(57)【要約】  対象の全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を診断するための方法及びキットが提供される。具体的には、本発明は、対象のＳＬＥの診断で有用な特定のオリゴヌクレオチド抗体の反応性に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を診断する方法であって、
（ｉ）前記対象からサンプルを得る工程と、
（ｉｉ）（ａ）ＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号４２）、ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧ（配列番号７）、ＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧ（配列番号５）、ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧ（配列番号２８）、及びＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号８）、又は
（ｂ）ＣＣＡＴＡＡＴＴＧＣＡＡＡＣＧＴＴＣＴＧ（配列番号１）及びＣＣＡＴＡＡＴＴＧＣＡＡＡＧＣＴＴＣＴＧ（配列番号３）、又は
（ｃ）ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号２２）
から成る群から選択される少なくとも１種のオリゴヌクレオチド抗原に対する前記サンプル中の抗体の反応性を決定する工程と、
（ｉｉｉ）前記サンプル中の前記抗体の反応性と健常な対照の反応性とを比較する工程と
を含み、
前記健常な対照の反応性と比較して前記サンプル中の前記抗体の有意に高い反応性は、前記対象がＳＬＥに罹患しているという指標である、上記方法。
【請求項２】
前記少なくとも１種のオリゴヌクレオチド抗原が、配列番号４２、配列番号７、配列番号５、配列番号２８及び配列番号８から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１種のオリゴヌクレオチド抗原が配列番号１又は配列番号３から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１種のオリゴヌクレオチド抗原が配列番号２２である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体の反応性がＩｇＧの反応性及びＩｇＭの反応性を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記サンプル中の前記抗体の有意に高い反応性がＩｇＧの反応性及びＩｇＭの反応性の増加を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＩｇＭの反応性の増加が、配列番号４２、配列番号７、配列番号５、配列番号２８、配列番号８、配列番号１、配列番号３及び配列番号２２から成る群から選択される少なくとも１種のオリゴヌクレオチド抗原に対するものである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＩｇＧの反応性の増加が、配列番号４２、配列番号７、配列番号５、配列番号２８、配列番号８、配列番号１、配列番号３及び配列番号２２から成る群から選択される少なくとも１種のオリゴヌクレオチド抗原に対するものである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記対象がｄｓＤＮＡ抗体に対して陽性である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記対象がｄｓＤＮＡ抗体に対して陰性である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記サンプルが、血清サンプル、血漿サンプル及び血液サンプルから成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記サンプルが血清サンプルである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記健常な対照の反応性が、少なくとも１例の健常な個体の反応性、一群の健常な個体からの一団の対照サンプル、及び健常な対照の個体からの保存された一群のデータから成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
複数種の前記オリゴヌクレオチド抗原に対する前記サンプル中の前記抗体の反応性を決定する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
配列番号４２、配列番号７、配列番号５、配列番号２８、配列番号８、配列番号１、配列番号３、及び配列番号２２から成る群から選択される少なくとも１種のオリゴヌクレオチド抗原と、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２８、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号６５、配列番号６６及び配列番号６７から成る群から選択される少なくとも１種の追加のオリゴヌクレオチド抗原とに対する前記サンプル中の前記抗体の反応性を決定する工程を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
配列番号４２、配列番号７、配列番号５、配列番号２８、配列番号８、配列番号１、配列番号３、及び配列番号２２から成る群から選択される少なくとも２種のオリゴヌクレオチド抗原に対する前記サンプル中の前記抗体の反応性を決定する工程を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記複数種の抗原を抗原プローブセット、抗原アレイ又は抗原チップの形で使用する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
対象の全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を診断する方法であって、
（ｉ）前記対象からサンプルを得る工程と、
（ｉｉ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２８、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号６５、配列番号６６及び配列番号６７から成る群から選択される複数種のオリゴヌクレオチド抗原に対する前記サンプル中の前記抗体の反応性を決定する工程と、
（ｉｉｉ）前記サンプル中の前記抗体の反応性と健常な対照の反応性とを比較する工程と
を含み、
前記健常な対照の反応性と比較して前記サンプル中の前記抗体の有意に高い反応性は、前記対象がＳＬＥに罹患しているという指標である、上記方法。
【請求項１９】
前記抗体の反応性がＩｇＧの反応性及びＩｇＭの反応性を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記サンプル中の前記抗体の有意に高い反応性がＩｇＧの反応性及びＩｇＭの反応性の増加を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記対象がｄｓＤＮＡ抗体に対して陽性である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記対象がｄｓＤＮＡ抗体に対して陰性である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記サンプルが、血清サンプル、血漿サンプル及び血液サンプルから成る群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記健常な対照の反応性が、少なくとも１例の健常な個体の反応性、一群の健常な個体からの一団の対照サンプル、及び健常な対照の個体からの保存された一群のデータから成る群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
前記複数種の抗原を抗原プローブセット、抗原アレイ又は抗原チップの形で使用する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２８、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号６５、配列番号６６及び配列番号６７から成る群から選択される複数種のオリゴヌクレオチド抗原プローブを含む抗原プローブセット。
【請求項２７】
請求項２６に記載の抗原プローブセットを含む製品。
【請求項２８】
抗原プローブアレイの形の、又は抗原チップの形の、又はディップスティックの形の、又はラテラルフロー試験の形の請求項２７に記載の製品。
【請求項２９】
請求項１に記載の方法を実施するための手段又はＳＬＥを診断するためのキットの使用説明書を更に含むキットの形の請求項２７又は２８に記載の製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対象の全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）等の自己免疫障害の診断で有用なオリゴヌクレオチド抗原に関する。
【背景技術】
【０００２】
原型的自己免疫疾患である全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は、広範囲の自己抗体と関連している。ＤＮＡ、ヌクレオソーム、ヒストン、ウイルス抗原、転写因子等の１００種を超える様々な抗原に対するＩｇＧ抗体が様々なＳＬＥ患者で報告されている（Ｓｈｅｒｅｒ他、２００４、Ｓｅｍｉｎ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｒｈｅｕｍ．３４：５０１〜３７）。驚いたことに、ＳＬＥの血清学的診断は存在せず、ＳＬＥは、米国リウマチ学会（ＡＣＲ）により定義された１１個の基準に基づいて診断される。この基準として、頬部発疹、円板状発疹、光線過敏症、口腔潰瘍、関節炎、漿膜炎、腎障害、神経障害、血液障害（例えば、白血球減少症、リンパ球減少症、溶血性貧血又は血小板減少症）、免疫学的障害、並びに抗体異常（特に、抗核抗体（ＡＮＡ）及び抗ＤＮＡ抗体）が挙げられる（Ｔａｎ他、１９９７、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  １９９７、４０：１７２５）。この基準に従って、対象は、１１個の基準の内の少なくとも４個が満たされる場合にＳＬＥと臨床的に診断され得る。Ｐｅｔｒｉ他（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ、２０１２、第６４巻、２６７７〜２６８６頁）で概説されているように、近年、全身性ループス協力クリニック（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｌｕｐｕｓ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｎｇ  Ｃｌｉｎｉｃｓ）（ＳＬＩＣＣ）がこの基準を改訂した。それにもかかわらず、存在する基準が４個未満の場合であっても依然としてＳＬＥの可能性がある。
【０００３】
ＳＬＥの正確な病理は不明ではあるが、自己抗体が重要な役割を果たすことが広く認められている。ＤＮＡに対する自己抗体は、その結合活性、免疫グロブリンサブクラスの組成、交差反応性及び補体固定能力に関して非常に不均一である。ＤＮＡ自己抗体の検出のために、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）及び放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）等の多くの技法が利用されている。しかしながら、抗二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）抗体の臨床的価値は、この抗体を定量的に及び免疫学的に特徴付けるために使用される方法のアッセイ原理及び分析変数に大きく依存する。
【０００４】
Ｐａｒｋ及び共同研究者（Ｐａｒｋ他、「抗ＤＮＡ抗体の一次構造及び鎖の優位性（Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｃｈａｉｎ  Ｄｏｍｉｎａｎｃｅ  ｏｆ  Ａｎｔｉ−ＤＮＡ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ、２００１、第１１巻（１）、５５〜６３頁）は、いくつかのｄｓＤＮＡ標的との相互作用におけるいくつかの抗ＤＮＡ自己抗体の重鎖及び軽鎖の相対的関与を調査しており、それらの中には（ＧＡ）２−（ＴＣ）２（本明細書に記載した配列番号６８に対応する）がある。
【０００５】
Ｈｅｒｋｅｌ及び共同研究者（Ｈｅｒｋｅｌ他、「ｐ５３のＤＮＡ結合ドメインに対するモノクローナル抗体はＤＮＡの電荷構造を模倣する：抗ｐ５３抗体に対する抗イディオタイプは抗ＤＮＡである（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ａ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｐ５３  ｍｉｍｉｃｓ  ｃｈａｒｇｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ＤＮＡ：ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｙｐｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ａｎｔｉ−ｐ５３  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｒｅ  ａｎｔｉ−ＤＮＡ）」、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００４、第３４巻、３６２３〜３６３２頁）は、本発明者らの一部に加えて、ＰＡｂ−４２１（ｐ５３のＣ末端ＤＮＡ結合ドメインと反応する原型のモノクローナル抗体）に対して産生された２種の抗イディオタイプモノクローナル抗体（Ｉｄｉ１及びＩｄｉ２）を調査した。これらの抗体がＰＡｂ−４２１及びＤＮＡの両方を特異的に認識することが分かった。加えて、両方の抗体は、一本鎖ポリＧ標的であるＧ２０（配列番号４３に対応する）及びＴ２Ｇ１６Ｔ２（本明細書に記載した配列番号１０に対応する）に特異的に結合することができた。しかしながら、これらの抗体は、ポリＴ標的、ポリＣ標的又はポリＡ標的に結合しなかった。
【０００６】
Ｐ．Ｌｅｎｅｒｔ（「全身性エリテマトーデスにおける核酸感知受容体：ループスを処置するための新規のＤＮＡ様の及び／又はＲＮＡ様の類似体の開発（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｎｓｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ：ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ＤＮＡ−  ａｎｄ／ｏｒ  ＲＮＡ−ｌｉｋｅ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｉｎｇ  ｌｕｐｕｓ）」、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２０１０、第１６１巻、２０８〜２２２頁）は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）での自己免疫の原因の一因となると考えられる遺伝因子、後成因子、性別に関連する因子及び環境因子を概説した。Ｌｅｎｅｒｔは、自己免疫の発症を予防することを目的とするいくつかの抑制性オリゴヌクレオチド（ＩＮＨ−ＯＤＮ）を更に概説しており、それらの中には（ＴＴＡＧＧＧ）４（本配列番号６６に対応する）がある
【０００７】
本発明者らの一部に対する国際特許出願公報第ＷＯ１１／０９９０１２号は、特定の抗体プロファイルを使用して対象の全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を診断するための方法及びキットに関する。’０１２公報には、特にエプスタイン・バー（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）ウイルス（ＥＢＶ）に対するＩｇＧの反応性が増加している患者が開示されている。特定の抗体プロファイルを使用する自己免疫疾患の診断を開示している更なる特許及び特許出願として、ＷＯ１０／０５５５１０、ＷＯ１２／０５２９９４、ＵＳ２００５／０２６０７７０及びＵＳ８０１０２９８が挙げられる。更に、米国特許出願公開第２０１２／０１２２７２０号は、個体における心疾患の発症、例えば急性心筋梗塞のプロセスを認識することに関する。本発明者らの一部の国際特許出願公開第ＷＯ２０１４／０９１４９０号は、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）に由来する抗原のアレイに対する特定の抗体プロファイルを使用することによりＳＬＥ又は強皮症を診断する方法に関する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＳＬＥ等の複雑な自己免疫疾患の臨床管理における最大の難問の内の１つは、患者の疾患の正確な及び早期の特定である。対象のＳＬＥの診断で有用な改良型の診断方法及び診断キットの必要性が残っている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、自己免疫障害を診断するための方法及びキット、特に全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を診断するための方法及びキットを提供する。本発明は、そのような診断を実行するための抗原プローブアレイ及びそのようなアレイを生成するための抗原プローブセットを更に提供する。
【００１０】
本発明は、その他の自己免疫状態と比較して、特に強皮症患者及び天疱瘡患者と比較して、並びに健常な対照と比較して、ＳＬＥ患者の抗体反応性の試験時に得た予期しない結果にある程度基づいている。驚いたことに、試験したＳＬＥ患者において、健常な対照と比較して特定のポリヌクレオチド抗原に対する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）及びＩｇＭの反応性の増加が発見された。そのため、本発明は、ＳＬＥを示す独特のオリゴヌクレオチド抗原を提供する。本発明は、ＳＬＥに関連している抗原−自己抗体反応性パターンを更に提供する。特定の実施形態では、本発明は、指標的なオリゴヌクレオチド抗原又はこの反応性パターンに基づいて、ＳＬＥを診断するための特異性が高く信頼性があり正確で識別力のあるアッセイを提供する。
【００１１】
そのため、本発明の実施形態によれば、ＳＬＥの悪化を診断する及びモニタリングする新規の方法が提供される。本発明の実施形態によれば、この方法は、本明細書に記載した少なくとも１種のオリゴヌクレオチド抗原に対する、対象から得た又は対象に由来するサンプル中の抗体の反応性を決定することを含む。本発明の方法は、少なくとも１種のオリゴヌクレオチド抗原に対するサンプル中の抗体の反応性と前記少なくとも１種のオリゴヌクレオチド抗原に対する対照の反応性とを比較する工程を更に含む。ある実施形態によれば、健常な対照の反応性と比較してサンプル中の抗体の有意に高い反応性は、対象がＳＬＥに罹患しているという指標である。
【００１２】
そのため、第１の態様によれば、本発明は、対象の全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を診断する方法であって、対象からサンプルを得る工程と、ＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号４２）、ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧ（配列番号７）、ＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧ（配列番号５）、ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧ（配列番号２８）、及びＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号８）；又はＣＣＡＴＡＡＴＴＧＣＡＡＡＣＧＴＴＣＴＧ（配列番号１）及びＣＣＡＴＡＡＴＴＧＣＡＡＡＧＣＴＴＣＴＧ（配列番号３）；又はＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号２２）から成る群から選択される少なくとも１種のオリゴヌクレオチド抗原に対するサンプル中の抗体の反応性を決定する工程と、サンプル中の抗体の反応性と健常な対照の反応性とを比較する工程とを含み、健常な対照の反応性と比較してサンプル中の抗体の有意に高い反応性は、対象がＳＬＥに罹患しているという指標である、上記方法を提供する。
【００１３】
明確に明らかなように、ＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号４２）、ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧ（配列番号７）、ＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧ（配列番号５）、ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧ（配列番号２８）、及びＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号８）は、共通の連続したコンセンサスモチーフ、即ち１個又は２個のグアノシン残基が先行する又は後続する一続きの少なくとも１６個の連続したチミンヌクレオチドを共有する。更に明らかなように、ＣＣＡＴＡＡＴＴＧＣＡＡＡＣＧＴＴＣＴＧ（配列番号１）及びＣＣＡＴＡＡＴＴＧＣＡＡＡＧＣＴＴＣＴＧ（配列番号３）も、共通の連続したコンセンサスモチーフ、即ちＣＧＴＴＣＴＧ（配列番号７０）又はＧＣＴＴＣＴＧ（配列番号７１）の何れかが後続するＣＣＡＴＡＡＴＴＧＣＡＡＡ（配列番号６９）を共有する。
【００１４】
別の態様によれば、本発明は、対象の全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を診断する方法であって、対象からサンプルを得る工程と、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２８、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号６５、配列番号６６及び配列番号６７から成る群から選択される複数種のオリゴヌクレオチド抗原に対するサンプル中の抗体の反応性を決定する工程と、サンプル中の抗体の反応性と健常な対照の反応性とを比較する工程とを含み、健常な対照の反応性と比較してサンプル中の抗体の有意に高い反応性は、対象がＳＬＥに罹患しているという指標である、上記方法を提供する。
【００１５】
ある実施形態では、健常な対照の反応性と比較してサンプル中の抗体の有意に高い反応性は、対象がＳＬＥに罹患している可能性が高いという指標である。その他のある実施形態では、健常な対照の反応性と比較してサンプル中の抗体の反応性が有意に高くない場合、健常な対照の反応性と比較してサンプル中の抗体の反応性が同じである場合、健常な対照の反応性と比較してサンプル中の抗体の反応性が低い場合、又は健常な対照の反応性と比較してサンプル中の抗体の反応性が有意に低い場合、このことは、対象がＳＬＥに罹患している可能性が低いという指標である。それぞれの可能性は本発明の別々の実施形態を表す。
【００１６】
本発明の方法のある実施形態では、この方法は、対象からサンプルを得ること又は取り出すことを含む工程から始まる。ある実施形態では、サンプルを非侵襲的な手段又は方法により対象から得る又は取り出す。
【００１７】
ある実施形態では、複数種のオリゴヌクレオチド抗原に対するサンプル中の抗体の反応性を決定することにより反応性パターンが作られ、対象のＳＬＥの診断に使用される。そのため、本発明の例示的な実施形態によれば、複数種のオリゴヌクレオチド抗原に対するサンプル中の抗体の反応性パターンと、前記複数種のオリゴヌクレオチド抗原に対する健常な対照の対象に対応するサンプル中の抗体の反応性パターンとを比較し、サンプルの反応性パターンと健常な対照の反応性パターンとの間の有意差（典型的には上昇）は、対象がＳＬＥに罹患していることを示す、又はその他の実施では、対象がＳＬＥを有する可能性が高いことを示す。例えば本明細書に記載した学習及びパターン認識アルゴリズムを使用して、反応性パターンを算出して比較することが好都合である。
【００１８】
いくつかの実施形態によれば、少なくとも１種のオリゴヌクレオチド抗原は、配列番号４２、配列番号７、配列番号５、配列番号２８及び配列番号８から成る群から選択される。追加の実施形態によれば、少なくとも１種のオリゴヌクレオチド抗原は配列番号１又は配列番号３から選択される。追加の実施形態によれば、少なくとも１種のオリゴヌクレオチド抗原は配列番号２２である。それぞれの可能性は本発明の別々の実施形態を表す。
【００１９】
別の実施形態によれば、抗体の反応性はＩｇＧの反応性及びＩｇＭの反応性を含む。別の実施形態によれば、サンプル中の抗体の有意に高い反応性は、ＩｇＧの反応性及び／又はＩｇＭの反応性の増加を含む。別の実施形態によれば、ＩｇＭの反応性の増加は、配列番号４２、配列番号７、配列番号５、配列番号２８、配列番号８、配列番号１、配列番号３及び配列番号２２から成る群から選択される少なくとも１種のオリゴヌクレオチド抗原に関するものである。別の実施形態によれば、ＩｇＧの反応性の増加は、配列番号４２、配列番号７、配列番号５、配列番号２８、配列番号８、配列番号１、配列番号３及び配列番号２２から成る群から選択される少なくとも１種のオリゴヌクレオチド抗原に関するものである。それぞれの可能性は本発明の別々の実施形態を表す。
【００２０】
ある実施形態では、対象は、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に対する抗体に対して陽性である。その他のある実施形態では、対象は、ｄｓＤＮＡに対する抗体に対して陰性である。別途に示さない限り、全ての一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）サンプル及びｄｓＤＮＡサンプルは仔ウシのｓｓＤＮＡサンプル及びｄｓＤＮＡサンプルである。
【００２１】
本発明の方法の追加の実施形態によれば、対象から得るサンプルは生体液である。いくつかの実施形態によれば、サンプルは、血漿、血清、血液、脳脊髄液、滑液、痰、尿、唾液、涙、リンパ液検体又は当分野で既知のあらゆるその他の生体液から成る群から選択される。それぞれの可能性は本発明の別々の実施形態を表す。ある実施形態によれば、対象から得るサンプルは、血清、血漿及び血液から成る群から選択される。一実施形態によれば、サンプルは血清サンプルである。ある実施形態によれば、サンプルを非侵襲的な手段又は方法により対象から得る、又は取り出す。
【００２２】
本発明の方法のある実施形態によれば、対照は、少なくとも１例の健常な個体からのサンプル、一群の健常な個体からの一団の対照サンプル、及び健常な個体からの保存された一群のデータから成る群から選択される。それぞれの可能性は本発明の別々の実施形態を表す。典型的には、健常な個体は、ＳＬＥ（又はあらゆるその他の形のループス）に罹患していない対象である。別の実施形態では、健常な個体は、自己免疫疾患（例えば強皮症）に罹患していない対象である。
【００２３】
別の実施形態によれば、本方法は、複数種のオリゴヌクレオチド抗原に対するサンプル中の抗体の反応性を決定することを含む。
【００２４】
別の実施形態によれば、本方法は、配列番号４２、配列番号７、配列番号５、配列番号２８、配列番号８、配列番号１、配列番号３及び配列番号２２から成る群から選択される少なくとも１種のオリゴヌクレオチド抗原と、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２８、列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号６５、配列番号６６及び配列番号６７から成る群から選択される少なくとも１種の追加のオリゴヌクレオチド抗原とに対するサンプル中の抗体の反応性を決定することを含む。それぞれの可能性は本発明の別々の実施形態を表す。
【００２５】
別の実施形態によれば、本方法は、配列番号４２、配列番号７、配列番号５、配列番号２８、配列番号８、配列番号１、配列番号３及び配列番号２２から成る群から選択される少なくとも２種のオリゴヌクレオチド抗原に対するサンプル中の抗体の反応性を決定することを含む。それぞれの可能性は本発明の別々の実施形態を表す。
【００２６】
別の実施形態によれば、複数種の抗原を抗原プローブセット、抗原アレイ又は抗原チップの形で使用する。
【００２７】
別の態様によれば、本発明は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２８、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号６５、配列番号６６及び配列番号６７から成る群から選択される複数種のオリゴヌクレオチド抗原プローブを含む抗原プローブセットを提供する。別の実施形態では、この抗原プローブセットは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２８、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号６５、配列番号６６及び配列番号６７のオリゴヌクレオチド抗原プローブを含む。
【００２８】
別の態様によれば、本発明は、上記に記載した抗原プローブセットを含む製品を提供する。
【００２９】
ある実施形態によれば、この製品は、抗原プローブアレイの形、又は抗原チップの形、又はディップスティックの形、又はラテラルフロー試験（ｌａｔｅｒａｌ  ｆｌｏｗ  ｔｅｓｔ）の形、又はＥＬＩＳＡプレートの形、又はＱｕａｎｔｅｒｉｘシステムの形、又はディップスティックの形、又は当業者に既知のあらゆるその他のプラットフォームである。ある実施形態では、この製品はキットの形である。
【００３０】
ある実施形態によれば、このキットは、複数種の抗原の内の少なくとも１種の抗原に対するサンプル中の抗体の反応性を決定するための手段を更に含む。別の実施形態によれば、このキットは、複数種の抗原の内の少なくとも１種の抗原に対する異なるサンプル中の抗体の反応性を比較するための手段を更に含む。別の実施形態によれば、このキットは、ＳＬＥを診断するためのキットの使用説明書を更に含む。
【００３１】
別の態様によれば、対象のＳＬＥの診断用の診断キットを調製するための、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２８、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号６５、配列番号６６及び配列番号６７から成る群から選択される少なくとも１種のオリゴヌクレオチド抗原の使用が提供される。それぞれの可能性は本発明の別々の実施形態を表す。この診断キットは、いくつかの実施形態ではサンプル中の抗体の反応性の決定に有用であり、従って少なくとも１種のオリゴヌクレオチド抗原に対するサンプルの反応性パターンの決定に有用である。いくつかの実施形態では、サンプルの反応性パターンと対照サンプルの反応性パターンとの間の有意差（例えば増加）はＳＬＥの指標である。
【００３２】
本発明のその他の目的、特徴及び利点は下記の説明及び図面から明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】健常な対象からの（四角形）、尋常性天疱瘡（ＰＶ）患者からの（星形）、強皮症（ＳＳｃ）患者からの（菱形）及びＳＬＥ患者（円形）からの血清中のＡ２０（配列番号２２）、Ｃ２０（配列番号１５）、Ｇ２０（配列番号４３）及びＴ２０（配列番号８）に対する個々のＩｇＭの反応性及びＩｇＧの反応性を示すグラフである。対象を、そのｄｓＤＮＡに対する反応性に従って左から右へと順に並べた。
【図２】健常な人、ＳＳｃ患者、ｄＳＤＮＡに対して陰性又は陽性であるＳＬＥ患者における、その他のオリゴヌクレオチド全てと比較した、Ｇ２０（配列番号４３）に対するＩｇＧの反応性を示すグラフである。Ｙ軸−Ｇ２０（配列番号４３）に対する反応性、Ｘ軸−オリゴヌクレオチドに対する反応性。両方の軸上に現れる数字は×１０，０００である。
【図３】鎖長の関数としてポリＧオリゴヌクレオチド及びポリＴオリゴヌクレオチドに結合する平均のＩｇＭ及びＩｇＧを示すグラフである。
【図４】Ｔ１Ｇ１６（配列番号３８）及びＧ１６Ｔ１（配列番号１８）と比較した、Ｇ１７（配列番号３６）オリゴヌクレオチドに対するＩｇＭの反応性及びＩｇＧの反応性を示すグラフである。
【図５Ａ】Ｔ１７（配列番号２）反応性と比較した、修飾Ｔ１７オリゴヌクレオチドであるＧ１Ｔ１６（配列番号４２）及びＴ１６Ｇ１（配列番号７）に対するＩｇＭの反応性及びＩｇＧの反応性を示すグラフである。
【図５Ｂ】Ｔ１７（配列番号２）反応性と比較した、Ｇ２Ｔ１６（配列番号１４）及びＴ１６Ｇ２（配列番号２８）に対するＩｇＭの反応性及びＩｇＧの反応性を示すグラフである。
【図６】健常な対象及びＳＳｃ患者及びＳＬＥ患者において、（ＣＧ）１０（配列番号２５）に結合するＩｇＧ及びＩｇＭを示すグラフである。
【図７Ａ】健常な対照と比較してＳＬＥ患者においてＩｇＧ結合が増加しているオリゴヌクレオチドを示す表である。
【図７Ｂ】健常な対照と比較してＳＬＥ患者においてＩｇＭ結合が増加しているオリゴヌクレオチドを示す表である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明は対象の自己免疫疾患又は自己免疫障害を診断する方法を提供し、特に対象の全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を診断する方法を提供する。本発明は、そのような診断を実行するための抗原プローブのセット又はアレイを更に提供し、そのようなセット又はアレイを生成するために特定の抗原プローブセットを同定する。
【００３５】
いかなる特定の理論又は作用機序にも拘束されることを望まないが、本発明は、健常な対象とＳＬＥ患者との間で非常に特徴的である独特のオリゴヌクレオチド抗原の発見にある程度基づく。本発明は、ＳＬＥ患者の血清における抗体反応性プロファイルが健常な対照個体と明確に異なったという発見に更に基づく。ＳＬＥでは血清自己抗体が広く研究されているが、本明細書に記載した独特の抗体免疫シグネチャーはこれまで説明されていない。好都合なことに、本開示の独特の抗体シグネチャーにより、ＳＬＥの診断用の感度及び特異性がより高いアッセイがもたらされ、特に、ｄｓＤＮＡに対して陽性であるＳＬＥ対象のＳＬＥの診断用の感度及び特異性がより高いアッセイがもたらされる。
【００３６】
本発明は、いくつかの実施形態では、特にＳＬＥに関係している独特の抗原−自己抗体反応性パターンを提供する。抗ＤＮＡ自己抗体の研究中に、本発明者らは、抗原マイクロアレイ及びインフォマティックス解析を使用して、健常な人と全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、強皮症（ＳＳｃ）又は尋常性天疱瘡（ＰＶ）と診断された人との血清中におけるＩｇＭ抗体及びＩｇＧ抗体の様々なオリゴヌクレオチド抗原に対する反応性を調べた。驚いたことに、健常か自己免疫疾患にかかわらず、調査したヒト対象の全てが、Ｇ２０（配列番号４３）に結合するがＡ２０（配列番号２２）、Ｃ２０（配列番号１５）及びＴ２０（配列番号８）には結合しない比較的高い量のＩｇＧ抗体をはっきりと示した。それにもかかわらず、ＳＬＥ患者は、ＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号４２）、ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧ（配列番号７）、ＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧ（配列番号５）、ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧ（配列番号２８）、ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号８）、ＣＣＡＴＡＡＴＴＧＣＡＡＡＣＧＴＴＣＴＧ（配列番号１）、ＣＣＡＴＡＡＴＴＧＣＡＡＡＧＣＴＴＣＴＧ（配列番号３）、及びＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号２２）等の、Ｇ２０（配列番号４３）以外の特定のオリゴヌクレオチド抗原（ＳＬＥのより高い指標である）に対するＩｇＧの反応性及びＩｇＭの反応性の増加を示した。
【００３７】
本明細書において下記に例示するように、あるアッセイでは、いくつかの試験したオリゴヌクレオチド抗原は、仔ウシの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）及び一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）の反応性と一部が重複した。しかしながら、オリゴヌクレオチドの一部は、ｄｓＤＮＡ及びｓｓＤＮＡと比較して類似の又は有利に高い感度及び／又は特異性を示した。生物学的起源に由来するオリゴヌクレオチドと比較して、短い一本鎖の合成オリゴヌクレオチド配列を使用する利点は多数あり、それらの中には配列の忠実度並びに生産の容易さ及びコストがある。本明細書の背景節で述べたように、抗ｄｓＤＮＡ抗体の臨床的価値は、この抗ｄｓＤＮＡ抗体を定量化するために及び免疫学的に特徴付けるために使用する方法のアッセイ原理及び分析変数に大きく依存する。本発明の実施形態では、これまで知られている方法と比較して臨床診断に有利な特性を有する改良型のアッセイ及び方法が提供される。
【００３８】
本発明は、ＳＬＥ患者を強皮症患者と血清学的に区別することができることを更に開示する。ＳＬＥ対象は、この対象を強皮症に罹患している対象から識別するために使用することができる独特な血清学的シグネチャーを有することが本明細書で初めて開示される。ＳＬＥ対象の独特な血清学的シグネチャーとして、ある種のオリゴヌクレオチド抗原に対するＩｇＧの反応性の増加及びＩｇＭの反応性の低下が挙げられる。そのため、いくつかの実施形態では、本発明は、ＳＬＥに罹患している対象と強皮症に罹患している対象とを識別する及び区別するためのアッセイを提供する。
【００３９】
別の態様によれば、本発明は、ＳＬＥに罹患している対象と強皮症に罹患している対象とを区別する方法であって、対象からサンプルを得ることと、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号９〜１５、配列番号１７〜２０、配列番号２２〜２３、配列番号２５〜３４及び配列番号３７〜３９から成る群から選択される少なくとも１種のオリゴヌクレオチド抗原に対するサンプル中の抗体の反応性を決定し、それによりサンプルの反応性パターンを決定することと、サンプルの反応性パターンと対照の反応性パターンとを比較することとを含み、対照の反応性サンプルと比較してサンプル中の抗体の有意に異なる反応性パターンは、対象がＳＬＥに罹患しているという指標である、上記方法を提供する。
【００４０】
一実施形態では、サンプルの反応性パターンはＩｇＧの反応性の増加を含む。特定の実施形態では、ＩｇＧの反応性の増加は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号９〜１５、配列番号１７〜２０、配列番号２２〜２３、配列番号２５〜３４及び配列番号３７〜３９から成る群から選択される少なくとも１種のオリゴヌクレオチド抗原に関するものである。別の実施形態では、サンプルの反応性パターンはＩｇＭの反応性の低下を含む。特定の実施形態では、ＩｇＭの反応性の低下は、配列番号２５及び配列番号２６から選択される少なくとも１種のオリゴヌクレオチド抗原に関するものである。
【００４１】
必要とする対象のＳＬＥ診断方法のいくつかの実施形態によれば、この方法は、配列番号４２、配列番号７、配列番号５、配列番号２８、配列番号８、配列番号１、配列番号３及び配列番号２２又はこれらの一部又はこれらの組み合わせから成る群から選択される少なくとも１種のオリゴヌクレオチド抗原に対する、対象から得たサンプル中の抗体の反応性を決定し、それによりサンプルの反応性パターンを決定することと、サンプル中の抗体の反応性パターンが対照と比較して有意に異なる場合に、対象を、ＳＬＥに罹患している対象と決定することとを含む。
【００４２】
第１の態様によれば、本発明は、対象の全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を診断する方法であって、対象からサンプルを得る工程と、配列番号４２、配列番号７、配列番号５、配列番号２８及び配列番号８から、又は配列番号１及び配列番号３から、又は配列番号２２から成る群から選択される少なくとも１種のオリゴヌクレオチド抗原に対するサンプル中の抗体の反応性を決定する工程と、サンプル中の抗体の反応性と健常な対照の反応性とを比較する工程とを含み、健常な対照の反応性と比較してサンプル中の抗体の有意に高い反応性は、対象がＳＬＥに罹患しているという指標である、上記方法を提供する。
【００４３】
関連する態様によれば、本発明は、対象の全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を診断する方法であって、配列番号４２、配列番号７、配列番号５、配列番号２８、及び配列番号８；又は配列番号１及び配列番号３；又は配列番号２２から成る群から選択される少なくとも１種のオリゴヌクレオチド抗原に対する、対象から得たサンプル中の抗体の反応性を決定する工程と、サンプル中の抗体の反応性と健常な対照の反応性とを比較する工程とを含み、健常な対照の反応性と比較してサンプル中の抗体の有意に高い反応性は、対象がＳＬＥに罹患しているという指標である、上記方法を提供する。
【００４４】
別の態様によれば、本発明は、対象の全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を診断する方法であって、対象からサンプルを得る工程と、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２８、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号６５、配列番号６６及び配列番号６７から成る群から選択される複数種のオリゴヌクレオチド抗原に対するサンプル中の抗体の反応性を決定する工程と、サンプル中の抗体の反応性と健常な対照の反応性とを比較する工程とを含み、健常な対照の反応性と比較してサンプル中の抗体の有意に高い反応性は、対象がＳＬＥに罹患しているという指標である、上記方法を提供する。
【００４５】
関連する態様によれば、本発明は、対象の全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を診断する方法であって、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２８、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号６５、配列番号６６及び配列番号６７から成る群から選択される複数種のオリゴヌクレオチド抗原に対する、対象から得たサンプル中の抗体の反応性を決定する工程と、サンプル中の抗体の反応性と健常な対照の反応性とを比較する工程とを含み、健常な対照の反応性と比較してサンプル中の抗体の優位に高い反応性は、対象がＳＬＥに罹患しているという指標である、上記方法を提供する。
【００４６】
本発明で開示した各オリゴヌクレオチド抗原のオリゴヌクレオチド配列に言及するために使用する名称は、下記の通りである：Ｘ２Ｙ３Ｚ２のオリゴヌクレオチド配列からな成るオリゴヌクレオチド抗原（即ち、Ｘから成る２個のオリゴヌクレオチド、続いてＹから成る３個のオリゴヌクレオチド、続いてＺから成る２個のオリゴヌクレオチドを、Ｘ２Ｙ３Ｚ２、（Ｘ）２（Ｙ）３（Ｚ）２若しくはＸＸＹＹＹＺＺと名付ける）、又はこの名称を、対応する配列番号で言及する。この例では、Ｘ、Ｙ及びＺを複数種のオリゴヌクレオチドに関連付けることができ、例えば２〜２０種のオリゴヌクレオチドに関連付けることができることを理解しなければならない。従って、Ｘ２（Ｘは、例えば２種のオリゴヌクレオチドのストレッチ、例えばＹＺである）のオリゴヌクレオチド配列から成るオリゴヌクレオチド抗原を、Ｘ２、（Ｘ）２若しくはＹＺＹＺと名付ける、又は対応する配列番号で言及する。
【００４７】
用語「全身性エリテマトーデス」、「ループス」及び「ＳＬＥ」は本明細書で使用する場合、交換可能であり、ＳＬＥの診断に関して１９８２年アメリカリウマチ学会（ＡＣＲ）で定められた基準及び／又は全身性ループス協力クリニック（ＳＬＩＣＣ）改正基準により定められた基準（Ｐｅｔｒｉ他（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，２０１２、第６４巻、２６７７〜２６８６頁）で概説されている）を特徴とする自己免疫疾患を概して意味する。
【００４８】
用語「オリゴヌクレオチド抗原」及び「抗原」は本明細書で使用する場合、交換可能であり、ある程度の長さの連続したヌクレオチドのストレッチを概して意味する。別途に示さない限り、用語「オリゴヌクレオチド抗原」は本明細書で使用する場合、１５個と４０個との間のヌクレオチド長のヌクレオチド配列を意味しており、或いは１７個と２８個との間のヌクレオチド長又は１８〜２５個のヌクレオチド長のヌクレオチド配列を意味する。ある実施形態では、オリゴヌクレオチド抗原は、少なくとも４個の、少なくとも５個の、少なくとも６個の、少なくとも７個の、少なくとも８個の、少なくとも９個の、少なくとも１０個の、少なくとも１６個の又はより多くの連続したヌクレオチドから成る。それぞれの可能性は本発明の別々の実施形態を表す。ある実施形態では、抗原は、５０個以下の、４５個以下の、４０個以下の、３５個以下の、３０個以下の、２５個以下の、２０個以下の、１６個以下の又はより少ない連続したヌクレオチドから成る。それぞれの可能性は本発明の別々の実施形態を表す。ある実施形態では、抗原は、１０〜３０個の、１５〜２５個の又は１７〜２０個の連続したヌクレオチドから成る。ある実施形態では、抗原は、１７個の、１８個の、１９個の又は２０個の連続したヌクレオチドから成る。
【００４９】
用語「健常な対照」は本明細書で使用する場合、健常な個体、複数の健常な個体、健常な個体若しくは複数の健常な個体に対応する又は健常な個体若しくは複数の健常な個体から得たデータセット又はデータ値を意味する。
【００５０】
用語「サンプル」は本明細書で使用する場合、対象から得た又は対象に由来する生物物質を含むあらゆる組成物を意味する。本発明に係るサンプルの非限定的な例は、抗体を含むあらゆる種類の生物組織又は体液である。
【００５１】
本明細書で使用する場合、「サンプル中の抗体の反応性」又は「ある抗原」若しくは「複数種の抗原」に対する「サンプル中の抗体の反応性」は、複数種の抗原から選択される少なくとも１種の特定の抗原に対するサンプル中の少なくとも１種の抗体の免疫反応性を意味する。抗原に対する抗体の免疫反応性を使用して、即ち抗体の抗原に特異的に結合する能力を使用して、サンプル中の抗体の量を決定することができる。サンプル中の試験した抗体それぞれの算出したレベルは、これらの抗原に対するサンプルの反応性パターンと総称される。サンプルの反応性パターンはサンプル中の試験した抗体それぞれのレベルを反映し、そのため定量的アッセイを提供する。好ましい実施形態では、抗体を定量的に決定する。
【００５２】
反応性パターン間の「有意差」は、様々な実施形態において統計的な有意差を意味する、又はその他の実施形態において当業者により認識される有意差を意味する。更に別の好ましい実施形態では、対象から得たサンプルの反応性パターンと対照の反応性パターンとの間の有意な（定量的な）差異は、対象がＳＬＥに罹患しているという指標である。特定の実施形態では、サンプル中の抗体の抗原に対する反応性の上方制御又はより高い反応性は、対照における抗体の抗原に対する反応性レベルと比べて少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍又は少なくとも約５倍高い（即ち大きい）増加（即ち上昇）を意味する。別の実施形態では、サンプル中の抗体の抗原に対する反応性の下方制御又はより低い反応性は、対照における抗体の抗原に対する反応性レベルと比べて少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍又は少なくとも約５倍低い低下（即ち減少）を意味する。
【００５３】
ある実施形態では、オリゴヌクレオチド抗原のサブセットは、配列ＣＣＡＴＡＡＴＴＧＣＡＡＡＣＧＴＴＣＴＧ（配列番号１）、Ｔ１７（配列番号２）、ＣＣＡＴＡＡＴＴＧＣＡＡＡＧＣＴＴＣＴＧ（配列番号３）、Ｇ１Ｔ１６Ｇ１（配列番号５）、Ｇ１０Ｔ１０（配列番号１１）及びＧ１６Ｔ２（配列番号１２）から成り、これらのそれぞれの可能性又は組み合わせは本発明の別々の実施形態を表す。本明細書において下記に例示するように、このサブセットは、ｄｓＤＮＡと比較して類似の又は有利に高い感度を示した。別の実施形態では、オリゴヌクレオチド抗原のサブセットはＴ２０（配列番号８）、Ｃ２０（配列番号１５）及びＡ２０（配列番号２２）を含み、これらのそれぞれの可能性又は組み合わせは本発明の別々の実施形態を表す。
【００５４】
いくつかの実施形態によれば、少なくとも１種のオリゴヌクレオチド抗原は、少なくとも５個の、６個の、７個の、８個の、９個の、１０個の、１１個の、１２個の、１３個の、１４個の、１５個の、１６個の、１７個の、１８個の、１９個の又は２０個の連続したアデニンヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列である。別の実施形態によれば、オリゴヌクレオチド配列は最大で２０個の連続したアデニンヌクレオチドを含む。追加の実施形態によれば、少なくとも１種のオリゴヌクレオチド抗原は、少なくとも５個の、６個の、７個の、８個の、９個の、１０個の、１１個の、１２個の、１３個の、１４個の、１５個の、１６個の、１７個の、１８個の、１９個の又は２０個の連続したチミンヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列である。別の実施形態によれば、オリゴヌクレオチド配列は最大で２０個の連続したチミンヌクレオチドを含む。
【００５５】
追加の実施形態によれば、少なくとも１種のオリゴヌクレオチド抗原は、少なくとも５個の、６個の、７個の、８個の、９個の、１０個の、１１個の、１２個の、１３個の、１４個の、１５個の、１６個の、１７個の、１８個の、１９個の又は２０個の連続したシトシンヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列である。別の実施形態によれば、オリゴヌクレオチド配列は最大で２０個の連続したシトシンヌクレオチドを含む。追加の実施形態によれば、少なくとも１種のオリゴヌクレオチド抗原は、５〜１７個の、６〜１７個の、７〜１７個の、８〜１７個の、９〜１７個の、１０〜１７個の、１１〜１７個の、１２〜１７個の、１３〜１７個の、１４〜１７個の、１５〜１７個の、１６〜１７個の又は最大で１７個の連続したグアニンヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列である。
【００５６】
いくつかの実施形態によれば、少なくとも１種のオリゴヌクレオチド抗原は、配列番号４２、配列番号７、配列番号５、配列番号２８及び配列番号８から成る群から選択される。追加の実施形態によれば、少なくとも１種のオリゴヌクレオチド抗原は配列番号１又は配列番号３から選択される。追加の実施形態によれば、少なくとも１種のオリゴヌクレオチド抗原は配列番号２２である。それぞれの可能性は本発明の別々の実施形態を表す。
【００５７】
本発明に係る各オリゴヌクレオチド抗原を、試験する対象から得た又は該対象に由来するサンプルから見出した又は単離したＩｇＭ抗体及び／又はＩｇＧ抗体で結合させることができることを理解しなければならない。ある種のエピトープ又は抗原に対するＩｇＭ抗体及びＩｇＧ抗体の相対量は本来、経時的に変化することから、本発明に係る各オリゴヌクレオチド抗原をＩｇＭ抗体、ＩｇＧ抗体又は両方で結合させることができる。ある実施形態では、抗体の反応性はＩｇＧ抗体の反応性を意味する。ある実施形態では、抗体の反応性はＩｇＭ抗体の反応性を意味する。別の実施形態によれば、サンプル中の抗体の有意に高い反応性はＩｇＧの反応性の増加を意味する。別の実施形態によれば、サンプル中の抗体の有意に高い反応性はＩｇＭの反応性の増加を含む。
【００５８】
別の実施形態によれば、ＩｇＭの反応性の増加は、配列番号１（ＣＣＡＴＡＡＴＴＧＣＡＡＡＣＧＴＴＣＴＧ）、配列番号２（Ｔ１７）、配列番号３（ＣＣＡＴＡＡＴＴＧＣＡＡＡＧＣＴＴＣＴＧ）、配列番号４（Ｔ１４）、配列番号５（Ｇ１Ｔ１６Ｇ１）、配列番号６（ＧＡＣＧＴＴ）、配列番号７（Ｔ１６Ｇ１）、配列番号８（Ｔ２０）、配列番号９（Ｔ７）、及び配列番号１０（Ｔ２Ｇ１６Ｔ２）から成る群から選択される少なくとも１種のオリゴヌクレオチド抗原に関するものである。別の実施形態によれば、ＩｇＧの反応性の増加は、配列番号１、配列番号３〜５、配列番号８〜４１から成る群から選択される少なくとも１種のオリゴヌクレオチド抗原に関するものである。
【００５９】
ある実施形態では、ＩｇＭ及びＩｇＧの反応性の増加は、Ｇ１Ｔ１６（配列番号４２）、ＣＣＡＴＡＡＴＴＧＣＡＡＡＣＧＴＴＣＴＧ（配列番号１）、Ｇ１Ｔ１６Ｇ１（配列番号５）、ＣＣＡＴＡＡＴＴＧＣＡＡＡＧＣＴＴＣＴＧ（配列番号３）、Ａ２０（配列番号２２）及びＴ２０（配列番号８）から成る群から選択される少なくとも１種のオリゴヌクレオチド抗原に関するものである。ある実施形態では、ＩｇＭの反応性の増加は、Ｔ１６Ｇ２（配列番号２８）及びＴ１６Ｇ１（配列番号７）から成る群から選択される少なくとも１種のオリゴヌクレオチド抗原に関するものである。それぞれの可能性は本発明の別々の実施形態を表す。
【００６０】
別の実施形態によれば、ＩｇＭの反応性の増加は、配列番号４２、配列番号７、配列番号５、配列番号２８、配列番号８、配列番号１、配列番号３及び配列番号２２から成る群から選択される少なくとも１種のオリゴヌクレオチド抗原に関するものである。別の実施形態によれば、ＩｇＧの反応性の増加は、配列番号４２、配列番号７、配列番号５、配列番号２８、配列番号８、配列番号１、配列番号３及び配列番号２２から成る群から選択される少なくとも１種のオリゴヌクレオチド抗原に関するものである。それぞれの可能性は本発明の別々の実施形態を表す。
【００６１】
別の実施形態によれば、本方法は、ｄｓＤＮＡ及び／又はｓｓＤＮＡに対するサンプルの反応性を決定することを更に含む。ある実施形態では、対象は、ｄｓＤＮＡに対する抗体に対して陽性である。その他のある実施形態では、対象は、ｓｓＤＮＡに対する抗体に対して陽性である。ある実施形態では、対象は、ｄｓｄＮＡに対する抗体に対して陰性である。その他のある実施形態では、対象は、ｓｓＤＮＡに対する抗体に対して陰性である。しかしながら、背景節で述べたように、抗ｄｓＤＮＡ抗体の臨床的価値は、この抗ｄｓＤＮＡ抗体を定量化すために及び免疫学的に特徴付けるために使用する方法のアッセイ原理及び分析変数に大きく依存する。
【００６２】
本発明の方法を実施するために、対象から得る又は対象に由来するサンプルは、対象自体によって作られた抗体を含む必要があることを理解しなければならない。従って、サンプルは、少なくとも対象の抗体の一部を自然に含むあらゆる組織、臓器又は体液から得られ得る、又は由来し得る。ある実施形態では、対象から得るサンプルは生体液である。いくつかの実施形態によれば、サンプルは、血漿、血清、血液、脳脊髄液、滑液、痰、尿、唾液、涙、リンパ検体又は当分野で既知のあらゆるその他の生体液から成る群から選択される。それぞれの可能性は本発明の別々の実施形態を表す。ある実施形態によれば、対象から得るサンプルは、血清、血漿及び血液から成る群から選択される。一実施形態によれば、サンプルは血清サンプルである。適切なサンプルを得るための及び単離するための方法は、十分に当業者の範囲内である。
【００６３】
本発明の方法のある実施形態によれば、対照は、少なくとも１例の健常な個体からのサンプル、一群の健常な個体からの一団の対照サンプル、及び健常な個体からの保存された一群のデータから成る群から選択される。それぞれの可能性は本発明の別々の実施形態を表す。典型的には、健常な個体は、ＳＬＥ（又はあらゆるその他の形のループス）に罹患していない対象である。別の実施形態では、健常な個体は、いかなる自己免疫疾患（例えば強皮症）にも罹患していない対象である。
【００６４】
特定の実施形態では、有意差を、少なくとも８５％の、好ましくは少なくとも９０％の陽性的中率（ＰＰＶ）のカットオフを使用して決定する。選択されたマーカー（例えば抗原）に関するＰＰＶの決定は当業者に公知であり、下記に記載する方法に例示される。典型的には、抗原に対する陽性を、ＰＰＶ≧９０％等の選択されたカットオフ値を使用して、特定の調査下位群における対象の１０％超を検出した場合に決定する。例えば、抗原ｉを、異なる調査グループＢと比較した際にＰＰＶ≧９０％を有するグループＡにおける対象の少なくとも１０％を検出した場合に、グループＡを特異的に特徴付けるために決定する。抗原ｉに関してＰＰＶ≧９０％のカットオフを超えるグループＡにおける対象は、抗原ｉに対して陽性であるとみなされる。
【００６５】
ある抗原「を対象とする」抗体とは本明細書で使用する場合、この抗原に特異的に結合することができる抗体のことである。複数種の抗原を対象とする抗体のレベルを決定することとして、サンプル中の各抗体のレベルを測定することであって、各抗体は本発明の特定のオリゴヌクレオチド抗原を対象とする、測定することが挙げられる。典型的には、本明細書で詳述したように、この工程を、免疫アッセイを使用して実施する。
【００６６】
その他の実施形態では、少なくとも１種の抗原に対するサンプル中の抗体の反応性（及びサンプル中の試験した抗体それぞれのレベル）の決定を、特定の抗原−抗体複合体が形成され得るような条件下で、サンプルと少なくとも１種の抗原（又は複数種の抗原を使用する場合には複数種の抗原を含む抗原プローブセット）とを接触させること、及び各抗原プローブに関して形成された抗原−抗体複合体の量を定量化することを含むプロセスにより実施する。抗原−抗体複合体の量は、サンプル中の試験した抗体のレベル（又はサンプルの抗原との反応性）の指標である。
【００６７】
別の実施形態では、本方法は、複数種の抗原に対するサンプル中の少なくとも１種のＩｇＧ抗体及び少なくとも１種のＩｇＭ抗体の反応性を決定することを含む。別の実施形態では、本方法は、複数種の抗原に対するサンプル中の複数種のＩｇＧ抗体及び少なくとも１種のＩｇＭ抗体の反応性を決定することを含む。別の実施形態では、本方法は、複数種の抗原に対するサンプル中の少なくとも１種のＩｇＧ抗体及び複数種のＩｇＭ抗体の反応性を決定することを含む。別の実施形態によれば、本方法は、複数種のオリゴヌクレオチド抗原に対するサンプル中の抗体の反応性を決定することを含む。
【００６８】
典型的には、少なくとも１種の抗原に対するサンプル中の抗体の反応性の決定を、免疫アッセイを使用して実施する。複数種の抗原を使用する場合、この複数種の抗原を抗原アレイの形で使用することができることが有利である。
【００６９】
抗原プローブ及び抗原プローブセット
更なる実施形態によれば、本明細書で詳述するように、本発明は、ＳＬＥの診断に有用な抗原プローブ及び抗原プローブセットを提供する。
【００７０】
本発明は、本明細書において抗原プローブセットとも称される複数種の抗原を更に提供する。この抗原プローブセットは、ＳＬＥを有する対象の血清と特異的に反応する複数種の抗原を含む。本発明の原理によれば、複数種の抗原を抗原アレイの形で有利に使用することができる。いくつかの実施形態によれば、抗原アレイが抗原チップの形で配置されるのが好都合である。
【００７１】
「プローブ」は本明細書で使用する場合、ある成分に特異的に結合することができるあらゆる化合物を意味する。一態様によれば、本発明は、配列番号１〜６７又はこれらのあらゆる組み合わせから成る群から選択される複数種のオリゴヌクレオチド抗原を含む抗原プローブセットを提供する。ある実施形態によれば、抗原プローブセットは本発明の抗原のサブセットを含む。特定の実施形態では、この抗原のサブセットは配列番号１〜１０から成る。別の特定の実施形態では、この抗原のサブセットは、配列番号１、配列番号３〜５及び配列番号８〜４１から成る。別の実施形態では、この抗原のサブセットは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号１１及び配列番号１２から成る。更に別の特定の実施形態では、この抗原のサブセットは、配列番号８、配列番号１５、配列番号２２及び配列番号３６から成る。ある実施形態では、この抗原のサブセットは、配列番号４２、配列番号７、配列番号５、配列番号２８、配列番号８、配列番号１、配列番号３及び配列番号２２から成る。
【００７２】
別の実施形態によれば、本発明の方法は、配列番号４２、配列番号７、配列番号５、配列番号２８、配列番号８、配列番号１、配列番号３及び配列番号２２から成る群から選択される少なくとも１種のオリゴヌクレオチド抗原と、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２８、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号６５、配列番号６６及び配列番号６７から成る群から選択される少なくとも１種の追加のオリゴヌクレオチド抗原とに対するサンプル中の抗体の反応性を決定することを含む。それぞれの可能性は本発明の別々の実施形態を表す。
【００７３】
別の実施形態によれば、本発明の方法は、配列番号４２、配列番号７、配列番号５、配列番号２８、配列番号８、配列番号１、配列番号３及び配列番号２２から成る群から選択される少なくとも２種のオリゴヌクレオチド抗原に対するサンプル中の抗体の反応性を決定することを含む。それぞれの可能性は本発明の別々の実施形態を表す。
【００７４】
本発明の複数種の抗原に対する抗体の反応性を、当分野で既知の技法に従って決定することができる。
【００７５】
好ましくは、本発明の方法及びキットの複数種の抗原は、本明細書に記載した抗原のセットを含む。更に、その他の実施形態では、複数種の抗原（又は抗原プローブセット）は、このサブセットを含み、又はこのサブセットから成り、例えば、本発明の抗原からそれぞれ選択される３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６又は６７の異なる抗原を含み、又はこれらの抗原から成り、それぞれの可能性は本発明の別々の実施形態を表す。そのようなサブセットを、診断アッセイの最適な感度及び／又は特異度が生じるように選択することができる。
【００７６】
本発明のアッセイで使用する抗原プローブを、当分野で公知の方法を使用して合成することができる。
【００７７】
本発明は抗原プローブを利用し、この相同体、断片及び類似体がこの抗原プローブと免疫学的に交差反応する限りにおいてこの相同体、断片及び類似体を更に利用することに留意しなければならない。用語「免疫学的な交差反応」は本明細書で使用する場合、同じ抗体が特異的に結合する２種以上の抗原を意味する。用語「相同体」は本明細書で使用する場合、抗原の核酸配列に対して少なくとも８０％の、少なくとも８５％の又は少なくとも９０％の同一性を有するオリゴヌクレオチドを意味する。交差反応性を、多くの免疫アッセイ技法のいずれかで、例えば競合アッセイ（試験抗原の、抗体の既知の抗原への結合を競合的に阻害する能力を測定する）で決定することができる。
【００７８】
用語「断片」は本明細書で使用する場合、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体の、例えば標的抗原を免疫特異的に認識するために抗原プローブとの免疫学的な交差反応を残す部分を意味する。この断片は、各抗原の約８０％の、約８５％の、約９０％の又は約９５％の長さを有することができる。
【００７９】
別の態様によれば、本発明は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２８、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号６５、配列番号６６及び配列番号６７から成る群から選択される複数種のオリゴヌクレオチド抗原プローブを含む抗原プローブセットを提供する。
【００８０】
別の関連する態様によれば、本発明は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２８、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号６５、配列番号６６及び配列番号６７から成る群から選択される少なくとも１種のオリゴヌクレオチド抗原プローブを含む抗原プローブセットを提供する。
【００８１】
別の態様によれば、本発明は、上記に記載した抗原プローブセットの内の少なくとも１種を含む製品を提供する。
【００８２】
ある実施形態では、この製品は、抗原プローブアレイの形、又は抗原チップの形、又はディップスティックの形、又はラテラルフロー試験の形、又は当業者に既知のあらゆるその他のプラットフォームである。「抗原プローブアレイ」は概して、単一の容器中で混合されている又は２個以上の容器中に配置されている複数種の抗原プローブを意味する。「抗原チップ」は概して、複数種の抗原が付着している又は接着されている実質的な２次元表面を意味する。「ディップスティック」は概して、複数種の抗原が付着している又は接着されている物体を意味しており、化学的検査を実施するために又は液体中に見出される量を測定するために液体に浸漬される。「ラテラルフロー試験」は概して、専門的で高価な装置を必要とすることなくサンプル（基質）中の標的分析物の存在（又は非存在）を検出することを目的とするデバイスを意味する。ある実施形態では、この製品はキットの形である。
【００８３】
ある実施形態によれば、このキットは、複数種の抗原の内の少なくとも１種の抗原に対するサンプル中の抗体の反応性を決定するための手段を更に含む。別の実施形態によれば、このキットは、複数種の抗原の内の少なくとも１種の抗原に対する様々なサンプル中の抗体の反応性を比較するための手段を更に含む。別の実施形態によれば、このキットは使用説明書を更に含む。例えば、上述した手段として、本発明の抗原プローブへの抗体の特異的結合の測定に使用することができる試薬、検出可能な標識及び／又は容器を挙げることができる。「手段」は本明細書で使用する場合、生物学的な又は化学的なアッセイを実施するために使用するデバイス、試薬及び化学物質、例えばバイアル、緩衝液、並びに文書化されたプロトコル又は説明書も意味することができる。
【００８４】
別の態様によれば、対象のＳＬＥの診断用の診断キットを調製するための、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２８、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号６５、配列番号６６及び配列番号６７から成る群から選択される少なくとも１種のオリゴヌクレオチド抗原の使用が提供される。この診断キットは、いくつかの実施形態では、サンプル中の抗体の反応性を決定し、それにより少なくとも１種のオリゴヌクレオチド抗原に対するサンプルの反応性パターンを決定するのに有用である。いくつかの実施形態では、サンプルの反応性パターンと対照サンプルの反応性パターンとの間の有意差（例えば増加）はＳＬＥの指標である。
【００８５】
その他の実施形態では、抗原プローブセットに含まれる複数種の抗原は、最大で５０種の、５５種の、６０種の、７０種の、８０種の、９０種の又は１００種の異なる抗原を含む、又はこれらの抗原から成る。その他の実施形態では、抗原プローブセットに含まれる複数種の抗原は、少なくとも５０種の、１００種の、１５０種の、２００種の又は５００種の異なる抗原を含む、又はこれらの抗原から成る。
【００８６】
その他の態様では、本発明のオリゴヌクレオチドを含む核酸ベクター、及びこの核酸ベクターを含む宿主細胞が提供される。これらの核酸、ベクター及び宿主細胞は、当分野で既知の組み換え法により容易に産生される。組み換えＤＮＡ技法（例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、クローニング）又は化学合成を使用して、ポリ核酸分子を産生することもできる。核酸配列として、天然の核酸配列及びこの相同体が挙げられ、これらとして、天然の対立遺伝子多様体、並びにヌクレオチドが挿入されている、欠失している、置換されている及び／又は逆位されている（このような修飾は核酸分子の本発明の方法を実施する能力を実質的に妨げない）修飾核酸配列が挙げられるがこれらに限定されない。
【００８７】
本発明によれば、本キットは、本明細書において抗原プローブセットとも称される複数種の抗原を含む。複数種の抗原を含むこの抗原プローブセットは、ＳＬＥを有する対象の血清と特異的に反応する。いくつかの実施形態では、抗原プローブセットは、ＳＬＥを有する対象の血清と強皮症を有する対象とを区別することができる。本発明の原理によれば、複数種の抗原を抗原アレイの形で有利に使用することができる。いくつかの実施形態によれば、抗原アレイは抗原チップの形で配置されるのが好都合である。
【００８８】
その他の実施形態では、本キットは、複数種の抗原に対するサンプル中の抗体の反応性を決定するための手段を更に含むことができる。例えば、本キットは、本発明の抗原プローブへの抗体の特異的結合の測定に使用することができる試薬、検出可能な標識及び／又は容器を含むことができる。特定の実施形態では、本キットは抗原アレイの形である。
【００８９】
いくつかの実施形態では、本キットは、複数種の抗原に対する様々なサンプル中の抗体の反応性パターンを比較するための手段を含む。その他の実施形態では、本キットは、陰性の及び／又は陽性の対照サンプルを更に含むことができる。例えば、陰性対照サンプルは、少なくとも１例の健常な個体（例えばＳＬＥに罹患していない個体）からのサンプルを含むことができる。陽性対照は、ＳＬＥ又は診断されているＳＬＥの亜型に罹患している少なくとも１例の個体からのサンプルを含むことができる。その他の非限定的な例は、一群の健常な個体若しくは病気にかかった個体からの一団の対照サンプル、又は対照の個体からの保存された一群のデータである。
【００９０】
抗体、サンプル及び免疫アッセイ
抗体又は免疫グロブリンは、ジスルフィド結合で互いに連結されている２本の重鎖と２本の軽鎖とを含み、各軽鎖は、「Ｙ」字形にジスルフィド結合で各重鎖に連結されている。各重鎖は一端で可変領域（ＶＨ）を有し、続いて多数の定常領域（ＣＨ）を有する。各軽鎖は一端で可変領域（ＶＬ）を有し、他端で定常領域（ＣＬ）を有し、軽鎖可変領域は重鎖の可変領域と整列されており、軽鎖定常領域は重鎖の第１の定常領域（ＣＨ１）と整列されている。各対の軽鎖及び重鎖の可変領域は抗原結合部位を形成する。
【００９１】
重鎖のアイソタイプ（ガンマ、アルファ、デルタ、イプシロン又はミュー）は免疫グロブリンクラス（それぞれＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭ）を決定する。全ての抗体クラスでは、軽鎖は２種のアイソタイプ（カッパ（κ）又はラムダ（λ））のいずれかが見出される。
【００９２】
用語「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」又は「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」を使用する場合、このことは、インタクトな抗体、例えばポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）と、このタンパク質分解断片、例えばＦａｂ断片又はＦ（ａｂ’）２断片とを含むことを意図しいていることを理解しなければならない。（例えば、本明細書に詳述するように、免疫アッセイ試薬として）本発明の範囲に更に含まれるのは、キメラ抗体、組み換え抗体及び操作抗体並びにこれらの断片である。
【００９３】
軽鎖及び重鎖の両方の可変領域の全体又は基本的に全体を含む例示的な機能的抗体断片は下記のように定義される：（ｉ）Ｆｖ、２本鎖として発現される軽鎖の可変領域及び重鎖の可変領域から成る遺伝子操作断片として定義される；（ｉｉ）一本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）、適切なポリペプチドリンカーで連結されている、軽鎖の可変領域及び重鎖の可変領域を含む遺伝子操作された一本鎖分子；（ｉｉｉ）Ｆａｂ、完全な抗体を酵素パパインで処理してインタクトな軽鎖及び重鎖のＦｄ断片（重鎖の可変ドメイン及びＣＨ１ドメインから成る）を生じさせることにより得られる、抗体分子の一価の抗原結合部分を含む抗体分子の断片：（ｉｖ）Ｆａｂ’、完全な抗体を酵素ペプシンで処理した後に還元することにより得られる（抗体分子１個当たり２個のＦａｂ’断片が得られる）、抗体分子の一価の抗原結合部分を含む抗体分子の断片；並びに（ｖ）ｆ（ａｂ’）２、完全な抗体を酵素ペプシンで処理することにより得られる、抗体分子の一価の抗原結合部分を含む抗体分子の断片（即ち、２個のジスルフィド結合により互いに結合しているＦａｂ’断片から成る二量体）。
【００９４】
用語「抗原」とは本明細書で使用する場合、抗体と結合することができる分子又は分子の一部のことである。抗原は典型的には、この抗原のエピトープに結合することができる抗体を産生させるように動物を誘導することができる。抗原は１個又は複数個のエピトープを有することができる。上記で言及した特異的反応は、抗原が対応する抗体と高選択的な方法で反応することができ、その他の抗原により誘起され得る多くのその他の抗体とは反応し得ないことを示すことを意図する。「抗原ペプチド」とは、抗体に特異的に結合することができるペプチドのことである。
【００９５】
別の実施形態では、抗体の抗原プローブに特異的に結合する能力の検出を、特定の抗原−抗体複合体の形成を定量化することにより実施することができる。用語「特異的に結合する」は本明細書で使用する場合、特定の抗原プローブへの抗体の結合が無関係な分子の存在の影響を受けないことを意味する。
【００９６】
ある実施形態では、本発明の方法を、本発明の抗原の、対象から単離されたＩｇＧアイソタイプの抗体又はその他の実施形態ではＩｇＭの抗体に特異的に結合する能力を決定することにより実施する。
【００９７】
対象から適切な抗体含有生体サンプルを得る方法は十分に当業者の能力内である。典型的には、適切なサンプルは、全血及びこの全血に由来する産物、例えば血漿及び血清を含む。その他の実施形態では、その他の抗体含有サンプル、例えばＣＳＦサンプル、尿サンプル及び唾液サンプルを使用することができる。
【００９８】
多数の公知の体液回収法を利用して対象から生体サンプルを回収し、本発明の方法を実施することができる。
【００９９】
本発明に従って、任意の適切な免疫アッセイを対象のオリゴヌクレオチドと共に使用することができる。そのような技法は当業者に公知であり、多くの標準的な免疫学のマニュアル及びテキストに記載されている。ある好ましい実施形態では、抗体の抗原プローブに特異的に結合する能力の決定を、抗原プローブアレイに基づく方法を使用して実施する。好ましくは、血清に含まれる抗体と固定された抗原プローブとの間の特異的な結合を可能とするために、このアレイを、対象の適切に希釈された血清と共にインキュベートし、アレイから未結合の血清を洗い流し、洗浄したアレイを、所望のアイソタイプの抗体の、検出可能標識がコンジュゲートしたリガンドと共にインキュベートし、アレイから未結合の標識を洗い流し、各抗原プローブに結合した標識のレベルを測定する。
【０１００】
様々な実施形態では、本発明の方法は、決定工程を実施する前にサンプルを希釈することを更に含む。一実施形態では、例えばＰＢＳを使用してサンプルを１：２で希釈する。別の実施形態では、サンプルを１：４で、１：６で、１：８で、１：１５で、１：２０で、１：５０で又は好ましくは１：１０で希釈する。それぞれの可能性は本発明の別々の実施形態を表す。別の実施形態では、サンプルを２倍〜１０倍の範囲で希釈する。別の実施形態では、サンプルを４倍〜１０倍の範囲で希釈する。別の実施形態では、サンプルを６倍〜１０倍の範囲で希釈する。別の実施形態では、サンプルを８倍〜１０倍の範囲で希釈する。
【０１０１】
抗原チップ
抗原マイクロアレイは、免疫反応のハイスループットな特徴付けに使用され（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ他、２００２、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ８、２９５〜３０１）、ワクチン接種及び自己免疫障害での免疫応答を分析するために使用されている（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ他、２００２；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ他、２００３、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１、１０３３〜９；Ｑｕｉｎｔａｎａ他、２００４；Ｋａｎｔｅｒ他、２００６、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １２、１３８〜４３）。健常な及び病気のマウス（Ｑｕｉｎｔａｎａ他、２００４；Ｑｕｉｎｔａｎａ他、２００１、Ｊ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ  １７、１９１〜７）及びヒト（Ｍｅｒｂｌ他、２００７、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１７、７１２〜８；Ｑｕｉｎｔａｎａ他、２００３、Ｊ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ  ２１、６５〜７５）の自己免疫レパートリーのこれまでの分析で示されているように、複数の反応性のパターンが単一の抗原−抗体関係よりも明らかであり得ることが仮定されている（Ｑｕｉｎｔａｎａ他、２００６、Ｌｕｐｕｓ  １５、４２８−３０）。そのため、自己抗体レパートリーは、疾患の病因への両方の新たな見識を提供する可能性、及び疾患の過程の免疫バイオマーカー（Ｃｏｈｅｎ、２００７、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７、５６９〜７４）として機能する可能性を有する。
【０１０２】
いくつかの態様によれば、本発明の方法を、本発明の発明者らの一部に対するＷＯ０２／０８７５５及びＵ．Ｓ．２００５／０２６０７７０に開示されている抗原アレイを使用して実行することができ、これらの内容は参照により本明細書に援用される。ＷＯ０２／０８７５５は、疾患の診断又は処置のモニタリングを必要とする患者対象由来の血清の未決定の免疫グロブリンとの所定の抗原反応をクラスター化し、それにより同定するためのシステム及び製品を対象とする。更に開示されているのは診断方法及びこの方法で有用なシステムであり、複数種の抗原から成る抗原のサブセットをクラスター化する工程であって、抗原のサブセットが複数人の患者に由来する複数種の抗体と反応する、クラスター化する工程と、対象の抗体を、得られたクラスターと関連付ける又は関連付けない工程とを利用する。
【０１０３】
本発明の発明者らの一部に対する米国特許出願公開第２００５／０２６０７７０号には、抗原アレイシステム及びこの診断用途が開示されている。この出願は、対象の免疫疾患、特に１型糖尿病、又は免疫疾患への素因を診断する方法であって、対象の免疫グロブリンの抗原プローブセットの各抗原プローブに特異的に結合する能力を決定することを含む方法を提供する。この開示の教示は、本明細書に完全に記載されているかのようにその全体が援用される。
【０１０４】
その他の実施形態では様々なその他の免疫アッセイを使用することができ、この免疫アッセイとして、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、マルチプレックスビーズによるフローサイトメトリー（例えばＬｕｍｉｎｅｘにより作製されたシステム）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、エリプソメトリー（ｅｌｉｐｓｏｍｅｔｒｙ）、並びに例えばレーザー走査、光検出、光電子倍増管による光子検出、デジタルカメラをベースとするシステム又はビデオシステムによる撮影、放射線計測、蛍光検出、電子、磁気検出、及び抗原−抗体結合の定量的測定を可能にするあらゆるその他のシステムを利用する様々なその他の免疫アッセイが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１０５】
本発明の方法に適したアレイを調製するために様々な方法が開発されている。最新の方法として、抗原プローブを含む別々の溶液を、平面支持体、典型的には顕微鏡スライド等のガラス支持体の表面上の密集した特定のアドレス可能な位置に塗布する又は「スポットする」ためのロボット装置の使用が挙げられ、支持体はその後、抗原プローブを支持体の表面に付着させるために適切な加熱処理及び／又は化学処理により処理される。最初に、ガラス表面を、表面上のエポキシ基等の反応基の層を残す化学処理により活性化し、この反応基は、遊離アミン基又は遊離チオール基を含む任意の分子と共有結合する。適切な支持体として、ケイ素、ニトロセルロース、紙、セルロース支持体等も挙げることができる。
【０１０６】
好ましくは、統計的に強固なデータの生成を可能とするために、本発明の各抗原プローブ又は抗原プローブの別々のサブセット（アレイの特定のアドレス可能な位置に付着される）は、アレイの少なくとも２箇所の、より好ましくは少なくとも３箇所の別々の特定のアドレス可能な位置に独立して付着される。
【０１０７】
追加の実施形態によれば、抗原プローブセットは、本発明により提供される１種又は複数種の抗原を含む少なくとも１００種の、少なくとも１５０種の、少なくとも２００種の又はより多くの種類の抗原を含む。追加の実施形態によれば、抗原プローブセットは、本発明により提供される１種又は複数種のオリゴヌクレオチド抗原を含む少なくとも１００種の、少なくとも１５０種の、少なくとも２００種の又はより多くの種類のオリゴヌクレオチド抗原を含む。
【０１０８】
本発明の抗原プローブに加えて、アレイは、対照の抗原プローブ又はその他の標準的な化学物質を有利に含むことができる。そのような対照の抗原プローブとして正規化対照プローブを挙げることができる。正規化対照プローブから得られるシグナルは、結合条件、標識強度、「読み取り」効率、及び変化する所与の結合抗体−プローブリガンド相互作用のシグナルを生じ得るその他の因子の変化に関する対照を提供する。例えば、シグナル、例えば蛍光強度、抗原プローブアレイの全てのその他の抗原プローブからの読み取りは、正規化対照プローブからのシグナル（例えば蛍光強度）により分類され、それにより測定が正規化される。正規化対照プローブを抗原プローブアレイ上の様々なアドレス可能な位置に結合させ、抗体−リガンドプローブ効率の空間的変化を制御することができる。好ましくは、正規化対照プローブは、エッジ効果を制御するためにアレイの隅又は端部に位置しており、更にアレイの中央にも位置する。
【０１０９】
標識化抗体リガンドは、種々の適切な種類の抗体リガンドの内のいずれかであることができる。好ましくは、抗体リガンドは、使用する対象の抗体のＦｃ部分に特異的に結合することができる抗体である。例えば、対象の抗体がＩｇＭアイソタイプである場合、抗体リガンドは好ましくは、対象のＩｇＭ抗体のＦｃ領域に特異的に結合することができる抗体である。
【０１１０】
対象の抗体のリガンドを、様々な種類の検出可能な標識の内のいずれかにコンジュゲートさせることができる。好ましくは、標識はフルオロフォアであり、最も好ましくはＣｙ３である。或いは、フルオロフォアは、Ｃｙ５、Ｄｙ５、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、ローダミン、テキサスレッド等の様々なフルオロフォアのいずれかであることができる。特定のアイソタイプの抗体に特異的である、適切なフルオロフォアがコンジュゲートした抗体は商業的供給者から広く入手可能であり、この抗体の産生方法は十分に確立されている。
【０１１１】
用途及び目的に応じて様々な方法の内のいずれかで対象の抗体の抗原プローブ結合能力を分析するために、この対象の抗体を単離することができる。対象の抗体は、適切に及び都合よく血清若しくは血漿又はこれらの希釈液（例えば１：１０希釈液）の形であることができるが、この抗体の抗原プローブに特異的に結合する能力に関して試験する前に、この抗体を任意の所望の程度の精製に供することができる。本発明の方法を、対象の全抗体、又は抗体の可変領域を含む対象の抗体断片を使用して実施することができる。
【０１１２】
データ分析
本発明の方法が、学習及びパターン認識のアナライザ、クラスタリングアルゴリズム等の使用を採用して、健常な対照の対象の反応性パターンとＳＬＥを有する患者の反応性パターンとを識別することができることが有利である。従って、この用語は具体的には、例えば、複数種の抗原に対する試験サンプル中の抗体の反応性を決定し、そのようなアルゴリズム及び／又はアナライザを使用して、結果として得られた反応性パターンと陰性対照サンプル及び陽性対照サンプル（例えば、ＳＬＥに罹患していない対照の対象又はＳＬＥに罹患している患者からそれぞれ得たサンプル）の反応性パターンとを比較することにより測定された差異を含む。この差異を、試験サンプルの反応性パターンと、そのような方法で得られた所定の分類規則とを比較することにより測定することもできる。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、学習及びパターン認識のアナライザ、クラスタリングアルゴリズム等の使用を採用して、ＳＬＥの亜型を有する対象の反応性パターンと対照の対象とを識別することができる。例えば、本方法は、複数種の抗原に対する試験サンプル中の抗体の反応性を決定すること、並びにそのようなアルゴリズム及び／又はアナライザを使用して、結果として得られたパターンと陰性対照サンプル及び陽性対照サンプルの反応性とを比較することを含むことができる。
【０１１４】
そのため、別の実施形態では、試験サンプルの反応性パターンと対照サンプルの反応性パターンとの有意差（この差は、学習及びパターン認識アルゴリズムを使用して算出される）は、対象がＳＬＥに罹患していることを示す。例えば、このアルゴリズムとして、統計アルゴリズム等の監視型分類器又は非監視型分類器を挙げることができるがこれらに限定されず、例えば、主成分分析（ＰＣＡ）、部分最小二乗法（ＰＬＳ）、多重線形回帰（ＭＬＲ）、主成分回帰（ＰＣＲ）、線形判別分析（ＬＤＡ）等の判別関数分析（ＤＦＡ）及びクラスター分析、例えば最近傍、人工神経ネットワーク、結合二方向クラスタリングアルゴリズム（ｃｏｕｐｌｅｄ  ｔｗｏ−ｗａｙ  ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）、多層パーセプトロン（ＭＬＰ）、一般化回帰神経ネットワーク（ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｎｅｕｒａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋ）（ＧＲＮＮ）、ファジー推論システム（ＦＩＳ）、自己組織化マップ（ＳＯＭ）、遺伝的アルゴリズム（ＧＡＳ）、神経ファジーシステム（ＮＦＳ）、適応共鳴理論（ＡＲＴ）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１１５】
ある実施形態では、１つ又は複数のアルゴリズム又はコンピュータプログラムを使用して、所定のカットオフに対して（又は多くの所定のカットオフに対して）試験サンプル中で定量化された各抗体の量を比較することができる。或いは、ヒトによって必要な工程を手動で実施するために、１つ又は複数の指示書を提供することができる。
【０１１６】
パターン分析を決定して比較するためのアルゴリズムとして、主成分分析、フィッシャー線形分析、神経ネットワークアルゴリズム、遺伝的アルゴリズム、ファジー論理パターン認識等が挙げられるがこれらに限定されない。分析の完了後、結果として得られた情報を、例えばディスプレイに表示することができる、ホストコンピュータに送信することができる、又はその後の検索のために保存装置に保存させることができる。
【０１１７】
アルゴリズムの多くは、神経ネットワークをベースとするアルゴリズムである。神経ネットワークは、入力層、処理層及び出力層を有する。神経ネットワークでの情報は処理層全体に分配される。処理層は、ニューロンのノードへの相互接続により該ニューロンを刺激するノードにより構成されている。データの収集における基礎的なパターンを明らかにする統計的分析と同様に、神経ネットワークは、所定の基準に基づいて、データの収集において一貫したパターンを検索する。
【０１１８】
好適なパターン認識アルゴリズムとして、主成分分析（ＰＣＡ）、フィッシャー線形判別分析（ＦＬＤＡ）、クラス類似性のソフト独立型モデリング（soft independent modeling of class analogy）（ＳＩＭＣＡ）、Ｋ−最近傍（ＫＮＮ）、神経ネットワーク、遺伝的アルゴリズム、ファジー論理及びその他のパターン認識アルゴリズムが挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、フィッシャー線形判別分析（ＦＬＤＡ）及び正準判別分析（ＣＤＡ）並びにこれらの組み合わせを使用して、出力シグネチャーとデータベースから入手可能なデータとを比較する。
【０１１９】
その他の実施形態では主成分分析を使用する。主成分分析（ＰＣＡ）は、多くの相関変数をより少数の非相関変数に変換する数学的技法を含む。より少数の非相関変数は主成分として知られている。第１の主成分又は固有ベクトルは可能な限りデータにおける多くの変動性を説明し、続いて起こる各成分は可能な限り多くの残りの変動性を説明する。ＰＤＡの主な目的は、データセットの次元を減少させ、新たな基礎的変数を特定することである。
【０１２０】
主成分分析は、２つ以上の共分散行列の構造を階層的な方法で比較する。例えば、一方の行列は、行列の各要素に単一の定数を乗じることを除き他方と同一の可能性がある。そのため、行列は互いに比例する。より具体的には、行列は同一の固有ベクトル（又は主成分）を共有するが、それらの固有値は定数が異なる。行列間の別の関係は、これらの行列が共通の主成分を共有するが、これらの行列の固有値が異なることである。主成分分析で使用する数学的技法は固有分析（ｅｉｇｅｎａｎａｌｙｓｉｓ）と呼ばれる。最大の固有値と関連する固有ベクトルは、第１の主成分と同じ方向を有する。２番目に大きな固有値と関連する固有ベクトルは第２の主成分の方向を決定する。固有値の合計は正方行列のトレースと等しく、固有ベクトルの最大数はこの行列の行の数と等しい。
【０１２１】
別の実施形態では、アルゴリズムは分類子である。分類子の一種は、アルゴリズムをトレーニングセット由来のデータにより「トレーニングする」ことにより生成され、その性能は試験セットデータにより評価される。本発明と共に使用される分類子の例は、判別分析、決定木分析、受信者動作曲線又は分割及びスコア分析である。
【０１２２】
用語「決定木」は、分類に採用されるフローチャート様のツリー構造を有する分類子を意味する。決定木は、データセットのサブセットへの分割の繰り返しから成る。各分割は、１つの変数に適用される簡単な規則から成り、例えば「「変数１」の値が「閾値１」よりも大きい場合には左に行き、そうでなければ右に行く」から成る。従って、所与の特徴空間が一連の長方形に区画化され、各長方形は１つのクラスに割り当てられる。
【０１２３】
用語「試験セット」又は「未知」又は「検証セット」は、トレーニングセットに含まれないエントリーから成る利用可能なデータセット全てのサブセットを意味する。試験データを適用して分類子の性能を評価する。
【０１２４】
用語「トレーニングセット」又は「既知のセット」又は「参照セット」は、個々の利用可能なデータセット全てのサブセットを意味する。このサブセットは典型的にはランダムに選択され、分類子の構築のためだけに使用される。
【０１２５】
診断方法
本明細書で使用する場合、用語「診断する」又は「診断」は、兆候、症状によって医学的状態又は疾患（例えばＳＬＥ）を特定するプロセスを意味しており、具体的には、１種又は複数種のオリゴヌクレオチド抗原に対する、個体から得た生体サンプル（例えば血清）中の抗体の反応性を検出する等の様々な診断手順の結果から医学的状態又は疾患（例えばＳＬＥ）を特定するプロセスを意味する。更に、本明細書で使用する場合、用語「診断する」又は「診断」は、疾患をスクリーニングすること、疾患の存在又は重症度を検出すること、ある疾患を、１種又は複数種の類似の又は同一の症状を特徴とし得る疾患等のその他の疾患等のその他の疾患から区別すること、疾患の予後を提供すること、疾患の進行又は再発をモニタリングすること、並びに処置の有効性及び／又は疾患、障害若しくは状態の再発の評価、並びに疾患の治療及び／又は処置を選択すること、疾患の所与の治療の最適化、疾患の処置をモニタリングすること、及び／又は特定の患者若しくは亜集団への治療の適性を予測すること、又は患者若しくは亜集団での治療薬の適切な用量を決定することを包含する。
【０１２６】
診断方法は、それらの感度及び特異度が異なる。診断アッセイの「感度」とは、陽性との結果がでる罹患個体の割合（「真の陽性」の割合）のことである。アッセイにより検出されない罹患個体は「偽陰性」である。罹患しておらず、アッセイにおいて陰性との結果がでる対象は、「真の陰性」と呼ばれる。診断アッセイの「特異度」は１から偽陽性率を引いたものであり、「偽陽性」率は、陽性との結果が出る疾患を有しない者の集団と定義される。特定の診断方法は状態の決定的な診断を提供することができないが、診断の助けとなる肯定的な指標をその方法が提供すれば十分である。診断アッセイの「確度」とは、測定結果の真の値への近接のことである。診断アッセイの「ｐ値」とは、帰無仮説が実質的に真実である場合に、観測したサンプルの結果（又はより極端な結果）を得る確率のことである。
【０１２７】
ある実施形態では、本発明により提供された抗原プローブセット又は本発明により提供された抗原プローブアレイの使用により、ＳＬＥ指標的であり（ｐ値≦１．００Ｅ−０８）、敏感であり（≧０．６００）、特異的であり（≧０．７００）、正確である（≧０．６００）抗体反応性プロファイルが得られる。ある実施形態では、この使用により、よりＳＬＥを示し（ｐ値≦１．００Ｅ−１０）、敏感であり（≧０．７００）、特異的であり（≧０．８００）、正確である（≧０．７００）抗体反応性プロファイルが得られる。ある実施形態では、この使用により、更にＳＬＥを示し（ｐ値≦１．００Ｅ−１２）、敏感であり（≧０．８００）、特異的であり（≧０．９００）、正確である（≧０．８００）抗体反応性プロファイルが得られる。ある実施形態では、この使用により、更によりＳＬＥを示し（ｐ値≦１．００Ｅ−１４）、敏感であり（≧０．９００）、特異的であり（≧０．９５０）、正確である（≧０．９００）抗体反応性プロファイルが得られる。ある実施形態では、この使用により、より高度にＳＬＥを示し（ｐ値≦１．００Ｅ−１６）、敏感であり（≧０．９５０）、特異的あり（≧０．９９０）、正確である（≧０．９５０）抗体反応性プロファイルが得られる。それぞれの可能性は本発明の別々の実施形態を表す。
【０１２８】
ある実施形態では、本発明により提供されるオリゴヌクレオチド抗原又は本発明により提供されるオリゴヌクレオチド抗原パターンは、ＳＬＥを示し（ｐ値≦１．８７Ｅ−０８）、敏感であり（≧０．６０９）、特異的であり（≧０．７６９）、正確である（≧０．６８７）。ある実施形態では、本発明により提供されるオリゴヌクレオチド抗原又は本発明により提供されるオリゴヌクレオチド抗原パターンは、有利にＳＬＥを示し（ｐ値≦２．８１Ｅ−１２）、敏感であり（≧０．６５７）、特異的であり（≧０．７９８）、正確である（≧０．７２５）。ある実施形態では、本発明により提供されるオリゴヌクレオチド抗原又は本発明により提供されるオリゴヌクレオチド抗原パターンは、更に有利にＳＬＥを示し（ｐ値≦８．００Ｅ−１４）、敏感であり（≧０．６６３）、特異的であり（≧０．８１４）、正確である（≧０．７３８）。
【０１２９】
別の実施形態では、本方法により、ＳＬＥ疾患の活動性のレベルを決定することができる。更なる実施形態では、本方法により、ＳＬＥ疾患の活動性をモニタリングするための実体との比較を提供することができる。これらの実施形態では、本方法を使用して、例えば活動的な疾患を有する対象と活動的ではない疾患を有する対象とを区別することができる。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）又はループスの診断で有用である。「ループス」とは本明細書で使用する場合、結合組織を攻撃する抗体が関与する自己免疫疾患又は自己免疫障害のことである。いくつかの実施形態によれば、本発明は、ＳＬＥの検出に有用な診断方法を提供する。
【０１３１】
一実施形態では、本発明の方法に従って診断する対象は症状を示す。その他の実施形態では、対象は症状を示さない。ある実施形態では、対象は、免疫抑制剤を投与されていない、若しくは投与されていなかった、又は免疫抑制処置を受けていない、若しくは受けていなかった。
【０１３２】
診断手順をインビボ又はインビトロで実施することができ、好ましくはインビトロで実施することができる。本発明の方法のある実施形態では、診断手順を非侵襲性の手段又は方法で実施する。
【０１３３】
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）
１９８２年アメリカリウマチ学会（ＡＣＲ）の基準には、ＳＬＥの診断に必要な特徴が記載されている。１１個の基準の内のわずか４個の存在により、ＳＬＥに対して８５％の感度及び９５％の特異度が生じる。ＳＬＥを有する患者は、ループスの臨床的特徴及び血清学的証拠のあらゆる組み合わせを示す可能性がある。ＡＣＲの基準は、（１）漿膜炎（検査又は診断用ＥＣＧ又は画像化での胸膜炎、心膜炎）、（２）口腔潰瘍（口腔又は鼻咽腔、通常は無痛性；口蓋が最も特徴的である）、（３）関節炎（非びらん性、圧痛又は腫れを有する２箇所以上の末梢関節）、（４）光線過敏症（光曝露に対する異常な皮膚反応）、（５）血液疾患（白血球減少症（複数の原因に対して＜４×１０３個の細胞／μＬ）、リンパ球減少症（複数の原因に対して＜１５００個の細胞／μＬ）、血小板減少症（原因薬物の非存在下で＜１００×１０３個の細胞／μＬ）、溶血性貧血）、（６）腎障害（タンパク尿（ディップスティック試験での＞０．５ｇ／ｄ若しくは３＋陽性）又は細胞円柱）、（７）ＡＮＡ（より高い力価は一般により特異的（＞１：１６０）；薬剤誘発性のループスに関連する薬物の非存在下でなければならない）、（８）免疫学的事象（ｄｓＤＮＡ；抗スミス（Ｓｍ）抗体；抗リン脂質抗体（抗カルジオリピン免疫グロブリンＧ［ＩｇＧ］又は免疫グロブリンＭ［ＩｇＭ］又はループス抗凝固因子）；梅毒、エリテマトーデス（ＬＥ）細胞に関する生物学的に偽陽性の血清学試験の結果（１９９７年に除外された）、（９）神経障害（その他の原因の非存在下での発作又は精神病）、（１０）頬部発疹（頬及び鼻梁にわたる固定された紅斑、平坦又は隆起）、並びに（１１）円板状発疹（角化性落屑及び毛孔性角栓を伴い、多くは瘢痕化を伴う紅斑性の隆起した縁の病変）である。
【０１３４】
全身性ループス協力クリニック（ＳＬＩＣＣ）は近年、臨床的関連を改善するために、厳密な方法論の要件を満たすために、及びＳＬＥ免疫学での新たな知見を組み込むために、米国リウマチ学会（ＡＣＲ）ＳＬＥ分類基準を改正して正当性を立証した（Ｐｅｔｒｉ他、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ、２０１２、第６４巻、２６７７〜２６８６頁）。１１個の臨床基準及び６個の免疫学的基準を含む１７個の基準が特定された。ＳＬＥ分類に関するＳＬＩＣＣ基準は、少なくとも１個の臨床基準及び１個の免疫学的基準を含む少なくとも４個の基準の充足、又はＡＮＡ若しくは抗ｄｓＤＮＡ抗体の存在下での唯一の臨床基準としてのループス腎炎を求める。
【０１３５】
ＳＬＥの診断に最も一般的に使用される手段の内の２つは、全身性エリテマトーデス疾患活動性指標（ＳＬＥＤＡＩ）及び全身性ループス活動性尺度（ＳＬＡＭ）である。
【０１３６】
ＳＬＥＤＡＩは、関与する各臓器系の重要性に重みを加えることにより疾患の活動性を測定する指標である。ＳＬＥＤＡＩは、９個の臓器系を表す２４個の項目を含む。病歴、身体検査及実験室での評価により変数が得られる。関与する臓器の重要性に基づいて、各項目に１から８の重みを加える。例えば、口腔内潰瘍に２というスコアを付け、発作に８というスコアを付ける。ＳＬＥＤＡＩに関与する実験室でのパラメータとして、白血球数、血小板数、尿検査、血清のＣ３、Ｃ４及び抗ｄｓＤＮＡが挙げられる。最大総スコアは１０５である。
【０１３７】
ＳＬＡＭは、１１個の臓器系を表す３２個の項目を含む。この項目は、存在／非存在としてスコア化されるだけでなく、重症度に基づいて１から３の階級でランク付けされる。ＳＬＡＭに関する可能な総スコアは８６である。ＳＬＥＤＡＩ及びＳＬＡＭの両方は経時的な変化に対して有効であり、信頼性があり、敏感であることが分かっており（Ｌｉａｎｇ他、１９８９、Ａｒｔｈ  Ｒｈｅｕｍ  ３２：１１０７〜１８）、研究プロトコル及び臨床試験で広く使用されている。これらの指標は、ＳＬＥにおける疾患活動性の新しく提案された血清学的な又は炎症性のマーカーの値を調べるのに特に有用である。
【０１３８】
これらの手段の明らかな有用性にもかかわらず、いくつかの欠点が存在する。最初に、同一のセットの患者においてＳＬＡＭとＳＬＥＤＡＩとが常に完全に一致するとは限らない。この不一致にはいくつかの理由が考えられる。ＳＬＥＤＡＩとは異なり、ＳＬＡＭには疲労及び発熱等の全身症状が含まれ、この全身症状は活動性ＳＬＥに起因すると見なされるかもしれないし見なされないかもしれず、この活動性指標は医師の解釈に依存する。加えて、ＳＬＥＤＡＩは、いくつかの臓器系での穏やかな程度の活動性を捕捉せず、溶血性貧血等のいくつかの種類の活動性に関する記述子を有しない。
【０１３９】
強皮症（又は全身性硬化症）は、内皮細胞の損傷、繊維芽細胞の活性化、細胞外基質（ＥＣＭ）の蓄積、並びに高い罹患率及び死亡率を保持する異常な血管形成を特徴とする自己免疫疾患である。死亡率の主な原因の１つは、肺組織の線維症（間質性肺疾患）及び重度の肺高血圧症である。強皮症の病因は不明なままであるが、この病因には、自己抗体が早期に産生される標的臓器に対する自己免疫反応、並びに炎症性単核細胞浸潤後の臓器機能の喪失及び線維症が含まれると考えられる。主な標的臓器は、皮膚、胃腸管、肺及び腎臓であるが、その他の臓器も頻繁に関与する。広範な強皮症は、ＳＬＥ等のその他の自己免疫疾患と共に生じる可能性がある。
【０１４０】
本発明のいくつかの実施形態をより完全に説明するために下記に実施例を示す。しかしながら、この実施例は本発明の広い範囲を限定すると決して解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１４１】
材料及び方法
ヒト対象
この調査は、参加している各臨床施設の施設内治験審査委員会により承認され、全ての参加者からインフォームドコンセントを得た。最初の調査では、２２例の健常な対象、１８例の尋常性天疱瘡（ＰＶ）患者、１５例の強皮症及び全身性硬化症（ＳＳｃ）患者、並びに３４例の全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者から得た血液サンプルに由来する血清を、Ａ２０（配列番号２２）一本鎖オリゴヌクレオチド、Ｃ２０（配列番号１５）一本鎖オリゴヌクレオチド、Ｇ２０（配列番号４３）一本鎖オリゴヌクレオチド、及びＴ２０（配列番号８）一本鎖オリゴヌクレオチドを含む抗原マイクロアレイを使用して試験した。追跡調査では、２３例の健常な対象、２４例のＳＳｃ患者、及び４９例のＳＬＥ患者から得た血清サンプルを、５８種の一本鎖オリゴヌクレオチドを含む抗原マイクロアレイを使用して試験した。全体では、６０例のＳＬＥ患者、２６例のＳＳｃ患者、１８例のＰＶ患者、及び３１例の健常な対象を試験した。ＳＬＥ患者及びＳＳｃ患者を、臨床的に認められた基準（ＥＭ  Ｔａｎ他、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  １９８２；２５：１２７１により公開され、ＭＣ  Ｈｏｃｈｂｅｒｇ、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  １９９７；４０：１７２５により更新された基準；「全身性硬化症（強皮症）の分類のための予備基準。米国リウマチ協会の診断及び治療基準委員会の強皮症基準小委員会（Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  （ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ）．Ｓｕｂｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ  ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）」．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．１９８０；２３（５）：５８１〜９０）に従って診断した。ＰＶの診断は、臨床的特徴及び臨床検査（皮膚病変の組織像上での基底層分離、陽性直接及び間接免疫蛍光顕微鏡、並びに／又は抗デスモグレインＡｂｓのＥＬＩＳＡ検出）に基づいた（Ｚａｇｏｒｏｄｎｉｕｋ  Ｉ他、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２００５  Ｊｕｌ；４４（７）：５４１〜４）。
【０１４２】
血液サンプル及び臨床データを、Ｒａｂｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒのリウマチ学部署及び腎臓学部署、イスラエル、ペタクチクヴァ（ＰｅｔａｃｈＴｉｋｖａ）；Ｓｈｅｂａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒのリウマチ学部署及び血液学部門、イスラエル；皮膚科学部門、Ｔｅｌ  Ａｖｉｖ  Ｓｏｕｒａｓｋｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ；並びにＤｉｐａｒｔｉｍｅｎｔｏ  ｄｉ  Ｓｃｉｅｎｚｅ  Ｍｅｄｉｃｈｅ  ｅ  Ｃｈｉｒｕｒｇｉｃｈｅ、Ｓｅｚｉｏｎｅ  ｄｉ  Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｍｅｄｉｃａ、イタリア、アンコーナ（Ａｎｃｏｎａ）、ポロディダッティコ（Ｐｏｌｏ  Ｄｉｄａｔｔｉｃｏ）に到着する患者から集めた。組み入れ基準は、診断時での＞３のＡＣＲ基準スコアであった。健常な対照のサンプルを、参加している各臨床施設の施設内治験審査委員会により承認された調査プロトコル下で得て、全ての参加者からインフォームドコンセントを得た。
【０１４３】
サンプルを、４７例のアフリカ人、１５例の白人、４例のインド人／アジア人／中東人及び１７例のヒスパニック系を含む、平均年齢が３５歳である８３例の健常な対象、並びに４７例のアフリカ人、６例の白人、１７例のヒスパニック系及び１例の別の系統を含む、平均年齢が同じである７７例のＳＬＥ患者からも得た。
【０１４４】
抗原及び血清試験
追跡調査では、様々な長さ（全体で１０４種の異なる調製物）である５８種の異なるオリゴヌクレオチド並びに二本鎖ＤＮＡ及び一本鎖ＤＮＡを、エポキシ活性化ガラス基板（ＡｒｒａｙＩｔ  ＳｕｐｅｒＥｐｏｘｉマイクロアレイ基板スライド、カリフォルニア州、サニーベール（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ））上にスポットした。オリゴヌクレオチドはＳＢＳ  Ｇｅｎｅｔｅｃｈ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（中国、上海）から購入した。次いで、マイクロアレイを、１％ウシ血清アルブミンにより３７°で１時間にわたりブロックした。１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）ブロッキング緩衝液中の試験血清サンプル（１：１０希釈液）を、３７°で１時間にわたりカバースリップ下にてインキュベートした。次いで、アレイを洗浄し、混ざり合った２種の検出抗体、即ちヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｃｙ３共役抗体及びヤギ抗ヒトＩｇＭ  Ｃｙ５共役抗体（両方ともＪａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．ペンシルバニア州、ウェストグローブ（Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ）から購入した）の１：５００希釈液と共に３７°で１時間にわたりインキュベートした。レーザー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州、サンタクララ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ））による画像取得を実施し、Ｑｕａｎｔａｒｒａｙソフトウェア（Ｐａｃｋａｒｄ  ＢｉｏＣｈｉｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、マサチューセッツ州、ビレリカ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ））を使用して結果を分析した。各抗原スポットへの結合のシグナル強度の定量的範囲は０〜６５，０００であり、この検出範囲により、試験血清サンプルの１：１０希釈液で信頼性のあるデータを得ることができた。
【０１４５】
或いは、様々な鎖長のオリゴヌクレオチド抗原並びに二本鎖ＤＮＡ及び一本鎖ＤＮＡを、エポキシヘキシルトリエトキシシラン（ＥＨＴＥＳ）活性化スライド上にスポットした。次いで、マイクロアレイを、１％カゼインにより室温で１時間にわたりブロックした。１％カゼインブロッキング緩衝液中の試験血清サンプル（１：２０希釈液）を、３７°で１時間にわたりカバースリップ下にてインキュベートした。次いで、アレイを洗浄し、混ざり合った２種の検出抗体、即ちヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｃｙ３共役抗体及びヤギ抗ヒトＩｇＭ  ＡＦ６４７共役抗体（両方ともＪａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．ペンシルバニア州、ウェストグローブから購入した）の１：５００希釈液と共に３７°で１時間にわたりインキュベートした。２種の波長５３０ｎｍ及び６３０ｎｍでのレーザー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州、サンタクララ）による画像取得を実施し、初期設定のＧｅｎｅｐｉｘ  Ｐｒｏ  ７．０ソフトウェアを使用して結果を分析した。各抗原スポットへの結合のシグナル強度の定量的範囲は０〜６５，０００であり、この検出範囲により、試験サンプルの１：２０希釈液で信頼性のあるデータを得ることができた。
【０１４６】
画像分析及びデータ処理
各スポットの強度を、局所的なバックグラウンド中央値の減算後のＬｏｇ２変換の後のピクセルの平均で表す。（バックグラウンドの減算後の）陰性スポットをバックグラウンド状強度に帰属させる。各抗原の複数のスポットのフォアグラウンド及びバックラウンドの強度を平均化し、フォアグラウンドとバックグラウンドとの間の差異を算出した。結果の値を、スポットとした抗原に結合する抗体の抗原反応性として取得した。全ての抗原は多数のスライド中において有意な反応性を示し、そのため除外した抗原はなかった。
【０１４７】
抗体の結果の統計的分析
その他の下位群と比較して特定の調査下位群において反応性が高かった又は低かった抗原を同定した。陽性的中率（ＰＰＶ）≧９０％及び感度≧２０％等の分類閾値の設定を可能にする抗原を実現し、特定の下位群を有意に特徴付けることを確認した。ＳＬＥ患者を、ｄｓＤＮＡに対する反応性がこの要件をパスした場合にｄｓＤＮＡに対して陽性と記録した。更なる限定のために、（多重仮説に対するＢｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ補正後の）両側ｔ検定のｐ値が０．０５未満である唯一の抗原を選択した。
【０１４８】
（例１）
ホモヌクレオチド２０ｍｅｒに結合する抗体
健常な対象、ＰＶ患者、ＳＳｃ患者及びＳＬＥ患者からの血清サンプルを、血清ＩｇＧ抗体及び血清ＩｇＭ抗体の４種の２０ｍｅｒホモヌクレオチド：Ｇ２０（配列番号４３）、Ａ２０（配列番号２２）、Ｃ２０（配列番号１５）及びＴ２０（配列番号８）への結合に関して試験した（図１）。左から右へとｄｓＤＮＡに対する各対象の反応性の順に反応性を並べた。Ｇ２０（配列番号４３）に対するＩｇＧの反応性が全ての対象で非常に高く、その他のオリゴヌクレオチドに対する非常に低い反応性と比べて有意に高かったことが分かる。しかしながら、ＰＶ患者は、ＳＳｃ患者と比べてＧ２０に対するＩｇＧの反応性及びＩｇＭの反応性が有意に低いことが分かった。このことを除き、調査群の間に差異は認められなかった。
【０１４９】
ＳＬＥ患者におけるＡ２０（配列番号２２）、Ｃ２０（配列番号１５）及びＴ２０（配列番号８）に対するＩｇＧの反応性は、そのｄｓＤＮＡに対する反応性と相関関係があり、ｄｓＤＮＡに対する反応性が低い患者は、Ａ２０（配列番号２２）、Ｃ２０（配列番号１５）及びＴ２０（配列番号８）に対する反応性をはっきりとは示さなかったが、ｄｓＤＮＡに対する反応性がより高い数例の患者は、Ａ２０（配列番号２２）、Ｃ２０（配列番号１５）及びＴ２０（配列番号８）に対してある程度の反応性を示した（図１）。健常な個体、ＳＳｃ患者及びＰＶ患者は、Ａ２０（配列番号２２）、Ｃ２０（配列番号１５）及びＴ２０（配列番号８）に対する反応性が非常に低かった、又はなかった。
【０１５０】
４種のホモヌクレオチド配列に対するＩｇＭの反応性は更にばらついており、各群において数例の対象はＧ２０（配列番号４３）に対するＩｇＧの反応性と比較してＧ２０（配列番号４３）に対する高い反応性を示したが、一部の血清は、Ｇ２０（配列番号４３）へのＩｇＭの結合をほとんど又は全く示さなかった。
【０１５１】
ポリＧオリゴヌクレオチド及びポリＴオリゴヌクレオチドに対する抗体の反応性の特徴を更に明らかにするために、２３例の健常な対象、２４例のＳＳｃ患者及び４９例のＳＬＥ患者に関する更なる調査を実施した。拡張型マイクロアレイ抗原チップを使用した。このチップは、修飾を有する及び有しないポリＧ配列及びポリＴ配列等の５８種のオリゴヌクレオチドを含んだ（下記を参照されたい）。ｄｓＤＮＡ陽性又はｄｓＤＮＡ陰性が合成オリゴヌクレオチドに対する抗体と関係があるかどうかを調べるために、ＳＬＥ患者を、そのｄｓＤＮＡに対する反応性に従って分類した。最初の調査のＧ２０（配列番号４３）、Ａ２０（配列番号２２）、Ｃ２０（配列番号１５）及びＴ２０（配列番号８）に対するＩｇＭの反応性及びＩｇＧの反応性の結果を裏付けた。両方の調査を組み合わせることにより、全てがＧ２０（配列番号４３）に対する高いＩｇＧの反応性を示すとともにＡ２０（配列番号２２）、Ｃ２０（配列番号１５）及びＴ２０（配列番号８）に対して比較的に低い反応性を示す合計で６０例のＳＬＥ患者、２６例のＳＳｃ患者、１８例のＰＶ患者及び３１例の健常な個体を得た。全ての調査群においてその他のポリヌクレオチドと比べて有意に高い、Ｇ２０（配列番号４３）に対するＩｇＧの平均の反応性。
【０１５２】
Ｇ２０（配列番号４３）に対するＩｇＧの反応性を、その他のオリゴヌクレオチド及びｓｓＤＮＡ及びｄｓＤＮＡに対するＩｇＧの反応性と比較した。図２は、特定のオリゴヌクレオチドで分類されたＧ２０（配列番号４３）に対するＩｇＧの反応性を各ドットが表す散布図を示す。一部のオリゴヌクレオチド及びｓｓＤＮＡ及びｄｓＤＮＡは反復されて混ざっていたことから、各対象を９７個のスポットで表す。異なるオリゴヌクレオチドと比較してＧ２０（配列番号４３）に対する高い反応性は、対角線よりも上のドットで表されるだろう。２３例の健常な対象の２２３１個のスポットの内、１０個のみが対角線よりも下であったことに留意しなければならない。この数はＳＳｃ患者及びｄｓＤＮＡ陰性のＳＬＥ患者の場合に少し増加し、ｄｓＤＮＡ陽性患者の場合にピークに達する（図２）。それにもかかわらず、Ｇ２０（配列番号４３）に対するＩｇＧの平均の反応性は、試験した４種の下位群全てにおいて、あらゆるその他のオリゴヌクレオチドに対するＩｇＧの反応性と比べて有意に高かった。
【０１５３】
抗原チップ上で試験したオリゴヌクレオチドのリストは下記の通りであった：Ａ２０（配列番号２２）、Ｃ２０（配列番号１５）、Ｔ２Ｇ１６Ｔ２（配列番号１０）、Ｇ２Ｔ１６Ｇ２（配列番号１６）、（ＧＡ）１０（配列番号４４）、（ＧＴ）１０（配列番号４５）、Ｇ４〜７、９、１１、１４、１７、２０（それぞれ配列番号４６、配列番号３７、配列番号１３、配列番号１７、配列番号３４、配列番号４７、配列番号４１、配列番号３６及び配列番号４３）、Ｔ４〜７、９、１１、１４、１７、２０（それぞれ配列番号４８、配列番号４９、配列番号３５、配列番号９、配列番号５０、配列番号４０、配列番号４、配列番号２及び配列番号８）、（ＣＧ）２〜６、８、１０（それぞれ配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号２９、配列番号５５及び配列番号２５）、（Ｃ＊Ｇ）２〜６、８、１０（＊＝Ｃメチルを有する）（それぞれ配列番号５６、配列番号５７、配列番号３９、配列番号５８、配列番号３０、配列番号３３及び配列番号２６）、Ｔ１Ｇ１６Ｔ１（配列番号２０）、Ｇ１６Ｔ１（配列番号１８）、Ｔ１Ｇ１６（配列番号３８）、Ｇ１６Ｔ２（配列番号１２）、Ｔ２Ｇ１６（配列番号２４）、Ｇ１Ｔ１６Ｇ１（配列番号５）、Ｔ１６Ｇ１（配列番号７）、Ｇ１Ｔ１６（配列番号４２）、Ｔ１６Ｇ２（配列番号２８）、Ｇ２Ｔ１６（配列番号１４）、ＧＡＣＧＣＴ（配列番号５９）、ＧＡＣＧＴＴ（配列番号６）、Ｇ１０ＧＡＣＧＣＴ（配列番号２７）、Ｇ１０ＧＡＣＧＴＴ（配列番号６０）、ＧＡＧＣＣＴ（配列番号２１）、ＧＡＧＣＴＴ（配列番号６１）、Ｇ１０ＧＡＧＣＣＴ（配列番号１９）、Ｇ１０ＧＡＧＣＴＴ（配列番号６２）、ＣＣＣＧＧＡ（配列番号６３）、Ｇ１０ＣＣＣＧＧＡ（配列番号３２）、並びにＴＣＣＡＴＡＡＣＧＴＴＧＣＡＡＣＧＴＴＣＴＧ（配列番号６４）。
【０１５４】
（例２）
ポリＧ又はポリＴへの抗体の結合はホモヌクレオチドの長さと関係がある
図３は、Ｔホモヌクレオチド又はＧホモヌクレオチドへの試験した各群の平均ＩｇＧ結合及び平均ＩｇＭ結合に対する種々の長さのヌクレオチドオリゴマーの影響を示す。Ｔ２０に対する反応性を示した、抗ｄｓＤＮＡに対して陽性であるＳＬＥ患者を除いて、その他の群はいずれも、ポリＴホモヌクレオチドのいずれかに対する感知され得るＩｇＧの平均の反応性又はＩｇＭの平均の反応性を示さなかったことが分かる。対照的に、全ての血清におけるポリＧに対するＩｇＧの平均の反応性はＧ２０（配列番号４３）に対して高く、ヌクレオチド鎖の長さがＧ１７（配列番号３６）以下まで短くなった場合に有意に低下した。驚いたことに、抗ｄｓＤＮＡに対して陽性であるＳＬＥ患者は、その他の群と比べて、より短いＧポリマーに対してより高いＩｇＧの平均の反応性をはっきりと示した。
【０１５５】
Ｇ２０（配列番号４３）への平均ＩｇＭ結合はＩｇＧ結合と比べて低く、ＩｇＭ結合はまた、オリゴマーの長さの短縮の影響も受けた。ｄｓＤＮＡに対して陽性であるＳＬＥ患者の平均ＩｇＭ結合とその他の群の平均ＩｇＭ結合とに差はなかったことに留意しなければならない。
【０１５６】
（例３）
Ｇ１６の５’末端又は３’末端のいずれかへの単一のＴの付加の影響
Ｇオリゴヌクレオチド鎖の５’末端又は３’末端のいずれかで単一のＴが付加されているＧ１６と比較したＧ１７（配列番号３６）へのＩｇＧ又はＩｇＭの結合の程度を試験した。図４は、個々の対象に関する結果を示す。Ｇ１７（配列番号３６）とＴ１Ｇ１６（配列番号３８）との間の対角線から明らかなように、Ｔ１Ｇ１６（配列番号３８）へのＩｇＧ結合及びＩｇＭ結合の両方がＧ１７（配列番号３６）鎖への結合と本質的に等しかったことが分かる。しかしながら、Ｇ１６Ｔ１（配列番号１８）への各対象の結合はＧ１７（配列番号３６）への結合と比べて大幅に低く、対角線の関係はもはや存在しなかった。そのため、各対象群におけるポリＧへの反応性はポリＧ鎖の３’末端への単一のＴ部分の付加の影響を大いに受けたが、Ｇ鎖の５’末端へのＴの付加の影響を受けなかったと思われ、ヌクレオチドの空間的順序は抗体結合に不可欠な抗原構造を形成すると思われる。
【０１５７】
（例４）
ポリＴ配列の末端への単一のＧの付加の影響
ポリＧ鎖の３’末端への単一のＴの付加の顕著な影響（例３）を考慮して、ポリＴ鎖の５’末端又は３’末端のいずれかへの単一のＧの付加によるＩｇＧ抗体又はＩｇＭ抗体の結合への影響を試験した。図５Ａは、Ｇ１Ｔ１６（配列番号４２）及びＴ１６Ｇ１（配列番号７）に対するＩｇＭの反応性及びＩｇＧの反応性の両方がほとんど全ての対象において増加した（ほとんどの点は対角線よりも上である）が、この増加は、グアニンを５’末端に付加した場合にはるかに顕著であったことを示す。同様に、Ｇ２Ｔ１６（配列番号１４）及びＴ１６Ｇ２（配列番号２８）に対するＩｇＭの反応性及びＩｇＧの反応性もＴ１７（配列番号２）と比較して増加した（図５Ｂ）。
【０１５８】
まとめると、鎖のいずれかの末端へのたとえ単一のＧの付加であってもポリＴオリゴヌクレオチドに対する反応性を有意に増加させることができ、このことは、鎖の３’末端への単一のＴの付加によるポリＧへの抗体の結合の阻害とは著しく対照的であった。
【０１５９】
（例５）
ＣｐＧ繰り返しに対する反応性
Ｃ−Ｇジヌクレオチドの１０回の反復で形成されている２０ｍｅｒ、即ち（ＣＧ）１０（配列番号２５）に対する３種の下位群でＩｇＭの反応性を測定した。１例を除く全ての健常な対象において、全てのＳＳｃ患者において、及びほとんどのＳＬＥ患者において、（ＣＧ）１０（配列番号２５）に対するＩｇＭの反応性が高かった。実際には、ＳＬＥ患者の下位群は、ＳＳｃ患者との有意差である（ＣＧ）１０（配列番号２５）に対する低いＩｇＭの反応性をはっきりと示した（図６）。大部分は抗ｄｓＤＮＡに対して陽性であるＳＬＥ患者の群は、（ＣＧ）１０（配列番号２５）に対する高いＩｇＧの反応性をはっきりと示した。
【０１６０】
（例６）
健常な対象及びＳＳｃ患者のと比較した、ＳＬＥ患者におけるｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ及び合成オリゴヌクレオチドに対するＩｇＧの反応性及びＩｇＭの反応性
表１には、健常な対照又はＳＳｃ患者と比較してＳＬＥ患者において抗体結合が増加している又は低下しているオリゴヌクレオチドが列挙されている。健常な対象と比較してＳＬＥ患者において広範囲のオリゴヌクレオチドがＩｇＭ抗体及びＩｇＧ抗体の両方に結合することが分かった。ｄｓＤＮＡに対するＩｇＭの反応性及びＩｇＧの反応性は重複しており、ＩｇＭ抗ｄｓＤＮＡに対して陽性である２３例のＳＬＥ患者の内の１８例（７８％）は、ＩｇＧ抗ｄｓＤＮＡに対しても陽性であった。更に、ＳＬＥ患者におけるオリゴヌクレオチドに対するＩｇＭの反応性及びＩｇＧの反応性の増加はそれぞれ、ｄｓＤＮＡに対するＩｇＭの反応性及びＩｇＧの反応性と重複した。そのため、ｄｓＤＮＡ陽性のＳＬＥ患者の下位群は、一般にｄｓＤＮＡ陰性患者と比較してオリゴヌクレオチドに対する反応性の増加を示し、おそらく骨格構造に対する反応性の増加を示す。
【０１６１】
オリゴヌクレオチドに対するＩｇＧの反応性及びＩｇＭの反応性は、健常な対照及び／又はＳＳｃ患者と比較してＳＬＥにおいて有意に増加することが分かった。
【０１６２】
【表１−１】
2017503169.tif 000002
【表１−２】
2017503169.tif 000003
【０１６３】
（例７）
健常な対象のと比較した、ＳＬＥ患者における合成オリゴヌクレオチドに対するＩｇＧの反応性及びＩｇＭの反応性
表２には、２種の下位群の対象（８３例の健常な対照と比較した７７例のＳＬＥ患者）において抗体結合が増加している又は低下しているオリゴヌクレオチドが列挙されている。
【０１６４】
様々なオリゴヌクレオチド抗原に対する、健常な対照と比較した、ＳＬＥ患者からのＩｇＭ抗体及びＩｇＧ抗体の結合の平均的な差異を、平均差、有意差（ｐ値）及び偽発見率−補正ｐ値（多重比較を補正するために使用する）として表し、ここで、正の値は、健常な対照（ＨＣ）で測定したレベルを超える結合の増加を示し、負の値は、ＨＣで測定したレベルを超える結合の低下を示す。
【０１６５】
健常な対象と比較してＳＬＥ患者において広範囲のオリゴヌクレオチドがより多くのＩｇＭ抗体及びＩｇＧ抗体に結合することが分かった。そのようなオリゴヌクレオチド抗原の例は、Ｇ１Ｔ１６（配列番号４２）、ＣＣＡＴＡＡＴＴＧＣＡＡＡＣＧＴＴＣＴＧ（配列番号１）、Ｇ１Ｔ１６Ｇ１（配列番号５）、ＣＣＡＴＡＡＴＴＧＣＡＡＡＧＣＴＴＣＴＧ（配列番号３）、Ａ２０（配列番号２２）及びＴ２０（配列番号８）である。健常な対象と比較してＳＬＥ患者においてその他のオリゴヌクレオチドがより多くのＩｇＭ抗体又はより多くのＩｇＧ抗体に結合することが分かった。より多くのＩｇＭに結合することが分かったオリゴヌクレオチド抗原の例は、Ｔ１６Ｇ２（配列番号２８）Ｔ１６Ｇ１（配列番号７）である。
【０１６６】
【表２−１】
2017503169.tif 000004
【表２−２】
2017503169.tif 000005
【０１６７】
（例８）
健常な対象のと比較した、ＳＬＥ患者における合成オリゴヌクレオチドに対する抗体反応性
図７Ａ及び図７Ｂには、８３例の健常な対照と比較した、７７例のＳＬＥ患者においてＩｇＧ結合（図７Ａ）及びＩｇＭ結合（図７Ｂ）が増加しているオリゴヌクレオチドが列挙されている。広範囲のオリゴヌクレオチドが、極めてＳＬＥ指標的（ｐ値≦１．８７Ｅ−０８）であり、敏感であり（≧０．６０９）、特異的であり（≧０．７６９）、正確である（≧０．６８７）ことが分かった（図７Ａ）。
【０１６８】
そのようなオリゴヌクレオチド抗原の例は、ｐ値９．４９Ｅ−１５、感度０．６８０、特異度０．８２２及び確度０．７５０を有するＧ１Ｔ１６（配列番号４２）、ｐ値２．８１Ｅ−１２、感度０．６５７、特異度０．７９８及び確度０．７２５を有するＣＣＡＴＡＡＴＴＧＣＡＡＡＣＧＴＴＣＴＧ（配列番号１）、ｐ値１．０７Ｅ−１８、感度０．７６７、特異度０．８６９及び確度０．８１９を有するＧ１Ｔ１６Ｇ１（配列番号５）、ｐ値９．８７Ｅ−１４、感度０．６５９、特異度０．８３０及び確度０．７４３を有するＣＣＡＴＡＡＴＴＧＣＡＡＡＧＣＴＴＣＴＧ（配列番号３）、ｐ値１．８７Ｅ−０８、感度０．６０９、特異度０．７６９及び確度０．６８７を有するＡ２０（配列番号２２）、ｐ値８．００Ｅ−１４、感度０．６６３、特異度０．８１４及び確度０．７３８を有するＴ２０（配列番号８）、ｐ値４．８１Ｅ−１５、感度０．６８２、特異度０．８５６及び確度０．７６９を有するＴ１６Ｇ２（配列番号２８）、並びにｐ値２．３８Ｅ−１１、感度０．６５６、特異度０．８２８及び確度０．７４１を有するＴ１６Ｇ１（配列番号７）
である。
【０１６９】
特定の実施形態に関する前述の説明は、過度の実験を行うことなく及び一般的概念から逸脱することなく、他者が、現在の知識を適用することによりそのような特定の実施形態を容易に改変することができる及び／又は様々な応用に適合させることができる本発明の一般的な性質を完全に明らかにすることから、そのような適合及び改変は、開示した実施形態の等価物の意味内に及び範囲内に包含されるべきであり、そのように意図される。本明細書で採用した表現又は専門用語は説明を目的としており限定を目的とするものではないことを理解しなければならない。様々な開示した機能を実行するための手段、材料及び工程は、本発明から逸脱することなく様々な代替形態を取ることができる。
【図１】
2017503169.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ１】
2017503169.tif 000013
【図７Ａ２】
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【図７Ｂ１】
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【図７Ｂ２】
2017503169.tif 000016
【配列表】
2017503169000001.app
【国際調査報告】
2017503169.tif 000017