはＩＬ−γ、ならびに他のサイトカイン、例えばＴＮＦ−αから選択することができる。タンパク質は、細菌タンパク質、真菌タンパク質、ウイルスタンパク質または寄生虫由来タンパク質であってもよい。
【０３２９】
標的分析物は、好ましくは、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドである。ヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、下で論じる。オリゴヌクレオチドは、通常は５０以下のヌクレオチド、例えば、４０以下、３０以下、２０以下、１０以下または５以下のヌクレオチドを有する、短いヌクレオチドポリマーである。オリゴヌクレオチドは、脱塩基および修飾ヌクレオチドを含む、下で論じるヌクレオチドのいずれかを含むことがある。
【０３３０】
標的ポリヌクレオチドなどの標的分析物は、下で論じる好適な試料のいずれかの中に存在することがある。
【０３３１】
ポアは、通常は、下で論じるような膜内に存在する。下で論じる方法を使用して標的分析物をその膜とカップリングすることまたはその膜に送達することができる。
【０３３２】
下で論じる測定のいずれかを使用して、標的分析物の存在、不在または１つもしくは複数の特徴を判定することができる。方法は、好ましくは、標的分析物とポアとを、分析物がポアに対して、例えばポアを通って、移動するように接触させるステップ、および分析物がポアに対して移動しているときにポアを通過する電流を測定することによって分析物の存在、不在または１つもしくは複数の特徴を判定するステップを含む。
【０３３３】
標的分析物は、電流が分析物に特異的な様式でポアを通って流れた場合（すなわち、ポアを通って流れる、分析物と関連づけられる特有の電流が検出された場合）、存在する。分析物は、電流がヌクレオチドに特異的な様式でポアを通って流れなかった場合、不在である。対照実験を分析物の存在下で行って、ポアを通って流れる電流に対するその分析物の影響の与え方を判定することができる。
【０３３４】
本発明を使用して、類似した構造の分析物をそれらがポアを通過する電流に与える異なる影響に基づいて区別することができる。個々の分析物を、単一分子レベルで、それらがポアと相互作用するときのそれらの電流振幅から同定することができる。本発明を使用して、特定の分析物が試料中に存在するか否かを判定することもできる。本発明を使用して、試料中の特定の分析物の濃度を測定することもできる。ＣｓｇＧ以外のポアを使用する分析物特徴づけは、当技術分野において公知である。
【０３３５】
ポリヌクレオチド特徴づけ
本発明は、標的ポリヌクレオチドを特徴づける、例えば、ポリヌクレオチドをシークエンシングする方法を提供する。ナノポアを使用してポリヌクレオチドを特徴づけるまたはシークエンシングするための２つの主要戦略、すなわち、鎖特徴づけ／シークエンシングおよびエキソヌクレアーゼ特徴づけ／シークエンシングがある。本発明の方法は、両方の方法に関しうる。
【０３３６】
鎖シークエンシングの場合、ＤＮＡは、印加電位に伴ってまたは反発してナノポアを通って移行される。二本鎖ＤＮＡに対して漸進的にまたは前進的に作用するエキソヌクレアーゼを、印加電位のもとで残りの一本鎖を送り込むためにポアのシス側で使用することができ、または逆転電位のもとでトランス側で使用することができる。同様に、二本鎖ＤＮＡを巻き戻すヘリカーゼも、同じように使用することができる。ポリメラーゼも使用することができる。シークエンシング用途のために印加電位に逆らって鎖移行を要する可能性もあるが、逆転電位のもとではまたは電位のない状態ではＤＮＡが酵素によって最初に「捕らえられる」はずである。その後、結合後に電位が切り替わると、鎖は、シスからトランスへとポアを通過し、伸長された高次構造で電流によって保持される。一本鎖ＤＮＡエキソヌクレアーゼまたは一本鎖ＤＮＡ依存性ポリメラーゼは、分子モーターとして作用して、ポアを通って移行されたばかりの一本鎖を印加電位に反発してトランスからシスへ、制御された段階的様式で引き戻すことができる。
【０３３７】
一実施形態では、標的ポリヌクレオチドを特徴づける方法は、標的配列とポアおよびヘリカーゼ酵素とを接触させるステップを含む。あらゆるヘリカーゼを方法において使用することができる。好適なヘリカーゼは、下で論じる。ヘリカーゼは、ポアに対して２つのモードで作用することができる。第一に、方法は、好ましくは、ヘリカーゼが印加された電圧の結果として生ずる場に伴ってポアを通る標的配列の移動を制御するように、ヘリカーゼを使用して行われる。このモードでは、ＤＮＡの５’末端が先ずポア内に捕捉され、酵素は、標的配列が最終的に二重層のトランス側に移行するまで場に伴って標的配列をポアに通すように、ＤＮＡのポア内への移動を制御する。あるいは、方法は、好ましくは、印加電圧の結果として生ずる場に反発してポアを通る標的配列の移動をヘリカーゼ酵素が制御するように行われる。このモードでは、ＤＮＡの３’末端が先ずポア内に捕捉され、酵素は、標的配列が最終的に二重層のシス側に押し戻されるまで印加された場に反発してポアから引き出されるように、ポアを通るＤＮＡの移動を制御する。
【０３３８】
エキソヌクレアーゼシークエンシングの場合、エキソヌクレアーゼは、標的ポリヌクレオチドの一方の末端から個々のヌクレオチドを遊離させ、これらの個々のヌクレオチドが下で論じるように同定される。別の実施形態では、標的ポリヌクレオチドを特徴づける方法は、標的配列とポアおよびエキソヌクレアーゼ酵素とを接触させるステップを含む。下で論じるエキソヌクレアーゼのいずれかを方法において使用することができる。酵素を下で論じるようにポアに共有結合させることができる。
【０３３９】
エキソヌクレアーゼは、通常は、ポリヌクレオチドの一方の末端にしっかりつかまっていてその配列をその末端から１ヌクレオチドずつ消化する酵素である。エキソヌクレアーゼは、ポリヌクレオチドを５’から３’方向にまたは３’から５’方向に消化することができる。エキソヌクレアーゼが結合するポリヌクレオチドの末端は、通常は、使用する酵素の選択によっておよび／または当技術分野において公知の方法を使用して判定される。ポリヌクレオチドのいずれかの末端でヒドロキシル基またはキャップ構造を使用して、ポリヌクレオチドの特定の末端とのエキソヌクレアーゼの結合を防止または助長することが通常はできる。
【０３４０】
方法は、ポリヌクレオチドをエキソヌクレアーゼと、ヌクレオチドがポリヌクレオチドの末端から上で論じたような割合のヌクレオチドの特徴づけまたは同定を可能にする速度で消化されるように接触させるステップを含む。これを行う方法は、当技術分野において周知である。例えば、エドマン分解を使用してポリペプチドの末端から単一のアミノ酸を順次消化し、その結果、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用してそれらを同定することができる。類似の方法を本発明において使用することができる。
【０３４１】
エキソヌクレアーゼが機能する速度は、通常は野生型エキソヌクレアーゼの最適速度より遅い。本発明の方法でのエキソヌクレアーゼの活性に好適な速度は、毎秒０．５〜１０００ヌクレオチド、毎秒０．６〜５００ヌクレオチド、毎秒０．７〜２００ヌクレオチド、毎秒０．８〜１００ヌクレオチド、毎秒０．９〜５０ヌクレオチド、または毎秒１〜２０もしくは１０ヌクレオチドの消化を含む。この速度は、好ましくは、毎秒１、１０、１００、５００または１０００ヌクレオチドである。エキソヌクレアーゼ活性の好適な速度を様々な方法で達成することができる。例えば、活性の最適速度が低下されたバリアントエキソヌクレアーゼを本発明に従って使用することができる。
【０３４２】
鎖特徴づけ実施形態では、方法は、ポリヌクレオチドをＣｓｇＧポアまたはその変異体、例えば本発明のポアと、ポリヌクレオチドがポアに対して、例えばポアを通って、移動するように接触させるステップ、およびポリヌクレオチドがポアに対して移動しているときに１回または複数回の測定を行い、測定がポリヌクレオチドの１つまたは複数の特徴を示し、それによって標的ポリヌクレオチドを特徴づけるステップを含む。
【０３４３】
エキソヌクレオチド特徴づけ実施形態では、方法は、ポリヌクレオチドを、ＣｓｇＧポアまたはその変異体、例えば本発明のポア、およびエキソヌクレアーゼと、エキソヌクレアーゼが標的ポリヌクレオチドの一方の末端から個々のヌクレオチドを消化し、個々のヌクレオチドがポアに対して、例えばポアを通って移動するように、接触させるステップ、および個々のヌクレオチドがポアに対して移動しているときに１回または複数回の測定を行い、測定が個々のヌクレオチドの１つまたは複数の特徴を示し、それによって標的ポリヌクレオチドを特徴づけるステップを含む。
【０３４４】
個々のヌクレオチドは、単一のヌクレオチドである。個々のヌクレオチドは、ヌクレオチド結合によって別のヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと結合されていないヌクレオチドである。ヌクレオチド結合は、別のヌクレオチドの糖基と結合しているヌクレオチドのリン酸基の１つを含む。個々のヌクレオチドは、通常は、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも５００、少なくとも１０００または少なくとも５０００ヌクレオチドの別のポリヌクレオチドと結合しているヌクレオチドによって結合されていないものである。例えば、個々のヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡ鎖などの標的ポリヌクレオチド配列から消化されたものである。ヌクレオチドは、下で論じるもののいずれかであってもよい。
【０３４５】
個々のヌクレオチドは、あらゆる様式で、あらゆる部位で、ポアと相互作用することができる。ヌクレオチドは、好ましくは、上で論じたようなアダプターによってまたはそのようなアダプターとともにポアと可逆的に結合する。ヌクレオチドは、最も好ましくは、それらがポアを通って膜を通過しているときにアダプターによってまたはアダプターとともにポアと可逆的に結合する。ヌクレオチドは、それらがポアを通って膜を通過しているときにアダプターによってまたはアダプターとともにポアのバレルまたはチャネルと可逆的に結合することもできる。
【０３４６】
個々のヌクレオチドとポアとの相互作用中、ヌクレオチドは、そのヌクレオチドに特異的な様式でポアを通って流れる電流に作用するのが一般的である。例えば、特定のヌクレオチドは、ポアを通って流れる電流を特定の平均時間にわたって、特定の程度に低減させることになる。言い換えると、ポアを通って流れる電流は、特定のヌクレオチドに特有のものである。対照実験を行って、特定のヌクレオチドがポアを通って流れる電流に与える影響を判定することができる。その後、試験試料に対する本発明の方法の実施の結果を、そのような対照実験から導出されたものと比較して、試料中の特定のヌクレオチドを同定することができ、または特定のヌクレオチドが試料中に存在するかどうかを判定することができる。ポアを通って流れる電流に特定のヌクレオチドを示す形で影響を与える周波数を使用して、試料中のそのヌクレオチドの濃度を判定することができる。試料中の異なるヌクレオチドの比も算出することができる。例えば、ｄＣＭＰのメチル−ｄＣＭＰに対する比を算出することができる。
【０３４７】
方法は、標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特徴を測定するステップを含む。標的ポリヌクレオチドをテンプレートポリヌクレオチドまたは目的のポリヌクレオチドと呼ぶこともある。
【０３４８】
この実施形態は、ＣｓｇＧポアまたはその変異体、例えば本発明のポアも使用する。標的分析物に関して上で論じたポアおよび実施形態のいずれかを使用することができる。
【０３４９】
ポリヌクレオチド
核酸などのポリヌクレオチドは、２つ以上のヌクレオチドを含む高分子である。ポリヌクレオチドまたは核酸は、あらゆるヌクレオチドのあらゆる組合せを含むことがある。ヌクレオチドは、天然に存在することもあり、または人工的なものであることもある。ポリヌクレオチド中の１つまたは複数のヌクレオチドは、酸化またはメチル化されることもある。ポリヌクレオチド中の１つまたは複数のヌクレオチドは、損傷されることもある。例えば、ポリヌクレオチドは、ピリミジンダイマーを含むことがある。そのようなダイマーは、概して紫外線によって損傷され、皮膚黒色腫の主原因である。ポリヌクレオチド中の１つまたは複数のヌクレオチドは、例えば標識またはタグで、修飾されることもある。好適な標識は、下で説明する。ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のスペーサーを含むこともある。
【０３５０】
ヌクレオチドは、通常は、核酸塩基、糖および少なくとも１つのリン酸基を含有する。核酸塩基と糖がヌクレオシドを形成する。
【０３５１】
核酸塩基は、通常は複素環式のものである。核酸塩基としては、プリンおよびピリミジン、より具体的にはアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミジン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）およびシトシン（Ｃ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３５２】
糖は、通常はペントース糖である。ヌクレオチド糖としては、リボースおよびデキストロースが挙げられるが、これらに限定されない。糖は、好ましくはデオキシリボースである。
【０３５３】
ポリヌクレオチドは、好ましくは次のヌクレオシドを含む：デオキシアデノシン（ｄＡ）、デオキシウリジン（ｄＵ）および／またはチミジン（ｄＴ）、デオキシグアノシン（ｄＧ）ならびにデオキシシチジン（ｄＣ）。
【０３５４】
ヌクレオチドは、通常は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドである。ヌクレオチドは、通常は、一リン酸、二リン酸または三リン酸を含有する。ヌクレオチドは、３つより多くのリン酸、例えば、４つまたは５つのリン酸を含むこともある。リン酸は、ヌクレオチドの５’側に結合されることもあり、または３’側に結合されることもある。ヌクレオチドとしては、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、５−メチルシチジン一リン酸、５−ヒドロキシメチルシチジン一リン酸、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）およびデオキシメチルシチジン一リン酸が挙げられるが、これらに限定されない。ヌクレオチドは、好ましくは、ＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＣＭＰおよびｄＵＭＰから選択される。
【０３５５】
ヌクレオチドは、脱塩基性である（すなわち、核酸塩基を欠いている）ことがある。ヌクレオチドは、核酸塩基および糖も欠いていることがある（すなわち、Ｃ３スペーサーである）。
【０３５６】
ポリヌクレオチド中のヌクレオチドは、いかなる様式で互いに結合されていてもよい。ヌクレオチドは、通常は、それらの糖およびリン酸基によって核酸の場合と同様に結合されている。ヌクレオチドは、それらの核酸塩基によってピリミジンダイマーの場合のように接続されていることもある。
【０３５７】
ポリヌクレオチドは、一本鎖状であることもあり、または二本鎖状であることもある。ポリヌクレオチドの少なくとも一部分は、好ましくは二本鎖状である。
【０３５８】
ポリヌクレオチドは、核酸、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）であることができる。ポリヌクレオチドは、１本のＤＮＡ鎖にハイブリダイズしている１本のＲＮＡ鎖を含むことができる。ポリヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、またはヌクレオチド側鎖を有する他の合成ポリマーなどの、当技術分野において公知のいかなる合成核酸であってもよい。ＰＮＡ主鎖は、ペプチド結合によって連結された反復Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシン単位で構成されている。ＧＮＡ主鎖は、ホスホジエステル結合によって連結された反復グリコール単位で構成されている。ＴＮＡ主鎖は、ホスホジエステル結合によって互いに連結された反復トレオース糖で構成されている。ＬＮＡは、リボース部分の２’酸素と４’炭素を接続する余分な架橋を有する、上で論じたようなリボヌクレオチドから形成される。架橋核酸（ＢＮＡ）は、修飾ＲＮＡヌクレオチドである。ＢＮＡは、束縛または隔絶ＲＮＡと呼ばれることもある。ＢＮＡモノマーは、「固定された」Ｃ３’−ｅｎｄｏ糖パッカリングを有する５員、６員またはさらには７員の架橋構造を含有することができる。架橋をリボースの２’，４’位に合成的に組み込んで、２’，４’−ＢＮＡモノマーを生成する。
【０３５９】
ポリヌクレオチドは、最も好ましくはリボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。
【０３６０】
ポリヌクレオチドは、あらゆる長さであることができる。例えば、ポリヌクレオチドは、長さ少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも４００または少なくとも５００ヌクレオチドまたはヌクレオチド対であることができる。ポリヌクレオチドは、長さ１０００ヌクレオチドもしくはヌクレオチド対以上、長さ５０００ヌクレオチドもしくはヌクレオチド対以上、または長さ１０００００ヌクレオチドもしくはヌクレオチド対以上であることができる。
【０３６１】
あらゆる数のポリヌクレオチドを調査することができる。例えば、本発明の方法は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０、１００以上のポリヌクレオチドの特徴づけに関することがある。２つ以上のポリヌクレオチドを特徴づける場合、それらは、異なるポリヌクレオチドであることもあり、同じポリヌクレオチドの２つの実例であることもある。
【０３６２】
ポリヌクレオチドは、天然に存在することもあり、または人工的なものであることもある。例えば、方法を使用して、製造されたオリゴヌクレオチドの配列を検証することができる。方法は、通常はｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる。
【０３６３】
試料
ポリヌクレオチドは、通常は、あらゆる好適な試料中に存在する。本発明は、通常は、ポリヌクレオチドを含有することが分かっているまたは含有すると推測される試料を用いて行われる。あるいは、本発明は、試料を用いて、その試料中に存在することが分かっているまたは予想されるポリヌクレオチドの同一性を確認するため行われることもある。
【０３６４】
試料は、生体試料であってもよい。本発明は、あらゆる生物または微生物から得られたまたは抽出された試料を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで行うことができる。生物または微生物は、通常は、古細菌性、原核性または真核性であり、通常は、五界、すなわち植物界、動物界、菌界、原核生物界および原生生物界、の１つに属する。本発明は、あらゆるウイルスから得られたまたは抽出された試料を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで行うことができる。試料は、好ましくは流体試料である。試料は、通常は患者の体液を含む。試料は、尿、リンパ液、唾液、粘液または羊水であってもよいが、好ましくは血液、血漿または血清である。
【０３６５】
試料は、通常は、起源がヒトであるが、代替的に、別の哺乳類動物からのもの、例えば、商業飼育動物、例えばウマ、ウシ、ヒツジ、魚、ニワトリもしくはブタからのものであってもよく、または代替的にペット、例えばネコもしくはイヌであってもよい。あるいは、試料は、植物起源のもの、例えば、商品作物、例えば、穀類、マメ科植物、果実または野菜、例えば、コムギ、オオムギ、オートムギ、キャノーラ、トウモロコシ、ダイズ、イネ、ダイオウ、バナナ、リンゴ、トマト、ジャガイモ、ブドウ、タバコ、マメ、レンズマメ、サトウキビ、カカオノキ、ワタから得られた試料であってもよい。
【０３６６】
試料は、非生体試料であってもよい。非生体試料は、好ましくは流体試料である。非生体試料の例としては、外科用流体、水、例えば飲用水、海水または河川水、および検査室検査用の試薬が挙げられる。
【０３６７】
試料は、通常は、本発明で使用される前に、例えば、遠心分離によって、または望ましくない分子もしくは細胞、例えば赤血球を濾過して取り除く膜を通過させることによって処理される。試料は、採取され次第、測定されることもある。試料がアッセイ前に、好ましくは−７０℃で保存されることがあることも一般的である。
【０３６８】
特徴づけ
方法は、ポリヌクレオチドの２、３、４または５以上の特徴を測定するステップを含むことがある。１つまたは複数の特徴は、好ましくは、（ｉ）ポリヌクレオチドの長さ、（ｉｉ）ポリヌクレオチドの同一性、（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）ポリヌクレオチドの二次構造、および（ｖ）ポリヌクレオチドが修飾されているか否かから選択される。｛ｉ｝、｛ｉｉ｝、｛ｉｉｉ｝、｛ｉｖ｝、｛ｖ｝、｛ｉ，ｉｉ｝、｛ｉ，ｉｉｉ｝、｛ｉ，ｉｖ｝、｛ｉ，ｖ｝、｛ｉｉ，ｉｉｉ｝、｛ｉｉ，ｉｖ｝、｛ｉｉ，ｖ｝、｛ｉｉｉ，ｉｖ｝、｛ｉｉｉ，ｖ｝、｛ｉｖ，ｖ｝、｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ｝、｛ｉ，ｉｉ，ｉｖ｝、｛ｉ，ｉｉ，ｖ｝、｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｖ｝、｛ｉ，ｉｉｉ，ｖ｝、｛ｉ，ｉｖ，ｖ｝、｛ｉｉ，ｉｉｉ．ｉｖ｝、｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｖ｝、｛ｉｉ，ｉｖ，ｖ｝、｛ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ｝、｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ｝、｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｖ｝、｛ｉ，ｉｉ，ｉｖ，ｖ｝、｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ｝、｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ｝または｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ｝などの、（ｉ）〜（ｖ）のいずれの組合せを、本発明に従って測定してもよい。上に列挙した組合せのいずれかを含む（ｉ）〜（ｖ）の異なる組合せを、第２のポリヌクレオチドと比較して、第１のポリヌクレオチドについて測定することができる。
【０３６９】
（ｉ）については、ポリヌクレオチドの長さを、例えば、ポリヌクレオチドとポアとの相互作用の数、またはポリヌクレオチドとポアとの相互作用の継続時間を判定することによって測定することができる。
【０３７０】
（ｉｉ）については、ポリヌクレオチドの同一性を、多数の方法で測定することができる。ポリヌクレオチドの同一性は、ポリヌクレオチドの配列の測定とともに測定されることもあり、またはポリヌクレオチドの配列の測定を伴わずに測定されることもある。先に述べた測定は容易であり、ポリヌクレオチドをシークエンシングし、それによって同定する。後で述べた測定は、いくつかの方法で行うことができる。例えば、ポリヌクレオチド内の特定のモチーフの存在を（ポリヌクレオチドの残存配列を測定せずに）測定してもよい。あるいは、その方法の中で特定の電気および／または光シグナルを測定することによって、ポリヌクレオチドが特定の源に由来すると同定されることもある。
【０３７１】
（ｉｉｉ）については、ポリヌクレオチドの配列を、以前に記載されたように判定することができる。好適なシークエンシング方法、特に電気的測定を用いるものは、Stoddart D et al., Proc Natl Acad Sci, 12;106(19):7702-7、Lieberman KR et al., J Am Chem Soc. 2010;132(50):17961-72、および国際出願国際公開第２０００／２８３１２号パンフレットに記載されている。
【０３７２】
（ｉｖ）については、二次構造を様々な方法で測定することができる。例えば、その方法が電気的測定を含む場合、滞留時間の変化、またはポアを通って流れる電流の変化を使用して、二次構造を測定してもよい。これによって、一本鎖ポリヌクレオチド領域と二本鎖ポリヌクレオチド領域を区別することが可能になる。
【０３７３】
（ｖ）については、あらゆる修飾の存在または不在を測定することができる。この方法は、ポリヌクレオチドがメチル化によって、酸化によって、損傷によって、１つもしくは複数のタンパク質でまたは１つもしくは複数の標識、タグもしくはスペーサーで修飾されているか否かを判定することを好ましくは含む。特異的修飾は、ポアとの特異的相互作用をもたらすことになり、下で説明する方法を用いてそのような特異的相互作用を測定することができる。例えば、メチルシトシンを、各ヌクレオチドとのその相互作用中にポアを通って、流れる電流に基づいて、シトシンと区別してもよい。
【０３７４】
標的ポリヌクレオチドをＣｓｇＧポアまたはその変異体、例えば本発明のポアと接触させる。ポアは、通常は膜内に存在する。好適な膜は、下で論じる。ポアが膜内に存在する膜／ポア系の調査に適しているあらゆる装置を使用して方法を行うことができる。膜貫通ポアセンシングに適しているあらゆる装置を使用して方法を行うことができる。例えば、装置は、水溶液を含むチャンバーと、そのチャンバーを２区画に分ける遮断壁とを含む。遮断壁は、通常は、ポアを含有する膜が形成される開口部を有する。あるいは、遮断壁は、ポアが存在する膜を形成する。
【０３７５】
国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／０００５６２号明細書（国際公開２００８／１０２１２０号パンフレット）に記載されている装置を使用して方法を行ってもよい。
【０３７６】
様々な異なるタイプの測定を行うことができる。この測定は、限定ではないが、電気的測定および光学的測定を含む。可能な電気的測定としては、電流測定、インピーダンス測定、トンネル効果測定（Ivanov AP et al., Nano Lett. 2011 Jan 12; 11(1):279-85）、およびＦＥＴ測定（国際公開出願第２００５／１２４８８８号パンフレット）が挙げられる。光学的測定を電気的測定と併用してもよい（Soni GV et al., Rev Sci Instrum. 2010 Jan; 81(1):014301）。測定は、膜貫通電流測定、例えば、ポアを通って流れるイオン電流の測定であることもある。
【０３７７】
Stoddart D et al., Proc Natl Acad Sci, 12; 106(19):7702-7、Lieberman KR et al., J Am Chem Soc. 2010;132(50):17961-72、および国際出願国際公開第２０００／２８３１２号パンフレットに記載されているような標準的単一チャネル記録機器を使用して、電気的測定を行ってもよい。あるいは、例えば国際出願国際公開第２００９／０７７７３４号パンフレットおよび国際出願国際公開第２０１１／０６７５５９号パンフレットに記載されているような多チャネルシステムを使用して、電気的測定を行ってもよい。
【０３７８】
方法は、好ましくは、膜を介して印加される電位を用いて行われる。印加される電位は、電圧電位であることがある。あるいは印加される電位は、化学的電位であることもある。この方法の例は、両親媒性層などの膜を横断する塩勾配の使用である。塩勾配は、Holden et al., J Am Chem Soc. 2007 Jul 11; 129(27):8650-5に開示されている。場合によっては、ポリヌクレオチドがポアに対して移動するときにポアを通過する電流を使用して、ポリヌクレオチドの配列を推定または判定する。これが鎖シークエンシングである。
【０３７９】
方法は、ポリヌクレオチドがポアに対して移動するときにポアを通過する電流を測定するステップを含むことがある。したがって、方法で使用される装置は、電位を印加することができる電気回路であって、膜およびポアを横断する電気シグナルを測定することができる電気回路も含むことがある。方法は、パッチクランプまたは電圧固定を使用して行われることもある。方法は、好ましくは電圧固定の使用を含む。
【０３８０】
本発明の方法は、ポリヌクレオチドがポアに対して移動するときポアを通過する電流を測定するステップを含むことがある。膜貫通タンパク質ポアを通るイオン電流の測定に好適な条件は、当技術分野において公知であり、実施例において開示する。方法は、通常は、膜とポアを介して印加される電圧を用いて行われる。使用される電圧は、通常は、＋５Ｖ〜−５Ｖ、例えば、＋４Ｖ〜−４Ｖ、＋３Ｖ〜−３Ｖ、または＋２Ｖ〜−２Ｖである。使用される電圧は、通常は、−６００ｍＶ〜＋６００ｍＶ、または−４００ｍＶ〜＋４００ｍＶである。使用される電圧は、好ましくは、−４００ｍＶ、−３００ｍＶ、−２００ｍＶ、−１５０ｍＶ、−１００ｍＶ、−５０ｍＶ、−２０ｍＶおよび０ｍＶから選択される下限と＋１０ｍＶ、＋２０ｍＶ、＋５０ｍＶ、＋１００ｍＶ、＋１５０ｍＶ、＋２００ｍＶ、＋３００ｍＶおよび＋４００ｍＶから独立して選択される上限とを有する範囲である。使用される電圧は、より好ましくは、１００ｍＶ〜２４０ｍＶの範囲、および最も好ましくは１２０ｍＶ〜２２０ｍＶの範囲である。増加された印加電位の使用により、ポアによる異なるヌクレオチド間の識別を増すことが可能である。
【０３８１】
方法は、通常は、金属塩、例えばアルカリ金属塩、ハロゲン化物塩、例えば塩化物塩、例えばアルカリ金属塩化物塩などの、任意の電荷担体の存在下で行われる。電荷担体としては、イオン性液体または有機塩、例えば塩化テトラメチルアンモニウム、塩化トリメチルフェニルアンモニウム、塩化フェニルトリメチルアンモニウムもしくは塩化１−エチル−３−メチルイミダゾリウムを挙げることができる。上で論じた例示的装置では、塩は、チャンバー内の水溶液中に存在する。塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）、またはフェロシアン化カリウムとフェリシアン化カリウムの混合物が通常は使用される。ＫＣｌ、ＮａＣｌ、およびフェロシアン化カリウムとフェリシアン化カリウムの混合物が好ましい。電荷担体は、膜に対して非対称であることがある。例えば、電荷担体のタイプおよび／または濃度が膜の両側で異なることがある。
【０３８２】
塩濃度は、飽和時のものでありうる。塩濃度は、３Ｍ以下であることができるが、通常は０．１〜２．５Ｍ、０．３〜１．９Ｍ、０．５〜１．８Ｍ、０．７〜１．７Ｍ、０．９〜１．６Ｍ、または１Ｍ〜１．４Ｍである。塩濃度は、好ましくは、１５０ｍＭ〜１Ｍである。方法は、好ましくは、少なくとも０．３Ｍ、例えば、少なくとも０．４Ｍ、少なくとも０．５Ｍ、少なくとも０．６Ｍ、少なくとも０．８Ｍ、少なくとも１．０Ｍ、少なくとも１．５Ｍ、少なくとも２．０Ｍ、少なくとも２．５Ｍまたは少なくとも３．０Ｍの塩濃度を使用して行われる。高い塩濃度は、高いシグナル対ノイズ比をもたらし、正常電流変動のバックグラウンドに対してヌクレオチドの存在を示す電流を同定することを可能にする。
【０３８３】
方法は、通常は緩衝液の存在下で行われる。上で論じた例示的装置では、緩衝液は、チャンバー内の水溶液中に存在する。いかなる緩衝液を本発明の方法において使用してもよい。通常は、緩衝液はリン酸緩衝液である。他の好適な緩衝液は、ＨＥＰＥＳおよびＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液である。方法は、通常は、４．０〜１２．０，４．５〜１０．０、５．０〜９．０．５．５〜８．８、６．０〜８．７、または７．０〜８．８、または７．５〜８．５のｐＨで行われる。使用されるｐＨは、好ましくは約７．５である。
【０３８４】
方法は、０℃〜１００℃、１５℃〜９５℃、１６℃〜９０℃、１７℃〜８５℃、１８℃〜８０℃、１９℃〜７０℃、または２０℃〜６０℃で行われることがある。方法は、通常は室温で行われる。方法は、場合により、酵素機能を支援する温度、例えば、約３７℃で行われる。
【０３８５】
ポリヌクレオチド結合タンパク質
鎖特徴づけ方法は、ポリヌクレオチドをポリヌクレオチド結合タンパク質と、タンパク質がポリヌクレオチドのポアに対する、例えばポアを通る、移動を制御するように接触させるステップを好ましくは含む。
【０３８６】
より好ましくは、方法は、（ａ）ポリヌクレオチドをＣｓｇＧポアまたはその変異体、例えば本発明のポア、およびポリヌクレオチド結合タンパク質と、タンパク質がポリヌクレオチドのポアに対する、例えばポアを通る、移動を制御するように接触させるステップ、ならびに（ｂ）ポリヌクレオチドがポアに対して移動しているときに１回または複数回の測定を行い、測定がポリヌクレオチドの１つまたは複数の特徴を示し、それによってポリヌクレオチドを特徴づけるステップを含む。
【０３８７】
より好ましくは、方法は、（ａ）ポリヌクレオチドをＣｓｇＧポアまたはその変異体、例えば本発明のポア、およびポリヌクレオチド結合タンパク質と、タンパク質がポリヌクレオチドのポアに対する、例えばポアを通る、移動を制御するように接触させるステップ、ならびに（ｂ）ポリヌクレオチドがポアに対して移動しているときにポアを通る電流を測定し、電流がポリヌクレオチドの１つまたは複数の特徴を示し、それによってポリヌクレオチドを特徴づけるステップを含む。
【０３８８】
ポリヌクレオチド結合タンパク質は、ポリヌクレオチドと結合することおよびポアを通るその移動を制御することができる、あらゆるタンパク質であることができる。当技術分野ではタンパク質がポリヌクレオチドと結合するか否かを判定することは容易である。タンパク質は、通常は、ポリヌクレオチドと相互作用し、ポリヌクレオチドの少なくとも１つの特性を修飾する。タンパク質は、ポリヌクレオチドを切断して個々のヌクレオチドまたはより短いヌクレオチド鎖、例えばジもしくはトリヌクレオチド、にすることによって、ポリヌクレオチドを修飾することがある。タンパク質は、ポリヌクレオチドを特異的位置に配向または移動させること、すなわちその移動を制御することによって、ポリヌクレオチドを修飾することもある。
【０３８９】
ポリヌクレオチド結合タンパク質は、好ましくは、ポリヌクレオチドハンドリング酵素（polynucleotide handling enzyme）に由来する。ポリヌクレオチドハンドリング酵素は、ポリヌクレオチドと相互作用してポリヌクレオチドの少なくとも１つの特性を修飾することができるポリペプチドである。酵素は、ポリヌクレオチドを切断して個々のヌクレオチドまたはより短いヌクレオチド鎖、例えばジもしくはトリヌクレオチド、にすることによって、ポリヌクレオチドを修飾することがある。酵素は、ポリヌクレオチドを特異的位置に配向または移動させることによって、ポリヌクレオチドを修飾することもある。ポリヌクレオチドハンドリング酵素は、ポリヌクレオチドに結合することができ、かつポアを通るその移動を制御することができるのであれば、酵素活性を示す必要がない。例えば、酵素は、その酵素活性を除去するように修飾されることもあり、または酵素として作用することを妨げる条件下で使用されることもある。そのような条件は、下でより詳細に論じる。
【０３９０】
ポリヌクレオチドハンドリング酵素は、好ましくは、核酸分解酵素に由来する。酵素の構築物に使用されるポリヌクレオチドハンドリング酵素は、より好ましくは、酵素分類（ＥＣ）群３．１．１１、３．１．１３、３．１．１４、３．１．１５、３．１．１６、３．１．２１、３．１．２２、３．１．２５、３．１．２６、３．１．２７、３．１．３０および３．１．３１のいずれかのメンバーに由来する。酵素は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号明細書（国際公開第２０１０／０８６６０３号パンフレットとして公開）に開示されているもののいずれかであってもよい。
【０３９１】
好ましい酵素は、ポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ、ヘリカーゼおよびトポイソメラーゼ、例えばジャイレースである。好適な酵素としては、大腸菌（E. coli）からのエキソヌクレアーゼ（配列番号３９９）、大腸菌（E. coli）からのエキソヌクレアーゼＩＩＩ酵素（配列番号４０１）、高度好熱菌（T. thermophilus）からのＲｅｃＪ（配列番号４０３）、およびバクテリオファージラムダエキソヌクレアーゼ（配列番号４０５）、ＴａｔＤエキソヌクレアーゼ、ならびにこれらのバリアントが挙げられるが、それらに限定されない。配列番号４０３で示される配列またはそのバリアントを構成する３つのサブユニットは相互作用してトリマーエキソヌクレアーゼを形成する。これらのエキソヌクレアーゼを本発明のエキソヌクレアーゼ方法において使用することもできる。ポリメラーゼは、ＰｙｒｏＰｈａｇｅ（登録商標）３１７３  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｕｃｉｇｅｎ（登録商標）Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されている）、ＳＤポリメラーゼ（Ｂｉｏｒｏｎ（登録商標）から市販されている）、またはそのバリアントであってもよい。酵素は、好ましくは、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号３９７）またはそのバリアントである。トポイソメラーゼは、好ましくは、部分分類（ＥＣ）群５．９９．１．２および５．９９．１．３のいずれかについてのメンバーである。
【０３９２】
酵素は、最も好ましくは、ヘリカーゼ、例えば、Ｈｅｌ３０８  Ｍｂｕ（配列番号４０６）、Ｈｅｌ３０８  Ｃｓｙ（配列番号４０７）、Ｈｅｌ３０８  Ｔｇａ（配列番号４０８）、Ｈｅｌ３０８  Ｍｈｕ（配列番号４０９）、Ｔｒａｌ  Ｅｃｏ（配列番号４１０）、ＸＰＤ  Ｍｂｕ（配列番号４１１）またはそのバリアントに由来する。いかなるヘリカーゼを本発明で使用してもよい。ヘリカーゼは、Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼ、ＲｅｃＤヘリカーゼ、例えばＴｒａｌヘリカーゼもしくはＴｒｗＣヘリカーゼ、ＸＰＤヘリカーゼまたはＤｄａヘリカーゼであることがあり、またはこれらに由来することもある。ヘリカーゼは、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５２５７９号明細書（国際公開第２０１３／０５７４９５号パンフレットとして公開）、同第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７４号明細書（国際公開第２０１３／０９８５６２号パンフレットとして公開）、同第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７３号明細書（国際公開第２０１３／０９８５６１号パンフレットとして公開）、同第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２５号明細書（国際公開第２０１４／０１３２６０号パンフレットとして公開）、同第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２４号明細書（国際公開第２０１４／０１３２５９号パンフレットとして公開）、同第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２８号明細書（国際公開第２０１４／０１３２６２号パンフレットとして公開）および同第ＰＣＴ／ＧＢ２０１４／０５２７３６号明細書に開示されている、ヘリカーゼ、修飾ヘリカーゼまたはヘリカーゼ構築物のいずれかであってもよい。
【０３９３】
ヘリカーゼは、好ましくは、配列番号４１３（Ｔｒｗｃ  Ｃｂａ）で示される配列もしくはそのバリアント、配列番号４０６（Ｈｅｌ３０８  Ｍｂｕ）で示される配列もしくはそのバリアント、または配列番号４１２（Ｄｄａ）で示される配列もしくはそのバリアントを含む。バリアントは、膜貫通ポアについて下で論じる点のいずれかでネイティブ配列と異なることがある。配列番号４１２の好ましいバリアントは、（ａ）Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃまたは（ｂ）Ｅ９４Ｃ、Ａ３６０Ｃ、Ｃ１０９ＡおよびＣ１３６Ａ、次いで場合により（ΔＭ１）Ｇ１Ｇ２（すなわち、Ｍ１の欠失、次いで追加のＧ１およびＧ２）を含む。
【０３９４】
あらゆる数のヘリカーゼを本発明に従って使用することができる。例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のヘリカーゼが使用されることもある。一部の実施形態では、異なる数のヘリカーゼが使用されることもある。
【０３９５】
本発明の方法は、好ましくは、ポリヌクレオチドと２つ以上のヘリカーゼを接触させるステップを含む。２つ以上のヘリカーゼは、通常は同じヘリカーゼである。２つ以上のヘリカーゼは、異なるヘリカーゼであることもある。
【０３９６】
２つ以上のヘリカーゼは、上で言及したヘリカーゼのいかなる組合せであってもよい。２つ以上のヘリカーゼは、２つ以上のＤｄａヘリカーゼであることもある。２つ以上のヘリカーゼは、１つまたは複数のＤｄａヘリカーゼと１つまたは複数のＴｒｗＣヘリカーゼであることもある。２つ以上のヘリカーゼは、同じヘリカーゼの異なるバリアントであることもある。
【０３９７】
２つ以上のヘリカーゼは、好ましくは、互いに結合される。２つ以上のヘリカーゼは、より好ましくは、互いに共有結合される。いかなる順序で、およびいかなる方法を使用して、ヘリカーゼを結合させてもよい。本発明での使用に好ましいヘリカーゼ構築物は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２５号明細書（国際公開第２０１４／０１３２６０号パンフレットとして公開）、同第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２４号明細書（国際公開第２０１４／０１３２５９号パンフレットとして公開）、同第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２８号明細書（国際公開第２０１４／０１３２６２号パンフレットとして公開）および同第ＰＣＴ／ＧＢ２０１４／０５２７３６号明細書に記載されている。
【０３９８】
配列番号３９７、３９９、４０１、４０３、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２または４１３のバリアントは、配列番号３９７、３９９、４０１、４０３、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２または４１３のものとは異なるアミノ酸配列を有する酵素であって、ポリヌクレオチド結合能力を保持する酵素である。この能力を、当技術分野において公知の任意の方法を使用して測定することができる。例えば、バリアントをポリヌクレオチドと接触させることができ、ポリヌクレオチドと結合するおよびポリヌクレオチドに沿って移動するその能力を測定することができる。バリアントは、ポリヌクレオチドの結合を助長する修飾ならびに／または高い塩濃度および／もしくは室温でその活性を助長する修飾を含むことがある。バリアントは、ポリヌクレオチドに結合する（すなわち、ポリヌクレオチド結合活性を保持する）がヘリカーゼとして機能しない（すなわち、移動を助長するためのすべての必要成分、例えばＡＴＰおよびＭｇ２＋、が備わっているときポリヌクレオチドに沿って移動しない）ように修飾されることもある。そのような修飾は、当技術分野において公知である。例えば、ヘリカーゼ中のＭｇ２＋結合ドメインの修飾は、通常は、ヘリカーゼとして機能しないバリアントをもたらす。これらのタイプのバリアントは、分子ブレーキとして作用（下記参照）することができる。
【０３９９】
配列番号３９７、３９９、４０１、４０３、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２または４１３のアミノ酸配列の全長にわたって、バリアントは、好ましくは、アミノ酸同一性に基づいてその配列と少なくとも５０％相同であることになる。より好ましくは、バリアントポリペプチドは、アミノ酸同一性に基づいて、配列全体にわたって配列番号３９７、３９９、４０１、４０３、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２または４１３のアミノ酸配列と少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同でありうる。連続する２００以上、例えば２３０、２５０、２７０、２８０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００以上のアミノ酸のストレッチにわたって、少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％または９５％アミノ酸同一性（「堅い相同性」）があることもある。相同性は、上で論じたように判定される。バリアントは、上記配列番号３９０に関して上で論じた点のいずれかで野生型配列と異なることがある。酵素をポアに共有結合されることもある。いかなる方法を使用して酵素をポアに共有結合させてもよい。
【０４００】
好ましい分子ブレーキは、ＴｒｗＣ  Ｃｂａ−Ｑ５９４Ａ（変異Ｑ５９４Ａを有する配列番号４１３）である。このバリアントは、ヘリカーゼとして機能しない（すなわち、ポリヌクレオチドに結合するが、移動を助長するためのすべての必要な成分、例えばＡＴＰおよびＭｇ２＋、が備わっているときにポリヌクレオチドに沿って移動しない）。
【０４０１】
鎖シークエンシングの場合、ポリヌクレオチドは、印加電位に伴ってまたは反発してポアを通って移行される。二本鎖ポリヌクレオチドに対して漸進的にまたは前進的に作用するエキソヌクレアーゼを、印加電位のもとで残りの一本鎖を送り込むためにポアのシス側で使用することができ、または逆転電位のもとでトランス側で使用することができる。同様に、二本鎖ＤＮＡを巻き戻すヘリカーゼも、同じように使用することができる。ポリメラーゼも使用することができる。シークエンシング用途のために印加電位に逆らって鎖移行を要する可能性もあるが、逆転電位のもとではまたは電位のない状態ではＤＮＡが酵素によって最初に「捕らえられる」はずである。その後、結合後に電位が切り替わると、鎖は、シスからトランスへとポアを通過し、伸長された高次構造で電流によって保持される。一本鎖ＤＮＡエキソヌクレアーゼまたは一本鎖ＤＮＡ依存性ポリメラーゼは、分子モーターとして作用して、ポアを通って移行されたばかりの一本鎖を印加電位に反発してトランスからシスへ、制御された段階的様式で引き戻すことができる。
【０４０２】
あらゆるヘリカーゼを方法において使用することができる。ヘリカーゼは、ポアに対して２つのモードで作用することができる。第一に、方法は、好ましくは、ヘリカーゼによってポリヌクレオチドが印加電圧の結果として生ずる場に伴ってポアを通って移動するように、ヘリカーゼを使用して行われる。このモードでは、ポリヌクレオチドの５’末端が先ずポア内に捕捉され、ヘリカーゼによってポリヌクレオチドは、最終的に膜のトランス側に移行するまで場に伴ってポアに通されるように、ポア内に移動する。あるいは、方法は、好ましくは、ヘリカーゼによってポリヌクレオチドが印加された電圧の結果として生ずる場に反発してポアを通って移動するように行われる。このモードでは、ポリヌクレオチドの３’末端が先ずポア内に捕捉され、ヘリカーゼによってポリヌクレオチドは、最終的に膜のシス側に押し戻されるまで印加された場に反発してポアから引き出されるように、ポアを通って移動する。
【０４０３】
方法は、反対方向で行われることもある。ポリヌクレオチドの３’末端が先ずポア内に捕捉されることがあり、ヘリカーゼによってポリヌクレオチドは、最終的に膜のトランス側に移行するまで場に伴ってポアを通されるようにポア内に移動することもある。
【０４０４】
ヘリカーゼに移動を助長するために必要な成分が備わっていない場合、またはヘリカーゼがその移動を妨げるもしくは防止するように修飾されている場合、ヘリカーゼはポリヌクレオチドに結合し、印加された場によってポリヌクレオチドがポアの中に引き入れられたときにポリヌクレオチドの移動を遅速させるブレーキとして作用することができる。この不活性モードでは、ポリヌクレオチドが３’から下って捕捉されるのか５’から下って捕捉されるのかは問題にならず、問題になるのは、酵素がブレーキとして作用してポリヌクレオチドをポア内のトランス側の方に引き入れる、印加される場である。不活性モードでの場合のヘリカーゼによるポリヌクレオチドの移動制御は、漸減、スライドおよび制動はじめとする多数の方法で説明することができる。ヘリカーゼ活性を欠いているヘリカーゼバリアントもこのようにして使用することができる。
【０４０５】
ポリヌクレオチドをポリヌクレオチド結合タンパク質およびポアといかなる順番で接触させてもよい。ポリヌクレオチドをヘリカーゼなどのポリヌクレオチド結合タンパク質およびポアと接触させる場合、ポリヌクレオチドは、先ず第一に、タンパク質と複合体を形成することが好ましい。ポアを介して電圧を印加すると、ポリヌクレオチド／タンパク質複合体はポアと複合体を形成し、ポアを通るポリヌクレオチドの移動を制御する。
【０４０６】
ポリヌクレオチド結合タンパク質を使用する方法におけるあらゆるステップが、通常は、遊離ヌクレオチドまたは遊離ヌクレオチド類似体とポリヌクレオチド結合タンパク質の作用を助長する酵素補因子との存在下で行われる。遊離ヌクレオチドは、上で論じた個々のヌクレオチドのいずれかの１つまたは複数でありうる。遊離ヌクレオチドとしては、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、チミジン三リン酸（ＴＴＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシアデノシン二リン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシグアノシン二リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシチミジン二リン酸（ｄＴＤＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）、デオキシウリジン二リン酸（ｄＵＤＰ）、デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）、デオキシシチジン二リン酸（ｄＣＤＰ）およびデオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）が挙げられるが、これらに限定されない。遊離ヌクレオチドは、好ましくは、ＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰまたはｄＣＭＰから選択される。遊離ヌクレオチドは、好ましくはアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）である。酵素補因子は、構築物が機能することを可能にする因子である。酵素補因子は、好ましくは二価金属カチオンである。二価金属カチオンは、好ましくは、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋またはＣｏ２＋である。酵素補因子は、最も好ましくはＭｇ２＋である。
【０４０７】
ヘリカーゼおよび分子ブレーキ
好ましい実施形態では、方法は、
（ａ）１つまたは複数のヘリカーゼおよび１つまたは複数の分子ブレーキが結合されたポリヌクレオチドを用意するステップ、
（ｂ）ポリヌクレオチドをＣｓｇＧポアまたはその変異体、例えば本発明のポアと接触させ、１つまたは複数のヘリカーゼおよび分子ブレーキが一緒にされ、両方がポアに対する、例えばポアを通る、ポリヌクレオチドの移動を制御するように、ポアにわたって電位を印加するステップ、ならびに
（ｃ）ポリヌクレオチドがポアに対して移動しているときに１回または複数回測定を行い、測定がポリヌクレオチドの１つまたは複数の特徴を示し、それによってポリヌクレオチドを特徴づけるステップ
を含む。
【０４０８】
このタイプの方法は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１４／０５２７３７号パンフレットにおいて詳細に論じられている。
【０４０９】
１つまたは複数のヘリカーゼは、上で論じたもののいずれかであってもよい。１つまたは複数の分子ブレーキは、ポリヌクレオチドと結合してそのポリヌクレオチドのポアを通る移動を遅速させる、あらゆる化合物または分子であることができる。１つまたは複数の分子ブレーキは、ポリヌクレオチドと結合する１つまたは複数の化合物を好ましくは含む。１つまたは複数の化合物は、好ましくは、１つまたは複数の大環状分子である。好適な大環状分子としては、シクロデキストリン、カリックスアレーン、環状ペプチド、クラウンエーテル、ククルビツリル、ピラーアレーン、これらの誘導体またはそれら組合せが挙げられるが、それらに限定されない。シクロデキストリンまたはその誘導体は、Eliseev, A. V., and Schneider, H-J. (1994) J. Am. Chem. Soc. 116, 6081-6088に開示されているもののいずれかであってもよい。この作用物質は、より好ましくは、ヘプタキス−６−アミノ−β−シクロデキストリン（ａｍ７−βＣＤ）、６−モノデオキシ−６−モノアミノ−β−シクロデキストリン（ａｍ１−βＣＤ）またはヘプタキス−（６−デオキシ−６−グアニジノ）−シクロデキストリン（ｇｕ７−βＣＤ）である。
【０４１０】
１つまたは複数の分子ブレーキは、好ましくは、１つまたは複数の一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）である。１つまたは複数の分子ブレーキは、正味負電荷を有さないカルボキシ末端（Ｃ末端）領域を含む一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）、または（ｉｉ）そのＣ末端領域にそのＣ末端領域の正味負電荷を減少させる１つもしくは複数の修飾を含む修飾ＳＳＢである。１つまたは複数の分子ブレーキは、最も好ましくは、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２４号明細書（国際公開第２０１４／０１３２５９号パンフレットとして公開）に開示されているＳＳＢの１つである。
【０４１１】
１つまたは複数の分子ブレーキは、好ましくは、１つまたは複数のポリヌクレオチド結合タンパク質である。ポリヌクレオチド結合タンパク質は、ポリヌクレオチドと結合することおよびポアを通るその移動を制御することができる、あらゆるタンパク質であることができる。当技術分野ではタンパク質がポリヌクレオチドと結合するか否かを判定することは容易である。タンパク質は、通常は、ポリヌクレオチドと相互作用し、ポリヌクレオチドの少なくとも１つの特性を修飾する。タンパク質は、ポリヌクレオチドを切断して個々のヌクレオチドまたはより短いヌクレオチド鎖、例えばジもしくはトリヌクレオチド、にすることによって、ポリヌクレオチドを修飾することがある。その部分は、ポリヌクレオチドを特定の位置に配向または移動させること、すなわち、その移動を制御することによって修飾することもある。
【０４１２】
ポリヌクレオチド結合タンパク質は、好ましくは、ポリヌクレオチドハンドリング酵素に由来する。１つまたは複数の分子ブレーキは、上で論じたポリヌクレオチドハンドリング酵素のいずれかに由来するものであってもよい。分子ブレーキとして作用するＰｈｉ２９ポリメラーゼ（配列番号３９６）の修飾バージョンは、米国特許第５，５７６，２０４号明細書に開示されている。１つまたは複数の分子ブレーキは、好ましくはヘリカーゼに由来する。
【０４１３】
ヘリカーゼに由来するあらゆる数の分子ブレーキを使用することができる。例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のヘリカーゼが、分子ブレーキとして使用されることがある。２つ以上のヘリカーゼが分子ブレーキとして使用される場合、その２つ以上のヘリカーゼは、通常は同じヘリカーゼである。２つ以上のヘリカーゼは、異なるヘリカーゼであることもある。
【０４１４】
２つ以上のヘリカーゼは、上で言及したヘリカーゼのいかなる組合せであってもよい。２つ以上のヘリカーゼは、２つ以上のＤｄａヘリカーゼであることがある。２つ以上のヘリカーゼは、１つまたは複数のＤｄａヘリカーゼと１つまたは複数のＴｒｗＣヘリカーゼであることもある。２つ以上のヘリカーゼは、同じヘリカーゼの異なるバリアントであることもある。
【０４１５】
２つ以上のヘリカーゼは、好ましくは、互いに結合される。２つ以上のヘリカーゼは、より好ましくは、互いに共有結合される。いかなる順序で、いかなる方法を使用して、ヘリカーゼを結合させてもよい。ヘリカーゼに由来する１つまたは複数の分子ブレーキは、少なくとも１つの配座状態でポリヌクレオチドがヘリカーゼから解離することができるポリヌクレオチド結合ドメイン内の開口のサイズを低減させるように、好ましくは修飾される。これは、国際公開第２０１４／０１３２６０号パンフレットに開示されている。
【０４１６】
本発明での使用に好ましいヘリカーゼ構築物は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２５号明細書（国際公開第２０１４／０１３２６０号パンフレットとして公開）、同第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２４号明細書（国際公開第２０１４／０１３２５９号パンフレットとして公開）、同第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２８号明細書（国際公開第２０１４／０１３２６２号パンフレットとして公開）および同第ＰＣＴ／ＧＢ２０１４／０５２７３６号明細書に記載されている。
【０４１７】
１つまたは複数のヘリカーゼが活性モードで使用される場合（すなわち、１つまたは複数のヘリカーゼに移動を助長するためのすべての必要成分、例えばＡＴＰおよびＭｇ２＋が備わっているとき）、１つまたは複数の分子ブレーキは、好ましくは、（ａ）不活性モードで使用される（すなわち、移動を助長するための必要成分の不在下で使用される、もしくは能動移動ができない）、（ｂ）その１つもしくは複数の分子ブレーキが１つもしくは複数のヘリカーゼとは反対方向に移動する活性モードで使用される、または（ｃ）その１つもしくは複数の分子ブレーキが１つもしくは複数のヘリカーゼと同じ方向に、１つもしくは複数のヘリカーゼより遅く移動する活性モードで使用される。
【０４１８】
１つまたは複数のヘリカーゼが不活性モードで使用される場合（すなわち、１つまたは複数のヘリカーゼに移動を助長するためのすべての必要成分、例えばＡＴＰおよびＭｇ２＋が備わっていないとき、もしくは能動移動ができない）、１つまたは複数の分子ブレーキは、好ましくは、（ａ）不活性モードで使用される（すなわち、移動を助長するための必要成分の不在下で使用される、もしくは能動移動ができない）、または（ｂ）その１つもしくは複数の分子ブレーキがポリヌクレオチドに沿って、ポリヌクレオチドと同じ方向にポアを通って移動する、活性モードで使用される。
【０４１９】
１つまたは複数のヘリカーゼおよび１つまたは複数の分子ブレーキを、ポリヌクレオチドのいかなる位置に結合させてもよく、その結果、それらは一緒になり、両方がポリヌクレオチドのポアを通る移動を制御する。１つまたは複数のヘリカーゼおよび１つまたは複数の分子ブレーキは、少なくとも１ヌクレオチド離れており、例えば、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも５０００、少なくとも１０，０００、少なくとも５０，０００ヌクレオチド以上離れている。方法が、一方の末端にＹアダプターおよび他方の末端にヘアピンループアダプターが備わっている二本鎖ポリヌクレオチドの特徴づけに関する場合、好ましくはＹアダプターに１つまたは複数のヘリカーゼが結合され、好ましくはヘアピンループアダプターに１つまたは複数の分子ブレーキが結合される。この実施形態では、１つまたは複数の分子ブレーキは、好ましくは、ポリヌクレオチドに結合するがヘリカーゼとして機能しないように修飾されている１つまたは複数のヘリカーゼである。Ｙアダプターに結合された１つまたは複数のヘリカーゼは、好ましくは、下でより詳細に論じるようにスペーサーで停止される。ヘアピンループアダプターに結合された１つまたは複数の分子ブレーキは、好ましくはスペーサーで停止されない。１つまたは複数のヘリカーゼおよび１つまたは複数の分子ブレーキは、好ましくは、１つまたは複数のヘリカーゼがヘアピンループに達したとき一緒になる。１つまたは複数のヘリカーゼは、Ｙアダプターをポリヌクレオチドに結合させる前にＹアダプターに結合させてもよく、またはＹアダプターをポリヌクレオチドに結合させた後にＹアダプターに結合させてもよい。１つまたは複数の分子ブレーキは、ヘアピンループアダプターをポリヌクレオチドに結合させる前にヘアピンループアダプターに結合させてもよく、またはヘアピンループアダプターをポリヌクレオチドに結合させた後にヘアピンループアダプターに結合させてもよい。
【０４２０】
１つまたは複数のヘリカーゼと１つまたは複数の分子ブレーキは、好ましくは、互いに結合されない。１つまたは複数のヘリカーゼと１つまたは複数の分子ブレーキは、より好ましくは、互いに共有結合されない。１つまたは複数のヘリカーゼおよび１つまたは複数の分子ブレーキは、好ましくは、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２５号明細書（国際公開第２０１４／０１３２６０号パンフレットとして公開）、同第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２４号明細書（国際公開第２０１４／０１３２５９号パンフレットとして公開）、同第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２８号明細書（国際公開第２０１４／０１３２６２号パンフレットとして公開）および同第ＰＣＴ／ＧＢ２０１４／０５２７３６号明細書に記載されているように結合されない。
【０４２１】
スペーサー
１つまたは複数のヘリカーゼを、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１４／０５０１７５号パンフレットにおいて論じられているように１つまたは複数のスペーサーで停止させてもよい。国際出願に開示されている１つまたは複数のヘリカーゼおよび１つまたは複数のスペーサーのいずれの立体配置を本発明において使用してもよい。
【０４２２】
ポリヌクレオチドの一部がポアに侵入し、印加された電位の結果として生じる場に沿ってポアを通って移動する場合、１つまたは複数のヘリカーゼは、ポリヌクレオチドがポアを通って移動するとそのポアによってスペーサーを超えて移動する。これは、（１つまたは複数のスペーサーを含む）ポリヌクレオチドがポアを通って移動し、１つまたは複数のヘリカーゼがそのポアの上部に残存するためである。
【０４２３】
１つまたは複数のスペーサーは、好ましくはポリヌクレオチドの一部であり、例えば、スペーサーはポリヌクレオチド配列に割り込んでいる。１つまたは複数のスペーサーは、好ましくは、ポリヌクレオチドにハイブリダイズされた１つまたは複数の遮断分子、例えばスピードバンプ、の一部ではない。
【０４２４】
ポリヌクレオチド内にあらゆる数のスペーサーがあることがあり、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のスペーサーがあることがある。好ましくは、ポリヌクレオチド内に２つ、４つまたは６つのスペーサーがある。ポリヌクレオチドの異なる領域内に１つまたは複数のスペーサーがあることもあり、例えば、Ｙアダプターおよび／またはヘアピンループアダプター内に１つまたは複数のスペーサーがあることもある。
【０４２５】
１つまたは複数のスペーサーは、１つまたは複数のヘリカーゼが活性モードであっても克服することができないエネルギー障壁を、各々がもたらす。１つまたは複数のスペーサーは、（例えばポリヌクレオチド中のヌクレオチドから塩基を除去することにより）ヘリカーゼの牽引力を低減させることによって、または（例えば嵩高い化学基を使用して）１つもしくは複数のヘリカーゼの移動を物理的に遮断することによって、１つまたは複数のヘリカーゼを停止させることができる。
【０４２６】
１つまたは複数のスペーサーは、１つまたは複数のヘリカーゼを停止させるあらゆる分子または分子の組合せを含むことができる。１つまたは複数のスペーサーは、１つまたは複数のヘリカーゼがポリヌクレオチドに沿って移動しないように防止する、あらゆる分子または分子の組合せを含むことができる。１つまたは複数のヘリカーゼが、膜貫通ポアおよび印加電位の不在下で１つまたは複数のスペーサーで停止されるか否かを判定することは容易である。例えば、スペーサーを超えて移動し、ＤＮＡの相補鎖を置換するヘリカーゼの能力を、ＰＡＧＥによって測定することができる。
【０４２７】
１つまたは複数のスペーサーは、通常は、ポリマーなどの直鎖状分子を含む。１つまたは複数のスペーサーは、通常は、ポリヌクレオチドとは異なる構造を有する。例えば、ポリヌクレオチドがＤＮＡである場合、１つまたは複数のスペーサーは通常はＤＮＡではない。詳細には、ポリヌクレオチドが、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）である場合、１つまたは複数のスペーサーは、好ましくは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、またはヌクレオチド側鎖を有する合成ポリマーを含む。１つまたは複数のスペーサーは、１つまたは複数のヌクレオチドをポリヌクレオチドと反対方向で含むことがある。例えば、ポリヌクレオチドが５’から３’への方向である場合、１つまたは複数のスペーサーは、１つまたは複数のヌクレオチドを３’から５’への方向で含むことがある。ヌクレオチドは、上で論じたもののいずれかであってもよい。
【０４２８】
１つまたは複数のスペーサーは、１つもしくは複数のニトロインドール、例えば１つもしくは複数の５−ニトロインドール、１つもしくは複数のイノシン、１つもしくは複数のアクリジン、１つもしくは複数の２−アミノプリン、１つもしくは複数の２，６−ジアミノプリン、１つもしくは複数の５−ブロモ−デオキシウリジン、１つもしくは複数の逆位チミジン（逆位ｄＴ）、１つもしくは複数の逆位ジデオキシチミジン（ｄｄＴ）、１つもしくは複数のジデオキシシチジン（ｄｄＣ）、１つもしくは複数の５−メチルシチジン、１つもしくは複数の５−ヒドロキシメチルシチジン、１つもしくは複数の２’−Ｏ−メチルＲＮＡ塩基、１つもしくは複数のイソデオキシシチジン（イソｄＣ）、１つもしくは複数のイソデオキシグアノシン（イソｄＧ）、１つもしくは複数のｉＳｐＣ３基（すなわち、糖および塩基を欠いているヌクレオチド）、１つもしくは複数の光切断性（ＰＣ）基、１つもしくは複数のヘキサンジオール基、１つもしくは複数のスペーサー９（ｉＳｐ９）基、１つもしくは複数のスペーサー１８（ｉＳｐ１８）基、ポリマーまたは１つもしくは複数のチオール結合を好ましくは含む。１つまたは複数のスペーサーは、これらの基のあらゆる組合せを含むことがある。これらの基の多くは、ＩＤＴ（登録商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標））から市販されている。
【０４２９】
１つまたは複数のスペーサーは、あらゆる数のこれらの基を含有することがある。例えば、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、５−ブロモ−デオキシウリジン、逆位ｄＴ、ｄｄＴ、ｄｄＣ、５−メチルシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ塩基、イソｄＣ、イソｄＧ、ｉＳｐＣ３基、ＰＣ基、ヘキサンジオール基およびチオール結合については、１つまたは複数のスペーサーは、好ましくは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２以上含む。１つまたは複数のスペーサーは、好ましくは、２、３、４、５、６、７、８以上のｉＳｐ９基を含む。１つまたは複数のスペーサーは、好ましくは、２、３、４、５または６以上のｉＳｐ１８基を含む。最も好ましいスペーサーは、４つのｉＳｐ１８基である。
【０４３０】
ポリマーは、好ましくは、ポリペプチドまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ポリペプチドは、好ましくは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２以上のアミノ酸を含む。ＰＥＧは、好ましくは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２以上のモノマーユニットを含む。
【０４３１】
１つまたは複数のスペーサーは、好ましくは、１つまたは複数の脱塩基ヌクレオチド（すなわち、核酸塩基を欠いているヌクレオチド）、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２以上の脱塩基ヌクレオチドを含む。核酸塩基は、脱塩基ヌクレオチドでは、−Ｈ（ｉｄＳｐ）または−ＯＨによって置換されていることがある。１つまたは複数の隣接ヌクレオチドから核酸塩基を除去することによって、脱塩基スペーサーをポリヌクレオチドに挿入することができる。例えば、ポリヌクレオチドは、３−メチルアデニン、７−メチルグアニン、１，Ｎ６−エテノアデニンイノシンまたはヒポキサンチンを含むように修飾されることがあり、核酸塩基は、ヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｈＡＡＧ）を使用してこれらのヌクレオチドから除去されることがある。あるいは、ポリヌクレオチドは、ウラシルを含むように修飾されることがあり、核酸塩基は、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）で除去されることもがる。一実施形態では、１つまたは複数のスペーサーは、いかなる脱塩基ヌクレオチドも含まない。
【０４３２】
１つまたは複数のヘリカーゼは、各々の直鎖状分子スペーサーによって（すなわちそれらの前で）停止されることもあり、または各々の直鎖状分子スペーサーで停止されることもある。直鎖状分子スペーサーが使用される場合、ポリヌクレオチドには、１つまたは複数のヘリカーゼが超えて移動することになる各スペーサーの末端に隣接してポリヌクレオチドの二本鎖領域が好ましくは備えられている。この二本鎖領域は、通常は、隣接スペーサーで１つまたは複数のヘリカーゼを停止させるのに役立つ。二本鎖領域の存在は、方法が約１００ｍＭ以下の塩濃度で行われる場合、特に好ましい。各二本鎖領域は、通常は、長さ少なくとも１０、例えば少なくとも１２ヌクレオチドである。本発明において使用されるポリヌクレオチドが一本鎖状である場合、二本鎖領域は、より短いポリヌクレオチドをスペーサーに隣接する領域にハイブリダイズすることによって形成することができる。このより短いポリヌクレオチドは、通常は、ポリヌクレオチドと同じヌクレオチドから形成されるが、異なるヌクレオチドから形成されることもある。例えば、より短いポリヌクレオチドは、ＬＮＡから形成されることがある。
【０４３３】
直鎖状分子スペーサーが使用される場合、ポリヌクレオチドには、好ましくは、１つまたは複数のヘリカーゼが超えて移動することになる末端とは反対側の各スペーサーの末端に遮断分子が備えられている。この遮断分子は、１つまたは複数のヘリカーゼが各スペーサーで停止した状態を確実に維持するのに役立つことができる。その遮断分子は、１つまたは複数のヘリカーゼを、該ヘリカーゼが溶液に拡散する場合、ポリヌクレオチド上に保持するのにも役立つことができる。遮断分子は、１つまたは複数のヘリカーゼを物理的に停止させる、下で論じる化学基のいずれかであることができる。遮断分子は、ポリヌクレオチドの二本鎖領域であることもある。
【０４３４】
１つまたは複数のスペーサーは、１つまたは複数のヘリカーゼを物理的に停止させる１つまたは複数の化学基を好ましくは含む。１つまたは複数の化学基は、好ましくは、１つまたは複数のペンダント化学基である。１つまたは複数の化学基は、ポリヌクレオチド中の１つまたは複数の核酸塩基に結合されていることもある。１つまたは複数の化学基は、ポリヌクレオチド主鎖に結合されていることもある。２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２以上などのあらゆる数の化学基が存在することがある。好適な基としては、フルオロフォア、ストレプトアビジンおよび／またはビオチン、コレステロール、メチレンブルー、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）、ジゴキシゲニンおよび／または抗ジゴキシゲニンならびにジベンジルシクロオクチン基が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４３５】
ポリヌクレオチド中の異なるスペーサーは、異なる停止分子を含むことがある。例えば、あるスペーサーは、上で論じた直鎖状分子の１つを含むことがあり、別のスペーサーは、１つまたは複数のヘリカーゼを物理的に停止させる１つまたは複数の化学基を含むことがある。スペーサーは、上で論じた直鎖状分子のいずれか、ならびに１つまたは複数のヘリカーゼを物理的に停止させる１つまたは複数の化学基、例えば１つ以上の脱塩基およびフルオロフォアを含むことがある。
【０４３６】
ポリヌクレオチドのタイプおよび本発明の方法が行われる条件に依存して、好適なスペーサーを設計することができる。大部分のヘリカーゼは、ＤＮＡに結合し、ＤＮＡに沿って移動するため、ＤＮＡではない何かを使用してそれらを停止させることができる。好適な分子は、上で論じている。
【０４３７】
本発明の方法は、好ましくは、遊離ヌクレオチドの存在下、および／またはヘリカーゼ補因子の存在下で行われる。このことは、下でより詳細に論じる。膜貫通ポアおよび印加電位の不在下では、１つまたは複数のスペーサーは、好ましくは、遊離ヌクレオチドの存在下および／またはヘリカーゼ補因子の存在下で１つまたは複数のヘリカーゼを停止させることができる。
【０４３８】
本発明の方法が、遊離ヌクレオチドおよび（１つまたは複数のヘリカーゼが活性モードであるように）下で論じるようなヘリカーゼ補因子の存在下で行われる場合、通常は、１つまたは複数のより長いスペーサーを使用して、１つまたは複数のヘリカーゼをポリヌクレオチド上で確実に停止させた後、それらを膜貫通ポアと接触させ、電位を印加する。遊離ヌクレオチドおよび（１つまたは複数のヘリカーゼが不活性モードであるように）ヘリカーゼの不在下では、１つまたは複数のより短いスペーサーを使用することができる。
【０４３９】
塩濃度も、１つまたは複数のヘリカーゼを停止させる１つまたは複数のスペーサーの能力に影響を及ぼす。膜貫通ポアおよび印加電位の不在下では、１つまたは複数のスペーサーは、好ましくは、約１００ｍＭ以下の塩濃度で１つまたは複数のヘリカーゼを停止させることができる。本発明の方法で使用される塩濃度が高いほど、概して使用される１つまたは複数のスペーサーは短く、逆もまた同様である。
【０４４０】
特徴の好ましい組合せを下の表３に示す。
【０４４１】
【表３】
2017527284.tif 000020
【０４４２】
方法は、２つ以上のヘリカーゼをスペーサーを超えて移動させることに関することもある。そのような場合、スペーサーの長さを通常は増加させて、ポアおよび印加電位の不在下で後従ヘリカーゼがスペーサーを超えて先導ヘリカーゼを押さないようにする。方法が、１つまたは複数のスペーサーを超えて２つ以上のヘリカーゼを移動させることに関する場合、上で論じたスペーサー長は、少なくとも１．５倍、例えば２倍、２．５倍または３倍増加されることがある。例えば、方法が、１つまたは複数のスペーサーを超えて２つ以上のヘリカーゼを移動させることに関する場合、上の表３の第３列におけるスペーサー長は、１．５倍、２倍、２．５倍または３倍増加されることがある。
【０４４３】
膜
本発明のポアは、膜内に存在することがある。本発明の方法では、ポリヌクレオチドを膜内のＣｓｇＧポアまたはその変異体、例えば本発明のポアと通常は接触させる。あらゆる膜を本発明に従って使用することができる。好適な膜は、当技術分野において周知である。膜は、好ましくは両親媒性層である。両親媒性層は、親水性部分と親油性部分両方を有する両親媒性分子、例えばリン脂質、から形成される層である。両親媒性分子は、合成のものであることもあり、または天然に存在することもある。天然に存在しない両親媒性物質、および単層を形成する両親媒性物質は、当技術分野において周知であり、例えば、ブロックコポリマーを含む（Gonzalez-Perez et al., Langmuir, 2009, 25, 10447-10450）。ブロックコポリマーは、２つ以上のモノマーサブユニットが互いに重合して単一ポリマー鎖を生成する高分子材料である。ブロックコポリマーは、通常は、各モノマーサブユニットが一因となる特性を有する。しかし、ブロックコポリマーは、個々のサブユニットから形成されたポリマーが有さない固有の特性を有することもある。ブロックコポリマーは、モノマーサブユニットの１つが疎水性（すなわち親油性）であるが他のサブユニットは水性媒体中にあるとき親水性であるように、工学的に操作することができる。この場合、ブロックコポリマーは、両親媒特性を有することおよび生体膜を模倣する構造を形成することができる。ブロックコポリマーは、（２つのモノマーサブユニットからなる）ジブロックであることがあるが、両親媒性物質として挙動する、より複雑な配置を形成するように、２つより多くのモノマーサブユニットから構築されることもある。コポリマーは、トリブロック、テトラブロックまたはペンタブロックコポリマーであることがある。膜は、好ましくは、トリブロックコポリマー膜である。
【０４４４】
古細菌双極性テトラエーテル脂質は、脂質が単層膜を形成するように構築される、天然に存在する脂質である。これらの脂質は、厳しい生物環境で生き残る好極限性細菌、好熱菌、好塩菌および好酸菌において一般に見出される。それらの安定性は、最終二重層の融合された性質に由来すると考えられている。親水性−疎水性−親水性の一般モチーフを有するトリブロックポリマーを生成することによってこれらの生物学的エンティティーを模倣するブロックコポリマー材料を構築することは容易である。この材料は、脂質二重層と同様に挙動し、かつ小胞から層状の膜までの範囲の相挙動を包含する、モノマー膜を形成することができる。これらのトリブロックコポリマーから形成される膜は、生体脂質膜に勝るいくつかの利点を保持する。トリブロックコポリマーを合成するので、まさにその構築を注意深く制御して、膜を形成するためにならびにポアおよび他のタンパク質と相互作用するために必要な正確な鎖長および特性を得ることができる。
【０４４５】
ブロックコポリマーは、脂質複素材として分類されないサブユニットから構築されることもある。例えば、疎水性ポリマーは、シロキサンまたは他の非炭化水素系モノマーから製造されることもある。ブロックコポリマーの親水性小部分は、低いタンパク質結合特性を有することもでき、この低いタンパク質結合特性によって、未加工の生体試料に曝露されたときに高度に耐性である膜の生成が可能になる。このヘッド基ユニットは、非古典的脂質ヘッド基に由来することもある。
【０４４６】
トリブロックコポリマー膜は、生体脂質膜と比較して増加された機械的および環境安定性、例えば、より高い動作温度またはｐＨ範囲も有する。ブロックコポリマーの合成性は、ポリマーに基づく膜を広範な用途に合わせてカスタマイズするためのプラットホームをもたらす。
【０４４７】
膜は、最も好ましくは、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５２７６６号または同第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５２７６７号パンフレットに開示されている膜の１つである。
【０４４８】
両親媒性分子は、ポリヌクレオチドのカップリングを助長するように化学的に修飾されるまたは官能化されることがある。
【０４４９】
両親媒性層は、単層であることもあり、または二重層であることもある。両親媒性層は、通常は平面状である。両親媒性層は、湾曲していることもある。両親媒性層は、支持されていることもある。
【０４５０】
両親媒性膜は、通常は自然移動性であり、本質的に二次元流体としておおよそ１０８ｃｍ・ｓ−１の脂質拡散速度で作用する。これは、ポアおよびカップリングされたポリヌクレオチドが通常は両親媒性膜内で移動することができることを意味する。
【０４５１】
膜は、脂質二重層であることがある。脂質二重層は、細胞膜のモデルであり、ある範囲の実験研究用の優れたプラットホームとして役立つ。例えば、脂質二重層を単一チャネル記録による膜タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究に使用することができる。あるいは、脂質二重層をバイオセンサーとして使用して、ある範囲の物質の存在を検出することができる。脂質二重層は、あらゆる脂質二重層であることができる。好適な脂質二重層としては、平面状脂質二重層、支持二重層またはリポソームが挙げられるが、これらに限定されない。脂質二重層は、好ましくは平面状脂質二重層である。好適な脂質二重層は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／０００５６３号明細書（国際公開２００８／１０２１２１号パンフレットとして公開）、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７号明細書（国際公開第２００９／０７７７３４号パンフレットとして公開）および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００１０５７号明細書（国際公開第２００６／１００４８４号パンフレットとして公開）に開示されている。
【０４５２】
脂質二重層を形成する方法は、当技術分野において公知である。脂質二重層は、脂質単層が水溶液／空気界面に、その界面に対して垂直である開口部の両側を超えて担持される、モンタル（Montal）およびミューラー（Mueller）の方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1972; 69: 3561-3566）によって、一般に形成される。通常、脂質を電解質水溶液の表面に、先ず脂質を有機溶媒に溶解し、次いで溶媒の液滴を開口部の両側の水性溶液の表面で蒸発させることによって、加える。有機溶媒を蒸発させたら、二重層が形成されるまで、開口部の両側の溶液／空気界面を開口部を超えて物理的に上下に移動させる。平面状脂質二重層は、膜の開口部を横断して形成されることもあり、または開口を横断して凹所の中に形成されることもある。
【０４５３】
モンタルおよびミューラーの方法は、タンパク質ポア挿入に適している良質脂質二重層を形成する対費用効果の高い比較的容易な方法であるため、評判がよい。他の一般的な二重層形成方法としては、先端部浸漬、二重層の塗装、および脂質二重層のパッチクランプが挙げられる。
【０４５４】
先端部浸漬二重層形成は、脂質の単層を担持している試験溶液の表面に開口部表面（例えばピペット先端部）を触れさせることを必要とする。この場合もやはり、有機溶媒に溶解された脂質の液滴を溶液表面で蒸発させることによって先ず脂質単層が溶液／空気界面で生成される。次いで、二重層がラングミュア（Langumur）・シェーファー（Schaefer）法によって形成され、溶液表面に対して開口部を移動させる機械的自動化を必要とする。
【０４５５】
塗装される二重層については、有機溶媒に溶解された脂質の液滴が開口部に直接塗布され、その開口部が試験水溶液に沈められる。脂質溶液は、塗装用刷毛または同等物を使用して開口部全面に薄く塗られる。溶媒が薄くなることで、脂質二重層が形成される結果となる。しかし、二重層からの溶媒の完全除去は困難であり、したがって、この方法によって形成される二重層は、安定性がより低く、電気化学的測定中にノイズをより生じやすい。
【０４５６】
パッチクランプは、生体細胞膜の研究に一般に使用される。細胞膜が吸引によってピペットの末端部にクランプされ、膜のパッチがその開口部全体に付着される。この方法は、リポソームをクランプする（その後、リポソームが破裂してピペットの開口部全面を封止する脂質二重層を残す）ことによる脂質二重層の生成に適している。この方法は、安定した巨大な単層状のリポソームと、ガラス表面を有する材料への小開口部の作製とを必要とする。
【０４５７】
リポソームは、超音波処理、抽出またはモザファリ（Mozafari）法（Colas et al., (2007) Micron 38:841-847）によって形成することができる。
【０４５８】
好ましい実施形態において、脂質二重層は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７号明細書（国際公開第２００９／０７７７３４号パンフレットとして公開）に記載されているように形成される。有利には、この方法では脂質二重層が乾燥脂質から形成される。最も好ましい実施形態では、脂質二重層は、国際公開第２００９／０７７７３４号パンフレット（ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７）に記載されているように開口を横断して形成される。
【０４５９】
脂質二重層は、２つの対向する脂質層から形成される。２つの脂質層は、それらの疎水性テール基が互いに向き合って疎水性の内部を形成するように配置される。脂質の親水性ヘッド基は、その二重層の両側の水性環境に向かって外側に向いている。二重層は、これらに限定されるものではないが脂質無秩序相（流体層状）、液体無秩序相、固体無秩序相（層状ゲル相、インターデジティテッドゲル相）および平面状二重層結晶（層状サブゲル相、層状結晶相）を含む、多数の脂質相に存在することがある。
【０４６０】
脂質二重層を形成するあらゆる脂質組成物を使用することができる。脂質組成物は、必要な特性、例えば、表面電荷、膜タンパク質を支持する能力、充填密度または機械的特性を有する脂質二重層が形成されるように選択される。脂質組成物は、１つまたは複数の異なる脂質を含むことができる。例えば、脂質組成物は、１００以下の脂質を含有することができる。脂質組成物は、好ましくは、１〜１０の脂質を含有する。脂質組成物は、天然に存在する脂質および／または人工脂質を含むことがある。
【０４６１】
脂質は、通常は、ヘッド基と、界面部分と、同じであってもまたは異なってもよい２つの疎水性テール基とを含む。好適なヘッド基としては、中性ヘッド基、例えばジアシルグリセリド（ＤＧ）およびセラミド（ＣＭ）、双性イオン性ヘッド基、例えばホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）およびスフィンゴミエリン（ＳＭ）、負電荷を有するヘッド基、例えばホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、リン酸（ＰＡ）およびカルジオリピン（ＣＡ）、ならびに正電荷を有するヘッド基、例えばトリメチルアンモニウム−プロパン（ＴＡＰ）が挙げられるが、これらに限定されない。好適な界面部分としては、天然に存在する界面部分、例えば、グリセロール系またはセラミド系部分が挙げられるが、これらに限定されない。好適な疎水性テール基としては、飽和炭化水素鎖、例えばラウリン酸（ｎ−ドデカン酸）、ミリスチン酸（ｎ−テトラデカン酸）、パルミチン酸（ｎ−ヘキサデカン酸）、ステアリン酸（ｎ−オクタデカン酸）およびアラキドン酸（ｎ−エイコサン酸）、不飽和炭化水素鎖、例えばオレイン酸（シス−９−オクタデカン酸）、ならびに分岐炭化水素鎖、例えばフィタノイルが挙げられるが、これらに限定されない。不飽和炭化水素鎖の鎖長ならびに不飽和炭化水素鎖中の二重結合の位置および数は、様々でありうる。分岐炭化水素鎖の鎖長ならびに分岐炭化水素鎖中のメチル基などの分枝の位置および数は、様々でありうる。疎水性テール基を界面部分にエーテルまたはエステルとして連結することができる。脂質は、ミコール酸であってもよい。
【０４６２】
脂質を化学的に修飾することもできる。脂質のヘッド基またはテール基は、化学的に修飾されることがある。ヘッド基が化学的に修飾されている好適な脂質としては、ＰＥＧ修飾脂質、例えば１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］、官能化ＰＥＧ脂質、例えば１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［ビオチニル（ポリエチレングリコール）２０００］、ならびに結合用に修飾された脂質、例えば１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（スクシニル）および１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（ビオチニル）が挙げられるが、これらに限定されない。テール基が化学的に修飾されている好適な脂質としては、重合性脂質、例えば１，２−ビス（１０，１２−トリコサジイノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、フッ素化脂質、例えば１−パルミトイル−２−（１６−フルオロパルミトイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、変性脂質、例えば１，２−ジパルミトイル−Ｄ６２−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、ならびにエーテル連結脂質、例えば１，２−ジ−Ｏ−フィタニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンが挙げられるが、これらに限定されない。脂質は、ポリヌクレオチドのカップリングを助長するように化学的に修飾されるまたは官能化されることもある。
【０４６３】
両親媒性層、例えば脂質組成物は、通常は、層の特性に影響を及ぼす１つまたは複数の添加剤を含む。好適な添加剤としては、脂肪酸、例えばパルミチン酸、ミリスチン酸およびオレイン酸、脂肪アルコール、例えばパルミチン酸アルコール、ミリスチン酸アルコールおよびオレイン酸アルコール、ステロール、例えばコレステロール、エルゴステロール、ラノステロール、シトステロールおよびスチグマステロール、リゾリン脂質、例えば１−アシル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、ならびにセラミドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４６４】
別の好ましい実施形態では、膜は固体層を含む。固体層は、これらに限定されるものではないがマイクロエレクトロニクス材料、絶縁材料、例えばＳｉ３Ｎ４、Ａｌ２Ｏ３およびＳｉＯ、有機および無機ポリマー、例えば、ポリアミド、プラスチック、例えばＴｅｆｌｏｎ（登録商標）またはエラストマー、例えば二成分付加硬化シリコーンゴム、およびガラスを含む、有機材料と無機材料両方から形成することができる。固体層は、グラフェンから形成されることもある。好適なグラフェン層は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１０６３７号明細書（国際公開第２００９／０３５６４７号パンフレットとして公開）に開示されている。膜が固体層を含む場合、ポアは、通常は、固体層の中に、例えば、固体層の穴、壁、間隙、チャネル、トレンチ、細隙の中に含まれている両親媒性膜または層中に存在する。当業者は、好適な固体／両親媒性ハイブリッド系を調製することができる。好適な系は、国際公開第２００９／０２０６８２号パンフレットおよび国際公開第２０１２／００５８５７号パンフレットに開示されている。上で論じた両親媒性膜または層のいずれかを使用することができる。
【０４６５】
方法は、通常は、（ｉ）ポアを含む人工両親媒性層、（ｉｉ）ポアを含む単離された自然に存在する脂質二重層、または（ｉｉｉ）中にポアが挿入された細胞を使用して行われる。方法は、通常は、人工トリブロックコポリマー層などの人工両親媒性層を使用して行われる。層は、他の膜貫通および／または膜内タンパク質ならびに他の分子をポアに加えて含むことがある。好適な装置および条件は、下で論じる。本発明の方法は、通常はｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる。
【０４６６】
カップリング
ポリヌクレオチドは、好ましくは、ポアを含む膜とカップリングされる。方法は、ポアを含む膜とポリヌクレオチドをカップリングするステップを含むことがある。ポリヌクレオチドは、好ましくは、１つまたは複数のアンカーを使用して膜とカップリングされる。いかなる公知の方法を使用してポリヌクレオチドを膜とカップリングしてもよい。
【０４６７】
各アンカーは、ポリヌクレオチドとカップリング（結合）する基、および膜とカップリング（結合）する基を含む。各アンカーは、ポリヌクレオチドおよび／または膜と共有結合でカップリング（結合）することができる。Ｙアダプターおよび／またはヘパリンループアダプターが使用される場合、ポリヌクレオチドは、好ましくは、アダプターを使用して膜とカップリングされる。
【０４６８】
あらゆる数のアンカー、例えば、２、３、４以上のアンカーを使用して、ポリヌクレオチドを膜とカップリングすることができる。例えば、各々がポリヌクレオチドと膜の両方と別々にカップリング（結合）する２つのアンカーを使用して、ポリヌクレオチドを膜にカップリングしてもよい。
【０４６９】
１つまたは複数のアンカーは、１つもしくは複数のヘリカーゼおよび／または１つもしくは複数の分子ブレーキを含むことがある。
【０４７０】
膜が両親媒性層、例えば、コポリマー膜または脂質二重層である場合、１つまたは複数のアンカーは、好ましくは、膜中に存在するポリペプチドアンカー、および／または膜中に存在する疎水性アンカーを含む。疎水性アンカーは、好ましくは、脂質、脂肪酸、ステロール、カーボンナノチューブ、ポリペプチド、タンパク質またはアミノ酸、例えばコレステロール、パルミチン酸またはトコフェロールである。好ましい実施形態では、１つまたは複数のアンカーはポアではない。
【０４７１】
膜の成分、例えば、両親媒性分子、コポリマーまたは脂質は、１つまたは複数のアンカーを形成するように化学的に修飾されるまたは官能化されることがある。好適な化学的修飾および膜の成分を官能化する好適な方法の例は、下でより詳細に論じる。膜成分のあらゆる割合、例えば、少なくとも０．０１％、少なくとも０．１％、少なくとも１％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％または１００％を、官能化することができる。
【０４７２】
ポリヌクレオチドが膜に直接カップリングされることもある。膜にポリヌクレオチドをカップリングするために使用される１つまたは複数のアンカーは、好ましくはリンカーを含む。１つまたは複数のアンカーが１つまたは複数、例えば２、３、４以上、のリンカーを含むこともある。１つのリンカーが、１つより多く、例えば２、３、４以上、のポリヌクレオチドを膜とカップリングするために使用されることもある。
【０４７３】
好ましいリンカーとしては、ポリマー、例えばポリヌクレオチド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、多糖類およびポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。これらのリンカーは、直鎖状であってもよく、分岐していてもよく、または環状であってもよい。例えば、リンカーは、環状ポリヌクレオチドであることがある。ポリヌクレオチドは、環状ポリヌクレオチドリンカーを用いて相補配列にハイブリダイズすることもある。
【０４７４】
１つもしくは複数のアンカーまたは１つもしくは複数のリンカーは、切断して破壊することができる成分、例えば、制限部位または光解離性基を含むこともある。
【０４７５】
官能化されたリンカー、およびそれらが分子をカップリングできる方法は、当技術分野において公知である。例えば、マレイミド基で官能化されたリンカーは、タンパク質中のシステイン残基と反応して、該システイン残基に結合することになる。本発明に関連して、タンパク質は、膜中に存在することもあり、またはポリヌクレオチドとカップリング（もしくは結合）するために使用されることもある。このことは、下でより詳細に論じる。
【０４７６】
ポリヌクレオチドの架橋は、「鍵と鍵穴」配置を使用して回避することができる。各リンカーの一方の末端のみが互いに反応してより長いリンカーを形成することがあり、リンカーの他方の末端は、各々がポリヌクレオチドまたは膜とそれぞれ反応する。そのようなリンカーは、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３２号明細書（国際公開第２０１０／０８６６０２号パンフレットとして公開）に記載されている。
【０４７７】
下で論じるシークエンシング実施形態ではリンカーの使用が好ましい。ポリヌクレオチドが、ポアと相互作用しているときにはアンカップリングしない（すなわち、ステップ（ｂ）でもステップ（ｅ）でもアンカップリングしない）という意味で膜に直接、永続的にカップリングされている場合には、膜とポアとの距離のためシークエンシング実験をポリヌクレオチドの末端まで継続することができないので、一部の配列データが失われることになる。リンカーを使用すればポリヌクレオチドを完了まで処理することができる。
【０４７８】
カップリングは、永続的または安定性であることがある。言い換えれば、カップリングは、ポリヌクレオチドが、ポアと相互作用しているときに膜とカップリングされたままであるようなカップリングであることがある。
【０４７９】
カップリングは、一時的であることもある。言い換えれば、カップリングは、ポリヌクレオチドが、ポアと相互作用しているとき、膜からアンカップリングされうるカップリングであることもある。
【０４８０】
アプタマー検出などの、ある特定の実施形態については、一時的な性質のカップリングが好ましい。永続的または安定性リンカーがポリヌクレオチドの５’または３’末端のどちらか一方に直接結合されており、リンカーが膜と膜貫通ポアのチャネル間の距離より短い場合には、シークエンシング実験をポリヌクレオチドの末端まで継続することができないので、一部の配列データが失われることになる。カップリングが一時的である場合には、カップリングされた末端から無作為に膜がなくなると、ポリヌクレオチドを完了まで処理することができる。永続的／安定性連結または一時的連結を形成する化学基は、下でより詳細に論じる。コレステロールまたは脂肪アシル鎖を使用して、ポリヌクレオチドを両親媒性層またはトリブロックコポリマー膜と一時的にカップリングすることもできる。６〜３０炭素原子の長さを有するあらゆる脂肪酸、例えば、ヘキサデカン酸を使用することができる。
【０４８１】
好ましい実施形態では、核酸などのポリヌクレオチドは、トリブロックコポリマーまたは脂質二重層などの両親媒性層とカップリングされる。核酸の合成脂質二重層へのカップリングは、様々な異なる繋留戦略を用いて以前に行われている。これらのことを下の表４に要約する。
【０４８２】
【表４】
2017527284.tif 000021
【０４８３】
合成ポリヌクレオチドおよび／またはリンカーは、コレステロール、トコフェロール、パルミチン酸、チオール、脂質およびビオチン基などの好適なアンカー基の直接付加に容易に適合する修飾ホスホロアミダイトを合成反応中に使用して、官能化することができる。これらの様々な結合用化学物質は、ポリヌクレオチドへの結合の一連の選択肢をもたらす。異なる修飾基各々がポリヌクレオチドにわずかに異なる方法でカップリングし、カップリングは必ずしも永続的であるとは限らないため、膜へのポリヌクレオチドの滞留に異なる時間が費やされる。一時的カップリングの利点は、上で論じている。
【０４８４】
リンカーへのまたは官能化膜へのポリヌクレオチドのカップリングは、相補的反応性基またはアンカー基をそのポリヌクレオチドに付加させることができることを条件に、多数の他の手段によって果たすこともできる。ポリヌクレオチドのどちらか一方の末端への反応性基の付加は、以前に報告されている。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよびＡＴＰγＳを使用して、チオール基をｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡの５’に付加させることができる（Grant, G. P. and P. Z. Qin (2007). "A facile method for attaching nitroxide spin labels at the 5' terminus of nucleic acids." Nucleic Acids Res 35(10): e77）。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよびγ−［２−アジドエチル］−ＡＴＰまたはγ−［６−アジドヘキシル］−ＡＴＰを使用して、アジド基をｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡの５’リン酸に付加させることができる。チオールまたはクリックケミストリーを使用して、チオール、ヨードアセトアミドＯＰＳＳもしくはマレイミド基（チオールに対して反応性）またはＤＩＢＯ（ジベンゾシクロオクチン）もしくはアルキン基（アジドに対して反応性）のどちらか一方を含有するテザーをポリヌクレオチドに共有結合させることができる。末端トランスフェラーゼを使用して、ビオチン、チオールおよびフルオロフォアなどの化学基のより多様な選択物を付加させて、ｓｓＤＮＡの３’に修飾オリゴヌクレオチドを組み込むことができる（Kumar, A., P. Tchen, et al., (1988). "Nonradioactive labeling of synthetic oligonucleotide probes with terminal deoxynucleotidyl transferase." Anal Biochem 169(2): 376-82）。ストレプトアビジン／ビオチンおよび／またはストレプトアビジン／デスチオビオチンカップリングをあらゆる他のポリヌクレオチドに使用することができる。下の実施例は、ストレプトアビジン／ビオチンおよびストレプトアビジン／デスチオビオチンを使用してポリヌクレオチドを膜とカップリングすることができる方法を説明する。末端トランスフェラーゼと好適に修飾されたヌクレオチド（例えばコレステロールまたはパルミチン酸）を使用してアンカーがポリヌクレオチドに直接付加されうる可能性もありうる。
【０４８５】
１つまたは複数のアンカーは、好ましくは、ポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションによって膜とカップリングする。１つまたは複数のアンカーのハイブリダイゼーションによって、上で論じたような一時的な様式でのカップリングが可能になる。ハイブリダイゼーションは、１つまたは複数のアンカーのいかなる部分に存在してもよく、例えば、１つまたは複数のアンカーとポリペプチドの間に、１つまたは複数のアンカー内に、または１つまたは複数のアンカーと膜の間に存在してもよい。例えば、リンカーは、互いにハイブリダイズされている２つ以上のポリヌクレオチド、例えば、３、４または５つのポリヌクレオチドを含むことがある。１つまたは複数のアンカーは、ポリヌクレオチドにハイブリダイズすることがある。１つまたは複数のアンカーは、（下で論じるように）ポリヌクレオチドに直接ハイブリダイズすることもあり、またはポリヌクレオチドに結合されたＹアダプターおよび／もしくはリーダー配列に直接ハイブリダイズすることもあり、またはポリヌクレオチドに結合されたヘアピンループアダプターに直接ハイブリダイズすることもある。あるいは、１つまたは複数のアンカーが１つまたは複数、例えば２つまたは３つ、の中間ポリヌクレオチド（または「スプリント」）にハイブリダイズされることがあり、中間ポリヌクレオチドは、（下で論じるように）ポリヌクレオチドに、ポリヌクレオチドに結合されたＹアダプターおよび／もしくはリーダー配列に、またはポリヌクレオチドに結合されたヘアピンループアダプターにハイブリダイズされる。
【０４８６】
１つまたは複数のアンカーは、一本鎖ポリヌクレオチドを含むこともあり、または二本鎖ポリヌクレオチドを含むこともある。アンカーの一部分が一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドにライゲーションされていることもある。Ｔ４  ＲＮＡリガーゼＩを使用する短いｓｓＤＮＡ片のライゲーションが報告されている（Troutt, A. B., M. G. McHeyzer-Williams, et al., (1992). "Ligation-anchored PCR: a simple amplification technique with single-sided specificity." Proc Natl Acad Sci U S A 89(20): 9823-5）。あるいは、一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドいずれかを二本鎖ポリヌクレオチドにライゲーションし、その後、２本の鎖を熱または化学変性によって分離することができる。二本鎖ポリヌクレオチドに対しては、その二重鎖の末端の一方もしくは両方に１本の一本鎖ポリヌクレオチドを付加させること、または一方もしくは両方の末端に二本鎖ポリヌクレオチドを付加させることが可能である。一本鎖ポリヌクレオチドの二本鎖ポリヌクレオチドへの付加については、この付加を、一本鎖ポリヌクレオチドの他の領域へのライゲーションの場合と同様にＴ４  ＲＮＡリガーゼＩを使用して果たすことができる。次に、二本鎖ポリヌクレオチドの二本鎖ポリヌクレオチドへの付加については、ライゲーションは、ポリヌクレオチドおよび付加されたポリヌクレオチドそれぞれの相補的３’ｄＡ／ｄＴテールを用いる（多くの試料調製用途について鎖状体またはダイマー形成を防止するために常例的に行われているような）「平滑末端型」であることもあり、またはポリヌクレオチドの制限消化および適合性アダプターのライゲーションによって生成された「突出末端」の使用であることもある。次に、二重鎖が融解されると、各々の一本鎖は、一本鎖ポリヌクレオチドが５’末端、３’末端でのライゲーションもしくは修飾に使用された場合には５’もしくは３’修飾のいずれか一方、または二本鎖ポリヌクレオチドがライゲーションに使用された場合には両方の修飾を有することになる。
【０４８７】
ポリヌクレオチドが合成鎖である場合、そのポリヌクレオチドの化学合成中に１つまたは複数のアンカーを組み込むことができる。例えば、反応性基が結合されたプライマーを使用してポリヌクレオチドを合成することができる。
【０４８８】
アデニル化ポリヌクレオチドは、アデノシン一リン酸をポリヌクレオチドの５’リン酸に結合させるライゲーション反応における中間体である。この中間体の生成には、ＮＥＢからの５’ＤＮＡアデニル化キットなどの様々なキットが利用可能である。さらにまた、反応中に修飾ヌクレオチド三リン酸をＡＴＰで置換することによって、ポリヌクレオチドの５’に反応性基（例えばチオール、アミン、ビオチン、アジドなど）の付加が可能でありうる。５’ＤＮＡアデニル化キットと好適に修飾されたヌクレオチド（例えばコレステロールまたはパルミチン酸）を使用してアンカーがポリヌクレオチドに直接付加されうる可能性もありうる。
【０４８９】
ゲノムＤＮＡ部分の一般的な増幅法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用である。ここで、２つの合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ＤＮＡの同じ部分の多数のコピーを生成することができ、この場合、各コピーの二重鎖における各鎖の５’が合成ポリヌクレオチドとなる。ポリメラーゼを利用することによって、単一または複数のヌクレオチドを一本鎖または二本鎖ＤＮＡの３’末端に付加させることができる。使用することができるポリメラーゼの例としては、ターミナルトランスフェラーゼ、クレノウおよび大腸菌（E. coli）ポリ（Ａ）ポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。さらにまた、反応中に修飾ヌクレオチド三リン酸をＡＴＰで置換することによって、コレステロール、チオール、アミン、アジド、ビオチンまたは脂質などのアンカーを二本鎖ポリヌクレオチドに組み込むことができる。したがって、増幅されたポリヌクレオチドの各コピーは、アンカーを含有することになる。
【０４９０】
理想的には、ポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドを官能化する必要なく、膜とカップリングされる。これは、１つもしくは複数のアンカー、例えばポリヌクレオチド結合タンパク質または化学基、を膜とカップリングし、１つもしくは複数のアンカーをポリヌクレオチドと相互作用させることによって、または膜を官能化することによって、果たすことができる。１つまたは複数のアンカーを本明細書に記載する方法のいずれかによって膜とカップリングしてもよい。特に、１つまたは複数のアンカーは、１つまたは複数のリンカー、例えばマレイミド官能化リンカーを含むことがある。
【０４９１】
この実施形態では、ポリヌクレオチドは、通常ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、ＴＮＡまたはＬＮＡであり、二本鎖状であってもよく、または一本鎖状であってもよい。この実施形態は、ゲノムＤＮＡポリヌクレオチドに特に適している。
【０４９２】
１つまたは複数のアンカーは、一本鎖もしくは二本鎖ポリヌクレオチドと、ポリヌクレオチド内の特異的ヌクレオチド配列と、またはポリヌクレオチド内の修飾ヌクレオチドのパターンと、またはポリヌクレオチド上に存在する任意の他のリガンドとカップリング、結合または相互作用する、あらゆる基を含むことができる。
【０４９３】
アンカーに使用するために好適な結合タンパク質としては、下に列挙するものを含めて、大腸菌（E. coli）一本鎖結合タンパク質、Ｐ５一本鎖結合タンパク質、Ｔ４  ｇｐ３２一本鎖結合タンパク質、ＴＯＰＯ  Ｖ  ｄｓＤＮＡ結合領域、ヒトヒストンタンパク質、大腸菌（E. coli）ＨＵ  ＤＮＡ結合タンパク質、および他の古細菌性、原核性または真核性一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチド（または核酸）結合タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４９４】
特異的ヌクレオチド配列は、転写因子、リボソーム、エンドヌクレアーゼ、トポイソメラーゼまたは複製開始因子によって認識される配列でありうる。修飾ヌクレオチドのパターンは、メチル化または損傷のパターンでありうる。
【０４９５】
１つまたは複数のアンカーは、ポリヌクレオチドとカップリングする、ポリヌクレオチドと結合する、ポリヌクレオチドにインターカレートする、またはポリヌクレオチドと相互作用する、あらゆる基を含むことができる。この基は、静電相互作用、水素結合相互作用、またはファンデルワールス相互作用によって、ポリヌクレオチドにインターカレートするまたはポリヌクレオチドと相互作用することがある。そのような基としては、リシンモノマー、ポリリシン（ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡと相互作用することになる）、臭化エチジウム（ｄｓＤＮＡにインターカレートすることになる）、ユニバーサル塩基またはユニバーサルヌクレオチド（任意のポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができる）、およびオスミウム錯体（メチル化塩基と反応することができる）が挙げられる。したがって、ポリヌクレオチドと膜を、その膜に結合された１つまたは複数のユニバーサル塩基を使用してカップリングすることができる。各ユニバーサルヌクレオチドは、１つまたは複数のリンカーを使用して膜とカップリングすることができる。ユニバーサルヌクレオチドは、好ましくは、次の核酸塩基のうちの１つを含む：ヒポキサンチン、４−ニトロインドール、５−ニトロインドール、６−ニトロインドール、ホルミルインドール、３−ニトロピロール、ニトロイミダゾール、４−ニトロピラゾール、４−ニトロベンゾイミダゾール、５−ニトロインダゾール、４−アミノベンゾイミダゾールまたはフェニル（Ｃ６−芳香族環）。ユニバーサルヌクレオチドは、より好ましくは、次のヌクレオシドのうちの１つを含む：２’−デオキシイノシン、イノシン、７−デアザ−２’−デオキシイノシン、７−デアザ−イノシン、２−アザ−デオキシイノシン、２−アザ−イノシン、２−Ｏ’−メチルイノシン、４−ニトロインドール２’−デオキシリボヌクレオシド、４−ニトロインドールリボヌクレオシド、５−ニトロインドール２’デオキシリボヌクレオシド、５−ニトロインドールリボヌクレオシド、６−ニトロインドール２’−デオキシリボヌクレオシド、６−ニトロインドールリボヌクレオシド、３−ニトロピロール２’−デオキシリボヌクレオシド、３−ニトロピロールリボヌクレオシド、ヒポキサンチンの非環状糖類似体、ニトロイミダゾール２’−デオキシリボヌクレオシド、ニトロイミダゾールリボヌクレオシド、４−ニトロピラゾール２’−デオキシリボヌクレオシド、４−ニトロピラゾールリボヌクレオシド、４−ニトロベンゾイミダゾール２’−デオキシリボヌクレオシド、４−ニトロベンゾイミダゾールリボヌクレオシド、５−ニトロインダゾール２’−デオキシリボヌクレオシド、５−ニトロインダゾールリボヌクレオシド、４−アミノベンゾイミダゾール２’−デオキシリボヌクレオシド、４−アミノベンゾイミダゾールリボヌクレオシド、フェニルＣ−リボヌクレオシド、フェニルＣ−２’−デオキシリボシルヌクレオシド、２’−デオキシネブラリン、２’−デオキシイソグアノシン、Ｋ−２’−デオキシリボース、Ｐ−２’−デオキシリボースおよびピロリジン。ユニバーサルヌクレオチドは、より好ましくは、２’−デオキシイノシンを含む。ユニバーサルヌクレオチドは、より好ましくは、ＩＭＰまたはｄＩＭＰである。ユニバーサルヌクレオチドは、最も好ましくは、ｄＰＭＰ（２’−デオキシ−Ｐ−ヌクレオシド一リン酸）またはｄＫＭＰ（Ｎ６−メトキシ−２，６−ジアミノプリン一リン酸）である。
【０４９６】
１つまたは複数のアンカーは、フーグスティーン（Hoogsteen）水素結合（２つの核酸塩基が水素結合によって一緒に保持される）または逆フーグスティーン水素結合（一方の核酸塩基が他方の核酸塩基に対して１８０°回転される）によってポリヌクレオチドとカップリング（または結合）されることもある。例えば、１つまたは複数のアンカーは、ポリヌクレオチドとフーグスティーン水素結合または逆フーグスティーン水素結合を形成する、１つもしくは複数のヌクレオチド、１つもしくは複数のオリゴヌクレオチドまたは１つもしくは複数のポリヌクレオチドを含むことがある。これらのタイプの水素結合は、第３のポリヌクレオチド鎖を二本鎖らせんの周りに巻きつかせ、三重鎖を形成させる。１つまたは複数のアンカーは、二本鎖ポリヌクレオチドと、その二本鎖二重鎖と三重鎖を形成することによって、カップリング（または結合）することもある。
【０４９７】
この実施形態では、膜成分の少なくとも１％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％または１００％が官能化されることもある。
【０４９８】
１つまたは複数のアンカーがタンパク質を含む場合、それらのアンカーは、例えば、そのタンパク質が膜と適合性である外部疎水性領域を既に有する場合、さらなる官能化なしに直接膜内に係留することができる。そのようなタンパク質の例としては、膜貫通タンパク質、膜内タンパク質および膜タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、タンパク質は、膜と適合性である遺伝子的に融合された疎水性領域を伴って発現されることもある。そのような疎水性タンパク質領域は、当技術分野において公知である。
【０４９９】
１つまたは複数のアンカーは、好ましくは、膜との接触前にポリヌクレオチドと混合されるが、１つまたは複数のアンカーを膜と接触させ、その後、ポリヌクレオチドと接触させてもよい。
【０５００】
別の態様では、ポリヌクレオチドは、上記の方法を使用して特異的結合基によって認識されうるように官能化されることがある。具体的には、ポリヌクレオチドは、リガンド、例えば、ビオチン（ストレプトアビジンと結合させるため）、アミロース（マルトース結合タンパク質もしくは融合タンパク質と結合させるため）、Ｎｉ−ＮＴＡ（ポリヒスチジンと、もしくはポリヒスチジンタグ付きタンパク質と結合させるため）、またはペプチド（例えば抗原）で官能化されることがある。
【０５０１】
好ましい実施形態によると、ポアを優先的に通り抜けるリーダー配列にポリヌクレオチドを結合させる場合、１つまたは複数のアンカーを使用してポリヌクレオチドを膜とカップリングすることができる。リーダー配列は、下でより詳細に論じる。好ましくは、ポリヌクレオチドは、ポアを優先的に通り抜けるリーダー配列に結合（例えばライゲーション）される。そのようなリーダー配列は、ホモポリマー型ポリヌクレオチドまたは脱塩基領域を含むことがある。リーダー配列は、１つまたは複数のアンカーに直接、または１つもしくは複数の中間ポリヌクレオチド（もしくはスプリント）を介して、ハイブリダイズするように設計されるのが一般的である。そのような場合、１つまたは複数のアンカーは、通常は、リーダー配列内の配列に相補的であるまたは１つもしくは複数の中間ポリヌクレオチド（もしくはスプリント）内の配列に相補的であるポリヌクレオチド配列を含む。そのような場合、１つまたは複数のスプリントは、通常は、リーダー配列内の配列に相補的であるポリヌクレオチド配列を含む。
【０５０２】
化学結合に使用される分子の例は、ＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩）である。市販のキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｐｉｅｒｃｅ、部品番号２２９８０）を使用して反応性基をポリヌクレオチドの５’に付加させることもできる。好適な方法には、ヒスチジン残基およびＮｉ−ＮＴＡを使用する一時的親和性結合はもちろん、反応性システイン、リシンまたは非天然アミノ酸による、より頑強な共有結合も含まれるが、これらに限定されない。
【０５０３】
二本鎖ポリヌクレオチド
ポリヌクレオチドは、二本鎖状であることがある。ポリヌクレオチドが二本鎖状である場合、方法は、接触ステップの前に、ヘアピンループなどの架橋部分をポリヌクレオチドの一方の末端にライゲーションするステップを好ましくはさらに含む。その場合、ポリヌクレオチドを本発明に従ってポアと接触させながらまたは接触させる前に、ポリヌクレオチドの２本の鎖を分離することができる。ポアを通るポリヌクレオチドの移動がポリヌクレオチド結合タンパク質、例えばヘリカーゼ、または分子ブレーキによって制御されるので、２本の鎖を分離することができる。
【０５０４】
このようにして二本鎖構築物の両方の鎖を連結させ、調べることによって、特徴づけの効率および精度が増す。
【０５０５】
架橋部分は、標的ポリヌクレオチドの２本の鎖を連結させることができる。架橋部分は、通常は、標的ポリヌクレオチドの２本の鎖を共有結合で連結する。架橋部分は、その架橋部分が一本鎖ポリヌクレオチドの膜貫通ポアを通る移動に干渉しないことを条件に、標的ポリヌクレオチドの２本の鎖を連結させることができるあらゆるものであることができる。
【０５０６】
当技術分野において公知のあらゆる好適な手段によって架橋部分を標的ポリヌクレオチドに連結させることができる。架橋部が別途合成され、標的ポリヌクレオチドに化学的に結合または酵素的にライゲーションされることもある。あるいは、架橋部分が標的ポリヌクレオチドのプロセシング中に生成されることもある。
【０５０７】
架橋部分は、標的ポリヌクレオチドに、その標的ポリヌクレオチドの一方の末端にまたは末端付近に連結される。架橋部分は、好ましくは、標的ポリヌクレオチドに、その標的ポリヌクレオチドの末端の１０ヌクレオチド以内に連結される。
【０５０８】
好適な架橋部分としては、高分子リンカー、化学的リンカー、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、架橋部分は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾ＤＮＡ（例えば脱塩基ＤＮＡ）、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡまたはＰＥＧを含む。架橋部分は、より好ましくはＤＮＡまたはＲＮＡである。
【０５０９】
架橋部分は、最も好ましくは、ヘアピンループまたはヘアピンループアダプターである。好適なヘアピンアダプターは、当技術分野において公知の方法を使用して設計することができる。ヘアピンループは、いかなる長さであってもよい。ヘアピンループは、通常は、長さ１１０ヌクレオチド以下、例えば、１００ヌクレオチド以下、９０ヌクレオチド以下、８０ヌクレオチド以下、７０ヌクレオチド以下、６０ヌクレオチド以下、５０ヌクレオチド以下、４０ヌクレオチド以下、３０ヌクレオチド以下、２０ヌクレオチド以下、または１０ヌクレオチド以下である。ヘアピンループは、好ましくは、長さ約１〜１１０、２〜１００、５〜８０、または６〜５０ヌクレオチドである。ヘアピンループがアダプターの分別選択可能性に関与する場合、５０〜１１０ヌクレオチドなどの、より長いヘアピンループ長が好ましい。同様に、ヘアピンループが、下で論じるような選択可能結合に関与しない場合、１〜５ヌクレオチドなどの、より短いヘアピンループ長が好ましい。
【０５１０】
ヘアピンアダプターは、第１および／または第２のポリヌクレオチドのどちらか一方の末端、すなわち５’または３’末端にライゲーションされることがある。当技術分野において公知のいかなる方法を使用して、ヘアピンアダプターを第１および／または第２のポリヌクレオチドにライゲーションしてもよい。リガーゼ、例えば、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、大腸菌（E. coli）ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔｍａ  ＤＮＡリガーゼおよび９ＯＮ  ＤＮＡリガーゼを使用して、ヘアピンアダプターをライゲーションすることができる。
【０５１１】
当技術分野において公知のいかなる方法を使用してポリヌクレオチドの２本の鎖を分離してもよい。例えば、ポリヌクレオチド結合タンパク質によって、または脱ハイブリダイゼーションに有利に働く条件を使用して、それらの鎖を分離することができる（脱ハイブリダイゼーションに有利に働く条件の例としては、高温、高ｐＨ、ならびに水素結合または塩基対合を破壊することができる作用物質、例えばホルムアミドおよび尿素、の添加が挙げられるが、これらに限定されない）。
【０５１２】
ヘアピンアダプターは、選択可能結合部分を好ましくは含む。これによって、第１および／または第２のポリヌクレオチドを精製または単離することが可能になる。選択可能結合部分は、その結合特性に基づいて選択することができる部分である。したがって、選択可能結合部分は、好ましくは、表面と特異的に結合する部分である。選択可能結合部分は、本発明に使用される他の部分よりはるかに大きい程度に表面と結合する場合、その表面に特異的に結合する。好ましい実施形態において、部分は、本発明に使用されるいかなる他の部分も結合しない表面と結合する。
【０５１３】
好適な選択的結合部分は、当技術分野において公知である。好ましい選択的結合部分としては、ビオチン、ポリヌクレオチド表面、抗体、抗体断片、例えばＦａｂおよびＳｃＳｖ、抗原、ポリヌクレオチド結合タンパク質、ポリヒスチジンテールおよびＧＳＴタグが挙げられるが、これらに限定されない。最も好ましい選択的結合部分は、ビオチンおよび選択可能ポリヌクレオチド配列である。ビオチンは、アビジンで被覆された表面と特異的に結合する。選択可能ポリヌクレオチド配列は、相同配列で被覆された表面と特異的に結合（すなわちハイブリダイズ）する。あるいは、選択可能ポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド結合タンパク質で被覆された表面と特異的に結合する。
【０５１４】
ヘアピンアダプターおよび／または選択可能結合部分は、切る、切り目を入れる、切断するまたは加水分解することができる領域を含むことができる。そのような領域は、第１および／または第２のポリヌクレオチドを、そのポリヌクレオチドが結合されている表面から精製または単離後に除去することを可能にするように設計することができる。好適な領域は、当技術分野において周知である。好適な領域としては、ＲＮＡ領域、デスチオビオチンおよびストレプトアビジンを含む領域、ジスルフィド結合、および光切断性領域が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５１５】
二本鎖標的ポリヌクレオチドは、好ましくは、ヘアピンループまたはヘアピンループアダプターなどの架橋部分の反対側の末端にリーダー配列を含む。リーダー配列は、下でより詳細に論じる。
【０５１６】
ラウンドザコーナーシークエンシング（Round the corner sequencing）
好ましい実施形態では、標的二本鎖ポリヌクレオチドには一方の末端に架橋部分、例えば、ヘアピンループまたはヘアピンループアダプターが備えられており、方法は、ポリヌクレオチドをポアと、ポリヌクレオチドの両方の鎖がポアを通って移動するように接触させるステップと、ポリヌクレオチドの両方の鎖がポアに対して移動しているときに１回または複数回の測定を行い、測定がポリヌクレオチドの鎖の１つまたは複数の特徴を示し、それによって標的二本鎖ポリヌクレオチドを特徴づけるステップとを含む。別の好ましい実施形態では、標的二本鎖ポリヌクレオチドには一方の末端に架橋部分、例えば、ヘアピンループまたはヘアピンループアダプターが備えられており、方法は、ポリヌクレオチドをポアおよびエキソヌクレアーゼと、ポリヌクレオチドの両方の鎖が消化されて個々のヌクレオチドになるように接触させるステップを含む。上で論じた実施形態のいずれかがこの方法に同等に適用される。
【０５１７】
リーダー配列
鎖特徴づけ／シークエンシング方法における接触ステップの前に、方法は、ポアを優先的に通り抜けるリーダー配列をポリヌクレオチドに結合させるステップを好ましくは含む。リーダー配列は、本発明の方法を助長する。リーダー配列は、ポアを優先的に通り抜けるように、およびそれによってポリヌクレオチドのポアを通る移動を助長するように、設計される。リーダー配列を使用して、ポリヌクレオチドを上で論じたような１つまたは複数のアンカーに連結させることもできる。
【０５１８】
リーダー配列は、通常はポリマーを含む。ポリマーは、好ましくは負電荷を有する。ポリマーは、好ましくは、ポリヌクレオチド、例えばＤＮＡもしくはＲＮＡ、修飾ポリヌクレオチド（例えば脱塩基ＤＮＡ）、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリペプチドである。リーダーは、好ましくはポリヌクレオチドを含み、より好ましくは一本鎖ポリヌクレオチドを含む。リーダー配列は、上で論じたポリヌクレオチドのいずれかを含むことができる。一本鎖リーダー配列は、最も好ましくは、ＤＮＡの１本の鎖、例えば、ポリｄＴ部分を含む。リーダー配列は、好ましくは１つまたは複数のスペーサーを含む。
【０５１９】
リーダー配列は、あらゆる長さであることができるが、通常は、長さ１０〜１５０ヌクレオチド、例えば、長さ２０〜１５０ヌクレオチドである。リーダーの長さは、方法に使用される膜貫通ポアに通常は依存する。
【０５２０】
リーダー配列は、好ましくは、下で定義するようなＹアダプターの一部である。
【０５２１】
二重カップリング
本発明の方法は、二本鎖ポリヌクレオチドの二重カップリングを含むことがある。好ましい実施形態では、本発明の方法は、
（ａ）一方の末端にＹアダプターを有し、他方の末端にヘアピンループアダプターなどの架橋部分アダプターを有する、二本鎖ポリヌクレオチドを用意するステップであって、Ｙアダプターがポリヌクレオチドを膜とカップリングするための１つまたは複数の第１のアンカーを含み、架橋部分アダプターがポリヌクレオチドを膜とカップリングするための１つまたは複数の第２のアンカーを含み、架橋部分アダプターの膜へのカップリング強度がＹアダプターの膜へのカップリング強度より大きい、ステップ、
（ｂ）ステップ（ａ）で用意されたポリヌクレオチドを、ＣｓｇＧポアまたはその変異体、例えば本発明のポアと、ポリヌクレオチドがポアに対して、例えばポアを通って、移動するように接触させるステップ、および
（ｃ）ポリヌクレオチドがポアに対して移動しているときに１回または複数回の測定を行い、測定が、ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性を示し、それによって標的ポリヌクレオチドを特徴づけるステップ
を含む。
【０５２２】
このタイプの方法は、英国特許出願公開第１４０６１４７号（1406147.7）明細書において詳細に論じられている。
【０５２３】
二本鎖ポリヌクレオチドには一方の末端にＹアダプターがおよび他方の末端に架橋部分アダプターが備えられている。Ｙアダプターおよび／または架橋部分アダプターは、通常はポリヌクレオチドアダプターである。それらのアダプターは、上で論じたポリヌクレオチドのいずれかから形成することができる。
【０５２４】
Ｙアダプターは、通常は、（ａ）二本鎖領域、および（ｂ）一本鎖領域または他方の末端に相補的でない領域を含む。Ｙアダプターは、一本鎖領域を含む場合、オーバーハングを有すると記述されることがある。Ｙアダプター内の非相補領域の存在がこのアダプターをＹ形にする。二本鎖部分とは異なり２本の鎖が通常は互いにハイブリダイズしないからである。Ｙアダプターは、１つまたは複数の第１のアンカーを含む。アンカーは、上でより詳細に論じている。
【０５２５】
Ｙアダプターは、ポアを優先的に通り抜けるリーダー配列を好ましくは含む。このことは、上で論じている。
【０５２６】
架橋部分アダプターは、上で論じたような選択可能結合部分を好ましくは含む。架橋部分アダプターおよび／または選択可能結合部分は、上で論じたように切る、切り目を入れる、切断するまたは加水分解することができる領域を含むことができる。
【０５２７】
１つまたは複数のヘリカーゼおよび１つまたは複数の分子ブレーキが上で論じたように使用される場合、Ｙアダプターが好ましくは１つまたは複数のヘリカーゼを含み、架橋部分アダプターが好ましくは１つまたは複数の分子ブレーキを含む。
【０５２８】
当技術分野において公知のいかなる方法を用いてＹアダプターおよび／または架橋部分アダプターをポリヌクレオチドにライゲーションしてもよい。リガーゼ、例えば、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、大腸菌（E. coli）ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔｍａ  ＤＮＡリガーゼおよび９ＯＮ  ＤＮＡリガーゼを使用して、一方または両方のアダプターをライゲーションすることができる。あるいは、下で論じる本発明の方法を使用してアダプターをポリヌクレオチドに付加させることができる。
【０５２９】
好ましい実施形態では、方法のステップａ）は、二本鎖ポリヌクレオチドを、該二本鎖ポリヌクレオチドが一方の末端にＹアダプターをおよび他方の末端に架橋部分アダプターを含むように修飾することを含む。あらゆる修飾様式を使用することができる。方法は、好ましくは、本発明に従って二本鎖ポリヌクレオチドを修飾することを含む。このことは、下でより詳細に論じる。修飾方法と特徴づけ方法をいかなる形で組み合わせてもよい。
【０５３０】
架橋部分アダプターの膜とのカップリング（または結合）強度は、Ｙアダプターの膜とのカップリング（または結合）強度より大きい。この強度を任意の方法で測定することができる。カップリング（または結合）強度の好適な測定方法は、英国特許出願公開第１４０６１４７号（1406147.7）明細書の実施例に開示されている。
【０５３１】
架橋部分アダプターのカップリング（または結合）強度は、好ましくは、Ｙアダプターのカップリング（または結合）強度の少なくとも１．５倍、例えば、アンカーアダプターのカップリング（または結合）強度の少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍である。架橋部分アダプターの膜に対する親和定数（Ｋｄ）は、好ましくは、Ｙアダプターの親和定数の少なくとも１．５倍、例えば、Ｙアダプターのカップリング強度の少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍である。
【０５３２】
架橋部分アダプターがＹアダプターより強く膜とカップリング（または結合）する方法はいくつかある。例えば、架橋部分アダプターは、Ｙアダプターより多くのアンカーを含むことがある。例えば、架橋部分アダプターは、２つ、３つ以上の第２のアンカーを含むことがあり、これに対してＹアダプターは、１つの第１のアダプターを含むことがある。
【０５３３】
１つまたは複数の第２のアンカーの膜とのカップリング（または結合）強度は、１つまたは複数の第１のアンカーの膜とのカップリング（または結合）強度より大きいことがある。１つまたは複数の第２のアンカーの架橋部分アダプターとのカップリング（または結合）強度は、１つまたは複数の第１のアンカーのＹアダプターとのカップリング（または結合）強度より大きいことがある。１つまたは複数の第１のアンカーおよび１つまたは複数の第２のアンカーは、それらのそれぞれのアダプターにハイブリダイゼーションによって結合されていることがあり、このハイブリダイゼーション強度は、１つまたは複数の第１のアンカーにおけるより１つまたは複数の第２のアンカーにおけるほうが大きい。これらの実施形態のあらゆる組合せも本発明に使用することができる。カップリング（または結合）強度は、当技術分野において公知の技術を使用して測定することができる。
【０５３４】
１つまたは複数の第２のアンカーは、膜とカップリング（または結合）する１つまたは複数の第１のアンカー中の１つまたは複数の基より大きい強度でその膜とカップリング（または結合）する１つまたは複数の基を好ましくは含む。好ましい実施形態では、架橋部分アダプター／１つまたは複数の第２のアンカーは、コレステロールを使用して膜とカップリング（または結合）し、Ｙアダプター／１つまたは複数の第１のアンカーは、パルミチン酸を使用して膜とカプリング（または結合）する。コレステロールは、パルミチン酸より強くトリブロックコポリマー膜および脂質膜と結合する。代替実施形態では、架橋部分アダプター／１つまたは複数の第２のアンカーは、パルミチン酸などのモノアシル化学種を使用して膜とカップリング（または結合）し、Ｙアダプター／１つまたは複数の第１のアンカーは、ジパルミトイルホスファチジルコリンなどのジアシル化学種を使用して膜とカップリング（または結合）する。
【０５３５】
ヘアピンループおよびリーダー配列の付加
用意する前に、二本鎖ポリヌクレオチドをＭｕＡトランスポサーゼ、および二本鎖ＭｕＡ基質の集団と接触させてもよく、この場合、集団中の基質の一部は、リーダー配列を含むＹアダプターであり、また集団中の基質の一部はヘアピンループアダプターである。トランスポサーゼは、二本鎖ポリヌクレオチド分析物を断片化し、それらの断片の一方または両方の末端にＭｕＡ基質をライゲーションする。これは、一方の末端にリーダー配列をおよび他方にヘアピンループを含む、複数の修飾二本鎖ポリヌクレオチドを生成する。その場合、本発明の方法を使用して修飾二本鎖ポリヌクレオチドを調査することができる。
【０５３６】
集団中の各基質は、好ましくは、ユニバーサルヌクレオチドの少なくとも１つのオーバーハングを含み、したがって、トランスポサーゼがテンプレートポリヌクレオチドを断片化し、基質を二本鎖断片の一方または両方の末端にライゲーションし、その結果、複数の断片／基質構築物を生成する。この場合、方法は、オーバーハングを構築物中の断片にライゲーションすることによって複数の修飾二本鎖ポリヌクレオチドを生成するステップをさらに含む。好適なユニバーサルヌクレオチドは、上で論じている。オーバーハングは、好ましくは、長さ５ヌクレオチドである。
【０５３７】
あるいは、集団中の各基質は、好ましくは、（ｉ）少なくとも１つのオーバーハングと、（ｉｉ）少なくとも１つのオーバーハングと同じ鎖内に、テンプレートポリヌクレオチド中に存在しないヌクレオシドを含む少なくとも１つのヌクレオチドとを含み、したがって、トランスポサーゼがテンプレートポリヌクレオチドを断片化し、二本鎖断片の一方または両方の末端に基質をライゲーションし、その結果、複数の断片／基質構築物を生成する。この場合、方法は、（ａ）少なくとも１つのヌクレオチドを選択的に除去することにより構築物からオーバーハングを除去することによって一本鎖ギャップを含む複数の二本鎖構築物を生成するステップ、および（ｂ）構築物中の一本鎖ギャップを修復することによって複数の修飾二本鎖ポリヌクレオチドを生成するステップをさらに含む。ポリヌクレオチドは、通常は、ヌクレオシド：デオキシアデノシン（ｄＡ）、デオキシウリジン（ｄＵ）および／またはチミジン（ｄＴ）、デオキシグアノシン（ｄＧ）ならびにデオキシシチジン（ｄＣ）を含む。ポリヌクレオチド中に存在しないヌクレオシドは、好ましくは、脱塩基性、アデノシン（Ａ）、ウリジン（Ｕ）、５−メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、シチジン（Ｃ）もしくはグアノシン（Ｇ）であるか、または尿素、５，６−ジヒドロキシチミン、チミングリコール、５−ヒドロキシ−５−メチルヒダントイン（5-hydroxy-5 methylhydanton）、ウラシルグリコール、６−ヒドロキシ−５，６−ジヒドロチミン（6-hyroxy-5,6-dihdrothimine）、メチルタルトロニル尿素、７，８−ジヒドロ−８−オキソグアニン（８−オキソグアニン）、８−オキソアデニン、ｆａｐｙ−グアニン、メチル−ｆａｐｙ−グアニン、ｆａｐｙ−アデニン、アフラトキシンＢ１−ｆａｐｙ−グアニン、５−ヒドロキシ−シトシン、５−ヒドロキシ−ウラシル、３−メチルアデニン、７−メチルグアニン、１、Ｎ６−エタノアデニン、ヒポキサンチン、５−ヒドロキシウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、５−ホルミルウラシルもしくはシス−ｓｙｎ−シクロブタンピリミジンダイマーを含む。少なくとも１つのヌクレオチドは、好ましくは、オーバーハングからの１０ヌクレオチド以下である。少なくとも１つのヌクレオチドは、オーバーハング中の第１のヌクレオチドである。オーバーハング中のヌクレオチドのすべてが、テンプレートポリヌクレオチド中に存在しないヌクレオシドを好ましくは含む。
【０５３８】
これらのＭｕＡベースの方法は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１４／０５２５０５号パンフレットに開示されている。それらは、英国特許出願公開第１４０６１４７号（1406147.7）明細書においても詳細に論じられている。
【０５３９】
１つまたは複数のヘリカーゼを、二本鎖ポリヌクレオチドおよびＭｕＡトランスポサーゼと接触させる前に、ＭｕＡ基質Ｙアダプターに結合させてもよい。あるいは、１つまたは複数のヘリカーゼを、二本鎖ポリヌクレオチドおよびＭｕＡトランスポサーゼと接触させる前に、ＭｕＡ基質Ｙアダプターに結合させてもよい。
【０５４０】
１つまたは複数の分子ブレーキを、二本鎖ポリヌクレオチドおよびＭｕＡトランスポサーゼと接触させる前に、ＭｕＡ基質ヘアピンループアダプターに結合させてもよい。あるいは、１つまたは複数の分子ブレーキを、二本鎖ポリヌクレオチドおよびＭｕＡトランスポサーゼと接触させる前に、ＭｕＡ基質ヘアピンループアダプターに結合させてもよい。
【０５４１】
アンカップリング
本発明の方法は、複数の標的ポリヌクレオチドの特徴づけおよび少なくとも第１の標的ポリヌクレオチドのアンカップリングを含むことがある。
【０５４２】
好ましい実施形態では、本発明は、２つ以上の標的ポリヌクレオチドの特徴づけを含む。方法は、
（ａ）第１の試料中の第１のポリヌクレオチドを用意するステップ、
（ｂ）第２の試料中の第２のポリヌクレオチドを用意するステップ、
（ｃ）１つまたは複数のアンカーを使用して第１の試料中の第１のポリヌクレオチドを膜とカップリングするステップ、
（ｄ）第１のポリヌクレオチドを、ＣｓｇＧポアまたはその変異体、例えば本発明のポアと、ポリヌクレオチドがポアに対して、例えばポアを通って、移動するように接触させるステップ、
（ｅ）第１ポリヌクレオチドがポアに対して移動しているときに１回または複数回の測定を行い、測定が第１のポリヌクレオチドの１つまたは複数の特徴を示し、それによって第１のポリヌクレオチドを特徴づけるステップ、
（ｆ）第１のポリヌクレオチドを膜からアンカップリングするステップ、
（ｇ）１つまたは複数のアンカーを使用して第２の試料中の第２のポリヌクレオチドを膜とカップリングするステップ、
（ｈ）第２のポリヌクレオチドを、ＣｓｇＧポアまたはその変異体、例えば本発明のポアと、第２ポリヌクレオチドがポアに対して、例えばポアを通って、移動するように接触させるステップ、および
（ｉ）第２のポリヌクレオチドがポアに対して移動しているときに１回または複数回の測定を行い、測定が第２のポリヌクレオチドの１つまたは複数の特徴を示し、それによって第２のポリヌクレオチドを特徴づけるステップ
を含む。
【０５４３】
このタイプの方法は、英国特許出願公開第１４０６１５５号（1406155.0）明細書において詳細に論じられている。
【０５４４】
ステップ（ｆ）（すなわち、第１のポリヌクレオチドのアンカップリング）をステップ（ｇ）の前に（すなわち、第２のポリヌクレオチドを膜とカップリングする前に）行ってもよい。ステップ（ｇ）をステップ（ｆ）の前に行ってもよい。第１のポリヌクレオチドをアンカップリングする前に第２のポリヌクレオチドを膜とカップリングする場合、ステップ（ｆ）は、好ましくは、膜からの第１のポリヌクレオチドの選択的アンカップリング（すなわち、膜からの第２のポリヌクレオチドではなく第１のポリヌクレオチドのアンカップリング）を含む。当業者は、選択的アンカップリングを果たす系を設計することができる。ステップ（ｆ）および（ｇ）を同時に行ってもよい。このことは、下でより詳細に論じる。
【０５４５】
ステップ（ｆ）では、第１のポリヌクレオチドの少なくとも１０％が好ましくは膜からアンカップリングされる。例えば、第１のポリヌクレオチドの少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％が膜からアンカップリングされることもある。好ましくは、第１のポリヌクレオチドのすべてが膜からアンカップリングされる。膜からアンカップリングされる第１のポリヌクレオチドの量は、ポアを使用して判定することができる。このことは、実施例において開示する。
【０５４６】
第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは、互いに異なることがある。あるいは、第１および第２のポリヌクレオチドは、異なるポリヌクレオチドであることがある。そのような場合、第２のポリヌクレオチドを添加する前に第１の試料の少なくとも一部を除去する必要がないこともある。このことは、下でより詳細に論じる。方法が３つ以上のポリヌクレオチドの調査に関する場合、それらのポリヌクレオチドは、すべてが互いに異なることもあり、またはそれらの一部が互いに異なることもある。
【０５４７】
第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは、同じポリヌクレオチドの２つの実例であることもある。第１のポリヌクレオチドが、第２のポリヌクレオチドと同一であることもある。これは、較正を可能にする。方法が、３つ以上のポリヌクレオチドの調査に関する場合、それらのポリヌクレオチドは、すべてが同じポリヌクレオチドの３つ以上の実例であることもあり、またはそれらの一部が同じポリヌクレオチドの別個の実例であることもある。
【０５４８】
第１の試料および第２の試料は、互いに異なることがある。例えば、第１の試料はヒトに由来することがあり、第２の試料はウイルスに由来することがある。第１および第２試料が互いに異なる場合、それらの試料は、同じ第１および第２のポリヌクレオチドを含有することもあり、または含有することが疑われることもある。方法が３つ以上の試料の調査に関する場合、それらの試料は、すべてが互いに異なることもあり、またはそれらの一部が互いに異なることもある。
【０５４９】
第１の試料および第２の試料は、好ましくは、同じ試料の２つの実例である。第１の試料は、好ましくは、第２の試料と同一である。これは、較正を可能にする。方法が、３つ以上の試料の調査に関する場合、それらの試料は、すべてが同じ試料の３つ以上の実例であることもあり、またはそれらの一部が同じ試料の別個の実例であることもある。
【０５５０】
あらゆる数のポリヌクレオチドを調査することができる。例えば、本発明の方法は、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０、１００以上のポリヌクレオチドの特徴づけに関することがある。本発明の方法を使用して３つ以上のポリヌクレオチドを調査する場合、第２のポリヌクレオチドも膜からアンカップリングされ、必要数のステップが第３のポリヌクレオチドに加えられる。同じことが４つ以上のポリヌクレオチドについても言える。
【０５５１】
本発明の方法は、第１のポリヌクレオチドを膜からアンカップリングするステップを含む。本発明の方法は、３つ以上のポリヌクレオチドを調査することになる場合、第２のポリヌクレオチドを膜からアンカップリングするステップを含むことがある。
【０５５２】
公知のいかなる方法を使用して第１のポリヌクレオチドを膜からアンカップリングしてもよい。第１のポリヌクレオチドは、好ましくは、ステップ（ｆ）では膜貫通ポアを使用して膜からアンカップリングされない。第１のポリヌクレオチドは、好ましくは、電圧または印加電位を使用して膜からアンカップリングされない。
【０５５３】
ステップ（ｆ）は、好ましくは、膜から１つまたは複数のアンカーを除去することによってその膜から第１のポリヌクレオチドをアンカップリングすることを含む。アンカーを除去したら、他の（または別の）アンカーを使用して第２のポリヌクレオチドをその膜とカップリングする。第２のポリヌクレオチドのカップリングに使用するアンカーは、第１のポリヌクレオチドをカップリングするために使用した同じタイプのアンカーであってもよく、または異なるタイプのアンカーであってもよい。
【０５５４】
ステップ（ｆ）は、１つまたは複数のアンカーを、その１つまたは複数のアンカーに対して、そのアンカーが膜に対して有する親和性より高い親和性を有する作用物質と接触させることを好ましくは含む。分子の特異的結合能力を判定するための競合結合または免疫放射定量測定アッセイの様々なプロトコルが当技術分野において周知である（例えば、Maddox et al., J. Exp. Med. 158, 1211-1226, 1993を参照されたい）。作用物質は、アンカーを膜から除去することによって第１のポリヌクレオチドをアンカップリングする。作用物質は、好ましくは糖である。１つまたは複数のアンカーが膜に対して有する親和性より高い親和性で１つまたは複数のアンカーと結合するいずれの糖を使用してもよい。糖は、シクロデキストリンまたは下で論じるようなその誘導体であることもある。
【０５５５】
１つまたは複数のアンカーがコレステロールなどの疎水性アンカーを含む場合、作用物質は、好ましくは、シクロデキストリンもしくはその誘導体または脂質である。シクロデキストリンまたはその誘導体は、Eliseev, A. V., and Schneider, H-J. (1994) J. Am. Chem. Soc. 116, 6081-6088に開示されているもののいずれかであってもよい。この作用物質は、より好ましくは、ヘプタキス−６−アミノ−β−シクロデキストリン（ａｍ７−βＣＤ）、６−モノデオキシ−６−モノアミノ−β−シクロデキストリン（ａｍ１−βＣＤ）またはヘプタキス−（６−デオキシ−６−グアニジノ）−シクロデキストリン（ｇｕ７−βＣＤ）である。本明細書において開示する脂質のいずれかを使用することができる。
【０５５６】
アンカーがストレプトアビジン、ビオチンまたはデスチオビオチンを含む場合、作用物質は、好ましくは、ビオチン、デスチオビオチンまたはストレプトアビジンである。ビオチンとデスチオビオチンの両方は、ストレプトアビジンが膜と結合するより高い親和性でストレプトアビジンと結合し、逆もまた同様である。ビオチンは、ストレプトアビジンに対してデスチオビオチンより強い親和性を有する。したがって、ストレプトアビジンを含むアンカーは、ビオチンまたはストレプトアビジンを使用して膜から除去することができるし、逆もまた同様である。
【０５５７】
アンカーがタンパク質を含む場合、作用物質は、好ましくは、タンパク質と特異的に結合する抗体またはその断片である。抗体は、あるタンパク質と優先的なまたは高い親和性で結合するが、他のまたは異なるタンパク質とは結合しないまたは低い親和性でしか結合しない場合、そのタンパク質と特異的に結合する。抗体は、１１０−６Ｍ以下、より好ましくは１×１０−７Ｍ以下、５×１０−８Ｍ以下、より好ましくは×１０−８Ｍ以下、またはより好ましくは５×１０−９Ｍ以下のＫｄで結合する場合、優先的なまたは高い親和性で結合する。抗体は、１×１０−６Ｍ以上、より好ましくは１×１０−５Ｍ以上、より好ましくは１×１０−４Ｍ以上、より好ましくは１×１０−３Ｍ以上、よりいっそう好ましくは１×１０−２Ｍ以上のＫｄで結合する場合、低い親和性で結合する。いずれの方法を使用して結合または特異的結合を検出してもよい。抗体のタンパク質との結合を定量的に測定する方法は、当技術分野において周知である。抗体は、モノクローナル抗体であってもよいし、またはポリクローナル抗体であってもよい。抗体の好適な断片には、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）およびＦ（ａｂ’）２断片はもちろん、一本鎖抗体も含まれるが、これらに限定されない。さらに、抗体またはその断片は、キメラ抗体もしくはその断片、ＣＤＲグラフト抗体もしくはその断片、またはヒト化抗体もしくはその断片であってもよい。
【０５５８】
ステップ（ｆ）は、１つまたは複数のアンカーの膜とカップリングする能力を低減させる作用物質と１つまたは複数のアンカーを接触させることを好ましくは含む。例えば、作用物質は、１つまたは複数のアンカーの構造および／または疎水性に干渉することによって膜とカップリングするそれらの能力を低減させることができる。アンカーがコレステロールを含む場合、作用物質は、好ましくはコレステロールデヒドロゲナーゼである。アンカーが脂質を含む場合、作用物質は、好ましくはホスホリパーゼである。アンカーがタンパク質を含む場合、作用物質は、好ましくはプロテイナーゼまたは尿素である。好適なアンカーと作用物質の他の組合せは、当業者には明らかである。
【０５５９】
ステップ（ｆ）は、好ましくは、第１のポリヌクレオチドから１つまたは複数のアンカーを分離することによって、第１のポリヌクレオチドを膜からアンカップリングすることを含む。これを任意の手法で行うことができる。例えば、リンカーを含むアンカーの場合、そのリンカーを切断することができる。この実施形態は、ハイブリダイゼーションによる連結に関わるアンカーに特に適用できる。そのようなアンカーは、上で論じている。
【０５６０】
ステップ（ｆ）は、第１のポリヌクレオチドおよび１つまたは複数のアンカーを、その１つまたは複数のアンカーとの結合について第１のポリヌクレオチドと競合する作用物質と接触させることによって、第１のポリヌクレオチドを膜からアンカップリングすることを好ましくは含む。競合的結合を判定および測定する方法は、当技術分野において公知である。作用物質は、好ましくは、１つまたは複数のアンカーとのハイブリダイゼーションについて第１のポリヌクレオチドと競合するポリヌクレオチドである。例えば、ハイブリダイゼーションに関わる１つまたは複数のアンカーを使用して第１のポリヌクレオチドを膜とカップリングする場合、ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のアンカーをハイブリダイゼーション部位に同じくハイブリダイズするポリヌクレオチドと接触させることによってアンカップリングすることができる。ポリヌクレオチド作用物質は、通常は、第１のポリヌクレオチドおよび１つまたは複数のアンカーの濃度より高い濃度で添加される。あるいは、ポリヌクレオチド作用物質は、１つまたは複数のアンカーに第１のポリヌクレオチドより強くハイブリダイズすることができる。
【０５６１】
ステップ（ｆ）は、より好ましくは、（ｉ）第１のポリヌクレオチドおよび１つまたは複数のアンカーを、尿素、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ストレプトアビジンもしくはビオチン、ＵＶ線、酵素または結合剤と接触させるステップ、（ｉｉ）第１のポリヌクレオチドおよび１つまたは複数のアンカーを加熱するステップ、または（ｉｉｉ）ｐＨを変更するステップを含む。尿素、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）またはジチオトレイトール（ＤＴＴ）は、アンカーを分解することができ、第１のポリヌクレオチドを膜から分離することができる。アンカーがストレプトアビジン−ビオチン連結を含む場合には、ストレプトアビジン作用物質は、ビオチンとの結合について競合することになる。アンカーがストレプトアビジン−デスチオビオチン連結を含む場合には、ビオチン作用物質は、ストレプトアビジンとの結合について競合することになる。ＵＶ線は、光解離性基を分解するために使用することができる。酵素および結合剤は、アンカーを切断、破壊または分解するために使用することができる。好ましい酵素としては、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼまたはヘリカーゼが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい結合剤としては、酵素、抗体もしくはその断片、または一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）が挙げられるが、これらに限定されない。下で論じる酵素または上で論じた抗体のいずれかを使用してもよい。熱およびｐＨは、ハイブリダイゼーションおよび他の連結を破壊するために使用することができる。
【０５６２】
第１のポリヌクレオチドを１つまたは複数のアンカーから分離することによって第１のポリヌクレオチドを膜からアンカップリングした場合、１つまたは複数のアンカーは、膜内に残存することになる。ステップ（ｇ）は、好ましくは、第１のポリヌクレオチドから分離された１つまたは複数のアンカーを使用して第２のポリヌクレオチドを膜とカップリングすることを含む。例えば、第２のポリヌクレオチドに、膜内に残存する１つまたは複数のアンカーにハイブリダイズする１つまたは複数のポリヌクレオチドを備えさせることもできる。あるいは、ステップ（ｇ）は、好ましくは、第１のポリヌクレオチドから分離されたものからの１つまたは複数の別個のアンカー（すなわち、１つまたは複数の他のアンカー）を使用して第２のポリヌクレオチドを膜とカップリングすることを含む。１つまたは複数の別個のアンカーは、第１のポリヌクレオチドを膜とカップリングするために使用した同じタイプのアンカーであってもよく、または異なるタイプのアンカーであってもよい。ステップ（ｇ）は、好ましくは、第１のポリヌクレオチドから分離された１つまたは複数のアンカーとは異なる１つまたは複数のアンカーを使用して第２のポリヌクレオチドを膜とカップリングすることを含む。
【０５６３】
好ましい実施形態では、ステップ（ｆ）および（ｇ）は、膜を第２のポリヌクレオチドと、第２のポリヌクレオチドが１つまたは複数のアンカーとの結合について第１のポリヌクレオチドと競合し、その第１のポリヌクレオチドを置換するように接触させることによって、膜から第１のポリヌクレオチドをアンカップリングすることを含む。例えば、ハイブリダイゼーションに関わる１つまたは複数のアンカーを使用して第１のポリヌクレオチドを膜とカップリングする場合、第１のポリヌクレオチドは、１つまたは複数のアンカー中のハイブリダイゼーション部位に同じくハイブリダイズするポリヌクレオチドと結合された第２のポリヌクレオチドとアンカーを接触させることによって、アンカップリングすることができる。第２のポリヌクレオチドは、通常は、第１のポリヌクレオチドおよび１つまたは複数のアンカーの濃度より高い濃度で添加される。あるいは、第２のポリヌクレオチドは、１つまたは複数のアンカーに第１のポリヌクレオチドより強くハイブリダイズすることができる。
【０５６４】
除去および洗浄
第１のポリヌクレオチドをステップ（ｆ）で膜からアンカップリングするが、それを必ずしも除去するまたは洗い流すとは限らない。第２のポリヌクレオチドを第１のポリヌクレオチドと容易に区別することができる場合、第１のポリヌクレオチドを除去する必要はない。
【０５６５】
ステップ（ｆ）と（ｇ）の間に、方法は、好ましくは、第１の試料の少なくとも一部を膜から除去するステップをさらに含む。第１の試料の少なくとも１０％、例えば、第１の試料の２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％が除去されることがある。
【０５６６】
方法は、好ましくは、膜から第１の試料のすべてを除去するステップをさらに含む。これを任意の方法で行うことができる。例えば、第１のポリヌクレオチドをアンカップリングした後、膜を緩衝液で洗浄することができる。好適な緩衝液は、下で論じる。
【０５６７】
修飾ポリヌクレオチド
特徴づけの前に、標的ポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドとポリメラーゼ、および遊離ヌクレオチドの集団とを、そのポリメラーゼが標的ポリヌクレオチドをテンプレートとして使用して修飾ポリヌクレオチドを形成する（ポリメラーゼは、修飾ポリヌクレオチドを形成するときに標的ポリヌクレオチド中のヌクレオチド化学種の１つまたは複数を、異なるヌクレオチド化学種で置換する）条件下で接触させることによって修飾されることがある。その場合、１つまたは複数のヘリカーゼがポリヌクレオチドに結合され１つまたは複数の分子ブレーキがポリヌクレオチドに結合された修飾ポリヌクレオチドを得ることができる。このタイプの修飾は、英国特許出願公開第１４０３０９６号（1403096.9）明細書に記載されている。上で論じたポリメラーゼのいずれかを使用してもよい。ポリメラーゼは、好ましくは、クレノウまたは９ｏ  Ｎｏｒｔｈである。
【０５６８】
テンプレートポリヌクレオチドをポリメラーゼと、ポリメラーゼがテンプレートポリヌクレオチドをテンプレートとして使用して修飾ポリヌクレオチドを形成する条件下で接触させる。そのような条件は、当技術分野において公知である。例えば、ポリヌクレオチドを、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標）からの緩衝液などの市販ポリメラーゼ緩衝液中でポリメラーゼと接触させるのが一般的である。温度は、好ましくは、クレノウについては好ましくは２０〜３７℃、９ｏ  Ｎｏｒｔｈについては６０〜７５℃である。プライマーまたは３’ヘアピンをポリメラーゼ伸長の核形成点として使用するのが一般的である。
【０５６９】
膜貫通ポアを使用するポリヌクレオチドの特徴づけ、例えばシークエンシングは、通常は、ｋ個のヌクレオチド（ｋは正の整数である）で構成されているポリマーユニット（すなわち「ｋ−ｍｅｒ」）の分析を含む。このことは、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５２３４３号明細書（国際公開第２０１３／０４１８７８号パンフレットとして公開）において論じられている。異なるｋ−ｍｅｒについての電流測定値間に明白な差があることが望ましいが、これらの測定値の一部が重複することはよくあることである。特に、ｋ−ｍｅｒ中のポリマーユニットの数が多いと、すなわちｋの値が大きいと、ポリヌクレオチドについての情報、例えばポリヌクレオチドの基礎配列の推定値、の導出が害されて、異なるｋ−ｍｅｒによって生じた測定値を分離することが困難になりうる。
【０５７０】
標的ポリヌクレオチド中の１つまたは複数のヌクレオチド化学種を修飾ポリヌクレオチド中の異なるヌクレオチド化学種で置換することによって、修飾ポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチド中のものとは異なるｋ−ｍｅｒを含有する。修飾ポリヌクレオチド中の異なるｋ−ｍｅｒは、標的ポリヌクレオチド中のｋ−ｅｍｒとは異なる電流測定値を生じさせることができるため、修飾ポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドとは異なる情報を与える。修飾ポリヌクレオチドからのこの追加情報は、標的ポリヌクレオチドの特徴づけを容易にすることができる。場合によっては、修飾ポリヌクレオチド自体を特徴づけるほうが容易であることもある。例えば、電流測定値間の離隔が増したもしくは明白な離隔を有するｋ−ｍｅｒ、またはノイズ低下を有するｋ−ｍｅｒを含むように、修飾ポリヌクレオチドを設計することができる。
【０５７１】
ポリメラーゼは、好ましくは、修飾ポリヌクレオチドを形成するときに標的ポリヌクレオチド中の２つ以上のヌクレオチド化学種を異なるヌクレオチド化学種で置換する。ポリメラーゼは、標的ポリヌクレオチド中の２つ以上のヌクレオチド化学種の各々を異質のヌクレオチド化学種で置換することもある。ポリメラーゼは、標的ポリヌクレオチド中の２つ以上のヌクレオチド化学種の各々を同じヌクレオチド化学種で置換することもある。
【０５７２】
標的ポリヌクレオチドがＤＮＡである場合、その修飾されたものの中の異なるヌクレオチド化学種は、通常は、アデニン、グアニン、チミン、シトシンもしくはメチルシトシンとは異なる核酸塩基を含む、および／またはデオキシアデノシン、デオキシグアノシン、チミジン、デオキシシチジンもしくはデオキシメチルシチジンとは異なるヌクレオシドを含む。標的ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、修飾ポリヌクレオチド中の異なるヌクレオチド化学種は、通常は、アデニン、グアニン、ウラシル、シトシンもしくはメチルシトシンとは異なる核酸塩基を含む、および／またはアデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジンもしくはメチルシチジンとは異なるヌクレオシドを含む。異なるヌクレオチド化学種は、上で論じたユニバーサルヌクレオチドのいずれかであることができる。
【０５７３】
ポリメラーゼは、１つまたは複数のヌクレオチド化学種を、その１つまたは複数のヌクレオチド化学種に不在の化学基または原子を含む異なるヌクレオチド化学種で置換することもある。化学基は、プロピニル基、チオ基、オキソ基、メチル基、ヒドロキシメチル基、ホルミル基、カルボキシ基、カルボニル基、ベンジル基、プロパルギル基、またはプロパルギルアミン基であることがある。
【０５７４】
ポリメラーゼは、１つまたは複数のヌクレオチド化学種を、その１つまたは複数のヌクレオチド化学種中に存在する化学基または原子を欠いているヌクレオチド化学種で置換することもある。ポリメラーゼは、１つまたは複数のヌクレオチド化学種を、電気陰性度が変更された異なるヌクレオチド化学種で置換することもある。電気陰性度が変更された異なるヌクレオチド化学種は、好ましくはハロゲン原子を含む。
【０５７５】
方法は、好ましくは、修飾ポリヌクレオチド中の１つまたは複数の異なるヌクレオチド化学種から核酸塩基を選択的に除去するステップをさらに含む。
【０５７６】
分析物送達
標的分析物を、好ましくは、その分析物を膜の方に送達する微粒子に結合させる。このタイプの送達は、英国特許出願公開第１４１８４６９号（1418469.1）明細書に記載されている。あらゆるタイプの微粒子および結合方法を使用することができる。
【０５７７】
他の特徴づけ方法
別の実施形態では、ポリメラーゼによって標的ポリヌクレオチドに付加され、その後、遊離される標識化学種を検出することによって、ポリヌクレオチドを特徴づける。ポリメラーゼは、ポリヌクレオチドをテンプレートとして使用する。各々の標識化学種が各々のヌクレオチドに特異的である。ポリヌクレオチドを、ＣｓｇＧポアまたはその変異体、例えば本発明のポア、ポリメラーゼおよび標識ヌクレオチドと、各ヌクレオチドに特異的な標識を含有するリン酸塩標識化学種がポリメラーゼによってポリヌクレオチドに逐次的に付加されるように接触させる。標識化学種を、それらがヌクレオチドから遊離される前に（すなわち、それらが標的ポリヌクレオチドに付加されているときに）、またはヌクレオチドから遊離された後に、ポアを使用して検出することができる。
【０５７８】
ポリメラーゼは、上で論じたもののいずれかであってもよい。ポアを使用してリン酸塩標識化学種を検出することによってポリヌクレオチドを特徴づける。このタイプの方法は、欧州特許出願第１３１８７１４９号明細書（13187149.3）（欧州特許出願公開第２６８２４６０号明細書として公開）明細書に開示されている。上で論じた実施形態のいずれかがこの方法に同等に適用される。
【０５７９】
標識化学種の例としては、ポリマー、ポリエチレングリコール、糖、シクロデキストリン、フルオロフォア、薬物、代謝物、ペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。そのようなタグの非限定的な例は、Kumar et al., Sci Rep. 2012; 2:684. Epub 2012 Sep 21の著述の中で見つけることができる。
【０５８０】
センサーを形成する方法
本発明は、標的ポリヌクレオチドを特徴づけるためのセンサーを形成する方法も提供する。この方法は、ＣｓｇＧポアまたはその変異体、例えば本発明のポアと、ポリヌクレオチド結合タンパク質、例えばヘリカーゼまたはエキソヌクレアーゼとの複合体を形成するステップを含む。標的ポリヌクレオチドの存在下でポアをタンパク質と接触させ、次いでポアを介して電位を印加することによって、複合体を形成することができる。印加される電位は、上に記載したように、化学的電位であってもよく、または電圧電位であってもよい。あるいは、ポアをタンパク質に共有結合させることによって複合体を形成することができる。共有結合の方法は当技術分野において公知であり、例えば、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号明細書（国際公開第２０１０／００４２６５号パンフレット）および同第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号明細書（国際公開第２０１０／０８６６０３号パンフレット）に開示されている。複合体は、標的ポリヌクレオチドを特徴づけるためのセンサーである。方法は、好ましくは、ＣｓｇＧポアまたはその変異体、例えば本発明のポアと、ヘリカーゼとの複合体を形成するステップを含む。上で論じた実施形態のいずれかがこの方法に同等に適用される。
【０５８１】
本発明は、標的ポリヌクレオチドを特徴づけるためのセンサーも提供する。このセンサーは、ＣｓｇＧポアまたはその変異体、例えば本発明のポア、とポリヌクレオチド結合タンパク質との複合体を含む。上で論じた実施形態のいずれかが本発明のセンサーに同等に適用される。
【０５８２】
キット
本発明は、標的ポリヌクレオチドを特徴づけるためのキットも提供する。このキットは、ＣｓｇＧポアまたはその変異体、例えば本発明のポアと、膜の成分とを含む。膜は、好ましくは、成分から形成される。ポアは、好ましくは、膜内に存在する。キットは、上で開示した膜のいずれか、例えば両親媒性層またはトリブロックコポリマー膜、の成分を含むことができる。
【０５８３】
キットは、ポリヌクレオチド結合タンパク質をさらに含むことがある。上で論じたポリヌクレオチド結合タンパク質のいずれかを使用することができる。
【０５８４】
キットは、ポリヌクレオチドを膜とカップリングさせるための１つまたは複数のアンカーをさらに含むことがある。
【０５８５】
キットは、好ましくは、二本鎖ポリヌクレオチドを特徴づけるためのキットであり、好ましくは、Ｙアダプターおよびヘアピンループアダプターを含む。Ｙアダプターには、好ましくは、１つまたは複数のヘリカーゼが結合されており、ヘアピンループアダプターには、好ましくは、１つまたは複数の分子ブレーキが結合されている。Ｙアダプターは、ポリヌクレオチドを膜とカップリングするための１つまたは複数の第１のアンカーを好ましくは含み、ヘアピンループアダプターは、ポリヌクレオチドを膜にカップリングするための１つまたは複数の第２のアンカーを好ましくは含み、ヘアピンループアダプターの膜とのカップリング強度は、好ましくは、Ｙアダプターのその膜とのカップリング強度より大きい。
【０５８６】
本発明のキットは、上述の実施形態のいずれかを行うことを可能にする１つまたは複数の他の試薬または器具をさらに含むことがある。そのような試薬または器具は、次のものの１つまたは複数を含む：好適な緩衝液（水溶液）、対象から試料を得るための手段（例えば、容器、もしくは針を備えている器具）、ポリヌクレオチドを増幅および／もしくは発現させるための手段、または電圧固定もしくはパッチクランプ装置。試薬は、流体試料によってそれらの試薬が再懸濁されるように、乾燥状態でキット内に存在することがある。キットは、場合により、キットを本発明の方法で使用することを可能にする説明書、またはその方法をどの生物に使用してもよいのかに関する詳説も含むことがある。
【０５８７】
装置
本発明は、標的ポリヌクレオチドなどの標的分析物を特徴づけるための装置も提供する。この装置は、複数のＣｓｇＧポアまたはそれらの変異体、および複数の膜を含む。複数のポアは、好ましくは、複数の膜内に存在する。ポアおよび膜の数は、好ましくは等しい。好ましくは、単一のポアが各膜内に存在する。
【０５８８】
装置は、好ましくは、本発明の方法を行うための説明書をさらに含む。装置は、分析物分析のための従来の装置のいずれか、例えば、アレイまたはチップであることができる。本発明の方法に関して上で論じた実施形態のいずれかが本発明の装置に同等に適用できる。装置は、本発明のキット中に存在する機構のいずれかをさらに含むことができる。
【０５８９】
装置は、好ましくは、本発明の方法を行うために組立てられる。
【０５９０】
装置は、好ましくは、
複数のポアおよび膜を支持することができ、かつポアおよび膜を使用して分析物の特徴づけを行うために操作可能である、センサーデバイスと、
特徴づけを行うための材料を送達するための少なくとも１つのポートと
を含む。
【０５９１】
あるいは、装置は、好ましくは、
複数のポアおよび膜を支持することができ、かつポアおよび膜を使用して分析物の特徴づけを行うために操作可能であるセンサーデバイスと、
特徴づけを行うための材料を保持するための少なくとも１つのリザーバーと
を含む。
【０５９２】
装置は、より好ましくは、
膜ならびに複数のポアおよび膜を支持することができ、かつポアおよび膜を使用して分析物の特徴づけを行うために操作可能である、センサーデバイスと、
特徴づけを行うための材料を保持するための少なくとも１つのリザーバーと、
少なくとも１つのリザーバーからセンサーデバイスに制御可能に材料を供給するように構成されている流体工学システムと、
それぞれの試料を受けるための１つまたは複数の容器と
を含み、流体工学システムは、１つまたは複数の容器からセンサーデバイスに試料を選択的に供給するように構成されている。
【０５９３】
装置は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７号明細書（国際公開第２００９／０７７７３４号パンフレットとして公開）、ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００７８９号明細書（国際公開第２０１０／１２２２９３号パンフレットとして公開）、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ１０／００２２０６号明細書（国際公開第２０１１／０６７５５９号パンフレットとして公開）または国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／２５６７９号明細書（国際公開第００／２８３１２号パンフレットとして公開）に記載されているもののいずれかであってもよい。
【０５９４】
以下の実施例は、本発明を例証するものである。
実施例
【実施例１】
【０５９５】
ＣｓｇＧのクローニングおよび株
外膜に局在するＣ−末端ＳｔｒｅｐＩＩタグＣｓｇＧ（ｐＰＧ１）および周辺質のＣ−末端ＳｔｒｅｐＩＩタグＣｓｇＧＣ１Ｓ（ｐＰＧ２）を産生するための発現構築物は記述されている（Goyal, P. et al., Acta Crystallogr. F. Struct. Biol. Cryst. Commun. 2013, 69, 1349-1353）。セレノメチオニン標識の場合、収量を増加させるためにＳｔｒｅｐＩＩタグＣｓｇＧＣ１Ｓを細胞質で発現させた。したがって、プライマー５’−ＴＣＴ  ＴＴＡ  ＡＣ  ＣＧＣ  ＣＣＣ  ＧＣＣ  ＴＡＡ  ＡＧ−３’（フォワード）（配列番号４３７）、および５’−ＣＡＴ  ＴＴＴ  ＴＴＧ  ＣＣＣ  ＴＣＧ  ＴＴＡ  ＴＣ−３’（リバース）  （ｐＰＧ３）（配列番号４３８）によるインバースＰＣＲを使用して、Ｎ−末端シグナルペプチドを除去するようにｐＰＧ２を変化させた。表現型アッセイの場合、大腸菌（E.coli）ＢＷ２５１４１（大腸菌（E.coli）ＮＶＧ２）のｃｓｇＧ欠失変異体を、[Datsenko, K. A. et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 97, 6640-6645 (2000)] に記述される方法によって（プライマー５’−ＡＡＴ  ＡＡＣ  ＴＣＡ  ＡＣＣ  ＧＡＴ  ＴＴＴ  ＴＡＡ  ＧＣＣ  ＣＣＡ  ＧＣＴ  ＴＣＡ  ＴＡＡ  ＧＧＡ  ＡＡＡ  ＴＡＡ  ＴＣＧ  ＴＧＴ  ＡＧＧ  ＣＴＧ  ＧＡＧ  ＣＴＧ  ＣＴＴ  Ｃ−３’（配列番号４３９）および５’−ＣＧＣ  ＴＴＡ  ＡＡＣ  ＡＧＴ  ＡＡＡ  ＡＴＧ  ＣＣＧ  ＧＡＴ  ＧＡＴ  ＡＡＴ  ＴＣＣ  ＧＧＣ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＡＴＣ  ＴＧＣ  ＡＴＡ  ＴＧＡ  ＡＴＡ  ＴＣＣ  ＴＣＣ  ＴＴＡ  Ｇ−３’（配列番号４４０）を使用して）構築した。Ｃｙｓアクセス可能性アッセイのためおよびチャネル狭窄の表現型プロービングのために使用する様々なＣｓｇＧ置換変異体を、ｔｒｃプロモーターの制御下でｃｓｇＧを含有するｐＴＲＣ９９ａベクターであるｐＭＣ２（Robinson, L. S., et al., Mol. Microbiol., 2006, 59, 870-881）から開始する部位特異的変異誘発（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅプロトコール；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によって構築した。
【実施例２】
【０５９６】
タンパク質の発現および精製
ＣｓｇＧおよびＣｓｇＧＣ１Ｓを、記述されるように発現および精製した（Robinson, L. S., et al., Mol. Microbiol., 2006, 59, 870-881）。簡単に説明すると、ＣｓｇＧを、ｐＰＧ１で形質転換した大腸菌（E.coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）において組換えにより産生させ、単離された外膜から緩衝液Ａ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ））中の１％ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（ＤＤＭ）を使用して抽出した。ＳｔｒｅｐＩＩタグＣｓｇＧを５ｍｌ  Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（Ｉｂａ，  ＧｍＢＨ）にロードして、０．５％テトラエチレングリコールモノオクチルエーテル（Ｃ８Ｅ４；Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）および４ｍＭラウリルジメチルアミン−Ｎ−オキシド（ＬＤＡＯ；Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を補充した緩衝液Ａの２０カラム容積で洗浄することによって洗浄剤を交換した。２．５ｍＭ  Ｄ−デスチオビオチンを添加してタンパク質を溶出させて、結晶化実験のために５ｍｇ・ｍｌ−１に濃縮した。セレノメチオニン標識の場合、ＣｓｇＧＣ１Ｓを、ｐＰＧ３で形質転換したメチオニン栄養素要求株Ｂ８３４（ＤＥ３）において産生させて、４０ｍｇ・Ｌ−１Ｌ−セレノメチオニンを補充したＭ９最少培地で増殖させた。細胞ペレットを、ｃＯｍｐｌｅｔｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ）を補充した５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＤＴＴに再懸濁させて、２０×１０３ｌｂ  ｉｎ−２で作動するＴＳシリーズ細胞破砕装置（Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌｔｄ）の中に通過させることによって破砕した。標識したＣｓｇＧＣ１Ｓを記述されるように精製した（Robinson, L. S., et al., Mol. Microbiol., 2006, 59, 870-881）。セレノメチオニンの酸化を防止するために精製手順を通してＤＴＴ（５ｍＭ）を添加した。
【０５９７】
ＣｓｇＥを、ｐＮＨ２７を有する大腸菌（E.coli）ＮＥＢＣ２５６６細胞において産生させた（Nenninger, A. A. et al., Mol. Microbiol. 2011, 81, 486-499)。２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭイミダゾール、５％（容量／容量）グリセロール中の細胞溶解物をＨｉｓＴｒａｐ  ＦＦ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。ＣｓｇＥ−ｈｉｓを、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５％（容量／容量）グリセロール緩衝液中で５００ｍＭイミダゾールへの直線勾配で溶出させた。ＣｓｇＥを含有する分画に２５０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４を補充して、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、５％（容量／容量）グリセロールで平衡にした５ｍｌ  ＨｉＴｒａｐ  Ｐｈｅｎｙｌ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、５％（容量／容量）グリセロールへの直線勾配を溶出のために適用した。ＣｓｇＥ含有分画を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５％（容量／容量）グリセロールに平衡にしたＳｕｐｅｒｏｓｅ  ６  Ｐｒｅｐ  Ｇｒａｄｅ  １０／６００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムにロードした。
【実施例３】
【０５９８】
溶液中のオリゴマー化状態の評価
洗浄剤可溶化ＣｓｇＧ（０．５％Ｃ８Ｅ４、４ｍＭ  ＬＤＡＯ）およびＣｓｇＧＣ１Ｓのそれぞれ約０．５ｍｇを、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ  ｐＨ８．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、４ｍＭ  ＬＤＡＯ、および０．５％Ｃ８Ｅ４（ＣｓｇＧ）、または２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、２００ｍＭ  ＮａＣｌ（ＣｓｇＧＣ１Ｓ）で平衡にしたＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００  ＧＬ分析的ゲルろ過カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用して０．７ｍｌ  分−１で実験を行った。カラムの溶出体積をウシサイログロブリン、ウシγ−グロブリン、ニワトリ卵アルブミン、ウマミオグロビン、およびビタミンＢ１２（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって較正した（図７）。洗浄剤可溶化タンパク質である膜抽出ＣｓｇＧの２０μｇも同様に３〜１０％ブルーネイティブＰＡＧＥで、Swamy, M., et al., Sci. STKE 2006, p14, [http://dx.doi.Org/10.1126/stke.3452006pl4(2006)]に記述される手順を使用して実験した（図７）。ＮａｔｉｖｅＭａｒｋ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）非染色タンパク質標準物質（７μｌ）を分子量推定のために使用した。成熟ＣｓｇＧは、Ｃ９対称性を有する別個のノナマーポア形成粒子として、ならびにノナマーポアのテール−テールダイマー（すなわち、Ｄ９対称性を有するオクタデカマー）として主に見出された。ナノポアセンシング用途の目的のために、タンパク質の好ましい状態は、単一ノナマーポアである。Ｄ９オクタデカマーポアに対してノナマーポアの集団を、サイズ排除クロマトグラフィーの前に試料を加熱することによって、および／またはナノポアセンシング用途のために脂質二重層に挿入することによって、増加させることができる。
【実施例４】
【０５９９】
結晶化、データ収集、および構造の決定
セレノメチオニン標識ＣｓｇＣ１Ｓを３．８ｍｇ・ｍｌ−１となるように濃縮して、１００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．２、８％  ＰＥＧ  ４０００、および１００ｍＭマロン酸ナトリウムｐＨ７．０を含有する溶液に対して、シッティングドロップ蒸気拡散によって結晶化した。結晶を、１５％グリセロールを補充した結晶化緩衝液中でインキュベートして、液体窒素中で急速凍結した。洗浄剤可溶化ＣｓｇＧを５ｍｇ・ｍｌ−１となるように濃縮して、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、８％  ＰＥＧ  ４０００、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、および５００ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有する溶液に対してハンギングドロップ蒸気拡散によって結晶化させた。結晶を液体窒素中で急速凍結して、結晶化溶液中に存在する洗浄剤によって凍結保護した。結晶条件を最適にするためおよび良好な回折品質を有する結晶に関してスクリーニングするために、結晶を、ｂｅａｍｌｉｎｅｓ  Ｐｒｏｘｉｍａ−１およびＰｒｏｘｉｍａ−２ａ（Ｓｏｌｅｉｌ，  Ｆｒａｎｃｅ）、ＰＸ−Ｉ（Ｓｗｉｓｓ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｉ０２、Ｉ０３、Ｉ０４、およびＩ２４（Ｄｉａｍｏｎｄ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅ，  ＵＫ）およびＩＤ１４ｅｈ２、ＩＤ２３ｅｈ１、およびＩＤ２３ｅｈ２（ＥＳＲＦ，  Ｆｒａｎｃｅ）において分析した。ＣｓｇＧＣ１ＳおよびＣｓｇＧの構造決定のために使用した最終回折データをそれぞれｂｅａｍｌｉｎｅｓ  Ｉ０４およびＩ０３で収集した（表５）。
【０６００】
【表５】
2017527284.tif 000022
【０６０１】
ＣｓｇＧＣ１Ｓの回折データをＸｉａ２およびＸＤＳパッケージを使用して処理した（Winter, G., J. Appl. Cryst., 2010, 43, 186-190; Kabsch, W., Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 2010, 66, 125-132）。ＣｓｇＧＣ１Ｓの結晶は、ａ＝１０１．３Å、ｂ＝１０３．６Å、ｃ＝１４１．７Å、α＝１１１．３°、β＝９０．５°、γ＝１１８．２°の単位格子寸法を有する空間群Ｐ１に属し、非対称単位にタンパク質１６コピーを含有する。構造決定および精密化のために、波長０．９７９５Åで収集したデータを、最高分解能シェルでの｜／σ｜カットオフ２に基づいて２．８Åで切り捨てした。単波長異常分散（ＳＡＤ）実験から計算した実験的位相を使用して、構造を解析した。全体で９２個のセレン部位が、ＳｈｅｌｘＣおよびＳｈｅｌｘＤ（Sheldrick, G. M., Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 2010, 66, 479-485）を使用して非対称単位に位置づけられ、これらを精密化して、Ｓｈａｒｐ（Bricogne, G., Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 2003, 59, 2023-2030）による位相計算のために使用した（フェージングパワー（phasing power）０．７９、性能指数（ＦＯＭ）０．２５）。実験的位相を密度修正してＰａｒｒｏｔ（Cowtan, K., Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 2010, 66, 470-478）を使用して非結晶学的対称性（ＮＣＳ）によって平均化した（図７、ＦＯＭ  ０．８５）。最初のモデルを、Ｂｕｃｃａｎｅｅｒ（Cowtan, K., Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 2006, 62, 1002-1011）によって作製して、Ｐｈｅｎｉｘ  ｒｅｆｉｎｅ（Adams, P. D. et al. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 2010, 66, 213-221）による最尤推定精密化の繰り返しラウンド、ならびにＣｏｏｔ（Emsley, P. et al., Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 2010, 66, 486-501）の手動での検分およびモデル（再）構築によって精密化した。最終的な構造は１６個のＣｓｇＧＣ１Ｓ鎖に属する３，７００個の残基中に２８，８５３原子を含有し（図７）、ｍｏｌｐｒｏｂｉｔｙ（Davis, I. W. et al., Nucleic Acids Res. 35 (Suppl 2), W375-W383）スコアは１．３４であり；残基の９８％がＲａｍａｃｈａｎｄｒａｎプロットの好ましい領域（許容領域の９９．７％）に存在する。電子密度マップは、可能性がある溶媒分子に対応する明白な密度を示さず、したがって、水分子またはイオンはその中に組み込まれなかった。精密化の初期および後期で厳密なローカルＮＣＳ制限をそれぞれ使用して、精密化を通して１６回のＮＣＳ平均を維持した。
【０６０２】
ＣｓｇＧの回折データを波長０．９７６３Åで単結晶から収集し、ＸＤＳパッケージ（Winter, G., J. Appl. Cryst. 2010, 43, 186-190; Kabsch, W., Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 2010, 66, 125-132）を使用して、非対称単位にＣｓｇＧ１８コピーおよび７２％溶媒含有量を包含する、単位格子寸法ａ＝１６１．７Å、ｂ＝３７２．３Å、ｃ＝１６１．８Å、およびβ＝９２．９°の空間群Ｃ２に指数化してスケーリングした。構造決定および精密化のための回折データを、逆格子方向ａ＊、ｂ＊、およびｃ＊に沿って３．６Å、３．７Å、および３．８Åの分解限界となるように、楕円形に切り捨てし、Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  Ａｎｉｓｏｔｒｏｐｙ  Ｓｅｒｖｅｒ（Strong, M. et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 2006, 103, 8060-8065）によって異方性にスケーリングした。ＣｓｇＧＣ１Ｓモノマーを使用する分子置換は、成功しなかった。自己回転関数の分析により、非対称単位におけるＤ９対称性が明らかとなった（示していない）。ＣｓｇＧＣ１Ｓの構造に基づいて、Ｃ８からＣ９オリゴマーに移行すると、粒子周囲のプロトマー間アークは、４５°から４０°に変化するプロトマー間角度とほぼ同じままであり、計算される半径の増加は約４Åであるという仮定に基づいてノナマー検索モデルを作成した。検索モデルとしての計算されたノナマーを使用して、２コピーを含有するという分子置換の解がPhaser（McCoy, A. J. et al., J. Appl. Cryst. 2007, 40, 658-674）によって見出された。密度修正およびＮＣＳ平均電子密度マップ（Parrot [Cowtan, K., Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 2010, 66, 470-478]；図８）の精査によって、ＴＭ１およびＴＭ２の手動での構築、タンパク質コアにおける隣接残基のリモデリングを行い、ならびにＣｓｇＧＣ１Ｓモデルで欠失しており、Ｎ−末端脂質アンカーにα１ヘリックスを連結させる残基２〜１８の構築を行った。ＣｓｇＧモデルの精密化は、初回および最終精密化ラウンドに関してそれぞれ、Ｂｕｓｔｅｒ−ＴＮＴ（Smart, O. S. et al., Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 2012, 68, 368-380）およびＲｅｆｍａｃ５（Murshudov, G. N. et al., Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr., 2011, 67, 355-367）によって実施した。１８回のローカルＮＣＳ制限を、精密化を通して適用し、σ０．０１のｊｅｌｌｙ−ｂｏｄｙ精密化およびＰｒｏｓｍａｒｔ（Nicholls, R. A., Long, F. & Murshudov, G. N., Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 2011, 68, 404-417）によって作成された水素結合の制限を用いて、Ｒｅｆｍａｃ５を実行した。最終構造は、１８ＣｓｇＧ鎖に属する４，４５１個の残基中に３４，１６５個の原子を含有し（図７）、ｍｏｌｐｒｏｂｉｔｙスコアは２．７９であった。残基の９３．０％がＲａｍａｃｈａｎｄｒａｎプロットの好ましい領域（許容領域の９９．３％）に存在する。Ｎ−末端脂質アンカーに対応する明白な電子密度は識別できなかった。
【実施例５】
【０６０３】
コンゴーレッドアッセイ
コンゴーレッド結合の分析に関して、Ｌｙｓｏｇｅｎｙ  Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）中、３７℃で増殖させた細菌の一晩培養物をＬＢ培地でＤ６００が０．５に達するまで希釈した。試料５μｌを、アンピシリン（１００ｍｇ・ｌ−１）、コンゴーレッド（１００ｍｇ・ｌ−１）、および０．１％（重量／容量）イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を補充したＬＢアガープレートにスポットした。プレートを室温（２０〜２２℃）で４８時間インキュベートして、ｃｕｒｌｉ発現を誘導した。コロニーの形態の発達および色素の結合を４８時間目に観察した。
【実施例６】
【０６０４】
システインアクセス可能性アッセイ
システイン変異体を、部位特異的変異誘発を使用してｐＭＣ２において作製して、大腸菌（E.coli）ＬＳＲ１２（Chapman, M. R. et al., Science, 2002, 295, 851-855）において発現させた。一晩増殖させた細菌培養物を、１ｍＭ  ＩＰＴＧおよび１００ｍｇ・ｌ−１アンピシリンを含有するＬＢアガープレートにスポットした。プレートを室温でインキュベートして、細胞を４８時間後に擦り取り、ＰＢＳ  １ｍＬに再懸濁させ、Ｄ６００を使用して標準化した。超音波処理によって細胞を溶解して、４℃、３，０００ｇで２０秒間遠心分離して、細胞溶解物および懸濁させた膜から非破砕細胞を除去した。上清中のタンパク質を１５ｍＭメトキシポリエチレングリコール−マレイミド（ＭＡＬ−ＰＥＧ  ５ｋＤａ）によって室温で１時間標識した。１００ｍＭ  ＤＴＴによって反応を停止させて、５０．４  Ｔｉローターにおいて４０，０００ｒ．ｐ．ｍ．（約１００，０００ｇ）で４℃で２０分間遠心分離して、全ての膜をペレットにした。ペレットを１％ラウロイルサルコシン酸ナトリウムによって洗浄して、細胞膜を可溶化させて再度遠心分離した。得られた外膜を、１％ＤＤＭを含有するＰＢＳを使用して懸濁し、可溶化した。ニッケルビーズによる金属親和性プルダウンをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗Ｈｉｓウェスタンブロットに使用した。空のｐＭＣ２ベクターを有する大腸菌（E.coli）ＬＳＲ１２細胞を陰性対照として使用した。
【実施例７】
【０６０５】
ＡＴＲ−ＦＴＩＲ分光法
ＡＴＲ−ＦＴＩＲ測定を、液体窒素冷蔵テルル化カドミウム水銀検出器およびＧｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ反射測定用アクセサリ（Ｓｐｅｃａｃ）を備えたＥｑｕｉｎｏｘ  ５５赤外線分光光度計（Ｂｒｕｋｅｒ）において乾燥空気で絶えずパージしながら実施した。内部反射測定用元素はダイヤモンド結晶（２ｍｍ×２ｍｍ）であり、ビーム入射角は４５°であった。それぞれの精製タンパク質試料（１μｌ）を結晶の表面に広げて、気体窒素流で乾燥させて被膜を形成させた。分解能２ｃｍ−１で記録された各スペクトルは、シグナル対ノイズ比を改善するための積算処理が平均で１２８回であった。スペクトルは全て水蒸気の関与を差し引いて処理し、アポダイゼーションによって最終分解能４ｃｍ−１で平滑化して、アミドＩ結合（１，７００〜１，６００ｃｍ−１）の領域で標準化して、その比較を可能にした（Goormaghtigh, E. ; Ruysschaert, J. M., Spectrochim. Acta, 1994, 50A, 2137-2144）。
【実施例８】
【０６０６】
ネガティブ染色ＥＭおよび対称性の決定
ネガティブ染色ＥＭを使用して、ＣｓｇＧ、ＣｓｇＧＣ１Ｓ、およびＣｓｇＥの溶液中のオリゴマー化状態をモニターした。ＣｓｇＥ、ＣｓｇＧＣ１Ｓ、およびａｍｐｈｉｐｏｌ結合ＣｓｇＧを０．０５ｍｇ・ｍｌ−１の濃度に調節して、グロー放電カーボンコーティング銅グリッド（ＣＦ−４００；  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に適用した。１分間インキュベートした後、試料をブロットし、次いで洗浄して２％酢酸ウラニルで染色した。画像を、電圧１２０ｋＶで作動するＴｅｃｎａｉ  Ｔ１２  ＢｉｏＴＷＩＮ  ＬａＢ６顕微鏡で、倍率４９，０００倍で８００〜２，０００ｎｍのデフォーカスにより収集した。コントラスト伝達関数（ＣＴＦ）、位相フリッピング、および粒子選択は、クライオ−ＥＭに関して記述されたように実施した。膜抽出ＣｓｇＧに関して、オクタデカマー粒子（全体で１，７８０個）を、ノナマーおよび上面図から個別に分析した。精製ＣｓｇＥに関して、全体で２，４５２個の粒子を分析した。三次元モデルを、以下のＣｓｇＧ−ＣｓｇＥのクライオ−ＥＭ分析に関して記述されたように得て、数ラウンドの多重参照配列アライメント（ＭＲＡ）、多重統計分析（ＭＳＡ）、およびアンカーセット精密化によって精密化した。全ての場合において、標準化および中心化後、クライオ−ＥＭの章で記述したようにＩＭＡＧＩＣ−４Ｄを使用して画像を分類した。特徴的な図に対応する最善のクラスを各組の粒子に関して選択した。ＣｓｇＧ上面図の対称性の決定は、クラスあたりおおよそ２０個の画像の最善のクラス平均を使用して行った。回転方向の自己相関関数はＩＭＡＧＩＣを使用して計算してプロットした。
【実施例９】
【０６０７】
ネガティブ染色ＥＭおよび対称性の決定
ネガティブ染色ＥＭを使用して、ＣｓｇＧ、ＣｓｇＧＣ１Ｓ、およびＣｓｇＥの溶液中のオリゴマー化状態をモニターした。ＣｓｇＥ、ＣｓｇＧＣ１Ｓ、およびａｍｐｈｉｐｏｌ結合ＣｓｇＧを０．０５ｍｇ・ｍｌ−１の濃度に調節して、グロー放電カーボンコーティング銅グリッド（ＣＦ−４００；  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に適用した。１分間インキュベートした後、試料をブロットし、次いで洗浄して２％酢酸ウラニルで染色した。画像を、電圧１２０ｋＶで作動するＴｅｃｎａｉ  Ｔ１２  ＢｉｏＴＷＩＮ  ＬａＢ６顕微鏡で、倍率４９，０００倍で８００〜２，０００ｎｍのデフォーカスにより収集した。コントラスト伝達関数（ＣＴＦ）、位相フリッピング、および粒子選択は、クライオ−ＥＭに関して記述されたように実施した。膜抽出ＣｓｇＧに関して、オクタデカマー粒子（全体で１，７８０個）を、ノナマーおよび上面図から個別に分析した。精製ＣｓｇＥに関して、全体で２，４５２個の粒子を分析した。三次元モデルを、以下のＣｓｇＧ−ＣｓｇＥのクライオ−ＥＭ分析に関して記述されたように得て、数ラウンドの多重参照配列アライメント（ＭＲＡ）、多重統計分析（ＭＳＡ）、およびアンカーセット精密化によって精密化した。全ての場合において、標準化および中心化後、クライオ−ＥＭの章で記述したようにＩＭＡＧＩＣ−４Ｄを使用して画像を分類した。特徴的な図に対応する最善のクラスを各組の粒子に関して選択した。ＣｓｇＧ上面図の対称性の決定は、クラスあたりおおよそ２０個の画像の最善のクラス平均を使用して行った。回転方向の自己相関関数はＩＭＡＧＩＣを使用して計算してプロットした。
【実施例１０】
【０６０８】
ＣｓｇＧ−ＣｓｇＥ複合体の形成
ＣｓｇＧ−ＣｓｇＥ複合体形成に関して、ＣｓｇＧ（０．５％Ｃ８Ｅ４、４ｍＭ  ＬＤＡＯ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ中で２４ｍｇ・ｍｌ−１タンパク質）１２０ｍｌを洗浄剤脱安定化リポソーム（１ｍｇ・ｍｌ−１  １，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）および０．４％ＬＤＡＯ）３００ｍｌに添加して氷中で５分間インキュベートした後、Ａ８−３５  ａｍｐｈｉｐｏｌｓの１００ｍｇ・ｍｌ−１保存液９０ｍｌを添加することによって、精製ＣｓｇＧ中の可溶化洗浄剤を、Ａｍｐｈｉｐｏｌｓ  Ａ８−３５（Ａｎａｔｒａｃｅ）に交換した。氷中でさらに１５分間インキュベートした後、試料をＳｕｐｅｒｏｓｅ  ６  １０／３００  ＧＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムにロードして、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５％キシリトール、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、０．２ｍＭ  ＤＴＴ中でゲルろ過を実施した。２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５％キシリトール、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、０．２ｍＭ  ＤＴＴ中の精製モノマーＣｓｇＥの等量を、ＣｓｇＥおよびＣｓｇＧに関してそれぞれ１５および５ｍＭのタンパク質最終濃度でａｍｐｈｉｐｏｌ可溶化ＣｓｇＧに添加して、試料を０．５×ＴＢＥ緩衝液中で４．５％ネイティブＰＡＧＥにおいて１８℃、１２５Ｖで泳動させた。第二の変性寸法に関して、ＣｓｇＧ−ＣｓｇＥ複合体に対応するバンドを、同じゲル上で同時に泳動させた未染色レーンから切り出して、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．８、２％ＳＤＳ、１０％グリセロール、５％  ２−メルカプトエタノール、０．０１％ブロモフェノールブルー）中で５分間沸騰させて、４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて泳動させた。精製ＣｓｇＥおよびＣｓｇＧを対照試料としての複合体と共に泳動させた。ゲルを、肉眼による可視化のためにＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ  Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、またはＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいてＣｓｇＥおよびＣｓｇＧバンドの蛍光検出（Ｔｙｐｈｏｏｎ  ＦＬＡ  ９０００）によるＣｓｇＧ−ＣｓｇＥ複合体の化学量論的評価のためにＳＹＰＲＯオレンジによって染色し、ＣｓｇＧ／ＣｓｇＥ比０．９７を生じた。
【実施例１１】
【０６０９】
ＣｓｇＧ−ＣｓｇＥのクライオ−ＥＭ
クライオ電子顕微鏡を使用して、Ｃ９  ＣｓｇＧ−ＣｓｇＥ複合体の溶液中の構造を決定した。上記のように調製したＣｓｇＧ−ＣｓｇＥ複合体は、ＨｉｓＴｒａｐ  ＦＦ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に結合させて溶出させ、非結合ＣｓｇＧを除去して、これを溶出させ、２０ｍＡで３０秒間グロー放電させたＱｕａｎｔｉｆｏｉｌ  Ｒ２／２カーボンコーティンググリッド（Ｑｕａｎｔｉｆｏｉｌ  Ｍｉｃｒｏ  Ｔｏｏｌｓ  ＧｍｂＨ）に直ちに適用した。試料を、自動システム（Ｌｅｉｃａ）を使用して液体窒素中で急速凍結して、電圧２００ｋＶで作動するＦＥＩ  Ｆ２０顕微鏡下で、低用量条件で５０，０００倍の名目上の倍率、および１．４〜３ｍｍのデフォーカス範囲で観察した。画像フレームをＦａｌｃｏｎ  ＩＩ検出器で記録した。標本レベルのピクセルサイズは、１．９Å／ピクセルであった。ＣＴＦパラメータを、ＣＴＦＦＩＮＤ３（Mindell, J. A. & Grigorieff, N., J. Struct. Biol. 2003, 142, 334-347）を使用して評価し、位相フリッピングをＳＰＩＤＥＲ（Shaikh, T. R. et al., Nature Protocols, 2008, 3, 1941-1974）で行った。粒子を、ＢＯＸＥＲ（EMAN2; Tang, G. et al., J. Struct. Biol., 2007, 157, 38-46）を使用してＣＴＦ補正顕微鏡写真から自動的に選択した。１０％を超える非点収差を有する画像を破棄した。全体で１，２２１個の粒子を７５個の顕微鏡写真から選択して１２８ピクセル×１２８ピクセルのボックスにウィンドウ化した。画像を同じ平均値および標準偏差に標準化して、約２００Åの低分解能カットオフでハイパスフィルターを通過させた。それらを中心化した後ＭＳＡの第一ラウンドに供した。ＩＭＡＧＩＣ−４Ｄ（Ｉｍａｇｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）の参照画像を使用しない分類を使用して、最初の参照セットを得た。Ｃ９円柱状粒子の特徴的な側面図に対応する最善のクラスをＭＲＡの参照として使用した。ＣｓｇＧ−ＣｓｇＥ複合体に関して、最初の三次元モデルを、角度の再構成（Ｉｍａｇｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）によって決定した方向を有する複合体の１，２２１個の粒子を包含する最善の１２５個の特徴的な図（良好なコントラストおよび明確な特徴を有する）から計算した。三次元マップをＭＲＡ、ＭＳＡ、およびアンカーセット精密化の繰り返しラウンドによって精密化した。分解能は、０．５の基準レベルに従ってフーリエシェル相関（ＦＳＣ）によって２４Åであると推定された（図５）。
【０６１０】
マップおよび図面の可視化は、ＵＣＳＦ  Ｃｈｉｍｅｒａ（Pettersen, E. F. et al., J. Comput. Chem., 2004, 25, 1605-1612）で実施した。
【実施例１２】
【０６１１】
ＣｓｇＧおよびＣｓｇＧ＋ＣｓｇＥポアの単一チャネル電流分析
陰性電場電位において、ＣｓｇＧポアは２つのコンダクタンス状態を示す。図５は、通常（＋５０、０、および−５０ｍＶで測定）、および低コンダクタンス型（０、＋５０、および−５０ｍＶで測定）それぞれの代表的な単一チャネル電流トレースを示す。全観察時間（ｎ＝２２）の間に、２つの状態の間での変換は観察されず、コンダクタンス状態が、長い寿命（数秒から数分の時間尺度）を有することを示している。左下のパネルは、＋５０ｍＶおよび−５０ｍＶで獲得したＣｓｇＧポアの通常および低コンダクタンス型の電流ヒストグラムを示す（ｎ＝３３）。通常および低コンダクタンス型を有するＣｓｇＧポアのＩ−Ｖ曲線を右下のパネルに示す。データは、少なくとも４回の独立した記録からの平均値および標準偏差を表す。低コンダクタンス型の性質または生理的存在は不明である。
【０６１２】
図６は、アクセサリ因子ＣｓｇＥで滴定したＣｓｇＧチャネルの電気生理学の結果を示す。プロットは、ＣｓｇＥ濃度の関数として、開、中間、および閉状態のチャネルの分画を示す。ＣｓｇＧの開状態および閉状態を図６に図示する（それぞれ、０ｎＭおよび１００ｎＭ  ＣｓｇＥ）。ＣｓｇＥの濃度を１０ｎＭ超に増加させると、ＣｓｇＧポアは閉鎖する。この効果は＋５０ｍＶ（左）および−５０ｍＶ（右）で起こり、ポアの遮断がＣｓｇＧポアへのＣｓｇＥ（計算ｐＩ  ４．７）の電気泳動によって引き起こされる可能性を除外する。頻度の低い（＜５％）中間状態は、開状態のチャネルコンダクタンスのほぼ半分を有する。これはＣｓｇＥによって誘導されるＣｓｇＧチャネルの不完全な閉鎖を表しうる；あるいは、これは電解質溶液の残留ＣｓｇＧモノマーが膜に埋もれたポアに結合することによって引き起こされるＣｓｇＧダイマーの一時的な形成を表しうる。３つの状態の分画を、単一チャネル電流トレースの全ての時点のヒストグラム分析から得た。ヒストグラムは、最大３つの状態のピーク面積を生じ、所定の状態の分画は、対応するピーク面積を記録における他の全ての状態の合計で除することによって得た。陰性電場電位では、２つの開コンダクタンス状態が識別され、これはＣｓｇＧに関する知見と類似である（ａを参照されたい）。開状態のチャネルの変化形はいずれもより高濃度のＣｓｇＥで遮断されたことから、図６における「開状態」トレース（０ｎＭ）は、両方のコンダクタンス型を組み合わせている。プロットにおけるデータは、３回の独立した記録の平均値および標準偏差を表す。
【０６１３】
結晶構造、サイズ排除クロマトグラフィー、およびＥＭは、洗浄剤抽出ＣｓｇＧポアが、より高いタンパク質濃度で非ネイティブのテール−テールスタックダイマーを形成することを示している（例えば、Ｄ９粒子としての２つのノナマー、図７）。これらのダイマーはまた、単一チャネル記録でも観察することができる。上のパネルは、＋５０、０、および−５０ｍＶ（左から右に）でのスタックされたＣｓｇＧポアの単一チャネル電流トレースを示す。左下のパネルは、＋５０および−５０ｍＶで記録されたダイマーＣｓｇＧポアの電流ヒストグラムを示す。＋５０および−５０ｍＶでの実験的コンダクタンス、それぞれ、＋１６．２±１．８および−１６．０±３．０ｐＡ（ｎ＝１５）は、２３ｐＡという理論的計算値に近い。右下のパネルは、スタックされたＣｓｇＧポアのＩ−Ｖ曲線を示す。データは、６回の独立した記録の平均値および標準偏差を表す。
【０６１４】
ＣｓｇＥがスタックされたＣｓｇＧポアに結合して遮断する能力を、電気生理学によって試験した。１０または１００ｎＭ  ＣｓｇＥの存在下で＋５０ｍＶ（上）または−５０ｍＶ（下）でのスタックされたＣｓｇＧポアの単一チャネル電流トレースを示す。電流トレースは、そうでなければ飽和濃度のＣｓｇＥがスタックされたＣｓｇＧダイマーに関してポア閉鎖を引き起こさないことを示している。これらの知見は、ＥＭおよび部位特異的変異誘発によって識別されるように、ＣｓｇＧ−ＣｓｇＥ接触域がヘリックス２およびＣｓｇＧ周辺質キャビティの口部分にマッピングされることと良好に一致する（図５および６）。
【実施例１３】
【０６１５】
胆汁酸塩毒性アッセイ
外膜の透過性を、胆汁酸塩を含有するアガープレートでの増殖の減少によって調べた。ｐＬＲ４２（Nenninger, A. A. et al., Mol. Microbiol., 2011, 81, 486-499）およびｐＭＣ２（Robinson, L. S. et al., Mol. Microbiol., 2006, 59, 870-881）の両方を有する大腸菌（E.coli）ＬＳＲ１２（Chapman, M. R. et al., Science, 2002, 295, 851-855）細胞（または誘導されたヘリックス２変異体）の１０倍連続希釈液（５ｍｌ）を、０．２％（重量／容量）Ｌ−アラビノースを含むまたは含まない、１００ｍｇ・ｌ−１アンピシリン、２５ｍｇ・ｌ−１クロラムフェニコール、１ｍＭ  ＩＰＴＧを含有するＭｃＣｏｎｋｅｙアガープレートにスポットした。３７℃で一晩インキュベートした後、コロニーの増殖を調べた。
【実施例１４】
【０６１６】
単一チャネル電流記録
単一チャネル電流記録は、ＮａｎｉｏｎのＯｒｂｉｔ  １６キットによって同時の高分解能電気的記録を使用して実施した。簡単に説明すると、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）の水平二重層を、１６チャネルのマルチ電極キャビティアレイ（ＭＥＣＡ）チップ（ｌｏｎｅｒａ）（del Rio Martinez, J. M., ACS NanoSmall, 2014, 5, 8080-8088）において（ピコリットル容積以下の）マイクロキャビティの上に形成した。二重層の上または下のシスおよびトランスキャビティはいずれも１．０Ｍ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０を含有した。チャネルを膜に挿入するために、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．５％Ｃ８Ｅ４、５ｍＭ  ＬＤＡＯに溶解したＣｓｇＧを、最終濃度９０〜３００ｎＭとなるようにシス区画に添加した。ＣｓｇＧチャネルとＣｓｇＥとの相互作用を試験するために、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中に溶解した後者のタンパク質溶液を最終濃度０．１、１、１０および１００ｎＭとなるようにシス区画に添加した。＋５０ｍＶおよび−５０ｍＶの保持電圧で（シス側を接地）、Ｔｅｃｅｌｌａ  Ｔｒｉｔｏｎ  １６−チャネル増幅器を使用してロウパスフィルタリング周波数３ｋＨｚおよびサンプリング周波数１０ｋＨｚで膜通過電流を記録した。電流のトレースをｐＣｌａｍｐスイートのＣｌａｍｐｆｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して分析した。Ｏｒｉｇｉｎ  ８．６（Ｍｉｃｒｏｃａｌ）（Movileanu, L, Nature Biotechnol., 2000, 18, 1091-1095）を使用してプロットを作製した。
【０６１７】
測定された電流を、３つのセグメント、すなわち膜貫通区画、周辺質前庭、および両者を接続する内部チャネル狭窄で構成されるようにモデル化したＣｓｇＧのＸ線構造のポア寸法に基づいて計算された電流と比較した。最初の２つのセグメントは、円錐形状のセグメントとなるようにモデル化されたが、狭窄は円柱状として表された。対応する抵抗Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３はそれぞれ、以下のように計算された：
Ｒ１＝Ｌ１／（πＤ１ｄ１κ）
Ｒ２＝Ｌ２／（πＤ２ｄ２κ）
Ｒ３＝Ｌ３／（πＤ１ｄ２κ）
式中、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３はセグメントの軸方向の長さであり、それぞれ、３．５、４．０、および２．０ｎｍであると測定され、Ｄ１、ｄ１、Ｄ２、およびｄ２は、セグメント１および２の最大および最小直径であり、それぞれ４．０、０．８、３．４、および０．８ｎｍであると測定された。導電率κは、１０．６Ｓ・ｍ−１の値を有する。電流は、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３ならびに電圧Ｖ＝５０ｍＶを
Ｉ＝Ｖ／（Ｒ１＋Ｒ２＋Ｒ３）
に代入することによって計算した。
【０６１８】
アクセス抵抗は、予想される電流を有意に変化させないことが見出された。
【０６１９】
上記の記録のような単一チャネル電流記録を、分析物の存在下で行ってもよく、それによってチャネルはバイオセンサーの役割を引き受けることができる。
【実施例１５】
【０６２０】
モデルポリアラニン鎖によるＣｓｇＧ狭窄の分子動力学シミュレーション
ＣｓｇＧ狭窄は、図９に示されるようにＣ末端からＮ末端方向に細長いコンフォメーションでチャネルの中を貫通するポリアラニン鎖によってモデル化されている。ＣｓｇＧトランスポーターの中の基質の通過はそれ自身、配列特異的ではない（Nenninger, A. A. et al., Mol. Microbiol., 2011, 81, 486-499; Van Gerven, N. et al, Mol. Microbiol. 2014, 91, 1022-1035 2014）。明確にするために、通過するポリペプチド鎖の推定の相互作用をモデル化するためにポリアラニン鎖を使用した。モデル領域は、それぞれが残基４７〜５８個を含む９個の同心円のＣｓｇＧ  Ｃ−ループで構成される。狭窄内部の側鎖を、Ａｓｎ５５およびＰｈｅ５６と表示するスティック表示で示す。狭窄内部のポリアラニン残基（＋１から＋５と表示される残基）の１０Å以内の溶媒分子（水）を点で示す。図９ｃは、図９ｂに示されるように位置するポリアラニン鎖のモデル化溶媒和を示し、明確にするためにＣ−ループを除去している（ポリアラニン鎖全体の１０Å以内の溶媒分子を示す）。Ａｓｎ５５およびＰｈｅ５６の環の最高点では、ポリアラニン鎖の溶媒和は、ペプチド骨格とアミドクランプ側鎖とをつなぐ単一の水シェルに低減される。Ｔｙｒ５１環におけるほとんどの側鎖は、ＣｓｇＧ（およびＣｓｇＧＣ１Ｓ）Ｘ線構造で観察されたその内向きの中心を向く位置と比較して溶媒に向かって回転している。モデルは、ＡＭＢＥＲ９９ＳＢ−ＩＬＤＮ（Lindorff-Larsen, K. et al., Proteins 2010, 78, 1950-1958）力場を使用し、Ｃ−ループ末端の残基（Ｇｌｎ４７およびＴｈｒ５８）のＣａ原子の位置が制限されている、ＧＲＯＭＡＣＳ（Pronk, S. et al., Bioinformatics, 2013, 29, 845-854）による４０ナノ秒の全原子の明白な溶媒分子動力学シミュレーションの結果である。
【実施例１６】
【０６２１】
核酸シークエンシングのためのＣｓｇＧナノポアの使用
Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡＰ）は、膜内に位置する変異体または野生型ＣｓｇＧナノポアがポアの中でのオリゴマープローブＤＮＡ鎖の制御された運動を可能にするために分子モーターとして使用されうる。ポアに電圧を印加すると、ナノポアのいずれかの側の塩溶液中のイオンの運動により電流が生じうる。プローブＤＮＡがポアの中を移動すると、ポアの中のイオン流はＤＮＡによって変化する。この情報は、配列依存的であることが示されており、実施例１４における上記の測定などの電流測定から正確にプローブの配列を読み取ることができる。
【実施例１７】
【０６２２】
本実施例は、ＣｓｇＧ内のＤＮＡの挙動を調べるために実行されるシミュレーションを記述する。
【０６２３】
材料および方法
ＤＮＡ転位に対するＣｓｇＧ−Ｅｃｏおよび様々な変異体のエネルギー障壁の程度を調べるために操舵分子動力学シミュレーションを実施した。シミュレーションは、ＧＲＯＭＡＣＳパッケージバージョン４．０．５を使用して、ＧＲＯＭＯＳ  ５３ａ６力場およびＳＰＣ水モデルによって実施した。ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ（配列番号３９０）の構造を、タンパク質データバンクから受託コード４ＵＶ３として得た。ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ変異体のモデルを作成するために、野生型のタンパク質構造をＰｙＭＯＬを使用して変異させた。調べた変異体は、ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｆ５６Ａ）（変異Ｆ５６Ａを有する配列番号３９０）、ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｆ５６Ａ−Ｎ５５Ｓ）（変異Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｓを有する配列番号３９０）、およびＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｆ５６Ａ−Ｎ５５Ｓ−Ｙ５１Ａ）（変異Ｆ５６Ａ／Ｎ５５Ｓ／Ｙ５１Ａを有する配列番号３９０）であった。
【０６２４】
次に、ＤＮＡをポアに入れた。異なる２つの系を設定した：
ｉ．ポアに、狭窄領域の真上（残基５６環の上おおよそ５〜１０Å）に１つのグアニンヌクレオチドを入れた。
ｉｉ．ＤＮＡの一本鎖（ｓｓＤＮＡ）を、５‘末端がポアのベータ−バレル側に向かうようにポアの軸に沿って入れた。この設定において、ｓｓＤＮＡは、ポアの全長にわたって予めその中を貫通していた。
【０６２５】
次に、シミュレーションボックスを溶媒和して、最急降下アルゴリズムを使用してエネルギーを最小限にした。
【０６２６】
それぞれのシステムを、ＢｅｒｅｎｄｓｅｎサーモスタットおよびＢｅｒｅｎｄｓｅｎバロスタットを３００Ｋとなるように使用してＮＰＴアンサンブルにおいてシミュレートした。シミュレーションを通して、ポアの骨格に制限を適用した。
【０６２７】
ＤＮＡをポアの中から引き抜くために、１グアニンシミュレーションにおいてリン原子に引き抜き力を適用した。ｓｓＤＮＡシミュレーションでは、引き抜き力を鎖の５‘末端のリン原子に適用した。引き抜き力は、上記のＤＮＡリン原子と、ポア軸に対して平行に定速で移動する想像上の点との間にばねをつなぐことによって、定速で適用した。ばねはいかなる形状も有しないか、またはいかなる流体力学的抗力も受けないことに注意されたい。ばね定数は５ｋＪｍｏｌ−１Å−２に等しかった。
【０６２８】
結果
１Ｇ転位
図１２に示すように、引き抜き力の時間に対するプロットは、ヌクレオチドが、野生型ＣｓｇＥ−Ｅｃｏポアにおけるフェニルアラニン残基Ｆ５６の環の中に入るには大きい障壁が存在することを示している。調べたＣｓｇＧ−Ｅｃｏ変異体に関してグアニン転位に対する有意な障壁は観察されなかった。
【０６２９】
ｓｓＤＮＡ転位
ｓｓＤＮＡ転位に関して、それぞれの実行が異なる引き抜き速度（１００Å／ナノ秒および１０Å／ナノ秒）を適用する２つのシミュレーションをポア毎に実行した。より速い引き抜き速度シミュレーションを図示する図１３に示すように、野生型ＣｓｇＧポアは、ｓｓＤＮＡの転位を可能にするために最大の引き抜き力を必要とした。より遅い引き抜き速度シミュレーションを図示する図１４に示すように、ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ（野生型、配列番号３９０）およびＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｆ５６Ａ）ポアはいずれも、ｓｓＤＮＡ転位を可能にするためには最大の力を適用する必要があった。ｓｓＤＮＡ転位にとって必要な引き抜き力をＣｓｇＧとＭｓｐＡベースラインポアの間で比較すると、類似のレベルのｓｓＤＮＡ転位を許容するためにはＣｓｇＧポアの変異が必要であることを示唆している。
【実施例１８】
【０６３０】
本実施例は、いくつかのＣｓｇＧ変異体の特徴づけを記述する。
【０６３１】
材料および方法
実験を設定する前に、ＤＮＡ構築物Ｘ（最終濃度０．１ｎＭ、構築物Ｘの概略図および説明に関しては図２２を参照されたい）を、Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ（変異Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃを有する配列番号４１２、緩衝液（１５１．５ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭリン酸カリウム、５％グリセロール、ｐＨ７．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で提供されるナノポア系に最終濃度１０ｎＭで添加）で、室温で５分間プレインキュベートした。５分後、ＴＭＡＤ（１００μＭ）をプレミクスに添加して、混合物をさらに５分間インキュベートした。最後に、ＭｇＣｌ２（ナノポア系に添加して最終濃度１．５ｍＭ）、ＡＴＰ（ナノポア系に添加して最終濃度１．５ｍＭ）、ＫＣｌ（ナノポア系に添加して最終濃度５００ｍＭ）、およびリン酸カリウム緩衝液（ナノポア系に添加して最終濃度２５ｍＭ）をプレミクスに添加した。
【０６３２】
緩衝液（２５ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液、１５０ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、１５０ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８．０）中のブロックコポリマーに挿入した多種のＣｓｇＧナノポア１つから、電気的測定を得た。ブロックコポリマーに挿入した１つのポアが得られた後、緩衝液（２ｍＬ、２５ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液、１５０ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、１５０ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８．０）を系の中に流して過剰量のいかなるＣｓｇＧナノポアも除去した。５００ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  リン酸カリウム、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．５ｍＭ  ＡＴＰ、ｐＨ８．０の１５０μｌを系に流した。１０分後、５００ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭリン酸カリウム、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．５ｍＭ  ＡＴＰ、ｐＨ８．０の１５０μｌを系に流して、次いで、酵素（Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ、最終濃度１０ｎＭ）、ＤＮＡ構築物Ｘ（最終濃度０．１ｎＭ）、燃料（ＭｇＣｌ２、最終濃度１．５ｍＭ、ＡＴＰ、最終濃度１．５ｍＭ）プレミックス（全体で１５０μｌ）をナノポア１つの実験系に流した。実験を−１２０ｍＶで実行して、ヘリカーゼ制御ＤＮＡ運動をモニターした。
【０６３３】
結果
範囲の増加を示すポア（図１５〜１７、および２７〜３９）
ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））（ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端に結合している配列番号３９０)は、約１０ｐＡの範囲を有する（図１５（ａ）を参照されたい）が、以下のＣｓｇＧ−Ｅｃｏポア変異体は、電流範囲の増加を示した−
１−  ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ｎ−Ｆ５６Ａ−Ｄ１４９Ｎ−Ｅ１８５Ｒ−Ｅ２０１Ｎ−Ｅ２０３Ｎ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ｎ／Ｆ５６Ａ／Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎを有し、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端に結合している配列番号３９０）は約３０ｐＡの範囲を示した（図１５（ｂ）を参照されたい）。
２−  ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｎ５５Ａ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｎ５５Ａを有し、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端に結合している配列番号３９０）は約３５ｐＡの範囲を示した（図１５（ｃ）を参照されたい）。
３−  ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｎ５５Ｓ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｎ５５Ｓを有し、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端に結合している配列番号３９０）は約４０ｐＡの範囲を示した（図１６（ａ）を参照されたい）。
４−  ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ｎ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ｎを有し、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端に結合している配列番号３９０）は約４０ｐＡの範囲を示した（図１６（ｂ）を参照されたい）。
５−  ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ−Ｆ５６Ａ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ａを有し、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端に結合している配列番号３９０）は約３０ｐＡの範囲を示した（図１６（ｃ）を参照されたい）。
６−  ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ−Ｆ５６Ｎ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｎを有し、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端に結合している配列番号３９０）は約２０ｐＡの範囲を示した（図１７（ａ）を参照されたい）。
７−  ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ−Ｎ５５Ｓ−Ｆ５６Ａ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｎ５５Ｓ／Ｆ５６Ａを有し、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端に結合している配列番号３９０）は約３０ｐＡの範囲を示した（図１７（ｂ）を参照されたい）。
８−  ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ−Ｎ５５Ｓ−Ｆ５６Ｎ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｎ５５Ｓ／Ｆ５６Ｎを有し、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端に結合している配列番号３９０）は約３０ｐＡの範囲を示した（図１７（ｃ）を参照されたい）。
１３−  ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｆ５６Ｈ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｆ５６Ｈを有し、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端に結合している配列番号３９０）は約３５ｐＡの範囲を示した（図２７を参照されたい）。
１４−  ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｆ５６Ｑ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｆ５６Ｑを有し、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端に結合している配列番号３９０）は約４０ｐＡの範囲を示した（図２８を参照されたい）。
１５−  ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｆ５６Ｔ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｆ５６Ｔを有し、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端に結合している配列番号３９０）は約３５ｐＡの範囲を示した（図２９を参照されたい）。
１６−  ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｓ５４Ｐ／Ｆ５６Ａ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｓ５４Ｐ／Ｆ５６Ａを有し、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端に結合している配列番号３９０）は約３５ｐＡの範囲を示した（図３０を参照されたい）。
１７−  ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ａ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ａを有し、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端に結合している配列番号３９０）は約３０ｐＡの範囲を示した（図３１を参照されたい）。
１８−  ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｆ５６Ｐ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｆ５６Ｐを有し、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端に結合している配列番号３９０）は約３０ｐＡの範囲を示した（図３２を参照されたい）。
１９−  ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｆ５６Ａ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｆ５６Ａを有し、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端に結合している配列番号３９０）は約４０ｐＡの範囲を示した（図３３を参照されたい）。
２０−  ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑを有し、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端に結合している配列番号３９０）は約３０ｐＡの範囲を示した（図３４を参照されたい）。
２１−  ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｎ５５Ｓ／Ｆ５６Ｑ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｎ５５Ｓ／Ｆ５６Ｑを有し、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端に結合している配列番号３９０）は約３５ｐＡの範囲を示した（図３５を参照されたい）。
２２−  ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ｔ／Ｎ５５Ｓ／Ｆ５６Ｑ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ｔ／Ｎ５５Ｓ／Ｆ５６Ｑを有し、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端に結合している配列番号３９０）は約３５ｐＡの範囲を示した（図３６を参照されたい）。
２３−  ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｆ５６Ｑ／Ｎ１０２Ｒ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｆ５６Ｑ／Ｎ１０２Ｒを有し、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端に結合している配列番号３９０）は約３０ｐＡの範囲を示した（図３７を参照されたい）。
２４−  ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ｑ／Ｆ５６Ｑ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ｑ／Ｆ５６Ｑを有し、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端に結合している配列番号３９０）は約４０ｐＡの範囲を示した（図３８を参照されたい）。
２５−  ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ａ／Ｆ５６Ｑを有し、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端に結合している配列番号３９０）は約３５ｐＡの範囲を示した（図３９を参照されたい）。
【０６３４】
スループットの増加を示すポア（図１８および１９）
図１８および１９から認められうるように、以下の変異体ポア（以下の９〜１２）は、４時間でチャネルあたり多数のヘリカーゼ制御ＤＮＡ運動（図１８および１９においてＸと表示）を示したのに対し、図１８（ａ）に示すＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端に結合している配列番号３９０）は、４時間でチャネルあたりわずか１または２のヘリカーゼ制御ＤＮＡ運動（図１８（ａ）においてＸと表示）をしばしば示し、その代わりに延長したブロック領域（図１８（ａ）においてＹと表示）を示した。
９−  ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｄ１４９Ｎ−Ｅ１８５Ｎ−Ｅ２０３Ｎ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０３Ｎを有し、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端に結合している配列番号３９０）（図１８（ｂ））。
１０−  ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｄ１４９Ｎ−Ｅ１８５Ｎ−Ｅ２０１Ｎ−Ｅ２０３Ｎ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎを有し、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端に結合している配列番号３９０）（図１８（ｃ））。
１１−  ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｄ１４９Ｎ−Ｅ１８５Ｒ−Ｄ１９５Ｎ−Ｅ２０１Ｎ−Ｅ２０３Ｎ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｎ／Ｅ２０３Ｎを有し、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端に結合している配列番号３９０）（図１９（ａ））。
１２−  ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｄ１４９Ｎ−Ｅ１８５Ｒ−Ｄ１９５Ｎ−Ｅ２０１Ｒ−Ｅ２０３Ｎ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｄ１４９Ｎ／Ｅ１８５Ｒ／Ｄ１９５Ｎ／Ｅ２０１Ｒ／Ｅ２０３Ｎを有し、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端に結合している配列番号３９０）（図１９（ｂ））。
【０６３５】
挿入の増加を示すポア（図２０および２１）
図２０および２１の比較によってわかるように、図２１に示される変異体ポアＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｔ１５０Ｉ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｔ１５０Ｉを有し、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端に結合している配列番号３９０）は、ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））（ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端に結合している配列番号３９０）ポア（図２０を参照されたい）と比較して増加したポア数（約４〜５倍）で膜に存在した。図２０および２１の矢印は、４時間の実験でブロックコポリマーに挿入されたＣｓｇＧ−Ｅｃｏナノポアの数を図示した（図２０の１３０〜１４０個、および図２１の１〜１１個は、それぞれ個別のナノポア実験に対応した）。ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））（ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端に結合している、配列番号３９０）に関して、３つの実験は、１つのナノポアの挿入を示したが、変異体ポア（ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｔ１５９Ｉ−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９）に関して、それぞれの実験は、少なくとも１つのナノポアの挿入を示し、いくつかの実験は多数のポア挿入を示した。
【実施例１９】
【０６３６】
本実施例は、ＣｓｇＧポアを精製するために開発された大腸菌（E.coli）精製法を記述する。
【０６３７】
材料および方法
ポリペプチドＰｒｏ−ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））（ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端に結合しており、Ｐｒｏが配列番号４３６であり、Ｎ−末端に結合している配列番号３９０）をコードするＤＮＡをＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ．が合成し、アンピシリン耐性遺伝子を含むｐＴ７ベクターにクローニングした。ｐＴ７ベクターのタンパク質発現を、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）によって誘導した。ＤＮＡ溶液の濃度を４００ｎｇ／μｌに調節した。ＤＮＡ（１μｌ）を使用してＬｅｍｏ２１（ＤＥ３）コンピテント大腸菌（E.coli）細胞（５０μｌ、ＮＥＢ、カタログ番号Ｃ２５２８Ｈ）を形質転換した。形質転換の前に、Ｌｅｍｏ２１（ＤＥ３）細胞（Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ  ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）からＣｓｇＧ遺伝子をノックアウトした。次に、細胞を、アンピシリン（０．１ｍｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天に播種して、３７℃で約１６時間インキュベートした。
【０６３８】
アンピシリンを含有するＬＢプレート上で増殖させた細菌コロニーは、ＣｓｇＧプラスミドを取り込んだ。そのような１つのコロニーを使用して、カルベニシリン（０．１ｍｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地（１００ｍｌ）の開始培養物に接種した。開始培養物を、ＯＤ６００が１．０〜１．２に達するまで撹拌しながら３７℃で増殖させた。開始培養物を使用して、カルベニシリン（０．１ｍｇ／ｍｌ）およびラムノース（５００μＭ）を含有する新しいＬＢ培地５００ｍＬにＯ．Ｄ．６００が０．１となるように接種した。培養物を、ＯＤ６００が０．６に達するまで、３７℃で撹拌しながら増殖させた。次に、培養物の温度を１８℃に調節して、ＩＰＴＧ（最終濃度０．２ｍＭ）を添加して誘導を開始した。誘導は、撹拌しながら１８℃で約１８時間行った。
【０６３９】
誘導後、培養物を６，０００ｇで３０分間の遠心分離によりペレットにした。ペレットを、プロテアーゼ阻害剤（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、５３９１３８）、ベンゾナーゼヌクレアーゼ（Ｓｉｇｍａ、Ｅ１０１４）、および１×バグバスター（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、７０９２１）ｐＨ８．０を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、３００ｍＭ  ＮａＣｌに懸濁させた（ペレット１グラムあたり緩衝液約１０ｍｌ）。懸濁液を、完全に均一になるまで十分に混合した後、試料を４℃のローラーミキサーに約５時間移した。溶解物を２０，０００ｇで４５分間の遠心分離によりペレットにして、上清を０．２２μｍのＰＥＳシリンジフィルターを通してろ過した。ＣｓｇＧを含有する上清（試料１として知られる）を、カラムクロマトグラフィーによる精製のために残した。
【０６４０】
試料１を５ｍｌ  Ｓｔｒｅｐ  Ｔｒｅｐカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。カラムを、１０カラム容積の安定なベースラインが維持されるまで２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０１％ＤＤＭ、ｐＨ８によって洗浄した。次いで、カラムを２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０１％ＤＤＭ、ｐＨ８によって洗浄後、１５０ｎＭ緩衝液に戻した。１０ｍＭデスチオビオチンによって溶出を行った。ＣｓｇＧタンパク質のＳｔｒｅｐ  ｔｒａｐ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）精製のクロマトグラフィートレースの一例を図２３に示す。溶出ピーク１をＥ１と表示する。図２４は、初回Ｓｔｒｅｐ精製後のＣｓｇＧ−Ｅｃｏタンパク質の典型的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ可視化の例を示す。レーン１〜３は、矢印で示されるようにＣｓｇＧタンパク質を含有する主要な溶出ピーク（図２３においてＥ１と表示）を示す。レーン４〜６は、混入物を含有する主要な溶出ピーク（図２３においてＥ１と表示）のテール部の溶出分画に対応した。
【０６４１】
溶出ピークをプールして、６５℃で１５分間加熱し、熱に不安定な混入タンパク質を除去した。加熱した溶液を２０，０００ｇで１０分間の遠心分離に供して、ペレットを破棄した。上清を、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０１％ＤＤＭ、０．１％ＳＤＳ、ｐＨ８中で１２０ｍｌ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｓ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によるゲルろ過に供した。タンパク質のトリプトファン成分が少ないために２２０ｎｍでモニタリングを行った。試料は約５５ｍＬの容積で溶出した（図２５は、サイズ排除カラムトレースを示し、５５ｍＬの試料ピークを星印で表示する）。溶出ピークを４〜２０％ＴＧＸ（図２６、Ｂｉｏ  Ｒａｄ）で泳動させて、目的のポアＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））（ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端に結合している配列番号３９０）の存在を確認した。同定された分画をプールして５０ｋＤ  Ａｍｉｃｏｎスピンカラムによって濃縮した。
【実施例２０】
【０６４２】
本実施例は、ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ）−（ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ変異を有し、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端ポア変異体２０に結合している配列番号３９０）とＴ４  Ｄｄａ−（Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ）（変異Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃを有し、次いで（ΔＭ１）Ｇ１Ｇ２である配列番号４１２）との相互作用を調べるために実行するシミュレーションを記述する。
【０６４３】
シミュレーション方法
ＧＲＯＭＡＣＳパッケージバージョン４．０．５を使用して、ＧＲＯＭＯＳ  ５３ａ６力場およびＳＰＣ水モデルによってシミュレーションを実施した。
【０６４４】
ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ（Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ）−（ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ変異を有し、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端ポア変異体２０に結合している配列番号３９０）モデルは、タンパク質データバンクの受託コード４ＵＶ３および４Ｑ７９で見出されるＣｓｇＧの結晶構造に基づいた。関連する変異を、ＰｙＭＯＬを使用して作製した。得られたポアモデルを、次に最急降下アルゴリズムを使用してエネルギーを最小限にした。Ｔ４  Ｄｄａ−（Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ）（変異Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃを有し、（ΔＭ１）Ｇ１Ｇ２である配列番号４１２）モデルは、タンパク質データバンクの受託コード３ＵＰＵに見出されるＤｄａ１９９３構造に基づいた。この場合も、関連する変異を、ＰｙＭＯＬを使用して作製し、モデルを最急降下アルゴリズムを使用してエネルギーを最小限にした。
【０６４５】
Ｔ４  Ｄｄａ−（Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ）（変異Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃを有し、（ΔＭ１）Ｇ１Ｇ２である配列番号４１２）モデルを次に、ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ（Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ）−（ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑを有し、ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号４３５であり、Ｃ−末端ポア変異体２０に結合している配列番号３９０）の上に置いた。異なる初回酵素コンフォメーション（実行１〜３（０ｎｓ）、図４０を参照されたい）について、３つのシミュレーションを実施した。
【０６４６】
全ての酵素コンフォメーションにおいて、ＤＮＡの５‘末端がポアの方向を向くように酵素を配置したところ、酵素はシミュレーションを通して制限を受けなかった。ポアの骨格は制限され、シミュレーションボックスは溶媒和された。系を、ＢｅｒｅｎｄｓｅｎサーモスタットおよびＢｅｒｅｎｄｓｅｎバロスタットを３００Ｋで使用してＮＰＴアンサンブルにおいて４０ナノ秒間シミュレートした。
【０６４７】
酵素とポアとの間の接触を、ＧＲＯＭＡＣＳ分析ソフトウェアとローカルな手書きコード（locally written code）の両方を使用して分析した。以下の表は、ポアおよび酵素アミノ酸の両方について観察された接触数を示す。表６〜８は、酵素上のアミノ酸接点と相互作用するポア上のアミノ酸接点を示す。３つのシミュレーションのうち２つにおいて、酵素はポアの上部で傾斜する（実行２および３（２０、３０、および４０ナノ秒）、図４０および４１を参照されたい）。実行１は、酵素が傾斜せずそのため、表６において高い相互作用を有することが示された点を、ポアキャップ上の酵素安定性を増加させるために最適化できることを示している。
【０６４８】
【表６−１】
2017527284.tif 000023
【０６４９】
【表６−２】
2017527284.tif 000024
【０６５０】
【表６−３】
2017527284.tif 000025
【０６５１】
【表６−４】
2017527284.tif 000026
【０６５２】
【表７−１】
2017527284.tif 000027
【０６５３】
【表７−２】
2017527284.tif 000028
【０６５４】
【表７−３】
2017527284.tif 000029
【０６５５】
【表７−４】
2017527284.tif 000030
【０６５６】
【表８−１】
2017527284.tif 000031
【０６５７】
【表８−２】
2017527284.tif 000032
【０６５８】
【表８−３】
2017527284.tif 000033
【０６５９】
【表８−４】
2017527284.tif 000034
【０６６０】
【表８−５】
2017527284.tif 000035
【実施例２１】
【０６６１】
チャネル狭窄においてＣｓｇＧナノポアが核酸を捕捉する能力
核酸シークエンシングのためのナノポアの使用は、ナノポアによる一本鎖ＤＮＡの捕捉および貫通を必要とする。本実施例において、ＣｓｇＧ  ＷＴタンパク質の単一チャネル電流トレースを、一本鎖ＤＮＡオーバーハングを有するＤＮＡヘアピンの存在下で追跡した。図５６に示す本実施例のトレースは、＋５０ｍＶまたは−５０ｍＶの間隔（矢印で示す）で測定される電位に応答して変化する電流を示す。最後の＋５０ｍＶセグメントにおける下向き電流の遮断は、内部ポア構築の中への一本鎖ヘアピンの末端が貫通していることを表し、ほぼ完全な電流の遮断が起こる。電場を−５０ｍＶに逆転させると、ポアの電気泳動の遮断解除が起こる。新たな＋５０ｍＶエピソードによって、再度ＤＮＡヘアピン結合およびポア遮断が起こる。＋５０ｍＶセグメントにおいて、ヘアピン構造のアンフォールディングによって、電流遮断の逆転によって示される電流遮断の終了が起こりうる。配列３’  ＧＣＧＧＧＧＡＧＣＧＴＡＴＴＡＧＡＧＴＴＧＧＡＴＣＧＧＡＴＧＣＡＧＣＴＧＧＣＴＡＣＴＧＡＣＧＴＣＡＴＧＡＣＧＴＣＡＧＴＡＧＣＣＡＧＣＡＴＧＣＡＴＣ  ＣＧＡＴＣ−５’（配列番号４４１）を有するヘアピンを最終濃度１０ｎＭで小室のシス側に添加した。
【実施例２２】
【０６６２】
本実施例は、変化した内部狭窄を有する変異体ＣｓｇＧポアの生成を記述する。
【０６６３】
本実施例において、狭窄ループにおける配列ＰＹＰＡ（残基５０〜５３）がＧＧに置換されている変異体ＣｓｇＧポアであるＣｓｇＧ−ΔＰＹＰＡに関して、安定性およびチャネル特性を証明する。この変異体に関して３８〜６３位の狭窄モチーフは、配列番号３５４に対応する。この変異は、ポアの読み取りヘッド、すなわちセンシング用途の際に測定される導電率が基質の結合またはポアの貫通の性質に対して最も感受性があるポアの最も狭い部分、の複雑さを低減するために、ポア狭窄からＹ５１の除去および狭窄ループの短縮を予見している。ＰＹＰＡ配列の置換は、ＣｓｇＧノナマーの安定性を保持し、図５７に示されるように導電率の増加を有するポアが得られる。
【０６６４】
ＣｓｇＧ−ΔＰＹＰＡポア変異体を、Ｎａｎｉｏｎ（Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のＯｒｂｉｔ  １６キットによる同時の高分解能電気的記録を使用する単一チャネル電流記録によって分析した。簡単に説明すると、１，２−ジフタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）の水平二重層を、１６−チャネルマルチ電極キャビティアレイ（ＭＥＣＡ）チップ（ｌｏｎｅｒａ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）５１においてマイクロキャビティ（ピコリットル容積以下の）の上に形成した。二重層の上および下のシスおよびトランスキャビティの両方が、１．０Ｍ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を含有した。チャネルを膜に挿入するために、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．５％Ｃ８Ｅ４、５ｍＭ  ＬＤＡＯに溶解したＣｓｇＧを、最終濃度１００ｎＭでシス区画に添加した。Ｈ膜通過電流を、Ｔｅｃｅｌｌａ  Ｔｒｉｔｏｎ  １６チャネル増幅器を使用して、ロウパスフィルタリング周波数３ｋＨｚおよびサンプリング周波数１０ｋＨｚで＋５０ｍＶおよび−５０ｍＶ（シス側を接地）の保持電位で記録した。電流のトレースをｐＣｌａｍｐスイート（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＵＳＡ）のＣｌａｍｐｆｉｔを使用して分析した。
【実施例２３】
【０６６５】
本実施例は、細菌アミロイド分泌チャネルＣｓｇＧに対する構造的および力学的洞察を記述する。
【０６６６】
Ｃｕｒｌｉは、バクテロイデス属（Bacteroidetes）およびプロテオバクテリア（Proteobacteria）（主にａおよびｃ綱）１〜３によって形成される菌膜バイオフィルムにおける細胞外マトリクスの主要なタンパク質成分を構成する機能的アミロイド線維である。これらは、病原性の株において適応度の利点をもたらし、細菌血症の際に強い炎症促進性応答を誘導する１，４，５。Ｃｕｒｌｉの形成は、外膜リポタンパク質ＣｓｇＧおよび２つの可溶性アクセサリタンパク質であるＣｓｇＥおよびＣｓｇＦ６，７を含む専用のタンパク質分泌機構を必要とする。本明細書において、本発明者らは、非脂質化可溶性型ならびにそのネイティブな膜抽出コンフォメーションの大腸菌（Escherichia coli）ＣｓｇＧのＸ線構造を報告する。ＣｓｇＧは、二重層を横切る３６ストランドのβ−バレルを生じて、周辺質のケージ様の前庭に接続される９個のアンチコドン結合ドメイン様単位で構成されるオリゴマー輸送複合体を形成する。膜貫通ドメインと周辺質ドメインとは、分泌ポアの中に細長いポリペプチド基質を誘導しうる、３つのスタックされた同心円のフェニルアラニン、アスパラギン、およびチロシン環で構成される０．９ｎｍのチャネル狭窄によって隔てられている。特異性因子ＣｓｇＥは、分泌チャネルの周辺質面に結合して閉じるノナマーアダプターを形成し、２４，０００Å３の狭窄前小室を作製する。本発明者らの構造、機能、および電気生理学分析は、ＣｓｇＧが、拡散に基づくエントロピー駆動性の輸送機構を用いると予想される無ゲートの非選択的タンパク質分泌チャネルであることを暗示している。
【０６６７】
Ｃｕｒｌｉは、アミロイド原線維の構造および物理的特徴を有する細菌表面付属器であり、ヒトの変性性疾患７〜９由来のものが最もよく知られている。しかし、ｃｕｒｌｉなどの細菌アミロイドの役割は、バイオフィルム形成を促進することである４、１０。タンパク質ミスフォールディングの産物である病原性のアミロイドとは異なり、ｃｕｒｌｉの形成は、２つの専用のオペロン、大腸菌（Escherichia coli）におけるｃｓｇＢＡＣ（ｃｕｒｌｉ特異的遺伝子ＢＡＣ）およびｃｓｇＤＥＦＧ（図４６)6,7においてコードされるタンパク質によって調整されている。分泌後、ＣｓｇＢは、ＣｓｇＡサブユニットの核を形成してｃｕｒｌｉ線維となる７，１１，１２。ＣｓｇＡおよびＣｓｇＢの分泌および細胞外沈着はそれぞれ、２つの可溶性アクセサリ因子であるＣｓｇＥおよびＣｓｇＦ、ならびに外膜に位置する２６２残基のリポタンパク質であるＣｓｇＧに依存する１３〜１６。加水分解可能なエネルギー源または外膜でのイオン勾配がないために、ＣｓｇＧは、代替のエネルギー賦活輸送機構を通して作動しなければならないタンパク質転位因子の特殊なクラスに分類される。構造モデルが不在であるため、ＣｓｇＧが生体膜を超えて調節された様式で非常に安定なアミロイド様の線維の分泌および集合をどのように促進するのかに関する動力学的研究はこれまで、不可解なままであった。
【０６６８】
外膜に挿入する前に、リポタンパク質は、リポタンパク質局在（Ｌｏｌ）経路１７によって周辺質を超えて誘導される。本発明者らは、ポア形成タンパク質および毒素で観察されるプレポア形態１８と類似の、可溶性の周辺質中間体として、非脂質化ＣｓｇＧ（ＣｓｇＧＣ１Ｓ）を単離できることを観察した。ＣｓｇＧＣ１Ｓは、別個のオリゴマー複合体の小さい分画に加えて、モノマーとして主に見出された（図４７）１９。可溶性のＣｓｇＧＣ１Ｓオリゴマーは、結晶化され、その構造は２．８Åであると決定され、テール−テール相互作用で結合した２つの環状オクタマー複合体（Ｃ８）からなる８回二平面対称性（Ｄ８）を有するヘキサデカマー粒子であることが判明した（図４７および図４６）。ＣｓｇＧＣ１Ｓプロトマーは、アミノおよびカルボキシ末端（それぞれ、αＮおよびαＣ、図４２および図４８ａ〜ｃ）で２つのα−ヘリックスと共に伸長するアンチコドン結合ドメイン（ＡＢＤ）様の折り畳みを示す。さらなるＣｓｇＧ特異的エレメントは、β１とα１とを連結する細長いループであり、ループにおける２つの挿入は、β３−β４およびβ５−α３と、隣接するモノマー間でのパッキングによってＣｓｇＧオリゴマー化に関係する細長いα２ヘリックスを接続する（図４２ｂ）。さらに、β３−β５シートの背部と細長いβ１−α１ループの間にプロトマー間の接点が形成される（図４８ｄ、ｅ）。
【０６６９】
ＣｓｇＧＣ１Ｓの構造において、α１をＮ−末端脂質アンカーに連結させる残基１〜１７は、無秩序であり、明白な膜貫通（ＴＭ）ドメインを識別することができない（図４２）。ＣｓｇＧＣ１Ｓおよびネイティブの膜抽出ＣｓｇＧの全反射測定フーリエ変換赤外分光法（ＡＴＲ−ＦＴＩＲ）は、膜抽出ＣｓｇＧがβシート領域（１，６２５〜１，６３０ｃｍ−１）においてより高い吸収を有すること、ならびにランダムコイルおよびα−ヘリカル領域（それぞれ、１，６４５〜１，６５０ｃｍ−１および１，６５６ｃｍ−１、図４３ａ）で同時に低減することを明らかにし、膜会合ＣｓｇＧがβ−バレルドメインを含有することを示唆している。β鎖形成の候補となる一連の配列は、β３−β４（残基１３４〜１５４）とβ５−α３（残基１８４〜２０４）とを接続する秩序化が不良な細長いループに見出された；これらが欠失すると、ｃｕｒｌｉ形成が失われた（図４３ｂ）。洗浄剤抽出ＣｓｇＧの結晶構造は、両方の領域のコンフォメーションの再配列により２つの隣接するβ−ヘアピンが形成され、β３−β４（ＴＭ１）およびβ５−α３（ＴＭ２）によって形成されるβシートを伸長させることを確認した（図４３ｃ）。ＣｓｇＧオリゴマーにおいてそれらが近接位置にあることにより、複雑な３６ストランドのβ−バレルを生じた（図４３ｄ）。結晶化されたＣｓｇＧＣ１ＳオリゴマーはＤ８対称性を示したが、ＣｓｇＧ構造はＤ９対称性を示し、ＣｓｇＧプロトマーは、中心軸に対して５°回転し、放射軸に沿って４Åの並進を除き、同等のプロトマー間接触を保持した（図４７）。この知見は、膜抽出ＣｓｇＧに関してＣ９およびＤ９対称性のみを見出した単粒子電子顕微鏡によって明らかとなった溶液中のオリゴマー状態と一致する（図４７）。非脂質化試料中にモノマーが主に存在すること、および膜結合タンパク質との対称性のミスマッチは、膜挿入の前に、ＣｓｇＧがモノマーのＬｏｌＡ−結合型で外膜を標的とすること、ならびにＣ８およびＤ８粒子がＣｓｇＧＣ１Ｓの高濃度溶液のアーチファクトであることを主張する。さらに、本発明者らは、単離された大腸菌（E.coli）外膜において、観察されたテール−テールダイマー形成に閉じ込められる残基をシステインに置換すると、マレイミドポリエチレングリコール（ＰＥＧ、５ｋＤａ；図４９）による標識に対してアクセス可能であることから、Ｄ９複合体ではなくてＣ９ノナマーが生理的に重要な粒子を形成することを示している。
【０６７０】
このため、ＣｓｇＧは、幅１２０Åで高さ８５Åのノナマー輸送複合体を形成する。複合体は、内径４０Åの３６ストランドのβバレルを通して外膜を横切る（図４３ｅ）。Ｎ−末端脂質アンカーは、隣接するプロトマーを包む１８残基のリンカーによってコアドメインから隔てられている（図４８ｄ）。Ｎ−末端Ｃｙｓにおけるジアシルグリセロールおよびアミド連結アシル鎖は、電子密度マップでは分解されていないが、Ｌｅｕ２の位置に基づいて、脂質アンカーは、β−バレルの外壁に隣接すると予想される。周辺質側では、トランスポーターは、ヘリックス２によって形成された５０Åの開口部を周辺質に開く、内径３５Åで高さ４０Åの溶媒アクセス可能な大きいキャビティを形成する（図４３ｅ）。その頂点において、この周辺質前庭は、β１とα１とを接続する保存された１２残基のループ（Ｃ−ループ；図４３ｅおよび４４ａ、ｂ）によってＴＭチャネルから隔てられており、これは分泌導管を９．０Åの溶媒除外直径へと狭窄する（図４４ａ、ｃ）。これらのポアの寸法は、残基５個が狭窄の高さに及ぶ１または２個の（例えば、ループ構造の）細長いポリペプチドセグメントの存在と適合する（図５０）。狭窄の管腔内層は、残基Ｔｙｒ５１、Ａｓｎ５５、およびＰｈｅ５６の側鎖によって形成された３つのスタックされた同心円の環で構成される（図４４ａ、ｂ）。炭疽菌ＰＡ６３毒素において、位相学的に同等の同心円のＰｈｅ環（Φ−クランプと呼ばれる）は、転位チャネルの入口に存在し、ポリペプチドの捕捉および通過を触媒する２０〜２２。ＣｓｇＧ様転位因子の多重配列アライメントは、Ｐｈｅ５６の絶対的な保存およびＡｓｎ５５のＳｅｒまたはＴｈｒへの保存的変化を示す（図５１）。Ｐｈｅ５６またはＡｓｎ５５からＡｌａへの変異によって、ｃｕｒｌｉ産生がほぼ失われるが（図４４ｄ）、Ａｓｎ５５からＳｅｒへの置換は、野生型の分泌レベルを保持し、Φ−クランプのスタックされた立体配置の後に、ＣｓｇＧ狭窄に水素結合ドナー／アクセプターが続く必要性を共に暗に示す（図４４ｂおよび図５１）。
【０６７１】
平面リン脂質二重層に再構成されたＣｓｇＧの単一チャネル電流記録によって、標準的な電解質条件および＋５０ｍＶまたは−５０ｍＶの電位を使用して、それぞれ４３．１±４．５ｐＡ（ｎ＝３３）または−４５．１±４．０ｐＡ（ｎ＝１３）の定常電流が得られた（図４４ｅ、ｆおよび図５２）。観察された電流は、単純な３セグメントポアモデルおよびＸ線構造で見られる中心狭窄の寸法に基づいて計算された４６．６ｐＡという予想される値と良好に一致した（図４４ｃ）。第二の低コンダクタンスコンフォメーションもまた、陰性電場電位で観察することができた（−２６．２±３．６ｐＡ（ｎ＝１３）；図５２）。しかし、この化学種が生理的条件で存在するか否かは不明である。
【０６７２】
本発明者らの構造データおよび単一チャネル記録は、ＣｓｇＧが無ゲートのペプチド拡散チャネルを形成することを暗示している。モデルペプチド拡散チャネルであるＰＡ６３において、ポリペプチドの通過は、転位チャネルにおける拡散ステップを調整するΔｐＨ駆動性のブラウンラチェットに依存する２０〜２２。しかし、そのようなプロトン勾配は、外膜には存在せず、代替の駆動力を必要とする。高濃度のＣｓｇＧは周辺質ポリペプチドの非選択的拡散的漏出を促進するが、分泌はネイティブ条件ではＣｓｇＡに特異的であり、周辺質因子ＣｓｇＥを必要とする１６，２３。過剰量のＣｓｇＥの存在下では、精製ＣｓｇＧは、ネイティブＰＡＧＥにおいてより遅く移動する化学種を形成する（図４５ａ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、この新しい化学種が、１：１の化学量論で存在するＣｓｇＧ−ＣｓｇＥ複合体からなることを示している（図４５ｂ）。プルダウンアフィニティ精製により単離されたＣｓｇＧ−ＣｓｇＥのクライオ電子顕微鏡（クライオ−ＥＭ）による可視化により、ＣｓｇＧノナマーに対応する９回対称粒子、ならびに単粒子ＥＭおよびサイズ排除クロマトグラフィーによっても同様に観察されたＣ９  ＣｓｇＥオリゴマーとサイズおよび形状が類似の、周辺質前庭の入口部でさらなるキャッピング密度が明らかとなった（図４５ｃ〜ｅ、および図５３）。観察されたＣｓｇＧ−ＣｓｇＥ接触界面の位置は、ＣｓｇＧヘリックス２における点突然変異を遮断することによって裏付けられた（図５３）。キャッピング機能と一致して、単一チャネル記録により、転位因子に対するＣｓｇＥの結合がそのイオンコンダクタンスの特異的サイレンシングを引き起こすことが示された（図４５ｆおよび図５２）。このＣｓｇＥによるチャネルのキャッピングは、ＣｓｇＥノナマー結合の関数において全か無かの応答であるように思われた。飽和すると、ＣｓｇＥ結合はチャネルの完全な遮断を誘導したが、約１０ｎＭでは、ＣｓｇＥ結合と解離事象との間の平衡によって、転位因子は、間欠的に遮断されるかまたは完全に開状態となった。１ｎＭまたはそれ未満では、モノマーＣｓｇＥとの短時間の遭遇により、一過性の（＜１ミリ秒）部分的遮断事象が起こりうる。
【０６７３】
このため、ＣｓｇＧおよびＣｓｇＥは、ＧｒｏＥＬシャペロニンおよびＧｒｏＥＳコシャペロニン２４で見出される、見たところ基質結合キャビティおよびカプセル化蓋構造を想起させる、約２４，０００Ａ３の中心キャビティを閉じ込めるケージ化複合体を形成するように思われる。ＣｓｇＧ−ＣｓｇＥの閉じ込めは、１２９残基のＣｓｇＡの完全なまたは部分的捕捉と適合性であろう。転位基質のケージ化は、最近、ＡＢＣ毒素で観察されている２５。アンフォールドされたポリペプチドの空間的拘束によって、そのコンフォメーション空間の減少が起こり、シャペロニンの場合のポリペプチドフォールディングにとって都合がよいことが示されているエントロピー電位を生じる２４，２６。同様に、本発明者らは、ｃｕｒｌｉの輸送において、ＣｓｇＧ前庭におけるｃｕｒｌｉサブユニットの局所的高濃度およびコンフォメーションの拘束によって、転位チャネルの上でエントロピー自由エネルギー勾配が生成されるであろうと推測する（図４５ｇ）。狭窄の中に捕捉されると、ポリペプチド鎖は、ＣｓｇＥ媒介拘束および／または分泌チャネル近傍の基質捕捉により生成されるエントロピー電位によって調整されるブラウン拡散によって、次第に外側へと移動すると予想される。プレ狭窄キャビティ内で完全に拘束されるためには、アンフォールドされた１２９残基のポリペプチドのバルク溶媒への逃避は、最大約８０ｋｃａｌ・ｍｏｌ−１（約３４０ｋＪ・ｍｏｌ−１；参考文献２７）のエントロピー自由エネルギー放出に対応するであろう。基質のドッキングおよび拘束に関する初回のエントロピーコストは、ＣｓｇＧ−ＣｓｇＥ−ＣｓｇＡ複合体の集合の際に放出される結合エネルギー、および周辺質でのすでに低下したＣｓｇＡエントロピーによって少なくとも部分的に代償される可能性がある。理論的見地から、ＣｓｇＡの分泌複合体への動員に関して可能性がある３つの経路を想定することができる（図５４）。
【０６７４】
Ｃｕｒｌｉ誘導バイオフィルムは、病原性の腸内細菌科（Enterobacteriaceae）において適応度およびビルレンス因子を形成する４，５。その独自の分泌および集合特性はまた、（生物）工学応用に関する関心が急速に得つつある２３，２８，２９。２つの重要な分泌成分に関する本発明者らの構造の特徴づけおよび生化学試験は、加水分解可能なエネルギー源、膜電位またはイオン勾配の不在下でのアンフォールドされたタンパク質基質の膜転位のための反復機構の暫定モデルを提供する（図４５ｅおよび図５４）。提唱される分泌モデルに関与する要因の完全なバリデーションおよび脱構築は、輸送の動力学を正確に１分子レベルで追跡するために転位因子のインビトロ再構成を必要とするであろう。
【０６７５】
方法
クローニングおよび株。外膜局在Ｃ−末端ＳｔｒｅｐＩＩ−タグＣｓｇＧ（ｐＰＧ１）および周辺質のＣ−末端ＳｔｒｅｐＩＩタグＣｓｇＧＣ１Ｓ（ｐＰＧ２）を産生するための発現構築物は、参考文献１９に記述されている。セレノメチオニン標識の場合、収量を増加させるために、ＳｔｒｅｐＩＩタグＣｓｇＣ１Ｓを細胞質で発現させた。したがって、プライマー５’−ＴＣＴＴＴＡＡＣＣＧＣＣＣＣＧＣＣＴＡＡＡＧ−３’（フォワード）および５’−ＣＡＴＴＴＴＴＴＧＣＣＣＴＣＧＴＴＡＴＣ−３’（リバース）（ｐＰＧ３）による逆転写ＰＣＲを使用してＮ−末端シグナルペプチドを除去するようにｐＰＧ２を変化させた。表現型アッセイの場合、大腸菌（E.coli）ＢＷ２５１４１（大腸菌（E.coli）ＮＶＧ２）のｃｓｇＧ欠失変異体を、参考文献３０に記載される方法によって構築した（プライマー５’−ＡＡＴＡＡＣＴＣＡＡＣＣ  ＧＡＴ  ＴＴＴ  ＴＡＡ  ＧＣＣ  ＣＣＡ  ＧＣＴ  ＴＣＡ  ＴＡＡ  ＧＧＡ  ＡＡＡ  ＴＡＡ  ＴＣＧ  ＴＧＴ  ＡＧＧ  ＣＴＧ  ＧＡＧ  ＣＴＧ  ＣＴＴ  Ｃ−３’および５’−ＣＧＣ  ＴＴＡ  ＡＡＣ  ＡＧＴ  ＡＡＡ  ＡＴＧ  ＣＣＧ  ＧＡＴ  ＧＡＴ  ＡＡＴ  ＴＣＣ  ＧＧＣ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＡＴＣ  ＴＧＣ  ＡＴＡ  ＴＧＡ  ＡＴＡ  ＴＣＣ  ＴＣＣ  ＴＴＡ  Ｇ−３’によって）。Ｃｙｓアクセス可能性アッセイおよびチャネル狭窄の表現型プロービングのために使用する様々なＣｓｇＧ置換変異体を、ｔｒｃプロモーターの制御下でｃｓｇＧを含有するｐＴＲＣ９９ａベクター１４であるｐＭＣ２から開始する部位特異的変異誘発（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅプロトコール；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によって構築した。
【０６７６】
タンパク質発現および精製。ＣｓｇＧおよびＣｓｇＧＣ１Ｓを、記述のように発現させて精製した１９。簡単に説明すると、ＣｓｇＧを、ｐＰＧ１で形質転換した大腸菌（E.coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）において組み換えにより産生させ、単離された外膜から、緩衝液Ａ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ））中で１％ｎ−ドデシル−ｂ−Ｄ−マルトシド（ＤＤＭ）を使用して抽出した。ＳｔｒｅｐＩＩタグＣｓｇＧを５ｍｌ  Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（Ｉｂａ  ＧｍｂＨ）にロードして、０．５％テトラエチレングリコールモノオクチルエーテル（Ｃ８Ｅ４；Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）および４ｍＭラウリルジメチルアミン−Ｎ−オキシド（ＬＤＡＯ；Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を補充した緩衝液Ａの２０カラム容積で洗浄することによって洗浄剤を交換した。２．５ｍＭ  Ｄ−デスチオビオチンを添加してタンパク質を溶出させて、結晶化実験のために５ｍｇ・ｍｌ−１に濃縮した。セレノメチオニン標識に関して、ＣｓｇＧＣ１Ｓを、ｐＰＧ３で形質転換したＭｅｔ栄養素要求株Ｂ８３４（ＤＥ３）において産生させて、４０ｍｇ・ｌ−１Ｌ−セレノメチオニンを補充したＭ９最少培地で増殖させた。細胞ペレットを、ｃＯｍｐｌｅｔｅプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を補充した５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＤＴＴに懸濁させて、２０×１０３ｌｂ・ｉｎ−２で作動するＴＳシリーズ細胞破砕装置（Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌｔｄ）の中を通過させて破砕した。標識されたＣｓｇＧＣ１Ｓを、記述されるように精製した１９。セレノメチオニンの酸化を防止するために、精製手順を通してＤＴＴ（５ｍＭ）を添加した。
【０６７７】
ＣｓｇＥを、ｐＮＨ２７を有する大腸菌（E.coli）ＮＥＢ２５６６細胞において産生させた（参考文献１６）。２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭイミダゾール、５％（容量／容量）グリセロール中の細胞溶解物をＨｉｓＴｒａｐ  ＦＦ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。ＣｓｇＥ−ｈｉｓを、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５％（容量／容量）グリセロール緩衝液中で５００ｍＭイミダゾールへの直線勾配によって溶出した。ＣｓｇＥを含有する分画に２５０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４を補充して、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、５％（容量／容量）グリセロールで平衡にした５ｍｌ  ＨｉＴｒａｐ  Ｐｈｅｎｙｌ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、５％（容量／容量）グリセロールへの直線勾配を、溶出のために適用した。ＣｓｇＥ含有分画を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５容量％グリセロールで平衡にしたＳｕｐｅｒｏｓｅ  ６  Ｐｒｅｐ  Ｇｒａｄｅ  １０／６００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムにロードした。
【０６７８】
溶液中のオリゴマー化状態の評価。洗浄剤可溶化ＣｓｇＧ（０．５％Ｃ８Ｅ４、４ｍＭ  ＬＤＡＯ）およびＣｓｇＧＣ１Ｓのそれぞれ約０．５ｍｇを、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、４ｍＭ  ＬＤＡＯ、および０．５％Ｃ８Ｅ４（ＣｓｇＧ）または２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、２００ｍＭ  ＮａＣｌ（ＣｓｇＧＣ１Ｓ）によって平衡にしたＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／  ３００  ＧＬ分析的ゲルろ過カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用して、０．７ｍｌ・分−１で実験した。カラムの溶出体積をウシサイログロブリン、ウシγ−グロブリン、ニワトリ卵アルブミン、ウマミオグロビンおよびビタミンＢ１２（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって較正した（図４７）。膜抽出ＣｓｇＧ、洗浄剤可溶化タンパク質２０ｍｇも同様に、参考文献３１に記述される手順を使用して３〜１０％ブルーネイティブＰＡＧＥで泳動させた（図４７）。ＮａｔｉｖｅＭａｒｋ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）未染色タンパク質標準物質（７ｍｌ）を分子量推定のために使用した。
【０６７９】
結晶化、データ収集、および構造の決定。セレノメチオニン標識ＣｓｇＧＣ１Ｓを３．８ｍｇ・ｍｌ−１に濃縮して、１００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．２、８％ＰＥＧ４０００、および１００ｍＭマロン酸ナトリウムｐＨ７．０を含有する溶液に対して、シッティングドロップ蒸気拡散によって結晶化した。結晶を、１５％グリセロールを補充した結晶化緩衝液中でインキュベートして、液体窒素中で急速凍結した。洗浄剤可溶化ＣｓｇＧを５ｍｇ・ｍｌ−１に濃縮して、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、８％ＰＥＧ４０００、１００ｍＭ  ＮａＣｌおよび５００ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有する溶液に対してハンギングドロップ蒸気拡散によって結晶化した。結晶を液体窒素中で急速凍結して、結晶化溶液中に存在する洗浄剤によって凍結保護した。結晶条件の最適化および良好な回折品質を有する結晶に関するスクリーニングのために、結晶をｂｅａｍｌｉｎｅｓ  Ｐｒｏｘｉｍａ−１およびＰｒｏｘｉｍａ−２ａ（Ｓｏｌｅｉｌ、Ｆｒａｎｃｅ）、ＰＸ−Ｉ（Ｓｗｉｓｓ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｉ０２、Ｉ０３、Ｉ０４、およびＩ２４（Ｄｉａｍｏｎｄ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅ、ＵＫ）、ならびにＩＤ１４ｅｈ２、ＩＤ２３ｅｈ１、およびＩＤ２３ｅｈ２（ＥＳＲＦ、Ｆｒａｎｃｅ）で分析した。ＣｓｇＧＣ１ＳおよびＣｓｇＧの構造決定のために使用する最終的な回折データをそれぞれ、ｂｅａｍｌｉｎｅｓ  Ｉ０４およびＩ０３で収集した（データ収集および精密化統計値に関しては図５５ａを参照されたい）。ＣｓｇＧＣ１Ｓの回折データをＸｉａ２およびＸＤＳパッケージを使用して処理した３２，３３。ＣｓｇＧＣ１Ｓの結晶は、非対称単位にタンパク質１６コピーを含有する、単位格子寸法ａ＝１０１．３Å、ｂ＝１０３．６Å、ｃ＝１４１．７Å、α＝１１１．３°、β＝９０．５°、γ＝１１８．２°の空間群Ｐ１に属した。構造の決定および精密化のために、波長０．９７９５Åで収集したデータを、最高分解能シェルにおいて２の｜／δ｜カットオフに基づいて２．８Åで切り捨てた。単波長異常分散（ＳＡＤ）実験から計算した実験的位相を使用して構造を分解した。全体で９２個のセレン部位が、ＳｈｅｌｘＣおよびＳｈｅｌｘＤ３４を使用して非対称単位に位置づけられ、これを精密化して、Ｓｈａｒｐ３５による位相計算（フェージングパワー０．７９、性能指数（ＦＯＭ）０．２５）のために使用した。実験的位相を密度修正して、Ｐａｒｒｏｔ３６（図５５；ＦＯＭ０．８５）を使用して非結晶学的対称性（ＮＣＳ）によって平均した。最初のモデルは、Ｂｕｃｃａｎｅｅｒ３７が構築して、Ｐｈｅｎｉｘ  ｒｅｆｉｎｅ３８による最尤推定精密化の数ラウンドおよび手動精査、ならびにＣｏｏｔ３９におけるモデル（再）構築によって精密化した。最終構造は、１６ＣｓｇＧＣ１Ｓ鎖に属する３，７００個の残基中に原子２８，８５３個を含有し（図４７）、ｍｏｌｐｒｏｂｉｔｙ４０スコアは１．３４であった；残基の９８％がＲａｍａｃｈａｎｄｒａｎプロットの好ましい領域（許容領域の９９．７％）に存在する。電子密度マップは、可能な溶媒分子に対応する明白な密度を示さず、したがって水分子またはイオンは含まれなかった。精密化の初期および後期ステージでそれぞれ、厳密およびローカルＮＣＳ制限を使用して、精密化を通して１６回のＮＣＳ平均化を維持した。
【０６８０】
ＣｓｇＧの回折データを、波長０．９７６３Åで単結晶から収集して、ＸＤＳパッケージ３２，３３を使用して、非対称単位にＣｓｇＧ１８コピーおよび７２％溶媒含有量を包含する、単位格子寸法ａ＝１６１．７Å、ｂ＝３７２．３Å、ｃ＝１６１．８Å、およびβ＝９２．９°の空間群Ｃ２に指数化およびスケーリングした。構造決定および精密化のための回折データを、逆格子方向ａ＊、ｂ＊、およびｃ＊に沿って３．６Å、３．７Å、および３．８Åの分解能限界となるように楕円形に切り捨てて、Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  Ａｎｉｓｏｔｒｏｐｙ  Ｓｅｒｖｅｒ４１によって異方性にスケーリングした。ＣｓｇＧＣ１Ｓモノマーを使用する分子置換は成功しなかった。自己回転関数の分析により、非対称単位におけるＤ９対称性が明らかとなった（示していない）。ＣｓｇＧＣ１Ｓの構造に基づいて、Ｃ８からＣ９オリゴマーに移行した後、粒子周囲でのプロトマー間アークは、４５°から４０°まで変化したプロトマー間角とほぼ同じままであり、半径が計算上約４Å増加すると仮定して、ノナマー検索モデルを作成した。検索モデルとして計算されたノナマーを使用して、２コピーを含有する分子置換の解が、Ｐｈａｓｅｒ４２によって見出された。密度修正およびＮＣＳ平均電子密度マップの精査（Ｐａｒｒｏｔ３６、図５５）により、ＴＭ１およびＴＭ２の手動での構築ならびにタンパク質コアにおける隣接残基のリモデリング、ならびにＣｓｇＧＣ１Ｓモデルでは失われており、Ｎ−末端脂質アンカーにα１ヘリックスを結合させる残基２〜１８の構築が可能となった。ＣｓｇＧモデルの精密化を、初回および最終精密化ラウンドにおいてそれぞれ、Ｂｕｓｔｅｒ−ＴＮＴ４３およびＲｅｆｍａｃ５（参考文献４４）によって行った。精密化を通して１８回のローカルＮＣＳ制限を適用し、Ｒｅｆｍａｃ５を、シグマ０．０１によるゼリーボディ精密化およびＰｒｏｓｍａｒｔ４５によって生成された水素結合制限を用いて実行した。最終構造は、１８ＣｓｇＧ鎖に属する４，４５１個の残基中に３４，１６５個の原子を含有し（図４７）、ｍｏｌｐｒｏｂｉｔｙスコアは２．７９であり、残基の９３．０％がＲａｍａｃｈａｎｄｒａｎプロットの好ましい領域（許容領域の９９．３％）に存在する。Ｎ−末端脂質アンカーに対応する明白な電子密度は識別できなかった。
【０６８１】
コンゴーレッドアッセイ。コンゴーレッド結合の分析に関して、Ｌｙｓｏｇｅｎｙブロス（ＬＢ）中、３７℃で増殖させた細菌の一晩培養物を、Ｄ６００が０．５に達するまでＬＢ培地で希釈した。試料５μｌを、アンピシリン（１００ｍｇ・ｌ−１）、コンゴーレッド（１００ｍｇ・ｌ−１）、および０．１％（重量／容量）イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を補充したＬＢアガープレートにスポットした。プレートを室温（２０〜２２℃）で４８時間インキュベートして、ｃｕｒｌｉ発現を誘導した。コロニー形態の発生および色素結合を４８時間観察した。
【０６８２】
システインアクセス可能性アッセイ。システイン変異体を、部位特異的変異誘発を使用してｐＭＣ２において作製し、大腸菌（E.coli）ＬＳＲ１２において発現させた（参考文献７）。一晩増殖させた細菌培養物を、１ｍＭ  ＩＰＴＧおよび１００ｍｇ・ｌ−１アンピシリンを含有するＬＢアガープレートにスポットした。プレートを室温でインキュベートして、細胞を４８時間後に擦り取り、ＰＢＳ  １ｍｌに懸濁させて、Ｄ６００を使用して標準化した。細胞を超音波処理によって溶解して、４℃、３，０００ｇで２０秒間遠心分離して、非破砕細胞を細胞溶解物から除去して、膜を懸濁させた。上清中のタンパク質を１５ｍＭメトキシポリエチレングリコール−マレイミド（ＭＡＬ−ＰＥＧ、５ｋＤａ）によって室温で１時間標識した。１００ｍＭ  ＤＴＴによって反応を停止させて、５０．４  Ｔｉローターにおいて４℃、４０，０００ｒ．ｐ．ｍ．（約１００，０００ｇ）で２０分間遠心分離して、全ての膜をペレットにした。ペレットを１％ラウロイルサルコシン酸ナトリウムで洗浄して、細胞膜を可溶化し、再度遠心分離した。得られた外膜を、１％ＤＤＭを含有するＰＢＳを使用して再懸濁させて可溶化した。ニッケルビーズによる金属親和性プルダウンをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗Ｈｉｓウェスタンブロットのために使用した。空のｐＭＣ２ベクターを有する大腸菌（E.coli）ＬＳＲ１２細胞を、陰性対照として使用した。
【０６８３】
ＡＴＲ−ＦＴＩＲ分光法。ＡＴＲ−ＦＴＩＲ測定を、液体窒素冷蔵テルル化カドミウム水銀検出器およびＧｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ反射測定用アクセサリ（Ｓｐｅｃａｃ）を備えたＥｑｕｉｎｏｘ  ５５赤外線分光光度計（Ｂｒｕｋｅｒ）において、乾燥空気で絶えずパージながら実施した。内部反射測定用元素はダイヤモンド結晶（２ｍｍ×２ｍｍ）であり、ビーム入射角は４５°であった。各精製タンパク質試料（１μｌ）を結晶表面に広げて気体窒素流下で乾燥させて被膜を形成させた。分解能２ｃｍ−１で記録された各スペクトルは、シグナル対ノイズ比を改善するための積算処理が平均で１２８回であった。スペクトルは全て水蒸気の関与を差し引いて処理し、アポダイゼーションによって最終分解能４ｃｍ−１で平滑化して、アミドＩバンド（１，７００〜１，６００ｃｍ−１）の領域で標準化して、その比較を行った４６。
【０６８４】
ネガティブ染色ＥＭおよび対称性の決定。ネガティブ染色ＥＭを使用して、ＣｓｇＧ、ＣｓｇＧＣ１ＳおよびＣｓｇＥの溶液中のオリゴマー化状態をモニターした。ＣｓｇＥ、ＣｓｇＧＣ１Ｓ、およびａｍｐｈｉｐｏｌ結合ＣｓｇＧを０．０５ｍｇ・ｍｌ−１の濃度に調節して、グロー放電カーボンコーティング銅グリッド（ＣＦ−４００；Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に適用した。１分間インキュベートした後、試料をブロットして、次いで洗浄および２％酢酸ウラニルで染色した。画像を、電圧１２０ｋＶで作動するＴｅｃｎａｉ  Ｔ１２  ＢｉｏＴＷＩＮ  ＬａＢ６顕微鏡で、倍率４９，０００倍および８００〜２，０００ｎｍの間のデフォーカスにより収集した。コントラスト伝達関数（ＣＴＦ）、位相フリッピングおよび粒子選択を、クライオ−ＥＭに関して記述したように実施した。膜抽出ＣｓｇＧに関して、オクタデカマー粒子（全体で１，７８０個）を、ノナマーおよび上面図から個別に分析した。精製ＣｓｇＥに関して、全体で２，４５２個の粒子を分析した。以下のＣｓｇＧ−ＣｓｇＥクライオ−ＥＭ分析に記述されるように三次元モデルを得て、数ラウンドの多重参照配列アライメント（ＭＲＡ）、多重統計分析（ＭＳＡ）、およびアンカーセット精密化によって精密化した。全ての場合において、標準化および中心化後、クライオ−ＥＭ選択に記述されるようにＩＭＡＧＩＣ−４Ｄを使用して画像を分類した。特徴的な図面に対応する最善のクラスを各セットの粒子に関して選択した。ＣｓｇＧ上面図の対称性の決定は、クラスあたりほぼ２０個の画像を使用して最善のクラス平均を使用して実施した。回転方向の自己相関関数を、ＩＭＡＧＩＣを使用して計算し、プロットした。
【０６８５】
ＣｓｇＧ−ＣｓｇＥ複合体の形成。ＣｓｇＧ−ＣｓｇＥ複合体形成に関して、精製ＣｓｇＧ中の可溶化洗浄剤を、ＣｓｇＧ（０．５％Ｃ８Ｅ４、４ｍＭ  ＬＤＡＯ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ中に２４ｍｇ・ｍｌ−１タンパク質）１２０μｌを洗浄剤脱安定化リポソーム（１ｍｇ・ｍｌ−１の１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）および０．４％ＬＤＡＯ）３００μｌに添加し、氷上で５分間インキュベートした後、１００ｍｇ・ｍｌ−１保存液にＡ８−３５  ａｍｉｐｈｉｐｏｌｓ  ９０ｍｌを添加することによって、Ａｍｐｈｉｐｏｌｓ  Ａ８−３５（Ａｎａｔｒａｃｅ）に交換した。氷上でさらに１５分間インキュベートした後、試料をＳｕｐｅｒｏｓｅ  ６  １０／３００  ＧＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムにロードして、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５％キシリトール、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８、０．２ｍＭ  ＤＴＴ中でゲルろ過を行った。２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５％キシリトール、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８、０．２ｍＭ  ＤＴＴ中での精製モノマーＣｓｇＥの等量を、ａｍｐｈｉｐｏｌ可溶化ＣｓｇＧに、ＣｓｇＥおよびＣｓｇＧに関してそれぞれ最終タンパク質濃度１５および５μＭで添加して、試料を４．５％ネイティブＰＡＧＥにおいて０．５×ＴＢＥ緩衝液中で１２５Ｖ、１８℃で泳動させた。二次元変性の場合、ＣｓｇＧ−ＣｓｇＥ複合体に対応するバンドを、同じゲルで同時に泳動させた未染色レーンから切り出して、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．８、２％ＳＤＳ、１０％グリセロール、５％２−メルカプトエタノール、０．０１％ブロモフェノールブルー）中で５分間沸騰させて、４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動させた。精製ＣｓｇＥおよびＣｓｇＧを対照試料として複合体と共に泳動させた。ゲルを視覚的に調べるためにＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ  Ｃｏｏｍａｓｓｉｅによって、またはＳＤＳ−ＰＡＧＥ上のＣｓｇＥおよびＣｓｇＧバンドの蛍光検出（Ｔｙｐｈｏｏｎ  ＦＬＡ  ９０００）によるＣｓｇＧ−ＣｓｇＥ複合体の化学量論的評価のためにＳＹＰＲＯオレンジによって染色し、ＣｓｇＧ／ＣｓｇＥ比０．９７を得た。
【０６８６】
ＣｓｇＧ−ＣｓｇＥクライオ−ＥＭ。クライオ電子顕微鏡を使用して、Ｃ９  ＣｓｇＧ−ＣｓｇＥ複合体の溶液中の構造を決定した。上記のように調製したＣｓｇＧ−ＣｓｇＥ複合体を、ＨｉｓＴｒａｐ  ＦＦ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に結合させて溶出し、未結合ＣｓｇＧを除去して、溶出後直ちに、２０ｍＡで３０秒間グロー放電されているＱｕａｎｔｉｆｏｉｌ  Ｒ２／２カーボンコーティンググリッド（Ｑｕａｎｔｉｆｏｉｌ  Ｍｉｃｒｏ  Ｔｏｏｌｓ  ＧｍｂＨ）に適用した。試料を、自動システム（Ｌｅｉｃａ）を使用して液体窒素中で瞬間凍結し、電圧２００ｋＶで作動するＦＥＩ  Ｆ２０顕微鏡下で、低用量条件下で名目上の倍率５０，０００倍、および１．４〜３μｍのデフォーカス範囲で観察した。画像フレームをＦａｌｃｏｎ  ＩＩ検出器で記録した。標本レベルのピクセルサイズはピクセルあたり１．９Åであった。ＣＴＦパラメータを、ＣＴＦＦＩＮＤ３（参考文献４７）を使用して評価して、位相フリッピングをＳＰＩＤＥＲ４８で実施した。粒子を、ＢＯＸＥＲ（ＥＭＡＮ２、参考文献４９）を使用してＣＴＦ補正顕微鏡写真から自動的に選択した。１０％を超える非点収差を有する画像を破棄した。全体で１，２２１個の粒子を７５個の顕微鏡写真から選択して、１２８ピクセル×１２８ピクセルのボックスにウィンドウ化した。画像を同じ平均値および標準偏差に標準化して、約２００Åの低分解能カットオフでハイパスフィルターを通過させた。これらを中心化した後、第一ラウンドのＭＳＡに供した。最初の参照物質の組を、ＩＭＡＧＩＣ−４Ｄ（Ｉｍａｇｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）における参照物質なしの分類を使用して得た。Ｃ９円柱粒子の特徴的な側面図に対応する最善のクラスをＭＲＡの参照物質として使用した。ＣｓｇＧ−ＣｓｇＥ複合体に関して、最初の三次元モデルを、複合体粒子１，２２１個を包含する最善の１２５個の特徴的な図面（良好なコントラストおよび良好に定義された特徴を有する）から計算して、角度の再構成によって方向を決定した（Ｉｍａｇｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）。ＭＲＡ、ＭＳＡ、およびアンカーセット精密化の繰り返しラウンドによって三次元マップを精密化した。分解能は、０．５基準レベルに従ってフーリエシェル相関（ＦＳＣ）によって２４Åであると推定された（図５２）。マップおよび図面の可視化は、ＵＣＳＦ  Ｃｈｉｍｅｒａ５０において実施した。
【０６８７】
胆汁酸塩毒性アッセイ。胆汁酸塩を含有するアガープレートでの増殖の減少によって外膜透過性を調べた。ｐＬＲ４２（参考文献１６）およびｐＭＣ２（参考文献１４）（または誘導されたヘリックス２変異体）の両方を有する大腸菌（E.coli）ＬＳＲ１２（参考文献７）細胞の１０倍連続希釈液（５μｌ）を、１００μｇ・ｌ−１アンピシリン、２５μｇ・ｌ−１クロラムフェニコール、１ｍＭ  ＩＰＴＧを含有し、０．２％（重量／容量）Ｌ−アラビノースを含むまたは含まないＭｃＣｏｎｋｅｙアガープレートにスポットした。３７℃で一晩インキュベートした後、コロニーの増殖を調べた。
【０６８８】
単一チャネル電流記録。単一チャネル電流記録を、ＮａｎｉｏｎのＯｒｂｉｔ  １６キットによる平行高解像電気的記録を使用して行った。簡単に説明すると、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）の水平二重層を、１６チャネルマルチ電極キャビティアレイ（ＭＥＣＡ）チップ（ｌｏｎｅｒａ）５１の（ピコリットル容積以下の）マイクロキャビティ上に形成した。二重層の上および下のシスおよびトランスキャビティはいずれも、１．０Ｍ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０を含有した。チャネルを膜に挿入するために、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．５％Ｃ８Ｅ４、５ｍＭ  ＬＤＡＯに溶解したＣｓｇＧをシス区画に最終濃度９０〜３００ｎＭとなるように添加した。ＣｓｇＧチャネルとＣｓｇＥとの相互作用を試験するために、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌに溶解したＣｓｇＥタンパク質溶液をシス区画に最終濃度０．１、１、１０、および１００ｎＭで添加した。膜通過電流を、Ｔｅｃｅｌｌａ  Ｔｒｉｔｏｎ  １６−チャネル増幅器を使用して、ロウパスフィルタリング周波数３ｋＨｚおよびサンプリング周波数１０ｋＨｚで＋５０ｍＶおよび−５０ｍＶ（シス側を接地した）の保持電位で記録した。電流のトレースをｐＣｌａｍｐスイートのＣｌａｍｐｆｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して分析した。プロットをＯｒｉｇｉｎ  ８．６（Ｍｉｃｒｏｃａｌ）５２を使用して作製した。
【０６８９】
測定された電流を、３つのセグメント、膜貫通区分、周辺質前庭、および両者を接続する内部チャネル狭窄で構成されるようにモデル化したＣｓｇＧのＸ線構造のポア寸法に基づいて計算された電流と比較した。最初の２つのセグメントは円錐形状のセグメントとなるようにモデル化された。狭窄を円柱として表した。対応する抵抗Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３をそれぞれ、以下のように計算した：
Ｒ１＝Ｌ１／（πＤ１ｄ１κ）
Ｒ２＝Ｌ２／（πＤ２ｄ２κ）
Ｒ３＝Ｌ３／（πＤ１ｄ２κ）
式中、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３はセグメントの軸方向の長さであり、それぞれ、３．５、４．０、および２．０ｎｍであると測定され、Ｄ１、ｄ１、Ｄ２、およびｄ３は、セグメント１および２の最大および最小直径であり、それぞれ４．０、０．８、３．４、および０．８ｎｍであると測定された。導電率κは、１０．６Ｓｍ−１の値を有する。電流は、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３ならびに電圧Ｖ＝５０ｍＶを
Ｉ＝Ｖ／（Ｒ１＋Ｒ２＋Ｒ３）
に代入することによって計算された。
アクセス抵抗性は予想電流を有意に変化させないことが見出された。
【０６９０】
参考文献
【０６９１】
【表９−１】
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【０６９２】
【表９−２】
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【０６９３】
【表９−３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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