(57)【要約】  糸状真菌細胞のゲノム中における標的部位でのゲノム改変用の組成物および方法が提供される。この方法および組成物は、標的部位を改変するためのまたは変更するためのガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムに関する。改変されている糸状真菌細胞が有する非相同末端結合経路が不完全である態様も提供される。【選択図】図２
2017538425.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糸状真菌細胞中でのゲノム遺伝子座とドナーＤＮＡとの相同組換えの方法であって、
ａ）Ｃａｓエンドヌクレアーゼと、ガイドＲＮＡと、前記真菌細胞のゲノム遺伝子座に対する相同性を有するドメインを含むドナーＤＮＡとを糸状真菌細胞の集団に導入することであって、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼおよび前記ガイドＲＮＡは、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼが前記真菌細胞の前記ゲノム遺伝子座中のまたは前記ゲノム遺伝子座付近の標的部位で作用することを可能にする複合体を形成することができる、導入すること、ならびに
ｂ）前記集団から、前記ゲノム遺伝子座と前記ドナーＤＮＡとの相同組換えが起きている少なくとも１個の真菌細胞を同定すること
を含み、
前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、前記ガイドＲＮＡまたは両方が前記真菌細胞の集団に一時的に導入される、
方法。
【請求項２】
前記真菌細胞中における前記標的部位での非相同末端結合（ＮＨＥＪ）メカニズムが活性化されていない、機能していない、または低下している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記真菌細胞中における非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路が、１種または複数種の機能していないまたは活性が低下している成分を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記１種または複数種の機能していないまたは活性が低下している成分が、ｋｕ８０、ｋｕ７０、ｒａｄ５０、ｍｒｅ１１、ｘｒｓ２、ｌｉｇ４、ｘｒｓおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記１種または複数種の機能していないまたは活性が低下している成分がｋｕ８０である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＣａｓエンドヌクレアーゼがＣａｓニッカーゼである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＣａｓエンドヌクレアーゼがＣａｓ９エンドヌクレアーゼまたはこの変異体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはこの変異体が、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種、Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、Ｎ．メニンジティデス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）種、Ｆ．ノビシダ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ）およびパスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）種、Ｐ．ムルトシダ（Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）からなる群から選択される種由来の完全長Ｃａｓ９またはこの機能的断片を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはこの変異体が、配列番号４５および４８〜５３のいずれか一つに対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ドナーＤＮＡが目的のポリヌクレオチド配列を含み、前記ゲノム遺伝子座での相同組換えにより前記目的のポリヌクレオチド配列が前記ゲノム遺伝子座に挿入される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記導入する工程が、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼ用の発現カセットを含むＤＮＡ構築物を前記真菌細胞に導入することを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記導入する工程が、前記ガイドＲＮＡ用の発現カセットを含むＤＮＡ構築物を前記真菌細胞に導入することを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記導入する工程が、選択可能マーカーをコードする配列を含むＤＮＡ構築物を前記真菌細胞に導入することを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＤＮＡ構築物が、前記選択可能マーカーをコードする配列と前記ドナーＤＮＡとの両方を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記導入する工程が、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードする配列と、前記ガイドＲＮＡをコードする配列と、選択可能マーカーをコードする配列と、前記ドナーＤＮＡとを含むＤＮＡ構築物を前記真菌細胞に導入することを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＤＮＡ構築物が線状ＤＮＡ構築物である、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＤＮＡ構築物が環状ＤＮＡ構築物である、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼ用の発現カセットまたは前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードする配列が、前記糸状真菌細胞中での発現に最適化されているＣａｓコーディング配列を含む、請求項１１および１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｃａｓコーディング配列が、配列番号４４に対して少なくとも７０％同一であるポリヌクレオチド配列を含むＣａｓ９コーディング配列である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記導入する工程が、前記真菌細胞に前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼを直接導入することを含む、請求項１〜１０、１２〜１４および１６〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記導入する工程が、前記真菌細胞に前記ガイドＲＮＡを直接導入することを含む、請求項１〜１１、１３〜１４および１６〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼが核局在化シグナルに作動可能に連結されている、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記糸状真菌細胞がユウミコチニア（Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ）真菌細胞またはペジゾミコチニア（Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ）真菌細胞である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記真菌細胞が、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、マイセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ヒポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）およびエメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）からなる群から選択される、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記標的部位が、オープンリーディングフレーム、プロモーター、制御配列、ターミネーター配列、制御エレメント配列、スプライス部位、コーディング配列、ポリユビキチン化部位、イントロン部位およびイントロン増強モチーフからなる群から選択される目的の遺伝子の領域内に位置する、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記相同組換えにより、前記標的部位でまたは前記標的部位付近でＤＮＡ配列が改変され、前記改変が、１個または複数個のヌクレオチドの欠失、１個または複数個のヌクレオチドの挿入、目的のタンパク質をコードする発現カセットの挿入、１個または複数個のヌクレオチドの置換およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記同定する工程が、前記相同組換えまたは前記改変を選択するためのまたはスクリーニングするための条件下で前記工程（ａ）からの細胞の集団を培養することを含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記同定する工程が、不安定な形質転換体をスクリーニングするための条件下で前記工程（ａ）からの細胞の集団を培養することを含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記導入する工程が、選択可能マーカーをコードする配列と前記ドナーＤＮＡとを含むＤＮＡ構築物を前記真菌細胞に導入することを含み、前記同定する工程が、前記選択可能マーカーを失っているが前記ドナーＤＮＡを保持している不安定な形質転換体をスクリーニングするための条件下で前記工程（ａ）からの細胞の集団を培養することを含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法により製造されている組換え糸状真菌細胞。
【請求項３１】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼ用の発現カセットを含む第１の組換えＤＮＡ構築物を含む組換え糸状真菌細胞。
【請求項３２】
前記組換え糸状真菌細胞が、ＮＨＥＪ経路中の１種または複数種の機能していないまたは活性が低下している成分を含む、請求項３０または３１に記載の組換え真菌細胞。
【請求項３３】
前記ＮＨＥＪ経路の１種または複数種の成分が、ｋｕ８０、ｋｕ７０、ｒａｄ５０、ｍｒｅ１１、ｘｒｓ２、ｌｉｇ４およびｘｒｓからなる群から選択される、請求項３２に記載の組換え真菌細胞。
【請求項３４】
目的のポリヌクレオチドを含むドナーＤＮＡを更に含む請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の組換え真菌細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、全体が参照により本明細書に援用されるＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＣＮ２０１４／０９３９１４、ＰＣＴ／ＣＮ２０１４／０９３９１６およびＰＣＴ／ＣＮ２０１４／０９３９１８（全てが２０１４年１２月１６日に出願されている）に対する優先権を主張する。
【０００２】
配列表
（３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５２（ｅ）に従って）ＥＦＳを介して提出した配列表を参照により本明細書に援用する。ＥＦＳを介して提出した配列表テキストファイルには、２０１５年１２月３日に作成したファイル「４０５３２−ＷＯ−ＰＣＴ−４＿２０１５−８３２  ｆｉｎａｌ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」（１６５キロバイトのサイズである）が含まれている。
【背景技術】
【０００３】
細菌および古細菌は、配列特異的にＤＮＡ中に二本鎖切断（ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ｂｅａｋ）を導入することができる群生性等間隔短回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）システムと呼ばれる適応免疫防御を進化させている。Ｃａｓシステムは、短いＲＮＡ配列（ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡ）と（ｃｒＲＮＡにおいて可変ターゲティングドメインと呼ばれる一部に対する相同性によって）特定のＤＮＡ配列を標的とするＲＮＡ依存性エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓエンドヌクレアーゼ）とを含むリボ核タンパク質複合体の活性により機能を発揮し、標的中で二本鎖を切断する。ＣＲＩＳＰＲの遺伝子座は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で初めて認識され（Ｉｓｈｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ．１６９：５４２９−５４３３、Ｎａｋａｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ．１７１：３５５３−３５５６）、その後、同様の散在した短い配列反復が多くの細菌種（ハロフェラックス・メディテラネイ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）およびマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）が挙げられるがこれらに限定されない）で同定された（Ｇｒｏｅｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０：１０５７−１０６５、Ｈｏｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．５：２５４−２６３、Ｍａｓｅｐｏｈｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １３０７：２６−３０、Ｍｏｊｉｃａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１７：８５−９３）。
【０００４】
ゲノムＤＮＡ中における特定の標的部位での切断の誘導を使用して、この部位でまたはこの部位付近で改変を導入することができることは公知である。例えば、遺伝子ターゲティングのための相同組換えは、標的とするＤＮＡ部位が二本鎖切断を含む場合に増強されることが分かっている（例えばＲｕｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２２：５１９−５３４、Ｓｍｉｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：５０１２−５０１９を参照されたい）。Ｃａｓシステムの部位特異的性質を前提して、例えば哺乳動物細胞中での、このシステムに基づくゲノム改変／操作技術が説明されている（例えば「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」という表題のＨｓｕ  ｅｔ  ａｌ．；Ｃｅｌｌ  ｖｏｌ．１５７，ｐ１２６２−１２７８，５  Ｊｕｎｅ  ２０１４を参照されたい）。Ｃａｓベースのゲノム操作の力は、ｃｒＲＮＡのＤＮＡターゲティング領域（可変ターゲティングドメイン）がゲノム中の所望の標的部位に対して相同である組換えｃｒＲＮＡ（または同等に機能するポリヌクレオチド）を設計し、この組換えｃｒＲＮＡとＣａｓエンドヌクレアーゼとを宿主細胞中で（あらゆる好都合な手段によって）機能的複合体へと組み合わせることにより、複雑なゲノム内での任意の特定の位置を事実上標的とする能力に由来する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
Ｃａｓベースのゲノム操作技術は多くの異なる宿主細胞型に適用されているが、真菌細胞中でのそのようなシステムの効率的な使用は困難であることが判明している。そのため、真菌細胞中でゲノム標的部位を改変するための／変更するための効率的で効果的なＣａｓベースのゲノム操作法および組成物を開発することが依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
真菌細胞（例えば糸状真菌細胞）中でのゲノム遺伝子座とドナーＤＮＡとの相同組換えを促進するためにガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムを用いる組成物および方法が提供される。
【０００７】
本開示の態様は、真菌細胞中でのゲノム遺伝子座とドナーＤＮＡとの相同組換えの方法に関する。一部の実施形態では、この方法は、ａ）Ｃａｓエンドヌクレアーゼと、ガイドＲＮＡと、真菌細胞のゲノム遺伝子座に対する相同性を有するドメインを含むドナーＤＮＡとを糸状真菌細胞の集団に導入することであって、ＣａｓエンドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼが真菌細胞のゲノム遺伝子座中のまたはこのゲノム遺伝子座付近の標的部位で作用することを可能にする複合体を形成することができる、導入すること、ならびにｂ）この集団から、ゲノム遺伝子座とドナーＤＮＡとの相同組換えが起きている少なくとも１個の真菌細胞を同定することを含み、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、ガイドＲＮＡまたは両方が真菌細胞の集団に一時的に導入される。
【０００８】
一態様では、本開示は、真菌細胞中でのゲノム遺伝子座とドナーＤＮＡとの相同組換えの方法であって、ａ）Ｃａｓエンドヌクレアーゼと、ガイドＲＮＡと、真菌細胞のゲノム遺伝子座に対する相同性を有するドメインを含むドナーＤＮＡとを真菌細胞に導入することであって、ＣａｓエンドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼが真菌細胞のゲノム遺伝子座中のまたはこのゲノム遺伝子座付近の標的部位で作用することを可能にする複合体を形成することができる、導入すること、ならびにｂ）真菌細胞中でゲノム遺伝子座とドナーＤＮＡとの相同組換えが起きているかどうかを確認することを含み、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、ガイドＲＮＡまたは両方が真菌細胞の集団に一時的に導入される、方法に関する。
【０００９】
本発明者らは、一部の実施形態において、真菌細胞中において標的部位（即ちＣａｓエンドヌクレアーゼ活性部位）で非相同末端結合（ＮＨＥＪ）メカニズムを抑制することによりまたは不活性化することによりゲノム遺伝子座でのドナーＤＮＡの相同組換えが増強されることを発見した。従って、本発明の態様は、真菌細胞中において標的部位での非相同末端結合（ＮＨＥＪ）メカニズムが活性化されていない、機能していないまたは低下している条件下で、本明細書で説明する相同組換え法を実施することを含む。
【００１０】
糸状真菌細胞中において標的部位でＮＨＥＪ経路を機能させない（不活性化する）ことまたは低下させることはあらゆる好都合な方法で達成され得、長期（もしくは安定した）表現型の宿主細胞または短期（もしくは一過性の）表現型の宿主細胞のいずれかであることができる。例えば、ＮＨＥＪ経路の長期不活性化を、この活性が低下するまたは宿主細胞から除去されるようなＮＨＥＪ経路に関与する１種または複数種の遺伝子の染色体遺伝子変更（例えばＮＨＥＪ経路における遺伝子の欠失）により達成することができる。この結果、ＮＨＥＪ経路がまだ機能していない／不活性化されているまたは低下している所望の遺伝子変更（所望の位置でのドナーＤＮＡとゲノムＤＮＡとの間の相同組換え）を有する子孫細胞が得られる。或いは、宿主細胞中における標的部位でのＮＨＥＪ経路の機能の遮断または低下を一時的に行うことができる。例えば、ＮＨＥＪ経路の一時的不活性化を、発現がＮＨＥＪ経路の１種または複数種の特定の成分の発現または活性を抑制する抑制性ＲＮＡまたはドミナントネガティブタンパク質を発現する一時的組換えＤＮＡ構築物を宿主細胞に導入することにより達成することができる。
【００１１】
所望の遺伝子変更を有する子孫細胞を得た後、例えば一時的組換えＤＮＡ構築物を維持するための選択圧を取り除くことにより、この子孫細胞から一時的組換えＤＮＡ構築物を除去することができる。この方法では、所望の子孫は、正常に機能するＮＨＥＪ経路を有することができる。機能しなくなり得るまたは活性が低下され得るＮＨＥＪ経路成分の例として、ｋｕ８０、ｋｕ７０、ｒａｄ５０、ｍｒｅ１１、ｘｒｓ２、ｌｉｇ４、ｘｒｓまたはこれらの任意の所望の組み合わせが挙げられる。特定の一実施形態では、真菌細胞はｋｕ８０の発現および／または活性が不活性化されている、または低下している。本明細書において、用語「機能しない」は、ＮＨＥＪ経路の特定の成分に関する場合、（例えば遺伝子欠失により）この成分が細胞に存在しない場合と、この成分は存在するが機能しない場合（例えば機能しない変異タンパク質）とを包含することが留意される。
【００１２】
或いは、二本鎖切断活性ではなくニッキングエンドヌクレアーゼ活性（即ち、標的部位でＤＮＡの一方の鎖のみを切断し、本明細書ではＣａｓニッカーゼとも称される）を有するＣａｓエンドヌクレアーゼを用いることができる。標的部位でのニックの導入により、二本鎖切断と同様に標的部位でＮＨＥＪ経路は活性化されないが、目的のゲノム遺伝子座（このゲノム遺伝子座はＣａｓニッカーゼの標的部位を含む、またはこの標的部位付近に存在する）とドナーＤＮＡとの間の相同組換えが改善されない。Ｃａｓニッカーゼの例として、下記で説明するＣａｓエンドヌクレアーゼ変異体が挙げられる。
【００１３】
いくつかの異なる型のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムが説明されており、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムおよびＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムに分類され得る（例えばＬｉｕ  ａｎｄ  Ｆａｎ，ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍ：ａ  ｐｏｗｅｒｆｕｌ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（２０１４）８５：２０９−２１８での説明を参照されたい）。ある特定の態様では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはこの変異体（例えばＣａｓニッカーゼが挙げられる）を用いるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである。このＣａｓ９エンドヌクレアーゼはあらゆる好都合なＣａｓ９エンドヌクレアーゼであることができ、この好都合なＣａｓ９エンドヌクレアーゼとして、下記の細菌種由来のＣａｓ９エンドヌクレアーゼおよびこの機能的断片が挙げられるがこれらに限定されない：ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種（例えばＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）およびＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種（例えばＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ））、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種（例えばＮ．メニンジティデス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ））、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）種（例えばＦ．ノビシダ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ））ならびにパスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）種（例えばＰ．ムルトシダ（Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ））。Ｃａｓ９に関して多くのその他の種を使用することができる。例えば、機能的Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはこの変異体であって、配列番号４５および４８〜５３のいずれか一つに対して少なくとも７０％の同一性を有し、例えば配列番号４５および４８〜５３のいずれか一つに対して少なくとも８０％の同一性を有し、少なくとも９０％の同一性を有し、少なくとも９５％の同一性を有し、少なくとも９６％の同一性を有し、少なくとも９７％の同一性を有し、少なくとも９８％の同一性を有し、少なくとも９９％の同一性を有し、例えば最大で１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む機能的Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはこの変異体を用いることができる。
【００１４】
ある特定の実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼおよび／またはガイドＲＮＡを真菌細胞に導入することは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ用の発現カセット、ガイドＲＮＡ用の発現カセットまたは両方を含む１種または複数種のＤＮＡ構築物を真菌細胞に導入することを含む。この１種または複数種のＤＮＡ構築物がいったん真菌細胞中に入ると、Ｃａｓエンドヌクレアーゼおよび／またはガイドＲＮＡが発現される。ある特定の実施形態では、このＤＮＡ構築物は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ用の発現カセット、ガイドＲＮＡ用の発現カセットおよびドナーＤＮＡを含む環状ＤＮＡ構築物であり、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは二本鎖切断ＣａｓエンドヌクレアーゼまたはＣａｓニッカーゼのいずれかであることができる。
【００１５】
ある特定の実施形態では、導入する工程は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼポリペプチド、ガイドＲＮＡまたは両方を真菌細胞に直接導入することを含む。直接導入とＤＮＡ構築物の使用との任意の組み合わせを用いることができる（例えば、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ用の発現カセットを有するＤＮＡ構築物を真菌細胞に導入し、同時にまたは望ましい場合には連続的に、この細胞にガイドＲＮＡを直接導入する）。
【００１６】
本明細書で説明する方法の内のいくつかでは、ＤＮＡ構築物中のＣａｓ発現カセットは、真菌細胞中での発現に最適化されているＣａｓエンドヌクレアーゼコーディング遺伝子を含む。例えば、糸状真菌細胞中での発現に最適化されているＣａｓエンドヌクレアーゼコーディング遺伝子は、配列番号４４（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９（配列番号４５）をコードする）に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む。
【００１７】
ある場合では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、１種または複数種の核ターゲティングシグナル（核局在化シグナル／配列とも称される、ＮＬＳ）に作動可能に連結されている。配列番号７および配列番号８はそれぞれ、Ｎ末端およびＣ末端でＮＬＳ配列を有する糸状真菌細胞最適化Ｃａｓ９遺伝子の一例とコードされるアミノ酸配列とを提供する。真核生物では多くの異なるＮＬＳが知られている。このＮＬＳとして、１分節（ｍｏｎｏｐａｒｔｉｔｅ）型、２分節（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）型および３分節（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）型が挙げられる。あらゆる好都合なＮＬＳを使用することができるが、例としてＳＶ４０  ＮＬＳ、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｂｌｒ２（青色光制御因子（ｂｌｕｅ  ｌｉｇｈｔ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）２）遺伝子に由来するＮＬＳまたは両方の組み合わせが挙げられる１分節型がやや好都合である。
【００１８】
ある特定の実施形態では、ドナーＤＮＡは目的のポリヌクレオチド配列を含み、ゲノム遺伝子座での相同組換えにより目的のポリヌクレオチド配列がゲノム遺伝子座に挿入される。
【００１９】
本方法の一部の実施形態では、導入する工程は、本明細書で説明する選択可能マーカーまたは表現型マーカーをコードする配列を含むＤＮＡ構築物を真菌細胞に導入することを含む。ある特定の実施形態では、このＤＮＡ構築物は、選択可能マーカーをコードする配列とドナーＤＮＡとの両方を含む。一部の実施形態では、このＤＮＡ構築物は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードする配列と、選択可能マーカーをコードする配列と、ドナーＤＮＡとを含む。一部の実施形態では、このＤＮＡ構築物は、ガイドＲＮＡをコードする配列と、選択可能マーカーをコードする配列と、ドナーＤＮＡとを含む。特定の実施形態では、このＤＮＡ構築物は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードする配列と、ガイドＲＮＡをコードする配列と、選択可能マーカーをコードする配列と、ドナーＤＮＡとを含む。ある特定の実施形態では、このＤＮＡ構築物は線状ＤＮＡ構築物である。ある特定の実施形態では、このＤＮＡ構築物は環状ＤＮＡ構築物である。
【００２０】
本方法で使用される真菌細胞は糸状真菌細胞種であることができる。ある特定の実施形態では、この真菌細胞はユウミコチニア（Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ）真菌細胞またはペジゾミコチニア（Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ）真菌細胞である。一部の実施形態では、この真菌細胞は、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、マイセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、サーモマイセス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）、ヒポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）およびエメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）から選択される。糸状真菌トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、Ｐ．クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、Ｍ．サーモフィラ（Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、サーモマイセス・ラヌギノサス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）、Ａ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）およびＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）が特に興味深い。酵母種等のその他の真菌細胞も用いることができる。
【００２１】
本開示の方法の使用者により選択される標的部位は、オープンリーディングフレーム、プロモーター、制御配列、ターミネーター配列、制御エレメント配列、スプライス部位、コーディング配列、ポリユビキチン化部位、イントロン部位およびイントロン増強モチーフからなる群から選択される目的の遺伝子の領域内に位置することができる。目的の遺伝子の例として、アセチルエステラーゼをコードする遺伝子、アミノペプチダーゼをコードする遺伝子、アミラーゼをコードする遺伝子、アラビナーゼをコードする遺伝子、アラビノフラノシダーゼをコードする遺伝子、キシペプチダーゼをコードする遺伝子、カタラーゼをコードする遺伝子、セルラーゼをコードする遺伝子、キチナーゼをコードする遺伝子、クチナーゼをコードする遺伝子、デオキシリボヌクレアーゼをコードする遺伝子、エピメラーゼをコードする遺伝子、エステラーゼをコードする遺伝子、α−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子、β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子、α−グルカナーゼをコードする遺伝子、グルカンリアーゼをコードする遺伝子、エンド−β−グルカナーゼをコードする遺伝子、グルコアミラーゼをコードする遺伝子、グルコースオキシダーゼをコードする遺伝子、α−グルコシダーゼをコードする遺伝子、β−グルコシダーゼをコードする遺伝子、グルクロニダーゼをコードする遺伝子、ヘミセルラーゼをコードする遺伝子、ヘキソースオキシダーゼをコードする遺伝子、ヒドロラーゼをコードする遺伝子、インベルターゼをコードする遺伝子、イソメラーゼをコードする遺伝子、ラッカーゼをコードする遺伝子、リパーゼをコードする遺伝子、リアーゼをコードする遺伝子、マンノシダーゼをコードする遺伝子、オキシダーゼをコードする遺伝子、オキシドレダクターゼをコードする遺伝子、ペクテートリアーゼをコードする遺伝子、ペクチンアセチルエステラーゼをコードする遺伝子、ペクチンデポリメラーゼをコードする遺伝子、ペクチンメチルエステラーゼをコードする遺伝子、ペクチン分解酵素をコードする遺伝子、ペルオキシダーゼをコードする遺伝子、フェノールオキシダーゼをコードする遺伝子、フィターゼをコードする遺伝子、ポリガラクツロナーゼをコードする遺伝子、プロテアーゼをコードする遺伝子、ラムノ−ガラクツロナーゼをコードする遺伝子、リボヌクレアーゼをコードする遺伝子、トランスフェラーゼをコードする遺伝子、輸送タンパク質をコードする遺伝子、トランスグルタミナーゼをコードする遺伝子、キシラナーゼをコードする遺伝子、ヘキソースオキシダーゼをコードする遺伝子およびこれらの組み合わせが挙げられる。細胞シグナル伝達、形態、増殖速度およびタンパク質分泌に関与する遺伝子に加えて、転写因子、リプレッサー等の制御タンパク質をコードする標的遺伝子、キナーゼ等のその他のタンパク質を改変するタンパク質をコードする標的遺伝子、翻訳後改変（例えばグリコシル化）に関与するタンパク質をコードする標的遺伝子にも、Ｃａｓ媒介型編集を施すことができる。これに関して制限は意図されていない。
【００２２】
ある特定の実施形態では、ゲノム遺伝子座とドナーＤＮＡとの相同組換えにより、標的部位でまたは標的部位付近でＤＮＡ配列が改変され、この改変は、１個または複数個のヌクレオチドの欠失、１個または複数個のヌクレオチドの挿入、目的のタンパク質をコードする発現カセットの挿入、１個または複数個のヌクレオチドの置換およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。一部の実施形態では、この改変はドナーＤＮＡ中に元々存在する。ある特定の実施形態では、発現カセットによりコードされる目的のタンパク質は酵素である。特定の実施形態では、目的のタンパク質は、ヘミセルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ケラチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マンナナーゼ、ベータ−グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、これらの変異体、これらの機能的断片またはこれらの内の２種以上のハイブリッドもしくは混合物である。更にその他の特定の実施形態では、目的のタンパク質は、ペプチドホルモン、増殖因子、凝固因子、ケモカイン、サイトカイン、リンホカイン、抗体、受容体、接着分子、微生物抗原、これらの変異体、これらの機能的断片またはこれらの内の２種以上のハイブリッドもしくは混合物である。
【００２３】
本方法の一部の実施形態では、目的の部位でまたは目的の部位付近でゲノム改変を有する真菌細胞を同定する工程は、相同組換えまたは改変を選択するためのまたはスクリーニングするための条件下で工程（ａ）からの細胞の集団を培養することを含む。そのような条件として、抗生物質選択条件、栄養要求性細胞（ａｕｘｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｃｅｌｌ）を選択するまたはスクリーニングする条件および同類のものが挙げられる。一部の実施形態では、同定する工程は、不安定な形質転換体をスクリーニングするための条件下で工程（ａ）からの細胞の集団を培養することを含む。
【００２４】
導入する工程が、選択可能マーカーをコードする配列とドナーＤＮＡとを含むＤＮＡ構築物を真菌細胞に導入することを含み、同定する工程が、選択可能マーカーを失っているがドナーＤＮＡを保持している不安定な形質転換体をスクリーニングするための条件下で工程（ａ）からの細胞の集団を培養することを含む、上述の請求項のいずれか一項に記載の方法。
【００２５】
本開示のその他の態様は、上記で説明した方法により製造されている組換え真菌細胞と、この方法の実施において親細胞として使用するための組換え真菌細胞とに関する。
【００２６】
そのため、ある特定の実施形態では、本開示の態様は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ用の発現カセットを含む第１の組換えＤＮＡ構築物を含む組換え真菌細胞を含む。ある特定の実施形態では、この組換え真菌細胞中のＮＨＥＪ経路は機能しておらず（不活性化されており）、または低下しており、例えばＮＨＥＪ経路の１種または複数種の成分が不活性化されている、機能していない、またはこの成分の活性が低下している（例えばｋｕ８０、ｋｕ７０、ｒａｄ５０、ｍｒｅ１１、ｘｒｓ２、ｌｉｇ４、ｘｒｓまたはこれらの組み合わせ）。例えば、この真菌細胞は、不活性化されている／活性が低下している形態のｋｕ８０を有することができる。ある特定のその他の実施形態では、この組換え真菌細胞中のＮＨＥＪ経路は機能している。
【００２７】
ある特定の実施形態では、この発現カセットから発現されるＣａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはこの変異体である。或いは、この発現カセットから発現されるＣａｓエンドヌクレアーゼはＣａｓニッカーゼである。
【００２８】
上記で説明したように、ある場合では、ＣａｓエンドヌクレアーゼはＣａｓ９エンドヌクレアーゼ（またはこの変異体）である。このＣａｓ９エンドヌクレアーゼはあらゆる好都合なＣａｓ９エンドヌクレアーゼであることができ、この好都合なＣａｓ９エンドヌクレアーゼとして、下記の細菌種由来のＣａｓ９エンドヌクレアーゼおよびこの機能的断片が挙げられるがこれらの限定されない：ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種（例えばＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）およびＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種（例えばＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ））、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種（例えばＮ．メニンジティデス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ））、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）種（例えばＦ．ノビシダ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ））ならびにパスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）種（例えばＰ．ムルトシダ（Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ））。Ｃａｓ９に関して多くのその他の種を使用することができる。本明細書で説明する真菌細胞の内のいくつかでは、第１の組換えＤＮＡ構築物は、真菌細胞中での発現に最適化されているＣａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子を含む。例えば、糸状真菌細胞中での発現に最適化されているＣａｓエンドヌクレアーゼコーディング遺伝子は、配列番号４４（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９（配列番号４５）をコードする）に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む。ある場合では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼポリペプチドは、１種または複数種の核ターゲティングシグナル（核局在化シグナル／配列（ＮＬＳ）とも称される）に作動可能に連結されている。あらゆる好都合なＮＬＳを使用することができ、例としてＳＶ４０  ＮＬＳ（配列番号４６）、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｂｌｒ２（青色光制御因子２）遺伝子由来のＮＬＳ（配列番号４７）または両方の組み合わせが挙げられる。一部の実施形態では、この組換えＤＮＡ構築物は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはこの変異体をコードする糸状真菌細胞最適化ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されているプロモーターを含む。
【００２９】
ある特定の態様では、上記で説明した組換え真菌細胞は、（任意選択で発現カセットを介して）ガイドＲＮＡを発現することができる第２の組換えＤＮＡ構築物を更に含み、ガイドＲＮＡおよびＣａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼが組換え真菌細胞のゲノム中の標的部位で作用することを可能にする複合体を形成することができ、「作用」は、予想したようにＣａｓエンドヌクレアーゼがＤＮＡを切断する（二本鎖切断またはニックのいずれかを引き起こす）ことを意味する。一部の実施形態では、この組換えＤＮＡ構築物またはガイドＲＮＡ用の発現カセットは、ユーサコマイセート（Ｅｕａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ）中でまたはペジゾマイセート（Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｅｔｅ）中で機能するＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ依存性プロモーターを含み、このプロモーターは、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡに作動可能に連結されている。一部の実施形態では、このプロモーターはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）Ｕ６  ｓｎＲＮＡ遺伝子に由来する。ある特定の実施形態では、このプロモーターは、配列番号４０または４１に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、このプロモーターは配列番号４０または４１の配列を含む。一部の実施形態では、この組換えＤＮＡ構築物またはガイドＲＮＡ用の発現カセットは、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）Ｕ６  ｓｎＲＮＡ遺伝子由来のイントロン配列を有するガイドＲＮＡコーディングＤＮＡを含む。一部の実施形態では、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）Ｕ６  ｓｎＲＮＡ遺伝子に由来するイントロン配列は、配列番号４２に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）Ｕ６  ｓｎＲＮＡ遺伝子に由来するイントロン配列は配列番号４２の配列を含む。
【００３０】
ある場合では、組換え真菌細胞は、目的のポリペプチド（開示する方法の使用者により、相同組換えを介したゲノム中の標的部位でのまたはこの標的部位付近での真菌細胞のゲノムへの挿入が意図されている）を含むドナーＤＮＡを更に含む。そのため、ある特定の実施形態では、この真菌細胞は、標的部位で／標的部位付近で挿入されている目的のポリヌクレオチドを有する。ある場合では、このドナーＤＮＡは、真菌細胞のゲノム遺伝子座の配列と比較した場合に、このゲノム遺伝子座に相同なドメイン中において下記の改変の内の少なくとも１種を含む：１個または複数個のヌクレオチドの欠失、１個または複数個のヌクレオチドの挿入、目的のタンパク質をコードする発現カセットの挿入、１個または複数個のヌクレオチドの置換およびこれらの任意の組み合わせ。
【００３１】
上記で述べたように、本発明者らは、Ｃａｓ標的型相同組換え（Ｃａｓ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）が、Ｃａｓ標的部位でのＮＨＥＪ経路が機能していない、低下している、または抑制されている細胞中で増強されることを示している。しかしながら、Ｃａｓ標的型相同組換えが成功裏にまたは更に効率的に起こるために、機能していない、低下しているまたは抑制されているＮＨＥＪ経路を有する必要はない。
【００３２】
一部の実施形態では、組換え真菌細胞は、本明細書で説明する選択可能マーカーまたは表現型マーカーをコードする配列を含むＤＮＡ構築物を含む。ある特定の実施形態では、このＤＮＡ構築物は、選択可能マーカーをコードする配列と本明細書で説明するドナーＤＮＡとの両方を含む。一部の実施形態では、このＤＮＡ構築物は、本明細書で説明するＣａｓエンドヌクレアーゼをコードする配列と、選択可能マーカーをコードする配列と、ドナーＤＮＡとを含む。一部の実施形態では、このＤＮＡ構築物は、本明細書で説明するガイドＲＮＡをコードする配列と、選択可能マーカーをコードする配列と、ドナーＤＮＡとを含む。特定の実施形態では、このＤＮＡ構築物は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードする配列と、ガイドＲＮＡをコードする配列と、選択可能マーカーをコードする配列と、ドナーＤＮＡとを含む。ある特定の実施形態では、このＤＮＡ構築物は線状ＤＮＡ構築物である。ある特定の実施形態では、このＤＮＡ構築物は環状ＤＮＡ構築物である。ある特定の実施形態では、このＤＮＡ構築物は真菌細胞のゲノムに少なくとも部分的に組み込まれる、またはこのゲノムと相同的に組み換えられる。特定の実施形態では、このＤＮＡ構築物に含まれるドナーＤＮＡの少なくとも一部または全てが真菌細胞のゲノムに組み込まれるが、またはこのゲノムと相同的に組み換えられるが、選択可能マーカーコーディング配列、Ｃａｓエンドヌクレアーゼコーディング配列またはガイドＲＮＡコーディング配列は真菌細胞のゲノムに組み込まれない、またはこのゲノムと相同的に組み換えられない。
【００３３】
本方法で使用される真菌細胞として、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、マイセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、サーモマイセス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）、ヒポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）およびエメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）から選択される糸状真菌細胞種が挙げられる。糸状真菌トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、Ｐ．クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、Ｍ．サーモフィラ（Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、サーモマイセス・ラヌギノサス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）、Ａ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）およびＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）が特に興味深い。酵母種等のその他の真菌細胞も用いることができる。
【００３４】
本開示の方法の使用者により選択される標的部位は、オープンリーディングフレーム、プロモーター、制御配列、ターミネーター配列、制御エレメント配列、スプライス部位、コーディング配列、ポリユビキチン化部位、イントロン部位およびイントロン増強モチーフからなる群から選択される目的の遺伝子の領域内に位置することができる。目的の遺伝子の例として、アセチルエステラーゼをコードする遺伝子、アミノペプチダーゼをコードする遺伝子、アミラーゼをコードする遺伝子、アラビナーゼをコードする遺伝子、アラビノフラノシダーゼをコードする遺伝子、カルボキシペプチダーゼをコードする遺伝子、カタラーゼをコードする遺伝子、セルラーゼをコードする遺伝子、キチナーゼをコードする遺伝子、キモシンをコードする遺伝子、クチナーゼをコードする遺伝子、デオキシリボヌクレアーゼをコードする遺伝子、エピメラーゼをコードする遺伝子、エステラーゼをコードする遺伝子、α−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子、β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子、α−グルカナーゼをコードする遺伝子、グルカンリアーゼをコードする遺伝子、エンド−β−グルカナーゼをコードする遺伝子、グルコアミラーゼをコードする遺伝子、グルコースオキシダーゼをコードする遺伝子、α−グルコシダーゼをコードする遺伝子、β−グルコシダーゼをコードする遺伝子、グルクロニダーゼをコードする遺伝子、ヘミセルラーゼをコードする遺伝子、ヘキソースオキシダーゼをコードする遺伝子、ヒドロラーゼをコードする遺伝子、インベルターゼをコードする遺伝子、イソメラーゼをコードする遺伝子、ラッカーゼをコードする遺伝子、リパーゼをコードする遺伝子、リアーゼをコードする遺伝子、マンノシダーゼをコードする遺伝子、オキシダーゼをコードする遺伝子、オキシドレダクターゼをコードする遺伝子、ペクテートリアーゼをコードする遺伝子、ペクチンアセチルエステラーゼをコードする遺伝子、ペクチンデポリメラーゼをコードする遺伝子、ペクチンメチルエステラーゼをコードする遺伝子、ペクチン分解酵素をコードする遺伝子、ペルオキシダーゼをコードする遺伝子、フェノールオキシダーゼをコードする遺伝子、フィターゼをコードする遺伝子、ポリガラクツロナーゼをコードする遺伝子、プロテアーゼをコードする遺伝子、ラムノ−ガラクツロナーゼをコードする遺伝子、リボヌクレアーゼをコードする遺伝子、タウマチンをコードする遺伝子、トランスフェラーゼをコードする遺伝子、輸送タンパク質をコードする遺伝子、トランスグルタミナーゼをコードする遺伝子、キシラナーゼをコードする遺伝子、ヘキソースオキシダーゼをコードする遺伝子およびこれらの組み合わせが挙げられる。これに関して制限は意図されていない。
【００３５】
本発明のある特定の態様は、糸状真菌細胞最適化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されているプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチドを含み、糸状真菌細胞最適化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡと複合体化された場合に糸状真菌ゲノム中のゲノム標的配列に結合してこのゲノム標的配列中で二本鎖切断を生じさせることができる。糸状真菌細胞最適化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ遺伝子の例として、配列番号４４および配列番号７ならびにこれらの同義の変異体が挙げられ、これらの配列では、これらの配列の親天然Ｃａｓ９コーディングヌクレオチド配列と比較した場合に糸状真菌細胞中での発現が改善されている。
【００３６】
追加の組換えポリヌクレオチド配列として、異種遺伝子に作動可能に連結されている、糸状真菌細胞に由来するＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌＩＩＩ）依存性プロモーター配列を有する組換えポリヌクレオチド配列が挙げられる。一部の実施形態では、糸状真菌細胞に由来するＲＮＡｐｏｌＩＩＩ依存性プロモーター配列は、Ｕ６遺伝子プロモーター（例えば配列番号４０、配列番号４１）またはこの機能的変異体を含む。ある場合では、この組換えポリヌクレオチドは、ＲＮＡｐｏｌＩＩＩ転写遺伝子に由来する異種配列中のイントロン（例えばＵ６遺伝子由来、配列番号４２）および／またはＲＮＡｐｏｌＩＩＩ転写遺伝子由来の転写ターミネーター（例えばＵ６遺伝子由来、例えば配列番号４３）を更に含む。特定の実施形態では、この異種配列はガイドＲＮＡをコードする。
【００３７】
本開示の方法および組成物の追加の実施形態を本明細書で示す。
【００３８】
下記の詳細な説明および本出願の一部を形成する添付図面から、本開示をより完全に理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】推定されるＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）Ｕ６遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）を表す図である。ＴＡＴＡボックス（下線を引いている）、転写開始部位（下向きの矢印）、Ａ−ボックス（下線を引いている）、イントロン（前向きの矢印）、Ｂ−ボックス（下線を引いている、遺伝子のイントロン内）、ヒトＵ６遺伝子と同一である配列（太字のイタリック体）およびターミネーター（下線を引いている）等の目的のエレメントを示す。
【図２】ｐＴｒｅｘ２ｇＨｙｇ−Ｍｏ  Ｃａｓプラスミドの概略を示す図である。
【図３】ｐ２１９Ｍプラスミドの概略を示す図である。
【図４】ＰＣＲプライマー部位およびイントロン領域を示す、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ａｄ３Ａ遺伝子の概略を示す図である。
【図５】ＰＣＲプライマー領域およびイントロン領域を示す、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ遺伝子（ＴｒＧＡ）の概略を示す図である。
【図６】テロメア配列を含むｐＴｒｅｘ２ｇＨｙｇＭｏＣａｓｇＰｙｒ２ＴＳ６プラスミドの概略を示す図である。
【図７】ｐＥＴ３０ａ−Ｃａｓ９−Ｄ１０Ａニッカーゼのプラスミドマップを示す図である。
【図８Ａ−８Ｂ】ｐＭＤ１８Ｔ（Ｔ７−Ｓｐｙ−ＴｒＧＡ＿ｓｇＦ１）（図８Ａ）およびｐＭＤ１８Ｔ（Ｔ７−Ｓｐｙ−ＴｒＧＡ＿ｓｇＲ１）（図８Ｂ）のプラスミドマップを示す図である。
【図９】ＳｐｙＣａｓ９ヌクレアーゼアッセイの結果を示すアガロースゲルを示す写真である。レーン１、ＤＮＡラダー；レーン２、コントロール；レーン３および４、ＴｒＧＡ＿ｓｇＲ１の存在下でのＳｐｙＣａｓ９アッセイ；レーン５および６、ＴｒＧＡ＿ｓｇＦ１の存在下でのＳｐｙＣａｓ９アッセイ。
【図１０】ＳｐｙＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）アッセイの結果を示すアガロースゲルを示す写真である。レーン１、ＤＮＡラダー；レーン２、ＳｐｙＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）とＴｒＧＡ＿ｓｇＦ１のみ；レーン３、ＳｐｙＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）とＴｒＧＡ＿ｓｇＲ１のみ；レーン４、ＳｐｙＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）と両方のＲＮＡ。
【図１１】ＴｒＧＡ欠失カセットの概略図である。
【図１２】フォーゲルのデンプン寒天上で増殖している形質転換体の形態と共に２４ウェルプレートを示す写真である。遅延した増殖表現型を有する形質転換体を円で示す。３種のコントロールの形態を右下にて正方形で示す。「ｃｅｌｌｕ」＝エンドグルカナーゼ−３、エンドグルカナーゼ−４、エンドグルカナーゼ−５、エンドグルカナーゼ−６、マンナナーゼ−１を更に欠失しているＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）の四重欠失株；「ΔＡＡ」＝アルファ−アミラーゼ遺伝子が欠失しているＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）の「ｃｅｌｌｕ」株；「ΔＧＡ」＝グルコアミラーゼ遺伝子が欠失しているＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）の「ｃｅｌｌｕ」株；および「空」＝細胞なし（空のウェル）。選択したクローン＃１〜＃９を示す。
【図１３Ａ】Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）中のＴｒＧＡ欠失の確認を示す図である。（図１３Ａ）野生型中のおよびＴｒＧＡ欠失株中のＴｒＧＡ遺伝子座の構造とプライマーＦｗ１、Ｒ３、ＫＯＦ１（５’−ｇａａｃａａｔｃｔｔｃｔｔｔｇｃａａｔｇｔｔｇｇｔｃ−３’）（配列番号７９）、ＫＯＲ２（５’−ｇｇｃａｇａｃｔａｃａａｇｔｃｔａｃｔａｇｔａｃｔａｃ−３’）（配列番号５８）、Ｒ１（５’−ｇａｇｇａａｇｔｃｃｔｇｃｔｔｇｔａｇｇｃａｇｇｃ−３’）（配列番号８０）およびＦ４（５’−ｃｇａｃａｇａｇｃａｇｔｃａｔａｔｇｇｇｇａｔａｃｇ−３’）（配列番号８１）の結合部位とを示す概略図。（図１３Ｂ）ＰＣＲの結果を示すアガロースゲル。０．８％のアガロースゲル、３０分にわたる１４０ボルトでの泳動を使用してＰＣＲ産物を分析した。
【図１３Ｂ】Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）中のＴｒＧＡ欠失の確認を示す図である。（図１３Ａ）野生型中のおよびＴｒＧＡ欠失株中のＴｒＧＡ遺伝子座の構造とプライマーＦｗ１、Ｒ３、ＫＯＦ１（５’−ｇａａｃａａｔｃｔｔｃｔｔｔｇｃａａｔｇｔｔｇｇｔｃ−３’）（配列番号７９）、ＫＯＲ２（５’−ｇｇｃａｇａｃｔａｃａａｇｔｃｔａｃｔａｇｔａｃｔａｃ−３’）（配列番号５８）、Ｒ１（５’−ｇａｇｇａａｇｔｃｃｔｇｃｔｔｇｔａｇｇｃａｇｇｃ−３’）（配列番号８０）およびＦ４（５’−ｃｇａｃａｇａｇｃａｇｔｃａｔａｔｇｇｇｇａｔａｃｇ−３’）（配列番号８１）の結合部位とを示す概略図。（図１３Ｂ）ＰＣＲの結果を示すアガロースゲル。０．８％のアガロースゲル、３０分にわたる１４０ボルトでの泳動を使用してＰＣＲ産物を分析した。
【図１４】ｐＴｒｅｘＭｏＣａｓＧＡＴＳ１１−ＨＤＲのプラスミドマップを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本開示は、真菌細胞中でのゲノム遺伝子座とドナーＤＮＡとの相同組換えの促進で使用される組成物および方法を含む。この方法は機能的ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を用い、この複合体は、所望の標的部位を認識してこの部位で二本鎖切断またはニックを導入し、それにより標的部位でのまたは標的部位付近での相同組換えを促進する、および／または増強する。ある特定の態様では、真菌細胞中の標的部位では非相同末端結合（ＮＨＥＪ）機構が活性化されておらず、機能しておらず、または低下しており（本明細書において本発明者らにより実証される）、そのため所望の相同組換え事象の効率が改善される。
【００４１】
本組成物および本方法をより詳細に説明する前に、本組成物および本方法は説明されている特定の実施形態に限定されず、当然のことながらそれ自体が変わり得ることを理解すべきである。本組成物および本方法の範囲は添付した特許請求の範囲によってのみ限定され得ることから、本明細書で使用する用語は特定の実施形態を説明することを目的とするのみであり、限定することを意図されていないことも理解すべきである。
【００４２】
ある範囲の値が記載されている場合、この範囲の上限と下限との間に介在する各値（別途文脈が明確に指示しない限り下限の単位の１０分の１まで）ならびにこの言及した範囲中におけるあらゆるその他の言及した値または間に介在する値が本組成物および本方法に包含されることが理解される。言及した範囲における任意の特定の除外された限度を条件として、これらのより小さい範囲の上限および下限は独立して、より小さい範囲にふくまれ得、本組成物および本方法にも包含され得る。言及した範囲が一方のまたは両方の限度を含む場合、これらの含まれた限度のいずれかまたは両方を除外する範囲も本組成物および本方法に含まれる。
【００４３】
本明細書では、ある特定の範囲が用語「約」に先行される数値で示される。用語「約」は本明細書において、この用語が先行する正確な数およびこの用語が先行する近いまたは近似的な数である数を文字通り補強するために使用される。ある数が具体的に列挙された数に近い数または近似的な数であるかどうかの判定では、列挙されていない近いまたは近似的な数は、この数が示されている文脈において、具体的に列挙された数の実質的な等価を提供する数であり得る。例えば、ある数値に関して、用語「約」は、この用語が文脈において別途明確に定義されていない限り、この数値の−１０％〜＋１０％の範囲を意味する。別の例では、語句「約６のｐＨ値」は、ｐＨ値が別途具体的に定義されていない限り、５．４〜６．６のｐＨ値を意味する。
【００４４】
本明細書に記載した見出しは、本明細書全体の参照により有することができる本組成物および本方法の様々な態様または実施形態を限定するものではない。従って、真下で定義する用語は、本明細書全体の参照により更に完全に定義される。
【００４５】
本文書は、読みやすくするために多くの節に分かれているが、読者は、ある節での記載をその他の節に適用することができることを認識するだろう。このように、本開示の様々な節に使用される見出しは限定的に解釈されるべきではない。
【００４６】
別途定義されない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本組成物および本方法が属する分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。本組成物および本方法の実施または試験では、本明細書で説明するものと類似のまたは等価のあらゆる方法および材料も使用することができるが、代表例の方法および材料をこれより説明する。
【００４７】
本明細書で引用する全ての刊行物および特許は、各個々の刊行物または特許が参照により援用されると具体的におよび個々に示されたかのように参照により本明細書に援用され、引用される刊行物に関連する方法および／または材料を開示するためにおよび説明するために参照により本明細書に援用される。引用したあらゆる刊行物はその開示が本出願日前であるが、本組成物および本方法が先行発明によりそのような刊行物に先行する権利がないということを認めると解釈すべきはない。更に、記載されている公開日は、個々に確認する必要があるであろう実際の公開日とは異なる場合がある。
【００４８】
この詳細な説明に従って、下記の略語および定義を適用する。単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は別途文脈が明確に指示しない限り複数の指示対象を含むことに留意されたい。そのため、例えば「酵素」への言及には複数のそのような酵素が含まれ、「投与量」への言及には、１回または複数回の投与量および当業者に既知のこの等量等への言及が含まれる。
【００４９】
あらゆる任意選択的な要素を除外するように特許請求の範囲を作成することができることに更に留意されたい。そのため、この記載は、特許請求の範囲の要素の列挙または「消極的な（ｎｅｇａｔｉｖｅ）」限定の使用に関連して「のみ（ｓｏｌｅｌｙ）」、「のみ（ｏｎｌｙ）」および同類のもののような排他的な用語を使用するための先行する根拠として機能することが意図されている。
【００５０】
本開示を読む際に当業者に明らかであるように、本明細書で説明されているおよび示されている個々の実施形態はそれぞれ、個別の成分と、本明細書で説明する本組成物および本方法の範囲および趣旨から逸脱することなくその他のいくつかの実施形態の内のいずれかの特徴から容易に分離され得るまたはこの特徴と容易に組み合わされ得る特徴とを有する。任意の列挙された方法を、列挙した事象の順序でまたは論理的に可能であるあらゆるその他の順序で実行することができる。
【００５１】
定義
本明細書で使用する場合、「Ｃａｓエンドヌクレアーゼ」と称されるまたは「Ｃａｓエンドヌクレアーゼ活性」を有するポリペプチドは、Ｃａｓ遺伝子によりコードされるＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチドに関し、Ｃａｓタンパク質は、１種または複数種のガイドポリヌクレオチドと機能的に連結された場合に標的ＤＮＡ配列を切断することができる（例えば「ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ａｌｔｅｒｉｎｇ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ」という表題の米国特許第８６９７３５９号明細書を参照されたい）。ガイドポリヌクレオチド依存性のエンドヌクレアーゼ活性を保持するＣａｓエンドヌクレアーゼの変異体もこの定義に含まれ、この変異体として、ニッキングエンドヌクレアーゼ活性を有する（即ち二本鎖ＤＮＡ標的部位で一本鎖ニックを導入する）Ｃａｓ変異体が挙げられる（下記の定義を参照されたい）。（これまで同定されている野生型Ｃａｓエンドヌクレアーゼは標的部位で二本鎖切断を導入することに留意されたい）。Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、ガイドポリヌクレオチドにより導かれて二本鎖ＤＮＡ中の特定の標的部位（例えば細胞のゲノム中の標的部位）を認識して切断する。いくつかの異なる型のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムが説明されており、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムおよびＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムに分類され得る（例えばＬｉｕ  ａｎｄ  Ｆａｎ，ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍ：ａ  ｐｏｗｅｒｆｕｌ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（２０１４）８５：２０９−２１８での説明を参照されたい）。ある特定の態様では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはこの変異体（例えばＣａｓニッカーゼ等）を用いるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、あらゆる好都合なＣａｓ９エンドヌクレアーゼであることができ、下記の細菌種由来のＣａｓ９エンドヌクレアーゼおよびこの機能的断片が挙げられるがこれらに限定されない：ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種（例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）およびＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種（例えばＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ））、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種（例えばＮ．メニンジティデス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ））、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）種（例えばＦ．ノビシダ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ））ならびにパスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）種（例えばＰ．ムルトシダ（Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ））。Ｃａｓ９に関して多くのその他の種を使用することができる。例えば、機能的Ｃａｓエンドヌクレアーゼまたはこの変異体であって、配列番号４５および４８〜５３のいずれか一つに対して少なくとも７０％の同一性を有し、例えば配列番号４５および４８〜５３のいずれか一つに対して少なくとも８０％の同一性を有し、少なくとも９０％の同一性を有し、���なくとも９５％の同一性を有し、少なくとも９６％の同一性を有し、少なくとも９７％の同一性を有し、少なくとも９８％の同一性を有し、少なくとも９９％の同一性を有し、例えば最大で１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む機能的Ｃａｓエンドヌクレアーゼまたはこの変異体を用いることができる。その他の実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼまたはこの変異体は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムのＣｐｆ１エンドヌクレアーゼである。Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９とは異なる特徴により頑強なＤＮＡ干渉を媒介する。Ｃｐｆ１はｔｒａｃｒＲＮＡを欠いており、Ｔリッチなプロトスペーサー隣接モチーフを用いる。Ｃｐｆ１は、千鳥足状のＤＮＡ二本鎖切断を介してＤＮＡを切断する。例えばＺｅｔｓｃｈｅ  ｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ（２０１５）１６３：７５９−７７１を参照されたい。
【００５２】
本明細書で使用する場合、「Ｃａｓニッカーゼ」は、１種または複数種のガイドポリヌクレオチドと機能的に連結された場合に標的の二本鎖ＤＮＡ配列中に一本鎖ニックを導入することができるＣａｓエンドヌクレアーゼである。（例えば部位特異的変異誘発により）親Ｃａｓエンドヌクレアーゼ中の２つのヌクレアーゼドメインの内の一方を不活性化することによって、Ｃａｓニッカーゼを組換えにより生成することができる。Ｃａｓニッカーゼの非限定的な一例は、Ｄ１０Ａ変異によりＲｕｖＣドメインが不活性化されている、ＳａｎｄｅｒおよびＪｏｕｎｇ（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，１−９）で説明されているＣａｓ９ニッカーゼである。上述したように、一般的用語「Ｃａｓエンドヌクレアーゼ」には、二本鎖切断ＣａｓポリペプチドおよびニッキングＣａｓポリペプチドの両方が包含される。例えば、ガイドＲＮＡがＣａｓエンドヌクレアーゼを所望の標的部位に誘導することができると説明されている場合、二本鎖切断ＣａｓエンドヌクレアーゼおよびニッキングＣａｓポリペプチド（下記で定義する）の両方に関してそうすることができることになる。
【００５３】
本明細書で使用する場合、用語「ガイドポリヌクレオチド」は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼと複合体を形成することができるおよびＣａｓエンドヌクレアーゼがＤＮＡ標的部位を認識して切断することを可能にするポリヌクレオチド配列に関する。このガイドポリヌクレオチドは単分子または二重分子であることができる。ガイドポリヌクレオチド配列は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列またはこれらの組み合わせ（ＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列）であることができる。任意選択で、ガイドポリヌクレオチドは、少なくとも１個のヌクレオチド、ホスホジエステル結合または連結修飾を含むことができ、この連結修飾として、ロックド核酸（ＬＮＡ）、５−メチルｄＣ、２，６−ジアミノプリン、２’−フルオロＡ、２’−フルオロＵ、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、ホスホロチオエート結合、コレステロール分子への連結、ポリエチレングリコール分子への連結、スペーサー１８（ヘキサエチレングリコール鎖）分子への連結、または環化をもたらす５’から３’への共有結合的連結が挙げられるがこれらに限定されない。リボ核酸のみを含むガイドポリヌクレオチドは「ガイドＲＮＡ」とも称される。
【００５４】
このガイドポリヌクレオチドは、標的ＤＮＡ中のヌクレオチド配列（下記において「プロトスペーサー」または「標的部位」とも呼ばれる）に相補的である第１のヌクレオチド配列ドメイン（可変ターゲティングドメインまたはＶＴドメインとも称される）と、Ｃａｓエンドヌクレアーゼポリペプチドと相互作用する第２のヌクレオチド配列ドメイン（Ｃａｓエンドヌクレアーゼ認識ドメインまたはＣＥＲドメインと称される）とを含む二重分子（二本鎖ガイドポリヌクレオチドとも称される）であることができる。この二重分子ガイドポリヌクレオチドのＣＥＲドメインは、相補領域に沿ってハイブリダイズされる２個の別々の分子を含む。この２個の別々の分子は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列および／またはＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列であることができる。一部の実施形態では、ＣＥＲドメインに連結されているＶＴドメインを含む二本鎖ガイドポリヌクレオチドの第１の分子は、（ＤＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成されている場合には）「ｃｒＤＮＡ」と称され、（ＲＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成されている場合には）「ｃｒＲＮＡ」と称され、（ＤＮＡヌクレオチドとＲＮＡヌクレオチドとの組み合わせで構成されている場合には）「ｃｒＤＮＡ−ＲＮＡ」と称される。ｃｒヌクレオチドは、細菌中におよび古細菌中に天然に存在するｃｒＲＮＡの断片を含むことができる。一実施形態では、本明細書で開示するｃｒヌクレオチド中に存在する細菌中におよび古細菌中に天然に存在するｃｒＲＮＡの断片のサイズは、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個またはより多くのヌクレオチドから変動することができるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、ＣＥＲドメインを含む二本鎖ガイドポリヌクレオチドの第２の分子は、（ＲＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成されている場合には）「ｔｒａｃＲＮＡ」と称され、（ＤＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成されている場合には）「ｔｒａｃｒＤＮＡ」と称され、（ＤＮＡヌクレオチドとＲＮＡヌクレオチドとの組み合わせで構成されている場合には）「ｔｒａｃｒＤＮＡ−ＲＮＡ」と称される。ある特定の実施形態では、ＲＮＡ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ複合体を誘導するＲＮＡは、二本鎖ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡを含む二本鎖ＲＮＡである。
【００５５】
ガイドポリヌクレオチドはまた、標的ＤＮＡ中のヌクレオチド配列に相補的である第１のヌクレオチド配列ドメイン（可変ターゲティングドメインまたはＶＴドメインと称される）と、Ｃａｓエンドヌクレアーゼポリペプチドと相互作用する第２のヌクレオチドドメイン（Ｃａｓエンドヌクレアーゼ認識ドメインまたはＣＥＲドメインと称される）とを含む単分子であることもできる。「ドメイン」は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列および／またはＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列であることができるヌクレオチドの連続ストレッチを意味する。単一ガイドポリヌクレオチドのＶＴドメインおよび／またはＣＥＲドメインは、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列を含むことができる。一部の実施形態では、単一ガイドポリヌクレオチドは、ｔｒａｃｒヌクレオチド（ＣＥＲドメインを含む）に連結されているｃｒヌクレオチド（ＣＥＲドメインに連結されているＶＴドメインを含む）を含み、この連結は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列を含むヌクレオチド配列である。ｃｒヌクレオチド由来の配列およびｔｒａｃｒヌクレオチド由来の配列で構成されている単一ガイドポリヌクレオチドを、（ＲＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成されている場合には）「単一ガイドＲＮＡ」と称することができ、（ＤＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成されている場合には）「単一ガイドＤＮＡ」と称することができ、（ＲＮＡヌクレオチドとＤＮＡヌクレオチドとの組み合わせで構成されている場合には）「単一ガイドＲＮＡ−ＤＮＡ」と称することができる。本開示の一実施形態では、単一ガイドＲＮＡは、ＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼと複合体を形成することができるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ断片およびｔｒａｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ断片を含み、このガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを真菌細胞ゲノム標的部位へと誘導することができ、Ｃａｓエンドヌクレアーゼがこのゲノム標的部位に二本鎖切断を導入することを可能にする。
【００５６】
二本鎖ガイドポリヌクレオチドと対比して単一ガイドポリヌクレオチドを使用する一態様は、標的細胞中で単一ガイドポリヌクレオチドを発現させるために作製する必要がある発現カセットが１種のみであるということである。
【００５７】
用語「可変ターゲティングドメイン」または「ＶＴドメイン」は本明細書において互換的に使用され、二本鎖ＤＮＡ標的部位の一方の鎖（ヌクレオチド配列）に相補的であるヌクレオチド配列を含む。第１のヌクレオチド配列ドメイン（ＶＴドメイン）と標的配列との間の相補性の％は少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６３％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％である、または１００％相補的である。ＶＴドメインは、少なくとも１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個または３０個のヌクレオチドの長さであることができる。一部の実施形態では、ＶＴドメインは１２〜３０個のヌクレオチドの連続ストレッチを含む。ＶＴドメインは、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、改変ＤＮＡ配列、改変ＲＮＡ配列またはこれらの任意の組み合わせで構成され得る。
【００５８】
ガイドポリヌクレオチドの用語「Ｃａｓエンドヌクレアーゼ認識ドメイン」または「ＣＥＲドメイン」は本明細書において互換的に使用され、Ｃａｓエンドヌクレアーゼポリペプチドと相互作用するヌクレオチド配列（例えば、ガイドポリヌクレオチドの第２のヌクレオチド配列ドメイン）を含む。ＣＥＲドメインは、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、改変ＤＮＡ配列、改変ＲＮＡ配列（例えば本明細書で説明する改変を参照されたい）またはこれらの任意の組み合わせで構成され得る。
【００５９】
単一ガイドポリヌクレオチドのｃｒヌクレオチドとｔｒａｃｒヌクレオチドとを連結するヌクレオチド配列は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列を含むことができる。一実施形態では、単一ガイドポリヌクレオチドのｃｒヌクレオチドとｔｒａｃｒヌクレオチドとを連結するヌクレオチド配列は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００個のヌクレオチドの長さであることができる。別の実施形態では、単一ガイドポリヌクレオチドのｃｒヌクレオチドとｔｒａｃｒヌクレオチドとを連結するヌクレオチド配列は、限定されないがＧＡＡＡテトラループ配列等のテトラループ配列を含むことができる。
【００６０】
ガイドポリヌクレオチド、ＶＴドメインおよび／またはＣＥＲドメインのヌクレオチド配列改変を、５’キャップ、３’ポリアデニル化テイル、リボスイッチ配列、安定した制御配列、ｄｓＲＮＡ二本鎖を形成する配列、ガイドポリヌクレオチドの標的を細胞内位置に設定する改変または配列、トラッキングが生じる改変または配列、タンパク質用の結合部位が生じる改変または配列、ロックド核酸（ＬＮＡ）、５−メチルｄＣヌクレオチド、２，６−ジアミノプリンヌクレオチド、２’−フルオロＡヌクレオチド、２’−フルオロＵヌクレオチド；２’−Ｏ−メチルＲＮＡヌクレオチド、ホスホロチオエート結合、コレステロール分子への連結、ポリエチレングリコール分子への連結、スペーサー１８分子への連結、５’から３’への共有結合的連結またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択することができるがこれらに限定されない。これらの改変により、少なくとも１種の追加の有利な特徴をもたらすことができ、この追加の有利な特徴は、安定性の変更または調節、細胞内ターゲティング、トラッキング、蛍光標識、タンパク質用のまたはタンパク質複合体用の結合部位、相補的な標的配列に対する結合親和性の変更、細胞分解に対する耐性の変更および細胞透過性の増加の群から選択される。
【００６１】
本明細書で使用する場合、用語「ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステム」（および等価物）には、ＤＮＡ標的部位で二本鎖切断を誘導することができる、Ｃａｓエンドヌクレアーゼとガイドポリヌクレオチド（単一または二重）との複合体が含まれる。Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ標的部位の極めて近くでＤＮＡ二本鎖をほどき、ガイドＲＮＡによる標的配列の認識時に両方のＤＮＡ鎖を切断するが、但し、正しいプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）が標的配列の３’末端で適切に配向されている場合に限られる。
【００６２】
用語「機能的断片」、「機能的に等価である断片」、「機能的に等価な断片」および同類のものは互換的に使用され、親ポリペプチドの定性的な酵素活性を保持する親ポリペプチドの一部または部分配列を意味する。例えば、Ｃａｓエンドヌクレアーゼの機能的断片は、ガイドポリヌクレオチドと共に二本鎖切断を生じさせる能力を保持する。機能的断片は親ポリペプチドと比較して定量的な酵素活性が変更されている場合があることに本明細書では留意されたい。
【００６３】
用語「機能的変異体」、「機能的に等価である変異体」、「機能的に等価な変異体」および同類のものは互換的に使用され、親ポリペプチドの定性的な酵素活性を保持する親ポリペプチドの変異体を意味する。例えば、Ｃａｓエンドヌクレアーゼの機能的変異体は、ガイドポリヌクレオチドと共に（当該の変異体に応じて）二本鎖切断またはニックを生じさせる能力を保持する。機能的変異体は親ペプチドと比較して定量的な酵素活性が変更されている場合があることに本明細書では留意されたい。
【００６４】
断片および変異体を、部位特異的な変異誘発および合成構築等のあらゆる好都合な方法により得ることができる。
【００６５】
用語「ゲノム」は、真菌細胞に適用する場合、核内で見出される染色体ＤＮＡだけでなく、細胞の細胞内成分（例えばミトコンドリア）内で見出される細胞小器官ＤＮＡも包含する。
【００６６】
「コドン改変遺伝子」または「コドン優先（ｃｏｄｏｎ−ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）遺伝子」または「コドン最適化遺伝子」とは、宿主細胞の好ましいコドン使用頻度を模倣するように設計されているコドン使用頻度を有する遺伝子のことである。遺伝子をコドン最適化するために行われる核酸変更は、親遺伝子のコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変更しないことを意味する「同義」である。しかしながら、天然遺伝子および変異遺伝子の両方を特定の宿主細胞用にコドン最適化することができ、従って、これに関して制限は意図されていない。
【００６７】
「コーディング配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を意味する。「制御配列」は、コーディング配列の上流（５’−非コーディング配列）、コーディング配列内またはコーディング配列の下流（３’−非コーディング配列）に位置するヌクレオチド配列を意味しており、関連するコーディング配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性または翻訳に影響を及ぼす。制御配列として、プロモーター、翻訳リーダー配列、５’非翻訳配列、３’非翻訳配列、イントロン、ポリアデニル化標的配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステム−ループ構造を挙げることができるがこれらに限定されない。
【００６８】
「プロモーター」は、コーディング配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することができるＤＮＡ配列を意味する。プロモーター配列は近位のおよびより遠位の上流エレメントからなり、後者のエレメントはエンハンサーと称されることが多い。「エンハンサー」はプロモーター活性を刺激することができるＤＮＡ配列であり、プロモーターの固有のエレメントであってもよいしプロモーターのレベルまたは組織特異性を増強するために挿入された異種エレメントであってもよい。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来していてもいし天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なるエレメントで構成されていてもよく、および／または合成ＤＮＡセグメントを含んでもよい。様々なプロモーターが、様々な組織型もしくは細胞型で、または様々な発達段階で、または様々な環境条件に応じて、遺伝子の発現を誘導することができることが当業者に理解される。ほとんどの場合では制御配列の正確な境界が完全には定義されていないことから、いくつかのバリエーションのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有する場合があることが更に認識される。当分野で公知であるように、プロモーターを、このプロモーターの強度および／またはこのプロモーターが活性である条件に従って、例えば構成的プロモーター、強力なプロモーター、弱いプロモーター、誘導性／抑制性プロモーター、組織特異的に／発達的に制御されるプロモーター、細胞周期依存性プロモーター等に分類することができる。
【００６９】
「ＲＮＡ転写物」は、ＲＮＡポリメラーゼにより触媒されるＤＮＡ配列の転写により生じる産物を意味する。「メッセンジャーＲＮＡ」または「ｍＲＮＡ」は、イントロンを有しておらず細胞によりタンパク質に翻訳され得るＲＮＡを意味する。「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡテンプレートに相補的であるおよび逆転写酵素を使用してｍＲＮＡテンプレートから合成されるＤＮＡを意味する。「センス」ＲＮＡは、ｍＲＮＡを含むおよび細胞内でまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでタンパク質に翻訳され得るＲＮＡ転写物を意味する。「アンチセンスＲＮＡ」は、標的一次転写物またはｍＲＮＡの全部または一部に対して相補的であるおよびある特定の条件下で標的遺伝子の発現をブロックするＲＮＡ転写物を意味する（例えば米国特許第５，１０７，０６５号明細書を参照されたい）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定の遺伝子転写物の任意の部分（即ち５’非コーディング配列、３’非コーディング配列、イントロンまたはコーディング配列）との相補性であることができる。「機能的ＲＮＡ」は、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡまたはポリペプチドに翻訳され得ないがそれにもかかわらず細胞内プロセスに影響を及ぼすその他のＲＮＡを意味する。用語「相補体」および「逆相補体」はｍＲＮＡ転写物に関して本明細書において互換的に使用され、メッセージのアンチセンスＲＮＡを定義することが意図されている。
【００７０】
本明細書で使用する場合、「機能的に付着している」または「作動可能に連結されている」は、既知のまたは所望の活性を有するポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列の制御領域または機能的ドメイン（例えばプロモーター、エンハンサー領域、ターミネーター、シグナル配列、エピトープタグ等）が、この既知のまたは所望の活性に従って、制御領域または機能的ドメインが標的（例えば遺伝子またはポリペプチド）の発現、分泌または機能を制御することを可能にするような様式でこの標的に付着しているまたは連結されていることを意味する。例えば、プロモーターは、コーディング配列の発現を制御することができる場合には、このコーディング配列に作動可能に連結されている（即ち、このコーディング配列はプロモーターの転写制御下にある）。
【００７１】
本明細書で使用される標準的な組換えＤＮＡ技術および分子クローニング技術は当分野で公知である。
【００７２】
「ＰＣＲ」または「ポリメラーゼ連鎖反応」は特定のＤＮＡセグメントの合成技術であり、一連の反復的な変性サイクル、アニーリングサイクルおよび伸長サイクルからなり、当分野で公知である。
【００７３】
用語「組換え」は、生物学的な成分または組成物（例えば細胞、核酸、ポリペプチド／酵素、ベクター等）に関して使用される場合、この生物学的な成分または組成物が天然では見出されない状態にあることを示す。換言すると、この生物学的な成分または組成物は、ヒトの介入により天然の状態から改変されている。例えば、組換え細胞には、天然の親（即ち非組換え）細胞中で見出されない１種もしくは複数種の遺伝子を発現する細胞、天然の親細胞とは異なる量で１種もしくは複数種の天然遺伝子を発現する細胞、および／または天然の親細胞とは異なる条件下で１種もしくは複数種の天然遺伝子を発現する細胞が包含される。組換え核酸は、１個もしくは複数個のヌクレオチドで天然配列と異なり得る、異種配列（例えば異種プロモーター、非天然のもしくは変異のシグナル配列をコードする配列等）に作動可能に連結され得る、イントロン配列を欠くことができる、および／または単離型であり得る。組換えポリペプチド／酵素は、１個もしくは複数個のアミノ酸で天然配列と異なり得る、異種配列と融合され得る、トランケートされ得る、もしくはアミノ酸の内部欠失を有し得る、天然細胞中では見出されない様式で発現され得る（例えば、このポリペプチドをコードする発現ベクターの細胞中の存在に起因して、このポリペプチドを過剰発現する組換え細胞から発現され得る）、および／または単離型であり得る。一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドまたは組換えポリペプチド／酵素は、野生型対応物と同一であるが非天然型（例えば単離型または富化型）である配列を有することが強調される。
【００７４】
用語「プラスミド」、「ベクター」、および「カセット」は、目的のポリヌクレオチド配列（例えば、細胞中で発現させる目的の遺伝子）を担持する染色体外エレメント（「発現ベクター」または「発現カセット」）を意味する。そのようなエレメントは概して、二本鎖ＤＮＡの形態であり、多くのヌクレオチド配列が連結されているまたは目的のポリヌクレオチドを細胞に導入することができる固有の構築物に組み換えられている（任意の起源に由来する）一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡの（線状のまたは環状の）自律的に複製する配列、ゲノム組込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列であることができる。目的のポリヌクレオチド配列は、標的細胞中で発現させようとするポリペプチドまたは機能的ＲＮＡをコードする遺伝子であることができる。発現カセット／ベクターは概して遺伝子を含み、この遺伝子は、この遺伝子の宿主細胞中での発現を可能にするエレメントに作動可能に連結されている。
【００７５】
用語「発現」は、本明細書で使用する場合、前駆体または成熟型のいずれかでの機能的最終産物（例えばｍＲＮＡ、ガイドＲＮＡまたはタンパク質）の産生を意味する。
【００７６】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの細胞への挿入（例えば組換えＤＮＡ構築物／発現構築物）に関する「導入される」は、そのような課題を実施するためのあらゆる方法を意味しており、所望の生体分子の導入を達成するための「遺伝子導入」、「形質転換」、「形質導入」、物理的手段または同類のものの内のいずれかの手段を含む。
【００７７】
「一時的に導入される（ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙ）」、「一時的に導入される（ｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ）」、「一時的導入」、「一時的に発現する」および同類のものは、非永続的な方法で生体分子が宿主細胞（または宿主細胞の集団）に導入されることを意味する。二本鎖ＤＮＡに関して、一時的導入として、導入されたＤＮＡが宿主細胞の染色体に組み込まれず、そのため増殖中に全ての娘細胞に伝達されない状況と、導入されたＤＮＡ分子（染色体に組み込まれている可能性がある）が、あらゆる好都合な方法を使用して（例えば、ｃｒｅ−ｌｏｘシステムを用いて、エピソームＤＮＡ構築物に関する陽性選択圧を除去することにより、選択培地を使用して染色体からの組込みポリヌクレオチドの全てまたは一部のループアウト（ｌｏｏｐｉｎｇ  ｏｕｔ）を促進することにより等）所望の時間で除去される状況とが挙げられる。これに関して制限は意図されていない。一般に、ＲＮＡ（例えばガイドＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボザイム等）またはポリペプチド（例えばＣａｓポリペプチド）の宿主細胞への導入は、この生体分子が複製されず、細胞増殖中に娘細胞に不確定に伝えられるという点で一時的と考えられる。Ｃａｓ／ガイドＲＮＡ複合体に関して、一時的導入は、標的とされたＣａｓエンドヌクレアーゼ活性を発揮するために両方の生体分子が必要とされることから、いずれかの成分が一時的に導入される状況をカバーする。そのため、Ｃａｓ／ガイドＲＮＡ複合体の一時的導入として、ＣａｓエンドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡの内のいずれか一方または両方が一時的に導入される実施形態が挙げられる。例えば、ガイドＲＮＡが一時的に導入される、ゲノムに組み込まれたＣａｓエンドヌクレアーゼ用発現カセット（そのため導入は一時的でなはない）を有する宿主細胞は、一時的に導入されたＣａｓ／ガイドＲＮＡ複合体（またはシステム）を有すると言うことができ、なぜならば、この機能的複合体は一時的に宿主細胞中に存在するからである。ある特定の実施形態では、導入する工程は、（ｉ）Ｃａｓエンドヌクレアーゼを安定的に発現する親真菌細胞集団を得ること、および（ｉｉ）この親真菌細胞集団にガイドＲＮＡを一時的に導入することを含む。逆を言えば、導入する工程は、（ｉ）ガイドＲＮＡを安定的に発現する親真菌細胞集団を得ること、および（ｉｉ）この親真菌細胞集団にＣａｓエンドヌクレアーゼを一時的に導入することを含むことができる。
【００７８】
「成熟」タンパク質は、翻訳後にプロセシングされたポリペプチド（即ち、一次翻訳産物中に存在する任意のプレペプチドまたはプロペプチドが除去されているポリペプチド）を意味する。「前駆体」タンパク質は、ｍＲＮＡの翻訳の一次産物（即ち、プレペプチドおよびプロペプチドが依然として存在している）を意味する。プレペプチドおよびプロペプチドは細胞内局在化シグナルであり得るがこれに限定されない。
【００７９】
「安定した形質転換」は、核ゲノムおよび細胞小器官ゲノムの両方が挙げられる宿主生物のゲノム中への核酸断片の移動を意味しており、遺伝的に安定した遺伝がもたらされる（結果として得られる宿主細胞が本明細書で「安定した形質転換体」と称される場合もある）。対照的に、「一過性の形質転換」は、組み込まれることなくまたは安定して遺伝することなく遺伝子が発現される、宿主生物の核中へのまたはその他のＤＮＡ含有細胞小器官中への核酸断片の移動を意味している（本明細書では「不安定な形質転換」と称される場合もあり、結果として得られる宿主細胞が本明細書で「不安定な形質転換体」と称される場合もある）。形質転換された核酸断片を含む宿主生物を「トランスジェニック」生物と称する。
【００８０】
「真菌細胞」、「真菌」、「真菌宿主細胞」および同類のものは、本明細書で使用する場合、子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）門、担子菌（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）門、ツボカビ（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）門および接合菌（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）門（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ，Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ  ａｎｄ  Ｂｉｓｂｙ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｆｕｎｇｉ，８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５，ＣＡＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫにより定義される）と、卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，上記を参照、で言及されている）および全ての栄養胞子形成（ｍｉｔｏｓｐｏｒｉｃ）真菌（（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，上記を参照）とを含む。ある特定の実施形態では、真菌宿主細胞は酵母細胞であり、「酵母」は、有子嚢胞子酵母（エンドミケス目（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ））、担子菌酵母（ｂａｓｉｄｉｏｓｐｏｒｏｇｅｎｏｕｓ  ｙｅａｓｔ）、および不完全菌（不完全酵母菌類（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｔｅｓ））に属する酵母を意味する。従って、酵母宿主細胞として、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス（ＳｃｈｉｚｏＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）またはヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の細胞が挙げられる。酵母の種として、下記のものが挙げられるがこれらに限定されない：サッカロマイセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・ジアスタティクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロマイセス・ドウグラシイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロマイセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセス・オビフォルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の細胞。
【００８１】
用語「糸状真菌細胞」は、ユウミコチニア（Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ）亜門またはペジゾミコチニア（Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ）亜門の全ての糸状形態を含む。糸状真菌属の適切な細胞として、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、コリナスカス（Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ）、ケトミウム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ジベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、マイセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペシロマイセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、シタリジウム（Ｓｃｙｔａｌｄｉｕｍ）、タラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、ヒポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）およびトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の細胞が挙げられるがこれらに限定されない。
【００８２】
糸状真菌種の適切な細胞として、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・フォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、クリソスポリウム・ラクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フサリウム・バクトリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フサリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フサリウム・クロックウェレンズ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フサリウム・クルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フサリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フサリウム・グラミナム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フサリウム・ヘテロスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フサリウム・ネグンジ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｎｅｇｕｎｄｉ）、フサリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フサリウム・レチキュラタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フサリウム・ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、フサリウム・サムブシウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フサリウム・サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フサリウム・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フサリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フサリウム・トルロサム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フサリウム・トリコセシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フサリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコーラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ヒポクレア・ジェコリナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｊｅｃｏｒｉｎａ）、マイセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、ニューロスポラ・インターメディア（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、ペニシリウム・プルプロゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ペニシリウム・カネスセンス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃａｎｅｓｃｅｎｓ）、ペニシリウム・ソリタム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｏｌｉｔｕｍ）、ペニシリウム・フニクロスム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）、ファネロケーテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、タラロマイセス・フラバス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｌａｖｕｓ）、チ��ラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンジブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）
およびトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）の細胞が挙げられるがこれらに限定されない。
【００８３】
用語「標的部位」、「標的配列」、「ゲノム標的部位」、「ゲノム標的配列」（および等価物）は本明細書において互換的に使用され、ゲノム改変（例えばドナーＤＮＡとの相同組換え）を促進するためにＣａｓエンドヌクレアーゼ切断が望ましい真菌細胞のゲノム中のポリヌクレオチド配列を意味する。しかしながら、この用語が使用される文脈では、この用語の意味がわずかに変更され得る。例えば、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ用の標的部位は一般に非常に特異的であり、正確なヌクレオチド配列／位置に定義され得ることが多いが、ある場合では、所望のゲノム改変用の標的部位は、ＤＮＡ切断が起こる部位のみと比べて広く定義され得る（例えば、相同組換えが望ましいゲノム遺伝子座または領域）。そのため、ある特定の場合（Ｃａｓ／ガイドＲＮＡの活性により起こるゲノム改変）では、ＤＮＡ切断が「標的部位でまたは標的部位付近で」起こると説明される。標的部位は真菌細胞ゲノム中の内在性部位であり得る、或いは、標的部位は真菌細胞に対して異種であり得、そのためゲノム中に天然には存在していない、または標的部位を、天然で生じる場所と比較して異種のゲノム位置で見出すことができる。ある特定のその他の場合では、ドナーＤＮＡが、真菌細胞のゲノム遺伝子座に対する相同性を有するドメインを含む場合、この真菌細胞に導入されるＣａｓエンドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼが真菌細胞のゲノム遺伝子座中のまたはこのゲノム遺伝子座付近の標的部位で作用することを可能にする複合体を形成することができる。一部の実施形態では、ゲノムＤＮＡ上のＣａｓエンドヌクレアーゼ切断部位（または標的部位）は、相同組換えが起こり得るドナーＤＮＡとゲノム遺伝子座との間の相同領域中に存在する。その他の実施形態では、この切断部位はドナーＤＮＡとゲノム遺伝子座との間の相同領域付近であり、この相同領域付近は相同領域から１ｂｐ〜約１０ｋｂの範囲で離れることができ、例えば相同領域の部位から１ｂｐ、２ｂｐ、５ｂｐ、１０ｂｐ、２０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、２５０ｂｐ、５００ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂまたは１０ｋｂ離れることができる。
【００８４】
本明細書で使用する場合、「核酸」はポリヌクレオチドを意味しており、デオキシリボヌクレオチド塩基またはリボヌクレオチド塩基の一本鎖ポリマーまたは二本鎖ポリマーを含む。核酸はまた、断片および改変ヌクレオチドも含むことができる。そのため、用語「ポリヌクレオチド」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」および「核酸断片」は、一本鎖または二本鎖であるＲＮＡおよび／またはＤＮＡのポリマーを示すために互換的に使用され、合成ヌクレオチド塩基、非天然ヌクレオチド塩基または改変ヌクレオチド塩基を任意選択で含む。ヌクレオチド（通常は５’−モノフォスフェート形態で見出される）は下記のように一文字記号で言及される：アデノシンまたはデオキシアデノシン（それぞれＲＮＡまたはＤＮＡの場合）の場合の「Ａ」、シトシンまたはデオキシシトシンの場合の「Ｃ」、グアノシンまたはデオキシグアノシンの場合の「Ｇ」、ウリジンの場合の「Ｕ」、デオキシチミジンの場合の「Ｔ」、プリンの場合の「Ｒ」（ＡまたはＧ）、ピリミジンの場合の「Ｙ」（ＣまたはＴ）、ＧまたはＴの場合の「Ｋ」、ＡまたはＣまたはＴの場合の「Ｈ」、イノシンの場合の「Ｉ」およびあらゆるヌクレオチドの場合の「Ｎ」。
【００８５】
用語「に由来する」は、用語「を起源とする」、「から得られる」、「から入手可能である」、「から単離される」および「から生成される」を包含しており、別の特定の材料中に起源が見出されるまたは別の特定の材料を参照して説明され得る特徴を有するある特定の材料を一般に示す。
【００８６】
本明細書で使用する場合、用語「ハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリダイゼーション反応を行う条件を意味する。この条件は概して、ハイブリダイゼーションが測定される条件の「ストリンジェンシー」の程度により分類される。このストリンジェンシーの程度は、例えば核酸結合複合体またはプローブの融解温度（Ｔｍ）をベースとすることができる。例えば、典型的には、「最高ストリンジェンシー」は約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍよりも５℃下）で起こり、「高ストリンジェンシー」はＴｍよりも約５〜１０℃下で起こり、「中間ストリンジェンシー」はプローブのＴｍよりも約１０〜２０℃下で起こり、「低ストリンジェンシー」はＴｍよりも約２０〜２５℃下で起こる。或いは、または加えて、ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションの塩強度条件もしくはイオン強度条件ならびに／または１回もしくは複数回のストリンジェンシー洗浄（例えば、６×ＳＳＣ＝非常に低いストリンジェンシー、３×ＳＳＣ＝低〜中間のストリンジェンシー、１×ＳＳＣ＝中間ストリンジェンシーおよび０．５×ＳＳＣ＝高ストリンジェンシー）をベースとすることができる。機能上、最高ストリンジェンシー条件を使用してハイブリダイゼーションプローブとの厳密な同一性またはほぼ厳密な同一性を有する核酸配列を同定することができ、高ストリンジェンシー条件が使用されるとプローブと約８０％以上の配列同一性を有する核酸配列が同定される。高選択性を必要とする用途の場合、ハイブリッドを形成するのに比較的ストリンジェントな条件を使用することが概して望ましい（例えば、比較的に低い塩条件および／または高い温度条件が使用される）。
【００８７】
本明細書で使用する場合、「ハイブリダイゼーション」は、当分野で既知であるように、核酸の鎖が塩基対合により相補鎖と結合するプロセスを意味する。より具体的には、「ハイブリダイゼーション」は、ブロットハイブリダイゼーション技術中におよびＰＣＲ技術中に起こるように核酸の一本鎖が相補鎖と二本鎖（即ち塩基対）を形成するプロセスを意味する。中間〜高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件および洗浄条件の下で２種の配列が互いに特異的にハイブリダイズする場合、核酸配列は参照核酸配列に対して「選択的にハイブリダイズ可能」であると考えられる。ハイブリダイゼーション条件は、核酸が結合する複合体またはプローブの融解温度（Ｔｍ）をベースとする。例えば、典型的には、「最高ストリンジェンシー」は約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍよりも５℃下）で起こり、「高ストリンジェンシー」はＴｍよりも約５〜１０℃下で起こり、「中間ストリンジェンシー」はプローブのＴｍよりも約１０〜２０℃下で起こり、「低ストリンジェンシー」はＴｍよりも約２０〜２５℃下で起こる。機能上、最高ストリンジェンシー条件を使用してハイブリダイゼーションプローブとの厳密な同一性またはほぼ厳密な同一性を有する配列を同定することができ、中間のまたは低いストリンジェンシー条件を使用してポリヌクレオチド配列相同体を同定することができる、または検出することができる。
【００８８】
中間ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件および高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は当分野で公知である。例えば、中間ストリンジェンシーハイブリダイゼーションを、２０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストランおよび２０ｍｈ／ｍＬの変性されて剪断されたサケ精子（ｄｅｎａｔｕｒｅｄ  ｓｈｅａｒｅｄ  ｓａｌｍｏｎ  ｓｐｅｒｍ）ＤＮＡを含む溶液中で３７℃にて一晩インキュベートし、続いて約３７〜５０℃にて１×ＳＳＣでフィルタを洗浄することにより実行することができる。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、６５℃および０．１×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸Ｎａ、ｐＨ７．０）でのハイブリダイゼーションであることができる。或いは、高ストリンジェンシー条件を、５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％のＳＤＳおよび１００μｇ／ｍＬの変性担体ＤＮＡ中で約４２℃にて実行することができ、続いて、室温にて２×ＳＳＣおよび０．５％のＳＤＳで２回洗浄し、４２℃にて０．１×ＳＳＣおよび０．５×ＳＤＳで更に２回洗浄する。そして、非常に高いストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６８℃および０．１×ＳＳＣでのハイブリダイゼーションであることができる。プローブ長および同類のもの等の因子を適応させるために、必要に応じて温度、イオン強度等を調整する方法が当業者に知られている。
【００８９】
少なくとも２種の核酸またはポリペプチドの文脈における語句「実質的に類似」または「実質的に同一」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、親配列もしくは参照配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは更に少なくとも９９％同一である配列を含むこと、または機能性を付加することなく本明細書を回避するためにのみ行われるアミノ酸の置換、挿入、欠失もしくは修飾を含まないことを意味する。
【００９０】
核酸配列またはポリペプチド配列の文脈における「配列同一性」または「同一性」は、特定の比較ウィンドウ全体にわたり最大の一致のためにアラインされた場合に同一である２種の配列における核酸塩基またはアミノ酸残基を意味する。
【００９１】
用語「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウ全体にわたり２種の適切にアラインされた配列を比較することにより決定される値を意味しており、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の部分は、これら２種の配列を最適にアラインさせるために、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して付加または欠失（即ちギャップ）を含む場合がある。このパーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列中に存在する位置の数を決定して一致した位置の数を得、この一致した位置の数を比較ウィンドウ中の位置の総数で除算し、結果を１００で乗算して配列同一性のパーセンテージを得ることにより算出される。配列同一性パーセントの有用な例として、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％または５０％〜１００％の任意の整数パーセンテージが挙げられるがこれらに限定されない。この同一性を、本明細書で説明するプログラムのいずれかを使用して決定することができる。
【００９２】
配列アラインメントおよび同一性パーセントまたは類似性計算を、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングサイト（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラムが挙げられるがこれに限定されない相同配列を検出するために設計された様々な比較方法を使用して決定することができる。本出願の文脈内では、配列分析ソフトウェアを分析に使用する場合、別途指定しない限り、分析結果は、言及したプログラムの「デフォルト値」をベースとすることが理解されるだろう。本明細書で使用する場合、「デフォルト値」は、最初に初期化された場合にソフトウェアで最初にロードされる値またはパラメータの任意のセットを意味することができる。
【００９３】
「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｖ方法」は、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖ（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｃｏｍｐｕｔ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｓｃｉ  ８：１８９−１９１により説明されている）と標識されているおよびＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングサイト（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラム中で見出されるアラインメント方法に対応する。多重アラインメントの場合、デフォルト値は、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０およびＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に対応する。Ｃｌｕｓｔａｌ方法を使用するタンパク質配列のペアワイズアラインメント（ｐａｉｒｗｉｓｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）用のおよび同一性パーセントの算出用のデフォルトパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５である。核酸の場合、これらのパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝４である。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖプログラムを使用した配列のアラインメントの後、同じプログラム中の「配列距離」表を調べることにより、「同一性パーセント」を得ることができる。
【００９４】
「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ方法」は、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｃｏｍｐｕｔ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｓｃｉ  ８：１８９−１９１により説明されている）と標識されているおよびＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングサイト（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）ｖ６．１プログラム中で見出されるアラインメント方法に対応する。多重アラインメント用のデフォルトパラメータ（ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．２、Ｄｅｌａｙ  Ｄｉｖｅｒｇｅｎ  Ｓｅｑｓ（％）＝３０、ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  Ｗｅｉｇｈｔ＝０．５、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ  Ｓｅｒｉｅｓ、ＤＮＡ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝ＩＵＢ）。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗプログラムを使用した配列のアラインメントの後、同じプログラム中の「配列距離」表を調べることにより、「同一性パーセント」を得ることができる。
【００９５】
別途述べない限り、本明細書で提供される配列の同一性／類似性の値は、下記のパラメータを使用するＧＡＰ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０（ＧＣＧ、Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して得られた値を意味する：ギャップ生成ペナルティの重み（ｐｅｎａｌｔｙ  ｗｅｉｇｈｔ）５０、ギャップ長伸長ペナルティの重み３およびｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリックスを使用するヌクレオチド配列に関する同一性％および類似性％；ＧＡＰ生成ペナルティの重み８およびギャップ長伸長ペナルティの重み２およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５）を使用するアミノ酸配列に関する同一性％および類似性％。ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，（１９７０）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４８：４４３−５３のアルゴリズムを使用して、一致の数を最大化するおよびギャップの数を最小限に抑える２種の配列全体のアラインメントを見出す。ＧＡＰは、全ての可能なアラインメントおよびギャップ位置を考慮し、一致した塩基の単位でギャップ生成ペナルティおよびギャップ伸長ペナルティを使用して、一致した塩基の最大数および最小のギャップを有するアラインメントを作成する。
【００９６】
多くのレベルの配列同一性が、その他の種からのまたは天然にもしくは合成により改変されているポリペプチド（そのようなポリペプチドは同一のまたは類似した機能または活性を有する）の同定で有用であることが当業者に理解されるだろう。同一性パーセントの有用な例として、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％または５０％〜１００％の任意の整数パーセンテージが挙げられるがこれらに限定されない。実際に、５０％〜１００％の任意の整数のアミノ酸同一性は本開示の説明に有用であり得、例えば５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％であり得る。
【００９７】
「遺伝子」は、機能的分子（限定されないが、例えば特定のポリペプチド（例えば酵素）または機能的ＲＮＡ分子（例えば、ガイドＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム等））をコードし、または発現させることができ、このコーディング配列に先行する制御配列（５’−非コーディング配列）および／または後続する制御配列（３’−非コーディング配列）を含む核酸断片を含む。「天然遺伝子」は、それ自体の制御配列と共に天然で見出される遺伝子を意味する。組換え遺伝子は、異なる生物または同一の生物に由来するであろう別の遺伝子の制御配列により制御される遺伝子を意味する。
【００９８】
「変異遺伝子」とは、人の介入により変更されている遺伝子のことである。そのような「変異遺伝子」は、少なくとも１個のヌクレオチドの付加、欠失または置換により、対応する非変異遺伝子の配列とは異なる配列を有する。本開示のある特定の実施形態では、この変異遺伝子は、本明細書で開示するガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムの結果として生じる変更を含む。変異真菌細胞とは、変異遺伝子を含む真菌細胞のことである。
【００９９】
本明細書で使用する場合、「標的型変異」は、本明細書で開示するまたは当分野で既知である標的配列のＤＮＡ中で二本鎖切断を導入することができる二本鎖切断誘導剤を含む方法を使用して、天然遺伝子内の標的とされる配列を変更することにより行われた天然遺伝子中の変異のことである。
【０１００】
用語「ドナーＤＮＡ」または「ドナー核酸配列」または「ドナーポリヌクレオチド」は、一般にはＣａｓ／ガイドポリヌクレオチド複合体の活性（上記で詳述したようにガイドポリヌクレオチドが標的部位を画定する）と関連して、標的部位でもしくは標的部位付近で挿入されるまたは標的部位のもしくは標的部位付近の領域を置き換える目的のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを意味する。そのため、ドナーＤＮＡ中の目的のポリヌクレオチド配列は、標的部位でもしくは標的部位付近で挿入される新規の領域および／または標的部位でもしくは標的部位付近で置き換えられる／編集されるヌクレオチドと比較した場合に改変されているポリヌクレオチド配列を含むことができる。ある特定の実施形態では、ドナーＤＮＡ構築物は、目的のポリヌクレオチド配列に隣接する相同の第１のおよび第２の領域を更に含む。ドナーＤＮＡの相同の第１のおよび第２の領域は、それぞれが真菌細胞ゲノムの標的部位中に存在するまたはこの標的部位に隣接する第１のおよび第２のゲノム領域に対する相同性を共有する。「相同性」は、類似するＤＮＡ配列を意味する。例えば、ドナーＤＮＡ上で見出される「ゲノム領域に対する相同領域」とは、真菌細胞ゲノムの所与の「ゲノム領域」と類似する配列を有するＤＮＡの領域のことである。相同領域は、切断される標的部位での相同組換えを促進するのに十分である任意の長さであることができる。例えば、相同領域は、この相同領域が、対応するゲノム領域との相同組換えを受けるのに十分な相同性を有するように、少なくとも５〜１０、５〜１５、５〜２０、５〜２５、５〜３０、５〜３５、５〜４０、５〜４５、５〜５０、５〜５５、５〜６０、５〜６５、５〜７０、５〜７５、５〜８０、５〜８５、５〜９０、５〜９５、５〜１００、５〜２００、５〜３００、５〜４００、５〜５００、５〜６００、５〜７００、５〜８００、５〜９００、５〜１０００、５〜１１００、５〜１２００、５〜１３００、５〜１４００、５〜１５００、５〜１６００、５〜１７００、５〜１８００、５〜１９００、５〜２０００、５〜２１００、５〜２２００、５〜２３００、５〜２４００、５〜２５００、５〜２６００、５〜２７００、５〜２８００、５〜２９００、５〜３０００、５〜３１００個またはより多い塩基の長さを含むことができる。「十分な相同性」は、２種のポリヌクレオチド配列が相同組換え反応用の基質として作用するのに十分な構造的類似性を有することを示す。この構造的類似性は、各ポリヌクレオチド断片の全長とポリヌクレオチドの配列類似性とを含む。配列類似性を、配列の全長にわたる配列同一性パーセントで、ならびに／または１００％配列同一性を有する連続ヌクレオチド等の局在化した類似性を含む保存領域および配列の長さの一部にわたる配列同一性パーセントで説明することができる。
【０１０１】
標的およびドナーポリヌクレオチドにより共有される相同性または配列同一性の量は多様であり得、約１〜２０ｂｐ、２０〜５０ｂｐ、５０〜１００ｂｐ、７５〜１５０ｂｐ、１００〜２５０ｂｐ、１５０〜３００ｂｐ、２００〜４００ｂｐ、２５０〜５００ｂｐ、３００〜６００ｂｐ、３５０〜７５０ｂｐ、４００〜８００ｂｐ、４５０〜９００ｂｐ、５００〜１０００ｂｐ、６００〜１２５０ｂｐ、７００〜１５００ｂｐ、８００〜１７５０ｂｐ、９００〜２０００ｂｐ、１〜２．５ｋｂ、１．５〜３ｋｂ、２〜４ｋｂ、２．５〜５ｋｂ、３〜６ｋｂ、３．５〜７ｋｂ、４〜８ｋｂ、５〜１０ｋｂの範囲で単位整数値を有する全長および／または全領域を含む、または最大で標的部位の全長を含む。これらの範囲にはこの範囲内の全ての整数が含まれ、例えば１〜２０ｂｐの範囲には、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および２０ｂｐが含まれる。相同性の量を、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性パーセントを含む２種のポリヌクレオチドの完全にアラインされた長さ全体にわたる配列同一性パーセントで説明することもできる。十分な相同性は、ポリヌクレオチドの長さと、全体的な配列同一性パーセントと、任意選択で連続ヌクレオチドの保存領域または局所的な配列同一性パーセントとの任意の組み合わせを含み、例えば、十分な相同性を、標的遺伝子座の領域に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する７５〜１５０ｂｐの領域として説明することができる。十分な相同性を、高ストリンジェンシー条件下で２種のポリヌクレオチドの特異的にハイブリダイズする予想された能力により説明することもでき、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ）およびＴｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照されたい。
【０１０２】
本明細書で使用する場合、「ゲノム領域」とは、標的部位のいずれかの側上に存在する、真菌細胞のゲノム中の染色体のセグメントのことである、或いは標的部位の一部も含むセグメントのことである。このゲノム領域は、少なくとも５〜１０、５〜１５、５〜２０、５〜２５、５〜３０、５〜３５、５〜４０、５〜４５、５〜５０、５〜５５、５〜６０、５〜６５、５〜７０、５〜７５、５〜８０、５〜８５、５〜９０、５〜９５、５〜１００、５〜２００、５〜３００、５〜４００、５〜５００、５〜６００、５〜７００、５〜８００、５〜９００、５〜１０００、５〜１１００、５〜１２００、５〜１３００、５〜１４００、５〜１５００、５〜１６００、５〜１７００、５〜１８００、５〜１９００、５〜２０００、５〜２１００、５〜２２００、５〜２３００、５〜２４００、５〜２５００、５〜２６００、５〜２７００、５〜２８００．５〜２９００、５〜３０００、５〜３１００個またはより多くの塩基を含むことができ、その結果、このゲノム領域は、対応する相同領域との相同組換えを受けるのに十分な相同性を有する。
【０１０３】
本明細書で使用する場合、「相同組換え」は、相同部位での２種のＤＮＡ分子間でのＤＮＡ断片の交換を含み、当分野で十分に説明されている。
【０１０４】
表現型マーカーとは、陽性選択可能マーカーであるか陰性選択可能マーカーであるかにかかわらず、視覚マーカーおよび選択可能マーカーが挙げられるスクリーニング可能なまたは選択可能なマーカーのことである。あらゆる表現型マーカーを使用することができる。具体的には、選択可能なまたはスクリーニング可能なマーカーは、多くの場合は特定の条件下で、ある分子もしくはこの分子を含む細胞を同定することまたはこの分子もしくは細胞を有利にもしくは不利に選択することを可能にするＤＮＡセグメントを含む。これらのマーカーは活性（限定されないが、ＲＮＡ、ペプチドもしくはタンパク質の産生等）をコードすることができる、またはＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、無機化合物および有機化合物もしくは組成物および同類のものの結合部位を提供することができる。
【０１０５】
選択可能マーカーの例として、制限酵素部位を含むＤＮＡセグメント；クロリムロンエチル、ベノミル、バスタおよびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）等の別の毒性化合物および抗生物質に対する耐性を付与する生成物をコードするＤＮＡセグメント；普通はレシピエント細胞で欠失している生成物（例えば、ｔＲＮＡ遺伝子、栄養要求性マーカー、優性異種マーカー−ａｍｄＳ）をコードするＤＮＡセグメント；容易に同定され得る生成物（例えば、β−ガラクトシダーゼ、ＧＵＳ等の表現型マーカー；緑色蛍光タンパク質（ＧＲＰ）、青緑色（ＣＦＰ）、黄色（ＹＦＰ）、赤色（ＲＦＰ）および細胞表面タンパク質等の蛍光タンパク質）をコードするＤＮＡセグメント；ＰＣＲ用の新たなプライマー部位の生成（例えば、以前は並置されていない２種のＤＮＡ配列の並置）、制限エンドヌクレアーゼおよびその他のＤＮＡ改変酵素、化学物質等が作用するまたは作用しないＤＮＡ配列の包含；ならびに同定を可能にする特定の改変（例えばメチル化）に必要なＤＮＡ配列の包含が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１０６】
真菌細胞ゲノムを改変する方法
真菌細胞（例えば糸状真菌細胞）中でのゲノム遺伝子座とドナーＤＮＡとの相同組み換えを促進するためにガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムを用いる方法が提供される。
【０１０７】
本開示の態様は、ＤＮＡ配列と真菌細胞のゲノム中のゲノム遺伝子座との相同組み換えのための方法であって、このゲノム遺伝子座に対する相同性を有するドメインを含むドナーＤＮＡと共にＣａｓエンドヌクレアーゼ／ガイドポリヌクレオチド複合体を細胞に一時的に導入することによる方法を含む。Ｃａｓエンドヌクレアーゼ／ガイドポリヌクレオチド複合体は真菌細胞のゲノム中の所望の標的部位で作用することができ、ここで、「作用する」は、（上記で定義した）ガイドポリヌクレオチド中の配列により導かれたＣａｓエンドヌクレアーゼが標的部位でＤＮＡの一方の鎖または両方の鎖を切断することを意味する。
【０１０８】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、ガイドポリヌクレオチドおよびドナーＤＮＡの導入を、遺伝子導入技術、形質導入技術、形質転換技術、電気穿孔技術、粒子衝突技術、細胞融合技術等が挙げられるあらゆる好都合な方法で行うことができる。これらの成分それぞれを、使用者が望むように同時にまたは順次に導入することができる。例えば、最初に、真菌細胞をＣａｓ発現ＤＮＡ構築物で安定的に遺伝子導入し、続いて、安定した遺伝子導入体に（直接的にまたはガイドポリヌクレオチド発現ＤＮＡ構築物を使用して）ガイドポリヌクレオチドを導入することができる。この仕組みは、使用者が、様々なガイドポリヌクレオチドを独立して導入することができる（ある場合では、複数種のガイドポリヌクレオチドを、このことが望まれるべき同一の細胞に導入することができる）安定したＣａｓ遺伝子導入真菌細胞の集団を生成することができることから有利でさえあり得る。一部の実施形態では、Ｃａｓ発現真菌細胞は使用者により得られ、そのため、使用者は、この細胞に、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを発現することができる組換えＤＮＡ構築物を導入する必要がなく、むしろこのＣａｘ発現細胞にガイドポリヌクレオチド導入することのみが必要である。
【０１０９】
ある特定の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドをコードする発現カセット（または遺伝子）を含む組換えＤＮＡ構築物を導入することにより、ガイドポリヌクレオチドを真菌細胞に導入する。一部の実施形態では、この発現カセットは真核生物のＲＮＡｐｏｌＩＩＩプロモーターに作動可能に連結されている。このプロモーターは、ＲＮＡｐｏｌＩＩ依存性プロモーターからＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写時に起こる５’キャップ構造の付加またはポリアデニル化をＲＮＡｐｏｌＩＩＩによる転写が生じないことから特に興味深い。ある特定の実施形態では、ＲＮＡｐｏｌＩＩＩプロモーターは、糸状真菌細胞のＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーター（例えば、配列番号４０およびこの機能的変異体（例えば配列番号４１）、下記で更に詳細に説明する）である。
【０１１０】
（例えば、標的部位でのＣａｓエンドヌクレアーゼ／ガイドＲＮＡ複合体（この複合体は二本鎖エンドヌクレアーゼ活性を有する）の活性により）宿主細胞のゲノムＤＮＡ中で二本鎖切断が導入される場合、細胞のＤＮＡ修復メカニズムは、（このエラーを起こしやすい性質に起因して）二本鎖切断部位での変異を起こし得る切断修復のために活性化される。破損した末端を結合させるための最も一般的な修復メカニズムは非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路である（Ｂｌｅｕｙａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）ＤＮＡ  Ｒｅｐａｉｒ  ５：１−１２）。染色体の構造的完全性は概して、この修復により維持されるが、欠失、挿入またはその他の再配列も起こり得る（Ｓｉｅｂｅｒｔ  ａｎｄ  Ｐｕｃｈｔａ，（２００２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １４：１１２１−３１、Ｐａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １７５：２１−９）。
【０１１１】
驚いたことに、本発明者らは、糸状真菌では、二本鎖切断での形質転換ＤＮＡの非相同挿入が、二本鎖切断での染色体ＤＮＡの２つの末端の間の単純な末端結合よりも高度に有利であることを発見した。従って、発現カセット含有ＤＮＡ構築物による形質転換によりＣａｓエンドヌクレアーゼまたはガイドＲＮＡが提供される場合では、このＤＮＡ構築物またはこの断片が高頻度にて二本鎖切断で挿入される。この挿入は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ上のまたはガイドＲＮＡ発現構築物上のＤＮＡ配列と二本鎖切断の周りの配列との間に相同性がない場合に起こる。このプロセスはまた、ドナーＤＮＡとゲノム遺伝子座との間の相同組み換えが望ましい場合には、ドナーＤＮＡ全体の挿入が相同組み換えよりも有利であることから問題もある。本発明者らは、形質転換ＤＮＡが、真菌細胞中で自律的に維持されることが期待されているテロメア配列を含むベクターの形態であっても、この形質転換ＤＮＡの望ましくない挿入が起こることを発見した。
【０１１２】
形質転換により取り込まれたＤＮＡは、ゲノム中で安定した様式で一体化し得る、または一時的に維持され得る。一時的な維持を不安定な表現型により認識することができる。例えば、形質転換ＤＮＡ上に存在するマーカー遺伝子の選択によりＤＮＡ取込みを認識することができる。形質転換および選択の後、形質転換体を数世代にわたり非選択条件下で増殖させた後に選択条件に戻すことができる。安定した形質転換体は、選択条件に戻した後に増殖することができるが、不安定な形質転換体は、形質転換ＤＮＡの喪失に起因して、選択条件に戻した後は増殖することができない。下記の実施例節で示すように、本発明者らは、真菌細胞／不安定な形質転換体中でＣａｓエンドヌクレアーゼおよび／またはガイドＲＮＡを一時的に発現させることができることを実証している。
【０１１３】
不安定な形質転換体が望まれる実施形態では、自律複製を促すテロメア配列を有するプラスミドを使用することができる。自律複製用に設計されているその他のタイプのプラスミド（例えば、自利複製配列、セントロメア配列またはその他の配列を有するプラスミド）も用いることができる。驚いたことにトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）では、複製開始点、自律複製配列、セントロメア配列またはテロメア配列が未知であるプラスミドを使用することができることを本発明者らは発見した。選択可能マーカーに関して不安定な表現型を示す形質転換体をスクリーニングすることにより、ベクターＤＮＡが挿入されていない効率的な標的部位遺伝子改変が得られる（例えば、ドナーＤＮＡ中の相同領域との相同組換え）。
【０１１４】
本開示のある特定の実施形態は、真菌のゲノム中でＣａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットおよび第１の選択可能マーカー（この発現カセットおよび第１の選択可能マーカーのその後の除去（ループアウト）を可能にするために反復配列が任意選択で隣接している）を組み込んでＣａｓエンドヌクレアーゼ発現宿主細胞を製造することを含む。この細胞を様々な方法で用いて、ドナーＤＮＡとの相同組換え等の目的の遺伝子改変を得ることができる。
【０１１５】
例えば、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ発現宿主細胞を、第２の選択可能マーカー（および任意選択で別のドナーＤＮＡ）を含むガイドＲＮＡ発現カセットを含むＤＮＡ構築物で形質転換することができる。第２の選択可能マーカーを使用するために選択された宿主細胞は、このＤＮＡ構築物からガイドＲＮＡを発現することができ、このガイドＲＮＡは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼの活動およびゲノム中の画定された目的の標的部位の標的化を可能にする。この宿主細胞を、第２の選択可能マーカーに関して不安定な表現型を示す形質転換体に関してスクリーニングすることにより、ＤＮＡ構築物が挿入されていない目的の改変部位（例えばドナーＤＮＡとの相同組換え）を有する宿主細胞を得ることができる。
【０１１６】
別の例として、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ発現宿主細胞は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼの活動およびゲノム中の画定された部位の標的化を可能にするために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成されたガイドＲＮＡを取り込むように誘導され得る。ある場合では、ガイドＲＮＡと、ＤＮＡが取り込まれているおよび高頻度でガイドＲＮＡが同時に取り込まれていると予想される細胞の選択を可能にするための選択可能マーカー遺伝子を担持する別のＤＮＡ構築物との両方の取込みを誘導することが望ましいであろう。上記のように、ベクターＤＮＡが挿入されていない目的の遺伝子改変（例えばドナーＤＮＡとの相同組換え）用の選択可能マーカーに関して不安定な表現型を示す形質転換体のスクリーニングが得られる。
【０１１７】
更に別の例として、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ発現宿主細胞を使用して、「標的株」にＣａｓエンドヌクレアーゼをｉｎ  ｔｒａｎｓで供給することができる「ヘルパー株（ｈｅｌｐｅｒ  ｓｔｒａｉｎ）」を生成することができる。簡潔に言うと、例えば、各株からのプロトプラストの融合により、または糸状真菌の種に応じた菌糸の吻合により、このヘルパー株と標的株との間で異核共存体を生成することができる。異核共存体の維持は、適切な栄養またはその他のマーカー遺伝子または各親株中の変異、および親株は増殖することができないが異核共存体は相補性に起因して増殖することができるような適切な選択培地上での増殖に依存するだろう。異核共存体形成時またはその後のいずれかで、ガイドＲＮＡ（および任意選択でドナーＤＮＡ）を遺伝子導入により導入する。ガイドＲＮＡを直接導入してもよいし、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ発現カセットおよび選択可能マーカー遺伝子を有するＤＮＡ構築物を介して導入してもよい。Ｃａｓエンドヌクレアーゼはヘルパー株の核中で遺伝子から発現され、異核共存体の細胞質中に存在する。Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡと会合してゲノム中の所望の標的部位を標的とする活性複合体を生成する。その後、この異核共存体から胞子を回収し、標的部位でまたは標的部位付近で改変（例えばゲノム遺伝子座でのドナーＤＮＡとの相同組換え）を有する標的株を回収するために選択またはスクリーニングにかける。発現カセットを使用してガイドＲＮＡを導入する場合、ガイドＲＮＡ発現構築物が安定的に維持されていない異核共存体を選択する。
【０１１８】
上記したように、本開示の方法は、ＤＮＡ構築物を、Ｃａｓ／ガイドＲＮＡ複合体の標的部位の各側上の染色体ＤＮＡ領域とのＤＮＡ配列相同性を有する細胞（またはドナーＤＮＡ）に導入することを含む。目的は、相同組込み／組換えにより、標的部位でのＤＮＡ中の切断の修復により、およびほとんど場合には所望の遺伝子座で（即ち、Ｃａｓ／ガイドＲＮＡ複合体の標的部位でまたは標的部位付近で）ゲノムの変化を導入することにより、ＤＮＡ断片（例えば線状ＤＮＡ断片）を組み込むことである。多くの生物では、染色体ＤＮＡ中での二本鎖切断により、この部位での線状ＤＮＡ断片の相同組込みが刺激される。驚いたことに、ＮＨＥＪ経路が機能している糸状真菌では、ドナー断片が導入された場合であっても、二本鎖切断での非相同挿入によるＤＮＡの挿入が線状ＤＮＡ断片の相同組換えよりも高度に有利であることを本発明者らは発見した。
【０１１９】
真菌細胞でのＤＮＡ修復に関して、本発明者らは、機能しているＮＨＥＪ経路の存在下では、エラーを起こしやすい修復が二本鎖切断部位での相同組換えよりも高度に有利であることを発見した。換言すると、糸状真菌細胞での二本鎖切断のＤＮＡ修復に関して、本発明者らは、機能しているＮＨＥＪ経路の存在下では、切断でのＤＮＡの非相同挿入が（１）ＤＮＡ挿入を伴わない非相同末端結合および（２）ドナーＤＮＡによる二本鎖切断部位での相同組換えよりも高度に有利であることを発見した。従って、本発明のある特定の態様では、集団中の真菌細胞中における標的部位での非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路の機能は抑制されている、活性化されていない、機能していない、または低下している。このことをあらゆる好都合な方法で達成することができ、この方法の一部を下記で説明する。
【０１２０】
一部の実施形態では、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路の１種または複数種の成分が機能していないまたは活性が低下している（例えば、ゲノムから欠失されているまたは機能しないようにもしくは活性が低いように変異している）ように真菌宿主細胞を変更することにより、真菌細胞中の標的部位でのＮＨＥＪ経路の機能が抑制されている、活性化されていない、機能していない、または低下している。真菌細胞のこの変更を、あらゆる好都合な手段により達成することができ、この手段として、遺伝子欠失、遺伝子変異、優性干渉性の組換えタンパク質の発現、遺伝子置換、例えばアンチセンスＲＮＡ／ＲＮＡｉ方法を使用する遺伝子発現抑制および同類のものが挙げられる。ある特定の態様では、ＮＨＥＪ経路の１種または複数種の成分は、ｋｕ８０、ｋｕ７０、ｒａｄ５０、ｍｒｅ１１、ｘｒｓ２、ｌｉｇ４およびｘｒｓからなる群から選択される。ほんの一例として、本発明の態様で使用される真菌細胞は、ｋｕ８０の発現および／または活性を抑制する遺伝子改変を含む。
【０１２１】
更なる実施形態では、ＤＮＡニッキング活性を有する（即ち、標的部位でＤＮＡの一方の鎖のみを切断する）Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（Ｃａｓニッカーゼとも呼ばれる）を使用することにより、真菌細胞中における標的部位での非相同結合部位（ＮＨＥＪ）経路の機能が抑制されている、活性化されていない、機能していない、または低下している。ＤＮＡ中の二本鎖切断とは異なり、ニックはＮＨＥＪ経路を活性化しないが、１つまたは複数の相同領域を有するドナーＤＮＡによる切断部位でのまたは切断部位付近での相同組換えを促進するには十分である。野生型Ｃａｓエンドヌクレアーゼの組換え変異体である多くのＣａｓニッカーゼが当分野で説明されており（例えば上記の定義を参照されたい）、開示した方法で使用され得る。
【０１２２】
ある場合では、ドナーＤＮＡは、真菌細胞のゲノム中の対応する第１のおよび第２の領域に対して相同である第１の領域および第２の領域を含み、これら相同領域は一般に、ゲノムＤＮＡがＣａｓエンドヌクレアーゼにより切断される標的部位を含む、またはこの標的部位を囲む。これらの相同領域は、対応するゲノムの相同領域との相同組換えを促進し、この相同組換えにより、ドナーＤＮＡとゲノムとの間でＤＮＡが交換される。そのため、この提供される方法により、真菌細胞ゲノム中での標的部位における切断部位でまたはこの切断部位付近でドナーＤＮＡの目的のポリヌクレオチドが組み込まれ、それによって元々の標的部位が変更され、それによって変更ゲノム標的部位が生じる。
【０１２３】
所与のゲノム領域とドナーＤＮＡ上に見出される対応する相同領域との間の構造的類似性は、相同組換えが起こることを可能にする任意の程度の配列同一性であることができる。例えば、ドナーＤＮＡの「相同領域」および真菌細胞ゲノムの「ゲノム領域」により共有される相同性または配列同一性の量は、配列が相同組換えを受けるように、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または更に１００％の配列同一性であることができる。
【０１２４】
ドナーＤＮＡ上の相同領域は、標的部位に隣接する任意の配列に対する相同性を有することができる。一部の実施形態では、相同領域は、標的部位に直接隣接するゲノム配列に対して相当な配列相同性を共有するが、この相同領域を、標的部位に対して更に５’または３’であり得る領域に対して十分な相同性を有するように設計することができることが認識される。更にその他の実施形態では、相同領域は、下流のゲノム領域に加えて標的部位の断片との相同性も有することができる。一実施形態では、第１の相同領域は標的部位の第１の断片を更に含み、第２の相同領域は標的部位の第２の断片を含み、これら第１の断片および第２の断片は異なる。
【０１２５】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼおよびガイドポリヌクレオチドの発現構築物と同様に、（本明細書の他の箇所で論じているように）ドナーＤＮＡをあらゆる好都合な手段で導入することができる。
【０１２６】
ある特定の実施形態では、ＣａｓエンドヌクレアーゼはＣａｓ９エンドヌクレアーゼである（例えば「ＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｃａｓ９−ｃｒＲＮＡ  Ｃｏｍｐｌｅｘ」という表題の国際公開第２０１３１４１６８０号パンフレットを参照されたい）。Ｃａｓエンドヌクレアーゼの例として、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種（例えばＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）およびＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種（例えばＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ））、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種（例えばＮ．メニンジティデス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ））、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）種（例えばＦ．ノビシダ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ））ならびにパスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）種（例えばＰ．ムルトシダ（Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ））に由来するものが挙げられる（例えば、Ｆｏｎｆａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０１３，ｐａｇｅｓ１−１４（参照により本明細書に援用される）で説明されているＣａｓ９エンドヌクレアーゼを参照されたい）。一部の実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、例えば真菌細胞中での発現に最適化されている最適化Ｃａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子（例えば、下記で説明するように、配列番号４４を含むＣａｓ９コーディング遺伝子（例えば配列番号７））によりコードされる。
【０１２７】
ある特定の場合には、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子は、核局在化シグナルをコードする１種または複数種のポリヌクレオチドに作動可能に連結されており、その結果、細胞中で発現されるＣａｓエンドヌクレアーゼ／ガイドポリヌクレオチド複合体は核へと効率的に運ばれる。あらゆる好都合な核局在化シグナル、例えばＣａｓコドン領域の上流およびこのＣａｓコドン領域を含むフレーム中に存在するＳＶ４０核局在化シグナルをコードするポリヌクレオチド、ならびにＣａｓコドン領域の下流およびこのＣａｓコドン領域を含むフレーム中に存在するＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｂｌｒ２（青色光制御因子２）遺伝子に由来する核局在化シグナルをコードするポリヌクレオチドを使用することができる。その他の核局在化シグナルを用いることができる。
【０１２８】
本開示のある特定の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、ＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼと複合体を形成することができるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのｃｒＲＮＡ領域（またはｃｒＲＮＡ断片）およびｔｒａｃｒＲＮＡ（またはｔｒａｃｒＲＮＡ断片）を含むガイドＲＮＡである。上記で示したように、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体はＣａｓエンドヌクレアーゼを真菌細胞のゲノム標的部位へと誘導することができ、Ｃａｓエンドヌクレアーゼがゲノム標的部位に二本鎖切断を導入することを可能にする。ある場合では、ＲＮＡ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ複合体を誘導するＲＮＡは、ｃｒＲＮＡと独立したｔｒａｃｒＲＮＡとを含む二本鎖である。その他の場合では、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ領域およびｔｒａｃｒＲＮＡ領域の両方を含む単一ＲＮＡ分子（本明細書において融合ガイドＲＮＡと称される場合がある）である。二本鎖ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡに対して融合ガイドＲＮＡを使用する利点の１つは、融合ガイドＲＮＡを発現させるために作製する必要がある発現カセットが１種のみであるということである。
【０１２９】
本明細書で開示する方法で用いる宿主細胞は、子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）門、担子菌（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）門、ツボカビ（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）門および接合菌（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）門（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ，Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ  ａｎｄ  Ｂｉｓｂｙ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｆｕｎｇｉ，８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５，ＣＡＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫにより定義される）と、卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，上記を参照、で言及されている）および全ての栄養胞子形成真菌（（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，上記を参照）とに由来するあらゆる真菌宿主細胞であることができる。ある特定の実施形態では、真菌宿主細胞は酵母細胞であり、例えば、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス（ＳｃｈｉｚｏＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）またはヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の細胞である。酵母の種として、下記のものが挙げられるがこれらに限定されない：サッカロマイセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・ジアスタティクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロマイセス・ドウグラシイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロマイセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセス・オビフォルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の細胞。追加の実施形態では、真菌細胞は糸状真菌細胞であり、糸状真菌細胞としてトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、マイセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ヒポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）およびエメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）の種が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、糸状真菌Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）およびＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）を本開示の方法の態様で使用する。
【０１３０】
標的部位が必要なプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む限り、本開示の方法を使用して真菌細胞ゲノム中の実質的にいかなる標的部位も標的とすることができる。Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の場合、ＰＡＭは配列ＮＧＧ（５’から３’へ、ＮはＡ、Ｇ、ＣまたはＴである）を有し、そのため、ゲノム中の標的部位の選択に対する相当な制限を加えない。その他の既知のＣａｓ９エンドヌクレアーゼは異なるＰＡＭ部位を有する（例えば、Ｆｏｎｆａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０１３，ｐａｇｅｓ１−１４（参照により本明細書に援用される）で説明されているＣａｓ９エンドヌクレアーゼＰＡＭ部位を参照されたい）。
【０１３１】
標的部位の長さは変動することができ、例えば、少なくとも１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個またはより多くのヌクレオチドの長さである標的部位が挙げられる。標的部位は回文構造であることができ、換言すれば、一方の鎖上の配列が相補鎖上で反対方向に同じものを読み取ることが更に可能である。切断部位は標的配列内に存在することができる、または切断部位は標的配列の外側に存在する可能性がある。別のバージョンでは、切断が互いに直接向かい合ったヌクレオチド位置で起きて平滑末端切断が起きる可能性があり、その他の場合では、切り込みが千鳥足状となり、５’オーバーハングまたは３’オーバーハングのいずれかであることができる一本鎖オーバーハング（「粘着末端」とも呼ばれる）を生じさせる可能性がある。
【０１３２】
ある場合では、真菌細胞のゲノム中の活性変異体標的配列も使用することができ、このことは、標的部位が（ガイドポリヌクレオチドのｃｒＲＮＡ配列内の）ガイドポリヌクレオチド中の関連配列と１００％同一ではないことを意味する。そのような活性変異体は、所与の標的部位に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはより高い配列同一性を含むことができ、活性変異体標的配列は生物学的活性を保持しており、従ってＣａｓエンドヌクレアーゼにより認識されて切断され得る。エンドヌクレアーゼによる標的部位の二本鎖切断を確認するためのアッセイは当分野で既知であり、一般には、認識部位を含むＤＮＡ基質への薬剤の全体的な活性および特異性を測定する。
【０１３３】
目的の標的部位として、目的の遺伝子の領域内に位置する標的部位が挙げられる。目的の遺伝子内の領域の非限定的な例として、オープンリーディングフレーム、プロモーター、転写制御エレメント、翻訳制御エレメント、転写ターミネーター配列、ｍＲＮＡスプライス部位、タンパク質コーディング配列、イントロン部位およびイントロン強化モチーフ（ｉｎｔｒｏｎ  ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｍｏｔｉｆ）が挙げられる。
【０１３４】
ある特定の実施形態では、真菌細胞のゲノム改変により検出可能な表現型効果が生じ、多くの場合には使用者の所望の結果である。非限定的な例として、選択可能な細胞増殖表現型（例えば抗生物質に対する耐性または感度、栄養要求性特性の獲得または喪失、増殖率の増加または低下等）、検出可能マーカー（例えば蛍光マーカー、細胞表面分子、発色酵素等）の発現、および培養上清中で活性が検出され得る酵素の分泌が挙げられる。
【０１３５】
真菌細胞のゲノムの改変により表現型効果が生じる場合、表現型マーカーである（または表現型マーカーをコードする）目的のポリヌクレオチドを含むドナーＤＮＡを用いることが多い。あらゆる好都合な表現型マーカーを使用することができ、この表現型マーカーとして、任意の選択可能なまたはスクリーニング可能なマーカーであって、多くの場合は特定の培養条件下で、このマーカーを含む真菌細胞を同定することまたはこの真菌細胞を有利にもしくは不利に選択することを可能にするマーカーが挙げられる。そのため、本発明の一部の態様では、所望のゲノム改変を有する真菌細胞の同定は、標的部位で改変を有する細胞を選択するためのまたはスクリーニングするための条件下で、Ｃａｓエンドヌクレアーゼおよびガイドポリヌクレオチド（ならびに任意選択でドナーＤＮＡ）が与えられている真菌細胞集団を培養することを含む。真菌細胞中の酵素活性（選択可能マーカーとも称される）の獲得または喪失（例えば抗生物質耐性の取得または栄養要求性マーカーの獲得／喪失）に関して評価すること等のあらゆるタイプの選択システムを用いることができる。
【０１３６】
ある場合では、真菌細胞中でのゲノム改変をあらゆる好都合な方法を使用して直接検出し、この方法として、シークエンシング、ＰＣＲ、サザンブロット、制限酵素分析および同類のもが挙げられ、そのような方法の組み合わせも挙げられる。
【０１３７】
一部の実施形態では、特定の遺伝子を本開示の方法を使用して改変の標的とし、この遺伝子として、酵素（例えば、アセチルエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルカナーゼ、グルカンリアーゼ、エンド−β−グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクテートリアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ラムノ−ガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼおよびこれらの組み合わせ）をコードする遺伝子が挙げられる。
【０１３８】
本明細書で説明する方法を実行するための多くのバリエーションが存在する。例えば、真菌宿主細胞中で外来性配列として存在するＣａｓ発現カセットを有する代わりに、このカセットを真菌宿主のゲノムに組み込むことができる。この親細胞株の生成により、本明細書の他の場所で詳述するように、使用者が、後に目的のゲノム部位を標的とするであろう所望のガイドＲＮＡを（例えばガイドＲＮＡ発現ベクターとして）簡単に導入することが可能になるだろう。これらの実施形態の内の一部では、組み込まれたＣａｓ遺伝子を、必要に応じてゲノムからのその後のループアウト／除去のためにこのＣａｓ遺伝子に隣接するポリヌクレオチド複製配列を含むように設計することができる。
【０１３９】
真菌細胞の組成物
本発明の態様は、上記で説明した方法の実行で使用されるトランスジェニック真菌細胞と、結果として生じる、改変ゲノムを有する真菌細胞とを含む。そのため、本発明の実施形態は、本明細書で説明する方法のいずれかの態様により製造されている組換え真菌細胞と、この組換え真菌細胞を製造するために用いられるあらゆる親真菌細胞とを含む。
【０１４０】
本発明のある特定の実施形態は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを含む組換え真菌細胞であって、この細胞中でＣａｓエンドヌクレアーゼが組換えＤＮＡ構築物から発現される、組換え真菌細胞に関する（第１の組換えＤＮＡ構築物）。一部の実施形態では、この組換え真菌細胞は、機能していないまたは活性が低下しているＮＨＥＪ経路を有する。上記で詳述したＣａｓエンドヌクレアーゼおよびこのＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドの実施形態は、この節での真菌細胞組成物での用途を見出す（その内のいくつかを下記に示す）。この真菌細胞は、目的のゲノムの所望の改変を有する真菌細胞を生成するための親として使用され、ゲノム改変を生じさせることは、（例えば発現カセットにより）ガイドポリヌクレオチドを細胞に導入し、それにより（上記で説明した）遺伝子改変を駆動させるＣａｓ／ガイドポリヌクレオチド複合体の形成を可能にすることを含む。ある特定の態様では、ＮＨＥＪ経路の１種または複数種の成分（例えばｋｕ８０、ｋｕ７０、ｒａｄ５０、ｍｒｅ１１、ｘｒｓ２、ｌｉｇ４、ｘｒｓおよびこれらの組み合わせ）は、この組換え真菌細胞中では機能していない、または活性が低下している。特定の一実施形態では、この組換え真菌細胞は、ｋｕ８０の発現および／または活性を抑制する遺伝子改変を有する。ＮＨＥＪ経路成分の破壊を達成するためにあらゆる好都合な遺伝子改変を用いることができ、この遺伝子改変として、遺伝子欠失、遺伝子変異、優性干渉性の組換えタンパク質の発現、遺伝子置換、例えばアンチセンスＲＮＡ／ＲＮＡｉ方法を使用する遺伝子発現抑制および同類のものが挙げられる。
【０１４１】
ある特定の態様では、この組換え真菌細胞はガイドＲＮＡを発現させることができる第２のＤＮＡ構築物を更に含み、ガイドＲＮＡおよびＣａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼが組換え真菌細胞のゲノム中の標的部位で二本鎖切断を導入することを可能にする複合体を形成することができる。上記で詳述したガイドポリヌクレオチドおよびこのガイドポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドの実施形態は、この節での真菌細胞組成物での用途を見出す（その内のいくつかを下記に示す）。ガイドＲＮＡの発現は真核生物のＲＮＡｐｏｌＩＩＩプロモーターにより駆動され得、ある特定の実施形態では、このＲＮＡｐｏｌＩＩＩプロモーターは糸状真菌細胞のＵ６遺伝子プロモーター（例えば下記で更に詳述する配列番号４０および配列番号４１）およびこの機能的変異体である。この複合体の作用により、（上記で説明した）真菌細胞の標的部位でゲノムＤＮＡ配列が改変され、その結果、標的部位で（または標的部位付近で）改変を有する真菌細胞が生成される。改変として、１個もしくは複数個のヌクレオチドの欠失、１個もしくは複数個のヌクレオチドの挿入、１個もしくは複数個のヌクレオチドの置換またはこれらのいずれかの組み合わせを挙げることができる。一部の実施形態では、この真菌細胞は、目的のポリヌクレオチドを有するドナーＤＮＡを更に含む。ドナーＤＮＡ中の目的のポリヌクレオチドは、標的部位で（または標的部位付近で）ゲノム中に存在することができ（例えば相同組換えによりゲノム中に挿入され）、このプロセスは標的部位でＣａｓ／ガイドポリヌクレオチド複合体の作用により駆動される。
【０１４２】
ある特定の実施形態では、組換えポリヌクレオチドによりコードされるＣａｓエンドヌクレアーゼはＣａｓ９エンドヌクレアーゼである。あらゆるＣａｓ９エンドヌクレアーゼをコードすることができ、このＣａｓ９エンドヌクレアーゼとして、下記の細菌種由来のＣａｓ９エンドヌクレアーゼおよびこの機能的断片が挙げられるがこれに限定されない：ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種（例えばＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）およびＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種（例えばＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ））、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種（例えばＮ．メニンジティデス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ））、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）種（例えばＦ．ノビシダ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ））ならびにパスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）種（例えばＰ．ムルトシダ（Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ））（例えば、Ｆｏｎｆａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０１３，ｐａｇｅｓ１−１４（参照により本明細書に援用される）で説明されているＣａｓ９エンドヌクレアーゼを参照されたい）。一部の実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子をコードするポリヌクレオチドは糸状真菌宿主細胞中での発現に最適化されているポリヌクレオチドであり、例えば配列番号４４（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼの糸状真菌細胞コドン最適化バージョン）または配列番号７（配列番号４４を含みＮ末端ＮＬＳ配列およびＣ末端ＮＬＳ配列も含む）で示すポリヌクレオチドである。配列番号４４または配列番号７の同義の変異体等の更なるコドン最適化Ｃａｓ９遺伝子を用いることができる。上記で説明したように、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを１種または複数種の核局在化シグナルに作動可能に連結させることができ、この核局在化シグナルは、作用部位への（即ち細胞の核中での）Ｃａｓエンドヌクレアーゼの細胞質から核への移行を増強するように機能する。ＳＶ４０核局在化シグナルＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｂｌｒ２（青色光制御因子２）遺伝子に由来する核局在化シグナルまたは両方の組み合わせ等のあらゆる好都合な核局在化シグナルを用いることができる。
【０１４３】
多種多様な糸状真菌宿主細胞のいずれかが本発明で使用され、この糸状真菌宿主細胞として、子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）門、担子菌（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）門、ツボカビ（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）門および接合菌（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）門（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ，Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ  ａｎｄ  Ｂｉｓｂｙ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｆｕｎｇｉ，８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５，ＣＡＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫにより定義される）ならびに卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，上記を参照、で言及されている）および全ての栄養胞子形成真菌（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，上記を参照）に由来する真菌宿主細胞が挙げられる。ある特定の実施形態では、真菌宿主細胞は酵母細胞であり、例えばカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス（ＳｃｈｉｚｏＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）またはヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の細胞である。酵母の種として下記のものが挙げられるがこれらに限定されない：サッカロマイセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・ジアスタティクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロマイセス・ドウグラシイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロマイセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセス・オビフォルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の細胞。更なる実施形態では、真菌細胞は糸状真細胞であり、この糸状真菌細胞として、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、マイセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、サーモマイセス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）、ヒポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）およびエメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）の種が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、糸状真菌トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、Ｐ．クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、Ｍ．サーモフィラ（Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、サーモマイセス・ラヌギノサス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）、Ａ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）およびＡ��ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）が本開示の態様で使用される。
【０１４４】
上記で説明したように、本発明は概して、糸状真菌細胞のゲノム中の目的の標的部位を改変するのに有用な方法をおよび組成物に関する。特定の目的の標的部位は、そのような方法および組成物の使用者により決定され、目的の遺伝子の領域内に位置する部位を含み、この部位として、プロモーター、制御配列、ターミネーター配列、制御エレメント配列、スプライス部位、コーディング配列、ポリユビキチン化部位、イントロン部位およびイントロン増強モチーフが挙げられる。加えて、目的の任意の遺伝子が使用者により選択され得、この遺伝子として、アセチルエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルカナーゼ、グルカンリアーゼ、エンド−β−グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクテートリアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ラムノ−ガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼおよびこれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１４５】
組換えポリヌクレオチド
本発明の態様は、本明細書で説明する方法および組成物で使用される組換えポリヌクレオチドに関する。
【０１４６】
本開示の実施形態は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードする真菌細胞最適化ヌクレオチド配列に作動可能に連結されているプロモーター配列を有する組換えポリヌクレオチドＤＮＡ構築物を含む。本開示の実施形態は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードする真菌細胞最適化ヌクレオチド配列またはＣａｓエンドヌクレアーゼをコードする細菌細胞最適化ヌクレオチド配列に作動可能に連結されているプロモーター配列を有する組換えポリヌクレオチドＤＮＡ構築物を含む。上記で説明したように、真菌細胞最適化ヌクレオチド配列中でおよび細菌細胞最適化ヌクレオチド配列中でコードされるＣａｓエンドヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡと複合体を形成した場合に標的部位で作用することができる。最適化ヌクレオチド配列により、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ（例えばＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９）が挙げられるがこれに限定されないあらゆるＣａｓエンドヌクレアーゼをコードすることができる。ある特定の実施形態では、真菌細胞最適化ヌクレオチド配列は糸状真菌細胞中での発現に最適化されている。例えば、糸状真菌細胞最適化配列はＣａｓ９エンドヌクレアーゼをコードすることができ、配列番号４４で示すヌクレオチド配列を含む（１００％の同一性）、またはＣａｓ９エンドヌクレアーゼをコードし、配列番号４４と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、細菌細胞最適化ヌクレオチド配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞中での発現に最適化されている。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞最適化配列は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードすることができ、配列番号６５で示すヌクレオチド配列を含む（１００％の同一性）、またはＣａｓ９エンドヌクレアーゼをコードし、配列番号６５と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。
【０１４７】
本開示の実施形態は更に、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ依存性プロモーターに関する。ＲＮＡｐｏｌＩＩＩ依存性プロモーターからのＲＮＡｐｏｌＩＩＩによる遺伝子の転写は、ＲＮＡｐｏｌＩＩ依存性プロモーターからのＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写時に起こる５’キャップ構造の付加またはポリアデニル化を生じない。下記の実施例で説明するように、本発明者らは、Ｕ６遺伝子および転写ターミネーター配列と関連しているＲＮＡｐｏｌＩＩＩ依存性プロモーター配列をＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）で同定した。完全なプロモーター配列を配列番号４０に記載し、ターミネーター配列を配列番号４３に記載する。加えて、Ｕ６遺伝子のＲＮＡｐｏｌＩＩＩ依存性プロモーターのより短いバージョンを同定しており、配列番号４１に記載する。そのため、本発明の態様は、ＲＮＡｐｏｌＩＩＩ依存性プロモーターとして機能するおよび配列番号４０または配列番号４１と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または最大１００％同一であるヌクレオチド配列を有するプロモーターを含む。このＲＮＡｐｏｌＩＩＩ依存性プロモーター配列は、目的の任意の異種配列の発現で使用される。そのため、本開示の態様は、目的の異種配列に作動可能に連結されているＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）由来のＲＮＡｐｏｌＩＩＩ依存性プロモーター配列を有する組換えポリヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、この異種配列は、ガイドポリヌクレオチド（例えばｔｒａｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡまたは単一ガイドＲＮＡ）をコードする配列である。目的の特定のゲノム部位を標的とするガイドＲＮＡコーディングポリヌクレオチドを実施例で詳細に説明し、ガイドＲＮＡコーディングポリヌクレオチドとして配列番号２〜６が挙げられる。ある特定の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、例えば目的の異種配列の下流の部位で目的の異種配列（ＲＮＡｐｏｌＩＩＩプロモーターに作動可能に連結されている）に作動可能に連結されている転写ターミネーター配列を更に含む（「下流」は当分野で一般的であるように転写の方向を意味する）。ターミネーター配列として、一部の実施形態では、配列番号４３に示すポリヌクレオチド配列またはこの機能的変異体が挙げられる。そのため、ある特定の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、ターミネーターに作動可能に連結されている目的の異種配列（例えばガイドＲＮＡ）に作動可能に連結されているＲＮＡｐｏｌＩＩＩプロモーターを含む。
【０１４８】
本明細書で開示する組成物および方法の非限定的な例または実施形態は下記の通りである。
１．糸状真菌細胞中でのゲノム遺伝子座とドナーＤＮＡとの相同組換えの方法であって、
ａ）Ｃａｓエンドヌクレアーゼと、ガイドＲＮＡと、前記真菌細胞のゲノム遺伝子座に対する相同性を有するドメインを含むドナーＤＮＡとを真菌細胞の集団に導入することであって、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼおよび前記ガイドＲＮＡは、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼが前記真菌細胞の前記ゲノム遺伝子座中のまたは前記ゲノム遺伝子座付近の標的部位で作用することを可能にする複合体を形成することができる、導入すること、ならびに
ｂ）前記集団から、前記ゲノム遺伝子座と前記ドナーＤＮＡとの相同組換えが起きている少なくとも１個の真菌細胞を同定すること
を含み、
前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、前記ガイドＲＮＡまたは両方が前記真菌細胞の集団に一時的に導入される、
方法。
２．前記真菌細胞中における前記標的部位での非相同末端結合（ＮＨＥＪ）メカニズムが活性化されていない、機能していない、または低下している、実施形態１に記載の方法。
３．前記真菌細胞中における非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路が、１種または複数種の機能していないまたは活性が低下している成分を含む、実施形態２に記載の方法。
４．前記１種または複数種の機能していないまたは活性が低下している成分が、ｋｕ８０、ｋｕ７０、ｒａｄ５０、ｍｒｅ１１、ｘｒｓ２、ｌｉｇ４、ｘｒｓおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態３に記載の方法。
５．前記１種または複数種の機能していないまたは活性が低下している成分がｋｕ８０である、実施形態４に記載の方法。
６．前記ＣａｓエンドヌクレアーゼがＣａｓニッカーゼである、実施形態１〜５のいずれか一つに記載の方法。
７．前記ＣａｓエンドヌクレアーゼがＣａｓ９エンドヌクレアーゼまたはこの変異体である、実施形態１〜５のいずれか一つに記載の方法。
８．前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはこの変異体が、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種、Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、Ｎ．メニンジティデス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）種、Ｆ．ノビシダ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ）およびパスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）種、Ｐ．ムルトシダ（Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）からなる群から選択される種由来の完全長Ｃａｓ９またはこの機能的断片を含む、実施形態７に記載の方法。
９．前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはこの変異体が、配列番号４５および４８〜５３のいずれか一つに対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態８に記載の方法。
１０．前記ドナーＤＮＡが目的のポリヌクレオチド配列を含み、前記ゲノム遺伝子座での相同組換えにより前記目的のポリヌクレオチド配列が前記ゲノム遺伝子座に挿入される、実施形態１〜９のいずれか一つに記載の方法。
１１．前記導入する工程が、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼ用の発現カセットを含むＤＮＡ構築物を前記真菌細胞に導入することを含む、実施形態１〜１０のいずれか一つに記載の方法。
１２．前記導入する工程が、前記ガイドＲＮＡ用の発現カセットを含むＤＮＡ構築物を前記真菌細胞に導入することを含む、実施形態１〜１１のいずれか一つに記載の方法。
１３．前記導入する工程が、選択可能マーカーをコードする配列を含むＤＮＡ構築物を前記真菌細胞に導入することを含む、実施形態１〜１２のいずれか一つまたは実施形態４８〜５４のいずれか一つに記載の方法。
１４．前記ＤＮＡ構築物が、前記選択可能マーカーをコードする配列と前記ドナーＤＮＡとの両方を含む、実施形態１３に記載の方法。
１５．前記導入する工程が、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードする配列と、前記ガイドＲＮＡをコードする配列と、選択可能マーカーをコードする配列と、前記ドナーＤＮＡとを含むＤＮＡ構築物を前記真菌細胞に導入することを含む、実施形態１〜１４のいずれか一つに記載の方法。
１６．前記ＤＮＡ構築物が線状ＤＮＡ構築物である、実施形態１１〜１５のいずれか一つに記載の方法。
１７．前記ＤＮＡ構築物が環状ＤＮＡ構築物である、実施形態１１〜１５のいずれか一つに記載の方法。
１８．前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼ用の発現カセットまたは前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードする配列が、前記糸状真菌細胞中での発現に最適化されているＣａｓコーディング配列を含む、実施形態１１および１５〜１７のいずれか一つに記載の方法。
１９．前記Ｃａｓコーディング配列が、配列番号４４に対して少なくとも７０％同一であるポリヌクレオチド配列を含むＣａｓ９コーディング配列である、実施形態１８に記載の方法。
２０．前記導入する工程が、前記真菌細胞に前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼを直接導入することを含む、実施形態１〜１０、１２〜１４および１６〜１７のいずれか一つに記載の方法。
２１．前記導入する工程が、前記真菌細胞に前記ガイドＲＮＡを直接導入することを含む、実施形態１〜１１、１３〜１４および１６〜２０のいずれか一つに記載の方法。
２２．前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼが核局在化シグナルに作動可能に連結されている、実施形態１〜２１のいずれか一つに記載の方法。
２３．前記真菌細胞がユウミコチニア（Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ）真菌細胞またはペジゾミコチニア（Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ）真菌細胞である、実施形態１〜２２のいずれか一つに記載の方法。
２４．前記真菌細胞が、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、マイセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ヒポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）およびエメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）からなる群から選択される、実施形態１〜２３のいずれか一つに記載の方法。
２５．前記標的部位が、オープンリーディングフレーム、プロモーター、制御配列、ターミネーター配列、制御エレメント配列、スプライス部位、コーディング配列、ポリユビキチン化部位、イントロン部位およびイントロン増強モチーフからなる群から選択される目的の遺伝子の領域内に位置する、実施形態１〜２４のいずれか一つに記載の方法。
２６．前記相同組換えにより、前記標的部位でまたは前記標的部位付近でＤＮＡ配列が改変され、前記改変が、１個または複数個のヌクレオチドの欠失、１個または複数個のヌクレオチドの挿入、目的のタンパク質をコードする発現カセットの挿入、１個または複数個のヌクレオチドの置換およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、実施形態１〜２５のいずれか一つに記載の方法。
２７．前記同定する工程が、前記相同組換えまたは前記改変を選択するためのまたはスクリーニングするための条件下で前記工程（ａ）からの細胞の集団を培養することを含む、実施形態１〜２６のいずれか一つに記載の方法。
２８．前記同定する工程が、不安定な形質転換体をスクリーニングするための条件下で前記工程（ａ）からの細胞の集団を培養することを含む、実施形態１〜２７のいずれか一つに記載の方法。
２９．前記導入する工程が、選択可能マーカーをコードする配列と前記ドナーＤＮＡとを含むＤＮＡ構築物を前記真菌細胞に導入することを含み、前記同定する工程が、前記選択可能マーカーを失っているが前記ドナーＤＮＡを保持している不安定な形質転換体をスクリーニングするための条件下で前記工程（ａ）からの細胞の集団を培養することを含む、実施形態１〜２８のいずれか一つに記載の方法。
３０．実施形態１〜２９のいずれか一つに記載の方法により製造されている組換え糸状真菌細胞。
３１．Ｃａｓエンドヌクレアーゼ用の発現カセットを含む第１の組換えＤＮＡ構築物を含む組換え糸状真菌細胞。
３２．前記組換え糸状真菌細胞が、ＮＨＥＪ経路中の１種または複数種の機能していないまたは活性が低下している成分を含む、実施形態３０または３１に記載の組換え真菌細胞。
３３．前記ＮＨＥＪ経路の１種または複数種の成分が、ｋｕ８０、ｋｕ７０、ｒａｄ５０、ｍｒｅ１１、ｘｒｓ２、ｌｉｇ４およびｘｒｓからなる群から選択される、実施形態３２に記載の組換え真菌細胞。
３４．前記真菌細胞がｋｕ８０の発現および／または活性を抑制する遺伝子改変を含む、実施形態３３に記載の組換え真菌細胞。
３５．前記ＣａｓエンドヌクレアーゼがＣａｓニッカーゼである、実施形態３１に記載の組換え真菌細胞。
３６．ガイドＲＮＡ用の発現カセットを含む第２の組換えＤＮＡ構築物を更に含み、前記ガイドＲＮＡおよび前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼが、前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼが前記組換え糸状真菌細胞のゲノム中の標的部位で作用することを可能にする複合体を形成することができる、実施形態３０〜３５のいずれか一つに記載の組換え真菌細胞。
３７．目的のポリヌクレオチドを含むドナーＤＮＡを更に含む実施形態３０〜３６のいずれか一つに記載の組換え真菌細胞。
３８．前記ＣａｓエンドヌクレアーゼがＣａｓ９エンドヌクレアーゼまたはこの変異体である、実施形態３０〜３７のいずれか一つに記載の組換え真菌細胞。
３９．前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはこの変異体が、配列番号４５および４８〜５３のいずれか一つに対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態３８に記載の組換え真菌細胞。
４０．前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼ用の発現カセットが、配列番号４４に対して少なくとも７０％同一であるポリヌクレオチド配列を含む、実施形態３１〜３９のいずれか一つに記載の組換え真菌細胞。
４１．前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼ用の発現カセットが、前記糸状真菌細胞中での発現に最適化されているＣａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子を含む、実施形態３１〜４０のいずれか一つに記載の組換え真菌細胞。
４２．前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼが核局在化シグナルに作動可能に連結されている、実施形態３１〜４１のいずれか一つに記載の組換え真菌細胞。
４３．前記核局在化シグナルが、ＳＶ４０核局在化シグナル（配列番号４６）、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｂｌｒ２（青色光制御因子２）遺伝子（配列番号４７）に由来する核ターゲティングシグナルおよびこれら両方の組み合わせからなる群から選択される、実施形態４２に記載の組換え真菌細胞。
４４．前記真菌細胞が、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、マイセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ヒポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）およびエメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）からなる群から選択される糸状真菌細胞である、実施形態３０〜４３のいずれか一つに記載の組換え真菌細胞。
４５．Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはこの変異体をコードする糸状真菌細胞最適化ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されているプロモーターを含む組換えＤＮＡ構築物。
４６．前記糸状真菌細胞最適化ポリヌクレオチド配列が配列番号４４に対して少なくとも７０％同一である、実施形態４５に記載の組換えＤＮＡ構築物。
４７．前記ガイドＲＮＡ用の発現カセットが、ユーサコマイセート（Ｅｕａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ）中でまたはペジゾマイセート（Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｅｔｅ）中で機能するＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ依存性プロモーターを含み、前記プロモーターが、前記ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡに作動可能に連結されている、実施形態１２に記載の方法。
４８．前記プロモーターがトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）Ｕ６  ｓｎＲＮＡ遺伝子に由来する、実施形態４７に記載の方法。
４９．前記プロモーターが、配列番号４０または４１に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施形態４８に記載の方法。
５０．前記プロモーターが配列番号４０または４１の配列を含む、実施形態４９に記載の方法。
５１．前記ガイドＲＮＡ用の発現カセットが、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）Ｕ６  ｓｎＲＮＡ遺伝子由来のイントロン配列を有するガイドＲＮＡコーディングＤＮＡを含む、実施形態１２および４７〜５０のいずれか一つに記載の方法。
５２．前記トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）Ｕ６  ｓｎＲＮＡ遺伝子に由来するイントロン配列が、配列番号４２に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施形態５１に記載の方法。
５３．前記トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）Ｕ６  ｓｎＲＮＡ遺伝子に由来するイントロン配列が配列番号４２の配列を含む、実施形態５２に記載の方法。
【実施例】
【０１４９】
下記の実施例では、別途明記しない限り、部および割合は重量によるものであり、度は摂氏である。この実施例は本開示の実施形態を示すが例示のみを目的として提示されることを理解すべきである。上記の議論およびこの実施例から、当業者は本開示の様々な変更および改変を行って本開示を様々な用法および条件に適合させることができる。そのような改変も、添付した特許請求の範囲に含まれるものとする。
【０１５０】
第Ａ節：発現ベクターによるＣａｓ／ガイドＲＮＡの導入
実施例１：Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）Ｕ６  ｓｎＲＮＡ遺伝子の同定
ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ依存性プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ依存性プロモーターの使用に起因するであろう５’キャップ構造の付加またはポリアデニル化が生じないＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）中でのガイドＲＮＡの産生に望ましい。しかしながら、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）中で機能するＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ依存性プロモーターは説明されていない。サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ｓｎｒ５２遺伝子、ヒトＵ６  ｓｎＲＮＡ遺伝子またはトウモロコシＵ６  ｓｎＲＮＡ遺伝子からの５’上流領域等のその他の種由来の既知のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ依存性プロモーターがＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）中で機能する能力に関して試験することを検討した。
【０１５１】
より望ましいのは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ依存性プロモーターとして機能することができる天然Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）配列を同定することであった。ヒトＵ６核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ１４４８６）をコードするＤＮＡ配列を使用し、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用してＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｖ２ゲノム配列（ｗｗｗ．ｊｇｉ．ｄｏｅ．ｇｏｖ）を検索した。このヒト配列に対する類似性を有するＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＤＮＡ配列の短い領域を同定した。周囲のＤＮＡ配列の検討および酵母（特にシゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）（Ｍａｒｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３４：１８１６−１８３５））のＵ６遺伝子との比較により、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）Ｕ６遺伝子の多くの特徴を推定的に同定することができた（配列番号１、下記に示す）。転写配列の開始およびターミネーターを上流のＴＡＴＡボックスと同様に同定した。この転写領域はイントロンで明らかに中断されており、可能性があるＡ−ボックスプロモーターエレメントおよびＢ−ボックスプロモーターエレメントをこの転写領域内で認めることができ、後者をイントロン内で認めることができる（図１を参照されたい）。
【化１】
2017538425.tif 000003
【０１５２】
実施例２：Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）遺伝子を標的とするためのｓｇＲＮＡ配列
単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）分子がストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質と相互作用することにより、このエンドヌクレアーゼの標的をｉｎ  ｖｉｖｏで真核生物のゲノム中の特定の遺伝子座に設定することができることが分かっている。ｓｇＲＮＡは、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの成分であることが自然に観測されるｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡとの間の融合体として設計されているハイブリッド分子である（Ｇａｓｉｕｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０９：Ｅ２５７９−８６、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７：８１６−２１、Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９：８２３−２６およびＣｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９：８１９−２３）。ｓｇＲＮＡの最初の２０個のヌクレオチドはゲノム中の標的部位に相補的である。ｓｇＲＮＡ相補領域に隣接するゲノム中の標的部位に追加の配列であるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）が存在することも必要である。Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の場合、ＰＡＭは配列ＮＧＧ（ＮはＡ、Ｇ、ＣまたはＴである）である。
【０１５３】
この実験で使用するｓｇＲＮＡの配列を下記に示し、標的部位に相補的であるように設計されている２０個のヌクレオチドをＮ残基（Ｎ＝Ａ、Ｇ、ＣまたはＵ）として示す（配列番号２）。
【化２】
2017538425.tif 000004
【０１５４】
ｓｇＲＮＡを、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）のゲノム中の様々な遺伝子座を標的とするように設計した。標的部位１（ＴＳ１）と命名した部位でＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ａｄ３Ａ遺伝子（ホスホリボシルアミドイミダゾール−スクシノカルボキシアミドシンターゼ）を標的とするためのｓｇＲＮＡ（ｇＡｄ３Ａ  ＴＳ１と呼ぶ）の配列を下記に示す（配列番号３）。Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）のゲノム配列に相補的である２０個のヌクレオチド領域を小文字で示す。
【化３】
2017538425.tif 000005
【０１５５】
標的部位２（ＴＳ２）と命名した部位でＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｇｌａ１（グルコアミラーゼ）遺伝子を標的とするためのｓｇＲＮＡ（ｇＴｒＧＡ  ＴＳ２と呼ぶ）の配列を下記に示す（配列番号４）。Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）のゲノム配列に相補的である２０個のヌクレオチド領域を小文字で示す。
【化４】
2017538425.tif 000006
【０１５６】
標的部位１１（ＴＳ１１）と命名した部位でＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｇｌａ１（グルコアミラーゼ）遺伝子を標的とするためのｓｇＲＮＡ（ｇＴｒＧＡ  ＴＳ１１と呼ぶ）の配列を下記に示す（配列番号５）。Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）のゲノム配列に相補的である２０個のヌクレオチド領域を小文字で示す。
【化５】
2017538425.tif 000007
【０１５７】
標的部位６（ＴＳ６）と命名した部位でＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｐｙｒ２（オロテートホスホリボシルトランスフェラーゼ）遺伝子を標的とするためのｓｇＲＮＡ（ｇＰｙｒ２  ＴＳ６と呼ぶ）の配列を下記に示す（配列番号６）。Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）のゲノム配列に相補的である２０個のヌクレオチド領域を小文字で示す。
【化６】
2017538425.tif 000008
【０１５８】
実施例３：Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）中での発現用のＣａｓ９ＤＮＡ配列およびＣａｓ９タンパク質配列
コドン最適化ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９コーディング遺伝子（ＮＬＳ配列を含む）を設計し、合成し、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）中での発現に関して試験した（配列番号７）。コードされるタンパク質（配列番号８）は、Ｎ末端ＳＶ４０核局在化シグナル（ＮＬＳ、配列番号４６）とＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｂｌｒ２（青色光制御因子２）遺伝子に由来するＣ末端ＮＬＳ（配列番号４７）とを有する（両方とも下記の配列番号８において下線を引いている）。
配列番号７
【化７】
2017538425.tif 000009
【化８】
2017538425.tif 000010
【化９】
2017538425.tif 000011
配列番号８
【化１０】
2017538425.tif 000012
【０１５９】
実施例４：Ｃａｓ９発現ベクターの構築
上記に示すＣａｓ９をコードする合成ＤＮＡ配列を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）クローニング技術（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）により適切な発現ベクター中に移すことを可能にすべく、この合成ＤＮＡ配列が、隣接するａｔｔＬ１部位とａｔｔＬ２部位との間に存在し得るように、ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯに挿入した。下記の特徴を含むＧａｔｅｗａｙ適合性発現ベクター（ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ）ｐＴｒｅｘ２ｇＨｙｇが入手可能であった：Ｇａｔｅｗａｙクローニング部位により離れているＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｐｋｉ１（ピルベートキナーゼ）遺伝子由来のプロモーター領域およびＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈ１（セロビオヒドロラーゼＩ）遺伝子由来のターミネーター領域、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）ｃｐｃ１（交差経路制御１）プロモーター領域とアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｔｒｐＣ（グルタミンアミドトランスフェラーゼ活性、インドールグリセロールホスフェートシンターゼ活性およびホスホリボシルアントラニレートイソメラーゼ活性を有する三機能タンパク質）ターミネーター領域とに機能的に連結されている細菌ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ならびに選択用のおよび大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での維持用の細菌ベクター配列。Ｇａｔｅｗａｙクローニング手順を使用してＣａｓ９遺伝子をｐＴｒｅｘ２ｇＨｙｇにクローニングし、ｐＴｒｅｘ２ｇＨｙｇ  ＭｏＣａｓを得た（図２を参照されたい）。
【０１６０】
実施例５：ｓｇＲＮＡ発現ベクターの構築
異なる推定上のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ依存性のプロモーターおよびターミネーターが隣接しているｇＡｄ３Ａ  ＴＳ１  ｓｇＲＮＡをコードする合成ＤＮＡ配列を得た。これらの合成ＤＮＡ配列はそれぞれ、両端に制限酵素認識部位（ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ）も有していた。
【０１６１】
下記の配列は、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ｓｎｒ５２プロモーターとＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ｓｕｐ４ターミネーターとを有するｇＡｄ３Ａ  ＴＳ１  ｓｇＲＮＡ（下線を引いている）をコードする（名称ｇＡｄ３Ａ  ＴＳ１−１。配列番号９）。
【化１１】
2017538425.tif 000013
【０１６２】
下記の配列は、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）Ｕ６のプロモーターおよびターミネーターを有するｇＡｄ３Ａ  ＴＳ１  ｓｇＲＮＡ（下線を引いている）をコードする（名称ｇＡｄ３Ａ  ＴＳ１−２、配列番号１０）。
【化１２】
2017538425.tif 000014
【０１６３】
下記の配列は、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）Ｕ６のプロモーター、ターミネーターおよびイントロン（イタリック体）を有するｇＡｄ３Ａ  ＴＳ１  ｓｇＲＮＡ（下線を引いている）をコードする（名称ｇＡｄ３Ａ  ＴＳ１−３、配列番号１１）。
【化１３】
2017538425.tif 000015
【０１６４】
プラスミドｐ２１９Ｍ（図３）は、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｐｙｒ４（オロチジンモノホスフェートデカルボキシラーゼ）遺伝子を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ベクターであり、この遺伝子は、この遺伝子の天然のプロモーターおよびターミネーターを含む。このベクターをＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化して末端を脱リン酸化した。上記の合成ＤＮＡ分子をそれぞれＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、切断したｐ２１９Ｍとライゲートさせて、ｓｇＲＮＡ発現カセットとｐｙｒ４遺伝子とを含む一連のベクターを作製した。各ベクターを、このベクターがコードするｓｇＲＮＡの名称で命名した（例えば、ｐ２１９Ｍ  ｇＡｄ３Ａ  ＴＳ１−１ではｇＡｄ３Ａ発現カセットとＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のｓｎｒ５２プロモーターおよびｓｕｐ４ターミネーターとが組み合わされている）。
【０１６５】
短いＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）Ｕ６プロモーター領域を有するガイドＲＮＡ発現カセットを合成ＤＮＡとして得た。ここで、ＴＳ１１でＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｇｌａ１遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡ用の配列を含む一例を示す（配列番号１２、イントロン配列に下線を引いている）。
【化１４】
2017538425.tif 000016
【０１６６】
上記のｇＲＮＡ発現カセットを、プライマー
【化１５】
2017538425.tif 000017
およびｇＲＮＡリバースｓｆｉＩ（５’−ｃｇｔｃａｇｇｇｃｃａｃｇｔｇｇｇｃｃＡＡＧＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧ、配列番号１４）を使用するＰＣＲにより増幅させた。これらのプライマーにより、ガイドＲＮＡ発現カセットの５’末端にａｆｌＩＩが付加されて３’末端にｓｆｉＩ部位が付加される。ＰＣＲ産物を、Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを製造業者の指示に従って使用して精製した。次いで、ＰＣＲ産物をＳｆｉＩおよびＡｆｌＩＩで消化し、Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔで再度洗浄した。プラスミドｐＴｒｅｘ２ｇ／Ｈｙｇ  ＭｏＣａｓをＳｆｉＩおよびＡｆｌＩＩで消化し、Ｒｏｃｈｅ  Ｒａｐｉｄアルカリホスファターゼキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．、ＩＮ）を使用して脱リン酸化した。最後に、消化したプラスミドおよびＰＣＲ産物をＲｏｃｈｅ  Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡリガーゼキットを使用してライゲートさせてｐＴｒｅｘ２ｇ／Ｈｙｇ  ＭｏＣａｓ  ｇＴｒＧＡ  ＴＳ１１Ｂを作製した。その他のｓｇＲＮＡ発現カセットを同様の方法でｐＴｒｅｘ２ｇ／Ｈｙｇ  ＭｏＣａｓに挿入した。
【０１６７】
実施例６：トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）中におけるＣａｓ９媒介型遺伝子不活性化
トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）株を２種の別々の発現ベクター（Ｃａｓ９産生用の１種およびｇＲＮＡ産生用の１種）で共形質転換した、またはＣａｓ９およびｇＲＮＡの両方の発現用の単一ベクターで形質転換した、一連の実験を下記に説明する。これらの実験から、Ｕ６イントロンがｇＲＮＡ転写領域内にも存在する場合にのみ、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）Ｕ６遺伝子からの５’上流領域がｇＲＮＡ転写を促進したことが実証される。これらの実験から、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）形質転換体では、標的とされた遺伝子の不活性化が高効率で起こり得ることも実証される。
【０１６８】
ａｄ３Ａ遺伝子の不活性化
４種の主要な分泌セルラーゼをコードする遺伝子（ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１およびｅｇｌ２）が欠失した、公的に入手可能な株ＲＬ−Ｐ３７に由来するトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）の株を使用した。この株は、機能するｐｙｒ４遺伝子も欠いていた。バイオリスティック形質転換（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（米国特許出願公開第２００６０００３４０８Ａ１号明細書で説明されている）を使用して、等量のｐＴｒｅｘ２ｇＨｙｇ  ＭｏＣａｓ（図２）とｐ２１９Ｍ  ｇＡｄ３Ａ  ＴＳ１−１、ｐ２１９Ｍ  ｇＡｄ３Ａ  ＴＳ１−２またはｐ２１９Ｍ  ｇＡｄ３Ａ  ＴＳ１−３のいずれかとの混合物で共形質転換した。２％のグルコース、１００ｍｇ／ＬのハイグロマイシンＢおよび２００ｍｇ／Ｌのアデニンを含むフォーゲルの最少培地を含む寒天プレート上で形質転換体を選択した。最初のプレート上での選択後、形質転換体コロニーを同じ選択培地の新鮮なプレートへと採取した。２番目のプレート上での増殖中に、安定したハイグロマイシン耐性形質転換体と不安定なハイグロマイシン形質転換体とを区別することができた。安定した形質転換体はより急速に増殖し、このコロニーは輪郭が滑らかであり、菌糸体はより密集していた。不安定な形質転換体はより遅く増殖し、菌糸体はより低密度であり、コロニーは輪郭がでこぼこで不規則であった。２番目のプレート上での増殖後、グルコースを含み、ハイグロマイシンを含まず、１４ｍｇ／Ｌのアデニンを含むフォーゲルの培地に形質転換体を移し、アデニン栄養要求体であることを示す赤色／褐色コロニーを示す形質転換体をスクリーニングした。ｐ２１９Ｍ  ｇＡｄ３Ａ  ＴＳ１−１により５個の安定した形質転換体および２３個の不安定な形質転換体が得られ、全てがアデニン原栄養体であった。ｐ２１９Ｍ  ｇＡｄ３Ａ  ＴＳ１−２により１１個の安定した形質転換体および３８個の不安定な形質転換体が得られ、１１個全ての安定した形質転換体および不安定な形質転換体の内の２９個がアデニン原栄養体であった。ｐ２１９Ｍ  ｇＡｄ３Ａ  ＴＳ１−３により１９個の安定した形質転換体および２個の不安定な形質転換体が得られ、全てがアデニン栄養要求体であった。明らかに、アデニン栄養要求体は、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）Ｕ６のプロモーター、イントロンおよびターミネーターを用いてｓｇＡｄ３Ａ  ＴＳ１の転写を制御するｇＡｄ３Ａ  ＴＳ１−３によってのみ得られた。アデニン栄養要求体は、天然Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ａｄ３Ａ遺伝子座での標的としたＣａｓ９切断を示す。試験したｇＡｄ３Ａ  ＴＳ１−３による全ての形質転換体がアデニン栄養要求体であったことから、Ｃａｓ９媒介型の遺伝子不活性化は効率的であると結論付けることができる。
【０１６９】
ｐＴｒｅｘ２ｇＨｙｇ  ＭｏＣａｓとｐ２１９Ｍ  ｇＡｄ３Ａ  ＴＳ１−３とによる共形質転換体におけるａｄ３Ａ遺伝子座での変異を確認するために、１０個の安定したアデニン栄養要求性形質転換体からゲノムＤＮＡを抽出した。このＤＮＡを、Ｃａｓ９標的部位にまで及んでいるまたはこの標的部位の上流もしくは下流である産物を生成するように設計されているいくつかの異なるプライマー対を使用するＰＣＲのテンプレートとして使用した。ＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を、製造業者の指示に従ってＰＣＲに使用した。いずれの場合においても、伸長時間は、下記で説明するＰＣＲ産物の予想したサイズ用に製造業者により示唆されているものであった。ＰＣＲ産物のサイズをアガロースゲル電気泳動により評価した。
【０１７０】
ＴＳ１標的部位の５’側上の領域を増幅するＡｄ３  ５’フォワードプライマー＋Ａｄ３  ５’リバースプライマー（それぞれ５’−ｔｇａａｃａｃａｇｃｃａｃｃｇａｃａｔｃａｇｃ［配列番号１５］および５’−ｇｃｔｇｇｔｇａｇｇｇｔｔｔｇｔｇｃｔａｔｔｇ［配列番号１６］）を使用して、全ての形質転換体において予想したサイズ（８７２ｂｐ）のＰＣＲ産物を得た。
【０１７１】
ＴＳ１標的部位の５’側上の領域を増幅するＡｄ３  ５’フォワードプライマー＋Ａｄ３ａ  ５００５リバースプライマー（それぞれ５’−ｔｇａａｃａｃａｇｃｃａｃｃｇａｃａｔｃａｇｃ［配列番号１５］および５’−ｇａｔｔｇｃｔｔｇｇｇａｇｇａｇｇａｃａｔ［配列番号１７］）を使用して、全ての形質転換体において予想したサイズ（１２１４ｂｐ）のＰＣＲ産物を得た。
【０１７２】
ＴＳ１標的部位の３’側上の領域を増幅するＡｄ３  ３’フォワードプライマー＋Ａｄ３  ３’リバースプライマー（それぞれ５’−ｃｇａｇｇｃｃａｃｔｇａｔｇａａｇｔｔｇｔｔｃ［配列番号１８］および５’−ｃａｇｔｔｔｔｃｃａａｇｇｃｔｇｃｃａａｃｇｃ［配列番号１９］）を使用して、全ての形質転換体において予想したサイズ（９０４ｂｐ）のＰＣＲ産物を得た。
【０１７３】
ＴＳ１標的部位の３’側上の領域を増幅するＡｄ３ａ  ５００３フォワードプライマー＋Ａｄ３  ｍｉｄリバースプライマー（それぞれ５’−ｃｔｇａｔｃｔｔｇｃａｃｃｃｔｇｇａａａｔｃ［配列番号２０］および５’−ｃｔｃｔｃｔａｔｃａｔｔｔｇｃｃａｃｃｃｔｃｃ［配列番号２１］）を使用して、全ての形質転換体において予想したサイズ（７５７ｂｐ）のＰＣＲ産物を得た。
【０１７４】
上記のＰＣＲ結果から、このゲノムＤＮＡ調製物がＣａｓ９標的部位の上流または下流のいずれかからのＰＣＲ産物を得るのに十分な品質であることを実証された。
【０１７５】
ａｄ３Ａ中のＴＳ１標的部位にまで及んでいるＡｄｆｒａｇフォワードプライマー＋Ａｄｆｒａｇリバースプライマー（それぞれ５’−ｃｔｃｃａｔｔｃａｃｃｃｔｃａａｔｔｃｔｃｃ［配列番号２２］および５’−ｇｔｔｃｃｃｔｔｇｇｃｇｇｔｇｃｔｔｇｇａｔｃ［配列番号２３］）を使用すると、あらゆる形質転換体に関してＰＣＲ産物を得ることができなかった。Ｃａｓ９活性に起因する大きなサイズ変化はないと仮定すると、このＰＣＲ産物の予想されるサイズは約７６４ｂｐであった。
【０１７６】
ａｄ３Ａ中のＴＳ１標的部位にまで及んでいるＡｄｆｒａｇフォワードプライマー＋Ａｄ３  ３’リバースプライマー（それぞれ５’−ｃｔｃｃａｔｔｃａｃｃｃｔｃａａｔｔｃｔｃｃ［配列番号２２］および５’−ｃａｇｔｔｔｔｃｃａａｇｇｃｔｇｃｃａａｃｇｃ［配列番号１９］）を使用すると、あらゆる形質転換体に関してＰＣＲ産物を得ることができなかった。Ｃａｓ９活性に起因する大きなサイズ変化はないと仮定すると、このＰＣＲ産物の予想されるサイズは約２５０４ｂｐであった。
【０１７７】
ａｄ３Ａ中のＴＳ１標的部位にまで及んでいるＡｄ３ａ  ２ｋフォワードプライマー＋Ａｄ３ａ  ２ｋリバースプライマー（それぞれ５’−ｃａａｔａｇｃａｃａａａｃｃｃｔｃａｃｃａｇｃ［配列番号２４］および５’−ｇａａｃａａｃｔｔｃａｔｃａｇｔｇｇｃｃｔｃｇ［配列番号２５］）を使用すると、あらゆる形質転換体に関してＰＣＲ産物を得ることができなかった。Ｃａｓ９活性に起因する大きなサイズ変化はないと仮定すると、このＰＣＲ産物の予想されるサイズは約１８１３ｂｐであった。
【０１７８】
形質転換体の内の５個では、ＴＳ１標的部位にまで及んでいるＡｄｆｒａｇフォワードプライマー＋Ａｄ３  ｍｉｄリバースプライマー（それぞれ５’−ｃｔｃｃａｔｔｃａｃｃｃｔｃａａｔｔｃｔｃｃ［配列番号２２］および５’−ｃｔｃｔｃｔａｔｃａｔｔｔｇｃｃａｃｃｃｔｃｃ［配列番号２１］）を使用してもＰＣＲ産物が得られなかった。Ｃａｓ９活性に起因する大きなサイズ変化はないと仮定すると、このＰＣＲ産物の予想されるサイズは約１４３８ｂｐであった。
【０１７９】
公開されているデータに基づくと、Ｃａｓ９媒介型の遺伝子不活性化は概して、標的部位でのＤＮＡ中の二本鎖切断のエラーを起こしやすい修復を含む。最終結果は、この標的部位での小さい欠失または挿入（インデル）である。上記のＰＣＲ分析結果は、標的部位にまで及んでいる予想サイズのＰＣＲ産物を得ることができなかったという驚くべきものであり、このことは、ａｄ３Ａの不活性化が標的部位での小さい挿入または欠失（インデル）に起因していなかったことを示唆する。その代わり、これらのデータは、標的部位での染色体再配置または大きな挿入によりａｄ３Ａの不活性が引き起こされた可能性と一致する。
【０１８０】
グルコアミラーゼ（ＧＡ）遺伝子の不活性化
４種の主要な分泌セルラーゼをコードする遺伝子（ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１およびｅｇｌ２）が欠失した、公的に入手可能な株ＲＬ−Ｐ３７に由来するトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）の株を使用した。この株は、機能するｐｙｒ４遺伝子も欠いていた。この株を、等量のｐＴｒｅｘ２ｇＨｙｇ  ＭｏＣａｓとｐ２１９Ｍ  ｇＴｒＧＡ  ＴＳ２との混合物でバイオリスティック法を使用して共形質転換した。１％のグルコース、１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢおよび２ｍｇ／ｍｌのウリジンを含むフォーゲルの最少培地を含む寒天プレート上で形質転換体を選択した。最初のプレート上での選択後、形質転換体コロニーを同じ選択培地の新鮮なプレートへと採取した。２番目のプレート上での増殖中に、安定したハイグロマイシン耐性形質転換体と不安定なハイグロマイシン形質転換体とを区別することができた。１７個の安定した形質転換体と４個の不安定な形質転換体を得た。これらの形質転換体を、グルコースを含まず１％の不溶性デンプンを含むフォーゲルの寒天プレートに移し、グルコアミラーゼの分泌の有無に関してスクリーニングした。グルコアミラーゼを分泌可能なコロニーは、よく増殖して胞子を形成する。グルコアミラーゼを分泌不能なコロニーは非常にまばらな菌糸体で増殖し、明らかに識別可能である。１７個の安定した形質転換体の内の１４個はグルコアミラーゼを分泌不能であり、４個全ての不安定な形質転換体がグルコアミラーゼを分泌しなかった。
【０１８１】
ｐＴｒｅｘ２ｇＨｙｇ  ＭｏＣａｓとｐ２１９Ｍ  ｇＴｒＧＡ  ＴＳ２とによる共形質転換体中におけるｇｌａ１（グルコアミラーゼ）遺伝子座での変異を確認するために、５個の安定した、グルコアミラーゼを産生しない形質転換体からゲノムＤＮＡを抽出した。このＤＮＡを、Ｃａｓ９標的部位にまで及んでいるまたはこの標的部位の上流もしくは下流である産物を生成するように設計されている様々なプライマー対を使用するＰＣＲのテンプレートとして使用した。ＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、製造業者の指示に従ってＰＣＲに使用した。いずれの場合においても、伸長時間は、下記で説明するＰＣＲ産物の予想したサイズ用に製造業者により示唆されているものであった。ＰＣＲ産物のサイズをアガロースゲル電気泳動により評価した。
【０１８２】
ｇｌａ１中のＴＳ２標的部位にまで及んでいるｇｌａＡプライマー＋ｇｌａＢプライマー（それぞれ５’−ｃｃｇｔｔａｇｔｔｇａａｇａｔｃｃｔｔｇｃｃｇ［配列番号２６］および５’−ｇｔｃｇａｇｇａｔｔｔｇｃｔｔｃａｔａｃｃｔｃ［配列番号２７］）を使用すると、あらゆる形質転換体に関してＰＣＲ産物を得ることができなかった。Ｃａｓ９活性に起因する大きなサイズ変化はないと仮定すると、このＰＣＲ産物の予想されるサイズは約１３７１ｂｐであった。
【０１８３】
ＴＳ２標的部位の５’側上の領域を増幅するｇｌａＡプライマー＋ｇｌａＪプライマー（それぞれ５’−ｃｃｇｔｔａｇｔｔｇａａｇａｔｃｃｔｔｇｃｃｇ［配列番号２６］および５’−ｔｇｃｃｇａｃｔｔｔｇｔｃｃａｇｔｇａｔｔｃｇ［配列番号３０］）を使用して、全ての形質転換体において予想したサイズ（３６４ｂｐ）のバンドを得た。
【０１８４】
ＴＳ２標的部位の３’側上の領域を増幅するｇｌａＫプライマー＋ｇｌａＢプライマー（それぞれ５’−ｔｔａｃａｔｇｔｇｇａｃｇｃｇａｇａｔａｇｃｇ［配列番号３１］および５’−ｇｔｃｇａｇｇａｔｔｔｇｃｔｔｃａｔａｃｃｔｃ［配列番号２７］）を使用して、形質転換体の内の４個において予想したサイズ（５２０ｂｐ）のバンドを得た。形質転換体の内の１個では、このプライマー対によりＰＣＲ産物が得られなかった。
【０１８５】
標的とされたＣａ９作用によるｇｌａ１遺伝子の不活性化を実証することを目的とする別の実験を、ＲＬ−Ｐ３７に由来するおよび不活性なｐｙｒ４遺伝子を有するＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）の株を使用して実施した。この株のプロトプラストを、ポリエチレングリコール媒介型方法（下記で説明する）を使用してｐＴｒｅｘ２ｇＨｙｇ  ＭｏＣａｓ  ｇＴｒＧＡ  ＴＳ１１で形質転換した。２％のグルコース、２ｍｇ／ｍｌのウリジン、１．１Ｍのソルビトールおよび１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを含むフォーゲルの最少培地の寒天プレート上で形質転換体を選択した。最初のプレート上での選択後、形質転換体コロニーを、ソルビトールを含まない同じ選択培地の新鮮なプレートへと採取した。２番目のプレート上での増殖中に、安定したハイグロマイシン耐性形質転換体と不安定なハイグロマイシン形質転換体とを区別することができた。形質転換体を、グルコースを含まず１％の不溶性デンプンを含むフォーゲルの寒天プレートに移し、グルコアミラーゼの分泌の有無に関してスクリーニングした。グルコアミラーゼを分泌しなかった５個の安定した形質転換体（Ｂ＃１、Ｂ＃２、Ｂ＃４、Ｂ＃５およびＢ＃６と命名した）を更なる分析用に選択した。これらの形質転換体それぞれからゲノムＤＮＡを抽出した。
【０１８６】
ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用し、ＴＳ１１標的部位にまで及んでいる野生型ｇｌａ１遺伝子座から９８３ｂｐの産物を生成するプライマーｇｌａ１ｒｅｐＦおよびｇｌａ１ｒｅｐＲ（それぞれ５’−ｇｔｇｔｇｔｃｔａａｔｇｃｃｔｃｃａｃｃａｃ［配列番号３２］および５’−ｇａｔｃｇｔｇｃｔａｇｃｇｃｔｇｃｔｇｔｔｇ［配列番号２３］）を使用してＰＣＲを実施した。ＰＣＲ条件に、ＰＣＲサイクル毎にプライマーアニーリング温度を徐々に下げること、および標的部位で大きな挿入があったかどうかを確認するための長い伸長時間を含めた。具体的なＰＣＲ条件は下記の通りであった。
工程１：１分にわたり９４℃
工程２：２５秒にわたり９４℃
工程３：３０秒にわたり６３℃（１サイクル当たり０．２℃の温度低下）
工程４：８分にわたり７０℃
工程２〜４を更に２４回繰り返した
工程５：４℃で保持した
【０１８７】
形質転換体の内の２個（Ｂ＃１およびＢ＃６）から１２ｋｂを超える明瞭なＣＰＲ産物を得ており、このことは、標的部位にまで及んでいるＤＮＡ領域中での１１ｋｂを超える増加を示唆する。その他の３個の形質転換体からは、アガロースゲル電気泳動で低強度バンドとして現れる非特異的ＰＣＲ産物のみを得た。Ｂ＃６からの＞１２ｋｂのＰＣＲ産物配の配列分析により、プラスミドｐＴｒｅｘ２ｇＨｙｇ  ＭｏＣａｓ  ｇＴｒＧＡ  ＴＳ１１に由来するＤＮＡがＴＳ１１標的部位で挿入されていることが実証された。
【０１８８】
ゲノムＤＮＡ試料Ｂ＃２、Ｂ＃４およびＢ＃５と、プライマー対１５５３Ｒおよび１５５５Ｆ（それぞれ５’−ＣＣＧＴＧＡＴＧＧＡＧＣＣＣＧＴＣＴＴＣＴ［配列番号３４］および５’−ＣＧＣＧＧＴＧＡＧＴＴＣＡＧＧＣＴＴＴＴＴＣ［配列番号３５］）とを使用してＰＣＲを実施した。プライマー１５５３Ｒは、標的部位１１の３’側上のｇｌａ１遺伝子に結合する。プライマー１５５５Ｆは、プラスミドｐＴｒｅｘ２ｇＨｙｇ  ＭｏＣａｓ  ｇＴｒＧＡ  ＴＳ１１上のハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇＢ）遺伝子の開始コドン付近に結合する。上記と同じＰＣＲ条件を使用した。形質転換体Ｂ＃４およびＢ＃５それぞれに関して、４．５ｋｂおよび６．５ｋｂのＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲ産物は、ｈｙｇＢ遺伝子を有するプラスミドがｇｌａ１遺伝子に挿入された場合にのみ得られるはずである。おそらく、形質転換体Ｂ＃４およびＢ＃５に挿入されたプラスミドＤＮＡが大きかったことから、プライマーｇｌａ１ｒｅｐＦおよびｇｌａ１ｒｅｐＲを使用してＰＣＲ産物を得ることができなった。
【０１８９】
まとめると、ＰＣＲデータから、ｇｌａ１遺伝子中の標的部位でのＣａｓ９およびガイドＲＮＡの発現ベクターの大きなセグメントの挿入により、グルコアミラーゼが不活性化されている安定したハイグロマイシン耐性形質転換体が生じていることが実証された。
【０１９０】
ｐｙｒ２遺伝子の不活性化
Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｐｙｒ２遺伝子内の様々な位置を標的とするガイドＲＮＡ発現カセットを含むプラスミドｐＴｒｅｘ２ｇＨｙｇ  ＭｏＣａｓの誘導体によるプロトプラストのＰＥＧ媒介型形質転換により、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株ＱＭ６ａまたはＲＬ−Ｐ３７の形質転換体を生成した。この遺伝子の不活性化により、ウリジン栄養要求性および５−フルオロオロチン酸（ＦＯＡ）に対する耐性が付与される。最初に、ハイグロマイシンＢを含む培地上で形質転換体を選択した。ハイグロマイシンＢを含む新鮮な寒天プレートに移して安定または不安定と印を付けた。次いで、形質転換体を、２ｍｇ／ｍｌのウリジンおよび１．２ｍｇ／ｍｌのＦＯＡを含むフォーゲルの最少培地の寒天プレートに移した。ＦＯＡの存在下で増殖する能力は、Ｃａｓ９媒介型のｐｙｒ２遺伝子不活性化に起因するウリジン栄養要求性を示す。
【０１９１】
ＦＯＡ耐性でハイグロマイシン安定なおよび不安定な形質転換体の内の一部から、ＰＣＲ分析用にゲノムＤＮＡを抽出した。この分析に使用したプライマーは、標的部位にまで及んでいるおよび約０．８ｋｂの長さであるｐｙｒ２遺伝子座の領域を増幅するように設計されているｐｙｒ２Ｆ（５’−ｇｔａｔａａｇａｇｃａｇｇａｇｇａｇｇｇａｇ［配列番号３６］）およびｐｙｒ２Ｒ（５’−ｇａａｃｇｃｃｔｃａａｔｃａｇｔｃａｇｔｃｇ［配列番号３７］）であった。
【０１９２】
ＦＯＡ耐性であることが分かったＱＭ６ａ形質転換体の内、１８個の安定したハイグロマイシン耐性形質転換体と５個の不安定なハイグロマイシン耐性形質転換体とを、サイズが野生型株でのサイズと類似すると仮定してｐｙｒ２遺伝子座の領域を増幅するのに十分な伸長時間を有するＰＣＲプロトコルを使用して試験した。安定した形質転換体のいずれにおいても、この短い伸長時間ではＰＣＲ産物が得られなかったが、不安定な形質転換体の内の２個でＰＣＲ産物を得た。これら２種のＰＣＲ産物のＤＮＡ配列分析により、予想した標的部位において一方が１個のみのヌクレオチド欠失を有し他方が１１１ｎｔの欠失を有することが分かった。
【０１９３】
ＦＯＡ耐性であることが分かったＲＬ−Ｐ３７形質転換体の内、４個の安定したハイグロマイシン耐性形質転換体と２個の不安定なハイグロマイシン耐性形質転換体とを、伸長時間が短いＰＣＲプロトコルを使用して試験した。安定した形質転換体のいずれにおいても、この短い伸長時間ではＰＣＲ産物が得られなかったが、不安定な形質転換体では両方ともＰＣＲ産物を得た。これら２種のＣＰＲ産物のＤＮＡ配列分析により、予想した標的部位において一方が１個のみのヌクレオチド欠失を有し他方が１３４ｎｔの挿入を有することが分かった。この挿入はｐＴｒｅｘ２ｇＨｙｇベクターの２種の小断片からなった。
【０１９４】
大きなＤＮＡ断片がｐｙｒ２遺伝子座中の標的部位で挿入されたと仮定して、異なる６個の安定したハイグロマイシン耐性ＲＬ−Ｐ３７形質転換体を、ｐｙｒ２遺伝子座の領域の増幅が可能なように設計した、先に説明したＰＣＲプロトコルを使用して分析した。６個全ての形質転換において、この長い伸長時間プロトコルにより大きなＰＣＲ産物（形質転換体に応じて約５ｋｂから＞１２ｋｂ）を得た。これらのＰＣＲ産物の内の５種のＤＮＡ配列分析により、全ての場合でｐＴｒｅｘ２ｇＨｙｇベクターＤＮＡまたはこの断片が組み込まれていることが分かった。
【０１９５】
まとめると、これらのデータから、Ｃａｓ９によって引き起こされる二本鎖切断の修復は、安定した形質転換体における大きなベクター断片の組み込みを主に伴うことが分かる。このことは、遺伝子不活性化の非常に効率的な方法であることができる。このことから、機能する遺伝子を有するが標的部位との配列相同性を有しないＤＮＡ断片またはベクターは、Ｃａｓ９切断および二本鎖切断の形成後の標的部位で部位特異的に組み込まれ得ることも実証される。対照的に、小さい欠失または挿入（インデル）は、不安定な形質転換体におけるＣａｓ９による遺伝子の不活性化と関連している。このことは、ベクターの組み込みが望ましくない場合に遺伝子不活性化のために選択される方法である。
【０１９６】
実施例７：テロメアを有する発現ベクターを使用するｃａｓ９およびｓｇＲＮＡの発現
Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡの発現ベクターｐＴｒｅｘ２ｇＨｙｇ  ＭｏＣＡＳ  ｇＰｙｒ２  ＴＳ６の、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）テロメア配列を含むバージョンを構築した（図６に示す）。このベクターに、下記に示すＤＮＡ配列（配列番号３８）を挿入した。下線を引いた領域は反復テロメア配列を含んでおり、それぞれがこの断片の中心方向へ読み取られる。中心部分は、テロメアの反復を確実に維持するために大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での選択を可能にするプロモーターおよびターミネーターを有する細菌カナマイシン耐性遺伝子である。トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）では、テロメアを有するベクターは各末端でテロメア配列と共に線状化すると予想され、低コピー数で自律的に維持されるはずであるが、染色体ＤＮＡ中への偶発的な組み込みも起こり得る。
【化１６】
2017538425.tif 000018
【０１９７】
このベクターを、プロトプラストのＰＥＧ媒介型形質転換によりＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株ＲＬ−Ｐ３７に挿入した。形質転換体をハイグロマイシン耐性に関して選択し、ハイグロマイシンを含む新鮮な寒天プレートに移した。大部分の形質転換体は不安定なハイグロマイシン耐性表現型を示した。個々の形質転換されたコロニーを、２ｍｇ／ｍｌのウリジンおよび１．２ｍｇ／ｍｌの５−フルオロオロチン酸を含む最少培地寒天プレートに移し、増殖することができてそのためＰｙｒマイナス表現型を有する形質転換体を選択した。１４２個の不安定な形質転換体の内の８個（６％）がＰｙｒマイナスであった。ｐｙｒ２遺伝子座のＰＣＲによる分析およびこれらの形質転換体の内の３個のシークエンシングにより、２個が標的部位で小さい欠失を有し（それぞれ１ｂｐおよび２７ｂｐ）、１個が、ｐＴｒｅｘ２ｇＨｙｇ  ＭｏＣＡＳ  ｇＰｙｒ２  ＴＳ６の細菌ベクター部分に由来する６８ｂｐの挿入と組み合わせて１ｂｐの欠失を有することが分かった。その他の５個の形質転換体では、大きなＤＮＡ断片を増幅するように設計したＰＣＲ条件［ＰＣＲ条件：工程１：１分にわたり９４℃、工程２：２５秒にわたり９４℃、工程３：３０秒にわたり６３℃（１サイクル当たり０．２℃の温度低下）、工程４：８分にわたり７０℃、工程２〜４を更に２４回繰り返した、工程５：４℃で保持した。ポリメラーゼ：ＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）］を使用したにもかかわらずＰＣＲ産物が得られなかった。
【０１９８】
これらの結果から、自律的に複製するベクターからのＣａｓ９およびガイドＲＮＡの発現によりＣａｓ９の標的を特定の遺伝子座（この場合はｐｙｒ２）に設定することが可能であることが実証される。結果として起こる遺伝子の不活性化は、標的部位でベクターＤＮＡを挿入することなしに起こり得る。
【０１９９】
実施例８：相同組込みによる遺伝子編集
トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）株Ｔ４（１）７を下記の実験に使用した。このＴ４（１）７は、セルラーゼ生産性の増大に関するスクリーニングによりＲＬ−Ｐ３７に由来する株であり、この株をウリジン栄養要求体にするｐｙｒ２遺伝子を不活性化する単一点変異を有する。
【０２００】
下記に示す配列を有する、Ｇｌａ１ｒｅｐと呼ぶ合成ＤＮＡ断片（配列番号３９）を設計し、オーダーメードで作製した。
【化１７】
2017538425.tif 000019
【０２０１】
Ｇｌａ１ｒｅｐ配列はＯＲＦ内からｇｌａ１遺伝子座の９８２ｂｐである。Ｇｌａ１ｒｅｐ配列はＴＳ１１標的部位（下線を引いている）にまで及んでいる。野生型Ｇｌａ１遺伝子の「ＣＣＧ」ＰＡＭ配列内の１個のみの「Ｃ」ヌクレオチド（ＴＳ１１標的部位のすぐ上流）が欠失しており、これによりＧｌａ１コーディング配列中でフレームシフトが起こり、およびＴＳ１１に隣接するＰＡＭが破壊され、従ってＣａｓ９による切断が防止される。このＰＡＭの残り２個のヌクレオチドを大文字および太字のフォントで示す。
【０２０２】
このＧｌａ１ｒｅｐ断片を、形質転換で使用するために、プライマーｇｌａ１ｒｅｐ  Ｆおよびｇｌａ１ｒｅｐ  Ｒ（それぞれ５’−ｇｔｇｔｇｔｃｔａａｔｇｃｃｔｃｃａｃｃａｃ［配列番号３２］および５’−ｇａｔｃｇｔｇｃｔａｇｃｇｃｔｇｃｔｇｔｔｇ［配列番号３３］）を使用するＰＣＲにより増幅させた。
【０２０３】
Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株Ｔ４（１）７のプロプラストを、ｐＴｒｅｘ２ｇＨｙｇ  ＭｏＣａｓ  ｇＴｒＧＡ  ＴＳ１１Ｂ（２μｇ）とＧｌａ１ｒｅｐ（８μｇ）とによるＰＥＧ媒介型方法により共形質転換した。５０μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ、２ｍｇ／ｍｌのウリジンおよび１．１Ｍのソルビトールを含むフォーゲルの最少培地を含む寒天プレート上で形質転換体を選択した。プラスミドｐＴｒｅｘ２ｇＨｙｇ  ＭｏＣａｓ  ｇＴｒＧＡ  ＴＳ１１ＢはｐＴｒｅｘ２ｇＨｙｇ  ＭｏＣａｓ  ｇＴｒＧＡ  ＴＳ１１と同じであるが、但し、ＴＳ１１ガイドＲＮＡ用の発現カセットは、このプラスミドの残りに対して反対方向である。
【０２０４】
形質転換体を、ウリジンおよびハイグロマイシンを含むフォーゲルの最少培地の新鮮な寒天プレートへと採取し、安定したハイグロマイシン耐性表現型と不安定なハイグロマイシン耐性表現型とを区別することができた。形質転換体を、ウリジンと唯一の炭素源としての１％の不溶性デンプンとを含むフォーゲルの最少培地の寒天プレートに移し、グルコアミラーゼ陽性表現型またはグルコアミラーゼ陰性表現型に印を付けた。安定したハイグロマイシン耐性形質転換体の約８３％がグルコアミラーゼ産生に関して陰性であったのに対して、不安定なハイグロマイシン耐性形質転換体の１５％がグルコアミラーゼ産生に関して陰性であった。グルコアミラーゼマイナス表現型である７個の不安定な形質転換体を非選択寒天培地（フォーゲル＋ウリジン）に移し、１週間にわたり増殖させた。その後、フォーゲル＋ウリジン＋ハイグロマイシンのプレートへと採取したとき、これらの形質転換体は全てハイグロマイシン感受性であり、このことから、ｐＴｒｅｘ２ｇＨｙｇ  ＭｏＣａｓ  ｇＴｒＧＡ  ＴＳ１１Ｂと関連するハイグロマイシン耐性遺伝子の喪失が実証される。
【０２０５】
ｐＴｒｅｘ２ｇＨｙｇ  ＭｏＣａｓ  ｇＴｒＧＡ  ＴＳ１１ＢおよびＧｌａ１ｒｅｐで得た５個の不安定なハイグロマイシン感受性およびグルコアミラーゼ陰性の形質転換体（形質転換体＃３１、１０７、１１４、１１８および１２０）からゲノムＤＮＡを単離し、ＴＳ１１またはｇｌａＫ［配列番号３１］（上記を参照されたい）にまで及んでいる約３．２ｋｂを増幅するように設計したプライマーｇｌａＡおよびｇｌａＤ（それぞれ５’−ｃｃｇｔｔａｇｔｔｇａａｇａｔｃｃｔｔｇｃｃｇ［配列番号２６］および５’−ｇａｇａｇａｃｇｃａｇｇａｔｇａｃｔｃａａａｇ［配列番号２８］）ならびにｇｌａＨ  ５’−ｔｇｃｃｇｔｇｇｇｔｃａｔｔｇｇｃａｔａｔｔｃ［配列番号２９］を使用するＰＣＲ（上記で説明したプログラム）でのテンプレートとして使用した。プライマーとしてｇｌａ１ｒｅｐ  Ｆおよびｇｌａ１ｒｅｐ  Ｒ（それぞれ５’−ｇｔｇｔｇｔｃｔａａｔｇｃｃｔｃｃａｃｃａｃ［配列番号３２］および５’−ｇａｔｃｇｔｇｃｔａｇｃｇｃｔｇｃｔｇｔｔｇ［配列番号３３］）を使用してＰＣＲ産物をシークエンシングして、標的部位ＴＳ１１での変更を確認した。形質転換体の内の１個は、ＴＳ１１と関連するＰＡＭで１ｂｐのみの欠失を導入してｇｌａ１遺伝子を不活性化するｇｌａ１遺伝子座でのＧｌａ１ｒｅｐの相同組換えと一致するＰＣＲ結果およびシークエンシング結果を示した。形質転換体の内、２個はＴＳ１１標的部位で小さいインデルを有したのに対して、その他の２個は、この部位を横切る相同組込みではなくＣａｓ９切断部位へのＧｌａ１ｒｅｐの断片の挿入を示した。
【０２０６】
プロトプラストをｐＴｒｅｘ２ｇＨｙｇ  ＭｏＣａｓ  ｇＴｒＧＡ  ＴＳ１１Ａ（ｐＴｒｅｘ２ｇＨｙｇ  ＭｏＣａｓ  ｇＴｒＧＡ  ＴＳ１１Ｂと同一であるが、但し、このベクター内ではガイドＲＮＡ発現カセットが逆方向である）とｇｌａ１遺伝子座での相同組換えにより組み込むように設計した線状ＤＮＡ断片とで共形質転換する上記の実験を繰り返した。しかしながら、グルコアミラーゼ遺伝子中の標的部位ＴＳ１１での相同組換え用のドナーとしての９８２ｂｐのＧｌａ１ｒｅｐ  ＤＮＡ断片の使用の代わりに、Ｇｌａ１ｒｅｐＬと命名した、より長い約２ｋｂの断片を使用した。Ｇｌａ１ｒｅｐＬの中心部はＧｌａ１ｒｅｐと同じ配列であったが、この断片の５’末端および３’末端はｇｌａ１遺伝子座のより多くの上流部および下流部を含むように伸びていた。この実験では、上記で使用した株Ｔ４（１）７の代わりにトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）株ＲＬ−Ｐ３７を使用した。コントロールとして、プロトプラストをＧｌａ１ｒｅｐＬとｐＴｒｅｘ２ｇＨｙｇ  ＭｏＣａｓとで共形質転換し、活性なＣａｓ９の非存在下にてｇｌａ１遺伝子座でＧｌａ１ｒｅｐＬが組み込まれる頻度を測定した。形質転換および表現型のスクリーニングの後、形質転換体を下記のカテゴリーに割り当てることができた。
【０２０７】
【表１】
2017538425.tif 000020
【０２０８】
ｐＴｒｅｘ２ｇＨｙｇ  ＭｏＣａｓ  ｇＴｒＧＡ  ＴＳ１１ＡおよびＧｌａ１ｒｅｐＬで得た５個の安定したおよび５個の不安定なハイグロマイシン感受性およびグルコアミラーゼ陰性の形質転換体（安定した形質転換体＃５１、５２、６０、６１および６７、不安定な形質転換体３３８、４１、６５、６６および６８）からゲノムＤＮＡを単離し、プライマーｇｌａＡおよびｇｌａＤ（上記を参照されたい）を使用するＰＣＲでのテンプレートとして使用した。ｇｌａ１遺伝子中の標的部位ＴＳ１１で挿入または大きな欠失が起きなかった場合、ＰＣＲ産物は３．２ｋｂであると予想した。
【０２０９】
５個の安定した形質転換体の内の３個（＃５２、６０および６１）から約３．２ｋｂのＰＣＲ産物を得たが、その他の２個からは、ＴＳ１１でのＤＮＡの挿入を示すより大きな産物を得た。約３．２ｋｂの３種のＰＣＲ産物を、プラマーとしてｇｌａｒｅｐＦを使用してシークエンシングした。２個の形質転換体（＃５２および６１）の場合、シークエンシングの結果はｇｌａ１遺伝子座での相同組換えによるＧｌａ１ｒｅｐＬの組込みと一致しており、それ以外は、容易に解釈することができない混合シグナルを有していた。
【０２１０】
５個の不安定な形質転換体の内の１個のみ（＃６６）から約３．２ｋｂのＰＣＲ産物を得て、その他の４個からは、ＴＳ１１でのＤＮＡの挿入を示すより大きな産物を得た。約３．２ｋｂの１種のＰＣＲ産物を、プライマーとしてｇｌａｒｅｐＦを使用してシークエンシングし、この結果は、ｇｌａ１遺伝子座での相同組換えによるＧｌａ１ｒｅｐＬの組込みと一致した。
【０２１１】
まとめると、これらの結果は、線状ＤＮＡ断片の相同組込みは、標的とした遺伝子座でのＣａｓ切断により刺激され得ることを示す。しかしながら、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）による小さいインデルまたはＤＮＡの大きな挿入も一般に起こる。より大きな相同の線状ＤＮＡ断片の使用は、その他の事象に対する標的部位での相同組込みの頻度の改善に役立つ。ハイグロマイシンを含まない培地上で増殖させることにより、その後にｐＴｒｅｘ２ｇ  ＭｏＣａｓベースのベクターを除去することができる不安定なハイグロマイシン耐性形質転換体中における標的部位での相同組込みを得ることができる。
【０２１２】
実施例９：Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）のＮＨＥＪ欠失株での遺伝子編集
トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）の「四重欠失株」（ＲＬ−Ｐ３７に由来し、セロビオヒドロラーゼ１遺伝子、セロビオヒドロラーゼ２遺伝子、エンドグルカナーゼ１遺伝子およびエンドグルカナーゼ２遺伝子が欠失している（Δｃｂｈ１、Δｃｂｈ２、Δｅｇｌ１およびΔｅｇｌ２株、国際公開第９２／０６１８４号パンフレットおよび国際公開第０５／００１０３６号パンフレットを参照されたい））に由来し、天然のエンドグルカナーゼ−３遺伝子およびベータグルコシダーゼ−１遺伝子の欠失を有する株（ＭＡＤ６）を、Ｃａｓ９標的部位での非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ挿入の役割を確認するために設計した実験に使用した。このＭＡＤ６株はまた、ＤＮＡ組換え用の主要なＮＨＥＪ経路に必須な天然遺伝子（ヒトｋｕ８０に対してオルソロガス）も欠失している（このＭＡＤ６株をどのようにして作製するかの説明に関して米国特許出願公開第２０１３０１４９７４２Ａ１号明細書「Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇａｌ  ｈｏｓｔ  ｓｔｒａｉｎｓ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ，ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｕｓｅ  ｔｈｅｒｅｏｆ」を参照されたい）。この株を、ｐＴｒｅｘ２ｇＨｙｇ  ＭｏＣＡＳ  ｇＴｒＧＡ  ＴＳ１１Ｂと上記で説明したドナーＧｌａ１ｒｅｐ断片とで共形質転換した。ｇｌａ１遺伝子座での相同組換えによるこの断片の組込みによって、ｇｌａ１遺伝子を不活性化させ、ＰＡＭ配列から１ｂｐを欠失させてＴＳ１１標的部位を除去することができた。ＰＥＧ媒介型方法によってプロトプラストから形質転換体を得た。１．１Ｍのソルビトールおよび１００ｕｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢを含むフォーゲルの最少培地上で形質転換体を選択した。ハイグロマイシンのみを含む最少培地の新鮮な寒天プレートに移した９１個の形質転換体の内、４個のみが安定したハイグロマイシン耐性表現型を有した（非選択的条件下での増殖期間後にハイグロマイシンを含む培地上に再び蒔いた場合に増殖する能力により確認した）。全ての形質転換体を、唯一の炭素源として１％の不溶性デンプンを含むフォーゲルの最少培地に移し、４個の安定した形質転換体を含む１７個（１８％）がグルコアミラーゼ陰性であることが分かった。ＰＣＲおよびＤＮＡ配列分析から、ｇｌａ１遺伝子座での相同組換えによりドナーＧｌａ１ｒｅｐが組み込まれている場合では、１３個の不安定な形質転換体の内の１２個および安定した形質転換体の内の１個が、予想したＴＳ１１ＰＡＭで１ｂｐのみの欠失を有していることが分かった。その他の不安定な形質転換体は、グルコアミラーゼ陰性表現型を有していたにもかかわらず野生型ｇｌａ１配列を有した。その他の３個の安定した形質転換体では、ｇｌａ１遺伝子座の場合に予想されるサイズの明瞭なＰＣＲ産物が得られず、これらの形質転換体ではベクターまたはドナーＧｌａ１ｒｅｐの挿入が起きていた可能性がある。全ての不安定なグルコアミラーゼ陰性形質転換体をハイグロマイシンを含まない培地上で増殖させ、ハイグロマイシンを含む培地に戻した。いずれも増殖することができず、このことは、これらの形質転換体がｐＴｒｅｘ２ｇＨｙｇ  ＭｏＣＡＳ  ｇＴｒＧＡ  ＴＳ１１Ｂベクターを失っていたことを示す。
【０２１３】
これらの結果から、ＮＨＥＪが欠失した株ではＣａｓ標的部位でのベクターまたはドナーＤＮＡ断片の挿入が最小限に抑えられることが明確に分かる。その結果、Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡが一時的に発現される不安定な形質転換体でのドナーＤＮＡ断片の相同組換えにより、高頻度の非常に特異的な遺伝子編集（１ｂｐのみの欠失）が可能である
【０２１４】
第Ｂ節：Ｃａｓニッカーゼ／ガイドＲＮＡの直接導入
実施例１０：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でのＣＲＩＳＰＲ  ＳｐｙＣａｓ９−Ｄ１０Ａニッカーゼの異種発現
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９−Ｄ１０Ａ（ＳｐｙＣａｓ９−Ｄ１０Ａ）ニッカーゼ遺伝子を合成し、Ｇｅｎｅｒａｙ（Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｃｈｉｎａ）によりＮｃｏＩ部位およびＨｉｎｄＩＩＩ部位で発現ベクターｐＥＴ３０ａに挿入し、結果としてプラスミドｐＥＴ３０ａ−ＳｐｙＣａｓ９−Ｄ１０Ａニッカーゼを得た（図７）。図７のプラスミドマップで示すように、発現カセットの完全なコーディング配列は、５’から３’への方向で、Ｎ末端Ｈｉｓ６タグ／トロンビン／Ｓ・Ｔａｇ（商標）／エンテロキナーゼ領域をコードする配列（配列番号６８、メチオニン用の開始コドンを含む）、ＳＶ４０核局在化シグナルをコードする配列（配列番号６９）、ＳｐｙＣａｓ９−Ｄ１０Ａニッカーゼをコードする配列（配列番号６５）、およびＢＬＲ２核局在化シグナルをコードする配列（配列番号７０）を含み、全てが作動可能に連結されている。この全コーディング配列を配列番号５４に示す。配列番号６８によりコードされるＮ−末端Ｈｉｓ６タグ／トロンビン／Ｓ・Ｔａｇ（商標）／エンテロキナーゼ領域のアミノ酸配列を配列番号６７（１位でメチオニンを含む）に示し、配列番号６９によりコードされるＳＶ４０核局在化シグナルのアミノ酸配列を配列番号４６に示し、配列番号６５によりコードされるＳｐｙＣａｓ９−Ｄ１０Ａニッカーゼのアミノ酸配列を配列番号６６に示し、配列番号７０によりコードされるＢＬＲ２核局在化シグナルのアミノ酸配列を配列番号４７に示す。配列番号５４によりコードされるアミノ酸配列を配列番号５５に示す。
【０２１５】
ｐＥＴ３０ａ−ＳｐｙＣａｓ９−Ｄ１０ＡニッカーゼプラスミドをＲｏｓｅｔｔａ２（Ｄｅ３）ｐｌｙｓＳ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株（Ｎｏｖａｇｅｎ（登録商標）、ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中に形質転換し、形質転換産物を、３４ｐｐｍのクロラムフェニコールおよび５０ｐｐｍのカナマイシンを補充したＬｕｒｉａ  Ａｇａｒプレート上に広げた。コロニーを採取し、３００ｒｐｍで３０℃にて２４時間にわたり、２５０ｍｌの振とうフラスコに入ったＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＭａｇｉｃＭｅｄｉａ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）２５ｍｌ中で発酵させた。
【０２１６】
ＳｐｙＣａｓ９−Ｄ１０Ａ配列が由来する、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来の野生型Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列を配列番号４５として示す。
【０２１７】
実施例１１：ＳｐｙＣａｓ９−Ｄ１０Ａの精製
ＳｐｙＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）の精製に、親和性クロマトグラフィー工程、疎水性相互作用クロマトグラフィー工程およびサイズ排除クロマトグラフィー工程の組み合わせを適用した。粗ブロス２リットルを得て遠心分離した。細胞をペレット化し、溶解緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、５００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍＭのＤＴＴおよび１ｍＭのＴＣＥＰ、Ｒｏｃｈｅから購入したプロテアーゼ阻害剤カクテル）４００ｍｌに再懸濁させ、超音波処理器（３５％パワー、２０分、２秒オン／３秒オフ）（ＳＣＩＥＮＴ２−ＩＩ  Ｄ、Ｎｉｎｇｂｏ  Ｓｃｉｅｎｔｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，ＬＴＤ．、Ｚｈｅｊｉａｎｇ、Ｃｈｉｎａ）で溶解させた。溶解物を、４０分にわたる２０，０００ｇでの遠心分離により清澄化した。
【０２１８】
清澄化した溶解物を、Ｒｏｌｌｉｎｇ  Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ（Ｋｙｌｉｎ−Ｂｅｌｌ  Ｌａｂ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、Ｈａｉｍｅｎ、Ｃｈｉｎａ）中で４℃、３０ｒｐｍにて一晩、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と共にインキュベートした。遠心分離後、この樹脂をＸＫ２６／２０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に移し、ＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に接続した。平衡緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、３００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００）および洗浄緩衝液（平衡緩衝液中の２５ｍＭのイミダゾール）で広範囲に洗浄した後、平衡緩衝液中の５０、２５０および５００ｍＭのイミダゾールで標的タンパク質を溶出させた。この所望のタンパク質を、５０ｍＭのイミダゾール溶出液中においておよび２５０ｍＭのイミダゾール溶出液中において比較的高純度で見出し、プールして更に別々に処理した。
【０２１９】
親和性工程から集めた活性画分に０．６Ｍまで硫酸アンモニウムを添加し、２０ｍｌのフェニル−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に充填した。このカラムを、ｐＨ７．５でＨＥＰＥＳ緩衝液中の０．６Ｍから０．０Ｍへの硫酸アンモニウムの勾配で溶出させた。各画分の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで評価し、目的のタンパク質がフロースルー画分中に主に存在することが明らかになった。
【０２２０】
最後に、このタンパク質を、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＫＣｌおよび１０％のグリセロール中のＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １６／６０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのサイズ排除クロマトグラフィーにより更に精製した。タンパク質を含む純粋な画分をプールし、Ａｍｉｃｏｎ  ３０ＫＤａメンブランフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮した。２つのバッチの精製済タンパク質（それぞれ５０ｍＭのイミダゾール溶出および２５０ｍＭのイミダゾール溶出に由来する）を、使用するまで−２０℃でｐＨ７．５にて１５０ｍＭのＫＣｌおよび４０％のグリセロールを含む２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液中で保存した。
【０２２１】
実施例１２：ニッカーゼｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ
ｉｎ  ｖｉｔｒｏニッカーゼ切断アッセイ用の基質ＤＮＡ断片の調製
Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）のＺＦ  Ｆｕｎｇａｌ／Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＤＮＡミニプレップキットを使用して、ＲＬ−Ｐ３７に由来するならびにセロビオヒドロラーゼ１遺伝子、セロビオヒドロラーゼ２遺伝子、エンドグルカナーゼ１遺伝子およびエンドグルカナーゼ２遺伝子が欠失している（Δｃｂｈ１、Δｃｂｈ２、Δｅｇｌ１およびΔｅｇｌ２株、「四重欠失株」とも呼ばれる、国際公開第９２／０６１８４号パンフレットおよび国際公開第０５／００１０３６号パンフレットを参照されたい）トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）株からゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したゲノムＤＮＡ  １ｎｇをテンプレートして用い、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ（ＴｒＧＡ）遺伝子（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：１８４８３８９５）およびこの遺伝子の部分５’−ＵＴＲを含むＤＮＡ断片（配列番号５６）を、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ  ＰＣＲキット（東洋紡株式会社、日本）とそれぞれ０．４μＭのフォワードプライマーおよびリバースプライマー：５’−ｇａｃｔｇｔｃｔｃｃａｃｃａｔｇｔａａｔｔｔｔｔｃ−３’（配列番号５７）および５’−ｇｇｃａｇａｃｔａｃａａｇｔｃｔａｃｔａｇｔａｃｔａｃ−３’（配列番号５８）とを使用するＰＣＲにより増幅させた。ＰＣＲ産物をＺｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ＆  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（商標）−５キットで精製して濃縮し、濃縮後のＰＣＲ産物のＤＮＡ濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）で測定した。
【０２２２】
配列番号５６（下記）は基質ＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を示す。ＵＴＲ配列を小文字で示し、ＴｒＧＡ遺伝子を大文字で示す。２つの選択したＶＴドメイン（ＴｒＧＡ＿ｓｇＦ１およびＴｒＧＡ＿ｓｇＲ１）をそれぞれ太字で示して下線を引いた（これらの配列が重複することに留意されたい）。
【化１８】
2017538425.tif 000021
【化１９】
2017538425.tif 000022
【化２０】
2017538425.tif 000023
【化２１】
2017538425.tif 000024
【０２２３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写
ＴｒＧＡ遺伝子中の２つのＶＴドメイン（ＴｒＧＡ＿ｓｇＦ１およびＴｒＧＡ＿ｓｇＲ１）ならびにこれらのＶＴドメインに特有のＰＡＭを、下流活性および形質転換実験のために同定した。ＴｒＧＡ＿ｓｇＦ１（配列番号５９）またはＴｒＧＡ＿ｓｇＲ１（配列番号６０）のいずれかを有する、Ｔ７プロモーター配列および単一ガイドＲＮＡ配列を含むオリゴヌクレオチドを合成し、ＧｅｎｅｒａｙによりｐＭＤ１８Ｔベクターに挿入し、結果としてｐＭＤ１８Ｔ（Ｔ７−Ｓｐｙ−ＴｒＧＡ＿ｓｇＦ１）（図８Ａ）またはｐＭＤ１８Ｔ（Ｔ７−Ｓｐｙ−ＴｒＧＡ＿ｓｇＲ１）（図８Ｂ）をそれぞれ得た。それぞれ０．４μＭのフォワードプライマーおよびリバースプライマー：５’−ｔｇａｔｇａｃｇｇｔｇａａａａｃｃｔｃ−３’（配列番号７１）および５’−ａａａａｇｃａｃｃｇａｃｔｃｇｇ−３’（配列番号７２）を用いるＰＣＲにより、ｐＭＤ１８Ｔ（Ｔ７−Ｓｐｙ−ＴｒＧＡ＿ｓｇＦ１）またはｐＭＤ１８Ｔ（Ｔ７−Ｓｐｙ−ＴｒＧＡ＿ｓｇＲ１）のいずれかから、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写用のＤＮＡ断片を増幅させた。ＰＣＲ産物をＺｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ＆  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（商標）−５キットで精製して濃縮し、濃縮後のＰＣＲ産物のＤＮＡ濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒで測定した。
【０２２４】
上記の特定のＰＣＲ産物をテンプレートとして用い、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．のＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ（商標）Ｔ７転写キットを製造業者の指示に従って使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写により、ＶＴドメインＴｒＧＡ＿ｓｇＦ１またはＴｒＧＡ＿ｓｇＲ１のＲＮＡを生成した。転写されたＲＮＡを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．のＭＥＧＡｃｌｅａｒ（商標）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐキットを使用して精製した。ＲＮＡ濃度をＮａｎｏＤｒｏｐＴＭで測定した。
【０２２５】
ＳｐｙＣａｓ９のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを実施して、合成した単一ガイドＲＮＡの機能を確認した。このアッセイを開始するために、精製したＳｐｙＣａｓ９  １μｇ、基質ＤＮＡ断片２００ｎｇおよび単一ガイドＲＮＡ（またはコントロールとしての水）２００ｎｇを、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．３、１５０ｍＭのＫＣｌ、０．５ｍＭのＤＴＴおよび１０ｍＭのＭｇＣｌ２を含む反応緩衝液１５μｌ中で一緒に混合した。アッセイを２０分にわたり３７℃で実行し、続いてＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ  Ｎｏ．Ｐ６５５６）２μｇを添加した。反応を２０分にわたり４０℃で継続し、２０分にわたる８０℃での更なるインキュベーションにより終了させた。そして、反応結果を、０．８％のアガロースゲル、３０分にわたる１４０Ｖでの泳動を使用して分析し、結果を図９に示す。図９において、レーン１はＤＮＡラダー（分子量を左側に示す）であり、レーン２はコントロールＳｐｙＣａｓ９反応（ガイドＲＮＡなし）であり、レーン３および４はＴｒＧＡ＿ｓｇＲ１の存在下でのＳｐｙＣａｓ９を示し、レーン５および６はＴｒＧＡ＿ｓｇＦ１の存在下でのＳｐｙＣａｓ９を示す。インタクトなＤＮＡ基質（配列番号５６）のサイズは４．９Ｋｂ（レーン２）であるのに対して、いずれかのｓｇＲＮＡの存在下での切断産物のサイズは２．８ｋｂおよび２．１ｋｂである。図９に示すように、特定の単一ガイドＲＮＡの存在下で、ＳｐｙＣａｓ９は基質ＤＮＡ断片を所望のサイズへと成功裏に切断することができ、このことから、合成したＲＮＡの正しい機能が確認される。
【０２２６】
配列番号５９（下記）は、Ｔ７プロモーター、ＣＥＲドメインおよびＶＴドメインＴｒＧＡ＿ｓｇＦ１の転写用のオリゴヌクレオチド配列を示す。ＶＴドメインを大文字で示し、Ｔ７プロモーターおよびＣＥＲドメイン領域をそれぞれ太字および小文字で示す。
【化２２】
2017538425.tif 000025
【０２２７】
配列番号６０（下記）は、Ｔ７プロモーター、ＣＥＲドメインおよびＶＴドメインＴｒＧＡ＿ｓｇＲ１の転写用のオリゴヌクレオチド配列を示す。ＶＴドメインを大文字で示し、Ｔ７プロモーターおよびＣＥＲドメイン領域をそれぞれ太字および小文字で示す。
【化２３】
2017538425.tif 000026
【０２２８】
精製したＳｐｙＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）によるｉｎ  ｖｉｔｒｏニッカーゼ切断アッセイ
このｉｎ  ｖｉｔｒｏニッカーゼ切断アッセイは二段階反応である。第１段階では、精製したＳｐｙＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）１μｇ、基質ＤＮＡ断片２００ｎｇおよび単一ガイドＲＮＡ（またはコントロールとしての水）２００ｎｇを、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．３、１５０ｍＭのＫＣｌ、０．５ｍＭのＤＴＴおよび１０ｍＭのＭｇＣｌ２を含む反応緩衝液１５μｌ中で一緒に混合した。ＳｐｙＣａｓ９ニッカーゼアッセイで説明したように反応を実施した。第１段階の反応の終了後、ＳｐｙＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）１μｇおよび特定の単一ガイドＲＮＡ  ２００ｎｇを添加した。第１段階の反応を繰り返した後、続いて反応結果を０．８％のアガロースゲル、３０分にわたる１４０ボルトでの泳動を使用して分析し、結果を図１０に示す。図１０において、レーン１はＤＮＡラダー（分子量を左側に示す）であり、レーン２はＳｐｙＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）と基質ＤＮＡおよびＴｒＧＡ＿ｓｇＦ１のみとの反応を示し、レーン３はＳｐｙＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）と基質ＤＮＡおよびＴｒＧＡ＿ｓｇＲ１のみとの反応を示し、レーン４はＳｐｙＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）と基質ＤＮＡおよび両方のｓｇＲＮＡとの反応を示す。インタクトなＤＮＡ基質（配列番号５６）のサイズは４．９ｋｂであるのに対して、両方のｓｇＲＮＡによる切断産物のサイズは２．８ｋｂおよび２．１ｋｂであるだろう。図１０に示すように、基質ＤＮＡ断片は両方のＲＮＡの存在下でのみ切断されており（レーン４）、このことは、ＳｐｙＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）が活性ニッカーゼであることを示唆する。
【０２２９】
実施例１３：ｉｎ  ｖｉｖｏニッカーゼ取込み実験
プロトプラストの調製
プロトプラストを調製するために、エンドグルカナーゼ−３遺伝子、エンドグルカナーゼ−４遺伝子、エンドグルカナーゼ−５遺伝子、エンドグルカナーゼ−６遺伝子、マンナナーゼ−１遺伝子およびアルファ−アミラーゼ遺伝子を更に欠失しているが正常なＮＨＥＪメカニズムを有するＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）の四重欠失株（上記で説明した）の５×１０８個の胞子（３０℃で５日にわたりＰＤＡプレート上で増殖させた）を、４つのバッフルを有する２５０ｍｌの振とうフラスコ中で発芽培地（米国特許第８，６７９，８１５号明細書で説明されているレシピ）５０ｍｌ中に播種し、１７０ｒｐｍで１７時間にわたり２７℃でインキュベートした。この液体体積を５０ｍｌのコニカルチューブ中に移して１０分にわたり３０００ｒｐｍで回転させることにより、菌糸体を回収した。上清をデカントし、菌糸体ペレットを１．２ＭのＭｇＳＯ４−１０ｍＭのリン酸Ｎａ緩衝液を使用して２回洗浄し、溶解酵素緩衝液（１．２ＭのＭｇＳＯ４−１０ｍＭのリン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ５．８）を使用してトリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）由来の溶解酵素（Ｓｉｇｍａカタログ＃Ｌ１４１２）を溶解する、５０ｍｇ／ｍｌ）１５ｍｌに再懸濁した。細胞懸濁液を、４つのバッフルを有する２５０ｍｌの振とうフラスコに移し、２００ｒｐｍで少なくとも２時間にわたり室温で振とうした。ガラス漏斗中で折り畳まれたＭｉｒａｃｌｏｔｈ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  Ａｒｔ．Ｎｏ．４７５８５５）に通すろ過によって、プロトプラストをＧｒｅｉｎｅｒチューブに回収した。ろ過したプロトプラストの上に、０．６Ｍのソルビトール−０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を慎重に添加した。４０００ｒｐｍでの１５分にわたる遠心分離によりプロトプラストを集めた。プロトプラストを含む中間相を新しいチューブに移し、１．２Ｍのソルビトール−１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液を少なくとも等体積で添加した。４０００ｒｐｍでの５分にわたる遠心分離によりプロトプラストを集め、１．２Ｍのソルビトール、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を使用して２回洗浄した。ペレットを１．２Ｍのソルビトール−１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５−１０ｍＭのＣａＣｌ２緩衝液  少なくとも１ｍｌに再懸濁し、顕微鏡下でプロトプラストの数を計数した。プロトプラスト懸濁液を、１．２Ｍのソルビトール−１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ−１０ｍＭのＣａＣｌ２  ４部および２５％のＰＥＧ６０００−５０ｍＭのＣａＣｌ２−１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  １部を使用して、将来の形質転換用に１ｍｌ当たり５×１０８個まで希釈した。
【０２３０】
検出カセットの調製
ＴｒＧＡ欠失カセットを構築し、図１１に概略を示す。このＴｒＧＡ欠失カセットは、ｐｙｒ２プロモーター、ｐｙｒ２ＣＤＳおよびｐｙｒ２ターミネーターを含むｐｙｒ２発現カセット、後のループアウト用の５００ｂｐの反復配列を含み、５’および３’のＴｒＧＡ相同領域が隣接していた。
【０２３１】
ＴｒＧＡノックアウト形質転換体を、グルコースを含まず１％の不溶性デンプンを含むフォーゲルの寒天プレート（フォーゲルのデンプン培地）上でスクリーニングすることができる。ＴｒＧＡノックアウト形質転換体は、インタクトなＴｒＧＡ遺伝子を有する株と比較して、この培地上ではほとんど増殖しない。ＴｒＧＡノックアウトカセットのヌクレオチド配列は４２４８塩基対の長さであり、塩基１〜１０００はＴｒＧＡの５’相同領域に対応し、塩基１００１〜２７３０はｐｙｒ２発現カセットに対応し、塩基２７３９〜３２４８は５００ｂｐの反復配列に対応し、塩基３２４９〜４２４８はＴｒＧＡ３’相同領域に対応する。ＴｒＧＡノックアウトカセットのヌクレオチド配列を配列番号６１として示す（下記に示す）。
【化２４】
2017538425.tif 000027
【化２５】
2017538425.tif 000028
【０２３２】
形質転換
Ｓｐｙｃａｓ９ニッカーゼプレミックスおよび欠失カセットを使用してＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）のＴｒＧＡ遺伝子をノックアウトさせるために、ＮＥＢ緩衝液３（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）３μｌ中で保存緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＫＣｌおよび４０％のグリセロール）中のＳｐｙｃａｓ９ニッカーゼタンパク質２５μｇとヌクレアーゼフリー水に溶解させたｓｇＲＮＡ（ＴｒＧＡ＿ｓｇＲ１）２０μｇとを緩やかに混合してプレミックス３０μｌを得て、室温で３０分にわたりインキュベートした。プレミックス３０μｌを欠失カセット２０μｇ（２０μｌ）と共にプロトプラスト２００μＬ（１×１０８個）に添加し、３０分にわたり氷上で維持した。３０分にわたる氷上でのインキュベーション後、プロトプラストを、最少フォーゲルの寒天プレートの最上層として使用する、冷却した溶融ソルビトール／フォーゲル寒天（２％のグルコースを含む最少フォーゲルの寒天中に１．１Ｍのソルビトール）に添加した（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １７Ａ，ｐｇｓ．７９−１４３およびＤａｖｉｓ，Ｒｏｗｌａｎｄ，ＮＥＵＲＯＳＰＯＲＡ，ＣＯＮＴＲＩＢＵＴＩＯＮＳ  ＯＦ  Ａ  ＭＯＤＥＬ  ＯＲＧＡＮＩＳＭ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，（２０００））。このプレートを１週間にわたり３０℃でインキュベートした。詳細な工程は米国特許第８，６７９，８１５号明細書（参照により本明細書に援用される）で説明されている。
【０２３３】
９０個の形質転換体を選択し、下記の３種のコントロールと一緒に１ウェル当たり新鮮なフォーゲル寒天１ｍｌである４つの２４ウェルプレート中に播種した：エンドグルカナーゼ−３、エンドグルカナーゼ−４、エンドグルカナーゼ−５、エンドグルカナーゼ−６、マンナナーゼ−１を更に欠失している四重欠失株（上記で説明したＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株、図１２中の「ｃｅｌｌｕ」）、アルファ−アミラーゼ遺伝子が更に欠失している「ｃｅｌｌｕ」株（ＡＡ欠失、図１２中のΔＡＡ）、およびグルコアミラーゼ遺伝子が更に欠失している「ｃｅｌｌｕ」株（ＧＡ欠失、図１２中のΔＧＡ）。１週間後、形質転換体を、１ウェル当たり新鮮なフォーゲルのデンプン寒天１ｍｌである別の４つの２４ウェルプレート中に移した。１週間後、これらの９０個の株の形態を観測した。フォーゲルのデンプンプレート中において、４７個の形質転換体の増殖は、「ｃｅｌｌｕ」株およびＡＡ欠失を有する「ｃｅｌｌｕ」株（ΔＡＡ）の増殖と比較して遅いが、ＧＡ欠失を有する「ｃｅｌｌｕ」株（ΔＧＡ）の増殖と似ているように見えた（図１２）。フォーゲルのデンプン寒天上では、唯一の炭素源は、炭素源としてグルコースを含む通常のフォーゲルの寒天と比較してデンプンであった。グルコアミラーゼは、デンプンの非還元末端からα−１，４グリコシド結合を連続的に加水分解し、その結果、真菌株により利用され得るグルコースが産生される。グルコアミラーゼが欠失している場合、利用できるグルコースが制限されることから増殖の遅延を観測することができる。
【０２３４】
株の検証
フォーゲルのデンプン寒天中では、９０個の株の内の４７個が増殖の遅延を示した。これらの内の９個（図１２を参照されたい、＃１〜＃９）を無作為に選択し、プライマーとしてＦｗ１（５’−ｃａｃｔａｃｔａｃａｔｃｃａｔａｃｇｃａｇｃａａａｃａｔｇｇ−３’（配列番号６２））およびＲ３（５’−ｇｇｔｃａａｇａａｇｃａｃａｔｇｃｃａｇａｇｔｔｃｇ−３’（配列番号６３））を使用するＰＣＲスクリーニングを実施した。図１３Ａは、野生型株およびＴｒＧＡ欠失株のゲノム遺伝子座とプライマーアニーリング部位（矢印は、ＰＣＲ反応で使用した場合の重合の方向を示す）とを示す。
【０２３５】
これら９個の株を、プライマー対ＦＷ１およびＲ３によるＰＣＲでプレススクリーニングした。ＰＣＲ産物を増幅させるためのＰＣＲ条件は下記の通りであった：工程１：５分にわたり９５℃、工程２：３０秒にわたり９５℃、工程３：３０秒にわたり６０℃、工程４：３分にわたり６８℃、工程２、３および４を更に２９サイクル繰り返した、工程５：１０分にわたり６８℃。理想的な条件では、このＰＣＲプレスクリーニングから２種のＰＣＲ断片（１．９ｋｂおよび５．２ｋｂ）が予想されるだろう。この結果では、５．２ｋｂの産物を明瞭に観察することができなかった。しかしながら、セルライタ（ｃｅｌｌｕｌｉｇｈｔｅｒ）の胞子由来の５．１ｋｂの産物（Ｃ１）ならびにセルライタおよびＴｒＧＡ欠失カセットの胞子由来のＰＣＲ産物（Ｃ２）と比較した１．９ｋｂの断片から、ＴｒＧＡ欠失カセットが相同組換えによりＴｒＧＡ遺伝子座で組み込まれていることを確実に確認することができた（図１３Ｂ、上部のゲル）。
【０２３６】
９個の株の内の２個（＃１および＃３）を選択して、それぞれプライマー対ＦＷ１／Ｒ１、Ｆ４／Ｒ３およびＫＯＦ１／ＫＯＲ２による更なるＰＣＲ確認を行った。Ｃ２（セルライタおよびＴｒＧＡ欠失カセットの胞子）からの結果と比較して＃１および＃３の胞子から２．０ｋｂおよび２．２ｋｂの断片を得た場合に、相同組換えによりＴｒＧＡ遺伝子座で組み込まれたＴｒＧＡ欠失カセットをプライマー対ＦＷ１／Ｒ１およびＦ４／Ｒ３によるＰＣＲで更に確認した（図１３Ｂ、左下のゲル）。＃１および＃３の胞子からＰＣＲ産物が得られなかったが２．１ｋｂの産物がセルライタから増幅された（Ｃ１）場合に、別のプライマー対ＫＯＦ１およびＦＯＲ２によるＰＣＲでもこの結果を確認した（図１３Ｂ、右下のゲル、最初の４レーン、分子量マーカーを含む）。
【０２３７】
プライマーＴｒＧＡＦ２（５’ｇａｃｔｇｔｃｔｃｃａｃｃａｔｇｔａａｔｔｔｔｔｃ３’（配列番号６４））およびＲ３（配列番号６３）を使用することにより、ＴｒＧＡ遺伝子座の全領域に関して＃１および＃３の胞子からＰＣＲ産物を得て、これらのＤＮＡ配列を決定した。シークエンシングの結果から、ＴｒｇＧＡ遺伝子がｐｙｒ２発現カセットに置き換えられていたことが分かった（図１３Ｂ、右下のゲル、最後の２レーンのＰＣＲ結果を参照されたい、シークエンシング結果に関するデータは示さない）。
【０２３８】
上記の結果から、ＳｐｙＣａ９ニッカーゼおよびｓｇＲＮＡが糸状真菌中で相同組換えを促進することができ、糸状真菌Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）対する相同組換えをベースとする遺伝子欠失が可能になったことが実証される。具体的には、９０個の形質転換体の内の４７個（約５２％）がフォーゲルのデンプンプレート上で遅延性の増殖表現型を示しており、このことは、ＴｒＧＡ遺伝子が破壊されていることを示す。意図された相同組換え事象をＰＣＲ産物のシークエンシングにより検証し、相同組換えにより欠失カセットが宿主細胞中においてＴｒＧＡ遺伝子座中に成功裏に組み込まれ、その結果、ＴｒＧＡ遺伝子がｐｙｒ２発現カセットに置き換えられることを確認した。本発明者らのデータから、ドナーＤＮＡ（即ち、目的のゲノム遺伝子座で相同組み換えされるＤＮＡ）に加えて、機能的ＳｐｙＣａｓ９ニッカーゼ複合体を標的真菌細胞に直接導入することにより、真菌での相同組換え率を有意に増加させることができることが実証される。
【０２３９】
第Ｃ節：単一発現ベクターによるＣａｓ／ガイドＲＮＡおよびドナーＤＮＡの導入
実施例１４：遺伝子編集用の特異的相同ドナー断片（ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｄｏｎｏｒ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）を含むｃａｓ９発現プラスミドの使用によるｇｌａ１遺伝子からの単一塩基の欠失
この実施例では、単一塩基欠失を含む相同ｇｌａ１ドナー断片をプラスミドｐＴｒｅｘ２ｇＨｙｇ  ＭｏＣａｓ  ｇＴｒＧＡ  ＴＳ１１Ｂ（実施例８で説明した）に組み込むことにより、遺伝子破壊を誘導した。約１ｋｂの合成ＤＮＡ断片Ｇｌａ１ｒｅｐ（配列番号３９、図１４中において「Ｔｒ−Ｇｌａ  １ｋｂ相同断片」と標識した）をプラスミドｐＴｒｅｘ２ｇＨｙｇＭｏＣａｓｇＴｒＧＡＴＳ１１Ｂの唯一のＥｃｏＲＶ制限部位に挿入することにより、プラスミドｐＴｒｅｘＭｏＣａｓＧＡＴＳ１１−ＨＤＲ（図１４）を生成した。ＥｃｏＲＶ部位は、ｐＳＬ１１８０配列とハイグロマイシン耐性マーカー（ｈｐｈ）のＮ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）ｃｐｃ１プロモーターとの間のポリリンカー配列中に存在する。プライマー１５５６Ｆ（５’−ＡＴＧＣＧＣＡＡＡＴＴＴＡＡＡＧＣＧＣＴＧＡＴｇｔｇｔｇｔｃｔａａｔｇｃｃｔｃｃａｃｃａｃ［配列番号７３］）および１５５７Ｒ（５’−ＡＴＡＴＧＧＡＴＣＴＧＣＧＣＧＣＧＡＴＣＧＡＴｇａｔｃｇｔｇｃｔａｇｃｇｃｔｇｃｔｇｔｔｇ［配列番号７４］）を使用して、Ｇｌａ１ｒｅｐと、ｐＴｒｅｘ２ｇＨｙｇＭｏＣａｓｇＴｒＧＡＴＳ１１Ｂ中のＥｃｏＲＶ部位の両側と重複するための加数相同テイル（ａｄｄｅｎｄ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｔａｉｌ）とを増幅させ、ＥｃｏｒＶ切断ｐＴｒｅｘ２ｇＨｙｇＭｏＣａｓｇＴｒＧＡＴＳ１１Ｂプラスミドを有する断片のＧｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（ＮＥＢ  Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡを使用する）を容易にした。
【０２４０】
ｐＴｒｅｘＭｏＣａｓＧＡＴＳ１１−ＨＤＲプラスミドを使用し、プロトプラストとＰＥＧ媒介型のＤＡＮ取込みとを使用して、正常なＮＨＥＪメカニズムを有する株であるＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株ＲＬ−Ｐ３７を形質転換した。この株は、この実験にとっては偶然にもｐｙｒ２に対して栄養要求性であったが、全ての増殖培地にウリジン（２ｇ／Ｌ）を含める必要があった。
【０２４１】
形質転換体を、フォーゲルの最少培地＋１．２Ｍのソルビトール＋７５ｐｐｍのハイグロマイシンの選択培地寒天プレート上で最初に増殖させた。増殖後、安定表現型および不安定表現型の両方の８０個の形質転換体を、フォーゲルのデンプン培地の２番目の寒天プレートに移した。２番目のプレート上での増殖後、デンプンクリアリングゾーン（ｓｔａｒｃｈ  ｃｌｅａｒｉｎｇ  ｚｏｎｅ）の存在または非存在をレポーターとして使用して、ｇｌａ１遺伝子が破壊されたかどうかを確認した。形質転換体を、２番目のプレートからフォーゲルの最少培地の３番目の非選択プレート上に移した。数日の増殖後、形質転換体を、フォーゲルの最少培地の３番目のプレートからフォーゲルの最少培地＋７５ｐｐｍのハイグロマイシンＢの４番目の選択プレートに移した。この４番目のプレート上で、増殖に関して形質転換体を利用して、形質転換体が２番目および３番目のプレートの非選択培地上での増殖後にハイグロマイシン含有培地上で増殖する能力を維持しているかどうかを確認することができた。
【０２４２】
８０個の形質転換体の内の１１個のみがフォーゲルのデンプン培地上にクリアリングゾーンを作り（このことはｇｌａ１の破壊を示す）、フォーゲルの最少培地＋７５ｐｐｍのハイグロマイシンの４番目のハイグロマイシン選択プレート上で増殖しないことが判明した。これらの形質転換体はｇｌａ１遺伝子の変化をおそらく有しており、これらの形質転換体では、これらの形質転換体のゲノムにプラスミド由来のハイグロマイシンマーカーが組み込まれなかった。
【０２４３】
３番目のフォーゲルの最少培地プレートの菌糸体より、これら１１個のｇｌａ１−形質転換体からゲノムＤＮＡを単離した。プライマーｇｌａＫ（配列番号３１）およびｇｌａＨ（配列番号２９）を使用してゲノムＤＮＡからｇｌａ１遺伝子をＰＣＲ増幅させ、ＴＳ１１遺伝子座の状態を確認した。ＰＣＲ産物を単離し、プライマー１５３８Ｆ  ５’−ＣＣＡＣＣＡＣＡＧＧＡＡＣＣＡＡＡＣＣ（配列番号７５）、１５３９Ｒ  ５’−ＣＴＧＣＧＡＣＧＧＡＧＧＧＡＡＴＧＡＣＧ（配列番号７６）、１５４０Ｆ  ５’−ＧＧＧＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＡＡＧＧＡＴＧＴ（配列番号７７）および１５４１Ｒ  ５’−ＧＣＣＧＴＣＡＣＧＣＣＡＧＧＡＡＣＡＡＧ（配列番号７８）を使用してシークエンシングした。
【０２４４】
シークエンシングの結果から、これら１１個のｇｌａ１−形質転換体の内の８個がＧｌａ１ｒｅｐ配列の単一塩基欠失を含むことが明らかになった。２個のｇｌａ１−形質転換体が、ＴＳ１１遺伝子座で９個および１００個の塩基のｇｌａ１欠失を含んでいた。１個のｇｌａ１−形質転換体がＴＳ１１で４７０個の塩基の挿入を含んでいた。
【０２４５】
ドナーＧｌａ１ｒｅｐ断片のプラスミドｐＴｒｅｘ２ｇＨｙｇ  ＭｏＣａｓ  ＴｒＧＡ  ＴＳ１１への組込みにより、遺伝子編集を誘導する単一プラスミドを生成した。高頻度のハイグロマイシン−不安定な形質転換体は、ドナーＧｌａ１ｒｅｐ断片へと操作されているｇｌａ１遺伝子中での単一塩基欠失を含んでいた。不安定な形質転換体を１番目の選択寒天培地（フォーゲルの最少培地＋７５ｐｐｍのハイグロマイシンＢ）上で生成し、この不安定な形質転換体はその後、形質転換Ｃａｓ９プラスミドを失った。そのような株はより有利であり、なぜならば、この株は、ゲノムへの遺伝子編集プラスミドのＮＨＥＪ組込みという不都合なことを有しないからである。
【０２４６】
本明細書でデータを示さない別の実験では、ｐＴｒｅｘ２ｇＨｙｇ  ＭｏＣａｓ  ｇＴｒＧＡ  ＴＳ１１Ｂにおいて挿入されている欠失の代わりに置換ヌクレオチドを含むｇｌａ１相同ＤＮＡ断片で、本明細書で説明したのと同じ相同組込み方法を使用してｇｌａ１の置換変異をＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株Ｐ３７に成功裏に導入した。
【０２４７】
これらの結果から、ｃａｓ９および標的部位ガイドＲＮＡと一緒に相同断片が組み込まれている単一のｃａｓ９編集プラスミドを作製する有効性が実証される。標的とする遺伝子座で特定のｃａｓ９が標的とする切断および遺伝子を編集する相同組換えの両方を誘導する単一プラスミドベクターを作製する。不安定なハイグロマイシン耐性形質転換体をスクリーニングすることにより、標的遺伝子座へのプラスミドＤＮＡのＮＨＥＪ挿入の発生が最小限に抑えられる。加えて、この実施例で不安定なハイグロマイシン耐性形質転換体をスクリーニングすることにより、相同組換えにより標的遺伝子座に相同ドナー断片が組み込まれている形質転換体を発見することができる。更に、そのような形質転換体は、標的とする組換えを誘導したプラスミドを都合よく欠失している。
【０２４８】
上述の組成物および方法は、理解を明確にするために例示および実施例により若干詳細に説明されているが、本明細書の教示を考慮して、添付した特許請求の範囲の趣旨および範囲から逸脱することなく上述の組成物および方法に対してある程度の変更および改変を行うことができることは当業者に容易に明らかである。
【０２４９】
従って、上述は本組成物および本方法の原理を単に例示しているにすぎない。本明細書で明確に説明されていないまたは示されていないが本組成物および本方法の原理を具体化するならびに本組成物および本方法の趣旨および範囲に含まれる様々な構成を当業者は考案することができることが認識されるだろう。更に、本明細書で列挙した全ての例および条件付き文言は、本組成物および本方法の原理ならびに当分野の促進に寄与する本発明者らによる概念の理解で読者を助けることが主に意図されており、そのように具体的に列挙された例および条件に限定されないと解釈すべきである。更に、本明細書において本組成物および本方法の原理、態様および実施形態を列挙する全ての記載ならびにこの具体例は、この構造および機能の両方の等価物を包含することが意図される。加えて、そのような等価物が、現在知られている等価物と将来創出される等価物（即ち、構造にかかわらず同じ機能を発揮する、創出されるあらゆる要素）との両方を含むことが意図される。従って、本発明および本組成物の範囲は、本明細書で示されたおよび説明された典型的な実施形態に限定されることが意図されていない。
【０２５０】
配列：
配列番号１
推定されるＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）Ｕ６遺伝子
【化２６】
2017538425.tif 000029
配列番号２
ｓｇＲＮＡの配列（Ｎは標的部位に相補的な配列である）
【化２７】
2017538425.tif 000030
配列番号３
ｓｇＲＮＡ：ｇＡｄ３Ａ  ＴＳ１
【化２８】
2017538425.tif 000031
配列番号４
ｓｇＲＮＡ：ｇＴｒＧＡ  ＴＳ２
【化２９】
2017538425.tif 000032
配列番号５
ｓｇＲＮＡ：ｇＴｒＧＡ  ＴＳ１１
【化３０】
2017538425.tif 000033
配列番号６
ｓｇＲＮＡ：ｇＰｙｒ２  ＴＳ６
【化３１】
2017538425.tif 000034
配列番号７
コドン最適化ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９コーディング遺伝子、Ｎ末端ＮＬＳ配列およびＣ末端ＮＬＳ配列あり
【化３２】
2017538425.tif 000035
【化３３】
2017538425.tif 000036
配列番号８
配列番号７によりコードされるストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９、Ｎ末端ＮＬＳ配列およびＣ末端ＮＬＳ配列あり
【化３４】
2017538425.tif 000037
配列番号９
合成ＤＮＡ：ｇＡｄ３Ａ  ＴＳ１−１（サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ｓｎｒ５２プロモーターとＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ｓｕｐ４ターミネーターとを有するｇＡｄ３Ａ  ＴＳ１  ｓｇＲＮＡ（配列番号３））
【化３５】
2017538425.tif 000038
配列番号１０
合成ＤＮＡ：ｇＡｄ３Ａ  ＴＳ１−２（Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）Ｕ６のプロモーターおよびターミネーターを有するｇＡｄ３Ａ  ＴＳ１  ｓｇＲＮＡ（配列番号３））
【化３６】
2017538425.tif 000039
配列番号１１
合成ＤＮＡ：ｇＡｄ３Ａ  ＴＳ１−３（Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）Ｕ６のプロモーター、ターミネーターおよびイントロンを有するｇＡｄ３Ａ  ＴＳ１  ｓｇＲＮＡ（配列番号３））
【化３７】
2017538425.tif 000040
配列番号１２
短いＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）Ｕ６プロモーター領域を有するガイドＲＮＡ発現カセットを合成ＤＮＡとして得た。ここで、ＴＳ１１でＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｇｌａ１遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡ用の配列を含む一例を示す。
【化３８】
2017538425.tif 000041
配列番号１３
プライマー：ｇＲＮＡフォワードａｆｌＩＩ
ｃｇｔｃａｇｃｔｔａａｇＡＡＴＴＣＣＴＡＡＡＧＡＡＡＣＡＧＣＡＴＧＡＡＡＴＧＧ
配列番号１４
プライマー：ｇＲＮＡリバースｓｆｉＩ
ｃｇｔｃａｇｇｇｃｃａｃｇｔｇｇｇｃｃＡＡＧＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧ
配列番号１５
プライマー：Ａｄ３  ５’フォワード
ｔｇａａｃａｃａｇｃｃａｃｃｇａｃａｔｃａｇｃ
配列番号１６
プライマー：Ａｄ３  ５’リバース
ｇｃｔｇｇｔｇａｇｇｇｔｔｔｇｔｇｃｔａｔｔｇ
配列番号１７
プライマー：Ａｄ３ａ  ５００５リバース
ｇａｔｔｇｃｔｔｇｇｇａｇｇａｇｇａｃａｔ
配列番号１８
プライマー：Ａｄ３  ３’フォワード
ｃｇａｇｇｃｃａｃｔｇａｔｇａａｇｔｔｇｔｔｃ
配列番号１９
プライマー：Ａｄ３  ３’リバース
Ｃａｇｔｔｔｔｃｃａａｇｇｃｔｇｃｃａａｃｇｃ
配列番号２０
プライマー：Ａｄ３ａ  ５００３フォワード
ｃｔｇａｔｃｔｔｇｃａｃｃｃｔｇｇａａａｔｃ
配列番号２１
Ａｄ３  ｍｉｄリバース
ｃｔｃｔｃｔａｔｃａｔｔｔｇｃｃａｃｃｃｔｃｃ
配列番号２２
プライマー：Ａｄｆｒａｇフォワード
ｃｔｃｃａｔｔｃａｃｃｃｔｃａａｔｔｃｔｃｃ
配列番号２３
プライマー：Ａｄｆｒａｇリバース
ｇｔｔｃｃｃｔｔｇｇｃｇｇｔｇｃｔｔｇｇａｔｃ
配列番号２４
プライマー：Ａｄ３ａ  ２ｋフォワード
ｃａａｔａｇｃａｃａａａｃｃｃｔｃａｃｃａｇｃ
配列番号２５
Ａｄ３ａ  ２ｋリバース
ｇａａｃａａｃｔｔｃａｔｃａｇｔｇｇｃｃｔｃｇ
配列番号２６
プライマー：ｇｌａＡ
ｃｃｇｔｔａｇｔｔｇａａｇａｔｃｃｔｔｇｃｃｇ
配列番号２７
プライマー：ｇｌａＢ
ｇｔｃｇａｇｇａｔｔｔｇｃｔｔｃａｔａｃｃｔｃ
配列番号２８
プライマー：ｇｌａＤ
ｇａｇａｇａｃｇｃａｇｇａｔｇａｃｔｃａａａｇ
配列番号２９
プライマー：ｇｌａＨ
ｔｇｃｃｇｔｇｇｇｔｃａｔｔｇｇｃａｔａｔｔｃ
配列番号３０
プライマー：ｇｌａＪ
ｔｇｃｃｇａｃｔｔｔｇｔｃｃａｇｔｇａｔｔｃｇ
配列番号３１
プライマー：ｇｌａＫ
ｔｔａｃａｔｇｔｇｇａｃｇｃｇａｇａｔａｇｃｇ
配列番号３２
プライマー：ｇｌａ１ｒｅｐＦ
ｇｔｇｔｇｔｃｔａａｔｇｃｃｔｃｃａｃｃａｃ
配列番号３３
プライマー：ｇｌａ１ｒｅｐＲ
ｇａｔｃｇｔｇｃｔａｇｃｇｃｔｇｃｔｇｔｔｇ
配列番号３４
プライマー：１５５３Ｒ
ＣＣＧＴＧＡＴＧＧＡＧＣＣＣＧＴＣＴＴＣＴ
配列番号３５
プライマー：１５５５Ｆ
ＣＧＣＧＧＴＧＡＧＴＴＣＡＧＧＣＴＴＴＴＴＣ
配列番号３６
プライマー：ｐｙｒ２Ｆ
ｇｔａｔａａｇａｇｃａｇｇａｇｇａｇｇｇａｇ
配列番号３７
プライマー：ｐｙｒ２Ｒ
ｇａａｃｇｃｃｔｃａａｔｃａｇｔｃａｇｔｃｇ
配列番号３８
トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）テロメア配列間の細菌カナマイシン耐性遺伝子（プロモーターおよびターミネーターを有する）
【化３９】
2017538425.tif 000042
配列番号３９
合成ＤＮＡ：Ｇｌａ１ｒｅｐ
【化４０】
2017538425.tif 000043
配列番号４０
完全なＵ６遺伝子プロモーター配列（転写開始部位を含まない）
【化４１】
2017538425.tif 000044
配列番号４１
トランケートされた／短いＵ６遺伝子プロモーター配列（転写開始部位を含まない）
【化４２】
2017538425.tif 000045
配列番号４２
Ｕ６遺伝子のイントロン
【化４３】
2017538425.tif 000046
配列番号４３
Ｕ６遺伝子の転写ターミネーター配列
ＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＣＴＴ
配列番号４４
糸状真菌細胞コドン最適化ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９コーディング遺伝子、ＮＬＳなし
【化４４】
2017538425.tif 000047
【化４５】
2017538425.tif 000048
【化４６】
2017538425.tif 000049
配列番号４５
配列番号４４によりコードされるストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９、ＮＬＳなし
【化４７】
2017538425.tif 000050
配列番号４６
ＳＶ４０  ＮＬＳ
ＰＫＫＫＲＫＶ
配列番号４７
Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｂｌｒ２（青色光制御因子２）遺伝子のＮＬＳ
ＫＫＫＫＬＫＬ
配列番号４８
ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＬＭＤ−９  Ｃａｓ９
【化４８】
2017538425.tif 000051
配列番号４９
ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）ＵＡ１５９  Ｃａｓ９
【化４９】
2017538425.tif 000052
配列番号５０
カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）Ｃａｓ９
【化５０】
2017538425.tif 000053
配列番号５１
ナイセリア・メニンジティデス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）Ｃａｓ９
【化５１】
2017538425.tif 000054
配列番号５２
フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）亜種ノビシダ（ｎｏｖｉｃｉｄａ）Ｃａｓ９
【化５２】
2017538425.tif 000055
配列番号５３
パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）Ｃａｓ９
【化５３】
2017538425.tif 000056
配列番号５４
プラスミドｐＥＴ３０ａ−Ｃａｓ９−Ｄ１０Ａニッカーゼ中における合成Ｃａｓ９−Ｄ１０Ａニッカーゼ遺伝子のヌクレオチド配列。Ｎ末端Ｈｉｓ６タグをコードするオリゴヌクレオチドを下線およびイタリック体で示し、ＳＶ４０核局在化シグナルをコードするオリゴヌクレオチドをイタリック体および灰色ハイライトで示し、ＢＬＲ核局在化シグナルをコードするオリゴヌクレオチドを下線および灰色ハイライトで示す。
【化５４】
2017538425.tif 000057
【化５５】
2017538425.tif 000058
【化５６】
2017538425.tif 000059
配列番号５５
プラスミドｐＥＴ３０ａ−Ｃａｓ９−Ｄ１０Ａニッカーゼ（配列番号５４によりコードされる）から発現されるＣａｓ９−Ｄ１０Ａニッカーゼタンパク質のアミノ酸配列。Ｎ末端Ｈｉｓ６タグを下線およびイタリック体で示し、変異アミノ酸は太字および下線であり（Ｄ１０Ａ）、ＳＶ４０核局在化シグナルをイタリック体および灰色で示し、ＢＬＲ核局在化シグナルを下線および灰色で示す。
【化５７】
2017538425.tif 000060
配列番号５６
基質ＤＮＡ断片のヌクレオチド配列。ＵＴＲ配列を小文字で示し、ＴｒＧＡ遺伝子を大文字で示した。２つの選択したＶＴドメイン（ＴｒＧＡ＿ｓｇＦ１およびＴｒＧＡ＿ｓｇＲ１）をそれぞれ太字で示して下線を引いた。
【化５８】
2017538425.tif 000061
【化５９】
2017538425.tif 000062
【化６０】
2017538425.tif 000063
配列番号５７
配列番号５６用のフォワードプライマー：
５’−ｇａｃｔｇｔｃｔｃｃａｃｃａｔｇｔａａｔｔｔｔｔｃ−３’
配列番号５８
ＴｒＧＡプライマーＫＯＲ２、配列番号５６用のリバースプライマー：
５’−ｇｇｃａｇａｃｔａｃａａｇｔｃｔａｃｔａｇｔａｃｔａｃ−３’
配列番号５９
Ｔ７プロモーター、ＣＥＲドメインおよびＶＴドメインＴｒＧＡ＿ｓｇＦ１の転写用のオリゴヌクレオチド配列。ＶＴドメインを大文字で示し、Ｔ７プロモーターおよびＣＥＲドメイン領域をそれぞれ太字および小文字で示す。
【化６１】
2017538425.tif 000064
配列番号６０
Ｔ７プロモーター、ＣＥＲドメインおよびＶＴドメインＴｒＧＡ＿ｓｇＲ１の転写用のオリゴヌクレオチド配列。ＶＴドメインを大文字で示し、Ｔ７プロモーターおよびＣＥＲドメイン領域をそれぞれ太字および小文字で示す。
【化６２】
2017538425.tif 000065
配列番号６１
ＴｒＧＡノックアウトカセットのヌクレオチド配列：
【化６３】
2017538425.tif 000066
【化６４】
2017538425.tif 000067
配列番号６２
Ｆｗ１（５’−ｃａｃｔａｃｔａｃａｔｃｃａｔａｃｇｃａｇｃａａａｃａｔｇｇ−３’）および
配列番号６３
Ｒ３（５’−ｇｇｔｃａａｇａａｇｃａｃａｔｇｃｃａｇａｇｔｔｃｇ−３’）
配列番号６４
ＴｒＧＡＦ２（５’ｇａｃｔｇｔｃｔｃｃａｃｃａｔｇｔａａｔｔｔｔｔｃ３’）
配列番号６５
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化Ｃａｓ９−Ｄ１０Ａニッカーゼ遺伝子（停止コドンなし）
【化６５】
2017538425.tif 000068
【化６６】
2017538425.tif 000069
配列番号６６
ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９−Ｄ１０Ａニッカーゼのアミノ酸配列、配列番号６５によりコードされる
【化６７】
2017538425.tif 000070
配列番号６７
Ｎ末端Ｈｉｓ６タグ／トロンビン／Ｓ・Ｔａｇ（商標）／エンテロキナーゼ領域のアミノ酸配列（開始メチオニンあり）
ｍｈｈｈｈｈｈｓｓｇｌｖｐｒｇｓｇｍｋｅｔａａａｋｆｅｒｑｈｍｄｓｐｄｌｇｔｄｄｄｄｋａｍａ
配列番号６８
Ｎ末端Ｈｉｓ６タグ／トロンビン／Ｓ・Ｔａｇ（商標）／エンテロキナーゼ領域のポリヌクレオチド配列（開始コドンあり）、配列番号６７をコードする
【化６８】
2017538425.tif 000071
配列番号６９
ＳＶ４０  ＮＬＳコーディング配列（配列番号４６をコードする）
ｃｃａａａａａａｇａａａｃｇｃａａｇｇｔｔ
配列番号７０
ＢＬＲ核局在化シグナルコーディング配列（配列番号４７をコードする）
Ａａｇａａｇａａａａａａｃｔｇａａａｃｔｇ
配列番号７１
ｔｇａｔｇａｃｇｇｔｇａａａａｃｃｔｃ
配列番号７２
ａａａａｇｃａｃｃｇａｃｔｃｇｇ
配列番号７３
Ｇｌａ１ｒｅｐプライマー１５５６Ｆ
ＡＴＧＣＧＣＡＡＡＴＴＴＡＡＡＧＣＧＣＴＧＡＴｇｔｇｔｇｔｃｔａａｔｇｃｃｔｃｃａｃｃａｃ
配列番号７４
Ｇｌａ１ｒｅｐプライマー１５５７Ｒ
ＡＴＡＴＧＧＡＴＣＴＧＣＧＣＧＣＧＡＴＣＧＡＴｇａｔｃｇｔｇｃｔａｇｃｇｃｔｇｃｔｇｔｔｇ
配列番号７５
シークエンシングプライマー１５３８Ｆ
ＣＣＡＣＣＡＣＡＧＧＡＡＣＣＡＡＡＣＣ
配列番号７６
シークエンシングプライマー１５３９Ｒ
ＣＴＧＣＧＡＣＧＧＡＧＧＧＡＡＴＧＡＣＧ
配列番号７７
シークエンシングプライマー１５４０Ｆ
ＧＧＧＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＡＡＧＧＡＴＧＴ
配列番号７８
シークエンシングプライマー１５４１Ｒ
ＧＣＣＧＴＣＡＣＧＣＣＡＧＧＡＡＣＡＡＧ
配列番号７９
ＴｒＧＡプライマーＫＯＦ１
ｇａａｃａａｔｃｔｔｃｔｔｔｇｃａａｔｇｔｔｇｇｔｃ
配列番号８０
Ｐｙｒ２プライマーＲ１
ｇａｇｇａａｇｔｃｃｔｇｃｔｔｇｔａｇｇｃａｇｇｃ
配列番号８１
Ｐｙｒ２プライマーＦ４
ｃｇａｃａｇａｇｃａｇｔｃａｔａｔｇｇｇｇａｔａｃｇ
【図１】
2017538425.tif 000072
【図２】
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【図３】
2017538425.tif 000074
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2017538425.tif 000078
【図８Ａ−８Ｂ】
2017538425.tif 000079
【図９】
2017538425.tif 000080
【図１０】
2017538425.tif 000081
【図１１】
2017538425.tif 000082
【図１２】
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【図１３Ａ】
2017538425.tif 000084
【図１３Ｂ】
2017538425.tif 000085
【図１４】
2017538425.tif 000086
【配列表】
2017538425000001.app
【国際調査報告】
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2017538425.tif 000088
2017538425.tif 000089
2017538425.tif 000090