(57)【要約】組換えタンパク質産物の等電性プロファイルをシフトさせる方法、および組換えタンパク質産物の製造におけるかかる方法の使用が、本明細書で提供される。かかる方法によって産生される組換えタンパク質産物もまた提供される。本発明は、組換えタンパク質産物を特定の条件下でさらなる期間にわたってインキュベートすることで、組換えタンパク質産物の等電性プロファイルのシフトが生じるという発見に、少なくとも一部基づく。このさらなる期間は、哺乳動物細胞培養物の衰退期の間のさらなる期間など、哺乳動物細胞培養物が臨界時点に達した後に生じるものとして測定され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えタンパク質産物の等電性プロファイルをシフトさせる方法であって、
（ａ）産生バイオリアクター中で、前記産物を産生するのに十分な条件下で、組換えタンパク質をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を、前記哺乳動物細胞の増殖期および／または静止期からなる第１の期間にわたって培養するステップ；
（ｂ）前記第１の期間の最後に、前記産物の等電性プロファイルをアッセイするステップ；ならびに
（ｃ）前記産物の等電性プロファイルをより酸性のプロファイルに向けてシフトさせるのに十分な条件下で、前記哺乳動物細胞の衰退期の中の少なくとも６時間からなる第２の期間にわたって、前記産物をインキュベートするステップ、または
前記産物の等電性プロファイルをより塩基性のプロファイルに向けてシフトさせるのに十分な条件下で、前記哺乳動物細胞の衰退期の第２の期間にわたって、前記産物をインキュベートするステップ；ならびに任意選択で
（ｄ）前記産物をアッセイして等電性プロファイルを決定し、前記等電性プロファイルがさらなるシフトを必要とする場合に、ステップ（ｃ）を反復するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
組換えタンパク質産物の等電性プロファイルをシフトさせる方法であって、
（ａ）産生バイオリアクター中で、前記産物を産生するのに十分な条件下で、組換えタンパク質をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を、前記哺乳動物細胞の増殖期を含み、かつ臨界時点において終結する第１の期間にわたって培養するステップ；
（ｂ）前記産物の等電性プロファイルをより酸性のプロファイルに向けてシフトさせるのに十分な条件下で、前記哺乳動物細胞の衰退期の中の少なくとも６時間からなる第２の期間にわたって、前記産物をインキュベートするステップ；ならびに任意選択で
（ｃ）前記産物をアッセイして等電性プロファイルを決定し、前記等電性プロファイルが、より酸性のプロファイルに向かうさらなるシフトを必要とする場合に、ステップ（ｂ）を反復するステップ
を含む、方法。
【請求項３】
組換えタンパク質産物の等電性プロファイルをシフトさせる方法であって、
（ａ）産生バイオリアクター中で、前記産物を産生するのに十分な条件下で、組換えタンパク質をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を、前記哺乳動物細胞の増殖期を含み、かつ臨界時点において終結する第１の期間にわたって培養するステップ；
（ｂ）前記産物の等電性プロファイルをより塩基性のプロファイルに向けてシフトさせるのに十分な条件下で、前記哺乳動物細胞の衰退期の第２の期間にわたって、前記産物をインキュベートするステップ；ならびに任意選択で
（ｃ）前記産物をアッセイして等電性プロファイルを決定し、前記等電性プロファイルが、より塩基性のプロファイルに向かうさらなるシフトを必要とする場合に、ステップ（ｂ）を反復するステップ
を含む、方法。
【請求項４】
ステップ（ａ）が、前記哺乳動物細胞を流加培養することを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の期間が、約５日間から約１２日間の間である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記第２の期間が、約６時間から約１２０時間の間である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｃ）でインキュベートされた前記産物が、培養物中の前記組換えタンパク質および前記哺乳動物細胞の混合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｂ）でインキュベートされた前記産物が、培養物中の前記組換えタンパク質および前記哺乳動物細胞の混合物を含む、請求項２または３に記載の方法。
【請求項９】
前記産物が、前記産生バイオリアクター中でインキュベートされる、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記産物が、貯蔵容器中でインキュベートされる、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｂ）とステップ（ｃ）の間に、培養物を清澄化するステップをさらに含み、ステップ（ｃ）でインキュベートされた前記産物が、清澄化された組織培養培地中の前記組換えタンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ａ）とステップ（ｂ）の間に、培養物を清澄化するステップをさらに含み、ステップ（ｂ）でインキュベートされた前記産物が、清澄化された組織培養培地中の前記組換えタンパク質を含む、請求項２または３に記載の方法。
【請求項１３】
前記産物が、貯蔵容器中でインキュベートされる、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ｂ）とステップ（ｃ）の間に、前記組換えタンパク質を精製するステップをさらに含み、ステップ（ｃ）でインキュベートされた前記産物が、希釈剤中の精製された前記組換えタンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ステップ（ａ）とステップ（ｂ）の間に、前記組換えタンパク質を精製するステップをさらに含み、ステップ（ｂ）でインキュベートされた前記産物が、希釈剤中の精製された前記組換えタンパク質を含む、請求項２または３に記載の方法。
【請求項１６】
ステップ（ａ）が、塩基性のプロファイルを有する産物を産生する少なくとも１つの条件下で、前記哺乳動物細胞を流加培養することを含み、ステップ（ｃ）が、前記産物をより酸性のプロファイルにシフトさせる、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ（ａ）が、塩基性のプロファイルを有する産物を産生する少なくとも１つの条件下で、前記哺乳動物細胞を流加培養することを含み、ステップ（ｂ）が、前記産物をより酸性のプロファイルにシフトさせる、請求項２に記載の方法。
【請求項１８】
前記条件が、Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄウシ血清を含む培養培地中で培養することを含む、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ａ）が、酸性のプロファイルを有する産物を産生する少なくとも１つの条件下で、前記哺乳動物細胞を流加培養することを含み、ステップ（ｃ）が、前記産物をより塩基性のプロファイルにシフトさせる、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ａ）が、酸性のプロファイルを有する産物を産生する少なくとも１つの条件下で、前記哺乳動物細胞を流加培養することを含み、ステップ（ｂ）が、前記産物をより塩基性のプロファイルにシフトさせる、請求項３に記載の方法。
【請求項２１】
前記産物の等電性プロファイルをより酸性のプロファイルに向けてシフトさせるのに十分な前記条件が、約２０％〜約４５％の間の溶存酸素（ｄＯ２）濃度中でインキュベートすることを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２２】
前記ｄＯ２濃度が、約２５％から約４０％の間である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ｄＯ２濃度が、約３０％から約３５％の間である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記産物の等電性プロファイルをより酸性のプロファイルに向けてシフトさせるのに十分な前記条件が、約７．０から約７．３の間のｐＨを有する培地中でインキュベートすることを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２５】
前記ｐＨが、約７．０から約７．２５の間である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ｐＨが、約７．０から約７．２０の間である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ｐＨが、約７．０から約７．１５の間である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記産物の等電性プロファイルをより酸性のプロファイルに向けてシフトさせるのに十分な前記条件が、約３０℃から約３７．５℃の間の温度でインキュベートすることを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２９】
前記温度が、約３３℃から約３７．５℃の間である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記産物の等電性プロファイルをより酸性のプロファイルにシフトさせるのに十分な前記条件が、約２００ＲＰＭから約４００ＲＰＭの間の撹拌速度でインキュベートすることを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項３１】
前記撹拌速度が、約２２０ＲＰＭから約３５０ＲＰＭの間である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記撹拌速度が、約２２０ＲＰＭから約３００ＲＰＭの間である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ステップ（ｂ）および／またはステップ（ｄ）が、等電点電気泳動を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
ステップ（ｃ）が、等電点電気泳動を含む、請求項２または３に記載の方法。
【請求項３５】
前記等電点電気泳動が、キャピラリー電気泳動またはゲル電気泳動である、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記組換えタンパク質が、免疫グロブリン、酵素、タンパク質または操作されたタンパク質である、請求項１から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記組換えタンパク質が抗体である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記抗体が、ヒト抗体またはヒト化抗体である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記抗体が、ヒト補体タンパク質Ｃ５に特異的に結合する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記抗体がエクリズマブである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
エクリズマブが、配列番号１を含む重鎖および配列番号２を含む軽鎖を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
エクリズマブが、配列番号１からなる重鎖および配列番号２からなる軽鎖を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
（ｅ）前記産物を医薬組成物に製剤化するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４４】
（ｄ）前記産物を医薬組成物に製剤化するステップをさらに含む、請求項２または３に記載の方法。
【請求項４５】
前記組換えタンパク質産物の等電性プロファイルが、約５．２から約６．７の間の等電点を有する７つのタンパク質下位集団を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４６】
前記産物の等電性プロファイルをより酸性のプロファイルに向けてシフトさせるのに十分な条件下で前記産物をインキュベートするステップが、前記７つのタンパク質下位集団の、より酸性のタンパク質下位集団のうち少なくとも２つの量の増加、およびより塩基性のタンパク質下位集団のうち少なくとも２つの量の減少を生じる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記より酸性のタンパク質下位集団のうちの前記少なくとも２つが、約５．２から約６．７の間の等電点を有する前記７つのタンパク質下位集団の、４番目および５番目に酸性が強いタンパク質下位集団である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記より塩基性の下位集団のうちの前記少なくとも２つが、約５．２から約６．７の間の等電点を有する前記７つのタンパク質下位集団の、１番目および２番目に塩基性が強いタンパク質下位集団である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記７つのタンパク質下位集団が、約５．４５から約６．５５の間の等電点を有する、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
約５．４５から約６．５５の間の等電点を有する７つのタンパク質下位集団を有する組換えタンパク質産物の等電性プロファイルをシフトさせる方法であって、
（ａ）産生バイオリアクター中で、前記産物を産生するのに十分な条件下で、組換えタンパク質をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を、前記哺乳動物細胞の増殖期または増殖期および静止期からなる第１の期間にわたって流加培養するステップ；
（ｂ）前記産物の等電性プロファイルをより酸性のプロファイルに向けてシフトさせるのに十分な条件下で、前記哺乳動物細胞の衰退期の中の少なくとも６時間からなる第２の期間にわたって、前記産物をインキュベートするステップであって、前記より酸性のプロファイルが、前記７つのタンパク質下位集団の、４番目および５番目に酸性が強いタンパク質下位集団の量の増加、ならびに前記７つのタンパク質下位集団の、１番目および２番目に塩基性が強いタンパク質下位集団の量の減少を含む、ステップ；ならびに任意選択で
（ｃ）前記産物をアッセイして等電性プロファイルを決定し、前記等電性プロファイルが、前記より酸性のプロファイルに向かうさらなるシフトを必要とする場合に、ステップ（ｂ）を反復するステップ
を含む、方法。
【請求項５１】
約５．４５から約６．５５の間の等電点を有する７つのタンパク質下位集団を有する組換えタンパク質産物の等電性プロファイルをシフトさせる方法であって、
（ａ）産生バイオリアクター中で、前記産物を産生するのに十分な条件下で、組換えタンパク質をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を、前記哺乳動物細胞の増殖期を含み、かつ臨界時点において終結する第１の期間にわたって流加培養するステップ；
（ｂ）前記産物の等電性プロファイルをより酸性のプロファイルに向けてシフトさせるのに十分な条件下で、前記哺乳動物細胞の衰退期の中の少なくとも６時間からなる第２の期間にわたって、前記産物をインキュベートするステップであって、前記より酸性のプロファイルが、前記７つのタンパク質下位集団の、４番目および５番目に酸性が強いタンパク質下位集団の量の増加、ならびに前記７つのタンパク質下位集団の、１番目および２番目に塩基性が強いタンパク質下位集団の量の減少を含む、ステップ；ならびに任意選択で
（ｃ）前記産物をアッセイして等電性プロファイルを決定し、前記等電性プロファイルが、前記より酸性のプロファイルに向かうさらなるシフトを必要とする場合に、ステップ（ｂ）を反復するステップ
を含む、方法。
【請求項５２】
前記より酸性のプロファイルが、等電性プロファイルであり、ここで、
前記７つのタンパク質下位集団の２番目、３番目および４番目に塩基性が強いタンパク質下位集団の各々に存在するタンパク質の量が、前記プロファイル中のタンパク質の総質量の≧１０％である；
前記７つのタンパク質下位集団の３番目および４番目に塩基性が強いタンパク質下位集団の各々に存在するタンパク質の量が、前記７つのタンパク質下位集団の２番目に塩基性が強いタンパク質下位集団の量未満である；
前記７つのタンパク質下位集団の最も酸性のタンパク質下位集団に存在するタンパク質の量が、前記プロファイル中のタンパク質の総質量の≦３％である；
前記７つのタンパク質下位集団の２番目に酸性が強いタンパク質下位集団に存在するタンパク質の量が、前記プロファイル中のタンパク質の総質量の≦６％である；
前記７つのタンパク質下位集団の３番目に酸性が強いタンパク質下位集団に存在するタンパク質の量が、前記プロファイル中のタンパク質の総質量の≦９％である；
前記７つのタンパク質下位集団の最も塩基性のタンパク質下位集団に存在するタンパク質の量が、前記プロファイル中のタンパク質の総質量の≦８％である；ならびに
前記７つのタンパク質下位集団の最も酸性の、２番目に酸性が強い、３番目に酸性が強い、および最も塩基性のタンパク質下位集団以外、タンパク質の総質量の≦６％であるタンパク質の量を有する他のタンパク質下位集団が存在しない、
請求項５０または５１に記載の方法。
【請求項５３】
（ｂ）のインキュベートするステップが、前記より酸性のプロファイルを有する組換えタンパク質産物を生じる、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
（ａ）産生バイオリアクター中で、産物を産生するのに十分な条件下で、組換えタンパク質をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を、前記哺乳動物細胞の増殖期および／または静止期からなる第１の期間にわたって培養するステップ；
（ｂ）前記第１の期間の最後に、前記産物をアッセイして等電性プロファイルを決定するステップ；ならびに
（ｃ）前記産物の等電性プロファイルをより酸性のプロファイルに向けてシフトさせるのに十分な条件下で、前記哺乳動物細胞の衰退期の中の少なくとも６時間からなる第２の期間にわたって、前記産物をインキュベートするステップ、または
前記産物の等電性プロファイルをより塩基性のプロファイルに向けてシフトさせるのに十分な条件下で、前記哺乳動物細胞の衰退期の第２の期間にわたって、前記産物をインキュベートするステップ；ならびに任意選択で、
（ｄ）前記産物をアッセイして等電性プロファイルを決定し、前記等電性プロファイルがさらなるシフトを必要とする場合に、ステップ（ｃ）を反復するステップ
を含む方法によって産生される組換えタンパク質産物。
【請求項５５】
（ａ）産生バイオリアクター中で、産物を産生するのに十分な条件下で、組換えタンパク質をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を、前記哺乳動物細胞の増殖期を含み、かつ臨界時点において終結する第１の期間にわたって培養するステップ；
（ｂ）前記産物の等電性プロファイルをより酸性のプロファイルに向けてシフトさせるのに十分な条件下で、前記哺乳動物細胞の衰退期の中の少なくとも６時間からなる第２の期間にわたって、前記産物をインキュベートするステップ；ならびに任意選択で
（ｃ）前記産物をアッセイして等電性プロファイルを決定し、前記等電性プロファイルが、より酸性のプロファイルに向かうさらなるシフトを必要とする場合に、ステップ（ｂ）を反復するステップ
を含む方法によって産生される組換えタンパク質産物。
【請求項５６】
（ａ）産生バイオリアクター中で、産物を産生するのに十分な条件下で、組換えタンパク質をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を、前記哺乳動物細胞の増殖期を含み、かつ臨界時点において終結する第１の期間にわたって培養するステップ；
（ｂ）前記産物の等電性プロファイルをより塩基性のプロファイルに向けてシフトさせるのに十分な条件下で、前記哺乳動物細胞の衰退期の第２の期間にわたって、前記産物をインキュベートするステップ；ならびに任意選択で
（ｃ）前記産物をアッセイして等電性プロファイルを決定し、前記等電性プロファイルが、より塩基性のプロファイルに向かうさらなるシフトを必要とする場合に、ステップ（ｂ）を反復するステップ
を含む方法によって産生される組換えタンパク質産物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２０１４年１０月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／０６４，３９７号（この開示は、その全体が参考として本明細書に援用される）に対する優先権および利益を主張する。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提供された、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１５年９月２５日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、ＡＸＪ−１９６ＰＣ＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、サイズは６，３２１バイトである。
【０００３】
本発明は、細胞培養および組換えタンパク質の製造の方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
組換えタンパク質をコードする核酸を含有する哺乳動物細胞は、治療的または商業的に重要なタンパク質を産生するためにしばしば使用される。得られた組換えタンパク質産物は、各々がその独自のセットの生物物理学的特性を有する、種々のタンパク質分子を含有する。例えば、哺乳動物細胞培養物によって産生された組換えタンパク質産物は、１つまたは複数のタンパク質下位集団を有し得、各々の下位集団は、その独自の等電点を有する。タンパク質下位集団の等電点は、タンパク質の正味の電荷、溶解度、フォールディング、基質結合親和性、生物学的活性、およびヒト身体におけるクリアランス速度のうち１つまたは複数をもたらし得る。タンパク質に対する等電点の影響を考慮して、組換えタンパク質産物の等電性プロファイル（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｐｒｏｆｉｌｅ）内で下位集団をシフトまたは再分布させることが望まれ得る。例えば、参照または出発等電性プロファイルと比較して、組換えタンパク質産物中の、特定の等電点を有するタンパク質下位集団（複数可）のうち１つまたは複数のレベル（または量）を増加または減少させることが望まれ得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、組換えタンパク質産物を特定の条件下でさらなる期間にわたってインキュベートすることで、組換えタンパク質産物の等電性プロファイルのシフトが生じるという発見に、少なくとも一部基づく。このさらなる期間は、哺乳動物細胞培養物の衰退期（ｄｅｃｌｉｎｅ  ｐｈａｓｅ）の間のさらなる期間など、哺乳動物細胞培養物が臨界時点（ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｔｉｍｅ  ｐｏｉｎｔ）に達した後に生じるものとして測定され得る。したがって、本明細書は、組換えタンパク質産物の等電性プロファイルをシフトさせる方法を含む。組換えタンパク質産物を製造する方法、および組換えタンパク質産物の等電性プロファイルをシフトさせるこれらの方法の使用を含む、薬物物質を製造する方法もまた、提供される。
【０００６】
組換えタンパク質産物の等電性プロファイルをシフトさせる方法であって、（ａ）産生バイオリアクター中で、産物を産生するのに十分な条件下で、組換えタンパク質をコードする核酸を含有する哺乳動物細胞を、哺乳動物細胞の増殖期および／または静止期からなる第１の期間にわたって培養するステップ；（ｂ）第１の期間の最後に、産物の等電性プロファイルをアッセイするステップ；ならびに（ｃ）産物の等電性プロファイルをより酸性のプロファイルに向けてシフトさせるのに十分な条件下で、哺乳動物細胞の衰退期の中の少なくとも６時間からなる第２の期間にわたって、この産物をインキュベートするステップ、または産物の等電性プロファイルをより塩基性のプロファイルに向けてシフトさせるのに十分な条件下で、哺乳動物細胞の衰退期の第２の期間にわたって、この産物をインキュベートするステップ；ならびに任意選択で、（ｄ）この産物をアッセイして等電性プロファイルを決定し、この等電性プロファイルがさらなるシフトを必要とする場合に、ステップ（ｃ）を反復するステップを含む方法が本明細書で提供される。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｃ）でインキュベートされた産物は、培養物中の組換えタンパク質および哺乳動物細胞の混合物を含む。
【０００７】
組換えタンパク質産物の等電性プロファイルをシフトさせる方法であって、（ａ）産生バイオリアクター中で、産物を産生するのに十分な条件下で、組換えタンパク質をコードする核酸を含有する哺乳動物細胞を、哺乳動物細胞の増殖期を含み、かつ臨界時点において終結する第１の期間にわたって培養するステップ；（ｂ）産物の等電性プロファイルをより酸性のプロファイルに向けてシフトさせるのに十分な条件下で、哺乳動物細胞の衰退期の中の少なくとも６時間からなる第２の期間にわたって、この産物をインキュベートするステップ；ならびに任意選択で（ｃ）この産物をアッセイして等電性プロファイルを決定し、この等電性プロファイルが、より酸性のプロファイルに向かうさらなるシフトを必要とする場合に、ステップ（ｂ）を反復するステップを含む方法も提供される。
【０００８】
組換えタンパク質産物の等電性プロファイルをシフトさせる方法であって、（ａ）産生バイオリアクター中で、産物を産生するのに十分な条件下で、組換えタンパク質をコードする核酸を含有する哺乳動物細胞を、哺乳動物細胞の増殖期を含み、かつ臨界時点において終結する第１の期間にわたって培養するステップ；（ｂ）産物の等電性プロファイルをより塩基性のプロファイルに向けてシフトさせるのに十分な条件下で、哺乳動物細胞の衰退期の第２の期間にわたって、この産物をインキュベートするステップ；ならびに任意選択で（ｃ）この産物をアッセイして等電性プロファイルを決定し、この等電性プロファイルが、より塩基性のプロファイルに向かうさらなるシフトを必要とする場合に、ステップ（ｂ）を反復するステップを含む方法も提供される。
【０００９】
本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ａ）は、哺乳動物細胞を流加培養することを含み得る。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、この第１の期間は、約５日間から約１２日間の間である。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、この第２の期間は、約６時間から約１２０時間の間である。
【００１０】
本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｂ）でインキュベートされた産物は、培養物中の組換えタンパク質および哺乳動物細胞の混合物を含む。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、この産物は、産生バイオリアクター中でインキュベートされる。本明細書に記載される方法のいずれかにおける一部の実施形態では、この産物は、貯蔵容器中でインキュベートされる。
【００１１】
本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態は、ステップ（ｂ）とステップ（ｃ）の間に、培養物を清澄化するステップをさらに含み、ステップ（ｃ）でインキュベートされた産物は、清澄化された組織培養培地中の組換えタンパク質を含む。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、この方法は、ステップ（ａ）とステップ（ｂ）の間に、培養物を清澄化するステップをさらに含み、ステップ（ｂ）でインキュベートされた産物は、清澄化された組織培養培地中の組換えタンパク質を含む。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、この産物は、貯蔵容器中でインキュベートされる。
【００１２】
本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態は、ステップ（ｂ）とステップ（ｃ）の間に、組換えタンパク質を精製するステップをさらに含み、ステップ（ｃ）でインキュベートされた産物は、希釈剤中の精製された組換えタンパク質を含む。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態は、ステップ（ａ）とステップ（ｂ）の間に、組換えタンパク質を精製するステップをさらに含み、ステップ（ｂ）でインキュベートされた産物は、希釈剤中の精製された組換えタンパク質を含む。
【００１３】
本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ａ）は、塩基性のプロファイルを有する産物を産生する少なくとも１つの条件下で、哺乳動物細胞を流加培養することを含み得、ステップ（ｃ）は、この産物をより酸性のプロファイルにシフトさせる。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ａ）は、塩基性のプロファイルを有する産物を産生する少なくとも１つの条件下で、哺乳動物細胞を流加培養することを含み得、ステップ（ｂ）は、この産物をより酸性のプロファイルにシフトさせる。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、この条件は、Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄウシ血清を含む培養培地中で培養することを含む。
【００１４】
本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ａ）は、酸性のプロファイルを有する産物を産生する少なくとも１つの条件下で、哺乳動物細胞を流加培養することを含み得、ステップ（ｃ）は、この産物をより塩基性のプロファイルにシフトさせる。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ａ）は、酸性のプロファイルを有する産物を産生する少なくとも１つの条件下で、哺乳動物細胞を流加培養することを含み得、ステップ（ｂ）は、この産物をより塩基性のプロファイルにシフトさせる。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、産物の等電性プロファイルをより酸性のプロファイルに向けてシフトさせるのに十分な条件は、約２０％〜約４５％の間（例えば、約２５％から約４０％の間または約３０％から約３５％の間）の溶存酸素（ｄＯ２）濃度中でインキュベートすることを含む。
【００１５】
本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、産物の等電性プロファイルをより酸性のプロファイルに向けてシフトさせるのに十分な条件は、約７．０から約７．３の間（例えば、約７．０から約７．２５の間、約７．０から約７．２０の間、または約７．０から約７．１５の間）のｐＨを有する培地中でインキュベートすることを含む。
【００１６】
本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、産物の等電性プロファイルをより酸性のプロファイルに向けてシフトさせるのに十分な条件は、約３０℃から約３７．５℃の間（例えば、約３３℃から約３７．５℃の間）の温度でインキュベートすることを含む。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、産物の等電性プロファイルをより酸性のプロファイルにシフトさせるのに十分な条件は、約２００ＲＰＭから約４００ＲＰＭの間（例えば、約２２０ＲＰＭから約３５０ＲＰＭの間または約２２０ＲＰＭから約３００ＲＰＭの間）の撹拌速度でインキュベートすることを含む。
【００１７】
本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｂ）および／またはステップ（ｄ）は、等電点電気泳動を含み得る。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、ステップ（ｃ）は、等電点電気泳動を含み得る。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、この等電点電気泳動は、キャピラリー電気泳動またはゲル電気泳動である。
【００１８】
本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、この組換えタンパク質は、免疫グロブリン、酵素、タンパク質または操作されたタンパク質である。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、この組換えタンパク質は、抗体（例えば、ヒト抗体またはヒト化抗体）である。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、この抗体は、ヒト補体タンパク質Ｃ５に特異的に結合する（例えば、エクリズマブ）。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、エクリズマブは、配列番号１を含む重鎖および配列番号２を含む軽鎖を含む。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、エクリズマブは、配列番号１からなる重鎖および配列番号２からなる軽鎖を含む。
【００１９】
本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態は、（ｅ）この産物を医薬組成物に製剤化するステップをさらに含む。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態は、（ｄ）この産物を医薬組成物に製剤化するステップをさらに含む。
【００２０】
本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、この組換えタンパク質産物の等電性プロファイルは、約５．２から約６．７の間の等電点を有する７つのタンパク質下位集団を含む。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、産物の等電性プロファイルをより酸性のプロファイルに向けてシフトさせるのに十分な条件下で産物をインキュベートするステップは、これら７つのタンパク質下位集団の、より酸性のタンパク質下位集団のうち少なくとも２つの量の増加、およびより塩基性のタンパク質下位集団のうち少なくとも２つの量の減少を生じる。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、より酸性のタンパク質下位集団のうちのこれら少なくとも２つは、約５．２から約６．７の間の等電点を有する７つのタンパク質下位集団の、４番目および５番目に酸性が強いタンパク質下位集団であり得る。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、より塩基性の下位集団のうちのこれら少なくとも２つは、約５．２から約６．７の間の等電点を有する７つのタンパク質下位集団の、１番目および２番目に塩基性が強いタンパク質下位集団であり得る。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、これら７つのタンパク質下位集団は、約５．４５から約６．５５の間の等電点を有する。
【００２１】
約５．４５から約６．５５の間の等電点を有する７つのタンパク質下位集団を有する組換えタンパク質産物の等電性プロファイルをシフトさせる方法であって、（ａ）産生バイオリアクター中で、産物を産生するのに十分な条件下で、組換えタンパク質をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を、哺乳動物細胞の増殖期または増殖期および静止期からなる第１の期間にわたって流加培養するステップ；（ｂ）産物の等電性プロファイルをより酸性のプロファイルに向けてシフトさせるのに十分な条件下で、哺乳動物細胞の衰退期の中の少なくとも６時間からなる第２の期間にわたって、この産物をインキュベートするステップであって、このより酸性のプロファイルは、これら７つのタンパク質下位集団の、４番目および５番目に酸性が強いタンパク質下位集団の量の増加、ならびにこれら７つのタンパク質下位集団の、１番目および２番目に塩基性が強いタンパク質下位集団の量の減少を含む、ステップ；ならびに任意選択で（ｃ）この産物をアッセイして等電性プロファイルを決定し、この等電性プロファイルが、より酸性のプロファイルに向かうさらなるシフトを必要とする場合に、ステップ（ｂ）を反復するステップを含む方法も本明細書で提供される。
【００２２】
約５．４５から約６．５の間の等電点を有する７つのタンパク質下位集団を有する組換えタンパク質産物の等電性プロファイルをシフトさせる方法であって、（ａ）産生バイオリアクター中で、産物を産生するのに十分な条件下で、組換えタンパク質をコードする核酸を含有する哺乳動物細胞を、哺乳動物細胞の増殖期を含み、かつ臨界時点において終結する第１の期間にわたって流加培養するステップ；（ｂ）産物の等電性プロファイルをより酸性のプロファイルに向けてシフトさせるのに十分な条件下で、哺乳動物細胞の衰退期の中の少なくとも６時間からなる第２の期間にわたって、この産物をインキュベートするステップであって、このより酸性のプロファイルは、これら７つのタンパク質下位集団の、４番目および５番目に酸性が強いタンパク質下位集団の量の増加、ならびにこれら７つのタンパク質下位集団の、１番目および２番目に塩基性が強いタンパク質下位集団の量の減少を含む、ステップ；ならびに任意選択で（ｃ）この産物をアッセイして等電性プロファイルを決定し、この等電性プロファイルが、より酸性のプロファイルに向かうさらなるシフトを必要とする場合に、ステップ（ｂ）を反復するステップを含む方法も提供される。
【００２３】
本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、このより酸性のプロファイルは、等電性プロファイルであり、これら７つのタンパク質下位集団の２番目、３番目および４番目に塩基性が強いタンパク質下位集団の各々に存在するタンパク質の量は、プロファイル中のタンパク質の総質量の≧１０％である；これら７つのタンパク質下位集団の３番目および４番目に塩基性が強いタンパク質下位集団の各々に存在するタンパク質の量は、これら７つのタンパク質下位集団の２番目に塩基性が強いタンパク質下位集団の量未満である；これら７つのタンパク質下位集団の最も酸性のタンパク質下位集団に存在するタンパク質の量は、プロファイル中のタンパク質の総質量の≦３％である；これら７つのタンパク質下位集団の２番目に酸性が強いタンパク質下位集団に存在するタンパク質の量は、プロファイル中のタンパク質の総質量の≦６％である；これら７つのタンパク質下位集団の３番目に酸性が強いタンパク質下位集団に存在するタンパク質の量は、プロファイル中のタンパク質の総質量の≦９％である；これら７つのタンパク質下位集団の最も塩基性のタンパク質下位集団に存在するタンパク質の量は、プロファイル中のタンパク質の総質量の≦８％である；ならびにこれら７つのタンパク質下位集団の最も酸性の、２番目に酸性が強い、３番目に酸性が強い、および最も塩基性のタンパク質下位集団以外、タンパク質の総質量の≦６％であるタンパク質の量を有する他のタンパク質下位集団は存在しない。本明細書に記載される方法のいずれかの一部の実施形態では、（ｂ）のインキュベートするステップは、より酸性のプロファイルを有する組換えタンパク質産物を生じ得る。
【００２４】
（ａ）産生バイオリアクター中で、産物を産生するのに十分な条件下で、組換えタンパク質をコードする核酸を含有する哺乳動物細胞を、哺乳動物細胞の増殖期および／または静止期からなる第１の期間にわたって培養するステップ；（ｂ）第１の期間の最後に、この産物をアッセイして等電性プロファイルを決定するステップ；ならびに（ｃ）産物の等電性プロファイルをより酸性のプロファイルに向けてシフトさせるのに十分な条件下で、哺乳動物細胞の衰退期の中の少なくとも６時間からなる第２の期間にわたって、この産物をインキュベートするステップ、または産物の等電性プロファイルをより塩基性のプロファイルに向けてシフトさせるのに十分な条件下で、哺乳動物細胞の衰退期の第２の期間にわたって、この産物をインキュベートするステップ；ならびに任意選択で、（ｄ）この産物をアッセイして等電性プロファイルを決定し、この等電性プロファイルがさらなるシフトを必要とする場合に、ステップ（ｃ）を反復するステップを含む方法によって産生される組換えタンパク質産物もまた提供される。
【００２５】
（ａ）産生バイオリアクター中で、産物を産生するのに十分な条件下で、組換えタンパク質をコードする核酸を含有する哺乳動物細胞を、哺乳動物細胞の増殖期を含み、かつ臨界時点において終結する第１の期間にわたって培養するステップ；（ｂ）産物の等電性プロファイルをより酸性のプロファイルに向けてシフトさせるのに十分な条件下で、哺乳動物細胞の衰退期の中の少なくとも６時間からなる第２の期間にわたって、この産物をインキュベートするステップ；ならびに任意選択で（ｃ）この産物をアッセイして等電性プロファイルを決定し、この等電性プロファイルが、より酸性のプロファイルに向かうさらなるシフトを必要とする場合に、ステップ（ｂ）を反復するステップを含む方法によって産生される組換えタンパク質産物もまた提供される。
【００２６】
（ａ）産生バイオリアクター中で、産物を産生するのに十分な条件下で、組換えタンパク質をコードする核酸を含有する哺乳動物細胞を、哺乳動物細胞の増殖期を含み、かつ臨界時点において終結する第１の期間にわたって培養するステップ；（ｂ）産物の等電性プロファイルをより塩基性のプロファイルに向けてシフトさせるのに十分な条件下で、哺乳動物細胞の衰退期の第２の期間にわたって、この産物をインキュベートするステップ；ならびに任意選択で（ｃ）この産物をアッセイして等電性プロファイルを決定し、この等電性プロファイルが、より塩基性のプロファイルに向かうさらなるシフトを必要とする場合に、ステップ（ｂ）を反復するステップを含む方法によって産生される組換えタンパク質産物もまた提供される。
【００２７】
本明細書で使用する場合、名詞の前の単語「１つの（ａ）」または「複数の」は、１つまたは複数のその特定の名詞を示す。例えば、語句「哺乳動物細胞」は、「１つまたは複数の哺乳動物細胞」を示す。
【００２８】
用語「等電性プロファイル」は、当技術分野で公知であり、溶液中のタンパク質産物の成分を、別個の等電点を有する下位集団へと分離するための等電点電気泳動法の使用を指す。溶液中のタンパク質は、いくらかの変動する量の化学的改変を有する分子の集団から構成される。一般に、等電点電気泳動法のために、ｐＨ勾配が確立され、タンパク質分子の集団を含むタンパク質の試料が導入される。試料集団中の個々のタンパク質分子は、それらの個々の等電点（ｐＩ）に対応する点まで移動することができる。タンパク質産物の等電性プロファイルは、当技術分野で公知の技術、例えば、等電点電気泳動、キャピラリー電気泳動またはゲル電気泳動を使用して決定され得る。一部の場合には、等電性プロファイルとは、あるｐＨ勾配内のタンパク質産物のタンパク質集団のメンバーの実質的に全ての集団分布を指す。他の場合には、等電性プロファイルとは、タンパク質産物のタンパク質集団のメンバーのサブセットまたはその下位集団のサブセットを指す。等電性プロファイルは、各々が異なるｐＩを有する、タンパク質産物の１、２、３、４、５もしくは６つまたはそれ超の下位集団（例えば、等電性タンパク質バンド）を含み得る。等電性プロファイル中の各バンドは、そのバンドが位置する勾配中の点におけるｐＨに対応するｐＩを有する分子の下位集団を示す。
【００２９】
用語「組換えタンパク質」は、当技術分野で公知であり、細胞培養系を使用して製造されたタンパク質を指す。これらの細胞は、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞または細菌細胞のいずれかに由来し得、ここで一般に、細胞培養物中の細胞は、目的の組換えタンパク質をコードする導入された核酸を含有する。組換えタンパク質をコードする核酸は、このタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結した異種プロモーターもまた含有し得る。
【００３０】
用語「組換えタンパク質産物」とは、細胞培養系を使用して製造された組換えタンパク質を含む組成物を指す。一部の場合には、この産物は、化学的改変および分解プロセスから生じる僅かに異なる生物物理学的特性を有し、別個の等電点を有する下位集団を生じる、組換えタンパク質の複数のメンバーを含み得る。組換えタンパク質産物は、例えば、清澄化された組織培養培地中の組換えタンパク質、希釈剤中の精製された組換えタンパク質、または培養物中の組換えタンパク質、液体培養培地および哺乳動物細胞の混合物であり得る。
【００３１】
用語「産生バイオリアクター」とは、本明細書で使用する場合、培養物中の哺乳動物細胞の増殖および培養物中の哺乳動物細胞による組換えタンパク質産物の産生に十分な条件下で、哺乳動物細胞培養物をインキュベートするために適切な容器を指す。産生バイオリアクターの非限定的な例は、本明細書に記載される。産生バイオリアクターのさらなる例は、当技術分野で公知である。
【００３２】
語句「産物を産生するのに十分な条件」とは、哺乳動物細胞培養物による組換えタンパク質の産生を可能にする、物理的パラメーター、例えば、温度、溶存酸素、培地組成、混合速度および細胞密度のセットを指す。産物を産生するのに十分な条件の非限定的な例は、当技術分野で公知である。産物を産生するのに十分な条件の一部の例は、本明細書に記載される。
【００３３】
用語「増殖期」とは、本明細書で使用する場合、生存細胞密度が時間をわたって増加する、哺乳動物細胞の培養中の期間を指す。これは、細胞培養物の静止期の間に時間をわたって観察される生存細胞密度における実質的な変化の欠如、または細胞培養物の衰退期の間に時間をわたって観察される生存細胞密度の減少とは、対照的である。
【００３４】
用語「静止期」は、細胞培養の分野において公知であり、生存細胞密度が実質的に同じままである、細胞培養における期間を指す。
【００３５】
語句「哺乳動物細胞の衰退期」とは、本明細書で使用する場合、生存細胞密度が減少し始める、細胞培養における期間を指す。
【００３６】
語句「産物をアッセイする」とは、本明細書で使用する場合、産物（例えば、組換えタンパク質産物）の１つまたは複数の物理的および／または機能的特性を決定するために分析方法を実施することを指す。物理的特性の非限定的な例には、分子量、タンパク質配列、等電性プロファイル、パーセント凝集、グリコシル化フィンガープリント、リン酸化、アシル化、断片化および変性が含まれる。決定され得る産物の機能的特性の非限定的な例には、酵素活性、結合特異性および結合親和性が含まれる。
【００３７】
語句「等電性プロファイルをシフトさせるのに十分な条件」とは、産物（例えば、組換えタンパク質産物）の等電性プロファイルを変化させる（例えば、酸性シフトまたは塩基性シフト）ために使用され得るパラメーター（例えば、時間、温度、ｐＨ、撹拌速度、ＣＯ２、温度、ｄＯ２および／または組織培養培地中に存在する試薬のうち１つまたは複数）のセットを指す。
【００３８】
語句「より酸性のプロファイルにシフトさせる」とは、本明細書で使用する場合、産物の等電性プロファイルを、それらの条件の適用なしの産物のプロファイルと比較して、より酸性のプロファイルにシフトさせるのに十分な条件を適用することを指す。
【００３９】
語句「より塩基性のプロファイルにシフトさせる」とは、本明細書で使用する場合、産物の等電性プロファイルを、それらの条件の適用なしの産物のプロファイルと比較して、より塩基性のプロファイルにシフトさせるのに十分な条件を適用することを指す。
【００４０】
用語「臨界時点」とは、本明細書で使用する場合、細胞培養物（例えば、流加培養物）が、生存度において有意に悪化し始めると認識される時点を指す。この点の後では、組換えタンパク質の品質特性は、ますます負に影響され得る。例えば、生存細胞密度が流加バイオリアクター中でピークに達した後、生存細胞密度は衰退し始める。臨界時点は、細胞増殖の衰退期における特定の生存細胞密度と関連付けられ得る。臨界時点は、生存細胞密度が衰退期において特定の生存細胞密度、例えば、１５×１０５細胞／ｍＬまで減少する時間に基づき得る。同様に、特定のプロセスについて、この臨界時点は、他の値、例えば、生存細胞密度が、衰退期における生存細胞密度、例えば、１０×１０５細胞／ｍＬ、１１×１０５細胞／ｍＬ、１２×１０５細胞／ｍＬ、１３×１０５細胞／ｍＬ、１４×１０５細胞／ｍＬ、１６×１０５細胞／ｍＬ、１７×１０５細胞／ｍＬ、１８×１０５細胞／ｍＬ、１９×１０５細胞／ｍＬ、２０×１０５細胞／ｍＬ、３０×１０５細胞／ｍＬ、４０×１０５細胞／ｍＬまたは５０×１０５細胞／ｍＬまで減少する時間において、設定され得る。
【００４１】
用語「貯蔵容器」とは、本明細書で使用する場合、組換えタンパク質産物の等電性プロファイルにおけるシフトを提供する物理的条件のセットの下で、組換えタンパク質産物（例えば、本明細書に記載される組換えタンパク質産物のいずれか）をインキュベートするために使用され得る、閉じた器（ｃｌｏｓｅｄ  ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）を指す。組換えタンパク質産物の等電性プロファイルにおけるシフトを提供する物理的条件の非限定的な例は、本明細書に記載される。
【００４２】
用語「培養物を清澄化する」とは、本明細書で使用する場合、哺乳動物細胞を実質的に含まない液体培養培地（即ち、清澄化された組織培養培地）を得るために、哺乳動物細胞培養物から哺乳動物細胞を除去または分離することを指す。培養物を清澄化する方法の非限定的な例は、本明細書に記載される。培養物を清澄化するためのさらなる方法は、当技術分野で公知である。
【００４３】
用語「清澄化された組織培養培地」とは、本明細書で使用する場合、哺乳動物細胞を実質的に含まないように処理された細胞培養物において使用される液体培養培地を指す。
【００４４】
用語「Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄウシ血清アルブミン」とは、本明細書で使用する場合、Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄで誕生し繁殖されたウシ（例えば、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）も他の公知のプリオン病も含まない集団において誕生し飼育されたウシ）由来の血清タンパク質を指す。当業者は、かかる血清アルブミンが市販されていることを理解する。
【００４５】
用語「哺乳動物細胞」とは、例えば、ヒト、ハムスター、マウス、ミドリザル、ラット、ブタ、ウシ、ハムスターまたはウサギを含む任意の哺乳動物由来のまたはかかる哺乳動物から誘導された、任意の細胞を指す。一部の実施形態では、この哺乳動物細胞は、不死化細胞、分化細胞または未分化細胞であり得る。
【００４６】
用語「実質的に含まない」とは、本明細書で使用する場合、特定の物質を、少なくとも９０％もしくは約９０％含まない、または約９５％、９６％、９７％、９８％含まない、または少なくとも９９％もしくは約９９％含まない、または約１００％含まない組成物（例えば、液体培養培地）を指す。
【００４７】
用語「培養」または「細胞培養」とは、本明細書で使用する場合、物理的条件の制御されたセットの下での、液体培養培地中での哺乳動物細胞の維持または増殖を指す。
【００４８】
用語「液体培養培地」または「培養培地」とは、哺乳動物細胞を培地中でｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させるのに十分な栄養素を含有する流体を指す。例えば、液体培養培地は、以下のうち１つまたは複数を含み得る：アミノ酸（例えば、２０種のアミノ酸）、プリン（例えば、ヒポキサンチン）、ピリミジン（例えば、チミジン）、コリン、イノシトール、チアミン、葉酸、ビオチン、カルシウム、ナイアシンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チミジン、シアノコバラミン、ピルベート、リポ酸、マグネシウム、グルコース、ナトリウム、カリウム、鉄、銅、亜鉛、セレンおよび他の必要な微量金属、ならびに炭酸水素ナトリウム。液体培養培地は、哺乳動物由来の血清または血清成分を含み得る。一部の場合には、液体培養培地は、哺乳動物由来の血清も別の抽出物も含有しない（化学的に規定された液体培養培地）。液体培養培地は、微量金属、哺乳動物成長ホルモンおよび／または哺乳動物増殖因子を含有し得る。液体培養培地の非限定的な例は、本明細書に記載されており、さらなる例は、当技術分野で公知であり、市販されている。
【００４９】
用語「動物由来成分を含まない液体培養培地」とは、動物由来の任意の成分（例えば、タンパク質または血清）を含有しない液体培養培地を指す。
【００５０】
用語「無血清液体培養培地」とは、動物血清を含有しない液体培養培地を指す。
【００５１】
用語「血清添加された液体培養培地」とは、動物血清を含む液体培養培地を指す。
【００５２】
用語「化学的に規定された液体培養培地」とは、化学的成分の実質的に全てが既知である液体培養培地を指す。例えば、化学的に規定された液体培養培地は、胎仔ウシ血清もウシ血清アルブミンもヒト血清アルブミンも含有しないが、それは、これらの調製物が、典型的には、アルブミンおよび脂質の複雑な混合物を含有するためである。
【００５３】
用語「無タンパク質液体培養培地」とは、いずれのタンパク質（例えば、いずれの検出可能なタンパク質）も含有しない液体培養培地を指す。
【００５４】
「回転撹拌」とは、当技術分野で周知の用語であり、例えば、バイオリアクター中の培養物における溶存Ｏ２濃度を増加させるための、例えば、時計回りまたは反時計回りの、概して円形の様式での、バイオリアクター（例えば、産生バイオリアクター）中での培養物の撹拌を指す。撹拌は、当技術分野で公知の任意の方法、例えば、円形または楕円形の動きで培養物を動かす装置、例えば、インペラを使用して、実施され得る。回転撹拌を実施するために使用され得る例示的なデバイスは、当技術分野で公知であり、市販されている。
【００５５】
用語「免疫グロブリン」とは、免疫グロブリンタンパク質（例えば、可変ドメイン配列、フレームワーク配列または定常ドメイン配列）の少なくとも１５アミノ酸（例えば、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０もしくは１００アミノ酸、または１００超のアミノ酸）のアミノ酸配列を含有するポリペプチドを指す。免疫グロブリンは、例えば、軽鎖免疫グロブリンの少なくとも１５アミノ酸、例えば、ＣＤＲＨ３などの重鎖免疫グロブリンの少なくとも１５アミノ酸を含み得る。免疫グロブリンは、単離された抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＡまたはＩｇＭ）であり得る。免疫グロブリンは、ＩｇＧのサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）であり得る。免疫グロブリンは、抗体断片、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片またはｓｃＦｖであり得る。免疫グロブリンはまた、二重特異性抗体もしくは三重特異性抗体、またはダイマー、トリマーもしくはマルチマー抗体、またはダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、ＤＶＤ−Ｉｇ、ＣＯＤＶ−Ｉｇ、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）もしくはＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）であり得る。免疫グロブリンはまた、少なくとも１つの免疫グロブリンドメインを含有する操作されたタンパク質（例えば、融合タンパク質）であり得る。免疫グロブリンの非限定的な例は、本明細書に記載されており、免疫グロブリンのさらなる例は、当技術分野で公知である。
【００５６】
用語「タンパク質断片」または「ポリペプチド断片」とは、少なくとも４アミノ酸長もしくは約４アミノ酸長、少なくとも５アミノ酸長もしくは約５アミノ酸長、少なくとも６アミノ酸長もしくは約６アミノ酸長、少なくとも７アミノ酸長もしくは約７アミノ酸長、少なくとも８アミノ酸長もしくは約８アミノ酸長、少なくとも９アミノ酸長もしくは約９アミノ酸長、少なくとも１０アミノ酸長もしくは約１０アミノ酸長、少なくとも１１アミノ酸長もしくは約１１アミノ酸長、少なくとも１２アミノ酸長もしくは約１２アミノ酸長、少なくとも１３アミノ酸長もしくは約１３アミノ酸長、少なくとも１４アミノ酸長もしくは約１４アミノ酸長、少なくとも１５アミノ酸長もしくは約１５アミノ酸長、少なくとも１６アミノ酸長もしくは約１６アミノ酸長、少なくとも１７アミノ酸長もしくは約１７アミノ酸長、少なくとも１８アミノ酸長もしくは約１８アミノ酸長、少なくとも１９アミノ酸長もしくは約１９アミノ酸長、または少なくとも２０アミノ酸長もしくは約２０アミノ酸長であるか、あるいは２０アミノ酸長を超えるポリペプチド配列の一部分を指す。
【００５７】
用語「操作されたタンパク質」とは、生物（例えば、哺乳動物）内に存在する内因性核酸によって天然にコードされないポリペプチドを指す。操作されたタンパク質の例には、操作された酵素の安定性および／または触媒活性における増加を生じる１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失、挿入または付加を有する改変された酵素、融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、二価抗体、三価抗体、４結合ドメイン抗体、ダイアボディ、ならびに少なくとも１つの組換え足場配列を含有する抗原結合タンパク質が含まれる。
【００５８】
用語「精製する」または「精製」とは、特定の文脈では、細胞培養培地または細胞培養溶解物中に存在する１つまたは複数の他の成分（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは他のタンパク質）から、組換えタンパク質を少なくとも部分的に単離することを意味する。精製の程度は、重量で少なくとも５％もしくは約５％、例えば、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または少なくとも９５％〜９９．９％もしくは約９５％〜９９．９％純粋であるなど、特定され得る。液体培養培地からまたは哺乳動物細胞溶解物からタンパク質を集めるための非限定的な方法は、本明細書に記載されており、その他は、当技術分野で公知である。
【００５９】
用語「分泌型タンパク質」または「分泌型組換えタンパク質」とは、哺乳動物細胞内で翻訳される場合、分泌シグナル配列を元々含んでいた組換えタンパク質を指す。シグナル配列は、通常、哺乳動物細胞において酵素的切断を介して除去され、タンパク質は、細胞外空間（例えば、液体培養培地）中に放出される。
【００６０】
語句「勾配灌流」とは、本明細書で使用する場合、漸増的期間にわたって初期細胞培養物から除去されるまたは初期細胞培養物に添加される培養培地の容積における漸増的変化（例えば、増加または減少）を指す。期間は、灌流培養（例えば、毎日の培養培地再フィード速度）を利用する培養方法において、第１の期間中に、約２４時間の期間、または約１分間から約２４時間の間の期間、または２４時間超の期間であり得る。各日に除去され置き換えられる培地の割合は、培養されている特定の細胞、初期播種密度、および特定の時間における細胞密度に依存して、変動し得る。
【００６１】
用語「流加細胞培養」または「流加培養」とは、細胞培養物からの第１の液体培養培地の実質的なまたは顕著な除去なしの、初期細胞培養物への第２の培養培地（例えば、液体または固体培養培地）の漸増的または連続的添加を意味する。一部の場合には、この第２の液体培養培地は、第１の液体培養培地と同じである。他の場合には、この第２の液体培養培地は、第１の液体培養培地の濃縮形態であり、および／または乾燥粉末として添加される。
【００６２】
「比産生率（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ  ｒａｔｅ）」または「ＳＰＲ」とは、本明細書で使用する場合、１日当たり哺乳動物細胞当たりの産生された組換えタンパク質の質量または酵素活性を指す。組換え抗体についてのＳＰＲは、通常、質量／細胞／日として測定される。組換え酵素についてのＳＰＲは、通常、単位／細胞／日または（単位／質量）／細胞／日として測定される。
【００６３】
「容積産生率（ｖｏｌｕｍｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ  ｒａｔｅ）」または「ＶＰＲ」とは、本明細書で使用する場合、１日当たり培養物の容積当たり（例えば、バイオリアクター、容器またはチューブ容積の１Ｌ当たり）の産生された組換えタンパク質の質量または酵素活性を指す。組換え抗体についてのＶＰＲは、通常、質量／Ｌ／日として測定される。組換え酵素についてのＶＰＲは、通常、単位／Ｌ／日または質量／Ｌ／日として測定される。
【００６４】
特記しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。方法および材料は、本発明における使用のために本明細書に記載されている；当技術分野で公知の他の適切な方法および材料もまた使用され得る。材料、方法および実施例は、例示にすぎず、限定として解釈されない。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリーおよび他の参考文献は、それらの全体が参照によって組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先する。
【００６５】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図面から、ならびに特許請求の範囲から、明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】図１は、５日目から１３日目までの、１０，０００Ｌバイオリアクターを使用して実施した第１の流加培養試行によって産生されたエクリズマブの等電性プロファイルにおける各バンドについてのバンド強度の百分率のグラフである。
【００６７】
【図２】図２は、５日目から１３日目までの、１０，０００Ｌバイオリアクターにおいて実施した第１の流加培養試行によって産生されたエクリズマブの等電性プロファイルにおける各バンドについてのバンド強度の百分率を示す別のグラフである。
【００６８】
【図３】図３は、５日目から１２日目までの、１０，０００Ｌバイオリアクターを使用して実施した第２の流加培養試行によって産生されたエクリズマブの等電性プロファイルにおける各バンドについてのバンド強度の百分率のグラフである。
【００６９】
【図４】図４は、５日目から１２日目までの、１０，０００Ｌバイオリアクターを使用して実施した第２の流加培養試行によって産生されたエクリズマブの等電性プロファイルにおける各バンドについてのバンド強度の百分率の別のグラフである。
【００７０】
【図５】図５は、２Ｌバイオリアクター、ならびにｐＨおよびｄＯ２の以下の組合せのうち１つを使用して実施した流加培養試行における、時間をわたっての生存細胞密度のグラフである：ｐＨ７．０および１５％のｄＯ２；ｐＨ７．３２および５０％のｄＯ２；ｐＨ７．３２および５％のｄＯ２；ｐＨ６．９５および５０％のｄＯ２；ならびにｐＨ６．９５および５％のｄＯ２。平均データ（ｎ＝２）が示される。
【００７１】
【図６】図６は、同じ培養物中の積分生存細胞濃度（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｖｉａｂｌｅ  ｃｅｌｌ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）と比較して、２Ｌ流加バイオリアクター培養物によって産生されたｍｇ／Ｌエクリズマブを比較するグラフである。異なる２Ｌ流加バイオリアクター培養試行を、２Ｌバイオリアクター、ならびにｐＨおよびｄＯ２の以下の組合せのうち１つを使用して実施した：ｐＨ７．０および１５％のｄＯ２；ｐＨ７．３２および５０％のｄＯ２；ｐＨ７．３２および５％のｄＯ２；ｐＨ６．９５および５０％のｄＯ２；ならびにｐＨ６．９５および５％のｄＯ２。平均データ（ｎ＝２）が示される。
【００７２】
【図７】図７は、培養の１０日目、１２日目、１４日目および１６日目における、２Ｌバイオリアクター、７．０のｐＨおよび１５％のｄＯ２を使用して実施した流加培養試行から回収されたエクリズマブの等電性プロファイルにおける各タンパク質バンドについてのバンド強度の百分率を示すグラフである。
【００７３】
【図８】図８は、培養の１０日目、１２日目、１４日目および１６日目における、２Ｌバイオリアクター、７．３２のｐＨおよび５％のｄＯ２を使用して実施した流加培養試行から回収されたエクリズマブの等電性プロファイルにおける各タンパク質バンドについてのバンド強度の百分率を示すグラフである。
【００７４】
【図９】図９は、培養の５日目、８日目、１０日目および１４日目における、２Ｌバイオリアクター、６．９５のｐＨおよび５０％のｄＯ２を使用して実施した流加培養試行から回収されたエクリズマブの等電性プロファイルにおける各タンパク質バンドについてのバンド強度の百分率を示すグラフである。
【００７５】
【図１０】図１０は、培養の１０日目、１２日目、１４日目および１６日目の、２Ｌバイオリアクター、７．３２のｐＨおよび５０％のｄＯ２を使用して実施した流加培養試行から回収されたエクリズマブの等電性プロファイルにおける各タンパク質バンドについてのバンド強度の百分率を示すグラフである。
【００７６】
【図１１】図１１は、それぞれ、各培養の１４日目の、２Ｌバイオリアクター、ならびにｐＨおよびｄＯ２の以下の組合せのうち１つを使用して実施した流加培養試行から回収されたエクリズマブの等電性プロファイルにおける各タンパク質バンドについてのバンド強度の百分率を示すグラフである：７．３２のｐＨおよび５％のｄＯ２、７．３２のｐＨおよび５０％のｄＯ２、７．０のｐＨおよび１５％のｄＯ２、ならびに６．９５のｐＨおよび５０％のｄＯ２。
【００７７】
【図１２】図１２は、２Ｌバイオリアクター、ならびに以下の細胞供給源および原材料組合せのうち１つを使用して実施した流加培養試行における、時間をわたっての生存細胞密度を示すグラフである：細胞供給源Ａおよび第１のセットの原材料（細胞培養試行１１）；細胞供給源Ｂおよび第１のセットの原材料（細胞培養試行１２）；細胞供給源Ａおよび第２のセットの原材料（細胞培養試行１４および１５）；ならびに細胞供給源Ｂおよび第２のセットの原材料（細胞培養試行１３、１６、１７および１８）。
【００７８】
【図１３】図１３は、２Ｌバイオリアクター、ならびに以下の細胞供給源および原材料組合せのうち１つを使用して実施した流加培養試行における、時間をわたっての百分率細胞生存度を示すグラフである：細胞供給源Ａおよび第１のセットの原材料（細胞培養試行１１）；細胞供給源Ｂおよび第１のセットの原材料（細胞培養試行１２）；細胞供給源Ａおよび第２のセットの原材料（細胞培養試行１４および１５）；ならびに細胞供給源Ｂおよび第２のセットの原材料（細胞培養試行１３、１６、１７および１８）。
【００７９】
【図１４】図１４は、２Ｌバイオリアクター、ならびに以下の細胞供給源および原材料組合せのうち１つを使用して実施した流加培養試行における、産生力（積分生存細胞濃度と比較した、ｍｇエクリズマブ／Ｌ）を示すグラフである：細胞供給源Ａおよび第１のセットの原材料（細胞培養試行１１）；細胞供給源Ｂおよび第１のセットの原材料（細胞培養試行１２）；細胞供給源Ａおよび第２のセットの原材料（細胞培養試行１４および１５）；ならびに細胞供給源Ｂおよび第２のセットの原材料（細胞培養試行１３、１６、１７および１８）。
【００８０】
【図１５】図１５は、培養の８日目、１１日目、１４日目、１５日目および１６日目の、２Ｌバイオリアクター、細胞供給源Ａおよび第１のセットの原材料を使用して実施した流加培養試行（細胞培養試行１１）から回収されたエクリズマブの等電性プロファイルにおける各タンパク質バンドについてのバンド強度の百分率を示すグラフである。
【００８１】
【図１６】図１６は、培養の８日目、１１日目、１４日目、１５日目および１６日目の、２Ｌバイオリアクター、細胞供給源Ｂおよび第１のセットの原材料を使用して実施した流加培養試行（細胞培養試行１２）から回収されたエクリズマブの等電性プロファイルにおける各タンパク質バンドについてのバンド強度の百分率を示すグラフである。
【００８２】
【図１７】図１７は、培養の１３日目、１４日目、１５日目および１６日目の、２Ｌバイオリアクター、細胞供給源Ｂおよび第２のセットの原材料を使用して実施した流加培養試行（細胞培養試行１３）から回収されたエクリズマブの等電性プロファイルにおける各タンパク質バンドについてのバンド強度の百分率を示すグラフである。
【００８３】
【図１８】図１８は、培養の１３日目、１４日目、１５日目および１６日目の、２Ｌバイオリアクター、細胞供給源Ａおよび第２のセットの原材料を使用して実施した流加培養試行（細胞培養試行１４）から回収されたエクリズマブの等電性プロファイルにおける各タンパク質バンドについてのバンド強度の百分率を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００８４】
組換えタンパク質産物の等電性プロファイルをシフトさせる方法が、本明細書で提供される。本明細書に記載される方法は、所望の等電性プロファイルを有する組換えタンパク質産物を達成できる。例えば、所望の等電性プロファイルを有する組換えタンパク質は、以下のうち１つまたは複数を有し得る：最適な正味の電荷（例えば、正味の表面電荷）、（同じｐＨにおける、異なる等電性プロファイルを有する同じ組換えタンパク質と比較して）減少したレベルの沈殿、所望の流体中での（同じ流体中の、同じ条件下での、異なる等電性プロファイルを有する同じ組換えタンパク質と比較して）増大した溶解度、増大した生物学的活性（例えば、同じ条件下で試験した、異なる等電性プロファイルを有する同じ組換えタンパク質と比較した、基質、標的もしくは抗原に対する結合、結合特異性または酵素活性）、（同じ条件下で試験した場合の、異なる等電性プロファイルを有する同じ組換えタンパク質中の、適切にフォールディングされたタンパク質のレベルと比較して）増加したレベルの、組換えタンパク質産物中の適切にフォールディングされたタンパク質、ならびにヒトの身体における（同じ条件下で試験した場合の、異なる等電性プロファイルを有する同じ組換えタンパク質のクリアランス速度と比較して）減少したクリアランス速度。組換えタンパク質産物の等電性プロファイルをシフトさせる方法の非限定的な態様は、以下に記載される。以下に記載される態様のいずれかは、任意の組合せで、または当技術分野で公知の任意の他の要素と共に、使用され得る。
【００８５】
等電性プロファイルおよび等電性プロファイルを決定する方法
等電性プロファイルとは、タンパク質産物のタンパク質集団の少なくとも１つの下位集団の酸性および／または塩基性の性質を指す。等電性プロファイルとは、タンパク質産物中の１つまたは複数の下位集団中のタンパク質の量もまた指し得る。一部の例では、等電性プロファイルとは、タンパク質産物（例えば、組換えタンパク質産物）の少なくとも２つのタンパク質下位集団の酸性および／または塩基性の性質を指し、ここで、これら少なくとも２つのタンパク質下位集団の各々は、タンパク質産物中の他のタンパク質下位集団と比較して、異なる等電点を有する。等電性プロファイルとは、組換えタンパク質産物において検出された全てのタンパク質下位集団の酸性および／もしくは塩基性の性質を指し得るか、または等電性プロファイルとは、組換えタンパク質産物について検出されたタンパク質下位集団のうち少なくとも２つのサブセットの酸性および／もしくは塩基性の性質を指し得る。例えば、等電性プロファイルとは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５のタンパク質下位集団の酸性および／もしくは塩基性の性質を指し得る。かかるタンパク質下位集団は、等電点電気泳動ゲル中のバンドとして言及される。
【００８６】
組換えタンパク質産物の等電性プロファイルは、約ｐＨ４．０とｐＨ７．３との間（例えば、約ｐＨ４．１と約ｐＨ７．３との間、約ｐＨ４．２と約ｐＨ７．３との間、約ｐＨ４．３と約ｐＨ７．３との間、約ｐＨ４．４と約ｐＨ７．３との間、約ｐＨ４．５と約ｐＨ７．３との間、約ｐＨ４．６と約ｐＨ７．３との間、約ｐＨ４．７と約ｐＨ７．３との間、約ｐＨ４．８と約ｐＨ７．３との間、約ｐＨ４．９と約ｐＨ７．３との間、約ｐＨ５．０と約ｐＨ７．３との間、約ｐＨ５．１と約ｐＨ７．３との間、約ｐＨ５．２と約ｐＨ７．３との間、約ｐＨ５．３と約ｐＨ７．３との間、約ｐＨ５．４と約ｐＨ７．３との間、約ｐＨ５．５と約ｐＨ７．３との間、約ｐＨ５．６と約ｐＨ７．３との間、約ｐＨ５．７と約ｐＨ７．３との間、約ｐＨ５．８と約ｐＨ７．３との間、約ｐＨ５．９と約ｐＨ７．３との間、約ｐＨ６．０と約ｐＨ７．３との間、約ｐＨ６．１と約ｐＨ７．３との間、約ｐＨ６．２と約ｐＨ７．３との間、約ｐＨ６．３と約ｐＨ７．３との間、約ｐＨ６．４と約ｐＨ７．３との間、約ｐＨ６．５と約ｐＨ７．３との間、約ｐＨ６．６と約ｐＨ７．３との間、約ｐＨ６．７と約ｐＨ７．３との間、約ｐＨ４．０と約ｐＨ７．０との間、約ｐＨ４．１と約ｐＨ７．０との間、約ｐＨ４．２と約ｐＨ７．０との間、約ｐＨ４．３と約ｐＨ７．０との間、約ｐＨ４．４と約ｐＨ７．０との間、約ｐＨ４．５と約ｐＨ７．０との間、約ｐＨ４．６と約ｐＨ７．０との間、約ｐＨ４．７と約ｐＨ７．０との間、約ｐＨ４．８と約ｐＨ７．０との間、約ｐＨ４．９と約ｐＨ７．０との間、約ｐＨ５．０と約ｐＨ７．０との間、約ｐＨ５．１と約ｐＨ７．０との間、約５．２と約ｐＨ７．０との間、約ｐＨ５．３と約ｐＨ７．０との間、約ｐＨ５．４と約ｐＨ７．０との間、約ｐＨ５．５と約ｐＨ７．０との間、約ｐＨ５．６と約ｐＨ７．０との間、約ｐＨ５．７と約ｐＨ７．０との間、約ｐＨ５．８と約ｐＨ７．０との間、約ｐＨ５．９と約ｐＨ７．０との間、約ｐＨ６．０と約ｐＨ７．０との間、約ｐＨ６．１と約ｐＨ７．０との間、約ｐＨ６．２と約ｐＨ７．０との間、約ｐＨ６．３と約ｐＨ７．０との間、約ｐＨ６．４と約ｐＨ７．０との間、約ｐＨ６．５と約ｐＨ７．０との間、約ｐＨ４．０と約ｐＨ６．８との間、約ｐＨ４．１と約ｐＨ６．８との間、約ｐＨ４．２と約ｐＨ６．８との間、約ｐＨ４．３と約ｐＨ６．８との間、約ｐＨ４．４と約ｐＨ６．８との間、約ｐＨ４．５と約ｐＨ６．８との間、約ｐＨ４．６と約ｐＨ６．８との間、約ｐＨ４．７と約ｐＨ６．８との間、約ｐＨ４．８と約ｐＨ６．８との間、約ｐＨ４．９と約ｐＨ６．８との間、約ｐＨ５．０と約ｐＨ６．８との間、約ｐＨ５．１と約ｐＨ６．８との間、約ｐＨ５．２と約ｐＨ６．８との間、約ｐＨ５．３と約ｐＨ６．８との間、約ｐＨ５．４と約ｐＨ６．８との間、約ｐＨ５．５と約ｐＨ６．８との間、約ｐＨ５．６と約ｐＨ６．８との間、約ｐＨ５．７と約ｐＨ６．８との間、約ｐＨ５．８と約ｐＨ６．８との間、約ｐＨ５．９と約ｐＨ６．８との間、約ｐＨ６．０と約ｐＨ６．８との間、約ｐＨ６．１と約ｐＨ６．８との間、約ｐＨ６．２と約ｐＨ６．８との間、約ｐＨ６．３とｐＨ６．８との間、約ｐＨ４．０と約ｐＨ６．６との間、約ｐＨ４．１と約ｐＨ６．６との間、約ｐＨ４．２と約ｐＨ６．６との間、約ｐＨ４．３と約ｐＨ６．６との間、約ｐＨ４．４と約ｐＨ６．６との間、約ｐＨ４．５と約ｐＨ６．６との間、約ｐＨ４．６と約ｐＨ６．６との間、約ｐＨ４．７と約ｐＨ６．６との間、約ｐＨ４．７と約ｐＨ６．６との間、約ｐＨ４．８と約ｐＨ６．６との間、約ｐＨ４．９と約ｐＨ６．６との間、約ｐＨ５．０と約ｐＨ６．６との間、約ｐＨ５．１と約ｐＨ６．６との間、約ｐＨ５．２と約ｐＨ６．６との間、約ｐＨ５．３と約ｐＨ６．６との間、約ｐＨ５．４と約ｐＨ６．６との間、約ｐＨ５．５と約ｐＨ６．６との間、約ｐＨ５．６と約ｐＨ６．６との間、約ｐＨ５．７と約ｐＨ６．６との間、約ｐＨ５．８と約ｐＨ６．６との間、約ｐＨ５．９と約ｐＨ６．６との間、約ｐＨ６．０と約ｐＨ６．６との間または約ｐＨ６．１と約ｐＨ６．６との間の等電点を有するタンパク質下位集団を含み得る。
【００８７】
組換えタンパク質産物の等電性プロファイルは、約ｐＨ６．０とｐＨ９．０との間、約ｐＨ６．２と約ｐＨ９．０との間、約ｐＨ６．４と約ｐＨ９．０との間、約ｐＨ６．６と約ｐＨ９．０との間、約ｐＨ６．８と約ｐＨ９．０との間、約ｐＨ７．０と約ｐＨ９．０との間、約ｐＨ７．２と約ｐＨ９．０との間、約ｐＨ７．４とｐＨ９．０との間、約ｐＨ７．６と約ｐＨ９．０との間、約ｐＨ７．８と約ｐＨ９．０との間、約ｐＨ８．０と約ｐＨ９．０との間、約ｐＨ８．２と約ｐＨ９．０との間、約ｐＨ８．４と約ｐＨ９．０との間、約ｐＨ６．０と約ｐＨ８．５との間、約ｐＨ６．２と約ｐＨ８．５との間、約ｐＨ６．４と約ｐＨ８．５との間、約ｐＨ６．６と約ｐＨ８．５との間、約ｐＨ６．８と約ｐＨ８．５との間、約ｐＨ７．０と約ｐＨ８．５との間、約ｐＨ７．２と約ｐＨ８．５との間、約ｐＨ７．４と約ｐＨ８．５との間、約ｐＨ７．６と約ｐＨ８．５との間、約ｐＨ７．８と約ｐＨ８．５との間、約ｐＨ８．０とｐＨ８．５との間、約ｐＨ６．０と約８．０との間、約ｐＨ６．２と約ｐＨ８．０との間、約ｐＨ６．４と約ｐＨ８．０との間、約ｐＨ６．６と約ｐＨ８．０との間、約ｐＨ６．８と約ｐＨ８．０との間、約ｐＨ７．０と約ｐＨ８．０との間、約ｐＨ７．２と約ｐＨ８．０との間、約ｐＨ７．４と約ｐＨ８．０との間、約ｐＨ６．０と約ｐＨ７．５との間、約ｐＨ６．２と約ｐＨ７．５との間、約ｐＨ６．４と約ｐＨ７．５との間、約ｐＨ６．６と約ｐＨ７．５との間、約ｐＨ６．８と約ｐＨ７．５との間または約ｐＨ７．０と約ｐＨ７．５との間の等電点を有するタンパク質下位集団を含み得る。
【００８８】
エクリズマブの等電性プロファイルの非限定的な例は、約５．２から約６．７の間の等電点を有する７つまたは８つのタンパク質下位集団を含有する。より具体的には、エクリズマブの等電性プロファイルは、等電点電気泳動によって決定される、約５．４５から約６．５５の間のｐＩを有する７つまたは８つのバンドを含有する。エクリズマブについての参照等電性プロファイルのさらなる一例は、実施例に記載されている。
【００８９】
組換えタンパク質産物の等電性プロファイルを決定するための方法は、当技術分野で公知である。例えば、等電点ゲル電気泳動（例えば、キャピラリー等電点ゲル電気泳動）およびチップは、当技術分野で公知である（例えば、Ｒｉｇｈｅｔｔｉら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ａｎａｌ．  ５４巻：３７９〜４０９頁、２０１１年；Ｆｒｉｅｄｍａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ４６３巻：５１５〜５４０頁、２００９年；Ｋｏｓｈｅｌら、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  １２巻：２９１８〜２９２６頁、２０１２年；Ｓｏｍｍｅｒら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ３０巻：７４２〜７５７頁、２００９年；Ｓｈｉｍｕｒａら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ３０巻：１１〜２８頁、２００９年に記載される方法を参照のこと）。組換えタンパク質の等電性プロファイルを決定するためのさらなる方法は、当技術分野で公知である。組換えタンパク質産物の等電性プロファイルを決定するためのアッセイには、等電点ゲル電気泳動（例えば、キャピラリー等電点ゲル電気泳動）の実施が含まれ得る。本明細書に記載される方法のいずれかは、１つまたは複数の時点（例えば、第１の期間の最後、第２の期間の最後、または第２の期間中の１つもしくは複数の時点）において、組換えタンパク質産物の等電性プロファイルを決定する１つまたは複数のステップを含み得る。一部の実施形態では、この組換えタンパク質産物は、等電性プロファイルの分析の前に精製される。この組換えタンパク質は、組織培養培地または清澄化された組織培養培地から精製され得る。一部の例では、この組換えタンパク質産物は、ある期間にわたって、約１５℃、約１０℃、約４℃、０℃、−２０℃、−７０℃または−８０℃の温度で貯蔵される。この貯蔵時間は、通常、組換えタンパク質産物の等電性プロファイルを決定するためのアッセイを実施する前の、２４時間未満、４８時間未満、３日間未満、４日間未満または１週間未満である。
【００９０】
本明細書に記載される方法のいずれかにおける参照等電性プロファイルは、産物の等電性プロファイルを、より酸性のプロファイルもしくはより塩基性のプロファイル、または１つもしくは複数の有益な生物物理学的特性を有する組換えタンパク質産物の等電性プロファイルに向けてシフトさせるのに十分な条件下でインキュベートする前の等電性プロファイルであり得る。有益な生物物理学的特性には、増大した溶解度、増大した酵素活性または結合活性、増大したｉｎ  ｖｉｖｏ半減期、および減少したｉｎ  ｖｉｖｏクリアランスが含まれ得る。エクリズマブについての参照等電性プロファイルの非限定的な一例は、本明細書に記載される。
【００９１】
哺乳動物細胞の培養
本明細書に記載される方法は、産生バイオリアクター中で、産物を産生するのに十分な条件下で、組換えタンパク質をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を、第１の期間にわたって培養するステップを含む。例えば、この第１の期間は、増殖期および静止期を含む、増殖期および静止期からなる、または増殖期および静止期から本質的になる。この第１の期間は、通常、増殖期および静止期を含む。一部の実施形態では、この第１の期間は、増殖の衰退期の一部分を含む。一部の実施形態では、これらの哺乳動物細胞は、産物を産生し、哺乳動物細胞の分裂を促進するのに十分な条件下で、第１の期間にわたって培養される。本明細書に記載される方法において使用され得る哺乳動物細胞を培養する態様の非限定的な例は、以下に記載される。
【００９２】
流加培養
本明細書に記載される方法における培養するステップは、流加培養を含み得る。当技術分野で公知のように、流加培養は、細胞培養物からの第１の液体培養培地の実質的なまたは顕著な除去なしの、初期細胞培養物への第２の培養培地の漸増的または連続的添加を含む。一部の場合には、この第２の培養培地は、第１の液体培養培地と同じである。この第２の培養培地は、液体形態または乾燥粉末のいずれかであり得る。他の場合には、この第２の培養培地は、第１の液体培養培地の濃縮形態であり、および／または乾燥粉末として添加される。
【００９３】
この第２の培養培地は、第１の期間中のある特定の時点または複数の時点において、初期細胞培養物に添加され得る。例えば、この第２の培養培地は、第１の期間の開始後、６時間と７日間との間、約６時間と約６日間との間、約６時間と約５日間との間、約６時間と約４日間との間、約６時間と約３日間との間、約６時間と約２日間との間、約６時間と約１日間との間、約１２時間と約７日間との間、約１２時間と約６日間との間、約１２時間と約５日間との間、約１２時間と約４日間との間、約１２時間と約３日間との間、約１２時間と約２日間との間、約１日間と約７日間との間、約１日間と約６日間との間、約１日間と約５日間との間、約１日間と約４日間との間、約１日間と約３日間との間、約１日間と約２日間との間、約２日間と約７日間との間、約２日間と約６日間との間、約２日間と約５日間との間、約２日間と約４日間との間、約２日間と約３日間との間、約３日間と約７日間との間、約３日間と約６日間との間、約３日間と約５日間との間、約３日間と約４日間との間、約４日間と約７日間との間、約４日間と約６日間との間、約４日間と約５日間との間、約５日間と約７日間との間または約５日間と約６日間との間である時点において、初期細胞培養物に添加され得る。
【００９４】
この第２の培養培地は、初期細胞培養物に連続的に添加され得るか、または第１の期間中に、この初期細胞培養物に周期的に（例えば、毎日）添加され得る。第２の培養培地が初期細胞培養物に周期的に添加される一部の例では、この第２の培養培地は、１回、２回、３回、４回、５回または６回、添加され得る。初期細胞培養物に添加される第２の液体培養培地の容積または第２の固体培養培地の量は、第１の期間中に変化（例えば、増加）し得る。第１の期間中の任意の２４時間の期間にわたって初期細胞培養物に添加される第２の液体培養培地の容積は、バイオリアクターの初期容積の一部の割合であり得る。第１の期間中の任意の２４時間の期間にわたって初期細胞培養物に添加される第２の液体培養培地の容積は、バイオリアクターの０．０１×容積から約０．３×容積の間であり得る。この割合は、バイオリアクターの約０．０１×容積と約０．２８×容積との間、約０．０１×容積と約０．２６×容積との間、約０．０１×容積と約０．２４×容積との間、約０．０１×容積と約０．２２×容積との間、約０．０１×容積と約０．２０×容積との間、約０．０１×容積と約０．１８×容積との間、約０．０１×容積と約０．１６×容積との間、約０．０１×容積と約０．１４×容積との間、約０．０１×容積と約０．１２×容積との間、約０．０１×容積と約０．１０×容積との間、約０．０１×容積と約０．０８×容積との間、約０．０１×容積と約０．０６×容積との間、約０．０１×容積と約０．０４×容積との間、約０．０２５×容積と約０．３×容積との間、約０．０２５×容積と約０．２８×容積との間、約０．０２５×容積と約０．２６×容積との間、約０．０２５×容積と約０．２４×容積との間、約０．０２５×容積と約０．２２×容積との間、約０．０２５×容積と約０．２０×容積との間、約０．０２５×容積と約０．１８×容積との間、約０．０２５×容積と約０．１６×容積との間、約０．０２５×容積と約０．１４×容積との間、約０．０２５×容積と約０．１２×容積との間、約０．０２５×容積と約０．１０×容積との間、約０．０２５×容積と約０．０８×容積との間、約０．０２５×容積と約０．０６×容積との間、約０．０２５×容積と約０．０４×容積との間、約０．０５×容積と約０．３×容積との間、約０．０５×容積と約０．２８×容積との間、約０．０５×容積と約０．２６×容積との間、約０．０５×容積と約０．２４×容積との間、約０．０５×容積と約０．２２×容積との間、約０．０５×容積と約０．２０×容積との間、約０．０５×容積と約０．１８×容積との間、約０．０５×容積と約０．１６×容積との間、約０．０５×容積と約０．１４×容積との間、約０．０５×容積と約０．１２×容積との間、約０．０５×容積と約０．１０×容積との間、約０．１×容積と約０．３×容積との間、約０．１×容積と約０．２８×容積との間、約０．１×容積と約０．２６×容積との間、約０．１×容積と約０．２４×容積との間、約０．１×容積と約０．２２×容積との間、約０．１×容積と約０．２０×容積との間、約０．１×容積と約０．１８×容積との間、約０．１×容積と約０．１６×容積との間、約０．１×容積と約０．１４×容積との間、約０．１×容積との間、約０．１５×容積と約０．３×容積との間、約０．１５×容積と約０．２×容積との間、約０．２×容積と約０．３×容積との間または約０．２５×容積と約０．３×容積との間であり得る。
【００９５】
他の実施形態では、第１の期間中の任意の２４時間の期間にわたって初期細胞培養物に添加される第２の液体培養培地の容積は、第１の期間の開始において、初期細胞培養物の０．０２×容積と約１．０×容積との間、約０．０２×容積と約０．９×容積との間、約０．０２×容積と約０．８×容積との間、約０．０２×容積と約０．７×容積との間、約０．０２×容積と約０．６×容積との間、約０．０２×容積と約０．５×容積との間、約０．０２×容積と約０．４×容積との間、約０．０２×容積と約０．３×容積との間、約０．０２×容積と約０．２×容積との間、約０．０２×容積と約０．１×容積との間、約０．０５×容積と約１．０×容積との間、約０．０５×容積と約０．８×容積との間、約０．０５×容積と約０．７×容積との間、約０．０５×容積と約０．６×容積との間、約０．０５×容積と約０．５×容積との間、約０．０５×容積と約０．４×容積との間、約０．０５×容積と約０．３×容積との間、約０．０５×容積と約０．２×容積との間、約０．０５×容積と約０．１×容積との間、約０．１×容積と約１．０×容積との間、約０．１×容積と約０．９×容積との間、約０．１×容積と約０．８×容積との間、約０．１×容積と約０．７×容積との間、約０．１×容積と約０．６×容積との間、約０．１×容積と約０．５×容積との間、約０．１×容積と約０．４×容積との間、約０．１×容積と約０．３×容積との間、約０．１×容積と約０．２×容積との間、約０．２×容積と約１．０×容積との間、約０．２×容積と約０．９×容積との間、約０．２×容積と約０．８×容積との間、約０．２×容積と約０．７×容積との間、約０．２×容積と約０．６×容積との間、約０．２×容積と約０．５×容積ｏｒとの間、約０．２×容積と約０．４×容積との間であり得る。
【００９６】
流加培養が本発明の方法において使用される場合、この第１の期間は、約４日間と約１２日間との間、約４日間と約１１日間との間、約４日間と約１０日間との間、約４日間と約９日間との間、約４日間と約８日間との間、約４日間と約７日間との間、約４日間と約６日間との間、約４日間と約５日間との間、約５日間と約１２日間との間、約５日間と約１１日間との間、約５日間と約１０日間との間、約５日間と約９日間との間、約５日間と約８日間との間、約５日間と約７日間との間、約６日間と約１２日間との間、約６日間と約１１日間との間、約６日間と約１０日間との間、約６日間と約９日間との間、約６日間と約８日間との間、約７日間と約１２日間との間、約７日間と約１１日間との間、約７日間と約１０日間との間、約７日間と約９日間との間、約８日間と約１２日間との間、約８日間と約１１日間との間、約８日間と約１０日間との間、約９日間と約１２日間との間、約９日間と約１１日間との間または約１０日間と約１２日間との間であり得る。
【００９７】
灌流培養
本明細書に記載される方法における培養するステップは、灌流培養であり得る。当技術分野で公知のように、灌流培養は、第１の容積の第１の液体培養培地を産生バイオリアクターから除去すること、および第２の容積の第２の液体培養培地を産生バイオリアクターに添加することを含み、この第１の容積および第２の容積は、ほぼ等しい。哺乳動物細胞は、ある種の細胞保持デバイスによって、または沈降コーンにおける細胞沈降などの技術を介して、バイオリアクター中に保持される。灌流培養における培地の除去および添加は、同時にもしくは逐次的に、またはこれら２つのある種の組合せで、実施され得る。さらに、除去および添加は、産生バイオリアクターの０．１％から８００％の間、１％と７００％との間、１％と６００％との間、１％と５００％との間、１％と４００％との間、１％と３５０％との間、１％と３００％との間、１％と２５０％との間、１％と１００％との間、１００％と２００％との間、５％と１５０％との間、１０％と５０％との間、１５％と４０％との間、８％と８０％との間または４％と３０％との間の容積を除去および置き換える速度などで、連続的に実施され得る。
【００９８】
除去される第１の容積の第１の液体培養培地および添加される第２の容積の第２の液体培養培地は、一部の例では、各２４時間の期間にわたってほぼ同じに保持され得る。当技術分野で公知のように、第１の容積の第１の液体培養培地が除去される速度（容積／時間の単位）および第２の容積の第２の液体培養培地が添加される速度（容積／時間の単位）は、特定の細胞培養系の状態によって変動し得、それらに依存し得る。第１の容積の第１の液体培養培地が除去される速度（容積／時間の単位）および第２の容積の第２の液体培養培地が添加される速度（容積／時間の単位）は、ほぼ同じであり得る、または異なり得る。
【００９９】
あるいは、除去および添加される容積は、各２４時間の期間にわたって徐々に増加することによって変化し得る。例えば、各２４時間の期間内に除去される第１の液体培養培地の容積および添加される第２の液体培養培地の容積は、培養期間にわたって増加され得る。この容積は、産生バイオリアクター容積の０．５％〜約２０％の間である容積から、第１の期間にわたって増加され得る。この容積は、産生バイオリアクター容積の約２５％〜約１５０％まで、または第１の液体培養培地容積まで、第１の期間にわたって増加され得る。
【０１００】
本明細書に記載される方法の一部の例では、第１の期間の最初の４８〜９６時間の後、（第１の期間内の）各２４時間の期間中に、除去される第１の容積の第１の液体培養培地および添加される第２の容積の第２の液体培養培地は、第１の液体培養培地の容積の約１０％から約９５％、約１０％から約２０％、約２０％から約３０％、約３０％から約４０％、約４０％から約５０％、約５０％から約６０％、約６０％から約７０％、約７０％から約８０％、約８０％から約９０％、約８５％から約９５％、約６０％から約８０％または約７０％である。
【０１０１】
当業者は、第１の液体培養培地および第２の液体培養培地が、同じ型の培地であり得ることを理解する。他の場合には、この第１の液体培養培地および第２の液体培養培地は、異なり得る。この第２の液体培養培地は、１つまたは複数の培地成分に関してより濃縮され得る。
【０１０２】
第１の容積の第１の液体培養培地は、任意の自動化システムを使用することによって除去され得る。例えば、交互接線流濾過が使用され得る。あるいは、第１の容積の第１の液体培養培地は、哺乳動物細胞を排除する分子量カットオフを有する滅菌メンブレンを通じて第１の容積の第１の液体培養培地を浸出させることまたはその重力流によって、除去され得る。あるいは、第１の容積の第１の液体培養培地は、少なくとも１分間、少なくとも２分間、３分間、４分間、５分間、１０分間、１５分間、２０分間、２５分間、３０分間、４０分間、５０分間または１時間の期間にわたって、撹拌を停止させることまたは撹拌速度を顕著に減少させること、および第１の容積の第１の液体培養培地を、産生バイオリアクターの上部から取り出しまたは吸引することによって、除去され得る。
【０１０３】
第２の容積の第２の液体培養培地は、ポンプによって、第１の液体培養培地に添加され得る。この第２の液体培養培地は、手動で、例えば、第２の容積の第２の液体培養培地を第１の液体培養培地上に直接ピペッティングもしくは注入することによって、または自動化様式で、第１の液体培養培地に添加され得る。
【０１０４】
第１の期間
本明細書に記載される方法では、組換えタンパク質をコードする核酸を含む哺乳動物細胞は、産生バイオリアクター中で、産物を産生するのに十分な条件下で、第１の期間にわたって培養される。一部の実施形態では、この第１の期間は、哺乳動物細胞の増殖期からなる、または哺乳動物細胞の増殖期および静止期からなる。一部の実施形態では、この第１の期間は、培養されている哺乳動物細胞の増殖期、静止期、および衰退期の一部分からなる。他の例では、この第１の期間は、哺乳動物細胞の増殖期を含み、かつ臨界時点において終結する。臨界時点の非限定的な例は、当技術分野で公知である。例えば、臨界時点は、細胞培養物が生存度において有意に悪化し始め、組換えタンパク質の臨界品質特性（ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｑｕａｌｉｔｙ  ａｔｔｒｉｂｕｔｅ）における悪化を引き起こし得る時点である。別の一例では、臨界時点は、培養培地または細胞培養物中の組換えタンパク質産物が、分解産物の増大した形成、増大した変性、望ましくないグリコフォームの増大した形成、凝集物の増大した形成、および／または生物学的活性の喪失など、特定の品質特性において顕著に悪化し始めている時間であり得る。細胞培養物についての臨界時点を検出および決定するための方法は、産生されているタンパク質、およびタンパク質産物の意図した使用に依存する。例えば、タンパク質分解産物、変性組換えタンパク質、組換えタンパク質凝集物および組換えタンパク質生物学的活性を検出するための方法は、当技術分野で周知である。
【０１０５】
非限定的な例では、この臨界時点は、第１の期間の開始後、約５日間〜約１２日間の間、約５日間〜約１１日間の間、約５日間〜約１０日間の間、約５日間〜約９日間の間、約５日間〜約８日間の間、約５日間〜約７日間の間、約６日間〜約１２日間の間、約６日間〜約１１日間の間、約６日間〜約１０日間の間、約６日間〜約９日間の間、約６日間〜約８日間の間、約７日間〜約１２日間の間、約７日間〜約１１日間の間、約７日間〜約１０日間の間、約７日間〜約９日間の間、約８日間〜約１２日間の間、約８日間〜約１１日間の間、約８日間〜約１０日間の間、約９日間〜約１２日間の間、約９日間〜約１１日間の間または約８日間〜約１０日間の間である。臨界時点のさらなる例は、実施例に記載されている。
【０１０６】
哺乳動物細胞
本明細書に記載される方法において培養される哺乳動物細胞は、種々の異なる哺乳動物細胞であり得る。一部の例では、この哺乳動物細胞は、接着細胞であり、細胞培養物は、マイクロキャリアを含む。一部の例では、この哺乳動物細胞は、懸濁物中で増殖する細胞であり得る。本明細書に記載される方法を使用して培養され得る哺乳動物細胞の非限定的な例には、以下が含まれる：チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えば、ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞）、Ｓｐ２／０骨髄腫細胞、他の骨髄腫細胞、例えばＮＳ／０細胞、Ｂ細胞、ハイブリドーマ細胞、Ｔ細胞、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞（例えば、ＨＥＫ  ２９３ＥおよびＨＥＫ  ２９３Ｆ）、アフリカミドリザル腎臓上皮細胞（Ｖｅｒｏ）細胞およびメイディン・ダービー・イヌ（コッカースパニエル）腎臓上皮細胞（ＭＤＣＫ）細胞。本明細書に記載される方法を使用して培養され得るさらなる哺乳動物細胞は、当技術分野で公知である。本明細書に記載される方法のいずれかの非限定的な例では、第１の期間のスタート時に産生バイオリアクター中に存在する哺乳動物細胞の細胞密度は、約０．１×１０６細胞／ｍＬ〜約０．５×１０６細胞／ｍＬ、約０．２×１０６細胞／ｍＬ〜約０．４×１０６細胞／ｍＬまたは約０．２５×１０６細胞／ｍＬ〜約０．５×１０６細胞／ｍＬである。
【０１０７】
本明細書に記載される方法において使用される哺乳動物細胞は、哺乳動物細胞のゲノム中に安定に組み込まれた、組換えタンパク質をコードする組換え核酸を含有することができる。一部の実施形態では、組換えタンパク質は、哺乳動物細胞によって組織培養培地中に分泌される。一部の場合には、培養された哺乳動物細胞は、シード培養物由来である。より具体的には、初期細胞培養物は、シードトレインプロセスの結果、または別の産生バイオリアクター由来の培養物である。
【０１０８】
培養培地
培養するステップにおいて使用され得る液体培養培地は、当技術分野で公知である。この液体培養培地には、哺乳動物血清または哺乳動物血清成分、例えば、成長ホルモンまたは増殖因子（例えば、インスリン、トランスフェリンまたは上皮増殖因子）が補充され得る。この哺乳動物血清または血清成分は、胎仔ウシ血清であり得、Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄウシ血清に排他的に由来し得る。あるいは、この液体培養培地は、化学的に規定された液体培養培地、動物由来成分を含まない液体培養培地、無血清液体培養培地または血清含有液体培養培地であり得る。化学的に規定された液体培養培地、動物由来成分を含まない液体培養培地、無血清液体培養培地および血清含有液体培養培地の非限定的な例は、市販されている。
【０１０９】
液体培養培地は、典型的には、グルコースなどの炭水化物由来のエネルギー源、アミノ酸（例えば、２０種のアミノ酸＋システインの基本的セット）、ビタミン、遊離脂肪酸、微量元素、および低濃度で要求される他の有機化合物を含有する。液体培養培地には、塩および緩衝液（例えば、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩）、ヌクレオシドおよび塩基（例えば、アデノシン、チミジンおよびヒポキサンチン）、タンパク質および組織加水分解物、ならびに／またはこれらもしくは他の添加剤の任意の組合せが補充することができる。
【０１１０】
本明細書に記載される方法において有用であり得る液体培養培地の非限定的な例には、例えば、ＣＤ  ＣＨＯ、Ｏｐｔｉ  ＣＨＯおよびＦｏｒｔｉ  ＣＨＯ（全てＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹから入手可能）、Ｈｙｃｅｌｌ  ＣＨＯ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．；Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、Ｅｘ−ｃｅｌｌ  ＣＤ  ＣＨＯ  Ｆｕｓｉｏｎ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）ならびにＰｏｗｅｒＣＨＯ培地（Ｌｏｎｚａ  Ｇｒｏｕｐ，Ｌｔｄ．；Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）が含まれる。本発明の方法においてこれもまた有用であり得る培地成分には、化学的に規定された（ＣＤ）加水分解物、例えば、ＣＤペプトン、ＣＤポリペプチド（２つまたはそれ超のアミノ酸）およびＣＤ増殖因子が含まれるがこれらに限定されない。液体組織培養培地および培地成分のさらなる例は、当技術分野で公知である。
【０１１１】
哺乳動物細胞の培養において使用される培養培地は、約６．５と約７．５との間、約６．５と約７．４との間、約６．５と約７．３との間、約６．５と約７．２との間、約６．５と約７．１との間、約６．５と約７．０との間、約６．５と約６．９との間、約６．５と約６．８との間、約６．５と約６．７との間、約６．６と約７．５との間、約６．６と約７．４との間、約６．６と約７．３との間、約６．６と約７．２との間、約６．６と約７．１との間、約６．６と約７．０との間、約６．６と約６．９との間、約６．６と約６．８との間、約６．７と約７．５との間、約６．７と約７．４との間、約６．７と約７．３との間、約６．７と約７．２との間、約６．７と約７．１との間、約６．７と約７．０との間、約６．７と約６．９との間、約６．８と約７．５との間、約６．８と約７．４との間、約６．８と約７．３との間、約６．８と約７．２との間、約６．８と約７．１との間、約６．８と約７．０との間、約６．９と約７．５との間、約６．９と約７．４との間、約６．９と約７．３との間、約６．９と約７．２との間、約６．９と約７．１との間、約７．０と約７．５との間、約７．０と約７．４との間、約７．０と約７．３との間、約７．０と約７．２との間、約７．１と約７．５との間、約７．１と約７．４との間、約７．１と約７．３との間、約７．２と約７．５との間、約７．２と約７．４との間または約７．３と約７．５との間のｐＨを有し得る。
【０１１２】
当業者は、培養において使用される液体培養培地が、同じであり得るか、または細胞培養条件に依存して第１の期間中に変化し得ることを理解する。
【０１１３】
一部の実施形態では、流加培養物に添加される培養培地は、固体組成物であり得る。流加培養物に添加され得る固体培養培地の例は、当技術分野で公知である。
【０１１４】
撹拌
哺乳動物細胞の培養は、通常、培養物の混合のための、いくつかの形態の撹拌を含む。例えば、培養において使用される撹拌は、インペラを使用した回転撹拌であり得る。撹拌は、約２００ＲＰＭ〜約５００ＲＰＭ、約２００ＲＰＭと４８０ＲＰＭとの間、約２００ＲＰＭと約４６０ＲＰＭとの間、約２００ＲＰＭと約４４０ＲＰＭとの間、約２００ＲＰＭと約４２０ＲＰＭとの間、約２００ＲＰＭと約４００ＲＰＭとの間、約２００ＲＰＭと約３８０ＲＰＭとの間、約２００ＲＰＭと約３６０ＲＰＭとの間、約２００ＲＰＭと約３４０ＲＰＭとの間、約２００ＲＰＭと約３２０ＲＰＭとの間、約２００ＲＰＭと約３００ＲＰＭとの間、約２００ＲＰＭと約２８０ＲＰＭとの間、約２００ＲＰＭと約２６０ＲＰＭとの間、約２００ＲＰＭと約２４０ＲＰＭとの間、約２００ＲＰＭと約２２０ＲＰＭとの間、約２４０ＲＰＭと約５００ＲＰＭとの間、約２４０ＲＰＭと約４８０ＲＰＭとの間、約２４０ＲＰＭと約４６０ＲＰＭとの間、約２４０ＲＰＭと約４４０ＲＰＭとの間、約２４０ＲＰＭと約４２０ＲＰＭとの間、約２４０ＲＰＭと約４００ＲＰＭとの間、約２４０ＲＰＭと約３８０ＲＰＭとの間、約２４０ＲＰＭと約３６０ＲＰＭとの間、約２４０ＲＰＭと約３４０ＲＰＭとの間、約２４０ＲＰＭと約３２０ＲＰＭとの間、約２４０ＲＰＭと約３００ＲＰＭとの間、約２４０ＲＰＭと約２８０ＲＰＭとの間、約２４０ＲＰＭと約２６０ＲＰＭとの間、約２６０ＲＰＭと約５００ＲＰＭとの間、約２６０ＲＰＭと約４８０ＲＰＭとの間、約２６０ＲＰＭと約４６０ＲＰＭとの間、約２６０ＲＰＭと約４４０ＲＰＭとの間、約２６０ＲＰＭと約４２０ＲＰＭとの間、約２６０ＲＰＭと約４００ＲＰＭとの間、約２６０ＲＰＭと約３８０ＲＰＭとの間、約２６０ＲＰＭと約３６０ＲＰＭとの間、約２６０ＲＰＭと約３４０ＲＰＭとの間、約２６０ＲＰＭと約３２０ＲＰＭとの間、約２６０ＲＰＭと約３００ＲＰＭとの間、約２６０ＲＰＭと約２８０ＲＰＭとの間、約２８０ＲＰＭと約５００ＲＰＭとの間、約２８０ＲＰＭと約４８０ＲＰＭとの間、約２８０ＲＰＭと約４６０ＲＰＭとの間、約２８０ＲＰＭと約４４０ＲＰＭとの間、約２８０ＲＰＭと約４２０ＲＰＭとの間、約２８０ＲＰＭと約４００ＲＰＭとの間、約２８０ＲＰＭと約３８０ＲＰＭとの間、約２８０ＲＰＭと約３６０ＲＰＭとの間、約２８０ＲＰＭと約３４０ＲＰＭとの間、約２８０ＲＰＭと約３２０ＲＰＭとの間、約２８０ＲＰＭと約２８０ＲＰＭとの間、約３００ＲＰＭと約５００ＲＰＭとの間、約３８０ＲＰＭと約４８０ＲＰＭとの間、約３８０ＲＰＭと約４６０ＲＰＭとの間、約３８０ＲＰＭと約４４０ＲＰＭとの間、約３８０ＲＰＭと約４２０ＲＰＭとの間、約３８０ＲＰＭと約４００ＲＰＭとの間、約４００ＲＰＭと約５００ＲＰＭとの間、約４００ＲＰＭと約４８０ＲＰＭとの間、約４００ＲＰＭと約４６０ＲＰＭとの間、約４００ＲＰＭと約４４０ＲＰＭとの間または約４００ＲＰＭと約４２０ＲＰＭとの間の回転数で行われ得る。撹拌は、連続的にまたは周期的に実施され得る。
【０１１５】
温度
本明細書に記載される培養するステップは、３２℃〜約３９℃、約３２℃〜約３７℃、約３２℃から約３７．５℃の間、約３４℃から約３７℃の間、または約３５℃から約３７℃の間の温度で実施され得る。例えば、哺乳動物細胞は、第１の期間の開始から最後まで、約３７℃の温度でインキュベートされ得る。当業者は、この温度が、第１の期間中に、例えば、１時間毎に、または毎日、僅かに変化され得るまたは変動し得ることを理解する。例えば、この温度は、第１の期間のスタートの約１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、７日後、８日後、９日後、１０日後、１１日後、１２日後、１４日後もしくは１５日後に、または第１の期間内の任意の時点において、変化またはシフト（例えば、上昇または低下）され得る。例えば、この温度は、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５または１０．０℃、上方にシフトされ得る。別の一例では、この温度は、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５または１０℃、下方にシフトされ得る。
【０１１６】
ＣＯ２
培養するステップは、約１％〜１５％ＣＯ２、多くて、１４％ＣＯ２、１２％ＣＯ２、１０％ＣＯ２、８％ＣＯ２、６％ＣＯ２、５％ＣＯ２、４％ＣＯ２、３％ＣＯ２、２％ＣＯ２もしくは約１４％ＣＯ２、１２％ＣＯ２、１０％ＣＯ２、８％ＣＯ２、６％ＣＯ２、５％ＣＯ２、４％ＣＯ２、３％ＣＯ２、２％ＣＯ２、または多くて、１％ＣＯ２もしくは約１％ＣＯ２を含有する雰囲気を使用して実施することができる。産生バイオリアクター中にＣＯ２をスパージするための方法は、当技術分野で周知である。
【０１１７】
本明細書に記載される方法のいずれかは、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８５％、８０％、８５％、９０％もしくは約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８５％、８０％、８５％、９０％、または少なくとも９５％もしくは約９５％の湿度、または約１００％の湿度を含む加湿雰囲気中で、第１の期間中に細胞を培養するステップもまた含み得る。
【０１１８】
ｄＯ２
培養するステップは、約３％と約５５％との間、約３％と約５０％との間、約３％と約４５％との間、約３％と約４０％との間、約３％と約３５％との間、約３％と約３０％との間、約３％と約２５％との間、約３％と約２０％との間、約３％と約１５％との間、約５％と約５５％との間、約５％と約５０％との間、約５％と約４５％との間、約５％と約４０％との間、約５％と約３５％との間、約５％と約３０％との間、約５％と約２５％との間、約５％と約２０％との間、約５％と約１５％との間、約５％と約１０％との間、約１０％と約５５％との間、約１０％と約５０％との間、約１０％と約４５％との間、約１０％と約４０％との間、約１０％と約３５％との間、約１０％と約３０％との間、約１０％と約２５％との間、約１０％と約２０％との間、約１５％と約５５％との間、約１５％と約５０％との間、約１５％と約４５％との間、約１５％と約４０％との間、約１５％と約３５％との間、約１５％と約３０％との間、約１５％と約２５％との間、約１５％と約２０％との間、約２０％と約５５％との間、約２０％と約５０％との間、約２０％と約４５％との間、約２０％と約４０％との間、約２０％と約３５％との間、約２０％と約３０％との間、約２０％と約２５％との間、約２５％と約５５％との間、約２５％と約５０％との間、約２５％と約４５％との間、約２５％と約４０％との間、約２５％と約３５％との間、約２５％と約３０％との間、約３０％と約５５％との間、約３０％と約５０％との間、約３０％と約４５％との間、約３０％と約４０％との間、約３０％と約３５％との間、約３５％と約５５％との間、約３５％と約５０％との間、約３５％と約４５％との間、約３５％と約４０％との間、約４０％と約５５％との間、約４０％と約５０％との間、約４０％と約４５％との間、約４５％と約５５％との間、約４５％と約５０％との間または約５０％と約５５％との間の溶存酸素（ｄＯ２）を細胞培養物中で維持することによって実施され得る。
【０１１９】
組換えタンパク質
本明細書に記載される方法のいずれかにおける組換えタンパク質の非限定的な例は、軽鎖および重鎖免疫グロブリンを含む免疫グロブリン、ヒト補体タンパク質Ｃ５に特異的に結合するヒト化抗体を含む抗体、例えばエクリズマブ、または抗体断片、酵素、例えば、α−ガラクトシダーゼ、Ｍｙｏｚｙｍｅ、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ、非抗体タンパク質、例えば、ヒトエリスロポエチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターフェロンアルファもしくはベータ、またはワクチンにおける使用のための免疫原性もしくは抗原性タンパク質もしくはタンパク質断片である。一部の実施形態では、この組換えタンパク質は、少なくとも１つの多機能性組換えタンパク質足場を含有する操作されたタンパク質である。例えば、Ｇｅｂａｕｅｒら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  １３巻：２４５〜２５５頁、２００９年；および米国特許出願公開第２０１２／０１６４０６６号に記載される組換え抗原結合タンパク質を参照のこと。抗体である組換えタンパク質の非限定的な例には、以下が含まれる：パニツムマブ、オマリズマブ、アバゴボマブ（ａｂａｇｏｖｏｍａｂ）、アブシキシマブ、アクトクスマブ（ａｃｔｏｘｕｍａｂ）、アダリムマブ、アデカツムマブ（ａｄｅｃａｔｕｍｕｍａｂ）、アフェリモマブ、アフツズマブ、アラシズマブ、アラシズマブ、アレムツズマブ、アリロクマブ、アルツモマブ（ａｌｔｕｍｏｍａｂ）、アマツキシマブ、アナツモマブ（ａｎａｔｕｍｏｍａｂ）、アポリズマブ、アチヌマブ（ａｔｉｎｕｍａｂ）、トシリズマブ、バシリキシマブ（ｂａｓｉｌｉｚｉｍａｂ）、ベクツモマブ（ｂｅｃｔｕｍｏｍａｂ）、ベリムマブ、ベバシズマブ、ビシロマブ（ｂｉｃｉｒｏｍａｂ）、カナキヌマブ、セツキシマブ、ダクリズマブ、デノスマブ（ｄｅｎｓｕｍａｂ）、エクリズマブ、エドレコロマブ、エファリズマブ、エフングマブ（ｅｆｕｎｇｕｍａｂ）、エルツマキソマブ（ｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂ）、エタラシズマブ（ｅｔａｒａｃｉｚｕｍａｂ）、ゴリムマブ、インフリキシマブ、ナタリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、トシリズマブおよびトラスツズマブ。本明細書に記載される方法によって産生され得る治療抗体のさらなる例は、当技術分野で公知である。
【０１２０】
エクリズマブは、配列番号１を含むまたは配列番号１からなる重鎖、および配列番号２を含むまたは配列番号２からなる軽鎖を含み得る。エクリズマブの重鎖および軽鎖をコードする核酸は、当技術分野で公知である（例えば、米国特許第６，３５５，２４５号中の核酸配列およびＡｎら、ｍＡｂｓ  １巻：６号、５７２〜５７９頁、２００９年中のＦｃ領域配列を参照のこと）。
【０１２１】
タンパク質産物の等電性プロファイルをシフトさせる方法
本明細書で提供される方法は、産物の等電性プロファイルをより酸性のプロファイルに向けてシフトさせるのに十分な条件下で、第２の期間にわたって、この産物をインキュベートするステップ、または産物の等電性プロファイルをより塩基性のプロファイルに向けてシフトさせるのに十分な条件下で、第２の期間にわたって、この産物をインキュベートするステップもまた含む。このインキュベートするステップの非限定的な態様は、本明細書に記載される。
【０１２２】
インキュベートされた組換えタンパク質産物
第２の期間中にインキュベートされた組換えタンパク質産物は、培養物中の組換えタンパク質および哺乳動物細胞の混合物であり得る。一部の実施形態では、これらの方法は、いくつかの形態の濾過を介して、培養物を清澄化するステップをさらに含む。第２の期間中にインキュベートされた組換えタンパク質産物は、清澄化された組織培養培地中の組換えタンパク質でもあり得る。一部の実施形態では、これらの方法は、第２の期間にわたるインキュベーションの前に組換えタンパク質を精製するステップをさらに含み、第２の期間中にインキュベートされた組換えタンパク質産物は、希釈剤中の精製されたタンパク質産物である。この希釈剤は、緩衝液、例えばリン酸緩衝食塩水であり得る。
【０１２３】
インキュベーションに使用される容器
本明細書に記載される例のいずれかでは、この組換えタンパク質産物は、産生バイオリアクター（例えば、本明細書に記載される例示的な産生バイオリアクターのいずれか）中または貯蔵容器中でインキュベートされ得る。貯蔵容器は、組換えタンパク質産物の等電性プロファイルをシフトさせる（例えば、酸性シフトまたは塩基性シフト）のに十分な条件下で、組換えタンパク質産物をインキュベートするために備えられ得る。例えば、この貯蔵容器は、（本明細書に記載される任意の形態の）組換えタンパク質産物のｄＯ２レベル、温度、ｐＨおよびＣＯ２レベルのうち１つまたは複数を調節するために備えられ得る。この貯蔵容器は、例えば、組換えタンパク質産物の撹拌を調節するためにも備えられ得る。この貯蔵容器は、例えば、約２０Ｌと約５０００Ｌとの間、約２０Ｌと約４０００Ｌとの間、約２０Ｌと約２０００Ｌとの間、約２０Ｌと約１０００Ｌとの間、約２０Ｌと約８００Ｌとの間、約２０Ｌと約６００Ｌとの間、約２０Ｌと約４００Ｌとの間、約２０Ｌと約２００Ｌとの間、約２０Ｌと約１００Ｌとの間、約５０Ｌと約５０００Ｌとの間、約５０Ｌと約４０００Ｌとの間、約５０Ｌと約２０００Ｌとの間、約５０Ｌと約１０００Ｌとの間、約５０Ｌと約８００Ｌとの間、約５０Ｌと約６００Ｌとの間、約５０Ｌと約４００Ｌとの間、約５０Ｌと約２００Ｌとの間、約５０Ｌと約１００Ｌとの間、約１００Ｌと約５０００Ｌとの間、約１００Ｌと約４０００Ｌとの間、約１００Ｌと約２０００Ｌとの間、約１００Ｌと約１０００Ｌとの間、約１００Ｌと約８００Ｌとの間、約１００Ｌと約６００Ｌとの間、約１００Ｌと約４００Ｌとの間、約１００Ｌと約２００Ｌとの間、約２００Ｌと約５０００Ｌとの間、約２００Ｌと約４０００Ｌとの間、約２００Ｌと約２０００Ｌとの間、約２００Ｌと約１０００Ｌとの間、約２００Ｌと約８００Ｌとの間、約２００Ｌと約６００Ｌとの間、約２００Ｌと約４００Ｌとの間、約５００Ｌと約５０００Ｌとの間、約５００Ｌと約４０００Ｌとの間、約５００Ｌと約２０００Ｌとの間、約５００Ｌと約１０００Ｌとの間、約５００Ｌと約８００Ｌとの間、約１０００Ｌと約５０００Ｌとの間、約１０００Ｌと約４０００Ｌとの間または約１０００Ｌと約２０００Ｌとの間の容積を有し得る。
【０１２４】
第２の期間
本明細書に記載される例のいずれかでは、第２の期間は、培養の臨界期間（ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｔｉｍｅ  ｐｅｒｉｏｄ）後、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも７時間、少なくとも８時間、少なくとも９時間、少なくとも１０時間、少なくとも１１時間、少なくとも１２時間、少なくとも１３時間、少なくとも１４時間、少なくとも１５時間、少なくとも１６時間、少なくとも１７時間、少なくとも１８時間、少なくとも１９時間、少なくとも２０時間、少なくとも２１時間、少なくとも２２時間、少なくとも２３時間、少なくとも２４時間、少なくとも２５時間、少なくとも２６時間、少なくとも２７時間、少なくとも２８時間、少なくとも２９時間、少なくとも３０時間、少なくとも３１時間、少なくとも３２時間、少なくとも３３時間、少なくとも３４時間、少なくとも３５時間、少なくとも３６時間、少なくとも３７時間、少なくとも３８時間、少なくとも３９時間、少なくとも４０時間、少なくとも４１時間、少なくとも４２時間、少なくとも４３時間、少なくとも４４時間、少なくとも４５時間、少なくとも４６時間、少なくとも４７時間、少なくとも４８時間、少なくとも４９時間、少なくとも５０時間、少なくとも５５時間、少なくとも６０時間、少なくとも６５時間、少なくとも７０時間、少なくとも７５時間、少なくとも８０時間、少なくとも８５時間、少なくとも９０時間、少なくとも９５時間、少なくとも１００時間、少なくとも１０５時間、少なくとも１１０時間、少なくとも１１５時間、少なくとも１２０時間、少なくとも１２５時間、少なくとも１３０時間、少なくとも１３５時間、少なくとも１４０時間、少なくとも１４５時間、少なくとも１５０時間、少なくとも１５５時間、少なくとも１６０時間、少なくとも１６５時間、少なくとも１７０時間、少なくとも１７５時間、少なくとも１８０時間、少なくとも１８５時間、少なくとも１９０時間、少なくとも１９５時間または少なくとも２００時間であり得る。
【０１２５】
本明細書に記載される、タンパク質産物をより塩基性の等電性プロファイルにシフトさせるための方法では、この第２の期間は、少なくとも２時間（例えば、培養の衰退期に入って少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも７時間、少なくとも８時間、少なくとも９時間、少なくとも１０時間、少なくとも１１時間、少なくとも１２時間、少なくとも１３時間、少なくとも１４時間、少なくとも１５時間、少なくとも１６時間、少なくとも１７時間、少なくとも１８時間、少なくとも１９時間、少なくとも２０時間、少なくとも２１時間、少なくとも２２時間、少なくとも２３時間、少なくとも２４時間、少なくとも２５時間、少なくとも２６時間、少なくとも２７時間、少なくとも２８時間、少なくとも２９時間、少なくとも３０時間、少なくとも３１時間、少なくとも３２時間、少なくとも３３時間、少なくとも３４時間、少なくとも３５時間、少なくとも３６時間、少なくとも３７時間、少なくとも３８時間、少なくとも３９時間、少なくとも４０時間、少なくとも４１時間、少なくとも４２時間、少なくとも４３時間、少なくとも４４時間、少なくとも４５時間、少なくとも４６時間、少なくとも４７時間、少なくとも４８時間、少なくとも４９時間、少なくとも５０時間、少なくとも５５時間、少なくとも６０時間、少なくとも６５時間、少なくとも７０時間、少なくとも７５時間、少なくとも８０時間、少なくとも８５時間、少なくとも９０時間、少なくとも９５時間、少なくとも１００時間、少なくとも１０５時間、少なくとも１１０時間、少なくとも１１５時間、少なくとも１２０時間、少なくとも１２５時間、少なくとも１３０時間、少なくとも１３５時間、少なくとも１４０時間、少なくとも１４５時間、少なくとも１５０時間、少なくとも１５５時間、少なくとも１６０時間、少なくとも１６５時間、少なくとも１７０時間、少なくとも１７５時間、少なくとも１８０時間、少なくとも１８５時間、少なくとも１９０時間、少なくとも１９５時間または少なくとも２００時間（例えば、衰退期の開始時にスタートする少なくとも２時間）であり得る。
【０１２６】
本明細書に記載される例のいずれか（例えば、タンパク質産物をより酸性の等電性プロファイルにシフトさせるための方法）では、この第２の期間は、培養の衰退期の約２時間〜約２００時間の間、約２時間と約１８０時間との間、約２時間と約１６０時間との間、約２時間と約１４０時間との間、約２時間と約１２０時間との間、約２時間と約１００時間との間、約２時間と約８０時間との間、約２時間と約６０時間との間、約２時間と約４０時間との間、約２時間と約２０時間との間、約４時間と約２００時間との間、約４時間と約１８０時間との間、約４時間と約１６０時間との間、約４時間と約１４０時間との間、約４時間と約１２０時間との間、約４時間と約１００時間との間、約４時間と約８０時間との間、約４時間と約６０時間との間、約４時間と約４０時間との間、約４時間と約２０時間との間、約６時間と約２００時間との間、約６時間と約１８０時間との間、約６時間と約１６０時間との間、約６時間と約１４０時間との間、約６時間と約１２０時間との間、約６時間と約１００時間との間、約６時間と約８０時間との間、約６時間と約６０時間との間、約６時間と約４０時間との間、約６時間と約２０時間との間、約８時間と約２００時間との間、約８時間と約１８０時間との間、約８時間と約１６０時間との間、約８時間と約１４０時間との間、約８時間と約１２０時間との間、約８時間と約１００時間との間、約８時間と約８０時間との間、約８時間と約６０時間との間、約８時間と約４０時間との間、約８時間と約２０時間との間、約１０時間と約２００時間との間、約１０時間と約１８０時間との間、約１０時間と約１６０時間との間、約１０時間と約１４０時間との間、約１０時間と約１２０時間との間、約１０時間と約１００時間との間、約１０時間と約８０時間との間、約１０時間と約６０時間との間、約１０時間と約４０時間との間、約１０時間と約２０時間との間、約１５時間と約２００時間との間、約１５時間と約１８０時間との間、約１５時間と約１６０時間との間、約１５時間と約１４０時間との間、１５時間と約１２０時間との間、１５時間と約１００時間との間、１５時間と約８０時間との間、１５時間と約６０時間との間、１５時間と約４０時間との間、１５時間と約２０時間との間、約２０時間と約２００時間との間、約２０時間と約１８０時間との間、約２０時間と約１６０時間との間、約２０時間と約１４０時間との間、約２０時間と約１２０時間との間、約２０時間と約１００時間との間、約２０時間と約８０時間との間、約２０時間と約６０時間との間、約２０時間と約４０時間との間、約２５時間と約２００時間との間、約２５時間と約１８０時間との間、約２５時間と約１６０時間との間、約２５時間と約１４０時間との間、約２５時間と約１２０時間との間、約２５時間と約１００時間との間、約２５時間と約８０時間との間、約２５時間と約６０時間との間または約２５時間と約４０時間との間であり得る。
【０１２７】
産物の等電性プロファイルをより酸性のプロファイルに向けてシフトさせるのに十分な条件
組換えタンパク質産物の等電性プロファイルをより酸性のプロファイルに向けてシフトさせるのに十分な条件は、以下のうち１つまたは複数を含み得る：ある範囲の温度、ある範囲のｄＯ２値、ある範囲のｐＨ値、ある範囲の撹拌速度、および組換えタンパク質産物を含有する液体（例えば、細胞および組換えタンパク質を含有する細胞培養培地、組換えタンパク質を含有する清澄化された培養培地、または組換えタンパク質を含有する緩衝液）中への１つまたは複数の薬剤の添加。第２の期間中の、組換えタンパク質産物の等電性プロファイルをより酸性のプロファイルに向けてシフトさせ得るｐＨ値の例は、約ｐＨ７．００〜約ｐＨ７．３０の間、約ｐＨ７．００〜約ｐＨ７．２５の間、約ｐＨ７．００〜約ｐＨ７．２０の間、約ｐＨ７．００〜約ｐＨ７．１５の間、約ｐＨ７．００〜約ｐＨ７．１０の間、約ｐＨ７．００〜約ｐＨ７．０５の間、約ｐＨ７．０５〜約ｐＨ７．３０の間、約ｐＨ７．０５〜約ｐＨ７．２５の間、約ｐＨ７．０５〜約ｐＨ７．２０の間、約ｐＨ７．０５〜約ｐＨ７．１５の間、約ｐＨ７．０５〜約ｐＨ７．１０の間、約ｐＨ７．１０〜約ｐＨ７．３０の間、約ｐＨ７．１０〜約ｐＨ７．２５の間、約ｐＨ７．１０〜約ｐＨ７．２０の間、約ｐＨ７．１０〜約ｐＨ７．１５の間、約ｐＨ７．１５〜約ｐＨ７．３０の間、約ｐＨ７．１５〜約ｐＨ７．２５の間、約ｐＨ７．１５〜約ｐＨ７．２０の間、約ｐＨ７．２０〜約ｐＨ７．３０の間、約ｐＨ７．２０〜約ｐＨ７．２５の間または約ｐＨ７．２５〜約ｐＨ７．３０の間である。
【０１２８】
第２の期間中の、組換えタンパク質産物の等電性プロファイルをより酸性のプロファイルに向けてシフトさせ得るｄＯ２値の例は、約２％〜約３５％の間、約２％〜約３５％の間、約２％〜約３０％の間、約２％〜約２５％の間、約２％〜約２０％の間、約２％〜約１５％の間、約２％〜約１０％の間、約２％〜約５％の間、約５％〜約３５％の間、約５％〜約３０％の間、約５％〜約２５％の間、約５％〜約２０％の間、約５％〜約１５％の間、約５％〜約１０％の間、約１０％〜約３５％の間、約１０％〜約３０％の間、約１０％〜約２５％の間、約１０％〜約２０％の間、約１０％〜約１５％の間、約１５％〜約３５％の間、約１５％〜約３０％の間、約１５％〜約２５％の間、約１５％〜約２０％の間、約２０％〜約３５％の間、約２０％〜約３０％の間、約２０％〜約２５％の間、約２５％〜約３５％の間、約２５％〜約３０％の間または約３０％〜約３５％の間である。
【０１２９】
第２の期間中の、組換えタンパク質産物の等電性プロファイルをより酸性のプロファイルに向けてシフトさせ得る温度の例は、約３０℃〜約３９℃の間、約３０℃〜約３８℃の間、約３０℃〜約３７．５℃の間、約３０℃〜約３７℃の間、約３０℃〜約３６℃の間、約３０℃〜約３５℃の間、約３０℃〜約３４℃の間、約３０℃〜約３３℃の間、約３０℃〜約３２℃の間、約３１℃〜約３９℃の間、約３１℃〜約３８℃の間、約３１℃〜約３７．５℃の間、約３１℃〜約３７℃の間、約３１℃〜約３６℃の間、約３１℃〜約３５℃の間、約３１℃〜約３４℃の間、約３１℃〜約３３℃の間、約３２℃〜約３９℃の間、約３２℃〜約３８℃の間、約３２℃〜約３７．５℃の間、約３２℃〜約３７℃の間、約３２℃〜約３６℃の間、約３２℃〜約３５℃の間、約３２℃〜約３４℃の間、約３３℃〜約３９℃の間、約３３℃〜約３８℃の間、約３３℃〜約３７．５℃の間、約３３℃〜約３７℃の間、約３３℃〜約３６℃の間、約３３℃〜約３５℃の間、約３４℃〜約３９℃の間、約３４℃〜約３８℃の間、約３４℃〜約３７．５℃の間、約３４℃〜約３７℃の間、約３４℃〜約３６℃の間、約３５℃〜約３９℃の間、約３５℃〜約３８℃の間、約３５℃〜約３７．５℃の間、約３５℃〜約３７℃の間、約３６℃〜約３９℃の間、約３６℃〜約３８℃の間、約３６℃〜約３７．５℃の間、約３７℃と約３９℃との間、約３７℃〜約３９℃の間または約３６℃〜約３７℃の間である。
【０１３０】
第２の期間中の、組換えタンパク質産物の等電性プロファイルをより酸性のプロファイルに向けてシフトさせ得る撹拌速度の例は、約２００ＲＰＭ〜約４００ＲＰＭの間、約２００ＲＰＭ〜約３８０ＲＰＭの間、約２００ＲＰＭ〜約３６０ＲＰＭの間、約２００ＲＰＭ〜約３４０ＲＰＭの間、約２００ＲＰＭ〜約３２０ＲＰＭの間、約２００ＲＰＭ〜約３００ＲＰＭの間、約２００ＲＰＭ〜約２８０ＲＰＭの間、約２００ＲＰＭ〜約２６０ＲＰＭの間、約２００ＲＰＭ〜約２４０ＲＰＭの間、約２００ＲＰＭ〜約２２０ＲＰＭの間、約２２０ＲＰＭ〜約４００ＲＰＭの間、約２２０ＲＰＭ〜約３８０ＲＰＭの間、約２２０ＲＰＭ〜約３６０ＲＰＭの間、約２２０ＲＰＭ〜約３４０ＲＰＭの間、約２２０ＲＰＭ〜約３２０ＲＰＭの間、約２２０ＲＰＭ〜約３００ＲＰＭの間、２２０ＲＰＭ〜約２８０ＲＰＭの間、約２２０ＲＰＭ〜約２６０ＲＰＭの間、約２２０ＲＰＭ〜約２４０ＲＰＭの間、約２４０ＲＰＭ〜約４００ＲＰＭの間、約２４０ＲＰＭ〜約３８０ＲＰＭの間、約２４０ＲＰＭ〜約３６０ＲＰＭの間、約２４０ＲＰＭ〜約３４０ＲＰＭの間、約２４０ＲＰＭ〜約３２０ＲＰＭの間、約２４０ＲＰＭ〜約３００ＲＰＭの間、約２４０ＲＰＭ〜約２８０ＲＰＭの間、約２４０ＲＰＭ〜約２６０ＲＰＭの間、約２６０ＲＰＭ〜約４００ＲＰＭの間、約２６０ＲＰＭ〜約３８０ＲＰＭの間、約２６０ＲＰＭ〜約３６０ＲＰＭの間、約２６０ＲＰＭ〜約３４０ＲＰＭの間、約２６０ＲＰＭ〜約３２０ＲＰＭの間、約２６０ＲＰＭ〜約３００ＲＰＭの間、約２６０ＲＰＭ〜約２８０ＲＰＭの間、約２８０ＲＰＭ〜約４００ＲＰＭの間、約２８０ＲＰＭ〜約３８０ＲＰＭの間、約２８０ＲＰＭ〜約３６０ＲＰＭの間、約２８０ＲＰＭ〜約３４０ＲＰＭの間２８０ＲＰＭ〜約３２０ＲＰＭの間、約２８０ＲＰＭ〜約３００ＲＰＭの間、約３００ＲＰＭ〜約４００ＲＰＭの間、約３００ＲＰＭ〜約３８０ＲＰＭの間、約３００ＲＰＭ〜約３６０ＲＰＭの間、約３００ＲＰＭ〜約３４０ＲＰＭの間、約３００ＲＰＭ〜約３２０ＲＰＭの間、約３２０ＲＰＭ〜約４００ＲＰＭの間、約３２０ＲＰＭ〜約３８０ＲＰＭの間、約３２０ＲＰＭ〜約３６０ＲＰＭの間、約３２０ＲＰＭ〜約３４０ＲＰＭの間、約３４０ＲＰＭ〜約４００ＲＰＭの間、約３４０ＲＰＭ〜約３８０ＲＰＭの間、約３４０ＲＰＭと約３６０ＲＰＭとの間、約３６０ＲＰＭ〜約４００ＲＰＭの間、約３６０ＲＰＭ〜約３８０ＲＰＭの間または約３８０ＲＰＭ〜約４００ＲＰＭの間である。
【０１３１】
第２の期間中の、組換えタンパク質産物の等電性プロファイルにおける酸性シフトを誘導し得る条件の非限定的な例には、以下のうち１つまたは複数が含まれる：約２００ＲＰＭ〜約２８０ＲＰＭの間、約２１０ＲＰＭ〜約２７０ＲＰＭの間、約２２０ＲＰＭ〜約２６０ＲＰＭの間、約２３０ＲＰＭ〜約２５０ＲＰＭまたは約２４０ＲＰＭの撹拌速度；約３１．５℃と約４１．５℃との間、約３２．５℃と約４０．５℃との間、約３３．５℃と約３９．５℃との間、約３４．５℃と約３８．５℃との間、約３５．５℃と約３７．５℃または約３６．５℃の温度；約７．１０と約７．５０との間のｐＨ（例えば、約７．１５と約７．４５との間、約７．２０と約７．４０との間、約７．２５と約７．３５との間または約７．３２のｐＨ；および約２％と約３５％との間、約２％と約３０％との間、約２％と約２５％との間、約２％と約２０％との間、約２％と約１５％との間、約２％と約１０％との間、約２％と約７％との間または約５％のｄＯ２値。
【０１３２】
産物の等電性プロファイルをより塩基性のプロファイルに向けてシフトさせるのに十分な条件
組換えタンパク質産物の等電性プロファイルをより塩基性のプロファイルに向けてシフトさせるのに十分な条件には、以下のうち１つまたは複数が含まれ得る：時間、ある範囲の特定の温度、ある範囲の特定のｄＯ２値、ある範囲の特定のｐＨ値、ある範囲の特定の撹拌速度、および組換えタンパク質産物を含有する液体（例えば、細胞および組換えタンパク質を含有する細胞培養培地、組換えタンパク質を含有する清澄化された培養培地、または組換えタンパク質を含有する緩衝液）への１つまたは複数の薬剤（例えば、Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄウシ血清アルブミン）の添加。第１の期間にわたって産物を産生するために使用される例示的な条件のいずれかは、第２の期間中に、等電性プロファイルをより塩基性のプロファイルにシフトさせるために使用され得る。組換えタンパク質産物の等電性プロファイルをより塩基性のプロファイルにシフトさせるために使用され得る例示的な条件は、以下に提供される。
【０１３３】
第２の期間中の、組換えタンパク質産物の等電性プロファイルをより塩基性のプロファイルに向けてシフトさせ得るｄＯ２値の例は、例えば、約３５％〜約５０％の間、約３５％〜約４５％の間、約３５％〜約４０％の間、約４０％〜約５０％の間、または約４５％〜約５０％の間である。
【０１３４】
第２の期間中の、組換えタンパク質産物の等電性プロファイルをより塩基性のプロファイルに向けてシフトさせ得るｐＨ値の例は、例えば、約ｐＨ６．７０〜約ｐＨ７．００の間、約ｐＨ６．７０〜約ｐＨ６．９０の間、約ｐＨ６．７０〜約ｐＨ６．９０の間、約ｐＨ６．７０〜約ｐＨ６．８０の間、約ｐＨ６．８０〜約ｐＨ７．００の間、ｐＨ６．８０〜約ｐＨ６．９０の間または約ｐＨ６．９０〜約ｐＨ７．００の間である。
【０１３５】
より塩基性のプロファイルに向かう組換えタンパク質産物の等電性プロファイルのシフトは、例えば、培養の臨界期間の後、約１０分間と約６時間との間、約１０分間と約５．５時間との間、約１０分間と約５．０時間との間、約１０分間と約４．５時間との間、約１０分間と約４．０時間との間、約１０分間と約３．５時間との間、約１０分間と約３．０時間との間、約１０分間と約２．５時間との間、約１０分間と約２．０時間との間、約１０分間と約１．５時間との間、約１０分間と約１．０時間との間または約１０分間と約０．５時間との間である第２の期間を使用することによって、一部達成され得る。より塩基性のプロファイルに向かう組換えタンパク質産物の等電性プロファイルのシフトは、例えば、培養の衰退期の約１０分間〜約８時間の間、約１０分間〜約７．５時間の間、約１０分間〜約７．０時間の間、約１０分間〜約６．５時間の間、約１０分間〜約６．０時間の間、約１０分間〜約５．５時間の間、約１０分間〜約５．０時間の間、約１０分間〜約４．５時間の間、約１０分間〜約４．０時間の間、約１０分間〜約３．５時間の間、約１０分間〜約３．０時間の間、約１０分間〜約２．５時間の間、約１０分間〜約２．０時間の間、約１０分間〜約１時間の間または約１０分間〜約０．５時間の間である第２の期間を使用することによって、一部達成され得る（例えば、衰退期の開始時にまたは衰退期に入る選択された時間にスタートする第２の期間）。
【０１３６】
等電性プロファイルにおいて達成されるシフト
一部の実施形態は、塩基性のプロファイルを有する産物を産生する条件の使用を含む。例えば、原材料Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄウシ血清またはＮｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄウシ血清アルブミンの使用は、より塩基性の等電性プロファイルを有する産物を産生し、インキュベートするステップは、産物をより酸性のプロファイルにシフトさせる。
【０１３７】
組換えタンパク質の等電性プロファイルをより酸性のプロファイルに向けてシフトさせるのに十分な条件下で組換えタンパク質産物をインキュベートするステップを含む方法の一部の実施形態は、プロファイル中のより酸性のタンパク質下位集団（複数可）のうち少なくとも１、２、３または４つのレベル（または量）の増加、およびプロファイル中のより塩基性のタンパク質下位集団のうち少なくとも１、２、３または４つのレベル（または量）の減少を生じる。等電性プロファイルが、約５．２から約６．７の間（例えば、約５．４５から約６．５５の間）の等電点を有する７つまたは８つのタンパク質下位集団を含む一部の実施形態では、この方法は、より酸性のタンパク質下位集団のうち少なくとも２、３、４または５つのレベル（または量）の増加、およびより塩基性のタンパク質下位集団のうち少なくとも２、３または４つのレベル（または量）の減少を生じる。
【０１３８】
組換えタンパク質の等電性プロファイルをより塩基性のプロファイルに向けてシフトさせるのに十分な条件下で組換えタンパク質産物をインキュベートするステップを含む方法の一部の実施形態は、プロファイル中のより塩基性のタンパク質下位集団（複数可）のうち少なくとも１、２、３もしくは４つのレベル（または量）の増加、および／またはプロファイル中のより酸性のタンパク質下位集団（複数可）のうち少なくとも１、２、３もしくは４つのレベル（または量）の減少を生じる。
【０１３９】
特定の一例では、組換えタンパク質産物が、約５．４５から約６．５５の間の等電点を有する７つのタンパク質下位集団を有する場合（例えば、エクリズマブ）、このより酸性のプロファイルまたはより塩基性のプロファイルは、以下を含むか、以下からなるか、または以下から本質的になる：（１）タンパク質の総質量の≧１０％の、これら７つのタンパク質下位集団の２番目、３番目および４番目に塩基性が強いタンパク質下位集団の各々に存在するタンパク質の量；（２）これら７つのタンパク質下位集団の２番目に塩基性が強いタンパク質下位集団に存在するタンパク質の量未満である、これら７つのタンパク質下位集団の３番目および４番目に塩基性が強いタンパク質下位集団の各々に存在するタンパク質の量；（３）最も酸性のタンパク質下位集団に存在するタンパク質の量は、タンパク質の総質量の≦３％である；（４）２番目に酸性が強いタンパク質下位集団に存在するタンパク質の量は、タンパク質の総質量の≦６％である；（５）３番目に酸性が強いタンパク質下位集団に存在するタンパク質の量は、タンパク質の総質量の≦９％である；（６）最も塩基性のタンパク質下位集団に存在するタンパク質の量は、タンパク質の総質量の≦８％である；（７）これら７つのタンパク質下位集団の最も酸性の、２番目に酸性が強い、３番目に酸性が強い、および最も塩基性のタンパク質下位集団以外、タンパク質の総質量の≦６％であるタンパク質の量を有する他の微量タンパク質下位集団は存在しない。一部の実施形態では、このインキュベーションは、このより塩基性のおよび／またはより酸性のプロファイルを有する組換えタンパク質産物（例えば、エクリズマブ）を生じる。
【０１４０】
組換えタンパク質産物の等電性プロファイルを決定すること
一部の実施形態は、産物をアッセイして等電性プロファイルを決定する１つまたは複数のステップをさらに含む。例えば、産物をアッセイしてその等電性プロファイルを決定するステップは、第１の期間の最後の直後に、およびインキュベートするステップの前に、実施され得る。これは、組換えタンパク質産物の等電性プロファイルをより酸性のプロファイルに向けてシフトさせるのに十分な条件下で、第２の期間中にこの産物をインキュベートするかどうかを決定するため、または組換えタンパク質産物の等電性プロファイルをより塩基性のプロファイルに向けてシフトさせるのに十分な条件下で、第２の期間中にこの産物をインキュベートするかどうかを決定するために、実施される。
【０１４１】
一部の実施形態は、等電性タンパク質産物のさらなるシフトが必要かどうかを決定するために、第２の期間の最後の直後に、この産物をアッセイして等電性プロファイルを決定するさらなるステップをさらに含む。例えば、第２の期間の直後のアッセイするステップは、さらなるインキュベートするステップ、例えば、インキュベートするステップの反復が、より酸性のまたはより塩基性のプロファイルにシフトさせるために必要かどうかを決定するために、使用され得る。かかる決定は、第２の期間の最後に決定した等電性プロファイルを、参照プロファイル（例えば、本明細書に記載されるまたは当技術分野で公知の参照プロファイルのいずれか）と比較することによって行われ得る。
【０１４２】
組換えタンパク質産物を精製すること
当技術分野で公知のように、組換えタンパク質産物（例えば、シフトされた組換えタンパク質産物）は、当技術分野で公知の方法を使用して精製され得る。例えば、濾過およびクロマトグラフィー、例えば、親和性クロマトグラフィー、プロテインＡ捕捉クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、混合モード樹脂クロマトグラフィー、分子篩クロマトグラフィー、および疎水性相互作用クロマトグラフィーの１つまたは複数のステップが、シフトさせる前または後に、組換えタンパク質産物を精製するために使用され得る。組換えタンパク質産物（例えば、シフトされた組換えタンパク質産物）を精製するためのさらなる方法は、当技術分野で周知である。
【０１４３】
次いで、精製されたタンパク質産物（例えば、シフトされた組換えタンパク質産物）は、薬物物質を創製するために、薬学的に許容される賦形剤に任意選択で混合または添加され得る。薬学的に許容される賦形剤（例えば、天然に存在しない薬学的に許容される賦形剤）の例は、当技術分野で周知である。
【０１４４】
組換えタンパク質産物
本明細書に記載される方法のいずれかによって産生される組換えタンパク質産物もまた提供される。例えば、（ａ）産生バイオリアクター中で、産物を産生するのに十分な条件下で、組換えタンパク質をコードする核酸を含有する哺乳動物細胞を、哺乳動物細胞の増殖期および／または静止期からなる第１の期間にわたって培養するステップ；（ｂ）第１の期間の最後に、この産物をアッセイして等電性プロファイルを決定するステップ；ならびに（ｃ）産物の等電性プロファイルをより酸性のプロファイルに向けてシフトさせるのに十分な条件下で、哺乳動物細胞の衰退期の中の少なくとも６時間からなる第２の期間にわたって、この産物をインキュベートするステップ、または産物の等電性プロファイルをより塩基性のプロファイルに向けてシフトさせるのに十分な条件下で、哺乳動物細胞の衰退期の第２の期間にわたって、この産物をインキュベートするステップ；ならびに任意選択で、（ｄ）この産物をアッセイして等電性プロファイルを決定し、この等電性プロファイルがさらなるシフトを必要とする場合に、ステップ（ｃ）を反復するステップを含む方法によって産生される組換えタンパク質産物（例えば、エクリズマブ）が、本明細書で提供される。
【０１４５】
（ａ）産生バイオリアクター中で、この産物を産生するのに十分な条件下で、組換えタンパク質をコードする核酸を含有する哺乳動物細胞を、哺乳動物細胞の増殖期を含み、かつ臨界時点において終結する第１の期間にわたって培養するステップ；（ｂ）産物の等電性プロファイルをより酸性のプロファイルに向けてシフトさせるのに十分な条件下で、哺乳動物細胞の衰退期の中の少なくとも６時間からなる第２の期間にわたって、この産物をインキュベートするステップ；ならびに任意選択で（ｃ）この産物をアッセイして等電性プロファイルを決定し、この等電性プロファイルが、より酸性のプロファイルに向かうさらなるシフトを必要とする場合に、ステップ（ｂ）を反復するステップを含む方法によって産生される組換えタンパク質産物（例えば、エクリズマブ）もまた提供される。（ａ）産生バイオリアクター中で、この産物を産生するのに十分な条件下で、組換えタンパク質をコードする核酸を含有する哺乳動物細胞を、哺乳動物細胞の増殖期を含み、かつ臨界時点において終結する第１の期間にわたって培養するステップ；（ｂ）産物の等電性プロファイルをより塩基性のプロファイルに向けてシフトさせるのに十分な条件下で、哺乳動物細胞の衰退期の第２の期間にわたって、この産物をインキュベートするステップ；ならびに任意選択で（ｃ）この産物をアッセイして等電性プロファイルを決定し、この等電性プロファイルが、より塩基性のプロファイルに向かうさらなるシフトを必要とする場合に、ステップ（ｂ）を反復するステップを含む方法によって産生される組換えタンパク質産物（例えば、エクリズマブ）がさらに提供される。
【０１４６】
本明細書に記載される組換えタンパク質産物を産生するために使用される方法の非限定的な態様は、上記されており、限定なしに任意の組合せで使用され得る。
【実施例】
【０１４７】
本発明を、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定しない、以下の実施例においてさらに記載する。
【０１４８】
（実施例１）
エクリズマブの等電性プロファイルのシフト
１セットの実験を実施して、エクリズマブの等電性プロファイルを、１０，０００Ｌバイオリアクター中で細胞培養物のインキュベーションを継続することによってシフトさせることができるかどうかを決定した。これらの実験では、培養物試料を毎日採取し、組換えエクリズマブを、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。得られた精製されたエクリズマブの等電性プロファイルを、等電点電気泳動法を使用して決定した。これらの実験で使用した方法および材料は、以下に記載される。
【０１４９】
材料
これらの実験に使用される材料には、以下が含まれる：エクリズマブをコードする核酸を含有する哺乳動物細胞の培養物由来の、清澄化されたバイオリアクター試料、およびプロテインＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム。
【０１５０】
方法
１０，０００Ｌ産生バイオリアクターに、エクリズマブをコードする核酸を含有する哺乳動物細胞を播種した。接種の５〜１５日後に、１０，０００Ｌバイオリアクター細胞培養物を、第１の実験および第２の実験において、５日目、６日目、７日目、８日目、９日目、１０日目、１１日目、１２日目、１３日目、１４日目および１５日目に試料採取した。各試料を、遠心分離および０．２２μｍ濾過によって清澄化し、２〜８℃で貯蔵した。次に、各清澄化された試料に対して、２回目の濾過を行い、プロテインＡカラムを通過させてエクリズマブを精製した。次いで、等電性プロファイリングを、精製されたエクリズマブ試料に対して実施した。
【０１５１】
結果
表１および２は、等電性タンパク質バンド１ａ、１、２、３、４、５および６の相対的量についての、それぞれ、第１および第２の１０，０００Ｌ細胞培養物において収集したデータをまとめる。これらのバンドを、５日目〜１３日目にわたって細胞培養物から取得された各試料について等電点ゲル電気泳動を使用して決定した、最も酸性から最も塩基性までの順序で番号付けした。これらの１０，０００Ｌ流加細胞培養物における臨界時点は、衰退期において生存細胞密度が減少し、約１５×１０５細胞／ｍＬの生存細胞密度に達する時点であると決定した。表１および２中のデータは、培養の臨界時点を超えて哺乳動物細胞の培養を継続することで、培養物中のエクリズマブの等電性プロファイルにおける酸性シフトを生じさせることができたことを実証している。第１の１０，０００Ｌバイオリアクター細胞培養物からのデータのグラフ表示は、図１および２に示され、第２の１０，０００Ｌバイオリアクター細胞培養物からのデータのグラフ表示は、図３および４に示される。
【０１５２】
図１〜４に示されるデータはまた、培養の臨界時点を超えて哺乳動物細胞の培養を継続する場合に、培養物中の等電性プロファイル内の、異なるが控えめなバンドに対応するエクリズマブ分子の分布が、より塩基性の等電性プロファイルからより酸性の等電性プロファイルにシフトすることを実証している。第１の１０，０００Ｌ細胞培養物では、培養の５日目から１３日目の間に観察された酸性バンド１ａ（０％から２％）、１（２％から６％）、２（４％から５％）および３（２０％から２９％）のレベル（または量）の増加が存在した。第１の細胞培養物における酸性バンドへの材料のこのシフトは、培養の５日目から１３日目の間の塩基性バンド４（４０％から３２％）、５（２１％から１９％）、６（１１％から７％）の量の減少によって反映された。バンド６よりも塩基性の１つのバンドは、１０日後に完全に消失した。第２の１０，０００Ｌ細胞培養物でのデータは、時間をわたって、エクリズマブの等電性プロファイル内での材料の類似のシフトを示した。
【表１】
2017532046.tif 000002
【０１５３】
この実施例のデータは、培養の臨界時点を超えるまたは培養物の衰退期の持続時間を延長させる第２の期間にわたって培養物のインキュベートを継続することで、培養物中のエクリズマブの等電性プロファイル内での材料の再分布または培養物中のエクリズマブの等電性プロファイルにおける「酸性シフト」が生じることを実証している。
【表２】
2017532046.tif 000003
【０１５４】
（実施例２）
エクリズマブの等電性プロファイルにおけるシフトに対するｐＨおよびｄＯ２の影響
次に、本発明者らは、細胞培養物によって産生された組換えタンパク質の得られた等電性プロファイルに対するｐＨおよびｄＯ２の影響を評価することを試みた。これらの小規模細胞培養物について、エクリズマブをコードする核酸を含有するＮＳ０哺乳動物細胞を、２Ｌ流加バイオリアクター中で培養した。
【０１５５】
方法
１０個の２Ｌ小規模流加バイオリアクターのセットに、１．３Ｌの作業容積で、エクリズマブをコードする核酸を含有するＮＳ０哺乳動物細胞を接種し、合計で１６日間培養した。これらのバイオリアクターを、３６．５℃の制御された温度で、２４０ＲＰＭの撹拌速度で培養した。スパージ空気の流量は、３ｓＬ／時間で始まり、９ｓＬ／時間まで増加し、その後、実験条件のために特定のｄＯ２設定ポイントを維持するためにさらなる酸素を補給した。これらの細胞培養物を、以下に列挙する５つの異なる実験条件（条件１〜５）で２連で試行した。各バイオリアクターを、０．０２のｐＨデッドバンド設定ポイント（例えば、７．３２±０．０２）で試行した。その条件は以下の通りであった：
（１）ｐＨ７．０および１５％のｄＯ２（対照条件）（細胞培養試行１および２）；
（２）ｐＨ７．３２および５％のｄＯ２（細胞培養試行３および４）；
（３）ｐＨ７．３２および５０％のｄＯ２（細胞培養試行５および６）；
（４）ｐＨ６．９５および５％のｄＯ２（細胞培養試行７および８）；ならびに
（５）ｐＨ６．９５および５０％のｄＯ２（細胞培養試行９および１０）。
【０１５６】
２Ｌバイオリアクター培養物の各々に、３．５×１０５細胞／ｍＬの初期生存細胞密度で接種した。これらのバイオリアクターについての接種細胞供給源の各々は、同じ細胞バンク由来であった。シードトレインプロセスから増殖させた２つの複製の撹拌培養物を使用して、バイオリアクターに接種した。細胞培養試行１、７および８のバイオリアクターは、第１の撹拌培養物から接種し、細胞培養試行２、３、４、５、６、９および１０のバイオリアクターは、第２の撹拌培養物から接種した。１０個の２Ｌバイオリアクター培養物の０日目の細胞の世代数は、およそ７７．３であった。
【０１５７】
プロセス規定されたフィードを、フィード規準の開始の際に各２Ｌ培養物に添加した。フィード規準を、細胞培養物が生存細胞密度≧１４×１０５に達したときとして指定した。フィード規準に達したときに、２つの異なる液体培養培地を、滅菌シリンジおよびサイドアーム隔壁（ｓｉｄｅａｒｍ  ｓｅｐｔｕｍ）によって、バイオリアクター中に導入した。全ての２Ｌバイオリアクターについての両方の液体フィードは、総タンク容積の４％であった。液体フィードは５２ｍＬであり、１３３時間にわたって分配（供給）した。フィード添加の方法を、最初の５日間の間の９．４ｍＬの各液体培養培地の毎日のボーラスフィードショット、供給の６日目および最終日の最終５．０ｍＬアリコートを使用して実施した。Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄから供給されたＢＳＡを、全ての培養培地および供給溶液において使用した。
【０１５８】
得られた等電性プロファイルを評価するために、７５ｍＬの試料を、以下のスケジュールで各２Ｌバイオリアクターから取り出した：試料を、細胞培養試行１、３および５については１０日目、１２日目および１４日目に取得し、試料を、細胞培養試行２、４、６、７、８、９および１０については、５日目、８日目および１０日目に取得した。細胞培養試行２、４、６、７、８、９および１０について、最終回収試料を、エクリズマブのプロテインＡ精製に使用し、引き続く等電点電気泳動アッセイを、１４日目に実施した。細胞培養試行１、３および５について、最終回収試料を、１６日目に採取した。培養培地の清澄化された試料を、各細胞培養物から調製し、エクリズマブを精製し、２℃〜８℃で貯蔵した。エクリズマブ含有培養培地の貯蔵された試料を、引き続いて、プロテインＡクロマトグラフィーによって精製し、等電性プロファイルを決定した。
【０１５９】
結果
５セットのバイオリアクター細胞培養条件における細胞増殖を決定した。図５を参照のこと。全ての２Ｌバイオリアクターについての初期播種密度は一貫していた。７．３２のｐＨを有する４つのバイオリアクターは、初期にはより速く増殖した。培養培地中での増殖に最適なｐＨは７．３０であったので、これは驚くべきことではなかった。しかし、これら４つのバイオリアクターは、対照条件下のバイオリアクターまたはｐＨ６．９５に設定したバイオリアクターよりも迅速に衰退期に入った細胞培養物を有した。ｐＨ６．９５およびｐＨ７．３２ならびに５％のｄＯ２設定ポイントに設定した細胞培養物は、それらの５０％溶存酸素対応物と同じ積分生存細胞濃度（ＩＶＣＣ）を達成しなかった。これは、酸素がこれらの培養物における制約であったことを示唆した。ｐＨ７．０および１５％のｄＯ２の対照条件は、高いｐＨ条件と低いｐＨ条件（それぞれ、ｐＨ７．３２および６．９５のｐＨ）との間であり、このことは、ｐＨ７を下回る僅かなｐＨ改変でさえ、細胞増殖に対して有意な影響を有し得ることを示している。
【０１６０】
５つの異なるバイオリアクター条件の産生力を決定した。図６を参照のこと。比産生力における有意差が、５つの異なる試験したｐＨ／ｄＯ２条件の間で観察された。高い酸素または低い酸素のいずれかにおいて７．３２のｐＨ設定ポイントでバイオリアクターを試行させることは、比産生力に対して顕著な影響を有する。高い酸素（５０％）で試行したｐＨ７．３２バイオリアクターは、その５％ｄＯ２対応物と比較して、より高い積分生存細胞濃度およびより高い最終力価を達成した。ｐＨ６．９５±０．０２で試行したバイオリアクターは、より高い比産生力を有し、対照条件下で試行した２Ｌバイオリアクターと、産生力が類似していた。したがって、ｐＨ６．９５では、差次的なｄＯ２設定ポイント（５％対５０％）は、ｐＨ７．３２でのｄＯ２の影響と比較して、比産生力または最終力価に対してそれほど影響を有さなかった。ｐＨ７．０および１５％ｄＯ２の対照条件で試行したバイオリアクターは、最も高い累積的な積分生存細胞濃度を生じた。対照条件で試行したバイオリアクターはまた、ｐＨ７．３２および５０％ｄＯ２で試行したバイオリアクター細胞培養物よりも性能が優れていた。対照条件で試行したバイオリアクターは、非対照条件で試行したバイオリアクターよりも４００ｍｇ／Ｌ超過する、１６００ｍｇ／Ｌでエクリズマブを産生した。
【０１６１】
５セットの細胞培養条件下で産生された抗体の等電性プロファイルの進化を決定した。図７から１０を参照のこと。これらのデータは、エクリズマブについての等電性プロファイル中の特定のタンパク質バンドに存在する材料の量が、それが培養の臨界時点に接近しそれを超えるときを含む培養持続時間にわたってどのように変化するかを示している。これらのデータは、エクリズマブの等電性プロファイルに影響を与えると思われるｐＨとｄＯ２の間の相互作用が存在することもまた示している。一般的傾向は、培養持続時間が臨界時点を超えて培養物の衰退期に入って増加する場合に、等電性プロファイル中の酸性タンパク質バンド（例えば、バンド１、２および３）内の材料の量もまた増加することである。対応して、塩基性タンパク質バンド（例えば、バンド５および６）に存在する材料の量は減少する。驚くべきことに、このデータは、低いｄＯ２設定ポイントは、等電性プロファイル中の酸性タンパク質バンドの増加したレベル（または量）を生じるが、より高いｄＯ２設定ポイントは、等電性プロファイル中の塩基性タンパク質バンドの出現およびレベル（または量）を増加させることもまた示している。
【０１６２】
図１１は、試験したバイオリアクター培養物のうち４つから１４日目に回収したエクリズマブの等電性プロファイル中の異なるタンパク質バンドのレベル（または量）を示す。このデータは、低いｄＯ２が、より酸性のタンパク質バンド、具体的にはバンド１ａ、１、２および３のより高いレベル（または量）を生じ、より高いｐＨは、より酸性のタンパク質バンド、具体的にはバンド１および２のより高いレベル（または量）を生じることを、明確に示している。
【０１６３】
この実施例のデータは、臨界時点を超えて衰退期（例えば、この実施例では、細胞培養物の衰退期は、６日目または７日目あたりで始まる）に十分入る期間にわたって細胞培養物を培養した場合に、エクリズマブについてより酸性の等電性プロファイルへのシフトが生じたことを示している。この実施例の臨界時点は、細胞培養物が、増殖の衰退期に１５×１０５細胞／ｍｌを下回って衰退するときである。
【０１６４】
（実施例３）
等電性プロファイルに対する細胞供給源および原材料の影響
さらなるセットの実験を、哺乳動物細胞培養物によって産生されたエクリズマブの等電性プロファイルに対する細胞供給源および原材料の影響を決定するために実施した。これらの実験を実施するために使用した材料および方法は、以下に記載される。
【０１６５】
方法
８つの２Ｌバイオリアクターに接種し、合計１８日間にわたってインキュベートした。各バイオリアクター培養物の作業容積は、１．３Ｌであった。２Ｌ流加バイオリアクター培養物の各々を、３６．５℃の熱電対温度で２４０ＲＰＭで反時計回りに撹拌した。スパージ流量は、３ｓｌ／時間で始まり、９ｓｌ／時間まで上昇させ、その後、酸素補給を使用して、ｄＯ２設定ポイントを１５％に維持した。バイオリアクター培養物を、±０．０２のデッドバンドで、７．０のｐＨで試行した。２Ｌ流加バイオリアクター培養物のうち４つを、細胞供給源Ａを用いて試行し、２Ｌ流加バイオリアクター培養物のうち４つを、細胞供給源Ｂを用いて試行した。各細胞供給源由来の２Ｌ流加バイオリアクター培養物のうち２つを、第１のセットの培養培地原材料を使用して培養し、他の６つの２Ｌ流加バイオリアクター培養物を、第２のセットの培養培地原材料を使用して培養した：各細胞供給源について３つの複製物。試験した実験条件の正確なセットは、表３に示される。８つのバイオリアクターに、撹拌培養物由来の細胞を接種した（即ち、１つの撹拌培養物を、各細胞供給源について調製した）。８つ全ての２Ｌ流加バイオリアクター培養物を、３．０×１０５細胞／ｍＬの標的播種密度で接種した。
【０１６６】
バイオリアクター試行の各々において、各バイオリアクター中への２つの液体培養培地の供給を、培養物がフィード規準（≧１４×１０５細胞／ｍＬの生存細胞密度）に達したときに開始し、その際、１×ボーラスの培地補充物を、滅菌シリンジおよびサイドアーム隔壁を介して各バイオリアクター中に導入した。８つ全てのバイオリアクターについての両方のフィードは、各々総タンク容積の４％であった、または５２ｍＬの各々の液体培養培地を添加し、１３３時間にわたって分配した。フィード添加の方法を、最初の５日間の間の９．４ｍＬの各フィードでの毎日のボーラスフィードショット、ならびに供給の６日目および最終日の５．０ｍＬの最終ショットを使用して実施した。
【表３】
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【０１６７】
試料（７５ｍＬ）を、以下に記載するように各バイオリアクターから回収した。細胞培養試行１１および１２について、試料を、８日目、１１日目、１４日目、１５日目および１６日目に採取した。バイオリアクター試行１３および１４について、試料を、１３日目、１４日目、１５日目および１６日目に採取した。各試料中に存在するエクリズマブを、プロテインＡクロマトグラフィーを使用して精製し、得られた精製されたタンパク質を、等電点電気泳動を使用して分析した。
【０１６８】
結果
８つの流加バイオリアクターについての細胞増殖を、図１２に示す。８つ全てのバイオリアクターについての初期播種密度は、容器毎に一貫している。黒の実線は、細胞供給源Ｂを接種した培養物からのデータを示し、黒の破線は、細胞供給源Ａを接種した培養物からのデータを示す。第１のセットの原材料を含んだ２つのサブセット試行は、そのそれぞれの細胞供給源について矢印によって示される。このデータは、細胞供給源Ｂ由来の細胞が、細胞供給源Ａの対応培養物よりも、より速く増殖し、より高いピーク生存細胞密度（ＶＣＤ）に達し、ＶＣＤがゆっくりと衰退することを示している。第１のセットの原材料と共にインキュベートされた培養物は、第２のセットの原材料と共にインキュベートされた培養物と比較した場合、累積生存細胞密度がより低い。これは、細胞培養試行１１データにおいて容易に見ることができる。
【０１６９】
各バイオリアクター培養物における、培養物中に時間をわたって存在する生存細胞の百分率は、図１３に示される。細胞供給源Ａと細胞供給源Ｂの間のデータは類似して見えるが、細胞培養試行１１は、最低の百分率の生存細胞密度を時間をわたって有する。細胞供給源Ｂを含有するバイオリアクターは、０日目〜１４日目の間、僅かにより高い百分率の生存細胞を有するようである。
【０１７０】
８つのバイオリアクター培養物の比産生力は、図１４に示される。細胞供給源は、培養物の産生力に対して影響を有する。第１のセットの原材料を使用する２つの培養物の増殖は、図１４中で矢印によって示される。使用した各細胞供給源について、第１のセットの原材料を使用する細胞試行は、第２のセットの原材料を使用するそれらの対応物と比較して、より低い比産生力を有した。細胞供給源Ｂを使用する４つのバイオリアクター培養物の平均力価は、細胞供給源Ａを使用するバイオリアクター培養物についての僅か１．１１グラム／リットルと比較して、１．６４グラム／リットルであった。細胞供給源Ｂを使用するバイオリアクター培養物はまた、細胞１つ当たりでより産生的であった（図１４中の線の傾きによって観察される）。
【０１７１】
図１５〜１８は、８つの異なるバイオリアクター培養物のうち４つから取得された試料から精製されたエクリズマブの等電性プロファイルの時間経過を示す。これらの時間経過研究において使用した４つの細胞培養試行は、細胞培養試行１１、１２、１３および１４であった（表４に示される）。図１５〜１８中のデータは、培養持続時間にわたるエクリズマブの等電性プロファイルにおける変化を示している（培養物が、臨界期間を超えるさらなる期間にわたってインキュベートされる、および／または培養物の衰退期間の間インキュベートされる場合）。図１５〜１８中のデータは、時間をわたっての等電性プロファイルにおける変化が、細胞供給源Ａまたは細胞供給源Ｂを使用する両方の培養物について同じであることを示している。一般的傾向は、培養持続時間が臨界時点を超えて衰退増殖期に入って増加する場合に、酸性タンパク質バンド（タンパク質バンド１、２および３）のレベル（または量）が増加し、塩基性タンパク質バンド（タンパク質バンド５および６）が減少することであることが留意される。このデータは、低いｄＯ２設定ポイントが、より酸性のタンパク質バンドのレベル（または量）を増加させるが、高いｄＯ２設定ポイントが、より塩基性のタンパク質バンドの出現および頻度を増加させることもまた示している。同じ原材料を使用した細胞供給源Ａおよび細胞供給源Ｂからのプロファイルは類似して見えるが、異なる原材料を使用する同じ細胞供給源からのプロファイルは、あまり似ていない。これらのデータは、使用した原材料が、これらの実験において、細胞供給源よりも、等電性プロファイルに対していっそう多くの影響を示すことを示している。第１のセットの原材料を使用したバイオリアクター培養物は両方とも、第２のセットの原材料を使用する培養物よりも早く、回収基準を満たした。
【０１７２】
細胞培養試行１１および１２は、１６日目に以下の参照等電性プロファイルを満たした：タンパク質バンド３、４および５≧１０％；タンパク質バンド３および４＞タンパク質バンド５；タンパク質バンド１ａ≦３％；タンパク質バンド１≦６％；タンパク質バンド２≦９％；タンパク質バンド６≦８％；タンパク質バンド１ａ、１、２および６以外の微量タンパク質バンドなし；ならびに全てのタンパク質バンドは、５．４５の等電点から６．５５の等電点の間で分離した。細胞培養試行１１および１２は、細胞培養試行１１については臨界時点（１２日目）の４日後、細胞培養試行１２については臨界時点（１４日目）の２日後に、参照等電性プロファイルを満たした。これらの実験で使用した臨界時点は、生存細胞密度が１５×１０５細胞／ｍＬを下回って衰退した時点であった。培養がＮｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄウシ血清成分（例えば、ウシ血清アルブミン）を利用する場合、等電性プロファイルにおける、より塩基性のタンパク質バンドに向かうかすかな全体的シフトが、おしなべて存在する。
【０１７３】
要約すると、これらのデータは、さらなる期間（臨界期間を超えてまたは培養物の衰退期に入る）にわたって培養物のインキュベートを継続することで、組換えタンパク質産物（例えば、本実施例ではエクリズマブなど）の等電性プロファイルにおけるシフトを生じ得ることを実証している。
【０１７４】
他の実施形態
本発明をその詳細な説明と併せて記載してきたが、上述の説明は、添付の特許請求の範囲の範囲によって規定される本発明の範囲を限定するのではなく説明する意図であることを、理解すべきである。他の態様、利点および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【化１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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