(57)【要約】  本開示には、脊髄再生を含む神経再生用のスキャフォールドとしての神経導管の使用が記載されている。この導管は、中空であってもよく、又は寒天若しくは他の生体適合性材料等の管腔充填材を含有していてもよい。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の脊髄成長又は再成長を促進するための方法であって、
管状体を含む導管を、脊髄欠損の部位に移植することを含み、
前記導管の中心軸は、前記導管の管腔が、所望の神経成長又は再成長の軸と概して平行になるように位置させる方法。
【請求項２】
前記導管を、隣接する椎骨分節間に係留することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
隣接する顔面シート又は筋肉繊維を縫合することにより、前記導管を前記部位に固定することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記導管が、ポリ−ラクチド酸、ポリ−ウレタン、ポリジオキサノン、シリコーン、セルロース、コラーゲン、ＰＬＧＡ、ポリカプロラクトン、又は変性天然細胞外マトリックスから構成されている、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記導管の前記管腔に配置されている管腔充填材（ＬＦ）を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＬＦが、寒天、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、又は糖タンパク質のうちの１つ又は複数を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＬＦが、前記導管の管腔にそって形成されるマイクロチャネルを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記ＬＦが神経成長因子を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記ＬＦが、微粒子又は溶出繊維を含むこと、及び
前記微粒子又は溶出繊維が、神経成長因子を含むことを更に含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記神経成長因子が経時的に溶出する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記導管の外側表面が、神経成長因子でコーティングされている、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記神経成長因子が、神経組織栄養性（ＮＧＦ、ＢＤＮＧ、ＮＴ−３）、グリア細胞由来（ＧＤＮＦ）、及び多面性（ＰＴＮ、ＶＥＧＦ）のもののうちの１つ又は複数を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＬＦが、高密度の神経成長因子からより低密度の神経成長因子への勾配を有する、前記導管の長さに沿って分布する神経成長因子を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＬＦが、１つ又は複数の神経成長因子の双方向勾配を有する、前記導管の長さに沿って分布する神経成長因子を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１５】
前記導管が、約０．５ｍｍから約５ｍｍまでの長さである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記導管が、約１．５ｍｍから約１４．０ｍｍまでの外径である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記導管の前記管腔が、約１．５ｍｍから約１３．０ｍｍまでの直径である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記導管の壁が、約０．２ｍｍから約０．６ｍｍまでの厚さである、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記導管又は移植部位が、コラーゲンで処理されている、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記所望の神経成長の軸が、前記脊髄欠損の部位の軸索と平行である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
対象の組織欠損を治療するための方法であって、導管、医療移植片、又はポリマー性再生誘導繊維を、対象の神経欠損の部位に外科的に移植することを含む方法。
【請求項２２】
前記神経欠損が、脳、脊髄、又は末梢神経にある、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記組織が、髄膜又は硬膜である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
医療移植片が、電極、深部脳刺激装置、ポンプ、又はアンテナである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
薬物を放出するためのデバイスであって、
管腔を含む導管、
前記管腔内に配置されており、前記導管を通って配置されている１つ又は複数のチャネルを含む管腔充填材、
１つ又は複数のチャネル内に配置されている繊維を含むデバイス。
【請求項２６】
前記繊維が、前記１つ又は複数のチャネルの長さに沿って巻回されている、請求項２５に記載のデバイス。
【請求項２６】
前記繊維が、第１の距離で互いに離間されている第１のセットのコイルを有する第１の部分、及び第２の距離で互いに離間されている第２のセットのコイルを有する第２の部分を含む、請求項２６に記載のデバイス。
【請求項２８】
前記コイル状繊維のピッチが、前記マイクロチャネルの長さに沿って変化する、請求項２６に記載のデバイス。
【請求項２９】
前記繊維が神経栄養因子を含む、請求項２５に記載のデバイス。
【請求項３０】
前記繊維が神経成長因子を含む、請求項２５に記載のデバイス。
【請求項３１】
前記管腔がコラーゲンを含む、請求項２５に記載のデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願とのクロスリファレンス
本出願は、２０１４年１１月１５日に出願された米国特許仮出願第６２／０８０３０２号、及び２０１５年３月２日に出願された米国特許仮出願第６２／１２６９５７号の米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく利益を主張するものであり、これら出願の各々は、あたかも全体が本明細書に示されているかの如く、出典明示により本明細書に援用される。
【０００２】
本開示は、概して医学及び神経生物学の分野に関する。より詳しくは、本開示は、脊髄損傷を治療するための組成物及び方法に関する。また、本開示は、小径脈管移植片を生成するための組成物及び方法、並びに戦場又は外傷で生じ得るもの等の複雑で複数の組織損傷を治癒するための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発生中及び損傷が起こると、神経細胞は、生体分子の勾配に応答して適切な標的細胞及び器官へと遊走し、軸索を伸長させ、それにより、細胞若しくは細胞外マトリックス（ＥＣＭ）との結合又は細胞外液への分泌のいずれかによる軸索再生（走化性）が誘導される。ある場合には、走化性可溶性分子が特定の細胞により分泌され、放出の部位から拡散及び対流することにより、勾配が形成される。そのような勾配に対する細胞応答は、コラーゲン、フィブロネクチン、及びラミニン等の生体分子の性質、並びにマトリックス孔径及び剛性等のＥＣＭの物理的特性の両方により影響を受ける場合がある。
【０００４】
発生中の末梢神経系（ＰＮＳ）では、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン３（ＮＴ−３）、及び脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）等の神経栄養因子（ＮＴＦ）の勾配は、遠位の標的細胞、並びに後根神経節（ＤＲＧ）の感覚ニューロンだけでなく、腹側脊髄からの運動ニューロン（ＶＭＮ）の直接軸索伸長及び標的認識により確立される。成体ＰＮＳでは、感覚ニューロンの遠心性分岐は、損傷後、自発的に皮膚及び筋肉標的に神経を再分布させるが、求心性軸索は、ＮＧＦ発現の誘導により誘発されない限り、成体脊髄の厳しい環境に進入することができない。
【０００５】
再生中の損傷したＶＭＮ及びＤＲＧニューロンによる経路探索誤謬は、適切なＮＴＦ勾配の確立により劇的に低減することができる。残念ながら、ＮＴＦ勾配等の化学勾配を生成すること、及び化学勾配を神経修復に使用することは、所望の分子シグナルを持続的に放出することができないため、及び／又はＥＣＭ支持体がないため、依然として非常に困難である。したがって、化学勾配を提供するための装置及び方法の向上が望まれている。
【発明の概要】
【０００６】
したがって、本開示によると、放出薬物（一又は複数）の１つ又は複数の濃度勾配を生成するように三次元空間に配置される薬物放出剤の組成物が提供される。この濃度勾配は、上記薬物（一又は複数）の濃度勾配（一又は複数）により指図されるような、増殖、遊走、又は成熟等の細胞レベル又は組織レベルの応答を開始及び／又は維持することが可能な増殖促進環境を生成するための手段を、器官、組織、細胞群、又は単離細胞に提供する。
【０００７】
本発明は幅広い活性に適合し、これはｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ（ヒト又は他の哺乳動物中で）、ｅｘ  ｖｉｖｏ、若しくはｉｎ  ｓｉｌｉｃｏであっても、又は細胞応答若しくは組織応答の誘導若しくは指図が望ましい他の環境若しくは試みにおけるものであってもよい。
【０００８】
また、対象の脊髄増殖又は再増殖を促進するための方法が提供される。本方法は、対象の脊髄損傷又は脊髄欠損の部位に導管を外科的に移植することを含み、上記導管は、上記導管の管腔が、所望の神経成長又は再成長の軸と平行になるように位置させる。導管は、隣接する椎骨分節間に係留してもよく、及び／又は硬膜等の隣接する神経帯膜に縫合することにより、若しくは潜在的には筋肉繊維等の、神経環境の外部に縫合することにより適所に保持してもよい。あるいは、導管は、適所に縫合されない。導管は、生分解性ポリマー、典型的には、ポリ−ラクチド、ＰＬＧＡ、ポリジオキサノン、ポリヒドロキシブテル酸、ポリカプロラクトン等のアルファ−１エステルから構成されていてもよく、また、ポリウレタン、シリコーン、セルロース若しくは修飾セルロースファミリーの任意のメンバー、アガロース、コラーゲン、ゼラチン、又は変性天然細胞外マトリックス等の他のタイプ又は種類のポリマーを使用してもよい。脊髄欠損は、先天性であってもよく、外傷、感染症、自己免疫疾患、頚部欠損、腰仙欠損、胸部欠損によるものであってもよく、又は外科的に誘発されたものであってもよい。対象は、ヒトであってもよく、又は非ヒト哺乳動物であってもよい。本方法は、手術前、手術中又は手術後に抗炎症療法を受けている上記対象を治療することを更に含んでいてもよい。本方法は、手術前又は手術後に第２の療法を受けている上記対象を治療することを更に含んでいてもよい。
【０００９】
管腔充填材（ＬＦ）が、上記導管の管腔に配置されていてもよい。ＬＦは、寒天、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、又は糖タンパク質ファミリーのいずれか、又は任意のポリサッカライドのうちの１つ又は複数で形成されていてもよい。ＬＦは、微小区画又はマイクロチャネルを含んでいてもよく、又は単一のチャネルであってもよく、上記単一のチャネルは神経成長因子を放出するための１つ又は複数の手段を含む導管管腔全体と合致及び調和していてもよい。チャネル又は区画が単一であろうと複数であろうと、そのようなチャネル又は区画は各々、上記ＬＦに配置されている微粒子又は溶出繊維に含まれている神経成長因子を含んでいてもよい。神経成長因子は、徐放性の様式で溶出してもよい。導管の表面は、神経組織栄養性（ＮＧＦ、ＢＤＮＧ、ＮＴ−３）、グリア細胞由来（ＧＤＮＦ）、多面性（ＰＴＮ、ＶＥＧＦ）である神経成長因子等の、１つ又は複数の神経成長因子又は生体適合性材料でコーティングされていてもよい。１つ又は複数の神経成長因子は、線形構成又は勾配構成で上記ＬＦに存在してしてもよい。勾配構成は、一方向であってもよく、又は双方向であってもよい。導管及びＬＦは、神経成長因子を一切含んでいなくともよい。
【００１０】
導管は、長さが、約０．５ｍｍから約５ｍｍまでであってもよい。幾つかの実施態様では、導管は、約１．５ｍｍから約４．０ｍｍの外径を有していてもよい。幾つかの実施態様では、導管は、約１．５ｍｍから約３．０ｍｍの内径を有していてもよい。幾つかの実施態様では、導管は、約０．２ｍｍから約０．６ｍｍまでの壁厚を有していてもよい。幾つかの実施態様では、導管は剛性であってもよい。幾つかの実施態様では、導管は可撓性であってもよい。幾つかの実施態様では、導管又は移植部位は、コラーゲンで処理されていてもよい。
【００１１】
また、対象の脊髄欠損を治療するための方法であって、対象の脊髄欠損の部位に導管を外科的に移植することを含み、上記導管は、上記導管の管腔が、所望の神経成長又は再成長の軸と平行になるように位置させる方法が提供される。治療は、上記対象の運動制御を向上させること、又は侵害受容機能若しくは機械受容機能等の、上記対象の感覚機能を向上させることを含んでいてもよい。
【００１２】
対象の神経（ｎｅｒｖｅ／ｎｅｕｒａｌ）組織欠損を治療するための方法であって、導管、医療移植片、又はポリマー性再生誘導繊維を、対象の神経欠損の部位に外科的に移植することを含む方法が更に提供される。神経欠損は、脳、脊髄、又は末梢神経の欠損であってもよい。脳欠損は、例えば、外傷性脳損傷又は脳卒中によるものであってもよい。医療移植片は、電極、深部脳刺激装置、ポンプ、又はアンテナであってもよい。
【００１３】
本開示の発明の実施態様は、細胞活性、組織形成及び組織機能、並びに器官再生を誘導及び指図する生分解性繊維を含む構造／構築体に関する。幾つかの特定の場合では、こうした構築体は、それらの管状構造内で細胞増殖／組織形成を誘発するための円柱状チャネルとして作用することができる。本発明の実施態様は、単一又は複数のチャネル内に誘導することができる軸索に関し、この誘導は、これらの成長中の軸索に持続的な濃度勾配を提供するために１つ又は複数の可変ピッチコイル（一又は複数）を使用して行われる。
【００１４】
本発明の別の実施態様は、小径脈管移植片を使用して、特定の細胞（具体的には、内皮細胞）を、周囲組織から、機能性組織がそこから生成される三次元スキャフォールドをその後提供することになるデバイスへと動員することができることを示すことに関する。本出願では、繊維は、細胞遊走及び協調のために適切な勾配及びチャネルを生成して、移植片の内部管腔に機能性内皮組織を生成するように、特定の位置に織った状態で配置されていてもよい。
【００１５】
ある実施態様では、この概念を、骨筋肉及び骨格筋等の他の組織タイプに拡張して、成長因子及びスキャフォールド構造を正しく選択すると、特定の位置に細胞を誘導又は誘引することができ、その後協調的に機能して生存血管新生化組織を形成することができることを示すことができる。本出願では、単繊維接続の分岐促進が求められる場合がある。例えば、単に骨格筋のチューブを生成することでは不十分であり、この筋肉を、血管新生及び神経支配して、患者の利益を最適化しなければならない。したがって、ＶＥＧＦ溶出繊維を介して局所機能性血管を移植片に接続させることにより、骨格筋への血管成長を誘導してもよい。同様に、神経栄養因子を放出し、周辺の神経を接続し、その後個々の繊維に分かれて骨格筋スキャフォールド内の種々の位置で終了する単繊維又は小さな編み繊維は、神経筋接合部の再編成を促進することができ、潜在的に移植片の機能増加をもたらすことができる。この実施態様は、多数の組織タイプが損傷し、同時修復が必要とされる外傷性傷害又は戦場傷害に関していてもよい。
【００１６】
損傷した成体神経系では、成長促進分子勾配の再確立が、神経修復を誘発及び誘導することが知られている。しかしながら、神経修復スキャフォールドの三次元走化性勾配を、特に単一又は複数の管腔（ＭＬ）構造を有するものに組み込むことは、依然として非常に困難である。この制限に取り組むため、神経成長因子（ＮＧＦ）を放出するコイル状の超極細繊維を、コラーゲン充填ヒドロゲルマイクロチャネルの壁面に係留することにより、高度に調節可能な三次元分子勾配を神経ガイド（ＮＧ）に確立する方法が開示される。勾配は、ニューロトロフィン溶出繊維のコイルのピッチを変化させることより達成される。また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究では、均一な成長因子濃度に曝されたものよりも、後根神経節（ＤＲＧ）からの軸索成長が６０％長く、転向角比の低減により示されるように、より直線性であることが示されている。そこで、本発明者らは、コンピュータモデルを開発して、６つの異なる設計の薬物放出導管：ａ）コラーゲン充填ＮＧ、ｂ）ＮＧでのＮＧＦ微粒子放出、ｃ）ＮＧでのＮＧＦコイル放出、ｄ）コラーゲン充填ＭＬ−ＮＧ、ｅ）ＭＬ−ＮＧでのＮＧＦ−微粒子放出、ｆ）ＭＬ−ＮＧでのＮＧＦ−コイル放出における、成長因子放出の動力学及び管腔コラーゲンへの拡散を推定した。有限要素計算モデルを使用して、６つのタイプの導管でのＮＧＦの経時的な空間時間的分布を計算し、これらデバイスの各々の経時的な成長因子拡散を比較した。更に、本発明者らは、ＮＧでの薬物放出の効力に対する幾何学的パラメータの効果を評価した。本発明者のモデルは、神経誘導導管の微小環境中での経時的に変化するＮＧＦ分布に関する定量的洞察を提供する。このモデルは、成長因子分泌神経導管の設計向上を支援し、現行の神経修復戦略を向上させて、損傷ニューロンの再生及び機能の回復を最適化することができる。
【００１７】
本発明の実施態様は、骨、血管、神経等の種々のタイプの組織が全て、修復及び再生される必要があるギャップ損傷を同時に修復することができるスキャフォールドを生成することに関する。この時点では、上記の技術、十分に維持された勾配を有する小チャネル、織物／編物、単繊維品の全ては、全てこのタイプの架橋スキャフォールドを生成するために必要となるだろう。
【００１８】
本発明の実施態様は、１）１つ又は複数の可変ピッチコイルを有する単一又は複数のチャネル管腔により持続性濃度勾配を作成し、動員した細胞を協調させて機能性組織を形成する能力、２）織り構造、編み構造、又はニット構造内に濃度勾配を作成し、動員した細胞を協調させて機能性組織を形成する能力、３）神経及び血管組織等の分岐又は二分岐構造を生成する能力を含む、単繊維に沿って特定の細胞タイプの増殖を誘導する能力、及び４）動員した細胞を協調させて機能性組織を形成する能力に関する。
【００１９】
本明細書に記載の任意の方法又は組成物は、本明細書に記載の任意の他の方法又は組成物に関して実施することができることが企図される。単語「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」の使用は、特許請求の範囲及び／又は明細書で「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語と共に使用される場合、「１つ」を意味していてもよいが、「１つ又は複数の」、「少なくとも１つの」、及び「１つ又は１つを超える」の意味と一致していてもよい。本明細書で考察されている任意の実施態様は、本開示の任意の方法又は組成物に関して実施することができ、その逆もできることが企図される。更に、本開示の組成物及びキットを使用して、本開示の方法を達成することができる。
【００２０】
本出願の全体にわたって、用語「約」は、値が、その値を決定するために使用されたデバイス、方法、又は研究対象中に存在する変動に固有な変動誤差を含むことを示すために使用される。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」（並びに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等の含むのあらゆる形態）、「有する」（並びに「有する（ｈａｓ）」及び「有する（ｈａｖｉｎｇ）」等の有するのあらゆる形態）、含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」（並びに「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」等の含有するのあらゆる形態）、及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」（並びに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」等の含むのあらゆる形態）は、非限定的な連結動詞である。その結果、１つ又は複数の要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「有する（ｈａｓ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、又は「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」デバイス又は方法は、そうした１つ又は複数の構成を有するが、そうした１つ又は複数の要素のみを有することに限定されない。同様に、１つ又は複数の特徴を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「有する（ｈａｓ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、又は「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」デバイス又は方法の要素は、そうした１つ又は複数の特徴を有するが、そうした１つ又は複数の特徴のみを有することに限定されない。
【００２１】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示のある態様を更に示すために含まれている。本開示は、本明細書に示されている特定の実施態様の詳細な説明と共に、これら図面の１つ又は複数を参照することによって、より良好に理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１Ａ】脊髄損傷（「ＳＣＩ」）の４ｍｍ完全切断を模式的に示す図である。
【図１Ｂ】脊髄ギャップへのポリウレタン生合成神経移植片（「ＰＵ−ＢＮＩ」）の移植を模式的に示す図である。
【図１Ｃ】図１ＢのＰＵチューブ外側及びアガロースマイクロチャネルに沿った脊髄再生を模式的に示す図である。
【図２Ａ】ＰＵ−ＢＮＩを移植した１２週間後に回収した脊髄の写真である。
【図２Ｂ】図２Ａで回収した脊髄の写真である。再生組織は、ＰＵチューブの外側表面から除去されている。
【図２Ｃ】図２Ａで回収した脊髄の写真である。ＰＵチューブは取り外されている。
【図３Ａ】ニューロン軸索の特異的マーカーとしてのｂ−チューブリンＩＩＩで染色したＰＵ−ＢＮＩ内にわたって再生した組織のマイクロ写真である。
【図３Ｂ】図３ＡのＰＵチューブ外側の軸索再成長のマイクロ写真である。
【図３Ｃ】ＢＮＩアガロースマイクロチャネル内部の軸索再成長のマイクロ写真である。
【図４】ＢＳＡ治療群による平均回復を示すグラフである。目盛りの０は完全な麻痺を示し、２１は正常な運動機能である。
【図５Ａ−５Ｂ】コラーゲン充填ヒドロゲルマイクロチャネルに分子勾配を形成するコイル状繊維の模式図である
【図６】ＴＭＭキャスティングデバイスの模式図である。繊維コイルの配置が示されている。
【図７Ａ−７Ｂ−７Ｃ】金属ロッドに巻回されたＣｙ３−ＰＬＧＡ繊維の模式図である。アガロースの配置後に形成された勾配は、蛍光画像化され、デンシトメトリーにかけられている。
【図８】高勾配コイル領域（Ｈ）及び低勾配コイル領域（Ｌ）の両方での、２４時間にわたるＢＳＡ放出をローディングパーセントとして経時的に示すグラフである。
【図９Ａ】１、５、及び７日後のコイルの均一分布及び勾配分布を比較するグラフである。
【図９Ｂ】１、５、及び７日後の均一ＮＧＦ及び勾配ＮＧＦの濃度対マイクロチャネル長さのグラフである。
【図１０Ａ−１０Ｂ−１０Ｃ】アガロースゲルに展開されたポリマー性Ｃｙ３−コイルを示す複数の共焦点画像集である。
【図１１Ａ】一方の端部にＤＲＧ外植片を有するマイクロチャネルを示すＴＭＭゲルのＤＩＣ画像である。
【図１１Ｂ】コイルを有していないＴＭＭゲル内のβ−チューブリンを視覚化するために免疫標識したＤＲＧ軸索成長の共焦点画像である。
【図１１Ｃ】低密度ＮＧＦをロードした繊維のコイルを有するＴＭＭゲル内のβ−チューブリンを視覚化するために免疫標識したＤＲＧ軸索成長の共焦点画像である。
【図１１Ｄ】均一な高密度ＮＧＦをロードした繊維のコイルを有するＴＭＭゲル内のβ−チューブリンを視覚化するために免疫標識したＤＲＧ軸索成長の共焦点画像である。
【図１１Ｅ】勾配高密度ＮＧＦをロードした繊維のコイルを有するＴＭＭゲル内のβ−チューブリンを視覚化するために免疫標識したＤＲＧ軸索成長の共焦点画像である。
【図１１Ｆ】３つのＮＧＦ濃度での平均軸索長を示すグラフである。
【図１１Ｇ】均一な高密度ＮＧＦ及び勾配高密度ＮＧＦの平均軸索長を示すグラフである。
【図１２】異なるサイズのメッシュ要素を示すメッシュ幾何構造を示す図である。
【図１３Ａ−１３Ｂ−１３Ｃ】６つの設計のコイル状繊維の活性チャネル／マイクロチャネルにおける軸方向濃度変化を示すグラフ集である。
【図１３Ｄ−１３Ｅ−１３Ｆ】６つの設計のコイル状繊維の活性チャネル／マイクロチャネルにおける軸方向濃度変化を示すグラフ集である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
脊髄損傷（ＳＣＩ）は、成体中枢神経系では自発的神経再生が起こらないため、一般的に、恒久的な麻痺及び感覚障害をもたらす。これは、損傷が外傷の結果として組織喪失をもたらす場合、更により悪化する。これに引き続き、損傷中心で細胞死が起こり、軸索再生を妨げる瘢痕組織及び流体充填包嚢が生じる。
【００２４】
ＰＬＧＡ、ＰＧＥ、又は多管腔アガロースヒドロゲル等の分解性ポリマーで作られている軟質スキャフォールドを含む幾つかの戦略が、損傷した脊髄を修復するために提唱されている。最も最近ではそのようなスキャフォールドは、神経再生を誘発する分子を送達するための管腔に成長因子又は細胞を含有することになる。こうした成長因子の幾つかは、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、又はグリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）等、神経向性である。こうした成長因子を腔内送達するための正確な方法は、精力的に研究されている中心的課題である。
【００２５】
ここで、本発明者らは、脊髄欠損に取り組むための新しい驚くべき治療手法を開発した。これまで脊髄欠損には適さないと考えられていた、末梢神経欠損を治療するために使用される手法の変法において、本発明者らは、驚くべきことに、剛性の非生物分解性導管を、対象に危害を加えずに脊髄欠損の部位に移植することができるだけでなく、剛性の非生物分解性導管は、導管内にわたって及び導管外側の両方で神経再生を促進することができることを見出した。更により驚くべきことに、この効果は、神経成長因子の有無に大きくは依存しないと考えられる。本開示のこれら及び他の態様は、下記に詳細に記載されている。
【００２６】
１．神経欠損
Ａ．脊髄神経欠損
脊髄損傷（ＳＣＩ）又は欠損は、脊髄の正常な運動機能、感覚機能、又は自律神経機能が、一時的に又は恒久的にのいずれかで妨げられる脊髄への傷害である。損傷の一般的な原因は、外傷（自動車事故、銃傷、転落、スポーツ傷害等）又は疾患（横断脊髄炎、ポリオ、二分脊椎、フリードライヒ運動失調等）である。脊髄は、切断されていなくとも、機能の喪失がもたらされる場合がある。脊髄及び神経根がどこで損傷するかに応じて、症状は、疼痛から麻痺そして失禁まで幅広く様々であり得る。脊髄損傷は、種々のレベルの「不完全性」で記述され、患者への影響無しから、機能の完全な喪失を意味する「完全」損傷まで、様々であり得る。
【００２７】
脊髄損傷の治療では、まず始めに、脊柱を安定及び固定し、炎症を制御して更なる損傷を防止する。実際の治療は、幅広く様々であり、損傷の位置及び程度に依存する場合がある。多くの場合、脊髄損傷は、特に患者の損傷が日常生活活動を妨げる場合、かなりの理学療法及びリハビリテーションが必要となる。
【００２８】
脊髄損傷の治療に関する研究は、神経保護剤の投与及び低体温症の制御により二次的な細胞損傷を制限することを含み、神経成長因子及び幹細胞の使用による神経再生を含むが、多くの治療は、徹底的には研究されておらず、標準的ケアで実施された新しい研究はほとんどなかった。
【００２９】
ｉ．分類
アメリカ脊髄損傷協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｐｉｎａｌ  Ｉｎｊｕｒｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、ＡＳＩＡ）は、脊髄損傷の国際的分類を１９８２年に初めて発表した。これは、脊髄損傷の神経学的及び機能的分類の国際基準（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ｆｏｒ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｐｉｎａｌ  Ｃｏｒｄ  Ｉｎｊｕｒｙ）と呼ばれている。現在は第６版である脊髄損傷の神経学的分類の国際基準（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ｆｏｒ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｐｉｎａｌ  Ｃｏｒｄ  Ｉｎｊｕｒｙ、ＩＳＮＣＳＣＩ）が、ＳＣＩ後の感覚及び運動障害の記述に依然として広く使用されている。これは、神経学的応答、各真皮節で試験した接触感覚及び針刺感覚、及び股関節屈曲（Ｌ２）、肩のすくみ（Ｃ４）、肘屈曲（Ｃ５）、関節伸展（Ｃ６）、及び関節伸展（Ｃ７）を含む、身体の両側における１０種の主要運動を制御する筋肉の強度に基づく。外傷性脊髄損傷は、ＡＳＩＡ障害尺度では５つのカテゴリに分類される。
【００３０】
Ａは、仙骨分節Ｓ４−Ｓ５の運動機能又は感覚機能が保存されていない「完全」脊髄損傷を示す。
【００３１】
Ｂは、神経学的レベルより下部の感覚は保存されているが、運動が保存されていない「不完全」脊髄損傷を示し、仙骨分節Ｓ４−Ｓ５を含む。これは、典型的には、移行局面であり、ある人が神経学的レベルより下部の任意の運動機能を回復させた場合、その人は、本質的に運動不完全となる、つまりＡＳＩＡ  Ｃ又はＤとなる。
【００３２】
Ｃは、神経学的レベルより下部の運動機能が保存されており、損傷の単一神経学的レベルより下部の主要筋肉の半分を超える部分が、３未満の筋肉等級（つまり、Ｍ０−収縮無し、筋肉運動無し、Ｍ１−わずかに収縮するが、運動はない、又はＭ２−重力に逆らわない運動）を示す「不完全」脊髄損傷を示す。
【００３３】
Ｄは、神経学的レベルより下部の運動機能が保存されており、神経学的レベルより下部の主要筋肉の少なくとも半分が（主要筋肉の５０パーセント超）、３以上の筋肉等級（つまり、Ｍ３、Ｍ４、又はＭ５、筋肉は、重力に逆らって（３）又は更なる抵抗があっても（４＆５）運動することができる）を有する「不完全」脊髄損傷を示す。
【００３４】
Ｅは、ＩＳＮＣＳＣＩによる運動機能及び感覚機能が全て正常であると分類され（全ての分節で）、患者が、ＳＣＩに由来する神経学的欠損をかつては有していたことを示す。注：ＳＣＩを有する患者にのみ、任意のＡＩＳ等級が与えられる。以下の不完全症候群は、国際基準診察の一部ではない：脊髄中心症候群、ブラウン−セカール症候群、脊髄前部症候群、馬尾症候群、脊髄円錐症候群、及び下位運動ニューロンの病変、つまり腕神経叢病変により引き起こされる全ての神経学的欠損。
【００３５】
ｉｉ．症状
臨床医が記録する徴候及び患者が経験する症状は、脊柱が損傷した場所及び損傷の程度に応じて様々であろう。これらは全て、脊柱の損傷部位が神経支配する身体の領域により決定される。脊柱の特定の部分から神経支配される皮膚の区画は、真皮節と呼ばれ、脊髄損傷は、関連領域の疼痛、しびれ感、又は感覚消失を引き起こす場合がある。脊柱の特定の部分から神経支配される筋肉群は、筋分節と呼ばれ、脊柱への損傷は、随意運動制御に関する問題を引き起こす場合がある。筋肉は、収縮抑制不能になるか、弱くなるか、又は完全に麻痺する場合がある。筋肉が使用されない場合、筋肉機能の喪失は、筋肉萎縮及び骨変性を含む更なる影響をもたらす。
【００３６】
また、重度の損傷は、損傷領域よりも下部の脊柱部分に問題を引き起こす場合がある。「完全」脊髄損傷では、損傷領域よりも下部の機能は全て失われる。「不完全」脊髄損傷は、脊髄の損傷のレベルよりも下部の運動機能又は感覚機能が保存されていることを含む。患者が肛門括約筋を随意収縮する能力、又は肛門周囲の針刺若しくは接触を感知する能力を有する場合、損傷は不完全であるとみなされる。この領域の神経は、脊柱のまさに最下部の領域である仙骨部と接続しており、身体のこれら部分で感覚及び機能が維持されていることは、脊髄の損傷は部分的に過ぎないことを示す。これは、病変レベルよりも下部の胸部真皮節及び腰椎真皮節で感覚が損なわれたとしても仙椎真皮節の皮膚感覚が保存されることを含む、仙椎保存として知られている現象を含む。また、仙椎保存は、最下部仙椎分節の運動機能（外肛門括約筋の随意収縮）の保存を含んでいてもよい。仙椎保存は、仙椎脊髄経路が、損傷後に他の脊髄経路ほど圧迫されていない可能性があるという事実により説明されている。仙椎脊髄経路の保存は、脊髄内での繊維の積層で説明することができる。
【００３７】
完全損傷は、多くの場合、患者の機能的回復の可能性がほとんどないことを意味する。完全脊髄損傷と比較した不完全損傷の相対発生率は、主に脊髄損傷患者のより良好な初期ケア及び安定化が強調されたため、過去半世紀にわたって改善している。不完全損傷を有するほとんどの患者は、少なくとも幾つかの機能を回復させる。
【００３８】
損傷の正確な「レベル」の決定は、麻痺及び機能喪失により影響を受ける可能性のある特定の身体部分を正確に予測するために重要である。レベルは、脊髄に対する損傷に最も近い脊柱の椎骨により、損傷位置に応じて割り当てられる。
【００３９】
頚部。頚部（首）損傷は、一般的に、完全な又は部分的な四肢麻痺（ｔｅｔｒａｐｌｅｇｉａ／  ｑｕａｄｒｉｐｌｅｇｉａ）をもたらす。しかしながら、外傷の特定の位置及び重症度に応じて、限定的な機能が保持される場合がある。
Ｃ−１／Ｃ−２レベルでの損傷は、多くの場合、呼吸の喪失をもたらし、機械式ベンチレータ又は横隔神経ペーシングが必要となるだろう。
Ｃ３より上部での損傷は、典型的には横隔膜機能の喪失をもたらし、人工呼吸器が必要である。
Ｃ４は、二頭筋及び肩の機能の著しい喪失をもたらす。
Ｃ５は、二頭筋及び肩の機能の喪失、並びに手首及び手の機能の完全な喪失をもたらす可能性がある。
Ｃ６は、手首制御の制限、及び手の機能の完全な喪失をもたらす。
Ｃ７及びＴ１は、手及び指の器用さの欠如をもたらすが、腕の限定的な使用は可能である。Ｃ７を超える完全損傷を有する患者は、典型的には、日常生活動作を行うことができず、自主的に動作することが困難になり、多くの場合は不可能になる。
【００４０】
頚部損傷の更なる徴候及び症状は、心拍数、血圧、発汗、及びしたがって体温を調節する能力が無くなること又は低減されることを含む。自律神経反射異常、又は血圧、発汗、及び疼痛に応答する他の自律反応の異常な亢進、又は感覚障害が一般的である。
【００４１】
胸部。胸部脊髄レベルでの又はそれよりの下部での完全損傷は、対麻痺をもたらす。手、腕、首、及び呼吸の機能は、通常は影響を受けない。
Ｔ１〜Ｔ８：腹筋の制御不能をもたらす。したがって、体幹安定性が影響を受ける。損傷のレベルが低いほど、影響の重症度は低くなる。
Ｔ９からＴ１２：体幹及び腹筋制御の部分的な喪失がもたらされる。
典型的には、Ｔ６脊髄レベルよりも上部の病変は、自律神経反射異常をもたらす場合がある。
【００４２】
腰仙部。腰椎又は脊髄の仙骨部に対する損傷の影響は、脚及び股関節、尿路系、及び肛門の制御の低下である。腸及び膀胱機能は、脊柱の仙骨部により調節される。その点では、外傷性損傷後に、膀胱の感染症及び肛門失禁を含む腸及び膀胱の機能不全を経験することが非常に一般的である。
【００４３】
また、仙椎脊髄分節には性機能が関連しており、損傷後に影響を受けることが多い。心因性性体験中、脳からのシグナルは、脊髄レベルＳ２−Ｓ４の仙椎副交感神経細胞体に送られた後、男性の場合は、陰茎へと中継され、そこで勃起を開始させる。したがって、レベルＳ２−Ｓ４へと降下する繊維の脊髄損傷は、潜在的に心因性勃起の喪失をもたらす場合がある。一方で、反射発生性勃起は、陰茎、又は耳、乳首、若しくは首等の他の性感的領域との直接的身体接触の結果として生じ、したがって、脳から降下する繊維は関与しない。反射勃起は不随意であり、性刺激的な思考がなくとも生じ得る。男性が反射勃起を起こす能力を制御する神経は、脊髄の仙骨神経（Ｓ２−Ｓ４）に位置しており、このレベルでの脊髄損傷後に影響を受ける場合がある。脊髄損傷での射精率は、脊髄損傷のレベルに応じて様々であり、例えば、厳密にオヌフ核（Ｓ２−Ｓ４）より上方の完全病変は、９８％の症例で陰茎振動刺激に応答性であるが、Ｓ２−Ｓ４分節の完全病変の症例では応答性ではない。
【００４４】
不完全損傷の他の症候群。脊髄中心症候群は、腕及び手並びに程度は低いが脚の障害を特徴とする不完全脊髄損傷の一形態である。これは、手及び腕は麻痺するが、脚及び下肢が正常に機能するため、逆対麻痺とも呼ばれる。最も多くの場合、損傷は、脊髄の頚部領域又は胸髄上部領域に対してであり、腕は脱力するが、脚の感覚消失は様々であり比較的保存されることを特徴とする。この状態は、脊髄の中央部分（大脳皮質から情報を直接伝達する大きな神経繊維）が関与する虚血、出血、又は壊死に伴う場合がある。脚に向かう皮質脊髄繊維は、脊髄での位置がより外側であるため保存される。
【００４５】
脊髄の虚血は、脊髄への血流低下である。血流は、前脊髄動脈及び対の後脊髄動脈により供給される。この状態は、動脈硬化、外傷、塞栓、大動脈の疾患、及び他の障害に伴う場合がある。長期の虚血は、脊髄組織の梗塞に結び付く場合がある。脊髄の虚血は、その機能に影響を及ぼし、筋力低下及び麻痺に結び付く場合がある。また、脊髄は、分節性髄質動脈、特に大前分節性髄質動脈が、閉塞動脈疾患により狭窄すると、循環障害を起こす場合がある。全身血圧が、３−６分間激しく低下すると、分節性髄質動脈から前脊髄動脈への、脊髄の胸中部領域に供給される血流が、低下又は止まる場合がある。また、こうした人々は、脊髄の患部レベルにより供給される領域での感覚及び随意運動を喪失する場合がある。この臨床パターンは、椎骨周囲又は椎骨付近の長期膨潤による脊髄ショックからの回復中に出現し、脊髄に対する圧力を引き起こす場合がある。症状は、一時的であってもよく、又は恒久的であってもよい。
【００４６】
前部脊髄症候群は、頚椎への屈曲型損傷に伴うことが多く、脊髄の前部分及び／又は前脊髄動脈からの血液供給に損傷をもたらす。損傷のレベルよりも下部では、運動機能、痛覚、及び温度感覚は失われるが、接触、固有受容性（空間における位置感知）、及び振動感覚は、完全なままである。
【００４７】
また、後部脊髄症候群が生じる場合があるが、非常に希である。脊髄の後部分への損傷及び／又は後脊髄動脈の分断は、損傷のレベルよりも下部に固有受容性及び判別性感覚（例えば、立体感覚、筆跡感覚）の喪失を引き起こす。運動機能、痛覚、及び軽い接触に対する感受性は、完全なままである。
【００４８】
脊髄が半側切断されるか又は側方に損傷を受けると、通常、ブラウン−セカール症候群が生じる。真性の脊髄半側切断は希であり、穿通創（例えば、銃創又は刃物創）による部分的な病変がより一般的である。損傷の同側（同じ側）には、運動機能、固有受容性、振動、及び軽い接触の喪失がある。対側では（損傷の反対側）、疼痛、温度、及び強い接触感覚の喪失がある。対側側方での喪失は、損傷のレベルよりも幾つか下方の真皮節分節で始まる。この矛盾は、外側脊髄視床路が、交差する前に同じ側で２つ又は４つの分節を上昇するために生じる。
【００４９】
脊髄癆は、脊髄の後部分への損傷、通常は梅毒等の感染症に起因し、接触感覚及び固有受容感覚の喪失を引き起こす。脊髄円錐症候群は、Ｌ１椎骨に位置する脊髄の先端に対する損傷に起因する。
【００５０】
ｉｉｉ．管理
脊髄損傷の疑いのある患者が、不適切に又は不完全に固定、取り扱い、パッケージ、又は移送されると、更に損傷が生じる場合がある。初期病変の悪化は、損傷の初期管理中に生じることが多いため、搬送及びケアの効果的手順を確立して、二次的な神経学的損傷のリスクを低減する必要がある。１９８８年の研究では、脊髄損傷の４人に１人もが、事故又は傷害時から病院への到着時までの間に悪化したと推定されている。その幾つかは、損傷自体の性質によるものがあるが、特に多発外傷又は大規模外傷の場合は、その幾つかは、そもそも脊髄損傷が生じたのではないかと考えて怪我人を適切に治療することができなかったことを反映している。
【００５１】
医療従事者は、幾つかの状況では、特にその人が、頭部傷害の結果として意識を消失しているか、いずれかの側の鎖骨（ｃｌａｖｉｃｌｅ／  ｃｏｌｌａｒｂｏｎｅ）の上部に怪我をしているか、高速自動車事故で怪我をしているか、又は脊髄損傷を引き起こすことが知られている任意の様式で怪我をしている場合、脊髄損傷を疑うことができる。
【００５２】
脊髄損傷が疑われる場合の管理における第１段階は、蘇生の基本的救命原則に従う。こうした原則は、頭文字ＤＲＳＡＢＣ（危険（ｄａｎｇｅｒ）、対応（ｒｅｓｐｏｎｓｅ）、支援要請（ｓｅｎｄ  ｆｏｒ  ｈｅｌｐ）、気道（ａｉｒｗａｙ）、呼吸（ｂｒｅａｔｈｉｎｇ）、循環（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）の略語である）により表されるが、脊髄損傷が疑われる状況では、本発明者らは、Ａに追加を加えて、気道に気を配り、更に頚椎管理を付け加える必要があることを強調する。基本原則として、頭部は、脊柱が、屈曲せず、伸張せず、いずれの側にも側方屈曲せず、又は回転しない中立位置に維持されるべきである。頭部は、この位置を維持するために、手による直線的支持（ｍａｎｕａｌ  ｉｎｌｉｎｅ  ｓｕｐｐｏｒｔ）で支持されるべきである。損傷は、脊髄椎骨を引き離し、脊髄を傷つける力により引き起こされる場合があるため、牽引（頚部の伸張）は使用しない。重要なのは、脊髄固定装置を使用して、損傷が疑われるレベルで、その上部で、及びその下部で、頚部を固定することである。この管理の大部分は、頚椎損傷を取り扱うものだが、最も一般的なものであるだけでなく、四肢全てに影響を及ぼす可能性がある頚部に関して評価も高いことを考慮すると、ほとんどの場合で、臨床的に最も重要なものである。しかしながら、同じ原則が、胸椎及び腰椎に当てはまる。
【００５３】
蘇生の必要性が、必要に応じて確立及び達成されたら、脊髄損傷が疑われる怪我人を、適切に固定されなければならない。応急手当てを行う人又は訓練されていないその場に居合わせた人の場合、頭部を中立位置に位置させ、より詳しい専門家の支援が得られるまで、頭部を維持することだけでよい場合がある。
【００５４】
これは、手による直線的支持（ＭＩＬＳ）を用いて、つまり頭部が身体に対して動かないように手を使用して頭部を保持することで達成される。この段階で行うことができることはこれが全てであり得るが、より高レベルのケアが施される前に怪我人を不注意に移動させることによる更なる損傷を防止する際の重要な行動である。
【００５５】
近代的な外傷ケアは、頚椎クリアリング（ｃｌｅａｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｓｐｉｎｅ）と呼ばれるステップを含み、このステップでは、損傷が疑われる人は、損傷が否定されるまでは、脊髄損傷を有するかの如く治療される。その目的は、あらゆるそれ以上の脊髄損傷を防止することである。怪我人は、脊柱の最上部分に損傷がないことが明らかになるまで、損傷の現場で固定される。これは、従来、ロングスパインボードと呼ばれるデバイス、Ｘ−Ｃｏｌｌａｒ、Ｓｔｉｆｎｅｃｋ、又はＷｉｚｌｏｃｋ等の半剛性頚椎カラーを使用して行われている。怪我人がまだ車両内部又は他の閉鎖空間内部にいる場合、救出デバイスが必要とされる場合がある。これは、短いバックボード、及び胸郭を包み込んだ後、ストラップを使用して圧力を加える可撓性の包袋用「ウイング」、並びに頭部固定デバイス及びストラップの組み合わせである。適切な固定を確実するためには、怪我人を締め付けることができる最低４つのストラップが必要とされる。スパインボードは、怪我人を密閉空間又は車両から引きずり出す際以外は、ストラップ無しで使用すべきではない（この状況では、救助又は救出のために使用されている）。
【００５６】
幾つかのスパインボードは単体であるが、他のものは、怪我人の下に差し入れる（又は一方の端部を切り取る）ことができ、開閉して、スパインボードを２つに分割可能にすることができる係止機構を有する。
【００５７】
怪我人の移動を支援するために使用される別の重要な装置は、頭部固定デバイス、すなわち「ヘッドベッド」である。このデバイスは、その下にあるスパインボードにストラップされている台板、及び典型的には、怪我人の頭部のいずれかの側に設置される２つの発泡体ブロックを有する。その後、マジックテープ（登録商標）又は粘着ストラップを、これらブロックの上部に配置して、頭部を適所に保持する。
【００５８】
頭部、頚部、及び身体の全体をこのように適切に固定し、装着中に動かないようにストラップを締め付けたら、初期対応者の手を、手による直線的支持から離すことが適切である。これは、怪我人が効果的に「パッケージ」されており、不適切な動きが抑制され、ほとんどの場合は排除されていることを確認して搬送することができるためである。
【００５９】
真空マットレスは、その内部から空気をポンプで抜き取って、怪我人の形状に沿った固い外側シェルを作ることができる全身ビーンバッグマットレスである。これは、仰向きに横になっている間、骨ばっている隆起により起こる可能性のある圧力を減少させるため、怪我人が搬送中に長い時間を過ごすことになる場合に理想的である。
【００６０】
カラー、スパインボード、及び頭部固定デバイスの効力に関しては、医学文献で考察されている。これらは、怪我人を搬送するためのより安全な方法を提供することができるように、正しく確実に適用することが重要である。あるいは、初期対応者は、怪我人の頭部に留まり、長時間になり得る期間にわたって手による直線的支持を適用し、怪我人を移動させる際、救急車に乗せたり下ろしたりする際、及び病院まで付き添う際に覚醒状態を維持することが求められる。
【００６１】
頚椎保護カラーを取り外す前に、脊柱は、「クリア」されなければならない。つまり、デリケートな脊髄に対する不安定性及び（更なる）損傷の可能性が排除されなければならない。これは、通常、ＮＥＸＵＳ及びＣａｎａｄｉａｎ  Ｃ  Ｓｐｉｎｅ研究を含む、脊髄損傷に関する研究のプロトコールに従って実施される。病院で患部を固定する技法としては、Ｇａｒｄｎｅｒ−Ｗｅｌｌｓトングが挙げられ、これにより、脊髄牽引をかけて、骨折又は脱臼を低減することもできる。
【００６２】
１つの実験的治療である低体温法が使用されるが、それが転帰を改善するという証拠はない。静脈内輸液、輸血、及び血管収縮剤を使用して、少なくとも８５から９０ｍｍＨｇの平均動脈圧を維持して、脊髄への適切な血液供給を保証し、脊髄への損傷を防止することは、別の治療であるが、有効性の証拠はほとんどない。また、脊柱管からあらゆる骨片を除去し、脊柱を安定させるために、外科手術が必要となる場合がある。
【００６３】
炎症は、脊髄に更なる損傷をもたらす場合があり、患者は、膨潤を低減するための薬物で治療されることがある。損傷の８時間以内に、コルチコステロイド薬が使用される。この治療は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃｕｔｅ  Ｓｐｉｎａｌ  Ｃｏｒｄ  Ｉｎｊｕｒｙ  Ｓｔｕｄｉｅｓ（ＮＡＳＣＩＳ）Ｉ及びＩＩに基づいているが、他の研究では有益性がほとんど示されておらず、薬物の副作用に対する懸念により、この治療は変更されている。高用量メチルプレドニゾロンを、損傷の６時間以内に投与すると、転帰を改善することができる。しかしながら、大規模治験により示された改善はわずかであり、高用量のコルチコステロイドの免疫抑制性特性による重度感染症又は敗血症のリスク増加という代償が伴う。メチルプレドニゾロンは、もはや急性脊髄損傷の治療には推奨されていない。
【００６４】
患者は、精髄専門ユニット又は集中治療室での長期間治療を必要とすることが多い。ＳＣＩを有する患者を治療する場合、損傷により生成された傷害の修復が最終的な目標である。様々な治療を使用することにより、より大きな改善が達成されるため、治療は、１つの方法に限定されるべきではない。更に、活動を増やすことにより、回復の可能性が大きくなるだろう。脊髄損傷後のリハビリテーションプロセスは、典型的には、急性期治療の場面で開始される。理学療法士、作業療法、看護師、ソーシャルワーカー、精神分析医、及び他の医療従事者は、典型的には、理学療法士の配下でチームとして働き、患者と共に目標を決定し、患者の状態に適切な退院計画を立てる。
【００６５】
急性期では、理学療法士は、患者の呼吸状態、間接合併症（圧迫潰瘍等）の予防、可動域の維持、及び使用可能な筋肉組織活性の維持に集中する。また、この回復段階中は、気道クリアランスが非常に重要である。脊髄損傷後、個体の呼吸筋は弱くなり、患者は効果的に咳をすることができなくなり、分泌物が肺内に蓄積してしまう場合がある。気道クリアランスのための理学療法的処置としては、手による打突及び振動、体位ドレナージ、呼吸筋トレーニング、及び咳支援法を挙げることができる。患者は、前屈みになることにより腹腔内圧力を増加させて、咳を誘発し、多少の分泌物を排除することを教えられる。仰向けに横たわっている患者には、四肢麻痺患者咳誘発法が行われ、理学療法士は、咳のリズムで腹部に圧力を加えて呼気流を最大化し、分泌物を移動させる。手による腹部圧迫は、後に咳を改善する呼気流を増加させるために使用される別の有効な技法である。呼吸機能不全を管理するために使用される他の技法としては、呼吸筋ペーシング、腹帯の使用、ベンチレータ支援発語、及び機械式人工呼吸が含まれる。
【００６６】
障害の神経学的レベル（ＮＬＩ）に応じて、吸入を促進する胸部拡張に関与する筋肉が影響を受ける場合がある。ＮＬＩが、換気筋の幾つかに影響を及ぼすようなものである場合、完全な機能を有する筋肉により重点が置かれるだろう。例えば、肋間筋は、Ｔ１−Ｔ１１からｎｏ神経支配を受容しており、いずれかが損傷したたら、より高いレベルのＣＮＳから神経支配されている非罹患筋肉により重点を置くことが必要となるであろう。ＳＣＩ患者は総肺気量及び一回呼吸量の低下を起こすため、理学療法士は、健常個人には普通教えない補助的な呼吸法（例えば、アピカル呼吸（ａｐｉｃａｌ  ｂｒｅａｔｈｉｎｇ）、舌咽呼吸等）をＳＣＩ患者に教える。
【００６７】
Ｂ．脳神経欠損
脳神経疾患は、１２個の脳神経の１つの機能不全である。頚静脈窩等の、多数の脳神経が併走している場所で外傷が生じた場合、１を超える脳神経の障害が同時に生じる可能性がある。また、脳幹病変は、複数の脳神経の機能不全を引き起こす場合があるが、この状態には、遠位運動障害が伴う可能性が高いだろう。
【００６８】
１２個の脳神経の７番目は、顔面神経である。この脳神経は、顔の筋肉を制御する。顔面神経麻痺は、小児よりも高齢者に多く、毎年１００，０００人中１５−４０人が罹患すると言われている。この疾患の形態は多様であり、先天性、感染性、外傷性、腫瘍性、又は特発性が挙げられる。この脳神経損傷の最も一般的な原因は、顔面神経の麻痺であるベル麻痺（特発性顔面神経麻痺）である。ベル麻痺は成人でより顕著であるが、２０歳よりも若い者又は６０歳よりも高齢の者に見出されると考えられる。ベル麻痺は、脱髄を引き起こす場合があり、顔面神経麻痺の患者に見出されているヘルペスウイルスの感染により生じると考えられている。症状としては、罹患顔面の側方での前額部の扁平化、眉のたわみ、並びに閉眼及び閉口の困難が挙げられる。口を閉じることができないため、食事及び発語に問題が起きる。また、味覚喪失、涙液分泌、及び流涎が引き起こされる。
【００６９】
脳障害又は脳損傷（ＢＩ）は、神経を含む脳細胞の破損又は変性である。脳損傷は、広範な内部及び外部要因により生じる。損傷が最も多い一般的な分類は、物理的な外傷又は外部要因による頭部損傷後の外傷性脳損傷（ＴＢＩ）であり、後天性脳損傷（ＡＢＩ）という用語は、出生後に生じる脳損傷と、障害又は先天性疾患による損傷を区別するために、適切な範囲で使用される。
【００７０】
一般的に、脳障害は、著しい無差別外傷誘導性障害を指し、神経毒性は、典型的には、選択的な化学誘導性ニューロン損傷を指す。脳損傷は、非常に広範な状態、疾患、損傷、及び医原性（医学的治療の有害効果）の結果により生じる。広範な脳障害の考え得る原因としては、出生時低酸素症、低酸素状態持続（酸素欠乏）、催奇形性物質（アルコールを含む）による中毒、感染症、及び神経学的疾患が挙げられる。化学療法は、神経幹細胞、及びミエリンを産生する乏突起膠細胞に脳障害をもたらす場合がある。局所（ｆｏｃａｌ／ｌｏｃａｌｉｚｅｄ）脳障害の一般的な原因は、物理的外傷（外傷性脳損傷、脳卒中、動脈瘤、外科手術、他の神経障害）、並びに水銀を含む重金属及びその鉛化合物による中毒である。
【００７１】
Ｃ．末梢神経欠損
末梢神経損傷は、神経及び周囲結合組織の両方への損傷程度に基づくＳｅｄｄｏｎ分類で分類される。それは、神経系が、支持グリアに対するニューロン依存を特徴とするためである。中枢神経系とは異なり、末梢神経系の再生は可能である。末梢再生で生じるプロセスは、以下の主要な事象：ウォラー変性、軸索再生／成長、及び再神経支配に分割することができる。末梢再生で生じる事象は、神経損傷の軸に対して生じる。近位断端は、ニューロン細胞体に依然として結合されている損傷ニューロンの端部を指す。再生するのはこの部分である。遠位断端は、軸索の端部に依然として結合されている損傷ニューロンの端部を指す。縮退することになるが、再生中の軸索がそれに向かって成長する領域であり続けるのはこの部分である。
【００７２】
神経は完全なままであるが、そのシグナル伝達能力が損なわれている最も低い度合いの神経損傷は、ニューラプラキシーと呼ばれている。軸索は損傷しているが、周囲の接続組織は完全なままである第２の度合いは、軸索断裂と呼ばれる。軸索及び結合組織の両方が損傷している最後の度合いは、神経断裂と呼ばれる。
【００７３】
２．神経成長スキャフォールド
本開示によると、本発明者らは、脊髄軸索がその上に及びその内にわたって再成長することができるスキャフォールドを提供するために、支持体を脊髄欠損の部位に挿入することを企図した。スキャフォールドは、神経成長を刺激、促進、又は改善することができる種々の生物学的因子等の他の特徴と組み合わせることができる。
【００７４】
Ａ．導管
本開示のスキャフォールドは、開放端及びそれを貫通する管腔を有する細長い管状構造により規定される導管により例示される。図１Ａ−図１Ｃには、脊髄ギャップへのチューブの移植が模式的に示されている。図１Ａには、第１の脊髄部分１４と第２の脊髄部分１６との間にギャップ１２が配置されている脊髄１０が示されている。図１Ｂには、ギャップ１２に配置されたチューブ１８が示されている。幾つかの実施態様では、チューブ１８は、ポリウレタン生合成神経移植片（「ＰＵ−ＢＮＩ」）であってもよい。チューブ１８は、円形断面、及びチューブ１８の長さに沿って軸方向に伸長する１つ又は複数のマイクロチャネル２０を含むチューブである。図１Ｃには、チューブ１８の外側周囲に形成された再生組織２２、及びマイクロチャネル、１つ又は複数のマイクロチャネル２０内にわたって形成された再生組織２４が示されている。
【００７５】
例示されているチューブ１８は、円形断面を有しているが、楕円形、正方形、長方形、又は六角形等の、他の断面形状も好適である。チューブ１８は、性質が剛性から半剛性であり、１００ｋＰａから２．０ＧＰａの力を保持する材料で製作することができる。チューブ１８は、非生物分解性であってもよく、又は移植後の数か月間から数年は少なくとも非生分解性であってもよい。
【００７６】
幾つかの実施態様では、チューブ１８は、例えば、ポリ−ラクチド酸（「ＰＬＡ」）、ポリ−ウレタン、シリコーン、セルロース、コラーゲン、ポリ−ラクチドｃｏ−グリコール酸、ポリカプロラクトン、又は変性天然細胞外マトリックスで形成されていてもよい。幾つかの実施態様では、チューブ１８は、約０．５ｍｍから約５ｍｍの長さ、約１．５ｍから約４．０ｍｍの外径、及び約１．５ｍｍから約３．０ｍｍの管腔直径を有していてもよい。幾つかの実施態様では、チューブ１８の壁は、約０．２ｍｍから約０．６ｍｍの厚さを有していてもよい。
【００７７】
幾つかの実施態様では、チューブ１８は、０．０３７”×０．０２７”のＭｉｃｒｏ−Ｒｅｎａｔｈａｎｅ（登録商標）、市販の血液適合性チューブを使用して形成することができる。幾つかの実施態様では、ポリウレタンチューブは、可塑剤、酸化防止剤、色調剤、又は着色剤を含有しておらず、加水分解的に安定していており、ほとんどの無極性溶媒及び医療用溶液により影響を受けない。
【００７８】
幾つかの実施態様では、チューブ１８は、以下に考察されているように、生体適合性材料又は神経成長因子で更にコーティングされていてもよい。例えば、チューブ１８は、コラーゲン及び他の細胞外マトリックス成分でコーティングされていてもよい。
【００７９】
Ｂ．ポリマー繊維
別の実施態様では、スキャフォールドは、神経組織を成長／再成長させるための再生ガイドとして作用するポリマー繊維から構成されることになる。上記繊維は、より伝統的なスキャフォールドとして作用し、神経は、スキャフォールドの上部又は周囲に成長することになる。好適なポリマーとしては、ポリ−ラクチド酸、ポリ−ウレタン、シリコーン、セルロース、コラーゲン、ポリ−ラクチドｃｏ−グリコール酸、及びポリカプロラクトンが挙げられる。
【００８０】
Ｃ．生合成神経移植片
幾つかの実施態様では、導管は、生合成神経移植片又は管腔充填材と様々に称される要素を含有していてもよい。この要素は、神経組織の成長の更なる支持、並びに成長因子を送達するためのデポーを提供することができる固体、半固体、又はゲルであってもよい（以下で考察されている）。管腔充填材の好適な材料としては、寒天、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、又は糖タンパク質が挙げられる。
【００８１】
幾つかの実施態様では、充填材は、性質が均一であってもよく、又は変化する濃度のコラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、成長因子、生体高分子、及び抗炎症性分子デキサメタゾン等の薬理学的作用剤等の分子を含有するように製作することができる。幾つかの実施態様では、充填材は固体であってもよく、又はこの場合も、導管に沿った新しい神経組織の成長を促進し、因子の保管場所として機能する微粒子、微小区画、又はマイクロチャネルを含有していてもよい。
【００８２】
幾つかの実施態様では、管腔の微小区画は、次いで、コラーゲン、ポリマー性微粒子、又は繊維及び／若しくはシュヴァン細胞、線維芽細胞、幹細胞、人工多能性細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ、ＩＰＣ）、又は他の支持細胞等の細胞で充填されていてもよい。こうした細胞は、自己供給源に由来していても、又は成長因子等の、軸索再生を促進することができる分子を発現するように遺伝子組み換えされていても、いずれでもよい。
【００８３】
幾つかの実施態様では、微小区画を使用して、移植前にそこで培養された細胞又は移植後にその中に遊走してくる細胞のための制御環境を提供することができる。この環境は、成長因子、サイトカイン、及び抗炎症性分子を持続送達するための多様な手段を組み込むことにあってもよい。
【００８４】
チューブ又は生合成神経移植片（「ＢＮＩ」）に組み込まれる分子は、中でも、ミエリン関連阻害剤（ＭＡＧ及びＥｐｈＢ３）、並びにコンドロイチン硫酸塩プロテオグリカン（ＣＳＰＧ）バーシカン及びニューロカンを阻止するように設計されているものを含む、成長阻害分子の遮断剤であってもよい。
【００８５】
Ｄ．神経成長因子
幾つかの実施態様では、生合成神経移植片は、成長因子を送達するように設計されていてもよい。あるいは、導管は、それ自体が神経成長因子でコーティングされていてもよい。こうした因子は、神経組織栄養性（ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３）、グリア細胞由来（ＧＤＮＦ）、又は多面性（ＰＴＮ、ＶＥＧＦ）のものであってもよい。
【００８６】
神経成長因子（ＮＧＦ）は、ある標的ニューロン（神経細胞）の成長、維持、及び生存に重要な小型分泌タンパク質である。これは、シグナル伝達分子としても機能する。
【００８７】
「神経成長因子」は、単数の場合は、単一の因子を指すが、複数の場合は、ニューロトロフィンとしても知られている因子のファミリーを指す。成長促進効果が十分に認識されているニューロトロフィンファミリーのメンバーとしては、以下のものが挙げられる：神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、及びニューロトロフィン４／５（ＮＴ−４／５）。ＢＤＮＦは、ＢＤＮＦ遺伝子によりコードされているタンパク質である。ＢＤＮＦは、この増殖因子、ＴｒｋＢ、及びＬＮＧＦＲ（ｐ７５としても知られている低親和性神経成長因子受容体）に応答することができる、細胞表面上の少なくとも２つの受容体に結合する。また、ＢＤＮＦは、アルファ−７ニコチン受容体を含む種々の神経伝達物質受容体の活性を調節することができる。また、ＢＤＮＦは、リーリンシグナル伝達鎖と相互作用することが示されている。
【００８８】
ニューロトロフィン−３は、ＮＴＦ３遺伝子によりコードされているタンパク質である。ニューロトロフィン−３は、末梢及び中枢神経系のあるニューロンに対して活性を示し、既存のニューロンの生存及び分化の支援を補助し、並びに新しいニューロン及びシナプスの成長及び分化を促進する。ニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）は、ニューロトロフィン−５（ＮＴ−５）又はＮＴ−４／５としても知られており、ＮＴＦ４遺伝子によりコードされている。ＮＴ−４は、主にＴｒｋＢ受容体チロシンキナーゼを介してシグナル伝達する神経栄養因子である。
【００８９】
ＧＤＮＦリガンドファミリー（ＧＦＬ）は、４つの神経栄養因子：グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン（ＮＲＴＮ）、アルテミン（ＡＲＴＮ）、及びパースフィン（ＰＳＰＮ）からなる。ＧＦＬは、細胞生存、神経突起成長、細胞分化、及び細胞遊走を含む幾つかの生物学的プロセスに役割を果たすことが示されている。特に、ＧＤＮＦによるシグナル伝達は、ドーパミン作動性ニューロンの生存を促進し、多くのタイプのニューロンの生存を強力に促進する。
【００９０】
プレイオトロフィン（ＰＴＮ）は、ヘパリン結合脳分裂促進因子（ＨＢＢＭ）又はヘパリン結合成長因子８（ＨＢＧＦ−８）、神経突起成長促進因子１（ＮＥＧＦ１）、ヘパリン親和性調節ペプチド（ＨＡＲＰ）、又はヘパリン結合成長関連分子（ＨＢ−ＧＡＭ）としても知られており、ＰＴＮ遺伝子によりコードされている。プレイオトロフィンは、ヘパリンに対して高親和性を示す１８ｋＤａの成長因子である。プレイオトロフィンは、構造的には、ミッドカイン及びレチノイン酸誘導性ヘパリン結合タンパク質と関連している。
【００９１】
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、元々は血管透過因子（ＶＰＦ）として知られており、脈管形成及び血管新生を刺激する細胞により産生されるシグナルタンパク質である。血液循環が不十分になった場合、組織への酸素供給量を回復させるのは、この系の一部である。ＶＥＧＦは、気管支喘息及び真性糖尿病で、高い血清濃度を示す。ＶＥＧＦの正常機能は、胚発生中に新しい血管を生成すること、損傷後に新しい血管を生成すること、運動後に筋肉を生成すること、及び閉塞血管をバイパスするために新しい血管（側副血行路）を生成することである。
【００９２】
ＰＣＴ／米国特許出願第１４／１６９０５号明細書及び米国特許出願公開第２００７００１０８３１号明細書にも、神経再生に使用される成長因子が記載されている。これら出願の内容は、出典明示により本明細書で援用される。
【００９３】
３．外科手術
手術に好適なレシピエントとしては、ヒト、並びにチンパンジー、サル、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、マウス、ラット、及びウサギ等の非ヒト動物が挙げられる。
【００９４】
損傷したヒト脊髄を有する患者は、本手術から利益を得ることができるか否か判断するために、幾つかの異なる診断基準により評価されることになり、診断基準には、損傷後の時間、罹患のレベル、及び患者の病変が、完全病変、不完全病変、又は非完全のいずれであるかが挙げられる。
【００９５】
いかなる実験的介入にもリスクが伴うため、胸部に急性病変を有する患者が、この技術を試験するための候補となる可能性が高いだろう。この場合、それほど重要ではない機能的結果のみがリスクに曝され、運動機能回復の利益及び腸機能回復の利益が最大化される。胸部病変を治療する治験から安全性データ及び効力データを得たら、より高次の病変へと、及びより慢性の損傷へと移行することができる。
【００９６】
最も良好な治療選択肢は、損傷の背腹側レベルに応じて、軸索タイプ特異的な明確に規定されている分子誘引剤を含有するＢＮＩ管腔充填剤を有する導管を含む可能性が高いだろう。また、それらは、成長阻害剤遮断剤のプログラム可能な持続放出を含むだろう。また、機能回復は、理学リハビリテーション療法、神経調節療法、又はそれらの組み合わせにより刺激することができる。
【実施例】
【００９７】
４．実施例
以下の例は、本開示の特定の実施態様を示すために含まれている。当業者であれば、以下の例に開示されている技法は、本開示の実施に際して良好に機能することが本発明者により発見された技法であり、したがって、その実施のために具体的に企図された態様を構成するとみなすことができることを理解すべきである。しかしながら、当業者であれば、本開示に照らして、開示されている特定の実施態様には、本開示の趣旨及び範囲から逸脱することなく数多くの変更をなすことができ、依然として同様の又は類似の結果を得ることができることを理解するべきである。
【００９８】
実施例１−物質及び方法
Ｔ９−１１での椎弓切除後に切断及び吸引することにより、５３匹の成体雌Ｌｏｎｇ  Ｅｖａｎｓラットの脊髄組織に、２−３ｍｍの損傷ギャップを導入した。椎骨の底部を刃物で擦って、あらゆる考え得る接続を排除し、自然に回復する可能性が決してないであろう徹底的なギャップ損傷を得た。
【００９９】
次に、生合成神経移植片（「ＢＮＩ」）を導入した。ＢＮＩは、剛性ポリウレタン（「ＰＵ」）チューブ（例えば、図１Ｂ及び図１Ｃのチューブ１８）により取り囲まれていた。ＰＵチューブは、比較的厚く、縫合可能であり、非生物分解性だった。１．５％アガロースプラグがＰＵチューブに充填されていた。マイクロチャネル（例えば、図１Ｂ及び図１Ｃの１つ又は複数のマイクロチャネル２２）を、アガロースに直線的に配置した金属ロッドを使用してＢＮＩにキャストした。この手法は、これまで末梢神経損傷モデルにしか使用されておらず、米国特許出願公開第２００７００１０８３１号明細書に記載されている。末梢神経とは異なり、脊髄は、非常に軟質の組織により構成されているため縫合することできず、これらモデル損傷の以前のプロトコールでは、ＰＵチューブが取り外され、多管腔アガロースのみが移植される。しかしながら、今回の場合、ＰＵチューブを適所に有するアガロースプラグを、直近の近位及び遠位椎体の下にＰＵチューブの端部を挿入することにより脊柱に係留した。その後、移植したＰＵチューブを、コラーゲンＩ型ゲルで覆い、筋肉を適所に縫合して元に戻した。
【０１００】
実施例２−結果
５２匹のラットが、ある型のＰＵ−ＢＮＩを受容し、動物を、以下のような試験群に帰属させた：
８匹：偽試験（移植片無し）；
８匹：管腔可変ピッチコイルによるＢＳＡ勾配を有するもの；
８匹：管腔可変ピッチコイルによるＢＳＡ（腹側）及びＢＤＮＦ（背側）の勾配を有するもの；
８匹：管腔可変ピッチコイルによるＧＤＮＦ（腹側）及びＢＳＡ（背側）の勾配を有するもの；
１２匹：管腔可変ピッチコイルによるＧＤＮＦ（腹側）及びＢＤＮＦ（背側）の勾配を有するもの（４匹の動物は、元々は４週間生存用に計画されていたが、後に群の残りと一緒にした）；及び
８匹：管腔可変ピッチコイルによるＢＤＮＦ（腹側）及びＧＤＮＦ（背側）の勾配を有するもの。
【０１０１】
この研究は、最初は９週間が計画されていたが、９週間の期間前に好調な行動データを得た後で、１２週間に延長された。罹患率及び死亡率の研究中に失われたラットを考慮に入れた後、本発明者らには、使用可能なデータ（少なくとも８週間の行動データ）が得られた各群において以下の数の動物が残った：
７匹：偽試験（移植片無し）；
６匹：管腔可変ピッチコイルによるＢＳＡ勾配を有するもの；
５匹：管腔可変ピッチコイルによるＢＳＡ（腹側）及びＢＤＮＦ（背側）の勾配を有するもの；
７匹：管腔可変ピッチコイルによるＧＤＮＦ（腹側）及びＢＳＡ（背側）の勾配を有するもの；
７匹：管腔可変ピッチコイルによるＧＤＮＦ（腹側）及びＢＤＮＦ（背側）の勾配を有するもの（４匹の動物は、元々は４週間生存用に計画されていたが、後に群の残りと一緒にした）；
６匹：管腔可変ピッチコイルによるＢＤＮＦ（腹側）及びＧＤＮＦ（背側）の勾配を有するもの；及び
５匹；可変ピッチコイル。
【０１０２】
研究終了時に、動物を検査し、損傷部位の脊髄組織を評価した。驚くべきことに、脊髄組織は、検査した最初の５匹の動物では、ある場合には損傷部位の特定が非常に困難であるほどまで再生した。幾つかの動物では、チューブは押しのけられて、脊髄にわたって見出された。しかしながら、脊髄はそれでも再生され、脊髄をチューブのアガロースチャネルに接続する組織が見られた。例示的な結果が、図２Ａ−図２Ｃに示されている。図２Ａは、１２週間後に対象から取り出した回収脊髄３０の写真である。図２Ａには、再生脊髄３２が、移植したＰＵチューブ３４の外側に成長して（図２Ｂに最も良好に示されている）、ＰＵチューブ３４を完全に覆っていることが示されている。信じられないことだが、この組織の肉眼的な解剖学的特徴は正常に見えた。図２Ｂは、脊髄３０の写真であり、再生脊髄３２は、ＰＵチューブ３４を露出させるために除去されている。図２Ｃは、脊髄３０の写真であり、再生脊髄３２及びＰＵチューブ３４は、ＰＵチューブ３４内で成長した再生脊髄３６を示すために除去されている。
【０１０３】
軸索（ｂ−チューブリンＩＩＩ）に特異的な抗体を使用した、再生組織の組織学的評価により、神経組織は、ＰＵチューブの上部に並びにＢＮＩマイクロチャネルの管腔内に成長した脊髄組織から発出する後根であると考えられるものを識別することができる程度まで、ＰＵチューブの外側に成長することが明らかになった。例えば、図３Ａを参照されたい。図３Ａは、成体ラットから除去した脊髄４０のマイクロ写真である。脊髄４０に対するＰＵチューブ４２の位置をより良好に示すために、ＰＵチューブ４２の輪郭を図３Ａと重ね合わせてある。ＰＵチューブ４２は、外側表面及び管腔を備えている。２つのマイクロチャネル４４が、ＰＵチューブ４２の管腔内に配置されていることが示されている。後根４６が、脊髄組織から発出し、ＰＵチューブ４２の外側表面にわたって成長していることが示されている。図３Ｂは、ＰＵチューブ４２の外側の軸索再成長を示すマイクロ写真である。図３Ｃは、ＰＵチューブ４２内部の軸索再成長を示すマイクロ写真である。この結果により、脊髄４０の全断面を修復する際に、ＰＵチューブ４２、及びマイクロチャネル４４内に配置することができるＢＮＩ多管腔充填剤が許容的な性質を持つことが確認される。
【０１０４】
観察された神経成長が、損傷部位にわたって再生しただけでなく、後肢の感覚運動機能を制御するより遠位の腰椎分節に到達したことを確認するために、本発明者らは、自発運動活動のオープンフィールド行動試験を実施し、Ｂａｓｓｏ、Ｂｅａｔｔｉｅ、及びＢｒｅｓｎａｈａｎ（ＢＢＢ）尺度として知られており広く受け入れられている尺度に基づいてスコアを割り当てた。ＢＢＢ尺度は、一連の自発運動回復パターンの証拠を提供し、回復初期（０から７までのＢＢＢスコア）、回復中期（８−１３）、及び回復後期（１４−２１）（Bassoら、1995）を考慮に入れる。
【０１０５】
本発明者らの研究では、損傷動物は全て、脊髄への病変後２週間は完全な麻痺を示した。その後、中性ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）コントロールを含む全ての群、並びにそれ自体と又はＢＳＡと組み合わせたＢＤＮＦ及びＧＤＮＦを含む幾つかの成長因子の持続放出を含む群はいずれも、後肢機能の漸増的改善を示した。図４は、ＢＳＡ治療群による平均回復を示すグラフであり、目盛りの０は完全な麻痺を示し、２１は正常な運動機能である。ＰＵ−ＢＮＩを移植した１１週後の終了時には、ＢＳＡ群は、平均ＢＢＢスコアが６であった。このスコアは、初期自発運動回復を強く示す指標である。
【０１０６】
実施例３
脊髄損傷及び移植
５２匹の成体雌Ｌｏｎｇ  Ｅｖａｎｓラットに脊髄生合成神経移植片（ＢＮＩ）を移植し、以下の７つの実験群に分割した：
ａ）偽損傷（ｎ＝８）、
ｂ）管腔可変ピッチコイルによるＢＳＡ勾配（ｎ＝８）、
ｃ）管腔可変ピッチコイルによるＢＳＡ（腹側）及びＢＤＮＦ（背側）の勾配（ｎ＝８）、
ｄ）管腔可変ピッチコイルによるＢＳＡ（腹側）及びＧＤＮＦ（背側）の勾配（ｎ＝８）、
ｅ）管腔可変ピッチコイルによるＧＤＮＦ（腹側）及びＢＤＮＦ（背側）の勾配、この場合、コイルは勾配を逆にして配置されており、つまりＢＤＮＦ勾配は尾部に向かって移動すると共に増加し、ＧＤＮＦコイルも、逆方向に配置されることになり、つまり勾配は頭部に向かって増加する（ｎ＝８）、及び
ｆ）管腔可変ピッチコイルによるＧＤＮＦ（腹側）及びＢＤＮＦ（背側）の勾配、４週間生存研究（ｎ＝４）、及び同じＢＮＩ構成だが９週間研究の一部である追加のｎ＝８。移植の１２週後に、神経再生の目視による解剖学的評価を実施した。
【０１０７】
電気生理学
幾つかの動物では、麻酔導入後、最初の切開（基線）の直前（５分以内）、及び脊髄切断後に、経頭蓋運動誘発電位（ＴｃＭＥＰ）の記録を得た。また、研究終了時に末梢電気生理学的特徴を取得し、脊髄が、回復後どの程度の電気的能力を有するかを決定した。
【０１０８】
行動試験
行動試験：各動物の運動は、歩行分析用のＢＢＢ採点尺度により運動機能回復を評価した。
【０１０９】
神経路追跡
組織化学的分析の前に、感覚軸索及び皮質脊髄軸索を、それぞれ１％コレラ毒素Ｂ（ＣＴＢ）及び１０％ビオチンデキストランアミン（ＢＤＡ）で標識した。これにより、再生及び再神経支配の程度の評価が可能になった。
【０１１０】
組織学的検査
各群の脊髄切片を染色して、背側領域及び腹側領域における軸索含有量を評価した。神経再生の量を定量化し、統計的に評価した。
【０１１１】
結果
生合成神経移植片（ＢＮＩ）を脊髄へと移植する外科手術の説明
雌Ｌｏｎｇ−Ｅｖａｎｓラット（２２５−２７５ｇ）を、この研究に使用した。ナトリウムペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）で動物に麻酔をかけた。適切な麻酔深度に到達したら（角膜反射消失）、毛剃した背面を、ポビドンヨードで消毒した。傍脊柱筋肉を切開することにより脊柱を露出させ、Ｔ１０及びＴ１１で椎弓切除を実施した。脊髄を、およそ２ｍｍ離して完全に２つの部分に切断し、ギャップ損傷を生成した。切断したら、脊髄断端を縮退させて、およそ４ｍｍのギャップを得た。ＢＮＩを、脊髄の残りの端部に接近させてギャップに配置した。コラーゲンの液体溶液を移植片の上部に加え、適所での重合を可能にした。その後、皮下脂肪組織の切片をコラーゲンの上に配置し、切開部を閉じた。４−０のクロムガットを使用して筋肉層を閉じ、皮膚を近づけて、創傷クリップで閉じた。
【０１１２】
結論
勾配の生物活性を、後根神経節外植片培養で確認した。軸索の長さは、成長因子の勾配に曝された場合、巻回数が同じであるにも関わらず、非勾配コイルと比較して著しく増加した。ＮＧＦの勾配放出により、軸索伸長の指向性が増強された。構成が異なると、同じ基準の１００ｎｇ／ｍｌ初期基準濃度でも、異なる空間時間的濃度が生成される。軸索直進性プロトコールを使用して、異なる設計における軸索の線形性を予測することができる。巻付け構成の場合、軸索線形性は、巻付けが変化すると共に、及びチャネルサイズが減少すると共に増加する。
【０１１３】
図５Ａ及び図５Ｂには、神経栄養因子（ＮＴＦ）勾配を有する管腔コラーゲンを有するチューブが、無勾配のＮＴＦを有する管腔コラーゲンを有するチューブと比較して示されている。複数のマイクロチャネル５４内に配置されている複数の管腔コラーゲン５２を含む第１のチューブ５０が示されている。複数のマイクロチャネル６４内に配置されている複数の管腔コラーゲン６２を含む第２のチューブ６０が示されている。管腔コラーゲン５２とは対照的に、管腔コラーゲン６２は、コラーゲン６２の長さに沿って密度勾配を含むように配置されているＮＴＦを含む。例えば、部分６６は、部分６８よりも比較的高い密度を含み、部分６８は、部分７０よりも比較的高い密度を含む。
【０１１４】
図６には、キャスティングデバイスを用いて繊維コイルをマイクロチャネルに配置するプロセスの段階が示されている。段階（ｉ）では、金属ロッド８０が、キャスティングデバイス８２に挿入されていることが示されている。キャスティングデバイス８２は、キャスティングチャネル８４を含む。段階（ｉ）に示されているように、アガロース重合は既に起きている。段階（ｉｉ）では、金属ロッド８０は、キャスティングチャネル８４から部分的に引き抜かれ、それにより、コラーゲンレザバ８６からキャスティングチャネル８４へとコラーゲンが引き出される。段階（ｉｉｉ）では、金属ロッド８０が、キャスティングチャネル８４から取り除かれることが示されている。アガロース重合後に金属ロッド８０をキャスティングデバイス８２から取り除くことにより、コイルがマイクロチャネルの壁面に係留されると同時に、管腔がコラーゲンで満たされる。図７には、Ａ）金属ロッド（例えば、図６の金属ロッド８０等）に巻回されたＣｙ３−ＰＬＧＡ繊維、Ｂ）金属ロッドに巻回されたＣｙ３−ＰＬＧＡ繊維の蛍光画像、及びＣ）Ｂ（Ｒｕ）のデンシトメトリーグラフが示されている。
【０１１５】
図８は、巻回された繊維の２つの領域の経時的なＢＳＡ放出を示すグラフである。このグラフは、高（Ｈ）及び低（Ｌ）巻回領域の両方における、２４時間の試験期間中の持続放出勾配を示す。
【０１１６】
図９Ａは、１、５、及び７日後のコイルの均一分布及び勾配分布を比較するグラフである。１、５、及び７日の終了時の、コラーゲン充填マイクロチャネル（容積１／４  ０．４９μｌ）のモデル計算ＮＧＦ濃度が、比較のために、均一コイル構成及び勾配コイル構成の両方について示されている。均一コイル構成の場合、ＮＧＦの放出は、チャネル全体にわたって一貫していると予想される。チャネル濃度は、１日目で７．５ｎｇ／ｍｌのレベル達し、７日目ではおよそ７ｎｇ／ｍｌを維持していた。近位及び遠位拡散の結果として、ＮＧＦ分布の均一性は、ＮＧＦ濃度が減少すると共に徐々に増加する。それによりチャネルの中央に高濃度帯がもたらされ、そのため、ニューロンは、遠位端部に向かって成長を続けることが難しくなる（図９Ａを参照）。対照的に、勾配コイル構成の場合、ＮＧＦの放出及びその結果生じるチャネルの濃度分布は、不均一になるように意図されている。本発明者らの結果は、ＮＧＦ濃度が、１日目では、０．０２から１２．４２ｎｇ／ｍｌまでの範囲であることを示している。７日目では、ＮＧＦ濃度勾配は、ピーク値が９．５３ｎｇ／ｍｌへとわずかに減少したものの、維持されている。高ＮＧＦ濃度の領域は、より高いコイル数に対応している。現行セットの設計パラメータの場合、０．０２−１０ｎｇ／ｍｌの平均勾配を１週間にわたって維持することができた。均一コイル構成とは異なり、勾配コイル構成は、チャネル遠位端部へと向かうニューロンの成長の誘発及び誘導を継続させる持続的走化性勾配を提供する。こうした結果は、アガロースチャネルの壁面に巻回された繊維の数を調節することにより、生物学的に活性な成長因子の好ましい持続可能な分子勾配を管腔コラーゲンマトリックスに確立及び維持することができるという概念を支持している。
【０１１７】
図９Ｂは、１、５、及び７日後の均一ＮＧＦ及び勾配ＮＧＦの濃度対マイクロチャネル長さのグラフである。図９Ａ及び図９Ｂには、巻回された繊維からのＮＧＦ拡散の有限要素シミュレーションが示されている。図９Ａには、コイルの均一分布は、開口部ではある程度希釈されているものの、１−７日間にわたってマイクロチャネルにわたるＮＧＦの均一な拡散をもたらすことが示されている。一方、巻回された繊維の配置が変化する場合、２２°の急勾配である１０−１００ｎｇ／ｍＬのＮＧＦ濃度勾配がもたらされ、勾配は経時的に増加及び拡大して、マイクロチャネルのほとんどの容積をカバーする。均一濃度及び勾配濃度を長軸に沿って比較すると、この違いは顕著である。
【０１１８】
図１０Ａ、図１０Ｂ、及び図１０Ｃには、アガロースゲルに配置されたポリマー性Ｃｙ３−コイルの３つの共焦点画像が含まれている。画像（１）は、Ｃｙ３−コイルを示すように強調されている。写真のより暗色の部分はアガロースを示す。アガロースは透明である。画像（２）は、Ｃｙ２標識コラーゲンを示すように強調されている。画像（３）は、画像（１）及び画像（２）を一緒にしたものである。画像（１）の左下に示されているバーは、１００μｍの長さを示す尺度バーである。
【０１１９】
図１１Ａは、近位端部にＤＲＧ外植片を有するマイクロチャネルを示すＴＭＭゲルのＤＩＣ画像である。図１１Ｂ−図１１Ｅは、β−チューブリンを視覚化するために免疫標識したＤＲＧ軸索成長の共焦点画像である（図１１Ｂ−図１１Ｅのより白い部分）。図１１Ｂには、コイルを有していないコントロールが示されている。図１１Ｂの尺度バーは、１００μｍの長さを示す。図１１Ｃには、低密度ＮＧＦをロードした繊維のコイルが示されている。図１１Ｄには、高密度ＮＧＦをロードした繊維のコイルが示されている。図１１Ｅには、勾配配置の低密度ＮＧＦをロードした繊維のコイルが示されている。図１１Ｃ−図１１Ｄの各々は、図１１Ｂに示されている成長と比較して、軸索成長が向上したことを示している。
【０１２０】
図１１Ｆは、３つのＮＧＦ濃度での平均軸索長を示すグラフである。約７ｎｇ／ｍｌのＮＧＦ濃度は、コントロールと比較して、わずかな向上をもたらし、約１８のＮＧＦ濃度は、コントロールと比較して、平均軸索長さの著しい向上を示した。図１１Ｇでは、ＮＧＦの均一分布の場合とＮＧＦの勾配分布の場合との平均軸索長さが比較されている。勾配分布は、漸増ＮＧＦ濃度（ｎ＝３−５）に向かって成長するニューロンの平均軸索長さの著しい増加を示した。
【０１２１】
図１２には、異なるサイズのメッシュ要素を示すメッシュ幾何構造が示されている。重要な幾何学的部分は、大きさの違いにより視覚化がより容易になるように、別々に拡大されている。
【０１２２】
図１３には、６つの設計の活性チャネル／マイクロチャネルでの軸方向濃度変化を示すグラフ（１）−（６）が含まれている。各々のグラフの濃度情報は、１、２、３、４、５、１０、２０、及び３０日目に測定した。グラフ（１）は、均一に混合されたＧＦの濃度対チャネル長さを示す。グラフ（２）は、均一に分布したＰＬＧＡミクロスフェア内にパッケージされたＧＦの濃度対チャネル長さを示す。グラフ（３）は、巻き方が異なる繊維内にパッケージされたＧＦの濃度対チャネル長さを示す。グラフ（４）は、マイクロチャネルに均一に混合されたＧＦの濃度対チャネル長さを示す。グラフ（５）は、マイクロチャネルに均一に分布したＰＬＧＡミクロスフェアにパッケージされたＧＦの濃度対チャネル長さを示す。グラフ（６）は、マイクロチャネル内部の巻き方が異なる繊維にパッケージされたＧＦの濃度対チャネル長さを示す。
【０１２３】
本明細書で開示及び特許請求されている組成物及び方法は全て、本開示に照らして過度の実験作業を行わずに製作及び実施することができる。本開示の組成物及び方法は、好ましい実施態様に関して記載されているが、本開示の概念、趣旨、及び範囲から逸脱せずに、本明細書に記載の組成物及び方法、並びに本明細書に記載の方法のステップ又はステップの順序に、変異を加えることができることは、当業者であれば明白だろう。より詳しくは、化学的にも及び生理学的にも関連しているある作用剤を、本明細書に記載の作用剤の代わりに使用することができ、その場合も、同じ又は同様の結果が達成されることになることは明白だろう。当業者に明白なそのような類似の代替物及び改変は全て、添付の特許請求の範囲により規定されている、本開示の趣旨、範囲、及び概念の範囲内にあるとみなされる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2017535342.tif 000004
【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ−Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ−Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ−Ｃ】
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【図８】
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【図９Ａ−Ｂ】
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【図１０Ａ−Ｃ】
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【図１１Ａ−Ｇ】
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【図１２】
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【図１３Ａ−Ｃ】
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【図１３Ｄ−Ｆ】
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【国際調査報告】
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