(57)【要約】  本発明は、腫瘍の転移を阻止する際に使用するための、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）の阻害剤に関する。さらに、本発明は、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）を阻害することにより腫瘍の転移を阻止する方法、および、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）を調節することにより、内皮を通る転移性腫瘍細胞の遊出（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔ）を調節するための方法、ならびに腫瘍転移の阻止のための、リード化合物としておよび／または、薬剤として、適切なネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）の阻害剤を、インビトロで、同定する方法にも関する。さらに、本発明は、また、ネクロトーシスおよび壊死細胞を同定する方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍の転移の阻止において使用するためのネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）の阻害剤。
【請求項２】
それを必要とする被験者に、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）の阻害剤の薬学的有効量を投与することを含む、ネクロトーシスを阻害することによる、腫瘍の転移を阻止する方法。
【請求項３】
以下の工程を含む、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）を調節することにより、内皮を通って、転移性腫瘍細胞（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓｉｎｇ  ｔｕｍｏｕｒ  ｃｅｌｌｓ）の遊出（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔ）を調節するための方法：
ａ）ネクロトーシスのモジュレーターと内皮を接触させる工程；および
ｂ）転移性腫瘍細胞（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓｉｎｇ  ｔｕｍｏｕｒ  ｃｅｌｌｓ）を提供し、そして、前記転移性腫瘍細胞が、内皮を通って遊出（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔ）することを可能にする工程。
【請求項４】
以下の工程を含む、腫瘍転移の阻止のための、リード化合物として、および／または、医薬として適切な、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）の阻害剤を同定するインビトロの方法：
ａ）
ｉ）試験薬剤の存在下で、および
ｉｉ）上記試験薬剤の非存在下に、
転移性腫瘍細胞（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓｉｎｇ  ｔｕｍｏｕｒ  ｃｅｌｌｓ）が、内皮から遊出（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔ）することを可能にする工程；
ｂ）
ａ）ｉ）およびａ）ｉｉ）のために、内皮を通る転移性腫瘍細胞（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓｉｎｇ  ｔｕｍｏｕｒ  ｃｅｌｌｓ）の遊出（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔ）のレベルおよび／または内皮細胞のネクロトーシスのレベルを決定する工程；
ｃ）
ａ）ｉ）のために工程ｂ）で決定されたレベルと、ａ）ｉｉ）のために工程ｂ）で決定されたレベルとを比較する工程、
ここで、ａ）ｉｉ）のレベルと比較した、ａ）ｉ）のレベルの減少は、試験薬剤が、腫瘍転移の阻止のための、リード化合物としておよび／または医薬として適切な、ネクロトーシスの阻害剤であることの指標である。
【請求項５】
請求項１の使用、または請求項２乃至４のいずれか１項に記載の方法のための阻害剤であって、前記阻害剤、モデュレーターまたは試験薬剤が、抗体、抗体模倣物（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｉｍｅｔｉｃ）、優勢阻害のタンパク質（ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、アプタマー、核酸分子、アンチセンス核酸分子、小分子、またはこれらの阻害剤、モデュレーターまたは試験薬剤の修飾体である、阻害剤。
【請求項６】
前記被験者または前記内皮が、哺乳動物である、請求項２乃至５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
請求項１の使用、または請求項２、３または５乃至６のいずれか１項に記載の方法のための阻害剤であって、ネクロソーム（ｎｅｃｒｏｓｏｍｅ）の形成および／またはネクロソームのネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）誘導活性を、上記阻害剤が阻止、または、モデュレーターが調節する、阻害剤。
【請求項８】
請求項１、５または７のいずれか１項に記載の使用、または請求項２、３または５乃至７のいずれか１項に記載の方法のための阻害剤であって、前記阻害剤または、前記モデュレーターが、受容体と相互作用するタンパク質１（ＲＩＰＫ１）の阻害剤、受容体と相互作用するタンパク質３（ＲＩＰＫ３）の阻害剤、ＭＬＫＬ（ｍｉｘｅｄ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｌｉｋｅ）の阻害剤またはそれらの組合せからなる群から選択される、阻害剤。
【請求項９】
請求項１、５、７または８のいずれか１項に記載の使用、または請求項２、３または５乃至８のいずれか１項に記載の方法のための阻害剤であって、前記阻害剤または、前記モデュレーターが、ＲＩＰＫ３の阻害剤である、阻害剤。
【請求項１０】
請求項１、５または７ま乃至９のいずれか１項に記載の使用、または請求項２、３または５乃至９のいずれか１項に記載の方法のための阻害剤であって、前記阻害剤または前記モジュレーターが、ネクロスタチン−１（ＮＥＣ−１；５−（１Ｈ−インドール−３−イルメチル）−３−メチル−２−チオキソ−４−イミダゾリジノン、５−インドール−３−イルメチル）−３−メチル−２−チオヒダントイン）、ネクロスタチン−１安定な（５−（（７−クロロ−１Ｈ−インドール−３−イル）メチル）−３−メチル−２，４−イミダゾリジンジオン、５−（（７−クロロ−１Ｈ−インドール−３−イル）メチル）−３−メチルイミダゾリジン−２，４−ジオン）、ネクロスタチン−１不活性（５−（（１Ｈ−インドール−３−イル）メチル）−２−チオキソイミダゾリジン−４−オン）、ネクロスルホンアミド（ＮＳＡ；（Ｅ）−Ｎ−（４−（Ｎ−（３−メトキシピラジン−２−イル）スルファモイル）フェニル）−３−（５−ニトロチオフェン−２−イル）アクリルアミド）、抗ＲＩＰＫ３のｓｉＲＮＡ、抗ＭＬＫＬ  ｓｉＲＮＡまたはこれらの組み合わせからなる群から選択される、阻害剤。
【請求項１１】
前記モデュレーターが、ＴＧＦ−β活性化キナーゼ１（ＴＡＫ１）の阻害剤である、請求項３、５、６または７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記阻害剤またはモジュレーターが、デス  リセプター６（ＤＲ６）の阻害剤である、請求項１、５または７のいずれか１項に記載の使用、または請求項２、３または５乃至７のいずれか１項に記載の方法のための阻害剤。
【請求項１３】
これに混合したか、または、さらなる薬学的に活性な薬剤と、別の容器で、付随された、請求項１、５、７乃至１０または１２のいずれか１項に記載の使用のための阻害剤。
【請求項１４】
以下の工程を含む、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）および壊死細胞を同定する方法。
ａ）原形質膜の破壊のために、マーカーと細胞を接触させる工程；
ｂ）クロマチン凝縮および／またはクロマチン断片化のためのマーカーと、前記細胞とを接触させる工程；そして
ｃ）原形質膜の破壊およびクロマチン凝縮および／またはクロマチン断片化が起こるかどうかを決定する工程；
ここで、クロマチン凝縮および／またはクロマチン断片化の非存在下で、アポトーシス細胞に発生するように、原形質膜の破壊が、工程ｃ）において判定された場合、前記細胞は、ネクロトーシスまたは壊死であることの指標である、方法。
【請求項１５】
工程ａ）における原形質膜破壊のマーカーが、膜不透過性のＤＮＡ結合染料からなる群から選択され、および／またはクロマチン凝縮および／またはクロマチン断片化のマーカーが、膜透過性のＤＮＡ結合染料からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍の転移の阻止において、使用するためのネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）の阻害剤に関する。さらに、本発明は、ネクロトーシスを阻害することによって、腫瘍の転移を阻止する方法、および、ネクロトーシスを調節することにより、内皮（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ）を通る、転移性腫瘍細胞（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓｉｎｇ  ｔｕｍｏｕｒ  ｃｅｌｌｓ）の遊出（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｉｏｎ）を調節する方法だけではなく、腫瘍転移を阻止するための、リード化合物として、および／または、医薬として適切である、ネクロトーシスの阻害剤を同定するインビトロの方法に関する。さらに、本発明は、また、ネクロトーシスおよび壊死細胞（ｎｅｃｒｏｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ）を同定する方法にも関する。
【０００２】
本明細書には、特許出願および製造業者のマニュアルを含む、多数の書類が引用されている。これらの文書の開示は、本発明の特許性に関連するとは考えていないが、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。より具体的には、すべての参照文書は、個々の文書が参照により組み込まれることを具体的かつ個別に指示されているのと同程度に、参照により組み込まれる。
【０００３】
腫瘍細胞の転移は、癌患者の死亡原因の第一の原因である。転移の過程は、原発腫瘍からの腫瘍細胞の離脱で始まる一連の時系列の事象である。これに続いて、循環系の脈管内への進入（ｉｎｔｒａｖａｓａｔｉｏｎ）が起こる。一旦、血流に入ると、腫瘍細胞の転移能は、血液細胞と内皮細胞との相互作用（ｉｎｔｅｒｐｌａｙ）に依存する（図１）。腫瘍細胞の転移能は、周囲の組織に滲出する（ｅｘｔｒａｖａｓａｔｅ）、迅速かつ効率的な方法に大きく依存する。腫瘍細胞または腫瘍細胞により活性化された免疫細胞から放出されたパラクリンシグナル（Ｐａｒａｃｒｉｎｅ  ｓｉｇｎａｌｓ）は、内皮細胞の局所における活性化を誘導し、腫瘍細胞を内皮にしっかりと接着させる、接着分子への曝露を齎す（ＪｏｙｃｅおよびＰｏｌｌａｒｄ、２００９年）（図１）。次の数時間以内に、腫瘍細胞は、内皮をさらに調節して、血管外滲出（ｅｘｔｒａｖａｓａｔｉｏｎ）を促進する内皮障壁の開口を誘導する。これらの調節には、たとえば、内皮接合部の変化および細胞骨格（ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ）の変化が含まれる（ＬａｂｅｌｌｅおよびＨｙｎｅｓ、２０１２年；Ｍｉｅｒｋｅ、２００８年）。遠隔臓器の実質組織（ｐａｒｅｎｃｈｙｍａ）に、一旦、滲出すると、腫瘍細胞のさらなる転移能は、滲出部位で生存し（ｓｕｒｖｉｖｅ）、接着し（ａｄｈｅｒｅ）、そして、さらに増殖する能力に依存する。
【０００４】
腫瘍細胞の転移能は、免疫細胞および内皮細胞によって大きく調節される。後者は、腫瘍細胞の滲出（ｅｘｔｒａｖａｓａｔｉｏｎ）が起こる原発部位であり、そして、それらは、転移形成を積極的に調節すると考えられるため、特に興味深い。たとえば、腫瘍細胞の滲出には、内皮細胞−細胞接合部の能動的な再構成ならびに細胞骨格の調節が含まれる。
【０００５】
腫瘍細胞の滲出（ｅｘｔｒａｖａｓａｔｉｏｎ）の現在のドグマは、白血球と同様に、細胞再編成を介した内皮細胞の退縮（ｒｅｔｒａｃｔｉｏｎ）を誘導することによって、内皮単層を有意に破壊（ｄｉｓｒｕｐｔｉｎｇ）することなく、腫瘍細胞が内皮を遊出（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｅ）することを示唆する（Ｒｅｙｍｏｎｄら、２０１３年）。腫瘍細胞との直接の接触によって、内皮細胞のアポトーシスが誘導されるような代替機構を示唆する報告は、ほんの僅かである（Ｈｅｙｄｅｒら、２００２年；Ｋｅｂｅｒｓら、１９９８年；Ｌｉｎら、２０１１年）。
十分に特徴付けられたアポトーシス細胞死に加えて、壊死のような他の形態の細胞死が存在する。アポトーシスは、様々な細胞シグナル伝達経路によって調節されている、「プログラムされた細胞死（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ）」の一形態として説明される一方、壊死は、有毒な損傷（ｉｎｓｕｌｔｓ）または物理的損傷によって誘導される「偶発的な（ａｃｃｉｄｅｎｔａｌ）」細胞死の一形態として説明される。アポトーシスは、表面レセプターの活性化によって誘導され、そして、カスパーゼによって細胞内で（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｌｙ）、形質変換（ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ）される。カスパーゼの遮断または阻害は、アポトーシスを阻止することができる。
【０００６】
アポトーシスとは対照的に、壊死は、極端な寒さ、熱または低酸素などの外的要因によって誘導され、そして、シグナリング分子は、壊死細胞死の調節に関与しない。形態学的には（Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ）、アポトーシスは、原形質膜（ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）の破壊なしに、核の凝縮および断片化（ｎｕｃｌｅａｒ  ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）、染色体ＤＮＡの切断および、死んだ細胞を、アポトーシス体へパッケージングすることと同時に起こる。アポトーシスの後期段階においてのみ、原形質膜の破壊（すなわち、後期アポトーシス）が起こり得る。対照的に、壊死細胞は、細胞の膨潤、および原形質膜の分解および、組織化されたクロマチン凝縮および断片化のない核の形態におけるわずかな変化のみによって形態学的に特徴付けられる。
【０００７】
より最近では、プログラム可能な細胞死は、アポトーシスの特徴はないが、壊死の特徴の存在下でも起こり得、そして、調節壊死または「ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）」と呼ばれることが記載されている（ＬｉｎｋｅｒｍａｎｎおよびＧｒｅｅｎ、２０１４年；ＭｕｒｐｈｙおよびＳｉｌｋｅ、２０１４年）。ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）は、カスパーゼによって実行されないか、またはポジティブに調節されない細胞内シグナル伝達経路に続く。その代わりに、プロテインキナーゼ１（ＲＩＰＫ１）、ＲＩＰＫ３およびＭＬＫＬ（ｍｉｘｅｄ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎ）と相互作用する受容体のような分子が、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）の重要な調節因子として同定された（ＬｉｎｋｅｒｍａｎｎおよびＧｒｅｅｎ、２０１４年；ＭｕｒｐｈｙおよびＳｉｌｋｅ、２０１４年）。
【０００８】
これまでのところ、ネクロトーシスのシグナリングは、生理的または病態生理学的条件下での、インビボにおけるその関連性を研究するためのツールが制限されていたので、主に、インビトロ系で研究された。おそらく、インビボでの、ネクロトーシスの最も検証された役割は、ウイルス感染の調節にある（Ｃｈｏら、２００９年）。さらなるインビボにおける証拠は、心筋梗塞および脳卒中（Ｓｍｉｔｈら、２００７年）、アテローム性動脈硬化症（Ｌｉｎら、２０１３年）、虚血再灌流傷害（Ｌｉｎｋｅｒｍａｎｎら、２０１２年）のような関連の研究から来ている。しかし、いずれの研究も、インビボでの、ネクロトーシス細胞死を直接示すことができなかった。その代わりに、ネクロトーシス経路の単一または複数の遺伝子変異を保有する動物を用いた、インビボでのネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）を間接的に、研究するために、遺伝的モデルが、一般的に、使用されている（Ｄｉｌｌｏｎら、２０１２年；Ｄｉｌｌｏｎら、２０１４年）。
【０００９】
アポトーシスおよびネクロトーシスの細胞死の区別は、多くの場合、電子顕微鏡による形態学的特徴の分析に基づく。しかしながら、この方法は、非常に手間がかかり、そして、大量の試料の分析または生物における全身的な関連性の研究には使用できない。これらの２つの形態の細胞死を区別するための別の方法が確立された。たとえば、原形質膜上における、ホスファチジルセリンの曝露は、アポトーシス細胞のマーカーとしてしばしば用いられ、そして、アネキシンＶに対する染色によって視覚化することができる。しかし、ネクロトーシス細胞もまた、ホスファチジルセリンに曝露する（Ｓａｗａｉ及びＤｏｍａｅ、２０１１年）。他方、アポトーシス細胞および生きている細胞は、完全な膜を有し、そして、染色が陰性であるため、ＤＮＡに結合する膜不透過性蛍光染料が、ネクロトーシス細胞を同定するためにしばしば使用される。しかし、上記のように、後期アポトーシス細胞は、その膜の完全性を失い、そして、したがって、これらの染料についても染色陽性である。まとめると、電子顕微鏡以外に、アポトーシスをネクロトーシス性細胞死と確実に区別する方法は存在しない。
【００１０】
この欠点を克服するために、研究者らは、間接的アプローチを用いて、アポトーシスおよびネクロトーシス性細胞死を区別する傾向がある。たとえば、アポトーシスおよび／またはネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）阻害物質またはそれぞれの細胞死経路の分子の遺伝子ノックダウンの下で、一般的な細胞生存率（たとえば、ＡＴＰレベル、トリパンブルー排除などを測定することによる）が決定される。しかし、これらの方法は、インビトロのシステムに限定され、そして、今日、確実に、生体内でのアポトーシスと壊死／ネクロトーシス細胞を区別するために使用できるアッセイはない。さらに、細胞死の１つの形態に必要なコンポーネントの阻害またはノックダウン／ノックアウトは、潜在的に、人為的に、死のタイプに影響を及ぼす可能性があり、そして、したがって、生理的条件下で生じる、実際の死のタイプに関して誤った結果をもたらす可能性がある。
【００１１】
癌の治療において、多くの進歩がなされてきたが、腫瘍細胞転移は、癌患者の死亡原因の主要なままである。したがって、腫瘍の転移を阻止する、代替的な、および／または改善された治療法が必要とされている。
【００１２】
さらに、ネクロトーシス性細胞死を決定する現行の方法に関連して、上述の欠点に起因する、ネクロトーシス性細胞死を測定する、代替的および／または改良された方法が必要とされている。
【００１３】
本発明の根底にある技術的問題は、腫瘍転移を阻止するための、代替的なおよび／または改良された手段および方法を特定すること、および／またはネクロトーシス細胞を検出するための代替的なおよび／または改良された方法を特定することであった。
【００１４】
この技術的課題に対する解決策は、特許請求の範囲に特徴づけられた実施形態を提供することによって達成される。
【００１５】
したがって、本発明は、腫瘍の転移を阻止するために使用される、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）の阻害剤に関する。
【００１６】
本明細書で使用される「阻害剤（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）」という用語は、シグナル伝達経路の誘導および／または実行を、特異的に、減少または無効させる化合物を指し、好ましくは、シグナリング伝達経路において阻害されることが必要とされるコンポーネント、より好ましくはタンパク質、の生物学的機能または活性を、低下させるかまたは無効にすることによる。阻害剤は、阻害されるべき、タンパク質の生物学的機能または活性を低下または無効にするために、以下の効果のいずれか１つ以上を行うことができる：
（i）（a）阻害されるべきタンパク質をコードする遺伝子の転写を低下する、すなわち、ｍＲＮＡのレベルを低下する。
（i）（b）阻害されるべきタンパク質を妨害する（ｃｏｕｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ）タンパク質をコードする遺伝子の転写が増強される、
（ii）（a）阻害されるべき、タンパク質をコードするｍＲＮＡの翻訳が低下される、
（ii）（b）阻害されるべき、タンパク質を妨害するタンパク質をコードするｍＲＮＡの翻訳が増強される、
（iii）（a）阻害剤の存在下に、阻害されるべきタンパク質の安定性が低下する、
（iii）（b）阻害剤の存在下に、阻害されるべき、タンパク質を妨害するタンパク質の安定性が増強する、
（iv）（a）阻害されるべき、タンパク質が、阻害剤の存在下に、効率が低下して、その生化学的または細胞機能を果たす、
（iv）（b）阻害剤の存在下に、阻害されるタンパク質を妨害するタンパク質が、、その効率を増強して、その生化学的または細胞機能を果たす。
【００１７】
本明細書で使用される、「タンパク質」という用語は、３０を超えるアミノ酸からなる分子のグループを表し、そして、本明細書では、用語「ポリペプチド」と互換的に使用されるが、本明細書で使用される、「ペプチド」という用語は、３０未満のアミノ酸からなる分子のグループを表す。ペプチドおよびポリペプチドの群は、共に、「（ポリ）ペプチド」という用語で言及される。また、用語「（ポリ）ペプチド」によって包含されるものは、３０個を超えるアミノ酸のタンパク質の断片も含む。本明細書で使用する「タンパク質の断片」という用語は、タンパク質の生物学的活性を維持するために必要な少なくともアミノ酸残基を含むタンパク質の一部を指す。好ましくは、アミノ酸鎖は直線状である。（ポリ）ペプチドは、少なくとも２つの同一または異なる分子からなる多量体をさらに形成することができる。そのような多量体の対応する、より高次の構造は、対応して、ホモ−またはヘテロダイマー、ホモ−またはヘテロトリマーなどと呼ばれる。さらに、アミノ酸および／またはペプチド結合が機能的な類縁体によって置換された、（ポリ）ペプチドのような、ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）も、また、本発明に包含される。そのような機能的類縁体は、セレノシステインのような、２０の遺伝子でコードされたアミノ酸以外の全ての既知のアミノ酸を含む。「（ポリ）ペプチド」という用語はまた、当分野で周知の、たとえば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化および類似の修飾によって修飾が行われる、天然の修飾（ポリ）ペプチドをも指す。
（ポリ）ペプチドは、必ずしも完全に直線状であるとは限らないこともよく知られている。たとえば、（ポリ）ペプチドは、ユビキチン化（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ）の結果として、分枝状であってもよく、そして、それらは、一般的に、天然プロセシング事象および、自然では起こらないヒトによる操作によってもたらされる事象を含む、翻訳後の事象の結果として、分枝の有無にかかわらず、環状になることもある。環状の、分枝の、および分枝環状の（ポリ）ペプチドは、非翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ）天然プロセスおよび合成方法によって合成することができる。当該修飾は、（ポリ）ペプチドがどのように作製されるかの機能であり得る。たとえば、組換え（ポリ）ペプチドの場合、たとえば、修飾は、宿主細胞の翻訳後の修飾能力およびアミノ酸配列中の修飾シグナルによって決定される。したがって、グリコシル化が所望される場合、（ポリ）ペプチドは、グリコシル化宿主、一般に、真核細胞、たとえばＣｏｓ７、ＨＥＬＡまたはその他において、発現される。同じタイプの修飾は、所与の（ポリ）ペプチドにおけるいくつかの部位で、同じまたは様々な程度で存在し得る。また、所与の（ポリ）ペプチドは、１つ以上のタイプの修飾を含むことができる。
【００１８】
本明細書中で使用される、「阻害されるべきタンパク質を妨害するタンパク質（ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｕｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｏ  ｂｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ）」という用語は、阻害されるべきタンパク質の、
発現（たとえば、転写リプレッサーとして作用することによる）、
安定性（たとえば、プロテアソーム（ｐｒｏｔｅａｓｏｍａｌ）分解のために阻害されるべきタンパク質をターゲットにすることにより、またはそれを不活性断片に切断することによって）、または、
活性（たとえば、阻害されるべきタンパク質に直接結合し、それによってその活性部位をブロックすることによって）、を、低下させるかまたは無効にする、あるいは、阻害されるべきタンパク質の効果に反する効果を仲裁（ｍｅｄｉａｔｅｓ）する、タンパク質を指す。
たとえば、阻害されるべきタンパク質がキナーゼである場合、後者のメカニズムによって作用する妨害タンパク質は、同じ基質を標的とするホスファターゼであり得る。
【００１９】
クラス（i）（a）に属する化合物には、転写機構、および／または前記遺伝子のプロモーターとのその相互作用を妨害する、および／またはエンハンサーのようなプロモーターから離れた発現制御エレメントを妨害する化合物が含まれる。
クラス（i）（b）に属する化合物は、転写機構および／または前記遺伝子のプロモーター、および／または、エンハンサーのようなプロモーターから離れた発現制御エレメント、とのその相互作用、の活性／効率を増強する化合物を含む。
【００２０】
クラス（ii）（a）の化合物は、本分野において周知の、アンチセンス構築物およびＲＮＡ干渉（たとえば、ｓｉＲＮＡ）を行うための構築物を含む（たとえば、Ｚａｍｏｒｅ（２００１年）Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ、８（９）、７４６；Ｔｕｓｃｈｌ（２００１年）Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．２（４）、２３９を参照されたい）。一般に、以下のことが当てはまる：核酸レベルの標的化は、しばしば、標的配列へのハイブリダイゼーションにより影響される。標的核酸の相補配列に対する標的化合物の同一性のレベルが高ければ高いほど、標的特異性のレベルはより高くなる。
【００２１】
クラス（ii）（b）は、たとえば、その安定性を高めることによって、ｍＲＮＡの翻訳を増強する化合物を包含する。
【００２２】
クラス（iii）（a）の化合物は、たとえば、正しいフォールディング（ｆｏｌｄｉｎｇ）を妨害することによって、プロテアソーム（ｐｒｏｔｅａｓｏｍａｌ）の分解のためにそれを標的化することによって、および／または不活性フラグメントへのその開裂を誘導または仲介することによって、阻害されるべきタンパク質の安定性を低下させる。
【００２３】
クラス（iii）（b）は、たとえば、正しいフォールディングを安定化することによって、および／またはそのプロテアソーム（ｐｒｏｔｅａｓｏｍａｌ）の分解または不活性フラグメントへの開裂を阻止することによって、阻害されるべきタンパク質を妨害するタンパク質の安定性を増強する化合物を包含する。
【００２４】
クラス（iv）（a）の化合物は、阻害されるべきタンパク質の分子または細胞の機能を妨害する。分子機能を阻害する化合物として、活性部位に結合する化合物（たとえば、小有機物（ｓｍａｌｌ  ｏｒｇａｎｉｃ）、抗体、ペプチドまたはアプタマー）、特に、阻害されるべきタンパク質の活性部位に結合することができる化合物が想定される。これはまた、阻害されるべきタンパク質に必ずしも直接に結合する必要はないが、たとえば、タンパク質に結合し、および／またはその機能を阻害することによって、または、阻害されるべきタンパク質が含まれる経路のメンバーの発現を阻害することによって、タンパク質の細胞活性を、依然として妨害する化合物を含む。これらのメンバーは、シグナル伝達経路内（ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ）で、阻害されるべき、タンパク質の上流または下流のいずれかであり得る。
【００２５】
クラス（iv）（b）の化合物には、阻害されるべきタンパク質を妨害するタンパク質の分子または細胞機能を増強するものが含まれる。これには、阻害されるべきタンパク質を妨害するタンパク質に結合し、そして、それによって、たとえば、妨害タンパク質の活性なコンフォメーションを維持することによって、阻害されるべきタンパク質を妨害するタンパク質の活性を増強する化合物が含まれる。これに関して、生化学的機能は、タンパク質そのものの機能、たとえばタンパク質の酵素的機能を示す。タンパク質の細胞機能は、たとえば、他の細胞のコンポーネント、特に、他のタンパク質との相互作用においてのみに起こり得る機能のような、細胞の状況（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｏｎｔｅｘｔ）におけるタンパク質の機能を含む。
【００２６】
本発明による阻害剤は、特定の実施形態では、タンパク質性（ｐｒｏｔｅｉｎａｃｅｏｕｓ）化合物として、または前記阻害剤をコードする核酸分子として提供され得る。たとえば、前記阻害剤をコードする核酸分子は、たとえば、特異的プロモーターなどの調節エレメントを含む発現ベクターに組み込まれ得、そして、したがって、細胞内に送達され得る。細胞および適切なベクターの標的化トランスフェクションのための方法は、当技術分野で公知である。たとえば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌ（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＮＹ（２００１年））を参照されたい。前記阻害剤をコードする核酸分子を発現ベクターに組み込むことにより、レシピエントの任意の細胞または選択された細胞のサブセットにおいて、コードされた阻害剤のレベルを、選択的にまたは永久に上昇させることが可能になる。したがって、阻害剤の組織および／または時間依存的発現は、たとえば、内皮細胞に限定して達成され得る。したがって、好ましい実施形態において、阻害剤は、内皮細胞特異的阻害剤である。
【００２７】
本明細書で使用される、用語「内皮細胞」とは、薄い平坦な細胞を指し、その層は、血管およびリンパ管の内面を覆う内皮を構成する。したがって、用語「内皮細胞」は、血管内皮細胞およびリンパ管内皮細胞を包含する。
【００２８】
「ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）」という用語は、本明細書では、用語「プログラムされた壊死」または「調節された壊死」と互換可能に使用される。ネクロトーシスは、当該技術分野において公知であり、そして、したがって、本明細書において、細胞の丸まり、細胞の体積の増加（オンコシス（ｏｎｃｏｓｉｓ）としても知られている）、オルガネラの腫脹、ヌクレオソーム間の（ｉｎｔｅｒｎｕｃｌｅｏｓｏｍａｌ）ＤＮＡ断片化の欠損および原形質膜破裂（ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒｕｐｔｕｒｅ）などの形態学的特徴において、壊死に似ており、そして、受容体と相互作用するタンパク質キナーゼ１（ＲＩＰＫ１）および／またはＲＩＰＫ３のキナーゼ活性に依存する、プログラム化細胞死（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ）のタイプを示すのに使用される（Ｋｒｙｓｋｏら、２００８年；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４４；２０５乃至２２１）。したがって、ネクロトーシスは、たとえば、ネクロソーム（ｎｅｃｒｏｓｏｍｅ）の形成および／またはネクロトーシス促進活性、および好ましくは、ＲＩＰＫ１および／またはＲＩＰＫ３の活性、および／またはＲＩＰＫ１とＲＩＰＫ３との相互作用を阻害することによって、避けることができるプログラム化細胞死（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ）の一種である。
【００２９】
本明細書で使用される「ネクロソーム（ｎｅｃｒｏｓｏｍｅ）」という用語は、コア複合体として、ＲＩＰＫ１およびＲＩＰＫ３を含む、細胞内多タンパク質複合体を指す。ネクロソーム（ｎｅｃｒｏｓｏｍｅ）複合体は、さらに、ＭＬＫＬ（ｍｉｘｅｄ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｄｏｍａｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を含む（Ｓｕｎら（２０１２年）、Ｃｅｌｌ  １４８：２１３乃至２２７）。デス  ドメイン  タンパク質を有する腫瘍壊死因子受容体１型（ＴＲＡＤＤ）およびデス  ドメインを有するＦＡＳ関連タンパク質（ＦＡＤＤ）、カスパーゼ８およびセリン／スレオニン  プロテイン  ホスファターゼ  ホスホグリセラート  ムターゼ  ファミリー  メンバー５（ＰＧＡＭ５）（Ｍｉｃｈｅａｕら、Ｃｅｌｌ  １４：１８１４乃至１９０（２００３年）およびＷａｎｇら、（２０１２年）、Ｃｅｌｌ  １４８：２２８乃至２４３）も、また、ネクロソームのコンポーネントとして記載されている。カスパーゼ８が活性化されると、それは、ＲＩＰＫ１およびＲＩＰＫ３を切断し、それにより、ネクロトーシスのエフェクター機構を阻止する（Ｖａｎｄｅｎａｂｅｅｌｅら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１１：７００乃至７１４（２０１０年））。したがって、カスパーゼ８は、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）の遂行に必要ではないが、代わりに、このタイプの細胞死の負の調節因子として作用する。ネクロソームにおいて、ＲＩＰＫ１およびＲＩＰＫ３は、それらの同型相互作用モチーフ（ＲＨＩＭ）ドメインを介して相互作用する。ＭＬＫＬのキナーゼ様ドメインは、ＲＩＰＫ３のキナーゼ  ドメインに結合し、したがって、ＭＬＫＬをネクロソームに動員する（ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ）（Ｄｏｎｄｅｌｉｎｇｅｒら、２０１４年  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ７、０７１乃至９８１）。
【００３０】
本明細書で使用される、「ＲＩＰＫ１」という用語は、受容体と相互作用するプロテインキナーゼ１（ＲＩＰ１としても知られている）である、Ｎ−末端にキナーゼ    ドメイン、ＲＩＰ同型相互作用モチーフ（ＲＨＩＭ）を含む中間ドメイン（ＩＤ）およびＣ末端にデス  ドメイン（ＤＤ）を含むセリン／スレオニン  キナーゼを指す。好ましくは、ＲＩＰＫ１は、配列番号１によりＤＮＡレベルで、および配列番号２によりアミノ酸レベルで特徴付けられる。そのＤＤを介して、ＲＩＰＫ１は、たとえば、腫瘍壊死因子受容体１（ＴＮＦＲ１）、腫瘍壊死因子関連のアポトーシスで誘導される、リガンド阻害因子受容体１または２（ＴＲＡＩＬＲ１もしくはＴＲＡＩＬＲ２）またはデス  レセプター６（ＤＲ６）のようなデス  レセプターに、直接の相互作用を介して、または、腫瘍壊死因子受容体１型（ＴＲＡＤＤ）と関連するデス  ドメイン  タンパク質およびデス  ドメインを有するＦＡＳ関連タンパク質（ＦＡＤＤ）のような、ＤＤを含むアダプター蛋白質を介して、集められる（ｒｅｃｒｕｉｔｅｄ）。さらに、ＲＩＰＫ１は、また、トール様受容体（ＴＬＲ）およびそれらのそれぞれのアダプター分子にも集められる（ｒｅｃｒｕｉｔｅｄ）。これは、核因子カッパＢ（ＮＦ−ｋＢ）の活性化のような生存促進（ｐｒｏｓｕｒｖｉｖａｌ）シグナル伝達経路において、および細胞死の誘導において、関与する。生存促進（ｐｒｏｓｕｒｖｉｖａｌ）シグナリングにおけるＲＩＰＫ１の役割は、そのキナーゼ活性と無関係である。同様に、ＲＩＰＫ１キナーゼ活性の非存在下でも、また、アポトーシスは起こりうる。しかし、特定の形態のアポトーシスおよびネクロトーシスは、ＲＩＰＫ１のキナーゼ活性に依存する。本明細書の上記のように、一般的に阻害剤に関する考察は、また、特に、ＲＩＰＫ１の阻害剤にも適用される。したがって、ＲＩＰＫ１阻害剤は、たとえば、ＲＩＰＫ１（たとえば、ＲＩＰＫ１に特異的なｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）の発現を低下させ、たとえば、ＲＩＰＫ１の分解を標的とするユビキチン鎖のその修飾を増加させることによって、ＲＩＰＫ１の安定性を低下させ、または、そのキナーゼ活性を妨害するかもしれない。好ましくは、ＲＩＰＫ１阻害剤は、ＲＩＰＫ１のキナーゼ活性を低下させるか、消滅させる阻害剤である。
【００３１】
ＲＩＰＫ１のキナーゼ活性を妨げる阻害剤の例は、ネクロスタチン−１（５−（１Ｈ−インドール−３−イルメチル）−３−メチル−２−チオキソ−４−イミダゾリジノン、５−（インドール−３−イルメチル）−３−メチル−２−チオ−ヒダントインおよび、ネクロスタチン−１安定な（５−（（７−クロロ−１Ｈ−インドール−３−イル）メチル）−３−メチル−２，４−イミダゾリジンジオン、５−（（７−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）メチル）−３−メチルイミダゾリジン−２，４−ジオン）である。さらに、インビトロで、Ｎｅｃ−１よりも約１００倍有効ではない、Ｎｅｃ−１不活性（Ｎｅｃ１ｉ；５−（（１Ｈ−インドール−３−イル）メチル）−２−チオキソイミダゾリジン−４−オン）も、Ｎｅｃ１ｉが活性型に変更することができる、細胞系またはインビボで、効率的に、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）を抑制することができることが記載されている（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２０１２年、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｓ．，３、ｅ４３７）。したがって、用途に応じて、Ｎｅｃ１ｉも、ＲＩＰＫ１阻害剤として使用することができる。
【００３２】
本明細書で使用される、用語「ＲＩＰＫ３」は、キナーゼ  ドメインおよびＲＨＩＭを含む、他のＲＩＰファミリー  メンバーからユニークなＣ末端ドメインを含む、ＲＩＰファミリーのセリン／スレオニン  キナーゼを指す。好ましくは、ＲＩＰＫ３は、配列番号３によってＤＮＡレベルで、および配列番号４によってアミノ酸レベルで特徴付けられる。壊死を誘導すると、ＲＩＰＫ３は、ＲＩＰＫ１およびＭＬＫＬと相互作用し、そして、ＲＩＰＫ１およびＭＬＫＬをリン酸化して、壊死を誘導する複合体を形成する。ＲＩＰＫ１との相互作用は、キナーゼのＲＨＩＭドメインを介して媒介されるが、ＭＬＫＬのキナーゼ様ドメインはＲＩＰＫ３のキナーゼ  ドメインに結合する。ＲＩＰＫ１およびＲＩＰＫ３は、相互リン酸化、自己（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ａｕｔｏ−）リン酸化およびリン酸転移（ｔｒａｎｓ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）を受ける。Ｓｅｒ−１９９のリン酸化は、ＲＩＰＫ３のネクロトーシス機能において役割を果たす。さらに、ＲＩＰＫ３は、また、ＰＧＡＭ５をリン酸化することも記載されている。阻害剤に関する一般的な考察は、また、ＲＩＰＫ３に特異的な阻害剤にも適用される。したがって、阻害剤は、たとえば、ＲＩＰＫ３の発現、安定性および／またはキナーゼ活性に影響を与え得る。ＲＩＰＫ３の発現に影響を及ぼす阻害剤は、ＲＩＰＫ３に特異的なｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡであり得る。さらに例示的な特異的ＲＩＰＫ３阻害剤は、Ｍａｎｄａｌら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ５６、４８１乃至４９５（２０１４年）およびＳｉｌｋｅら、Ｎａｔ  Ｉｍｍ  １６，６８９乃至６９７（２０１５年）に記載されている、ＧＳＫ８４０、ＧＳＫ８４３およびＫＳＫ８７２である。
【００３３】
用語「ＭＬＫＬ」は、ミクスト  ライネジ  キナーゼ  ドメイン様タンパク質（ｍｉｘｅｄ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｄｏｍａｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）である、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）誘導に関与すると報告されている偽キナーゼ（ｐｓｅｕｄｏｋｉｎａｓｅ）を指す。ヒトにおいては、このタンパク質の２つのアイソフォームが知られている。アイソフォーム１は、配列番号５により、ＤＮＡレベルで、および配列番号６により、アミノ酸レベルで特徴付けられる。配列番号７は、ＤＮＡレベルでのアイソフォーム２を表し、配列番号８は、このアイソフォームのアミノ酸配列を示す。好ましくは、ＭＬＫＬは、配列番号５によってＤＮＡレベルで、および配列番号６によってアミノ酸レベルで特徴付けられる。
【００３４】
構造的には、ＭＬＫＬは、Ｃ末端の偽キナーゼ  ドメインにつながれた、Ｎ−末端の４ヘリカル  バンドル（ｈｅｌｉｃａｌ  ｂｕｎｄｌｅ）を含み、これは通常ではない偽活性部位を含む。偽キナーゼ  ドメインは、ＡＴＰに結合するが、触媒的に不活性である。Ｔ３５７とＳ３５８での、ＲＩＰＫ３によるリン酸化は、ＭＬＫＬのコンフォメーショナルスイッチを誘導する。このコンフォメーショナルな変化は、ＭＬＫＬのホモトリメリゼーションまたはオリゴマー化、および三量体もしくはオリゴマーの細胞内および原形質膜への転位を誘導する。膜では、三量体またはオリゴマーは、カルシウムまたはナトリウム流入を誘導するか、または直接、膜を透過可能にさせることが記載されている。代替的なメカニズムとして、ＭＬＫＬは、ネクロソームにＰＧＡＭ５を動員することに関与することが示唆されている。全体的に、ネクロトーシスのシグナリングにおいて、ＭＬＫＬの本質的な非酵素的役割は、受容体が相互作用するセリン−スレオニン  キナーゼ３（ＲＩＰＫ３）の介在するリン酸化によって誘導されることである。さらに、ネクロスルホンアミド（（Ｅ）−Ｎ−（４−（Ｎ−（３−メトキシピラジン−２−イル）スルファモイル）フェニル）−３−（５−ニトロチオフェン−２−イル）アクリルアミド）‐ＭＬＫＬのＣｙｓ−８６を標的とするネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）の特異的阻害剤である−によってＭＬＫＬが阻害されることが報告されている。あるいは、ＭＬＫＬの阻害剤は、上記の本明細書に記載の一般的な阻害剤のクラスのいずれかであってもよい。たとえば、阻害剤は、ＭＬＫＬに特異的なｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡであり得る。
【００３５】
ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）は、たとえば、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）ファミリーのメンバーを含む、様々な刺激によって誘導することができる。ネクロトーシスの誘導は、しばしば、たとえば、カスパーゼが非存在または不活性化されることによって、アポトーシスが阻害されることを必要とする。ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）が一旦、開始されると、ネクロソームが形成される。ネクロトーシスのシグナルは、ホスファターゼＰＧＡＭ５およびダイナミン関連タンパク質１（ＤＲＰ１）で媒介されるミトコンドリア断片化の結合および活性化によってさらに変換されることが報告されている。さらに、ＡＴＰおよび反応性酸素種（ＲＯＳ）の枯渇は、ネクロトーシス性細胞死の重要なメディエーターとして関与している。ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）の遂行のための代替機構として、ＭＬＫＬが原形質膜に移行し、多量体化し、一過性の受容体潜在性メラスタチン関連７（ＴＲＰＭ７）からの、細胞外カルシウムの流入を誘発し（Ｃａｉら、２０１４年、Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１６（１）：５５乃至６５）、ナトリウムの流入を齎すか（Ｃｈｅｎら、２０１４年；Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．２４（１）：１０５乃至２１））、または、細孔を形成することによって、原形質膜を、潜在的に、直接、透過可能にさせることが示唆されている（Ｄｏｎｄｅｌｉｎｇｅｒら、２０１４年、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ７、９７１乃至９８１；Ｗａｎｇら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．５４（１）：１３３乃至４６）。これらの事象は、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）を特徴づけ、そして、最終的には、細胞のネクロトーシス性の死を齎す。細胞死のプログラム化形態であり、たとえば、ネクロソームの形成および／またはネクロソームのネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）誘導活性、を阻害することによって回避できるネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）とは対照的に、壊死は偶発的な細胞死の形態である。ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）を阻害する可能性は、ネクロトーシス（プログラム化された壊死）と壊死の形態での偶発的な細胞死とを区別する便利な手段であることを示す（Ｋｒｏｍｅｒら、２００９年、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆ．１６（１）：３乃至１１）。
【００３６】
本明細書中で使用される、用語「ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）阻害剤」は、このシグナリング伝達経路に関与する、コンポーネント、さらに好ましくは、タンパク質の生物学的機能または活性を、好ましくは、低下させるか、または無効にすることにより、ネクロトーシス細胞死を齎す、シグナリング伝達経路の誘導および／または実行を、特異的に、減少または消滅させる化合物を指す。また、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）阻害剤により標的化され得る、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）経路の非タンパク質のコンポーネントは、たとえば、活性酸素種（ＲＯＳ）およびカルシウムイオン（Ｃａ２＋）を含む。ＲＯＳの細胞内レベルを調節する化合物（ＲＯＳ−阻害剤）には、たとえば、アスコルビン酸およびＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）などの抗酸化剤が含まれる。Ｃａ２＋のネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｔｉｃ）効果は、たとえば、キレート剤または、カルシウムチャネル遮断薬によって、阻害することができる。好ましくは、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）阻害剤は、ＲＯＳ阻害剤ではない。一般に、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）阻害剤は、細胞がネクロトーシスを起こさないように阻止する。好ましくは、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）阻害剤は、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）経路において必要とされるタンパク質を特異的に阻害する。より好ましくは、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）阻害剤は、ネクトロソームの形成および／またはネクロソームのネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）促進活性を特異的に阻害する。
【００３７】
この文脈における、用語「特異的（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ）」は、標的分子以外の他の分子に対して効果または本質的な効果を持たない、阻害剤の能力を意味する。換言すれば、対応する阻害剤は、交差反応性を示さず、または本質的に交差反応性を示さない。これに関連して、用語「本質的に（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ）」は、重要でない、または無視できる効果を指すことを意味する。重要でないか無視できるかは、機能的パラメータまたは定量的パラメータに基づくことができる。たとえば、交差反応性の最小量のみが、異なる非標的分子で生じる。好ましくは、非標的分子の発現および／または活性は、阻害剤の非存在下での発現および／または活性と比較して、非標的分子の、たとえば１５％以下のような２０％以下、好ましくは、たとえば５％以下、たとえば２％以下のような１０％以下、より好ましくは１％以下で阻害される。さらに、異なる非標的分子との交差反応性は、もしあっても、無視し得るまたは有意でない効果のみを有することが好ましい。これに関して、非標的分子によって齎されるか、または非標的分子によって寄与される、生物学的または細胞の機能が、阻害剤の非存在下での生物学的または細胞の機能と比較して、たとえば１５％未満のような２０％未満、、好ましくは、たとえば５％未満、たとえば２％未満のような１０％未満、より好ましくは１％未満で、低下するのが好ましい。最も好ましくは、異なる非標的分子との交差反応性は、いかなる効果も有しない、すなわち、非標的分子によって齎される、または寄与する生物学的または細胞の機能は低下しない、ことである。特に、特異的にネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）を阻害する、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）の阻害剤は、アポトーシスを実行するための重要な化合物と交差反応性を示さない。換言すれば、本発明によるネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）阻害剤は、アポトーシスを阻害しない。すなわち、本阻害剤は、アポトーシス阻害剤ではない。
【００３８】
用語「ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）阻害剤」は、したがって、
（１）細胞上、または、前記標的細胞で発現されている受容体に結合することによって、他の細胞に、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）を誘導する細胞によって、分泌または放出される、コンポーネント（たとえば、一つの細胞によって発現され、かつ、別の細胞（前記標的細胞）にネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）を誘導するリガンドのような）を標的にする化合物、
（２）内皮細胞におけるネクロソームの上流のシグナル伝達経路のコンポーネントを標的とする化合物、
（３）ネクロソーム自体を標的、好ましくは、ＲＩＰＫ１および／またはＲＩＰＫ３の活性を標的とする、および／または、内皮細胞におけるＲＩＰＫ１とＲＩＰＫ３の相互作用を標的とするコンポーネントを標的とする化合物、および
（４）内皮細胞におけるネクロソームの下流のネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）のシグナルの進行および実行を阻止する、コンポーネントを標的とする化合物、
を包含する。
（１）乃至（４）のクラスの化合物については、クラス（２）および（３）の化合物が好ましく、そして、さらにより好ましいのは、クラス（３）の化合物である。
【００３９】
ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）を阻害する化合物の上記のタイプは、本明細書の上述の阻害剤のクラス（i）乃至（iv）のいずれかに属することができる：
【００４０】
（i）（a）ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）の実行、または、実行に寄与するタンパク質（本明細書中では、プロ−ネクロトーシス（ｐｒｏ−ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）タンパク質としても呼ばれる）をコードする遺伝子の転写を、低下または無効にする（たとえば、ＲＩＰＫ１、ＲＩＰＫ３またはＭＬＫＬをコードする遺伝子、ネクロソーム（ｎｅｃｒｏｓｏｍｅ）の上流のネクロソームを活性化するために必要なシグナリングコンポーネント（たとえば、
ＤＲ６のようなデス  レセプターなどのシグナリングコンポーネント。ＤＲ６は、たとえば、アミロイドβ前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のような、転移性腫瘍細胞において、発現されるか、または、転移性腫瘍細胞によって、分泌される、対応するリガンド（ＡＰＰは、ＤＲ６に結合し、細胞死を誘導することが示され（Ｎｉｋｏｌａｅｖら、２００９年，Ｎａｔｕｒｅ，４５７（７２３２）：９８１乃至９８９）、そして、いくつかの腫瘍細胞によって発現される（ＷｏｏｄｓおよびＰａｄｍａｎａｂｈａｎ、２０１３年，ＪＢＣ，２８８（４２）：３０１１４乃至３０１２４））対応するリガンド、
ＴＲＡＤＤ、ＦＡＤＤ、インターフェロンβを誘導するトール−インターロイキン−１受容体ドメイン含有アダプタータンパク質（ｔｏｌｌ−ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｏｍａｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａｄａｐｔｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＴＲＩＦ）、腫瘍壊死因子受容体関連因子（ＴＲＡＦ）および骨髄分化一次応答タンパク質（ＭＹＤ８８）のようなアダプタータンパク質、または、ＣＹＬＤまたはＡ２０のような脱ユビキチン化酵素（ｄｅｕｂｉｑｕｔｉｎａｓｅｓ））、
あるいは、ネクロソームの下流のネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）の実行に必要な細胞コンポーネント）；
【００４１】
（i）（b）ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）を阻止するタンパク質（本明細書では、抗ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）タンパク質とも呼ぶ）をコードする遺伝子の転写が増強される（たとえば、カスパーゼ８、ｃＩＡＰ１、ｃＩＡＰ２、またはＴＡＫ１をコードする遺伝子）；
【００４２】
（ii）（a）プローネクロトーシス（ｐｒｏ−ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）タンパク質をコードする遺伝子の翻訳を低下させるか、または、無効にする（たとえば、
ＲＩＰＫ１、ＲＩＰＫ３またはＭＬＫＬ、
ネクロソームの上流のネクロソームを活性化するために必要な、シグナリング  コンポーネント
（たとえば、ＤＲ６のようなデス  レセプターのようなシグナリング  コンポーネント、
たとえば、ＡＰＰのような、転移性腫瘍細胞において発現または転移性腫瘍細胞によって分泌される対応するリガンド、
ＴＲＡＤＤ、ＦＡＤＤ、トールインターロイキン１受容体ドメイン含有アダプタータンパク質が誘導するインターフェロンβ（ＴＲＩＦ）、
腫瘍壊死因子受容体関連因子（ＴＲＡＦ）および骨髄分化一次応答タンパク質（ＭＹＤ８８）のようなアダプタータンパク質、または、
ＣＹＬＤまたはＡ２０のような脱ユビキチン化酵素（ｄｅｕｂｉｑｕｔｉｎａｓｅｓ））、
あるいは、ネクロソームの下流のネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）の実行に必要な細胞のコンポーネントをコードする遺伝子）；
【００４３】
（ii）（b）抗ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）タンパク質をコードする遺伝子の翻訳が増強される（たとえば、カスパーゼ８、ｃＩＡＰ１、ｃＩＡＰ２、またはＴＡＫ１をコードする遺伝子）。
【００４４】
（iii）（a）ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）を実行または実行に寄与するタンパク質の安定性を、低下または無効にする（たとえば、ＲＩＰＫ１、ＲＩＰＫ３またはＭＬＫＬ、ネクロソームの上流のネクロソームを活性化するために必要なシグナリング  コンポーネント
（たとえば、ＤＲ６のようなデス  リセプターのようなシグナリング  コンポーネント、
たとえば、ＡＰＰのような、転移性の腫瘍細胞において発現または転移性の腫瘍細胞によって分泌される対応するリガンド、
ＴＲＡＤＤ、ＦＡＤＤ、トールインターロイキン１受容体ドメイン含有アダプタータンパク質を誘導するインターフェロンβ（ＴＲＩＦ）、腫瘍壊死因子受容体関連因子（ＴＲＡＦ）および骨髄分化一次応答タンパク質（ＭＹＤ８８）のようなアダプタータンパク質、または、
ＣＹＬＤまたはＡ２０のような脱ユビキチン化酵素（ｄｅｕｂｉｑｕｔｉｎａｓｅｓ））、あるいは、
ネクロソームの下流のネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）の実行に必要な細胞成分）；
【００４５】
（iii）（b）ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）を阻止するタンパク質の安定性を向上させる（たとえば、カスパーゼ８、ｃＩＡＰ１、ｃＩＡＰ２、またはＴＡＫ１）；
【００４６】
（iv）（a）プロ−ネクロトーシス（ｐｒｏ−ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）タンパク質（たとえば、ＲＩＰＫ１、ＲＩＰＫ３、ＭＬＫＬ、ＣＹＬＤまたはＡ２０）が、低下した効率で、その生化学的または細胞機能を実行するか、または、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）阻害剤の存在下に、生化学的または細胞機能を無効する；
【００４７】
（iv)（b）抗ネクロトーシス性タンパク質（たとえば、カスパーゼ８、ｃＩＡＰ１、ｃＩＡＰ２、またはＴＡＫ１）は、強化された効率で、その生化学的または細胞の機能を実行するか、または、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）阻害剤の存在下で、生化学的または細胞の機能を増強する。
【００４８】
この点において、「低下された（ｌｏｗｅｒｅｄ）」という用語は、遺伝子の転写または、タンパク質の効率が、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）阻害剤の非存在下での転写または効率と比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、および、少なくとも１００倍の増大する好適性で低下することを意味する。「増強された（ｅｎｈａｎｃｅｄ」」という用語は、遺伝子の転写またはタンパク質の効率が、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）阻害剤の非存在下での転写または効率に比べて、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、および少なくとも１００倍の増加する好適性で、増強されることを意味する。
【００４９】
上述したように、
クラス（ii）（a）の化合物は、当技術分野で周知の、アンチセンス構造（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）および、ＲＮＡ干渉（たとえば、ｓｉＲＮＡ）を実行するための構造（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）を含む（たとえば、Ｚａｍｏｒｅ、（２００１年）Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ．８（９），７４６；Ｔｕｓｃｈｌ（２００１年）Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．２（４），２３９を参照）。特に、ＲＩＰＫ１、ＲＩＰＫ３またはＭＬＫＬ、好ましくは、ＲＩＰＫ３またはＭＬＫＬを、特異的にターゲットにする、アンチセンス構造（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）およびＲＮＡ干渉を実行するための構造（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）が想定される。このような構造（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）を設計する方法は、当該技術分野で知られている。ＲＩＰＫ１、ＲＩＰＫ３およびＭＫＬＫのための例示的なｓｉＲＮＡは、それぞれ、開示され、たとえば、シグマ社またはキアゲン社から、市販されている。
【００５０】
クラス（ii）（b）は、抗ネクロトーシス  タンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡを安定化させる（たとえば、カスパーゼ８、ｃＩＡＰ１、ｃＩＡＰ２、またはＴＡＫ１をコードする遺伝子）、または別の方法で、その翻訳を増強する化合物を包含する。タンパク質への（ｍ）ＲＮＡの翻訳およびタンパク質自体の安定性は、特異的な非コード化の（ｎｃ）ＲＮＡによって調節することができる。これらは、マイクロＲＮＡ、長い非コードのＲＮＡ、円形−ＲＮＡなどを含む。通常、ｎｃＲＮＡの活性は、それぞれのｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の分解を齎し、そして、そのため、タンパク質の量を低下させる。したがって、このクラスの阻害剤は、間接的に、翻訳、そして、したがって、対応するｎｃＲＮＡを遮断することによって、抗ネクロトーシス  タンパク質のレベルを増加させる。
【００５１】
クラス（iii）（a）は、たとえば、その正しい折り畳み構造（ｆｏｌｄｉｎｇ）を妨害することによって、および／またはプロテアソームの分解のために、それを標的とすることによって、プロ−ネクロトーシス（ｐｒｏ−ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）タンパク質の安定性を低下させる化合物を含む。これは、プロテアソーム分解のために、プロ−ネクロトーシス  タンパク質を、特異的に、標的とする、ユビキチン  リガーゼ、または、不活性なフラグメントに、プロ−ネクロトーシス  タンパク質を特異的に切断するプロテアーゼを含む。
【００５２】
クラス（iii）（b）に属する化合物は、抗ネクロトーシス性タンパク質の安定性を増強する。したがって、このクラスは、たとえば、化合物の非存在下に、抗ネクロトーシス性タンパク質の分解または切断を導く、ユビキチン  リガーゼまたはプロテアーゼを阻害する化合物を含む。また、包含されるものは、直接、抗ネクロトーシス性タンパク質に結合し、そして、その正しい折り畳み構造を安定化させる化合物である。
【００５３】
クラス（iv）（a）の化合物は、プロ−ネクロトーシス性タンパク質の分子または細胞機能、特に、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）の誘導および／または実行を妨害する。したがって、活性部位に結合する化合物（たとえば、小有機物、抗体、ペプチド、またはアプタマー）、特に、キナーゼＲＩＰＫ１またはＲＩＰＫ３の活性部位に結合することができる化合物、が想定される。より好ましくは、ＲＩＰＫ３の活性部位に特異的に結合する化合物である。また、想定されるものは、それによって、他の相互作用のパートナーのためのこれらのサイトをブロックする、プロ−ネクロトーシス性タンパク質の結合部位に結合またはブロックする化合物である。タンパク質の結合部位を遮断する化合物の後者の群は、天然に存在する結合のパートナーの改善された薬理学的特性を有する、そのフラグメントまたは改変フラグメントであってもよい。これに関して、ＲＩＰＫ１のＲＩＰＫ３との結合、ＲＩＰＫ１またはＲＩＰＫ３の二量体化またはＭＬＫＬとＲＩＰＫ３との間の相互作用をブロックする化合物が好ましい。たとえば、ＲＨＩＭ配列（コンセンサス配列Ｉ／Ｖ−Ｑ−Ｉ／Ｌ／Ｖ−Ｇ−ｘ−ｘ−Ｎ−ｘ−Ｍ／Ｌ／Ｉ）を含むタンパク質またはペプチドは、ＲＩＰＫ１とＲＩＰＫ３間の相互作用を破壊することがあり、そして、したがって、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）を阻害することができることが報告されている（Ｍａｃｋら、２００８年，ＰＮＡＳ  １０５，３０９４乃至３０９９；Ｋａｉｓｅｒら、２００８年，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８１，６４２７乃至６４３４）。
【００５４】
また、プロ−ネクロトーシス性タンパク質のドミナント  ネガティブ  バージョン（ｄｏｍｉｎａｎｔ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｖｅｒｓｉｏｎｓ）が想定される。このようなドミナント  ネガティブ  タンパク質は、相互作用のパートナーに結合し、そして、したがって、それらの天然に存在する活性な相手と競合する能力を維持する。同時に、それらは、天然に存在する変異体の活性を欠く。たとえば、ＲＩＰＫ１またはＲＩＰＫ３のキナーゼ・デッド（ｋｉｎａｓｅ−ｄｅａｄ）の変異体は、まだ、ネクロソームへ動員されることができ、したがって、天然に存在する活性なタンパク質と競合できるが、しかし、ＲＩＰＫ１またはＲＩＰＫ３のターゲットをリン酸化することはできず、したがって、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）を遮断する。
【００５５】
クラス（iv）（b）は、抗ネクロトーシス性タンパク質の分子または細胞機能を増強する化合物を含む。これは、たとえば、ＴＡＫ１の構成的に活性な形態のような、抗ネクロトーシス性タンパク質の構成的に活性な形態を包含し得る。
【００５６】
「ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）阻害剤」の効率は、本明細書中で、定義され、そして、さらに詳細に説明されているように、ネガティブ  コントロールおよび／またはポジティブ  コントロールと比較することによって決定できる。
【００５７】
本明細書で使用される「ポジティブ  コントロール」は、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）をテストするための条件／実験設定において、既に陽性であることが知られているか、または陽性であることが予想される結果を示す化合物、すなわち、ポジティブ  コントロールは、所定の時間後にネクロトーシス性細胞死の阻害を齎し、そして公知のネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）阻害剤であって良い化合物を示す。ポジティブ  コントロールの１例は、ネクロスタチン−１である。
【００５８】
本明細書で使用される、「ネガティブ  コントロール」は、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）をテストするための条件／実験設定において、陰性であることが、すでに知られているか、または陰性が予想されている結果を示す化合物を指し、すなわち、ネガティブ  コントロールは、所定の時間後に、ネクロトーシス性細胞死の発生を齎し、そして、たとえば、非活性のネクロスタチン類縁体のような不活性な化合物であってもよい。
【００５９】
本明細書で上述したように、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）阻害剤は、細胞がネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）を受けるのを阻止する。この点において、用語「阻止する（ｐｒｅｖｅｎｔ」」は、また、所定時間後のネガティブ  コントロールと比較して、ネクロトーシス性細胞死が、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、そして、少なくとも９５％の増加する好適性で、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）阻害剤によって低減されることを意味する、ネクロトーシス性細胞死の減少を含む。
【００６０】
本明細書で用いられる、用語「所定の時間（ａ  ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｔｉｍｅ）」は、ネクロトーシス性細胞死の誘導に十分である期間を特定する。このような期間を決定する方法は、当該技術分野において知られている。好適性の増加に伴って、所定の時間は、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間または少なくとも７２時間である。
【００６１】
対照は、好ましくは、実験の設定に含まれているが、これは必要でないことに注意する。対照は、たとえば、以前に行った、上記のタイプの化合物を使用した対照実験から得られた、細胞死の統計的な読み出しであってもよい。統計的読み出しは、一般に、以前に、行われた複数の対照実験を平均することによって得られる。平均値は、同一の対照実験を繰り返した結果を重み付けすることによって、または異なる対照実験からの結果を重み付けすることによって得ることができる。統計的な読み出し（ｒｅａｄｏｕｔ）を得るための統計的方法は、当技術分野において周知である。統計的読み出しは、その後、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）の阻害剤として作用する能力について、化合物を試験して得られた結果と比較される。
【００６２】
好ましい実施形態において、阻害剤は、前記阻害剤の非存在下でのネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）と比べて、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％、そして、さらにより好ましくは、少なくとも９８％のような少なくとも９５％、またさらには１００％、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）を減少させる。作用の前記メカニズムに応じて、たとえば、７５％の減少は、与えられた阻害剤によって、ネクロソームのすべてまたは実質的にすべての形成および／またはネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）誘導活性を、７５％減少することによって、または、ネクロソームのすべてまたは実質的にすべての、完全に７５％を阻害することによって、達成することができる。換言すれば、前記生物学的機能または活性の減少は、定性的または定量的な性質のものであってもよい。用語「実質的に全て（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ａｌｌ）」は、ネクロソームの少なくとも９５％以上が包含されることを特定することを意味する。「実質的に全て（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ａｌｌ）」という用語の使用は、ネクロソームの全てを正確に表すことを阻止する、細胞で観察された、タンパク質発現および生じたシグナリング事象のコンスタントな変化の証拠である。好ましくは、すべてのネクロソームは完全に抑制される。
【００６３】
ネクロトーシス性細胞死は、たとえば、アポトーシスまたはネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）阻害剤の存在下、電子顕微鏡法によって、または細胞死のタイプのいずれか１つの薬理学的または遺伝的阻害の存在下および非存在下に、細胞死の定量を含む間接的な方法によって、形態学的特徴を分析することにより、たとえば、定量することができる。好ましくは、本明細書の以下の実施例に記載される方法は、細胞死の量と質を決定するために使用される。この点において、「細胞死の質を決定する（ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ）」は、どの細胞死の形態（たとえば、アポトーシス、ネクロトーシス、壊死）で、細胞が死亡したか、または、死にかけているかによって分析することを指す。換言すれば、本明細書の以下の実施例に記載の方法は、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）によって死亡した、または、死にかけている内皮細胞の数を決定するために使用されることが好ましい。
【００６４】
本発明において、言及されている、いずれかの阻害剤の機能は、たとえば、ハイスループットスクリーニングアッセイ（ＨＴＳ）を用いて、同定および／または、確認することができる。ハイスループットアッセイは、生化学的な、細胞のまたは他のアッセイから独立して、一般的に、マイクロタイター  プレートのウェル中で行うことができる。その各々のプレートは、たとえば、９６、３８４または１５３６ウェルを含んでいてもよい。周囲温度以外の温度でのインキュベーションを含むプレートの取扱い、および、試験化合物をアッセイ混合物と接触させることは、ピペット操作デバイスを含む、１つまたは複数のコンピュータ制御ロボットシステムにより、好適に行われる。試験化合物の大きなライブラリーをスクリーニングする場合、および／または、スクリーニングを、短時間で行う事が効果的である場合、たとえば、１０、２０、３０、４０、５０または１００の試験化合物の混合物を、各ウェルに添加してもよい。１つのウェルが生物活性を示す場合に、試験化合物の前記混合物は、観察された生物学的活性を生じる前記混合物中の１つまたは複数の試験化合物を特定するための複雑化を解消する（ｄｅ−ｃｏｎｖｏｌｕｔｅｄ）できる。
【００６５】
たとえば、限定することなく、阻害剤と機能／活性アッセイを実施する前に、試験分子との結合を同定するために使用することができる、生物物理学的結合アッセイのような任意の結合アッセイは、潜在的阻害剤の結合の決定に効果を齎すことができる。適切な生物物理学的結合アッセイは、当技術分野で知られており、そして、蛍光偏光（ＦＰ）アッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイ、および、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイを含む。結合アッセイによって、阻害剤とその標的分子との直接的相互作用を評価するのに代わりに、または、加えて、阻害剤とその標的分子との相互作用を、適切な読み出しを用いて、間接的に、決定することができる。たとえば、阻害剤が、標的タンパク質の発現レベルを減少させることによって作用する場合には、タンパク質の発現レベルの決定は、たとえば、核酸レベルまたはアミノ酸レベルで行うことができる。
【００６６】
核酸レベルで、タンパク質の発現を決定するための方法としては、ノーザンブロッティング、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲまたはリアルＲＴ−ＰＣＲを含むが、これらに限定されない。
【００６７】
ノーザンブロットは、試料中のＲＮＡまたは単離されたｍＲＮＡの決定を可能にする。ノーザンブロッティングは、ＲＮＡ試料のサイズによる分離のための電気泳動の使用および、一部または全部の標的配列に相補的なハイブリダイゼーションプローブを用いた検出を含む。最初に、典型的には、試料から、全ＲＮＡの抽出を行う。所望の場合、ｍＲＮＡは、ポリ（Ａ）テール（ｐｏｌｙ（Ａ）  ｔａｉｌ）を有するＲＮＡのみを単離するために、オリゴ（ｄＴ）セルロース  クロマトグラフィーを使用することによって、前記初期ＲＮＡ試料から分離することができる。ＲＮＡサンプルは、次に、ゲル電気泳動によって分離される。分離されたＲＮＡは、その後、毛細管または真空ブロッティングシステムを介してナイロン膜に移動される。膜への移動後、前記ＲＮＡは、たとえば、ＵＶ光または熱によって膜に共有結合を介して固定化される。その後、前記ＲＮＡは、適切に標識されたプローブとＸ線フィルムを用いて検出され、そして、続いてデンシトメトリーによって定量することができる。ゲル剤、緩衝液および標識の適切な組成物は、当該技術分野において周知であり、同定される特定の試料および標的に依存して変化し得る。上記のプロトコールは、典型的なものだが、ノーザンブロットのために制限されるものではない。
【００６８】
ＰＣＲは、当技術分野で周知であり、標的配列のコピーを多数作るために使用される。これは、非常に短い時間で、反応混合物の入った容器を加熱し、そして、冷却することができる、自動化されたサイクラー装置で行われる。前記ＰＣＲは、一般的に、以下からなる、サイクルの多くの繰り返しで構成される：
（ａ）ＤＮＡ分子の両方の鎖を融解し、以前のすべての酵素反応を終了させる、変性工程；
（ｂ）ＤＮＡ分子の融解された鎖に、プライマーが、特異的に、アニールすることを可能にすることを目的とするアニール工程；および
（ｃ）テンプレート鎖によって提供される情報を用いて、アニーリングされたプライマーを伸長する伸長工程。
【００６９】
一般に、ＰＣＲは、たとえば、１．５ｍＭの塩化マグネシウム、各デオキシヌクレオシド三リン酸の２００μＭ、各プライマーの０．５μＬ（１０μＭ）、鋳型ＤＮＡの約１０乃至１００ｎｇおよび、１〜２．５単位のＴａｑポリメラーゼを有する、１０×ＰＣＲ緩衝液５μｌを含有する５０μｌの反応混合物中で、実行することができる。増幅のためのプライマーは、標識されてもよく、または非標識でもよい。ＤＮＡ増幅は、たとえば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｖｅｒｉｔｉ(R)のサーマルサイクラー（ライフテクノロジーズ社、カリフォルニア州カールスバッド）、Ｃ１０００TMサーマルサイクラー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、カリフォルニア州ハーキュリーズ）、または、ＳｕｒｅＣｙｃｌｅｒ  ８８００（アジレント・テクノロジー社、カリフォルニア州サンタ  クララ）を用いて、実行することができる。：９４℃で２分間、続いて、アニーリング（たとえば、５０℃で３０秒）、伸長（使用されるＤＮＡ鋳型の長さと使用される酵素に応じて、たとえば、７２℃で、１分）、変性（たとえば、９４℃で、１０秒）および、最終アニール工程（たとえば、５５℃で１分）、そして、最終伸長工程（たとえば、７２℃で、５分間）からなる３０〜４０サイクルでＤＮＡ増幅が行なわれる。ＤＮＡ鋳型と共に使用するのに適切な、ポリメラーゼには、たとえば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩまたはそのクレノウ断片（Ｋｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、サーマス・アクアティカスベント（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  Ｖｅｎｔ）、Ａｍｐｌｉｔａｑ、ＰｆｕおよびＫＯＤから単離された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含み、これらのいくつかは、プルーフ  リーディング機能および／または異なる温度最適条件を示す。しかし、異なる長さおよび／または組成物のプライマーを用いて、特定の核酸分子の増幅のために、ＰＣＲ条件を最適化する方法、または、反応混合物の体積を縮小または増加させる方法は、当該技術分野においてよく知られている。増幅される核酸がＲＮＡからなる場合、「逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応」（ＲＴ−ＰＣＲ）が使用される。
【００７０】
用語「逆転写酵素」は、リボ核酸の鋳型に相補的なプライマー伸長産物を形成するために、デオキシリボヌクレオシド三リン酸の重合を触媒する酵素を指す。当該酵素は、プライマーの３’末端で合成を開始し、そして、合成が終了するまで、鋳型の５’末端に向かって進行する。相補的な、コピーＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列に、ＲＮＡ標的配列を変換する適切な重合剤の例は、トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素、および、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、パーキンエルマー社によって、市販されている、逆転写酵素活性をもつ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである。典型的には、ゲノムＲＮＡ／ｃＤＮＡを二本鎖鋳型は、増幅の鋳型として入手可能なＤＮＡ鎖を残す、最初の逆転写工程の後の最初の変性工程の間に、熱変性される。高温ＲＴは、より高いプライマーの特異性と効率性の向上を提供する。１９９１年８月１５日に出願された、米国特許出願シリアル番号０７／７４６１２１は、同一のプライマーおよびポリメラーゼが、逆転写およびＰＣＲ増幅段階の両方に十分な「均一ＲＴ−ＰＣＲ（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ＲＴ−ＰＣＲ）」を開示し、そして、その反応条件は、試薬の変更なしに、両反応が起こるように最適化されている。サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼは、、逆転写酵素として機能することができる熱安定性のＤＮＡポリメラーゼであって、テンプレートに関係なく、すべてのプライマー伸長工程に使用することができる。両方のプロセスは、試薬を変更したり、または、追加するために、チューブを開くことなく行うことができる；温度プロファイルだけが、最初のサイクル（ＲＮＡ鋳型）と増幅サイクル残り（ＤＮＡ鋳型）の間に、調整される。ＲＴ反応は、たとえば、０．５乃至１μｇの総ＲＮＡ、それぞれ、約１０〜３０ｐｍｏｌの順方向（ｆｏｒｗａｒｄ）および逆プライマー、１０×ＲＴ−ＰＣＲ緩衝液２μｌ、０．２μｌのＡＭＶ逆転写酵素（２５Ｕ／μｌ）、１μｌのＴａｑポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）、リボヌクレアーゼ阻害剤および、最終容量を２０μＬまでにする水を含む、２０μｌの反応混合物中で、達成される。
【００７１】
この反応は、たとえば、以下の条件を用いて行うことができる。この反応は、逆転写を可能にするために、３０分間４５℃に保持される。反応温度は、その後、逆転写酵素反応を停止し、そして、ＲＮＡ−ｃＤＮＡの二本鎖を変性させるために、５分間、９４℃に上昇させる。次に、反応温度を、９４°Ｃで、３０秒、６０℃で、４５秒、および、７２°Ｃで、１乃至３分間の３０〜４０サイクルを受ける。最後に、反応温度は、最終伸長工程のために、７分間、７２℃℃に保持され、１５°Ｃに冷却し、そして増幅されたサンプルのさらなる処理まで、その温度で保持される。上記の反応条件のいずれも、特別な場合のニーズに応じてスケールアップすることができる。得られた生成物は、たとえば、アガロースゲル上にロードされ、そして、バンド強度は、臭化エチジウムまたはＳｙｂｒＧｒｅｅｎのようなインターカレート色素で、核酸分子を染色した後に比較される。未処理サンプルと比較して、阻害剤で処理したサンプルの低いバンド強度は、阻害剤が、成功裏に、タンパク質を阻害したことを示す。
【００７２】
リアルタイムＰＣＲは、また、本分野で、また、共有結合で、５’末端に結合したレポーター染料および３’末端でクエンチャーと結合した、ＴａｑＭａｎプローブとも呼ばれる、特殊なプローブを使用する。ＴａｑＭａｎプローブは、増幅されたポリヌクレオチドの相補的部位に対する、ＰＣＲ反応のアニーリング工程において、ハイブリダイズされた後、ＰＣＲ反応の伸長相において、Ｔａｑポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性によって、５’フルオロフォアは切断される。これは、ＴａｑＭａｎプローブ配列中の３‘アクセプターに非常に近接するために、以前にクエンチされていた、５’ドナーの蛍光を増強する。これにより、増幅のプロセスは、直接的かつリアルタイムでモニターすることができ、従来のエンドポイントＰＣＲよりも発現レベルが、より非常に正確な決定を可能にする。また、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ実験において、二本鎖ＤＮＡ分子のデノボ合成を監視するためのＳｙｂｒＧｒｅｅｎなどのＤＮＡインターカレート染料が使用される。
【００７３】
アミノ酸レベルでのタンパク質の発現を決定するための方法としては、クーマシー  ブリリアント  ブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｂｌｕｅ）または銀染色などのタンパク質染色法と組み合わせて、ウェスタン  ブロッティングまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動を含み、これらに限定されない。全タンパク質を、ポリアクリルアミドゲルにロードし、そして、電気泳動を行う。その後、分離されたタンパク質は、電流を印加することによって、膜、たとえば、ポリビニルジフルオライド（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ  ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ）（ＰＶＤＦ）膜に移動される。膜上のタンパク質を、目的のタンパク質を、特異的に認識する抗体に曝露される。洗浄後、特異的に、一次抗体を認識し、蛍光染料のような読み出しシステムを有する二次抗体が適用される。関心対象のタンパク質の量は、阻害剤で処理されたサンプル由来のタンパク質と、非処理サンプル由来のタンパク質の蛍光強度を比較することによって決定される。阻害剤で処理したサンプル由来のタンパク質のより低い蛍光強度は、成功したタンパク質の阻害剤を示す。また、タンパク質の定量においては、アジレント  バイオアナライザー技術（たとえば、アジレント２１００  バイオアナライザー；アジレント  テクノロジー社、サンタ  クララ、カリフォルニア）が使用される。
【００７４】
好ましくは、本発明の阻害剤は、医薬組成物中に含まれ、好ましくは、薬学的に許容される担体、賦形剤および／または希釈剤をさらに含む。
【００７５】
本明細書で使用される用語「医薬組成物」は、被験者、好ましくはヒトの被験者への投与のための組成物に関する。本発明の医薬組成物は、たとえば、少なくとも３つのような、少なくとも２つのような、少なくとも一つ、さらなる実施形態では、最大で５つのような、少なくとも４つの本明細書に記載の阻害剤を含む。複数の阻害剤が、医薬組成物に含まれている場合において、これらの阻害剤のいずれも、組成物に、また含まれる他の阻害剤に対して、いかなる、または本質的にいかなる、阻害効果をも有していないことが理解される。この文脈における用語「本質的な」は、重要でないか、無視できる抑制効果を指す。また、阻害剤は、追加の効果、および、必要に応じて、それらの阻害活性において相乗効果を提供することが好ましい。
【００７６】
組成物は、固体、液体または気体の形態であってもよく、とりわけ、粉末、錠剤、溶液またはエアロゾルの形態でよい。
【００７７】
上述のように、前記医薬組成物は、薬学的に許容される担体、賦形剤および／または希釈剤を含むことが好ましい。適切な薬学上の担体、賦形剤および／または希釈剤の例は、当該技術分野で周知であり、そして、リン酸緩衝生理食塩水、水、油／水エマルジョンのようなエマルジョン、様々な種類の湿潤剤、滅菌溶液を含む。担体、賦形剤および希釈剤は、ある程度、実際の阻害剤の化学的性質に依存し、そして、確立されたプロトコールに応じて選択することができる。そのような担体を含む組成物は、周知の従来の方法によって製剤化することができる。これらの医薬組成物は、適切な用量で被験体に投与することができる。適切な組成物の投与は、たとえば、静脈内、経口、直腸、腹腔内、皮下、筋肉内、局所、皮内、鼻腔内または気管支内投与による、ような、様々な方法によって行うことができる。投与のモードは、たとえば、冠動脈のような血流中の部位に、たとえば、注射および／または送達することによって行われるような全身投与であることが好ましい。
【００７８】
組成物は、また、たとえば、外部または内部標的部位、好適には、腫瘍が位置する部位へのバイオリスティック送達（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）によるような、標的部位に直接投与することもできる。転移領域または腫瘍細胞が転移する器官が小さく、境界が定められている場合には、局部的な投与は、全身投与よりも好ましい場合がある。これらの場合、局所投与は、たとえば、使用される薬物の量を最小限に抑えるか、また、もしあれば、有害な副作用のリスクを減少させることができ、有利である。全身および局部的な投与の組み合わせは、体内の特定の部位に、本明細書で定義される阻害剤を一時的に増加した濃度を達成するために選択することができる。投与計画は、主治医および臨床的因子によって決定される。医学分野でよく知られているように、任意の一人の患者のための投薬量は、患者のサイズ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物の効力およびバイオアベイラビリティ、性別、投与の時間および経路、一般的な健康状態、および同時に投与される、他の薬剤を含む多くの要因に依存する。特に、阻害剤の作用の効力およびモードは、その投与量だけでなく、その投与方法も指示することができる。薬学的に活性な物質は、１回の投与当たり、１ｎｇ乃至１０ｍｇ／ｋｇ体重の間の量で存在することができる。しかしながら、この例示的な範囲以下または以上の投与量は、特に、前述の要因を考慮して、想定される。もし、投与計画が継続注入である場合、それはまた、１分当たり体重１キログラム当たり、０．０１μｇ乃至１０ｍｇ単位の範囲であるべきである。継続注入レジメンは、１ｎｇ乃至１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量範囲内の負荷用量で完了することができる。
【００７９】
本発明の阻害剤を、内皮または腫瘍（単数または複数）に局所送達の場合には、それぞれ、内皮または腫瘍（単数または複数）に、前記部位特異的送達を達成するために、様々なオプションが存在する。たとえば、阻害剤（複数可）は、その一部において、官能化されていてもよく、それぞれ、内皮細胞または腫瘍細胞を特異的に標的とするように結合されてよい。内皮細胞および腫瘍細胞によって定義される抗原の特異的発現に基づいて、それぞれ、阻害剤は、すなわち内皮細胞または腫瘍細胞によって、それぞれの細胞により発現される抗原と、特異的に、相互作用する抗体または抗体フラグメントに結合させることができる。また、特異的に、腫瘍細胞または内皮細胞を標的とするように、阻害剤（複数可）を保持するビヒクルが官能基化されてもよい。腫瘍細胞が、特定の酵素活性または取り込みメカニズムを示す場合には、阻害剤は、それぞれ、それが機能的に活性な形態に、酵素活性によって変換される方法、または、特異的な取り込み機構に付すような方法で官能基化することができる。腫瘍（単数または複数）への局所化された送達は、特に、クラス（１）のネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）阻害剤、すなわち、腫瘍細胞によって、発現または分泌または放出され、そして、内皮細胞におけるネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）を誘導するコンポーネントを標的とする、阻害剤に想定される。
【００８０】
進行は、定期的な評価によってモニターすることができる。組成物は、局所的または全身的に投与することができる。非経口投与のための製剤は、無菌の水溶液または非水溶液、懸濁液、およびエマルジョンを含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性担体は、生理食塩水および緩衝媒体を含む、水、アルコール／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液を含む。非経口のビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液、または固定油を含む。静脈内ビヒクルは、流体および栄養補充液（ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒｓ）、（リンゲルデキストロースに基づくもののような）電解質補充液等（ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ  ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒｓ）などを含む。たとえば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどのような、防腐剤および他の添加物も、存在してもよい。特に、前記医薬組成物は、心不全に拮抗する、当技術分野で知られている、さらなる薬剤を含むことが好ましい。医薬製剤は、上記阻害剤に依拠するので、上記言及したさらなる薬剤は、すなわち、唯一の薬剤として使用される場合、たとえば、さらなる薬剤によって付与される副作用を低減するように、推奨される用量と比較して、低減された用量で、補助として使用されるのみであることが好ましい。従来の賦形剤は、結合剤、充填剤、潤滑剤および湿潤剤を含む。
【００８１】
本明細書で使用される用語「腫瘍」は、たとえば、転移が公知であるか、または疑われ、そして、したがって、転移を阻止するために、本明細書で定義される阻害剤の使用を保証する、異常な組織の増殖によって特徴づけられる、新生物、に関する。転移することが知られている腫瘍は、転移を形成する能力を欠いている良性腫瘍とは対照的に、悪性腫瘍（また、当該技術分野では、癌性腫瘍（ｃａｎｃｅｒｏｕｓ  ｔｕｍｏｕｒｓ）とも呼ばれる）である。しかし、後者の腫瘍の多くの種類は、悪性になる、すなわち、転移する、可能性を有する（たとえば、奇形腫（ｔｅｒａｔｏｍａｓ）のような）。転移が予想される場合、転移を阻止するために、本明細書で定義される阻害剤の使用は正当化することができる。本発明による腫瘍は、ｉ）癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、ii）肉腫、ｉｉｉ）血液形成組織の腫瘍、ｉｖ）胚細胞腫瘍、ｖ）芽細胞腫、ＶＩ）混合型の腫瘍である。
【００８２】
たとえば、ｉ）による腫瘍は、身体の外側をカバーし、そして、粘膜および、たとえば、乳、肺、呼吸器および消化管、内分泌腺、および泌尿生殖器系のような、臓器などの内部の空洞構造に並ぶ（ｌｉｎｅ）上皮組織で発生する。乳管または腺要素は、たとえば、甲状腺癌、胃腺癌、子宮腺癌のような腺癌のような、上皮腫瘍に持続し得る。皮膚および、たとえば、舌、口唇、喉頭、膀胱、子宮頸部、または陰茎の腫瘍のような、皮膚のおよび特定の粘膜の一般的な上皮細胞の腫瘍は、それぞれの組織の表皮または扁平上皮癌と呼ぶことができ、そして、同様に腫瘍の定義の範囲内にある。
【００８３】
ｉｉ）による腫瘍は、たとえば、骨肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫、または滑膜肉腫のような、線維組織、脂肪（脂肪）組織、筋肉、血管、骨、および、軟骨を含む結合組織で発症する。
【００８４】
ｉｉｉ）の腫瘍は、血液（白血病）の癌またはリンパ系（リンパ腫）であってもよい。白血病は、血液形成細胞の癌の１つのグループである。それらは、通常、骨髄で開始し、そして、異常な細胞が、そこから、血流および身体の他の部分に広がる。白血病は、そこから異常な白血病細胞が発症した、骨髄中の造血細胞のタイプに応じて、リンパ系または骨髄系として記載される。さらに、白血病は、それらが、急性または慢性であるか否かにしたがって、そして、また、癌となった血液形成細胞の種類に応じて、分類される。したがって、４つの主要なタイプの白血病がある：急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）。
リンパ腫は、リンパ球から由来し、そして、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）（リード・シュテルンベルク細胞の存在によって特徴付けられる）および非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の２つの主なカテゴリに分割することができる。後者は、さらに、いくつかのサブカテゴリに分類される。
【００８５】
ｉｖ）の腫瘍は、生殖細胞由来の腫瘍である。これは、卵巣または精巣だけでなく、たとえば、頭部、胸部、腹部、骨盤、および仙尾のような、これらの器官の外側に発生することがある。これらの腫瘍は、胚細胞腫、内胚葉洞腫瘍または卵黄嚢腫瘍、絨毛癌および胚性癌腫が含まれる。卵巣に位置するときに、胚細胞腫はまた、未分化胚細胞腫とも呼ばれる。そして、精巣に位置するときには、セミノーマとも呼ばれる。絨毛がんは、胎盤の絨毛膜層内の細胞から発生する、非常にまれな、胚細胞腫瘍である。
【００８６】
ｖ）に従った腫瘍は、たとえば、肝芽腫、髄芽腫、腎芽、神経芽細胞腫、膵芽、胸膜肺芽細胞腫、網膜芽細胞腫および神経膠芽腫のような前駆細胞または芽細胞（未成熟または胚組織）に由来する。
【００８７】
ｖｉ）に記載の腫瘍は、異なるタイプの腫瘍細胞を含む。異なる種類は、同じまたは別の上記のカテゴリに属していてもよい。１例は、癌肉腫である。癌肉腫は、上皮および結合組織の両方に発症する腫瘍である。それらは、発癌性のイベントのせいで、同時に隣接する上皮および間葉細胞に影響を与えて発症する場合があり、また、癌および肉腫を同時に生じる衝突（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ）から生じる場合がある。この定義の範囲内の腫瘍は、原発または二次性腫瘍であってもよく、それにより、原発は、その腫瘍が、他の腫瘍病変部からの転移を介して、二次サイトとして確立されたというより、見いだされた組織で発生した腫瘍であることを示す。上記で概説したように、この定義の範囲内の腫瘍は、良性であるか、または悪性であってもよく、そして、被験者、好ましくは哺乳動物、の身体の全ての解剖学的構造に影響を及ぼし得る。
【００８８】
たとえば、それらは、以下の腫瘍を含む。
ａ）骨髄および骨髄由来細胞（白血病）、
ｂ）たとえば、甲状腺、副甲状腺、下垂体、副腎、唾液腺、膵臓、などのような内分泌および外分泌腺、
ｃ）たとえば、男性または女性のいずれかの、乳腺、乳管、腺癌、髄様癌、面皰癌、乳頭のパジェット病、若い女性の炎症性癌におけるたとえば良性または悪性腫瘍のような乳癌、
ｄ）肺、
ｅ）胃、
ｆ）肝臓および脾臓、
ｇ）小腸、
ｈ）結腸、
ｉ）たとえば、悪性骨肉腫、良性骨腫、軟骨腫瘍などの、悪性または良性の骨腫のような；悪性軟骨肉腫または良性軟骨腫のような；骨およびその支えおよび結合組織；
ｊ）骨髄悪性骨髄腫または良性好酸球性肉芽腫様腫瘍のような骨髄腫、ならびに身体の他の場所の骨組織からの転移性腫瘍；
ｋ）、口、喉、喉頭および食道、
ｌ）膀胱および、卵巣、子宮、子宮頸部、精巣、および前立腺のような男性と女性の泌尿生殖器系の、膀胱およびその内部および外部の臓器および構造、
ｍ）前立腺、
ｎ）膵臓の腺管癌のような膵臓、
ｏ）リンパ球性リンパ腫およびリンパ系起源の他の腫瘍のようなリンパ組織、
ｐ）皮膚、
ｑ）食道筋肉およびライニングを含む、呼吸や呼吸器系に属する、全ての解剖学的構造の癌および腫瘍疾患、
ｒ）リンパ節の原発または二次癌
ｓ）舌および硬口蓋または副鼻腔の骨構造、
ｔ）口、頬、首、唾液腺、
ｕ）心臓とそのライニングを含む血管、
ｖ）平滑または骨格筋およびそれらの靭帯およびライニング、
ｗ）小脳を含む、周辺、自律、中枢神経系、
ｘ）脂肪組織。
【００８９】
腫瘍は、当該腫瘍が、まだ起源の組織（または原発部位）の組織に限定される、初期の段階のような、または、癌細胞が、すでに、隣接する組織または原発部位から身体の離れた部分に侵入している時（すなわち、腫瘍がすでに転移）の、その進行のどの段階であってもよい。
【００９０】
腫瘍の文脈における用語「転移」は、当技術分野で周知である。腫瘍の転移は、癌細胞が原発腫瘍から離脱し、そして、血管またはリンパ管を介して拡散した後、娘腫瘍（ｄａｕｇｈｔｅｒ  ｔｕｍｏｕｒｓ）を生み出すことができるプロセスである。図１に示すように、これは、血管内への進入（ｉｎｔｒａｖａｓａｔｉｏｎ）、通過（ｔｒａｎｓｉｔ）、内皮（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ）への滞留および接着（ａｒｒｅｓｔ  ａｎｄ  ａｄｈｅｓｉｏｎ）、滲出、滲出場所での接着（播種）および、生存および新しいサイトでの転移性腫瘍細胞（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓｉｎｇ  ｔｕｍｏｕｒ  ｃｅｌｌｓ）の増殖の工程を含む。転移の発生率が高い腫瘍は、たとえば、肺、乳房、結腸、腎臓、前立腺、膵臓、子宮頸部の腫瘍、ならびに黒色腫である。臓器の空洞内での移動時の際、腫瘍細胞はまた、組織の下部に進入するために、細胞の（非内皮細胞）障壁を克服する必要があるかもしれない。これは、（いくつかの）細胞が形成した障壁におけるネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）の誘導を含むことができる。したがって、血管またはリンパ管を通過しない転移も、また、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）の阻害剤を使用して阻害されることが想定される。好ましくは、本発明において、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）阻害剤は、血行性および／またはリンパ転移、すなわち、血管やリンパ管を通過する転移、を阻止する際に使用するためのものである。
【００９１】
腫瘍転移の文脈において、用語「阻止する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」は、本発明の阻害剤の存在下での、腫瘍が転移することを妨げていることを意味する。分子レベルで、その阻止は、腫瘍細胞の血管外滲出（ｅｘｔｒａｖａｓａｔｉｏｎ）が発生する程度に、腫瘍細胞は、内皮細胞のネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）を引き起こさないことを特徴とする。理解されるように、特に、転移に対する高い率および／またはリスクによって特徴づけられる腫瘍について、それは、臨床的観点から、病気を、より管理可能にする可能性があり、そして、腫瘍に罹患した患者の余命を増大させることができる可能性があるので、転移の発生するリスクおよび／または率における減少でさえ、有益である。したがって、「阻止する」という用語はまた、腫瘍転移のリスクおよび／または率を低下させる意味も、また、包含する。換言すれば、用語「阻止する」は、したがって、転移の無効、すなわち、転移が起こらない、を含む一方で、それは、たとえば、少なくとも（各値について）３０％、４０％、または、少なくとも（各値に対して）５５％、６０％、６５％、７０％または７５％のような５０％、好ましくは少なくても８０％または８５％（各値について）、より好ましくは、少なくとも９０％または９５％（各値について）、そして、最も好適には、１００％、すなわち、前述したように、腫瘍転移の無効、によって、発生する腫瘍の転移のリスクおよび／または率の減少にも関連する。
【００９２】
本明細書で定義される阻害剤は、既に転移されたものと同様に、まだ転移を開始していない腫瘍の転移を阻止するために使用することができることは、本発明にしたがって理解される。
【００９３】
好ましくは、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）の阻害剤は、哺乳動物被験体における腫瘍の転移を阻止する際に使用される。より好ましくは、対象はヒトである。
【００９４】
本発明によれば、驚くべきことに、腫瘍細胞の内皮遊出（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔ）は、内皮細胞のネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）を含むことが見出された。科学的理論に拘束されることを望まないが、腫瘍細胞の転移は、内皮細胞におけるネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）を誘導することができると考えられる。これは、内皮を通って、腫瘍細胞の遊出（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｉｏｎ）、および、それによる、腫瘍細胞の血管外滲出（ｅｘｔｒａｖａｓａｔｉｏｎ）に寄与する。転移形成のこの重要なステップは、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）の阻害剤を使用してネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）を遮断することによって阻止することができる。
【００９５】
これらの知見は、多くの理由のために驚くべきことである。腫瘍細胞の血管外滲出（ｅｘｔｒａｖａｓａｔｉｏｎ）の現在のドグマは、白血球と同様に、腫瘍細胞が、有意に内皮単層を破壊することなく、細胞の再構成を介して内皮細胞の退縮を誘導することにより、内皮を遊出（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｅ）することを示唆する（Ｒｅｙｍｏｎｄら、２０１３年）。さらに、内皮細胞における細胞死の誘導が、遊出（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｅ）に寄与する別のメカニズムとして提案された場合でさえ、この細胞死は、排他的にアポトーシスであることが記載されていた。この背景で、細胞死、特に、アポトーシス、を誘導する化合物は、腫瘍の治療のために使用されるので、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）阻害剤の使用は、特に経験にそぐわない（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｉｎｔｕｉｔｉｖｅ）。
このように、最高の知識を使って、本発明者らは、初めて、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）経路および内皮を通る腫瘍細胞の遊出（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｅ）間の直接のリンクを明らかにした。
【００９６】
アポトーシスは、多くの生理学的プロセスにおいて役割を果たすことがよく知られている。他方、いくつかの生理学的機能だけが、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）について知られている。おそらく、インビボでのネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）の最も証明された役割は、ウイルス感染の調節である（Ｃｈｏら、２００９年）。これまでに、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）について報告された、限定的なインビボの機能に基づくと、このタイプの細胞死が、転移性の腫瘍細胞の内皮を通った遊出（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｅ）に関与しており、そして、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）阻害剤は、このプロセス、したがって、転移形成の全体のプロセスを阻害するために使用することができることは驚くべきことである。
【００９７】
現在の知識によれば、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）の阻害剤は、正常な生理におけるネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）の限定された機能に起因して、アポトーシス阻害剤と比較して、より少ない副作用と関連することが期待できるので、本発明は、有利な治療の機会を提供する。アポトーシス阻害剤はまた、このタイプの死が、正常な生理機能を維持するために必要とされる状況においても、アポトーシスをブロックし、したがって、特に、全身に適用した場合、、潜在的に、重篤な副作用を伴うことになる。特に、腫瘍がすでに存在するか、または、発症することが予想される場合、アポトーシス阻害剤の適用は、有益であるより、有害である可能性が高い。これは、アポトーシスは、異常で、潜在的に、発癌（ｃａｎｃｅｒｏｇｅｎｏｕｓ）細胞を阻害するための機構であり、そして、この制御機構の妨害は、腫瘍の発生と成長を促進するからである。したがって、本発明によるネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）阻害剤の使用は、現在の知識によれば、重篤な副作用に関連することが予想されない、内皮を通った転移性腫瘍細胞（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓｉｎｇ  ｔｕｍｏｕｒ  ｃｅｌｌｓ）の遊出（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｅ）を防ぐための機会を提供する。
【００９８】
さらに、本発明は、それを必要とする被験者に、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）の阻害剤の薬学的有効量を投与することを含む、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）を阻害することによる、腫瘍の転移を阻止する方法にも関する。
【００９９】
本発明にしたがって使用するための阻害剤についての定義および好ましい実施形態は、腫瘍の転移を阻止する方法にも準用される。
【０１００】
本明細書において使用される、用語「必要とされる被検者（ｓｕｂｊｅｃｔ  ｉｎ  ｎｅｅｄ  ｔｈｅｒｅｏｆ）」は、動物に関し、好ましくは脊椎動物、より好ましくは哺乳動物、そして、最も好ましくは、腫瘍に罹患しているヒト患者に関する。
【０１０１】
本発明はさらに、以下の工程を含む、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）を調節することにより、内皮を通る転移性腫瘍細胞（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓｉｎｇ  ｔｕｍｏｕｒ  ｃｅｌｌｓ）の遊出（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｅ）を調節するための方法に関する。
ａ）内皮を、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）のモジュレーターと接触する工程、および
ｂ）転移性腫瘍細胞（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓｉｎｇ  ｔｕｍｏｕｒ  ｃｅｌｌｓ）を提供し、そして、前記転移性腫瘍細胞（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓｉｎｇ  ｔｕｍｏｕｒ  ｃｅｌｌｓ）が内皮を通って遊出（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｅ）することを可能にする工程。
【０１０２】
本発明に従って、使用するためおよび、腫瘍の転移を阻止する方法のための阻害剤について記載された、定義および好ましい実施形態は、内皮を通った転移性の腫瘍細胞の遊出（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｅ）を調節するための方法にもまた準用する。
【０１０３】
好ましくは、内皮を通った転移性の腫瘍細胞の遊出（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｅ）を調節するための方法は、インビトロまたはエクスビボの方法である。試験動物に、たとえば、研究目的のために、本発明の方法を実施することも想定される。試験動物は人間ではない。
【０１０４】
本明細書で使用される、「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ）」という用語は、遊出（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｅ）の率を変化させることを意味し、そして、遊出（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｅ）の増強ならびに阻止の両方を包含する。
【０１０５】
本明細書で使用される、用語「遊出する（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｅ）」は、他の細胞の層を通って移動する細胞のプロセスを指す。したがって、用語「内皮を通って遊出（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ）」は、内皮細胞層の一方の側から、その反対側に、細胞を横断させるプロセスを指す。インビボでは、これは、血管の内側から、内皮細胞の層を通って、内皮細胞下のマトリックスに、そして、最終的には、周囲の組織に細胞が移動することを包含する。
【０１０６】
本明細書で使用される、用語「内皮（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ）」は、血管またはリンパ管の内面に並ぶ内皮細胞の層を指す。また、包含されるものは、インビトロで連続層を形成し、そして、自然の内皮を模倣する内皮細胞である。
【０１０７】
本発明の方法の文脈において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、本方法は、さらなる工程を含んでもよいことを意味する。反対は、本方法は、特定の工程からなる、であり、すなわち、本明細書に記載の工程に加えて、いかなる他の工程も実行されない。
【０１０８】
本明細書で使用される、「内皮を、ネクロトーシスのモジュレーターと接触させる（ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ  ｗｉｔｈ  ａ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）」という用語は、モジュレーターと、細胞との間の相互作用が起こるような、近接さと条件下に、内皮細胞とネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）のモデュレーターを運ぶことを指す。特に、もし、モジュレーターが、細胞内の化合物に作用することによって、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）に影響する場合、その条件は、モジュレーターが、内皮細胞によって取り込まれることを許容する態様が選択される。同時に、この用語は、モジュレーターの濃度だけでなく、接触が発生する、温度、ｐＨ、モジュレーターの濃度などの条件が、前記接触が、別の方法で、前記細胞に対して、それだけで、毒または有害ではないような条件、すなわち、転移性腫瘍細胞（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓｉｎｇ  ｔｕｍｏｕｒ  ｃｅｌｌｓ）の不存在下、であることを包含する。
【０１０９】
本明細書で使用される、「モジュレーター（ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）」は、プロセスを、増強または阻止／減速するか、または、タンパク質の活性を増強または減少させる、いずれかの化合物である。言い換えれば、モジュレーターは、アクチベーター／エンハンサーまたは阻害剤である。したがって、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）を阻害するモジュレーターは、上記本明細書で定義されるように、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）の阻害剤である。内皮を通る、転移性腫瘍細胞（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓｉｎｇ  ｔｕｍｏｕｒ  ｃｅｌｌｓ）の遊出（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｅ）を活性化するモジュレーターは、たとえば、研究目的のために、有用であり得る。たとえば、腫瘍細胞の移動の促進剤として作用するモジュレーターは、インビトロアッセイまたは、試験動物におけるインビボにおいて、（特に強力な）ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）阻害剤（すなわち、モジュレーターの存在する場合においてさえ、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）および／または腫瘍細胞の遊出（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｅ）を阻害することができる化合物）を同定するために使用することができる。これは、（たとえば、（内皮細胞が、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）をより受けやすくする）突然変異のような）変更に、内皮細胞が付される状況を、模倣してもよい。ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）を増強するモジュレーターは、また、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）細胞の数は、通常、制限される設定において、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）を研究（たとえば、研究目的）するのに有用である。このような設定において、モジュレーターが増加させたネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）は、ネクロトーシス性細胞数を増強するため、および、したがって分析を容易にするために用いることができる。
【０１１０】
本明細書で使用される、「転移性腫瘍細胞を提供する（ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓｉｎｇ  ｔｕｍｏｕｒ  ｃｅｌｌｓ）」という用語は、積極的に、転移性腫瘍細胞（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓｉｎｇ  ｔｕｍｏｕｒ  ｃｅｌｌｓ）を、内皮に、直接または間接的に追加することを指す。間接的に、転移性腫瘍細胞（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓｉｎｇ  ｔｕｍｏｕｒ  ｃｅｌｌｓ）を内皮に加えることは、たとえば、生成された原発腫瘍が転移すること、および、腫瘍細胞が、内皮に直接（たとえば、血流に注射することによる）加えられていないことを条件に、試験動物における原発腫瘍の積極的生成（たとえば、試験動物に癌細胞または発癌物質を適用することによって）を包含する。転移性腫瘍細胞（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓｉｎｇ  ｔｕｍｏｕｒ  ｃｅｌｌｓ）は、原発腫瘍の形成を誘導することによって提供されないことが好ましい。内皮へ、直接、転移性腫瘍細胞（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓｉｎｇ  ｔｕｍｏｕｒ  ｃｅｌｌｓ）を提供することが好ましい。本発明の方法は、治療または、ヒトまたは動物の身体における手術による、治療方法ではない。
【０１１１】
転移性腫瘍細胞（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓｉｎｇ  ｔｕｍｏｕｒ  ｃｅｌｌｓ）の添加は、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）のモジュレーターの添加に先立ち、同時にまたはその後に行われてよい。すなわち、工程ａ）およびｂ）は同時に行ってもよいか、または、工程ａ）は、工程ｂ）の前、または工程ｂ）の後に行ってもよい。ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）のモジュレーターが、腫瘍細胞の転移後に添加される場合、すなわち、工程ａ）が工程ｂ）の後に実行される場合、この時間差は、モジュレーターが追加される前に、腫瘍細胞の遊出（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｅ）がまだ発生していない、として理解される。他方、もし、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）のモジュレーターが、腫瘍細胞の転移前に添加される場合、添加の間の時間間隔は、その間に、モジュレーターが、異なる方法で分解または不活性化されたほど大きくはない。工程の順序および時間枠は、実験の設定に依存する。もし、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）および遊出（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｅ）が、すぐに起こることが予想される場合（たとえば、インビトロアッセイにおいて）、または、もし、腫瘍細胞が、試験動物の静脈内に注入された場合、モジュレーターは、腫瘍細胞の転移の前、同時にまたは直後に、適用されるべきである。好ましくは、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）のモジュレーターは、その場合、腫瘍細胞の転移の前に適用される、すなわち、工程ａ）は、ｂ）の前に行われる。
【０１１２】
他方、もし、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）および遊出（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｅ）の誘導が、腫瘍細胞を添加した後すぐに起こらないことが予想される場合（たとえば、腫瘍細胞が、試験動物に適用される場合（腫瘍細胞は、最初に、試験動物に原発腫瘍を形成する必要があり、その後、転移性腫瘍細胞（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓｉｎｇ  ｔｕｍｏｕｒ  ｃｅｌｌｓ）を生じ、次いで、原発腫瘍から分離され、そして、ネクロトーシスの誘導および遊出（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｅ）が発生する前に、転移のプロセスを開始する必要がある））を形成する必要がある）、好ましくは、モジュレーターは、腫瘍細胞の後（すなわち、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）の誘導および遊出（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｅ）が予想されるおおよその時期）に、適用される。その場合には、工程ａ）は、工程ｂ）の後に行われることが好ましい。
【０１１３】
「前記転移性腫瘍細胞が、内皮を通って遊出することを可能にする（ａｌｌｏｗｉｎｇ  ｓａｉｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓｉｎｇ  ｔｕｍｏｕｒ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ）」という用語は、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）のモジュレーターの非存在下に、転移性腫瘍細胞（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓｉｎｇ  ｔｕｍｏｕｒ  ｃｅｌｌｓ）が、内皮細胞層の一方の側からその反対側に横断することを可能にするように、内皮と腫瘍細胞との接触の条件および時間が、選択されることを意味する。ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）のモジュレーターが、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）の阻害剤である場合、「可能にする（ａｌｌｏｗｉｎｇ）」という用語は、また、転移性腫瘍細胞（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓｉｎｇ  ｔｕｍｏｕｒ  ｃｅｌｌｓ）が、この阻害剤によって内皮を遊出（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｅ）することを阻止されることを包含すると理解される。すなわち、遊出（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔ）が、前記阻害剤の非存在下で起こるように選択された、条件および時間にも拘らず、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）の阻害剤の存在下、転移性腫瘍細胞（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓｉｎｇ  ｔｕｍｏｕｒ  ｃｅｌｌｓ）が、内皮細胞層の一方の側からその反対側に横断することができない、ことを包含すると理解される。言い換えれば、この用語は、転移性腫瘍細胞（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓｉｎｇ  ｔｕｍｏｕｒ  ｃｅｌｌｓ）が、実際に、内皮を通って遊出（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｅ）することを必要としない。代わりに、もし、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）のモジュレーターによって、そうすることが阻止されていない場合、転移性腫瘍細胞（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓｉｎｇ  ｔｕｍｏｕｒ  ｃｅｌｌｓ）が、内皮を通って遊出する（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｅ）ことができることで十分である。
【０１１４】
さらに、本発明は、腫瘍転移の阻止のための、リード化合物としておよび／または医薬として適切な、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）の阻害剤を、インビトロで同定する、以下の工程を含む方法に関する。
ａ）
転移性腫瘍細胞が、内皮を遊出（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｅ）することを可能にする工程；
ｉ）試験薬剤の存在下での、および
ｉｉ）前記試験薬剤の非存在下での、
ｂ）
ａ）ｉ）およびａ）ｉｉ）に対して、内皮を通る、転移性腫瘍細胞（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓｉｎｇ  ｔｕｍｏｕｒ  ｃｅｌｌｓ）の遊出（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｅ）のレベル、および／または内皮細胞のネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）のレベルを決定する工程；
ｃ）
工程ｂ）において、ａ）ｉ）のために決定されたレベルと、工程ｂ）において、ａ）ｉｉ）のために決定されたレベルとを比較する工程、
ここで、ａ）ｉｉ）のレベルと比較して、ａ）ｉ）のレベルの減少は、試験薬剤が、腫瘍転移の阻止のためのリード化合物としておよび／または医薬として適切な、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）の阻害剤であることの指標である。
【０１１５】
本明細書で使用される、用語「リード化合物（ｌｅａｄ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」は、本明細書中上記で定義された、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）阻害剤として分類することができる化合物を指す。そのようなリード化合物は、たとえば、それらの効力、それらの薬物動態学的プロファイルまたは特定の医薬製剤に使用されるそれらの適合性に関連して、有利で、安全かつ効果的に、医薬組成物に使用することができる化合物に到達するように、最適化することができるという点で、腫瘍の転移を阻止するための薬物を開発するための出発化合物として使用される。
【０１１６】
スクリーニングにおいて同定された化合物‐リード化合物‐の薬理学的特性の最適化のための方法およびツールは、当技術分野で知られている。たとえば、インシリコでリード化合物を最適化するためのツールは、当技術分野で知られており、たとえば、Ｃｒｕｃｉａｎｉら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｖｏｌ．１１，  ｓｕｐｐｌ．２，ｐ．Ｓ２９乃至Ｓ３９（２０００年）に開示されている。さらに、リード化合物の特性を評価するための、ハイスループット  アプローチは、ＴａｒｂｉｔおよびＢｅｒｍａｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２，ｉｓｓｕｅ  ３，ｐ．４１１乃至４１６（１９９８年）に記載されている。
【０１１７】
本発明の方法のより好ましい実施形態では、最適化は、以下を達成するために、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）の阻害剤を修飾することを含む：
ｉ）修飾された、活性のスペクトル、器官特異性、および／または、
ｉｉ）改善された効力、および／または
ｉｉｉ）減少した毒性（改善された治療指数）、および／または
ｉｖ）副作用の減少、および／または
ｖ）治療作用の改変された開始、効果の持続時間、および／または
ｖｉ）薬物動態パラメータの改変（吸収、分布、特定の細胞型への取込み、代謝および排泄）、および／または
ｖｉｉ）改変された物理化学的パラメータ（溶解性、吸湿性、色、味、臭気、安定性、状態）、および／または
ｖｉｉｉ）改善された、一般的な特異性、臓器／組織特異性、および／または
ｉｘ）最適化された適用形態およびルート
について、以下によって達成することを含む。
(a)  カルボキシル基のエステル化、または
(b)  ヒドロキシル基のカルボン酸によるエステル化、または、
(c)  たとえば、リン酸エステル、ピロリン酸エステルまたは硫酸エステルまたはヘミコハク酸エステルのような、ヒドロキシル基のエステル化、または
(d)  薬学的に許容される塩の形成、または
(e)  薬学的に許容される複合体の形成、または
(f)  薬理学的に活性なポリマーの合成、または
(g)  親水性部分の導入、または
(h)  アロメート（ａｒｏｍａｔｅｓ）または側鎖上における、置換基の導入／交換、置換パターンの変更、または
(i)  等価または生物学的等価性部分（ｉｓｏｓｔｅｒｉｃ  ｏｒ  ｂｉｏｉｓｏｓｔｅｒｉｃ  ｍｏｉｅｔｉｅｓ）の導入による改変、または
(j)  同族化合物の合成、または
(k)  分枝側鎖の導入、または
(l)  アルキル置換基の、環状類縁体への変換、または
(m)  ヒドロキシル基のケタール、アセタールへの誘導体化、または
(n)  アミド、フェニルカルバメートのＮ−アセチル化、または
(o)  マンニッヒ塩基、イミンの合成、または
(p)  ケトンまたはアルデヒドを、シッフ塩基、オキシム、アセタール（ａｃｅｔａｌｅｓ）、ケタール、エノールエステル、オキサゾリジン、チアゾリジンまたはそれらの組み合わせへの変換。
【０１１８】
上記の種々の工程は、一般に、上述のように、当技術分野で知られている。それらには、定量的構造活性相関（ＱＳＡＲ）（Ｋｕｂｉｎｙｉ（１９９２年）「Ｈａｕｓｃｈ−解析および関連アプローチ」、ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ社、ワインハイム）、コンビナトリアル生化学、古典化学など（たとえば、ＨｏｌｚｇｒａｂｅおよびＢｅｃｈｔｏｌｄ（２０００年）Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ａｐｏｔｈｅｋｅｒ  Ｚｅｉｔｕｎｇ  １４０（８），８１３参照）を含み、または、依拠する。
【０１１９】
本明細書で使用される、用語「試験薬剤（ｔｅｓｔ  ａｇｅｎｔ）」は、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）を阻害するその能力について分析されるまたは分析される予定の物質を指す。試験薬剤は、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）経路のコンポーネント、および、特に、ネクロソームの特定のコンポーネントをターゲットとすることが設計され、または期待される化合物であってもよい。しかし、任意の物質、すなわち、また、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）経路の特定のコンポーネントを標的とするように、特別に設計されていない物質も、試験薬剤として使用することができる。
【０１２０】
工程ａ）ｉ）およびａ）ｉｉ）は、任意の順序で実行されてもよい、すなわち、工程ａ）ｉ）は、工程ａ）ｉｉ）の前、後、または同時に行ってもよい、ことが理解される。同様に、工程ｂ）において、試験薬剤の存在下（ａ）ｉ）での内皮を通る、転移性腫瘍細胞（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓｉｎｇ  ｔｕｍｏｕｒ  ｃｅｌｌｓ）の遊出（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｅ）のレベルは、試験薬剤の非存在下（ａ）ｉｉ））に内皮を通る転移性腫瘍細胞（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓｉｎｇ  ｔｕｍｏｕｒ  ｃｅｌｌｓ）の遊出（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｅ）のレベルを決定する、前、後、または同時に決定してもよい。同じことが、試験薬剤の存在下または非存在下での内皮細胞のネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）のレベルを決定することに関して適用される。さらに、工程ｂ）において、試験薬剤の非存在下（ａ）ｉｉ））での内皮細胞および／または内皮細胞のネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）を通る、転移性腫瘍細胞（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓｉｎｇ  ｔｕｍｏｕｒ  ｃｅｌｌｓ）の遊出（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｅ）のレベルを決定することは、もし、試験薬剤の非存在下での、前記の転移性腫瘍細胞（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓｉｎｇ  ｔｕｍｏｕｒ  ｃｅｌｌｓ）の前記内皮を通る遊出（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔ）に関する、および／または同一の実験条件下での内皮細胞のネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）のレベルに関する、データが、既に以前の実験で得られていた、または別のソースから知られている場合には、実験的に行われる必要はない。換言すれば、工程ｃ）において、ａ）ｉ）のために、工程ｂ）で決定されたデータは、ａ）ｉｉ）のための、既存のデータとも比較することができる。そのような既存のデータは、たとえば、対照実験から得られた、遊出（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｅ）および／またはネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）細胞死の統計的な読み出し（ｒｅａｄｏｕｔ）、すなわち、以前に行われた、試験薬剤の非存在下に行われた実験であってもよい。統計的読み出し（ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｒｅａｄｏｕｔ）は、一般的に、同一の対照実験を繰り返した結果を重み付けすることによって、または異なる対照実験からの結果を重み付けすることによって得られる。統計的な読み出し（ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｒｅａｄｏｕｔ）を得るための統計的方法は、当該分野で周知である。
【０１２１】
本明細書で使用される、「内皮を通る、転移性腫瘍細胞の遊出のレベルを決定する（ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｌｅｖｅｌ  ｏｆ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓｉｎｇ  ｔｕｍｏｕｒ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ）」という用語は、どのくらい多くの転移性腫瘍細胞（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓｉｎｇ  ｔｕｍｏｕｒ  ｃｅｌｌｓ）が、内皮細胞層の一方の側から、当該層の反対側に通過したか、分析し、そして、定量することを指す。腫瘍細胞の遊出（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｅ）を分析するための方法は、当技術分野において公知であり、そして、限定なく、以下の方法を含む。たとえば、蛍光標識された腫瘍細胞（ＧＦＰ‐発現またはカルセイン−ＡＭのような蛍光染料を用いた予備染色）は、トランスウェル（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）プレート（孔径は、たとえば８ミクロン）上で成長する内皮層の上に、遊出（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｅ）させることができる。使用される腫瘍細胞に依存するが、しかし、通常は、６乃至２４時間後である、一定の時間後に、、フィルターの上の非遊出（ｎｏｎ−ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｅ）腫瘍細胞は除去され、そして、フィルターの下側の上またはレシーバーウェル（ｒｅｃｅｉｖｅｒ  ｗｅｌｌ）の底部の上に遊出（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｅ）された腫瘍細胞の数を、顕微鏡を用いて記録することができ、そして、さらに分析し、そして定量できる。あるいは、非標識腫瘍細胞を、内皮層の上に遊出（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｅ）させることもできる。腫瘍細胞は、次いで、遊出（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｅ）した後、任意の一般的に使用される細胞染料によって、染色され、撮像、分析、および定量される。
【０１２２】
本明細書で使用される、「内皮細胞のネクロトーシスのレベルを決定する（ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｌｅｖｅｌ  ｏｆ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）」という用語は、内皮細胞がネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）によって死亡した数を定量することを指す。換言すれば、この用語は、生細胞と死細胞を区別すること、さらに、死細胞内で、これらの細胞が死亡した細胞死のタイプによって区別すること、したがって、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）によって死亡した細胞の数を決定することを包含する。後者の工程は、特に、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）／壊死細胞を、アポトーシスのような細胞死の他の形態によって死んだ細胞から、区別することが必要である。好ましくは、内皮細胞のネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）のレベルは、本明細書の以下の実施例に記載した方法を用いて決定される。
【０１２３】
試験薬剤の存在下で得られたデータを、試験化合物の非存在下で得られたデータと比較するための方法は、当技術分野において周知である。たとえば、ホールドの変化（ｆｏｌｄ−ｃｈａｎｇｅ）は、試験薬剤（ａ）ｉ））の存在下でのレベルを、試験薬剤（ａ）ｉｉ））の非存在下での対応するレベルで、割ることによって計算することができる。もし、ａ）ｉ）のレベルの、ａ）ｉｉ）のレベルに対する割合が、０．８未満、好ましくは、０．７未満、０．６未満、０．５未満、好適には０．２５未満、より好ましくは、０．１未満、そして、さらにより好ましくは、０．０２のような０．０５未満または、０でさえある場合には、試験薬剤は、本発明によるネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）の阻害剤であると考えられる。
【０１２４】
本発明の阻害剤または本発明の方法の好ましい実施形態において、阻害剤、モジュレーターまたは試験薬剤は、抗体、抗体模倣物（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｉｍｅｔｉｃ）、ドミナント  ネガティブ  タンパク質、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、アプタマー、アンチセンス核酸分子、小分子、またはこれらの阻害剤の改変体（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｖｅｒｓｉｏｎ）、モジュレーターまたは試験薬剤である。
【０１２５】
本明細書で使用される、用語「抗体」は、たとえば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を含む。さらに、まだ依然として結合特異性を保持する、その誘導体もしくは断片も、「抗体」という用語に含まれる。抗体断片または誘導体は、とりわけ、ＦａｂまたはＦａｂ’断片、Ｆｄ、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖまたはｓｃＦｖフラグメント、ＶｈＨまたはＶ−ＮＡＲドメインのような単一ドメインのＶＨまたはＶ様ドメインだけでなく、ミニボディ、ダイアボディ、トリボディまたはトリプルボディ（ｔｒｉｐｌｅｂｏｄｉｅｓ）、テトラボディまたは化学的に結合した（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）Ｆａｂ’−多量体を含む（たとえば、Ａｌｔｓｈｕｌｅｒ  ＥＰ、Ｓｅｒｅｂｒｙａｎａｙａ  ＤＶ、Ｋａｔｒｕｋｈａ  ＡＧ．２０１０年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｍｏｓｃ）．，ｖｏｌ．７５（１３），１５８４；Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  Ｐ、Ｈｕｄｓｏｎ  ＰＪ．、２００５年、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ｖｏｌ．２３（９）、１１２６参照）。「抗体」という用語はまた、キメラ（ヒト定常ドメイン、非ヒト可変ドメイン）、単鎖およびヒト化抗体（非ヒトＣＤＲを除くヒト抗体）のような実施形態を含む。
【０１２６】
抗体の産生のための様々な技術は、当技術分野で周知であり、たとえば、Ａｌｔｓｈｕｌｅｒら、２０１０年（Ａｌｔｓｈｕｌｅｒ  ＥＰ、Ｓｅｒｅｂｒｙａｎａｙａ  ＤＶ、Ｋａｔｒｕｋｈａ  ＡＧ、２０１０年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （Ｍｏｓｃ）．，ｖｏｌ．７５（１３）、１５８４）に記載されている。したがって、ポリクローナル抗体は、添加剤および補助剤の混合物中の抗原による免疫後、動物の血液から得ることができ、そして、モノクローナル抗体は、連続細胞系培養（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ）により産生される抗体を提供する、任意の技術によって製造することができる。
そのような技術の例は、たとえば、Ｈａｒｌｏｗ  ＥおよびＬａｎｅ  Ｄ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８８年；Ｈａｒｌｏｗ  ＥおよびＬａｎｅ  Ｄ、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９９年に開示されており、ＫoｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５年によって最初に開示されたハイブリドーマ技術、トリオーマ技術、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ技術（たとえば、Ｋｏｚｂｏｒ  Ｄ、１９８３年、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、ｖｏｌ．４，７；Ｌｉ  Ｊら、２００６年，ＰＮＡＳ，ｖｏｌ．１０３（１０）、３５５７を参照）およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、１９８５年、Ａｌａｎ  Ｒ．、Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ、７７乃至９６）を含む。
【０１２７】
さらに、組換え抗体は、モノクローナル抗体から得ることができるか、または、ファージ、リボソーム、ｍＲＮＡ、または細胞ディスプレイ（ｃｅｌｌ  ｄｉｓｐｌａｙ）のような種々のディスプレイ方法を使用して、デノボで製造できる。組換え（ヒト化）抗体の発現のための適切なシステムは、たとえば、細菌、酵母、昆虫、哺乳動物細胞株またはトランスジェニック動物若しくは植物から選択することができる（たとえば、米国特許６，０８０，５６０；ホリガーＰ、ハドソンＰＪ、２００５年、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，ｖｏｌ．２３（９）、１１２６５を参照）。さらに、単鎖抗体の製造のために記載された技術（とりわけ、米国特許４，９４６，７７８を参照）は、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）経路のコンポーネントのエピトープに特異的な単鎖抗体を産生するために適合させることができる。ＢＩＡｃｏｒｅシステムで使用されるような表面プラズモン共鳴は、ファージ抗体の効率を増加させるために使用することができる。
【０１２８】
本明細書で使用される、用語「抗体模倣物（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ）」は、抗体のように、特異的に抗原に結合することができ、しかし、構造的に、抗体に関連しない化合物を指す。抗体模倣物は、通常、約３乃至２０キロダルトンのモル質量を有する、人工のペプチドまたはタンパク質である。たとえば、抗体模倣物は、（ブドウ球菌プロテインＡのＺ‐ドメインに基づく）アフィボディ、（ヒトのフィブロネクチンの１０番目のドメインに基づく）アドネクチン、（リポカリンに由来する）アンチカリン、（アンキリン  リピート  タンパク質由来の）ダルピン（ＤＡＲＰｉｎｓ）、（たとえば、多量体化された低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）−Ａに基づく）アビマー（ａｖｉｍｅｒｓ）、（スルホロブス  アシドカルダリウスのＤＮＡ結合タンパク質のＳａｃ７ｄ由来の）ナノフィチン（ｎａｎｏｆｉｔｉｎｓ）、（構造的に、ガンマ−Ｂの結晶またはユビキチン由来の）アフィリン（ａｆｆｉｌｉｎｓ）、（様々なプロテアーゼ阻害剤のクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）ドメインに由来する）クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）  ドメイン  ペプチド、およびヒトＦｙｎ  ＳＨ３ドメインに由来するフィノマー（Ｆｙｎｏｍｅｒｓ）(R)（たとえば、Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉら、（２００７年）  ＪＢＣ、２８２、ｐ．３１９６乃至３２０４；ＷＯ ２００８／０２２７５９；Ｂｅｒｔｓｃｈｉｎｇｅｒら、（２００７年）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２０（２）：５７乃至６８；ＧｅｂａｕｅｒおよびＳｋｅｒｒａ、（２００９年）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １３：２４５乃至２５５；またはＳｃｈｌａｔｔｅｒら、（２０１２年）ＭＡｂｓ  ４：４、１乃至１２を参照）からなる群から選択することができる。
これらのポリペプチドは、当技術分野において周知であり、そして、本明細書で以下にさらに詳細に説明する。
【０１２９】
本明細書で使用される、用語「ＤＡＲＰｉｎ」は、典型的には３回の繰り返しβターンから生じる剛性のインターフェースを提供する、設計されたアンキリン  リピート  ドメイン（ａｎｋｙｒｉｎ  ｒｅｐｅａｔ  ｄｏｍａｉｎ）（１６６残基）を意味する。「ＤＡＲＰｉｎ」は、通常、繰り返しごとに６つの位置がランダム化される、人工的コンセンサス配列に対応する３つの繰返しを有する。その結果、「ＤＡＲＰｉｎ」は、構造的柔軟性（ＧｅｂａｕｅｒおよびＳｋｅｒｒａ、２００９年）を欠く。
【０１３０】
「ナノフィチン（ｎａｎｏｆｉｔｉｎ）」（また、アフィチンとして知られている）は、ＤＮＡ結合タンパク質である、スルフォロブス  アシドカルダリウス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）のＳａｃ７ｄに由来する、抗体模倣タンパク質である。ナノフィチン（Ｎａｎｏｆｉｔｉｎｓ）は、通常、およそ７ｋＤａの分子量を有し、結合する表面上のアミノ酸をランダム化することにより、標的分子に、特異的に結合するように設計されている（Ｍｏｕｒａｔｏｕ  Ｂ、Ｂeｈａｒ  Ｇ、Ｐａｉｌｌａｒｄ−Ｌａｕｒａｎｃｅ  Ｌ、Ｃｏｌｉｎｅｔ  Ｓ、Ｐｅｃｏｒａｒｉ  Ｆ．、（２０１２年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．；８０５：３１５乃至３１）。
【０１３１】
本明細書において使用される、用語「アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）」は、リポカリン（ｌｉｐｏｃａｌｉｎ）に由来する操作されたタンパク質を指す（Ｂｅｓｔｅ  Ｇ、Ｓｃｈｍｉｄｔ  ＦＳ、Ｓｔｉｂｏｒａ  Ｔ，  Ｓｋｅｒｒａ  Ａ．  （１９９９年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９６（５）：１８９８乃至１９０３；ＧｅｂａｕｅｒおよびＳｋｅｒｒａ（２００９年）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １３：２４５乃至２５５）。アンチカリンは、リポカリン間で高度に保存されたコア部を形成し、そして、開放端に４つの構造的に可変なループの手段を用いて、リガンドの結合部位を、自然に形成する、８本鎖のβ−バレル（ｅｉｇｈｔ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  b−ｂａｒｒｅｌ）を有する。アンチカリンは、ＩｇＧのスーパーファミリー（ＩｇＧ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）に相同的ではないが、これまで、抗体の結合部位に典型的であると考えられてきた、次の特徴を示す：
【０１３２】
（i）配列変異の結果として、高い構造可塑性、および
（ii）異なる形状を有するターゲットに誘導適合を可能にする、上昇したコンフォメーションの柔軟性。
【０１３３】
本明細書で使用される、用語「アドネクチン（ａｄｎｅｃｔｉｎ）」（また、「モノボディ」とも呼ばれる）は、２から３の露出したループを有する９４残基のＩｇ様βサンドイッチフォールドを有するが、しかし、中央のジスルフィド架橋を欠く、ヒトフィブロネクチンＩＩＩ（１０Ｆｎ３）の１０番目の細胞外ドメインに基づく（ＧｅｂａｕｅｒおよびＳｋｅｒｒａ、（２００９年）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １３：２４５乃至２５５）。所望の標的特異性を有するアドネクチンは、タンパク質の特定のループに修飾を導入することによって、遺伝子操作することができる。
【０１３４】
本明細書で使用される、用語「アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）」は、ブドウ球菌タンパク質ＡのＺ‐ドメインに由来する、抗体模倣物の１ファミリーを指す。構造的に、アフィボディ分子は、融合タンパク質に組み込むこともできる、３つのヘリックス  バンドル  ドメイン（ｔｈｒｅｅ−ｈｅｌｉｘ  ｂｕｎｄｌｅ  ｄｏｍａｉｎ）に基づく。それ自体では、アフィボディは、おおよそ６ｋＤａの分子量を有し、かつ高温および酸性またはアルカリ性の条件下で安定である。ターゲット特異性は、親タンパク質ドメインの結合活性に関与する、２つのαヘリックスに位置する１３のアミノ酸のランダム化によって得られる（Ｆｅｌｄｗｉｓｃｈ  Ｊ，  Ｔｏｌｍａｃｈｅｖ  Ｖ．；（２０１２年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．８９９：１０３乃至１２６）。
【０１３５】
本明細書で使用される、用語「アフィリン（ａｆｆｉｌｉｎ）」は、足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）として、γ−Ｂ結晶またはユビキチン（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）のいずれかを使用して、そして、ランダム突然変異により、これらのタンパク質の表面上のアミノ酸を改変することによって開発された抗体模倣物（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ）を指す。所望の標的特異性を有する、アフィリン（ａｆｆｉｌｉｎｓ）の選択は、たとえば、ファージ  ディスプレイまたはリボソーム  ディスプレイ技術によって、達成される。足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）に依存して、アフィリン（ａｆｆｉｌｉｎｓ）は、約１０または２０ｋＤａの分子量を有する。本明細書で使用される用語「アフィリン（ａｆｆｉｌｉｎｓ）」は、また、アフィリン（ａｆｆｉｌｉｎｓ）のジまたは多量体化形態を指す（Ｗｅｉｄｌｅ  ＵＨら、（２０１３年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ；１０（４）：１５５乃至１６８）。
【０１３６】
本明細書で使用される、用語「アビマー（ａｖｉｍｅｒ）」とは、様々な膜受容体のＡ−ドメインに由来し、そして、リンカーペプチドによって接続された、それぞれ、３０乃至３５個のアミノ酸の２つ以上のペプチド配列からなる抗体模倣物の１クラスを指す。標的分子の結合は、Ａ‐ドメインを介して起こり、そして、所望の結合特異性を有するドメインは、たとえば、ファージ  ディスプレイ技術によって選択することができる。アビマーに含まれる異なるＡ−ドメインの結合特異性は、同一であってもよいが、同一である必要はない（Ｗｅｉｄｌｅ  ＵＨら、（２０１３年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ；１０（４）：１５５乃至１６８）。
【０１３７】
「クニッツ  ドメイン  ペプチド（Ｋｕｎｉｔｚ  ｄｏｍａｉｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）」は、ウシ膵臓トリプシン阻害剤（ＢＰＴＩ）、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）または組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）のようなクニッツ型プロテアーゼ阻害剤のクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）ドメインに由来する。クニッツ  ドメインは、約６ｋＤＡの分子量を有し、そして、必要な標的特異性を有するドメインは、ファージ  ディスプレイのようなディスプレイ技術によって選択することができる  （Ｗｅｉｄｌｅら、（２０１３年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ；１０（４）：１５５乃至１６８）。  
【０１３８】
本明細書中で使用される用語「Ｆｙｎｏｍｅｒ(R)」は、ヒトのＦｙｎ  ＳＨ３ドメインに由来する、非免疫グロブリン由来の結合ポリペプチドを意味する。ＦｙｎＳＨ３由来のポリペプチドは、当技術分野で周知であり、そして、たとえば、Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉら、（２００７年）ＪＢＣ、２８２、Ｐ３１９６乃至３２０４、ＷＯ  ２００８／０２２７５９号パンフレット、Ｂｅｒｔｓｃｈｉｎｇｅｒら、（２００７年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２０（２）：５７乃至６８、ＧｅｂａｕｅｒおよびＳｋｅｒｒａ（２００９年）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １３：２４５乃至２５５またはＳｃｈｌａｔｔｅｒら、（２０１２年），ＭＡｂｓ  ４：４，１乃至１２）に開示されている。
【０１３９】
本明細書で使用される用語「ドミナント  ネガティブ  タンパク質（ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」は、対応する天然に存在するタンパク質の相互作用のパートナーと相互作用する能力を維持するが、少なくとも、対応する天然に存在するタンパク質のプロ−ネクロトーシス活性を欠く、プロ−ネクロトーシス  タンパク質のバージョンを指す。したがって、ドミナント  ネガティブ  タンパク質は、相互作用のパートナーの、対応する天然に存在するタンパク質と競合するが、プロ−ネクロトーシス活性を欠くタンパク質である。ドミナント  ネガティブ  タンパク質の例は、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）に影響するタンパク質の不活性な変異体である。これは、膜貫通ドメインを欠いているデス    レセプターの可溶性変異体を含む。これらの受容体様タンパク質は、まだ、依然として、天然のリガンドと結合することができ、したがって、膜貫通受容体へのその結合を阻止する。同時に、可溶性受容体は、細胞内にシグナルを伝えることができず、したがって、ネクロトーシスを誘導することはできない。また、膜アンカー（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ａｎｃｈｏｒｅｄ）および可溶性受容体も、それらが天然のリガンドに結合し、細胞内で、シグナルを伝達することができない限り、ドミナント  ネガティブ  タンパク質として作用することができることが理解される。これはまた、細胞外ドメインの切断によって生成された受容体の可溶性形態、同一の内因性リガンドに結合する、１つの受容体または他の受容体の天然に存在する代替の形態、したがって、阻害すべき受容体への結合を阻止するが、阻害すべき受容体に結合することによって、リガンドが誘導する信号を伝達することができない形態を包含する。そのような受容体も、また、デコイ受容体とも呼ばれる。
【０１４０】
本明細書で用いられる、用語「デコイ受容体」もまた、天然に存在する受容体を包含する。好ましくは、ドミナント  ネガティブ  タンパク質は、ネクロソームの特定のコンポーネント、すなわち、他のシグナル伝達経路、特に、アポトーシスの誘導において、必要とされていないネクロソームのコンポーネント、に対応する。それは、たとえば、ＲＩＰＫ１またはＲＩＰＫ３のキナーゼ・デッド（ｋｉｎａｓｅ−ｄｅａｄ）変異体であってもよい。細胞内タンパク質のドミナント  ネガティブ  バージョンの場合には、これらは、ドミナント  ネガティブ  タンパク質をコードする核酸分子の形態で使用されることが好ましい。
【０１４１】
本明細書で使用される、「低分子干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）（ｓｉＲＮＡ）」という用語は、また、短い干渉ＲＮＡまたはサイレンシングＲＮＡとしても知られているが、生物学における様々な役割を果たす、１８乃至３０のクラス、好ましくは１９乃至２５、最も好ましくは、２１乃至２３、またはさらにより好適には、２１塩基長の二本鎖ＲＮＡ分子を指す。最も顕著には、ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡが特定の遺伝子の発現に干渉する、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路に関与する。ＲＮＡｉ経路におけるそれらの役割に加えて、ｓｉＲＮＡは、また、たとえば、抗ウイルス機構として、またはゲノムのクロマチン構造の形成において、のような、ＲＮＡｉの関連経路においても作用する。
【０１４２】
自然界に見られるｓｉＲＮＡは、明確に定義された構造：いずれかの末端に、２塩基３’突出部（２−ｎｔ  ３’ｏｖｅｒｈａｎｇｓ）を有するＲＮＡの短い二本鎖（ｄｓＲＮＡ）、を有する。各々の鎖は、５’リン酸基および３’ヒドロキシル基（−ＯＨ）を有する。この構造は、長いｄｓＲＮＡまたは小ヘアピンＲＮＡのいずれかを、ｓｉＲＮＡに変換する酵素である、ダイサーによる処理の結果である。ｓｉＲＮＡは、また、外因的に（人為的に）、関心対象の遺伝子を、特異的にノックダウンを惹き起すために細胞に導入することができる。本質的に、配列が知られている任意の遺伝子は、したがって、適切に調整されたｓｉＲＮＡとの配列相補性に基づいて、標的化することができる。二本鎖ＲＮＡ分子またはその代謝処理物は、その標的特異的な核酸修飾、特に、ＲＮＡ干渉および／またはＤＮＡのメチル化、を媒介することができる。外因的に導入されたｓｉＲＮＡは、その３’および５’末端に、突出部（ｏｖｅｒｈａｎｇｓ）を欠いてもよいが、しかし、少なくとも１つのＲＮＡ鎖は、５’‐および／または３’−突出部（ｏｖｅｒｈａｎｇｓ）を有することが好ましい。好ましくは、二本鎖の一方の端部は、１乃至５個のヌクレオチド、より好ましくは１乃至３個のヌクレオチド、そして、最も好ましくは、２つのヌクレオチドの、３’−突出部（ｏｖｅｒｈａｎｇｓ）を有する。もう一方の末端は、平滑末端であるか、または６ヌクレオチドまでの３’‐突出部（ｏｖｅｒｈａｎｇｓ）を有する。一般的には、ｓｉＲＮＡとして作用するのに適した任意のＲＮＡ分子が、本発明で想定される。最も効率的なサイレンシングは、これまでに、２塩基の３’‐突出部（ｏｖｅｒｈａｎｇｓ）を有するような方法で対になった、２１塩基のセンスおよび２１塩基のアンチセンス鎖からなる、ｓｉＲＮＡ二本鎖で得られた。２塩基の３’‐突出部（ｏｖｅｒｈａｎｇｓ）の配列は、最初の塩基対に隣接する不対ヌクレオチドに制限された、標的認識の特異性に小さな寄与をする（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１年）。３’−突出部（ｏｖｅｒｈａｎｇｓ）における２’−デオキシヌクレオチドは、リボヌクレオチドと同等に効果的ではあるが、しかし、多くの場合、より安く合成でき、そして、おそらく、よりヌクレアーゼ耐性である。
【０１４３】
ｓｉＲＮＡの送達は、たとえば、生理食塩水とｓｉＲＮＡを組合せ、そして、静脈内または鼻腔内に、その組合せを投与することによって、または、グルコース（たとえば、５％グルコースのような）、または、静脈内（ｉｖ）または腹腔内（ｉｐ）のいずれかで、全身経路を介して、インビボで、ｓｉＲＮＡを送達するために使用することができるカチオン性脂質およびポリマーでｓｉＲＮＡを製剤することにより、当技術分野で公知の方法のいずれかを使用して達成される（Ｆｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓら、（２００８年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，８：２８０乃至２８５；Ｌｕら、（２００８年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．４３７：Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ-Ｃｈａｐｔｅｒ  ３：Ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ  Ｓｍａｌｌ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ  ｆｏｒ  Ｎｏｖｅｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）。
【０１４４】
ｓｉＲＮＡの活性および特異性は、３’および５’末端にブロッキング基を含むことによるような、様々な修飾によって変更することができる。ここで、「ブロッキング基（ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）」という用語は、オリゴヌクレオチドまたはヌクレオモノマーに、合成のための保護基またはカップリング基のいずれかとして、細胞への取り込みを促進するために、コンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ）または錯化剤（ｃｏｍｐｌｅｘｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）に接着、またはそれをカプセル化し、または標的送達のために標的部分に接着する、挿入剤（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）（たとえば、アクリジン、クロラムブシル、フェナジニウム、ベンゾフェナンスリジン（ｂｅｎｚｏｐｈｅｎａｎｔｈｉｒｄｉｎｅ））のような標的配列への親和性を増強する薬剤を含ませることによって、オリゴヌクレオチドまたはヌクレオモノマーに接着することができる置換基を指す（ＷＯ  ９８／１３５２６、ＥＰ  ２２２１３７７  Ｂ１参照）。
【０１４５】
ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉を介して、遺伝子発現をサイレンシングするために使用することができるタイトなヘアピンターンを作るＲＮＡの配列である。実験的に、ｓｈＲＮＡは、細胞内に導入されたベクターを使用し、そして、ｓｈＲＮＡが発現されることを保証するために、Ｕ６プロモーターを利用する。このベクターは、通常、遺伝子サイレンシングの継承を可能にする、娘細胞に渡される。ｓｈＲＮＡのヘアピン構造は、その後、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に結合された、ｓｉＲＮＡの中で、細胞機構によって切断される。この複合体は、それに結合されたｓｉＲＮＡと一致するｍＲＮＡに結合し、そして、切断する。
【０１４６】
本発明に使用される、ｓｉ／ｓｈＲＮＡは、好ましくは、適切に保護されたリボヌクレオシド  ホスホルアミダイトおよび従来のＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを用いて、化学的に合成される。ＲＮＡ合成試薬の供給業者は、プロリゴ社（Ｐｒｏｌｉｇｏ）（ハンブルク、ドイツ）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎリサーチ社（ラファイエット、コロラド、ＵＳＡ）、ピアース  ケミカル社（ペルビオ  サイエンス社の一部、ロックフォード、米国イリノイ）、グレン・リサーチ社（スターリング、米国バージニア）、ケムジーンズ（アッシュランド、米国マサチューセッツ）およびＣｒｕａｃｈｅｍ社（英国グラスゴー）である。最も好ましくは、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、異なる品質とコストのＲＮＡ合成製品を販売する、商業的なＲＮＡオリゴ合成供給業者から入手できる。一般に、本発明で適用可能なＲＮＡは、従来から合成され、そして、容易にＲＮＡｉに適した品質で提供される。
【０１４７】
ＲＮＡｉに影響する、さらなる分子は、たとえば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む。前記ＲＮＡ種は、内因性のＲＮＡ分子として、遺伝子発現を調節する、一本鎖ＲＮＡ分子である。相補的なｍＲＮＡ転写物への結合は、ＲＮＡ干渉と同様のプロセスを介して、前記ｍＲＮＡ転写物の分解を誘発する。
【０１４８】
（リボ核酸酵素に由来し、ＲＮＡ酵素または触媒ＲＮＡとも呼ばれる、）リボザイムは、化学反応を触媒するＲＮＡ分子である。多くの天然リボザイムは、自分の切断または他のＲＮＡの切断のいずれかを触媒するが、それらはまた、リボソームのアミノトランスフェラーゼ活性を触媒することもまた、見出されている。十分に特徴付けられた、小さな自己切断のＲＮＡの非限定的な例は、ハンマーヘッド、ヘアピン、デルタ肝炎ウイルス、およびインビトロで選択された鉛依存性リボザイム（ｌｅａｄ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ）であり、そのグループＩイントロンは、より大きなリボザイムのための一例である。触媒的自己切断の原理は、当技術分野で確立されている。ハンマーヘッド  リボザイムは、リボザイム活性を有するＲＮＡ分子の中で、最も良く特徴付けられている。ハンマーヘッド構造は、異種ＲＮＡ配列に統合することができ、そして、リボザイム活性は、それによって、これらの分子に移動することができることが示されたので、標的配列が、潜在的にマッチング切断部位を含む限り、ほとんどすべての標的配列のための触媒的アンチセンス配列を作成することができると思われる、ハンマーヘッド  リボザイムの構築の基本原理は次のとおりである。
【０１４９】
ＧＵＣ（またはＣＵＣ）トリプレットを含むＲＮＡの興味深い領域が選択される。２つのオリゴヌクレオチド鎖（それぞれ、通常、６乃至８個のヌクレオチドを有する）は取得され、そして、触媒的ハンマーヘッド配列は、それらの間に挿入される。このタイプの分子は、多数の標的配列のために合成された。それらは、インビトロおよび、いくらかの場合には、また、インビボで、触媒活性を示した。最良の結果は、通常、短いリボザイムおよび標的配列を用いて得られる。
【０１５０】
アプタマーは、特定の標的分子に結合する、核酸分子またはペプチド分子である。アプタマーは、通常、大きなランダム配列プールからそれらを選択して作成されるが、天然アプタマーも、また、リボスイッチ（ｒｉｂｏｓｗｉｔｃｈｅｓ）に存在する。アプタマーは、高分子薬物として、基礎研究や臨床目的の両方に使用することができる。アプタマーは、それらの標的分子の存在下で、自己切断するリボザイムと組み合わせることができる。これらの化合物分子は、追加の、研究、産業および臨床の応用を有する（Ｏｓｂｏｒｎｅら、（１９９７年）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１：５乃至９；ＳｔｕｌｌおよびＳｚｏｋａ（１９９５年）、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１２、４：４６５乃至４８３）。
【０１５１】
より特異的には、アプタマーは、ＤＮＡ若しくはＲＮＡアプタマーのような核酸アプタマー、またはペプチドアプタマーとして分類することができる。前者は、通常、オリゴヌクレオチドの（通常は短い）の鎖から構成され、一方、後者は、好ましくは、タンパク質の足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）の両端に取り付けられた、短い可変ペプチドドメインからなる。
【０１５２】
核酸アプタマーは、原則として、小分子、タンパク質、核酸、および、さらには細胞、組織および生物自体でさえも含む様々な分子標的に結合するように、インビトロでの選択または同等なＳＥＬＥＸ（指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ））の繰り返しラウンドを通して操作された核酸種である。
【０１５３】
ペプチド  アプタマーは、通常、細胞内の他のタンパク質相互作用を妨害するように設計されたペプチドまたはタンパク質である。それらは、タンパク質の足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）の両端に取り付けられた可変ペプチド  ループからなる。この二重構造的な制約が、大きく、抗体の（ナノモル範囲）に匹敵するレベルへと、ペプチド  アプタマーの結合親和性を増大させる。可変ペプチド  ループは、典型的には、１０乃至２０個のアミノ酸を含み、そして、足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）は、良好な溶解特性を有する任意のタンパク質であってもよい。現在、細菌タンパク質のチオレドキシン−Ａは、最も一般的に使用される足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）タンパク質であって、野生型タンパク質において、−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ループである、酸化還元活性部位内に挿入される可変ペプチド  ループであって、側鎖の二つのシステインは、ジスルフィド架橋を形成することができる。ペプチド  アプタマーの選択は、異なるシステムを用いて作製することができるが、最も広く使用されているものは、現在、酵母ツーハイブリッド  システム（ｙｅａｓｔ  ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ）である。
【０１５４】
アプタマーは、一般的に使用される生体分子、特に抗体、に匹敵する分子認識特性を提供するので、生物工学および治療用途のためのユーティリティを提供する。それらの区別認識に加えて、アプタマーは、それらは試験管内で完全に操作することができ、容易に化学合成によって産生され、望ましい貯蔵特性を有し、そして、治療用途においてほとんどまたは全く免疫原性を誘発しないので、抗体を上回る利点を提供する。非修飾アプタマーは、アプタマーは本質的に低分子量であることの結果、主として、ヌクレアーゼ分解および腎臓によって体内からクリアランスされるため、およびに、数分乃至数時間の半減期で、血流から急速に消失する。未修飾アプタマーの用途は、現在、血液凝固などの一過的状態の治療、または局所的送達が可能である眼などの臓器の治療に焦点を当てている。この急速なクリアランスは、インビボでの画像診断などの用途で有利である。２’−フッ素置換ピリミジン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）結合、アルブミンまたは他の半減期延長タンパク質などとの融合などのいくつかの修飾は、アプタマーの半減期を数日または数週間さえも増加させることができるように利用可能である。
【０１５５】
また有用なのは、小さな化合物を認識するアプタマーと、ハンマーヘッド型リボザイムとの組み合わせである。標的分子に結合することによって、そのアプタマーに誘導されるコンホメーション変化は、リボザイムの触媒機能を調節すると考えられる。
【０１５６】
本明細書で使用する用語「アンチセンス核酸分子（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」とは、標的核酸に相補的である核酸を指す。アンチセンス分子は、標的核酸と相互作用することができ、より特異的には、標的核酸とハイブリダイズすることが可能である、ハイブリッドの形成のため、標的遺伝子の転写および／または標的ｍＲＮＡの翻訳は、低下または遮断される。アンチセンス技術に関連する標準的な方法は、記載されている（たとえば、Ｍｅｌａｎｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９１）５１：２８９７乃至２９０１参照）。
【０１５７】
本明細書で使用される「小分子（ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」は、たとえば、有機小分子であってもよい。有機小分子は、炭素原子が炭素−炭素結合によって一緒に連結された炭素単位を有する化合物のクラスに関係するか、または属する。「有機（ｏｒｇａｎｉｃ）」という用語の本来の定義は、化合物の起源に関し、有機化合物は、植物または動物または微生物源から得られる炭素含有の化合物である有機化合物であり、一方、無機化合物は、鉱物源から得られたものである。有機化合物は、天然または合成であり得る。また、「小分子」は、無機化合物であってもよい。無機化合物は、鉱物源に由来し、そして、炭素原子のない（二酸化炭素、一酸化炭素、および炭酸塩を除く）、全ての化合物を含む。好ましくは、小分子は、約２０００原子質量単位未満、または、約５００原子質量単位未満のような約１０００原子質量単位未満、そしてさらに好ましくは、約２５０原子質量単位未満の分子量を有する。小分子の大きさは、当技術分野で周知の方法、たとえば、質量分析法により決定することができる。小分子は、たとえば、標的分子の結晶構造に基づいて、設計されることができ、生物学的活性を、おそらく担うその部位を同定することができ、そして、インビボのハイスループット  スクリーニング（ＨＴＳ）アッセイのような、インビボのアッセイにおいて、確認することができる。
【０１５８】
本明細書で使用される用語「これらの阻害剤の修飾されたバージョン（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｖｅｒｓｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）」は、たとえば、リード化合物に関連して、上記のように本明細書に記載の方法によって、最適化された阻害剤のバージョンを意味する。
【０１５９】
本発明の方法のさらに好ましい実施形態では、被験体または内皮細胞は、哺乳動物である。
【０１６０】
また、本発明の阻害剤または本発明の方法についての、別の好ましい実施態様において、阻害剤は、ネクロソームの形成および／またはネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）誘導活性を阻止し、または当該モジュレーターは、ネクロソームの形成および／またはネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）誘導活性を調節する。
【０１６１】
本明細書で用いられる用語「ネクロソームの形成（ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｅｃｒｏｓｏｍｅ）」は、ＲＩＰＫ１、ＲＩＰＫ３の複合体へのアセンブリ、ＭＬＫＬの動員、そして、必要に応じて、ＴＲＡＤＤ、ＦＡＤＤ、カスパーゼ８、および／またはＰＧＡＭ５のような追加のコンポーネントを含む、多タンパク質複合体への更なるアセンブリを指す。したがって、ネクロソーム（ｎｅｃｒｏｓｏｍｅ）の形成を阻止する阻害剤は、ネクロソーム（ｎｅｃｒｏｓｏｍｅ）内のその結合パートナーと、ネクロソーム（ｎｅｃｒｏｓｏｍｅ）のコンポーネントの少なくとも１つとの相互作用を妨害する。好ましくは、阻害剤は、コア複合体のコンポーネント間、すなわち、ＲＩＰＫ１とＲＩＰＫ３の間、の相互作用を低減または無効にする。この点で、たとえば、そのＲＨＩＭがそれぞれ他のキナーゼに結合するために、模倣するキナーゼと競合する、ＲＩＰＫ１またはＲＩＰＫ３のＲＨＩＭドメインを模倣するペプチドが想定される。また、阻害剤は、たとえば、競合的阻害剤として、再び、作用することにより、ＭＬＫＬが、ＲＩＰＫ３と結合することを阻止することができる。
【０１６２】
ネクロソームの形成を調節するモデュレーターは、阻害剤として、またはエンハンサーのいずれかとして作用することができる。後者の場合、モデュレーターは、、ネクロソーム（ｎｅｃｒｏｓｏｍｅ）のコンポーネントの少なくとも１つの、好ましくはコアのコンポーネントの一つの、ネクロソーム（ｎｅｃｒｏｓｏｍｅ）内のその結合パートナーとの相互作用を高めることができるか、または、そのネクロソーム（ｎｅｃｒｏｓｏｍｅ）の全体的な安定性を高めることができる。本明細書で上述したように、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）および／または腫瘍細胞の遊出（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｅ）を活性化することは、研究目的のために有用であり得る。したがって、モデュレーターが増強する、たとえば、ネクロソームの安定性は、たとえば、（特に強力な）ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）阻害剤の同定のためのアッセイにおいて使用することができる。
【０１６３】
本明細書で使用される用語「ネクロソームのネクロトーシス誘導活性（ｔｈｅ  ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｅｃｒｏｓｏｍｅ）」とは、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）のエフェクター機構に関与するネクロソームの能力、すなわち、最終的に細胞死をもたらす下流の事象を誘導する能力を指す。この能力は、たとえば、ＲＩＰＫ１とＲＩＰＫ３のキナーゼ活性に依存するような、たとえば、ネクロソームのコンポーネントの活性に依存する。また、ＲＩＰＫ３による、ＭＬＫＬのリン酸化（Ｓｕｎら、２０１３年；Ｃｅｌｌ  １４８、２１３乃至２２７；Ｗａｎｇら、２０１４年；Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．５４、１３３乃至１４６）および、そのＮ末端の４ヘリックスバンドル（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｆｏｕｒ  ｈｅｌｉｘ  ｂｕｎｄｌｅ）を介して多量体化し、そして、そのヘリックスバンドル内の正に荷電した残基を介してホスホイノシトールリン酸（ＰＩＰ）との相互作用をする、ＭＬＫＬの能力は、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）のために必要であることが記載されている（Ｄｏｎｄｅｌｉｎｇｅｒら、（２０１４年）Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ７、９７１乃至９８１）。
【０１６４】
ネクロソームのネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）誘導活性を阻止する阻害剤は、したがって、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）のエフェクター機構に関与することに影響または寄与する、ネクロソームのコンポーネントのうちの１つの活性を妨害する阻害剤であってよい。好ましくは、当該阻害剤により阻止された活性は、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）のために、特異的に必要な活性であるが、他のシグナル伝達経路のためには必要でない活性である。もし、モジュレーターが、阻害剤として作用する場合には、阻害剤に関する上記の考察は、モジュレーターに関しても同様に適用される。他方、もし、モジュレーターがエンハンサーとして作用するのであれば、直接的（たとえば、有利なおよび／またはそのコンポーネントの活性なコンホメーションを好適化および／または安定化することによって）、または間接的（たとえば、そうでなければ、そのコンポーネントの活性を低下させるであろう修飾のような、事象を減少させることによって）のいずれかによって、少なくとも１つのネクロソームのコンポーネントの酵素活性を増大させることができる。
【０１６５】
本発明の阻害剤または本発明の方法の別の好ましい実施態様において、前記阻害剤または前記モジュレーターは、タンパク質１と相互作用する受容体（ＲＩＰＫ１）の阻害剤、タンパク質３と相互作用する受容体（ＲＩＰＫ３）の阻害剤、ＭＬＫＬ（ｍｉｘｅｄ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｌｉｋｅ）の阻害剤またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【０１６６】
本発明の阻害剤または本発明の方法の、さらなる好ましい実施形態において、前記阻害剤または前記モジュレーターは、ＲＩＰＫ３の阻害剤である。
【０１６７】
本発明の阻害剤または本発明の方法の、さらに別の好ましい実施形態では、前記阻害剤または前記モジュレーターは、以下からなる群から選択される。ネクロスタチン−１（ＮＥＣ−１；５−（１Ｈ−インドール−３−イルメチル）−３−メチル−２−チオキソ−４−イミダゾリジノン、５−（インドール−３−イルメチル）−３−メチル−２−チオヒダントイン）、ネクロスタチン−１安定（５−（（７−クロロ−１Ｈ−インドール−３−イル）メチル）−３−メチル−２，４−イミダゾリジンジオン、５−（（７−クロロ−１Ｈ−インドール−３−イル）メチル）−３−メチルイミダゾリジンジオン−２，４−ジオン）、ネクロスタチン−１不活性（５−（（１Ｈ−インドール−３−イル）メチル）−２−チオキソイミダゾリジン−４−オン）、ネクロスルホナミド（ＮＳＡ；（Ｅ）−Ｎ−（４−（Ｎ−（３−メトキシピラジン−２−イル）スルファモイル）フェニル）−３−（５−ニトロチオフェン−２−イル）アクリルアミド）、抗ＲＩＰＫ３  ｓｉＲＮＡ、アンチＭＬＫＬ  ｓｉＲＮＡまたはそれらの組み合わせ。
【０１６８】
内皮を通る転移性の腫瘍細胞の遊出（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｅ）を調節する方法の別の好ましい実施形態において、前記モジュレーターは、ＴＧＦ−β活性化キナーゼ１（ＴＡＫ１）の阻害剤である。
【０１６９】
本明細書で使用する用語「ＴＡＫ１」は、ＴＧＦ−β活性化キナーゼ１（また、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ７（ＭＡＰ３Ｋ７）としても知られている）−転写制御およびアポトーシスを含む細胞の様々な機能を制御する、セリン／スレオニン  タンパク質  キナーゼ  ファミリーのメンバー−を指す。さらに、ＴＡＫ１の欠如または阻害は、内皮細胞において増大したネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）を齎すということが知られていた（Ｍｏｒｉｏｋａら、２０１２年）。重要なことは、本明細書の以下の実施例４に示すように、ｓｉＲＮＡを用いて、ＴＡＫ１がサイレンシングされた内皮細胞は、腫瘍細胞で刺激されると、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）の増加を示した。さらに、内皮細胞において、特異的に、ＴＡＫ１を欠くマウスも、また、増加した腫瘍転移と平行して、内皮細胞における増加したネクロトーシス性細胞死を示した。ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）関連分子である、ＲＩＰＫ３が、さらに削除された動物は、転移形成の低下を示した。
【０１７０】
したがって、ＴＡＫ１阻害剤は、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）を増加させるために使用することができる。ＴＡＫ１阻害剤は、本明細書中の前記のクラスのいずれかから選択することができる。好ましくは、ＴＡＫ１阻害剤は、ＴＡＫ１の発現を阻害する。たとえば、ＴＡＫ１阻害剤は、ＴＡＫ１に特異的なｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡであってもよい。ＴＡＫ１阻害剤は、したがって、本発明による、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）のアクチベーター／エンハンサーである。
【０１７１】
本発明の阻害剤または本発明の方法のさらに好ましい実施態様において、前記阻害剤または前記モジュレーターは、デス  レセプター６（ＤＲ６）の阻害剤である。
【０１７２】
本明細書で使用される用語「ＤＲ６」は、デス  レセプター６を指し、また、ＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーである、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー２１（ＴＮＦＲＳＦ２１）としても知られている。ＤＲ６は、オーファン受容体であると考えられたが、最近では、アミロイド前駆体タンパク質（Ｎ−ＡＰＰ）のＮ末端は、ニューロンにおいて細胞死を誘導するＤＲ６のリガンドであることが、ニューロンで見出された（Ｎｉｋｏｌａｅｖら、２００９年、Ｎａｔｕｒｅ、４５７（７２３２）：９８１乃至９８９）。以下の図６に示すように、ＤＲ６またはＤＲ６−Ｆｃ融合タンパク質に特異的なｓｉＲＮＡは、それぞれ、腫瘍細胞と腫瘍細胞の遊出（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｅ）によって誘導された内皮ネクロトーシス性細胞死を減少させる。したがって、ＤＲ６の阻害剤は、内皮細胞におけるネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）および転移性腫瘍細胞の遊出（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｅ）を阻止するために使用することができる。
【０１７３】
ＤＲ６の阻害剤は、本明細書で上述した阻害剤クラスのいずれかから選択することができる。特に、ＤＲ６の阻害剤は、受容体の発現を阻止することができ、原形質膜へのそのシャトリング（ｓｈｕｔｔｌｉｎｇ）を妨害し得、または、そのリガンドへの結合を阻止し（たとえば、利用可能なリガンドの数を減少させることを介して；これは、たとえば、腫瘍細胞におけるリガンドＡＰＰに対するｓｉＲＮＡを介して、達成することができる。図１０乃至１２参照）、または、刺激依存性の細胞内コンポーネントへの結合を妨害し、したがって、細胞死の活性化を齎すさらなる下流の標的の活性化を妨害することができる。好ましくは、前記ＤＲ６の阻害剤は、ＤＲ６またはＤＲに対するリガンドの結合を阻止するタンパク質に特異的なｓｉＲＮＡである。たとえば、デコイ受容体、ＤＲ６に対するアンタゴニスト抗体、または、受容体の細胞外部分と抗体のＦｃ部分を含む融合タンパク質（ＤＲ６−Ｆｃタンパク質）のような受容体の可溶性形態は、阻害剤として使用できる（また、図６Ｄと６Ｅ、８および９を参照）。ＤＲ６に特異的なｓｉＲＮＡは、当技術分野で公知であり、そして、たとえば、シグマ社またはキアゲン社から、取得することができる。ＤＲ６−Ｆｃ融合タンパク質もまた、当技術分野で知られており、たとえば、Ｒ＆Ｄシステム社から、商業的に入手できる。
【０１７４】
さらに、本発明の阻害剤の別の好ましい実施形態において、腫瘍の転移の阻止に使用するための阻害剤は、さらなる薬学的活性薬剤と混合しているか、または、さらなる薬学的活性薬剤と別の容器に入れられる。
【０１７５】
想定されるのは、たとえば、本発明の阻害剤と抗腫瘍剤との組み合わせである。抗腫瘍剤は、化学療法で使用され、当技術分野で知られており、たとえば、腫瘍細胞を死滅させるまたはそれらの増殖を阻害する抗腫瘍薬を含む。抗腫瘍剤は、それらの作用または起源によって分類することができ、そして、たとえば、アルキル化剤、代謝拮抗物質、植物アルカロイドおよびテルペノイド、トポイソメラーゼ阻害剤および細胞傷害性抗体を含む。
【０１７６】
アルキル化剤の例としては、たとえば、ナイトロジェンマスタード（メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル）、メチルヒドラジン誘導体（プロカルバジン（Ｎ−メチルヒドラジン、ＭＩＨ））、アルキルスルホネート（ブスルファン）、ニトロソウレア（カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ストレプトゾシン（ストレプトゾトシン、ベンダムスチン）、トリアゼン（ダカルバジン（ＤＴＩＣ、ジメチルトリアゼノイミダゾール  カルボキサミド）、テモゾロミド）、白金配位錯体（シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン）を含む。
代表的な代謝拮抗剤は、たとえば、葉酸類似体（メトトレキサート（アメトプテリン）、ペメトレキセド）、ピリミジン類縁体（フルオロウラシル（５−フルオロウラシル；５−ＦＵ）、カペシタビン、シタラビン（シトシン  アラビノシド）、ゲムシタビン、５−アザ−シチジン、デオキシ−５−アザシチジン、プリン類縁体および関連阻害剤（メルカプトプリン（６−メルカプトプリン；６−ＭＰ）、ペントスタチン（２’−デオキシコホルマイシン）、フルダラビン、クロファラビン、ネララビン）を含む。代表的な天然物の例、（たとえば、植物アルカロイドおよびテルペノイド）は、たとえば、ビンカアルカロイド（ビノブラスチン、ビノレルビン、ビンクリスチン）、タキサン（パクリタキセル、ドセタキセル）、エピポドフィロトキシン（エトポシド、テニポシド）、カンプトテシン（トポテカン、イリノテカン）、抗生物質（ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン（ダウノマイシン、ルビドマイシン）、ドキソルビシン）、エキノカンジン（ヨンデリス）、アントラセンジオン（ミトザントロン、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ）、酵素（Ｌ−アスパラギナーゼ）を含む。ホルモンおよびアンタゴニストの例は、たとえば、副腎皮質抑制剤（ミトタン（ｏ．ｐ’−ＤＤＤ））、副腎皮質ステロイド（プレドニゾン（他の同等の製剤入手可能））、プロゲスチン（カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストール）、エストロゲン（ジエチルスチルベストロール、エチニル、エストラジオール（利用可能な他の製剤）、抗エストロゲン（タモキシフェン、トレミフェン）、アロマターゼ阻害薬（アナストロゾール、レトロゾール、エキセメスタン）、アンドロゲン（プロピオン酸テストステロン、フルオキシメステロン（他の製剤入手可能））、抗アンドロゲン（フルタミド、カソデックス）、ＧｎＲＨ類縁体（ロイプロリド）を含む。さらなる抗腫瘍剤の例としては、たとえば、置換尿素（ヒドロキシ尿素）、分化剤（トレチノイン、三酸化ヒ素、ヒストン脱アセチル化酵素、阻害剤（ボリノスタット））、タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤（イマチニブ、ダサチニブ、ニロチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、ラパチニブ）、プロテアソーム阻害剤（ボルテゾミブ）、生物学的応答調節剤（インターフェロンアルファ、インターロイキン−２）、免疫調節剤（サリドマイド、レナリドマイド）、ｍＴＯＲ阻害剤（テムシロリムス、エベロリムス）およびモノクローナル抗体を含む。
【０１７７】
また、想定されるのは、他の転移阻止剤を有する、本発明の阻害剤の組み合わせである。このような組み合わせの例としては、Ｇ．Ｙ．Ｐｅｒｒｅｔ、Ｍ．Ｃｒeｐｉｎ、Ｆｕｎｄａｍ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２２，４６５乃至４９２（２００８年）で見ることができる。本明細書で定義された活性薬剤と阻害剤の組み合わせの適切な治療計画は、後者が、混合されるか、または、さらなる薬学的に活性な薬剤が、容器内に別々に提供される場合には、ルーティンの方法により決定することができる。容器は、たとえば、バイアルの形をとることができる。当該バイアルは、薬学的に活性な薬剤に加えて、保存のための防腐剤または緩衝剤、維持および保存のためのメディアを含んでもよい。薬学的に活性な薬剤は、さらに、薬学的組成物に含まれてもよい。用語「医薬組成物」に関する、本明細書の上記の定義は、この実施形態にも、準用される。
【０１７８】
本明細書において上記で定義されたように、本実施形態は、すなわち転移することが知られているまたは転移すると推測される、腫瘍に罹患した被験体の疾患管理において、より完全な臨床的アプローチを提供するのに適切であることが理解されよう。
【０１７９】
さらに、本発明は、以下の工程を含む、ネクロトーシス性および壊死細胞を同定する方法に関する：
ａ）原形質膜の破壊のためのマーカーと細胞を接触させる工程；
ｂ）クロマチン凝縮および／またはクロマチン断片化のためのマーカーと、前記細胞を接触させる工程；および
ｃ）原形質膜の破壊およびクロマチン凝縮および／またはクロマチン断片化が起こるかどうかを決定する工程。もし、アポトーシス細胞で生じるように、原形質膜の破壊が、クロマチン凝縮および／またはクロマチン断片化の非存在下に、工程ｃ）において判定された場合、それは、前記細胞が、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）または壊死であることの指標である。
【０１８０】
用語「ネクロトーシス性および壊死細胞」は、それぞれ、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）および壊死によって、死亡したか、または、死につつある細胞を指す。
【０１８１】
特に、本発明の方法にしたがって、ネクロトーシス性／壊死細胞は、一方で、生細胞と区別され、そして、他方、死の他のタイプによって、死亡したか、死につつある細胞、特に、アポトーシス細胞から区別される。
【０１８２】
本明細書で使用される「原形質膜破壊のマーカーと、細胞を接触させる（ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｂｒｅａｋｄｏｗｎ）」という用語は、マーカー、すなわち、原形質膜の透過化を示すのに適した物質と、細胞との相互作用が起こるように、近接させ、および、そのような状態の下に、細胞とマーカーを運ぶことを指す。特に、前記状態は、もし、原形質膜が透過可能化された場合、そのマーカーは、細胞に入ることができ、しかし、原形質膜が無傷である場合には、細胞から排除されるようなものである。これは、この状態が、原形質膜の透過化を引き起こさないことが必要である。原形質膜の完全性に影響を与える条件は、当技術分野で周知であり、そして、たとえば、温度、酸素濃度、ｐＨ、培地の塩濃度および界面活性剤の存在を含む。
【０１８３】
本明細書で用いられる用語「原形質膜の破壊のためのマーカー（ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｂｒｅａｋｄｏｗｎ）」は、細胞の原形質膜が、もはや完全に無傷ではない、すなわち、細胞の外側からその内部への化合物の通過が、もはや効果的に調節されていない、ことを示す物質を指す。たとえば、マーカーは、膜が無傷である限り、原形質膜を通過することはできない物質、すなわち、膜不透過性物質であってもよい。好ましくは、当該マーカーは、マーカーの位置、すなわち、マーカーが細胞の内または外に配置されているか否か、が、容易に決定することができるように、その便利な検出を可能にするような態様で設計される。たとえば、マーカーは、それ自体が染料であってもよく、または標識されていてもよい。適切な標識は、当技術分野で周知である。好ましくは、当該マーカーは、蛍光染料であるか、または蛍光標識を有する。原形質膜破壊のマーカーは、膜不透過性のＤＮＡ結合蛍光染料であることが、さらに好ましい。
【０１８４】
最も好ましくは、原形質膜破壊のマーカーは、エチジウム  ホモダイマーＩＩＩ（ＥｔＤＩＩＩ）である。
【０１８５】
用語「クロマチン凝縮および／またはクロマチン断片化のためのマーカー（ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ  ａｎｄ／ｏｒ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）」は、異なるクロマチンの状態間の区別を可能にする物質を指す。たとえば、当該マーカーは、染色された領域のパターンが、クロマチンが、凝縮および／または断片化されているか否かの指標になるように、クロマチンを染色するか、または、マーカーが、クロマチンの状態のいずれか１つの場合、たとえば、凝縮および／または断片化の状態にのみ結合することができるか、のいずれかである。後者の場合には、染色の存在は、クロマチンが凝縮および／または断片化されていることの指標となる。
【０１８６】
クロマチンを染色することができるようにするために、前記物質は、細胞内、特に、核内に入ることができる必要がある。したがって、クロマチン凝縮および／またはクロマチン断片化のためのマーカーは、好ましくは、膜透過性物質である。簡単に検出するためには、クロマチン凝縮および／またはクロマチン断片化のマーカーが、染料自体であるか、または標識化されることが好ましい。好ましくは、マーカーは、蛍光性であるか、蛍光標識を有する。さらに、クロマチン凝縮および／またはクロマチン断片化のためのマーカーは、膜透過性のＤＮＡ結合染料であることが好ましい。さらに、マーカーは、それらの自然な状態で、細胞を染色するのに適していること、すなわち、非固定細胞に使用することができることが好ましい。最も好ましくは、クロマチン凝縮および／またはクロマチン断片化のためのマーカーは、ヘキスト３３３４２である。
【０１８７】
さらに、クロマチン凝縮および／またはクロマチン断片化のためのマーカーは、検出されたときに、原形質膜の破壊のマーカーと区別することができることが好ましい。たとえば、二つのマーカーは、異なる波長で蛍光を発することができ、したがって、それらの区別を可能にする。
【０１８８】
細胞を、原形質膜破壊のマーカーと接触させる工程（工程ａ））は、前記細胞を、クロマチン凝縮および／またはクロマチン断片（工程ｂ））のマーカーと接触する、前、後、または、同時に行ってもよい。原形質膜破壊が発生したか否かを判断する工程（工程ｃ））は、原形質膜の破壊のマーカーが追加された後に行われる。すなわち、工程ａ）の後、そして、クロマチン凝縮および／またはクロマチン断片化が起こったか否かを判断する工程（工程Ｃ））は、上記細胞が、クロマチン凝縮および／またはクロマチン断片化のためのマーカーと接触させた後に行われる（工程ｂ））。好ましくは、工程ｃ）は、工程ａ）およびｂ）の後に行われる。もし、原形質膜の破壊が発生した場合、すなわち、もし、原形質膜の破壊のためのマーカーとの陽性染色が観察された場合、そして、もし、同時に、アポトーシス細胞において生じるような、いかなるクロマチン凝縮および／またはクロマチン断片化も発生していない場合、すなわち、もし、クロマチン断片化の染色指標がなく、および／またはクロマチン凝縮の染色指標が、アポトーシス細胞におけるこのような染色と比較して、存在しないか、または弱い場合には、当該細胞は、ネクロトーシス性／壊死であると考えられる（更なる詳細は、一般的に参照できる、実施例１の「細胞死の解析」のセクションを参照してください）。また、工程ｃ）は、光学顕微鏡によって行われることが、好ましい。
【０１８９】
原形質膜の完全性の喪失、すなわち、原形質膜の破壊のためのマーカーでの陽性染色は、細胞が死んでいるまたは瀕死のプロセスにあることを示す。しかし、このような染色は、区別すべき後期のアポトーシスおよびネクロトーシス性／壊死細胞については、役に立たない。他方、この特徴は、ネクロトーシス性／壊死細胞には存在しないのに対し、アポトーシスは、多くの場合、クロマチン断片化が付随する。さらに、ネクロトーシス性／壊死中のクロマチン凝縮の程度は、もしあっても、非常に緩やかである。通常、アポトーシスには、本当の（非常により強い）凝縮がある一方、ネクロトーシス性／壊死には、弱い凝縮としても解釈することができる、核の僅かな「縮み」がある。この凝縮は、追加の断片化の不在下でも、また、アポトーシスのマーカーである。したがって、原形質膜の破壊、クロマチン断片化の有無およびクロマチン凝縮の程度の組み合わせは、アポトーシスおよびネクロトーシス性／壊死細胞死の間の識別を可能にする。クロマチン断片化および／またはクロマチン凝縮の非存在下に、アポトーシス細胞において生じるような、原形質膜の破壊の存在は、ネクロトーシス性細胞の指標である。
【０１９０】
本明細書で使用する「アポトーシスにおいて生じるようなクロマチン凝縮および／またはクロマチン断片化の非存在下で（ｉｎ  ｔｈｅ  ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ  ａｎｄ／ｏｒ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｓ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  ｉｎ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）」という用語は、クロマチン断片化が存在しないことを示し、そして、アポトーシス細胞で観察されるクロマチンの凝縮と比較して、クロマチン凝縮は、もしあっても、弱いことことを示す。好ましくは、全くクロマチン断片化が存在せず、そして、
（i）クロマチン凝縮がないこと、または
（ii）存在するクロマチン凝縮が、アポトーシス細胞におけるクロマチン凝縮と比較して、顕著に低減されている。基準として使用されるアポトーシス細胞におけるクロマチン凝縮は、特定のアポトーシス細胞におけるクロマチン凝縮である必要はないことが理解される。その代わりに、一般に、アポトーシス細胞で観察されるクロマチン凝縮の平均量を基準として用いてもよい。一般に、与えられたセル内のクロマチン凝縮または断片化の程度が、アポトーシス細胞の典型的なものであるかどうかを決定する方法は、当該技術分野において知られている。特に、原形質膜破壊のマーカーと組み合わせると、細胞は、当該技術分野の知識に基づいて、更なる面倒もなく、分類することができる。
【０１９１】
この方法は、たとえば、９６ウェル、３８４ウェルまたは１５３６ウェル形式で、アッセイを行うことによって、そして、それぞれの形態学的基準の自動化された画像取得と半自動画像解析を用いて、大量の試料の分析のためにスケールアップすることができる。
【０１９２】
さらに、壊死性／ネクロトーシス性およびアポトーシス細胞の間の区別を裏付けるために、たとえば、ＴＵＮＥＬアッセイまたは切断されたカスパーゼ３の染色のようなアポトーシス細胞を検出する他の方法と、本方法を組み合わせることが可能であるが、必要ではない。
【０１９３】
これまでのところ、ネクロトーシス性細胞死と、アポトーシスを区別する、最も信頼性の高い方法は、電子顕微鏡による形態学的特徴の分析に基づいて判別することである。しかし、この方法は、非常に面倒でしかも、サンプルの大量の分析のため、または生物における全身的な関連性を研究するためには実現不可能である。他の方法は、多くの場合、後期アポトーシス細胞とネクロトーシス性細胞を区別することができない。対照的に、本発明の方法は、壊死／ネクロトーシス性、対、アポトーシス細胞の間の識別を可能にする方法を提供し、より少ない労力で、大量の試料の分析を容易にする（実施例２参照）。また、本発明の方法は、本明細書の下記の実施例４および５に示すように、インビボでまた、適用することもできる、さらに、それは、細胞死の一つのタイプを特異的にブロックすることによって、細胞死の種類の間接的な分析に依存しない。したがって、従来技術の間接的な方法に対して、本発明の方法は、人為的に細胞死の種類を変化させる危険性を付随しない。また、本発明の方法にしたがって、細胞は、個別に分析することができ、したがって、分析の高い感度を可能にする。本発明の方法に基づいて、アポトーシスとネクロトーシス性細胞死の間で、非常に正確な区別を達成することができる。また、それぞれの細胞死の形態のサブタイプであっても（すなわち、初期および後期アポトーシス対初期および後期ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ））、可視化でき、かつ定量することができる。対照的に、既知の方法は、多くの場合、ネクロトーシス性細胞から、後期のアポトーシス細胞を区別することができない（両方の場合に、原形質膜の完全性の損失が発生する）。
【０１９４】
ネクロトーシス性および壊死細胞を、同定する方法の好ましい実施形態では、工程ａ）における原形質膜破壊のためのマーカーは、膜不透過性のＤＮＡ結合染料からなる群から選択され、および／またはクロマチン凝縮および／またはクロマチン断片化のためのマーカーは、膜透過性のＤＮＡ結合染料からなる群から選択される。
【０１９５】
標識された小器官は、非共焦点顕微鏡（ｎｏｎ−ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）を用いて可視化するには小さすぎるかもしれないので、たとえば、小器官を染色する染料は、検出がより困難であるので、他の膜不透過性マーカーを使用することと比較して、原形質膜の破壊のためのマーカーとして、膜不透過性のＤＮＡ結合染料を使用することは有利である。したがって、このような染料に基づく方法は、より複雑な検出システムを必要とし、そして、より面倒かもしれない。染料は、単に漏れる可能性があるので、細胞質を染色する膜不透過性染料は、強力なバックグラウンドを引き起こす可能性がある。これらの欠点は、原形質膜の破壊のマーカーとして、膜不透過性ＤＮＡ結合染料を使用することによって回避される。さらに、酵素活性は、ネクロトーシス性細胞では、低くまたは存在しないことが予想されるので、酵素活性化の際に、蛍光性となる非蛍光、非透過性染料は、ネクロトーシス性／壊死細胞を染色するのに適していない。
【０１９６】
本明細書中、特に、特許請求の範囲において、特徴付けられる実施形態に関して、従属請求項で述べた各実施形態は、前記従属請求項が従属する各請求項（独立または従属）の各実施形態と組み合わされることが意図される。たとえば、独立請求項１が、３つの選択肢Ａ、ＢおよびＣを規定し、従属請求項２が、３つの代替Ｄ、ＥおよびＦを規定し、そして、請求項１および２に従属する請求項３が、３つの代替Ｇ、ＨおよびＩを定義する場合、それは、特に他に言及しない限り、明細書は、下記の組合せに相当する実施態様が明確に開示されていると理解すべきである。
Ａ，  Ｄ，  Ｇ；  
Ａ，  Ｄ，  Ｈ；
Ａ，  Ｄ，  Ｉ；
Ａ，  Ｅ，  Ｇ；  
Ａ，  Ｅ，  Ｈ；
Ａ，  Ｅ，  Ｉ；  
Ａ，  Ｆ，  Ｇ；  
Ａ，  Ｆ，  Ｈ；  
Ａ，  Ｆ，  Ｉ；  
Ｂ，  Ｄ，  Ｇ；  
Ｂ，  Ｄ，  Ｈ；  
Ｂ，  Ｄ，  Ｉ；  
Ｂ，  Ｅ，  Ｇ；  
Ｂ，  Ｅ，  Ｈ；  
Ｂ，  Ｅ，  Ｉ；  
Ｂ，  Ｆ，  Ｇ；  
Ｂ，  Ｆ，  Ｈ；  
Ｂ，  Ｆ，  Ｉ；  
Ｃ，  Ｄ，  Ｇ；  
Ｃ，  Ｄ，  Ｈ；  
Ｃ，  Ｄ，  Ｉ；  
Ｃ，  Ｅ，  Ｇ；  
Ｃ，  Ｅ，  Ｈ；  
Ｃ，  Ｅ，  Ｉ；  
Ｃ，  Ｆ，  Ｇ；  
Ｃ，  Ｆ，  Ｈ；  
Ｃ，  Ｆ，  Ｉ。
【０１９７】
同様に、また、独立したおよび／または従属請求項は、選択肢を列挙しないような場合にも、従属請求項が、先行する複数の請求項を参照するならば、それによって保護される主題の任意の組み合わせが、明示的に開示されていると考えられることが理解される。たとえば、独立請求項１、請求項１を参照する従属請求項２、そして、請求項２および１の両方を参照する従属請求項３である場合、請求項３および１の主題の組み合わせは、請求項３，２および１の主題の組み合わせとして、明確かつ明白に開示されていると理解される。さらに、請求項１乃至３の請求項のいずれか１項を参照する、従属請求項４が存在する場合には、請求項４および１、請求項４、２および１、請求項４、３および１、請求項４、３、２および１、の主題の組合せは、明確かつ明白に開示されていると理解される。
【０１９８】
上記の考察は、すべての添付の特許請求の範囲に準用される。
【０１９９】
図は、以下を示す。
【図面の簡単な説明】
【０２００】
【図１】図１は、転移時の、腫瘍、免疫および内皮細胞の相互作用に関する概略図である（ラブレとハインズ（Ｌａｂｅｌｌｅ  ａｎｄ  Ｈｙｎｅｓ）２０１２年から採用）。
【図２】壊死性細胞死からアポトーシスを判別する方法である。Ａ：ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、示された刺激で処理し、ヘキスト３３３４２およびＥｔＤＩＩＩで染色することにより分析した。過酸化水素または酸素で処理した細胞は、壊死性表現型を示すのに対し、ＴＲＡＩＬおよびスタウロスポリンは、アポトーシスを誘導した。Ｂ：ＴＮＦ処理は、ヘキスト３３３４２とＥｔＤＩＩＩで染色することによって示されるように、ネクロスタチン−１の添加によってブロックすることができ、Ｌ９２９細胞において、壊死性表現型を齎した。
【図３−１】腫瘍細胞（ＴＣ）は、インビトロで、内皮細胞（ＥＣ）に、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）を誘導した。Ａ：ヘキスト３３３４２とＥｔＤＩＩＩで染色することによって示されるように、ＣＦＰａｃおよびＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞は、ＨＵＶＥＣにおいて、インビトロで、内皮細胞に、ネクロトーシス性細胞死を誘導した。Ｂ：異なるＴＣで処理した後のネクロトーシス性ＨＵＶＥＣの定量。Ｃ：増加するＭＤＡ−ＭＢ−２３１のＴＣ数で処理した後の、ネクロトーシス性ＨＵＶＥＣの定量。
【図３−２】腫瘍細胞（ＴＣ）は、インビトロで、内皮細胞（ＥＣ）に、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）を誘導した。Ｄ：静脈内注射されたＴＣ（Ｂ１６またはＬＬＣ１）は、インビボで、マウスの肺の内皮細胞の死を誘導する。ＤＡＰＩ染色により示されるように、核凝縮や断片化の不在下で、ＥｔＤＩＩＩでの陽性染色によって示されるように、この死はネクロトーシスである。さらに、切断されたカスパーゼを検出することはできなかった。Ｅ：ＣＤ３１およびＥＲＧは、内皮特異的マーカーとして提供された。
【図４−１】内皮細胞（ＥＣｓ）において、増加したネクロトーシスは、増加した腫瘍細胞（ＴＣ）が誘導する内皮細胞死および転移を齎す。Ａ：ＴＡＫ１の削除は、ＨＵＶＥＣにおいて、ＴＣ−誘導されたネクロトーシスを増加させる。Ｂ：インビボで、内皮細胞において、ＴＣ（Ｂ１６）によって誘導されるネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）は、野生型（ｗｔ）マウスと比較して、内皮細胞（ＴＡＫ１ＥＣＫＯ）でのＴＡＫ１欠損マウスにおいて増加する。Ｃ：ｗｔおよびＴＡＫ１ＥＣＫＯマウスにおいて、ＴＣ（Ｂ１６またはＬＬＣ１）により誘導される、ネクロトーシス性ＥＣの定量である。
【図４−２】内皮細胞（ＥＣｓ）において、増加したネクロトーシスは、増加した腫瘍細胞（ＴＣ）が誘導する内皮細胞死および転移を齎す。Ｄ：ＴＡＫ１のサイレンシング（Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）は、遊出する（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｅ）ＴＣの数を増加させた。Ｅ：Ｅｗｔマウスと比較して、ＴＡＫ１ＥＣＫＯ  マウスにおける、ＴＣ（Ｂ１６）によって、転移形成が増加した。
【図５−１】腫瘍細胞（ＴＣ）で誘導された、内皮細胞（ＥＣ）死の薬理学的阻害は、減少した転移形成を齎す。Ａ：ネクロスタチン１（ＮＥＣ−１）は、インビトロで、ＴＣ−誘導されたネクロトーシス性ＨＵＶＥＣの数を減少させた。Ｂ：ＮＥＣ−１は、インビボで、ＴＣ（Ｂ１６）が誘導したネクロトーシス性ＥＣ、およびＴＣ（Ｂ１６またはＬＬＣ１）による転移形成を減少させた。
【図５−２】腫瘍細胞（ＴＣ）で誘導された、内皮細胞（ＥＣ）死の薬理学的阻害は、減少した転移形成を齎す。Ｃ：インビボで、ＴＣ（Ｂ１６）により誘導された、ネクロトーシス性のＥＣの数における、ＮＥＣ−１の効果の定量を示す。Ｄ：インビボで、ＮＥＣ−１の存在下および非存在下での、Ｂ１６の転移の定量を示す。Ｅ：インビボで、ＮＥＣ−１の存在下および非存在下での、ＬＬＣ１転移の定量を示す。
【図６−１】ＤＲ６は、腫瘍細胞（ＴＣ）で誘導される内皮細胞（ＥＣ）死とＴＣ遊出（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｅ）のために必要とされることを示す。Ａ：ＴＣで誘導されたネクロトーシス性のＥＣ死を仲介する、潜在的な受容体を同定するための、ｓｉＲＮＡスクリーニング（ＲＩＰＫ３とＭＡＰ３Ｋ７（＝ＴＡＫ１）を、内部対照として用いた）を示す。Ｂ：異なるｓｉＲＮＡを用いた、スクリーニングヒット（ＤＲ６）の確認を示す。Ｃ：サイレンス化された（ｓｉｌｅｎｃｅｄ）ＤＲ６の発現を有する、ＨＵＶＥＣ単層を通る、ＴＣの経内皮移動の減少（ノックダウン効率＞７０％、データは示さない）を示す。
【図６−２】ＤＲ６は、腫瘍細胞（ＴＣ）で誘導される内皮細胞（ＥＣ）死とＴＣ遊出（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｅ）のために必要とされることを示す。Ｄ：ＴＣで誘導されたネクロトーシス性のＥＣ死における、ＤＲ６−Ｆｃ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄシステムズ社、＃１４４−ＤＲ）の効果を示す。Ｅ：ＨＵＶＥＣ単層を通る、ＴＣ経内皮移動における、ＤＲ６−Ｆｃ融合タンパク質の効果を示す。
【図７−１】腫瘍細胞によって誘導される内皮ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）と転移形成は、内皮のＲＩＰＫ３およびカスパーゼ８によって制御されている。（ＡおよびＢ）内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＴＲＬ）で、または、ＲＩＰＫ３（ｓｉＲＩＰＫ３）、ＭＬＫＬ（ｓｉＭＬＫＬ）またはカスパーゼ−８（ｓｉＣａｓｐ８）をコードするメッセンジャーＲＮＡに対するｓｉＲＮＡで、トランスフェクトされた。そして、（Ａ）内皮細胞死は、腫瘍細胞の非存在下（−ＴＣ、白棒）またはＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞の存在で（＋ＴＣ、黒棒）、決定された。示されているように、ｓｉＲＮＡ媒介の遺伝子ノックダウン後の、ＨＵＶＥＣ単層の上の遊出された（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｅ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞の数は、（Ｂ）において決定された（ｎ＝１条件あたり６ウェル）。（Ｄ乃至Ｆ）（Ｄ）は、６時間での、ＥｔｈＤ−ＩＩＩ陽性内皮細胞の定量を示す。（Ｅ）は、６時間での、血管外滲出（ｅｘｔｒａｖａｓａｔｅ）した腫瘍細胞数を示す。または、（Ｆ）は、Ｂ１６腫瘍細胞を、ＲＩＰＫ３ＥＣＫＯマウスに静脈注射後、１２日での肺転移を示す。（Ｄ）および（Ｆ）において、定量は、図７（Ｃ）に示されている画像に基づく。図７（Ｄ）の白棒は、腫瘍細胞（ｎは、１条件当たり４乃至６匹）の代わりに、ＰＢＳを受けたマウスを表す。すべてのパネルは、３つ以上の独立した実験の代表的な結果である。示されているのは、平均値±ＳＥＭ（Ａ、Ｄ、Ｅ）または±ＳＤ（Ｂ、Ｆ）；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１（一元配置分散分析とボンフェローニの事後検定）。
【図７−２】腫瘍細胞によって誘導される内皮ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）と転移形成は、内皮のＲＩＰＫ３およびカスパーゼ８によって制御されている。（Ｃ）インビボでの、腫瘍細胞により誘導される内皮細胞死（６時間、左パネル）および転移形成（１２日、右パネル）における、ＲＩＰＫ３（ＲＩＰＫ３ＥＣＫＯ）の内皮特異的欠失の効果を示す。右上の概略図は、実験計画を示す。６時間：Ｂ１６腫瘍細胞を、示された遺伝子型の動物に静脈注射し、そして、切断されたカスパーゼ３（緑色を提供する）、ＥｔｈＤ−ＩＩＩ（黄色を提供する）、ＣＤ３１（赤色を提供する）および細胞核（青色を提供する、ＤＡＰＩ）に対して染色した後６時間での、肺切片の代表的な共焦点画像。１２日：それぞれの遺伝子型の動物への、Ｂ１６腫瘍細胞の静脈内注射後１２日での、肺の代表的な画像。Ｃｒｅ陰性同腹子（Ｃｒｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅｓ）を対照とした。バーの長さは、５０μｍである。
【図８】ＤＲ６は、様々なヒトの臓器の内皮細胞において発現されることを示す。ＣＤ３１（赤色を提供する）、ＤＲ６（緑色を提供する）および細胞核（ＤＡＰＩ、青色を提供する）に対して染色された、示された起源のヒト組織の代表的な共焦点画像（左パネル）。ＤＲ６がノックダウンされたＨＵＶＥＣ（ｓｉＤＲ６）は、抗体特異性（下パネル）のための対照として機能した。透過化剤は、染色のためには、一切使用されなかった。対照のＩｇＧ抗体と、ＡＦ−４８８に結合された、ロバ抗ウサギ二次抗体は、ネガティブ  コントロールとして機能した（右のパネル）。バーの長さは５μｍである。
【図９−１】ＤＲ６に結合するリガンドは、内皮ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）を誘導し、そして、転移形成を促進する。（Ａ）は、腫瘍細胞によって誘導される内皮細胞死（６時間、左パネル）およびインビボ（１２日、右パネル）における転移形成における、（マウス）ＩｇＧ２Ａ−ＦｃまたはＤＲ６−Ｆｃ融合タンパク質（用量当たり０．２μｇ／ｇ）の効果を示す。右上の概略図は、実験計画を示す。６時間：Ｂ１６腫瘍細胞の静脈注射および指示されているように処理された後、６時間での、肺切片の代表的な共焦点画像。対照動物は、腫瘍細胞の代わりにＰＢＳを受けた。組織切片は、切断されたカスパーゼ３（緑）、ＥｔｈＤ−ＩＩＩ（黄色）、ＣＤ３１（赤色）および細胞核（青色。ＤＡＰＩ）に対して染色された。１２日：Ｂ１６の腫瘍細胞の静脈内注射、およびそれぞれで処理後、１２日での肺の代表的な画像。バーの長さは５０μｍである。
【図９−２】ＤＲ６に結合するリガンドは、内皮ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）を誘導し、そして、転移形成を促進する。（Ｂ乃至Ｄ）（Ｂ）は、６時間でのＥｔｈＤ−ＩＩＩ陽性内皮細胞の定量を示す。（Ｃ）は、６時間での血管外滲出（ｅｘｔｒａｖａｓａｔｅｄ）した腫瘍細胞数を示す。または（Ｄ）は、Ｂ１６またはＬＬＣ１腫瘍細胞を、指示されたように処理された、マウスに静脈内注射後、１２日での肺転移を示す。（Ｂ）および（Ｄ）における定量は、図９（Ａ）に示す、画像に基づく。図９（Ｂ）の白棒は、腫瘍細胞（ｎは、１条件当たり４乃至６匹）の代わりに、ＰＢＳを受けたマウスを表す。すべてのパネルは、３つ以上の独立した実験の代表的な結果である。図示したのは、平均値±ＳＥＭ（Ｂ、Ｃ）または±ＳＤ（Ｄ）；＊Ｐ＜０．０５。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１；ｎ．ｓ．は、有意ではない（一元配置分散分析（Ｂ）とボンフェローニの事後検定または不対、両側スチューデントのｔ検定（Ｃ、Ｄ））。
【図１０】腫瘍細胞−内皮細胞の直接の接触は、内皮ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）の誘導に必要である。ＨＵＶＥＣ単独における細胞死（ネクロトーシス）（白棒）または、示されたように、異なったタイプの腫瘍細胞の存在下に培養されたＨＵＶＥＣの細胞死（黒棒、直接の接触）、または、腫瘍細胞と一緒に、一晩、共培養した内皮細胞からの馴化培地で刺激された（灰色の棒、馴化培地）、ＨＵＶＥＣの細胞死の定量。示されているのは、平均値±ＳＥＭ；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；ｎ．ｓ．は有意ではない（一元配置分散分析とボンフェローニの事後検定）。
【図１１】腫瘍細胞におけるＡＰＰ欠損は、腫瘍細胞の増殖、細胞死または遊走に影響しない。（Ａ）は、ＡＰＰに対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＡＰＰ）を用いて、Ｂ１６またはＬＬＣ１腫瘍細胞における、ノックダウン効率の分析。スクランブル（Ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）ｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＴＲＬ）は対照として機能した。示されているのは、ＧＡＰＤＨレベルに対して、およびスクランブル（Ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）ｓｉＲＮＡで処理されたサンプルに検出された当該レベルに対して、正規化された、相対的なｍＲＮＡの発現である。（Ｂ乃至Ｄ）（Ｂ）：細胞数の定量的評価、（Ｃ）：細胞死の定量的評価、または（Ｄ）スクランブル（Ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）ｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＴＲＬ）でトランスフェクトされた腫瘍細胞と比較した、ＡＰＰに対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＡＰＰ）でトランスフェクトされた、Ｂ１６またはＬＬＣ１腫瘍細胞の遊走能の定量的評価（ｎは、１条件当たり３乃至６のウェル）。  すべてのパネルは、３つ以上の独立した実験の代表的な結果である。示されるものは、平均値±ＳＤ、＊＊＊Ｐ  ＜０．００１；であり、ｎｓは、有意ではない（不対、両側スチューデント  ｔ−検定）。
【図１２−１】腫瘍細胞によって発現されるＡＰＰは、内皮ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）を誘導し、そして、転移の形成を促進する。（ＡおよびＢ）（Ａ）腫瘍細胞（−ＴＣ、白棒）の非存在下、または、ＡＰＰをコードするｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ（２３１ｓｉＡＰＰ）または、対照のｓｉＲＮＡ（２３１ｓｉＣＴＲＬ）（＋ＴＣ、黒棒）でトランスフェクトされた、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞に暴露された、ＨＵＶＥＣにおける、細胞死（壊死）の定量。２３１ｓｉＣＴＲＬまたは２３１ｓｉＡＰＰ腫瘍細胞の、ＨＵＶＥＣ単層の経内皮移動は、（Ｂ）において、決定された（ｎ＝１条件あたり６ウェル）。（Ｃ）サイレンス化された（ｓｉｌｅｎｃｅｄ）ＡＰＰ発現（Ｂ１６ｓｉＡＰＰ））を用いた、Ｂ１６腫瘍細胞の、内皮細胞死（６時間、左パネル）、および、インビボでの転移形成（１２日、右パネル）に対する効果。右上の概略図は、実験計画を示す。６時間：Ｂ１６ｓｉＡＰＰまたはＢ１６ｓｉＣＴＲＬ腫瘍細胞の静脈注射後６時間で、切断されたカスパーゼ３（緑の色を提供する）、ＥｔｈＤ−ＩＩＩ（黄色を提供する）、ＣＤ３１（赤色を提供する）および細胞核（青色を提供する、ＤＡＰＩ）について染色された、肺切片の代表的な共焦点画像。１２日：それぞれの腫瘍細胞の静脈内注射後、１２日での肺の代表的な画像である。  バーの長さ：５０μｍ。（Ｄ乃至Ｆ）（Ｄ）６時間でのＥｔｈＤ−ＩＩＩ陽性内皮細胞の定量、
【図１２−２】腫瘍細胞によって発現されるＡＰＰは、内皮ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）を誘導し、そして、転移の形成を促進する。（Ｄ乃至Ｆ）（Ｅ）６時間での血管外滲出（ｅｘｔｒａｖａｓａｔｅｄ）した腫瘍細胞の数、または、（Ｆ）ＡＰＰ−サイレンス化された（ｓｉｌｅｎｃｅｄ）（Ｂ１６ｓｉＡＰＰおよびＬＬＣ１ｓｉＡＰＰ）または対照のＢ１６腫瘍細胞（Ｂ１６ｓｉＣＴＲＬ）および対照のＬＬＣ１腫瘍細胞（ＬＬＣ１ｓｉＣＴＲＬ）の静脈注射から１２日での肺転移。（Ｄ）および（Ｆ）における定量は、（Ｃ）に示す、画像に基づく。（Ｄ）の白棒は、腫瘍細胞（ｎは、１条件当たり４乃至６匹）の代わりに、ＰＢＳを受けたマウスを表す。示されているのは、平均値±ＳＥＭ（Ａ、Ｄ、Ｅ）または±ＳＤ（Ｂ、Ｆ）；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１；ｎｓは、有意ではない（一元配置分散分析およびボンフェローニの事後検定（Ａ、Ｂ、Ｄ）または不対、両側スチューデントのｔ検定（Ｅ、Ｆ））。
【図１３】尾静脈へのＢ１６腫瘍細胞の注射の直前と３時間と６時間後に、ＤＭＳＯ、１−メチルトリプトファン（１−ＭＴ、用量あたり、１．６５μｇ／ｇ）または、ＮＥＣ−１の安定したアイソフォーム（ＮＥＣ−１ｓ、用量あたり、１．６５μｇ／ｇ）の静脈注射によって、動物の肺に形成された転移の、代表的な画像と定量。肺転移の形成は、その後、１２日目に決定された（ｎ＝条件あたり、４‐５匹）。すべてのパネルは、３つ以上の独立した実験の代表的な結果である。図示されているのは、平均値±ＳＤは、＊＊Ｐ＜０．０１であり、ｎ．ｓ．は、顕著ではないことを示す（一元配置分散分析とボンフェローニの事後検定）。
【０２０１】
実施例は本発明を説明する。
【０２０２】
実施例１：方法
インビトロ：
内皮細胞は、図面に示されるように、エチジウム  ホモダイマーＩＩＩ（ＥｔＤＩＩＩ）のみ、または、物質と一緒に、または、物質または阻害剤と一緒に腫瘍細胞を添加する前に、８０乃至９０％の集密度（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）に達するまで成長させた。６乃至１８時間後、細胞を、ヘキスト３３３４２で染色し、そして、画像を取得した。細胞死のモードを識別するために、すべての画像をＦＩＪＩを用いて分析した。核の総数は、すべてのヘキスト陽性核について、低閾値によって決定した。同じチャンネル（ｃｈａｎｎｅｌ）で、第二の、別個の閾値は、凝縮核の数を決定するために使用された。第二のチャンネル（ｃｈａｎｎｅｌ）で、第３の閾値は、ＥｔＤＩＩＩについて陽性に染色された核の数を決定するために使用された。細胞のノックダウンは、リボフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）ＲＮｉＭＡＸを用いて、ｓｉＲＮＡとの二重トランスフェクションによって達成された。
【０２０３】
インビボ：
野生型動物またはそれぞれの遺伝子型の動物に、図５Ｂに図式に示されているように、腫瘍細胞と、物質または阻害剤は、静脈内に注射された。インビボで、ＥｔＤＩＩＩ陽性細胞を同定するため、動物を、屠殺前１０分に、ＥｔＤＩＩＩを、静脈に注入した。臓器を単離し、免疫組織化学的分析のために処理した。転移の数を決定するために、動物を屠殺し、肺を単離し、巨視的に分析した。
これらの研究（ＤＲ６−Ｆｃを含む）のために使用される全ての試薬は（たとえば、ロンザ、セル  シグナリング社（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ）、シグマ社、Ｒ＆Ｄ社など）、市販されている。
【０２０４】
細胞死アッセイ：
ＨＵＶＥＣ、ＨＭＶＥＣ−ＬまたはＬ９２９細胞（１．５×１０  ４を、１００μｌで播種）を、９６ウェルプレートで、２４時間培養した。細胞死を誘導するために、細胞を、ｒｈＴＲＡＩＬ（１００ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、スタウロスポリン（０．５μＭ、イエナ  バイオサイエンス社）、過酸化水素（１ｍＭ、ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ社）またはｒｍＴＮＦα（１００ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）のそれぞれを用いて、一晩、刺激するか、または、低酸素条件下で培養した（１％酸素、コイ  ラボラトリー社）。代替的に、共培養実験において、１．５×１０３ＧＦＰ−発現腫瘍細胞、カルセイン−ＡＭで標識された腫瘍細胞、ＣＯＳ−１またはＨＥＫ細胞（詳細は、補足実験手順（ｐｒｏｃｅｄｕｅｓ）を参照）、または、血小板の２０倍の数を含むカルセイン‐ＡＭで染色された、新たに単離されたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、単独で、または、お互いの組み合わせで、または、下記の物質の存在下に、内皮細胞の単層の上に添加され、そして、一晩培養された：Ｎｅｃ−１（３０μＭ）、
ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（１００μＭ）、
１−ＭＴ（３０μＭ）、
ＤＲ６−Ｆｃまたは
ＩｇＧ１−Ｆｃ（０．１乃至１μｇ／ｍｌ）。
ＰＢＭＣを、フィコール密度勾配遠心分離（Ｆｉｃｏｌｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）を用いて、標準的なプロトコールを用いて単離した。上清の実験のために、コンフルエントになるまで成長させたＨＵＶＥＣ単層を、１８時間、腫瘍細胞の存在下、共培養されたＨＵＶＥＣから得られた馴化培地で培養した。ノックダウン実験のために、１．５×１０４のＨＵＶＥＣは、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）ＲＮＡｉＭＡＸ（ライフ  テクノロジー社）を用いて、異なるｓｉＲＮＡのセット（シグマ社またはキアゲン社）で、トランスフェクトし、そして、９６ウェルプレートにて、培養した。ノックダウン効率は、レムリ緩衝液（Ｌａｅｍｍｌｉ  ｂｕｆｆｅｒ）での加水分解の後、ＲＩＰＫ３（Ａｂｃａｍ社）、カスパーゼ−８（ＰｒｏＳｃｉ社）およびαチューブリン（シグマ社）に対する抗体を用いたウェスタン  ブロッティングによって、または定量的ＰＣＲ（ロシュ社）により決定した。ｓｉＲＮＡ媒介ノックダウンを、腫瘍細胞で行った場合には、細胞は、ｓｉＲＮＡの異なるセット（シグマ社）で、リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸを用いてトランスフェクトされ、そして、トランスフェクションした後、４８時間で、ＨＵＶＥＣのコンフルエントな単層に播種された。ノックダウン効率は、定量的ＰＣＲ（ロッシュ社）を用いて決定された。ノックダウンの際の腫瘍細胞の数は、ヘキスト３３３４２陽性細胞を計数することにより測定し、そして、腫瘍細胞死は、凝縮および／またはＥｔｈＤ−ＩＩＩ陽性核をカウントすることによって決定された（下記参照）。細胞遊走（Ｃｅｌｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）は、スクラッチ  アッセイ（ｓｃｒａｔｃｈ  ａｓｓａｙ）によって決定された（Ｌｉａｎｇら、２００７年）。
【０２０５】
細胞死の解析：  すべての条件において、ＥｔｈＤ−ＩＩＩ（１．６μＭ、Ｂｉｏｔｉｕｍ社）は、一晩の培養前に、培地に添加され、そして、ヘキスト３３３４２（２μＭ、サーモ    サイエンティフィック社）は、オリンパスＩＸ８１顕微鏡を使用して、雰囲気制御室内（ａｔｍｏｓｐｈｅｒｅ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｃｈａｍｂｅｒ）（３７℃、５％ＣＯ２）で、自動的に、画像を取得する直前に、添加された。定義された、アポトーシス、壊死またはネクロトーシスの条件下に培養され、そして、ヘキスト（細胞透過性の（ｃｅｌｌｐｅｒｍｅａｂｌｅ）核染料）およびＥｔｈＤ−ＩＩＩ（膜非透過性の核染料）で染色された細胞に基づき、生存中の細胞と比較した、壊死（またはネクロトーシス）細胞から、アポトーシスを識別するための形態学的基準は、以下のように、定義した：
生きている細胞は、通常の丸から腎臓形の核で表示され（ヘキストによって可視化されると）、そして、ＥｔｈＤ−ＩＩＩにはネガティブである、
アポトーシス細胞は、強力な凝縮と頻繁に断片化された核で表示され、ＥｔｈＤ−ＩＩＩにネガティブである、
壊死性またはネクロトーシス細胞は、通常の丸から腎臓形の核、またはマイナーな核の収縮で示され（凝縮なしおよび断片化なし）、および、ＥｔｈＤＩＩＩにポジティブである。
【０２０６】
後期アポトーシス細胞は、ＥｔｈＤ−ＩＩＩに対して陽性であるが、その核の強い凝縮（および頻繁な断片化）のために、壊死／ネクロトーシス細胞から識別することができる。分析されるすべての画像に対して、３画素の半径のガウスぼかしを適用し（Ｇａｕｓｓｉａｎ  ｂｌｕｒ  ｗｉｔｈ  ａ  ｒａｄｉｕｓ  ｏｆ  ３  ｐｉｘｅｌｓ）、アポトーシス核の断片化された部分を重複してカウントするのを防止した。内皮細胞は、ＧＦＰ‐またはカルセイン‐ＡＭ陰性細胞として定義された。すべての内皮核の合計数は、すべてのヘキスト陽性核（腫瘍細胞の核を引く（ｍｉｎｕｓ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅｉ  ｆｒｏｍ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ））について、低閾値（ｌｏｗ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）（ＴＨ１）および、得られた二値画像上の流域（ｗａｔｅｒｓｈｅｄ）を適用して、決定した。可能な場合、第二の別個の閾値（ｓｅｃｏｎｄ  ｓｅｐａｒａｔｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）（ＴＨ２）が、凝縮された核の数を決定するために使用された。
【０２０７】
ＥｔｈＤ−ＩＩＩ陽性細胞の数は、独立した第２の低閾値のみで決定した。この自動解析が失敗した場合には、細胞死のモードは、上記に要約した基準を適用することにより、各個別の内皮細胞について、手動で決定した。全ての画像は、ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）で分析された。各実験は、各条件について、最少６つのウェルで少なくとも３回実施され、１ウェル当たり４つの独立した画像を得た。
【０２０８】
転移モデル：
５×１０４の標識されていない、または、ＣＦＳＥ標識腫瘍細胞（Ｂ１６Ｆ１０メラノーマまたはＬＬＣ１肺癌細胞）、または、サイレンス化されたＡＰＰ発現（ｓｉｌｅｎｃｅｄ  ＡＰＰ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）または蛍光ミクロスフェア（１５μｍ、ライフ  テクノロジー社）を有する腫瘍細胞を、ＰＢＳ中に含む５０μｌを、マウスの側尾静脈に注射した。阻害実験では、５０μｌのＮＥＣ−１（１．６５μｇ／  ｇ）、ＮＥＣ−１ｓ（１．６５μｇ／ｇ）、１−ＭＴ（１．６５μｇ／ｇ）、Ｚ−ＶＡＤ（ＯＭｅ）−ｆｍｋ（４μｇ／ｇ）の２つの用量またはｒｍＤＲ６−ＦｃまたはｒｍＩｇＧ２Ａ-Ｆｃの２５μｌ（それぞれ０．２μｇ／ｇ）の２つの用量を、腫瘍細胞の注射の直前、および腫瘍細胞の注射後３時間に、尾静脈に注射した。全ての場合において、腫瘍細胞によって誘導される内皮細胞死の評価のために、腫瘍細胞の注射後６時間に、５０μｌのＥｔｈＤ−ＩＩＩ（ＰＢＳ中の３００μＭ）を静脈注射し、そして、１０分後に動物を屠殺し、そして、ＰＢＳおよび４％パラホルムアルデヒドで灌流し、そして、直接、免疫組織化学的分析のために処理した。血管外滲出（ｅｘｔｒａｖａｓａｔｅｄ）した腫瘍細胞の数の評価のために、ＣＦＳＥで標識されたＢ１６腫瘍細胞は、静脈中に注入され、そして、６時間後に非灌流肺を単離し、そして、４％パラホルムアルデヒドで固定した。組織の凍結切片（Ｃｒｙｏｓｅｃｔｉｏｎｓ）を、切断されたカスパーゼ３（セルシグナル社）、アネキシンＶ（サンタ  クルズ生物工学社）、ＥＲＧ（アブカム（Ａｂｃａｍ）社）、およびＣＤ３１またはＣＤ４５（ＢＤバイオサイエンス社）について染色した。ＤＡＰＩ（ライフ  テクノロジー社）は、核を可視化するために使用された。
【０２０９】
ＴＵＮＥＬ染色キットは、ロッシュ社から入手した。切片は、ライカＳＰ５共焦点顕微鏡でのＸＹＺビューで分析された。ＥｔｈＤ−ＩＩＩ陽性内皮細胞の数は、臓器ごとに最少で４つのランダムな組織切片において、ＥｔｈＤ−ＩＩＩ／ＥＲＧ−またはＥｔｈＤ−ＩＩＩ／ＣＤ３１陽性細胞の手動計数によって決定した。血管外滲出（Ｅｘｔｒａｖａｓａｔｉｎｇ）の腫瘍細胞の定量のために、凍結切片（ｃｒｙｏｓｅｃｔｉｏｎｓ）は、二つの基準によって分析された：
ＣＤ３１染色で、直接囲まれ（すなわち、血管）、かつ非侵襲的な表現型（ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）（すなわち、円形細胞形状）を有する腫瘍細胞は、血管内としてスコア化した。一方、侵襲性の表現型（ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）（すなわち、突出（ｐｒｏｔｒｕｓｉｏｎｓ）付きの不規則な細胞形状）を有する血管外細胞は、血管外として記録された。肺転移の評価のために、上記の物質を用いた、追加の（第三の）処理が、腫瘍細胞注射の６時間後に行われ、そして、肺転移は、それから１２日後に肉眼で分析された。１群当たり、最少３匹の動物を使用した。すべての実験動物手順は、ヘッシアン地方委員会によって承認された。
【０２１０】
統計分析：
特に明記しない場合は、少なくとも３つの独立して行った実験の１つの代表例を示す。すべての研究において、平均値の比較は、対になっていない、両側スチューデント  ｔ−検定、または、ボンフェローニの事後検定を伴った、一元配置分散分析または二元配置分散分析（双方向のＡＮＯＶＡ）を用いて行われた。全ての分析において、統計的有意性は、５％レベル（ｐ＜０．０５）で決定された。示されているのは、図の説明文に示すように、平均値±ＳＤまたは平均値±ＳＥＭである。
【０２１１】
材料：
培地やサプリメントは、ライフ  テクノロジー社からのものであった。ＮＥＣ−１は、エンゾ  ライフサイエンス社からであった。ＮＥＣ−１ｓは、バイオビジョン社からであった。Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋはアレクシス社から、および、ｚ−ＶＡＤ（ＯＭｅ）−ｆｍｋは、ケイマン社からだった。１−ＭＴは、シグマ社からであった。ｒｈＤＲ６−Ｆｃ、ｒｈＩｇＧ１−Ｆｃ、ｒｍＤＲ６−ＦｃおよびｒｍＩｇＧ２Ａ−Ｆｃは、Ｒ＆Ｄシステムズ社からであった。カルセイン−ＡＭは、ＡＡＴバイオクエスト社からであった。ＣＦＳＥはアレクシス社からだった、ウエスタンブロットおよび免疫組織化学的染色のための抗ＤＲ６抗体は、バイオス社からであった。
【０２１２】
細胞：
ヒト初代内皮細胞および培地は、ロンザ社からであった。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＧＦＰ腫瘍細胞は、アンチキャンサー社からであった。ＴＨＰ−１、Ａ５４９、ＰＣ３、ＭｅＷｏおよびＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞は、ＣＬＳ社からであった。Ｂ１６Ｆ１０およびＬＬＣ１は、ＡＴＣＣのものであった。Ｌ９２９細胞は、ヤン  ウィーガー（バイオセンター社、インスブルック、オーストリア）からの親切な寄贈であった。Ｕ−８７  ＭＧ細胞は、ステファン  リーケン（大学病院、ハイデルベルク、ドイツ）から、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２およびＣＦＰＡＣ−１細胞は、ナタリア  ギース（大学病院、ハイデルベルク、ドイツ）から、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、ＨｅＬａおよびＨＴ１０８０細胞は、マイケル・バール（ＤＫＦＺ、ドイツ）から、およびＭＯＬＴ−４細胞は、ヤツェク  ウィトコフスキー（ポーランドのグダニスク医科大学）から入手した。ＣＯＳ−１細胞は、ＡＴＣＣからであった。全ての細胞は、３７℃で、５％二酸化炭素で培養された。ヒト臍帯静脈内皮細胞（Ｈｕｍａｎ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｖｅｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）（ＨＵＶＥＣ）および肺からのヒト微小血管静脈内皮細胞（ＨＭＶＥＣｓ−Ｌ）は、それぞれ、ＥＧＭ２またはＥＧＭ２−ＭＶ培地中で培養され、そして、継代（ｐａｓｓａｇｅｓ）＜Ｐ６は、全ての実験に使用された。他のすべての細胞株は、１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン（１００単位／ｍｌ）およびグルタミン（２ｍＭ）で補充された、ＲＰＭＩまたはＤＭＥＭのいずれかで培養された。前述のように、初代マウス肺内皮細胞は単離され、そして、培養された（Ｓｉｖａｒａｊら、２０１３年）。
【０２１３】
トランスウェル  アッセイ：
詳細については、（Schumacherら、２０１３年）を参照して下さい。簡単に言えば、阻害実験のために、ＨＵＶＥＣｓ（１．５×１０４、５０μｌで播種）を２日間培養した。また、ノックダウン実験のために、８×１０３のＨＵＶＥＣは、異なるｓｉＲＮＡのセット（シグマ社またはキアゲン社）で、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）ＲＮＡｉＭＡＸを使用してトランスフェクトされ、そして、９６−トランスウェル  プレート上で、８μｍの細孔サイズ（コーニング）のポリエステル膜を用いて、コンフルエントに達するまで、毎日、培地交換して培養された。遊出（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｅ）するために、上部区画から培地を除去し、そして、７．５×１０３のＧＦＰを発現する、またはカルセイン−ＡＭで標識された腫瘍細胞は、５０μｌのＥＧＭ−２培地単独、または異なる物質（上記参照）の存在下に添加された。すべての実験において、フィルターの下側に遊出（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｅ）した腫瘍細胞を画像化し（ツァイス  アクシオ  オブザーバー  Ｚ１またはオリンパス  ＩＸ８１）、そして、ＩｍａｇｅＪを用いて定量した。透過性アッセイにおいて、７０ｋＤａのＦＩＴＣ−デキストラン（２ｍｇ／ｍｌ）を含有するＥＧＭ−２培地は、上部区画内の内皮単層の上に添加された。９０分後、ＥＧＭ−２のみを含む下部区画へと通過したＦＩＴＣ−デキストランの量を測定した（ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）。各実験は、条件あたり、最小５ウェルを用いて、少なくとも３回行われた。
【０２１４】
遺伝的マウスモデル：
対照のＣ５７ＢＩ／６動物は、チャールス  リバー社から入手した。ＲＩＰＫ３条件付きノックアウト動物（ＲＩＰＫ３  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ  ａｎｉｍａｌｓ）を作製するために、５’−相同性アームおよび３’−相同性アームだけでなく、ｒｉｐｋ３からの、ｌｏｘＰで挟み込まれた（ｆｌａｎｋｅｄ）エクソン２および３を含む、８８０−ｂｐの断片を、ＢＡＣ  ＲＰＣＩ−２３−２３７Ｇ１８（オークランド研究所の小児病院）から増幅させた。次いで、ネガティブ選択マーカーとして、Ｆｒｔで挟み込まれた（ｆｌａｎｋｅｄ）ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏＲ）およびジフテリア毒素Ａ遺伝子（ｄｔａ）を追加的に含む、ｐＫＯＩＩの標的ベクターにクローニングした。標的ベクターは、ＮｏｔＩで線状化され、そして、エレクトロポレーションにより、Ｖ６．５  ＥＳ細胞に導入された。４００μｇ／ｍｌのＧ４１８で処理し、４００個のクローンからＤＮＡを単離し、そして、サザンブロットにより、正しい組換えに関してスクリーン（ｓｃｒｅｅｎｅｄ）された。二つの独立したＥＳ細胞のクローンを、Ｃ５７Ｂｌ／６胚盤胞（ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ）に注入し、次いで、キメラ子孫を生成するため、偽妊娠した雌に移された。雄キメラは、ヘテロ接合体を製造するために、Ｃ５７Ｂｌ／６雌マウスと交配された。生殖系列伝達は、ＰＣＲジェノタイピング戦略（ＰＣＲ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｓｔｒａｔｅｇｙ）を使用して、Ｆ１世代で確認された。次いで、マウスを、ネオマイシン  カセットを除去するため、Ｆｌｐ−ｄｅｌｅｔｅｒマウスと交配し、そして、その後、Ｔｉｅ２−ＣｒｅＥＲＴ２動物と交配して、内皮細胞特異的なノックアウト動物（（Ｔｉｅ２−ＣｒｅＥＲＴ２；ＲＩＰＫ３ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ＝ＲＩＰＫ３ＥＣＫＯ）を得た。ｌｏｘＰ−ＰＣＲ反応は、野生型対立遺伝子（＋）およびフロックス（ｆｌｏｘｅｄ）（ｆｌ）の対立遺伝子の検出のために使用された。組換えを誘導するために、動物を、５×１ｍｇ／ｄのタモキシフェン（シグマ社）で処理し、そして、７乃至９日後に実験を開始した。内皮細胞におけるＲＩＰＫ３欠失は、ノックアウト動物（（Ｔｉｅ２−ＣｒｅＥＲＴ２；ＲＩＰＫ３ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ  （−／−）））の肺から単離された内皮細胞のタンパク質レベルを、対照動物（ＲＩＰＫ３ｆｌ／ｆｌ  （＋／＋）の肺からの内皮細胞と、ウエスタンブロットを使用して、比較することにより確認した。インビボでの透過性の定量は、マイルス  アッセイ（Ｍｉｌｅｓ  ａｓｓａｙ）を用いて行った。簡潔には、タモキシフェンによってノックアウトを誘導した後１１日目に、マウスは、ＰＢＳ中、０．５％のエバンスブルー染料の１００μｌを尾静脈注射を受けた。３０分後、マウスを屠殺し、そして、血管外に滲出された（ｅｘｔｒａｖａｓａｔｅｄ）青色染料は、５６℃で、ホルムアミドを用いて、肺から溶出され、そして、６２０ｎｍで分光法により測定した。
【０２１５】
ヒト試料：
凍結ヒト組織試料は、Ｚｙａｇｅｎ社から得、そして、ＣＤ３１（Ａｃｒｉｓ社）とＤＲ６（Ｂｉｏｓｓ社）に対して染色された。ヒト試料を用いた実験では、ヘッシアン地域医療委員会の現地の倫理委員会の規則にしたがって行われ、そして、インフォームドコンセントを、すべての被験者から得た。
【０２１６】
実施例２：壊死細胞死からアポトーシスを区別する方法
壊死／ネクロトーシス細胞死から、アポトーシスを区別するためのアッセイを確立した。この方法を試験するために、ＨＵＶＥＣは、制御条件下で使用されるか、またはアポトーシス（ＴＲＡＩＬおよびスタウロスポリン）、または壊死（過酸化水素および低酸素濃度）のための種々の既知の刺激で処理された。細胞は、ＥｔＤＩＩＩとヘキストで染色され、そして、核の形態を分析した。対照で処理された細胞は、クロマチン凝縮や断片化の兆候がなく、かつ、ＥｔＤＩＩＩの染色もない、腎臓のような形の核を示した。これとは対照的に、そのうちのいくつかは、また、ＥｔＤＩＩＩにも陽性である（すなわち、後期アポトーシス）、アポトーシス細胞（ＴＲＡＩＬまたはスタウロスポリン）の核は、凝縮され、断片化されていた。壊死細胞の核（過酸化水素または低酸素濃度）は、クロマチン凝縮または断片化をせずに、しかし、ＥｔＤＩＩＩについては陽性であり、核の形態において、ほんの僅かな変化しか示さなかった（図２Ａ）。結果は、マウス胚性線維芽細胞Ｌ９２９細胞に対するのと、同じ染色法を適用することにより確認した。これらの細胞をＴＮＦαで刺激すると、ネクロトーシス性細胞死を齎し、そして、ＲＩＰＫ１阻害剤である、ネクロスタチン−１（Ｎｅｃ−１）の存在によって遮断することができるので、これらの細胞は、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）を研究するための、インビトロのモデルシステムにおいて、一般に、標準として使用される。ＴＮＦαで処理されたＬ９２９細胞（ネクロトーシス）は、過酸化素または低酸素で処理したＨＵＶＥＣと同様の染色パターンを示し、そして、この効果は、Ｎｅｃ−１の添加によってブロックすることができた（図２Ｂ）。
【０２１７】
実施例３：インビトロで、腫瘍細胞は、内皮細胞におけるネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）を誘導する。
本明細書で上述した、ネクロトーシス性細胞死から、アポトーシスを区別するためのアッセイに基づいて、様々な腫瘍細胞が、内皮細胞のネクロトーシス性細胞死を誘導することができることが示された（図３Ａおよび図３Ｂ）。また、内皮細胞のネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）の程度は、腫瘍細胞数（図３Ｃ）に依存する。すなわち、多くの腫瘍細胞が追加されればされるほど、内皮細胞のネクロトーシス性細胞死の割合が高くなる。壊死／ネクロトーシス性内皮細胞を可視化するために同じ方法を適用すると、腫瘍細胞も、また、インビボで、内皮細胞死を誘導することができることが示された。腫瘍細胞を静脈内に注射すると、マウスの肺の内皮細胞は、ＤＡＰＩ染色により可視化されるように、核凝縮や断片化の兆候なしに、ＥｔＤＩＩＩに対して陽性であった。さらに、切断されたカスパーゼ−３のようなアポトーシスのマーカーを検出することはできなかった（図３Ｄ）。ＥｔＤＩＩＩ陽性細胞は、内皮細胞のマーカーである、ＥＲＧと共局在した（図３Ｅ）。
【０２１８】
実施例４：腫瘍細胞によって誘導される内皮細胞の死の増加は、転移の増加を齎す。
ＴＧＦ−β活性化キナーゼ１（ＴＡＫ１）は、細胞生存および細胞死の間の分子スイッチとして作用するシグナル分子である。これは、ＴＡＫ１の不存在または阻害は、内皮細胞におけるネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）の増加を齎すことが、以前に示されていた（Ｍｏｒｉｏｋａら、２０１２年）。重要なことに、ｓｉＲＮＡを用いて、ＴＡＫ１がサイレンシングされた、内皮細胞は、腫瘍細胞の刺激によるネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）の増加を示したことが、本件で見出された（図４Ａ）。さらに、内皮細胞（ＴＡＫＥＣＫＯ）において、特異的に、ＴＡＫ１を欠くマウスもまた、腫瘍転移の増加と一致した、内皮細胞における、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）細胞死の増加を示した（図４Ｂ乃至４Ｅ）。
【０２１９】
実施例５：腫瘍細胞によって誘導される内皮細胞の死の薬理学的阻害は、転移形成の減少を齎す。
ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）阻害剤である、ネクロスタチン−１（ＮＥＣ−１）で、インビトロで、処理した内皮細胞は、腫瘍細胞で誘導されたネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）の減少を示した（図５Ａ）。また、ＮＥＣ−１で処置した動物も、また、腫瘍細胞によって誘導される内皮ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）の減少および、インビボでの転移形成の減少を示した（図５Ａ乃至５Ｅ）。
【０２２０】
実施例６：ＤＲ６は、腫瘍細胞（ＴＣ）で誘導される内皮細胞（ＥＣ）死とＴＣ遊出（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｅ）のために必要である。
ｓｉＲＮＡスクリーニングは、腫瘍細胞によって誘導される内皮細胞ネクロトーシス性細胞死を媒介する潜在的な受容体を同定するために行われた。ＲＩＰＫ３およびＴＡＫ１（ＭＡＰ３Ｋ７）に特異的なｓｉＲＮＡは、それぞれ、ポジティブおよびネガティブ  コントロールとして使用された。スクリーニングは、ＤＲ６のノックダウン（ＴＮＦＲＳＦ２１）は、ＲＩＰＫ３のノックダウン（図６Ａ）によって達成された減少に匹敵する程度に、内皮細胞のネクロトーシスを減少させることを明らかにした。ＤＲ６に関して、ｓｉＲＮＡスクリーニングで得られたデータを確認するために、ＤＲ６（ｓｉＤＲ６＃１、ｓｉＤＲ６＃２およびｓｉＤＲ６＃３）に特異的な、異なるｓｉＲＮＡが、内皮細胞において、ＤＲ６をノックダウンするために使用された。これは、対照のｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＴＲＬ）で処理された内皮細胞と比較して、腫瘍細胞（ＴＣｓ）で処理することにより、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）によって死亡した内皮細胞の数を減少させた（図６Ｂ）。異なるｓｉＲＮＡを使用した、ＤＲ６のノックダウンは、＞７０％のＤＲ６発現の低下を齎し（データは示していない）、そして、また、ＨＵＶＥＣ単層を通る、腫瘍細胞の遊出（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｅ）をも減少させた（図６Ｃ）。内皮細胞の死および腫瘍細胞の遊出（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｅ）も、濃度依存的に、ＤＲ６−Ｆｃ融合タンパク質（ＤＲ６−Ｆｃ）によって減少した。ＩｇＧ１−Ｆｃは、ネガティブコントロールとして使用された（図６Ｄおよび６Ｅ）。
【０２２１】
実施例７：ＲＩＰＫ３、ＭＬＫＬおよびカスパーゼ８のノックダウン
ＲＩＰＫ３およびＭＬＫＬは、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）の特異的な調節因子であると考えられている（Ｎｅｗｔｏｎら、２０１４年；Ｗａｎｇら、２０１４年）。インビトロでの内皮細胞におけるＲＩＰＫ３またはＭＬＫＬのノックダウンは、腫瘍細胞の誘導する内皮ネクロトーシス性細胞死を遮断した（図７（Ａ））。これとは対照的に、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）の主要な負の調節因子の１つである、カスパーゼ−８のノックダウン（Ｇｕｎｔｈｅｒら、２０１１年；Ｏｂｅｒｓｔら、２０１１年）、は、腫瘍細胞が誘導した内皮ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）の増加を齎した（図７（Ａ））。また、腫瘍細胞によって誘導される内皮細胞のネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）の程度は、内皮細胞層の上に移行する腫瘍細胞の能力と相関した（図７（Ａ）と図７（Ｂ）を比較する。）。
さらに、ＲＩＰＫ３の欠損が、インビボでの、腫瘍細胞により誘導される内皮細胞死、腫瘍細胞の血管外滲出および転移形成に影響するかどうかをテストするために、内皮細胞特異的ノックアウトマウスを、タモキシフェン誘導性のＴｉｅ２−ＣｒｅＥＲＴ２の動物（Ｋｏｒｈｏｎｅｎら、２００９年）と、ＲＩＰＫ３のｆｌｏｘｅｄ対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅｓ）（Ｔｉｅ２−ＣｒｅＥＲＴ２；ＲＩＰＫ３ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ，以下、ＲＩＰＫ３ＥＣＫＯと呼ぶ）を有するマウスとを交配させることによって生成した。しかし、ＲＩＰＫ３の内皮細胞特異的欠損を有する動物は、腫瘍細胞注射後６時間で、ＥｔｈＤ−ＩＩＩ陽性内皮細胞数の減少および血管外滲出（ｅｘｔｒａｖａｓａｔｅｄ）した腫瘍細胞数の減少を示し、そして、これらの動物は、より少数の転移を発症した（図７（Ｃ）乃至（Ｆ））。
【０２２２】
実施例８：ＤＲ６は異なるヒトの臓器に発現する
また、異なる血管床のマウスおよびヒトの内皮細胞でも、発現されることが見出されたＤＲ６（図８）は、細胞死のシグナル伝達を可能にする、細胞質のデス  ドメインを含有する、ＴＮＦ受容体ファミリーのサブグループに属する（Ｌａｖｒｉｋら、２００５年；Ｐａｎら、１９９８年）。
【０２２３】
実施例９：ＤＲ６のリガンド結合による、ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）の誘導
ＤＲ６は、腫瘍細胞によって誘導される内皮のネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）と転移を促進するので、ＤＲ６に結合するリガンドは、これらの効果のために必要か否かを試験した。推定リガンドに対する内因性ＤＲ６と競合するために、Ｆｃフラグメントに融合したＤＲ６外部ドメイン（ＤＲ６−Ｆｃ）−デコイ受容体として機能する−を使用した。ＤＲ６−Ｆｃを用いた動物の処置は、内皮ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）および腫瘍細胞滲出（ｅｘｔｒａｖａｓａｔｉｏｎ）を減少させるのに十分であり、そして、これらの動物はまた、より少ない転移（図９（Ａ）乃至（Ｄ））を発症した。
【０２２４】
実施例１０：ＤＲ６リガンドのさらなる機能的特徴
ＤＲ６の以前に同定されたリガンドは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）であり（ニコラエフら、２００９年）、それは非常に高く、神経系（Ａｙｄｉｎら、２０１２年；ＭｕｌｌｅｒおよびＺｈｅｎｇ，２０１２年）と同様に、腫瘍細胞を含むいくつかの細胞系（Ｈａｎｓｅｌら、２００３年；Ｋｒａｕｓｅら、２００８年；Ｍｅｎｇら、２００１年；Ｔａｋａｇｉら、２０１３年；ＷｏｏｄｓおよびＰａｄｍａｎａｂｈａｎ、２０１３年）において発現しており、そして、プログラムされた細胞死を誘導することができる（Ｎｉｋｏｌａｅｖら、２００９年）。これは、ＡＰＰ  ｍＲＮＡの発現レベルが、ｓｉＲＮＡ媒介ノックダウンを使用した、３％未満に減少された腫瘍細胞が、内皮ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）を誘導する能力を失い、対照のｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた腫瘍細胞と比較した場合、内皮細胞層を遊出（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔ）する能力が著しく低下したことを見出した（図１２（Ａ）および（Ｂ））。
野生型動物において、一時的に減少したＡＰＰ発現（図１１（Ａ））を有する腫瘍細胞を、静脈内に注射した後、本発明者は、これらの動物の肺において、ネクロトーシス性内皮細胞および血管外滲出（ｅｘｔｒａｖａｓａｔｅｄ）した腫瘍細胞数（図１２（Ｃ）乃至（Ｆ））の有意な減少を発見した。重要なことは、強く減少したＡＰＰ発現を有する腫瘍細胞は、正常な増殖、細胞生存および基底遊走活性を示し（図１１（Ｂ）乃至（Ｄ））、しかし、ほぼ完全に、転移を形成する能力を喪失した（図１２（Ｃ）乃至（Ｆ））。これは、腫瘍細胞および内皮ＤＲ６によって発現されたＡＰＰは、腫瘍細胞によって誘導される内皮ネクロトーシス（ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ）に必要であり、そして、この活性は、腫瘍細胞の血管外滲出（ｅｘｔｒａｖａｓａｔｉｏｎ）および転移形成を促進することを示す。
【０２２５】
［更なる参考文献］
Ｃｈｏ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｌｌａ，Ｓ．，Ｍｏｑｕｉｎ，Ｄ．，Ｇｅｎｇａ，  Ｒ．，Ｒａｙ，Ｔ．Ｄ．，Ｇｕｉｌｄｆｏｒｄ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｃｈａｎ，Ｆ．Ｋ．（２００９）．Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ−ｄｒｉｖｅｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＲＩＰ１−ＲＩＰ３  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｖｉｒｕｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ  １３７，１１１２−１１２３．
Ｄｉｌｌｏｎ，Ｃ．Ｐ．，Ｏｂｅｒｓｔ，Ａ．，Ｗｅｉｎｌｉｃｈ，Ｒ．，Ｊａｎｋｅ，Ｌ．Ｊ．，Ｋａｎｇ，Ｔ．Ｂ．，Ｂｅｎ−Ｍｏｓｈｅ，Ｔ．，Ｍａｋ，Ｔ．Ｗ．，Ｗａｌｌａｃｈ，Ｄ．，  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎ，Ｄ．Ｒ．（２０１２）．Ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＦＡＤＤ−ＣＡＳＰＡＳＥ−８−ｃＦＬＩＰ（Ｌ）  ｃｏｍｐｌｅｘ．  Ｃｅｌｌ  ｒｅｐｏｒｔｓ  １，  ４０１−４０７．
Ｄｉｌｌｏｎ，Ｃ．Ｐ．，Ｗｅｉｎｌｉｃｈ，Ｒ．，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｄ．Ａ．，Ｃｒｉｐｐｓ，Ｊ．Ｇ．，Ｑｕａｒａｔｏ，Ｇ．，Ｇｕｒｕｎｇ，Ｐ．，Ｖｅｒｂｉｓｔ，Ｋ．Ｃ．，Ｂｒｅｗｅｒ，Ｔ．Ｌ．，Ｌｌａｍｂｉ，Ｆ．，Ｇｏｎｇ，Ｙ．Ｎら（２０１４）．ＲＩＰＫ１  Ｂｌｏｃｋｓ  Ｅａｒｌｙ  Ｐｏｓｔｎａｔａｌ  Ｌｅｔｈａｌｉｔｙ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  Ｃａｓｐａｓｅ−８  ａｎｄ  ＲＩＰＫ３．Ｃｅｌｌ．
Ｈｅｙｄｅｒ，Ｃ．，Ｇｌｏｒｉａ−Ｍａｅｒｃｋｅｒ，Ｅ．，Ｅｎｔｓｃｈｌａｄｅｎ，Ｆ．，Ｈａｔｚｍａｎｎ，Ｗ．，Ｎｉｇｇｅｍａｎｎ，Ｂ．，Ｚａｎｋｅｒ，Ｋ．Ｓ．，およびＤｉｔｔｍａｒ，Ｔ．（２００２）．Ｒｅａｌｔｉｍｅ  ｖｉｓｕａｌｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ／ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ａｃｒｏｓｓ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｂａｒｒｉｅｒ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １２８，５３３−５３８．
Ｊｏｙｃｅ，Ｊ．Ａ．，ａｎｄ  Ｐｏｌｌａｒｄ，Ｊ．Ｗ．（２００９）．Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ９，２３９−２５２．
Ｋｅｂｅｒｓ，Ｆ．，Ｌｅｗａｌｌｅ，Ｊ．Ｍ．，Ｄｅｓｒｅｕｘ，Ｊ．，Ｍｕｎａｕｔ，Ｃ．，Ｄｅｖｙ，Ｌ．，Ｆｏｉｄａｒｔ，Ｊ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｎｏｅｌ，  Ａ．（１９９８）．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｂｙ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２４０，１９７−２０５．
Ｌａｂｅｌｌｅ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｈｙｎｅｓ，Ｒ．Ｏ．（２０１２）．Ｔｈｅ  ｉｎｉｔｉａｌ  ｈｏｕｒｓ  ｏｆ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ：ｔｈｅ  ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｈｏｓｔ−ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｈｅｍａｔｏｇｅｎｏｕｓ  ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ２，１０９１−１０９９．
Ｌｉｎ，Ｊ．，Ｌｉ，Ｈ．，Ｙａｎｇ，Ｍ．，Ｒｅｎ，Ｊ．，Ｈｕａｎｇ，Ｚ．，Ｈａｎ，Ｆ．，Ｈｕａｎｇ，Ｊ．，Ｍａ，Ｊ．，Ｚｈａｎｇ，Ｄ．，Ｚｈａｎｇ，Ｚ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．Ａ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＲＩＰ３−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｃｅｌｌ  ｒｅｐｏｒｔｓ  ３，２００−２１０．
Ｌｉｎ，Ｒ．Ｚ．，Ｗａｎｇ，Ｔ．Ｐ．，Ｈｕｎｇ，Ｒ．Ｊ．，Ｃｈｕａｎｇ，Ｙ．Ｊ．，Ｃｈｉｅｎ，Ｃ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｃｈａｎｇ，Ｈ．Ｙ．（２０１１）．Ｔｕｍｏｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ：ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ  ｏｘｉｄａｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２２６，１７５０−１７６２．
Ｌｉｎｋｅｒｍａｎｎ，Ａ．，Ｂｒａｓｅｎ，Ｊ．Ｈ．，Ｈｉｍｍｅｒｋｕｓ，Ｎ．，Ｌｉｕ，Ｓ．，Ｈｕｂｅｒ，Ｔ．Ｂ．，Ｋｕｎｚｅｎｄｏｒｆ，Ｕ．，ａｎｄ  Ｋｒａｕｔｗａｌｄ，Ｓ．（２０１２）．Ｒｉｐ１（ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  １）  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ｒｅｎａｌ  ｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｙ．  Ｋｉｄｎｅｙ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ８１，７５１−７６１．
Ｌｉｎｋｅｒｍａｎｎ，Ａ．，ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎ，Ｄ．Ｒ．（２０１４）．Ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ．Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３７０，４５５−４６５．
Ｍｉｅｒｋｅ，Ｃ．Ｔ．（２００８）．  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ：  ｉｓ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ  ａ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｏｒ  ａ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ？  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ２００８，１８３５１６．
Ｍｏｒｉｏｋａ，Ｓ．，Ｉｎａｇａｋｉ，Ｍ．，Ｋｏｍａｔｓｕ，Ｙ．，Ｍｉｓｈｉｎａ，Ｙ．，Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｋ．，  ａｎｄ  Ｎｉｎｏｍｉｙａ−Ｔｓｕｊｉ，Ｊ．（２０１２）．ＴＡＫ１  ｋｉｎａｓｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎｄ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ．  Ｂｌｏｏｄ  １２０，３８４６−３８５７．
Ｍｕｒｐｈｙ，Ｊ．Ｍ．，  ａｎｄ  Ｓｉｌｋｅ，Ｊ．（２０１４）．Ａｒｓ  Ｍｏｒｉｅｎｄｉ；  ｔｈｅ  ａｒｔ  ｏｆ  ｄｙｉｎｇ  ｗｅｌｌ  −  ｎｅｗ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｏｆ  ｎｅｃｒｏｐｔｏｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ．  ＥＭＢＯ  ｒｅｐｏｒｔｓ  １５，１５５−１６４．
Ｒｅｙｍｏｎｄ，Ｎ．，ｄ’Ａｇｕａ，Ｂ．Ｂ．，ａｎｄ  Ｒｉｄｌｅｙ，Ａ．Ｊ．（２０１３）．Ｃｒｏｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｄｕｒｉｎｇ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  １３，８５８−８７０．
Ｓａｗａｉ，Ｈ．，  ａｎｄ  Ｄｏｍａｅ，Ｎ．（２０１１）．Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ａｎｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｂｙ  ｎｅｃｒｏｓｔａｔｉｎ−１  ｉｎ  Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ／ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｅｌｌｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ４１１，５６９−５７３．
Ｓｍｉｔｈ，Ｃ．Ｃ．，Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｓ．Ｍ．，Ｌｉｍ，Ｓ．Ｙ．，Ｓｉｍｐｋｉｎ，Ｊ．Ｃ．，Ｈｏｔｈｅｒｓａｌｌ，Ｊ．Ｓ．，  ａｎｄ  Ｙｅｌｌｏｎ，Ｄ．Ｍ．（２００７）．Ｎｅｃｒｏｓｔａｔｉｎ：  ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙ  ｎｏｖｅｌ  ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ？  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ  ／  ｓｐｏｎｓｏｒｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ  ２１，  ２２７−２３３．
Ａｙｄｉｎ，Ｄ．，Ｗｅｙｅｒ，Ｓ．Ｗ．，ａｎｄ  Ｍｕｌｌｅｒ，Ｕ．Ｃ．（２０１２）．Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＰＰ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ：  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｆｒｏｍ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌｓ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｂｒａｉｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２１７，４２３−４３４．
Ｂｅｉｓｎｅｒ，Ｄ．Ｒ．，Ｃｈ’ｅｎ，Ｉ．Ｌ．，Ｋｏｌｌａ，Ｒ．Ｖ．，Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ａ．，  ａｎｄ  Ｈｅｄｒｉｃｋ，Ｓ．Ｍ．（２００５）．Ｃｕｔｔｉｎｇ  ｅｄｇｅ：ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｃｏｎｆｅｒｒｅｄ  ｂｙ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ  ｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｃａｓｐａｓｅ−８．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １７５，３４６９−３４７３．
Ｇｕｎｔｈｅｒ，Ｃ．，Ｍａｒｔｉｎｉ，Ｅ．，Ｗｉｔｔｋｏｐｆ，Ｎ．，Ａｍａｎｎ，Ｋ．，Ｗｅｉｇｍａｎｎ，Ｂ．，Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｈ．，Ｗａｌｄｎｅｒ，Ｍ．Ｊ．，Ｈｅｄｒｉｃｋ，Ｓ．Ｍ．，Ｔｅｎｚｅｒ，Ｓ．，Ｎｅｕｒａｔｈ，Ｍ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．Ｃａｓｐａｓｅ−８  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ＴＮＦ−ａｌｐｈａ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｉｌｅｉｔｉｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４７７，３３５−３３９．
Ｈａｎｓｅｌ，Ｄ．Ｅ．，Ｒａｈｍａｎ，Ａ．，Ｗｅｈｎｅｒ，Ｓ．，Ｈｅｒｚｏｇ，Ｖ．，Ｙｅｏ，Ｃ．Ｊ．，  ａｎｄ  Ｍａｉｔｒａ，Ａ．（２００３）．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｍａｙ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６３，７０３２−７０３７．
Ｋｏｒｈｏｎｅｎ，Ｈ．，Ｆｉｓｓｌｔｈａｌｅｒ，Ｂ．，Ｍｏｅｒｓ，Ａ．，Ｗｉｒｔｈ，Ａ．，Ｈａｂｅｒｍｅｈｌ，Ｄ．，Ｗｉｅｌａｎｄ，Ｔ．，Ｓｃｈｕｔｚ，Ｇ．，Ｗｅｔｔｓｃｈｕｒｅｃｋ，Ｎ．，Ｆｌｅｍｉｎｇ，Ｉ．，  ａｎｄ  Ｏｆｆｅｒｍａｎｎｓ，Ｓ．（２００９）．Ａｎａｐｈｙｌａｃｔｉｃ  ｓｈｏｃｋ  ｄｅｐｅｎｄｓ  ｏｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｑ／Ｇ１１．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０６，４１１−４２０．
Ｋｒａｕｓｅ，Ｋ．，Ｋａｒｇｅｒ，Ｓ．，Ｓｈｅｕ，Ｓ．Ｙ．，Ａｉｇｎｅｒ，Ｔ．，Ｋｕｒｓａｗｅ，Ｒ．，Ｇｉｍｍ，Ｏ．，Ｓｃｈｍｉｄ，Ｋ．Ｗ．，Ｄｒａｌｌｅ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｆｕｈｒｅｒ，Ｄ．（２００８）．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｔｈｙｒｏｉｄ  ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １９８，２９１−２９９．
Ｌａｖｒｉｋ，Ｉ．，Ｇｏｌｋｓ，Ａ．，ａｎｄ  Ｋｒａｍｍｅｒ，Ｐ．Ｈ．（２００５）．Ｄｅａｔｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｓｃｉｅｎｃｅ  １１８，２６５−２６７．
Ｌｉａｎｇ，Ｃ．Ｃ．，Ｐａｒｋ，Ａ．Ｙ．，  ａｎｄ  Ｇｕａｎ，Ｊ．Ｌ．（２００７）．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｃｒａｔｃｈ  ａｓｓａｙ：  ａ  ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ  ａｎｄ  ｉｎｅｘｐｅｎｓｉｖｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ２，３２９−３３３．
Ｍｅｎｇ，Ｊ．Ｙ．，Ｋａｔａｏｋａ，Ｈ．，Ｉｔｏｈ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｋｏｏｎｏ，Ｍ．（２００１）．Ａｍｙｌｏｉｄ  ｂｅｔａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｉｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｄｕ  ｃａｎｃｅｒ  ９２，  ３１−３９．
Ｍｕｌｌｅｒ，Ｕ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｚｈｅｎｇ，Ｈ．（２０１２）．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＡＰＰ  ｆａｍｉｌｙ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２，ａ００６２８８．
【図１】
2017526670.tif 000002
【図２】
2017526670.tif 000003
【図３−１】
2017526670.tif 000004
【図３−２】
2017526670.tif 000005
【図４−１】
2017526670.tif 000006
【図４−２】
2017526670.tif 000007
【図５−１】
2017526670.tif 000008
【図５−２】
2017526670.tif 000009
【図６−１】
2017526670.tif 000010
【図６−２】
2017526670.tif 000011
【図７−１】
2017526670.tif 000012
【図７−２】
2017526670.tif 000013
【図８】
2017526670.tif 000014
【図９−１】
2017526670.tif 000015
【図９−２】
2017526670.tif 000016
【図１０】
2017526670.tif 000017
【図１１】
2017526670.tif 000018
【図１２−１】
2017526670.tif 000019
【図１２−２】
2017526670.tif 000020
【図１３】
2017526670.tif 000021
【配列表】
2017526670000001.app
【国際調査報告】
2017526670.tif 000022
2017526670.tif 000023
2017526670.tif 000024
2017526670.tif 000025
2017526670.tif 000026
2017526670.tif 000027
2017526670.tif 000028