(57)【要約】  本発明は、生物学的サンプル中の強毒型クロストリジウム ディフィシル（Clostridium difficile）株を検出するための、核酸増幅に基づく方法を提供する。本発明は、強毒型クロストリジウム ディフィシル ゲノム中の負のマーカー又は正のマーカーに特異的なオリゴヌクレオチドプライマー及びオリゴヌクレオチドプローブの使用に基づく。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的サンプル中の強毒型クロストリジウム ディフィシル（Clostridium difficile）株の存在を検出するための方法であって、
生物学的サンプルから抽出したＤＮＡをテンプレートとし、Ｃ．ディフィシル（C. difficile）hydR 遺伝子中の標的配列の増幅に特異的な第１オリゴヌクレオチドプライマーセット（ただし、該 hydR 遺伝子は配列番号１の配列を有する）と、配列番号２のＣ．ディフィシル配列を有する標的配列の少なくとも一部の増幅に特異的な第２オリゴヌクレオチドプライマーセットとを用いる核酸増幅反応を行うことを特徴とする方法。
【請求項２】
該生物学的サンプル中の強毒型クロストリジウム ディフィシル株の存在を検出する工程を含み、第１オリゴヌクレオチドプライマーセットは特異的な産物を増幅せず第２オリゴヌクレオチドプライマーセットは特異的な産物を増幅するときに該強毒型クロストリジウム ディフィシル株が検出されるものであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該強毒型クロストリジウム ディフィシル株がクロストリジウム ディフィシル株０２７型リボタイプ又は該０２７型リボタイプ類似のクロストリジウム ディフィシル株であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
該生物学的サンプル中のＣ．ディフィシル hydR 遺伝子ＤＮＡの存在が該クロストリジウム ディフィシル株０２７型リボタイプが該生物学的サンプル中に存在しないことの指標であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
第１オリゴヌクレオチドプライマーセットのためのＣ．ディフィシル特異的標的配列が配列番号１のＣ．ディフィシル hydR 遺伝子中のヌクレオチド領域であって、該ヌクレオチド領域の少なくとも一部が特異的に増幅されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
第１オリゴヌクレオチドプライマーセットが、配列番号３のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含むかそれからなるオリゴヌクレオチドと、配列番号４のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含むかそれからなるオリゴヌクレオチドとを含むことを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
第１オリゴヌクレオチドプライマーセットが、配列番号３のヌクレオチド配列を含むかそれからなるオリゴヌクレオチドと、配列番号４のヌクレオチド配列を含むかそれからなるオリゴヌクレオチドとを含むことを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
第１オリゴヌクレオチドプライマーセットにより増幅される標的配列の存在を、配列番号７のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含むかそれからなるプローブを用いて検出することを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項９】
第１オリゴヌクレオチドプライマーセットにより増幅される標的配列の存在を、配列番号７のヌクレオチド配列を含むかそれからなるプローブを用いて検出することを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
第２オリゴヌクレオチドプライマーセットが、配列番号５のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含むかそれからなるオリゴヌクレオチドと、配列番号６のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含むかそれからなるオリゴヌクレオチドとを含むことを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
第２オリゴヌクレオチドプライマーセットが、配列番号５のヌクレオチド配列を含むかそれからなるオリゴヌクレオチドと、配列番号６のヌクレオチド配列を含むかそれからなるオリゴヌクレオチドとを含むことを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
第２オリゴヌクレオチドプライマーセットにより増幅される標的配列の存在を、配列番号８又は９のヌクレオチド配列を含むかそれからなるプローブを用いて検出することを特徴とする、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
該核酸増幅反応がＣ．ディフィシル毒素Ｂ遺伝子（tcdB）の増幅に特異的な第３オリゴヌクレオチドプライマーセットをさらに用い、配列番号１０のヌクレオチド領域の少なくとも一部が該核酸増幅反応において特異的に増幅されることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
第３オリゴヌクレオチドプライマーセットが、配列番号１１のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含むかそれからなるオリゴヌクレオチドと、配列番号１２のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含むかそれからなるオリゴヌクレオチドとを含むことを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
第３オリゴヌクレオチドプライマーセットが、配列番号１１のヌクレオチド配列を含むかそれからなるオリゴヌクレオチドと、配列番号１２のヌクレオチド配列を含むかそれからなるオリゴヌクレオチドとを含むことを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
第３オリゴヌクレオチドプライマーセットにより増幅される標的配列の存在を、配列番号１３のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含むかそれからなるプローブを用いて検出することを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
第３オリゴヌクレオチドプライマーセットにより増幅される標的配列の存在を、配列番号１３のヌクレオチド配列を含むかそれからなるプローブを用いて検出することを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
該生物学的サンプルが糞便サンプル又は食品サンプルであることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
強毒型クロストリジウム ディフィシル株の検出を、ＤＮＡチップ、ゲル電気泳動、放射線測定、蛍光測定又は燐光測定によって行うことを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項２０】
該方法をリアルタイムＰＣＲアッセイによって行うことを特徴とする、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
配列番号３のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含むかそれからなるオリゴヌクレオチドと、配列番号４のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含むかそれからなるオリゴヌクレオチドとを含み、Ｃ．ディフィシル hydR 遺伝子中の標的配列を増幅することを特徴とする、オリゴヌクレオチドプライマーセット。
【請求項２２】
配列番号３のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号４のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドとを含むことを特徴とする、請求項２１に記載のオリゴヌクレオチドプライマーセット。
【請求項２３】
配列番号３のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号４のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドとを含むことを特徴とする、請求項２２に記載のオリゴヌクレオチドプライマーセット。
【請求項２４】
配列番号７のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含むかそれからなるプローブをさらに含むことを特徴とする、請求項２１〜２３のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプライマーセット。
【請求項２５】
該プローブが配列番号７のヌクレオチド配列を含むかそれからなることを特徴とする、請求項２４に記載のオリゴヌクレオチドプライマーセット。
【請求項２６】
配列番号５のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含むかそれからなるオリゴヌクレオチドと、配列番号６のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含むかそれからなるオリゴヌクレオチドとを含み、Ｃ．ディフィシル ゲノム中の標的配列を増幅することを特徴とする、オリゴヌクレオチドプライマーセット。
【請求項２７】
配列番号５のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号６のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドとを含むことを特徴とする、請求項２６に記載のオリゴヌクレオチドプライマーセット。
【請求項２８】
配列番号５のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号６のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドとを含むことを特徴とする、請求項２７に記載のオリゴヌクレオチドプライマーセット。
【請求項２９】
配列番号８又は９のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含むかそれからなるプローブをさらに含むことを特徴とする、請求項２６〜２８のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプライマーセット。
【請求項３０】
該プローブが配列番号８又は９のヌクレオチド配列を含むかそれからなることを特徴とする、請求項２４に記載のオリゴヌクレオチドプライマーセット。
【請求項３１】
請求項２１〜２５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプライマーセットをさらに含むことを特徴とする、請求項２６〜３０のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプライマーセット。
【請求項３２】
配列番号１１のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含むかそれからなるオリゴヌクレオチドと、配列番号１２のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含むかそれからなるオリゴヌクレオチドとを含み、Ｃ．ディフィシル tcdB 遺伝子中の標的配列を増幅することを特徴とする、オリゴヌクレオチドプライマーセット。
【請求項３３】
配列番号１１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号１２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドとを含むことを特徴とする、請求項３２に記載のオリゴヌクレオチドプライマーセット。
【請求項３４】
配列番号１１のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号１２のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドとを含むことを特徴とする、請求項３３に記載のオリゴヌクレオチドプライマーセット。
【請求項３５】
配列番号１３のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含むかそれからなるプローブをさらに含むことを特徴とする、請求項３２〜３４のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプライマーセット。
【請求項３６】
該プローブが配列番号１３のヌクレオチド配列を含むかそれからなることを特徴とする、請求項３５に記載のオリゴヌクレオチドプライマーセット。
【請求項３７】
請求項３１に記載のオリゴヌクレオチドプライマーセットにおいて定義したオリゴヌクレオチドをさらに含むことを特徴とする、請求項３２〜３４のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプライマーセット。
【請求項３８】
配列番号７、８、９又は１３のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含むかそれからなるオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項３９】
請求項２１〜３７のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプライマーセットの、生物学的サンプル中の強毒型クロストリジウム ディフィシル株の存在を検出するための使用。
【請求項４０】
該生物学的サンプルが糞便サンプル又は食品サンプルであることを特徴とする、請求項３９に記載の使用。
【請求項４１】
生物学的サンプル中の強毒型クロストリジウム ディフィシル株を検出するためのキットであって、請求項２１〜３７のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプライマーセットと、核酸の増幅を行うための試薬とを含むキット。
【請求項４２】
該試薬がＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ及びバッファーからなる群より選ばれることを特徴とする、請求項４１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅に基づく診断アッセイの分野に関する。さらに詳しくは、本発明は、生物学的サンプル（たとえば糞便サンプル）中の強毒型クロストリジウム ディフィシル（Clostridium difficile）株、好ましくは毒素産生性クロストリジウム ディフィシル株０２７型リボタイプ、を検出するための、ＰＣＲに基づく方法を提供する。本発明は、強毒型クロストリジウム ディフィシル株の負のマーカーに特異的なオリゴヌクレオチドプライマー及びオリゴヌクレオチドプローブ並びに正のマーカーに特異的なオリゴヌクレオチドプライマー及びオリゴヌクレオチドプローブの使用に基づく。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ．ディフィシル（C. difficile）感染（ＣＤＩ）は、毒素媒介性の腸疾患である。ＣＤＩの臨床結果は、無症候性定着（無症候性保菌）から、重度の下痢、腹痛、発熱、白血球増加などのより重度の疾患症候群までにわたる。Ｃ．ディフィシルは、入院して抗生治療を受けた後の患者に発生する感染性下痢の主因であると認識されている。したがって、ＣＤＩは現在、医療関連感染症の最も重要なものの１つであると考えられている。さらに、Ｃ．ディフィシルの非院内関連の感染源も現れており、また、Ｃ．ディフィシルは動物宿主の間で広がることができる（Deneve et al., 2009; Rupnik et al, 2009）。
【０００３】
現在のＣ．ディフィシル検査方法には、細胞毒素産生培養法、Ｃ．ディフィシルによって産生される毒素Ａ及び毒素Ｂを検出する細胞毒性アッセイ（ＣＹＴ）、Ｃ．ディフィシルの tcdＢ 遺伝子を検出するためのＰＣＲに基づくアッセイ、Ｃ．ディフィシル特異的グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を検出するためのアッセイなどが含まれる（Eastwood et al., 2009）。
【０００４】
先行技術において、ＰＣＲに基づく検査は、Ｃ．ディフィシルを含むサンプルの迅速なスクリーニング及び同定のための、信頼できる、高感度で特異的な診断手段であることが判明している（Eastwood et al., 2009; Hirvonen et al., 2013; Houser et al., 2010 及び WO2012087135）。工業的には、WO2010116290（Philips）に開示された方法が用いられている。この方法は、細胞毒素遺伝子である tcdB 遺伝子の存在又は不存在及び tcdC 遺伝子における欠失を分析することによって毒素産生性Ｃ．ディフィシル株を検出するためのマルチプレックスＰＣＲアッセイに関する。
【０００５】
毒素産生性クロストリジウム ディフィシル株を検出するための、ＰＣＲに基づく数多くのアッセイが既に開示されているけれども、依然としてこの分野において、強毒型であるこれらのＣ．ディフィシル株の検出のための高い特異性及び信頼性を提供することができるＰＣＲアッセイが必要とされている。本発明者らは、この度、強毒型クロストリジウム ディフィシル株の負のマーカー及び正のマーカーの特異的で高感度の増幅に驚くべきほどよく適する、クロストリジウム ディフィシルゲノムのＤＮＡ配列領域の位置を突き止めた。
【０００６】
下痢の診断におけるサンプルマトリックスは一般に糞便サンプル又は食品サンプルであるが、このようなサンプルマトリックスは数多くのＰＣＲ阻害剤を含有する可能性が高い。それによりＰＣＲ反応の増幅効率が低下するので、アンプリコン設計段階から、更に注意深い最適化を行い、全てのテンプレートとコピー数が均等に且つ充分効率的に増幅されることを確認することが期待される。したがって、高いＰＣＲ効率（できる限り１００％に近いことが最適である）を可能にするオリゴヌクレオチド設計が必要である。用いられる検出方法も増幅効率及び／又は増幅の偏りに影響を与える可能性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、下痢性の強毒型クロストリジウム ディフィシル株を特異的且つ高感度に増幅及び定量するのに好適なＤＮＡ配列領域の位置を突き止めた。アンプリコンは、どんなマルチプレックスセットにおいても互いに組み合わせ可能である特異性を持つように設計した。当然、その前提条件として、開示する全てのアンプリコンはまた、同じ反応及びサイクル条件において増幅するように設計した。本発明の目的は、強毒型クロストリジウム ディフィシルのためのスクリーニング検査である抗原検査や培養に代えて、豊富な情報のまとまりを迅速に提供することによって実験室的及び臨床的利益のためのプロセス改善を提供して、患者管理の向上をもたらすことにある。さらに、もし臨床的微生物学実験室が非毒素産生性Ｃ．ディフィシルと強毒型Ｃ．ディフィシルとを容易に区別することができるのであれば、感染制御に役立ち得る。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の１つの目的は、生物学的サンプル中の強毒型クロストリジウム ディフィシル株の存在を検出するための方法であって、生物学的サンプルから抽出したＤＮＡをテンプレートとし、Ｃ．ディフィシル hydR 遺伝子中の標的配列の増幅に特異的な第１オリゴヌクレオチドプライマーセット（ただし、該 hydR 遺伝子は配列番号１の配列を有する）と、配列番号２のＣ．ディフィシル配列を有する標的配列の少なくとも一部の増幅に特異的な第２オリゴヌクレオチドプライマーセットとを用いる核酸増幅反応を行うことを特徴とする方法を提供することである。
【０００９】
本発明の別の１つの目的は、配列番号３のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含むかそれからなるオリゴヌクレオチドと、配列番号４のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含むかそれからなるオリゴヌクレオチドとを含み、Ｃ．ディフィシル hydR 遺伝子中の標的配列を増幅することを特徴とするオリゴヌクレオチドプライマーセットを提供することである。
【００１０】
本発明の別の１つの目的は、配列番号５のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含むかそれからなるオリゴヌクレオチドと、配列番号６のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含むかそれからなるオリゴヌクレオチドとを含み、Ｃ．ディフィシル ゲノム中の標的配列を増幅することを特徴とするオリゴヌクレオチドプライマーセットを提供することである。
【００１１】
本発明の別の１つの目的は、配列番号１１のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含むかそれからなるオリゴヌクレオチドと、配列番号１２のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含むかそれからなるオリゴヌクレオチドとを含み、Ｃ．ディフィシル tcdB 遺伝子中の標的配列を増幅することを特徴とするオリゴヌクレオチドプライマーセットを提供することである。
【００１２】
本発明の別の１つの目的は、生物学的サンプル中の強毒型クロストリジウム ディフィシル株を検出するためのキットであって、上記のオリゴヌクレオチドプライマーセットと、核酸増幅反応において核酸の増幅を行うための試薬とを含むキットを提供することである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の方法の目的は、強毒型Ｃ．ディフィシル及び再発性疾患に関連する０２７型リボタイプの定量的な同定のための主要な微生物学的スクリーニング検査として役立てることである。本発明の方法は、好ましくは、濃縮培養を用いず、生物学的サンプル（たとえば糞便サンプル）から直接抽出したＤＮＡを用いて行われる。本発明の方法は、好ましくは、強毒型クロストリジウム ディフィシルの検出及び同定に対応する核酸マーカーや毒素産生性０２７型リボタイプに選択的なマーカーの検出を目的とする、ＰＣＲに基づくＣ．ディフィシルアッセイ（たとえば、ｑＰＣＲ（定量ＰＣＲ）アッセイ、又は核酸に基づく定量マルチプレックス in vitro 診断検査）である。
【００１４】
本願明細書において、核酸サンプル中に存在する「標的配列」とは、「プライマー」によってプライムされ伸長されるＣ．ディフィシルＤＮＡの鎖を言う。標的配列は、一本鎖でもよいし、相補的な配列との二本鎖でもよい。本発明における標的配列は、本願明細書に記載される増幅反応の前に或る程度精製されることが好ましい。
【００１５】
本願明細書において、「オリゴヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ヌクレオ塩基、又は、ＤＮＡ増幅方法において試薬として用いる関連化合物（たとえば、プライマー及びプローブ）が、２個又は３個以上結合してなるポリマーを意味する。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡでもよいし、ＲＮＡでもよいし、それらのアナログでもよいし、これらのいずれか２つ以上の混合物でもよい。「オリゴヌクレオチド」という用語は、試薬としての特定の機能を有することを意味するものではなく、本願明細書に記載される試薬を総称的に表すものである。以下、本発明の特異的オリゴヌクレオチドについてさらに詳しく説明する。本願明細書において、オリゴヌクレオチドは、実質的にどんな長さのものであってもよく、単に、ＤＮＡ増幅反応における特異的な機能によって限定されるだけである。一定の配列と化学構造とを有するオリゴヌクレオチドは、当業者に知られている技術、たとえば、化学的・生化学的合成、組み換え核酸分子（細菌ベクター、ウイルスベクターなど）を用いた in vitro 発現又は in vivo 発現などの技術によって製造することができる。オリゴヌクレオチドは、その望ましい機能が損なわれない限り、どのような修飾を施してもよい。当業者は、本発明のオリゴヌクレオチドに施される修飾が適切ないし望ましいものであるかどうかを容易に判断することができる。修飾の例として、塩基修飾、糖修飾及び骨格修飾が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明のためのオリゴヌクレオチドの設計及び配列決定は、以下に説明する機能に応じてなされるものであるが、一般にはいくつかの変数を考慮しなければならない。これらの変数の中で最も重要なものは、長さ、Ｇ／Ｃ含有量、融解温度（Ｔｍ）、ギブス自由エネルギー（Ｇ）、特異性、自己相補性、系の中に存在する他のオリゴヌクレオチドとの相補性、ポリピリミジン伸長（Ｔ、Ｃの場合）又はポリプリン伸長（Ａ、Ｇの場合）、３'−末端配列、などである。上記の変数及び他の変数を制御することは、オリゴヌクレオチドの設計において標準的で周知な操作であって、容易に入手できる各種のコンピュータープログラムを用いて、候補としての多数のオリゴヌクレオチドのスクリーニングを行って最適のものを選び出すことができる。
【００１６】
本願明細書において、「ＰＣＲ反応」、「ＰＣＲ増幅をする」又は「ＰＣＲ増幅」という用語は、相補鎖にハイブリダイズするプライマーを用いた、サイクル的な、ポリメラーゼに媒介される核酸の指数関数的な増幅を総称するものである。これについては、たとえば、Innis et al, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990) を参照することができる。特定の波長の光線を放出することができる蛍光指示薬を含む組成物との熱サイクル反応を行い、蛍光色素の強度を読み取り、各サイクル後の蛍光強度を表示することができる装置が開発されている。増幅産物は、標的核酸配列又はその相補体との配列同一性を有する配列を含み、その検出は、たとえば、当該標的核酸配列又はその相補体の或る領域に対して特異性を有する挿入色素（intercalating dye）又は検出プローブを用いて行うことができる。本発明におけるＰＣＲ反応は、好ましくは、リアルタイムＰＣＲアッセイとして行う。
【００１７】
本願明細書において、「プローブ」という用語は、増幅の表示となるシグナル分子を意味する。このような分子は数多くあり、どのようなものでもよい。検出プローブの例として、SYBR（登録商標）Green や、他のＤＮＡ結合色素を挙げることができる。検出プローブは、配列に基づくプローブ（５'−ヌクレアーゼプローブなど）であってもよい。多様な検出プローブが当分野において知られており、例として、TaqMan（登録商標）プローブが挙げられる（米国特許第 5,538,848 号を参照）。プローブの融解温度（Ｔｍ）は、修飾ヌクレオチドの付加によって上昇させることができる。１つのプローブにおける修飾ヌクレオチドの数は、好ましくは１、２、３、４又は５以上である。修飾ヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオチド（Exiqon A/S）、小溝結合剤（MGB（登録商標））、超塩基（SuperBase）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、又は、プローブの融解温度（Ｔｍ）を上昇させる他の修飾物であってもよい。
【００１８】
当業者は、増幅される標的配列、即ちアンプリコンは、当然、関連する株の相互間で変異が存在することを知っている。この小さな変異は、本発明の方法において当該アンプリコンを増幅するのに適当なプライマーを設計する際に考慮することができる。好ましくは、配列番号１、２及び１０からなる群より選ばれる標的アンプリコンの各々において、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０又は１００ヌクレオチド長の配列が本発明の方法において増幅される。
【００１９】
好ましくは、プライマー及びプローブは、請求の範囲において定義される配列であって、そのヌクレオチド長は３０、３５、４０、４５、５０又は５５より小さい。さらに好ましくは、そのヌクレオチド長は５０より小さい。本発明のプライマー及びプローブの各々は、配列番号３〜９及び１１〜１３からなる群より選ばれるプライマー配列又はプローブ配列の任意のものの中の少なくとも１０、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個の連続したヌクレオチドからなるものであってもよいし、配列番号３〜９及び１１〜１３からなる群より選ばれる配列を含むものであってもよい。
【００２０】
本発明は、生物学的サンプル中の強毒型クロストリジウム ディフィシル株の存在を検出するための方法に関する。好ましくは、本発明の方法は、リアルタイムＰＣＲアッセイである。本発明の方法は、ＤＮＡチップ、ゲル電気泳動、放射線測定、蛍光測定又は燐光測定によって行うことができる。当業者は、本発明のプライマー及びプローブを、ＰＣＲ又は核酸増幅反応を利用する他の方法及びプラットフォームに用いてもよい。生物学的サンプルは、たとえば、糞便サンプル、環境サンプル又は食品サンプルであってよい。
【００２１】
本発明の方法は、生物学的サンプルから抽出したＤＮＡをテンプレートとし、Ｃ．ディフィシル hydR 遺伝子中の標的配列の増幅に特異的な第１オリゴヌクレオチドプライマーセット（ただし、該 hydR 遺伝子は配列番号１の配列を有する）と、配列番号２のＣ．ディフィシル配列を有する標的配列の少なくとも一部の増幅に特異的な第２オリゴヌクレオチドプライマーセットとを用いる核酸増幅反応を行う工程を含む。好ましくは、本発明の方法は、増幅される標的配列を検出することができる任意の方法を用いて生物学的サンプル中の強毒型クロストリジウム ディフィシル株の存在を検出する工程を含む。
【００２２】
サンプル中の強毒型クロストリジウム ディフィシル株は、第１オリゴヌクレオチドプライマーセットが特異的な産物を増幅せず、即ち、hydR 遺伝子中の標的配列が強毒型クロストリジウム ディフィシル株の負のマーカーであって、第２オリゴヌクレオチドプライマーセットが特異的な産物を増幅する、即ち、Ｃ．ディフィシル ゲノム中の、第２オリゴヌクレオチドプライマーセットによって標的とされる配列が強毒型クロストリジウム ディフィシル株の正のマーカーであるときに、検出される。
【００２３】
本発明の方法によって検出される最も重要な強毒型クロストリジウム ディフィシル株は、毒素産生性クロストリジウム ディフィシル株０２７型リボタイプである。したがって、本発明の方法は特に、このクロストリジウム ディフィシル株の検出に関する。しかし、サンプル中のＣ．ディフィシル hydR 遺伝子ＤＮＡの存在は、クロストリジウム ディフィシル株０２７型リボタイプが検査した当該サンプル中に存在しないこと、又は、毒素産生性クロストリジウム ディフィシル株０２７型リボタイプの存在に加えて別の種類のクロストリジウム ディフィシル株が当該サンプル中に存在することの指標である。しかし、当業者は、０２７型リボタイプ株には分類されない強毒型Ｃ．ディフィシル株があることを知っているので、本発明は強毒型０２７型リボタイプ類似のクロストリジウム ディフィシル株の検出にも関する。
【００２４】
好ましくは、第１オリゴヌクレオチドプライマーセットは、Ｃ．ディフィシル hydR 遺伝子を標的とし、配列番号１の配列を有する該 hydR 遺伝子を増幅し、この増幅反応において該配列の少なくとも一部が特異的に増幅される。さらに好ましくは、第１オリゴヌクレオチドプライマーセットは、配列番号３のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含むかそれからなるオリゴヌクレオチドと、配列番号４のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含むかそれからなるオリゴヌクレオチドとを含み、これらのオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号１の配列を有する該 hydR 配列の少なくとも一部を増幅する。最も好ましくは、第１オリゴヌクレオチドプライマーセットは、配列番号３のヌクレオチド配列を含むかそれからなるオリゴヌクレオチドと、配列番号４のヌクレオチド配列を含むかそれからなるオリゴヌクレオチドとを含む。
【００２５】
第１オリゴヌクレオチドプライマーセットにより増幅される標的配列の存在は、配列番号７のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含むかそれからなるプローブを用いて、好ましくは配列番号７のヌクレオチド配列を含むかそれからなるプローブを用いて、検出することができる。
【００２６】
Ｃ．ディフィシル ゲノム中の、第２オリゴヌクレオチドプライマーセットの標的配列は、推定接合トランスポゾン（conjugative transposon）ＤＮＡ組換えタンパク質をコードする遺伝子に対応する。好ましくは、第２オリゴヌクレオチドプライマーセットは、配列番号５のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含むかそれからなるオリゴヌクレオチドと、配列番号６のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含むかそれからなるオリゴヌクレオチドとを含む。さらに好ましくは、第２オリゴヌクレオチドプライマーセットは、配列番号５のヌクレオチド配列を含むかそれからなるオリゴヌクレオチドと、配列番号６のヌクレオチド配列を含むかそれからなるオリゴヌクレオチドとを含む。
【００２７】
第２オリゴヌクレオチドプライマーセットによって増幅される標的配列を検出するための、それぞれ配列番号８及び９のヌクレオチド配列を有するプローブは、競合プローブとして、それぞれ配列番号８及び９のヌクレオチド配列の第１２位に対応する位置におけるＣ．ディフィシル ゲノムのＧ／Ａ多型を検出するために同一反応において用いることができる。第２オリゴヌクレオチドプライマーセットにより増幅される標的配列の存在は、配列番号７のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含むかそれからなるプローブを用いて検出することができ、これによりＧ／Ａ多型が検出される。好ましくは、第２オリゴヌクレオチドプライマーセットにより増幅される標的配列は、配列番号８又は９のヌクレオチド配列を含むかそれからなるプローブを用いて検出される。
【００２８】
本発明における核酸増幅反応は、Ｃ．ディフィシル毒素Ｂ遺伝子（tcdB）の増幅に特異的な第３オリゴヌクレオチドプライマーセットをさらに含んでいてもよい。第３オリゴヌクレオチドプライマーセットは、配列番号１０のヌクレオチド領域の少なくとも一部を増幅する。
【００２９】
好ましくは、第３オリゴヌクレオチドプライマーセットは、配列番号１１のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含むかそれからなるオリゴヌクレオチドと、配列番号１２のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含むかそれからなるオリゴヌクレオチドとを含む。
【００３０】
さらに好ましくは、第３オリゴヌクレオチドプライマーセットは、配列番号１１のヌクレオチド配列を含むかそれからなるオリゴヌクレオチドと、配列番号１２のヌクレオチド配列を含むかそれからなるオリゴヌクレオチドとを含む。
【００３１】
第３オリゴヌクレオチドプライマーセットにより増幅される標的配列の存在は、配列番号１３のヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含むかそれからなるプローブを用いて、好ましくは配列番号１３のヌクレオチド配列を含むかそれからなるプライマーを用いて、検出される。
【００３２】
本発明はまた、オリゴヌクレオチドプライマーセット、即ち、上記の第１、第２又は第３オリゴヌクレオチドプライマーセット又はそれらの組合せを構成するものとして定義されたオリゴヌクレオチドプライマーの集合にも関する。オリゴヌクレオチドプライマーセットは、当該プライマーセットとともに用いるものとして定義されたプローブを含んでいてよい。本発明はまた、これらのオリゴヌクレオチドプライマーセットの、生物学的サンプル（たとえば、糞便サンプル又は食品サンプル）中の強毒型クロストリジウム ディフィシル株の存在を検出するための使用にも関する。
【００３３】
本発明はまた、生物学的サンプル中の強毒型クロストリジウム ディフィシル株を検出するためのキットを提供する。本発明のキットは、上記のオリゴヌクレオチドプライマーセットと、核酸の増幅を行うための試薬とを含んでよい。好ましくは、試薬はＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ及びバッファーからなる群より選ばれる。
【００３４】
本発明の別の１つの態様は、修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプライマー及びオリゴヌクレオチドプローブを用いた、生物学的サンプル中の強毒型クロストリジウム ディフィシル株の存在を検出するための方法である。通常、修飾ヌクレオチドの使用は、特異性を損なうことなくオリゴヌクレオチドプライマー又はオリゴヌクレオチドプローブを短くすることができる。１つのプライマー又はプローブにおける修飾ヌクレオチドの数は、好ましくは１、２、３、４又は５以上である。修飾ヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオチド（Exiqon A/S）、小溝結合剤（MGB（登録商標））、超塩基（SuperBase）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、又は、当該オリゴヌクレオチドに対して同一の効果を与えるヌクレオチド修飾を有する修飾ヌクレオチドであってもよい。この方法は、上記の又は請求の範囲に記載した方法と実質的に同一の工程を含むが、少なくとも１つの修飾プライマー又は修飾プローブを用いて行う。この方法において用いるプライマー及びプローブの例は、以下のものである。
プライマーペアー１（hydR 遺伝子の検出のためのもの）：配列番号３の配列を有するプライマーと配列番号４の配列を有するプライマー。対応するプローブは、配列番号７の配列を有する。
プライマーペアー２（推定接合トランスポゾン（pct）の検出のためのもの）：配列番号５の配列を有するプライマーと配列番号６の配列を有するプライマー。対応するプローブは、CTG TAG ATT TCG GTA CGA（配列番号１４）という配列を有する（下線を付したヌクレオチドは、ＬＮＡなどの修飾ヌクレオチドである）。
プライマーペアー３（tcdB 遺伝子の検出のためのもの）：配列番号１１の配列を有するプライマーと配列番号１２の配列を有するプライマー。対応するプローブは、配列番号１３の配列を有する。
【００３５】
したがって、当業者は、上記のうち任意のプライマー又はプローブの長さを、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを用いて同様の方法で短くすることができることを理解する。
【００３６】
本発明の背景を説明するために（特に、本発明の実施に関して追加的な詳細を提供するために）本願明細書で用いられた刊行物及び他の資料は、言及によって本願明細書に組み入れられたものとする。以下の実施例において本発明をさらに説明するが、実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【００３７】
実験
【実施例１】
【００３８】
この実施例では、本発明のアッセイを用いて、毒素産生性Ｃ．ディフィシル株と非毒素産生性Ｃ．ディフィシル株の両方を検出した。異なる３７種類のリボタイプを代表する合計４８個の特徴付けされたサンプルを試験した。この試験では、０２７型リボタイプ及びそれと遺伝的に非常に近縁のリボタイプを排除した。
【００３９】
このアッセイは、標的パネル（表１）を増幅する１つのマルチプレックスＰＣＲ反応を含む。毒素産生性Ｃ．ディフィシル株の同定と強毒型Ｃ．ディフィシル株の識別は、以下のマーカーの組合せの検出に基づく。毒素マーカー：tcdB 遺伝子は毒素Ｂをコードする。０２７型リボタイプの負のマーカー：hydR 遺伝子は TetR ファミリーの転写制御タンパク質をコードする。０２７リボタイプ型の正のマーカー：pct 遺伝子は、推定接合トランスポゾンＤＮＡ組換えタンパク質をコードする。プライマーとプローブは表９に定義される。
【００４０】
Ｃ．ディフィシルのアッセイは、種々の異なる毒素産生性Ｃ．ディフィシル株について正の結果を与え、また、非毒素産生性Ｃ．ディフィシル株については負の結果を与えるはずである。包括性（inclusivity）（分析的反応性（analytical reactivity））をテストして、パネルに含まれる標的間の潜在的な遺伝的変異を説明する。この実施例は、よく特徴付けされた株を用いるＣ．ディフィシルｑＰＣＲ（定量ＰＣＲ）アッセイの包括性の結果を記述する。
【００４１】
【表１】
2017538434.tif 000002
【００４２】
材料と方法
１．１    標的細菌株のリスト
Ｃ．ディフィシルのアッセイは胃腸感染症を引き起こす病原体をカバーする。非毒素産生性Ｃ．ディフィシルと毒素Ｂ産生性Ｃ．ディフィシルとをカバーするこの包括性研究では、異なる３７種類のリボタイプを代表する合計４８個の特徴付けされたサンプルを試験した。細菌株のリストを表２に示す。この試験では、０２７型リボタイプ及び遺伝的にそれと非常に近縁のリボタイプを排除した。
【００４３】
細菌株は商業的に利用可能なバイオバンク（ATCC、DSMZ、及び Microbiologics 社）から収集した。ＤＮＡサンプルは１００ｎｇ／μｌ未満の濃度で試験した。
【００４４】
【表２】
2017538434.tif 000003
【００４５】
１．２    試薬と機器
定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）試薬：
qPCR Mastermix（Mobidiag 社製）
Ｃ．ディフィシル定量ＰＣＲ用プライマーとプローブからなるアッセイ混合物
【００４６】
装置：
Stratagene MxPro 3000
【００４７】
ＰＣＲセットアップ：
反応用液において：
１０μｌ ２× Mastermix
５μｌ ４× Primer mix
５μｌサンプル／陽性対照（pos. control）DNA mix／ＤＮＡ抽出対照／Ｈ２Ｏ
（合計量は２０μｌ）
ＰＣＲプログラム
2017538434.tif 000004
【００４８】
結果
【００４９】
【表３】
2017538434.tif 000005
【００５０】
対照の相関性
−  正の対照は陽性として検出される
−  負の対照は陰性として検出される
−  内部増幅対照（Internal Amplification Control）は全てのサンプルで検出される
【００５１】
結論
３９個の毒素産生性株は、全て正しく「ＴｏｘＢ＋」と同定された。９個の非毒素産生性株は、全て正しく「Negative」（「陰性」）と同定された。誤って「０２７型リボタイプ」として同定された株（ＴｏｘＢ＋、ｐｃｔ＋、ｈｙｄＲ−）は無かった。
対照は予想通りに同定され、結果の信頼性が裏付けられた。
【実施例２】
【００５２】
この実施例では、０２７型リボタイプを識別する本発明の機能を試験した。０２７型リボタイプと遺伝的に非常に近縁のリボタイプ（０１６型リボタイプと１７６型リボタイプ）をサンプルに含めた。
【００５３】
材料と方法
ＤＮＡ抽出
単離されたＣ．ディフィシルのＤＮＡを以下のようにして抽出した。
細菌株培養物のコロニーを１×ＰＢＳバッファーに最終濃度約１．５×１０８ＣＦＵ／ｍｌ（参照：マクファーランド標準濁度０．５）で懸濁させた。１００μｌの細菌株懸濁液をオフボード（off-board）の細胞溶解工程に付した後、NucliSENS EasyMAG 装置（bioMerieux 社製）を製造者の Generic 2.0.1 program 用プロトコルに従って用いてＤＮＡの自動化抽出を行った。ＤＮＡを１００μｌの溶出バッファーに溶出した。抽出系列には抽出対照（Extraction Control）、即ち、Ｃ．ディフィシル（非毒素産生性株）を含めた。
【００５４】
リアルタイムＰＣＲと分析
ＰＣＲ反応を実施例１と同様に行った。内部増幅対照、正のＰＣＲ対照、及び負のＰＣＲ対照を試験系列に含めた。
【００５５】
合計で１８個の異なる０２７型リボタイプ株、１個の０１６型リボタイプ株、及び１個の１７６型リボタイプ株を試験した。
【００５６】
【表４】
2017538434.tif 000006
【００５７】
このアッセーは、１８個の異なる０２７型リボタイプ株の全てを正しく陽性に同定し、また、０１６型リボタイプ株と１７６型リボタイプ株を陽性に同定した。こうして、このアッセーは、０２７型リボタイプ株を０２７＋（陽性）に同定したことに加えて、それと遺伝的に近縁である０１６型リボタイプ株と１７６型リボタイプ株を検出した。
【実施例３】
【００５８】
この実施例では、本発明の方法を、０２７型リボタイプ陽性と推定されるＣ．ディフィシルを検出するための従来技術の方法と比較した。本発明のアッセイを Xpert C. difficile/Epi 試験（Cepheid 社）と比較した。
【００５９】
Xpert C. difficile/Epi 試験（Cepheid 社）は、tcdC 遺伝子中の欠失を検出して０２７型リボタイプ陽性推定と判定する。
【００６０】
合計で１１個の異なる株（１１個の異なるリボタイプを代表する）を両者の方法で試験し、結果を比較した。
【００６１】
【表５】
2017538434.tif 000007
【００６２】
試験された株には０２７型リボタイプは含まれなかったにもかかわらず、Xpert C. difficile/Epi 試験では、５個の株が毒素産生性Ｃ．ディフィシル陽性、０２７型リボタイプ陽性推定と判定された。これら５つの株のうち、本発明の方法で０２７型リボタイプ陽性と判定されたのは２個だけであり、先行技術の方法に比べて０２７型リボタイプと非０２７型リボタイプの識別効果が向上していることが示された。なお、これら２個の株（０１６型リボタイプ株と１７６型リボタイプ株）は強毒型Ｃ．ディフィシルと近縁性が高いことが知られている（Knetsch et al., 2011）。
【００６３】
本発明におけるマーカーを同定した結果、予想通り、９個の株が、ＴｏｘＢ＋（ＴｏｘＢ陽性）と正しく判定され、０２７＋（０２７型陽性）とは判定されなかった。まとめると、０２７型陰性の推定に関して、本発明のアッセイでは、９／１１個の株が正しく０２７−（０２７型陰性）と同定され、一方、Xpert C. difficile/Epi 試験では、６／１１個の株が正しく０２７−（０２７型陰性）と同定された。
【実施例４】
【００６４】
本発明の方法の作業工程は、糞便サンプルからの核酸の抽出（NucliSens easyMAG）、リアルタイムＰＣＲ増幅、及び標遺伝子領域の検出、並びに結果の分析からなる。
【００６５】
この実施例では、毒素産生性Ｃ．ディフィシルの異なる複数株を糞便バックグラウンドにおけるスパイク サンプルとして試験した。合計３５個の異なる株を用いた。各株をＣ．ディフィシルについて陰性の糞便サンプルにスパイク添加した。糞便サンプルからＤＮＡを抽出して、表６−１と表６−２に示すように、株の濃度が７．５ＣＦＵ／反応用液又は７５ＣＦＵ／反応用液となるように定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）反応用液を作製した。全てのサンプルを２回の反応で試験した。
【００６６】
結果として、全てのケースで株が正しく陽性と同定された。
【００６７】
【表６−１】
2017538434.tif 000008
【００６８】
【表６−２】
2017538434.tif 000009
【実施例５】
【００６９】
この実施例では、交差反応によりＣ．ディフィシルの定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）アッセイの結果に生じる潜在的な偽陽性についての研究結果を述べる。この計画アッセイのためのサンプル材料は糞便サンプルである。したがって、胃腸感染に関連する病原体（細菌、ウイルス、及び寄生生物）で、アッセイパネルでカバーされていないものは、潜在的な交差反応を引き起こし得る。また、片利共生フローラに含まれる細菌も交差反応する可能性がある。さらに、アッセイ標的パネルに含まれる病原体を交差反応研究に含める理由は、標的病原体のみが検出されるべきであり、他の標的との間の交差反応は起きるべきではないからである。
【００７０】
材料と方法
試薬、装置、及びサンプル
定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）試薬：
qPCR Mastermix (MM)（Mobidiag 社製）
Ｃ．ディフィシル定量ＰＣＲ用プライマーとプローブからなるアッセイ混合物（表９を参照）
【００７１】
装置：
Stratagene Mxp 3000
【００７２】
ＰＣＲセットアップ：
反応用液において：
１０μｌ ２× MM
５μｌ ４× Primer mix
５μｌサンプル／陽性対照（Pos. Control）DNA mix／Ｈ２Ｏ
（合計量は２０μｌ）
陽性対照（Pos. Control）＝テンプレート混合物
2017538434.tif 000010
【００７３】
サンプル：
１２７種類の病原体から抽出したＤＮＡ（又はＲＮＡ）。株は、主に、商業的に利用可能なバイオバンク（ATCC、DSMZ、Microbiologics 社、Qnostics 社、及び Vircell 社）から収集した。一部の株は、Mobidiag 社のバイオバンクから取得したもので、これらの株は、元々は患者サンプルから精製し、ＨＵＳＬＡＢ（ヘルシンキ大学中央病院研究所（Helsinki University central hospital laboratory））で特徴付けされたものである。
ＤＮＡの定量は、16S rRNA アッセイ又は NanoDrop で行った。
【００７４】
【表７−１】
2017538434.tif 000011
【００７５】
【表７−２】
2017538434.tif 000012
【００７６】
【表７−３】
2017538434.tif 000013
【００７７】
対照の相関性
−  正の対照は陽性として検出された
−  負の対照は陰性として検出された
【００７８】
結果
交差反応性試験では偽陽性は示されなかった。
【００７９】
【表８】
2017538434.tif 000014
【００８０】
【表９】
2017538434.tif 000015
【００８１】
文献
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2017538434.tif 000017
2017538434.tif 000018
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