(57)【要約】  本発明は、患者ががんに罹患しているか、またはがんに罹患するリスクが高いかどうかを判定する、または予後診断する方法に関するが、その方法は、患者から得られたサンプル中の、1つもしくは複数のがん関連融合遺伝子、またはそれに由来するタンパク質の存在を調べることを含む。さらに具体的には、本発明は、胃がんにおけるCLEC16A-EMP2、SNX2-PRDM6、MLL3-PRKAG2、DUS2L-PSKH1、およびCLDN18-ARHGAP26に関する。本方法の使用、および本方法で使用されるキットも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者ががんに罹患しているか、またはがんに罹患するリスクが高いかどうかを判定する、または予後診断する方法であって、その方法が、患者から得られたサンプル中の、1つもしくは複数のがん関連融合遺伝子、またはそれに由来するタンパク質の存在を調べることを含み、該サンプル中の1つもしくは複数のがん関連融合遺伝子の存在は、前記患者ががんに罹患していること、またはがんに罹患するリスクが高いことを示し、該がん関連融合遺伝子は、CLEC16A-EMP2（配列番号97、99または101）、SNX2-PRDM6（配列番号113または115）、MLL3-PRKAG2（配列番号121、123または125）、およびDUS2L-PSKH1（配列番号131または133）からなる一群から選択されるか、または該がん関連融合遺伝子は、CLDN18-ARHGAP26（配列番号107）と組み合わせて、CLEC16A-EMP2（配列番号97、99または101）、SNX2-PRDM6（配列番号113または115）、MLL3-PRKAG2（配列番号121、123または125）およびDUS2L-PSKH1（配列番号131または133）からなる一群から選択される、前記方法。
【請求項２】
サンプル中の1つもしくは複数のがん関連遺伝子の存在が、患者が差異に基づく治療プランの候補となることを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記がん関連融合遺伝子が、CLEC16A-EMP2（配列番号97、99または101）、SNX2-PRDM6（配列番号113または115）、MLL3-PRKAG2（配列番号121、123または125）、およびDUS2L-PSKH1（配列番号131または133）からなる一群から選択される2つ、もしくは3つ、もしくは4つの融合遺伝子であるか、または前記がん関連融合遺伝子が、CLDN18-ARHGAP26（配列番号107）と組み合わせて、CLEC16A-EMP2（配列番号97、99または101）、SNX2-PRDM6（配列番号113または115）、MLL3-PRKAG2（配列番号121、123または125）およびDUS2L-PSKH1（配列番号131または133）からなる一群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
がんが上皮がんである、請求項１〜３のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
上皮がんが、胃がん、肺がん、乳がん、泌尿生殖器がん、結腸がん、前立腺がん、および子宮頸がんからなる一群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記がんが胃がんである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記がん関連融合遺伝子が、CLEC16A-EMP2（配列番号97、99または101）であるか、またはCLDN18-ARHGAP26（配列番号107）と組み合わせたCLEC16A-EMP2（配列番号97、99または101）である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記がん関連融合遺伝子が、CLEC16A-EMP2（配列番号97、99または101）である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
1つもしくは複数のがん関連融合遺伝子を持たない患者由来のサンプルと比較して、がんのリスクが高いことを判定する、請求項1〜８のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
１つもしくは複数の融合遺伝子が、CLEC16A-EMP2（配列番号97、99または101）、SNX2-PRDM6（配列番号113または115）、MLL3-PRKAG2（配列番号121、123または125）、DUS2L-PSKH1（配列番号131または133）、およびCLDN18-ARHGAP26（配列番号107）からなる一群から選択される配列と、少なくとも70%同一である、請求項１〜９のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
CLEC16A-EMP2（配列番号97、99または101）、SNX2-PRDM6（配列番号113または115）、MLL3-PRKAG2（配列番号121、123または125）、DUS2L-PSKH1（配列番号131または133）、またはCLDN18-ARHGAP26（配列番号107）のいずれか１つをコードする核酸配列を含有する発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載の発現ベクターで形質転換された細胞。
【請求項１３】
請求項１２に記載の形質転換された細胞を、ポリペプチド発現に適した条件下で培養すること、ならびにその細胞からポリペプチドの総量を回収することを含む、ポリペプチドを作製する方法。
【請求項１４】
患者のがんの判定もしくは予後診断におけるがん関連融合遺伝子の使用であって、患者から得られたサンプル中の１つもしくは複数のがん関連遺伝子の存在は、該患者ががんに罹患していること、または、がんを発症するリスクが高いことを示し、該がん関連融合遺伝子は、CLEC16A-EMP2（配列番号97、99または101）、SNX2-PRDM6（配列番号113または115）、MLL3-PRKAG2（配列番号121、123または125）、およびDUS2L-PSKH1（配列番号131または133）からなる一群から選択されるか、または該がん関連融合遺伝子は、CLDN18-ARHGAP26（配列番号107）と組み合わせて、CLEC16A-EMP2（配列番号97、99または101）、SNX2-PRDM6（配列番号113または115）、MLL3-PRKAG2（配列番号121、123または125）およびDUS2L-PSKH1（配列番号131または133）からなる一群から選択される、前記使用。
【請求項１５】
サンプル中の１つもしくは複数のがん関連遺伝子の存在が、その患者が差異に基づく治療プランの候補であることを示す、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記がん関連遺伝子が、CLEC16A-EMP2（配列番号97、99または101）、SNX2-PRDM6（配列番号113または115）、MLL3-PRKAG2（配列番号121、123または125）、およびDUS2L-PSKH1（配列番号131または133）からなる一群から選択される2つ、もしくは3つ、もしくは4つの融合遺伝子であるか、またはがん関連融合遺伝子が、CLDN18-ARHGAP26（配列番号107）と組み合わせて、CLEC16A-EMP2（配列番号97、99または101）、SNX2-PRDM6（配列番号113または115）、MLL3-PRKAG2（配列番号121、123または125）およびDUS2L-PSKH1（配列番号131または133）からなる一群から選択される、請求項１４または１５に記載の使用。
【請求項１７】
少なくとも２つのがん関連遺伝子が検出され、その一方がCLDN18-ARHGAP26（配列番号107）であって、他方のがん関連融合遺伝子がCLEC16A-EMP2（配列番号97、99または101）、SNX2-PRDM6（配列番号113または115）、MLL3-PRKAG2（配列番号121、123または125）およびDUS2L-PSKH1（配列番号131または133）からなる一群から選択される、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
がんが上皮がんである、請求項１４〜１７のいずれか1項に記載の使用。
【請求項１９】
上皮がんが、胃がん、肺がん、乳がん、泌尿生殖器がん、結腸がん、前立腺がん、および子宮頸がんからなる一群から選択される、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記がんが胃がんである、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
１つもしくは複数の融合遺伝子が、CLEC16A-EMP2（配列番号97、99または101）、SNX2-PRDM6（配列番号113または115）、MLL3-PRKAG2（配列番号121、123または125）、DUS2L-PSKH1（配列番号131または133）、およびCLDN18-ARHGAP26（配列番号107）からなる一群から選択される配列と、少なくとも70%同一である、請求項１４〜２０のいずれか1項に記載の使用。
【請求項２２】
請求項１〜１０のいずれか1項に記載の方法で使用されるキットであって：
a) 配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、および配列番号9からなる一群から選択される第1のプライマー；
b) 配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、および配列番号10からなる一群から選択される第2のプライマー；
を含み、場合により使用説明書を併せて含んでいてもよい、前記キット。
【請求項２３】
デオキシリボヌクレオチド塩基（dNTP）をさらに含む、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
DNAポリメラーゼをさらに含む、請求項２２または２３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本明細書は、シンガポール出願第10201400876T号、出願日2014年3月21日、の優先権の利益を主張するものであり、その内容はあらゆる目的のために参考としてその全体を本明細書に含めるものとする。
発明の分野
本発明は、がんバイオマーカー、より詳細には、がんの予後バイオマーカーとしての融合遺伝子、の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは、正常な制御機構を失って制御されない増殖を来した細胞群を特徴とする疾病の一分類である。がん細胞はまた悪性細胞とも呼ばれ、あらゆる臓器内のいかなる組織からも発生しうる。がん細胞は、成長し増殖するにつれて、隣接する正常な組織に浸潤してこれを破壊する腫瘍を形成する。がん細胞は原発部位から全身に広がる可能性もある。
【０００３】
がんの一例として胃がん（GC）がある。ほとんどのGCは進行期に診断されるが、そのことが現行の治療法を制限しており、遠隔の、すなわち転移性の疾患のため5年全生存率は約3％である。
【０００４】
分子レベルでは、GCは不均一であり、目下のところ唯一の治療標的は増幅された受容体型チロシンキナーゼERBB2である。
【０００５】
全ゲノムおよびエクソームシーケンシング研究は反復突然変異遺伝子を同定してきたが、GCにおけるゲノム再構成は、あまり詳細には研究されていない。ゲノム再構成は、増幅、欠失、および遺伝子破壊によって遺伝子機能に劇的な影響を及ぼし、新たな機能を有する融合遺伝子を作り出す可能性がある。
【０００６】
したがって、高リスクおよび低リスクのがん患者を識別して、異なる治療法を割り当てることができるように、胃がんなどのがんに罹患した患者の予後を確実に判定するために使用することができる、予後因子およびマーカーを特定する必要がある。
【発明の概要】
【０００７】
ある態様において、患者ががんに罹患しているか、またはがんに罹患するリスクが高いかどうかを判定する、または予後診断する方法が与えられるが、その方法は、患者から得られたサンプル中の、1つもしくは複数のがん関連融合遺伝子、またはそれに由来するタンパク質の存在を調べることを含み、このサンプル中の1つもしくは複数のがん関連融合遺伝子の存在は、前記患者ががんに罹患していること、またはがんに罹患するリスクが高いことを示すが、このがん関連融合遺伝子は、CLEC16A-EMP2（配列番号97、99または101）、SNX2-PRDM6（配列番号113または115）、MLL3-PRKAG2（配列番号121、123または125）、およびDUS2L-PSKH1（配列番号131または133）からなる一群から選択されるか、またはこのがん関連融合遺伝子は、CLDN18-ARHGAP26（配列番号107）と組み合わせて、CLEC16A-EMP2（配列番号97、99または101）、SNX2-PRDM6（配列番号113または115）、MLL3-PRKAG2（配列番号121、123または125）およびDUS2L-PSKH1（配列番号131または133）からなる一群から選択される。
【０００８】
ある態様において、患者ががんに罹患しているか、またはがんに罹患するリスクが高いかどうかを判定する方法が与えられるが、その方法は、患者から得られたサンプル中の、１つもしくは複数のがん関連融合遺伝子、またはそれに由来するタンパク質の存在を調べることを含んでおり、このサンプル中の1つもしくは複数のがん関連融合遺伝子の存在は、前記患者において、がん、またはがんリスクの増大を示すが、このがん関連融合遺伝子は、CLEC16A-EMP2（配列番号97、99または101）、SNX2-PRDM6（配列番号113または115）、MLL3-PRKAG2（配列番号121、123または125）、DUS2L-PSKH1（配列番号131または133）、およびCLDN18-ARHGAP26（配列番号107）からなる一群から選択される。
【０００９】
ある態様において、患者ががんに罹患しているか、またはがんを発症するリスクが高いかどうかを判定する方法が与えられるが、その方法は、患者から得られたサンプルにおいて、CLEC16A-EMP2（配列番号97、99または101）、SNX2-PRDM6（配列番号113または115）、MLL3-PRKAG2（配列番号121、123または125）、およびDUS2L-PSKH1（配列番号131または133）からなる一群から選択される１つもしくは複数のがん関連融合遺伝子を検出すること、またはCLDN18-ARHGAP26（配列番号107）と組み合わせて、CLEC16A-EMP2（配列番号97、99または101）、SNX2-PRDM6（配列番号113または115）、MLL3-PRKAG2（配列番号121、123または125）およびDUS2L-PSKH1（配列番号131または133）からなる一群から選択される１つもしくは複数のがん関連融合遺伝子を検出することを含んでおり、この、サンプル中の１つもしくは複数のがん関連融合遺伝子の存在は、その患者ががんに罹患しているか、またはがんを発症するリスクが高いことを示す。
【００１０】
ある態様において、患者ががんに罹患しているか、またはがんを発症するリスクが高いかどうかを判定する方法が与えられるが、その方法は、患者から得られたサンプルにおいて、CLEC16A-EMP2（配列番号97、99または101）、SNX2-PRDM6（配列番号113または115）、MLL3-PRKAG2（配列番号121、123または125）、DUS2L-PSKH1（配列番号131または133）、およびCLDN18-ARHGAP26（配列番号107）からなる一群から選択される１つもしくは複数のがん関連融合遺伝子を検出することを含んでおり、この、サンプル中の１つもしくは複数のがん関連融合遺伝子の存在は、その患者ががんに罹患しているか、またはがんを発症するリスクが高いことを示す。
【００１１】
ある態様において、CLEC16A-EMP2（配列番号97、99または101）、SNX2-PRDM6（配列番号113または115）、MLL3-PRKAG2（配列番号121、123または125）、DUS2L-PSKH1（配列番号131または133）、またはCLDN18-ARHGAP26（配列番号107）のいずれか１つをコードする核酸配列を含有する発現ベクターが与えられる。
【００１２】
ある態様において、本明細書に記載の発現ベクターで形質転換された細胞が与えられる。
【００１３】
ある態様において、ポリペプチドを作製するための方法が与えられるが、その方法は、ポリペプチド発現に適した条件下で本明細書に記載の形質転換細胞を培養すること、およびその細胞から前記ポリペプチドの存在量を集めることを含む。
【００１４】
ある態様において、患者のがんの判定もしくは予後診断におけるがん関連融合遺伝子の使用が与えられるが、患者から得られたサンプル中の１つもしくは複数のがん関連融合遺伝子の存在は、その患者ががんに罹患していること、または、がんを発症するリスクが高いことを示しており、このがん関連融合遺伝子は、CLEC16A-EMP2（配列番号97、99または101）、SNX2-PRDM6（配列番号113または115）、MLL3-PRKAG2（配列番号121、123または125）、およびDUS2L-PSKH1（配列番号131または133）からなる一群から選択されるか、またはこのがん関連融合遺伝子は、CLDN18-ARHGAP26（配列番号107）と組み合わせて、CLEC16A-EMP2（配列番号97、99または101）、SNX2-PRDM6（配列番号113または115）、MLL3-PRKAG2（配列番号121、123または125）およびDUS2L-PSKH1（配列番号131または133）からなる一群から選択される。
【００１５】
ある態様において、患者ががんに罹患しているか、またはがんのリスクが高いかどうかの判定に、がん関連融合遺伝子を使用することが与えられるが、患者から得られたサンプル中の1つもしくは複数のがん関連融合遺伝子の存在は、その患者ががんに罹患していること、または、がんを発症するリスクが高いことを示しており、このがん関連融合遺伝子は、CLEC16A-EMP2（配列番号97、99または101）、SNX2-PRDM6（配列番号113または115）、MLL3-PRKAG2（配列番号121、123または125）、およびDUS2L-PSKH1（配列番号131または133）からなる一群から選択されるか、またはこのがん関連融合遺伝子は、CLDN18-ARHGAP26（配列番号107）と組み合わせて、CLEC16A-EMP2（配列番号97、99または101）、SNX2-PRDM6（配列番号113または115）、MLL3-PRKAG2（配列番号121、123または125）およびDUS2L-PSKH1（配列番号131または133）からなる一群から選択される。
【００１６】
ある態様において、本明細書に記載の方法で使用されるキットが与えられるが、それは：
a) 配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、および配列番号9からなる一群から選択される第1のプライマー；
b) 配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、および配列番号10からなる一群から選択される第2のプライマー；
を含み、場合により使用説明書を併せて含んでいてもよい。
【００１７】
本発明は、詳細な説明を参照し、制限的でない実例および添付の図面を併せて考察すると、よりよく理解することができるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１−１】GCにおいてDNA-PETにより同定された体細胞SVの特徴。(A) GC患者125に関するSVフィルタリング手順を示す。Circosによって、円形に配置されたヒトゲノムの全域にわたってSVをプロットしたが、外側の輪にコピー数変化を示し、欠失、タンデム重複、逆位/ペアの存在しない逆位と続き、内側の輪には単独の染色体間転座を示す。患者125の血中で確認されたSV（上の左図）を、患者125の胃腫瘍において確認されたSV（上の右図）から引き去ると、腫瘍に特異的な、体細胞的に獲得されたSV（下図）が与えられた。
【図１−２】(B) 15個のGCの体細胞性および生殖系列SVの分布。
【図１−３】(C) 15個のGCにおける体細胞性および生殖細胞SVの割合。SV数を上部に示す。
【図１−４】(D) GCの体細胞SVを生殖系列SVと比べた比較。SV数を上部に示す。
【図１−５】(E) GCの体細胞SV構成と、既報の膵臓がん、乳がん、および前立腺がんの体細胞SVとの比較。SVは比較することができる4つのカテゴリーにまとめた。
【図２−１】体細胞SVのブレイクポイントの特徴は機構的な洞察を与える。(A-C) GCの体細胞SVのブレイクポイント位置の特徴。リピートおよび遺伝子の座標をUCSCゲノムブラウザからダウンロードして、オープンクロマチン領域をEncyclopedia of DNA Elements (ENCODE)から収集した。
【図２−２】図２−１の続きである。
【図２−３】(D) 再構成に関わる遺伝子は、SVブレイクポイントの1つに由来する低分子DNA断片の挿入を有する可能性がある。矢印はゲノム断片を表す。ブレイクポイントの座標が示され、マイクロホモロジーをブレイクポイントペアの上に示す。
【図２−４】(E) 体細胞タンデム重複およびクロマチン相互作用のオーバーラップ例。第4染色体および拡大された遺伝子座の座標を上部に示す。GC腫瘍100の体細胞59 kbタンデム重複のPETマッピング座標を、左側の上流マッピング領域および右側の下流マッピング領域とともに示す。括弧内の数字は、2つの領域を連結する非冗長PET読み取り数を示す（クラスターサイズ）。下図：細胞株MCF-7においてChIA-PETにより確認されたクロマチン相互作用は、2つのブレイクポイント領域間の相互作用がアーチで表されることを示す。
【図３−１】15個のGCにおいて同定されたSVと、ChIA-PETシーケンシングにより確認されたクロマチン相互作用との相関。(A) 乳がん（BC、n = 1,935）およびGC（n = 1,945）においてDNA-PETで同定された体細胞SVならびにGC患者（n = 1,667）の生殖系列SVと、乳がん細胞株MCF-7（n = 87,253）においてRNAポリメラーゼIIに関連づけられた遠距離クロマチン相互作用とのオーバーラップ。絶対数を棒グラフのバーの上に示す。ChIA-PET相互作用とオーバーラップするSVの割合は、各データセットのSV総数（たとえばGCのSV）に対して算出する。全SV/クロマチン相互作用オーバーラップは、偶然によって予想されるよりも有意に高い（P < 0.001、並べ替え検定による）。
【図３−２】(B) 慢性骨髄性白血病（CML、n = 189）およびGC（n = 1,945）においてDNA-PETで同定された体細胞SVならびにGC患者（n = 1,667）の生殖系列SVと、CML細胞株K562（n = 154,130）においてRNAポリメラーゼIIに関連づけられた遠距離クロマチン相互作用とのオーバーラップ。全SV/クロマチン相互作用オーバーラップは、偶然によって予想されるよりも有意に高い（P < 0.001、並べ替え検定による）。(C、EおよびG) ペアの存在するGC患者の正常組織で同定された1,667個の非冗長性生殖系列SVと、MCF-7のChIA-PETにより確認された87,253個のRNAポリメラーゼIIクロマチン相互作用との間の、オーバーラップの特徴を示す。(D、FおよびH) 15個のGCで同定された1,945個の体細胞SVと、C、EおよびGと同じMCF-7のクロマチン相互作用との間の、オーバーラップの特徴を示す。
【図３−３】(C)および(D) SVとクロマチン相互作用との間のオーバーラップの割合を図解するベン図であって、小さなオーバーラップを示すが、これは偶然によって予想されるよりも有意に大きい（P < 0.001、並べ替え検定による）。
【図３−４】(E)および(F) それぞれ、クロマチン相互作用部位とオーバーラップする（共通の）、またはオーバーラップしない（特有の）SVのクラスタサイズ分布の比較。
【図３−５】図３−４の続きである。
【図３−６】(G)および(H)は、SVとクロマチン相互作用部位との間の距離の分布を示す。
【図３−７】図３−６の続きである。
【図４−１】GCの再発性CLDN18-ARHGAP26インフレーム融合物は、HGC27において増殖促進効果を有する。(A) RefSeq遺伝子トラック（上図）、DNA-PETシーケンシングによる腫瘍136のコピー数（中間の図）、および腫瘍136におけるCLDN18およびARHGAP26のブレイクポイントを有する体細胞均衡型転座のPETマッピング（下図）。融合エクソンの数を赤で示す。DNA-PETクラスタのマッピング領域を、赤およびグレーの矢じり形で示したが、クラスタサイズは括弧内、破線は角括弧内のサンガーシーケンシングで検証されたブレークポイント座標にある。腫瘍07K611Tのゲノムブレイクポイントの位置（chr3:139,237,526およびchr5:142,309,897）を縦の矢印で示す。
【図４−２】(B) 腫瘍138のFISHによるゲノム再構成の検証。(C) CLDN18-ARHGAP26融合物を有する2つの胃がんの、腫瘍/正常ペアのRT-PCR。βアクチンに関するRT-PCRはポジティブコントロールとなる。N、正常な胃組織；T、胃腫瘍；M、マーカー。
【図４−３】(D) CLDN18のエクソン5のコード領域内の隠れたスプライス部位は、ARHGAP26へのオープンリーディングフレームの延長をもたらす。融合転写物の配列は、太字で強調され、縦線で結ばれる。
【図４−４】(E) CLDN18-ARHGAP26のタンパク質ドメインイデオグラム。(F) 腫瘍136のCLDN18-ARHGAP26の、RT-PCRのサンガーシーケンシングクロマトグラム。CLDN18とARHGAP26との間の融合ポイントを縦の破線で示す。
【図４−５】(G) HGC27親細胞、ならびに空の発現ベクターおよびCLDN18-ARHGAP26発現ベクターを有する安定細胞株におけるCLDN18-ARHGAP26融合転写物のqRT-PCR。(H) CLDN18-ARHGAP26を安定的に発現するHGC27細胞の増殖アッセイ。アッセイは4連で実施される。エラーバーは標準偏差を表す。OD450、450 nmにおける光学密度。MLL3-PRKAG2、DUS2L-PSKH1、CLEC16A-EMP2、およびSNX2-PRDM6の特性解析については、図5から8まで、および実施例12を参照されたい。
【図５−１】GCの再発性MLL3-PRKAG2インフレーム融合物は、TMK1において増殖促進効果を有する。(A) UCSCからダウンロードしたRefSeq遺伝子トラック（上図）、TMK1のDNA-PETシーケンシングによる物理的カバレッジ（中間の図）、ならびにMLL3およびPRKAG2PETのブレイクポイントを有する体細胞性欠失のマッピング（下図）。
【図５−２】(B) Ensembl (www.ensembl.org)からダウンロードされたMLL3およびPRKAG2の遺伝子構造。転写物レベルでのエクソン-エクソン融合物は、斜めの線によって示され、エクソン番号はそれぞれ遺伝子の上と下に示される。斜め線に沿って記載の数字は、それぞれの融合物の観測数を示す。
【図５−３】(C) MLL3-PRKAG2融合物を有する3つの胃がんの、腫瘍/正常ペアのRT-PCR。βアクチンに関するRT-PCRはポジティブコントロールとなる。M、マーカー；N、正常な胃組織；T、胃腫瘍。
【図５−４】(D) TMK1のMLL3-PRKAG2融合物の、RT-PCRのサンガーシーケンシングクロマトグラム。MLL3とPRKAG2との間の融合ポイントを縦の破線で示す。
【図５−５】(E) 内在性MLL3およびPRKAG2、ならびに融合ポイントに特異的なsiRNA AおよびBを用いてTMK1においてノックダウンした後の融合転写物に関する定量的RT-PCR。実験は3連で実施した。エラーバーは、3連の標準偏差を表す。
【図５−６】(F) MLL3-PRKAG2融合物を標的とするsiRNAを有するTMK1細胞の増殖アッセイ。FGFR4は、ノックダウン後のマイナスの増殖性効果に関するポジティブコントロールである。アッセイは4連で行う。エラーバーは標準偏差を表す。OD450、450 nmにおける光学密度、WST-1アッセイの比色分析読み取り。
【図６−１】再発性インフレーム融合遺伝子DUS2L-PSKH1の同定および融合物ノックダウン後のTMK1の増殖アッセイ。（A) 縦のボックスによって強調された、拡大領域（下図）を有する染色体イデオグラム（上図）。拡大されたゲノムビューは、上にゲノム座標を示し、下にUCSC遺伝子トラックを示す。遺伝子GFOD2、RANBP10、NUTF2、NRN1L、DPEP2/3、DDX28、DUS2L、およびNFATC3は、Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer (COSMIC)への複数登録に基づいて、がんに関与している。TMK1のコピー数およびSVトラックを遺伝子トラックの下に示し、物理的カバレッジは、なめらかな、またはなめらかでない線として示され、PETマッピングは、5'マッピング領域については左矢印、3'マッピング領域については右矢印として示される。TMK1のタンデム重複に基づいて再構築されたゲノム構造を下部に示す。
【図６−２】(B) DUS2L-PSKH1遺伝子融合物を有する2つの胃がんの、腫瘍/正常ペアのRT-PCR。βアクチンに関するRT-PCRはポジティブコントロールとなる。M、マーカー；N、正常な胃組織；T、胃腫瘍。
【図６−３】（C) TMK1のDUS2L-PSKH1融合物の、RT-PCRのサンガーシーケンシングクロマトグラム。DUS2LとPSKH1との間の融合ポイントを縦の破線で示す。
【図６−４】（D) DUS2L-PSKH1転写物の融合ポイントを標的とする4つのsiRNAを使用して、TMK1においてその融合遺伝子の発現をノックダウンした。実験は3連で実施した。2つの実験を一方で代表する。エラーバーは3連の標準偏差を表す。
【図６−５】(E) DUS2L-PSKH1に対するsiRNAs AおよびCを使用して、増殖特性に及ぼす融合遺伝子ノックダウンの影響を比較した。TMK1細胞は、siRNAにより一過性にトランスフェクトし、WST-1試薬を用いた比色分析によって増殖を評価した。FGFR4はポジティブコントロールとして使用した。実験は3連で実施した。エラーバーは3連の標準偏差を表す。siRNA AおよびCについて矛盾した結果に注目すべきである。2つの実験を一方で代表する。
【図７−１】再発性インフレーム融合遺伝子CLEC16A-EMP2の同定およびCLEC16A-EMP2を安定的に発現するHGC27の増殖分析。(A) DNA-PETにより同定された腫瘍133におけるペアの存在しない逆位はCLEC16AおよびEMP2の融合物をもたらす。染色体イデオグラム、遺伝子トラック、コピー数、およびSV表示は図6のための記載の通りであり、EMP2、TEKT5、NUBP1、FAM18A、CIITA、およびCLEC16Aはがんに関与する。
【図７−２】(B) 腫瘍06/0159の融合物CLEC16A-EMP2のサンガーシーケンシングクロマトグラム。CLEC16AとEMP2との間の融合ポイントは、縦の破線で表される。
【図７−３】(C) CLEC16A-EMP2融合物を有する2つの胃がんの、腫瘍/正常ペアのRT-PCR。βアクチンに関するRT-PCRはポジティブコントロールとなる。M、マーカー；N、正常な胃組織；T、胃腫瘍。
【図７−４】(D) CLEC16A-EMP2融合遺伝子を安定的に発現するHGC27細胞のqPCR分析。倍数変化は、親細胞株および空ベクターにより安定的にトランスフェクトされた細胞に対して計算した。エラーバーは3連の標準偏差を表す。
【図７−５】(E) CLEC16A-EMP2を安定的に発現するHGC27細胞の増殖アッセイ。アッセイは4連で行った。エラーバーは標準偏差を表す。OD450、450 nmにおける光学密度、WST-1アッセイの比色分析読み取り。
【図８−１】再発性インフレーム融合遺伝子SNX2-PRDM6の同定およびSNX2-PRDM6を安定的に発現するHGC27の増殖分析。(A) DNA-PETにより同定された腫瘍125における欠失はSNX2およびPRDM6の融合物をもたらす。染色体イデオグラム、遺伝子トラック、コピー数、およびSV表示は図6のための記載の通りである。
【図８−２】(B) SNX2-PRDM6融合物に関する、腫瘍160およびペアとなる正常組織のRT-PCR。βアクチンに関するRT-PCRはポジティブコントロールとなる。M、マーカー；N、正常な胃組織；T、胃腫瘍。
【図８−３】（C）腫瘍125の融合物SNX2-PRDM6のサンガーシーケンシングクロマトグラム。SNX2およびPRDM6間の融合ポイントを縦の破線で示す。
【図８−４】（D）SNX2-PRDM6融合遺伝子を安定的に発現するHGC27細胞のqPCR分析。倍数変化は親細胞株および空ベクターで安定的にトランスフェクトされた細胞に対して計算した。エラーバーは3連の標準偏差を表す。
【図８−５】（E）SNX2-PRDM6を安定的に発現するHGC27細胞の増殖アッセイ。アッセイは、4連で行った。エラーバーは標準偏差を表す。OD450、450 nmにおける光学密度、WST-1アッセイの比色分析読み取り。
【図９−１】CLDN18、ARHGAP26、およびCLDN18-ARHGAP26を発現する細胞株の特性解析。（A） CLDN18およびARHGAP26に対する抗体は、CLDN18-ARHGAP26融合たんぱく質を検知する。CLDN18およびARHGAP26に対する抗体を用いて、CLDN18-ARHGAP26を発現するMDCK細胞を免疫染色した。
【図９−２】（BおよびC） DAPI、ならびにNカドヘリン（B）、βカテニン(C) およびHAに対する抗体を用いた、CLDN18およびCLDN18-ARHGAP26融合遺伝子を安定的に発現するHeLa細胞の免疫蛍光分析で観察されるように、HeLa細胞におけるCLDN18の強制発現は、上皮形態に逆戻りする。
【図９−３】図９−２の続きである。
【図９−４】(D) 非トランスフェクトHeLaならびにCLDN18およびCLDN18ΔPを発現する安定株の、Nカドヘリン、βカテニンおよびPAK1レベルに関するq-PCR分析。
【図９−５】(E) CLDN18、ARHGAP26、およびCLDN18-ARHGAP26を安定的に発現するタイトジャンクションタンパク質のq-PCR分析によって観察される、CLDN18-ARHGAP26発現MDCK細胞におけるタイトジャンクションタンパク質の代償効果。倍数変化は非トランスフェクトMDCK細胞に対して計算した。
【図９−６】（F) CLDN18、ARHGAP26、およびCLDN18-ARHGAP26融合物を安定的に発現するMDCK細胞を固定し、ZO-1、HAまたはGFPに対する抗体で免疫染色した。
【図１０−１】CLDN18-ARHGAP26融合物を発現する患者検体およびMDCK細胞は、上皮形態の喪失、およびがん進行の増大を示す。正常検体および胃腫瘍患者検体における(A) CLDN18および(B) ARHGAP26発現。EカドヘリンおよびDAPI、ならびにCLDN18およびARHGAP26に対する抗体でそれぞれ染色されたヒト正常（上図）および腫瘍（下図）胃切片の免疫蛍光分析。
【図１０−２】図１０−１の続きである。
【図１０−３】(C) CLDN18-ARHGAP26融合物発現MDCK細胞は、紡錘状および突出状の形態を示す。サブコンフルエント段階で得られたMDCK細胞においてCLDN18、ARHGAP26、およびCLDN18-ARHGAP26を発現する安定株の位相差画像。
【図１０−４】(D) 細胞凝集アッセイ。MDCK非トランスフェクト細胞株、ならびにCLDN18、ARHGAP26、およびCLDN18-ARHGAP26融合遺伝子を発現する安定株を懸滴として播種し、翌日位相差画像を得た。
【図１０−５】(E) CLDN18、ARHGAP26、およびCLDN18-ARHGAP26をそれぞれ安定的に発現するMDCK細胞におけるEMTマーカーのqPCR。
【図１０−６】(F)および(G) Nカドヘリン、βカテニン(F)、Akt、pAkt、およびPAK1(G)に対する抗体に関するイムノブロッティングによる、非トランスフェクトHeLa、ならびにCLDN18、ARHGAP26、およびCLDN18-ARHGAP26融合遺伝子を発現する安定株のウェスタンブロット分析。アクチンはローディングコントロールとして使用する。
【図１１−１】CLDN18-ARHGAP26発現は細胞-ECM接着の減少をもたらす。(A)上図、 CLDN18、ARHGAP26、およびCLDN18-ARHGAP26融合遺伝子を発現するMDCK安定株を未処理プレートに播種し、播種の2時間後に位相差画像が得られた。MDCK非トランスフェクト細胞を対照として使用した。下図、未処理、I型コラーゲンおよびフィブロネクチン処理表面に付着した細胞の定量。2x104個の細胞をこれらの表面に播き、PBSで3回洗浄して、PFA中で10分間固定した。フィールド当たりの細胞数を3-4回カウントした。付着した細胞の割合は、非トランスフェクトMDCK細胞に対して数値化した(100％)。
【図１１−２】(B) CLDN18、ARHGAP26、およびCLDN18-ARHGAP26融合遺伝子を発現するMDCK安定株を固定し、活性化FAKおよびHAまたはGFPに対する抗体で免疫染色した。
【図１１−３】(C) CLDN18-ARHGAP26発現MDCK細胞の自由端にはパキシリンが存在しない。CLDN18、ARHGAP26、およびCLDN18-ARHGAP26融合遺伝子を発現するMDCK安定株を固定し、パキシリンおよびHAまたはGFPに対する抗体で免疫染色した。
【図１１−４】(D) MDCK非トランスフェクト株ならびにCLDN18、ARHGAP26およびCLDN18-ARHGAP26融合遺伝子を発現する安定株における接着斑（focal adhesion）分子レベルのウェスタンブロット分析。GAPDHをローディングコントロールとして使用した。
【図１１−５】(E) CLDN18-ARHGAP26発現MDCKにおける接着斑分子レベルの低下。CLDN18、ARHGAP26およびCLDN18-ARHGAP26を発現するMDCK安定株の接着斑分子に関するqPCR分析。倍数変化はMDCK非トランスフェクト細胞に対して計算した。
【図１１−６】(F) 非トランスフェクトMDCKならびにCLDN18、ARHGAP26およびCLDN18-ARHGAP26を発現する安定株のウェスタンブロット分析。ブロットはインテグリンβ1およびβ5を目的として探索し、ローディングコントロールとしてチューブリンを用いた。
【図１１−７】(G) CLDN18-ARHGAP26融合物を発現するMDCKにおけるインテグリンサブユニットレベルの減少。MDCK-CLDN18、-ARHGAP26、および-CLDN18-ARHGAP26安定株のインテグリンサブユニットqPCR分析。倍数変化はMDCK非トランスフェクト細胞に対して計算した。
【図１１−８】(H) CLDN18、不活化C末端PDZ-結合モチーフ（CLDN18ΔP）を有するCLDN18、ARHGAP26、CLDN18-ARHGAP26を発現するMDCK安定株、および非トランスフェクトMDCK細胞をトランズウェル（Transwell）インサート上に蒔き、48時間にわたってTER値を測定した。空のトランズウェルインサートをネガティブコントロールとして使用した。
【図１１−９】(I) 非トランスフェクトMDCK、ならびにCLDN18、ARHGAP26およびCLDN18-ARHGAP26を発現する安定株のコンフルエント段階での位相差画像。
【図１２−１】CLDN18-ARHGAP26は、細胞環境に特有の影響を、増殖、浸潤、および創傷閉鎖に及ぼす。(A) CLDN18-ARHGAP26融合物発現MDCK細胞において細胞増殖速度は遅くなる。CLDN18、ARHGAP26、およびCLDN18-ARHGAP26を発現するMDCK安定株を、細胞800個で4連として24ウェルプレートに播種した。MDCK非トランスフェクト細胞を対照として使用した。
【図１２−２】(B) 創傷閉鎖アッセイ。CLDN18、ARHGAP26、およびCLDN18-ARHGAP26を発現するMDCK安定株を、Ibidi μ-Dish内のカルチャーインサート上に播種し、翌日、インサートを剥がして傷を作り、閉鎖をモニターした。播種する前に、μ-DishプレートをI型コラーゲンで処理した。実験の開始時点、および間隔を置いて、位相差画像を得た。
【図１２−３】(C) CLDN18、ARHGAP26、およびCLDN18-ARHGAP26融合遺伝子を安定的に発現するHeLa細胞を、マトリゲルインベージョンチャンバーに蒔いた。非トランスフェクトHeLa細胞を対照として使用した。5% FBPを化学誘引物質として基本培地に添加し、24時間インキュベートした。細胞を固定し、洗浄して、クリスタルバイオレットで染色し、位相差画像が得られ（左）、さらに、マトリゲルに侵入した細胞数を数えた（右）。
【図１２−４】(D) CLDN18、ARHGAP26、およびCLDN18-ARHGAP26を安定的に発現するHeLaおよびHGC27細胞を軟寒天に播種し、1月間インキュベートして、画像化（左）および計数（右）した。ベクターで安定的にトランスフェクトされた親株を対照として用いた。
【図１３−１】CLDN18およびARHGAP26は上皮形態を調節する。(A) CLDN18、ARHGAP26、およびCLDN18-ARHGAP26を発現するMDCK細胞のアクチン細胞骨格染色。細胞は、CLDN18およびCLDN18-ARHGAP26発現細胞についてはHAで免疫染色され、さらにファロイジンのAlexa 594蛍光コンジュゲートで染色した。矢印は、ARHGAP26およびCLDN18-ARHGAP26発現MDCK細胞においてストレスファイバーがなくなっていることを示す。
【図１３−２】(B) 非トランスフェクトMDCK、ならびにCLDN18、ARHGAP26、およびCLDN18-ARHGAP26を発現する細胞における全RhoAのウェスタンブロット分析。細胞はRhoA抗体およびGAPDHで免疫染色した。(C) CLDN18、ARHGAP26、およびCLDN18-ARHGAP26を発現するMDCK細胞における、活性型RhoA免疫蛍光分析。MDCK安定細胞は、活性RhoAおよびCAPIに対する抗体で染色した。
【図１３−３】(D) ARHGAP26およびCLDN18-ARHGAP26を発現するMDCK安定株におけるGAP活性の低下。GAP活性はプルダウンアッセイ（G-LISA、細胞骨格）で分析した。内在する活性型GTP結合RhoAの量は、Rhoファミリーエフェクタータンパク質のRDBドメインでコートした96ウェルプレートにおいて測定した。プレートに結合したさまざまな安定株の細胞溶解物に由来するRhoのGTP型は、RhoA一次抗体およびHRPにコンジュゲートした二次抗体を用いて測定された。ルミネセンスの値は、非トランスフェクトMDCK細胞に対して計算された。
【図１３−４】(E) CLDN18、ARHGAP26、およびCLDN18-ARHGAP26を発現する生きたHeLa細胞を、Alexa 594とコンジュゲートしたCTxBとともに37℃にて15分間インキュベートした後、洗浄して固定した。細胞はHAもしくはGFP抗体、およびDAPIにより免疫染色した。
【００１９】
定義
本明細書で使用される以下の語および用語は、指示された意味を有する：
本明細書で使用される「予後（診断）」という用語またはその文法的異形は、病態もしくは疾病で起こりうる経過および転帰の予測を示す。患者の予後診断は、疾病の好ましい経過および転帰、または好ましくない経過および転帰の兆候である、その疾病の要因もしくは症状を評価することによって行われる。「予後（診断）」という用語は、100%の正確さをもって疾患の経過もしくは転帰を予測できることを意味しない。その代わり、「予後(診断）」という用語は、一定の経過もしくは転帰が起こる可能性が高いことを示しており、すなわち、特定の状態を示す患者では、その状態を示さない個体よりも、ある経過もしくは転帰が起こりやすい、という高い可能性を示す。たとえば、疾患の経過もしくは転帰は、99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、および50%の正確さをもって予測することができる。
【００２０】
予後診断の一例としては、マーカーの存在を調べるサンプルの検査があるが、このマーカーの存在は、疾病の好ましい経過または好ましくない転帰を示す。予後診断のもう1つの例として、マーカーの存在を調べるサンプルの検査があり、このマーカーの存在は、患者がある種の治療の対象となることを示す。
【００２１】
本明細書で使用される「差異に基づく治療プラン」という用語は、患者もしくは疾病亜型に対して個別特異的な、個別化治療プランを指す。たとえば、患者サンプル中のがんマーカーの存在は、その患者が差異に基づく治療プランの対象であることを示すが、この差異に基づく治療プランは、がん標的治療である。
【００２２】
本明細書で使用される「サンプル」もしくは「生体サンプル」という用語は、被験体から得られた、取り出された、または分離された、細胞、組織、もしくは体液を表す。サンプルの一例は、腫瘍組織生検試料である。サンプルは、凍結された新鮮組織、パラフィン包埋組織、またはホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織であってもよい。サンプルの別の一例は細胞株である。体液サンプルの例としては、血液、血清、唾液、尿、脳脊髄液、および骨髄液があるがそれに限定されない。
【００２３】
遺伝子、融合遺伝子、またはそれらに由来するタンパク質産物に関して「存在を検査する」という表現は、サンプル中の遺伝子、融合遺伝子、またはそれらに由来するタンパク質産物の有無についてスクリーニングすることを表す。遺伝子、融合遺伝子、またはそれらに由来するタンパク質産物に関して「存在を検査する」という表現はまた、サンプル中の遺伝子、融合遺伝子、またはそれらに由来するタンパク質産物の発現を定量することを表す。発現の定量には、サンプル中の遺伝子、融合遺伝子、またはタンパク質産物の発現絶対量を定量することを含めると理解される。
【００２４】
本明細書で使用される「融合遺伝子」という用語は、2つ以上の別々の遺伝子から形成されるハイブリッド遺伝子を指す。コード配列、非コード配列もしくはその両方の全長配列または断片を融合することができる。融合は、染色体再構成プロセスのうち1つもしくはいくつかによって起こる可能性があり、これには染色体転座、逆位、重複、または欠失が含まれるがそれに限定されない。2つ以上の遺伝子は、同一の染色体上、異なる染色体上、またはその両方に存在する可能性がある。2つ以上の融合遺伝子を、インフレームまたはアウトオブフレームで融合することができる。
【００２５】
融合遺伝子は、未融合の元の遺伝子のうち1つの機能を獲得することもあるが、未融合の元の遺伝子のうち1つの機能を失うこともあり、またその両方である可能性もあると理解される。また、融合遺伝子は、未融合の遺伝子のいずれにも存在しない機能を獲得する可能性があると理解される。説明のために、遺伝子Aおよび遺伝子Bから融合された融合遺伝子は、遺伝子Aの機能のみを獲得し、遺伝子Bの機能を失うことがある。あるいはまた、遺伝子Aおよび遺伝子Bから融合された融合遺伝子は、遺伝子Aにも遺伝子Bにも見られない機能を獲得することがある。
【００２６】
したがって、融合遺伝子を有する細胞は、融合遺伝子のない細胞では見られない性質を有する可能性があると理解される。
【００２７】
本明細書で使用される「がん関連融合遺伝子」という用語は、がんに関連する融合遺伝子を表す。1つもしくは複数の融合遺伝子ががんに関連していることがあると理解される。たとえば、患者サンプル中の1つもしくは複数のがん関連融合遺伝子の存在は、その被験体ががんに罹患しているか、またはその被験体のがんのリスクが高いことを示す可能性がある。患者サンプル中の1つもしくは複数のがん関連融合遺伝子の検出は、その被験体が、がん標的治療プランを受けるのにふさわしいことを示すこともある。がん関連融合遺伝子の例にはCLEC16A-EMP2、SNX2-PRDM6、MLL3-PRKAG2、DUS2L-PSKH1、およびCLDN18-ARHGAP26があるが、これらに限定されない。融合タンパク質は、単独で、または組み合わせて、検出することができると理解される。理論にとらわれず、2つ以上のがん関連融合遺伝子の組み合わせの存在は、1つのがん関連融合遺伝子が存在するよりよくない予後または疾患の転帰と関連していると理解される。そのため、2つ以上のがん関連融合遺伝子の組み合わせが存在することは、疾患の転帰もしくは予後を予測すると理解される。たとえば、融合遺伝子は、CLDN18-ARHGAP26と組み合わせて、CLEC16A-EMP2、SNX2-PRDM6、MLL3-PRKAG2、およびDUS2L-PSKH1からなる一群から選択することができる。0、1、2、3、4、5または6以上の融合遺伝子がサンプル中に検出されることがあると理解される。たとえば、CLEC16A-EMP2がサンプル中に検出されることがあるが、CLDN18-ARHGAP26と組み合わせたCLEC16A-EMP2がサンプル中に検出されることもある。一例として、CLDN18-ARHGAP26は、CLDN18機能の喪失およびARHGAP26機能の獲得を示す。
【００２８】
異なる被験体において融合遺伝子のヌクレオチドおよびアミノ酸配列の間で差異が存在する可能性があると理解される。こうした遺伝的差異は、変異、多型性、またはスプライスバリアントに起因することがある。やはり、遺伝的差異は結果として被験体もしくはサンプルにおいて表現型の変化をもたらすこともあり、表現型に変化を示さないこともあると理解される。
【００２９】
融合遺伝子に由来するタンパク質は機能することもあるが、機能を持たないこともある。融合遺伝子に由来するタンパク質は伸長されていることもあり、トランケートされていることもある。本明細書で使用される「機能タンパク質」は、生物学的活性を有するポリペプチドを表す。融合遺伝子に由来する機能タンパク質の生物学的活性または特性は、未融合の元の遺伝子のうち1つに由来する機能タンパク質と同一である場合もあると理解される。やはり、融合遺伝子に由来する機能タンパク質の生物学的活性または特性は、未融合遺伝子の生物学的活性もしくは特性とは異なることもあると理解される。
【００３０】
本明細書で使用される「トランケート型タンパク質」は、全長の非トランケート型タンパク質よりアミノ酸数が減少した、タンパク質もしくはポリペプチドを表す。
【００３１】
本明細書で使用される「伸長タンパク質」は、全長の非トランケート型タンパク質よりアミノ酸数が増加したタンパク質を表す。
【００３２】
やはり、融合遺伝子は、細胞に異なる生物学的特性を与えることがあると理解される。たとえば、融合遺伝子は、高い遊走率、転移を進める特性、または細胞形状の変化を有する細胞をもたらす可能性がある。融合遺伝子はまた、上皮の表現型を喪失した細胞、上皮バリア特性が損なわれた細胞、および創傷治癒特性が損なわれた細胞を生じさせることもある。
【００３３】
当業者には、融合遺伝子の存在は、さまざまな方法によって検出することができると理解される。例としては、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、定量的PCR、マイクロアレイ、RT-PCR、サザンブロット、ノーザンブロット、蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）、およびDNAシーケンシングがあるが、これらに限定されない。DNAシーケンシングには、DNAペアエンドタグ（DNA-PET）、および次世代シーケンシング、SOLiD(商標)シーケンシングが含まれるが、これらに限定されない。
【００３４】
当業者にはやはり、融合遺伝子を検出するために、さまざまな検出試薬を使用することができると理解される。検出試薬の例としては、融合遺伝子にハイブリダイズする、プライマー、プローブ、および相補的核酸配列があるが、これらに限定されない。
【００３５】
「プライマー」という用語は本明細書では、たとえばPCR技術において、プライマーとして使用することができる任意の一本鎖オリゴヌクレオチド配列の意味で使用される。したがって、「プライマー」は本明細書によれば、（フォワードプライマーについては）コピーすべき核酸ストランドと実質的に同一であり、（リバースプライマーについては）実質的に、コピーすべき核酸ストランドの逆相補体である、プライマー伸長産物を合成するための開始点の機能を果たすことができる一本鎖オリゴヌクレオチド配列を表す。プライマーはたとえば、PCR技術での使用に適していると考えられる。
【００３６】
本明細書で使用される「プローブ」という用語は、標的配列にハイブリダイズする任意の核酸断片を表す。プローブは、プローブの検出を容易にするために、放射性同位体、蛍光タグ、抗体、または化学標識で標識化することができる。
【００３７】
本明細書で使用される「ハイブリダイズする」は、プライマー、プローブ、またはオリゴヌクレオチドが、標準的なストリンジェンシー条件下で、標的核酸分子と非共有相互作用をなすことを意味する。ハイブリダイズするプライマーもしくはオリゴヌクレオチドは、クローニングを容易にするために、非共有相互作用の形成を妨げない非ハイブリッド形成ヌクレオチド、たとえば、5'末端鎖、または制限酵素認識部位を含有してもよい。
【００３８】
さらに、本明細書で用いられる「ハイブリダイゼーション」はいずれも、ストリンジェントな条件下で実施される。「ストリンジェントな条件」という表現は、プライマーをアレル伸長部分のヌクレオチド配列に特異的に結合させることができるが、他のヌクレオチド配列とはいずれも結合させない、任意のハイブリダイゼーション条件を意味する。たとえば、「ストリンジェントな」ハイブリダイゼーション条件下の、核酸標的領域に対するプローブの特異的なハイブリダイゼーションは、50℃にて3X SSC、0.1% SDSといった条件を含む。特異的なハイブリダイゼーションを達成することができるように、温度、プローブ長、および塩濃度というパラメーターを変更することは当業者の裁量範囲内である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は当技術分野でよく知られている。
【００３９】
当業者には、融合タンパク質はさまざまな方法で検出することができると理解される。融合タンパク質を検出する方法の例としては、免疫組織化学的検査（IHC）、免疫蛍光標識法、ウェスタンブロット、ELISA、およびSDS-PAGEがあるがそれらに限定されない。
【００４０】
やはり当業者には、融合タンパク質発現を定量するためにさまざまな検出試薬があると理解される。検出試薬の例としては、融合タンパク質に特異的に結合する抗体およびリガンドがあるがそれらに限定されない。
【００４１】
上記のように、患者から得られたサンプルにおける1つもしくは複数の融合遺伝子の検出は、がんを示すか、またはがんのリスクが高いことを示す。
【００４２】
本明細書で使用される「がんのリスクが高い」は、被験体ががんに罹患していると診断されてはいないが、1つもしくは複数の融合遺伝子を持たない対照もしくは基準と比べて、がんに罹患する可能性が高いことを意味する。
【００４３】
本明細書で使用される「基準」、「対照」、または「標準」という用語は、予後を判定するために比較されるサンプルもしくは被験体を示す。「基準」、「対照」、または「標準」の例には、同一被験体から得られた非がん性サンプル、非転移性腫瘍から得られたサンプル、がんに罹患していない被験体から得られたサンプル、または異なるがんサブタイプを有する被験体から得られたサンプルがある。本明細書で使用される「基準」、「対照」、または「標準」という用語はまた、患者コホートの遺伝子もしくはタンパク質の平均発現レベルを表すこともある。本明細書で使用される「基準」、「対照」、または「標準」という用語はまた、1つもしくは複数の細胞株における融合遺伝子もしくはタンパク質の有無を表すこともある。本明細書で使用される「基準」、「対照」、または「標準」という用語はまた、がんに罹患していない被験体、または異なる型のがんに罹患している被験体を表すことがある。基準もしくは対照の一例は、1つもしくは複数のがん関連融合遺伝子をまったく持たない患者である。
【００４４】
本明細書で使用される「がん」は、上皮がんを指す。上皮がんの例には、胃がん、肺がん、乳がん、泌尿生殖器がん、結腸がん、前立腺がん、および子宮頸がんがあるがこれらに限定されない。
【００４５】
融合ポリペプチドは、融合遺伝子を発現ベクターに挿入することによって得ることができる。本明細書で使用される「発現ベクター」という用語は、特定の遺伝子を標的細胞に導入するために使用されるプラスミドを表す。発現ベクターは、一過性発現ベクターであっても、安定的発現ベクターであってもよい。
【００４６】
発現ベクターを用いて細胞を形質転換することができると理解される。細胞を形質転換するための方法は、当業者には明らかである。たとえば、細胞は、エレクトロポレーション、熱ショック、化学的もしくはウイルスによるトランスフェクションによって、形質転換することができる。
【００４７】
本明細書で実例により説明される本発明は、本明細書に具体的に記載されない、任意の1つもしくは複数の要素、1つもしくは複数の制限がない状態で、適切に実行されることもある。したがって、たとえば、「含んでなる」、「含む」、「含有する」などの用語は、包括的であって制限でないと解釈されるべきである。それに加えて、本明細書で用いられる用語および表現が使用されるのは、説明の用語としてであり、制限の用語としてではないのであって、そうした用語および表現の使用において、図示および記載された特徴のいかなる同等物もその一部も、除外する意図はないが、請求される発明の範囲内でさまざまな変更が可能であることは認められている。したがって、本発明は、好ましい実施形態および任意選択可能な特徴によって具体的に明らかにされたが、当業者は、本明細書に記載の、そこに具体化された本発明の修正および変更を用いることが可能であり、そうした修正および変更は、本発明の範囲に含まれると考えられると理解される。
【００４８】
本発明は、本明細書において広範かつ包括的に記載される。包括的な開示に含まれる狭義の種および下位分類集団もそれぞれ、本発明の一部を形作っている。条件付きの本発明の包括的記述、または類概念から任意の対照を取り除く、否定による限定は、除去されるものが本明細書に具体的に記載されているか否かにかかわらず、これに含まれる。
【００４９】
他の実施形態は、以下のクレイムおよび非限定例の範囲に含まれる。それに加えて、本発明の特徴もしくは態様がマーカッシュ群（Markush group）の表現で記載されている場合、本発明はそれによって、マーカッシュ群のいかなる個別メンバーに関しても、そのメンバーの下位集団に関しても、記載されていると、当業者は認識するものである。
【００５０】
任意選択可能な実施形態の開示
患者ががんであるか、またはがんに罹患するリスクが高いかどうかを判定し、もしくは予後診断する方法に関する、典型的な非限定的実施形態をここで明らかにする。
【００５１】
その方法は、患者から得られたサンプルにおいて、1つもしくは複数のがん関連融合遺伝子、またはそれに由来するタンパク質の存在を検査することを含み、前記サンプル中の1つもしくは複数のがん関連融合遺伝子の存在は、患者ががんに罹患しているか、またはがんのリスクが高いことを示すが、このがん関連融合遺伝子は、CLEC16A-EMP2、SNX2-PRDM6、MLL3-PRKAG2、およびDUS2L-PSKH1からなる一群から選択されるか、またはこのがん関連融合遺伝子は、CLDN18-ARHGAP26と組み合わせて、CLEC16A-EMP2、SNX2-PRDM6、MLL3-PRKAG2、およびDUS2L-PSKH1からなる一群から選択される。
【００５２】
ある実施形態において、がん関連融合遺伝子は、CLEC16A-EMP2、SNX2-PRDM6、MLL3-PRKAG2、DUS2L-PSKH1、またはCLDN18-ARHGAP26である。好ましい実施形態において、がん関連融合遺伝子はCLEC16A-EMP2である。ある実施形態において、融合遺伝子のうち2つ、3つ、または4つは、CLDN18-ARHGAP26と組み合わせた、CLEC16A-EMP2、SNX2-PRDM6、MLL3-PRKAG2、およびDUS2L-PSKH1からなる一群から選択される。
【００５３】
ある実施形態において、CLEC16A-EMP2は、CLDN18-ARHGAP26と組み合わせて用いられる。ある実施形態において、SNX2-PRDM6は、CLDN18-ARHGAP26と組み合わせて用いられる。ある実施形態において、MLL3-PRKAG2は、CLDN18-ARHGAP26と組み合わせて用いられる。ある実施形態において、DUS2L-PSKH1は、CLDN18-ARHGAP26と組み合わせて用いられる。好ましい実施形態において、CLEC16A-EMP2は、CLDN18-ARHGAP26と組み合わせて用いられる。好ましい実施形態において、MLL3-PRKAG2は、CLDN18-ARHGAP26と組み合わせて用いられる。
【００５４】
本明細書に記載の方法は、がんを判定する、またはがんの予後診断をするのに適している。がんは、癌腫（上皮性悪性腫瘍）、肉腫（非上皮性悪性腫瘍）、白血病、リンパ腫、骨髄腫、または中枢神経系のがんとすることができる。
【００５５】
ある実施形態において、がんは上皮がんである。上皮がんは好ましくは、皮膚がん、肺がん、胃がん、乳がん、泌尿生殖器がん、結腸がん、前立腺がん、子宮頸がん、皮膚がん、卵巣がん、肝がん、および腎がんからなる一群から選択される。好ましい実施形態において、がんは胃がんである。
【００５６】
本明細書に記載の方法は、新鮮組織、凍結組織、パラフィン保存組織、および/またはエタノール保存組織のサンプルに好適である。サンプルは生物学的サンプルとすることができる。生物学的サンプルの非限定例には、全血もしくはその成分（たとえば、血漿、血清）、尿、唾液、リンパ液、胆汁、痰、涙、脳脊髄液、気管支肺胞洗浄液、滑液、精液、腹水、母乳、および膿汁がある。ある実施形態において、サンプルは、血液、羊水、または頬側スミアから得られる。好ましい実施形態において、サンプルは組織生検試料である。
【００５７】
本明細書で考慮される生物学的サンプルには、組織サンプル、培養生物材料があり、この培養生物材料としては、培養細胞由来サンプル、たとえば培養細胞から収集された培地、または細胞ペレットが挙げられる。したがって、生物学的サンプルは、全生物体もしくはその組織の一部、細胞もしくは構成成分、またはそれらの分画もしくは部分から調製された、溶解液、ホモジネート、または抽出物を示すと考えられる。生物学的サンプルは、使用前に、たとえば、１つもしくは複数の構成成分の精製、希釈、および/または遠心分離によって、改変されることもある。
【００５８】
よく知られている抽出および精製法は、サンプルからの核酸の単離に利用することができる。核酸はサンプルから抽出した後そのまま使用してもよいが、より好ましくは、ポリヌクレオチド増幅ステップ（たとえばPCR）後に使用することができる。増幅されたポリヌクレオチドは、サンプルに「由来する」。
【００５９】
増幅に先立って核酸配列を変性させることが好ましい。ある実施形態において、変性は熱処理を含む。好ましくは、熱処理は、約70-110℃；約75-105℃；約80-100℃；および約85-95℃からなる一群から選択される範囲内の温度で実施される。変性ステップは94℃で行うことが好ましい。
【００６０】
別の実施形態において、変性ステップは、約1-30分；約2-25分；および約3-10分からなる一群から選択される期間、実施される。変性ステップは3分間行うことが好ましい。
【００６１】
好ましい実施形態において、増幅ステップは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を含む。好ましくは、PCRは、94℃にて20秒間、58℃にて30秒間、および68℃にて10分間を15サイクル、さらに94℃にて20秒間、55℃にて30秒間、および68℃にて10分間を20サイクル、ならびに最後の伸長ステップ68℃にて15分間を含む。
【００６２】
1つもしくは複数の増幅産物を、キャピラリー電気泳動、融解曲線分析、DNAチップ、または次世代シーケンシングで分析することができる。
【００６３】
プライマーは、本明細書によれば、プローブを検出できる検出可能な標識を追加して含有することができる。使用できる標識の例としては、蛍光マーカーもしくはレポーター色素、たとえば、6-カルボキシフルオレセインン（6FAMTM）、NEDTM（Applera Corporation）、HEXTMもしくはVICTM（Applied Biosystems）；TAMRATMマーカー（Applied Biosystems, CA, USA）；化学発光マーカー、たとえばルテニウムプローブがある。
【００６４】
あるいはまた、標識は、エレクトロスミネセントタグ、磁性タグ、アフィニティもしくは結合タグ、ヌクレオチド配列タグ、位置特異的タグ、および/または特定の物理的性質、たとえば異なる大きさ、質量、回転運動、イオン強度、誘電特性、分極もしくはインピーダンスを有するタグからなる一群から選択することができる。
【００６５】
よく知られている抽出および精製法は、サンプルからのタンパク質の単離に利用することができる。タンパク質はサンプルから抽出後そのまま使用してもよい。タンパク質抽出は、物理的細胞破壊、または界面活性剤に基づく細胞溶解によって行うことができる。抽出されたタンパク質は、ウェスタンブロット、クーマシー染色、ブラッドフォード法、およびBCA法で分析することができる。
【００６６】
本明細書に記載の方法は、患者が、差異に基づく治療プランの候補となるかどうかを判定するのに適している。差異に基づく治療プランは、化学療法、免疫療法、放射線治療、標的治療および移植からなる一群から選択される、1つもしくは複数のタイプの治療を包含することができる。差異に基づく治療プランは、1つもしくは複数の治療法を組み合わせてもよい。差異に基づく治療プランは、同時に、または順に適用される、1つもしくは複数の治療法を含んでいてもよい。好ましい実施形態において、差異に基づく治療法は標的治療である。別の好ましい実施形態において、差異に基づく治療法は、化学療法と併用される標的治療である。ある実施形態において、差異に基づく治療プランは、トラスツズマブまたはラムシルマブである。別の実施形態において、差異に基づく治療プランは、化学療法と組み合わせたトラスツズマブまたはラムシルマブである。
【００６７】
本明細書に記載の方法は、患者にがんのリスクがあるかどうかを判定する、または予後診断するのに適している。上記のように、がんのリスクのある人は、1つもしくは複数の融合遺伝子を持たない対照もしくは基準と比較して、がんに罹患する可能性が高い。ある実施形態において、個人もしくは患者は、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または99%高いがんのリスクを有する。
【００６８】
1つもしくは複数の融合遺伝子のヌクレオチド配列は、CLEC16A-EMP2（配列番号97、99、または101）、SNX2-PRDM6（配列番号115）、MLL3-PRKAG2（配列番号121、123、または125）、DUS2L-PSKH1（配列番号131または133）、およびCLDN18-ARHGAP26（配列番号107）からなる一群から選択される配列に対して、少なくとも70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%同一であると考えられる。一例を挙げると、CLEC16A-EMP2のヌクレオチド配列は、配列番号97に対して70%同一である。さらに例を挙げると、CLDN18-ARHGAP26のヌクレオチド配列は、配列番号107に対して95%同一である。また別の例では、がん関連融合遺伝子は、CLDN18-ARHGAP26と組み合わせたCLEC16A-EMP2であって、CLEC16A-EMP2は配列番号97に対して80%同一であり、CLDN18-ARHGAP26は、配列番号107に対して85%同一である。
【００６９】
本明細書に記載の融合遺伝子のいずれかのコード配列を含有する発現ベクターも与えられる。ある実施形態において、発現ベクターは、哺乳動物発現ベクターである。適当な発現ベクターには、pMXs-Puro、pVSVG、pEGFP、およびpCMVmycがあるが、それに限定されない。
【００７０】
本明細書に記載の発現ベクターで形質転換された細胞も与えられる。形質転換は、エレクトロポレーション、熱ショック、化学的もしくはウイルスによるトランスフェクションによって可能である。ある実施形態において、細胞は化学的トランスフェクションによって形質転換される。別の実施形態において、化学的トランスフェクションは、Lipofectamine 2000によるものである。もう1つの実施形態において、形質転換はウイルスによるトランスフェクションで行われる。また別の実施形態において、ウイルスによるトランスフェクションは、レンチウイルスもしくはレトロウイルスによるトランスフェクションである。
【００７１】
ポリペプチドを作製する方法も与えられるが、その方法は、形質転換細胞を、ポリペプチド発現のために加湿チャンバー内5% CO2および37℃にて、10%ウシ血清、2mMグルタミン、1%非必須アミノ酸、および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを加えた、イーグル最小必須培地もしくはダルベッコ改変イーグル培地もしくはRPMI中で培養すること、ならびに前記ポリペプチドを細胞から回収することを含む。培養条件のパラメーターを、ポリペプチドの生成および抽出を最適化するように変更することは、当業者の裁量範囲に含まれる。
【００７２】
患者におけるがんの判定もしくは予後診断にがん関連融合遺伝子を使用することも開示されるが、この場合、患者から得られたサンプル中の1つもしくは複数のがん関連融合遺伝子の存在は、その患者ががんに罹患しているか、またはがんを発症するリスクが高いことを示す。
【００７３】
実験の部
本発明の非限定例および比較例は、具体的な実施例を参照することによってさらに、より詳細に以下に説明されるが、この実施例はけっして本発明の範囲を限定するとみなされるべきではない。
【００７４】
材料および方法
臨床腫瘍サンプル
患者サンプルおよび臨床情報は、National University Hospital、シンガポール、およびTan Tock Seng Hospital、シンガポール、において胃がんの手術を受けた患者から得られた。すべての被験者からインフォームドコンセントを得て、研究は、Institutional Review Board of the National University of Singapore (reference code 05-145)、ならびにNational Healthcare Group Domain Specific Review Board (reference code 2005/00440)により承認された。
【００７５】
サンプルからのDNA/RNA抽出
組織サンプルからのゲノムDNAおよびトータルRNA抽出は、Allprep DNA/RNA Mini Kit (Qiagen)を用いて行った。ゲノムDNAは、Blood & Cell Culture DNA Kit (Qiagen)を用いて血液サンプルから抽出した。
【００７６】
プライマーおよびオリゴヌクレオチド
本研究に使用したプライマーおよびオリゴヌクレオチドを表１に記載する。
【００７７】
表１：本研究に使用したプライマー
【００７８】
【表１】
2017514514.tif 000002
2017514514.tif 000003
2017514514.tif 000004
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2017514514.tif 000006
抗体および試薬
市販の一次および二次抗体ならびに試薬を表2に記載する。
【００７９】
表２：市販の一次および二次抗体ならびに試薬
【００８０】
【表２】
2017514514.tif 000007
【００８１】
融合遺伝子の存在に関するRT-PCRスクリーニング
SuperScript IIIキット(Invitrogen)を使用し、メーカーの推奨にしたがって、1μgのトータルRNAをcDNAに逆転写する。JumpStart RED AccuTaq LA DNA ポリメラーゼキット(Sigma)を以下のプロトコルに基づいて使用した：
2017514514.tif 000008
サイクリング条件は以下の通りである：94℃ 3分、（94℃ 20秒、58℃ 30秒、68℃ 10分） x 15サイクル、（94℃ 20秒、55℃ 30秒、68℃ 10分） x 20サイクル、68℃ 15分。
【００８２】
細胞培養条件およびトランスフェクション
MDCK II、HeLa、HGC27、およびTMK1細胞株を、標準条件により培養した。JetPrimePolyPlusトランスフェクションキットを使用し、メーカーの説明書にしたがって、一過性および安定的トランスフェクション実験を行った。安定的トランスフェクションはG418選択によりもたらされた。
【００８３】
DNA-PETライブラリー構築、シーケンシング、マッピング、およびデータ解析
ゲノムDNAの10 kb断片のDNA-PETライブラリー構築、シーケンシング、マッピング、およびデータ解析は、精密な生物情報解析フィルタリングによって実施された。Bioscope (Life Technologies)を用いて、ショートリードをNCBI ヒトリファレンスゲノムbuild 36.3 (hg18)に対してアラインメントした。TMK1、ならびに腫瘍17、26、28、および38のDNA-PETデータはすでに記載されており（NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) アクセッション番号GSE26954）、さらに腫瘍82および92のデータも記載されている（NCBI GEO アクセッション番号GSE30833）。追加の8個の腫瘍/正常ペアのSOLiDシーケンシングデータは、NCBI Sequence Read Archive (SRA)でBioProject ID PRJNA234469のもとにアクセスすることができる。再発性ゲノムのCLDN18-ARHGAP26ブレイクポイントを同定する方法、がんゲノムにおける生殖系列構造多型（SV）のフィルタリング、およびブレイクポイント分布解析は以下のように記述される。
【００８４】
15個のGCサンプルのうち10個について、ペアとなる正常サンプルが得られ、それぞれのDNA-PETデータを使用して、腫瘍で同定されたSVから生殖系列SVをフィルタリングした。このために、SVを明示する不調和なペアエンドタグ（dPET）配列のクラスタの広範なマッピングコーディネートを、ペアとなる正常サンプルのdPETクラスタとのオーバーラップについて検索した。それに加えて、特に、ペアとなる正常サンプルのない腫瘍（腫瘍17、26、28、および38）およびTMK1について、ペアの存在する正常サンプルおよび16人の無関係な非がん個体の全SVをフィルタリングに使用した。さらに、代表的なライブラリの距離分布において、ペア配列タグをリファレンス配列からランダムに選択し、マッピングしてパイプラインで処理するシミュレーションを行った。得られたdPETクラスタはマッピングアーティファクトを表し、SVフィルタリングに使用された。さらに、比較的大きなSVががんゲノムにおいて同定されたSVと80%以上オーバーラップした場合、dPETクラスタを、非がん個体のペアエンドシーケンシング研究である、ゲノムバリアントのデータベース（http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home）内のSVと比較した。標準的なパイプラインによるデータ処理は、結果として、患者82の血液サンプルについて異常なインサートサイズ分布に起因する多数の小さな欠失をもたらしたが、12 kbより小さい欠失はすべて除去された。
【００８５】
MCF-7 RNAポリメラーゼII ChIA-PETおよびGC DNA-PETの比較
本研究の生殖系列および体細胞性SVの2つのパートナー部位が、核内で互いの近傍にある遺伝子座に高頻度に存在するかどうかを調べるために、クロマチン相互作用は細胞型の違いを越えて保存されることがあるという根拠によって、乳がん細胞株MCF-7のChIA-PETシーケンシングから導き出されたゲノムワイドクロマチン相互作用データセットを用いて、SVのオーバーラップを検証した。
【００８６】
ドライバー融合遺伝子予測
上記のようにコンピューターによる解析によって、ドライバー融合遺伝子と見込まれる遺伝子を予測した。コンピューターによる解析は、転写物ネットワーク内の遺伝子産物の位置を用いて、ネットワークが機能するための遺伝子産物の重要性を予測する、ネットワーク融合中心性アプローチである。閾値0.37は、融合ドライバーと見込まれる遺伝子を同定するために設定された。
【００８７】
RT-PCRによるインフレーム融合遺伝子の確認およびスクリーニング
メーカーの使用説明書にしたがってSuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen)を用いて、トータルRNA 1μgを逆転写してcDNAとした。JumpStart（登録商標）REDAccuTaq LA DNA Polymerase (Sigma-Aldrich Inc.)を用いてPCRを行った。
【００８８】
GC融合遺伝子構築物およびレトロウイルスによるトランスフェクション
2x Phusion MastermixをHFバッファー（Thermo Scientific）および以下のプライマーとともに使用して、PCRにより、腫瘍サンプルからGC融合遺伝子CLEC16A-EMP2、CLDN18-ARHGAP26、SNX2-PRDM6、およびDUS2L-PSKH1を増幅した。
2017514514.tif 000009
【００８９】
MLL3-PRKAG2は、gBlock法（Integrated DNA Technologies, Inc）により、pMXs-PuroのFLAGペプチドとともに合成された。PCR産物またはMLL3-PRKAG2をpMXs-Puroレトロウイルスベクター（Cell biolabs, RTV-012）にクローニングした。lipofectamine 2000を用いて、融合遺伝子を含有するpMXs-Puroレトロウイルスベクターを、pVSVG (pseudotyping construct)とともにGP2-293細胞に同時導入し、ウイルスを作製した。HGC27およびHeLa細胞は、空ベクターまたは融合遺伝子を含有するウイルス上清で感染させた。安定的トランスフェクションが得られ、ピューロマイシン二塩酸塩（Sigma, P9620）による選択圧の下で維持された。
【００９０】
CLDN18およびARHGAP26プラスミドの構築
ヒトCLDN18 cDNAは、IMAGEコンソーシアム (http://www.imageconsortium.org/)から入手し、N末端HAタグとともに、pcDNA3ベクターにクローニングした。PDZ結合モチーフをコードするCLDN18の最後の3アミノ酸（DYV）は変異してアラニンになっており、CLDN18ΔPと命名した。pEGFPベクター中のヒトARHGAP26 (GRAF1アイソフォーム2) cDNAおよびpCMVmycは、Dr Richard Lundmark (Medical Biochemistry and Biophysics, Umea University, 901 87 Umea, Sweden)のご厚意により提供された。
【００９１】
ARHGAP26アイソフォームの詳細は以下の通りである：
転写物：ARHGAP26-008 ENST00000378004 (http://www.ensembl.org) (配列番号135）
2017514514.tif 000010
2017514514.tif 000011
2017514514.tif 000012
その後ろにインフレームでHAタグが続き、さらに終止コドンが続く。ヒトインフルエンザヘマグルチニン（HA）タグは、次のヌクレオチド配列の1つを有する：5' TAC CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC GCT 3' または 5' TAT CCA TAT GAT GTT CCA GAT TAT GCT 3'。これも、終止コドンは次のTAG、TAA、またはTGAのいずれか1つから選択することができると理解される。
【００９２】
融合遺伝子再発有意性検定
融合遺伝子の観測度数の統計的有意性を、ランダム化フレームワークを用いて評価した。DNA-PETにより配列解析されたサンプルにおいて同定されたSVのタイプ、数、およびサイズ分布を模倣したSVプロファイルを明らかにした。15個のGCのテストデータセットのSVを、SVプロファイルを用いてシミュレートし、85個のGCサンプルのシミュレートされたバリデーションセットに基づいて再発性SVの頻度を評価した。N =10,000をランダムシミュレーションの数とし、esを、テストデータセットに含まれるSVのバリデーションデータセットにおける度数とすると、P値（es）は、p/Nと定義され、このpは、SV kがek≧ esの頻度で存在するシミュレーションの数である。
【００９３】
細胞凝集、細胞接着、および創傷治癒アッセイ
細胞凝集アッセイのために、1.2 x106/mlの細胞20μlを組織培養ディッシュ上に懸滴として蒔き、翌日Nikon Eclipse TE2000-Sを用いて、位相差画像を得た。
【００９４】
細胞接着アッセイのために、24ウェルプレートを1 mg/mlのフィブロネクチンおよび10μg/mlのラットI型コラーゲンで2時間処理するか、または未処理とし、0.1% BSAでブロックした。2.5 x 104/mlの細胞を播種して37℃にて2時間インキュベートした。
【００９５】
より詳細には、24ウェルプレートを1 mg/mlのフィブロネクチンおよび10μg/mlのラットI型コラーゲンで2時間処理した。その後プレートを洗浄し、その表面を0.1%ウシ血清アルブミン（BSA）で20分間処理することによって、非特異的結合を防止した。表面を再びPBSで洗浄し、2.5 x 104/mlの細胞を播種して37℃にて2時間インキュベートした。対照として未処理の24ウェルプレートにも細胞を播種した。位相差顕微鏡により細胞を画像化した。表面に付着した細胞を定量するために、細胞をPBSで3回緩やかに洗浄し、PFAで固定して計数した。
【００９６】
創傷治癒アッセイのために、7 x105 /mlの細胞70μlを、マイクロディッシュ35mmに入れたカルチャーインサート（Culture-Insert in μ-Dish 35mm (Ibidi)）の上に蒔いた。翌日、カルチャーインサートを剥がして創傷を作り、創傷が閉じるまでNikon Eclispe TE2000により遊走を画像化した。
【００９７】
細胞増殖アッセイ
24ウェルプレートにおいて、800個の細胞を、各条件について4連で播種し、メーカーの使用説明書（Cell Proliferation Reagent WST-1; Roche）にしたがって7日間測定値をとった。吸光度は、Infinite M200 Quad4 Monochromator (Tecan)を使用し、650nmの基準波長を用いて450nmで測定した。
【００９８】
細胞浸潤遊走アッセイ
安定的にトランスフェクトされた1 x105個のHeLaおよびMDCK細胞をRPMI無血清培地中に懸濁した0.5mlを、メーカーの説明書（Corning）にしたがってBiocoatマトリゲルインベージョンチャンバー内に蒔き、培地に溶解した5% FBSを、化学誘引物質としてマトリゲルインベージョンチャンバーのウェルに24時間添加した。具体的には、CLDN18、ARHGAP26、およびCLDN18-ARHGAP26により安定的にトランスフェクトされた1 x105個のHeLaおよびMDCK細胞をRPMI無血清培地中に懸濁した0.5mlを、メーカーの説明書（Corning）にしたがってBiocoatマトリゲルインベージョンチャンバー内に蒔いた。培地に溶解した5% FBSを、化学誘引物質としてマトリゲルインベージョンチャンバーのウェルに24時間添加した。翌日、細胞を3.7% PFA中で10分間固定し、インサートをPBSで洗浄した。クリスタルバイオレット0.1%をインサートに10分間添加して、水で2回洗浄した。綿棒を用いて非浸潤細胞を取り除き、再度洗浄した。Nikon Eclipse TE2000-Sを用いて浸潤細胞を画像化し、計数した。
【００９９】
経上皮電気抵抗（TER）分析
2 x105個の安定的にトランスフェクトされたMDCK細胞を12mm トランズウェル（Transwell）インサート（Corning）に播種し、極性化された単層を得た。翌日、TER測定のためにインサートをCellZcope (nanoAnalytics)に入れた。
【０１００】
軟寒天コロニー形成アッセイ
各実験について3連の設定で、HeLaおよびHGC27安定細胞株500個を2ml軟寒天（2X FBS添加0.35% Noble寒天培地）に加え、固化した基層（2X FBS添加0.7% Noble寒天培地）の上に重層した。2-4週間後、コロニーを計数した。
【０１０１】
融合遺伝子
以下の表3に詳述するように、5つの融合遺伝子を本研究に使用した。
表3：融合遺伝子
【０１０２】
【表３】
2017514514.tif 000013
5つの再発性融合遺伝子の詳細を以下に記載する。
【０１０３】
すべてのゲノムコーディネートは、2009年2月のリファレンス配列（GRCh37もしくはhg19; http://genome.ucsc.edu/）に基づく。転写物IDは、Ensemblゲノムデータベース（http://www.ensembl.org/）に基づく。黄色の網掛けは、最初のスクリーニングで見いだされた5'融合パートナー遺伝子のコード部分であり、緑色の網掛けは、3'融合パートナー遺伝子である。
【０１０４】
融合遺伝子#1：CLEC16A-EMP2
CLEC16A
ゲノムPCRで確認されたブレイクポイント - chr16: 11073471
RT-PCRで確認されたエクソン9のRNA融合ポイント - 11073239
EMP2
ゲノムPCRで確認されたブレイクポイント - chr16: 10666428
RT-PCRで確認されたエクソン2内のRNA融合ポイント（5’ UTR） - 10641534
転写物：CLEC16A-001 ENST00000409790
cDNA配列（配列番号93）、融合遺伝子のコード部分に網掛け。
2017514514.tif 000014
2017514514.tif 000015
2017514514.tif 000016
【０１０５】
転写物：CLEC16A-001 ENST00000409790
タンパク質配列（配列番号94）、融合遺伝子のコード部分に網掛け。
2017514514.tif 000017
2017514514.tif 000018
【０１０６】
転写物：EMP2-001 ENST00000359543
cDNA配列（配列番号95）、融合遺伝子のコード部分に網掛け。
2017514514.tif 000019
2017514514.tif 000020
【０１０７】
転写物：EMP2-001 ENST00000359543
cDNA配列
2017514514.tif 000021
2017514514.tif 000022
2017514514.tif 000023
2017514514.tif 000024
2017514514.tif 000025
2017514514.tif 000026
転写物：EMP2-001 ENST00000359543
タンパク質配列（配列番号96）
2017514514.tif 000027
CLEC16A -EMP2融合配列エクソン9からエクソン2 UTRまで
cDNA配列（配列番号97）、EMP2に下線。
2017514514.tif 000028
タンパク質配列（配列番号98）、EMP2に下線。
2017514514.tif 000029
2017514514.tif 000030
タンパク質ドメイン
506残基のクエリ配列内のドメイン
2017514514.tif 000031
CLEC16A -EMP2融合配列エクソン4からエクソン2 UTRまで
cDNA配列（配列番号99）、EMP2に下線。
2017514514.tif 000032
タンパク質配列(配列番号100）
2017514514.tif 000033
タンパク質ドメイン
351残基のクエリ配列内のドメイン
2017514514.tif 000034
CLEC16A -EMP2融合配列エクソン10からエクソン2 UTRまで
cDNA配列（配列番号101）、EMP2に下線。
2017514514.tif 000035
タンパク質配列(配列番号102）
2017514514.tif 000036
タンパク質ドメイン
544残基のクエリ配列内のドメイン
2017514514.tif 000037
融合遺伝子#2：CLDN18-ARHGAP26
CLDN18
ゲノムPCRで確認された開示サンプルのブレイクポイント - chr3:137,752,065
RT-PCRで確認されたエクソン5のRNA融合ポイント - chr3: 137,749,947
ARHGAP26
ゲノムPCRで確認された開示サンプルのブレイクポイント - chr5:142318274
RT-PCRで確認されたエクソン12のRNA融合ポイント - chr5: 142393645
転写物：CLDN18-001 ENST00000343735
cDNA配列（配列番号103）、融合遺伝子のコード部分に網掛け。
2017514514.tif 000038
2017514514.tif 000039
【０１０８】
転写物：CLDN18-001 ENST00000343735
タンパク質配列（配列番号104）、融合遺伝子のコード部分に網掛け。
2017514514.tif 000040
【０１０９】
転写物：ARHGAP26-001 ENST00000274498
cDNA配列（配列番号105）、融合遺伝子のコード部分に網掛け。
2017514514.tif 000041
2017514514.tif 000042
2017514514.tif 000043
【０１１０】
転写物：ARHGAP26-001 ENST00000274498
タンパク質配列（配列番号106）、融合遺伝子のコード部分に網掛け。
2017514514.tif 000044
【０１１１】
CLDN18-ARHGAP26融合配列
cDNA配列（配列番号107）、ARHGAP26に下線。
2017514514.tif 000045
2017514514.tif 000046
タンパク質配列（配列番号108）、ARHGAP26に下線。
2017514514.tif 000047
タンパク質ドメイン
695残基のクエリ配列内のドメイン
2017514514.tif 000048
融合遺伝子#3：SNX2-PRDM6
転写物：SNX2-001 (ENST00000379516)のイントロン12-13にあるchr5:122162808上のSNX2について確認されたゲノムブレイクポイント
転写物：PRDM6-001 (ENST00000407847)のイントロン3-4にあるchr5:122437347上のPRDM6について確認されたゲノムブレイクポイント
転写物：SNX2-001 ENST00000379516
cDNA配列（配列番号109）、融合遺伝子のコード部分に網掛け。
2017514514.tif 000049
【０１１２】
転写物：SNX2-001 ENST00000379516
タンパク質配列（配列番号110）、融合遺伝子のコード部分に網掛け。
2017514514.tif 000050
【０１１３】
転写物：PRDM6-001 ENST00000407847
cDNA配列（配列番号111）、融合遺伝子のコード部分に網掛け。
2017514514.tif 000051
2017514514.tif 000052
【０１１４】
転写物：PRDM6-001 ENST00000407847
タンパク質配列（配列番号112）、融合遺伝子のコード部分に網掛け。
2017514514.tif 000053
2017514514.tif 000054
【０１１５】
SNX2-PRDM6融合配列エクソン12から4まで
cDNA配列（配列番号113）
2017514514.tif 000055
タンパク質配列（配列番号114）
2017514514.tif 000056
タンパク質ドメイン
膜貫通ドメインなし
SNX2-PRDM6融合遺伝子エクソン2からエクソン7まで
ｃDNA配列（配列番号115）
2017514514.tif 000057
タンパク質配列（配列番号116）
2017514514.tif 000058
タンパク質ドメイン
膜貫通ドメインなし
融合遺伝子#4：MLL3-PRKAG2
chr7:151365906上のMLL3について確認されたゲノムブレイクポイント（リファレンス転写物：MLL3-001 (ENST00000262189)）
chr7:151951997上のPRKAG2について確認されたゲノムブレイクポイント（リファレンス転写物：PRKAG2-001 (ENST00000287878)）
cDNA配列（配列番号117）、融合遺伝子の部分に網掛け。
2017514514.tif 000059
2017514514.tif 000060
2017514514.tif 000061
2017514514.tif 000062
2017514514.tif 000063
2017514514.tif 000064
【０１１６】
転写物：MLL3-001 ENST00000262189
タンパク質配列（配列番号118）、融合遺伝子の部分に網掛け。
2017514514.tif 000065
2017514514.tif 000066
【０１１７】
転写物：PRKAG2-001 ENST00000287878
cDNA配列（配列番号119）、融合遺伝子の部分に網掛け。
2017514514.tif 000067
2017514514.tif 000068
【０１１８】
転写物：PRKAG2-001 ENST00000287878
タンパク質配列（配列番号120）、融合遺伝子の部分に網掛け。
2017514514.tif 000069
2017514514.tif 000070
【０１１９】
MLL3-PRKAG2融合配列エクソン9からエクソン5まで
cDNA配列（配列番号121）、PRKAG2に下線。
2017514514.tif 000071
タンパク質配列エクソン9からエクソン5まで（配列番号122）、PRKAG2に下線。
2017514514.tif 000072
タンパク質ドメイン エクソン9からエクソン5まで
ドメインのオーバーラップのため、タンパク質について4つの表現型がある。膜貫通ドメインなし。
【０１２０】
MLL3-PRKAG2融合配列 エクソン6からエクソン7まで
cDNA配列（配列番号123）、PRKAG2に下線。
2017514514.tif 000073
タンパク質配列 エクソン6からエクソン7まで（配列番号124）
2017514514.tif 000074
タンパク質ドメイン エクソン6からエクソン7まで
566残基のクエリ配列内に膜貫通ドメインなし。
【０１２１】
MLL3-PRKAG2融合配列 エクソン23からエクソン6まで
cDNA配列（配列番号125）、PRKAG2に下線。
2017514514.tif 000075
2017514514.tif 000076
2017514514.tif 000077
タンパク質配列 エクソン23からエクソン6まで（配列番号126）
2017514514.tif 000078
タンパク質ドメイン エクソン23からエクソン6まで
ドメインのオーバーラップのため、タンパク質について40の表現型がある。膜貫通ドメインなし。
融合遺伝子#5：DUS2L-PSKH1
確認されたゲノムブレイクポイント：DUS2L - chr16:67930935, PSKH1 - chr16:68103638
転写物：DUS2L-001 ENST00000565263
cDNA配列（配列番号127）、融合遺伝子の部分に網掛け。
2017514514.tif 000079
【０１２２】
転写物：DUS2L-001 ENST00000565263
cDNA配列
2017514514.tif 000080
2017514514.tif 000081
2017514514.tif 000082
転写物：DUS2L-001 ENST00000565263
タンパク質配列（配列番号128）、融合遺伝子の部分に網掛け。
2017514514.tif 000083
2017514514.tif 000084
【０１２３】
転写物：PSKH1-001 ENST00000291041
cDNA配列（配列番号129）、融合遺伝子の部分に網掛け。
2017514514.tif 000085
2017514514.tif 000086
【０１２４】
転写物：PSKH1-001 ENST00000291041
cDNA配列
2017514514.tif 000087
2017514514.tif 000088
2017514514.tif 000089
2017514514.tif 000090
転写物：PSKH1-001 ENST00000291041
タンパク質配列（配列番号130）
2017514514.tif 000091
DUS2L-PSKH1融合配列 エクソン10からエクソン2 UTRまで
cDNA配列（配列番号131）、PSKH1に下線。
2017514514.tif 000092
2017514514.tif 000093
【０１２５】
DUS2L-PSKH1融合配列 エクソン10からエクソン2 UTRまで
タンパク質配列（配列番号132）、PSKH1に下線。
2017514514.tif 000094
タンパク質ドメイン
膜貫通ドメインなし。
【０１２６】
DUS2L-PSKH1融合配列 エクソン3からエクソン2 UTRまで
cDNA配列（配列番号133）、PSKH1に下線。
2017514514.tif 000095
タンパク質配列（配列番号134）
2017514514.tif 000096
タンパク質ドメイン
ドメインなし。
【０１２７】
本研究の融合遺伝子のそれぞれについてmRNA融合ポイントのゲノム位置を表4に示す。
【０１２８】
表4。本研究の5つの再発性融合遺伝子のmRNA融合ポイントに対応するゲノム位置。
【０１２９】
【表４】
2017514514.tif 000097
（実験方法）
【実施例１】
【０１３０】
全ゲノムDNA-PETシーケンシングにより同定された胃がん（GC）における構造多型（SV）
DNA-PETによって、10個のペアとなる正常サンプルおよび胃がん細胞株TMK1を含めて、14個の原発性胃腫瘍からゲノムDNAを配列決定した。ゲノムについて約2倍のbpカバレッジおよび200倍の物理的カバレッジで、1,945個の体細胞SVが同定され（図1A-C）、生殖細胞系列と体細胞のSVの間でSV分布に有意な相違があったが（P = 2.2 x 10-16、χ2 検定、図1D）、それはさまざまに異なる変異機構および選択機構を示唆している。SVが詳細に解析されている他のがん型と比較すると、GCは前立腺がんより高い割合のタンデム重複を示し、膵臓がんより多くの逆位を示したが（図1E）、それは、それぞれのがん型がそれ自体の再構成パターンを有することを示す。
【実施例２】
【０１３１】
GCにおける体細胞SVの特徴は再構成機構を理解する手がかりとなる
生殖系列および体細胞のブレイクポイントはいずれも、反復領域（P < 10-5、図2A）およびオープンクロマチン領域（P < 10-21 χ2検定；図2B）に多く存在するのに対して、遺伝子には体細胞ブレイクポイントだけが多く存在し（P < 10-15 χ2 検定）、生殖系列ブレイクポイントは遺伝子において激減している（P < 10-15χ2 検定、図2C）。これは、生殖系列における遺伝子破壊的な再構成のネガティブ選択を反映する一方、遺伝子構造を変化させる体細胞再構成のがん促進の可能性を反映しているのかもしれない。こうした所見は、ゲノムの転写活性のある部分の方がGCにおいて体細胞再構成を起こしやすいことを示唆する。
【０１３２】
有効な融合ポイントの2%は、挿入された配列が融合ポイントに近い遺伝子座に由来するという特徴的なパターンを有することが観察された（図2D）。こうした事例の3つが融合遺伝子を作り出した（ARHGAP26-CLDN18、LIFR-GATA4、およびMLL3-PRKAG2）。同一遺伝子座におけるこれらの再構成の特徴に関する所見は、転写と連動している可能性のある特異的な機構を示唆する。
【０１３３】
体細胞SVの再構成パートナー部位が核の内部で空間的に近接している傾向があるという可能性を、ペアエンドタグ（ChIA-PET）シーケンシングデータによる、SV間のオーバーラップ検索、およびクロマチン相互作用解析によって検証した。概念の実証として、細胞株由来（MCF-7および K562）クロマチン相互作用、ならびに乳がんおよび慢性骨髄性白血病（CML）に関する腫瘍由来体細胞SVをそれぞれ比較し、相当なオーバーラップが観察された。
【０１３４】
本研究の生殖系列および体細胞SVの2つのパートナー部位が、核内で互いに近傍にある遺伝子座について高頻度に存在するかどうかを調べるために、クロマチン相互作用には異なる細胞型を越えて保存されるものがあるという論拠により、乳がん細胞株MCF-7のChIA-PETシーケンシングから得られたゲノムワイドクロマチン相互作用データセットを用いて、SVのオーバーラップを検証した（図3）。
【０１３５】
胃がん細胞株のChIA-PETデータは利用できないので、クロマチン相互作用のなかには異なる組織を越えて安定しているものがあるという仮定により、乳がん細胞株MCF-7を使用した。15 GCの1,667 生殖系列および1,945体細胞SVが、MCF-7の87,253クロマチン相互作用とオーバーラップし、61 (3.7%)生殖系列および19 (1%)体細胞SVオーバーラップが見いだされたが、それは偶然に起こる可能性より高く（P < 0.001、並べ替え検定による、図2E）、クロマチン相互作用が生殖系列および体細胞GC SVの形態に寄与することを示す。
【実施例３】
【０１３６】
GCにおける再構成ホットスポット
厳しい検索基準によって14個の再発性体細胞SVが同定され、緩い検索基準によってさらに173個が同定された。再発の再構成は、7つのホットスポットに集まっていたが、FHIT、WWOX、MACROD2、PARK2、およびPDE4Dは既知の壊れやすい部位にあり、NAALADL2およびCCSER1 (FAM190A)は新しいホットスポットにあった。再発で再構成される遺伝子はすべて、がんに関連性があった。興味深いことに、7つの再構成ホットスポットの中にもっとも多数の体細胞SVを有する腫瘍17およびTMK1（SVはそれぞれ12および11個）は、もっとも多数の体細胞SVを有するGCの中にも位置を占めており（図1B）、そのことは、これらの再構成ホットスポットがゲノム不安定性を有する腫瘍において速やかに再構成を蓄積するか、またはホットスポット遺伝子の破壊が、機構的にゲノム不安定性の一因となることを示唆する。がんの生物学における2つの重要遺伝子である、MYC遺伝子座の再発性タンデム重複、およびATM遺伝子座の再発性欠失も見いだされ、それはさらに、再発性体細胞SVががんの生物学に関連する可能性が高いことを示す。
【実施例４】
【０１３７】
GCにおける再発性融合遺伝子
15個のGCの体細胞SVを用いて、136個の融合遺伝子を予想し、そのうち97個をゲノムPCRおよびサンガー（Sanger）シーケンシングにより検証し、44個の発現を逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）により、それぞれの腫瘍において確認した。15個の発現された融合遺伝子はインフレームであった。構成的に活性のある発がん性融合遺伝子は通常インフレーム融合物であるので、このカテゴリーに焦点を合わせて、RT-PCRにより85個のGC腫瘍/正常ペアのセットを追加してスクリーニングしたが、追加した1つの腫瘍においてSNX2-PRDM6を見いだし、追加した2つの腫瘍においてCLDN18-ARHGAP26、追加した3つの腫瘍においてMLL3-PRKAG2、ならびに追加した4つの腫瘍においてCLEC16A-EMP2を見いだし、全体的な頻度2-5%が与えられた（図4A-Cおよび図5から8まで）。統計シミュレーションを行って、そうした再発率の有意性を評価した。融合遺伝子の観測頻度の統計的有意性は、ランダム化フレームワークを用いて評価した。DNA-PETにより配列決定されたサンプルにおいて同定された、SVのタイプ、数、およびサイズ分布を模倣した、15個のSVプロファイルを定義した。そのSVプロファイルを用いて15個のGCテストデータセットのSVをシミュレートし、シミュレートされた85個のGCサンプルの検証セットについて、再発SVの頻度を評価した。N =10,000をランダムシミュレーションの回数とし、esを、テストデータセット中に存在するSVの検証データセット中の頻度とすると、P値(es)はp/Nと定義され、このpは、SV kがek ≧esの頻度で存在するシミュレーションの数である。
【０１３８】
それは偶然によって予想されるものではなく、（P = 0.00472）、2つの再発見（P = 9.98 x 10-5）および3つの再発見（P = 1.11 x 10-5）にとって、高レベルの有意性があることが判明した。このことは、これらの融合遺伝子がランダムに作り出されるのではなくて、標的化された再構成機構による可能性が高いこと、および/または、結果として得られた融合遺伝子が選択的優位性をもたらすことを示唆する。
【実施例５】
【０１３９】
細胞増殖に及ぼす融合遺伝子の影響
融合遺伝子が選択的優位性をもたらすかどうかを調べるために、バイオインフォマティックスおよび細胞生物学的アプローチを用いた。コンピューターによって、ネットワーク融合中心性解析を用いて、ドライバー融合遺伝子を予測した。136個の本研究の融合遺伝子の中で、38個を可能性のあるドライバー融合遺伝子に分類したが、これにはCLDN18-ARHGAP26、SNX2-PRDM6、およびMLL3-PRKAG2が含まれる（表５）。TMK1においてMLL3-PRKAG2およびDUS2L-PSKH1が同定されたので、MLL3-PRKAG2およびDUS2L-PSKH1転写物の融合ポイントに特異的な低分子干渉RNA（siRNA）実験を行った。MLL3-PRKAG2を発現抑制すると63%の細胞増殖減少が観察された（図５）が、DUS2L-PSKH1ノックダウン細胞に関しては結論に達しない変化が観察された（図６）。したがって、GCにおける4%の頻度、予想されるドライバーの特性、および増殖促進効果の実験的証拠に基づいて、MLL3-PRKAG2はGCに対して発がん促進的であることが示唆される。
【０１４０】
表５．ドライバー融合遺伝子予測
【０１４１】
【表５】
2017514514.tif 000098
2017514514.tif 000099
2017514514.tif 000100
2017514514.tif 000101
GCにおけるCLDN18-ARHGAP26、CLEC16A-EMP2、およびSNX2-PRDM6の機能を調べるために、GC細胞株HGC27において安定な過剰発現を生じさせると、CLDN18-ARHGAP26（85% 増加、P = 4.2 x 10-6、T検定；図4G、H）およびCLEC16A-EMP2（50% 増加、P = 7.9 x 10-5、T検定；図7）については細胞増殖速度の増加を示したが、SNX2-PRDM6については増殖速度の低下を示した（46% 減少、P = 9 x 10-6、T検定；図8）。
【０１４２】
CLDN18-ARHGAP26の過剰発現による増殖速度の増加は、この融合遺伝子の発がん性の役割を示唆したので、その機能をさらに検討した。CLDN18-ARHGAP26は75.6 kDa融合タンパク質をコードしており、このタンパク質は、CLDN18の4つの膜貫通ドメインのすべて、およびARHGAP26のRhoGAPドメインを含有するが、閉鎖帯足場タンパク質（ZO-1、ZO-2、ZO-3）との相互作用に関与するCLDN18のRDZ結合モチーフのC末端を欠いている（図4E）。CLDN18は、クローディンタンパク質のファミリーに属し、このタンパク質はタイトジャンクション（TJ）の構成成分である。ARHGAP26 (GRAF1)は、接着斑キナーゼ（FAK）に結合するが、これは細胞の成長、増殖、生存、接着および遊走を調節する。ARHGAP26はまた、低分子量GTP結合タンパク質RhoAをネガティブに制御することができるが、それはRASの関与する悪性転換における増殖促進効果でよく知られている。
【０１４３】
CLDN18-ARHGAP26融合物を有する3つの腫瘍すべてにおいて、転写物は、CLDN18のエクソン5のコード領域内の隠れたスプライス部位（cryptic splice site）、およびARHGAP26のエクソン12の通常のスプライス部位で連結された（図4D）。ゲノムレベルで、蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH、図4B）およびPCR/サンガーシーケンシング（図4C）によって、腫瘍136におけるCLDN18-ARHGAP26再構成を検証した。カスタムキャプチャーシーケンシングによって、腫瘍07K611Tにおけるゲノム融合ポイントは、CLDN18の2,342 bp下流に特定されたが（図4A）、それは、ブレイクポイントがCLDN18遺伝子の下流にあっても、隠れたスプライス部位がインフレーム融合に関与することを示す。
【実施例６】
【０１４４】
CLDN18-ARHGAP26を発現する患者検体およびMDCK細胞における上皮表現型の喪失
腫瘍検体の免疫蛍光のために、CLDN18およびARHGAP26抗体を使用したが、これらはいずれもCLDN18-ARHGAP26融合タンパク質を検出することができるものである（図9A）。正常な胃検体および融合物発現腫瘍の胃検体において、CLDN18タンパク質は、胃小窩領域の内側を覆うを上皮細胞、および胃腺の底部にある上皮細胞の細胞膜に見られた（図10A）。ARHGAP26はすでに、HeLa細胞において多形性管状構造および点状膜構造で検出された。本研究において、ARHGAP26は、正常な胃において、胃粘膜の全体にわたる小胞構造で観測された（図10B）。十分に分化した正常な胃上皮とは対照的に、CLDN18-ARHGAP26を発現する胃腫瘍検体は、無秩序な構造を示した。上皮マーカーCDH1（E-カドヘリン）は、対照組織において上皮細胞の膜に発現していたが、腫瘍サンプルにおいては、細胞内の点状分布を示すか、または細胞に存在しなかった（図10A、B）。CLDN18-ARHGAP26は腫瘍サンプルにおいて、E-カドヘリン陽性細胞にも、陰性細胞にも存在したが、E-カドヘリン陰性細胞は間葉の特徴を示し（図10A、B）、融合タンパク質が細胞間接着を変化させて上皮表現型の喪失をもたらすことと一致する。総じて、融合遺伝子は、胃上皮の完全性の決定的な損傷と相関する。
【０１４５】
腫瘍サンプルにおいて観察される上皮の完全性の変化に対する融合タンパク質の寄与を理解するために、がん化していない上皮MDCK細胞において、CLDN18、ARHGAP26、またはCLDN18-ARHGAP26を安定的に発現させた。位相差により検分すると、対照およびMDCK-CLDN18細胞培養物は、特徴的な上皮形態を示した（図10C）。MDCK-ARHGAP26細胞はそれよりやや紡錘状で、短い突起を有していたが、MDCK-CLDN18-ARHGAP26細胞は、上皮表現型の劇的な喪失、および長い突起を示し、これは上皮間葉転換（EMT）を示す（図10C）。細胞凝集アッセイは、MDCK-CLDN18-ARHGAP26細胞について弱い凝集を示したが（図10D）、それは、融合遺伝子がたしかに、観察された上皮の変化を引き起こすことを示唆する。同様の結果は、HGC27細胞でも得られた。
【０１４６】
CLDN18-ARHGAP26によって引き起こされる表現型の変化がEMTを反映するかどうかを評価するために、定量的PCR（qPCR）を用いて、さまざまなEMTマーカーの発現を調べた。EカドヘリンmRNAレベルはARHGAP26およびCLDN18-ARHGAP26発現細胞では変化していなかったが、主要EMT制御因子SNAI1（Snail）およびSNAI2（Slug）は減少していた（図10E）。MDCK-CLDN18-ARHGAP26は、対照MDCK細胞と比べて、MMP2（マトリックスメタロプロテイナーゼ2）mRNAレベルの5.2倍の増加を示し、それは融合遺伝子により引き起こされた細胞外マトリックス（ECM）接着の変化を示唆する。
【０１４７】
興味深いことに、融合タンパク質ではないが、CLDN18の発現でダウンレギュレートされたN-カドヘリンおよびβ-カドヘリン発現が、がん化しているHeLa細胞で観察されたが（図10Fおよび9B-D）、それはそれぞれ、CLDN18が、EMTの際に観察される上皮型カドヘリンから間葉系カドヘリンへの転換を逆行させることができること、ならびにWntシグナル伝達を抑制することができることを示唆する。Wntシグナル伝達は、多くのがんで過剰に活性化されており、N-カドヘリン発現はAKTシグナル伝達を活性化するが、これは多くの腫瘍で過剰に活性化されている。実際、pAKTタンパク質レベルは、下流エフェクターp21活性化キナーゼ（PAK）レベルと同様に、CLDN18を過剰発現するHeLa細胞において、対照と比べて減少していた（図10G）。これは、AKTおよびWntシグナル伝達を弱めることによる、腫瘍抑制因子としてのCLDN18の役割を示唆する。
【実施例７】
【０１４８】
CLDN18-ARHGAP26は細胞-細胞外マトリックス接着を低下させる
ARHGAP26はおそらく、そのFAKとの相互作用およびRhoAの制御を通じて、細胞とECMとの接着に影響を及ぼし、それがひいては接着斑を制御する。接着アッセイは、対照細胞およびMDCK-CLDN18細胞が、未処理表面にもECMコート表面にも付着して広がることを示した。ARHGAP26発現細胞のみならず、CLDN18-ARHGAP26発現細胞はなおさら、その表面への付着の効率は劣るが（図11A）、付着しない細胞は播種の2時間後に依然として球形をとっており（図11A）、それは、融合遺伝子が、ARHGAP26の効果を促進し、細胞-ECM接着特性に強く影響することを示す。融合タンパク質に存在するARHGAP26のSH3ドメインは、接着斑分子、FAKおよびPXN（パキシリン）に結合する。したがって、CLDN18-ARHGAP26発現の接着斑タンパク質に及ぼす影響を調べた。pFAKおよびパキシリンはMDCK-CLDN18細胞およびMDCK-ARHGAP26細胞の自由端において検出されたが、MDCK-CLDN18-ARHGAP26細胞のこの部位には存在しなかった（図11B、C）。ARHGAP26に関連する接着分子、すなわち接着斑複合タンパク質のウエスタンブロット分析は、MDCK-ARHGAP26細胞において、β-Pix、LIMS1 (PINCH1)、およびパキシリンのレベルの低下を示したが、MDCK-CLDN18-ARHGAP26細胞ではさらに顕著であった（図11D）。
【０１４９】
タンパク質レベルの変化を反映して、PINCH1およびパキシリン転写物レベルの有意な低下が、MDCK-ARHGAP26細胞およびMDCK-CLDN18-ARHGAP26細胞においてqPCRにより観測された（図11E）。Talin-1、Talin-2およびSDC1 (Syndecan 1) mRNAレベルの実質的減少も、融合タンパク質発現細胞において観察され、CLDN18-ARHGAP26細胞のECM接着の弱さをさらに示唆した（図11E）。
【０１５０】
接着斑の細胞質成分に加えて、ECM成分と直接相互作用するインテグリンファミリーメンバーのタンパク質レベルを分析した。MDCK-CLDN18-ARHGAP26細胞のコラーゲンコート表面への付着が弱いことと合致して（図11A）、この細胞はレベルの低下したITGB1（インテグリンβ1）およびITGB5（インテグリンβ5）を発現した（図11F）。実際、多くのインテグリンサブユニット、特にインテグリンα5、の転写物レベルの低下がMDCK-CLDN18-ARHGAP26細胞において観察された（図11G）。要約すると、ARHGAP26の過剰発現はECM接着を妨害するが、融合遺伝子の過剰発現ではなおさらそうである。
【実施例８】
【０１５１】
CLDN18により促進される上皮バリアは、CLDN18-ARHGAP26によって損なわれる
クローディンは、管腔内の酸性環境から胃組織を保護することを含む、傍細胞上皮バリアの決定的に重要な成分である。このバリア機能の変化は、慢性の炎症を引き起こす可能性があり、GC発症のリスクファクターである。したがって、CLDN18および融合タンパク質のバリア形成における役割を検討した。CLDN18はMDCKにおいて内因的に発現されていないが、その過剰発現は、結果としてMDCK-CLDN18単層の経上皮電気抵抗（TER）の劇的な増加をもたらした。ARHGAP26はTERに有意な影響を与えないが、CLDN18-ARHGAP26はTERを完全になくした（図11H）。この影響は、C末端PDZ結合モチーフ欠如を単純に反映しなかったが、それはCLDN18構築物が、このC末端PDZ結合モチーフが不活化されている場合（CLDN18ΔP）も依然としてMDCK細胞のベースラインTERを増加させたからである。コンフルエントなCLDN18-ARHGAP26融合物発現MDCK細胞の位相差画像は、この細胞が密着した単層を形成できなかったことを示し、それはTERの消失を明白にする（図11I）。アクチン細胞骨格にクローディンを直接結合する裏打ちタンパク質であるTJP1 (ZO-1)の発現レベルおよび細胞内局在性は、融合タンパク質を発現するMDCK細胞において変化していなかったが（図9E、F）、他のいくつかのTJ成分の発現は、おそらくは代償機構として、MDCK-CLDN18-ARHGAP26細胞においてアップレギュレートされていた（図9E）。
【実施例９】
【０１５２】
CLDN18-ARHGAP26は細胞環境に特有の影響を細胞増殖、浸潤および遊走に及ぼす
GC細胞株HGC27において、CLDN18-ARHGAP26は増殖増加を引き起こす（図4H）。しかしながら興味深いことに、がん化していないMDCK細胞において、MDCK-CLDN18-AHGAP26細胞の増殖速度は対照より低かった（図12A）。創傷閉鎖実験は、対照と比較してMDCK-CLDN18-ARHGAP26細胞の細胞遊走の低下を示した（図12B）のに対して、MDCK細胞におけるCLDN18-ARHGAP26の発現は、浸潤および足場非依存性増殖には影響を及ぼさなかったが、それはがんの進行および転移の特徴である。したがって、こうしたプロセスを検討して、がん細胞株HGC27およびHeLaにおいてそれが変化しているかどうかを判定した。安定的にCLDN18-ARHGAP26を発現する2つの独立したHeLa細胞株は、細胞浸潤の3倍から4倍の増加を示し（図12C）、その融合タンパク質を安定的に発現するHeLaおよびHGC27細胞は、軟寒天増殖アッセイにおいて30%多くのコロニーを形成した（図12D）。これらの所見は、がん化していない細胞およびがん化している細胞における増殖、浸潤、および足場非依存性増殖に及ぼす、融合タンパク質のさまざまに異なる影響を強調しており、浸潤および転移などの後期がんイベントに至らしめる融合タンパク質の役割を示唆する。
【実施例１０】
【０１５３】
ARHGAP26およびCLDN18-ARHGAP26はいずれもRhoAおよびストレスファイバー形成を阻害する
RhoAは、増殖因子受容体もしくはインテグリンの各リガンドとの結合に際して、アクチン重合、収縮、およびストレスファイバー形成のような多くのアクチンイベントを制御する。ARHGAP26は、GAPドメインを介して、CDC42およびRhoAのGTPアーゼ活性を刺激し、その結果、不活化をもたらす。CLDN18-ARHGAP26融合タンパク質は、ARHGAP26のGAPドメインを保持しているので、RhoAを依然として不活化することができるかもしれない。これを検証するために、ストレスファイバー形成、ならびに活性型RhoAの存在および細胞内局在性に及ぼすCLDN18-ARHGAP26発現の影響を分析した。HeLa細胞において、ARHGAP26もしくはCLDN18-ARHGAP26の安定的過剰発現は、細胞骨格の変化、特にRhoA不活化を示唆するストレスファイバーの減少を引き起こす（図13A）。活性化されたRhoAを特異的に認識する抗体による安定発現株の標識化は、ARHGAP26およびCLDN18-ARHGAP26融合タンパク質発現細胞における標識化の減少を示したが、総RhoAレベルはそのまま変化していなかった（図13B、C）。活性型RhoAレベルを測定するGLISAアッセイは、さらにこの結果を確認した（図13D）。これらの所見は、CLDN18-ARHGAP26融合タンパク質のGAPドメインがRhoAへの阻害活性を保持することを示す。
【実施例１１】
【０１５４】
CLDN18-ARHGAP26融合タンパク質はクラスリン非依存性エンドサイトーシスを抑制する
エンドサイトーシスの変化は、細胞-ECM間および細胞間接着タンパク質ならびに受容体型チロシンキナーゼ（RTK）の細胞表面滞留時間および/または分解に影響を及ぼす可能性があり、それによって、細胞接着、遊走、およびRKTシグナル伝達を変化させうるが、それは発がんを促進する可能性がある。他の細胞株とは対照的に、CLDN18-ARHGAP26融合タンパク質を発現するHeLa細胞は、エンドサイトーシスの有意な減少を示し、融合タンパク質に、エンドサイトーシスに必須のBARおよびPHドメインがないことと一致する。
【実施例１２】
【０１５５】
再発性融合遺伝子CLEC16A-EMP2、SNX2-PRDM6、MLL3-PRKAG2およびDUS2L-PSKH1の生物学的背景
DUS2LとPSKH1との融合転写物は、がん細胞株TMK1において確認され、続いて2つの原発性胃腫瘍において確認された。しかしながら、一方の腫瘍では、DUS2Lのエクソン3がPSKH1のエクソン2（UTR領域）に融合され、結果としてアウトオブフレーム融合転写物となった（図6）。TMK1および第2の腫瘍では、DUS2Lのエクソン10がPSKH1のエクソン2にインフレームで融合されていた。非小細胞肺がん細胞におけるDUS2LのsiRNAノックダウンは増殖を抑制したが、さらに、腫瘍における高レベルのDUS2Lと肺がん患者の予後不良との関連性が報告されている。PSKH1は前立腺がん細胞増殖の制御因子であると確認された。整合するDUS2L-PSKH1の増殖促進効果は見られなかった（図6）。しかしながら、増殖は、（融合）遺伝子が腫瘍の発生もしくは進行に関与しうる唯一の可能性のある機構であって、DUS2L-PSKH1がGCに関与することは依然としてありうる。
【０１５６】
ペアの存在しない逆位が、融合遺伝子CLEC16A-EMP2を生じさせたが、これは100個のGCのうち5つで確認された。CLEC16Aの、エクソン4（1つの腫瘍）、エクソン9（2つの腫瘍）、またはエクソン10（2つの腫瘍）がEMP2のエクソン2に融合されていた（図7）。EMP2エクソン2の最初の60 bpは5' UTRであり、その融合物は結果的にEMP2の正規の開始メチオニンの前の20アミノ酸を含むことになる。予想されるオープンリーディングフレームは、機能ドメインを有する完全なEMP2タンパク質を保持している328、486および524アミノ酸をコードする。B細胞リンパ腫細胞株での実験は、腫瘍抑制因子としてのEMP2の機能を示唆する。その一方で、EMP2は卵巣腫瘍の≧70%で高度に発現されていることが判明し、EMP2に対する抗体は、卵巣がん細胞株によるマウス異種移植片において、有意に腫瘍増殖を抑制し、細胞死を誘導した。したがって、EMP2は薬剤標的となる可能性がある。2つの実験はともに、がんにおけるEMP2の役割を示唆するが、効果は組織特異的となる可能性がある。配列決定された15個のGCのうち14個のGCを発現マイクロアレイによって解析し、すべてのGCにおいて高発現レベルのEMP2が見られたが、最高発現は腫瘍113で見られ、これはCLEC16A-EMP2融合物を有していた（データは示さない）。このことは、融合物の一部としてのEMP2の発がん機能と一致する。融合遺伝子を安定的に発現するHGC27の増殖アッセイ（図7）は、CLEC16A-EMP2が発がん性を有する可能性があることをさらに裏付ける。
【０１５７】
SNX2-PRDM6は、1つの胃腫瘍においてインフレームで融合されており（SNX2のエクソン12がPRDM6のエクソン4に融合）、もう1つの腫瘍ではアウトオブフレームで融合されている（SNX2のエクソン2がPRDM6のエクソン7に融合、図8）ことが判明した。SNX2はソーティングネキシンファミリーのメンバーをコードしており、このファミリーメンバーは、細胞内輸送に関与する。PRDM6は、ヒストンメチルトランスフェラーゼ機能を有する可能性が高く、転写リプレッサーとして作用する可能性がある。マウス胎仔内皮細胞におけるPRDM6の過剰発現は、アポトーシス、ならびに管形成の低下を引き起こすが、それは、PRDM6がクロマチンモデリングによって血管系に関与する可能性があることを示唆する。SNX2-PRDM6を安定的に発現するHGC27の増殖速度の低下が観察されたが、発がんをもたらす可能性のある効果は、増殖よりむしろ血管系の強化と関係するのかもしれない。
【実施例１３】
【０１５８】
CLDN18-ARHGAP26融合タンパク質はクラスリン非依存性エンドサイトーシスを抑制する
ARHGAP26は、クラスリン非依存性エンドサイトーシスに不可欠であると報告されており、多くの受容体型チロシンキナーゼ（RTK）は、クラスリン依存性および非依存性経路によって内在化することができる。CLDN18-ARHGAP26融合タンパク質のクラスリン非依存性エンドサイトーシスに及ぼす影響を評価するために、クラスリン非依存性エンドサイトーシスのマーカーであるフルオレセインイソチオシアネート（FITC）結合CTxBを、対照の生細胞であるHeLa細胞、またはCLDN18、ARHGAP26、もしくはCLDN18-ARHAGP26を安定的に発現する細胞とともに15分間インキュベートした。次に、細胞を固定して、内在化されたFITC-CTxBを蛍光顕微鏡により可視化した。他の細胞株とは対照的に、CLDN18-ARHGAP26融合タンパク質を発現するHeLa細胞は、取り込まれたCTxB量の有意な減少を示し（図13）、それは融合タンパク質に、エンドサイトーシスに必須のBARおよびPHドメインがないことと一致する。
【０１５９】
再発性体細胞SVおよび再発性融合遺伝子が本実験で観察された。シミュレーションによれば、再発性融合遺伝子の比率を偶然で説明することはできないが、それは、他より特異的再構成の起こる可能性が高いこと、および/または選択的プロセスがそうした再構成を強化することを示す。体細胞SVをクロマチン相互作用のゲノムワイドな所見と比較することによって、再構成部位とクロマチン相互作用とのオーバーラップが偶然として予想されるより有意に多く観察されたが、それは、クロマチン構造がGCにおいて離れた伝子座の再発性融合に関与することを示唆する。
【０１６０】
これは、がんの体細胞SVとクロマチン相互作用との間の、最初の系統的相関分析である。クロマチン構造はGCとは異なる細胞型において特性解析されたので、クロマチン相互作用と再構成との間のオーバーラップの実際の比率は、低く見積もられた可能性がある。
【０１６１】
136個の融合遺伝子の妥当性、発現、およびリーディングフレーム特性を評価し、5個の再発性融合遺伝子を広範なスクリーニングによって特定した。CLDN18-ARHGAP26を詳細に分析し、早期のがん発生および後期の疾患の進行をいずれも促進する機能的特性が判明した。CLDN18およびARHGAP26は胃粘膜上皮において発現されるが、その胃粘膜上皮においてCLDN18はタイトジャンクション（TJ）に局在し、ARHGAP26は上皮細胞の点状管状の小胞構造に集まっている。したがって、CLDN18-ARHGAP26融合遺伝子は、RhoAの制御因子の機能タンパク質ドメインをTJタンパク質に結び付けて、性質の変化をもたらす。これらは、GAP活性の異常な局在化と同様に、GCに関連する細胞機能の変化をもたらす。
【０１６２】
腫瘍形成性HeLaおよびHGC27細胞において、CLDN18-ARHGAP26は、増加する増殖、足場依存性増殖および浸潤に関係していたが、このような細胞プロセスは、がん化していないMDCK細胞では低下しており（増殖、創傷閉鎖）、このことは悪性転換のレベルが融合タンパク質の効果にある程度の影響を及ぼすことを示唆し、発がんの多段階モデルと合致した。関連するin situのGCにおいて、ならびにMDCK細胞における過剰発現時に、CLDN18-ARHGAP26は、上皮表現型の喪失に関係していた。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図３−６】
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【図３−７】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図５−６】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図９−５】
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【図９−６】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１０−５】
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【図１０−６】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１１−５】
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【図１１−６】
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【図１１−７】
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【図１１−８】
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【図１１−９】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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