(57)【要約】  ビーズＨＴＳプラットフォーム上のライブラリおよび光ファイバーアレイ走査技術を使用した、親和性試薬および触媒を発見するためのデバイス、システム、および方法であって、各ビーズが、分岐および三次構造への折り畳みが事前に規定されている配列を有する特徴的な生物活性モノマーの結合非天然ポリマーを含むデバイス、システム、および方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハイスループット薬物スクリーニング用に構成されているビーズのライブラリであって、各ビーズが、分岐および三次構造への折り畳みが事前に規定されている配列を有する特徴的な生物活性モノマーの結合非天然ポリマーを含むライブラリ。
【請求項２】
前記ポリマーの各々に組み込まれている、ターンを強制することにより前記三次構造を誘導する二次構造制約（ＳＳＣ）モノマーを更に含み、前記ＳＳＣモノマーが、質量分析に基づく前記ポリマーの配列決定を容易にするために酸切断可能である、請求項１に記載のライブラリ。
【請求項３】
前記ポリマーまたは重合が、スルホンアミド、還元的アミノ化、ペプトイド結合、鈴木カップリング、ホスポアミジットカップリング、またはラジカルクロスカップリングを含み、
前記モノマーが、ジヒドロイソキノリンオンであり、および／または
前記重合が、アミド結合カップリング法を、化学的に直交性の銅触媒環化付加（クリック反応）を使用して導入されたペプチドトリアゾール分岐点と組み合わせる、請求項１に記載のライブラリ。
【請求項４】
前記ポリマーが、内因的に組み込まれたアイソトープでコード化された質量分析タグまたはバーコードにより内因的に自己読取り可能な分子を含む、請求項１に記載のライブラリ。
【請求項５】
スライドにアレイ状に構成されている、請求項１に記載のライブラリ。
【請求項６】
光ファイバースキャナに取り付けられているスライドにアレイ状に構成されている、請求項１に記載のライブラリ。
【請求項７】
前記ポリマーを前記ビーズに結合させること、または連続モノマーカップリングにより前記ビーズに前記ポリマーを構築することを含む、請求項１に記載のライブラリを製作するための方法。
【請求項８】
請求項１に記載のライブラリの配列アレイを含むスライドを取り付けた光ファイバースキャナを使用するための方法であって、
前記アレイを生物活性（親和性または触媒作用）マーカーで標識して、標的モノマーを含む標的ビーズに蛍光標識を生成することと、
前記アレイを前記スキャナで蛍光画像化することとを含む方法。
【請求項９】
請求項１に記載のライブラリの配列アレイを含むスライドを取り付けた光ファイバースキャナを使用するための方法であって、
前記アレイを生物活性（親和性または触媒作用）マーカーで標識して、標的モノマーを含む標的ビーズに蛍光標識を生成すること、
前記アレイを前記スキャナで蛍光画像化することとを含み、
前記標識が、複数の蛍光波長を提供し、前記画像化が、光学フィルタリングを含み、バックグラウンドシグナルおよび偽陽性が低減される方法。
【請求項１０】
請求項１に記載のライブラリを使用するための方法であって、
前記ライブラリを蛍光アッセイして、前記対応するモノマーの生物活性に基づいて候補ビーズを検出すること、
前記アッセイされたライブラリから前記候補ビーズを単離することと、
前記単離された候補ビーズからポリマーを切断することと、
前記切断されたポリマーを構造的に分析することとを含む方法。
【請求項１１】
分岐および三次構造への折り畳みが事前に規定されている配列を有する特徴的な生物活性モノマーの非天然ポリマー。
【請求項１２】
中に組み込まれている、ターンを強制することにより前記三次構造を誘導する二次構造制約（ＳＳＣ）モノマーを更に含み、前記ＳＳＣモノマーが、質量分析に基づく前記ポリマーの配列決定を容易にするために酸切断可能である、請求項１１に記載のポリマー。
【請求項１３】
前記ポリマーが、ポリアミド、ビニル性ポリマー、ビニル性ポリアミド、またはエステルであり、
前記ポリマーが、ウルツ反応、グレーサーカップリング、ウルマン反応、ゴンベルグ−バックマン反応、カディオ−ホトキェヴィチカップリング、ピナコールカップリング反応、カストロ−ステファンズカップリング、ギルマン試薬カップリング、カサール反応、熊田カップリング、ヘック反応、薗頭カップリング、根岸カップリング、スティルクロスカップリング、鈴木反応、檜山カップリング、ブッフバルト−ハートウィッグ反応、福山カップリング、およびリエベスキンド−スログルカップリングから選択されるカップリング反応で重合されており、
前記ポリマーまたは重合が、スルホンアミド、還元的アミノ化、ペプトイド結合、鈴木カップリング、ホスポアミジットカップリング、およびラジカルクロスカップリングから選択され、
前記モノマーが、ジヒドロイソキノリンオンであり、ならびに／または
前記重合が、アミド結合カップリング法を、化学的に直交性の銅触媒環化付加（クリック反応）を使用して導入されたペプチドトリアゾール分岐点と組み合わせる、請求項１１に記載のポリマー。
【請求項１４】
内因的に組み込まれたアイソトープでコード化された質量分析タグまたはバーコードにより内因的に自己読取り可能な分子を含む、請求項１１に記載のポリマー。
【請求項１５】
ハイスループット薬物スクリーニング用のビーズのライブラリであって、前記ビーズのそれぞれが、請求項１１に記載の結合非天然ポリマーを含むライブラリ。
【請求項１６】
蛍光ビーズを担持するスライドを取り付けた光ファイバースキャナ。
【請求項１７】
前記スライドを含む試料を支持するための平坦表面を有する画像化装置試料台と、
２つの光ファイバー束であって、各束が、前記画像化装置試料台上の前記試料を観察するための入力開口部を画定するように配置されている第１の端部、および前記画像化装置試料台から遠ざかるように配置されている出力開口部を画定するように配置されている遠位束端部を有する光ファイバー束を有する二分岐光路と、
前記画像化装置試料台上の前記試料に対して垂直であり、前記二分岐光路の両束に緊密に隣接する経路に沿ってビームを走査するように配置されている走査源であって、前記走査源により前記画像化装置試料台に提供される照明の実質的に円形なスポットが、光シグナルを提供し、少なくともその一部が、各束の前記入力開口部により受信され、前記二分岐光路を介して前記出力開口部へと伝達される走査源と、
前記遠位端部で前記光シグナルを検出するように配置されている光検出器と、
前記光検出器により検出された前記光シグナルを処理するプロセッサとを含む、請求項１６に記載のスキャナ。
【請求項１８】
請求項１５に記載の蛍光ビーズを担持する前記スライドを含む試料を画像化するための方法であって、
前記試料に対して垂直な放射の実質的に円形なビームを供給することと、
前記試料の走査経路に沿って掃引する間、前記放射ビームの前記垂直方向を維持することと、
前記試料とのビーム相互作用により生成される少なくともある程度の光を、前記試料から遠ざかる方向に反射させることと、
光ファイバー第１端部のアレイの少なくとも１つの近接要素で、前記試料とのビーム相互作用により生成される光を収集することと、
収集した光を選択された出力領域で検出することと、
掃引、移動、および検出を協調させて、前記試料の少なくとも一部を表す画素のアレイを生成することとを含む方法。
【請求項１９】
請求項１５に記載の蛍光ビーズを担持するスライドを取り付けた前記光ファイバースキャナを使用するための方法であって、
前記ビーズを前記スキャナで蛍光画像化するステップを含む方法。
【請求項２０】
請求項１５に記載の蛍光ビーズを担持するスライドを取り付けた前記光ファイバースキャナを使用するための方法であって、
前記ビーズを前記スキャナで蛍光画像化して、候補ビーズを検出するステップと、
前記候補ビーズを前記ビーズから単離するステップと、
前記候補ビーズの機能または構造を分析するステップとを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
大規模な化合物群を生物学的、物理的、または化学的特性についてスクリーニングするための迅速で対費用効果の高い方法は、多くの産業で依然として困難な課題である。製薬会社は、およそ数か月で最大２００万個の化合物をスクリーニングすることができるハイスルースクリーニング工程を開発しているが、こうした工程を実行および維持するには、高度な自動化、化合物保管、および情報検索システム、および幾つかのＦＴＥが必要である。
【０００２】
本発明者らは、ＳＲＩ社により開発された、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）をスクリーニングするための光ファイバーアレイ走査技術（ＦＡＳＴ）に基づき、同じプラットフォームを使用して、白血球細胞（１０〜２０ミクロンだが、＜１ミクロンまたは５００ミクロンを超える場合がある）と同様のサイズのビーズに共有結合で結合されているかまたは吸収されているかのいずれかである化合物をスクリーニングすること、およびそれらを同一のガラススライドに配列させること、およびＦＡＳＴ  ＣＴＣスキャナで使用されるアッセイに基づいて蛍光を試験することを企図した。このプラットフォームでは、約６０秒で２５，０００，０００個の化合物をスクリーニングすることができる。１００，０００，０００個の化合物のライブラリであれば、４枚のスライドで４分間でスクリーニングすることができる。
【０００３】
このスクリーニングプラットフォームを使用すると、試薬（化合物、スクリーニング試薬、プレート等）のコストが大幅に低減される。加えて、そのようなアッセイは、１人の助手レベルの人員で実行することができる。本発明は、製薬会社にとって非常に有益であり、診断薬および治療薬ならびに触媒の新規親和性試薬の迅速な発見の応用することにより、リード化合物の発見において、安価なスクリーニングおよび非常により大きな多様性の化合物ライブラリへのアクセスを提供する。
【０００４】
関連文献：希少細胞の検出器、Ｋｒｉｖａｃｉｃ  ｅｔ  ａｌ．２００４，ＰＮＡＳ  １０１（２９）１０５０１−１０５０４；米国特許第７２８０２６１号明細書；米国特許第７８４２４６５号明細書；新規検出技術を使用した、局所進行性／炎症性のステージ４の乳がんを有する患者の原発部位および転移部位に由来する腫瘍組織と比較した循環腫瘍細胞での複合バイオマーカーの発現；Ｓｏｍｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ．２０１１  Ｊｕｌ；１２８（１）：１５５−６３；Ｅｘ  Ｖｉｖｏ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ＣＴＣｓ：Ａｎ  Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ｔｏ  Ｇｕｉｄｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍａｈｅｓｗａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｊｕｎｅ  １５，２０１５，７５：２４１１−２４１５。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第７２８０２６１号明細書
【特許文献２】米国特許第７８４２４６５号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｋｒｉｖａｃｉｃ  ｅｔ  ａｌ．２００４，ＰＮＡＳ  １０１（２９）１０５０１−１０５０４
【非特許文献２】Ｓｏｍｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ．２０１１  Ｊｕｌ；１２８（１）：１５５−６３
【非特許文献３】Ｅｘ  Ｖｉｖｏ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ＣＴＣｓ：Ａｎ  Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ｔｏ  Ｇｕｉｄｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍａｈｅｓｗａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｊｕｎｅ  １５，２０１５，７５：２４１１−２４１５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、生物活性モノマーの大型非天然ポリマー、およびビーズ、および上記ポリマーを含むビーズのライブラリを提供する。別の態様では、本発明は、対象ポリマーを含むビーズを含む蛍光ビーズをスクリーニングするための光ファイバーアレイ走査技術（ＦＡＳＴ）の使用を提供する。本発明は、親和性試薬および触媒を発見するための強力なプラットフォーム、およびビーズハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）のライブラリを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一態様では、本発明は、ハイスループット薬物スクリーニング用に構成されているビーズのライブラリであって、各ビーズは、分岐および三次構造への折り畳みが事前に規定されている配列を有する特徴的な生物活性モノマーの結合非天然ポリマーを含むライブラリを提供する。分岐および三次構造への折り畳みが事前に規定されている必要不可欠な生物活性モノマーおよび配列が組み込まれている任意の好適なポリマーおよび重合を使用することができる。
【０００９】
複数の実施形態では、ライブラリは、ポリマーの各々に組み込まれている、ターンを強制することにより三次構造を誘導する二次構造制約（ＳＳＣ）モノマーを更に含み、好ましくは、ＳＳＣモノマーは、質量分析に基づくポリマーの配列決定を容易にするために酸切断可能であり；
ポリマーが、ポリアミド、ビニル性ポリマー、ビニル性ポリアミド、またはエステルであり；
ポリマーが、ウルツ反応、グレーサーカップリング、ウルマン反応、ゴンベルグ−バックマン反応、カディオ−ホトキェヴィチ（Ｃａｄｉｏｔ−Ｃｈｏｄｋｉｅｗｉｃｚ）カップリング、ピナコールカップリング反応、カストロ−ステファンズカップリング、ギルマン試薬カップリング、カサール（Ｃａｓｓａｒ）反応、熊田カップリング、ヘック反応、薗頭カップリング、根岸カップリング、スティルクロスカップリング、鈴木反応、檜山カップリング、ブッフバルト−ハートウィッグ（Ｂｕｃｈｗａｌｄ−Ｈａｒｔｗｉｇ）反応、福山カップリング、およびリエベスキンド−スログル（Ｌｉｅｂｅｓｋｉｎｄ−Ｓｒｏｇｌ）カップリングから選択されるカップリング反応で重合されており；
ポリマーまたは重合が、スルホンアミド、還元的アミノ化、ペプトイド結合、鈴木カップリング、ホスポアミジットカップリング、およびラジカルクロスカップリングから選択され；
モノマーが、ジヒドロイソキノリンオンであり；
重合が、アミド結合カップリング法を、化学的に直交性の銅触媒環化付加（クリック反応）を使用して導入されたペプチドトリアゾール（ｐｅｐｔｉｄｏｔｒｉａｚｏｌｅ）分岐点と組み合わせ；および／または
ポリマーが、内因的に組み込まれたアイソトープでコード化された質量分析タグまたはバーコードにより内因的に自己読取り可能な分子を含む。
【００１０】
別の態様では、本発明は、対象ライブラリが、一次元、二次元、および／または三次元に配列されていてもよいアレイを提供する。
【００１１】
別の態様では、本発明は、対象ライブラリの配列されたアレイを含むスライドを取り付けた光ファイバースキャナを提供する。
【００１２】
別の態様では、本発明は、ポリマーをビーズに結合させること、または連続モノマーカップリングによりビーズにポリマーを構築することを含む、対象ライブラリを製作するための方法を提供する。
【００１３】
別の態様では、本発明は、対象ライブラリのアレイを含むスライドを取り付けた光ファイバースキャナを使用するための方法であって、
アレイを生物活性（親和性または触媒作用）マーカーで標識して、標的モノマーを含む標的ビーズに蛍光標識を生成すること、および
スキャナを用いてアレイを蛍光画像化することを含み、好ましくは、標識が、複数の蛍光波長を提供し、画像化が、光学フィルタリングを含み、バックグラウンドシグナルおよび偽陽性が低減される方法を提供する。
【００１４】
１つの実施形態では、フルオロフォアの励起にレーザ（例えば、４８８ｎｍ）を使用し、その後バンドパスフィルタを使用して、放射光を２つ以上のチャネル（例えば、５２０ｎｍおよび５８０ｎｍ）に分割し、この場合、一方のチャネル（例えば、５２０ｎｍの光）は、バックグラウンド光であり、他方（例えば、５８０ｎｍ）は、目的のシグナル光である。これら２つのシグナル比の計算を使用して、活性ポリマーを選択する。
【００１５】
別の実施形態では、異なる波長を放射するフルオロフォアで、非標的分子（例えば、ウシ血清アルブミン、または目的標的と関連するタンパク質）を標識する。その後、目的波長シグナル対非目的波長シグナルの比を使用して、活性および特異性を有するポリマーを選択する。
【００１６】
別の態様では、本発明は、対象ライブラリを使用するための方法であって、
ライブラリを蛍光アッセイして、対応するモノマーの生物活性に基づいて候補ビーズを検出すること；
アッセイされたライブラリから候補ビーズを単離すること；
単離された候補ビーズからポリマーを切断すること；および
切断されたポリマーを構造的に分析することを含む方法を提供する。
【００１７】
別の態様では、本発明は、分岐および三次構造への折り畳みが事前に規定されている特徴的な生物活性および配列の非天然ポリマーを提供する。複数の実施形態では：
ポリマーが、ポリアミド、ビニル性ポリマー、ビニル性ポリアミド、またはエステルであり；
ポリマーが、ウルツ反応、グレーサーカップリング、ウルマン反応、ゴンベルグ−バックマン反応、カディオ−ホトキェヴィチカップリング、ピナコールカップリング反応、カストロ−ステファンズカップリング、ギルマン試薬カップリング、カサール反応、熊田カップリング、ヘック反応、薗頭カップリング、根岸カップリング、スティルクロスカップリング、鈴木反応、檜山カップリング、ブッフバルト−ハートウィッグ反応、福山カップリング、およびリエベスキンド−スログルカップリングから選択されるカップリング反応で重合されており；
ポリマーまたは重合が、スルホンアミド、還元的アミノ化、ペプトイド結合、鈴木カップリング、ホスポアミジットカップリング、およびラジカルクロスカップリングから選択され；
モノマーが、ジヒドロイソキノリンオンであり；
重合が、アミド結合カップリング法を、化学的に直交性の銅触媒環化付加（クリック反応）を使用して導入されたペプチドトリアゾール分岐点と組み合わせ；および／または
ポリマーが、内因的に組み込まれたアイソトープでコード化された質量分析タグまたはバーコードにより内因的に自己読取り可能な分子を含む。
【００１８】
別の態様では、本発明は、ハイスループット薬物スクリーニング用に構成されているビーズのライブラリであって、各ビーズが、本明細書で開示されているような結合非天然ポリマーを含むライブラリを提供する。
【００１９】
別の態様では、本発明は、蛍光ビーズを担持するスライドを取り付けた光ファイバースキャナであって、好ましくは、
スライドを含む試料を支持するための平坦表面を有する画像化装置試料台；
２つの光ファイバー束であって、各束が、画像化装置試料台上の試料を観察するための入力開口部を画定するように配置されている第１の端部、および画像化装置試料台から遠ざかるように配置されている出力開口部を画定するように配置されている遠位束端部を有する光ファイバー束を有する二分岐光路；
画像化装置試料台上の試料に対して垂直であり、二分岐光路の両束に緊密に隣接する経路に沿ってビームを走査するように配置されている走査源であって、走査源により画像化装置試料台に提供される照明の実質的に円形なスポットが、光シグナルを提供し、少なくともその一部が、各束の入力開口部により受信され、二分岐光路を介して出力開口部へと伝達される走査源；
遠位端部で光シグナルを検出するように配置されている光検出器；および
光検出器により検出された光シグナルを処理するプロセッサを含むスキャナを提供する。
【００２０】
別の態様では、本発明は、本明細書で開示されている蛍光ビーズを担持するスライドを含む試料を画像化するための方法であって、
試料に対して垂直な放射の実質的に円形なビームを適用すること；
試料の走査経路に沿って掃引する間、放射ビームの垂直方向を維持すること；
試料とのビーム相互作用により生成される少なくともある程度の光を、試料から遠ざかる方向に反射させること；
光ファイバー第１端部のアレイの少なくとも１つの近接要素で、試料とのビーム相互作用により生成される光を収集すること；
収集した光を選択出力領域で検出すること；および
掃引、移動、および検出を協調させて、試料の少なくとも一部を表す画素のアレイを生成することを含む方法を提供する。
【００２１】
別の態様では、本発明は、本明細書で開示されている蛍光ビーズを担持するスライドを取り付けた光ファイバースキャナを使用するための方法であって、
ビーズをスキャナで蛍光画像化すること、および好ましくは：
ビーズをスキャナで蛍光画像化して、候補ビーズを検出すること；
候補ビーズをビーズから単離すること；および
候補ビーズの機能または構造を分析することを含む方法を提供する。
【００２２】
本発明は、記載されている実施形態の全ての組み合わせを、あたかも各々が入念に個々に示されているかの如く具体的に提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】タンパク質二次構造特徴を模倣するポリアミドモノマーの設計戦略を示す図である。
【図２】配列規定分岐を有するポリアミドの合成スキームを示す図である。
【図３】非天然ポリマービーズの構成を示す図である。
【図４】ＮＮＰ  ＭＳ断片化の配列決定手法を示す図である。
【図５】容易で迅速な配列決定用のライブラリ設計；自己読取り可能なＮＮＰを示す図である。
【図６】配列決定用のアイソトープでコード化されたＭＳタグを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、ビーズＨＴＳプラットフォームでのライブラリおよび光ファイバーアレイ走査技術を使用して、親和性試薬および触媒を発見するための方法を提供する。
【００２５】
生物活性モノマーを重合して、生物活性モノマーの非天然ポリマーを形成し、それらをマイクロビーズ（直径が、１、２、５、または１０〜１０、２０、５０、１００、２００、５００または１０００ｕｍ）と結合させる。複数の態様では、本発明は、親和性試薬および触媒の発見を最大化するように二次構造分子骨格および分岐構造が組み込まれている新しいポリマーを合成するための新規非天然モノマー、および１０８個メンバーのライブラリを５分未満でスクリーニングすることができる革命的ハイスルースクリーニング（ＨＴＳ）プラットフォームを提供する。
【００２６】
モノマーの合成およびポリマーのライブラリ。十分に確立されている固相ペプチド化学技術を使用して、特有の構成および官能性、タンパク質二次構造の特徴を模倣する非ペプチド骨格、ならびに配列規定分岐構造を有する非天然アミノ酸モノマー等の特有の非天然特徴を有するポリアミドのライブラリを生成する。
【００２７】
二次構造特徴の低分子テンプレート。タンパク質構造中のアミノ酸はごく一部が、結合相互作用または触媒機能に直接関与するに過ぎず、大部分は、主として、相互作用残基を正しい向きに位置決めする構造決定要因である。本発明は、低分子テンプレートを使用して二次構造要素を模倣するための戦略を提供する。一実施形態では、二次構造要素に関連する距離および角度を、ベクトルとしてモデル化し、列挙型仮想フレームワークライブラリを検索するために使用する。その後、ヒットを３Ｄ構造データベースで検索し、手作業で詳しく調べて、合成モノマー標的を特定する（図１）。本発明者らは、α−ヘリックスおよびβ−ターンの角度および側鎖突出を模倣するテンプレートを設計および検証した。それらは両方とも、グラム規模で調製されていた［３、４］。これらテンプレートをポリアミド鎖に組み込むことにより、立体構造的に制約された骨格を有する生物活性構造特徴の空間的配向性を模倣することができる。また、これらモノマーは、ロバストなコンビナトリアル誘導体化にかけることができ、それにより、非天然官能基を生物活性ポリマーに組み込むことが可能になる。
【００２８】
分岐用モノマーの組み込み。配列規定分岐ポリアミドは、空間的自由度が低減されているため、特有の生物活性特性を有する構造化されたおよび折り畳まれた三次構造を形成する。線形ポリマーに対する分岐ポリアミドの別の有益性は、一定数のモノマーユニットからもたらされる配列多様性が指数関数的に増加することである。配列規定分岐ポリアミドは、タンパク質の化学的特性を有するが、多糖類のような驚くべき多様性を示す能力を有する。一実施形態では、分岐ポリアミドを得るための本発明者らの手法は、化学的に直交性の銅触媒環化付加（「クリック反応」）を使用して導入したペプチドトリアゾール分岐点を、標準的アミド結合カップリング法と組み合わせて使用することである（図２）。
【００２９】
非天然アミノ酸モノマーの設計および合成。本発明は、ポリアミドの機能的立体構造への折り畳みを容易にする非天然モノマーを提供する。上記手法に加えて、本発明者らは、ラマチャンドランプロットで典型的に見出される主鎖二面角の外側にある主鎖二面角を有する非天然アミノ酸モノマーを設計した。これらアミノ酸としては、コンパクトな構造化立体構造を形成する天然アミノ酸のβ−およびγ−アミノ酸変異体が挙げられる。本発明者らは、１Ｄおよび２Ｄ  ＮＭＲにより評価したところ、コンパクトな二次構造へと折り畳まれる、４個のモノマーしか有していない非天然ポリペプチドを、分子動力学を使用して設計している［５］。モノマーは全て、容易に合成され、ＨＰＬＣによる純度が＞９８％であり、構造は、１Ｄ／２Ｄ  ＮＭＲ、ＭＳ、およびＣＤを使用して一義的に帰属された。本発明者らが、＞１グラム規模で＞９８％の純度で製作した非天然モノマーの例［１〜３］としては、以下のものが挙げられる。
【化１】
2017535517.tif 000003
【００３０】
計算設計および最適化。本発明は、ペプチドおよびタンパク質の構造および機能をモデリングするためのものと類似した、非天然構造単位、ポリマー、およびライブラリ設計をモデル化するための計算機化学ツールを提供する。開発基準としては、以下のものが挙げられる。
【００３１】
非天然モノマーをパラメータ化すること；
構造単位に対して量子力学（ＱＭ）計算を行って、正確な電荷、結合距離、および角度を導き出すこと；
モノマーの二量体および三量体に対してＱＭ計算を行って、二面角優先性を導き出すこと。
【００３２】
これら構造単位を有するポリマーに関する計算ツールを検証すること；
可能な場合、類似構造単位を有する擬似ペプチドのデータセットをタンパク質構造データバンク（ＰＤＢ）から抽出すること；
（１）のパラメータを用いて、初期ヒットのデータセットおよび構造データ（ＮＭＲ、Ｘ線）に対してツールの関連モジュールを実行すること；
新規生物活性ポリマーの設計に応用すること；
折り畳まれて、新規で多様な様式の結合機能性または触媒機能性を示す可能性がより高い配列を有するバイアスライブラリを設計すること。
【００３３】
大型（＞１０８＋）コンビナトリアルライブラリの生成。非天然ポリマーの膨大な理論的配列空間に対応するために、＞１０８−１２個ポリマーのライブラリを、コンビナトリアルスプリットアンドプール合成戦略（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｓｐｌｉｔ  ａｎｄ  ｐｏｏｌ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｓｔｒａｔｅｇｙ）を使用して合成する［６］。一実施形態では、確立されている固相合成法を使用し、その場合、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）グラフトマイクロビーズを固体支持体として使用する。主にＦｍｏｃ化学法を使用してモノマーユニットを付加し、９６ウエルろ過マニフォールドで実施する。試薬添加、洗浄、および減圧ろ過ステップは、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＪａｎｕｓまたはＢｉｏｍｅｋ  Ｆｘ液体ハンドリングワークステーションのいずれかを使用して実施する。最終モノマーユニットを付加したら、ポリマーを、ビーズ上で脱保護し、洗浄し、乾燥する。本発明者らのカップリング反応は大部分が、確立されているＦｍｏｃ化学に基づいているため、標準的ペプチドカップリングの既存プロトコールを使用し、非天然モノマーユニットを含むステップの反応条件を最適化する。
【００３４】
複数の実施形態では、モノマーユニットが２０〜３０個の範囲であるポリアミドを使用して、良好な折り畳み構造を形成可能な最低限の長さを決定する。本発明者らは、１Ｄおよび２Ｄ  ＮＭＲにより評価したところ、コンパクトな二次構造へと折り畳まれる、４個のモノマーしか有していない天然ポリペプチドを、分子動力学により設計することが可能であることを示している［５］。また、ランダムバリエーション（ｒａｎｄｏｍ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）［７］ならびにポジショナルスキャニング手法（ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ａｐｐｒｏａｃｈ）［８］の両方を用いてライブラリを生成してもよい。
【００３５】
結合物質および触媒を特定するための非天然ポリマーライブラリのスクリーニング；がん診断。循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）は、腫瘍から脱落して血流へと流入した、転移のプロセスに関与すると考えられる個々のがん細胞である。ＣＴＣ表現型は、原発腫瘍の状態を表し、したがって、簡単な血液採取により、がん患者の全体的な腫瘍状態の「液体生検」−がん治療を非侵襲的にモニターおよび方針決定するための潜在的に非常に強力な診断ツールを提供する。ＣＴＣの特定における主な問題は、ＣＴＣが非常に希少な（５００万個中、＞１細胞）ことであるが、走査レーザを用いて血液試料を「コピー」し、高密度に充填された光ファイバーアレイ束を用いて試料の高解像度キャプチャ画像を収集するという概念に基づく、光ファイバーアレイ走査技術（ＦＡＳＴ（商標））サイトメータと呼ばれるＳＲＩプラットフォーム［９］。
【００３６】
ＦＡＳＴでは、処理血液試料を、標準的マイクロタイタープレートの設置面積を有するガラススライドに播種する。スライドを、単層分散細胞層の形成を確かなものにし、かつ細胞をガラス表面に固定する役目を果たすポリ−リジングラフトでコーティングする。その後、ガラススライド上の細胞単層を、蛍光的に標識されたＣＴＣ標的剤で処理し、ＦＡＳＴシステムで走査する。スライドに存在する蛍光的に標識したＣＴＣの位置のデジタル画像を作成するのに６０秒しか必要としない。これは、極めて高感度のシステムであり、本発明者らは、＞２５，０００，０００個の白血球細胞を含有するガラススライド上の１桁数のＣＴＣが信頼性高く検出されることを実証している。このシステムは、十分に検証されており、ロバストである。ＳＲＩ社は、ＦＡＳＴシステム上で数千もの血液試料を処理しており、これは、現在、がん治療でのＣＴＣ分析を検証するヒト治験における診断プラットフォームとして含まれている。
【００３７】
ＦＡＳＴシステムによりそれらの位置を特定したら、吸引システムを使用して個々の細胞をガラススライドから日常的な方法でピッキングし、その後更なる処理のために３８４ウエルプレートまたは１５３６ウエルプレートの緩衝液中に個々の細胞を移動させる。
【００３８】
大型コンビナトリアルライブラリのＦＡＳＴハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）：＞１００，０００，０００個の化合物（＞１０８個）の生体高分子ライブラリをたった４分間でスクリーニングすることができる非常に迅速で高感度のスクリーニングプラットフォーム。
【００３９】
オンビーズスクリーニングを容易にするために、ＰＥＧグラフトコポリマー表面を有するポリスチレンビーズコアを含むＴｅｎｔａｇｅｌ型レジンに化合物を合成した。ＰＥＧコーティングにより、スクリーニングのためにビーズ表面に結合された化合物が、水性緩衝液に提示されやすくなる。本発明者らの手法は、複数の革新的な手法を用いて、オンビーズ固相スクリーニングを再考する機会を提供する。例えば、
ビーズは、細胞と同じサイズであってもよく、固相スクリーニング用のビーズは、直径が５〜５００ミクロンと様々である。ＦＡＳＴプラットフォームでスクリーニングされる白血球細胞は、典型的には８〜３０ミクロンの範囲である。オンビーズスクリーニングでは、より大きなビーズに化合物を合成して化合物収率を最大化する傾向があるが、本発明者らは、（ｉ）親和性または触媒活性を示し、（ｉｉ）予備ヒットとしていったん選択されたポリマー分子構造を特定するのに十分なポリマーしか必要としない。より小さなビーズ（直径が約１０〜２０ミクロンの範囲）にライブラリを合成することにより、本発明者らは、２５０〜５００ｍｇと少量のレジンに１００，０００，０００個メンバーのライブラリを合成することができる。
【００４０】
ビーズは、ＦＡＳＴプラットフォームを使用してスクリーニングすることができる。２５，０００，０００個メンバーのオンビーズライブラリを、ＣＴＣスクリーニングに使用されるものと同様の、ガラススライド上での蛍光に基づくアッセイを使用してスクリーニングすることができる。ポリマーライブラリを固体支持体に合成したら、ライブラリをＦＡＳＴガラススライドに分散させ、蛍光的に標識された標的作用剤で処理し、親和性または酵素活性をＦＡＳＴスキャナでスクリーニングする。ＳＲＩ  ＦＡＳＴシステムでは、４分間で（１スライド当たり６０秒）、１０８個メンバーのライブラリを走査して、ヒットを特定することができる。
【００４１】
ビーズを選択して特徴付けを行うことができる。ＦＡＳＴ  ＣＴＣピッキング用に開発された同じ細胞ピッキングシステムを使用すると、選択したビーズをガラススライドからピッキングし、３８４ウエルプレートまたは１５３６ウエルプレートに移して、レジンを切断し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより特徴付けを行うことができる（下記の配列決定の項を参照）。個々の細胞ピッキングには、１細胞当たり１５〜２０秒かかる。例えば、１００個のヒットがプレートで検出されたとすると、ビーズピッキングには、わずか３３分しかかからず、全１０８個ライブラリ全体では約２時間しかかからないことになる。
【００４２】
本発明者らは、この例を１０８のライブラリ規模としたが、プロセス全体は、より大きなライブラリ（１１０−１２）または複数の多様なライブラリへと容易に拡張可能である。また、このプロセスは、そのような生物外被断片またはタンパク質、オリゴ糖、タンパク質、ＤＮＡ／ＲＮＡ配列、サイトカイン、またはペプチド等の生物学的標的との、本質的には、蛍光標識でタグ付けすることができ、ライブラリをスライドに直接塗布して、上記に記載のように読み取ることができるあらゆる作用剤との結合のスクリーニングに直ちに応用される。幾つかの低分子の場合、蛍光標識でタグ付けすると、その作用剤の物理化学的特性およびその結合プロファイルが著しく影響を受ける場合がある。したがって、代替的な手法では、合成した各ライブラリ化合物の開始端および終端に蛍光標識および消光標識を組み込み、その後、ＦＡＳＴを使用して、スライド上の個々のビーズの蛍光の、作用剤の適用前後の変化を特定することによる蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）アッセイを使用する。ＦＲＥＴアッセイおよびフルオロフォアは、このタイプのアッセイのために最適化することができるが、ＦＡＳＴスキャナは、蛍光強度および波長のごくわずかな変化を検出するのに必要な感度を有する。
【００４３】
非天然ポリマーの配列決定および特徴付け。一実施形態では、直径が１０〜２０ミクロンのＰＥＧグラフトポリスチレンビーズを使用して、大型ライブラリを合成する。典型的には、こうしたタイプのレジンは、１グラムのレジン当たり０．２〜０．３ｍｍｏｌの化合物を負荷する能力を有する。１グラムのレジンには、およそ２億５０００万個の２０ミクロンビーズがあり、合成、切断、産物とビーズの単離が１００％成功したとすると、これは、１ビーズ当たり約１ｐｍｏｌの化合物に相当する。最大負荷量が１ｐｍｏｌである単一ビーズからの３０量体ポリマーの収率がわずか１％という最悪のシナリオを仮定したとしても、１０ｆｍｏｌの産物が生成されることになる。この量であれば、産物を、１Ｄ  ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析により容易に特定することができる。
【００４４】
ライブラリの全ての考え得る配列を含むデータベースを構築し、ＭＳおよびＭＳ／ＭＳデータから生体高分子を特定するために使用することができる。ビーズの単一化合物からは、断片化パターンデータにより他の一致するＭＳライブラリメンバーからデコンボリューションする［ＭＳ、ＭＳ／ＭＳ］スペクトル対の数は少数しかない。
【００４５】
検証。配列決定した後、再合成により、およびＫｄの測定を含む二次的な溶液に基づく結合アッセイにより、ヒットを確認してもよい。単独でおよび標的作用剤と結合したままでの、ＮＭＲまたはＸ線結晶解析による一連の親和性試薬ヒットの立体構造分析は、以下のステップ等により、予測モデルの精密化を可能にする。
【００４６】
ヒットのバルク（１Ｄ）および構造（３Ｄ）特性を非ヒットと比較する。
【００４７】
ヒットの立体構造および標的結合挙動を非ヒットと比較して分析する。
【００４８】
計算された特性に基づいてライブラリをクラスタ化する。
【００４９】
ヒットが著しく大きな比率を占めるクラスタに注目する。
【００５０】
構造−活性モデルを導き出す。
【００５１】
このアンサンブルを使用して、スクリーニングおよび次世代ライブラリ設計で見出された結合モチーフを代表される新規の二次構造の種類のモデルを生成し、構造−活性相関（ＳＡＲ）マッピングにより、特定の標的作用剤と結合するための親和性試薬を最適化することができる。
【００５２】
References
1. Kee J-M, Villani B, Carpenter LR, Muir TW (2010) Development of Stable Phosphohistidine Analogues. J Am Chem Soc 132: 14327-14329.
2. Webb TR, Eigenbrot C (1991) Conformationally restricted arginine analogs. J Org Chem 56: 3009-3016.
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6. Salmon SE, Lam KS, Lebl M, Kandola A, Khattri PS, et al. (1993) Discovery of biologically active peptides in random libraries: solution-phase testing after staged orthogonal release from resin beads. Proc Natl Acad Sci U S A 90: 11708-11712.
7. Menendez A, Scott JK (2005) The nature of target-unrelated peptides recovered in the screening of phage-displayed random peptide libraries with antibodies. Anal Biochem 336: 145-157.
8. Houghten RA (1993) The broad utility of soluble peptide libraries for drug discovery. Gene 137: 7-11.
9. Liu X, Hsieh HB, Campana D, Bruce RH (2012) A new method for high speed, sensitive detection of minimal residual disease. Cytom Part A 81A: 169-175.
本発明の追加説明
一態様では、本発明は、以下のものを含む：
特別な機能を有する非天然ポリマー（ＮＮＰ）へと構築される機能的に豊な分子フレームワークに基づく薬物様モノマー；および／または
光ファイバーアレイ走査技術（ＦＡＳＴ）は、＜５、＜１０、または＜３０分間で１０８−１０個メンバーのライブラリの蛍光に基づくスクリーニングを実施する。
【００５３】
配列構造に組み込まれているＭＳ「バーコード」を使用した、内因的に自己読取り可能な分子として設計されたＮＮＰ
新規生物活性ＮＮＰの構造分析は、分子認識のモダリティを明らかにする。
【００５４】
非天然モノマーの設計。薬物様モノマー骨格を開発するための基準としては、以下のものが挙げられる：安定性、キラル性、合成的な拡大可能性、最低限の分子量、適度な可撓性、官能基密度、高信頼性化学でのカップリング、および直交性の側鎖保護基等。これら基準を使用して、候補セット１〜３により例示されるもの等のモノマーセットを生成する。これらの場合、−ＯＨ／ＣｌおよびＦｍｏｃ位置でモノマー鎖の連結が生じる。
【表１】
2017535517.tif 000004
【００５５】
モノマーセットは、異なる主鎖ねじれ角を試みて、新しいタイプのポリマー折り畳み幾何配置の可能性を探索するように設計することができる。
【００５６】
モノマーセット１の設計および合成
【化２】
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【００５７】
例示的なモノマー
【化３】
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【００５８】
切断可能な二次構造制約；三次構造の誘導
特殊モノマー、二次構造制約（ＳＳＣ）を使用して、ＮＮＰへの三次構造を誘導する。また、ＳＳＣは、ＭＳに基づくＮＮＰの配列決定を容易にするために切断可能に設計されていてもよい。
【表２】
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2017535517.tif 000008
【００５９】
ＮＮＰサブライブラリの構成。モノマーおよびＳＳＣを有する約３０量体の構成を構築して、多様性を最大化する；図３。ヌルスペーサーモノマー（例えば、ベータＡｌａ）を組み込んで、配列および合成を単純化してもよい。
【表３】
2017535517.tif 000009
【００６０】
総ライブラリ=4.03×108
無ウエルプレートを使用したビーズ上のライブラリのＦＡＳＴスクリーニングでは、化合物が、ウエルにではなくビーズに結合されており、アッセイ／プレートの数は、ビーズサイズ（例えば、直径）によって決定され、例えば、５０〜１００ｕｍの場合は１×１０５−６個；１０ｕｍビーズの場合は２５×１０６個である。
【００６１】
ＦＡＳＴ超大規模スクリーニングは、毎分何百万もの化合物のスクリーニングを可能にする。例示的なアッセイでは、蛍光標的をチューブ中で１０８個ビーズライブラリと混合し、インキュベートし、洗浄し、約２５Ｍ  １０ｕｍビーズ／スライドを移し、ＦＡＳＴ走査（約１分／プレート）し、シグナル強度をランク付けおよび決定し、その際、二重波長であれば偽陽性を低減することでき、自動ビーズピッキングを行って３８４ウエルプレートに移し、ＮＮＰをビーズから切断し、配列を決定する。
【００６２】
スクリーニング：一般化可能なスクリーニング戦略およびプラットフォームを作成および実証する。
【００６３】
ビーズのスライドへの分散および結合−蛍光アッセイ、結合、または酵素活性−ＦＡＳＴによるヒットの特定−ＡＤＭによるヒットの検証−ビーズピッキング−配列決定。
【００６４】
ヒットの特徴付け。ヒットを、結合親和性または触媒活性について特徴付ける。
【００６５】
親和性試薬：結合親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により結合定数および解離定数（ｋａ、ｋｄ）を測定することにより決定する。
【００６６】
触媒：ミカエリス−メンテンモデルを使用して、Ｖｍａｘ（最大速度）、Ｋｍ（ミカエリス定数、１／２Ｖｍａｘ）を決定する。触媒定数（ｋｃａｔ）
示差走査型蛍光定量法（ＤＳＦ）、動的光散乱（ＤＬＳ）、分析サイズ排除クロマトグラフィー（ａｎＳＥＣ）
折り畳み、複合体形成、溶解性、安定性
１標的当たり最大３個のヒットのＸ線構造決定
ＮＮＰのＭＳ同定
【表４】
2017535517.tif 000010
【００６７】
*NNP単離収率は10%。
【００６８】
ＮＮＰ  ＭＳ断片化の配列決定手法：配列決定イオンを検出する：ａ、ｂ、ｃ、ｘ、ｙ、ｚ；複雑なＮＮＰ主鎖の場合は更に主鎖断片化を行う；図４。
【００６９】
容易で迅速な配列決定用のライブラリ設計；自己読取り可能なＮＮＰは、図５に示されている。
【００７０】
配列決定用のアイソトープでコード化されたＭＳタグ：
【表５】
2017535517.tif 000011
【００７１】
ＭＳタグを組み込むことにより、配列決定の感度が増強され、より小さなポリマー断片から完全な配列の再構成が可能になる、図６。
【００７２】
複数のおよび／または別の断片化モードを使用してもよい：
【表６】
2017535517.tif 000012
【００７３】
配列決定は最適化することができ、例えば、各種類のＮＮＰの各断片化方法を最適化し；より多くの配列決定イオンを生成し：複数の断片化方法を使用し；ＭＳｎ；ライブラリ。
【００７４】
設計；各方法、方法の組み合わせ；サポートベクターマシン学習分析等を使用して、既知ＮＮＰの特定された配列決定イオンを比較する。
【００７５】
自己読取り可能なポリマーの自動配列決定
【表７】
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【００７６】
実施基準：ＮＮＰ断片化データを使用して、複雑なデータをソフトウェア分析し、様々なサーチエンジンを適用、比較する；上記カテゴリーでもっとも高性能のプロテオミクスエンジンを用いて、既知ＮＮＰの初期データセットを分析する；エンジンを組み合わせで使用する；断片化、ＭＳｎ等を組み合わせる；；ライブラリ設計、例えば、モノマーは等重性でない。
【００７７】
本発明は、記載されている特定のおよび好ましい実施形態の組み合わせを全て包含する。本明細書に記載されている例および実施形態は、説明のために過ぎず、当業者であれば、その教示に照らして種々の改変または変更が示唆されることになり、それらは、本出願の趣旨および範囲ならびに添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることになることが理解される。本明細書中で引用されている刊行物、特許、および特許出願は全て、それらの中で引用されているものを含み、参照によりそれらの全体があらゆる目的で本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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