(57)【要約】共通構造フォールドを有するアミノ酸配列のライブラリを構築する方法、ならびにそのライブラリを用いて分子的存在物の対象分子表面に対する所望の親和性を有するアミノ酸配列を設計および選択する方法を本明細書において提供する。その方法は、共通構造フォールドを有する実験的に利用可能なタンパク質構造に認められる主鎖立体配座およびアミノ酸保存性パターンの確率論的標本抽出に基づく。【選択図】図２
2017526053.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
共通構造フォールドを有するアミノ酸配列のライブラリをコンピュータ計算により構築する方法であって：
（ｉ）前記共通構造フォールドを有する複数のソース構造を提供することを含み、前記共通構造フォールドが、構造フレームワークおよび多様構造領域を定義する保存構造領域を有するものであり、前記構造フレームワークが、構造保存性の最も高い場所を有するものであり；
（ｉｉ）前記複数のソース構造の構造を構造相同セグメントへとセグメント化することを含み、構造相同セグメントの群を複数個得るべく前記構造相同セグメントの各々が、前記構造保存性の最も高い場所のうちの２つの場所によって定義されるものであり、前記群の各々が、前記構造保存性の最も高い場所のうちの２つの場所によって定義されるものであり；
（ｉｉｉ）前記共通構造フレームワークを有しかつ前記場所に対応する特定位置を有する鋳型構造を選択することを含み；
前記群の各々について：
（ｉｖ）分割セグメントを得るべく、前記構造相同セグメントのうちの少なくとも１つの構造相同セグメントを前記構造相同セグメント内の部位において分割することを含み；
（ｖ）前記分割セグメントの各位置を、前記場所に対応する前記特定位置の対応する位置に重ね合わせ、前記鋳型構造における対応するセグメントを変位させることを含み；
（ｖｉ）前記鋳型構造において重み調整再閉鎖セグメントを得るべく、前記分割セグメントをセグメント閉鎖のために重み調整することを含み；
（ｖｉｉ）場合によって、別の部位で分割しながらステップ（ｉｖ）〜（ｖｉ）を繰り返すこと、または前記構造相同セグメントのさらなる操作を中止することを含み；
（ｖｉｉｉ）前記群の各々に対応する追加の少なくとも１つの重み調整再閉鎖セグメントを得るべく、追加の少なくとも１つの構造相同セグメントについてステップ（ｉｖ）〜（ｖｉｉ）を繰り返すことを含み；
（ｉｘ）複数の再構築構造を再構築するために、前記群の各々に対応する複数の前記重み調整再閉鎖セグメントを組み合わせ的に用いることを含み、前記再構築構造の各々が、前記構造フレームワークを定義する前記保存構造領域と、前記多様構造領域と、前記構造保存性の最も高い場所に対応する位置とを有する前記共通構造フォールドを有するものであり；
それにより、前記共通構造フォールドを有するアミノ酸配列の前記ライブラリをコンピュータ計算により構築する、方法。
【請求項２】
前記複数のソース構造において末端セグメントを定義することをさらに含み、前記末端セグメントを定義すべく前記末端セグメントの各々が、前記構造保存性の最も高い場所のうちの少なくとも１つの場所と前記共通構造フォールドの末端場所とによって定義されるものであり；
前記末端セグメントのうちの少なくとも１つをステップ（ｖ）における分割セグメントとして見なすことをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記部位が多様構造領域にある、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記部位がランダムに選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｉｘ）の前に、前記群の各々に対応する前記重み調整再閉鎖セグメントの各々を少なくとも１つの構造クラスタに分類すること、および前記構造クラスタのために代表の重み調整再閉鎖セグメントを選択し、それによりステップ（ｉｘ）の前記重み調整再閉鎖セグメントの各々を前記代表の重み調整再閉鎖セグメントとすることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記分類が、セグメント長さに基づいて行われる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記分類がさらに、アラインメントされたポリペプチドの主鎖位置の平均二乗偏差に基づいて行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
分子的存在物の対象分子表面に対する所望の親和性を有するアミノ酸配列を設計および選択する方法であって、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法に従って共通構造フォールドを有するアミノ酸配列のライブラリをコンピュータ計算により構築することを含み、さらに：
（ｘ）マッチングスコアを各々が有している複数の再構築構造−分子表面複合体を設計すべく、前記再構築構造のうちの少なくとも１つを前記対象分子表面上にマッチングさせること、および場合によって前記複合体における前記再構築構造についてステップ（ｘ）を繰り返すことを含み；
（ｘｉ）場合によって、マッチングスコアを有する被置換再構築構造−分子表面複合体を設計すべく、少なくとも１つの前記複合体の前記再構築構造における前記重み調整再閉鎖セグメントのうちの少なくとも１つを、対応する別の重み調整再閉鎖セグメントで置換すること、およびステップ（ｘ）を繰り返すことを含み；
（ｘｉｉ）前記マッチングスコアに基づいて、前記分子的存在物の前記対象分子表面に対する前記所望の親和性を有する前記アミノ酸配列を選択することを含む、方法。
【請求項９】
対象分子表面に対する所望の親和性を有するアミノ酸配列を作製する方法であって、
請求項８に記載の方法に従って前記対象分子表面に対する前記所望の親和性を有するアミノ酸配列を設計および選択することと；
前記アミノ酸配列を発現系において発現させることとを含み；
それにより、前記対象分子表面に対する前記所望の親和性を有する前記アミノ酸配列を作製する、方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法によって作製された、対象分子表面に対する所望の親和性を有するアミノ酸配列。
【請求項１１】
前記位置が、ポリペプチド主鎖位置上にある位置である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリペプチド主鎖位置が、原子、および予め定義された原子間位置から構成される群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記原子が、アルファ炭素、主鎖カルボニル炭素、主鎖カルボニル酸素および主鎖窒素から構成される群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記重み調整が、主鎖二面角の調節、アミノ酸側鎖パッキング、およびアミノ酸の変更から構成される群から選択される少なくとも１つの操作を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記分割セグメントの前記主鎖二面角の調節が、前記分割セグメントに対応する前記構造相同セグメントの少なくとも１つの二面角によって制約される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記アミノ酸の変更が、前記分割セグメントのアミノ酸、および前記分割セグメントを取り囲む外殻の内部に少なくとも部分的に存在する前記鋳型構造におけるアミノ酸に対してもたらされる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記アミノ酸の変更が規則によって規定される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記規則が位置特異的スコア行列を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記マッチングが、剛体配向、主鎖二面角の調節、アミノ酸側鎖パッキング、およびアミノ酸の変更から構成される群から選択される少なくとも１つの操作を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項２０】
前記剛体配向が、簡約表現ドッキング操作および／または完全表現ドッキング操作によって引き起こされる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記アミノ酸の変更が、前記対応する別の重み調整再閉鎖セグメントのアミノ酸、および前記対応する別の重み調整再閉鎖セグメントを取り囲む外殻の内部に少なくとも部分的に存在する前記鋳型構造におけるアミノ酸に対してもたらされる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記アミノ酸の変更が規則によって規定される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記規則が位置特異的スコア行列を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記マッチングスコアが、結合エネルギー、埋没面積、形状相補性およびそれらのあらゆる組み合わせから構成される群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項２５】
フォールド安定性スコアリングをさらに含み、ステップ（ｘｉｉ）における前記選択が前記フォールド安定性スコアリングに基づくものである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記共通構造フォールドが抗体のものである、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法およびアミノ酸配列。
【請求項２７】
前記共通構造フォールドが、アンキリンリピート、アルマジロリピート、ベータグラスプ、ベータトレフォイル、ギリシャキー、ゼリーロール、キーロール、プレイト（Ｐｌａｉｔ）、ロスマンフォールド、テトラトリコペプチドリピートおよびＴＩＭバレルから構成される群から選択される、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法およびアミノ酸配列。
【請求項２８】
アミノ酸配列を有する標的タンパク質の構造を予測する方法であって：
（ｉ）共通構造フォールド、および長さが前記標的タンパク質と同一であるアミノ酸配列を有する、複数のソース構造を提供することを含み、前記共通構造フォールドが、構造フレームワークおよび多様構造領域を定義する保存構造領域を有するものであり、前記構造フレームワークが、構造保存性の最も高い場所を有するものであり；
（ｉｉ）各々の前記複数のソース構造の前記アミノ酸配列を前記標的タンパク質の前記アミノ酸配列で置き換え、前記複数のソース構造の構造を構造相同セグメントへとセグメント化することを含み、構造相同セグメントの群を複数個得るべく前記構造相同セグメントの各々が、前記構造保存性の最も高い場所のうちの２つの場所によって定義されるものであり、前記群の各々が、前記構造保存性の最も高い場所のうちの２つの場所によって定義されるものであり；
（ｉｉｉ）前記共通構造フレームワークを有しかつ前記場所に対応する特定位置を有する鋳型構造を選択することを含み；
前記群の各々について：
（ｉｖ）分割セグメントを得るべく、前記構造相同セグメントのうちの少なくとも１つの構造相同セグメントを前記構造相同セグメント内の部位において分割することを含み；
（ｖ）前記分割セグメントの各位置を、前記場所に対応する前記特定位置の対応する位置に重ね合わせ、前記鋳型構造における対応するセグメントを変位させることを含み；
（ｖｉ）前記標的タンパク質の前記アミノ酸配列を維持しながら、前記鋳型構造において重み調整再閉鎖セグメントを得るべく、前記分割セグメントをセグメント閉鎖のために重み調整することを含み；
（ｖｉｉ）場合によって、別の部位で分割しながらステップ（ｉｖ）〜（ｖｉ）を繰り返すこと、または前記構造相同セグメントのさらなる操作を中止することを含み；
（ｖｉｉｉ）前記群の各々に対応する追加の少なくとも１つの重み調整再閉鎖セグメントを得るべく、追加の少なくとも１つの構造相同セグメントについてステップ（ｉｖ）〜（ｖｉｉ）を繰り返すことを含み；
（ｉｘ）複数の再構築構造を再構築するために、前記群の各々に対応する複数の前記重み調整再閉鎖セグメントを組み合わせ的に用いることを含み、前記再構築構造の各々が、前記構造フレームワークを定義する前記保存構造領域と、前記多様構造領域と、前記構造保存性の最も高い場所に対応する位置とを有する前記共通構造フォールドを有するものであり；
（ｘ）各々の前記再構築構造についてエネルギースコアを計算することを含み、
前記標的タンパク質の構造が低エネルギースコアを有するものである、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、計算化学、およびコンピュータ計算によるタンパク質設計に関し、より具体的には、限定はしないが、共通構造フォールドを有するアミノ酸配列のライブラリをコンピュータ計算により構築する方法；ならびに分子的存在物の対象分子表面に対する所望の親和性を有するアミノ酸配列を設計および選択する方法に関する。これらの方法は、例えば、構造安定性と所定の分子標的に対する高い結合親和性とを有する結合タンパク質を設計するために用いることができる。さらに本発明は、そのいくつかの実施形態において、計算化学に関し、より具体的には、限定はしないが、対象分子表面に対する所望の親和性を有するアミノ酸配列を作製する方法および、対象分子表面に対する所望の親和性を有するアミノ酸配列に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子認識は多くの中心的な生物学的プロセスの基礎をなし、それゆえ、新規タンパク質相互作用を設計する能力は、化学工業ならびに治療、診断および研究用プローブにおいて使用するための極めて特異的かつ有力な分子を創出するために大いに有望である。タンパク質結合剤設計における近年の方策は、結合に必要な構造的特徴を獲得するために、結合表面を設計する足場として天然起源のタンパク質を用いると同時に単一タンパク質の足場かまたは数百個の異なる足場に依拠してきた。いずれの事例においても、設計された足場は、主鎖自由度の摂動が最小限に抑えられた剛直な構造要素として扱われた。これらの方策のいくつかは、実験的に検証済のホモオリゴマー、阻害剤およびタンパク質親和性精製用試薬の設計をもたらした。
【０００３】
例えば天然起源のおおよそ２２０個のアミノ酸の配列（抗体Ｆｖドメインと概ね等価）を有するｄｅ  ｎｏｖｏタンパク質を設計する場合のコンピュータ計算は、１つのタンパク質のアミノ酸配列を定義するのに２０220＝１０286通りの特有のアミノ酸の並べ替えを必要とするであろう；現在の巧妙な計算機は未だそれを処理できるように実装されていない。現在のコンピュータ計算による設計の技法は、天然起源の剛直な足場を用いてｄｅ  ｎｏｖｏ分子関数を設計しているが、しかし根本的にこれらの手法は、既知の三次元構造を有する適した足場の数によって制限される。しかも、上記方策により成功裏に設計された結合表面にはいくつかの全般的な欠点がある：
１．それらは、二次構造（αヘリックスおよびβシート）を豊富に含有する表面を含む；
２．標的との相互作用の大部分には疎水性アミノ酸側鎖が介在している；
３．結合時の埋没面積は、天然に生じるタンパク質−タンパク質相互作用の場合での平均値（１６００Å2と推定される）以下である。コンピュータ計算による結合剤設計を一般的なものとするために不可欠である広い極性表面の設計は、未対処の課題として残っている。
【０００４】
多くのタンパク質において同定されているいくつかの共通タンパク質フォールドは、そのうちのいくつかが系図、生物および機能に関して互いに無関係であるらしく、保存ドメインフォールドとしても知られているのだが、たとえ共通フォールドを共有するものの無関係な機能を呈するタンパク質についてのいくつかの観察結果が未だに現代科学に異論を唱えるとしても、それは配列−構造−機能の関係性の根本を研究する独特の機会を提供する。それでもなお、いつくかの研究では、コンピュータ計算によるタンパク質設計を支援するために共通構造フォールドを利用することが試みられてきた。
【０００５】
最も興味をそそる保存タンパク質フォールドの１つは、ＴＩＭバレルすなわちα／βタンパク質フォールドとして知られている。このフォールドは多くのタンパク質および多くの生物によって共有されているが、このフォールドについての観察結果は、系統の異なる種において類似する特性に関係した収束的な進化論の発展に役立ってきた。同様に、ＴＩＭバレルはｄｅ  ｎｏｖｏタンパク質設計に適する足場として検討されてきた。
【０００６】
Ｏｆｆｒｅｄｉ，Ｆ．ら［Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．、２００３、３２５（１）、ｐ．１６３−７４］は、ＴＩＭバレルフォールドタンパク質の結晶構造からの構造データを用いて４回対称性を有する「理想的な」フォールドの形状規則を定義し、主鎖形状の定義に従って配列検索を試みて、立体配座を安定化させるであろう配列を見出した。
【０００７】
Ｆｉｇｕｅｒｏａ，Ｍ．ら［ＰＬｏｓ  Ｏｎｅ、２０１３、８（８）、ｐ．ｅ７１８５８］は、「オクタレリンＶ（Ｏｃｔａｒｅｌｌｉｎ  Ｖ）」として知られるモデルを出発主鎖モデルとして用いて、Ｒｏｓｅｔｔａソフトウェア一式を使用してＴＩＭバレルタンパク質を設計し、選抜された二次構造パターンを呈しているＰＤＢタンパク質の６残基断片から、Ｒｏｓｅｔｔａループ組立プロトコルを用いてループ領域を構築した。最終的な構造は、βストランド間での水素結合、βストランド−αヘリックス境界面におけるパッキング、およびＲｏｓｅｔｔａ全原子エネルギー関数に基づいて評価された。
【０００８】
タンパク質結合相互作用、構造予測および分子設計に関連して最もよく研究されているタンパク質のファミリーの１つは、抗体のファミリーである。抗体は、軽鎖および重鎖と呼ばれる２種類のポリペプチドを含む。軽鎖および重鎖は、類似構造を有する別個のドメインからなり、軽鎖はそのようなドメインを２つ含み、重鎖はそのようなドメインを４つ含む。各ドメインは、逆平行βストランドからなる２つのβシートを特徴とする「サンドイッチ」を含み、当該２つのβシートはジスルフィド結合により連結されている。重鎖および軽鎖の各々のＮ末端の端部にあるドメインはアミノ酸配列が可変である。これらの「可変ドメイン」は様々な抗体の広範な多様性を提供する。その他のドメインは軽重鎖の「定常領域」を構成する。
【０００９】
抗体の抗原結合領域は、１つの重鎖可変ドメインと組み合わさった１つの軽鎖可変ドメインで形成されている。可変ドメインにおいて、アミノ酸配列の可変性は、比較的保存されている「フレームワーク領域」で隔てられた３つの「相補性決定領域（ＣＤＲ）」（「超可変領域」としても知られ、個別にはＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と呼ばれる）によって主に制限される。したがって、抗原結合領域は、３つの軽鎖ＣＤＲ（Ｌ１、Ｌ２およびＬ３と呼ばれる）と、３つの重鎖ＣＤＲ（Ｈ１、Ｈ２およびＨ３と呼ばれる）とを含有する。各ドメイン内の３つのＣＤＲは抗体の標的結合表面に密集しており、各ＣＤＲは、２つのβストランドを連結するループに関係している。保存フレームワーク領域は、構造的な相同性を特徴とする剛直な構造を形成しているが、それは抗体に安定性を与え、ＣＤＲの立体配座の剛直性に影響を与えている。
【００１０】
ＣＤＲの可変性の大部分はＶ（Ｄ）Ｊ（可変、多様性および連結の遺伝子セグメント）組替えの結果であり、Ｖ（Ｄ）Ｊ組替えにおいて免疫細胞ゲノムは、約４４個のＶ遺伝子セグメントのうちの１つを６つのＪ遺伝子セグメントのうちの１つとランダムに組み合わせるような組替えを受ける。さらに、重鎖遺伝子において、２７個のＤ遺伝子セグメントのうちの１つが、選択されたＶとＪの遺伝子セグメントの間に配置される。Ｖ遺伝子セグメントは最も大きく、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２、ならびにＣＤＲ３の一部分をコード化しているが、他方、Ｄ遺伝子断片およびＪ遺伝子断片はＣＤＲ３の一部分（Ｊ遺伝子断片の場合はＬ３またはＨ３、Ｄ断片の場合はＨ３）をコード化している。Ｖ（Ｄ）Ｊ組替えは、多種多様な軽鎖および重鎖の配列を可能にする。様々な軽重鎖の組み合わせならびに、軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子におけるヌクレオチドの追加および／もしくは削除または他の突然変異を生じるプロセスによって、さらなる可変性がもたらされる。
【００１１】
膨大な多様性にも拘らず、（Ｈ３  ＣＤＲは例外として）ＣＤＲは、多くの別個の「カノニカル立体配座」と呼ばれる立体配座に該当する。例えば、何百個もの抗体分子構造には、Ｌ２  ＣＤＲについてたった７つの立体配座変異体しか認められない。カノニカル立体配座は、主鎖立体配座を維持する重要な保存残基同一性によって特徴付けられる。
【００１２】
機能する主鎖断片の設計における重要な課題は、設計された表面が機能する（その標的に結合する）のみならず立体配座の安定性を有する必要がある、ということである。上記のとおり、抗体は保存性の高いセグメントと可変性の高いセグメントとが交互になった配列ブロックで構築されており、抗体の分子構造から、保存セグメントは抗体に所要の安定性を与えるフレームワークとして知られた構造的に相同な剛直構造に属する一方、可変セグメントは標的結合表面に密集している、ということが示され、それゆえに可変セグメントは相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれた。
【００１３】
抗体工学の重要な魅力は、組み合わせ的に大いに複雑である良好に折り畳まれた主鎖を選定できることを示唆する、抗体のモジュール式構成様式にある。早くも１９８０年代において抗体の構造モジュール性についての観察結果から、天然起源の抗体の断片を組み合わせることによって合成抗体を構築できるであろうと提唱された。この洞察を元に、研究者らは、マウス抗体由来のＣＤＲをヒト抗体フレームワーク上に移植してヒト化機能性抗体を生み出す抗体ヒト化の方法を考案し、安全な治療用抗体工学への道を開いた。これらの初期の進歩は、抗体を第一原理から完全に設計することは達成可能であるというセンセーションを起こしたが、最近までタンパク質設計用のコンピュータ計算ツールはこの目標を実現するほど十分に成熟していなかった。
【００１４】
コンピュータ計算による抗体設計における近年の研究は、結合親和性の向上［Ｃｌａｒｋ，ＬＡ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．、２００６、１５（５）、ｐ．９４９−６０；Ｌｉｐｐｏｗ，ＳＭ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００７、２５（１０）、ｐ．１１７１−６；Ｃｌａｒｋ，ＬＡ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ．、２００９、２２（２）、ｐ．９３−１０１］、実験的なランダム変異誘発に好ましい位置の同定［Ｂａｒｄｅｒａｓ，Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００８、１０５（２６）、ｐ．９０２９−３４］、結合特異性の改変［Ｆａｒａｄｙ，Ｃ．Ｊ．ら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、２００９、１９（１４）、ｐ．３７４４−７］、および耐熱性の向上［Ｍｉｋｌｏｓ，Ａ．Ｅ．ら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、２０１２、１９（４）、ｐ．４４９−５５］を目指すものであった。
【００１５】
抗体ＣＤＲがカノニカル立体配座を呈するという観察結果を活用するｄｅ  ｎｏｖｏ抗体設計方策がＰａｎｔａｚｅｓらによって提案された。
【００１６】
ＰａｎｔａｚｅｓおよびＭａｒａｎａｓ［Ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．、２０１０、２３、８４９−８５８］は、選択した抗原に好適に結合する可能性が最も高いのはカノニカル構造のいずれの組み合わせであるかをまず決定した後、ＣＤＲ主鎖の改良と各位置に最適なアミノ酸の選択とを同時に行うことによって抗体の結合部分を設計する、一般的なコンピュータ計算方法（「ＯｐｔＣＤＲ」）を記載している。
【００１７】
また、ＰａｎｔａｚｅｓおよびＭａｒａｎａｓ［ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｍａｔｉｃｓ  ２０１３、１４：１６８］は、実験的に決定された抗体構造を用いて９２９個のモジュール式部分抗体（ＭＡＰ）（それは組み合わされて２．３・１０10個の特有の抗体を作り出すことができる）のデータベースを蓄積することにより抗体構造を予測する方法を記載している。ＭＡＰＳはＶ、ＤおよびＪの遺伝子断片に類似していると記載されている。
【００１８】
Ｗｅｉｔｚｎｅｒ  Ｂ．Ｄ．ら［Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、ｅｐｕｂ．２０１４年２月１２日］は、鎖特異的フレームワーク上に個々の抗体ＣＤＲを移植することによって初期モデルが構築されることを示しており、Ｈ３は、Ｒｏｓｅｔｔａドッキングアルゴリズムを使用して剛体配向を標本抽出しながらｄｅ  ｎｏｖｏによりモデリングされている。
【００１９】
Ｓｈｉｒａｉ  Ｈ．ら［Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、ｅｐｕｂ．２０１４年４月２２日］は、Ｈ３を含めて全てのカノニカルループの立体配座のデータベースの構築を位置特異的スコア行列（ＰＳＳＭ）に関連付けて、Ｈ３サブタイプに基づいて抗体Ｆｖドメインのフレームワーク鋳型を同定し、そのＰＳＳＭスコアに基づいて所与の配列に最もふさわしいクラスタを選択し、続いて鋳型モデルに対する調和主鎖制約が最小限に抑えられたモデルを構築することを教示している。
【００２０】
しかし、たとえ遺伝子レベルでの並べ替えによって生成され得る全ての立体配座組み合わせ空間を理論的に包含できるとともに効果的かつ体系的に標本抽出できる方法があったとしても、そのような方法は天然起源の抗体に認められる無数のランダム変異を説明することができないであろう。
【００２１】
さらなる背景技術としては、米国特許出願第２００３００５９８２７号、第２０１１０２２４１００号、第２０１３０２４４９４０号、第２０１３０２９６２２１号および第２０１４０００５１２５号、Ｓｍａｄｂｅｃｋ，Ｊ．、Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｂ．、Ｋｈｏｕｒｙ，Ｇ．Ａ．、Ｔａｙｌｏｒ，Ｍ．Ｓ．、Ｆｌｏｕｄａｓ，Ｃ．Ａ．「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＷＩＳＤＯＭ：Ａ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ  ｆｏｒ  Ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ  Ｄｅ  ｎｏｖｏ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ＢｉｏＭｏｌｅｃｕｌｅｓ」、Ｊ．Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．、（７７）、ｅ５０４７６、ならびにＫｈｏｕｒｙ，Ｇ．Ａ．、Ｓｍａｄｂｅｃｋ，Ｊ．、Ｋｉｅｓｌｉｃｈ，Ｃ．Ａ．およびＦｌｏｕｄａｓ，Ｃ．Ａ．らによる総説「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｅ  ｎｏｖｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｓｉｇｎ  ｆｏｒ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０１４、３２（２）、ｐ．９９−１０９（それは参照によってその全体が本明細書において完全に示されているかのように組み込まれる）が挙げられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２２】
【特許文献１】米国特許出願第２００３／００５９８２７号明細書
【特許文献２】米国特許出願第２０１１／０２２４１００号明細書
【特許文献３】米国特許出願第２０１３／０２４４９４０号明細書
【特許文献４】米国特許出願第２０１３／０２９６２２１号明細書
【特許文献５】米国特許出願第２０１４／０００５１２５号明細書
【非特許文献】
【００２３】
【非特許文献１】Ｏｆｆｒｅｄｉ，Ｆ．ら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．、２００３、３２５（１）、ｐ．１６３−７４
【非特許文献２】Ｆｉｇｕｅｒｏａ，Ｍ．ら、ＰＬｏｓ  Ｏｎｅ、２０１３、８（８）、ｐ．ｅ７１８５８
【非特許文献３】Ｃｌａｒｋ，ＬＡ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．、２００６、１５（５）、ｐ．９４９−６０
【非特許文献４】Ｌｉｐｐｏｗ，ＳＭ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００７、２５（１０）、ｐ．１１７１−６
【非特許文献５】Ｃｌａｒｋ，ＬＡ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ．、２００９、２２（２）、ｐ．９３−１０１
【非特許文献６】Ｂａｒｄｅｒａｓ，Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００８、１０５（２６）、ｐ．９０２９−３４
【非特許文献７】Ｆａｒａｄｙ，Ｃ．Ｊ．ら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、２００９、１９（１４）、ｐ．３７４４−７
【非特許文献８】Ｍｉｋｌｏｓ，Ａ．Ｅ．ら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、２０１２、１９（４）、ｐ．４４９−５５
【非特許文献９】ＰａｎｔａｚｅｓおよびＭａｒａｎａｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．、２０１０、２３、８４９−８５８
【非特許文献１０】ＰａｎｔａｚｅｓおよびＭａｒａｎａｓ、ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｍａｔｉｃｓ  ２０１３、１４：１６８
【非特許文献１１】Ｗｅｉｔｚｎｅｒ  Ｂ．Ｄ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、ｅｐｕｂ．２０１４年２月１２日
【非特許文献１２】Ｓｈｉｒａｉ  Ｈ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、ｅｐｕｂ．２０１４年４月２２日
【非特許文献１３】Ｓｍａｄｂｅｃｋ，Ｊ．、Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｂ．、Ｋｈｏｕｒｙ，Ｇ．Ａ．、Ｔａｙｌｏｒ，Ｍ．Ｓ．、Ｆｌｏｕｄａｓ，Ｃ．Ａ．「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＷＩＳＤＯＭ：Ａ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ  ｆｏｒ  Ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ  Ｄｅ  ｎｏｖｏ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ＢｉｏＭｏｌｅｃｕｌｅｓ」、Ｊ．Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．、（７７）、ｅ５０４７６
【非特許文献１４】Ｋｈｏｕｒｙ，Ｇ．Ａ．、Ｓｍａｄｂｅｃｋ，Ｊ．、Ｋｉｅｓｌｉｃｈ，Ｃ．Ａ．およびＦｌｏｕｄａｓ，Ｃ．Ａ．ら、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｅ  ｎｏｖｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｓｉｇｎ  ｆｏｒ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０１４、３２（２）、ｐ．９９−１０９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、共通構造フォールドを有するアミノ酸配列のライブラリをコンピュータ計算により構築する方法であって：
（ｉ）共通構造フォールドを有する１つ以上のソース構造を提供するステップを含み、その一方で、共通構造フォールドが、構造フレームワークおよび多様構造領域を定義する保存構造領域を有するものであり、構造フレームワークが、構造保存性の最も高い場所を有するものであり；
（ｉｉ）ソース構造の全てまたはいくつかを構造相同セグメントへとセグメント化するステップを含み、構造相同セグメントの群を複数個得るべく当該構造相同セグメントの各々が、当該構造保存性の最も高い場所のうちの２つの場所によって定義されるものであり、当該群の各々が、当該２つの構造保存性の最も高い場所によって定義されるものであり；
（ｉｉｉ）共通構造フレームワークを有しかつ当該構造保存性の最も高い場所に対応する特定位置を有する鋳型構造を選択するステップを含み；
当該セグメント群の各々について：
（ｉｖ）分割セグメントを得るべく、当該構造相同セグメントのうちの少なくとも１つの構造相同セグメントを構造相同セグメント内の部位において分割するステップを含み；
（ｖ）分割セグメントの各位置を、当該場所に対応する当該特定位置の対応する位置に重ね合わせ、鋳型構造における対応するセグメントを変位させるステップを含み；
（ｖｉ）鋳型構造において重み調整再閉鎖セグメントを得るべく、分割セグメントをセグメント閉鎖のために重み調整するステップを含み；
（ｖｉｉ）場合によって、別の部位で分割しながらステップ（ｉｖ）〜（ｖｉ）を繰り返すステップ、または当該構造相同セグメントのさらなる操作を中止するステップを含み；
（ｖｉｉｉ）当該群の各々に対応する追加の少なくとも１つの重み調整再閉鎖セグメントを得るべく、追加の少なくとも１つの構造相同セグメントについてステップ（ｉｖ）〜（ｖｉｉ）を繰り返すステップを含み；
（ｉｘ）複数の再構築構造を再構築するために、当該群の各々に対応する複数の重み調整再閉鎖セグメントを組み合わせ的に用いるステップを含み、再構築構造の各々が、当該構造フレームワークを定義する当該保存構造領域と、当該多様構造領域と、当該構造保存性の最も高い場所に対応する位置とを有する当該共通構造フォールドを有するものであり；
それにより、共通構造フォールドを有するアミノ酸配列のライブラリをコンピュータ計算により構築する、方法が提供される。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、場合によって、複数のソース構造において末端セグメントを定義することをさらに含み、末端セグメントを定義すべく当該末端セグメントの各々が、構造保存性の最も高い場所のうちの少なくとも１つの場所と共通構造フォールドの末端場所とによって定義されるものであり；当該末端セグメントのうちの少なくとも１つをステップ（ｖ）における分割セグメントとして見なすことをさらに含む。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、分割部位は多様構造領域にある。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、分割部位はランダムに選択される。
【００２８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、方法はさらに、ステップ（ｉｘ）の前に、群の各々に対応する重み調整再閉鎖セグメントの各々を少なくとも１つの構造クラスタに分類することおよび、当該構造クラスタのために代表の重み調整再閉鎖セグメントを選択し、それによりステップ（ｉｘ）の重み調整再閉鎖セグメントの各々を当該代表の重み調整再閉鎖セグメントとすることを含む。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、分類は、セグメント長さに基づいて行われる。
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、分類はさらに、アラインメントされたポリペプチドの主鎖位置の平均二乗偏差に基づいて行われる。
【００３１】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、分子的存在物の対象分子表面に対する所望の親和性を有するアミノ酸配列を設計および選択する方法であって、本明細書において示される方法に従って共通構造フォールドを有するアミノ酸配列のライブラリをコンピュータ計算により構築することを含み、さらに：
（ｘ）マッチングスコアを各々が有している複数の再構築構造−分子表面複合体を設計すべく再構築構造のうちの少なくとも１つを対象分子表面上にマッチングさせること、および場合によって当該複合体における再構築構造についてステップ（ｘ）を繰り返すことを含み；
（ｘｉ）マッチングスコアを有する被置換再構築構造−分子表面複合体を設計すべく、少なくとも１つの複合体の再構築構造における重み調整再閉鎖セグメントのうちの少なくとも１つを対応する別の重み調整再閉鎖セグメントで置換すること、およびステップ（ｘ）を繰り返すことを、場合によって含み；
（ｘｉｉ）マッチングスコアに基づいて、分子的存在物の対象分子表面に対する所望の親和性を有するアミノ酸配列を選択することを含む、方法が提供される。
【００３２】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、対象分子表面に対する所望の親和性を有するアミノ酸配列を作製する方法であって：
本明細書において示される方法のいずれか１つの実施形態に従って対象分子表面に対する所望の親和性を有するアミノ酸配列を設計および選択すること；および
当該アミノ酸配列を発現系において発現させることを含み、
それにより、対象分子表面に対する所望の親和性を有するアミノ酸配列を作製する、方法が提供される。
【００３３】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、本明細書において示される方法のいずれか１つの実施形態に従って作製された、対象分子表面に対する所望の親和性を有するアミノ酸配列が提供される。
【００３４】
本発明のあらゆる実施形態および態様のいくつかの実施形態によれば、本明細書において示されるいずれかの方法において使用される位置は、ポリペプチド主鎖位置上にある位置である。
【００３５】
本発明のあらゆる実施形態および態様のいくつかの実施形態によれば、ポリペプチド主鎖位置は、原子、および予め定義された原子間位置から構成される群から選択される。
【００３６】
本発明のあらゆる実施形態および態様のいくつかの実施形態によれば、原子は、アルファ炭素、主鎖カルボニル炭素、主鎖カルボニル酸素および主鎖窒素から構成される群から選択される。
【００３７】
本発明のあらゆる実施形態および態様のいくつかの実施形態によれば、重み調整は、主鎖二面角の調節、アミノ酸側鎖パッキング、およびアミノ酸の変更から構成される群から選択される少なくとも１つの操作を含む。
【００３８】
本発明のあらゆる実施形態および態様のいくつかの実施形態によれば、分割セグメントの主鎖二面角の調節は、分割セグメントに対応する構造相同セグメントの少なくとも１つの二面角によって制約される。
【００３９】
本発明のあらゆる実施形態および態様のいくつかの実施形態によれば、アミノ酸の変更は、分割セグメントのアミノ酸、および分割セグメントを取り囲む外殻の内部に少なくとも部分的に存在する鋳型構造におけるアミノ酸に対してもたらされる。
【００４０】
本発明のあらゆる実施形態および態様のいくつかの実施形態によれば、アミノ酸の変更は規則によって規定される。
【００４１】
本発明のあらゆる実施形態および態様のいくつかの実施形態によれば、規則は位置特異的スコア行列を含む。
【００４２】
本発明のあらゆる実施形態および態様のいくつかの実施形態によれば、マッチング手順は、剛体配向、主鎖二面角の調節、アミノ酸側鎖パッキング、およびアミノ酸の変更から構成される群から選択される少なくとも１つの操作を含む。
【００４３】
本発明のあらゆる実施形態および態様のいくつかの実施形態によれば、剛体配向は、簡約表現ドッキング操作および／または完全表現ドッキング操作によって引き起こされる。
【００４４】
本発明のあらゆる実施形態および態様のいくつかの実施形態によれば、アミノ酸の変更は、対応する別の重み調整再閉鎖セグメントのアミノ酸、および対応する別の重み調整再閉鎖セグメントを取り囲む外殻の内部に少なくとも部分的に存在する鋳型構造におけるアミノ酸に対してもたらされる。
【００４５】
本発明のあらゆる実施形態および態様のいくつかの実施形態によれば、マッチングスコアは、結合エネルギー、埋没面積、形状相補性およびそれらのあらゆる組み合わせから構成される群から選択される。
【００４６】
本発明のあらゆる実施形態および態様のいくつかの実施形態によれば、方法は、フォールド安定性スコアリングをさらに含み、ステップ（ｘｉｉ）における選択がフォールド安定性スコアリングにも基づくものである。
【００４７】
本発明のあらゆる実施形態および態様のいくつかの実施形態によれば、共通構造フォールドは抗体のものである。
【００４８】
本発明のあらゆる実施形態および態様のいくつかの実施形態によれば、共通構造フォールドは、免疫グロブリンまたはその一部、アンキリンリピート、アルマジロリピート、ベータグラスプ、ベータトレフォイル、ギリシャキー、ゼリーロール、キーロール、プレイト（Ｐｌａｉｔ）、ロスマンフォールド、テトラトリコペプチドリピートおよびＴＩＭバレルから構成される群から選択される。
【００４９】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、アミノ酸配列を有する標的タンパク質の構造を予測する方法であって：
（ｉ）共通構造フォールドおよび、長さが標的タンパク質と同一であるアミノ酸配列を有する、複数のソース構造を提供することを含み、共通構造フォールドが、構造フレームワークおよび多様構造領域を定義する保存構造領域を有するものであり、構造フレームワークが、構造保存性の最も高い場所を有するものであり；
（ｉｉ）各々の当該複数のソース構造の当該アミノ酸配列を標的タンパク質のアミノ酸配列で置き換え、複数のソース構造の構造を構造相同セグメントへとセグメント化することを含み、構造相同セグメントの群を複数個得るべく当該構造相同セグメントの各々が、当該構造保存性の最も高い場所のうちの２つの場所によって定義されるものであり、当該群の各々が、当該構造保存性の最も高い場所のうちの２つの場所によって定義されるものであり；
（ｉｉｉ）共通構造フレームワークを有しかつ当該場所に対応する特定位置を有する鋳型構造を選択することを含み；
当該群の各々について：
（ｉｖ）分割セグメントを得るべく、当該構造相同セグメントのうちの少なくとも１つの構造相同セグメントを構造相同セグメント内の部位において分割することを含み；
（ｖ）分割セグメントの各位置を、当該場所に対応する当該特定位置の対応する位置に重ね合わせ、鋳型構造における対応するセグメントを変位させることを含み；
（ｖｉ）標的タンパク質のアミノ酸配列を維持しながら、鋳型構造において重み調整再閉鎖セグメントを得るべく、分割セグメントをセグメント閉鎖のために重み調整することを含み；
（ｖｉｉ）場合によって、別の部位で分割しながらステップ（ｉｖ）〜（ｖｉ）を繰り返すこと、または当該構造相同セグメントのさらなる操作を中止することを含み；
（ｖｉｉｉ）当該群の各々に対応する追加の少なくとも１つの重み調整再閉鎖セグメントを得るべく、追加の少なくとも１つの構造相同セグメントについてステップ（ｉｖ）〜（ｖｉｉ）を繰り返すことを含み；
（ｉｘ）複数の再構築構造を再構築するために、当該群の各々に対応する複数の当該重み調整再閉鎖セグメントを組み合わせ的に用いることを含み、再構築構造の各々が、当該構造フレームワークを定義する当該保存構造領域と、当該多様構造領域と、当該構造保存性の最も高い場所に対応する位置とを有する当該共通構造フォールドを有するものであり；
（ｘ）各々の再構築構造についてエネルギースコアを計算することを含み、
標的タンパク質の構造が低エネルギースコアを有するものである、方法が提供される。
【００５０】
特に指定のない限り、本明細書において使用される全ての技術的および／または科学的用語は、本発明の関連する技術分野における当業者によって普通に理解され得るのと同じ意味を有する。本明細書において記載されるものに類似するかまたは等価である方法および資料を本発明の実施形態の実施または試験で用いることができるが、例示的な方法および／または資料を以下に記載する。係争の場合には定義を含めた特許明細書によって規制されるであろう。さらに、資料、方法および実施例は例示的なものに過ぎず、必ずしも限定を意図したものではない。
【００５１】
本発明のいくつかの実施形態を、添付の図面を参照して例のみによって本明細書に記載する。図に対する目下の詳細な具体的言及に関して、示される詳細は例として示されるものであり、本発明の実施形態の例示的な詳解を目的とするものであることを強調しておく。この点で、図とともに示される記載は、本発明の実施形態がいかにして実施され得るかを当業者に明白なものにする。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１は、本発明のいくつかの実施形態に従って共通構造フォールドを有するアミノ酸配列のライブラリをコンピュータ計算により構築する方法を実行するための例示的なアルゴリズムの模式的な流れ図である。
【図２】図２は、主鎖原子位置の構造類似性の変動の図を表し、主鎖の見取図が、類似構造タンパク質ファミリーの構成要素であるタンパク質群の３Ｄ構造における主鎖原子位置の変動に対応した様々な太さおよび濃さの管として示されており、当該構造は、全体構造の最適な一致を与えるように互いに重ね合わせられている（目盛りはＣα原子位置におけるＲＭＳＤを０Å（白）〜１Å（黒）の範囲で示す）。
【図３】図３は、本発明のいくつかの実施形態に従って分子的存在物の対象分子表面に対する所望の親和性を有するアミノ酸配列を設計および選択する方法を実行するための例示的なアルゴリズムの模式的な流れ図である。
【図４】図４は、目的関数、すなわち安定性と式１で定義される結合性シグモイドとの積値の３Ｄプロットを示し、設計中に標本抽出された主鎖立体配座は、抗体安定性と結合親和性との両方により制約される目的関数によって評価される。
【図５Ａ】図５Ａは、本明細書において示される方法のいくつかの実施形態による改良の前後における設計抗体の安定性をその結合エネルギー（図５Ｂ）と対比させて示した散布図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、本明細書において示される方法のいくつかの実施形態による改良の前後における設計抗体の結合エネルギーをその安定性（図５Ａ）と対比させて示した散布図である。
【図６Ａ】図６Ａは、本明細書において示される方法の最終ステップにおいて設計抗体構造をフィルタリングするために使用されるエネルギーおよび構造の基準を示す曲線プロットを表し、予測結合エネルギーのパラメータに基づいて設計抗体がフィルタリングされており、その一方で、一連の３０３個の天然タンパク質結合抗体から導き出されたカットオフ値を破線で表しており、さらに、全てのフィルタを通過した抗体設計（黒色曲線）を天然タンパク質結合抗体（灰色曲線）と比較している。
【図６Ｂ】図６Ｂは、本明細書において示される方法の最終ステップにおいて設計抗体構造をフィルタリングするために使用されるエネルギーおよび構造の基準を示す曲線プロットを表し、埋没面積のパラメータに基づいて設計抗体がフィルタリングされており、その一方で、一連の３０３個の天然タンパク質結合抗体から導き出されたカットオフ値を破線で表しており、さらに、全てのフィルタを通過した抗体設計（黒色曲線）を天然タンパク質結合抗体（灰色曲線）と比較している。
【図６Ｃ】図６Ｃは、本明細書において示される方法の最終ステップにおいて設計抗体構造をフィルタリングするために使用されるエネルギーおよび構造の基準を示す曲線プロットを表し、抗体構造とリガンドとの間での形状相補性のパラメータに基づいて設計抗体がフィルタリングされており、その一方で、一連の３０３個の天然タンパク質結合抗体から導き出されたカットオフ値を破線で表しており、さらに、全てのフィルタを通過した抗体設計（黒色曲線）を天然タンパク質結合抗体（灰色曲線）と比較している。
【図６Ｄ】図６Ｄは、本明細書において示される方法の最終ステップにおいて設計抗体構造をフィルタリングするために使用されるエネルギーおよび構造の基準を示す曲線プロットを表し、可変軽重鎖ドメインドメインとリガンドとの間でのパッキング性のパラメータに基づいて設計抗体がフィルタリングされており、その一方で、一連の３０３個の天然タンパク質結合抗体から導き出されたカットオフ値を破線で表しており、さらに、全てのフィルタを通過した抗体設計（黒色曲線）を天然タンパク質結合抗体（灰色曲線）と比較している。
【図７】図７は、発現レベルおよび結合性に関して染色された細胞を使用する酵母表面ディスプレイの散布図を示し、「４ｍ５．３」で表される鋳型構造を灰色の散布点で示し、「Ｄｅｓｉｇｎ＃１」（配列番号１）で表される設計構造を黒色の散布点で示す。
【図８Ａ】図８Ａは、点突然変異の導入前後における抗ＡＣＰ設計（Ｄｅｓｉｇｎ＃１〜５；配列番号１〜５）の力価曲線を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、抗ＡＣＰ設計（Ｄｅｓｉｇｎ＃１  配列番号１）の力価曲線を設計基質ＡＣＰ（図８Ｂ中に丸で示してある）および陰性対照（ＴＥＭ、図８Ｂ中に四角で示してある）に関して示す。
【図９】図９は、設計鋳型としての役目を果たした元来の酵素の配列（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ由来のラクトナーゼ；配列番号１３）に比べて基質特異性を変化させて設計された、５つのＴＩＭバレル・フォールド設計（配列番号８〜１２）の配列アラインメントを示す。（発明の詳細な説明）
【００５３】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、計算化学およびコンピュータ計算によるタンパク質設計に関し、より具体的には、限定はしないが、共通構造フォールドを有するアミノ酸配列のライブラリをコンピュータ計算により構築する方法；ならびに分子的存在物の対象分子表面に対する所望の親和性を有するアミノ酸配列を設計および選択する方法に関する。これらの方法は、例えば、構造安定性と所定の分子標的またはｄｅ  ｎｏｖｏ関数により設計されたｄｅ  ｎｏｖｏ酵素に対する高い結合親和性とを有する結合タンパク質を設計するために用いることができる。さらに本発明は、そのいくつかの実施形態において、計算化学に関し、より具体的には、限定はしないが、対象分子表面に対する所望の親和性を有するアミノ酸配列を作製する方法および、対象分子表面に対する所望の親和性を有するアミノ酸配列に関する。
【００５４】
本発明の実施形態の原理および操作は、例およびそれに付随する記載を参照することによってより良く理解され得る。
【００５５】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明がその適用において以下の記載で示されるかまたは実施例によって例示される詳細に必ずしも限定されない、ということを理解すべきである。本発明は、他の実施形態を可能とし、または様々な方法で実施もしくは実行されることができる。
【００５６】
上に論じたように、抗体をｄｅ  ｎｏｖｏ設計する従来の方法は、既知のカノニカル立体配座に依拠した後、エピトープ結合部位（主に、ＣＤＲとして知られる領域）にあるアミノ酸配列の並べ替えによって標的エピトープに結合するようにドッキングおよび設計するものであった。そのようなコンピュータ計算方法は、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで標的に対する高い親和性を呈する抗体構造を提供し得るものの、これらの方法は、抗体の全体主鎖の寄与によって影響される抗体安定性の問題に取り組むこと、ならびに主鎖立体配座および主鎖全体のアミノ酸配列の軽微かつ微小な差異に敏感であることができない。
【００５７】
主鎖はこれまで結合剤設計方策により選定されてこなかった多くの付加的な立体配座の自由度を提供することから、広い極性結合表面を設計するという課題を解決する手がかりはタンパク質主鎖の設計とともにあると推論できる。しかしながら、機能（例えば、安定性および結合性）を有する主鎖の設計は、極性基からの自由エネルギーへの寄与を正確に釣り合わせる際につきものである複雑さゆえに、またタンパク質主鎖に許される立体配座空間の広さゆえに、未解決の課題である。
【００５８】
現在のコンピュータ計算資力では、（たとえカノニカル立体配座とアミノ酸配列の並べ替えの遺伝子レベルで設定された制限とによって小規模化されたとしても）全ての立体配座組み合わせ空間に配列の並べ替え空間を掛け合わせたものを定義し、次いでその空間の各構成要素を結合親和性に応じて評価することを試みる、という妙技は不可能ではないにしても実用的でないことが明白である。さらに、たとえ遺伝子レベルでの並べ替えによって生成され得る全ての立体配座の組み合わせ空間を理論的に包含でき、効果的かつ体系的に標本抽出できる方法が実用的になったとしても、そのような方法は抗体に認められるかまたは発生し得る無数のランダム変異を説明することができないであろう。
【００５９】
本発明を着想する間に本発明者らは、何千年にも亘って進化してきた構造に設計の基礎を置くため、およびそれによって結合親和性が高く構造安定性の高いフォールド（例えば抗体）の設計を改善するために、相同性の高いものを含めた全ての天然のフォールド（例えば抗体）から主鎖立体配座および配列情報を標本抽出する手法（そのために一連の三次元原子座標すなわち３Ｄ構造が利用可能である）を検討した。
【００６０】
この手法ではその基礎として、自然界は、現在実現可能な最も野心的で腕力のあるコンピュータ計算技術を上回る、最も効果的な足場を標本抽出および選択するための進化的な時間スケールおよび試験の場の利点を有している、ということを想定している。その上さらに、天然起源の構造に依拠することで、予測可能な足場および配列が使われるだけでなく天然の抗体に生じる予測不可能なランダム変異も使われるであろう。
【００６１】
本発明を実用的なものへとまとめ上げて例証する間に本発明者らは、天然起源の免疫系抗体のモジュール式構造に依拠してｄｅ  ｎｏｖｏ分子的結合剤を構築する方法を開発し、ベンチマーク再現性試験を用いてこの方法を試験した。当該ベンチマーク再現性試験の結果は、この方法が、従来の設計方法を用いて構築された天然起源の構造に類似する構造への到達を可能とし、従来の設計方法を用いて構築された構造に比べて全ての結合および構造のパラメータを改善する、ということを示している。既知の三次元構造を有する一連の多様な天然起源の高親和性の抗体結合複合体に対する本発明の方法の適用および検証を、当該一連の抗体結合複合体の構成要素から全ての配列および主鎖立体配座の情報を取り除くことならびに、特に天然の結合表面が広い場合にそれらの天然の結合様式、天然の主鎖立体配座および配列を再現することによって行った。
【００６２】
本発明者らはさらに、類似構造タンパク質ファミリー（ＦＳＳＰ）の構成要素である分子的結合タンパク質、すなわち、天然に繰り返し生じる（つまり、保存された）１つ以上のフォールドを少なくとも一部に呈しているファミリーに属するタンパク質、例えば、限定はしないが抗体およびそのドメイン、α／β加水分解酵素、ＴＩＭバレルタンパク質などを設計するためにこの方法が実施され得ると予想している。
【００６３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本明細書において提供される方法は、いかなる所定の立体配座のいかなる標的分子にも原理的に高い親和性で結合できる高度に安定なタンパク質を設計するために有用である。抗体についての例示的な事例において当該方法は、超可変性断片の主鎖が、しばしば互いに交換可能であり、１０１３のオーダーの理論的総複雑性で新しい主鎖断片の組み合わせを生じる、という観察結果を利用する。それゆえ、当該方法は、抗体可変ドメインのＶ（Ｄ）Ｊ遺伝子セグメントによってコード化された主鎖立体配座を用い、それらを互いに組み合わせて多様性の高い一連の抗体足場を作り出す。この予備計算ステップは、前例のない主鎖の組み合わせ空間、および安定で標的に対する親和性が高いと予測される大きな配列データセットを作り出す。その後、足場を標的分子に対してドッキングさせる。主鎖立体配座断片を天然抗体に認められるもので置き換え、最適な結合性および抗体安定性のためにアミノ酸配列を設計する、という反復プロセスによって、設計抗体を改良する。本発明のいくつかの実施形態によれば、設計プロセス全体を通じて、各立体配座セグメントについて導き出された配列制約を使用して配列−構造規則を強化する。最後に、一連の天然の抗体結合複合体から導き出されたエネルギーおよび立体配座の基準によってモデルを選択する。
【００６４】
本明細書において提供されるタンパク質設計方法は、抗体に適用された場合に：
１．立体配座および配列のデータベースからの知識を組み込んで設計選択を制約すること；
２．二次構造を安定化する要素がほとんど欠けている可変セグメントと、堅固にパッキングされ安定な構造基盤を形成するフレームワークとの間での長距離の残基相関関係をコード化すること；
３．抗体の主鎖と配列との広い組み合わせ空間を効率的に標本抽出すること；ならびに
４．抗体安定性と標的分子結合性との両方を最適化する抗体の立体配座および配列を設計すること
を含めたいくつかの関係する課題に取り組む。以下の節では、アルゴリズムの様々な要素、およびそれらがいかにして現在の設計課題に対処するかについて記載する。
【００６５】
共通構造フォールドを有するアミノ酸配列のライブラリをコンピュータ計算により構築する方法：
これより、本発明のいくつかの実施形態の態様に従って、共通構造フォールドを有するアミノ酸配列のライブラリをコンピュータ計算により構築する方法を提供するが、当該方法は以下に記載するステップに従って実行される。本発明のいくつかの実施形態によれば、当該ライブラリは、この共通構造フォールドを共有する天然起源タンパク質ファミリーの構成要素によって占められた広大な立体配座空間を効果的かつ簡潔に標本抽出するように設計されており、したがって、本明細書において以下に記載するｄｅ  ｎｏｖｏタンパク質設計の基礎を提供するために用いることができる。
【００６６】
図１は、本発明のいくつかの実施形態に従って共通構造フォールドを有するアミノ酸配列のライブラリをコンピュータ計算により構築する方法を実行するための例示的なアルゴリズムの模式的な流れ図である。以下に続く記載は、図１に示すアルゴリズムにおけるいくつかの操作に言及するものである。以下の記載から理解されるように、当該アルゴリズムにおけるいくつかの操作は、順序を代えて、またサイクル数を代えて、実行することができる。
【００６７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、方法はそのステップ（ｉ）において、共通構造フォールドを有する複数のソース構造を提供すること（図１のボックス１）を含む。
【００６８】
本発明の実施形態との関連において、用語「ソース構造」は、共通ペプチド主鎖フォールドが少なくとも１つのドメインにおいてそのドメインにおける互いの配列相同性の有無に拘わらず共有されている、実験的に解明されたタンパク質の３Ｄ構造の集まりを指す。一般に、ソース構造の集まりは、実験的に解明されたタンパク質構造のいくつかまたは全てによって形成され得る。あるいは、ソース構造は、利用可能な全ての３Ｄ構造のサブセット、ひいてはその小部分を含んでいてもよい。それゆえ、本発明のいくつかの実施形態によれば、ソース構造の数は５００個超、１００個超、５０個超、１０個超、５個超、または２個超である。
【００６９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、共通構造フォールドは、構造フレームワーク領域を定義する保存構造領域と、多様構造領域とを有することを特徴とし、構造フレームワーク領域は通常、高い構造保存性を呈し、さらに通常、構造フレームワーク領域のいくつかの場所は、最も高い構造保存性を呈する。これらの場所は、本明細書において「構造保存性の最も高い場所」と呼ばれる。構造保存性は図２によって概念化され得る。
【００７０】
図２は、主鎖原子位置の構造類似性の変動の図を表し、主鎖の見取図が、類似構造タンパク質ファミリー（ＦＳＳＰ）の構成要素であるタンパク質群（例えば、この例示的な図では４０個の非冗長性抗体Ｆｖ構造）の３Ｄ構造における主鎖原子位置の変動に対応した様々な太さおよび濃さの管として示されており、当該構造は、全体構造の最適な一致を与えるように互いに重ね合わせられている（目盛りはＣα原子位置におけるＲＭＳＤを０Å（白）〜１Å（黒）の範囲で示す）。
【００７１】
図２から見て取れるように、ほとんどの構造の主鎖に沿ったいくつかの領域は、それらの３Ｄ構造がずれており、平均経路の周りの太い包みを満たしているが、他の領域は、平均経路の周りの引き締まった細い包みを満たしている。本発明のいくつかの実施形態によれば、ソース構造の集まりの中で「細い」領域は、高い構造保存性を呈すると表現される。典型的には、細い領域は構造フレームワーク領域に相当し、太い領域は多様構造領域に相当する。
【００７２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、重ね合わせられたポリペプチド主鎖鎖の集まりに沿って最も細い場所は、本明細書において「構造保存性の最も高い場所」と呼ばれる。図１に示すグラフィック図に起因する用語「細い」および「太い」は、典型的にはオングストローム（Å）単位で与えられる、アラインメントされた複数のポリペプチド主鎖位置の平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）によって表現することもでき、その場合、「細い」は「太い」に比べて相対的に小さな値を有する。重ね合わせられた複数の構造のうちの特定の構造に言及する場合、構造保存性の最も高い場所は特定位置に対応し、その逆も同様に、構造保存性の最も高い特定位置は構造保存性の最も高い場所に対応する。
【００７３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ソース構造の選択および／またはセグメントの選択は、１つ以上の特質に類似し呈示する可能性がより高い配列を得るために、方法の結果にバイアスをかけるように選択基準を課しながら行われ得る。選択基準は、起源生物（例えば発現系または所望の最終宿主との適合性を確保するため）、アミノ酸配列長（全体として、またはセグメント毎で、もしくはループ長毎で、など）に基づくものであり得る。ソース構造の特異的酵素活性に基づくそのような選択基準の使用は実施例５で実証されており、実施例５では、立体配座ライブラリの構築においてＰＴＥ酵素相同体を起源とするブレード７立体配座を選択するためにバイアスをかけた。
【００７４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ポリペプチド主鎖内の「位置」は、主鎖原子、または予め定義された主鎖原子間位置によって表され、主鎖原子は通常、アルファ炭素原子、主鎖カルボニル炭素原子、主鎖カルボニル酸素原子または主鎖窒素原子である。
【００７５】
本発明の実施形態によれば、ソース構造を用いて、複数のポリペプチド鎖セグメントが集合した主鎖立体配座データベースを構築する。いかなる特定の理論にもとらわれず、タンパク質立体配座の安定性は正および負の設計要素の両方に依存すると仮定する。共通フォールドを共有する多種多様なファミリーに属するタンパク質をコンピュータ計算により設計する重要な利点は、これらの要素のうちの少なくともいくつかをコード化する位置毎での基準でのアミノ酸選択に関する統計値を抽出して、設計プロセスを誘導できる、という点である。さらに、天然主鎖の立体配座と配列とを相互に関係づけることによって、特定の立体配座分類へと折り畳まれる一連の天然のセグメント配列を分類することが可能である。
【００７６】
本発明の実施形態によれば、ポリペプチド鎖のセグメント化は、認識および結合の起こるドメインを構成する領域と関係がある。本発明の実施形態によれば、方法は、実験的に決定された３Ｄ構造の構造アラインメントと、構造保存領域の考慮に基づくポリペプチド鎖のセグメント化（それゆえ、構造相同セグメントへのセグメント化）とに基づくものである。それは、アミノ酸配列相同性アラインメントと、保存領域の考慮に基づくポリペプチド鎖のセグメント化とに基づいた従来既知のコンピュータ計算方法とは異なる。
【００７７】
したがって、本発明のいくつかの実施形態によれば、方法はそのステップ（ｉｉ）において、ソース構造の各構造を構造相同セグメントへとセグメント化することを含み、構造相同セグメントの群を複数個得るべく当該構造相同セグメントの各々は、構造保存性の最も高い場所のうちの２つの場所によって定義されるものである。それゆえ、構造相同セグメントの群の各々は、構造保存性の最も高い２つの場所によって定義される（図１のボックス２）。
【００７８】
場合によって、セグメント化はさらに、各構造のポリペプチド鎖の端部（終端すなわち尾部）を含む１つ以上の末端セグメントを含み、ポリペプチド鎖終端は、本明細書において「末端場所」と呼ばれる。したがって、末端セグメント群の各々は、本明細書において尾部セグメントとも呼ばれるが、１つの構造保存性の最も高い場所と、１つの末端場所とによって定義される。末端場所は必ずしも高い構造的相同性を共有してはいない、ということに留意されたい。
【００７９】
それゆえ、本発明の実施形態との関連において、用語「セグメント」は、いずれか１つのソース構造のポリペプチド鎖の連続した切片であって、２つの場所またはその近傍で開始および終了する切片を指す。「構造相同セグメント」は、構造保存性の最も高い２つの場所またはその近傍で開始および終了するセグメントとして定義される。「末端セグメント」は、１つの構造保存性の最も高い場所またはその近傍で開始／終了し、１つの末端場所で開始／終了するセグメントとして定義される。
【００８０】
本発明のいずれかの実施形態のいくつかの実施形態によれば、ステップ（ｉｉ）との関連において、各ソース構造のポリペプチド鎖は「構造相同セグメント」へとセグメント化される。場合によっては、本発明のいずれかの実施形態のいくつかの実施形態によれば、ステップ（ｉｉ）との関連において、各ソース構造のポリペプチド鎖は「構造相同セグメント」へとセグメント化され、さらに「末端セグメント」へとセグメント化される。
【００８１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、提供される方法の例示的な用途は、抗体のｄｅ  ｎｏｖｏＦｖ断片を設計するために適用され、後の実施例の節においてベンチマーク再現性実験を実証した。これらの例示的な実施形態では、κ軽鎖を有するＦｖドメインのみを、ソース抗体（すなわちソース構造）の集まりの中に含めた。具体的には、本明細書において示される方法によって得られた結果を試験するためのベンチマーク再現性実験において、７８８個の可変κ軽鎖と７８５個の可変重鎖構造とをソース抗体として使用した。
【００８２】
抗体を用いる、本明細書において示される方法の例示的な実証において、ソース抗体はＦｖドメインである結合ドメインを含み、全ソース抗体のＦｖドメインを構成する２本の鎖の各々、すなわち軽鎖および重鎖の各々は、連続する２つの構造保存性の最も高い場所を同定すること、例えば、構造的に保存された鎖内ジスルフィド結合を形成する可変ドメインの２つのシステイン残基、および第２のシステインの近くにある第３の構造的に保存された位置を同定することによって、２つの構造相同セグメントへとセグメント化され、それにより、各Ｆｖドメインにつき４つの構造相同セグメントが形成された。
【００８３】
具体的には、本発明のいくつかの実施形態によれば、後の実施例の節で抗体のＦｖについて実証された本明細書において示される方法の例示的な実証では、次の４つのセグメント：いずれも軽重鎖可変ドメインの２つの構造的に保存されたシステイン残基間の全アミノ酸に亘って延びている、Ｌ１−Ｌ２（「VL」と呼ぶ）およびＨ１−Ｈ２（「VH」と呼ぶ）ならびに、いずれも第２システインの後の最初のアミノ酸において開始され、かつＣｈｏｔｈｉａ位置付番体系を用いて可変κ軽鎖ドメインの位置１００および可変重鎖ドメインの位置１０３において終了している、Ｌ３およびＨ３（以下の表２を参照）に分割することに従ってセグメント化が行われる。
【００８４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、主鎖立体配座データベースの構築は、全てのセグメントを単一の相対座標系へ移すことを含む。本発明のいくつかの実施形態によれば、方法はそのステップ（ｉｉｉ）において、ソース構造が有するのと同じ共通構造フレームワークを有してそれゆえ構造保存性の最も高い場所に対応する特定位置を有する鋳型構造を選択することと、全ての構造相同セグメントを鋳型構造の座標系へと移すこととを含む（図１のボックス４）。
【００８５】
本発明のいずれかの実施形態のいくつかにおいて、鋳型構造は、ソース構造から任意および／またはランダムに選択される。本発明のいくつかの実施形態によれば、鋳型構造は、ソース構造由来の構造相同セグメントを移植される役目を果たす。本発明のいくつかの実施形態によれば、ｄｅ  ｎｏｖｏタンパク質設計の間、鋳型構造は、参照としていくつかの構造特性を用いて設計タンパク質を比較するための、参照構造として用いられる。
【００８６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、いくつかの構造相同セグメントは異なる立体配座および時として異なる長さを有し得るため、全ての構造相同セグメントが共通開始点および共通終了点を共有するようにする。あるいは、いくつかまたは全ての構造保存性の最も高い場所の空間的アラインメントに基づいて全ての構造を構造的にアラインメントさせる。
【００８７】
これらの実施形態のいくつかによれば、全ての構造相同セグメントが、共通開始点および共通終了点を共有し、かつ場合によっては１つ、いくつか、または全ての末端セグメントの構造保存性の最も高い場所をさらに共有するようにするために、本発明のいくつかの実施形態に従って以下の手順を行う：
【００８８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、方法はそのステップ（ｉｖ）において、分割セグメントを得るべく、少なくとも１つの構造相同セグメントをその内部の部位において分割することを含む（図１のボックス３）；
【００８９】
場合によって、方法に１つ以上の末端セグメントがさらに含まれる場合には、末端セグメントを分割するのではなく、末端セグメントを分割セグメントとして手順の中に入り込ませると同時に、手順内の他の全てのステップを本明細書において示されるとおりに適用する、つまり、ステップ（ｖ）において末端セグメントを分割セグメントとして見なす；
【００９０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、方法はそのステップ（ｖ）において、構造相同セグメントの群の各々について、分割セグメントの構造保存性の最も高い位置の各々を鋳型構造の対応する特定位置に重ね合わせ、対応するセグメントを鋳型構造から変位させることを含む（図１のボックス５）；
【００９１】
また、本発明のいくつかの実施形態によれば、方法はそのステップ（ｖｉ）において、セグメントの主鎖が内部歪みのほとんど無いかまたは全く無い化学的に健全な立体配座を形成することを可能にしながらセグメント閉鎖を達成するために、分割セグメントを重み調整することを含み、それにより、鋳型構造において重み調整再閉鎖セグメントを得る（図１のボックス６）。末端セグメントについては、重み調整は閉鎖を含まない。
【００９２】
用語「重み調整」は、本発明のいずれかの実施形態のいくつかの実施形態によれば、例えば改良された構造の配列相同性スコア、主鎖二面角および／または原子位置（変数）に関係する所定の重み、拘束および制約（定数）に基づいて多項式関数を最小化することによって幾何学的基準、空間的基準および／またはエネルギー基準を最適化することを目的とした、コンピュータ計算によって構造改良する１つ以上の手順または操作を指す。いくつかの実施形態によれば、重み調整手順は、主鎖二面角の調節、調整されたセグメントの長さに対する変更（増加または減少のいずれか）、アミノ酸側鎖パッキング、およびアミノ酸配列の変更のうちの１つ以上を含むが、本明細書において用語「主鎖二面角の調節」、「アミノ酸側鎖パッキング」および「アミノ酸配列の変更」は、とりわけ、計算科学および計算生物学の分野で広く用いられるよく知られた最適化の手順および操作を指すためにも使用される。一般的な最適化手法の総説については、例えば、Ｃｈｒｉｓｔｏｄｏｕｌｏｓ  Ａ．ＦｌｏｕｄａｓおよびＰａｎｏｓ  Ｍ．Ｐａｒｄａｌｏｓによる「Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｐｕｂ．、２００８を参照されたい。本発明のいくつかの実施形態によれば、例示的な最適化手順は、本明細書において以下に詳解する循環座標降下（ＣＣＤ）であるが、本明細書においてそれは、巨大分子モデリング用のＲｏｓｅｔｔａソフトウェア一式に実装されたデフォルトの全原子エネルギー関数とともに用いられる。
【００９３】
本発明のいくつかの実施形態において、重み調整における拘束および制約（重み）にはコンピュータ計算手順を規定する規則が考慮される。例えば、第１立体配座を有する任意の所与のポリペプチドセグメントの主鎖原子位置および二面角を、別の第２立体配座に認められる二面角を可能な限り保存するように試みつつ第２立体配座に近づけるべく改良する場合、コンピュータ計算手順は、例えばＣα位置にバイアスをかける調和拘束、および第２立体配座に認められる二面角から自由に逸脱しないように主鎖二面角にバイアスをかける調和拘束を使用するものとなり、それゆえ全体主鎖を第２立体配座へと変化するように仕向けつつ各構造決定因子あたり最小限の立体配座変化を起こすものとなるであろう。
【００９４】
制約は、タンパク質のアミノ酸配列を変更する手順においても適用され得る。また、前身配列から受け継いだ配列のいくつかの部分を少なくともある程度維持するためにこれらの制約を用いてもよい。アミノ酸配列変更に使用される最も一般的な制約のうちの１つは、ＦＳＳＰにおいて典型的に示される特定位置における保存性の高い配列パターンから（場所を）導き出すものである。本発明のいくつかの実施形態によれば、重み調整プロセスの間にアミノ酸の変更を規定する規則には、位置特異的スコア行列値すなわちＰＳＳＭが含まれる。
【００９５】
「位置特異的スコア行列」（ＰＳＳＭ）は、当該技術分野において位置重み行列（ＰＷＭ）または位置特異的重み行列（ＰＳＷＭ）としても知られているが、配列に沿った所与の位置における特徴（モノマー；アミノ酸；核酸など）の出現頻度に基づく、生物学的配列において繰り返し生じるパターンについての一般に用いられる表現である。ＰＳＳＭは、大抵、構造的および機能的に関係があると考えられるアラインメントされた一連の配列から導き出されるものであり、コンピュータ計算によるモチーフ発見のための多くのソフトウェアツールに広く用いられるようになった。アミノ酸配列との関連において、ＰＳＳＭは、タンパク質多重配列アラインメントにおける各位置についてアミノ酸置換スコアが別々に与えられる、タンパク質ＢＬＡＳＴ検索で使用されるスコア行列の一種である。それゆえ、アラインメントの位置ＡでのＴｙｒ−Ｔｙｐ置換は、位置Ｂでの同じ置換と比べると、２つの位置で異なるアミノ酸保存性のレベルに影響されて非常に異なったスコアが与えられ得る。これは、Ｔｙｒ−Ｔｙｐ置換がどの場所で起こっても同じスコアを与えるＰＡＭ行列およびＢＬＯＳＵＭ行列などの位置非依存行列とは対照的である。ＰＳＳＭスコアは一般に、正および負の整数として示される。正のスコアは、所与のアミノ酸置換がアラインメントにおいて偶然から予想されるよりも頻繁に起こるということを指し示し、その一方で負のスコアは、置換が予想より低い頻度で起こることを指し示す。大きな正のスコアは、重大な機能的残基を指し示していることが多く、それは活性部位残基または分子間もしくは分子内の他の相互作用に必要な残基であり得る。ＰＳＳＭは、位置特異的反復基礎的局所アラインメント検索ツール（ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ）を使用して作り出すことができ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴは、検索配列に類似するタンパク質配列を見つけ、その後に結果として生じるアラインメントからＰＳＳＭを構築する。あるいは、国立生物工学情報センターの保存ドメインデータベース（ＮＣＢＩ  ＣＤＤ）のデータベースからＰＳＳＭを引き出すことができる、というのも、各保存ドメインは、シードアラインメントにおいて認められる置換をコード化するＰＳＳＭによって表されるからである。Ｅｎｔｒｅｚ保存ドメインでのテキスト検索かまたはＣＤ検索としても知られる位置特異的逆ＢＬＡＳＴ（ＲＰＳ−ＢＬＡＳＴ）の使用かのどちらかによってこれらのＣＤ記録を見つけて、入力タンパク質配列上のこれらのドメインの位置を突き止めることができる。
【００９６】
上に論じたように、本明細書において示される方法では、ＰＳＳＭスコアは、様々な重み調整ならびに他の改良および設計の計算中に、本発明のいくつかの実施形態に従って２つの方法で使用される。第１に、設計配列選択は、ＰＳＳＭに従って一定の保存性閾値を上回る同一性のみに制限される。カットオフは、結合表面（例示的なＰＳＳＭスコアは、Ｃβの１０Å距離のカットオフ以内にある分子的存在物の対象分子表面の全てのタンパク質残基について０以上）、多様構造領域（１以上）、ならびに構造フレームワーク領域、場所および位置（２以上）について別々に決定される；結合性に関連する位置は、事実上、タンパク質のコアおよびそのフレームワークにおける位置に比べて集団的一致から変動する自由度がより大きく許される。第２に、配列設計において使用する全原子エネルギー関数は、ＰＳＳＭに従ってより有望な同一性へと仕向けるバイアスを配列にかける項を含むように改変され、またこれらの場合において配列の集団的一致へと仕向けるバイアスは、結合部位から離れるほど強くなる。
【００９７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、構造相同セグメントは２つのサブセグメントに分割され、その各々は、分割セグメントの各位置に対応する鋳型構造における特定位置に移植されると同時に鋳型構造における対応するセグメントを置き換え、その後、分割され重ね合わせされたセグメントは、鋳型構造との関連において重み調整を受ける。
【００９８】
重み調整は、第１立体配座を有する分割セグメントを閉鎖へと仕向けるべく、当該分割セグメントの主鎖二面角を改良することを含み、このことは、後に分割セグメントがわずかに異なった立体配座を有することになることを意味する。上に述べたように、末端セグメントの場合には重み調整は閉鎖を含まない。重み調整プロセスは、元の二面角を可能な限り維持することを試みるものであり、それゆえコンピュータ計算手順は二面角の可変性をソース構造に認められるものに制約し、それにより、各二面角あたり最小限の立体配座変化を可能にすると同時に分割セグメントを閉鎖へと仕向け、それにより、鋳型構造との関連において重み調整再閉鎖セグメントを得る。このプロセスは、ＰＳＳＭ由来の制約の影響下で分割セグメントのアミノ酸配列を変更しながら反復的に成し遂げられる。アミノ酸配列の変更は、主鎖二面角と一緒にアミノ酸側鎖パッキングを最適化させることによって主鎖立体配座に小さな変更が起こることを可能にする。
【００９９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、重み調整プロセスは、分割セグメントを取り囲む外殻の内部に少なくとも部分的に存在する、設計構造におけるアミノ酸をも変更する。いくつかの実施形態によれば、外殻は、半径が２〜２０Åであること、あるいは半径が２Å、３Å、４Å、５Å、６Å、７Å、８Å、９Å、１０Å、１１Å、１２Å、１５Åまたは２０Åであることを特徴とする。いくつかの実施形態によれば、外殻半径は６Åである。
【０１００】
以下は、本発明のいくつかの実施形態による例示的な重み調整プロセスの簡単な説明であるが、当該重み調整プロセスは、本発明との関連における「重み調整」の定義に関して限定するものではない。構造相同セグメントは、長さによって分類され、構造相同セグメントの各群の長さサブグループの各々について、主鎖二面角（Φ、ΨおよびΩ）がソース構造（「元の」主鎖立体配座）から抽出され、鋳型構造における対応するセグメントの二面角をソース二面角で置き換えると同時に、移植されたセグメントのランダムな選択位置に主鎖分割部位を導入する。主鎖分割は末端セグメントには導入されないということに留意されたい。言い換えれば、全ての非鋳型構造に由来するセグメントは、構造フレームワーク領域から離れかつ構造保存性の最も高い位置（セグメントの端部）から離れた任意の位置で切断され、対応する位置を重ね合わせることによって鋳型構造における対応するセグメントの代わりに鋳型構造に配置され、その後、２部分の分割セグメントの二面角は制約に従って漸進的に変化することを許され、その一方で同時に、セグメントのアミノ酸配列が、本明細書に記載されているようにＰＳＳＭ由来の制約の影響下で変更される。末端セグメントは、鋳型構造上の対応する末端セグメントを置き換えながら、保存された位置を重ね合わせることによって、鋳型構造上に配置される。
【０１０１】
いくつかの実施形態によれば、分割され移植された各セグメントは、循環座標降下（ＣＣＤ）を用いた後に例えばＲｏｓｅｔｔａソフトウェア一式に実装されている「ＣＣＤムーバー（ＣＣＤ  ｍｏｖｅｒ）」で実施されるような小さなずり移動をさせることによって、鋳型構造上に重み調整される。末端セグメントは、後の実施例の節で示す「ＴａｉｌＳｅｇｍｅｎｔＭｏｖｅｒ」スクリプトなどのスクリプトを使用してＲｏｓｅｔｔａソフトウェアにおいて実装される小さなずり移動のみを用いて、鋳型構造上に重み調整される。改良の間、ファンデルワールスパッキング、水素結合および暗黙の溶媒和によって支配される標準的な全原子エネルギー関数は、主鎖分割部位の閉鎖に有利に働く調和項と、ソース構造における元の位置に比べたときの重み調整されたセグメント内の主鎖Ｃα位置の相違を不利にする、Ｃα位置にバイアスをかける調和拘束と、ソース構造において認められる元の角度に比べたときの二面角の相違を不利にする、主鎖二面角についての調和項とを追加することよって改変される。セグメント立体配座の調節は、組み合わせ的なアミノ酸側鎖パッキングを伴って主鎖の動きを変化させる。パッキングステップの間、当該手順は、セグメントのＰＳＳＭ由来の制約の影響下で、モデリングされたセグメント全体、および当該セグメントを取り囲む６Åの外殻内におけるアミノ酸配列変更を可能にする。各ＣＣＤステップまたはＴａｉｌＳｅｇｍｅｎｔＭｏｖｅｒは、利用可能な計算力および他の実用上の検討事項に応じて数百回繰り返され、各ＣＣＤ手順の最後には、ソースセグメントからのモデリングされたセグメントの平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）が計算され、それが１Åを超える場合または、例えば分割部位での主鎖ギャップスコア（Ｒｏｓｅｔｔａソフトウェア一式において定義された主鎖連続性についての例示的な基準；これは末端セグメントには当てはまらない）が大きすぎる（例えば０．５以上）場合には、そのセグメントについて当該手順がもう一回繰り返される。数百回後にスコアが依然として許容不可能なものである場合には、別の任意かつランダムに選択された分割部位を使用して別の閉鎖試行のために当該手順が再実行される。
【０１０２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、方法はそのステップ（ｖｉｉ）において、場合によって、別の部位で分割（図１のボックス８ａ）しながらステップ（ｉｖ）〜（ｖｉ）を繰り返すこと（図１のボックス７）、またはこの構造相同セグメントのさらなる操作を中止すること（図１のボックス８ｂ）を含む。
【０１０３】
したがって、予め選択された回数での重み調整サイクル（閉鎖を達成する試み）の後に適切に閉鎖できないセグメントは、さらなる検討から除かれ捨てられる（図１のボックス８ｂ）。重み調整手順は、鋳型構造との関連においてソースセグメント主鎖立体配座を調節する上で非常に効果的であることが分った。以下の実施例の節において示される事例では、セグメント閉鎖手順のためのこの重み調整は、平均反復回数を１．２回として分割部位試行をたった６回行うだけで、最長で７４アミノ酸長のセグメントをうまく閉鎖する。
【０１０４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、方法はそのステップ（ｖｉｉｉ）において、群の各々に対応する追加の少なくとも１つの重み調整再閉鎖セグメントを得るべく、追加の少なくとも１つの構造相同セグメントについてステップ（ｉｖ）〜（ｖｉｉ）を繰り返すことを含む。
【０１０５】
ひとたび分割セグメントが重み調整手順によって閉鎖を達成すれば、それは重み調整再閉鎖セグメントと呼ばれる。本発明のいくつかの実施形態によれば、そのセグメントの新しい主鎖二面角は、ライブラリの一部を形成する歪みデータベースに記録される。
【０１０６】
上記プロセスの産物は、鋳型構造上に移植されている重み調整再閉鎖セグメントの集まりである；それゆえ、いかなるセグメント群からの各セグメントも、他の全てのセグメント群からのセグメントと組み合わさって完全な再構築構造を形成することができる（図１のボックス９）。
【０１０７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、構造相同セグメントは、連続する２つの構造保存性の最も高い場所によって定義され、その一方で末端セグメントは、１つの末端場所と、連続するポリペプチド鎖の末端場所の最も近くにある構造保存性の最も高い場所であり得る、１つの構造保存性の最も高い場所とによって定義される。そのような実施形態では、セグメント間でのアミノ酸の重複は本質的に存在しない；つまり、連続する２つのセグメントによって共有されるアミノ酸位置は存在しない。いくつかの実施形態では、連続する２つのセグメント間に１〜２０、１〜１０または１〜５のアミノ酸重複の範囲でいくつかのアミノ酸残基の重複がいくらか存在するように２つの構造保存性の最も高い場所が選択される、つまり、隣り合うセグメントの端部の近傍にあるいくつかのアミノ酸は２つの隣り合うセグメントによって共有される。
【０１０８】
上に論じたように、主鎖−立体配座標本抽出はコンピュータ計算上非常に厳しいものであり、いくつかの成功があるにも拘らず主鎖再設計は、元々計算されたモデルから逸脱した立体配座をもたらした。立体配座の非常に多様なファミリー内でタンパク質を設計することによって、各主鎖セグメントのために天然起源の立体配座変異体を利用することができ、その場合、立体配座は宿主タンパク質フォールド内で安定であると期待できる。天然タンパク質に認められる主鎖立体配座の豊富さをコンピュータ計算で効率よく利用するために、ソース構造の全ての構造的に相同な重み調整再閉鎖セグメントの立体配座を、タンパク質設計プロセス中に使用するためのデータベースに格納する。
【０１０９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、方法はそのステップ（ｉｘ）において、複数の再構築構造を組み合わせ的に再構築するために、群の各々に対応する重み調整再閉鎖セグメントを場合によって使用することを含み、当該再構築構造の各々は、構造フレームワークを定義する保存構造領域と、多様構造領域と、構造保存性の最も高い場所に対応する位置とを有する共通構造フォールドを有するものである。本明細書においてこの複数の再構築構造は、共通構造フォールドを有するアミノ酸配列のライブラリ、と呼ばれる（図１のボックス１２）。場合により行われるこのステップにおいて、ライブラリは網羅的であり、当該方法の先のステップで生成した全ての重み調整再閉鎖セグメントを組み合わせるための可能な組み合わせを本質的に全て含む。
【０１１０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、方法を用いて、対象領域に重複する１つ以上の特定のセグメントを選択することによって所与のタンパク質の構造における特定の領域のみに変異を生じさせることができる。つまり、可能な全てのセグメント組み合わせの複数の再構築構造を作り出すのではなく、その代わりにタンパク質内の１つ以上の対象セグメントを選択することによって当該方法を用いて、立体配座が対象セグメントにおいてのみ変化した複数の再構築構造を作り出すことができる。当該方法のこの使用様式は、以下の実施例４（１セグメント）および実施例５（４セグメント）で例示される
【０１１１】
本明細書において示される方法を実行する際の計算負荷を簡素化するために、本発明のあらゆる実施形態のいくつかの実施形態に従って標本抽出・簡約化手順を行ってもよい。
【０１１２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、共通構造フォールドを有するアミノ酸配列のライブラリをコンピュータ計算により構築する方法はさらに、ステップ（ｉｘ）の前に、構造相同セグメントの群の各々に対応する重み調整再閉鎖セグメントの各々を少なくとも１つの構造クラスタに分類すること（図１のボックス１０）、および構造クラスタから代表の重み調整再閉鎖セグメントを選択し、それによりステップ（ｉｘ）の重み調整再閉鎖セグメントの各々を代表の重み調整再閉鎖セグメントとすることを含む（図１のボックス１１）。
【０１１３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本明細書において示される方法の、場合により行われるこのステップ（本明細書において「標本抽出・簡約化手順」とも呼ばれる）では、構造相同セグメントの群の各々の中身が一連の代表セグメントによって表現される。その後、これらの代表セグメントは、あらゆる並べ替えへと再結合されて、共通構造フォールドを有するアミノ酸配列のライブラリを形成する（図１のボックス１２）。
【０１１４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、共通構造フォールドを有するアミノ酸配列のライブラリをコンピュータ計算により構築する方法との関連において、用語「分類」は、構造相同セグメントの群の各々における重み調整再閉鎖セグメントのうちの少なくともいくつかを長さによって分類する手順を指す。本発明のいくつかの実施形態によれば、用語「分類」はさらに、長さで分類された重み調整再閉鎖セグメントを、アラインメントされたポリペプチド主鎖位置の平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）に基づいてクラスタリングすることを包含する。
【０１１５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＰＳＳＭは、現在の標本抽出された立体配座セグメントを含む再構築構造全体に割り当てられ、それによって配列制約を現在標本抽出された主鎖立体配座に同期させる。この手順は好都合である、というのも、重み調整されたセグメントの外側の２〜２０Å外殻内の残基もまた重み調整ステップの間に変化し得たからであり、この結果、そのステップにおいて調整を受けなかったセグメントを含めた全ての立体配座セグメントとの一貫性をＰＳＳＭが有することになるからである。配列に関するこれらのＰＳＳＭ制約は、組み合わせ的な配列最適化問題を大幅に軽減する。
【０１１６】
簡約化されてはいるものの、本明細書において示される方法によって作製されるライブラリは、同じ共通構造フォールドを有する実験的に利用可能な構造の数を超える数の再構築構造を含有し得る；しかもライブラリの再構築構造は、実験的に利用可能な構造に比べて立体配座がより多様である。
【０１１７】
対象分子表面に対する所望の親和性を有する１つ以上のアミノ酸配列を設計および選択する方法：
本明細書において示される方法に従って蓄積された、共通構造フォールドを有するアミノ酸配列のライブラリは、既知構造の立体配座空間を標本抽出するために最適化された再構築構造を含むものであり、分子的存在物の対象分子表面との相互作用を試験するために用いられる。ライブラリの構成要素は、対象分子表面に対する所望の親和性および分子安定性に関して設計された適格なアミノ酸配列を設計および選択する方法を用いて、対象分子表面に対する親和性に関してさらに設計および評価され、構造的な実現可能性に関してさらに評価される。
【０１１８】
本発明のいくつかの実施形態の別の態様によれば、分子的存在物の対象分子表面に対する所望の親和性を有するアミノ酸配列を設計および選択する方法が提供される。
【０１１９】
図３は、本発明のいくつかの実施形態に従って分子的存在物の対象分子表面に対する所望の親和性を有するアミノ酸配列を設計および選択する方法を実行するための例示的なアルゴリズムの模式的な流れ図である。以下に続く記載は、図３に示されるアルゴリズムにおけるいくつかの操作に言及するものである。以下の記載から理解されるように、当該アルゴリズムにおけるいくつかの操作は、代替的な順序および代替的なサイクル数で実行され得る。
【０１２０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、方法はそのステップ（ｘ）において、マッチングスコアを各々が有する複数の再構築構造−分子表面複合体を設計すべく、上記のライブラリ（図２、ボックス１２）を形成している再構築構造のうちの少なくとも１つを対象分子表面上（図２、ボックス１３）にマッチングさせることを含む。いくつかの実施形態によれば、ステップ（ｘ）はさらに、前の反復において生じる複合体を使用してステップ（ｘ）を場合によって繰り返し行うことを含み得る。
【０１２１】
本発明の実施形態との関連において本明細書で用いられる用語「マッチング」は、ドッキングまたは表面相補性剛体配向改良としても知られる、あらゆる所与のグリッド分解能での剛体配向最適化を含む手順を指し、当該手順はさらに、１つ以上の追加操作、例えば、限定はしないが、主鎖二面角の改変（最適化）、アミノ酸側鎖パッキング最適化、およびアミノ酸の変更すなわち配列最適化を含み得る。
【０１２２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、マッチング手順は、剛体の原子のいかなるサブセットをも定義する剛体配向最適化の操作を含むが、当該操作は、複合体における相手同士をそれぞれ剛体として扱いながら再構築構造と分子表面との間の境界面における表面相補性を最適化する。この剛体表面相補性最適化は所定の原子サブセットに対して行われ、当該原子サブセットは、主鎖と側鎖原子の重心を表す仮想原子とを表す簡約化原子セットであり得る（本明細書において「簡約表現ドッキング」と呼ばれる）かまたは、両方の剛体の全体構造を表す一連の原子であり得る（本明細書において「完全表現ドッキング」と呼ばれる）。
【０１２３】
本明細書において記載される本発明のいくつかの実施形態によれば、マッチング手順は、対象分子表面および再構築構造をいずれも不変のアミノ酸配列を有する剛体として扱いながら対象分子表面に対する再構築構造の最適な適合を探索する、簡約表現ドッキング操作を含む（剛体配向改良）。そのようなマッチング手順は本明細書において「概略マッチング」と呼ばれる（図２のボックス１４）。
【０１２４】
あるいは、本明細書において記載される本発明のいくつかの実施形態において、マッチング手順は、完全表現ドッキング操作に基づく剛体配向改良を含み、さらに、対象分子表面に関する最適な構造相補性を有する構造を得ることを本質的な目的として、アミノ酸配列の最適化（配列設計）、主鎖および側鎖の立体配座の最適化、ならびに原子位置の最適化を非限定的に含む構造最適化操作を含む。そのようなマッチング手順は本明細書において「伝導マッチング手順」と呼ばれる。
【０１２５】
マッチング手順のいずれか１つの操作は、上に論じた制約および拘束などといった最適化のための規則、例えば、原子位置の移動に対する調和拘束および、アミノ酸の変更のためのＰＳＳＭ値を用いる間に行われ得る。さらに、いくつかの最適化操作は様々な領域において再構成構造のアミノ酸配列を変化させるため、結果として生じる構造全体に新しい一連の配列制約規則（例えばＰＳＳＭ）を再び割り当ててもよい。
【０１２６】
剛体配向操作は通常、再構築構造と化学的存在物の一部を形成する対象分子表面との間での相対配向により、互いに異なった複数の再構築構造−分子表面複合体を生成する（図２のボックス１５）。
【０１２７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、マッチング手順は概略マッチング手順であり、当該手順は簡約表現ドッキング操作を含む。いくつかの実施形態によれば、概略マッチング手順の結果として生じる複数のマッチング済複合体は、ＲＭＳＤによって相対配向の類似性を有するクラスタへとさらに分類され得（典型的には、Åで表した範囲基準によってクラスタリングされる）、マッチング手順ステップの中でのさらなるプロセス、すなわち別サイクルのマッチング手順、例えば他の最適化操作を含み得る伝導マッチング手順のために、各相対配向クラスタからクラスタ代表複合体が選択される。
【０１２８】
いくつかの実施形態によれば、伝導マッチング手順（別サイクルのステップ（ｘ））は、概略マッチング手順において生じる複合体構造の選抜のために行われる（図２のボックス１６ａ）。
【０１２９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、伝導マッチング手順は完全表現ドッキング操作を含み得、当該完全表現ドッキング操作は、他の最適化操作、例えば現在の複合体の再構築構造におけるアミノ酸の変更と組み合わせて行われ、当該アミノ酸の変更は、本明細書において「配列設計」と呼ばれる。配列設計は通常、ＰＳＳＭ値などの規則、例えば再構築構造全体に対して再び割り当てられるＰＳＳＭによって規定される。これらの実施形態によれば、配列設計は、いくつかの実施形態または本発明に従って：
再構築構造と対象分子表面との間の境界面；
境界面を取り囲む外殻内にある再構築構造の領域；
セグメントを取り囲む外殻内にある再構築構造の領域；および／または
再構築構造の全体またはそのあらゆる（１つ以上の）部分
に存在する、再構築構造アミノ酸残基に対して実行される。
【０１３０】
いくつかの実施形態によれば、外殻は、半径が２〜２０Åであること、あるいは半径が２Å、３Å、４Å、５Å、６Å、７Å、８Å、９Å、１０Å、１１Å、１２Å、１５Åまたは２０Åであることを特徴とする。いくつかの実施形態によれば、外殻半径は６Åである。
【０１３１】
いくつかの実施形態によれば、マッチング手順はさらにマッチング評価手順を含み、当該評価手順は、マッチング手順の現在のサイクルにおいて生じる最適化された複合体の各々について１つ以上のマッチングスコアを生成する。
【０１３２】
用語「マッチングスコア」は、（構造と対象分子表面との間の境界面で埋没した）埋没面積、構造と対象分子表面との間での形状相補性、および構造と対象分子表面との間の結合エネルギーまたは親和性、ならびにそれらのあらゆる組み合わせを非限定的に含めた、様々な複合体属性評価を包含する。
【０１３３】
複合体評価に用いられる別の基準は、再構築構造に関係するフォールド安定性であり、当該フォールド安定性は、対象分子表面に結合していないときの遊離タンパク質との関連において考慮される。いくつかの実施形態によれば、再構築構造のフォールド安定性はパッキング性によって決定され得、当該パッキング性は、計算された再構築構造の自由エネルギーに応じて評価される。
【０１３４】
各々のマッチングスコア基準には、選択フィルタとして用いられるカットオフ値、すなわち最小埋没面積、最小形状相補性、最小結合自由エネルギー、最小パッキング性および最小パッキング性が割り当てられる（図２のボックス１７ａ）。
【０１３５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、代替的なステップ（ｘ）は伝導マッチング手順を含み、当該伝導マッチング手順において、再構築構造−分子表面複合体にはマッチングスコア、例えば埋没表面についてのスコアが割り当られており、選択された所定のカットオフ基準に基づきそのマッチングスコアが許容可能であると見出される場合、例えば、そのマッチングスコアが最小埋没表面カットオフ値を超える場合（図２のボックス１７ａ）には、その適格な複合体は、現在の複合体の再構築構造における少なくとも１つの重み調整再閉鎖セグメントが、本明細書において「置換セグメント」と呼ばれる対応する別の重み調整再閉鎖セグメント（図２のボックス９）で場合により置換され得る（図２のボックス１８）。
【０１３６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、適格な複合体は、複数の適格な複合体からランダムに抜き出され、ステップ（ｘｉ）を受け、結果として生じる複合体は追加でのステップ（ｘ）のサイクル、例えばもう１回の伝導マッチングサイクルを受ける（図２のボックス１６ｂ）。いくつかの実施形態によれば、適格な複合体をランダムに抜き出すことを、ランダム選択のためのモンテカルロ・ルーチンによって実行してもよい。
【０１３７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、場合により行われるステップ（ｘｉ）は、被置換再構築構造−分子表面複合体を設計すべく、ランダムに抜き出された適格な複合体の再構築構造における少なくとも１つの重み調整再閉鎖セグメントを対応する別の重み調整再閉鎖セグメントで置換すること、およびステップ（ｘ）を繰り返すことを含む（図２のボックス１８）。
【０１３８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ステップ（ｘ）を繰り返すサイクルは、被置換再構築構造について行われるものであり、上記の伝導マッチング手順である（図２のボックス１６ｂ）。いくつかの実施形態において、伝導マッチング手順の一部を形成している配列設計は、置き換えられたセグメント全体および、場合によっては被置換再構築構造の他の領域、例えば、対象分子表面と被置換再構築構造との間の境界面を取り囲む外殻内にある領域、置き換えられたセグメント全体を取り囲む外殻内にある被置換再構築構造の領域、あるいは被置換再構築構造の全体またはそのあらゆる（１つ以上の）部分に対して行われ得る。本発明のいくつかの実施形態によれば、伝導マッチング手順は、分子的存在物の対象分子表面に対する被置換再構築構造の親和性を最適化することを目的とし、また被置換再構築構造のフォールドの安定性を得るための、いかなる最適化操作を含んでいてもよい。そのような追加の最適化操作としては、限定はしないが、例えば、単独アミノ酸あるいは組み合わせたアミノ酸のアミノ酸同一性および立体配座（回転異性体の立体配座（立体配座異性）のみの場合または非回転異性体の立体配座の場合を含む）を変更するかまたは同じＦＳＳＰの天然起源の構造に認められる立体配座で制限／補完すること、置き換えられたセグメントの主鎖立体配座を主鎖最小化、ＣＣＤ、ペプチド断片挿入、運動学的ループ閉鎖またはあらゆる主鎖立体配座改良操作の使用によって変更すること、天然起源の抗体構造に認められる配向に由来する制約を使用して他のセグメントの相対的な立体配座を互いに関して変更および最適化することなどが挙げられる。
【０１３９】
本発明の実施形態によれば、伝導マッチング手順を受ける複合体には、埋没面積スコア、形状相補性スコアおよび結合エネルギースコアのうちの少なくとも１つ、ならびにフォールド安定性スコア、ならびにそれらのあらゆる組み合わせを非限定的に含む、マッチングスコアが割り当てられる。本発明のいくつかの実施形態によれば、マッチングスコアは、分子的存在物の対象分子表面に対する被置換再構築構造の親和性を評価しかつ被置換再構築構造のフォールドの安定性を評価するために使用され得る属性のいかなる組み合わせをも含み、当該組み合わせには、結合境界面に関係する電荷相補性、極性および疎水性のスコア、分子動力学によって評価される立体配座剛直性スコア、ブラウン動力学スコア、タンパク質可動性スコアの基準振動解析（ＮＭＡ）、（ヒト天然アミノ酸配列との類似性を反映する）ヒト化スコア、所与の発現系に対するアミノ酸配列適合性、アミノ酸配列の望ましくない部分の回避などがあらゆる組み合わせで非限定的に含まれる。
【０１４０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、組み合わせたマッチングスコアを使用して、設計最適化マッチング手順を受けた適格な複合体が評価され、分子的存在物の対象分子表面に対する所望の親和性を有するアミノ酸配列が選択され、当該アミノ酸配列は、再構築され最適化された適格な複合体の構造に対応する。
【０１４１】
いくつかの実施形態によれば、ステップ（ｘｉｉ）は、上記のマッチングスコアのうちの１つ以上に基づいて、分子的存在物の対象分子表面に対する所望の親和性を有するアミノ酸配列を選択することを含む（図２のボックス１７ｂ）。
【０１４２】
ステップ（ｘｉｉ）から生じる適格な複合体に属する複数のアミノ酸配列は、分子的存在物の対象分子表面に対する所望の親和性、ならびに属性スコアリングの様々な組み合わせから生じる他の所望の属性を有する配列の群を構成する（図２のボックス１９）。
【０１４３】
共通構造フォールド：
上に論じたように、共通構造フォールドを有するアミノ酸配列のライブラリをコンピュータ計算により構築する方法ならびに分子的存在物の対象分子表面に対する所望の親和性を有するアミノ酸配列を設計および選択する方法は、本発明のいくつかの実施形態によれば、実験的に得られた３Ｄ構造の利用可能ないずれかの類似構造タンパク質ファミリー（ＦＳＳＰ）に適用することができる。
【０１４４】
広く知られているいくつかのＦＳＳＰの例としては、限定はしないが例えば、「アルファ／ベータ加水分解酵素」、「ベータグラスプ」（ユビキチン様フォールド）、「ギリシャキー」、「ゼリーロール」、「キーロール」、「プレイト」（フェレドキシン様フォールド）、「ロスマンフォールド」、「ベータトレフォイル」、「アンキリンリピート」、「アルマジロリピート」、「テトラトリコペプチドリピート」および「ＴＩＭバレル」が挙げられ、これらの天然に遍在するフォールドは当該技術分野において既知である。本明細書において示される方法は主に抗体との関連において例示されているものの、いくつかの天然起源の巨大分子によって共有されている他の共通タンパク質フォールド、モチーフおよびドメインに対して同じ概念を適用できることを理解すべきであることに留意されたい。
【０１４５】
以下の表１は、ＳＣＯＰ２サーバー［Ｍｕｒｚｉｎ  Ａ．Ｇ．ら、「ＳＣＯＰ：ａ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ」、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９５、２４７、５３６−５４０；Ａｎｄｒｅｅｖａ，Ａ．ら、「ＳＣＯＰ２  ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ：ａ  ｎｅｗ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｍｉｎｉｎｇ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２０１４、４２（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）、ｐ．Ｄ３１０−４］によって蓄積された共通タンパク質フォールドの非限定的な一覧を表し、それを用いてＦＳＳＰにおけるソース構造を同定することができる。
【０１４６】
【表１】
2017526053.tif 000003
2017526053.tif 000004
【０１４７】
表１（続き）
2017526053.tif 000005
2017526053.tif 000006
【０１４８】
表１（続き）
2017526053.tif 000007
2017526053.tif 000008
【０１４９】
表１（続き）
2017526053.tif 000009
2017526053.tif 000010
【０１５０】
表１（続き）
2017526053.tif 000011
2017526053.tif 000012
【０１５１】
表１（続き）
2017526053.tif 000013
2017526053.tif 000014
2017526053.tif 000015
【０１５２】
表１（続き）
2017526053.tif 000016
【０１５３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上に示したＦＳＳＰ（表１）の小サブセットとしては、限定はしないが例えば、免疫グロブリンの共通フォールド、「アルファ／ベータ加水分解酵素」、「ベータグラスプ」（ユビキチン様フォールド）、「ギリシャキー」、「ゼリーロール」、「キーロール」、「プレイト」（フェレドキシン様フォールド）、「ロスマンフォールド」、「ベータトレフォイル」、「アンキリンリピート」、「アルマジロリピート」、「テトラトリコペプチドリピート」および「ＴＩＭベータ／アルファバレル」が挙げられる。
【０１５４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、共通構造フォールドは抗体のものである。本発明がなされた時点で１９００個を超えるＰＤＢエントリーが利用可能であることに留意されたい。
【０１５５】
本明細書において用いられる用語「抗体」は、完全な分子ならびにその機能的断片、例えば、マクロファージなどに結合できるＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂおよびＦｖを包含する。これらの機能的抗体断片としては、限定はしないが例えば：（１）Ｆａｂ、すなわち、完全な軽鎖と１つの重鎖の一部とをもたらすパパインなどのタンパク質分解酵素による全抗体の分解によって生成し得る、抗体分子の一価抗原結合断片を含有する断片；（２）Ｆａｂ’、すなわち、完全な軽鎖と重鎖の一部とをもたらすペプシンなどのタンパク質分解酵素による全抗体の処理およびその後の還元によって得られ得る、抗体分子の断片；１つの抗体分子あたり２つのＦａｂ’断片が得られる；（３）Ｆ（ａｂ’）２、すなわち、ペプシンなどのタンパク質分解酵素により全抗体を処理することによって、その後の還元を行わずして得られる抗体の断片；Ｆ（ａｂ’）２は、２つのジスルフィド結合によって繋ぎ合わされた２つのＦａｂ’断片からなる二量体である；（４）Ｆｖ、すなわち、２本の鎖として発現される軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域とを含有する遺伝子組換え断片として定義されるもの；および（５）一本鎖抗体（「ＳＣＡ」）、すなわち、遺伝子融合一本鎖分子として適切なポリペプチドリンカーによって連結された、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域とを含有する遺伝子組換え分子が挙げられる。
【０１５６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、共通構造フォールドは、２本の鎖として発現される軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域とを含有する遺伝子組換え断片として定義される抗体のＦｖの共通構造フォールドである。
【０１５７】
ＴＩＭベータ／アルファバレル・フォールドの例示的なＦＳＳＰに関して、本発明のなされた時点で、ＴＩＭベータ／アルファバレル・フォールドを有するかまたは少なくともＴＩＭベータ／アルファバレル・ドメインを含有するタンパク質について２０００個を超えるＰＤＢエントリーが利用可能であることに留意されたい。この例示的なＦＳＳＰとしては、限定はしないが例えば、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＩＭ）、リブロースリン酸結合バレル、チアミンリン酸合成酵素、ピリドキシン５’リン酸合成酵素、ＦＭＮ連結オキシドレダクターゼ、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＭＰＤＨ）、ＰＬＰ結合バレル、ＮＡＤ（Ｐ）連結オキシドレダクターゼ、（トランス）グリコシダーゼ、金属依存性加水分解酵素、アルドラーゼ、エノラーゼＣ末端ドメイン様、ホスホエノールピルビン酸／ピルビン酸ドメイン、マレイン酸合成酵素Ｇ、ＲｕＢｉｓＣｏ・Ｃ末端ドメイン、キシロースイソメラーゼおよびキシロースイソメラーゼ様、バクテリアルシフェラーゼおよびバクテリアルシフェラーゼ様、ニコチン酸／キノリン酸ＰＲＴアーゼＣ末端ドメイン様、ＰＬＣ様ホスホジエステラーゼ、コバラミン（ビタミンＢ１２）依存性酵素、ｔＲＮＡグアニントランスグリコシラーゼ、ジヒドロプテロイン酸合成酵素およびジヒドロプテロイン酸合成酵素様、ＦＡＤ連結オキシドレダクターゼ、モノメチルアミン・メチルトランスフェラーゼＭｔｍＢ、ホモシステインＳ−メチルトランスフェラーゼ、（２ｒ）−ホスホ−３−スルホラクテート合成酵素ＣｏｍＡ、ラジカルＳＡＭ酵素、ＧｌｐＰ様、ＣｕｔＣ様、ＴｈｉＧ様、ＴＭ１６３１様ならびにＥＡＬドメイン様のタンパク質が挙げられる。
【０１５８】
アルファ／ベータ加水分解酵素フォールドの代表的なＦＳＳＰに関しては、本発明のなされた時点で、アルファ／ベータ加水分解酵素フォールドを有するかまたは少なくともアルファ／ベータ加水分解酵素ドメインを含有するタンパク質について１６００個を超えるＰＤＢエントリーが利用可能であることに留意されたいが、当該タンパク質は、限定はしないものの、アセチルコリンエステラーゼ、カルボキシルエステラーゼ、マイコバクテリア抗原、仮説上のタンパク質ＴＴ１６６２、ＰｅｐＸ触媒ドメイン、プロリルオリゴペプチダーゼＣ末端ドメイン、ＤＰＰ６触媒ドメイン、セリンカルボキシペプチダーゼ、胃リパーゼ、プロリンイミノペプチダーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、ハロアルカンデハロゲナーゼ、ジエンラクトン加水分解酵素、炭素−炭素結合加水分解酵素、ビオチン生合成タンパク質ＢｉｏＨ、アクラシノマイシンメチルエステラーゼＲｄｍＣ、カルボキシエステラーゼ／リパーゼ、エポキシド加水分解酵素、ハロペルオキシダーゼ、チオエステラーゼ、カルボキシエステラーゼ／チオエステラーゼ１、Ｃｃｇｌ／ＴａｆＩＩ２５０相互作用因子Ｂ（Ｃｉｂ）、細菌エステラーゼ、真菌リパーゼ、細菌リパーゼ、膵臓リパーゼのＮ末端ドメイン、ヒドロキシニトリルリアーゼ、ポリペプチドのチオエステラーゼドメイン、ポリケチドおよび脂肪酸の合成酵素、クチナーゼ、ＹｄｅＮ、推定上のセリン加水分解酵素Ｙｄｒ４２８ｃ、アシルアミノ酸遊離酵素のＣ末端ドメイン、仮説上のエステラーゼＹＪＬ０６８Ｃ、Ａｔｕ１８２６、ＰＨＢ解重合酵素、ＩｒｏＥ様、ＴＴＨＡ１５４４、Ｏ−アセチルトランスフェラーゼならびに２，６−ジヒドロ擬似オキシニコチン加水分解酵素に認められる。
【０１５９】
ロスマンフォールドの代表的なＦＳＳＰに関しては、本発明のなされた時点で、ロスマンフォールドを有するかまたは少なくともロスマンドメインを含有するタンパク質について１３５０個を超えるＰＤＢエントリーが利用可能であることに留意されたいが、当該タンパク質は、限定はしないものの、アルコールデヒドロゲナーゼ、チロシン依存性オキシドレダクターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ギ酸／グリセリン酸デヒドロゲナーゼ、ＬＤＨ・Ｎ末端ドメイン様、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼ、カリウムチャネルＮＡＤ結合ドメイン、転写抑制因子Ｒｅｘ、ＣｏＡ結合ドメインならびにオルニチンシクロデアミナーゼに認められる。
【０１６０】
ＦＳＳＰ、ならびにタンパク質の三次元構造における保存されたフォールドおよびドメインの同定および分類についての議論は、例えば、Ｈｏｌｍ，Ｌ．ら、［Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９２、１、ｐ．１６９１−１６９８；Ｍａｒｃｈｌｅｒ−Ｂａｕｅｒ  Ａ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２００７、３５（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）、Ｄ２３７−４０；およびＭａｒｃｈｌｅｒ−Ｂａｕｅｒ  Ａ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２０１３、４１（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）、Ｄ３４８−５２において提供されており、それらは参照によってその全体があたかも本明細書において完全に示されたかのように本明細書に組み込まれる。ＦＳＳＰの包括的な議論、分類および同定については、当業者は例えば、公的に利用可能なサービス、例えばＳＣＯＰ［Ａｎｄｒｅｅｖａ  Ａ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００８、３６（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）、ｐ．Ｄ４１９−２５］、ＳＣＯＰ２［Ａｎｄｒｅｅｖａ，Ａ．ら、「ＳＣＯＰ２  ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ：ａ  ｎｅｗ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｍｉｎｉｎｇ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２０１４、４２（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）、ｐ．Ｄ３１０−４］などを使用することができる。
【０１６１】
対象分子表面に対する所望の親和性を有するタンパク質のアミノ酸配列を作製する方法：
本明細書において示される方法の産物は、本発明のいくつかの実施形態によれば、実験的な生体外／生体内での手順を用いた発現およびさらなる最適化が推奨される一連のアミノ酸配列（図２のボックス１９）である。
【０１６２】
したがって、本発明のいくつかの実施形態の別の態様によれば、対象分子表面に対する所望の親和性を有するアミノ酸配列を作製する方法が提供され、当該方法は：
本明細書において示される、分子的存在物の対象分子表面に対する所望の親和性を有するアミノ酸配列を設計および選択する方法の実施形態に従って、対象分子表面に対する所望の親和性を有するアミノ酸配列を設計および選択すること；ならびに
当該アミノ酸配列を発現系において発現させること
によって実行され、
それにより、対象分子表面に対する所望の親和性を有するアミノ酸配列を作製する。
【０１６３】
最も一般的には、設計されたタンパク質またはタンパク質の断片を、タンパク質または断片をコード化するＤＮＡセグメント（本明細書において遺伝子鋳型と呼ばれる）へと逆翻訳および逆転写することができる。その後、この遺伝子鋳型を、一般的かつ商業的に利用可能な確立された技法を用いて合成することができる。一般に使用されるｐＥＴまたはその他のタンパク質発現プラスミドへの制限−ライゲーション反応または相同組換えが可能な５’および３’断片を、標準的なＰＣＲ伸長によって遺伝子鋳型に追加する。その後、適合する制限酵素を使用して遺伝子鋳型を発現プラスミド内に制限すること、または相同組換えによって遺伝子鋳型を発現プラスミドに組み込むことができる。適合する遺伝子をコード化するプラスミドを用いて標準的な発現生物（細菌、酵母、ファージ、昆虫または哺乳動物細胞）を形質転換し、発現を誘導する。
【０１６４】
タンパク質の大きさおよび複雑性を考えると、化学合成は通常、本明細書において示されるいずれか１つの方法によって得られるアミノ酸配列を発現させるための実現可能な選択肢ではない。その代わりに、生細胞およびそれらの細胞機構を生体発現系として利用して、対応する遺伝子鋳型に基づいて設計タンパク質を形成および構築することができる。
【０１６５】
タンパク質とは異なり、対象タンパク質の遺伝子鋳型（ＤＮＡ）は、十分に確立された組換えＤＮＡ技術を用いて合成的にまたは生体外で構築することが比較的簡単である。したがって、本明細書において示されるいずれか１つの方法によって得られた、追加のレポーターまたは親和性タグ配列を有するかまたは有さない特定のアミノ酸配列のＤＮＡ鋳型を、設計組換えタンパク質の発現のための鋳型として構築することができる。
【０１６６】
組換えタンパク質発現のための方策は、当該技術分野においてよく知られており、典型的には、対象遺伝子鋳型を含有するＤＮＡベクターを細胞に遺伝子導入した後、細胞を培養して、その結果として細胞に設計タンパク質の転写および翻訳を行わせる、ということを含む。通常はその後に細胞を溶解させて、発現されたタンパク質を次の精製のために抽出する。原核性および真核性の生体内タンパク質発現系はいずれも広く用いられている。系の選択は、タンパク質の種類、機能的活性のための必要条件、および望まれる収率に応じてなされる。
【０１６７】
細菌は培養が容易であり、速やかに増殖し、設計された組換えタンパク質を高収率で生産することから、細菌性タンパク質発現系は最も広く用いられている。しかしながら、細菌内で発現した多ドメインの真核性タンパク質は機能的でないことが多い、というのも、必要とされる翻訳後修飾または分子折り畳みを達成するために必要なものが細胞に備わっていないからである。また、多くのタンパク質は、過酷な変性剤およびそれに続く煩雑なタンパク質再折り畳み手順無しでは回復が非常に困難な封入体となって不溶になる。
【０１６８】
哺乳動物生体内発現系は通常、いくつかの注目すべき限界を有して機能的タンパク質を産生する。無細胞のタンパク質発現は、翻訳に適合した全細胞抽出物を使用する生体外でのタンパク質合成である。原理的に、全細胞抽出物は転写、翻訳、ひいては翻訳後修飾のために必要なあらゆる巨大分子成分を含有する。これらの成分としては、例えば、ＲＮＡポリメラーゼ、制御性タンパク質因子、転写因子、リボソームおよびｔＲＮＡが挙げられる。補因子、ヌクレオチドおよび特定の遺伝子鋳型が補給されると、これらの抽出物は比較的容易に対象タンパク質を合成することができる。
【０１６９】
通常は大規模生産のためには維持不可能であるものの、無細胞のタンパク質発現系は、従来の生体内での系に対していくつかの利点を有する。無細胞系は、細胞内プロテアーゼによる迅速なタンパク質分解変性を受ける設計タンパク質の発現だけでなく、改変されたアミノ酸によるタンパク質標識をも可能にする。また、無細胞法を用いた場合、多様なタンパク質を同時に発現させること（例えば、多様な組換えＤＮＡ鋳型からの小規模での発現によって設計タンパク質を試験すること）がより簡単である。
【０１７０】
本発明のいくつかの実施形態において、共通構造フォールドは、抗体の共通構造フォールドである。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体ならびにその断片を作製する方法は、当該技術分野においてよく知られている（例えば、参照によって本明細書に組み込まれる、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク、１９８８を参照）。
【０１７１】
本発明のいくつかの実施形態において、共通構造フォールドは、抗体の断片の共通構造フォールドである。本発明のいくつかの実施形態による抗体断片は、抗体のタンパク質加水分解、または当該断片をコード化するＤＮＡの大腸菌もしくは哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養物または他のタンパク質発現系）における発現によって作製することができる。抗体断片は、従来の方法による全抗体の分解のためにペプシンまたはパパインなどのタンパク質分解酵素を使用することによって得ることができる。例えば、ペプシンによる抗体の酵素的開裂によって抗体断片を作製して、Ｆ（ａｂ’）２で表される５Ｓ断片を得ることができる。チオール還元剤と、場合によってはジスルフィド結合の開裂により生じるスルフヒドリル基の保護基とを使用してこの断片をさらに開裂させて、３．５Ｓ  Ｆａｂ’一価断片を得ることができる。あるいは、ペプシンを使用する酵素的開裂は２つの一価Ｆａｂ’断片とＦｃ断片とを直接生成する。これらの方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇによる米国特許番第４，０３６，９４５号および第４，３３１，６４７号ならびにその中に含まれる参考文献に記載されており、その特許は参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。また、Ｐｏｒｔｅｒ，Ｒ．Ｒ．［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．７３：１１９−１２６（１９５９）］も参照されたい。また、完全抗体によって認識される抗原に断片が結合する限り、抗体を開裂させるその他の方法、例えば、一価の軽重鎖断片を形成するための重鎖の分離、断片のさらなる開裂、または他の酵素的、化学的もしくは遺伝子的な技術を用いてもよい。
【０１７２】
Ｆｖ断片は、VH鎖とVL鎖との会合体を含む。この会合体は、Ｉｎｂａｒらの［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国  ６９：２６５９−６２］に記載されているように非共有結合性のものであり得る。あるいは、可変鎖を分子間ジスルフィド結合によって連結させるかまたはグルタルアルデヒドなどの化学物質で架橋させることができる。好ましくは、Ｆｖ断片は、ペプチドリンカーによって連結されたVH鎖およびVL鎖を含む。これらの一本鎖抗原結合タンパク質（ｓｃＦｖ）は、オリゴヌクレオチドによって連結されたVHおよびVLのドメインをコード化するＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することによって作製される。構造遺伝子を発現ベクターに挿入し、次にそれを大腸菌などの宿主細胞内に導入する。組換え宿主細胞は、２つのＶドメインに架橋したリンカーペプチドを有する一本のポリペプチド鎖を合成する。ｓｃＦｖを作製する方法は、例えば、［ＷｈｉｔｌｏｗおよびＦｉｌｐｕｌａ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２：９７−１０５（１９９１）；Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６（１９８８）；Ｐａｃｋら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：１２７１−７７（１９９３）；および米国特許第４，９４６，７７８号に記載されており、それは参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１７３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本明細書において示される方法は、その実施形態のいずれか１つ、およびそのあらゆる組み合わせを含めて、例えば抗体などのタンパク質の構造をヒト化するために用いることができる。本発明のこれらの実施形態との関連において、タンパク質、例えば抗体のＦｖ断片の結合ドメインのアミノ酸配列を本発明の実施形態に従って設計し、その後、当該アミノ酸配列との適合性が最も高いヒトフレームワークを見つけることによってタンパク質全体をヒト化する。そのような方法は、本明細書において記載されるタンパク質ヒト化のためのいくつかの技法の原理に倣うものである。
【０１７４】
非ヒト抗体をヒト化するための方法は当該技術分野において既知である。通常、ヒト化抗体は、非ヒト根源から導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしばインポート残基と呼ばれるが、本発明のいくつかの実施形態との関連においては、本明細書において示される方法による設計の産物である。ヒト化は本質的に、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同者らの方法［Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４−１５３６（１９８８）］に従って非ヒト配列によって対応する設計アミノ酸配列を置換することにより行うことができる。
【０１７５】
非ヒト（例えばマウス）抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含有する、免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはその断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2または抗体のその他の抗原結合小配列など）のキメラ分子である。ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であって、相補性決定領域（ＣＤＲ）を形成しているアミノ酸配列、またはレシピエントのフレームワーク部分をも含んだより大きなドメイン（例えばＦｖドメイン）が、本発明において示される方法に従って設計された所望の特異性、親和性、安定性および能力を有するアミノ酸配列で置き換わった、ヒト免疫グロブリンを含む。いくつかの事例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワークアミノ酸配列は、本明細書において示される方法によって与えられる対応する非ヒトアミノ酸配列で置き換えられる。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもインポートされたＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見受けられない残基を含んでいてもよい。大抵、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインのうちの実質的に全てを含むものとなり、当該可変ドメインにおいて、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全ては、本明細書において示される方法によって与えられるＣＤＲ領域に相当し、ＦＲ領域の大部分または実質的に全ては、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲ領域である。場合によって、ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）（典型的にはヒト免疫グロブリンのそれ）の少なくとも一部をも含むであろう［Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２:３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、２：５９３−５９６（１９９２）］。
【０１７６】
完全または部分的に設計された抗体は、ファージディスプレイライブラリを含めた当該技術分野において既知の様々な技術を用いて作製することもできる［ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１（１９９１）］。ＣｏｌｅらおよびＢｏｅｒｎｅｒらの技術もまた、ヒトモノクローナル抗体を作製するために利用可能である［Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、ｐ．７７（１９８５）およびＢｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７（１）：８６−９５（１９９１）］。同様に、完全または部分的に設計された抗体は、内因性免疫グロブリン遺伝子を部分的または完全に不活性化させた遺伝子組換え動物（例えばマウス）にヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することによって作ることができる。免疫誘導に際して、完全または部分的に設計された抗体の産生が観察され、当該抗体は、遺伝子再構成、組立て、および抗体レパートリーを含めたあらゆる点で、ヒトにおいて見受けられるものに密接に類似する。この手法は、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号；第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，６６１，０１６号ならびに以下の科学文献：Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０、：７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６−８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８  ８１２−１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４、８４５−５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８２６（１９９６）；ならびに、ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３、６５−９３（１９９５）に記載されている。
【０１７７】
分子的存在物の対象分子表面：
本発明のいくつかの実施形態によれば、分子的存在物の対象分子表面に対する所望の親和性を有するアミノ酸配列（本明細書において「設計タンパク質」と呼ぶ）を設計および選択する方法は、分子的存在物の一部を形成する定義可能な対象分子表面の原子の原子座標を提供することによって、実行され得る。
【０１７８】
定義可能な分子表面を有する、とは、設計タンパク質との相互作用の意図された分子的存在物または少なくとも対象分子表面を三次元の原子座標によって表現できることを意味する。
【０１７９】
本明細書において用いられる語句「分子的存在物」は、三次元空間における一連の原子座標によって表現できる分子、化合物、複合体、付加物および／または合成物を表す。本発明のいくつかの実施形態によれば、原子座標は、標的の全ての原子または少なくとも非水素原子の相対位置を表す。
【０１８０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、分子的存在物の一部を形成している対象分子表面の原子座標を提供することで十分である、というのも本質的には、２つの存在物が複合体を形成する（互いに結合する）ときに設計タンパク質と相互作用するのは対象分子表面であるからである。言い換えると、本発明のいくつかの実施形態によれば、少なくとも、設計タンパク質と相互作用および結合することの意図される分子表面を定義する原子座標によって、分子的存在物が定義され得る。本発明のいくつかの実施形態によれば、対象分子表面は、方法が認識および結合の予想面積よりも広い面積を探索および同定することを可能にすべく、設計タンパク質への結合の推定面積よりも広い面積を包含するように定義される。
【０１８１】
分子的存在物の少なくとも対象分子表面の原子座標の元は、実体的な天然起源物質もしくは合成物質の試料に対して行われる例えばＸ線回折またはＮＭＲ分析などの実験的手順、コンピュータ計算による手順、またはその組み合わせによって得ることができる。
【０１８２】
対象分子表面は、それに関連し、かつ主要部分の枠組み内で原子座標を割り当てることができるものの必ずしも共有結合的に結合していない、原子を含み得る。例えば、本発明のいくつかの実施形態によれば、対象分子表面は、分子的存在物に属する原子の原子座標、および水素結合によって分子的存在物に結合している溶媒(例えば水)分子の原子座標によって表現される。同様に、分子的存在物に関連するイオンの原子座標も、対象分子表面の構造表現の一部を形成し得る。
【０１８３】
対象分子表面の原子座標は、本発明のいくつかの実施形態によれば、所与の条件下で熱力学的に安定なものを表してもよく、あるいは、同じ分子的存在物のより安定な２つの立体配座の間での標的分子の遷移状態の場合のように、不安定な立体配座の三次元構造を表してもよい。対象分子表面は、２つ以上の状態、したがって２つ以上の認識可能な分子表面を有する細胞受容体タンパク質の場合のように、単一の分子的存在物のいくつかの配座異性体のうちの１つを表すこともできる；当該分子表面の各々について、本発明の開示の方法を用いて設計タンパク質を設計することができる。
【０１８４】
分子的存在物は、典型的には、他を排除しないものの、１つ以上の生物学的活性および／または薬理活性を発揮できるものである。本発明のいくつかの実施形態によれば、分子的存在物は、用語「生理活性剤」、「薬理活性剤」、「薬理活性物質」、「治療活性剤」、「生物学的活性剤」、「治療剤」、「薬剤」ならびにその他の、例えば遺伝子治療剤、非遺伝子治療剤、小分子および細胞を含めた関連用語のいずれかと交換可能に使用することができる。
【０１８５】
分子的存在物であって、そのために本明細書において記載される方法を用いて設計タンパク質が設計され得る分子的存在物の代表例としては、限定はしないが、アミノ酸ならびにペプチド系およびタンパク質系物質、例えばサイトカイン、ケモカイン、化学遊走物質、化学忌避物質、作動薬、拮抗薬、抗体、抗原、酵素、補因子、増殖因子、ハプテン、ホルモンおよび毒素；ヌクレオチド系物質、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、標識されたオリゴヌクレオチド、核酸構成物およびアンチセンス；糖類、多糖類、リン脂質、糖脂質、ウイルスおよび細胞、ならびに親水性または両親媒性の放射性同位体、放射性医薬品、受容体、ステロイド、ビタミン、血管新生促進剤、薬剤、抗ヒスタミン剤、抗生物質、抗鬱薬、降圧薬、抗炎症薬、抗酸化物質、抗増殖剤、抗ウイルス薬、化学療法剤、補因子、コレステロール、脂肪酸、胆汁酸、サポニン、ホルモン、金属イオン、合成または天然の表面、阻害剤およびリガンド、ならびにそのあらゆる組み合わせが挙げられる。
【０１８６】
本明細書において記載される分子的存在物の各々は、巨大生体分子または小さな有機分子であり得る。
【０１８７】
本明細書において用いられる用語「巨大生体分子」は、生きた生物において天然に生じる高分子生化学物質またはバイオポリマーを指す。高分子巨大生体分子は、主として有機化合物である、つまりそれらは、主として炭素および水素から構成され、場合によって、典型的に窒素、酸素、リンおよび／または硫黄と共に構成され、他の元素が低発生率ながら中に含まれ得る。アミノ酸およびヌクレオチドは、高分子巨大生体分子の最も重要な構成要素のうちのいくつかであり、したがって巨大生体分子は典型的には、重合アミノ酸（例えばペプチドおよびタンパク質）、重合ヌクレオチド（例えば核酸）、重合糖類、重合脂質およびそれらの組み合わせのうちの１本以上の鎖からなる。巨大分子は、互いに共有結合的または非共有結合的に連結され得るいくつかの巨大分子サブユニットの複合体を含み得る。リボソーム、細胞小器官および完全ウイルスもまた、用語「巨大生体分子」のもとで本明細書において包含される。
【０１８８】
本明細書において使用される巨大生体分子は、分子量が１０００ダルトン（Ｄａ）超であり、３０００Ｄａ超、５０００Ｄａ超、１０ｋＤａ超、ひいては５０ＫＤａ超であり得る。
【０１８９】
巨大生体分子であって、そのために本明細書において記載される方法を用いて抗体が設計され得る巨大生体分子の代表例としては、限定はしないが、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、酵素、抗体、オリゴヌクレオチドおよび標識されたオリゴヌクレオチド、核酸構成物、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンス、多糖類、受容体、ウイルスならびにそれらのあらゆる組み合わせ、ならびに完全細胞または他の細胞内成分および細胞断片が挙げられる。
【０１９０】
本明細書において用いられる語句「小有機分子」または「小有機化合物」は、窒素、酸素、リンおよび硫黄ならびに低発生率の他元素と共に、主として炭素および水素から構成される、小化合物を指す。有機分子は、生物界全体および合成的に作られた全ての有機化合物を構成し、したがってそれらは全ての天然代謝物および人工薬を含む。本発明との関連において、化合物、薬剤または分子に関する用語「小」は、１モル当たり約１０００グラム未満の分子量を指す。それゆえ、小有機分子は分子量が１０００Ｄａ未満、５００Ｄａ未満、３００Ｄａ未満または１００Ｄａ未満である。
【０１９１】
小有機分子であって、そのために本明細書において記載される方法を用いて抗体が設計され得る小有機分子の代表例としては、限定はしないが、血管新生促進剤、サイトカイン、ケモカイン、化学遊走物質、化学忌避物質、薬剤、遷移状態類似体、作動薬、アミノ酸、拮抗薬、抗ヒスタミン剤、抗生物質、抗原、抗鬱薬、降圧薬、抗炎症薬、抗酸化物質、抗増殖剤、抗ウイルス薬、化学療法剤、補因子、脂肪酸、増殖因子、ハプテン、ホルモン、阻害剤、リガンド、糖類、放射性同位体、放射性医薬品、ステロイド、毒素、ビタミンおよびそれらのあらゆる組み合わせが挙げられる。
【０１９２】
ｄｅ  ｎｏｖｏ設計タンパク質：
上記に示したように、本発明の実施形態はアミノ酸配列を設計する方法を提供し、当該アミノ酸配列は、対象分子表面に対する所望の親和性を呈する安定な３Ｄ構造へと折り畳まれることができる。本明細書において開示される方法は、ふさわしい安定な全体構造を維持しつつ、定義可能な分子表面を有するいかなる分子的存在物にも高い親和性および選択性で結合できる、結合タンパク質を設計するために適用できる。「定義可能」とは、分子表面が、その原子の各々またはその原子の少なくともいくつかについての一連の原子座標によって表現できることを意味する。
【０１９３】
本発明のいくつかの実施形態の別の態様によれば、対象分子表面に対する所望の親和性を有するアミノ酸配列が提供される。このアミノ酸配列は、以下に例示するように生体外発現系において使用するための対応する遺伝子鋳型を作り出すために用いることができる。
【０１９４】
本発明のいくつかの実施形態において、対象分子表面に対する所望の親和性を有するアミノ酸配列は、抗体断片のそれであり、当該抗体断片は、例えば、一本鎖構成物（ｓｃＦｖ）としての抗体の可変ドメイン（Ｆｖ）または、天然起源の定常ドメインと融合して、ジスルフィド連結されるか一本鎖（ｓｃＦａｂ）へと融合するかのいずれかによって抗体断片（Ｆａｂ）となったもの、もしくは抗体の完全長ＩｇＧとなったものである。抗体を発現させ結合性を試験する多くの代替経路が存在する。これらとしては、例えば、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイおよび酵母ディスプレイ、細菌発現および封入体からの再折り畳み、細菌、酵母、哺乳動物または昆虫の細胞からの抗体分泌が挙げられる。これらの経路の各々における最初のステップとして、設計された対象の設計抗体は、可変軽鎖および可変重鎖のドメインが別々で、あるいはｓｃＦｖ構成物の場合には１つの遺伝子セグメントとして融合されて、発現プラスミド内へクローニングされる。手短に言えば、各設計抗体は、オリゴＤＮＡから合成されるかまたは、カスタムＤＮＡ合成サービスで注文され、酵母細胞表面ディスプレイのためにｐＣＴＣＯＮ２プラスミド内へクローニングされる。酵母の形質転換、発現および結合性評価は当該技術分野において既知であり、標準的な実験用フローサイトメーターまたは蛍光活性化フローサイトメーター（ＦＡＣＳ）を使用して、蛍光標識された抗ｃｍｙｃ抗体および結合を用いて設計抗体の発現レベルをモニタリングする。
【０１９５】
設計タンパク質の例示的な用途：
本明細書において示される方法は、限定はしないが：
既存の天然結合タンパク質に基づく改善および改良された結合タンパク質（それは天然タンパク質に比べて安定性、親和性または特異性が高いことを特徴とする）を設計するために用いることができ；
既知の非ヒト結合タンパク質（例えば抗体）に最も適合するヒトフレームワークを見つけることによって当該非ヒト結合タンパク質をヒト化するために用いることができ；
医薬、分析または診断での使用を含めた、合成および精製作業などのためのツールとしてのあらゆる使用のために、いかなる分子的存在物に対してもｄｅ  ｎｏｖｏ結合タンパク質を設計するために用いることができ；
実験的３Ｄ構造が利用可能でない結合タンパク質の構造を、既知のそのリガンドの構造に基づいて、または単離されたタンパク質の配列だけに基づいて予測するために用いることができる。
【０１９６】
対象分子表面は、たとえその表面が立体配座的に動的である、つまり所与の条件下で立体配座が変化する分子的存在物の表面であるとしても原子座標によって定義され得るため、本明細書において示される方法は、たとえ分子的存在物の分子表面が遷移状態または中間体として現れるとしてもその表面に結合できるタンパク質（例えば抗体など）を設計することができる。
【０１９７】
本明細書において示される方法を用いて、遷移状態の分子表面を使用することによって酵素および他の触媒タンパク質、例えば触媒抗体を設計することができる。例えば、基質と生成物との間の遷移状態に対応する立体配座における分子の分子表面に結合するようにタンパク質を設計することができる。そのようなタンパク質は、分子に結合すると同時に分子の遷移状態立体配座を付与または促進し、それによって基質から生成物への遷移（反応）を触媒するであろう。
【０１９８】
また、本明細書において示される方法は、受容体のいずれか１つの立体配座状態、さもなければあらゆる分子スイッチの分子表面として使用することによって、シグナルタンパク質を設計するために用いることもできる。例えば、「オン」、「オフ」、「開く」、「閉じる」または何らかの生物学的表現を有する他のあらゆる状態に対応する受容体立体配座で受容体の分子表面に結合するように、タンパク質を設計することができる。そのようなタンパク質は、生体系における対応する受容体に結合すると同時に受容体の「オン」、「オフ」、「開く」、「閉じる」または他のあらゆる立体配座を付与または促進し、それによってシグナルタンパク質としての役目を果たすであろう。
【０１９９】
新規酵素機能の設計：
本発明のいくつかの実施形態によれば、本明細書において示される方法は、あらゆる所与の結合／活性部位におけるあらゆるリガンドまたは基質の対象構造に対する親和性を呈する構造を得るために用いることができる。いくつかの実施形態によれば、当該方法は、結合した対象リガンド／基質またはその類似体を有する既存のタンパク質構造の活性／結合部位に由来する触媒残基の官能基を、設計構造における対応する基に重ね合わせることによって実施され得る。既存の結合構造が利用可能でない場合は、官能基をその予測自由エネルギーが低くなるように遷移状態の周りに幾何学的に配向させるモデルをコンピュータ計算によって生成させて、触媒についての基礎を提供することができる。その後、他の足場位置に最適な残基同一性を選択して、リガンド／基質に相補的な形状を有すると同時に触媒残基をそれらの所定の立体配座において安定化させもする活性／結合部位を定義できる。形状相補性および触媒残基の位置を最適化するために、主鎖立体配座の標本抽出を導入することもできる。
【０２００】
アミノ酸配列に基づくタンパク質構造予測：
構造設計方法の拡張は、既知配列と既知配列のセグメントと同じように正確な数のアミノ酸を有するセグメントへとセグメント化され得る既知構造のデータベースとを使用してタンパク質の構造を予測する方法である。当該方法は本明細書において抗体を使用して例示されている。
【０２０１】
構造予測方法は、タンパク質構造データバンク（ＰＤＢ）において認められるVL／VH剛体配向の標本抽出に基づくものであり、各抗体ＰＤＢエントリーにおける軽重鎖の互いに関する剛体配向を予備計算すること、およびこの情報をデータベース内に格納することから始める。配列設計方法は、アミノ酸の挿入および欠失を含めたアミノ酸配列の変更を可能とするものの、主鎖および側鎖の立体配座を単に標本抽出するに過ぎないが、他方、当該構造予測方法は、標的タンパク質のアミノ酸を固定したままで、予備計算されたデータベースから剛体変位を標本抽出することを含む。
【０２０２】
方法は、標的抗体を含むセグメントと同じ長さを有する主鎖セグメントの複数の組み合わせを組み合わせ的に生成させることによって継続される。標本抽出は、５種類の動き、すなわち、モデリングされた断片（VL、VH、Ｌ３およびＨ３）のうちの１つを、予備計算された主鎖ライブラリからの同一長さのランダム立体配座で置き換えること、および剛体配向を、予備計算された剛体ライブラリから選択されるランダム選択配向で置き換えることを含む。いくつかの実施形態によれば、剛体配向もまた組み合わせ的に標本抽出される。そのような動きの各々に従って、モデリングされたセグメントを取り囲む６Å外殻内のアミノ酸側鎖立体配座は、全原子Ｒｏｓｅｔｔａエネルギー関数を使用してパッキングおよび最小化され、結果として生じるエネルギーは、先に受け入れられたエネルギーと比較される；新しく生成した構造はメトロポリス基準の影響下で受け入れられ、そのプロセスは、シミュレーテッドアニーリングプロトコルを用いて数ステップ（１００〜５００）繰り返され、温度０において終了する。
【０２０３】
本方法は、抗体構造を予測する他の方法とは対照的に、全ての自由度（セグメントおよび軽鎖／重鎖剛体配向）をモデリングするために実験的構造に依拠するものである。本発明のいくつかの実施形態によれば、本明細書において示される構造予測方法は、ループ立体配座の精度と立体化学的性質との両方の観点から、そのベンチマークにおける最良の方法よりも性能が優れていることが見出された（データ示さず）。誤りがちな力場に対する非制限の立体配座構造を許可せず、その代わりにさらに実験的構造に依拠することによって、本明細書において示される構造予測方法は標的構造の立体配座的なエネルギー地形をより正確に捉えることができると期待される
【０２０４】
この出願から満期へと向かう特許権存続期間の間に、天然起源の抗体に見受けられる配列および立体配座情報に基づいてｄｅ  ｎｏｖｏ抗体構造を設計するための関係する多くの方法が開発されると予想され、天然起源の抗体に見受けられる配列および立体配座情報に基づいてｄｅ  ｎｏｖｏ抗体構造を設計するための有期の方法の範囲は、そのような新しい技術を全て先験的に包含することが意図される。
【０２０５】
本明細書において使用される用語「約」は、±１０％を指す。
【０２０６】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する」およびそれらの同根語は、「非限定的に含むこと」を意味する。
【０２０７】
用語「から構成される」は「を限定的に含む」を意味する。
【０２０８】
用語「から本質的に構成される」は、構成、方法または構造が追加の構成要素、ステップおよび／または部分を含んでいてもよいがしかしそれは当該追加の構成要素、ステップおよび／または部分が特許請求の範囲に記載の基本的かつ新規な特徴を実質的に変化させない場合に限る、ということを意味する。
【０２０９】
本明細書において使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈から明白な別段の定めがない限り、複数形の表示を含む。例えば、用語「足場（ａ  ｓｃａｆｆｏｌｄ）」または「少なくとも１つの足場」は、その混合物を含めて複数の足場を包含し得る。
【０２１０】
本出願の全体を通して、本発明の様々な実施形態は範囲形式で示され得る。範囲形式での記載は単に便宜および簡潔さのためのものであり、本発明の範囲に対する固定的な限定として解釈されるべきでない、ということを理解すべきである。したがって、範囲の記載は、具体的に開示された全ての可能な小範囲およびその範囲内の個別の数値を含むと見なされるべきである。例えば、１〜６などの範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などの小範囲ならびにその範囲内の個々の数、例えば１、２、３、４、５および６を具体的に開示したとして見なされるべきである。これは範囲の広さに関係なく適用される。
【０２１１】
本明細書において数値範囲が示されるときはいつでも、示された範囲内で引用されるいずれの数字（分数または整数）をも包含することを意味している。第１指示数と第２指示数との「間の範囲内／範囲」なる語句と、第１指示数「から」第２指示数「までの範囲内／範囲」なる語句は、本発明において交換可能に使用され、第１および第２の指示数ならびにその間の全ての分数および整数を指し示すことを意味する。
【０２１２】
本明細書において使用される用語「方法」は、与えられた課題、例えば、化学的、薬理的、生物学的、生化学的および医学的な技術を実施する者に知られているかまたは彼らによって既知の様式、手段、技術および手順から速やかに開発されるかのいずれかである様式、手段、技術および手順を非限定的に含む、所与の課題を達成するための様式、手段、技術および手順を指す。
【０２１３】
本明細書において使用される用語「処置する」は、症状の進行を緩和し、実質的に阻害し、遅延させ、もしくは逆転させること、症状の臨床的および審美的な症候を実質的に改善すること、または症状の臨床的および審美的な症候の出現を実質的に防止することを含む。
【０２１４】
特定の配列表に言及する場合、そのような言及は、実質的にその相補的配列に相当する配列、例えば、シーケンシングエラー、クローニングエラーまたは、塩基置換、塩基欠失もしくは塩基追加をもたらす他の変化から生じる小さな配列変異を含むものなどをも包含する、と理解されるべきであり、但し、そのような変異は、頻度が５０ヌクレオチドに１つ未満、あるいは１００ヌクレオチドに１つ未満、あるいは２００ヌクレオチドに１つ未満、あるいは５００ヌクレオチドに１つ未満、あるいは１０００ヌクレオチドに１つ未満、あるいは５,０００ヌクレオチドに１つ未満、あるいは１０，０００ヌクレオチドに１つ未満の頻度であることを条件とする。
【０２１５】
本発明の特定の特性は、明確にするために別個の実施形態との関連において記載されているが、単一の実施形態において組み合わせて提供され得ることが理解される。逆に、本発明の様々な特性もまた、簡潔さのために単一の実施形態との関連において記載されているが、別個で、またはあらゆる適切な部分的組み合わせとして、または記載されている他のあらゆる本発明の実施形態において適切なものとして、提供され得る。様々な実施形態との関連において記載されている特定の特性は、それらの要素無しでは実施形態が実施されないというわけではない限り、それらの実施形態の本質的な特徴として見なすべきでない。
【０２１６】
上に詳述し以下の特許請求の範囲に記載した本発明の様々な実施形態および態様は、下記実施例において実験的に支持されている。
【実施例】
【０２１７】
これより下記実施例を参照するが、当該実施例は、上の記載と併せて本発明のいくつかの実施形態を非限定的な様式で例示する。
【０２１８】
方法
ソースコード利用可能性：
方法のいくらかの部分は、Ｒｏｓｅｔｔａ巨大分子モデリングソフトウェア一式［ＤａｓおよびＢａｋｅｒ、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２００８、７７：３６３−３８２］内に実装されたものであり、Ｒｏｓｅｔｔａ  Ｃｏｍｍｏｎｓの同意によって利用可能である。いくつかの方法はＲｏｓｅｔｔａスクリプトを通じて実施した［Ｆｌｅｉｓｈｍａｎら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１１、６：ｅ２０１６１］。
【０２１９】
方法のいくらかの部分はモンテカルロ法を用いて実施した［Ｈａｚｅｗｉｎｋｅｌ，Ｍｉｃｈｉｅｌ,ｅｄ．（２００１）、「モンテカルロ法」、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、ＩＳＢＮ  ９７８−１−５５６０８−０１０−４］。
【０２２０】
結合モード基準：
どの設計が天然の結合モードを再現しているかについては、ＣＡＰＲＩ挑戦基準に基づいて判定した［Ｍｅｎｄｅｚら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ２００３、５２：５１−６７］。具体的には、設計構造と天然構造とをアラインメントさせた後に両抗体構造間での標的境界面残基（抗体の半径１０Å以内の原子を有する全ての残基）のＲＭＳＤを評価する、Ｉ＿ＲＭＳである。天然抗体と設計抗体との間での境界面ＲＭＳＤカットオフを４Åに設定した。
【０２２１】
下記スクリプトは、Ｐｙｔｈｏｎで記述したものであり、Ｐｙｍｏｌ［Ｔｈｅ  ＰｙＭＯＬ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  １．６．１  Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ、ＬＬＣ．］を使用して実施した。このスクリプトを実行するために、設計複合体データベースを天然抗体−抗原複合体と共にフォルダ内に入れた。テキストファイルを作る。最初のエントリーとして全ての設計ＰＤＢファイルの一覧と天然抗体−抗原複合体の一覧とが入った、「ｐｄｂ＿ｆｉｌｅ＿ｌｉｓｔ」と名前を付けたこのテキストファイルを作った。実行コマンドはＢａｓｈターミナルで「ｐｙｍｏｌ−ｃ  ｌｉｇ＿ｒｍｓ．ｐｙ」である。当該コマンドはＰＤＢが格納されているのと同じフォルダから実行した。このスクリプトからの出力は２つのフォルダであり、１つ目のフォルダには４Åより大きい（「ｍｏｒｅ＿ｔｈａｎ＿４」）Ｉ＿ＲＭＳ値を有する全ての設計のコピーが入っており、２つ目のフォルダには４Å未満（「ｌｅｓｓ＿ｔｈａｎ＿４」）のＩ＿ＲＭＳ値を有する全ての設計が入っていた。
【０２２２】
2017526053.tif 000017
2017526053.tif 000018
【０２２３】
ＣＤＲ定義：
この研究で用いられるＣＤＲ定義は、当該技術分野において既知の従来の定義に概して一致する。明確にするため、本明細書において示されるＣＤＲ定義はＣｈｏｔｈｉａ位置付番体系に従う。以下の実施例では、異なる２つのＣＤＲ定義を用いている。１つ目のものは、Ｖ（Ｄ）Ｊ遺伝子セグメントを密接にマッチングさせてＣＤＲ１およびＣＤＲ２を１つのユニットとして扱う。この定義は、以下に記載するように、ＰＳＳＭを構築する間および主鎖を標本抽出する間に用いた。２つ目の定義は、従来のＣＤＲ定義に類似するものであり、以下に記載するように、各ＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）を別個のユニットとして扱って配列制約閾値のレベルを決定する。上記ＣＤＲ定義の比較を上の表２に示す。
【０２２４】
形状相補性：
形状相補性は、Ｓｉｎｇｅｒら［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９３、１５０、ｐ．２８４４−２８５７］により説明されている、Ｒｏｓｅｔｔａソフトウェア一式に実装されているアルゴリズムを使用して計算した。下記スクリプト「ｓｃ．ｘｍｌ」を使用して形状相補性最適化を実行した。このスクリプトは、「ＲｏｓｅｔｔａＳｃｒｉｐｔ」で記述したものであり、Ｒｏｓｅｔｔａモデリングソフトウェア一式を使用して実施した。
【０２２５】
実行例：
2017526053.tif 000019
【０２２６】
標的エピトープに対する抗体足場のドッキング：
まず、下記のとおり構築した４，５００個の抗体足場の各々を複合体構造における天然抗体フレームワークにアラインメントした。その後、抗体足場構造に標的座標を加えた。その後、下記のｄｏｃｋＬｏｗＲｅｓ．ｘｍｌスクリプトを使用して、簡約表現ドッキング（重心モード）を用いてＲｏｓｅｔｔａＤｏｃｋによって結合モードに摂動を加えた［Ｇｒａｙら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２００３、３３１：２８１−２９９］。このスクリプトは、「ＲｏｓｅｔｔａＳｃｒｉｐｔ」で記述したものであり、Ｒｏｓｅｔｔａモデリングソフトウェア一式を使用して実施した。
【０２２７】
実行例：
2017526053.tif 000020
2017526053.tif 000021
【０２２８】
結合エネルギー計算：
結合エネルギーは、結合状態と未結合状態とでの系全体のエネルギーの差として定義した。各状態において境界面残基を再パッキングさせる。数値安定性のために、結合エネルギー計算を３回繰り返し、その平均を取った。
【０２２９】
下記のｄｄｇ．ｘｍｌスクリプトを使用してこの計算を実行した。このスクリプトは、「ＲｏｓｅｔｔａＳｃｒｉｐｔ」で記述したものであり、Ｒｏｓｅｔｔａモデリングソフトウェア一式を使用して実施した。
【０２３０】
実行例：
2017526053.tif 000022
【０２３１】
抗体安定性計算：
安定性エネルギーは、抗体モノマーの系の自由エネルギーとして定義した。抗体の安定性エネルギーを評価するために、標的を取り除き、抗体の全エネルギースコア（スコア１２）を計算した。
【０２３２】
下記のＡＢ＿ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．ｘｍｌスクリプトを使用してこの計算を行った。このスクリプトは、「ＲｏｓｅｔｔａＳｃｒｉｐｔ」で記述したものであり、Ｒｏｓｅｔｔａモデリングソフトウェア一式を使用して実装した。
【０２３３】
実行例：
2017526053.tif 000023
【０２３４】
パッキング性評価：
抗体コアおよび抗体−標的境界面におけるタンパク質パッキング性は、下記のＰａｃｋｓｔａｔ．ｘｍｌスクリプトを使用して、Ｒｏｓｅｔｔａソフトウェア一式に実装されている「ＲｏｓｅｔｔａＨｏｌｅｓ」（Ｐａｃｋｓｔａｔ）を使用して計算した［ＳｈｅｆｆｌｅｒおよびＢａｋｅｒ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  ２００９、１８：２２９−２３９］。このスクリプトは、「ＲｏｓｅｔｔａＳｃｒｉｐｔ」で記述されたものであり、Ｒｏｓｅｔｔａモデリングソフトウェア一式を使用して実装した。
【０２３５】
実行例：
2017526053.tif 000024
【０２３６】
境界面側鎖の立体配座ボルツマン確率：
立体配座ボルツマン確率は、ＰａｎｔａｚｅｓおよびＭａｒａｎａｓ［Ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．、２０１０、２３、８４９−８５８］が記載しているとおりに計算した。方法はまず、各複合体について相手同士を分離させ、結合性にかなりの寄与をする（アラニンへの突然変異で結合エネルギーが１Ｒ．ｅ．ｕ超高くなる）各残基について、それは主鎖依存的回転異性体のＤｕｎｂｒａｃｋライブラリにおいて定義される全てのその回転異性体の状態に亘って、タンパク質主鎖またはＣβ原子との立体衝突を生じると予測される回転異性体を排除することを繰り返す。各回転異性体の配置について、６Å外殻内の全ての残基を再パッキングし最小化した。その後、Ｒｏｓｅｔｔａ全原子エネルギー関数（スコア１２）を使用してそのような状態の各々のエネルギーＥを見積もった［ＫｏｒｔｅｍｍｅおよびＢａｋｅｒ、ＰＮＡＳ  ２００２、９９：１４１１６−１４１２１］。その後、ボルツマン分布を仮定して残基ｉの立体配座の確率Ｐｉをコンピュータ計算する：
【０２３７】
（式１）
2017526053.tif 000025
式中、ｓは回転異性体の状態であり、ｋＢはボルツマン定数であり、Ｔは絶対温度である。全てのシミュレーションにおいてｋＢＴを０．８Ｒ．ｅ．ｕに設定した。Ｅｉは未結合状態のエネルギーである。下記のスクリプトは、「ＲｏｓｅｔｔａＳｃｒｉｐｔ」で記述したものであり、Ｒｏｓｅｔｔａモデリングソフトウェア一式を使用して実装した。
【０２３８】
実行例： 
2017526053.tif 000026
【０２３９】
主鎖セグメントのクラスタリング：
以下に記載するデータベース内の抗体構造を個別に、抗体４ｍ５．３（ＰＤＢ  ＩＤ  １Ｘ９Ｑ）の可変重鎖および可変軽鎖のドメインにアラインメントした［Ｌｉｐｐｏｗら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００７、２５：１１７１-１１７６］。その後、VL、Ｌ３、VHおよびＨ３の定義によるＣＤＲの座標を抽出し、長さに応じてクラスタリングした。Ｌ３およびＨ３については、Ｒｏｓｅｔｔａクラスタリングアプリケーションを使用してさらなる立体配座クラスタリングを行った。主鎖立体配座を、Ｃα原子間で測定されるＲＭＳＤが２．０Åのビンの中にクラスタリングした。結果として生じるクラスタを共通配列モチーフがないか手動で調べた。主鎖立体配座に違いのある多数の配列モチーフを含有するクラスタは、クラスタリングのビンの大きさを小さくすることによって分けた。同様に、多数のクラスタが同じ配列モチーフを含有する場合にはクラスタリングのビンの大きさを大きくしてクラスタを統合した。
【０２４０】
コマンドライン例：
2017526053.tif 000027
【０２４１】
配列プロファイルの生成：
各主鎖立体配座クラスタについて、位置特異的スコア行列（ＰＳＳＭ）を生成させた。各構造からアミノ酸配列を抽出して、まず、配列冗長性の１００％除去された多重配列アラインメントを生成させた（アラインメントにおける各配列は、アラインメントにおける他の全ての配列に比べて少なくとも１つのアミノ酸が異なる）。デフォルトパラメータおよび入力としての多重配列アラインメントを用いて、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴソフトウェア一式を使用してＰＳＳＭを生成させた［ＢｉｅｇｅｒｔおよびＳｏｄｉｎｇ、ＰＮＡＳ  ２００９、１０６：３７７０−３７７５］。
【０２４２】
下記スクリプトは、ｂａｓｈで記述したものであり、２つのプログラム、すなわち「ｍｕｓｔｌｅ」［Ｅｄｇａｒ  ＲＣ．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｈ３４０．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１５０３４１４７．］および「ｐｓｉｂｌａｓｔ」に基づいている。このスクリプトを、クラスタリングされた主鎖セグメントと同じフォルダ内で実行して、単一のＰＳＳＭを生成させた。
【０２４３】
2017526053.tif 000028
【０２４４】
アルゴリズム性能：
代表的な軌跡は、標準的な単一のＣＰＵにおいて実行開始から成功裏に完了するまで約７時間要した。プロトコルは２つの部分に分けられる。まず、設計された抗体足場（アルゴリズム、ｄ節）と標的分子との間で形成された複合体をドッキング、設計および最適化／最小化（アルゴリズム、節ｅ）させた。大部分の時間は下流での改良ステップ（アルゴリズム、節ｆ）に費やされた。コンピュータ計算資力を効率的に使用するために、改良へと進む前にエネルギーおよび構造のフィルタリングを適用した；平均して、全軌跡のたった４％のみがこのフィルタリングを通過した。コンピュータ計算資力の利用可能性および設計問題の大きさに応じてこのステップにおけるフィルタを調節することができる。
【０２４５】
チェックポインティング：
設計軌跡が時期尚早に終了している場合にそれを最後のバックアップ点から再開できることを確実にする、チェックポインティング策を実施した。主鎖最適化手順の開始からチェックポインティング策を強化する。標本抽出された主鎖が目的関数を改善する時（アルゴリズム、節ｇ）にはいつも、複合体の座標情報が入ったＰＤＢフォーマット済ファイルを正確な設計段階、複合体安定性および結合エネルギーと共にディスクに保存した。プログラムを開始する時、自動的にチェックポインティングファイルの存在が調査される。チェックポインティングファイルが見つかる場合には、最後に計算が停止されたのと同じ点から計算を続行することになる。
【０２４６】
コードフローおよびモジュール性：
全ての主要なＲｏｓｅｔｔａ機能に簡便なユーザーインターフェースを提供するＲｏｓｅｔｔａＳｃｒｉｐｔを使用して設計プロトコルを実施した［Ｆｌｅｉｓｈｍａｎら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１１、６：ｅ２０１６１］。この実装形態は、コーディングの知識を事前に持たない非熟練ユーザーが設計プロトコルの全ての態様の制御を達成することを可能にする。プロトコルは、将来的にユーザーによって適すると思われるプロトコル内の様々な要素の追加、変更または除去が行われ得るように、意図的にモジュール式にされた。
【０２４７】
（実施例１）
設計抗体―例示的手順
鋳型抗体：
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記のとおり、方法における２つの予備計算ステップは、立体配座データベースを作り出すことを含む。任意の鋳型抗体のために作られたデータベースは、当該鋳型抗体に関してのみ使用することができる。本明細書において示される結果には抗フルオレセイン抗体４ｍ５．３（ＰＤＢ  ＩＤ  １Ｘ９Ｑ）を使用したが、任意のいかなる抗体鋳型も使用され得ることに留意されたい。
【０２４８】
ＰＳＳＭおよび主鎖立体配座データベースの生成：
本発明のいくつかの実施形態によれば、手順における最初のステップは、ソース抗体をセグメントへと分解し、セグメントを長さに応じてグループ分けすることである。以下に示す実施例で使用した全てのソース抗体の集まりは、７８８個の可変κ軽鎖と７８５個の可変重鎖ソース抗体構造とで構成された。
【０２４９】
上に論じたように、４つのセグメント：いずれも軽重鎖可変ドメインの構造的に保存された２つのシステインを両側に配している、Ｌ１−Ｌ２（「VL」と呼ぶ）およびＨ１−Ｈ２（「VH」と呼ぶ）、ならびにいずれも第２システインの後の最初のアミノ酸において開始し、かつ可変κ軽鎖ドメインの位置１００および可変重鎖ドメインの位置１０３において終了している、Ｌ３およびＨ３（以下の表２を参照）へと分けることに従ってソース抗体のＦｖ断片をセグメント化した。
【０２５０】
以下の表２は、位置に基づくスコアリングステップにおいて用いた構造相同セグメント種の定義、および広く受け入れられているいくつかの位置付番体系との対比を示す。
【０２５１】
【表２】
2017526053.tif 000029
【０２５２】
各セグメントクラスタには様々な長さの配列が存在しており、それゆえ、各クラスタを長さ群へとさらに分けた。配列によりコード化されている３Ｄ立体配座に応じて配列を差別化するために、各長さ群の中でさらなる立体配座クラスタリングを行った。そのようなクラスタの各々について配列アラインメントプロセスを実行し、例えばＰＳＩ−ＢＬＡＳＴソフトウェアパッケージを使用して、構造相同セグメントの各々に位置特異的スコア行列（ＰＳＳＭ）を割り当てる。
【０２５３】
以下の表３は、長さ分類体系でのセグメントを一覧にしたものであり、対応する各ソース抗体のＰＤＢエントリーを表す。上述したようにこれらのセグメントの各々にＰＳＳＭを割り当てた。
【０２５４】
主鎖立体配座データベースを生成させるために、全てのソース抗体構造を鋳型抗体に重ね合わせると同時に、全ての抗体において、構造上重要な幹位置（構造保存性の最も高い場所）を構造的に非常に良くアラインメントされている立体配座セグメントのために使用して、挿入セグメントを確実に、人工抗体の構築に際して任意に再結合できるモジュール部品として扱えるようにした。
【０２５５】
各々の構造相同セグメントクラスタ（VL、Ｌ３、VHおよびＨ３）の各長さ群について、各ソース抗体から主鎖二面角（Φ、ΨおよびΩ）を抽出した。また、鋳型抗体において対応するセグメントにおけるそれら二面角を、ソースの二面角で置き換え、モデリングされたセグメント内のランダム選択位置に主鎖切断部位を導入した。言い換えれば、ソース構造からの構造相同セグメントを任意の位置、典型的にはセグメントの端部から離れたいくつかの位置で切断し、対応する構造保存性の最も高い位置を重ね合わせることによって鋳型構造上に配置し、その後、セグメントの両半分の二面角を構造制約に基づいて重み調整すると同時に、上述したようにＰＳＳＭ値に応じてセグメントのアミノ酸配列を変更した。
【０２５６】
以下の例示的なｓｐｌｉｃｅ＿ｏｕｔ．ｘｍｌ  ＲｏｓｅｔｔａＳｃｒｉｐｔ  ｘｍｌプロトコルを用いて、各々の主鎖セグメント、すなわちＬ１−Ｌ２（VL）、Ｌ３、Ｈ１−Ｈ２（VH）およびＨ３の二面角を各ソース抗体から抽出し、鋳型抗体にそれら二面角を負わせる。
【０２５７】
2017526053.tif 000030
2017526053.tif 000031
2017526053.tif 000032
【０２５８】
最後の３つのフラグは、フラグファイルの中からコマンドラインへと移動されたことに留意されたい。また、この部分のプロトコルに関して、入力ＰＤＢファイル（コマンドラインにおいて−ｓフラグで表される）は鋳型ｐｄｂと同じにすべきである。
【０２５９】
以下のパラメータは種々のセグメントについて変更され得る：
「ｓｐｌｉｃｅ＿ｏｕｔ．ｘｍｌ」を実行する前において、Ｈ１＿Ｈ２、Ｈ３セグメントを抽出するときには可変重鎖ドメインに、また鋳型抗体のＬ１＿Ｌ２、Ｌ３セグメントを抽出するときには可変軽鎖ドメインにソース抗体ＰＤＢがアラインメントされ得る。
ｌｏｏｐ＿ｄｂａｓｅ＿ｆｉｌｅ＿ｎａｍｅ  ―  データベースファイルを正しいセグメントと関連付けて意味のある名前を与えるべきである。
ｆｒｏｍ＿ｒｅｓ／ｔｏ＿ｒｅｓ  ―  鋳型抗体構造の開始および終了の残基番号とすべきである。
ｓｅｇｍｅｎｔ  ―  これを利用可能な４つの抗体セグメント（Ｌ１＿Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１＿Ｈ２およびＨ３）のうちの１つに変更する。
【０２６０】
【表３】
2017526053.tif 000033
2017526053.tif 000034
2017526053.tif 000035
2017526053.tif 000036
2017526053.tif 000037
2017526053.tif 000038
2017526053.tif 000039
2017526053.tif 000040
2017526053.tif 000041
2017526053.tif 000042
【０２６１】
抗体立体配座代表の生成：
上に論じたように、Ｆｖアミノ酸配列のライブラリは、抗体のＦｖソース構造からの４つの重み調整再閉鎖セグメント（セグメント群としてVL、Ｌ３、VHおよびＨ３で表される）の組み合わせ的な結合から生じる。本実施例では、ソース構造の数は約７００であり、それぞれについて４つのセグメントを考慮すれば、再構築構造の数は７００4 すなわち約１０11 になるであろう。簡約化をしなければ、方法は抗体の再構築構造のひどく大きなライブラリを生じるであろう。しかしながら、従前の研究で得られた結果は、Ｈ３を除いて各抗体主鎖セグメントが数多くのカノニカル立体配座に当てはまることを際立たせたため、本明細書において示される方法の結合タンパク質設計手順は、これらのカノニカル立体配座に一連のＨ３主鎖立体配座を加えてなる空間を標本抽出する抗体主鎖すなわち足場の簡約化ライブラリを生成することによって、開始される。これらの結果により本発明者らは、長さによるセグメントの分類によって再結合セグメントの数を減らし、それらの立体配座をＲＭＳＤに応じて標本抽出し、それによって立体配座空間を十分に表す少数の代表セグメントの選択を可能にする、ということを思料するに至った。実際、当該標本抽出手順はセグメント数を管理可能な数に減らした。そのためには、全ての並べ替えを組み合わせ的に用いて、共通構造フォールドを有するアミノ酸配列の簡約化された代表ライブラリを構成する再構築構造を形成する。
【０２６２】
ひとたび立体配座データベースが生成すれば、次のステップは立体配座代表を作り出すことであった；これらは抗体立体配座空間に亘って広がる抗体構造である。予備計算ステップでは、ｓｐｌｉｃｅ＿ｏｕｔ．ｘｍｌプロトコルを用いて鋳型抗体にうまく挿入された主鎖セグメントを、立体配座別にクラスタリングした。
【０２６３】
抗体立体配座代表の生成：
各クラスタから主鎖代表を選択した後、それを他の主鎖クラスタ代表セグメントと組み合わせて立体配座代表を作り出した。下記の「ｓｐｌｉｃｅ＿ｉｎ．ｘｍｌ」スクリプトを使用して、指定された抗体のデータベースファイルから二面角を抽出し、それらを足場抗体に挿入した。その後、出力抗体を次の主鎖セグメント挿入ための入力として使用することなどを行った（例えば、まずＨ３主鎖セグメントを挿入し、その後、出力構造を使用してＬ３主鎖立体配座に挿入することなどを行った）。この手順は全ての主鎖立体配座変異体が生成するまで繰り返され得る。
【０２６４】
下記スクリプトはＬ１＿Ｌ２主鎖立体配座クラスタ代表を鋳型抗体に挿入するために使用されるものであり、他のセグメントを挿入するために必要な改変は以降に説明する。
【０２６５】
ｓｐｌｉｃｅ＿ｉｎ．ｘｍｌスクリプト：
2017526053.tif 000043
2017526053.tif 000044
【０２６６】
以下のパラメータは種々のセグメントについて変更され得る：
ｄａｔａｂａｓｅ＿ｐｄｂ＿ｅｎｔｒｙ  ―  鋳型抗体に挿入されるべき歪みデータベースに見受けられる立体配座代表の名前を挿入する（名前は、歪みデータベースファイル内の各エントリーの最後の値である）。
ｔｏｒｓｉｏｎ＿ｄａｔａｂａｓｅ  −  標本抽出されている主鎖立体配座に従って変更する（例えば、Ｌ１＿Ｌ２主鎖セグメントを標本抽出している場合には、歪みデータベースを「Ｌ１＿Ｌ２．ｄｂ」とすべきである）。
【０２６７】
実行例：
2017526053.tif 000045
この例示的な実行からの出力ＰＤＢファイルは、１ＡＨＷ由来のＬ１＿Ｌ２の主鎖立体配座が挿入された１Ｘ９Ｑ抗体構造になるであろうことに留意されたい。次いで、この構造は次のセグメント挿入のために入力構造として使用される。セグメントを挿入する順序は重要ではない。
【０２６８】
この実施例のために、各クラスタから主鎖代表を選択し、次いでそれを他の主鎖クラスタ代表セグメントと組み合わせて立体配座代表を作り出した。
【０２６９】
表４は、ソース抗体構造から抽出され、セグメント簡約化手順を受け、次いで約４，５００個の構造足場代表の簡約化ライブラリを構築するために使用された、セグメントを示す。
【０２７０】
【表４】
2017526053.tif 000046
【０２７１】
表４から分かるように、この代表的事例では、表３に示されている、セグメント閉鎖のための重み調整を受けたセグメントは、５（VL）×２（Ｌ３）×９（VH）×５０（Ｈ３）に簡約化された。これらの代表セグメントを全ての並べ替えへと組み合わせることにより、約４，５００個の構造代表の簡約化ライブラリが得られた。この手順では、可変軽鎖ドメインおよび可変重鎖ドメインにおけるジスルフィド結合したシステインの相対配向は別として、鋳型抗体に由来する全ての配列および立体配座の情報が取り除かれた。また、ＰＳＳＭ由来の配列制約を使用して配列設計選択を案内している。
【０２７２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、共通構造フォールドを有するアミノ酸配列のライブラリは歪みデータベースを含み、各歪みデータベースは「ｎ個」のエントリーを含有し、ｎは、鋳型抗体との関連においてうまく重み調整再閉鎖セグメントの数である。いくつかの実施形態において、歪みデータベース内の各エントリーは、４（Ｎ＋１）個の場を有し、Ｎは挿入主鎖セグメントの配列長である。いくつかの実施形態において、当該場は、Ψ、ΦおよびΩ、挿入主鎖セグメントの各残基についての二面角値、ならびに残基同一性である。いくつかの実施形態において、最後の４つの場は、鋳型抗体と比べたときの移植済セグメントの開始、終了および分割部位の残基番号、ならびに他の識別タグ、例えばソース抗体のファイル名である。
【０２７３】
本明細書において示される方法を実行する間、異なった主鎖立体配座が標本抽出されたときにはいつも、配列制約を主鎖立体配座に同期させて抗体全体についてのＰＳＳＭを現在のセグメントに従って再び割り当てた。効率のため、当該方法の種々の段階において様々な一連の残基を設計に供した。例えば、いくつかの初期設計段階は単にリガンド結合表面を最適化するのみであるが、その一方で設計プロトコルの最後には、全ての抗体位置の全配列最適化が（配列制約の影響下で）数回繰り返された。配列制約、例えばＰＳＳＭは、組み合わせ上の設計問題を大幅に軽減する；代表的な事例において、２３０アミノ酸長の可変断片に対する後者の完全設計のステップは、合計約１０117 通りの異なる可能な配列組み合わせを有し、わずか９３個の位置の完全再設計と等価である；ＰＳＳＭカットオフを高めることはこの組み合わせ空間をさらに縮小させるであろう。
【０２７４】
ＣＤＲ内およびフレームワーク内の位置間の相関関係が果たす役割の例示的な実証として、主鎖立体配座クラスタＬ１．１６＿Ｌ２．８（表３参照）は、完全に保存されたフェニルアラニンをフレームワーク位置Ｌ７１に有するが、当該フェニルアラニンはＣＤＲ１上の位置Ｌ３０にあるロイシンまたはイソロイシンのいずれかと相互作用する。主鎖立体配座クラスタＬ１．１０＿Ｌ２．８は、フレームワーク内の様々な保存残基を使用してＣＤＲ  Ｌ１を安定化させる、つまり、Ｌ３０にあるバリンまたはイソロイシンのいずれかと、位置７１にある完全に保存されたチロシンとを安定化させる。これらの保存配列−立体配座相関関係は、セグメント立体配座と相関する配列制約を使用することによってＣＤＲ  Ｌ１安定性を維持するための手がかりとして以前に同定されたが、設計プロセスはこれらの関係を説明する。
【０２７５】
軽重鎖剛体配向の標本抽出：
主鎖立体配座および配列に加えて、Ｆｖ構造の第３の決定因子は、軽重鎖間での剛体配向（ＲＢＯ）である。ＲＢＯを標本抽出する必要性を理解しながら、実験的κ軽鎖抗体構造に基づいてＲＢＯのデータベースを構築すべくＲＢＯｕｔを記述した。データベース内で各抗体のＲＢＯは各Ｉｇドメイン内の第２システイン（近似的な質量中心）同士の変換行列として表現される。具体的には、ＲＢＯによってデータベースに生じる全ての抗体に亘って下記を実行することによってＲＢＯｕｔデータベースが構築される：
【０２７６】
2017526053.tif 000047
【０２７７】
さらに、抗体設計プロトコルの間にＲＢＯデータベースからＲＢＯを標本抽出することを可能にするために、アルゴリズム「ＲＢＩｎ」を実装する。ＲＢＩｎの使用を下記のｄｅｓｉｇｎ＿ｒｅｆｉｎｅ．ｘｍｌに示す。
【０２７８】
１Ｘ９Ｑ由来のＲＢＯを使用する代わりに抗髄膜炎菌抗体（ＰＤＢ  ＩＤ：２ＢＲＲ）の剛体配向を実装したが、当該抗髄膜炎菌抗体は他の抗体に比べて、軽鎖のアライメントされた抗体について重鎖における主鎖および第２システインのｃ−ベータ原子が最も平均的な配置を有していた。
【０２７９】
配列とＣＤＲ立体配座との間での共分散に類似して、境界面残基の同一性に従ってＲＢＯの標本抽出を誘導できるかもしれない。これは、他のどこか［Ａｂｈｉｎａｎｄａｎ，  Ｋ．Ｒら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ、２０１０、２３（９）、ｐｐ．６８９−６９７］に記載されているようなニュートラルネットワーク法によってなされ得る。そのような方法では、データベース内のＲＢＯを標本抽出する確率は、推定されたＲＢＯの尤度に比例し得るであろう。
【０２８０】
ドッキングおよび改良アルゴリズムにシードを与える方法：
VL（５）、Ｌ３（３）、VH（８）上のカノニカル立体配座を５０個の多様なＨ３立体配座と組み合わせることによって、６０００個の要素からなる極大多様性キメラライブラリを構築した（上記参照、立体配座代表の生成）。次いで、パッキング、互いのセグメント適合性を向上させるため、およびタンパク質の安定性を全体的に向上させるために、これらのシードをｏｐｔｉｍｉｚｅ＿ｃｈｉｍｅｒａ．ｘｍｌスクリプトで改良する。
【０２８１】
2017526053.tif 000048
2017526053.tif 000049
2017526053.tif 000050
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【０２８２】
ＰａｔｃｈＤｏｃｋアルゴリズム［Ｓｃｈｎｅｉｄｍａｎ−Ｄｕｈｏｖｎｙ  Ｄ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、２００５、３３、Ｗ３６３−３６７］を使用して、キメラライブラリの各構成要素についておおよそ５０００個の候補抗原−抗体複合体を生成させた。Ｐａｔｃｈｄｏｃｋアルゴリズムを実行するために、「ｐｅｒｌ  ｂｕｉｌｄＭＳ．ｐｌ  ＄ｔａｒｇｅｔ」を使用して分子表面ファイルを構築し、続いて、最終的に「ｓｕｂｍｉｔ＿ｐａｔｃｈｄｏｃｋ．ｓｈ  ｐａｒａｍｓ．ｔｘｔ  ｏｕｔ／＄ｂｉｎｄｅｒ．ｐｄ」によってＰａｔｃｈｄｏｃｋを実行する前にパラメータファイル「ｂｕｉｌｄＰａｒａｍｓ．ｐｌ  ｂｉｎｄｅｒｓ／＄ｂｉｎｄｅｒ  ｔａｒｇｅｔ／＄ｔａｒｇｅｔｎａｍｅ」を構築した。
【０２８３】
代替的な標本抽出技法：
主鎖立体配座を標本抽出および改良するための方策は、座標降下に基づき、最良のものを選出する前に実験的主鎖立体配座のデータベースから各セグメントを順に標本抽出し５０回最適化するものであった。立体配座多様性の代替的な標本抽出を提供するために、主鎖立体配座の標本抽出および改良のプロトコルにおいて座標降下をモンテカルロシミュレーテッドアニーリング（ＭＣＳＡ）で置き換えた。異なる５つの動きをＭＣＳＡ標本抽出のために利用できるようにした：VL、Ｌ３、VH、Ｈ３およびＲＢＯ。各動きは、異なる立体配座多様性を含み、許容される確率が様々であった。この原因となって、Ｈ３が最も標本抽出されやすくなるように動きのランダム選択にバイアスをかけ、その一方で他の動きをより少ない頻度で標本抽出した。具体的には、下記に示すｄｅｓｉｇｎ＿ａｎｄ＿ｒｅｆｉｎｅ．ｘｍｌプロトコルで示されているように、Ｈ３、Ｌ３、VL、VHおよびＲＢＯを０．４０、０．０５、０．１５、０．２５および０．１５の確率で標本抽出した。
【０２８４】
アルゴリズム最適化：
ＡｂＤｅｓｉｇｎアルゴリズムを最適化するためには、不運な軌跡に対して費やされる時間を予め無効にすることによって効率を高め得ることが提案されてきた。その結果として、最終ポーズの質の予測性について様々な構造的統計値を評価した。ループ接合を開始する前の様々な段階における埋没面積および結合エネルギーは、最終ポーズの質を予言していたことが見出された。下記のｘｍｌプロトコルにおけるｓｏｆｔ＿ｄｏｃｋ＿ｓａｓａ＿ｆｉｌｔｅｒ、２ｎｄ＿ｈａｒｄ＿ｍｉｎ＿ｓａｓａ＿ｆｉｌｔｅｒおよびｄｄｇ＿ｆｉｎａｌ＿ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔフィルタを参照されたい。ループを接合させている間、主鎖衝突はループがうまく挿入されるか否かを予言している、ということが見出された。
【０２８５】
ＡｂＤｅｓｉｇｎアルゴリズム：
最適化されたキメラ、Ｐａｔｃｈｄｏｃｋファイル、および抗原を入力として使用する設計・改良アルゴリズムは下記のとおり実行できる：
【０２８６】
2017526053.tif 000055
2017526053.tif 000056
2017526053.tif 000057
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【０２８７】
ＭｉｎＭｏｖｅｒを使用する最小化は問題を提起する、というのも、ポーズがカノニカル構造段階にあるにも拘らず、どのｄｏｆを最小化すべきかを決定するムーブマップ（ｍｏｖｅｍａｐ）がｐａｒｓｅｔｉｍｅにおいて生成されるからである。設計の間にポーズ長は変化し、このことは、最小化が不適切なｄｏｆに適用されることになる、ということを意味する。ＴａｓｋＡｗａｒｅＭｉｎＭｏｖｅｒは、実行時間中にｔａｓｋｏｐｅｒａｔｉｏｎｓを適用する。再パッキングへと制限された残基はそれらの側鎖のみを最小化させることになり、設計の許された残基は側鎖と主鎖との両方を最小化させることになる。
【０２８８】
2017526053.tif 000060
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【０２８９】
設計抗体の生成：
方法は、上に記載のとおり生成した構造代表を入力構造として使用するものであった。ベンチマーク設計を生成するために、代表抗体立体配座の各々を複合体構造における天然抗体に対してアラインメントし、その後、標的タンパク質座標を代表抗体立体配座に加えた。その後、簡約表現ドッキングを用いて本来の結合モードに摂動を加えた。最終設計の全てが、同じ標的タンパク質に対する天然抗体と同じ結合モードを有しているというわけではなかった。天然抗体結合モードの４Åカットオフ内で結合している構造を得るために、ｐｙｔｈｏｎスクリプトを使用してさらなるフィルタリングを行った。
【０２９０】
本発明のいくつかの実施形態との関連において上に記載したように、本明細書において一括して概略マッチング手順と呼ばれる低分解能の剛体表面相補性（配向）改良手順を用いて、前のステップで生成した再構築抗体のライブラリの構成要素を分子的存在物の対象分子表面にドッキングさせた。ひとたびドッキングがなされると、再構築抗体は結合部位の残基についてアミノ酸配列最適化を受け、当該残基はＰＳＳＭ制約の影響下で改変された。その後、概略マッチング手順によって、再構築抗体上の側鎖残基が最適化され、自由エネルギーおよび構造安定性フィルタに従って複合体が評価された。その後、結果として生じる複合体をドッキングおよび安定性のスコアに従ってランク分けし、ＲＭＳＤによってクラスタリングし、それによってこのステップは、利用可能な計算力および他の実用上の検討事項に応じて数十万〜数百万個の複合体になる少数の一連の代表複合体を与えた。
【０２９１】
前のステップの構造フィルタを通過した複合体については、モンテカルロ選択ルーチンを使用して、ランク分けされ分類された複合体の中からランダムに複合体を選択する手順を用いた。本発明のいくつかの実施形態のもとでは他の選択基準およびランダム抜き出しルーチンが考えられるということに留意されたい。
【０２９２】
本発明のいくつかの実施形態との関連において上に論じたように、選択された複合体は、抗原−足場境界面領域にあるアミノ酸残基についてのＰＳＳＭに基づく確率論的配列最適化（ＰＳＳＭ−ＳＳＯ）を伴う、より細かな分解能のドッキング手順（本明細書において一括して伝導マッチング手順と呼ばれる）を受けた。マッチングスコアの所定のカットオフ値、例えば結合時の最小埋没面積（抗体の場合、典型的には１０００Å2に予め決められる）としてのカットオフ値を獲得した複合体は、次の伝導マッチング手順へと通過させ、他方でこれらのカットオフを獲得しなかった複合体は捨てた。
【０２９３】
次の伝導マッチング手順では、予備計算された主鎖立体配座データベースによって導かれる高速主鎖標本抽出方策を実装した（図１および２のボックス９）。手短に言えば、重み調整再閉鎖セグメントのうちの１つを、同じクラスタに属する別の重み調整再閉鎖セグメントによる置換のためにランダムに選択し、本発明のいくつかの実施形態に従ってそのセグメント選択が長さを０〜４アミノ酸残基だけ変化することを可能にした（図２のボックス１８）。
【０２９４】
本明細書において示される方法の目下の例示的な実証において、手順は、入力セグメントに関して予め定義された配列長変化範囲内にある該当する立体配座データベースから、異なる５０個の重み調整再閉鎖セグメントをランダムに標本抽出した。例えば、設計を受けている代表の重み調整再閉鎖セグメントが長さｘアミノ酸のＨ３を有していた場合、改良は長さｘ±４のＨ３主鎖セグメントを標本抽出する。許可される長さ変化は、現在設計されているセグメントに依存する。セグメント長さ標本抽出を制限することで、より好ましい安定性および結合エネルギーをおそらく有していたと思われるより長いセグメントへの偏りが低減される。例えば、以下に示すベンチマーク評価再現性試験では、許可される長さ変化パラメータを、セグメント種VL、VHおよびＬ３については±２、セグメント種Ｈ３については±４に設定した。
【０２９５】
現在の重み調整再閉鎖セグメントを歪みデータベース内の他のいずれかの重み調整再閉鎖セグメントに変更することは、当該データベース内で指定された主鎖二面角を課すことから構成されており、標準的なＣＰＵにおいて優に１秒未満で行われた。標本抽出された各主鎖について、方法は、組み合わせ的な側鎖パッキングを用いて上記のＰＳＳＭ制約の影響下で配列を設計する。その後、手順は、高分解能の剛体配向改良と、標的結合表面および置き換わったセグメントの周りの半径３〜１０Å内における側鎖立体配座およびアミノ酸同一性の、ＰＳＳＭ−ＳＳＯを用いる最適化とによって、同時に複合体結合境界面を最適化した。伝導マッチング手順は、低反発ポテンシャルから始めて標準的全原子エネルギー関数で終えるまで、３回繰り返された。当該手順ではその後に、単一の側鎖のランダム選択、パッキングおよび最小化を行うものである回転異性体試行最小化プロトコルが用いられた。この反復的な手順は、抗体コアおよび抗体−標的境界面に側鎖パッキングの改善をもたらした。
【０２９６】
したがって、上記のとおり、設計プロトコルは２部分に分けられた：概略マッチング手順（図３のボックス１４）および、抗体と標的タンパク質との間の結合エネルギーを最適化することを目的とする伝導マッチング手順（図２のボックス１６ａおよび１６ｂ）；ならびに、４つ全ての抗体セグメントの主鎖標本抽出を引き起こす集中計算的な改良ステップ（図２のボックス１８）。第１の部分は、「ｓｔａｒｔ＿ｆｒｅｓｈ」と名付けられた設計ｘｍｌにおいてサブプロトコルのもとで記述された。
【０２９７】
第２の部分は、結合および安定性のスコアにより制約された最適化関数の影響下で座標降下を用いて４つのセグメントの各々に対して主鎖標本抽出を行った、サブプロトコル「ｒｅｃｏｖｅｒ」のもとで記述される。
【０２９８】
コマンドラインオプション（「フラグ」ファイルに包まれ得る）：
2017526053.tif 000074
【０２９９】
機能するタンパクの設計における重要な課題は、タンパク質がその標的分子に結合するのみならずその設計立体配座において安定であることが必要である、ということである。目下の例示的な事例では、４つの主鎖セグメント（VL、Ｌ３、VHおよびＨ３）の各々について手順はそのセグメントの立体配座データベースに由来する５０個の主鎖立体配座をランダムに標本抽出し（図２のボックス１８）、再設計された抗体の結合エネルギー（ＥＢ）と安定性（ＥＳ）とを計算し、それぞれを下記のシグモイド関数に従って変換した：
【０３００】
（式２）
2017526053.tif 000075
式中、Ｅは結合エネルギー（ＥＢ）または未結合抗体のエネルギー（ＥＳ）のいずれかであり、ｏは、ｆ（Ｅ）が１／２の値を取るときのシグモイド中点であり、ｓは中点辺りのシグモイドの傾斜度である。当該シグモイドは、非常に低いエネルギーでは１の値に近づき、非常に高い値ではゼロに近づく。各セグメントについて立体配座を標本抽出する前に、式１中のパラメータｏを現在の設計抗体のエネルギー値に設定し直して、各セグメントの改良開始時に両シグモイドがそれらの中点に近くなるようにした。最適化目的関数は２つのシグモイドの積：ｏ＝ｆ（ＥＳ）×ｆ（ＥＢ）であり、ＥＳとＥＢとがいずれも低い場合には１に近い値を生じ、どちらか１つのエネルギー基準が高い場合にはゼロに近い値を生じものであった。この目的関数を最適化することによって、十分に安定なだけでなく高い親和性も有する主鎖立体配座が見つかる、という効果が得られる。
【０３０１】
例えば、図４で示すように、結合エネルギーを１０Ｒｏｓｅｔｔａエネルギー単位（Ｒ．ｅ．ｕ．）（変換シグモイド値で０．９９）だけ改善し、安定性を１０Ｒ．ｅ．ｕ．（変換値で０．９７、積（ＥＳ×ＥＢ）は０．９６３）だけ改善する主鎖立体配座は、結合エネルギーを１Ｒ．ｅ．ｕ（変換値で０．６１）だけ改善し、安定性を３０Ｒ．ｅ．ｕ（変換値０．９９９、積は０．６）だけ改善する主鎖立体配座よりも好ましいであろう。
【０３０２】
図４は、目的関数、すなわち式１で定義される安定性シグモイドと結合性シグモイドとの積値の３Ｄプロットを示し、設計中に標本抽出された主鎖立体配座は、抗体安定性と結合親和性との両方により制約される目的関数によって評価される。
【０３０３】
図４から分かるように、結合性および安定性の変換値が−１０Ｒ．ｅ．ｕ変化することは、安定性が−３０Ｒ．ｅ．ｕ変化し結合性が−１Ｒ．ｅ．ｕ変化することよりも好ましい。２つの変換の積は、組み込まれたセグメントが抗体の安定性と標的に対する結合親和性とに与える影響をベースラインスコア（これまでで暫定的に最良の抗体構造）に関して計る。
【０３０４】
セグメント最適化の前後における結合エネルギーおよび安定性の変化の例を図５に示す。
【０３０５】
図５Ａ−Ｂは、改良の前後における設計抗体の安定性（図５Ａ）と結合エネルギー（図５Ｂ）とを対比する散布図を示す。Ｘ軸は、配列最適化後であって改良前における抗体−標的複合体の計算エネルギー（Ｒ．ｅ．ｕ）である。Ｙ軸は、主鎖改良段階の後における設計抗体エネルギー（Ｒ．ｅ．ｕ）である。
【０３０６】
図５Ａ−Ｂから分かるように、剛体、立体配座および配列の改良は、設計抗体の結合エネルギーと安定性との両方を改善する。平均すると主鎖改良段階の後に結合エネルギーについては約５Ｒ．ｅ．ｕ（おおよそ２．５ｋｃａｌ／モルに等価）の改善、抗体安定性については１００Ｒ．ｅ．ｕ（おおよそ５０ｋｃａｌ／モルに等価）の改善が認められる。
【０３０７】
天然類似結合モードを有する設計のためのフィルタリング
本明細書において示される方法のこのステップでは、マッチングスコアの様々なパラメータに対応する４つのカットオフパラメータ、すなわち、予測結合エネルギー、埋没面積、設計抗体の可変軽重鎖ドメインと結合リガンドとの間でのパッキング性、および抗体と結合リガンドとの間での形状相補性を使用して、設計抗体の最終的フィルタリングを行った。上に論じたように、これらのパラメータの各々についてのカットオフは、ソース抗体ファミリーに属する抗体の複合体の実験的構造データから導き出され、これらのパラメータの各々についてのカットオフは、以下に一覧で示す３０３個の天然抗体−タンパク質複合体から導き出されたものであり、当該複合体は「ＳａｂＤａｂ」データベースを使用してタンパク質構造データバンクから抽出されたものである。これらの上記カットオフ値を、以下に示す例示的なベンチマーク再現性試験で使用した。
【０３０８】
天然類似結合モードを有する設計抗体は、タンパク質立体構造予測コンテスト（ＣＡＳＰ）のＩ＿ＲＭＳ基準［Ｍｅｎｄｅｚ，Ｒ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、２００３、５２（１）、ｐ．５１−６７］を用いて定義された。手短に言えば、同じ分子を標的とする天然抗体に設計抗体を構造的にアラインメントした。天然複合体に関して、設計複合体における標的の境界面残基（抗体構造の距離１０Åのカットオフ内にある全ての標的残基）間での平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）を計算した。Ｉ＿ＲＭＳ値が４Å未満である設計抗体複合体は天然類似結合モードを有すると見なした。
【０３０９】
結合エネルギー、埋没面積、パッキング性および形状相補性についてカットオフ値を設定する際に使用した天然抗体−タンパク質複合体の３０３個のＰＤＢエントリーは、下記のとおりである：
2017526053.tif 000076
【０３１０】
図６Ａ−Ｄは、抗体のＦｖドメインについて実証した場合での、本明細書において示される方法の最終ステップにおいて設計抗体構造をフィルタリングするために使用されるエネルギーおよび構造の基準を示す確率密度プロットを表し、当該確率密度プロットは,
４つのパラメータ、すなわち、予測結合エネルギー（図６Ａ）、埋没面積（図６Ｂ）、抗体構造とリガンドとの間での形状相補性（図６Ｃ）、および可変軽重鎖ドメインドメインとリガンドとの間でのパッキング性（図６Ｄ）に基づいて設計抗体をフィルタリングしたものであり、その一方で、一連の３０３個の天然タンパク質結合抗体から導き出されたカットオフ値を破線で表しており、さらに、全てのフィルタを通過した抗体設計（黒色曲線）を天然タンパク質結合抗体（灰色曲線）と比較している。
【０３１１】
抗体構造を配列からブラインド予測するためのアルゴリズムＡｂＰｒｅｄｉｃｔの使用：
設計抗体の安定性を検証するために、ｏｐｔｉｍｉｚｅ＿ｃｈｉｍｅｒａ．ｘｍｌにおいて配列設計を不可能にすることができ、種々の構造セグメントおよび剛体配向から標本抽出するＭＣＳＡプロトコルを用いることができる。実験的構造に対するベンチマークについて、元来の構造がおおよそ８Ｒｏｓｅｔｔａエネルギー単位のエネルギーギャップによって代替的立体構造から良好に分離されることが認められた（データ示さず）。そのようなエネルギーギャップが認められる場合、予測および設計は実現可能になる［Ｆｌｅｉｓｈｍａｎら、Ｃｅｌｌ、２０１２、１４９（２）、ｐｐ．２６２−２７３］。
【０３１２】
（実施例２）
設計抗体―再現性ベンチマーク
本発明のいくつかの実施形態に従う方法の、タンパク質結合抗体の構造および配列を予測する能力を試験するために、構造抗体データベース「ＳＡｂＤａｂ」を使用して、高親和性（Ｋｄ＜１０ｎＭ）かつ高分解能（Ｘ線分解能＜２．５Å）の９つのタンパク質結合抗体（以下の表５を参照）についての別種のベンチマークを選択した。
【０３１３】
一連の天然抗体は、ヒト抗体であるＦａｂ４０、Ｄ５中和ｍＡｂ、およびＢＯ２Ｃ１１（ＰＤＢ  ＩＤはそれぞれ３Ｋ２Ｕ、２ＣＭＲおよび１ＩＱＤ）、マウス抗体であるＥ８、Ｄ１．３  ｍＡｂ、Ｆ１０．６．６、ＪＥＬ４２、および５Ｅ１  Ｆａｂ（ＰＤＢ  ＩＤはそれぞれ１ＷＥＪ、１ＶＦＢ、１Ｐ２Ｃ、２ＪＥＬおよび３ＭＸＷ）、ならびにヒト化マウス抗体Ｄ３Ｈ４４（ＰＤＢ  ＩＤ  １ＪＰＳ）を含む。標的分子は、凸面（２ＪＥＬ、１ＩＱＤ）、平面（１Ｐ２Ｃ）、および凹面（３ＭＸＷ）を含み、ヘリックス（２ＣＭＲ）、シート（１ＪＰＳ）、およびループ（１Ｐ２Ｃ、３Ｋ２Ｕ）の二次構造要素を含有する。
【０３１４】
ベンチマーク再現性試験は、コンピュータ計算により再構築および設計された一連の４，５００個の抗体構造から開始された。各構造を、結合時の立体配座にある天然結合抗体の位置にアラインメントし、設計構造と、対象表面を含む分子的存在物とを含む複合体構造を生成した。天然抗体に由来する配列および主鎖立体配座の全情報を取り除いた。ＲｏｓｅｔｔａＤｏｃｋを使用して簡約表現ドッキングを適用（上記を参照）し、抗体と標的との間での初期結合モードに摂動を加えた。
【０３１５】
方法の性能を試験するために、一連のベンチマークにおいて各抗体―標的複合体について計算された結合親和性が最も高い設計抗体を単離し、この設計を次のパラメータに従って天然抗体と対比した：配列同一性、ＲＭＳＤ、境界面形状相補性（Ｓｃ）、パッキング統計値、埋没面積、結合エネルギーおよび主鎖立体配座クラスタリング。
【０３１６】
表５は、再現性ベンチマークのために使用された結合時の抗体複合体を表し、ベンチマーク再現性試験の実験結果をまとめたものである。
【０３１７】
【表５】
2017526053.tif 000077
【０３１８】
表５から分かるように、本明細書において示される設計方法は、ＰＤＢにおいて認められる天然結合モードのみを生成するものではない。実験的に観測された結合モードにおける設計立体配座および設計配列を解析するために、標的境界面が４Å ＲＭＳＤ超である場合の結合時の立体配座を天然立体配座から除去した。
【０３１９】
さらに表５から分かるように、本明細書において示される設計方法は、天然抗体立体配座を高確率で再現した。一連のベンチマークにおいて９つの抗体のうち５つは、計算された結合エネルギーに関して上位１０％のランクに入った。広い埋没面積（１８００Å2超）を有する結合時の立体配座は、より狭い埋没面積を有するものよりも一貫して正確な予測がなされた。
【０３２０】
成功裏に再現される結合モードの代表的な実施例として、ヒト化抗組織因子抗体Ｄ３Ｈ４４（ＰＤＢ  ＩＤ  １ＪＰＳ）および抗膜貫通糖タンパク質Ｄ５中和ｍＡｂ（ＰＤＢ  ＩＤ  ２ＣＭＲ）と同じ表面を標的とする設計を検討した。設計抗体を含む全ての主鎖立体配座セグメントは、実験的に決定された１ＪＰＳ（Ｌ１．１１＿Ｌ２．８、Ｌ３．１０．１、Ｈ１．１４＿Ｈ２．１５、Ｈ３．１６．５）および２ＣＭＲ（Ｈ１．１４＿Ｈ２．１５、Ｈ３．１８．７、Ｌ１．１１＿Ｌ２．８、Ｌ３．１０．１）の構造と同じ主鎖クラスタに属する。これらの設計の主鎖立体配座および結合モードは、高レベルでの天然抗体との一致を示す。
【０３２１】
天然抗体と類似した立体構造を有する設計の予測結合エネルギーランクが低い事例は、設計方法における潜在的な偏りを際立たせる。抗リゾチーム抗体Ｆ１０．６．６（ＰＤＢ  ＩＤ  １Ｐ２Ｃ）の場合、天然抗体は比較的小さな表面積を埋没させる（表５参照）。同じリゾチームエピトープを標的とする、上位のランクに入るほとんどの設計は、より長いＬ１セグメントを使用してより広い表面（１６００Å2超）を埋没させている。より広い表面を埋没させかつ標的に対する高い相補性を維持する、より長いセグメントが、フィルタリング手順によって優先的に選択された；そのような設計が実際にそれらの標的に対して天然抗体よりも高い親和性を有するか否かを実証するための実験が必要とされた。抗肝細胞増殖因子アクチベータ抗体（ＰＤＢ  ＩＤ  ３Ｋ２Ｕ）は、１９８０Å2の結合面積を有するが、その一方で、最も高いランクを占めた類似立体配座設計はたった１７００Å2しか埋没させていない（表５参照）。この埋没面積の差は、天然抗体と設計抗体との軽重鎖可変ドメイン間でのパッキング角度の差によるものである；そのような不正確性に対処するためには、可変ドメイン間でのパッキング角度のより高度なモデリングが実行され得る。
【０３２２】
配列再現率は、以前に記載した設計ベンチマークの範囲内に入った。しかし、値を直接比較することはできなかった、というのも、設計研究の従前の試みでは機能性部位設計またはタンパク質コアのどちらかを取り扱ったのに対し、本明細書において示される抗体設計ベンチマークはその両方を取り扱うからであり、また、本明細書において示される方法は、実験データに基づいて配列変異および立体配座選択を制約しながら実行するものであるからである。
【０３２３】
従前のベンチマーク研究でのように、抗体コア内での配列はおおよそ６０〜８０％以内の同一性で再現され、タンパク質結合性および酵素設計のベンチマークと同様に、結合表面配列同一性は約３０％であった。
【０３２４】
天然の相互作用の再現性の高い２つの顕著な例は、抗組織因子設計抗体および抗膜貫通糖タンパク質設計抗体であった。いずれの事例においても、境界面配列再現性は３０％超となり（表５を参照）、境界面にある保存残基は側鎖立体配座をも保存している。天然抗体について認められるのと同じ様に、一連の設計抗体における配列変異の大部分は標的結合表面に制限されていた；抗体コア位置は大いによりよく保存されていた。この高い配列保存性は、抗体コアにおける側鎖立体配座の高再現性にも反映されている。
【０３２５】
アミノ酸立体配座の柔軟性は、結合特異性および親和性を低下させる潜在性を有するため、結合表面において側鎖を剛直にする設計アルゴリズムによってタンパク質阻害剤ならびにタンパク質および小分子の結合剤が概してうまく設計される。結合剤がその標的から解離しているときの全ての側鎖立体配座の集合において結合時の側鎖立体配座のボルツマン重みを計算する、側鎖剛直性を評価するためのコンピュータ計算による計測基準が提案された。既存の方策を用いて設計された結合剤は通常、天然結合剤よりも小さい側鎖ボルツマン重みを示し、おそらくはより低い剛直性を示す。側鎖剛直性を設計方式に組み込んだ以前の設計試行は、設計の間にそれを明示的に説明するか、または設計評価のためのさらなるフィルタとしてそれを用いるかのいずれかであった。主鎖立体配座ライブラリにおいてコード化された配列−構造規則および関連するＰＳＳＭは、暗黙のうちに設計抗体結合表面にある残基をより剛直な選択肢に制約する、という仮説が立てられる。本明細書において記載される方法を用いて３０３個の高親和性天然抗体の結合表面での側鎖立体配座柔軟性を本発明の設計抗体と比較することにより、予測結合エネルギーに１Ｒ．ｅ．ｕ超の寄与をするものである結合表面の設計芳香族残基は天然抗体に非常に近い立体配座確率密度を呈したことが示される。非常に低い確率（確率５％未満）を有する側鎖立体配座は、未結合状態ではそれらの予定立体配座にある見込みがなかったが、当該側鎖立体配座の割合は１０％未満であり、全ての設計抗体の境界面残基のうち半分を上回る境界面残基は、１５％超の確率を有する側鎖立体配座を呈した。
【０３２６】
（実施例３）
Ｄｅ−ｎｏｖｏ設計抗体の発現
本明細書において記載される方法を用いることによって数千個のタンパク質配列が得られ、そのうちの１９個を実験的発現および活性試験のために選択した。当該アミノ酸配列を、パン酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現のためにコドン最適化された、ＧＳリンカーによりVH鎖のＣ末端をVL鎖のＮ末端に連結した一本鎖可変断片としてのＤＮＡへと転写した。外注合成の後に、上流および下流にフランキング領域を有するＤＮＡセグメントをＰＣＲによって増幅させ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＥＢＹ１００での相同組換えによってｐＥＴＣＯＮプラスミドへと挿入した。得られたプラスミドを配列決定によって検証し、酵母表面ディスプレイにおける試験のために使用し、当該試験では発現を設計抗体の蛍光染色によってモニタリングし、その一方でリガンド認識をビオチン化リガンドの蛍光標識によってモニタリングした。
【０３２７】
その後、初期設計の比較的低い親和性を、生体外での発生によって向上させた；元の設計を、１遺伝子あたり１〜３個の突然変異を生じる条件下でエラープローンＰＣＲによって増幅し、結果として生じるＤＮＡから（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＥＢＹ１００において）酵母ライブラリを生成した。数回のＦＡＣＳ選別によって、親和性の向上したクローンを単離し、必要に応じてそのプロセスを繰り返した。
【０３２８】
本発明の実施形態によれば、７５％以上の発現レベルを呈する設計タンパク質が得られた。これらの率は、現在知られているコンピュータ計算による設計方法によって以前に達成されなかった率であり、抗フルオレセイン抗体４ｍ５．３の発現レベルと同等であった（当該抗フルオレセイン抗体は、酵母表面ディスプレイにおける高い発現およびｓｃＦｖとしての安定性についての至適基準としての役目だけでなく設計プロセスにおける鋳型としての役目も果たした）。
【０３２９】
加えて、本明細書において示される方法は、ランダムな抗体構造が与える親和性よりも著しく高い親和性で、抗体への結合の予定された標的を認識する抗体構造を生み出した。
【０３３０】
図７は、発現レベルおよび結合性に関して染色された細胞を用いる、２つの抗体を試験するための酵母表面ディスプレイの散布図を示し、当該２つの抗体は、本明細書において記載されるアルゴリズムを使用して設計された、ＡＣＰに結合する「Ｄｅｓｉｇｎ＃１」（配列番号１）（灰色の点で示してある）ならびに、鋳型構造としての役目およびＡＣＰとＤｅｓｉｇｎ＃１（配列番号１）との結合が特異的であることを実証する結合性試験で対照としての役目を果たした、ＡＣＰに結合しない抗組織因子抗体「４ｍ５．３」（黒色の点で示してある）であり、発現レベルはＸ軸上での左方シフトによって特徴付けられ、結合性はＹ軸上での上方シフトによって特徴付けられる。
【０３３１】
図７から分かるように、抗ＡＣＰ・Ｄｅｓｉｇｎ＃１（配列番号１）は、この集団のｙシフトから導き出され得るように、１０μＭのＡＣＰに対して対照４ｍ５．３よりも強い結合性を呈する。続いて当該結合剤を、結合性を増大させる単一アミノ酸置換を有するクローンの同定につながる生体外での発生に供した。
【０３３２】
図８Ａ−Ｂは、点突然変異の導入前後における抗ＡＣＰ設計（Ｄｅｓｉｇｎ＃１〜５；配列番号１〜５、図８Ａ）の力価曲線を示し、また、抗ＡＣＰ設計（Ｄｅｓｉｇｎ＃１  配列番号１）の力価曲線を予定基質ＡＣＰ（図８Ｂ中に丸で示してある）および陰性対照（ＴＥＭ、図８Ｂ中で四角で示してある）に関して示す。
【０３３３】
記載のアルゴリズムを使用して生成したモデルによるＤｅｓｉｇｎ＃１（配列番号１）の結合境界面に、点突然変異を導入した。これらの点突然変異は、結合性に悪影響を及ぼすことが予測された。２つの別個の点突然変異を導入：Ａ３４Ｎ（Ｄｅｓｉｇｎ＃２；配列番号２）およびＳ１００Ｗ（Ｄｅｓｉｇｎ＃３；配列番号３）したことに加え、ＡＣＰに結合しない抗フルオレセイン抗体（４ｍ５．３）に由来するループＨ２およびＨ３を別々に導入する完全なセグメント変更を行った（それぞれＤｅｓｉｇｎ＃４（配列番号４）およびＤｅｓｉｇｎ＃５（配列番号５））。
【０３３４】
図８に見られるように、本発明のアルゴリズムを使用して、初期推定ｋＤが８８５ｎＭの、ＡＣＰに対する第２結合剤を生成したが、それは生体外での発生によって４５ｎＭに増大させることができた。さらに図８に見られるように、結合を妨害すると予測される単一アミノ酸およびループの交換の導入は、結合性を極端に低下させることが示された。
【０３３５】
また、図８Ａに見られるように、Ｄｅｓｉｇｎ＃１（配列番号１）の結合境界面に対するいずれの変化もＡＣＰに対する結合性を無くさせ、それによってＤｅｓｉｇｎ＃１（配列番号１）とＡＣＰとの間でのモデリングされた相互作用が支持される。Ｄｅｓｉｇｎ＃１（配列番号１）はＡＣＰに特異的に結合するものであって無差別的（「粘着性」）ではない、ということを実証するために、別の基質（ＴＥＭ）に対する結合性を試験したところ、結合性は示されなかった（図８Ｂ）。
【０３３６】
（実施例４）
ホスホトリエステラーゼ（ＰＴＥ）酵素の特異性の改変
本明細書において記載される方法を用いて、ＴＩＭバレルの一般的タンパク質フォールドに属する二核金属依存性酵素であるホスホトリエステラーゼ（ＰＴＥ）の活性部位のモデルを生成した。ＰＴＥは、広く使用されている殺虫剤であるパラオキソンを拡散律速で加水分解することができる。ＰＴＥは、ラクトンを加水分解する別のＴＩＭバレル・フォールド酵素から発生したという仮説が立てられている［Ａｆｒｉａｔ−Ｊｕｒｎｏｕ，Ｌ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０１２、５１、６０４７−６０５５］。ＰＴＥはラクトンを加水分解できないが、ラクトナーゼは無差別的なＰＴＥ活性を呈することが知られている［Ｈｉｂｌｏｔ，Ｊ．、Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．、２０１２、２、ｐ．７７９］。ＰＴＥはラクトンのアシル鎖と酵素のループ７との衝突のためにラクトンを加水分解できない、という仮説が立てられた。
【０３３７】
本明細書において示される方法を用いて、ブレード７の改変立体配座を有しながら構造の他の全ての部分の立体配座が変化せず保たれたホスホトリエステラーゼＴＩＭバレルを生成した。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ由来のパラチオン加水分解酵素（ＰＤＢ  ＩＤ：１ＨＺＹ）を鋳型タンパク質として使用した。ブレード７の幹残基（構造保存性の最も高い場所）は２１６および２６３（ＰＤＢ構造による付番）である。
【０３３８】
可能性のある百七十七個（１７７個）の立体配座変異体を生成し、Ｐｙｍｏｌを使用する目視検査と、Ｆｏｌｄｉｔ［Ｋｈａｔｉｂ，Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、２０１１、１０８、ｐｐ．１８９４９−１８９５３］を使用して主としてタンパク質パッキングを向上させるための手動での突然変異の追加とを行った後にそれらのうちの九つ（９つ）を実験的試験のために選出した。全ての設計構造は同じＮ末端領域（アミノ酸残基１−１９６）を共有しているため、Ｎ末端遺伝子と可変Ｃ末端領域とを別々に注文し、ＰＣＲを用いてそれらを組み合わせた。タンパク質の洗浄および安定性に役立つように全ての設計をＮ末端ＭＢＰと融合させ、シャペロン無しで大腸菌ＢＬ２１細胞において発現させた。
【０３３９】
９つの設計構造のうち２つは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で見たところ野生型レベルで発現された（データ示さず）。良好に発現された２つの設計について、Ｄｅｓｉｇｎ＃６（配列番号６）はＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓラクトナーゼ（ＰＤＢ  ＩＤ：４ＨＡ０）に由来するブレード７立体配座を保有し、Ｄｅｓｉｇｎ＃７（配列番号７）はＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓラクトナーゼ（ＰＤＢ  ＩＤ：３ＰＮＺ）に由来するブレード立体配座を保有する。いずれの設計も、バックグラウンドを上回ってパラオキソンに対するＰＴＥ活性を呈示したが、チオアルキルブチロラクトン基質（ＴＢＢＬ）基質で試験したところ検出可能なラクトナーゼ活性を呈示しなかった。設計を検査することにより、位置２２０には、以前にラクトナーゼ活性に重要であると報告されたアルギニンが存在するはずである、ということが明らかになった。両設計において位置２２０にアルギニン残基を再導入したところ、修正された両設計はいずれも以前と類似する発現レベルを呈示した。
【０３４０】
突然変異の後、Ｄｅｓｉｇｎ＃６（配列番号６）はパラオキソン活性のみならずラクトナーゼ活性をも呈した。Ｄｅｓｉｇｎ＃６は基質特異性を変化させた；元来の鋳型（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ由来のパラチオン加水分解酵素）が約３×１０−５のＴＢＢＬ／パラオキソン比を有する一方、Ｄｅｓｉｇｎ＃６（配列番号６）は、１０3倍の変化に当たる０．１５のＴＢＢＬ／パラオキソン比を有する。それに対して、Ｄｅｓｉｇｎ＃７（配列番号７）はパラオキソンまたは試験されたその他のラクトン基質に対する検出可能な活性を呈さなかった。
【０３４１】
（実施例５）
ラクトナーゼ酵素の特異性の改変
主鎖設計を使用して方法が酵素特異性に対する完全な制御を提供できることをさらに実証するために、方法を用いてラクトナーゼ酵素の基質特異性を変化させた。Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ由来の超熱安定性ラクトナーゼ（ＰＤＢ  ＩＤ：２ＶＣ７）を鋳型構造として選択した。当該鋳型構造はパラオキソンに対する中程度のＫcat／Ｋm効率を有する（上の表６参照）。２つの相違点、すなわち（ｉ）主鎖設計中に４つのブレード（ブレード４〜７）を変化させる一方、ブレード１、２、３および８は二量化境界面の一部を形成しているため変化させずに保ったこと、ならびに（ｉｉ）ブレード７の立体配座を既知のＰＴＥに由来するものに制限したことを除けば、設計立体配座の生成はホスホトリエステラーゼについての上記方法に類似していた。
【０３４２】
パラオキソンの最初のドッキング配向は、パラオキソン類似体（ＰＤＢ  ＩＤ：２Ｒ１Ｎ）に結合したＰＴＥの結晶構造を鋳型タンパク質の結晶構造にアラインメントしてリガンド座標を鋳型タンパク質構造に複製することによって生成した。
【０３４３】
種々のブレード７立体配座および配列設計選択を有する５つの設計構造（配列番号８〜１２）を実験的試験のために選択した。
【０３４４】
図９は、設計鋳型としての役目を果たした元々の酵素の配列（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ由来のラクトナーゼ；ＰＤＢ  ＩＤ：２ＶＣ７；配列番号１３）とは異なる基質特異性を有するように設計された、Ｄｅｓｉｇｎ＃８〜１２（それぞれ配列番号８〜１２）で表される５つのＴＩＭバレル・フォールド設計の配列アラインメントを示す。
【０３４５】
図９から分かるように、１４個のアミノ酸が鋳型タンパク質に挿入され、当該挿入を調整するために挿入セグメント（太線で示してある）の周辺にさらなる配列改変が導入された。ＰＴＥファミリー内の他の構成要素からの挿入を導入する従前の試みでは、非機能的タンパク質が生じた［Ａｆｒｉａｔ−Ｊｕｒｎｏｕ，Ｌ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０１２、５１、６０４７−６０５５］。
【０３４６】
本発明をその特定の実施形態と共に説明してきたが、多くの代替形態、改変形態および変形形態が当業者にとって明らかであろうということは明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の精神および広義の範囲に入る全てのそのような代替形態、改変形態および変形形態を包含することが意図される。
【０３４７】
本明細書において言及される全ての刊行物、特許および特許出願は、各個別の刊行物、特許または特許出願が具体的かつ個別に示されて参照によって本明細書に組み込まれた場合と同じ程度に、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。さらに、本出願におけるいかなる参考文献の引用または特定も、そのような参考文献が本発明の先行技術として利用可能であることの容認として解釈されるべきではない。見出しが使用されている限りにおいて、それらは必ずしも限定的であると解釈されるべきではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ−６Ｄ】
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【図７】
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【図８Ａ−８Ｂ】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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