(57)【要約】【課題】骨肉腫を患う被験体のニーズを満たす。【解決手段】本発明は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原を発現する腫瘍に対して免疫応答を誘発する方法、ならびに放射線療法と組み換え型弱毒化リステリア株ワクチンとを併用して、ヒトおよびイヌの被験体において上記腫瘍を治療し、該腫瘍のワクチンを接種する方法を提供する。【選択図】図３０
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体におけるＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍増殖またはガンを治療する方法であって、
放射線療法と併用して、追加的なポリペプチドに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含みかつ代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含むような核酸を含む組み換え型弱毒化リステリア株を投与するステップを含み、
前記代謝酵素が、前記組み換え型弱毒化リステリア株の染色体内の突然変異した内因性遺伝子を相補し、
前記放射線療法の投与が、該放射線療法の少なくとも２回の投与を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原が、配列番号：２に示される配列によりコードされることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記被験体が、ヒトの大人または子どもであることを特徴とする請求項１〜２に記載の方法。
【請求項４】
前記被験体が、イヌであることを特徴とする請求項１〜２に記載の方法。
【請求項５】
前記ＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原が、マッピングされたヒトＭＨＣクラスＩエピトープのうちの少なくとも５、９、１３、１４、または１７を含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原が、イヌＭＨＣクラスＩエピトープのうちの少なくとも５、９、１３、１４、または１７を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸分子が、前記リステリアゲノムに組み込まれることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記核酸分子が前記組み換え型弱毒化リステリア株の中のプラスミドの中にあり、かつ前記プラスミドが、抗生物質選択がない場合に前記組み換え型弱毒化リステリア株の中に安定して維持されることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記組み換え型リステリアが、前記ａｃｔＡ病毒性遺伝子内に欠失を含むことを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記追加的なポリペプチドが、ａ）非溶血性ＬＬＯタンパク質もしくはＮ末端断片、ｂ）ＰＥＳＴ配列、またはｃ）ＡｃｔＡ断片からなる群から選択されることを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記第２のオープンリーディングフレームによってコードされる前記代謝酵素が、アラニン・ラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記放射線療法が、前記組み換え型弱毒化リステリア株の投与よりも前に施されることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記放射線療法が、２日連続で各々８Ｇｙ、合計１６Ｇｙにて施されることを特徴とする請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記組み換え型弱毒化リステリア株が、ＡＤＸＳ３１−１６４であることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記組み換え型弱毒化リステリア株が、１回の投与あたり３．３×１０９ＣＦＵの用量で複数回投与されることを特徴とする請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記組み換え型弱毒化リステリア株が、３週ごとに１回ないし最大で８回投与されることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ブースター処理を施すステップをさらに含むことを特徴とする請求項１５〜１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ブースター処理を２ヶ月ごとに施すことを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記組み換え型弱毒化リステリア株が、独立したアジュバントと共に投与され、
前記アジュバントが、顆粒球性／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンＱＳ２１、モノホスホリルリピドＡ、またはメチル化されていないＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記腫瘍増殖またはガンが、再燃または転移であることを特徴とする請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ガンが、骨肉腫であることを特徴とする請求項１〜２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記転移が、肺の転移性疾患であることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
被験体におけるＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍増殖またはガンに対する強化した免疫応答を引き出す方法であって、
放射線療法と併用して、追加的なポリペプチドに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含みかつ代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含むような核酸を含む組み換え型弱毒化リステリア株を投与するステップを含み、
前記代謝酵素が、前記組み換え型弱毒化リステリア株の染色体内の突然変異した内因性遺伝子を相補し、
前記放射線療法の投与が、前記放射線療法の少なくとも２回の投与を含むことを特徴とする方法。
【請求項２４】
前記ＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原が、配列番号：２に示される配列によりコードされることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記被験体が、ヒトの大人または子どもであることを特徴とする請求項２３〜２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記被験体が、イヌであることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原が、マッピングされたヒトＭＨＣクラスＩエピトープのうちの少なくとも５、９、１３、１４、または１７を含むことを特徴とする請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原が、イヌＭＨＣクラスＩエピトープのうちの少なくとも５、９、１３、１４、または１７を含むことを特徴とする請求項２３または２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記核酸分子が、前記リステリアゲノムに組み込まれることを特徴とする請求項２３〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記核酸分子が、前記組み換え型リステリア株の中のプラスミドの中にあり、かつ前記プラスミドが、抗生物質選択がない場合に前記組み換え型弱毒化リステリア株の中に安定して維持されることを特徴とする請求項２３〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記組み換え型リステリアが、前記ａｃｔＡ病毒性遺伝子内に欠失を含むことを特徴とする請求項２３〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記追加的なポリペプチドが、ａ）非溶血性ＬＬＯタンパク質もしくはＮ末端断片、ｂ）ＰＥＳＴ配列、またはｃ）ＡｃｔＡ断片からなる群から選択されることを特徴とする請求項２３〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記第２のオープンリーディングフレームによってコードされる前記代謝酵素が、アラニン・ラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素であることを特徴とする請求項２３〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記放射線療法が、前記組み換え型弱毒化リステリア株の投与よりも前に施されることを特徴とする請求項２３〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記放射線療法が、２日連続で各々８Ｇｙ、合計１６Ｇｙにて施されることを特徴とする請求項２３〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記組み換え型弱毒化リステリア株が、ＡＤＸＳ３１−１６４であることを特徴とする請求項２３〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記組み換え型弱毒化リステリア株が、１回の投与あたり３．３×１０９ＣＦＵの用量で複数回投与されることを特徴とする請求項２３〜３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記組み換え型弱毒化リステリア株が、３週ごとに１回ないし最大で８回投与されることを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ブースター処理を施すステップをさらに含むことを特徴とする請求項３７〜３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ブースター処理を２ヶ月ごとに施すことを特徴とする請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記組み換え型弱毒化リステリア株が、独立したアジュバントと共に投与され、
前記アジュバントが、顆粒球性／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンＱＳ２１、モノホスホリルリピドＡ、またはメチル化されていないＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項２３〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記腫瘍増殖またはガンが、再燃または転移であることを特徴とする請求項２３〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記ガンが、骨肉腫であることを特徴とする請求項２３〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記転移が、肺の転移性疾患であることを特徴とする請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記強化免疫応答を引き出すステップが、結果としてＨＥＲ２／ｎｅｕに特異的なＴ細胞応答の増加をもたらすことを特徴とする請求項２３〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
ＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍増殖またはガンを患う被験体の生存を延長させる方法であって、
放射線療法と併用して、追加的なポリペプチドに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームおよび代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組み換え型弱毒化リステリア株を投与するステップを含み、
前記代謝酵素が、前記組み換え型弱毒化リステリア株の染色体内の突然変異した内因性遺伝子を相補し、
前記放射線療法の投与が、該放射線療法の少なくとも２回の投与を含むことを特徴とする方法。
【請求項４７】
前記ＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原が、配列番号：２に示される配列によりコードされることを特徴とする請求法４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記ヒトの被験体が、大人または子どもであることを特徴とする請求項４６または４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記被験体が、イヌであることを特徴とする請求項４６または４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記ＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原が、マッピングされたヒトＭＨＣクラスＩエピトープのうちの少なくとも５、９、１３、１４、または１７を含むヒトキメラ型ＨＥＲ２／ｎｅｕであることを特徴とする請求項４６〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原が、イヌＭＨＣクラスＩエピトープのうちの少なくとも５、９、１３、１４、または１７を含むことを特徴とする請求項４６に記載の方法。
【請求項５２】
前記核酸分子が、前記リステリアゲノムに組み込まれることを特徴とする請求項４６〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記核酸分子が、前記組み換え型弱毒化リステリア株の中のプラスミドの中にあり、かつ前記プラスミドが、抗生物質選択がない場合に前記組み換え型弱毒化リステリア株の中に安定して維持されることを特徴とする請求項４６〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記組み換え型リステリアが、前記ａｃｔＡ病毒性遺伝子内に欠失を含むことを特徴とする請求項４６〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記追加的なポリペプチドが、ａ）非溶血性ＬＬＯタンパク質もしくはＮ末端断片、ｂ）ＰＥＳＴ配列、またはｃ）ＡｃｔＡ断片からなる群から選択されることを特徴とする請求項４６〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記第２のオープンリーディングフレームによってコードされる前記代謝酵素が、アラニン・ラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素であることを特徴とする請求項４６〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記放射線療法が、前記組み換え型弱毒化リステリア株の投与よりも前に施されることを特徴とする請求項４６〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記放射線療法を２日連続で各々８Ｇｙ、合計１６Ｇｙにて施されることを特徴とする請求項４６〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記組み換え型弱毒化リステリア株が、ＡＤＸＳ３１−１６４であることを特徴とする請求項４６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記組み換え型弱毒化リステリア株が、１回の投与あたり３．３×１０９ＣＦＵの用量で複数回投与される、請求項４６〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記組み換え型弱毒化リステリア株が、３週ごとに１回ないし最大で８回投与されることを特徴とする請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
ブースター処理を施すステップをさらに含むことを特徴とする請求項６０〜６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記ブースター処理を２ヶ月ごとに施すことを特徴とする請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記組み換え型弱毒化リステリア株が、独立したアジュバントと共に投与され、
前記アジュバントが、顆粒球性／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンＱＳ２１、モノホスホリルリピドＡ、またはメチル化されていないＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項４６〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記腫瘍増殖またはガンが、再燃または転移であることを特徴とする請求項４６〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記ガンが、骨肉腫であることを特徴とする請求項４６〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記転移が、肺の転移性疾患であることを特徴とする請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
ＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍増殖またはガンを患う被験体における転移性疾患を遅延する方法であって、
放射線療法と併用して、追加的なポリペプチドに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームおよび代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組み換え型弱毒化リステリア株を投与するステップを含み、
前記代謝酵素が、前記組み換え型弱毒化リステリア株の前記染色体内の突然変異した内因性遺伝子を相補し、
前記放射線療法の投与が、該放射線療法の少なくとも２回の投与を含むことを特徴とする方法。
【請求項６９】
前記ＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原が、配列番号：２に示される配列によりコードされることを特徴とする請求法６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記ヒトの被験体が、大人または子どもであることを特徴とする請求項６８または６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記被験体が、イヌであることを特徴とする請求項６８または６９に記載の方法。
【請求項７２】
前記ＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原が、マッピングされたヒトＭＨＣクラスＩエピトープのうちの少なくとも５、９、１３、１４、または１７を含むことを特徴とする請求項６８〜７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記ＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原が、イヌＭＨＣクラスＩエピトープのうちの少なくとも５、９、１３、１４、または１７を含むことを特徴とする請求項６８に記載の方法。
【請求項７４】
前記核酸分子が、前記リステリアゲノムに組み込まれることを特徴とする請求項６８〜７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記核酸分子が、前記組み換え型弱毒化リステリア株の中のプラスミドの中にあり、かつ前記プラスミドが、抗生物質選択がない場合に前記組み換え型リステリア株の中に安定して維持されることを特徴とする請求項６８〜７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記組み換え型リステリアが、前記ａｃｔＡ病毒性遺伝子内に欠失を含むことを特徴とする請求項６８〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記追加的なポリペプチドが、ａ）非溶血性ＬＬＯタンパク質もしくはＮ末端断片、ｂ）ＰＥＳＴ配列、またはｃ）ＡｃｔＡ断片からなる群から選択されることを特徴とする請求項６８〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記第２のオープンリーディングフレームによってコードされる前記代謝酵素が、アラニン・ラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素であることを特徴とする請求項６８〜７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記放射線療法が、前記組み換え型弱毒化リステリア株の投与よりも前に施されることを特徴とする請求項６８〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記放射線療法を２日連続で各々８Ｇｙ、合計１６Ｇｙにて施されることを特徴とする請求項６８〜７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
前記組み換え型弱毒化リステリア株が、ＡＤＸＳ３１−１６４であることを特徴とする請求項６８〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
前記組み換え型弱毒化リステリア株が、１回の投与あたり３．３×１０９ＣＦＵの用量で複数回投与されることを特徴とする請求項６８〜８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
前記組み換え型弱毒化リステリア株が、３週ごとに１回ないし最大で８回投与されることを特徴とする請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
ブースター処理を施すステップをさらに含むことを特徴とする請求項８２または８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記ブースター処理を２ヶ月ごとに施すことを特徴とする請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記組み換え型弱毒化リステリア株が、独立したアジュバントと共に投与され、
前記アジュバントが、顆粒球性／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンＱＳ２１、モノホスホリルリピドＡ、またはメチル化されていないＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項６８〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
前記腫瘍増殖またはガンが、再燃または転移であることを特徴とする請求項６８〜８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
前記ガンが、骨肉腫であることを特徴とする請求項６８〜８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記転移が、肺の転移性疾患であることを特徴とする請求項８８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原を発現する腫瘍に対して免疫応答を誘発する方法、ならびに放射線療法および組み換え型弱毒化リステリア株ワクチンを併用して、ヒトおよびイヌの被験体において当該腫瘍を治療し、該腫瘍のワクチンを接種する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＥＲ２／ｎｅｕ（これ以降、「Ｈｅｒ−２」と呼ぶ。）は、チロシンキナーゼの上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーのメンバーである１８５ｋＤａの糖タンパク質であり、全ての乳ガンの２５〜４０％、並びに多くの骨ガン（骨肉腫―ＯＳＡ）、卵巣ガン、肺ガン、膵臓ガン、脳および胃腸管のガンにおいて過剰発現する。Ｈｅｒ−２を過剰発現するガンを有する患者は、Ｈｅｒ−２に対して向けられた検出可能な体液性のＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＣＤ４＋Ｔ細胞応答にさえも耐性を示す。
【０００３】
大型犬は、組織学的不均質性、侵攻性局所疾病、および早期の転移を含む小児科のＯＳＡの数多くの態様を反復するＯＳＡを自発的に発生する。診断では、９５％の犬が微小転移性疾患を有し、切断術および化学療法にも関わらず、平均生存期間は１０ヶ月であり、ほとんどの犬は進行性の転移性疾患により安楽死させられる。転移性骨肉腫を有するヒトの患者の全生存は、部位および転移巣の数にもよるが、１０〜５０％の範囲である。
【０００４】
腫瘍細胞を破壊するかまたは腫瘍／間質構造を変化させるために使用される放射線療法（ＲＴ）は、多くの種類のガンの治療の不可欠な部分である。しかしながら、ＯＳＡは放射線療法の標準要領に放射線抵抗性であるので、ＲＴはＯＳＡの治療には使用されていない。
【０００５】
最近では、ＲＴが標的免疫療法との相乗作用を与えることできることが証明されている。例えば、ＲＴは免疫原性細胞死を誘発するが、このとき腫瘍細胞は、免疫系による死細胞の排除に繋がるアポトーシス、ネクローシスおよび／または有糸分裂の破局からゆっくりと時間をかけて死ぬ。これは、順番に、免疫療法のための腫瘍抗原の潜在的な供給源として機能する。ＲＴはまた、細胞死受容体、腫瘍関連抗原および接着分子の腫瘍細胞表面発現を調節するが、それは腫瘍細胞を免疫媒介死滅に対してより感染しやすくする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、明確に定義された減衰機構を有しかつ抗生物質選択マーカーを欠いているＬｍｄｄＡ−ＨＥＲ２／ｎｅｕワクチンベクターを用いて生成される組み換え型リステリアワクチン（ＡＤＸＳ３１−１６４）と併用した場合に放射線療法が骨肉腫および肺転移に対して特に有効であるというという驚くべき知見を以て、ＯＳＡを患う被験体のニーズを満たす。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一実施形態では、本発明は、被験体におけるＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍増殖またはガンを治療する方法であって、放射線療法と併用して、追加的なポリペプチドに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームおよび代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組み換え型弱毒化リステリアを投与するステップを含み、代謝酵素が、組み換え型弱毒化リステリア株の染色体内の突然変異した内因性遺伝子を相補し、放射線療法の投与が、該放射線療法の少なくとも２回の投与を含むような方法を提供する。
【０００８】
別の実施形態では、本発明は、被験体におけるＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍増殖またはガンに対する強化した免疫応答を引き出す方法であって、放射線療法と併用して、追加的なポリペプチドに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームおよび代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組み換え型弱毒化リステリアを投与するステップを含み、代謝酵素が、組み換え型弱毒化リステリア株の染色体内の突然変異した内因性遺伝子を相補し、放射線療法の投与が、該放射線療法の少なくとも２回の投与を含むような方法を提供する。
【０００９】
別の実施形態では、本発明は、ＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍増殖またはガンを患う被験体の生存を延長させる方法であって、放射線療法と併用して、追加的なポリペプチドに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームおよび代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組み換え型弱毒化リステリアを投与するステップを含み、代謝酵素が、組み換え型弱毒化リステリア株の染色体内の突然変異した内因性遺伝子を相補し、放射線療法の投与が、該放射線療法の少なくとも２回の投与を含むような方法を提供する。
【００１０】
別の実施形態では、本発明は、ＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍増殖またはガンを患う被験体における転移性疾患を遅延する方法であって、放射線療法と併用して、追加的なポリペプチドに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームおよび代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組み換え型弱毒化リステリアを投与するステップを含み、代謝酵素が、組み換え型弱毒化リステリア株の染色体内の突然変異した内因性遺伝子を相補し、放射線療法の投与が、該放射線療法の少なくとも２回の投与を含むような方法を提供する。
【００１１】
別の実施形態では、本発明は、ＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍増殖またはガンを患う被験体におけるＨｅｒ２−ｎｅｕへの耐性を破壊する方法であって、放射線療法と併用して、追加的なアジュバントに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームおよび代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組み換え型弱毒化リステリアを投与するステップを含み、代謝酵素が、組み換え型弱毒化リステリア株の染色体内の突然変異した内因性遺伝子を相補し、放射線療法の投与が、該放射線療法の少なくとも２回の投与を含む方法を提供する。
【００１２】
一実施形態では、被験体はヒトである。一実施形態では、ヒトの被験体は子どもである。別の実施形態では、ヒトの被験体は大人である。別の実施形態では、被験体はイヌ科の動物である。
【００１３】
別の実施形態では、融合ポリペプチドを被験体に投与することは、腫瘍内のエスケープ変異を防止する。
【００１４】
別の実施形態では、ＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原は、マッピングされたヒトのＭＨＣクラスＩエピトープのうちの少なくとも５、９、１３、１４、または１７を含む。別の実施形態では、ＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原は、マッピングされたイヌのＭＨＣクラスＩエピトープのうちの少なくとも５、９、１３、１４、または１７を含む。
【００１５】
一実施形態では、核酸分子はリステリアゲノムの中へと組み込まれる。別の実施形態では、核酸分子が組み換え型リステリアワクチン株の中のプラスミドの中にあり、かつプラスミドは、抗生物質選択がない場合に組み換え型リステリアワクチン株の中に安定して維持される。
【００１６】
一実施形態では、組み換え型リステリアは、ａｃｔＡ病原性遺伝子を欠いている。一実施形態では、追加的なポリペプチドは、ａ）非溶血性ＬＬＯタンパク質もしくはＮ末端断片、ｂ）ＰＥＳＴ配列、またはｃ）ＡｃｔＡ断片からなる群から選択される。一実施形態では、第２のオープンリーディングフレームによってコードされる代謝酵素は、アラニン・ラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である。本発明のいくつかの実施形態では、組み換え型弱毒化リステリア株は、ＡＤＸＳ３１−１６４である。
【００１７】
一実施形態では、組み換え型弱毒化リステリア株は、独立したアジュバントと共に投与され、アジュバントは、一実施形態では、顆粒球性／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンＱＳ２１、モノホスホリルリピドＡ、またはメチル化されていないＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含む。
【００１８】
一実施形態では、ガンは骨肉腫（ＯＳＡ）である。別の実施形態では、ガンまたは腫瘍は肺の転移性疾患である。一実施形態では、投与は組み換え型弱毒化リステリア株の少なくとも２回の投与を含む。一実施形態では、放射線療法の投与は、該放射線療法の少なくとも２回の投与を含む。一実施形態では、放射線療法と本明細書に記載のＡＤＸＳ３１−１６４の投与とを含む併用療法が本明細書に提供される。一実施形態では、放射線療法は、組み換え型弱毒化リステリア株の投与よりも前に施された。
【００１９】
別の実施形態では、被験体は、放射線療法および組み換え型弱毒化リステリア株の投与よりも前に、切断術を経験しなかった。別の実施形態では、本発明の方法はさらに、放射線療法および、被験体における再発または転移（一実施形態では肺の転移性疾患である）に続く組み換え型弱毒化リステリア株の投与を含む。
【００２０】
一実施形態では、本発明の方法は、被験体の全生存の上昇をもたらす。別の実施形態では、本発明の方法は、被験体における転移性疾患の遅延をもたらす。別の実施形態では、本発明の方法は、ＨＥＲ２／ｎｅｕに特異的なＴ細胞応答の増加をもたらす。別の実施形態では、強化した免疫応答の誘発は、被験体の全生存の増加をもたらす。別の実施形態では、前記強化した免疫応答の誘発は、被験体における転移性疾患の遅延をもたらす。一実施形態では、転移性疾患は肺の転移性疾患である。別の実施形態では、強化免疫応答の誘発は、ＨＥＲ２／ｎｅｕに特異的なＴ細胞応答の増加をもたらす。
【００２１】
本発明に関する主題は、本明細書の結論部分に特定的に指摘され、かつ明瞭に主張されている。しかしながら、本発明の構成および運用方法の両方については、その目的、特徴、および利点とともに、添付図面とともに読んだとき、以下の発明を実施するための形態を参照することによって最も良好に理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１Ａ】ＡＤＸＳ３１−１６４の構築。構造性のリステリアｐ６０プロモータの制御下で、ＬｍｄｄＡ株内の染色体のｄａｌ−ｄａｔ欠失の相補のために、バシラスサチリスｄａｌ遺伝子を寄生するｐＡｄｖ１６４のプラスミドマップ。これは、Ｈｅｒ２／ｎｅｕの３つの断片：ＥＣ１（ａａ  ４０−１７０）、ＥＣ２（ａａ  ３５９−５１８）およびＩＣＩ（ａａ  ６７９−８０８）の直接融合によって構造化された、切断ＬＬＯ（１−４４１）のキメラ型ヒトＨｅｒ２／ｎｅｕ遺伝子への融合も含有する。右側のベクターの概略図は、切断ＬＬＯに融合したヒトＨＥＲ２／ｎｅｕの２つの細胞外領域および１つの細胞内領域から構成されるキメラ型ＨＥＲ２／ｎｅｕ融合タンパク質を発現するｐＡｄｖ１６４の詳細を示す。プラスミドはｄａｌ遺伝子の栄養要求性相補によって組み換え型ｄａｌ／ｄａｔ／ａｃｔＡ−リステリア株（ＬｍｄｄＡ）内に維持される（実施例を参照）。
【図１Ｂ】ＡＤＸＳ３１−１６４の構築。抗ＬＬＯ抗体でブロットしたＴＣＡ沈殿した細胞培養上清のウエスタンブロット解析によって、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２（Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８）およびＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２（ＡＤＸＳ３１−１６４）内でｔＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２の発現および分泌が検出された。〜１０４ＫＤの差を示す帯はｔＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２に対応する。内因性のＬＬＯは、５８ＫＤ帯として検出される。リステリア対照はＣｈＨｅｒ２発現を欠いている。
【図２Ａ】ＡＤＸＳ３１−１６４の免疫原性特性。ＮＴ−２細胞を刺激薬として使用し、かつ３Ｔ３／ｎｅｕ細胞を標的として使用して、免疫化マウスからの脾細胞内でＨＥＲ２／ｎｅｕリステリアベースのワクチンによって引き出された細胞毒性Ｔ細胞応答を試験した。Ｌｍ−対照は、すべてのやり方で同一であるが、無関連の抗原（ＨＰＶ１６−Ｅ７）が発現される、ＬｍｄｄＡバックグラウンドに基づく。各データ点は、３回のデータ±標準誤差の平均であった。＊Ｐ値＜０．００１。
【図２Ｂ】ＡＤＸＳ３１−１６４の免疫原性特性。脾細胞によって免疫化ＦＶＢ／Ｎマウスから細胞培地の中へと分泌されたＩＦＮ−γが、ＮＴ−２細胞によって処置されたマイトマイシンＣを用いたインビトロの刺激の２４時間後、ＥＬＩＳＡによって測定された。各データ点は、３回のデータ±標準誤差の平均であった。＊Ｐ値＜０．００１。
【図２Ｃ】ＡＤＸＳ３１−１６４の免疫原性特性。インビトロでのタンパク質の異なる領域からのペプチドを用いたインキュベーションに応答する、キメラワクチンを用いて免疫化したＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスからの脾細胞によるＩＦＮ−γ分泌。図の凡例にリスト表示したように、組み換え型ＣｈＨｅｒ２タンパク質がポジティブコントロールとして使用され、無関連ペプチドまたはペプチドを含まない群がネガティブコントロールを構成要素とした。コインキュベーションの７２時間後に採取した細胞培養上清を使用するＥＬＩＳＡアッセイによって、ＩＦＮ−γ分泌が検出された。各データ点は、３回のデータ±標準誤差の平均であった。＊Ｐ値＜０．００１。
【図３】リステリア−ＣｈＨＥＲ２／ｎｅｕワクチンのための腫瘍防止研究。ＨＥＲ２／ｎｅｕトランスジェニックマウスに各々組み換え型リステリア−ＣｈＨｅｒ２または対照リステリアワクチンを６回注射した。生後６週で免疫化を開始し、２１週目まで３週ごとに継続した。腫瘍の外観を毎週観察して、腫瘍を有しないマウスのパーセンテージで表現した。＊ｐ＜０．０５、１群当たりＮ＝９。
【図４】脾臓中のＴｒｅｇの％で示したＡＤＸＳ３１−１６４を用いた免疫化の効果。ＦＶＢ／Ｎマウスに１×１０６ＮＴ−２細胞を用いて皮下で接種し、各々のワクチンを用いて一週間間隔で３回免疫化した。第２の免疫化の７日後、脾臓を採取した。免疫細胞の分離後、Ｔｒｅｇの検出のためにこれらを抗ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２５、およびＦｏｘＰ３抗体によって染色した。代表的な実験からのＴｒｅｇのドットプロットは、異なる治療群の間での全ＣＤ３＋またはＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するパーセンテージとして表されるＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の頻度を示す。
【図５Ａ】ＮＴ−２腫瘍内の腫瘍浸潤Ｔｒｅｇの％で示したＡＤＸＳ３１−１６４を用いた免疫化の効果。ＦＶＢ／Ｎマウスに１×１０６ＮＴ−２細胞を用いて皮下で接種し、各々のワクチンを用いて１週間間隔で３回免疫化した。第２の免疫化の７日後に腫瘍を採取した。免疫細胞の分離後、Ｔｒｅｇの検出のために、抗ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２５、およびＦｏｘＰ３抗体によってこれらを染色した。代表的な実験からのＴｒｅｇのドットプロット。データは、２つの独立した実験から得られた平均±ＳＥＭとして示す。
【図５Ｂ】ＮＴ−２腫瘍内の腫瘍浸潤Ｔｒｅｇの％で示したＡＤＸＳ３１−１６４を用いた免疫化の効果。異なる投与群にわたって全ＣＤ３＋またはＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞（左のパネル）、および腫瘍内のＣＤ８／Ｔｒｅｇ比（右のパネル）に対するパーセンテージとして表される、ＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の頻度。データは、２つの独立した実験から得られた平均±ＳＥＭとして示す。
【図６Ａ】Ｂａｌｂ／ｃマウスにＡＤＸＳ３１−１６４または対照リステリアワクチンを用いて３回免疫化した。ＥＭＴ６−Ｌｕｃ細胞（５，０００）を麻酔をかけたマウスの頭蓋内に注射した。示された日にＸｅｎｏｇｅｎ  Ｘ−１００  ＣＣＤカメラを使用してマウスのエクスビボ撮像を遂行した。
【図６Ｂ】ＡＤＸＳ３１−１６４を用いたワクチン接種は乳ガン細胞株の脳内での増殖を遅延することができる。ピクセルの輝度は、１秒当たり表面積１ｃｍ２当たりの光子数としてグラフ表示され、平均放射輝度として提示される。
【図６Ｃ】ＡＤＸＳ３１−１６４を用いたワクチン接種は乳ガン細胞株の脳内での増殖を遅延することができる。ウエスタンブロットによって、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体を使用して、ＥＭＴ６−Ｌｕｃ細胞、４Ｔ１−Ｌｕｃ、およびＮＴ−２細胞株によるＨＥＲ２／ｎｅｕの発現が検出された。Ｊ７７４．Ａ２細胞、マウスのマクロファージ様細胞株をネガティブコントロールとして使用した。
【図７】ＡＤＸＳ３１−１６４でワクチン接種し、続いて切断術および化学療法を施した最初の１８のイヌ骨肉腫の患者を示す。
【図８】ＡＤＸＳ３１−１６４の投与がＡ）拡張型心筋症の初期の証拠を生じないことを示す。Ｂ）シーケンシャル心筋トロポニンＩレベルを、大多数のイヌについての研究機関を通して、正常範囲内にレベルが留まることを示す研究の過程で評価した。一時的に上昇した心筋トロポニンＩレベルを有する一匹のイヌは、これらの値が緩やかに上昇した時点で注意をひかない心電図を有したことに留意すべきである（図２６Ｄを参照）。
【図９】ＡＤＸＳ３１−１６４に関連する、Ａ）体温および、Ｂ）収縮期血圧の変化を示す。ベースラインおよびＡＤＸＳ３１−１６４投与後２時間ごとの体温および収縮期血圧を記録した。各々のイヌに対する各々のワクチン接種でのパラメータが表示される。水平のバーは各々の時点における各々の投与群でのすべてのイヌの中央値を示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５。
【図１０】切断術および化学療法無しの原発性四肢骨肉腫の状況におけるＡＤＸＳ３１−１６４および緩和放射線療法（ＲＴ）の組み合わせ（併用）による治療のスケジュールを示す。
【図１１】上のパネル：骨肉腫と関連する上腕骨近位端の骨折の存在を示す放射線写真および２枚の骨プレートおよび髄内ピンを使用した骨折固定の後に撮影された放射線写真。下のパネル：組み入れ時、転移性疾患の証拠を示さない胸部のＣＴスキャン。また、放射線写真をベースライン時点および８回のＡＤＸＳ−３１−１６４投与後に撮った。これらの放射線写真は、肺の転移性疾患の証拠を示さず、および骨肉腫の存在にも関わらず、骨折治癒を示す骨折部位を囲む骨カルスの存在を示す。
【図１２】四肢骨肉腫を有する、四肢の切断術およびフォローアップ化学療法を受けたイヌで治療的に効果的な抗腫瘍免疫性を引き出すためにＡＤＸＳ３１−１６４を発現するＬ．モノサイトゲネス組み換え型の安全性および有効性を評価するための試験段階Ｉ臨床試験のタイムライン。
【図１３Ａ】ＡＤＸＳ−３１−１６４投与に続く、治療に関連する有害事象を示す。
【図１３Ｂ】ＡＤＸＳ−３１−１６４投与に続く、治療に関連する生存曲線を示す。試験に組み入れた時点で転移性疾患を有していないすべてのイヌを示す。四肢の切断術を受け、それに続いてカルボプラチン単独またはカルボプラチンに加えてアドリアマイシンを受けた対照群のイヌ。２匹のイヌは関係のない原因で死んだため（１匹のイヌは誤嚥性肺炎で死に、もう一匹は腎芽細胞腫で死んだ）、ワクチン群から打ち切りにされた。ワクチン接種した群  赤い線、対照群  黒い線。
【図１４】ＡおよびＢからなり、ヒト（Ａ）およびイヌ（Ｂ）の患者での原発性および転移性骨肉腫（ＯＳＡ）の放射線写真の画像を示す。両方の種で、原発病巣は骨幹端での増殖および溶解の区域（Ａの中の矢印）によって特徴付けられる。
【図１５】フェーズＩの、ＨＥＲ２＋骨肉腫（ＯＳＡ）を有するイヌでのＡＤＸＳ３１−１６４の安全性および有効性を評価するための３＋３臨床試験の概略図である。自発性ＨＥＲ２＋四肢ＯＳＡに罹患した個人所有のイヌが標準的である治療切断、およびフォローアップのカルボプラチン化学療法を受けた。最後のカルボプラチン投与の３週間後、２×１０８、５×１０８、１×１０９、または３．３×１０９ＣＦＵのいずれかのＡＤＸＳ３１−１６４を用いてイヌに静脈内でワクチン接種した（３週間おきに３回のワクチン接種）。転移性疾患を防止するうえでのワクチンの有効性を決定するために、死ぬまで２か月ごとにイヌを再ステージングした。
【図１６】Ａ〜Ｃからなり、イヌの原発性骨肉腫におけるＨＥＲ２／ｎｅｕ発現を示す。（Ａ）悪性骨芽細胞および類骨沈着の病巣を示すイヌからの原発性ＯＳＡのＨ＆Ｅ染色。（Ｂ）イヌの原発性ＯＳＡの免疫組織化学的評価は悪性骨芽細胞内のＨＥＲ２／ｎｅｕ発現を示す。（Ｃ）ＨＥＲ２／ｎｅｕの発現のばらつきを示す、５匹の個人所有のイヌからの原発性ＯＳＡサンプルのウエスタンブロット。ポジティブコントロールは：ヒトの乳ガン細胞株ＭＣＦ−７、およびイヌの乳ガン細胞株ＣＡＭＡＣ２。
【図１７】Ａ〜Ｄからなり、ベースラインおよびＡＤＸＳ３１−１６４投与後２４時間の時点での血液学的数値。各々の投与群内のすべてのイヌからの各々のワクチン接種前および後の値を平均した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５。白血球および好中球の計数（Ａ〜Ｂ）では、ＡＤＸＳ３１−１６４投与の２４時間後に生じた一時的だが統計的に有意な増加を示し、また血小板およびリンパ球の一時的な減少が付随して起きた（Ｃ〜Ｄ）。
【図１８】ＡＤＸＳ３１−１６４は、生存と相関する白血球（ＷＢＣ）、好中球、および単球の計数の増加を誘発した。ＷＢＣ、好中球、および単球の数をベースラインおよびワクチン接種の２４時間後に測定した。各々のワクチン接種に引き続いてパーセント増加を計算し、各々のイヌについて平均した。（Ａ）生存（死または生）によって結果を表示した。（Ｂ）受容したＡＤＸＳ３１−１６４投与量によって結果を表示した。水平のバーは群の中央値を表す。
【図１９】ＡＤＸＳ３１−１６４によって誘発されるＨｅｒ−２に特異的なＴ細胞応答のＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔによる評価の結果を示す。
【図２０】ＡおよびＢからなり、Ｈｅｒ−２に特異的な免疫性を刺激する繰返し「ブースター」ワクチン接種を示す。（Ａ）患者２８９−００３に対する結果を示す。（Ｂ）患者２８９−００４に対する結果を示す。ＥＣ１、ＥＣ２、およびＩＣ１はＨＥＲ２／ｎｅｕポリペプチドのペプチド断片を表す。
【図２１】ＡおよびＢからなり、Ａは転移までの時間（ＴＴＭ）、ＢはＯＳＡ特異的な生存についてのカプラン・マイヤー推定値である。
【図２２】Ａ〜Ｌからなり、ＡＤＸＳ３１−１６４が転移性疾患の発生を防止することを示す。（ＡおよびＢ）カルボプラチン療法の３週間後（Ａ）、および第３のＡＤＸＳ３１−１６４ワクチンの３週間後（Ｂ）に撮った胸部放射線写真。右肺中葉内の前から存在する転移性結節のサイズの増加を示すが、残りの肺葉内ではさらなる転移性疾患の発生を欠いている。（ＣおよびＤ）ＩＣＧの投与に引き続いて近赤外光の下で蛍光を発する、胸腔鏡検査で識別される肺結節（Ｃ）。近赤外光の下で蛍光を示す転移巣切除のときに取り出した大幅な正常な外見の肺組織（差し込み図）（Ｄ）。（ＥおよびＦ）Ｈ＆Ｅ染色した肺結節（Ｅ）および蛍光を発する正常な肺組織（Ｆ）の病理組織。封入された肺結節（Ｅ）および大幅に正常な外見の肺組織内の炎症の巣状地域（Ｆ）の著しい出血および壊死を示す。（ＧおよびＨ）組織内の最小限のＣＤ３＋Ｔ細胞で肺結節を取り囲むＣＤ３＋Ｔ細胞を示す低倍率（Ｇ）および高倍率（Ｈ）の肺結節の免疫組織化学。（ＩおよびＪ）ＣＤ３＋Ｔ細胞の巣状滞留を示す、正常な外見の肺組織の低倍率（Ｉ）および高倍率（Ｊ）の免疫組織化学。（Ｋ）リンパ球によって包囲された有糸分裂像を有する大きい異常細胞を示す巣状肺炎の高倍率のＨ＆Ｅ染色。（Ｌ）単核細胞によって取り囲まれた有糸分裂像を有する大きいビメンチン陽性細胞を示す肺炎の領域のビメンチン染色。
【図２３】ＡＤＸＳ３１−１６４は転移性疾患を遅延／防止し、自発性ＨＥＲ２＋骨肉腫を有するイヌの全生存を長持ちさせる。ワクチン接種したイヌのカプラン−マイヤー生存率曲線を歴史的な対照群と比較して示す。対照群は、切断術を用いて治療され、フォローアップ化学療法を受けたがＡＤＸＳ３１−１６４を受けていない、ＨＥＲ２＋四肢ＯＳＡに罹患したイヌから成る。Ｐ＜０．０００１。ワクチン接種した群  赤い線、対照群  黒い線。
【図２４】ＡＤＸＳ３１−１６４がＨＥＲ２／ｎｅｕに対する耐性を破壊することを示す。第３のワクチンの３週間後（９週目）および２か月後（１７週目）にＰＢＭＣをベースライン収集し、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔによってＨＥＲ２／ｎｅｕの高度に保存されたＩＣ１領域に対する応答について解析した。結果は、応答の早いもの、応答の遅いもの、および明らかな応答の無いものにイヌを分けて示した。適用外はこれらのイヌに対する１７週目のサンプルがまだ評価されていないことを示す。
【図２５Ａ】ＡＤＸＳ３１−１６４が心臓の機能に有害な影響を及ぼすことが無いことを示す。心臓のパラメータＬＶＩＤ（拡張期）を各々のイヌについてベースライン、ワクチン接種時、およびその後２か月ごとに評価した。
【図２５Ｂ】ＡＤＸＳ３１−１６４が心臓の機能に有害な影響を及ぼすことが無いことを示す。ＬＶＩＤ（収縮期）を各々のイヌについてベースライン、ワクチン接種時、およびその後２か月ごとに評価した。
【図２５Ｃ】ＡＤＸＳ３１−１６４が心臓の機能に有害な影響を及ぼすことが無いことを示す。短縮率を各々のイヌについてベースライン、ワクチン接種時、およびその後２か月ごとに評価した。
【図２５Ｄ】ＡＤＸＳ３１−１６４が心臓の機能に有害な影響を及ぼすことが無いことを示す。心筋トロポニンＩレベルを同じ時点で評価した。
【図２６】ＡＤＸＳ３１−１６４がＨＥＲ２／ｎｅｕの高度に保存された細胞内領域への免疫寛容を破壊することを示す。
【図２７Ａ】放射線療法とＡＤＸＳ３１−１６４療法の併用が、被験体３８６−００２における原発性骨肉腫（ＯＳＡ）の進行を遅延させることを示す。
【図２７Ｂ】放射線療法とＡＤＸＳ３１−１６４療法の併用が、被験体３８５−００５における原発性骨肉腫（ＯＳＡ）の進行を遅延させることを示す。
【図２７Ｃ】放射線療法とＡＤＸＳ３１−１６４療法の併用が、被験体３８６−００３における原発性骨肉腫（ＯＳＡ）の進行を遅延させることを示す。
【図２７Ｄ】放射線療法とＡＤＸＳ３１−１６４療法の併用が、被験体３８６−００７における原発性骨肉腫（ＯＳＡ）の進行を遅延させることを示す。
【図２８Ａ】一般的な活動を妨害する痛みを有する被験体における疼痛質問表の結果を示す。
【図２８Ｂ】歩行能力を妨害する痛みを有する被験体における疼痛質問表の結果を示す。
【図２８Ｃ】人生を楽しむことを妨害する痛みを有する被験体における疼痛質問表の結果を示す。
【図２９Ａ】緩和放射線療法とＡＤＸＳ３１−１６４療法の併用が、溶解を減少し、腫瘍の地固めを促進し、被験体の生存を延長する。マーキングされた皮質骨リモデリングおよび１６Ｇｙの放射線（２０１４年９月１３日に開始し２日連続で８Ｇｙとして与えられる）ならびにＡＤＸＳ３１−１６４の３回の投与（２０１４年１１月２５日）に続く、溶解の減少を実証する遠位脛骨骨肉腫障害の側面（図２９Ａ）および前後方向（図２９Ｃ）の放射線写真の視野である。
【図２９Ｂ】緩和放射線療法とＡＤＸＳ３１−１６４療法の併用が、溶解を減少し、腫瘍の地固めを促進し、被験体の生存を延長する。１６Ｇｙの放射線（２０１４年７月１６日に開始し２日連続で８Ｇｙとして与えられる）ならびにＡＤＸＳ３１−１６４の３回の投与（２０１４年１０月１３日）により治療される遠位脛骨骨肉腫障害の側面の放射線写真の視野である。橈骨遠位部内の腫れおよび骨の溶解における有意な減少に留意のこと（図２９Ｂの２０１４年７月１６日付けと２０１４年１０月１３日付けの放射線写真を比較のこと）。
【図２９Ｃ】緩和放射線療法とＡＤＸＳ３１−１６４療法の併用が、溶解を減少し、腫瘍の地固めを促進し、被験体の生存を延長する。マーキングされた皮質骨リモデリングおよび１６Ｇｙの放射線（２０１４年９月１３日に開始し２日連続で８Ｇｙとして与えられる）ならびにＡＤＸＳ３１−１６４の３回の投与（２０１４年１１月２５日）に続く、溶解の減少を実証する遠位脛骨骨肉腫障害の前後方向の放射線写真の視野である。
【図２９Ｄ】緩和放射線療法とＡＤＸＳ３１−１６４療法の併用が、溶解を減少し、腫瘍の地固めを促進し、被験体の生存を延長する。１６Ｇｙの放射線（２０１４年７月１６日に開始し２日連続で８Ｇｙとして与えられる）ならびにＡＤＸＳ３１−１６４の３回の投与（２０１４年１０月１３日）により治療される遠位脛骨骨肉腫障害の前後方向の放射線写真の視野である。遠位脛骨の内側部の増加した骨密度がある（図２９Ｄの２０１４年７月１６日付けと２０１４年１０月１３日付けの放射線写真を比較のこと）。図２９Ｄの２０１４年１０月１３日付けの放射線写真に見られる橈骨遠位部の内側面の小さな最小限の変位骨折がある。
【図３０】ＡおよびＢからなり、放射線療法とＡＤＸＳ３１−１６４の併用が、骨肉腫（ＯＳＡ）を有するイヌの生存を延長することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
図示の単純化および明瞭化のために図に示される要素は必ずしも実寸に比例していないことを理解されたい。例えば、一部の要素の寸法は、明瞭化のために他の要素に対して相対的に誇張されている場合がある。さらに、適切と考えられる場合には、参照番号は対応するかまたは類似する要素を示す図の間で繰り返される場合がある。
【００２４】
以下の発明を実施するための形態では、本発明の完全な理解を提供するために多数の具体的な詳細が示される。しかしながら、本発明はこれらの具体的な詳細を含まずに実施されてもよいことが当業者によって理解されるであろう。他の事例では、本発明を不明瞭にしないために周知の方法、手順、および構成成分は詳細には記述されていない。
【００２５】
一実施形態では、本発明は、被験体における腫瘍増殖またはガンを治療する方法であって、放射線療法と併用して、追加的なポリペプチドに融合した腫瘍特異的抗原を含む融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組み換え型弱毒化リステリア株を投与するステップを含むような方法を提供する。
【００２６】
一実施形態では、本発明は、被験体における腫瘍増殖またはガンを防止する方法であって、放射線療法と併用して、追加的なポリペプチドに融合した腫瘍特異的抗原を含む融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組み換え型弱毒化リステリア株を投与するステップを含むような方法を提供する。
【００２７】
一実施形態では、本発明は、被験体におけるＨｅｒ２−ｎｅｕ抗原の準優占エピトープに対する強化した免疫応答を引き出す方法であって、放射線療法と併用して、追加的なポリペプチドに融合した腫瘍特異的抗原を含む融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組み換え型弱毒化リステリア株を投与するステップを含むような方法を提供する。
【００２８】
一実施形態では、本発明は、腫瘍増殖またはガンを患う被験体の生存を延長させる方法であって、放射線療法と併用して、追加的なポリペプチドに融合した腫瘍特異的抗原を含む融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組み換え型弱毒化リステリア株を投与するステップを含むような方法を提供する。
【００２９】
一実施形態では、本発明は、腫瘍増殖またはガンを患う被験体における転移性疾患を遅延する方法であって、放射線療法と併用して、追加的なポリペプチドに融合した腫瘍特異的抗原を含む融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組み換え型弱毒化リステリア株を投与するステップを含むような方法を提供する。
【００３０】
一実施形態では、本発明は、腫瘍特異的抗原を発現する腫瘍増殖またはガンを患う被験体における腫瘍特異的抗原への耐性を破壊する方法であって、放射線療法と併用して、追加的なポリペプチドに融合した腫瘍特異的抗原を含む融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組み換え型弱毒化リステリア株を投与するステップを含むような方法を提供する。
【００３１】
一実施形態では、腫瘍特異抗原はＨＥＲ２／ｎｅｕである。
【００３２】
一実施形態では、本発明は、被験体内でＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍増殖またはガンを治療する方法であって、放射線療法と併用して、追加的なポリペプチドに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組み換え型弱毒化リステリアを投与するステップを含むような方法を提供する。
【００３３】
一実施形態では、本発明は、被験体内でＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍増殖またはガンを防止する方法であって、放射線療法と併用して、追加的なポリペプチドに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組み換え型弱毒化リステリアを投与するステップを含むような方法を提供する。
【００３４】
別の実施形態では、本発明は、被験体内でＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍増殖またはガンに対する強化した免疫応答を引き出す方法であって、放射線療法と併用して、追加的なポリペプチドに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組み換え型弱毒化リステリアを投与するステップを含むような方法を提供する。
【００３５】
別の実施形態では、本発明は、ＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍増殖またはガンを患う被験体の生存を延長させる方法であって、放射線療法と併用して、追加的なポリペプチドに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組み換え型リステリアを投与するステップを含むような方法を提供する。
【００３６】
別の実施形態では、本発明は、ＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍増殖またはガンを患う被験体における転移性疾患を遅延する方法であって、放射線療法と併用して、追加的なポリペプチドに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組み換え型リステリアを投与するステップを含むような方法を提供する。
【００３７】
別の実施形態では、本発明は、ＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍増殖またはガンを患う被験体におけるＨｅｒ２−ｎｅｕへの耐性を破壊する方法であって、放射線療法と併用して、追加的なアジュバントに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組み換え型リステリアを投与するステップを含むような方法を提供する。
【００３８】
一実施形態では、組み換え型弱毒化リステリア株は、代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含み、代謝酵素は、組み換え型リステリア株の染色体内の突然変異した内因性遺伝子を相補する。
【００３９】
一実施形態では、本発明は、被験体におけるＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍増殖またはガンを治療する方法であって、放射線療法と併用して、追加的なポリペプチドに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組み換え型弱毒化リステリアを投与するステップを含み、核酸が代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含み、代謝酵素が組み換え型弱毒化リステリア株の染色体内の突然変異した内因性遺伝子を相補するような方法を提供する。
【００４０】
一実施形態では、本発明は、被験体におけるＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍増殖またはガンを防止する方法であって、放射線療法と併用して、追加的なポリペプチドに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組み換え型弱毒化リステリアを投与するステップを含み、核酸が代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含み、代謝酵素が組み換え型弱毒化リステリア株の染色体内の突然変異した内因性遺伝子を相補するような方法を提供する。
【００４１】
別の実施形態では、本発明は、被験体におけるＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍増殖またはガンに対する強化した免疫応答を引き出す方法であって、放射線療法と併用して、追加的なポリペプチドに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組み換え型弱毒化リステリアを投与するステップを含み、核酸が代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含み、代謝酵素が組み換え型弱毒化リステリア株の染色体内の突然変異した内因性遺伝子を相補するような方法を提供する。
【００４２】
別の実施形態では、本発明は、ＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍増殖またはガンを患う被験体の生存を延長させる方法であって、放射線療法と併用して、追加的なポリペプチドに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組み換え型弱毒化リステリアを投与するステップを含み、核酸が代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含み、代謝酵素が組み換え型弱毒化リステリア株の染色体内の突然変異した内因性遺伝子を相補するような方法を提供する。
【００４３】
別の実施形態では、本発明は、ＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍増殖またはガンを患う被験体における転移性疾患を遅延する方法であって、放射線療法と併用して、追加的なポリペプチドに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組み換え型弱毒化リステリアを投与するステップを含み、核酸分子が代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含み、代謝酵素が組み換え型弱毒化リステリア株の染色体内の突然変異した内因性遺伝子を相補するような方法を提供する。
【００４４】
別の実施形態では、本発明は、ＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍増殖またはガンを患う被験体におけるＨｅｒ２−ｎｅｕへの耐性を破壊する方法であって、放射線療法と併用して、追加的なアジュバントに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組み換え型弱毒化リステリアを投与するステップを含み、核酸が代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含み、代謝酵素が組み換え型弱毒化リステリア株の染色体内の突然変異した内因性遺伝子を相補するような方法を提供する。
【００４５】
一実施形態では、放射線療法の投与は、該放射線療法の少なくとも２回の投与を含む。
【００４６】
一実施形態では、本発明は、被験体におけるＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍増殖またはガンを治療する方法であって、放射線療法と併用して、追加的なポリペプチドに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組み換え型弱毒化リステリアを投与するステップを含み、核酸が代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含み、代謝酵素が組み換え型弱毒化リステリア株の染色体内の突然変異した内因性遺伝子を相補し、かつ放射線療法の投与が該放射線療法の少なくとも２回の投与を含むような方法を提供する。
【００４７】
別の実施形態では、本発明は、被験体におけるＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍増殖またはガンに対する強化した免疫応答を引き出す方法であって、放射線療法と併用して、追加的なポリペプチドに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組み換え型弱毒化リステリアを投与するステップを含み、核酸が代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含み、代謝酵素が組み換え型弱毒化リステリア株の染色体内の突然変異した内因性遺伝子を相補し、かつ放射線療法の投与が該放射線療法の少なくとも２回の投与を含むような方法を提供する。
【００４８】
別の実施形態では、本発明は、ＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍増殖またはガンを患う被験体の生存を延長させる方法であって、放射線療法と併用して、追加的なポリペプチドに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組み換え型弱毒化リステリアを投与するステップを含み、核酸が代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含み、代謝酵素が組み換え型弱毒化リステリア株の染色体内の突然変異した内因性遺伝子を相補し、かつ放射線療法の投与が該放射線療法の少なくとも２回の投与を含むような方法を提供する。
【００４９】
別の実施形態では、本発明は、ＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍増殖またはガンを患う被験体における転移性疾患を遅延する方法であって、放射線療法と併用して、追加的なポリペプチドに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームおよび代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組み換え型弱毒化リステリアを投与するステップを含み、代謝酵素が組み換え型弱毒化リステリア株の染色体内の突然変異した内因性遺伝子を相補し、放射線療法の投与が該放射線療法の少なくとも２回の投与を含むような方法を提供する。
【００５０】
別の実施形態では、本発明は、ＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍増殖またはガンを患う被験体におけるＨｅｒ２−ｎｅｕへの耐性を破壊する方法であって、放射線療法と併用して、追加的なアジュバントに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームおよび代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組み換え型弱毒化リステリアを投与するステップを含み、代謝酵素が組み換え型弱毒化リステリア株の染色体内の突然変異した内因性遺伝子を相補し、放射線療法の投与が該放射線療法の少なくとも２回の投与を含むような方法を提供する。
【００５１】
一実施形態では、被験体はヒトである。一実施形態では、ヒトの被験体は子どもである。別の実施形態では、ヒトの被験体は大人である。
【００５２】
一実施形態では、本発明は、ヒトの被験体におけるＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍増殖またはガンを治療する方法であって、放射線療法と併用して、追加的なポリペプチドに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームおよび代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組み換え型弱毒化リステリアを投与するステップを含み、代謝酵素が組み換え型弱毒化リステリア株の染色体内の突然変異した内因性遺伝子を相補するような方法を提供する。
【００５３】
一実施形態では、本発明は、ヒトの被験体におけるＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍増殖またはガンを防止する方法であって、放射線療法と併用して、追加的なポリペプチドに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームおよび代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組み換え型弱毒化リステリアを投与するステップを含み、代謝酵素が組み換え型弱毒化リステリア株の染色体内の突然変異した内因性遺伝子を相補するような方法を提供する。
【００５４】
別の実施形態では、本発明は、ヒトの被験体におけるＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍増殖またはガンに対する強化した免疫応答を引き出す方法であって、放射線療法と併用して、追加的なポリペプチドに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームおよび代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組み換え型弱毒化リステリアを投与するステップを含み、代謝酵素が組み換え型弱毒化リステリア株の染色体内の突然変異した内因性遺伝子を相補するような方法を提供する。
【００５５】
別の実施形態では、本発明は、ＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍増殖またはガンを患うヒトの被験体の生存を延長させる方法であって、放射線療法と併用して、追加的なポリペプチドに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームおよび代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組み換え型弱毒化リステリアを投与するステップを含み、代謝酵素が組み換え型弱毒化リステリア株の染色体内の突然変異した内因性遺伝子を相補するような方法を提供する。
【００５６】
別の実施形態では、本発明は、ＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍増殖またはガンを患うヒトの被験体における転移性疾患を遅延する方法であって、放射線療法と併用して、追加的なポリペプチドに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームおよび代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組み換え型弱毒化リステリアを投与するステップを含み、代謝酵素が組み換え型弱毒化リステリア株の染色体内の突然変異した内因性遺伝子を相補するような方法を提供する。
【００５７】
別の実施形態では、本発明は、ＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍増殖またはガンを患うヒトの被験体におけるＨｅｒ２−ｎｅｕへの耐性を破壊する方法であって、放射線療法と併用して、追加的なアジュバントに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームおよび代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組み換え型弱毒化リステリアを投与するステップを含み、代謝酵素が組み換え型弱毒化リステリア株の染色体内の突然変異した内因性遺伝子を相補するような方法を提供する。
【００５８】
別の実施形態では、被験体はイヌ科の動物である。一実施形態では、イヌ科の動物はイヌである。
【００５９】
一実施形態では、本発明は、イヌの被験体におけるＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍増殖またはガンを治療する方法であって、放射線療法と併用して、追加的なポリペプチドに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームおよび代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組み換え型弱毒化リステリアを投与するステップを含み、代謝酵素が組み換え型弱毒化リステリア株の染色体内の突然変異した内因性遺伝子を相補するような方法を提供する。
【００６０】
一実施形態では、本発明は、イヌの被験体におけるＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍増殖またはガンを防止する方法であって、放射線療法と併用して、追加的なポリペプチドに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームおよび代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組み換え型弱毒化リステリアを投与するステップを含み、代謝酵素が組み換え型弱毒化リステリア株の染色体内の突然変異した内因性遺伝子を相補するような方法を提供する。
【００６１】
別の実施形態では、本発明は、イヌの被験体におけるＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍増殖またはガンに対する強化した免疫応答を引き出す方法であって、放射線療法と併用して、追加的なポリペプチドに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームおよび代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組み換え型弱毒化リステリアを投与するステップを含み、代謝酵素が組み換え型弱毒化リステリア株の染色体内の突然変異した内因性遺伝子を相補するような方法を提供する。
【００６２】
別の実施形態では、本発明は、ＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍増殖またはガンを患うイヌの被験体の生存を延長させる方法であって、放射線療法と併用して、追加的なポリペプチドに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームおよび代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組み換え型弱毒化リステリアを投与するステップを含み、代謝酵素が組み換え型弱毒化リステリア株の染色体内の突然変異した内因性遺伝子を相補するような方法を提供する。
【００６３】
別の実施形態では、本発明は、ＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍増殖またはガンを患うイヌの被験体における転移性疾患を遅延する方法であって、放射線療法と併用して、追加的なポリペプチドに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームおよび代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組み換え型弱毒化リステリアを投与するステップを含み、代謝酵素が組み換え型弱毒化リステリア株の染色体内の突然変異した内因性遺伝子を相補するような方法を提供する。
【００６４】
別の実施形態では、本発明は、ＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍増殖またはガンを患うイヌの被験体におけるＨｅｒ２−ｎｅｕへの耐性を破壊する方法であって、放射線療法と併用して、追加的なアジュバントに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームおよび代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組み換え型弱毒化リステリアを投与するステップを含み、代謝酵素が組み換え型弱毒化リステリア株の染色体内の突然変異した内因性遺伝子を相補するような方法を提供する。
【００６５】
一実施形態では、本発明は、被験体における転移性疾患を遅延または転移性疾患を治療する方法を提供する。一実施形態では、転移性疾患は肺の転移性疾患である。
【００６６】
従って、一実施形態では、本発明は、腫瘍増殖またはガンを患う被験体における肺の転移性疾患を遅延する方法であって、放射線療法と併用して、追加的なポリペプチドに融合した腫瘍特異的抗原を含む融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組み換え型弱毒化リステリア株を投与するステップを含む方法を提供する。
【００６７】
別の実施形態では、本発明は、腫瘍増殖またはガンを患う被験体における肺の転移性疾患を治療する方法であって、放射線療法と併用して、追加的なポリペプチドに融合した腫瘍特異的抗原を含む融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組み換え型弱毒化リステリア株を投与するステップを含む方法を提供する。
【００６８】
一実施形態では、Ｈｅｒ２−ｎｅｕ抗原を発現する腫瘍に対して防止、治療、生存を延長させ、転移性疾患を遅延させ、Ｈｅｒ２−ｎｅｕへの耐性を破壊し、およびワクチン接種し、免疫応答を誘発し、Ｈｅｒ２−ｎｅｕ抗原の準優占エピトープに対する強化した免疫応答を引き出し、一方で変異回避を避けるための方法が本明細書に提供される。別の実施形態では、本発明の融合ポリペプチドを被験体に投与することは、腫瘍内のエスケープ変異を防止する。別の実施形態では、変異回避を避けることは、エピトープ拡大に起因する。さらに別の実施形態では、変異回避は抗原のキメラ的な性質に起因する。
【００６９】
別の実施形態では、融合ポリペプチを含む特許請求される方法における使用のための免疫原性組成物が本明細書に提供され、融合ポリペプチドは追加的なポリペプチドに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含み、またＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍を有する被験体に融合タンパク質を投与することは腫瘍内のエスケープ変異を防止する。別の実施形態では、免疫原性組成物を含む特許請求される方法における使用のための組み換え型リステリアワクチン株が本明細書に提供される。
【００７０】
一実施形態では、組み換え型弱毒化リステリア株は、ワクチン株である。一実施形態では、本明細書で言及する核酸は、核酸分子である。
【００７１】
一実施形態では、本発明の方法における使用のための組み換え型弱毒化リステリア株は、代謝酵素をコードする第３のオープンリーディングフレームを含む核酸分子をさらに含み、代謝酵素は組み換え型リステリア株の染色体内の突然変異している内因性遺伝子を相補する。
【００７２】
別の実施形態では、核酸分子を含む組み換え型弱毒化リステリア株が本明細書に提供され、核酸分子はポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、ポリペプチドはＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含み、核酸分子は代謝酵素をコードする第２および第３のオープンリーディングフレームをさらに含み、それぞれ代謝酵素をコードし、代謝酵素は組み換え型リステリア株の染色体内の突然変異している内因性遺伝子を相補する。
【００７３】
一実施形態では、核酸分子はリステリアゲノムの中へと組み込まれる。別の実施形態では、核酸分子は組み換え型リステリアワクチン株内のプラスミドの中にある。さらに別の実施形態では、抗生物質選択が無いときにプラスミドは組み換え型リステリアワクチン株内で安定して維持される。別の実施形態では、プラスミドは組み換え型リステリア上に抗生物質抵抗性を与えない。別の実施形態では、組み換え型リステリア株は、弱毒化されている。別の実施形態では、組み換え型リステリアは、弱毒化栄養要求性株である。別の実施形態では、外来抗原の発現が本発明のうちの１つなどの細菌上に行使する高い代謝負担も、弱毒化の重要な機構である。
【００７４】
一実施形態では、弱毒化株はＬｍｄｄＡである。別の実施形態では、この株は、リステリアベースのワクチンの先天的特性である強いアジュバント効果を発揮する。このアジュバント効果の１つの兆候は、ヒトキメラ型ＨＥＲ２／ｎｅｕ以外の抗原を発現するリステリア、またはＡＤＸＳ−３１−１６４（ヒトキメラ型ＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する）ワクチンのいずれかによって生じた腫瘍内のＴｒｅｇの数の５分の１への減少である（本明細書内の図５を参照）。別の実施形態では、恐らく免疫性応答の結果と同様に、異なる抗原（ＨＰＶ１６  Ｅ７）を発現するＬｍｄｄＡベクターは腫瘍内のＴｒｅｇの頻度の著しい減少とも関連付けられる。別の実施形態では、ＬｍｄｄＡベクターは前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ヒトパピローマウィルス（ＨＰＶ）抗原（Ｅ６、Ｅ７）を発現する。別の実施形態では、ＨＰＶ株はＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、または当該技術分野で既知のいずれかの株である。
【００７５】
一実施形態では、弱毒化した栄養要求性リステリアワクチン株はＡＤＸＳ−３１−１６４株である。ＡＤＸＳ−３１−１６４は、リステリアワクチンベクターに基づき、これは病毒性遺伝子ＡｃｔＡの欠失に起因して弱毒化され、かつインビボおよびインビトロでのＨＥＲ２／ｎｅｕ発現のためにｄａｌ遺伝子の相補によってプラスミドを保持する。一実施形態では、ＡＤＸＳ３１−１６４はリステリオリシンＯ（ＬＬＯ）の最初の４４１のアミノ酸を融合したキメラ型ＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質を発現および分泌する。別の実施形態では、ＡＤＸＳ３１−１６４は、耐性を破壊する能力を有する強くかつ抗原特異的な抗腫瘍応答をトランスジェニック動物内のＨＥＲ２／ｎｅｕに対して行使する（実施例を参照）。別の実施形態では、免疫化したマウスの脾臓からより迅速に除去されるので、ＡＤＸＳ３１−１６４株は高度に弱毒化され、以前のリステリアワクチン世代より良好な安全性プロファイルを有する。別の実施形態では、トランスジェニック動物で、このワクチンの抗生剤耐性でかつより病毒性のバージョンであるＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２よりも長い腫瘍発症の遅延を、ＡＤＸＳ３１−１６４はもたらす（図３を参照）。一実施形態では、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２株はＬｍ−ＬＬＯ−１３８である。
【００７６】
別の実施形態では、ＡＤＸＳ３１−１６４株は高度に免疫原性であり、ＨＥＲ２／ｎｅｕトランスジェニック動物内でＨＥＲ２／ｎｅｕ自己抗原に対する耐性を破壊し、腫瘍形成を防止することができる。別の実施形態では、ＡＤＸＳ３１−１６４は、腫瘍内の調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の著しい減少を生じる。別の実施形態では、ＬｍｄｄＡワクチンで処理した腫瘍内のＴｒｅｇのより低い頻度は、腫瘍内のＣＤ８／Ｔｒｅｇ比の増加をもたらし、ＬｍｄｄＡワクチンを用いた免疫化後により好ましい腫瘍の微小環境を得ることができることを示唆する。別の実施形態では、このキメラ抗原の使用は、腫瘍が突然変異してこの新規な抗原を用いた治療に対する治療的に有効な応答から離れることを示すエスケープ変異をもたさない（実施例６を参照）。別の実施形態では、ＡＤＸＳ３１−１６４を用いた末梢の免疫化は脳内の転移性乳ガン細胞株の増殖を遅延する（実施例７を参照）。
【００７７】
別の実施形態では、骨肉腫を患い、かつ切断術、化学療法、およびＡＤＸＳ３１−１６４を用いたワクチン接種を含む治療を提供されたイヌの被験体は、ＡＤＸＳ３１−１６４を用いたワクチン接種を受けていない対照被験体と比較して長い生存期間が得られた（実施例９および１０を参照）。別の実施形態では、骨肉腫を患い、かつ切断術、化学療法、およびＡＤＸＳ３１−１６４を用いたワクチン接種を含む治療を提供されたイヌの被験体は、ＡＤＸＳ３１−１６４を用いたワクチン接種を受けていない対照被験体と比較して転移の減少を示した（実施例１０を参照）。別の実施形態では、骨肉腫を患い、かつ切断術、化学療法、およびＡＤＸＳ３１−１６４を用いたワクチン接種を含む治療を提供されたイヌの被験体は、ＡＤＸＳ３１−１６４を用いたワクチン接種を受けていない対照被験体と比較して誘発された特異的なＴ細胞応答の増加を示した（実施例１０を参照）。別の実施形態では、骨肉腫を患い、かつ切断術、化学療法、およびＡＤＸＳ３１−１６４を用いたワクチン接種に先立つ放射線療法を提供されたイヌの被験体は、放射線療法のみまたはＡＤＸＳ３１−１６４を用いたワクチン接種のみを受けた対照被験体と比較して生存を延長させた（実施例１１を参照）。別の実施形態では、骨肉腫を患い、かつ切断術、化学療法、およびＡＤＸＳ３１−１６４を用いたワクチン接種に先立つ放射線療法を含む治療を提供されたイヌの被験体は、放射線療法のみまたはＡＤＸＳ３１−１６４を用いたワクチン接種のみを受けた対照被験体と比較して転移の減少を示した（実施例１１を参照）。
【００７８】
別の実施形態では、用語「ＡＤＸＳ３１−１６４」、「Ｌｍ−ヒトキメラ型ＨＥＲ２／ｎｅｕ」、「Ｌｍ−ｈｕＨｅｒ２−ｎｅｕ」、および「Ｌｍ−ｈｕＨｅｒ２−ｎｅｕ」は、本明細書において、互いに同じ意味で使用される。
【００７９】
一実施形態では、骨肉腫細胞は放射線によって容易に死滅しないので、放射線療法は骨肉腫治療にはほとんど使用されない。一実施形態では、本明細書に例示したように、組み換え型の弱毒化した、抗生物質を含まないリステリアを発現するキメラ抗原は、ガンまたは固形腫瘍を防止および治療するために有用である。別の実施形態では、腫瘍はＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性腫瘍である。別の実施形態では、ガンはＨＥＲ２を発現するガンである。別の実施形態では、ガンは乳ガン、中枢神経系（ＣＮＳ）のガン、頭頸部ガン、骨肉腫（ＯＳＡ）、イヌの骨肉腫、ユーイング肉腫（ＥＳ）、または当該技術分野で既知のいずれかのＨＥＲ２／ｎｅｕを発現するガンである。別の実施形態では、イヌの骨肉腫は四肢骨肉腫である。別の実施形態では、腫瘍は骨肉腫腫瘍、乳房腫瘍、頭頸部腫瘍、または当該技術分野で既知の任意の他の抗原を発現する腫瘍である。別の実施形態では、ガンまたは固形腫瘍は、再燃または転移性疾患の結果である。一実施形態では、転移性疾患は肺の転移性疾患である。
【００８０】
一実施形態では、本発明は転移を治療、防止、または遅延する方法を提供する。一実施形態では、本発明はＯＳＡの転移を治療、防止、または遅延する方法を提供する。一実施形態では、転移は肺における。別の実施形態では、転移は別の組織にある。別の実施形態では、転移は骨内にあり、これは、一実施形態では、初期のＯＳＡの部位の近位にあり、別の実施形態では、初期のＯＳＡの部位の遠位にある。別の実施形態では、転移は腎臓にある。別の実施形態では、転移は心臓にある。別の実施形態では、転移は単離している。別の実施形態では、転移は単離した局所再発である。別の実施形態では、転移は他部位転移である。
【００８１】
別の実施形態では、キメラ型ＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する組み換え型リステリアは、ＨＥＲ２／ｎｅｕを過剰発現する固形腫瘍に対する治療のための治療ワクチンとして有用である。別の実施形態では、本明細書に提供されるＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原は、ＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍を治療するため、およびそのエスケープ変異を防止するのに有用である。別の実施形態では、「エスケープ変異」という用語は、治療に対する治療的に有効な応答から変異して離れる腫瘍を指す。
【００８２】
一実施形態では、本明細書に記載の組み換え型ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸分子であって、組み換え型リステリアワクチン株の中に常在する分子が本明細書に記載されている。別の実施形態では、本明細書に記載の核酸分子は、組み換え型リステリアに到達するために、リステリアを形質転換するように使用される。別の実施形態では、本明細書に記載の核酸は病毒性遺伝子を欠いている。別の実施形態では、リステリアゲノムの中へと組み込まれた核酸分子は、非機能性病毒性遺伝子を担持する。別の実施形態では、病毒性遺伝子は組み換え型リステリアのゲノム内で突然変異する。さらに別の実施形態では、核酸分子はリステリアゲノム内に存在する内因性の遺伝子を不活性化するために使用される。さらに別の実施形態では、病毒性遺伝子はａｃｔＡ遺伝子である。別の実施形態では、病毒性遺伝子はｐｒｆＡ遺伝子である。別の実施形態では、病毒性遺伝子はｉｎｌＢ遺伝子である。当業者であれば理解するとおり、病毒性遺伝子は、組み換え型リステリア内で病毒性と関連付けられる、当該技術分野で既知の任意の遺伝子とすることができる。
【００８３】
一実施形態では、代謝遺伝子、病毒性遺伝子、または両方はリステリア株の染色体を欠いている。別の実施形態では、代謝遺伝子、病毒性遺伝子、または両方はリステリア株の染色体および何らかのエピソームの遺伝要素を欠いている。「エピソーム」、「エピソーム性の」などの用語が、本明細書に提供されるリステリアの染色体の中に組み込まれないプラスミドベクターまたはその使用を指すことを当業者は理解するであろう。別の実施形態では、この用語は本明細書に提供されるリステリアの染色体の中に組み込まれるプラスミドベクターを指す。別の実施形態では、代謝遺伝子、病毒性遺伝子、または両方は、リステリア株のゲノムを欠いている。一実施形態では、代謝遺伝子、病毒性遺伝子、または両方は、染色体内で突然変異する。別の実施形態では、代謝遺伝子、病毒性遺伝子、または両方は染色体から欠失される。別の実施形態では、代謝遺伝子、病原性遺伝子、または両方は、染色体に不活性化される。
【００８４】
別の実施形態では、本明細書に提供される核酸およびプラスミドは、組み換え型リステリアに抗生物質抵抗性を与えない。
【００８５】
一実施形態では、「核酸分子」はプラスミドを指す。別の実施形態では、該用語は組み換え型ベクターを指す。別の実施形態では、該用語は非組み換え型ベクターを指す。別の実施形態では、該用語は組込み型ベクターを含むプラスミドを指す。別の実施形態では、組込み型ベクターは部位特異的な組込み型ベクターである。別の実施形態では、本発明の方法および組成物の核酸分子は、当該技術分野で既知の任意のタイプのヌクレオチドで成り立っている。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【００８６】
別の実施形態では、「代謝酵素」は、宿主細菌によって要求される栄養素の合成に関与する酵素を指す。別の実施形態では、この用語は宿主細菌によって要求される栄養素の合成のために要求される酵素を指す。別の実施形態では、この用語は宿主細菌によって利用される栄養素の合成に関与する酵素を指す。別の実施形態では、この用語は宿主細菌の増殖の保持のために要求される栄養素の合成に関与する酵素を指す。別の実施形態では、この酵素は栄養素の合成のために要求される。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【００８７】
「安定して維持される」とは、別の実施形態では、選択（例えば、抗生物質選択）無しで検出可能な損失無しでの、核酸分子またはプラスミドの１０世代の間の維持を指す。別の実施形態では、維持期間は１５世代である。別の実施形態では、維持期間は２０世代である。別の実施形態では、維持期間は２５世代である。別の実施形態では、維持期間は３０世代である。別の実施形態では、維持期間は４０世代である。別の実施形態では、維持期間は５０世代である。別の実施形態では、維持期間は６０世代である。別の実施形態では、維持期間は８０世代である。別の実施形態では、維持期間は１００世代である。別の実施形態では、維持期間は１５０世代である。別の実施形態では、維持期間は２００世代である。別の実施形態では、維持期間は３００世代である。別の実施形態では、維持期間は５００世代である。別の実施形態では、維持期間は５００世代を超えるものである。別の実施形態では、核酸分子またはプラスミドは、インビトロで（例えば、培養液内で）安定して維持される。別の実施形態では、核酸分子またはプラスミドは、インビボで安定して維持される。別の実施形態では、核酸分子またはプラスミドは、インビトロおよびインビトロの両方で安定して維持される。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【００８８】
一実施形態では、本発明は抗原を発現する組み換え型リステリア株を提供する。本発明は、ＨＥＲ２キメラタンパク質またはその断片に融合したリステリオリシン（ＬＬＯ）タンパク質断片を含む組み換え型ポリペプチド、ワクチンおよびこれを含む免疫原性組成物、ならびに抗ＨＥＲ２免疫応答を誘発する方法およびこれを含むＨＥＲ２を発現する腫瘍に対して治療およびワクチン接種する方法も提供する。
【００８９】
別の実施形態では、本発明の組み換え型リステリア株は動物宿主を通して継代されている。別の実施形態では、継代は株のワクチンベクターとしての有効性を最大化する。別の実施形態では、継代はリステリア株の免疫原性を安定化する。別の実施形態では、継代はリステリア株の病毒性を安定化する。別の実施形態では、継代はリステリア株の免疫原性を増加する。別の実施形態では、継代はリステリア株の病毒性を増加する。別の実施形態では、継代はリステリア株の不安定な亜系を除去する。別の実施形態では、継代はリステリア株の不安定な亜系の有病率を低下させる。別の実施形態では、リステリア株は抗原含有組み換え型ペプチドをコードする遺伝子のゲノム挿入を含有する。別の実施形態では、リステリア株は抗原含有組み換え型ペプチドをコードする遺伝子を含むプラスミドを担持する。別の実施形態では、当該技術分野で既知の任意の他の方法によって継代を遂行する。
【００９０】
一実施形態では、本明細書に提供されるポリペプチドは、ａ）非溶血性ＬＬＯタンパク質もしくはＮ末端断片、ｂ）ＰＥＳＴ配列、またはｃ）ＡｃｔＡ断片から成る群から選択される追加的なポリペプチドを含む融合タンパク質であり、さらに追加的なポリペプチドは、ＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原に融合している。別の実施形態では、追加的なポリペプチドは機能性である。別の実施形態では、追加的なポリペプチドの断片は免疫原性である。別の実施形態では、追加的なポリペプチドは免疫原性である。
【００９１】
別の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、非溶血性ＬＬＯタンパク質またはＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原に融合したＮ末端断片を含む融合タンパク質である。別の実施形態では、本発明の方法および組成物の融合タンパク質は、リステリア生物体からのＡｃｔＡ配列を含む。一実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質およびその断片は抗原発現および免疫性をＬＬＯと類似の様式で増強する。
【００９２】
本発明の方法および組成物の一実施形態では、融合タンパク質はＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原および追加的なポリペプチドを含む。別の実施形態では、ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原と融合した追加のポリペプチドは追加的なアジュバントポリペプチドと呼ばれる。一実施形態では、追加的なポリペプチドは非溶血性ＬＬＯタンパク質またはその断片である（本明細書に記載の実施例）。別の実施形態では、追加的なポリペプチドはＰＥＳＴ配列である。別の実施形態では、追加的なポリペプチドはＡｃｔＡタンパク質またはその断片である。
【００９３】
本発明の方法および組成物の追加的なポリペプチドは、別の実施形態ではリステリオリシン（ＬＬＯ）ペプチドである。別の実施形態では、追加的なポリペプチドはＡｃｔＡペプチドである。別の実施形態では、追加的なポリペプチドはＰＥＳＴ配列ペプチドである。別の実施形態では、追加的なポリペプチドは抗原ペプチドの免疫原性を強化する能力を有する任意の他のペプチドである。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【００９４】
ＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む融合タンパク質を、例えば、クローニングおよび適切な配列の制限、または以下に考察する方法による直接的な化学合成を含む任意の好適な方法で調製してもよい。あるいは、部分配列をクローニングし、適切な部分配列を適切な制限酵素を使用して分割してもよい。次いで断片を連結し、望ましいＤＮＡ配列を生産してもよい。一実施形態では、抗原をコードするＤＮＡは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）などのＤＮＡ増幅法を使用して生産することができる。まず、未変性のＤＮＡのいずれかの側の新しい末端の区分を別個に増幅する。１つの増幅した配列の５’末端はペプチドリンカーをコードし、一方でもう１つの増幅した配列の３’末端もペプチドリンカーをコードする。第１の断片の５’末端は第２の断片の３’末端の相補なので、２つの断片を（例えば、ＬＭＰアガロース上での部分的な精製後）第３のＰＣＲ反応での重複テンプレートとして使用することができる。増幅した配列は、コドン、開放部位のカルボキシ側上の区分（ここではアミノ配列を形成している）、リンカー、および開放部位のアミノ側上の配列（ここではカルボキシル配列を形成している）を含有することになる。抗原はプラスミドへと連結される。各々の方法は本発明の別個の実施形態を表す。
【００９５】
本発明の結果は、本発明の組成物の投与が腫瘍細胞を識別しかつ死滅させる抗原特異的なＴ細胞（例えば、細胞毒性Ｔ細胞）の形成を誘発するために有用性を有することを実証する（実施例が本明細書に含まれる）。
【００９６】
一実施形態では、本発明は、ＨＥＲ２キメラタンパク質に融合したまたはその断片に融合したＬＬＯタンパク質のＮ末端断片を含む組み換え型ポリペプチドを提供する。一実施形態では、本発明は、ＨＥＲ２キメラタンパク質に融合したまたはその断片に融合したＬＬＯタンパク質のＮ末端断片から構成される組み換え型ポリペプチドを提供する。
【００９７】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物のＨＥＲ２キメラタンパク質はヒトＨＥＲ２キメラタンパク質である。別の実施形態では、ＨＥＲ２タンパク質はマウスのＨＥＲ２キメラタンパク質である。別の実施形態では、ＨＥＲ２タンパク質はラットのＨＥＲ２キメラタンパク質である。別の実施形態では、ＨＥＲ２タンパク質は霊長類のＨＥＲ２キメラタンパク質である。別の実施形態では、ＨＥＲ２タンパク質はイヌのＨＥＲ２キメラタンパク質である。別の実施形態では、Ｈｅｒ−２タンパク質は、当該技術分野で既知のヒトもしくは任意の他の動物種のＨＥＲ２キメラタンパク質またはその組み合わせである。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【００９８】
別の実施形態では、Ｈｅｒ−２タンパク質は、「ＨＥＲ２／ｎｅｕ」、「Ｅｒｂｂ２」、「ｖ−ｅｒｂ−ｂ２」、「ｃ−ｅｒｂ−ｂ２」、「ｎｅｕ」、または「ｃＮｅｕ」と称されるタンパク質である。別の実施形態では、用語「Ｈｅｒ２−ｎｅｕ」、またはその文法的等価物も、「Ｈｅｒ−２」、「Ｈｅｒ−２タンパク質」、「ＨＥＲ２タンパク質」、または「ＨＥＲ２」として本明細書で言及される。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【００９９】
一実施形態では、Ｈｅｒ２−ｎｅｕキメラタンパク質は、ガン遺伝子のＭＨＣクラスＩエピトープのクラスターを示すＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原の２つの細胞外および１つの細胞内の断片を寄生し、一方別の実施形態では、キメラタンパク質は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原の３つのＨ２Ｄｑおよび少なくとも１７のマッピングされたヒトＭＨＣクラスＩエピトープ（断片ＥＣ１、ＥＣ２、およびＩＣ１）を寄生する（図１Ａを参照）。別の実施形態では、キメラタンパク質は少なくとも１３のマッピングされたヒトＭＨＣクラスＩエピトープ（断片ＥＣ２およびＩＣ１）を寄生する。別の実施形態では、キメラタンパク質は少なくとも１４のマッピングされたヒトＭＨＣクラスＩエピトープ（断片ＥＣ１およびＩＣ１）を寄生する。別の実施形態では、キメラタンパク質は少なくとも９のマッピングされたヒトＭＨＣクラスＩエピトープ（断片ＥＣ１およびＩＣ２）を寄生する。別の実施形態では、Ｈｅｒ２−ｎｅｕキメラタンパク質は非溶血性リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）に融合する。別の実施形態では、Ｈｅｒ２−ｎｅｕキメラタンパク質は切断リステリオリシンＯ（ｔＬＬＯ）に融合する。別の実施形態では、Ｈｅｒ２−ｎｅｕキメラタンパク質はリステリア−モノサイトゲネスリステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質の最初の４４１のアミノ酸に融合し、リステリア・モノサイトゲネス弱毒化栄養要求性株ＬｍｄｄＡによって発現および分泌される。別の実施形態では、キメラ型ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原／ＬＬＯ融合タンパク質を発現する本明細書に提供される弱毒化栄養要求性株からの融合タンパク質ｔＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２の発現および分泌は、インビトロで８時間増殖した後ＴＣＡ沈殿させた細胞培養上清内のＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２のものと同等である（図１Ｂを参照）。
【０１００】
一実施形態では、無処置の動物、または無関連のリステリアワクチンを注射したマウスではＣＴＬ活性は検出されなかった（図２Ａ）。一方で別の実施形態では、本明細書に提供される弱毒化栄養要求性株（ＡＤＸＳ３１−１６４）は、野生型ＦＶＢ／Ｎマウスからの脾細胞によるＩＦＮ−γの分泌を刺激することができる（図２Ｂ）。
【０１０１】
別の実施形態では、本明細書に提供される方法および組成物の代謝酵素はアミノ酸代謝酵素であり、一方で別の実施形態では、代謝酵素はアラニン・ラセマーゼ酵素である。別の実施形態では、代謝酵素はＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である。別の実施形態では、代謝酵素は組み換え型リステリア株内で細胞壁合成のために使用されるアミノ酸の形成に触媒作用を及ぼし、一方で別の実施形態では、代謝酵素はアラニン・ラセマーゼ酵素である。
【０１０２】
別の実施形態では、代謝酵素をコードする遺伝子は、リステリアｐ６０プロモータの制御下で発現する。別の実施形態では、ｉｎｌＡ（インターナリンをコードする）プロモータが使用される。別の実施形態では、ｈｌｙプロモータが使用される。別の実施形態では、ａｃｔＡプロモータが使用される。別の実施形態では、インテグラーゼ遺伝子は任意の他のグラム陽性プロモータの制御下で発現される。別の実施形態では、代謝酵素をコードする遺伝子は、リステリア内で機能する任意の他のプロモータの制御下で発現する。遺伝子の発現を駆動するために他のプロモータまたはポリシストロニック発現カセットが使用されてもよいことを当業者は理解するであろう。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０１０３】
別の実施形態では、ＨＥＲ２／ｎｅｕキメラタンパク質は、配列番号：１に示される以下の核酸配列によってコードされる。
【０１０４】
ｇａｇａｃｃｃａｃｃｔｇｇａｃａｔｇｃｔｃｃｇｃｃａｃｃｔｃｔａｃｃａｇｇｇｃｔｇｃｃａｇｇｔｇｇｔｇｃａｇｇｇａａａｃｃｔｇｇａａｃｔｃａｃｃｔａｃｃｔｇｃｃｃａｃｃａａｔｇｃｃａｇｃｃｔｇｔｃｃｔｔｃｃｔｇｃａｇｇａｔａｔｃｃａｇｇａｇｇｔｇｃａｇｇｇｃｔａｃｇｔｇｃｔｃａｔｃｇｃｔｃａｃａａｃｃａａｇｔｇａｇｇｃａｇｇｔｃｃｃａｃｔｇｃａｇａｇｇｃｔｇｃｇｇａｔｔｇｔｇｃｇａｇｇｃａｃｃｃａｇｃｔｃｔｔｔｇａｇｇａｃａａｃｔａｔｇｃｃｃｔｇｇｃｃｇｔｇｃｔａｇａｃａａｔｇｇａｇａｃｃｃｇｃｔｇａａｃａａｔａｃｃａｃｃｃｃｔｇｔｃａｃａｇｇｇｇｃｃｔｃｃｃｃａｇｇａｇｇｃｃｔｇｃｇｇｇａｇｃｔｇｃａｇｃｔｔｃｇａａｇｃｃｔｃａｃａｇａｇａｔｃｔｔｇａａａｇｇａｇｇｇｇｔｃｔｔｇａｔｃｃａｇｃｇｇａａｃｃｃｃｃａｇｃｔｃｔｇｃｔａｃｃａｇｇａｃａｃｇａｔｔｔｔｇｔｇｇａａｇａａｔａｔｃｃａｇｇａｇｔｔｔｇｃｔｇｇｃｔｇｃａａｇａａｇａｔｃｔｔｔｇｇｇａｇｃｃｔｇｇｃａｔｔｔｃｔｇｃｃｇｇａｇａｇｃｔｔｔｇａｔｇｇｇｇａｃｃｃａｇｃｃｔｃｃａａｃａｃｔｇｃｃｃｃｇｃｔｃｃａｇｃｃａｇａｇｃａｇｃｔｃｃａａｇｔｇｔｔｔｇａｇａｃｔｃｔｇｇａａｇａｇａｔｃａｃａｇｇｔｔａｃｃｔａｔａｃａｔｃｔｃａｇｃａｔｇｇｃｃｇｇａｃａｇｃｃｔｇｃｃｔｇａｃｃｔｃａｇｃｇｔｃｔｔｃｃａｇａａｃｃｔｇｃａａｇｔａａｔｃｃｇｇｇｇａｃｇａａｔｔｃｔｇｃａｃａａｔｇｇｃｇｃｃｔａｃｔｃｇｃｔｇａｃｃｃｔｇｃａａｇｇｇｃｔｇｇｇｃａｔｃａｇｃｔｇｇｃｔｇｇｇｇｃｔｇｃｇｃｔｃａｃｔｇａｇｇｇａａｃｔｇｇｇｃａｇｔｇｇａｃｔｇｇｃｃｃｔｃａｔｃｃａｃｃａｔａａｃａｃｃｃａｃｃｔｃｔｇｃｔｔｃｇｔｇｃａｃａｃｇｇｔｇｃｃｃｔｇｇｇａｃｃａｇｃｔｃｔｔｔｃｇｇａａｃｃｃｇｃａｃｃａａｇｃｔｃｔｇｃｔｃｃａｃａｃｔｇｃｃａａｃｃｇｇｃｃａｇａｇｇａｃｇａｇｔｇｔｇｔｇｇｇｃｇａｇｇｇｃｃｔｇｇｃｃｔｇｃｃａｃｃａｇｃｔｇｔｇｃｇｃｃｃｇａｇｇｇｃａｇｃａｇａａｇａｔｃｃｇｇａａｇｔａｃａｃｇａｔｇｃｇｇａｇａｃｔｇｃｔｇｃａｇｇａａａｃｇｇａｇｃｔｇｇｔｇｇａｇｃｃｇｃｔｇａｃａｃｃｔａｇｃｇｇａｇｃｇａｔｇｃｃｃａａｃｃａｇｇｃｇｃａｇａｔｇｃｇｇａｔｃｃｔｇａａａｇａｇａｃｇｇａｇｃｔｇａｇｇａａｇｇｔｇａａｇｇｔｇｃｔｔｇｇａｔｃｔｇｇｃｇｃｔｔｔｔｇｇｃａｃａｇｔｃｔａｃａａｇｇｇｃａｔｃｔｇｇａｔｃｃｃｔｇａｔｇｇｇｇａｇａａｔｇｔｇａａａａｔｔｃｃａｇｔｇｇｃｃａｔｃａａａｇｔｇｔｔｇａｇｇｇａａａａｃａｃａｔｃｃｃｃｃａａａｇｃｃａａｃａａａｇａａａｔｃｔｔａｇａｃｇａａｇｃａｔａｃｇｔｇａｔｇｇｃｔｇｇｔｇｔｇｇｇｃｔｃｃｃｃａｔａｔｇｔｃｔｃｃｃｇｃｃｔｔｃｔｇｇｇｃａｔｃｔｇｃｃｔｇａｃａｔｃｃａｃｇｇｔｇｃａｇｃｔｇｇｔｇａｃａｃａｇｃｔｔａｔｇｃｃｃｔａｔｇｇｃｔｇｃｃｔｃｔｔａｇａｃｔａａ（配列番号：１）。
【０１０５】
別の実施形態では、ＨＥＲ２キメラタンパク質は次の配列を有する。
【０１０６】
E  T  H  L  D  M  L  R  H  L  Y  Q  G  C  Q  V  V  Q  G  N  L  E  L  T  Y  L  P  T  N  A  S  L  S  F  L  Q  D  I  Q  E  V  Q  G  Y  V  L  I  A  H  N  Q  V  R  Q  V  P  L  Q  R  L  R  I  V  R  G  T  Q  L  F  E  D  N  Y  A  L  A  V  L  D  N  G  D  P  L  N  N  T  T  P  V  T  G  A  S  P  G  G  L  R  E  L  Q  L  R  S  L  T  E  I  L  K  G  G V  L  I  Q R  N  P  Q  L  C  Y  Q  D  T  I  L  W  K  N  I  Q  E  F  A  G  C  K K  I  F  G  S  L  A  F  L  P  E  S  F  D  G  D  P  A  S  N  T  A  P  L  Q  P  E  Q  L  Q  V  F  E  T  L  E  E  I  T  G  Y  L  Y  I  S  A  W  P  D  S  L  P  D  L  S  V  F  Q N  L  Q  V  I  R  G  R  I  L  H  N  G  A  Y  S  L  T  L  Q  G  L  G  I  S  W  L  G  L  R  S  L  R  E L  G  S  G  L  A  L  I  H  H  N  T  H  L  C  F  V  H  T  V  P  W  D  Q  L  F  R  N  P  H  Q  A  L  L  H  T  A  N  R  P  E  D  E  C  V  G  E  G  L  A  C  H  Q  L  C  A  R  G  Q  Q  K  I  R  K  Y  T  M  R  R  L  L  Q  E  T  E  L  V  E  P  L  T  P  S  G  A  M  P  N  Q  A  Q  M  R  I  L  K  E  T  E  L  R  K  V  K  V  L  G  S  G  A  F  G  T  V  Y  K  G  I  W  I  P  D  G  E  N  V  K  I  P  V  A  I  K V  L  R  E  N  T  S  P  K  A  N K E I  L D E  A  Y V  M  A  G  V  G  S P Y  V  S  R  L L G  I  C  L  T  S  T  V  Q  L  V  T  Q  L  M  P  Y  G  C  L  L  D（配列番号：２）。
【０１０７】
以下の表１は、ヒトとイヌとのそれぞれＨｅｒ−２  ＥＣおよびＩＣ断片アミノ酸配列の間の同一性パーセント（％）を示す。
2017514904.tif 000003
【０１０８】
別の実施形態では、ヒトＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＥＣ１断片をコードするアミノ酸配列は（配列番号：６９）で示される：
【０１０９】
ＳＬＳＦＬＱＤＩＱＥＶＱＧＹＶＬＩＡＨＮＱＶＲＱＶＰＬＱＲＬＲＩＶＲＧＴＱＬＦＥＤＮＹＡＬＡＶＬＤＮＧＤＰＬＮＮＴＴＰＶＴＧＡＳＰＧＧＬＲＥＬＱＬＲＳＬＴＥＩＬＫＧＧＶＬＩＱＲＮＰＱＬＣＹＱＤＴＩＬＷＫＤＩＦＨＫＮＮＱＬＡＬＴＬＩＤＴＮＲＳＲＡＣＨＰＣＳＰＭＣＫ（配列番号：６９）。
【０１１０】
別の実施形態では、イヌのｈｅｒ２／ｎｅｕ  ＥＣ１断片をコードするアミノ酸配列が（配列番号：７０）で示される：
【０１１１】
ＳＬＳＦＬＱＤＩＱＥＶＱＧＹＶＬＩＡＨＳＱＶＲＱＩＰＬＱＲＬＲＩＶＲＧＴＱＬＦＥＤＮＹＡＬＡＶＬＤＮＧＤＰＬＥＧＧＩＰＡＰＧＡＡＰＧＧＬＲＥＬＱＬＲＳＬＴＥＩＬＫＧＧＶＬＩＱＲＳＰＱＬＣＨＱＤＴＩＬＷＫＤＶＦＨＫＮＮＱＬＡＬＴＬＩＤＴＮＲＳＲＡＣＰＰＣＳＰＡＣＫ（配列番号：７０）。
【０１１２】
別の実施形態では、ヒトｈｅｒ２／ｎｅｕ  ＥＣ２断片をコードするアミノ酸配列が（配列番号：７１）で示される：
【０１１３】
ＴＡＰＬＱＰＥＱＬＱＶＦＥＴＬＥＥＩＴＧＹＬＹＩＳＡＷＰＤＳＬＰＤＬＳＶＦＱＮＬＱＶＩＲＧＲＩＬＨＮＧＡＹＳＬＴＬＱＧＬＧＩＳＷＬＧＬＲＳＬＲＥＬＧＳ（配列番号：７１）。
【０１１４】
別の実施形態では、イヌのｈｅｒ２／ｎｅｕ  ＥＣ２断片をコードするアミノ酸配列が（配列番号：７２）で示される：
【０１１５】
ＴＡＰＬＱＰＥＱＬＲＶＦＥＡＬＥＥＩＴＧＹＬＹＩＳＡＷＰＤＳＬＰＮＬＳＶＦＱＮＬＲＶＩＲＧＲＶＬＨＤＧＡＹＳＬＴＬＱＧＬＧＩＳＷＬＧＬＲＳＬＲＥＬＧＳ  （配列番号：７２）。
【０１１６】
別の実施形態では、ヒトｈｅｒ２／ｎｅｕ  ＩＣ１断片をコードするアミノ酸配列が（配列番号：７３）で示される：
【０１１７】
ＮＱＡＱＭＲＩＬＫＥＴＥＬＲＫＶＫＶＬＧＳＧＡＦＧＴＶＹＫＧＩＷＩＰＤＧＥＮＶＫＩＰＶＡＩＫＶＬＲＥＮＴＳＰＫＡＮＫＥＩＬＤＥＡＹＶＭＡＧＶＧＳＰＹＶＳＲＬＬＧＩＣＬＴＳＴＶＱＬＶＴＱＬＭＰＹＧＣＬＬＤＨＶＲＥＮＲＧＲＬＧＳＱＤＬＬＮＷＣＭＱＩＡＫＧＭＳＹＬＥＤ（配列番号：７３）。
【０１１８】
別の実施形態では、イヌのｈｅｒ２／ｎｅｕ  ＩＣ１断片をコードするアミノ酸配列が（配列番号：７４）で示される：
【０１１９】
ＮＱＡＱＭＲＩＬＫＥＴＥＬＲＫＶＫＶＬＧＳＧＡＦＧＴＶＹＫＧＩＷＩＰＤＧＥＮＶＫＩＰＶＡＩＫＶＬＲＥＮＴＳＰＫＡＮＫＥＩＬＤＥＡＹＶＭＡＧＶＧＳＰＹＶＳＲＬＬＧＩＣＬＴＳＴＶＱＬＶＴＱＬＭＰＹＧＣＬＬＤＨＶＲＥＮＲＧＲＬＧＳＱＤＬＬＮＷＣＭＱＩＡＫＧＭＳＹＬＥＤ（配列番号：７４）。
【０１２０】
一実施形態では、ヒトのＨＥＲ２  ＥＣ１断片のアミノ酸配列（配列番号：６９）は、イヌのＨＥＲ２  ＥＣ１断片のアミノ酸配列（配列番号：７０）と８９％の同一性を有する。別の実施形態では、ヒトのＨＥＲ２  ＥＣ２断片のアミノ酸配列（配列番号：７１）は、イヌのＨＥＲ２  ＥＣ２断片のアミノ酸配列（配列番号：７２）と９３％の同一性を有する。別の実施形態では、ヒトのＨＥＲ２  ＩＣ１断片のアミノ酸配列（配列番号：７３）は、イヌのＨＥＲ２  ＩＣ１断片のアミノ酸配列（配列番号：７４）と９８％の同一性を有する。
【０１２１】
一実施形態では、本明細書に提供される方法および組成物のＨＥＲ２キメラタンパク質またはその断片は、そのシグナル配列を含まない。別の実施形態では、シグナル配列の高い疎水性により、シグナル配列の削除はＨＥＲ２断片がリステリア内で順調に発現できるようにする。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０１２２】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物のＨＥＲ２キメラタンパク質の断片は、その膜貫通領域（ＴＭ）を含まない。一実施形態では、ＴＭの高い疎水性により、ＴＭの削除はＨＥＲ２断片がリステリア内で順調に発現できるようにする。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０１２３】
一実施形態では、ラットのＨＥＲ２／ｎｅｕ遺伝子の核酸配列は、ＣＣＧＧＡＡＴＣＧＣＧＧＧＣＡＣＣＣＡＡＧＴＧＴＧＴＡＣＣＧＧＣＡＣＡＧＡＣＡＴＧＡＡＧＴＴＧＣＧＧＣＴＣＣＣＴＧＣＣＡＧＴＣＣＴＧＡＧＡＣＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＣＴＣＣＧＣＣＡＣＣＴＧＴＡＣＣＡＧＧＧＣＴＧＴＣＡＧＧＴＡＧＴＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＴＴＧＧＡＧＣＴＴＡＣＣＴＡＣＧＴＧＣＣＴＧＣＣＡＡＴＧＣＣＡＧＣＣＴＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＣＡＧＧＡＣＡＴＣＣＡＧＧＡＡＧＴＴＣＡＧＧＧＴＴＡＣＡＴＧＣＴＣＡＴＣＧＣＴＣＡＣＡＡＣＣＡＧＧＴＧＡＡＧＣＧＣＧＴＣＣＣＡＣＴＧＣＡＡＡＧＧＣＴＧＣＧＣＡＴＣＧＴＧＡＧＡＧＧＧＡＣＣＣＡＧＣＴＣＴＴＴＧＡＧＧＡＣＡＡＧＴＡＴＧＣＣＣＴＧＧＣＴＧＴＧＣＴＡＧＡＣＡＡＣＣＧＡＧＡＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＡＡＴＧＴＣＧＣＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＣＣＡＧＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＧＧＣＴＧＣＧＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＧＡＡＧＴＣＴＣＡＣＡＧＡＧＡＴＣＣＴＧＡＡＧＧＧＡＧＧＡＧＴＴＴＴＧＡＴＣＣＧＴＧＧＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣＡＧＧＡＣＡＴＧＧＴＴＴＴＧＴＧＧＡＡＧＧＡＣＧＴＣＴＴＣＣＧＣＡＡＧＡＡＴＡＡＣＣＡＡＣＴＧＧＣＴＣＣＴＧＴＣＧＡＴＡＴＡＧＡＣＡＣＣＡＡＴＣＧＴＴＣＣＣＧＧＧＣＣＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＴＧＣＣＣＣＣＧＣＣＴＧＣＡＡＡＧＡＣＡＡＴＣＡＣＴＧＴＴＧＧＧＧＴＧＡＧＡＧＴＣＣＧＧＡＡＧＡＣＴＧＴＣＡＧＡＴＣＴＴＧＡＣＴＧＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＡＣＣＡＧＴＧＧＴＴＧＴＧＣＣＣＧＧＴＧＣＡＡＧＧＧＣＣＧＧＣＴＧＣＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＣＴＧＣＣＡＴＧＡＧＣＡＧＴＧＴＧＣＣＧＣＡＧＧＣＴＧＣＡＣＧＧＧＣＣＣＣＡＡＧＣＡＴＴＣＴＧＡＣＴＧＣＣＴＧＧＣＣＴＧＣＣＴＣＣＡＣＴＴＣＡＡＴＣＡＴＡＧＴＧＧＴＡＴＣＴＧＴＧＡＧＣＴＧＣＡＣＴＧＣＣＣＡＧＣＣＣＴＣＧＴＣＡＣＣＴＡＣＡＡＣＡＣＡＧＡＣＡＣＣＴＴＴＧＡＧＴＣＣＡＴＧＣＡＣＡＡＣＣＣＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＴＧＧＴＧＣＣＡＧＣＴＧＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＴＧＣＣＣＣＴＡＣＡＡＣＴＡＣＣＴＧＴＣＴＡＣＧＧＡＡＧＴＧＧＧＡＴＣＣＴＧＣＡＣＴＣＴＧＧＴＧＴＧＴＣＣＣＣＣＧＡＡＴＡＡＣＣＡＡＧＡＧＧＴＣＡＣＡＧＣＴＧＡＧＧＡＣＧＧＡＡＣＡＣＡＧＣＧＴＴＧＴＧＡＧＡＡＡＴＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＣＴＧＴＧＣＴＣＧＡＧＴＧＴＧＣＴＡＴＧＧＴＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＡＧＣＡＣＣＴＴＣＧＡＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＧＴＧＡＣＡＡＴＧＴＣＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＴＴＧＧＧＡＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＴＴＴＧＣＣＧＧＡＧＡＧＣＴＴＴＧＡＴＧＧＧＧＡＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＧＧＣＡＴＴＧＣＴＣＣＧＣＴＧＡＧＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＴＧＴＴＣＧＡＡＡＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＴＣＡＣＡＧＧＴＴＡＣＣＴＧＴＡＣＡＴＣＴＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＡＧＡＣＡＧＴＣＴＣＣＧＴＧＡＣＣＴＣＡＧＴＧＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＴＣＧＡＡＴＣＡＴＴＣＧＧＧＧＡＣＧＧＡＴＴＣＴＣＣＡＣＧＡＴＧＧＣＧＣＧＴＡＣＴＣＡＴＴＧＡＣＡＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＡＴＣＣＡＣＴＣＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＧＧＧＡＧＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＣＴＣＴＧＡＴＴＣＡＣＣＧＣＡＡＣＧＣＣＣＡＴＣＴＣＴＧＣＴＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＴＧＴＡＣＣＴＴＧＧＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＴＣＣＧＧＡＡＣＣＣＡＣＡＴＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＣＡＧＴＧＧＧＡＡＣＣＧＧＣＣＧＧＡＡＧＡＧＧＡＴＴＧＴＧＧＴＣＴＣＧＡＧＧＧＣＴＴＧＧＴＣＴＧＴＡＡＣＴＣＡＣＴＧＴＧＴＧＣＣＣＡＣＧＧＧＣＡＣＴＧＣＴＧＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＣＣＡＣＣＣＡＧＴＧＴＧＴＣＡＡＣＴＧＣＡＧＴＣＡＴＴＴＣＣＴＴＣＧＧＧＧＣＣＡＧＧＡＧＴＧＴＧＴＧＧＡＧＧＡＧＴＧＣＣＧＡＧＴＡＴＧＧＡＡＧＧＧＧＣＴＣＣＣＣＣＧＧＧＡＧＴＡＴＧＴＧＡＧＴＧＡＣＡＡＧＣＧＣＴＧＴＣＴＧＣＣＧＴＧＴＣＡＣＣＣＣＧＡＧＴＧＴＣＡＧＣＣＴＣＡＡＡＡＣＡＧＣＴＣＡＧＡＧＡＣＣＴＧＣＴＴＴＧＧＡＴＣＧＧＡＧＧＣＴＧＡＴＣＡＧＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＧＣＧＣＣＣＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＴＣＧＴＣＣＴＣＣＴＧＴＧＴＧＧＣＴＣＧＣＴＧＣＣＣＣＡＧＴＧＧＴＧＴＧＡＡＡＣＣＧＧＡＣＣＴＣＴＣＣＴＡＣＡＴＧＣＣＣＡＴＣＴＧＧＡＡＧＴＡＣＣＣＧＧＡＴＧＡＧＧＡＧＧＧＣＡＴＡＴＧＣＣＡＧＣＣＧＴＧＣＣＣＣＡＴＣＡＡＣＴＧＣＡＣＣＣＡＣＴＣＣＴＧＴＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＡＴＧＡＡＣＧＡＧＧＣＴＧＣＣＣＡＧＣＡＧＡＧＣＡＧＡＧＡＧＣＣＡＧＣＣＣＧＧＴＧＡＣＡＴＴＣＡＴＣＡＴＴＧＣＡＡＣＴＧＴＡＧＴＧＧＧＣＧＴＣＣＴＧＣＴＧＴＴＣＣＴＧＡＴＣＴＴＡＧＴＧＧＴＧＧＴＣＧＴＴＧＧＡＡＴＣＣＴＡＡＴＣＡＡＡＣＧＡＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＡＧＡＴＣＣＧＧＡＡＧＴＡＴＡＣＧＡＴＧＣＧＴＡＧＧＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＡＡＡＣＴＧＡＧＴＴＡＧＴＧＧＡＧＣＣＧＣＴＧＡＣＧＣＣＣＡＧＣＧＧＡＧＣＡＡＴＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＧＣＴＣＡＧＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＡＡＡＡＧＡＧＡＣＧＧＡＧＣＴＡＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＡＧＧＡＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＣＣＣＣＧＴＧＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＴＧＴＴＧＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴＣＴＣＣＴＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＡＧＡＴＧＡＡＧＣＧＴＡＴＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＴＴＣＴＣＣＧＴＡＴＧＴＧＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＣＣＡＴＧＴＣＣＧＡＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＧＴＣＧＣＣＴＡＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＴＣＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＧＣＧＧＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＣＣＧＧＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＣＡＡＧＡＧＴＣＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＣＡＡＧＡＴＴＡＣＡＧＡＴＴＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＧＡＡＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＧＡＣＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＣＴＡＴＧＧＡＧＴＧＡＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＧＣＣＡＡＡＣＣＴＴＡＣＧＡＴＧＧＡＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡＣＧＣＣＴＡＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＴＡＣＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＴＧＴＴＧＧＡＴＧＡＴＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＴＣＧＣＣＣＧＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＡＧＴＴＧＧＴＧＴＣＡＧＡＡＴＴＴＴＣＡＣＧＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＣＧＴＴＴＴＧＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＧＡＧＧＡＣＴＴＧＧＧＣＣＣＡＴＣＣＡＧＣＣＣＣＡＴＧＧＡＣＡＧＴＡＣＣＴＴＣＴＡＣＣＧＴＴＣＡＣＴＧＣＴＧＧＡＡＧＡＴＧＡＴＧＡＣＡＴＧＧＧＴＧＡＣＣＴＧＧＴＡＧＡＣＧＣＴＧＡＡＧＡＧＴＡＴＣＴＧＧＴＧＣＣＣＣＡＧＣＡＧＧＧＡＴＴＣＴＴＣＴＣＣＣＣＧＧＡＣＣＣＴＡＣＣＣＣＡＧＧＣＡＣＴＧＧＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＣＡＴＡＧＡＡＧＧＣＡＣＣＧＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＣＣＡＧＧＡＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＴＧＡＧＣＴＧＡＣＡＣＴＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＣＣＣＴＣＧＧＡＡＧＡＡＧＧＧＣＣＣＣＣＣＡＧＡＴＣＴＣＣＡＣＴＧＧＣＴＣＣＣＴＣＧＧＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＣＧＡＴＧＴＧＴＴＴＧＡＴＧＧＴＧＡＣＣＴＧＧＣＡＡＴＧＧＧＧＧＴＡＡＣＣＡＡＡＧＧＧＣＴＧＣＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＴＣＣＡＣＡＴＧＡＣＣＴＣＡＧＣＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＧＧＴＡＣＡＧＣＧＡＧＧＡＣＣＣＣＡＣＡＴＴＡＣＣＴＣＴＧＣＣＣＣＣＣＧＡＧＡＣＴＧＡＴＧＧＣＴＡＴＧＴＴＧＣＴＣＣＣＣＴＧＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＧＡＧＴＡＴＧＴＧＡＡＣＣＡＡＴＣＡＧＡＧＧＴＴＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＴＴＴＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＧＴＣＣＴＣＴＧＣＣＴＣＣＴＧＴＣＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＧＴＧＣＴＡＣＴＣＴＡＧＡＡＡＧＡＣＣＣＡＡＧＡＣＴＣＴＣＴＣＴＣＣＴＧＧＧＡＡＧＡＡＴＧＧＧＧＴＴＧＴＣＡＡＡＧＡＣＧＴＴＴＴＴＧＣＣＴＴＣＧＧＧＧＧＴＧＣＴＧＴＧＧＡＧＡＡＣＣＣＴＧＡＡＴＡＣＴＴＡＧＴＡＣＣＧＡＧＡＧＡＡＧＧＣＡＣＴＧＣＣＴＣＴＣＣＧＣＣＣＣＡＣＣＣＴＴＣＴＣＣＴＧＣＣＴＴＣＡＧＣＣＣＡＧＣＣＴＴＴＧＡＣＡＡＣＣＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＧＧＡＣＣＡＧＡＡＣＴＣＡＴＣＧＧＡＧＣＡＧＧＧＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＴＡＡＣＴＴＴＧＡＡＧＧＧＡＣＣＣＣＣＡＣＴＧＣＡＧＡＧＡＡＣＣＣＴＧＡＧＴＡＣＣＴＡＧＧＣＣＴＧＧＡＴＧＴＡＣＣＴＧＴＡ（配列番号：４５）である。
【０１２４】
一実施形態では、ラットのＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＥＣ１断片をコードする核酸配列は、ＣＣＣＡＧＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＧＧＣＴＧＣＧＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＧＡＡＧＴＣＴＣＡＣＡＧＡＧＡＴＣＣＴＧＡＡＧＧＧＡＧＧＡＧＴＴＴＴＧＡＴＣＣＧＴＧＧＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣＡＧＧＡＣＡＴＧＧＴＴＴＴＧＴＧＧＡＡＧＧＡＣＧＴＣＴＴＣＣＧＣＡＡＧＡＡＴＡＡＣＣＡＡＣＴＧＧＣＴＣＣＴＧＴＣＧＡＴＡＴＡＧＡＣＡＣＣＡＡＴＣＧＴＴＣＣＣＧＧＧＣＣＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＴＧＣＣＣＣＣＧＣＣＴＧＣＡＡＡＧＡＣＡＡＴＣＡＣＴＧＴＴＧＧＧＧＴＧＡＧＡＧＴＣＣＧＧＡＡＧＡＣＴＧＴＣＡＧＡＴＣＴＴＧＡＣＴＧＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＡＣＣＡＧＴＧＧＴＴＧＴＧＣＣＣＧＧＴＧＣＡＡＧＧＧＣＣＧＧＣＴＧＣＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＣＴＧＣＣＡＴＧＡＧＣＡＧＴＧＴＧＣＣＧＣＡＧＧＣＴＧＣＡＣＧＧＧＣＣＣＣＡＡＧＣＡ（配列番号：４６）である。
【０１２５】
別の実施形態では、ラットのＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＥＣ２断片をコードする核酸配列は、ＧＧＴＣＡＣＡＧＣＴＧＡＧＧＡＣＧＧＡＡＣＡＣＡＧＣＧＴＴＧＴＧＡＧＡＡＡＴＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＣＴＧＴＧＣＴＣＧＡＧＴＧＴＧＣＴＡＴＧＧＴＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＡＧＣＡＣＣＴＴＣＧＡＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＧＴＧＡＣＡＡＴＧＴＣＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＴＴＧＧＧＡＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＴＴＴＧＣＣＧＧＡＧＡＧＣＴＴＴＧＡＴＧＧＧＧＡＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＧＧＣＡＴＴＧＣＴＣＣＧＣＴＧＡＧＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＴＧＴＴＣＧＡＡＡＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＴＣＡＣＡＧＧＴＴＡＣＣＴＧＴＡＣＡＴＣＴＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＡＧＡＣＡＧＴＣＴＣＣＧＴＧＡＣＣＴＣＡＧＴＧＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＴＣＧＡＡＴＣＡＴＴＣＧＧＧＧＡＣＧＧＡＴＴＣＴＣＣＡＣＧＡＴＧＧＣＧＣＧＴＡＣＴＣＡＴＴＧＡＣＡＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＡＴＣＣＡＣＴＣＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＧＧＧＡＧＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＣＴＣＴＧＡＴＴＣＡＣＣＧＣＡＡＣＧＣＣＣＡＴＣＴＣＴＧＣＴＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＴＧＴＡＣＣＴＴＧＧＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＴＣＣＧＧＡＡＣＣＣＡＣＡＴＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＣＡＧＴＧＧＧＡＡＣＣＧＧＣＣＧＧＡＡＧＡＧＧＡＴＴＧＴＧＧＴＣＴＣＧＡＧＧＧＣＴＴＧＧＴＣＴＧＴＡＡＣＴＣＡＣＴＧＴＧＴＧＣＣＣＡＣＧＧＧＣＡＣＴＧＣＴＧＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＣＣＡＣＣＣＡ（配列番号：４７）である。
【０１２６】
別の実施形態では、ラットのＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＩＣ１断片をコードする核酸配列は、ＣＧＣＣＣＡＧＣＧＧＡＧＣＡＡＴＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＧＣＴＣＡＧＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＡＡＡＡＧＡＧＡＣＧＧＡＧＣＴＡＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＡＧＧＡＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＣＣＣＣＧＴＧＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＴＧＴＴＧＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴＣＴＣＣＴＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＡＧＡＴＧＡＡＧＣＧＴＡＴＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＴＴＣＴＣＣＧＴＡＴＧＴＧＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＣＣＡＴＧＴＣＣＧＡＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＧＴＣＧＣＣＴＡＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＴＣＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＧＣＧＧＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＣＣＧＧＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＣＡＡＧＡＧＴＣＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＣＡＡＧＡＴＴＡＣＡＧＡＴＴＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＧＡＡＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＧＡＣＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＣＴＡＴＧＧＡＧＴＧＡＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＧＣＣＡＡＡＣＣＴＴＡＣＧＡＴＧＧＡＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡＣＧＣＣＴＡＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＴＡＣＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＴＧＴＴＧＧＡＴＧＡＴＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＴＣＧＣＣＣＧＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＡＧＴＴＧＧＴＧＴＣＡＧＡＡＴＴＴＴＣＡＣＧＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＣＧＴＴＴＴＧＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＧＡＧＧＡＣＴＴＧＧＧＣＣＣＡＴＣＣＡＧＣＣＣＣＡＴＧＧＡＣＡＧＴＡＣＣＴＴＣＴＡＣＣＧＴＴＣＡＣＴＧＣＴＧＧＡＡ（配列番号：４８）である。
【０１２７】
一実施形態では、ヒトのＨＥＲ２／ｎｅｕ遺伝子の核酸配列は、ＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＣＧＧＣＣＴＴＧＴＧＣＣＧＣＴＧＧＧＧＧＣＴＣＣＴＣＣＴＣＧＣＣＣＴＣＴＴＧＣＣＣＣＣＣＧＧＡＧＣＣＧＣＧＡＧＣＡＣＣＣＡＡＧＴＧＴＧＣＡＣＣＧＧＣＡＣＡＧＡＣＡＴＧＡＡＧＣＴＧＣＧＧＣＴＣＣＣＴＧＣＣＡＧＴＣＣＣＧＡＧＡＣＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＣＴＣＣＧＣＣＡＣＣＴＣＴＡＣＣＡＧＧＧＣＴＧＣＣＡＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧＧＧＡＡＡＣＣＴＧＧＡＡＣＴＣＡＣＣＴＡＣＣＴＧＣＣＣＡＣＣＡＡＴＧＣＣＡＧＣＣＴＧＴＣＣＴＴＣＣＴＧＣＡＧＧＡＴＡＴＣＣＡＧＧＡＧＧＴＧＣＡＧＧＧＣＴＡＣＧＴＧＣＴＣＡＴＣＧＣＴＣＡＣＡＡＣＣＡＡＧＴＧＡＧＧＣＡＧＧＴＣＣＣＡＣＴＧＣＡＧＡＧＧＣＴＧＣＧＧＡＴＴＧＴＧＣＧＡＧＧＣＡＣＣＣＡＧＣＴＣＴＴＴＧＡＧＧＡＣＡＡＣＴＡＴＧＣＣＣＴＧＧＣＣＧＴＧＣＴＡＧＡＣＡＡＴＧＧＡＧＡＣＣＣＧＣＴＧＡＡＣＡＡＴＡＣＣＡＣＣＣＣＴＧＴＣＡＣＡＧＧＧＧＣＣＴＣＣＣＣＡＧＧＡＧＧＣＣＴＧＣＧＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＧＡＡＧＣＣＴＣＡＣＡＧＡＧＡＴＣＴＴＧＡＡＡＧＧＡＧＧＧＧＴＣＴＴＧＡＴＣＣＡＧＣＧＧＡＡＣＣＣＣＣＡＧＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣＡＧＧＡＣＡＣＧＡＴＴＴＴＧＴＧＧＡＡＧＧＡＣＡＴＣＴＴＣＣＡＣＡＡＧＡＡＣＡＡＣＣＡＧＣＴＧＧＣＴＣＴＣＡＣＡＣＴＧＡＴＡＧＡＣＡＣＣＡＡＣＣＧＣＴＣＴＣＧＧＧＣＣＴＧＣＣＡＣＣＣＣＴＧＴＴＣＴＣＣＧＡＴＧＴＧＴＡＡＧＧＧＣＴＣＣＣＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＡＧＡＧＡＧＴＴＣＴＧＡＧＧＡＴＴＧＴＣＡＧＡＧＣＣＴＧＡＣＧＣＧＣＡＣＴＧＴＣＴＧＴＧＣＣＧＧＴＧＧＣＴＧＴＧＣＣＣＧＣＴＧＣＡＡＧＧＧＧＣＣＡＣＴＧＣＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＣＴＧＣＣＡＴＧＡＧＣＡＧＴＧＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＴＧＣＡＣＧＧＧＣＣＣＣＡＡＧＣＡＣＴＣＴＧＡＣＴＧＣＣＴＧＧＣＣＴＧＣＣＴＣＣＡＣＴＴＣＡＡＣＣＡＣＡＧＴＧＧＣＡＴＣＴＧＴＧＡＧＣＴＧＣＡＣＴＧＣＣＣＡＧＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＴＡＣＡＡＣＡＣＡＧＡＣＡＣＧＴＴＴＧＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＣＡＡＴＣＣＣＧＡＧＧＧＣＣＧＧＴＡＴＡＣＡＴＴＣＧＧＣＧＣＣＡＧＣＴＧＴＧＴＧＡＣＴＧＣＣＴＧＴＣＣＣＴＡＣＡＡＣＴＡＣＣＴＴＴＣＴＡＣＧＧＡＣＧＴＧＧＧＡＴＣＣＴＧＣＡＣＣＣＴＣＧＴＣＴＧＣＣＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＡＧＡＧＧＴＧＡＣＡＧＣＡＧＡＧＧＡＴＧＧＡＡＣＡＣＡＧＣＧＧＴＧＴＧＡＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＣＴＧＴＧＣＣＣＧＡＧＴＧＴＧＣＴＡＴＧＧＴＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＡＧＣＡＣＴＴＧＣＧＡＧＡＧＧＴＧＡＧＧＧＣＡＧＴＴＡＣＣＡＧＴＧＣＣＡＡＴＡＴＣＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＣＴＧＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＴＴＧＧＧＡＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＴＣＴＧＣＣＧＧＡＧＡＧＣＴＴＴＧＡＴＧＧＧＧＡＣＣＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＣＡＣＴＧＣＣＣＣＧＣＴＣＣＡＧＣＣＡＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＴＧＴＴＴＧＡＧＡＣＴＣＴＧＧＡＡＧＡＧＡＴＣＡＣＡＧＧＴＴＡＣＣＴＡＴＡＣＡＴＣＴＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＧＧＡＣＡＧＣＣＴＧＣＣＴＧＡＣＣＴＣＡＧＣＧＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＧＣＡＡＧＴＡＡＴＣＣＧＧＧＧＡＣＧＡＡＴＴＣＴＧＣＡＣＡＡＴＧＧＣＧＣＣＴＡＣＴＣＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＣＡＡＧＧＧＣＴＧＧＧＣＡＴＣＡＧＣＴＧＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＧＡＡＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＧＡＣＴＧＧＣＣＣＴＣＡＴＣＣＡＣＣＡＴＡＡＣＡＣＣＣＡＣＣＴＣＴＧＣＴＴＣＧＴＧＣＡＣＡＣＧＧＴＧＣＣＣＴＧＧＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＴＴＣＧＧＡＡＣＣＣＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＣＴＧＣＴＣＣＡＣＡＣＴＧＣＣＡＡＣＣＧＧＣＣＡＧＡＧＧＡＣＧＡＧＴＧＴＧＴＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＴＧＧＣＣＴＧＣＣＡＣＣＡＧＣＴＧＴＧＣＧＣＣＣＧＡＧＧＧＣＡＣＴＧＣＴＧＧＧＧＴＣＣＡＧＧＧＣＣＣＡＣＣＣＡＧＴＧＴＧＴＣＡＡＣＴＧＣＡＧＣＣＡＧＴＴＣＣＴＴＣＧＧＧＧＣＣＡＧＧＡＧＴＧＣＧＴＧＧＡＧＧＡＡＴＧＣＣＧＡＧＴＡＣＴＧＣＡＧＧＧＧＣＴＣＣＣＣＡＧＧＧＡＧＴＡＴＧＴＧＡＡＴＧＣＣＡＧＧＣＡＣＴＧＴＴＴＧＣＣＧＴＧＣＣＡＣＣＣＴＧＡＧＴＧＴＣＡＧＣＣＣＣＡＧＡＡＴＧＧＣＴＣＡＧＴＧＡＣＣＴＧＴＴＴＴＧＧＡＣＣＧＧＡＧＧＣＴＧＡＣＣＡＧＴＧＴＧＴＧＧＣＣＴＧＴＧＣＣＣＡＣＴＡＴＡＡＧＧＡＣＣＣＴＣＣＣＴＴＣＴＧＣＧＴＧＧＣＣＣＧＣＴＧＣＣＣＣＡＧＣＧＧＴＧＴＧＡＡＡＣＣＴＧＡＣＣＴＣＴＣＣＴＡＣＡＴＧＣＣＣＡＴＣＴＧＧＡＡＧＴＴＴＣＣＡＧＡＴＧＡＧＧＡＧＧＧＣＧＣＡＴＧＣＣＡＧＣＣＴＴＧＣＣＣＣＡＴＣＡＡＣＴＧＣＡＣＣＣＡＣＴＣＣＴＧＴＧＴＧＧＡＣＣＴＧＧＡＴＧＡＣＡＡＧＧＧＣＴＧＣＣＣＣＧＣＣＧＡＧＣＡＧＡＧＡＧＣＣＡＧＣＣＣＴＣＴＧＡＣＧＴＣＣＡＴＣＧＴＣＴＣＴＧＣＧＧＴＧＧＴＴＧＧＣＡＴＴＣＴＧＣＴＧＧＴＣＧＴＧＧＴＣＴＴＧＧＧＧＧＴＧＧＴＣＴＴＴＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＣＡＡＧＣＧＡＣＧＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧＡＴＣＣＧＧＡＡＧＴＡＣＡＣＧＡＴＧＣＧＧＡＧＡＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＡＡＡＣＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＣＣＧＣＴＧＡＣＡＣＣＴＡＧＣＧＧＡＧＣＧＡＴＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＧＣＧＣＡＧＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＧＡＡＡＧＡＧＡＣＧＧＡＧＣＴＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＴＧＧＣＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＡＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＴＣＣＡＧＴＧＧＣＣＡＴＣＡＡＡＧＴＧＴＴＧＡＧＧＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴＣＣＣＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＣＴＴＡＧＡＣＧＡＡＧＣＡＴＡＣＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＣＴＣＣＣＣＡＴＡＴＧＴＣＴＣＣＣＧＣＣＴＴＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＴＧＧＣＴＧＣＣＴＣＴＴＡＧＡＣＣＡＴＧＴＣＣＧＧＧＡＡＡＡＣＣＧＣＧＧＡＣＧＣＣＴＧＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣＴＧＧＴＧＴＡＴＧＣＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＴＧＴＧＣＧＧＣＴＣＧＴＡＣＡＣＡＧＧＧＡＣＴＴＧＧＣＣＧＣＴＣＧＧＡＡＣＧＴＧＣＴＧＧＴＣＡＡＧＡＧＴＣＣＣＡＡＣＣＡＴＧＴＣＡＡＡＡＴＴＡＣＡＧＡＣＴＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＣＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡＡＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＴＣＣＡＴＴＣＴＣＣＧＣＣＧＧＣＧＧＴＴＣＡＣＣＣＡＣＣＡＧＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＴＴＡＴＧＧＴＧＴＧＡＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＧＣＣＡＡＡＣＣＴＴＡＣＧＡＴＧＧＧＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＴＧＧＡＡＡＡＧＧＧＧＧＡＧＣＧＧＣＴＧＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＣＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＴＡＣＡＴＧＡＴＣＡＴＧＧＴＣＡＡＡＴＧＴＴＧＧＡＴＧＡＴＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＴＣＧＧＣＣＡＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＡＧＴＴＧＧＴＧＴＣＴＧＡＡＴＴＣＴＣＣＣＧＣＡＴＧＧＣＣＡＧＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＣＧＣＴＴＴＧＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＧＡＡＴＧＡＧＧＡＣＴＴＧＧＧＣＣＣＡＧＣＣＡＧＴＣＣＣＴＴＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＴＣＴＡＣＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＴＧＧＧＧＧＡＣＣＴＧＧＴＧＧＡＴＧＣＴＧＡＧＧＡＧＴＡＴＣＴＧＧＴＡＣＣＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＴＴＣＴＴＣＴＧＴＣＣＡＧＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＧＧＧＣＧＣＴＧＧＧＧＧＣＡＴＧＧＴＣＣＡＣＣＡＣＡＧＧＣＡＣＣＧＣＡＧＣＴＣＡＴＣＴＡＣＣＡＧＧＡＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＧＧＡＣＣＴＧＡＣＡＣＴＡＧＧＧＣＴＧＧＡＧＣＣＣＴＣＴＧＡＡＧＡＧＧＡＧＧＣＣＣＣＣＡＧＧＴＣＴＣＣＡＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＧＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＣＧＡＴＧＴＡＴＴＴＧＡＴＧＧＴＧＡＣＣＴＧＧＧＡＡＴＧＧＧＧＧＣＡＧＣＣＡＡＧＧＧＧＣＴＧＣＡＡＡＧＣＣＴＣＣＣＣＡＣＡＣＡＴＧＡＣＣＣＣＡＧＣＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＧＧＴＡＣＡＧＴＧＡＧＧＡＣＣＣＣＡＣＡＧＴＡＣＣＣＣＴＧＣＣＣＴＣＴＧＡＧＡＣＴＧＡＴＧＧＣＴＡＣＧＴＴＧＣＣＣＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＣＣＡＧＣＣＴＧＡＡＴＡＴＧＴＧＡＡＣＣＡＧＣＣＡＧＡＴＧＴＴＣＧＧＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＴＴＣＧＣＣＣＣＧＡＧＡＧＧＧＣＣＣＴＣＴＧＣＣＴＧＣＴＧＣＣＣＧＡＣＣＴＧＣＴＧＧＴＧＣＣＡＣＴＣＴＧＧＡＡＡＧＧＧＣＣＡＡＧＡＣＴＣＴＣＴＣＣＣＣＡＧＧＧＡＡＧＡＡＴＧＧＧＧＴＣＧＴＣＡＡＡＧＡＣＧＴＴＴＴＴＧＣＣＴＴＴＧＧＧＧＧＴＧＣＣＧＴＧＧＡＧＡＡＣＣＣＣＧＡＧＴＡＣＴＴＧＡＣＡＣＣＣＣＡＧＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＣＣＣＣＴＣＡＧＣＣＣＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣＣＴＧＣＣＴＴＣＡＧＣＣＣＡＧＣＣＴＴＣＧＡＣＡＡＣＣＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＧＧＡＣＣＡＧＧＡＣＣＣＡＣＣＡＧＡＧＣＧＧＧＧＧＧＣＴＣＣＡＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＴＣＡＡＡＧＧＧＡＣＡＣＣＴＡＣＧＧＣＡＧＡＧＡＡＣＣＣＡＧＡＧＴＡＣＣＴＧＧＧＴＣＴＧＧＡＣＧＴＧＣＣＡＧＴＧＴＧＡＡＣＣＡＧＡＡＧＧＣＣＡＡＧＴＣＣＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＴＧＡ（配列番号：４９）である。
【０１２８】
別の実施形態では、ヒトＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＥＣ１断片をコードする核酸配列は、ヒトのＥＣ１領域の１２０〜５１０ｂｐにわたるキメラ内に組み入れられ、（配列番号：５０）で示される。
【０１２９】
ＧＡＧＡＣＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＣＴＣＣＧＣＣＡＣＣＴＣＴＡＣＣＡＧＧＧＣＴＧＣＣＡＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧＧＧＡＡＡＣＣＴＧＧＡＡＣＴＣＡＣＣＴＡＣＣＴＧＣＣＣＡＣＣＡＡＴＧＣＣＡＧＣＣＴＧＴＣＣＴＴＣＣＴＧＣＡＧＧＡＴＡＴＣＣＡＧＧＡＧＧＴＧＣＡＧＧＧＣＴＡＣＧＴＧＣＴＣＡＴＣＧＣＴＣＡＣＡＡＣＣＡＡＧＴＧＡＧＧＣＡＧＧＴＣＣＣＡＣＴＧＣＡＧＡＧＧＣＴＧＣＧＧＡＴＴＧＴＧＣＧＡＧＧＣＡＣＣＣＡＧＣＴＣＴＴＴＧＡＧＧＡＣＡＡＣＴＡＴＧＣＣＣＴＧＧＣＣＧＴＧＣＴＡＧＡＣＡＡＴＧＧＡＧＡＣＣＣＧＣＴＧＡＡＣＡＡＴＡＣＣＡＣＣＣＣＴＧＴＣＡＣＡＧＧＧＧＣＣＴＣＣＣＣＡＧＧＡＧＧＣＣＴＧＣＧＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＧＡＡＧＣＣＴＣＡＣＡＧＡＧＡＴＣＴＴＧＡＡＡＧＧＡＧＧＧＧＴＣＴＴＧＡＴＣＣＡＧＣＧＧＡＡＣＣＣＣＣＡＧＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣＡＧＧＡＣＡＣＧＡＴＴＴＴＧＴＧＧＡＡＧ（配列番号：５０）。
【０１３０】
一実施形態では、完全なＥＣ１ヒトＨＥＲ２／ｎｅｕ断片は（ヒトのＨＥＲ２／ｎｅｕ遺伝子の５８〜９７９ｂｐ）にわたり、（配列番号：５４）で示される。
【０１３１】
ＧＣＣＧＣＧＡＧＣＡＣＣＣＡＡＧＴＧＴＧＣＡＣＣＧＧＣＡＣＡＧＡＣＡＴＧＡＡＧＣＴＧＣＧＧＣＴＣＣＣＴＧＣＣＡＧＴＣＣＣＧＡＧＡＣＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＣＴＣＣＧＣＣＡＣＣＴＣＴＡＣＣＡＧＧＧＣＴＧＣＣＡＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧＧＧＡＡＡＣＣＴＧＧＡＡＣＴＣＡＣＣＴＡＣＣＴＧＣＣＣＡＣＣＡＡＴＧＣＣＡＧＣＣＴＧＴＣＣＴＴＣＣＴＧＣＡＧＧＡＴＡＴＣＣＡＧＧＡＧＧＴＧＣＡＧＧＧＣＴＡＣＧＴＧＣＴＣＡＴＣＧＣＴＣＡＣＡＡＣＣＡＡＧＴＧＡＧＧＣＡＧＧＴＣＣＣＡＣＴＧＣＡＧＡＧＧＣＴＧＣＧＧＡＴＴＧＴＧＣＧＡＧＧＣＡＣＣＣＡＧＣＴＣＴＴＴＧＡＧＧＡＣＡＡＣＴＡＴＧＣＣＣＴＧＧＣＣＧＴＧＣＴＡＧＡＣＡＡＴＧＧＡＧＡＣＣＣＧＣＴＧＡＡＣＡＡＴＡＣＣＡＣＣＣＣＴＧＴＣＡＣＡＧＧＧＧＣＣＴＣＣＣＣＡＧＧＡＧＧＣＣＴＧＣＧＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＧＡＡＧＣＣＴＣＡＣＡＧＡＧＡＴＣＴＴＧＡＡＡＧＧＡＧＧＧＧＴＣＴＴＧＡＴＣＣＡＧＣＧＧＡＡＣＣＣＣＣＡＧＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣＡＧＧＡＣＡＣＧＡＴＴＴＴＧＴＧＧＡＡＧＧＡＣＡＴＣＴＴＣＣＡＣＡＡＧＡＡＣＡＡＣＣＡＧＣＴＧＧＣＴＣＴＣＡＣＡＣＴＧＡＴＡＧＡＣＡＣＣＡＡＣＣＧＣＴＣＴＣＧＧＧＣＣＴＧＣＣＡＣＣＣＣＴＧＴＴＣＴＣＣＧＡＴＧＴＧＴＡＡＧＧＧＣＴＣＣＣＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＡＧＡＧＡＧＴＴＣＴＧＡＧＧＡＴＴＧＴＣＡＧＡＧＣＣＴＧＡＣＧＣＧＣＡＣＴＧＴＣＴＧＴＧＣＣＧＧＴＧＧＣＴＧＴＧＣＣＣＧＣＴＧＣＡＡＧＧＧＧＣＣＡＣＴＧＣＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＣＴＧＣＣＡＴＧＡＧＣＡＧＴＧＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＴＧＣＡＣＧＧＧＣＣＣＣＡＡＧＣＡＣＴＣＴＧＡＣＴＧＣＣＴＧＧＣＣＴＧＣＣＴＣＣＡＣＴＴＣＡＡＣＣＡＣＡＧＴＧＧＣＡＴＣＴＧＴＧＡＧＣＴＧＣＡＣＴＧＣＣＣＡＧＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＴＡＣＡＡＣＡＣＡＧＡＣＡＣＧＴＴＴＧＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＣＡＡＴＣＣＣＧＡＧＧＧＣＣＧＧＴＡＴＡＣＡＴＴＣＧＧＣＧＣＣＡＧＣＴＧＴＧＴＧＡＣＴＧＣＣＴＧＴＣＣＣＴＡＣＡＡＣＴＡＣＣＴＴＴＣＴＡＣＧＧＡＣＧＴＧＧＧＡＴＣＣＴＧＣＡＣＣＣＴＣＧＴＣＴＧＣＣＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＡＧＡＧＧＴＧＡＣＡＧＣＡＧＡＧＧＡＴ（配列番号：５４）。
【０１３２】
別の実施形態では、ヒトのＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＥＣ２断片をコードする核酸配列は、ヒトのＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＥＣ２断片の１０７７〜１５５４ｂｐにわたるキメラ内に組み入れられかつ５０ｂｐの延長部を含み、（配列番号：５１）で示される。
【０１３３】
ＡＡＴＡＴＣＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＣＴＧＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＴＴＧＧＧＡＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＴＣＴＧＣＣＧＧＡＧＡＧＣＴＴＴＧＡＴＧＧＧＧＡＣＣＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＣＡＣＴＧＣＣＣＣＧＣＴＣＣＡＧＣＣＡＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＴＧＴＴＴＧＡＧＡＣＴＣＴＧＧＡＡＧＡＧＡＴＣＡＣＡＧＧＴＴＡＣＣＴＡＴＡＣＡＴＣＴＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＧＧＡＣＡＧＣＣＴＧＣＣＴＧＡＣＣＴＣＡＧＣＧＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＧＣＡＡＧＴＡＡＴＣＣＧＧＧＧＡＣＧＡＡＴＴＣＴＧＣＡＣＡＡＴＧＧＣＧＣＣＴＡＣＴＣＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＣＡＡＧＧＧＣＴＧＧＧＣＡＴＣＡＧＣＴＧＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＧＡＡＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＧＡＣＴＧＧＣＣＣＴＣＡＴＣＣＡＣＣＡＴＡＡＣＡＣＣＣＡＣＣＴＣＴＧＣＴＴＣＧＴＧＣＡＣＡＣＧＧＴＧＣＣＣＴＧＧＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＴＴＣＧＧＡＡＣＣＣＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＣＴＧＣＴＣＣＡＣＡＣＴＧＣＣＡＡＣＣＧＧＣＣＡＧＡＧＧＡＣＧＡＧＴＧＴＧＴＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＴＧＧＣＣＴＧＣＣＡＣＣＡＧＣＴＧＴＧＣＧＣＣＣＧＡＧＧＧ（配列番号：５１）。
【０１３４】
一実施形態では、完全なＥＣ２ヒトＨＥＲ２／ｎｅｕ断片はヒトのＨＥＲ２／ｎｅｕ遺伝子の９０７〜１５０４ｂｐにわたり、（配列番号：５５）で示される。
【０１３５】
ＴＡＣＣＴＴＴＣＴＡＣＧＧＡＣＧＴＧＧＧＡＴＣＣＴＧＣＡＣＣＣＴＣＧＴＣＴＧＣＣＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＡＧＡＧＧＴＧＡＣＡＧＣＡＧＡＧＧＡＴＧＧＡＡＣＡＣＡＧＣＧＧＴＧＴＧＡＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＣＴＧＴＧＣＣＣＧＡＧＴＧＴＧＣＴＡＴＧＧＴＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＡＧＣＡＣＴＴＧＣＧＡＧＡＧＧＴＧＡＧＧＧＣＡＧＴＴＡＣＣＡＧＴＧＣＣＡＡＴＡＴＣＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＣＴＧＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＴＴＧＧＧＡＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＴＣＴＧＣＣＧＧＡＧＡＧＣＴＴＴＧＡＴＧＧＧＧＡＣＣＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＣＡＣＴＧＣＣＣＣＧＣＴＣＣＡＧＣＣＡＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＴＧＴＴＴＧＡＧＡＣＴＣＴＧＧＡＡＧＡＧＡＴＣＡＣＡＧＧＴＴＡＣＣＴＡＴＡＣＡＴＣＴＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＧＧＡＣＡＧＣＣＴＧＣＣＴＧＡＣＣＴＣＡＧＣＧＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＧＣＡＡＧＴＡＡＴＣＣＧＧＧＧＡＣＧＡＡＴＴＣＴＧＣＡＣＡＡＴＧＧＣＧＣＣＴＡＣＴＣＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＣＡＡＧＧＧＣＴＧＧＧＣＡＴＣＡＧＣＴＧＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＧＡＡＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＧＡＣＴＧＧＣＣＣＴＣＡＴＣＣＡＣＣＡＴＡＡＣＡＣＣＣＡＣＣＴＣＴＧＣＴＴＣＧＴＧＣＡＣＡＣＧＧＴＧＣＣＣＴＧＧＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＴＴＣＧＧＡＡＣＣＣＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＣＴＧＣＴＣＣＡＣＡＣＴＧＣＣＡＡＣＣＧＧＣＣＡＧＡＧ（配列番号：５５）。
【０１３６】
別の実施形態では、ヒトのＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＩＣ１断片をコードする核酸配列は（配列番号：５２）で示されるキメラ内に組み入れられる。
【０１３７】
ＣＡＧＣＡＧＡＡＧＡＴＣＣＧＧＡＡＧＴＡＣＡＣＧＡＴＧＣＧＧＡＧＡＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＡＡＡＣＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＣＣＧＣＴＧＡＣＡＣＣＴＡＧＣＧＧＡＧＣＧＡＴＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＧＣＧＣＡＧＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＧＡＡＡＧＡＧＡＣＧＧＡＧＣＴＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＴＧＧＣＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＡＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＴＣＣＡＧＴＧＧＣＣＡＴＣＡＡＡＧＴＧＴＴＧＡＧＧＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴＣＣＣＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＣＴＴＡＧＡＣＧＡＡＧＣＡＴＡＣＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＣＴＣＣＣＣＡＴＡＴＧＴＣＴＣＣＣＧＣＣＴＴＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＴＧＧＣＴＧＣＣＴＣＴＴＡＧＡＣＴ（配列番号：５２）。
【０１３８】
別の実施形態では、完全なヒトのＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＩＣ１断片をコードする核酸配列は、ヒトのＨＥＲ２／ｎｅｕ遺伝子の２０３４〜３２４３にわたり、（配列番号：５６）で示される。
【０１３９】
ＣＡＧＣＡＧＡＡＧＡＴＣＣＧＧＡＡＧＴＡＣＡＣＧＡＴＧＣＧＧＡＧＡＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＡＡＡＣＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＣＣＧＣＴＧＡＣＡＣＣＴＡＧＣＧＧＡＧＣＧＡＴＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＧＣＧＣＡＧＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＧＡＡＡＧＡＧＡＣＧＧＡＧＣＴＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＴＧＧＣＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＡＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＴＣＣＡＧＴＧＧＣＣＡＴＣＡＡＡＧＴＧＴＴＧＡＧＧＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴＣＣＣＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＣＴＴＡＧＡＣＧＡＡＧＣＡＴＡＣＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＣＴＣＣＣＣＡＴＡＴＧＴＣＴＣＣＣＧＣＣＴＴＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＴＧＧＣＴＧＣＣＴＣＴＴＡＧＡＣＣＡＴＧＴＣＣＧＧＧＡＡＡＡＣＣＧＣＧＧＡＣＧＣＣＴＧＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣＴＧＧＴＧＴＡＴＧＣＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＴＧＴＧＣＧＧＣＴＣＧＴＡＣＡＣＡＧＧＧＡＣＴＴＧＧＣＣＧＣＴＣＧＧＡＡＣＧＴＧＣＴＧＧＴＣＡＡＧＡＧＴＣＣＣＡＡＣＣＡＴＧＴＣＡＡＡＡＴＴＡＣＡＧＡＣＴＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＣＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡＡＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＴＣＣＡＴＴＣＴＣＣＧＣＣＧＧＣＧＧＴＴＣＡＣＣＣＡＣＣＡＧＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＴＴＡＴＧＧＴＧＴＧＡＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＧＣＣＡＡＡＣＣＴＴＡＣＧＡＴＧＧＧＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＴＧＧＡＡＡＡＧＧＧＧＧＡＧＣＧＧＣＴＧＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＣＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＴＡＣＡＴＧＡＴＣＡＴＧＧＴＣＡＡＡＴＧＴＴＧＧＡＴＧＡＴＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＴＣＧＧＣＣＡＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＡＧＴＴＧＧＴＧＴＣＴＧＡＡＴＴＣＴＣＣＣＧＣＡＴＧＧＣＣＡＧＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＣＧＣＴＴＴＧＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＧＡＡＴＧＡＧＧＡＣＴＴＧＧＧＣＣＣＡＧＣＣＡＧＴＣＣＣＴＴＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＴＣＴＡＣＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＴＧＧＧＧＧＡＣＣＴＧＧＴＧＧＡＴＧＣＴＧＡＧＧＡＧＴＡＴＣＴＧＧＴＡＣＣＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＴＴＣＴＴＣＴＧＴＣＣＡＧＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＧＧＧＣＧＣＴＧＧＧＧＧＣＡＴＧＧＴＣＣＡＣＣＡＣＡＧＧＣＡＣＣＧＣＡＧＣＴＣＡＴＣＴＡＣＣＡＧＧＡＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＧＧＡＣＣＴＧＡＣＡＣＴＡＧＧＧＣＴＧＧＡＧＣＣＣＴＣＴＧＡＡＧＡＧＧＡＧＧＣＣＣＣＣＡＧＧＴＣＴＣＣＡＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＧＡＡＧＧＧＧＣＴ（配列番号：５６）。
【０１４０】
一実施形態では、本明細書に提供される方法および組成物で利用されるＬＬＯは、リステリアＬＬＯである。一実施形態では、ＬＬＯが由来するリステリアはリステリア・モノサイトゲネス（ＬＭ）である。別の実施形態では、リステリアはリステリア・イバノビである。別の実施形態では、リステリアはリステリア・ウェルシメリである。別の実施形態では、リステリアはリステリア・シーリゲリである。別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質は、非リステリア系ＬＬＯタンパク質である。別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質は、合成ＬＬＯタンパク質である。別の実施形態では、これは組み換え型ＬＬＯタンパク質である。
【０１４１】
一実施形態では、ＬＬＯタンパク質は、（配列番号：３）に示される以下の核酸配列によってコードされる。 
【０１４２】
ａｔｇａａａａａａａｔａａｔｇｃｔａｇｔｔｔｔｔａｔｔａｃａｃｔｔａｔａｔｔａｇｔｔａｇｔｃｔａｃｃａａｔｔｇｃｇｃａａｃａａａｃｔｇａａｇｃａａａｇｇａｔｇｃａｔｃｔｇｃａｔｔｃａａｔａａａｇａａａａｔｔｃａａｔｔｔｃａｔｃｃａｔｇｇｃａｃｃａｃｃａｇｃａｔｃｔｃｃｇｃｃｔｇｃａａｇｔｃｃｔａａｇａｃｇｃｃａａｔｃｇａａａａｇａａａｃａｃｇｃｇｇａｔｇａａａｔｃｇａｔａａｇｔａｔａｔａｃａａｇｇａｔｔｇｇａｔｔａｃａａｔａａａａａｃａａｔｇｔａｔｔａｇｔａｔａｃｃａｃｇｇａｇａｔｇｃａｇｔｇａｃａａａｔｇｔｇｃｃｇｃｃａａｇａａａａｇｇｔｔａｃａａａｇａｔｇｇａａａｔｇａａｔａｔａｔｔｇｔｔｇｔｇｇａｇａａａａａｇａａｇａａａｔｃｃａｔｃａａｔｃａａａａｔａａｔｇｃａｇａｃａｔｔｃａａｇｔｔｇｔｇａａｔｇｃａａｔｔｔｃｇａｇｃｃｔａａｃｃｔａｔｃｃａｇｇｔｇｃｔｃｔｃｇｔａａａａｇｃｇａａｔｔｃｇｇａａｔｔａｇｔａｇａａａａｔｃａａｃｃａｇａｔｇｔｔｃｔｃｃｃｔｇｔａａａａｃｇｔｇａｔｔｃａｔｔａａｃａｃｔｃａｇｃａｔｔｇａｔｔｔｇｃｃａｇｇｔａｔｇａｃｔａａｔｃａａｇａｃａａｔａａａａｔａｇｔｔｇｔａａａａａａｔｇｃｃａｃｔａａａｔｃａａａｃｇｔｔａａｃａａｃｇｃａｇｔａａａｔａｃａｔｔａｇｔｇｇａａａｇａｔｇｇａａｔｇａａａａａｔａｔｇｃｔｃａａｇｃｔｔａｔｃｃａａａｔｇｔａａｇｔｇｃａａａａａｔｔｇａｔｔａｔｇａｔｇａｃｇａａａｔｇｇｃｔｔａｃａｇｔｇａａｔｃａｃａａｔｔａａｔｔｇｃｇａａａｔｔｔｇｇｔａｃａｇｃａｔｔｔａａａｇｃｔｇｔａａａｔａａｔａｇｃｔｔｇａａｔｇｔａａａｃｔｔｃｇｇｃｇｃａａｔｃａｇｔｇａａｇｇｇａａａａｔｇｃａａｇａａｇａａｇｔｃａｔｔａｇｔｔｔｔａａａｃａａａｔｔｔａｃｔａｔａａｃｇｔｇａａｔｇｔｔａａｔｇａａｃｃｔａｃａａｇａｃｃｔｔｃｃａｇａｔｔｔｔｔｃｇｇｃａａａｇｃｔｇｔｔａｃｔａａａｇａｇｃａｇｔｔｇｃａａｇｃｇｃｔｔｇｇａｇｔｇａａｔｇｃａｇａａａａｔｃｃｔｃｃｔｇｃａｔａｔａｔｃｔｃａａｇｔｇｔｇｇｃｇｔａｔｇｇｃｃｇｔｃａａｇｔｔｔａｔｔｔｇａａａｔｔａｔｃａａｃｔａａｔｔｃｃｃａｔａｇｔａｃｔａａａｇｔａａａａｇｃｔｇｃｔｔｔｔｇａｔｇｃｔｇｃｃｇｔａａｇｃｇｇａａａａｔｃｔｇｔｃｔｃａｇｇｔｇａｔｇｔａｇａａｃｔａａｃａａａｔａｔｃａｔｃａａａａａｔｔｃｔｔｃｃｔｔｃａａａｇｃｃｇｔａａｔｔｔａｃｇｇａｇｇｔｔｃｃｇｃａａａａｇａｔｇａａｇｔｔｃａａａｔｃａｔｃｇａｃｇｇｃａａｃｃｔｃｇｇａｇａｃｔｔａｃｇｃｇａｔａｔｔｔｔｇａａａａａａｇｇｃｇｃｔａｃｔｔｔｔａａｔｃｇａｇａａａｃａｃｃａｇｇａｇｔｔｃｃｃａｔｔｇｃｔｔａｔａｃａａｃａａａｃｔｔｃｃｔａａａａｇａｃａａｔｇａａｔｔａｇｃｔｇｔｔａｔｔａａａａａｃａａｃｔｃａｇａａｔａｔａｔｔｇａａａｃａａｃｔｔｃａａａａｇｃｔｔａｔａｃａｇａｔｇｇａａａａａｔｔａａｃａｔｃｇａｔｃａｃｔｃｔｇｇａｇｇａｔａｃｇｔｔｇｃｔｃａａｔｔｃａａｃａｔｔｔｃｔｔｇｇｇａｔｇａａｇｔａａａｔｔａｔｇａｔ（配列番号：３）。
【０１４３】
別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質は、配列番号：４を含む。
【０１４４】
M  K  K  I  M  L  V  F  I  T  L  I  L  V  S  L  P  I  A  Q  Q  T  E  A  K  D  A  S  A  F  N  K  E  N  S  I  S  S  M  A  P  P  A  S  P  P  A  S  P  K  T  P  I  E  K  K  H  A  D  E  I  D  K  Y  I  Q  G  L  D  Y  N  K  N  N  V  L  V  Y  H  G  D  A  V  T  N  V  P  P  R  K  G  Y  K  D  G  N  E  Y  I  V  V  E  K  K  K  K  S  I  N  Q  N  N  A  D  I  Q  V  V  N  A  I  S  S  L  T  Y  P  G  A  L  V  K  A  N  S  E  L  V  E  N  Q  P  D  V  L  P  V  K  R  D  S  L  T  L  S  I  D  L  P  G  M  T  N  Q  D  N  K  I  V  V  K  N  A  T  K  S  N  V  N  N  A  V  N  T  L  V  E  R  W  N  E  K  Y  A  Q  A  Y  P  N  V  S  A  K  I  D  Y  D  D  E  M  A  Y  S  E  S  Q  L  I  A  K  F  G  T  A  F  K  A  V  N  N  S  L  N  V  N  F  G  A  I  S  E  G  K  M  Q  E  E  V  I  S  F  K  Q  I  Y  Y  N  V  N  V  N  E  P  T  R  P  S  R  F  F  G  K  A  V  T  K  E  Q  L  Q  A  L  G  V  N  A  E  N  P  P  A  Y  I  S  S  V  A  Y  G  R  Q  V  Y  L  K  L  S  T  N  S  H  S  T  K  V  K  A  A  F  D  A  A  V  S  G  K  S  V  S  G  D  V  E  L  T  N  I  I  K  N  S  S  F  K  A  V  I  Y  G  G  S  A  K  D  E  V  Q  I  I  D  G  N  L  G  D  L  R  D  I  L  K  K  G  A  T  F  N  R  E  T  P  G  V  P  I  A  Y  T  T  N  F  L  K  D  N  E  L  A  V  I  K  N  N  S  E  Y  I  E  T  T  S  K  A  Y  T  D  G  K  I  N  I  D  H  S  G  G  Y  V  A  Q  F  N  I  S  W  D  E  V  N  Y  D  （配列番号：４）。
【０１４５】
この配列に対応するタンパク質の最初の２５個のアミノ酸はシグナル配列であり、また細菌によって分泌されるときにＬＬＯから分割される。したがって、この実施形態では、全長の活性ＬＬＯタンパク質は５０４残基長である。別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質は、遺伝子銀行受入番号ＤＱ０５４５８８、ＤＱ０５４５８９、ＡＹ８７８６４９、Ｕ２５４５２、またはＵ２５４５２で示される配列を有する。別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質は、ＬＬＯタンパク質の変異体である。別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質は、ＬＬＯタンパク質の相同体である。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０１４６】
別の実施形態では、「切断ＬＬＯ」または「ｔＬＬＯ」は、ＰＥＳＴドメインを含むＬＬＯの断片を指す。別の実施形態では、この用語は、アミノ末端において活性化ドメインを含有せず、シスチン４８４を含まないＬＬＯ断片を指す。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はＰＥＳＴ配列から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はＰＥＳＴ配列を含む。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は５２９アミノ酸全長ＬＬＯタンパク質の最初のおよそ４００〜４４１アミノ酸から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はＬＬＯタンパク質の非溶血性の形態である。
【０１４７】
本発明の方法および組成物の別の実施形態では、本発明の方法および組成物の核酸配列によってコードされたポリペプチドは、キメラ型ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原および追加的なポリペプチドを含む融合タンパク質であり、一方で別の実施形態では、融合タンパク質は、とりわけリステリア・モノサイトゲネス非溶血性ＬＬＯタンパク質を含む（実施例が本明細書に含まれる）。
【０１４８】
一実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜２５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜５０から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜７５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜１００から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜１２５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜１５０から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜１７５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜２００から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜２２５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜２５０から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜２７５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜３００から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜３２５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜３５０から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜３７５から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜４００から構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はおよそ残基１〜４２５から構成される。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０１４９】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物の融合タンパク質は、ＬＬＯタンパク質由来または別の生物体（例えば、原核生物生命体など）由来のいずれかの、ＰＥＳＴ配列を含む。
【０１５０】
別の実施形態では、ＰＥＳＴアミノ酸配列は、別の実施形態では、配列番号：５〜９から選択される配列を有する。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列はリステリア・モノサイトゲネスＡｃｔＡタンパク質由来のＰＥＳＴ配列である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、ＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲ（配列番号：５）、ＫＡＳＶＴＤＴＳＥＧＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＴＰＱＰＬＫ（配列番号：６）、ＫＮＥＥＶＮＡＳＤＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲ（配列番号：７）、またはＲＧＧＩＰＴＳＥＥＦＳＳＬＮＳＧＤＦＴＤＤＥＮＳＥＴＴＥＥＥＩＤＲ（配列番号：８）である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、ストレプトコッカス種のストレプトリジンＯタンパク質由来である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、ストレプトコッカス・ピオゲネスストレプトリジンＯ、例えば、アミノ酸３５〜５１においてＫＱＮＴＡＳＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号：９）由来である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、ストレプトコッカス・エクイシミリスストレプトリジンＯ、例えば、アミノ酸３８〜５４においてＫＱＮＴＡＮＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号：１０）由来である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、原核生物に由来する別のＰＥＳＴアミノ酸配列である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、当該技術分野で既知の任意の他のＰＥＳＴ配列である。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０１５１】
一実施形態では、リステリア・モノサイトゲネスのＰＥＳＴ配列への抗原の融合は媒介した細胞および抗原の抗腫瘍免疫性を強化した。したがって、他の原核生物に由来する他のＰＥＳＴ配列への抗原の融合は、抗原の免疫原性も強化する。他の原核生物のＰＥＳＴ配列を、例えば、リステリア・モノサイトゲネスについてＲｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒおよびＲｏｇｅｒｓ（１９９６，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２１：２６７−２７１）に記述されているものなどの方法に従って同定することができる。あるいは、この方法に基づいて他の原核生物由来のＰＥＳＴアミノ酸配列を同定することもできる。ＰＥＳＴアミノ酸配列を含むことが期待される他の原核生物は、他のリステリア種を含むが、これに限定されない。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列は抗原タンパク質の中に埋め込まれる。したがって、別の実施形態では、「融合」は、抗原の一方の端部にリンクしているかまたは抗原の中に埋め込まれるかのどちらかで、抗原とＰＥＳＴアミノ酸配列との両方を含む抗原タンパク質を指す。
【０１５２】
別の実施形態では、本発明の組み換え型ポリペプチドを含むワクチンが本明細書に提供される。別の実施形態では、本発明の組み換え型ポリペプチドから構成されるワクチンが本明細書に提供される。
【０１５３】
別の実施形態では、本発明の組み換え型ポリペプチドをコードするヌクレオチド分子が本明細書に提供される。別の実施形態では、ヌクレオチド分子を含むワクチンが本明細書に提供される。
【０１５４】
別の実施形態では、本発明の組み換え型ポリペプチドをコードするヌクレオチド分子が本明細書に提供される。
【０１５５】
別の実施形態では、本発明のヌクレオチド分子によってコードされる組み換え型ポリペプチドが本明細書に提供される。
【０１５６】
別の実施形態では、本発明のヌクレオチド分子または組み換え型ポリペプチドを含むワクチンが本明細書に提供される。
【０１５７】
別の実施形態では、本発明のヌクレオチド分子または組み換え型ポリペプチドを含む免疫原性組成物が本明細書に提供される。
【０１５８】
別の実施形態では、本発明のヌクレオチド分子または組み換え型ポリペプチドを含むベクターが本明細書に提供される。
【０１５９】
別の実施形態では、本発明のヌクレオチド分子を含むリステリアの組み換え型形態が本明細書に提供される。
【０１６０】
別の実施形態では、本発明のリステリアの組み換え型の形態を含むワクチンが本明細書に提供される。
【０１６１】
別の実施形態では、本発明のリステリアの組み換え型形態のカルチャーが本明細書に提供される。
【０１６２】
一実施形態では、本発明の方法で使用するためのワクチンまたは組成物は組み換え型リステリア・モノサイトゲネスを、本明細書に記述されるような任意の形態または実施形態で含む。一実施形態では、本発明で使用するためのワクチンまたは組成物は本発明の組み換え型リステリア・モノサイトゲネスから、本明細書に記述されるような任意の形態または実施形態で構成される。別の実施形態では、本発明の方法で使用するためのワクチンまたは組成物は本発明の組み換え型リステリア・モノサイトゲネスから、本明細書に記述されるような任意の形態または実施形態で本質的に構成される。一実施形態では、「含む」という用語は組み換え型リステリア・モノサイトゲネスをワクチンまたは組成物の中に含むこと、ならびに当該技術分野で既知である場合がある他のワクチン、組成物、または処置を含むことを指す。別の実施形態では、「本質的に含む」という用語は、機能的な構成成分は組み換え型リステリア・モノサイトゲネスであるが、しかしながらワクチンの他の構成成分が含まれる場合があるワクチンを指し、他の構成成分はワクチンの治療的な効果に直接的に関与せず、例えば、組み換え型リステリア・モノサイトゲネスの効果を促進する（例えば、安定する、保存する、等々）構成成分を指す場合がある。別の実施形態では、「含む」という用語は、組み換え型リステリア・モノサイトゲネスを含有するワクチンを指す。
【０１６３】
一実施形態では、被験体におけるＨＥＲ２を発現する腫瘍からの転移性疾患の起因を妨げるまたは遅延する方法が本明細書に提供され、また別の実施形態では、この方法は本明細書に記述される組み換え型リステリアワクチン株を含む組成物を被験体に投与するステップを含む。
【０１６４】
別の実施形態では、本発明の方法は組み換え型リステリア・モノサイトゲネスを本明細書に記述されるような任意の形態または実施形態で投与するステップを含む。一実施形態では、本発明の方法は本発明の組み換え型リステリア・モノサイトゲネスを本明細書に記述されるような任意の形態または実施形態で投与するステップを含む。別の実施形態では、本発明の方法は本発明の組み換え型リステリア・モノサイトゲネスを本明細書に記述されるような任意の形態または実施形態で投与するステップを本質的に含む。一実施形態では、「含む」という用語は方法の中に組み換え型リステリア・モノサイトゲネスを投与するステップを含むこと、ならびに当該技術分野で既知である場合がある他の方法または処置を含むことを指す。別の実施形態では、「本質的に〜からなる」という用語は、その機能的な構成要素が組み換え型リステリア・モノサイトゲネスを投与することであるが、しかしながらこの方法の他のステップを含んでもよく、そのステップは、方法の治療的な効果に直接的に関与せず、例えば、組み換え型リステリア・モノサイトゲネスの投与の効果を促進するステップを指す場合がある、方法を指す。一実施形態では、「〜からなる」という用語は、追加的なステップを含まずに組み換え型リステリア・モノサイトゲネスを投与する方法を指す。
【０１６５】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物のリステリアはリステリア・モノサイトゲネスである。別の実施形態では、リステリアはリステリア・イバノビである。別の実施形態では、リステリアはリステリア・ウェルシメリである。別の実施形態では、リステリアはリステリア・シーリゲリである。各々のタイプのリステリアは本発明の別個の実施形態を表す。
【０１６６】
一実施形態では、本発明の方法および組成物のリステリア株はＡＤＸＳ３１−１６４株である。別の実施形態では、ＡＤＸＳ３１−１６４は、野生型ＦＶＢ／Ｎマウスからの脾細胞によってＩＦＮ−γの分泌を刺激する。さらに、本明細書に提示されたデータは、ＡＤＸＳ３１−１６４が抗ＨＥＲ２／ｎｅｕに特異的な免疫応答を標的化した抗原の異なるドメインに位置するヒトエピトープへと引き出すことができることを示す。
【０１６７】
別の実施形態では、本発明はＨＥＲ２キメラタンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド分子を含むリステリアの組み換え型形態を提供する。
【０１６８】
一実施形態では、融合タンパク質の２つの分子（ＬＬＯ、ＡｃｔＡ断片またはＰＥＳＴ配列および抗原）は、直接的に結合する。別の実施形態では、２つの分子は１つ以上のアミノ酸から構成される短いスペーサペプチドによって結合される。一実施形態では、スペーサは、タンパク質を結合すること、またはこれらの間の何らかの最低限の距離もしくは他の空間的関係を保持すること以外には特異的な生物活性を有しない。別の実施形態では、スペーサの構成アミノ酸は、フォールディング、正味荷電、または疎水性などの分子のいくつかの特性に影響を与えるように選択される。別の実施形態では、タンパク質の２つの分子（ＬＬＯ断片および抗原）は別個に合成される、または非融合される。別の実施形態では、タンパク質の２つの分子は同じ核酸から別個に合成される。さらに別の実施形態では、２つの分子は別個の核酸から個別に合成される。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０１６９】
一実施形態では、本明細書に提供される組み換え型ポリペプチドをコードする核酸は、シグナルペプチドまたは配列もコードする。別の実施形態では、本発明の方法および組成物の融合タンパク質はＬＬＯからのＬＬＯシグナル配列を含む。一実施形態では、異種抗原は、リステルアシグナル配列（例えば、溶血素シグナル配列またはＡｃｔＡシグナル配列）などのシグナル配列の使用を通して発現される場合がある。代替的には、例えば、融合タンパク質を作り出すことなく外来遺伝子をＬ．モノサイトゲネスプロモータから下流で発現することができる。別の実施形態では、シグナルペプチドは、細菌性（リステリア性または非リステリア性）である。一実施形態では、シグナルペプチドは、細菌に対してネイティブである。別の実施形態では、シグナルペプチドは、細菌に対して外来である。別の実施形態では、シグナルペプチドは、ｓｅｃＡ１シグナルペプチドなどのリステリア・モノサイトゲネスからのシグナルペプチドである。別の実施形態では、シグナルペプチドは、ラクトコッカス・ラクティスからのＵｓｐ４５シグナルペプチド、またはバチルス・アントラシスからの保護抗原シグナルペプチドである。別の実施形態では、シグナルペプチドは、ｐ６０シグナルペプチドなどの、リステリア・モノサイトゲネスからのｓｅｃＡ２シグナルペプチドである。さらに、組み換え型核酸分子は、任意選択的にｐ６０またはその断片をコードする第３のポリヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、シグナルペプチドは、バシラスサチリスＴａｔシグナルペプチドなどのＴａｔシグナルペプチド（例えば、ＰｈｏＤ）である。一実施形態では、シグナルペプチドは、組み換え型ポリペプチドをコードする同一の翻訳リーディングフレームである。
【０１７０】
別の実施形態では、被験体内に抗ＨＥＲ２免疫応答を誘発する方法であって、ＨＥＲ２キメラタンパク質に融合したまたはその断片に融合したＬＬＯタンパク質のＮ末端断片を含む組み換え型ポリペプチドをコードする組み換え型ヌクレオチドを被験体に投与することを含む方法が本明細書に提供され、これによって抗ＨＥＲ２免疫応答を被験体内に誘発する。
【０１７１】
一実施形態では、被験体におけるＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍に強化した免疫応答を引き出す方法が本明細書に提供され、一方で別の実施形態では、この方法は本明細書に提供される組み換え型リステリアワクチン株を含む組成物を被験体に投与することを含む。別の実施形態では、ＨＥＲ２を発現する腫瘍に対する免疫応答はＨＥＲ２タンパク質に対する準優占エピトープに対する免疫応答を含む。別の実施形態では、ＨＥＲ２を発現する腫瘍に対する免疫応答はＨＥＲ２タンパク質のいくつかの準優占エピトープに対する免疫応答を含む。別の実施形態では、ＨＥＲ２を発現する腫瘍に対する免疫応答はＨＥＲ２タンパク質の少なくとも１〜５個の準優占エピトープに対する免疫応答を含む。別の実施形態では、ＨＥＲ２を発現する腫瘍に対する免疫応答はＨＥＲ２タンパク質の少なくとも１〜１０個の準優占エピトープに対する免疫応答を含む。別の実施形態では、ＨＥＲ２を発現する腫瘍に対する免疫応答はＨＥＲ２タンパク質の少なくとも１〜１７個の準優占エピトープに対する免疫応答を含む。別の実施形態では、ＨＥＲ２を発現する腫瘍に対する免疫応答はＨＥＲ２タンパク質の少なくとも１７個の準優占エピトープに対する免疫応答を含む。
【０１７２】
小さい断片リステリアベースのワクチンまたはトラスツズマブ（ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原の細胞外領域に位置するエピトープに対するモノクローナル抗体）によってこれらの腫瘍が標的化されたとき、ガン遺伝子タンパク質ＨＥＲ２／ｎｅｕ内での点突然変異またはアミノ酸欠失が耐性腫瘍細胞の処置を媒介することが報告されている。ガン遺伝子のＭＨＣクラスＩエピトープのクラスターを示すＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原の２つの細胞外断片および１つの細胞内断片を寄生するキメラ型ＨＥＲ２／ｎｅｕベースの組成物が本明細書に記述される。ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原の３個のＨ２Ｄｑおよび少なくとも１７個のマッピングされたヒトのＭＨＣクラスＩエピトープを寄生する、このキメラタンパク質は、リステリア・モノサイトゲネスリステリオリシンＯタンパク質の最初の４４１のアミノ酸に融合し、リステリア・モノサイトゲネス弱毒化株ＬｍｄｄＡによって発現および分泌した。
【０１７３】
以前の報告は、ＨＥＲ２／ｎｅｕトランスジェニックマウスにＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原の小さい断片（その各々がＨＥＲ２／ｎｅｕガン遺伝子の１つのＨ２Ｄｑエピトープのみを寄生する）を発現し、分離して分泌するリステリアベースのワクチンを用いて免疫化したとき、ＨＥＲ２／ｎｅｕ過剰発現腫瘍は各々のワクチンによって標的化されたＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原のこれらのエピトープでの突然変異に起因してエスケープする可能性があることを示している（Ｓｉｎｇｈ  Ｒ，Ｐａｔｅｒｓｏｎ  Ｙ．Ｉｍｍｕｎｏｅｄｉｔｉｎｇ  ｓｃｕｌｐｔｓ  ｔｕｍｏｒ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００７；６７：１８８７−９２を参照）。キメラ型ワクチン内にＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質の３つ以上のエピトープが組み込まれたとき、これらの腫瘍の選択を除去し、エスケープ変異によってエスケープすることができるという予期しない結果が本明細書で実証された。新規のＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ型リステリアワクチンを用いた免疫化は、点突然変異またはアミノ酸欠失と関連付けられる可能性があるいかなるエスケープ変異もＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原内にもたらさない（本明細書の実施例４を参照）。
【０１７４】
一実施形態では、ＨＥＲ２キメラタンパク質またはキメラタンパク質を発現する組み換え型ポリペプチドを発現するためにリステリアワクチン株を改変する方法が本明細書に提供され、この方法は核酸分子を用いたリステリア株の形質転換を含む。別の実施形態では、核酸分子はポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、ポリペプチドはＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む。別の実施形態では、核酸分子は代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含み、前記代謝酵素は組み換え型リステリア株の染色体内で突然変異している内因性遺伝子を相補し、それによってＨＥＲ２キメラタンパク質を発現するためにリステリアワクチン株を改変する。
【０１７５】
一実施形態では、本明細書に提供される方法および組成物はさらにアジュバントを含み、一実施形態では、これは独立したアジュバントであり、一方で別の実施形態では、アジュバントまたは独立したアジュバントは、顆粒球性／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンＱＳ２１、モノホスホリルリピドＡ、またはメチル化されていないＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含む。別の実施形態では、アジュバントはアルミニウムアジュバント、フロイントアジュバント、ＭＰＬ、エマルション、ＳＢＡＳ２、免疫刺激性サイトカインをコードするヌクレオチド分子、細菌マイトジェン、または細菌毒素である。
【０１７６】
一実施形態では、「アジュバント」は抗原に対する免疫応答を増強および/または所望の免疫応答に向けてそれを調節する成分である。一実施形態では、アジュバントは免疫アジュバントであって、一実施形態では、特定のワクチン抗原と組み合わせて使用（併用）される場合に抗原特異的免疫応答を加速、延長、または増強するように作用する物質である。
【０１７７】
一実施形態では、「独立」アジュバントは、独立しているアジュバントであって、一実施形態では、一実施形態ではＨＥＲ２／ｎｅｕである腫瘍特異的抗原との融合ポリペプチドに存在する本発明の「追加的なアジュバントポリペプチド」と同一ではない。
【０１７８】
一実施形態では、本発明では、リステリア・モノサイトゲネスｄｅｌｔａ−ａｃｔＡ  ｍｕｔａｎｔ（Ｂｒｕｎｄａｇｅ  ｅｔ  ａｌ，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９０：１１８９０−１１８９４）、Ｌ．モノサイトゲネスｄｅｌｔａ−ｐｌｃＡ（Ｃａｍｉｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ、１９９１、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７３：７５１−７５４）、またはｄｅｌｔａ−ＡｃｔＡ、ｄｅｌｔａ  ＩＮＬ−ｂ（Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ５  ａｌ，２００４、ＰＮＡＳ、１０１：１３８３２−１３８３７）などの弱毒化リステリア株が使用される。別の実施形態では、弱毒化リステリア株は、本明細書の開示を装備するとき当業者であれば理解するとおり、１つ以上の弱毒化突然変異を導入することによって構築される。かかる株の例としては、芳香族アミノ酸に対する栄養要求性のリステリア株（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９３，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １０  ６１：２２４５−２２４８）およびリポタイコ酸の形成のための突然変異体（Ａｂａｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ，２００２，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３：１−１４）、および病毒性遺伝子を欠くことによって弱毒化されるもの（本明細書に含まれる実施例を参照）が挙げられるが、これに限定されない。
【０１７９】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物の核酸分子は、プロモータ／調節配列に動作可能にリンクする。別の実施形態では、本発明の方法および組成物の第１のオープンリーディングフレームは、プロモータ／調節配列に動作可能にリンクする。別の実施形態では、本発明の方法および組成物の第２のオープンリーディングフレームは、プロモータ／調節配列に動作可能にリンクする。別の実施形態では、本発明の方法および組成物の第３のオープンリーディングフレームは、プロモータ／調節配列に動作可能にリンクする。別の実施形態では、オープンリーディングフレームの各々は、プロモータ／調節配列に動作可能にリンクする。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０１８０】
本開示および本明細書に提供される方法が装備されたとき、異なる転写プロモータ、停止剤、キャリアベクター、または特異的な遺伝子配列（例えば、市販のクローニングベクター内のもの）を本発明の方法および組成物内で順調に使用することができることを当業者は容易に理解するであろう。本発明で意図されるように、これらの機能性は、例えば、ｐＵＣシリーズとして知られる市販のベクターで提供される。別の実施形態では、非必須ＤＮＡ配列（例えば、抗生物質抵抗性遺伝子）は除去される。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。別の実施形態では、本発明で市販のプラスミドが使用される。かかるプラスミドは、例えば、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（米国カリフォルニア州ラホヤ）、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（カリフォルニア州ラホヤ）、クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（カリフォルニア州パロアルト）などの様々な供給元から入手可能であり、または当該技術分野で周知の方法を使用して構築することができる。
【０１８１】
別の実施形態では、ｐＣＲ２．１（インビトロジェン，米国カリフォルニア州ラホヤ）などの、原核生物の複製起点およびプロモータ／調節要素を有する原核生物発現ベクターであるプラスミドは、原核生物内での本発明のポリペプチドの発現を容易にするために使用される。別の実施形態では、外来ヌクレオチド配列は、プラスミドのサイズを減少しかつその中に定置することができるカセットのサイズを増加するために除去される。
【０１８２】
かかる方法は当該技術分野で周知であり、また例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）およびＡｕｓｕｂｅｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ  ＆  Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に記述されている。
【０１８３】
抗生物質抵抗性遺伝子は、分子生物学およびワクチン調製で一般的に採用される従来の選択およびクローニングプロセスで使用される。本発明で企図される抗生物質抵抗性遺伝子としては、アンピシリン、ペニシリン、メチシリン、ストレプトマイシン、エリスロマイシン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール（ＣＡＴ）、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ゲンタマイシンおよび当該技術分野で周知の他のものに抵抗を与える遺伝子産物が挙げられるがこれらに限定されない。各々の遺伝子は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１８４】
細菌を形質転換する方法は当該技術分野で周知であり、塩化カルシウムコンピテント細胞に基づく方法、エレクトロポレーション法、バクテリオファージ媒介形質導入、化学的、および物理的な形質転換技術（ｄｅ  Ｂｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  １９８９，  Ｃｅｌｌ  ５６：６４１−６４９；  Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  １９９５，  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，  ９：１９０−１９９；  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．１９８９，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；  Ｇｅｒｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  １９９４，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  ＤＣ；  Ｍｉｌｌｅｒ，  １９９２，  Ａ  Ｓｈｏｒｔ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．）。別の実施形態では、本発明のリステリアワクチン株はエレクトロポレーションにより形質転換される。各々の方法は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１８５】
別の実施形態では、遺伝物質および／またはプラスミドを細菌の中へと導入するために結合が使用される。結合のための方法は当該技術分野で周知であり、また例えば、Ｎｉｋｏｄｉｎｏｖｉｃ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．（Ａ  ｓｅｃｏｎｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｎｐ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ［２］Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ［３］ｓｈｕｔｔｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ  ｔｈａｔ  ｉｓ  ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｂｌｅ  ｂｙ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ．Ｐｌａｓｍｉｄ．２００６  Ｎｏｖ；５６（３）：２２３−７）およびＡｕｃｈｔｕｎｇ  ＪＭ  ｅｔ  ａｌ  （Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｍｏｂｉｌｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｇｌｏｂａｌ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２００５  Ａｕｇ  ３０；１０２  （３５）：１２５５４−９）に記述されている。各々の方法は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１８６】
一実施形態では、「形質転換」という用語は、「形質移入」いう用語と同じ意味で使用され、プラスミドまたは他の異種ＤＮＡ分子を取り上げるために細菌細胞を改変することを指す。別の実施形態では、「形質転換」は、プラスミドまたは他の異種ＤＮＡ分子の遺伝子を発現するために細菌細胞を改変することを指す。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０１８７】
本発明で有用なプラスミドおよび他の発現ベクターは、本明細書のいずれかに記述され、プロモータ／調節配列、グラム陰性およびグラム陽性細菌に対する複製の起点、融合タンパク質をコードする孤立核酸、および分離されたアミノ酸代謝遺伝子をコードする核酸などの特徴を含むことができる。さらに、融合タンパク質およびアミノ酸代謝遺伝子をコードする孤立核酸は、かかる孤立核酸の発現を駆動するのに好適なプロモータを有する。細菌系で発現を駆動するために有用であるプロモータは当該技術分野で周知であり、またバクテリオファージλ、ｐＢＲ３２２のβラクタマーゼ遺伝子のｂｌａプロモータ、およびｐＢＲ３２５のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のＣＡＴプロモータを含む。原核生物プロモータのさらなる例として、５  バクテリオファージλの主要な右および左のプロモータ（ＰＬおよびＰＲ）、ｔｒｐ、ｒｅｃＡ、ｌａｃＺ、ｌａｄ、および［２］Ｅ．  ｃｏｌｉ［３］のｇａｌプロモータ、αアミラーゼ（Ｕｌｍａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ，  １９８５．  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １６２：１７６−１８２）およびＢ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓのＳ２８特異的プロモータ（Ｇｉｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，  １９８４  Ｇｅｎｅ  ３２：１１−  ２０）、Ｂａｃｉｌｌｕｓのバクテリオファージのプロモータ（Ｇｒｙｃｚａｎ，  １９８２，  Ｉｎ：  Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂａｃｉｌｌｉ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）およびストレプトミセスプロモータ（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ，  １９８６，  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２０３：４６８−４７８）が挙げられる。本発明において企図される追加的な原核生物プロモータは、例えば、（１９８７，  Ｊ．  Ｉｎｄ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１：２７７−２８２）；  Ｃｅｎａｔｉｅｍｐｏ，  （１９８６，  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，  ６８：５０５−５１６）；  ａｎｄ  Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，  （１９８４，  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｅｔ．１８：４１５−４４２）に概説されている。本発明で企図されるプロモータ／調節要素のさらなる実施例としては、リステリアのｐｒｆＡプロモータ、リステリア のｈｌｙプロモータ、リステリアのｐ６０プロモータ、およびリステリアのＡｃｔＡプロモータ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００３２１０）またはその断片が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８８】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物のプラスミドは、融合タンパク質をコードする遺伝子を含む。別の実施形態では、部分配列はクローニングされ、また適切な部分配列は適切な制限酵素を使用して分割される。別の実施形態では、次いで断片は連結され、望ましいＤＮＡ配列が生産される。別の実施形態では、抗原をコードするＤＮＡは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）などのＤＮＡ増幅法を使用して生産される。まず、未変性のＤＮＡのいずれかの側の新しい末端の区分を別個に増幅する。１つの増幅した配列の５’末端はペプチドリンカーをコードし、一方でもう１つの増幅した配列の３’末端もペプチドリンカーをコードする。第１の断片の５’末端は第２の断片の３’末端の相補なので、２つの断片を（例えば、ＬＭＰアガロース上での部分的な精製後）第３のＰＣＲ反応での重複テンプレートとして使用することができる。増幅した配列は、コドン、開放部位のカルボキシ側上の区分（ここではアミノ配列を形成している）、リンカー、および開放部位のアミノ側上の配列（ここではカルボキシル配列を形成している）を含有することになる。抗原はプラスミドへと連結される。各々の方法は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１８９】
別の実施形態では、本発明は臨床用途のためのファージベースの染色体組込系をさらに含む。ｄ−アラニンラセマーゼ（しかしこれに限定されない）を含む必須酵素のための栄養要求性宿主株は、例えばＬｍｄａｌ（−）ｄａｔ（−）を使用されることになる。別の実施形態では、「ファージ治癒ステップ」を避けるためにＰＳＡベースのファージ組込系を使用した（Ｌａｕｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，２００２  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１８４：４１７７−４１８６）。別の実施形態では、これは組込まれた遺伝子を維持するための抗生物質による継続的な選択を要求する。したがって、別の実施形態では、本発明は、抗生物質を用いた選択を要求しないファージベースの染色体組込系の確立を可能にする。別の方法で、栄養要求性宿主株を相補することになる。
【０１９０】
別の実施形態では、組み換え型ＤＮＡ法を使用して本発明の組み換え型タンパク質を合成した。一実施形態では、これは、融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を作り出すことと、特定のプロモータ／調節要素の制御下で本発明のプラスミドなどの発現カセット内にＤＮＡを定置することと、タンパク質を発現することと、に関与する。別の実施形態では、本発明の融合タンパク質（例えば、非溶血性ＬＬＯ／抗原）をコードするＤＮＡは、任意の好適な方法によって調製され、この方法としては、例えば、適切な配列のクローニングおよび制限、またはＮａｒａｎｇらのホスホトリエステル法（１９７９，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ６８：９０−９９）；Ｂｒｏｗｎらのホスホジエステル法 （１９７９，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ６８：１０９−１５１）、Ｂｅａｕｃａｇｅらのジエチルホスホラミダイト法 （１９８１，  Ｔｅｔｒａ．  Ｌｅｔｔ．，  ２２：１５  １８５９−１８６２）、および米国特許 第４，４５８，０６６号の固定法などの方法による直接化学合成が挙げられる。
【０１９１】
別の実施形態では、一本鎖のオリゴヌクレオチドを生産するために化学合成が使用される。様々な実施形態では、一本鎖をテンプレートとして使用して、相補的な配列を用いたハイブリダイゼーションによって、またはＤＮＡポリメラーゼを用いた重合によって、この一本鎖のオリゴヌクレオチドを二本鎖のＤＮＡへと変換する。ＤＮＡの化学合成が約１００個の塩基の配列に限られ一方で、より短い配列の連結によってより長い配列を得ることができることを当業者は認識するであろう。別の実施形態では、部分配列はクローニングされ、また適切な部分配列は適切な制限酵素を使用して分割される。次いで断片は連結され、望ましいＤＮＡ配列が生産される。
【０１９２】
別の実施形態では、本発明の融合タンパク質または組み換え型タンパク質をコードするＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）などのＤＮＡ増幅法を使用してクローニングされる。したがって、非溶血性ＬＬＯに対する遺伝子は、クローニングを容易にするために、好適な制限部位を含むセンスプライマーと、例えば、同一でない制限部位などの別の制限部位を含むアンチセンスプライマーとを使用して増幅されたＰＣＲである。抗原をコードする孤立核酸に対しても同じことを繰り返す。非溶血性ＬＬＯおよび抗原配列の連結、ならびにプラスミドまたはベクターの中への挿入は抗原の末端に結合する非溶血性ＬＬＯをコードするベクターを生産する。２つの分子は、直接的か、または制限部位によって導入された短いスペーサによってかのいずれかで結合する。
【０１９３】
別の実施形態では、分子は１つ以上のアミノ酸から構成されるペプチドスペーサによって分離され、一般的にスペーサはタンパク質を結合することまたはこれらの間のなんらかの最少距離もしくは他の空間関係を保持すること以外には特定の生物活性を有しない。別の実施形態では、スペーサの構成アミノ酸は、フォールディング、正味荷電、または疎水性などの分子のいくつかの特性に影響を与えるように選択される。別の実施形態では、融合タンパク質または組み換え型タンパク質をコードする核酸配列は、大腸菌、リステリアなどの他の細菌宿主、酵母、および様々なより高度な真核生物細胞（ＣＯＳ、ＣＨＯおよびＨｅＬａ細胞株、ならびに骨髄腫細胞株などの）を含む様々な宿主細胞へと形質転換される 組み換え型融合タンパク質遺伝子は、各々の宿主に対して適切な発現対照配列に動作可能にリンクする。プロモータ／調節配列は、本明細書のいずれかに詳細に記述される。別の実施形態では、プラスミドは、追加的なプロモータ調節要素、ならびにリボソーム結合部位および転写終結シグナルをさらに含む。真核生物細胞については、対照配列は、例えば、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、サイトメガロウイルス、等々に由来するプロモータおよびエンハンサー、およびポリアデニレーション配列を含む。別の実施形態では、配列はスプライスドナーおよびアクセプター配列を含む。
【０１９４】
一実施形態では、「動作可能にリンクする」という用語は並置を指し、そのように記述される構成成分はそれらの意図される様式で機能することができるようにする関係にある。コード配列に「動作可能にリンクする」対照配列は、コード配列の発現が対照配列に対応する条件の下で達成されるようなやり方で連結される。
【０１９５】
別の実施形態では、プラスミドを含む栄養要求性細菌を選択するために、形質転換した栄養要求性細菌をアミノ酸代謝遺伝子の発現を選択する培地上で増殖する。別の実施形態では、Ｄ−グルタミン酸合成のための栄養要求性の細菌は、Ｄ−グルタミン酸合成のための遺伝子を含むプラスミドを用いて形質転換され、また栄養要求性細菌はＤ−グルタミン酸無しで増殖することになり、一方でＤ−グルタミン酸合成のためにプラスミドを用いて形質転換されていない栄養要求性細菌、またはタンパク質をコードするプラスミドを発現していない栄養要求性細菌は、増殖しないことになる。別の実施形態では、Ｄ−アラニン合成のための栄養要求性の細菌は、プラスミドがＤ−アラニン合成のためのアミノ酸代謝酵素をコードする孤立核酸を含む場合、本発明のプラスミドを形質転換し、かつ発現するときＤ−アラニン無しで増殖することになる。必要な増殖因子、サプリメント、アミノ酸、ビタミン、抗生物質、およびこれに類するものを含んでいる、または欠いている適切な培地を作成するためのかかる方法は当該技術分野で既知であり、また市販されている（ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ），米国ニュージャージー州フランクリン・レイクス）。各々の方法は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１９６】
別の実施形態では、本発明のプラスミドを含む栄養要求性細菌が一旦選択されると、この細菌は適切な培地上で選択的な圧力の存在の中で繁殖する。かかる繁殖は、栄養要求性因子を有しない培地内での細菌の増殖を含む。栄養要求性細菌内でのアミノ酸代謝酵素を発現するプラスミドの存在は、細菌とともにプラスミドの複製を確保し、したがって継続的にプラスミドが規制する細菌を選択する。本開示および本明細書の方法を備えるとき、プラスミドを含む栄養要求性細菌が増殖する培地の体積を調節することによって、当業者は、リステリアワクチンベクターの生産を容易にスケールアップすることができる。
【０１９７】
別の実施形態では、他の栄養要求性株および相補系が本発明の使用に採用されことを当業者は理解するであろう。
【０１９８】
一実施形態では、被験体におけるＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍の増殖を妨げる方法が本明細書に提供され、また別の実施形態では、この方法は本明細書に記述される組み換え型リステリアワクチン株を含む組成物を被験体に投与するステップを含む。
【０１９９】
別の実施形態では、被験体におけるＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍に強化した免疫応答を引き出す方法が本明細書に提供され、また別の実施形態では、この方法は本明細書に記述される組み換え型リステリアワクチン株を含む組成物を被験体に投与するステップを含む。さらに別の実施形態では、ＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍に対する免疫応答はＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質の少なくとも１つの準優占エピトープへの免疫応答を含む。
【０２００】
一実施形態では、ＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍の治療でのエスケープ変異を防止する方法が本明細書に提供され、また別の実施形態では、この方法は本明細書に提供される組み換え型リステリアワクチン株を含む組成物を前記被験体に投与するステップを含む。
【０２０１】
別の実施形態では、被験体におけるＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原を発現する腫瘍の発症を防止する方法が本明細書に提供され、また別の実施形態では、この方法は本明細書に提供される組み換え型リステリアワクチン株を含む組成物を被験体に投与するステップを含む。
【０２０２】
一実施形態では、腫瘍内の調節性Ｔ細胞の頻度を低下させる方法が本明細書に提供され、また別の実施形態では、この方法は本明細書に提供される組み換え型リステリアワクチン株を含む組成物を被験体に投与するステップを含む。
【０２０３】
一実施形態では、腫瘍内の骨髄系由来抑制細胞の頻度を低下させる方法が本明細書に提供され、また別の実施形態では、この方法は本明細書に提供される組み換え型リステリアワクチン株を含む組成物を被験体に投与するステップを含む。
【０２０４】
別の実施形態では、骨髄系由来抑制細胞の頻度を低下させる方法が本明細書に提供され、また別の実施形態では、この方法は本明細書に提供される組み換え型リステリアワクチン株を含む組成物を被験体に投与するステップを含む。
【０２０５】
一実施形態では、被験体におけるＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍の形成を防止する方法が本明細書に提供され、また別の実施形態では、この方法は本明細書に提供される組み換え型リステリアワクチン株を含む組成物を被験体に投与するステップを含む。
【０２０６】
別の実施形態では、被験体におけるＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍から起因する転移性疾患の形成を防止する方法が本明細書に提供され、また別の実施形態では、この方法は本明細書に提供される組み換え型リステリアワクチン株を含む組成物を被験体に投与するステップを含む。
【０２０７】
別の実施形態では、被験体におけるＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍から来る転移性疾患を治療する方法が本明細書に提供され、また別の実施形態では、この方法は本明細書に提供される組み換え型リステリアワクチン株を含む組成物を被験体に投与するステップを含む。
【０２０８】
一実施形態では、本発明の組成物を投与する方法が本明細書に提供される。別の実施形態では、本発明のワクチンを投与する方法が本明細書に提供される。別の実施形態では、本発明の組み換え型ポリペプチドまたは組み換え型ヌクレオチドを投与する方法が本明細書に提供される。別の実施形態では、本発明の組成物、ワクチン、組み換え型ポリペプチド、または組み換え型ヌクレオチドを投与するステップを、弱毒化組み換え型形態のリステリアを含む組成物、ワクチン、組み換え型ヌクレオチド、またはこれを発現する組み換え型ポリペプチドを用いて、各々その独自の個別の実施形態の中で遂行する。別の実施形態では、異なる弱毒化細菌ベクターを用いて投与を遂行する。別の実施形態では、ＤＮＡワクチン（例えば、ネイキッドＤＮＡワクチン）を用いて投与を遂行する。別の実施形態では、本発明の組み換え型ポリペプチドの投与は、タンパク質を遺伝子組み換えによって生産し、次いで組み換え型タンパク質を被験体に投与することによって遂行される。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０２０９】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物によって引き出される免疫応答はＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性応答を含む。別の実施形態では、免疫応答は主としてＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性応答から構成される。別の実施形態では、免疫応答の唯一検出可能な構成成分は、ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性応答である。
【０２１０】
別の実施形態では、本明細書に提供される方法および組成物によって引き出される免疫応答はＣＤ４＋Ｔ細胞媒介性応答を含む。別の実施形態では、免疫応答は主としてＣＤ４＋Ｔ細胞媒介性応答から構成される。別の実施形態では、免疫応答の唯一検出可能な構成成分は、ＣＤ４＋Ｔ細胞媒介性応答である。別の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞媒介性応答は抗原に対する測定可能な抗体応答に付随して起こる。別の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞媒介性応答は抗原に対する測定可能な抗体応答に付随しない。
【０２１１】
別の実施形態では、本発明は被験体内に抗原の準優占ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープに対してＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性免疫応答を誘発する方法を提供し、この方法は（ａ）Ｈｅｒ２−ｎｅｕキメラ抗原またはその断片をコードするヌクレオチド分子をＬＬＯタンパク質のＮ末端断片をコードするヌクレオチド分子に融合してこれによってＬＬＯ−抗原融合タンパク質をコードする組み換え型ヌクレオチドを生成するステップと、（ｂ）組み換え型ヌクレオチドまたはＬＬＯ−抗原融合を被験体に投与するステップとを含み、これによってＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性免疫応答を抗原の準優占ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープに対して誘発する。
【０２１２】
一実施形態では、腫瘍内のＣＤ８＋／調節性Ｔ細胞の比を増加する方法が本明細書に提供され、また別の実施形態では、この方法は本発明の組み換え型ポリペプチド、組み換え型リステリア、または組み換え型ベクターを含む組成物を被験体に投与するステップを含む。
【０２１３】
別の実施形態では、腫瘍内の調節性Ｔ細胞の頻度を低下させる方法が本明細書に提供され、また別の実施形態では、この方法は本明細書に提供される組み換え型リステリアワクチン株を含む組成物を被験体に投与するステップを含む。
【０２１４】
別の実施形態では、本明細書に提供される方法および組成物によって引き出された免疫応答は少なくとも１つの抗原の準優占エピトープへの免疫応答を含む。別の実施形態では、免疫応答は準優占エピトープへの免疫応答を含まない。別の実施形態では、免疫応答は少なくとも１つの準優占エピトープへの免疫応答から構成される。別の実施形態では、ただ１つの測定可能な免疫応答の構成成分は少なくとも１つの準優占エピトープへの免疫応答である。各々のタイプの免疫応答は本発明の別個の実施形態を表す。
【０２１５】
一実施形態では、本発明の方法は被験体におけるＨＥＲ２／発現腫瘍またはガンに対する耐性を破壊し、また別の実施形態では、当該方法は本明細書に記述される組み換え型リステリアワクチン株を含む組成物を被験体に投与するステップを含む。
【０２１６】
免疫応答を測定する方法は当該技術分野で周知であり、例えば、腫瘍増殖の抑制の測定、フローサイトメトリー、標的細胞溶解アッセイ（例えば、クロム遊離アッセイ）、四量体の使用、および他のものが挙げられる。各々の方法は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０２１７】
別の実施形態では、本発明は被験体内でＨｅｒ−２を発現する腫瘍の増殖を妨げる方法を提供し、また別の実施形態では、当該方法は、被験体に、放射線療法と併用して、ＨＥＲ２キメラタンパク質またはその断片に融合したＬＬＯタンパク質のＮ末端断片を含む組み換え型ポリペプチド、あるいは組み換え型ポリペプチドをコードする組み換え型ヌクレオチドを投与するステップを含み、被験体は、ＨＥＲ２を発現する腫瘍に対する免疫応答を搭載し、これによって被験体内でＨＥＲ２を発現する腫瘍の増殖を妨げる。
【０２１８】
別の実施形態では、本発明は、被験体内でＨｅｒ−２を発現する腫瘍から発する転移性疾患を遅延または阻害する方法を提供し、また別の実施形態では、当該方法は、被験体に、放射線療法と併用して、ＨＥＲ２キメラタンパク質はまたその断片に融合したＬＬＯタンパク質のＮ末端断片を含む組み換え型ポリペプチド、もしくは組み換え型ポリペプチドをコードする組み換え型ヌクレオチドを投与するステップを含み、被験体は、ＨＥＲ２を発現する腫瘍に対する免疫応答を搭載し、これによって被験体内でＨＥＲ２を発現する腫瘍から発する転移性疾患を遅延または阻害する。
【０２１９】
別の実施形態では、本発明はＨＥＲ２キメラタンパク質の抗原性を改善する方法を提供し、また別の実施形態では、方法はＬＬＯタンパク質のＮ末端断片をＨｅｒ−２タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチドにコードするヌクレオチドを融合して組み換え型ポリペプチドを作り出すステップを含み、これによってＨＥＲ２キメラタンパク質の抗原性を改善する。
【０２２０】
別の実施形態では、ＨＥＲ２キメラタンパク質の抗原性を改善する方法が本明細書に提供され、また別の実施形態では、方法は組み換え型ヌクレオチドを発現するためにリステリア株を改変することを含む。別の実施形態では、組み換え型ヌクレオチドを発現するために異なる細菌ベクターが使用される。別の実施形態では、細菌ベクターは弱毒化される。別の実施形態では、ＤＮＡワクチン（例えば、ネイキッドＤＮＡワクチン）は組み換え型ヌクレオチドを発現するために使用される。別の実施形態では、ヌクレオチドによってコードされたＬＬＯ−ＨＥＲ２キメラ融合ペプチドの投与は、タンパク質を遺伝子組み換えによって生産し、次いで組み換え型タンパク質を被験体に投与することによって遂行される。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０２２１】
一実施形態では、本発明は腫瘍の「エピトープ拡大」を誘発する方法を提供する。別の実施形態では、本明細書に提供される組成物および方法を使用する免疫化は、本発明のワクチン内で搬送される抗原以外の抗原を持つ他の腫瘍の上へのエピトープ拡大を誘発する。
【０２２２】
別の実施形態では、優占エピトープまたは準優占エピトープは、治療される被験体内でそれぞれ優占または準優占である。別の実施形態では、優占エピトープまたは準優占エピトープは、治療される母集団内でそれぞれ優占または準優占である。
【０２２３】
一実施形態では、エピトープ拡大によって被験体における腫瘍増殖またはガンに対する準優占エピトープに対する強化した免疫応答を防止する、治療する、抑制する、阻害する、誘発する、または引き出す方法が本明細書に提供され、また別の実施形態では、前記ガンは本発明の組成物内に含まれる抗原またはその断片の発現と関連付けられる。別の実施形態では、方法は前記被験体に本発明の組み換え型ポリペプチド、組み換え型リステリア、または組み換え型ベクターを含む組成物を投与することを含む。さらに別の実施形態では、被験体は抗原を発現するガンまたは抗原を発現する腫瘍に対する免疫応答を搭載し、これによって被験体における腫瘍増殖またはガンを治療、抑制、または阻害する。
【０２２４】
一実施形態では、「優占ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ」は、ワクチン接種、タンパク質もしくは病原体による感染または悪性増殖、またはタンパク質を含有するガン細胞によって引き出される、３０％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、これによって引き出される３５％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、４０％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、４５％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、５０％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、５５％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、６０％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、６５％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、７０％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、７５％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、８０％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、８５％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、９０％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、９５％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、９６％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、９７％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、９８％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。
【０２２５】
一実施形態では、「準優占ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ」は、ワクチン接種、タンパク質もしくは病原体による感染または悪性増殖、またはタンパク質を含有するガン細胞によって引き出される、３０％より少ない抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、２８％より少ない抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、２６％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、２４％より少ない抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、２２％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、２０％より少ない抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、１８％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、１６％より少ない抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、１４％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、１２％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、１０％より少ない抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、８％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、６％より少ない抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、５％より少ない抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、４％を超える抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、３％より少ない抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、２％より少ない抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、１％より少ない抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。別の実施形態では、この用語は、０．５％より少ない抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞によって識別されるエピトープを指す。
【０２２６】
各々のタイプの優占エピトープおよび準優占エピトープは、本発明の別個の実施形態を表す。
【０２２７】
一実施形態では、本発明の方法および組成物での抗原は被験体の非腫瘍細胞上で検出可能なレベルで発現される。別の実施形態では、抗原は被験体の非腫瘍細胞の少なくともある特定のパーセンテージ（例えば、０．０１％、０．０３％、０．１％、０．３％、１％、２％、３％、または５％）の検出可能なレベルで発現される。一実施形態では、「非腫瘍細胞」は腫瘍の本体の外側の細胞を指す。別の実施形態では、「非腫瘍細胞」は非悪性細胞を指す。別の実施形態では、「非腫瘍細胞」は形質転換されていない細胞を指す。別の実施形態では、非腫瘍細胞は体細胞である。別の実施形態では、非腫瘍細胞は生殖細胞である。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０２２８】
一実施形態では、「検出可能なレベル」は標準的なアッセイ使用するときに検出可能なレベルを指す。一実施形態では、アッセイは免疫学的アッセイである。一実施形態では、アッセイは酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）である。別の実施形態では、アッセイはウエスタンブロットである。別の実施形態では、アッセイはＦＡＣＳである。当該技術分野において利用可能である任意の他のアッセイを本明細書に提供される方法において使用することができることが当業者によって理解されるべきである。別の実施形態では、検出可能なレベルは特定のアッセイのバックグラウンドレベルに対して決定される。これらの技法の各々を遂行するための方法は当業者に周知であり、各々の技法は本発明の別個の実施形態を表す。
【０２２９】
一実施形態では、組み換え型の抗原を発現するリステリア・モノサイトゲネスを用いたワクチン接種はエピトープ拡大を誘発する。別の実施形態では、ＬＬＯ−抗原融合を用いたワクチン接種は、Ｈｅｒ２の状況の外側でさえも、エピトープ拡大を同様に誘発する。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０２３０】
別の実施形態では、本発明は被験体内でＨＥＲ２を発現する腫瘍の増殖を妨げる方法を提供し、被験体にＨＥＲ２キメラ抗原に融合したＬＬＯタンパク質のＮ末端断片を含む組み換え型ポリペプチドを投与することを含み、抗原は１つ以上の準優占ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを有し、被験体は抗原を発現する腫瘍に対する免疫応答を搭載し、これによって被験体内でＨＥＲ２を発現する腫瘍の増殖を妨げる。別の実施形態では、抗原は優占ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープのうちのいずれも含有しない。別の実施形態では、被験体内でのＨＥＲ２を発現する腫瘍の増殖を妨げる方法が本明細書に提供され、この方法は本明細書に提供される組み換え型ポリペプチドをコードする組み換え型ヌクレオチドを含むリステリアの組み換え型形態を被験体に投与することを含む。
【０２３１】
別の実施形態では、本発明はガンを有する宿主内に細胞毒性Ｔ細胞の形成を誘発するための方法を提供し、該方法は宿主に本発明の組成物を投与するステップを含み、これによってガンを有する宿主内の細胞毒性Ｔ細胞の形成を誘発する。
【０２３２】
別の実施形態では、本発明は、ガンの発生率を低下させる方法を提供し、該方法は、本発明の組成物を投与するステップを含む。別の実施形態では、本発明は、ガンを軽快する方法を提供し、該方法は本発明の組成物を投与するステップを含む。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０２３３】
一実施形態では、組成物を被験体の細胞にエクスビボで投与し、別の実施形態では、組成物をドナーの細胞にエクスビボで投与し、別の実施形態では、組成物をドナーの細胞にインビボで投与し、次いで被験体に移入した。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０２３４】
一実施形態では、本発明の方法で治療されるガンは乳ガンである。別の実施形態では、このガンはＨｅｒ２を含有するガンである。別の実施形態では、このガンはメラノーマである。別の実施形態では、このガンは膵臓ガンである。別の実施形態では、このガンは卵巣ガンである。別の実施形態では、このガンは胃ガンである。別の実施形態では、このガンは膵臓のガンの病巣である。別の実施形態では、このガンは肺腺ガンである。別の実施形態では、このガンは結腸直腸腺ガンである。別の実施形態では、このガンは肺扁平上皮腺ガンである。別の実施形態では、このガンは胃腺ガンである。別の実施形態では、このガンは卵巣表面の上皮性新生物（例えば、その良性の、増殖性の、または悪性の変種）である。別の実施形態では、このガンは口腔扁平上皮ガンである。別の実施形態では、このガンは非小細胞性肺ガンである。別の実施形態では、このガンはＣＮＳガンである。別の実施形態では、このガンは子宮内膜ガンである。別の実施形態では、このガンは膀胱ガンである。別の実施形態では、このガンは中皮腫である。別の実施形態では、このガンは悪性中皮腫（ＭＭ）である。別の実施形態では、このガンは頭頸部ガンである。別の実施形態では、このガンは前立腺ガンである。
【０２３５】
一実施形態では、このガンは骨肉腫であり、一方で一実施形態では、ガン骨腫瘍である。一実施形態では、この骨肉腫は次のサブタイプのいずれか１つである：骨芽細胞性、軟骨芽細胞性、線維芽細胞性ＯＳＡ、毛細血管拡張性ＯＳＡ、小細胞性ＯＳＡ、低悪性度ＯＳＡ、骨膜性ＯＳＡ、二次ＯＳＡ、高悪性度ＯＳＡ、または骨外性ＯＳＡ。
【０２３６】
別の実施形態では、このガンはＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する骨肉腫である。一実施形態では、この骨肉腫はイヌの骨肉腫である。別の実施形態では、この骨肉腫は限局性骨肉腫である。別の実施形態では、この骨肉腫は転移性骨肉腫である。別の実施形態では、この骨肉腫は高悪性度骨肉腫である。別の実施形態では、この骨肉腫はイヌの四肢骨肉腫である。別の実施形態では、ガンは肺の転移性疾患である。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０２３７】
本発明の方法の別の実施形態では、被験体は抗原を発現する腫瘍または標的抗原に対して免疫応答を搭載し、これによって抗腫瘍効果を媒介する。
【０２３８】
別の実施形態では、本発明はガンを治療するために免疫原性組成物を提供し、この組成物はＨＥＲ２キメラタンパク質への切断ＬＬＯの融合を含む。別の実施形態では、免疫原性組成物は融合を発現するリステリア株をさらに含む。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。別の実施形態では、本発明はガンを治療するために免疫原性組成物を提供し、この組成物はＨＥＲ２キメラタンパク質を発現するリステリア株を含む。
【０２３９】
別の実施形態では、本発明のリステリアの組み換え型を含む免疫原性組成物が本明細書に提供される。
【０２４０】
一実施形態では、本発明の治療プロトコルは治療的である。別の実施形態では、プロトコルは予防的である。別の実施形態では、当業者であれば理解するとおり、本発明のワクチンは、家族性の遺伝子または人々がこれらのタイプの病気にかかりやすくする他の状況の原因で、乳ガンまたは他のタイプのＨＥＲ２含有腫瘍などのガンのリスクがある人々を保護するために使用される。別の実施形態では、ワクチンは、外科手術による腫瘍増殖の減量術、従来の化学療法、または放射線治療の後のガン免疫療法として使用される。別の実施形態では、ワクチンは、放射線治療および、外科手術または従来の化学療法のいずれか一方または両方と併用される。かかる治療に続いて、本発明のワクチンを投与し、これによってワクチンの腫瘍抗原に対するＣＴＬ応答が残りの転移を破壊し、ガンからの寛解を長持ちさせる。別の実施形態では、ワクチンは、外科手術、従来の化学療法、放射線治療、またはそれらの任意の組み合わせと併用されてガン免疫療法として使用される。別の実施形態では、切断術を受けることができない被験体にかかる併用療法が使用される。別の実施形態では、切断術を受けることができない原発性骨肉腫を有する被験体にかかる併用療法が使用される。別の実施形態では、本発明のワクチンは、それまでに定着した腫瘍の増殖に効果を持ち、既存の腫瘍細胞を死滅させるために使用される。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０２４１】
別の実施形態では、上述の方法のいずれかで利用されるワクチンおよび免疫原性組成物は、本発明のワクチンおよび免疫原性組成物の特徴のいずれかを有する。各々の特徴は本発明の別個の実施形態を表す。組成物および本発明の使用の文脈で記述される組成物は、免疫原性組成物およびその逆と称されてもよいことを理解すべきである。
【０２４２】
本発明によって投与範囲の様々な実施形態が企図される。一実施形態では、ワクチンベクターの場合は、投与量は０．４ＬＤ５０／回の範囲である。別の実施形態では、投与量は約０．４〜４．９ＬＤ５０／回である。別の実施形態では、投与量は約０．５〜０．５９ＬＤ５０／回である。別の実施形態では、投与量は約０．６〜０．６９ＬＤ５０／回である。別の実施形態では、投与量は約０．７〜０．７９ＬＤ５０／回である。別の実施形態では、投与量は約０．８ＬＤ５０／回である。別の実施形態では、投与量は０．４ＬＤ５０／回〜０．８のＬＤ５０／回である。
【０２４３】
別の実施形態では、投与量は細菌数１０７個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数１．５×１０７個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数２×１０７個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数３×１０７個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数４×１０７個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数６×１０７個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数８×１０７個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数１×１０８個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数１．５×１０８個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数２×１０８個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数３×１０８個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数４×１０８個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数６×１０８個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数８×１０８個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数１×１０９個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数１．５×１０９個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数２×１０９個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数３×１０９個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数５×１０９個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数６×１０９個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数８×１０９個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数１×１０１０個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数１．５×１０１０個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数２×１０１０個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数３×１０１０個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数５×１０１０個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数６×１０１０個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数８×１０１０個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数８×１０９個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数１×１０１１個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数１．５×１０１１個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数２×１０１１個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数３×１０１１個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数５×１０１１個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数６×１０１１個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数８×１０１１個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数５．０×１０８個／回である。別の実施形態では、投与量は細菌数３．３×１０９個／回である。別の実施形態では、本明細書に提供される方法で使用するための組成物の投与量はリステリア３．３×１０９個／回を含む。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０２４４】
一実施形態では、本発明のワクチンまたは免疫原性組成物を被験体に単独で投与する。別の実施形態では、本発明のワクチンまたは免疫原性組成物を別のガン療法と一緒に投与し、一方で一実施形態では放射線療法である。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０２４５】
一実施形態では、本発明の方法および組成物の組み換え型リステリアは、ＨＥＲ２キメラ抗原またはＬＬＯ−ＨＥＲ２キメラ抗原融合をコードする構築体を用いて安定して形質転換される。一実施形態では、構築体はさらなるサブクローニングを容易にするためにポリリンカーを含有する。組み換え型リステリアを生産するためのいくつかの技法が既知である。
【０２４６】
一実施形態では、構築体または核酸分子は相同的組み換えを使用してリステリアの染色体の中へと組込まれる。相同的組み換えのための技法は周知であり、また例えば以下の文献に記述されている。Ｂａｌｏｇｌｕ  Ｓ、Ｂｏｙｌｅ  ＳＭ，ｅｔ  ａｌ．（Ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｏｆ  ｍｉｃｅ  ｔｏ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｅｉｔｈｅｒ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｐａｒｔｉａｌ  ｌｉｓｔｅｒｉｏｌｙｓｉｎ  ｏｒ  Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｌ７／Ｌ１２  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｖｅｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２００５，  １０９（１−２）：１１−７）；およびＪｉａｎｇ  ＬＬ，  Ｓｏｎｇ  ＨＨ，  ｅｔ  ａｌ．  （Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｕｔａｎｔ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｓｔｒａｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｓｉｎ  （Ｓｈａｎｇｈａｉ）  ２００５，  ３７（１）：１９−２４） 別の実施形態では、相同的組み換えを米国特許第６，８５５，３２０号に記述されるように実施した。この場合、Ｅ７を発現する組み換え型リステリア・モノサイトゲネス株は、ｈｌｙプロモータの制御下で、また遺伝子生成物の分泌を確保するためにｈｌｙシグナル配列を含むことによって、Ｅ７遺伝子の染色体組込によって作成され、Ｌｍ−ＡＺ／Ｅ７と称される組み換え型を得る。別の実施形態では、温度感受性プラスミドは、組み換え型を選択するために使用される。各々の技法は本発明の別個の実施形態を表す。
【０２４７】
別の実施形態では、構築体または核酸分子はトランスポゾン挿入を使用してリステリア染色体の中へと組込まれる。トランスポゾン挿入の技法は当該技術分野で周知であり、とりわけ以下のＳｕｎらの文献 ＤＰ−Ｌ９６７の構造における（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １９９０，  ５８：  ３７７０−３７７８）に記載されている。トランスポゾン突然変異生成は、別の実施形態では、安定したゲノム挿入変異体を形成することができるという有利点を有するが、外来性遺伝子が挿入されるゲノム内の位置が未知であるという不利点を有する。
【０２４８】
別の実施形態では、構築体または核酸分子は、ファージ組み込み部位を使用してリステリアの染色体の中へと組込まれる（Ｌａｕｅｒ  Ｐ，  Ｃｈｏｗ  ＭＹ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｗｏ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｈａｇｅ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  ２００２；１８４（１５）：  ４１７７−８６）。この方法のある特定の実施形態では、異種遺伝子を、ゲノム内の任意の適切な部位であってもよい、対応する付着部位（例えば、ｃｏｍＫまたはａｒｇ  ｔＲＮＡ遺伝子の３’末端）の中へとインサートするために、バクテリオファージ（例えば、Ｕ１５３またはＰＳＡリステリオファージ）のインテグラーゼ遺伝子および付着部位が使用される。別の実施形態では、内因性のプロファージは構築体または異種遺伝子組込の前に利用された付着部位から回復した。別の実施形態では、この方法は結果として単一コピー組み込み体をもたらす。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０２４９】
別の実施形態では、様々なプロモータのうちの１つが、これを含有する抗原または融合タンパク質を発現するために使用される。一実施形態では、リステリア・モノサイトゲネスプロモータが使用され、例えば、リステリアのタンパク質溶血素、ａｃｔＡ、ホスホチジルイノシトールに特異的なホスホリパーゼ、ホスホリパーゼＣ、およびメタロプロテアーゼをそれぞれコードする遺伝子ｈｌｙ、ａｃｔＡ、ｐｌｃａ、ｐｌｃＢ、およびｍｐｌのためのプロモータである。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０２５０】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物は、本発明のＨＥＲ２キメラタンパク質またはＬＬＯ配列の相同体を利用する。別の実施形態では、本発明の方法および組成物はヒト以外の哺乳類のＨＥＲ２キメラタンパク質を利用する。「相同性」、「相同の」等々という用語は、いずれかのタンパク質またはペプチドに関するとき、一実施形態では、最大パーセントの相同性を達成するため、配列同一性の部分としていかなる保存的置換も考慮せずに、必要に応じて配列をアラインしギャップを導入した後の対応する未変性ポリペプチドの残基と同一の候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージを指す。アラインメントのための方法およびコンピュータープログラムは当該技術分野で周知である。
【０２５１】
別の実施形態では、「相同性」という用語は、いずれかの核酸配列を参照するとき、対応する未変性核酸配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセンテージを同様に示す。
【０２５２】
別の実施形態では、本発明のシグナルペプチドもしくは組み換え型ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする孤立核酸を本発明は提供する。一実施形態では、孤立核酸は少なくとも６５％の相同性を本発明のシグナルペプチドもしくは組み換え型ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸と共有する配列を含む。別の実施形態では、孤立核酸は少なくとも７５％の相同性を本発明のシグナルペプチドもしくは組み換え型ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸と共有する配列を含む。別の実施形態では、孤立核酸は少なくとも８５％の相同性を本発明のシグナルペプチドもしくは組み換え型ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸と共有する配列を含む。別の実施形態では、孤立核酸は少なくとも９０％の相同性を本発明のシグナルペプチドもしくは組み換え型ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸と共有する配列を含む。別の実施形態では、孤立核酸は少なくとも９５％の相同性を本発明のシグナルペプチドもしくは組み換え型ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸と共有する配列を含む。別の実施形態では、孤立核酸は少なくとも９７％の相同性を本発明のシグナルペプチドもしくは組み換え型ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸と共有する配列を含む。別の実施形態では、孤立核酸は少なくとも９９％の相同性を本発明のシグナルペプチドもしくは組み換え型ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸と共有する配列を含む。
【０２５３】
一実施形態では、当該技術分野において適切に記述される方法によって、相同性は配列アライメントに対してコンピューターアルゴリズムによって決定される。例えば、核酸配列相同性のコンピューターアルゴリズム解析は入手可能な任意の数のソフトウェアパッケージの利用を含む場合があり、これらは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＤＯＭＡＩＮ、ＢＥＡＵＴＹ（ＢＬＡＳＴ増強アラインメントユーティリティ）、ＧＥＮＰＥＰＴ、およびＴＲＥＭＢＬパッケージなどである。
【０２５４】
別の実施形態では、「相同性」は本明細書に提供される配列（核酸またはアミノ酸配列）から選択された配列との同一性が６５％より大きいことを指す。別の実施形態では、「相同性」は本明細書に提供される配列から選択された配列との同一性が７０％より大きいことを指す。別の実施形態では、同一性は７５％より大きい。別の実施形態では、同一性は７８％より大きい。別の実施形態では、同一性は８０％より大きい。別の実施形態では、同一性は８２％より大きい。別の実施形態では、同一性は８３％より大きい。別の実施形態では、同一性は８５％より大きい。別の実施形態では、同一性は８７％より大きい。別の実施形態では、同一性は８８％より大きい。別の実施形態では、同一性は９０％より大きい。別の実施形態では、同一性は９２％より大きい。別の実施形態では、同一性は９３％より大きい。別の実施形態では、同一性は９５％より大きい。別の実施形態では、同一性は９６％より大きい。別の実施形態では、同一性は９７％より大きい。別の実施形態では、同一性は９８％より大きい。別の実施形態では、同一性は９９％より大きい。別の実施形態では、同一性は１００％である。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０２５５】
別の実施形態では、相同性は、候補配列ハイブリダイゼーションの決定を介し決定され、その方法は当業者によりよく記述されている（例えば、“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”  Ｈａｍｅｓ，  Ｂ．  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．  Ｊ．，  Ｅｄｓ．（１９８５）；  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎ．Ｙ．；  ａｎｄ  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｎ．Ｙを参照）。例えば、ハイブリダイゼーションの方法は、未変性カスパーゼペプチドをコードするＤＮＡの補体に対して中程度からストリンジェントな条件下で実行される場合がある。例えば、ハイブリダイゼーション条件は、１０〜２０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％の硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍＬの変性断片化サケ精子ＤＮＡを含む溶液中４２℃にて一晩のインキュベーションである。
【０２５６】
本発明の一実施形態では、「核酸」は少なくとも２つの塩基−糖−リン酸塩の組合せのストリングを指す。一実施形態では、この用語はＤＮＡおよびＲＮＡを含む。一実施形態では、「ヌクレオチド」は核酸高分子の単量体単位を指す。一実施形態では、ＲＮＡは、ｔＲＮＡ（転移ＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、阻害的低分子ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、およびリボザイムの形態をとる。ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの使用が記述される（Ｃａｕｄｙ  ＡＡ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌ  １６：２４９１−９６およびそこに引用された参考文献）。ＤＮＡは、プラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、線状ＤＮＡ、もしくは染色体ＤＮＡの形態、またはこれらの群の誘導体であってもよい。さらに、ＤＮＡおよびＲＮＡのこれらの形態は、１本鎖、２本鎖、３本鎖、または４本鎖であってもよい。別の実施形態では、この用語は他の種類のバックボーンであるが同一の塩基を含有する人工核酸も含む。一実施形態では、この人工核酸はＰＮＡ（ペプチド核酸）である。ＰＮＡはペプチドバックボーンおよびヌクレオチド塩基を含有し、一実施形態では、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子に結合することができる。別の実施形態では、このヌクレオチドはオキセタン修飾される。別の実施形態では、ヌクレオチドは１つ以上のホスホジエステル結合をホスホロチオエート結合で置き換えることによって修飾される。別の実施形態では、人工核酸は当該技術分野で既知の未変性の核酸のリン酸バックボーンの任意の他の変異体を含有する。ホスホロチオエート核酸およびＰＮＡの使用は、当業者に既知であり、また例えば、Ｎｅｉｌｓｅｎ  ＰＥ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ９：３５３−５７、およびＲａｚ  ＮＫ  ｅｔ  ａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２９７：１０７５−８４に記述される。核酸の生産および使用は、当業者には既知であり、また例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，（２００１），Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  ｅｄｓ．およびＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ（２００３）Ｐｕｒｃｈｉｏ  ａｎｄ  Ｇ．  Ｃ．  Ｆａｒｅｅｄに記述される。各々の核酸誘導体は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０２５７】
本明細書に列挙された任意のアミノ酸配列に対するタンパク質および／またはペプチド相同性は、一実施形態では、免疫ブロット解析を含む当該技術分野において適切に記述される方法によって、または確立された方法を介して利用可能な任意の数のソフトウェアパッケージを利用したアミノ酸配列のコンピューターアルゴリズム解析を介して決定される。これらのパッケージのうちのいくつかはＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＭＰｓｒｃｈ、またはＳｃａｎｐｓパッケージを含んでもよく、また例えば、スミス−ウォーターマンアルゴリズムの使用、および／または解析のための広範囲／局所的もしくはＢＬＯＣＫＳアラインメントを採用してもよい。各々の相同性を決定する方法は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０２５８】
別の実施形態では、本発明は、発明の方法を実施するうえで利用される試薬を含むキットを提供する。別の実施形態では、本発明は、本発明の組成物、ツール、または器具を含むキットを提供する。
【０２５９】
一実施形態では、「接触させる」または「投与する」という用語は本発明の組成物にガン細胞または腫瘍を直接的に接触させることを指す。別の実施形態では、この用語は、本発明の組成物にガン細胞または腫瘍を間接的に接触させることを指す。別の実施形態では、本発明の方法は、被験体に本発明の組成物を接触させ、その後、これによって化合物が体内を循環する当該技術分野で既知の拡散または任意の他の能動輸送もしくは受動輸送プロセスによって、組成物がガン細胞または腫瘍に接触させられる方法を含む。
【０２６０】
別の実施形態では、本発明の方法は本発明の組成物の少なくとも単回投与を含んでもよく、別の実施形態では、本発明の方法は本発明の組成物の複数の投与を含んでもよい。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０２６１】
一実施形態では、本発明は、組み換え型リステリアが１回だけ投与される方法を提供する。別の実施形態では、リステリアは２回投与される。別の実施形態では、リステリアは３回投与される。別の実施形態では、リステリアは４回投与される。別の実施形態では、リステリアは５回以上投与される。別の実施形態では、リステリアは複数回投与される。別の実施形態では、リステリアは一定の間隔で施され、一方一実施形態では、毎日、隔週、３週間毎、または毎月であってもよい。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０２６２】
一実施形態では、本発明は、放射線療法が１回だけ施される方法を提供する。別の実施形態では、放射線療法は２回施される。別の実施形態では、放射線療法は３回施される。別の実施形態では、放射線療法は４回施される。別の実施形態では、放射線療法は５回以上施される。別の実施形態では、放射線療法は複数回施される。別の実施形態では、放射線療法は一定の間隔で施され、一方一実施形態では、毎日、隔週、３週間毎、または毎月であってもよい。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０２６３】
一実施形態では、放射線療法は、組み換え型弱毒化リステリアの投与よりも前に施される。別の実施形態では、放射線療法は、組み換え型弱毒化リステリアの最初の投与よりも前に２回施される。別の実施形態では、放射線療法は、組み換え型弱毒化リステリアの最初の投与よりも前に３回施される。
【０２６４】
別の実施形態では、組み換え型弱毒化リステリアは、放射線療法の実施よりも前に投与される。別の実施形態では、組み換え型弱毒化リステリアは、放射線療法の最初の実施よりも前に２回投与される。別の実施形態では、組み換え型弱毒化リステリアは、放射線療法の最初の実施よりも前に３回投与される。
【０２６５】
別の実施形態では、「遺伝子」および「組み換え型遺伝子」という用語は、本発明のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子を指す。かかる自然の対立遺伝子変異は、典型的には所与の遺伝子のヌクレオチド配列中に１〜５％の変異を生じる。数多くの異なる個体または生物体の中の対象となる遺伝子を配列決定することによって、代替的な対立遺伝子を同定することができる。これはハイブリダイゼーションプローブを使用して、様々な個体または生物体中の同一の遺伝子座を識別するために、容易に実行することができる。自然の対立遺伝子変異の結果であり、また機能活性を変更しない、ありとあらゆるかかるヌクレオチドの変種および結果として得られるアミノ酸多型もしくは変種が本発明の範囲内であることが意図される。
【０２６６】
医薬組成物
用語「免疫原性組成物」、「組成物」および「医薬組成物」は、同じ意味で使用してもよいことが当業者により理解されるであろう。本明細書にさらに提供されるように、かかる組成物の投与が免疫応答を強化する、またはＴエフェクター細胞に対する調節性Ｔ細胞の比を増加するもしくは抗腫瘍免疫応答を引き出すことも理解されるべきである。
【０２６７】
一実施形態では、本明細書に提供される免疫原性組成物は、本明細書に提供される組み換え型リステリアを含む。
【０２６８】
一実施形態では、「併用療法」は、本明細書の組み換え型リステリアを含む組成物の投与と併せて、または先立って施される本明細書に記載の放射線療法の組み合わせを指す。
【０２６９】
別の実施形態では、非経口的に、ガン近傍に、経粘膜的に、経皮的に、筋肉内に、静脈内に、皮内に、皮下に、腹腔内に、脳室内に、頭蓋内に、腟内に、または腫瘍内になどの当業者に既知の任意の方法によって、本発明のワクチンおよび組成物を含有する医薬組成物を被験体に投与する。
【０２７０】
本明細書に提供される方法および組成物の別の実施形態では、ワクチンまたは組成物は経口で投与され、したがってこれは経口投与に好適な形態、すなわち固形調製物または液状調製物で処方される。好適な固形の経口剤形としては、錠剤、カプセル、丸薬、顆粒、ペレット、およびこれに類するものが挙げられる。好適な液状の経口剤形としては、溶液、懸濁液、分散剤、エマルション、オイル、およびこれに類するものが挙げられる。本発明の別の実施形態では、活性成分はカプセルで処方される。この実施形態によると、本発明の組成物は活性化合物および不活性担体または希釈剤に加えて、硬いゼラチンカプセルを含む。
【０２７１】
別の実施形態では、ワクチンまたは組成物は、液状調製物の静脈内、動脈内、または筋肉内注射によって投与される。好適な液体剤形としては、溶液、懸濁液、分散剤、エマルション、オイルおよびこれに類するものが挙げられる。
【０２７２】
一実施形態では、医薬組成物は静脈内に投与され、したがって静脈内投与に好適な形態で処方される。別の実施形態では、医薬組成物は動脈内に投与され、したがって動脈内投与に好適な形態で処方される。別の実施形態では、医薬組成物は筋肉内に投与され、したがって筋肉内投与に好適な形態で処方される。
【０２７３】
一実施形態では、腫瘍退行を達成するために、第１の処置の過程にすぐ引き続いて、または数日、数週間、または数か月の間隔の後、本発明の組成物の繰返し投与（ブースター投与量）を行ってもよい。別の実施形態では、腫瘍増殖の抑制を達成するために、第１の処置の過程にすぐ引き続いて、または数日、数週間、または数か月の間隔の後、繰返し投与を行ってもよい。撮像技法、血清腫瘍マーカーの解析、生検、または腫瘍に伴う症状の存在、不在、または寛解などの診断方法を含む当該技術分野で既知の任意の技法によって評価を決定してもよい。
【０２７４】
一実施形態では、意図した抗腫瘍応答を達成するため、被験体に１〜２週間毎、２〜３週間毎、３〜４週間毎、４〜５週間毎、６〜７週間毎、７〜８週間毎、８〜９週間毎、または９〜１０週間毎にブースター投与量を投与する。一実施形態では、意図した抗腫瘍応答を達成するため、被験体に１〜２ヶ月毎、２〜３ヶ月毎、３〜４ヶ月毎、４〜５ヶ月毎、６〜７ヶ月毎、８〜９ヶ月毎、または９〜１０ヶ月毎にブースター投与量を投与する。
【０２７５】
一実施形態では、「治療する」という用語は疾患を治癒することを指す。別の実施形態では、「治療する」とは疾患を防止することを指す。別の実施形態では、「治療する」とは疾患の発生率を低下させることを指す。別の実施形態では、「治療する」とは疾患の症状を軽快することを指す。別の実施形態では、「治療する」とは患者のパフォーマンスのない生存率または全体的な生存率が増加することを指す。別の実施形態では、「治療する」とは疾患の進行を安定させることを指す。別の実施形態では、「治療する」とは寛解を誘発することを指す。別の実施形態では、「治療する」とは疾患の進行を減速することを指す。別の実施形態では、「低下させる」、「抑制する」、および「阻害する」という用語は、より少なくすることまたは減らすことを指す。各々の可能性は別個の本発明の実施形態を表す。
【０２７６】
本明細書で使用される時、「約」という用語は定量的な用語プラスまたはマイナス５％を意味し、別の実施形態ではプラスまたはマイナス１０％を意味し、別の実施形態ではプラスまたはマイナス１５％を意味し、別の実施形態ではプラスまたはマイナス２０％を意味する。
【０２７７】
「被験体」という用語は、症状もしくはその後遺症に対するまたはその症状になりやすいことに対する療法を必要とする、成人のヒト、またはヒトの子ども、ティーンエージャー、もしくは青年を含むことができ、これはイヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラット、およびマウスなどのヒト以外の哺乳類を包含してもよいことを当業者は理解するべきである。この用語が家畜を包含してもよいことも理解されるであろう。「被験体」という用語は、あらゆる点で正常な個体を除外しない。
【０２７８】
一実施形態では、「被験体」という用語は切断術を行うことができないイヌ科の動物も包含する。別の実施形態では、「被験体」という用語は外科手術を行うことができないヒトも包含する。別の実施形態では、「被験体」という用語は切断術を行うことができないヒトも包含する。
【０２７９】
治療の目的については、［哺乳類」という用語は哺乳類と分類されたあらゆる動物を指し、ヒト、飼育動物および家畜物、ならびに動物園の動物、スポーツ用の動物、または愛玩用動物（イヌを含むイヌ科の動物、およびウマ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ等々など）を含むがこれに限定されないことを当業者は理解するであろう。
【０２８０】
腫瘍の治療に関して「治療的に有効な量」とは、以下の効果のうちの１つ以上を引き起こす能力を有する量を指す。（１）増殖の減速および完全な増殖停止を含むある程度の腫瘍増殖の阻害、（２）腫瘍細胞の数の減少、（３）腫瘍サイズの減少、（４）周辺器官への腫瘍細胞の浸潤の阻害（すなわち、減少、減速、または完全な停止）、（５）転移の阻害（すなわち、減少、減速、または完全な停止）、（６）腫瘍の退行もしくは拒絶をもたらす場合があるが、必ずしもそうでなくてもよい、抗腫瘍免疫応答の強化、および／または（７）障害に関連した１つ以上の症状のある程度の軽減。腫瘍の治療の目的については、本明細書に提供されるワクチンの「治療的に有効な量」は、経験的におよび習慣的な様式で決定される場合がある。
【０２８１】
一実施形態では、本発明の方法における使用のための組成物は代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームを含み、前記代謝酵素は前記組み換え型弱毒化リステリア株の染色体内の突然変異した内因性遺伝子を相補する。別の実施形態では、代謝酵素は、前記組み換え型弱毒化リステリア株の染色体を欠いている内因性の遺伝子を相補する。
【０２８２】
一実施形態では、「変異した（ｍｕｔａｔｅｄ）」または「変異体（ｍｕｔａｎｔ）」は欠失について説明する。別の実施形態では、「変異した」または「変異体」は不活性化について説明する。別の実施形態では、「変異した」または「変異体」は切断について説明する。別の実施形態では、「変異した」または「変異体」は添加について説明する。別の実施形態では、「変異した」または「変異体」は置換について説明する。別の実施形態では、「変異した」または「変異体」は未熟終止コドンの挿入について説明する。別の実施形態では、「変異した」または「変異体」は遺伝子の発現を妨害する遺伝子内の１つまたは複数の核酸の変更について説明する。
【０２８３】
一実施形態では、「放射線療法（ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ）」または「放射線療法（ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ）」は、腫瘍細胞を制御または根絶するガン治療の一部としての電離放射線の医学的使用を指す。放射線療法は、治癒的、アジュバント、または対症療法のために使用されてもよい。放射線療法の適切な型として、従来の体外照射療法、定位放射線治療（例えば、アクセス（Ａｘｅｓｓｅ）、サイバーナイフ、ガンマナイフ、ノバリス、Ｐｒｉｍａｔｏｍ、シナジー、Ｘ−ナイフ、トモセラピーまたはトリロジー）、強度変調放射線療法、重粒子線がん治療、（例えば、陽子線治療）、密封小線源治療、放射性同位元素の送達、術中照射、オージェ療法、強度変調回転放射線治療（ＶＭＡＴ）、仮想シミュレーション、三次元原体照射療法、および強度変調放射線療法等が挙げられる。このリストは限定を意味するものではないことが理解されるべきである。
【０２８４】
一実施形態では、放射線療法は、高エネルギー放射線を使用することによって、腫瘍を縮小し、がん細胞を死滅させる。一実施形態では、Ｘ線、ガンマ線、荷電粒子は、ガン治療に使用することができる放射線の種類である。一実施形態では、放射線療法はガン細胞を、それらのＤＮＡに直接損傷を与えることまたは順番にＤＮＡに損傷を与えることができる細胞内の遊離基を生成することにより死滅させる。
【０２８５】
一実施形態では、放射線は、体外の機械によって送達することができ（定位体外照射療法）、または別の実施形態では、ガン細胞の近くの体内に配置された放射性物質から発せられるものであってよい（内部放射線療法（近接照射療法とも呼ばれる））。
【０２８６】
一実施形態では、全身放射線療法は、ガン細胞を死滅させるために血液中を移動する放射性ヨウ素などの放射性物質を使用する。
【０２８７】
一実施形態では、本発明は、骨肉腫等の放射線不感受性ガンを、より短い放射線治療時間しか必要とないので通常放射線治療に関連する副作用を軽快するレジメンでの組み換え型リステリアの投与等の免疫療法と標準的な放射線との組み合わせ（併用）により同時に治療する方法を提供する。
【０２８８】
一実施形態では、放射線は、ＡＥＣＬ、サイラトロン８０、バリアン社製リニアック４またはバリアン社製リニアックなどの標準的な超高圧機器を伴う標準的な技術により本発明に従い投与される。一実施形態では、放射線ポータルの最大サイズは３００ｃｍ２を超えてはならない。一実施形態では、適切な用量は、治療体の面積に応じた特定の用量で、約１５Ｇｙないし３５Ｇｙである。従って、脊髄への用量は約３５Ｇｙであろうが、両側の腎臓への用量は約１５Ｇｙ、肝臓全体への用量は２０Ｇｙであろう。治療の中断は、放射線療法への患者の耐性を考慮した臨床医の裁量である。
【０２８９】
別の実施形態では、併用療法における放射線量が順次に投与される。別の実施形態では、併用療法における放射線量が、本明細書に例示した通り（実施例１１を参照）、連続した日に投与される。別の実施形態では、本明細書の実施例に例証した通り（実施例１１を参照）、ＡＤＸＳ３１−１６４の複数回投与（最大８回）の実施が３週間に一度行われたのに先立ち、併用療法における８Ｇｙの放射線量が連日、合計１６Ｇｙ投与される。別の実施形態では、本明細書の実施例に例証した通り（実施例１１を参照）、最高３．３×９のＡＤＸＳ３１−１６４の複数回投与（最大８回）が３週間に一度行われたのに先立ち、併用療法における８Ｇｙの放射線量が連日、合計１６Ｇｙ投与される。別の実施形態では、本明細書の実施例に例証した通り（実施例１１を参照）、３．３×９のＡＤＸＳ３１−１６４の複数回投与（最大８回）３週間に一度行われたのに先立ち、併用療法における８Ｇｙの放射線量が連日、合計１６Ｇｙ投与される。
【０２９０】
別の実施形態では、本明細書の実施例に例証した通り（実施例１１を参照）、３．３×１０９のＡＤＸＳ３１−１６４の複数回投与（最大８回）の実施が３週間毎に一度行われたのに先立つ、併用療法における８Ｇｙの放射線量は連日であり、合計１６Ｇｙの用量である。
【０２９１】
一実施形態では、本明細書に提供されるＡＤＸＳ３１−１６４の複数回投与は、１〜８、８〜１５、１５〜２５、または意図された治療目標を達成するために必要な数である。
【０２９２】
一実施形態では、本明細書に提供される併用療法のために投与される総放射線量は７０〜８０Ｇｙの範囲である。別の実施形態では、本明細書に提供される併用療法のために投与される総放射線量は１０〜２６Ｇｙの範囲である。別の実施形態では、１０〜２６Ｇｙの範囲の放射線量が順次に投与される。一実施形態では、シーケンスは、毎時、毎日、毎週または隔週であってもよい。一実施形態では、７０〜８０Ｇｙの範囲の放射線量が順次に投与される。別の実施形態では、１０〜２６Ｇｙの範囲の放射線量が投与される。別の実施形態では、放射線量は大人の男性につき、約α／β＝５．４Ｇｙ、μ＝１．７３  Ｇｙ−１である。
【０２９３】
一実施形態では、併用療法の一部として本発明に記載の放射線治療は緩和的放射線療法である。一実施形態では、放射線療法は、緩和目的で与えられてもよい。一実施形態では、対症療法は、症状を緩和し、ガンまたは腫瘍によって引き起こされる苦痛を軽減することを意図している。別の実施形態では、併用療法の一部として本明細書に記載される放射線療法は、ガンまたは腫瘍を治療することを意味する。
【０２９４】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態をより完全に例示するために提示される。しかしながら、これらは本発明の幅広い範囲を制限するものとはけっして理解するべきでない。
【０２９５】
実施例
【０２９６】
材料および方法
オリゴヌクレオチドは、インビトロジェン（米国カリフォルニア州カールスバッド）によって合成され、またＤＮＡ配列決定は、ジーンウィズ・インコーポレーテッド（Ｇｅｎｅｗｉｚ  Ｉｎｃ）（米国ニュージャージー州サウス・プレインフィールド）によって行われた。フローサイトメトリー試薬は、ベクトン・ディッキンソン・バイオサイエンス（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（ＢＤ，米国カリフォルニア州サンディエゴ）から購入した。細胞培養培地、補助剤および他のすべての試薬は、示されない限りシグマ（Ｓｉｇｍａ）（米国ミズーリ州セントルイス）から入手した。ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＨＬＡ−Ａ２ペプチドは、ＥＺバイオラボ（ＥＺｂｉｏｌａｂｓ）（米国インディアナ州ウエストフィールド）によって合成された。完全なＲＰＭＩ  １６４０（Ｃ−ＲＰＭＩ）培地は、２ｍＭグルタミン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、および１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｈｅｐｅｓ（２５ｍＭ）を含有した。多クローン性の抗ＬＬＯ抗体が以前に記述され、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体はシグマから購入した。
【０２９７】
マウスおよび細胞株
すべての動物実験は、ペンシルバニア大学またはラトガース大学において、ＩＡＣＵＣによって認可されたプロトコルに従って実施した。ＦＶＢ／Ｎマウスは、ジャクソン・ラボラトリーズ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（米国メーン州バー・ハーバー）から購入した。ラットＨＥＲ２／ｎｅｕ腫瘍性タンパク質を過剰発現するＦＶＢ／Ｎ  ＨＥＲ２／ｎｅｕトランスジェニックマウスは、ペンシルバニア大学の動物コア施設で収容および飼育された。ＮＴ−２腫瘍細胞株は高いレベルのラットＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質を発現し、これはこれらのマウスの自然発生的な乳腺腫瘍に由来し、以前記述したように増殖した。ＤＨＦＲ−Ｇ８（３Ｔ３／ｎｅｕ）細胞はＡＴＣＣから得られ、ＡＴＣＣの推奨に従って増殖した。ＥＭＴ６−Ｌｕｃ細胞株は、Ｊｏｈｎ  Ｏｈｌｆｅｓｔ博士（ミネソタ大学，米国ミネソタ州）からの寛大な供与物であり、また完全なＣ−ＲＰＭＩ培地中で増殖した。生物発光の作業は、ペンシルバニア大学（米国ペンシルバニア州フィラデルフィア）の小動物イメージング施設（Ｓｍａｌｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ：ＳＡＩＦ）によるガイダンスに従って実行された。
【０２９８】
リステリア構築体および抗原発現
ＨＥＲ２／ｎｅｕ−ｐＧＥＭ７Ｚは、親切にもＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａのＭａｒｋ  Ｇｒｅｅｎｅ博士によって提供され、これはｐＧＥＭ７Ｚプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）へとクローニングされた全長のヒトＨＥＲ２／ｎｅｕ（ｈＨｅｒ２）遺伝子を含んでいた。このプラスミドは、ＰＣＲによってｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン）および表２に示されるオリゴを使用して、ｈＨｅｒ−２／ｎｅｕの３つの区分、すなわちＥＣ１、ＥＣ２、およびＩＣ１を増幅するためのテンプレートとして使用された。
【０２９９】
2017514904.tif 000004
【０３００】
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕキメラ構築体はＳＯＥｉｎｇ  ＰＣＲ法およびテンプレートとしての各々の別個のｈＨｅｒ−２／ｎｅｕ区分による直接融合によって生成された。プライマーを表３に示す。
【０３０１】
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【０３０２】
ＣｈＨｅｒ２遺伝子は、ＸｈｏＩおよびＳｐｅＩ制限酵素を使用してｐＡｄｖ１３８から切り離され、Ｌｍｄｄシャトルベクター、ｐＡｄｖ１３４で、ＬＬＯの切断非溶血性断片を用いてインフレームでクローニングされた。インサート、ＬＬＯ、およびｈｌｙプロモータの配列はＤＮＡシークエンシング解析によって確認された。このプラスミドは電子コンピテントＡｃｔＡ、ｄａｌ、ｄａｔ突然変異体リステリア・モノサイトゲネス株、ＬｍｄｄＡへと電気穿孔され、ストレプトマイシン（２５０μｇ／ｍＬ）を含有するブレインハートインフージョン（ＢＨＩ）寒天培養基プレート上で陽性クローンが選択された。いくつかの実験では、ｈＨｅｒ２／ｎｅｕ（Ｌｍ−ｈＨｅｒ２）断片を発現する類似のリステリア株が比較の目的で使用された。これらは以前に記述した。すべての研究で、無関連リステリア構築体（Ｌｍ対照）が、免疫系でリステリアの抗原と無関係な効果を説明するために含まれる。Ｌｍ対照は、ＡＤＸＳ３１−１６４と同一のリステリアプラットフォームに基づくが、ＨＰＶ１６−Ｅ７またはＮＹ−ＥＳＯ−１などの異なる抗原を発現した。融合タンパク質のリステリアからの発現および分泌が試験された。各々の構築体はインビボで２回継代された。
【０３０３】
細胞毒性アッセイ
３〜５匹のＦＶＢ／Ｎマウスの群が、１×１０８コロニー形成単位（ＣＦＵ）のＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２、ＡＤＸＳ３１−１６４、Ｌｍ−ｈＨｅｒ２  ＩＣＩ、またはＬｍ対照（無関連抗原を発現する）を用いて一週間間隔で３回免疫化されるか、または無処置のままとされた。ＮＴ−２細胞をインビトロで増殖させ、トリプシンで取り出し、マイトマイシンＣ（血清を含まないＣ−ＲＰＭＩ媒体中２５０μｇ／ｍＬ）で３７℃にて４５分間処置した。５回洗浄した後、これらを免疫化した動物または無処置の動物から採取した脾細胞を用いて１：５の比（刺激薬：レスポンダー）で５日間、３７℃および５％ＣＯ２で共インキュベートした。標的として３Ｔ３／ｎｅｕ（ＤＨＦＲ−Ｇ８）細胞のラベルが付いているユーロピウムを使用して、前述した方法により、標準的な細胞毒性アッセイを実施した。４時間のインキュベーションの後、分光光度計（パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ），Ｖｉｃｔｏｒ２）を５９０ｎｍにて使用して、死滅した標的細胞から放出されたユーロピウムを測定した。特異的な溶解のパーセントが（実験群での溶解−自然発生的溶解）／（最大溶解−自然発生的溶解）として定義された。
【０３０４】
免疫化マウスからの脾細胞によるインターフェロン−γ分泌
３〜５匹のＦＶＢ／ＮまたはＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスの群が、１×１０８ＣＦＵのＡＤＸＳ３１−１６４、陰性リステリア対照（無関連抗原を発現する）を用いて一週間間隔で３回免疫化されるか、または無処置のままとされた。最後の免疫化の一週間後、ＦＶＢ／Ｎマウスからの脾細胞が分離され、５×１０６細胞／ウェルにて２４ウェルプレートでマイトマイシンＣで処置したＮＴ−２細胞の存在下でＣ−ＲＰＭＩ培地中で共培養された。ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスからの脾細胞は、１μＭのＨＬＡ−Ａ２特異的なペプチドまたは１μｇ／ｍＬの組み換え型Ｈｉｓタグ付きＣｈＨｅｒ２タンパク質（大腸菌内で生産され、ニッケルベースのアフィニティークロマトグラフィーシステムによって精製された）の存在下でインキュベートされた。上清からのサンプルが２４時間または７２時間後に得られ、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の存在について、製造業者の推奨に従ってマウスＩＦＮ−γ酵素にリンクした免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットを使用して試験した。
【０３０５】
ＩＮＦ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ
各々の表示された時点での凍結保存したＰＢＭＣを解凍し、３７℃で一晩置き、次いで計数した。キメラ型ワクチン、および組み換え型ヒトＩＬ−２（インビトロジェン，米国メリーランド州フレドリック）の中に存在するＨＥＲ２／ＮｅｕのＥＣ１、ＥＣ２、およびＩＣ１ドメインを代表する重複ヒトＨＥＲ２／Ｎｅｕペプチド（５アミノ酸によって１１ｍｅｒが重複する）の２．５μＭのプールを用いて細胞を５日間にわたって刺激した。細胞を採取し、１×のＰＢＳ中で２回洗浄し、計数した。製造業者のプロトコルに従って市販のイヌのＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイキット（Ｒ＆Ｄシステムズ社（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ），米国ミネソタ州ミネアポリス）を使用して、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを遂行した。簡潔に述べると、０．８−２×１０５の刺激された細胞を２．５μＭのＥＣ１、ＥＣ２、またはＩＣ１ペプチドプールプラスＩＬ−２を用いて、またはＩＬ−２を単独で用いてインキュベートした（バックグラウンド計数を決定するため）。すべてのアッセイを２回ずつ遂行した。製造業者の取扱い説明書に従ってプレートを発色させた。ＣＴＬ−Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔアナライザー（Ｃ．Ｔ．Ｌ社，米国オハイオ州シェーカーハイツ）を使用してスポットを計数した。刺激していないウェルで計数したスポットの数を２回差し引くことによってスポットの数を正規化した。
【０３０６】
Ｈｅｒ２トランスジェニック動物での腫瘍研究
生後６週間のＦＶＢ／ＮラットＨＥＲ２／ｎｅｕトランスジェニックマウス（９〜１４／群）に５×１０８ＣＦＵのＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２、ＡＤＸＳ３１−１６４、またはＬｍ対照を６回免疫化した。これらを、自然発生的な乳腺腫瘍の出現について週に２回観察し、これらは最高５２週間まで電子カリパスを使用して測定された。平均直径が１ｃｍ２のサイズに達したとき、エスケープした腫瘍を切り離し、ＲＮＡｌａｔｅｒ内で−２０℃にて保存した。これらの腫瘍のエスケープ上のＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質内の突然変異の効果を決定するために、ゲノムＤＮＡ分離キットを使用してゲノムＤＮＡを抽出し、配列決定した。
【０３０７】
脾臓および腫瘍内の調節性Ｔ細胞へのＡＤＸＳ３１−１６４の効果
マウスに１×１０６ＮＴ−２細胞を皮下（ｓ．ｃ．）で移植した。７日目、１４日目、および２１日目に、これらに１×１０８ＣＦＵのＡＤＸＳ３１−１６４、ＬｍｄｄＡ対照で免疫化、または無処置のままにした。２８日目に腫瘍および脾臓を抽出し、ＦＡＣＳ解析によってＣＤ３＋／ＣＤ４＋／ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇの存在について試験した。簡潔に述べると、Ｃ−ＲＰＭＩ培地中で２枚のガラススライドの間で脾臓を均質化することによって脾細胞を分離した。滅菌したカミソリの刃を使用して腫瘍を細かく刻み、ＰＢＳ中にＤＮａｓｅ（１２Ｕ／ｍＬ）およびコラゲナーゼ（２ｍｇ／ｍＬ）を含有するバッファーを用いて消化した。室温にて撹拌しながら６０分間インキュベーションした後で、細胞を激しいピペッティングによって分離した。赤血球をＲＢＣ溶解バッファーによって溶解し、続いて１０％ＦＢＳを含有する完全なＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて数回洗浄した。ナイロンメッシュを通した濾過の後、腫瘍細胞および脾細胞をＦＡＣＳバッファー（２％ＦＢＳ／ＰＢＳ）中で再懸濁し、抗ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＣＤ４−ＦＩＴＣ、ＣＤ２５−ＡＰＣ抗体を用いて染色し、続いて抗Ｆｏｘｐ３−ＰＥを用いて透過処理および染色した。４色ＦＡＣＳキャリバー（ＢＤ）を使用してフローサイトメトリー解析を実施し、ｃｅｌｌ  ｑｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ）を使用してデータを解析した。
【０３０８】
統計的解析
生存データに対して対数順位χ二乗検定を使用し、ＣＴＬおよびＥＬＩＳＡアッセイに対してスチューデントのｔ検定を使用し、これらを３回行った。これらの解析では、０．０５未満（＊印をつけた）のｐ値は統計的に有意であると考えられる。Ｐｒｉｓｍソフトウェア、Ｖ．４．０ａ（２００６）またはＳＰＳＳソフトウェア、Ｖ．１５．０（２００６）のいずれかを用いてすべての統計的な解析が行われた。別段の記載がない限り、すべてのＦＶＢ／ＮラットＨＥＲ２／ｎｅｕトランスジェニック研究のために、群あたり８〜１４匹のマウスを使用し、すべての野生型ＦＶＢ／Ｎ研究のために、群あたり少なくとも８匹のマウスを使用した。ＨＥＲ２／ｎｅｕトランスジェニックマウスモデルの長期腫瘍研究を除いて、すべての研究を少なくとも１回は繰り返した。
【０３０９】
実施例１：
Ｈｅｒ−２断片に融合されたＬＬＯ断片を分泌するＬ．モノサイトゲネス株の発生：ＡＤＸＳ３１−１６４の構築。
【０３１０】
キメラＨＥＲ２／ｎｅｕ遺伝子（ＣｈＨｅｒ２）の構築については前述した。簡潔に述べると、ＣｈＨｅｒ２遺伝子は、ＳＯＥｉｎｇ  ＰＣＲ法によって、ＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質の２つの細胞外断片（ａａ４０〜１７０およびａａ３５９〜４３３）と１つの細胞内断片（ａａ６７８〜８０８）との直接融合によって生成された。キメラタンパク質は、タンパク質の既知のヒトＭＨＣクラスＩエピトープのほとんどを有する。ＣｈＨｅｒ２遺伝子は、プラスミド、ｐＡｄｖ１３８（これは構築体Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２に使用される）から切り離され、ＬｍｄｄＡシャトルプラスミドへとクローニングされ、結果としてプラスミドｐＡｄｖ１６４が得られる（図１Ａ）。これらの２つのプラスミドバックボーンの間には２つの大きい違いがある。１）組み換え型細菌のインビトロでの選択のためにｐＡｄｖ１３８はクロラムフェニコール耐性マーカー（ｃａｔ）を使用しているが、ｐＡｄｖ１６４はバシラスサチリスからのＤ−アラニン・ラセマーゼ遺伝子（ｄａｌ）を寄生し、これはｄａｌ−ｄａｔ遺伝子を欠いているＬｍｄｄＡ株内でインビトロでの選択のためおよびインビボでのプラスミド保持のために代謝相補経路を使用する。このワクチンプラットフォームは、ＦＤＡによる改変リステリアワクチン株の抗生物質抵抗性についての憂慮に対処するために設計および開発された。２）ｐＡｄｖ１３８とは異なり、これはインビボでのＬｍｄｄ株の相補に必要ないので、プラスミド（以下の配列および図１Ａを参照）中でｐＡｄｖ１６４はｐｒｆＡ遺伝子のコピーを寄生しない。ＬｍｄｄＡワクチン株も、ａｃｔＡ遺伝子（リステリア細胞内移動、および細胞から細胞への拡散を担当する）を欠いているので、このバックボーンに由来する組み換え型ワクチン株は、その親株であるＬｍｄｄに由来するものより病毒性が１００倍少ない。ＬｍｄｄＡベースのワクチンは、免疫化マウスの脾臓からのＬｍｄｄベースのワクチンよりもずっと速く（４８時間未満の間に）除去される。この株からの融合タンパク質ｔＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２の発現および分泌は、インビトロで８時間増殖したＴＣＡ沈殿した細胞培養上清の中のＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２のもの（図１Ｂ）と同等であり、ウエスタンブロット解析を使用して約１０４ＫＤの帯域として抗ＬＬＯ抗体によって検出される。ネガティブコントロールとしてｔＬＬＯのみを発現するリステリアバックボーン株が使用される。
【０３１１】
ｐＡｄｖ１６４配列（７０７５塩基対）（図１を参照）：
【０３１２】
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【０３１３】
実施例２：
ＡＤＸＳ３１−１６４は、ＬＭ−ＬＬＯ−ＣｈＨＥＲ２と同じく免疫原性である。
【０３１４】
抗ＨＥＲ２／ｎｅｕに特異的な細胞毒性Ｔ細胞を発生するうえでのＡＤＸＳ３１−１６４の免疫原性の特性が、標準的なＣＴＬアッセイでＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２ワクチンのものと比較された。両方のワクチンは、３Ｔ３／ｎｅｕ標的細胞によって発現されるＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原に対して強いが同等の細胞毒性Ｔ細胞応答を引き出す。したがって、ＬＬＯに対してＨｅｒ２に融合された細胞内断片のみを発現するリステリアを用いて免疫化されたマウスは、より多くのＭＨＣクラスＩエピトープを含有するキメラより低い溶解活性を示す。無処置の動物、または無関連リステリアワクチンを注射したマウスではＣＴＬ活性は検出されなかった（図２Ａ）。ＡＤＸＳ３１−１６４は、野生型ＦＶＢ／Ｎマウスからの脾細胞によってＩＦＮ−γの分泌を刺激することもできる（図２Ｂ）。これはマイトマイシンＣで処理されたＮＴ−２細胞と共培養されたこれらの細胞のカルチャー上清の中で検出され、これらは高いレベルのＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原（図５Ｃ）を発現する。
【０３１５】
ヒトＭＨＣクラスＩエピトープのＡＤＸＳ３１−１６４を用いた免疫化後の適切な処置および提示は、ＨＬＡ−Ａ２マウスで試験された。免疫化したＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックからの脾細胞は、マッピングされたＨＬＡ−Ａ２で制限されたエピトープに対応するペプチドと７２時間共インキュベートされ、このペプチドはＨＥＲ２／ｎｅｕ分子の細胞外（ＨＬＹＱＧＣＱＶＶ  配列番号：１１またはＫＩＦＧＳＬＡＦＬ  配列番号：１２）、または細胞内（ＲＬＬＱＥＴＥＬＶ  配列番号：１３）ＨＥＲ２／ｎｅｕ分子のドメインに位置する（図２Ｃ）。組み換え型ＣｈＨｅｒ２タンパク質は、ポジティブコントロール、および無関連ペプチド、またはネガティブコントロールとしてペプチドなしで使用された。この実験からのデータは、ＡＤＸＳ３１−１６４が抗ＨＥＲ２／ｎｅｕに特異的な免疫応答を標的化した抗原の異なるドメインに位置するヒトエピトープへと引き出すことができることを示す。
【０３１６】
実施例３：
ＡＤＸＳ３１−１６４は、自然発生的な乳腺腫瘍の発症の防止には、ＬＭ−ＬＬＯ−ＣｈＨＥＲ２より有効である。
【０３１７】
ＡＤＸＳ３１−１６４の抗腫瘍効果が、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２とＨＥＲ２／ｎｅｕトランスジェニック動物のそれにおいて比較され、この動物は生後２０〜２５週間で増殖の遅い自然発生的な乳腺腫瘍を発生した。無関連リステリア対照ワクチンを用いて免疫化されたすべての動物は、２１〜２５週の間に乳房の腫瘍を発生し、３３週の前に犠牲にされた。対照的に、リステリア−ＨＥＲ２／ｎｅｕ組み換え型ワクチンは、乳腺腫瘍の形成の著しい遅延を生じた。４５週には、５０％を超えるＡＤＸＳ３１−１６４をワクチン接種したマウス（９匹中５匹）は、まだ腫瘍がなく、これはＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２を用いて免疫化したマウスの２５％と比較される。５２週には、ＡＤＸＳ３１−１６４を用いて免疫化した８匹中２匹のマウスは、まだ腫瘍を有しないままであったが、一方で他の実験的な群からのマウスはすべて、すでにこれらの疾患に屈服していた（図３）。これらの結果は、ＡＤＸＳ３１−１６４はより弱毒化しているにもかかわらず、ＨＥＲ２／ｎｅｕトランスジェニック動物の自然発生的な乳腺腫瘍の発症の防止ではＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２より有効であることを示す。
【０３１８】
実施例４：
ＡＤＸＳ３１−１６４を用いた免疫化の際のＨＥＲ２／ＮＥＵ遺伝子での突然変異。
【０３１９】
ＨＥＲ２／ｎｅｕのＭＨＣクラスＩエピトープ内の突然変異は、小さい分量のワクチンまたはトラスツズマブ（ハーセプチン）、ＨＥＲ２／ｎｅｕの細胞外領域でエピトープを標的化するモノクローナル抗体、を用いた免疫化の際にエスケープした腫瘍を担当すると考えられてきた。これを評価するために、トランスジェニック動物内のエスケープした腫瘍からゲノム材料が抽出され、キメラワクチンまたは対照ワクチンを用いて免疫化した腫瘍内のｎｅｕ遺伝子の対応する断片を配列決定した。代替的なエスケープ機構を示唆するいかなるワクチン接種した腫瘍サンプルのＨｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子の中にも突然変異は観察されなかった（データ示さず）。
【０３２０】
実施例５：
ＡＤＸＳ３１−１６４は、腫瘍内の調節性Ｔ細胞の著しい減少を生じる。
【０３２１】
脾臓および腫瘍内での調節性Ｔ細胞の頻度に対するＡＤＸＳ３１−１６４の効果を解明するために、マウスにＮＴ−２腫瘍細胞を移植した。３回の免疫化の後、脾細胞および腫瘍内のリンパ球が分離され、Ｔｒｅｇのために染色した。これらは、ＣＤ３＋／ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋細胞と定義されたが、別個に解析したとき、ＦｏｘＰ３マーカーまたはＣＤ２５マーカーのいずれかを用いて同等の結果が得られた。この結果は、無関連リステリアワクチンまたは無処置の動物と比較して、ＡＤＸＳ３１−１６４を用いた免疫化は、脾臓内のＴｒｅｇの頻度については効果を有しないことを示した（図４を参照）。対照的に、リステリアワクチンを用いた免疫化は、腫瘍内のＴｒｅｇの存在に少なからぬ影響を生じた（図５Ａ）。処理されていない腫瘍ではすべてのＣＤ３＋Ｔ細胞の平均で１９．０％がＴｒｅｇであったが、この頻度は、無関連ワクチンについては４．２％、ＡＤＸＳ３１−１６４ついては３．４％にそれぞれ減少し、腫瘍内のＴｒｅｇの頻度が５分の１に減少した（図５Ｂ）。いずれかのＬｍｄｄＡワクチンで処置したマウスでの腫瘍内のＴｒｅｇの頻度の減少は、腫瘍のサイズの差異には貢献しなかった。代表的実験では、ＡＤＸＳ３１−１６４を用いて免疫化したマウスからの腫瘍（平均直径（ｍｍ）±ＳＤ：６．７１±０．４３、ｎ＝５）は、未処置マウス（８．６９±０．９８、ｎ＝５、ｐ＜０．０１）、または無関連ワクチン（８．４１±１．４７、ｎ＝５、ｐ＝０．０４）で処置されたマウスからの腫瘍より著しくより小さかったが、一方で後者のこれら２つの群の比較は腫瘍サイズでは統計的な有意さを示さなかった（ｐ＝０．７３）。ＬｍｄｄＡワクチンで処置した腫瘍内のＴｒｅｇのより低い頻度は、腫瘍内のＣＤ８／Ｔｒｅｇ比の増加をもたらし、ＬｍｄｄＡワクチンを用いた免疫化後により好ましい腫瘍の微小環境を得ることができることを示唆する。しかしながら、標的抗原ＨＥＲ２／ｎｅｕ（ＡＤＸＳ３１−１６４）を発現するワクチンのみが腫瘍増殖を低下させることができ、Ｔｒｅｇの減少は腫瘍内で抗原特異的な応答が存在するときのみ効果を有することを示す。
【０３２２】
実施例６：
ＨＥＲ−２キメラを発現するリステリアワクチンによってエスケープ変異が導入されない。
【０３２３】
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８、ＬｍｄｄＡ１６４、および無関連ワクチンＬｍ−ＬＬＯ−ＮＹなどの異なるワクチンを用いて免疫化したマウスの腫瘍サンプルを採取した。これらのサンプルからＤＮＡを精製し、ＨＥＲ２／ｎｅｕ領域に対応するＤＮＡ断片、ＩＣ１、ＥＣ１、およびＥＣ２を増幅し、何らかの免疫エスケープ変異があるかどうかを決定するために配列決定した。ＣＬＵＳＴＡＬＷを使用して各々のＤＮＡからの配列のアラインメントを遂行した。解析の結果腫瘍から採取したＤＮＡ配列内には突然変異がないことを示した。参照配列は、以下に記載する：
【０３２４】
ＥＣ２のアラインメント（９７５−１０２９ｂｐのＨＥＲ２／ｎｅｕ）
【０３２５】
ＧＧＴＣＡＣＡＧＣＴＧＡＧＧＡＣＧＧＡＡＣＡＣＡＧＣＧＴＴＧＴＧＡＧＡＡＡＴＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＣＴＧＴＧＣＴ（配列番号：１４）
【０３２６】
ＣＧＡＧＴＧＴＧＣＴＡＴＧＧＴＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＡＧＣＡＣＣＴＴＣＧＡＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＧＴＧＡＣ（配列番号：１５）
【０３２７】
ＡＡＴＧＴＣＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＴＴＧＧＧＡＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＴＴＴＧＣＣＧＧＡＧ（配列番号：１６）
【０３２８】
ＡＧＣＴＴＴＧＡＴＧＧＧＧＡＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＧＧＣＡＴＴＧＣＴＣＣＧＣＴＧＡＧＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＴＧ（配列番号：１７）
【０３２９】
ＴＴＣＧＡＡＡＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＴＣＡＣＡＧＧＴＴＡＣＣＴＧＴＡＣＡＴＣＴＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＡＧＡＣＡＧＴＣＴＣ（配列番号：１８）
【０３３０】
ＣＧＴＧＡＣＣＴＣＡＧＴＧＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＴＣＧＡＡＴＣＡＴＴＣＧＧＧＧＡＣＧＧＡＴＴＣＴＣＣＡＣＧＡＴＧＧＣ（配列番号：１９）
【０３３１】
ＧＣＧＴＡＣＴＣＡＴＴＧＡＣＡＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＡＴＣＣＡＣＴＣＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＧＧ（配列番号：２０）
【０３３２】
ＧＡＧＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＣＴＣＴＧＡＴＴＣＡＣＣＧＣＡＡＣＧＣＣＣＡＴＣＴＣＴＧＣＴＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＴ（配列番号：２１）
【０３３３】
ＧＴＡＣＣＴＴＧＧＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＴＣＣＧＧＡＡＣＣＣＡＣＡＴＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＣＡＧＴＧＧＧＡＡＣＣＧＧ（配列番号：２２）
【０３３４】
ＣＣＧＧＡＡＧＡＧＧＡＴＴＧＴＧＧＴＣＴＣＧＡＧＧＧＣＴＴＧＧＴＣＴＧＴＡＡＣＴＣＡＣＴＧＴＧＴＧＣＣＣＡＣＧＧＧＣＡＣ（配列番号：２３）
【０３３５】
ＴＧＣＴＧＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＣＣＡＣＣＣＡＧＴＧＴＧＴＣＡＡＣＴＧＣＡＧＴＣＡＴＴＴＣＣＴＴＣＧＧＧＧＣＣＡＧＧＡＧ（配列番号：２４）
【０３３６】
ＩＣ１のアラインメント（２１１４−３０４２ｂｐのＨＥＲ２／ｎｅｕ）
【０３３７】
ＣＧＣＣＣＡＧＣＧＧＡＧＣＡＡＴＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＧＣＴＣＡＧＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＡＡＡＡＧＡＧＡＣＧＧＡＧＣ（配列番号：２５）
【０３３８】
ＴＡＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＡＧＧＡＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡ（配列番号：２６）
【０３３９】
ＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＣＣＣＣＧＴＧＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＴＧＴＴＧＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴ（配列番号：２７）
【０３４０】
ＣＴＣＣＴＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＡＧＡＴＧＡＡＧＣＧＴＡＴＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＴＴＣＴＣ（配列番号：２８）
【０３４１】
ＣＧＴＡＴＧＴＧＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣ（配列番号：２９）
【０３４２】
ＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＣＣＡＴＧＴＣＣＧＡＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＧＴＣＧＣＣＴＡＧＧＣＴＣＣＣ（配列番号：３０）
【０３４３】
ＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＴＣＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＧＣ（配列番号：３１）
【０３４４】
ＧＧＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＣＣＧＧＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＣＡＡＧＡＧＴＣＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＣＡ（配列番号：３２）
【０３４５】
ＡＧＡＴＴＡＣＡＧＡＴＴＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧ（配列番号：３３）
【０３４６】
ＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＧＡＡＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＧＡＣＧＣＣＧＧＴＴＣＡ（配列番号：３４）
【０３４７】
ＣＣＣＡＴＣＡＧＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＣＴＡＴＧＧＡＧＴＧＡＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＧ（配列番号：３５）
【０３４８】
ＣＣＡＡＡＣＣＴＴＡＣＧＡＴＧＧＡＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡ（配列番号：３６）
【０３４９】
ＣＧＣＣＴＡＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＴＡＣＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＴＧＴＴ（配列番号：３７）
【０３５０】
ＧＧＡＴＧＡＴＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＴＣＧＣＣＣＧＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＡＧＴＴＧＧＴＧＴＣＡＧＡＡＴＴＴＴ（配列番号：３８）
【０３５１】
ＣＡＣＧＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＣＧＴＴＴＴＧＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＧＡＧＧＡＣＴＴ（配列番号：３９）
【０３５２】
ＥＣ１のアラインメント（３９９−７５８ｂｐのＨＥＲ２／ｎｅｕ） 
【０３５３】
ＣＣＣＡＧＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＧＧＣＴＧＣＧＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＧＡＡＧＴＣＴＣＡＣＡＧＡＧＡＴＣＣＴ（配列番号：４０）
【０３５４】
ＧＡＡＧＧＧＡＧＧＡＧＴＴＴＴＧＡＴＣＣＧＴＧＧＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣＡＧＧＡＣＡＴＧＧＴＴＴＴＧＴＧ（配列番号：４１）
【０３５５】
ＣＣＧＧＧＣＣＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＴＧＣＣＣＣＣＧＣＣＴＧＣＡＡＡＧＡＣＡＡＴＣＡＣＴＧＴＴＧＧＧＧＴＧＡＧＡＧＴＣＣ（配列番号：４２）
【０３５６】
ＧＧＡＡＧＡＣＴＧＴＣＡＧＡＴＣＴＴＧＡＣＴＧＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＡＣＣＡＧＴＧＧＴＴＧＴＧＣＣＣＧＧＴＧＣＡＡＧＧＧ（配列番号：４３）
【０３５７】
ＣＣＧＧＣＴＧＣＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＣＴＧＣＣＡＴＧＡＧＣＡＧＴＧＴＧＣＣＧＣＡＧＧＣＴＧＣＡＣＧＧＧＣＣＣＣＡＡＧＣＡ（配列番号：４４）
【０３５８】
実施例７：
ＡＤＸＳ３１−１６４を用いた末梢の免疫化は転移性乳ガン細胞株の脳内での増殖を遅延することができる。
【０３５９】
ＡＤＸＳ３１−１６４または無関連Ｌｍ対照ワクチンを用いてマウスに腹腔内で免疫化し、次いでルシフェラーゼおよび低いレベルのＨＥＲ２／ｎｅｕを発現するＥＭＴ６−Ｌｕｃ腫瘍細胞を５，０００頭蓋内に移植した（図６Ｃ）。麻酔をかけたマウスのエクスビボでの撮像によって接種後の異なる時点で腫瘍をモニターした。腫瘍接種後８日目に、すべての対照動物で腫瘍が検出されたが、ＡＤＸＳ３１−１６４群のマウスではいかなる検出可能な腫瘍を示すものもなかった（図６Ａおよび図６Ｂ）。ＡＤＸＳ３１−１６４はこれらの腫瘍の発症を明らかに遅延することができ、腫瘍接種後１１日目にはネガティブコントロール群のマウスはすべてその腫瘍によって死んだが、ＡＤＸＳ３１−１６４群のマウスはすべてまだ生存しており、腫瘍増殖の小さい兆候を示すのみであった。これらの結果は、ＡＤＸＳ３１−１６４の末梢投与を用いて得られた免疫応答が中枢神経系に到達することができる可能性があり、かつＬｍｄｄＡベースのワクチンがＣＮＳ腫瘍の治療のための使用の可能性を有する場合があることを強く示唆する。
【０３６０】
実施例８：
ＡＤＸＳ３１−１６４を用いた免疫化によるイヌの骨肉腫の治療。
【０３６１】
イヌの骨肉腫は、１０歳を超える大型犬の主要な死亡原因である長骨（下肢骨）のガンである。標準的な治療は、診断直後の切断術と、後に続く化学療法である。しかしながら、常にガンは肺に転移する。化学療法を用いたイヌは約１８か月生存した。これに対して、治療しないイヌは６〜１２か月であった。骨肉腫の最大５０％においてＨＥＲ２抗原が存在すると考えられる。ＡＤＸＳ３１−１６４は、この抗原を発現する細胞を攻撃する免疫を作り出し、ヒトの乳ガンを治療するために開発されてきた。
【０３６２】
骨肉腫の組織学的な診断、および悪性細胞によるＨＥＲ２／ｎｅｕ発現の証拠を有するイヌは、組み入れの対象である。
【０３６３】
イヌの骨肉腫の試験
【０３６４】
第１のレジメンでは、四肢を切断し、化学療法治療のラウンドがその後に続いた。３投与のＨｅｒ−２ワクチンをこれに続いて投与し、６か月間隔でブースターするか、またはブースターなしとした。
【０３６５】
すべてのイヌは４週間のカルボプラチン療法を受けた。最後のカルボプラチン投与の４週間後、イヌはＡＤＸＳ−ＨＥＲ２を３週間に１回、合計３回の投与を受けた。群１（３匹のイヌ）は投与当たり１×１０８ＣＦＵを受け、群２（３匹のイヌ）は各々投与当たり５×１０８ＣＦＵを受け、群３（３匹のイヌ）は投与当たり１×１０９ＣＦＵを受けた。潜在的用量制限毒性の場合、さらに多くのデータを収集するために追加的なイヌが群に追加される。したがって初期の研究では９〜１８匹のイヌが治療される場合がある。
【０３６６】
第２のレジメンでは、化学療法の前（１か月前）にワクチンを１投与しかせず合計４投与であることを除いて、第１のレジメンと同様のものを繰り返した。
【０３６７】
さらに、両方のレジメンで、化学療法の１か月後に１投与のみを投与した。
【０３６８】
実施例９：
ＨＥＲ２／ＮＥＵを過剰発現するイヌの骨肉腫を有する愛玩犬でのＡＤＸＳ−ｃＨＥＲ２の安全性を評価するフェーズ１投与量エスカレーション研究。
【０３６９】
骨肉腫を有するイヌで腫瘍特異的な免疫性を安全かつ効果的に刺激することができる、ヒトＨＥＲ２／ｎｅｕ組み換え型ワクチンを発現するＬ．モノサイトゲネス投与を決定するために試験段階Ｉ投与量エスカレーション研究を遂行した。ＯＳＡの疑いまたは確認されたＯＳＡに起因する四肢の切断術のためにＰｅｎｎＶｅｔに提示されたすべてのイヌの腫瘍を、定期的に採取し、ＯＳＡの診断を確認するために病理組織的に評価した。加えて、すべてのイヌからの腫瘍の断面を、腫瘍がＨＥＲ２／ｎｅｕを発現するかどうかを決定するためにＩＨＣおよびウエスタンブロット解析によって評価した。ＯＳＡの組織学的な診断、および悪性細胞によるＨＥＲ２／ｎｅｕ発現の証拠を有するイヌのみが組み入れ対象である。外科手術で取った腫瘍組織の単一細胞懸濁液を凍結保存し、抗腫瘍免疫性を決定するためにクロム遊離アッセイで自己腫瘍標的として使用した。
【０３７０】
四肢ＯＳＡを有し、かつＨｅｒ２−ｎｅｕの発現を確認した最高１８匹の個人所有のイヌが組み入れられた（図７）。組み入れ時（最後のカルボプラチン処置後３週間）に、すべてのイヌは全血算定（ＣＢＣ）、化学スクリーニング（ＣＳ）、および尿検査（ＵＡ）を含む基本的な臨床検査、ならびに心エコー図および心臓に特異的なトロポニンＩ（ｃＴｎＩ）レベルの測定による心臓機能のベースライン評価を受けた。胸部放射線写真を取って、肺の転移が存在するかどうかを決定した。肺の転移の兆候が見られないイヌのみにこの研究に含まれる資格がある。組み入れ時に、抗腫瘍免疫性のベースラインレベルを評価するために末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を収集した（抗腫瘍免疫性の評価を参照）。さらに、これらがすでにカルボプラチンによって免疫抑制されていないことを確認する目的で、ベースライン免疫機能性を評価するために血液を取った。機能的に無傷な免疫系を有するイヌのみにリステリアワクチンを受ける資格がある。
【０３７１】
Ｌｍ組み換え型投与およびデータ取得
【０３７２】
すべてのイヌに単一のＬｍ−ｈｕＨｅｒ−２／ｎｅｕ組み換え型ワクチンを使用してワクチン接種した。第１のＬｍ−ｈｕＨｅｒ２−ｎｅｕワクチンを最後のカルボプラチン投与の３週間後に与え、この後３週間に１度、合計３投与だけ与えた（図７）。
【０３７３】
群１（３匹のイヌ）はＡＤＸＳ３１−１６４（Ｌｍ−ｈｕＨｅｒ２）ワクチンを投与当たり１×１０８ＣＦＵで受け、群２（３匹のイヌ）は各々投与当たり５×１０８ＣＦＵで受け、群３（３匹のイヌ）は投与当たり１×１０９ＣＦＵで受け、投与当たり３．３×１０９ＣＦＵで受けた（１匹のイヌ）。組み換え型Ｌｍは３０分間にわたる遅い静脈内点滴で投与された。群１のために選択された投与量は、マウスでキメラ型ｈｕＨｅｒ２／ｎｅｕ組み換え型に対して確立された安全な投与量である。ヒトではＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７に対する非毒性投与量はマウスで確立されたものよりも１−ｌｏｇ（１０倍）多いだけであり、この投与量はこのパイロット試験の群３で評価された投与量である。
【０３７４】
Ｌｍ投与の時点で、全身的な悪影響の兆候についてイヌをモニターした。点滴の間の、ＥＣＧによって心拍数および心リズムをモニターし、呼吸数を記録した。さらに、超音波の使用およびトロポニンＩレベルの測定によって心臓障害をモニターした（図８）。点滴後４８時間にわたってイヌを注意深くモニターした。ミニミッター・レスピロニクス社（ＭｉｎｉＭｉｔｔｅｒ  Ｒｅｓｐｉｒｏｎｉｃｓ）製のＶｉｔａｌ  Ｓｅｎｓｅ連続体温監視システム（発明者らの獣医臨床試験センター（ＶＣＩＣ）で日常的に使用されている）を使用して中核体温を点滴後１２時間未満の間連続的にモニターした。脈拍の数、リズム、および質、ならびに呼吸数および呼吸努力をモニターし、最初の６時間は１時間ごとに記録し、次いでそれ以後は４時間ごとに記録し、血圧および体温も同様にした（図９）。免疫刺激と一致したすべての症状に留意され、必要に応じて激しい反応を制御するために液体、鎮痛薬、制吐薬、および抗ヒスタミン薬を使用した。すべてのイヌを１日に６回観察し、不快症状、昏睡、吐き気、嘔吐、および下痢を含む組み換え型剤の毒性的な影響のあらゆる兆候を記録した。全身的投与後のＬｍの除去を評価する培養のために、最初のＡＤＸＳ３１−１６４ワクチンの２４、４８、および７２時間後に血液サンプルを採取した。
【０３７５】
抗腫瘍免疫性の評価
最後のカルボプラチン投与に続く３週間、イヌは定期的な臨床検査ならびにＣＢＣ、ＣＳ、ＵＡ、およびｃＴｎＩレベルを含むベースライン血液検査を受けた。抗腫瘍免疫性のベースライン評価のためにこの時点でＰＢＭＣを取った。各々のワクチン接種の時点および最後のワクチン接種の３週間後に繰返し免疫評価を遂行した。以下に概要を示すように、ＣＦＳＥ増殖、サイトカイン産生（ＥＬＩＳｐｏｔおよびｑＲＴ−ＰＣＲ）、およびＣＴＬアッセイによって、ＨＥＲ２／ｎｅｕに特異的なＴ細胞応答についてＰＢＭＣを自己腫瘍標的に対して解析した（図１２）。
【０３７６】
結果
【０３７７】
今日までに、発明者らは１６匹のイヌで合計４１件のＡＤＸＳ３１−１６４の点滴を遂行した。
【０３７８】
2017514904.tif 000006
【０３７９】
ＡＤＸＳ３１−１６４投与量は、１×１０８、５×１０８、１×１０９、および３．３×１０９ＣＦＵからの範囲であった。
【０３８０】
2017514904.tif 000007
【０３８１】
ワクチン投与のための標準作業手順
【０３８２】
ＡＤＸＳ３１−１６４の投与のための標準作業手順を開発した。ワクチン接種の１時間前に患者は筋肉内注射を介しての２ｍｇ／ｋｇのジフェンヒドラミンと、ゆっくりとした静注として０．２ｍｇ／ｋｇのオンダンセトロンとを受けた。ワクチンを−８０℃に保持し、患者の傍で解凍した。これを２００ｍＬの０．９％ＮａＣｌ中で３０分間にわたって投与した。次いで点滴ラインを３０ｍＬのプラズマライト（Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ）でフラッシングした。アモキシシリンの３日間の過程（ワクチン接種後７２時間に開始）、および細胞の増殖および修復を助ける肝臓補助剤（Ｓ−アデノシル−メチオニン）の７日間の過程付きでイヌを家庭に帰した。
【０３８３】
研究の主要評価項目は、ＡＤＸＳ３１−１６４の最大許容投与量を決定することであった。
【０３８４】
最大３．３×１０９までの投与量は、体重が２５ｋｇ〜６７ｋｇのイヌでは良好に許容された。報告されたすべての副作用は、グレードＩの毒性で、最大耐量にはまだ達していなかった。副作用はワクチン投与の２〜４時間以内に常套的に生じた。高熱は通常、等張液を維持速度（４ｍＬ／ｋｇ／時間）で２〜４時間にわたって静脈内に送達することによって解消された。体温が１０４．７°Ｆ以上に達した２つの事例では、カルプロフェンの単一の皮下注射が１〜２時間以内に正常体温を誘発した。吐き気および嘔吐は通常自己限定的であったが、場合によってはいくつかのエピソードが注記され、１ｍｇ／ｋｇのセレニアを投与し、これはさらなる吐き気および嘔吐の防止に大変効果的であった。合計５匹のイヌがワクチン投与の４８時間以内に中程度の肝臓酵素のグレードＩ上昇を発生し、これはワクチン接種の１週間後までに解消された。
【０３８５】
リステリアの除去
【０３８６】
ワクチン接種した１６匹のイヌすべてに対して血液培養を遂行した後、今日までワクチン接種後２４時間の時点でいずれのイヌの末梢循環内でも検出可能なリステリアは無かった。ワクチン接種したイヌの尿および排泄物内へのリステリアの排出は評価しなかった。
【０３８７】
研究の副次的評価項目は、無増悪生存および全生存である。四肢の切断術およびカルボプラチンの４投与後ＡＤＸＳ３１−１６４を投与した場合に、骨肉腫を有するイヌでの統計的に有意な全生存優位性が観察された。最初の２つの投与群（６匹のイヌ）からの早期の結果は、飼い主が試験に参加しないことを選択したが生存ついて追跡された６匹のイヌと比較して、ＡＤＸＳ３１−１６４を受けたイヌにおける有意な生存優位性を示す（ｐ＝０．００３）（図１３）。ワクチン接種していないイヌの平均生存時間は２３９．５日である。ワクチン接種したイヌに対する平均生存時間にはまだ達していない。治療を意図する群の中のすべてのイヌが解析に含まれる場合、これは真実となる。
【０３８８】
結論として、心臓血管系、造血系、肝臓系、または腎臓系で有意な短期または長期の副作用の証拠はない。さらに、最小限の残余疾患の存在下でのＡＤＸＳ３１−１６４の投与は転移性疾患を遅延／防止することができ、ＨＥＲ２／ｎｅｕが陽性の骨肉腫を有するイヌの全生存を長くすることができる。
【０３８９】
実施例１０：
自然発生的なイヌの骨肉腫（ＯＳＡ）のモデルでＡＤＸＳ３１−１６４を評価するフェーズ１臨床試験。
【０３９０】
ワクチン製造業者
ＡＤＸＳ３１−１６４の設計および生成。簡潔に述べると、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｍ）のｄａｌ  ｄａｔ  ａｃｔＡ突然変異体株を、キメラ型ヒトＨＥＲ２／ｎｅｕ構築体を担持するｐＡＤＶプラスミドを用いて形質移入する。この構築体はヒトＨＥＲ２／ｎｅｕ分子の２つの細胞外領域（ＥＣ１およびＥＣ２）と１つの細胞内領域（ＩＣ１）とを含有し、この分子はＨＬＡ−Ａ２で制限された免疫優性エピトープの大部分を含有し、切断リステリオリシンＯ構築体と融合した。伝達プラスミドは、桿菌ｐ６０ｄａｌ遺伝子およびも含有し、これは栄養要求性相補を介して突然変異体Ｌｍの中に維持される。細菌耐性カセットはない。ワクチンはヴィバロジクス社（Ｖｉｂａｌｏｇｉｃｓ  ＧｍｂＨ）（ドイツ国クックスハーフェン）によって製造され、使用前は−８０℃で保存された。
【０３９１】
病理組織学、病期分類、および免疫組織化学
すべての原発性四肢骨肉腫腫瘍の病理組織学的評価が有資格獣医病理学者（Ｊ．Ｅ．）によって遂行された。腫瘍は組織学的な特徴に基づいて、骨芽細胞性、軟骨芽細胞性、線維芽細胞性、および毛細血管拡張性として記述された。原発性腫瘍は、有糸分裂指数、核多形性、ならびにマトリクスおよび壊死が存在する量に基づいてスコアリングされた。組織学的スコアはグレード（Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩ）へと変換された。
【０３９２】
ＨＥＲ２／ｎｅｕ染色については、ホルマリン固定し、脱灰し、パラフィン包埋した組織の５マイクロメートル厚の連続切片を負電荷を帯びたガラススライド上に搭載した。切片を２０分間８０℃で加熱し、Ｐｒｏ  Ｐａｒ（透明剤）内に浸し、エタノール中で再水和した。切片のクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨが９．０付近）内での煮沸によって抗原の回収を遂行した。３％の過酸化水素を使用して内因性ペルオキシダーゼを閉鎖した。ウサギの抗ヒトＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体（Ｎｅｕ（ｃ−１８）：ｓｃ−２８４，サンタクルーズ・バイオテクノロジー社（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｙ））またはウサギのＩｇＧアイソタイプを用いて染色を遂行した（ユニバーサルネガティブコントロール血清ＮＣ４９８，バイオケア・メディカル社（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ））。ユニバーサル・ストレプトアビジン−ビオチン２システム（ＤＡＫＯ／ＬＳＡＢ２，ＨＲＰ）を使用して結合抗体を検出した。組織を３，３’−ジアミノベンジジン溶液（ＤＡＫＯ）を用いて染色し、ヘマトキシリンを用いて対比染色した。ニコン（Ｎｉｋｏｎ）Ｅ６００無限遠補正正立顕微鏡を使用してスライドを見た。画像解析のためにニコンＤｉｇｉｔａｌ  ＳｉｇｈｔシリーズＤＳ−Ｆｉ１カラーカメラおよびＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔ  ＢＲ３．０を使用して明るい視野画像が得られた。有資格獣医病理学者（Ｊ．Ｅ．）によって、ＨＥＲ２／ｎｅｕを染色している新生細胞のパーセンテージ（＜１０％＝１、１０％〜５０％＝２、＞５０％＝３）およびＨＥＲ２／ｎｅｕ染色の強度（弱＝１、中＝２、強＝３）に基づいて組織切片を評価し、ＨＥＲ２／ｎｅｕ正陽性のためにスコアリングした。スコアは各々の組織切片に対して１０ｈｐｆ以内で解析された細胞に基づいた。ＨＥＲ２／ｎｅｕ染色およびＨＥＲ２／ｎｅｕ染色強度に対して陽性の腫瘍細胞のパーセンテージに対して与えられた２つの別個のスコアを掛け算することによって、組み合わせられたＨＥＲ２／ｎｅｕスコアが得られた。ＨＥＲ２／ｎｅｕに陽性となる染色が腫瘍細胞の１０％以上であるイヌのみが、試験の組み入れ対象であった。
【０３９３】
資格の基準および臨床試験設計
ＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性ＯＳＡの病理組織学的および免疫組織化学的診断を有し、四肢の切断術または四肢の温存のいずれかの手術によって原発性腫瘍の除去を受けたイヌで、アジュバント化学療法として３週間毎に１度（または骨髄抑制が生じた場合は４週間毎に１度）の３００ｍｇ／ｍ２のカルボプラチンの４回の投与を受けたイヌはスクリーニングのために資格を有する。最後のカルボプラチン処置の３週間後イヌをスクリーニングした。詳細な身体検査、全血算定（ＣＢＣ）、化学スクリーニング（ＣＳ）、および尿検査（ＵＡ）を遂行して、全体的な健康状態を決定した。フローサイトメトリーの好中球酸化バーストアッセイおよびマイトジェン誘発性のリンパ球増殖アッセイをそれぞれ使用して、基本的に先天的および適応性の免疫機能を試験した。ベースラインの心臓の状態を心電図記録法、心エコー図、および血清心筋トロポニンＩレベルによって評価した。肺の転移性疾患の存在を決定するために胸部放射線写真を遂行した（図１４Ｂを参照）。先天的および適応性免疫が無傷であり、心臓の疾患を受けている兆候のない、かつ肺の転移性疾患の兆候のない、全身的に健康であることが見いだされたイヌのみが、組み入れ対象である。研究の過程の間に死んだイヌは検視を受けた。転移性疾患の存在および場所を記録し、転移性病巣内でのＨＥＲ２／ｎｅｕ発現を評価するために病理組織的および免疫組織化学的検査を遂行した。
【０３９４】
免疫解析
好中球酸化バーストアッセイ。ナトリウムヘパリン抗凝固剤処置血液中の赤血球を０．８３％ＮＨ４Ｃｌを使用して溶解し、残った白血球を１×ＰＢＳ中で２回洗浄した。１５μｇ／ｍＬのジヒドロローダミン１２３（ＤＨＲ−１２３，モレキュラープローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ），米国ニューヨーク州グランドアイランド）を用いて血球を標識し、３ｎＭの１３−酢酸１２−ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ，シグマ社，米国ミズーリ州セントルイス）を用いて３７℃にて３０分間活性化した。フローサイトメトリー解析の前に、血球を氷上に１５分間定置した。血球をＦＡＣＳＣａｎｔｏ（登録商標）血球計算器（ＢＤバイオサイエンス社（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ），米国カリフォルニア州サンノゼ）の上に取得し、ＦｌｏＪｏソフトウェア（トゥリースター社（Ｔｒｅｅｓｔａｒ），米国カリフォルニア州サンカルロス）を使用して解析した。
【０３９５】
リンパ球増殖アッセイ．密度遠心分離によって末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をナトリウムヘパリン抗凝固剤処置全血から分離した。ＰＢＭＣを、１×ＰＢＳ中で２回洗浄され、計数した。血球を５μＭのＣＦＳＥを用いて標識し、１．２５μＭのコンカナバリンＡを用いて３７℃にて５日間刺激した。細胞を採取し、ＦＡＣＳバッファー内で２回洗浄し、ＡＰＣ結合ラット抗イヌＣＤ４およびＰＥ結合ラット抗イヌＣＤ８抗体（セロテック社（Ｓｅｒｏｔｅｃ），米国ノースカロライナ州ラレー）を用いて標識し、フローサイトメトリーによって解析した。免疫機能の解析のために、ポジティブコントロールとして健康なコロニー犬（ＩＡＣＵＣ  ＃８０４１９７）から取った末梢血液を使用した。
【０３９６】
Ｔ細胞サブセット解析。各々のワクチン接種の前にベースラインにおいて、再ステージングにおいて、およびその後２か月毎に採取したＰＢＭＣをＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞サブセットについて解析した。簡潔に述べると、凍結保存した細胞を解凍し、ＦＡＣＳバッファー（１×ＰＢＳ、０．２％のＢＳＡ  ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ、および４ｍＭのアジ化ナトリウム）内で２回洗浄し、その後、マウス抗イヌＣＤ３、ＰＥ標識したラット抗イヌＣＤ８、またはＡｌｅｘａ標識した抗イヌＣＤ４（セロテック社，米国ノースカロライナ州ラレー）を用いて表面染色した。フローサイトメトリーの取得の直前に細胞を生体染色色素７−ＡＤＤとともにインキュベートした。ＣＤ４＋Ｔ細胞数およびＣＤ８＋Ｔ細胞数の合計をフローサイトメトリーのパーセンテージから計算し、Ｃｅｌｌ  Ｄｙｎ  ３７００ＣＳ血液分析器を使用してリンパ球計数の合計を決定した。
【０３９７】
ワクチン投与
ワクチン接種の前に、それぞれ吐き気およびアナフィラキシーを防止するために、イヌに、５ＨＴ３拮抗薬オンダンセトロン（０．２ｍｇ／ｋｇ）を静脈内投与し、Ｈ１受容体遮断薬、ジフェンヒドラミン（２ｍｇ／ｋｇ）を筋肉内投与した。標準的な３＋３臨床試験設計が採用された。ＡＤＸＳ３１−１６４を以下の投与で投与した。群１（２×１０８ＣＦＵ）、群２（５×１０８ＣＦＵ）、群３（１×１０９ＣＦＵ）および群４（３．３×１０９ＣＦＵ）。ＡＤＸＳ３１−１６４を１００ｍＬの０．９％のＮａＣｌ（群１および群２）、ならびに２００ｍＬの０．９％のＮａＣｌ（群３および群４）内に希釈し、３０分にわたり静脈内で投与した。点滴後一時間ごとに体温、脈拍、呼吸数、心拍数および心リズム（ＥＫＧによる）ならびに血圧をモニターした。体温が１０３°Ｆを超えた場合、イヌに静脈内でプラズマライトを４ｍＬ／ｋｇ／時間で体温が１０３°Ｆより低くなるまで与えた。イヌを１時間ごとに昏睡、吐き気、または嘔吐の兆候についてモニターした。血液学的パラメータまたは生化学的パラメータに何らかの変化がないかを評価するためにワクチン接種の２４時間後および１週間後に血液サンプルを抜き出し、ワクチン接種の２４時間後に血液培養を遂行して血流中の生細菌の持続性を決定した。すべてのイヌはワクチン接種後７２時間にアモキシシリンおよびＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭｅ）の短い過程を受け、残っているリステリアをすべて死滅させ、肝臓に抗酸化剤酸サポートを提供した。
【０３９８】
初回シリーズの最後のワクチン接種後少なくとも５か月転移性疾患のないイヌの飼い主は、１×１０９ＣＦＵの標準的な投与量でブースターワクチンを受けるオプションの提案を受けた。ブースターワクチンを記述されているように投与し、点滴後イヌを上述のようにモニターした。
【０３９９】
毒性
毒性を、獣医がん臨床研究グループの有害事象共通用語基準（ＶＣＯＧ−ＣＴＣＡＥ）に従ってグレード付けした。各々のワクチン接種のとき、最後のワクチン接種後３週間、およびその後死ぬまで２か月毎に、連続心電図、心エコー図、およびベースラインにおける血清心筋トロポニンＩレベルを通して心毒性の評価を遂行した。評価したパラメータとしては左室内径短縮率（ＬＶＦＳ）、ならびに左室拡張末期径（ＬＶＩＤｄ）および左室収縮末期径（ＬＶＩＤｓ）が挙げられる。イヌの間でからだの大きさの範囲が幅広いことを考慮してＬＶＩＤｄおよびＬＶＩＤｓを体重で正規化した。
【０４００】
ＥＬＩＳｐｏｔ解析
各々の表示された時点での凍結保存したＰＢＭＣを解凍し、３７℃で一晩置き、次いで計数した。キメラ型ワクチン、および組み換え型ヒトＩＬ−２（インビトロジェン，米国メリーランド州フレドリック）の中に存在するＨＥＲ２／ＮｅｕのＥＣ１、ＥＣ２、およびＩＣ１ドメインを代表する重複ヒトＨＥＲ２／Ｎｅｕペプチド（５アミノ酸によって１１ｍｅｒが重複する）の２．５μＭのプールを用いて細胞を５日間にわたって刺激した。細胞を採取し、１×のＰＢＳ中で２回洗浄し、計数した。製造業者のプロトコルに従って市販のイヌのＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイキット（Ｒ＆Ｄシステムズ社，米国ミネソタ州ミネアポリス）を使用して、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを遂行した。簡潔に述べると、０．８−２×１０５の刺激された細胞を２．５μＭのＥＣ１、ＥＣ２、またはＩＣ１ペプチドプールプラスＩＬ−２を用いて、またはＩＬ−２を単独で用いてインキュベートした（バックグラウンド計数を決定するため）。すべてのアッセイを２回ずつ遂行した。製造業者の取扱い説明書に従ってプレートを発色させた。ＣＴＬ−Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔアナライザー（Ｃ．Ｔ．Ｌ社、米国オハイオ州シェーカーハイツ）を使用してスポットを計数した。
【０４０１】
一次および二次転帰の測定
転移の時期（ＴＴＭ）は切断術と転移性疾患発生との間の時間として計算される。切断術と死との間の時間としてＯＳＡに特異的な生存を計算した。無関係な原因で死んだ患者は、その死の時点で打ち切った。
【０４０２】
結果
【０４０３】
資格種特異の基準を満たした１８匹のイヌをこのフェーズＩ臨床試験に組み入れた。年齢、品種、性別、腫瘍の場所、サブタイプ、グレード、およびＨＥＲ２／ｎｅｕの状態を記録した（表４）。標準的な３＋３臨床試験設計が採用された。ＡＤＸＳ３１−１６４を以下の投与量で投与した。群１：２×１０８ＣＦＵ（ｎ＝３）、群２：５×１０８ＣＦＵ（ｎ＝３）、群３：１×１０９ＣＦＵ（ｎ＝９）、および群４：３×１０９ＣＦＵ（ｎ＝３）。スクリーニングの時点で識別された既存の肺の転移性疾患を有する５匹の追加的なイヌも、思いやりのあるケアとしてＡＤＸＳ３１−１６４を受容した（表４）。これらのイヌのうち４匹はその原発性腫瘍からの新生細胞の＞５０％で強いＨＥＲ２／ｎｅｕ染色を有した。スクリーニングの際にこれらのイヌのうち３匹は複数の肺の転移性結節を有し、２匹のイヌは単一の転移性結節を有した。複数の肺結節を有するイヌは、疾患の進行の前に各々１つのワクチンを受容し、代替的な治療のために研究から離脱した。単一の結節を有する２匹のイヌは、各々３つのワクチンの全過程を受容した。既存の転移性疾患を有するイヌは１×１０９ＣＦＵ（ｎ＝３）または３×１０９ＣＦＵ（ｎ＝２）のいずれかのＡＤＸＳ３１−１６４を受容した（表５）。
【０４０４】
図１５はフェーズ１臨床試験のタイムラインの概略図を示し、切断およびフォローアップの化学療法に続いて３つのワクチン接種を投与した。
【０４０５】
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【０４０６】
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【０４０７】
結果
【０４０８】
安全性および毒性＝２３匹のワクチン接種したイヌすべてに対して安全性が評価された。すべてのイヌはＡＤＸＳ３１−１６４投与に対して十分な耐性があり、ワクチン接種の日に一時的な低グレードの毒性のみが観察された（表６）。投与量に関わらずすべての群で、ＡＤＸＳ３１−１６４の投与の４時間後に体温の統計的に有意な増加が生じた（図９Ａ）。低血圧はいかなる時点でもまたはいずれの投与量でも観察されなかった（図９Ｂ）。８匹／１８匹のイヌ（既存の転移性疾患のない）、および３匹／５匹のイヌ（既存の転移性疾患を有する）は、ワクチン接種の４時間以内に＞１０３°Ｆの熱を発生し、その時点で静脈内に液体を与えられた。３匹のイヌは体温を下げるために単一投与の非ステロイド抗炎症薬を受容した。すべての事例で、さらなる介入なしに発熱は解消した。投与量に関わらず、ワクチン接種の４時間以内に、治療的な介入を必要としない一時的な昏睡、吐き気、ならびに嘔吐が発生した。２匹のイヌでは、ワクチン接種のすぐ後で一時的な単一のまたは二段の心室性期外収縮が識別された。既存の転移性疾患を有する１匹のイヌは、ワクチン接種の２時間以内に心室頻拍を発生した。リドカイン、プロカインアミド、ソタロール、および副腎皮質ステロイドを用いた治療はあまり効果が無かったが、しかしながら不整脈は７２時間以内に解消された。ＡＤＸＳ３１−１６４の２４時間後に、一時的ではあったが、白血球および好中球の計数の統計的に有意な増加が生じ、血小板およびリンパ球の一時的減少が付随して起きた（図１７）。ＡＤＸＳ３１−１６４投与量と血液学的変化の程度との間に相関はなかったが、生存したイヌと死亡したイヌとの白血球、好中球、および単球の程度の応答の間には有意な差があった（図１８Ａ〜図１８Ｆ）。肝臓酵素の血清濃度の中程度の一時的な増加がおよそ半分のイヌで、肝臓指向性リステリアによって発生した中程度の炎症と一致して生じた（表６）。末梢血液で識別されたすべての変化は無症候性であり、一週間以内のＡＤＸＳ３１−１６４投与で解消された。いずれのイヌでも腎臓の機能では有意な変更は記載されなかった。１９匹／２３匹のイヌはＡＤＸＳ３１−１６４投与の２４時間後に血液培養を遂行し、高度に弱毒化したＬｍｄｄＡ株の急速な除去と一致してすべて陰性であった。
【０４０９】
ＨＥＲ２／ｎｅｕを標的化したモノクローナル抗体が心臓毒性を生じると仮定して、心筋トロポニンＩ、短縮率（％）、ベースラインにおけるＬＶＩＤｄおよびＬＶＩＤｓを含む、心臓障害のバイオマーカーおよび機能障害の心エコー測定を、各々のワクチン接種の前およびその後２か月ごとに評価した。いずれかのワクチン接種したイヌで、心筋トロポニンＩ、短縮率、ＬＶＩＤｄまたはＬＶＩＤｓの有意でない、持続的な変化が識別された（図２６Ａ〜図２６Ｄ）。群３の中の１匹のイヌは各々のワクチン接種の時点で血清心筋トロポニンＩの段階的な増加を示したが、これは心エコーの機能障害の兆候に付随して起きたものではなかった。値は最後のワクチン接種に続いてベースラインに戻り、繰り返し評価では上昇しなかった。
【０４１０】
図２５（Ａ〜Ｄ）に示すように、臨床試験を通して、短縮率、左室収縮末期径（ＬＶＩＤｓ）、および拡張期のＬＶＩＤ（ＬＶＩＤｄ）とともに心筋トロポニンＩのレベルを測定し、ＡＤＸＳ３１−１６４の投与に続く長期または短期の心臓毒性の兆候はなかった。
【０４１１】
最低限の治療に関連する有害事象を示すデータを提供する下表６が臨床試験の間に報告された。
【０４１２】
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【０４１３】
結論：ＡＤＳＸ３１−１６４の毒性のグレードは、低くかつ一時的であった。
【０４１４】
ＡＤＸＳ３１−１６４への免疫応答
【０４１５】
図１８に提示する結果は、イヌの生存が予測されるワクチンを受容したイヌでのＡＤＸＳ３１−１６４への早期の免疫応答を実証する。図１８は、ＡＤＸＳ３１−１６４が生存と相関するＷＢＣ、好中球、および単球の計数の増加を誘発したことを示し、これは血小板およびリンパ球の一時的な減少に付随して起こる（図１７）。
【０４１６】
ＡＤＸＳ３１−１６４の免疫応答を誘発および維持する能力、および特にＨＥＲ２／Ｎｅｕに特異的なＴ細胞免疫性を誘発する能力を臨床試験の間に評価した。免疫応答を評価し、ＡＤＸＳ３１−１６４によってＨＥＲ２／Ｎｅｕに特異的なＴ細胞応答が誘発されるかどうかを決定するために、ＨＥＲ２／Ｎｅｕに特異的なＴ細胞数をＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔによって評価した。ベースライン（カルボプラチンの３週間後）において、ワクチン接種ごと、およびその後２か月に一度サンプルを取った。図１９はＥＬＩＳｐｏｔアッセイの結果を示す。
【０４１７】
ＨＥＲ２／ｎｅｕに特異的な免疫応答。ＨＥＲ２／ｎｅｕのヒトＥＣ１、ＥＣ２、およびＩＣ１ドメインに対する免疫学的応答（それぞれ８９％、９３％、および９８％の同一性をイヌのＨＥＲ２／ｎｅｕと共有する）をそれぞれ４／１８、６／１８、および１／１８のイヌでベースラインにおいて検出した。１つ以上のＨＥＲ２／ｎｅｕドメインに対する誘発されたＩＦＮ−γ応答が７匹のイヌで第３のＡＤＸＳ３１−１６４ワクチン接種の３週間後に検出された（表７）。これらのイヌのうちの５匹は高度に保存されたＩＣ１ドメインに対して免疫応答を発生した。５匹の追加的なイヌは２か月後ＩＣ１ドメインに対してＩＦＮ−γ応答を発生した。３匹の追加的なイヌは、再燃の時点でＥＣ２単独、ＥＣ２およびＩＣ１、またはＥＣ１、ＥＣ２、およびＥＣ３の何れかに対してＩＦＮ−γ応答を発生した（イヌ００１、００２、および０１７）。初期のワクチン接種の一連の間にＨＥＲ２／ｎｅｕに対して免疫学的応答を発生した３匹のイヌは、１５〜１７か月にわたってＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔによって評価された。ＨＥＲ２／Ｎｅｕに特異的なＩＦＮ−γ応答は維持されなかったが、この期間中、イヌは転移性疾患がないままだった。１０匹のイヌが追加的なブースターワクチン接種を受け、６匹の評価可能なもののうち、２匹のイヌは、ブースターワクチン接種の２か月後、ＨＥＲ２／ｎｅｕに特異的なＩＦＮ−γ応答の検出可能な増加を有した。再燃した８匹のイヌのうち、５匹はＡＤＸＳ３１−１６４後３週間、ＨＥＲ２／ｎｅｕに特異的なＩＦＮ−γ応答の増加がなかった。
【０４１８】
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【０４１９】
ブースターワクチン接種。組み入れ時に転移性疾患を有しない１８匹のイヌ中の１０匹に、初期の一連のワクチンの後５〜１０か月の間に単一のブースターワクチンを投与した。これらのイヌのうちの４匹は、第１のブースターワクチンの後４〜１５か月の間に与えられる追加的なブースターワクチンを受容した。ブースターワクチン接種の時点で、初期の一連のワクチン接種と類似のグレードの低い一時的な副作用に気付いた。
【０４２０】
図２０（ＡおよびＢ）は、繰返しブースターワクチン接種もＨＥＲ２に特異的な免疫を刺激することを示している。動物２８９−００３に対しては６か月および１０か月に、動物２８９−００４に対しては８か月に繰返しブースターワクチン接種を投与した。
【０４２１】
臨床的転帰。ワクチン接種した群の中の８匹／１８匹のイヌが再燃し、４匹は肺の転移性疾患を有し、４匹は骨転移を有した。骨転移を有する２匹のイヌは肺の転移へと進行した。仙骨に骨病巣を有する１匹のイヌは、誤嚥性肺炎で死に、孤立性肺結節を有する１匹のイヌは腎芽細胞腫で死んだが、骨および肺の病巣からのそれぞれの検視標本を転移性骨肉腫の病理組織学的な確認のために利用することができなかった。これらの２匹のイヌはＯＳＡに特異的な生存解析から打ち切られた。再燃したイヌは主任臨床医の自由裁量で異なる救援化学療法および放射線療法を受けた。骨転移を有する４匹のイヌは、鎮痛薬のみを用いて処置するか（１匹のイヌ）、緩和放射線を単独で用いて処置するか（１匹のイヌ）、または化学療法と併用して（２匹のイヌ）処置した。２匹のイヌにはアドリアマイシンを投与し、１匹のイヌには肺の転移性疾患の治療のためにパラディアを投与した。ワクチン接種したイヌに対するＯＳＡに特異的な平均生存期間にはまだ到達していない。ＴＴＭおよびＯＳＡに特異的な生存に対するカプラン−マイヤー生存率曲線を図２１に示す。ワクチン接種したイヌに対する１年および２年の全生存率は、それぞれ７１．４％および５７％である。ワクチン接種の２か月以内にＨＥＲ２／ｎｅｕに特異的なＩＦＮ−γ応答を発生した１２匹のイヌのうち、９匹がまだ生存している（３匹のイヌ＞９００日、１匹のイヌ＞７００日、３匹のイヌ＞４００日、および２匹のイヌ＞３００日、７匹は今日まで腫瘍が無いままである（表７））。図２４に提示される結果は、ＡＤＸＳ３１−１６４がＨＥＲ２／Ｎｅｕへの耐性を破壊することを実証する。これはＯＳＡの治療ならびに他のＨＥＲ２／Ｎｅｕ腫瘍および／またはガンに対して有意である場合がある。
【０４２２】
剖検所見。６匹中１８匹のイヌは研究期間中に死亡し、これらのイヌのうち４匹で剖検を遂行した。３匹のイヌは、肺（３匹のイヌ）、骨（２匹のイヌ）、縦隔（１匹のイヌ）、および腎臓（１匹のイヌ）が関与するグレードＩＩおよびグレードＩＩＩの多巣性転移性骨肉腫を有することが見出された。大きい進行性の腎腫瘤のために安楽死させた１匹のイヌは、腎芽細胞腫を有することが見出された。このイヌは単一の肺結節も有したが、これは残念ながら病理組織検査による評価はされなかった。
【０４２３】
ＡＤＸＳ３１−１６４の投与に続く生存、生存の延長、腫瘍進行 
【０４２４】
スクリーニング時に複数の転移性肺結節を有し、思いやりのあるケアとして治療された３匹のイヌは、疾患の進行の前に各々１つのワクチンを受容し、研究から除外された。スクリーニング時に孤立性転移性肺結節を提示した２匹のイヌは３つのワクチンすべてを受容した（表徴および腫瘍特徴については表５を参照）。ワクチン接種にもかかわらずこれらのイヌのうちの１匹で進行性の肺転移性疾患が発生した。既存の肺結節の大きさが３週間ごとに倍になっていたのにもかかわらず、第２のイヌではいかなる追加的な肺の病巣も発生しなかった（図２２Ａおよび図２２Ｂ）。最後のワクチン接種の１週間後、ＣＴスキャンは追加的な転移性病巣が無いことを確認し、そのイヌは転移巣切除術を受けた。外科手術の前に、腫瘍境界および炎症の区域を検出するために使用される染料であるインドシアニングリーン（ＩＣＧ）を静脈内投与し、外科手術では近赤外光の下で肺結節および孤立性結節の近くの健康に見える肺実質のいくつかの他の区域で蛍光が見られた（図２２Ｃおよび図２２Ｄ）。肺結節の病理組織検査では、出血および壊死の大きい区域を有し、厚い線維性被膜によって取り囲まれた転移性ＯＳＡを明らかにした（図２２Ｅ）。ＩＨＣは、結節自体の中にごくわずかなＴ細胞を有する線維性被膜の周りのＣＤ３＋Ｔ細胞の蓄積を示した（図２２Ｇおよび図２２Ｈ）。近赤外光蛍光によって識別される他の区域はＴ細胞浸潤の焦点地域を示す（図２２Ｆ、図２２Ｉ、および図２２Ｊ）。Ｔ細胞は、異常に大きいビメンチン陽性細胞を包囲して目立つ有糸分裂像を用いて示される（図２２Ｋおよび図２２Ｌ）。これらの所見は単一の転移性肉腫細胞が肺の中の腫瘍に特異的なＴ細胞によって効果的に標的化される場合があり、ＡＤＸＳ３１−１６４がこれによって肺の転移性疾患を防止する、可能な機構を提供する場合があることを示唆する。このイヌは外科手術から良好に回復し、広い範囲に及ぶ侵攻性のＨＥＲ２／ｎｅｕ＋転移性疾患が皮下組織（骨芽細胞性、グレードＩＩおよび軟骨芽細胞性、グレードＩＩＩ）、縦隔（骨芽細胞、グレードＩＩ）、および横隔膜（骨芽細胞、グレードＩＩＩ）に発生する前５か月間にわたって肺の転移性疾患が無いままであった。結果は、ＨＥＲ２／ｎｅｕに特異的なＴ細胞応答の誘導にもかかわらず、腫瘍外での副作用が識別されず、したがってＨＥＲ２／ｎｅｕに特異的なＴ細胞の誘導はＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性の転移性細胞の除去および疾患の再燃からの長期の保護を担当することを示す。これはＨＥＲ２／Ｎｅｕに特異的なＴ細胞増幅のタイミングによってサポートされ、これは数多くのイヌが転移性疾患を発生するとき、また巣状Ｔ細胞の病理組織学的所見によってワクチン接種および転移巣切除術に続いて１匹のイヌの肺実質の中で応答するとき、５匹のイヌでは診断のおよそ８か月後に発生した。
【０４２５】
図２２および図２３に提示される結果は、ＡＤＸＳ３１−１６４の投与が自然発生的なＨＥＲ２＋骨肉腫を有するイヌの転移性疾患を遅延および／または防止し、かつ全生存を長くすることを実証する。両方の図で見ることができるように、ワクチンを受容しているイヌは、有意に延長された生存時間を有し、一方でこれらのワクチンを受容しているイヌに対する平均生存期間にはまだ達していない。
【０４２６】
発明者らの研究は転移性疾患を防止するうえでのこのアプローチの有効性を実証するが、ＡＤＸＳ３１−１６４を用いたワクチン接種は、思いやりのあるケアに基づき治療を受けた５匹のイヌでは既存の大きい肺の転移性疾患の退行を誘発することができなかった。１匹のイヌでは、これはＴ細胞が転移性病巣を包囲する線維性被膜に浸透することができないこと、またはこれらの細胞が定着した腫瘍微小環境内で生存することと関連付けられると思われた（図２２Ｃ）。しかしながら、この同じイヌで、周囲の大きい活動的に分割している間葉細胞を浸潤し、転移性ＯＳＡ細胞となると言われているＴ細胞の焦点地域は大幅に正常な肺実質内で識別され、また予想に反してこのイヌの転移巣切除術の後はさらなる肺の転移性疾患は発生しなかった。これらを考え合わせると、これらのデータは、転移性ＯＳＡ細胞をＦＡＳ／ＦＡＳＬ媒介アポトーシスに敏感にする場合があるその有能な先天的な免疫応答、および微小転移性肺疾患を除去するＨＥＲ２／Ｎｅｕに特異的なＴ細胞の形態の適応性免疫応答を誘発する能力を通してＡＤＸＳ３１−１６４が肺の転移性疾患を防止していることを示唆する。
【０４２７】
結論：
【０４２８】
本願出願時において、１２匹中１８匹のイヌは肺の転移性疾患を発生しておらず、最低限の残留疾患の設定で投与するときＡＤＸＳ３１−１６４が自然発生ＨＥＲ２＋骨肉腫を患う被験体における転移性疾患を防止することを実証していた。ワクチン接種したイヌは、履歴的なＨＥＲ２／Ｎｅｕ＋対照群と比較して、全生存の統計的に有意な増加を示した。ＨＥＲ２／Ｎｅｕ＋対照のイヌ（ｎ＝１１）での平均生存期間は、３１６日（ｐ＝０．０３２）であり、ＡＤＳＸ３１−１６４処置されたイヌでの平均生存期間はまだ達していない。さらに、結果はＡＤＸＳ３１−１６４がＨＥＲ２／Ｎｅｕの高度に保存されたＩＣ１ドメインに対する末梢耐性を破壊することを示している（図２６）。ＡＤＸＳ３１−１６４投与の２４時間以内の白血球の増加の程度は（図１８）は、生存と相関し、ワクチンに応答するため転帰がイヌの免疫系の能力に部分的に依存することを示唆する。重要なことに、この研究は自発性ＯＳＡに罹患したイヌに最高３×１０９ＣＦＵまでのＡＤＸＳ３１−１６４の投与が安全であり、投与時に単に一時的な低いグレードの副作用のみを発生することを示している。さらに、肺の転移性疾患の防止は、部分的にＣＤ３＋Ｔ細胞が媒介する肺内の顕微鏡的な転移性疾患の除去と関連付けられる場合がある。この研究は小児科のＯＳＡおよびＨＥＲ２／Ｎｅｕを発現する他のヒトのガンのために重要な意味合いを有する。
【０４２９】
さらに、ここで発明者らはイヌでの最高３．３×１０＾９  ＣＦＵまでの投与量でのＡＤＸＳ３１−１６４の投与が安全であること、ＨＥＲ２／ｎｅｕに特異的な免疫性を誘発するにもかかわらず、短期または長期の心毒性につながらないことを示した。標的上で、心毒性を含む腫瘍外での副作用は、多数のＨＥＲ２／ｎｅｕに特異的なＴ細胞の投与と、またはトラスツズマブがアントラサイクリンとの同時使用時とに関連付けられてきた。発明者らは、あらゆる潜在的な心毒性のリスクを低下させるためにドキソルビシンを用いない標準的な化学療法プロトコルを採用した。
【０４３０】
発明者らの研究は、ＯＳＡに罹患したイヌでＡＤＸＳ３１−１６４が肺の転移性疾患を防止することができることを実証した。これらの結果は安全性およびかつてないほどの生存時間をＯＳＡに罹患したイヌで実証し、小児骨肉腫および乳ガンを含むＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍を有する患者内の転移性疾患を防止する、ＡＤＸＳ３１−１６４の能力を調査する道筋を固めるものである。
【０４３１】
実施例１１：
イヌならびにヒトの骨肉腫（ＯＳＡ）および肺の転移性疾患の治療のためのＡＤＸＳ３１−１６４および放射線療法の併用。
【０４３２】
肺の転移性疾患を防止し、自然に起こる四肢骨肉腫を有するイヌにおける全生存を延長させるために緩和放射線と組み合わせて使用（併用）される、ヒトキメラ型ＨＥＲ２／ｎｅｕ構造（ＡＤＸＳ３１−１６４）を発現する組み換え型リステリア・モノサイトゲネスについて説明する。イヌとヒト骨肉腫の間の類似性を考えると、本願出願人は、この組み合わせは、ヒト疾患のための有効な治療法であると考えている。
【０４３３】
材料および方法
【０４３４】
ワクチン調製 
ＡＤＸＳ３１−１６４の構成の詳細を前述した。ＡＤＸＳ３１−１６４株を調製し、−７０℃の冷凍庫で１ｍｌのアリコートとして保存した。注射の前に、ワクチン株を３７℃で２〜３分解凍し、次いでリン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄し、５×１０８コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍｌの最終濃度でのＰＢＳで再懸濁した。この懸濁液２００μｌを各イヌに腹腔内に免疫した。
【０４３５】
放射線療法および免疫療法
病理組織学的に確認され、治験未経験であり、ＨＥＲ２＋四肢骨肉腫であり、心疾患または転移性疾患の証拠のない１０匹の全身健康なイヌが組み入れられた。全てのイヌは、連日２つの画分で１６Ｇｙの放射線治療を受け、続いて最初の８回のＡＤＸＳ３１−１６４の静脈内投与（用量あたり３．３×１０＾９  ＣＦＵ）を３週間毎に一度受けた。リステリアベースのワクチンでの免疫化を３週間毎に行った（例えば、７日目、２８日目、４９日目、７０日目、９１日目、１１２日目、１３３日目、および１５４日目）（図１０）。免疫解析をまた、免疫化の日にも行った。
【０４３６】
４日目と５日目、８Ｇｙの体外照射療法をシーメンス社（Ｓｉｅｍｅｎｓ）の６ＭＶの線形加速器を用いて送達した。放射線療法を、全身麻酔下で行った。腫瘍を３週間毎に臨床的に、およびベースライン時、４回目のワクチン投与時（７０日目）、ならびに８回目のワクチン投与（１５４日目）時にＸ線検査で評価した。この時点で、肺の転移性疾患の存在を決定するために胸部放射線写真を遂行した。
【０４３７】
骨肉腫の診断を確認するために、組み入れ時に骨生検を行った。全血算定（ＣＢＣ）、化学スクリーニング（ＣＳ）、尿検査（ＵＡ）、心電図（ＥＫＧ）／心エコー図／心筋トロポニンＩの血清濃度（ｃＴｎｌ）および患肢と胸部の放射線写真を、その後安楽死まで０日目、７０日目、および１３３日目および２ヶ月毎に行った。安楽死の日、全血算定（ＣＢＣ）、化学スクリーニング（ＣＳ）、尿検査（ＵＡ）、免疫解析、心電図（ＥＫＧ）／心エコー図／心筋トロポニンＩの血清濃度（ｃＴｎｌ）；および剖検を行った。
【０４３８】
各々の表示された時点でのＥＬＩＳｐｏｔアッセイ凍結保存したＰＢＭＣを解凍し、３７℃で一晩置き、次いで計数した。キメラ型ワクチン、および組み換え型ヒトＩＬ−２（インビトロジェン，米国メリーランド州フレドリック）の中に存在するＨＥＲ２／ＮｅｕのＥＣ１、ＥＣ２、およびＩＣ１ドメインを代表する重複ヒトＨＥＲ２／Ｎｅｕペプチド（５アミノ酸によって１１ｍｅｒが重複する）の２．０μＭのプールを用いて細胞を５日間にわたって刺激した。細胞を採取し、１×のＰＢＳ中で２回洗浄し、計数した。製造業者のプロトコルに従って市販のイヌのＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイキット（Ｒ＆Ｄシステムズ社，米国ミネソタ州ミネアポリス）を使用して、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを遂行した。簡潔に述べると、０．１−３×１０５の刺激された細胞を２．５μＭのＥＣ１、ＥＣ２、またはＩＣ１ペプチドプールプラスＩＬ−２を用いて、またはＩＬ−２を単独で用いてインキュベートした（バックグラウンド計数を決定するため）。すべてのアッセイを２回ずつ遂行した。製造業者の取扱い説明書に従ってプレートを発色させた。ＣＴＬ−Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔアナライザー（Ｃ．Ｔ．Ｌ社、米国オハイオ州シェーカーハイツ）を使用してスポットを計数した。
【０４３９】
結果
【０４４０】
本明細書で上述したよう、我々は自然に起こる骨肉腫を有するイヌにおけるアジュバント療法としてＡＤＸＳ３１−１６４の使用を評価した。ＡＤＸＳ３１−１６４を、２日連続で１６Ｇｙの放射線療法を施した後に、自然に起こる四肢骨肉腫を有するイヌに投与した。最高８用量のＡＤＸＳ３１−１６４を投与した。この研究は、ＡＤＸＳ３１−１６４の３．３×１０９ＣＦＵの反復投与が安全であることを示した。
【０４４１】
抗腫瘍性免疫（特にＨＥＲ−２／ｎｅｕ特異的Ｔ細胞の生成）を促進し、原発性腫瘍の進行を遅延させ、肺の転移性疾患を防止／遅延させる放射線療法およびＡＤＸＳ３１−１６４の間の潜在的な相乗効果を次いで調査した。
【０４４２】
図１０は、治療プロトコルを示している。試験に組み入れるために０日目にイヌをスクリーンした。スクリーニングは、基本的な血液検査の評価、尿検査、心機能評価、胸部および患肢の放射線写真および骨肉腫の診断を確認するための骨生検を含む。組み入れ後２日間連続で緩和放射線を照射した。ＡＤＸＳ３１−１６４の複数回投与（最大８回）を、単に一時的な低いグレードの副作用のみを伴う緩和放射線療法の後、３週間毎に１度受けた。胸部および四肢の放射線写真を７０日目および１５４日目で繰り返した。跛行スコアは、２人の有資格獣医病理学整形外科医により、各時点での各イヌを撮影したビデオのそれらの評価に基づき、各時点で各イヌに割り当てられた。イヌの飼い主は、生活の質に対する飼い主の認識が記録される有効性が認められた疼痛質問表に記入した（図２８）。１０匹中５匹のイヌはまだ生きており、３匹は腫瘍の進行または肺の転移性疾患の証拠は無い。本明細書を書いている時点では、平均生存期間は２８５日であり、これは放射線療法単体で達成される１３６日の平均生存期間と比べて優っている。一人の患者において、２枚の骨プレートおよび髄内ピンにより安定化された上腕骨近位端の病的骨折で試験組み入れのために提示し、放射線写真は骨折治癒の証拠を示し、放射線療法およびＡＤＸＳ３１−１６４投与の３ヶ月後の肺の転移性疾患の証拠を示さない（図１１）。
【０４４３】
さらに、結果は、緩和放射線療法とＡＤＸＳ３１−１６４療法との組み合わせ（併用）は、溶解を減少し、腫瘍の地固めを促進し、被験体の生存を延長することを示す（図２９Ａ〜Ｄおよび図３０Ａ〜Ｂ）。マーキングされた皮質骨リモデリングおよび１６Ｇｙの放射線（２０１４年９月１３日に開始し２日連続で８Ｇｙとして与えられる）ならびにＡＤＸＳ３１−１６４の３回の投与（２０１４年１１月２５日）に続く、溶解の減少を実証する遠位脛骨骨肉腫障害の側面（図２９Ａ）および前後方向（図２９Ｃ）の放射線写真の視野である。１６Ｇｙの放射線（２０１４年７月１６日に開始し２日連続で８Ｇｙとして与えられる）ならびにＡＤＸＳ３１−１６４の３回の投与（２０１４年１０月１３日）により治療される遠位脛骨骨肉腫障害の側面（図２９Ｂ）および前後方向（図２９Ｄ）の放射線写真の視野である。橈骨遠位部内の腫れおよび骨の溶解における有意な減少に留意のこと（図２９Ｂの２０１４年７月１６日付けと２０１４年１０月１３日付けの放射線写真を比較のこと）。遠位脛骨の内側部の増加した骨密度がある（図２９Ｄの２０１４年７月１６日付けと２０１４年１０月１３日付けの放射線写真を比較のこと）。図２９Ｄの２０１４年１０月１３日付けの放射線写真に見られる橈骨遠位部の内側面の小さな最小限の変位骨折がある。従って、ＡＤＸＳ３１−１６４は、化学療法なしで使用されても、転移性疾患を防止するための切断術および化学療法よりも前に放射線と組み合わせて潜在的にネオアジュバント設定において使用されてもよい。
【０４４４】
本発明のある特定の特徴が本明細書に例示され記述されてきたが、今では当業者には数多くの修正、置換、変更、および均等物が生じるであろう。したがって、添付の特許請求の範囲が、本発明の真の趣旨に含まれるかかるすべての修正および変更を網羅することを意図していることが理解されるべきである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２７Ｄ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２８Ｃ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図２９Ｄ】
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【図３０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年4月10日(2017.4.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体におけるＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍増殖またはガンを治療するための薬剤であって、
追加的なポリペプチドに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含みかつ代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含むような核酸を含む組み換え型弱毒化リステリア株を効果的な量で含み、
前記代謝酵素が、前記組み換え型弱毒化リステリア株の染色体内の突然変異した内因性遺伝子を相補し、
前記薬剤が、少なくとも２回の放射線療法と併用して投与されることを特徴とする薬剤。
【請求項２】
被験体におけるＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍増殖またはガンに対する強化免疫応答を引き出すための薬剤であって、
追加的なポリペプチドに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含みかつ代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含むような核酸を含む組み換え型弱毒化リステリア株を効果的な量で含み、
前記代謝酵素が、前記組み換え型弱毒化リステリア株の染色体内の突然変異した内因性遺伝子を相補し、
前記薬剤が、少なくとも２回の放射線療法と併用して投与されることを特徴とする薬剤。
【請求項３】
前記ＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原が、配列番号：２に示される配列によりコードされることを特徴とする請求項１または２に記載の薬剤。
【請求項４】
前記被験体が、ヒトの大人または子どもであることを特徴とする請求項１または２に記載の薬剤。
【請求項５】
前記ＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原が、マッピングされたヒトＭＨＣクラスＩエピトープのうちの少なくとも５、９、１３、１４、または１７を含むことを特徴とする請求項１または２に記載の薬剤。
【請求項６】
前記核酸分子が、前記リステリアゲノムに組み込まれることを特徴とする請求項１または２に記載の薬剤。
【請求項７】
前記核酸分子が前記組み換え型弱毒化リステリア株の中のプラスミドの中にあり、かつ前記プラスミドが、抗生物質選択がない場合に前記組み換え型弱毒化リステリア株の中に安定して維持されることを特徴とする請求項１または２に記載の薬剤。
【請求項８】
前記組み換え型リステリアが、前記ａｃｔＡ病毒性遺伝子内に欠失を含むことを特徴とする請求項１または２に記載の薬剤。
【請求項９】
前記追加的なポリペプチドが、ａ）非溶血性ＬＬＯタンパク質もしくはＮ末端断片、ｂ）ＰＥＳＴ配列、またはｃ）ＡｃｔＡ断片からなる群から選択されることを特徴とする請求項１または２に記載の薬剤。
【請求項１０】
前記第２のオープンリーディングフレームによってコードされる前記代謝酵素が、アラニン・ラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素であることを特徴とする請求項１または２に記載の薬剤。
【請求項１１】
前記放射線療法が、前記組み換え型弱毒化リステリア株の投与よりも前に施されるか、または、２日連続で各々８Ｇｙ、合計１６Ｇｙにて施されることを特徴とする請求項１または２に記載の薬剤。
【請求項１２】
前記組み換え型弱毒化リステリア株が、ＡＤＸＳ３１−１６４であることを特徴とする請求項１または２に記載の薬剤。
【請求項１３】
前記組み換え型弱毒化リステリア株が、１回の投与あたり３．３×１０９ＣＦＵの用量で複数回投与されることを特徴とする請求項１または２に記載の薬剤。
【請求項１４】
前記組み換え型弱毒化リステリア株が、３週ごとに１回ないし最大で８回投与されることを特徴とする請求項１３に記載の薬剤。
【請求項１５】
１回目のワクチン接種後に投与されるブースターワクチンであることを特徴とする請求項１または２に記載の薬剤。
【請求項１６】
前記ブースターワクチンが２ヶ月ごとに投与されることを特徴とする請求項１５に記載の薬剤。
【請求項１７】
前記組み換え型弱毒化リステリア株が、独立したアジュバントと共に投与され、
前記アジュバントが、顆粒球性／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンＱＳ２１、モノホスホリルリピドＡ、またはメチル化されていないＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１または２に記載の薬剤。
【請求項１８】
前記腫瘍増殖またはガンが、再燃または転移であることを特徴とする請求項１または２に記載の薬剤。
【請求項１９】
前記ガンが、骨肉腫であることを特徴とする請求項１または２に記載の薬剤。
【請求項２０】
前記転移が、肺の転移性疾患であることを特徴とする請求項１または２に記載の薬剤。
【請求項２１】
前記腫瘍増殖またはガンに対する強化免疫応答を引き出すことにより、ＨＥＲ２／ｎｅｕに特異的なＴ細胞応答の増加をもたらすことを特徴とする請求項１または２に記載の薬剤。
【請求項２２】
ヒト以外の被験体におけるＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍増殖またはガンを治療する方法であって、
放射線療法と併用して、追加的なポリペプチドに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含みかつ代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含むような核酸を含む組み換え型弱毒化リステリア株を投与するステップを含み、
前記代謝酵素が、前記組み換え型弱毒化リステリア株の染色体内の突然変異した内因性遺伝子を相補し、
前記放射線療法の投与が、該放射線療法の少なくとも２回の投与を含むことを特徴とする方法。
【請求項２３】
ヒト以外の被験体におけるＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍増殖またはガンに対する強化免疫応答を引き出す方法であって、
放射線療法と併用して、追加的なポリペプチドに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含みかつ代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含むような核酸を含む組み換え型弱毒化リステリア株を投与するステップを含み、
前記代謝酵素が、前記組み換え型弱毒化リステリア株の染色体内の突然変異した内因性遺伝子を相補し、
前記放射線療法の投与が、前記放射線療法の少なくとも２回の投与を含むことを特徴とする方法。
【請求項２４】
ＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍増殖またはガンを患うヒト以外の被験体の生存を延長させる方法であって、
放射線療法と併用して、追加的なポリペプチドに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームおよび代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組み換え型弱毒化リステリア株を投与するステップを含み、
前記代謝酵素が、前記組み換え型弱毒化リステリア株の染色体内の突然変異した内因性遺伝子を相補し、
前記放射線療法の投与が、該放射線療法の少なくとも２回の投与を含むことを特徴とする方法。
【請求項２５】
ＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍増殖またはガンを患うヒト以外の被験体における転移性疾患を遅延する方法であって、
放射線療法と併用して、追加的なポリペプチドに融合したＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームおよび代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組み換え型弱毒化リステリア株を投与するステップを含み、
前記代謝酵素が、前記組み換え型弱毒化リステリア株の前記染色体内の突然変異した内因性遺伝子を相補し、
前記放射線療法の投与が、該放射線療法の少なくとも２回の投与を含むことを特徴とする方法。
【請求項２６】
前記ＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原が、配列番号：２に示される配列によりコードされることを特徴とする請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記被験体が、イヌであることを特徴とする請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＨＥＲ２／ｎｅｕキメラ抗原が、イヌＭＨＣクラスＩエピトープのうちの少なくとも５、９、１３、１４、または１７を含むことを特徴とする請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記核酸分子が、前記リステリアゲノムに組み込まれることを特徴とする請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記核酸分子が、前記組み換え型弱毒化リステリア株の中のプラスミドの中にあり、かつ前記プラスミドが、抗生物質選択がない場合に前記組み換え型リステリア株の中に安定して維持されることを特徴とする請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記組み換え型リステリアが、前記ａｃｔＡ病毒性遺伝子内に欠失を含むことを特徴とする請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記追加的なポリペプチドが、ａ）非溶血性ＬＬＯタンパク質もしくはＮ末端断片、ｂ）ＰＥＳＴ配列、またはｃ）ＡｃｔＡ断片からなる群から選択されることを特徴とする請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記第２のオープンリーディングフレームによってコードされる前記代謝酵素が、アラニン・ラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素であることを特徴とする請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記放射線療法が、前記組み換え型弱毒化リステリア株の投与よりも前に施されるか、または、２日連続で各々８Ｇｙ、合計１６Ｇｙにて施されることを特徴とする請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記組み換え型弱毒化リステリア株が、ＡＤＸＳ３１−１６４であることを特徴とする請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記組み換え型弱毒化リステリア株が、１回の投与あたり３．３×１０９ＣＦＵの用量で複数回投与されることを特徴とする請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記組み換え型弱毒化リステリア株が、３週ごとに１回ないし最大で８回投与されることを特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ブースター処理を施すステップをさらに含むことを特徴とする請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記ブースター処理を２ヶ月ごとに施すことを特徴とする請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記組み換え型弱毒化リステリア株が、独立したアジュバントと共に投与され、
前記アジュバントが、顆粒球性／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンＱＳ２１、モノホスホリルリピドＡ、またはメチル化されていないＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記腫瘍増殖またはガンが、再燃または転移であることを特徴とする請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記ガンが、骨肉腫であることを特徴とする請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記腫瘍増殖またはガンに対する強化免疫応答を引き出すことにより、ＨＥＲ２／ｎｅｕに特異的なＴ細胞応答の増加をもたらすことを特徴とする請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【国際調査報告】
2017514904.tif 000060
2017514904.tif 000061