(57)【要約】  本発明は、概して、目的タンパク質の増加した発現をもたらす遺伝子改変を有する細菌細胞、ならびにこうした細胞を作製および使用する方法に関する。本発明の態様は、胞子形成のための遺伝子の発現または活性化を遅延、低減または阻止する遺伝子改変を有し、それにより目的タンパク質の増加した発現をもたらす、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）のメンバーなどのグラム陽性微生物を含む。遺伝子改変は、ｋｉｎＡ遺伝子、ｐｈｒＡ遺伝子またはｐｈｒＥ遺伝子の発現を低減するものである。【選択図】図５
2017538433.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グラム陽性菌細胞における目的タンパク質（ＰＯＩ）の発現を増加する方法であって、
（ａ）ＰＯＩを産生する改変グラム陽性菌細胞を取得するステップであって、前記改変グラム陽性菌細胞は、ｋｉｎＡ遺伝子、ｐｈｒＡ遺伝子またはｐｈｒＥ遺伝子の発現を低減する少なくとも１つの遺伝子改変を含む、ステップと；
（ｂ）前記ＰＯＩが発現されるような条件下で前記改変グラム陽性菌細胞を培養するステップと
を含み、前記ＰＯＩの前記増加した発現は、非改変グラム陽性菌細胞中の同じＰＯＩの発現に対するものである、方法。
【請求項２】
ステップ（ｂ）の前記改変グラム陽性菌細胞は、ｋｉｎＡ、ｐｈｒＡおよびｐｈｒＥから選択される少なくとも２つの遺伝子の発現を低減する少なくとも２つの遺伝子改変を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｂ）の前記改変グラム陽性菌細胞は、ｋｉｎＡの発現を低減する遺伝子改変、ｐｈｒＡの発現を低減する遺伝子改変、およびｐｈｒＥの発現を低減する遺伝子改変を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記遺伝子改変は、ｋｉｎＡ  ｍＲＮＡ転写物のレベルの低下、ｐｈｒＡ  ｍＲＮＡ転写物のレベルの低下、および／またはｐｈｒＥ  ｍＲＮＡ転写物のレベルの低下としてさらに定義される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＰＯＩの前記発現の増加は、ＰＯＩ  ｍＲＮＡ転写物のレベルの増加としてさらに定義される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記改変グラム陽性菌細胞および前記非改変グラム陽性菌細胞は、少なくとも１つの欠陥または不活性胞子形成遺伝子をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つの欠陥または不活性胞子形成遺伝子は、Ｓｐｏ０Ａ、ＳｉｇＦ、ＳｉｇＧ、ＳｉｇＥ、ＳｉｇＫ、ｓｐｏＩＩＡＡ、ｓｐｏＩＩＡＢ、ｓｐｏＩＩＲ、ｓｐｏＩＩＧＡ、ｓｐｏＩＩＩＡＡ、ｓｐｏＩＩＩＡＢ、ｓｐｏＩＩＩＡＣ、ｓｐｏＩＩＩＡＤ、ｓｐｏＩＩＩＡＥ、ｓｐｏＩＩＩＡＦ、ｓｐｏＩＩＩＡＧ、ｓｐｏＩＩＩＡＨ、ｓｐｏＩＶＢ、ｂｏｆＣ、ｓｐｏＩＶＦＡ、ｓｐｏＩＶＦＢ、ｓｐｏＩＶＣＡ、ｓｐｏＩＶＣＢ、ｓｐｏＩＩＩＣ、およびｓｐｏＩＩＥからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記改変グラム陽性菌細胞は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）のメンバーである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細胞は、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・ソノレンシス（Ｂ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、バチルス・ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、バチルス・プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ラウツス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・パブリ（Ｂ．ｐａｂｕｌｉ）、バチルス・セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・アガラドハエレンス（Ｂ．ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）、バチルス・アキバイ（Ｂ．ａｋｉｂａｉ）、バチルス・クラーキイ（Ｂ．ｃｌａｒｋｉｉ）、バチルス・シュードファーマス（Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・レヘンシス（Ｂ．ｌｅｈｅｎｓｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サークランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）、およびバチルス・チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）またはバチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記遺伝子改変は、前記ｋｉｎＡ、ｐｈｒＡおよびｐｈｒＥ遺伝子の１つまたは複数の全部または一部の欠失である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記遺伝子改変は、前記ＫｉｎＡ、ＰｈｒＡおよびＰｈｒＥタンパク質の１つまたは複数の活性の低減をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＰＯＩは酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記酵素は、アセチルエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシナーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルカナーゼ、グルカンリアーゼ、エンド−β−グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルヒドロラーゼ、ポリオールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記酵素はプロテアーゼである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
ＰＯＩを回収するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記非改変グラム陽性細胞に対する発現ＰＯＩの増加量は、少なくとも１０％増加している、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
非改変グラム陽性菌細胞中の同じＰＯＩの発現に対して増加した量のＰＯＩを発現する改変グラム陽性菌細胞であって、ｋｉｎＡ遺伝子、ｐｈｒＡ遺伝子またはｐｈｒＥ遺伝子の発現を低減する少なくとも１つの遺伝子改変を含む、改変グラム陽性菌細胞。
【請求項１９】
ｋｉｎＡ、ｐｈｒＡおよびｐｈｒＥから選択される少なくとも２つの遺伝子の発現を低減する少なくとも２つの遺伝子改変を含む、請求項１８に記載の改変細胞。
【請求項２０】
ｋｉｎＡの発現を低減する遺伝子改変、ｐｈｒＡの発現を低減する遺伝子改変、およびｐｈｒＥの発現を低減する遺伝子改変を含む、請求項１８に記載の改変細胞。
【請求項２１】
前記改変細胞および前記非改変細胞は、少なくとも１つの欠陥または不活性胞子形成遺伝子をさらに含む、請求項１８に記載の改変細胞。
【請求項２２】
前記少なくとも１つの欠陥または不活性胞子形成遺伝子は、Ｓｐｏ０Ａ、ＳｉｇＦ、ＳｉｇＧ、ＳｉｇＥ、ＳｉｇＫ、ｓｐｏＩＩＡＡ、ｓｐｏＩＩＡＢ、ｓｐｏＩＩＲ、ｓｐｏＩＩＧＡ、ｓｐｏＩＩＩＡＡ、ｓｐｏＩＩＩＡＢ、ｓｐｏＩＩＩＡＣ、ｓｐｏＩＩＩＡＤ、ｓｐｏＩＩＩＡＥ、ｓｐｏＩＩＩＡＦ、ｓｐｏＩＩＩＡＧ、ｓｐｏＩＩＩＡＨ、ｓｐｏＩＶＢ、ｂｏｆＣ、ｓｐｏＩＶＦＡ、ｓｐｏＩＶＦＢ、ｓｐｏＩＶＣＡ、ｓｐｏＩＶＣＢ、ｓｐｏＩＩＩＣ、およびｓｐｏＩＩＥからなる群から選択される、請求項２１に記載の細胞。
【請求項２３】
バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属のメンバーである、請求項１８に記載の変異細胞。
【請求項２４】
前記バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細胞は、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・ソノレンシス（Ｂ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、バチルス・ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、バチルス・プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ラウツス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・パブリ（Ｂ．ｐａｂｕｌｉ）、バチルス・セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・アガラドハエレンス（Ｂ．ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）、バチルス・アキバイ（Ｂ．ａｋｉｂａｉ）、バチルス・クラーキイ（Ｂ．ｃｌａｒｋｉｉ）、バチルス・シュードファーマス（Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・レヘンシス（Ｂ．ｌｅｈｅｎｓｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サークランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）、およびバチルス・チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）からなる群から選択される、請求項２３に記載の変異細胞。
【請求項２５】
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）またはバチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）である、請求項２４に記載の変異細胞。
【請求項２６】
前記遺伝子改変は、ｋｉｎＡ  ｍＲＮＡ転写物のレベルの低下、ｐｈｒＡ  ｍＲＮＡ転写物のレベルの低下、および／またはｐｈｒＥ  ｍＲＮＡ転写物のレベルの低下としてさらに定義される、請求項１８に記載の改変細胞。
【請求項２７】
ｋｉｎＡ遺伝子、ｐｈｒＡ遺伝子またはｐｈｒＥ遺伝子の発現を低減する前記遺伝子改変は、前記ｋｉｎＡ、ｐｈｒＡおよびｐｈｒＥ遺伝子の全部または一部の欠失である、請求項１８に記載の改変細胞。
【請求項２８】
前記遺伝子改変は、ＫｉｎＡ、ＰｈｒＡおよび／またはＰｈｒＥタンパク質の活性の低減をもたらす、請求項１８に記載の改変細胞。
【請求項２９】
前記ＰＯＩは酵素である、請求項１８に記載の変異細胞。
【請求項３０】
前記酵素は、アセチルエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシナーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルカナーゼ、グルカンリアーゼ、エンド−β−グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルヒドロラーゼ、ポリオールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２９に記載の変異細胞。
【請求項３１】
前記酵素はプロテアーゼである、請求項２９に記載の改変細胞。
【請求項３２】
ＰＯＩを回収するステップをさらに含む、請求項１８に記載の改変細胞。
【請求項３３】
前記非改変グラム陽性細胞に対する発現ＰＯＩの増加量は、少なくとも１０％増加している、請求項１８に記載の改変細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、米国特許法第１１９条の下、２０１４年１２月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／０９４，７５１号明細書の優先権を主張するものであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、概して、目的タンパク質の増加した発現をもたらす遺伝子改変を有する細菌細胞、ならびにこうした細胞を作製および使用する方法に関する。本発明の態様は、胞子形成のための遺伝子の発現または活性化を遅延、低減または阻止する遺伝子改変を有し、それにより目的タンパク質の増加した発現をもたらす、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）のメンバーなどのグラム陽性微生物を含む。遺伝子改変の例として、ＫｉｎＡ、ＰｈｒＡおよび／またはＰｈｒＥの発現または活性を低減するものが挙げられる。
【０００３】
配列表の参照
電子的手段により提出された、２０１５年１１月３０日作成の１８キロバイトのサイズを有するＮＢ４０５２２−ＷＯ−ＰＣＴ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名称の配列表テキストファイルの内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
遺伝子工学により、工業用バイオ反応器として、細胞工場として、また食品発酵において使用する微生物が改善されてきた。多くのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種の菌を含むグラム陽性微生物が、多くの有用なタンパク質および代謝物の製造に使用されている（例えば、Ｚｕｋｏｗｓｋｉ，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｌｙ  ｖａｌｕａｂｌｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ，”：Ｄｏｉ  ａｎｄ  ＭｃＧｌｏｕｇｌｉｎ（編）Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｉ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｔｏ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，Ｓｔｏｎｅｈａｍ．Ｍａｓｓ  ｐｐ  ３１１−３３７［１９９２］を参照）。工業で汎用されているバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種の菌としては、バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、およびバチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が挙げられる。それらはＧＲＡＳ（一般に安全と認められる）のステータスが与えられているため、これらのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種の菌種は、食品および医薬品工業で使用するタンパク質を製造するための天然の候補である。グラム陽性微生物で産生されるタンパク質の例としては、酵素、例えば、α−アミラーゼ、およびアルカリ（またはセリン）プロテアーゼが挙げられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
細菌宿主細胞でのタンパク質産生の理解が進んでいるとはいえ、目的タンパク質を高レベルで発現する新しい組み換え菌株の開発が要望されている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、より高レベルの目的タンパク質を発現する組換えグラム陽性細胞、ならびにこうした細胞を作製および使用する方法に提供する。特に、本発明は、遺伝子改変を含まない細菌細胞と比較して、目的タンパク質の増加した発現をもたらす遺伝子改変を有する細菌細胞に関する。したがって、本発明の態様は、リン酸リレー型経路（例えば、図５のリン酸リレー型経路概略図を参照）を活性化するように機能する遺伝子の発現を低減し、それにより目的タンパク質（以後、「ＰＯＩ」）の増大した発現をもたらす遺伝子改変を含む、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）のメンバーなどのグラム陽性微生物を含む。こうした組換え細菌細胞を作製および使用する方法も提供される。
【０００７】
本発明の態様は、グラム陽性菌細胞からのＰＯＩの発現を増加する方法を含み、この方法は、（ａ）ＰＯＩを産生する改変グラム陽性菌細胞を取得するステップであって、改変グラム陽性菌細胞が、リン酸リレー型経路を活性化する１種または複数種のタンパク質の発現または活性を低減する少なくとも１つの遺伝子改変を含む、ステップと、（ｂ）ＰＯＩが発現されるような条件下で前記改変グラム陽性菌細胞を培養するステップとを含み、ＰＯＩの増加した発現は、ほぼ同じ培養条件下で増殖させた非改変（親）グラム陽性菌細胞中の同じＰＯＩの発現に対するものである。いくつかの実施形態では、リン酸リレー型経路を活性化する１種または複数種のタンパク質の発現または活性を低減する遺伝子改変は、ｋｉｎＡ遺伝子、ｐｈｒＡ遺伝子および／またはｐｈｒＥ遺伝子の遺伝子改変である。
【０００８】
いくつかの他の実施形態では、改変グラム陽性細胞は、１つまたは複数の欠陥または不活性胞子形成遺伝子（例えば、その発現がＳｐｏ０Ａにより制御されているか、またはＳｐｏ０Ａの下流にある遺伝子）を有する親細胞から得られ、したがって胞子の形成が既に阻止されている。例えば、本出願人は、この非胞子形成の遺伝的背景でも、リン酸リレー型経路を活性化する１種または複数種のタンパク質の発現または活性を低減する別の遺伝子改変（すなわち、胞子形成開始遺伝子の発現を制御する遺伝子）により、細胞からのＰＯＩの発現が増大することを認めた。したがって、本開示の遺伝子改変（娘）細胞のタンパク質発現／産生の向上は、グラム陽性細胞の胞子形成の阻止のみによるものではない。例えば、本開示の改変グラム陽性（娘）細胞が得られる親グラム陽性細胞は、非機能性胞子形成遺伝子、変異胞子形成遺伝子、欠失胞子形成遺伝子などを有し得る（例えば、胞子形成欠損バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞を使用する実施例のセクションを参照）。
【０００９】
いくつかの実施形態では、改変グラム陽性菌細胞は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）のメンバー（例えば、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・ソノレンシス（Ｂ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、バチルス・ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、バチルス・プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ラウツス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・パブリ（Ｂ．ｐａｂｕｌｉ）、バチルス・セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・アガラドハエレンス（Ｂ．ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）、バチルス・アキバイ（Ｂ  ａｋｉｂａｉ）、バチルス・クラーキイ（Ｂ．ｃｌａｒｋｉｉ）、バチルス・シュードファーマス（Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・レヘンシス（Ｂ．ｌｅｈｅｎｓｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サークランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）、およびバチルス・チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ））からなる群から選択されるバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞である。いくつかの実施形態では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞である。いくつかの実施形態では、改変グラム陽性菌細胞は、ｄｅｇＵ、ｄｅｇＱ、ｄｅｇＳ、ｓｃｏＣ４などからなる群から選択される遺伝子中の突然変異をさらに含む。いくつかの実施形態では、突然変異は、ｄｅｇＵ（Ｈｙ）３２である。
【００１０】
いくつかの実施形態では、遺伝子改変により、ほぼ同じ培養条件下で増殖させた対応する非改変グラム陽性（親）菌細胞と比較して、改変されたグラム陽性（娘）菌細胞中のｋｉｎＡ、ｐｈｒＡおよびｐｈｒＥ遺伝子の１つまたは複数の発現レベルの低下が起こる。したがって、遺伝子改変は、ｋｉｎＡ、ｐｈｒＡおよびｐｈｒＥ遺伝子のいずれか１つ；ｋｉｎＡ、ｐｈｒＡおよびｐｈｒＥ遺伝子のいずれか２つ；またはｋｉｎＡ、ｐｈｒＡおよびｐｈｒＥ遺伝子の全３つの発現レベルの低下をもたらすことができる。別の実施形態では、遺伝子改変により、ほぼ同じ培養条件下で増殖させた対応する非改変グラム陽性菌細胞と比較して、改変されたグラム陽性菌細胞中のＫｉｎＡ、ＰｈｒＡおよびＰｈｒＥタンパク質の１つまたは複数の活性の低減が起こる。したがって、遺伝子改変は、ＫｉｎＡ、ＰｈｒＡおよびＰｈｒＥタンパク質のいずれか１つ；ＫｉｎＡ、ＰｈｒＡおよびＰｈｒＥタンパク質のいずれか２つ；またはＫｉｎＡ、ＰｈｒＡおよびＰｈｒＥタンパク質の全３つの活性の低減をもたらすことができる。
【００１１】
いくつかの実施形態では、野生型ｋｉｎＡ遺伝子の配列は、配列番号１と少なくとも６０％同一であり；野生型ｐｈｒＡ遺伝子の配列は、配列番号６と少なくとも６０％同一であり、また、野生型ｐｈｒＥ遺伝子の配列は、配列番号８と少なくとも６０％同一である。いくつかの実施形態では、野生型ＫｉｎＡタンパク質の配列は、配列番号２と少なくとも８０％同一であり；野生型ＰｈｒＡタンパク質の配列は、配列番号７と少なくとも８０％同一であり；野生型ＰｈｒＥタンパク質の配列は、配列番号９と少なくとも８０％同一である。いくつかの実施形態では、遺伝子改変は、ｋｉｎＡ、ｐｈｒＡおよびｐｈｒＥ遺伝子の１つまたは複数の全部または一部の欠失である。
【００１２】
いくつかの実施形態では、ＰＯＩは、相同性タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＰＯＩは、異種タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＰＯＩは、酵素である。いくつかの実施形態では、酵素は、プロテアーゼ、セルラーゼ、プルラナーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、リパーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼ、およびホスファターゼからなる群から選択される。いくつかの他の実施形態では、酵素は、アセチルエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルカナーゼ、グルカンリアーゼ、エンド−β−グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルヒドロラーゼ、ポリオールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００１３】
いくつかの他の実施形態では、ＰＯＩは、プロテアーゼである。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、スブチリシンである。いくつかの他の実施形態では、スブチリシンは、スブチリシン１６８、スブチリシンＢＰＮ’、スブチリシンカールスバーグ（Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）、スブチリシンＤＹ、スブチリシン１４７、スブチリシン３０９、およびこれらの変異体からなる群から選択される。
【００１４】
いくつかの実施形態では、本方法は、ＰＯＩを単離して回収するステップをさらに含む。また別の実施形態では、単離および回収されたＰＯＩをさらに精製する。
【００１５】
本発明の態様は、改変グラム陽性菌細胞を含み、ここで、前記改変グラム陽性菌細胞は、ほぼ同じ培養条件下で増殖させた対応する非改変グラム陽性菌細胞と比較して、胞子形成開始遺伝子の発現を誘導する、リン酸リレー型経路を活性化する１種または複数種のタンパク質の発現または活性を低減する少なくとも１つの遺伝子改変を含む。いくつかの実施形態では、改変グラム陽性菌細胞は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）のメンバーである。いくつかの実施形態では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・ソノレンシス（Ｂ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、バチルス・ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、バチルス・プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ラウツス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・パブリ（Ｂ．ｐａｂｕｌｉ）、バチルス・セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・アガラドハエレンス（Ｂ．ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）、バチルス・アキバイ（Ｂ  ａｋｉｂａｉ）、バチルス・クラーキイ（Ｂ．ｃｌａｒｋｉｉ）、バチルス・シュードファーマス（Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・レヘンシス（Ｂ．ｌｅｈｅｎｓｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サークランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）、およびバチルス・チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）からなる群から選択される。いくつかの他の実施形態では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞である。いくつかの実施形態では、改変グラム陽性菌細胞は、ｄｅｇＵ、ｄｅｇＱ、ｄｅｇＳ、ｓｃｏＣ４などからなる群から選択される遺伝子中の突然変異をさらに含む。いくつかの実施形態では、突然変異は、ｄｅｇＵ（Ｈｙ）３２である。
【００１６】
いくつかの実施形態では、遺伝子改変により、ほぼ同じ培養条件下で増殖させた対応する非改変グラム陽性菌細胞と比較して、改変されたグラム陽性菌細胞中のｋｉｎＡ、ｐｈｒＡおよびｐｈｒＥ遺伝子の１つまたは複数の発現レベルの低下が起こる。したがって、遺伝子改変は、ｋｉｎＡ、ｐｈｒＡおよびｐｈｒＥ遺伝子のいずれか１つ；ｋｉｎＡ、ｐｈｒＡおよびｐｈｒＥ遺伝子のいずれか２つ；またはｋｉｎＡ、ｐｈｒＡおよびｐｈｒＥ遺伝子の全３つの発現レベルの低下をもたらすことができる。別の実施形態では、遺伝子改変により、ほぼ同じ培養条件下で増殖させた対応する非改変グラム陽性菌細胞と比較して、改変されたグラム陽性菌細胞中のＫｉｎＡ、ＰｈｒＡおよびＰｈｒＥタンパク質の１つまたは複数の活性の低減が起こる。したがって、遺伝子改変は、ＫｉｎＡ、ＰｈｒＡおよびＰｈｒＥタンパク質のいずれか１つ；ＫｉｎＡ、ＰｈｒＡおよびＰｈｒＥタンパク質のいずれか２つ；またはＫｉｎＡ、ＰｈｒＡおよびＰｈｒＥタンパク質の全３つの活性の低減をもたらすことができる。
【００１７】
いくつかの実施形態では、野生型ｋｉｎＡ遺伝子の配列は、配列番号１と少なくとも６０％同一であり；野生型ｐｈｒＡ遺伝子の配列は、配列番号６と少なくとも６０％同一であり；野生型ｐｈｒＥ遺伝子の配列は、配列番号８と少なくとも６０％同一である。いくつかの実施形態では、野生型ｋｉｎＡタンパク質の配列は、配列番号２と少なくとも８０％同一であり；野生型ｐｈｒＡタンパク質の配列は、配列番号７と少なくとも８０％同一であり；野生型ｐｈｒＥタンパク質の配列は、配列番号９と少なくとも８０％同一である。いくつかの実施形態では、遺伝子改変は、ｋｉｎＡ、ｐｈｒＡおよびｐｈｒＥ遺伝子の１つまたは複数の全部または一部の欠失である。
【００１８】
いくつかの実施形態では、改変細胞は、ＰＯＩを発現する。いくつかの実施形態では、ＰＯＩは、相同性タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＰＯＩは、異種タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＰＯＩは、酵素である。
【００１９】
いくつかの実施形態では、酵素は、プロテアーゼ、セルラーゼ、プルラナーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、リパーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼ、およびホスファターゼからなる群から選択される。いくつかの他の実施形態では、酵素は、アセチルエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルカナーゼ、グルカンリアーゼ、エンド−β−グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルヒドロラーゼ、ポリオールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ラムノ−ガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。別の実施形態では、ＰＯＩは、プロテアーゼである。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、スブチリシンである。いくつかの実施形態では、スブチリシンは、スブチリシン１６８、スブチリシンＢＰＮ’、スブチリシンカールスバーグ（Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）、スブチリシンＤＹ、スブチリシン１４７、スブチリシン３０９、およびこれらの変異体からなる群から選択される。
【００２０】
いくつかの実施形態では、遺伝子改変により、ほぼ同じ培養条件下で増殖させた対応する非改変グラム陽性菌細胞と比較して、改変されたグラム陽性菌細胞中のｋｉｎＡ、ｐｈｒＡおよびｐｈｒＥ遺伝子の１つまたは複数の発現レベルの低下が起こる。したがって、遺伝子改変は、ｋｉｎＡ、ｐｈｒＡおよびｐｈｒＥ遺伝子のいずれか１つ；ｋｉｎＡ、ｐｈｒＡおよびｐｈｒＥ遺伝子のいずれか２つ；またはｋｉｎＡ、ｐｈｒＡおよびｐｈｒＥ遺伝子の全３つの発現レベルの低下をもたらすことができる。別の実施形態では、遺伝子改変により、ほぼ同じ培養条件下で増殖させた対応する非改変グラム陽性菌細胞と比較して、改変されたグラム陽性菌細胞中のＫｉｎＡ、ＰｈｒＡおよびＰｈｒＥタンパク質の１つまたは複数の活性の低減が起こる。したがって、遺伝子改変は、ＫｉｎＡ、ＰｈｒＡおよびＰｈｒＥタンパク質のいずれか１つ；ＫｉｎＡ、ＰｈｒＡおよびＰｈｒＥタンパク質のいずれか２つ；またはＫｉｎＡ、ＰｈｒＡおよびＰｈｒＥタンパク質の全３つの活性の低減をもたらすことができる。
【００２１】
いくつかの実施形態では、野生型ｋｉｎＡ遺伝子の配列は、配列番号１と少なくとも６０％同一であり；野生型ｐｈｒＡ遺伝子の配列は、配列番号６と少なくとも６０％同一であり；野生型ｐｈｒＥ遺伝子の配列は、配列番号８と少なくとも６０％同一である。いくつかの実施形態では、野生型ＫｉｎＡタンパク質の配列は、配列番号２と少なくとも８０％同一であり；野生型ＰｈｒＡタンパク質の配列は、配列番号７と少なくとも８０％同一であり；野生型ＰｈｒＥタンパク質の配列は、配列番号９と少なくとも８０％同一である。いくつかの実施形態では、遺伝子改変は、ｋｉｎＡ、ｐｈｒＡおよびｐｈｒＥ遺伝子の１つまたは複数の全部または一部の欠失である。
【００２２】
いくつかの実施形態では、前記改変グラム陽性菌細胞は、目的タンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、本方法は、前記目的タンパク質をコードする発現カセットを前記親グラム陽性菌細胞に導入するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、前記目的タンパク質をコードする発現カセットを前記改変グラム陽性菌細胞に導入するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、目的タンパク質は、相同性タンパク質である。いくつかの実施形態では、目的タンパク質は、異種タンパク質である。いくつかの実施形態では、目的タンパク質は、酵素である。いくつかの実施形態では、酵素は、プロテアーゼ、セルラーゼ、プルラナーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、リパーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼ、およびホスファターゼからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、目的タンパク質は、プロテアーゼである。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、スブチリシンである。いくつかの実施形態では、スブチリシンは、スブチリシン１６８、スブチリシンＢＰＮ’、スブチリシンカールスバーグ（Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）、スブチリシンＤＹ、スブチリシン１４７、スブチリシン３０９、およびこれらの変異体からなる群から選択される。
【００２３】
いくつかの実施形態では、本方法は、前記目的タンパク質が前記改変グラム陽性菌細胞により発現されるような条件下で前記改変グラム陽性菌細胞を培養するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、前記目的タンパク質を回収するステップをさらに含む。
【００２４】
本発明の態様は、前述した方法によって産生される改変グラム陽性菌細胞を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ｋｉｎＡ（ΔｋｉｎＡ）欠失の遺伝子マップを示す。
【図２Ａ】ＡｍｙＥを発現する非改変（親）バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞および改変（ΔｋｉｎＡ）バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞の細胞密度のグラフを示す。
【図２Ｂ】非改変（親）バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞および改変（ΔｋｉｎＡ）バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞からのＡｍｙＥ発現のグラフを示す。
【図３Ａ】ＦＮＡを発現する非改変（親）バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞および改変（ΔｋｉｎＡ）バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞の細胞密度のグラフを示す。
【図３Ｂ】非改変（親）バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞および改変（ΔｋｉｎＡ）バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞のＦＮＡ発現のグラフを示す。
【図４Ａ】緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する非改変（親）バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞および改変（ΔｋｉｎＡ）バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞の細胞密度のグラフを示す。
【図４Ｂ】非改変（親）バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞および改変（ΔｋｉｎＡ）バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞のＧＦＰ発現のグラフを示す。
【図５】バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞における胞子形成を調節するリン酸リレー型経路の概略図を示す。特定の飢餓シグナルによって１つまたは複数のキナーゼの自己リン酸化がトリガーされた後、Ｓｐｏ０Ｆ、Ｓｐｏ０ＢおよびＳｐｏ０Ａタンパク質の連続的リン酸化が起こる。Ｓｐｏ０Ａ−Ｐは、胞子形成カスケードの活性化を制御する。キナーゼ（例えば、ｋｉｎＡ、ｋｉｎＢ、ｋｉｎＣ、ｋｉｎＤ、ｋｉｎＥ）およびホスファターゼ（例えば、ＲａｐＡ、ＲａｐＢ、ＲａｐＥ）は、遺伝子名により示す。矢印は、リン酸化または標的遺伝子の発現に対する制御などのプラスの作用を示すのに対し、先が平坦な線は、脱リン酸化または遺伝子発現の抑制などのマイナスの作用を示す。例えば、キナーゼＫｉｎＡは、Ｓｐｏ０Ｆホスファターゼをリン酸化し、Ｓｐｏ０Ｆホスファターゼは、ホスホリル基をＳｐｏ０Ｂ、続いてＳｐｏ０Ａに輸送するのに対し、転写調節因子ＡｂｒＢは、Ｓｐｏ０Ｈ（ｓｉｇＨ）発現を阻害し、その結果、Ｓｐｏ０Ａ発現を阻害する。
【図６】ｐｈｒＡ欠失の遺伝子構築物を示す。
【図７】ｐｈｒＥ欠失の遺伝子構築物を示す。
【図８Ａ】ＧＦＰを発現する非改変（親）バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞および改変バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞（すなわち、改変バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞は、ｐｈｒＡおよびｐｈｒＥ遺伝子の両方の欠失を含む。本明細書では、ΔｐｈｒＡ／ΔｐｈｒＥ）の細胞密度のグラフを示す。
【図８Ｂ】非改変（親）バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞および改変（ΔｐｈｒＡ／ΔｐｈｒＥ）バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞のＧＦＰ発現のグラフを示す。
【図９Ａ】ＦＮＡを発現する非改変（親）バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞および改変（ΔｐｈｒＡ／ΔｐｈｒＥ）バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞の細胞密度のグラフを示す。
【図９Ｂ】非改変（親）バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞および改変（ΔｐｈｒＡ／ΔｐｈｒＥ）バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞のＦＮＡ発現のグラフを示す。
【図１０Ａ】ＡｍｙＥを発現する非改変（親）バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞および改変（ΔｐｈｒＡ／ΔｐｈｒＥ）バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞の細胞密度のグラフを示す。
【図１０Ｂ】発現する非改変（親）バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞および改変（ΔｐｈｒＡ／ΔｐｈｒＥ）バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞のＡｍｙＥ発現のグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明は、概して、目的タンパク質（以後、「ＰＯＩ」）の増加した発現／産生をもたらす遺伝子改変を有する細菌細胞、ならびにこうした細胞を作製および使用する方法に関する。本発明のいくつかの態様は、リン酸リレー型経路を活性化する１種または複数種のタンパク質の発現および／または活性を低減し、それによりＰＯＩの増加した発現をもたらす遺伝子改変を含む、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）のメンバーなどのグラム陽性菌を含む。
【００２７】
本組成物および本方法をより詳細に記載する前に、本組成物および本方法が記載されている特定の実施形態に限定されず、したがって、当然変わり得ることは理解されるべきである。また、本組成物および本方法の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書中で使用されている用語が、特定の実施形態を記載する目的でのみ使用され、それらの範囲を限定することを意図していないこともまた理解されるべきである。
【００２８】
ある数値範囲が示された場合、文脈中に明らかな別段の記載がない限り、その範囲の上限から下限の間に介在する値は、下限の単位の十分の一まで、またその記載範囲に記載された、または介在するいかなる他の値も本組成物および本方法に包含されると理解される。これらのより狭い範囲の上限および下限は、その狭い範囲に独立して含まれてよく、また、記載の範囲で明示的に排除された境界の支配下にある、本組成物および本方法に含まれる。記載の範囲が、その範囲の一端または両端を含む場合、それらの含まれる境界の一方または両方を排除する範囲もまた、本組成物および本方法に含まれる。
【００２９】
本明細書において、いくつかの範囲は、「約」という用語が先行する数値で示される。本明細書では、「約」という用語は、これが先行する正確な数、およびこの用語が先行する数に近い数または近似する数に対するリテラルサポートを提供するために使用される。ある数が明示的に記載された数に近いかまたは近似しているかの決定では、記載されていない近いかまたは近似している数は、提示されている文脈中で、明示的に記載されている数と実質的に均等な数を提供する数であり得る。例えば、数値に関連して、「約」という用語は、文脈中に別段の定義がなされていない限り、その数値の−１０％〜＋１０％の範囲を指す。他の例では、「約６のｐＨ値」という句は、別段の定義がなされていない限り、５．４〜６．６のｐＨ値を指す。
【００３０】
本明細書に記載される見出しは、本明細書全体を参照することにより得られる、本組成物および本方法の各種態様または実施形態の限定となるものではない。したがって、すぐ下で定義される用語は、本明細書全体を参照することにより、より完全に定義される。
【００３１】
本明細書は、読みやすくするために多くのセクションで編成されている。しかしながら、１つのセクションでなされた記載が他のセクションに適用され得ることは、読者は理解するであろう。このように、本開示の異なるセクションに使用される見出しを、限定のためのものと解釈すべきではない。
【００３２】
別段の定義がなされていない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語は全て、本組成物および本方法が属する技術分野において、通常の知識を有する者が一般に理解しているものと同じ意味を有する。本組成物および本方法を実施または試験する際に、本明細書に記載のものに類似した、または同等の方法および材料を使用することができるが、ここで、代表的な、説明に役立つ方法および材料を記載する。
【００３３】
本明細書中に引用する刊行物および特許は全て、参照により本明細書に組み込まれる。いかなる刊行物の引用も出願日前の開示に対するものであり、先行発明であるとの理由で、本組成物および本方法が、そのような刊行物に先行する資格がないということを承認していると解釈されるべきではない。
【００３４】
この詳細な説明に基づき、以下の略語および定義が使用される。文脈中に明らかな別段の記載がない限り、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」には複数の参照対象が含まれることに注意すべきである。したがって、例えば、「１つの酵素（ａｎ  ｅｎｚｙｍｅ）」と言った場合は、複数のそのような酵素を含み、「その用量（ｔｈｅ  ｄｏｓａｇｅ）」といった場合は、１つ以上の用量および当業者に知られたそれに均等なものを含む、などである。
【００３５】
さらに、特許請求の範囲が任意選択要素を排除するように記載されている（例えば、但しなど）可能性があることにも留意すべきである。したがって、ここで述べることは、特許請求範囲の構成要件の記載に関連して「単に（ｓｏｌｅｌｙ）」、「唯一の（ｏｎｌｙ）」、「除外する（ｅｘｃｌｕｄｉｎｇ）」などの排他的な用語を使用する場合、または「負の」の限定を使用する場合の優先的基準となることを意図している。
【００３６】
さらに、「実質的に〜から構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」との用語は、本明細書で使用されるとき、その用語の後に記載されている成分が、全量が全組成物の３０重量％未満であって、その成分の作用または活性に貢献も阻害もしない他の知られた成分の存在下にある組成物を指すことに留意すべきである。
【００３７】
さらに、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、本明細書で使用されるとき、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の後に記載の成分を含むが、それに限定されないことを意味することに留意すべきである。「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語の後に記載の成分は必要または必須であるが、その成分を含む組成物は、他の必須でないかまたは任意選択による成分をさらに含み得る。
【００３８】
また、「〜から構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語は、本明細書で使用されるとき、「〜から構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語の後に記載の成分を含み、かつそれに限定されることを意味することに留意すべきである。「〜から構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語の後に記載される成分は、したがって、必要または必須であり、そして、その組成物には他の成分は含まれない。
【００３９】
本開示を読めば当業者に明らかなように、本明細書に記載され、説明された個々の実施形態のそれぞれは、本明細書に記載された本組成物および本方法の範囲または趣旨から逸脱せずに、他のいくつかの実施形態の特徴から容易に分離され、または容易に統合することができる個別の成分および特徴を有する。記載された方法はいずれも、記載された事象の順序で、または論理的に可能な他の任意の順序で実施することができる。
【００４０】
定義
本発明は、概して、１種以上のＰＯＩを発現および／または産生する能力が増大するよう変異または改変させたグラム陽性菌細胞（ならびにその作製方法および使用方法）に関する。
【００４１】
したがって、いくつかの実施形態は、リン酸リレー型経路（ＫｉｎＡ、ＰｈｒＡ、ＰｈｒＥをコードする遺伝子）を活性化するために機能する１種または複数種の遺伝子の発現を低減する少なくとも１つの遺伝子改変を含む、改変グラム陽性菌細胞に関する。例えば、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のリン酸リレー型経路（すなわち、シグナル伝達系）は、一般に、転写因子Ｓｐｏ０Ａの周囲を回転すると考えられている（“Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｇｒａｍ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ”；Ｅｄｓ．Ａ．Ｌ．Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ，Ｊ．Ａ．Ｈｏｃｈ，Ｒ．Ｌｏｓｉｃｋ，Ａｍ．Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｏｒｂｉｏｌｏｇｙ，１９９３を参照）。
【００４２】
さらに具体的には、リン酸リレーシグナル伝達系の役割は、（不活性）Ｓｐｏ０Ａ転写因子を最終的にＳｐｏ０Ａ〜Ｐにリン酸化することであると考えられ、ここで、Ｓｐｏ０Ａ〜Ｐ転写因子は、胞子形成の初期段階に関与する遺伝子の転写を担う。特定の理論または本発明の操作方法に拘束されることは意図しないが、図５は、概して、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞での胞子形成開始を調節するリン酸リレー型経路の概略図を示す。例えば、いくつかのキナーゼ（例えば、ＫｉｎＡ、ＫｉｎＢなど）は、環境シグナルの解釈、およびこの情報の自己リン酸化キナーゼタンパク質（例えば、ＫｉｎＡからＫｉｎＡ〜Ｐ）への伝達に関与すると考えられている。次に、リン酸化キナーゼは、リン酸塩をＳｐｏ０Ｆタンパク質に輸送することによりＳｐｏ０Ｆ〜Ｐを産生するが、これは、リン酸リレーにおける二次メッセンジャーとしての役割を果たすと考えられ、その際、Ｓｐｏ０Ｆ〜Ｐは、そのリン酸塩をＳｐｏ０Ｂに輸送することによりＳｐｏ０Ｂ〜Ｐをもたらし、次にこれがリン酸基をＳｐｏ０Ａに輸送してＳｐｏ０Ａ〜Ｐをもたらす。
【００４３】
特定の理論に拘束されるかまたは依存することは意図しないが、以下に掲載する実施例のセクションでは、ＫｉｎＡ活性の阻止または低減（これにより、Ｓｐｏ０Ａ転写因子のリン酸化および活性化が阻止または低減される）が、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞での１種または複数種のＰＯＩの増加した発現をもたらすことを明らかにする。さらに、特定の理論に拘束または依存することは意図しないが、ペンタペプチドＰｈｒＡおよびペンタペプチドＰｈｒＥ（図５を参照）は、それぞれＲａｐＡおよびＲａｐＥホスファターゼの機能を阻止するために作用し、それにより、ＫｉｎＡによって活性化されるリン酸リレー型経路が抑制解除される。実施例のセクションで立証されるように、Ｒａｐホスファターゼに対するＲｈｒＡおよび／またはＰｈｒＥの阻害活性の阻止により、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞におけるＰＯＩの発現増大が起こる。
【００４４】
本明細書で定義される場合、「改変細胞」、「修飾細胞」、「改変細菌細胞」、「修飾細菌細胞」、「改変宿主細胞」または「修飾宿主細胞」は、置き換え可能に使用することができ、リン酸リレー型経路を活性化するために機能する１種または複数種の遺伝子の発現を低減する少なくとも１つの遺伝子改変を含む、組換えグラム陽性菌細胞を指す。例えば、本開示の「改変」グラム陽性菌細胞は、親細菌細胞から得られる「改変細胞」としてさらに定義することができ、ここで、改変（娘）細胞は、リン酸リレー型経路を活性化するために機能する１種または複数種の遺伝子の発現を低減する少なくとも１つの遺伝子改変を含む。
【００４５】
本明細書で定義される場合、「非改変細胞」、「非修飾細胞」、「非改変細菌細胞」、「非修飾細菌細胞」、「非改変宿主細胞」または「非修飾宿主細胞」は、置き換え可能に使用することができ、リン酸リレー型経路を活性化するために機能する１種または複数種の遺伝子の発現を低減する少なくとも１つの遺伝子改変を含まない「非改変」「親」グラム陽性菌細胞を指す。いくつかの実施形態では、非改変（親）グラム陽性菌細胞は、「対照細胞」または非改変（親）グラム陽性菌「対照」細胞と呼ばれる。
【００４６】
例えば、本開示のある実施形態は、ＰＯＩを多量に発現する「変異」グラム陽性菌（娘）細胞であって、その多量に発現するＰＯＩの量は、「非変異」グラム陽性菌（親）細胞（すなわち、非変異グラム陽性菌「対照」細胞における同じＰＯＩの発現と比較したものである細胞）に関する。したがって、本明細書で定義されるように、「非変異細菌細胞」、「非変異グラム陽性菌細胞」、「非変異陽性菌「対照」細胞」などの用語または句が、本開示の１種以上の「変異細菌細胞」と比較する中で使用される場合、変異（娘）細胞も非変異親（対照）細胞も実質的に同じ条件および培地で増殖／培養されると理解される。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「宿主」細胞は、新たに導入されるＤＮＡ配列のための宿主または発現ビヒクルとして作用する能力を有する「グラム陽性菌細胞」を指す。
【００４８】
本発明のいくつかの実施形態では、宿主細胞は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）のメンバーである。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）」または「バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種」は、当業者に周知の通りの「バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）」属に属する全ての種を含み、限定はしないが、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・ソノレンシス（Ｂ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、バチルス・ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、バチルス・プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ラウツス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・パブリ（Ｂ．ｐａｂｕｌｉ）、バチルス・セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・アガラドハエレンス（Ｂ．ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）、バチルス・アキバイ（Ｂ  ａｋｉｂａｉ）、バチルス・クラーキイ（Ｂ．ｃｌａｒｋｉｉ）、バチルス・シュードファーマス（Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・レヘンシス（Ｂ．ｌｅｈｅｎｓｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サークランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）およびバチルス・チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）が挙げられる。
【００５０】
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）は、引き続き分類学的再構成を経ていることが認識されている。したがって、この属は、再分類された種、例えば、限定はしないが、現在、「ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）」と称される「バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）」などの生物を含む。酸素の存在下での耐性内生胞子の産生がバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の典型的な特徴とみなされるが、この特徴は、近年名付けられたアリサイクロバチルス属（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アンフィバチルス属（Ａｍｐｈｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アニューリニバチルス属（Ａｎｅｕｒｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アノキシバチルス属（Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバチルス属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、フィロバチルス属（Ｆｉｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、グラシリバチルス属（Ｇｒａｃｉｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、ハロバチルス属（Ｈａｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、サリバチルス属（Ｓａｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、サーモバチルス属（Ｔｈｅｒｍｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ウレイバチルス属（Ｕｒｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、およびビルジバチルス属（Ｖｉｒｇｉｂａｃｉｌｌｕｓ）にも適用される。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「核酸」は、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列、およびそれらの断片もしくは部分、ならびにゲノムまたは合成起源のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、およびＲＮＡを指し、これらは、センスもしくはアンチセンス鎖のいずれにも関係なく、二本鎖または一本鎖のいずれであってもよい。遺伝コードの同義性の結果として、様々なヌクレオチド配列が所与のタンパク質をコードし得ることは理解されよう。
【００５２】
本明細書で使用される場合、用語「ベクター」は、細胞中に複製することができ、新たな遺伝子もしくはＤＮＡ（ポリヌクレオチド）セグメントを細胞中に運ぶことができる任意の核酸を指す。したがって、この用語は、様々な宿主細胞間の輸送のために設計された核酸構築物を指す。「発現ベクター」は、外来細胞において異種ＤＮＡ断片を発現する能力を有するベクターを指す。多くの原核および真核ベクターが市販されている。「ターゲティングベクター」は、それが形質転換される細胞の染色体内の領域と相同的であり、かつその領域で相同組換えを駆動することができるポリヌクレオチド配列を含むベクターである。ターゲティングベクターは、相同組換えにより細胞の染色体に突然変異を導入する上で有用である。一部の実施形態では、ターゲティングベクターは、他の非相同的配列を含み、これは、例えば末端に付加される（すなわち、スタッファー配列またはフランキング配列）。末端は、ターゲティングベクターが、閉じた環、例えばベクター内への挿入などを形成するように閉じていてもよい。適切なベクターの選択および／または構築は当業者の知識の範囲内である。
【００５３】
本明細書で使用される場合、用語「プラスミド」は、クローンニングベクターとして用いられ、多くの細菌および一部の真核生物中で染色体外自己複製遺伝子エレメントを形成する環状二本鎖ＤＮＡ構築物を指す。一部の実施形態では、プラスミドは、宿主細胞のゲノムに組み込まれる。
【００５４】
「精製された」または「単離された」または「濃縮された」は、生体分子（例えば、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチド）が、それが天然で結合している天然の構成成分の一部または全部からそれを分離することにより、その天然の状態から改変されていることを意味する。こうした単離または精製は、最終組成物中の不要な全細胞、細胞残屑、不純物、外性タンパク質、または酵素を除去するためのイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水性分離、透析、プロテアーゼ処理、硫酸アンモニウム沈殿もしくはその他のタンパク質塩沈殿、遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー、濾過、精密濾過、ゲル電気泳動または勾配による分離などの当該技術分野で認識される分離技術によって達成することができる。さらには、続いて別の利益を付与する成分、例えば、活性化剤、抗阻害剤、望ましいイオン、ｐＨを調節するための化合物、またはその他の酵素もしくは化学物質を精製または単離された生体分子組成物に添加することも可能である。
【００５５】
本明細書で使用される場合、用語「増加した」、「増大した」および「向上した（改善された）」は、目的の生体分子（例えば、目的タンパク質）の発現に関して言うとき、置き換え可能に用いられ、生体分子の発現（すなわち、改変細胞での）が、ほぼ同じ増殖条件下で増殖させた対応する非改変（親）細胞における発現レベルを上回ることを示す。
【００５６】
本明細書で定義される場合、遺伝子配列、ＯＲＦ配列またはポリヌクレオチド配列に関して、「発現」または「発現された」という用語は、遺伝子、ＯＲＦまたはポリヌクレオチドの転写、ならびに必要に応じて、得られたｍＲＮＡ転写物のタンパク質への翻訳を指す。したがって、文脈から明らかになるように、タンパク質の発現は、オープンリーディングフレーム配列の転写および翻訳の結果として生じる。宿主微生物における所望の発現レベルは、宿主に存在する対応するｍＲＮＡの量、または選択した配列によりコードされる所望の産物の量のいずれかに基づいて決定することができる。例えば、選択した配列から転写されるｍＲＮＡは、ＰＣＲまたはノーザンハイブリダイゼーションにより定量することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９を参照）。選択した配列によりコードされるタンパク質は、様々な方法により（例えば、ＥＬＩＳＡにより、タンパク質の生物活性をアッセイすることにより、またはそうした活性とは無関係のアッセイ、例えば、ウェスタンブロッティングもしくは放射性免疫アッセイにより、タンパク質を認識し、これに結合して、これと反応する抗体を用いて）定量することができる。遺伝子（またはそのポリヌクレオチド）に関して「発現」という用語は、遺伝子（またはそのポリヌクレオチド）の核酸配列に基づいてタンパク質が産生されるプロセスであり、したがって転写および翻訳の両方を含む。
【００５７】
本明細書で定義される場合、少なくとも１つのポリヌクレオチドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、またはその遺伝子、またはそのベクターを「細菌細胞に導入する」などの語句において使用されるとき、「導入する」という用語は、細胞にポリヌクレオチドを導入するための当該技術分野で公知の方法を含み、そうした方法として、限定はしないが、プロトプラスト融合、形質転換（例えば、塩化カルシウム、エレクトロポレーション）、形質導入、トランスフェクション、共役などが挙げられる（例えば、Ｆｅｒｒａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，”ｉｎ  Ｈａｒｄｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ，（ｅｄｓ．），Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．，ｐａｇｅｓ  ５７−７２，１９８９を参照）。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「形質転換された」および「安定に形質転換された」という用語は、ポリヌクレオチド配列が人の介入により導入された細胞を指す。ポリヌクレオチドは、細胞のゲノムに組み込むことができるか、または少なくとも２つの世代にわたって維持されるエピソームプラスミドとして存在し得る。
【００５９】
本明細書で使用されるとき、「選択可能マーカー」または「選択マーカー」という用語は、宿主細胞で発現することができる核酸（例えば、遺伝子）を指し、その核酸を含む宿主の選択を容易にする。そのような選択可能マーカーの例としては、限定はされないが、抗微生物剤が挙げられる。したがって、「選択可能マーカー」という用語は、宿主細胞が導入ＤＮＡを取りいれたか、または何らかの他の反応が起こったことを示す遺伝子を指す。通常、選択可能マーカーは、形質転換中に外来性の配列を受け取っていない細胞から外来性ＤＮＡを含む細胞を区別することを可能にする抗微生物剤耐性または代謝有利性を宿主細胞に付与する遺伝子である。本発明に有用な他のマーカーとしては、限定はされないが、トリプトファンなどの栄養要求性マーカー、およびβ−ガラクトシダーゼなどの検出マーカーが挙げられる。
【００６０】
本明細書で使用される場合、用語「プロモータ」は、下流遺伝子の転写を指令するように機能する核酸配列を指す。いくつかの実施形態では、プロモータは、標的遺伝子が発現される宿主細胞に対して適切である。プロモータは、他の転写および翻訳調節核酸配列（「制御配列」とも呼ばれる）と一緒に、所与の遺伝子を発現する必要がある。一般に、転写および翻訳調節配列として、限定はしないが、プロモータ配列、リボソーム結合部位、転写開始および終結配列、翻訳開始および終結配列、ならびにエンハンサーまたは活性化配列が挙げられる。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「機能的に結合された」または「作動可能に連結された」は、既知もしくは所望の活性を有する調節領域または機能性ドメイン、例えば、プロモータ、ターミネータ、シグナル配列もしくはエンハンサー領域が標的（例えば、遺伝子もしくはポリペプチド）に、調節領域または機能性ドメインがその既知もしくは所望の活性に従って上記標的の発現、分泌もしくは機能を制御することができるように結合または連結されていることを意味する。
【００６２】
用語「遺伝子改変」は、組換え細胞（例えば、「改変」グラム陽性菌細胞）を記載するために使用されるとき、その細胞が親細胞と比較して少なくとも１つの遺伝的相違を有することを意味する。１つまたは複数の遺伝子改変は、染色体突然変異（例えば、別のものによる染色体領域の挿入、欠失、逆転、置換（例えば、異種プロモータによる染色体プロモータの置換）など）および／または染色体外ポリヌクレオチド（例えば、プラスミド）の導入であってよい。一部の実施形態では、染色体外ポリヌクレオチドを宿主細胞の染色体に組み込むことにより、安定したトランスフェクタント／形質転換体を作製することができる。本開示の実施形態は、ＫｉｎＡ、ＰｈｒＡ、および／またはＰｈｒＥタンパク質の発現または活性を低減する遺伝子改変（転写、翻訳的に、またはタンパク質自体の活性の低減により、例えば、アミノ酸配列の突然変異により）を含む。本明細書に詳述するように、こうした改変は、目的タンパク質の発現を改善する。
【００６３】
遺伝子の「不活性化」は、遺伝子の発現、またはそのコードされるタンパク質の活性が阻止されるか、またはそうでなければその既知の機能を発揮することができないことを意味する。遺伝子の不活性化は、任意の好適な手段、例えば、前述した通りの遺伝子改変によって実施することができる。いくつかの実施形態では、不活性化遺伝子の発現産物は、タンパク質の生物活性に相応の変化を伴う短縮タンパク質である。一部の実施形態では、改変されたグラム陽性菌細胞は、１つまたは複数の遺伝子の不活性化を含み、これにより安定かつ不可逆の不活性化が起こる。
【００６４】
いくつかの実施形態では、遺伝子不活化は、欠失によって行われる。いくつかの実施形態では、欠失の標的とされた領域（例えば、遺伝子）は、相同組み換えによって欠失される。例えば、欠失の標的とされた領域に相同な配列が各側に存在する選択マーカーを有する入来（ｉｎｃｏｍｉｎｇ）配列を含むＤＮＡコンストラクトが使用される（ここで、これらの配列は、本明細書において、「相同ボックス」と呼ばれ得る）。ＤＮＡコンストラクトが宿主細胞染色体の相同配列と並び、ダブルクロスオーバー事象で、欠失の標的とされた領域が宿主染色体から切り出される。
【００６５】
「挿入」または「付加」は、天然に存在する配列、または親配列と比較して、それぞれ１つ以上のヌクレオチド残基またはアミノ酸残基が付加されるヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の変化である。
【００６６】
本明細書で使用されるとき、「置換」は、それぞれ異なるヌクレオチドまたはアミノ酸による１つ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の置き換えによって生じる。
【００６７】
遺伝子を変異させる方法は、当該技術分野ではよく知られており、例えば、限定はされないが、部位特異的変異、ランダム変異の生成、およびギャップ二本鎖法が挙げられる（例えば、米国特許第４，７６０，０２５号明細書；Ｍｏｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．２：６４６［１９８４］；およびＫｒａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２：９４４１［１９８４］を参照）。
【００６８】
本明細書で使用されるとき、「相同遺伝子」は、異なるものの、通常、関連する種の１対の遺伝子を指し、それらは、互いに対応し、かつ同一であるか、または非常に類似している。この用語は、種分化（すなわち、新しい種の開発）によって分離される遺伝子（例えば、オルソロガス遺伝子）、および遺伝子複製によって分離された遺伝子（例えば、パラロガス遺伝子）を包含する。
【００６９】
本明細書で使用されるとき、「オルソログ」および「オルソロガス遺伝子」は、種分化によって共通の先祖遺伝子（すなわち、相同遺伝子）から生じた、異なる種の遺伝子を指す。通常、オルソログは、進化の過程で同じ機能を保持している。オルソログの同定は、新しく配列が決定されたゲノムにおける遺伝子機能の信頼性の高い予測に使用される。
【００７０】
本明細書で使用されるとき、「パラログ」および「パラロガス遺伝子」は、ゲノム内での複製に関係する遺伝子を指す。オルソログが進化の過程を通して同じ機能を保持し、一方、パラログは、いくつかの機能は多くは元の機能に関連するものの、新しい機能を生じる。パラログ遺伝子の例としては、限定はされないが、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼおよびトロンビン（これらはいずれも、セリンプロテイナーゼであり、同じ種において同時に発生する）をコードする遺伝子が挙げられる。
【００７１】
本明細書で使用されるとき、「相同性」は、配列の類似性または同一性を指し、好ましくは同一性である。この相同性は、当該技術分野で知られた標準的な手法によって決定される（例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２：４８２［１９８１］；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３［１９７０］；Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４［１９８８］；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡなどのプログラム；ならびにＤｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１２：３８７−３９５［１９８４］を参照）。
【００７２】
本明細書で使用されるとき、「アナログ配列」は、遺伝子の機能が、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株１６８から示される遺伝子と実質的に同じ配列である。さらに、アナログ遺伝子は、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株１６８遺伝子の配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を含む。あるいは、アナログ配列は、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８の領域で見られる７０〜１００％の遺伝子のアライメントを有し、かつ／またはバチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８の染色体の遺伝子と一致する領域で見られる少なくとも５〜１０の遺伝子を有する。さらなる実施形態では、上記特性の２つ以上が配列に当てはまる。アナログ配列は、既知のシーケンスアライメント法で決定される。一般に使用されるアライメント法はＢＬＡＳＴであるが、上記および下記に示すように、他の方法も配列の決定に使用される。
【００７３】
有用なアルゴリズムの一例がＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、プログレッシブ、ペアワイズアライメントを用いて、関連する一群の配列からマルチプルシーケンスアライメントを作成する。それはまた、アライメントの作成に使用するクラスタリング関係を示すツリーをプロットすることができる。ＰＩＬＥＵＰは、ＦｅｎｇおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅのプログレッシブアライメント法の簡略化を用いる（Ｆｅｎｇ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．，３５：３５１−３６０［１９８７］）。この方法はＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐが記載したものと類似している（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３［１９８９］）。有用なＰＩＬＥＵＰパラメータは、初期設定ギャップウエイト３．００、初期設定ギャップ長ウエイト０．１０、および加重エンドギャップを含む。
【００７４】
有用なアルゴリズムの他の例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、Ａｌｔｓｃｈｕｌらにより説明されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０，［１９９０］；およびＫａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７［１９９３］）。特に有用性ＢＬＡＳＴプログラムは、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２６６：４６０−４８０［１９９６］を参照）である。
【００７５】
本明細書で使用されるとき、本明細書において同定されているアミノ酸またはヌクレオチド配列に関する「配列同一性パーセント（％）」は、配列をアライメントし、最大パーセントの配列同一性を達成するために必要に応じてギャップを導入した後の、目的配列のアミノ酸残基またはヌクレオチドと同一である、候補配列におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドの割合として定義され、いかなる同類置換も配列同一性の一部として考慮しない。
【００７６】
「ホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）」（または「ホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」は、対象アミノ酸配列および対象ヌクレオチド配列と特定の同一性を有する実在物を意味するであろう。相同配列は、従来の配列アライメントツール（例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ、ＢＬＡＳＴなど）を使用して、対象配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含み得る。別段の規定がなければ、ホモログは、通常、対象アミノ酸配列と同じ活性部位残基を含むであろう。
【００７７】
配列アライメントを行い、配列の同一性を決定する方法は、当業者に知られており、過度の実験をせずとも行うことができ、同一性の値を明確に算出することができる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １９（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；およびＡＬＩＧＮ  ｐｒｏｇｒａｍ（Ｄａｙｈｏｆｆ（１９７８）  ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５：Ｓｕｐｐｌ．３（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）を参照されたい。配列のアライメントおよび配列同一性の決定に多くのアルゴリズムを利用することができ、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アライメントアルゴリズム；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所相同性アルゴリズム；Ｐｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４の類似性探索法；Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７０：１７３−１８７（１９９７））；ならびにＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０を参照）が挙げられる。
【００７８】
これらのアルゴリズムを使用したコンピュータプログラムも利用可能であり、限定はされないが、ＡＬＩＧＮもしくはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア、またはＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．，２６６：４６０−４８０（１９９６））；あるいはＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）パッケージ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）で利用可能なＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ；ならびにＩｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によるＰＣ／ＧｅｎｅプログラムのＣＬＵＳＴＡＬが挙げられる。当業者は、アライメントを測定するために、比較する配列の長さ全体で最大限のアライメントを達成するのに必要なアルゴリズムも含めて、適切なパラメータを決定することができる。
【００７９】
本明細書で使用されるとき、「ハイブリダイゼーション」という用語は、当該技術分野で知られた塩基対合により、核酸鎖を相補鎖と接合させるプロセスを指す。
【００８０】
核酸配列は、２つの配列が中〜高ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件および洗浄条件下でお互いに特異的にハイブリダイズする場合、対照核酸配列に「選択的にハイブリダイズ可能」であると考えられる。ハイブリダイゼーション条件は核酸結合複合体またはプローブの融解温度（Ｔｍ）に基づいている。例えば、「最大ストリンジェンシーは、通常、約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍより５℃低い）で起こり、「高ストリンジェンシー」は、Ｔｍより約５〜１０℃低い温度で起こり；「中間ストリンジェンシー」は、プローブのＴｍより約１０〜２０℃低い温度で起こり；そして「低ストリンジェンシー」はＴｍより約２０〜２５℃低い温度で起こる。機能上、最大ストリンジェンシー条件はハイブリダイゼーションプローブと厳密な同一性、またはほぼ厳密な同一性を有する配列を同定するために用いることができ、一方、中間または低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションはポリヌクレオチド配列ホモログを同定または検出するために用いることができる。
【００８１】
中〜高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は当該技術分野ではよく知られている。高ストリンジェンシー条件の例としては、５０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ、５ＸＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌ変性キャリアＤＮＡ中、約４２℃でハイブリダイゼーションし、続いて２ＸＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ中、室温で２回洗浄し、さらに、０．１ＸＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ中、４２℃で２回洗浄することが挙げられる。中ストリンジェント条件の例としては、２０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸３ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５Ｘデンハルト溶液、１０％硫酸デキストランおよび２０ｍｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中、３７℃で終夜インキュベートし、続いて１ＸＳＳＣ中、約３７〜５０℃でフィルターを洗浄することが挙げられる。プローブ長などの因子を適合させるために必要な温度、イオン強度などの調節の仕方は、当業者であれば知っている。
【００８２】
「組み換え体」という用語は、生物学的構成要素または組成物（例えば、細胞、核酸、ポリペプチド／酵素、ベクターなど）に関連して使用されるとき、それらの生物学的構成要素または組成物が天然では見られない状態のものであることを示す。言い換えれば、生物学的構成要素または組成物は、人の介入によって天然状態が変えられている。例えば、組み換え細胞は、天然の親（すなわち、非組み換え）細胞中には存在しない１つ以上の遺伝子を発現する細胞、１つ以上の天然遺伝子を天然親細胞とは異なる量で発現する細胞、および／または１つ以上の天然遺伝子を天然親細胞とは異なる条件下で発現する細胞を包含する。組み換え核酸は、天然配列と１つ以上のヌクレオチドが異なっている、異種配列（例えば、異種プロモータ、非天然または変異シグナル配列をコードする配列など）に機能可能に結合している、イントロンを欠いている、および／または単離された形態にあり得る。組み換えポリペプチド／酵素は、天然配列と１つ以上のアミノ酸が異なっている、トランケートされるか、もしくはアミノ酸の内部欠失を有する、天然細胞に見られない態様で（例えば、ポリペプチドをコードする発現ベクターが細胞中に存在することにより、ポリペプチドを過剰発現する組み換え細胞から）発現する、および／または単離された形態にあり得る。いくつかの実施形態では、組み換えポリヌクレオチド、またはポリペプチド／酵素が、その野生型の相手と同一の配列を有するが、非天然形態（例えば、単離、または富化された形態）であることが強調されている。
【００８３】
本明細書で使用されるとき、「標的配列」という用語は、入来配列が宿主細胞ゲノム内に挿入されることが望ましい配列をコードする宿主細胞中のＤＮＡ配列を指す。いくつかの実施形態では、標的配列は野生型機能遺伝子またはオペロンをコードし、一方、他の実施形態では、標的配列は変異機能遺伝子またはオペロンまたは非機能遺伝子またはオペロンをコードする。
【００８４】
本明細書で使用されるとき、「フランキング配列」は、対象配列の上流または下流にある配列を指す（例えば、遺伝子Ａ−Ｂ−Ｃでは、遺伝子ＢがＡおよびＣ遺伝子配列にフランキングされている）。一実施形態では、入来配列の両側に相同ボックスがフランキングしている。他の実施形態では、入来配列および相同ボックスは両側にスタッファー配列がフランキングしている単位を含む。いくつかの実施形態では、フランキング配列は一方の側（３’または５’）にのみ存在するが、ある実施形態では、フランキングされている配列の両側に存在する。各相同ボックスの配列は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）染色体の配列に相同である。これらの配列は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）染色体に新しいコンストラクトが組み込まれ、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）染色体の一部が入来配列により置換されることを目的とする。一実施形態において、選択マーカーの５’および３’末端は、不活化染色体断片の一部を含むポリヌクレオチド配列によってフランキングされている。いくつかの実施形態では、フランキング配列は一方の側（３’または５’）にのみ存在するが、ある実施形態では、フランキングされている配列の両側に存在する。
【００８５】
本明細書で使用されるとき、「増幅性マーカー」、「増幅性遺伝子」および「増幅ベクター」という用語は、適当な増殖条件下で遺伝子の増幅を可能にする遺伝子をコードする遺伝子またはベクターを指す。
【００８６】
「鋳型特異性」は、酵素を選択することにより、殆どの増幅技術において達成される。増幅酵素は、その使用条件下で、核酸の異種混合物中、核酸の特定の配列のみを処理する酵素である。例えば、Ｑβレプリカーゼの場合、ＭＤＶ−１  ＲＮＡがレプリカーゼの特異的鋳型である（例えば、Ｋａｃｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９：３０３８［１９７２］を参照）。その他の核酸は、この増幅酵素によっては複製されない。同様に、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの場合、この増幅酵素はそれ自体のプロモータにストリンジェントな特異性を有する（Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２２８：２２７［１９７０］を参照）。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの場合、連結接合部分にオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド基質とテンプレートとの間に不整合が存在すると、この酵素は２つのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを連結しない（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：５６０［１９８９］を参照）。最後に、ＴａｑおよびＰｆｕポリメラーゼは、高温で機能する能力を有するため、結合する配列に高い特異性を示すことが分かっており、そのため、プライマーにより確定され、高温が標的配列とのプライマーハイブリダイゼーションに有利に作用し、非標的配列とのハイブリダイゼーションには有利でない熱力学的条件を生じさせる。
【００８７】
本明細書で使用されるとき、「増幅性核酸」という用語は、任意の増幅方法により増幅され得る核酸を指す。「増幅性核酸」は、通常、「サンプルテンプレート」を含むと考えられる。
【００８８】
本明細書で使用されるとき、「サンプルテンプレート」という用語は、「標的」（下記に定義）の存在を分析するサンプルから生じる核酸を指す。一方、「バックグラウンドテンプレート」は、サンプルテンプレート以外の核酸に関して用いられ、サンプル内に存在していてもいなくてもよい。バックグラウンドテンプレートは、殆どの場合、故意のものではない。それは、キャリーオーバーの結果、またはサンプルから精製すべき核酸汚染物質の存在によるものであり得る。例えば、検出すべき生物以外の生物由来の核酸は試験サンプル内のバックグラウンドとして存在し得る。
【００８９】
本明細書で使用されるとき、「プライマー」という用語は、精製制限消化などにおいて自然に生成されるか、合成的に生成されるかにかかわらず、核酸鎖に相補的なプライマー伸長生成物の合成が誘導される条件下に置かれた場合（すなわち、ヌクレオチド、およびＤＮＡポリメラーゼなどの誘発剤の存在下、適切な温度およびｐＨで）、合成開始点として作用し得るオリゴヌクレオチドを指す。増幅効率を最大にするためには、プライマーは一本鎖であることが好ましいが、あるいは二本鎖であってもよい。二本鎖の場合、プライマーは、伸長生成物の生成に使用する前にまず、その鎖を分離する処理を行う。プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドであることが好ましい。プライマーは、誘発剤の存在下、伸長生成物の合成を開始するため、十分に長くなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマー源、および使用方法などの多くの因子に左右される。
【００９０】
本明細書で使用されるとき、「プローブ」という用語は、精製制限消化などにおいて自然に生成されるか、合成、組み換え、またはＰＣＲ増幅により生成されるかにかかわらず、他の目的のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド（すなわちヌクレオチド配列）を指す。プローブは一本鎖であっても二本鎖であってもよい。プローブは、特定の遺伝子配列の検出、同定および単離に有用である。本発明で使用されるプローブはいずれも任意の「レポーター分子」で標識されるため、任意の検出システム、例えば、限定はされないが、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡ、および酵素をベースとした組織化学的分析）、蛍光、放射性および発光性システムなどにおいて検出されると考えられる。本発明を特定の検出システムまたは標識に限定することは意図されていない。
【００９１】
本明細書で使用されるとき、「標的」という用語は、ポリメラーゼ連鎖反応に関して用いる場合、ポリメラーゼ連鎖反応に用いるプライマーによって結合される核酸領域を指す。したがって、「標的」は、他の核酸配列から選別されようとするものである。「断片」は、標的配列内の核酸領域と定義される。
【００９２】
本明細書で使用されるとき、「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）という用語は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，６８３，１９５号明細書、同第４，６８３，２０２号明細書および同第４，９６５，１８８号明細書に記載の方法を指し、例えば、クローニングまたは精製することなくゲノムＤＮＡの混合物において標的配列の断片濃度を増加させる方法が挙げられる。
【００９３】
本明細書で使用されるとき、「増幅試薬」という用語は、プライマー、核酸テンプレートおよび増幅酵素以外の増幅に必要な試薬（デオキシリボヌクレオチド３リン酸、バッファなど）を指す。通常、増幅試薬は、その他の反応成分と共に、反応容器（試験管、マイクロウェルなど）内に加え、含有される。
【００９４】
ＰＣＲを用いて、ゲノムＤＮＡ中の特定の標的配列の１つのコピーを、いくつかの異なる方法（例えば、標識プローブを用いるハイブリダイゼーション；ビオチン化プライマー組み込み後のアビジン−酵素結合の検出；ｄＣＴＰまたはｄＡＴＰなどの３２Ｐ標識デオキシヌクレオチド３リン酸の増幅断片への組み込み）で検出可能なレベルにまで増幅することができる。ゲノムＤＮＡに加えて、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列を、適当なプライマー分子のセットを用いて増幅することができる。特に、ＰＣＲプロセスにより作成された増幅断片はそれ自体、続くＰＣＲ増幅の効率的な鋳型となる。
【００９５】
本明細書で使用されるとき、「ＰＣＲ産物」、「ＰＣＲフラグメント」および「増幅生成物」という用語は、変性、アニーリングおよび伸長のＰＣＲ工程の２つ以上のサイクル完了後に得られる化合物の混合物を指す。これらの用語は、１つ以上の標的配列の１つ以上の断片の増幅が行われた場合を包含する。
【００９６】
本明細書で使用されるとき、「ＲＴ−ＰＣＲ」という用語は、ＲＮＡ配列の複製および増幅を指す。この方法では、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，３２２，７７０号明細書に記載されているように、殆どの場合、熱安定性ポリメラーゼを用いる１つの酵素手順を用いて、逆転写をＰＣＲと組み合わせる。ＲＴ−ＰＣＲでは、ＲＮＡテンプレートが、ポリメラーゼの逆転写酵素活性によりｃＤＮＡに転換され、その後、ポリメラーゼの重合活性により増幅される（すなわち、他のＰＣＲ法と同様）。
【００９７】
本明細書で使用されるとき、「染色体の組み込み」という用語は、入来配列が宿主細胞（例えば、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ））の染色体内に導入されるプロセスを指す。形質転換ＤＮＡのホモログ領域が、染色体の相同領域と整列する。続いて、相同ボックス間の配列がダブルクロスオーバーで入来配列により置換される（すなわち、相同組み換え）。いくつかの実施形態では、ＤＮＡコンストラクトの不活化染色体断片の相同部分が、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）染色体の固有染色体領域のフランキング相同領域と整列する。続いて、固有染色体領域が、ダブルクロスオーバーでＤＮＡ構築体により欠失される（すなわち、相同組換え）。
【００９８】
「相同組み換え」は、同一、またはほぼ同一のヌクレオチド配列部位における、２つのＤＮＡ分子間、または対の染色体間のＤＮＡフラグメントの交換を意味する。一実施形態では、染色体組み込みは、相同組み換えである。
【００９９】
本明細書で使用されるとき、「相同配列」は、比較のために最適に整列させた場合に、他の核酸またはポリペプチド配列に対して１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８８％、８５％、８０％、７５％または７０％の配列同一性を有する核酸またはポリペプチド配列を意味する。いくつかの実施形態では、相同配列は８５％〜１００％の配列同一性を有し、一方、他の実施形態では、９０％〜１００％の配列同一性を有し、また、より多くの実施形態では、９５％〜１００％の配列同一性を有する。
【０１００】
本明細書で使用されるとき、「アミノ酸」は、ペプチドまたはタンパク質配列、またはそれらの一部を指す。「タンパク質」、「ぺプチド」および「ポリペプチド」という用語は、互換的に使用される。
【０１０１】
本明細書で使用されるとき、「目的タンパク質」（ＰＯＩ）は、所望の、および／または評価対象のタンパク質／ポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、目的タンパク質は細胞内にあり、さらに、他の実施形態では、それは分泌ポリペプチドである。ポリペプチドとしては、酵素が挙げられ、酵素としては、限定はされないが、デンプン分解酵素、タンパク質分解酵素、細胞分解（ｃｅｌｌｕｌｙｔｉｃ）酵素、酸化還元酵素および植物細胞壁分解酵素から選択される酵素が挙げられる。より具体的には、これらの酵素としては、限定はされないが、アミラーゼ、プロテアーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ラッカーゼ、フェノールオキシダーゼ、オキシダーゼ、クチナーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、エステラーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、フィターゼ、ペクチナーゼ、ペルヒドロラーゼ、ポリオールオキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、グルコシダーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、ガラクトシダーゼおよびキチナーゼが挙げられる。本発明の特定の実施形態では、目的ポリペプチドは、プロテアーゼである。いくつかの実施形態では、目的タンパク質は、シグナルペプチドに融合される分泌ポリペプチドである（すなわち、分泌されるタンパク質上でのアミノ末端伸長）。分泌タンパク質は大半が、膜透過の前駆体タンパク質のターゲッティングおよび翻訳に重要な役割を果たすアミノ末端タンパク質伸長を用いる。この伸長は、膜移動の間、またはそのすぐ後に、シグナルペプチダーゼによるタンパク質分解によって除去される。
【０１０２】
本発明のいくつかの実施形態では、目的ポリペプチドは、ホルモン、抗体、成長因子、受容体などから選択される。本発明に包含されるホルモンとしては、限定はされないが、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、ソマトスタチン、ゴナドトロピンホルモン、バソプレシン、オキシトシン、エリスロポエチン、インスリンなどが挙げられる。成長因子としては、限定はされないが、血小板由来成長因子、インスリン様成長因子、上皮成長因子、神経成長因子、線維芽細胞成長因子、形質転換成長因子、サイトカイン、例えばインターロイキン（例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−１３）、インターフェロン、コロニー刺激因子などが挙げられる。抗体としては、限定はされないが、抗体を生成するのが望ましい任意の種から直接得られる免疫グロブリンが挙げられる。さらに、本発明は、修飾抗体を包含する。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体もまた、本発明に包含される。特に好ましい実施形態では、抗体はヒト抗体である。
【０１０３】
本明細書で使用されるとき、ポリペプチドの「誘導体」または「変異体」は、１つ以上のアミノ酸のＣ末端およびＮ末端の一方または両方への付加、アミノ酸配列における１つまたは多くの異なる部位での１つ以上のアミノ酸の置換、ポリペプチドの一端もしくは両端での、またはアミノ酸配列の１つ以上の部位での１つ以上のアミノ酸の欠失、アミノ酸配列の１つ以上の部位での１つ以上のアミノ酸の挿入、およびこれらの任意の組み合わせにより、前駆体ポリペプチド（例えば、天然ポリペプチド）から誘導されるポリペプチドを意味する。ポリペプチドの誘導体または変異体の作製は、任意の都合の良い方法で、例えば、天然ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を変更して誘導／変異ポリペプチドを生成することにより、そのようなＤＮＡ配列を適切な宿主へ形質転換して誘導／変異ポリペプチドを生成することにより、および改変ＤＮＡ配列を発現させて誘導／変異ポリペプチドを生成することにより、行うことができる。誘導体または変異体としては、さらに、化学的に改変したポリペプチドが挙げられる。
【０１０４】
本明細書で使用されるとき、「異種タンパク質」という用語は、宿主細胞で天然には生じないタンパク質またはポリペプチドを指す。異種タンパク質の例としては、ヒドロラーゼ、例えば、プロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼおよびリパーゼ；イソメラーゼ、例えば、ラセマーゼ、エピメラーゼ、トートメラーゼまたはムターゼ；トランスフェラーゼ；キナーゼおよびホスファターゼなどの酵素が挙げられる。いくつかの実施形態では、タンパク質は治療的に重要なタンパク質またはペプチドであり、例えば、限定はされないが、成長因子、サイトカイン、リガンド、受容体およびインヒビター、ならびにワクチンおよび抗体が挙げられる。さらなる実施形態では、タンパク質は商業的に重要な工業タンパク質／ぺプチド（例えば、プロテアーゼ、アミラーゼおよびグルコアミラーゼなどのカルボヒドラーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼおよびリパーゼ）である。いくつかの実施形態では、タンパク質をコードする遺伝子は天然に存在する遺伝子であり、一方、他の実施形態では、変異および／または合成遺伝子が使用される。
【０１０５】
本明細書で使用されるとき、「相同タンパク質」は、細胞内の天然の、すなわち、細胞内に天然に存在するタンパク質またはポリペプチドを指す。いくつかの実施形態において、その細胞はグラム陽性細胞であり、一方、いくつかの他の実施形態では、グラム陽性細胞はバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞である。代替の実施形態において、相同タンパク質は、他の生物、例えば、限定はされないが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などにより生成された天然タンパク質である。本発明は、組み換えＤＮＡ技術により相同タンパク質を産生する宿主細胞を包含する。
【０１０６】
本明細書で使用される場合、「オペロン」は、一般的プロモータからの１転写単位として転写することができ、したがって同時調節を被る連続した遺伝子の群を含む。一部の実施形態では、オペロンは、複数の異なるｍＲＮＡの転写を駆動する複数のプロモータを含み得る。
【０１０７】
前述したように、本開示のいくつかの実施形態は、ＰＯＩの増加した発現をもたらす遺伝子改変を含む修飾細菌細胞、ならびにこうした細胞を作製および使用する方法に関する。したがって、本発明のいくつかの態様は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）のメンバーなどの改変グラム陽性細胞を含み、ここで、改変グラム陽性菌（娘）細胞は、ｋｉｎＡ遺伝子、ｐｈｒＡ遺伝子および／またはｐｈｒＥ遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルの低下をもたらす遺伝子改変を含む。前述し、また実施例のセクションで詳しく説明するように、本発明の改変グラム陽性菌細胞（すなわち、ｋｉｎＡ遺伝子、ｐｈｒＡ遺伝子および／またはｐｈｒＥ遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルの低下をもたらす遺伝子改変を含む）は、ほぼ同じ培養条件下で増殖させた対応する非改変グラム陽性菌（親）細胞と比較して、１種または複数種のＰＯＩの発現増加を示す。したがって、本開示の遺伝子改変は、ｋｉｎＡ遺伝子、ｐｈｒＡ遺伝子およびｐｈｒＥ遺伝子のいずれか１つ；ｋｉｎＡ遺伝子、ｐｈｒＡ遺伝子およびＰｈｒＥ遺伝子のいずれか２つ；またはｋｉｎＡ遺伝子、ｐｈｒＡ遺伝子およびｐｈｒＥ遺伝子の全３つの発現レベルを低下させる任意の改変である。他の実施形態では、遺伝子改変は、ほぼ同じ培養条件下で増殖させた対応する非改変グラム陽性菌（親）細胞と比較して、改変グラム陽性菌（娘）細胞のＫｉｎＡ、ＰｈｒＡおよびＰｈｒＥタンパク質の１つまたは複数の活性の低減をもたらす。したがって、いくつかの実施形態では、遺伝子改変は、ＫｉｎＡ、ＰｈｒＡおよびＰｈｒＥタンパク質のいずれか１つ；ＫｉｎＡ、ＰｈｒＡおよびＰｈｒＥタンパク質のいずれか２つ；またはＫｉｎＡ、ＰｈｒＡおよびＰｈｒＥタンパク質の全３つを低減する任意の改変である。
【０１０８】
上に要約したように、本発明のいくつかの態様は、グラム陽性菌細胞からのＰＯＩの発現を増加する方法を含み、これは、リン酸リレー型経路を活性化する１つまたは複数の遺伝子の発現を低減するように遺伝子改変されたグラム陽性菌（娘）細胞において、ＰＯＩの産生が、対応する非改変グラム陽性菌（親）細胞中の同じＰＯＩの産生に対して増加するという観察に基づく。前述したように、遺伝子改変は、例えば、エピソーム付加および／または染色体挿入、欠失、反転、塩基変化などにより、宿主細胞の遺伝子構造を変化させる宿主細胞における任意の改変として定義される。これに関して何ら限定は意図しない。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、親グラム陽性菌細胞は、１つまたは複数の欠陥もしくは不活性胞子形成開始遺伝子（すなわち、その発現が、Ｓｐｏ０Ａにより制御されるか、またはＳｐｏ０Ａの下流にある遺伝子）を有し、したがって親細胞は胞子の形成が妨げられる。驚くべきことに、本発明の出願人は、この遺伝的背景（すなわち、１つまたは複数の欠陥もしくは不活性胞子形成開始遺伝子を含む親グラム陽性菌細胞）においてさえも、別の遺伝子改変（例えば、ｋｉｎＡ遺伝子、ｐｈｒＡ遺伝子および／またはｐｈｒＥ遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルの低下をもたらす遺伝子改変）が、こうした改変グラム陽性菌（娘）細胞においてＰＯＩの発現を増加したことを見出した。したがって、本開示の遺伝子改変（娘）細胞におけるタンパク質発現／産生の向上は、グラム陽性細胞の胞子形成の阻止のみによるものではない。例えば、本開示の改変グラム陽性細胞が得られる親グラム陽性細胞は、Ｓｐｏ０Ａによりまたはシグマ因子ＳｉｇＦ、ＳｉｇＧ、ＳｉｇＥおよびＳｉｇＫにより調節される非機能性／突然変異／欠失胞子形成遺伝子を有し得る（例えば、胞子形成欠損バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞を使用する、実施例のセクションを参照）。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、本発明は、リン酸リレー型経路を活性化する１つまたは複数の遺伝子の発現を低減する少なくとも１つの遺伝子改変を含む、改変グラム陽性菌（娘）細胞を生産または取得する方法（およびその組成物）に関する。別の実施形態では、リン酸リレー型経路を活性化する１つまたは複数の遺伝子の発現を低減する少なくとも１つの遺伝子改変を含む改変グラム陽性菌（娘）細胞は、目的タンパク質が改変グラム陽性菌（娘）細胞によって発現されるような条件下で培養したとき、１つまたは複数のＰＯＩの増加した量を発現および／または産生する。したがって、これにより、ＰＯＩの発現および／または生産は、ほぼ同じ培養条件下で増殖させた対応する非改変グラム陽性菌（親）細胞中の同じＰＯＩの発現および／または産生と比較して（すなわち、これに対して）増加する。
【０１１１】
いくつかの実施形態によれば、遺伝子改変グラム陽性菌細胞（または遺伝子改変グラム陽性菌細胞が産生される親細胞）は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）のメンバーである。一部の実施形態では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、好アルカリ性バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞である。多数の好アルカリ性バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞が当該技術分野で知られている（例えば、米国特許第５，２１７，８７８号明細書；およびＡｕｎｓｔｒｕｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  ＩＶ  ＩＦＳ：Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，２９９−３０５［１９７２］を参照）。一部の実施形態では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、工業関連バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞である。工業用バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞の例として、限定はしないが、バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、およびバチルス・アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）が挙げられる。別の実施形態では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サークランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ラウツス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、またはバチルス・チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、ならびに上に挙げたバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の他の生物からなる群から選択される。特定の実施形態では、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が使用される。例えば、米国特許第５，２６４，３６６号明細書および同第４，７６０，０２５号明細書（ＲＥ３４，６０６）は、本発明において用途が見出される様々なバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞を記載するが、他の好適な細胞も本発明での使用に考慮される。
【０１１２】
本明細書に記載される遺伝子改変グラム陽性菌細胞の親細胞（例えば、親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞）は、組換えグラム陽性細胞であり、この場合、ＰＯＩをコードする異種ポリヌクレオチドが細胞に導入されている。ＰＯＩをコードするポリヌクレオチドの導入は、親細胞に実施してもよいが、このステップは、本明細書で詳述するようにポリペプチド産生増加のために既に遺伝子改変された細胞で実施してもよい。一部の実施形態では、宿主細胞は、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主株、例えば、組換えバチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株である。
【０１１３】
本発明の態様で使用される多くのバチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株が知られており、限定はされないが、例えば、１Ａ６（ＡＴＣＣ  ３９０８５）、１６８（１Ａ０１）、ＳＢ１９、Ｗ２３、Ｔｓ８５、Ｂ６３７、ＰＢ１７５３〜ＰＢ１７５８、ＰＢ３３６０、ＪＨ６４２、１Ａ２４３（ＡＴＣＣ  ３９，０８７）、ＡＴＣＣ  ２１３３２、ＡＴＣＣ  ６０５１、ＭＩ１１３、ＤＥ１００（ＡＴＣＣ  ３９，０９４）、ＧＸ４９３１、ＰＢＴ  １１０およびＰＥＰ  ２１１株が挙げられる（例えば、Ｈｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，７３：２１５−２２８［１９７３］；米国特許第４，４５０，２３５号明細書；同第４，３０２，５４４号明細書および欧州特許第０１３４０４８号明細書を参照）。バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）を発現宿主として使用することは、さらに、Ｐａｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．およびその他にも記載されている（Ｐａｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １９：８１−８７［１９８２］を参照；またＦａｈｎｅｓｔｏｃｋ  ａｎｄ  Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６５：７９６−８０４［１９８６］；およびＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ６９：３９−４７［１９８８］を参照）。
【０１１４】
ある実施形態では、プロテアーゼを産生する工業用バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株は、親発現宿主としての役割を果たすことができる。いくつかの実施形態では、本発明でのこれらの菌株の使用は、プロテアーゼの産生効率をさらに増大させる。プロテアーゼの２種類の一般型、すなわち、中性プロテアーゼ（または「金属プロテアーゼ」）およびアルカリ性（または「セリン」）プロテアーゼは、通常、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種により分泌される。セリンプロテアーゼは、活性部位に必須のセリン残基があるペプチド結合の加水分解を触媒する酵素である。セリンプロテアーゼは、２５，０００〜３０，０００の範囲の分子量を有する（Ｐｒｉｅｓｔ，Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｒｅｖ．，４１：７１１−７５３［１９７７］を参照）。サブチリシンは、本発明で使用するセリンプロテアーゼである。様々なバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来のサブチリシン、例えば、サブチリシン１６８、サブチリシンＢＰＮ’、サブチリシンカールスバーグ、サブチリシンＤＹ、サブチリシン１４７およびサブチリシン３０９が同定され、その配列が決定されている（例えば、欧州特許４１４２７９Ｂ号明細書；国際公開第８９／０６２７９号パンフレット；およびＳｔａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５９：８１１−８１８［１９８４］を参照）。本発明のいくつかの実施形態では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主菌株は変異（ｍｕｔａｎｔ）（例えば、変異（ｖａｒｉａｎｔ））プロテアーゼを産生する。多くの参考文献が、変異プロテアーゼを提示している（例えば、国際公開第９９／２０７７０号パンフレット；国際公開第９９／２０７２６号パンフレット；国際公開第９９／２０７６９号パンフレット；国際公開第８９／０６２７９号パンフレット；ＲＥ３４，６０６；米国特許第４，９１４，０３１号明細書；米国特許第４，９８０，２８８号明細書；米国特許第５，２０８，１５８号明細書；米国特許第５，３１０，６７５号明細書；米国特許第５，３３６，６１１号明細書；米国特許第５，３９９，２８３号明細書；米国特許第５，４４１，８８２号明細書；米国特許第５，４８２，８４９号明細書；米国特許第５，６３１，２１７号明細書；米国特許第５，６６５，５８７号明細書；米国特許第５，７００，６７６号明細書；米国特許第  ５，７４１，６９４号明細書；米国特許第５，８５８，７５７号明細書；米国特許第５，８８０，０８０号明細書；米国特許第６，１９７，５６７および米国特許第６，２１８，１６５号明細書を参照）。
【０１１５】
本発明では、目的タンパク質がプロテアーゼに限定されないことに留意されたい。実際、本発明は、グラム陽性細胞において発現の増大が望まれる様々な目的タンパク質を包含する（下記に詳述する）。
【０１１６】
他の実施形態では、本発明の態様で使用するためのグラム陽性菌細胞は、他の遺伝子に別の遺伝子改変を有してもよく、これにより、有益な表現型が得られる。例えば、以下の遺伝子：ｄｅｇＵ、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＲおよびｄｅｇＱのうちの少なくとも１つに突然変異または欠失を含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞を使用してもよい。一部の実施形態では、突然変異は、ｄｅｇＵ遺伝子にあり、例えば、ｄｅｇＵ（Ｈｙ）３２突然変異である。（Ｍｓａｄｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２：８２４−８３４［１９９０］；およびＯｌｍｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２５３：５６２−５６７［１９９７］を参照）。したがって、本発明の態様に用途が見出される親／遺伝子改変グラム陽性細胞の一例は、ｄｅｇＵ３２（Ｈｙ）突然変異を担持するバチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞である。別の実施形態では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、ｓｃｏＣ４（Ｃａｌｄｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８３：７３２９−７３４０［２００１］を参照）；ｓｐｏＩＩＥ（Ａｒｉｇｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３１：１４０７−１４１５［１９９９］を参照）；ｏｐｐＡまたはｏｐｐオペロンの他の遺伝子（Ｐｅｒｅｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５：１７３−１８５［１９９１］を参照）に突然変異または欠失を含む。実際に、ｏｐｐＡ遺伝子中の突然変異と同じ表現型をもたらすｏｐｐオペロン中の任意の突然変異は、本発明の改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞の一部の実施形態において用途が見出されると考えられる。一部の実施形態では、これらの突然変異は、単独で起こるが、他の実施形態では、突然変異の組み合わせが存在する。一部の実施形態では、本発明の改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）は、上に挙げた遺伝子の１つまたは複数に対する突然変異を既に含む親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞から得られる。別の実施形態では、本発明の事前に遺伝子改変されたバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）は、上に挙げた遺伝子の１つまたは複数に対する突然変異を含むようにさらに操作される。
【０１１７】
前述したように、リン酸リレー型経路を活性化する少なくとも１つの遺伝子の発現は、親細胞（ほぼ同じ条件下で増殖させた）と比較して、遺伝子改変グラム陽性細胞において低減される。この発現の低減は、いずれか従来の方法で達成することができ、転写、ｍＲＮＡ安定性、翻訳のレベルであってもよく、またはその活性を低減する遺伝子から産生されるポリペプチドの１つまたは複数における変異の存在によるものであってもよい（すなわち、これは、ポリペプチドの活性に基づく発現の「機能性」低減である）。このように、胞子形成開始遺伝子の発現を誘導する少なくとも１つの遺伝子の発現が低減される遺伝子改変の種類または方法に限定は意図されない。例えば、一部の実施形態では、グラム陽性細胞における遺伝子改変は、目的遺伝子のプロモータの１つまたは複数を改変し、その結果、転写活性の低減をもたらすものである。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、遺伝子改変により、対応する非改変グラム陽性菌細胞と比較して、改変グラム陽性菌細胞中のｋｉｎＡ、ｐｈｒＡおよびｐｈｒＥ遺伝子の１つまたは複数の発現レベルの低下が起こる。したがって、遺伝子改変は、ｋｉｎＡ、ｐｈｒＡおよびｐｈｒＥ遺伝子のいずれか１つ；ｋｉｎＡ、ｐｈｒＡおよびｐｈｒＥ遺伝子のいずれか２つ；またはｋｉｎＡ、ｐｈｒＡおよびｐｈｒＥ遺伝子の全３つの発現レベルの低下をもたらすことができる。他の実施形態では、遺伝子改変により、対応する非改変グラム陽性菌細胞と比較して、改変グラム陽性菌細胞中のＫｉｎＡ、ＰｈｒＡおよびＰｈｒＥタンパク質の１つまたは複数の活性の低減が起こる。したがって、遺伝子改変は、ＫｉｎＡ、ＰｈｒＡおよびＰｈｒＥタンパク質のいずれか１つ；ＫｉｎＡ、ＰｈｒＡおよびＰｈｒＥタンパク質のいずれか２つ；またはＫｉｎＡ、ＰｈｒＡおよびＰｈｒＥタンパク質の全３つの活性の低減をもたらすことができる。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、胞子形成開始遺伝子の発現を活性化するリン酸リレー型経路における遺伝子の発現は、遺伝子改変グラム陽性細胞において、ほぼ同じ培養条件下で培養した野生型および／または親細胞での発現レベルの約３％、例えば、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、または約８０％に低下する。このように、胞子形成開始遺伝子の発現を誘導する１つまたは複数の遺伝子の発現の低減の範囲は、約３％〜約８０％、約４％〜約７５％、約５％〜約７０％、約６％〜約６５％、約７％〜約６０％、約８％〜約５０％、約９％〜約４５％、約１０％〜約４０％、約１１％〜約３５％、約１２％〜約３０％、約１３％〜約２５％、約１４％〜約２０％などであってよい。上に挙げた範囲内の発現の任意の部分範囲が考慮される。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、改変グラム陽性菌細胞は、ほぼ同じ培養条件下で増殖させた対応する非改変グラム陽性菌細胞と比較して、ｋｉｎＡ、ｐｈｒＡおよびｐｈｒＥ遺伝子のいずれか１つ、２つまたは３つの発現が低減している。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、遺伝子改変（または突然変異）は、ｋｉｎＡ遺伝子の発現を低減するものである。親グラム陽性細胞（すなわち、本明細書に記載するように遺伝子改変される前）におけるｋｉｎＡ遺伝子は、配列番号１と少なくとも約６０％、例えば、配列番号１と少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一の遺伝子である。いくつかの実施形態では、遺伝子改変は、ｋｉｎＡ遺伝子の全部または一部の欠失である。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、遺伝子改変（または突然変異）は、ｐｈｒＡ遺伝子の発現を低減するものである。親グラム陽性細胞（すなわち、本明細書に記載するように遺伝子改変される前）におけるｐｈｒＡ遺伝子は、配列番号６と少なくとも約６０％、例えば、配列番号６と少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一の遺伝子である。いくつかの実施形態では、遺伝子改変は、ｐｈｒＡ遺伝子の全部または一部の欠失である。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、遺伝子改変（または突然変異）は、ｐｈｒＥ遺伝子の発現を低減するものである。親グラム陽性細胞（すなわち、本明細書に記載するように遺伝子改変される前）におけるｐｈｒＥ遺伝子は、配列番号８と少なくとも約６０％、例えば、配列番号８と少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一の遺伝子である。いくつかの実施形態では、遺伝子改変は、ｐｈｒＥ遺伝子の全部または一部の欠失である。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、改変グラム陽性菌細胞は、ほぼ同じ培養条件下で増殖させた対応する非改変グラム陽性菌細胞と比較して、ｋｉｎＡ、ｐｈｒＡおよびｐｈｒＥ遺伝子のいずれか１つ、２つまたは３つの発現が低減している。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、遺伝子改変（または突然変異）は、ＫｉｎＡタンパク質の活性を低減するもの、例えば、変異型ＫｉｎＡタンパク質（例えば、野生型配列と比較して１つまたは複数のアミノ酸の欠失、挿入または置換を有する）である。変異型ＫｉｎＡタンパク質は、配列番号２と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一のアミノ酸配列を含有し得る。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、遺伝子改変（または突然変異）は、ＰｈｒＡタンパク質の活性を低減するもの、例えば、変異型ＰｈｒＡタンパク質（例えば、野生型配列と比較して１つまたは複数のアミノ酸の欠失、挿入または置換を有する）である。変異型ＰｈｒＡタンパク質は、配列番号７と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一のアミノ酸配列を含有し得る。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、遺伝子改変（または突然変異）は、ＰｈｒＥタンパク質の活性を低減するもの、例えば、変異型ＰｈｒＥタンパク質（例えば、野生型配列と比較して１つまたは複数のアミノ酸の欠失、挿入または置換を有する）である。変異型ＰｈｒＥタンパク質は、配列番号９と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一のアミノ酸配列を含有し得る。
【０１２８】
前述したように、多様なタンパク質が、グラム陽性細胞におけるＰＯＩ（例えば、遺伝子改変細胞においてその発現が増加するタンパク質）としての用途を見出される。ＰＯＩは、相同性タンパク質または異種タンパク質のいずれでもよく、また野生型タンパク質、天然の変異体もしくは組換え変異体であってもよい。いくつかの実施形態では、ＰＯＩは、酵素であり、特定の実施形態において、酵素は、アセチルエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルカナーゼ、グルカンリアーゼ、エンド−β−グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルヒドロラーゼ、ポリオールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、およびこれらの組み合わせから選択される。
【０１２９】
いくつかの他の実施形態では、ＰＯＩは、プロテアーゼであり、ここで、プロテアーゼは、スブチリシン、例えば、スブチリシン１６８、スブチリシンＢＰＮ’、スブチリシンカールスバーグ（Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）、スブチリシンＤＹ、スブチリシン１４７、スブチリシン３０９、およびこれらの変異体から選択されるスブチリシンである。いくつかの実施形態では、ＰＯＩは、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、本方法およびその組成物は、目的タンパク質を回収するステップをさらに含む。目的タンパク質の発現／産生のレベルは、遺伝子改変グラム陽性（娘）細胞において増加する（非改変親細胞と比較して）ことから、回収されたＰＯＩの量は、ほぼ同じ培養条件下（および同じ規模）で培養したとき、対応する非改変グラム陽性（親）細胞に対して増加している。細胞内および細胞外で発現されたポリペプチドの発現レベル／産生を検出および測定するための、当業者に周知の様々なアッセイがある。こうしたアッセイは、本発明のユーザによって決定され、ＰＯＩのアイデンティティーおよび／または活性（例えば、酵素活性）よって変わり得る。例えば、プロテアーゼのアッセイの場合、２８０ｎｍでの吸光度として、またはフォリン（Ｆｏｌｉｎ）法を用いた比色測定により測定される、カゼインまたはヘモグロビンからの酸可溶性ペプチドの放出に基づくアッセイがある（例えば、Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ”ｖｏｌ．５，Ｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，Ｖｅｒｌａｇ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ［１９８４］を参照）。他のアッセイは、色素生成基質の可溶化を含む（例えば、Ｗａｒｄ，“Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ，”ｉｎ  Ｆｏｇａｒｔｙ（ｅｄ．）．，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，［１９８３］，ｐｐ  ２５１−３１７を参照）。アッセイの別の例として、スクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−パラニトロアニリドアッセイ（ＳＡＡＰＦｐＮＡ）および２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム塩アッセイ（ＴＮＢＳアッセイ）がある。それ以外にも当業者に周知の多数の参照文献が好適な方法を記載している（例えば、Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１：７９１１−７９２５［１９８３］；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２３：１１９−１２９［１９９４］；およびＨｓｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２４２：２２１−２２７［１９９９］を参照）。
【０１３１】
また、上述したように、ＰＯＩの分泌レベルを測定する手段として、目的タンパク質に特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を用いる免疫測定法が挙げられる。その例としては、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、および蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）は挙げられる。しかしながら、他の方法が当業者に知られており、目的タンパク質の評価に使用される（例えば、Ｈａｍｐｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＡＰＳ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ［１９９０］；およびＭａｄｄｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１５８：１２１１［１９８３］を参照）。当該技術分野で知られているように、本発明により作製される変異バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、細胞培養物からのＰＯＩの発現および回収に適した条件下で維持され、増殖される（例えば、Ｈａｒｄｗｏｏｄ  ａｎｄ  Ｃｕｔｔｉｎｇ（ｅｄｓ．）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ［１９９０］を参照）。なお、さらに、本明細書に記載の遺伝子変異細胞は、２種以上のＰＯＩ、例えば、２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、７種以上、８種以上、９種以上、１０種以上などの目的タンパク質を発現し得る。いくつかの実施形態では、細胞から分泌される多くの様々なタンパク質を含む細菌セクレトームにおけるタンパク質の発現の増加が望まれる。
【０１３２】
本発明の態様は、タンパク質産生能力が向上した修飾グラム陽性菌細胞を取得する方法を含む。一般に、本方法は、親グラム陽性細胞を遺伝子改変することにより、遺伝子改変された娘グラム陽性細胞を取得するステップを含み、ここで、リン酸リレー系（上に定義した通り）を活性化する１つまたは複数の遺伝子の発現である。
【０１３３】
一部の実施形態では、本方法は、染色体に組み込むか、またはエピソーム遺伝子エレメントとして維持されると、遺伝子改変グラム陽性細胞をもたらす、親グラム陽性菌細胞にポリヌクレオチド配列を導入するステップを含み、ここで、リン酸リレー系を活性化する１つまたは複数の遺伝子の発現レベルである。
【０１３４】
当業者に周知のポリヌクレオチドベクター（例えば、プラスミド構築物）を用いて染色体を改変するか、またはバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞中にエピソーム遺伝子エレメントを維持する目的でバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種を形質転換する様々な方法が知られている。バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞中にポリヌクレオチド配列を導入する好適な方法は、例えば、Ｆｅｒｒａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，”ｉｎ  Ｈａｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．），Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．［１９８９］，ｐａｇｅｓ  ５７−７２に見出され；また、以下も参照されたい：Ｓａｕｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５７：７１８−７２６［１９８４］；Ｈｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，９３：１９２５−１９３７［１９６７］；Ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３：１３１−１３５［１９８６］；およびＨｏｌｕｂｏｖａ，Ｆｏｌｉａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３０：９７［１９８５］；バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）については、Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８：１１−１１５［１９７９］；バチルス・メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）については、Ｖｏｒｏｂｊｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，７：２６１−２６３［１９８０］；バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）については、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５１：６３４（１９８６）；バチルス・チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）については、Ｆｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３９：２１３−２１７［１９８１］；ならびにバチルス・スファエリカス（Ｂ．ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）については、ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３０：２０３［１９８４］。実際に、プロトプラスト形質転換および会合を含む形質転換、形質導入、およびプロトプラスト融合などの方法が知られており、本発明での使用に適している。形質転換の方法は、とりわけ、本発明により提供されるＤＮＡ構築物を宿主細胞に導入するものである。
【０１３５】
さらに、ＤＮＡコンストラクトを宿主細胞に導入する方法として、ターゲティングＤＮＡコンストラクトをプラスミドまたはベクターに挿入せずに物理的または化学的にＤＮＡを宿主細胞に導入する、当該技術分野で知られた方法が挙げられる。そのような方法としては、限定はされないが、塩化カルシウム沈澱、エレクトロポレーション、裸ＤＮＡ、リポソームなどが挙げられる。さらなる実施形態では、ＤＮＡコンストラクトをプラスミドに挿入せずに、プラスミドと共に同時形質転換することができる。
【０１３６】
選択可能マーカー遺伝子が安定な形質転換のための選択に使用される実施形態では、任意の便宜の良い方法を用いて、遺伝子変異グラム陽性菌株から選択マーカーを欠失させることが望ましく、多くの方法が当該技術分野で知られている（Ｓｔａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５８：４１１−４１８［１９８４］；およびＰａｌｍｅｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ２４７：２５５−２６４［２０００］を参照）。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、２つ以上のＤＮＡコンストラクト（すなわち、それぞれ宿主細胞の遺伝子を変異させるように設計されているＤＮＡコンストラクト）が、親グラム陽性細胞に導入され、細胞において２つ以上の遺伝子変異、例えば、２つ以上の染色体領域での変異の導入を生じる。いくつかの実施形態では、これらの領域は隣接しており（例えば、単一のオペロン内の２つの領域）、一方、他の実施形態では、領域は離れている。いくつかの実施形態では、遺伝子変異の１つ以上は、エピソーム遺伝因子の付加による。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は本発明の１つ以上のＤＮＡコンストラクトで形質転換され、変異バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株が生成される。そこでは、宿主細胞の２つ以上の遺伝子が不活化されている。いくつかの実施形態では、２つ以上の遺伝子が宿主細胞染色体から欠失される。代替の実施形態では、２つ以上の遺伝子がＤＮＡコンストラクトの挿入により不活化される。いくつかの実施形態では、不活化遺伝子は隣接しており（欠失および／または挿入による不活化であるかに関わりなく）、一方、他の実施形態では、それらは隣接した遺伝子ではない。
【０１３９】
遺伝子変異宿主細胞が生成されると、目的タンパク質が発現する条件下で培養することができ、ある実施形態ではＰＯＩが回収される。
【０１４０】
一部の実施形態では、本発明は、宿主細胞に安定に組み込まれると、胞子形成開始遺伝子の発現を誘導するリン酸リレー系を活性化する１つまたは複数の遺伝子の発現が低減されるように、上記細胞を遺伝子改変する新来の配列を含むＤＮＡ構築物を含む（上記で詳述の通り）。一部の実施形態では、ＤＮＡ構築物をｉｎ  ｖｉｔｒｏでアセンブリングした後、ＤＮＡ構築物が宿主細胞染色体に組み込まれるように、競合グラム陽性（例えば、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ））宿主中に上記構築物の直接クローニングを実施する。例えば、ＰＣＲ融合および／または連結を使用して、ＤＮＡ構築物をｉｎ  ｖｉｔｒｏでアセンブリングすることができる。一部の実施形態では、ＤＮＡ構築物は、非プラスミドであるが、他の実施形態では、これは、ベクター（例えば、プラスミド）に組み込まれる。一部の実施形態では、環状プラスミドが使用される。一部の実施形態では、環状プラスミドは、適切な制限酵素（すなわち、ＤＮＡ構築物を破壊しないもの）を使用するように設計される。したがって、線状プラスミドは、本発明に用途が見出される。しかしながら、当業者に周知のように他の方法も本発明での使用に好適である（例えば、Ｐｅｒｅｇｏ，“Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ，”ｉｎ（Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｇｒａｍ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ［１９９３］）。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡターゲティングベクターは、ｋｉｎＡ遺伝子、ｐｈｒＡ遺伝子、またはｐｈｒＥ遺伝子の全部もしくは一部を欠失する（またはその欠失を可能にする）ように設計される。いくつかの実施形態では、複数のＤＮＡ構築物を同時にまたは順次使用して、ｋｉｎＡ遺伝子、ｐｈｒＡ遺伝子、およびｐｈｒＥ遺伝子のいずれか２つまたは３つを欠失させる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡターゲティングベクターは、選択マーカーを含む。一部の実施形態では、選択マーカーは、２つのｌｏｘＰ部位の間に配置し（Ｋｕｈｎ  ａｎｄ  Ｔｏｒｒｅｓ，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１８０：１７５−２０４［２００２］を参照）、次に、Ｃｒｅタンパク質の作用により抗菌遺伝子を欠失させる。
【０１４２】
本発明の態様は、グラム陽性菌細胞におけるＰＯＩの発現を増大する方法を含み、この方法は、前述したＤＮＡ構築物またはベクター（すなわち、宿主細胞に安定に組み込まれると、リン酸リレー型経路の１つまたは複数の遺伝子の発現が低減されるように、上記細胞を遺伝子改変する新来の配列を含むもの）で親グラム陽性菌細胞を形質転換し、ベクターおよび親グラム陽性菌細胞の目的遺伝子中の対応する領域の相同組換えにより、改変されたグラム陽性菌細胞を産生させるステップと；ＰＯＩの発現に好適な条件下で、改変グラム陽性菌細胞を増殖させるステップとを含み、その際、ＰＯＩの産生は、グラム陽性菌（親）細胞と比較して改変グラム陽性菌（娘）細胞で増加している。本発明のこの態様で用途が見出されるグラム陽性菌細胞、突然変異およびその他の特徴の例は、上に詳しく記載している。
【０１４３】
ＤＮＡコンストラクトがベクターに組み込まれようと、あるいはプラスミドＤＮＡの非存在下に使用されようと、それは微生物を形質転換させるために使用される。適切ないかなる形質転換方法も、本発明で使用されると考えられる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡコンストラクトの少なくとも１つのコピーは、宿主バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の染色体に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本発明の１種以上のＤＮＡコンストラクトが、宿主細胞の形質転換に使用される。
【０１４４】
本発明を実施する仕方および方法は、以下の実施例を参照することにより当業者により深く理解され得る。これらの実施例は、いかなる方法によっても、本発明の範囲またはそれに係る特許請求の範囲を限定することを意図されていない。
【実施例】
【０１４５】
以下の実施例は、本発明の特定の実施例および態様を実証し、かつさらに詳しく説明するために提供されるものであり、その範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【０１４６】
以下の実験の開示において、次の略語のいくつかが用いられる：℃（摂氏温度）；ｒｐｍ（毎分の回転数）；μｇ（マイクログラム）；ｍｇ（ミリグラム）；μｌ（マイクロリットル）；ｍｌ（ミリリットル）；ｍＭ（ミリモル）；μＭ（マイクロモル）；ｓｅｃ（秒）；ｍｉｎ（分）；ｈｒ（時間）；ＯＤ２８０（２８０ｎｍにおける光学濃度）；ＯＤ６００（６００ｎｍにおける光学濃度）；ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）；ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）；ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）。
【０１４７】
実施例１
ｋｉｎＡ遺伝子の欠失によるバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）におけるタンパク質発現の増加
Ａ．バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるｋｉｎＡ遺伝子座の欠失
ｋｉｎＡ遺伝子中の欠失を、ｋｉｎＡ欠失カセットを用いた相同組換えにより親バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞に導入した（図１）。この欠失は、ＰＣＲおよびｋｉｎＡ遺伝子座の配列決定により確認した。得られた娘細胞は、ΔｋｉｎＡにより示し、非改変バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞は、本明細書において親細胞と呼ぶ。配列番号１は、ｋｉｎＡ遺伝子の野生型配列を示し、配列番号２は、ＫｉｎＡタンパク質配列を示す。
【０１４８】
Ｂ．ｋｉｎＡ欠失株でのアミラーゼ発現
ａｐｒＥプロモータからのＡｍｙＥの発現を駆動すると共に、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ耐性（ｃａｔＲ）マーカー遺伝子（本明細書では、「ＰａｐｒＥ−ａｍｙＥ  ｃａｔＲ」）を含むアミラーゼ発現構築物を、ΔｋｉｎＡ（娘細胞）と非改変親細胞との両方のａｐｒＥ遺伝子座に導入した。成熟ＡｍｙＥタンパク質配列を配列番号３に示す。
【０１４９】
２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するルリア（Ｌｕｒｉａ）寒天プレート上で細胞を増幅した。ΔｋｉｎＡ（娘）細胞および親細胞を５ｍＬのルリアブロス培地中で一晩増殖させた。ＡｍｙＥアミラーゼタンパク質の発現を試験するために、１ｍｌの前培養物を用いて、振盪フラスコ中の２５ｍＬのルリアブロス培地に３７℃、２５０ｒｐｍで接種した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ，ＵＳＡ）を用いて、１時間毎に６００ｎｍで細胞密度を測定した。６００ｎｍでの吸光度を時間の関数としてプロットし、結果を図２Ａに示す。例えば、図２Ａから、親細胞およびΔｋｉｎＡ（娘）細胞の細胞増殖は均等であることが分かり、これは、（娘）細胞におけるｋｉｎＡ遺伝子の欠失が細胞増殖に影響を与えないことを示している。
【０１５０】
全ブロスのＡｍｙＥアミラーゼ活性は、セラルファ（Ｃｅｒａｌｐｈａ）試薬（Ｍｅｇａｚｙｍｅ，Ｗｉｃｋｌｏｗ，Ｉｒｅｌａｎｄ）を用いて測定した。初めにセラルファ（Ｃｅｒａｌｐｈａ）ＨＲキットからのセラルファ（Ｃｅｒａｌｐｈａ）試薬ミックスを１０ｍｌのＭｉｌｌｉＱ水に溶解させ、続いて３０ｍｌの５０ｍＭマレイン酸バッファ、ｐＨ５．６を添加した。培養物上清をＭｉｌｌｉＱ水に４０×希釈した後、５μｌの希釈サンプルを５５μＬの希釈作業基質溶液に添加した。振盪後、ＭＴＰプレートを室温で４分間インキュベートした。７０μｌの２００ｍＭホウ酸バッファｐＨ１０．２（停止溶液）を添加することにより、反応を停止させた。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ，ＵＳＡ）を用いて、溶液の吸光度を４００ｎｍで測定した。４００ｎｍでの吸光度を時間の関数としてプロットし、結果を図２Ｂに示す。図２Ｂのグラフは、改変（ΔｋｉｎＡ；娘）細胞において６時間の増殖で開始するＡｍｙＥ産生の増加を示す。改変（ΔｋｉｎＡ；娘）細胞において細胞増殖が影響を受けなかった（図２Ａ）ことを考慮すれば、非改変（親）バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞（同じ培養条件下で増殖）に対する改変（ΔｋｉｎＡ；娘）バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞でのＡｍｙＥ産生の増加は、培養中の細胞の数の増加によるのではなく、細胞自体における（すなわち、細胞毎の）発現レベルの増加によるものである。
【０１５１】
Ｃ．ｋｉｎＡ欠失株でのプロテアーゼ（ＦＮＡ）発現
ＦＮＡプロテアーゼ（Ｙ２１７Ｌ置換を含むスブチリシンＢＰＮ’；配列番号４）の発現に対するｋｉｎＡ欠失（ΔｋｉｎＡ）の作用を、ＦＮＡ発現カセット（本明細書では、「ＰａｐｒＥ−ＦＮＡ−ｃａｔＲ」）を含むバチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞で試験した。改変バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（娘）細胞におけるｋｉｎＡ遺伝子は、図１に示す構築物での株の形質転換により欠失させた。ｋｉｎＡの欠失を担持するスペクチノマイシン耐性コロニーを、２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するＬＡプレート上で増幅させた。５ｍＬのルリアブロス培地中で、親バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞とΔｋｉｎＡノックアウト娘細胞とを一晩増殖させた。プロテアーゼ発現を試験するために、１ｍｌの前培養物を用いて、トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）フラスコ中の２５ｍＬの２×ＮＢ（国際公開第２０１０／１４４８３号パンフレットに記載の２×ニュートリエントブロス、１×ＳＮＢ塩）に２５０ｒｐｍで接種した。全ブロスの細胞密度を２０×希釈し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ，ＵＳＡ）を用いて１時間毎に６００ｎｍで測定した。６００ｎｍでの吸光度を時間の関数としてプロットし、結果を図３Ａに示すが、この図から、ＦＮＡを発現するバチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）親細胞と、ＦＮＡを発現するバチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）娘細胞（すなわち、ΔｋｉｎＡ）との細胞増殖は均等であることが分かり、これは、娘細胞におけるｋｉｎＡの欠失が細胞増殖に影響を与えないことを示している。
【０１５２】
国際公開第２０１０／１４４２８３号パンフレットに記載されているように、Ｎ−ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ基質（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）を用いて、ＦＮＡプロテアーゼ発現をモニターした。手短には、全ブロスをアッセイバッファ（１００ｍＭトリス、０．００５％Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ８．６）で４０×希釈した後、１０μｌの希釈サンプルをマイクロタイタープレート内に配置した。ＡＡＰＦ原液をアッセイバッファで希釈し（ＤＭＳＯ中の１００ｍｇ／ｍｌＡＡＰＦの１００×希釈）、１９０μｌのこの溶液をマイクロタイタープレートに添加し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ，ＵＳＡ）を用いて、溶液の吸光度を４０５ｎｍで測定した。４０５ｎｍでの吸光度を時間の関数としてプロットし、結果を図３Ｂに示すが、この図から、ＦＮＡ産生は、同じ培養条件下で増幅させた親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞の培養物と比較して、ΔｋｉｎＡ欠失を含む娘バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞において増加していることが分かる。改変（ΔｋｉｎＡ）バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）娘細胞において細胞増殖が影響を受けなかった（図３Ａに示す通り）ことを考慮すれば、非改変親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞（同じ培養条件下で増殖）に対するバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（ΔｋｉｎＡ）娘細胞におけるＦＮＡ産生の増加は、培養中の細胞の数の増加によるのではなく、改変細胞自体での（すなわち、細胞毎の）発現レベルの増加によるものである。
【０１５３】
Ｄ．ｋｉｎＡ欠失株での緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現
他のタンパク質の発現に対するｋｉｎＡ欠失の作用を試験するために、ａｐｒＥプロモータの制御下で、さらにクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ耐性マーカー（配列番号５は、ＧＦＰのアミノ酸配列を示す）を含有するＧＦＰ発現カセット（本明細書では、「ＰａｐｒＥ−ＧＦＰ−ｃａｔＲ」）を、非改変バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）親細胞および改変（ΔｋｉｎＡ）バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）娘細胞のａｐｒＥ遺伝子座に導入した。５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するルリア寒天プレート上で形質転換体を選択した。５ｍＬのルリアブロス培地中で、ＧＦＰを発現する改変バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ΔｋｉｎＡ）娘細胞と、ＧＦＰを発現する非改変バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）親細胞とを一晩増殖させた。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現を試験するために、１ｍｌの前培養物を用いて、振盪フラスコ中の２５ｍＬの２×ＮＢ培地（２×ニュートリエントブロス、１×ＳＮＢ塩）に３７℃、２５０ｒｐｍで接種した。２０×希釈した全ブロスの細胞密度を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ，ＵＳＡ）を用いて１時間毎に６００ｎｍで測定した。６００ｎｍでの吸光度を時間の関数としてプロットし、結果を図４Ａに示すが、この図から、ＧＦＰを発現するバチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）親細胞の細胞増殖は、ＧＦＰを発現するバチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ΔｋｉｎＡ）娘細胞と比較して低減していることが分かり、これは、これらのＧＦＰ発現細胞におけるｋｉｎＡ欠失が細胞増殖にプラスに影響することを示している。
【０１５４】
ＧＦＰ発現を測定するために、１００μｌの培養物を９６ウェルマイクロタイタープレートに移し、４９５ｎｍ発光カットオフフィルタを備え、励起波長４８５ｎｍ、発光波長５０８ｎｍを用いる蛍光プレートリーダでＧＦＰ発現を測定した。４８５／５０８ｎｍでの相対蛍光単位（ＲＦＵ）を時間の関数としてプロットし、結果を図４Ｂに示す。グラフは、ｋｉｎＡ欠失により、６時間の増殖からのＧＦＰ産生の増加を示す。非改変バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）親細胞と比較した改変バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ΔｋｉｎＡ）娘細胞で増加したＧＦＰ発現レベルは、図４Ａに認められる細胞生存性の向上から単純に予想され得るものを上回る。
【０１５５】
実施例２
ｐｈｒＡおよびｐｈｒＥ遺伝子の欠失によるバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）におけるタンパク質発現の増加
Ａ．バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるｐｈｒＡ遺伝子座の欠失
ｐｈｒＡ遺伝子の欠失は、図６に概略を示す欠失カセットの相同組換えにより親バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞に導入した。このｐｈｒＡ欠失（ΔｐｈｒＡ）は、ＰＣＲおよびｐｈｒＡ遺伝子座の配列決定により確認した。プラスミドコード化Ｃｒｅリコンビナーゼを用いて、スペクチノマイシン（ｓｐｅｃＲ）を除去した。
【０１５６】
Ｂ．改変（ΔｐｈｒＡ）バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞におけるｐｈｒＥ遺伝子座の欠失
図７に概略を示す欠失カセットの相同組換えにより、実施例２．Ａに記載した改変（ΔｐｈｒＡ）バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）娘細胞においてｐｈｒＥ遺伝子も欠失させた。ｐｈｒＥ欠失は、ＰＣＲおよびｐｈｒＥ遺伝子座の配列決定により確認した。
【０１５７】
Ｃ．改変（ΔｐｈｒＡ／ΔｐｈｒＥ）バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞におけるタンパク質発現
実施例１に既述した発現カセット（すなわち、「ＰａｐｒＥ−ＦＮＡ  ｃａｔＲ」カセット、「ＰａｐｒＥ−ＧＦＰ  ｃａｔＲ」カセットまたは「ＰａｐｒＥ−ａｍｙＥ  ｃａｔＲ」カセット）を、非改変（親）バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞および改変（ΔｐｈｒＡ／ΔｐｈｒＥ）バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞の染色体に導入した。株選択、細胞増殖、および酵素アッセイを実施例１に記載のように実施した。「ＰａｐｒＥ−ＦＮＡ  ｃａｔＲ」カセットを含むバチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞をクロラムフェニコール２５ｐｐｍプレート上で選択した。「ＰａｐｒＥ−ＧＦＰ  ｃａｔＲ」カセットまたは「ＰａｐｒＥ−ａｍｙＥ  ｃａｔＲ」カセットを含むバチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞は、クロラムフェニコール５ｐｐｍプレート上で選択した。細胞密度およびタンパク質発現は、実施例１に記載の通りに測定した。
【０１５８】
図８Ａから、ＧＦＰ発現親バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞と、ＧＦＰ発現娘（ΔｐｈｒＡ／ΔｐｈｒＥ）バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞との細胞増殖は均等であることが分かり、これは、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（娘）細胞におけるｐｈｒＡ−ｐｈｒＥ欠失が細胞増殖に影響しないことを示している。図８Ｂは、ｐｈｒＡ−ｐｈｒＥ欠失の結果として４時間の増殖からのＧＦＰ産生の増加を示す。
【０１５９】
図９Ａから、ＦＮＡ発現親バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞と、ＦＮＡ発現娘（ΔｐｈｒＡ／ΔｐｈｒＥ）バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞との細胞増殖は均等であることが分かり、これは、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（娘）細胞におけるｐｈｒＡ−ｐｈｒＥ欠失が細胞増殖に影響しないことを示している。図９Ｂは、ｐｈｒＡ−ｐｈｒＥ欠失の結果として４時間の増殖からのＦＮＡ産生の増加を示す。
【０１６０】
図１０Ａから、ＡｍｙＥ発現親バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞と、ＡｍｙＥ発現娘（ΔｐｈｒＡ／ΔｐｈｒＥ）バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞との細胞増殖は均等であることが分かり、これは、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（娘）細胞におけるｐｈｒＡ−ｐｈｒＥ欠失が細胞増殖に影響しないことを示している。図１０Ｂは、ｐｈｒＡ−ｐｈｒＥ欠失の結果としてのＡｍｙＥ産生の増加を示す。
【０１６１】
上述の組成物および方法は、明瞭な理解のために図面および実施例を通していくらか詳細に記載してきたが、添付の特許請求の範囲の趣旨または範囲から逸脱することなく、一定の変更と修正を行い得ることは、本明細書に記載の教示に照らせば当業者に容易に明らかである。
【０１６２】
したがって、先の記述は単に本組成物および方法の原理を説明したものである。本明細書に明示的に記載または示されていないが、本発明の組成物および方法の原理を具体化し、かつ本発明の趣旨および範囲に含まれる各種配置を当業者が考案できるであろうことは認識されよう。さらに、本明細書に記載の実施例および条件付き文言は全て、本組成物および本方法の原理、ならびに発明者らによって技術の進展に寄与する概念について読者の理解を助けることを主に意図しており、またそのような具体的に記載された実施例および条件に限定されないと解されるべきである。さらに、本組成物および本方法の原理、態様および実施形態、ならびにそれらの具体的実施例を述べている本明細書中の全ての記述は、それらの構造的均等物および機能的均等物の両方を包含するものとする。さらに、そのような透過物には、現在知られている均等物、および将来開発される均等物、すなわち、構造に関わりなく同じ機能を有するように開発されるあらゆる要素がいずれも含まれるものとする。したがって、本組成物および本方法の範囲は、本明細書に示され、記載されている例示の実施形態に限定されるものではない。
【０１６３】
配列
【化１】
2017538433.tif 000003
【化２】
2017538433.tif 000004
【化３】
2017538433.tif 000005
【図１】
2017538433.tif 000006
【図２Ａ】
2017538433.tif 000007
【図２Ｂ】
2017538433.tif 000008
【図３Ａ】
2017538433.tif 000009
【図３Ｂ】
2017538433.tif 000010
【図４Ａ】
2017538433.tif 000011
【図４Ｂ】
2017538433.tif 000012
【図５】
2017538433.tif 000013
【図６】
2017538433.tif 000014
【図７】
2017538433.tif 000015
【図８Ａ】
2017538433.tif 000016
【図８Ｂ】
2017538433.tif 000017
【図９Ａ】
2017538433.tif 000018
【図９Ｂ】
2017538433.tif 000019
【図１０Ａ】
2017538433.tif 000020
【図１０Ｂ】
2017538433.tif 000021
【配列表】
2017538433000001.app
【国際調査報告】
2017538433.tif 000022
2017538433.tif 000023
2017538433.tif 000024
2017538433.tif 000025
2017538433.tif 000026