(57)【要約】本発明は、二重特異性抗ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３（ＦＧＦＲ２／３）抗体、ならびにこれらの抗体を含む組成物及びこれらの抗体の使用方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３に結合する単離された抗体であって、ＦＧＦＲ１及びＦＧＦＲ４の結合が表面プラズモン共鳴によって検出されない、単離された抗体。
【請求項２】
単離された抗体であって、ＦＧＦＲ２及び／またはＦＧＦＲ３に結合する、単離された抗体。
【請求項３】
抗体が、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ、及び／またはＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃに結合する、請求項１または２に記載の単離された抗体。
【請求項４】
抗体が、ヒトＦＧＦＲ２及び／またはＦＧＦＲ３に結合する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離された抗体。
【請求項５】
抗体が、アゴニスト機能をほとんどまたは全く有しない、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離された抗体。
【請求項６】
抗体が、エフェクター機能を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離された抗体。
【請求項７】
エフェクター機能が、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性を含む、請求項６に記載の単離された抗体。
【請求項８】
抗体が、細胞の機能を阻害もしくは阻止し、及び／または細胞の破壊を引き起こす細胞傷害性薬である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離された抗体。
【請求項９】
細胞が癌細胞である、請求項８に記載の単離された抗体。
【請求項１０】
癌細胞が、ｔ（４；１４）転座を含む多発性骨髄腫細胞、乳癌細胞、トリプルネガティブ乳癌細胞、骨髄腫細胞、及び膀胱癌細胞である、請求項９に記載の単離された抗体。
【請求項１１】
抗体がエピトープに結合し、該エピトープが、ＴＮＴＥＫＭＥＫＲＬＨＡＶＰＡＡＮＴＶＫＦＲＣＰＡ（配列番号９１）及びＹＫＶＲＮＱＨＷＳＬＩＭＥＳ（配列番号９２）から選択される１つのアミノ酸配列を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の単離された抗体。
【請求項１２】
抗体がエピトープに結合し、該エピトープが、ＴＲＰＥＲＭＤＫＫＬＬＡＶＰＡＡＮＴＶＲＦＲＣＰＡ（配列番号９３）及びＩＫＬＲＨＱＱＷＳＬＶＭＥＳ（配列番号９４）から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の単離された抗体。
【請求項１３】
抗体がエピトープに結合し、該エピトープが、配列番号９１及び９２のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の単離された抗体。
【請求項１４】
抗体がエピトープに結合し、該エピトープが、配列番号９３及び９４のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の単離された抗体。
【請求項１５】
抗体が、第１のエピトープ及び第２のエピトープに結合し、前記第１のエピトープが、配列番号９１及び９２のアミノ酸配列を含み、第２のエピトープに結合し、該エピトープが、配列番号９３及び９４のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の単離された抗体。
【請求項１６】
抗体がエピトープに結合し、該エピトープが、アミノ酸配列ＴＮＴＥＫＭＥＫＲＬＨＡＶＰＡＡＮＴＶＫＦＲＣＰＡ（配列番号９１）及び／またはＹＫＶＲＮＱＨＷＳＬＩＭＥＳ（配列番号９２）と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性または類似性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の単離された抗体。
【請求項１７】
抗体がエピトープに結合し、該エピトープが、アミノ酸配列ＴＲＰＥＲＭＤＫＫＬＬＡＶＰＡＡＮＴＶＲＦＲＣＰＡ（配列番号９３）及びＩＫＬＲＨＱＱＷＳＬＶＭＥＳ（配列番号９４）と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性または類似性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の単離された抗体。
【請求項１８】
抗体が、アミノ酸配列（ａ）ＴＮＴＥＫＭＥＫＲＬＨＡＶＰＡＡＮＴＶＫＦＲＣＰＡ（配列番号９１）及び／またはＹＫＶＲＮＱＨＷＳＬＩＭＥＳ（配列番号９２）、ならびに（ｂ）ＴＲＰＥＲＭＤＫＫＬＬＡＶＰＡＡＮＴＶＲＦＲＣＰＡ（配列番号９３）及びＩＫＬＲＨＱＱＷＳＬＶＭＥＳ（配列番号９４）と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性または類似性を有するアミノ酸配列に結合する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の単離された抗体。
【請求項１９】
抗体がエピトープに結合し、該エピトープが、配列番号９１、９２、９３、及び９４のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性または類似性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の単離された抗体。
【請求項２０】
抗体が、配列番号５２及び／または５４のアミノ酸配列範囲１５７〜１８１内で結合する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の単離された抗体。
【請求項２１】
抗体が、配列番号５２及び／または５４のアミノ酸配列範囲２０７〜２２０内で結合する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の単離された抗体。
【請求項２２】
抗体が、配列番号５２及び５４のアミノ酸配列範囲１５７〜１８１及び２０７〜２２０内で結合する、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の単離された抗体。
【請求項２３】
抗体が、恒常的ＦＧＦＲ２活性及び／またはＦＧＦＲ３活性を阻害する、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の単離された抗体。
【請求項２４】
恒常的ＦＧＦＲ２活性及び／またはＦＧＦＲ３活性が、リガンド依存性恒常的ＦＧＦＲ２活性及び／またはＦＧＦＲ３活性である、請求項２３に記載の単離された抗体。
【請求項２５】
恒常的ＦＧＦＲ２活性及び／またはＦＧＦＲ３活性が、リガンド非依存性恒常的ＦＧＦＲ２活性及び／またはＦＧＦＲ３活性である、請求項２３に記載の単離された抗体。
【請求項２６】
恒常的活性が、ＦＧＦＲ２活性及びＦＧＦＲ３活性である、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の単離された抗体。
【請求項２７】
抗体が、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＲ２４８Ｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＫ６５２Ｅ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＳ２４９Ｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＧ３７２Ｃ、及びＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＹ３７５Ｃから選択される変異のうちのいずれか１つに対応する変異を含むＦＧＦＲ３を阻害する、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の単離された抗体。
【請求項２８】
抗体が、ＦＧＦＲ３活性及びＦＧＦＲ２活性を阻害する、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の単離された抗体。
【請求項２９】
抗体が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、及び１６から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の単離された抗体。
【請求項３０】
抗体が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、及び１５から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の単離された抗体。
【請求項３１】
抗体が、
ａ．配列番号１の軽鎖及び配列番号２の重鎖、
ｂ．配列番号３の軽鎖及び配列番号４の重鎖、
ｃ．配列番号５の軽鎖及び配列番号６の重鎖、
ｄ．配列番号７の軽鎖及び配列番号８の重鎖、
ｅ．配列番号９の軽鎖及び配列番号１０の重鎖、
ｆ．配列番号１１の軽鎖及び配列番号１２の重鎖、
ｇ．配列番号１３の軽鎖及び配列番号１４の重鎖、ならびに
ｈ．配列番号１５の軽鎖及び配列番号１６の重鎖を含む群から選択される重鎖及び軽鎖を含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の単離された抗体。
【請求項３２】
抗体が、配列番号１３の軽鎖及び配列番号１４の重鎖を含む、請求項３１に記載の単離された抗体。
【請求項３３】
抗体が、配列番号１５の軽鎖及び配列番号１６の重鎖を含む、請求項３１に記載の単離された抗体。
【請求項３４】
抗体が、３つの軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３）ならびに３つの重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及びＨＶＲ−Ｈ３）を含み、
（ａ）ＨＶＲ−Ｌ１が配列番号１のアミノ酸配列を含み、
（ｂ）ＨＶＲ−Ｌ２が配列番号２のアミノ酸配列を含み、
（ｃ）ＨＶＲ−Ｌ３が配列番号３のアミノ酸配列を含み、
（ｄ）ＨＶＲ−Ｈ１が配列番号４のアミノ酸配列を含み、
（ｅ）ＨＶＲ−Ｈ２が配列番号５のアミノ酸配列を含み、ならびに
（ｆ）ＨＶＲ−Ｈ３が配列番号６のアミノ酸配列を含む、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の単離された抗体。
【請求項３５】
抗体が、３つの軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３）ならびに３つの重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及びＨＶＲ−Ｈ３）を含み、
（ａ）ＨＶＲ−Ｌ１が配列番号７のアミノ酸配列を含み、
（ｂ）ＨＶＲ−Ｌ２が配列番号８のアミノ酸配列を含み、
（ｃ）ＨＶＲ−Ｌ３が配列番号９のアミノ酸配列を含み、
（ｄ）ＨＶＲ−Ｈ１が配列番号１０のアミノ酸配列を含み、
（ｅ）ＨＶＲ−Ｈ２が配列番号１１のアミノ酸配列を含み、ならびに
（ｆ）ＨＶＲ−Ｈ３が配列番号１２のアミノ酸配列を含む、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の単離された抗体。
【請求項３６】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体。
【請求項３７】
抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、親和性成熟抗体、ヒト抗体、及び二重特異性抗体からなる群から選択される、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の単離された抗体。
【請求項３８】
抗体が抗体断片である、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体。
【請求項３９】
請求項１〜３８のいずれか一項に記載の抗体をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項４０】
請求項３９に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項４１】
ベクターが発現ベクターである、請求項４０に記載のベクター。
【請求項４２】
請求項４０または４１に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項４３】
宿主細胞が原核細胞である、請求項４２に記載の宿主細胞。
【請求項４４】
宿主細胞が真核細胞である、請求項４２に記載の宿主細胞。
【請求項４５】
宿主細胞が哺乳類細胞である、請求項４２に記載の宿主細胞。
【請求項４６】
抗ＦＧＦＲ２／３抗体の作製方法であって、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の抗体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、前記ポリヌクレオチドが発現されるように培養することと、任意に、該抗体を該培養物から回収することと、を含む、方法。
【請求項４７】
宿主細胞が原核細胞である、請求項４６に記載の方法
【請求項４８】
宿主細胞が真核細胞である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
腫瘍、癌、または細胞増殖性障害の治療方法であって、該方法が、腫瘍、癌、または細胞増殖性障害を有する対象に、有効量の請求項１〜３８のいずれか一項に記載の抗ＦＧＦＲ３アンタゴニスト抗体を投与することを含み、それにより前記腫瘍、前記癌、または前記細胞増殖性障害が治療される、方法。
【請求項５０】
前記癌、前記腫瘍、または前記細胞増殖性障害が、多発性骨髄腫、膀胱癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、甲状腺癌、頭頸部癌、肝臓癌、乳癌、胃癌、または結腸直腸癌である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記癌、前記腫瘍、または前記細胞増殖性障害が、移行上皮癌である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記癌、前記腫瘍、または前記細胞増殖性障害が、浸潤性移行上皮癌である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
前記癌、前記腫瘍、または前記細胞増殖性障害が、多発性骨髄腫である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
前記癌、前記腫瘍、または前記細胞増殖性障害が、ＦＧＦＲ３転座を発現する、請求項４９〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記癌、前記腫瘍、または前記細胞増殖性障害が、変異ＦＧＦＲ３を発現する、請求項４９〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記癌、前記腫瘍、または前記細胞増殖性障害が、変異ＦＧＦＲ２を発現する、請求項４９〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記癌、前記腫瘍、または前記細胞増殖性障害が、該腫瘍または細胞が、ＦＧＦＲ２及び／またはＦＧＦＲ３を過剰発現する、請求項４９〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
変異が恒常的変異である、請求項５５または５６に記載の方法。
【請求項５９】
乳癌がトリプルネガティブ乳癌である、請求項５０に記載の方法。
【請求項６０】
癌が胃癌である、請求項５０に記載の方法。
【請求項６１】
対象に有効量の別の治療薬を投与することを更に含む、請求項４９〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
細胞増殖の阻害方法であって、該方法が、対象に有効量の請求項１〜３８のいずれか一項に記載の抗ＦＧＦＲ２／３抗体を投与することを含み、それにより該細胞増殖が阻害される、方法。
【請求項６３】
多発性骨髄腫細胞の枯渇方法であって、該方法が、対象に有効量の請求項１〜３８のいずれか一項に記載の抗ＦＧＦＲ２／３抗体を投与することを含み、それにより該多発性骨髄腫細胞が枯渇する、方法。
【請求項６４】
（ａ）ベータ−Ｋｌｏｔｈｏ（ＫＬＢ）、ＦＧＦＲ２、及びＦＧＦＲ３に結合する単離された二重特異性抗体またはその抗原結合部分、
（ｂ）ＫＬＢ、ＦＧＦＲ２、及びＦＧＦＲ３に結合する二重特異性抗体またはその抗原結合部分をコードする核酸、
（ｃ）ＫＬＢ、ＦＧＦＲ２、及びＦＧＦＲ３に結合する二重特異性抗体またはその抗原結合部分をコードする核酸を含む宿主細胞、
（ｄ）ＫＬＢ、ＦＧＦＲ２、及びＦＧＦＲ３に結合する単離された二重特異性抗体またはその抗原結合部分を含む薬学的製剤を含む、組成物。
【請求項６５】
二重特異性抗体またはその抗原結合部分が、ＦＧＦＲ２／３エピトープに結合し、かつ／またはＦＧＦＲ２／３エピトープへの結合において競合する、請求項６４に記載の組成物。
【請求項６６】
ＦＧＦＲ２／３エピトープが、ＴＮＴＥＫＭＥＫＲＬＨＡＶＰＡＡＮＴＶＫＦＲＣＰＡ（配列番号９１）及びＹＫＶＲＮＱＨＷＳＬＩＭＥＳ（配列番号９２）から選択されるＦＧＦＲ２エピトープである、請求項６５に記載の組成物。
【請求項６７】
ＦＧＦＲ２／３エピトープが、ＴＮＴＥＫＭＥＫＲＬＨＡＶＰＡＡＮＴＶＫＦＲＣＰＡ（配列番号９１）及びＹＫＶＲＮＱＨＷＳＬＩＭＥＳ（配列番号９２）の両方を含むＦＧＦＲ２エピトープである、請求項６５に記載の組成物。
【請求項６８】
ＦＧＦＲ２／３エピトープが、ＴＲＰＥＲＭＤＫＫＬＬＡＶＰＡＡＮＴＶＲＦＲＣＰＡ（配列番号９３）及びＩＫＬＲＨＱＱＷＳＬＶＭＥＳ（配列番号９４）から選択されるＦＧＦＲ３エピトープである、請求項６５に記載の組成物。
【請求項６９】
ＦＧＦＲ２／３エピトープが、ＴＲＰＥＲＭＤＫＫＬＬＡＶＰＡＡＮＴＶＲＦＲＣＰＡ（配列番号９３）及びＩＫＬＲＨＱＱＷＳＬＶＭＥＳ（配列番号９４）の両方を含むＦＧＦＲ２エピトープである、請求項６５に記載の組成物。
【請求項７０】
二重特異性抗体またはその抗原結合部分が、アミノ酸配列ＳＳＰＴＲＬＡＶＩＰＷＧＶＲＫＬＬＲＷＶＲＲＮＹＧＤＭＤＩＹＩＴＡＳ（配列番号１０３）からなるＫＬＢの断片内のＫＬＢエピトープに結合する、請求項６４〜６９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７１】
抗ＫＬＢ抗体またはその抗原結合部分が、
（ａ）配列番号１０８〜１２２からなる群から選択されるアミノ酸配列及びその保存的置換を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、
（ｂ）配列番号１３８〜１５３からなる群から選択されるアミノ酸配列及びその保存的置換を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２ドメインと、
（ｃ）配列番号１５４〜１６９からなる群から選択されるアミノ酸配列及びその保存的置換を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３ドメインと、を含む、請求項６４〜７０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７２】
抗ＫＬＢ抗体またはその抗原結合部分が、
（ａ）配列番号１７０〜１８４からなる群から選択されるアミノ酸配列及びその保存的置換を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１ドメインと、
（ｂ）配列番号１８５〜２００からなる群から選択されるアミノ酸配列及びその保存的置換を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２ドメインと、
（ｃ）配列番号２０１〜２１５からなる群から選択されるアミノ酸配列及びその保存的置換を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３ドメインと、を含む、請求項６４〜７１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７３】
抗ＦＧＦＲ２／３抗体またはその抗原結合部分が、３つの軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３）を含み、
（ａ）ＨＶＲ−Ｌ１が配列番号７のアミノ酸配列を含み、
（ｂ）ＨＶＲ−Ｌ２が配列番号８のアミノ酸配列を含み、
（ｃ）ＨＶＲ−Ｌ３が配列番号９のアミノ酸配列を含む、請求項６４〜７２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７４】
抗ＦＧＦＲ２／３抗体またはその抗原結合部分が、３つの重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及びＨＶＲ−Ｈ３）を含み、
（ａ）ＨＶＲ−Ｈ１が配列番号１０のアミノ酸配列を含み、
（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２が配列番号１１のアミノ酸配列を含み、
（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３が配列番号１２のアミノ酸配列を含む、請求項６４〜７３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７５】
抗ＦＧＦＲ２／３抗体またはその抗原結合部分が、３つの軽鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３）を含み、
（ａ）ＨＶＲ−Ｌ１が配列番号２７６のアミノ酸配列を含み、
（ｂ）ＨＶＲ−Ｌ２が配列番号２７７のアミノ酸配列を含み、
（ｃ）ＨＶＲ−Ｌ３が配列番号２７８のアミノ酸配列を含む、請求項６４〜７２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７６】
抗ＦＧＦＲ２／３抗体またはその抗原結合部分が、３つの重鎖超可変領域（ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及びＨＶＲ−Ｈ３）を含み、
（ａ）ＨＶＲ−Ｈ１が配列番号２７９のアミノ酸配列を含み、
（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２が配列番号２８０のアミノ酸配列を含み、
（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３が配列番号２８１のアミノ酸配列を含む、請求項６４〜７２及び７５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７７】
二重特異性抗体またはその抗原結合部分が、線維芽細胞成長因子受容体４（ＦＧＦＲ４）に更に結合する、請求項６４〜７６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７８】
組成物が薬学的に許容される担体を更に含む、請求項６４〜７７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７９】
多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）、メタボリック症候群（ＭｅｔＳ）、肥満、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、脂質異常症、高血圧症、２型糖尿病、非２型糖尿病、１型糖尿病、潜在性自己免疫性糖尿病（ＬＡＤ）、若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）、ならびに加齢及び関連疾患、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病及びＡＬＳ、バルデー・ビードル症候群、プラダー・ウィリ症候群、アルストレム症候群、コーエン症候群、オルブライト遺伝性骨異栄養症（偽性副甲状腺機能低下症）、カーペンター症候群、ＭＯＭＯ症候群、ルビンステイン・テイビ症候群、脆弱性Ｘ症候群、及びベルエソン・フォルスマン・レーマン症候群からなる群から選択される疾患を有する個体の治療方法であって、該個体に、有効量の請求項６４〜７８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合部分を投与することを含む、方法。
【請求項８０】
疾患がＮＡＳＨである、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
二重特異性抗体がインビボで血中グルコースレベルを低減する、請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
請求項６４〜７８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体の産生方法であって、ＫＬＢ、ＦＧＦＲ２、及びＦＧＦＲ３に結合する二重特異性抗体またはその抗原結合部分をコードする１つ以上の核酸を含む１つ以上の細胞を培養することを含む、方法。
【請求項８３】
代謝性疾患を治療するための医薬における使用のための請求項６４〜７８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体のうちのいずれかの使用であって、疾患が、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）、メタボリック症候群（ＭｅｔＳ）、肥満、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、脂質異常症、高血圧症、２型糖尿病、非２型糖尿病、１型糖尿病、潜在性自己免疫性糖尿病（ＬＡＤ）、若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）、ならびに加齢及び関連疾患、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病及びＡＬＳ、バルデー・ビードル症候群、プラダー・ウィリ症候群、アルストレム症候群、コーエン症候群、オルブライト遺伝性骨異栄養症（偽性副甲状腺機能低下症）、カーペンター症候群、ＭＯＭＯ症候群、ルビンステイン・テイビ症候群、脆弱性Ｘ症候群、及びベルエソン・フォルスマン・レーマン症候群からなる群から選択される、使用。
【請求項８４】
代謝性疾患を治療するための医薬における使用のための請求項６４〜７８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体のうちのいずれかの使用であって、代謝性疾患がＮＡＳＨである、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照により全体が本明細書に組み込まれる、２０１４年１１月５日出願の米国仮出願第６２／０７５，７４０号の優先権の利益を主張するものである。
【０００２】
配列表
なし。
【０００３】
本発明は、概して、二重特異性抗ＦＧＦＲ２／３抗体及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）及びそれらの受容体（ＦＧＦＲ）は、胚発育、組織ホメオスタシス、及び代謝中に重要な役割を果たす（Ｅｓｗａｒａｋｕｍａｒ，Ｖ．Ｐ．，Ｌａｘ，Ｉ．，ａｎｄ  Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．２００５．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｂｙ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ  １６：１３９−１４９、Ｌ’Ｈｏｔｅ，Ｃ．Ｇ．，ａｎｄ  Ｋｎｏｗｌｅｓ，Ｍ．Ａ．２００５．Ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ＦＧＦＲ３  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ：ｇｒｏｗｔｈ，ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ３０４：４１７−４３１、Ｄａｉｌｅｙ，Ｌ．，Ａｍｂｒｏｓｅｔｔｉ，Ｄ．，Ｍａｎｓｕｋｈａｎｉ，Ａ．，ａｎｄ  Ｂａｓｉｌｉｃｏ，Ｃ．２００５．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ＦＧＦ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ  １６：２３３−２４７）。ヒトにおいて、２２個のＦＧＦ（ＦＧＦ１〜１４、ＦＧＦ１６〜２３）及びチロシンキナーゼドメインを有する４個のＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ１〜４）が存在する。ＦＧＦＲは、２つまたは３つの免疫グロブリン様ドメイン（ＩｇＤ１〜３）を有する細胞外リガンド結合領域、１回膜貫通領域、及び細胞質性の分裂チロシンキナーゼドメインからなる。ＦＧＦＲ１、２、及び３は各々、ＩＩＩｂ及びＩＩＩｃと指定される２つの主要な選択的にスプライスされたアイソフォームを有する。これらのアイソフォームは、ＩｇＤ３の後半の約５０個のアミノ酸が異なり、はっきりと異なる組織分布及びリガンド特異性を有する。一般に、ＩＩＩｂアイソフォームが上皮細胞で見られる一方で、ＩＩＩｃは間葉細胞で発現する。ヘパラン硫酸プロテオグリカンと協調してＦＧＦに結合すると、ＦＧＦＲは二量体化し、特定のチロシン残基でリン酸化される。これにより、ＦＧＦＲ基質２α（ＦＲＳ２α）等の重要なアダプタータンパク質の動員が容易になり、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）及びＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ経路を含む複数のシグナル伝達カスケードの活性化をもたらす（Ｅｓｗａｒａｋｕｍａｒ，Ｖ．Ｐ．，Ｌａｘ，Ｉ．，ａｎｄ  Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．２００５．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｂｙ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ  １６：１３９−１４９、Ｄａｉｌｅｙ，Ｌ．，Ａｍｂｒｏｓｅｔｔｉ，Ｄ．，Ｍａｎｓｕｋｈａｎｉ，Ａ．，ａｎｄ  Ｂａｓｉｌｉｃｏ，Ｃ．２００５．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ＦＧＦ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ  １６：２３３−２４７、Ｍｏｈａｍｍａｄｉ，Ｍ．，Ｏｌｓｅｎ，Ｓ．Ｋ．，ａｎｄ  Ｉｂｒａｈｉｍｉ，Ｏ．Ａ．２００５．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ���ｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ  １６：１０７−１３７）。その結果として、ＦＧＦ及びそれらの同族受容体は、増殖、分化、遊走、及び生存を含む広範囲の細胞過程を文脈依存的様式で調節する。
【０００５】
異常に活性化されたＦＧＦＲは、特定のヒト悪性腫瘍に関与している（Ｅｓｗａｒａｋｕｍａｒ，Ｖ．Ｐ．，Ｌａｘ，Ｉ．，ａｎｄ  Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．２００５．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｂｙ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ  １６：１３９−１４９、Ｇｒｏｓｅ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｄｉｃｋｓｏｎ，Ｃ．２００５．Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ  １６：１７９−１８６）。具体的には、ｔ（４；１４）（ｐ１６．３；ｑ３２）染色体転座は、多発性骨髄腫患者の約１５〜２０％に起こり、ＦＧＦＲ３の過剰発現をもたらし、より短い全生存期間と相関する（Ｃｈａｎｇ，Ｈ．，Ｓｔｅｗａｒｔ，Ａ．Ｋ．，Ｑｉ，Ｘ．Ｙ．，Ｌｉ，Ｚ．Ｈ．，Ｙｉ，Ｑ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｔｒｕｄｅｌ，Ｓ．２００５．Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｃｃｕｒａｔｅｌｙ  ｐｒｅｄｉｃｔｓ  ＦＧＦＲ３  ａｂｅｒｒａｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｔ（４；１４）ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ．Ｂｌｏｏｄ  １０６：３５３−３５５、Ｃｈｅｓｉ，Ｍ．，Ｎａｒｄｉｎｉ，Ｅ．，Ｂｒｅｎｔｓ，Ｌ．Ａ．，Ｓｃｈｒｏｃｋ，Ｅ．，Ｒｉｅｄ，Ｔ．，Ｋｕｅｈｌ，Ｗ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｂｅｒｇｓａｇｅｌ，Ｐ．Ｌ．１９９７．Ｆｒｅｑｕｅｎｔ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｔ（４；１４）（ｐ１６．３；ｑ３２．３）ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １６：２６０−２６４、Ｆｏｎｓｅｃａ，Ｒ．，Ｂｌｏｏｄ，Ｅ．，Ｒｕｅ，Ｍ．，Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．，Ｏｋｅｎ，Ｍ．Ｍ．，Ｋｙｌｅ，Ｒ．Ａ．，Ｄｅｗａｌｄ，Ｇ．Ｗ．，Ｖａｎ  Ｎｅｓｓ，Ｂ．，Ｖａｎ  Ｗｉｅｒ，Ｓ．Ａ．，Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｋ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｂｅｒｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｍｙｅｌｏｍａ．Ｂｌｏｏｄ  １０１：４５６９−４５７５、Ｍｏｒｅａｕ，Ｐ．，Ｆａｃｏｎ，Ｔ．，Ｌｅｌｅｕ，Ｘ．，Ｍｏｒｉｎｅａｕ，Ｎ．，Ｈｕｙｇｈｅ，Ｐ．，Ｈａｒｏｕｓｓｅａｕ，Ｊ．Ｌ．，Ｂａｔａｉｌｌｅ，Ｒ．，ａｎｄ  Ａｖｅｔ−Ｌｏｉｓｅａｕ，Ｈ．２００２．Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  １４ｑ３２  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  ｔｈｅ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ  ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｂｌｏｏｄ  １００：１５７９−１５８３）。ＦＧＦＲ３は、骨髄腫培養細胞株への化学療法耐性の付与にも関与し（Ｐｏｌｌｅｔｔ，Ｊ．Ｂ．，Ｔｒｕｄｅｌ，Ｓ．，Ｓｔｅｒｎ，Ｄ．，Ｌｉ，Ｚ．Ｈ．，ａｎｄ  Ｓｔｅｗａｒｔ，���．Ｋ．２００２．Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｙｅｌｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３  ｃｏｎｆｅｒｓ  ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｂｌｏｏｄ  １００：３８１９−３８２１）、その化学療法耐性は、ｔ（４；１４）＋患者の従来の化学療法への臨床応答不良と一致する（Ｆｏｎｓｅｃａ，Ｒ．，Ｂｌｏｏｄ，Ｅ．，Ｒｕｅ，Ｍ．，Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．，Ｏｋｅｎ，Ｍ．Ｍ．，Ｋｙｌｅ，Ｒ．Ａ．，Ｄｅｗａｌｄ，Ｇ．Ｗ．，Ｖａｎ  Ｎｅｓｓ，Ｂ．，Ｖａｎ  Ｗｉｅｒ，Ｓ．Ａ．，Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｋ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｂｅｒｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｍｙｅｌｏｍａ．Ｂｌｏｏｄ  １０１：４５６９−４５７５）。突然変異で活性化されたＦＧＦＲ３の過剰発現は、造血細胞及び線維芽細胞で発癌性形質転換を誘導し（Ｂｅｒｎａｒｄ−Ｐｉｅｒｒｏｔ，Ｉ．，Ｂｒａｍｓ，Ａ．，Ｄｕｎｏｉｓ−Ｌａｒｄｅ，Ｃ．，Ｃａｉｌｌａｕｌｔ，Ａ．，Ｄｉｅｚ  ｄｅ  Ｍｅｄｉｎａ，Ｓ．Ｇ．，Ｃａｐｐｅｌｌｅｎ，Ｄ．，Ｇｒａｆｆ，Ｇ．，Ｔｈｉｅｒｙ，Ｊ．Ｐ．，Ｃｈｏｐｉｎ，Ｄ．，Ｒｉｃｏｌ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．２００６．Ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｕｔａｔｅｄ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３ｂ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２７：７４０−７４７、Ａｇａｚｉｅ，Ｙ．Ｍ．，Ｍｏｖｉｌｌａ，Ｎ．，Ｉｓｃｈｅｎｋｏ，Ｉ．，ａｎｄ  Ｈａｙｍａｎ，Ｍ．Ｊ．２００３．Ｔｈｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ＳＨＰ２  ｉｓ  ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｍｅｄｉａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２：６９０９−６９１８、Ｒｏｎｃｈｅｔｔｉ，Ｄ．，Ｇｒｅｃｏ，Ａ．，Ｃｏｍｐａｓｓｏ，Ｓ．，Ｃｏｌｏｍｂｏ，Ｇ．，Ｄｅｌｌ’Ｅｒａ，Ｐ．，Ｏｔｓｕｋｉ，Ｔ．，Ｌｏｍｂａｒｄｉ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｎｅｒｉ，Ａ．２００１．Ｄｅｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ＦＧＦＲ３  ｍｕｔａｎｔｓ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｗｉｔｈ  ｔ（４；１４）：ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｙ３７３Ｃ，  Ｋ６５０Ｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｎｏｖｅｌ  Ｇ３８４Ｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２０：３５５３−３５６２、Ｃｈｅｓｉ，Ｍ．，Ｂｒｅｎｔｓ，Ｌ．Ａ．，Ｅｌｙ，Ｓ．Ａ．，Ｂａｉｓ，Ｃ．，Ｒｏｂｂｉａｎｉ，Ｄ．Ｆ．，Ｍｅｓｒｉ，Ｅ．Ａ．，Ｋｕｅｈｌ，Ｗ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｂｅｒｇｓａｇｅｌ，Ｐ．Ｌ．２００１．Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３  ｉｓ  ａｎ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｔｈａｔ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ｔｕｍｏｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ．Ｂｌｏｏｄ  ９７：７２９−７３６、Ｐｌｏｗｒｉｇｈｔ，Ｅ．Ｅ．，Ｌｉ，Ｚ．，Ｂｅｒｇｓａｇｅｌ，Ｐ．Ｌ．，Ｃｈｅｓｉ，Ｍ．，Ｂａｒｂｅｒ，Ｄ．Ｌ．，Ｂｒａｎｃｈ，Ｄ．Ｒ．，Ｈａｗｌｅｙ，Ｒ．Ｇ．，ａｎｄ  Ｓｔｅｗａｒｔ，Ａ．Ｋ．２０００．Ｅｃｔｏｐｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｂｌｏｏｄ  ９５：９９２−９９８）、かつマウス骨髄移植モデルで発癌性形質転換を誘導するのに十分である（Ｃｈｅｎ，Ｊ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｉ．Ｒ．，Ｌｅｅ，Ｂ．Ｈ．，Ｄｕｃｌｏｓ，Ｎ．，Ｈｕｎｔｌｙ，Ｂ．Ｊ．，Ｄｏｎｏｇｈｕｅ，Ｄ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ，Ｄ．Ｇ．２００５．Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＦＧＦＲ３  ｍｕｔａｎｔｓ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＰＬＣｇａｍｍａ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｄ  −ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｆｏｒ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ  １０６：３２８−３３７、Ｌｉ，Ｚ．，Ｚｈｕ，Ｙ．Ｘ．，Ｐｌｏｗｒｉｇｈｔ，Ｅ．Ｅ．，Ｂｅｒｇｓａｇｅｌ，Ｐ．Ｌ．，Ｃｈｅｓｉ，Ｍ．，Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｂ．，Ｈａｗｌｅｙ，Ｔ．Ｓ．，Ｈａｗｌｅｙ，Ｒ．Ｇ．，ａｎｄ  Ｓｔｅｗａｒｔ，Ａ．Ｋ．２００１．Ｔｈｅ  ｍｙｅｌｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３  ｉｓ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｉｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ  ９７：２４１３−２４１９）。したがって、多発性骨髄腫における潜在的治療標的としてＦＧＦＲ３が提案されている。実際には、ＦＧＦＲを標的とするいくつかの小分子阻害剤は、ＦＧＦＲ３に選択的ではなく、ある特定の他のキナーゼに対して交差阻害活性を有するが、ＦＧＦＲ３陽性骨髄腫培養細胞及びマウスモデルにおけるＦＧＦＲ３陽性骨髄腫細胞に対する細胞毒性を実証している（Ｔｒｕｄｅｌ，Ｓ．，Ｅｌｙ，Ｓ．，Ｆａｒｏｏｑｉ，Ｙ．，Ａｆｆｅｒ，Ｍ．，Ｒｏｂｂｉａｎｉ，Ｄ．Ｆ．，Ｃｈｅｓｉ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｂｅｒｇｓａｇｅｌ，Ｐ．Ｌ．２００４．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｔ（４；１４）ｍｙｅｌｏｍａ．Ｂｌｏｏｄ  １０３：３５２１−３５２８、Ｔｒｕｄｅｌ，Ｓ．，Ｌｉ，Ｚ．Ｈ．，Ｗｅｉ，Ｅ．，Ｗｉｅｓｍａｎｎ，Ｍ．，Ｃｈａｎｇ，Ｈ．，Ｃｈｅｎ，Ｃ．，Ｒｅｅｃｅ，Ｄ．，Ｈｅｉｓｅ，Ｃ．，ａｎｄ  Ｓｔｅｗａｒｔ，Ａ．Ｋ．２００５．ＣＨＩＲ−２５８，ａ  ｎｏｖｅｌ，ｍｕｌｔｉｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔ（４；１４）  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ．Ｂｌｏｏｄ  １０５：２９４１−２９４８、Ｃｈｅｎ，Ｊ．，Ｌｅｅ，Ｂ．Ｈ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ���Ｉ．Ｒ．，Ｋｕｔｏｋ，Ｊ．Ｌ．，Ｍｉｔｓｉａｄｅｓ，Ｃ．Ｓ．，Ｄｕｃｌｏｓ，Ｎ．，Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．，Ａｄｅｌｓｐｅｒｇｅｒ，Ｊ．，Ｏｋａｂｅ，Ｒ．，Ｃｏｂｕｒｎ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．２００５．ＦＧＦＲ３  ａｓ  ａ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＰＫＣ４１２  ｉｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２４：８２５９−８２６７、Ｐａｔｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｌ．，Ｌｉ，Ｚ．，Ｗｅｎ，Ｘ．Ｙ．，Ｍａｓｉｈ−Ｋｈａｎ，Ｅ．，Ｃｈａｎｇ，Ｈ．，Ｐｏｌｌｅｔｔ，Ｊ．Ｂ．，Ｔｒｕｄｅｌ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｓｔｅｗａｒｔ，Ａ．Ｋ．２００４．Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３  ａｓ  ａ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ．Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  １２４：５９５−６０３、Ｇｒａｎｄ，Ｅ．Ｋ．，Ｃｈａｓｅ，Ａ．Ｊ．，Ｈｅａｔｈ，Ｃ．，Ｒａｈｅｍｔｕｌｌａ，Ａ．，ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ，Ｎ．Ｃ．２００４．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＦＧＦＲ３  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ：ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔ（４；１４）−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ＳＵ５４０２  ａｎｄ  ＰＤ１７３０７４．Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １８：９６２−９６６）。
【０００６】
ＦＧＦＲ３過剰発現は、膀胱癌の高い割合でも実証されている（Ｇｏｍｅｚ−Ｒｏｍａｎ，Ｊ．Ｊ．，Ｓａｅｎｚ，Ｐ．，Ｍｏｌｉｎａ，Ｍ．，Ｃｕｅｖａｓ  Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｊ．，Ｅｓｃｕｒｅｄｏ，Ｋ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｓ．，Ｊｕｎｑｕｅｒａ，Ｃ．，Ｓｉｍｏｎ，Ｌ．，Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ａ．，Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ  Ｂａｎｏｓ，Ｊ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．２００５．Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３  ｉｓ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｕｒｉｎａｒｙ  ｔｒａｃｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１：４５９−４６５、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｄ．Ｃ．，Ｂａｌｄｏ，Ｏ．，Ｈａｒｎｄｅｎ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｋｎｏｗｌｅｓ，Ｍ．Ａ．２００７．ＦＧＦＲ３  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｔｏ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｓｔａｔｕｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｖａｒｉａｂｌｅｓ  ｉｎ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ．Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２１３：９１−９８）。更に、ＦＧＦＲ３における体細胞活性化変異が乳頭癌の６０〜７０％及び筋肉浸潤性膀胱癌の１６〜２０％で確認されている（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｄ．Ｃ．，Ｂａｌｄｏ，Ｏ．，Ｈａｒｎｄｅｎ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｋｎｏｗｌｅｓ，Ｍ．Ａ．２００７．ＦＧＦＲ３  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｔｏ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｓｔａｔｕｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｖａｒｉａｂｌｅｓ  ｉｎ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ．Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２１３：９１−９８、ｖａｎ  Ｒｈｉｊｎ，Ｂ．Ｗ．，Ｍｏｎｔｉｒｏｎｉ，Ｒ．，Ｚｗａｒｔｈｏｆｆ，Ｅ．Ｃ．，Ｊｏｂｓｉｓ，Ａ．Ｃ．，ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｗａｓｔ，Ｔ．Ｈ．２００２．Ｆｒｅｑｕｅｎｔ  ＦＧＦＲ３  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ  ｐａｐｉｌｌｏｍａ．Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １９８：２４５−２５１）。細胞培養実験では、ＲＮＡ干渉（Ｂｅｒｎａｒｄ−Ｐｉｅｒｒｏｔ，Ｉ．，Ｂｒａｍｓ，Ａ．，Ｄｕｎｏｉｓ−Ｌａｒｄｅ，Ｃ．，Ｃａｉｌｌａｕｌｔ，Ａ．，Ｄｉｅｚ  ｄｅ  Ｍｅｄｉｎａ，Ｓ．Ｇ．，Ｃａｐｐｅｌｌｅｎ，Ｄ．，Ｇｒａｆｆ，Ｇ．，Ｔｈｉｅｒｙ，Ｊ．Ｐ．，Ｃｈｏｐｉｎ，Ｄ．，Ｒｉｃｏｌ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．２００６．Ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｕｔａｔｅｄ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３ｂ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２７：７４０−７４７、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｄ．Ｃ．，Ｈｕｒｓｔ，Ｃ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｋｎｏｗｌｅｓ，Ｍ．Ａ．２００７．Ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ  ｂｙ  ｓｈＲＮＡ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  Ｓ２４９Ｃ  ｍｕｔａｎｔ  ＦＧＦＲ３  ａｓ  ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔ  ｉｎ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２６：５８８９−５８９９）またはＦＧＦＲ３一本鎖Ｆｖ抗体断片が膀胱癌細胞増殖を阻害した（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｔｏｒｒｅｃｕａｄｒａｄａ，Ｊ．，Ｃｉｆｕｅｎｔｅｓ，Ｇ．，Ｌｏｐｅｚ−Ｓｅｒｒａ，Ｐ．，Ｓａｅｎｚ，Ｐ．，Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ａ．，ａｎｄ  Ｃａｓａｌ，Ｊ．Ｉ．２００５．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３  ｗｉｔｈ  ｈｕｍａｎ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１：６２８０−６２９０）。最近の研究では、ＦＧＦＲ３抗体−毒素コンジュゲートが、腫瘍へのＦＧＦＲ３媒介毒素送達により膀胱癌細胞株の異種移植片成長を減弱させることが証明された（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｔｏｒｒｅｃｕａｄｒａｄａ，Ｊ．Ｌ．，Ｃｈｅｕｎｇ，Ｌ．Ｈ．，Ｌｏｐｅｚ−Ｓｅｒｒａ，Ｐ．，Ｂａｒｄｅｒａｓ，Ｒ．，Ｃａｎａｍｅｒｏ，Ｍ．，Ｆｅｒｒｅｉｒｏ，Ｓ．，Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ，Ｍ．Ｇ．，ａｎｄ  Ｃａｓａｌ，Ｊ．Ｉ．２００８．Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ  ｉｎ  ａ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ７：８６２−８７３）。しかしながら、ＦＧＦＲ３シグナル伝達が実際にインビボにおける膀胱腫瘍成長の発癌性要因であるかは不明なままである。更に、膀胱癌におけるＦＧＦＲ３を標的とする治療可能性は、インビボモデルに基づいて定義されていない。ＦＧＦＲ３及び抗ＦＧＦＲ３抗体に関する刊行物としては、米国特許公開第２００５／０１４７６１２号、Ｒａｕｃｈｅｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８（４０）：３８１９４−３８２０５（２００３）、ＷＯ２００６／０４８８７７、Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｔｏｒｒｅｃｕａｄｒａｄａ  ｅｔ  ａｌ，（２００８）Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ７（４）：８６２−８７３、ＷＯ２００７／１４４８９３、Ｔｒｕｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）１０７（１０）：４０３９−４０４６、Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｔｏｒｒｅｃｕａｄｒａｄａ  ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１（１７）：６２８０−６２９０、Ｇｏｍｅｚ−Ｒｏｍａｎ  ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１：４５９−４６５、Ｄｉｒｅｎｚｏ，Ｒ  ｅｔ  ａｌ（２００７）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ＡＡＣＲ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｏ．２０８０、ＷＯ２０１０／００２８６２が挙げられる。ＦＧＦＲ３：抗ＦＧＦＲ３抗体の結晶構造は、米国特許公開第２０１００２９１１１４号に開示されている。
【０００７】
成体組織ホメオスタシスを乱すことなくＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３が阻害され得る一方で、特定の代謝機能を調節する密接に関連したＦＧＦＲ１及びＦＧＦＲ４を遮断することにより、大きな安全性リスクが生じる。米国特許公開第２０１００２９１１１４号に開示される抗ＦＧＦＲ３抗体を本明細書で再操作して、二重特異性でＦＧＦＲ３及びＦＧＦＲ２に結合するが、ＦＧＦＲ１及びＦＧＦＲ４を残す機能遮断抗体を作製した。したがって、ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３（すなわち、ＦＧＦＲ２／３）へのＦＧＦ結合を遮断し、それによりＦＧＦＲ１またはＦＧＦＲ４を遮断することなく下流シグナル伝達を阻害する二重特異性抗体を設計及び作製した。
【０００８】
治療薬として開発に最適な臨床属性を有する薬剤が依然として必要とされていることは明らかである。
【０００９】
本明細書に記載されるように、ＦＧＦＲ３に単一特異的に結合する抗体を、ＦＧＦＲ２への結合の動員及びＦＧＦＲ４への結合の除去を含む複数回の操作ラウンドにより他のＦＧＦＲファミリメンバーに結合するように再設計した。第１の操作ステップを行い、ファージディスプレイライブラリを使用してＦＧＦＲ２結合を獲得した。各ファージライブラリは、１つの接触ＣＤＲの変異誘発を構成し、変異誘発の範囲は、ライブラリサイズによって許容される数のそのＣＤＲ内の残基を網羅した。変異誘発のために複数の連続した位置を選択することにより、ＣＤＲ骨格にかなりの自由度を許可した。ＦＧＦＲ２に会合することができた結果として生じたクローンの大半が、ＣＤＲ  Ｈ２における５つ全ての変異を有した。結晶構造は、全範囲の変異誘発がＣＤＲループの形状の完全リモデリングとカップリングしたことを実証した。ＦＧＦＲ２へ結合を獲得した様々なＨ２変異体の特定によって証明されるように、ＣＤＲの空間的再編成の解決策は多数存在する。かかる多種多様の解決策は、典型的には、標準の親和性成熟実験からの結果とは見なされないので、回収された配列は、通常、個々のＣＤＲにわずかな位置しか含有しない。したがって、相同抗原に更なる特異性を得ることは、親和性成熟よりも高い変異誘発自由度を必要とし得る。
【００１０】
第２の操作ラウンドは、ＦＧＦＲ４結合を除去するための特異性の改良である。抗体ＣＤＲループと抗原表面との間の接触残基の詳細な構造分析を使用して、ファージディスプレイライブラリの設計を誘導した。選択された抗体変異形は、ＦＧＦＲ２／３への結合を保持した状態でＦＧＦＲ４結合の低減を示した。この特異性改良ステップの配列解決策は、第１の操作ラウンドと比較してより限定されていた。この改良ステップは、抗体再操作における密接に関連した抗原間の結合特異性を区別する能力を更に実証した。
【００１１】
本明細書に記載の抗体操作によって生成された二重特異性抗体は、２つの密接に関連した抗原、すなわち、ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３に結合する（抗ＦＧＦＲ２／３抗体）。これらの抗ＦＧＦＲ２／３抗体（２Ｂ．１．３抗体変異形）は、それらが同一の重鎖及び軽鎖を使用する通常のＩｇＧ分子である。本発明のある特定の抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、それぞれ、二価または一価様式で、２つのＦＧＦＲ２アイソフォーム、２つのＦＧＦＲ３アイソフォーム、または１つのＦＧＦＲ２アイソフォーム及び１つのＦＧＦＲ３アイソフォームに結合することができる。これは、一価様式で２つの異なる抗原に結合するために２つの異なる重鎖／軽鎖対を通常使用する従来の二重特異性ＩｇＧとは対照的である。記載される二重特異性抗体は、「ツーインワン」抗体といくつかの類似点を共有する（Ｇｒａｎｄ，Ｅ．Ｋ．，Ｃｈａｓｅ，Ａ．Ｊ．，Ｈｅａｔｈ，Ｃ．，Ｒａｈｅｍｔｕｌｌａ，Ａ．，ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ，Ｎ．Ｃ．２００４．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＦＧＦＲ３  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ：ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔ（４；１４）−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ＳＵ５４０２  ａｎｄ  ＰＤ１７３０７４．Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １８：９６２−９６６）。Ｂｏｓｔｒｏｍらは、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎの３つ全ての軽鎖ＣＤＲをランダム化し、第２の特異性、ならびに親特異性について選択した。予想通り、第２の特異性は、軽鎖ＣＤＲの主要な寄与因子に由来する（Ｇｒａｎｄ，Ｅ．Ｋ．，Ｃｈａｓｅ，Ａ．Ｊ．，Ｈｅａｔｈ，Ｃ．，Ｒａｈｅｍｔｕｌｌａ，Ａ．，ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ，Ｎ．Ｃ．２００４．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＦＧＦＲ３  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ：ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔ（４；１４）−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ＳＵ５４０２  ａｎｄ  ＰＤ１７３０７４．Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １８：９６２−９６６、Ｇｏｍｅｚ−Ｒｏｍａｎ，Ｊ．Ｊ．，Ｓａｅｎｚ，Ｐ．，Ｍｏｌｉｎａ，Ｍ．，Ｃｕｅｖａｓ  Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｊ．，Ｅｓｃｕｒｅｄｏ，Ｋ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｓ．，Ｊｕｎｑｕｅｒａ，Ｃ．，Ｓｉｍｏｎ，Ｌ．，Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ａ．，Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ  Ｂａｎｏｓ，Ｊ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．２００５．Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３  ｉｓ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｕｒｉｎａｒｙ  ｔｒａｃｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１：４５９−４６５）。ある事例では、ＥＧＦＲ及びＨｅｒ３は相同であるが、抗ＥＧＦＲ／Ｈｅｒ３「ツーインワン」抗体による結合エピトープは異なる（Ｇｏｍｅｚ−Ｒｏｍａｎ，Ｊ．Ｊ．，Ｓａｅｎｚ，Ｐ．，Ｍｏｌｉｎａ，Ｍ．，Ｃｕｅｖａｓ  Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｊ．，Ｅｓｃｕｒｅｄｏ，Ｋ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｓ．，Ｊｕｎｑｕｅｒａ，Ｃ．，Ｓｉｍｏｎ，Ｌ．，Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ａ．，Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ  Ｂａｎｏｓ，Ｊ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．２００５．Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３  ｉｓ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｕｒｉｎａｒｙ  ｔｒａｃｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１：４５９−４６５）。本明細書に記載のアプローチは、それが２つの相同抗原間の配列及び構造類似性を理解し、操作中に親エピトープを保持するようにより限定された組の変異誘発に焦点を当てるという点で「ツーインワン」抗体とは異なる。
【００１２】
本明細書に提示される抗体操作は、癌療法に潜在的有用性を有する既存の広範囲にわたって特徴付けられた抗体である抗ＦＧＦＲ抗体から開始した。第１の治療量モノクローナル抗体が１９８０年代半ばに導入されたため、トラスツズマブ、セツキシマブ、アダリムマブ、ベバシズマブ等を含む多くの臨床的及び商業的に成功した抗体薬物が異なる疾患分野に存在する。これらの抗体は、それらの分子標的の阻害において並外れた活性を呈した。その一方で、ＦＧＦＲファミリーと同様に、複数の相同タンパク質は、それらの様々な疾患関連の分子標的として追求されている。動物免疫化または他のディスプレイに基づくライブラリ選択のいずれかの機能的エピトープを標的とする抗体を得るための伝統的な発見ルートの成功は保証されていない。あるいは、本明細書に記載されるように、相同標的に対する特異性を得るように抗体を操作し、それにより、抗体発見の代替ルートを提供することができる。更に、このアプローチは、機能的エピトープを維持し、及び推定上生物学的機能も維持することによって、以前に開発された抗体の好ましい特性を利用する。臨床的抗体レパートリーが拡大するにつれて、より多くの抗体は、最初から発見される代わりに操作され得る。潜在的用途は、ＥＧＦＲファミリー（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｄ．Ｃ．，Ｂａｌｄｏ，Ｏ．，Ｈａｒｎｄｅｎ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｋｎｏｗｌｅｓ，Ｍ．Ａ．２００７．ＦＧＦＲ３  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｔｏ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｓｔａｔｕｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｖａｒｉａｂｌｅｓ  ｉｎ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ．Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２１３：９１−９８）、ＴＮＦＲファミリー（ｖａｎ  Ｒｈｉｊｎ，Ｂ．Ｗ．，Ｍｏｎｔｉｒｏｎｉ，Ｒ．，Ｚｗａｒｔｈｏｆｆ，Ｅ．Ｃ．，Ｊｏｂｓｉｓ，Ａ．Ｃ．，ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｗａｓｔ，Ｔ．Ｈ．２００２．Ｆｒｅｑｕｅｎｔ  ＦＧＦＲ３  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ  ｐａｐｉｌｌｏｍａ．Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １９８：２４５−２５１）、ＴＡＭファミリー（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｄ．Ｃ．，Ｈｕｒｓｔ，Ｃ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｋｎｏｗｌｅｓ，Ｍ．Ａ．２００７．Ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ  ｂｙ  ｓｈＲＮＡ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  Ｓ２４９Ｃ  ｍｕｔａｎｔ  ＦＧＦＲ３  ａｓ  ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔ  ｉｎ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２６：５８８９−５８９９、Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｔｏｒｒｅｃｕａｄｒａｄａ，Ｊ．，Ｃｉｆｕｅｎｔｅｓ，Ｇ．，Ｌｏｐｅｚ−Ｓｅｒｒａ，Ｐ．，Ｓａｅｎｚ，Ｐ．，Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ａ．，ａｎｄ  Ｃａｓａｌ，Ｊ．Ｉ．２００５．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３  ｗｉｔｈ  ｈｕｍａｎ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１：６２８０−６２９０）、エフリンファミリー（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｔｏｒｒｅｃｕａｄｒ��ｄａ，Ｊ．Ｌ．，Ｃｈｅｕｎｇ，Ｌ．Ｈ．，Ｌｏｐｅｚ−Ｓｅｒｒａ，Ｐ．，Ｂａｒｄｅｒａｓ，Ｒ．，Ｃａｎａｍｅｒｏ，Ｍ．，Ｆｅｒｒｅｉｒｏ，Ｓ．，Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ，Ｍ．Ｇ．，ａｎｄ  Ｃａｓａｌ，Ｊ．Ｉ．２００８．Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ  ｉｎ  ａ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ７：８６２−８７３）等の疾患標的として複数のメンバーを含むタンパク質ファミリーを含む。伝統的な発見過程において見られるように、相同体に対して操作された抗体は、新たな分子と見なされるべきであり、いずれの潜在的治療用途のためにも、それらの生化学的、生物物理学的、及び生物学的特性の完全な特徴付けを依然として必要とする。
【００１３】
特許出願及び刊行物を含む本明細書に引用される全ての参考文献は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、一部には、ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３（「ＦＧＦＲ２／３」）に結合する様々なＦＧＦＲ結合剤（抗体、及びその断片等）の特定に基づく。ＦＧＦＲ３は、重要かつ有利な治療標的を提示し、本発明は、それらの薬剤のＦＧＦＲ３への結合に基づく、具体的には、ＦＧＦＲに結合する薬剤に基づく組成物及び方法を提供する。具体的には、本発明は、それらの薬剤のＦＧＦＲ２／３への結合（すなわち、ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３に二重特異性を有するそれらの薬剤の結合）に基づく組成物及び方法を提供する。本明細書に記載の本発明のＦＧＦＲ２／３結合剤は、ＦＧＦＲ３及び／またはＦＧＦＲ２の発現及び／または活性に関連する病理学的状態の標的に使用するための重要な治療薬及び診断薬を提供する。したがって、本発明は、ＦＧＦＲ３及びＦＧＦＲ２結合に関連する方法、組成物、キット、及び製品を提供する。
【００１５】
本発明は、ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３に結合する抗体（抗ＦＧＦＲ２／３抗体）を提供する。一態様では、本発明は、ＦＧＦＲ３に結合する単離された抗体を特色とする。いくつかの実施形態では、本抗体は、ＦＧＦＲ３  ＩＩＩｂアイソフォーム及び／またはＦＧＦＲ３  ＩＩＩｃアイソフォームに結合する。いくつかの実施形態では、本抗体は、変異ＦＧＦＲ３（例えば、ＦＧＦＲ３  ＩＩＩｂ  Ｒ２４８Ｃ、Ｓ２４９Ｃ、Ｇ３７２Ｃ、Ｙ３７５Ｃ、Ｋ６５２Ｅのうちの１つ以上、及び／またはＦＧＦＲ３  ＩＩＩｃ  Ｒ２４８Ｃ、Ｓ２４９Ｃ、Ｇ３７０Ｃ、Ｙ３７３Ｃ、Ｋ６５０Ｅのうちの１つ以上）に結合する。いくつかの実施形態では、本抗体は、単量体ＦＧＦＲ３（例えば、単量体ＦＧＦＲ３  ＩＩＩｂ及び／またはＩＩＩｃアイソフォーム）に結合する。いくつかの実施形態では、本抗体は、例えば、二量体ＦＧＦＲ３形態に対して単量体ＦＧＦＲ３形態を安定させることによって、単量体ＦＧＦＲ３の形成を促進する。いくつかの実施形態では、本抗体は、ＦＧＦＲ２またはその変異形に結合する。いくつかの実施形態では、本抗体は、ＦＧＦＲ２及び本明細書に記載のＦＧＦＲ３変異形のうちのいずれか１つ以上に結合する。
【００１６】
一態様では、本発明は、単離された抗ＦＧＦＲ２／３抗体を提供し、本抗体の全長ＩｇＧ形態は、１×１０−７Ｍ以上の親和性（Ｋｄ）でヒトＦＧＦＲ３に結合する。一態様では、本発明は、単離された抗ＦＧＦＲ２／３抗体を提供し、本抗体の全長ＩｇＧ形態は、１×１０−７Ｍ以上の親和性（Ｋｄ）でヒトＦＧＦＲ２に結合する。当該技術分野で確立されているように、リガンドのその受容体への結合親和性は、様々なアッセイのうちのいずれかを使用して決定することができ、様々な定量値によって表すことができる。したがって、一実施形態では、結合親和性は、Ｋｄ値として表され、（例えば、結合力効果を最小限に抑えて）内因性結合親和性を反映する。一般に、かつ好ましくは、結合親和性は、無細胞設定か細胞結合設定かにかかわらず、インビトロで測定される。例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、及びＥＬＩＳＡを含む本明細書に記載のもの等の当該技術分野で既知のいくつかのアッセイのうちのいずれかを使用して、結合親和性測定値を得ることができる。いくつかの実施形態では、本抗体の全長ＩｇＧ形態は、１×１０−８Ｍ以上の親和性（Ｋｄ）、１×１０−９Ｍ以上の親和性（Ｋｄ）、または１×１０１０Ｍ以上の親和性（Ｋｄ）でヒトＦＧＦＲ３に結合する。いくつかの実施形態では、本抗体の全長ＩｇＧ形態は、１×１０−８Ｍ以上の親和性（Ｋｄ）、１×１０−９Ｍ以上の親和性（Ｋｄ）、または１×１０−１０Ｍ以上の親和性（Ｋｄ）でヒトＦＧＦＲ２に結合する。いくつかの実施形態では、本抗体の全長ＩｇＧ形態は、１×１０−８Ｍ以上の親和性（Ｋｄ）、１×１０−９Ｍ以上の親和性（Ｋｄ）、または１×１０-１０Ｍ以上の親和性（Ｋｄ）でヒトＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３に結合する。
【００１７】
概して、本発明の抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、アンタゴニスト抗体である。したがって、一態様では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ３活性（例えば、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ及び／またはＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ活性）を阻害する。いくつかの実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体（一般に二価形態のもの）は、実質的なＦＧＦＲ３アゴニスト機能を有しない。いくつかの実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３アンタゴニスト抗体（一般に二価形態のもの）は、ＦＧＦＲ３アゴニスト機能をほとんどまたは全く有しない。一実施形態では、本発明の抗体（一般に二価形態のもの）は、統計的に有意なバックグラウンドレベルを超えるＦＧＦＲ３アゴニスト活性レベルを呈しない。
【００１８】
一態様では、本抗体のＦＧＦＲ３への結合は、受容体のその受容体の別の単位との二量体化を阻害することができ、それにより、その受容体の活性化が阻害される（少なくとも部分的に、受容体の二量体化の欠如により）。阻害は、直接的または間接的であり得る。
【００１９】
一態様では、本発明は、実質的なアポトーシス活性を有しない（例えば、細胞、例えば、移行上皮癌細胞または多発性骨髄腫細胞、例えば、ｔ（４；１４）転座等のＦＧＦＲ３転座を含む多発性骨髄腫細胞等の移行上皮癌細胞または多発性骨髄腫細胞のアポトーシスを誘導しない）抗ＦＧＦＲ２／３抗体を提供する。いくつかの実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、アポトーシス機能をほとんどまたは全く有しない。いくつかの実施形態では、ＦＧＦＲ２／３抗体は、統計的に有意なバックグラウンドレベルを超えるアポトーシス機能を呈しない。
【００２０】
一態様では、本発明は、実質的なＦＧＦＲ３下方調節を誘導しない抗ＦＧＦＲ２／３抗体を提供する。いくつかの実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、受容体下方調節をほとんどまたは全く誘導しない。いくつかの実施形態では、ＦＧＦＲ２／３抗体は、統計的に有意なバックグラウンドレベルを超える受容体下方調節を誘導しない。
【００２１】
一態様では、本発明は、エフェクター機能を有する抗ＦＧＦＲ２／３抗体を提供する。一実施形態では、エフェクター機能は、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を含む。一実施形態では、本発明の抗ＦＧＦＲ２／３抗体（いくつかの実施形態では、ネイキッド抗ＦＧＦＲ２／３抗体）は、細胞、いくつかの実施形態では、多発性骨髄腫細胞（例えば、ｔ（４；１４）転座等の転座を含む多発性骨髄腫細胞）を死滅させることができる。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、１細胞当たり約１０，０００個以上のＦＧＦＲ３分子（例えば、１細胞当たり約１１，０００個、約１２，０００個、約１３，０００個、約１４，０００個、約１５，０００個、約１６，０００個、約１７，０００個、約１８，０００個、またはそれ以上のＦＧＦＲ３分子）を発現する細胞を死滅させることができる。他の実施形態では、細胞は、１細胞当たり約２０００個、約３０００個、約４０００個、約５０００個、約６０００個、約７０００個、約８０００個、またはそれ以上のＦＧＦＲ３分子を発現する。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、１細胞当たり約１０，０００個以上のＦＧＦＲ２分子（例えば、１細胞当たり約１１，０００個、約１２，０００個、約１３，０００個、約１４，０００個、約１５，０００個、約１６，０００個、約１７，０００個、約１８，０００個、またはそれ以上のＦＧＦＲ３分子）を発現する細胞を死滅させることができる。他の実施形態では、細胞は、１細胞当たり約２０００個、約３０００個、約４０００個、約５０００個、約６０００個、約７０００個、約８０００個、またはそれ以上のＦＧＦＲ２分子を発現する。
【００２２】
一態様では、本発明の抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、恒常的ＦＧＦＲ３活性を阻害する。いくつかの実施形態では、恒常的ＦＧＦＲ３活性は、リガンド依存性恒常的ＦＧＦＲ３活性である。いくつかの実施形態では、恒常的ＦＧＦＲ３活性は、リガンド非依存性恒常的ＦＧＦＲ３活性である。一態様では、本発明の抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、恒常的ＦＧＦＲ２活性を阻害する。一態様では、本発明の抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、恒常的ＦＧＦＲ２活性及びＦＧＦＲ３活性を阻害する。
【００２３】
一態様では、本発明の抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＲ２４８Ｃに対応する変異を含むＦＧＦＲ３を阻害する。本明細書で使用されるとき、「ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＲ２４８Ｃに対応する変異を含む」という用語は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ  Ｒ２４８に対応する位置にＲからＣへの変異を含むＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＲ２４８Ｃ及びＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＲ２４８Ｃ、ならびに更なるＦＧＦＲ３形態を包含するものと理解される。当業者であれば、ＦＧＦＲ３配列をアライメントして、それぞれのＦＧＦＲ３配列間の対応する残基を同定する方法、例えば、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ配列をＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ配列とアライメントして、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ内のＲ２４８位に対応するＦＧＦＲ３の位置を同定する方法を理解する。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＲ２４８Ｃ及び／またはＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＲ２４８Ｃを阻害する。
【００２４】
一態様では、本発明の抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＫ６５２Ｅに対応する変異を含むＦＧＦＲ３を阻害する。便宜上、「ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＫ６５２Ｅに対応する変異を含む」という用語は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ  Ｋ６５２に対応する位置にＫからＥへの変異を含むＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＫ６５２Ｅ及びＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＫ６５０Ｅ、ならびに更なるＦＧＦＲ３形態を包含するものと理解される。当業者であれば、ＦＧＦＲ３配列をアライメントして、それぞれのＦＧＦＲ３配列間の対応する残基を同定する方法、例えば、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ配列をＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ配列とアライメントして、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ内のＫ６５２位に対応するＦＧＦＲ３の位置を同定する方法を理解する。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＫ６５２Ｅ及び／またはＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＫ６５０Ｅを阻害する。
【００２５】
一態様では、本発明の抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＳ２４９Ｃに対応する変異を含むＦＧＦＲ３を阻害する。便宜上、「ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＳ２４９Ｃに対応する変異を含む」という用語は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ  Ｓ２４９に対応する位置にＳからＣへの変異を含むＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＳ２４９Ｃ及びＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＳ２４９Ｃ、ならびに更なるＦＧＦＲ３形態を包含するものと理解される。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＳ２４９Ｃ及び／またはＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＳ２４９Ｃを阻害する。
【００２６】
一態様では、本発明の抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＧ３７２Ｃに対応する変異を含むＦＧＦＲ３を阻害する。便宜上、「ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＧ３７２Ｃに対応する変異を含む」という用語は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ  Ｇ３７２に対応する位置にＧからＣへの変異を含むＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＧ３７２Ｃ及びＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＧ３７０Ｃ、ならびに更なるＦＧＦＲ３形態を包含するものと理解される。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＧ３７２Ｃ及び／またはＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＧ３７０Ｃを阻害する。
【００２７】
一態様では、本発明の抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＹ３７５Ｃに対応する変異を含むＦＧＦＲ３を阻害する。便宜上、「ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＹ３７５Ｃに対応する変異を含む」という用語は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ  Ｓ２４９に対応する位置にＳからＣへの変異を含むＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＹ３７５Ｃ及びＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＹ３７３Ｃ、ならびに更なるＦＧＦＲ３形態を包含するものと理解される。いくつかの実施形態では、本発明の抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＹ３７５Ｃ及び／またはＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＹ３７３Ｃを阻害する。
【００２８】
一態様では、本発明の抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、（ａ）ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＫ６５２Ｅ、ならびに（ｂ）ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＲ２４８Ｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＹ３７５Ｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＳ２４９Ｃ、及びＦＧＦＲ３ＩＩＩｂＧ３７２Ｃのうちの１つ以上を阻害する。
【００２９】
一態様では、本発明の抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、（ａ）ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＫ６５０Ｅ、ならびに（ｂ）ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＲ２４８Ｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＹ３７３Ｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＳ２４９Ｃ、及びＦＧＦＲ３ＩＩＩｃＧ３７０Ｃのうちの１つ以上を阻害する。
【００３０】
一態様では、本発明の抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、（ａ）ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＲ２４８Ｃ、ならびに（ｂ）ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＫ６５２Ｅ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＹ３７５Ｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＳ２４９Ｃ、及びＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＧ３７２Ｃのうちの１つ以上を阻害する。
【００３１】
一態様では、本発明の抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、（ａ）ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＲ２４８Ｃ、ならびに（ｂ）ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＫ６５０Ｅ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＹ３７３Ｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＳ２４９Ｃ、及びＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＧ３７０Ｃのうちの１つ以上を阻害する。
【００３２】
一態様では、本発明の抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、（ａ）ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＧ３７２Ｃ、ならびに（ｂ）ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＫ６５２Ｅ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＹ３７５Ｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＳ２４９Ｃ、及びＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＲ２４８Ｃのうちの１つ以上を阻害する。
【００３３】
一態様では、本発明の抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、（ａ）ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＧ３７０Ｃ、ならびに（ｂ）ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＫ６５０Ｅ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＹ３７３Ｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＳ２４９Ｃ、及びＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＲ２４８Ｃのうちの１つ以上を阻害する。
【００３４】
一態様では、本発明の抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＲ２４８Ｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＫ６５２Ｅ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＹ３７５Ｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＳ２４９Ｃ、及びＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＧ３７２Ｃを阻害する。
【００３５】
一態様では、本発明の抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＲ２４８Ｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＫ６５０Ｅ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＹ３７３Ｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＳ２４９Ｃ、及びＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＧ３７０Ｃを阻害する。
【００３６】
一態様では、本発明は、配列番号１：ＲＡＳＱＤＶＤＴＳＬＡ、配列番号２：ＳＡＳＦＬＹＳ、配列番号３：ＱＱＳＴＧＨＰＱＴ、配列番号４：ＧＦＰＦＴＳＱＧＩＳ、配列番号５：ＲＴＨＬＧＤＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ、及び配列番号６：ＡＲＴＹＧＩＹＤＴＹＤＫＹＴＥＹＶＭＤＹから選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの超可変領域（ＨＶＲ）配列を含む単離された抗ＦＧＦＲ２／３抗体を提供する。特定の一実施形態では、本発明は、ＨＶＲ−Ｌ１：ＲＡＳＱＤＶＤＴＳＬＡ、ＨＶＲ−Ｌ２：ＳＡＳＦＬＹＳ、ＨＶＲ−Ｌ３：ＱＱＳＴＧＨＰＱＴ、ＨＶＲ−Ｈ１：ＧＦＰＦＴＳＱＧＩＳ、ＨＶＲ−Ｈ２：ＲＴＨＬＧＤＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ、及びＨＶＲ−Ｈ３：ＡＲＴＹＧＩＹＤＴＹＤＫＹＴＥＹＶＭＤＹを含む２Ｂ．１．３．１０抗ＦＧＦＲ２／３抗体を提供する。
【００３７】
一態様では、本発明は、配列番号７：ＲＡＳＱＤＶＤＴＳＬＡ、配列番号８：ＳＡＳＦＬＹＳ、配列番号９：ＱＱＳＴＧＨＰＱＴ、配列番号１０：ＧＦＰＦＴＳＴＧＩＳ、配列番号１１：ＲＴＨＬＧＤＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ、及び配列番号１２：ＡＲＴＹＧＩＹＤＴＹＤＭＹＴＥＹＶＭＤＹから選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの超可変領域（ＨＶＲ）配列を含む単離された抗ＦＧＦＲ２／３抗体を提供する。特定の一実施形態では、本発明は、ＨＶＲ−Ｌ１：ＲＡＳＱＤＶＤＴＳＬＡ、ＨＶＲ−Ｌ２：ＳＡＳＦＬＹＳ、ＨＶＲ−Ｌ３：ＱＱＳＴＧＨＰＱＴ、ＨＶＲ−Ｈ１：ＧＦＰＦＴＳＴＧＩＳ、ＨＶＲ−Ｈ２：ＲＴＨＬＧＤＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ、及びＨＶＲ−Ｈ３：ＡＲＴＹＧＩＹＤＴＹＤＭＹＴＥＹＶＭＤＹを含む２Ｂ．１．３．１２抗ＦＧＦＲ２／３抗体を提供する。
【００３８】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗ＦＧＦＲ２／３抗体のＨＶＲ−Ｈ１は、配列番号４の４〜６位に配列ＦＴＳを含む。
【００３９】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗ＦＧＦＲ２／３抗体の少なくとも１つのＨＶＲは、変異形ＨＶＲであり、この変異形ＨＶＲ配列は、配列番号１〜６に示される配列の少なくとも１つの残基（少なくとも２つの残基、少なくとも３つ以上の残基）の修飾を含む。この修飾は、望ましくは、置換、挿入、または欠失である。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ−Ｌ１変異形は、１〜６つ（１、２、３、４、５、または６つ）の置換を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ−Ｌ２変異形は、１〜６つ（１、２、３、４、５、または６つ）の置換を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ−Ｌ３変異形は、１〜６つ（１、２、３、４、５、または６つ）の置換を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ−Ｈ１変異形は、１〜６つ（１、２、３、４、５、または６つ）の置換を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ−Ｈ２変異形は、１〜６つ（１、２、３、４、５、または６つ）の置換を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ−Ｈ３変異形は、１〜６つ（１、２、３、４、５、または６つ）の置換を含む。
【００４０】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗ＦＧＦＲ２／３抗体のＨＶＲ−Ｈ１は、変異形ＨＶＲ−Ｈ１であり、この変異形ＨＶＲ−Ｈ１は、アミノ酸Ｐ３及び／またはＱ７（配列番号４）に置換を含む。特定の実施形態では、変異形ＨＶＲ−Ｈ１は、Ｐ３Ｔ置換を含む。特定の実施形態では、変異形ＨＶＲ−Ｈ１は、Ｑ７ＴまたはＱ７Ｌ置換を含む。特定の実施形態では、変異形ＨＶＲ−Ｈ１は、Ｐ３Ｔ及びＱ７Ｌ置換を含む。特定の実施形態では、変異形ＨＶＲ−Ｈ１は、Ｐ３Ｔ及びＱ７Ｔ置換を含む。ある特定の実施形態では、変異形ＨＶＲ−Ｈ１は、表１１に列記される群：ＴＦＴＳＴ、ＰＦＴＳＬ、ＰＦＴＳＱ、及びＰＦＴＳＴから選択される配列を含む。
【００４１】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗ＦＧＦＲ２／３抗体のＨＶＲ−Ｈ３は、変異形ＨＶＲ−Ｈ３であり、この変異形ＨＶＲ−Ｈ３は、アミノ酸Ｔ９、Ｄ１１、及び／またはＫ１２（配列番号６）に置換を含む。特定の実施形態では、変異形ＨＶＲ−Ｈ３は、Ｔ９Ｉ置換を含む。特定の実施形態では、変異形ＨＶＲ−Ｈ３は、Ｔ９Ｌ置換を含む。特定の実施形態では、変異形ＨＶＲ−Ｈ３は、Ｄ１１Ｖ置換を含む。特定の実施形態では、変異形ＨＶＲ−Ｈ３は、Ｄ１１Ｇ置換を含む。特定の実施形態では、変異形ＨＶＲ−Ｈ３は、Ｄ１１Ｅ置換を含む。特定の実施形態では、変異形ＨＶＲ−Ｈ３は、Ｋ１２Ｄ置換を含む。特定の実施形態では、変異形ＨＶＲ−Ｈ３は、Ｋ１２Ｎ置換を含む。特定の実施形態では、変異形ＨＶＲ−Ｈ３は、Ｋ１２Ｇ置換を含む。特定の実施形態では、変異形ＨＶＲ−Ｈ３は、Ｋ１２Ｅ置換を含む。特定の実施形態では、変異形ＨＶＲ−Ｈ３は、Ｋ１２Ｍ置換を含む。特定の実施形態では、変異形ＨＶＲ−Ｈ３は、Ｔ９Ｌ、Ｄ１１Ｖ、及びＫ１２Ｄ置換を含む。特定の実施形態では、変異形ＨＶＲ−Ｈ３は、Ｋ１２Ｄ置換のみを含む。特定の実施形態では、変異形ＨＶＲ−Ｈ３は、Ｔ９Ｉ、Ｄ１１Ｇ、及びＫ１２Ｇ置換を含む。特定の実施形態では、変異形ＨＶＲ−Ｈ３は、Ｋ１２Ｅ置換のみを含む。特定の実施形態では、変異形ＨＶＲ−Ｈ３は、Ｔ９Ｉ及びＤ１１Ｅ置換を含む。特定の実施形態では、変異形ＨＶＲ−Ｈ３は、Ｋ１２Ｍ置換のみを含む。ある特定の実施形態では、変異形ＨＶＲ−Ｈ３は、表１１に列記される群：ＬＹＶＤ、ＴＹＤＮ、ＩＹＧＧ、ＴＹＤＥ、ＩＫＥＫ、ＴＹＤＫ、及びＴＹＤＭから選択される配列を含む。
【００４２】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗ＦＧＦＲ２／３抗体のＨＶＲ−Ｈ１は、変異形ＨＶＲ−Ｈ１であり、当該変異形ＨＶＲ−Ｈ１は、アミノ酸Ｐ３及び／またはＱ７（配列番号４）に置換を含み、本明細書に記載の抗ＦＧＦＲ２／３抗体のＨＶＲ−Ｈ３は、変異形ＨＶＲ−Ｈ３であり、当該変異形ＨＶＲ−Ｈ３は、アミノ酸Ｔ９、Ｄ１１、及び／またはＫ１２（配列番号６）に置換を含む。ある特定の実施形態では、本発明の抗ＦＧＦＲ２／３抗体の変異形ＨＶＲ−Ｈ１及びＨＶＲ−Ｈ３は、表１１に列記される群：ＴＦＴＳＴ（ＨＶＲ−Ｈ１）及びＬＹＶＤ（ＨＶＲ−Ｈ３）、ＴＦＴＳＴ（ＨＶＲ−Ｈ１）及びＴＹＤＮ（ＨＶＲ−Ｈ３）、ＴＦＴＳＴ（ＨＶＲ−Ｈ１）及びＩＹＧＧ（ＨＶＲ−Ｈ３）、ＴＦＴＳＴ（ＨＶＲ−Ｈ１）及びＴＹＤＥ（ＨＶＲ−Ｈ３）、ＰＦＴＳＬ（ＨＶＲ−Ｈ１）及びＩＹＥＫ（ＨＶＲ−Ｈ３）、ＰＦＴＳＱ（ＨＶＲ−Ｈ１）及びＴＹＤＫ（ＨＶＲ−Ｈ３）、ＰＦＴＳＴ（ＨＶＲ−Ｈ１）及びＴＹＤＭ（ＨＶＲ−Ｈ３）から選択される配列を含む。
【００４３】
ある特定の実施形態では、本発明の抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、配列番号１３〜４４に列挙される配列からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｈ２配列を含む。ある特定の実施形態では、本発明の抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、配列番号４５〜５０に列挙される配列からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｈ２配列を含む。
【００４４】
特定の実施形態では、本発明の抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ（配列番号５１及び５２）、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃ（配列番号５３及び５４）、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ（配列番号５５及び５６）、及び／またはＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ（配列番号５７及び５８）に結合する。ある特定の実施形態では、本発明の抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ、及びＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃに結合する。特定の実施形態では、本発明の抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ、及びＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃからなる群から選択されるＦＧＦＲに結合する。特定の実施形態では、本発明の抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ、及びＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃからなる群から選択される２つのＦＧＦＲに結合する。特定の実施形態では、本発明の抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ、及びＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃからなる群から選択される３つのＦＧＦＲに結合する。
【００４５】
本発明の抗体は、任意の好適なフレームワーク可変ドメイン配列を含み得るが、但し、ＦＧＦＲ３及びＦＧＦＲ２に対する結合活性が実質的に保持されることを条件とする。例えば、いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、ヒト下位群ＩＩＩ重鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。これらの抗体の一実施形態では、このフレームワークコンセンサス配列は、７１位、７３位、及び／または７８位に置換を含む。これらの抗体のいくつかの実施形態では、７１位はＡであり、７３位はＴであり、かつ／または７８位はＡである。一実施形態では、これらの抗体は、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）（米国特許第６，４０７，２１３号及び同第５，８２１，３３７号、ならびにＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００４），３４０（５）：１０７３−１０９３でも言及されている）の重鎖可変ドメインフレームワーク配列を含む。一実施形態では、これらの抗体は、ヒトκＩ軽鎖フレームワークコンセンサス配列を更に含む。具体的な一実施形態では、これらの抗体は、米国特許第６，４０７，２１３号及び同第５，８２１，３３７号に記載のｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８の軽鎖ＨＶＲ配列を含む。一実施形態では、これらの抗体は、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）（米国特許第６，４０７，２１３号及び同第５，８２１，３３７号、ならびにＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００４），３４０（５）：１０７３−１０９３）の軽鎖可変ドメイン配列を含む。
【００４６】
一実施形態では、本発明の抗体の軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号５９を含む。
【００４７】
一実施形態では、本発明の抗体の軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号６０を含む。
【００４８】
一実施形態では、本発明の抗体の軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号６１を含む。
【００４９】
一実施形態では、本発明の抗体の軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号６２を含む。
【００５０】
一実施形態では、本発明の抗体の軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号６３を含む。
【００５１】
一実施形態では、本発明の抗体の軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号６４を含む。
【００５２】
一実施形態では、本発明の抗体の軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号６５を含む。
【００５３】
一実施形態では、本発明の抗体の軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号６６を含む。
【００５４】
一実施形態では、本発明の抗体の重鎖のアミノ酸配列は、配列番号７５を含む。
【００５５】
一実施形態では、本発明の抗体の重鎖のアミノ酸配列は、配列番号７６を含む。
【００５６】
一実施形態では、本発明の抗体の重鎖のアミノ酸配列は、配列番号７７を含む。
【００５７】
一実施形態では、本発明の抗体の重鎖のアミノ酸配列は、配列番号７８を含む。
【００５８】
一実施形態では、本発明の抗体の重鎖のアミノ酸配列は、配列番号７９を含む。
【００５９】
一実施形態では、本発明の抗体の重鎖のアミノ酸配列は、配列番号８０を含む。
【００６０】
一実施形態では、本発明の抗体の重鎖のアミノ酸配列は、配列番号８１を含む。
【００６１】
一実施形態では、本発明の抗体の重鎖のアミノ酸配列は、配列番号８２を含む。
【００６２】
特定の実施形態では、本発明の抗体は、アミノ酸配列番号５９を含む軽鎖及び配列番号７５を含む重鎖アミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、本発明の抗体は、配列番号６０を含む軽鎖アミノ酸配列及び配列番号７６を含む重鎖アミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、本発明の抗体は、配列番号６１を含む軽鎖アミノ酸配列及び配列番号７７を含む重鎖アミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、本発明の抗体は、配列番号６２を含む軽鎖アミノ酸配列及び配列番号７８を含む重鎖アミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、本発明の抗体は、配列番号６３を含む軽鎖アミノ酸配列及び配列番号７９を含む重鎖アミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、本発明の抗体は、配列番号６４を含む軽鎖アミノ酸配列及び配列番号６０を含む重鎖アミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、本発明の抗体は、配列番号６５を含む軽鎖アミノ酸配列及び配列番号８１を含む重鎖アミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、本発明の抗体は、配列番号６６を含む軽鎖アミノ酸配列及び配列番号８２を含む重鎖アミノ酸配列を含む。
【００６３】
一実施形態では、本発明の抗体の軽鎖の核酸配列は、配列番号６７を含む。
【００６４】
一実施形態では、本発明の抗体の軽鎖の核酸配列は、配列番号６８を含む。
【００６５】
一実施形態では、本発明の抗体の軽鎖の核酸配列は、配列番号６９を含む。
【００６６】
一実施形態では、本発明の抗体の軽鎖の核酸配列は、配列番号７０を含む。
【００６７】
一実施形態では、本発明の抗体の軽鎖の核酸配列は、配列番号７１を含む。
【００６８】
一実施形態では、本発明の抗体の軽鎖の核酸配列は、配列番号７２を含む。
【００６９】
一実施形態では、本発明の抗体の軽鎖の核酸配列は、配列番号７３を含む。
【００７０】
一実施形態では、本発明の抗体の軽鎖の核酸配列は、配列番号７４を含む。
【００７１】
一実施形態では、本発明の抗体の重鎖の核酸配列は、配列番号８３を含む。
【００７２】
一実施形態では、本発明の抗体の重鎖の核酸配列は、配列番号８４を含む。
【００７３】
一実施形態では、本発明の抗体の重鎖の核酸配列は、配列番号８５を含む。
【００７４】
一実施形態では、本発明の抗体の重鎖の核酸配列は、配列番号８６を含む。
【００７５】
一実施形態では、本発明の抗体の重鎖の核酸配列は、配列番号８７を含む。
【００７６】
一実施形態では、本発明の抗体の重鎖の核酸配列は、配列番号８８を含む。
【００７７】
一実施形態では、本発明の抗体の重鎖の核酸配列は、配列番号８９を含む。
【００７８】
一実施形態では、本発明の抗体の重鎖の核酸配列は、配列番号９０を含む。
【００７９】
特定の実施形態では、本発明の抗体は、核酸配列番号６７を含む軽鎖及び配列番号８３を含む重鎖核酸配列を含む。特定の実施形態では、本発明の抗体は、配列番号６８を含む軽鎖核酸配列及び配列番号８４を含む重鎖核酸配列を含む。特定の実施形態では、本発明の抗体は、配列番号６９を含む軽鎖核酸配列及び配列番号８５を含む重鎖核酸配列を含む。特定の実施形態では、本発明の抗体は、配列番号７０を含む軽鎖核酸配列及び配列番号８６を含む重鎖核酸配列を含む。特定の実施形態では、本発明の抗体は、配列番号７１を含む軽鎖核酸配列及び配列番号８７を含む重鎖核酸配列を含む。特定の実施形態では、本発明の抗体は、配列番号７２を含む軽鎖核酸配列及び配列番号８８を含む重鎖核酸配列を含む。特定の実施形態では、本発明の抗体は、配列番号７３を含む軽鎖核酸配列及び配列番号８９を含む重鎖核酸配列を含む。特定の実施形態では、本発明の抗体は、配列番号７４を含む軽鎖核酸配列及び配列番号９０を含む重鎖核酸配列を含む。
【００８０】
ある特定の実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、配列番号６５を含む軽鎖アミノ酸配列及び配列番号８１を含む重鎖核酸配列を含む。特定の実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、以下のＣＤＲを有する：
ＨＶＲ−Ｌ１：ＲＡＳＱＤＶＤＴＳＬＡ（配列番号１）
ＨＶＲ−Ｌ２：ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号２）
ＨＶＲ−Ｌ３：ＱＱＳＴＧＨＰＱＴ（配列番号３）
ＨＶＲ−Ｈ１：ＧＦＰＦＴＳＱＧＩＳ（配列番号４）
ＨＶＲ−Ｈ２：ＲＴＨＬＧＤＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５）
ＨＶＲ−Ｈ３：ＡＲＴＹＧＩＹＤＴＹＤＫＹＴＥＹＶＭＤＹ（配列番号６）
【００８１】
ある特定の実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、配列番号６６を含む軽鎖アミノ酸配列及び配列番号８２を含む重鎖核酸配列を含む。ある特定の実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、以下のＣＤＲを有する：
ＨＶＲ−Ｌ１：ＲＡＳＱＤＶＤＴＳＬＡ（配列番号７）
ＨＶＲ−Ｌ２：ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号８）
ＨＶＲ−Ｌ３：ＱＱＳＴＧＨＰＱＴ（配列番号９）
ＨＶＲ−Ｈ１：ＧＦＰＦＴＳＴＧＩＳ（配列番号１０）
ＨＶＲ−Ｈ２：ＲＴＨＬＧＤＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１１）
ＨＶＲ−Ｈ３：ＡＲＴＹＧＩＹＤＴＹＤＭＹＴＥＹＶＭＤＹ（配列番号１２）
【００８２】
ある特定の実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ２（配列番号５２及び５４）のアミノ酸１５３〜２５１内の領域に結合する：
2017538442.tif 000002
【００８３】
ある特定の実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ３（配列番号５６及び５８）のアミノ酸１５０〜２４８内の領域に結合する：
2017538442.tif 000003
【００８４】
好ましい一実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ２（配列番号５２及び５４）のアミノ酸１５３〜２５１内の領域及びＦＧＦＲ３（配列番号５６及び５８）のアミノ酸１５０〜２４８内の領域に結合する。
【００８５】
ある特定の実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ２（配列番号５２及び５４）（図９）のアミノ酸１５７〜１８１（ＴＮＴＥＫＭＥＫＲＬＨＡＶＰＡＡＮＴＶＫＦＲＣＰＡ）内の領域に結合する。ある特定の実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ２（配列番号５２及び５４）（図９）のアミノ酸２０７〜２２０（ＹＫＶＲＮＱＨＷＳＬＩＭＥＳ）内の領域に結合する。特定の実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、配列番号５２とアライメントするＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂの領域に結合する。特定の実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、配列番号５４とアライメントするＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃの領域に結合する。
【００８６】
ある特定の実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ（配列番号５２）のアミノ酸１５７〜１８１（ＴＮＴＥＫＭＥＫＲＬＨＡＶＰＡＡＮＴＶＫＦＲＣＰＡ）に結合する。ある特定の実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃ（配列番号５４）のアミノ酸１５７〜１８１に結合する。ある特定の実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ２（配列番号５２及び５４）（図９）のアミノ酸２０７〜２２０（ＹＫＶＲＮＱＨＷＳＬＩＭＥＳ）に結合する。ある特定の実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ（配列番号５２）のアミノ酸２０７〜２２０に結合する。ある特定の実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃ（配列番号５４）のアミノ酸２０７〜２２０に結合する。
【００８７】
特定の一実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ２（配列番号５２及び５４）のアミノ酸１５７〜１８１（ＴＮＴＥＫＭＥＫＲＬＨＡＶＰＡＡＮＴＶＫＦＲＣＰＡ）内の領域及びＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ（配列番号５２及び５４）のアミノ酸２０７〜２２０（ＹＫＶＲＮＱＨＷＳＬＩＭＥＳ）内の領域に結合する。特定の一実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ２（配列番号５２及び５４）のアミノ酸１５７〜１８１（ＴＮＴＥＫＭＥＫＲＬＨＡＶＰＡＡＮＴＶＫＦＲＣＰＡ）及びＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ（配列番号５２及び５４）のアミノ酸２０７〜２２０（ＹＫＶＲＮＱＨＷＳＬＩＭＥＳ）に結合する。
【００８８】
ある特定の実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ（ＴＲＰＥＲＭＤＫＫＬＬＡＶＰＡＡＮＴＶＲＦＲＣＰＡ）（配列番号５６）のアミノ酸１５４〜１７８内の領域に結合する。ある特定の実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ）（配列番号５８）のアミノ酸１５４〜１７８（ＴＲＰＥＲＭＤＫＫＬＬＡＶＰＡＡＮＴＶＲＦＲＣＰＡ）内の領域に結合する。ある特定の実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ（配列番号５６）のアミノ酸２０４〜２１７（ＩＫＬＲＨＱＱＷＳＬＶＭＥＳ）内の領域に結合する。ある特定の実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ（配列番号５８）のアミノ酸２０４〜２１７（ＩＫＬＲＨＱＱＷＳＬＶＭＥＳ）内の領域に結合する。特定の実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、配列番号５６とアライメントするＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂの領域に結合する。特定の実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、配列番号５８とアライメントするＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂの領域に結合する。
【００８９】
特定の実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ（配列番号５６）のアミノ酸１５４〜１７８（ＴＲＰＥＲＭＤＫＫＬＬＡＶＰＡＡＮＴＶＲＦＲＣＰＡ）に結合する。特定の実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ（配列番号５８）のアミノ酸１５４〜１７８（ＴＲＰＥＲＭＤＫＫＬＬＡＶＰＡＡＮＴＶＲＦＲＣＰＡ）に結合する。特定の実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ（ＩＫＬＲＨＱＱＷＳＬＶＭＥＳ）（配列番号５６）のアミノ酸２０４〜２１７に結合する。特定の実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ（配列番号５８）のアミノ酸２０４〜２１７（ＩＫＬＲＨＱＱＷＳＬＶＭＥＳ）に結合する。
【００９０】
好ましい一実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ２の以下のエピトープに結合する：ＴＮＴＥＫＭＥＫＲＬＨＡＶＰＡＡＮＴＶＫＦＲＣＰＡ（配列番号９１）及びＹＫＶＲＮＱＨＷＳＬＩＭＥＳ（配列番号９２）。好ましい一実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ３の以下のエピトープに結合する：
ＴＲＰＥＲＭＤＫＫＬＬＡＶＰＡＡＮＴＶＲＦＲＣＰＡ（配列番号９３）及びＩＫＬＲＨＱＱＷＳＬＶＭＥＳ（配列番号９４）。好ましい実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、以下のエピトープに結合する：
ＦＧＦＲ２：ＴＮＴＥＫＭＥＫＲＬＨＡＶＰＡＡＮＴＶＫＦＲＣＰＡ（配列番号９１）及び
ＹＫＶＲＮＱＨＷＳＬＩＭＥＳ（配列番号９２）、ならびに
ＦＧＦＲ３：ＴＲＰＥＲＭＤＫＫＬＬＡＶＰＡＡＮＴＶＲＦＲＣＰＡ（配列番号９３）及び
ＩＫＬＲＨＱＱＷＳＬＶＭＥＳ（配列番号９４）。
【００９１】
ある特定の実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、配列番号９１〜９４に結合する。ある特定の実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、配列番号９１及び９２に結合する。ある特定の実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、配列番号９１〜９３に結合する。ある特定の実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、配列番号９１、９３、及び９４に結合する。ある特定の実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、配列番号９１及び９４に結合する。ある特定の実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、配列番号９２〜９４に結合する。ある特定の実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、配列番号９２及び９３に結合する。ある特定の実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、配列番号９２及び９４に結合する。ある特定の実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、配列番号９３及び９１に結合する。ある特定の実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、配列番号９１、９２、及び９４に結合する。ある特定の実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、配列番号９１〜９４に提供されるいずれか２つ以上のエピトープの組み合わせに結合する。
【００９２】
ある特定の実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ（配列番号５２）のアミノ酸１５３〜２５１内の領域に結合する。ある特定の実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃ（配列番号５４）のアミノ酸１５３〜２５１内の領域に結合する。好ましい実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ（配列番号５２）及びＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃ（配列番号５４）のアミノ酸１５３〜２５１内の領域に結合する。ある特定の実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ（配列番号５６）のアミノ酸１５０〜２４８内の領域に結合する。ある特定の実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ（配列番号５８）のアミノ酸１５０〜２４８内の領域に結合する。好ましい実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ（配列番号５６）及びＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ（配列番号５８）のアミノ酸１５０〜２４８内の領域に結合する。
【００９３】
好ましい一実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ（配列番号５２）及び／またはＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃ（配列番号５４）のアミノ酸１５３〜２５１内の領域、ならびにＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ（配列番号５６）及び／またはＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ（配列番号５８）のアミノ酸１５０〜２４８内の領域に結合する。
【００９４】
いくつかの実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ２（例えば、配列番号５２及び５４）のＴ１５７、Ｎ１５８、Ｔ１５９、Ｅ１６０、Ｋ１６１、Ｍ１６２、Ｅ１６３、Ｋ１６４、Ｒ１６５、Ｌ１６６、Ｈ１６７、Ａ１６８、Ｖ１６９、Ｐ１７０、Ａ１７１、Ａ１７２、Ｎ１７３、Ｔ１７４、Ｖ１７５、Ｋ１７６、Ｆ１７７、Ｒ１７８、Ｃ１７９、Ｐ１８０、及びＡ１８１から選択される１つ以上のアミノ酸を含むエピトープに結合する。  いくつかの実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ２（例えば、配列番号５２及び５４）のアミノ酸Ｔ１５７、Ｎ１５８、Ｔ１５９、Ｅ１６０、Ｋ１６１、Ｍ１６２、Ｅ１６３、Ｋ１６４、Ｒ１６５、Ｌ１６６、Ｈ１６７、Ａ１６８、Ｖ１６９、Ｐ１７０、Ａ１７１、Ａ１７２、Ｎ１７３、Ｔ１７４、Ｖ１７５、Ｋ１７６、Ｆ１７７、Ｒ１７８、Ｃ１７９、Ｐ１８０、及びＡ１８１を含むエピトープに結合する。  いくつかの実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ２に結合する場合、ＦＧＦＲ２（例えば、配列番号５２及び５４）の１つ以上のアミノ酸Ｔ１５７、Ｎ１５８、Ｔ１５９、Ｅ１６０、Ｋ１６１、Ｍ１６２、Ｅ１６３、Ｋ１６４、Ｒ１６５、Ｌ１６６、Ｈ１６７、Ａ１６８、Ｖ１６９、Ｐ１７０、Ａ１７１、Ａ１７２、Ｎ１７３、Ｔ１７４、Ｖ１７５、Ｋ１７６、Ｆ１７７、Ｒ１７８、Ｃ１７９、Ｐ１８０、及びＡ１８１から４オングストローム以下に位置付けられる。  いくつかの実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ２に結合する場合、ＦＧＦＲ２（例えば、配列番号５２及び５４）のアミノ酸Ｔ１５７、Ｎ１５８、Ｔ１５９、Ｅ１６０、Ｋ１６１、Ｍ１６２、Ｅ１６３、Ｋ１６４、Ｒ１６５、Ｌ１６６、Ｈ１６７、Ａ１６８、Ｖ１６９、Ｐ１７０、Ａ１７１、Ａ１７２、Ｎ１７３、Ｔ１７４、Ｖ１７５、Ｋ１７６、Ｆ１７７、Ｒ１７８、Ｃ１７９、Ｐ１８０、及びＡ１８１から４オングストローム以下に位置付けられる。  いくつかの実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ２に結合する場合、ＦＧＦＲ２（例えば、配列番号５２及び５４）の１つ以上のアミノ酸Ｔ１５７、Ｎ１５８、Ｔ１５９、Ｅ１６０、Ｋ１６１、Ｍ１６２、Ｅ１６３、Ｋ１６４、Ｒ１６５、Ｌ１６６、Ｈ１６７、Ａ１６８、Ｖ１６９、Ｐ１７０、Ａ１７１、Ａ１７２、Ｎ１７３、Ｔ１７４、Ｖ１７５、Ｋ１７６、Ｆ１７７、Ｒ１７８、Ｃ１７９、Ｐ１８０、及びＡ１８１から３．５オングストローム以下に位置付けられる。  いくつかの実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ２に結合する場合、ＦＧＦＲ２（例えば、配列番号５２及び５４）のアミノ酸Ｔ１５７、Ｎ１５８、Ｔ１５９、Ｅ１６０、Ｋ１６１、Ｍ１６２、Ｅ１６３、Ｋ１６４、Ｒ１６５、Ｌ１６６、Ｈ１６７、Ａ１６８、Ｖ１６９、Ｐ１７０、Ａ１７１、Ａ１７２、Ｎ１７３、Ｔ１７４、Ｖ１７５、Ｋ１７６、Ｆ１７７、Ｒ１７８、Ｃ１７９、Ｐ１８０、及びＡ１８１から３．５オングストローム以下に位置付けられる。  いくつかの実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ２に結合する場合、ＦＧＦＲ２（例えば、配列番号５２及び５４）の１つ以上のアミノ酸Ｔ１５７、Ｎ１５８、Ｔ１５９、Ｅ１６０、Ｋ１６１、Ｍ１６２、Ｅ１６３、Ｋ１６４、Ｒ１６５、Ｌ１６６、Ｈ１６７、Ａ１６８、Ｖ１６９、Ｐ１７０、Ａ１７１、Ａ１７２、Ｎ１７３、Ｔ１７４、Ｖ１７５、Ｋ１７６、Ｆ１７７、Ｒ１７８、Ｃ１７９、Ｐ１８０、及びＡ１８１から３．０オングストローム以下に位置付けられる。  いくつかの実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ２に結合する場合、ＦＧＦＲ２（例えば、配列番号５２及び５４）のアミノ酸Ｔ１５７、Ｎ１５８、Ｔ１５９、Ｅ１６０、Ｋ１６１、Ｍ１６２、Ｅ１６３、Ｋ１６４、Ｒ１６５、Ｌ１６６、Ｈ１６７、Ａ１６８、Ｖ１６９、Ｐ１７０、Ａ１７１、Ａ１７２、Ｎ１７３、Ｔ１７４、Ｖ１７５、Ｋ１７６、Ｆ１７７、Ｒ１７８、Ｃ１７９、Ｐ１８０、及びＡ１８１から３．０オングストローム以下に位置付けられる。  いくつかの実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ２に結合する場合、ＦＧＦＲ２（例えば、配列番号５２及び５４）の１つ以上のアミノ酸Ｔ１５７、Ｎ１５８、Ｔ１５９、Ｅ１６０、Ｋ１６１、Ｍ１６２、Ｅ１６３、Ｋ１６４、Ｒ１６５、Ｌ１６６、Ｈ１６７、Ａ１６８、Ｖ１６９、Ｐ１７０、Ａ１７１、Ａ１７２、Ｎ１７３、Ｔ１７４、Ｖ１７５、Ｋ１７６、Ｆ１７７、Ｒ１７８、Ｃ１７９、Ｐ１８０、及びＡ１８１から４．０、３．７５、３．５、３．２５、または３．０オングストローム以下に位置付けられる。いくつかの実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ２に結合する場合、ＦＧＦＲ２（例えば、配列番号５２及び５４）のアミノ酸Ｔ１５７、Ｎ１５８、Ｔ１５９、Ｅ１６０、Ｋ１６１、Ｍ１６２、Ｅ１６３、Ｋ１６４、Ｒ１６５、Ｌ１６６、Ｈ１６７、Ａ１６８、Ｖ１６９、Ｐ１７０、Ａ１７１、Ａ１７２、Ｎ１７３、Ｔ１７４、Ｖ１７５、Ｋ１７６、Ｆ１７７、Ｒ１７８、Ｃ１７９、Ｐ１８０、及びＡ１８１から４．０、３．７５、３．５、３．２５、または３．０オングストローム以下に位置付けられる。いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸及び／または１つ以上のアミノ酸残基は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、及び／または１２個のアミノ酸及び／またはアミノ酸残基のうちのおよそいずれかである。いくつかの実施形態では、エピトープは、結晶学（例えば、実施例に記載の結晶学法）によって決定される。好ましい実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ヒトＦＧＦＲ２（ｈＦＧＦＲ２）（例えば、配列番号５２及び５４）に結合する。
【００９５】
いくつかの実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ２（例えば、配列番号５２及び５４）のＹ２０７、Ｋ２０８、Ｖ２０９、Ｒ２１０、Ｎ２１１、Ｑ２１２、Ｈ２１３、Ｗ２１４、Ｓ２１５、Ｌ２１６、Ｉ２１７、Ｍ２１８、Ｅ２１９、及びＳ２２０から選択される１つ以上のアミノ酸を含むエピトープに結合する。  いくつかの実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ２（例えば、配列番号５２及び５４）のアミノ酸Ｙ２０７、Ｋ２０８、Ｖ２０９、Ｒ２１０、Ｎ２１１、Ｑ２１２、Ｈ２１３、Ｗ２１４、Ｓ２１５、Ｌ２１６、Ｉ２１７、Ｍ２１８、Ｅ２１９、及びＳ２２０を含むエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ２に結合する場合、ＦＧＦＲ２（例えば、配列番号５２及び５４）の１つ以上のアミノ酸Ｙ２０７、Ｋ２０８、Ｖ２０９、Ｒ２１０、Ｎ２１１、Ｑ２１２、Ｈ２１３、Ｗ２１４、Ｓ２１５、Ｌ２１６、Ｉ２１７、Ｍ２１８、Ｅ２１９、及びＳ２２０から４オングストローム以下に位置付けられる。いくつかの実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ２に結合する場合、ＦＧＦＲ２（例えば、配列番号５２及び５４）のアミノ酸Ｙ２０７、Ｋ２０８、Ｖ２０９、Ｒ２１０、Ｎ２１１、Ｑ２１２、Ｈ２１３、Ｗ２１４、Ｓ２１５、Ｌ２１６、Ｉ２１７、Ｍ２１８、Ｅ２１９、及びＳ２２０から４オングストローム以下に位置付けられる。いくつかの実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ２に結合する場合、ＦＧＦＲ２（例えば、配列番号５２及び５４）の１つ以上のアミノ酸Ｙ２０７、Ｋ２０８、Ｖ２０９、Ｒ２１０、Ｎ２１１、Ｑ２１２、Ｈ２１３、Ｗ２１４、Ｓ２１５、Ｌ２１６、Ｉ２１７、Ｍ２１８、Ｅ２１９、及びＳ２２０から３．５オングストローム以下に位置付けられる。いくつかの実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ２に結合する場合、ＦＧＦＲ２（例えば、配列番号５２及び５４）のアミノ酸Ｙ２０７、Ｋ２０８、Ｖ２０９、Ｒ２１０、Ｎ２１１、Ｑ２１２、Ｈ２１３、Ｗ２１４、Ｓ２１５、Ｌ２１６、Ｉ２１７、Ｍ２１８、Ｅ２１９、及びＳ２２０から３．５オングストローム以下に位置付けられる。いくつかの実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ２に結合する場合、ＦＧＦＲ２（例えば、配列番号５２及び５４）の１つ以上のアミノ酸Ｙ２０７、Ｋ２０８、Ｖ２０９、Ｒ２１０、Ｎ２１１、Ｑ２１２、Ｈ２１３、Ｗ２１４、Ｓ２１５、Ｌ２１６、Ｉ２１７、Ｍ２１８、Ｅ２１９、及びＳ２２０から３．０オングストローム以下に位置付けられる。いくつかの実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ２に結合する場合、ＦＧＦＲ２（例えば、配列番号５２及び５４）のアミノ酸Ｙ２０７、Ｋ２０８、Ｖ２０９、Ｒ２１０、Ｎ２１１、Ｑ２１２、Ｈ２１３、Ｗ２１４、Ｓ２１５、Ｌ２１６、Ｉ２１７、Ｍ２１８、Ｅ２１９、及びＳ２２０から３．０オングストローム以下に位置付けられる。いくつかの実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ２に結合する場合、ＦＧＦＲ２（例えば、配列番号５２及び５４）の１つ以上のアミノ酸Ｙ２０７、Ｋ２０８、Ｖ２０９、Ｒ２１０、Ｎ２１１、Ｑ２１２、Ｈ２１３、Ｗ２１４、Ｓ２１５、Ｌ２１６、Ｉ２１７、���２１８、Ｅ２１９、及びＳ２２０から４．０、３．７５、３．５、３．２５、または３．０オングストローム以下に位置付けられる。いくつかの実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ２に結合する場合、ＦＧＦＲ２（例えば、配列番号５２及び５４）のアミノ酸Ｙ２０７、Ｋ２０８、Ｖ２０９、Ｒ２１０、Ｎ２１１、Ｑ２１２、Ｈ２１３、Ｗ２１４、Ｓ２１５、Ｌ２１６、Ｉ２１７、Ｍ２１８、Ｅ２１９、及びＳ２２０から４．０、３．７５、３．５、３．２５、または３．０オングストローム以下に位置付けられる。いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸及び／または１つ以上のアミノ酸残基は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、及び／または１２個のアミノ酸及び／またはアミノ酸残基のうちのおよそいずれかである。いくつかの実施形態では、エピトープは、結晶学（例えば、実施例に記載の結晶学法）によって決定される。）。好ましい実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ヒトＦＧＦＲ２（ｈＦＧＦＲ２）（例えば、配列番号５２及び５４）に結合する。  
【００９６】
いくつかの実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ３（例えば、配列番号５６及び５８）のＴ１５４、Ｒ１５５、Ｐ１５６、Ｅ１５７、Ｒ１５８、Ｍ１５９、Ｄ１６０、Ｋ１６１、Ｋ１６２、Ｌ１６３、Ｌ１６４、Ａ１６５、Ｖ１６６、Ｐ１６７、Ａ１６８、Ａ１６９、Ｎ１７０、Ｔ１７１、Ｖ１７２、Ｒ１７３、Ｆ１７４、Ｒ１７５、Ｃ１７６、Ｐ１７７、及びＡ１７８から選択される１つ以上のアミノ酸を含むエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ３（例えば、配列番号５６及び５８）のアミノ酸Ｔ１５４、Ｒ１５５、Ｐ１５６、Ｅ１５７、Ｒ１５８、Ｍ１５９、Ｄ１６０、Ｋ１６１、Ｋ１６２、Ｌ１６３、Ｌ１６４、Ａ１６５、Ｖ１６６、Ｐ１６７、Ａ１６８、Ａ１６９、Ｎ１７０、Ｔ１７１、Ｖ１７２、Ｒ１７３、Ｆ１７４、Ｒ１７５、Ｃ１７６、Ｐ１７７、及びＡ１７８を含むエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ３に結合する場合、ＦＧＦＲ３（例えば、配列番号５６及び５８）の１つ以上のアミノ酸Ｔ１５４、Ｒ１５５、Ｐ１５６、Ｅ１５７、Ｒ１５８、Ｍ１５９、Ｄ１６０、Ｋ１６１、Ｋ１６２、Ｌ１６３、Ｌ１６４、Ａ１６５、Ｖ１６６、Ｐ１６７、Ａ１６８、Ａ１６９、Ｎ１７０、Ｔ１７１、Ｖ１７２、Ｒ１７３、Ｆ１７４、Ｒ１７５、Ｃ１７６、Ｐ１７７、及びＡ１７８から４オングストローム以下に位置付けられる。いくつかの実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ３に結合する場合、ＦＧＦＲ３（例えば、配列番号５６及び５８）のアミノ酸Ｔ１５４、Ｒ１５５、Ｐ１５６、Ｅ１５７、Ｒ１５８、Ｍ１５９、Ｄ１６０、Ｋ１６１、Ｋ１６２、Ｌ１６３、Ｌ１６４、Ａ１６５、Ｖ１６６、Ｐ１６７、Ａ１６８、Ａ１６９、Ｎ１７０、Ｔ１７１、Ｖ１７２、Ｒ１７３、Ｆ１７４、Ｒ１７５、Ｃ１７６、Ｐ１７７、及びＡ１７８から４オングストローム以下に位置付けられる。いくつかの実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ３に結合する場合、ＦＧＦＲ３（例えば、配列番号５６及び５８）の１つ以上のアミノ酸Ｔ１５４、Ｒ１５５、Ｐ１５６、Ｅ１５７、Ｒ１５８、Ｍ１５９、Ｄ１６０、Ｋ１６１、Ｋ１６２、Ｌ１６３、Ｌ１６４、Ａ１６５、Ｖ１６６、Ｐ１６７、Ａ１６８、Ａ１６９、Ｎ１７０、Ｔ１７１、Ｖ１７２、Ｒ１７３、Ｆ１７４、Ｒ１７５、Ｃ１７６、Ｐ１７７、及びＡ１７８から３．５オングストローム以下に位置付けられる。いくつかの実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ３に結合する場合、ＦＧＦＲ３（例えば、配列番号５６及び５８）のアミノ酸Ｔ１５４、Ｒ１５５、Ｐ１５６、Ｅ１５７、Ｒ１５８、Ｍ１５９、Ｄ１６０、Ｋ１６１、Ｋ１６２、Ｌ１６３、Ｌ１６４、Ａ１６５、Ｖ１６６、Ｐ１６７、Ａ１６８、Ａ１６９、Ｎ１７０、Ｔ１７１、Ｖ１７２、Ｒ１７３、Ｆ１７４、Ｒ１７５、Ｃ１７６、Ｐ１７７、及びＡ１７８から３．５オングストローム以下に位置付けられる。いくつかの実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ３に結合する場合、ＦＧＦＲ３（例えば、配列番号５６及び５８）の１つ以上のアミノ酸Ｔ１５４、Ｒ１５５、Ｐ１５６、Ｅ１５７、Ｒ１５８、Ｍ１５９、Ｄ１６０、Ｋ１６１、Ｋ１６２、Ｌ１６３、Ｌ１６４、Ａ１６５、Ｖ１６６、Ｐ１６７、Ａ１６８、Ａ１６９、Ｎ１７０、Ｔ１７１、Ｖ１７２、Ｒ１７３、Ｆ１７４、Ｒ１７５、Ｃ１７６、Ｐ１７７、及びＡ１７８から３．０オングストローム以下に位置付けられる。いくつかの実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ３に結合する場合、ＦＧＦＲ３（例えば、配列番号５６及び５８）のアミノ酸Ｔ１５４、Ｒ１５５、Ｐ１５６、Ｅ１５７、Ｒ１５８、Ｍ１５９、Ｄ１６０、Ｋ１６１、Ｋ１６２、Ｌ１６３、Ｌ１６４、Ａ１６５、Ｖ１６６、Ｐ１６７、Ａ１６８、Ａ１６９、Ｎ１７０、Ｔ１７１、Ｖ１７２、Ｒ１７３、Ｆ１７４、Ｒ１７５、Ｃ１７６、Ｐ１７７、及びＡ１７８から３．０オングストローム以下に位置付けられる。いくつかの実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ３に結合する場合、ＦＧＦＲ３（例えば、配列番号５６及び５８）の１つ以上のアミノ酸Ｔ１５４、Ｒ１５５、Ｐ１５６、Ｅ１５７、Ｒ１５８、Ｍ１５９、Ｄ１６０、Ｋ１６１、Ｋ１６２、Ｌ１６３、Ｌ１６４、Ａ１６５、Ｖ１６６、Ｐ１６７、Ａ１６８、Ａ１６９、Ｎ１７０、Ｔ１７１、Ｖ１７２、Ｒ１７３、Ｆ１７４、Ｒ１７５、Ｃ１７６、Ｐ１７７、及びＡ１７８から４．０、３．７５、３．５、３．２５、または３．０オングストローム以下に位置付けられる。いくつかの実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ３に結合する場合、ＦＧＦＲ３（例えば、配列番号５６及び５８）のアミノ酸Ｔ１５４、Ｒ１５５、Ｐ１５６、Ｅ１５７、Ｒ１５８、Ｍ１５９、Ｄ１６０、Ｋ１６１、Ｋ１６２、Ｌ１６３、Ｌ１６４、Ａ１６５、Ｖ１６６、Ｐ１６７、Ａ１６８、Ａ１６９、Ｎ１７０、Ｔ１７１、Ｖ１７２、Ｒ１７３、Ｆ１７４、Ｒ１７５、Ｃ１７６、Ｐ１７７、及びＡ１７８から４．０、３．７５、３．５、３．２５、または３．０オングストローム以下に位置付けられる。いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸及び／または１つ以上のアミノ酸残基は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、及び／または１２個のアミノ酸及び／またはアミノ酸残基のうちのおよそいずれかである。いくつかの実施形態では、エピトープは、結晶学（例えば、実施例に記載の結晶学法）によって決定される。好ましい実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ヒトＦＧＦＲ３（ｈＦＧＦＲ３）（例えば、配列番号５６及び５８）に結合する。
【００９７】
いくつかの実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ３（例えば、配列番号５６及び５８）のＩ２０４、Ｋ２０５、Ｌ２０６、Ｒ２０７、Ｈ２０８、Ｑ２０９、Ｑ２１０、Ｗ２１１、Ｓ２１２、Ｌ２１３、Ｖ２１４、Ｍ２１５、Ｅ２１６、及びＳ２１７から選択される１つ以上のアミノ酸を含むエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ３（例えば、配列番号５６及び５８）のアミノ酸Ｉ２０４、Ｋ２０５、Ｌ２０６、Ｒ２０７、Ｈ２０８、Ｑ２０９、Ｑ２１０、Ｗ２１１、Ｓ２１２、Ｌ２１３、Ｖ２１４、Ｍ２１５、Ｅ２１６、及びＳ２１７を含むエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ３に結合する場合、ＦＧＦＲ３（例えば、配列番号５６及び５８）の１つ以上のアミノ酸Ｉ２０４、Ｋ２０５、Ｌ２０６、Ｒ２０７、Ｈ２０８、Ｑ２０９、Ｑ２１０、Ｗ２１１、Ｓ２１２、Ｌ２１３、Ｖ２１４、Ｍ２１５、Ｅ２１６、及びＳ２１７から４オングストローム以下に位置付けられる。いくつかの実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ３に結合する場合、ＦＧＦＲ３（例えば、配列番号５６及び５８）のアミノ酸Ｉ２０４、Ｋ２０５、Ｌ２０６、Ｒ２０７、Ｈ２０８、Ｑ２０９、Ｑ２１０、Ｗ２１１、Ｓ２１２、Ｌ２１３、Ｖ２１４、Ｍ２１５、Ｅ２１６、及びＳ２１７から４オングストローム以下に位置付けられる。いくつかの実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ３に結合する場合、ＦＧＦＲ３（例えば、配列番号５６及び５８）の１つ以上のアミノ酸Ｉ２０４、Ｋ２０５、Ｌ２０６、Ｒ２０７、Ｈ２０８、Ｑ２０９、Ｑ２１０、Ｗ２１１、Ｓ２１２、Ｌ２１３、Ｖ２１４、Ｍ２１５、Ｅ２１６、及びＳ２１７から３．５オングストローム以下に位置付けられる。いくつかの実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ３に結合する場合、ＦＧＦＲ３（例えば、配列番号５６及び５８）のアミノ酸Ｉ２０４、Ｋ２０５、Ｌ２０６、Ｒ２０７、Ｈ２０８、Ｑ２０９、Ｑ２１０、Ｗ２１１、Ｓ２１２、Ｌ２１３、Ｖ２１４、Ｍ２１５、Ｅ２１６、及びＳ２１７から３．５オングストローム以下に位置付けられる。いくつかの実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ３に結合する場合、ＦＧＦＲ３（例えば、配列番号５６及び５８）の１つ以上のアミノ酸Ｉ２０４、Ｋ２０５、Ｌ２０６、Ｒ２０７、Ｈ２０８、Ｑ２０９、Ｑ２１０、Ｗ２１１、Ｓ２１２、Ｌ２１３、Ｖ２１４、Ｍ２１５、Ｅ２１６、及びＳ２１７から３．０オングストローム以下に位置付けられる。いくつかの実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ３に結合する場合、ＦＧＦＲ３（例えば、配列番号５６及び５８）のアミノ酸Ｉ２０４、Ｋ２０５、Ｌ２０６、Ｒ２０７、Ｈ２０８、Ｑ２０９、Ｑ２１０、Ｗ２１１、Ｓ２１２、Ｌ２１３、Ｖ２１４、Ｍ２１５、Ｅ２１６、及びＳ２１７から３．０オングストローム以下に位置付けられる。いくつかの実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ３に結合する場合、ＦＧＦＲ３（例えば、配列番号５６及び５８）の１つ以上のアミノ酸Ｉ２０４、Ｋ２０５、Ｌ２０６、Ｒ２０７、Ｈ２０８、Ｑ２０９、Ｑ２１０、Ｗ２１１、Ｓ２１２、Ｌ２１３、Ｖ２１４、Ｍ２１５、Ｅ２１６、及びＳ２１７から４．０、３．７５、３．５、３．２５、または３．０オングストローム以下に位置付けられる。いくつかの実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ３に結合する場合、ＦＧＦＲ３（例えば、配列番号５６及び５８）のアミノ酸Ｉ２０４、Ｋ２０５、Ｌ２０６、Ｒ２０７、Ｈ２０８、Ｑ２０９、Ｑ２１０、Ｗ２１１、Ｓ２１２、Ｌ２１３、Ｖ２１４、Ｍ２１５、Ｅ２１６、及びＳ２１７から４．０、３．７５、３．５、３．２５、または３．０オングストローム以下に位置付けられる。いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸及び／または１つ以上のアミノ酸残基は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、及び／または１２個のアミノ酸及び／またはアミノ酸残基のうちのおよそいずれかである。いくつかの実施形態では、エピトープは、結晶学（例えば、実施例に記載の結晶学法）によって決定される。好ましい実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ヒトＦＧＦＲ３（ｈＦＧＦＲ３）（例えば、配列番号５６及び５８）に結合する。  
【００９８】
特定の実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、配列番号９１及び９２から選択されるＦＧＦＲ２上の１つのエピトープ、ならびに配列番号９３及び９４から選択されるＦＧＦＲ３上の１つのエピトープに結合する。ある特定の実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、配列番号９１及び９２を含むＦＧＦＲ２上の２つのエピトープ、ならびに配列番号９３及び９４から選択されるＦＧＦＲ３上の１つのエピトープに結合する。  ある特定の実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、配列番号９１及び９２から選択されるＦＧＦＲ２上の１つのエピトープ、ならびに配列番号９３及び９４を含むＦＧＦＲ３上の２つのエピトープに結合する（図９）。好ましい一実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、配列番号９１及び９２を含むＦＧＦＲ２上の２つのエピトープ、ならびに配列番号９３及び９４を含むＦＧＦＲ３上の２つのエピトープに結合する（図９）。
【００９９】
一態様では、本発明は、以下のアミノ酸配列を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなるポリペプチドに結合する抗ＦＧＦＲ２／３抗体を提供する：ＴＮＴＥＫＭＥＫＲＬＨＡＶＰＡＡＮＴＶＫＦＲＣＰＡ（配列番号９１）及び／またはＹＫＶＲＮＱＨＷＳＬＩＭＥＳ（配列番号９２）。
【０１００】
一態様では、本発明は、以下のアミノ酸配列を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなるポリペプチドに結合する抗ＦＧＦＲ２／３抗体を提供する：ＴＲＲＥＲＭＤＫＫＬＬＡＶＰＡＡＮＴＶＲＦＲＣＰＡ（配列番号９３）及び／またはＩＫＬＲＨＱＱＷＳＬＶＭＥＳ（配列番号９４）。
【０１０１】
一態様では、本発明は、以下のアミノ酸配列を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなるポリペプチドに結合する抗ＦＧＦＲ２／３抗体を提供する：ＴＮＴＥＫＭＥＫＲＬＨＡＶＰＡＡＮＴＶＫＦＲＣＰＡ（配列番号９１）またはＹＫＶＲＮＱＨＷＳＬＩＭＥＳ（配列番号９２）及びＴＲＲＥＲＭＤＫＫＬＬＡＶＰＡＡＮＴＶＲＦＲＣＰＡ（配列番号９３）またはＩＫＬＲＨＱＱＷＳＬＶＭＥＳ（配列番号９４）。
【０１０２】
一実施形態では、本発明の抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、配列ＴＮＴＥＫＭＥＫＲＬＨＡＶＰＡＡＮＴＶＫＦＲＣＰＡ（配列番号９１）及び／またはＹＫＶＲＮＱＨＷＳＬＩＭＥＳ（配列番号９２）と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性または類似性を有するアミノ酸配列に特異的に結合する。一実施形態では、本発明の抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、配列ＴＲＲＥＲＭＤＫＫＬＬＡＶＰＡＡＮＴＶＲＦＲＣＰＡ（配列番号９３）及び／またはＩＫＬＲＨＱＱＷＳＬＶＭＥＳ（配列番号９４）と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性または類似性を有するアミノ酸配列に特異的に結合する。
【０１０３】
一実施形態では、本発明の抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、配列ＴＮＴＥＫＭＥＫＲＬＨＡＶＰＡＡＮＴＶＫＦＲＣＰＡ（配列番号９１）またはＹＫＶＲＮＱＨＷＳＬＩＭＥＳ（配列番号９２）と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性または類似性を有するアミノ酸配列、及び配列ＴＲＲＥＲＭＤＫＫＬＬＡＶＰＡＡＮＴＶＲＦＲＣＰＡ（配列番号９３）またはＩＫＬＲＨＱＱＷＳＬＶＭＥＳ（配列番号９４）と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性または類似性を有するアミノ酸配列に特異的に結合する。
【０１０４】
当業者であれば、それぞれのＦＧＦＲ３配列間の対応する残基を同定するためのＦＧＦＲ３配列のアライメント法を理解している。同様に、当業者であれば、それぞれのＦＧＦＲ２配列間の対応する残基を同定するためのＦＧＦＲ２配列のアライメント法を理解している。
【０１０５】
一態様では、本発明は、ＦＧＦＲ３及び／またはＦＧＦＲ２への結合において上述の抗体のうちのいずれかと競合する抗ＦＧＦＲ２／３抗体を提供する。一態様では、本発明は、ＦＧＦＲ３及び／またはＦＧＦＲ２上の上述の抗体のうちのいずれかと同じまたは同様のエピトープに結合する抗ＦＧＦＲ２／３抗体を提供する。
【０１０６】
当該技術分野で知られているように、かつ本明細書でより詳細に記載されているように、抗体の超可変領域を定めるアミノ酸位置／境界は、文脈及び（以下に記載される）当該技術分野で既知の様々な定義によって異なり得る。可変ドメイン内のいくつかの位置は、ハイブリッド超可変位置と見なされ得る。これは、これらの位置が、一組の判断基準下で超可変領域内にあると見なされ得るが、異なる組の判断基準下では超可変領域外にあると見なされ得るためである。これらの位置のうちの１つ以上は、（以下で更に定義される）伸長超可変領域でも見つけることができる。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、本抗体は、モノクローナル抗体である。他の実施形態では、本抗体は、ポリクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、本抗体は、キメラ抗体、親和性成熟抗体、ヒト化抗体、及びヒト抗体からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、本抗体は、抗体断片である。いくつかの実施形態では、本抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、またはｓｃＦｖである。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、ＦＧＦＲ２／３抗体は、Ｆｃ領域を含むワンアーム抗体（すなわち、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインが単一の抗原結合アームを形成する）であり、当該Ｆｃ領域は、第１及び第２のＦｃポリペプチドを含み、当該第１及び第２のＦｃポリペプチドは、複合体に存在し、前記抗原結合アームを含むＦａｂ分子と比較して前記抗体断片の安定性を増大させるＦｃ領域を形成する。例えば、ＷＯ２００６／０１５３７１を参照されたい。
【０１０９】
一実施形態では、本抗体は、キメラ抗体、例えば、異種非ヒト、ヒト、またはヒト化配列（例えば、フレームワーク配列及び／または定常ドメイン配列）にグラフトされた非ヒトドナー由来の抗原結合配列を含む抗体である。一実施形態では、非ヒトドナーは、マウスである。更なる一実施形態では、抗原結合配列は、合成であり、例えば、変異誘発（例えば、ファージディスプレイスクリーニング等）によって得られる。具体的な一実施形態では、本発明のキメラ抗体は、マウスＶ領域及びヒトＣ領域を有する。一実施形態では、マウス軽鎖Ｖ領域は、ヒトカッパ軽鎖に融合される。別の実施形態では、マウス重鎖Ｖ領域は、ヒトＩｇＧ１Ｃ領域に融合される。
【０１１０】
本発明のヒト化抗体としては、フレームワーク領域（ＦＲ）にアミノ酸置換を有するもの及びグラフトされたＣＤＲが変化した親和性成熟変異形が挙げられる。ＣＤＲまたはＦＲにおける置換アミノ酸は、ドナーまたはレシピエント抗体に存在するものに限定されない。他の実施形態では、本発明の抗体は、増強されたＣＤＣ及び／またはＡＤＣＣ機能ならびにＢ細胞死滅を含む改善されたエフェクター機能をもたらすＦｃ領域内のアミノ酸残基の変化を更に含む。本発明の他の抗体としては、安定性を改善する特定の変化を有するものが挙げられる。他の実施形態では、本発明の抗体は、低下したＣエフェクター機能、例えば、低下したＣＤＣ及び／もしくはＡＤＣＣ機能ならびに／または低下したＢ細胞死滅をもたらすＦｃ領域内のアミノ酸残基の変化を含む。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞におけるヒト補体因子Ｃ１ｑ及び／またはヒトＦｃ受容体への低下した結合（結合の不在等）を特徴とする。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、ヒトＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、及び／またはＦｃγＲＩＩＩＡへの低下した結合（結合の不在）を特徴とする。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、ＩｇＧクラスのもの（例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４）であり、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｇ２３６、Ｄ２６５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ａ３２７、Ａ３３０、Ｐ３３１、及び／またはＰ３２９（ＥＵ指数に従って番号付け）に少なくとも１つの変異を含む。いくつかの実施形態では、本抗体は、変異Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５ＡまたはＤ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａを含む。
【０１１１】
本抗体がＦｃ領域を含む場合、それに結合している炭水化物が改変され得る。例えば、本抗体のＦｃ領域に結合したフコースを欠く成熟した炭水化物構造を有する抗体が、米国特許出願第ＵＳ２００３／０１５７１０８号に記載されている。同第ＵＳ２００４／００９３６２１号も参照されたい。本抗体のＦｃ領域に結合した炭水化物中に二分Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を有する抗体が、ＷＯ２００３／０１１８７８及び米国特許第６，６０２，６８４号に参照されている。本抗体のＦｃ領域に結合したオリゴ糖中に少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体が、ＷＯ１９９７／３００８７に報告されている。抗体のＦｃ領域に結合した改変された炭水化物を有する抗体に関しては、ＷＯ１９９８／５８９６４及びＷＯ１９９９／２２７６４も参照されたい。修飾グリコシル化を有する抗原結合分子については第ＵＳ２００５／０１２３５４６号も参照されたい。一態様では、本発明は、本明細書に提供される抗原結合配列のうちのいずれかを含むＦＧＦＲ３結合ポリペプチドを提供し、ＦＧＦＲ３結合ポリペプチドは、ＦＧＦＲ３、例えば、ヒト及び／またはカニクイザル及び／またはマウスＦＧＦＲ３に特異的に結合する。
【０１１２】
本発明の抗体は、ＦＧＦＲ３（例えば、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ及び／またはＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ）ならびにＦＧＦＲ２（例えば、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ及び／またはＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃ）に結合（例えば、特異的に結合）し、いくつかの実施形態では、ＦＧＦＲ３及び／もしくはＦＧＦＲ２シグナル伝達（例えば、ＦＧＦＲ３リン酸化）、ならびに／またはいずれかの生物学的に関連したＦＧＦＲ３及び／もしくはＦＧＦＲ３リガンド生物学的経路の破壊、ならびに／またはいずれかの生物学的に関連したＦＧＦＲ２及び／もしくはＦＧＦＲ２リガンド生物学的経路の破壊、ならびに／または腫瘍、細胞増殖性障害、もしくは癌の治療及び／もしくは予防、ならびに／またはＦＧＦＲ３及び／またはＦＧＦＲ２発現及び／または活性（例えば、増大したＦＧＦＲ３及び／またはＦＧＦＲ２発現及び／または活性）に関連する障害の治療もしくは予防のうちの１つ以上の態様を調節（例えば、阻害）することができる。いくつかの実施形態では、ＦＧＦＲ２／３抗体は、ＦＧＦＲ３（例えば、ヒトもしくはマウスＦＧＦＲ３）及び／またはＦＧＦＲ２（例えば、ヒトもしくはマウスＦＧＦＲ３）からなるか、またはそれらから本質的になるポリペプチドに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、本抗体は、１×１０−７Ｍ以上の親和性（Ｋｄ）を有するＦＧＦＲ３に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、本抗体は、１×１０−７Ｍ以上の親和性（Ｋｄ）を有するＦＧＦＲ２に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、本抗体は、１×１０−７Ｍ以上の親和性（Ｋｄ）を有するＦＧＦＲ３及びＦＧＦ２に特異的に結合する。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、米国特許公開第２００５／０１４７６１２号に記載の抗ＦＧＦＲ３抗体（例えば、抗体ＭＳＰＲＯ２、ＭＳＰＲＯ１２、ＭＳＰＲＯ５９、ＭＳＰＲＯ１１、ＭＳＰＲＯ２１、ＭＳＰＲＯ２４、ＭＳＰＲＯ２６、ＭＳＰＲＯ２８、ＭＳＰＲＯ２９、ＭＳＰＲＯ４３、ＭＳＰＲＯ５５）、Ｒａｕｃｈｅｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８（４０）：３８１９４−３８２０５（２００３）に記載の抗体、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００６／０４８８７７号に記載の抗体（例えば、抗体ＰＲＯ−００１）、Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｔｏｒｒｅｃｕａｄｒａｄａ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ（２００８）７（４）：８６２−８７３に記載の抗体（例えば、ｓｃＦｖαＦＧＦＲ３  ３Ｃ）、Ｄｉｒｅｎｚｏ，Ｒ  ｅｔ  ａｌ（２００７）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ＡＡＣＲ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｏ．２０８０に記載の抗体（例えば、Ｄ１１）、または同第ＷＯ２０１０／００２８６２号に記載の抗体（例えば、抗体１５Ｄ８、２７Ｈ２、４Ｅ７、２Ｇ４、２０Ｂ４）ではない。
【０１１４】
一態様では、本発明は、本発明の１つ以上の抗体及び担体を含む組成物を提供する。一実施形態では、担体は、薬学的に許容される。
【０１１５】
別の態様では、本発明は、本発明のＦＧＦＲ２／３抗体をコードする核酸を提供する。
【０１１６】
なお別の態様では、本発明は、本発明の核酸を含むベクターを提供する。
【０１１７】
更なる一態様では、本発明は、本発明の１つ以上の核酸及び担体を含む組成物を提供する。一実施形態では、担体は、薬学的に許容される。
【０１１８】
一態様では、本発明は、本発明の核酸またはベクターを含む宿主細胞を提供する。ベクターは、任意の種類のもの、例えば、発現ベクター等の組換えベクターであり得る。様々な宿主細胞のうちのいずれかを使用することができる。一実施形態では、宿主細胞は、原核細胞、例えば、大腸菌である。別の実施形態では、宿主細胞は、真核細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等の哺乳類細胞である。
【０１１９】
更なる一態様では、本発明は、本発明の抗体の作製方法を提供する。例えば、本発明は、抗ＦＧＦＲ２／３抗体（本明細書に定義されるように、その全長抗体及び断片を含む）の作製方法であって、好適な宿主細胞で該抗体をコードする本発明の組換えベクターを発現させることと、該抗体を回収することと、を含む、当該方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、本抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することを含み、これにより、核酸が発現する。いくつかの実施形態では、本方法は、宿主細胞培養物から本抗体を回収することを更に含む。いくつかの実施形態では、本抗体は、宿主細胞培養培地から回収される。いくつかの実施形態では、本方法は、回収された抗体を薬学的に許容される担体、賦形剤、または担体と合わせて、本ヒト化抗体を含む薬学的製剤を調製することを更に含む。
【０１２０】
一態様では、本発明は、容器と、その容器内に収容される組成物とを含む製品を提供し、この組成物は、１つ以上の本発明のＦＧＦＲ２／３抗体を含む。一実施形態では、この組成物は、本発明の核酸を含む。別の実施形態では、抗体を含む組成物は、担体を更に含み、この担体は、いくつかの実施形態では、薬学的に許容される。一実施形態では、本発明の製品は、本組成物（例えば、本抗体）を個体に投与するための指示（本明細書に記載の方法のうちのいずれかの指示等）を更に含む。
【０１２１】
別の態様では、本発明は、本発明の１つ以上の抗ＦＧＦＲ２／３抗体を含む組成物を含む第１の容器と、緩衝液を含む第２の容器とを含むキットを提供する。一実施形態では、緩衝液は、薬学的に許容される。一実施形態では、抗体を含む組成物は、担体を更に含み、この担体は、いくつかの実施形態では、薬学的に許容される。別の実施形態では、キットは、本組成物（例えば、本抗体）を個体に投与するための指示を更に含む。
【０１２２】
更なる一態様では、本発明は、薬物として使用するための本発明の抗ＦＧＦＲ２／３抗体を提供する。
【０１２３】
更なる一態様では、本発明は、ＦＧＦＲ３活性化及び／または発現（いくつかの実施形態では、過剰発現）に関連する病理学的状態等の障害の治療または予防に使用するための本発明の抗ＦＧＦＲ２／３抗体を提供する。更なる一態様では、本発明は、ＦＧＦＲ２活性化及び／または発現（いくつかの実施形態では、過剰発現）に関連する病理学的状態等の障害の治療または予防に使用するための本発明の抗ＦＧＦＲ２／３抗体を提供する。更なる一態様では、本発明は、ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３活性化及び／または発現（いくつかの実施形態では、過剰発現）に関連する病理学的状態等の障害の治療または予防に使用するための本発明の抗ＦＧＦＲ２／３抗体を提供する。いくつかの実施形態では、障害は、癌、腫瘍、及び／または細胞増殖性障害である。いくつかの実施形態では、癌、腫瘍、及び／または細胞増殖性障害は、多発性骨髄腫もしくは膀胱癌（例えば、移行上皮癌）、乳癌、または肝臓癌である。
【０１２４】
更なる一態様では、本発明は、骨格障害等の障害の治療または予防に使用するための本発明の抗ＦＧＦＲ２／３抗体を提供する。いくつかの実施形態では、障害は、軟骨形成不全、軟骨低形成症、小人症、致死性骨異形成症（ＴＤ、臨床型ＴＤ１及びＴＤＩＩ）、または頭蓋骨癒合症症候群である。
【０１２５】
更なる一態様では、本発明は、細胞増殖の低減に使用するための本発明の抗ＦＧＦＲ２／３抗体を提供する。
【０１２６】
更なる一態様では、本発明は、細胞の死滅に使用するための本発明の抗ＦＧＦＲ２／３抗体を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は、多発性骨髄腫細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＡＤＣＣによって死滅する。いくつかの実施形態では、抗体は、ネイキッド抗体である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＦＧＦＲ３を過剰発現する。いくつかの実施形態では、細胞は、ＦＧＦＲ２を過剰発現する。いくつかの実施形態では、細胞は、ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３を過剰発現する。
【０１２７】
更なる一態様では、本発明は、多発性骨髄腫細胞等の細胞の枯渇に使用するための本発明の抗ＦＧＦＲ２／３抗体を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は、ＡＤＣＣによって死滅する。いくつかの実施形態では、抗体は、ネイキッド抗体である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＦＧＦＲ３を過剰発現する。
【０１２８】
更なる一態様では、本発明は、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ２、またはＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３活性化及び／または発現（いくつかの実施形態では、過剰発現）に関連する病理学的状態等の障害の治療的及び／または予防的治療用の薬物の調製における本発明の抗ＦＧＦＲ２／３抗体の使用を提供する。いくつかの実施形態では、障害は、癌、腫瘍、及び／または細胞増殖性障害である。いくつかの実施形態では、癌、腫瘍、及び／または細胞増殖性障害は、多発性骨髄腫もしくは膀胱癌（例えば、移行上皮癌）、乳癌、または肝臓癌である。いくつかの実施形態では、障害は、骨格障害、例えば、軟骨形成不全、軟骨低形成症、小人症、致死性骨異形成症（ＴＤ、臨床型ＴＤ１及びＴＤＩＩ）、または頭蓋骨癒合症症候群である。
【０１２９】
一態様では、本発明は、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ２、またはＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３活性化及び／または発現（いくつかの実施形態では、過剰発現）に関連する病理学的状態等の障害の治療的及び／または予防的治療用の薬物の調製における本発明の核酸の使用を提供する。いくつかの実施形態では、障害は、癌、腫瘍、及び／または細胞増殖性障害である。いくつかの実施形態では、癌、腫瘍、及び／または細胞増殖性障害は、多発性骨髄腫もしくは膀胱癌（例えば、移行上皮癌）、乳癌、または肝臓癌である。いくつかの実施形態では、障害は、骨格障害、例えば、軟骨形成不全、軟骨低形成症、小人症、致死性骨異形成症（ＴＤ、臨床型ＴＤ１及びＴＤＩＩ）、または頭蓋骨癒合症症候群である。
【０１３０】
別の態様では、本発明は、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ２、またはＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３活性化及び／または発現（いくつかの実施形態では、過剰発現）に関連する病理学的状態等の障害の治療的及び／または予防的治療用の薬物の調製における本発明の発現ベクターの使用を提供する。いくつかの実施形態では、障害は、癌、腫瘍、及び／または細胞増殖性障害である。いくつかの実施形態では、癌、腫瘍、及び／または細胞増殖性障害は、多発性骨髄腫もしくは膀胱癌（例えば、移行上皮癌）、乳癌、または肝臓癌である。いくつかの実施形態では、障害は、骨格障害、例えば、軟骨形成不全、軟骨低形成症、小人症、致死性骨異形成症（ＴＤ、臨床型ＴＤ１及びＴＤＩＩ）、または頭蓋骨癒合症症候群である。
【０１３１】
なお別の態様では、本発明は、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ２、またはＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３活性化及び／または発現（いくつかの実施形態では、過剰発現）に関連する病理学的状態等の障害の治療的及び／または予防的治療用の薬物の調製における本発明の宿主細胞の使用を提供する。いくつかの実施形態では、障害は、癌、腫瘍、及び／または細胞増殖性障害である。いくつかの実施形態では、癌、腫瘍、及び／または細胞増殖性障害は、多発性骨髄腫もしくは膀胱癌（例えば、移行上皮癌）、乳癌、または肝臓癌である。いくつかの実施形態では、障害は、骨格障害、例えば、軟骨形成不全、軟骨低形成症、小人症、致死性骨異形成症（ＴＤ、臨床型ＴＤ１及びＴＤＩＩ）、または頭蓋骨癒合症症候群である。
【０１３２】
更なる一態様では、本発明は、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ２、またはＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３活性化及び／または発現（いくつかの実施形態では、過剰発現）に関連する病理学的状態等の障害の治療的及び／または予防的治療用の薬物の調製における本発明の製品の使用を提供する。いくつかの実施形態では、障害は、癌、腫瘍、及び／または細胞増殖性障害である。いくつかの実施形態では、癌、腫瘍、及び／または細胞増殖性障害は、多発性骨髄腫もしくは膀胱癌（例えば、移行上皮癌）、乳癌、または肝臓癌である。いくつかの実施形態では、障害は、骨格障害、例えば、軟骨形成不全、軟骨低形成症、小人症、致死性骨異形成症（ＴＤ、臨床型ＴＤ１及びＴＤＩＩ）、または頭蓋骨癒合症症候群である。
【０１３３】
一態様では、本発明は、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ２、またはＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３活性化及び／または発現（いくつかの実施形態では、過剰発現）に関連する病理学的状態等の障害の治療的及び／または予防的治療用の薬物の調製における本発明のキットの使用も提供する。いくつかの実施形態では、障害は、癌、腫瘍、及び／または細胞増殖性障害である。いくつかの実施形態では、癌、腫瘍、及び／または細胞増殖性障害は、多発性骨髄腫もしくは膀胱癌（例えば、移行上皮癌）、乳癌または肝臓癌である。いくつかの実施形態では、障害は、骨格障害、例えば、軟骨形成不全、軟骨低形成症、小人症、致死性骨異形成症（ＴＤ、臨床型ＴＤ１及びＴＤＩＩ）、または頭蓋骨癒合症症候群である。
【０１３４】
更なる一態様では、本発明は、細胞増殖の阻害用の薬物の調製における本発明の抗ＦＧＦＲ２／３抗体の使用を提供する。更なる一態様では、本発明は、細胞死滅用の薬剤の調製における本発明の抗ＦＧＦＲ２／３抗体の使用を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は、多発性骨髄腫細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＡＤＣＣによって死滅する。いくつかの実施形態では、抗体は、ネイキッド抗体である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＦＧＦＲ３を過剰発現する。いくつかの実施形態では、細胞は、ＦＧＦＲ２を過剰発現する。いくつかの実施形態では、細胞は、ＦＧＦＲ３及びＦＧＦＲ２を過剰発現する。
【０１３５】
更なる一態様では、本発明は、多発性骨髄腫細胞等の細胞の枯渇用の薬物の調製における本発明の抗ＦＧＦＲ２／３抗体の使用を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は、ＡＤＣＣによって死滅する。いくつかの実施形態では、抗体は、ネイキッド抗体である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＦＧＦＲ３を過剰発現する。いくつかの実施形態では、細胞は、ＦＧＦＲ２を過剰発現する。いくつかの実施形態では、細胞は、ＦＧＦＲ３及びＦＧＦＲ２を過剰発現する。
【０１３６】
本発明は、増大した発現及び／もしくはシグナル伝達または望ましくない発現及び／もしくはシグナル伝達等のＦＧＦＲ３の発現及び／またはシグナル伝達に関連する障害の調節に有用な方法及び組成物を提供する。本発明は、増大した発現及び／もしくはシグナル伝達または望ましくない発現及び／もしくはシグナル伝達等のＦＧＦＲ２の発現及び／またはシグナル伝達に関連する障害の調節に有用な方法及び組成物を提供する。本発明は、増大した発現及び／もしくはシグナル伝達または望ましくない発現及び／もしくはシグナル伝達等のＦＧＦＲ３及びＦＧＦＲ２の発現及び／またはシグナル伝達に関連する障害の調節に有用な方法及び組成物を提供する。
【０１３７】
本発明の方法を使用して、任意の好適な病理学的状態に影響を与えることができる。例示の障害は、本明細書に記載されており、非小細胞肺癌、卵巣癌、甲状腺癌、睾丸癌、子宮内膜癌、頭頸部癌、脳癌（例えば、神経芽細胞腫または髄膜腫）、皮膚癌（例えば、黒色腫、基底細胞癌、または扁平上皮癌）、膀胱癌（例えば、移行上皮癌）、乳癌、胃癌、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、肝細胞癌、子宮頸癌、肺癌、膵臓癌、前立腺癌、ならびに血液悪性腫瘍（例えば、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｂ細胞悪性腫瘍、ホジキンリンパ腫、及び多発性骨髄腫）からなる群から選択される癌を含む。いくつかの実施形態では、障害は、浸潤性移行上皮癌である。いくつかの実施形態では、障害は、多発性骨髄腫である。更なる例示の障害としては、軟骨形成不全、軟骨低形成症、小人症、致死性骨異形成症（ＴＤ、臨床型ＴＤ１及びＴＤＩＩ）、または頭蓋骨癒合症症候群等の骨格障害が挙げられる。
【０１３８】
ある特定の実施形態では、癌は、ＦＧＦＲ３、増幅ＦＧＦＲ３、転座ＦＧＦＲ３、及び／または変異ＦＧＦＲ３を発現する。ある特定の実施形態では、癌は、活性化ＦＧＦＲ３を発現する。ある特定の実施形態では、癌は、転座ＦＧＦＲ３（例えば、ｔ（４；１４）転座）を発現する。ある特定の実施形態では、癌は、恒常的ＦＧＦＲ３を発現する。いくつかの実施形態では、恒常的ＦＧＦＲ３は、チロシンキナーゼドメイン及び／または膜近傍ドメイン及び／またはリガンド結合ドメインにおける変異を含む。ある特定の実施形態では、癌は、リガンド非依存性ＦＧＦＲ３を発現する。いくつかの実施形態では、癌は、リガンド依存性ＦＧＦＲ３を発現する。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、癌は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＳ２４８Ｃに対応する変異を含むＦＧＦＲ３を発現する。いくつかの実施形態では、癌は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＳ２４８Ｃ及び／またはＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＳ２４８Ｃを発現した。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、癌は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＫ６５２Ｅに対応する変異を含むＦＧＦＲ３を発現する。いくつかの実施形態では、癌は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＫ６５２Ｅ及び／またはＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＫ６５０Ｅを発現した。
【０１４１】
ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＳ２４９Ｃに対応する変異を含むＦＧＦＲ３。いくつかの実施形態では、癌は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＳ２４９Ｃ及び／またはＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＳ２４９Ｃを発現する。
【０１４２】
一態様では、癌は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＧ３７２Ｃに対応する変異を含むＦＧＦＲ３を発現する。いくつかの実施形態では、癌は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＧ３７２Ｃ及び／またはＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＧ３７０Ｃを発現する。
【０１４３】
一態様では、癌は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＹ３７５Ｃに対応する変異を含むＦＧＦＲ３を発現する。いくつかの実施形態では、癌は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＹ３７５Ｃ及び／またはＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＹ３７３Ｃを発現する。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、癌は、（ａ）ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＫ６５２Ｅ、ならびに（ｂ）ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＲ２４８Ｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＹ３７５Ｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＳ２４９Ｃ、及びＦＧＦＲ３ＩＩＩｂＧ３７２Ｃのうちの１つ以上を発現する。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、癌は、（ａ）ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＲ２４８Ｃ、ならびに（ｂ）ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＫ６５２Ｅ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＹ３７５Ｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＳ２４９Ｃ、及びＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＧ３７２Ｃのうちの１つ以上を発現する。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、癌は、（ａ）ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＧ３７２Ｃ、ならびに（ｂ）ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＫ６５２Ｅ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＹ３７５Ｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＳ２４９Ｃ、及びＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＲ２４８Ｃのうちの１つ以上を発現する。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、癌は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＲ２４８Ｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＫ６５２Ｅ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＹ３７５Ｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＳ２４９Ｃ、及びＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＧ３７２Ｃを発現する。
【０１４８】
ある特定の実施形態では、癌は、対照試料（例えば、正常組織試料）またはレベルに対して増加したレベルのリンＦＧＦＲ３、リンＦＲＳ２、及び／またはリンＭＡＰＫを発現する。
【０１４９】
ある特定の実施形態では、癌は、ＦＧＦＲ２、増幅ＦＧＦＲ２、転座ＦＧＦＲ２、及び／または変異ＦＧＦＲ２を発現する。ある特定の実施形態では、癌は、活性化ＦＧＦＲ２を発現する。ある特定の実施形態では、癌は、転座ＦＧＦＲ２を発現する。ある特定の実施形態では、癌は、恒常的ＦＧＦＲ２を発現する。ある特定の実施形態では、癌は、リガンド非依存性ＦＧＦＲ２を発現する。いくつかの実施形態では、癌は、リガンド依存性ＦＧＦＲ２を発現する。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、癌は、変異を含むＦＧＦＲ２を発現する。
【０１５１】
ある特定の実施形態では、癌は、１）ＦＧＦＲ３、増幅ＦＧＦＲ３、転座ＦＧＦＲ３、及び／または変異ＦＧＦＲ３、ならびに２）ＦＧＦＲ２、増幅ＦＧＦＲ２、転座ＦＧＦＲ２、及び／または変異ＦＧＦＲ２を発現する。ある特定の実施形態では、癌は、上述のように、活性化ＦＧＦＲ３及びＦＧＦＲ２を発現する。ある特定の実施形態では、癌は、上述のように、転座ＦＧＦＲ３（例えば、ｔ（４；１４）転座）及びＦＧＦＲ２を発現する。ある特定の実施形態では、癌は、上述のように、恒常的ＦＧＦＲ３及びＦＧＦＲ２を発現する。いくつかの実施形態では、恒常的ＦＧＦＲ３は、チロシンキナーゼドメイン及び／または膜近傍ドメイン及び／またはリガンド結合ドメインにおける変異を含む。ある特定の実施形態では、癌は、上述のように、リガンド非依存性ＦＧＦＲ３及びＦＧＦＲ２を発現する。いくつかの実施形態では、癌は、上述のように、リガンド依存性ＦＧＦＲ３及びＦＧＦＲ２を発現する。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、癌は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＳ２４８Ｃに対応する変異を含むＦＧＦＲ３、ならびに上述のＦＧＦＲ２（例えば、ＦＧＦＲ２、増幅ＦＧＦＲ２、転座ＦＧＦＲ２、及び／または変異ＦＧＦＲ２）を発現する。いくつかの実施形態では、癌は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＳ２４８Ｃ及び／またはＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＳ２４８Ｃ、ならびに上述のＦＧＦＲ２（例えば、ＦＧＦＲ２、増幅ＦＧＦＲ２、転座ＦＧＦＲ２、及び／または変異ＦＧＦＲ２）を発現する。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、癌は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＫ６５２Ｅに対応する変異を含むＦＧＦＲ３、ならびに上述のＦＧＦＲ２（例えば、ＦＧＦＲ２、増幅ＦＧＦＲ２、転座ＦＧＦＲ２、及び／または変異ＦＧＦＲ２）を発現する。いくつかの実施形態では、癌は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＫ６５２Ｅ及び／またはＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＫ６５０Ｅ、ならびに上述のＦＧＦＲ２（例えば、ＦＧＦＲ２、増幅ＦＧＦＲ２、転座ＦＧＦＲ２、及び／または変異ＦＧＦＲ２）を発現する。
【０１５４】
ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＳ２４９Ｃに対応する変異を含むＦＧＦＲ３、ならびに上述のＦＧＦＲ２（例えば、ＦＧＦＲ２、増幅ＦＧＦＲ２、転座ＦＧＦＲ２、及び／または変異ＦＧＦＲ２）。いくつかの実施形態では、癌は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＳ２４９Ｃ及び／またはＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＳ２４９Ｃ、ならびに上述のＦＧＦＲ２（例えば、ＦＧＦＲ２、増幅ＦＧＦＲ２、転座ＦＧＦＲ２、及び／または変異ＦＧＦＲ２）を発現する。
【０１５５】
一態様では、癌は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＧ３７２Ｃに対応する変異を含むＦＧＦＲ３、ならびに上述のＦＧＦＲ２（例えば、ＦＧＦＲ２、増幅ＦＧＦＲ２、転座ＦＧＦＲ２、及び／または変異ＦＧＦＲ２）を発現する。いくつかの実施形態では、癌は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＧ３７２Ｃ及び／またはＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＧ３７０Ｃ、ならびに上述のＦＧＦＲ２（例えば、ＦＧＦＲ２、増幅ＦＧＦＲ２、転座ＦＧＦＲ２、及び／または変異ＦＧＦＲ２）を発現する。
【０１５６】
一態様では、癌は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＹ３７５Ｃに対応する変異を含むＦＧＦＲ３、ならびに上述のＦＧＦＲ２（例えば、ＦＧＦＲ２、増幅ＦＧＦＲ２、転座ＦＧＦＲ２、及び／または変異ＦＧＦＲ２）を発現する。いくつかの実施形態では、癌は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＹ３７５Ｃ及び／またはＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＹ３７３Ｃ、ならびに上述のＦＧＦＲ２（例えば、ＦＧＦＲ２、増幅ＦＧＦＲ２、転座ＦＧＦＲ２、及び／または変異ＦＧＦＲ２）を発現する。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、癌は、（ａ）ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＫ６５２Ｅ、ならびに（ｂ）ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＲ２４８Ｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＹ３７５Ｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＳ２４９Ｃ、及びＦＧＦＲ３ＩＩＩｂＧ３７２Ｃのうちの１つ以上、ならびに（ｃ）上述のＦＧＦＲ２（例えば、ＦＧＦＲ２、増幅ＦＧＦＲ２、転座ＦＧＦＲ２、及び／または変異ＦＧＦＲ２）を発現する。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、癌は、（ａ）ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＲ２４８Ｃ、ならびに（ｂ）ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＫ６５２Ｅ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＹ３７５Ｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＳ２４９Ｃ、及びＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＧ３７２Ｃのうちの１つ以上、ならびに（ｃ）上述のＦＧＦＲ２（例えば、ＦＧＦＲ２、増幅ＦＧＦＲ２、転座ＦＧＦＲ２、及び／または変異ＦＧＦＲ２）を発現する。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、癌は、（ａ）ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＧ３７２Ｃ、ならびに（ｂ）ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＫ６５２Ｅ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＹ３７５Ｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＳ２４９Ｃ、及びＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＲ２４８Ｃのうちの１つ以上、ならびに（ｃ）上述のＦＧＦＲ２（例えば、ＦＧＦＲ２、増幅ＦＧＦＲ２、転座ＦＧＦＲ２、及び／または変異ＦＧＦＲ２）を発現する。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、癌は、（ａ）ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＲ２４８Ｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＫ６５２Ｅ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＹ３７５Ｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＳ２４９Ｃ、及びＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＧ３７２Ｃ、ならびに（ｂ）上述のＦＧＦＲ２（例えば、ＦＧＦＲ２、増幅ＦＧＦＲ２、転座ＦＧＦＲ２、及び／または変異ＦＧＦＲ２）を発現する。
【０１６１】
ある特定の実施形態では、癌は、対照試料（例えば、正常組織試料）またはレベルに対して増加したレベルのリンＦＧＦＲ３、リンＦＲＳ２、及び／またはリンＭＡＰＫ、ならびに上述のＦＧＦＲ２（例えば、ＦＧＦＲ２、増幅ＦＧＦＲ２、転座ＦＧＦＲ２、及び／または変異ＦＧＦＲ２）を発現する。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、癌は、１細胞当たり約１０，０００個以上のＦＧＦＲ３分子（例えば、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００個、またはそれ以上のＦＧＦＲ３受容体）を（例えば、細胞表面上で）発現する。いくつかの実施形態では、癌は、約１３０００個のＦＧＦＲ３分子を発現する。他の実施形態では、癌は、約５０００、６０００、７０００、８０００個、またはそれ以上のＦＧＦＲ３分子を発現する。いくつかの実施形態では、癌は、約４０００、３０００、２０００、１０００個未満、またはそれ以下のＦＧＦＲ３分子を発現する。いくつかの実施形態では、癌は、約１０００個未満のＦＧＦＲ３分子を発現する。いくつかの実施形態では、癌は、１細胞当たり約１０，０００個以上のＦＧＦＲ２分子（例えば、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００個、またはそれ以上のＦＧＦＲ２受容体）を（例えば、細胞表面上で）発現する。いくつかの実施形態では、癌は、約１３０００個のＦＧＦＲ２分子を発現する。他の実施形態では、癌は、約５０００、６０００、７０００、８０００個、またはそれ以上のＦＧＦＲ２分子を発現する。いくつかの実施形態では、癌は、約４０００、３０００、２０００、１０００個未満、またはそれ以下のＦＧＦＲ２分子を発現する。いくつかの実施形態では、癌は、約１０００個未満のＦＧＦＲ２分子を発現する。いくつかの実施形態では、癌は、１細胞当たり約１０，０００個以上のＦＧＦＲ３及び１０，０００個以上のＦＧＦＲ２分子（例えば、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００個、またはそれ以上のＦＧＦＲ３受容体、及び１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００個、またはそれ以上のＦＧＦＲ２受容体）を（例えば、細胞表面上で）発現する。いくつかの実施形態では、癌は、約１３０００個のＦＧＦＲ３分子及び１３０００個のＦＧＦＲ２分子を発現する。他の実施形態では、癌は、約５０００、６０００、７０００、８０００個、またはそれ以上のＦＧＦＲ３分子、及び約５０００、６０００、７０００、８０００個、またはそれ以上のＦＧＦＲ２分子を発現する。いくつかの実施形態では、癌は、約４０００、３０００、２０００、１０００個未満、またはそれ以下のＦＧＦＲ３分子、及び約４０００、３０００、２０００、１０００個未満、またはそれ以下のＦＧＦＲ２分子を発現する。いくつかの実施形態では、癌は、約１０００個未満のＦＧＦＲ３分子及び約１０００個未満のＦＧＦＲ２分子を発現する。
【０１６３】
一実施形態では、本発明の方法において標的とされる細胞は、癌細胞である。例えば、癌細胞は、乳癌細胞、結腸直腸癌細胞、肺癌細胞（例えば、非小細胞肺癌細胞）、甲状腺癌細胞、多発性骨髄腫細胞、睾丸癌細胞、乳頭癌細胞、結腸癌細胞、膵臓癌細胞、卵巣癌細胞、子宮頸癌細胞、中枢神経系癌細胞、骨肉腫細胞、腎臓癌細胞、肝細胞癌細胞、膀胱癌細胞（例えば、移行上皮癌細胞）、胃癌細胞、頭頸部扁平上皮癌細胞、黒色腫細胞、白血病細胞、多発性骨髄腫細胞（例えば、ｔ（４：１４）ＦＧＦＲ３転座を含む多発性骨髄腫細胞）、及び結腸腺腫細胞からなる群から選択されるものであり得る。一実施形態では、本発明の方法において標的とされる細胞は、過剰増殖性及び／または過形成性細胞である。別の実施形態では、本発明の方法において標的とされる細胞は、異形成細胞である。なお別の実施形態では、本発明の方法において標的とされる細胞は、転移細胞である。
【０１６４】
一態様では、本発明は、対象における細胞増殖の阻害方法であって、該対象に有効量の抗ＦＧＦＲ２／３抗体を投与して、細胞増殖を低減することを含む、該方法を提供する。
【０１６５】
一態様では、本発明は、対象における細胞の死滅方法であって、該対象に有効量の抗ＦＧＦＲ２／３抗体を投与して、細胞を死滅させることを含む、該方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は、多発性骨髄腫細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＡＤＣＣによって死滅する。いくつかの実施形態では、抗体は、ネイキッド抗体である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＦＧＦＲ３を過剰発現する。いくつかの実施形態では、細胞は、ＦＧＦＲ２を過剰発現する。いくつかの実施形態では、細胞は、ＦＧＦＲ３及びＦＧＦＲ２を過剰発現する。
【０１６６】
一態様では、本発明は、対象における細胞（多発性骨髄腫細胞等）の枯渇方法であって、該対象に有効量の抗ＦＧＦＲ２／３抗体を投与して、細胞を死滅させることを含む、該方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は、ＡＤＣＣによって死滅する。いくつかの実施形態では、抗体は、ネイキッド抗体である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＦＧＦＲ２／３を過剰発現する。
【０１６７】
一態様では、本発明は、骨格障害の治療または予防方法を提供する。いくつかの実施形態では、障害は、軟骨形成不全、軟骨低形成症、小人症、致死性骨異形成症（ＴＤ、臨床型ＴＤ１及びＴＤＩＩ）、または頭蓋骨癒合症症候群である。
【０１６８】
本発明の方法は、更なる治療ステップを更に含み得る。例えば、一実施形態では、方法は、標的とされた細胞及び／または組織（例えば、癌細胞）が放射線治療または化学療法剤に曝露されるステップを更に含む。
【０１６９】
一態様では、本発明は、有効量の抗ＦＧＦＲ２／３抗体を、有効量の別の治療薬（例えば、抗血管新生剤、別の抗体、化学療法剤、細胞毒性薬、免疫抑制剤、プロドラッグ、サイトカイン、細胞毒性放射線療法、コルチコステロイド、制吐剤、癌ワクチン、鎮痛剤、または成長阻害剤）と組み合わせて投与することを含む方法を提供する。例えば、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、抗癌剤または抗血管新生剤と併用されて、様々な腫瘍性または非腫瘍性状態を治療する。具体的な例では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ベルケイド、レブリミド、タモキシフェン、レトロゾール、エキセメスタン、アナストロゾール、イリノテカン、セツキシマブ、フルベストラント、ビノレルビン、ベバシズマブ、ビンクリスチン、シスプラチン、ゲムシタビン、メトトレキサート、ビンブラスチン、カルボプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、ペメトレキセド、５−フルオロウラシル、ドキソルビシン、ボルテゾミブ、レナリドミド、デキサメタゾン、メルファリン、プレドニゾン、ビンクリスチン、及び／またはサリドマイドと併用される。
【０１７０】
治療される特定の癌適応症に応じて、本発明の併用療法は、化学療法剤等の更なる治療薬、または放射線療法もしくは外科等の更なる療法と組み合わせられ得る。多くの既知の化学療法剤を本発明の併用療法で使用することができる。好ましくは、特定の適応症の治療に標準の化学療法剤が使用される。併用される各治療薬の投薬量または頻度は、好ましくは、他の薬剤（複数可）なしで使用される場合、対応する薬剤の投薬量または頻度と同じか、またはそれ未満である。
【０１７１】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の抗ＦＧＦＲ２／３抗体のうちのいずれかを提供し、該抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、検出可能な標識を含む。
【０１７２】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の抗ＦＧＦＲ２／３抗体のうちのいずれかとＦＧＦＲ２／３の複合体を提供する。いくつかの実施形態では、複合体は、インビボまたはインビトロに存在する。いくつかの実施形態では、複合体は、癌細胞を含む。いくつかの実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、検出可能に標識される。
【０１７３】
本開示は、ベータ−Ｋｌｏｔｈｏ（ＫＬＢ）に結合する抗体、ならびにＫＬＢとＦＧＦＲ２及び／またはＦＧＦＲ３（「ＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体」）の両方に結合する二重特異性抗体、ならびにその使用方法も提供する。特定の実施形態では、ＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体を使用して、体重減少ならびにグルコース及び脂質代謝の改善を含む代謝性疾患及び障害を治療することができる。ある特定の実施形態では、ＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体を使用して、肝臓に著しい影響を及ぼすことなく、かつ骨量を著しく減少することなく、代謝性障害または疾患を治療することができる。好ましい実施形態では、ＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を治療するために使用される。
【０１７４】
ある特定の実施形態では、二重特異性抗体は、単離された抗体である。ある特定の実施形態では、二重特異性抗体は、ＫＬＢ及びＦＧＦＲ２の両方、ＫＬＢ及びＦＧＦＲ３の両方、またはＫＬＢ、ＦＧＦＲ２、及びＦＧＦＲ３の３つ全てに結合することができ、本抗体は、ＫＬＢのＣ末端ドメインに結合する。ある特定の実施形態では、二重特異性抗体は、アミノ酸配列ＳＳＰＴＲＬＡＶＩＰＷＧＶＲＫＬＬＲＷＶＲＲＮＹＧＤＭＤＩＹＩＴＡＳ（配列番号１０３）を含むＫＬＢの断片に結合する。  
【０１７５】
ある特定の実施形態では、ＫＬＢに結合する二重特異性抗体は、アミノ酸配列ＴＮＴＥＫＭＥＫＲＬＨＡＶＰＡＡＮＴＶＫＦＲＣＰＡ（配列番号９１）またはＹＫＶＲＮＱＨＷＳＬＩＭＥＳ（配列番号９２）を含むＦＧＦＲ２の断片内のエピトープにも結合する。ある特定の実施形態では、ＫＬＢに結合する二重特異性抗体は、アミノ酸配列ＴＲＰＥＲＭＤＫＫＬＬＡＶＰＡＡＮＴＶＲＦＲＣＰＡ（配列番号９３）及びＩＫＬＲＨＱＱＷＳＬＶＭＥＳ（配列番号９４）を含むＦＧＦＲ３の断片内のエピトープにも結合する。ある特定の実施形態では、ＫＬＢに結合する二重特異性抗体は、アミノ酸配列ＴＮＴＥＫＭＥＫＲＬＨＡＶＰＡＡＮＴＶＫＦＲＣＰＡ（配列番号９１）またはＹＫＶＲＮＱＨＷＳＬＩＭＥＳ（配列番号９２）を含むＦＧＦＲ２の断片内のエピトープにも結合し、アミノ酸配列ＴＲＰＥＲＭＤＫＫＬＬＡＶＰＡＡＮＴＶＲＦＲＣＰＡ（配列番号９３）及びＩＫＬＲＨＱＱＷＳＬＶＭＥＳ（配列番号９４）を含むＦＧＦＲ３の断片内のエピトープにも結合する。
【０１７６】
ある特定の実施形態では、ＫＬＢに結合する二重特異性抗体は、アミノ酸配列ＴＮＴＥＫＭＥＫＲＬＨＡＶＰＡＡＮＴＶＫＦＲＣＰＡ（配列番号９１）及び／またはＹＫＶＲＮＱＨＷＳＬＩＭＥＳ（配列番号９２）と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性または類似性を有するＦＧＦＲ２の断片内のエピトープにも結合する。ある特定の実施形態では、ＫＬＢに結合する二重特異性抗体は、アミノ酸配列ＴＲＰＥＲＭＤＫＫＬＬＡＶＰＡＡＮＴＶＲＦＲＣＰＡ（配列番号９３）及びＩＫＬＲＨＱＱＷＳＬＶＭＥＳ（配列番号９４）と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性または類似性を有するＦＧＦＲ３の断片内のエピトープにも結合する。ある特定の実施形態では、ＫＬＢに結合する二重特異性抗体は、アミノ酸配列ＴＮＴＥＫＭＥＫＲＬＨＡＶＰＡＡＮＴＶＫＦＲＣＰＡ（配列番号９１）及び／またはＹＫＶＲＮＱＨＷＳＬＩＭＥＳ（配列番号９２）と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性または類似性を有するＦＧＦＲ２の断片内のエピトープにも結合し、アミノ酸配列ＴＲＰＥＲＭＤＫＫＬＬＡＶＰＡＡＮＴＶＲＦＲＣＰＡ（配列番号９３）及びＩＫＬＲＨＱＱＷＳＬＶＭＥＳ（配列番号９４）と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性または類似性を有するＦＧＦＲ３の断片内のエピトープにも結合する。
【０１７７】
ある特定の実施形態では、ＫＬＢに結合する二重特異性抗体は、配列番号５２または５４のアミノ酸配列範囲１５７〜１８１内でＦＧＦＲ２にも結合する。ある特定の実施形態では、ＫＬＢに結合する二重特異性抗体は、配列番号５２または５４のアミノ酸配列範囲２０７〜２２０内でＦＧＦＲ２にも結合する。ある特定の実施形態では、ＫＬＢに結合する二重特異性抗体は、配列番号５２または５４のアミノ酸配列範囲１５７〜１８１及び２０７〜２２０内でＦＧＦＲ２にも結合する。
【０１７８】
ある特定の実施形態では、ＫＬＢ及びＦＧＦＲ２／３に結合する二重特異性抗体は、恒常的ＦＧＦＲ２及び／またはＦＧＦＲ３活性を阻害する。ある特定の実施形態では、恒常的ＦＧＦＲ２／３活性は、リガンド依存性恒常的ＦＧＦＲ２／３活性である。ある特定の実施形態では、恒常的ＦＧＦＲ２／３活性は、リガンド非依存性恒常的ＦＧＦＲ２／３活性である。ある特定の実施形態では、恒常的ＦＧＦＲ２／３活性は、ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３活性である。
【０１７９】
ある特定の実施形態では、本開示のＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体は、インビボで血中グルコース濃度を低減する。ある特定の実施形態では、本開示のＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体は、骨密度に著しい影響を及ぼさない。ある特定の実施形態では、本開示のＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体は、肝臓に著しい影響を及ぼさない。ある特定の実施形態では、本開示のＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体は、ＦＧＦ２１が誘導するよりも著しく低いレベルの肝臓におけるＥＲＫ及びＭＥＫリン酸化を含む。ある特定の実施形態では、本開示のＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体は、１０−８Ｍ〜１０−１３ＭのＫｄでＫＬＢに結合する。ある特定の実施形態では、本開示のＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体は、１０−８Ｍ〜１０−１３ＭのＫｄでＦＧＦＲ２及び／またはＦＧＦＲ３タンパク質に結合することができる。ある特定の実施形態では、本開示のＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体は、１０−８Ｍ〜１０−１３ＭのＫｄでＦＧＦＲ２及び／またはＦＧＦＲ３に結合することができる。
【０１８０】
ある特定の実施形態では、本開示のＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体は、ＫＬＢ上に存在するエピトープに結合する。例えであって、限定するものではなく、本開示は、ＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体を提供し、図１１Ａ及び１１Ｂに示される抗体と同じＫＬＢ上のエピトープに結合することができる。ある特定の実施形態では、本開示のＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体は、１２Ａ１１または８Ｃ５抗体と同じエピトープに結合することができる。ある特定の実施形態では、本開示のＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体は、ＫＬＢのＣ末端ドメイン内のエピトープに結合することができる。ある特定の実施形態では、本開示のＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体は、アミノ酸配列  ＳＳＰＴＲＬＡＶＩＰＷＧＶＲＫＬＬＲＷＶＲＲＮＹＧＤＭＤＩＹＩＴＡＳ（配列番号１０３）からなるＫＬＢの断片に結合することができる。
【０１８１】
ある特定の実施形態では、本開示のＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体のうちのいずれかのＫＬＢアームは、その全体が本明細書に組み込まれるＵＳ２０１５０２１８２７６に記載のいずれかのＫＬＢ抗体のアームである。
【０１８２】
ある特定の実施形態では、本開示のＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体のうちのいずれかのＦＧＦＲ２／３アームは、本明細書に記載のいずれかのＦＧＦＲ２／３抗体のアームである。
【０１８３】
ある特定の実施形態では、本開示のＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む第１の抗体またはその抗原結合部分を含み、重鎖可変領域は、配列番号１０４に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含み、軽鎖可変領域は、配列番号１０５に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含む。  ある特定の実施形態では、第２の抗体またはその抗原結合部分は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、表１の列２に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含み、軽鎖可変領域は、表１の列３に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含む。
2017538442.tif 000004
【０１８４】
ある特定の実施形態では、本開示の抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体は、重鎖領域及び軽鎖領域を含む第１の抗体またはその抗原結合部分を含み、重鎖領域は、配列番号１０６に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含み、軽鎖領域は、配列番号１０７に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含む。  ある特定の実施形態では、第２の抗体またはその抗原結合部分は、重鎖領域及び軽鎖領域を含み、重鎖領域は、表１の列２に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含み、軽鎖領域は、表１の列３に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含む。
【０１８５】
好ましい実施形態では、本開示のＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む第１の抗ＫＬＢ抗体またはその抗原結合部分を含み、重鎖可変領域は、配列番号１０４に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含み、軽鎖可変領域は、配列番号１０５に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含み、第２の抗ＦＧＦＲ２／３抗体またはその抗原結合部分は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、配列番号６６に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含み、軽鎖可変領域は、配列番号８２に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含む。  
【０１８６】
好ましい実施形態では、本開示のＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む第１の抗ＫＬＢ抗体またはその抗原結合部分（重鎖可変領域は、配列番号１０６に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含み、軽鎖可変領域は、配列番号１０７に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含み、第２の抗ＦＧＦＲ２／３抗体またはその抗原結合部分は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、配列番号８２に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含み、軽鎖可変領域は、配列番号６６に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含む。  
【０１８７】
好ましい実施形態では、本開示のＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む第１の抗ＫＬＢ抗体またはその抗原結合部分（重鎖可変領域は、配列番号１０６に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含み、軽鎖可変領域は、配列番号１０７に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含み、第２の抗ＦＧＦＲ２／３抗体またはその抗原結合部分は、重鎖及び軽鎖を含み、重鎖は、配列番号２８２に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含み、軽鎖は、配列番号２８３に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含む。  
【０１８８】
好ましい実施形態では、本開示のＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む第１の抗ＫＬＢ抗体またはその抗原結合部分（重鎖可変領域は、配列番号１０６に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含み、軽鎖可変領域は、配列番号１０７に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含む）と、第２の抗ＦＧＦＲ２／３抗体またはその抗原結合部分（軽鎖上のＣＤＲは、配列番号７〜９（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３）と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を有するアミノ酸を含み、重鎖上のＣＤＲは、配列番号１０〜１２（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３）と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を有するアミノ酸を含む）とを含む。  
【０１８９】
好ましい実施形態では、本開示のＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む第１の抗ＫＬＢ抗体またはその抗原結合部分（重鎖可変領域は、配列番号１０６に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含み、軽鎖可変領域は、配列番号１０７に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含む）と、第２の抗ＦＧＦＲ２／３抗体またはその抗原結合部分（軽鎖上のＣＤＲは、配列番号２７６〜２７８（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３）と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を有するアミノ酸を含み、重鎖上のＣＤＲは、配列番号２７９〜２８１（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３）と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を有するアミノ酸を含む）とを含む。  
【０１９０】
ある特定の実施形態では、本開示のＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体は、（ａ）配列番号２３０〜２３２及び２３６〜２４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｂ）配列番号１２３〜１３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、ならびに（ｃ）配列番号１４２及び２４８〜２６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む第１の抗ＫＬＢ抗体またはその抗原結合部分を含む。
【０１９１】
ある特定の実施形態では、本開示のＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体は、（ａ）配列番号２３０〜２３２及び２３６〜２４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１４２及び２４８〜２６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、ならびに（ｃ）配列番号２６３〜２７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む第１の抗ＫＬＢ抗体またはその抗原結合部分を含む。
【０１９２】
ある特定の実施形態では、本開示のＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体は、（ａ）配列番号２７９〜２９３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号２９４〜３０９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号３１０〜３２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む第１の抗ＫＬＢ抗体またはその抗原結合部分を含む。
【０１９３】
ある特定の実施形態では、本開示のＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体は、（ａ）配列番号１１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１５０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号１６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号１８１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号１９７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号２１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む第１の抗ＫＬＢ抗体またはその抗原結合部分を含む。
【０１９４】
ある特定の実施形態では、本開示のＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体は、（ａ）配列番号１２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号１６９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号１８４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号２００のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号２１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む第１の抗ＫＬＢ抗体またはその抗原結合部分を含む。
【０１９５】
ある特定の実施形態では、本開示のＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体は、本明細書に開示される抗ＫＬＢ抗体またはその全体が本明細書に組み込まれるＵＳ２０１５０２１８２７６に開示される抗ＫＬＢ抗体のうちのいずれかから選択される抗ＫＬＢ抗体またはその抗原結合部分の１つのアームと、本明細書に開示されるＦＧＦＲ２／３抗体の１つのアームとを含む。特定の実施形態では、ＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性のアームは、以下の組み合わせから選択される：
ａ）８Ｃ５．Ｋ４．Ｍ４Ｌ．Ｈ３．ＫＮＶ抗ＫＬＢ抗体の１つのアーム（配列番号１０４（ＨＣＶＲ）及び配列番号１０５（ＬＣＶＲ）を含む）と２Ｂ．１．３．１２抗ＦＧＦＲ２／３抗体の１つのアーム（配列番号８２（重鎖）及び配列番号６６（軽鎖）を含む）、
ｂ）８Ｃ５．Ｋ４．Ｍ４Ｌ．Ｈ３．ＫＮＶ抗ＫＬＢ抗体の１つのアーム（配列番号１０６（重鎖）及び配列番号１０７（軽鎖）を含む）と２Ｂ．１．３．１２抗ＦＧＦＲ２／３抗体の１つのアーム（配列番号８２（重鎖）及び配列番号６６（軽鎖）を含む）、
ｃ）８Ｃ５．Ｋ４．Ｍ４Ｌ．Ｈ３．ＫＮＶ抗ＫＬＢ抗体の１つのアーム（配列番号１０４（ＨＣＶＲ）及び配列番号１０５（ＬＣＶＲ）を含む）と２Ｂ．１．３．１２抗ＦＧＦＲ２／３抗体の１つのアーム（配列番号７〜９（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３）ならびに配列番号１０〜１２（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３）を含む）、
ｄ）８Ｃ５．Ｋ４．Ｍ４Ｌ．Ｈ３．ＫＮＶ抗ＫＬＢ抗体の１つのアーム（配列番号１０６（重鎖）及び配列番号１０７（軽鎖）を含む）との１つ２Ｂ．１．３．１２抗ＦＧＦＲ２／３抗体のアーム（配列番号７〜９（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３）ならびに配列番号１０〜１２（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３）を含む）、
ｅ）８Ｃ５．Ｋ４．Ｍ４Ｌ．Ｈ３．ＫＮＶ抗ＫＬＢ抗体の１つのアーム（配列番号１０４（ＨＣＶＲ）及び配列番号１０５（ＬＣＶＲ）を含む）と２Ｂ．１．１．６抗ＦＧＦＲ２／３抗体の１つのアーム（配列番号２８２（重鎖）及び配列番号２８３（軽鎖）を含む）、
ｆ）８Ｃ５．Ｋ４．Ｍ４Ｌ．Ｈ３．ＫＮＶ抗ＫＬＢ抗体の１つのアーム（配列番号１０６（重鎖）及び配列番号１０７（軽鎖）を含む）と２Ｂ．１．１．６抗ＦＧＦＲ２／３抗体の１つのアーム（配列番号２８２（重鎖）及び配列番号２８３（軽鎖）を含む）、
ｇ）８Ｃ５．Ｋ４．Ｍ４Ｌ．Ｈ３．ＫＮＶ抗ＫＬＢ抗体の１つのアーム（配列番号１０４（ＨＣＶＲ）及び配列番号１０５（ＬＣＶＲ）を含む）と２Ｂ．１．１．６抗ＦＧＦＲ２／３抗体の１つのアーム（配列番号２７６〜２７８（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３）ならびに配列番号２７９〜２８１（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３）を含む）、ならびに
ｈ）８Ｃ５．Ｋ４．Ｍ４Ｌ．Ｈ３．ＫＮＶ抗ＫＬＢ抗体の１つのアーム（配列番号１０６（重鎖）及び配列番号１０７（軽鎖）を含む）と２Ｂ．１．１．６抗ＦＧＦＲ２／３抗体の１つのアーム（配列番号２７６〜２７８（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３）ならびに配列番号２７９〜２８１（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３）を含む）。
【０１９６】
ある特定の実施形態では、本開示のＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体は、（ａ）配列番号１０４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び（ｂ）配列番号１０５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む第１の抗ＫＬＢ抗体またはその抗原結合部分を含む。  ある特定の実施形態では、本開示のＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体は、（ａ）配列番号１０６のアミノ酸配列を含む重鎖及び（ｂ）配列番号１０７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む第１の抗ＫＬＢ抗体またはその抗原結合部分を含む。  
【０１９７】
別の態様では、本開示のＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体は、（ａ）配列番号１０４のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域、（ｂ）配列番号１０５のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、及び（ｃ）（ａ）と同様の重鎖可変領域及び（ｂ）と同様の軽鎖可変領域を含む第１の抗ＫＬＢ抗体またはその抗原結合部分を含む。
【０１９８】
ある特定の実施形態では、本開示のＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体は、モノクローナル抗体である。ある特定の実施形態では、本抗体は、ヒト、ヒト化、またはキメラ抗体である。ある特定の実施形態では、本抗体は、低下したエフェクター機能を有する。
【０１９９】
別の態様では、本開示は、本開示のＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体をコードする単離された核酸を提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、本開示のＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、ＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体の産生方法であって、本開示の宿主細胞を培養することを含み、これにより、本抗体が産生される、方法を提供する。ある特定の実施形態では、本方法は、宿主細胞からＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体を回収することを更に含む。
【０２００】
本開示は、本発明の１つ以上の抗体及び薬学的に許容される担体を含む薬学的製剤を更に提供する。具体的には、本開示は、本明細書に記載のＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体を含む薬学的製剤を提供する。ある特定の実施形態では、薬学的製剤は、更なる治療薬を含む。
【０２０１】
別の態様では、本開示は、薬物として使用するための本発明のＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体を提供する。ある特定の実施形態では、抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体は、代謝性障害、例えば、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）、メタボリック症候群（ＭｅｔＳ）、肥満、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、脂質異常症、高血圧症、２型糖尿病、非２型糖尿病、１型糖尿病、潜在性自己免疫性糖尿病（ＬＡＤ）、及び若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）の治療に使用するためのものである。ある特定の実施形態では、ＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体は、２型糖尿病の治療に使用するためのものである。ある特定の実施形態では、ＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体は、肥満の治療に使用するためのものである。ある特定の実施形態では、本開示は、バルデー・ビードル症候群、プラダー・ウィリ症候群、アルストレム症候群、コーエン症候群、オルブライト遺伝性骨異栄養症（偽性副甲状腺機能低下症）、カーペンター症候群、ＭＯＭＯ症候群、ルビンステイン・テイビ症候群、脆弱性Ｘ症候群、及びベルエソン・フォルスマン・レーマン症候群の治療に使用するためのＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体を提供する。ある特定の実施形態では、ＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体は、ＮＡＳＨの治療に使用するためのものである。
【０２０２】
別の態様では、本開示は、代謝性障害、例えば、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）、メタボリック症候群（ＭｅｔＳ）、肥満、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、脂質異常症、高血圧症、２型糖尿病、非２型糖尿病、１型糖尿病、潜在性自己免疫性糖尿病（ＬＡＤ）、及び若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）、ならびに加齢及び関連疾患、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、及びＡＬＳの治療用の薬剤の製造における本明細書に開示されるＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体の使用を提供する。ある特定の実施形態では、代謝性障害は、２型糖尿病である。ある特定の実施形態では、代謝性障害は、ＮＡＳＨである。
【０２０３】
別の態様では、本開示は、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）、メタボリック症候群（ＭｅｔＳ）、肥満、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、脂質異常症、高血圧症、２型糖尿病、非２型糖尿病、１型糖尿病、潜在性自己免疫性糖尿病（ＬＡＤ）、及び若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）、ならびに加齢及び関連疾患、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、及びＡＬＳからなる群から選択される疾患を有する個体の治療方法であって、前記個体に有効量の１つ以上の本開示のＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体を投与することを含む、該方法を提供する。ある特定の実施形態では、疾患は、糖尿病、例えば、２型糖尿病である。ある特定の実施形態では、疾患は、肥満である。ある特定の実施形態では、本開示は、バルデー・ビードル症候群、プラダー・ウィリ症候群、アルストレム症候群、コーエン症候群、オルブライト遺伝性骨異栄養症（偽性副甲状腺機能低下症）、カーペンター症候群、ＭＯＭＯ症候群、ルビンステイン・テイビ症候群、脆弱性Ｘ症候群、及びベルエソン・フォルスマン・レーマン症候群からなる群から選択される疾患及び／または障害を有する個体の治療方法であって、前記個体に有効量の１つ以上の本開示のＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体を投与することを含む、該方法を提供する。ある特定の実施形態では、本方法は、個体に更なる治療薬を投与することを更に含む。ある特定の実施形態では、１つ以上の本開示のＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体の使用方法は、個体における肝機能に影響を及ぼさない。ある特定の実施形態では、本開示は、体重減少の誘導方法であって、個体に有効量の本開示の１つ以上の抗体を投与することを含む体重減少の誘導方法を提供する。
【０２０４】
別の実施形態では、本開示のＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体は、薬物として使用することができ、本明細書に開示される抗ＫＬＢ抗体またはその全体が本明細書に組み込まれるＵＳ２０１５０２１８２７６に開示される抗ＫＬＢ抗体のうちのいずれかから選択される抗ＫＬＢ抗体またはその抗原結合部分の１つのアームと、本明細書に開示されるＦＧＦＲ２／３抗体の１つのアームとを含む。特定の実施形態では、薬物として使用することができるＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体のアームは、以下の組み合わせから選択される：
ａ）８Ｃ５．Ｋ４．Ｍ４Ｌ．Ｈ３．ＫＮＶ抗ＫＬＢ抗体の１つのアーム（配列番号１０４（ＨＣＶＲ）及び配列番号１０５（ＬＣＶＲ）を含む）と２Ｂ．１．３．１２抗ＦＧＦＲ２／３抗体の１つのアーム（配列番号８２（重鎖）及び配列番号６６（軽鎖）を含む）、
ｂ）８Ｃ５．Ｋ４．Ｍ４Ｌ．Ｈ３．ＫＮＶ抗ＫＬＢ抗体の１つのアーム（配列番号１０６（重鎖）及び配列番号１０７（軽鎖）を含む）と２Ｂ．１．３．１２抗ＦＧＦＲ２／３抗体の１つのアーム（配列番号８２（重鎖）及び配列番号６６（軽鎖）を含む）、
ｃ）８Ｃ５．Ｋ４．Ｍ４Ｌ．Ｈ３．ＫＮＶ抗ＫＬＢ抗体の１つのアーム（配列番号１０４（ＨＣＶＲ）及び配列番号１０５（ＬＣＶＲ）を含む）と２Ｂ．１．３．１２抗ＦＧＦＲ２／３抗体の１つのアーム（配列番号７〜９（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３）ならびに配列番号１０〜１２（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３）を含む）、
ｄ）８Ｃ５．Ｋ４．Ｍ４Ｌ．Ｈ３．ＫＮＶ抗ＫＬＢ抗体の１つのアーム（配列番号１０６（重鎖）及び配列番号１０７（軽鎖）を含む）との１つ２Ｂ．１．３．１２抗ＦＧＦＲ２／３抗体のアーム（配列番号７〜９（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３）ならびに配列番号１０〜１２（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３）を含む）、
ｅ）８Ｃ５．Ｋ４．Ｍ４Ｌ．Ｈ３．ＫＮＶ抗ＫＬＢ抗体の１つのアーム（配列番号１０４（ＨＣＶＲ）及び配列番号１０５（ＬＣＶＲ）を含む）と２Ｂ．１．１．６抗ＦＧＦＲ２／３抗体の１つのアーム（配列番号２８２（重鎖）及び配列番号２８３（軽鎖）を含む）、
ｆ）８Ｃ５．Ｋ４．Ｍ４Ｌ．Ｈ３．ＫＮＶ抗ＫＬＢ抗体の１つのアーム（配列番号１０６（重鎖）及び配列番号１０７（軽鎖）を含む）と２Ｂ．１．１．６抗ＦＧＦＲ２／３抗体の１つのアーム（配列番号２８２（重鎖）及び配列番号２８３（軽鎖）を含む）、
ｇ）８Ｃ５．Ｋ４．Ｍ４Ｌ．Ｈ３．ＫＮＶ抗ＫＬＢ抗体の１つのアーム（配列番号１０４（ＨＣＶＲ）及び配列番号１０５（ＬＣＶＲ）を含む）と２Ｂ．１．１．６抗ＦＧＦＲ２／３抗体の１つのアーム（配列番号２７６〜２７８（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３）ならびに配列番号２７９〜２８１（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３）を含む）、ならびに
ｈ）８Ｃ５．Ｋ４．Ｍ４Ｌ．Ｈ３．ＫＮＶ抗ＫＬＢ抗体の１つのアーム（配列番号１０６（重鎖）及び配列番号１０７（軽鎖）を含む）と２Ｂ．１．１．６抗ＦＧＦＲ２／３抗体の１つのアーム（配列番号２７６〜２７８（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３）ならびに配列番号２７９〜２８１（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３）を含む）。
【０２０５】
別の実施形態では、本開示のＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体は、代謝性疾患（例えば、ＮＡＳＨまたは関連疾患）を治療するために使用することができ、本明細書に開示される抗ＫＬＢ抗体またはその全体が本明細書に組み込まれるＵＳ２０１５０２１８２７６に開示される抗ＫＬＢ抗体のうちのいずれかから選択される抗ＫＬＢ抗体またはその抗原結合部分の１つのアームと、本明細書に開示されるＦＧＦＲ２／３抗体の１つのアームとを含む。特定の実施形態では、代謝性疾患（例えば、ＮＡＳＨまたは関連疾患）を治療するために使用することができるＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体のアームは、以下の組み合わせから選択される：
ａ）８Ｃ５．Ｋ４．Ｍ４Ｌ．Ｈ３．ＫＮＶ抗ＫＬＢ抗体の１つのアーム（配列番号１０４（ＨＣＶＲ）及び配列番号１０５（ＬＣＶＲ）を含む）と２Ｂ．１．３．１２抗ＦＧＦＲ２／３抗体の１つのアーム（配列番号８２（重鎖）及び配列番号６６（軽鎖）を含む）、
ｂ）８Ｃ５．Ｋ４．Ｍ４Ｌ．Ｈ３．ＫＮＶ抗ＫＬＢ抗体の１つのアーム（配列番号１０６（重鎖）及び配列番号１０７（軽鎖）を含む）と２Ｂ．１．３．１２抗ＦＧＦＲ２／３抗体の１つのアーム（配列番号８２（重鎖）及び配列番号６６（軽鎖）を含む）、
ｃ）８Ｃ５．Ｋ４．Ｍ４Ｌ．Ｈ３．ＫＮＶ抗ＫＬＢ抗体の１つのアーム（配列番号１０４（ＨＣＶＲ）及び配列番号１０５（ＬＣＶＲ）を含む）と２Ｂ．１．３．１２抗ＦＧＦＲ２／３抗体の１つのアーム（配列番号７〜９（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３）ならびに配列番号１０〜１２（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３）を含む）、
ｄ）８Ｃ５．Ｋ４．Ｍ４Ｌ．Ｈ３．ＫＮＶ抗ＫＬＢ抗体の１つのアーム（配列番号１０６（重鎖）及び配列番号１０７（軽鎖）を含む）との１つ２Ｂ．１．３．１２抗ＦＧＦＲ２／３抗体のアーム（配列番号７〜９（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３）ならびに配列番号１０〜１２（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３）を含む）、
ｅ）８Ｃ５．Ｋ４．Ｍ４Ｌ．Ｈ３．ＫＮＶ抗ＫＬＢ抗体の１つのアーム（配列番号１０４（ＨＣＶＲ）及び配列番号１０５（ＬＣＶＲ）を含む）と２Ｂ．１．１．６抗ＦＧＦＲ２／３抗体の１つのアーム（配列番号２８２（重鎖）及び配列番号２８３（軽鎖）を含む）、
ｆ）８Ｃ５．Ｋ４．Ｍ４Ｌ．Ｈ３．ＫＮＶ抗ＫＬＢ抗体の１つのアーム（配列番号１０６（重鎖）及び配列番号１０７（軽鎖）を含む）と２Ｂ．１．１．６抗ＦＧＦＲ２／３抗体の１つのアーム（配列番号２８２（重鎖）及び配列番号２８３（軽鎖）を含む）、
ｇ）８Ｃ５．Ｋ４．Ｍ４Ｌ．Ｈ３．ＫＮＶ抗ＫＬＢ抗体の１つのアーム（配列番号１０４（ＨＣＶＲ）及び配列番号１０５（ＬＣＶＲ）を含む）と２Ｂ．１．１．６抗ＦＧＦＲ２／３抗体の１つのアーム（配列番号２７６〜２７８（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３）ならびに配列番号２７９〜２８１（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３）を含む）、ならびに
ｈ）８Ｃ５．Ｋ４．Ｍ４Ｌ．Ｈ３．ＫＮＶ抗ＫＬＢ抗体の１つのアーム（配列番号１０６（重鎖）及び配列番号１０７（軽鎖）を含む）と２Ｂ．１．１．６抗ＦＧＦＲ２／３抗体の１つのアーム（配列番号２７６〜２７８（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３）ならびに配列番号２７９〜２８１（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３）を含む）。
【図面の簡単な説明】
【０２０６】
【図１】ＦＧＦ７刺激ＭＣＦ−７細胞増殖に対する操作された２Ｂ．１抗体の阻害作用を示す。エラーバーは、ＳＥＭを表す。
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｃは、ＦＧＦＲ２  Ｄ２ドメインとＭａｂ  ２Ｂ．１．３のＦａｂ断片との間の複合体の結晶構造を示す。図２Ａは、複合体の全体構造を示す。ＦＧＦＲ２−Ｄ２を赤紫色で色付けし、Ｆａｂ  ２Ｂ．１．３の重鎖を緑色で色付けし、軽鎖を青色で色付けした。図２Ｂは、ＦＧＦＲ２−Ｄ２：２Ｂ．１．３の構造とＦＧＦＲ３−Ｄ２Ｄ３：Ｒ３Ｍａｂの構造のオーバーレイを示す。前述の複合体を図２Ａと同じ色で色付けした。ＦＧＦＲ３−Ｄ２Ｄ３を黄色で色付けし、Ｒ３Ｍａｂを灰色で色付けした。図２Ｃは、２つの複合体間の構造的差異を示す図２Ｂ中の囲まれた領域の拡大表示を示す。色スキームは、図２Ｂと同じである。
【図２Ｂ】図２Ａ〜２Ｃは、ＦＧＦＲ２  Ｄ２ドメインとＭａｂ  ２Ｂ．１．３のＦａｂ断片との間の複合体の結晶構造を示す。図２Ａは、複合体の全体構造を示す。ＦＧＦＲ２−Ｄ２を赤紫色で色付けし、Ｆａｂ  ２Ｂ．１．３の重鎖を緑色で色付けし、軽鎖を青色で色付けした。図２Ｂは、ＦＧＦＲ２−Ｄ２：２Ｂ．１．３の構造とＦＧＦＲ３−Ｄ２Ｄ３：Ｒ３Ｍａｂの構造のオーバーレイを示す。前述の複合体を図２Ａと同じ色で色付けした。ＦＧＦＲ３−Ｄ２Ｄ３を黄色で色付けし、Ｒ３Ｍａｂを灰色で色付けした。図２Ｃは、２つの複合体間の構造的差異を示す図２Ｂ中の囲まれた領域の拡大表示を示す。色スキームは、図２Ｂと同じである。
【図２Ｃ】図２Ａ〜２Ｃは、ＦＧＦＲ２  Ｄ２ドメインとＭａｂ  ２Ｂ．１．３のＦａｂ断片との間の複合体の結晶構造を示す。図２Ａは、複合体の全体構造を示す。ＦＧＦＲ２−Ｄ２を赤紫色で色付けし、Ｆａｂ  ２Ｂ．１．３の重鎖を緑色で色付けし、軽鎖を青色で色付けした。図２Ｂは、ＦＧＦＲ２−Ｄ２：２Ｂ．１．３の構造とＦＧＦＲ３−Ｄ２Ｄ３：Ｒ３Ｍａｂの構造のオーバーレイを示す。前述の複合体を図２Ａと同じ色で色付けした。ＦＧＦＲ３−Ｄ２Ｄ３を黄色で色付けし、Ｒ３Ｍａｂを灰色で色付けした。図２Ｃは、２つの複合体間の構造的差異を示す図２Ｂ中の囲まれた領域の拡大表示を示す。色スキームは、図２Ｂと同じである。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｄは、Ｒ３Ｍａｂ変異形によるＦＧＦリガンドの示差遮断を示す。図３Ａは、ヒトＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂへのＦＧＦ−７結合の遮断を示す。図３Ｂは、ヒトＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃへのＦＧＦ−１結合の遮断を示す。図３Ｃは、ヒトＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂへのＦＧＦ−１結合の遮断を示す。図３Ｄは、ヒトＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃへのＦＧＦ−１結合の遮断を示す。図３Ｅは、ヒトＦＧＦＲ４へのＦＧＦ−１９結合の遮断を示す。
【図３Ｂ】図３Ａ〜３Ｄは、Ｒ３Ｍａｂ変異形によるＦＧＦリガンドの示差遮断を示す。図３Ａは、ヒトＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂへのＦＧＦ−７結合の遮断を示す。図３Ｂは、ヒトＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃへのＦＧＦ−１結合の遮断を示す。図３Ｃは、ヒトＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂへのＦＧＦ−１結合の遮断を示す。図３Ｄは、ヒトＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃへのＦＧＦ−１結合の遮断を示す。図３Ｅは、ヒトＦＧＦＲ４へのＦＧＦ−１９結合の遮断を示す。
【図３Ｃ】図３Ａ〜３Ｄは、Ｒ３Ｍａｂ変異形によるＦＧＦリガンドの示差遮断を示す。図３Ａは、ヒトＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂへのＦＧＦ−７結合の遮断を示す。図３Ｂは、ヒトＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃへのＦＧＦ−１結合の遮断を示す。図３Ｃは、ヒトＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂへのＦＧＦ−１結合の遮断を示す。図３Ｄは、ヒトＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃへのＦＧＦ−１結合の遮断を示す。図３Ｅは、ヒトＦＧＦＲ４へのＦＧＦ−１９結合の遮断を示す。
【図３Ｄ】図３Ａ〜３Ｄは、Ｒ３Ｍａｂ変異形によるＦＧＦリガンドの示差遮断を示す。図３Ａは、ヒトＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂへのＦＧＦ−７結合の遮断を示す。図３Ｂは、ヒトＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃへのＦＧＦ−１結合の遮断を示す。図３Ｃは、ヒトＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂへのＦＧＦ−１結合の遮断を示す。図３Ｄは、ヒトＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃへのＦＧＦ−１結合の遮断を示す。図３Ｅは、ヒトＦＧＦＲ４へのＦＧＦ−１９結合の遮断を示す。
【図３Ｅ】図３Ａ〜３Ｄは、Ｒ３Ｍａｂ変異形によるＦＧＦリガンドの示差遮断を示す。図３Ａは、ヒトＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂへのＦＧＦ−７結合の遮断を示す。図３Ｂは、ヒトＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃへのＦＧＦ−１結合の遮断を示す。図３Ｃは、ヒトＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂへのＦＧＦ−１結合の遮断を示す。図３Ｄは、ヒトＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃへのＦＧＦ−１結合の遮断を示す。図３Ｅは、ヒトＦＧＦＲ４へのＦＧＦ−１９結合の遮断を示す。
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｃは、２Ｂ．１変異形がインビトロでＦＧＦＲ２シグナル伝達を阻害し、インビボで異種移植片成長を抑制することを示す。図４Ａは、胃癌細胞株ＳＮＵ−１６における２Ｂ．１変異形によるＦＧＦ７刺激ＦＧＦＲ２シグナル伝達の遮断を示す。図４Ｂは、対照抗体と比較した、ＦＧＦＲ２依存性ＳＮＵ−１６異種移植片の成長に対する２Ｂ．１．３．１０及び２Ｂ．１．３．１２の影響を示す。図４Ｃは、ＦＧＦＲ３依存性ＲＴ１１２膀胱癌異種移植片の成長に対する２Ｂ．１．３．１０及び２Ｂ．１．３．１２の影響を示す。
【図４Ｂ】図４Ａ〜４Ｃは、２Ｂ．１変異形がインビトロでＦＧＦＲ２シグナル伝達を阻害し、インビボで異種移植片成長を抑制することを示す。図４Ａは、胃癌細胞株ＳＮＵ−１６における２Ｂ．１変異形によるＦＧＦ７刺激ＦＧＦＲ２シグナル伝達の遮断を示す。図４Ｂは、対照抗体と比較した、ＦＧＦＲ２依存性ＳＮＵ−１６異種移植片の成長に対する２Ｂ．１．３．１０及び２Ｂ．１．３．１２の影響を示す。図４Ｃは、ＦＧＦＲ３依存性ＲＴ１１２膀胱癌異種移植片の成長に対する２Ｂ．１．３．１０及び２Ｂ．１．３．１２の影響を示す。
【図４Ｃ】図４Ａ〜４Ｃは、２Ｂ．１変異形がインビトロでＦＧＦＲ２シグナル伝達を阻害し、インビボで異種移植片成長を抑制することを示す。図４Ａは、胃癌細胞株ＳＮＵ−１６における２Ｂ．１変異形によるＦＧＦ７刺激ＦＧＦＲ２シグナル伝達の遮断を示す。図４Ｂは、対照抗体と比較した、ＦＧＦＲ２依存性ＳＮＵ−１６異種移植片の成長に対する２Ｂ．１．３．１０及び２Ｂ．１．３．１２の影響を示す。図４Ｃは、ＦＧＦＲ３依存性ＲＴ１１２膀胱癌異種移植片の成長に対する２Ｂ．１．３．１０及び２Ｂ．１．３．１２の影響を示す。
【図５】Ｒ３Ｍａｂ（ＰＤＢ  ３ＧＲＷ）と接触したＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂの表面領域を示す。ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂのＤ２ドメイン及びＤ３ドメインの表面を灰色で示す。Ｒ３Ｍａｂの個別のＣＤＲループとの接触領域には色付けされている。各ＣＤＲとの接触領域及び全接触領域のそれらの割合を丸括弧内に番号で表示する。
【図６】Ｗｅｂｌｏｇｏ  ３（Ｃｒｏｏｋｓ，Ｇ．Ｅ．，Ｇ．Ｈｏｎ，Ｊ．Ｍ．Ｃｈａｎｄｏｎｉａ  ａｎｄ  Ｓ．Ｅ．Ｂｒｅｎｎｅｒ（２００４）．“ＷｅｂＬｏｇｏ：ａ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｌｏｇｏ  ｇｅｎｅｒａｔｏｒ．”Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  １４（６）：１１８８−１１９０）を使用して作成されたＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂへの結合のために選択されたファージライブラリからのＣＤＲ  Ｈ２の配列ロゴを示す。
【図７】ＦＧＦＲ２−Ｄ２：２Ｂ．１．３複合体及びＦＧＦＲ３−Ｄ２Ｄ３：Ｒ３Ｍａｂ複合体の全構造アライメントを示す。
【図８Ａ】乳癌細胞株ＭＦＭ−２２３ｘ２．２における２Ｂ．１変異形によるＦＧＦ７刺激ＦＧＦＲ２シグナル伝達の遮断を示す。
【図８Ｂ】ＦＧＦＲ２依存性ＭＦＭ−２２３ｘ２．２乳癌異種移植片の成長に対する２Ｂ．１．３．１０及び２Ｂ．１．３．１２の影響を示す。実験下のマウスは、エストロゲン毒性を示した。１群当たりｎ＝１０であり、エラーバーは、ＳＥＭを表す。
【図９Ａ】図９Ａ〜９Ｄは、２Ｂ．１．３．１０（すなわち、１．３．１０）及び２Ｂ．１．３．１２（すなわち、１．３．１２）抗ＦＧＦＲ２／３抗体のエピトープを示す。図９Ａは、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ配列を示し、抗ＦＧＦＲ２／３  １．３．１０及び１．３．１２抗体のエピトープには下線が引かれており、太字になっている。図９Ｂは、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃ配列を示し、抗ＦＧＦＲ２／３  １．３．１０及び１．３．１２抗体のエピトープには下線が引かれており、太字になっている。図９Ｃは、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ配列を示し、抗ＦＧＦＲ２／３  １．３．１０及び１．３．１２抗体のエピトープには下線が引かれており、太字になっている。図９Ｄは、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ配列を示し、抗ＦＧＦＲ２／３  １．３．１０及び１．３．１２抗体のエピトープには、下線が引かれており、太字になっている。抗体２Ｂ．１．３．１０は、配列番号５２及び５４（エピトープ配列については、配列番号９１及び９２も参照のこと）に従う残基番号１５７〜１８１及び２０７〜２２０を有する２つのベータ鎖から成るＦＧＦＲ２上のエピトープに結合する。抗体２Ｂ．１．３．１０は、配列番号５６及び５８（エピトープ配列については、配列番号９３及び９４も参照のこと）に従う残基番号１５４〜１７８及び２０４〜２１７を有する２つのベータ鎖から成るＦＧＦＲ３上のエピトープにも結合する。２Ｂ．１．３．１２は、２Ｂ．１．３．１０と同じエピトープに結合する。具体的には、２Ｂ．１．３．１２は、残基番号１５７〜１８１及び２０７〜２２０を有する２つのベータ鎖から成るＦＧＦＲ２上のエピトープに結合する。２Ｂ．１．３．１２は、残基番号１５４〜１７８及び２０４〜２１７を有する２つのベータ鎖から成るＦＧＦＲ３上のエピトープにも結合する。
【図９Ｂ】図９Ａ〜９Ｄは、２Ｂ．１．３．１０（すなわち、１．３．１０）及び２Ｂ．１．３．１２（すなわち、１．３．１２）抗ＦＧＦＲ２／３抗体のエピトープを示す。図９Ａは、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ配列を示し、抗ＦＧＦＲ２／３  １．３．１０及び１．３．１２抗体のエピトープには下線が引かれており、太字になっている。図９Ｂは、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃ配列を示し、抗ＦＧＦＲ２／３  １．３．１０及び１．３．１２抗体のエピトープには下線が引かれており、太字になっている。図９Ｃは、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ配列を示し、抗ＦＧＦＲ２／３  １．３．１０及び１．３．１２抗体のエピトープには下線が引かれており、太字になっている。図９Ｄは、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ配列を示し、抗ＦＧＦＲ２／３  １．３．１０及び１．３．１２抗体のエピトープには、下線が引かれており、太字になっている。抗体２Ｂ．１．３．１０は、配列番号５２及び５４（エピトープ配列については、配列番号９１及び９２も参照のこと）に従う残基番号１５７〜１８１及び２０７〜２２０を有する２つのベータ鎖から成るＦＧＦＲ２上のエピトープに結合する。抗体２Ｂ．１．３．１０は、配列番号５６及び５８（エピトープ配列については、配列番号９３及び９４も参照のこと）に従う残基番号１５４〜１７８及び２０４〜２１７を有する２つのベータ鎖から成るＦＧＦＲ３上のエピトープにも結合する。２Ｂ．１．３．１２は、２Ｂ．１．３．１０と同じエピトープに結合する。具体的には、２Ｂ．１．３．１２は、残基番号１５７〜１８１及び２０７〜２２０を有する２つのベータ鎖から成るＦＧＦＲ２上のエピトープに結合する。２Ｂ．１．３．１２は、残基番号１５４〜１７８及び２０４〜２１７を有する２つのベータ鎖から成るＦＧＦＲ３上のエピトープにも結合する。
【図９Ｃ】図９Ａ〜９Ｄは、２Ｂ．１．３．１０（すなわち、１．３．１０）及び２Ｂ．１．３．１２（すなわち、１．３．１２）抗ＦＧＦＲ２／３抗体のエピトープを示す。図９Ａは、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ配列を示し、抗ＦＧＦＲ２／３  １．３．１０及び１．３．１２抗体のエピトープには下線が引かれており、太字になっている。図９Ｂは、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃ配列を示し、抗ＦＧＦＲ２／３  １．３．１０及び１．３．１２抗体のエピトープには下線が引かれており、太字になっている。図９Ｃは、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ配列を示し、抗ＦＧＦＲ２／３  １．３．１０及び１．３．１２抗体のエピトープには下線が引かれており、太字になっている。図９Ｄは、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ配列を示し、抗ＦＧＦＲ２／３  １．３．１０及び１．３．１２抗体のエピトープには、下線が引かれており、太字になっている。抗体２Ｂ．１．３．１０は、配列番号５２及び５４（エピトープ配列については、配列番号９１及び９２も参照のこと）に従う残基番号１５７〜１８１及び２０７〜２２０を有する２つのベータ鎖から成るＦＧＦＲ２上のエピトープに結合する。抗体２Ｂ．１．３．１０は、配列番号５６及び５８（エピトープ配列については、配列番号９３及び９４も参照のこと）に従う残基番号１５４〜１７８及び２０４〜２１７を有する２つのベータ鎖から成るＦＧＦＲ３上のエピトープにも結合する。２Ｂ．１．３．１２は、２Ｂ．１．３．１０と同じエピトープに結合する。具体的には、２Ｂ．１．３．１２は、残基番号１５７〜１８１及び２０７〜２２０を有する２つのベータ鎖から成るＦＧＦＲ２上のエピトープに結合する。２Ｂ．１．３．１２は、残基番号１５４〜１７８及び２０４〜２１７を有する２つのベータ鎖から成るＦＧＦＲ３上のエピトープにも結合する。
【図９Ｄ】図９Ａ〜９Ｄは、２Ｂ．１．３．１０（すなわち、１．３．１０）及び２Ｂ．１．３．１２（すなわち、１．３．１２）抗ＦＧＦＲ２／３抗体のエピトープを示す。図９Ａは、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ配列を示し、抗ＦＧＦＲ２／３  １．３．１０及び１．３．１２抗体のエピトープには下線が引かれており、太字になっている。図９Ｂは、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃ配列を示し、抗ＦＧＦＲ２／３  １．３．１０及び１．３．１２抗体のエピトープには下線が引かれており、太字になっている。図９Ｃは、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ配列を示し、抗ＦＧＦＲ２／３  １．３．１０及び１．３．１２抗体のエピトープには下線が引かれており、太字になっている。図９Ｄは、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ配列を示し、抗ＦＧＦＲ２／３  １．３．１０及び１．３．１２抗体のエピトープには、下線が引かれており、太字になっている。抗体２Ｂ．１．３．１０は、配列番号５２及び５４（エピトープ配列については、配列番号９１及び９２も参照のこと）に従う残基番号１５７〜１８１及び２０７〜２２０を有する２つのベータ鎖から成るＦＧＦＲ２上のエピトープに結合する。抗体２Ｂ．１．３．１０は、配列番号５６及び５８（エピトープ配列については、配列番号９３及び９４も参照のこと）に従う残基番号１５４〜１７８及び２０４〜２１７を有する２つのベータ鎖から成るＦＧＦＲ３上のエピトープにも結合する。２Ｂ．１．３．１２は、２Ｂ．１．３．１０と同じエピトープに結合する。具体的には、２Ｂ．１．３．１２は、残基番号１５７〜１８１及び２０７〜２２０を有する２つのベータ鎖から成るＦＧＦＲ２上のエピトープに結合する。２Ｂ．１．３．１２は、残基番号１５４〜１７８及び２０４〜２１７を有する２つのベータ鎖から成るＦＧＦＲ３上のエピトープにも結合する。
【図１０】抗ＦＧＦＲ２／３抗体１．３、１．９５、１．７３、１．３２、１．８８、１．１、１．３．１０、及び１．３．１２に対応する核酸及びアミノ酸配列番号の図表を示す。
【図１１Ａ】は、１７個の抗ＫＬＢ抗体の軽鎖可変領域配列を示す。ＣＤＲ  Ｌ１配列は、順に、配列番号２７９〜２９３であり、ＣＤＲ  Ｌ２配列は、順に、配列番号２９４〜３０９であり、ＣＤＨ  Ｌ３配列は、順に、配列番号１２３〜１３７である。軽鎖可変領域配列は、順に、配列番号１１１〜１２７である。
【図１１Ｂ】１７個の抗ＫＬＢ抗体の重鎖可変領域配列を示す。これらの抗体のＣＤＲ  Ｈ１配列は、順に（１１Ｆ１から８Ｃ５まで）、配列番号２３０〜２３２及び２３６〜２４７であり、ＣＤＲ  Ｈ２配列は、順に、配列番号１４２及び２４８〜２６２であり、ＣＤＲ  Ｈ３配列は、順に、配列番号２６３〜２７８である。これらの抗体の重鎖可変領域配列は、順に、配列番号２１６〜２３２である。
【図１２】ｈＫＬＢを発現する２９３細胞への様々な抗ＫＬＢ抗体の結合を０．８μｇ／ｍＬで測定したＦＡＣＳプロットにおいて観察されたシフト中央値を示す。
【図１３】様々な抗ＫＬＢ抗体のｈＫＬＢ−ＥＣＤ−ＨＩＳタンパク質への相対的結合を示す。
【図１４Ａ】マウスＫＬＢタンパク質のＮ末端アミノ酸配列（配列番号１６５）を示し、ＫＯマウスにおけるＫｌｂ対立遺伝子によってコードされる対応するアミノ酸配列（配列番号１６６）を示す。Ｋｌｂ遺伝子におけるミスセンス変異により、赤色の文字で示されるように、ＫＯ対立遺伝子における第２のアミノ酸の後にフレームシフトがもたらされる。
【図１４Ｂ】野生型（＋／＋）及びＫＬＢノックアウト（−／−）マウスにおける精巣上体白色脂肪組織でのＫＬＢタンパク質発現を示す。
【図１４Ｃ】グルコース代謝に影響を及ぼすためにＫＬＢがＢｓＡｂ２０にとって重要であることを示す。ＢｓＡｂ２０または対照ＩｇＧを３ｍｐｋで毎週４回注射したＤＩＯマウスにおけるグルコース耐性試験（ＧＴＴ）。ＧＴＴを最後の注射の３日後である２３日目に行った。マウスにＨＦＤをＧＴＴ前２０週間与えた。＊ｐ＝０．０５未満。
【図１５Ａ】図１５Ａ及び１５Ｂは、ＳＮＵ−１６異種移植片腫瘍におけるヒトＦＧＦＲ２（図１５Ａ）及びＦＧＦＲ３（図１５Ｂ）の検出を示す。腫瘍試料を溶解させ、ヒトＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３タンパク質についてウエスタンブロット分析に供した。この研究から収集した腫瘍は、ＦＧＦＲ３（図１５Ｂ、レーン５〜２４）に対するシグナルを示した。加えて、先のＳＮＵ−１６研究（図１５Ｂ、レーン３）及びインビトロ培養ＳＮＵ−１６細胞（図Ｂ、レーン４）から収集した腫瘍も、検出可能ではあるが、より弱いＦＧＦＲ３発現を示した。
【図１５Ｂ】図１５Ａ及び１５Ｂは、ＳＮＵ−１６異種移植片腫瘍におけるヒトＦＧＦＲ２（図１５Ａ）及びＦＧＦＲ３（図１５Ｂ）の検出を示す。腫瘍試料を溶解させ、ヒトＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３タンパク質についてウエスタンブロット分析に供した。この研究から収集した腫瘍は、ＦＧＦＲ３（図１５Ｂ、レーン５〜２４）に対するシグナルを示した。加えて、先のＳＮＵ−１６研究（図１５Ｂ、レーン３）及びインビトロ培養ＳＮＵ−１６細胞（図Ｂ、レーン４）から収集した腫瘍も、検出可能ではあるが、より弱いＦＧＦＲ３発現を示した。
【図１６Ａ】図１６Ａ〜１６Ｃは、発現させ、かつアゴニスト活性、ならびにＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、及びＦＧＦＲ４結合について試験した７つの２Ｂ１．１変異形を示す。図１６Ａは、抗ＦＧＦＲ２／３抗体変異形、各変異形のＣＤＲ  Ｈ１〜Ｈ３の配列、ならびにＢｉａｃｏｒアッセイ及びＥＬＩＳＡによって測定されたＦＧＦＲ３親和性について詳述する図表を示する。図１６Ｂは、ＥＬＩＳＡによって測定された変異形のＦＧＦＲ３の結合親和性を示す。図１６Ｃは、ＥＬＩＳＡによって測定された変異形のＦＧＦＲ４の結合親和性を示す。
【図１６Ｂ】図１６Ａ〜１６Ｃは、発現させ、かつアゴニスト活性、ならびにＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、及びＦＧＦＲ４結合について試験した７つの２Ｂ１．１変異形を示す。図１６Ａは、抗ＦＧＦＲ２／３抗体変異形、各変異形のＣＤＲ  Ｈ１〜Ｈ３の配列、ならびにＢｉａｃｏｒアッセイ及びＥＬＩＳＡによって測定されたＦＧＦＲ３親和性について詳述する図表を示する。図１６Ｂは、ＥＬＩＳＡによって測定された変異形のＦＧＦＲ３の結合親和性を示す。図１６Ｃは、ＥＬＩＳＡによって測定された変異形のＦＧＦＲ４の結合親和性を示す。
【図１６Ｃ】図１６Ａ〜１６Ｃは、発現させ、かつアゴニスト活性、ならびにＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、及びＦＧＦＲ４結合について試験した７つの２Ｂ１．１変異形を示す。図１６Ａは、抗ＦＧＦＲ２／３抗体変異形、各変異形のＣＤＲ  Ｈ１〜Ｈ３の配列、ならびにＢｉａｃｏｒアッセイ及びＥＬＩＳＡによって測定されたＦＧＦＲ３親和性について詳述する図表を示する。図１６Ｂは、ＥＬＩＳＡによって測定された変異形のＦＧＦＲ３の結合親和性を示す。図１６Ｃは、ＥＬＩＳＡによって測定された変異形のＦＧＦＲ４の結合親和性を示す。
【図１７Ａ】図１７Ａ及び１７Ｂは、ルシフェラーゼアッセイを使用したＦＧＦＲに対する抗ＦＧＦＲ２／３抗体変異形活性の比較を示す。図１７Ａは、ＦＧＦＲ３活性及びＦＧＦＲ４活性を示す。図１７Ｂは、ＦＧＦＲ２活性及びＦＧＦＲ１活性を示す。
【図１７Ｂ】図１７Ａ及び１７Ｂは、ルシフェラーゼアッセイを使用したＦＧＦＲに対する抗ＦＧＦＲ２／３抗体変異形活性の比較を示す。図１７Ａは、ＦＧＦＲ３活性及びＦＧＦＲ４活性を示す。図１７Ｂは、ＦＧＦＲ２活性及びＦＧＦＲ１活性を示す。
【図１８】ＦＧＦＧＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体に使用すべき抗ＦＧＦＲ２／３抗体を選択するために使用した抗ＦＧＦＲ２／３抗体変異形決定行列を示す。
【図１９Ａ】図１９Ａ〜１９Ｂは、選択された抗ＦＧＦＲ２／３抗体変異形のＦＧＦＲ活性を示す。図１９Ａは、ＦＧＦＲ３活性を示す。図１９Ｂは、ＦＧＦＲ２活性を示す。図１９Ｃは、ＦＧＦＲ４活性を示す。
【図１９Ｂ】図１９Ａ〜１９Ｂは、選択された抗ＦＧＦＲ２／３抗体変異形のＦＧＦＲ活性を示す。図１９Ａは、ＦＧＦＲ３活性を示す。図１９Ｂは、ＦＧＦＲ２活性を示す。図１９Ｃは、ＦＧＦＲ４活性を示す。
【図１９Ｃ】図１９Ａ〜１９Ｂは、選択された抗ＦＧＦＲ２／３抗体変異形のＦＧＦＲ活性を示す。図１９Ａは、ＦＧＦＲ３活性を示す。図１９Ｂは、ＦＧＦＲ２活性を示す。図１９Ｃは、ＦＧＦＲ４活性を示す。
【発明を実施するための形態】
【０２０７】
線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）及びそれらのチロシンキナーゼ受容体（ＦＧＦＲ）は、胚発育中の特定の経路の調節、ならびに成体動物における様々な組織、創傷治癒プロセス、及びある特定の代謝機能のホメオスタシスに重要な役割を果たす。ヒトにおいて、４個の高相同性ＦＧＦＲ（ＦＧＦＲ１〜４）及び２２個のＦＧＦ（ＦＧＦ１〜１４及びＦＧＦ１６〜２３）が存在する（Ｇｏｅｔｚ  Ｒ  ＆  Ｍｏｈａｍｍａｄｉ  Ｍ（２０１３）Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ＦＧＦ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｌｅｎｓ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４（３）：１６６−１８０、Ｔｕｒｎｅｒ  Ｎ  ＆  Ｇｒｏｓｅ  Ｒ（２０１０）Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ：ｆｒｏｍ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｔｏ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  １０（２）：１１６−１２９、Ｂｅｅｎｋｅｎ  Ａ  ＆  Ｍｏｈａｍｍａｄｉ  Ｍ（２００９）Ｔｈｅ  ＦＧＦ  ｆａｍｉｌｙ：ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ８（３）：２３５−２５３、Ｗｅｓｃｈｅ  Ｊ，Ｈａｇｌｕｎｄ  Ｋ，＆  Ｈａｕｇｓｔｅｎ  ＥＭ（２０１１）Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ４３７（２）：１９９−２１３）。ＦＧＦＲは、３つの免疫グロブリンドメイン（Ｄ１、Ｄ２、及びＤ３）を有する細胞外領域、１回膜貫通領域、及び分割細胞質キナーゼ部分を含む（Ｇｏｅｔｚ  Ｒ  ＆  Ｍｏｈａｍｍａｄｉ  Ｍ（２０１３）Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ＦＧＦ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｌｅｎｓ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４（３）：１６６−１８０、Ｍｏｈａｍｍａｄｉ  Ｍ，Ｏｌｓｅｎ  ＳＫ，＆  Ｉｂｒａｈｉｍｉ  ＯＡ（２００５）Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ  １６（２）：１０７−１３７）。代替スプライシングにより、アイソフォームＩＩＩｂ及びＩＩＩｃと呼ばれるＦＧＦＲ１〜３の２つの主な変異形が生じ、これらは、Ｄ３の後半、その結果として、リガンド結合特異性の点で異なる（Ｃｈａｎｇ，Ｈ．，Ｓｔｅｗａｒｔ，Ａ．Ｋ．，Ｑｉ，Ｘ．Ｙ．，Ｌｉ，Ｚ．Ｈ．，Ｙｉ，Ｑ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｔｒｕｄｅｌ，Ｓ．２００５．Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｃｃｕｒａｔｅｌｙ  ｐｒｅｄｉｃｔｓ  ＦＧＦＲ３  ａｂｅｒｒａｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｔ（４；１４）ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ．Ｂｌｏｏｄ  １０６：３５３−３５５）。
【０２０８】
ＦＧＦＲ１〜４によるシグナル伝達の調節不全は、いくつかの癌型における発病に関連する（Ｌ’Ｈｏｔｅ，Ｃ．Ｇ．，ａｎｄ  Ｋｎｏｗｌｅｓ，Ｍ．Ａ．２００５．Ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ＦＧＦＲ３  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ：ｇｒｏｗｔｈ，ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ３０４：４１７−４３１、Ｄａｉｌｅｙ，Ｌ．，Ａｍｂｒｏｓｅｔｔｉ，Ｄ．，Ｍａｎｓｕｋｈａｎｉ，Ａ．，ａｎｄ  Ｂａｓｉｌｉｃｏ，Ｃ．２００５．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ＦＧＦ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ  １６：２３３−２４７）。遺伝子増幅、染色体転座、及び活性化変異等のゲノムＦＧＦＲ改変は、ＦＧＦ経路の異常な活性化を駆動し、正常細胞の腫瘍性形質転換を促進し得る。ＦＧＦＲ２遺伝子増幅が胃癌の約１０％及びトリプルネガティブ乳癌の約４％に生じる（Ｃｈｅｓｉ，Ｍ．，Ｎａｒｄｉｎｉ，Ｅ．，Ｂｒｅｎｔｓ，Ｌ．Ａ．，Ｓｃｈｒｏｃｋ，Ｅ．，Ｒｉｅｄ，Ｔ．，Ｋｕｅｈｌ，Ｗ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｂｅｒｇｓａｇｅｌ，Ｐ．Ｌ．１９９７．Ｆｒｅｑｕｅｎｔ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｔ（４；１４）（ｐ１６．３；ｑ３２．３）ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １６：２６０−２６４、Ｆｏｎｓｅｃａ，Ｒ．，Ｂｌｏｏｄ，Ｅ．，Ｒｕｅ，Ｍ．，Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．，Ｏｋｅｎ，Ｍ．Ｍ．，Ｋｙｌｅ，Ｒ．Ａ．，Ｄｅｗａｌｄ，Ｇ．Ｗ．，Ｖａｎ  Ｎｅｓｓ，Ｂ．，Ｖａｎ  Ｗｉｅｒ，Ｓ．Ａ．，Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｋ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｂｅｒｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｍｙｅｌｏｍａ．Ｂｌｏｏｄ  １０１：４５６９−４５７５、Ｍｏｒｅａｕ，Ｐ．，Ｆａｃｏｎ，Ｔ．，Ｌｅｌｅｕ，Ｘ．，Ｍｏｒｉｎｅａｕ，Ｎ．，Ｈｕｙｇｈｅ，Ｐ．，Ｈａｒｏｕｓｓｅａｕ，Ｊ．Ｌ．，Ｂａｔａｉｌｌｅ，Ｒ．，ａｎｄ  Ａｖｅｔ−Ｌｏｉｓｅａｕ，Ｈ．２００２．Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  １４ｑ３２  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  ｔｈｅ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ  ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｂｌｏｏｄ  １００：１５７９−１５８３）一方で、ＦＧＦＲ３増幅は、膀胱癌の特定のサブセットに関連する（Ｍｏｒｅａｕ，Ｐ．，Ｆａｃｏｎ，Ｔ．，Ｌｅｌｅｕ，Ｘ．，Ｍｏｒｉｎｅａｕ，Ｎ．，Ｈｕｙｇｈｅ，Ｐ．，Ｈａｒｏｕｓｓｅａｕ，Ｊ．Ｌ．，Ｂａｔａｉｌｌｅ，Ｒ．，ａｎｄ  Ａｖｅｔ−Ｌｏｉｓｅａｕ，Ｈ．２００２．Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  １４ｑ３２  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  ｔｈｅ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙ���ｌｏｍａ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ  ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｂｌｏｏｄ  １００：１５７９−１５８３、Ｐｏｌｌｅｔｔ，Ｊ．Ｂ．，Ｔｒｕｄｅｌ，Ｓ．，Ｓｔｅｒｎ，Ｄ．，Ｌｉ，Ｚ．Ｈ．，ａｎｄ  Ｓｔｅｗａｒｔ，Ａ．Ｋ．２００２．Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｙｅｌｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３  ｃｏｎｆｅｒｓ  ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｂｌｏｏｄ  １００：３８１９−３８２１）。ミスセンスＦＧＦＲ変異も複数の癌型で見つけられる（Ｌ’Ｈｏｔｅ，Ｃ．Ｇ．，ａｎｄ  Ｋｎｏｗｌｅｓ，Ｍ．Ａ．２００５．Ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ＦＧＦＲ３  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ：ｇｒｏｗｔｈ，ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ３０４：４１７−４３１、Ａｇａｚｉｅ，Ｙ．Ｍ．，Ｍｏｖｉｌｌａ，Ｎ．，Ｉｓｃｈｅｎｋｏ，Ｉ．，ａｎｄ  Ｈａｙｍａｎ，Ｍ．Ｊ．２００３．Ｔｈｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ＳＨＰ２  ｉｓ  ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｍｅｄｉａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２：６９０９−６９１８）。具体的には、Ｄ２とＤ３との間のリンカー領域におけるアミノ酸置換、例えばＦＧＦＲ２におけるＳ２５２ＷとＦＧＦＲ３におけるＳ２４９Ｃとの間のアミノ酸置換は、ＦＧＦ駆動型シグナル伝達及び腫瘍細胞増殖を増強し、体細胞変異のホットスポットを表す（Ａｇａｚｉｅ，Ｙ．Ｍ．，Ｍｏｖｉｌｌａ，Ｎ．，Ｉｓｃｈｅｎｋｏ，Ｉ．，ａｎｄ  Ｈａｙｍａｎ，Ｍ．Ｊ．２００３．Ｔｈｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ＳＨＰ２  ｉｓ  ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｍｅｄｉａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２：６９０９−６９１８、Ｒｏｎｃｈｅｔｔｉ，Ｄ．，Ｇｒｅｃｏ，Ａ．，Ｃｏｍｐａｓｓｏ，Ｓ．，Ｃｏｌｏｍｂｏ，Ｇ．，Ｄｅｌｌ’Ｅｒａ，Ｐ．，Ｏｔｓｕｋｉ，Ｔ．，Ｌｏｍｂａｒｄｉ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｎｅｒｉ，Ａ．２００１．Ｄｅｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ＦＧＦＲ３  ｍｕｔａｎｔｓ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｗｉｔｈ  ｔ（４；１４）：  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｙ３７３Ｃ，  Ｋ６５０Ｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｎｏｖｅｌ  Ｇ３８４Ｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２０：３５５３−３５６２）。活性化変異は、ＦＧＦＲのチロシンキナーゼ領域でも生じる（Ｃｈｅｓｉ，Ｍ．，Ｂｒｅｎｔｓ，Ｌ．Ａ．，Ｅｌｙ，Ｓ．Ａ．，Ｂａｉｓ，Ｃ．，Ｒｏｂｂｉａｎｉ，Ｄ．Ｆ．，Ｍｅｓｒｉ，Ｅ．Ａ．，Ｋｕｅｈｌ，Ｗ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｂｅｒｇｓａｇｅｌ，Ｐ．Ｌ．２００１．Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔ��  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３  ｉｓ  ａｎ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｔｈａｔ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ｔｕｍｏｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ．Ｂｌｏｏｄ  ９７：７２９−７３６）。
【０２０９】
ＦＧＦ−ＦＧＦＲ経路を標的とすることが、抗癌剤開発分野における主な焦点になっている。この尽力には、小分子チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）、遮断抗体、ならびにリガンド捕捉剤が含まれている（Ｍｏｒｅａｕ，Ｐ．，Ｆａｃｏｎ，Ｔ．，Ｌｅｌｅｕ，Ｘ．，Ｍｏｒｉｎｅａｕ，Ｎ．，Ｈｕｙｇｈｅ，Ｐ．，Ｈａｒｏｕｓｓｅａｕ，Ｊ．Ｌ．，Ｂａｔａｉｌｌｅ，Ｒ．，ａｎｄ  Ａｖｅｔ−Ｌｏｉｓｅａｕ，Ｈ．２００２．Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  １４ｑ３２  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  ｔｈｅ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ  ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｂｌｏｏｄ  １００：１５７９−１５８３）。現在の高力価ＦＧＦＲ  ＴＫＩは、異なるＦＧＦＲの選択性を制限しており（Ｍｏｒｅａｕ，Ｐ．，Ｆａｃｏｎ，Ｔ．，Ｌｅｌｅｕ，Ｘ．，Ｍｏｒｉｎｅａｕ，Ｎ．，Ｈｕｙｇｈｅ，Ｐ．，Ｈａｒｏｕｓｓｅａｕ，Ｊ．Ｌ．，Ｂａｔａｉｌｌｅ，Ｒ．，ａｎｄ  Ａｖｅｔ−Ｌｏｉｓｅａｕ，Ｈ．２００２．Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  １４ｑ３２  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  ｔｈｅ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ  ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｂｌｏｏｄ  １００：１５７９−１５８３）、これによりそれらの治療域に影響が及ぼされ得る。例えば、ＦＧＦＲ１と共受容体Ｋｌｏｔｈｏβとのヘテロ複合体によるＦＧＦ２３シグナル伝達の破壊により、患者における高リン血症及び組織石灰化がもたらされ得る（Ｐｌｏｗｒｉｇｈｔ，Ｅ．Ｅ．，Ｌｉ，Ｚ．，Ｂｅｒｇｓａｇｅｌ，Ｐ．Ｌ．，Ｃｈｅｓｉ，Ｍ．，Ｂａｒｂｅｒ，Ｄ．Ｌ．，Ｂｒａｎｃｈ，Ｄ．Ｒ．，Ｈａｗｌｅｙ，Ｒ．Ｇ．，ａｎｄ  Ｓｔｅｗａｒｔ，Ａ．Ｋ．２０００．Ｅｃｔｏｐｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｂｌｏｏｄ  ９５：９９２−９９８、Ｃｈｅｎ，Ｊ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｉ．Ｒ．，Ｌｅｅ，Ｂ．Ｈ．，Ｄｕｃｌｏｓ，Ｎ．，Ｈｕｎｔｌｙ，Ｂ．Ｊ．，Ｄｏｎｏｇｈｕｅ，Ｄ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ，Ｄ．Ｇ．２００５．Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＦＧＦＲ３  ｍｕｔａｎｔｓ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＰＬＣｇａｍｍａ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｄ  −  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｆｏｒ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ  １０６：３２８−３３７）一方で、ＦＧＦＲ４とＫｌｏｔｈｏβとのヘテロ複合体によるＦＧＦ１９シグナル伝達の遮断により、胆汁酸代謝が破壊される（Ｌｉ，Ｚ．，Ｚｈｕ，Ｙ．Ｘ．，Ｐｌｏｗｒｉｇｈｔ，Ｅ．Ｅ．，Ｂｅｒｇｓａｇｅｌ，Ｐ．Ｌ．，Ｃｈｅｓｉ，Ｍ．，Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｂ．，Ｈａｗｌｅｙ，Ｔ．Ｓ．，Ｈａｗｌｅｙ，Ｒ．Ｇ．，ａｎｄ  Ｓｔｅｗａｒｔ，Ａ．Ｋ．２００１．Ｔｈｅ  ｍｙｅｌｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３  ｉｓ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｉｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ  ９７：２４１３−２４１９）。ＦＧＦＲ１（Ｔｒｕｄｅｌ，Ｓ．，Ｅｌｙ，Ｓ．，Ｆａｒｏｏｑｉ，Ｙ．，Ａｆｆｅｒ，Ｍ．，Ｒｏｂｂｉａｎｉ，Ｄ．Ｆ．，Ｃｈｅｓｉ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｂｅｒｇｓａｇｅｌ，Ｐ．Ｌ．２００４．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｔ（４；１４）ｍｙｅｌｏｍａ．Ｂｌｏｏｄ  １０３：３５２１−３５２８）、ＦＧＦＲ２（Ｔｒｕｄｅｌ，Ｓ．，Ｌｉ，Ｚ．Ｈ．，Ｗｅｉ，Ｅ．，Ｗｉｅｓｍａｎｎ，Ｍ．，Ｃｈａｎｇ，Ｈ．，Ｃｈｅｎ，Ｃ．，Ｒｅｅｃｅ，Ｄ．，Ｈｅｉｓｅ，Ｃ．，ａｎｄ  Ｓｔｅｗａｒｔ，Ａ．Ｋ．２００５．ＣＨＩＲ−２５８，ａ  ｎｏｖｅｌ，ｍｕｌｔｉｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔ（４；１４）  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ．Ｂｌｏｏｄ  １０５：２９４１−２９４８）、及びＦＧＦＲ３（Ｃｈｅｎ，Ｊ．，Ｌｅｅ，Ｂ．Ｈ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｉ．Ｒ．，Ｋｕｔｏｋ，Ｊ．Ｌ．，Ｍｉｔｓｉａｄｅｓ，Ｃ．Ｓ．，Ｄｕｃｌｏｓ，Ｎ．，Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．，Ａｄｅｌｓｐｅｒｇｅｒ，Ｊ．，Ｏｋａｂｅ，Ｒ．，Ｃｏｂｕｒｎ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．２００５．ＦＧＦＲ３  ａｓ  ａ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＰＫＣ４１２  ｉｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２４：８２５９−８２６７）等の個々のＦＧＦＲによりリガンドシグナル伝達をアンタゴナイズするより選択的な抗体が開発されている。しかしながら、２つ以上のＦＧＦＲを認識する抗体はまだ報告されていない。
【０２１０】
前述の単一特異性抗ＦＧＦＲ３抗体Ｒ３Ｍａｂは、ＦＧＦ１及びＦＧＦ９の野生型ＦＧＦＲ３のＩＩＩｂアイソフォーム及びＩＩＩｃアイソフォームの両方への結合、ならびにＦＧＦＲ３のある特定の癌関連変異型への結合を効果的に遮断する（Ｃｈｅｎ，Ｊ．，Ｌｅｅ，Ｂ．Ｈ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｉ．Ｒ．，Ｋｕｔｏｋ，Ｊ．Ｌ．，Ｍｉｔｓｉａｄｅｓ，Ｃ．Ｓ．，Ｄｕｃｌｏｓ，Ｎ．，Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．，Ａｄｅｌｓｐｅｒｇｅｒ，Ｊ．，Ｏｋａｂｅ，Ｒ．，Ｃｏｂｕｒｎ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．２００５．ＦＧＦＲ３  ａｓ  ａ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＰＫＣ４１２  ｉｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２４：８２５９−８２６７、Ｐａｔｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｌ．，Ｌｉ，Ｚ．，Ｗｅｎ，Ｘ．Ｙ．，Ｍａｓｉｈ−Ｋｈａｎ，Ｅ．，Ｃｈａｎｇ，Ｈ．，Ｐｏｌｌｅｔｔ，Ｊ．Ｂ．，Ｔｒｕｄｅｌ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｓｔｅｗａｒｔ，Ａ．Ｋ．２００４．Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３  ａｓ  ａ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ．Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  １２４：５９５−６０３）。Ｘ線構造分析により、Ｒ３Ｍａｂがリガンド結合に必要なＦＧＦＲ３上の特異的エピトープに結合することが明らかになった。Ｒ３Ｍａｂは、ヒト膀胱癌及び多発性骨髄腫腫瘍異種移植片に対するマウスにおける強力な抗腫瘍活性を呈した。現在の研究では、構造誘導型ファージディスプレイを繰り返し使用して、Ｒ３Ｍａｂを、ＦＧＦＲ３及びＦＧＦＲ２に対する二重特異性を有しながらＦＧＦＲ１及びＦＧＦＲ４を共有する派生抗体に再操作した。この研究の実践目標は、潜在的治療範囲を親分子のそれを超えて広げると同時に、追加された安全性リスクを避けることである。再操作された抗体は、インビトロでのＦＧＦ刺激腫瘍細胞成長の阻害、及びインビボでのＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ３を過剰発現するヒト癌異種移植片に対する著しい有効性を呈する。
【０２１１】
本発明は、本明細書において、例えば、ＦＧＦＲ２及び／もしくはＦＧＦＲ３の発現及び／もしくは活性、例えば、増大した発現及び／もしくは活性または望ましくない発現及び／もしくは活性に関連する疾患状態の治療または予防に有用な抗ＦＧＦＲ２／３抗体を提供する。特定の実施形態では、本発明は、本明細書において、例えば、ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３の発現及び／もしくは活性、例えば、増大した発現及び／もしくは活性または望ましくない発現及び／もしくは活性に関連する疾患状態の治療または予防に有用な抗ＦＧＦＲ２／３抗体を提供する。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、腫瘍、癌、及び／または細胞増殖性障害を治療するために使用される。
【０２１２】
別の態様では、本発明の抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、様々な組織型及び細胞型におけるＦＧＦＲ２及び／またはＦＧＦＲ３の検出及び／または単離、例えば、ＦＧＦＲ３の検出用の試薬として有用である。特定の一実施形態では、本発明の抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、様々な組織型及び細胞型におけるＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３の検出及び／または単離、例えば、ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３の検出用の試薬として有用である。
【０２１３】
本発明は、抗ＦＧＦＲ２／３抗体の作製及び使用方法、ならびに抗ＦＧＦＲ２／３抗体をコードするポリヌクレオチドを更に提供する。
【０２１４】
一般技法
本明細書において記載または参照される技法及び手順は、当業者によって一般に十分に理解され、従来の方法論、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ．ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，（２００３））、ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ  ２：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ  ｅｄｓ．（１９９５））、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．（１９８８）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，ａｎｄ  ＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８７））に記載の広く利用されている方法論等を使用して一般に用いられている。
【０２１５】
定義
「単離された」抗体とは、その天然環境の成分から特定及び分離され、かつ／または回収されたものである。その天然環境の混入成分は、抗体の診断的及び治療的使用を妨害する物質であり、これらとしては、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性もしくは非タンパク質性溶質が挙げられ得る。好ましい実施形態では、抗体は、（１）ローリー法によって決定される抗体の９５重量％を超える、最も好ましくは９９重量％を超えるまで、（２）スピニングカップシークエネーターを使用してＮ末端もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５個の残基を得るのに十分な程度まで、または（３）クマシーブルーもしくは好ましくは銀染色を使用して還元もしくは非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）により均質になるまで精製される。単離された抗体としては、組換え細胞内のインサイツの抗体が挙げられるが、これは、抗体の天然環境の少なくとも１つの成分が存在しないためである。しかしながら、通常は、単離された抗体は、少なくとも１つの精製ステップによって調製される。
【０２１６】
参照抗体と「結合において競合する抗体」とは、競合アッセイにおいて参照抗体のその抗原への結合を５０％以上遮断する抗体を指し、逆に、参照抗体は、競合アッセイにおいて抗体のその抗原への結合を５０％以上遮断する。例示の競合アッセイが、“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）に記載されている。
【０２１７】
抗体の「クラス」とは、その重鎖によって保有される定常ドメインまたは定常領域の型を指す。抗体には５つの主なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に更に分類され得る。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【０２１８】
本明細書で使用される「細胞毒性薬」という用語は、細胞機能を阻害もしくは阻止し、及び／または細胞死もしくは破壊を引き起こす物質を指す。細胞毒性薬としては、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、及びＬｕの放射性同位体）；化学療法剤または薬物（例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン、または他の挿入剤）；成長阻害剤；酵素及びその断片、例えば、核酸分解酵素；抗生物質；細菌、真菌、植物、または動物起源の毒素、例えば、小分子毒素または酵素的に活性な毒素（その断片及び／または変異形を含む）；ならびに以下に開示される様々な抗腫瘍剤または抗癌剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１９】
薬剤、例えば、薬学的製剤の「有効量」とは、必要な投薬量で、かつ期間にわって、所望の治療的または予防的結果を達成するのに有効な量を指す。例えであって、限定するものではなく、「有効量」とは、疾患及び／または障害の症状を軽減し、最小限に抑え、かつ／または予防し、生存を長引かせ、かつ／または疾患及び／または障害が再発するまでの期間を長引かせることができる本明細書に開示される抗体の量を指し得る。
【０２２０】
「全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」という用語は、本明細書において、天然抗体構造と実質的に同様の構造を有するか、または本明細書に定義されるＦｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指すために同義に使用される。
【０２２１】
本明細書で同義に使用される「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養」という用語は、かかる細胞の子孫を含む、外因性核酸が導入された細胞を指す。宿主細胞としては、初代形質転換細胞及び継代の数にかかわらずそれに由来する子孫を含む「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれる。子孫の核酸含有量は親細胞と完全に同一ではない場合があるが、変異を含有し得る。元来形質転換された細胞においてスクリーニングまたは選択されたものと同じ機能または生物活性を有する変異体子孫が本明細書に含まれる。
【０２２２】
本明細書で同義に使用される「個体」または「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物としては、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及び非ヒト霊長類、例えば、サル）、ウサギ、ならびに齧歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、個体または対象は、ヒトである。
【０２２３】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、同一であり、及び／または同じエピトープに結合するが、例えば、天然に存在する変異を含有するか、またはモノクローナル抗体調製物の産生中に発生する可能性のある変異形抗体を除き、かかる変異形は、一般に、少量で存在する。異なる決定基（エピトープ）に対して指向された異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向される。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、実質的に同種の抗体集団から得られるという抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものと解釈されるべきではない。例えば、本開示の主題に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含むが、これらに限定されない様々な技法によって作製することができ、かかる方法及び他の例示のモノクローナル抗体の作製方法は、本明細書に記載されている。
【０２２４】
「ネイキッド抗体」は、異種部分（例えば、細胞毒性部分）または放射標識にコンジュゲートされない抗体を指す。ネイキッド抗体は、薬学的製剤中に存在し得る。
【０２２５】
「天然抗体」とは、様々な構造を有する天然に存在する免役グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合された２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖から成る約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端まで、各重鎖は、可変重ドメイン（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｄｏｍａｉｎ）または重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）、続いて、３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、各軽鎖は、可変軽ドメイン（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｄｏｍａｉｎ）または軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）、続いて、定常軽（ＣＬ）ドメインを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの型のうちの１つに割り当てられ得る。
【０２２６】
本明細書で使用される「添付文書」という用語は、かかる治療剤製品の使用に関する指示、用法、投薬量、投与、併用療法、禁忌、及び／または警告についての情報を含む、治療剤製品の商用包装に通例含まれている取扱説明書を指す。  
【０２２７】
「単離された」核酸分子とは、少なくとも１つの混入核酸分子から特定及び分離された核酸分子であり、この核酸分子は、通常、核酸の天然源と関連する。単離された核酸分子は、天然に見られる形態または環境以外のものである。したがって、単離された核酸分子は、天然細胞内に存在する核酸分子とは区別される。しかしながら、単離された核酸分子は、核酸（例えば、抗体をコードする核酸）を通常発現する細胞内に含まれている核酸分子を含み、この場合、例えば、核酸分子は、天然細胞の染色体位置とは異なる染色体位置にある。
【０２２８】
「抗体をコードする単離された核酸」（特異的抗体、例えば、抗ＫＬＢ抗体への言及を含む）とは、抗体重鎖及び軽鎖（またはその断片）をコードする１つ以上の核酸分子、例えば、単一のベクターまたは別個のベクター中の核酸分子（複数可）及び宿主細胞内の１つ以上の位置に存在する核酸分子（複数可）を指す。
【０２２９】
「Ｋａｂａｔと同様の可変ドメイン残基番号付け」または「Ｋａｂａｔと同様のアミノ酸位置番号付け」という用語、及びそれらの変形は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）における抗体編集の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインに使用される番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを使用して、実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲまたはＣＤＲの短縮またはそれへの挿入に対応するより少ないアミノ酸または追加のアミノ酸を含有し得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に単一のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔによる残基５２ａ）、及び重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔによる残基８２ａ、８２ｂ、及び８２ｃ等）を含み得る。残基のＫａｂａｔ番号付けは、抗体の配列の相同領域における「標準の」Ｋａｂａｔ番号付け配列とのアライメントにより所与の抗体について決定され得る。
【０２３０】
本明細書で使用される「実質的に同様」または「実質的に同じ」という語句は、２つの数値（一般に、一方が本発明の抗体に関連し、他方が参照／コンパレータ抗体に関連する）間の十分に高い類似度を指し、これにより、当業者は、前記値（例えば、Ｋｄ値）によって測定される生物学的特性の文脈の中で２つの値間の差異には生物学的及び／または統計的有意性がほとんどまたは全くないと見なす。。前記２つの値間の差異は、参照／コンパレータ抗体の値の関数として、好ましくは約５０％未満、好ましくは約４０％未満、好ましくは約３０％未満、好ましくは約２０％未満、好ましくは約１０％未満である。
【０２３１】
「結合親和性」とは、概して、分子の単一の結合部位（例えば、抗体）とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有相互作用の合計の強度を指す。別途指定されない限り、本明細書で使用されるとき、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗体及び抗原）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般に、解離定数（Ｋｄ）で表され得る。望ましくは、Ｋｄは、１×１０−７、１×１０−８、５×１０−８、１×１０−９、３×１０−９、５×１０−９、もしくは更には１×１０−１０、またはそれよりも高い親和性である。親和性は、本明細書に記載される方法を含む、当該技術分野で既知の一般的な方法によって測定することができる。低親和性の抗体は、一般に、抗原に緩徐に結合し、容易に解離する傾向がある一方で、高親和性の抗体は、一般に、抗原により素早く結合し、より長期にわたって結合した状態のままである傾向がある。様々な結合親和性の測定方法が当該技術分野で既知であり、それらのうちのいずれかを本発明の目的のために使用することができる。具体的な例証的実施形態が以下に記載される。
【０２３２】
一実施形態では、本発明による「Ｋｄ」または「Ｋｄ値」は、非標識抗原の滴定系列の存在下でＦａｂを最小濃度の（１２５Ｉ）標識抗原と平衡化し、その後、抗Ｆａｂ抗体コーティングプレートに結合している抗原を捕捉することによってＦａｂの抗原に対する溶液結合親和性を測定する以下のアッセイによって説明される目的とする抗体のＦａｂバージョン及びその抗原を用いて行われる放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって測定される（Ｃｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１）。このアッセイのための条件を確立するために、マイクロタイタープレート（Ｄｙｎｅｘ）が、５０ｍＭの炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中５μｇ／ｍＬの捕捉抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ  Ｌａｂｓ）で一晩コーティングされ、その後、ＰＢＳ中２％(ｗ／ｖ)のウシ血清アルブミンで、室温（およそ２３℃）で２〜５時間遮断される。非吸着プレート（Ｎｕｎｃ番号２６９６２０）では、１００ｐＭまたは２６ｐＭの［１２５Ｉ］抗原が、目的とする（例えば、Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９における抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ−１２の評価と一致する）Ｆａｂの連続希釈液と混合される。その後、目的とするＦａｂは一晩インキュベートされるが、インキュベーションは、確実に平衡に到達するように、より長い期間（例えば、６５時間）続けても良い。その後、混合物が捕捉プレートに移されて、室温で（例えば、１時間）インキュベートされる。その後、溶液が除去され、プレートがＰＢＳ中０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で８回洗浄される。プレートが乾いたときに、１５０μｌ／ウェルのシンチラント（ＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ−２０、Ｐａｃｋａｒｄ）が添加され、プレートがＴｏｐｃｏｕｎｔガンマ計数器（Ｐａｃｋａｒｄ）で１０分間計数される。最大結合の２０％以下をもたらす各Ｆａｂの濃度が競合結合アッセイにおける使用のために選択される。別の実施形態によれば、ＫｄまたはＫｄ値は、約１０応答単位（ＲＵ）で固定化抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃でＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−２０００またはＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用する表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定される。簡潔に、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｃ．）が、供給業者の指示に従って、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化される。抗原が５μｇ／ｍＬ（約０．２μＭ）中１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で希釈された後、５μｌ／分の流量で注入されて、カップリングされたタンパク質の応答単位（ＲＵ）がおよそ１０に到達する。抗原注入後、１Ｍのエタノールアミンが注入されて、未反応基を遮断する。反応速度測定の場合、Ｆａｂの２倍連続希釈液（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）が０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中に２５℃及びおよそ２５μｌ／分の流量で注入される。いくつかの実施形態では、以下の修正点が表面プラズモン共鳴アッセイ法に使用さ��る：抗体がＣＭ５バイオセンサーチップに固定されて、およそ４００ＲＵに到達し、反応速度測定の場合、標的タンパク質の２倍連続希釈液（例えば、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂまたは−ＩＩＩｃ）（６７ｎＭから開始）がＰＢＳＴ緩衝液中に２５℃及び約３０ｕｌ／分の流量で注入される。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）は、単純１：１ラングミュア結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ評価ソフトウェア３．２バージョン）を使用して会合センサーグラムと解離センサーグラムを同時に当てはめることにより算出される。平衡解離定数（Ｋｄ）は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出される。例えば、Ｃｈｅｎ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１を参照されたい。ｏｎ速度が上の表面プラズモン共鳴アッセイにより１０６Ｍ−１Ｓ−１を超える場合、ｏｎ速度は、分光計、例えば、ストップフローを装備した分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）または８０００シリーズＳＬＭ−Ａｍｉｎｃｏ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）において赤色撹拌キュベットで測定された増加濃度の抗原の存在下でＰＢＳ（ｐＨ７．２）中の２０ｎＭ抗抗原抗体（Ｆａｂ形態）の２５℃での蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ、発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍ帯域通過）の増加または減少を測定する蛍光クエンチ技法を使用して決定することができる。
【０２３３】
本発明による「ｏｎ速度」または「会合の速度」または「会合速度」または「ｋｏｎ」は、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−２０００またはＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用する上述の同じ表面プラズモン共鳴技法で決定することもできる。簡潔に、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｃ．）が、供給業者の指示に従って、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化される。抗原が５μｇ／ｍＬ（約０．２ｕＭ）中１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で希釈された後、５μｌ／分の流量で注入されて、カップリングされたタンパク質の応答単位（ＲＵ）がおよそ１０に到達する。抗原注入後、１Ｍのエタノールアミンが注入されて、未反応基を遮断する。反応速度測定の場合、Ｆａｂの２倍連続希釈液（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）が０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中に２５℃及びおよそ２５μｌ／分の流量で注入される。いくつかの実施形態では、以下の修正点が表面プラズモン共鳴アッセイ法に使用される：抗体がＣＭ５バイオセンサーチップに固定されて、およそ４００ＲＵに到達し、反応速度測定の場合、標的タンパク質の２倍連続希釈液（例えば、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂまたは−ＩＩＩｃ）（６７ｎＭから開始）がＰＢＳＴ緩衝液中に２５℃及び約３０ｕｌ／分の流量で注入される。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）は、単純１：１ラングミュア結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ評価ソフトウェア３．２バージョン）を使用して会合センサーグラムと解離センサーグラムを同時に当てはめることにより算出される。平衡解離定数（Ｋｄ）が、ｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出された。例えば、Ｃｈｅｎ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１を参照されたい。しかしながら、ｏｎ速度が上の表面プラズモン共鳴アッセイにより１０６Ｍ−１Ｓ−１を超える場合、ｏｎ速度は、好ましくは、分光計、例えば、ストップフローを装備した分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）または８０００シリーズＳＬＭ−Ａｍｉｎｃｏ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）において赤色撹拌キュベットで測定された増加濃度の抗原の存在下でＰＢＳ（ｐＨ７．２）中の２０ｎＭ抗抗原抗体（Ｆａｂ形態）の２５℃での蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ、発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍ帯域通過）の増加または減少を測定する蛍光クエンチ技法を使用して決定される。
【０２３４】
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、核酸分子であって、それが連結した別の核酸を輸送することができる核酸分子を指すよう意図されている。１つの種類のベクターは「プラスミド」であり、これは、追加のＤＮＡセグメントがライゲートされ得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターは、ファージベクターである。別の種類のベクターは、ウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲートされ得る。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内で自己複製することができる（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ得、それにより、宿主ゲノムとともに複製される。更に、ある特定のベクターは、それらが作動可能に連結する遺伝子の発現を誘導することができる。かかるベクターは、本明細書において「組換え発現ベクター」（または単に「組換えベクター」）と称される。概して、組換えＤＮＡ技法に有用な発現ベクターは、多くの場合、プラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」及び「ベクター」は、プラスミドが最も一般的に使用されるベクターの形態であるため、同じ意味で使用され得る。
【０２３５】
本明細書で同義に使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」とは、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドまたは塩基、及び／もしくはそれらの類似体、またはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼにより、または合成反応によりポリマーに組み込まれ得る任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体等の修飾ヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーのアセンブリ前または後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、標識とのコンジュゲーション等により合成後に更に修飾され得る。他の種類の修飾としては、例えば、「キャップ」、天然に存在するヌクレオチドのうちの１つ以上の類似体との置換、ヌクレオチド間修飾、例えば、非荷電結合を有するもの（例えば、ホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバミン酸塩等）及び荷電結合を有するもの（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）、ペンダント部分、例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ｐｌｙ−Ｌ−リジン等）等を含有するもの、インターカレータを有するもの（例えば、アクリジン、ソラレン等）、キレート剤を含有するもの（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属等）、アルキル化剤を含有するもの、修飾結合を有するもの（例えば、アルファアノマー核酸等）、ならびにポリヌクレオチド（複数可）の非修飾形態が挙げられる。更に、糖中に通常存在するヒドロキシル基のうちのいずれかは、例えば、ホスホン酸基、リン酸基で置き換えられ得るか、標準の保護基で保護され得るか、または活性化されて更なるヌクレオチドへの更なる結合を調製するか、または固体もしくは半固体支持体にコンジュゲートされ得る。５’及び３’末端ＯＨは、リン酸化され得るか、またはアミンもしくは１〜２０個の炭素原子の有機キャッピング基部分で置換され得る。他のヒドロキシルはまた、標準の保護基に誘導体化され得る。ポリヌクレオチドは、例えば、２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−または２’−アジド−リボース、炭素環式糖類似体、アルファ−アノマー糖、エピマー糖、例えば、アラビノース、キシロース、またはリキソース、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体及び塩基性ヌクレオシド類似体、例えば、メチルリボシド等の一般に当該技術分野で既知のリボースまたはデオキシリボース糖の類似形態も含み得る。１つ以上のホスホジエステル結合は、代替の連結基で置き換えられ得る。これらの代替の連結基としては、リン酸塩がＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ、またはＣＨ２（「ホルムアセタール」）で置き換えられる実施形態が挙げられるが、これに限定されず、式中、各ＲまたはＲ’は独立して、Ｈであるか、または置換もしくは非置換アルキル（１〜２０Ｃ）（任意にエーテル（−Ｏ−）結合を含む）、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、またはアラルジルである。ポリヌクレオチド中の全ての結合が同一である必要はない。前述の説明は、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む本明細書で言及される全てのポリヌクレオチドに適用される。
【０２３６】
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」は、概して、一般に約２００ヌクレオチド長未満であるが、必ずしもそうではない、短く、一般に一本鎖であり、一般に合成のポリヌクレオチドを指す。「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、相互排他的ではない。ポリヌクレオチドについての上記の説明は、オリゴヌクレオチドに等しく完全に適用可能である。
【０２３７】
ペプチドまたはポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入して、最大配列同一性パーセントを達成した後の、いずれの保存的置換も配列同一性の一部と見なさない、特定のペプチドまたはポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一の候補配列中のアミノ酸残基の百分率と定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアライメントは、当該技術分野の技術の範囲内の様々な方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア等の公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者であれば、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するのに必要ないずれのアルゴリズムも含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書での目的のために、アミノ酸配列同一性％値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生成され、ＡＬＩＧＮ−２プログラムの完全なソースコードは、以下の図表に提供される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ著のものであり、ソースコードは、米国著作権局（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，２０５５９）のユーザー文書に申請されており、これは、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから公的に入手可能であるか、または例えばＷＯ２００７／００１８５１に提供されているソースコードから編集することができる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ＵＮＩＸオペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ  Ｖ４．０Ｄで使用するために編集されるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定されており、変更されない。
【０２３８】
ＡＬＩＧＮ−２がアミノ酸配列比較のために用いられる場合、所与のアミノ酸配列Ｂに対する、それとの、またはそれと対比した所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂに対する、それとの、またはそれと対比したある特定のアミノ酸配列同一性％を有するまたは含む所与のアミノ酸配列Ａと表現され得る）は、以下のように算出され、
１００×分数Ｘ／Ｙ
式中、Ｘは、配列アライメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により、そのプログラムのＡ及びＢのアライメントにおいて完全な一致としてスコア化されたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡのアミノ酸配列同一性％は、Ａに対するＢのアミノ酸配列同一性％と等しくはならないことが理解されよう。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、２つ以上のアミノ酸配列は、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％同一である。いくつかの実施形態では、２つ以上のアミノ酸配列は、少なくとも９５％、９７％、９８％、９９％、または更には１００％同一である。別途具体的に述べられない限り、本明細書で使用される全てのアミノ酸配列同一性％値は、直前の段落に記載されるように、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用して得られる。
【０２４０】
本明細書で使用される「ＦＧＦＲ３」という用語は、別途具体的または文脈的に指示されない限り、任意の天然または変異形（天然か合成かにかかわらず）ＦＧＦＲ３ポリペプチド（例えば、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂアイソフォームまたはＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃアイソフォーム）を指す。「天然配列」という用語は、具体的には、天然に存在する切断型（例えば、細胞外ドメイン配列または膜貫通サブユニット配列）、天然に存在する変異型（例えば、あるいはスプライス型）、及び天然に存在する対立遺伝子変異形を包含する。「野生型ＦＧＦＲ３」という用語は、概して、天然に存在するＦＧＦＲ３タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。「野生型ＦＧＦＲ３配列」という用語は、概して、天然に存在するＦＧＦＲ３に見られるアミノ酸配列を指す。
【０２４１】
本明細書で使用される「ＦＧＦＲ３リガンド」（同義に「ＦＧＦ」と呼ばれる）という用語は、別途具体的または文脈的に指示されない限り、任意の天然または変異形（天然か合成かにかかわらず）ＦＧＦＲ３リガンド（例えば、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ２３）ポリペプチドを指す。「天然配列」という用語は、具体的には、天然に存在する切断型（例えば、細胞外ドメイン配列または膜貫通サブユニット配列）、天然に存在する変異型（例えば、あるいはスプライス型）、及び天然に存在する対立遺伝子変異形を包含する。「野生型ＦＧＦＲ３リガンド」という用語は、概して、天然に存在するＦＧＦＲ３リガンドタンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。「野生型ＦＧＦＲ３リガンド配列」という用語は、概して、天然に存在するＦＧＦＲ３リガンドに見られるアミノ酸配列を指す。
【０２４２】
「ＦＧＦＲ３活性化」という用語は、ＦＧＦＲ３受容体の活性化またはリン酸化を指す。概して、ＦＧＦＲ３活性化は、シグナル伝達（例えば、ＦＧＦＲ３または基質ポリペプチド中のチロシン残基をリン酸化するＦＧＦＲ３受容体の細胞内キナーゼドメインによって引き起こされるシグナル伝達）をもたらす。ＦＧＦＲ３活性化は、目的とするＦＧＦＲ３受容体に結合するＦＧＦＲリガンドによって媒介され得る。ＦＧＦＲ３に結合するＦＧＦＲ３リガンド（例えば、ＦＧＦ１またはＦＧＦ９等）は、ＦＧＦＲ３のキナーゼドメインを活性化し、それによりＦＧＦＲ３中のチロシン残基のリン酸化及び／または更なる基質ポリペプチド（複数可）中のチロシン残基のリン酸化をもたらし得る。
【０２４３】
本明細書で使用される「ＦＧＦＲ２」という用語は、別途具体的または文脈的に指示されない限り、任意の天然または変異形（天然か合成かにかかわらず）ＦＧＦＲ２ポリペプチド（例えば、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂアイソフォームまたはＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃアイソフォーム）を指す。「天然配列」という用語は、具体的には、天然に存在する切断型（例えば、細胞外ドメイン配列または膜貫通サブユニット配列）、天然に存在する変異型（例えば、あるいはスプライス型）、及び天然に存在する対立遺伝子変異形を包含する。「野生型ＦＧＦＲ２」という用語は、概して、天然に存在するＦＧＦＲ２タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。「野生型ＦＧＦＲ２配列」という用語は、概して、天然に存在するＦＧＦＲ２に見られるアミノ酸配列を指す。
【０２４４】
本明細書で使用される「ＦＧＦＲ２リガンド」（同義に「ＦＧＦ２」と呼ばれる）という用語は、別途具体的または文脈的に指示されない限り、任意の天然または変異形（天然か合成かにかかわらず）ＦＧＦＲ２リガンドを指す。「天然配列」という用語は、具体的には、天然に存在する切断型（例えば、細胞外ドメイン配列または膜貫通サブユニット配列）、天然に存在する変異型（例えば、あるいはスプライス型）、及び天然に存在する対立遺伝子変異形を包含する。「野生型ＦＧＦＲ２リガンド」という用語は、概して、天然に存在するＦＧＦＲ２リガンドタンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。「野生型ＦＧＦＲ２リガンド配列」という用語は、概して、天然に存在するＦＧＦＲ２リガンドに見られるアミノ酸配列を指す。
【０２４５】
「ＦＧＦＲ２活性化」という用語は、ＦＧＦＲ２受容体の活性化またはリン酸化を指す。ＦＧＦＲ２活性化は、目的とするＦＧＦＲ２受容体に結合するＦＧＦＲリガンドによって媒介され得る。ＦＧＦＲ２に結合するＦＧＦＲ２リガンドは、ＦＧＦＲ２のキナーゼドメインを活性化し、それによりＦＧＦＲ２中のチロシン残基のリン酸化及び／または更なる基質ポリペプチド（複数可）中のチロシン残基のリン酸化をもたらし得る。
【０２４６】
「ＦＧＦＲ２／３抗体」という用語は、ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３に結合する二重特異性抗体を指す。ＦＧＦＲ２／３抗体の非限定的な例としては、本明細書に記載の二重特異性モノクローナル抗体２Ｂ．１．３．１０及び２Ｂ．１．３．１２が挙げられる。ＦＧＦＲ２／３及び「ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３」及び「ＦＧＦＲ３及びＦＧＦＲ２」という用語は、本明細書で同義に使用される。
【０２４７】
本明細書で使用される「恒常的」という用語は、例えば、受容体キナーゼ活性に適用される場合、リガンドまたは他の活性化分子の存在に依存しない受容体の連続したシグナル伝達活性を指す。受容体の本質に応じて、活性の全てが恒常的であり得るか、または受容体の活性が他の分子（例えば、リガンド）の結合によって更に活性化され得る。受容体の活性化につながる細胞事象は、当業者に周知である。例えば、活性化としては、より高次の受容体複合体へのオリゴマー化、例えば、二量体化、三量体化等が挙げられ得る。複合体は、単一種のタンパク質、すなわち、ホモマー複合体を含み得る。あるいは、複合体は、少なくとも２つの異なるタンパク質種、すなわち、ヘテロマー複合体を含み得る。複合体形成は、例えば、細胞の表面上での受容体の正常型または変異型の過剰発現によって引き起こされ得る。複合体形成は、受容体における特異的変異（複数可）によっても引き起こされ得る。
【０２４８】
本明細書で使用される「リガンド非依存性」という用語は、例えば、受容体シグナル伝達活性に適用される場合、リガンドの存在に依存しないシグナル伝達活性を指す。リガンド非依存性キナーゼ活性を有する受容体は、キナーゼ活性の更なる活性化をもたらすためにリガンドのその受容体への結合を必ずしも妨げるわけではない。
【０２４９】
本明細書で使用される「リガンド依存性という用語は、例えば、受容体シグナル伝達活性に適用される場合、リガンドの存在に依存するシグナル伝達活性を指す。
【０２５０】
「遺伝子増幅」という語句は、遺伝子または遺伝子断片の複数のコピーが特定の細胞または細胞株に形成されるプロセスを指す。重複領域（一続きの増幅ＤＮＡ）は、多くの場合、「増幅産物」と称される。通常、産生されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の量、すなわち、遺伝子発現のレベルは、発現した特定の遺伝子で作製されたコピー数の割合も増大させる。
【０２５１】
「チロシンキナーゼ阻害剤」とは、ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３受容体等のチロシンキナーゼのチロシンキナーゼ活性をある程度阻害する分子である。
【０２５２】
「ＦＧＦＲ３発現、増幅、または活性化を呈する」癌または生体試料とは、診断試験において、ＦＧＦＲ３を発現し（過剰発現を含む）、増幅ＦＧＦＲ３遺伝子を有し、かつ／またはさもなければＦＧＦＲ３の活性化またはリン酸化を示すものである。「ＦＧＦＲ２発現、増幅、または活性化を呈する」癌または生体試料とは、診断試験において、ＦＧＦＲ２を発現し（過剰発現を含む）、増幅ＦＧＦＲ２遺伝子を有し、かつ／またはさもなければＦＧＦＲ２の活性化またはリン酸化を示すものである。「ＦＧＦＲ２／３発現、増幅、もしくは活性化を呈する」または「ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３発現、増幅、もしくは活性化を呈する」癌または生体試料とは、診断試験において、ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３を発現し（過剰発現を含む）、増幅ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３遺伝子を含み、かつ／またはさもなければＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３のの活性化またはリン酸化を示すものである。
【０２５３】
本明細書で使用される「Ｋｌｏｔｈｏ−ベータ」、「ＫＬＢ」、及び「ベータ−Ｋｌｏｔｈｏ」とは、別途指示されない限り、哺乳動物、例えば、霊長類（例えば、ヒト）ならびに齧歯類（例えば、マウス及びラット）等の任意の脊椎動物源由来の任意の天然ベータ−Ｋｌｏｔｈｏを指す。この用語は、「全長」の処理されていないＫＬＢ、ならびに細胞における処理から生じるＫＬＢの任意の形態を包含する。この用語は、ＫＬＢの天然に存在する変異形、例えば、スプライス変異形または対立遺伝子変異形も包含する。シグナル配列を除く本開示の抗体により標的とされるヒトＫＬＢアミノ酸配列の非限定的な例としては、以下が挙げられる：
2017538442.tif 000005
（配列番号２３３）。
【０２５４】
ある特定の実施形態では、ＫＬＢタンパク質は、アミノ酸配列
2017538442.tif 000006
（配列番号２３４）を有するＮ末端シグナル配列を含み得る。
【０２５５】
「ＫＬＢのＣ末端ドメイン」という用語は、ＫＬＢのカルボキシ末端グリコシダーゼ様ドメインを指す。例えば、配列番号２３３に示される例示のＫＬＢタンパク質のＣ末端ドメインは、以下のアミノ酸配列を含む：
2017538442.tif 000007
（配列番号２３５）。
【０２５６】
「抗ＫＬＢ抗体」及び「ＫＬＢに結合する抗体」という用語は、抗体がＫＬＢを標的とする際に診断薬及び／または治療薬として有用であるのに十分な親和性でＫＬＢに結合することができる抗体を指す。一実施形態では、抗ＫＬＢ抗体の無関係の非ＫＬＢタンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定された場合、抗体のＫＬＢへの結合の約１０％未満である。ある特定の実施形態では、ＫＬＢに結合する抗体は、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下、または０．００１ｎＭ以下（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば、１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の解離定数を有する。ある特定の実施形態では、抗ＫＬＢ抗体は、異なる種由来のＫＬＢ間で保存されたＫＬＢのエピトープに結合する。ある特定の実施形態では、抗ＫＬＢ抗体は、タンパク質のＣ末端部分に存在するＫＬＢのエピトープに結合する。
【０２５７】
「薬学的製剤」という用語は、調製物中に含有される活性成分の生物学的活性が有効になるような形態であり、かつ製剤が投与される対象にとって許容できないほど有毒である更なる構成成分を含有しない調製物を指す。
【０２５８】
本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」とは、活性成分以外の対象に無毒である薬学的製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体としては、緩衝液、賦形剤、安定剤、または防腐剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２５９】
本明細書で使用されるとき、「治療」（及び「治療する」または「治療すること」等のその文法上の変形）は、治療されている個体の自然経過を変えることを目的とした臨床的介入を指し、予防のために、または臨床病理学的過程中のいずれかに行うことができる。治療の望ましい効果としては、疾患の発生または再発の予防、症状の緩和、疾患の任意の直接的または間接的病理学的帰結の減少、転移の予防、疾患進行速度の低減、病状の寛解または緩和、及び緩解または予後の改善が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、本開示の抗体を使用して、疾患の発症を遅延させるか、または疾患の進行を減速させることができる。「治療」とは、治療的治療及び予防的措置または予防措置の両方を指す。これがＦＧＦＲ２／３抗体に関連するため、治療を必要とする者としては、良性、前癌状態、または非転移性の腫瘍をすでに有する者、ならびに癌の発生または再発が予防される者が挙げられる。
【０２６０】
「ＦＧＦＲ３活性化を呈する」癌または生体試料とは、診断試験において、ＦＧＦＲ３の活性化またはリン酸化を示すものである。かかる活性化は、直接（例えば、ＥＬＩＳＡでのＦＧＦＲ３リン酸化の測定により）または間接的に決定することができる。「ＦＧＦＲ２活性化を呈する」癌または生体試料とは、診断試験において、ＦＧＦＲ２の活性化またはリン酸化を示すものである。かかる活性化は、直接または間接的に決定することができる。「ＦＧＦＲ２活性化及びＦＧＦＲ３活性化を呈する」癌または生体試料とは、診断試験において、ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３の活性化またはリン酸化を示すものである。かかる活性化は、直接または間接的に決定することができる。
【０２６１】
「恒常的ＦＧＦＲ３活性化を呈する」癌または生体試料とは、診断試験において、ＦＧＦＲ３の恒常的活性化またはリン酸化を示すものである。かかる活性化は、直接（例えば、ＥＬＩＳＡでのｃ−ＦＧＦＲ３リン酸化の測定により）または間接的に決定することができる。「恒常的ＦＧＦＲ２活性化を呈する」癌または生体試料とは、診断試験において、ＦＧＦＲ２の恒常的活性化またはリン酸化を示すものである。かかる活性化は、直接または間接的に決定することができる。「恒常的ＦＧＦＲ２及び恒常的ＦＧＦＲ３活性化を呈する」癌または生体試料とは、診断試験において、ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３の恒常的活性化またはリン酸化を示すものである。かかる活性化は、直接または間接的に決定することができる。
【０２６２】
「ＦＧＦＲ３増幅を呈する」癌または生体試料とは、診断試験において、増幅ＦＧＦＲ３遺伝子を有するものである。「ＦＧＦＲ２増幅を呈する」癌または生体試料とは、診断試験において、増幅ＦＧＦＲ２遺伝子を有するものである。「ＦＧＦＲ２増幅及びＦＧＦＲ３増幅を呈する」癌または生体試料とは、診断試験において、増幅ＦＧＦＲ２遺伝子及び増幅ＦＧＦＲ３遺伝子を有するものである。
【０２６３】
「ＦＧＦＲ３転座を呈する」癌または生体試料とは、診断試験において、転座ＦＧＦＲ３遺伝子を有するものである。ＦＧＦＲ３転座の例は、いくつかの多発性骨髄腫腫瘍で生じるｔ（４；１４）転座である。「ＦＧＦＲ２転座を呈する」癌または生体試料とは、診断試験において、転座ＦＧＦＲ２遺伝子を有するものである。「ＦＧＦＲ２転座及びＦＧＦＲ３転座を呈する」癌または生体試料とは、診断試験において、転座ＦＧＦＲ２遺伝子及び転座ＦＧＦＲ３遺伝子を有するものである。
【０２６４】
本明細書における「リンＥＬＩＳＡアッセイ」とは、１つ以上のＦＧＦＲ（例えば、ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３）、基質、または下流シグナル伝達分子のリン酸化が、試薬、通常、抗体を使用して、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で評価されて、リン酸化ＦＧＦＲ（例えばＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３）、基質、または下流シグナル伝達分子を検出するアッセイである。いくつかの実施形態では、リン酸化ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、またはｐＭＡＰＫを検出する抗体が使用される。特定の一実施形態では、リン酸化ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３を検出する抗体が使用される。このアッセイは、好ましくは、新鮮なまたは凍結させた生体試料由来の細胞溶解物で行うことができる。
【０２６５】
「リガンド非依存性ＦＧＦＲ３活性化を呈する」癌または生体試料とは、診断試験において、ＦＧＦＲ３のリガンド非依存性活性化またはリン酸化を示すものである。かかる活性化は、直接（例えば、ＥＬＩＳＡでのＦＧＦＲ３リン酸化の測定により）または間接的に決定することができる。「リガンド非依存性ＦＧＦＲ２活性化を呈する」癌または生体試料は、診断試験において、ＦＧＦＲ２のリガンド非依存性活性化またはリン酸化を示すものである。かかる活性化は、直接または間接的に決定することができる。「リガンド非依存性ＦＧＦＲ２／３活性化を呈する」癌または生体試料は、診断試験において、ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３のリガンド非依存性活性化またはリン酸化を示すものである。かかる活性化は、直接または間接的に決定することができる。
【０２６６】
「リガンド依存性ＦＧＦＲ３活性化を呈する」癌または生体試料は、診断試験において、ＦＧＦＲ３のリガンド依存性活性化またはリン酸化を示すものである。かかる活性化は、直接（例えば、ＥＬＩＳＡでのＦＧＦＲ３リン酸化の測定により）または間接的に決定することができる。「リガンド依存性ＦＧＦＲ２活性化を呈する」癌または生体試料は、診断試験において、ＦＧＦＲ２のリガンド依存性活性化またはリン酸化を示すものである。かかる活性化は、直接または間接的に決定することができる。「リガンド依存性ＦＧＦＲ２／３活性化を呈する」癌または生体試料は、診断試験において、ＦＧＦＲ２／３のリガンド依存性活性化またはリン酸化を示すものである。かかる活性化は、直接または間接的に決定することができる。
【０２６７】
「リガンド非依存性ＦＧＦＲ３活性化を呈する」癌または生体試料は、診断試験において、ＦＧＦＲ３のリガンド非依存性活性化またはリン酸化を示すものである。かかる活性化は、直接（例えば、ＥＬＩＳＡでのＦＧＦＲ３リン酸化の測定により）または間接的に決定することができる。「リガンド非依存性ＦＧＦＲ２活性化を呈する」癌または生体試料は、診断試験において、ＦＧＦＲ２のリガンド非依存性活性化またはリン酸化を示すものである。かかる活性化は、直接または間接的に決定することができる。「リガンド非依存性ＦＧＦＲ２／３活性化を呈する」癌または生体試料は、診断試験において、ＦＧＦＲ２／３のリガンド非依存性活性化またはリン酸化を示すものである。かかる活性化は、直接または間接的に決定することができる。
【０２６８】
「ＦＧＦＲ３過剰発現または増幅」を伴う癌細胞は、同じ組織型の非癌性細胞と比較して著しく高いレベルのＦＧＦＲ３タンパク質または遺伝子を有するものである。かかる過剰発現は、遺伝子の増幅、または転写もしくは翻訳の増加によって引き起こされ得る。ＦＧＦＲ３過剰発現または増幅は、診断または予後アッセイにおいて、（例えば、免疫組織化学アッセイ（ＩＨＣ）により）細胞の表面上に存在する増大したレベルのＦＧＦＲ３タンパク質を評価することによって決定することができる。あるいは、または加えて、例えば、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ、１９９８年１０月公開のＷＯ９８／４５４７９を参照のこと）、サザンブロット法、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法、例えば、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）により、細胞内のＦＧＦＲ３をコードする核酸のレベルを測定することができる。上述のアッセイに加えて、様々なインビボアッセイが当業者に利用可能である。例えば、患者の身体内の細胞を、検出可能な標識、例えば、放射性同位体で任意に標識される抗体に曝露することができ、この抗体の患者における細胞への結合を、例えば、放射活性の外部スキャニングによって、またはこの抗体に以前に曝露された患者から採取された生検を分析することによって評価することができる。
【０２６９】
「ＦＧＦＲ２過剰発現または増幅」を伴う癌細胞は、同じ組織型の非癌性細胞と比較して著しく高いレベルのＦＧＦＲ２のタンパク質または遺伝子を有するものである。かかる過剰発現は、遺伝子の増幅、または転写もしくは翻訳の増加によって引き起こされ得る。ＦＧＦＲ２過剰発現または増幅は、診断または予後アッセイにおいて、（例えば、免疫組織化学アッセイ（ＩＨＣ）により）細胞の表面上に存在する増大したレベルのＦＧＦＲ２タンパク質を評価することによって決定することができる。あるいは、または加えて、例えば、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ、１９９８年１０月公開のＷＯ９８／４５４７９を参照のこと）、サザンブロット法、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法、例えば、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）により、細胞内のＦＧＦＲ２をコードする核酸のレベルを測定することができる。上述のアッセイに加えて、様々なインビボアッセイが当業者に利用可能である。例えば、患者の身体内の細胞を、検出可能な標識、例えば、放射性同位体で任意に標識される抗体に曝露することができ、この抗体の患者における細胞への結合を、例えば、放射活性の外部スキャニングによって、またはこの抗体に以前に曝露された患者から採取された生検を分析することによって評価することができる。
【０２７０】
「ＦＧＦＲ２／３過剰発現または増幅」を伴う癌細胞は、同じ組織型の非癌性細胞と比較して著しく高いレベルのＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３タンパク質または遺伝子を有するものである。かかる過剰発現は、遺伝子の増幅、または転写もしくは翻訳の増加によって引き起こされ得る。ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３過剰発現または増幅は、診断または予後アッセイにおいて、（例えば、免疫組織化学アッセイ（ＩＨＣ）により）細胞の表面上に存在する増大したレベルのＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３タンパク質を評価することによって決定することができる。あるいは、または加えて、例えば、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ、１９９８年１０月公開のＷＯ９８／４５４７９を参照のこと）、サザンブロット法、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法、例えば、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）により、細胞内のＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３をコードする核酸のレベルを測定することができる。上述のアッセイに加えて、様々なインビボアッセイが当業者に利用可能である。例えば、患者の身体内の細胞を、検出可能な標識、例えば、放射性同位体で任意に標識される抗体に曝露することができ、この抗体の患者における細胞への結合を、例えば、放射活性の外部スキャニングによって、またはこの抗体に以前に曝露された患者から採取された生検を分析することによって評価することができる。
【０２７１】
本明細書で使用される「変異」という用語は、それぞれ、野生型タンパク質または核酸に対して、特定のタンパク質または核酸（遺伝子、ＲＮＡ）のアミノ酸配列または核酸配列の差異を意味する。変異タンパク質または核酸は、遺伝子の一方の対立遺伝子（ヘテロ接合性）または両方の対立遺伝子（ホモ接合性）から発現され得るか、またはそれに見られ得、体細胞系列または生殖系列であり得る。本発明では、変異は、概して、体細胞変異である。変異としては、配列再配置、例えば、挿入、欠失、及び点変異（単一ヌクレオチド／アミノ酸多型を含む）が挙げられる。
【０２７２】
「阻害する」とは、基準と比較して活性、機能、及び／または量を低減または減少させることである。
【０２７３】
薬剤が目的とするポリペプチド（例えば、ＦＧＦ１またはＦＧＦ９等のＦＧＦＲリガンド）の機能的活性のうちの少なくとも１つを模倣する場合、薬剤は、「アゴニスト活性または機能」を有する。
【０２７４】
本明細書で使用される「アゴニスト抗体」とは、目的とするポリペプチド（例えば、ＦＧＦ１またはＦＧＦ９等のＦＧＦＲリガンド）の機能的活性のうちの少なくとも１つを模倣する抗体である。
【０２７５】
タンパク質「発現」は、遺伝子にコードされた情報の、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、その後、タンパク質への変換を指す。
【０２７６】
本明細書において、目的とするタンパク質（ＦＧＦ受容体またはＦＧＦ受容体リガンド等）を「発現」する試料または細胞は、そのタンパク質をコードするｍＲＮＡまたはそのタンパク質（その断片を含む）が試料または細胞内に存在すると決定されたものである。
【０２７７】
「免疫コンジュゲート」（同義に「抗体−薬物コンジュゲート」または「ＡＤＣ」と称される）とは、１つ以上の細胞毒性薬、例えば、化学療法剤、薬物、成長阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素、またはその断片）、または放射性同位体（すなわち、放射性コンジュゲート）にコンジュゲートされる抗体を意味する。
【０２７８】
本明細書で使用される「Ｆｃ領域」という用語は、概して、免疫グロブリン重鎖のＣ末端ポリペプチド配列を含む二量体複合体を指し、Ｃ末端ポリペプチド配列とは、インタクトな抗体のパパイン消化により得ることができるものである。Ｆｃ領域は、天然または変異形Ｆｃ配列を含み得る。免疫グロブリン重鎖のＦｃ配列の境界は変動し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ配列は、通常、約Ｃｙｓ２２６位のアミノ酸残基から、または約Ｐｒｏ２３０位から、Ｆｃ配列のカルボキシル末端まで伸びていると定義される。免疫グロブリンのＦｃ配列は、概して、２つの定常ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含み、任意にＣＨ４ドメインを含む。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵ番号付けシステムに従って残基４４７）は、例えば、抗体の精製中に、または抗体をコードする核酸の組換え操作により除去され得る。したがって、本発明によるＦｃ領域を有する抗体を含む組成物は、Ｋ４４７を有する抗体、Ｋ４４７が全て除去された抗体、またはＫ４４７残基を有する抗体とＫ４４７残基を有しない抗体との混合物を含み得る。
【０２７９】
本明細書において「Ｆｃポリペプチド」とは、Ｆｃ領域を構成するポリペプチドのうちの１つを意味する。Ｆｃポリペプチドは、任意の好適な免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭから得ることができる。いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、野生型ヒンジ配列の一部または全てを（一般に、そのＮ末端に）含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、機能的または野生型ヒンジ配列を含まない。
【０２８０】
「遮断」抗体または抗体「アンタゴニスト」とは、それが結合する抗原の生物学的活性を阻害または低減するものである。好ましい遮断抗体またはアンタゴニスト抗体は、抗原の生物学的活性を完全に阻害する。
【０２８１】
「ネイキッド抗体」とは、細胞毒性部分等の異種分子または放射標識にコンジュゲートされない抗体である。
【０２８２】
指定された抗体の「生物学的特性」を有する抗体とは、ある抗体を同じ抗原に結合する他の抗体と区別するその抗体の生物学的特性のうちの１つ以上を有するものである。
【０２８３】
目的とする抗体によって結合された抗原上のエピトープに結合する抗体についてスクリーニングするために、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）に記載のもの等の通例の交差遮断アッセイを行うことができる。
【０２８４】
本発明のアミノ酸配列を含む抗体またはポリペプチドの半減期を増大させるために、例えば、米国特許５，７３９，２７７号に記載されるように、サルベージ受容体結合エピトープを抗体（特に、抗体断片）に結合させることができる。例えば、サルベージ受容体結合エピトープをコードする核酸分子は、操作された核酸分子により発現した融合タンパク質がサルベージ受容体結合エピトープ及び本発明のポリペプチド配列を含むように、本発明のポリペプチド配列をコードする核酸にインフレームで連結され得る。本明細書で使用されるとき、「サルベージ受容体結合エピトープ」という用語は、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期の増大に関与するＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープ（例えば、Ｇｈｅｔｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：７３９−７６６（２０００）、表１）を指す。そのＦｃ領域での置換及び増大した血清半減期を有する抗体も、ＷＯ００／４２０７２、ＷＯ０２／０６０９１９、Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１−６６０４（２００１）、Ｈｉｎｔｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：６２１３−６２１６（２００４））に記載されている。別の実施形態では、血清半減期は、例えば、他のポリペプチド配列を結合させることによっても増大し得る。例えば、本発明の方法に有用な抗体または他のポリペプチドは、血清アルブミンが抗体またはポリペプチドに結合するように、ＦｃＲｎ受容体または血清アルブミン結合ペプチドに結合する血清アルブミンまたは血清アルブミンの一部に結合することができ、例えば、かかるポリペプチド配列は、ＷＯ０１／４５７４６に開示されている。好ましい一実施形態では、結合される血清アルブミンペプチドは、アミノ酸配列ＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷ（配列番号１８３）を含む。別の実施形態では、Ｆａｂの半減期は、これらの方法により増大する。血清アルブミン結合ペプチド配列については、Ｄｅｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３５０３５−３５０４３（２００２）も参照されたい。
【０２８５】
「断片」とは、好ましくは、参照核酸分子またはポリペプチドの全長の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上を含むポリペプチドまたは核酸分子の一部を意味する。断片は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００、２００、３００、４００、５００、６００個、もしくはそれ以上のヌクレオチド、または１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、１９０、２００個、もしくはそれ以上のアミノ酸を含み得る。
【０２８６】
本明細書で使用される、本発明の抗体に関して「アゴニスト機能がほとんどまたは全くない」という語句は、抗体が、例えば、対象への投与時に、生物学的に有意な量のアゴニスト活性を誘発しないことを意味する。当該技術分野で理解されるであろうように、活性の量は、本発明の抗体と基準対応物との間の比較が行われ得る限り、量的または質的に決定することができる。活性は、例えば、本明細書に記載のものを含む、当該技術分野で既知の任意のアッセイまたは技法に従って測定または検出することができる。本発明の抗体及びその基準対応物の活性の量は、並行運転または個別運転で決定することができる。いくつかの実施形態では、本発明の二価抗体は、実質的なアゴニスト機能を有さない。
【０２８７】
「アポトーシス」及び「アポトーシス活性」という用語は、広い意味で使用され、細胞質の凝縮、形質膜微絨毛の喪失、核のセグメント化、染色体ＤＮＡの分解、またはミトコンドリア機能の喪失等の１つ以上の特徴的な細胞変化を典型的に伴う哺乳動物における細胞死の秩序ある形態または制御された形態を指す。この活性は、当該技術分野で既知の技法を使用して、例えば、細胞生存率アッセイ、ＦＡＣＳ分析、またはＤＮＡ電気泳動によって、より具体的には、アネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、細胞収縮、小胞体の膨張、細胞断片化、及び／または膜小胞（アポトーシス小体と呼ばれる）の形成によって決定及び測定することができる。
【０２８８】
「抗体」及び「免疫グロブリン」という用語は、最も広い意味で同義に使用され、モノクローナル抗体（例えば、全長またはインタクトなモノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、多価抗体、多特異性抗体（例えば、それらが所望の生物学的活性を呈する限り、二重特異性抗体）を含み、ある特定の抗体断片（本明細書により詳細に記載されるもの）も含み得る。抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、及び／または親和性成熟抗体であり得る。
【０２８９】
「可変」という用語は、可変ドメインのある特定の部分の配列が抗体間で大幅に異なり、それらが各特定の抗体のその特定の抗原に対する結合及び特異性に使用されるという事実を指す。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメイン全体にわたって均等に分布していない。それは、相補性決定領域（ＣＤＲ）または軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインの両方における超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。天然重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々、４つのＦＲ領域を含み、主にβシート配置を採用し、３つのＣＤＲにより接続され、これらは、βシート構造を接続する（場合によってはβシート構造の一部を形成する）ループを形成する。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域によって密に接近して一緒に保持され、他方の鎖からのＣＤＲとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））。定常ドメインは、抗体を抗原に結合することに直接関与しないが、抗体依存性細胞毒性における抗体の参加等の様々なエフェクター機能を呈する。
【０２９０】
抗体のパパイン消化により、各々単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片と、その名称が容易に結晶化するその能力を反映する残りの「Ｆｃ」断片がもたらされる。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有し、かつ依然として抗原を架橋することができるＦ（ａｂ’）２断片が得られる。
【０２９１】
「Ｆｖ」とは、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小抗体断片である。二鎖Ｆｖ種において、この領域は、１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインが緊密に非共有会合した二量体からなる。一鎖Ｆｖ種では、１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインは、軽鎖及び重鎖が二鎖Ｆｖ種の二量体に類似した「二量体」構造で会合し得るように、可動性ペプチドリンカーによって共有結合され得る。各可変ドメインの３つのＣＤＲがＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を規定するように相互作用するのは、この配置においてである。集合的に、６つのＣＤＲは、抗体に抗原結合特異性を与える。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的なＣＤＲを３つのみ含むＦｖの半分）でさえも、全結合部位よりも低い親和性ではあるが、抗原を認識してそれに結合する能力を有する。
【０２９２】
Ｆａｂ断片は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含む。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端での数個の残基の付加だけＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨとは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を持つＦａｂ’についての本明細書における表記である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元来、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片対として産生された。抗体断片の他の化学的結合も既知である。
【０２９３】
任意の脊椎動物種由来の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの明らかに異なる型のうちの１つに割り当てられ得る。
【０２９４】
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンが異なるクラスに割り当てられ得る。免疫グロブリンには５つの主なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に更に分類され得る。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元配置は、周知である。「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部のみを含み、この一部は、好ましくは、インタクトな抗体中に存在する場合にその一部に通常関連する機能のうちの少なくとも１つ、好ましくは、大半または全てを保持する。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；ダイアボディ；直鎖状抗体；一本鎖抗体分子；ならびに抗体断片から形成された多特異性抗体が挙げられる。一実施形態では、抗体断片は、インタクトな抗体の抗原結合部位を含み、それ故に、抗原に結合する能力を保持する。別の実施形態では、抗体断片、例えば、Ｆｃ領域を含む抗体断片は、インタクトな抗体中に存在する場合にＦｃ領域に通常関連する生物学的機能、例えば、ＦｃＲｎ結合、抗体半減期調節、ＡＤＣＣ機能、及び補体結合等のうちの少なくとも１つを保持する。一実施形態では、抗体断片は、インタクトな抗体と実質的に同様のインビボ半減期を有する一価抗体である。例えば、かかる抗体断片は、断片にインビボ安定性を与えることができるＦｃ配列に連結される抗原結合アームを含み得る。
【０２９５】
「超可変領域」、「ＨＶＲ」、または「ＨＶ」という用語は、本明細書で使用されるとき、配列内で超可変性であり、かつ／または構造的に規定されたループを形成する抗体可変ドメインの領域を指す。概して、抗体は、ＶＨ中に３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬ中に３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）の６つの超可変領域を含む。いくつかの超可変領域描写が使用されており、本明細書に包含されている。Ｋａｂａｔ相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列多様性に基づいており、最も一般に使用されている（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））。Ｃｈｏｔｈｉａは、代わりに構造ループの位置に言及している（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））。ＡｂＭ超可変領域は、ＫａｂａｔのＣＤＲ及びＣｈｏｔｈｉａの構造ループとの間の妥協案を表し、Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって使用されている。「接触」超可変領域は、利用可能な複合体結晶構造の分析に基づく。これらの超可変領域の各々由来の残基を以下に示す。
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【０２９６】
超可変領域は、以下の「伸長超可変領域」：ＶＬにおいて、２４〜３６または２４〜３４（Ｌ１）、４６〜５６または５０〜５６（Ｌ２）、及び８９〜９７（Ｌ３）、ならびにＶＨにおいて、２６〜３５（Ｈ１）、５０〜６５または４９〜６５（Ｈ２）、及び９３〜１０２、９４〜１０２または９５〜１０２（Ｈ３）を含み得る。可変ドメイン残基は、これらの定義の各々について、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（上記参照）に従って番号付けされる。
【０２９７】
「フレームワーク」または「ＦＲ」残基とは、本明細書に定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【０２９８】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含むキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、レシピエントの超可変領域からの残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ、もしくは非ヒト霊長類等の非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域由来の残基で置き換えられる。いくつかの事例では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基で置き換えられる。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体には見られない残基を含み得る。これらの修飾を行い、抗体の性能を更に改良する。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインのうちの実質的に全てを含み、超可変ループのうちの全てまたは実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、ＦＲのうちの全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のＦＲである。ヒト化抗体は、任意に、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的には、ヒト免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含む。更なる詳細については、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）、及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照されたい。以下の総説及びそれらに引用されている参考文献：Ｖａｓｗａｎｉ  ａｎｄ  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ＆Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：１０５−１１５（１９９８）、Ｈａｒｒｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ２３：１０３５−１０３８（１９９５）、Ｈｕｒｌｅ  ａｎｄ  Ｇｒｏｓｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：４２８−４３３（１９９４）も参照されたい。
【０２９９】
「キメラ」抗体（免疫グロブリン）は、特定の種由来の抗体または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同の重鎖及び／または軽鎖の一部を有する一方で、鎖（複数可）の残りは、それらが所望の生物学的活性を呈する限り、別の種由来の抗体または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体、ならびにかかる抗体の断片における対応する配列と同一または相同である（米国特許第４，８１６，５６７号、及びＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５（１９８４））。本明細書で使用されるヒト化抗体は、キメラ抗体のサブセットである。
【０３００】
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一ポリペプチド鎖内に存在する。一般に、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に、ｓｃＦｖが抗原結合にとって所望の構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーを更に含む。ｓｃＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたい。
【０３０１】
「抗原」とは、抗体が選択的に結合する所定の抗原である。標的抗原は、ポリペプチド、炭水化物、核酸、脂質、ハプテン、または他の天然に存在するもしくは合成の化合物であり得る。好ましくは、標的抗原は、ポリペプチドである。
【０３０２】
「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小さい抗体断片を指し、それらの断片は、同じポリペプチド鎖内の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）（ＶＨ−ＶＬ）を含む。同じ鎖上でのこれらの２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用することにより、これらのドメインは別の鎖の相補的ドメインと対合させられ、２つの抗原結合部位を作り出す。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７、ＷＯ９３／１１１６１、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）により完全に記載されている。
【０３０３】
「ヒト抗体」とは、ヒトによって産生された抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有し、及び／または本明細書に開示されるヒト抗体を作製する技法のうちのいずれかを使用して作製された抗体である。ヒト抗体のこの定義は、特に、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を除外する。
【０３０４】
「親和性成熟」抗体とは、その１つ以上のＣＤＲに１つ以上の改変を有する抗体であって、それらの改変（複数可）を有しない親抗体と比較して抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらす抗体である。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対してナノモルまたは更にはピコモルの親和性を有する。親和性成熟抗体は、当該技術分野で既知の手順によって産生される。Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）は、ＶＨ及びＶＬドメインシャッフリングによる親和性成熟について記載している。ＣＤＲ及び／またはフレームワーク残基のランダム変異誘発は、Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ  ９１：３８０９−３８１３（１９９４）、Ｓｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １６９：１４７−１５５（１９９５）、Ｙｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１９９４−２００４（１９９５）、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（７）：３３１０−９（１９９５）、及びＨａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６（１９９２）によって説明されている。
【０３０５】
抗体「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域またはアミノ酸配列変異形Ｆｃ領域）に起因する生物学的活性を指し、抗体アイソタイプによって異なる。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞毒性、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体の下方調節（例えば、Ｂ細胞受容体）、ならびにＢ細胞活性化が挙げられる。
【０３０６】
「抗体依存性細胞媒介性細胞毒性」または「ＡＤＣＣ」とは、ある特定の細胞毒性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合した分泌Ｉｇにより、これらの細胞毒性エフェクター細胞が抗原を持つ標的細胞に特異的に結合し、その後、細胞毒素で標的細胞を死滅させることができるようになる細胞毒性の形態を指す。これらの抗体は、細胞毒性細胞を「武装」させ、かかる死滅に絶対必要である。ＡＤＣＣの媒介のための主要な細胞であるＮＫ細胞がＦｃγＲＩＩＩのみを発現する一方で、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２（１９９１）の４６４貢の表３に要約されている。目的とする分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号もしくは同５，８２１，３３７号、またはＰｒｅｓｔａの米国特許第６，７３７，０５６号に記載のアッセイ等のインビトロＡＤＣＣアッセイを行うことができる。かかるアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいは、または加えて、目的とする分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されるモデル等の動物モデルで評価され得る。
【０３０７】
「ヒトエフェクター細胞」とは、１つ以上のＦｃＲを発現し、かつエフェクター機能を果たす白血球である。好ましくは、これらの細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を果たす。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞毒性Ｔ細胞、及び好中球が挙げられ、ＰＢＭＣ及びＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞は、天然源、例えば、血液から単離され得る。
【０３０８】
「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を表す。好ましいＦｃＲは、天然配列ヒトＦｃＲである。更に、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）に結合し、かつＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含むＦｃＲであり、これらには、これらの受容体の対立遺伝子変異形及び選択的スプライスされた形態が含まれる。ＦｃγＲＩＩ受容体としては、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）が挙げられ、これらは、主にそれらの細胞質ドメインの点で異なる同様のアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメイン内に免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。阻害受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメイン内に免疫受容体チロシン系阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む。（概説Ｍ．Ｄａｅｒｏｎ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３−２３４（１９９７）を参照のこと）。ＦｃＲは、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２（１９９１）、Ｃａｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２５−３４（１９９４）、及びｄｅ  Ｈａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０−４１（１９９５）に概説されている。今後特定されるものを含む他のＦｃＲは、本明細書において「ＦｃＲ」という用語により包含されている。この用語は、母体ＩｇＧの胎児への移動に関与し（Ｇｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））、かつ免疫グロブリンのホメオスタシスを調節する新生児受容体ＦｃＲｎも含む。ＷＯ００／４２０７２（Ｐｒｅｓｔａ）は、ＦｃＲへの結合が改善または減少した抗体変異形について記載している。この特許刊行物の内容は、参照により本明細書に明確に組み込まれる。Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１−６６０４（２００１）も参照されたい。
【０３０９】
ＦｃＲｎへの結合の測定方法は既知である（例えば、Ｇｈｅｔｉｅ  １９９７，Ｈｉｎｔｏｎ  ２００４を参照のこと）。インビボでのヒトＦｃＲｎへの結合及びヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドの血清半減期は、例えば、ヒトＦｃＲｎを発現するトランスジェニックマウスもしくはトランスフェクトヒト細胞株、またはＦｃ変異形ポリペプチドを投与した霊長類においてアッセイすることができる。
【０３１０】
「補体依存性細胞毒性」または「ＣＤＣ」とは、補体の存在下での標的細胞の溶解を指す。古典的な補体経路の活性化は、補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）の、同族抗原に結合している（適切なサブクラスの）抗体への結合により開始される。補体活性化を評価するために、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３（１９９６）に記載のＣＤＣアッセイが行われ得る。
【０３１１】
改変されたＦｃ領域アミノ酸配列及び増加または減少したＣ１ｑ結合能力を有するポリペプチド変異形が、米国特許第６，１９４，５５１Ｂ１号及びＷＯ９９／５１６４２に記載されている。これらの特許刊行物の内容は、参照により本明細書に明確に組み込まれる。Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８−４１８４（２０００）も参照されたい。
【０３１２】
「Ｆｃ領域を含むポリペプチド」という用語は、Ｆｃ領域を含む抗体またはイムノアドヘシン等のポリペプチドを指す。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵ番号付けシステムに従って残基４４７）は、例えば、ポリペプチドの精製中に、またはポリペプチドをコードする核酸の組換え操作により除去され得る。したがって、本発明によるＦｃ領域を有するポリペプチドを含む組成物は、Ｋ４４７を有するポリペプチド、Ｋ４４７が全て除去されたポリペプチド、またはＫ４４７残基を有するポリペプチドとＫ４４７残基を有しないポリペプチドとの混合物を含み得る。
【０３１３】
本明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」とは、ヒト免疫グロブリンフレームワーク由来またはヒトコンセンサスフレームワーク由来のＶＬフレームワークまたはＶＨフレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワーク「由来」のアクセプターヒトフレームワークは、同じそのアミノ酸配列を含み得るか、または既存のアミノ酸配列変化を含み得る。好ましくは５つ以下、好ましくは４つ以下、または３つ以下の既存のアミノ酸変化が存在する場合、既存のアミノ酸変化が存在する。既存のアミノ酸変化がＶＨに存在する場合、好ましくはそれらの変化が位置７１Ｈ、７３Ｈ、及び７８Ｈのうちの３つ、２つ、または１つにのみ存在する場合、例えば、それらの位置のアミノ酸残基は、７１Ａ、７３Ｔ、及び／または７８Ａであり得る。一実施形態では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークの配列は、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列と同一である。
【０３１４】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」とは、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般に生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免役グロブリンＶＬまたはＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列の下位群から行われる。一般に、配列の下位群とは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌと同様の下位群である。一実施形態では、ＶＬの場合、下位群は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌと同様の下位群カッパＩである。一実施形態では、ＶＨの場合、下位群は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌと同様の下位群ＩＩＩである。
【０３１５】
「ＶＨ下位群ＩＩＩコンセンサスフレームワーク」は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌの可変重鎖下位群ＩＩＩ内のアミノ酸配列から得られるコンセンサス配列を含む。一実施形態では、ＶＨ下位群ＩＩＩコンセンサスフレームワークアミノ酸配列は、以下の配列：ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号９５）−Ｈ１−ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ（配列番号９６）−Ｈ２−ＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣ（配列番号９７）−Ｈ３−ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号９８）の一部またはすべてを含む。
【０３１６】
「ＶＬ下位群Ｉコンセンサスフレームワーク」は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌの可変軽鎖カッパ下位群Ｉ内のアミノ酸配列から得られるコンセンサス配列を含む。一実施形態では、ＶＨ下位群Ｉコンセンサスフレームワークアミノ酸配列は、以下の配列：ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号９９）−Ｌ１−ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１００）−Ｌ２−ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（配列番号１０１）−Ｌ３−ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１０２）の一部またはすべてを含む。
【０３１７】
本明細書で使用されるとき、「抗体変異体」または「抗体変異形」は、抗体のアミノ酸配列変異形を指し種依存性抗体のアミノ酸残基のうちの１つ以上が修飾されている。かかる変異体は、必然的に種依存性抗体と１００％未満の配列同一性または類似性を有する。一実施形態では、抗体変異体は、種依存性抗体の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインのいずれかのアミノ酸配列と少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性または類似性を有するアミノ酸配列を有する。この配列に関する同一性または類似性は、本明細書において、これらの配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入して、最大配列同一性パーセントを達成した後の、種依存性抗体残基と同一（すなわち、同じ残基）または同様（すなわち、共通の側鎖特性に基づいて同じ群のアミノ酸残基（以下を参照のこと））の候補配列中のアミノ酸残基の百分率と定義される。可変ドメインの外部の抗体配列内のＮ末端、Ｃ末端、または内部伸長、欠失、もしくは挿入のいずれも、配列同一性または類似性に影響を及ぼすものと解釈されるべきではない。
【０３１８】
「障害」または「疾患」とは、物質／分子での治療または本発明の方法から恩恵を受ける任意の状態である。これには、哺乳動物を問題の障害にかかりやすくする病理学的状態を含む慢性及び急性障害または疾患が挙げられる。本明細書における治療される障害の非限定的な例としては、悪性及び良性腫瘍、癌腫、芽細胞腫、ならびに肉腫が挙げられる。
【０３１９】
「治療有効量」という用語は、哺乳動物における疾患または障害を治療または予防するための治療薬の量を指す。癌の場合、治療有効量の治療薬は、癌細胞の数を低減し、原発腫瘍サイズを低減し、末梢臓器への癌細胞浸潤を阻害し（すなわち、ある程度減速し、好ましくは停止する）、腫瘍転移を阻害し（すなわち、ある程度減速し、好ましくは停止する）、腫瘍成長をある程度阻害し、及び／または障害に関連する症状のうちの１つ以上をある程度軽減することができる。薬物が既存の癌細胞の成長を予防し、かつ／またはそれらを死滅させることができる程度まで、この薬物は、細胞増殖抑制性及び／または細胞毒性であり得る。癌療法の場合、インビボでの有効性は、例えば、生存期間、疾患進行までの時間（ＴＴＰ）、応答速度（ＲＲ）、応答期間、及び／または生活の質を評価することによって測定することができる。
【０３２０】
「癌」及び「癌性」という用語は、制御されていない細胞成長を典型的に特徴とする哺乳動物における生理学的状態を指すか、またはそれを表す。この定義には、良性癌及び悪性癌が含まれる。「早期癌」または「早期腫瘍」とは、浸潤性でも転移性でもない癌を意味し、０期癌、Ｉ期癌、またはＩＩ期癌に分類される。癌の例としては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫（髄芽細胞腫及び網膜芽細胞腫等）、肉腫（脂肪肉腫及び滑膜細胞肉腫等）、神経内分泌腫瘍（カルチノイド腫瘍、ガストリノーマ、及び島細胞癌等）、中皮腫、神経鞘腫（聴神経腫等）、髄膜腫、腺癌、黒色腫、及び白血病またはリンパ性悪性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。かかる癌のより具体的な例としては、扁平上皮癌（例えば、上皮扁平上皮癌）、肺癌、例えば、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺腺肉腫、及び肺扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）または胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、例えば、消化管癌、膵臓癌、膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌（転移性乳癌等）、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌または腎癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌、肛門癌、陰茎癌、睾丸癌、食道癌、胆道腫瘍、ならびに頭頸部癌及び多発性骨髄腫が挙げられる。
【０３２１】
「前癌」という用語は、典型的に癌に先行するか、または癌に進展する状態または成長を指す。「前癌」成長は、異常な細胞周期調節、増殖、または分化を特徴とする細胞を有し、細胞周期調節、細胞増殖、または分化のマーカーによって決定することができる。
【０３２２】
「異形成症」とは、組織、臓器、または細胞の任意の異常な成長または発達である。好ましくは、異形成症は、高悪性度または前癌状態のものである。
【０３２３】
「転移」とは、その原発部位から体内の他の場所への癌の広がりを意味する。癌細胞は、原発腫瘍から離脱し、リンパ管及び血管に浸透し、血流を通じて循環し、体内の他の場所の正常組織内の遠位焦点で成長する（転移する）場合がある。転移は、局所的または遠位であり得る。転移は、腫瘍細胞が原発腫瘍から離脱し、血流を通じて移動し、遠位部位で停止することを条件とする逐次プロセスである。新たな部位で、細胞は、血液供給を確立し、成長して、生命を脅かす塊を形成し得る。
【０３２４】
腫瘍細胞内の刺激分子経路も阻害分子経路もいずれもこの挙動を調節し、遠位部位における腫瘍細胞と宿主細胞との間の相互作用も有意である。
【０３２５】
「非転移性」とは、良性であるか、または原発部位に留まる癌であり、リンパ系もしくは血管系または原発部位以外の組織に浸透していない癌を意味する。一般に、非転移性癌とは、０期癌、Ｉ期癌、またはＩＩ期癌であり、時折、ＩＩＩ期癌である任意の癌である。
【０３２６】
「原発腫瘍」または「原発癌」とは、元の癌であって、対象の体内の別の組織、臓器、または場所にある転移性病変ではない。
【０３２７】
「良性腫瘍」または「良性癌」とは、発生部位に局在した状態のままであり、遠位部位に浸潤するか、入り込むか、または転移する能力を有しない腫瘍を意味する。
【０３２８】
「腫瘍負荷量」とは、体内の癌細胞の数、腫瘍のサイズ、または癌の量を意味する。腫瘍負荷量は、腫瘍負荷とも称される。
【０３２９】
「腫瘍数」とは、腫瘍の数を意味する。
【０３３０】
「対象」とは、ヒトまたは非ヒト哺乳動物、例えば、ウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、もしくはネコを含むが、これらに限定されない哺乳動物を意味する。好ましくは、対象は、ヒトである。
【０３３１】
「抗癌療法」という用語は、癌の治療に有用な療法を指す。抗癌治療薬の例としては、例えば、化学療法剤、成長阻害剤、細胞毒性薬、放射線療法に使用される薬剤、抗血管新生剤、アポトーシス剤、抗チューブリン剤、及び癌を治療するための他の薬剤、抗ＣＤ２０抗体、血小板由来成長因子阻害剤（例えば、Ｇｌｅｅｖｅｃ（商標）（Ｉｍａｔｉｎｉｂ  Ｍｅｓｙｌａｔｅ））、ＣＯＸ−２阻害剤（例えば、セレコキシブ）、インターフェロン、サイトカイン、以下の標的ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＰＤＧＦＲ−ベータ、ＢｌｙＳ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ、またはＶＥＧＦ受容体（複数可）のうちの１つ以上に結合するアンタゴニスト（例えば、中和抗体）、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２、ならびに他の生物活性剤及び有機化学剤等が挙げられるが、これらに限定されない。これらの組み合わせも本発明に含まれる。
【０３３２】
化学療法剤とは、癌の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例としては、癌の治療に有用な化学的化合物が挙げられる。化学療法剤の例としては、アルキル化剤、例えば、チオテパ及びＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）シクロホスファミド、スルホン酸アルキル、例えば、ブスルファン、インプロスルファン、及びピポスルファン、アジリジン、例えば、ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、及びウレドーパ、エチレンイミン及びメチルアメラミン、例えば、アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホラミド、及びトリメチローロメラミン、アセトゲニン（具体的には、ブラタシン及びブラタシノン）、カンプトテシン（合成類似体トポテカン等）、ブリオスタチン、カリスタチン、ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン、及びバイゼレシン合成類似体等）、クリプトフィシン（具体的には、クリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）、ドラスタチン、デュオカルマイシン（合成類似体体ＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１等）、エリュテロビン、パンクラチスタチン、サルコジクチイン、スポンギスタチン、ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、及びウラシルマスタード、ニトロソウレア、例えば、カムルスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムスチン、抗生物質、例えば、エンジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、具体的には、カリケアマイシンガンマ１Ｉ及びカリケアマイシンオメガＩ１（例えば、Ａｇｎｅｗ，Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：１８３−１８６（１９９４））、ジネミシン、例えば、ジネミシンＡ、ビスホスフォネート、例えば、クロドロネート、エスペラミシン、ならびにネオカルチノスタチン発色団及び関連色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウトラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルチノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、及びデオキシドキソルビシン等）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えば、マイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン、代謝拮抗物質、例えば、メトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、葉酸類似体、例えば、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート、プリン類似体、例えば、フル���ラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン、ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン、抗副腎剤、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン、葉酸補充剤、例えば、フォリン酸、アセグラトン、アルドホスファミド配糖体、アミノレブリン酸、エニルウラシル、アムサクリン、ベストラブシル、ビサントレン、エダトラキサート、デフォファミン、デメコルチン、ジアジクオン、エフロールニチン、酢酸エリプチニウム、エポチロン、エトグルシド、硝酸ガリウム、ヒドロキシ尿素、レンチナン、ロニダミン、メイタンシノイド、例えば、メイタンシン及びアンサミトシン、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダモール、ニトラクリン、ペントスタチン、フェナメト、ピラルビシン、ロソキサントロン、ポドフィリン酸、２−エチルヒドラジド、プロカルバジン、ＰＳＫ（登録商標）多糖複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）、ラゾキサン、リゾキシン、シゾフィラン、スピロゲルマニウム、テヌアゾン酸、トリアジクオン、２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン、トリコテセン（具体的には、Ｔ−２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡ、及びアングイジン）、ウレタン、ビンデシン、ダカルバジン、マンノムスチン、ミトブロニトール、ミトラクトール、ピポブロマン、ガシトシン、アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）、シクロホスファミド、チオテパ、タキソイド、例えば、ＴＡＸＯＬ（登録商標）パクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）パクリタキセルのクレモフォールアルブミン操作されたナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ、Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）、及びＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）ドセタキセル（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ、Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）、クロランブシル、ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）ゲムシタビン、６−チオグアニン、メルカプトプリン、メトトレキサート、白金類似体、例えば、シスプラチン及びカルボプラチン、ビンブラスチン、白金、エトポシド（ＶＰ−１６）、イホスファミド、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標）ビノレルビン、ノバントロン、テニポシド、エダトレキサート、ダウノマイシン、アミノプテリン、ゼローダ、イバンドロネート、イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ、ＣＰＴ−１１）（イリノテカンの５−ＦＵ及びロイコボリンでの治療レジメン等）、トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ  ２０００、ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）、レチノイド、例えば、レチノイン酸、カペシタビン、コンブレタスタチン、ベルケイドボルテゾミブ、レブリミドレナリドミド、ロイコボリン（ＬＶ）、オキサリプラチン、例えば、オキサリプラチン治療レジメン（ＦＯＬＦＯＸ）、細胞増殖を低減するＰＫＣ−アルファ、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、ＥＧＦＲ（例えば、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（商標）））及びＶＥＧＦ−Ａ阻害剤、ならびに上述のうちのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が挙げられる。
【０３３３】
腫瘍におけるホルモン作用を調節または阻害する役割を果たす抗ホルモン剤、例えば、抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体調節薬（ＳＥＲＭ）、例えば、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）タモキシフェン等）、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン、及びＦＡＲＥＳＴＯＮトレミフェン等、副腎におけるエストロゲン産生を調節する、酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば、４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）酢酸メゲストロール、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）エキセメスタン、ホルメスタイン、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）ボロゾール、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）レトロゾール、及びＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）アナストロゾール等、ならびに抗アンドロゲン、例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン、ならびにトロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、具体的には、異常な細胞増殖に関与するシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えば、ＰＫＣ−アルファ、Ｒａｆ、及びＨ−Ｒａｓ等、リボザイム、例えば、ＶＥＧＦ発現阻害剤（例えば、ＡＮＧＩＯＺＹＭＥ（登録商標）リボザイム）及びＨＥＲ２発現阻害剤、ワクチン、例えば、遺伝子療法ワクチン、例えば、ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、及びＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチン、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）ｒＩＬ−２、ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤、ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ、ビノレルビン、及びエスペラミシン（米国特許第４，６７５，１８７号を参照のこと）、ならびに上述のうちのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体も、この定義に含まれる。
【０３３４】
本明細書で使用される「プロドラッグ」という用語は、親薬物と比較して腫瘍細胞への細胞毒性が低く、かつより活性な親形態に酵素的に活性化または変換されることができる薬学的に活性な物質の前駆体または誘導体形態を指す。例えば、Ｗｉｌｍａｎ，“Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ，１４，ｐｐ．３７５−３８２，６１５ｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｂｅｌｆａｓｔ（１９８６）、及びＳｔｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｒｏｄｒｕｇｓ：Ａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｂｏｒｃｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄ．），ｐｐ．２４７−２６７，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９８５）を参照されたい。本発明のプロドラッグとしては、より活性な細胞毒性遊離薬物に変換され得るリン酸塩含有プロドラッグ、チオリン酸塩含有プロドラッグ、硫酸塩含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β−ラクタム含有プロドラッグ、任意に置換されたフェノキシアセタミド含有プロドラッグまたは任意に置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、５−フルオロシトシン及び他の５−フルオロウリジンプロドラッグが挙げられるが、これらに限定されない。本発明で使用するためのプロドラッグ形態に誘導体化され得る細胞毒性薬物の例としては、上述の化学療法剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３３５】
「放射線療法」とは、十分な損傷を細胞に誘発して、細胞を正常に機能させるか、またはまとめて破壊する能力を制限するように指向されたガンマ線またはベータ線の使用を意味する。投薬量及び治療期間を決定するための当該技術分野で既知の多くの方法が存在することが理解されるであろう。典型的な治療は、１回投与として与えられ、典型的な投薬量は、１日当たり１０〜２００単位（Ｇｒａｙｓ）の範囲である。
【０３３６】
「生体試料」（同義に「試料」または「組織もしくは細胞試料」と呼ばれる）は、個体から得られる様々な種類の試料を包含し、診断アッセイまたは監視アッセイで使用され得る。この定義は、生物学的起源の血液及び他の液体試料、固形組織試料、例えば、生検標本またはそれ由来の組織培養物もしくは細胞、ならびにそれらの子孫を包含する。この定義は、試料を入手した後に任意の方法で、例えば、試薬での処理、可溶化、またはタンパク質もしくはポリヌクレオチド等のある特定の成分の濃縮により、または区分するために半固体もしくは固体マトリックスに包埋することにより操作された試料も含む。「生体試料」という用語は、臨床試料を包含し、培養細胞、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、生体液、及び組織試料も含む。生体試料源は、新鮮、凍結、及び／もしくは保存臓器または組織試料または生検または吸引物；血液もしくは任意の血液成分；体液、例えば、脳脊髄液、羊水、腹水、または間質液；個体の妊娠または発育の任意の時点の細胞由来の固形組織であり得る。いくつかの実施形態では、生体試料は、原発性腫瘍または転移性腫瘍から得られる。生体試料は、本来組織とは自然に混ざり合っていない化合物、例えば、防腐剤、抗凝固剤、緩衝液、固定剤、栄養素、抗生物質等を含有し得る。
【０３３７】
本明細書の目的のために、組織試料の「切片」とは、組織試料の単一部分または一片、例えば、組織試料から切り取られた組織または細胞の薄片を意味する。組織試料の複数の切片が採取され、本発明に従って分析に供され得ることが理解される。いくつかの実施形態では、組織試料の同じ切片が、形態学的レベル及び分子レベルの両方で分析されるか、またはタンパク質及び核酸の両方に関して分析される。
【０３３８】
「標識」という単語は、本明細書で使用されるとき、核酸プローブまたは抗体等の試薬に直接または間接的にコンジュゲートまたは融合され、かつそれがコンジュゲートまたは融合される試薬の検出を容易にする化合物または組成物を指す。標識は、それ自体が検出可能であり得る（例えば、放射性同位体標識もしくは蛍光標識）か、または酵素標識の場合、検出可能な基質化合物もしくは組成物の化学的改変を触媒し得る。
【０３３９】
抗ＦＧＦＲ２／３抗体組成物及び抗ＦＧＦＲ２／３抗体を使用する方法
本発明は、組成物、例えば、抗ＦＧＦＲ２／３抗体を含む薬学的組成物、及び抗ＦＧＦＲ２／３抗体をコードする配列を含むポリヌクレオチドを包含する。本明細書で使用されるとき、組成物は、ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３に結合する１つ以上の抗体、及び／またはＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３に結合する１つ以上の抗体をコードする配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドを含む。これらの組成物は、当該技術分野で周知の好適な担体、例えば、緩衝液等の薬学的に許容される賦形剤を更に含み得る。
【０３４０】
本発明は、単離された抗体及びポリヌクレオチド実施形態も包含する。本発明は、実質的に純粋な抗体及びポリヌクレオチド実施形態も包含する。
【０３４１】
本発明は、抗ＦＧＦＲ２／３抗体（本明細書に記載のものまたは当該技術分野で既知のもの）を使用して、障害、例えば、多発性骨髄腫または移行期癌（例えば、浸潤性移行期癌）の治療方法も包含する。
【０３４２】
抗ＦＧＦＲ２／３抗体組成物
本発明の抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。本明細書に提供される抗ＦＧＦＲ２／３抗体のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、及びＦ（ａｂ’）２断片も本発明の範囲内に包含される。これらの抗体断片は、酵素消化等の伝統的な手段によって作製され得るか、または組換え技法によって生成され得る。かかる抗体断片は、キメラ抗体断片またはヒト化抗体断片であり得る。これらの断片は、以下に記載の診断目的及び治療目的に有用である。
【０３４３】
モノクローナル抗体は、実質的に同種の抗体の集団から得られ、すなわち、その集団を含む個々の抗体は、少量で存在し得る可能な天然に存在する変異を除いて同一である。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、別個の抗体の混合物ではない抗体の特徴を示す。
【０３４４】
本発明の抗ＦＧＦＲ２／３モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）により初めて説明されたハイブリドーマ法を使用して作製され得るか、または組換えＤＮＡ方法（米国特許第４，８１６，５６７号）によって作製され得る。
【０３４５】
ハイブリドーマ法において、マウスまたは他の適切な宿主動物、例えば、ハムスターが免疫化されて、免疫化に使用されるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するか、または産生することができるリンパ球を誘発する。ＦＧＦＲ２／３に対する抗体は、ＦＧＦＲ２／３及びアジュバントの複数回皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射により動物において産生され得る。ＦＧＦＲ２／３は、当該技術分野で周知の方法を使用して調製され得、それらのうちのいくつかは、本明細書に更に記載される。例えば、ヒト及びマウスＦＧＦＲ２／３の組換え産生については、以下に記載されている。一実施形態では、動物は、免疫グロブリン重鎖のＦｃ部分に融合されたＦＧＦＲ２／３で免疫化される。好ましい一実施形態では、動物は、ＦＧＦＲ２／３−ＩｇＧ１融合タンパク質で免疫化される。動物は、通常、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）／ジコリノミコール酸トレハロース（ＴＤＭ）でＦＧＦＲ２／３の免疫原性コンジュゲートまたは誘導体に対して免疫化され（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）、その溶液は、複数の部位に皮内注射される。２週間後、動物は追加免疫される。７〜１４日後、動物が採血され、血清が抗ＦＧＦＲ２／３力価についてアッセイされる。力価が水平状態に達するまで動物は追加免疫される。
【０３４６】
あるいは、リンパ球がインビトロで免疫化され得る。その後、リンパ球は、ポリエチレングリコール等の好適な融合剤を使用して骨髄腫細胞に融合されて、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。
【０３４７】
そのように調製されたハイブリドーマ細胞は播種され、融合されていない親骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する１つ以上の物質を好ましくは含有する好適な培養培地で成長する。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマ用の培養培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン（ＨＡＴ培地）を含み、これらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を阻止する。
【０３４８】
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定した高レベルの産生を支持し、ＨＡＴ培地等の培地に感受性があるものである。これらのうち、好ましい骨髄腫細胞株は、マウス骨髄腫株、例えば、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＵＳＡから入手可能なＭＯＰＣ−２１及びＭＰＣ−１１マウス腫瘍、ならびにＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ  ＵＳＡから入手可能なＳＰ−２またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞由来のものである。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒト異種骨髄腫細胞株もヒトモノクローナル抗体の産生のために説明されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）、Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７））。
【０３４９】
ハイブリドーマ細胞が成長する培養培地は、ＦＧＦＲ２／３に対して指向されたモノクローナル抗体の産生についてアッセイされる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって、またはインビトロ結合アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって決定される。
【０３５０】
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Ｍｕｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）のスキャッチャード分析によって決定され得る。
【０３５１】
所望の特異性、親和性、及び／または活性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞が特定された後、クローンは、限界希釈手技及びによってサブクローニングされ、標準の方法によって成長し得る（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。この目的に好適な培養培地としては、例えば、Ｄ−ＭＥＭ培地またはＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。加えて、ハイブリドーマ細胞は、ある動物における腹水腫瘍としてインビボで成長し得る。
【０３５２】
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手技、例えば、タンパク質Ａ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、または親和性クロマトグラフィー等によって、培養培地、腹水、または血清から好適に分離される。
【０３５３】
本発明の抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、コンビナトリアルライブラリを使用して作製されて、所望の活性（複数可）を有する合成抗体クローンについてスクリーニングすることができる。原則として、合成抗体クローンは、ファージコートタンパク質に融合された抗体可変領域（Ｆｖ）の様々な断片を提示するファージを含有するファージライブラリをスクリーニングすることによって選択される。かかるファージライブラリは、所望の抗原に対する親和性クロマトグラフィーによってパニングされる。所望の抗原に結合することができるＦｖ断片を発現するクローンは、その抗原に吸着し、それ故にライブラリ中の非結合クローンから分離される。その後、結合クローンは、抗原から溶出され、更なる抗原吸着／溶出サイクルによって更に濃縮され得る。本発明の抗ＦＧＦＲ３抗体のうちのいずれかは、目的とするファージクローンを選択するための好適な抗原スクリーニング手技を設計し、その後、目的とするファージクローン由来のＦｖ配列、及びＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１−３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤ（１９９１），ｖｏｌｓ．１−３に記載の好適な定常領域（Ｆｃ）配列を使用して全長抗ＦＧＦＲ２／３抗体クローンを構築することによって得ることができる。
【０３５４】
抗体の抗原結合ドメインは、約１１０個のアミノ酸の２つの可変（Ｖ）領域から形成され、それらは各々、軽（ＶＬ）鎖及び重（ＶＨ）鎖由来であり、それらはいずれも３つの超可変ループまたは相補性決定領域（ＣＤＲ）に存在する。可変ドメインは、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３−４５５（１９９４）に記載されるように、ＶＨ及びＶＬが短い可動性ペプチドによって共有結合している一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、または各々定常ドメインに融合され、かつ非共有的に相互作用するＦａｂ断片のいずれかとしてファージ上で機能的に提示され得る。本明細書で使用されるとき、ファージクローンをコードするｓｃＦｖ及びファージクローンをコードするＦａｂは、集合的に「Ｆｖファージクローン」または「Ｆｖクローン」と称される。
【０３５５】
ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーは、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３−４５５（１９９４）に記載されるように、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別個にクローニングされ、ファージライブラリ中でランダムに組換えられ得、その後、これは、抗原結合クローンについて検索され得る。免疫化源由来のライブラリは、ハイブリドーマを構築する必要なく、免疫原に対する高親和性抗体を提供する。あるいは、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ，１２：７２５−７３４（１９９３）に記載されるように、ナイーブレパートリーがクローニングされて、いずれの免疫化もなしにヒト抗体の単一源を広範囲の非自己抗原のみならず自己抗原にも提供することができる。最後に、ナイーブライブラリは、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１−３８８（１９９２）に記載されるように、幹細胞由来の再配置されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、かつランダム配列を含むＰＣＲプライマーを使用して、高度に可変のＣＤＲ３領域をコードし、インビトロでの再配置を達成することによって合成的にも作製され得る。
【０３５６】
繊維状ファージは、マイナーコートタンパク質ｐＩＩＩへの融合による抗体断片を提示するために使用される。抗体断片は、例えば、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載されるように、ＶＨドメイン及びＶＬドメインが可動性ポリペプチドスペーサーによって同じポリペプチド鎖上で接続される一本鎖Ｆｖ断片として、または例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９：４１３３−４１３７（１９９１）に記載されるように、一方の鎖がｐＩＩＩに融合され、他方が、Ｆａｂコートタンパク質構造のアセンブリが野生型コートタンパク質のうちのいくつかを置換することによりファージ表面上に提示されるようになる細菌宿主細胞ペリプラズムに分泌されるＦａｂ断片として提示され得る。
【０３５７】
一般に、抗体遺伝子断片をコードする核酸は、ヒトまたは動物から収集される免疫細胞から得られる。抗ＦＧＦＲ２／３クローンに好意的なライブラリが所望される場合、個体は、ＦＧＦＲ２／３で免疫化されて、抗体応答を発生させ、脾臓細胞及び／または循環Ｂ細胞、他の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）がライブラリ構築のために回収される。好ましい一実施形態では、ＦＧＦＲ２／３に対するヒト抗体を産生するＢ細胞を生じさせるように、機能的ヒト免疫グロブリン遺伝子アレイを持つ（かつ機能的内因性抗体産生系を欠く）トランスジェニックマウスにおいて抗ＦＧＦＲ２／３抗体応答を発生させることによって、抗ＦＧＦＲ２／３クローンに好意的なヒト抗体遺伝子断片ライブラリが得られる。ヒト抗体産生トランスジェニックマウスの生成については、以下に記載されている。
【０３５８】
抗ＦＧＦＲ２／３反応性細胞集団の更なる濃縮は、ＦＧＦＲ２／３特異的膜結合抗体を発現するＢ細胞を単離するための好適なスクリーニング手技を使用することによって、例えば、ＦＧＦＲ２／３親和性クロマトグラフィー、または細胞の蛍光色素標識ＦＧＦＲ２／３への吸着、その後、フロー活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）で細胞を分離することによって得ることができる。
【０３５９】
あるいは、免疫化されていないドナー由来の脾臓細胞及び／またはＢ細胞または他のＰＢＬの使用により、可能な抗体レパートリーのより良好な表示が提供され、ＦＧＦＲ２／３が抗原性ではない任意の動物（ヒトまたは非ヒト）種を使用して抗体ライブラリを構築することも可能になる。インビトロ抗体遺伝子構築を組み込むライブラリの場合、幹細胞が個体から収集されて、再配置されていない抗体遺伝子セグメントをコードする核酸を提供する。目的とする免疫細胞は、様々な動物種、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、オオカミ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマ、及びトリ種等から得ることができる。
【０３６０】
抗体可変遺伝子セグメント（ＶＨ及びＶＬセグメントを含む）をコードする核酸は、目的とする細胞から回収され、増幅される。再配置されたＶＨ及びＶＬ遺伝子ライブラリの場合、所望のＤＮＡは、Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８６：３８３３−３８３７（１９８９）に記載されるように、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡをリンパ球から単離し、その後、再配置されたＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子の５’末端と３’末端が一致したプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって得ることができ、それにより発現のための多様なＶ遺伝子レパートリーを作製することができる。Ｖ遺伝子は、Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）及びＷａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４１：５４４−５４６（１９８９）に記載されるように、成熟Ｖ−ドメインをコードするエクソンの５’末端のバックプライマー及びＪ−セグメント内にあるフォワードプライマーを用いて、ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡから増幅され得る。しかしながら、ｃＤＮＡから増幅されるように、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，９：８８−８９（１９９１）に記載されるように、バックプライマーがリーダーエクソン内にあり、Ｓａｓｔｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８６：５７２８−５７３２（１９８９）に記載されるように、フォワードプライマーが定常領域内にある場合もある。相補性を最大化するために、Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）またはＳａｓｔｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）に記載されるように、縮重がプライマーに組み込まれ得る。好ましくは、ライブラリ多様性は、例えば、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）の方法に記載されるように、またはＯｒｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２１：４４９１−４４９８（１９９３）の方法に記載されるように、免疫細胞核酸試料中に存在する全ての利用可能なＶＨ配置及びＶＬ配置を増幅するために、各Ｖ遺伝子ファミリーを標的としたＰＣＲプライマーを使用することによって最大化される。増幅ＤＮＡを発現ベクターにクローニングするために、稀な制限部位が、Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）に記載されるように、一本の末端でタグとしてＰＣＲプライマーに導入され得るか、またはＣｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）に記載されるように、ダグ付けされたプライマーを用いた更なるＰＣＲ増幅によって導入され得る。
【０３６１】
合成的に再配置されたＶ遺伝子のレパートリーは、インビトロでＶ遺伝子セグメントから得ることができる。ヒトＶＨ−遺伝子セグメントの大半は、クローニング及び配列決定されており（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：７７６−７９８（１９９２）で報告されている）、マッピングされており（Ｍａｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，３：８８−９４（１９９３）で報告されている）、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１−３８８（１９９２）に記載されるように、これらのクローニングされたセグメント（Ｈ１ループ及びＨ２ループの全ての主要な立体構造を含む）を使用して、多様な配列及び長さのＨ３ループをコードするＰＣＲプライマーを用いて多様なＶＨ遺伝子レパートリーを生成することができる。ＶＨレパートリーは、Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４４５７−４４６１（１９９２）に記載されるように、単一長の長いＨ３ループに集中した全ての配列多様性で作製することもできる。ヒトＶκ及びＶλセグメントは、クローニング及び配列決定されており（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２３：１４５６−１４６１（１９９３）に報告されている）、それらを使用して、合成軽鎖レパートリーを作製することができる。合成Ｖ遺伝子レパートリーは、ＶＨ及びＶＬフォールドの範囲、ならびにＬ３及びＨ３の長さに基づいて、かなりの構造的多様性を有する抗体をコードする。ＤＮＡをコードするＶ遺伝子の増幅後、生殖系列Ｖ遺伝子セグメントは、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１−３８８（１９９２）の方法に従ってインビトロで再配置され得る。
【０３６２】
抗体断片のレパートリーは、いくつかの方法でＶＨ遺伝子レパートリーとＶＬ遺伝子レパートリーを一緒に組み合わせることによって構築され得る。各レパートリーは、異なるベクター内に作製され、これらのベクターは、例えば、Ｈｏｇｒｅｆｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１２８：１１９−１２６（１９９３）に記載されるようにインビトロで、またはＷａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２１：２２６５−２２６６（１９９３）に記載されるようにインビボでｌｏｘＰ系等のコンビナトリアル感染によって組換えられる。インビボ組換えアプローチは、Ｆａｂ断片の二本鎖性質を利用して、大腸菌形質転換効率によって課せられるライブラリサイズの制限を打開する。ナイーブＶＨ及びＶＬレパートリーは、別個に、一方がファージミドに、他方がファージベクターにクローニングされる。その後、これらの２つのライブラリは、ファージミド含有細菌のファージ感染によって組み合わせられて、各細胞が異なる組み合わせを含み、ライブラリサイズが存在する細胞の数（約１０１２個のクローン）によってのみ制限されるようになる。両ベクターは、インビボ組換えシグナルを含み、ＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子が単一レプリコンに組換えられ、ファージビリオンに共パッケージングされるようになる。これらの巨大なライブラリにより、良好な親和性（約１０−８ＭのＫｄ−１）を有する多数の多様な抗体が提供される。
【０３６３】
あるいは、これらのレパートリーは、例えば、Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：７９７８−７９８２（１９９１）に記載されるように、同じベクターに逐次クローニングされ得るか、または例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）に記載されるように、ＰＣＲによって一緒にアセンブルされ、その後、クローニングされる。ＰＣＲアセンブリを使用して、ＶＨ及びＶＬ  ＤＮＡを、可動性ペプチドスペーサーをコードするＤＮＡと連結させて、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）レパートリーを形成することもできる。なお別の技法では、「細胞内ＰＣＲアセンブリ」は、Ｅｍｂｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０：３８３１−３８３７（１９９２）に記載されるように、ＰＣＲによりリンパ球内のＶＨ遺伝子とＶＬ遺伝子を組み合わせ、その後、連結された遺伝子のレパートリーをクローニングするために使用される。
【０３６４】
ナイーブライブラリ（天然または合成のいずれか）によって産生された抗体は、中程度の親和性（約１０６〜１０７Ｍ−１のＫｄ−１）を有し得るが、親和性成熟は、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）（上記参照）に記載されるように、二次ライブラリを構築し、かつそれから再選択することによってインビトロで模倣することができる。例えば、変異は、Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２６：８８９−８９６（１９９２）の方法において、またはＧｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８９：３５７６−３５８０（１９９２）の方法において、変異性ポリメラーゼを使用してインビトロでランダムに導入され得る（Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，１：１２３０−２３２  ａｎｄ  ２３６−２４７（１９８９）に報告されている）。更に、親和性成熟は、例えば、目的とするＣＤＲに及ぶランダム配列を持つプライマーを用いたＰＣＲを使用して、選択された個別のＦｖクローンにおいて１つ以上のＣＤＲをランダムに変異させ、かつより高い親和性クローンについてスクリーニングすることによって行われ得る。ＷＯ９６／０７７５４（１９９６年３月１４日公開）は、免疫グロブリン軽鎖の相補性決定領域における変異誘発を誘導して、軽鎖遺伝子のライブラリを作製するための方法について記載している。別の有効なアプローチは、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０：７７９−７８３（１９９２）に記載されるように、免疫化されていないドナーから得られた天然に存在するＶドメイン変異形のレパートリーでファージディスプレイによって選択されたＶＨドメインまたはＶＬドメインを組換え、かつ数回の鎖リシャッフリングにおいてより高い親和性についてスクリーニングすることである。この技法により、１０−９Ｍ範囲の親和性を有する抗体及び抗体断片の産生が可能になる。
【０３６５】
ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３核酸配列ならびにアミノ酸配列は、当該技術分野で既知である。ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３をコードする核酸配列は、ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３の所望の領域のアミノ酸配列を使用して設計され得る。例えば、ＦＧＦＲ３は、Ｒ３Ｍａｂのアミノ酸配列を使用して設計され得る。当該技術分野で周知のように、ＦＧＦＲ３の２つの主要なスプライスアイソフォームには、ＦＧＦＲ３  ＩＩＩｂ及びＦＧＦＲ３  ＩＩＩｃがある。ＦＧＦＲ３配列は、当該技術分野で周知であり、ＵｎｉＰｒｏＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ２２６０７（ＦＧＦＲ３  ＩＩＩｃ）またはＰ２２６０７＿２（ＦＧＦＲ３  ＩＩＩｂ）の配列を含み得る。ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３変異が特定されており、当該技術分野で周知であり、以下の変異を含む（ＵｎｉＰｒｏＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ２２６０７（ＦＧＦＲ３  ＩＩＩｃ）またはＰ２２６０７＿２（ＦＧＦＲ３  ＩＩＩｂ）に示される配列を参照）：
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【０３６６】
ＦＧＦＲ２及び／またはＦＧＦＲ３をコードする核酸は、当該技術分野で既知の様々な方法によって調製され得る。これらの方法としては、Ｅｎｇｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｇｎｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，２８：７１６−７３４（１９８９）に記載の方法のうちのいずれか、例えば、トリエステル、亜リン酸塩、ホスホラミダイト、及びＨ−ホスホン酸塩方法による化学合成が挙げられるが、これに限定されない。一実施形態では、発現宿主細胞によって好まれるコドンは、ＦＧＦＲ２及び／またはＦＧＦＲ３をコードするＤＮＡの設計に使用される。あるいは、ＦＧＦＲ２及び／またはＦＧＦＲ３をコードするＤＮＡは、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリから単離され得る。
【０３６７】
ＦＧＦＲ２及び／またはＦＧＦＲ３をコードするＤＮＡ分子の構築後、ＤＮＡ分子は、プラスミド等の発現ベクター中の発現制御配列に作動可能に連結され、この制御配列は、ベクターで形質転換された宿主細胞によって認識される。一般に、プラスミドベクターは、宿主細胞と適合する種由来の複製配列及び制御配列を含む。このベクターは、通常、複製部位、ならびに形質転換細胞において表現型選択を提供ことができるタンパク質をコードする配列を持つ。原核及び真核宿主細胞での発現に好適なベクターが当該技術分野で既知であり、それらのうちのいくつかが本明細書に更に記載されている。酵母等の真核生物または哺乳動物等の多細胞生物由来の細胞が使用され得る。
【０３６８】
任意に、ＦＧＦＲ２及び／またはＦＧＦＲ３をコードするＤＮＡは、分泌リーダー配列に作動可能に連結されて、発現産物の宿主細胞による培養培地への分泌をもたらす。分泌リーダー配列の例としては、ｓｔＩＩ、エコチン、ｌａｍＢ、ヘルペスＧＤ、ｌｐｐ、アルカリホスファターゼ、インベルターゼ、及びアルファ因子が挙げられる。タンパク質Ａの３６アミノ酸リーダー配列も本明細書での使用に好適である（Ａｂｒａｈｍｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，４：３９０１（１９８５））。
【０３６９】
宿主細胞は、上述の本発明の発現ベクターまたはクローニングベクターでトランスフェクトされ、好ましくは形質転換され、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適切なものになるように改質された従来の栄養素培地中で培養される。
【０３７０】
トランスフェクションとは、任意のコード配列が実際に発現されるか否かにかかわらず、宿主細胞による発現ベクターの取り込みを指す。多数のトランスフェクション方法、例えば、ＣａＰＯ４沈降及び電気穿孔が当業者に既知である。このベクターの作動のいずれかの兆候が宿主細胞内で生じるときに、トランスフェクションの成功が一般に認識される。トランスフェクション方法が当該技術分野で周知であり、それらのうちのいくつかが本明細書に更に記載されている。
【０３７１】
形質転換とは、ＤＮＡの生物への導入を意味し、これにより、そのＤＮＡが、染色体外要素として、または染色体組み込み体によってのいずれかで複製可能になる。使用される宿主細胞に応じて、形質転換は、かかる細胞に適切な標準の技法を使用して行われる。形質転換法が当該技術分野で周知であり、それらのうちのいくつかが本明細書に更に記載されている。
【０３７２】
ＦＧＦＲ２及び／またはＦＧＦＲ３を産生するために使用される原核宿主細胞は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（上記参照）に概して記載されるように培養され得る。
【０３７３】
ＦＧＦＲ２及び／またはＦＧＦＲ３を産生するために使用される哺乳類宿主細胞は、当該技術分野で周知であり、かつそれらのうちのいくつかが本明細書に記載されている様々な培地中で培養され得る。
【０３７４】
本開示で言及される宿主細胞は、インビトロ培養細胞、ならびに宿主動物に存在する細胞を包含する。
【０３７５】
ＦＧＦＲ２及び／またはＦＧＦＲ３の精製は、当該技術分野で認識されている方法を使用して達成され得、それらのうちのいくつかは、本明細書に記載されている。
【０３７６】
精製されたＦＧＦＲ２及び／またはＦＧＦＲ３は、ファージディスプレイクローンの親和性クロマトグラフ分離で使用するために、好適なマトリックス、例えば、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、ガラスビーズ、セルロース、様々なアクリルコポリマー、ヒドロキシルメタクリレートゲル、ポリアクリル酸及びポリメタクリル酸コポリマー、ナイロン、中性及びイオン性担体等に結合し得る。ＦＧＦＲ２及び／またはＦＧＦＲ３タンパク質のマトリックスへの結合は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．４４（１９７６）に記載される方法によって達成され得る。一般に用いられるタンパク質リガンドを多糖マトリックス、例えば、アガロース、デキストラン、またはセルロースに結合させるための技法は、ハロゲン化シアンでの担体の活性化、及びペプチドリガンドの一級脂肪族または芳香族アミンの活性化されたマトリックスへのその後のカップリングを伴う。
【０３７７】
あるいは、ＦＧＦＲ２及び／またはＦＧＦＲ３を使用して、吸着プレートのウェルをコーティングすることができ、吸着プレートに付着された宿主細胞で発現されるか、または細胞選別に使用されるか、またはストレプトアビジンコーティングビーズで捕捉するためにビオチンにコンジュゲートされるか、またはファージディスプレイライブラリをパニングするための任意の他の当該技術分野で既知の方法で使用される。
【０３７８】
ファージライブラリ試料は、ファージ粒子の少なくとも一部の吸着剤との結合に好適な条件下で固定化ＦＧＦＲ２及び／またはＦＧＦＲ３と接触させられる。通常、ｐＨ、イオン強度、温度等を含む条件は、生理学的条件を模倣するように選択される。固相に結合しているファージは、洗浄され、その後、例えば、Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８８：７９７８−７９８２（１９９１）に記載されるように酸によって、または例えば、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載されるようにアルカリによって、または例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）の抗原競合法と同様の手技におけるＦＧＦＲ３抗原競合によって溶出される。ファージは、単一の選択ラウンドで２０〜１，０００倍濃縮され得る。更に、濃縮されたファージは、細菌培養物中で成長することができ、更なる選択ラウンドに供され得る。
【０３７９】
選択の効率は、洗浄中の解離速度、及び単一ファージ上の複数の抗体断片が抗原と同時に会合することができるか等の多くの要因に依存する。高速解離速度（及び弱い結合親和性）を有する抗体は、短時間洗浄、多価ファージディスプレイ、及び固相中の抗原の高コーティング密度の使用によって保持され得る。高密度は、多価相互作用によりファージを安定化するのみならず、解離したファージの再結合も好む。低速解離速度（及び良好な結合親和性）を有する抗体の選択は、Ｂａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，８：３０９−３１４（１９９０）及びＷＯ９２／０９６９０に記載されるように、長時間洗浄及び一価ファージディスプレイの使用によって、かつＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０：７７９−７８３（１９９２）に記載されるように、抗原の低コーティング密度の使用によって促進され得る。
【０３８０】
ＦＧＦＲ２及び／またはＦＧＦＲ３について親和性がわずかに異なる場合でさえも異なる親和性のファージ抗体を選択することが可能である。しかしながら、（例えば、上述の親和性成熟技法のうちのいくつかで行われる）選択された抗体のランダム変異により、多くの変異体が生じる可能性があり、それらの大半が抗原に結合し、より高い親和性を有するものはわずかしかない。ＦＧＦＲ２及び／またはＦＧＦＲ３を限定することにより、稀な高親和性のファージが競合して除かれ得る。全てのより高い親和性の変異体を保持するために、ファージが過剰なビオチン化ＦＧＦＲ２及び／またはＦＧＦＲ３であるが、ＦＧＦＲ２及び／またはＦＧＦＲ３に対する標的モル親和定数よりも低いモル濃度のビオチン化ＦＧＦＲ２及び／またはＦＧＦＲ３とインキュベートされ得る。その後、高親和性結合ファージがストレプトアビジンコーティング常磁性ビーズによって捕捉され得る。かかる「平衡捕捉」により、わずか２倍高い親和性しか有しない変異体クローンのより低い親和性を有するかなりの過剰なファージからの単離を許容する感受性で、抗体がそれらの結合親和性に従って選択されることが可能になる。固相に結合しているファージの洗浄に使用される条件は、解離速度に基づいて区別するように操作される場合もある。
【０３８１】
ＦＧＦＲ２／３クローンは、活性に基づいて選択され得る。一実施形態では、本発明は、ＦＧＦＲ３受容体及びそのリガンド（ＦＧＦ１及び／またはＦＧＦ９等）とＦＧＦＲ２及びそのリガンドとの間の結合を遮断するＦＧＦＲ２／３抗体を提供する。かかるＦＧＦＲ２／３抗体に対応するＦｖクローンは、（１）上述のようにＦＧＦＲ２／３クローンをファージライブラリから単離し、任意に、単離されたファージクローンの集団を好適な細菌宿主中で成長させることによって増幅することと、（２）それぞれ、遮断活性及び非遮断活性が所望されるＦＧＦＲ２／３及び第２のタンパク質を選択することと、（３）抗ＦＧＦＲ２／３ファージクローンを固定化ＦＧＦＲ２／３に吸着させることと、（４）過剰な第２のタンパク質を使用して、重複するか、または第２のタンパク質の結合決定基と共有されるＦＧＦＲ２／３結合決定基を認識する任意の望ましくないクローンを溶出することと、（５）ステップ（４）後に吸着した状態のままのクローンを溶出することとによって選択され得る。任意に、本明細書に記載の選択手技を１回以上繰り返すことによって、所望の遮断特性／非遮断特性を有するクローンが更に濃縮され得る。
【０３８２】
本発明のハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体またはファージディスプレイＦｖクローンをコードするＤＮＡは、従来の手技を使用して（例えば、ハイブリドーマまたはファージＤＮＡ鋳型由来の目的とする重鎖及び軽鎖コード領域を特異的に増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用して）容易に単離及び配列決定される。単離されると、ＤＮＡが発現ベクター中に置かれ、その後、それが、宿主細胞、例えば、別様には免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞にトランスフェクトされ、組換え宿主細胞における所望のモノクローナル抗体の合成を得ることができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌における組換え発現に関する総説としては、Ｓｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５：２５６（１９９３）及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ，１３０：１５１（１９９２）が挙げられる。
【０３８３】
本発明のＦｖクローンをコードするＤＮＡは、重鎖及び／または軽鎖定常領域をコードする既知のＤＮＡ配列と組み合わせられて（例えば、適切なＤＮＡ配列は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（上記参照）から得ることができる）、全長または部分長の重鎖及び／または軽鎖をコードするクローンを形成することができる。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ定常領域等の任意のアイソタイプの定常領域をこの目的のために使用することができ、かかる定常領域を任意のヒトまたは動物種から得ることができることが理解される。ある動物（ヒト等）種の可変ドメインＤＮＡから得られ、その後、別の動物種の定常領域ＤＮＡに融合されて、「ハイブリッド」全長重鎖及び／または軽鎖のコード配列（複数可）を形成するＦｖクローンは、本明細書で使用される「キメラ」及び「ハイブリッド」抗体の定義に含まれる。好ましい一実施形態では、ヒト可変ＤＮＡ由来のＦｖクローンは、ヒト定常領域ＤＮＡに融合されて、全てのヒト全長または部分長重鎖及び／または軽鎖のコード配列（複数可）を形成する。
【０３８４】
本発明のハイブリドーマ由来の抗ＦＧＦＲ２／３抗体をコードするＤＮＡは、例えば、ハイブリドーマクローン由来の相同マウス配列の代わりにヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を用いることによって（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４）の方法と同様に）修飾される場合もある。ハイブリドーマまたはＦｖクローン由来の抗体もしくは断片をコードするＤＮＡは、非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全てまたは一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合することによって更に修飾され得る。この様式で、本発明のＦｖクローンまたはハイブリドーマクローン由来の抗体の結合特異性を有する「キメラ」または「ハイブリッド」抗体が調製される。
【０３８５】
二重特異性抗体
一態様では、本発明は、一部には、ＫＬＢ及びＦＧＦＲ２／３の両方に結合する二重特異性抗体（「ＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体」）の発見に基づく。ある特定の態様では、ＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体は、代謝性疾患及び障害の治療に使用することができ、かかる治療は、肝臓に大きな影響を及ぼすことなく、かつ骨量を著しく失うことなく、体重減少及び／またはグルコース及び脂質代謝の改善をもたらす。ある特定の態様では、ＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体は、ＮＡＳＨの治療に使用することができる。
【０３８６】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体は、本明細書に開示される抗ＦＧＦＲ２／３抗体のうちのいずれかの第１のアームと、本明細書に開示される任意の抗ＫＬＢ抗体または全体が本明細書に組み込まれるＵＳ２０１５０２１８２７６に開示の任意の抗ＫＬＢ抗体の第２のアームとを含む。
【０３８７】
ある特定の実施形態では、本開示のＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体は、肝臓、例えば、肝臓機能に大きな影響を及ぼさない。ある特定の実施形態では、本開示のＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体は、ＦＧＦ２１タンパク質による肝臓におけるＦＧＦＲ／ＫＬＢ受容体複合体の調節と比較して肝臓におけるＦＧＦＲ／ＫＬＢ受容体複合体の活性を調節しない。ある特定の実施形態では、本開示のＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体は、ＦＧＦＲ４／ＫＬＢ複合体の阻害をもたらさず、及び／またはＡＬＴ、ＡＳＴ、ＡＬＰ、及びＧＬＤＨ等であるが、これらに限定されない肝臓酵素の上昇をもたらさない。ある特定の実施形態では、本開示のＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体は、肝臓におけるＦＧＦＲ２ｃ／ＫＬＢ複合体及び／またはＦＧＦＲ３ｃ／ＫＬＢ複合体のアゴニストとして機能せず、これは、肝臓における活性化ＭＡＰＫシグナル伝達ならびに／またはＳｐｒｙ４及びＤｕｓｐ６の発現の変化につながり得る。ある特定の実施形態では、本開示のＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体は、ＦＧＦ２１タンパク質によるＭＡＰＫシグナル伝達の活性化と比較して、肝臓におけるＭＡＰＫシグナル伝達の活性化をもたらさない。ある特定の実施形態では、本開示のＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体は、肝臓におけるＦＧＦＲ４／ＫＬＢ複合体のアゴニストとして機能しない。
【０３８８】
ある特定の実施形態では、本開示のＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体は、ヒト化され得る。ある特定の実施形態では、本開示のＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。
【０３８９】
ある特定の実施形態では、本開示のＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体は、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体等のモノクローナル抗体であり得る。ある特定の実施形態では、本開示のＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体は、抗体断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、またはＦ（ａｂ’）２断片であり得る。ある特定の実施形態では、ＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体は、全長抗体、例えば、インタクトなＩｇＧ１抗体、または本明細書に定義される他の抗体クラスもしくはアイソタイプである。ある特定の実施形態では、本開示のＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体は、以下に詳述される特徴のうちのいずれかを単独でまたは組み合わせで組み込み得る。
【０３９０】
本開示のＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体は、例えば、代謝性障害の診断または治療に有用である。代謝性障害の非限定的な例としては、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）、メタボリック症候群（ＭｅｔＳ）、肥満、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、脂質異常症、高血圧症、２型糖尿病、非２型糖尿病、１型糖尿病、潜在性自己免疫性糖尿病（ＬＡＤ）、若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）、ならびに加齢及び関連疾患、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、及びＡＬＳが挙げられる。好ましい態様では、代謝性疾患は、ＮＡＳＨである。
【０３９１】
ある特定の実施形態では、本開示のＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体は、例えば、代謝性障害の診断または治療に使用され得る。代謝性障害の非限定的な例としては、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）、メタボリック症候群（ＭｅｔＳ）、肥満、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、脂質異常症、高血圧症、２型糖尿病、非２型糖尿病、１型糖尿病、潜在性自己免疫性糖尿病（ＬＡＤ）、若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）、ならびに加齢及び関連疾患、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、及びＡＬＳが挙げられる。好ましい態様では、代謝性疾患は、ＮＡＳＨである。
【０３９２】
例示の抗ＫＬＢ抗体
一態様では、本開示は、ＫＬＢタンパク質に結合する単離された抗体を提供する。ある特定の実施形態では、本開示の抗ＫＬＢ抗体は、ＫＬＢのＣ末端ドメインに結合する。ある特定の実施形態では、本開示の抗ＫＬＢ抗体は、アミノ酸配列ＳＳＰＴＲＬＡＶＩＰＷＧＶＲＫＬＬＲＷＶＲＲＮＹＧＤＭＤＩＹＩＴＡＳ（配列番号１０３）を含むＫＬＢの断片に結合する。ある特定の実施形態では、本抗体は、本明細書に記載の抗ＫＬＢ抗体、例えば、８Ｃ５と同じエピトープに結合する。
【０３９３】
ある特定の実施形態では、本開示の抗ＫＬＢ抗体は、（ａ）配列番号２３０〜２３２及び２３６〜２４７のうちのいずれか１つ、例えば、２４４または２４７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１４２及び２４８〜２６２のうちのいずれか１つ、例えば、２５９または２６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号２６３〜２７８のうちのいずれか１つ、例えば、１６６または１６９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号２７９〜２９３のうちのいずれか１つ、例えば、１７１または１８４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号２９４〜３０９のうちのいずれか１つ、例えば、１９７または２００のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、ならびに（ｆ）配列番号３１０〜３２４のうちのいずれか１つ、例えば、２１２または２１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＨＶＲを含む。
【０３９４】
ある特定の実施形態では、本開示は、（ａ）配列番号１１９を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１５０を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号１６６を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号１７１を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号１９７を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号２１２を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＨＶＲを含む抗ＫＬＢ抗体を提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、（ａ）配列番号１２２を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１５３を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号１６９を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号１８４を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号２００を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号２１５を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＨＶＲを含む抗ＫＬＢ抗体を提供する。
【０３９５】
本開示は、配列番号１０４のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む抗ＫＬＢ抗体を更に提供する。  ある特定の実施形態では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列に対して置換（例えば、以下に開示される保存的置換）、挿入、または欠失を含むが、その配列を含む抗ＫＬＢ抗体は、ＫＬＢに結合する能力を保持する。ある特定の実施形態では、配列番号１０４において、合計１〜１０個のアミノ酸が置換、挿入、及び／または欠失されている。  ある特定の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、ＨＶＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。あるいはまたは更に、抗ＫＬＢ抗体は、配列番号１０４にＶＨ配列（以下に開示されるその配列の翻訳後修飾を含む）を含む。ある特定の実施形態では、ＶＨは、（ａ）配列番号１２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１６９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される１つ、２つ、または３つのＨＶＲを含む。  
【０３９６】
別の態様では、本開示は、配列番号１０５のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗ＫＬＢ抗体を提供する。  ある特定の実施形態では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列に対して置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含むが、その配列を含む抗ＫＬＢ抗体は、ＫＬＢに結合する能力を保持する。ある特定の実施形態では、配列番号１０５において、合計１〜１０個のアミノ酸が置換、挿入、及び／または欠失されている。  ある特定の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、ＨＶＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。あるいはまたは更に、抗ＫＬＢ抗体は、配列番号１０５にＶＬ配列（その配列の翻訳後修飾を含む）を含む。ある特定の実施形態では、ＶＬは、（ａ）配列番号１８４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号２００のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号２１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される１つ、２つ、または３つのＨＶＲを含む。  
【０３９７】
本開示は、上述の実施形態のうちのいずれかにあるようなＶＨ、及び上述の実施形態のうちのいずれかにあるようなＶＬを含む抗ＫＬＢ抗体を更に提供する。ある特定の実施形態では、本抗体は、それぞれ、配列番号１０４及び配列番号１０５にＶＨ及びＶＬ配列（それらの配列の翻訳後修飾を含む）を含む。
【０３９８】
ある特定の実施形態では、抗ＫＬＢ抗体は、アミノ酸配列ＳＳＰＴＲＬＡＶＩＰＷＧＶＲＫＬＬＲＷＶＲＲＮＹＧＤＭＤＩＹＩＴＡＳ（配列番号１０３）からなるＫＬＢの断片に結合する。  
【０３９９】
二重特異性抗ＦＧＦＲ２／３抗体
本開示は、ＫＬＢ及びＦＧＦＲ２／３の両方に結合する二重特異性抗体（すなわち、ＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体）を更に提供する。二重特異性抗体は、２つの異なる結合特異性を有し、例えば、米国特許第５，９２２，８４５号及び同第５，８３７，２４３号、Ｚｅｉｌｄｅｒ（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：１２４６−１２５２、Ｓｏｍａｓｕｎｄａｒａｍ（１９９９）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ９：４７−５４、Ｋｅｌｅｒ（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４００８−４０１４を参照されたい。例であって、限定するものではなく、本開示の主題は、ＫＬＢに存在する第１のエピトープに対する１つの結合部位（例えば、抗原結合部位）と、ＦＧＦＲ２／３に存在する第２のエピトープに対する第２の結合部位を有する二重特異性抗体を提供する。例であって、限定するものではなく、本開示は、１つのアームがＫＬＢに結合し、本明細書に記載の抗ＫＬＢ抗体配列のうちのいずれかを含み、第２のアームがＦＧＦＲ２／３に結合し、本明細書に記載の抗ＦＧＦＲ２／３抗体配列のうちのいずれかを含む抗体を提供する。ある特定の実施形態では、本開示のＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体は、ＫＬＢに存在する第１のエピトープに対する１つの結合部位と、ＦＧＦＲ２／３に存在する第２のエピトープに対する第２の結合部位とを有する。
【０４００】
ある特定の実施形態では、ＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体またはその抗原結合部分は、重鎖領域及び軽鎖領域を含む。ある特定の実施形態では、全長重鎖は、配列番号１０６に記載の配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を有するアミノ酸を含む。  ある特定の実施形態では、全長軽鎖は、配列番号１０７に記載の配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を有するアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、全長重鎖は、配列番号１０６に記載の配列を有するアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、全長軽鎖は、配列番号１０７に記載の配列を有するアミノ酸を含む。
【０４０１】
ある特定の実施形態では、ＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体またはその抗原結合部分は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。ある特定の実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１０４に記載の配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を有するアミノ酸を含む。  ある特定の実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号１０５に記載の配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を有するアミノ酸を含む。  ある特定の実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１０４に記載の配列を有するアミノ酸を含む。  ある特定の実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号１０５に記載の配列を有するアミノ酸を含む。  
【０４０２】
ある特定の実施形態では、ＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体は、（ａ）配列番号２３０〜２３２及び２３６〜２４７のうちのいずれか１つ、例えば、２４４または２４７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１４２及び２４８〜２６２のうちのいずれか１つ、例えば、２５９または２６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号２６３〜２７８のうちのいずれか１つ、例えば、２７５または２７８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号２７９〜２９３のうちのいずれか１つ、例えば、２８０または２９３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号２９４〜３０９のうちのいずれか１つ、例えば、３０６または３０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、ならびに（ｆ）配列番号３１０〜３２４のうちのいずれか１つ、例えば、３２１または３２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＨＶＲを含む。
【０４０３】
ある特定の実施形態では、ＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体は、（ａ）配列番号１１９を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１５０を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号１６６を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号１７１を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号１９７を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号２１２を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＨＶＲを含む抗ＫＬＢ抗体を提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、（ａ）配列番号１２２を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１５３を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）配列番号１６９を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）配列番号１８４を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）配列番号２００を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）配列番号２１５を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＨＶＲを含む抗ＫＬＢ抗体を提供する。
【０４０４】
ある特定の実施形態では、ＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域と、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域とを含む。ある特定の実施形態では、重鎖可変領域ＣＤＲ１ドメインは、配列番号２３０〜２３２及び２３６〜２４７に記載の配列を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、重鎖可変領域ＣＤＲ２ドメインは、配列番号１４２及び２４８〜２６２に記載の配列  アミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、重鎖可変領域ＣＤＲ３ドメインは、配列番号２６３〜２７８と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を有するアミノ酸配列を含む。  ある特定の実施形態では、軽鎖可変領域ＣＤＲ１ドメインは、配列番号２７９〜２９３と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を有するアミノ酸配列を含む。  ある特定の実施形態では、軽鎖可変領域ＣＤＲ２ドメインは、配列番号２９４〜３０９と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、軽鎖可変領域ＣＤＲ３ドメインは、配列番号３１０〜３２４と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を有するアミノ酸配列を含む。  
【０４０５】
ある特定の実施形態では、ＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域と、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域とを含む。ある特定の実施形態では、重鎖可変領域ＣＤＲ１ドメインは、配列番号２３０〜２３２及び２３６〜２４７に記載の配列を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、重鎖可変領域ＣＤＲ２ドメインは、配列番号１０３及び２４８〜２６２に記載の配列を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、重鎖可変領域ＣＤＲ３ドメインは、配列番号２６３〜２７８に記載の配列を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、軽鎖可変領域ＣＤＲ１ドメインは、配列番号２７９〜２９３に記載の配列を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、軽鎖可変領域ＣＤＲ２ドメインは、配列番号２９４〜３０９に記載の配列を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、軽鎖可変領域ＣＤＲ３ドメインは、配列番号３１０〜３２４に記載の配列を有するアミノ酸配列を含む。
【０４０６】
ある特定の実施形態では、ＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体は、配列番号１２２に記載の配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号１５３に記載の配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号１６９に記載の配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号１８４に記載の配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２００に記載の配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ２、及び配列番号２１５に記載の配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。  
【０４０７】
ある特定の実施形態では、ＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体は、第１の抗体またはその抗原結合部分を含み、第２の抗体またはその抗原結合部分を含み、第１の抗体またはその抗原結合部分は、ＫＬＢに存在するエピトープに結合し、第２の抗体またはその抗原結合部分は、ＦＧＦＲ２／３に存在するエピトープに結合する。例であって、限定するものではなく、第１の抗体またはその抗原結合部分は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み得、第２の抗体またはその抗原結合部分は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み得る。ある特定の実施形態では、第１の抗体またはその抗原結合部分の重鎖可変領域は、配列番号１０４に記載の配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を有するアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、第１の抗体またはその抗原結合部分の軽鎖可変領域は、配列番号１０５に記載の配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を有するアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、第２の抗体（抗ＦＧＦＲ２／３抗体）またはその抗原結合部分の重鎖は、配列番号２８２に記載の配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を有するアミノ酸を含む。  ある特定の実施形態では、第２の抗体（抗ＦＧＦＲ２／３抗体）またはその抗原結合部分の軽鎖は、配列番号２８３に記載の配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を有するアミノ酸を含む。  
【０４０８】
ある特定の実施形態では、抗ＫＬＢ抗体と同じエピトープに結合するＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体が本明細書に提供される。例えば、ある特定の実施形態では、配列番号１０４のＶＨ配列及び配列番号１０５のＶＬ配列を含む抗ＫＬＢ抗体と同じエピトープに結合するＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体が提供される。ある特定の実施形態では、アミノ酸配列ＳＳＰＴＲＬＡＶＩＰＷＧＶＲＫＬＬＲＷＶＲＲＮＹＧＤＭＤＩＹＩＴＡＳ（配列番号１０３）からなるＫＬＢの断片に結合するＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体が提供される。  
【０４０９】
ある特定の実施形態では、配列番号１０３に記載の配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を有するＫＬＢの断片に結合するＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体が提供される。
【０４１０】
ある特定の実施形態では、抗ＫＬＢ抗体と同じエピトープに結合するＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体が本明細書に提供される。例えば、ある特定の実施形態では、配列番号１０６の全長重鎖配列及び配列番号１０７の全長軽鎖配列を含む抗ＫＬＢ抗体と同じエピトープに結合するＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体が提供される。  
【０４１１】
ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書に提供される抗ＦＧＦＲ２／３抗体と同じエピトープに結合するＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体を提供する。例えば、ある特定の実施形態では、配列番号８２のＶＨ配列及び配列番号６６のＶＬ配列を含む抗ＦＧＦＲ２／３抗体と同じエピトープに結合するＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体が提供される。  ある特定の実施形態では、アミノ酸配列ＴＮＴＥＫＭＥＫＲＬＨＡＶＰＡＡＮＴＶＫＦＲＣＰＡ（配列番号９１）及び／またはＹＫＶＲＮＱＨＷＳＬＩＭＥＳ（配列番号９２）を含むＦＧＦＲ２のエピトープに結合し、及び／またはアミノ酸配列ＴＲＰＥＲＭＤＫＫＬＬＡＶＰＡＡＮＴＶＲＦＲＣＰＡ（配列番号９３）及び／またはＩＫＬＲＨＱＱＷＳＬＶＭＥＳ（配列番号９４）を含むＦＧＦＲ３のエピトープにも結合するＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体が提供される。  
【０４１２】
ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書に提供される抗ＦＧＦＲ２／３抗体と同じエピトープに結合するＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体を提供する。例えば、ある特定の実施形態では、本明細書に開示される２Ｂ．１．３．１２、２Ｂ．１．３．１０、または２Ｂ．１．１．６抗ＦＧＦＲ２／３抗体と同じエピトープに結合するＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体が提供される。ある特定の実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／３抗体２Ｂ．１．３．１０及び２Ｂ．１．３．１２と同じエピトープに結合するＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体が提供される（すなわち、ＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体は、アミノ酸配列ＴＮＴＥＫＭＥＫＲＬＨＡＶＰＡＡＮＴＶＫＦＲＣＰＡ（配列番号９１）及び／またはＹＫＶＲＮＱＨＷＳＬＩＭＥＳ（配列番号９２）を含むＦＧＦＲ２のエピトープ（複数可）に結合し、及び／またはアミノ酸配列ＴＲＰＥＲＭＤＫＫＬＬＡＶＰＡＡＮＴＶＲＦＲＣＰＡ（配列番号９３）及び／またはＩＫＬＲＨＱＱＷＳＬＶＭＥＳ（配列番号９４）を含むＦＧＦＲ３のエピトープ（複数可）にも結合し、これらのエピトープは、２Ｂ．１．３．１０及び２Ｂ．１．３．１２が結合するエピトープと同じである）。
【０４１３】
ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書に提供される２Ｂ．１．３．１０及び２Ｂ．１．３．１２抗体とＦＧＦＲ２／３への結合において競合するＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体を提供する。
【０４１４】
ある特定の実施形態では、配列番号１０３に記載の配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を有するＫＬＢの断片に結合し、かつＴＮＴＥＫＭＥＫＲＬＨＡＶＰＡＡＮＴＶＫＦＲＣＰＡ（配列番号９１）及びＹＫＶＲＮＱＨＷＳＬＩＭＥＳ（配列番号９２）から選択されるＦＧＦＲ２エピトープに結合するか、またはＦＧＦＲ２エピトープへの結合において競合し、ＴＲＰＥＲＭＤＫＫＬＬＡＶＰＡＡＮＴＶＲＦＲＣＰＡ（配列番号９３）及びＩＫＬＲＨＱＱＷＳＬＶＭＥＳ（配列番号９４）から選択されるＦＧＦＲ３エピトープに結合するか、またはＦＧＦＲ３エピトープへの結合において競合するＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体が提供される。  
【０４１５】
ある特定の実施形態では、配列番号１０３に記載のアミノ酸配列を有するＫＬＢの断片に結合し、かつ配列番号９１及び９２に提供されるＦＧＦＲ２エピトープに結合するか、またはＦＧＦＲ２エピトープへの結合において競合し、配列番号９３及び９４に提供されるＦＧＦＲ３エピトープに結合するか、またはＦＧＦＲ３エピトープへの結合において競合する抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１二重特異性抗体が提供される。  
【０４１６】
抗体断片
本発明は、抗体断片を包含する。ある特定の状況では、全抗体ではなく抗体断片を使用することが有利である。より小さい断片により、迅速なクリアランスが可能になり、固形腫瘍へのアクセスが改善され得る。
【０４１７】
抗体断片を産生するための様々な技法が開発されている。伝統的には、これらの断片は、インタクトな抗体のタンパク質消化により得られた（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：１０７−１１７（１９９２）、及びＢｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照のこと）。しかしながら、現在、これらの断片は、組換え宿主細胞から直接産生することができる。Ｆａｂ、Ｆｖ、及びＳｃＦｖ抗体断片は全て、大腸菌で発現し、かつ大腸菌から分泌することができ、それ故に、これらの断片の容易な大量産生を可能にする。抗体断片は、上述の抗体ファージライブラリから単離され得る。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨ断片は、大腸菌から直接回収され、化学的にカップリングされて、Ｆ（ａｂ’）２断片を形成することができる（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２））。別のアプローチに従って、Ｆ（ａｂ’）２断片は、組換え宿主細胞培養から直接単離され得る。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含むインビボ半減期が増大したＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片が、米国特許第５，８６９，０４６号に記載されている。抗体断片を産生するための他の技法は、当業者に明らかである。他の実施形態では、最適な抗体は、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である（例えば、ＷＯ９３／１６１８５、米国特許第５，５７１，８９４号、及び同第５，５８７，４５８号を参照のこと）。Ｆｖ及びｓＦｖは、定常領域を欠くインタクトな結合部位を有する唯一の種であり、それ故に、Ｆｖ及びｓＦｖは、インビボでの使用中の非特異的結合の低減に好適である。ｓＦｖ融合タンパク質は、ｓＦｖのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかにエフェクタータンパク質の融合をもたらすように構築され得る。Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｅｄ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ（上記参照）を参照されたい。本抗体断片は、例えば、米国特許第５，６４１，８７０号に記載の「直鎖抗体」でもあり得る。かかる直鎖抗体断片は、単一特異的または二重特異的であり得る。
【０４１８】
ヒト化抗体
本発明は、ヒト化抗体を包含する。非ヒト抗体をヒト化するための様々な方法が当該技術分野で既知である。例えば、ヒト化抗体は、非ヒト源からそれに導入された１つ以上のアミノ酸残基を有し得る。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は、本質的には、Ｗｉｎｔｅｒ及び同僚の方法（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６）に従って、超可変領域配列をヒト抗体の対応する配列の代わりに用いることによって行われ得る。したがって、かかる「ヒト化」抗体は、キメラ抗体であり（米国特許第４，８１６，５６７号）、実質的にインタクト未満のヒト可変ドメインは、非ヒト種由来の対応する配列により置換されている。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかの超可変領域残基及び恐らくいくつかのＦＲ残基が齧歯類抗体における類似部位由来の残基により置換されるヒト抗体である。
【０４１９】
ヒト化抗体の作製に使用されるヒト可変ドメイン（重鎖及び軽鎖の両方）の選択は、抗原性を低減するのに非常に重要である。いわゆる「最良適合」方法に従って、齧歯類抗体の可変ドメイン配列が、既知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリに対してスクリーニングされる。その後、齧歯類の配列に最も近いヒト配列がヒト化抗体のヒトフレームワークとして認められる（Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１。別の方法は、軽鎖または重鎖の特定の下位群の全てのヒト抗体のコンセンサス配列由来の特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークがいくつかの異なるヒト化抗体に使用され得る（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５、Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３。
【０４２０】
抗原に対する高親和性及び他の好ましい生物学的特性を保持しながら抗体がヒト化されることも更に重要である。この目標を達成するために、１つの方法に従って、ヒト化抗体は、親配列及びヒト化配列の三次元モデルを使用して親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析プロセスによって調製される。三次元免疫グロブリンモデルは、一般に入手可能であり、当業者に周知である。選択された候補免疫グロブリン配列の予想される三次元立体配座構造を図解及び表示するコンピュータプログラムが入手可能である。これらの表示されたものを調べることにより、候補免疫グロブリン配列が機能する際の可能性のある残基の役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このような方法で、標的抗原（複数可）に対する親和性の増大等の所望の抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基がレシピエント配列及び移入配列から選択され、組み合わせられ得る。一般に、超可変領域残基は、抗原結合への影響に直接かつ最も実質的に関与する。
【０４２１】
ヒト抗体
本発明のヒト抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ヒト由来のファージディスプレイライブラリから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列（複数可）を上述の既知のヒト定常ドメイン配列（複数可）と組み合わせることによって構築され得る。あるいは、本発明のヒトモノクローナル抗ＦＧＦＲ２／３抗体は、ハイブリドーマ法によって作製され得る。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒト異種骨髄腫細胞株が、例えば、Ｋｏｚｂｏｒ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）、Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）、及びＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１）によって記載されている。
【０４２２】
内因性免疫グロブリン産生の不在下で免疫化時にヒト抗体の全レパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を産生することが可能になった。例えば、キメラ及び生殖系列変異体マウスにおける抗体重鎖連結領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合性欠失により、内在性抗体産生の完全な阻害がもたらされることが説明されている。かかる生殖系列変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移行により、抗原チャレンジ時のヒト抗体の産生がもたらされる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５（１９９３）、Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７：３３（１９９３）を参照されたい。
【０４２３】
遺伝子シャッフリングを使用して、非ヒト抗体、例えば、齧歯類抗体からヒト抗体を得ることもでき、このヒト抗体は、出発非ヒト抗体と同様の親和性及び特異性を有する。「エピトープインプリンティング」とも呼ばれるこの方法に従って、上述のファージディスプレイ技法によって得られた非ヒト抗体断片の重鎖可変領域または軽鎖可変領域のいずれかが、ヒトＶドメイン遺伝子のあるレパートリーで置き換えられ、非ヒト鎖／ヒト鎖ｓｃＦｖまたはＦａｂキメラの集団を作製する。抗原の選択により、非ヒト鎖／ヒト鎖キメラｓｃＦｖまたはＦａｂの単離がもたらされ、このヒト鎖は、一次ファージディスプレイクローンにおける対応する非ヒト鎖の除去時に破壊された抗原結合部位を回復させ、すなわち、このエピトープは、ヒト鎖パートナーの選択を決定（インプリント）する。このプロセスが繰り返されれて残りの非ヒト鎖が置き換えられると、ヒト抗体が得られる（１９９３年４月１日公開のＰＣＴ  ＷＯ９３／０６２１３）。ＣＤＲグラフティングによる非ヒト抗体の伝統的なヒト化とは異なり、この技法は、非ヒト起源のＦＲまたはＣＤＲ残基を有しない完全なヒト抗体を提供する。
【０４２４】
二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有する、モノクローナル抗体、好ましくはヒト抗体またはヒト化抗体である。この場合、結合特異性の一方はＦＧＦＲ３に対するものであり、他方はＦＧＦＲ２に対するものである。二重特異性抗体を使用して、細胞毒性薬をＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ２、またはＦＧＦＲ２／３を発現する細胞に局在させることもできる。二重特異性抗体は、全長抗体または抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製され得る。
【０４２５】
二重特異性抗体の作製方法は、当該技術分野で既知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え産生は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の共発現に基づき、これらの２つの重鎖は、異なる特異性を有する（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７（１９８３））。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のランダム分類のため、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０個の異なる抗体分子の可能性のある混合物を産生し、それらのうちの１つのみが正しい二重特異性構造を有する。親和性クロマトグラフィーステップによって通常行われるこの正しい分子の精製は扱いにくく、生成物の収率は低い。同様の手技が、１９９３年５月１３日公開のＷＯ９３／０８８２９、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１０：３６５５（１９９１）に開示されている。
【０４２６】
異なるより好ましいアプローチに従って、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体抗原結合部位）が免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合される。この融合は、好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合である。これらの融合物のうちの少なくとも１つに存在する軽鎖結合に必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合物をコードするＤＮＡ、及び所望の場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡが別個の発現ベクターに挿入され、好適な宿主生物に共トランスフェクトされる。これにより、構築に使用される３つのポリペプチド鎖の不均等な比率が最適収率を提供する実施形態では、３つのポリペプチド断片の相互割合を調整する際に高い柔軟性が提供される。しかしながら、均等な比率での少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現により高収率がもたらされる場合、またはそれらの比率が特に重要ではない場合に、２つまたは３つ全てのポリペプチド鎖のコード配列を１つの発現ベクターに挿入することが可能である。
【０４２７】
このアプローチの好ましい一実施形態では、二重特異性抗体は、一方のアームに第１の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖と、他方のアームに（第２の結合特異性を提供する）ハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対から成る。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖が存在しないことにより容易な分離方法が提供されるため、この非対称構造が、所望の二重特異性化合物の望ましくない免疫グロブリン鎖の組み合わせからの分離を容易にすることが見出された。このアプローチは、ＷＯ９４／０４６９０に開示されている。二重特異性抗体の生成の更なる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）を参照されたい。
【０４２８】
別のアプローチに従って、一対の抗体分子間の界面を操作して、組換え細胞培養から回収されるヘテロ二量体の割合を最大化することができる。好ましい界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１の抗体分子の界面由来の１つ以上の小さいアミノ酸側鎖は、より大きい側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置き換えられる。大きいアミノ酸側鎖をより小さいアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）で置き換えることによって、これらの大きい側鎖（複数可）と同一または同様の大きさの代償的「空洞」が第２の抗体分子の界面上に作製される。これにより、ホモ二量体等の他の望ましくない最終産物よりもヘテロ二量体の収率を増加させるための機構が提供される。
【０４２９】
二重特異性抗体は、架橋または「ヘテロコンジュゲート」抗体を含む。例えば、ヘテロコンジュゲート中の抗体の一方がアビジンにカップリングされ、他方がビオチンにカップリングされ得る。かかる抗体は、例えば、免疫系細胞を望ましくない細胞に標的し（米国特許第４，６７６，９８０）、かつＨＩＶ感染を治療する（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／００３７３、及びＥＰ０３０８９）ものとして提案されている。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の簡便な架橋方法を使用して作製され得る。好適な架橋剤は当該技術分野で周知であり、いくつかの架橋技法とともに米国特許第４，６７６，９８０号に開示されている。
【０４３０】
抗体断片から二重特異性抗体を生成するための技法も文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体は、化学結合を使用して調製され得る。Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）は、インタクトな抗体がタンパク質分解的に切断されて、Ｆ（ａｂ’）２断片を生成する手技について記載している。これらの断片は、ジチオール錯化剤亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元され、ビシナルジチオールを安定させ、分子間ジスルフィド形成を阻止する。その後、生成されたＦａｂ’断片は、チオニトロ安息香酸塩（ＴＮＢ）誘導体に変換される。その後、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の一方がメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ’−チオールに再変換され、等モル量の他方のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合されて、二重特異性抗体を形成する。生成された二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化用の薬剤として使用され得る。
【０４３１】
最近の進展により、大腸菌からのＦａｂ’−ＳＨ断片の直接回収が容易になっており、それらが化学的にカップリングされて、二重特異性抗体を形成することができる。Ｓｈａｌａｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７５：２１７−２２５（１９９２）は、完全ヒト化二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の産生について記載している。各Ｆａｂ’断片を大腸菌から別個に分泌し、インビトロでの直接化学的カップリングに供して、二重特異性抗体を形成した。このようにして形成された二重特異性抗体は、ＨＥＲ２受容体を過剰発現する細胞及び正常ヒトＴ細胞に結合することができ、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞毒性リンパ球の溶解活性を誘発することもできた。
【０４３２】
二重特異性抗体断片を組換え細胞培養から直接作製及び単離するための様々な技法も説明されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを使用して産生されている。Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に結合させた。抗体ホモ二量体をヒンジ領域において還元して単量体を形成し、その後、再酸化して抗体ヘテロ二量体を形成した。この方法は、抗体ホモ二量体の産生に利用することもできる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）によって説明される「ダイアボディ」技術により、二重特異性抗体断片を作製するための代替機構が提供された。これらの断片は、短すぎて同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にすることができないリンカーによって軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。したがって、１つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは、別の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと対合させられ、それにより、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用によって二重特異性抗体断片を作製するための別の戦略も報告されている。Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）を参照されたい。
【０４３３】
２を超える原子価を有する抗体が企図される。例えば、三重特異性抗体が調製され得る。Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。
【０４３４】
多価抗体
多価抗体は、その抗体が結合する抗原を発現する細胞により二価抗体よりも速く内部化（及び／または異化）され得る。本発明の抗体は、その抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により容易に産生され得る３つ以上の抗原結合部位を有する多価抗体（例えば、四価抗体）であり得る（ＩｇＭクラス以外のものである）。多価抗体は、二量体化ドメイン及び３つ以上の抗原結合部位を含み得る。好ましい二量体化ドメインは、Ｆｃ領域またはヒンジ領域を含む（か、またはそれからなる）。このシナリオでは、本抗体は、Ｆｃ領域及びＦｅ領域に対してアミノ末端側の３つ以上の抗原結合部位を含む。本明細書における好ましい多価抗体は、３つ〜約８つであるが、好ましくは４つの抗原結合部位を含む（またはそれらからなる）。多価抗体は、少なくとも１つのポリペプチド鎖（及び好ましくは２つのポリペプチド鎖）を含み、このポリペプチド鎖（複数可）は、２つ以上の可変ドメインを含む。例えば、このポリペプチド鎖（複数可）は、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−（Ｘ２）ｎ−Ｆｃを含み得、ここで、ＶＤ１は、第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は、第２の可変ドメインであり、Ｆｃは、Ｆｃ領域の１つのポリペプチド鎖であり、Ｘ１及びＸ２は、アミノ酸またはポリペプチドを表し、ｎは、０または１である。例えば、このポリペプチド鎖（複数可）は、ＶＨ−ＣＨ１−可動性リンカー−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖、またはＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖を含み得る。本明細書における多価抗体は、好ましくは、少なくとも２つ（好ましくは４つ）の軽鎖可変ドメインポリペプチドを更に含む。本明細書における多価抗体は、例えば、約２つ〜約８つの軽鎖可変ドメインポリペプチドを含み得る。本明細書に企図される軽鎖可変ドメインポリペプチドは、軽鎖可変ドメインを含み、任意に、ＣＬドメインを更に含む。
【０４３５】
抗体変異体
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体のアミノ酸配列修飾（複数可）が企図される。例えば、本抗体の結合親和性及び／または他の生物学的特性の改善が望ましくあり得る。本抗体のアミノ酸配列変異形は、適切なヌクレオチド変化を抗体核酸に導入することによって、またはペプチド合成によって調製される。かかる修飾としては、例えば、本抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／またはその残基への挿入、及び／またはその残基の置換が挙げられる。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが作製されて最終構築物に到達するが、但し、最終構築物が所望の特徴を有することを条件とする。これらのアミノ酸改変は、その配列が作製された時点で主題の抗体のアミノ酸配列に導入され得る。
【０４３６】
変異誘発に好ましい位置である本抗体のある特定の残基または領域の特定に有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５に記載される「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。ここで、残基または標的残基群（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、及びｇｌｕ等の荷電残基）が特定され、中性または負荷電アミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）で置き換えられて、アミノ酸の抗原との相互作用に影響を及ぼす。その後、置換への機能的感受性を示すそれらのアミノ酸位置は、その置換部位でのまたはその置換部位に対する更なるまたは他の変異形の導入により精密化される。したがって、アミノ酸配列変異を導入する部位が予め決定されているが、変異の本質はそれ自体予め決定されている必要はない。例えば、所与の部位での変異の性能を分析するために、ａｌａスキャニングまたはランダム変異誘発が標的コドンまたは領域で行われ、発現された免疫グロブリンが所望の活性についてスクリーニングされる。
【０４３７】
アミノ酸配列挿入には、１個の残基〜１００個以上の残基を含有するポリペプチドの範囲の長さのアミノ末端及び／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内（ｉｎｔｒａｓｅｑｕｅｎｃｅ）挿入が挙げられる。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体または細胞毒性ポリペプチドに融合される抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入変異形としては、抗体の血清半減期を増大させる酵素（例えば、ＡＤＥＰＴ）またはポリペプチドに対する抗体のＮ末端もしくはＣ末端への融合が挙げられる。
【０４３８】
ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合型またはＯ結合型である。Ｎ結合型とは、炭水化物部分のアスパラギン残基の側鎖への結合を指す。トリペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−トレオニン（ここで、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である）は、炭水化物部分のアスパラギン側鎖への酵素結合の認識配列である。したがって、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在により、可能性のあるグリコシル化部位が作製される。Ｏ結合型グリコシル化とは、糖であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの１つのヒドロキシアミノ酸、最も一般的には、セリンまたはトレオニン（５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンも使用され得る）への結合を指す。
【０４３９】
グリコシル化部位の本抗体への付加は、アミノ酸配列を改変することによって好都合に達成され、これにより、それが上述のトリペプチド配列のうちの１つ以上を含むようになる（Ｎ結合型グリコシル化部位の場合）。この改変は、元の抗体の配列への１つ以上のセリンまたはトレオニン残基の付加またはそれによる置換によって行うこともできる（Ｏ結合型グリコシル化部位の場合）。
【０４４０】
本抗体がＦｃ領域を含む場合、それに結合している炭水化物が改変され得る。例えば、本抗体のＦｃ領域に結合しているフコースを欠く成熟炭水化物構造を有する抗体が、米国特許出願第ＵＳ２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）に記載されている。同第ＵＳ２００４／００９３６２１号（Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ  Ｋｏｇｙｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）も参照されたい。本抗体のＦｃ領域に結合している炭水化物中の二分Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を有する抗体が、ＷＯ２００３／０１１８７８（Ｊｅａｎ−Ｍａｉｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．）及び米国特許第６，６０２，６８４（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．）に参照されている。本抗体のＦｃ領域に結合しているオリゴ糖中の少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体が、ＷＯ１９９７／３００８７（Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．）に報告されている。そのＦｃ領域に結合している改変された炭水化物を有する抗体に関して、ＷＯ１９９８／５８９６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）及びＷＯ１９９９／２２７６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）も参照されたい。修飾されたグリコシル化を有する抗原結合分子に関して、ＵＳ２００５／０１２３５４６（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．）も参照されたい。
【０４４１】
本明細書における好ましいグリコシル化変異形は、Ｆｃ領域を含み、Ｆｃ領域に結合している炭水化物構造は、フコースを欠く。かかる変異形は、改善されたＡＤＣＣ機能を有する。任意に、Ｆｃ領域は、ＡＤＣＣを更に改善する１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２９８位、３３３位、及び／または３３４位（Ｅｕ残基番号付け）での置換をその中に更に含む。「脱フコシル化」抗体または「フコース欠損」抗体に関する刊行物の例としては、ＵＳ２００３／０１５７１０８、ＷＯ２０００／６１７３９、ＷＯ２００１／２９２４６、ＵＳ２００３／０１１５６１４、ＵＳ２００２／０１６４３２８、ＵＳ２００４／００９３６２１、ＵＳ２００４／０１３２１４０、ＵＳ２００４／０１１０７０４、ＵＳ  ２００４／０１１０２８２、ＵＳ２００４／０１０９８６５、ＷＯ２００３／０８５１１９、ＷＯ２００３／０８４５７０、ＷＯ２００５／０３５５８６、ＷＯ２００５／０３５７７８、ＷＯ２００５／０５３７４２、Ｏｋａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９−１２４９（２００４）、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）が挙げられる。脱フコシル化抗体を産生する細胞株の例としては、タンパク質フコシル化が欠損したＬｅｃ１３  ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３−５４５（１９８６）、米国特許出願第ＵＳ２００３／０１５７１０８  Ａ１号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ）、及びＷＯ２００４／０５６３１２  Ａ１（Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．）、特に実施例１１）、及びノックアウト細胞株、例えば、アルファ−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４））が挙げられる。
【０４４２】
別の種類の変異形は、アミノ酸置換変異形である。これらの変異形は、異なる残基で置き換えられた抗体分子中の少なくとも１つ（少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、またはそれ以上）のアミノ酸残基を有する。置換変異誘発において最も興味深い部位は、超可変領域を含むが、ＦＲ改変も企図される。保存的置換は、「好ましい置換」という見出しで以下の図表に示される。かかる置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、以下の図表で「例示の置換」と命名されるか、またはアミノ酸クラスを参照して以下で更に説明されるより実質的な変化が導入され、生成物がスクリーニングされ得る。
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【０４４３】
本抗体の生物学的特性の実質的な修飾は、（ａ）置換領域におけるポリペプチド骨格の構造、例えば、シートもしくはヘリックス立体配座、（ｂ）標的部位での分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の容積の維持への置換の影響の点で著しく異なる置換を選択することによって達成される。天然に存在する残基は、一般的な側鎖特性に従って分類される：
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ、
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ、
（４）塩基性：ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ、
（５）鎖の配向に影響を及ぼす残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ、
（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
【０４４４】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴う。
【０４４５】
一種の置換変異形は、親抗体（例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基の置換を伴う。一般に、更なる開発のために選択される結果として生じる変異形（複数可）は、それらが生成される親抗体に対して改善された生物学的特性を有する。かかる置換変異形を生成するための簡便な方法は、ファージディスプレイを使用した親和性成熟を伴う。簡潔に、いくつかの超可変領域部位（例えば、６〜７つの部位）が変異されて、各部位に全ての可能なアミノ酸置換をもたらす。このようにして生成された抗体は、繊維状ファージ粒子から各粒子内にパッケージングされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合物として提示される。その後、ファージ提示変異形は、本明細書に開示されるそれらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。修飾の候補超可変領域部位を特定するために、アラニンスキャニング変異誘発が行われて、抗原結合に著しく寄与する超可変領域残基を同定することができる。あるいは、または加えて、抗原−抗体複合体の結晶構造を分析して、抗体と抗原との間の接触点を特定することが有益であり得る。かかる接触残基及び隣接残基は、本明細書に詳述される技法に従う置換の候補である。かかる変異形が生成されると、変異形のパネルが本明細書に記載のスクリーニングに供され、１つ以上の関連アッセイにおいて優れた特性を有する抗体が更なる開発のために選択され得る。
【０４４６】
本抗体のアミノ酸配列変異形をコードする核酸分子は、当該技術分野で既知の様々な方法によって調製される。これらの方法としては、天然源からの単離（天然に存在するアミノ酸配列変異形の場合）、または事前に調製された変異形または本抗体の非変異形バージョンのオリゴヌクレオチド媒介（または部位特異的）変異誘発、ＰＣＲ変異誘発、及びカセット変異誘発による調製が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４４７】
１つ以上のアミノ酸修飾を本発明の免疫グロブリンポリペプチドのＦｃ領域に導入し、それによりＦｃ領域変異形を生成することが望ましくあり得る。Ｆｃ領域変異形は、ヒンジシステインの位置を含む１つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４Ｆｃ領域）を含み得る。
【０４４８】
本記述及び当該技術分野の教示に従って、いくつかの実施形態では、本発明の方法に使用される抗体が、例えば、Ｆｃ領域において、野生型対応物抗体と比較して１つ以上の改変を含み得ることが企図される。それにもかかわらず、これらの抗体は、それらの野生型対応物と比較して治療的有用性に必要な実質的に同じ特徴を保持する。例えば、Ｆｃ領域にある特定の改変を行うことにより、例えば、ＷＯ９９／５１６４２に記載されるように、改変された（すなわち、改善または減少のいずれか）Ｃ１ｑ結合及び／または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）がもたらされると考えられる。Ｆｃ領域変異形の他の例に関しては、Ｄｕｎｃａｎ  ＆  Ｗｉｎｔｅｒ  Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：７３８−４０（１９８８）、米国特許第５，６４８，２６０号、米国特許第５，６２４，８２１号、及びＷＯ９４／２９３５１も参照されたい。ＷＯ００／４２０７２（Ｐｒｅｓｔａ）及びＷＯ２００４／０５６３１２（Ｌｏｗｍａｎ）は、ＦｃＲｓへの改善または減少した結合を有する抗体変異形について記載している。これらの特許刊行物の内容は、参照により本明細書に明確に組み込まれる。Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１−６６０４（２００１）も参照されたい。増大した半減期及び母体ＩｇＧの胎児への移送に関与する新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への改善された結合を有する抗体（Ｇｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））については、ＵＳ２００５／００１４９３４Ａ１（Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）に記載されている。これらの抗体は、Ｆｃ領域のＦｃＲｎへの結合を改善する１つ以上の置換を内部に有するＦｃ領域を含む。改変されたＦｃ領域アミノ酸配列及び増加または減少したＣ１ｑ結合能力を有するポリペプチド変異形が、米国特許第６，１９４，５５１Ｂ１号、ＷＯ９９／５１６４２に記載されている。これらの特許刊行物の内容は、参照により本明細書に明確に組み込まれる。Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８−４１８４（２０００）。
【０４４９】
抗体誘導体
本発明の抗体は、当該技術分野で既知であり、かつ容易に入手可能な更なる非タンパク質部分を含有するように更に修飾され得る。好ましくは、本抗体の誘導体化に好適なこれらの部分は、水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレン（ｐｒｏｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）グリコールホモポリマー、プロリプロピレン（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）オキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、ならびにそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性に起因して、製造における利点を有し得る。ポリマーは、任意の分子量のものであり得、分岐または非分岐であり得る。本抗体に結合したポリマーの数は異なる場合があり、２つ以上のポリマーが結合しているとき、それらは、同じ分子または異なる分子であり得る。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／または種類は、改善される抗体の特定の特性または機能、抗体誘導体が規定の条件下である療法に使用されるか等を含むが、これらに限定されない考慮すべき事項に基づいて決定され得る。
【０４５０】
所望の特性を有する抗体のスクリーニング
本発明の抗体は、当該技術分野で既知の様々なアッセイ（これらのうちのいくつかは本明細書に開示されている）によってそれらの物理的／化学的特性及び生物学的機能について特徴付けられ得る。いくつかの実施形態では、抗体は、ＦＧＦ（ＦＧＦ１及び／またはＦＧＦ９等）結合の低減もしくは遮断、ＦＧＦＲ３活性化の低減もしくは遮断、ＦＧＦＲ３下流分子シグナル伝達の低減もしくは遮断、リガンド（例えば、ＦＧＦ１、ＦＧＦ９）に結合するＦＧＦＲ３の破壊もしくは遮断、ＦＧＦＲ３二量体化の低減もしくは遮断、単量体ＦＧＦＲ３の形成の促進、単量体ＦＧＦＲ３への結合、ならびに／または腫瘍、細胞増殖性障害、もしくは癌の治療及び／もしくは予防、ならびに／またはＦＧＦＲ３発現及び／もしくは活性（増加したＦＧＦＲ３発現及び／または活性等）に関連する障害の治療もしくは予防のうちのいずれか１つ以上について特徴付けられる。いくつかの実施形態では、本抗体は、ＦＧＦＲ３活性化の増加、ＦＧＦＲ３下流分子シグナル伝達の増加、アポトーシス活性、ＦＧＦＲ３下方調節、及びエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ活性）についてスクリーニングされる。ある特定の実施形態では、抗体は、ＦＧＦＲ２活性化の低減もしくは遮断、ＦＧＦＲ２下流分子シグナル伝達の低減もしくは遮断、リガンドに結合するＦＧＦＲ２の破壊もしくは遮断、ＦＧＦＲ２二量体化の低減もしくは遮断、単量体ＦＧＦＲ２の形成の促進、単量体ＦＧＦＲ２への結合、ならびに／または腫瘍、細胞増殖性障害、もしくは癌の治療及び／もしくは予防、ならびに／またはＦＧＦＲ２発現及び／もしくは活性（増加したＦＧＦＲ２発現及び／もしくは活性等）に関連する障害の治療もしくは予防のうちのいずれか１つ以上について特徴付けられる。いくつかの実施形態では、本抗体は、ＦＧＦＲ２活性化の増加、ＦＧＦＲ２下流分子シグナル伝達の増加、ＦＧＦＲ２下方調節、及びエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ活性）についてスクリーニングされる。ある特定の実施形態では、抗体は、ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３活性化の低減もしくは遮断、ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３下流分子シグナル伝達の低減もしくは遮断、リガンド（例えば、ＦＧＦ１、ＦＧＦ９）に結合するＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３の破壊もしくは遮断、ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３二量体化の低減もしくは遮断、単量体ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３の形成の促進、単量体ＦＧＦＲ２及び単量体ＦＧＦＲ３への結合、ならびに／または腫瘍、細胞増殖性障害、若しくは癌の治療及び／もしくは予防、ならびに／またはＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３発現及び／もしくは活性（増加したＦＧＦＲ２及び／もしくはＦＧＦＲ３発現及び／または活性等）に関連する障害の治療もしくは予防のうちのいずれか１つ以上について特徴付けられる。いくつかの実施形態では、本抗体は、ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３活性化の増加、ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３下流分子シグナル伝達の増加、アポトーシス活性、ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３下方調節、ならびにエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ活性）についてスクリーニングされる。
【０４５１】
精製された抗体は、Ｎ末端配列決定、アミノ酸分析、非変性サイズ排除高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量分析、イオン交換クロマトグラフィー、及びパパイン消化を含むが、これらに限定されない一連のアッセイによって更に特徴付けられ得る。
【０４５２】
本発明のある特定の実施形態では、本明細書で産生された抗体は、それらの生物学的活性について分析される。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、それらの抗原結合活性について試験される。当該技術分野で既知であり、かつ本明細書で使用される抗原結合アッセイとしては、ウエスタンブロット等の技法を使用した任意の直接または競合結合アッセイ、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、蛍光免疫アッセイ、及びタンパク質Ａ免疫アッセイが挙げられるが、これらに限定されない。例証的な抗原結合及び他のアッセイは、以下の実施例の項に提供される。
【０４５３】
細胞成長を阻害する抗ＦＧＦＲ２／３抗体が所望される場合、候補抗体は、細胞成長の阻害を測定するインビトロ及び／またはインビボアッセイで試験され得る。アポトーシスを促進するかまたは促進しない抗ＦＧＦＲ２／３抗体が所望される場合、候補抗体は、アポトーシスを測定するアッセイで試験され得る。癌細胞の成長及び／または増殖を試験するか、または癌細胞のアポトーシスを決定するための方法は、当該技術分野で周知であり、それらのうちのいくつかが本明細書に記載及び例示されている。細胞成長及び／または増殖及び／またはアポトーシスを決定するための例示の方法としては、例えば、ＢｒｄＵ組み込みアッセイ、ＭＴＴ、［３Ｈ］−チミジン組み込み（例えば、ＴｏｐＣｏｕｎｔアッセイ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ））、細胞生存率アッセイ（例えば、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ））、ＤＮＡ断片化アッセイ、カスパーゼ活性化アッセイ、トリプタンブルー排除、クロマチン形態アッセイ等が挙げられる。
【０４５４】
一実施形態では、本発明は、エフェクター機能を有する抗体を企図する。ある特定の実施形態では、本抗体のＦｃ活性が測定される。インビトロ及び／またはインビボ細胞毒性アッセイを行い、ＣＤＣ及び／またはＡＤＣＣ活性の低減／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを行い、本抗体がＦｃγＲ結合を欠いている（それ故に、ＡＤＣＣ活性を欠いている可能性がある）が、ＦｃＲｎ結合能力は保持していることを確実にすることができる。ＡＤＣＣを媒介するための主要な細胞であるＮＫ細胞がＦｃγＲＩＩＩのみを発現する一方で、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２（１９９１）の４６４貢の表３に要約されている。目的とする分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの例は、米国特許第５，５００，３６２号または同第５，８２１，３３７号に記載されている。ＡＤＣＣ活性を検出するためのアッセイも本明細書に例示されている。かかるアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいはまたは更に、目的とする分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されるモデル等の動物モデルで評価され得る。Ｃ１ｑ結合アッセイを行い、本抗体がＣ１ｑに結合することができず、それ故にＣＤＣ活性を欠いていることを確認することができる。補体活性化を評価するために、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３（１９９６）に記載のＣＤＣアッセイが行われ得る。ＦｃＲｎ結合及びインビボクリアランス／半減期決定も、当該技術分野で既知の方法、例えば、実施例の項に記載の方法を使用して行われ得る。
【０４５５】
単量体ＦＧＦＲ２及び／またはＦＧＦＲ３に結合する抗ＦＧＦＲ２／３抗体が所望される場合、候補抗体は、単量体ＦＧＦＲ２及び／またはＦＧＦＲ３への結合ならびに単量体ＦＧＦＲ２及び／またはＦＧＦＲ３の形成の促進を測定するアッセイ（インビトロアッセイ等）で試験され得る。かかるアッセイが当該技術分野で既知であり、いくつかのアッセイが本明細書に記載及び例示されている。
【０４５６】
ＦＧＦＲ２及び／またはＦＧＦＲ３二量体化を阻害する抗ＦＧＦＲ２／３抗体が所望される場合、候補抗体は、二量体化アッセイ、例えば、本明細書に記載の二量体化アッセイで試験され得る。
【０４５７】
いくつかの実施形態では、候補抗体のＦＧＦＲ２及び／またはＦＧＦＲ３アゴニスト機能が決定される。ＦＧＦＲ２及び／またはＦＧＦＲ３抗体のアゴニスト機能または活性を評価するための方法が当該技術分野で既知であり、それらのうちのいくつかが本明細書にも記載されている。
【０４５８】
いくつかの実施形態では、例えば、本明細書に記載及び例示される方法を使用して、ＦＧＦＲ２及び／またはＦＧＦＲ３受容体下方調節を促進するＦＧＦＲ２／３抗体の能力が決定される。一実施形態では、ＦＧＦＲ２／３抗体は、好適な試験細胞、例えば、膀胱癌細胞株（例えば、ＲＴ１１２）とインキュベートされ、好適な期間後に、細胞溶解物が収集され、総ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３レベルについて試験される。ＦＡＣＳ分析を使用して、候補ＦＧＦＲ２／３抗体とのインキュベーション後に表面ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３受容体レベルを試験することもできる。
【０４５９】
ベクター、宿主細胞、及び組換え方法
本発明の抗体の組換え産生について、それをコードする核酸が単離され、更なるクローニング（ＤＮＡ増幅）または発現のために複製可能なベクターに挿入される。本抗体をコードするＤＮＡは容易に単離され、従来の手技を使用して（例えば、本抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用して）配列決定される。多くのベクターが利用可能である。ベクターの選択は、一部には、使用される宿主細胞に依存する。一般に、好ましい宿主細胞は、原核起源または真核（一般に哺乳類）起源のいずれかのものである。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ定常領域等の任意のアイソタイプの定常領域をこの目的のために使用することができ、かかる定常領域を任意のヒトまたは動物種から得ることができることが理解される。
【０４６０】
ａ．原核宿主細胞を使用した抗体の生成
ｉ．ベクター構築
本発明の抗体のポリペプチド成分をコードするポリヌクレオチド配列は、標準の組換え技法を使用して得ることができる。所望のポリヌクレオチド配列は、ハイブリドーマ細胞等の抗体産生細胞から単離され、配列決定され得る。あるいは、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド合成機またはＰＣＲ技法を使用して合成され得る。得られた時点で、ポリペプチドをコードする配列が、原核宿主で異種ポリヌクレオチドを複製及び発現することができる組換えベクターに挿入される。利用可能であり、かつ当該技術分野で既知の多くのベクターが本発明の目的のために使用され得る。適切なベクターの選択は、主に、ベクターに挿入される核酸のサイズ及びそのベクターで形質転換される特定の宿主細胞に依存する。各ベクターは、その機能（異種ポリヌクレオチドの増幅もしくは発現、またはそれらの両方）及びそれが存在する特定の宿主細胞とのその適合性に応じて、様々な成分を含む。これらのベクター成分としては、一般に、複製起点、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、シグナル配列、異種核酸挿入、及び転写終結配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４６１】
一般に、レプリコン及び宿主細胞と適合性のある種由来の制御配列を含有するプラスミドベクターが、これらの宿主に関連して使用される。このベクターは、通常、複製部位、ならびに形質転換細胞における表現型選択を提供することができるマーキング配列を持つ。例えば、大腸菌は、典型的には、大腸菌種由来のプラスミドであるｐＢＲ３２２を使用して形質転換される。ｐＢＲ３２２は、アンピシリン（Ａｍｐ）及びテトラサイクリン（Ｔｅｔ）耐性をコードする遺伝子を含有し、それ故に、形質転換細胞を特定するための容易な手段を提供する。ｐＢＲ３２２、その誘導体、または他の微生物プラスミドもしくはバクテリオファージは、内因性タンパク質の発現のために微生物によって使用され得るプロモーターも含有するか、または含有するように修飾され得る。特定の抗体の発現のために使用されるｐＢＲ３２２誘導体の例は、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，６４８，２３７号に詳述されている。
【０４６２】
加えて、レプリコン及び宿主微生物と適合性のある制御配列を含有するファージベクターが、これらの宿主に関連して形質転換ベクターとして使用され得る。例えば、λＧＥＭ．ＴＭ．−１１等のバクテリオファージを組換えベクターの作製に利用することができ、この組換えベクターを使用して、大腸菌ＬＥ３９２等の感受性宿主細胞を形質転換することができる。
【０４６３】
本発明の発現ベクターは、ポリペプチド成分の各々をコードする２つ以上のプロモーター−シストロン対を含み得る。プロモーターは、その発現を調節するシストロンに対して上流（５’）に位置する非翻訳調節配列である。原核プロモーターは、典型的には、誘導型及び構成型の２つのクラスに分類される。誘導型プロモーターは、培養条件の変化、例えば、栄養素の存在もしくは不在または温度変化に応答してシストロンの増大したレベルの転写をその制御下で引き起こすプロモーターである。
【０４６４】
様々な潜在的宿主細胞によって認識される多数のプロモーターが周知である。選択されたプロモーターは、プロモーターを制限酵素消化によりＤＮＡ源から除去し、かつ単離されたプロモーター配列を本発明のベクターに挿入することによって、軽鎖または重鎖をコードするシストロンＤＮＡに作動可能に連結され得る。天然プロモーター配列も多くの異種プロモーターもいずれも、標的遺伝子の直接増幅及び／または発現に使用することができる。いくつかの実施形態では、異種プロモーターが利用され、それらが、一般に、天然標的ポリペプチドプロモーターと比較して発現した標的遺伝子のより大きい転写及びより高い収率を可能にするためである。
【０４６５】
原核宿主との使用に好適なプロモーターとしては、ＰｈｏＡプロモーター、β−ガラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ならびにハイブリッドプロモーター、例えば、ｔａｃプロモーターまたはｔｒｃプロモーターが挙げられる。しかしながら、細菌において機能的な他のプロモーター（他の既知の細菌プロモーターまたはファージプロモーター等）も好適である。それらのヌクレオチド配列は公開されており、それにより、熟練者が、任意の必要な制限部位を供給するリンカーまたはアダプターを使用して、標的軽鎖及び重鎖をコードするシストロンにそれらを作動可能にライゲートすることが可能になった（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８０）Ｃｅｌｌ  ２０：２６９）。
【０４６６】
本発明の一態様では、組換えベクター内の各シストロンは、膜を通過する発現したポリペプチドの転座を指向する分泌シグナル配列成分を含む。一般に、シグナル配列は、このベクターの成分であり得るか、またはこのベクターに挿入される標的ポリペプチドＤＮＡの一部であり得る。本発明の目的のために選択されるシグナル配列は、宿主細胞によって認識及び処理される（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）配列であるべきである。異種ポリペプチド原産のシグナル配列を認識及び処理しない原核宿主細胞の場合、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐ、または熱安定性腸毒素ＩＩ（ＳＴＩＩ）リーダー、ＬａｍＢ、ＰｈｏＥ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ、及びＭＢＰからなる群から選択される原核シグナル配列により置換される。本発明の一実施形態では、発現系の両シストロンで使用されるシグナル配列は、ＳＴＩＩシグナル配列またはその変異形である。
【０４６７】
別の態様では、本発明に従う免疫グロブリンの産生は、宿主細胞の細胞質で生じ得、それ故に、各シストロン内に分泌シグナル配列の存在を必要としない。その点において、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖が発現され、フォールドされ、アセンブルされて、その細胞質内に機能的免疫グロブリンを形成する。ある特定の宿主株（例えば、大腸菌ｔｒｘＢ−株）は、ジスルフィド結合形成に好ましい細胞質状態を提供し、それにより、発現したタンパク質サブユニットの適切なフォールディング及びアセンブリが可能になる。Ｐｒｏｂａ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  Ｇｅｎｅ，１５９：２０３（１９９５）。
【０４６８】
本発明の抗体の発現に好適な原核宿主細胞としては、古細菌及び真正細菌、例えば、グラム陰性またはグラム陽性生物が挙げられる。有用な細菌の例としては、エシェリキア（例えば、大腸菌）、バシラス（例えば、枯草菌）、腸内細菌、シュードモナス種（例えば、緑膿菌）、サルモネラ・チフィムリウム、セラチア・マルセッセンス、クレブシエラ、プロテウス、シゲラ、リゾビウム、ビトレオシラ、またはパラコッカスが挙げられる。 一実施形態では、グラム陰性細胞が使用される。一実施形態では、大腸菌細胞が本発明の宿主として使用される。大腸菌株の例としては、株Ｗ３１１０（Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９８７），ｐｐ．１１９０−１２１９、ＡＴＣＣ寄託番号２７，３２５）及びその誘導体（遺伝子型Ｗ３１１０  ΔｆｈｕＡ（ΔｔｏｎＡ）ｐｔｒ３  ｌａｃ  Ｉｑ  ｌａｃＬ８  ΔｏｍｐＴΔ（ｎｍｐｃ−ｆｅｐＥ）ｄｅｇＰ４１  ｋａｎＲを有する株３３Ｄ３等）（米国特許第５，６３９，６３５号）が挙げられる。他の株及びその誘導体、例えば、大腸菌２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）、大腸菌Ｂ、大腸菌λ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）、及び大腸菌ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ３１，６０８）も好適である。これらの例は、限定するものではなく、例証するものである。規定された遺伝子型を有する上述の細菌のうちのいずれかの誘導体を構築するための方法が当該技術分野で既知であり、例えば、Ｂａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，８：３０９−３１４（１９９０）に記載されている。概して、細菌の細胞におけるレプリコンの複製可能性を考慮して、適切な細菌の選択が必要である。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、またはｐＫＮ４１０等の周知のプラスミドを使用してレプリコンを提供する場合、大腸菌、セラチア、またはサルモネラ種が宿主として好適に使用され得る。典型的には、宿主細胞は、最小量のタンパク質分解酵素を分泌すべきで、望ましくは、更なるプロテアーゼ阻害剤が細胞培養に組み込まれ得る。
【０４６９】
ｉｉ．抗体産生
宿主細胞は、上述の発現ベクターで形質転換され、必要に応じて、プロモーターを誘導するか、形質転換体を選択するか、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するように修飾された従来の栄養素培地中で培養される。
【０４７０】
形質転換とは、ＤＮＡの原核宿主への導入を意味し、これにより、そのＤＮＡが、染色体外要素として、または染色体組み込み体によってのいずれかで複製可能になる。使用される宿主細胞に応じて、形質転換は、かかる細胞に適切な標準の技法を使用して行われる。塩化カルシウムを用いたカルシウム処理が、かなりの細胞−壁障壁を含む細菌細胞に一般に使用される。形質転換のための別の方法は、ポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを用いる。使用される更に別の技法は、電気穿孔である。
【０４７１】
本発明のポリペプチドを産生するために使用される原核細胞は、当該技術分野で既知であり、かつ選択された宿主細胞の培養に好適な培地で成長する。好適な培地の例としては、必要な栄養素補充物を加えたルリア・ブロス（ＬＢ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、この培地は、発現ベクターの構築に基づいて選択される選択剤も含有し、発現ベクターを含む原核細胞の成長を選択的に可能にする。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞を成長させるためにアンピシリンが培地に添加される。
【０４７２】
炭素、窒素、及び無機リン酸塩源以外の任意の必要な補充物は、適切な濃度で含まれ、単独で、または複合体窒素源等の別の補充物もしくは培地との混合物として導入され得る。任意に、培養培地は、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレート、ジチオエリトリトール、及びジチオスレイトールからなる群から選択される１つ以上の還元剤を含有し得る。
【０４７３】
原核宿主細胞は、好適な温度で培養される。大腸菌成長の場合、例えば、好ましい温度は、約２０℃〜約３９℃、より好ましくは約２５℃〜約３７℃の範囲であり、更により好ましくは約３０℃である。培地のｐＨは、主に宿主生物に応じて約５〜約９の範囲の任意のｐＨであり得る。大腸菌の場合、ｐＨは、好ましくは、約６．８〜約７．４、より好ましくは約７．０である。
【０４７４】
誘導型プロモーターが本発明の発現ベクターにおいて使用される場合、タンパク質発現は、プロモーターの活性化に好適な条件下で誘導される。本発明の一態様では、ＰｈｏＡプロモーターがポリペプチドの転写を制御するために使用される。したがって、形質転換宿主細胞は、誘導のためにリン酸限定培地中で培養される。好ましくは、リン酸限定培地は、Ｃ．Ｒ．Ａ．Ｐ培地である（例えば、Ｓｉｍｍｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００２），２６３：１３３−１４７を参照のこと）。当該技術分野で既知の用いられるベクター構築物に従って、様々な他の誘導因子を使用することができる。
【０４７５】
一実施形態では、本発明の発現したポリペプチドは、宿主細胞のペリプラズムに分泌され、それから回収される。タンパク質回収は、典型的には、一般に、浸透圧衝撃、超音波処理、または溶解等の手段による微生物の破壊を伴う。細胞が破壊されると、細胞残屑または全細胞が遠心分離または濾過によって除去され得る。タンパク質は、例えば、親和性樹脂クロマトグラフィーによって更に精製され得る。あるいは、タンパク質は、培養培地に輸送され、そこで単離され得る。細胞が培養物から除去され、培養上清が濾過され、産生されたタンパク質の更なる精製のために濃縮され得る。発現したポリペプチドは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）及びウエスタンブロットアッセイ等の一般に既知の方法を使用して更に単離及び特定され得る。
【０４７６】
本発明の一態様では、抗体の大量産生は、発酵プロセスによって行われる。様々な大規模流加回分発酵手技は、組換えタンパク質の産生に利用可能である。大規模発酵は、少なくとも１０００リットルの容積、好ましくは約１，０００〜１００，０００リットルの容積を有する。これらの発酵槽は、撹拌器インペラを使用して、酸素及び栄養素、特にグルコース（好ましい炭素／エネルギー源）を分布する。小規模発酵とは、一般に、およそ１００リットル以下の容積であり、約１リットル〜約１００リットルの範囲であり得る発酵槽内での発酵を指す。
【０４７７】
発酵プロセスにおいて、タンパク質発現の誘導は、典型的には、細胞が好適な条件下で所望の密度、例えば、約１８０〜２２０のＯＤ５５０に成長した後に開始し、その段階で、細胞は、初期静止期にある。当該技術分野で既知であり、かつ上述されている用いられるベクター構築に従って、様々な誘導因子を使用することができる。細胞は、誘導前により短い期間成長し得る。細胞は、通常、約１２〜５０時間誘導されるが、より長いまたはより短い誘導時間も使用され得る。
【０４７８】
本発明のポリペプチドの産生収率及び品質を改善するために、様々な発酵条件が変更され得る。例えば、分泌抗体ポリペプチドの適切なアセンブリ及びフォールディングを改善するために、シャペロンタンパク質、例えば、Ｄｓｂタンパク質（ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ、及び／もしくはＤｓｂＧ）またはＦｋｐＡ（シャペロン活性を有するペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ）を過剰発現する更なるベクターを使用して、宿主原核細胞を共形質転換することができる。シャペロンタンパク質が細菌宿主細胞内で産生された異種タンパク質の適切なフォールディング及び溶解を容易にすることが実証されている。Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１９６０１−１９６０５、Ｇｅｏｒｇｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第６，０８３，７１５号、Ｇｅｏｒｇｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第６，０２７，８８８号、Ｂｏｔｈｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１７１００−１７１０５、Ｒａｍｍ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１７１０６−１７１１３、Ａｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９：１９９−２１０。
【０４７９】
発現した異種タンパク質（特にタンパク質分解的に感受性のもの）のタンパク質分解を最小限に抑えるために、タンパク質分解酵素が欠損したある特定の宿主株が本発明に使用され得る。例えば、宿主細胞株は、既知の細菌プロテアーゼ、例えば、プロテアーゼＩＩＩ、ＯｍｐＴ、ＤｅｇＰ、Ｔｓｐ、プロテアーゼＩ、プロテアーゼＭｉ、プロテアーゼＶ、プロテアーゼＶＩ、及びそれらの組み合わせをコードする遺伝子における遺伝子変異（複数可）を達成するように修飾され得る。いくつかの大腸菌プロテアーゼ欠損株が利用可能であり、例えば、Ｊｏｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）（上記参照）、Ｇｅｏｒｇｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，２６４，３６５号、Ｇｅｏｒｇｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，５０８，１９２号、Ｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，２：６３−７２（１９９６）に記載されている。
【０４８０】
一実施形態では、タンパク質分解酵素が欠損しており、かつ１つ以上のシャペロンタンパク質を過剰発現するプラスミドで形質転換された大腸菌株が、本発明の発現系において宿主細胞として使用される。
【０４８１】
ｉｉｉ．抗体精製
当該技術分野で既知の標準のタンパク質精製方法が用いられ得る。以下の手技が好適な精製手技の例示となるものである：免疫親和性またはイオン交換カラム上での分別、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカまたは陽イオン交換樹脂（ＤＥＡＥ等）上でのクロマトグラフィー、クロマト分画、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿、及び例えばＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５を使用したゲル濾過。
【０４８２】
一態様では、固相上に固定化されたタンパク質Ａが、本発明の全長抗体産物の免疫親和性精製に使用される。タンパク質Ａは、高親和性で抗体のＦｃ領域に結合する黄色ブドウ球菌由来の４１ｋＤの細胞壁タンパク質である。Ｌｉｎｄｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３。タンパク質Ａが固定化される固相は、好ましくは、ガラスまたはシリカ表面を含むカラム、より好ましくは、制御細孔ガラスカラムまたはケイ酸カラムである。いくつかの適用では、このカラムは、汚染物質の非特異的付着を阻止するために、グリセロール等の試薬でコーティングされている。
【０４８３】
精製の第１のステップとして、上述の細胞培養由来の調製物がタンパク質Ａ固定化固相に適用されて、目的とする抗体のタンパク質Ａへの特異的結合を可能にする。その後、固相が洗浄されて、固相に非特異的に結合した汚染物質が除去される。最終的に、目的とする抗体が溶出により固相から回収される。
【０４８４】
ｂ．真核宿主細胞を使用した抗体の生成
ベクター成分としては、一般に、以下：シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、及び転写終結配列のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４８５】
（ｉ）シグナル配列成分
真核宿主細胞で使用するためのベクターは、目的とする成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドも含有し得る。選択される異種シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞によって認識及び処理される（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）配列である。哺乳類細胞発現において、哺乳類シグナル配列、ならびにウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。
【０４８６】
かかる前駆体領域のＤＮＡがリーディングフレーム内で本抗体をコードするＤＮＡにライゲートされる。
【０４８７】
（ｉｉ）複製起点
一般に、複製起点成分は、哺乳類発現ベクターに必要ではない。例えば、ＳＶ４０起点が初期プロモーターを含有するため、ＳＶ４０起点が典型的に使用され得る。
【０４８８】
（ｉｉｉ）選択遺伝子成分
発現及びクローニングベクターは、選択可能なマーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含有し得る。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、またはテトラサイクリンへの耐性を付与するタンパク質、（ｂ）関連性がある場合、栄養要求性欠損を補足するタンパク質、または（ｃ）複合培地から入手不可能な重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
【０４８９】
選択スキームの一例は、宿主細胞の成長を停止させるための薬物を利用する。異種遺伝子での形質転換に成功した細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を産生し、それ故に、選択レジメンに耐えて生き残る。かかる優性選択の例は、ネオマイシン、ミコフェノール酸、及びハイグロマイシンといった薬物の使用である。
【０４９０】
哺乳類細胞に好適な選択可能なマーカーの別の例は、ＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン−Ｉ及び−ＩＩ、好ましくは霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等の抗体核酸の取り込みにコンピテントな細胞の特定を可能にするものである。
【０４９１】
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換された細胞は、形質転換体の全てを、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトレキサート（Ｍｔｘ）を含有する培養培地中で培養することによって最初に特定される。野生型ＤＨＦＲが用いられる場合、適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性が欠損したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０９６）である。
【０４９２】
あるいは、抗体、野生型ＤＨＦＲタンパク質、及び別の選択可能なマーカー、例えば、アミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）をコードするＤＮＡ配列で形質転換または共形質転換された宿主細胞（具体的には、内因性ＤＨＦＲを含有する野生型宿主）が、選択可能なマーカーの選択剤、例えば、アミノグリコシド抗生物質、例えば、カナマイシン、ネオマイシン、またはＧ４１８を含有する培地中での細胞成長によって選択され得る。米国特許第４，９６５，１９９号を参照されたい。
【０４９３】
（ｉｖ）プロモーター成分
発現及びクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、かつ抗体ポリペプチド核酸に作動可能に連結されるプロモーターを含有する。真核生物のプロモーター配列が既知である。実質的には、全ての真核遺伝子は、転写が開始する部位からおよそ２５〜３０塩基上流に位置するＡＴに富んだ領域を有する。多くの遺伝子の転写開始から７０〜８０塩基上流に見られる別の配列は、Ｎが任意のヌクレオチドであり得るＣＮＣＡＡＴ領域である。大半の真核遺伝子の３’末端は、ポリＡ尾部のコード配列の３’末端への付加のためのシグナルであり得るＡＡＴＡＡＡ配列である。これらの配列は全て、真核発現ベクターに好適に挿入される。
【０４９４】
哺乳類宿主細胞におけるベクターからの抗体ポリペプチド転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２等）、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）等のウイルスのゲノムから、異種哺乳類プロモーター、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターから、熱ショックプロモーターから得られるプロモーターによって制御されるが、但し、かかるプロモーターが宿主細胞系と適合性であることを条件とする。
【０４９５】
ＳＶ４０ウイルスの早期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含有するＳＶ４０制限断片として好都合に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの前初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限断片として好都合に得られる。ベクターとしてウシ乳頭腫ウイルスを使用して哺乳類宿主におけるＤＮＡを発現させるための系は、米国特許第４，４１９，４４６号に開示されている。この系の修飾は、米国特許第４，６０１，９７８号に記載されている。あるいは、ラウス肉腫ウイルス長末端反復配列をプロモーターとして使用することができる。
【０４９６】
（ｖ）エンハンサー要素成分
より高次の真核生物による本発明の抗体ポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、多くの場合、エンハンサー配列をベクターに挿入することによって増加する。現在、哺乳類遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトタンパク質、及びインスリン）由来の多くのエンハンサー配列が既知である。しかしながら、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用する。例としては、複製起点の後期側（ｂｐ１００〜２７０）のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス早期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。真核プロモーターの活性化のためのエンハンサー要素については、Ｙａｎｉｖ，Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：１７−１８（１９８２）も参照されたい。このエンハンサーは、抗体ポリペプチドコード配列に対して５’位または３’位でベクターにスプライスされるが、好ましくは、プロモーターから５’部位に位置する。
【０４９７】
（ｖｉ）転写終結成分
真核宿主細胞で使用される発現ベクターは、典型的には、転写終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含有する。かかる配列は、一般に、真核またはウイルスＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’非翻訳領域、時折、３’非翻訳領域から入手可能である。これらの領域は、抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分中のポリアデニル化断片として転写されたヌクレオチドセグメントを含有する。１つの有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ９４／１１０２６及びそこに開示される発現ベクターを参照されたい。
【０４９８】
（ｖｉｉ）宿主細胞の選択及び形質転換
本明細書でのベクターにおけるＤＮＡのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞としては、脊椎動物宿主細胞を含む本明細書に記載のより高次の真核生物細胞が挙げられる。脊椎動物培養細胞（組織培養）の繁殖が日常的な手技になっている。有用な哺乳類宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）、ヒト胚腎臓株（懸濁培養における成長のためにサブクローニングされた２９３または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））、サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞、及びヒト肝細胞癌株（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。
【０４９９】
宿主細胞は、抗体産生のために上述の発現またはクローニングベクターで形質転換され、必要に応じて、プロモーターを誘導するか、形質転換体を選択するか、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するように修飾された従来の栄養素培地中で培養される。
【０５００】
（ｖｉｉｉ）宿主細胞の培養
本発明の抗体を産生するために使用される宿主細胞は、様々な培地中で培養され得る。市販の培地、例えば、ハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びダルベッコ修飾イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）が、宿主細胞の培養に好適である。加えて、Ｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号、同第４，６５７，８６６号、同第４，９２７，７６２号、同第４，５６０，６５５号、もしくは同第５，１２２，４６９号、ＷＯ９０／０３４３０、ＷＯ８７／００１９５、または米国再発行特許第３０，９８５号に記載の培地のうちのいずれかを、宿主細胞の培養培地として使用することができる。これらの培地のうちのいずれかには、必要に応じて、ホルモン及び／または他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、または上皮成長因等子）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩等）、緩衝液（ＨＥＰＥＳ等）、ヌクレオチド（アデノシン及びチミジン等）、抗生物質（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬物等）、微量元素（通常マイクロモル範囲の最終密度で存在する無機化合物と定義される）、ならびにグルコースまたは等価エネルギー源が補充され得る。任意の他の必要な補充物も当業者に既知の適切な濃度で含まれ得る。温度、ｐＨ等の培養条件は、発現のために選択された宿主細胞で以前に使用された条件であり、当業者に明らかである。
【０５０１】
（ｉｘ）抗体の精製
組換え技法を使用する際、本抗体は、細胞内に産生され得るか、または培地に直接分泌され得る。本抗体が第１のステップとして細胞内に産生される場合、粒子残屑（宿主細胞または溶解断片のいずれか）は、例えば、遠心分離または限外濾過によって除去される。本抗体が培地に分泌される場合、かかる発現系由来の上清は、一般に、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過装置を使用して最初に濃縮される。タンパク質分解を阻害するためのＰＭＳＦ等のプロテアーゼ阻害剤が前述のステップのうちのいずれかに含まれ得、外来性汚染物質の成長を阻止するための抗生物質が含まれ得る。
【０５０２】
細胞から調製された抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及び親和性クロマトグラフィーを使用して精製され得、親和性クロマトグラフィーが好ましい精製技法である。タンパク質Ａの親和性リガンドとしての適合性は、本抗体中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプに依存する。タンパク質Ａを使用して、ヒトγ１、γ２、またはγ４重鎖に基づく抗体を精製することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３（１９８３））。タンパク質Ｇが全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている（Ｇｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．５：１５６７１５７５（１９８６））。親和性リガンドが結合するマトリックスは、ほとんどの場合、アガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。制御細孔ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼン等の機械的に安定なマトリックスは、アガロースで達成されるよりも速い流速及び短い処理時間を可能にする。本抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）が精製に有用である。タンパク質を精製するための他の技法、例えば、イオン交換カラム上での分別、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー、ヘパリンセファロース（商標）上でのクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラム等）上でのクロマトグラフィー、クロマト分画、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿も回収される抗体に応じて利用可能である。
【０５０３】
任意の予備精製ステップ（複数可）後、目的とする抗体及び汚染物質を含む混合物が、約２．５〜４．５のｐＨの溶出緩衝液を使用して、低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに供され得り、好ましくは、低塩濃度（例えば、約０〜０．２５Ｍの塩）で行われ得る。
【０５０４】
免疫コンジュゲート
本発明は、細胞毒性薬、例えば、化学療法剤、薬物、成長阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素、またはその断片）、または放射性同位体（すなわち、放射性コンジュゲート）のうちのいずれかにコンジュゲートされる本明細書に記載の抗ＦＧＦＲ２／３抗体を含む免疫コンジュゲート（同義に「抗体−薬物コンジュゲート」または「ＡＤＣ」と呼ばれる）も提供する。
【０５０５】
癌の治療における細胞毒性剤または細胞増殖抑制剤、すなわち、腫瘍細胞を死滅させるか、または阻害する薬物の局所送達のための抗体−薬物コンジュゲートの使用（Ｓｙｒｉｇｏｓ  ａｎｄ  Ｅｐｅｎｅｔｏｓ（１９９９）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９：６０５−６１４、Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ−Ｄｕｖａｚ  ａｎｄ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（１９９７）Ａｄｖ．Ｄｒｇ．Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．２６：１５１−１７２、米国特許第４，９７５，２７８号）により、薬物部分の腫瘍への標的送達及びそこでの細胞内蓄積が可能になり、これらのコンジュゲートされていない薬物の全身投与により、正常細胞にも排除が要求されている腫瘍細胞にも許容できないレベルの毒性がもたらされ得る（Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｌａｎｃｅｔ  ｐｐ．（Ｍａｒ．１５，１９８６）：６０３−０５、Ｔｈｏｒｐｅ，（１９８５）“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ，”ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａ．Ｐｉｎｃｈｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．ｓ），ｐｐ．４７５−５０６）。それにより、最小毒性での最大有効性が求められる。ポリクローナル抗体もモノクローナル抗体もいずれもこれらの戦略において有用なものとして報告されている（Ｒｏｗｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２１：１８３−８７）。これらの方法で使用される薬物としては、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキサート、及びビンデシン（Ｒｏｗｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）（上記参照））。抗体−毒素コンジュゲートに使用される毒素としては、細菌毒素、例えば、ジフテリア毒素、植物毒素、例えば、リシン、小分子毒素、例えば、ゲルダナマイシン（Ｍａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｊｏｕｒ．ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９２（１９）：１５７３−１５８１、Ｍａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １０：１０２５−１０２８、Ｍａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１３：７８６−７９１）、メイタンシノイド（ＥＰ１３９１２１３、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：８６１８−８６２３）、及びカリケアマイシン（Ｌｏｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：２９２８、Ｈｉｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：３３３６−３３４２）が挙げられる。これらの毒素は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合、またはトポイソメラーゼ阻害を含む機構によるそれらの細胞毒性効果及び細胞増殖抑制性効果をもたらし得る。いくつかの細胞毒性薬物は、大きい抗体またはタンパク質受容体リガンドにコンジュゲートされた場合、不活性であるか、または活性が低い傾向がある。
【０５０６】
ＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標）（イブリツモマブチウキセタン、Ｂｉｏｇｅｎ／Ｉｄｅｃ）は、正常リンパ球及び悪性Ｂリンパ球の表面に見られるＣＤ２０抗原に対して指向されたマウスＩｇＧ１カッパモノクローナル抗体、及びチオ尿素リンカー−キレート剤によって結合された１１１Ｉｎまたは９０Ｙ放射性同位体から成る抗体−放射性同位体コンジュゲートである（Ｗｉｓｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｅｕｒ．Ｊｏｕｒ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２７（７）：７６６−７７、Ｗｉｓｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｂｌｏｏｄ  ９９（１２）：４３３６−４２、Ｗｉｔｚｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０（１０）：２４５３−６３、Ｗｉｔｚｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０（１５）：３２６２−６９）。ＺＥＶＡＬＩＮがＢ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）に対する活性を有するが、投与により、大半の患者において重度の長期に及ぶ血球減少症がもたらされる。カリケアマイシンに連結されたｈｕ  ＣＤ３３抗体から成る抗体−薬物コンジュゲートであるＭＹＬＯＴＡＲＧ（商標）（ゲムツズマブオゾガマイシン、Ｗｙｅｔｈ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）が、注射による急性骨髄性白血病のための薬物として２０００年に承認された（Ｄｒｕｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｕｔｕｒｅ（２０００）２５（７）：６８６、米国特許第４，９７０，１９８号、同第５，０７９，２３３号、同第５，５８５，０８９号、同第５，６０６，０４０号、同第５，６９３７，６２号、同第５，７３９，１１６号、同第５，７６７，２８５号、同第５，７７３，００１号）。ジスルフィドリンカーＳＰＰを介してメイタンシノイド薬物部分ＤＭ１に連結されたｈｕＣ２４２抗体から成る抗体−薬物コンジュゲートであるカンツズマブメルタンシン（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）は、結腸癌、膵臓癌、胃癌等のＣａｎＡｇを発現する癌の治療のための第ＩＩ相試験に進んでいる。メイタンシノイド薬物部分ＤＭ１に連結された抗前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）モノクローナル抗体から成る抗体−薬物コンジュゲートであるＭＬＮ−２７０４（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍ．，ＢＺＬ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．）は、前立腺腫瘍の治療可能性のために開発中である。ドラスタチンの合成類似体であるアウリスタチンペプチド、アウリスタチンＥ（ＡＥ）、及びモノメチルアウリスタチン（ＭＭＡＥ）が、キメラモノクローナル抗体ｃＢＲ９６（癌腫のルイスＹに特異的）及びｃＡＣ１０（血液学的悪性腫瘍のＣＤ３０に特異的）にコンジュゲートされており（Ｄｏｒｏｎｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１（７）：７７８−７８４）、治療のために開発中である。
【０５０７】
免疫コンジュゲートの生成に有用な化学療法剤が本明細書に記載（例えば、上述）されている。使用され得る酵素的に活性な毒素及びそれらの断片としては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシ阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ阻害剤、ゲロニン、マイトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、及びトリコテセンが挙げられる。例えば、１９９３年１０月２８日公開のＷＯ９３／２１２３２を参照されたい。様々な放射性核種が放射性コンジュゲート抗体の産生に利用可能である。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、及び１８６Ｒｅが挙げられる、抗体と細胞毒性薬とのコンジュゲートは、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（アジプイミド酸ジメチルＨＣｌ等）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジル等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン等）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン等）、ジイソシアン酸塩（２，６−ジイソシアン酸トルエン等）、及びビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン等）を使用して作製される。例えば、リシン免疫毒素を、Ｖｉｔｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８：１０９８（１９８７）に記載されるように調製することができる。炭素−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）が、放射性ヌクレオチドを本抗体にコンジュゲートするための例示のキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照されたい。
【０５０８】
抗体と１つ以上の小分子毒素とのコンジュゲート、例えば、カリケアマイシン、メイタンシノイド、ドラスタチン、アウリスタチン、トリコテセン、及びＣＣ１０６５、ならびに毒素活性を有するこれらの毒素の誘導体も本明細書で企図される。
【０５０９】
ｉ．メイタンシン及びメイタンシノイド
いくつかの実施形態では、免疫コンジュゲートは、１つ以上のメイタンシノイド分子にコンジュゲートされた本発明の抗体（全長または断片）を含む。
【０５１０】
メイタンシノイドは、チューブリン重合の阻害によって作用する有糸分裂阻害剤である。メイタンシンは、東アフリカ低木メイテナス・セラタから最初に単離された（米国特許第３，８９６，１１１号）。その後、ある特定の微生物もマイタンシノール及びＣ−３マイタンシノールエステル等のメイタンシノイドを産生することが発見された（米国特許第４，１５１，０４２号）。合成マイタンシノールならびにその誘導体及び類似体が、例えば、米国特許第４，１３７，２３０号、同第４，２４８，８７０号、同第４，２５６，７４６号、同第４，２６０，６０８号、同第４，２６５，８１４号、同第４，２９４，７５７号、同第４，３０７，０１６号、同第４，３０８，２６８号、同第４，３０８，２６９号、同第４，３０９，４２８号、同第４，３１３，９４６号、同第４，３１５，９２９号、同第４，３１７，８２１号、同第４，３２２，３４８号、同第４，３３１，５９８号、同第４，３６１，６５０号、同第４，３６４，８６６号、同第４，４２４，２１９号、同第４，４５０，２５４号、同第４，３６２，６６３号、及び同第４，３７１，５３３号に開示されている。
【０５１１】
メイタンシノイド薬物部分は、抗体−薬物コンジュゲートにおいて魅力的な薬物部分であり、それは、イタンシノイド薬物部分が、（ｉ）発酵または化学修飾、発酵産物の誘導体化により比較的調製しやすく、（ｉｉ）非ジスルフィドリンカーによる抗体へのコンジュゲーションに好適な官能基での誘導体化に対応でき、（ｉｉｉ）血漿中で安定しており、かつ（ｉｖ）様々な腫瘍細胞株に対して有効であるためである。
【０５１２】
メイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲート、それを作製する方法、及びそれらの治療的使用が、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号、同第５，４１６，０６４号、及び欧州特許第０  ４２５  ２３５  Ｂ１号に開示されており、それらの開示は、参照により本明細書に明確に組み込まれる。Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：８６１８−８６２３（１９９６）は、ヒト結腸直腸癌に対して指向されたモノクローナル抗体Ｃ２４２に連結されたＤＭ１と指定されたメイタンシノイドを含む免疫コンジュゲートについて記載している。このコンジュゲートは、培養された結腸癌細胞に対して高度に細胞毒性であることが見出され、インビボ腫瘍成長アッセイで抗腫瘍活性を示した。Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１（１９９２）は、メイタンシノイドが、ジスルフィドリンカーにより、ヒト結腸癌細胞株の抗原に結合するマウス抗体Ａ７またはＨＥＲ−２／ｎｅｕ癌遺伝子に結合する別のマウスモノクローナル抗体ＴＡ．１にコンジュゲートされた免疫コンジュゲートについて記載している。ＴＡ．１−メイタンシノイドコンジュゲートの細胞毒性が、１細胞当たり３×１０５個のＨＥＲ−２表面抗原を発現するヒト乳癌細胞株ＳＫ−ＢＲ−３においてインビトロで試験された。薬物コンジュゲートは、遊離メイタンシノイド薬物と同様の細胞毒性度を達成し、１抗体分子当たりのメイタンシノイド分子の数を増加させることによって増大させることができた。Ａ７−メイタンシノイドコンジュゲートは、マウスにおいて低い全身細胞毒性を示した。
【０５１３】
抗体−メイタンシノイドコンジュゲートは、抗体またはメイタンシノイド分子のいずれの生物学的活性も著しく低下させることなく抗体をメイタンシノイド分子に化学的に連結させることによって調製される。例えば、米国特許第５，２０８，０２０号（その開示は、参照により本明細書に明確に組み込まれる）を参照されたい。１抗体分子当たりの平均３〜４つのコンジュゲートされたメイタンシノイド分子が、抗体の機能または溶解性に悪影響を及ぼすことなく標的細胞の細胞毒性の強化に有効性を示したが、毒素／抗体の１つの分子であっても、ネイキッド抗体の使用により細胞毒性を強化することが予想された。メイタンシノイドが当該技術分野で周知であり、既知の技法によって合成され得るか、または天然源から単離され得る。好適なメイタンシノイドが、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号、ならびに本明細書に上述されている他の特許及び非特許刊行物に開示されている。好ましいメイタンシノイドは、芳香環または様々なマイタンシノールエステル等のマイタンシノール分子の他の位置が修飾されたマイタンシノール及びマイタンシノール類似体である。
【０５１４】
例えば、米国特許第５，２０８，０２０号または欧州特許第０  ４２５  ２３５  Ｂ１号、Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１（１９９２）、及び米国特許出願第１０／９６０，６０２号（２００４年１０月８日出願）に開示されるものを含む、抗体−メイタンシノイドコンジュゲートを作製するための当該技術分野で既知の連結基が多く存在し、それらの開示は、参照により本明細書に明確に組み込まれる。米国特許出願第１０／９６０，６０２号（２００４年１０月８日出願）に開示されるリンカー成分ＳＭＣＣを含む抗体−メイタンシノイドコンジュゲートを調製することができる。これらの連結基としては、上述の特許に開示される、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定基、感光性基、ペプチダーゼ不安定基、またはエステラーゼ不安定基が挙げられ、ジスルフィド基及びチオエーテル基が好ましい。更なる連結基が本明細書に記載及び例示されている。
【０５１５】
抗体とメイタンシノイドとのコンジュゲートは、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（アジプイミド酸ジメチルＨＣｌ等）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジル等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン等）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン等）、ジイソシアン酸（２，６−ジイソシアン酸トルエン等）、及びビス活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン等）を使用して作製され得る。ジスルフィド結合の提供に特に好ましいカップリング剤としては、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（Ｃａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１７３：７２３−７３７（１９７８））及びＮ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）が挙げられる。
【０５１６】
このリンカーは、結合の種類に応じて様々な位置でメイタンシノイド分子に結合し得る。例えば、エステル結合が従来のカップリング技法を使用したヒドロキシル基との反応によって形成され得る。この反応は、ヒドロキシル基を有するＣ−３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ−１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ−１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ−２０位で生じ得る。好ましい一実施形態では、結合は、マイタンシノールまたはマイタンシノール類似体のＣ−３位に形成される。
【０５１７】
ｉｉ．アウリスタチン及びドラスタチン
いくつかの実施形態では、免疫コンジュゲートは、ドラスタチンまたはドロスタチンペプチド類似体及び誘導体であるアウリスタチンにコンジュゲートされた本発明の抗体を含む（米国特許第５，６３５，４８３号及び同第５，７８０，５８８号）。ドラスタチン及びオーリスタチンは、微小管動態、ＧＴＰ加水分解、ならびに核及び細胞分裂を妨害し（Ｗｏｙｋｅ  ｅｔ  ａｌ（２００１）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５（１２）：３５８０−３５８４）、抗癌活性（米国特許第５，６６３，１４９号）及び抗真菌活性（Ｐｅｔｔｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４２：２９６１−２９６５）を有することが示されている。ドラスタチンまたはオーリスタチン薬物部分は、ペプチド薬物部分のＮ（アミノ）末端またはＣ（カルボキシル）末端を介して本抗体に結合することができる（ＷＯ０２／０８８１７２）。
【０５１８】
例示のアウリスタチン実施形態としては、「Ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌｖａｌｉｎｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  Ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｌｉｇａｎｄｓ」米国  第１０／９８３，３４０号（２００４年１１月５日出願）に開示されるＮ末端結合モノメチルアウリスタチン薬物部分ＤＥ及びＤＦが挙げられ、その開示は、参照によりその全体が明確に組み込まれる。
【０５１９】
典型的には、ペプチドベースの薬物部分は、２つ以上のアミノ酸及び／またはペプチド断片間にペプチド結合を形成することによって調製され得る。かかるペプチド結合は、例えば、ペプチド化学の分野で周知の液相合成法（Ｅ．Ｓｃｈｒｏｄｅｒ  ａｎｄ  Ｋ．Ｌｕｂｋｅ，“Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，”ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐｐ．７６−１３６，１９６５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）に従って調製され得る。アウリスタチン／ドラスタチン薬物部分は、米国特許第５，６３５，４８３号及び同第５，７８０，５８８号、Ｐｅｔｔｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：５４６３−５４６５、Ｐｅｔｔｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  １３：２４３−２７７、Ｐｅｔｔｉｔ，Ｇ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９９６，７１９−７２５、ならびにＰｅｔｔｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．１  ５：８５９−８６３の方法に従って調製され得る。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｄｏｒｏｎｉｎａ（２００３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１（７）：７７８−７８４「Ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌｖａｌｉｎｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  Ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｌｉｇａｎｄｓ」米国第１０／９８３，３４０号（２００４年１１月５日出願）（例えば、リンカーならびにリンカーにコンジュゲートされたＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ等のモノメチルバリン化合物を調製する方法を開示する）も参照されたい。
【０５２０】
ｉｉｉ．カリケアマイシン
他の実施形態では、免疫コンジュゲートは、１つ以上のカリケアマイシン分子にコンジュゲートされた本発明の抗体を含む。抗生物質のカリケアマイシンファミリーは、ピコモルを下回る濃度で二本鎖ＤＮＡ切断をもたらすことができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第５，７１２，３７４号、同第５，７１４，５８６号、同第５，７３９，１１６号、同第５，７６７，２８５号、同第５，７７０，７０１号、同第５，７７０，７１０号、同第５，７７３，００１号、及び同第５，８７７，２９６号（すべてＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｙａｎａｍｉｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を参照されたい。使用され得るカリケアマイシンの構造的類似体としては、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ−アセチル−γ１Ｉ、ＰＳＡＧ、及びθＩ１が挙げられるが、これらに限定されない（Ｈｉｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：３３３６−３３４２（１９９３）、Ｌｏｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５８：２９２５−２９２８（１９９８）、及び上述のＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｙａｎａｍｉｄの米国特許）。本抗体がコンジュゲートされ得る別の抗腫瘍薬物は、抗葉酸剤であるＱＦＡである。カリケアマイシンもＱＦＡもいずれも、細胞内作用部位を有し、原形質膜を容易には通過しない。したがって、抗体媒介内部化によるこれらの薬剤の細胞取り込みにより、それらの細胞毒性効果が大いに高まる。
【０５２１】
ｉｖ．他の細胞毒性薬
本発明の抗体にコンジュゲートされ得る他の抗腫瘍剤としては、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン、及び５−フルオロウラシル（米国特許第５，０５３，３９４号及び同第５，７７０，７１０号に記載のＬＬ−Ｅ３３２８８複合体として集合的に既知の薬剤のファミリー）、ならびにエスペラミシン（米国特許第５，８７７，２９６号）が挙げられる。
【０５２２】
使用され得る酵素的に活性な毒素及びそれらの断片としては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシ阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ阻害剤、ゲロニン、マイトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、及びトリコテセンが挙げられる。例えば、ＷＯ９３／２１２３２（１９９３年１０月２８日出願）を参照されたい。
【０５２３】
本発明は、抗体と核酸分解活性を有する化合物（例えば、リボヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えば、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ））との間に形成された免疫コンジュゲートを更に企図する。
【０５２４】
腫瘍を選択的に破壊する場合、本抗体は、高放射性原子を含み得る。様々な放射活性アイソトープが、放射性コンジュゲート抗体の産生に利用可能である。例としては、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、及びＬｕの放射性同位体が挙げられる。本コンジュゲートが検出に使用される場合、これは、シンチグラフ研究用に放射性原子、例えば、ｔｃ９９ｍもしくはＩ１２３、または核磁気共鳴（ＮＭＲ）映像法（別名、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ））用にスピン標識、例えば、この場合もヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン、または鉄を含み得る。
【０５２５】
放射性標識または他の標識は、既知の方法で本コンジュゲートに組み込まれ得る。例えば、ペプチドが生合成され得るか、または例えば水素の代わりにフッ素−１９を含む好適なアミノ酸前駆体を使用してアミノ酸化学合成によって合成され得る。ｔｃ９９ｍまたはＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、及びＩｎ１１１等の標識は、ペプチド中のシステイン残基を介して結合され得る。イットリウム−９０がリジン残基を介して結合され得る。ＩＯＤＯＧＥＮ法（Ｆｒａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．８０：４９−５７を使用して、ヨウ素−１２３を組み込むことができる。「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ」（Ｃｈａｔａｌ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９）は、他の方法について詳述している。
【０５２６】
抗体と細胞毒性薬とのコンジュゲートが、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（アジプイミド酸ジメチルＨＣｌ等）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジル等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン等）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン等）、ジイソシアン酸（２，６−ジイソシアン酸トルエン等）、及びビス活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン等）を使用して作製され得る。例えば、リシン免疫毒素を、Ｖｉｔｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１０９８（１９８７）に記載されるように調製することができる。炭素−１４標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドを抗体にコンジュゲートするための例示的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照されたい。このリンカーは、細胞内での細胞毒性薬物の放出を容易にする「切断可能なリンカー」であり得る。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、感光性リンカー、ジメチルリンカー、またはジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１（１９９２）、米国特許第５，２０８，０２０号）が使用され得る。
【０５２７】
本発明の化合物は、架橋剤試薬：ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、及びＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）を用いて調製されたＡＤＣを明確に企図するが、これらに限定されず、これらは、市販（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．，Ｕ．Ｓ．Ａ）されている。２００３−２００４  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ａｎｄ  Ｃａｔａｌｏｇの４６７〜４９８頁を参照されたい。
【０５２８】
ｖ．抗体−薬物コンジュゲートの調製
本発明の抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）において、抗体（Ａｂ）は、リンカー（Ｌ）を介して、１つ以上の薬物部分（Ｄ）（例えば、１抗体当たり約１〜約２０個の薬物部分）にコンジュゲートされる。式ＩのＡＤＣは、当業者に既知の有機化学反応、条件、及び試薬を用いて、（１）抗体の求核基を二価リンカー試薬と反応させて、共有結合によりＡｂ−Ｌを形成し、その後、薬物部分Ｄと反応させる手段、及び（２）薬物部分の求核基を二価リンカー試薬と反応させて、共有結合によりＤ−Ｌを形成し、その後、抗体の求核基と反応させる手段を含むいくつかの経路によって調製され得る。ＡＤＣを調製するための更なる方法が本明細書に記載されている。
Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐ    Ｉ
【０５２９】
このリンカーは、１つ以上のリンカー成分から成り得る。例示のリンカー成分としては、６−マレイミドカプロイル（「ＭＣ」）、マレイミドプロパノイル（「ＭＰ」）、バリン−シトルリン（「ｖａｌ−ｃｉｔ」）、アラニン−フェニルアラニン（「ａｌａ−ｐｈｅ」）、ｐ−アミノベンジルオキシカルボキシル（「ＰＡＢ」）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（「ＳＰＰ」）、Ｎ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１カルボキシレート（「ＳＭＣＣ’）、及びＮ−スクシンイミジル（４−ヨード−アセチル）アミノベンゾエート（「ＳＩＡＢ」）が挙げられる。更なるリンカー成分が当該技術分野で既知であり、それらのうちのいくつかが本明細書に記載されている。「Ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌｖａｌｉｎｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  Ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｌｉｇａｎｄｓ」米国  第１０／９８３，３４０号（２００４年１１月５日出願）も参照されたく、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０５３０】
いくつかの実施形態では、リンカーは、アミノ酸残基を含み得る。例示のアミノ酸リンカー成分としては、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、またはペンタペプチドが挙げられる。例示のジペプチドとしては、バリン−シトルリン（ｖｃまたはｖａｌ−ｃｉｔ）、アラニン−フェニルアラニン（ａｆまたはａｌａ−ｐｈｅ）が挙げられる。例示のトリペプチドとしては、グリシン−バリン−シトルリン（ｇｌｙ−ｖａｌ−ｃｉｔ）及びグリシン−グリシン−グリシン（ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ）が挙げられる。アミノ酸リンカー成分を含むアミノ酸残基としては、天然に存在するもの、ならびに微量アミノ酸及び天然に存在しないアミノ酸類似体、例えば、シトルリンが挙げられる。アミノ酸リンカー成分は、それらの選択時に、特定の酵素、例えば、腫瘍関連プロテアーゼ、カテプシンＢ、Ｃ、及びＤ、またはプラスミンプロテアーゼによる酵素的切断のために設計及び最適化され得る。
【０５３１】
抗体の求核基としては、（ｉ）Ｎ末端アミン基、（ｉｉ）側鎖アミン基、例えば、リジン、（ｉｉｉ）側鎖チオール基、例えば、システイン、及び（ｉｖ）本抗体がグリコシル化される糖ヒドロキシル基またはアミノ基が挙げられるが、これらに限定されない。アミン基、チオール基、及びヒドロキシル基は、求核性であり、（ｉ）活性エステル、例えば、ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメート、及び酸ハロゲン化物、（ｉｉ）アルキル及びベンジルハロゲン化物、例えば、ハロアセトアミド、（ｉｉｉ）アルデヒド基、ケトン基、カルボキシル基、及びマレイミド基を含むリンカー部分及びリンカー試薬の求電子基と反応して共有結合を形成することができる。ある特定の抗体は、還元可能な鎖間ジスルフィド、すなわち、システイン架橋を有する。抗体は、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）等の還元剤での処理によってリンカー試薬とのコンジュゲーションに反応するようにさせられ得る。したがって、各システイン架橋は、理論上、２つの反応性チオール求核剤を形成する。リジンを２−イミノチオラン（トラウト試薬）と反応させることにより更なる求核基が抗体に導入されて、アミンのチオールへの変換がもたらされ得る。１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のシステイン残基を導入することにより（例えば、１つ以上の非天然システインアミノ酸残基を含む変異抗体を調製することにより）、反応性チオール基が抗体に導入され得る。
【０５３２】
本発明の抗体−薬物コンジュゲートは、抗体を修飾してリンカー試薬または薬物の求核置換基と反応することができる求電子部分を導入することによって産生することもできる。グリコシル化抗体の糖が、例えば、過ヨウ素酸塩酸化試薬で酸化されて、リンカー試薬または薬物部分のアミン基と反応することができるアルデヒド基またはケトン基を形成することができる。結果として生じるイミンシッフ塩基は、安定した結合を形成することができるか、または例えばホウ化水素試薬によって還元されて、安定したアミン結合を形成することができる。一実施形態では、グリコシル化抗体の炭水化物部分のガラクトースオキシダーゼまたはメタ過ヨウ素酸ナトリウムのいずれかとの反応により、薬物の適切な基と反応することができるタンパク質中にカルボニル（アルデヒド及びケトン）基を産出することができる（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）。別の実施形態では、Ｎ末端セリンまたはトレオニン残基を含有するタンパク質がメタ過ヨウ素酸ナトリウムと反応して、第１のアミノ酸の代わりにアルデヒドの産生をもたらすことができる（Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ  ＆  Ｓｔｒｏｈ，（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．３：１３８−１４６、米国特許第５，３６２，８５２号）。かかるアルデヒドは、薬物部分またはリンカー求核剤と反応することができる。
【０５３３】
同様に、薬物部分の求核基としては、リンカー部分及びリンカー試薬の求電子基と反応して共有結合を形成することができるアミン基、チオール基、ヒドロキシル基、ヒドラジド基、オキシム基、ヒドラジン基、チオセミカルバゾン基、ヒドラジンカルボキシレート基、及びアリールヒドラジド基が挙げられるが、これらに限定されず、これらのリンカー部分及びリンカー試薬の求電子基は、（ｉ）活性エステル、例えば、ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメート、及び酸ハロゲン化物、（ｉｉ）アルキル及びベンジルハロゲン化物、例えば、ハロアセトアミド、（ｉｉｉ）アルデヒド基、ケトン基、カルボキシル基、及びマレイミド基を含む。
【０５３４】
あるいは、抗体及び細胞毒性薬を含む融合タンパク質は、例えば、組換え技法またはペプチド合成によって作製され得る。ＤＮＡの長さは、互いに隣接しているか、またはコンジュゲートの所望の特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域によって分離されているかのいずれかのコンジュゲートの２つの部分をコードするそれぞれの領域を含み得る。
【０５３５】
なお別の実施形態では、本抗体は、腫瘍の事前標的に利用するための「受容体」（かかるストレプトアビジン）にコンジュゲートされ得、この抗体−受容体コンジュゲートが個体に投与され、続いて、除去剤を使用して結合していないコンジュゲートが血液循環から除去され、その後、細胞毒性薬（例えば、放射性ヌクレオチド）にコンジュゲートされた「リガンド」（例えば、アビジン）が投与される。
【０５３６】
抗ＦＧＦＲ２／３抗体の使用方法
本発明は、この治療薬の活性から有益な効果を提供するよう意図された特定の治療レジメンの一環としてのＦＧＦＲ２／３抗体の使用を特色とする。本発明は、様々な病期の様々な種類の癌の治療に特に有用である。
【０５３７】
癌という用語は、前癌成長、良性腫瘍、及び悪性腫瘍を含むが、これらに限定されない一群の増殖性障害を包含する。良性腫瘍とは、発生部位に局在した状態のままであり、遠位部位に浸潤するか、入り込むか、または転移する能力を有しない腫瘍を意味する。悪性腫瘍は、腫瘍周辺の他の組織に入り込み、それらを損傷する。それらは、その発生部位から離脱して、通常、血流またはリンパ節が位置するリンパ系を通って身体の他の部分に広がる（転移する）能力も獲得する。原発腫瘍は、それらが生じる組織型によって分類され、転移性腫瘍は、癌細胞が生じる組織型によって分類される。時間とともに、悪性腫瘍の細胞はより異常になり、正常細胞には見えなくなる。癌細胞のこの外観変化は腫瘍悪性度と呼ばれ、癌細胞は、高分化（低悪性度）、中分化、低分化、または未分化（高悪性度）とされる。高分化細胞は極めて正常に見え、それらが生じる正常細胞と似ている。未分化細胞とは、異常すぎてもはや細胞の起源を決定することができなくなった細胞である。
【０５３８】
癌病期分類システムは、癌が解剖学的にどの程度広がっているかを説明し、同様の予後及び治療を有する患者を同じ病期分類群に入れるよう試みる。生検及びある特定の画像検査、例えば、胸部Ｘ線、マンモグラム、骨のスキャン、ＣＴスキャン、及びＭＲＩスキャンを含む癌の病期分類の助けとなるいくつかの試験が行われ得る。患者の全体的な健康状態を評価し、癌がある特定の臓器に広がっているかを検出するために、血液検査及び臨床評価も使用される。
【０５３９】
癌を病期分類するために、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｃａｎｃｅｒは、最初にＴＮＭ分類システムを使用して、癌、具体的には、固形腫瘍を文字カテゴリーに入れる。癌は、文字Ｔ（腫瘍サイズ）、Ｎ（触知可能な結節）、及び／またはＭ（転移）と指定される。Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、及びＴ４は、原発病巣の大きさの増加を表し、Ｎ０、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３は、進行性結節関与を示し、Ｍ０及びＭ１は、遠隔転移の不在または存在を反映する。
【０５４０】
第２の病期分類法（別名、全病期群分けまたはローマ数字病期分類）では、癌は、原発病巣の大きさ、ならびに結節の広がり及び遠隔転移の存在を組み込む病期０〜ＩＶに分けられる。このシステムでは、症例がローマ数字Ｉ〜ＩＶで示される４つの病期に群分けされるか、または「再発性」と分類される。いくつかの癌の場合、病期０は、乳癌の上皮内腺管癌または上皮内小葉癌等の「上皮内」または「Ｔｉｓ」と称される。高悪性度の腺腫は、病期０と分類される場合もある。一般に、病期Ｉ癌が通常治癒可能な小さい限局性癌である一方で、病期ＩＶは、通常、手術不可能な癌または転移性癌を表す。病期ＩＩ及びＩＩＩ癌は、通常、局所進行性であり、かつ／または局所リンパ節の関与を呈する。一般に、より高い数の病期は、より大きい腫瘍サイズならびに／または原発腫瘍に隣接する近くのリンパ節及び／もしくは臓器への癌の広がりを含む、より広範囲に及ぶ疾患を示す。これらの病期は正確に定義されているが、この定義は、癌の種類毎に異なり、当業者に既知である。
【０５４１】
ＮＣＩ’ｓ  Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ、Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ、及びＥｎｄ  Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｇｒａｍ（ＳＥＥＲ）等の多くの癌登録所が、要約病期分類を使用している。このシステムは、全ての種類の癌に使用される。このシステムにより、癌症例が５つの主なカテゴリーに群分けされる。
上皮内とは、癌が生じる細胞の層にしか存在しない早期癌である。
限局性とは、広がりの兆候が見られない癌が生じた臓器に限局される癌である。
局所性とは、発生（原発）部位を越えてリンパ節または臓器及び組織近くまで広がった癌である。
遠隔とは、原発部位から遠隔臓器または遠隔リンパ節まで広がった癌である。
未知は、病期を示すのに十分な情報がない症例を表すために使用される。
【０５４２】
加えて、原発腫瘍が除去されてから数ヶ月または数年後の癌の再発が一般的である。全ての目に見える腫瘍が根絶された後に再発する癌は、再発性疾患と呼ばれる。原発腫瘍の領域に再発する疾患は、局所再発性のものであり、転移として再発する疾患は、遠隔再発と称される。
【０５４３】
腫瘍は、固形腫瘍または非固形もしくは軟組織腫瘍であり得る。軟組織腫瘍の例としては、白血病（例えば、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、成人急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、成熟Ｂ細胞急性リンパ性白血病、慢性リンパ球性白血病、前リンパ球性白血病、もしくはヘアリー細胞白血病）、またはリンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、もしくはホジキン病）が挙げられる。固形腫瘍は、血液、骨髄、またはリンパ系以外の身体組織の任意の癌を含む。固形腫瘍は、上皮細胞起源のものと非上皮細胞起源のものに更に分けられ得る。上皮細胞固形腫瘍の例としては、胃腸管、結腸、乳房、前立腺、肺、腎臓、肝臓、膵臓、卵巣、頭頸部、口腔、胃、十二指腸、小腸、大腸、肛門、胆嚢、唇、鼻咽頭、皮膚、子宮、生殖器官、泌尿器、膀胱、及び皮膚の腫瘍が挙げられる。非上皮起源の固形腫瘍としては、肉腫、脳腫瘍、及び骨腫瘍が挙げられる。腫瘍の他の例が定義の項に記載されている。
【０５４４】
いくつかの実施形態では、本明細書における患者は、例えば、治療前及び／または治療中及び／または治療後に、診断試験に供される。一般に、診断試験が行われる場合、試料は、治療を必要とする患者から得ることができる。対象が癌を有する場合、試料は、腫瘍試料、または他の生体試料、例えば、血液、尿、唾液、腹水、または血清及び血漿等の誘導体を含むが、これらに限定されない生体液であり得る。
【０５４５】
本明細書における生体試料は、固定試料、例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料、または凍結試料であり得る。
【０５４６】
ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を決定するための様々な方法としては、遺伝子発現プロファイリング、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）等のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、マイクロアレイ分析、遺伝子発現連続分析（ＳＡＧＥ）、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ、大規模並列シグネチャー配列決定（ＭＰＳＳ）による遺伝子発現分析、プロテオミクス、免疫組織化学（ＩＨＣ）等が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、ｍＲＮＡが定量される。かかるｍＲＮＡ分析は、好ましくは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法を使用して、またはマイクロアレイ分析によって行われる。ＰＣＲが用いられる場合、好ましい形態のＰＣＲは、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）である。一実施形態では、上述の遺伝子のうちの１つ以上の発現は、例えば、同じ腫瘍型の他の試料と比較して中央値以上である場合に、陽性発現と見なされる。中央値発現レベルは、遺伝子発現の測定と本質的に同時に決定され得るか、また事前に決定されている場合がある。
【０５４７】
ＲＮＡ源として固定パラフィン包埋組織を使用して遺伝子発現をプロファイリングするための代表的なプロトコルのステップ、例えば、ｍＲＮＡ単離、精製、プライマー伸長、及び増幅が、様々な公開された雑誌論文（例えば、Ｇｏｄｆｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ２：８４−９１（２０００）、Ｓｐｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５８：４１９−２９（２００１））に提供されている。簡潔に、代表的なプロセスは、厚さ約１０マイクログラムのパラフィン包埋腫瘍組織試料切片の切断から始まる。その後、ＲＮＡが抽出され、タンパク質及びＤＮＡが除去される。ＲＮＡ濃度を分析した後に、ＲＮＡ修復及び／または増幅ステップが必要に応じて含まれ得、ＲＮＡが遺伝子特異的プロモーターを使用して逆転写され、その後、ＰＣＲが行われる。最後に、データが分析されて、試験された腫瘍試料において特定される特徴的な遺伝子発現パターンに基づいて、患者に利用可能な最良の治療選択肢（複数可）を特定する。
【０５４８】
遺伝子またはタンパク質発現の検出は、直接または間接的に決定され得る。
【０５４９】
癌におけるＦＧＦＲ２及び／またはＦＧＦＲ３の発現または転座または増幅を（直接または間接的に）決定することができる。様々な診断／予後アッセイがこれに利用可能である。一実施形態では、ＦＧＦＲ３過剰発現がＩＨＣによって分析される。腫瘍生検由来のパラフィン包埋組織切片がＩＨＣアッセイに供され、以下のようにＦＧＦＲ２及び／またはＦＧＦＲ３タンパク質染色強度判断基準に合致する：
スコア０：染色が観察されないか、または膜染色が腫瘍細胞の１０％未満で観察される。
スコア１＋：かすかな／ほとんど知覚できない膜染色が腫瘍細胞の１０％超で検出される。これらの細胞は、それらの膜の一部のみ染色されている。
スコア２＋：弱度→中程度の完全な膜染色が腫瘍細胞の１０％超で観察される。
スコア３＋：中程度〜強度の完全な膜染色が腫瘍細胞の１０％超で観察される。
【０５５０】
いくつかの実施形態では、ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３過剰発現評価の各々で０または１＋のスコアを有する腫瘍がＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３を過剰発現しないものと見なされ得る一方で、２＋または３＋のスコアを有する腫瘍は、ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３の各々を過剰発現するものと見なされ得る。
【０５５１】
いくつかの実施形態では、ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３の各々を過剰発現する腫瘍は、１細胞当たりの発現されるＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３分子の各々のコピー数に対応する免疫組織化学的スコアによって評定され得、生化学的に決定され得る。
０＝０〜９０個のコピー／細胞
１＋＝少なくとも約１００個のコピー／細胞
２＋＝少なくとも約１０００個のコピー／細胞
３＋＝少なくとも約１０，０００個のコピー／細胞
【０５５２】
あるいは、または加えて、ＦＩＳＨアッセイがホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍組織で行われて、腫瘍におけるＦＧＦＲ２及び／またはＦＧＦＲ３増幅または転座の存在または及び／または程度（存在する場合）を決定することができる。
【０５５３】
ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３活性化は、直接（例えば、リンＥＬＩＳＡ試験、若しくはリン酸化受容体を検出する他の手段によって）、または間接的に（例えば、活性化下流シグナル伝達経路成分の検出、受容体二量体（例えば、ホモ二量体、ヘテロ二量体）の検出、遺伝子発現プロファイルの検出等によって決定され得る。
【０５５４】
同様に、恒常的ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３ならびに／またはリガンド非依存性もしくはリガンド依存性ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３は、直接または間接的に（例えば、恒常的活性と相関する受容体変異の検出、恒常的活性と相関する受容体増幅の検出等によって）検出され得る。
【０５５５】
核酸変異を検出するための方法が当該技術分野で周知である。多くの場合であって、必ずしもではないが、試料中の標的核酸が増幅されて、変異が存在するかを決定するために所望の量の物質を提供する。増幅技法が当該技術分野で周知である。例えば、増幅産物が、変異が存在すると思われる特定のアミノ酸／核酸配列位置を含む限り、増幅産物は、目的とするタンパク質をコードする核酸配列のすべてを包含してもしなくても良い。
【０５５６】
一例では、変異の存在は、試料由来の核酸を、変異核酸をコードする核酸に特異的にハイブリダイズすることができる核酸プローブと接触させ、そのハイブリダイゼーションを検出することによって決定され得る。一実施形態では、プローブは、例えば、放射性同位体（３Ｈ、３２Ｐ、３３Ｐ等）、蛍光剤（ローダミン、蛍光等）、または発色剤で検出可能に標識される。いくつかの実施形態では、プローブは、アンチセンスオリゴマー、例えば、ＰＮＡ、モルホリノ−ホスホロアミデート、ＬＮＡ、または２’−アルコキシアルコキシである。プローブは、約８ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、または約１０〜約７５、または約１５〜約５０、または約２０〜約３０であり得る。別の態様では、本発明の核酸プローブは、試料中のＦＧＦＲ２及び／またはＦＧＦＲ３変異を特定するためのキットに提供され、前記キットは、ＦＧＦＲ２及び／またはＦＧＦＲ３をコードする核酸における変異部位にまたはそれに隣接する部位に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む。このキットは、このキットを使用したハイブリダイゼーション試験の結果に基づいてＦＧＦＲ２及び／またはＦＧＦＲ３変異を含む腫瘍を有する患者をＦＧＦＲ２及び／またはＦＧＦＲ３アンタゴニストで治療するための指示を更に含み得る。
【０５５７】
変異は、増幅核酸の電気泳動移動度を、野生型ＦＧＦＲ２及び／またはＦＧＦＲ３をコードする対応する核酸の電気泳動移動度と比較することによって検出することもできる。移動度の差異は、増幅核酸配列における変異の存在を示す。電気泳動移動度は、例えばポリアクリルアミドゲル上での任意の適切な分子分離技法によって決定され得る。
【０５５８】
核酸は、酵素変異検出（ＥＭＤ）を使用して変異の検出についても分析され得る（Ｄｅｌ  Ｔｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４４：７３１−７３９，１９９８）。ＥＭＤは、点変異、挿入、及び欠失等の核酸改変に起因する塩基対ミスマッチによって引き起こされる構造的歪みを検出及び切断するまで二本鎖ＤＮＡに沿ってスキャンするバクテリオファージレゾルバーゼＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩを使用する。例えばゲル電気泳動によるレゾルバーゼ切断によって形成される２つの短い断片の検出は、変異の存在を示す。ＥＭＤ法の利点は、増幅反応から直接アッセイされる点変異、欠失、及び挿入を特定する単一のプロトコル、試料精製の必要性の排除、ハイブリダイゼーション時間の短縮、及び信号対雑音比の増加である。最大２０倍過剰の正常核酸及び最大４ｋｂの大きさの断片を含有する混合試料がアッセイされ得る。しかしながら、ＥＭＤスキャニングは、変異陽性試料で生じる特定の塩基の変化を特定せず、それ故に、多くの場合、必要に応じて特異的変異を特定する更なる配列決定手技を必要とする。米国特許第５，８６９，２４５号に示されるように、レゾルバーゼＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩと同様のＣＥＬ  Ｉ酵素が使用され得る。    
【０５５９】
変異を検出するための別の単純なキットは、ヘモクロマトーシスを引き起こすＨＦＥ、ＴＦＲ２、及びＦＰＮ１遺伝子における多重変異を検出するためのＨａｅｍｏｃｈｒｏｍａｔｏｓｉｓ  ＳｔｒｉｐＡｓｓａｙ（商標）（Ｖｉｅｎｎａｌａｂｓ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂａｍｂｕｒｇｈｍａｒｒｓｈ．ｃｏｍ／ｐｄｆ／４２２０．ｐｄｆ）と同様の逆ハイブリダイゼーション試験条片である。かかるアッセイは、配列特異的ハイブリダイゼーションに続くＰＣＲによる増幅に基づく。単一変異アッセイの場合、マイクロプレートベースの検出システムが適用され得る一方で、多重変異アッセイの場合、試験条片が「マクロアレイ」として使用され得る。キットは、試料調製、増幅、及び変異検出のための使用準備済の試薬を含み得る。多重増幅プロトコルにより利便性が提供され、非常に限られた体積での試料の試験が可能になる。この単純なＳｔｒｉｐＡｓｓａｙ形式を使用して、高価な装置を用いることなく２０以上の変異の試験を５時間未満で終了することができる。ＤＮＡが試料から単離され、標的核酸がインビトロで（例えば、ＰＣＲによって）増幅され、一般に単一（「多重」）増幅反応においてビオチンで標識される。その後、増幅産物がオリゴヌクレオチドプローブ（野生型及び変異体特異的）に選択的にハイブリダイズされ、これらのオリゴヌクレオチドプローブは、プローブが平行な線またはバンドとして固定化される試験条片等の固体支持体上に固定化されている。結合したビオチン化増幅産物がストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ及び色基質を使用して検出される。かかるアッセイは、本発明の変異の全てまたは任意のサブセットを検出することができる。特定の変異体プローブバンドに関して、３つのシグナル伝達パターン：（ｉ）正常核酸配列を示す野生型プローブのみのバンド、（ｉｉ）ヘテロ接合性遺伝子型を示す野生型プローブ及び変異体プローブの両方のバンド、ならびに（ｉｉｉ）ホモ接合性変異遺伝子型を示す変異体プローブのみのバンドのうちの１つが可能である。したがって、一態様では、本発明は、本発明の変異の検出方法であって、増幅産物がリガンドを含むように、標的ＦＧＦＲ２及び／またはＦＧＦＲ３核酸配列を試料から単離及び／または増幅することと、増幅産物を、リガンドに対する検出可能な結合パートナーを含むプローブであって、本発明の変異に特異的にハイブリダイズすることができる、プローブと接触させることと、その後、前記プローブの前記増幅産物へのハイブリダイゼーションを検出することと、を含む、方法を提供する。一実施形態では、リガンドは、ビオチンであり、結合パートナーは、アビジンまたはストレプトアビジンを含む。一実施形態では、結合パートナーは、色基質で検出可能なストレプトアビジン−アルカリを含む。一実施形態では、プローブは、例えば試験条片上に固定化され、異なる変異に相補的なプローブが互いに分離される。あるいは、増幅核酸は、放射性同位体で標識され、その場合、プローブは、検出可能な標識を含む必要はない。
【０５６０】
野生型遺伝子の改変は、すべての形態の変異、例えば、挿入、逆位、欠失、及び／または点変異を包含する。一実施形態では、変異は、体細胞変異である。体細胞変異は、ある特定の組織、例えば、腫瘍組織にのみ生じる変異であり、生殖系列に遺伝していない。生殖系列変異は、身体組織のうちのいずれかに見られ得る。
【０５６１】
標的核酸を含む試料は、当該技術分野で周知であり、かつ腫瘍の特定の種類及び位置に適切な方法によって得ることができる。組織生検は、多くの場合、代表的な腫瘍組織片を得るために使用される。あるいは、腫瘍細胞は、目的とする腫瘍細胞を含有することが知られているか、または含有すると考えられる組織／体液の形態で間接的に得ることができる。例えば、肺癌病巣の試料は、切除、気管支鏡検査、細針吸引、気管支擦過によって、痰、胸膜液、もしくは血液から得ることができる。変異体遺伝子または遺伝子産物は、腫瘍または他の身体試料、例えば、尿、痰、もしくは血清から検出され得る。腫瘍試料中の変異標的遺伝子または遺伝子産物の検出について上述されている同じ技法が、他の身体試料に適用され得る。癌細胞は、腫瘍から脱落し、かかる身体試料に見られるようになる。かかる身体試料をスクリーニングすることによって、癌等の疾患のための単純な早期診断が達成され得る。加えて、かかる身体試料を変異標的遺伝子または遺伝子産物について試験することによって、治療の経過がより容易に監視され得る。
【０５６２】
腫瘍細胞の組織調製物を濃縮するための手順が当該技術分野で既知である。例えば、組織は、パラフィンまたはクリオスタット切片から単離される。癌細胞は、フローサイトメトリーまたはレーザーキャプチャーマイクロダイセクションによって正常細胞からも分離され得る。これらの技法、ならびに腫瘍を正常細胞から分離するための他の技法が当該技術分野で周知である。腫瘍組織に多くの正常細胞が混入している場合、変異の検出がより困難になる場合があるが、混入及び／または偽陽性／偽陰性結果を最小限に抑えるための技法が既知であり、それらのうちのいくつかが以下の本明細書に記載されている。例えば、試料は、目的とする腫瘍細胞に関連するが、対応する正常細胞には関連しないことが知られている（またはその逆も同様である）バイオマーカー（変異を含む）の存在についても評価され得る。
【０５６３】
標的核酸における点変異の検出は、当該技術分野で周知の技法を使用した標的核酸の分子クローニング及び核酸の配列決定によって達成され得る。あるいは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等の増幅技法を使用して、標的核酸配列を腫瘍組織由来のゲノムＤＮＡ調製物から直接増幅することができる。その後、増幅配列の核酸配列が決定され、変異がそれから特定され得る。増幅技法、例えば、Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：４８７，１９８８、米国特許第４，６８３，２０３号、及び同第４，６８３，１９５号に記載のポリメラーゼ連鎖反応が当該技術分野で周知である。
【０５６４】
適切なプライマーの設計及び選択が当該技術分野で十分に確立された技法であることに留意されたい。
【０５６５】
当該技術分野で既知のリガーゼ連鎖反応を使用して、標的核酸配列を増幅させることができる。例えば、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｖｏｌ．４，ｐｐ．５６０−５６９（１９８９）を参照されたい。加えて、対立遺伝子特異的ＰＣＲとして既知の技法も使用することができる。例えば、Ｒｕａｎｏ  ａｎｄ  Ｋｉｄｄ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１７，ｐ．８３９２，１９８９を参照されたい。この技法に従って、プライマーの３’末端で特定の標的核酸変異にハイブリダイズするプライマーが使用される。特定の変異が存在しない場合、増幅産物は観察されない。欧州特許出願公開第０３３２４３５号、及びＮｅｗｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１７，ｐ．７，１９８９に開示される増幅不応性変異系（ＡＲＭＳ）も使用することができる。遺伝子の挿入及び欠失は、クローニング、配列決定、及び増幅によって検出することもできる。加えて、遺伝子または周囲のマーカー遺伝子の制限断片長多型（ＲＦＬＰ）プローブを使用して、多型断片に対立遺伝子の改変または挿入をスコア化することができる。一本鎖立体配座多型（ＳＳＣＰ）分析を使用して、対立遺伝子の塩基変化変異形を検出することもできる。例えばＯｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  Ｖｏｌ．８６，ｐｐ．２７６６−２７７０，１９８９、及びＧｅｎｏｍｉｃｓ，Ｖｏｌ．５，ｐｐ．８７４−８７９，１９８９を参照されたい。当該技術分野で既知の挿入及び欠失を検出ための他の技法も使用することができる。
【０５６６】
野生型遺伝子の改変は、遺伝子の野生型発現産物の改変に基づいて検出することもできる。かかる発現産物は、ｍＲＮＡもタンパク質産物もいずれも含む。点変異は、ｍＲＮＡの増幅及び配列決定によって、またはｍＲＮＡから作製されたｃＤＮＡの分子クローニングによって検出され得る。クローニングされたｃＤＮＡの配列は、当該技術分野で周知のＤＮＡ配列決定技法を使用して決定され得る。ｃＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって配列決定することもできる。
【０５６７】
ミスマッチは、１００％相補的ではないハイブリダイズされた核酸二本鎖である。全相補性の欠如は、欠失、挿入、逆位、置換、またはフレームシフト変異に起因し得る。ミスマッチ検出を使用して、標的核酸における点変異を検出することができる。これらの技法は、配列決定よりも感受性が低い場合があるが、多数の組織試料でより簡単に行われる。ミスマッチ切断技法の一例は、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８２，ｐ．７５７５，１９８５、及びＭｅｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２３０，ｐ．１２４２，１９８５に詳述されているＲＮａｓｅ保護法である。例えば、本発明の方法は、ヒト野生型標的核酸に相補的な標識リボプローブの使用を伴い得る。組織試料由来のリボプローブ及び標的核酸は、一緒にアニール（ハイブリダイズ）され、その後、二本鎖ＲＮＡ構造内でいくつかのミスマッチを検出することができる酵素ＲＮａｓｅ  Ａで消化される。ミスマッチがＲＮａｓｅ  Ａによって検出される場合、それは、ミスマッチの部位で切断する。したがって、アニールされたＲＮＡ調製物が電気泳動ゲルマトリックス上で分離されるとき、ミスマッチが検出され、かつＲＮａｓｅ  Ａによって切断される場合、リボプローブ及びｍＲＮＡまたはＤＮＡの完全長二本鎖ＲＮＡよりも小さいＲＮＡ産物が見られる。リボプローブは、標的核酸ｍＲＮＡまたは遺伝子の全長である必要はなく、標的核酸の一部であり得るが、但し、それが、変異されると思われる位置を包含することを条件とする。リボプローブが、標的核酸ｍＲＮＡまたは遺伝子のセグメントのみを含む場合、全標的核酸配列を所望の場合ミスマッチについてスクリーニングするためにいくつかのこれらのプローブを使用することが望ましくあり得る。
【０５６８】
同様の方法で、ＤＮＡプローブを使用して、例えば、酵素または化学的切断によってミスマッチを検出することができる。例えば、Ｃｏｔｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８５，４３９７，１９８８、及びＳｈｅｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．７２，ｐ．９８９，１９７５を参照されたい。あるいは、ミスマッチは、マッチ二本鎖に対するミスマッチ二本鎖の電気泳動移動度のシフトによって検出され得る。例えば、Ｃａｒｉｅｌｌｏ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．４２，ｐ．７２６，１９８８を参照されたい。リボプローブまたはＤＮＡプローブのいずれかを用いて、変異を含み得る標的核酸ｍＲＮＡまたはＤＮＡがハイブリダイゼーション前に増幅され得る。標的核酸ＤＮＡの変化は、特にそれらの変化が欠失及び挿入等の全体再配置である場合に、サザンハイブリダイゼーションを使用して検出することもできる。
【０５６９】
増幅された標的核酸ＤＮＡ配列は、対立遺伝子特異的プローブを使用してスクリーニングすることもできる。これらのプローブは核酸オリゴマーであり、これらは各々、既知の変異を内部に持つ標的核酸遺伝子の領域を含有する。例えば、１つのオリゴマーは、約３０ヌクレオチド長であり得、標的遺伝子配列の一部に対応する。一連のかかる対立遺伝子特異的プローブの使用により、標的核酸増幅産物をスクリーニングして、標的遺伝子における以前に特定された変異の存在を特定することができる。増幅標的核酸配列を有する対立遺伝子特異的プローブのハイブリダイゼーションは、例えば、ナイロンフィルター上で行われ得る。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下での特定のプローブへのハイブリダイゼーションは、腫瘍組織における対立遺伝子特異的プローブと同じ変異の存在を示す。
【０５７０】
野生型標的遺伝子の改変は、対応する野生型タンパク質の改変についてスクリーニングすることによって検出することもできる。例えば、標的遺伝子産物と免疫反応性のモノクローナル抗体を使用して、組織、例えば、遺伝子産物（タンパク質）の特定の変異位置に結合することが知られている抗体をスクリーニングすることができる。例えば、使用される抗体は、欠失したエクソンに結合するか、または標的タンパク質の欠失部分を含む立体配座エピトープに結合する抗体であり得る。同族抗原の欠如が変異を示す。変異体対立遺伝子産物に特異的な抗体を使用して、変異体遺伝子産物を検出することもできる。抗体は、ファージディスプレイライブラリから特定され得る。かかる免疫学的アッセイは、当該技術分野で既知の任意の簡便な形式で行われ得る。これらとしては、ウエスタンブロット、免疫組織化学的アッセイ、及びＥＬＩＳＡアッセイが挙げられる。改変タンパク質を検出するための任意の手段を使用して、野生型標的遺伝子の改変を検出することができる。
【０５７１】
プライマー対は、ポリメラーゼ連鎖反応等の核酸増幅技法を使用した標的核酸のヌクレオチド配列の決定に有用である。一本鎖ＤＮＡプライマーの対は、標的配列の増幅を刺激するために標的核酸配列内の配列または標的核酸配列周辺の配列にアニールされ得る。対立遺伝子特異的プライマーも使用され得る。かかるプライマーは、特定の変異体標的配列にのみアニールし、それ故に、鋳型として変異体標的配列の存在下で産物のみを増幅する。増幅配列のその後のクローニングを容易にするために、プライマーは、それらの末端に付加された制限酵素部位配列を有し得る。かかる酵素及び部位は、当該技術分野で周知である。プライマー自体が当該技術分野で周知の技法を使用して合成され得る。一般に、プライマーは、市販のオリゴヌクレオチド合成機を使用して作製され得る。特定のプライマーの設計は、十分に当該技術分野の技術の範囲内である。
【０５７２】
核酸プローブは、いくつかの目的に有用である。それらは、ゲノムＤＮＡへのサザンハイブリダイゼーション及び前述の点変異を検出するためのＲＮａｓｅ保護法に使用され得る。これらのプローブを使用して、標的核酸増幅産物を検出することができる。これらのプローブは、他の技法を使用して野生型遺伝子またはｍＲＮＡとのミスマッチを検出するために使用することもできる。ミスマッチは、酵素（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ）、化学物質（例えば、ヒドロキシルアミンもしくは四酸化オスミウム及びピペリジン）、または完全にマッチしたハイブリッドと比較したミスマッチしたハイブリッドの電気泳動移動度の変化のいずれかを使用して検出され得る。これらの技法は、当該技術分野で既知である。Ｎｏｖａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８３，ｐ．５８６，１９８６を参照されたい。一般に、これらのプローブは、キナーゼドメイン外の配列に相補的である。全一連の核酸プローブを使用して、標的核酸における変異を検出するためのキットを構成することができる。このキットにより、目的とする標的配列の大きい領域へのハイブリダイゼーションが可能になる。これらのプローブは、互いに重複し得るか、または近接し得る。
【０５７３】
リボプローブがｍＲＮＡとのミスマッチを検出するために使用される場合、これは、標的遺伝子のｍＲＮＡに概して相補的である。したがって、リボプローブは、それがセンス鎖に相補的であるという理由から対応する遺伝子産物をコードしないという点でアンチセンスプローブである。リボプローブは、一般に、放射性、比色、または蛍光物質で標識され、これは、当該技術分野で既知の任意の手段によって達成され得る。リボプローブがＤＮＡとのミスマッチを検出するために使用される場合、これは、極性、センス、またはアンチセンスのいずれかのものであり得る。同様に、ＤＮＡプローブもミスマッチを検出するために使用され得る。
【０５７４】
いくつかの事例では、癌は、ＦＧＦＲ２及び／またはＦＧＦＲ３を過剰発現するか、または過剰発現しない。受容体過剰発現は、細胞の表面上に存在する増大したレベルの受容体タンパク質を（例えば、免疫組織化学アッセイ（ＩＨＣ）によって）評価することによって診断または予後アッセイで決定され得る。あるいは、または加えて、例えば、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ、１９９８年１０月公開のＷＯ９８／４５４７９を参照のこと）、サザンブロット法、またはリアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）等のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法によって、細胞内の受容体をコードする核酸のレベルを測定することができる。上述のアッセイに加えて、様々なインビボアッセイが当業者に利用可能である。例えば、患者の身体内の細胞を、検出可能な標識、例えば、放射性同位体で任意に標識される抗体に曝露することができ、この抗体の患者における細胞への結合を、例えば、放射活性の外部スキャニングによって、またはこの抗体に以前に曝露された患者から採取された生検を分析することによって評価することができる。
【０５７５】
化学療法剤
本発明の併用療法は、１つ以上の化学療法剤を更に含み得る。併用投与は、別個の製剤または単一の薬学的製剤を使用する共投与または同時投与、及びいずれかの順での連続投与を含み、好ましくは、両方（またはすべて）の活性薬剤がそれらの生物学的活性を同時にもたらす期間が存在する。
【０５７６】
化学療法剤は、投与された場合、通常、既知の投薬量で投与されるか、または薬物の複合作用または代謝拮抗物質化学療法剤の投与に起因する負の副作用により任意に減らされる。かかる化学療法剤の調製及び投薬スケジュールは、製造業者の指示に従って使用され得るか、または当業者によって経験的に決定される。
【０５７７】
併用される様々な化学療法剤が本明細書に開示される。
【０５７８】
いくつかの実施形態では、併用される化学療法剤は、レナリドミド（レブリミド）、プロテオソーム阻害剤（ボルテゾミブ（ベルケイド）及びＰＳ３４２等）、ボラタキソイド（ドセタキセル及びパクリタキセル等）、ビンカ（ビノレルビンまたはビンブラスチン等）、白金化合物（カルボプラチンもしくはシスプラチン等）、アロマターゼ阻害剤（レトロゾール、アナストラゾール、またはエキセメスタン等）、抗エストロゲン（例えば、フルベストラントもしくはタモキシフェン）、エトポシド、チオテパ、シクロホスファミド、ペメトレキセド、メトトレキサート、リポソームドキソルビシン、ペグ化リポソームドキソルビシン、カペシタビン、ゲムシタビン、メルタリン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ＣＯＸ−２阻害剤（例えば、セレコキシブ）、またはステロイド（例えば、デキサメタゾン及びプレドニゾン）からなる群から選択される。いくつかの実施形態（例えば、ｔ（４；１４）＋多発性骨髄腫の治療を伴う実施形態では、デキサメタゾン及びレナリドミド、またはデキサメタゾン、またはボルテゾミブ、またはビンクリスチン、ドキソルビシン及びデキサメタゾン、またはサリドマイド及びデキサメタゾン、またはリポソームドキソルビシン、ビンクリスチン及びデキサメタゾン、またはレナリドミド及びデキサメタゾン、またはボルテゾミブ及びデキサメタゾン、またはボルテゾミブ、ドキソルビシン、及びデキサメタゾンが併用される。いくつかの実施形態（例えば、膀胱癌を伴う実施形態）では、ゲムシタビン及びシスプラチン、またはタキサン（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル）、またはペメトレキセド、またはメトトレキサート、ビンブラスチン、ドキソルビシン及びシスプラチン、またはカルボプラチン、またはマイトマイシンＣが、５−フルオロウラシル、またはシスプラチン、またはシスプラチン、及び５−フルオロウラシルと組み合わせて併用される。
【０５７９】
製剤、投薬量、及び投与
本発明で使用される治療薬は、優れた医療行為と一致した様式で製剤化、投薬、及び投与される。この文脈での考慮すべき要因としては、治療される特定の障害、治療される特定の対象、個々の患者の臨床的症状、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、併用される薬剤の薬物−薬物相互作用、及び医療従事者に既知の他の要因が挙げられる。
【０５８０】
治療的製剤は、当該技術分野で既知の標準の方法を使用して、所望の純度を有する活性成分を任意の生理学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤と混合することによって調製される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（２０ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ），ｅｄ．Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，２０００，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）。許容される担体としては、生理食塩水、もしくは緩衝液、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸；抗酸化物質、例えば、アスコルビン酸；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン、アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、もしくはリジン；単糖、二糖、及び他の炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、もしくはデキストリン；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖アルコール、例えば、マンニトールもしくはソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；ならびに／または非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはＰＥＧが挙げられる。
【０５８１】
任意であるが、好ましくは、製剤は、薬学的に許容される塩、好ましくは塩化ナトリウムを、好ましくは約生理学的濃度で含有する。任意に、本発明の製剤は、薬学的に許容される防腐剤を含有し得る。いくつかの実施形態では、防腐剤の濃度は、０．１〜２．０％（典型的にはｖ／ｖ％）の範囲である。好適な防腐剤としては、薬学技術分野で既知のものが挙げられる。ベンジルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、メチルパラベン、及びプロピルパラベンが好ましい防腐剤である。任意に、本発明の製剤は、薬学的に許容される界面活性剤を０．００５〜０．０２％の濃度で含み得る。
【０５８２】
本明細書における製剤は、治療される特定の適応症に必要な２つ以上の活性化合物、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有する化合物も含有し得る。かかる分子は、意図される目的に有効な量で組み合わせて好適に存在する。
【０５８３】
活性成分は、例えば、それぞれ、コアセルベーション技法または界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル内に、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）内に、またはマクロエマルジョン内に封入されても良い。かかる技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（上記参照）に開示されている。
【０５８４】
徐放性調製物が調製され得る。徐放性調製物の好適な例としては、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、形成物品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とＬ−グルタミン酸γエチルとのコポリマー、非分解性エチレン酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えば、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドから成る注射可能なマイクロスフェア）、ならびにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸等のポリマーが１００日間以上にわたる分子の放出を可能にする一方で、ある特定のヒドロゲルは、より短い期間しかタンパク質を放出しない。カプセル化抗体が長期間体内に留まると、それらは、３７℃の水分への曝露の結果として変性または凝集する場合があり、生物学的活性の喪失及び免疫原性の可能な変化をもたらし得る。必要とされる機構に応じて安定化への合理的な戦略が考案され得る。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド相互変換による分子間Ｓ−Ｓ結合形成であることが見出された場合、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥させ、適切な添加物を使用して水分含有量を制御し、かつ特異的なポリマーマトリックス組成物を開発することによって達成され得る。
【０５８５】
本発明の治療薬は、既知の方法に従って、ボーラスとしての静脈内投与によって、またはある期間にわたる持続注入によって、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液嚢内、髄腔内、経口、局所、もしくは吸入経路によってヒト患者に投与される。治療用途のためにエクスビボ戦略も使用され得る。エクスビボ戦略は、対象から得られた細胞を、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、またはＦＧＦＲ２／３アンタゴニストをコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトまたは形質導入することを伴う。その後、トランスフェクトまたは形質導入された細胞は、対象に戻される。これらの細胞は、造血細胞（例えば、骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、Ｔ細胞、またはＢ細胞）、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、または筋細胞を含むが、これらに限定されない広範囲の種類のうちのいずれかであり得る。
【０５８６】
例えば、ＦＧＦＲ２／３アンタゴニストが抗体である場合、この抗体は、非経口、皮下、腹腔内、肺内、及び経鼻投与を含む任意の好適な手段（局所免疫抑制治療が所望される場合、病巣内投与）によって投与され得る。非経口注入としては、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与が挙げられる。加えて、抗体は、パルス注入によって（特に減少用量の抗体で）好適に投与される。好ましくは、投薬は、一部には投与が短時間であるか長期間であるかに応じて、注射、最も好ましくは静脈内注射または皮下注射によって行われる。
【０５８７】
別の例では、ＦＧＦＲ２／３アンタゴニスト化合物は、障害または腫瘍の位置が許容する場合局所投与、例えば、直接注射により投与され、注射は、定期的に繰り返され得る。ＦＧＦＲ２／３アンタゴニストは、対象に全身的に送達されるか、または腫瘍の外科的切除後に腫瘍細胞に、例えば、腫瘍または腫瘍床に直接送達されて、局所再発または転移を予防または軽減することもできる。
【０５８８】
治療薬の併用投与は、典型的には、規定された期間（通常、選択される組み合わせに応じて、数分間、数時間、数日、または数週間）行われる。併用療法は、これらの治療薬の逐次様式での投与を包含するよう意図されており、すなわち、各治療薬を異なる時点で投与することができ、これらの治療薬、またはこれらの治療薬のうちの少なくとも２つを実質的に同時に投与することもできる。
【０５８９】
治療薬は、同じ経路または異なる経路で投与され得る。例えば、組み合わせでの抗ＦＧＦＲ２／３抗体が静脈内注射により投与され得る一方で、組み合わせでの化学療法剤は、経口投与され得る。あるいは、例えば、特定の治療薬に応じて、これらの治療薬の両方が経口投与され得るか、またはこれらの治療薬の両方が静脈内注射により投与され得る。治療薬が投与される順序も特定の薬剤に応じて異なり得る。
【０５９０】
疾患の種類及び重症度に応じて、例えば、１回以上の別個の投与であるか、持続注入によるかにかかわらず、各治療薬の約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇが患者に投与される候補初期投薬量である。典型的な１日投薬量は、上述の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であり得る。数日間またはそれ以上にわたる繰り返し投与の場合、状態に応じて、上述の方法によって測定されるように、癌が治療されるまで治療が続けられる。しかしながら、他の投薬レジメンも有用であり得る。
【０５９１】
本出願は、遺伝子療法によるＦＧＦＲ２／３抗体の投与を企図する。例えば、細胞内抗体を生成するための遺伝子療法の使用に関する１９９６年３月１４日公開のＷＯ９６／０７３２１を参照されたい。
【０５９２】
製品
本発明の別の態様では、上述の障害の治療、予防、及び／または診断に有用な材料を含有する製品が提供される。製品には、容器と、容器の上または容器と関連したラベルまたは添付文書とが含まれる。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ等が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチック等の様々な材料から形成され得る。容器は、組成物をそれ自体で、または状態の治療、予防、及び／または診断に有効な別の組成物（複数可）と組み合わせて保有し、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、静脈注射用溶液袋または皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有するバイアルであり得る）。本組成物中の少なくとも１つの活性薬剤は、本発明の抗体である。ラベルまたは添付文書は、本組成物が癌等の選択された状態を治療するために使用されることを示す。更に、本製品は、（ａ）本発明の抗体を含む組成物が中に含有された第１の容器と、（ｂ）更なる細胞毒性薬を含む組成物が中に含有された第２の容器とを含み得る。本発明のこの実施形態における製品は、第１及び第２の抗体組成物を使用して、特定の状態、例えば、癌を治療することができることを示す添付文書を更に含み得る。あるいは、または加えて、本製品は、薬学的に許容される緩衝液、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、及びデキストロース溶液を含む第２の（または第３の）容器を更に含み得る。これは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的観点及び使用者の立場から望ましい他の材料を更に含み得る。
【０５９３】
以下は、本発明の方法及び組成物実施例である。上に提供される概要を考慮して、様々な他の実施形態が実施され得ることが理解される。
【実施例】
【０５９４】
実施例１．抗ＦＧＦＲ３抗体の特異性の拡大。抗ＦＧＦＲ２／３抗体の結合特異性を拡大するための実験を行った。具体的には、高度に関連した受容体ＦＧＦＲ１及びＦＧＦＲ４に結合しないＦＧＦＲ３及びＦＧＦＲ２に対して二重特異性を有する癌療法用の抗体を開発するための実験を行った。出発点は、サブナノモル親和性でＦＧＦＲ３  ＩＩＩｂ及びＩＩＩｃアイソフォームに結合する単一特異性抗体Ｒ３Ｍａｂであった（Ｑｉｎｇ，Ｊ．，Ｘ．Ｄｕ，Ｙ．Ｃｈｅｎ，Ｐ．Ｃｈａｎ，Ｈ．Ｌｉ，Ｐ．Ｗｕ，Ｓ．Ｍａｒｓｔｅｒｓ，Ｓ．Ｓｔａｗｉｃｋｉ，Ｊ．Ｔｉｅｎ，Ｋ．Ｔｏｔｐａｌ，Ｓ．Ｒｏｓｓ，Ｓ．Ｓｔｉｎｓｏｎ，Ｄ．Ｄｏｒｎａｎ，Ｄ．Ｆｒｅｎｃｈ，Ｑ．Ｒ．Ｗａｎｇ，Ｊ．Ｐ．Ｓｔｅｐｈａｎ，Ｙ．Ｗｕ，Ｃ．Ｗｉｅｓｍａｎｎ  ａｎｄ  Ａ．Ａｓｈｋｅｎａｚｉ（２００９）．“Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｂａｓｅｄ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ＦＧＦＲ３  ｉｎ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｎｄ  ｔ（４；１４）−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．”Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １１９（５）：１２１６−１２２９）。Ｒ３Ｍａｂは、インビボでのＦＧＦＲ３シグナル伝達及び腫瘍成長の強い阻害を示し（Ｑｉｎｇ，Ｊ．，Ｘ．Ｄｕ，Ｙ．Ｃｈｅｎ，Ｐ．Ｃｈａｎ，Ｈ．Ｌｉ，Ｐ．Ｗｕ，Ｓ．Ｍａｒｓｔｅｒｓ，Ｓ．Ｓｔａｗｉｃｋｉ，Ｊ．Ｔｉｅｎ，Ｋ．Ｔｏｔｐａｌ，Ｓ．Ｒｏｓｓ，Ｓ．Ｓｔｉｎｓｏｎ，Ｄ．Ｄｏｒｎａｎ，Ｄ．Ｆｒｅｎｃｈ，Ｑ．Ｒ．Ｗａｎｇ，Ｊ．Ｐ．Ｓｔｅｐｈａｎ，Ｙ．Ｗｕ，Ｃ．Ｗｉｅｓｍａｎｎ  ａｎｄ  Ａ．Ａｓｈｋｅｎａｚｉ（２００９）．“Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｂａｓｅｄ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ＦＧＦＲ３  ｉｎ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｎｄ  ｔ（４；１４）−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．”Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １１９（５）：１２１６−１２２９）、第Ｉ相臨床試験で研究されている。
【０５９５】
抗体再設計戦略をＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ（ＰＤＢ  ３ＧＲＷ）と複合したＲ３Ｍａｂ  Ｆａｂ断片の以前に決定された結晶学的構造により誘導した（Ｑｉｎｇ，Ｊ．，Ｘ．Ｄｕ，Ｙ．Ｃｈｅｎ，Ｐ．Ｃｈａｎ，Ｈ．Ｌｉ，Ｐ．Ｗｕ，Ｓ．Ｍａｒｓｔｅｒｓ，Ｓ．Ｓｔａｗｉｃｋｉ，Ｊ．Ｔｉｅｎ，Ｋ．Ｔｏｔｐａｌ，Ｓ．Ｒｏｓｓ，Ｓ．Ｓｔｉｎｓｏｎ，Ｄ．Ｄｏｒｎａｎ，Ｄ．Ｆｒｅｎｃｈ，Ｑ．Ｒ．Ｗａｎｇ，Ｊ．Ｐ．Ｓｔｅｐｈａｎ，Ｙ．Ｗｕ，Ｃ．Ｗｉｅｓｍａｎｎ  ａｎｄ  Ａ．Ａｓｈｋｅｎａｚｉ（２００９）．“Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｂａｓｅｄ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ＦＧＦＲ３  ｉｎ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｎｄ  ｔ（４；１４）−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．”Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １１９（５）：１２１６−１２２９）。この構造は、Ｒ３ＭａｂがＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂのＤ２ドメイン及びＤ３ドメインの両方と相互作用することを示す。Ｄ２がその後にこの試験でＲ３Ｍａｂ結合に十分であることが見出されたが、初期分析は、この元の構造上の接触点に基づいた。ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ抗原の接触表面の大半が抗体相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ３（４６％）、Ｈ１（２３％）、及びＬ２（２２％）に寄与し、ＣＤＲ  Ｈ２及びフレームワーク領域（ＦＲ）残基の寄与はわずかであった（Ｑｉｎｇ，Ｊ．，Ｘ．Ｄｕ，Ｙ．Ｃｈｅｎ，Ｐ．Ｃｈａｎ，Ｈ．Ｌｉ，Ｐ．Ｗｕ，Ｓ．Ｍａｒｓｔｅｒｓ，Ｓ．Ｓｔａｗｉｃｋｉ，Ｊ．Ｔｉｅｎ，Ｋ．Ｔｏｔｐａｌ，Ｓ．Ｒｏｓｓ，Ｓ．Ｓｔｉｎｓｏｎ，Ｄ．Ｄｏｒｎａｎ，Ｄ．Ｆｒｅｎｃｈ，Ｑ．Ｒ．Ｗａｎｇ，Ｊ．Ｐ．Ｓｔｅｐｈａｎ，Ｙ．Ｗｕ，Ｃ．Ｗｉｅｓｍａｎｎ  ａｎｄ  Ａ．Ａｓｈｋｅｎａｚｉ（２００９）．“Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｂａｓｅｄ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ＦＧＦＲ３  ｉｎ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｎｄ  ｔ（４；１４）−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．”Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １１９（５）：１２１６−１２２９）（図５）。ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂと目的とする更なるＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ抗原との間の類似性を比較した。これらの２つの相同体のＤ２Ｄ３領域が６８％のタンパク質配列同一性を共有した一方で、それらのＤ２ドメインは、７６％の同一性を共有した（表２）。表２は、同じＦＧＦＲの２つのアイソフォームの同一性％（太字）、Ｄ３にアイソフォーム依存性領域を含むＤ２Ｄ３ドメインの完全配列（下線）、及びアイソフォーム依存性領域を欠くＤ２Ｄ３ドメイン（太字及び下線）を示す。Ｒ３Ｍａｂ結合ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂのＤ３が全ての他のＦＧＦＲ構造と比較して異なる形状を有した（Ｑｉｎｇ，Ｊ．，Ｘ．Ｄｕ，Ｙ．Ｃｈｅｎ，Ｐ．Ｃｈａｎ，Ｈ．Ｌｉ，Ｐ．Ｗｕ，Ｓ．Ｍａｒｓｔｅｒｓ，Ｓ．Ｓｔａｗｉｃｋｉ，Ｊ．Ｔｉｅｎ，Ｋ．Ｔｏｔｐａｌ，Ｓ．Ｒｏｓｓ，Ｓ．Ｓｔｉｎｓｏｎ，Ｄ．Ｄｏｒｎａｎ，Ｄ．Ｆｒｅｎｃｈ，Ｑ．Ｒ．Ｗａｎｇ，Ｊ．Ｐ．Ｓｔｅｐｈａｎ，Ｙ．Ｗｕ，Ｃ．Ｗｉｅｓｍａｎｎ  ａｎｄ  Ａ．Ａｓｈｋｅｎａｚｉ（２００９）．“Ａｎｔｉｂｏ���ｙ−ｂａｓｅｄ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ＦＧＦＲ３  ｉｎ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｎｄ  ｔ（４；１４）−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．”Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １１９（５）：１２１６−１２２９）ため、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ及びＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂの構造をそれらのＤ２領域に重ね合わせ、これにより、α−炭素の二乗平均平方根偏差（ＲＭＳＤ）０．７８Åを算出した。この分析に基づいて、Ｒ３Ｍａｂを再操作してＦＧＦＲ２に結合させてＦＧＦＲ２を阻害する実験も設計した。
表２．ＦＧＦＲタンパク質間の配列同一性
ＦＧＦＲの同一性（％）
2017538442.tif 000011
【０５９６】
ファージディスプレイライブラリを構築するために、個別の重鎖ＣＤＲの各々における大半の残基及び全てのＣＤＲ上の選択された接触残基を網羅する変異を設計した（表３）。表３中、Ｎは、Ｇ、Ａ、Ｔ、またはＣであり、Ｋは、ＧまたはＴである。ファージ粒子上にＦａｂ断片として提示されたＲ３Ｍａｂ変異形をＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂへの結合のために選択した。出願人は、新たなＦＧＦＲ２特異性をもたらす際に選択ストリンジェンシーを低く保つことを望んだため、この段階ではＦＧＦＲ３の選択を行わなかった。第１のパニングラウンド後、個別のライブラリからのファージ出力を組み合わせ、更に３回の選択ラウンドに供した。２Ｂ．１シリーズと指定した９５個のクローンをＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。これらの中で、３２個のユニーク配列を表す８１個のクローンがＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂに結合した。全ての結合クローンが他の箇所ではなくＣＤＲ  Ｈ２での変異を含んだため、それらは明らかにＨ２ライブラリ由来のものであった（表４）。表４は、Ｒ３Ｍａｂ中の残基と同じ残基を下線で識別する。表４は、Ｒ３Ｍａｂ中の残基とは異なる残基を斜体で識別する。表４で使用するとき、「ＮＤ」は、「検出不能」を指し、「ＮＡ」は、タンパク質凝集のため「該当なし」を指す。全ての選択された抗体は、Ｒ３Ｍａｂに対してＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂへの結合の実質的な改善を示し、ＫＤ値は、０．３〜１７ｎＭの範囲であった（表４）。注目すべきことに、変異Ｈ２配列は著しい変動を含み、明確なコンセンサスを欠き、４位または５位でＲ３Ｍａｂとは異なった（表４、図６）。したがって、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂのＲ３Ｍａｂへの高親和性結合を与えるための複数の可能な解決策が存在する。
表３．ＦＧＦＲ２結合特異性動員のためのライブラリ設計
2017538442.tif 000012
表４．Ｒ３Ｍａｂ中の残基とは異なる残基
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2017538442.tif 000014
【０５９７】
次に、それらのＦＧＦＲ２に対する親和性（３ｎＭ未満）及び配列多様性に基づいてＦＧＦＲ３への結合を測定するために６つの変異形を選択した。全ての変異形がＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂの親和性の改善を示した（表５）。受容体依存性細胞成長を阻害するそれらの能力を更に評価するために、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂに対するＦＧＦ７−ａ特異的リガンドを用いてまたは用いずにのいずれかでＭＣＦ７乳癌細胞の増殖をアッセイした（Ｇｏｅｔｚ，Ｒ．ａｎｄ  Ｍ．Ｍｏｈａｍｍａｄｉ（２０１３）．“Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ＦＧＦ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｌｅｎｓ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ．”Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４（３）：１６６−１８０、Ｂａｉ，Ａ．，Ｋ．Ｍｅｅｔｚｅ，Ｎ．Ｙ．Ｖｏ，Ｓ．Ｋｏｌｌｉｐａｒａ，Ｅ．Ｋ．Ｍａｚｓａ，Ｗ．Ｍ．Ｗｉｎｓｔｏｎ，Ｓ．Ｗｅｉｌｅｒ，Ｌ．Ｌ．Ｐｏｌｉｎｇ，Ｔ．Ｃｈｅｎ，Ｎ．Ｓ．Ｉｓｍａｉｌ，Ｊ．Ｊｉａｎｇ，Ｌ．Ｌｅｒｎｅｒ，Ｊ．Ｇｙｕｒｉｓ  ａｎｄ  Ｚ．Ｗｅｎｇ（２０１０）．“ＧＰ３６９，ａｎ  ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，  ｅｘｈｉｂｉｔｓ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒｓ  ｄｒｉｖｅｎ  ｂｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＦＧＦＲ２  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．”Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７０（１９）：７６３０−７６３９）。変異形２Ｂ．１．３は、阻害をほとんどまたは全く示さず、かつ刺激効果さえも呈した他の変異形と比較して最も高いアンタゴニスト活性を呈した（図２）。したがって、２Ｂ．１．３を更なる特徴付けのために機能的抗体として持ち越した。
表５．ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ及びＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂの選択された２Ｂ．１．３変異形の結合親和性
2017538442.tif 000015
＊Ｒ３Ｍａｂ中の残基と同じ残基には下線が引かれている。
【０５９８】
全てのＦＧＦＲ相同体が互いにほぼ７０％の配列同一性を共有するため（表２）、再操作された変異形２Ｂ．１．３の他のＦＧＦＲへの結合を評価した。Ｍａｂ  ２Ｂ．１．３は、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂと同様の親和性でＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃに結合した（表６）。使用した選択戦略がＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂへの結合に基づいたにもかかわらず、Ｍａｂ  ２Ｂ．１．３は、Ｒ３Ｍａｂよりも数倍高いＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ及びＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃに対する親和性も示した。ＦＧＦＲ３に対する親和性の増加が試験した全ての他の選択された変異形によって一貫して示された（データ示されず）。更に、Ｍａｂ  ２Ｂ．１．３はＦＧＦＲ４にも結合し、ＫＤ値が３２ｎＭであったが、ＦＧＦＲ１への検出不能な結合を示した（表６）。したがって、変異形２Ｂ．１．３は、三重特異性であり、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、及びＦＧＦＲ４に結合するが、ＦＧＦＲ１には結合しない。
表６．Ｒ３Ｍａｂ及びその変異形の全てのＦＧＦＲ相同体への結合親和性
2017538442.tif 000016
＊ＮＤ：５００ｎＭで検出不能である。
【０５９９】
実施例２．Ｍａｂ２Ｂ．１及びＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ複合体の構造を決定する。具体的には、再操作された変異形２Ｂ．１．３がどのようにＦＧＦＲ２に対する特異性を得たかを直接見抜くために、そのＦＧＦＲ２との複合体の結晶構造を決定した（図２Ａ、表７）。ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ  Ｄ２Ｄ３を、大腸菌での発現及び封入体からのリフォールディングによって最初に生成し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び質量分析によってインタクトであると判断した。しかしながら、結晶中、このタンパク質は、アイソフォーム非依存性Ｄ２ドメインしか含有せず、結晶化プロセス中のＤ２とＤ３との間のタンパク質分解を示唆した。以前に決定されたＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ：Ｒ３Ｍａｂ複合体構造は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂのＤ２ドメイン及びＤ３ドメインの両方を含有した。ＦＧＦＲ２−Ｄ２：Ｍａｂ  ２Ｂ．１．３の全複合体をＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ：Ｒ３Ｍａｂ構造に密接に重ね合わせ（図７）、全α−炭素ＲＭＳＤが１．４Åであり、再操作が元の抗体Ｒ３Ｍａｂと同じ結合形状を保有したことを示した。ＦＧＦＲ３：Ｒ３Ｍａｂ結晶構造は、ＦＧＦＲ３  Ｄ３とＣＤＲ  Ｈ１ループとの間のかなりの相互作用を示唆する。したがって、Ｄ３の結合への関与を調査するために、ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３のＤ２ドメインのタンパク質を調製し、Ｒ３Ｍａｂ及びＭａｂ  ２Ｂ．１．３に対するそれらの結合親和性を測定した。両受容体に対するＤ２単独とＤ２Ｄ３ドメインとの間の結合親和性の差はわずかしか観察されなかった（表８）。したがって、Ｄ２が主にＲ３Ｍａｂ及びその誘導体の結合に関与する一方で、Ｄ３は、最小限の役割しか果たさない。
表７．２Ｂ．１．３とＦＧＦＲ２−Ｄ２との間の親和性のデータ収集及び精密化統計値
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＊括弧内の値は、最高分解能シェルのものである。
表８．ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３のＤ２単独及びＤ２Ｄ３ドメインの結合親和性とＲ３ＭａｂまたはＭａｂ  ２Ｂ．１．３の結合親和性との比較
2017538442.tif 000018
＊ＮＤは、２００ｎＭで検出不能であり、＊＊は、Ｂｉａｃｏｒｅ適合限度に到達したことを示す。
【０６００】
Ｍａｂ  ２Ｂ．１．３におけるＣＤＲ  Ｈ２配列ＴＨＬＧＤは、Ｒ３Ｍａｂにおける親Ｈ２配列ＩＹＰＴＮとは完全に異なる。予想通り、２つのＭａｂにおけるＣＤＲ  Ｈ２ループの立体配座は大きく異なる（図２Ｃ）。Ｍａｂ  ２Ｂ．１．３の可変ドメインをＲ３Ｍａｂの可変ドメインと整列させると（図２Ｂ）、Ｈ３ループも数度捩れているように見え、両構造におけるＨ３先端残基Ｙ１００ｂのＣα原子間に２．６Åの距離をもたらす（図２Ｃ）。したがって、ＦＧＦＲ２  Ｄ２ドメインの位置が全体的にＦＧＦＲ３  Ｄ２ドメインの位置から約３Åシフトされている。変異形とＦＧＦＲ抗原との間の界面の比較により、かかるＭａｂ  ２Ｂ．１．３におけるＨ２及びＨ３  ＣＤＲループの再編成がＦＧＦＲ２表面に対するパッキングを著しく改善することが明らかになった。親構造において、Ｒ３ＭａｂとＦＧＦＲ３  Ｄ２との間の形状相補性（ｓｃ）スコアは、０．７３１である。ＦＧＦＲ２のＤ２ドメインがＦＧＦＲ３  Ｄ２と整列され、かつＦＧＦＲ３  Ｄ２に置き換えられる場合、Ｒ３ＭａｂとＦＧＦＲ２  Ｄ２との間のｓｃは、０．６８５に低下する。これは、ＦＧＦＲ２へのＲ３Ｍａｂの結合の欠如を説明し得る（表６）。しかしながら、新たな結晶構造において、２Ｂ．１．３とＦＧＦＲ２−Ｄ２との間のｓｃスコアは０．７６８に劇的に増加し、これは、Ｒ３Ｍａｂの再操作によるＦＧＦＲ２への高親和性結合の獲得と一致する。
【０６０１】
ＦＧＦＲ間の顕著な類似性により、２Ｂ．１．３は、このファミリーにおける複数の相同体と交差反応する。ＦＧＦＲ１結合がＦＧＦＲ２結合とともに得られなかったが、ＦＧＦＲ４相互作用が得られた。ＦＧＦＲ４阻害が毒性リスクを高める（Ｐａｉ，Ｒ．，Ｄ．Ｆｒｅｎｃｈ，Ｎ．Ｍａ，Ｋ．Ｈｏｔｚｅｌ，Ｅ．Ｐｌｉｓｅ，Ｌ．Ｓａｌｐｈａｔｉ，Ｋ．Ｄ．Ｓｅｔｃｈｅｌｌ，Ｊ．Ｗａｒｅ，Ｖ．Ｌａｕｒｉａｕｌｔ，Ｌ．Ｓｃｈｕｔｔ，Ｄ．Ｈａｒｔｌｅｙ  ａｎｄ  Ｄ．Ｄａｍｂａｃｈ（２０１２）．“Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  １９  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｂｉｌｅ  ａｃｉｄｓ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｌｅａｌ  ｍａｌａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｌｅ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍｏｎｋｅｙｓ．”Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｓｃｉ  １２６（２）：４４６−４５６）ことを考慮して、第２の再操作ラウンドに着手して、ＦＧＦＲ４結合を排除した。
【０６０２】
実施例３．ＦＧＦＲ３抗体の更なる再操作を行い、ＦＧＦＲ４結合を除去した。
ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３に結合するが、ＦＧＦＲ４には結合しないＭａｂ  ２Ｂ．１．３誘導体を生成して、抗体と相互作用した可能性があるが、様々なＦＧＦＲ間で異なる抗原残基が特定され（表９）、Ｍａｂ  ２Ｂ．１．３がそのＦＧＦＲ２との相互作用と類似の様式で全てのＦＧＦＲを認識すると推測する。３つのファージディスプレイライブラリを２Ｂ．１．３鋳型に基づいて構築し、接触したＣＤＲ  Ｈ１、Ｈ３、及びＬ２上の選択された位置でランダム変異誘発を行った（表１０）。操作中、出願人は、先の操作で行ったようにＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３の両方を維持する代わりにＦＧＦＲ２への結合に焦点を当てるよう試みた。したがって、パニング中の固定化ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ単独での選択に着手した。ＦＧＦＲ４結合剤を対抗選択するために、ファージ粒子を過剰量の可溶性ＦＧＦＲ４−Ｆｃタンパク質とインキュベートした。次に続く選択ラウンドのためにＦＧＦＲ４−Ｆｃの濃度を最大０．４６μＭに増加させた（方法を参照のこと）。第４ラウンド（ｎ＝９６）からの個別のクローンをＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ及びＦＧＦＲ４でのＥＬＩＳＡによってアッセイし、ＦＧＦＲ２結合−ＥＬＩＳＡ値のＦＧＦＲ４結合−ＥＬＩＳＡ値に対する比率によってランク付けした。最も高いＦＧＦＲ２／ＦＧＦＲ４結合比を有する６つのクローンを配列決定し、ＩｇＧとして発現させ、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ及びＦＧＦＲ４への結合について特徴付けした（表１１）。Ｈ３／Ｌ２ライブラリ２Ｂ．１．３．２、２Ｂ．１．３．４及び２Ｂ．１．３．６由来の特徴付けられたクローンがＣＤＲ  Ｌ２ではなくＣＤＲ  Ｈ３にのみ変異を含んだ一方で、Ｈ１／Ｈ３ライブラリ２Ｂ．１．３．８、２Ｂ．１．３．１０及び２Ｂ．１．３．１２由来の特徴付けられたクローンは、ＣＤＲ  Ｈ１及びＨ３の両方に変異を含んだ。Ｌ１００ａ〜Ｄ１００ｄ由来のＨ３における４つの残基が完全にランダム化されたが、Ｙ１００ｂは変化しないままであり、Ｙ１００ｂのＦＧＦＲ２との相互作用が結合にとって重要であることを示唆する。加えて、Ｌ１００ａは、ＴｈｒまたはＩｌｅに保存的に変異し、Ｖ１００ｃは主にＡｓｐに変異した。更なるＴ２８ＰのＨ１変異を含むＨ１／Ｈ３変異体は、わずかにより高いＦＧＦＲ２に対する親和性を呈した。これらの抗体は、１．４〜６．６ｎＭのＫＤ値でＦＧＦＲ２に結合するが、測定のために最大１μＭの濃度を使用した場合、クローン２Ｂ．１．３．８が依然として検出可能であるが弱いＦＧＦＲ４に対する親和性を保持したことを除いて、ＦＧＦＲ４への最小結合を示した（表１１）。Ｒ３Ｍａｂ中の残基と同じ残基には下線が引かれており、Ｒ３Ｍａｂ中の残基とは異なる残基は太字になっている（表１１）。２Ｂ．１．３変異形の配列及び親和性の両方の収束は、最後のファージ選択ラウンドが所望の機能を有する結合剤の強化の限界に達した。すなわち、ＦＧＦＲ４結合を減少させ、密接なＦＧＦＲ２結合を保持したことを示した。
表９．２Ｂ．１．３との潜在的接触をもたらす位置でのＦＧＦＲ２とＦＧＦＲ４との間の残基変動
2017538442.tif 000019
＊接触点のカットオフ距離は、４．５Åである。
表１０．ＦＧＦＲ４結合特異性を操作された抗体２Ｂ．１．３から除去するためのライブラリ設計
2017538442.tif 000020
Ｎは、Ｇ、Ａ、ＴまたはＣであり、Ｋは、ＧまたはＴである。
表１１．最小のＦＧＦＲ４結合及び維持されたＦＧＦＲ２結合を有する２Ｂ．１．３変異形
2017538442.tif 000021
【０６０３】
ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ４への結合のより大きい差異、ならびにより少ない変異が好ましいことを考慮して、Ｍａｂ  ２Ｂ．１．３．１０及び２Ｂ．１．３．１２を更なる特徴付けのために選択した。両抗体はＦＧＦＲ１への結合を示さず、２Ｂ．１．３よりもわずかに弱い親和性でのＦＧＦＲ３への強力な結合を保持した（表６）。したがって、第２のステップの操作後、２Ｂ．１．３誘導体Ｍａｂ  ２Ｂ．１．３．１０及び２Ｂ．１．３．１２は、ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３と交差反応するが、ＦＧＦＲ４を認識しない。
【０６０４】
次に、我々は、特異的ＦＧＦＲに結合するＦＧＦリガンドを遮断するＲ３Ｍａｂ変異形の能力を確認した。Ｒ３Ｍａｂは、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂアイソフォーム及びＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃアイソフォームの両方に結合するＦＧＦリガンドを遮断する。それらの異なるＦＧＦＲに対する異なる特異性のため、新たな抗体の各々の遮断スペクトルは変動した（図３）。全ての操作された抗体がＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３の両方に遮断活性を示した一方で、Ｒ３Ｍａｂは、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂへのＦＧＦ７結合またはＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃへのＦＧＦ１結合を阻害しなかった。２Ｂ．１．３がＦＧＦＲ４へのＦＧＦ１９結合を強力に阻害した一方で、２Ｂ．１．３．１０及び２Ｂ．１．３．１２は、実質的に減少したＦＧＦＲ４親和性のため、後者の相互作用を遮断しなかった。
【０６０５】
実施例４．再操作されたＭａｂ変異形は、ＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ３依存性腫瘍細胞成長を阻害する。
新たに操作された変異形２Ｂ．１．３．１０及び２Ｂ．１．３．１２は、ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３に対する二重特異性を呈する。それらの生物学的活性を調査するために、我々は、異なる種類の腫瘍細胞における受容体依存性シグナル伝達及び増殖へのそれらの影響を試験した。第１に、新たな変異形を、インビトロでのＦＧＦＲ２過剰発現腫瘍細胞の成長の阻害について評価した。ＳＮＵ−１６胃癌細胞株もＭＦＭ−２２３ｘ２．２トリプルネガティブ乳癌細胞株もいずれもＦＧＦＲ２の増幅を有し、これは、増大したＦＧＦＲ２遺伝子コピー数及びタンパク質過剰発現により明らかである（Ｋｕｎｉｉ，Ｋ．，Ｌ．Ｄａｖｉｓ，Ｊ．Ｇｏｒｅｎｓｔｅｉｎ，Ｈ．Ｈａｔｃｈ，Ｍ．Ｙａｓｈｉｒｏ，Ａ．Ｄｉ  Ｂａｃｃｏ，Ｃ．Ｅｌｂｉ  ａｎｄ  Ｂ．Ｌｕｔｔｅｒｂａｃｈ（２００８）．“ＦＧＦＲ２−ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｒｅｑｕｉｒｅ  ＦＧＦＲ２  ａｎｄ  Ｅｒｂｂ３  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｆｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ．”Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６８（７）：２３４０−２３４８）。ＳＮＵ−１６細胞において、２Ｂ．１．３．１０及び２Ｂ．１．３．１２は、ＦＧＦ７によって誘導されるＦＧＦＲ２リン酸化を実質的に抑制した。加えて、これらの２つの２Ｂ．１．３変異形は、下流シグナル伝達分子ＦＲＳ２α、ＭＡＰＫ、ＰＬＣγ１、及びＡＫＴのリン酸化を顕著に低減した（図４Ａ）。同様に、両変異形は、ＦＧＦ７で処理されたＭＦＭ−２２３ｘ２．２細胞におけるＦＧＦＲ２、ＦＲＳ２α、ＭＡＰＫ、及びＨｅｒ３のリン酸化を低減した（図８）。
【０６０６】
次に、腫瘍異種移植片のＦＧＦＲ２依存性またはＦＧＦＲ３依存性成長をインビボで阻害する二重特異性Ｍａｂ、２Ｂ．１．３．１０及び２Ｂ．１．３．１２の能力を調査した。ＦＧＦＲ２特異的処理の場合、ヒト胃癌細胞ＳＮＵ−１６を注入したマウスに、非特異的ＩｇＧ対照抗体ならびに二重特異性Ｍａｂ、２Ｂ．１．３．１０及び２Ｂ．１．３．１２を投薬した。対照抗体と比較して、二重特異性抗体は、約６７％及び５７％の腫瘍成長阻害を呈した（図４Ｂ）。別の実験では、２Ｂ．１．３．１０及び２Ｂ．１．３．１２もマウスにおけるＭＦＭ−２２３ｘ２．２腫瘍異種移植片の成長を遅延させた（図８）。したがって、これらの２つの操作された抗体は、ＦＧＦＲ２依存性腫瘍成長の阻害における効力を示した。それらが操作後にＦＧＦＲ３に対する親特異性を保持するため、ＦＧＦＲ３依存性腫瘍成長の阻害を調査した。予想通り、Ｍａｂ  ２Ｂ．１．３．１０も２Ｂ．１．３．１２もいずれもＲＴ１１２腫瘍異種移植片の成長を抑制した（図４Ｃ）。集合的に、操作された抗体は、ＦＧＦＲ２依存性癌細胞成長もＦＧＦＲ３依存性癌細胞成長もいずれも有効に阻害する二重薬剤としての役割を果たすことができる。しかしながら、ＲＴ１１２モデルにおける操作された変異形の効力は、親Ｒ３Ｍａｂと比較して低減し、これは恐らく修飾された薬物動態に起因する。
【０６０７】
ＲＴ１１２細胞株は、ＦＧＦＲ３を発現するが、ＦＧＦＲ２は発現しない。予想通り、操作後にＦＧＦＲ３に対する親特異性を保持したＭａｂ  ２Ｂ．１．３．１０及び２Ｂ．１．３．１２の両方、ならびに親抗体Ｒ３Ｍａｂは、ＦＧＦＲ３過剰発現ＲＴ１１２腫瘍異種移植片の成長を抑制した（図４Ｂ）。本研究における操作された変異形２Ｂ．１．３．１０及び２Ｂ．１．３．１２（腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）値４８％及び６４％）は、親Ｒ３Ｍａｂ（ＴＧＩ８２％）よりも弱い効力を呈し、これは恐らく修飾された薬物動態に起因し得る。ＦＧＦＲ２に基づく有効性について、我々は、非常に低いレベルでのＦＧＦＲ３発現に加えて容易に検出可能なＦＧＦＲ２を発現するＳＮＵ−１６細胞株を調べた。ＳＮＵ−１６異種移植片を持つマウスに、非特異的ＩｇＧ対照抗体、親Ｒ３Ｍａｂ、または操作された変異形２Ｂ．１．３．１０もしくは２Ｂ．１．３．１２を投薬した。操作された変異形は、それぞれ、同様のＴＧＩ値６３％及び６１％を呈した（図４Ｃ）。驚くべきことに、ＦＧＦＲ２に結合しないが、Ｒ３Ｍａｂも測定可能なＴＧＩ４４％を示した。その後、腫瘍試料を収集し、ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３発現について分析した（図１５）。ＦＧＦＲ３をＳＮＵ−１６腫瘍異種移植片においてインビボで上方調節し、これにより、このモデルにおけるＲ３Ｍａｂの阻害作用の観察を説明することができる。それにもかかわらず、操作された変異形は、Ｒ３Ｍａｂと比較して著しく強い活性を示した（３１日目にｐ＜０．００１）。別の実験では、２Ｂ．１．３．１０及び２Ｂ．１．３．１２もマウスにおけるＭＦＭ−２２３ｘ２．２腫瘍異種移植片の成長を遅延させた（図８Ａ及び図８Ｂ）。集合的に、操作された抗体は、ＦＧＦＲ２依存性癌細胞成長もＦＧＦＲ３依存性癌細胞成長もいずれも有効に阻害する二重薬剤としての役割を果たすことができる。
【０６０８】
実施例５．ＦＧＦＲ２結合Ｒ３Ｍａｂ変異形をファージライブラリ選択によって生成した。
ファージミド提示Ｒ３Ｍａｂ  Ｆａｂ断片については、以前に説明されている（Ｑｉｎｇ，Ｊ．，Ｘ．Ｄｕ，Ｙ．Ｃｈｅｎ，Ｐ．Ｃｈａｎ，Ｈ．Ｌｉ，Ｐ．Ｗｕ，Ｓ．Ｍａｒｓｔｅｒｓ，Ｓ．Ｓｔａｗｉｃｋｉ，Ｊ．Ｔｉｅｎ，Ｋ．Ｔｏｔｐａｌ，Ｓ．Ｒｏｓｓ，Ｓ．Ｓｔｉｎｓｏｎ，Ｄ．Ｄｏｒｎａｎ，Ｄ．Ｆｒｅｎｃｈ，Ｑ．Ｒ．Ｗａｎｇ，Ｊ．Ｐ．Ｓｔｅｐｈａｎ，Ｙ．Ｗｕ，Ｃ．Ｗｉｅｓｍａｎｎ  ａｎｄ  Ａ．Ａｓｈｋｅｎａｚｉ（２００９）．“Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｂａｓｅｄ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ＦＧＦＲ３  ｉｎ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｎｄ  ｔ（４；１４）−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．”Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １１９（５）：１２１６−１２２９）。３つの連続した終止コドンを導入して、Ｒ３ＭａｂのＨ１、Ｈ２、Ｈ３、またはＬ２  ＣＤＲループの各々における３つの残基を置き換え、これはファージディスプレイライブラリを構築するための鋳型としての役割を果たした。その後、Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｋｕｎｋｅｌ  ＴＡ，Ｂｅｂｅｎｅｋ  Ｋ，＆  ＭｃＣｌａｒｙ  Ｊ（１９９１）Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｕｒａｃｉｌ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ＤＮＡ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２０４：１２５−１３９）の方法を使用して、ランダム変異を上述のＣＤＲループ（表３）の各々に組み込んだ。その後、精製されたライブラリＤＮＡを電気穿孔（ＢＴＸ  ＥＣＭ  ６３０）によってＳＳ３２０コンピテント細胞に形質転換した（Ｃｌａｃｋｓｏｎ  Ｔ  ＆  Ｌｏｗｍａｎ  ＨＢ（２００４）Ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）。形質転換されたライブラリ細胞を３７℃の２ＹＴ培地中で一晩成長させて、ファージ粒子の繁殖を可能にした（Ｃｌａｃｋｓｏｎ  Ｔ  ＆  Ｌｏｗｍａｎ  ＨＢ（２００４）Ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）。ＦＧＦＲ２結合剤を選別するために、２μｇ／ｍＬのＨｉｓタグＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂを９６ウェルＭａｘｉＳｏｒｐプレート上にコーティングした。各ライブラリ由来の１ＯＤの精製されたファージ懸濁液を第１のパニングラウンドにわたって別々に固定化抗原とインキュベートした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＰＢＳＴ）を加えたリン酸緩衝液生理食塩水で短時間洗浄した後、結合したファージ粒子を低ｐＨで溶出した。個別のライブラリから収集されたファージを一緒にプールし、その後のパニングランドのためにＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞内で繁殖させた。第４のパニングラウンドについて、洗浄ステップを３回１５分間洗浄に延長し、それらの間に３０分間のＰＢＳＴインキュベーションを設けて、密接な結合剤を強化した。ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞を第４のラウンドから回収されたファージ粒子に感染させ、２ＹＴ寒天上にプレーティングした。９６個のランダムに選択されたコロニーをファージ産生のために個別に培養した。上清をアッセイして、ファージＥＬＩＳＡによっ��ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ結合を検証した。その間、ファージミドＤＮＡを各クローンから抽出し、配列決定した。
【０６０９】
実施例６．ライブラリを構築し、ＦＧＦＲ４に結合しなかったＦＧＦＲ２結合剤を選択した。
抗体２Ｂ．１．３のＦａｂ断片を提示するファージミドに基づいてファージディスプレイライブラリを構築した。Ｋｕｎｋｅｌ変異誘発のための終止鋳型は、ＣＤＲ  Ｈ１ループもしくはＨ３ループのいずれか、またはそれらの両方に３つの終止コドンを含んだ。ＣＤＲ  Ｈ１、Ｈ３、またはＬ２ループの選択された位置は、ランダム変異誘発を受けやすかった（表１０）。ライブラリ調製手技は、上述と同じであった。第１のラウンドでＦＧＦＲ２特異性を保持しながらＦＧＦＲ４結合を低減したクローンの選択の場合、１．５ＯＤのファージライブラリを０．５ｎＭのＦＧＦＲ４−Ｆｃタンパク質と混合した。混合物を、２μｇ／ｍＬのＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂを事前コーティングしたＭａｘｉＳｏｒｐプレート中で、４℃で一晩インキュベートした。結合したファージ粒子を短時間洗浄し、溶出し、次の選択ラウンドのために繁殖させた。第２のラウンドでは、１．５ＯＤのファージ調製物を１０ｎＭのＦＧＦＲ４−Ｆｃと混合し、４℃で一晩インキュベートした。第３及び第４のラウンドでは、０．５ＯＤのファージ調製物を４６０ｎＭのＦＧＦＲ４−Ｆｃタンパク質と混合し、室温で２０分間振盪した後、コーティングされたＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂとインキュベートした。ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂと室温で３０分間インキュベートした後、ＭａｘｉＳｏｒｐプレートを３回洗浄し、１０分毎にＰＢＳＴでインキュベートした。溶出したファージ粒子を使用してＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞を感染させ、２ＹＴ寒天上にプレーティングした。無作為に選択されたクローンを上述のファージＥＬＩＳＡアッセイ及びＤＮＡ配列決定のために培養した。
【０６１０】
実施例７．ファージＥＬＩＳＡ結合アッセイを行った。３８４ウェルＭａｘｉＳｏｒｐプレートを３０μＬの１μｇ／ｍＬ  Ｅ２５（対照抗体）、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ−Ｈｉｓ、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃ−Ｈｉｓ、またはＦＧＦＲ４−Ｈｉｓ（各象限）と４℃で一晩コーティングした。ＰＢＳ中２％ＢＳＡで室温にて１時間遮断した後、３０μＬの１０倍希釈ファージ上清を象限に添加した。プレートを室温で２時間振盪した。結合したファージ粒子を検出するために、ＨＲＰコンジュゲート抗Ｍ１３モノクローナル抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を１：３０００で希釈し、プレート中で１５分間インキュベートした。ＴＭＢペルオキシダーゼ基質を各ウェルに添加して発色させた。プレートが４５０ｎＭの吸光度を示す前に１００μＬの１Ｍリン酸を添加して反応を停止した。
【０６１１】
実施例８．表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイを行った。
Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ＦＧＦＲ抗原に対するＲ３Ｍａｂ変異形の結合親和性を決定した。飽和量の抗ヒトＦｃモノクローナル抗体を製品取扱説明書に従ってＣＭ５バイオセンサーチップ上に固定化した。約５００共鳴単位のＲ３Ｍａｂ由来の抗体分子を各フローセル中に捕捉した。様々な濃度のＦＧＦＲ抗原を３０μＬ／分の流量で注入した。各結合サイクル後、３ＭのＭｇＣｌ２を使用してフローセルを再生した。Ｔ１００評価ソフトウェアを使用して速度分析を行い、速度定数及び親和定数を得た。
【０６１２】
実施例９．タンパク質発現、精製、及び構造決定
ヒトＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ  ＥＣＤ（残基１４０〜３６９）をＰＣＲで増幅し、ｐＥＴ−２１ｂ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にサブクローニングした。タンパク質を封入体として大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞内に発現させた。封入体を２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、５％グリセロール、１ｍＭのＥＤＴＡ、及び２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で洗浄した後、６Ｍのグアニジン−ＨＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）、１０ｍＭのＴＣＥＰ中に溶解させた。インビトロフォールディングのために、封入体を、１００ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、０．４ＭのＬ−アルギニンＨＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、３．７ｍＭのシスタミン、及び６．６ｍＭのシステアミンを含有するリフォールディング緩衝液中に５０ｍｇ／Ｌになるまで迅速に希釈した。４℃で７２時間後、フォールディング混合物を濃縮し、５ｍＬのヘパリンＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通した。試料をＭｏｎｏＳカラム及びＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムで更に精製した。２Ｂ．１．３  Ｆａｂを発現させ、記載されるように精製した（Ｑｉｎｇ，Ｊ．，Ｘ．Ｄｕ，Ｙ．Ｃｈｅｎ，Ｐ．Ｃｈａｎ，Ｈ．Ｌｉ，Ｐ．Ｗｕ，Ｓ．Ｍａｒｓｔｅｒｓ，Ｓ．Ｓｔａｗｉｃｋｉ，Ｊ．Ｔｉｅｎ，Ｋ．Ｔｏｔｐａｌ，Ｓ．Ｒｏｓｓ，Ｓ．Ｓｔｉｎｓｏｎ，Ｄ．Ｄｏｒｎａｎ，Ｄ．Ｆｒｅｎｃｈ，Ｑ．Ｒ．Ｗａｎｇ，Ｊ．Ｐ．Ｓｔｅｐｈａｎ，Ｙ．Ｗｕ，Ｃ．Ｗｉｅｓｍａｎｎ  ａｎｄ  Ａ．Ａｓｈｋｅｎａｚｉ（２００９）．“Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｂａｓｅｄ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ＦＧＦＲ３  ｉｎ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｎｄ  ｔ（４；１４）−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．”Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １１９（５）：１２１６−１２２９）。ＦＧＦＲ２及びＦａｂタンパク質を１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．０）、５ｍＭのＮａＣｌに対して別々に透析した後に、１：１のモル比で一緒に混合した。タンパク質混合物を結晶化のために２ｍｇ／ｍＬに希釈した。蒸気拡散法を使用して、結晶を２０％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ３３５０、０．１Ｍのクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．５）、０．２Ｍの硫酸アンモニウムで成長させた。結晶が凍結防止溶液に感受性を示し、かつ母液から移されたときに結晶にひびが入ったため、回折可能な結晶を、凍結防止を果たすのに十分な高さのＰＥＧ３３５０濃度でで４ヶ月触れないまま放置されたトレイから最終的に収集した。したがって、結晶を液滴から直接取り出し、液体窒素中で急速冷凍した。回折データをＬａｗｒｅｎｃｅ  Ｂｅｒｋｅｌｅｙ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙのＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅで、１Åのビーム長で収集した。ＨＫＬ２０００及びＳｃａｌｅｐａｃｋ（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ  Ｚ  ＆  Ｍｉｎｏｒ  Ｗ（１９９７）Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  Ｘ−ｒａｙ  ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  ｄａｔａ  ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ  ｉｎ  ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ  ｍｏｄｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２７６：３０７−３２６）を使用して、データ処理を行った。ＣＣＰ４パッケージソフト内のＰｈａｓｅｒというプログ��ム（ＭｃＣｏｙ  ＡＪ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｐｈａｓｅｒ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ｓｏｆｔｗａｒｅ．Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ４０（Ｐｔ  ４）：６５８−６７４．Ｗｉｎｎ  ＭＤ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＣＰ４  ｓｕｉｔｅ  ａｎｄ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ６７（Ｐｔ  ４）：２３５−２４２）を使用して、構造を分子置換で解いた。Ｆａｂ及びＦＧＦＲ２−Ｄ２の検索モデルは、それぞれ、ＰＤＢ  ３ＧＲＷ及び３ＣＵ１であった。２つの複合体が非対称単位セル内で見つかった。Ｐｈｅｎｉｘ（Ａｄａｍｓ  ＰＤ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）ＰＨＥＮＩＸ：ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｐｙｔｈｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ６６（Ｐｔ  ２）：２１３−２２１）を使用して、剛体及び模擬アニーリング精密化を行った。Ｃｏｏｔというプログラム（Ｅｍｓｌｅｙ  Ｐ，Ｌｏｈｋａｍｐ  Ｂ，Ｓｃｏｔｔ  ＷＧ，＆  Ｃｏｗｔａｎ  Ｋ（２０１０）Ｆｅａｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｏｏｔ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ６６（Ｐｔ  ４）：４８６−５０１）を用いて、手動モデル構築を行った。Ｐｈｅｎｉｘを使用して、その後の位置及び原子転位パラメータを精密化した。水分子を３．４Åの距離カットオフで添加した。最終モデルをＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙというプログラム（Ｃｈｅｎ  ＶＢ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）ＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙ：ａｌｌ−ａｔｏｍ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ６６（Ｐｔ  １）：１２−２１）で検証した。ラマチャンドラン異常値は検出されなかった。
【０６１３】
実施例１０．ＦＧＦリガンド遮断ＥＬＩＳＡ
９６ウェルＭａｘｉＳｏｒｐプレートに１．５μｇ／ｍＬの抗ヒトＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ）を４℃で一晩コーティングした。ＰＢＳ中２％ＢＳＡで室温にて１時間遮断した後、０．２５μｇ／ｍＬのＦＧＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質を室温で２時間インキュベートした。プレートを５回洗浄した後、抗体及びＦＧＦリガンド混合物に添加し、これを４９μＬの１００ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦリガンド、１μＬの２５ｍｇ／ｍＬヘパリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、及び５０μＬの抗体希釈物として調製した。室温で２時間振盪した後、プレートを５回洗浄した。その後、十分に発色するまで室温で０．５μｇ／ｍＬビオチン化抗ＦＧＦ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（０．５時間）、１：２，５００で希釈したストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（０．５時間）、及びＴＭＢ基質とインキュベートして、結合したリガンドを検出した。
【０６１４】
実施例１１．細胞株
ＳＮＵ１６及びＭＦＭ−２２３ｘ２．２細胞株を内部細胞バンクから入手した。細胞株ＲＴ１１２をＡＴＣＣから入手した。１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ培地中で細胞を培養した。新たなストックを生成したときに、全ての細胞株をマイコプラズマ、交差汚染、遺伝子フィンガープリントについて試験して、品質を確保し、祖先を確認する。細胞株フィンガープリンティング：ＳＮＰフィンガープリンティング。新たなストックを凍結保存のために拡大する毎にＳＮＰ遺伝子型決定を行う。Ｆｌｕｉｄｉｇｍ多重アッセイを使用したハイスループットＳＮＰ遺伝子型決定によって細胞株同一性を検証する。市販の遺伝子型決定プラットホームでの軽微な対立遺伝子頻度及び存在に基づいてＳＮＰを選択した。ＳＮＰプロファイルを利用可能な内部及び外部データ（入手可能な場合）ＳＮＰコールからのと比較して、祖先を決定または確認する。データが利用不可能であるか、または細胞株祖先が疑わしい場合、ＤＮＡまたは細胞株を再度購入してプロファイリングを行い、細胞株祖先を確認する。ＳＮＰ：ｒｓ１１７４６３９６、ｒｓ１６９２８９６５、ｒｓ２１７２６１４、ｒｓ１００５００９３、ｒｓ１０８２８１７６、ｒｓ１６８８８９９８、ｒｓ１６９９９５７６、ｒｓ１９１２６４０、ｒｓ２３５５９８８、ｒｓ３１２５８４２、ｒｓ１００１８３５９、ｒｓ１０４１０４６８、ｒｓ１０８３４６２７、ｒｓ１１０８３１４５、ｒｓ１１１００８４７、ｒｓ１１６３８８９３、ｒｓ１２５３７、ｒｓ１９５６８９８、ｒｓ２０６９４９２、ｒｓ１０７４０１８６、ｒｓ１２４８６０４８、ｒｓ１３０３２２２２、ｒｓ１６３５１９１、ｒｓ１７１７４９２０、ｒｓ２５９０４４２、ｒｓ２７１４６７９、ｒｓ２９２８４３２、ｒｓ２９９９１５６、ｒｓ１０４６１９０９、ｒｓ１１１８０４３５、ｒｓ１７８４２３２、ｒｓ３７８３４１２、ｒｓ１０８８５３７８、ｒｓ１７２６２５４、ｒｓ２３９１６９１、ｒｓ３７３９４２２、ｒｓ１０１０８２４５、ｒｓ１４２５９１６、ｒｓ１３２５９２２、ｒｓ１７０９７９５、ｒｓ１９３４３９５、ｒｓ２２８０９１６、ｒｓ２５６３２６３、ｒｓ１０７５５５７８、ｒｓ１５２９１９２、ｒｓ２９２７８９９、ｒｓ２８４８７４５、ｒｓ１０９７７９８０。ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）プロファイリング。Ｐｒｏｍｅｇａ  ＰｏｗｅｒＰｌｅｘ  １６  Ｓｙｓｔｅｍを使用して各列のＳＴＲプロファイルを決定する。これを１回行い、細胞株の外部ＳＴＲプロファイル（入手可能な場合）と比較して、細胞株祖先を決定する。遺伝子座を分析する。Ｄ３Ｓ１３５８、ＴＨ０１、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、ペンタＥ、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１６Ｓ５３９、ＣＳＦ１ＰＯ、ペンタＤ、ＡＭＥＬ、ｖＷＡ、Ｄ８Ｓ１１７９、及びＴＰＯＸを含む、１６個の遺伝子座（１５個のＳＴＲ遺伝子座及び性別特定用のアメロゲニン）の検出。
【０６１５】
実施例１２．免疫ブロッティング
細胞を、１０μｇ／ｍＬのＦＧＦＲ遮断または対照抗ｇＤ抗体で事前処理した組織培養プレート上に２４時間播種し、その後、２０μｇ／ｍＬのヘパリン（Ｓｉｇｍａ）の存在下にて２５ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−７（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で１５分間刺激した。細胞を氷上にプレーティングし、タンパク質をＩＰ溶解緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で即座に収集した。タンパク質溶解物をシリンジに通し、遠心分離により取り除き、その後、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量した。タンパク質を４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で分離し、ニトロセルロース膜に移し、ＴＢＳＴ中５％ＢＳＡまたは乳液で３０分間遮断し、その後、一次抗体を用いて４Ｃで一晩ブロットした。使用した抗体：リンＦＧＦＲ（Ｙ６５３／６５４）、リンＦＲＳ２（Ｙ１９６）、リンＥＲＫ１／２（Ｔ２０２／Ｙ２０４）、ＥＲＫ１／２、リンＡＫＴ（Ｓ４７３）、ＡＫＴ、リンＨＥＲ３（Ｙ１２８９）、ＨＥＲ３、リンＰＬＣγ１（Ｙ７８３）、ＰＬＣγ１（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ＦＧＦＲ２、ＦＲＳ２（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、β−アクチン（Ｓｉｇｍａ）。膜を洗浄し、適切なＨＲＰコンジュゲート二次抗体と１時間インキュベートし、その後、洗浄し、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて検出した。ＦｌｕｏｒＣｈｅｍ  Ｑ（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ）を用いて発光シグナルを取得した。
【０６１６】
実施例１３．異種移植片実験
全ての手技は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈによって承認され、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈにより規定されたガイドライン及び原則に準拠するものであり、これらの手技を認定機関であるＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ（ＡＡＡＬＡＣ）で行った。細胞接種の１日前に０．３６ｍｇのエストロゲンペレットを皮下移植した。  マトリゲルを有するＨＢＳＳ中に懸濁された１千万個のＭＦＭ−２２３ｘ２．２乳癌細胞を、６〜８週齢の雌ＮＣＲヌードマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ（商標））の乳房脂肪体＃４に接種した。約１５〜３０ｍｍ３のＳＮＵ−１６腫瘍断片を６〜８週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ）の右側腹部に皮下移植した。マトリゲルを有するＨＢＳＳ中に懸濁された７百万個のＲＴ−１１２膀胱癌細胞を６〜８週齢の雌Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂ）に皮下接種した。平均腫瘍体積が１００〜２００ｍｍ３に達したときに（０日目）、マウスを６つの群（ＳＮＵ−１６、ＲＴ１１２）または７つの群（ＭＦＭ−２２３ｘ２．２）に無作為に分け、１日目から２Ｂ１．３．１０または２Ｂ１．３．１２の腹腔内注射（１０、３０、または５０ｍｇ／ｋｇ）で週２回処理した。対照群をＰＢＳ（３０ｍｇ／ｋｇ）中に希釈した対照ヒトＩｇＧ１抗体で処理した。Ｕｌｔｒａ  Ｃａｌ  ＩＶキャリパー（Ｍｏｄｅｌ  ５４  １０  １１１、Ｆｒｅｄ  Ｖ．Ｆｏｗｌｅｒ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を使用して、腫瘍体積の２つの寸法（長さ及び幅）を測定した。以下の式を使用して、腫瘍体積を算出した。腫瘍体積（ｍｍ３）＝（長さ×幅２）×０．５．Ａｄｖｅｎｔｕｒｅｒ  Ｐｒｏ  ＡＶ８１２スケール（Ｏｈａｕｓ）を使用して、動物の体重を測定した。以下の式を使用して、体重変化％を算出した。体重変化（％）＝［（新たな日の体重−０日目の体重）／０日目の体重］×１００％各動物の体重％を本研究にわたって追跡し、各群の体重変化％を算出及びプロットした。
【０６１７】
実施例１４．ＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体の特定
本明細書に記載の抗ＦＧＦＲ２／３抗体の抗腫瘍活性に加えて、ＦＧＦＲ２及び／またはＦＧＦＲ３発現に関連する増殖性障害及び疾患、より具体的には代謝性疾患の治療に使用するためのＦＧＦＲ２／３及びＫＬＢに指向された二重特異性抗体（「ＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体」）を作製することができる。ＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体によって治療され得る代謝性疾患としては、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）、メタボリック症候群（ＭｅｔＳ）、肥満、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、脂質異常症、高血圧症、２型糖尿病、非２型糖尿病、１型糖尿病、潜在性自己免疫性糖尿病（ＬＡＤ）、若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）、２型糖尿病、肥満、バルデー・ビードル症候群、プラダー・ウィリ症候群、アルストレム症候群、コーエン症候群、オルブライト遺伝性骨異栄養症（偽性副甲状腺機能低下症）、カーペンター症候群、ＭＯＭＯ症候群、ルビンステイン・テイビ症候群、脆弱性Ｘ症候群及びベルエソン・フォルスマン・レーマン症候群が挙げられるが、これらに限定されない。より具体的には、ＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体をＮＡＳＨの治療のために使用することができる。
【０６１８】
最初に、抗ＦＧＦＲ２／３抗体変異形の活性を比較する実験を行った（図１７Ａ及び１７Ｂ）。具体的には、１日目に、２３９Ｔ  ＦＧＦＲ１欠失細胞を０．９×１０６の密度で９６ウェルプレートに播種した。２日目に、細胞を、ＦＧＦＲ、ＦＦルシフェラーゼ、レニラルシフェラーゼ（トランスフェクション効率対照）、及びＥｌｋ１等の構築物でトランスフェクトした。３日目に、細胞を、無血清培地中で、抗ＦＧＦＲ２／３抗体変異形２Ｂ１．３、２Ｂ１．３．１２、２Ｂ１．１．２、２Ｂ１．１．４、２Ｂ１．１．６、２Ｂ１．１．８、２Ｂ１．１．１０、２Ｂ１．１、及び２Ｂ１．１．１２で刺激した。初期濃度は１０μｇ／ｍＬであり、一連の希釈を１／５で行った。７．５時間反応させ、プレートから培地を除去し、１×受動的溶解緩衝液を添加して、反応を停止した。その後、ルシフェラーゼ基質を添加した後にＷａｌｌａｃｅ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーを使用してプレートを分析し、レニラ発現に正規化した。
【０６１９】
一部にはルシフェラーゼアッセイに加えて本明細書に記載していないが行った他のアッセイに基づいて、抗ＦＧＦＲ２／３抗体変異形決定行列を構築した（図１８）。２Ｂ１．３は、ＭＣＦ−７／ＦＧＦ７アッセイにおいて、成長を遮断することを示し、ＦＧＦ１９遮断を示した。２Ｂ１．３．１２は、腫瘍進行を遮断した。
【０６２０】
決定行列に基づいて、変異形２Ｂ１．３．１２、２Ｂ１．１．６、及び２Ｂ１．１を更に試験し（図１９Ａ〜１９Ｃ）、各々の活性を試験した。更に、２Ｂ１．１、２Ｂ１．３、及び２Ｂ１．３．１２のＦＧＦＲ結合を試験した（表１２）。表１２中、ＮＢは、「結合なし」を指し、ＮＤは、「決定されず」を指す。ＩｇＧを捕捉し、ＦＧＦＲ４−６ｘＨｉｓを流すことによって、２Ｂ．１．１のＦＧＦＲ４を測定した（表１２中「＊」で識別された実験）。その後、ＦＧＦＲ４−Ｆｃを捕捉し、抗体Ｆａｂ断片を流すことによって、２Ｂ．１．３変異形のＫＤを決定した（表１２）。
表１２：ヒトＦＧＦＲに対するＲ３Ｍａｂ変異形の結合親和性
2017538442.tif 000022
【０６２１】
その後、７つの２Ｂ１．１変異形を発現させ、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、及びＦＧＦＲ４結合に対するアゴニスト活性を試験した（図１６Ａ〜１６Ｃ）。Ｂｉａｃｏｒｅアッセイを使用して、全ての２Ｂ１．１変異形がＦＧＦＲ３に対してｎＭ未満〜低ｐＭの範囲の親和性を示した。ＦＧＦＲ４タンパク質粘性のため、結合親和性は、分析物としてＦａｂを用いるＢｉａｃｏｒｅによって最良に決定される。ＥＬＩＳＡにより、２Ｂ１．１及び２Ｂ１．１．４以外の変異形の大半がＦＧＦＲ４への弱い結合を示した。
【０６２２】
実施例１４に記載の実験に基づいて、抗ＫＬＢ抗体との二重特異性アセンブリのために変異形２Ｂ１．３．１２及び２Ｂ１．１．６を選択した。
【０６２３】
実施例１４．ＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体の生成
任意の二重特異性抗体産生方法を使用して、ＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体を作製することができる。特定の実施例では、ｋｎｏｂ  ａｎｄ  ｈｏｌｅ技法を使用して、本発明のＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体を作製することができる。
【０６２４】
ＨＥＫ２９３細胞を、抗ＦＧＦＲ２／３抗体変異形２Ｂ１．３．１２または２Ｂ１．１．６の重鎖及び軽鎖ならびに本明細書に記載の抗ＫＬＢ抗体のうちの１つの重鎖及び軽鎖をコードする４つの発現ベクターの混合物と共トランスフェクトすることができる（例えば、表１３及び１４を参照のこと）。
表１３．マウス抗ＫＬＢモノクローナル抗体のＣＤＲ  Ｈ配列
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表１４．マウス抗ＫＬＢモノクローナル抗体のＣＤＲ  Ｌ配列
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【０６２５】
抗ＦＧＦＲ２／３及び抗ＫＬＢの重鎖を、それぞれ、Ｆｌａｇペプチド及びＯｃｔ−ヒスチジンでタグ付けすることができ、ヘテロ二量体ＩｇＧを逐次的親和性精製によって馴化培地から精製することができるようになる。その後、部分的に精製されたヘテロ二量体ＩｇＧをＧＡＬ−ＥＬＫ１ベースのルシフェラーゼアッセイで分析して、ＫＬＢ依存性アゴニストを特定することができる。重鎖及び軽鎖の誤対合を最小限に抑えるために、ヒトＦａｂ定常領域を有する抗ＦＧＦＲ２／３を発現させることができ、マウスＦａｂ定常領域を有する抗ＫＬＢを発現させることができる。その後、ＦＧＦＲ２／３抗体変異形２Ｂ１．３．１２または２Ｂ１．１．６のいずれかのアーム１つと本明細書に記載のＫＬＢ抗体のうちのいずれかのアーム１つとの組み合わせを使用して、タグ付けされた二重特異性ＩｇＧを最初に粗形態で試験することができる。具体的には、ＫＬＢアームが生じる抗ＫＬＢ抗体は、以下を含み得る：
８Ｃ５．Ｋ４．Ｍ４Ｌ．Ｈ３．ＫＮＶ重鎖可変領域
2017538442.tif 000027
（配列番号１０４）
８Ｃ５．Ｋ４．Ｍ４Ｌ．Ｈ３．ＫＮＶ完全重鎖
2017538442.tif 000028
（配列番号１０６）
８Ｃ５．Ｋ４．Ｍ４Ｌ．Ｈ３．ＫＮＶ軽鎖可変領域
2017538442.tif 000029
（配列番号１０５）
８Ｃ５．Ｋ４．Ｍ４Ｌ．Ｈ３．ＫＮＶ完全軽鎖
2017538442.tif 000030
（配列番号１０７）
【０６２６】
更に、ヒトＩｇＧ１定常領域（野生型、エフェクター機能を有する）及びエフェクター機能を排除するＮ２９７Ｇ変異を有するヒトＩｇＧ１定常領域またはマウス定常領域（エフェクター機能を排除する二重［Ｄ２６５Ｇ／Ｎ２９７Ｇ］変異（ＤＡＮＧ）を有する）を有する二重特異性抗体を産生することができる。
【０６２７】
実施例１５：二重特異性抗体の試験
８Ｃ５．Ｋ４Ｈ３．Ｍ４Ｌ．ＫＮＶ（上の実施例１４を参照のこと）と異なる抗ＦＧＦＲ２／３アームとの様々な二重特異性抗体組み合わせを作製し、ＫＬＢを有するＨＥＫ２９３細胞またはＫＬＢを有しないＨＥＫ２９３細胞におけるＧＡＬ−ＥＬＫ１ベースのルシフェラーゼアッセイで試験することができる。各二重特異性抗体組み合わせは、組換えＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ３及びＫＬＢを発現する細胞におけるルシフェラーゼ活性を用量依存的様式で誘導することができたが、ＫＬＢを発現しない細胞では誘導することができなかった。このデータは、ＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体が、親抗体、例えば、２Ｂ１．３．１２または２Ｂ１．１．６の利点を保持することを裏付けることができる。更に、ＫＬＢ結合、ＦＧＦＲ２結合、及びＦＧＦＲ３結合に対するヒト化８Ｃ５アーム（８Ｃ５．Ｋ４．Ｍ４Ｌ．Ｈ３．ＫＮＶ）及び２Ｂ１．３．１２変異形または２Ｂ１．１．６変異形のいずれかのアームを有するＦＧＦＲ２／３＋ＫＬＢ二重特異性抗体の結合親和性を決定することができる。
【０６２８】
描写され、特許請求される様々な実施形態に加えて、本開示の主題は、本明細書に開示され、特許請求される特徴の他の組み合わせを有する他の実施形態も対象とする。したがって、本明細書に提示される特定の特徴は、本開示の主題が本明細書に開示される特徴の任意の好適な組み合わせを含むように、本開示の主題の範囲内において他の様式で互いに組み合わせられても良い。本開示の主題の特定の実施形態の前述の説明は、例証及び説明目的のために提示されている。包括的であるようにも本開示の主題を開示される実施形態に限定するようにも意図されていない。
【０６２９】
本開示の主題の趣旨または範囲から逸脱することなく、本開示の主題の組成物及び方法に様々な修正及び変形を加えることができることは、当業者には明らかである。したがって、本開示の主題が添付の特許請求の範囲及びそれらの等価物の範囲内の修正及び変形を含むよう意図されている。
【０６３０】
様々な刊行物、特許、及び特許出願が本明細書に引用されており、それらの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０６３１】
配列
配列番号１
２Ｂ．１．３．１０  ＨＶＲ−Ｌ１
ＲＡＳＱＤＶＤＴＳＬＡ
配列番号２
２Ｂ．１．３．１０  ＨＶＲ−Ｌ２
ＳＡＳＦＬＹＳ
配列番号３
２Ｂ．１．３．１０  ＨＶＲ−Ｌ３
ＱＱＳＴＧＨＰＱＴ
配列番号４
２Ｂ．１．３．１０  ＨＶＲ−Ｈ１
ＧＦＰＦＴＳＱＧＩＳ
配列番号５
２Ｂ．１．３．１０  ＨＶＲ−Ｈ２
ＲＴＨＬＧＤＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ
配列番号６
２Ｂ．１．３．１０  ＨＶＲ−Ｈ３
ＡＲＴＹＧＩＹＤＴＹＤＫＹＴＥＹＶＭＤＹ
配列番号７
２Ｂ．１．３．１２  ＨＶＲ−Ｌ１
ＲＡＳＱＤＶＤＴＳＬＡ
配列番号８
２Ｂ．１．３．１２  ＨＶＲ−Ｌ２
ＳＡＳＦＬＹＳ
配列番号９
２Ｂ．１．３．１２  ＨＶＲ−Ｌ３
ＱＱＳＴＧＨＰＱＴ
配列番号１０
２Ｂ．１．３．１２  ＨＶＲ−Ｈ１
ＧＦＰＦＴＳＴＧＩＳ
配列番号１１
２Ｂ．１．３．１２  ＨＶＲ−Ｈ２
ＲＴＨＬＧＤＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ
配列番号１２
２Ｂ．１．３．１２  ＨＶＲ−Ｈ３
ＡＲＴＹＧＩＹＤＴＹＤＭＹＴＥＹＶＭＤＹ
配列番号１３
２Ｂ．１．１  ＨＶＲ−Ｈ２
ＹＷＡＷＤ
配列番号１４
２Ｂ．１．８８  ＨＶＲ−Ｈ２
ＩＷＭＦＴ
配列番号１５
２Ｂ．１．３８  ＨＶＲ−Ｈ２
ＦＷＡＹＤ
配列番号１６
２Ｂ．１．２０  ＨＶＲ−Ｈ２
ＬＤＶＦＷ
配列番号１７
２Ｂ．１．３２  ＨＶＲ−Ｈ２
ＷＶＧＦＴ
配列番号１８
２Ｂ．１．４９  ＨＶＲ−Ｈ２
ＬＳＦＦＳ
配列番号１９
２Ｂ．１．８６  ＨＶＲ−Ｈ２
ＬＳＦＷＴ
配列番号２０
２Ｂ．１．９  ＨＶＲ−Ｈ２
ＹＨＰＹＬ
配列番号２１
２Ｂ．１．７３  ＨＶＲ−Ｈ２
ＭＩＦＹＮ
配列番号２２
２Ｂ．１．７４  ＨＶＲ−Ｈ２
ＹＨＰＦＲ
配列番号２３
２Ｂ．１．１４  ＨＶＲ−Ｈ２
ＬＷＹＦＤ
配列番号２４
２Ｂ．１．７１  ＨＶＲ−Ｈ２
ＶＷＭＦＤ
配列番号２５
２Ｂ．１．２８  ＨＶＲ−Ｈ２
ＦＷＡＷＳ
配列番号２６
２Ｂ．１．９５  ＨＶＲ−Ｈ２
ＬＩＦＦＴ
配列番号２７
２Ｂ．１．５０  ＨＶＲ−Ｈ２
ＬＮＦＹＳ
配列番号２８
２Ｂ．１．８１  ＨＶＲ−Ｈ２
ＶＮＮＦＹ
配列番号２９
２Ｂ．１．２５  ＨＶＲ−Ｈ２
ＷＨＰＷＭ
配列番号３０
２Ｂ．１．３  ＨＶＲ−Ｈ２
ＴＨＬＧＤ
配列番号３１
２Ｂ．１．６５  ＨＶＲ−Ｈ２
ＹＮＡＹＴ
配列番号３２
２Ｂ．１．９４  ＨＶＲ−Ｈ２
ＬＶＦＦＳ
配列番号３３
２Ｂ．１．７８  ＨＶＲ−Ｈ２
ＬＳＦＹＳ
配列番号３４
２Ｂ．１．７２  ＨＶＲ−Ｈ２
ＶＨＰＦＥ
配列番号３５
２Ｂ．１．４４  ＨＶＲ−Ｈ２
ＷＷＳＷＧ
配列番号３６
２Ｂ．１．５２  ＨＶＲ−Ｈ２
ＦＳＬＧＤ
配列番号３７
２Ｂ．１．３０  ＨＶＲ−Ｈ２
ＶＳＦＦＳ
配列番号３８
２Ｂ．１．８２  ＨＶＲ−Ｈ２
ＩＮＦＦＳ
配列番号３９
２Ｂ．１．９３  ＨＶＲ−Ｈ２
ＩＤＮＹＷ
配列番号４０
２Ｂ．１．５５  ＨＶＲ−Ｈ２
ＶＤＶＦＷ
配列番号４１
２Ｂ．１．３５  ＨＶＲ−Ｈ２
ＷＨＰＦＲ
配列番号４２
２Ｂ．１．３３  ＨＶＲ−Ｈ２
ＹＨＰＦＨ
配列番号４３
２Ｂ．１．８０  ＨＶＲ−Ｈ２
ＹＷＡＦＳ
配列番号４４
２Ｂ．１．９２  ＨＶＲ−Ｈ２
ＷＶＡＦＳ
配列番号４５
２Ｂ．１．３  ＨＶＲ−Ｈ２
ＴＨＬＧＤ
配列番号４６
２Ｂ．１．９５  ＨＶＲ−Ｈ２
ＬＩＦＦＴ
配列番号４７
２Ｂ．１．７３  ＨＶＲ−Ｈ２
ＭＩＦＹＮ
配列番号４８
２Ｂ．１．３２  ＨＶＲ−Ｈ２
ＷＶＧＦＴ
配列番号４９
２Ｂ．１．８８  ＨＶＲ−Ｈ２
ＩＷＭＦＴ
配列番号５０
２Ｂ．１．１  ＨＶＲ−Ｈ２
ＹＷＡＷＤ
配列番号５１
ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ核酸配列
2017538442.tif 000031
2017538442.tif 000032
配列番号５２
ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂアミノ酸配列
2017538442.tif 000033
配列番号５３
ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃ核酸配列
2017538442.tif 000034
2017538442.tif 000035
配列番号５４
ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃアミノ酸配列
2017538442.tif 000036
配列番号５５
ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ核酸配列
2017538442.tif 000037
配列番号５６
ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂアミノ酸配列
2017538442.tif 000038
2017538442.tif 000039
配列番号５７
ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ核酸配列
2017538442.tif 000040
2017538442.tif 000041
配列番号５８
ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃアミノ酸配列
2017538442.tif 000042
配列番号５９
２Ｂ．１．３軽鎖アミノ酸
2017538442.tif 000043
配列番号６０
２Ｂ．１．９５軽鎖アミノ酸
2017538442.tif 000044
配列番号６１
２Ｂ．１．７３軽鎖アミノ酸  
2017538442.tif 000045
配列番号６２
２Ｂ．１．３２軽鎖アミノ酸
2017538442.tif 000046
配列番号６３
２Ｂ．１．８８軽鎖アミノ酸
2017538442.tif 000047
配列番号６４
２Ｂ．１．１軽鎖アミノ酸
2017538442.tif 000048
配列番号６５
２Ｂ．１．３．１０軽鎖アミノ酸
2017538442.tif 000049
配列番号６６
２Ｂ．１．３．１２軽鎖アミノ酸
2017538442.tif 000050
配列番号６７
２Ｂ．１．３軽鎖核酸
2017538442.tif 000051
配列番号６８
２Ｂ．１．９５軽鎖核酸
2017538442.tif 000052
配列番号６９
２Ｂ．１．７３軽鎖核酸
2017538442.tif 000053
配列番号７０
２Ｂ．１．３２軽鎖核酸
2017538442.tif 000054
配列番号７１
２Ｂ．１．８８軽鎖核酸
2017538442.tif 000055
2017538442.tif 000056
配列番号７２
２Ｂ．１．１軽鎖核酸
2017538442.tif 000057
配列番号７３
２Ｂ．１．３．１０軽鎖核酸
2017538442.tif 000058
配列番号７４
２Ｂ．１．３．１２軽鎖核酸
2017538442.tif 000059
2017538442.tif 000060
配列番号７５
２Ｂ．１．３重鎖アミノ酸
2017538442.tif 000061
配列番号７６
２Ｂ．１．９５重鎖アミノ酸
2017538442.tif 000062
配列番号７７
２Ｂ．１．７３重鎖アミノ酸
2017538442.tif 000063
配列番号７８
２Ｂ．１．３２重鎖アミノ酸
2017538442.tif 000064
2017538442.tif 000065
配列番号７９
２Ｂ．１．８８重鎖アミノ酸
2017538442.tif 000066
配列番号８０
２Ｂ．１．１重鎖アミノ酸
2017538442.tif 000067
配列番号８１
２Ｂ．１．３．１０重鎖アミノ酸
2017538442.tif 000068
配列番号８２
２Ｂ．１．３．１２重鎖アミノ酸
2017538442.tif 000069
2017538442.tif 000070
配列番号８３
２Ｂ．１．３重鎖核酸
2017538442.tif 000071
配列番号８４
２Ｂ．１．９５重鎖核酸
2017538442.tif 000072
2017538442.tif 000073
配列番号８５
２Ｂ．１．７３重鎖核酸
2017538442.tif 000074
配列番号８６
２Ｂ．１．３２重鎖核酸
2017538442.tif 000075
2017538442.tif 000076
配列番号８７
２Ｂ．１．８８重鎖核酸
2017538442.tif 000077
配列番号８８
２Ｂ．１．１重鎖核酸
2017538442.tif 000078
配列番号８９
２Ｂ．１．３．１０重鎖核酸
2017538442.tif 000079
2017538442.tif 000080
配列番号９０
２Ｂ．１．３．１２重鎖核酸
2017538442.tif 000081
配列番号９１
２Ｂ．１．３．１０  ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ及びＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃエピトープ１
ＴＮＴＥＫＭＥＫＲＬＨＡＶＰＡＡＮＴＶＫＦＲＣＰＡ
配列番号９２
２Ｂ．１．３．１０  ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ及びＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃエピトープ２
ＹＫＶＲＮＱＨＷＳＬＩＭＥＳ
配列番号９３
２Ｂ．１．３．１０  ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ及びＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃエピトープ１
ＴＲＰＥＲＭＤＫＫＬＬＡＶＰＡＡＮＴＶＲＦＲＣＰＡ
配列番号９４
２Ｂ．１．３．１０  ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ及びＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃエピトープ２
ＩＫＬＲＨＱＱＷＳＬＶＭＥＳ
配列番号９５
ＶＨ下位群ＩＩＩコンセンサスフレームワーク
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ
配列番号９６
ＶＨ下位群ＩＩＩコンセンサスフレームワーク
ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ
配列番号９７
ＶＨ下位群ＩＩＩコンセンサスフレームワーク
ＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣ
配列番号９８
ＶＨ下位群ＩＩＩコンセンサスフレームワーク
ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号９９
ＶＬ下位群Ｉコンセンサスフレームワーク
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ
配列番号１００
ＶＬ下位群Ｉコンセンサスフレームワーク
ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ
配列番号１０１
ＶＬ下位群Ｉコンセンサスフレームワーク
ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ
配列番号１０２
ＶＬ下位群Ｉコンセンサスフレームワーク
ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号１０３
2017538442.tif 000082
配列番号１０４
2017538442.tif 000083
配列番号１０５
2017538442.tif 000084
配列番号１０６
2017538442.tif 000085
配列番号１０７
2017538442.tif 000086
配列番号１０８
Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ
配列番号１０９
Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｍｅｔ  Ａｓｎ
配列番号１１０
Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ
配列番号１１１
Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ｍｅｔ  Ａｓｎ
配列番号１１２
Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ｉｌｅ  Ｈｉｓ
配列番号１１３
Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｔｒｐ  Ｉｌｅ  Ｈｉｓ
配列番号１１４
Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｈｉｓ
配列番号１１５
Ｇｌｕ  Ｔｙｒ  Ｔｈｒ  Ｍｅｔ  Ａｓｎ
配列番号１１６
Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｔｒｐ  Ｉｌｅ  Ｇｌｕ
配列番号１１７
Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ｇｌｕ  Ｍｅｔ  Ｈｉｓ
配列番号１１８
Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ｉｌｅ  Ｈｉｓ
配列番号１１９
Ａｒｇ  Ｔｙｒ  Ｔｒｐ  Ｍｅｔ  Ｓｅｒ
配列番号１２０
Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｍｅｔ  Ａｓｎ
配列番号１２１
Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｍｅｔ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ
配列番号１２２
Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｈｉｓ
配列番号１２３
Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ｔｙｒ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｔｒｐ  Ｔｈｒ
配列番号１２４
Ｐｈｅ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ
配列番号１２５
Ｈｉｓ  Ｇｌｎ  Ｖａｌ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｔｒｐ  Ｔｈｒ
配列番号１２６
Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ｔｙｒ  Ｔｒｐ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ
配列番号１２７
Ｐｈｅ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ
配列番号１２８
Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ｈｉｓ  Ｔｙｒ  Ｉｌｅ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｔｙｒ  Ｔｈｒ
配列番号１２９
Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｐｒｏ  Ｔｒｐ  Ｔｈｒ
配列番号１３０
Ｈｉｓ  Ｇｌｎ  Ｔｒｐ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ
配列番号１３１
Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｔｙｒ  Ｔｈｒ
配列番号１３２
Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｍｅｔ  Ｔｙｒ  Ｔｈｒ
配列番号１３３
Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ｔｙｒ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｔｙｒ  Ｔｈｒ
配列番号１３４
Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ｇｌｙ  Ｈｉｓ  Ａｓｎ  Ｐｈｅ  Ｐｒｏ  Ｔｙｒ  Ｔｈｒ
配列番号１３５
Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ｔｙｒ  Ｔｒｐ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ
配列番号１３６
Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ｔｈｒ
配列番号１３７
Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｔｒｐ  Ｔｈｒ
配列番号１３８
Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｔｙｒ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ
配列番号１３９
Ｔｒｐ  Ｉｌｅ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ
配列番号１４０
Ｖａｌ  Ｉｌｅ  Ｔｒｐ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ
配列番号１４１
Ａｒｇ  Ｉｌｅ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ
配列番号１４２
Ａｒｇ  Ｉｌｅ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ｇｌｎ  Ａｓｐ
配列番号１４３
Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ
配列番号１４４
Ａｒｇ  Ｉｌｅ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ
配列番号１４５
Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ
配列番号１４６
Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｔｙｒ  Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｐｈｅ  Ａｒｇ  Ａｓｐ
配列番号１４７
Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｔｒｐ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ
配列番号１４８
Ａｒｇ  Ｉｌｅ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ
配列番号１４９
Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ｔｙｒ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ
配列番号１５０
Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ａｓｐ
配列番号１５１
Ｔｒｐ  Ｉｌｅ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ
配列番号１５２
配列番号１５２
Ｈｉｓ  Ｉｌｅ  Ｔｒｐ  Ｔｒｐ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｔｙｒ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ
配列番号１５３
Ｖａｌ  Ｉｌｅ  Ｔｒｐ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ
配列番号１５４
Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ
配列番号１５５
Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｐｈｅ  Ａｌａ  Ｔｙｒ
配列番号１５６
Ｔｈｒ  Ｈｉｓ  Ａｓｐ  Ｔｒｐ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ
配列番号１５７
Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ
配列番号１５８
Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｓｅｒ  Ｔｒｐ  Ｐｈｅ  Ａｌａ  Ｔｙｒ
配列番号１５９
Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｍｅｔ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｐｈｅ  Ｔｒｐ  Ｐｈｅ  Ａｌａ  Ｔｙｒ
配列番号１６０
Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ
配列番号１６１
Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ
配列番号１６２
Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｔｒｐ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ
配列番号１６３
Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ
配列番号１６４
Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ
配列番号１６５
Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｈｉｓ  Ｔｙｒ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｔｒｐ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ
配列番号１６６
Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ
配列番号１６７
Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｐｒｏ  Ｔｙｒ
配列番号１６８
Ｉｌｅ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ
配列番号１６９
Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ
配列番号１７０
Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ｖａｌ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ
配列番号１７１
Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｔｙｒ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ
配列番号１７２
Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ
配列番号１７３
Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｈｉｓ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ｔｒｐ  Ｌｅｕ  Ａｌａ
配列番号１７４
Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｖａｌ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ
配列番号１７５
Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ａｌａ
配列番号１７６
Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ
配列番号１７７
Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｔｙｒ
配列番号１７８
Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ａｌａ
配列番号１７９
Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ａｓｎ  Ｈｉｓ  Ｍｅｔ  Ｔｙｒ
配列番号１８０
Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｖａｌ  Ａｌａ
配列番号１８１
Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ
配列番号１８２
Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ｔｙｒ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ａｌａ
配列番号１８３
Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｍｅｔ  Ｈｉｓ
配列番号１８４
Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｔｙｒ  Ｍｅｔ  Ｔｈｒ
配列番号１８５
Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ
配列番号１８６
Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｓｅｒ
配列番号１８７
Ｔｙｒ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ
配列番号１８８
Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｔｈｒ
配列番号１８９
Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ
配列番号１９０
Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ｔｙｒ  Ｔｈｒ
配列番号１９１
Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｔｈｒ
配列番号１９２
Ａｌａ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ
配列番号１９３
Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｓｅｒ
配列番号１９４
Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ
配列番号１９５
Ｔｙｒ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｐｒｏ
配列番号１９６
Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ
配列番号１９７
Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ
配列番号１９８
Ａｌａ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｔｈｒ
配列番号１９９
Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ
配列番号２００
Ａｒｇ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ
配列番号２０１
Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ｔｙｒ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｔｒｐ  Ｔｈｒ
配列番号２０２
Ｐｈｅ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ
配列番号２０３
Ｈｉｓ  Ｇｌｎ  Ｖａｌ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｔｒｐ  Ｔｈｒ
配列番号２０４
Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ｔｙｒ  Ｔｒｐ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ
配列番号２０５
Ｐｈｅ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ
配列番号２０６
Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ｈｉｓ  Ｔｙｒ  Ｉｌｅ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｔｙｒ  Ｔｈｒ
配列番号２０７
Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｐｒｏ  Ｔｒｐ  Ｔｈｒ
配列番号２０８
Ｈｉｓ  Ｇｌｎ  Ｔｒｐ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ
配列番号２０９
Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｔｙｒ  Ｔｈｒ
配列番号２１０
Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｍｅｔ  Ｔｙｒ  Ｔｈｒ
配列番号２１１
Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ｔｙｒ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｔｙｒ  Ｔｈｒ
配列番号２１２
Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ｇｌｙ  Ｈｉｓ  Ａｓｎ  Ｐｈｅ  Ｐｒｏ  Ｔｙｒ  Ｔｈｒ
配列番号２１３
Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ｔｙｒ  Ｔｒｐ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ
配列番号２１４
Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ｔｈｒ
配列番号２１５
Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｔｒｐ  Ｔｈｒ
配列番号２１６
2017538442.tif 000087
配列番号２１７
2017538442.tif 000088
配列番号２１８
2017538442.tif 000089
配列番号２１９
2017538442.tif 000090
配列番号２２０
2017538442.tif 000091
配列番号２２１
2017538442.tif 000092
配列番号２２２
2017538442.tif 000093
配列番号２２３
2017538442.tif 000094
配列番号２２４
2017538442.tif 000095
配列番号２２５
2017538442.tif 000096
配列番号２２６
2017538442.tif 000097
配列番号２２７
2017538442.tif 000098
配列番号２２８
2017538442.tif 000099
配列番号２２９
2017538442.tif 000100
配列番号２３０
2017538442.tif 000101
配列番号２３１
2017538442.tif 000102
配列番号２３２
2017538442.tif 000103
配列番号２３３
2017538442.tif 000104
2017538442.tif 000105
配列番号２３４
2017538442.tif 000106
配列番号２３５
2017538442.tif 000107
配列番号２３６
2017538442.tif 000108
配列番号２３７
2017538442.tif 000109
配列番号２３８
2017538442.tif 000110
配列番号２３９
2017538442.tif 000111
配列番号２４０
2017538442.tif 000112
配列番号２４１
2017538442.tif 000113
配列番号２４２
2017538442.tif 000114
配列番号２４３
2017538442.tif 000115
配列番号２４４
2017538442.tif 000116
配列番号２４５
2017538442.tif 000117
配列番号２４６
2017538442.tif 000118
配列番号２４７
2017538442.tif 000119
配列番号２４８
Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ
配列番号２４９
Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ａｌａ
配列番号２５０
Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ｔｙｒ  Ｓｅｒ
配列番号２５１
Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ
配列番号２５２
Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｈｉｓ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ｃｙｓ  Ｐｒｏ
配列番号２５３
Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ｈｉｓ  Ａｒｇ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ａｒｇ  Ｔｙｒ
配列番号２５４
2017538442.tif 000120
2017538442.tif 000121
配列番号２５５
2017538442.tif 000122
2017538442.tif 000123
配列番号２５６
2017538442.tif 000124
2017538442.tif 000125
配列番号２５７
2017538442.tif 000126
2017538442.tif 000127
配列番号２５８
2017538442.tif 000128
2017538442.tif 000129
配列番号２５９
2017538442.tif 000130
2017538442.tif 000131
配列番号２６０
2017538442.tif 000132
2017538442.tif 000133
配列番号２６１
Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ
配列番号２６２
Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ
配列番号２６３
Ｇｌｕ  Ｈｉｓ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｔｒｐ  Ｖａｌ  Ｈｉｓ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｖａｌ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ
配列番号２６４
2017538442.tif 000134
配列番号２６５
ｇｔｔａｃｃｇｇｃｔ  ｔｃｔｃｃｇｇａｇａ  ｃｇｇｇａａａｇｃａ  ａｔａｔｇｇ
配列番号２６６
2017538442.tif 000135
配列番号２６７
2017538442.tif 000136
2017538442.tif 000137
配列番号２６８
2017538442.tif 000138
配列番号２６９
Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｉｌｅ  Ｐｒｏ  Ｔｒｐ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｔｒｐ  Ｖａｌ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ｔｙｒ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｓｅｒ
配列番号２７０
Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｉｌｅ  Ｐｒｏ  Ｔｒｐ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｔｒｐ  Ｖａｌ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ｔｙｒ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｓｅｒ
配列番号２７１
Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｔｒｐ  Ｇｌｙ  Ｍｅｔ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｔｒｐ  Ｉｌｅ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ｔｙｒ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ａｓｎ
配列番号２７２
Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｔｒｐ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｔｒｐ  Ｉｌｅ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ｔｙｒ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ａｓｎ
配列番号２７３
Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｍｅｔ  Ｐｒｏ  Ｔｒｐ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｔｒｐ  Ｍｅｔ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ａｓｎ
配列番号２７４
Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｔｒｐ  Ａｓｐ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｇｌｎ  Ｔｙｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ
配列番号２７５
Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｎ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ
配列番号２７６
２Ｂ．１．１．６  ＨＶＲ−Ｌ１
ＲＡＳＱＤＶＤＴＳＬＡ
配列番号２７７
２Ｂ．１．１．６  ＨＶＲ−Ｌ２
ＳＡＳＦＬＹＳ
配列番号２７８
２Ｂ．１．１．６  ＨＶＲ−Ｌ３
ＱＱＳＴＧＨＰＱＴ
配列番号２７９
２Ｂ．１．１．６  ＨＶＲ−Ｈ１
ＧＦＴＦＴＳＴＧＩＳ
配列番号２８０
２Ｂ．１．１．６  ＨＶＲ−Ｈ２
ＲＹＷＡＷＤＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ
配列番号２８１
２Ｂ．１．１．６  ＨＶＲ−Ｈ３
ＡＲＴＹＧＩＹＤＴＹＤＥＹＴＥＹＶＭＤＹ
配列番号２８２
２Ｂ．１．１．６  ＨＣ
2017538442.tif 000139
配列番号２８３
２Ｂ．１．１．６  ＬＣ
2017538442.tif 000140
【図１】
2017538442.tif 000141
【図２Ａ】
2017538442.tif 000142
【図２Ｂ】
2017538442.tif 000143
【図２Ｃ】
2017538442.tif 000144
【図３Ａ】
2017538442.tif 000145
【図３Ｂ】
2017538442.tif 000146
【図３Ｃ】
2017538442.tif 000147
【図３Ｄ】
2017538442.tif 000148
【図３Ｅ】
2017538442.tif 000149
【図４Ａ】
2017538442.tif 000150
【図４Ｂ】
2017538442.tif 000151
【図４Ｃ】
2017538442.tif 000152
【図５】
2017538442.tif 000153
【図６】
2017538442.tif 000154
【図７】
2017538442.tif 000155
【図８Ａ】
2017538442.tif 000156
【図８Ｂ】
2017538442.tif 000157
【図９Ａ】
2017538442.tif 000158
【図９Ｂ】
2017538442.tif 000159
【図９Ｃ】
2017538442.tif 000160
【図９Ｄ】
2017538442.tif 000161
【図１０】
2017538442.tif 000162
【図１１Ａ】
2017538442.tif 000163
【図１１Ｂ】
2017538442.tif 000164
【図１２】
2017538442.tif 000165
【図１３】
2017538442.tif 000166
【図１４Ａ】
2017538442.tif 000167
【図１４Ｂ】
2017538442.tif 000168
【図１４Ｃ】
2017538442.tif 000169
【図１４Ｄ】
2017538442.tif 000170
【図１５Ａ】
2017538442.tif 000171
【図１５Ｂ】
2017538442.tif 000172
【図１６Ａ】
2017538442.tif 000173
【図１６Ｂ】
2017538442.tif 000174
【図１６Ｃ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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