(57)【要約】本発明は、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ４−５モジュールに特異的に結合する抗体を提供する。当該抗体は、がんまたは腫瘍細胞若しくは組織を選択的に染色できる。当該抗体は、がんを検出し、がん療法の効果を評価し、がんを治療し、及びその他の応用の中で特に、肥満または肥満関連疾患を治療するために使用できる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラミニンα４のＧドメインのＬＧ４−５モジュール内のエピトープに、特異的に結合する抗体。
【請求項２】
ラミニンα４のＭＣＡＭへの結合を阻害しない、請求項１に記載の前記抗体。
【請求項３】
ＬＧ４内のエピトープに結合する、請求項１に記載の前記抗体。
【請求項４】
ＬＧ５内のエピトープに結合する、請求項１に記載の前記抗体。
【請求項５】
ＬＧ４及びＬＧ４が寄与している残基の両方へのエピトープに結合する、請求項１に記載の前記抗体。
【請求項６】
ラミニンα４のヘパラン硫酸プロテオグリカンへの結合を阻害する、請求項１に記載の前記抗体。
【請求項７】
前記ヘパラン硫酸プロテオグリカンが、シンデカン−１である、請求項６に記載の前記抗体。
【請求項８】
前記ヘパラン硫酸プロテオグリカンが、シンデカン−２である、請求項６に記載の前記抗体。
【請求項９】
前記ヘパラン硫酸プロテオグリカンが、シンデカン−３である、請求項６に記載の前記抗体。
【請求項１０】
前記ヘパラン硫酸プロテオグリカンが、シンデカン−４である、請求項６に記載の前記抗体。
【請求項１１】
前記ヘパラン硫酸プロテオグリカンが、グリピカン、ベータグリカン、ＣＤ４４、パールカン、アグリン、またはＸＶＩＩＩ型コラーゲンである、請求項６に記載の前記抗体。
【請求項１２】
対照サンプルと比較した場合、がん細胞を含む生体サンプルと選択的に結合する、請求項１に記載の前記抗体。
【請求項１３】
前記対照サンプル及び前記生体サンプルが、同じ組織起源の細胞を含む、請求項１２に記載の前記抗体。
【請求項１４】
前記抗体の前記生体サンプルへの結合が、前記抗体の前記対照サンプルへの結合に比べて、少なくとも２倍大きい、請求項１２または１３に記載の前記抗体。
【請求項１５】
前記抗体の前記生体サンプルへの結合が、前記抗体の前記対照サンプルへの結合に比べて、少なくとも５倍大きい、請求項１２または１３に記載の前記抗体。
【請求項１６】
前記がん細胞が、黒色腫細胞を含む、請求項１２から１５のいずれか１項に記載の前記抗体。
【請求項１７】
配列番号１６の成熟した重鎖可変領域及び配列番号１７の成熟した軽鎖可変領域により特徴づけられる抗体１５Ｆ７、若しくは配列番号２６の成熟した重鎖可変領域及び配列番号２７の成熟した軽鎖可変領域により特徴づけられる抗体６Ｃ１２、または配列番号３６または３７の成熟した重鎖可変領域及び配列番号３８の成熟した軽鎖可変領域により特徴づけられる抗体１３Ｇ１０と競合する、請求項１に記載の前記抗体。
【請求項１８】
１５Ｆ７、６Ｃ１２、または１３Ｇ１０と、ラミニンα４上の同じエピトープに結合する、請求項１に記載の前記抗体。
【請求項１９】
各ＣＤＲが、１５Ｆ７の（各々配列番号１６及び１７）、６Ｃ１２の（各々配列番号２６及び２７）、または１３Ｇ１０の（各々配列番号３６／３７及び３８）重鎖及び軽鎖可変領域由来の相応するＣＤＲと、少なくとも９０％の配列同一性を有する、３つの軽鎖ＣＤＲ及び３つの重鎖ＣＤＲを含む、請求項１に記載の前記抗体。
【請求項２０】
１５Ｆ７、６Ｃ１２、または１３Ｇ１０の３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む、請求項１に記載の前記抗体。
【請求項２１】
モノクローナル抗体である、請求項１から２０または８８から８９のいずれか１項に記載の前記抗体。
【請求項２２】
キメラ、ヒト化、バーニア化、またはヒト抗体である、請求項１から２１または８８から８９のいずれか１項に記載の前記抗体。
【請求項２３】
ヒトＩｇＧ１カッパのアイソタイプを有する、請求項１から２２または８８から８９のいずれか１項に記載の前記抗体。
【請求項２４】
１５Ｆ７が、配列番号１６の成熟した重鎖可変領域及び配列番号１７の成熟した軽鎖可変領域により特徴づけられるマウス抗体である、ラミニンα４へ特異的に結合するヒト化またはキメラ１５Ｆ７抗体。
【請求項２５】
１５Ｆ７重鎖可変領域（配列番号１６）の３つのＣＤＲを含むヒト化重鎖及び１５Ｆ７軽鎖可変領域（配列番号１７）の３つのＣＤＲを含むヒト化軽鎖を含む、請求項２４に記載の前記ヒト化抗体。
【請求項２６】
配列番号５８に少なくとも９０％の配列同一性であるアミノ酸配列を有する成熟したヒト化重鎖可変領域及び配列番号５９に少なくとも９０％の配列同一性であるアミノ酸配列を有する成熟したヒト化軽鎖可変領域を含む、請求項２４に記載の前記ヒト化抗体。
【請求項２７】
１５Ｆ７重鎖可変領域（配列番号１６）の３つのＣＤＲを含むヒト化重鎖及び１５Ｆ７軽鎖可変領域（配列番号１７）の３つのＣＤＲを含むヒト化軽鎖を含む、請求項２６に記載の前記ヒト化抗体。
【請求項２８】
Ｌ４２、Ｌ４９、及びＬ６９が、各々Ｎ、Ｓ、及びＫによって占められる位置の、少なくとも１つを、及びＨ１、Ｈ２０、Ｈ２７、Ｈ３０、Ｈ３８、Ｈ４０、Ｈ４８、Ｈ６６、Ｈ６７、Ｈ７５、Ｈ８２Ａ、及びＨ９１が、各々Ｅ、Ｌ、Ｙ、Ｔ、Ｋ、Ｒ、Ｉ、Ｋ、Ａ、Ｓ、Ｒ、及びＦによって占められる位置の、少なくとも１つを与えられる、請求項２７に記載の前記ヒト化抗体。
【請求項２９】
Ｌ４２、Ｌ４９、及びＬ６９が、各々Ｎ、Ｓ、及びＫによって占められる位置を、及びＨ１、Ｈ２０、Ｈ２７、Ｈ３０、Ｈ３８、Ｈ４０、Ｈ４８、Ｈ６６、Ｈ６７、Ｈ７５、Ｈ８２Ａ、及びＨ９１が、各々Ｅ、Ｌ、Ｙ、Ｔ、Ｋ、Ｒ、Ｉ、Ｋ、Ａ、Ｓ、Ｒ、及びＦによって占められる位置を与えられる、請求項２８に記載の前記ヒト化抗体。
【請求項３０】
Ｌ８、Ｌ４５、及びＬ８０が、各々Ｓ、Ｒ、及びＴによって占められる位置の、少なくとも１つが与えられる、請求項２７から２９のいずれか１項に記載の前記ヒト化抗体。
【請求項３１】
Ｈ４１、及びＨ６９が、各々Ａ及びＬによって占められる位置の、少なくとも１つが与えられる、請求項２７から２９のいずれか１項に記載の前記ヒト化抗体。
【請求項３２】
Ｌ８、Ｌ４５、及びＬ８０が、各々Ｓ、Ｒ及びＴによって占められる位置が与えられる、請求項３０または９０に記載の前記ヒト化抗体。
【請求項３３】
Ｈ４１及びＨ６９が、各々Ａ及びＬによって占められる位置が与えられる、請求項３１に記載の前記ヒト化抗体。
【請求項３４】
配列番号５８に少なくとも９５％の配列同一性であるアミノ酸配列を有する成熟した重鎖可変領域及び配列番号５９に少なくとも９５％の配列同一性であるアミノ酸配列を有する成熟した軽鎖可変領域を含む、請求項２６に記載の前記ヒト化抗体。
【請求項３５】
前記成熟した重鎖可変領域が、配列番号５７のアミノ酸配列を有し、及び前記成熟した軽鎖可変領域が、配列番号５９のアミノ酸配列を有する、請求項２６に記載の前記ヒト化抗体。
【請求項３６】
前記成熟した重鎖可変領域が、配列番号５７のアミノ酸配列を有し、及び前記成熟した軽鎖可変領域が、配列番号６０のアミノ酸配列を有する、請求項２６に記載の前記ヒト化抗体。
【請求項３７】
前記成熟した重鎖可変領域が、配列番号５８のアミノ酸配列を有し、及び前記成熟した軽鎖可変領域が、配列番号５９のアミノ酸配列を有する、請求項２６に記載の前記ヒト化抗体。
【請求項３８】
前記成熟した重鎖可変領域が、配列番号５８のアミノ酸配列を有し、及び前記成熟した軽鎖可変領域が、配列番号６０のアミノ酸配列を有する、請求項２６に記載の前記ヒト化抗体。
【請求項３９】
無傷抗体である、請求項１から３８または８８から９１のいずれか１項に記載の前記抗体。
【請求項４０】
一本鎖抗体、Ｆａｂ、またはＦａｂ′２フラグメントである、請求項１から３８または８８から９１のいずれか１項に記載の前記抗体。
【請求項４１】
前記成熟した軽鎖可変領域が、軽鎖定常領域に融合され、及び前記成熟した重鎖可変領域が、重鎖定常領域に融合された、請求項２４から４０または９０から９１のいずれか１項に記載の前記ヒト化抗体。
【請求項４２】
前記重鎖定常領域が、天然のヒト重鎖定常領域と比べて、Ｆｃγ受容体への結合を低下させた天然のヒト重鎖定常領域の突然変異形態である、請求項４１に記載の前記ヒト化抗体。
【請求項４３】
前記重鎖定常領域が、ＩｇＧ１アイソタイプのものである、請求項４１または４２に記載の前記ヒト化抗体。
【請求項４４】
前記成熟した重鎖可変領域が、配列番号６１の配列を有する重鎖定常領域に融合され、及び／または前記成熟した軽鎖可変領域が、配列番号６２の配列を有する軽鎖定常領域に融合された、請求項４１に記載の前記ヒト化抗体。
【請求項４５】
各々Ｈ６０からＨ６５の位置に存在し、配列番号１６及び１７由来の成熟した重鎖可変領域及び成熟した軽鎖可変領域のＣＤＲに任意の差異を与える、請求項２４から４４または９０から９２のいずれか１項に記載の前記ヒト化抗体。
【請求項４６】
前記抗体が、治療薬または細胞毒性薬と共役している、請求項１から４５または８８から９２のいずれか１項に記載の前記抗体。
【請求項４７】
前記細胞毒性薬が、サポリンである、請求項４６に記載の前記抗体。
【請求項４８】
前記細胞毒性薬が、放射性同位体である、請求項４６に記載の前記抗体。
【請求項４９】
請求項１から４８または８８から９２のいずれか１項に記載の前記抗体及び薬学的に許容されるキャリアを含む、医薬組成物。
【請求項５０】
請求項１から４５または８８から９２のいずれか１項に記載の抗体の、重鎖及び／または軽鎖をコードする、核酸。
【請求項５１】
配列番号６３から６４、６７から６８、７１から７３、または７７から８０のいずれか１つを含む配列を有する、請求項５０に記載の前記核酸。
【請求項５２】
請求項５０、５１、または９３のいずれか１項に記載の核酸を含む、組換え発現ベクター。
【請求項５３】
請求項５２に記載の前記組換え発現ベクターで形質転換された、宿主細胞。
【請求項５４】
抗体のヒト化法であって、その方法が、（ａ）マウス抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域の配列を決定し、（ｂ）前記マウス抗体の重鎖のＣＤＲを含むヒト化重鎖をコードする核酸、及び前記マウス抗体の軽鎖のＣＤＲを含むヒト化軽鎖をコードする核酸を合成し、（ｃ）ヒト化抗体を産生するために、前記核酸を宿主細胞に発現することを含み、ここで、前記マウス抗体が、１５Ｆ７、６Ｃ１２、または１３Ｇ１０である、前記方法。
【請求項５５】
ヒト化、キメラ、またはバーニア化抗体を産生する方法であって、その方法が、（ａ）前記抗体の重鎖及び軽鎖をコードする核酸で形質転換された細胞を培養し、そのためその細胞が、前記抗体を分泌し、及び（ｂ）細胞の培養培地から前記抗体を精製することを含み、ここで、前記抗体が、１５Ｆ７、６Ｃ１２、または１３Ｇ１０のヒト化、キメラ、またはバーニア化形態の抗体である、前記方法。
【請求項５６】
ヒト化、キメラ、またはバーニア化抗体を産生する細胞株を産生する方法であって、その方法が、（ａ）細胞に、抗体の重鎖及び軽鎖をコードするベクター及び選択的マーカーを導入し、（ｂ）前記ベクターの増加した複製数を有する細胞を選択するための条件下で、前記細胞を増殖し、（ｃ）選択された前記細胞から単一細胞を単離し、及び（ｄ）抗体の産出に基づいて選択された単一細胞からクローン化された細胞を備蓄することを含み、ここで前記抗体が１５Ｆ７、６Ｃ１２、または１３Ｇ１０のヒト化、キメラ、またはバーニア化形態である、前記方法。
【請求項５７】
選択的条件下の前記細胞を増殖し及び天然に発現している細胞株を選別し、ならびに少なくとも１００ｍｇ／Ｌ／１０６細胞／２４時間を分泌することをさらに含む、請求項５６に記載の前記方法。
【請求項５８】
がんを患っているかまたはそのリスクを有している患者において、がんの治療法または効果的な予防法であって、その方法が、請求項１から４８または８８から９２のいずれか１項に記載の前記抗体の、効果的な投薬計画を前記患者に与えることを含む、前記方法。
【請求項５９】
前記患者ががんを患っており、及びそのがんが、悪性黒色腫、乳がん、肺がん、または大腸がんである、請求項５８に記載の前記方法。
【請求項６０】
生体サンプルにおける、細胞接着の阻害法であって、その方法が、請求項１から４８または８８から９２のいずれか１項に記載の抗体の効果的な量で、その生体サンプルに接触することを含む、前記方法。
【請求項６１】
前記細胞接着が、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ４−５モジュールにより媒介される、請求項６０に記載の前記方法。
【請求項６２】
前記生体サンプルが、がん細胞を含む、請求項６０に記載の前記方法。
【請求項６３】
生体サンプルにおける、がんの存在の検出法であって、その方法が、（ａ）前記生体サンプルを、請求項１から４８または８８から９２のいずれか１項に記載の前記抗体と接触させ、（ｂ）前記抗体の前記生体サンプルへの結合を検出し、（ｃ）対照サンプルを、請求項１から４８または８８から９２のいずれか１項に記載の前記抗体と接触させ、（ｄ）前記抗体の前記対照サンプルへの結合を検出し、及び（ｅ）前記抗体の前記生体サンプルへの結合を、前記抗体の前記対照サンプルへの結合と比較することを含み、ここで、前記対照サンプルと比較した前記生体サンプルへの前記抗体の増加した結合が、前記生体サンプルにおけるがんの存在をしめす、前記方法。
【請求項６４】
前記対照サンプル及び前記生体サンプルが、同じ組織起源の細胞を含む、請求項６３に記載の前記方法。
【請求項６５】
前記抗体の前記生体サンプルへの結合が、前記抗体の前記対照サンプルへの結合と比べて、少なくとも２倍大きい、請求項６３または６４に記載の前記方法。
【請求項６６】
前記抗体の前記生体サンプルへの結合が、前記抗体の前記対照サンプルへの結合と比べて、少なくとも５倍大きい、請求項６３または６４に記載の前記方法。
【請求項６７】
前記がんが、黒色腫である、請求項６３から６６のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項６８】
がんと診断された患者における治療薬の効果の評価法であって、その方法が、（ａ）前記治療薬での処置に先立ち得られた、前記患者からの第一生体サンプルを、請求項１から４８または８８から９２のいずれか１項に記載の前記抗体と接触させ、（ｂ）前記抗体の前記第一生体サンプルへの結合を検出し、（ｃ）前記治療薬での処置に沿って得られた、前記患者からの第二生体サンプルを、請求項１から４８または８８から９２のいずれか１項に記載の前記抗体と接触させ、（ｄ）前記抗体の前記第二生体サンプルへの結合を検出し、（ｅ）前記抗体の前記第一生体サンプルへの結合を、前記抗体の前記第二生体サンプルへの結合と比較することを含み、ここで、前記第一生体サンプルと比べた前記第二生体サンプルへの前記抗体の低下した結合が、前記治療薬が、前記患者の前記がんの治療に効果的であることを示す、前記方法。
【請求項６９】
生体サンプルにおける、ラミニンα４のヘパラン硫酸プロテオグリカンへの結合の阻害法であって、その方法が、前記生体サンプルを、請求項１から４８または８８から９２のいずれか１項に記載の前記抗体と接触させることを含む、前記方法。
【請求項７０】
前記ヘパラン硫酸プロテオグリカンが、シンデカン−１である、請求項６９に記載の前記方法。
【請求項７１】
前記ヘパラン硫酸プロテオグリカンが、シンデカン−２である、請求項６９に記載の前記方法。
【請求項７２】
前記ヘパラン硫酸プロテオグリカンが、シンデカン−３である、請求項６９に記載の前記方法。
【請求項７３】
前記ヘパラン硫酸プロテオグリカンが、シンデカン−４である、請求項６９に記載の前記方法。
【請求項７４】
前記ヘパラン硫酸プロテオグリカンが、グリピカン、ベータグリカン、ＣＤ４４、パールカン、アグリン、またはＸＶＩＩＩ型コラーゲンである、請求項６９に記載の前記方法。
【請求項７５】
ラミニンα４のＧドメインのＬＧ４−５モジュールが、疾患の発達に寄与する場合における、疾患の治療法または効果的な予防法であって、その方法が、その疾患を患っているかまたはそのリスクがある患者へ、請求項１から４８または８８から９２のいずれか１項に記載の前記抗体の効果的な投薬計画を与えることを含む、前記方法。
【請求項７６】
前記疾患が、がんである、請求項７５に記載の前記方法。
【請求項７７】
前記疾患が、悪性黒色腫、乳がん、肺がんまたは大腸がんである、請求項７６に記載の前記方法。
【請求項７８】
ラミニンα４のＧドメインのＬＧ４−５モジュールが、ヘパラン硫酸プロテオグリカンとの相互作用により前記疾患の発達に寄与している、請求項７５に記載の前記方法。
【請求項７９】
前記ヘパラン硫酸プロテオグリカンが、シンデカン−１である、請求項７８に記載の前記方法。
【請求項８０】
前記ヘパラン硫酸プロテオグリカンが、シンデカン−２である、請求項７８に記載の前記方法。
【請求項８１】
前記ヘパラン硫酸プロテオグリカンが、シンデカン−３である、請求項７８に記載の前記方法。
【請求項８２】
前記ヘパラン硫酸プロテオグリカンが、シンデカン−４である、請求項７８に記載の前記方法。
【請求項８３】
前記疾患が、乾癬、サルコイドーシス、多発性硬化症、または乾癬性関節炎である、請求項７５に記載の前記方法。
【請求項８４】
自己免疫疾患を患っているかまたはそのリスクを有している患者において、自己免疫疾患の治療法または効果的な予防法であって、その方法が、請求項１から４８または８８から９２のいずれか１項に記載の前記抗体の、効果的な投薬計画を前記患者に与えることを含む、前記方法。
【請求項８５】
前記疾患が、糖尿病、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、全身硬直症候群、リウマチ性関節炎、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、セリアック病、乾癬、乾癬性関節炎、サルコイドーシス、強直性脊椎炎、シェーグレン症候群、またはぶどう膜炎である、請求項８４に記載の前記方法。
【請求項８６】
患者の血管新生の阻害法であって、その方法が、請求項１から４８または８８から９２のいずれか１項に記載の前記抗体の、効果的な投薬計画を前記患者に与えることを含む、前記方法。
【請求項８７】
前記患者が、がんを患っている、請求項８６に記載の前記方法。
【請求項８８】
配列番号１６の成熟した重鎖可変領域及び配列番号１７の成熟した軽鎖可変領域により特徴づけられる抗体１５Ｆ７、若しくは配列番号２６の成熟した重鎖可変領域及び配列番号２７または９４の成熟した軽鎖可変領域により特徴づけられる抗体６Ｃ１２、または配列番号３６または３７の成熟した重鎖可変領域及び配列番号３８の成熟した軽鎖可変領域により特徴づけられる抗体１３Ｇ１０と競合する、請求項１に記載の前記抗体。
【請求項８９】
各ＣＤＲが、１５Ｆ７の（各々配列番号１６及び１７）、６Ｃ１２の（各々配列番号２６及び２７／９４）、または１３Ｇ１０の（各々配列番号３６／３７及び３８）重鎖及び軽鎖可変領域由来の相応するＣＤＲと、少なくとも９０％の配列同一性を有する、３つの軽鎖ＣＤＲ及び３つの重鎖ＣＤＲを含む、請求項１に記載の前記抗体。
【請求項９０】
Ｌ８、Ｌ４５、Ｌ８０、及びＬ１０４が、各々Ｓ、Ｒ、Ｔ、及びＶによって占められる位置の、少なくとも１つが与えられる、請求項２７から２９のいずれか１項に記載の前記ヒト化抗体。
【請求項９１】
Ｌ１０４が、Ｖによって占められる位置が与えられる、請求項９０に記載の前記ヒト化抗体。
【請求項９２】
前記成熟した重鎖可変領域が、配列番号６１、８９、または１０１の配列を有する重鎖定常領域に融合され、及び／または前記成熟した軽鎖可変領域が、配列番号６２または９０の配列を有する軽鎖定常領域に融合された、請求項４１に記載の前記ヒト化抗体。
【請求項９３】
配列番号６３から６４、６７から６８、７１から７３、７７から８０、９２から９３、９９から１００、または１０２の、いずれか１つを含む配列を有する、請求項５０に記載の前記核酸。
【請求項９４】
肥満若しくは肥満関連疾患を患っているかまたはそのリスクがある患者における、肥満若しくは肥満関連疾患の治療法または効果的な予防法であって、その方法が、前記患者に、請求項１から４８または８８から９２のいずれか１項に記載の前記抗体の効果的な投薬計画を与えることを含む、前記方法。
【請求項９５】
前記肥満関連疾患が、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、プラダー・ウィリー症候群、頭蓋咽頭腫、バルデ・ビードル症候群、コーエン症候群、またはＭＯＭＯ症候群である、請求項７９に記載の前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年３月１２日に出願された米国特許出願番号６１／９５２，１３２、２０１４年７月１１日に出願された米国特許出願番号６２／０２３，７６０、及び２０１４年１０月２４日に出願された米国特許出願番号６２／０６８，３４９による利益を主張し、その各々を、全ての目的に対し、その全体を参照として援用し、本明細書に組み入れる。
【０００２】
配列リストの参照
ファイル４５９０１２ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔに記録された配列リストは、１４１キロバイトであり、２０１５年３月５日に作成され、及び参照として援用し、本明細書に組み入れる。
【背景技術】
【０００３】
がんは、公衆衛生上の主要な課題である。米国における死亡者の４分の１は、がんが原因であり、及び浸潤性がんと診断された者の生存率は、およそ４０％である。Ｓｉｅｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．Ｃｌｉｎ．６２：１０−２９  （２０１２）。毎年、５００，０００人のアメリカ人が、がんで亡くなると推定されている（Ｓｉｅｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．Ｃｌｉｎ．６２：１０−２９（２０１２））。従来の化学療法における特異性の欠如及びそれに伴う副作用が、主要ながん細胞を除去するために必要な投薬量の送達を制約している。
【０００４】
ラミニンα４鎖を含むラミニンタンパク質が、ある種のがんを発現することが報告されている。ラミニンα４の結合相手として報告されているシンデカンもまた、ある種のがんを発現することが報告されている。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ４−５モジュール内のエピトープに特異的に結合する抗体を提供する。いくつかの抗体は、ラミニンα４のＭＣＡＭへの結合を阻害しない。いくつかの抗体は、ＬＧ４内のエピトープに結合する。いくつかの抗体は、ＬＧ５内のエピトープに結合する。いくつかの抗体は、ＬＧ４及びＬＧ４が寄与している残基の両方に対する、１つのエピトープに結合する。いくつかの抗体は、シンデカン−１、−２、−３、−４、グリピカン、ベータグリカン、ＣＤ４４、パールカン、アグリン、またはＸＶＩＩＩ型コラーゲンなどのヘパラン硫酸プロテオグリカンへの、ラミニンα４の結合を阻害する。
【０００６】
前述の抗体のいくつかは、悪性黒色腫細胞などのがん細胞を含む生体サンプルに選択的に結合し、対照サンプルとの比較において、任意で、ここでその対照サンプル及び生体サンプルは、同じ組織由来の細胞を含み、及び任意で、ここでその生体サンプルへの抗体の結合は、その対照サンプルへの抗体の結合に比べて、少なくとも２倍または５倍大きい。
【０００７】
前述の抗体のいくつかは、配列番号１６の成熟した重鎖可変領域及び配列番号１７の成熟した軽鎖可変領域により特徴づけられる抗体１５Ｆ７、若しくは配列番号２６の成熟した重鎖可変領域及び配列番号２７の成熟した軽鎖可変領域により特徴づけられる抗体６Ｃ１２、または配列番号３６若しくは３７の成熟した重鎖可変領域及び配列番号３８の成熟した軽鎖可変領域により特徴づけられる抗体１３Ｇ１０と、ラミニンα４への結合で競合する。前述の抗体のいくつかは、配列番号１６の成熟した重鎖可変領域及び配列番号１７の成熟した軽鎖可変領域により特徴づけられる抗体１５Ｆ７、または配列番号２６の成熟した重鎖可変領域及び配列番号２７若しくは９４の成熟した軽鎖可変領域により特徴づけられる抗体６Ｃ１２、または配列番号３６若しくは３７の成熟した重鎖可変領域及び配列番号３８の成熟した軽鎖可変領域により特徴づけられる抗体１３Ｇ１０と、ラミニンα４への結合で競合する。
【０００８】
前述の抗体のいくつかは、１５Ｆ７、６Ｃ１２、または１３Ｇ１０と同じ、ラミニンα４上のエピトープに結合する。
【０００９】
前述の抗体のいくつかは、３つの軽鎖ＣＤＲ及び３つの重鎖ＣＤＲを含み、ここで各ＣＤＲは、１５Ｆ７の（各々、配列番号１６及び１７）、６Ｃ１２の（各々、配列番号２６及び２７）、または１３Ｇ１０の（各々、配列番号３６／３７及び３８）重鎖及び軽鎖の可変領域由来の相応するＣＤＲに、少なくとも９０％の配列同一性を有する。前述の抗体のいくつかは、３つの軽鎖ＣＤＲ及び３つの重鎖ＣＤＲを含み、ここで各ＣＤＲは、１５Ｆ７の（各々、配列番号１６及び１７）、６Ｃ１２の（各々、配列番号２６及び２７／９４）、または１３Ｇ１０の（各々、配列番号３６／３７及び３８）重鎖及び軽鎖の可変領域由来の相応するＣＤＲに、少なくとも９０％の配列同一性を有する。
【００１０】
前述の抗体のいくつかは、１５Ｆ７、６Ｃ１２、または１３Ｇ１０の３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む。
【００１１】
前述の抗体のいくつかは、モノクローナル抗体である。前述の抗体のいくつかは、キメラ、ヒト化、バーニア化、またはヒト抗体である。前述の抗体のいくつかは、ヒトＩｇＧ１カッパのアイソタイプを有する。
【００１２】
本発明はさらに、ラミニンα４に特異的に結合する、ヒト化またはキメラ１５Ｆ７を提供し、ここで１５Ｆ７は、配列番号１６の成熟した重鎖可変領域及び配列番号１７の成熟した軽鎖可変領域により特徴づけられるマウス抗体である。任意で、当該ヒト化抗体は、その１５Ｆ７の重鎖可変領域（配列番号１６）の３つのＣＤＲを含むヒト化重鎖、及びその１５Ｆ７の軽鎖可変領域（配列番号１７）の３つのＣＤＲを含むヒト化軽鎖を含む。任意で、当該ヒト化抗体は、配列番号５８に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するヒト化の成熟した重鎖可変領域、及び配列番号５９に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するヒト化の成熟した軽鎖可変領域を含む。任意で、当該ヒト化抗体は、その１５Ｆ７の重鎖可変領域（配列番号１６）の３つのＣＤＲを含むヒト化重鎖、及びその１５Ｆ７の軽鎖可変領域（配列番号１７）の３つのＣＤＲを含むヒト化軽鎖を含む。任意で、配列番号１６及び１７各々からの成熟した重鎖可変領域及び成熟した軽鎖可変領域のＣＤＲにおけるいずれの差異も、Ｈ６０−Ｈ６５の位置に存在する。いくつかのヒト化抗体において、Ｌ４２、Ｌ４９及びＬ６９の位置の少なくとも１つは、各々Ｎ、Ｓ及びＫに占められ、及びＨ１、Ｈ２０、Ｈ２７、Ｈ３０、Ｈ３８、Ｈ４０、Ｈ４８、Ｈ６６、Ｈ６７、Ｈ７５、Ｈ８２Ａ、及びＨ９１の位置の少なくとも１つは、各々Ｅ、Ｌ、Ｙ、Ｔ、Ｋ、Ｒ、Ｉ、Ｋ、Ａ、Ｓ、Ｒ、及びＦに占められる。いくつかのヒト化抗体において、Ｌ４２、Ｌ４９及びＬ６９の位置は、各々Ｎ、Ｓ及びＫに占められ、及びＨ１、Ｈ２０、Ｈ２７、Ｈ３０、Ｈ３８、Ｈ４０、Ｈ４８、Ｈ６６、Ｈ６７、Ｈ７５、Ｈ８２Ａ、及びＨ９１の位置は、各々Ｅ、Ｌ、Ｙ、Ｔ、Ｋ、Ｒ、Ｉ、Ｋ、Ａ、Ｓ、Ｒ、及びＦに占められる。いくつかのヒト化抗体において、Ｌ８、Ｌ４５、及びＬ８０の位置の少なくとも１つは、各々Ｓ、Ｒ、及びＴに占められる。いくつかのヒト化抗体において、Ｌ８、Ｌ４５、Ｌ８０、及びＬ１０４の位置の少なくとも１つは、各々Ｓ、Ｒ、Ｔ、及びＶに占められる。いくつかのヒト化抗体において、Ｈ４１、及びＨ６９の位置の少なくとも１つは、各々Ａ、及びＬに占められる。いくつかのヒト化抗体において、Ｌ８、Ｌ４５、及びＬ８０の位置は、各々Ｓ、Ｒ、及びＴに占められる。いくつかのヒト化抗体において、Ｌ１０４の位置は、Ｖに占められる。いくつかのヒト化抗体において、Ｈ４１、及びＨ６９の位置は、各々Ａ、及びＬに占められる。いくつかのヒト化抗体は、配列番号５８に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する成熟した重鎖可変領域、及び配列番号５９に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する成熟した軽鎖可変領域を含む。いくつかのヒト化抗体において、当該成熟した重鎖可変領域は、配列番号５７のアミノ酸配列を有し、及び当該成熟した軽鎖可変領域は、配列番号５９のアミノ酸配列を有する。いくつかのヒト化抗体において、当該成熟した重鎖可変領域は、配列番号５７のアミノ酸配列を有し、及び当該成熟した軽鎖可変領域は、配列番号６０のアミノ酸配列を有する。いくつかのヒト化抗体において、当該成熟した重鎖可変領域は、配列番号５８のアミノ酸配列を有し、及び当該成熟した���鎖可変領域は、配列番号５９のアミノ酸配列を有する。いくつかのヒト化抗体において、当該成熟した重鎖可変領域は、配列番号５８のアミノ酸配列を有し、及び当該成熟した軽鎖可変領域は、配列番号６０のアミノ酸配列を有する。
【００１３】
前述の抗体のいずれもが、無償抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ、またはＦａｂ′２フラグメントであり得る。当該抗体のいずれかにおいて、当該成熟した軽鎖可変領域は、軽鎖の定常領域に融合され得て、及び当該成熟した重鎖可変領域は、重鎖の定常領域に融合され得る。任意で、当該重鎖定常領域は、天然のヒト重鎖定常領域に比べて、Ｆｃγ受容体への結合を低下させた、天然のヒト重鎖定常領域の突然変異形態である。任意で、当該重鎖定常領域は、ＩｇＧ１アイソタイプの重鎖定常領域である。任意で、当該重鎖定常領域は、配列番号６１の配列を有する重鎖定常領域に融合され、及び当該成熟した軽鎖定常領域は、配列番号６２の配列を有する軽鎖定常領域に融合される。任意で、当該成熟した重鎖可変領域は、配列番号６１、８９、または１０１の配列を有する重鎖定常領域に融合され、及び当該成熟した軽鎖可変領域は、配列番号６２または９０配列を有する軽鎖定常領域に融合される。前述の抗体のいずれもが、サポリンまたは放射性同位体などの治療薬または細胞毒性薬に共役され得る。
【００１４】
本発明はさらに、前述の抗体のいずれか及び薬学的に許容されるキャリアを含む医薬組成物を提供する。
【００１５】
本発明はさらに、配列番号６３−６４、６７−６８、７１−７３、及び７７−８０のいずれかなどの、前述の抗体のいずれかの重鎖及び／または軽鎖をコードする、核酸を提供する。本発明はさらに、配列番号６３−６４、６７−６８、７１−７３、７７−８０、９２−９３、９９−１００、または１０２のいずれかなどの、前述の抗体のいずれかの重鎖及び／または軽鎖をコードする、核酸を提供する。
【００１６】
本発明はさらに、前述の核酸及び組み換え発現ベクターなどで形質転換された宿主細胞を含む、組み換えベクターを提供する。
【００１７】
本発明はさらに、抗体をヒト化する方法を提供し、その方法は、（ａ）マウス抗体の、重鎖及び軽鎖可変領域の配列を決定し、（ｂ）そのマウス抗体の重鎖のＣＤＲを含むヒト化重鎖をコードする核酸及びそのマウス抗体の軽鎖のＣＤＲを含むヒト化軽鎖をコードする核酸を合成し、（ｃ）ヒト化抗体を産生するために、宿主細胞にその核酸を発現させることを含み、ここで当該マウス抗体が、１５Ｆ７、６Ｃ１２、または１３Ｇ１０である。
【００１８】
本発明はさらに、ヒト化、キメラ、またはバーニア化抗体を産生する方法を提供し、その方法は、（ａ）その抗体の重鎖及び軽鎖をコードする核酸で形質転換された細胞を培養し、そのため、その細胞が、当該抗体を分泌し、及び（ｂ）細胞培養培地からの抗体を精製することを含み、ここで当該抗体が、１５Ｆ７、６Ｃ１２、または１３Ｇ１０のヒト化、キメラ、またはバーニア化形態の抗体である。
【００１９】
本発明はさらに、ヒト化、キメラ、またはバーニア化抗体を産生する細胞株を生成する方法を提供し、その方法は、（ａ）抗体及び選択可能マーカーの重鎖及び軽鎖をコードするベクターを細胞に導入し、（ｂ）そのベクターのコピー数を増加させた細胞を選択する条件下で、その細胞を増殖し、（ｃ）その選択された細胞から単一細胞を単離し、及び（ｄ）抗体の産生量に基づき選択された単一細胞からクローンした細胞を備蓄することを含み、ここで当該抗体は、１５Ｆ７、６Ｃ１２、または１３Ｇ１０のヒト化、キメラ、またはバーニア化形態である。任意で、当該方法はさらに、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ／１０６細胞／２４時間で、天然に発現し及び分泌する細胞株を、選択的に選別し、その細胞を増殖することを含む。
【００２０】
本発明はさらに、がんを患っているかまたはそのリスクがある患者において、がんを治療しまたは効果的に予防する方法を提供し、当該方法は、前述の抗体のいずれかの効果的な投薬計画をその患者に与えることを含む。いくつかの方法において、当該患者は、がんを患っており、及びそのがんは、悪性黒色腫、乳がん、肺がん、及び大腸がんである。
【００２１】
本発明はさらに、生体サンプルにおける細胞接着を阻害する方法を提供し、その方法は、前述の抗体のいずれかの効果的な量で、その生体サンプルに接触することを含む。いくつかの方法において、当該細胞接着は、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ４−５モジュールにより媒介される。いくつかの方法において、当該生体サンプルは、がん細胞を含む。
【００２２】
本発明はさらに、生体サンプルにおける、悪性黒色腫などのがんの存在を検出する方法を提供し、その方法は、（ａ）その生体サンプルを、前述の抗体のいずれかと接触させ、（ｂ）その生体サンプルへの、当該抗体の結合を検出し、（ｃ）対照サンプルを、当該抗体と接触させ、（ｄ）その対照サンプルへの、当該抗体の結合を検出し、及び（ｅ）その生体サンプルへの当該抗体の結合と、その対照サンプルへの当該抗体の結合を比較することを含み、ここで、対照サンプルと比較して、当該生体サンプルへの当該抗体の増加した結合が、その生体サンプルにおけるがんの存在を示す、ことを含む。任意で、当該対照サンプル及び当該生体サンプルは、同じ組織由来の細胞を含む。任意で、当該生体サンプルへの当該抗体の結合は、当該対照サンプルへの当該抗体の結合と比べて、少なくとも２倍または５倍大きい。
【００２３】
本発明はさらに、がんと診断された患者における、治療薬の効果の評価法を提供し、その方法は、（ａ）その患者から治療に先立って得た第一生体サンプルを、前述の抗体のいずれかを伴うその治療薬と接触させ、（ｂ）その第一生体サンプルへの、当該抗体の結合を検出し、（ｃ）次の治療のために得た、その患者の第二生体サンプルを、当該抗体を伴うその治療薬と接触させ、（ｄ）その第二生体サンプルへの、当該抗体の結合を検出し、（ｅ）その第一生体サンプルへの当該抗体の結合を、その第二生体サンプルへの当該抗体の結合と比較することを含み、ここで第一生体サンプルと比べて第二生体サンプルへの当該抗体の低下した結合が、その治療薬が、その患者のがんの治療に効果的であることを示す。
【００２４】
本発明はさらに、生体サンプルにおけるヘパラン硫酸プロテオグリカンへの、ラミニンα４の結合を阻害する方法を提供し、その方法は、その生体サンプルと前述の抗体のいずれかとの接触を含む。任意で、当該ヘパラン硫酸プロテオグリカンは、シンデカン−１、−２、−３、若しくは−４、またはグリピカン、ベータグリカン、ＣＤ４４、パールカン、アグリン、若しくはＸＶＩＩＩ型コラーゲンである。
【００２５】
本発明はさらに、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ４−５モジュールが、疾患の発達に寄与している場合における、疾患の治療法または効果的な予防法を提供し、その方法は、その疾患を患っているかまたはそのリスクがある患者へ、前述の抗体のいずれかの効果的な投薬計画を与えることを含む。任意で、当該疾患は、悪性黒色腫、乳がん、肺がん、または大腸がんなどのがんである。任意で、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ４−５モジュールは、ヘパラン硫酸プロテオグリカンによる疾患の発達に寄与している。任意で、当該ヘパラン硫酸プロテオグリカンは、シンデカン−１、−２、−３、または−４である。任意で、当該疾患は、乾癬、サルコイドーシス、多発性硬化症、または乾癬性関節炎である。
【００２６】
本発明はさらに、自己免疫疾患を患っているかまたはそのリスクがある患者において、自己免疫疾患の治療法または効果的な予防法を提供し、その方法は、その患者へ、前述の抗体のいずれかの効果的な投薬計画を与えることを含む。任意で、当該疾患は、糖尿病、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、全身硬直症候群、リウマチ性関節炎、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、セリアック病、乾癬、乾癬性関節炎、サルコイドーシス、強直性脊椎炎、シェーグレン症候群、またはぶどう膜炎である。
【００２７】
本発明はさらに、患者の血管新生を阻害する方法を提供し、その方法は、前述の抗体のいずれかの効果的な投薬計画を患者に与えることを含む。任意で、当該患者は、がん患者である。
【００２８】
本発明はさらに、肥満または肥満関連疾患を患っているかまたはそのリスクがある患者における、肥満または肥満関連疾患の治療法または効果的な予防法を提供し、その方法は、前述の抗体のいずれかの効果的な投薬計画をその患者に与えることを含む。任意で、当該肥満関連疾患は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、プラダー・ウィリー症候群、頭蓋咽頭腫、バルデ・ビードル症候群、コーエン症候群、またはＭＯＭＯ症候群である。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】フローサイトメトリーにより評価した、ＬＧ１−５、ＬＧ１−３、及びＬＧ４−５を含むＬＡＭＡ４フラグメントを示している２９３の細胞への、ＬＧ１−３特異のＬＡＭＡ４抗体ならびに当該６Ｃ１２、１３Ｇ１０、及び１５Ｆ７抗体の結合度を示す。
【００３０】
【図２Ａ−２Ｃ】各々ＦｏｒｔｅＢｉｏアッセイにより評価した、当該１５Ｆ７、６Ｃ１２、及び１３Ｇ１０抗体の、相対結合度及びオン／オフ率を示す。
【００３１】
【図３】フローサイトメトリーにより評価した、ＬＡＭＡ４を示している２９３細胞に結合する、連続希釈された６Ｃ１２、１３Ｇ１０、及び１５Ｆ７抗体の結合能力を示す。
【００３２】
【図４Ａ−４Ｃ】競合するブロッキング抗体の低下比率（５：１、１：１、及び１：５）の存在下での、ＦＡＣＳ解析による、ＬＡＭＡ４を示している２９３細胞への、各々６Ｃ１２、１３Ｇ１０、及び１５Ｆ７抗体の結合度の評価を示す。
【００３３】
【図５Ａ−５Ｃ】１５Ｆ７抗体による、ヒトの胸部、結腸、及び肺腫瘍の各々に対する、腫瘍マイクロアレイスライドの染色を示す。
【００３４】
【図６】組換えＬＧ４−５をコーティングしたＥＬＩＳＡプレートを、１５Ｆ７、６Ｃ１２、１３Ｇ１０、及びマウスＩｇＧ１対照サンプルの２０ｕｇ／ｍｌと共に培養し、次いで、それらの、ＷＭ−２６６−４ヒト黒色腫細胞への結合能力を評価した際の、細胞接着アッセイを示す。
【００３５】
【図７】当該１５Ｆ７抗体及びサポリン共役化抗−マウス二次抗体と共に培養した、ＷＭ−２６６−４細胞の毒性を示す。
【００３６】
【図８】フローサイトメトリーにより評価した、ＬＡＭＡ４表示細胞への、連続希釈のキメラ１５Ｆ７ならびにヒト化１５Ｆ７変異体のＨ１Ｌ１、Ｈ１Ｌ２、Ｈ２Ｌ１、及びＨ２Ｌ２の結合能力を示す。
【００３７】
【図９】フローサイトメトリーにより評価した、ＬＧ１−５、ＬＧ１−３、及びＬＧ４−５を含むＬＡＭＡ４フラグメントを表示する２９３細胞への、キメラ１５Ｆ７ならびにヒト化１５Ｆ７変異体のＨ１Ｌ１、Ｈ１Ｌ２、Ｈ２Ｌ１、及びＨ２Ｌ２の結合度。
【００３８】
【図１０Ａ−１０Ｂ】図１０Ａにおける、抗−ＨｉｓセンサーへのＨｉｓ−ＬＡＭＡ４の負荷とそれに続く当該１５Ｆ７抗体の会合及び解離、及び図１０Ｂにおける、ヤギ−ヒトＦｃセンサーへの当該抗体の負荷とそれに続くＨｉｓ−ＬＡＭＡ４の会合と解離を伴う、ＦｏｒｔｅＢｉｏアッセイにより評価された、ｍ１５Ｆ７、キメラ１５Ｆ７ならびにヒト化１５Ｆ７変異体のＨ１Ｌ１、Ｈ１Ｌ２、Ｈ２Ｌ１、及びＨ２Ｌ２の相対結合度及びオン／オフ率を示す。
【００３９】
【図１１Ａ−１１Ｂ】ラミニン４１１またはＢＳＡ対照サンプル及び１５Ｆ７またはｍＩｇＧ１対照サンプルで処理されたヒト黒色腫細胞における、ｐＡｋｔのＡｋｔに対する相対レベルの比率を示す。図１１Ａは、個別サンプルの比率を示し、及び図１１Ｂは、各グループ（ｎ＝３）の平均及び標準誤差を示す。
【００４０】
配列の簡単な説明
付属の配列リストに網羅されるヌクレオチド及びアミノ酸の配列は、ヌクレオチド塩基に対する標準文字略語、及びアミノ酸に対する３文字コードを使って示される。ヌクレオチド配列は、その配列の５′末端から始めて３′末端方向に進める（すなわち、各ラインの左から右へ）とする標準規則に従う。各ヌクレオチド配列の一本鎖のみが示され、その相補鎖は、その示された鎖の任意の参照を含んでいると理解される。アミノ酸配列は、その配列のアミノ末端から始めてカルボキシ末端方向に進める（すなわち、各ラインの左から右へ）とする標準規則に従う。
【００４１】
配列番号１は、ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｑ１６３６３により与えられる、ラミニンα４のアミノ酸配列を記述する。
【００４２】
配列番号２は、ＧｅｎＢａｎｋ受入れ番号ＮＰ００１０９８６７６により与えられる、ラミニンα４のアミノ酸配列を記述する。
【００４３】
配列番号３は、ＧｅｎＢａｎｋ受入れ番号ＮＰ００１０９８６７７により与えられる、ラミニンα４のアミノ酸配列を記述する。
【００４４】
配列番号４は、ラミニンα４のＧドメインのアミノ酸配列を記述する。
【００４５】
配列番号５は、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ１モジュールのアミノ酸配列を記述する。
【００４６】
配列番号６は、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ２モジュールのアミノ酸配列を記述する。
【００４７】
配列番号７は、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ３モジュールのアミノ酸配列を記述する。
【００４８】
配列番号８は、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ１−３モジュールのアミノ酸配列を記述する。
【００４９】
配列番号９は、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ４モジュールのアミノ酸配列を記述する。
【００５０】
配列番号１０は、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ５モジュールのアミノ酸配列を記述する。
【００５１】
配列番号１１は、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ４−５モジュールのアミノ酸配列を記述する。
【００５２】
配列番号１２は、ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ１８８２７により与えられる、シンデカン−１のアミノ酸配列を記述する。
【００５３】
配列番号１３は、ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ３４７４１により与えられる、シンデカン−２のアミノ酸配列を記述する。
【００５４】
配列番号１４は、ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｏ７５０５６により与えられる、シンデカン−３のアミノ酸配列を記述する。
【００５５】
配列番号１５は、ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ３１４３１により与えられる、シンデカン−４のアミノ酸配列を記述する。
【００５６】
配列番号１６は、マウス１５Ｆ７の成熟した重鎖可変領域のアミノ酸配列を記述する。
【００５７】
配列番号１７は、マウス１５Ｆ７の成熟した軽鎖可変領域のアミノ酸配列を記述する。
【００５８】
配列番号１８は、当該１５Ｆ７の重鎖可変領域のシグナルペプチドのアミノ酸配列を記述する。
【００５９】
配列番号１９は、当該１５Ｆ７の軽鎖可変領域のシグナルペプチドのアミノ酸配列を記述する。 
【００６０】
配列番号２０は、マウス１５Ｆ７重鎖の、Ｋａｂａｔにより定義される、ＣＤＲ１のアミノ酸配列を記述する。
【００６１】
配列番号２１は、マウス１５Ｆ７重鎖の、Ｋａｂａｔにより定義される、ＣＤＲ２のアミノ酸配列を記述する。
【００６２】
配列番号２２は、マウス１５Ｆ７重鎖の、Ｋａｂａｔにより定義される、ＣＤＲ３のアミノ酸配列を記述する。
【００６３】
配列番号２３は、マウス１５Ｆ７軽鎖の、Ｋａｂａｔにより定義される、ＣＤＲ１のアミノ酸配列を記述する。
【００６４】
配列番号２４は、マウス１５Ｆ７軽鎖の、Ｋａｂａｔにより定義される、ＣＤＲ２のアミノ酸配列を記述する。
【００６５】
配列番号２５は、マウス１５Ｆ７軽鎖の、Ｋａｂａｔにより定義される、ＣＤＲ３のアミノ酸配列を記述する。
【００６６】
配列番号２６は、マウス６Ｃ１２の成熟した重鎖可変領域のアミノ酸配列を記述する。
【００６７】
配列番号２７は、マウス６Ｃ１２の成熟した軽鎖可変領域、バージョン１のアミノ酸配列を記述する。
【００６８】
配列番号２８は、マウス６Ｃ１２の重鎖可変領域のシグナルペプチドのアミノ酸配列を記述する。
【００６９】
配列番号２９は、マウス６Ｃ１２の軽鎖可変領域のシグナルペプチドのアミノ酸配列を記述する。
【００７０】
配列番号３０は、マウス６Ｃ１２重鎖の、Ｋａｂａｔにより定義される、ＣＤＲ１のアミノ酸配列を記述する。
【００７１】
配列番号３１は、マウス６Ｃ１２重鎖の、Ｋａｂａｔにより定義される、ＣＤＲ２のアミノ酸配列を記述する。
【００７２】
配列番号３２は、マウス６Ｃ１２重鎖の、Ｋａｂａｔにより定義される、ＣＤＲ３のアミノ酸配列を記述する。
【００７３】
配列番号３３は、マウス６Ｃ１２軽鎖、バージョン１の、Ｋａｂａｔにより定義される、ＣＤＲ１のアミノ酸配列を記述する。
【００７４】
配列番号３４は、マウス６Ｃ１２軽鎖の、Ｋａｂａｔにより定義される、ＣＤＲ２のアミノ酸配列を記述する。
【００７５】
配列番号３５は、マウス６Ｃ１２軽鎖の、Ｋａｂａｔにより定義される、ＣＤＲ３のアミノ酸配列を記述する。
【００７６】
配列番号３６は、マウス１３Ｇ１０の成熟した重鎖可変領域、バージョン１のアミノ酸配列を記述する。
【００７７】
配列番号３７は、マウス１３Ｇ１０の成熟した重鎖可変領域、バージョン２のアミノ酸配列を記述する。
【００７８】
配列番号３８は、マウス１３Ｇ１０の成熟した軽鎖可変領域のアミノ酸配列を記述する。
【００７９】
配列番号３９は、マウス１３Ｇ１０の重鎖可変領域シグナルペプチド、バージョン１のアミノ酸配列を記述する。
【００８０】
配列番号４０は、マウス１３Ｇ１０の重鎖可変領域シグナルペプチド、バージョン２のアミノ酸配列を記述する。
【００８１】
配列番号４１は、マウス１３Ｇ１０の軽鎖可変領域シグナルペプチドのアミノ酸配列を記述する。
【００８２】
配列番号４２は、マウス１３Ｇ１０重鎖、バージョン１の、Ｋａｂａｔにより定義される、ＣＤＲ１のアミノ酸配列を記述する。
【００８３】
配列番号４３は、マウス１３Ｇ１０重鎖、バージョン１の、Ｋａｂａｔにより定義される、ＣＤＲ２のアミノ酸配列を記述する。
【００８４】
配列番号４４は、マウス１３Ｇ１０重鎖、バージョン１の、Ｋａｂａｔにより定義される、ＣＤＲ３のアミノ酸配列を記述する。
【００８５】
配列番号４５は、マウス１３Ｇ１０重鎖、バージョン２の、Ｋａｂａｔにより定義される、ＣＤＲ１のアミノ酸配列を記述する。
【００８６】
配列番号４６は、マウス１３Ｇ１０重鎖、バージョン２の、Ｋａｂａｔにより定義される、ＣＤＲ２のアミノ酸配列を記述する。
【００８７】
配列番号４７は、マウス１３Ｇ１０重鎖、バージョン２の、Ｋａｂａｔにより定義される、ＣＤＲ３のアミノ酸配列を記述する。
【００８８】
配列番号４８は、マウス１３Ｇ１０軽鎖の、Ｋａｂａｔにより定義される、ＣＤＲ１のアミノ酸配列を記述する。
【００８９】
配列番号４９は、マウス１３Ｇ１０軽鎖の、Ｋａｂａｔにより定義される、ＣＤＲ２のアミノ酸配列を記述する。
【００９０】
配列番号５０は、マウス１３Ｇ１０軽鎖の、Ｋａｂａｔにより定義される、ＣＤＲ３のアミノ酸配列を記述する。
【００９１】
配列番号５１は、ＮＣＢＩ受入れコードＡＣＦ３６８５７．１、バージョン１により与えられる、ヒトＶＨ受容体ＦＲのアミノ酸配列を記述する。
【００９２】
配列番号５２は、ＮＣＢＩ受入れコードＢＡＣ０１５３０．１、バージョン１により与えられる、ヒトＶＨ受容体ＦＲのアミノ酸配列を記述する。
【００９３】
配列番号５３は、ＮＣＢＩ受入れコードＡＡＹ３３３５０．１により与えられる、ヒトＶＬ受容体ＦＲのアミノ酸配列を記述する。
【００９４】
配列番号５４は、ＮＣＢＩ受入れコードＢＡＣ０１５８３．１、バージョン１により与えられる、ヒトＶＬ受容体ＦＲのアミノ酸配列を記述する。
【００９５】
配列番号５５は、逆突然変異またはその他の突然変異を伴わない、ヒト化１５Ｆ７の重鎖可変領域のアミノ酸配列を記述する。
【００９６】
配列番号５６は、逆突然変異またはその他の突然変異を伴わない、ヒト化１５Ｆ７の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を記述する。
【００９７】
配列番号５７は、ヒト化１５Ｆ７の重鎖可変領域バージョン１（Ｈ１）のアミノ酸配列を記述する。
【００９８】
配列番号５８は、ヒト化１５Ｆ７の重鎖可変領域バージョン２（Ｈ２）のアミノ酸配列を記述する。
【００９９】
配列番号５９は、ヒト化１５Ｆ７の軽鎖可変領域バージョン１（Ｌ１）のアミノ酸配列を記述する。
【０１００】
配列番号６０は、ヒト化１５Ｆ７の軽鎖可変領域バージョン２（Ｌ２）のアミノ酸配列を記述する。
【０１０１】
配列番号６１は、例示的なヒトＩｇＧ１の定常領域のアミノ酸配列を記述する。
【０１０２】
配列番号６２は、Ｎ末端アルギニンを伴わない、例示的なヒトカッパ軽鎖定常領域のアミノ酸配列を記述する。
【０１０３】
配列番号６３は、マウス１５Ｆ７の重鎖定常領域の核酸配列を記述する。
【０１０４】
配列番号６４は、マウス１５Ｆ７の軽鎖定常領域バージョンの核酸配列を記述する。
【０１０５】
配列番号６５は、マウス１５Ｆ７の重鎖定常領域シグナルペプチドの核酸配列を記述する。
【０１０６】
配列番号６６は、マウス１５Ｆ７の軽鎖定常領域シグナルペプチドの核酸配列を記述する。
【０１０７】
配列番号６７は、マウス６Ｃ１２の重鎖定常領域の核酸配列を記述する。
【０１０８】
配列番号６８は、マウス６Ｃ１２の軽鎖定常領域、バージョン１の核酸配列を記述する。
【０１０９】
配列番号６９は、マウス６Ｃ１２の重鎖定常領域シグナルペプチドの核酸配列を記述する。
【０１１０】
配列番号７０は、マウス６Ｃ１２の軽鎖定常領域シグナルペプチドの核酸配列を記述する。
【０１１１】
配列番号７１は、マウス１３Ｇ１０の重鎖可変領域、バージョン１の核酸配列を記述する。
【０１１２】
配列番号７２は、マウス１３Ｇ１０の重鎖可変領域、バージョン２の核酸配列を記述する。
【０１１３】
配列番号７３は、マウス１３Ｇ１０の軽鎖可変領域の核酸配列を記述する。
【０１１４】
配列番号７４は、１３Ｇ１０の重鎖可変領域シグナルペプチド、バージョン１の核酸配列を記述する。
【０１１５】
配列番号７５は、１３Ｇ１０の重鎖可変領域シグナルペプチド、バージョン２の核酸配列を記述する。
【０１１６】
配列番号７６は、１３Ｇ１０の軽鎖可変領域シグナルペプチドの核酸配列を記述する。
【０１１７】
配列番号７７は、ヒト化１５Ｆ７の重鎖可変領域バージョン１（Ｈ１）の核酸配列を記述する。
【０１１８】
配列番号７８は、ヒト化１５Ｆ７の重鎖可変領域バージョン２（Ｈ２）の核酸配列を記述する。
【０１１９】
配列番号７９は、ヒト化１５Ｆ７の軽鎖可変領域バージョン１（Ｌ１）の核酸配列を記述する。
【０１２０】
配列番号８０は、ヒト化１５Ｆ７の軽鎖可変領域バージョン２（Ｌ２）の核酸配列を記述する。
【０１２１】
配列番号８１は、ラミニンα４のＧドメインの核酸配列を記述する。
【０１２２】
配列番号８２は、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ１モジュールの核酸配列を記述する。
【０１２３】
配列番号８３は、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ２モジュールの核酸配列を記述する。
【０１２４】
配列番号８４は、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ３モジュールの核酸配列を記述する。
【０１２５】
配列番号８５は、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ１−３モジュールの核酸配列を記述する。
【０１２６】
配列番号８６は、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ４モジュールの核酸配列を記述する。
【０１２７】
配列番号８７は、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ５モジュールの核酸配列を記述する。
【０１２８】
配列番号８８は、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ４−５モジュールの核酸配列を記述する。
【０１２９】
配列番号８９は、例示的な、ＩｇＧ１Ｇ１ｍ３アロタイプのヒトＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列を記述する。
【０１３０】
配列番号９０は、例示的な、Ｎ末端アルギニンを伴うヒトカッパ軽鎖定常領域のアミノ酸配列を記述する。
【０１３１】
配列番号９１は、例示的な、Ｃ末端リシンを伴わないヒトＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列を記述する。
【０１３２】
配列番号９２は、例示的な、ＩｇＧ１Ｇ１ｍ３アロタイプのヒトＩｇＧ１定常領域の核酸配列を記述する。
【０１３３】
配列番号９３は、例示的な、Ｎ末端アルギニンを伴うヒトカッパ軽鎖定常領域の核酸配列を記述する。
【０１３４】
配列番号９４は、マウス６Ｃ１２の成熟した軽鎖可変領域、バージョン２のアミノ酸配列を記述する。
【０１３５】
配列番号９５は、マウス６Ｃ１２の軽鎖、バージョン２の、Ｋａｂａｔにより定義される、ＣＤＲ１のアミノ酸配列を記述する。
【０１３６】
配列番号９６は、ＮＣＢＩ受入れコードＡＣＦ３６８５７．１、バージョン２により与えられる、ヒトＶＨ受容体ＦＲのアミノ酸配列を記述する。
【０１３７】
配列番号９７は、ＮＣＢＩ受入れコードＢＡＣ０１５３０．１、バージョン２により与えられる、ヒトＶＨ受容体ＦＲのアミノ酸配列を記述する。
【０１３８】
配列番号９８は、ＮＣＢＩ受入れコードＢＡＣ０１５８３．１、バージョン２により与えられる、ヒトＶＬ受容体ＦＲのアミノ酸配列を記述する。
【０１３９】
配列番号９９は、マウス６Ｃ１２の軽鎖可変領域、バージョン２の核酸配列を記述する。
【０１４０】
配列番号１００は、ヒト化１５Ｆ７の軽鎖可変領域バージョン１（Ｌ１）、バージョン２の核酸配列を記述する。
【０１４１】
配列番号１０１は、例示的な、ＩｇＧ１Ｇ１ｍ３アロタイプのヒトＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列を記述する。
【０１４２】
配列番号１０２は、例示的な、Ｎ末端アルギニンを伴わないヒトカッパ軽鎖定常領域の核酸配列を記述する。
【０１４３】
定義
モノクローナル抗体またはその他の生体エンティティーは、通常は単離された形態で提供される。このことは、抗体またはその他の生体エンティティーは通常、その産生または精製に起因する干渉タンパク質及びその他の不純物を含んでいて、少なくとも５０％ｗ／ｗ純度であるが、そのモノクローナル抗体が、過剰な薬学的に許容されるキャリアまたはその他のその利用を容易にすることを意図した賦形剤と組み合わされる可能性を排除はしないことを意味する。いくつかのモノクローナル抗体は、産生または精製からの干渉タンパク質及び不純物を含んでいて、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％ｗ／ｗ純度である。しばしば、単離されたモノクロナル抗体またはその他の生体エンティティーは、その精製後に残っている顕著なマクロ分子である。
【０１４４】
抗体のその標的抗原への特異的な結合は、少なくとも１０６、１０７、１０８、１０９、または１０１０Ｍ−１の親和力を意味する。特異的結合は、その規模が検出可能なほど高く、及び少なくとも１つの無関係な標的に対して起こる非特異的な結合とは、区別できる。特異的結合は、特定の官能基または特定の空間的合致形状（例えば、鍵と鍵穴の型）間の結合形成の結果であり得るのに対して、非特異的結合は、通常はファンデルワールス力の結果である。特異的結合はしかし、抗体が１つ及び１つだけの標的を結合することを、必ずしも意味しない。
【０１４５】
抗体の基本的な構造単位は、四量体のサブ単位である。各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一ペアーを含み、各ペアーは、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）及び１つの「重」鎖（約５０−７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部は、抗原認識に対して主として責任をもつ、約１００から１１０の、またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。この可変領域が、開裂可能なシグナルペプチドへ結合するように、最初に発現する。そのシグナルペプチドのない可変領域は、成熟した可変領域を呼ばれる。したがって、例えば、軽鎖の成熟した可変領域は、軽鎖シグナルペプチドのない軽鎖可変領域を意味する。各鎖のカルボキシ末端部は、エフェクター機能に対して主として責任をもつ定常領域であると定義する。
【０１４６】
軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかに分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンに分けられ、及び抗体のアイソタイプが、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥとして、各々定められる。軽鎖及び重鎖内において、可変領域と定常領域は、約１２またはそれ以上のアミノ酸の「Ｊ」領域で繋がり、重鎖はまた、約１０またはそれ以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。一般的には、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ  ｅｄ．Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９８９），Ｃｈ．７（全ての目的に対して、この全体を参照として組み込む）を参照のこと。
【０１４７】
軽／重鎖ペアーの各々の成熟可変領域は、抗体結合部位を形成する。したがって、無傷抗体は、２つの結合部位を有する。二官能性または二重特異性抗体を除き、この２つの結合部位は同じである。全ての当該結合鎖は、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる３つの超可変領域に繋がった比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）から成る同じ一般構造を示す。各ペアーの２つの結合鎖の当該ＣＤＲは、特定のエピトープに結合可能な、フレームワーク領域により一列に並ぶ。Ｎ末端からＣ末端に向かって、両軽鎖及び重鎖は、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４を含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９８７  ａｎｄ  １９９１）、またはＣｈｏｔｈｉａ  ＆  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３（１９８９）の定義に従う。Ｋａｂａｔはまた、異なる重鎖間または異なる軽鎖間の対応残基が、同じ番号に割り当てられた場合の、広範囲に利用される番号付け規則（Ｋａｂａｔ番号規則）を提供している。
【０１４８】
用語「抗体」は、無傷抗体及びそれらの結合フラグメントを含む。通常、フラグメントは、分離した重鎖、軽鎖のＦａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆ（ａｂ）ｃ、Ｄａｂ、ナノボディー、及びＦｖを含む、標的への特異的な結合に対して誘導された、無傷抗体と競合する。フラグメントは、組換えＤＮＡ技術により、または無傷免疫グロブリンの酵素的または科学的分離法により産生できる。用語「抗体」はまた、二重特異性抗体及び／またはヒト化抗体を含む。二重特異性または二官能性抗体は、２組の異なる重／軽鎖ペアー及び２つの異なる結合部位を有する、人工的なハイブリッド抗体である（例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ  ａｎｄ  Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７９：３１５−３２１（１９９０）；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：１５４７−５３（１９９２）を参照）。いくつかの二重特異性抗体において、その２組の異なる重／軽鎖ペアーは、ヒト化１５Ｆ７重／軽鎖ペアー、及び１５Ｆ７による結合とは異なる、ラミニンα４上のエピトープに特異的な重鎖／軽鎖のペアーを含む。
【０１４９】
いくつかの二重特異性抗体において、１組の重鎖軽鎖ペアーは、さらに以下に開示されるヒト化１５Ｆ７抗体であり、及びその重軽鎖ペアーは、インスリン受容体、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）受容体、レプチン受容体、若しくはリポタンパク質受容体、またはトランスフェリン受容体などの、血液脳関門に発現する受容体に結合する抗体由来である（Ｆｒｉｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ８８：４７７１−４７７５，１９９１；  Ｆｒｉｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：３７３−３７７，１９９３）。そのような二重特異性抗体は、受容体媒介のトランスサイトーシスにより、その血液脳関門を通り抜けて運搬され得る。当該二重特異性抗体の脳吸収は、その血液脳関門受容体への親和性を低下させるための、その二重特異性抗体の人工的な操作により、さらに高めることができる。当該受容体に対する低下させた親和性は、その脳において広範な送達をもたらした（例えば、Ａｔｗａｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓ．Ｍｅｄ．３，８４ｒａ４３，２０１１；Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓ．Ｍｅｄ．３，８４ｒａ４４，２０１１を参照）。
【０１５０】
例示的な二重特異性抗体はまた、（１）軽鎖及び重鎖の各々が、短いペプチド連結を介した、直列の２つの可変ドメインを含む、二重可変ドメイン抗体（ＤＶＤ−Ｉｇ（商標））（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｄｕａｌ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（ＤＶＤ−Ｉｇｔｍ）Ｍｏｌｅｃｕｌｅ，Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ（２０１０））、（２）２つの一本鎖ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）の融合体で、各標的抗体に対し２つの結合部位を有する４価の二重特異性抗体をもたらす、タンダブ（Ｔａｎｄａｂ）、（３）ダイアボディを伴うｓｃＦｖｓの組み合わせで、多価分子をもたらす、フレキシボディ（ｆｌｅｘｉｂｏｄｙ）、（４）タンパク質キナーゼＡの「二量体化及びドッキングドメイン」に基づき、Ｆａｂｓに適用の場合、異なるＦａｂフラグメントに連結した２つの同じＦａｂフラグメントから成る、三価の二重特異性結合タンパク質を産出できる、いわゆる「ドッキング・ロック（ｄｏｃｋ  ａｎｄ  ｌｏｃｋ）」分子、（５）例えば、ヒトＦｃ領域の両末端に融合されるｓｃＦｖｓを含む、いわゆる「スコーピオン（Ｓｃｏｒｐｉｏｎ）」分子であり得る。二重特異性抗体の生成に有用なプラットフォームの例示には、ＢｉＴＥ（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ、  ＤＡＲＴ（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）、Ｆｃａｂ及びＭａｂ２（Ｆ−ｓｔａｒ）、  Ｆｃ−改変のＩｇＧｌ（Ｘｅｎｃｏｒ）、またはＤｕｏＢｏｄｙ（Ｆａｂアーム部の交換の基づく、Ｇｅｎｍａｂ）を含む。
【０１５１】
用語「エピトープ」は、抗体が結合する抗原上の部位を指す。エピトープは、連続したアミノ酸または１つ以上のタンパク質の３次元折り畳みにより並置された非連続のアミノ酸から形成できる。連続したアミノ酸から形成されたエピトープ（直鎖状エピトープとして知られる）は通常、変成溶媒への暴露で保存されるのに対して、３次元折り畳みにより形成されたエピトープ（構造的エピトープとして知られる）は通常、変成溶媒の処理で失われる。エピトープは通常、特徴的な空間形態での、少なくとも３つの、及び普通はそれ以上の、少なくとも５または８−１０のアミノ酸を含む。エピトープの空間形態を決定する方法には、例えば、Ｘ線結晶構造解析及び二次元核磁気共鳴を含む。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６，Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ．（１９９６）を参照のこと。
【０１５２】
同じかまたは重なっているエピトープを認識する抗体は、標的抗原に対し、別の抗体の結合と競合している１つの抗体の能力を示す、単純な免疫測定法で識別できる。抗体のエピトープはまた、接触残基を特定するためにその抗原に結合させた抗体の、Ｘ線結晶構造解析により特定できる。あるいは、仮に１つの抗体の結合を低下させるかまたは排除する抗原の全てのアミノ酸変異が、その他の抗体の結合を低下させるかまたは排除する場合、２つの抗体は、同じエピトープを有する。仮に、１つの抗体の結合を低下させるかまたは排除する抗原のいくつかのアミノ酸変異が、その他の抗体の結合を低下させるかまたは排除する場合、２つの抗体は、重複するエピトープを有する。
【０１５３】
抗体間の競合は、評価中の抗体が、参照抗体の一般的な抗原への特異的結合を阻害するアッセイにより決定する（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０：１４９５，１９９０を参照）。仮に、過剰な試験抗体（例えば、少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍または１００倍）が、競合結合アッセイにおいて測定された少なくとも５０％で、参照抗体の結合を阻害する場合、その試験抗体は、参照抗体と競合する。いくつかの試験抗体は、少なくとも７５％、９０％または９９％で、その参照抗体の結合を阻害する。競合アッセイにより識別された抗体（競合している抗体）は、参照抗体と同じエピトープを結合する抗体及び立体障害の発生に対応して、その参照抗体により結合されたエピトープの十分な近位の隣接エピトープに結合する抗体を含む。
【０１５４】
用語「薬学的に許容される」は、キャリア、希釈剤、賦形剤、または補強剤が、その処方物のその他の成分と互換的であり、及びそれらの受給者に対して実質的に有害ではないことを意味する。
【０１５５】
用語「患者」には、予防または治療的処置のいずれかを受けるヒト及びその他の哺乳類対象者を含む。
【０１５６】
仮に当該対象者が、そのリスク要因の無い複数の個人に比べて、その疾患を発達させる統計的に非常に高いリスクにおける要因を伴う複数の個人が置かれている、少なくとも１つの公知のリスク要因（例えば、遺伝的、生化学的、家族の歴史的、及び状況的露出の）を有する場合、一個人は、疾患の増大するリスク状況に置かれている。
【０１５７】
用語「生体サンプル」は、生体源、例えば、ヒトまたは哺乳類対象者内のまたはそこから得られる生体物質のサンプルを指す。そのようなサンプルは、臓器、細胞小器官、組織、組織の切片、体液、末梢血、血漿、血清、細胞、タンパク質やペプチドなどの分子、及び任意の部位またはそこから派生した組み合わせであり得る。用語の生体サンプルはまた、そのサンプルを加工して派生した任意の物質を包含できる。派生物質には、細胞またはその子孫を含むことができる。当該生体サンプルの加工には、ろ過、蒸留、抽出、濃縮、固定、干渉成分の不活性化などの、１つ以上を伴って良い。
【０１５８】
用語「対照サンプル」は、がん性細胞を含むことが未知の若しくは疑われる、または少なくとも対象種のがん性細胞を含むことが未知の若しくは疑われる生体サンプルを指す。対照サンプルは、がんまたは特別に選ばれた種類のがんを患っていない個人から得ることができる。あるいは、対照サンプルは、がんまたは特別に選ばれたがんの種類に苦しんでいる患者から得ることができる。そのようなサンプルは、そのがんを含むと思われる生体サンプルと、同時にまたは異なる機会に得ることができる。生体サンプル及び対照サンプルは共に、同じ組織（例えば、腫瘍組織及び周辺の正常組織を共に含む組織の切片）から得ることができる。好ましくは、対照サンプルは、本質的にまたは全体として正常で健康な細胞から成り、及びがん細胞または特定の種類のがん細胞を含むと思われる生体サンプルとの比較に利用できる。好ましくは、当該対照サンプルの細胞は、当該生体サンプル（例えば、肺または脳）にあると思われるがん細胞と、同じ組織起源を有する。好ましくは、当該生体サンプルにあると思われるがん細胞は、その対照サンプルの細胞型と同じ細胞型（例えば、神経、上皮、間葉系、造血）から生じる。
【０１５９】
用語「疾患」は、生理的機能が低下する、任意の異常な症状を指す。当該用語は、その病気の原因の性質に関係なく、生理的機能が損なわれる任意の、障害、疾患、異常、病理、病気、症状、または症候群を広く網羅して使用する。
【０１６０】
用語「症状」は、変化した歩行などのその対象者により知覚される、疾患の主観的な証拠を指す。「兆候」は、医師によって観察される客観的な証拠を指す。
【０１６１】
保存的または非保存的なアミノ酸置換のために、アミノ酸を以下のようにグループ分けする。グループＩ（疎水性側鎖）：メチオニン（ｍｅｔ）、アラニン（ａｌａ）、バリン（ｖａｌ）、ロイシン（ｌｅｕ）、イソロシン（ｉｌｅ）、グループＩＩ（中性の親水性側鎖）：システイン（ｃｙｓ）、セリン（ｓｅｒ）、トレオニン（ｔｈｒ）、グループＩＩＩ（酸性側鎖）：アスパラギン酸（ａｓｐ）、グルタミン酸（ｇｌｕ）、グループＩＶ（塩基性側鎖）：アスパラギン（ａｓｎ）、グルタミン（ｇｌｎ）、ヒスチジン（ｈｉｓ）、リシン（ｌｙｓ）、アルギニン（ａｒｇ）、グループＶ（鎖配向に影響を及ぼす残基）：グリシン（ｇｌｙ）、プロリン（ｐｒｏ）、グループＶＩ（芳香族側鎖）：トリプトファン（ｔｒｐ）、チロシン（ｔｙｒ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ）。保存置換には、同じ分類のアミノ酸間の置換を含む。非保存置換は、これらの分類の１つの１構成員の、別の構成員との交換で構成する。
【０１６２】
配列同一性パーセントは、Ｋａｂａｔ番号規則により並べられた抗体の最大配列により決定される。整列後、仮に対象の抗体領域（例えば、重鎖または軽鎖の成熟可変領域の全体）が、参照抗体の同じ領域と比較される場合、その対象と参照の抗体配列間の配列同一性パーセントは、パーセントに換算するため１００倍される考慮外のギャップを伴い、その２つの領域の整列位置の総数により分けられた、その対象と参照の両抗体領域における、同じアミノ酸により占められた位置の数である。
【０１６３】
１つ以上の列挙される要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」若しくは「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」組成物または方法は、特に列挙されないその他の要素を含んで良い。例えば、抗体を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」組成物は、その抗体を単独でまたはその他の成分との組み合わせで含んで良い。
【０１６４】
値の範囲の指定は、その範囲内のまたはその範囲の定義の全ての整数、及びその範囲内の整数により定められるすべてのサブ範囲を含む。
【０１６５】
その文脈から明白でない限り、用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、記載値の測定標準許容誤差（例えば、ＳＥＭ）内の値を包含する。
【０１６６】
統計的有意差は、ｐ≦０．０５を意味する。
【０１６７】
本文中の単数形「ａ」「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、その文脈が指示しない限り、複数参照を含む。例えば、用語「化合物（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または「少なくとも１つの化合物（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ  ｋｏｍｐｏｕｎｄ）」は、それらの混合物を含む、複数の化合物を含むことができる。
【発明を実施するための形態】
【０１６８】
Ｉ．一般
本発明は、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ４−５モジュールに特異的に結合する抗体を提供する。当該抗体は、正常組織と比較してがんである細胞を、選択的に染色する能力を有する。当該抗体はまた、ラミニンα４が媒介するがんまたは腫瘍の細胞接着を阻害する能力を有する。当該抗体は、がんを検出し、がん療法の効果を評価し、がんを治療し、及びその他の応用の中で特に、肥満または肥満関連疾患を治療するために使用できる。
【０１６９】
ＩＩ．標的分子
ラミニンは、細胞外基質の糖タンパク質ファミリーであり、及び基底膜の主要な非コラーゲン構成体である。ラミニンは、細胞接着、分化、移行、シグナル伝達、神経突起の伸長、及びその他のプロセスの中で特に転移を含む、生体プロセスに関与すると報告されている。ラミニンは、アルファ鎖、ベータ鎖、及びガンマ鎖の３結合鎖の三量体タンパク質である。この３結合鎖は、各々が、異なる鎖で形成される３つの短い腕、及び３結合鎖すべてから構成される長い腕から成る、十字形構造を形成する。哺乳類においては、５つの異なるアルファ鎖、３つの異なるベータ鎖、及び３つの異なるガンマ鎖が特定されており、１５の異なるヘテロ三量体の組み合わせを組み立てることができる。
【０１７０】
当該ラミニンアルファ鎖は、約２００のアミノ酸から成る、５つの直列の同種ラミニンＧ様モジュール（ＬＧ１−５）を有する、大きなＣ末端球状ドメイン（Ｇドメイン）を有する。例えば、ラミニンα４のＧドメインは、アミノ酸位置８３３−１８２０（配列番号４）としてＵｎｉＰｒｏｔ配列Ｑ１６３６３により特定されおり、及びラミニンα４の５つのモジュールは、ＬＧ１（配列番号５）は、アミノ酸位置８３３−１０３５を含み、ＬＧ２（配列番号６）は、アミノ酸位置１０４７−１２２７を含み、ＬＧ３（配列番号７）は、アミノ酸位置１２３４−１４０２を含み、ＬＧ４（配列番号９）は、アミノ酸位置１４６９−１６４０を含み、及びＬＧ５（配列番号１０）は、アミノ酸位置１６４７−１８２０を含む。いくつかのケースにおいて、当該Ｇドメインは、配列番号４であり得て、その他のケースにおいては、ＵｎｉＰｒｏｔ配列Ｑ１６３６３のアミノ酸位置８３３−１８２０を含むことができる。いくつかのケースにおいて、当該ＬＧ１モジュールは、配列番号５であり得て、その他のケースにおいては、ＵｎｉＰｒｏｔ配列Ｑ１６３６３のアミノ酸位置８３３−１０３５を含むことができる。いくつかのケースにおいて、当該ＬＧ２モジュールは、配列番号６であり得て、その他のケースにおいては、ＵｎｉＰｒｏｔ配列Ｑ１６３６３のアミノ酸位置１０４７−１２２７を含むことができる。いくつかのケースにおいて、当該ＬＧ３モジュールは、配列番号７であり得て、その他のケースにおいては、ＵｎｉＰｒｏｔ配列Ｑ１６３６３のアミノ酸位置１２３４−１４０２を含むことができる。いくつかのケースにおいて、当該ＬＧ４モジュールは、配列番号９であり得て、その他のケースにおいては、ＵｎｉＰｒｏｔ配列Ｑ１６３６３のアミノ酸位置１４６９−１６４０を含むことができる。いくつかのケースにおいて、当該ＬＧ５モジュールは、配列番号１０であり得て、その他のケースにおいては、ＵｎｉＰｒｏｔ配列Ｑ１６３６３のアミノ酸位置１６４７−１８２０を含むことができる。当該ＬＧ１−３モジュール（配列番号８）は、リンカードメインにより、当該ＬＧ４−５モジュール（配列番号１１）に結合される。当該ラミニンα４鎖（またはＬＡＭＡ４、ラミニンサブユニットα４、ラミニン−１４サブユニットアルファ、ラミニン−８サブユニットアルファ、ラミニン−９サブユニットアルファとして知られる）は、２００ｋＤａであり及び最も短い変異体である。そのα１、α２、及びα５と比べて、ラミニンα４は、切断されたＮ末端を有する。ラミニンα４は、成熟期及び成長期の両方に広く分布する。それは、ラミニン−８（ラミニン４１１またはアルファ４／ベータ１／ガンマ１）、ラミニン−９（ラミニン４２１またはアルファ４／ベータ２／ガンマ１）、及びラミニン−１４（ラミニン４１１またはアルファ４／ベータ１／ガンマ１）に存在する。
【０１７１】
文脈から明確でない限り、ラミニンα４若しくはそのフラグメント、ドメイン、またはモジュールの参照には、アイソフォーム及びそれらの対立遺伝子の変異体を含む、天然のヒトアミノ酸配列を含む。例示的なヒト配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｑ１６３６３ならびにＧｅｎＢａｎｋ受入れ番号ＮＰ００１０９８６７６及びＮＰ００１０９８６７７（各々、配列番号１、２、及び３）に指定される。いくつかの抗体は、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ４−５モジュール内のエピトープに結合する。当該エピトープは、ＬＧ４、ＬＧ５、または断片に在り得て、そのためそのエピトープを形成する残基は、ＬＧ４及びＬＧ５の両方の由来である。
【０１７２】
ラミニンα４は、シンデカンの結合相手であると報告されている。例えば、細胞過剰発現のシンデカン−２または−４は、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ４モジュールに結合すると報告されている。Ｍａｔｓｕｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１２２：６１４−６２０（２００４）を参照のこと。シンデカンは、細胞表面にあるヘパラン硫酸の主要な生理的形態を構成する、膜貫通型のヘパラン硫酸プロテオグリカン受容体である。報告されている当該シンデカンタンパク質ファミリー構成員は、４つあり、シンデカン−１（ＳＹＮＤ１、ＳＤＣ１、ＳＤＣ、またはＣＤ１３８として知られる）、シンデカン−２（ＳＹＮＤ２、ＳＤＣ２、フィブログリカン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン核タンパク質、ＨＳＰＧ、ＨＳＰＧ１、及びＣＤ３６２として知られる）、シンデカン−３（ＳＹＮＤ３及びＳＤＣ３として知られる）、及びシンデカン−４（ＳＹＮＤ４、ＳＤＣ４、アンフィグリカン、及びリュードカン核タンパク質として知られる）である。シンデカンは、短い細胞質ドメイン、単一スパンの膜貫通ドメイン、及び細胞外ドメインを有する。それらは、成長因子、サイトカイン、細胞外基質タンパク質に結合すると報告されている。シンデカンは、細胞の成長の調節、分化、血管新生、及びその他のプロセスの中で特に接着を含む、多数の報告された生物学的役割を有する。文脈で明確にしない限り、シンデカン若しくはそのフラグメントまたはドメインの参照には、アイソフォーム及びそれらの対立遺伝子の変異体を含む、天然のヒトアミノ酸配列を含む。例示的なヒト配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ１８８２７（シンデカン−１）、Ｐ３４７４１（シンデカン−２）、Ｏ７５０５６（シンデカン−３）、及びＰ３１４３１（シンデカン−４）（配列番号１２−１５）のそれぞれに指定される。
【０１７３】
ラミニンα４のＧドメインのＬＧ４及びＬＧ５モジュールはまた、グリピカン、ベータグリカン、及びＣＤ４４（例えば、Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ．Ｐ１６０７０）など細胞表面タンパク質、ならびにパールカン（例えば、Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ．Ｐ９８１６０）、アグリン（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ．Ｑ００４６８）、及びＸＶＩＩＩ型コラーゲン（例えば、Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ．Ｐ３９０６０）などの基質タンパク質を含む、その他のヘパラン硫酸プロテオグリカンに結合する。ラミニンα４のＧドメインのＬＧ４−５モジュールの、それらの任意のまたは全てへの、若しくはその他のプロテオグリカンへの結合は、その成長促進特性、炎症、血管新生、及びがんの成長と転移に寄与するであろう。
【０１７４】
ＩＩＩ．がん
前述の標的分子は、がんの発達及び／または進行に関与する。がんは、一般的には、無秩序な細胞成長及び増殖によって特徴づけられる哺乳類における生理学的症状である。がんは、がん予備軍を含む、過剰な細胞成長または増殖からもたらされる、血液悪性腫瘍または固形腫瘍、すなわち細胞の塊であり得る。転移がんは、体の最初に発がんした場所から別の場所へ広がったがんである。転移がん細胞により形成された腫瘍は、転移腫瘍または転移と呼ばれ、それはまた、がん細胞が、体の他の場所に広がるプロセスを指して使用される用語である。一般に、転移がんは、その起源となるがん細胞、または最初のがんと同じ名前及び種類を持つ。例示的な固形腫瘍には、悪性黒色腫、上皮性悪性腫瘍、芽細胞腫、及び肉腫を含む。血液悪性腫瘍には、白血病またはリンパ腫などのリンパ系腫瘍を含む。そのようながんのより特定の例示には、扁平上皮がんまたは上皮性悪性腫瘍、肺がん、腹膜がん、肝細胞がん、消化器がんを含む胃がん、膵がん、神経膠腫、神経膠芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、肝細胞腫、乳がん、大腸がん、直腸がん、大腸がん、子宮体がんや子宮がん、唾液腺がん、腎臓または腎がん、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝がん、肛門がん、陰茎がん、及び頭頸部がんを含む。
【０１７５】
ＩＶ．抗体
Ａ．結合特異的及び機能的特徴
本発明は、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ４−５モジュール内のエピトープに結合する抗体を提供する。例えば、ラミニンα４のＵｎｉＰｒｏｔ配列Ｑ１６３６３で定義される、ＬＧ４（配列番号９）は、アミノ酸位置１４６９−１６４０を含み、ＬＧ５（配列番号１０）は、アミノ酸位置１６４７−１８２０を含み、及びＬＧ４−５（配列番号１１）は、アミノ酸位置１４６９−１８２０を含む。当該エピトープは、ＬＧ４、ＬＧ５、または断片に在り得て、そのためそのエピトープを形成する残基は、両ＬＧ４及びＬＧ５由来である。当該エピトープは、位置１４６９−１５１９、１５２０−１５７０、１５７１−１６２１、１６２２−１６７２、１６７３−１７２３、１７２４−１７７４、及び１７７５−１８２０の範囲にあるラミニンα４のＵｎｉＰｒｏｔ配列Ｑ１６３６３由来のセグメントなどの、ＬＧ４−５内の特定のセグメントに在り得る。当該エピトープは、例えば、ＬＧ４、ＬＧ５、ＬＧ４−５、若しくは先に特定されたセグメントまたは隣接セグメントのペアーのいずれかの由来の、２−５、３−５、３−１０、３−１５、３−２０、５−１０、５−１５、または５−２０位置の連続するアミノ酸のエピトープなどの、直鎖状であり得る。当該エピトープはまた、例えば、ＬＧ４、ＬＧ５、ＬＧ４−５の任意の組み合わせ、及び先に特定されたセグメントのいずれかの由来の、２−５、３−５、３−１０、３−１５、３−２０、５−１０、５−１５、または５−２０位置の非連続アミノ酸を含む、立体構造エピトープであり得る。
【０１７６】
１５Ｆ７、６Ｃ１２、及び１３Ｇ１０と指定した抗体は、３つのそのような例示的なマウス抗体である。これら３つのモノクロナル抗体は各々、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ４及び／またはＬＧ５モジュール内のエピトープに特異的に結合する。これらの抗体はさらに、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ１−３モジュールへの著しい結合の欠如（ＬＧ１−３モジュールに特異的な抗体と比べて、無関係な対照抗体として、実験誤差内で同じか、または少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、または１０倍少ない（例えば、フローサイトメトリー結合アッセイによる測定で）結合）により特徴づけられる。いくつかの抗体は、その他のラミニンアルファ鎖、例えば、ラミニンα１、ラミニンα２、ラミニンα３、及びラミニンα５（関連するその他のラミニンアルファ鎖に特異的な抗体と比べて、無関係な対照抗体として、実験誤差内で同じか、または少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、または１０倍少ない（例えば、フローサイトメトリー結合アッセイによる測定で）結合）への著しい結合の欠如により特徴づけられる。いくつかの抗体はさらに、実施例２に黒色腫サンプルで示すように、対照サンプルと比較した場合（その生体サンプルへの当該抗体の結合が、その対照サンプルへのその抗体の結合より、少なくとも１．５倍、２倍、５倍、または１０倍大きい）、がん細胞（例えば、腫瘍組織のサンプル）を含む生体サンプルに選択的に結合するそれら抗体の能力により特徴づけられる。好ましくは、当該対照サンプル及び当該生体サンプルが、同じ組織由来の細胞を含む。特定のタンパク質、モジュール、またはドメインへ結合する能力は、実施例に示される例示的なアッセイ様式を使用して証明することができる。同様に、選択的結合及び腫瘍組織の染色能力は、実施例に示される例示的なアッセイ様式を使用して証明することができる。
【０１７７】
ＬＧ４−５内に結合するいくつかの抗体は、ＭＣＡＭ（すなわち、無関係な対照抗体と、実験誤差内で同じ阻害の程度）へのラミニンα４の結合を阻害する能力を欠いている。いくつかの抗体は、シンデカン−１、シンデカン−２、シンデカン−３、またはシンデカン−４などのシンデカンへのラミニンα４の結合を阻害する。いくつかの抗体は、グリピカン、ベータグリカン、及びＣＤ４４のいずれかをまたは全てを含む複数のその他の細胞表面タンパク質、ならびにパールカン、アグリン、及びＸＶＩＩＩ型コラーゲンなどの基質タンパク質を含む、その他のヘパラン硫酸プロテオグリカンへの、ラミニンα４の結合を阻害する。本開示の抗体のいくつかは、これらのプロテオグリカンのいずれかまたは全てへの、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ４−５モジュールの結合を阻害でき、及びその結果またはそれ以外の場合は、血管新生、炎症、がんの成長と転移を阻害する。
【０１７８】
ラミニンα４の結合相手、例えば、シンデカンまたはその他のプロテオグリカンへの結合の阻害は、抗体を、組換えラミニンα４タンパク質、ラミニンα４陽性組織、またはラミニンα４表示細胞と予備培養し、その後、組換えプロテオグリカンまたはプロテオグリカン発現細胞の、ラミニンα４への結合能力を評価する結合アッセイで試験できる。任意で、試験抗体の阻害は、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ４−５モジュールを結合しない無関係な対照抗体との比較で、またはいずれの抗体も持たない賦形剤との比較で証明できる。
【０１７９】
いくつかの抗体は、がん細胞のラミニンα４媒介の細胞接着、好ましくはラミニンα４のＧドメインのＬＧ４−５モジュールにより媒介された細胞接着を阻害する能力を有する。例示的な細胞接着アッセイを、実施例に記述する。
【０１８０】
いくつかの抗体はまた、ラミニンα４誘発のｐＡｋｔ活性化を阻害する能力を有する。例示的なアッセイを、実施例に記述する。
【０１８１】
阻害は、ラミニンα４の、単独またはシンデカンとの組み合わせによる、結合、細胞接着及び／またはその他の機能的活性、またはその機能的活性のいずれかへのその他の寄与（例えば、その他のプロテオグリカン）の、少なくとも１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、または７５％（例えば、１０％−７５％または３０％−７０％）の阻害を意味する。阻害は一般に、その抗体が、約２０ｕｇ／ｍｌの濃度で存在する場合に、証明できる。当該抗体は、例えば、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ４−５モジュールにより媒介された細胞接着などの、ラミニンα４媒介の細胞接着の少なくとも３０％の阻害を示すことができる。
【０１８２】
好ましい抗体は、がん細胞の発達若しくは進行、または、動物モデルや臨床試験で示される転移などの、それらのあらゆる側面を阻害する。ヒトがん細胞を免疫不全の実験動物に注入する場合のがんの動物モデル、若しくは実験動物がヒト腫瘍遺伝子を発現するか、または腫瘍阻害遺伝子をノックアウトされた場合の形質転換モデルが、広く利用可能である。さらに、がん細胞の特定の性質に対応した細胞に基づくアッセイ、例えば、増殖アッセイ、成長アッセイ、生存分析、移行アッセイ、浸潤アッセイ、及びその他のアッセイなどが、広く利用可能である。
【０１８３】
いくつかの抗体は、１５Ｆ７、６Ｃ１２、または１３Ｇ１０に指定された抗体と、同じかまたは重なったエピトープに結合する。これら抗体の重鎖及び軽鎖の成熟した可変領域の配列は、各々配列番号１６及び１７、２６及び２７、ならびに３６／３７及び３８に指定される。６Ｃ１２の軽鎖の成熟した可変領域の別のバージョンは、配列番号９４である。そのような結合特異性を有するその他の抗体は、任意で、１５Ｆ７、６Ｃ１２、または１３Ｇ１０との競合において、ラミニンα４を伴う免疫マウス、または望ましいエピトープを含むそれらの部分、及びラミニンα４のＧドメインのＬＧ４−５モジュールへの結合をもたらした抗体の選別により産生できる。そのようなアッセイにより特定された抗体は次いで、実施例に記述されるかまたはその他の場合において、ラミニンα４のＧドメインの、ＬＧ１−３モジュールではなく当該ＬＧ４−５モジュールへの特異的結合の能力に対して選別できる。抗体はまた、実施例に記述されるかまたはその他の場合において、腫瘍細胞の選択的染色能力に対して選別できる。抗体はまた、実施例に記述されるかまたはその他の場合において、ラミニンα４媒介の腫瘍細胞接着の能力に対して選別できる。
【０１８４】
１つ以上の特定された残基を含むエピトープを結合する抗体は、それらの１つ以上の残基を含むラミニンα４のフラグメントで免疫化することにより生成できる。当該フラグメントは、例えば、配列番号１１由来の１００、５０、２５、１０または５未満の連続したアミノ酸を有することができる。そのようなフラグメントは通常、配列番号１１由来の少なくとも５、６、７、８または９の連続した残基を有する。当該フラグメントは、そのフラグメントの抗体応答を引き出す手助けをする、及び／またはそのような応答を引き出す手助けをする補強剤と組み合わせたキャリアに連結できる。あるいは、望ましい残基に結合する抗体は、完全長のラミニンα４（配列番号１）または完全長のラミニンα４のＧドメイン（配列番号４）またはラミニンα４のＧドメインのＬＧ４−５モジュール（配列番号１１）若しくはそれらの任意のグラグメントで免疫化することにより得ることができる。そのような抗体は次いで、ＬＧ１−３、ＬＧ１−５、ＬＧ４−５、ＬＧ４、またはＬＧ５（各々配列番号８、４、１１、９、及び１０）などの、Ｇドメインの異なるＬＧモジュールを含むラミニンα４のバージョンに異なって結合するためか、または特定残基の変異体との比較で、野生型ラミニンα４に異なって結合するために選別できる。Ｇドメインの異なるＬＧモジュールを伴うラミニンα４のバージョンに対抗する選別で、ラミニンα４のＧドメイン内の特定のＬＧモジュールに結合する抗体をマッピングする。変異体に対する選別で、特定残基の突然変異生成により、その結合が阻害され、及びその他の例示した抗体の阻害因子特性を分かちやすい抗体の識別を可能にする結合特異性を、より正確に定める。
【０１８５】
選択されたマウス抗体（例えば、１５Ｆ７、６Ｃ１２、または１３Ｇ１０）の結合特異性を有するヒト抗体はまた、ファージ表示法の変異体を使用して産生できる。Ｗｉｎｔｅｒ、ＷＯ９２／２０７９１を参照。この方法は、ヒト抗体の産生に特に適切である。この方法において、選択されたマウス抗体の重鎖または軽鎖可変領域のいずれかが、開始物質として使用される。例えば、仮に軽鎖の可変領域が、開始物質として選択された場合、同じ軽鎖可変領域（すなわち、そのマウス開始物質）及び異なる重鎖可変領域を示す構成員によるファージライブラリーが構成される。その重鎖可変領域は、例えば、再編成されたヒトの重鎖可変領域のライブラリーから得ることができる。ラミニンα４のＧドメインのＬＧ４−５モジュールに対して、強力な特異的結合（例えば、少なくとも１０８及び好ましくは１０９Ｍ−１）を示すファージが選択される。次いで、このファージからの重鎖可変領域は、さらなるファージライブラリーの構築に対して、開始物質としての役割を果たす。このライブラリーにおいて、各ファージは、同じ重鎖可変領域（すなわち、その第一表示ライブラリーから特定された領域）及び異なる軽鎖可変領域を示す。この軽鎖可変領域は、例えば、再編成されたヒトの軽鎖可変領域のライブラリーから得ることができる。再び、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ４−５モジュールに対して、強力な特異的結合を示すファージが選択される。もたらされた抗体は通常、マウス開始物質と同じかまたは類似のエピトープ特異性を有する。
【０１８６】
その他の抗体を、１５Ｆ７、６Ｃ１２、または１３Ｇ１０などの例示的抗体の重鎖及び軽鎖をコードするｃＤＮＡの突然変異生成により得ることができる。成熟した重鎖及び／または軽鎖の可変領域のアミノ酸配列において、１５Ｆ７、６Ｃ１２、または１３Ｇ１０と、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり、及びその機能的特徴を保持しており、及び／またはそれぞれの抗体とは、少量の、機能的に重要ではないアミノ酸置換（例えば、保存置換）、欠損、または挿入により異なる、モノクローナル抗体をまた、本発明に含める。相応する１５Ｆ７、６Ｃ１２、または１３Ｇ１０と、９０％、９５％、９９％、または１００％同一である、Ｋａｂａｔにより定められる少なくも１つまたは６つ全てのＣＤＲを有するモノクローナル抗体をまた、本発明に含める。
【０１８７】
本発明はまた、１５Ｆ７、６Ｃ１２、または１３Ｇ１０由来のＣＤＲのいくつかをまたは全てを（例えば、３、４、５、または６）全体としてまたは実質的に有する抗体を提供する。そのような抗体は、１５Ｆ７、６Ｃ１２、または１３Ｇ１０の重鎖可変領域由来の少なくとも２つの、及び３つ全てのＣＤＲの全体をまたは実質的に有する重鎖可変領域、及び／または１５Ｆ７、６Ｃ１２、または１３Ｇ１０の軽鎖可変領域由来の少なくとも２つの、及び３つ全てのＣＤＲの全体をまたは実質的に有する軽鎖可変領域を含むことができる。当該抗体は、重鎖及び軽鎖を共に含むことができる。ＣＤＲは実質的に、ＣＤＲＨ２（Ｋａｂａｔにより定められる）が、６、５、４、３、２、または１未満の置換、挿入、または欠損を有することができる場合を除き、ＣＤＲが４、３、２、または１未満の置換、挿入、または欠損を含む場合、相応する１５Ｆ７、６Ｃ１２、または１３Ｇ１０のＣＤＲ由来である。そのような抗体は、成熟した重鎖及び／または軽鎖の可変領域のアミノ酸配列において、１５Ｆ７、６Ｃ１２、または１３Ｇ１０と、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有し、及びその機能的特徴を保持し、及び／または少量の、機能的に重要ではないアミノ酸置換（例えば、保存置換）、欠損、または挿入により、１５Ｆ７、６Ｃ１２、または１３Ｇ１０とは異なることができる。
【０１８８】
Ｂ．非ヒト抗体
ラミニンα４のＧドメインのＬＧ４−５モジュールに対抗する、その他の、例えば、マウス、モルモット、霊長類、ウサギやラットの非ヒト抗体は、例えば、ラミニンα４またはそのグラグメントでその動物を免疫化することにより、達成できる。Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（ＣＳＨＰ  ＮＹ，１９８８）を参照のこと（全ての目的に対して、参照として組み込む）。そのような免疫源は、天然の供給源から、ペプチド合成により、または組換え発現により得ることができる。任意で、当該免疫源は、キャリアタンパク質と融合してまたは複合して、投与できる。任意で、当該免疫源は、補強剤と共に投与できる。複数種類の補強剤が、以下の記述のように使用できる。完全フロイントアジュバント、それに続く不完全フロイントアジュバントが、実験動物の予防接種のために好まれる。ウサギまたはモルモットが、ポリクローナル抗体を作るため通常使用される。ポリクローナル抗体を作るため、マウスが通常使用される。抗体は、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ４−５モジュールへの特異的結合のために選別される。そのような選別は、ＧドメインのＬＧ１−３モジュール、ＧドメインのＬＧ１−５モジュール、ＧドメインのＬＧ４−５モジュールを含むラミニンα４変異体などの、回収したラミニンα４変異体への抗体の結合を決定することで、及びその抗体へのラミニンα４変異体の結合を決定することにより達成できる。結合は、例えば、ウェスタンブロット法、ＦＡＣＳまたはＥＬＩＳＡにより評価できる。
【０１８９】
Ｃ．ヒト化抗体
ヒト化抗体は、非ヒト「ドナー」抗体由来のＣＤＲが、ヒト「受容体」抗体の配列に移植された、一般的には人工的に作られた抗体である（例えば、Ｑｕｅｅｎ，米国特許第５，５３０，１０１号及び第５，５８５，０８９号、Ｗｉｎｔｅｒ，米国特許第５，２２５，５３９号、Ｃａｒｔｅｒ，米国特許第６，４０７，２１３号、Ａｄａｉｒ，米国特許第５，８５９，２０５号、６，８８１，５５７号Ｆｏｏｔｅ，米国特許第６，８８１，５５７号を参照）。その受容体抗体配列は、例えば、成熟したヒト抗体配列、そのような配列の合成物、ヒト抗体配列のコンセンサス配列、または生殖領域配列であり得る。したがって、ヒト化抗体は、全体的にまたは実質的にドナー抗体由来のいくつかのまたは全てのＣＤＲ、ならびに、仮に存在するなら、全体的にまたは実質的にヒト抗体配列由来の、可変領域のフレームワーク配列及び定常領域を有する抗体である。同様に、ヒト化重鎖は、全体的にまたは実質的にドナー抗体の重鎖由来の１つ、２つ及び通常３つ全てのＣＤＲ、ならびに、仮に存在するなら、実質的にヒト重鎖可変領域のフレームワーク及び定常領域配列由来の、重鎖可変領域のフレームワーク配列及び重鎖定常領域を有する。同様に、ヒト化軽鎖は、全体的にまたは実質的にドナー抗体の軽鎖由来の１つ、２つ及び通常３つ全てのＣＤＲ、ならびに、仮に存在するなら、実質的にヒト軽鎖可変領域のフレームワーク及び定常領域配列由来の、軽鎖可変領域のフレームワーク配列及び軽鎖定常領域を有する。ナノボディー及びｄＡｂ以外の、ヒト化抗体は、ヒト化重鎖及びヒト化軽鎖を含む。ヒト化抗体のＣＤＲは、（Ｋａｂａｔにより定められる）相応する残基の少なくとも８５％、９０％、９５％または１００％が、各々のＣＤＲ間で同一である場合、実質的に非ヒト抗体における相応するＣＤＲ由来である。抗体鎖の可変領域のフレームワーク配列または抗体鎖の定常領域は、Ｋａｂａｔにより定められる相応する残基の少なくとも８５％、９０％、９５％または１００％が同一である場合、実質的に各々、ヒト可変領域のフレームワーク配列またはヒト定常領域である。
【０１９０】
ヒト化抗体はしばしば、マウス抗体由来の（好ましくはＫａｂａｔにより定められる）６つすべてのＣＤＲを組み込むが、それらは、マウス抗体由来の全てのＣＤＲ以下でも（例えば、少なくとも３、４、または５つのＣＤＲ）作ることができる（例えば、Ｐａｓｃａｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：３０７６，２００２、Ｖａｊｄｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３２０：４１５−４２８，２００２、Ｉｗａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：１０７９−１０９１，１９９９、  Ｔａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１６４：１４３２−１４４１，２０００）。
【０１９１】
いくつかの抗体において、そのＣＤＲの部分だけが、つまり、ＳＤＲと呼ばれる、結合に必要なＣＤＲ残基のサブセットが、ヒト化抗体において結合を保持するために必要である。抗原に接触せず及びそのＳＤＲに存在しないＣＤＲ残基は、従来の研究を基に（例えば、ＣＤＲ  Ｈ２のＨ６０−Ｈ６２の残基は、しばしば必要ではない）、Ｃｈｏｔｈｉａ超可変ループの外側に位置するＫａｂａｔのＣＤＲ領域から（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１，１９８７）、分子モデリングによって及び／または経験的に、若しくはＧｏｎｚａｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４１：８６３，２００４に記述のように、特定することができる。そのようなヒト化抗体において、１つ以上のドナーＣＤＲ残基が不在の位置、またはドナーＣＤＲ全体が除外されている位置では、その位置を占めるアミノ酸は、その受容体抗体配列において、対応する位置（Ｋａｂａｔ番号規則による）を占めているアミノ酸であり得る。含めるべき当該ＣＤＲのドナーアミノ酸に対応した、受容体のそのような置換の数は、競合状態のバランスを反映する。そのような置換は、ヒト化抗体のマウスアミノ酸の数を減らし及びその結果として潜在的な免疫原性を減らすことになり、潜在的に有利である。しかしながら、置換はまた親和性の変化を引き起こので、親和性の著しい低下を、好ましくは避ける。ＣＤＲ内の置換の位置及び置換をするためのアミノ酸はまた、経験的に選択できる。
【０１９２】
当該ヒト受容体の抗体配列は、任意で、ヒト受容体配列の可変領域フレームワークとドナー抗体鎖の相応する可変領域フレームワーク間の高い配列同一性（例えば、６５−８５％の同一性）を与える、多数の公知のヒト抗体から選択できる。
【０１９３】
当該重鎖に対応する受容体配列の例示には、ＮＣＢＩ受入れコードＡＣＦ３６８５７．１及びＢＡＣ０１５３０．１（各々、配列番号５１及び５２）による、ヒト成熟重鎖可変領域がある。ＡＣＦ３６８５７．１及びＢＡＣ０１５３０．１のその他のバージョンは、各々、配列番号９６及び９７である。これらの受容体配列には、マウス１５Ｆ７の重鎖と同じ基準形態を有する２つのＣＤＲを含む。当該軽鎖に対応する受容体配列の例示には、ＮＣＢＩ受入れコードＡＡＹ３３３５０．１及びＢＡＣ０１５８３．１（各々、配列番号５３及び５４）による、ヒト成熟軽鎖可変領域がある。ＢＡＣ０１５８３．１の別バージョンは、配列番号９８である。これらの受容体配列には、マウス１５Ｆ７の軽鎖と同じ標準形態を有する３つのＣＤＲを含む。
【０１９４】
当該ヒト可変領域のフレームワークの残基由来の特定アミノ酸は、ＣＤＲ構造及び／または抗原への結合における、それらの可能な影響力に基づいて、置換で選択できる。そのような可能な影響力の検討は、モデリング、特定位置のアミノ酸特性の検討、または特定アミノ酸の置換若しくは突然変異生成の影響の経験的な観察により行われる。
【０１９５】
例えば、アミノ酸が、マウスの可変領域のフレームワーク残基と、選択されたヒト可変領域のフレームワーク残基の間で異なる場合、そのヒトのフレームワークのアミノ酸は、そのアミノ酸が、
（１）抗原を、直接に非共有的に結合する、
（２）Ｋａｂａｔではなく、Ｃｈｏｔｈｉａにより定義されるＣＤＲ領域に隣接するかまたはＣＤＲ内である、（
３）さもなければ、ＣＤＲ領域と相互作用する（例えば、ＣＤＲ領域の約６Å以内である）（例えば、同種であるとして公知の免疫グロブリン鎖の溶解された構造における、軽鎖及び重鎖のモデリングにより特定される）または
（４）ＶＬ−ＶＨ相互作用に参加する残基である、と合理的に考えられる場合、そのマウス抗体由来の等価のフレームワークアミノ酸により置換できる。
【０１９６】
Ｑｕｅｅｎ，米国特許第５，５３０，１０１号により定義される、クラス（１）から（３）のフレームワーク残基は、時として互換的に、標準及びバーニア化残基と呼ばれる。ＣＤＲループ構造を定義するのに役立つフレームワーク残基は、時として、標準残基と呼ばれる（Ｃｈｏｔｈｉａ  ＆  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）；Ｔｈｏｒｎｔｏｎ  ＆  Ｍａｒｔｉｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：８００−８１５（１９９６））。抗原結合ループ構造を支え、及び抗体の抗原への適合を微調整する役割を果たすフレームワーク残基は、時として、バーニア化残基と呼ばれる（Ｆｏｏｔｅ  ＆  Ｗｉｎｔｅｒ，  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｖｉｏｌ  ２２４：４８７−４９９（１９９２））。
【０１９７】
置換の候補であるその他のフレームワーク残基は、潜在的なグリコシル化部位をつくる残基である。置換のためのさらなるその他の残基は、その位置におけるヒト免疫グロブリンに対して稀な、受容体ヒトフレームワークアミノ酸である。これらのアミノ酸は、マウスドナー抗体の等価位置由来の、またはより一般的なヒト免疫グロブリンの等価位置由来のアミノ酸で置換できる。
【０１９８】
例示的なヒト化抗体は、Ｈｕ１５Ｆ７に指定される、マウス１５Ｆ７抗体のヒト化形態である。このマウス抗体は、各々配列番号１６及び１７を含むアミノ酸配列を有する、成熟した重鎖及び軽鎖可変領域を含む。本発明は、２つの例示的なヒト化成熟重鎖可変領域である、Ｈｕ１５Ｆ７ＶＨｖ１（Ｈ１；配列番号５７）及びＨｕ１５Ｆ７ＶＨｖ２（Ｈ２；配列番号５８）を提供する。本発明は、２つの例示的なヒト成熟軽鎖可変領域である、Ｈｕ１５Ｆ７ＶＬｖ１（Ｌ１；配列番号５９）及びＨｕ１５Ｆ７ＶＬｖ２（Ｌ２；配列番号６０）を提供する。
【０１９９】
ＣＤＲ構造及び／または抗原への結合における可能な影響、重鎖と軽鎖間の相互作用の仲介、定常領域との相互作用、必要なまたは不要な翻訳後修飾の部位であること、ヒト可変領域配列におけるその位置に対してまれな残基であり、したがって潜在的免疫原性である、潜在的な凝集になりつつある、及びその他の理由などの理由から、次の２０の可変領域フレームワークの位置を、実施例においてさらに特定されるが、その２つの例示的な成熟した軽鎖可変領域及び２つの例示的な成熟した重鎖可変領域における置換の候補である考えた。Ｌ８（Ｐ８Ｓ）、Ｌ４２（Ｋ４２Ｎ）、Ｌ４５（Ｋ４５Ｒ）、Ｌ４９（Ｙ４９Ｓ）、Ｌ６９（Ｔ６９Ｋ）、Ｌ８０（Ｐ８０Ｔ）、Ｈ１（Ｑ１Ｅ）、Ｈ２０（Ｖ２０Ｌ）、Ｈ２７（Ｇ２７Ｙ）、Ｈ３０（Ｓ３０Ｔ）、Ｈ３８（Ｒ３８Ｋ）、Ｈ４０（Ａ４０Ｒ）、Ｈ４１（Ｐ４１Ａ）、Ｈ４８（Ｍ４８Ｉ）、Ｈ６６（Ｒ６６Ｋ）、Ｈ６７（Ｖ６７Ａ）、Ｈ６９（Ｉ６９Ｌ）、Ｈ７５（Ｔ７５Ｓ）、Ｈ８２Ａ（Ｓ（８２Ａ）Ｒ）、及びＨ９１（Ｙ９１Ｆ）。さらに、Ｌ１０４（Ｌ１０４Ｖ）を、当該２つの提示的なヒト成熟軽鎖可変領域における置換の候補と考えた。
【０２００】
ここで、他の場所として、最初に言及した残基は、ＫａｂａｔＣＤＲのヒト受容体フレームワークへのグラフト化により形成されたヒト化抗体の残基であり、及び２番目に言及した残基は、そのような残基の置き換えに考慮される残基である。したがって、可変領域のフレームワーク内にある、１番目に言及した残基は、ヒトで、ＣＤＲ内にある、１番目に言及した残基は、マウスである。
【０２０１】
例示的な抗体には、当該例示的な重鎖及び軽鎖の可変領域の、任意の順列または組み合わせを含む（例えば、ＶＨｖ１／ＶＬｖ１またはＨ１Ｌ１、ＶＨｖ１／ＶＬｖ２またはＨ１Ｌ２、ＶＨｖ２／ＶＬｖ１またはＨ２Ｌ１、及びＶＨｖ２／ＶＬｖ２またはＨ２Ｌ２）。例えば、そのＨ１Ｌ１抗体は、以下に記述のように、１４の重鎖の逆突然変異またはその他の突然変異及び６の軽鎖の逆突然変異を含み、ラミニンα４に結合し、及び実質的にキメラ１９Ｃ１２抗体と同じか、優れてはいないレベルで、ラミニンα４に結合しているＭＣＡＭを阻害する（図８−１０参照）。比較結果を、Ｈ１Ｌ２、Ｈ２Ｌ１、及びＨ２Ｌ２抗体と共に示す（図８−１０参照）。
【０２０２】
本発明は、当該ヒト化成熟重鎖可変領域が、Ｈ１（配列番号５７）に対し、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を示し、及び当該ヒト化成熟軽鎖可変領域が、Ｌ１（配列番号５９）に対し、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を示す、当該Ｈ１Ｌ１ヒト化１５Ｆ７抗体の変異体を提供する。いくつかのそのような抗体において、Ｈ１Ｌ１における、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０すべての逆突然変異またはその他の突然変異は、保持される。本発明はまた、当該ヒト化成熟重鎖可変領域が、Ｈ２（配列番号５８）に対し、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を示し、及び当該ヒト化成熟軽鎖可変領域が、Ｌ１（配列番号５９）に対し、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を示す、当該Ｈ２Ｌ１ヒト化１５Ｆ７抗体の変異体を提供する。いくつかのそのような抗体において、Ｈ２Ｌ１における、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８すべての逆突然変異またはその他の突然変異は、保持される。いくつかの抗体において、当該Ｖｈ領域における、位置Ｈ１、Ｈ２０、Ｈ２７、Ｈ３０、Ｈ３８、Ｈ４０、Ｈ４８、Ｈ６６、Ｈ６７、Ｈ７５、Ｈ８２Ａ、及びＨ９１の少なくとも１つは、各々Ｅ、Ｌ、Ｙ、Ｔ、Ｋ、Ｒ、Ｉ、Ｋ、Ａ、Ｓ、Ｒ、及びＦにより占められる。いくつかの抗体において、当該Ｖｈ領域における、位置Ｈ１、Ｈ２０、Ｈ２７、Ｈ３０、Ｈ３８、Ｈ４０、Ｈ４８、Ｈ６６、Ｈ６７、Ｈ７５、Ｈ８２Ａ、及びＨ９１は、バージョンＨ２などの、各々Ｅ、Ｌ、Ｙ、Ｔ、Ｋ、Ｒ、Ｉ、Ｋ、Ａ、Ｓ、Ｒ、及びＦにより占められる。いくつかの抗体において、当該Ｖｈ領域における、位置Ｈ４１及びＨ６９の少なくとも１つは、各々Ａ及びＬにより占められる。いくつかの抗体において、当該Ｖｈ領域における、位置Ｈ４１及びＨ６９は、バージョンＨ１などの、各々Ａ及びＬにより占められる。いくつかの抗体において、当該Ｖｋ領域における、位置Ｌ４２、Ｌ４９、及びＬ６９の少なくとも１つは、各々Ｎ、Ｓ、及びＫにより占められる。いくつかの抗体において、当該Ｖｋ領域における、位置Ｌ４２、Ｌ４９、及びＬ６９は、バージョンＬ２などの、各々Ｎ、Ｓ、及びＫにより占められる。いくつかの抗体において、当該Ｖｋ領域における、位置Ｌ８、Ｌ４５、及びＬ８０の少なくとも１つは、各々Ｓ、Ｒ、及びＴにより占められる。いくつかの抗体において、当該Ｖｋ領域における、位置Ｌ８、Ｌ４５、Ｌ８０、及びＬ１０４の少なくとも１つは、各々Ｓ、Ｒ、Ｔ、及びＶにより占められる。いくつかの抗体において、当該Ｖｋ領域における、位置Ｌ８、Ｌ４５、及びＬ８０は、バージョンＬ１などの、各々Ｓ、Ｒ、及びＴにより占められる。いくつかの抗体において、Ｌ１０４は、バージョンＬ２などの、Ｖにより占められる。そのようなヒト化抗体のＣＤＲ領域は、Ｈ１Ｌ１のＣＤＲ領域と同一かまたは実質的に同一であり得て、マウスドナー抗体のそれらと同じである。当該ＣＤＲ領域は、任意の従来の定義（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ）により、しかし好ましくはＫａｂａｔにより定義され得る。
【０２０３】
本発明はまた、その他の例示的なＨｕ１５Ｆ７抗体の変異体を提供する。そのような変異体は、例示的なヒト化１５Ｆ７のＨ１Ｌ２、Ｈ２Ｌ１、またはＨ２Ｌ２の成熟した軽鎖及び重鎖可変領域に、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を示す、成熟した軽鎖及び重鎖可変領域を有する。そのようなヒト化抗体のＣＤＲ領域は、マウスドナー抗体のそれらと、同一であるかまたは実質的に同一であり得る。当該ＣＤＲ領域は、任意の従来の定義（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ）により、しかし好ましくはＫａｂａｔにより定義され得る。可変領域のフレームワーク位置は、特に明示しない限り、Ｋａｂａｔ番号規則に従う。その他のそのような変異体は通常、少ない数（例えば、通常は１、２、３、５、１０、または１５未満）の交換、欠損または挿入により、例示的なＨｕ１５Ｆ７抗体の配列とは異なる。そのような差異は、通常はそのフレームワークにあり、しかしまたそのＣＤＲにもあり得る。
【０２０４】
ヒト化１５Ｆ７変異体の可能性のある追加の変異は、その可変領域のフレームワークにおける追加の逆突然変異である。ヒト化ｍＡｂにおけるＣＤＲとの接触がない多数のフレームワーク残基は、ドナーマウスｍＡｂまたはヒト抗体の相応する位置のアミノ酸置換に対応でき、及び多数の潜在的なＣＤＲ接触残基でさえも、置換を受け入れる。ＣＤＲ内のアミノ酸でさえも、例えば、可変領域のフレームワークを供給するために使用する、ヒト受容体配列の相応する位置に見出せる残基で変更されて良い。さらに、代替ヒト受容体配列が、例えば、その重鎖及び／または軽鎖のために使用できる。仮に異なる受容体配列を使用する場合、その対応するドナーと受容体残基が、逆突然変異なしで既に同じならば、先に推奨の１つ以上の逆突然変異が、実施されなくて良い。
【０２０５】
好ましくは、Ｈｕ１５Ｆ７の交換または逆突然変異が（保存のあるなしに関わらず）、当該ヒトｍＡｂの結合親和力または効力に、すなわち、ラミニンα４またはラミニンα４のＧドメインのＬＧ４−５モジュールへの結合能力に、実質的に影響しない（例えば、変異体ヒト化１５Ｆ７抗体の本事例において記載のいくつかのまたは全てのアッセイにおける効力が、マウス１５Ｆ７またはＨ１Ｌ１のそれと、実験誤差内で、本質的に同じ）。
【０２０６】
Ｄ．キメラ及びバーニア化抗体
本発明はさらに、非ヒト抗体、特に当該例示の１５Ｆ７、６Ｃ１２、または１３Ｇ１０抗体のキメラ及びバーニア化形態を提供する。
【０２０７】
キメラ抗体は、非ヒト抗体（例えば、マウス）の成熟した重鎖及び軽鎖の可変領域を、ヒトの重鎖及び軽鎖の定常領域と組み合わせた抗体である。そのような抗体は実質的にまたは全体的に、そのマウス抗体の結合特性を保持しており、及びおおよそ３分の２がヒト配列である。
【０２０８】
バーニア化抗体は、そのＣＤＲのいくつか及び通常は全て、ならびに非ヒト抗体の非ヒト可変領域フレームワーク残基のいくつかを保持し、しかしＢ−またはＴ−細胞エピトープ、例えば暴露された残基（Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９，１９９１）に寄与するであろう、その他の可変領域のフレームワーク残基を、ヒト抗体配列の相応する位置の残基で交換した、ヒト化抗体の１つの型である。その結果、そのＣＤＲが、全体としてまたは実質的に非ヒト抗体由来であり、及びその非ヒト抗体の可変領域のフレームワークが、その置換によりよりヒト化された抗体である。当該１５Ｆ７抗体のバーニア化形態を、本発明に含む。
【０２０９】
Ｅ．ヒト抗体
ラミニンα４のＧドメインのＬＧ４−５モジュールに対抗するヒト抗体を、以下に記述の多様な技術により提供する。いくつかのヒト抗体を、実施例に記載のマウスモノクローナル抗体の１つなどの、特定のマウス抗体と同じエピトープ特異性を持つように、競合結合性実験により、あるいは、前述の、Ｗｉｎｔｅｒのファージ表示法により選定する。ヒト抗体はまた、標的抗原としての、ＧドメインのＬＧ４−５モジュールだけを含むラミニンα４変異体などの、ラミニンα４のフラグメントだけを使用して、及び／またはＧドメインのＬＧ１−３モジュール、ＧドメインのＬＧ１−５モジュール、及びＧドメインのＬＧ４−５モジュールを含むラミニンα４変異体などの、ラミニンα４変異体の集合に対抗する抗体の選別により、特定のエピトープ特異性に対して選別できる。
【０２１０】
ヒト抗体を産生する方法には、Ｏｅｓｔｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ２：３６１−３６７（１９８３）のトリオーマ法、Ｏｅｓｔｂｅｒｇ，米国特許第  ４，６３４，６６４号、及びＥｎｇｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，６３４，６６６号、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含む遺伝子導入マウスの利用、（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ９３／１２２２７（１９９３）、米国特許第５，８７７，３９７号、米国特許第５，８７４，２９９号、米国特許第５，８１４，３１８号、米国特許第５，７８９，６５０号、米国特許第５，７７０，４２９号、米国特許第５，６６１，０１６号、米国特許第５，６３３，４２５号、米国特許第５，６２５，１２６号、米国特許第５，５６９，８２５号、米国特許第５，５４５，８０６号、Ｎａｔｕｒｅ  １４８，１５４７−１５５３（１９９４）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，８２６（１９９６）、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ，  ＷＯ  ９１／１０７４１（１９９１）を参照）、ならびにファージ示法（例えば、Ｄｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ  ９１／１７２７１及びＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ  ９２／０１０４７、米国特許第５，８７７，２１８号、米国特許第５，８７１，９０７号、米国特許第５，８５８，６５７号、米国特許第５，８３７，２４２号、米国特許第５，７３３，７４３号及び米国特許第５，５６５，３３２号を参照）を含む。
【０２１１】
Ｆ．定常領域の選定
キメラ、ヒト化（バーニア化を含む）、またはヒト抗体の重鎖及び軽鎖可変領域は、少なくともヒトの定常領域部分に連結できる。当該定常領域の選択は、部分的に、抗体依存の補体であるかどうか及び／または細胞媒介の細胞毒性が必要かどうかに依存する。例えば、ヒトアイソタイプのＩｇＧ１及びＩｇＧ３は、補体媒介細胞毒性を有し、及びヒトアイソタイプのＩｇＧ２及びＩｇＧ４は、有しない。ヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ３は、ヒトＩｇＧ２及びＩｇＧ４に比べて、より強い細胞媒介エフェクター機能を含む。当該抗体への包含に適したヒトＩｇＧ１の定常領域は、配列番号６１の配列を有することができる。そのヒトＩｇＧ１の定常領域が、配列番号９１のアミノ酸配列を有する場合、配列番号６１のＣ末端リシンを排除できる。軽鎖の定常領域は、ラムダまたはカッパであり得る。当該抗体への包含に適したヒトカッパ軽鎖定常領域は、配列番号９０の配列を有することができる。配列番号９０は、配列番号９３の核酸配列によりコードされ得る。そのカッパ軽鎖定常領域が、配列番号６２のアミノ酸配列を有する場合、配列番号９０のＮ末端アルギニンを排除できる。配列番号６２は、配列番号１０２の核酸配列によりコードされ得る。抗体は、２つの軽鎖及び２つの重鎖を含む四量体として、別々の重鎖、軽鎖として、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、及びＦｖとして、または重鎖及び軽鎖の可変領域が、スペーサーを介して連結している場合の単鎖抗体として発現できる。
【０２１２】
ヒト定常領域は、異なる個体間で、アロタイプ変異及びアイソアロタイプ変異を示し、すなわち、当該定常領域は、１つ以上の多形位置における異なる個体において、異なり得る。アイソアロタイプは、アイソアロタイプを認識する血清が、１つ以上のアイソタイプの非多形領域に結合する場合には、アロタイプとは異なる。したがって、例えば、別の重鎖定常領域が、ＩｇＧ１のＧ１ｍ３アロタイプにあり、及び配列番号８９のアミノ酸配列を有する。配列番号８９は、配列番号９２の核酸配列によりコードされ得る。当該ＩｇＧ１のＧ１ｍ３アロタイプの別の重鎖定常領域は、配列番号１０１のアミノ酸配列を有する。ヒト定常領域と呼ばれるものには、任意の天然アロタイプまたは天然アロタイプにおいて多形位置を占める残基の、任意の順列を伴う定常領域を含む。
【０２１３】
重鎖のＣ末端リシンなどの、軽鎖及び／または重鎖のアミノ末端またはカルボキシ末端での１つまたは複数のアミノ酸は、その分子の一部またはすべてを、そのままにしておくかまたは誘導体化して良い。補体媒介の細胞毒性またはＡＤＣＣなどのエフェクター機能を低下または増加するために（例えば、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，６２４，８２１号、Ｔｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，８３４，５９７号、及び  Ｌａｚａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０３：４００５，２００６を参照）、または、ヒトにおいての半減期を延長するために（例えば、Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：６２１３，  ２００４を参照）、その定常領域において、置換を行うことができる。例示的な置換には、抗体の半減期を伸ばすための、位置２５０のＧｌｎ及び／または位置４２８のＬｅｕ（ＥＵ番号規則）を含む。位置２３４、２３５、２３６及び／または２３７のいずれかでの置換は、Ｆｃγ受容体、特にＦｃγＲＩ受容体に対する親和性を低下させる（例えば、米国特許第６，６２４，８２１号を参照）。ヒトＩｇＧ１の位置２３４、２３５、及び２３７でのアラニン置換は、エフェクター機能の低下に利用できる。任意で、ヒトＩｇＧ２の位置２３４、２３６、及び２３７は、アラニンで、及び位置２３５はグルタミンで置換される。米国特許第５，６２４，８２１号を参照のこと。いくつかの抗体において、ヒトＩｇＧ１のＥＵ番号規則による、位置２４１、２６４、２６５、２７０、２９６、２９７、３２２、３２９、及び３３１の１つ以上における突然変異が利用される。いくつかの抗体において、ヒトＩｇＧ１のＥＵ番号規則による、位置３１８、３２０、及び３２２の１つ以上における突然変異が利用される。いくつかの抗体において、位置２３４及び／または２３５は、アラニンで、及び／または位置３２９は、グリシンで置換される。いくつかの抗体において、位置２３４及び２３５は、配列番号１０１などの、アラニンで置換される。いくつかの抗体において、当該アイソタイプは、ヒトＩｇＧ２またはＩｇＧ４である。
【０２１４】
Ｇ．組換え抗体の発現
抗体発現細胞株（例えば、ハイブリドーマ）を使用した、キメラ及びヒト化抗体の産生のための多数の方法が公知である。例えば、抗体の免疫グロブリン可変領域は、公知の方法を使用してクローンを作成でき及び配列化できる。１つの方法において、重鎖可変ＶＨ領域は、ハイブリドーマから生成されたｍＲＮＡを使用したＲＴ−ＰＣＲにより、クローン化できる。５′プライマー及びｇ２ｂ定常領域特異の３′プライマーとして、翻訳開始コドンを包含する当該ＶＨ領域のリーダーペプチドへ、コンセンサスプライマーを採用する。例示的なプライマーは、Ｓｃｈｅｎｋらによる米国公開特許番号２００５／０００９１５０（これ以降は、「Ｓｃｈｅｎｋ」）に記載される。増幅中に変化が導入されていないことを保証するために、複数の、独立して誘導されたクローン由来の配列を比較できる。当該ＶＨ領域の配列はまた、５′ＲＡＣＥ  ＲＴ−ＰＣＲ法及び３′ｇ２ｂ特異プライマーにより得られたＶＨフラグメントを優先順位付けすることにより、決定または確認できる。
【０２１５】
当該軽鎖可変ＶＬ領域は、類似の方法でクローン化できる。１つのアプローチにおいて、翻訳開始コドン及びそのＶ−Ｊ結合領域下流のＣｋ領域に対して特異的な３′プライマーを包含するＶＬ領域に、相補的形成するために設計された５′プライマーを使用してＶＬ領域を増幅するために、コンセンサスプライマーを設計する。二番目のアプローチにおいて、ｃＤＮＡをコードするＶＬをクローン化するために、５′ＲＡＣＥ  ＲＴ−ＰＣＲを採り入れる。例示的なプライマーが、上記のＳｃｈｅｎｋに記載される。次いで、そのクローン化された配列が、ヒト（またはその他のヒト以外の種）の定常領域をコードする配列と組み合わされる。ヒト定常領域をコードする例示的な配列には、ヒトＩｇＧ１定常領域をコードする配列番号６１、及びヒトのカッパ軽鎖定常領域をコードする配列番号６２を含む。
【０２１６】
１つのアプローチにおいて、当該重鎖及び軽鎖可変領域は、ＶＤＪまたはＶＪ接合の各々の下流のスプライスドナー配列をコードするために、再組み換えされ、ならびに重鎖に対応するｐＣＭＶ−ｈγ１及び軽鎖に対応する  ｐＣＭＶ−Ｍｃｌなどの、哺乳類発現ベクターにクローン化される。これらのベクターは、その挿入された可変領域カセットの下流のエクソンのフラグメントとしての、ヒトγ１及びＣｋ定常領域をコードする。以下の配列検証において、当該重鎖及び軽鎖の発現ベクターは、キメラ抗体を産生するために、ＣＨＯ細胞に共導入され得る。調整された媒体が、形質導入の４８時間後に取集され、及び抗体産生に対してはウェスタンブロット法で、抗原結合に対してはＥＬＩＳＡで評価される。当該キメラ抗体は、上記のようにヒト化される。
【０２１７】
キメラ、バーニア化、ヒト化、及びヒト抗体は通常、組換え発現で産生される。組換えポリヌクレオチド構築体は通常、プロモーターなどの、天然に関連しているかまたは非相同の、発現制御要素を含む抗体鎖をコードする配列に、操作を加えて連結された発現制御配列を含む。この発現制御要素は、真核生物または原核生物の宿主細胞を形質転換または形質導入できるベクターにおける、プロモーターシステムであり得る。一旦、当該ベクターが適切な宿主に組み入れられると、その宿主は、その核酸配列の高レベルの発現ならびに交差反応している抗体の収集及び精製に適切な条件下で保持される。
【０２１８】
これらの発現ベクターは通常、エピソームまたはその宿主染色体ＤＮＡの不可欠な部分のどちらかとして、その宿主有機体に複製可能である。一般的に、発現ベクターは、望ましいＤＮＡ配列で形質転換されたそれら細胞の検出を可能にするために、例えば、アンピシリン耐性またはハイグロマイシン耐性などの選択マーカーを含む。
【０２１９】
大腸菌は、抗体、特に抗体フラグメントの発現にとって有用な１つの原核生物宿主である。酵母などの微生物もまた、発現に対して有用である。サッカロミセスは、発現制御配列、複製起点、終点配列、及びその他必要なものを有する適切なベクターを伴った酵母宿主である。典型的なプロモーターには、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ及びその他の糖分解酵素を含む。誘発性酵母プロモーターには、特に、アルコール脱水素酵素、イソシトクロムＣ、ならびにマルトース及びガラクトースの利用に対応する酵素由来のプロモーターを含む。
【０２２０】
哺乳類細胞を、免疫グロブリンまたはそのフラグメントをコードするヌクレオチドセグメントの発現に利用できる。Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ，（ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮＹ，１９８７）を参照のこと。無傷の異質タンパク質の分泌が可能な、多数の適切な宿主細胞株が開発されており、及びＣＨＯ細胞株、多様なＣＯＳ細胞株、ＨｅＬａ  細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｌ細胞、ならびにＳｐ２／０及びＮＳ０を含む非抗体産生骨髄腫を含む。当該細胞は、ヒト以外であり得る。これらの細胞に対応する発現ベクターには、複製の起点、プロモーター、エンハンサー（Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９（１９８６））などの発現制御配列、及びリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写ターミネーター配列などの必要な情報処理部位を含むことができる。発現制御配列には、内因性遺伝子、サイトメガロウイルス、ＳＶ４０、アデノウイルス、牛パピローマウイルスなどから誘導されたプロモーターを含むことができる。Ｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９（１９９２）を参照のこと。
【０２２１】
あるいは、配列をコードする抗体を、形質転換動物のゲノムへの導入に対応した導入遺伝子に組み込み、及びそれに続くその形質転換動物の乳に発現させることができる（例えば、米国特許第５，７４１，９５７号、米国特許第５，３０４，４８９号、米国特許第５，８４９，９９２号を参照）。適切な導入遺伝子には、カゼインまたはベータラクトグロブリンなどの、乳腺に特異的な遺伝子由来のプロモーター及びエンハンサーに、操作を加えて連結した軽鎖及び／または重鎖に対するコード配列を含む。
【０２２２】
関心のあるＤＮＡセグメントを含む当該ベクターを、宿主の細胞型に依存した方法で、その宿主細胞に導入できる。例えば、原核細胞に対して、塩化カルシウムの導入が一般的に利用される一方で、その他の細胞宿主に対しては、リン酸カルシウム処理、エレクトロポレーション、リポフェクション、遺伝子銃、またはウイルスベースの形質導入が利用できる。哺乳類細胞の形質転換に利用されるその他の方法には、ポリブレン、プロトプラスト融合、リポソーム、エレクトロポレーション、及びマイクロインジェクションの利用を含む。遺伝子導入動物の産出には、導入遺伝子を、受精卵母細胞にマイクロインジェクションすることができ、または胚性幹細胞のゲノムに組み込むことができ、及びそのような細胞の核を除核卵子に導入できる。
【０２２３】
抗体の重鎖及び軽鎖をコードするベクターを細胞培養に導入することで、血清の無い培地における細胞集団を、成長の生産性及び産生品質に対応して、選別できる。次いで、一番産生された細胞集団を、モノクローナル株を生成するために、ＦＡＣＳベースの単細胞クローニングに供することができる。７．５ｇ／Ｌ培養より多量の抗体価を産生することに相当する、１日１細胞当たり５０ｐｇまたは１００ｐｇを上回る特別の生産性を利用できる。単細胞クローンにより産生された抗体はまた、濁度、ろ過特性、ＰＡＧＥ、ＩＥＦ、ＵＶスキャン、ＨＰ−ＳＥＣ、炭水化物オリゴ糖マッピング、質量分析法、及びＥＬＩＳＡまたはＢｉａｃｏｒｅなどの結合アッセイに対応して、試験できる。次いで、選択されたクローンは、複数のバイアル瓶に格納し、及びその後の利用のために凍結貯蔵できる。
【０２２４】
一旦発現した抗体は、タンパク質Ａキャプチャ、高速液体クロマトグラフィー精製、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む、当技術分野で標準的な手順に従って精製できる（一般的には、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ，１９８２）を参照）。
【０２２５】
抗体の商業生産の方法論には、コドン最適化、プロモーターの選択、転写要素の選択、ターミネーターの選択、無血清の単細胞クローニング、細胞バンク、コピー数の増幅のための選択マーカーの使用、ＣＨＯターミネーター、またはタンパク質抗体価の改善を含んで、それらを用いることができる（例えば、米国特許第５，７８６，４６４号、米国特許第６，１１４，１４８号、米国特許第６，０６３，５９８号、米国特許第７，５６９，３３９号、Ｗ０２００４／０５０８８４、Ｗ０２００８／０１２１４２、Ｗ０２００８／０１２１４２、Ｗ０２００５／０１９４４２、Ｗ０２００８／１０７３８８、及びＷ０２００９／０２７４７１、ならびに米国特許第５，８８８，８０９号を参照）。
【０２２６】
Ｈ．核酸
本発明はさらに、前述の重鎖及び軽鎖のいずれかをコードする核酸を提供する（例えば、配列番号６３−６４、６７−６８、７１−７３、及び７７−８０）。配列番号９２−９３、９９−１００、及び１０２は、前述の重鎖及び軽鎖をコードする核酸の追加の例示である。通常、核酸はまた、当該成熟した重鎖及び軽鎖に融合する単一ペプチドをコードする（例えば、配列番号６５、６９、７４、及び７５の各々（重鎖）、ならびに６６、７０、及び７６の各々（軽鎖）によりコードされ得る、配列番号１８、２８、３９、及び４０（重鎖）、ならびに１９、２９、及び４１（軽鎖）のアミノ酸配列を有する単一ペプチド）。核酸のコード配列は、そのコード配列の発現を確実にするために、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合部位、転写終了シグナルなどの、制御配列に操作を加えて連結できる。重鎖及び軽鎖をコードする核酸は、単離された形態で存在することができ、または１つ以上のベクターにクローン化され得る。当該核酸は、例えば、重なったオリゴヌクレオチドの、固相合成またはＰＣＲにより合成できる。重鎖及び軽鎖をコードする核酸は、例えば、発現ベクター内に、１つの連続した核酸として結合でき、または、例えばその発現ベクター自身に、各々クローン化されて、分離できる。
【０２２７】
Ｉ．共役抗体
がん及び腫瘍に優先的に存在する、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ４−５モジュールなどの抗原に、特異的に結合する抗体は、破壊するがんまたは腫瘍を標的化するために有用である。同様に、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ４−５モジュールを特異的に結合する抗体は、免疫疾患またはラミニンα４のＧドメインのＬＧ４−５モジュールの発現により、少なくともその一部に媒介された任意のその他疾患に関与する細胞を標的化するのに有用である。例えば、そのような抗体は、その他の治療薬または細胞毒性薬と共役できる。ＷＯ０３／０５７８３８を参照のこと。同様に、そのような抗体は、その他のタンパク質、その他の抗体、及び／または検出可能な標識と共役できる。ＷＯ０３／０５７８３８、米国特許第８，４５５，６２２号を参照のこと。そのような治療薬は、患者の望まない症状または疾患を治療し、それと戦い、改善し、予防し、または好転させるために使用できる、任意の薬剤であり得る。そのような症状または疾患の例示には、がんまたは自己免疫疾患を含む。治療薬には、細胞毒性薬、細胞増殖阻害剤、放射線治療薬、免疫調節剤、またはその抗体の活性を促進し若しくは強化する任意の生物活性剤を含む。そのような細胞毒性薬は、細胞に毒性を持つ任意の薬剤であり得る。細胞毒性薬は、細胞増殖を阻害する任意の薬剤であり得る。免疫調整剤は、免疫応答の発達または保全を刺激または阻害する任意の薬剤であり得る。放射線治療薬は、放射線を放つ任意の分子または化合物であり得る。仮にそのような治療薬または細胞毒性薬が、本明細書に記載の抗体などの、腫瘍に特異的な抗体と結合する場合、その結合された治療または細胞毒性薬は、正常細胞を超えた、腫瘍細胞またはがん細胞への特異的な親和性を有するであろう。同様に、その結合した治療または細胞毒性薬は、その他の細胞を超えた、ラミニンα４発現細胞に対する特異的な親和性を有するであろう。その結果、その共役した抗体の投与は、周辺の正常な、健康な組織へのダメージを最小にしながら、がん細胞を直接的に標的にする。このことは、それら自身が投与された場合に、強い毒性をもつ治療薬または細胞毒性薬を、特に有効に活用できる。さらに、その治療薬または細胞毒性薬のより少ない量で使用が可能である。
【０２２８】
抗体を、免疫毒素として作用するように改変できる。例えば、米国特許第５，１９４，５９４号を参照のこと。例えば、リシン、植物由来の細胞毒素は、抗体に対応したＳ−アセチルメルカプト無水コハク酸及びリシンに対応したコハク酸イミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸の、２官能性試薬を使用して、抗体と結合できる。Ｐｉｅｔｅｒｓｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８（１６）：４４６９−４４７６（１９９８）を参照のこと。この結合は、リシンのＢ鎖結合活性を失わせる結果になる一方で、リシンのＡ鎖の潜在的毒性とその抗体の活性のいずれをも損なわない。同様に、リボソーム組み立ての阻害剤である、サポリンは、化学的に挿入されたスルフヒドリル基間のジスルフィド結合を介して抗体に結合できる。Ｐｏｌｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １８：１２１５−１２２２（２００４）を参照のこと。
【０２２９】
放射性同位元素、例えば、イットリウム９０（９０Ｙ）、インジウム１１１（１１１Ｉｎ）、１３１Ｉ、９９ｍＴｃ、放射性銀−１１１（ｒａｄｉｏｓｉｌｖｅｒ−１１１）、放射性銀−１９９（ｒａｄｉｏｓｉｌｖｅｒ−１９９）、及びビスマス２１３なども抗体に連結できる。放射性同位元素の抗体への連結は、従来の２官能性キレートを伴って実施されて良い。放射性銀―１１（ｒａｄｉｏｓｉｌｖｅｒ−１１）、  放射性銀―１９９（ｒａｄｉｏｓｉｌｖｅｒ−１９９）に対しては、硫黄ベースのリンカーが使用されて良い。Ｈａｚｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４−２５：１−７（１９９４）を参照のこと。銀放射性同位体の連結は、アスコルビン酸での免疫グロブリンの還元を伴うであろう。１１１Ｉｎ及び９０Ｙなどの放射性同位体に対しては、イブリツモマブ・チウキセタンが使用でき、及びそのような同位体と反応して、各々１１１Ｉｎ−イブリツモマブ・チウキセタン、９０Ｙ−イブリツモマブ・チウキセタンを形成する。Ｗｉｔｚｉｇ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４８  Ｓｕｐｐｌ  １：Ｓ９１−Ｓ９５（２００１）を参照のこと。
【０２３０】
その他の治療薬がまた、抗体に連結されて良い。治療薬は通常、細胞毒性または細胞増殖阻害性である。例えば、抗体は、マイタンシン、ゲルダナマイシン、チューブリン結合剤（例えば、アウリスタチン）  などのチューブリン阻害剤、またはカリチアマイシンなどのマイナーな溝結合剤などの毒性化学療法薬と共役できる。その他の代表的な治療薬には、がん若しくは自己免疫疾患の治療、管理、または改善、またはがん若しくは自己免疫疾患の症状に有効であるとして知られる薬剤を含む。そのような治療薬の例示は、本明細書の他の場所で記述する。
【０２３１】
抗体はまた、その他のタンパク質と共役できる。例えば、抗体は、フィノマー（Ｆｙｎｏｍｅｒｓ）と共役できる。フィノマーは、ヒトＦｙｎのＳＨ３ドメイン由来の小さな結合タンパク質（例えば、７ｋＤａ）である。それらは安定で可溶性であり得て、及びシステイン及びジスルフィド結合を欠いている可能性がある。フィノマーは、抗体と同じ親和性及び特異性を持つ標的分子に、人工的に結合できる。それらは、抗体を基にした多特異性融合タンパク質を創出するのに適している。例えば、フィノマーは、異なる構造の二重及び三重特異性ＦｙｎｏｍＡｂを創出するために、抗体のＮ末端及び／またはＣ末端と融合できる。フィノマーは、ＦＡＣＳ、Ｂｉａｃｏｒｅ、及び最適な特性を持つフィノマーの効果的な選択を可能にする細胞ベースアッセイを使用した選別技術を介した、フィノマーライブラリーを利用して選択できる。フィノマーの例示は、Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２：３１９６−３２０４（２００７）、Ｂｅｒｔｓｃｈｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．２０：５７−６８（２００７）、Ｓｃｈｌａｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＡｂｓ．４：４９７−５０８（２０１１）、Ｂａｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ．Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．６９（Ｐｔ６）：１１２４−１１３７（２０１３）、及びＢｒａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．１３：２０３０−２０３９（２０１４）に開示される。
【０２３２】
本明細書に開示する抗体はまた、１つ以上のその他の抗体と結合または共役できる（例えば、抗体異種共役体を形成するために）。そのようなその他の抗体は、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ４−５モジュール内の異なるエピトープに結合でき、または異なる標的抗原に結合できる。
【０２３３】
抗体はまた、検出可能な標識と結合できる。そのような抗体は、例えば、がんまたは自己免疫疾患を診断のため、がんまたは自己免疫疾患の進行を監視するため、及び／または治療の有効性を評価するために利用できる。そのような抗体は、がんまたは自己免疫疾患を患っているか若しくはかかりやすい対象者において、またはそのような対象者から得た適切な生体サンプルにおいて、そのような決定を行うために有用であり得る。抗体に結合または連結されて良い代表的な検出可能な標識には、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリ性フォスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼなどの多様な酵素、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンなど補欠分子族、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、またはフィコエリスリンなどの蛍光体材料、ルミノールなどの発光材料、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びイクオリンなどの生物発光材料、放射性銀―１１１、放射性銀−１９９、ビスマス２１３、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、及び１１７Ｔｉｎなどの放射性物質、多様な陽電子放出断層撮影法に使用する陽電子放出金属、非放射性の常磁性金属イオン、特定の放射性同位元素と放射性標識化されたまたは共役された分子を含む。
【０２３４】
治療薬、その他のタンパク質、その他の抗体、及び／または検出可能な標識は、当技術分野で公知の技術を使用したマウス、キメラ、バーニア化、またはヒト化の抗体と、直接的にまたは中間体（例えば、リンカー）を介して間接的に結合または共役して良い。例えば、Ａｒｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，”ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．２４３−５６（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（２ｎｄ  Ｅｄ．），Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．６２３−５３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）、  Ｔｈｏｒｐｅ，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ，”ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．４７５−５０６（１９８５）“Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，”ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．３０３−１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）、及び  Ｔｈｏｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９−５８（１９８２）を参照のこと。適切なリンカーには、例えば、開裂可能な及び非開裂性のリンカーを含む。酸性または還元性の条件下で、若しくは特定のプロテアーゼへの暴露下で当該薬剤を放出する、異なるリンカーを採用することができる。同様に、酸性または還元性の条件下で、特定のプロテアーゼへの暴露下、若しくはその他の定められる条件下で、当該結合した治療薬、タンパク質、抗体、及び／または検出可能な標識を放出する、異なるリンカーを採用することができる。
【０２３５】
Ｖ．治療への応用
前述の抗体を、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ４−５モジュールの発現により、少なくとも部分的に媒介された疾患を患っているかもしくはそのリスクがある患者において、疾患の治療または効果的な予防に対して使用できる。いくつかのそのような疾患において、当該ラミニンα４のＧドメインのＬＧ４−５モジュールは、シンデカン−１、シンデカン−２、シンデカン−３、またはシンデカン−４などの、ヘパラン硫酸プロテオグリカンとの相互作用により、その疾患の発達に寄与する。
【０２３６】
そのような疾患は、がんであり得る。治療される例示的ながんは、先に記述されている。当該方法は、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ４−５モジュールの検出可能レベルを示すがんの治療に対して、特に修正が可能である（例えば、当該開示の抗体の１つを使用する免疫測定法）。いくつかのそのようながんは、同じ種類の非がん性組織と比較して、ラミニンα４の増加発現を示す。いくつかのそのようながんは、神経膠腫と膠細胞腫瘍（例えば、Ｎａｇａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １１７：４１−５０（２００５）、  Ｌｊｕｂｉｍｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  １０１（３）：６０４−６１２（２００４）を参照）、肝細胞がん（例えば、Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１３４（６）：７０５−１４（２００８）を参照）、腎細胞がん（例えば、Ｖａｉｎｉｏｎｐａａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．８７（８）：７８０−７９１（２００７）を参照）、口腔扁平上皮がん（例えば、Ｔａｋｋｕｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１３０（３）：５０９−５２５（２００８）を参照）、前立腺がん（例えば、Ｓｐｒｅｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  １０（１２）：１３５０−１３６１（２００８）を参照）、及び黒色腫（例えば、Ｌｕｇａｓｓｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｕｔａｎ．Ｐａｔｈｏｌ．３６（１２）：１２３７−１２４３（２００９）を参照）を含んで、ラミニンα４の発現に関連して報告されているものである。いくつかのそのようながんは、乳がん、子宮頚がん、大腸がん、子宮内膜がん、線維肉腫、胆嚢がん、胃がん、神経膠腫、頭頸部がん、肝細胞がん、若年性鼻咽頭血管線維腫、肺がん、悪性黒色腫、中皮腫、性骨髄腫、神経内分泌腫瘍、口腔のがん、口腔扁平上皮がん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がんなどの、１つ以上のシンデカンの発現に関連したものである。例えば、Ｔｈｅｏｃｈａｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２７７：３９０４−３９２３（２０１０）を参照のこと。前述の抗体のいくつかは、悪性黒色腫、乳がん、肺がん、及び大腸がんの治療に有効である。いくつかの抗体は、子宮がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、線維肉腫、胆嚢がん、胃がん、神経膠腫、頭頸部がん、肝細胞が、若年性鼻咽頭血管線維腫、中皮腫、性骨髄腫、神経内分泌腫瘍、口腔がん、扁平上皮がん、口腔扁平上皮がん、骨肉腫、膵臓がん、及び／または前立腺がんの治療に有効であって良い。いくつかの抗体は、転移性腫瘍の治療に有効であって良い。いくつかの例示において、当該患者は、脳腫瘍若しくは中枢神経系または頭蓋内の別の種類の腫瘍にかかっている。例えば、当該患者は、星細胞系腫瘍（例えば、星細胞腫、退形成性星細胞腫、膠芽腫、毛様細胞性星状細胞腫、上衣巨細胞星状細胞腫、多形性黄色星状膠細胞腫）、オリゴデンドログリア腫瘍（例えば、乏突起膠腫、退形成性乏突起膠腫）、上衣細胞腫（例えば、上衣腫、退形成性上衣腫、粘液乳頭状上衣腫、上衣下腫）、混合神経膠腫（例えば、混合乏突起星細胞腫、未分化乏突起星細胞腫）、原因が不明確の上皮細胞内腫瘍（例えば、極性海綿芽細胞腫、星状芽細胞腫、大脳神経膠腫症��、脈絡叢の腫瘍（例えば、脈絡叢乳頭腫、脈絡叢がん）、神経または混合神経細胞・膠細胞腫瘍（例えば、神経節細胞腫、小脳、神経節膠腫、退形成性神経節膠腫、線維形成性神経節細胞腫、中央神経細胞腫、胎生期奇形神経上皮腫瘍、嗅神経芽細胞腫）、松果体実質腫瘍（松果体細胞腫、松果体芽細胞腫、混合松果体細胞腫／松果体芽細胞腫）、若しくは混合神経芽細胞を伴う腫瘍、または神経膠芽細胞要素（例えば、髄上皮腫、髄芽腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、上衣芽腫）を患っている可能性がある。いくつかの抗体は、その他のがんの治療に有効であって良い。
【０２３７】
そうような疾患は、自己免疫疾患であり得る。自己免疫疾患には、全身性の自己免疫疾患、器官または組織特有の自己免疫疾患、及び自己免疫型の発現を示す疾患を含む。これらの疾患において、身体は、それ自身の抗原の１つに対抗して、細胞及び／または体液性の免疫応答を発達させ、その抗原の破壊ならびに潜在的に破壊的な及び／または致命的な結果をもたらす。仮に存在するなら、その細胞応答は、Ｂ細胞若しくはＴ細胞またはその両方であり得る。インターロイキン（ＩＬ）−１７及びＩＬ−２２の産生により特徴づけられる血統ヘルパーＴ細胞である、ＴＨ１７細胞は、ヒトの多発性硬化症及びマウスの実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を含む、病原性の自己免疫応答を促進するために、組織に入り込むと報告されている。例えば、Ｃｕａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４２１：７４４−７４８（２００３）；Ｉｖｏｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １２６：１１２１−１１３３（２００６）を参照のこと。ＴＨ１７は、それらに特異的な継続的刺激による炎症反応及び組織の浸潤を開始または増殖するであろう。
【０２３８】
自己免疫疾患の例示には、バセドウ病、橋本甲状腺炎、自己免疫性多腺性症候群、インスリン依存型糖尿病（１型糖尿病）、インスリン抵抗性の糖尿病（２型糖尿病）、免疫性不妊、自己免疫アジソン病、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、疱疹状皮膚炎、自己免疫性の脱毛症、白斑、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性血小板減少性紫斑病、悪性貧血、重症筋無力症、ギランバレー症候群、全身硬直症候群、急性リウマチ熱、交感性眼炎、グッドパスチャー症候群、自己免疫性ぶどう膜炎、側頭動脈炎、ベーチェット病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎、線維筋痛、多発性筋炎、皮膚筋炎、強直性脊椎炎、高安動脈炎、脂肪織炎、類天疱瘡、原因不明の血管炎、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）陰性の血管炎、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）陽性の血管炎、全身性エリテマトーデス、乾癬性関節炎、リウマチ性関節炎、強皮症、全身性壊死性血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、クレスト症候群、抗リン脂質抗体症候群、シェーグレン症候群、好酸球性胃腸炎、非定型の局所性皮膚炎、心筋症、ポスト症候群、感染後心内膜心筋炎、セリアック病、多発性硬化症、サルコイドーシス、及び乾癬を含む。
【０２３９】
メカニズムを理解するために実践をする必要はないが、以下のメカニズムのいずれもまたはすべてが、がんの治療に寄与すると考えられる。当該抗体は、腫瘍細胞の接着を阻害し、ラミニンα４媒介のシグナル伝達事象を阻害し、またはシンデカンを伴うラミニンα４の相互作用を阻害することにより、がんを治療する。当該抗体は、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ４−５モジュールの処理または排除を誘発することにより、付随してまたは代わりにがんを治療する。当該抗体は、転移またはがん細胞の浸潤を、付随してまたは代わりに阻害する。ラミニンα４のＧドメインのＬＧ４−５モジュールへの抗体の結合はまた、細胞接着、細胞の増殖、成長、細胞死への抵抗、血管新生に関わるシグナル伝達メカニズム、またはがんのその他の特徴に影響を与える。当該抗体は、Ａｋｔ活性化及びそれに続く細胞生存／増殖シグナル伝達の阻害を介して、腫瘍成長を阻害する。いくつかの例示において、当該抗体は、内皮のＤｌｌ４／ノッチシグナル伝達を変えることにより、血管新生を妨害または阻害する。いくつかのケースにおいて、当該抗体による、血管新生の中断または阻害は、インテグリンα２、インテグリンα６、またはインテグリンβ１を含むインテグリンなどの、ラミニンα４とインテグリン間の相互作用の中断に関与する。抗体薬共役体は、通常はがん細胞内に取り込んだ後での、結合薬の細胞毒性または増殖阻害効果を含む、付随的な作用メカニズムを有する。抗体薬共役体はまた、その他の標的細胞におけるそのような作用メカニズムにより、作用できる。抗体薬共役体はまた、腫瘍関連マクロファージの毒性を含んで良い。
【０２４０】
本発明の抗体により治療可能なその他の疾患には、肥満関連希少疾病などの、肥満及び肥満関連疾患を含む。肥満は、過剰な食物エネルギーの摂取、身体活動の欠如、及び／または遺伝的な感受性により引き起こされる疾患である。体格指数（ＢＭＩ）＞３５は、深刻な肥満を示し、ＢＭＩ＞４０は、病的な肥満を示し、及びＢＭＩ＞４５は、超肥満を示す。肥満関連疾患には、肥満に関連した、肥満により引き起こされる、または肥満がもたらす疾患または障害を含む。肥満関連疾患の例示には、心血管疾患、２型糖尿病、睡眠時無呼吸症候群、がん、変形性関節症、喘息、脂肪肝、及び非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を含む。
【０２４１】
ＮＡＳＨは、肝の炎症や脂肪蓄積によって特徴付けられる。一次リスク要因は、肥満、糖尿病、及び高脂血症である。肝硬変や肝がんとの強い関連がある。ＮＡＳＨは、しばしば無症状で、上昇したＡＳＴ／ＡＬＴ（アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）とアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）の濃度の比率）と関連する。ＮＡＳＨの治療には、生活習慣の変更（減量と運動）、肥満症手術、及び吸収減少（Ｘｅｎｉｃａｌ／Ａｌｌｉ（リパーゼ阻害剤））、食欲阻害  （Ｂｅｌｖｉｑ、Ｂｙｅｔｔａ、Ｓｙｍｌｉｎ、Ｑｓｙｍｉａ）、及び代謝刺激（Ｂｅｌｏｒａｎｉｂ）を含むメカニズムを伴う医薬品を含む。
【０２４２】
肥満関連希少疾病の例示には、プラダー・ウィリー症候群（例えば、過食とともに）、頭蓋咽頭腫（例えば、過食とともに）、バルデ・ビードル症候群、コーエン症候群、及びＭＯＭＯ症候群を含む。プラダー・ウィリー症候群は、染色体１５における遺伝子の欠損／サイレンシングにより引き起こされる、まれな遺伝子疾患である。その症状には、神経症状（知的障害、自閉症、制御不能な食欲（視床下部））、代謝遅延、内分泌疾患（例えば、成長ホルモン欠損症（ＧＨＤ）、副腎不全（ＡＤ））を含む。
【０２４３】
抗体は、発症を遅らせ、重症度を軽減し、さらなる悪化を阻害し、及び／または治療を受けている疾患（例えば、がん）の少なくとも１つの兆候または症状を改善する、投与量、投与の経路及び投与回数を意味する、効果的な投薬計画に基づいて投与される。仮に、患者がすでに障害を患っている場合、その投薬計画は、治療に効果的な投薬計画であると呼ぶことができる。仮にその患者が、その一般的な集団と比較して、その疾患の高いリスク状態にあって、しかしまだ発症していない場合、その投薬計画は、予防に効果的な投薬計画と呼ぶことができる。いくつかの例示において、治療または予防効果は、その同じ患者の歴史的な対照サンプルまたは過去経験と比べて、個々の患者において観察できる。その他の例示において、治療または予防効果は、未治療患者の対照集団と比べて、治療患者の集団における前臨床または臨床試験で実証できる。
【０２４４】
例示的な抗体の投与量は、０．１−２０、または０．５−５ｍｇ／ｋｇ体重（例えば、０．５、１、２、３、４または５ｍｇ／ｋｇ）若しくは固定投与量として１０−１５００ｍｇである。その投与量は、その患者の症状及び事前処置への応答、その他の要因において、もしありうれば、その処置が予防的か治療的か及びその疾患が急性か慢性化かにより異なる。
【０２４５】
投与は、静脈、静脈内投与、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、髄腔内、腹腔内、局所、鼻腔内または筋肉であり得る。いくつかの抗体は、静脈内または皮下投与により体循環に投与できる。静脈内投与は、例えば、３０−９０分の一定時間をかけた点滴により実施できる。
【０２４６】
その投与頻度は、その循環における抗体の半減期、その患者の症状、及びその他の要因の中で特に、投与の経路により異なる。その頻度は、その患者の症状または治療を受けている疾患の進行具合における変化に対応して、毎日、毎週、毎月、四半期ごと、または不規則な間隔であり得る。静脈内投与の例示的な頻度は、継続的な原因の治療期間を通して、毎週と四半期ごとの間に在るが、それ以上または以下の頻繁投与もまた可能である。皮下投与に対する例示的な投与頻度は、毎日から毎月であるが、それ以上または以下の頻繁投与もまた可能である。
【０２４７】
投与の回数は、その疾患が急性か慢性化、及びその治療に対するその疾患の応答により異なる。急性疾患または慢性疾患の急性な悪化に対しては、１回から１０回の投与が、しばしば適切である。時には、一回のボーラス投与が、任意で分割形態で、急性疾患または慢性疾患の急性な悪化に対して適切である。急性疾患または急性悪化の再発に対しては、治療を繰り返すことができる。慢性疾患に対して、定期的に、例えば、毎週、隔週、毎月、四半期ごと、少なくとも１、５または１０年間の半年ごと、若しくはその患者の生涯にわたり投与できる。
【０２４８】
非経口投与に対する医薬組成物は、好ましくは滅菌され及び実質的に等張性で、ならびにＧＭＰ条件下で製造されたものである。医薬組成物は、単位投与形態（すなわち、単一投与に対応した用量）で提供できる。医薬組成物は、生理学的及び薬学的に許容される、キャリア、希釈剤、賦形剤、または補助剤の１つ以上を使用して処方できる。その処方物は、選択された投与経路により異なる。注射に対しては、抗体を、水溶液中に、好ましくはハンクス液、リンゲル液、若しくは生理食塩水、または酢酸緩衝液（注射部位の不快感を抑えるため）などの、生理学的に対応している緩衝液中に処方できる。その溶液は、懸濁、安定化及び／または分散などの調合薬を含むことができる。あるいは、抗体は、使用に先立ち、適切な担持体、例えば、滅菌されたパイロジェン除去水で構成された凍結乾燥形態であり得る。
【０２４９】
本明細書に記述する抗体による治療は、治療している疾患に対して効果的な、その他の治療と組み合わせることができる。がん治療に使用する場合、当該抗体は、化学療法、放射線療法、幹細胞治療、外科治療、またはＨＥＲ２抗原に対する  Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）、ＶＥＧＦに対するＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）（ベバシズマブ）、または（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）、セツキシマブ）、及びＶｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）（パニツムマブ）などのＥＧＦ受容体への抗体を含む、その他の生物製剤による治療と組み合わせることができる。化学療法薬には、クロランブシル、シクロホスファミドまたはメルファラン、カルボプタチナム、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、及びミトキサントロン、メトトレキサート、フルダラビン、及びシタラビン、エトポシドまたはトポテカン、ビンクリスチン及びビンブラスチンを含む。
【０２５０】
ＶＩ．その他の応用
当該抗体は、臨床診断若しくは治療との関連において、または研究において、ラミニンα４の検出に使用できる。より特異的には、当該抗体はまた、臨床診断若しくは治療との関連において、または研究において、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ４−５モジュールまたはそれのグラグメントの検出に使用できる。例えば、生体サンプルが、がん細胞または腫瘍細胞を含むことを示す、その生体サンプル中のラミニンα４のＧドメインのＬＧ４−５モジュールの存在の検出に使用できる。その生体サンプルへの当該抗体の結合は、対照サンプルへの当該抗体の結合と比較できる。その対照サンプル及び生体サンプルは、同じ組織起源の細胞を含むことができる。いくつかのアッセイにおいて、当該生体サンプルに存在して良いがん細胞は、当該対照サンプルにおける細胞型と同じ細胞型から生じる。対照サンプル及び生体サンプルは、同じ個人または異なる個人から、及び同じ機会または異なる機会において取得できる。仮に必要であれば、サンプル間の相違とは無関係なランダム変動を防ぐために、複数の生体サンプル及び複数の対照サンプルを、複数の機会において評価する。次いで、当該生体サンプルに結合している抗体（すなわち、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ４−５モジュールに存在）が、当該対照サンプルに結合している抗体と比べて、相対的に増加しているか、減少しているか、または同じであるかを決定するために、その生体サンプルと対照サンプルとの直接比較を実施することができる。当該抗体の、当該対照サンプルに比べて増加した当該生体サンプルへの結合は、その生体サンプルにおけるがんの存在を示す。いくつかの例示において、その増加した抗体結合は、統計的に著しい。任意で、当該生体サンプルへの抗体結合は、その対照サンプルへの抗体結合と比べて、少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、または１００倍高いレベルである。
【０２５１】
さらに、がんと診断された患者を治療するために使用した治療薬の効果をモニターし及び評価するために、当該抗体を、生体サンプルにおけるラミニンα４のＧドメインのＬＧ４−５モジュールの存在の検出に使用できる。がんと診断された患者からの生体サンプルは、その治療薬による処置を開始する前の、そのサンプルへの当該抗体の結合に対する基準値（すなわち、そのサンプル中のラミニンα４のＧドメインのＬＧ４−５モジュールの存在に対する基準値）を作るために評価される。いくつかの例示において、当該患者由来の複数生体サンプルは、治療とは無関係なランダム変動の基準値及び測定値を共に得るために、複数の機会において評価される。次いで、治療薬が、投薬計画に与えられる。当該投薬計画は、一定期間にわたる当該薬剤の複数投与を含んで良い。任意で、当該抗体の結合（すなわち、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ４−５モジュールの存在）を、ランダム変動の測定値を得ると共に免疫療法への応答の傾向を示すために、当該患者からの複数生体サンプルでの、複数の機会で評価する。次いで、当該生体サンプルへの抗体結合の多様な評価を比較する。仮に２つだけの評価が行われる場合、抗体結合（すなわち、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ４−５モジュールの存在）が、その２つの評価の間で増加したか、減少したか、または同じに維持されているかを決定するために、その２つの評価の間での直接比較が実施できる。仮に２つ以上の測定が行われる場合、その測定は、治療薬による処置の前に開始して及び治療コースを通して進めることで、経時的な変化として解析できる。生体サンプルへの抗体結合が減少した患者において（すなわち、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ４−５モジュールの存在が減少した）、その治療薬が、その患者のがんの治療に効果的であった、と結論付けることができる。好ましくは、抗体結合の減少は、統計的に著しい。任意で、結合は、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％まで減少する。抗体結合の評価は、がんのその他の兆候及び症状の評価と共に、実施できる。
【０２５２】
当該抗体はまた、ラミニンα４、またはより特異的には、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ４−５モジュール、またはそれのフラグメントにおける、実験研究のための研究試薬として使用できる。そのようなケースにおいて、抗体は、蛍光分子、スピン標識分子、酵素、または放射性同位体で標識化でき、及びラミニンα４、またはより特異的には、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ４−５モジュール、またはそれのフラグメントに対するアッセイを実施するために必要な全ての試薬で、キットを形成して提供できる。当該抗体はまた、ラミニンα４、ラミニン含有ラミニンα４、またはラミニンα４の結合相手を、例えば、親和性クロマトグラフィーにより精製するために使用できる。
【０２５３】
当該抗体はまた、生体サンプルにおける細胞接着を阻害するために使用できる。好ましくは、その細胞接着は、ラミニンα４により異なる。例えば、その細胞接着は、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ４−５モジュールにより媒介される。当該生体サンプルは、腫瘍、がん、またはそれらから誘発された細胞を含むことができる。任意で、当該腫瘍またはがんは、悪性黒色腫である。例示的な細胞接着は、実施例に記述する。いくつかの例示において、細胞接着は、少なくとも１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、または７５％、（例えば、１０％−７５％または３０％−７０％）まで、阻害される。
【０２５４】
当該抗体はまた、生体サンプルにおけるラミニンα４のシンデカンへの結合を阻害するため使用できる。任意で、当該シンデカンは、シンデカン−１、シンデカン−２、シンデカン−３、またはシンデカン−４である。阻害は、当該抗体の存在または不在における、シンデカン発現細胞のラミニンα４の結合能力を評価する結合アッセイにおいて証明されて良い。任意で、試験抗体の阻害は、担持体を含まない任意の抗体との比較において、ラミニンα４のＧドメインのＬＧ４−５モジュールに結合しない無関係な対照抗体との比較で証明できる。例えば、シンデカンへのラミニンα４の結合を、少なくとも１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、または７５％、（例えば、１０％−７５％または３０％−７０％）まで阻害する。
【０２５５】
当該抗体はまた、生体サンプルにおけるラミニンα４誘発のｐＡｋｔ活性化の阻害に使用できる。例示的なアッセイを、実施例に記述する。いくつかの方法において、ラミニンα４誘発のｐＡｋｔ活性化を、少なくとも１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、または７５％、（例えば、１０％−７５％または３０％−７０％）まで阻害する。
【０２５６】
全てのファイル、ウェブサイト、その他の出版物、受入れ番号及び前述または以下に引用するものは、同じ内容への全ての目的に対して、あたかも、各個別アイテムが、特別に及び個別に参照として組み入れられることを示すかのように、それらの全体を参照として援用し、組み入れる。仮に異なる配列バージョンが、その時々において、受入れ番号に関連付けられているとしても、本出願の有効出願日における受入れ番号に関連付けられたバージョンが、意味を持つ。当該有効出願日は、実際の登録日より前の日付または仮出願の受入れ番号で呼ばれる優先出願の登録日を意味する。同様に、出版物、ウェブサイトまたはそれらに類するものの異なるバージョンは、その時々に公開されており、本出願の有効出願日に最も近く公開されたバージョンが、特に明示しない限り、意味を持つ。本発明の任意の特徴、ステップ、要素、実施形態、または態様は、特に明示しない限り、任意のその他と組み合わせて使用できる。本発明は、明瞭化し及び理解を助ける目的に対して、解説及び例示の方法で、その詳細を記述しているが、特定の変更及び修正が、付帯の請求項の範囲内において実施されて良いことは、明白であろう。
【実施例】
【０２５７】
実施例１．ＬＧ４−５−ドメインに特異的な、抗−ＬＡＭＡ４モノクローナル抗体の特定
ＬＡＭＡ４腫瘍発現は、腫瘍の悪性度、再発、及び生存と相関すると報告されている一方で、ダウンレギュレーション（下方制御）が、試験管内及び生体内における腫瘍の浸潤を阻害することが報告されている。例えば、Ｌｊｕｂｉｍｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  １０１：６０４−６１２（２００４）及び  Ｎａｇａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １１７：４１−５０（２００５）を参照のこと。興味深いことに、ＬＡＭＡ４同族体のＬＡＭＡ３のＧドメインのＬＧ４−５モジュールは、扁平上皮がん（ＳＣＣ）に独占的に見出せるが、正常な健康組織では排除／処理される、と報告されている。さらに、ＬＡＭＡ３のＧドメインのＬＧ４−５モジュールは、ＳＣＣの腫瘍成長に必要であると報告されており、ポリクローナル抗体が、ＳＣＣ異種移植マウスモデルにおいて、腫瘍成長を阻害すると報告されている。例えば、Ｔｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６８：２８８５−２８９４（２００８）を参照のこと。したがって、（１）ＬＡＭＡ４が、腫瘍において同様の方法で処理されるかどうか、（２）ＬＧ４−５に特異的な抗−ＬＡＭＡ４抗体が、ＬＡＭＡ４陽性腫瘍において、効果的であるかどうか、が大きな関心事であった。
【０２５８】
ＬＡＭＡ４のＧドメインのＬＧ４−５モジュールに対するモノクローナル抗体を、材料と方法に記述されるように生成した。モノクロナル抗体とＬＡＭＡ４のＧドメインのＬＧ４−５モジュール間の特異的な結合は、フローサイトメトリーにより、ＬＡＭＡ４−フラグメント−表示のヒト萌芽期の腎臓２９３細胞を染色する、モノクローナル抗体の能力を評価することにより確認された。フローサイトメトリーを介して蛍光シグナルを評価し、及び図１に示すように、平均蛍光強度（ＭＦＩ）としてプロットした。ＬＧ１−３に特異的なＬＡＭＡ４抗体を、ＬＧ１−５及びＬＧ１−３を示す２９３細胞に結合できたが、ＬＡＭＡ４タンパク質のＬＧ４−５には結合できなかった。その反対に、クローン化した６Ｃ１２、１３Ｇ１０、及び１５Ｆ７を、ＬＧ１−３ではなく、ＬＧ１−５及びＬＧ４−５を示す２９３細胞に特異的に結合できた。
【０２５９】
１５Ｆ７、６Ｃ１２、及び１３Ｃ１０抗体に対する、相対的結合及びオン／オフ率を、各々、図２Ａ−Ｃに示すように、ＦｏｒｔｅＢｉｏアッセイにより解析した。抗体濃度を、１００ｎＭで一定に保ち、及びＬＡＭＡ４濃度を、図２Ａ―Ｃに示すように変動させた。ＬＡＭＡ４の各濃度に対して、図２Ａ−Ｃにおいて、２種類の線を与えた。太字線は、生データを表わし、及び非太字線は、生データの統計的適合を表わしている。１３Ｇ１０、１５Ｆ７、及び６Ｃ２１に対して、詳細の結合速度論的パラメーター（会合速度（ｋａ）、解離速度（ｋｄ）、及び結合親和定数（ＫＤ））を、表１に示すように、Ｂｉａｃｏｒｅにより決定した。ＦｏｒｔｅＢｉｏ及びＢｉａｃｏｒｅアッセイにおいて、１５Ｆ７が、最も高い結合強度及び最も遅いオフ率を示した。
【表１】
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【０２６０】
６Ｃ１２、１３Ｇ１０、及び１５Ｆ７を、マウスＩｇＧ対照サンプルと共に、それらのＬＡＭＡ４−表示細胞を結合する能力について試験した。ＬＡＭＡ４結合能力を試験するために、連続的に希釈した抗体を、ＬＡＭＡ４表示のヒト２９３細胞と共に予備培養し、次いで材料と方法に記述されるように、抗―ヒト６５０二次抗体の培養を行った。図３に示すように、結合能力を、フローサイトメトリーにより評価した。１５Ｆ７が、再び最も高い結合強度を示した。
【０２６１】
エピトープ結合により、当該６Ｃ１２、１３Ｇ１０、及び１５Ｆ７抗体を分化する、比較実験を実施した。ＬＡＭＡ４表示２９３細胞への当該抗体の結合を、ネガティブ対照として使用したマウスＩｇＧ１と共に、結合抗体に対するブロック抗体の比率（５：１、１：１、及び１：５）を低下させて評価した。当該６Ｃ１２、１３Ｇ１０、及び１５Ｆ７抗体の結合を、各々図４Ａ−Ｃに示すように、フローサイトメトリーにより評価した。フローサイトメトリー解析を介して、蛍光シグナルを評価し、及び平均蛍光強度（ＭＦＩ）をプロットした。３つの抗体全てで、各々が、５：１比率（（ブロッキング抗体）：（結合抗体））において最も高いブロッキング効果を持ち、及びその比率の低下と共にブロッキング効果をより低めるようにして、互いにＬＧ４−５結合を完了することができた。これらの結果は、これら抗体の全てが、ＬＡＭＡ４タンパク質上の同じエピトープを結合することを示している。
【０２６２】
実施例２．ＬＧ４−５−ドメインに特異的な、抗−ＬＡＭＡ４モノクローナル抗体は独占的に、ヒト及びマウス黒色腫組織を染色する
ＬＡＭＡ４のＧドメインのＬＧ４−５モジュールを、腫瘍組織に独占的に見出せるかどうかを決定するために、ＷＭ−２６６−４ヒト黒色腫細胞を、ポリクローナル抗−ＬＡＭＡ４抗体でのＬＡＭＡ４発現に対して試験した。ＭＣＡＭ及びＬＡＭＡ４の両方に対して、染色を行った。ＭＣＡＭ陽性ＷＭ−２６６−４細胞は、ＬＡＭＡ４発現に対して陽性であった。
【０２６３】
ＷＭ−２６６−４腫瘍を、ヌードマウスの皮下に移植し、及び５週間成長させた。次に、ＰＢＳを伴う経心腔的灌流を行い、腫瘍及び健康な組織を凍結し、切片にし、及び材料と方法に記述されるように、マウスＩｇＧ対照サンプル、ＬＧ１−３特異的及びＬＧ４−５特異的モノクローナル抗体の６Ｃ１２、１３Ｇ１０、ならびに１５Ｆ７で染色した。ＬＧ１−３特異的及びＬＧ４−５特異抗体は共に、ＷＭ−２６６−４皮下腫瘍及び血管系を染色できた。
【０２６４】
マウスの黒色腫細胞株、Ｂ１６を使用して、追加の皮下腫瘍実験を実施した。Ｂ１６マウス黒色腫細胞を、マウスへ皮下注射または静脈内注射を行い、及び肺への転移を起こさせた。Ｂ１６腫瘍組織及び健康なマウスの脳、肝臓、腎臓、及び肺組織の染色を、ＬＧ１−３特異抗体、対照として使用したマウスＩｇＧ１で行った。当該ＬＧ１−３特異抗体は、試験したあらゆる組織を確実に染色できた。Ｂ１６腫瘍組織及び健康なマウスの脳、肝臓、腎臓、及び肺組織の染色をまた、ＬＧ４−５特異抗体の６Ｃ１２、１３Ｇ１０、及び１５Ｆ７で行った。ＬＧ１−３特異抗体とは対照的に、これら３つのＬＧ４−５特異抗体は、一次皮下腫瘍中のＢ１６腫瘍血管を独占的に染色し、及び健康組織のいずれをも、確実に染色することができなかった。Ｂ１６肺転移巣を含むサンプル及び隣接する健康な肺組織の染色を、当該ＬＧ１−３特異抗体、当該ＬＧ４−５特異抗体（６Ｃ１２、１３Ｇ１０、及び１５Ｆ７）、及び対照マウスのＩｇＧ１で行った。当該ＬＧ１−３特異抗体は、その転移巣及び健康な隣接組織共に、確実に染色できた。対照的に、当該６Ｃ１２、１３Ｇ１０、及び１５Ｆ７抗体は、健康な隣接肺組織を染色できず、及び転移巣中のＢ１６腫瘍血管を独占的に染色した。
【０２６５】
二人の異なる患者由来の健康な皮膚及び皮膚黒色腫のサンプルを、ＬＧ４−５特異抗体、１５Ｆ７で染色した。前述の染色結果に一貫していたのは、１５Ｆ７は、両皮膚黒色腫サンプルを染色できたが、健康な皮膚組織を染色できなかったことである。
【０２６６】
その他の種類のヒト腫瘍を、同様に染色した。図５Ａ−Ｃに示すように、ＬＧ４−５特異抗体の１５Ｆ７を、ヒトの胸、結腸、及び肺腫瘍の各々に対応した腫瘍マイクロアレイスライドの染色に使用した。正常組織を、無地の長方形で囲っている。上記黒色腫の染色に一貫しているのは、ヒトの胸、結腸、及び肺がんに対応した腫瘍マイクロアレイスライドにおいて、１５Ｆ７が、腫瘍患者のサンプルのほとんどを、選択的に染色したことである。これらの結果は、ＬＡＭＡ４のＧドメインのＬＧ４−５モジュールが、ヒト及びマウスの多様な腫瘍種に独占的に見出せるというモデルと一致しており、ＬＡＭＡ４のＧドメインのＬＧ４−５モジュールが、診断及び標的腫瘍の治療を対象とした腫瘍特異マーカーになり得ることを示している。
【０２６７】
実施例３．ＬＧ４−５−ドメインに特異的な、抗−ＬＡＭＡ４モノクローナル抗体は、ヒト黒色腫の細胞接着を阻害し及び抗体薬の共役細胞毒性を誘発する
抗−ＬＧ４−５抗体で標的化したＬＡＭＡ４のＧドメインのＬＧ４−５モジュールの機能的配列を決定するために、組換えＬＧ４−５をコーティングしたＥＬＩＳＡプレートを、２０ｕｇ／ｍｌの１５Ｆ７、６Ｃ１２、及び１３Ｇ１０（またはマウスＩｇＧ１対照サンプル）と共に培養し、及び次いで、材料と方法に記述されるヒト黒色腫細胞株ＷＭ−２６６−４を結合するそれらの能力を試験した。緩衝液をネガティブ対照に及びペハリンをポジティブ対照に使用した。細胞を含まないサンプルを、追加のネガティブ対照として使用した。当該細胞接着アッセイの結果を、図６に示す。この結果を、定数が任意の単位（Ａ．Ｕ．）で、そのｙ軸上に表した。マウスＩｇＧ１は、ＬＡＭＡ４媒介の細胞接着を阻止することに失敗したが、３つ全ての抗−ＬＧ４−５抗体は、約３５％またはそれより多く、ＬＡＭＡ４媒介ヒト黒色腫の細胞接着を阻害することができ、抗−ＬＧ４−５抗体が、腫瘍の細胞接着、増殖、及び転移に不可欠な細胞接着事象を阻止できることを示した。
【０２６８】
ＬＡＭＡ４のＬＧ４−５ドメインは、健康なヒト組織に比べて、多様なヒト腫瘍組織には非常に多く存在するので、我々は、抗−ＬＧ４−５抗体を、抗体薬の共役標的戦略の候補として、試験した。図７に示すように、ＬＡＭＡ４＋ＷＭ−２６６−４細胞を、リボソーム毒性のサポリン共役抗マウス二次（抗体）と共に、１５Ｆ７抗−ＬＧ４−５抗体またはマウスアイソタイプの対照で培養した。ＬＡＭＡ４のＬＧ４−５は、可溶性の細胞外基質タンパク質であるが、１５Ｆ７は、サポリン媒介細胞毒性を、強力に媒介できた。
【０２６９】
これらのデータは、抗−ＬＧ４−５抗体が、ＷＭ−２６６−４ヒト黒色腫の細胞接着を阻止し、及び抗体薬の共役治療アプローチに対する強力な候補であることを示した。標的化したＬＧ４−５の、腫瘍の成長及び転移を効果的に遅らせることができた。
【０２７０】
実施例４．ヒト化１５Ｆ７抗体の設計
ヒト化に対応した開始点またはドナー抗体は、マウス抗体１５Ｆ７であった。成熟ｍ１５Ｆ７の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１６で与えられる。成熟ｍ１５Ｆ７の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１７で与えられる。重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、各々配列番号２０、２１、及び２２（Ｋａｂａｔによる定義）で与えられる。重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、各々配列番号２３、２４、及び２５（Ｋａｂａｔによる定義）で与えられる。Ｋａｂａｔ番号規則を、本実施例を通して使用する。
【０２７１】
ｍ１５Ｆ７の可変カッパ領域（Ｖｋ）は、マウスのＫａｂａｔサブグループ５に属し、ヒトのＫａｂａｔサブグループ１に対応する。ｍ１５Ｆ７の可変重鎖領域は、マウスのＫａｂａｔサブグループ５ａに属し、Ｋａｂａｔサブグループ１に対応する。Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２，１９９１を参照のこと。Ｖｋにおいて、第１１残基ＣＤＲ−Ｌ１は、基準クラス１に属し、第７残基ＣＤＲ−Ｌ２は、基準クラス１に属し、及び第９残基ＣＤＲ−Ｌ３は、基準クラス１に属する。Ｍａｒｔｉｎ  ＆  Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：８００−１５，１９９６を参照のこと。第５残基ＣＤＲ−Ｈ１（Ｋａｂａｔによる定義）は、基準クラス１に属し、及び第１７残基ＣＤＲ−Ｈ２は、基準クラス１に属する。Ｍａｒｔｉｎ  ＆  Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：８００−１５，１９９６  を参照のこと。ＣＤＲ−Ｈ３は、基準クラスを持たないが、第１０残基ループは、おそらく、Ｓｈｉｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４５５：１８８−９７（１９９９）の規則に従う屈折基盤を有する。
【０２７２】
当該Ｖｋ及びＶｈドメイン間の残基は、その界面にあるのがふつうである。
【０２７３】
１５Ｆ７のおおまかな構造モデルを与える構造を見出すための研究が、ＰＤＢデータベース（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：Ｄ２３３−７，２００５）のタンパク質配列全体にわたって実施された。単球走化性因子タンパク質（ＭＣＰ）に対する抗体の結晶構造を、Ｖｋ構造に対して使用した。それは、１５Ｆ７と同じ、ループに対する基準構造を保持している（ｐｄｂコード２ＢＤＮ、解像度２．５３Ａ）。ＬｅｕＴ変異体に対する抗体の重鎖（ｐｄｂコード３ＴＴ１、解像度３．１Ａ）を、Ｖｈ構造に対して使用した。それは、１５Ｆ７ＶＨのものと同じ、ＣＤＲ−Ｈ１及びＣＤＲ−Ｈ２に対する基準構造及びまた屈折基盤と同じ長さのＣＤＲ−Ｈ３を含む。ＢｉｏＬｕｍｉｎａｔｅを、１５Ｆ７Ｆｖの大まかな構造のモデルに使用した。
【０２７４】
ＣＤＲ「Ｘ」ｅｄ１５Ｆ７Ｆｖについての、ＮＣＢＩのからの冗長タンパク質配列のデータベースの研究が、マウスＣＤＲへ移植する適切なヒトフレームワークの選択を可能にした。Ｖｈに対して、２つのヒトＩｇ重鎖、ＡＣＦ３６８５７．１及びＢＡＣ０１５３０．１（各々配列番号９６、９７）を選んだ。それらは、１５Ｆ７ＣＤＲ−Ｈ１及びＨ２の基準形態を有しており、及びＢＡＣ０１５３０．１のＨ３は、予測屈折基盤を伴う１０残基である。Ｖｋに対して、ＮＣＢＩの受入れコードＡＡＹ３３３５０．１及びＢＡＣ０１５８３．１（各々、配列番号５３及び９８）を有する２つのヒトカッパ軽鎖を選んだ。それらは、親Ｖｋのそれらと同じ、ＣＤＲ−Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３に対する基準クラスを有していた。逆突然変異またはその他の突然変異を持たない、ヒト化１５Ｆ７重鎖及び軽鎖の可変領域配列は、配列番号５５及び５６で与えられる。
【０２７５】
２つのヒト化重鎖可変領域の変異体及び２つのヒト化軽鎖可変領域の変異体を、置換の異なる順列（Ｈｕ１５Ｆ７ＶＨｖ１−２（各々、配列番号５７及び５８）及びＨｕ１５Ｆ７ＶＬｖ１−２（各々、配列番号５９及び６０））を含んで構成した（表２−５）。選択したヒトフレームワークに基づく逆突然変異及びその他の突然変異を伴う、例示的なヒト化Ｖｈ及びＶｋの設計を、各々、表２及び３に示す。表２及び３の第一列のグレーの網掛け部分は、Ｃｈｏｔｈｉａにより定義されたＣＤＲを示し、及び表２及び３の残りの列のグレーの網掛け部分は、Ｋａｂａｔにより定義されたＣＤＲを示す。表４に示すように、配列番号５７−６０は、逆突然変異及びその他の突然変異を含む。Ｈｕ１５Ｆ７ＶＨｖ１−２及びＨｕ１５Ｆ７ＶＬｖ１−２の、位置Ｈ１、Ｈ２０、Ｈ２７、Ｈ３０、Ｈ３８、Ｈ４０、Ｈ４１、Ｈ４８、Ｈ６６、Ｈ６７、Ｈ６９、Ｈ７５、Ｈ８２Ａ、Ｈ９１、Ｌ８、Ｌ４２、Ｌ４５、Ｌ４９、Ｌ６９、及びＬ８０におけるアミノ酸を、表５に網羅する。Ｈｕ１５Ｆ７ＶＬｖ１−２の、位置Ｌ１０４におけるアミノ酸をまた、表５に網羅する。
【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【０２７６】
置換候補としての、軽鎖可変領域における前記位置の選択の根拠は、以下の通りである。
【０２７７】
Ｐ８Ｓ：当該ヒトＩｇＧフレームワークにおいて、ＰはＳよりもより頻繁にあるが、プロリンのシス−トランス異性化が、タンパク質の折り畳みに影響を与えるので、Ｐを１バージョンで及びＳをその他のバージョンで試みた。
【０２７８】
Ｋ４２Ｎ：Ｎは、ＶＨにおいて界面残基Ｆ９１を含み、及びそのため抗体構造の維持にとって重要である。
【０２７９】
Ｋ４５Ｒ：Ｒ及びＫは、当該ヒトＩｇＧフレームワークにおける類似配列を含み、そのためＲを１つのバージョンで及びＫをその他のバージョンで試みた。
【０２８０】
Ｙ４９Ｓ：ＳはＬＣＤＲ２に接触し及び重要である。
【０２８１】
Ｔ６９Ｋ：ＫはＬＣＤＲ１に接触し及び重要である。
【０２８２】
Ｐ８０Ｔ：当該ヒトＩｇＧフレームワークにおいて、ＰはＴよりもより頻繁にあるが、プロリンのシス−トランス異性化が、タンパク質の折り畳みに影響を与えるので、Ｐを１バージョンで及びＴをその他のバージョンで試みた。
【０２８３】
Ｌ１０４Ｖ：Ｌを１バージョンで、及びＶをその他のバージョンで試みた。
【０２８４】
置換候補としての、当該重鎖可変領域における前記位置の選択の根拠は、以下の通りである。
【０２８５】
Ｑ１Ｅ：これは、突然変異であって逆突然変異ではない。グルタミン酸塩（Ｅ）の、ポリグルタミン酸塩（ｐＥ）への変換は、グルタミン（Ｑ）に比べてよりゆっくり起こる。グルタミンのｐＥへの変換における第一級アミンの欠如のために、抗体は、より酸性になる。不完全変換は、抗体に、電荷ベースの分析法を使用した場合に複数ピークとして観察される不均一を生み出す。不均一な差異は、プロセス制御の欠如を示す。
【０２８６】
Ｖ２０Ｌ：当該ヒトＩｇＧフレームワークにおいて、Ｌは、Ｖよりもより頻繁にある。
【０２８７】
Ｇ２７Ｙ：Ｃｈｏｔｈｉａで定義のように、この残基は、ＨＣＤＲ１内にあり、そのため結合能力を維持するために、Ｙを使用した。
【０２８８】
Ｓ３０Ｔ：Ｃｈｏｔｈｉａで定義のように、この残基は、ＨＣＤＲ１内にあり、そのため結合能力を維持するために、Ｔを使用した。
【０２８９】
Ｒ３８Ｋ：Ｋは、ＶＨにおける２つの界面残基、Ｌ４５及びＷ４７に接触し、及びそのため重要である。
【０２９０】
Ａ４０Ｒ：Ｒは、ＫＱＲＡＧＱＧ（ＶＨアミノ酸３８−４４）ループの末端に位置し、ＶＨにおける２つの界面残基、Ｖ３７及びＬ４５を支える。それは、抗体の折り畳みを維持するために重要である。
【０２９１】
Ｐ４１Ａ：当該ヒトＩｇＧフレームワークにおいて、ＰはＡよりもより頻繁にあるが、そのフレームワークへのＰの導入が、いくつかの構造変化を引き起こすかもしれず、そのため、Ｐを１バージョンで及びＡをその他のバージョンで試みた。
【０２９２】
Ｍ４８Ｉ：Ｉは、ＶＨにおけるＨＣＤＲ２ならびに界面残基、Ｖ３７及びＬ４５に接触している。
【０２９３】
Ｒ６６Ｋ：Ｋは、ＨＣＤＲ２に接触している。
【０２９４】
Ｖ６７Ａ：Ａは、ＨＣＤＲ２に接触している。
【０２９５】
Ｉ６９Ｌ：当該ヒトＩｇＧフレームワークにおいて、ＩはＬよりもより頻繁にあるが、ＬはＨＣＤＲ１及びＨＣＤＲ２に接触しており、そのため、Ｉを１バージョンで及びＬをその他のバージョンで試みた。
【０２９６】
Ｔ７５Ｓ：当該ヒトＩｇＧフレームワークにおいて、Ｔ及びＳ共に頻繁にある。
【０２９７】
Ｓ（８２Ａ）Ｒ：ＲはＨＣＤＲ２に接触しており、及び重要である。
【０２９８】
Ｙ９１Ｆ：Ｆは界面残基であり、及び抗体の折り畳みを支えるために重要である。
【０２９９】
当該２つの軽鎖可変領域の変異体及び２つの重鎖可変領域の変異体は、以下の通りである。
【０３００】
Ｈｕ１５Ｆ７ＶＬバージョン１（小文字は、Ｐ８Ｓ、Ｋ４２Ｎ、Ｋ４５Ｒ、Ｙ４９Ｓ、Ｔ６９Ｋ、及びＰ８０Ｔの逆突然変異）：ＤＩＱＭＴＱＳｓＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＥＤＩＹＮＲＬＡＷＹＱＱＫＰＧｎＡＰｒＬＬＩｓＧＡＴＳＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧｋＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱｔＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＷＳＩＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲ（配列番号５９）。
【０３０１】
Ｈｕ１５Ｆ７ＶＬバージョン２（小文字は、Ｋ４２Ｎ、Ｙ４９Ｓ、及びＴ６９Ｋの逆突然変異、ならびにＬ１０４Ｖの突然変異）：ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＥＤＩＹＮＲＬＡＷＹＱＱＫＰＧｎＡＰＫＬＬＩｓＧＡＴＳＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧｋＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＷＳＩＰＹＴＦＧＧＧＴＫｖＥＩＫＲ（配列番号６０）。
【０３０２】
Ｈｕ１５Ｆ７ＶＨバージョン１（小文字は、Ｑ１Ｅの突然変異及びＶ２０Ｌ、Ｇ２７Ｙ、Ｓ３０Ｔ、Ｒ３８Ｋ、Ａ４０Ｒ、Ｐ４１Ａ、Ｍ４８Ｉ、Ｒ６６Ｋ、Ｖ６７Ａ、Ｉ６９Ｌ、Ｔ７５Ｓ、Ｓ（８２Ａ）Ｒ、ならびにＹ９１Ｆの逆突然変異）：ｅＶＱＬＱＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫｌＳＣＫＡＳＧｙＴＦｔＳＹＧＬＳＷＶｋＱｒａＧＱＧＬＥＷｉＧＥＩＦＰＲＳＧＮＴＹＹＮＥＫＦＫＧｋａＴｌＴＡＤＫＳｓＳＴＡＹＭＥＬｒＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹｆＣＡＲＧＶＲＳＰＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号５７）。
【０３０３】
Ｈｕ１５Ｆ７ＶＨバージョン２（小文字は、Ｑ１Ｅの突然変異及びＶ２０Ｌ、Ｇ２７Ｙ、Ｓ３０Ｔ、Ｒ３８Ｋ、Ａ４０Ｒ、Ｍ４８Ｉ、Ｒ６６Ｋ、Ｖ６７Ａ、Ｔ７５Ｓ、Ｓ（８２Ａ）Ｒ、ならびにＹ９１Ｆの逆突然変異）：ｅＶＱＬＱＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫｌＳＣＫＡＳＧｙＴＦｔＳＹＧＬＳＷＶｋＱｒＰＧＱＧＬＥＷｉＧＥＩＦＰＲＳＧＮＴＹＹＮＥＫＦＫＧｋａＴＩＴＡＤＫＳｓＳＴＡＹＭＥＬｒＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹｆＣＡＲＧＶＲＳＰＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号５８）。
【０３０４】
実施例５．ヒト化１５Ｆ７抗体の結合の速度論的解析
Ｈｕ１５Ｆ７ＶＨｖ１−２（Ｈ１及びＨ２）から選択された重鎖、及びＨｕ１５Ｆ７ＶＬｖ１−２（Ｌ１及びＬ２）から選択された軽鎖を含むヒト化１５Ｆ７抗体の結合を速度論で特徴づけた。
【０３０５】
キメラ１５Ｆ７、Ｈ１Ｌ１、Ｈ１Ｌ２、Ｈ２Ｌ１、Ｈ２Ｌ２、及び緩衝液単独の、ＬＡＭＡ４−フラグメント表示細胞への結合能力を試験した。ＬＡＭＡ４結合能力を試験するために、連続的に希釈した抗体を、ＬＧ４−５を表示しているヒト２９３細胞と予備培養し、次いで、材料と方法に記載のように、抗−ヒト６５０二次抗体の培養を行った。フローサイトメトリー解析を介して蛍光シグナルを評価し、及び図８に示すように、平均蛍光強度（ＭＦＩ）をプロットした。連続希釈したＨ１Ｌ１、Ｈ１Ｌ２、Ｈ２Ｌ１、及びＨ２Ｌ２抗体を、キメラ１５Ｆ７と比較した結合能力で、各々示した。
【０３０６】
キメラ１５Ｆ７、Ｈ１Ｌ１、Ｈ１Ｌ２、Ｈ２Ｌ１、及びＨ２Ｌ２抗体の、ＬＡＭＡ４のＧドメインのＬＧ４−５モジュールへの特異的な結合を、フローサイトメトリーにより、ＬＡＭＡ４−フラグメント表示２９３細胞を、それら抗体が染色する能力を評価することにより試験した。それら抗体の各々は、２９３細胞が表示するＬＧ１−５及びＬＧ４−５を特異的に結合できたが、ＬＧ１−３は結合できなかった。
【０３０７】
図１０Ａ及び１０Ｂに示すように、相対結合及びオン／オフ率をＦｏｒｔｅＢｉｏアッセイで解析した。図１０Ａにおいて、抗−Ｈｉｓセンサーに、１０ｕｇ／ｍｌの精製したＨｉｓ−ＬＡＭＡ４を、次いで、５ｕｇ／ｍｌのｍ１５Ｆ７、キメラ１５Ｆ７、Ｈ１Ｌ１、Ｈ１Ｌ２、Ｈ２Ｌ１、及びＨ２Ｌ２を負荷した。会合及び解離を解析した。図１０Ｂにおいて、ヤギ抗−ヒトＦｃセンサーに、５ｕｇ／ｍｌで指示されたｍ１５Ｆ７、キメラ１５Ｆ７、Ｈ１Ｌ１、Ｈ１Ｌ２、Ｈ２Ｌ１、及びＨ２Ｌ２を、次いで、１０ｕｇ／ｍｌのＨｉｓ−ＬＡＭＡ４を負荷した。会合及び解離を解析した。相対結合及びオン／オフ比率について、キメラ１５Ｆ７及びｍ１５Ｆ７の結合に比べて同じかまたは高い相対結合度を示すＨ１Ｌ１及びＨ２Ｌ１を、試験した全ての抗体と比較した。
【０３０８】
次に、抗体のＢｉａｃｏｒｅ完全結合速度論解析を実施した。材料と方法に記述されるように、ＳＰＲ解析を行った。詳細な、結合速度論的パラメーター（会合率（ｋａｓｓｏｃ）、解離率（ｋｄｉｓｓｏｃ）、及び結合親和定数（ＫＤ））を、キメラ１５Ｆ７、ヒト化Ｈ１Ｌ１、及びヒト化Ｈ２Ｌ１に対して決定した。当該ヒト化１５Ｆ７変異体のＨ１Ｌ１及びＨ２Ｌ１に対する結合速度論的パラメーターを、キメラ１５Ｆ７のそれらと比較した（表６を参照）。
【表６】
2017514458.tif 000017
【０３０９】
実施例６．抗−ラミニン抗体は、ラミニン−４１１誘発ｐＡｋｔ活性化を阻害する
ＷＭ２６６．４ヒト腫瘍黒色腫細胞を、２４時間の血清飢餓にし、及び次いで、１０ｕｇ／ｍｌのラミニン４１１（ガンマ１及びベータ１と複合したＬＡＭＡ４）及び２０ｕｇ／ｍｌの１５Ｆ７またはｍＩｇＧ１対照抗体を伴う無血清細胞培養培地に、３０分間懸濁した。ラミニン４１１に対する対照サンプルとして、ＢＳＡタンパク質を使用した。細胞を遠心沈降させ、及びイムノブロット分析のために溶解した。ｐＡｋｔ及び総Ａｋｔレベルを、イムノブロットにより評価した。これらのレベルの比率（ｐＡｋｔ／Ａｋｔ）を、図１１Ａ及びＢに示す。各条件（ｍＩｇＧ１＋ラミニン４１１、１５Ｆ７＋ラミニン４１１、及びｍＩｇＧ１＋ＢＳＡ）を、３回反復して試験した。図１１Ａは、各個別サンプルの結果を示し、及び図１１Ｂは、各条件に対する平均及び標準誤差を示している。図１１Ｂに示すように、ラミニン４１１誘発のｐＡｋｔシグナル伝達（すなわち、より高いｐＡｋｔ／Ａｋｔ比）を、ＢＳＡ対照サンプル、及び１５Ｆ７部分阻止のラミニン４１１誘発のｐＡｋｔ活性化（５０％以下の阻害）と比較した。
【０３１０】
実施例７．ノッチシグナル伝達における、ラミニン４１１及び抗−ラミニン抗体の効果
ノッチリガンドＤｌｌ４の転写／翻訳には、インテグリン結合及びそれに続くリン酸化Ａｋｔのシグナル伝達が必要なので、ノッチシグナル伝達における、抗−ＬＡＭＡ４抗体の効果を試験した。ＨＵＶＥＣ、ＷＭ２６６．４、及びＲＡＷ細胞を、１０ｕｇ／ｍｌのラミニン−４１１（ガンマ１及びベータ１と複合したＬＡＭＡ４）及び２０ｕｇ／ｍｌの１５Ｆ７またはアイソタイプの対照抗体と共に、細胞培養培地中で、２４時間再懸濁した。ラミニン４１１に対する対照サンプルとして、ＢＳＡタンパク質を使用する。細胞を遠心沈降させ、及び開裂した／活性化したノッチ１、Ｄｌｌ４、ＭＣＡＭ、アクチン、ｐＡｋｔ、及びＡｋｔに対して、イムノブロット分析のために溶解する。さらに、Ｈｅｙ１、ＭＣＰ−１（炎症における単球走化性因子）、ＭＣＡＭ、ＬＡＭＡ４、及びＧＡＰＤＨに対するｑＰＣＲ解析を実施する。
【０３１１】
実施例８．生体内肥満モデルにおける抗−ラミニン抗体の効果
Ａｋｔシグナル伝達は、ノッチシグナル伝達にとって重要であり、及びノッチシグナル伝達は、脂肪細胞の成長を促すので、ＬＡＭＡ４に対する抗体の、体重の増減ならびに脂肪細胞の代謝及び脂肪分解における効果を、生体内肥満モデルにおいて試験した。マウスの高脂肪食（ＨＦＤ）駆動の体重増加を、抗−ラミニン４１１抗体への応答で評価した。野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、高脂肪食（例えば、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ，Ｉｎｃ．の製品＃Ｄ１２４５１などの、４５％ｋｃａｌ％脂肪の齧歯動物食）を不断給餌する。２つの実験グループ、（１）対照Ｉｇで処置されたマウス、及び（２）１５Ｆ７で処置されたマウスを試験した。各グループには、１０匹のマウスがいて、及び各マウスを、３か月から４か月間、１０ｍｇ／ｋｇ／週の抗体で処置する。体重測定を、２〜４週ごとに行う。
【０３１２】
脂肪組織へのＬＡＭＡ４の局在化を評価するために、抗−ＬＡＭＡ４抗体（アイソタイプの対照抗体との比較で）を、マウスに静脈内投与する。脂肪組織への局在化を評価するために、染色を行う。
【０３１３】
実施例９．材料と方法
ＬＡＭＡ４フラグメントの精製
Ｈｉｓタグ化されたＬＡＭＡ４Ｇドメインのフラグメントを、標準的な手順によりクローン化し、及び２９３細胞に、一過性で発現させた。タンパク質を、ニッケル−ＮＴＡカラムを使用して精製した。
【０３１４】
ＬＡＭＡ４ノックアウトマウス
Ｌａｍａ４ヌルマウスを、最初に、Ｄｒ．Ｋａｒｌ  Ｔｒｙｇｇｖａｓｏｎ（Ｋａｒｏｌｉｎｓｋａ大学）から得た。
【０３１５】
組換えＭＣＡＭ−Ｆｃタンパク質の生成
ＭＣＡＭ−Ｆｃを、ヒトまたはマウスＭＣＡＭの細胞外ドメインをヒトＩｇＧ１に融合することにより、実験室内で生成し、及び標準的技術を使用して、ＣＨＯ細胞内で産生／精製した。
【０３１６】
抗体の生成
Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社から得た組換えマウスのラミニン４（Ｌａｍａ４）及び最初にＤｒ．Ｋａｒｌ  Ｔｒｙｇｇｖａｓｏｎ（Ｋａｒｏｌｉｎｓｋａ大学）から得た１０週成長後のＬａｍａ４ヌルマウスを、当該抗体の発達のために使用した。精製したラミニンα４（ＬＡＭＡ４）を、１０ｕｇＬＡＭＡ４／２５ｕｌ補助剤の割合で、ＲＩＢＩ補助剤に懸濁した。マウスをイソフルランで麻酔し、及び２７ゲージの注射針で、３匹のマウスには、各後部足蹠または後部膝に、ＲＩＢＩ補助剤中の５ｕｇのＬａｍａ４を免疫注入し、一方２匹のマウスには、ＲＩＢＩ補助剤中の１２．５ｕｇのＬａｍａ４を、各後部足蹠または後部膝に免疫注入した。マウスは、前述の手順に従って、０、４、１２、１６及び２０日目に注入した。２４日目に、動物を安楽死させ、及び無菌フード内で、膝窩及び鼠径リンパ節を除去する。そのリンパ節を解離し、及びＰＥＧ融合の代わりに電気融合を組み込んだ、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ手順の修正版を使用して、ＳＰ２／０で融合する。融合細胞を、９６ウェルプレートに配置し、及び成長させる。
【０３１７】
細胞が、半分から４分の３に到達したら、合流選別を開始する。簡単にいうと、コ−スターＲＩＡ／ＥＩＡプレートを、１ｕｇ／ｍＬ、５０ｕＬ／ウェルのウサギの抗−Ｈｉｓタグ（Ａｎａｓｐｅｃ社、＃２９６７３）でコーティングし、ＰＢＳ中で１時間置いた。次いで、プレートを、２５０ｕｌ／ウェルの１％ＢＳＡ／ＰＢＳで１５分間ブロックし、及び次いで除去した。Ｈｉｓタグ化されたＬａｍａ４を、０．２５ｕｇ／ｍＬ、５０ｕＬ／ウェルにおける、そのプレートに添加して１時間置き、及び２回洗浄した。融合プレートからの７５ｕＬの上清を添加し、及び１時間培養し、プレートを２回洗浄した。ヤギ−抗−マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ社、＃１１５−０３５−１６４）を、０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ／ＴＢＳＴに、１：２０００希釈で添加して１時間置き、次いで５回洗浄した。プレートを、５０ｕｌ／ウェルのＴＭＢ（ＳｕｒＭｏｄｉｃｓｓ社、＃ＴＭＢＷ２４）で発達させて５分間置き、及び１５ｕＬで２ＮのＨ２ＳＯ４で停止させ、ならびに４５０ｎｍで読み込んだ。ＯＤが１．０を超えて大きいウェルを、追加選別のために選定した。ＥＬＩＳＡにより、陽性であることを見出したウェルからの細胞を成長させ及び凍結した。上清を、以下に記述する追加の選別に提供した。以下に記述の特定の基準に合致するウェルからの細胞を、Ｃｌｏｎｅｐｉｘ  ＦＬを使用してクローン化し、及び単一細胞クローンを見出すために、その会社が推奨する設定条件で選別した。これらを拡張し及びその抗体を上清から精製した。
【０３１８】
ＬＡＭＡ４表示の、フローサイトメトリーによる結合評価
ヒトＬＡＭＡ４のＧドメイン１−５及び変異体を、ｐＤｉｓｐｌａｙ発現コンストラクト（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）にクローン化し、及び標準手順を使用して２９３に一過性のトランスフェクションを行った。抗−ＬＡＭＡ４抗体を、細胞と共に４℃で３０分間培養し、及び次いで抗−マウス−６５０と共に、４℃で３０分間培養した。標準手順を使用したフローサイトメトリーにより、細胞の抗−ラミニン結合を分析した。
【０３１９】
ＷＭ−２６６−４細胞のトランスフェクション及び染色
培養したＷＭ−２６６−４を、完全長のヒトＭＣＡＭ−ＧＦＰ融合コンストラクトでトランスフェクションし、及び標準手順を使用して抗−ＬＡＭＡ４抗体で染色した。
【０３２０】
ＷＭ−２６６−４ヒト黒色腫皮下腫瘍組織
細胞を培養し、及び動物当たり５×１０５の細胞を、ヌードマウスの肩の上方に皮下投与した。５週間後、動物を、ＰＢＳで経心腔的に灌流し、及び腫瘍を摘出しならびに急速凍結した。
【０３２１】
Ｂ１６マウス黒色腫皮下腫瘍組織
細胞を培養し、及び動物当たり５×１０５の細胞を、ｃ５７ｂl６マウスの肩の上方に皮下投与した。５週間後、動物を、ＰＢＳで経心腔的に灌流し、及び腫瘍を摘出しならびに急速凍結した。
【０３２２】
Ｂ１６マウス黒色腫肺転移肺組織
細胞を培養し、及び動物当たり５×１０５の細胞を、チャールズ川（Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ社の屋外敷地）から得たヌード／ベージュマウスに静脈内注射した。３週間後、動物を、ＰＢＳで経心腔的に灌流し、及び肺を摘出しならびに急速凍結した。
【０３２３】
蛍光顕微鏡／標準免疫蛍光法
マウス組織をＯＣＴにおいて急速冷凍し、及び１０ｕＭで切片化した。切片を冷却アセトン中で固定し、及び抗−ＬＡＭＡ４抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社）で染色した。
【０３２４】
ヒト黒色腫の細胞接着アッセイ
１０ｕｇ／ｍｌの組換えｍＬＡＭＡ４（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社）を、９６−ウェルプレートにコートし、４℃で一晩置いた。ＰＢＳ洗浄ステップに従い、ウェルを、１％ＢＳＡ／ＭＥＭで、室温で１時間ブロックした。０．１％ＢＳＡ／ＭＥＭ中の２０ｕｇ／ｍｌの抗−ＬＡＭＡ４抗体を、プレートに添加し、室温で１時間置いた。ＷＭ−２６６−４細胞を、ＥＤＴＡで再懸濁し、洗浄し及び０．１％／ＭＥＭ中の３００，０００細胞／ｍｌで再懸濁し、次いで３７℃の蓋のない試験管の、組織培養培地で１０分間培養した。ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中に１％ＦＢＳ）での２回の洗浄に次いで、細胞を、６５０−共役の抗−パン−ラミニン抗体（１：１０００、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社）に再懸濁し、及び４℃で２０分間培養し、ならびに再び洗浄した。抗体溶液を除去せずに、細胞懸濁液をウェルに添加し、及び組織培養器中で、覆い無しで１．５時間培養した。ＰＢＳ洗浄ステップに従い、５７０ｎｍでのプレート読み取り分析に先立って、グルタルアルデヒド／クリスタルバイオレット溶液で染色／固定した。
【０３２５】
Ｆａｂフラグメントの生成
全抗体のＦａｂフラグメントを、製造者の指示（Ｐｉｅｒｃｅ社）に従う、Ｆａｂ  Ｍｉｃｒｏ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎキットを使用して生成した。解放されたＦｃの除去及び無傷の最終生成物の検証を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりモニターし、及び濃度を、ビシンコニン酸アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ社）を使用して決定した。
【０３２６】
親和性のＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）測定
異なるラミニン抗体の結合を比較するために、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００を使用して、ＳＰＲ解析を実施した。Ｆａｂ調合に対応して、抗−６ｘＨｉｓ抗体（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を、アミンカップリングを介してＣ１センサーチップ上に固定化し、ならびにヒトＨｉｓ−ラミニン−α４、マウスＨｉｓ−ラミニン−α４（両方を、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社から）、及び無関係の６ｘＨｉｓ−タグ化タンパク質（反応対照サンプルとして）を、２５ＲＵの最大結合を保証するレベルで、検出した。３００−０．４１ｎＭの範囲の多様な濃度のＦａｂ調合物を、５０ｕｌ／分の流速で、２４０秒の会合時間及び変動させた解離時間で、緩衝液（ＨＢＳ＋０．０５％Ｐ−２０、１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ）中を並行して移動させ、検出配位子上を通過させた。検出分子からの配位子の解離を計測するために、Ｈｉｓタグ化配位子を含まない無関係なセンサー、及び０ｎＭの被分析物濃度の両方のデータを、二重参照した。次いで、異種配位子モデルまたは広範囲の１対１合致のいずれかを使用して、データを解析した。
【０３２７】
全ＩｇＧに対して、抗−マウス抗体を、アミンカップリングを介して、Ｃ１センサーチップ（デキストラン鎖を欠如）上に固定化し、及びラミニンｍＡｂｓを、５０ＲＵの被分析物の最大結合を保証するレベルで、検出した。３１．２５ｎＭから０．１２２ｎＭの範囲の多様な濃度の被分析物（Ｑ８２６から開始する、組換えヒトまたはマウスＨｉｓ−ラミニン−α４フラグメント（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社））を、３０ｕｌ／分の速度で、１８０秒の会合時間／９００秒の解離時間で、緩衝液（ＨＢＳ＋０．０５％Ｐ−２０、１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、ここで記載される場合を除き）中を移動させ、検出配位子上を通過させた。検出分子からの配位子の配位子の解離を計測するために、Ｈｉｓタグ化配位子を含まない無関係なセンサー、及び０ｎＭの被分析物濃度の両データを、二重参照した。可能であれば、広範囲な１対１合致を使用して、データを解析した。仮に、動的センサーグラム曲率が、適切なモデルに合致できなかった場合、定常状態近似を行い及び報告した。
【０３２８】
サポリン媒介ＷＭ−２６６−４の細胞毒性アッセイ
製造者の指示書による（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）。
【０３２９】
ヒト黒色腫組織及び腫瘍マイクロアレイスライド
固定化していない、健康な及び黒色腫の皮膚のスライドを、Ｏｒｉｇｅｎｅ社から入手した。アセトン固定の腫瘍マイクロアレイ（ＴＭＡ）スライドを、Ｂｉｏｃｈａｉｎ社から入手した。
【図１】
2017514458.tif 000018
【図２Ａ】
2017514458.tif 000019
【図２Ｂ】
2017514458.tif 000020
【図２Ｃ】
2017514458.tif 000021
【図３】
2017514458.tif 000022
【図４Ａ】
2017514458.tif 000023
【図４Ｂ】
2017514458.tif 000024
【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
2017514458.tif 000026
【図５Ｂ】
2017514458.tif 000027
【図５Ｃ】
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【図６】
2017514458.tif 000029
【図７】
2017514458.tif 000030
【図８】
2017514458.tif 000031
【図９】
2017514458.tif 000032
【図１０Ａ】
2017514458.tif 000033
【図１０Ｂ】
2017514458.tif 000034
【図１１Ａ】
2017514458.tif 000035
【図１１Ｂ】
2017514458.tif 000036
【配列表】
2017514458000001.app
【国際調査報告】
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