(57)【要約】  Ｐｔ（ＩＶ）化合物はミトコンドリア標的化部分を含む。ミトコンドリア標的化部分を有するＰｔ（ＩＶ）化合物の一例は、Ｐｔ（ＩＶ）シスプラチンベースの化合物である。還元されると、ミトコンドリア標的化部分が放出され、Ｐｔ（ＩＩ）治療剤が生じる。ミトコンドリア標的化部分を含むＰｔ（ＩＶ）化合物は、ナノ粒子に含まれ得る。これらの化合物またはナノ粒子は、例えば、癌を処置するために使用することができる。
2017516755.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｐｔ（ＩＶ）プロドラッグにコンジュゲートした１つまたは複数のミトコンドリア標的化部分を含む化合物であって、前記Ｐｔ（ＩＶ）プロドラッグがＰｔ（ＩＩ）に還元されると、前記１つまたは複数のミトコンドリア標的化部分が放出され、およびＰｔ（ＩＩ）治療剤がもたらされる、化合物。
【請求項２】
前記Ｐｔ（ＩＶ）プロドラッグが２つのミトコンドリア標的化部分を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
式Ｉ：
【化１】
2017516755.tif 000025
（式中、
Ｑ1、Ｑ2、Ｑ3、およびＱ4はそれぞれ独立して、中性または負に荷電した配位子を表し、ただし、Ｑ1、Ｑ2、Ｑ3、およびＱ4の最大で２つが負に荷電した配位子を表すことができ、Ｑ1、Ｑ2、Ｑ3、およびＱ4の２つ以上が任意選択的に結合して、１つまたは複数の５員または６員白金環式環を形成し；
Ｒ1は、−（Ｌ1）m−（Ｒ3）nであり；
Ｒ2は、ＯＨまたは−（Ｌ2）x−（Ｒ4）yであり；
Ｒ3は、ミトコンドリア標的化部分であり；
Ｒ4は、コンジュゲートしたシクロオキシゲナーゼ阻害剤、標的化部分、フルオロフォア、解糖系阻害剤、またはミトコンドリア作用治療剤であり、Ｒ4がミトコンドリア標的化部分である場合、Ｒ3およびＲ4は同じであるかまたは異なっており；
Ｌ1は、リンカーであり；
Ｌ2は、リンカーであり、Ｌ1およびＬ2は、両方とも存在する場合、同じであるかまたは異なっており；
ｍおよびｘは独立して、ゼロまたは１であり；かつ
ｎおよびｙは独立して、１以上の整数である）
の化合物。
【請求項４】
ｍ＝０の場合、ｎ＝１であり、およびｘ＝０の場合、ｙ＝１である、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
Ｑ1、Ｑ2、Ｑ3、およびＱ4のうちの１つまたは２つが負に荷電した配位子である、請求項３または４に記載の化合物。
【請求項６】
Ｑ1、Ｑ2、Ｑ3、およびＱ4のうちの２つが負に荷電した配位子である、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
負に荷電した配位子であるＱ1、Ｑ2、Ｑ3、およびＱ4のそれぞれが、ハロゲン化物、アルコキシド、アリールオキシド、カルボキシレート、およびスルフェートからなる群から選択される、請求項５または６に記載の化合物。
【請求項８】
負に荷電した配位子であるＱ1、Ｑ2、Ｑ3、およびＱ4のそれぞれが、ハロゲン化物である、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
負に荷電した配位子であるＱ1、Ｑ2、Ｑ3、およびＱ4のそれぞれが、塩化物である、請求項７に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｑ1、Ｑ2、Ｑ3、およびＱ4のうちの１つまたは２つが中性配位子である、請求項３〜９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１】
中性配位子であるＱ1、Ｑ2、Ｑ3、およびＱ4のそれぞれが独立して、Ｒ3Ｎ（式中、各Ｒは個々にＨまたは有機基を表し、２つ以上のＲ基は任意選択的に結合して、１つまたは複数の環を形成することができる）；および窒素含有ヘテロ芳香族からなる群から選択される、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
中性配位子であるＱ1、Ｑ2、Ｑ3、およびＱ4のそれぞれが独立して、Ｒ3Ｎである、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
中性配位子であるＱ1、Ｑ2、Ｑ3、およびＱ4のそれぞれが、ＮＨ3である、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｒ4が、ミトコンドリア標的化部分である、請求項３〜１３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１５】
式ＩＶ：
【化２】
2017516755.tif 000026
（式中、
Ｒ1は、−（Ｌ1）m−（Ｒ3）nであり；
Ｒ2は、ＯＨまたは−（Ｌ2）x−（Ｒ4）yであり；
Ｒ3は、ミトコンドリア標的化部分であり；
Ｒ4は、コンジュゲートしたシクロオキシゲナーゼ阻害剤、標的化部分、フルオロフォア、解糖系阻害剤、またはミトコンドリア作用治療剤であり、Ｒ4がミトコンドリア標的化部分である場合、Ｒ3およびＲ4は同じであるかまたは異なっており；
Ｌ1は、リンカーであり；
Ｌ2は、リンカーであり、Ｌ1およびＬ2は、両方とも存在する場合、同じであるかまたは異なっており；
ｍおよびｘは独立して、ゼロまたは１であり；
ｎおよびｙは独立して、１以上の整数であり；
各Ｙは独立して、負に荷電した配位子を表し、両方のＹ配位子は任意選択的に結合して、５員または６員白金環式環を形成し；かつ
各Ｌは独立して、中性配位子を表し、両方のＬ配位子は任意選択的に結合して、５員または６員白金環式環を形成する）
の化合物。
【請求項１６】
式Ｖ、ＶＩ、またはＶＩＩ：
【化３】
2017516755.tif 000027
の化合物であって、Ｒ1およびＲ2の一方または両方が、ミトコントリア標的化部分を含む、化合物。
【請求項１７】
前記化合物が、式（Ｖ）：
【化４】
2017516755.tif 000028
の化合物である、請求項１６に記載の化合物。
【請求項１８】
Ｒ1およびＲ2の両方が、ミトコンドリア標的化部分を含む、請求項１６または１７に記載の化合物。
【請求項１９】
Ｒ1およびＲ2の一方が、ミトコンドリア標的化部分を含み、Ｒ1およびＲ2の他方が、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、ミトコンドリア標的化部分以外の標的化部分、フルオロフォア、解糖系阻害剤、もしくはミトコンドリア作用治療剤を含むか、またはＯＨである、請求項１６または１７に記載の化合物。
【請求項２０】
少なくとも１つのミトコンドリア標的化部分が、トリフェニルホスホニウム（ＴＰＰ）、ローダミンカチオン、またはＳｚｅｔｏ−Ｓｈｉｌｌｅｒペプチドを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２１】
少なくとも１つのミトコンドリア標的化部分がＴＰＰを含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２２】
プラチンＭ化合物：
【化５】
2017516755.tif 000029
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載の化合物を含むナノ粒子。
【請求項２４】
ミトコンドリア標的化部分をさらに含む、請求項２３に記載のナノ粒子。
【請求項２５】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載の化合物または請求項２３もしくは２４に記載のナノ粒子の、それを必要とする被験体の癌の処置における使用。
【請求項２６】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載の化合物または請求項２３もしくは２４に記載のナノ粒子を被験体に投与することを含む、方法。
【請求項２７】
有効量の請求項１〜２２のいずれか一項に記載の化合物または請求項２３もしくは２４に記載のナノ粒子を、それを必要とする被験体に投与することを含む、前記被検体の癌を処置するための方法。
【請求項２８】
被験体の脳の疾患を処置するための方法であって、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の化合物または請求項２３もしくは２４に記載のナノ粒子を前記被験体に投与することを含む、方法。
【請求項２９】
前記化合物またはナノ粒子が全身投与される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
被験体のミトコンドリア病を処置するための方法であって、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の化合物または請求項２３もしくは２４に記載のナノ粒子を前記被験体に投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府支援に関する記載
本発明は、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）からの助成金第Ｐ３０ＧＭ０９２３７８号の下で、政府の支援によりなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
関連出願
本出願は、（ｉ）２０１４年４月８日に出願された米国仮特許出願第６１／９７６，５５９号明細書、（ｉｉ）２０１４年１２月１２日に出願されたＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０６９９９７号明細書；および（ｉｉｉ）２０１５年３月４日に出願されたＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１５／０１８７２０号明細書の利益を主張するものであり、これらの出願は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本開示は、ミトコンドリア標的化小分子、標的化ナノ粒子、またはミトコンドリア標的化小分子および標的化ナノ粒子の両方を使用して、白金含有治療剤をプロドラッグの形態でミトコンドリアに標的化することに関し、またその使用および製造の方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
シスプラチンまたは他の抗癌剤に対する耐性は、取り込みの減少およびヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）機構によるＤＮＡ修復の加速を含む、いくつかの機序により生じ得る。別のまたは改良された抗癌剤またはプロドラッグの開発が求められている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示は、とりわけ、ミトコンドリア標的化部分を有する白金含有プロドラッグおよびミトコンドリア標的化部分を有する白金含有プロドラッグを含むナノ粒子の合成および特性評価に関する。
【０００６】
本明細書に記載のプロドラッグおよびナノ粒子製剤は、とりわけ、ミトコンドリアＤＮＡに作用することによって、特定の癌タイプの耐性を回避するように考案された。ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）は、細胞死および転移能において重要な役割を果たす。ｍｔＤＮＡが活性酸素種（ＲＯＳ）生成部位に近接しているため、このゲノムは酸化的損傷を受けやすくなっており、このことは、癌において多くの場合に観察されるｍｔＤＮＡの突然変異の増加を説明する。ミトコンドリアの機能障害および関連したｍｔＤＮＡの喪失により、癌の発生に寄与する核のエピジェネティックな修飾が可逆的に調節される。したがって、ｍｔＤＮＡを標的化することにより、高悪性度の癌に対する新規で効果的な療法がもたらされ得る。さらに、高悪性度の癌における、ミトコンドリアのＮＥＲの欠如およびミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の突然変異の亢進により、ミトコンドリア基質の内部に向けられたシスプラチンが効果的な治療オプションを提供できる可能性がある。
【０００７】
本明細書に記載の一部の実施形態では、化合物は、Ｐｔ（ＩＶ）プロドラッグおよびＰｔ（ＩＶ）プロドラッグにコンジュゲートした１つまたは複数のミトコンドリア標的化部分を含む。Ｐｔ（ＩＩ）に還元されると、１つまたは複数のミトコンドリア標的化部分は放出され、およびＰｔ（ＩＩ）治療剤が生じる。
【０００８】
本明細書に記載の実施形態では、化合物は、プロドラッグであってもよく、下記の構造：
【化１】
2017516755.tif 000003
（式中、
Ｑ1、Ｑ2、Ｑ3、およびＱ4はそれぞれ独立して、中性または負に荷電した配位子を表し、ただし、Ｑ1、Ｑ2、Ｑ3、およびＱ4の最大で２つが負に荷電した配位子を表すことができ、Ｑ1、Ｑ2、Ｑ3、およびＱ4の２つ以上が任意選択的に結合して、１つまたは複数の５員または６員白金環式環（ｐｌａｔｉｎｏｃｙｃｌｉｃ  ｒｉｎｇ）（例えば、単環式環、二環式環、三環式環等）を形成し；
Ｒ1は、−（Ｌ1）m−（Ｒ3）nであり；
Ｒ2は、ＯＨまたは−（Ｌ2）x−（Ｒ4）yであり；
Ｒ3は、ミトコンドリア標的化部分であり；
Ｒ4は、コンジュゲートしたシクロオキシゲナーゼ阻害剤、標的化部分、フルオロフォア、解糖系阻害剤、またはミトコンドリア作用治療剤であり、Ｒ4がミトコンドリア標的化部分である場合、Ｒ3およびＲ4は同じであるかまたは異なっており；
Ｌ1は、リンカーであり；
Ｌ2は、リンカーであり、Ｌ1およびＬ2は、両方とも存在する場合、同じであるかまたは異なっており；
ｍおよびｘは独立して、ゼロまたは１であり；かつ
ｎおよびｙは独立して、１以上の整数である）
を有する。一部の実施形態では、ｍ＝０の場合、ｎ＝１であり、およびｘ＝０の場合、ｙ＝１である。
【０００９】
本明細書に記載の一部の実施形態では、化合物は、プロドラッグであってもよく、下記の構造：
【化２】
2017516755.tif 000004
（式中、Ｒ1およびＲ2は、式（Ｉ）の化合物に関して上記に定義された通りである）
の１つを有する。
【００１０】
一部の実施形態では、Ｐｔ（ＩＶ）プロドラッグは、下記の式：
【化３】
2017516755.tif 000005
を有するプラチンＭ（Ｐｌａｔｉｎ−Ｍ）である。この場合、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ、トリフェニルホスホニウム（ＴＰＰ）含有ミトコンドリア標的化部分を含む。当然のことながら、Ｒ1およびＲ2の一方または両方が、例えばローダミンカチオン、Ｓｚｅｔｏ−Ｓｈｉｌｌｅｒペプチド等の他のミトコンドリア標的化部分を含んでもよい。
【００１１】
一部の実施形態では、１つまたは複数のミトコンドリア標的化部分を有するＰｔ（ＩＶ）プロドラッグが、ナノ粒子に含まれる。一部の実施形態では、ナノ粒子は、ミトコンドリア標的化部分または疾患標的化部分、例えば癌標的化部分を含む。
【００１２】
本明細書に記載の化合物またはナノ粒子は、それを必要とする患者の癌またはミトコンドリア病を処置するために使用することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載の化合物またはナノ粒子は、シスプラチン耐性癌を処置するために使用される。
【００１３】
一部の実施形態では、本明細書に記載の化合物またはナノ粒子は、被験体の中枢神経系（ＣＮＳ）の疾患を処置するために使用することができる。種々の実施形態では、本明細書に記載の化合物またはナノ粒子は、被験体の脳の疾患を処置するために使用される。本明細書に記載のミトコンドリア標的化化合物またはナノ粒子は、ＣＮＳ（例えば、脳）に蓄積することができる。ＣＮＳへの蓄積は全身投与により起こすことができる（例えば、直接投与  −  これも使用することができる  −  に対するものとして、経口、ＩＶ、ＩＭ、ＩＰ等の投与）。
【００１４】
療法、治療剤、および方法に関する、本明細書に提示の種々の実施形態の１つまたは複数の利点が、添付図面と併せて読むと、以下の詳細な説明に基づいて当業者に容易に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】標的化送達ビヒクルを使用する、ミトコンドリア内部へのシスプラチンプロドラッグの送達および作用機序の概略図である。
【図２】ミトコンドリア標的化Ｐｔ（ＩＶ）プロドラッグシスプラチンおよびそのＮＰの合成である。
【図３Ａ】（Ａ）ＩＣＰ−ＭＳ分析（上段）およびＩＶＩＳ分析（下段）による、ＰＣ３細胞の種々のミトコンドリアコンパートメントにおけるＰＬＧＡHMW−ｂ−ＰＥＧ−ＴＰＰおよびＰＬＧＡLMW−ｂ−ＰＥＧ−ＴＰＰ−ＮＰの分布である。
【図３Ｂ−１】（Ｂ）（左側）ＱＤを含むまたは含まない、標的化および非標的化ＨＤＬ模倣ＮＰのサイズおよびゼータ電位、ならびに（右側）標的化および非標的化ＱＤ負荷ＨＤＬ模倣ＮＰのＴＥＭ画像である。（Ｂ）ＸＦ２４ミトストレスアッセイによる、ＰＣ３細胞およびシスプラチン耐性Ａ２７８０／ＣＰ７０細胞に対するＰＬＧＡLMW−ｂ−ＰＥＧ−ＴＰＰ−ＮＰのミトコンドリア毒性である。
【図３Ｂ−２】（Ｂ）（左側）ＱＤを含むまたは含まない、標的化および非標的化ＨＤＬ模倣ＮＰのサイズおよびゼータ電位、ならびに（右側）標的化および非標的化ＱＤ負荷ＨＤＬ模倣ＮＰのＴＥＭ画像である。（Ｂ）ＸＦ２４ミトストレスアッセイによる、ＰＣ３細胞およびシスプラチン耐性Ａ２７８０／ＣＰ７０細胞に対するＰＬＧＡLMW−ｂ−ＰＥＧ−ＴＰＰ−ＮＰのミトコンドリア毒性である。
【図３Ｃ】（Ｃ）雄性ラットへのＴ−ＱＤ−ＮＰの静脈内投与後における、血漿中Ｃｄ濃度の時間変動、ＰＫパラメーター、組織分布、および累積排泄プロファイルである。
【図４Ａ】（Ａ）Ｔ−プラチンＭおよびＮＴ−プラチンＭ−ＮＰのサイズ、ゼータ電位、％負荷、％ＥＥ、およびＴＥＭ画像である。
【図４Ｂ】（Ｂ）ＰＢＳ中で３７℃における、ＴおよびＮＴ−ＮＰからのプラチンＭの放出カイネティクスである。
【図４Ｃ】（Ｃ）ＰＣ３細胞のサイトゾル、核、およびミトコンドリアの画分における、シスプラチン、プラチンＭ、ＮＴ−プラチンＭ−ＮＰ、およびＴ−プラチンＭ−ＮＰの分布である。
【図４Ｄ】（Ｄ）ＰＣ３細胞における、シスプラチン、プラチンＭ、ＮＴ−プラチンＭ−ＮＰ、およびＴ−プラチンＭ−ＮＰのＰｔ−ｎＤＮＡ付加体およびＰｔ−ｍｔＤＮＡ付加体の比較である。
【図５−１】シスプラチン、プラチンＭ、ＮＴ−プラチンＭ−ＮＰ、およびＴ−プラチンＭ−ＮＰに応答した、ＰＣ３細胞株、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞株、およびＡ２７８０／ＣＰ７０細胞株におけるミトコンドリア生体エネルギー分析である。対照、シスプラチン、プラチンＭ、ＮＴ−プラチンＭ−ＮＰ、およびＴ−プラチンＭ−ＮＰ処理のＰＣ３細胞、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞、およびＡ２７８０／ＣＰ７０細胞のＸＦ２４アナライザーからのＯＣＲ出力およびオリゴマイシン、ＦＣＣＰ、アンチマイシンＡ／ロテノンに対するその応答、ならびに処理細胞における予備呼吸容量、共役効率、基礎呼吸、およびＥＴＣアクセラレーター応答、およびＡＴＰカップラー応答の比較を示す代表的なグラフである。
【図５−２】シスプラチン、プラチンＭ、ＮＴ−プラチンＭ−ＮＰ、およびＴ−プラチンＭ−ＮＰに応答した、ＰＣ３細胞株、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞株、およびＡ２７８０／ＣＰ７０細胞株におけるミトコンドリア生体エネルギー分析である。対照、シスプラチン、プラチンＭ、ＮＴ−プラチンＭ−ＮＰ、およびＴ−プラチンＭ−ＮＰ処理のＰＣ３細胞、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞、およびＡ２７８０／ＣＰ７０細胞のＸＦ２４アナライザーからのＯＣＲ出力およびオリゴマイシン、ＦＣＣＰ、アンチマイシンＡ／ロテノンに対するその応答、ならびに処理細胞における予備呼吸容量、共役効率、基礎呼吸、およびＥＴＣアクセラレーター応答、およびＡＴＰカップラー応答の比較を示す代表的なグラフである。
【図５−３】シスプラチン、プラチンＭ、ＮＴ−プラチンＭ−ＮＰ、およびＴ−プラチンＭ−ＮＰに応答した、ＰＣ３細胞株、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞株、およびＡ２７８０／ＣＰ７０細胞株におけるミトコンドリア生体エネルギー分析である。対照、シスプラチン、プラチンＭ、ＮＴ−プラチンＭ−ＮＰ、およびＴ−プラチンＭ−ＮＰ処理のＰＣ３細胞、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞、およびＡ２７８０／ＣＰ７０細胞のＸＦ２４アナライザーからのＯＣＲ出力およびオリゴマイシン、ＦＣＣＰ、アンチマイシンＡ／ロテノンに対するその応答、ならびに処理細胞における予備呼吸容量、共役効率、基礎呼吸、およびＥＴＣアクセラレーター応答、およびＡＴＰカップラー応答の比較を示す代表的なグラフである。
【図６】酸素消費速度（ＯＣＲ）を機能として測定した、シスプラチンまたはプラチンＭまたはＮＴ−Ｐｌａｔｎ−Ｍ−ＮＰまたはＴ−プラチンＭ−ＮＰ（シスプラチンまたはプラチンＭについて１０μΜ）の２４時間処理に応答した、２種のイヌ脳腫瘍細胞株におけるミトコンドリア生体エネルギーである。平均値をプロットし、ｎ＝４であり、エラーバーはＳＤを表す。
【図７】イヌ脳腫瘍細胞株ＳＤＴ３Ｇにおける、Ｔ−プラチンＭ−ＮＰのｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力およびシスプラチン、カルボプラチン、プラチンＭ、およびＮＴ−プラチンＭ−ＮＰとの比較である。指定濃度の被験物質で４８時間または７２時間処理した後、細胞生存率をＭＴＴアッセイにより評価した。すべてのＮＰ処理について、培地を１２時間後に交換し、細胞をさらに３６時間または６０時間インキュベートした。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３ウェル）である。ＩＣ５０値は、３つの独立した実験の平均として示される。
【図８】（Ａ）ビーグル犬における生体内分布および安全性試験の試験計画である。（Ｂ）２匹のビーグル犬における、Ｔ−プラチンＭＮＰ（プラチンＭに関して０．５ｍｇ／ｋｇ）の単回静脈内注射１４日後の臓器中白金濃度、ならびに小脳、大脳、心臓、肺、肝臓、腎臓、および脾臓の注射１４日後の病理組織の代表的画像である。Ｔ−プラチンＭ−ＮＰ注射に関連した変化は観察されなかった。（Ｃ）両方のイヌの血中尿素窒素（ＢＵＮ）、クレアチニン、およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の値は、試験期間中、臨床的に許容される範囲内に留まった。
【図９】２匹の雌性イヌにおける、１４日間、用量０．５ｍｇ／ｋｇのＴ−プラチンＭ−ＮＰによる安全性およびｂｉｏＤ試験による完全な臨床化学データおよび一部の血液学データである。
【図１０】（Ａ）２匹の雄性ビーグル犬における、２ｍｇ／ｋｇのＴ−プラチンＭ−ＮＰの投薬前、単回静脈内注射後１日目、７日目、および１４日目の完全な血清化学の結果である。（Ｂ）この試験期間中の両方のイヌに関するＢＵＮ、クレアチニン、およびＡＬＴの値である。（Ｃ）試験期間中の２匹のビーグル犬の白血球（ＷＢＣ）数および血小板数である。Ｌ：低水準。
【図１１】（Ａ）２匹の雄性ビーグル犬における、２．２ｍｇ／ｋｇのＴ−プラチンＭ−ＮＰの投薬前、単回静脈内注射後１日目、７日目、および１４日目の完全な血清化学の結果である。（Ｂ）この試験期間中の両方のイヌに関するＢＵＮ、クレアチニン、およびＡＬＴの値である。（Ｃ）試験期間中の２匹のビーグル犬のＷＢＣ数および血小板数である。Ｈ：高水準。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
概略図面は必ずしも一定の縮尺ではない。
【００１７】
ミトコンドリア標的化シスプラチンプロドラッグであるプラチンＭは、歪み促進アルキンアジド付加環化化学を使用して構築した。細胞のミトコンドリアを標的化する注目すべき活性を有する末端トリフェニルホスホニウム（ＴＰＰ）カチオンにより機能的にされた、生分解性ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）−ブロック（ｂ）−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に基づく生体適合性ポリマーナノ粒子（ＮＰ）を使用する、プラチンＭの効率的な送達により、突然変異したミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）を攻撃するようにミトコンドリア基質の内部で局所的にプラチンＭからシスプラチンが制御放出され、そうでなければ耐性の進行癌をシスプラチンベースの化学療法に感受性にした。脳浸透性を有する最適化された標的化ＮＰ製剤の同定により、神経芽細胞腫細胞のミトコンドリア内部へのプラチンＭの送達が可能になり、シスプラチンよりも約１８倍高い活性が得られた。シスプラチン耐性細胞におけるプラチンＭおよびその標的化ＮＰの注目すべき活性は、これらの細胞のミトコンドリアの過分極と相関し、耐性細胞におけるミトコンドリア生体エネルギー研究から生まれた仮説をさらに支持した。ＮＥＲ機構を欠くミトコンドリアゲノムを攻撃するように、ミトコンドリアにプロドラッグの形態でシスプラチンを制御送達させるこのユニークな手法および脳への送達ビヒクルのｉｎ  ｖｉｖｏ分布特性により、神経芽細胞腫の処置に関するシスプラチンベースの療法に対するこれまでに記載されていない経路が示唆された。
【００１８】
細胞の発電所であるミトコンドリアは、エネルギー産生およびアポトーシスにおけるその極めて重要な役割のために、発癌の過程に関与する。ミトコンドリアは、副産物として活性酸素種（ＲＯＳ）を生成する酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）による細胞エネルギー産生の重要なプレーヤーである。ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）は、細胞死および転移能において重要な役割を果たす。ｍｔＤＮＡがＲＯＳ生成部位に近接しているため、このゲノムは酸化的損傷を受けやすくなっており、このことは、癌において多くの場合に観察されるｍｔＤＮＡの突然変異の増加を説明する。ミトコンドリアの機能障害および関連したｍｔＤＮＡの喪失により、癌の発生に寄与する核のエピジェネティックな修飾がおそらく可逆的に調節される。したがって、ｍｔＤＮＡを標的化することにより、高悪性度の癌に対する新規で効果的な療法がもたらされ得る。
【００１９】
広範に使用され、食品医薬品局（Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）（ＦＤＡ）が承認した化学療法剤であるシスプラチンは、精巣癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、および肺癌を含む、いくつかの癌に対して極めて効果的である。したがって、本明細書に記載の化合物およびナノ粒子も、シスプラチンが使用される癌を含む、種々の癌を処置するために使用することができる。
【００２０】
シスプラチンは、ＤＮＡ傷害剤として最も広範に特徴付けられており、シスプラチンの細胞傷害性は、鎖間および鎖内核ＤＮＡ（ｎＤＮＡ）架橋を形成するその能力に起因する。ヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）経路は、シスプラチン−ｎＤＮＡ付加体の修復に主要な役割を果たす。ＮＥＲ機構が損なわれた細胞は、多くの場合、シスプラチン処置に感受性になる。シスプラチンに対する耐性は、取り込みの減少およびＮＥＲ機構によるＤＮＡ修復の加速を含む、いくつかの機序により起こり得る。限られた試験ではあるが、癌細胞のｍｔＤＮＡに対するシスプラチンの活性が調べられている。実際、ｍｔＤＮＡは、一連の薬剤により誘導される損傷に対してｎＤＮＡよりも顕著に感受性がある。ミトコンドリアにおけるＮＥＲの欠如および高悪性度の癌におけるｍｔＤＮＡ突然変異の亢進は、プロドラッグの形態でシスプラチンを癌細胞のミトコンドリア基質の内部に向けることに強固な理論的根拠を与え、効果的な治療オプションを提供する。
【００２１】
限られた数の試験のみが、ｍｔＤＮＡに対するシスプラチンの活性について検討し、矛盾するデータを示した。ｍｔＤＮＡを喪失した細胞は、化学療法剤に対して顕著な耐性を示す。シスプラチン誘導のミトコンドリア損傷は、シスプラチン媒介の胃腸毒性、聴器毒性、および腎毒性に関係付けられた。しかしながら、耐性を克服するためまたはシスプラチン誘導のミトコンドリア毒性を理解するための、シスプラチンによるｍｔＤＮＡの標的化に重要なステップとして、ミトコンドリア標的化プロドラッグおよび一層好適には、ｍｔＤＮＡが位置する、最も内側のミトコンドリア腔であるミトコンドリア基質に到達させることができる最適な薬物送達システムが必要とされる。
【００２２】
本発明者らは最近、その高い親油性、正電荷の存在、および適切なサイズ範囲により、細胞のミトコンドリアを標的化する注目すべき活性を有する末端トリフェニルホスホニウム（ＴＰＰ）カチオンにより機能的にされた、生分解性ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）−ブロック（ｂ）−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に基づく生体適合性ポリマーナノ粒子（ＮＰ）を開発した。本発明者らは、効率的なミトコンドリア標的化および最大のミトコンドリア基質蓄積のために適切な直径および表面電荷を有する最適化されたＮＰ製剤を同定した。本明細書において、本発明者らは、歪み促進アルキンアジド付加環化（ＳＰＡＡＣ）化学を使用する、疎水性ミトコンドリア標的化シスプラチンプロドラッグであるプラチンＭの構築および突然変異したｍｔＤＮＡを攻撃するようにミトコンドリア基質の内部で局所的にシスプラチンを放出するためにＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＴＰＰ  ＮＰを使用するその送達について記載するが、これらにより、そうでなければ耐性の進行癌をシスプラチンベースの化学療法に感受性にすることができる（図１）。
【００２３】
高濃度の薬物およびそのナノ粒子は、ＤＢＣＯ部分およびＴＰＰ部分が存在するため、何らかの毒性を示す可能性がある。しかしながら、これは、濃度を低めて使用することによって、さらに２つの標的化部分を１つにするように分子を修飾することによって解決することができる。
【００２４】
これらの結果は、１つまたは複数のミトコンドリア標的化部分を有する他のＰｔ（ＩＶ）プロドラッグまたはそのようなプロドラッグを含むナノ粒子の開発のための基礎として役立つ。
【００２５】
Ａ．Ｐｔ（Ｖ）プロドラッグ
本明細書に記載の化合物は、１つまたは複数のミトコンドリア標的化部分を含むいずれのＰｔ（ＩＶ）プロドラッグであってもよい。化合物が還元されると、１つまたは複数のミトコンドリア標的化部分が放出され得、白金（ＩＩ）治療剤が生じ得る。
【００２６】
いずれの白金治療剤を使用してもよい。好ましくは、白金治療剤はＰｔ（ＩＩ）治療剤であり、そこではアキシャル位を設けることができる。
【００２７】
一部の実施形態では、Ｐｔ（ＩＶ）プロドラッグは、下記の構造：
【化４】
2017516755.tif 000006
（式中、
Ｑ1、Ｑ2、Ｑ3、およびＱ4はそれぞれ独立して、中性または負に荷電した配位子を表し、ただし、Ｑ1、Ｑ2、Ｑ3、およびＱ4の最大で２つが負に荷電した配位子を表すことができ、Ｑ1、Ｑ2、Ｑ3、およびＱ4の２つ以上が任意選択的に結合して、１つまたは複数の５員または６員白金環式環（例えば、単環式環、二環式環、三環式環等）を形成し；
Ｒ1は、−（Ｌ1）m−（Ｒ3）nであり；
Ｒ2は、ＯＨまたは−（Ｌ2）x−（Ｒ4）yであり；
Ｒ3は、ミトコンドリア標的化部分であり；
Ｒ4は、コンジュゲートしたシクロオキシゲナーゼ阻害剤、標的化部分、フルオロフォア、解糖系阻害剤、またはミトコンドリア作用治療剤であり、Ｒ4がミトコンドリア標的化部分である場合、Ｒ3およびＲ4は同じであるかまたは異なっており；
Ｌ1は、リンカーであり；
Ｌ2は、リンカーであり、Ｌ1およびＬ2は、両方とも存在する場合、同じであるかまたは異なっており；
ｍおよびｘは独立して、ゼロまたは１であり；かつ
ｎおよびｙは独立して、１以上の整数である）
を有する。
【００２８】
一部の実施形態では、ｍ＝０の場合、ｎ＝１であり、およびｘ＝０の場合、ｙ＝１である。
【００２９】
一部の実施形態では、式Ｉ（または下記の式ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、もしくはＶＩＩ）のｎおよびｙはそれぞれ独立して、整数１〜８、例えば整数１〜４である。リンカーのＬ1およびＬ2は、使用する場合、式Ｉの化合物に存在するＲ3部分およびＲ4部分の数を制御するように選択することができる。すなわち、リンカーのＬ1およびＬ2により、ｎおよびｙの値が決定され得る。
【００３０】
Ｑ1、Ｑ2、Ｑ3、およびＱ4のうちの２つが負に荷電した配位子である実施形態の場合、得られる白金（ＩＶ）化合物は中性である。Ｑ1、Ｑ2、Ｑ3、およびＱ4のうちの１つのみが負に荷電した配位子である実施形態の場合、得られる白金（ＩＶ）化合物の白金は、１個の正電荷（＋１）を有し、白金（ＩＶ）化合物は、負に荷電した（−１）対イオン（例えば、ＮＯ3-、ＨＳＯ4-等）を含む塩である。Ｑ1、Ｑ2、Ｑ3、およびＱ4のいずれも負に荷電した配位子ではない実施形態の場合、得られる白金（ＩＶ）化合物の白金は、＋２の正電荷を有し、白金（ＩＶ）化合物は、−２の電荷を有する対イオン（例えば、ＳＯ4-2等）、または１個の負電荷（−１）の２つの対イオン（例えば、ＮＯ3-、ＨＳＯ4-、それらの組合せ等）を含む塩である。
【００３１】
例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ピコプラチン、アロプラチン、ネダプラチン、ロバプラチン、ピリプラチン、スピロプラチン、キノプラチン（ｑｕｉｎｏｐｌａｔｉｎ）、フェナントリプラチン等のＰｔ（ＩＩ）化合物の負に荷電した配位子として知られているものを含む、多種多様な負に荷電した配位子が有用になり得る。代表的な負に荷電した配位子としては、例えば、ハロゲン化物（例えば、Ｃｌ-、Ｂｒ-等）、アルコキシドおよびアリールオキシド（例えば、ＲＯ-）、カルボキシレート（例えば、ＲＣ（Ｏ）Ｏ-）、スルフェート（例えば、ＲＳＯ4-）（各Ｒは個々にＨまたは有機基を表す）等が挙げられる。
【００３２】
例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ピコプラチン、アロプラチン、ネダプラチン、ロバプラチン、ピリプラチン、スピロプラチン、キノプラチン、フェナントリプラチン等のＰｔ（ＩＩ）化合物の中性配位子として知られているものを含む、多種多様な中性配位子が有用になり得る。代表的な中性配位子としては、例えば、Ｒ5Ｎ（式中、各Ｒは個々にＨまたは有機基を表し、２つ以上のＲ基は任意選択的に結合して１つまたは複数の環を形成することができる）；および窒素含有ヘテロ芳香族（例えば、ピリジン、キノリン、フェナントリジン等）が挙げられる。
【００３３】
一部の実施形態では、２つの負に荷電した配位子；２つ以上の中性配位子；および／または２つ以上の中性配位子および負に荷電した配位子を結合して二座配位子、三座配位子、または四座配位子を形成させることができる。
【００３４】
一部の実施形態では、Ｐｔ（ＩＶ）プロドラッグは、下記の構造：
【化５】
2017516755.tif 000007
（式中、
Ｒ1およびＲ2は、式（Ｉ）の化合物に関して上記に定義された通りであり；かつ
各Ｙは独立して、負に荷電した配位子を表し、両方のＹ配位子は任意選択的に結合して、５員または６員白金環式環を形成し；各Ｌは独立して中性配位子を表し、両方のＬ配位子は任意選択的に結合して、５員または６員白金環式環を形成する）
を有する。
【００３５】
一部の実施形態では、Ｐｔ（ＩＶ）プロドラッグは、下記の構造：
【化６】
2017516755.tif 000008
（式中、Ｒ1およびＲ2は、式（Ｉ）の化合物に関して上記に定義された通りである）
を有する。
【００３６】
種々の実施形態では、式Ｉ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、またはＶＩＩの化合物のＲ4は、コンジュゲートしたシクロオキシゲナーゼ阻害剤である。Ｒ4は、任意の適切なコンジュゲートしたシクロオキシゲナーゼ阻害剤であり得る。適切なコンジュゲートしたシクロオキシゲナーゼ阻害剤の例は、ＰＣＴ特許出願ＰＣＴである、２０１３年１２月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／９１５，１１０号明細書の利益を主張する、２０１４年１２月１２日に出願され、ＰＲＯＤＲＵＧ  ＦＯＲ  ＲＥＬＥＡＳＥ  ＯＦ  ＣＩＳＰＬＡＴＩＮ  ＡＮＤ  ＣＹＣＬＯＯＸＹＧＥＮＡＳＥ  ＩＮＨＩＢＩＴＯＲという名称のＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０６９９９号明細書に含まれており、これらの特許出願は、本明細書に提示の開示内容と矛盾しない範囲で、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００３７】
ＰＴ（ＩＶ）化合物のＰｔにコンジュゲートすることができるかまたはＰｔ（ＩＶ）化合物にコンジュゲートしたリンカーにコンジュゲートすることができる適切なシクロオキシゲナーゼ阻害剤の例としては、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）が挙げられる。適切なＮＳＡＩＤの例としては、アスピリン、サリチル酸（例えば、ナトリウム、マグネシウム、コリン）、セレコキシブ、ジクロフェナクカリウム、ジクロフェナクナトリウム、ジフルニサル、エトドラック、フェノプロフェンカルシウム、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、メクロフェナム酸ナトリウム、メフェナム酸、メロキシカム、ナブメトン、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、オキサプロジン、ピロキシカム、ロフェコキシブ、サルサラート、スリンダク、トルメチンナトリウム、バルデコキシブ等が挙げられる。一部の実施形態では、式Ｉによる化合物は、医薬として活性な形態で放出され得る、下記のコンジュゲートしたシクロオキシゲナーゼ阻害剤の１つまたは複数を含む：アスピリン（アセチルサリチル酸）；サリチル酸；スリンダクスルホン（（Ｚ）−５−フルオロ−２−メチル−１［ｐ−（メチルスルホニル）ベンジリデン］インデン−３−酢酸）；スリンダクスルフィド（（Ｚ）−５−フルオロ−２−メチル−１−［ｐ−（メチルチオ）ベンジリデン］インデン−３−酢酸）；ＳＣ−５６０（５−（４−クロロフェニル）−１−（４−メトキシフェニル）−３−トリフルオロメチルピラゾール）；リスベラトロール（ｔｒａｎｓ−３，４，５−トリヒドロキシスチルベン）；プテロスチルベンスクシネート、（（Ｅ）−４−（４−（３，５−ジメトキシスチリル）フェノキシ）−４−オキソブタン酸）；メロキシカム（４−（（２−メチル−３−（（５−メチルチアゾール−２−イル）カルバモイル）−１，１−ジオキシド−２Ｈ−ベンゾ［ｅ］［１，２］チアジン−４−イル）オキシ）−４−オキソブタン酸）；インドメタシンエステル、４−メトキシフェニル−（ｌ−（ｐ−クロロベンゾイル）−５−メトキシ−２−メチル−ｌＨ−インドール−３−酢酸，４−メトキシフェニルエステル；インドメタシン１−（ｐ−クロロベンゾイル）−５−メトキシ−２−メチル−ｌＨ−インドール−３−酢酸；イブプロフェン；フルルビプロフェン（±）−２−フルオロ−ａ−メチル［１，１’−ビフェニル］−４−酢酸）；ジクロフェナクナトリウム（２−［（２，６−ジクロロフェニル）アミノ］ベンゼン酢酸ナトリウム）；ジクロフェナク、４’−ヒドロキシ−（２−［（（２’，６’−ジクロロ−４’−ヒドロキシ）フェニル）アミノ］ベンゼン酢酸）、およびＣＯＸ−２阻害剤Ｉ（メチル［５−メチルスルホニル−ｌ−（４−クロロベンジル）−ｌＨ−２−インドリル］カルボキシレート）。
【００３８】
種々の実施形態では、式Ｉ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、またはＶＩＩによる化合物のＲ4は、コンジュゲートしたミトコンドリア作用治療剤である。適切なミトコンドリア作用治療剤の例としては、ロテノン、バンレイシ科アセトゲニン、α−トコフェリルスクシネート、メトホルミン、ミキソチアゾールＡ、アンチマイシンＡ3b、オリゴマイシンＣ、アポトリジンＡ、Ｂｚ−４２３、リスベラトロール、ジインドイル−メタン、ＰＫ１１１９５、オーロベルチンＢ、Ｒ２０７９１０、エレスクロモル、２−メトキシエストラジオール、ＭｉｔｏＱ、Ｆ１６、ＭＫＴ−０７７等が挙げられる。
【００３９】
種々の実施形態では、式Ｉ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、またはＶＩＩによる化合物のＲ4は、フルオロフォアである。任意の適切なフルオロフォアを使用することができる。例えば、フルオロフォアは、蛍光タンパク質であっても非タンパク質性有機フルオロフォアであってもよい。非タンパク質性有機フルオロフォアの例としては、キサンテン誘導体、シアニン誘導体、スクアライン誘導体および環置換型スクアライン、ナフタレン誘導体、クマリン誘導体、オキサジアゾール誘導体、アントラセン誘導体、ピレン誘導体、オキサジン誘導体、アクリジン誘導体、アリールメチン誘導体、ならびにテトラピロール誘導体が挙げられる。キサンテン誘導体の例としては、フルオレセイン、ローダミン、オレゴングリーン、エオシン、およびテキサスレッドが挙げられる。シアニン誘導体の例としては、シアニン、インドカルボシアニン、オキサカルボシアニン、チアカルボシアニン、およびメロシアニンが挙げられる。スクアライン誘導体および環置換型スクアラインの例としては、Ｓｅｔａ染料、ＳｅＴａｕ染料、およびＳｑｕａｒｅ染料が挙げられる。ナフタレン誘導体の例としては、ダンシル誘導体およびプロダン誘導体が挙げられる。オキサジアゾール誘導体の例としては、ピリジルオキサゾール、ニトロベンゾオキサジアゾール、およびベンゾオキサジアゾールが挙げられる。アントラセン誘導体の例としては、アントラキノン、例えば、ＤＲＡＱ５、ＤＲＡＱ７、およびＣｙＴＲＡＫオレンジが挙げられる。ピレン誘導体の例としては、カスケードブルー等が挙げられる。オキサジン誘導体の例としては、ナイルレッド、ナイルブルー、クレシルバイオレット、オキサジン１７０等が挙げられる。アクリジン誘導体の例としては、プロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリジンイエロー等が挙げられる。アリールメチン誘導体の例としては、オーラミン、クリスタルバイオレット、およびマラカイトグリーンが挙げられる。テトラピロール誘導体の例としては、ポルフィン、フタロシアニン、およびビリルビンが挙げられる。
【００４０】
種々の実施形態では、式Ｉ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、またはＶＩＩによる化合物のＲ4は、解糖系阻害剤である。１つまたは複数の解糖系酵素を阻害する任意の化合物を使用することができる。解糖系阻害剤の例としては、２−デオキシグルコース、ロニダミン、３−ブロモピルバート、イマチニブ、およびオキシチアミンが挙げられる。
【００４１】
種々の実施形態では、式Ｉ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、またはＶＩＩによる化合物のＲ4は、標的化部分である。本明細書に示す教示に従って、任意の適切な標的化部分を使用することができる。本明細書で使用する場合、「標的化部分」とは、その分子が被験体に導入されたときに、標的化部分を欠く化合物に比較して、目的の組織、細胞等の中またはその近傍における化合物の濃度を増加させる部分である。標的化部分は、Ｐｔ（ＩＶ）化合物のＰｔにコンジュゲートすることも、Ｐｔ（ＩＶ）化合物のＰｔにコンジュゲートしたリンカーにコンジュゲートすることもできる。
【００４２】
標的化部分は、例えば、癌標的化部分またはミトコンドリア標的化部分などの疾患標的化部分であってもよい。任意の適切な癌標的化部分を、本明細書に記載のナノ粒子に結合させることができる。癌標的化部分の例としては、癌細胞に選択的であるか、または過剰発現しているか、アップレギュレートされているか、もしくは非癌細胞中には見出すことのない量で存在している細胞表面抗原またはマーカーに結合する部分が挙げられる。
【００４３】
種々の実施形態では、式Ｉ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、またはＶＩＩによる化合物のＲ4は、ミトコンドリア標的化部分である。Ｒ4の標的化部分は、Ｒ3の標的化部分と同じであることも異なっていることもある。任意の適切なミトコンドリア標的化部分を使用することができる。ミトコンドリア内膜を横切って維持される実質的な負の電気化学ポテンシャルにより、非局在化した親油性カチオンは、疎水性膜の横断およびミトコンドリア基質への蓄積に効果的である。トリフェニルホスホニウム（ＴＰＰ）含有部分を、ミトコンドリア基質に化合物を濃縮するために使用することができる。任意の適切なＴＰＰ含有化合物を、ミトコンドリア基質標的化部分として使用することができる。ＴＰＰベースの部分の代表的な例は、式ＩＸ、式Ｘ、または式ＸＩで下記に示す構造：
【化７】
2017516755.tif 000009
【化８】
2017516755.tif 000010
を有することができる。ここで、（示されている）アミンは、式Ｉによる化合物のＰｔ（ＩＶ）にコンジュゲートしたリンカーにコンジュゲートすることができる。当然のことながら、コンジュゲーションは、式ＩＸ、Ｘ、またはＸＩによる化合物の他の基を介して行うことができる。
【００４４】
一部の実施形態では、ミトコンドリア基質に標的化するための非局在化した親油性カチオンは、ローダミンカチオン、例えば、下記に示す式ＸＩＩ：
【化９】
2017516755.tif 000011
を有するローダミン１２３である。ここで、（示されている）二級アミンは、式Ｉによる化合物のＰｔ（ＩＶ）にコンジュゲートしたリンカーにコンジュゲートすることができる。当然のことながら、コンジュゲーションは、式ＸＩＩによる化合物の別の基を介して行うことができる。
【００４５】
当然のことながら、非カチオン性化合物は、ミトコンドリア基質を標的化し、その中に蓄積するように機能することができる。例として、Ｓｚｅｔｏ−Ｓｈｉｌｌｅｒペプチドは、ミトコンドリア基質を標的化し、その中にナノ粒子を蓄積するように機能することができる。任意の適切なＳｚｅｔｔｏ−Ｓｈｉｌｌｅｒペプチドを、ミトコンドリア基質標的化部分として使用することができる。適切なＳｚｅｔｏ−Ｓｈｉｌｌｅｒペプチドの非限定例としては、下記に示す式ＸＩＩＩおよび式ＸＩＶ：
【化１０】
2017516755.tif 000012
をそれぞれ有するＳＳ−０２およびＳＳ−３１が挙げられる。ここで、（示されている）二級アミンは、式Ｉによる化合物のＰｔ（ＩＶ）にコンジュゲートしたリンカーにコンジュゲートすることができる。当然のことながら、コンジュゲーションは、式ＸＩＩまたはＸＩＶによる化合物の他の基を介して行うことができる。
【００４６】
標的化部分は、本明細書に記載のＰｔ（ＩＶ）化合物に組み込むように必要に応じて修飾することができる。例えば、標的化部分は、例えば２０１４年１２月１２日に出願され、ＰＲＯＤＲＵＧ  ＦＯＲ  ＲＥＬＥＡＳＥ  ＯＦ  ＣＩＳＰＬＡＴＩＮ  ＡＮＤ  ＣＹＣＬＯＯＸＹＧＥＮＡＳＥ  ＩＮＨＩＢＩＴＯＲという名称のＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０６９９９号明細書、および２０１３年１２月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／９１５，１１０号明細書に記載されるように、クリックケミストリーに適するように修飾することができる。
【００４７】
一部の実施形態では、ミトコンドリア標的化部分を、ジベノジズロオズチン (dibenozyzlooztyne)（ＤＢＣＯ）誘導体または当業者に公知のシクロオクチンなど別のシクロオクチン誘導体にコンジュゲートして、本開示によるＰｔ（ＩＶ）化合物の中に組み込むためのＤＢＣＯ−ミトコンドリア標的化部分またはシクロオクチン−ミトコンドリア標的化部分を得ることができる。
【００４８】
一部の実施形態では、Ｐｔ（ＩＶ）プロドラッグは、下記の式：
【化１１】
2017516755.tif 000013
を有するプラチンＭである。この場合、ミトコンドリア標的化部分はトリフェニルホスホニウム（ＴＰＰ）部分を含む。
【００４９】
クリックケミストリーを使用して、標的化部分、または１つもしくは複数のシクロオキシゲナーゼ阻害剤、標的化部分等が結合するリンカーを、Ｐｔ（ＩＶ）化合物にコンジュゲートすることができる。本開示によるＰｔ（ＩＶ）化合物を生成するために使用することができるクリックケミストリー手法の例は、例えば、２０１５年３月４日に出願され、ＰＬＡＴＩＮＵＭ（ＩＶ）ＣＯＭＰＯＵＮＤＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＭＡＫＩＮＧ  ＡＮＤ  ＵＳＩＮＧ  ＳＡＭＥという名称のＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１５／０１８７２０号明細書および２０１５年３月４日に出願された米国仮特許出願第６１／９４７，７０３号明細書に記載されており、これらの出願は、本開示内容と矛盾しない範囲で、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。より一般的には、適切なクリックケミストリー手法の例としては、銅触媒アジド−アルキン付加環化（ＣｕＡＡＣ）、歪み促進アルキン付加環化（ＳＰＡＡＣ）等が挙げられる。アジド官能性は、例えば、下記：
【化１２】
2017516755.tif 000014
（式中、ｏおよびｐは独立して０〜１０、例えば３〜７または例えば５である）
に示すように、Ｐｔ（ＩＶ）化合物をアジド無水物と反応させることにより、ｃ，ｃ，ｔ［ＰｔＣｌ2（ＮＨ3）2（ＯＨ）2］などのＰｔ（ＩＶ）化合物に容易に付加することができる。一部の実施形態では、ｏとｐは同じである。一部の実施形態では、アジド無水物は、６−アジドヘキサン酸無水物である。一部の実施形態では、アジド無水物の濃度を限定することにより、またはヒドロキシル基の１つをブロックすることにより、１つのアジド部分のみが、得られるＰｔ化合物に付加される。任意の適切な溶媒を使用することができる。適切な溶媒の例としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）等が挙げられる。ｃ，ｃ，ｔ［ＰｔＣｌ2（ＮＨ3）2（ＯＨ）2］は、任意の適切な方法、例えば、ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）を過酸化水素と反応させることにより合成することができる。
【００５０】
次いで、上記の式ＩＩによる化合物など、アジド官能性をもたせたＰｔ（ＩＶ）化合物は、任意選択的に、１つまたは複数のコンジュゲートしたシクロオキシゲナーゼ阻害剤、標的化部分等を含有し得る、アルキン含有リンカーと反応させることができる。アルキン含有リンカーが、例えば、１つまたは複数のコンジュゲートしたシクロオキシゲナーゼ阻害剤または標的化部分を含有しない場合、そのような部分は、リンカーを、アジド官能性をもたせたＰｔ（ＩＶ）化合物と反応させた後に、リンカーにコンジュゲートさせることができる。
【００５１】
上記に示すように、ＣｕＡＡＣ、ＳＰＡＡＣ、または他の適切な形態のクリックケミストリーを使用することができる。シクロオキシゲナーゼ阻害剤、標的化部分等を含むことができるかまたは含むように修飾することができるＳＰＡＡＣアルキン含有化合物の例は、例えば、ＡＬＫＹＮＥＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＲＥＡＣＴＩＮＧ  ＡＬＫＹＮＥＳ  ＷＩＴＨ  １，３−ＤＩＰＯＬＥ−ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ  ＣＯＭＰＯＵＮＤＳという名称の米国特許第８，１３３，５１５号明細書、および２０１４年３月４日に出願され、ＳＴＲＡＩＮ  ＰＲＯＭＯＴＥＤ  ＡＺＩＤＥ  ＡＬＫＹＮＥ  ＣＹＣＬＯＡＤＤＩＴＩＯＮ  ＲＥＡＣＴＩＯＮ  ＯＮ  ＰＴ（ＩＶ）ＳＣＡＦＦＯＬＤ：Ａ  ＶＥＲＳＡＴＩＬＥ  ＢＩＯＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ  ＴＯ  ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬＩＺＥ  ＣＩＳＰＬＡＴＩＮ  ＰＲＯＤＲＵＧＳという名称の米国仮特許出願第６１／９４７，７０３号明細書に記載されており、これらの特許および特許出願はそれぞれ、本開示内容と矛盾しない範囲で、その個々の内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００５２】
例示を目的として、官能性のあるアザジベンゾシクロオクチン（ＡＤＩＢＯ）誘導体と、式ＩＩによるアジド官能性をもたせたＰｔ（ＩＶ）化合物とのＳＰＡＡＣ反応を下記に示す。
【化１３】
2017516755.tif 000015
式中、ｏおよびｐは、式ＩＩによる化合物に関して上記に定義された通りであり、Ｘは、Ｒ3もしくは−リンカー−Ｒ3、またはＲ3もしくは−リンカー−Ｒ3がコンジュゲートすることができる官能基であり、Ｙは、Ｒ4もしくは−リンカー−Ｒ4、またはＲ3もしくは−リンカー−Ｒ3がコンジュゲートすることができる官能基である。Ｒ3およびＲ4は、式Ｉ（またはＩＶ、Ｖ、ＶＩ、もしくはＶＩＩ）による化合物に関して上記に定義された通りである。ＸおよびＹのリンカーは、存在する場合、独立して、Ｒ3またはＲ4が結合することができる任意の適切なリンカーであり得る。一部の実施形態では、リンカーは、切断可能なリンカーを含む。切断可能なリンカーは、例えば、シクロオキシゲナーゼ阻害剤（例えば、Ｒ4がシクロオキシゲナーゼ阻害剤である場合、Ｒ4）の制御可能な放出を提供することができる。任意の適切な切断可能なリンカーを使用することができる。適切な切断可能なリンカーの例としては、例えば、ジスルフィドリンカー、オキシムリンカー、ヒドラジンリンカー、ジアゾリンカー、カルボニルオキシエチルスルホンリンカー、アミノ酸リンカー、フェニルアセトアミドリンカー等、米国特許第８，１３３，５１５号明細書の図１２に提示されるものが挙げられる。リンカーは、任意選択的に式Ｉ（またはＩＶ、Ｖ、ＶＩ、もしくはＶＩＩ）による化合物が投与される被験体の標的位置で予想される環境でＲ3またはＲ4の放出を促進するように選択することができる。一部の実施形態では、式Ｉ（またはＩＶ、Ｖ、ＶＩ、もしくはＶＩＩ）による化合物の実施形態が、癌を有する被験体に投与された場合、Ｒ3またはＲ4は、細胞／腫瘍環境においてエステラーゼまたは酸塩基触媒反応によって放出されることになる。癌細胞は、多くの場合、細胞エステラーゼのアップレギュレーションを特徴とし、その腫瘍微小環境は酸性になっている。したがって、エステラーゼまたは酸塩基触媒による、例えばシクロオキシゲナーゼの放出は、腫瘍の微小環境または腫瘍細胞の内部で選択的に行われ得る。したがって、例えばシクロオキシゲナーゼの早まった放出は最小限に抑えることができる。
【００５３】
上記の特定の化合物および反応スキームは、例えば、式Ｉ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、またはＶＩＩによる多種多様な化合物が、種々の反応スキームに従って作製できることを説明する目的のために提示されているものであり、限定を目的として提示されているものではないことを理解されたい。
【００５４】
以下の実施例で記載するように、ＴＰＰ配位子との通常のカップリング反応によるプラチンＭの合成は、Ｐｔ（ＩＶ）の還元のために問題があることが見出された。しかしながら、ミトコンドリア標的化ＴＰＰ部分をジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）誘導体に導入してＤＢＣＯ−ＴＰＰを得る別の経路が、Ｐｔ（ＩＶ）プロドラッグへのカップリングに効果的であることが判明した。アジド−Ｐｔ（ＩＶ）前駆体のプラチンＡｚ（Ｐｌａｔｉｎ−Ａｚ）とＤＢＣＯ−ＴＰＰとの間の歪み促進アルキン−アジド付加環化（ＳＰＡＡＣ）反応により、高効率および高純度でプラチンＭが得られた。親油性ＤＢＣＯ−ＴＰＰ部分の存在は、プラチンＭの親油性を増大させ、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）−ｂ−ポリエチレングリコール（ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ）ナノ粒子（ＮＰ）の疎水性コア内部への効率的な負荷をもたらした。
【００５５】
本明細書に提示する種々の実施形態によるＰｔ（ＩＶ）のＰｔ（ＩＩ）への還元から得られるＲ1Ｈ、Ｒ2Ｈ、およびシスプラチンを下記に示す。
【化１４】
2017516755.tif 000016
【００５６】
Ｒ2がＲ4であり、Ｒ4がコンジュゲートしたシクロオキシゲナーゼ阻害剤である場合、Ｐｔの還元は、シクロオキシゲナーゼ阻害剤Ｒ2Ｈの放出をもたらす。上記に記載する（例えば、ｘが１である）ように、Ｒ2がリンカーＬ2を含有する場合、一部の例では、Ｐｔの還元およびＲ2の残存部分の放出前に、１つまたは複数のＲ4部分が放出され得る（例えば、切断可能なリンカー切断、加水分解等により）。
【００５７】
以下に論じられるように、１つまたは複数のミトコンドリア標的化部分を有するＰｔ（ＩＶ）プロドラッグは、そうである必要はないが、ナノ粒子に含まれ得る。
【００５８】
Ｂ．ナノ粒子
本明細書に記載するナノ粒子は、一部の実施形態では、疎水性コア、コアを包囲する親水性層、１つまたは複数のミトコンドリア標的化部分を含むＰｔ（ＩＶ）プロドラッグ、１つまたは複数の任意選択の追加の治療剤、および１つまたは複数の任意選択の標的化部分を含む。複数の実施形態では、Ｐｔ（ＩＶ）プロドラッグは、コア内に含有されるかまたは埋め込まれる。Ｐｔ（ＩＶ）プロドラッグは、好ましくは、所望の速度でコアから放出される。複数の実施形態では、コアは生分解性であり、コアが分解または侵食されるにつれて、Ｐｔ（ＩＶ）プロドラッグを放出する。標的化部分は、存在する場合、好ましくは、細胞成分との相互作用に利用できるように、またはナノ粒子の表面の性質に影響を及ぼすようにコアから外に向かって伸び、その相互作用または表面の性質により、癌細胞などの所望の細胞またはミトコンドリアなどの細胞小器官に優先的に分布するように促進されることになる。標的化部分は、コアまたはコアと相互作用する成分に繋留させることができる。
【００５９】
Ｉ．コア
ナノ粒子のコアは、任意の適切な１つまたは複数の成分から形成させることができる。好ましくは、コアは、疎水性ポリマーまたはポリマーの疎水性部分などの疎水性成分から形成される。コアは、さらにまたは代わりに、水性環境で疎水性コアと親水性外表面を有する粒子に自己組織化することができる、疎水性部分と親水性部分を有するブロックコポリマーを含むことができる。一部の実施形態では、コアは、１つまたは複数の生分解性ポリマーまたは生分解性部分を有するポリマーを含む。
【００６０】
任意の適切な合成または天然の生体吸収性ポリマーを使用することができる。そのようなポリマーは、当業者により認識または同定可能である。合成生分解性ポリマーの非限定例としては、ポリ（アミド）、例えば、ポリ（アミノ酸）およびポリ（ペプチド）；ポリ（エステル）、例えば、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、およびポリ（カプロラクトン）；ポリ（無水物）；ポリ（オルトエステル）；ポリ（カーボネート）；およびそれらの化学誘導体（化学基、例えばアルキル、アルキレンの置換、付加、水酸化、酸化、および当業者によりルーチン的に行われる他の修飾）、フィブリン、フィブリノーゲン、セルロース、デンプン、コラーゲン、ならびにヒアルロン酸、それらのコポリマーおよび混合物が挙げられる。これらのポリマーおよび他の適切なポリマーの特性および放出プロファイルは公知であるかまたは容易に確認可能である。
【００６１】
本明細書に記載の種々の実施形態では、コアはＰＬＧＡを含む。ＰＬＧＡは、所望の速度で治療剤を送達し放出するために使用される周知の十分研究されている疎水性生分解性ポリマーである。
【００６２】
好ましくは、コアを形成するために使用されるポリマーの少なくとも一部は、疎水性部分と親水性部分を有する両親媒性である。疎水性部分はコアを形成することができ、一方親水性領域は、ナノ粒子が免疫系による認識を回避することを促進し、血液循環半減期を延長させるように、コアを包囲する層を形成することができる。両親媒性ポリマーの例としては、疎水性ブロックと親水性ブロックを有するブロックコポリマーが挙げられる。一部の実施形態では、コアは、ブロックコポリマーの疎水性部分、疎水性ポリマー、またはそれらの組合せから形成される。
【００６３】
疎水性ポリマー対両親媒性ポリマーの比を変動させて、ナノ粒子のサイズを変化させることができる。多くの場合、疎水性ポリマー対両親媒性ポリマーの比が大きくなると、ナノ粒子の直径が大きくなる。疎水性ポリマー対両親媒性ポリマーの任意の適切な比を使用することができる。一部の実施形態では、ナノ粒子は、両親媒性ポリマー対疎水性ポリマーの約５０／５０重量比、または親水性ポリマーよりも多くの両親媒性ポリマーを含む比、例えば、約２０／８０比、約３０／７０比、約４０／６０比、約５５／４５比、約６０／４０比、約６５／４５比、約７０／３０比、約７５／３５比、約８０／２０比、約８５／１５比、約９０／１０比、約９５／５比、約９９／１比、または約１００％の両親媒性ポリマーを含む。
【００６４】
複数の実施形態では、疎水性ポリマーは、ＰＬＧＡ、例えば、ＰＬＧＡ−ＣＯＯＨまたはＰＬＧＡ−ＯＨを含む。複数の実施形態では、両親媒性ポリマーは、ＰＬＧＡおよびＰＥＧ、例えばＰＬＧＡ−ＰＥＧを含む。両親媒性ポリマーは、分枝状親水性部分を有する樹枝状ポリマーであってもよい。分枝状ポリマーは、２つ以上の末端を有するため、分枝状親水性ポリマー尾部の末端に２つ以上の部分が結合できる可能性がある。
【００６５】
本明細書に記載のナノ粒子は、任意の適切なサイズを有することができる。一部の実施形態では、ナノ粒子の平均直径は、約５００ｎｍ以下、例えば約２５０ｎｍ以下または約２００ｎｍ以下である。典型的には、ナノ粒子の平均直径は、約５ｎｍ以上である。一部の実施形態では、ナノ粒子の平均直径は、約１０ｎｍ〜約３００ｎｍ、例えば約２０ｎｍ〜約１００ｎｍまたは約３０ｎｍ〜約７０ｎｍである。
【００６６】
ＩＩ．コアを包囲する親水性層
本明細書に記載のナノ粒子は、任意選択的に、疎水性コアを包囲する親水性層を含むことができる。親水性層は、ナノ粒子が免疫系による認識を回避することを促進することができ、ナノ粒子の血液循環半減期を延長させることができる。
【００６７】
上記に示すように、親水性層は、疎水性ブロックと親水性ブロックを有するブロックコポリマーなどの両親媒性ポリマーの親水性部分によって、全体的にまたは部分的に形成することができる。
【００６８】
任意の適切な親水性ポリマーまたは両親媒性ポリマーの親水性部分は、親水性層またはその一部を形成することができる。親水性ポリマーまたはポリマーの親水性部分は、直鎖状または分枝状または樹枝状であってもよい。適切な親水性ポリマーの例としては、多糖類、デキストラン、キトサン、ヒアルロン酸、ポリエチレングリコール、ポリメチレンオキシド等が挙げられる。
【００６９】
一部の実施形態では、ブロックコポリマーの親水性部分はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。複数の実施形態では、ブロックコポリマーは、ＰＬＧＡを含む疎水性部分とＰＥＧを含む親水性部分を含む。
【００７０】
親水性ポリマーまたはポリマーの親水性部分は、緩衝生理食塩水、例えば、ｐＨが約７．４のリン酸塩またはクエン酸塩の緩衝生理食塩水等により近似できる生理的条件下で荷電する部分を含有することができる。種々の実施形態では、親水性ポリマーまたはポリマーの親水性部分は、生理学的な水性環境に置かれると、酸素アニオンを生じ得るヒドロキシル基を含む。例えば、ポリマーは、ＯＨが生理的条件下で荷電した部分として機能するＰＥＧ−ＯＨを含むことができる。
【００７１】
生理的条件下で荷電する部分は、ナノ粒子の電荷密度またはゼータ電位に寄与する可能性がある。ゼータ電位は、コロイド系における界面動電位に関する用語である。ゼータ電位は、直接測定することはできないが、電気泳動度、動的電気泳動度等を使用して実験的に決定することができる。
【００７２】
本明細書に記載のナノ粒子は、任意の適切なゼータ電位を有することができる。種々の実施形態では、本明細書に記載のナノ粒子は、正のゼータ電位を有する。例えば、ナノ粒子のゼータ電位は、約５ｍＶ以上であり得る。一部の実施形態では、本明細書に記載のナノ粒子のゼータ電位は、約３０ｍＶ；例えば、約２０ｍＶ〜約４０ｍＶである。
【００７３】
ＩＩＩ．治療剤
本明細書に記載のナノ粒子は、ミトコンドリア標的化Ｐｔ（ＩＶ）プロドラッグに加えて任意の１つまたは複数の治療剤を含むことができる。１つまたは複数の治療剤は、ナノ粒子のコアの中に埋め込むこともコアの内部に含有することもできる。好ましくは、１つまたは複数の治療剤は、所望の速度でコアから放出される。コアが公知の放出速度を有するポリマー（ＰＬＧＡなど）またはポリマーの組合せから形成される場合、放出速度は容易に制御することができる。
【００７４】
複数の実施形態では、治療剤またはその前駆体は、標的化部分に関する上記の方法で、ポリマーまたはナノ粒子の他の成分にコンジュゲートされる。治療剤は、切断可能なリンカーを介してコンジュゲートすることができる。
【００７５】
治療剤は、任意の適切な濃度でナノ粒子中に存在させることができる。例えば、治療剤は、ナノ粒子の約０．０１重量％〜約３７重量％の濃度でナノ粒子中に存在させることができる。
【００７６】
種々の実施形態では、ナノ粒子は、１つまたは複数の化学療法剤を含む。本明細書で使用する場合、「化学療法剤」は、癌の処置のための薬剤、例えば、細胞傷害性薬剤または抗新生物剤である。任意の適切な化学療法剤を、本明細書に記載のナノ粒子中に含むことができる。化学療法剤の例としては、（ｉ）アルキル化剤、例えば、シクロホスファミド、メクロレタミン、クロランブシル、メルファラン等；（ｉｉ）アントラサイクリン類、例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、バルルビシン等；（ｉｉｉ）細胞骨格破壊剤、例えば、パクリタキセル、ドセタキセル等；（ｉｖ）エポチロン類、例えば、エポチロン等；（ｖ）ヒストンデアクチラーゼ (deactylase)阻害剤、例えば、ボリノスタット、ロミデプシン等；（ｖｉ）トポイソメラーゼＩ阻害剤、例えば、イリノテカン、トポテカン等；（ｖｉｉ）阻害剤またはトポイソメラーゼＩＩ (inhibitors or topoisomerase II)、例えば、エトポシド、テニポシド、タフルポシド等；（ｖｉｉｉ）キナーゼ阻害剤、例えば、ボルテゾミブ、エルロンチブ (erlontib)、ゲフィチニブ、イマチニブ、ベルムラフェニブ (vermurafenib)、ビスモデギブ、ビスモデギブ等；（ｉｘ）モノクローナル抗体、例えば、ベバシズマブ、セツキシマブ、イピリムマン (ipilimuman)、オファツムマブ、オクレリズマブ、パニツマブ(panitumab)、リツキシマブ等；（ｘ）ヌクレオチドアナログおよび前駆体アナログ、例えば、アザシチジン、アザチオプリン、カペシタビン、シタラビン、ドキシフルリジン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、メルカプトプリン、メトトレキセート、チオグアニン等；（ｘｉ）ペプチド系抗生物質、例えば、ブレオマイシン、アクチノマイシン等；（ｘｉｉ）白金ベースの薬剤、例えば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン等；（ｘｉｉｉ）レチノイド類、例えば、トレチノイン、アリトレチノイン、ベキサロテン等；（ｘｉｖ）ビンカアルカロイド類および誘導体、ビンブラスチン、ビンクリスチン、シンデシン(cindesine)、ビノレルビン等；ならびに（ｘｖ）その他同種のものが挙げられる。一部の実施形態では、１つまたは複数の化学療法剤の少なくとも１つは、ドセタキセル、ミトキサントロン、パクリタキセル、サトラプラチン、およびシスプラチンからなる群から選択される。
【００７７】
ＩＶ．標的化部分
ａ．癌標的化部分
本明細書に記載のナノ粒子は、任意選択的に、癌細胞にナノ粒子を標的化する１つまたは複数の部分を含むことができる。本明細書で使用する場合、癌細胞へのナノ粒子の「標的化」は、実質的に同様の非標的化ナノ粒子よりも高濃度で、他の細胞に比較して標的化された癌の中／上／近傍にナノ粒子が蓄積することを意味する。実質的に同様の非標的化ナノ粒子は、標的化ナノ粒子と実質的に同じ相対濃度（例えば、約５％以内）で同じ成分を含むが、標的化部分を欠いている。
【００７８】
癌標的化部分は、コアの一部を形成する分子またはコアに結合した分子への結合など、任意の適切な方法でコアに繋留することができる。一部の実施形態では、標的化部分は、コアの一部を形成する疎水性ポリマーに結合した親水性ポリマーに結合している。種々の実施形態では、標的化部分は、コアの一部を形成する疎水性ブロックを有するブロックコポリマーの親水性部分に結合している。
【００７９】
標的化部分は、ポリマーの任意の適切な部分に結合させることができる。一部の実施形態では、標的化部分は、ポリマーの末端に結合している。種々の実施形態では、標的化部分は、ポリマーの末端以外の位置で、ポリマーの骨格または骨格に結合した分子に結合している。２つ以上の標的化部分を所与のポリマーに結合させることができる。複数の実施形態では、ポリマーは複数の末端を有する樹枝状ポリマーであり、２つ以上の末端に標的化部分を結合させることができる。
【００８０】
標的化部分が結合しているポリマーまたはその一部は、適切な官能基を有するかまたは有するように修飾された標的化部分と反応して結合するための適切な官能基、例えば、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ2、−ＳＨ、−Ｎ3、−Ｂｒ、−Ｃｌ、−Ｉ、−ＣＨ＝ＣＨ2、Ｃ≡ＣＨ、−ＣＨＯ等を含有することができるかまたは含有するように修飾することができる。
【００８１】
標的化部分は、任意の適切な濃度でナノ粒子中に存在させることができる。ｉｎ  ｖｉｖｏの試験または使用の前に、初期のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析に基づいて濃度を変動させて容易に最適化することができることは理解されよう。一部の実施形態では、標的化部分の表面被覆率は、約５％〜約１００％になる。
【００８２】
好ましくは、標的化部分は、ナノ粒子のコアから伸びて標的化部分の効果を促進するように、親水性ポリマーまたはポリマーの親水性部分に結合している。種々の実施形態では、標的化部分はＰＥＧに結合している。
【００８３】
任意の適切な癌標的化部分を、本明細書に記載のナノ粒子に結合させることができる。癌標的化部分の例としては、癌細胞に選択的であるか、または過剰発現しているか、アップレギュレートされているか、もしくは非癌細胞中には見出すことのない量で存在している細胞表面抗原またはマーカーに結合する部分が挙げられる。
【００８４】
ｂ．ミトコンドリア標的化部分
複数の実施形態では、ナノ粒子はミトコンドリア標的化部分を含む。アポトーシスをモニターするための任意の適切な部分をナノ粒子に組み込むことができる。使用することができるミトコンドリア標的化部分の例は、例えば、ＡＰＯＰＴＯＳＩＳ−ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ  ＮＡＮＯＰＡＲＴＩＣＬＥＳという名称であり、２０１３年３月７日に公表された国際公開第２０１３／０３３５１３Ａｌ号パンフレットに記載されている。複数の実施形態では、ミトコンドリア標的化部分は、ミトコンドリア基質へのナノ粒子の蓄積を促進する部分である。
【００８５】
ミトコンドリア基質内へのナノ粒子の蓄積を促進するための任意の適切な部分を使用することができる。ミトコンドリア内膜を横切って維持される実質的な負の電気化学ポテンシャルにより、非局在化した親油性カチオンは、疎水性膜の横断およびミトコンドリア基質への蓄積において効果的である。トリフェニルホスホニウム（ＴＰＰ）含有化合物は、ミトコンドリア基質内に１０〜１０，０００倍超蓄積することができる。任意の適切なＴＰＰ含有化合物を、ミトコンドリア基質標的化部分として使用することができる。ＴＰＰベースの部分の代表的な例は、式ＸＩＩ、式ＸＩＩＩ、または式ＸＩＶで下記に示す構造：
【化１５】
2017516755.tif 000017
【化１６】
2017516755.tif 000018
を有することができる。ここで、（示されている）アミンは、ナノ粒子に組み込むために、ポリマー、脂質等にコンジュゲートさせることができる。
【００８６】
複数の実施形態では、ミトコンドリア基質に標的化するための非局在化した親油性カチオンは、ローダミンカチオン、例えば、下記に示す式ＸＶ：
【化１７】
2017516755.tif 000019
を有するローダミン１２３である。ここで、（示されている）二級アミンは、ナノ粒子に組み込むために、ポリマー、脂質等にコンジュゲートさせることができる。
【００８７】
当然のことながら、非カチオン性化合物は、ミトコンドリア基質を標的化し、その中に蓄積するように機能することができる。例として、Ｓｚｅｔｏ−Ｓｈｉｌｌｅｒペプチドは、ミトコンドリア基質を標的化し、その中にナノ粒子を蓄積するように機能することができる。任意の適切なＳｚｅｔｔｏ−Ｓｈｉｌｌｅｒペプチドを、ミトコンドリア基質標的化部分として使用することができる。適切なＳｚｅｔｏ−Ｓｈｉｌｌｅｒペプチドの非限定例としては、下記に示す式ＸＶＩおよび式ＸＶＩＩ：
【化１８】
2017516755.tif 000020
をそれぞれ有するＳＳ−０２およびＳＳ−３１が挙げられる。ここで、（示されている）二級アミンは、ナノ粒子に組み込むために、ポリマー、脂質等にコンジュゲートさせることができる。
【００８８】
例として、ジステアロイル−ｓｎグリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）−ＰＥＧ−ＴＰＰの合成のための反応スキームを下記にスキーム４で示す。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＴＰＰを合成するために他のスキームを使用することができること、およびＤＳＰＥ−ＰＥＧに他のミトコンドリア標的化部分を繋留するために、またはナノ粒子に標的化部分を組み込むための他のポリマー、コポリマー、または脂質に部分を繋留するために同様の反応スキームを使用することができることを理解されよう。
【化１９】
2017516755.tif 000021
【００８９】
Ｖ．ナノ粒子の合成
本明細書に記載のナノ粒子は、任意の適切なプロセスにより合成または構築することができる。好ましくは、ナノ粒子は、プロセスの変動を最小限に抑えるために、一段階で構築される。一段階プロセスはナノ沈殿および自己集合を含むことができる。
【００９０】
一般に、ナノ粒子は、有機溶媒、好ましくは沈殿のために使用される水性溶媒に混和可能な溶媒の中に疎水性成分を溶解または懸濁することにより合成または構築することができる。複数の実施形態では、有機溶媒としてアセトニトリルを使用するが、例えば、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトン等の任意の適切な溶媒を使用してもよい。親水性成分は、例えば水、４重量％エタノール等の適切な水性溶媒中に溶解される。有機相溶液を水相溶液に滴下して加えて、疎水性成分をナノ沈殿させ、水性溶媒中でナノ粒子の自己集合を可能にすることができる。
【００９１】
ナノ粒子形成のための適切な条件を決定するプロセスは、以下のように行うことができる。手短に言えば、機能を有するポリマーおよび他の成分を、それらが含まれている場合または必要に応じて、有機溶媒混合物中に同時溶解させることができる。この溶液を、高温（例えば、６５℃）の水性溶媒（例えば、水、４重量％エタノール等）に滴下して加えることができ、その後、溶媒を蒸発させて、ＰＥＧなどの親水性ポリマー成分により包囲された疎水性コアを有するナノ粒子を生成させる。いったん、所望のレベルの標的化部分表面負荷（存在する場合）が達成される一連の条件が得られたならば、ナノ沈殿中およびナノ粒子の自己集合中に、治療剤を含ませることができる。
【００９２】
手動混合により結果を所望どおりに再現することができない場合、ミクロ流体チャネルを使用してもよい。
【００９３】
ナノ粒子は、周知または公表の方法を使用して、そのサイズ、電荷、安定性、薬物負荷、薬物放出カイネティクス、表面形状、および安定性について特性評価を行うことができる。
【００９４】
ナノ粒子の特性は、（ａ）ポリマー溶液の組成を制御すること、および（ｂ）混合時間、温度、および水対有機溶媒の比などの混合条件を制御することによって、制御することができる。ナノ粒子特性の変動の可能性は、合成に必要とされるプロセス段階の数と共に増大する。
【００９５】
生成するナノ粒子のサイズは、疎水性コア成分対両親媒性シェル成分の比を変えることによって変動させることができる。ナノ粒子のサイズはまた、ポリマー長を変えることによって、混合時間を変えることによって、また有機相対その相の比を調節することによって制御することができる。種々の長さのＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧによるナノ粒子に関する以前の経験から、ナノ粒子のサイズは、短いポリマー（例えば、ＰＬＧＡ3000〜ＰＥＧ750）についての最小約２０ｎｍから長いポリマー（例えば、ＰＬＧＡ100,000〜ＰＥＧ10,000）についての最大約１５０ｎｍまで増大することが示唆されている。したがって、ポリマーの分子量は、サイズを調節するのに役立つことになる。
【００９６】
ナノ粒子の表面電荷は、適切に荷電した末端基を有するポリマーを混合することによって制御することができる。加えて、組成および表面化学は、種々の親水性ポリマー長のポリマー、分枝状親水性ポリマーを混合することによって、または疎水性ポリマーを加えることによって制御することができる。
【００９７】
ナノ粒子は、いったん形成されれば、遠心分離、遠心限外濾過等により収集および洗浄することができる。凝集が生じる場合には、ナノ粒子について、透析による精製、低速での長時間遠心分離による精製、界面活性剤の使用による精製等を行うことができる。
【００９８】
いったん収集されれば、いかなる残存溶媒も除去することができ、また粒子を乾燥させることができるが、これは、成分のいかなる時期尚早の分解または放出も最小限に抑えることを促進する。ナノ粒子は、マンニトールなどの増量剤の使用と共に凍結乾燥することも、またはそうでなければ使用前の保存用に調製することもできる。
【００９９】
治療剤は、その溶解性に応じて、有機相に入れることも水相に入れることも可能であることは理解されよう。
【０１００】
本明細書に記載のナノ粒子は、ナノ粒子中に包含するのに適していると当技術分野で一般に知られているかまたは理解されている他の適切な成分、例えば、リン脂質またはコレステロール成分を含むことができる。ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１２／０５３３０７号明細書は、ナノ粒子に包含され得るいくつかの追加の成分について記載している。
【０１０１】
ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１２／０５３３０７号明細書に開示されたナノ粒子は、ホスファチジルセリン（ＰＳ）を標的化する部分など、アポトーシス細胞にナノ粒子を標的化する標的化部分を含む。標的化部分は、ナノ粒子の成分にコンジュゲートしている。そのような部分には、種々のポリペプチドまたは亜鉛２，２’−ジピコリルアミン（Ｚｎ2+−ＤＰＡ）配位錯体が含まれる。複数の実施形態では、本明細書に記載のナノ粒子は、アポトーシス細胞標的化部分を含まないかまたは実質的に含まない。複数の実施形態では、本明細書に記載のナノ粒子は、ナノ粒子の成分にコンジュゲートしたアポトーシス細胞標的化部分を含まないかまたは実質的に含まない。複数の実施形態では、本明細書に記載のナノ粒子は、ＰＳ標的化部分を含まないかまたは実質的に含まない。複数の実施形態では、本明細書に記載のナノ粒子は、ナノ粒子の成分にコンジュゲートしたＰＳ標的化部分を含まないかまたは実質的に含まない。複数の実施形態では、本明細書に記載のナノ粒子は、ＰＳ−ポリペプチド標的化部分もＺｎ2+−ＤＰＡ部分も含まないかまたは実質的に含まない。複数の実施形態では、本明細書に記載のナノ粒子は、ナノ粒子の成分にコンジュゲートしたＰＳ−ポリペプチド標的化部分もＺｎ2+−ＤＰＡ部分も含まないかまたは実質的に含まない。
【０１０２】
ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１２／０５３３０７号明細書に開示されたナノ粒子は、ナノ粒子の成分にコンジュゲートした、単糖などのマクロファージ標的化部分を含む。複数の実施形態では、本明細書に記載のナノ粒子は、マクロファージ標的化部分を含まないかまたは実質的に含まない。複数の実施形態では、本明細書に記載のナノ粒子は、ナノ粒子またはその成分にコンジュゲートしたマクロファージ標的化部分を含まないかまたは実質的に含まない。複数の実施形態では、本明細書に記載のナノ粒子は、単糖部分を含まないかまたは実質的に含まない。複数の実施形態では、本明細書に記載のナノ粒子は、ナノ粒子またはその成分にコンジュゲートした単糖部分を含まないかまたは実質的に含まない。
【０１０３】
Ｃ．プロドラッグまたはナノ粒子の使用
本明細書に記載のＰｔ（ＩＶ）プロドラッグまたはＰｔ（ＩＶ）プロドラッグを含むナノ粒子は、任意の適切な目的のために使用することができる。一部の実施形態では、Ｐｔ（ＩＶ）プロドラッグまたはＰｔ（ＩＶ）プロドラッグを含むナノ粒子は、癌、増殖性疾患、ミトコンドリア病、ＣＮＳ疾患、または炎症性疾患を有するか、罹患しているか、またはそのリスクがある被験体を処置するために使用される。
【０１０４】
「癌を有する被験体の処置」は、以下の１つまたは複数を部分的にまたは実質的に達成することを含む：癌の増殖または拡散の阻止、癌の範囲の縮小（例えば、腫瘍サイズの縮小または冒された部位の数の低減）、癌の増殖速度の抑制、および癌に関連した臨床症状または指標（組織または血清成分など）の寛解または改善。
【０１０５】
有効量のＰｔ（ＩＶ）プロドラッグまたはＰｔ（ＩＶ）プロドラッグを含むナノ粒子は、炎症性疾患を処置するために被験体に投与することができる。処置することができる炎症性疾患としては、限局性または全身性の炎症反応の一方または両方によって特徴付けられる疾患、例えば、消化管およびその関連組織を含む疾患（例えば、虫垂炎、消化性、胃、および十二指腸の潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍性、偽膜性、急性、および虚血性の大腸炎、炎症性腸疾患、憩室炎、喉頭蓋炎、無弛緩症、胆管炎、セリアック病、胆嚢炎、肝炎、クローン病、腸炎、ならびにウィップル病）；全身性または局所性の炎症性疾患または病態（例えば、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、免疫複合体疾患、臓器虚血、再潅流障害、臓器壊死、枯草熱、敗血症（ｓｅｐｓｉｓ）、敗血症（ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）、内毒素ショック、悪液質、異常高熱症、好酸球性肉芽腫、肉芽腫症、およびサルコイドーシス）；泌尿生殖系およびその関連組織を含む疾患（例えば、敗血性流産、精巣上体炎、膣炎、前立腺炎、および尿道炎）；呼吸器およびその関連組織を含む疾患（例えば、気管支炎、肺気腫、鼻炎、嚢胞性線維症、成人呼吸窮迫症候群、肺臓炎、超微小火山性珪素塵肺（ｐｎｅｕｍｏｕｌｔｒａｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃｓｉｌｉｃｏｖｏｌｃａｎｏｃｏｎｉｏｓｉｓ）、肺胞炎、細気管支炎、咽頭炎、胸膜炎、および副鼻腔炎）；種々のウイルス（例えば、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルス、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、および疱疹）、細菌（例えば、播種性菌血症、デング熱）、真菌（例えば、カンジダ症）、ならびに原生動物および多細胞寄生生物（マラリア、フィラリア症、アメーバ症、および包虫嚢胞）による感染から発症する疾患；皮膚科疾患および皮膚の病態（例えば、熱傷、皮膚炎、皮膚筋炎、日焼け、蕁麻疹、疣贅、および膨疹）；心血管系およびその関連組織を含む疾患（例えば、血管炎、脈管炎、心内膜炎、動脈炎、アテローム性動脈硬化症、血栓静脈炎、心膜炎、心筋炎、心筋虚血症、うっ血性心不全、結節性動脈周囲炎、およびリウマチ熱）；中心または末梢神経系およびその関連組織を含む疾患（アルツハイマー病、脳膜炎、脳炎、多発性硬化症、脳梗塞、脳塞栓症、ギラン・バレー症候群、神経炎、神経痛、脊髄損傷、麻痺、およびブドウ膜炎）；骨、関節、筋肉、および結合組織の疾患（例えば、種々の関節炎および関節痛、骨髄炎、筋膜炎、パジェット病、痛風、歯周疾患、関節リウマチ、ならびに滑膜炎）；他の自己免疫および炎症性の障害（例えば、重症筋無力症、甲状腺炎、全身性エリトマトーデス、グッドバスチャー症候群、ベーチェット症候群、同種移植片拒絶、移植片対宿主疾患、Ｉ型糖尿病、強直性脊椎炎、ベルガー病、Ｉ型糖尿病を含む糖尿病、強直性脊椎炎、ベルガー病、およびライター症候群）；院内感染症；ならびに種々の癌、腫瘍、および増殖性障害（例えば、ホジキン病）が挙げられる。
【０１０６】
任意の適切なタイプの癌は、それを必要とする被験体に、有効量のＰｔ（ＩＶ）プロドラッグまたはＰｔ（ＩＶ）プロドラッグを含むナノ粒子を投与することにより処置することができる。それを必要とする被験体に、有効量のＰｔ（ＩＶ）プロドラッグまたはＰｔ（ＩＶ）プロドラッグを含むナノ粒子を投与することによって、処置または予防することができる癌としては、以下に限定されるものではないが、ヒトの肉腫および癌腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮細胞肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、結腸直腸癌、肛門癌、食道癌、胃癌、肝細胞癌、膀胱癌、子宮内膜癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、粘液腫、有棘細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、甲状腺および副甲状腺の腫瘍、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝細胞腫、胆管癌、絨毛膜癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、下垂体腫瘍、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、シュワン細胞腫、乏突起膠腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、黒色腫、神経芽細胞腫、褐色細胞腫、内分泌腫瘍症１型〜３型、網膜芽細胞腫；白血病、例えば、急性リンパ球性白血病および急性骨髄球性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、および赤血白血病）；慢性白血病（慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ球性白血病）；ならびに真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、および重鎖病が挙げられる。Ｐｔ（ＩＶ）プロドラッグまたはＰｔ（ＩＶ）プロドラッグを含むナノ粒子は、前立腺癌を有する被験体を処置するのに特に有効であり得ると考えられている。一部の実施形態では、有効量のＰｔ（ＩＶ）プロドラッグまたはＰｔ（ＩＶ）プロドラッグを含むナノ粒子は、去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）を処置するために被験体に投与される。
【０１０７】
有効量のＰｔ（ＩＶ）プロドラッグまたはＰｔ（ＩＶ）プロドラッグを含むナノ粒子は、非癌性増殖性障害を処置するために被験体に投与することができる。非癌性増殖障害としては、平滑筋細胞増殖、全身性硬化症、肝硬変、成人呼吸窮迫症候群、特発性心筋症、エリテマトーデス、網膜症、例えば、糖尿病性網膜症または他の網膜症、心臓過形成、良性前立腺肥大症および卵巣嚢胞などの生殖器系関連障害、肺線維症、子宮内膜症、線維腫症、過誤腫、リンパ管腫症、サルコイドーシス、類腱腫等が挙げられる。
【０１０８】
「有効量」とは、化合物またはナノ粒子が被験体に投与された場合に、有益な臨床成績が達成される化合物またはナノ粒子の量である。例えば、Ｐｔ（ＩＶ）プロドラッグまたはＰｔ（ＩＶ）プロドラッグを含むナノ粒子が癌の被検体に投与された場合、「有益な臨床成績」には、腫瘍体積の縮小、転移の低減、癌関連症状の重症度の低減、または処置しない場合と比較した被験体の寿命の延長が含まれる。
【０１０９】
被験体に投与される化合物またはナノ粒子の正確な量は、疾患または病態のタイプおよび重症度ならびに被験体の特性、例えば、健康状態、年齢、性別、体重、および薬物に対する認容性に依存することになる。それはまた、癌の程度、重症度、およびタイプにも依存することがある。当業者は、これらの因子および他の因子に応じて、適切な投与量を決定することができる。開示化合物の有効量は、１日当たり約１ｍｇ／ｍｍ2〜１日当たり約１０グラム／ｍｍ2の範囲に及び得る。癌を処置するための別の抗癌剤と同時投与される場合、第２の抗癌剤の「有効量」は、使用される薬物のタイプに依存することになる。適切な投与量は、承認された抗癌剤については公知であり、被験体の病態、処置されている癌のタイプ、および使用されているＰｔ（ＩＶ）プロドラッグまたはＰｔ（ＩＶ）プロドラッグを含むナノ粒子に応じて当業者が調節することができる。
【０１１０】
種々の実施形態では、Ｐｔ（ＩＶ）プロドラッグ、その互変異性体、薬学的に許容される塩、溶媒和物、またはクラスレート、あるいはＰｔ（ＩＶ）プロドラッグを含むナノ粒子、またはその互変異性体、薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくはクラスレートを、医薬組成物に含むことができる。医薬組成物は、化合物および薬学的に許容される担体または希釈剤を含むことができる。
【０１１１】
適切な薬学的に許容される担体は、好ましくはＰｔ（ＩＶ）プロドラッグの生物活性を阻害しない不活性成分を含有することができる。薬学的に許容される担体は、好ましくは、生体適合性のもの、すなわち、被験体への投与に際して、無毒、非炎症性、非免疫原性のものであり、かつ他の望ましくない反応のないものである。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａに記載のものなど、標準医薬品製剤技術を使用することができる。投与される化合物の製剤は、選択した投与ルートによって変えることになる（たとえば、溶液、エマルジョン、カプセル）。非経口投与に適した医薬担体には、たとえば、滅菌水、生理食塩水、静菌食塩水（約０．９％ｍｇ／ｍｌのベンジルアルコールを含有する食塩水）、リン酸緩衝生理食塩水、ハンクス溶液、乳酸リンゲル液などが含まれる。組成物の封入方法（固いゼラチンのコーティングまたはシクロデキストラン中など）は、当技術分野で公知である（Ｂａｋｅｒ，ｅｔ  ａｌ，“Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｅ  Ａｇｅｎｔｓ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９８６）。
【０１１２】
Ｐｔ（ＩＶ）プロドラッグまたはＰｔ（ＩＶ）プロドラッグを含むナノ粒子は、例えば、カプセル剤、懸濁剤、または錠剤での経口投与、または非経口投与によるものを含めて、任意の適切な経路により投与することができる。非経口投与には、例えば、筋肉内、静脈内、皮下、または腹腔内注射によるものなど、全身投与が含まれる。本発明の化合物はまた、処置される癌のタイプに応じて、経口的に（例えば、食餌）、局所的に、吸入（例えば、気管支内、鼻腔内、口腔内吸入、もしくは鼻腔内滴下）により、または経腸的に投与することができる。
【０１１３】
癌患者の処置に腫瘍専門医が使用する多くの新薬が現在入手可能である。多くの場合、抗癌剤が個々にかつ逐次的に投与される場合よりも、併用して患者に投与される場合の方が、処置に対する腫瘍の応答性がよい。この手法の１つの利点は、腫瘍細胞が複数の作用様式を有する薬剤で同時に攻撃されるため、抗癌剤が相乗的に作用することが多いことである。したがって、多くの場合、これらの薬剤を併用して投与することにより、腫瘍サイズのより迅速な縮小を達成することが可能である。併用化学療法の別の利点は、腫瘍が完全に根絶される可能性を高め、患者を処置するために使用されている抗癌剤に対する耐性を発現させる可能性を低下させることである。
【０１１４】
いかなるミトコンドリア病も本明細書に開示の化合物またはナノ粒子で処置することができる。処置することができるミトコンドリア病の例としては、ミトコンドリアミオパシー、糖尿病および聴覚障害、レーベル遺伝性視神経症、ウルフ・パーキンソン・ホワイト症候群、多発性硬化症、リー症候群、ニューロパシー、運動失調、色素性網膜炎および眼瞼下垂（ＮＡＲＰ）、筋神経胃腸脳症、赤色ぼろ線維・ミオクローヌスてんかん症候群（ＭＥＲＲＦ）等が挙げられる。
【０１１５】
Ｄ．定義
本明細書で使用する科学用語および専門用語はすべて、特に明記されない限り、当技術分野で一般に使用される意味を有する。本明細書に提供する定義は、本明細書で頻繁に使用される特定の用語についての理解を容易にするためであり、本開示の範囲を限定することを意味するものではない。
【０１１６】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用する場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、その内容が他に明示されない限り、複数の指示対象を有する実施形態も包含する。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用する場合、用語「または」は、一般には、その内容が他に明示されない限り、「および／または」を含めた意味で使用される。
【０１１７】
本明細書で使用する場合、「有する（ｈａｖｅ）」、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等は、オープンエンドの意味で使用され、一般には、「含むが、それに限定されない」を意味する。「から本質的になる」、「からなる」等は、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」に包含されることが理解されよう。
【０１１８】
本明細書で使用する場合、「疾患」は、正常な機能を損なう、生物またはその１つまたは複数の部分の状態を意味する。本明細書で使用する場合、疾患という用語は、疾患、障害、病態、機能障害等の用語を包含する。
【０１１９】
本明細書で使用する場合、「処置する」等は、疾患の１つまたは複数の症状を治癒、予防、または寛解することを意味する。
【０１２０】
本明細書で使用する場合、「疎水性」である化合物は、水に不溶であるか、１ミリグラム／リットル未満の水溶解性を有する化合物である。
【０１２１】
本明細書で使用する場合、「親水性」である化合物は、水溶性であるか、１ミリグラム／リットルを超える水溶解性を有する化合物である。
【０１２２】
本明細書で使用する場合、「結合する（ｂｉｎｄ）」、「結合している（ｂｏｕｎｄ）」等は、化学実体が任意の適切なタイプの結合、例えば、共有結合、イオン結合、水素結合、ファンデルワールス力等により連結されていることを意味する。「結合する」、「結合している」等は、本明細書において、「結合する（ａｔｔａｃｈ）」、「結合している（ａｔｔａｃｈｅｄ）」等と互換的に使用される。
【０１２３】
本明細書で使用する場合、ナノ粒子のコアに「結合している」分子または部分は、コア中に埋め込まれているか、コア内部に含有されているか、コアの少なくとも一部を形成する分子に結合しているか、コアに結合した分子に結合しているか、またはコアに直接結合している場合がある。
【０１２４】
ＶＩＩＩ．参照による組み込み
本明細書に引用の特許、公表された特許出願、仮特許出願、および非特許文献のそれぞれは、本開示と矛盾しない範囲でその個々の内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２５】
以下において、代表的なナノ粒子の種々の実施形態、ナノ粒子を生成するための方法、およびナノ粒子を使用するための方法について記載する非限定例を提示する。
【実施例】
【０１２６】
ミトコンドリア標的化シスプラチンプロドラッグの構築。ミトコンドリア標的化シスプラチンアナログは、耐性の克服のために、また可能性としてシスプラチン媒介性ミトコンドリア毒性を理解するために極めて有益になり得る。ミトコンドリア標的化Ｐｔ（ＩＶ）−シスプラチンのプロドラッグであるプラチンＭは、２つのミトコンドリア標的化非局在化親油性ＴＰＰカチオンをアキシャル位に導入することにより設計した。
【０１２７】
Ｐｔ（ＩＶ）プロドラッグは、その安定性の増大および標的部位で活性薬の割合を高めることができる局所活性化のために、Ｐｔ（ＩＩ）対応物よりも有利である。置換に対して不活性であることは、Ｐｔ（ＩＶ）錯体が、予め不活性化しているため、副作用および薬物消失の低下を少なくするために重要な役割を果たす。
【０１２８】
呼吸を含むミトコンドリアの機能は、癌細胞では大幅に低下しており、腫瘍微小環境は、正常組織とは大幅に異なる。ほとんどの癌細胞のミトコンドリア膜電位（ΔΨm）は、正常細胞と比較して大きい。したがって、ＴＰＰカチオン含有プラチンＭは、いったんプロドラッグがＮＰから放出されると、基質の内部に効率的に蓄積するように、ミトコンドリア内膜（ＩＭＭ）を横切る実質的な負のΔΨmを利用することになる（図１）。
【０１２９】
プラチンＭの合成戦略を図２に示す。ＴＰＰ配位子との通常のカップリング反応は、Ｐｔ（ＩＶ）の還元のために問題があることが見出された。本発明者らは、最近、銅（Ｉ）ベースのクリックケミストリーもＰｔ（ＩＶ）の還元をもたらし得ることに留意することにより、Ｐｔ（ＩＶ）に数多くの機能性を高効率に導入するための付加環化法を開発した。ＴＰＰ部分をジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）誘導体に導入してＤＢＣＯ−ＴＰＰを得た（図２、図Ｓ１〜Ｓ４）。本発明者らにより最近開発されたアジド−Ｐｔ（ＩＶ）前駆体プラチンＡｚ（Ｐａｔｈａｋ，Ｒ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｅｍ  Ｅｕｒ  Ｊ  ＤＯＩ：１０．１００２／ｃｈｅｍ．２０１４０２５７３）とＤＢＣＯ−ＴＰＰとの間の歪み促進アルキン−アジド付加環化（ＳＰＡＡＣ）反応により、プラチンＭを高効率で得た（図２）。プロドラッグプラチンＭは、微量分析および分光学的手法を使用して特性評価した（図Ｓ５〜Ｓ１０）。Ｐｔ（ＩＶ）プロドラッグの実行可能な細胞還元が、活性なシスプラチンを放出するために必要とされる。生物学的に関連のある２つの異なるｐＨ値７．４および６．０で行った電気化学的試験から、プラチンＭが細胞の環境で活性なシスプラチンを放出することが実証された（データを示さず）。
【０１３０】
プラチンＭのためのミトコンドリア標的化ＮＰの開発。小分子、特にＰｔベースの治療剤は、不十分な生体内分布（ｂｉｏＤ）および薬物動態（ＰＫ）の特性、迅速なクリアランス、ならびに細胞の標的に到達する前の生物学的な求核剤による不活性化を示す。本発明者らは、ミトコンドリア標的化Ｐｔ（ＩＶ）プロドラッグのプラチンＭは、その当初の形態で投与された場合、同様な課題に直面し、そのため所望のミトコンドリア標的化が低減すると予想した。生分解性ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）−ブロック（ＰＬＧＡ−ｂ）−ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）ブロックコポリマーで構成される自己集合ポリマーナノ粒子は、小分子の担体として有望と考えられる。しかしながら、細胞のミトコンドリアへのプラチンＭの送達を成功させることができるＮＰ系は困難であり得る。
【０１３１】
本発明者らは、最近、トリブロックコポリマーＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＴＰＰに由来する改変ＮＰ系を開発し、小分子のミトコンドリア送達に最適化した製剤を特定した。本発明者らは、以前に報告したＮＰをさらに改変すると、より良好なｂｉｏＤ、ＰＫ、およびｍｔＤＮＡが位置するミトコンドリア基質へのプラチンＭの蓄積の増大が示され得ると予測した。本発明者らは、プラチンＭの制御放出のために効率的にミトコンドリアに分布させる目的で、２つのトリブロックコポリマーＰＬＧＡLMW−ｂ−ＰＥＧ−ＴＰＰ（データを示さず）およびＰＬＧＡHMW−ｂ−ＰＥＧ−ＴＰＰ（データを示さず）をそれぞれ、低分子量および高分子量のＰＬＧＡポリマーをベースに構築した（図２）。本発明者らは、異なる分子量のポリマーに由来するＮＰの改変により、種々のミトコンドリアコンパートメント、ミトコンドリア外膜（ＯＭＭ）、ＩＭＭ、膜間腔（ＩＭＳ）、およびミトコンドリア基質へのＮＰ分布に対して制御すること、さらにこれらのＮＰからのプラチンＭの放出カイネティクスを制御することが可能になると予測した。
【０１３２】
本発明者らの以前の報告から、本発明者らは、共焦点顕微鏡検査および全ミトコンドリア画分における誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰＭＳ）により、ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＴＰＰベースのＮＰがミトコンドリアに優先的に蓄積することを知っている。異なるミトコンドリアコンパートメントへのＮＰの分布特性をさらに理解するために、本発明者らは、ＰＬＧＡHMW−ｂ−ＰＥＧ−ＴＰＰおよびＰＬＧＡLMW−ｂ−ＰＥＧ−ＴＰＰに由来するＮＰで処理した前立腺癌ＰＣ３細胞から単離したミトコンドリアをＯＭＭ、ＩＭＭ、ＩＭＳ、およびミトコンドリア基質の画分に分画した。本発明者らは、異なる細胞および細胞内コンパートメントにおける両方のＮＰを定量するために、両方のＮＰにＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ量子ドット（ＱＤ）を１０％組み込んだ。ＩＣＰ−ＭＳによるＣｄ定量およびサイトゾル、ＩＭＭ、ＯＭＭ、ＩＭＳ、およびミトコンドリア基質のｉｎ  ｖｉｖｏイメージングシステム（ＩＶＩＳ）を使用するイメージングから、ＰＬＧＡLMW−ｂ−ＰＥＧ−ＴＰＰ由来のＮＰは、ミトコンドリア基質に最も効率的に分布し、ＰＬＧＡHMW−ｂ−ＰＥＧ−ＴＰＰ由来のＮＰは、主としてＯＭＭに分布することが示された（図３Ａ）。したがって、本発明者らは、さらなる試験すべてについて、ミトコンドリア内部にプラチンＭを効率的に送達するためにＰＬＧＡLMW−ｂ−ＰＥＧ−ＴＰＰベースのＮＰを使用した。
【０１３３】
Ｔ−ＮＰのミトコンドリア毒性。本発明者らは、次に、ＴＰＰ分子を含有する空の標的化ＮＰ（Ｔ−ＮＰ）がミトコンドリアに入った後に何らかの有害作用を示すか否かを試験した。多くのＴＰＰベースの小分子は、ΔΨmを破壊し、ＯＸＰＨＯＳを脱共役し、ミトコンドリアの呼吸を阻害すると記載されていた。前臨床のミトコンドリア毒性試験は、高い陽性的中率になり得る。本発明者らは、ミトコンドリア毒性の尺度として、前立腺癌（ＰＣａ）ＰＣ３細胞およびシスプラチン耐性卵巣癌Ａ２７８０／ＣＰ７０細胞のミトコンドリア呼吸における、空のＴ−ＮＰ、空の非標的化ＮＰ（ＮＴ−ＮＰ）、およびＤＢＣＯ−ＴＰＰによる誘導変化を調べた（図３Ｂ）。細胞の酸素消費速度（ＯＣＲ）は、正常なミトコンドリア機能の重要な指標である。したがって、ＯＣＲは、ＴＰＰ誘導ミトコンドリア毒性を検討するためのパラメーターとして使用することができる。空のＴ−ＮＰ、空のＮＴ−ＮＰ、およびＤＢＣＯ−ＴＰＰの存在下における、ＰＣ３細胞およびＡ２７８０／ＣＰ７０細胞のミトコンドリア生体エネルギー機能を、ＸＦ２４細胞外フラックスアナライザーを使用して評価した。
【０１３４】
両方の細胞株を、空のＴ−ＮＰ（０．５ｍｇ／ｍＬ）、空のＮＴ−ＮＰ（０．５ｍｇ／ｍＬ）、およびＤＢＣＯＴＰＰ（１０μΜ）で１２時間処理した後、処理剤を洗い流して、新鮮な培地に戻した。１２時間後、ＯＣＲを測定し、代謝調節剤であるオリゴマイシン、カルボニルシアニド４−（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）、アンチマイシンＡ、およびロテノンの効果から、ミトコンドリア機能の複数のパラメーターを決定することができた（図３Ｂ）。空のＴ−ＮＰおよびＤＢＣＯ−ＴＰＰでは、処理した細胞の基礎ＯＣＲおよびＡＴＰ産生に連結したＯＣＲに何ら変化が示されなかった。ミトコンドリア呼吸に連結したいくつかのパラメーター；予備呼吸容量、共役効率、基礎呼吸、ＥＴＣアクセラレーター応答、およびＡＴＰカップラー応答は、図３ＢのＯＣＲ（ｐＭｏｌｅ／分）対時間（分）トレースから算出した。ＡＴＰシンターゼ阻害剤オリゴマイシンは、これらの細胞においてＴ−ＮＰがミトコンドリア内部に蓄積したときのミトコンドリア共役を評価するために注入した。
【０１３５】
ＡＴＰシンターゼによるプロトンフラックスが阻害されると、リン酸化呼吸が停止し、残存する酸素消費は主としてＩＭＭを横切るプロトン漏出によるものとなる。オリゴマイシンは、健常細胞ならびに空のＴ−ＮＰおよびＤＢＣＯ−ＴＰＰ処理細胞において、同レベルにＯＣＲを低下させ（図３Ｂ）、ミトコンドリアは依然として共役されていることが示された。次に、本発明者らは、最大呼吸容量を調べるために、Ｈ＋イオノフォアおよび酸化的リン酸化の脱共役剤であるＦＣＣＰを注入した。ＦＣＣＰは、ＩＭＭを横切るプロトン勾配を消失させ、酸化的リン酸化による電子伝達を脱共役させるため、ＦＣＣＰの存在下では、ＯＣＲは、ＥＴＣおよび基質供給に支援された最大限まで増大する。健常ならびに空のＴ−ＮＰおよびＤＢＣＯ−ＴＰＰにおけるＦＣＣＰによる呼吸の刺激が同程度であることから、生体エネルギー機能は、処理細胞でも十分維持されていることが示された。健常細胞ならびに空のＴ−ＮＰおよびＤＢＣＯ−ＴＰＰ処理細胞における、ロテノン、複合体Ｉ阻害剤およびアンチマイシンＡ、複合体ＩＩＩ阻害剤の添加によるミトコンドリアフラックスの完全な阻害から、同様レベルのミトコンドリア呼吸および非ミトコンドリア呼吸が示された。まとめると、これらのデータから、いくつかのＴＰＰ含有Ｔ−ＮＰは極めて効率的にミトコンドリア基質に入るが、これらのＮＰはミトコンドリア阻害または毒性を少しも引き起こさないことが示唆された。この特性は、Ｔ−ＮＰを、ミトコンドリア内部に治療剤を送達するのに適したものにする。ＤＢＣＯ−ＴＰＰは、その低毒性により、プラチンＭの構築に適した配位子であることが示された。
【０１３６】
心臓細胞が過分極したミトコンドリアを含有することに留意して、本発明者らは、心筋細胞において、空のＴ−ＮＰを蓄積するミトコンドリアの毒性を注視した（データを示さず）。培養初代心筋細胞は、心臓の代謝能を試験するための価値あるツールである。単離心筋細胞の主要な制限は、それらが脆弱で単離するのが困難であることである。したがって、本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルとして胎仔ラットの心室Ｈ９Ｃ２に由来する市販の筋原細胞株を使用した。０．５ｍｇ／ｍＬの空のＴ−ＮＰおよび空のＮＴ−ＮＰによる１２時間処理後の心筋細胞に対する、前に記載したミトコンドリア阻害剤を使用するミトコンドリア機能アッセイでは、これらの細胞の基礎ＯＣＲレベルはあまり影響を受けなかった（データを示さず）。しかしながら、心筋細胞の基礎ＯＣＲレベルが、顕著なミトコンドリア過分極を示す他の細胞に比較して低いことに注目すべきである。基礎呼吸、共役効率、予備呼吸容量などのパラメーターはいずれも、Ｔ−ＮＰまたはＮＴ−ＮＰの存在により影響を受けなかった。これらの結果をまとめと、ミトコンドリア標的化ＮＰは、心臓細胞に対して少しも有害作用を有していないことが示された。
【０１３７】
長期循環Ｔ−ＮＰは脳に分布する。プラチンＭの送達時のＴ−ＮＰのｉｎ  ｖｉｖｏ移行の可能性に関して、Ｔ−ＮＰのｂｉｏＤ、排泄、およびＰＫ特性が最も重要なボトルネックである。本発明者らは、Ｔ−ＮＰのＰＫおよびｂｉｏＤ特性を理解するために、スプラーグドーリーラットにＴ−ＱＤ−ＮＰを単回用量静脈内注射により注入した。注入後最大２４時間の所定時点での血液サンプル、２４時間後の臓器、および２４時間にわたる蓄積尿および糞便を集め、ＩＣＰ−ＭＳによりＣｄを分析した。２コンパートメントの静脈内注入モデルによるＰＫパラメーターの定量から、２．４時間の中心コンパートメントの血漿消失半減期（ｔ1/2）と、その後に続く約２１４時間の周辺コンパートメントの極めて長いｔ1/2値が明らかになった（図３Ｃ）。
【０１３８】
Ｔ−ＮＰの全身クリアランス（ＣＬ）は、中心コンパートメントで約４．７ｍＬ／時・ｋｇであり、末端相で０．０５ｍＬ／時・ｋｇであった（図３Ｃ）。長いｔ1/2値および小さいＣＬ値から、Ｔ−ＮＰの長期循環特性が示された。さらに、３４７８４±２１１７時・ｎｇ／ｍＬの顕著に高い曲線下面積（ＡＵＣ）が、これらのＮＰの長期循環特性を支持した。３２３７±１２８ｎｇ／ｍＬの最高血漿中濃度（Ｃｍａｘ）は、これらのミトコンドリア１０標的化ＮＰが血流に極めて効率的に分布することを示した（図３Ｃ）。中心コンパートメントの大きい分布容積（Ｖｄ）は、Ｔ−ＮＰが初期に、体内組織に広範囲に分布することを示した。しかしながら、末梢コンパートメントにおけるＶｄの減少により、−ＴＰＰ部分で覆われた立体障害のある表面を有するそのユニークな組成のために、これらのＮＰは低下したタンパク結合を示すことが支持され、したがって、Ｔ−ＮＰはプラチンＭのミトコンドリア送達の優れた候補になる。
【０１３９】
投与２４時間後の脾臓、肝臓、肺、脳、心臓、腎臓、および精巣を含む主要組織におけるＴ−ＮＰレベルの変動から、脳へのＮＰ蓄積が最大であることが示された（図３Ｃ）。血液脳関門（ＢＢＢ）を形成する脳毛細血管内皮と末梢内皮との間の二分が、親水性のアニオン性表面を有する大きいＮＰの通過を防止する。循環ＮＰの血液から脳への通過は、経細胞機序によってのみ起こり得るものであり、これには、高度に親油性のＮＰ系に適したサイズおよび電荷が必要とされる。硫酸化プロテオグリカン類に由来する高度にアニオン性の電荷を有する脳内皮細胞表面および基底膜成分は、非脳内皮とは異なっており、カチオン性ＮＰの吸着媒介の経細胞輸送を可能にするであろう。したがって、Ｔ−ＮＰにより提供される小サイズおよび高度に親油性の表面は、脳へのその分布を促進した。
【０１４０】
さらに、末梢内皮に比べ大脳内皮細胞のミトコンドリアが高密度であるため、これらのＴ−ＮＰが脳に効率的に蓄積される可能性が生まれる。脳内皮特有の特性およびＴ−ＮＰの高度に親油性のミトコンドリア標的化特性により、これらのＮＰの脳への選択的標的化が得られる。Ｔ−ＮＰの濃度は、正に荷電した表面にもかかわらず、約２．４の極めて高い脳対脾臓比を示した（図３Ｃ）。Ｔ−ＮＰはまた、約１０の高い脳対腎臓比および約１．６の中程度の脳対肝臓比を示した（図３Ｃ）。多くの実例では、正に荷電したＮＰは、肝臓および脾臓に主として位置する単核食細胞系（ＭＰＳ）に存在する食細胞により、これらの臓器に蓄積する。約２．２の高い脳対肺の分配比から、これらのＮＰの十分なコロイド性安定性が示された。
【０１４１】
Ｔ−ＮＰの保持が心臓で極端に低く、脳対心臓比が１１倍であったが、これは、心臓細胞が過分極したミトコンドリアを有するにもかかわらず、Ｔ−ＮＰの親油性により脳への優先的な分布が促進されることを示す。これらの高度に正に荷電したＮＰは胆汁排泄を示した。肝臓に蓄積したＮＰは、通常肝臓内に捕捉されたままである負に荷電したＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ−ＮＰに比較して、消化管に迅速に排泄され得るものであり、そのため、Ｔ−ＮＰは肝臓蓄積による毒性を示さないと予測される。
【０１４２】
プラチンＭのミトコンドリア標的化ＮＰ製剤。プラチンＭに対してミトコンドリア標的化送達システムを組み入れることの背後にある本発明者らの理論的根拠は、ＰＬＧＡＬＭＷ−ｂ−ＰＥＧ−ＴＰＰ−ＮＰが疎水性のプラチンＭを効率的に封入し、その血液循環を増大させ、過分極したΔΨmを有する癌細胞に取り込まれると、これらのＮＰは、高い精度および効率でプラチンＭを送達することになることであった。しかしながら、ミトコンドリアに到達する前にＮＰから放出されたいずれのプラチンＭも、ミトコンドリア取り込みのためにプラチンＭ上に存在するＴＰＰ部分を利用することになる。したがって、この２重の標的化システムにより、効果的なミトコンドリア蓄積が示されることになる。
【０１４３】
本発明者らは、ＰＬＧＡＬＭＷｂ−ＰＥＧ−ＴＰＰポリマーマトリックスの内部にプラチンＭを捕捉することによりＴ−プラチンＭ−ＮＰを構築した。単一標的化対照として、本発明者らは、プラチンＭがＰＬＧＡＬＭＷ−ｂ−ＰＥＧ−ＯＨポリマーの内部に捕捉されたＮＴ−プラチンＭ−ＮＰを使用した。本発明者らは、これらのポリマーにプラチンＭを捕捉するためにナノ沈殿法を使用し、動的光散乱（ＤＬＳ）によりＮＰを特性評価して、各調製物のサイズ、多分散性指数（ＰＤＩ）、およびゼータ電位を得た（図４Ａ、表Ｓ１、およびＳ２）。Ｔ−プラチンＭ−ＮＰおよびＮＴ−プラチンＭ−ＮＰは、５０〜５５ｎｍの範囲のサイズを示した。Ｔ−プラチンＭ−ＮＰは、３０〜３５ｍＶの高度に正のゼータ電位を示した。本発明者らが以前に報告したミトコンドリア標的化ＮＰに基づいて、この範囲のサイズおよびゼータ電位は、効果的なミトコンドリア標的化について最適化されたものである。
【０１４４】
ＮＴ−プラチンＭ−ＮＰは、−２２〜−３４ｍＶの負のゼータ電位を示した。Ｔ−プラチンＭおよびＮＴ−プラチンＭ−ＮＰの形態を、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を使用して調べた（図４Ａ）。ポリマーに対するＰｔ（ＩＶ）の種々の付加重量百分率でのプラチンＭの負荷効率から、プラチンＭは、極めて高い負荷および封入効率（ＥＥ）でこれらのＮＰ中に捕捉することができることが示された（図４Ａ）。プラチンＭのパーセント負荷は、ポリマー供給量に対するパーセント供給量に基づくと、６〜２７％で変動した（図４Ａ、表Ｓ１、およびＳ２）。２つのカチオン性ＴＰＰヘッドグループと親油性ＤＢＣＯ部分を有するプラチンＭの両親媒性を考慮して、本発明者らは、プラチンＭの高い負荷が自己ミセルの形成によるものか否かについて検討することにした。プラチンＭのＤＭＦ溶液を水にナノ沈殿させると、不安定なマクロ粒子（サイズ：９４１．６±５８９．５ｎｍ；ＰＤＩ：０．７９９；ゼータ電位：−５．３８±１．６６ｍＶ）が得られ、このような可能性は除外された。
【０１４５】
本発明者らが知る限りでは、プラチンＭは、文献で公知のＰＬＧＡ−ＰＥＧベースのＮＰ系における公知の白金錯体の中で最も高い負荷効率を示した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で生理学的ｐＨ７．４、３７℃におけるＴ−ＮＰおよびＮＴ−ＮＰからのプラチンＭの放出カイネティクスから、７２時間の長時間にわたる持続放出が実証された（図４Ｂ）。Ｔ−ＮＰとＮＴ−ＮＰの放出カイネティクスを比較すると、プラチンＭは、より遅い速度でＮＴ−ＮＰ系から放出されることが実証された（図４Ｂ）。非標的化ＮＰから放出された正に荷電したプラチンＭは、負に荷電したＮＰ表面上に吸着される可能性があり、この非共有結合的相互作用が、ＮＴ−ＮＰからのプラチンＭのより遅い放出カイネティクスの原因である可能性がある。
【０１４６】
プラチンＭおよびＮＰのミトコンドリア蓄積。プラチンＭ、Ｔ−プラチンＭ−ＮＰ、ＮＴ−プラチンＭ−ＮＰ、およびシスプラチンで処理したＰＣ３細胞から単離したミトコンドリア画分、サイトゾル画分、および核画分の分析から、ミトコンドリアタンパク質画分の白金濃度は、プラチンと対照的に、プラチンＭまたはそのＴ−ＮＰ製剤に関し、核タンパク質画分よりも３０倍高いことがわかった（図４Ｃ）。シスプラチンの全取り込み量は、プラチンＭまたはそのＮＰ製剤よりもはるかに少なかった。非標的化系では、シスプラチンに比較して、ミトコンドリア画分へのプラチンＭの蓄積は約８倍大きいに過ぎず、ＮＴ−プラチンＭ−ＮＰからのプラチンＭはかなりの量サイトゾル画分で見出され、その全取り込み量は、プラチンＭまたはそのＴ−ＮＰよりもはるかに少なかった（図４Ｃ）。これは、２重の標的化がプラチンＭのミトコンドリア送達効率を増大させるという本発明者らの仮説をさらに裏付けるものである。
【０１４７】
さらに、処理したＰＣ３細胞に由来するｎＤＮＡおよびｍｔＤＮＡに結合したＰｔの定量および比較から、プラチンＭおよびＴ−プラチンＭ−ＮＰから放出されたシスプラチンがｍｔＤＮＡと結合することが示された（図４Ｄ）。ｎＤＮＡ中のシスプラチン付加体のレベルは、ｍｔＤＮＡ中のシスプラチン付加体のレベルよりもはるかに高かった。プラチンＭは、Ｔ−プラチンＭ−ＮＰ系に比較して、わずかに高いｍｔＤＮＡ付加体を示した。これは、Ｔ−ＮＰ系の場合、シスプラチンへの還元およびその後のｍｔＤＮＡとの相互作用より前に、プラチンＭがＮＰから放出される必要があり、またすべてのプラチンＭがこの実験期間中にＮＰから放出されたとは限らない可能性があり、プラチンＭの約５０％のみがＴ−ＮＰから放出されることに対応する１２時間後に、ｍｔＤＮＡの単離が行われたという事実から説明可能である（図４Ｂ）。
【０１４８】
ＮＴ−プラチンＭ−ＮＰは、ｍｔＤＮＡおよびｎＤＮＡ付加体形成のレベルが低かった。これは、ＮＴ−ＮＰからのプラチンＭの遅い放出カイネティクスによる可能性があり、プラチンＭの約２６％のみが１２時間で放出されると予測される（図４Ｂ）。
【０１４９】
神経芽細胞腫およびシスプラチン耐性細胞におけるプラチンＭおよびＮＰの効力。ＰＣａ  ＰＣ３細胞株、ヒト神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞株、およびシスプラチン耐性Ａ２７８０／ＣＰ７０卵巣癌細胞株に対する、プラチンＭ、Ｔ−プラチンＭ、およびＮＴ−プラチンＭのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性を、３−（４，５−ジメチルチアゾ−ル−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド、すなわちＭＴＴアッセイにより評価した（表１）。アンドロゲン非依存性ＰＣ３細胞株の使用の背後にある理論的根拠は、ＮＥＲによるＰｔ−ｎＤＮＡ付加体の修復が増強されていること、標的化が不十分なこと、および正常なｍｔＤＮＡが減少したアンドロゲン非依存性ＰＣａは、ｎＤＮＡに突然変異を誘導することによって、さらに進行性の表現型を獲得していることによる、シスプラチン療法に対するこれらの細胞の本来的な耐性であった。したがって、ｍｔＤＮＡの標的化は、高悪性度のアンドロゲン非依存性ＰＣａに対する効果的な療法をもたらす可能性がある。ヒト神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞株は、神経細胞のいくつかの特徴を示し、神経細胞のほとんどのＡＴＰはＯＸＰＨＯＳによって産生されるため、神経細胞は通常、ミトコンドリアの数の増加を必要とする。Ｔ−ＮＰの脳への分布およびミトコンドリアの数の増加の点から、本発明者らは、この試験において、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を使用するように促された。
【０１５０】
シスプラチン耐性細胞に対するプラチンＭの効果を理解するために、本発明者らは、過分極したミトコンドリアを有するＡ２７８０／ＣＰ７０細胞を使用した。Ａ２７８０／ＣＰ７０細胞株は、シスプラチンに耐性であり、シスプラチン−ｎＤＮＡ損傷の修復がより効率的である。すべての細胞株において、プラチンＭおよびそのＮＰは、シスプラチンに比較して、効力が極めて高いことを示した。耐性細胞では、プラチンＭ活性はシスプラチンよりも約１６倍良好であった。Ｔ−ＮＰ中にプラチンＭを組み込むと、この活性はさらに増強され、Ｔ−プラチンＭ−ＮＰの効力は、耐性細胞において、シスプラチンよりも約８５倍良好であった。非標的化ＮＰ系にプラチンＭを組み込んだ場合は、耐性細胞において、シスプラチンに比較して約６倍の増大のみを示した。
【０１５１】
プラチンＭとそのミトコンドリア標的化および非標的化ＮＰ製剤との間のこれらの活性差は、Ａ２７８０／ＣＰ７０細胞、ＰＣ３細胞、およびＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞のΔΨm値の差による可能性がある。Ｓｅａｈｏｒｓｅ  ＸＦ  ＭｉｔｏＳｔｒｅｓｓアッセイを使用する、これらの細胞に関する簡単なＯＣＲ試験は、この仮説を支持した（データを示さず）。シスプラチン耐性Ａ２７８０／ＣＰ７０細胞は、他の２つの細胞株に比較して、過分極したΔΨmのために低い基礎ＯＣＲを示した。この過分極により、基質へのプラチンＭの効率的な蓄積が促進された。ＮＰ表面上に複数の−ＴＰＰ分子を有するミトコンドリア標的化ＮＰ系の内部にプラチンＭを組み込むと、蓄積が増加し、耐性細胞における活性の増強がさらに実証された。しかしながら、ＮＴ−プラチンＭは、過分極した耐性細胞に蓄積することができず、耐性細胞の高いグルタチオンレベルにより、放出されたプラチンＭの還元が促進されて、サイトゾルでシスプラチンが生成し、そのため、ＮＴ−プラチンＭ−ＮＰは、耐性細胞において、プラチンＭおよびＴ−プラチンＭ−ＮＰに比較して、低い活性を示した。
【０１５２】
これらの観察から、ミトコンドリア基質の内部にシスプラチンを効果的に送達するために、２重標的化の手法を使用する本発明者らの理論的根拠がさらに支持された。神経芽細胞腫は、すべての小児癌の死亡の約１５％を占める。シスプラチンは高リスクな神経芽細胞腫の患者を処置するために広く使用されている。したがって、Ｔ−ＮＰが脳に分布することから、本発明者らは、神経芽細胞腫への適用可能性を求めて、プラチンＭおよびそのＮＰの使用を検討するように促された。本発明者らは、神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞株において、シスプラチンに比較して、プラチンＭの活性が顕著に増大していることを観察した。この細胞株におけるプラチンＭ活性は、シスプラチンに比較して５．５倍高かった。Ｔ−ＮＰ中にプラチンＭを封入すると、シスプラチンにより示される効果よりも約１７倍大きい応答が得られた（表１）。ＮＴ−プラチンＭ−ＮＰもまた、シスプラチンを上回る増強された活性を示した。シスプラチンを上回るプラチンＭおよびそのＮＰの効力増大は、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞中に存在するミトコンドリアの数が増加していることによる可能性がある。これは、これらの神経芽細胞腫細胞が、数が増加したミトコンドリアの存在のため、より高いＯＣＲを示すという本発明者らのデータによってさらに支持された（データを示さず）。非癌細胞におけるこれらの製剤の影響を理解するために、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）におけるプラチンＭおよびそのＮＰの毒性を検討した。ｈＭＳＣにおけるプラチンＭの毒性は、耐性細胞の約１／３であることが見出された。Ｔ−ＮＰの内部にプラチンＭを組み込むと、毒性はさらに低下し、Ｔ−プラチンＭ−ＮＰは、耐性細胞に比較して、ｈＭＳＣ細胞では約１／５．５の毒性を示した（表１）。シスプラチン耐性を克服する、プラチンＭおよびそのＴ−ＮＰ製剤のこの注目すべき能力は、この技術の成功に重要な役割を果たすことになる。
【０１５３】
ミトコンドリアの生体エネルギー。次に、本発明者らは、ＸＦ２４  ＭｉｔｏＳｔｒｅｓｓアッセイキットを使用して、プラチンＭおよびそのＮＰに応答した基礎呼吸、共役効率、および予備呼吸容量を検討した（図５）。ＰＣ３細胞またはＡ２７８０／ＣＰ７０細胞のミトコンドリア基質の内部へのプラチンＭの蓄積がミトコンドリア呼吸を阻害するか否かを判定するために、本発明者らは、ＯＸＰＨＯＳを評価する方法としてこれらの細胞の酸素消費速度（ＯＣＲ）を測定した。ＰＣ３細胞のＯＣＲレベルは、シスプラチン耐性Ａ２７８０／ＣＰ７０細胞よりも高く、耐性細胞における過分極したΔΨmが示された。ＰＣ３細胞またはＡ２７８０／ＣＰ７０細胞を、プラチンＭ、シスプラチン、Ｔ−プラチンＭ−ＮＰ、ＮＴ−プラチンＭ−ＮＰで１２時間処理した。
【０１５４】
プラチンＭまたはＴ−プラチンＭ−ＮＰ処理細胞の基礎ＯＣＲレベルは、対照細胞より低いことが見出され、ミトコンドリアの全体量が減少していることが示された。しかしながら、シスプラチンでは変化は少しも見られなかった（図５）。これらの細胞におけるミトコンドリア内部へのプラチンＭの蓄積時のミトコンドリア共役を評価するために、ＡＴＰシンターゼ阻害剤オリゴマイシンを注入した。オリゴマイシンを加えると、ＡＴＰ産生関連呼吸のレベルが対照細胞またはシスプラチン、ＮＴ−プラチンＭ−ＮＰで処理した細胞で減弱することがわかった；プラチンＭ処理細胞での減少は少なく、Ｔ−プラチンＭ−ＮＰでは何ら顕著な変化は見られなかった。最大呼吸容量を判定するために、ミトコンドリア脱共役剤ｐ−トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）を培地に注入した。オリゴマイシン後のＦＣＣＰによるミトコンドリア呼吸の刺激は、シスプラチン、ＮＴ−プラチンＭ−ＮＰ、対照の細胞ついては同等であったが、プラチンＭおよびＴ−プラチンＭ−ＮＰは、ＯＣＲレベルの増強を示さなかった。
【０１５５】
最後に、ミトコンドリア複合体ＩＩＩ阻害剤アンチマイシンＡとミトコンドリア複合体Ｉ阻害剤ロテノンを組み合せて注入すると、ミトコンドリアＲＯＳの形成および非ミトコンドリアＯ2消費のために、ＯＣＲが顕著に阻害された。全体として、プラチンＭおよびＴ−プラチンＭ−ＮＰは、ＰＣ３細胞よりも大きい程度でＡ２７８０／ＣＰ７０細胞のミトコンドリア呼吸の阻害を示した。プラチンＭおよびそのＴ−ＮＰによる、このミトコンドリア呼吸プログラミングは、本来的に過分極したミトコンドリアを有する化学療法抵抗性腫瘍の処置および細胞に存在するミトコンドリアの数が増加した神経芽細胞腫の処置における、現行技術の極めて有望な可能性を示した。心臓細胞が過分極したミトコンドリアを含有することに留意して、本発明者らは、心筋細胞における、空のＴ−ＮＰを蓄積するミトコンドリアの毒性を注視した（データを示さず）。
【０１５６】
他の細胞株について記述したものと同じ条件下における、Ｈ９Ｃ２心筋細胞に対するシスプラチン、プラチンＭ、ＮＴ−プラチンＭ−ＮＰ、およびＴ−プラチンＭ−ＮＰの効果は、他の細胞株での観察と同様な傾向を示した（データを示さず）。さらに、他の細胞株について記述したものと同じ条件下における、２つのイヌ脳腫瘍細胞株のＳＤＴ３Ｇ神経膠芽腫細胞およびＪ３ＴＢＧ神経膠腫細胞に対するシスプラチン、プラチンＭ、ＮＴ−プラチンＭ−ＮＰ、およびＴ−プラチンＭ−ＮＰの効果は、他の細胞株での観察と同様な傾向を示した（図６）。
【０１５７】
本発明者らは、イヌ脳腫瘍細胞株ＳＤＴ３Ｇにおける、Ｔ−プラチンＭ−ＮＰのｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力を、シスプラチン、カルボプラチン、プラチンＭ、およびＮＴ−プラチンＭ−ＮＰの効力と比較した。指示濃度の被験物質による４８時間または７２時間処理後の、（３−（４，５−ジメチルチアゾ−ル−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）テトラゾリウム還元（ＭＴＴ）アッセイによって、細胞生存率を評価した。すべてのＮＰ処理の場合、培地を１２時間後に交換し、細胞を３６時間または６０時間さらにインキュベートした。図７に提示するデータは平均±ＳＤ（ｎ＝３ウェル）である。ＩＣ５０値は、３回の独立した実験からの平均として示される（図７）。図７に示すように、ナノ粒子、特に標的化ナノ粒子（Ｔ−プラチンＭ−ＮＰ）は、シスプラチンよりも実質的に低いＩＣ５０値を示す。
【０１５８】
Ｔ−プラチンＭ−ＮＰの生体内分布および安全性について、ビーグル犬で試験した。２匹のビーグル犬を、０．５ｍｇ／ｋｇ（プラチンＭに関して）のＴ−プラチンＭ−ＮＰの単回ＩＶ投与の前、０日目に、物理的および神経学的検査、全血球計算、血清化学プロファイル、および脳脊髄液（ＣＳＦ）分析に供した。１、７、および１４日目に、イヌを、物理的および神経学的検査、全血球計算、血清化学プロファイル、およびＣＳＦ分析に供した。１４日目に試験を終了し、組織を採取し、病理組織診断を行い、臓器を誘導結合プラズマ−質量分析法（ＩＣＰ−ＭＳ）により分析した。試験計画のグラフ表現を図８（Ａ）に提示する。図８（Ｂ）は、Ｔ−プラチンＭ−ＮＰビーグル犬の単回静脈内注射後１４日目の臓器中白金濃度および注射後１４日目の小脳、大脳、心臓、肺、肝臓、腎臓、および脾臓の病理組織診断の代表的な画像を示す。Ｔ−プラチンＭ−ＮＰ注射に関連した変化は観察されなかった。図８（Ｃ）は、両方のイヌの血中尿素窒素（ＢＵＮ）、クレアチニン、およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の値は、試験期間中、臨床的に許容される限度内に留まったことを示す。
【０１５９】
図９は、２匹の雌性イヌにおける、１４日間、用量０．５ｍｇ／ｋｇのＴ−プラチンＭ−ＮＰによる安全性およびｂｉｏＤ試験（上記のように）からの完全な臨床化学データおよび一部の血液学データを示す。
【０１６０】
図１０（Ａ）は、（Ａ）２匹の雄性ビーグル犬における、２ｍｇ／ｋｇのＴ−プラチンＭ−ＮＰの投薬前、単回静脈内注射後１日目、７日目、および１４日目の完全な血清化学の結果を示す（上記のように、ただし、より高濃度のＴ−プラチンＭ−ＮＰを用いて）。図１０（Ｂ）は、この試験期間中の両方のイヌのＢＵＮ、クレアチニン、およびＡＬＴ値を示し；図１０（Ｃ）は、試験期間中の２匹のビーグル犬の白血球（ＷＢＣ）数および血小板数を示す（Ｌ：低水準）。
【０１６１】
図１１（Ａ）は、２匹の雄性ビーグル犬における、２．２ｍｇ／ｋｇのＴ−プラチンＭ−ＮＰの投薬前、単回静脈内注射後１日目、７日目、および１４日目の完全な血清化学の結果を示す（上記のように、ただし、より高濃度のＴ−プラチンＭ−ＮＰを用いて）。図１１（Ｂ）は、この試験期間中の両方のイヌのＢＵＮ、クレアチニン、およびＡＬＴ値を示し；図１１（Ｃ）は、試験期間中の２匹のビーグル犬の白血球（ＷＢＣ）数および血小板数を示す（Ｈ：高水準）。
【０１６２】
本明細書において、本発明者らは、シスプラチン耐性の環境および中枢神経系の癌において実行することができる、化学療法抵抗性の高悪性度癌に対するシスプラチンのミトコンドリア送達を設計するための戦略  −  ミトコンドリア標的化シスプラチンプロドラッグの構築から標的化送達ビヒクル中へのその製剤化まで  −  を概説した。これらの研究は、シスプラチンベースの療法について、以前に記載されていない経路の最初の開発を表す。ほとんどの末期癌では、化学療法抵抗性が発生するためにシスプラチン処置に耐性になるため、本明細書に概説するように、標的化ＮＰを使用して、ミトコンドリア基質の内部にシスプラチンを送達して、ＮＥＲを欠くｍｔＤＮＡを攻撃することは、別の方法では抵抗性になる進行癌に取り組むための新規の治療戦略を提供する点で極めて有益であり得る。
【０１６３】
材料および方法
上記に記載のない範囲で、以下に、実施例に提示した試験のための材料および方法について記載する。
【０１６４】
材料および機器：特に明記のない限り、化学物質はすべて、入手してさらに精製することなく使用した。シスプラチンはＳｔｒｅｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から購入した。ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、Ｋ２ＰｔＣｌ４、２’−デオキシグアノシン５’−一リン酸ナトリウム塩水和物（５’−ｄＧＭＰ）、およびアスコルビン酸ナトリウム、ＫＣｌ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、トリエチルアミン、５−ブロモペンタン酸、６−ブロモヘキサン酸、アジ化ナトリウム、Ν，Ν’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、過酸化水素水溶液（Ｈ2Ｏ中３０重量％）、３−（４，５−ジメチルチアゾ−ル−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）−アミン（製品番号Ａ１０３）は、Ｃｌｉｃｋ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｔｏｏｌｓ  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｍｐａｎｙから入手した。カルボキシ末端のもの（ｄＬ／ｇ、０．１５〜０．２５および０．５５〜０．７５）は、Ｌａｃｔｅｌから入手し、分子量３３５０のＯＨ−ＰＥＧ−ＯＨは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。トリフェニルホスフィン（ＴＰＰ）は、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ  ２３２２７）は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。哺乳動物細胞用のミトコンドリア単離キット（カタログ番号ＰＩ−８９８７４）は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンは、Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、スクロース、塩化カリウム、およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）は、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒから購入した。オリゴマイシン、ロテノン、アンチマイシンＡ、およびトリフルオロカルボニルシアニドフェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）は、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。プロテアーゼ阻害剤カクテルは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  ＭＩＮＩ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｕｎｉｔｓ（カタログ番号６９５７２）は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。ミトコンドリアＤＮＡ単離キット（ａｂ６５３２１）およびゲノムＤＮＡ単離キット（ａｂ６５３５８）は、Ａｂｃａｍから購入した。蒸留水は、０．２２μｍフィルターを装着したＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｌｌｉ−Ｑ  Ｂｉｏｃｅｌ浄水装置（１８．２ＭΩ）を通過させて精製した。１Ｈ、１３Ｃのスペクトルは４００ＭＨｚで記録し；３１Ｐ  ＮＭＲおよび１９５Ｐｔ  ＮＭＲスペクトルは、５００ＭＨｚのＶａｒｉａｎ  ＮＭＲ分光計でそれぞれ記録した。エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）および高分解能質量分析（ＨＲＭＳ）−ＥＳＩはそれぞれ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＳＣＩＥＸ  ＡＰＩ  １  ｐｌｕｓおよびＴｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＯＲＢＩＴＲＡＰ  ＥＬＩＴＥ機器で記録した。
【０１６５】
電気化学測定は、ＣＨ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）製の分析システムモデルＣＨＩ  ９２０ｃポテンショスタットにて２５℃で行った。細胞は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手したＣｏｕｎｔｅｓｓ（登録商標）自動細胞カウンターを使用してカウントした。動的光散乱（ＤＬＳ）測定は、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳシステムを使用して行った。光学測定は、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００分光光度計で行った。透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像は、Ｐｈｉｌｉｐｓ／ＦＥＩ  Ｔｅｃｈｎａｉ  ２０顕微鏡を使用して得た。誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ）試験は、ＶＧ  ＰｌａｓｍａＱｕａｄ  ３  ＩＣＰ質量分析計で行った。プレートリーダー分析は、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴマイクロプレートリーダーで行った。ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）分析は、屈折率検出器およびＷａｔｅｒｓカラムを装着したＳｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣ２０−ＡＤ  ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ液体クロマトグラフィーで行い；分子量は、温度４０℃で溶出液としてテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を使用する狭いポリスチレン標準試料から構築した通常の検量線を使用して算出した。生体エネルギーアッセイは、Ｓｅａｈｏｒｓｅ  ＸＦ２４アナライザー（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎｏｒｔｈ  Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して行った。細胞成分の蛍光イメージングは、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ（登録商標）Ｌｕｍｉｎａシステムで行った。
【０１６６】
細胞株および細胞培養：ヒト前立腺癌細胞株ＰＣ３および神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は、米国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｔｙｐｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）から入手した。シスプラチン耐性ヒト卵巣癌細胞株Ａ２７８０／ＣＰ７０は、Ｔｈｏｍａｓ  Ｈａｍｉｌｔｏｎ（Ｆｏｘ  Ｃｈａｓｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｊｅｎｋｉｎｔｏｗｎ，ＰＡ）により親切にも提供されたものである。ヒト骨髄由来ＭＳＣは、Ｌｏｎｚａから購入した。Ｈ９Ｃ２心筋細は、Ｍａｒｋ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ教授、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｏｗａから寛大にも贈与されたものである。心筋細胞は、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１．５ｇ／Ｌピルピン酸ナトリウム、４．５ｇ／Ｌグルコース、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、および１０％ウシ胎児血清を添加した、８９％ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させた。ＰＣ３細胞およびＡ２７８０／ＣＰ７０細胞は、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、ピルピン酸ナトリウム（１００ｍＭ）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（１Ｍ）、およびＬグルタミン（２００ｍＭ）を添加したＲｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）１６４０培地中にて、５％ＣＯ２、３７℃で増殖させた。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ中で培養した。ヒトＭＳＣは、２％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、組換えヒト線維芽細胞増殖因子−塩基性（５ｎｇ／ｍＬ）、組換えヒト線維芽細胞増殖因子−酸性（５ｎｇ／ｍＬ）、および組換えヒト上皮性増殖因子（５ｎｇ／ｍＬ）を添加した間葉系幹細胞基本培地中で増殖させた。細胞は３〜４日ごとに継代し、継代数がＰＣ３、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、Ａ２７８０／ＣＰ７０、Ｈ９Ｃ２細胞について２０代、ＭＳＣについて１０代に到達すると凍結ストックから再開した。
【０１６７】
ＤＢＣＯ−ＴＰＰの合成：乾燥ＣＨ2Ｃｌ2中のＴＰＰ−（ＣＨ2）5−ＣＯＯＨ（１）（２５０ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）およびＮＨＳ（７５．４０ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）の混合物を０℃で３０分間撹拌した。この反応混合物に、ＤＣＣ（１２４ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）のＣＨ2Ｃｌ2溶液を滴下して加えた。反応物を０℃から室温まで１２時間撹拌した。沈殿したΝ、Ν’−ジシクロヘキシル尿素（ＤＣＵ）副生成物を濾去し、ロータリエバポレーターを使用して溶液を蒸発させた。この残渣を乾燥ＣＨ2Ｃｌ2に溶解した。トリエチルアミン（６６．２７ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）およびＤＢＣＯ−ＮＨ2（１８１ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）のＣＨ2Ｃｌ2溶液を、上記の反応混合物に徐々に加えた。この反応混合物を激しく撹拌しながら、室温で２４時間保持した。溶媒を蒸発させて乾固した。残渣をＣＨ2Ｃｌ2に溶解し、ジエチルエーテルで沈殿させた（ＣＨ2Ｃｌ2：ジエチルエーテル：１：９）。この工程を５回繰り返した。最後に、生成物を（ＣＨ2Ｃｌ2：エタノール：ジエチルエーテル＝１：１：８）溶媒混合物により沈殿させることにより精製した。収率、２６６ｍｇ、６８％。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、４００ＭＨｚ）：δ７．６７−７．７５（ｍ，１５Ｈ），７．２３−７．３３（ｍ，８Ｈ），６．８３（ｔ，１Ｈ），５．１２（ｄ，１Ｈ），３．６４（ｍ，３Ｈ），３．２０（ｔ，２Ｈ），２．５１（ｍ，１Ｈ），２．０３（ｔ，２Ｈ），１．９５（ｍ，１Ｈ），１．５８（ｍ，６Ｈ）（図Ｓ１）ｐｐｍ。13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、１００ＭＨｚ）：δ１７２．９４，１７１．８６，１５１．１７，１４８．０２，１３４．９８，１３５．０１，１３３．６７，１３３．５７，１３３．５３，１３２．１３，１３０．６０，１３０．５３，１３０．４０，１２９．２８，１２８．６９，１２８．１８，１２８．１３，１２７．７９，１２７．０１，１２５．５１，１２３．００，１２２．３１，１１８．６９，１１７．８４，１１４．７４，１０７．８８，６５．８２，５５．３９，３５．８５，３５．２９，３４．６５，２９．７３，２９．５６，２５．４８，２４．６２，２２．７５，２２．２５，２２．０５，２２．０１，１５．２４ｐｐｍ（図Ｓ２）。３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ２４．６５ｐｐｍ（図Ｓ３）。ＨＲＭＳ−ＥＳＩ（ｍ／ｚ）：［Ｍ−Ｂｒ］＋  Ｃ42Ｈ40Ｎ2Ｏ2Ｐ+についての計算値、６３５．２８２２；実測値、６３５．２８２３（図Ｓ４）。
【０１６８】
プラチンＭの合成：プラチンＡｚ（６０ｍｇ、０．０９８ｍｍｏｌ）およびＤＢＣＯ−ＴＰＰ（１４０ｍｇ、０．１９６ｍｍｏｌ）の乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液１０ｍＬを、室温で１２時間撹拌した。この反応混合物を濃縮し、ジエチルエーテルを使用して生成物を沈殿させた。粗生成物をＣＨ2Ｃｌ2およびＣＨ3ＣＮに懸濁し、ジエチルエーテルで沈殿させた。最後に、ＣＨ2Ｃｌ2：ＣＨ3ＣＮ：ジエチルエーテル（１：１：８）による沈殿により生成物を単離して、淡黄色固体を得た。収率、１４０ｍｇ、７１％。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6、４００ＭＨｚ）：δ７．７８−７．９０（ｍ，３０Ｈ），７．２７−７．６６（ｍ，１８Ｈ），６．５７（ブロード，６Ｈ），５．８６−５．９７（ｍ，２Ｈ），４．４３−４．４７（ｍ，２Ｈ），４．２０−４．３８（ｍ，４Ｈ），３．３０および３．５６（ｍ，４Ｈ），２．８７−２．９９（ｍ，４Ｈ），２．１４−２．２１（ｍ，４Ｈ），１．９２（ｍ，４Ｈ），１．８３（ｍ，２Ｈ），１．３９−１．５０（ｍ，２４Ｈ），１．０１−１．１０（ｍ，２Ｈ）ｐｐｍ（図Ｓ５）、ｇＣＯＳＹ（図Ｓ６）。13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、１００ＭＨｚ）：δδ１８１．１６，１８１．１３，１７２．２５，１７２．０８，１７０．１４，１６９．７９，１４４．１８，１４２．６４，１４１．３４，１４０．４６，１３５．７８，１３５．３３，１３５．３１，１３４．２７，１３４．２１，１３４．０８，１３３．９８，１３２．３６，１３２．０３，１３１．７２，１３１．１１，１３０．７４，１３０．７２，１３０．６２，１３０．２９，１２９．９８，１２９．５９，１２９．１１，１２８．７２，１２７．９４，１２７．２８，１２４．７０，１１９．４２，１１９．４０，１１８．５７，１１８．５５，５５．３９，５２．２６，５１．０２，４８．８９，４８．１９，４０．６０，４０．３９，４０．１８，３９．９８，３９．７７，３９．５６，３９．３５，３５．９６，３５．７０，３５．２４，３５．１８，３５．０７，３３．９１，３０．０１，２９．８４，２９．５４，２８．４８，２６．２７，２６．１６，２５．５４，２５．４０，２５．３６，２５．１９，２４．８３，２４．７２，２２．１０，２０．８６，２０．３６ｐｐｍ（図Ｓ７）。31Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ２４．１０ｐｐｍ（図Ｓ８）。195Ｐｔ（ＤＭＳＯ−ｄ6，１０７．６ＭＨｚ）δ１１０８．９４ｐｐｍ（図Ｓ９）。ＨＲＭＳ  ｍ／ｚ  Ｃ96Ｈ106Ｃｌ2Ｎ12Ｏ8Ｐ2Ｐｔ2+についての計算値：（Ｍ）2+  ９４１．３３９０。実測値９４１．３３７８（図Ｓ１０）。元素分析Ｃ96Ｈ106Ｂｒ2Ｃｌ2Ｎ12Ｏ8Ｐ2Ｐｔ．ＣＨ3ＣＮ．ＣＨ2Ｃｌ2．Ｈ2Ｏについての計算値（％）：Ｃ５４．３５，Ｈ５．２１，Ｎ８．３２；実測値：Ｃ５４．１０，Ｈ５．４４，Ｎ８．５５。
【０１６９】
プラチンＭの電気化学：電気化学測定は、ＣＨ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）製の分析システムモデルＣＨＩ  ９２０ｃのポテンショスタットにて２５℃で行った。ガラス状カーボン作用電極、白金線補助電極、およびＡｇ／ＡｇＣｌ（３Ｍ  ＫＣｌ）基準電極を含む、通常の３電極セットアップを、電気化学測定のために使用した。電気化学データは接合部電位について補正しなかった。ＫＣｌを支持電解質として使用した。プラチンＭ（１ｍＭ）溶液は、０．１Ｍ  ＫＣ１を含む、２０％ＤＭＦ−リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ６．０および７．４で調製し、ボルタンモグラムを種々の走査速度で記録した（データを示さず）。プラチンＭの酸化還元電位は、ｐＨ７．４ではＡｇ／ＡｇＣｌ対して−０．３７６Ｖ；ＮＨＥに対して−０．２７５であることが見出され、ｐＨ６．０では、Ａｇ／ＡｇＣｌに対して−０．３６９Ｖ；ＮＨＥに対して−０．２６９であることが見出された。
【０１７０】
プラチンＭのミセル形成能の判定：プラチンＭをＤＭＦに溶解し、最終濃度を１．５ｍｇ／ｍＬにした。この溶液を、激しく撹拌するナノ純水（１０ｍＬ）に徐々に加え、室温で３時間撹拌した。次いで、この溶液を、１００ｋＤａの分子量カットオフのＡｍｉｃｏｎフィルターを通して３回濾過洗浄して、すべての残留有機溶媒を確実に除去した。最後に、ＮＰをナノ純水（１ｍＬ）に再懸濁し、０．２μｍのフィルターを通して濾過した。得られた懸濁液をＤＬＳにより特性評価した。
【０１７１】
ＰＬＧＡLMW−ｂ−ＰＥＧ−ＯＨおよびＰＬＧＡLMW−ｂ−ＰＥＧ−ＴＰＰの合成：これらの２つのポリマーは，本発明者らが以前に報告した方法に従って合成した（Ｍａｒｒａｃｈｅ  Ｓ．ａｎｄ  Ｄｈａｒ  Ｓ．（２０１２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０９：１６２８８−１６２９３）。ＰＬＧＡLMW−ｂ−ＰＥＧ−ＯＨについてのスペクトルデータ（図Ｓ１２）：1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣ１3、４００ＭＨｚ）：δ５．３［ｍ，４３Ｈ（ＯＣＨＣＨ3Ｃ（Ｏ）］，４．９［ｍ，８６Ｈ（ＯＣＨ2Ｃ（Ｏ）］，３．６［ｓ，１１９Ｈ（ＯＣＨ2）］，１．９［ｍ，１３２Ｈ（ＣＨ3ＣＨ）］ｐｐｍ。13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣ１3、４００ＭＨｚ）：δ１６９．８，１６６．１，７０．５，６９．３，６１．１，１５．４６ｐｐｍ。ＰＬＧＡLMW−ｂ−ＰＥＧ−ＴＰＰについてのスペクトルデータ（図Ｓ１３）：1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、４００ＭＨｚ）：δ５．３［ｍ，６０４Ｈ（ＯＣＨＣＨ3Ｃ（Ｏ）］，４．９［ｍ，１１９４Ｈ（ＯＣＨ2Ｃ（Ｏ）］，３．６［ｓ，１９７Ｈ（ＯＣＨ2）］，１．９［ｍ，１９６０Η（ＣＨ3ＣＨ）］ｐｐｍ。13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣ１3、１００ＭＨｚ）：δ１６９．８，１６６．１，７０．５，６９．３，６１．１，１５．４６ｐｐｍ。31Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣ１3、１００ＭＨｚ）：δ２４．６ｐｐｍ。ＧＰＣ：Ｍｎ＝１４，４２０ｇ／ｍｏｌ、Ｍｗ＝１７，０３０ｇ／ｍｏｌ、Ｍｚ＝２０，３２０ｇ／ｍｏｌ、ＰＤＩ＝１．１８（図Ｓ１６）。
【０１７２】
ＰＬＧＡHMW−ｂ−ＰＥＧ−ＯＨの合成：ＯＨ−ＰＥＧ−ＯＨ（３．７５ｇ、１．１ｍｍｏｌ）、ＰＬＧＡ−ＣＯＯＨ（固有粘度０．５５〜０．７５、５．０ｇ、０．３８ｍｍｏｌ）、およびＤＭＡＰ（０．０４５ｇ、０．３８ｍｍｏｌ）を、乾燥ＣＨ2Ｃｌ2（５０ｍＬ）に溶解した。この反応混合物を撹拌しながら０℃に冷却した。ＤＣＣ（０．２ｇ、１．１ｍｍｏｌ）をＣＨ2Ｃｌ2（３ｍＬ）に溶解し、ポリマー溶液に滴下して加えた。次いで、この混合物を室温に加温し、一晩撹拌した。その後、ＤＣＵを濾去し、得られた混合物を冷ジエチルエーテル：メタノール（２００ｍＬ）の５０：５０混合物中で繰り返し沈殿させた。得られた固体を５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。得られた固体を一晩凍結乾燥して、４１％の収率でポリマーを得た。最終生成物をＮＭＲおよびＧＰＣにより分析した。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣ１3、４００ＭＨｚ）：δ５．３［ｍ，６０４Ｈ（ＯＣＨＣＨ3Ｃ（Ｏ）］，４．９［ｍ，１１９４Ｈ（ＯＣＨ2Ｃ（Ｏ）］，３．６［ｓ，１９７Ｈ（ＯＣＨ2）］，１．９［ｍ，１９６０Ｈ（ＣＨ3ＣＨ）］ｐｐｍ（図Ｓ１４）。13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、４００ＭＨｚ）：δ１６９．６，１６６．５，６６．０，６１．１，６０．９，１６．８９，１５．４６ｐｐｍ（図Ｓ１４）。ＧＰＣ：Ｍｎ＝４７，２８０ｇ／ｍｏｌ、Ｍｗ＝６８，２１０ｇ／ｍｏｌ、Ｍｚ＝９２，９００ｇ／ｍｏｌ、ＰＤＩ＝１．３６（図Ｓ１６）。
【０１７３】
ＰＬＧＡHMW−ｂ−ＰＥＧ−ＴＰＰの合成：ＰＬＧＡHMW−ｂ−ＰＥＧ−ＯＨ（１ｇ、０．０２ｍｍｏｌ）、ＴＰＰ−（ＣＨ2）4−ＣＯＯＨ（０．０４５ｇ、０．１２ｍｍｏｌ）、およびＤＭＡＰ（０．０１０ｇ、０．０８ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２に０℃で３０分間溶解した。ＤＣＣ（１２ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）溶液を滴下して加えた。この溶液を室温に徐々に戻し、１２時間撹拌した。得られたＤＣＵを重力濾過により除去した。ＣＨ2Ｃｌ2を真空除去し、得られたポリマーをＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨの５０：５０混合物に溶解し、ジエチルエーテルで沈殿させた。得られた固体を遠心分離（５０００ｒｐｍ、１０分、４℃）により単離した。この工程を４回繰り返して、残留ＴＰＰ−（ＣＨ2）4−ＣＯＯＨを除去した。最後に、得られたポリマーを一晩凍結乾燥して、５９％の収率で標的化ポリマーを得た。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、４００ＭＨｚ）：δ７．６−７．７［ｍ，１５Ｈ，（ＰＰｈ3）］，５．３［ｍ，６５７Ｈ（ＯＣＨＣＨ3Ｃ（Ｏ）］，４．９［ｍ，１２７８Ｈ（ＯＣＨ2Ｃ（Ｏ）］，３．６［ｓ，１９７Ｈ（ＯＣＨ2）］，１．９［ｍ，２０６８Ｈ（ＣＨ3ＣＨ）］ｐｐｍ（図Ｓ１５）。13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、４００ＭＨｚ）：δ１６９．６，１６６．５，６６．０，６１．１，６０．９，１６．８９，１５．４６ｐｐｍ（図Ｓ１５）。31Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣ１3、１００ＭＨｚ）：δ２４．８ｐｐｍ（図Ｓ１５）。ＧＰＣ：Ｍｎ＝５４，５１０ｇ／ｍｏｌ、Ｍｗ＝７３，５１０ｇ／ｍｏｌ、Ｍｚ＝９４，３８０ｇ／ｍｏｌ、ＰＤＩ＝１．３５（図Ｓ１６）。
【０１７４】
プラチンＭを封入したＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧポリマーナノ粒子（ＮＰ）の調製：プラチンＭを封入した標的化ＮＰ（Ｔ−プラチンＭ−ＮＰ）および非標的化ＮＰ（ＮＴ−プラチンＭ−ＮＰ）を、ナノ沈殿法により調製した。手短に言えば、ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧＴＰＰ（Ｍａｒｒａｃｈｅ  ａｎｄ  Ｄｈａｒ、前出）またはＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＯＨを、ＤＭＦに溶解した（５０ｍｇ／ｍＬ）。種々の量のプラチンＭ（ＤＭＦ中１０ｍｇ／ｍＬ）をＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＴＰＰまたはＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＯＨ溶液に加えて、５ｍｇ／ｍＬの最終ポリマー溶液にした。これを、激しく撹拌するナノ純水（１０ｍＬ）に徐々に滴下して加え、室温で３時間撹拌した。次いで、この溶液を、１００ｋＤａの分子量カットオフの遠心濾過機を通して３回濾過洗浄して、すべての残留有機溶媒を確実に除去した。最後に、ＮＰをナノ純水（１ｍＬ）に再懸濁し、０．２μｍのフィルターを通して濾過した。ＮＰをサイズおよびゼータ電位についてＤＬＳにより特性評価し（表Ｓ１およびＳ２）、また封入されたプラチンＭの量をＩＣＰ−ＭＳにより分析した（表Ｓ１およびＳ２）。
【０１７５】
ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＱＤを封入したＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＴＰＰ−ＮＰの調製：ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＱＤを封入したＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧＴＰＰ−ＮＰ（Ｍａｒｒａｃｈｅ  ａｎｄ  Ｄｈａｒ、前出）を、ナノ沈殿法を使用して合成した。ＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＴＰＰ（ＤＭＦ中５ｍｇ／ｍＬ）およびＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＱＤ（１０μＬ、ＤＭＦ中８μΜ）の溶液を激しく撹拌する水に滴下して加えた。このＮＰを２時間撹拌した。有機溶媒を、１００ｋＤａのカットオフの遠心濾過機を使用する３回の洗浄により除去した。ＮＰをナノ純水に再懸濁した。
【０１７６】
ＮＰからのプラチンＭの放出カイネティクス：プラチンＭがＮＰコアから放出される速度を観察するために、Ｔ−プラチンＭ−ＮＰおよびＮＴ−プラチンＭ−ＮＰの放出カイネティクスを分析した。ＮＰ（ＴまたはＮＴ）は、上記の方法に従って合成した。得られたＮＰを、生理的条件（ｐＨ７．４、３７℃）の１×ＰＢＳ中で、１００ｋＤａの分子量カットオフのＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｍｉｎｉ透析装置を使用して透析した。ＰＢＳを１２時間ごとに交換した。種々の時点において、透析バッグを取り出し、ポリマーコア中の残存プラチンＭ量をＩＣＰ−ＭＳにより分析した。
【０１７７】
プラチンＭ−ＮＰ、プラチンＭ、およびシスプラチンの処理細胞の細胞分画：プラチンＭ、Ｔ−プラチンＭ−ＮＰ、ＮＴ−プラチンＭ−ＮＰ、およびシスプラチン（Ｐｔに関して１μΜ）を、ＰＣ３細胞（１５ｍＬ中に１．０×１０6細胞／ｍＬ）に１２時間内部移行させた。内部移行させた後、哺乳動物細胞用のミトコンドリア単離キットを使用してミトコンドリアおよびサイトゾルを単離した。細胞をトリプシン処理により分離し、１×ＰＢＳで３回洗浄した。プロテアーゼ阻害剤（１０ｍｇ／ｍＬ）を添加した試薬Ａを加えた後、氷上で２分間インキュベートした。試薬Ｂを加え、１分ごとに穏やかにボルテックスしながら、氷上で５分間インキュベートした。これに続いて、試薬Ｃを加え、細胞を遠心分離した（７００×ｇにて、４℃で１０分間）。得られたペレットから核および細胞デブリを得た。サイトゾル画分およびミトコンドリア画分を含有する上清を取り出し、さらに遠心分離した（１２，０００×ｇにて、４℃で１５分間）。得られた上清はサイトゾル画分を含有し、ペレットは不純なミトコンドリア画分を含有した。これを、試薬Ｃで洗浄することによってさらに精製し、遠心分離した（１２，０００×ｇにて、４℃で５分間）。分離した核および細胞デブリを純粋な核画分を得るためにさらに分画した。ペレットを、改変ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ７．０、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ2、３０ｍＭスクロース）６００μＬに再懸濁した。これを氷上で１０分間インキュベートし、遠心分離した（３０００ＲＰＭ、４℃）。得られたペレットを、予め冷却したＣａＣｌ2緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ７．０、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ2、３０ｍＭスクロース、１０ｍＭ  ＣａＣｌ2）１ｍＬに再懸濁した。これをＣａＣｌ2緩衝液で繰り返し遠心洗浄し、その上清を毎回廃棄した。ペレットを、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．９、２０％グリセロール、０．１Ｍ  ＫＣｌ、および０．２ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する緩衝液に再懸濁し、４℃で３０分間、１４，０００ｒｐｍで遠心分離することによりさらに精製した。得られたペレットから精製された核画分を得、Ｈ2Ｏに再懸濁した。各画分のタンパク質量をＢＣＡアッセイにより分析し、各画分のＰｔ含量をＩＣＰ−ＭＳにより定量した。
【０１７８】
ミトコンドリアの亜分画：ＱＤをブレンドしたＰＬＧＡ−ｂ−ＰＥＧ−ＴＰＰ−ＮＰ（ＮＰに関して０．５ｍｇ／ｍＬ）をＰＣ３細胞（３０ｍＬ中に１．０×１０6細胞／ｍＬ）に６時間内部移行させた。内部移行させた後、哺乳動物細胞用のミトコンドリア単離キットを使用してミトコンドリアおよびサイトゾルを単離した。これらの画分はさらに亜分画した。ＰＢＳ（ｌ×）中の新たに単離したＰＣ３ミトコンドリアを、プロテアーゼ阻害剤（０．１２５ｍｇ／ｍＬ）および０．６％ジギトニンと氷上で１０分間インキュベートした。インキュベーション直後に、ミトコンドリアを４℃で１０分間、１０，０００ｇで遠心分離した。上清（ＳＮ−Ｉ）はミトコンドリア外膜（ＯＭＭ）画分および膜間腔を含有した。ペレットを、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ、プロテアーゼ阻害剤（０．１２５ｍｇ／ｍＬ）に再懸濁し、氷上で１０分間インキュベートした。これを４℃で１０分間、１０，０００ｇで遠心分離した。ミトコンドリア基質を含有する上清を回収した。これに、１×細胞溶解緩衝液（３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０％ｗ／ｖスクロース）５０μｌを加えた。次いで、これを超音波処理し、４℃で１５分間、１０，０００ｇで遠心分離した。精製されたミトコンドリア内膜（ＩＭＭ）画分および基質を含有する上清（ＳＮ−ＩＩ）を回収した。ＳＮ−ＩおよびＳＮ−ＩＩを１０５，０００ｇで６０分間遠心分離した。ＳＮ−Ｉ由来のペレットはＯＭＭ画分を含有し、上清は膜間腔を含有した。ＳＮ−ＩＩ由来のペレットは、Ｌｕｂｒｏｌ  ＷＸ（０．５ｍｇ／ｍＬ）、３７％スクロースを含有するＰＢＳに再懸濁し、氷上で１５分間インキュベートした。これをもう１回、４℃で６０分間、１０５，０００ｇで遠心分離した。ＩＭＭ画分を含有するペレットおよび基質を含有する上清を回収した。回収した画分を、ＩＣＰ−ＭＳによりＣｄ濃度について分析した。すべての画分についてＢＣＡアッセイを行い、Ｃｄ（ｎｇ）／タンパク質（ｐｇ）を算出した。回収した画分を、５７０の励起波長およびＣｙ５．５発光チャネルを有するＸｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ（登録商標）Ｌｕｍｉｎａシステムにて０．５秒の露光時間で画像化した。
【０１７９】
ミトストレス試験分析：種々の呼吸パラメーター：基礎呼吸、共役効率、および予備呼吸容量を、Ｓｅａｈｏｒｓｅ  ＸＦ−２４細胞Ｍｉｔｏ  Ｓｔｒｅｓｓ試験キットを使用して検討した。アッセイの前に、ＸＦセンサーカートリッジを水和させた。ＸＦユーティリティプレートの各ウェルに、Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ校正液１ｍＬを加え、ＸＦセンサーカートリッジをユーティリティプレートの上に置き、ＣＯ２なしの３７℃インキュベーターにて、最低限１２時間保持した。ＰＣ３細胞、Ａ２７８０−ＣＰ７０細胞、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞、およびＨ９Ｃ２細胞（図Ｓ１８）を、ＸＦ２４ウェル細胞培養マイクロプレート（Ｓｅａｈｏｒｃｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）にて、増殖培地２００μＬ中、２．５×ｌ０4細胞／ウェルの密度（Ｈ９Ｃ２を除いて、この細胞株の細胞密度：５×ｌ０4細胞／ウェル）（０．３２ｃｍ２）で培養し、次いで、５％ＣＯ2雰囲気中、３７℃で２４時間インキュベートした。細胞を、プラチンＭ（１０μΜ）、シスプラチン（１０μΜ）、ＤＢＣＯ−ＴＰＰ（１０μΜ）、空のＴ−ＮＰ、空のＮＴ−ＮＰ、Ｔ−プラチンＭ−ＮＰ、ＮＴ−プラチンＭ−ＮＰ（Ｐｔに関して１０μΜ；空のＮＰについて約０．５ｍｇ／ｍＬ）で、５％ＣＯ2雰囲気中、３７℃で１２時間処理した。１２時間後、培養培地を５０μＬ以外すべて各ウェルから除去し、３７℃に予め加温したＸＦストレス試験解糖系最適化培地５００μＬで細胞を２回すすぎ、最後に、グルコース枯渇最適化培地４５０μＬを各ウェルに加え、アッセイ前に１時間、ＣＯ2なしの３７℃にプレートを置いた。種々の呼吸パラメーターを、電子伝達阻害剤オリゴマイシン（１．０μΜ）、トリフルオロカルボニルシアニドフェニルヒドラゾンすなわちＦＣＣＰ（１．０μΜ）、移動性イオン担体であるイオノフォア、ならびに複合体ＩＩＩ阻害剤であるアンチマイシンＡ（１．０μΜ）と複合体ＩのＦｅ−Ｓ中心からユビキノンへの電子移動を妨げるミトコンドリア阻害剤であるロテノン（１．０μΜ）の混合物の添加前後の平均呼吸速度を差し引くことにより算出した。算出したパラメーターには以下のものが含まれる：基礎呼吸（ベースライン呼吸−アンチマイシンＡ注入後呼吸）、ＡＴＰ代謝回転（ベースライン呼吸−オリゴマイシン注入後呼吸）、最大呼吸容量（ＦＣＣＰ刺激呼吸−アンチマイシンＡ注入後呼吸）、および予備呼吸容量（ＦＣＣＰ刺激呼吸−ベースライン呼吸）。各ウェルの被験物質には４つのレプリケートがあった（データを示さず）。
【０１８０】
Ｔ−ＮＰのｉｎ  ｖｉｖｏ生体内分布（ｂｉｏＤ）および薬物動態（ＰＫ）：ｂｉｏＤおよびＰＫの特性を、体重約３００ｇの雄性スプラーグドーリーラットを使用して決定した。１群当たり３匹のラットに、Ｔ−ＱＤ−ＮＰを、約１ｍＬのＴ−ＮＰ（ＮＰに関して２３ｍｇ／ｋｇ、Ｃｄに関して８１μｇ／ｋｇ）または生理食塩水と一緒に、尾静脈を介して注入した。種々の時間間隔で、血液サンプルをヘパリン処理チューブに採取し、遠心分離して血漿を集めた。血液が体重の７％を構成し、血漿が血液量の５５％を構成することを考慮して、ＱＤのパーセントを算出した。血漿中のＱＤ由来Ｃｄ量をＩＣＰ−ＭＳにより算出した。２４時間後、動物を屠殺し、重要臓器を摘出した。尿および糞便もすべて２４時間にわたり集めた。全体的なｂｉｏＤは、各臓器ならびに尿および糞便中のＣｄ量をＩＣＰ−ＭＳにより分析して算出した。分析前に、臓器および糞便を、穏やかに加熱および撹拌しながら、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ｓｏｌｖａｂｌｅ（製品番号：６ＮＥ９１００）で２４時間溶解した。ＡＵＣ、Ｃmax、Ｔmax、およびＣL（ｔ＝０）についての計算を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（バージョン５．０１）で行った。ＰＫパラメーターは、２コンパートメントモデル式を使用して、データを適合させることにより決定した。
【０１８１】
プラチンＭおよびプラチンＭ−ＮＰの細胞傷害性分析：プラチンＭ、Ｔ−プラチンＭ−ＮＰ、ＮＴ−プラチンＭ−ＮＰ、およびシスプラチンの細胞傷害性を、ＰＣ３、Ａ２７８０／ＣＰ７０、ＳＨ−ＳＹ−５Ｙ、およびＭＳＣにおいて、（４，５−ジメチルチアゾ−ル−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイにより試験した（データを示さず）。ＰＣ３細胞（２０００細胞／ウェル）、Ａ２７８０／ＣＰ７０細胞（２０００細胞／ウェル）、ＳＨＳＹ−５Ｙ（２０００細胞／ウェル）、およびＭＳＣ（２０００個の細胞／ウェル）を、９６ウェルプレート上に播種し、一晩増殖させた。培地を交換し、漸増濃度の各製剤を加えた。Ｔ−プラチンＭ−ＮＰ、ＮＴ−プラチンＭ−ＮＰの場合、培地を１２時間後に交換し、さらに６０時間インキュベートした。遊離薬物では、さらに培地交換することなく、７２時間インキュベートした。所与のインキュベーション時間後、ＭＴＴを加え（５ｍｇ／ｍＬ、２０μＬ／ウェル）、ＭＴＴが還元されて紫色のホルマザンになるように５時間インキュベートした。培地を除去し、細胞をＤＭＳＯ１００μＬで溶解した。ホルマザン溶液を均質にするために、プレートを緩やかに１０分間振盪し、プレートリーダーを用いて、８００ｎｍのバックグラウンドを読み取ると共に、５５０ｎｍの吸光度を読み取った。細胞傷害性は、曝露されなかった対照に対する平均パーセント増加±ＳＤとして表現した。対照の値を０％の細胞傷害性または１００％の細胞生存率に設定した。細胞傷害性データを（適切な場合）シグモイド曲線に適合させ、３パラメーターロジスティックモデルを使用してＩＣ50を算出した。ＩＣ50は、未処理対照に比較して５０％の阻害をもたらす化学療法剤の濃度である。平均ＩＣ50は、実験条件下で細胞増殖を５０％減少させる薬剤の濃度であり、再現可能でかつ統計的に有意である、少なくとも３回の独立した測定からの平均である。ＩＣ50値は、±９９％信頼区間で報告した。この分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｕ．Ｓ．Ａ）で行なった。
【０１８２】
ｍｔＤＮＡ−Ｐｔ付加体およびｎＤＮＡ−Ｐｔ付加体の定量：ミトコンドリアおよび核を前述のプロトコールに従って単離した。これらの画分をさらに分画して、それぞれミトコンドリアＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを単離した。ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）については、新たに単離したミトコンドリアをミトコンドリア溶解緩衝液３５μＬに再懸濁した。これに、酵素混合物５μＬを加えた。これを、溶液が透明になるまで、水浴中にて５０℃でインキュベートした（約１時間）。これに無水エタノール１００μＬを加え、得られた溶液を−２０℃で１０分間インキュベートした。次いで、溶液を室温で５分間、１４０００ｒｐｍで遠心分離した。次いで、得られたペレットを７０％エタノールナノ純水（Ｈ2Ｏ）溶液で洗浄することにより精製した。得られた精製ｍｔＤＮＡを、ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝液に再懸濁した。得られた溶液について、ＵＶ−Ｖｉｓ分光法（２６０／２８０ｎｍ）によりＤＮＡの量および純度、またＩＣＰ−ＭＳによりＰｔ量を定量した。ゲノムＤＮＡ（ｎＤＮＡ）については、新たに単離した核を細胞溶解緩衝液４０μＬに再懸濁した。これに、酵素混合物５μＬを加えた。これを、溶液が透明になるまで、５０℃の水浴中でインキュベートした（約１時間）。これに無水エタノール１００μＬを加え、得られた溶液を−２０℃で１０分間インキュベートした。次いで、溶液を室温で５分間、１４０００ｒｐｍで遠心分離した。次いで、得られたペレットを７０％エタノールナノ純水（Ｈ2Ｏ）溶液で洗浄することにより精製した。２６０と２８０ｎｍの吸光度の比が、≧１．７５かつ≦２．１になるまで、７０％エタノールナノ純水溶液で再沈殿を行なった。得られた精製ｎＤＮＡをＴＥ緩衝液に再懸濁した。得られた溶液について、ＵＶ−Ｖｉｓ分光法（２６０／２８０ｎｍ）によりＤＮＡ量、またＩＣＰ−ＭＳによりＰｔ量を定量した。
【０１８３】
動物。動物は、Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手し、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ（ＡＡＡＬＡＣ）の“Ｔｈｅ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ”、Ａｎｉｍａｌ  Ｗｅｌｆａｒｅ  Ａｃｔ（ＡＷＡ）、および他の適用可能な連邦および州のガイドラインに従って取り扱った。本明細書に提示したすべての動物試験は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）ｏｆ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｏｒｇｉａにより承認されたものである。
【０１８４】
統計。データはすべて、平均±Ｓ．Ｄ（標準偏差）として表した。統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウェアｖ５．００（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．，ＣＡ）を使用して行なった。２つの値の間の比較は、独立スチューデントｔ検定を使用して行なった。ポストホックテューキー検定と共に一元配置分散分析を、群間の有意差を確認するために使用した。
【０１８５】
【表１】
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【０１８６】
【表２】
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【０１８７】
【表３】
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【０１８８】
上記のように、ミトコンドリア標的化白金（ＩＶ）プロドラッグの実施形態を開示する。当業者は、本明細書に記載のナノ粒子および方法を開示したもの以外の実施形態で実行し得ることを認識されよう。開示した実施形態は、説明を目的として提示したものであり、限定を目的とするものではない。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ−１】
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【図３Ｂ−２】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年10月19日(2016.10.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
一部の実施形態では、ミトコンドリア標的化部分を、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）誘導体または当業者に公知のシクロオクチンなど別のシクロオクチン誘導体にコンジュゲートして、本開示によるＰｔ（ＩＶ）化合物の中に組み込むためのＤＢＣＯ−ミトコンドリア標的化部分またはシクロオクチン−ミトコンドリア標的化部分を得ることができる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７６】
種々の実施形態では、ナノ粒子は、１つまたは複数の化学療法剤を含む。本明細書で使用する場合、「化学療法剤」は、癌の処置のための薬剤、例えば、細胞傷害性薬剤または抗新生物剤である。任意の適切な化学療法剤を、本明細書に記載のナノ粒子中に含むことができる。化学療法剤の例としては、（ｉ）アルキル化剤、例えば、シクロホスファミド、メクロレタミン、クロランブシル、メルファラン等；（ｉｉ）アントラサイクリン類、例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、バルルビシン等；（ｉｉｉ）細胞骨格破壊剤、例えば、パクリタキセル、ドセタキセル等；（ｉｖ）エポチロン類、例えば、エポチロン等；（ｖ）ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、例えば、ボリノスタット、ロミデプシン等；（ｖｉ）トポイソメラーゼＩ阻害剤、例えば、イリノテカン、トポテカン等；（ｖｉｉ）トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えば、エトポシド、テニポシド、タフルポシド等；（ｖｉｉｉ）キナーゼ阻害剤、例えば、ボルテゾミブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、ベムラフェニブ、ビスモデギブ、ビスモデギブ等；（ｉｘ）モノクローナル抗体、例えば、ベバシズマブ、セツキシマブ、イピリムマブ、オファツムマブ、オクレリズマブ、パニツマブ（ｐａｎｉｔｕｍａｂ）、リツキシマブ等；（ｘ）ヌクレオチドアナログおよび前駆体アナログ、例えば、アザシチジン、アザチオプリン、カペシタビン、シタラビン、ドキシフルリジン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、メルカプトプリン、メトトレキセート、チオグアニン等；（ｘｉ）ペプチド系抗生物質、例えば、ブレオマイシン、アクチノマイシン等；（ｘｉｉ）白金ベースの薬剤、例えば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン等；（ｘｉｉｉ）レチノイド類、例えば、トレチノイン、アリトレチノイン、ベキサロテン等；（ｘｉｖ）ビンカアルカロイド類および誘導体、ビンブラスチン、ビンクリスチン、シンデシン（ｃｉｎｄｅｓｉｎｅ）、ビノレルビン等；ならびに（ｘｖ）その他同種のものが挙げられる。一部の実施形態では、１つまたは複数の化学療法剤の少なくとも１つは、ドセタキセル、ミトキサントロン、パクリタキセル、サトラプラチン、およびシスプラチンからなる群から選択される。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３８】
Ｔ−ＮＰの全身クリアランス（ＣＬ）は、中心コンパートメントで約４．７ｍＬ／時・ｋｇであり、末端相で０．０５ｍＬ／時・ｋｇであった（図３Ｃ）。長いｔ1/2値および小さいＣＬ値から、Ｔ−ＮＰの長期循環特性が示された。さらに、３４７８４±２１１７時・ｎｇ／ｍＬの顕著に高い曲線下面積（ＡＵＣ）が、これらのＮＰの長期循環特性を支持した。３２３７±１２８ｎｇ／ｍＬの最高血漿中濃度（Ｃｍａｘ）は、これらのミトコンドリア標的化ＮＰが血流に極めて効率的に分布することを示した（図３Ｃ）。中心コンパートメントの大きい分布容積（Ｖｄ）は、Ｔ−ＮＰが初期に、体内組織に広範囲に分布することを示した。しかしながら、末梢コンパートメントにおけるＶｄの減少により、−ＴＰＰ部分で覆われた立体障害のある表面を有するそのユニークな組成のために、これらのＮＰは低下したタンパク結合を示すことが支持され、したがって、Ｔ−ＮＰはプラチンＭのミトコンドリア送達の優れた候補になる。
【国際調査報告】
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