(57)【要約】本開示は、インプットサンプルの全量が少ない場合か、または対象のターゲットが全サンプル内で相対的に少量またはまれな集団として存在する場合に、サンプルを処理及び分析するための方法及びシステムに関する。本開示は詳細には、対象のターゲット核酸が全核酸に対して相対的に低い割合であるサンプルを含む核酸サンプルを分析することに関する。本開示は、特にインプット核酸量が低い場合に、核酸を分析するための方法及びシステムを提供する。一態様では、本開示は、核酸サンプルに由来し、核酸分子を５０ナノグラム（ｎｇ）未満の量で含む核酸コレクションを提供すること；パーティション内で核酸コレクションを増幅させて、核酸コレクションの増幅産物を形成すること；核酸コレクション及び増幅産物を貯留して、貯留混合物を形成すること；及び貯留混合物内で、核酸の少なくとも一部の核酸配列を検出することを含む、核酸を分析する方法を提供する。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を分析する方法であって、
（ａ）核酸サンプルに由来し、核酸分子を５０ナノグラム（ｎｇ）未満の量で含む核酸コレクションを提供すること；
（ｂ）前記核酸コレクションを、ビーズに放出可能に連結されている複数のオリゴヌクレオチドと組み合わせて、混合物を形成すること；
（ｃ）前記混合物を複数のパーティションに分配し、前記パーティション内で、前記ビーズから前記オリゴヌクレオチドを放出すること；
（ｄ）前記パーティション内で前記核酸コレクションを増幅させて、前記核酸コレクションの増幅産物を形成すること；
（ｅ）前記核酸コレクション及び前記増幅産物を貯留して、貯留混合物を形成すること；及び
（ｆ）前記貯留混合物内の核酸の少なくとも一部の核酸配列を検出すること
を含む前記方法。
【請求項２】
（ｆ）において、前記検出を、９０％超の確度で完了する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｆ）において、前記検出を、９５％超の確度で完了する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
（ｆ）において、前記検出を、９９％超の確度で完了する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
（ｆ）において、前記検出が、前記核酸コレクション内の前記核酸の少なくとも９０％の検出を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
（ｆ）において、前記検出が、前記核酸コレクション内の少量集団の配列の検出を含み、その少量集団が、前記核酸コレクションの５０％未満を構成している、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記少量集団が、前記核酸コレクションの２５％未満を構成している、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記少量集団が、前記核酸コレクションの１０％未満を構成している、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記少量集団が、前記核酸コレクションの５％未満を構成している、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記量が４０ｎｇ未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記量が２０ｎｇ未満である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記量が１０ｎｇ未満である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記量が５ｎｇ未満である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記量が１ｎｇ未満である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記量が０．１ｎｇ未満である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記複数のオリゴヌクレオチドのそれぞれが、少なくとも１つの定常領域及び１つの可変領域を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記定常領域がバーコード配列を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記バーコード配列が、約６ヌクレオチド〜約２０ヌクレオチドの間の長さである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記可変領域がプライマー配列を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
（ｄ）において、前記複数のオリゴヌクレオチドが、前記核酸コレクションの増幅の際のプライマーとして機能する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記オリゴヌクレオチドが、１種または複数種の刺激に曝露されると、前記ビーズから放出される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記刺激が、温度、ｐＨ、光、化学種、及び／または還元剤を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記刺激が、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）またはトリス（２−カルボキシルエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を含む還元剤を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記パーティションが、液滴、マイクロカプセル、ウェル、またはチューブを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記パーティションが流動液滴である、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記流動液滴が、油中水型エマルション内の水性液滴である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
（ｃ）において、前記パーティションを、微小流体デバイスによって発生させる、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記核酸コレクションが体液に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記体液が、血液、血漿、血清、または尿を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記核酸コレクションの少なくとも１サブセットが、１種または複数種の循環腫瘍細胞に由来する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記核酸の１サブセットが腫瘍に由来する、請求項２８または３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記核酸コレクションが組織生検に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記核酸コレクションが胎児核酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記核酸コレクションの核酸の５％未満が胎児核酸を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記核酸サンプルが細胞サンプルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞サンプルが循環腫瘍細胞５％未満を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞サンプルが腫瘍細胞５％未満を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記核酸サンプルが、生サンプル、非保存サンプル、保存サンプル、防腐処置サンプル、及び固定サンプルからなる群から選択されるサンプルに由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
前記サンプルが包埋サンプルである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記サンプルが、ホルムアルデヒド固定及びパラフィン包埋サンプルである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記１種または複数種の循環腫瘍細胞を、非保存サンプルから、またはホルムアルデヒド固定及びパラフィン包埋サンプルから得る、請求項３１に記載の方法。
【請求項４２】
核酸を分析する方法であって：
ａ）核酸サンプルに由来する核酸コレクションを、ビーズに放出可能に連結されている複数のオリゴヌクレオチドと組み合わせて、混合物を形成すること；
ｂ）前記混合物を複数のパーティションに分配すること；
ｃ）前記パーティション内で、前記ビーズから前記オリゴヌクレオチドを放出すること；
ｄ）前記パーティション内で前記核酸コレクションを増幅させて、前記核酸コレクションの増幅産物を形成すること；
ｅ）前記核酸コレクション及び前記増幅産物を貯留して、貯留混合物を形成すること；及び
ｆ）前記貯留混合物中で、前記核酸コレクション内の少量集団の核酸配列を検出するが、その少量集団が、前記核酸コレクションの５０％未満を構成していること
を含む前記方法。
【請求項４３】
前記少量集団が４０％未満を構成している、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記少量集団が３０％未満を構成している、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記少量集団が２０％未満を構成している、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
前記少量集団が１０％未満を構成している、請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
前記少量集団が５％未満を構成している、請求項４２に記載の方法。
【請求項４８】
前記少量集団が１％未満を構成している、請求項４２に記載の方法。
【請求項４９】
前記少量集団が０．１％未満を構成している、請求項４２に記載の方法。
【請求項５０】
前記複数のオリゴヌクレオチドのそれぞれが、少なくとも１つの定常領域及び１つの可変領域を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項５１】
前記定常領域がバーコード配列を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記可変領域がプライマー配列を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
（ｄ）において、前記複数のオリゴヌクレオチドが、前記核酸コレクションの増幅の際にプライマーとして機能する、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記オリゴヌクレオチドが、１種または複数種の刺激に曝露されると、前記ビーズから放出される、請求項４２に記載の方法。
【請求項５５】
前記刺激が、温度、ｐＨ、光、化学種、及び／または還元剤を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記パーティションが、液滴、マイクロカプセル、ウェル、またはチューブを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項５７】
（ｂ）において、前記パーティションを、微小流体デバイスによって発生させる、請求項４２に記載の方法。
【請求項５８】
前記核酸コレクションが体液に由来する、請求項４２に記載の方法。
【請求項５９】
前記体液が、血液、血漿、血清、または尿を含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記核酸コレクションが組織生検に由来する、請求項４２に記載の方法。
【請求項６１】
前記少量集団が腫瘍核酸を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項６２】
前記少量集団が胎児核酸を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項６３】
前記少量集団が循環腫瘍細胞核酸を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項６４】
核酸を分析する方法であって、
ａ）核酸サンプルに由来し、核酸分子を５０ナノグラム（ｎｇ）未満の量で含む核酸コレクションを提供すること；
ｂ）前記核酸コレクションを複数のオリゴヌクレオチドと組み合わせて、混合物を形成するが、前記複数のオリゴヌクレオチドのそれぞれが、少なくとも１つの定常領域及び１つの可変領域を含み、その定常領域がバーコード配列を含むこと；
ｃ）前記混合物を複数のパーティションに分配し、前記パーティション内で、前記核酸コレクションを増幅させて、前記核酸コレクションの増幅産物を形成すること；
ｄ）前記核酸コレクション及び前記増幅産物を貯留して、貯留混合物を形成すること；及び
ｅ）前記貯留混合物内の核酸の少なくとも一部の核酸配列を、少なくとも９０％の感度で検出すること
を含む前記方法。
【請求項６５】
前記量が４０ｎｇ未満である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記量が２０ｎｇ未満である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記量が１０ｎｇ未満である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記量が５ｎｇ未満である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記量が１ｎｇ未満である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記量が０．１ｎｇ未満である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記可変領域が１つのプライマー配列を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項７２】
（ｃ）において、前記複数のオリゴヌクレオチドが、前記核酸コレクションの増幅の際にプライマーとして機能する、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
（ｅ）において、前記検出が、前記貯留混合物内の核酸の少なくとも一部の核酸配列を少なくとも９５％の感度で検出することを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項７４】
（ｅ）において、前記検出が、前記貯留混合物内の核酸の少なくとも一部の核酸配列を少なくとも９９％の感度で検出することを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項７５】
核酸配列を分析するための方法であって、
ａ）核酸サンプルから生成された核酸分子を含むパーティションを提供すること；
ｂ）前記核酸分子を前記パーティションから核酸混合物に貯留すること；
ｃ）前記核酸混合物を核酸シーケンシングに掛けて、前記核酸分子の核酸配列を含むシーケンシング読み取りデータを生成すること；
ｄ）プログラムコンピュータプロセッサを使用して、（ｉ）前記シーケンシング読み取りデータを分析し、かつ（ｉｉ）前記シーケンシング読み取りデータ中で、前記核酸混合物中のコンタミナント核酸分子に関連する少なくとも１つのコンタミナント読み取りデータを特定すること；
ｅ）前記シーケンシング読み取りデータから前記コンタミナント読み取りデータを除去すること；
ｆ）前記コンタミナント読み取りデータを除去して、前記シーケンシング読み取りデータから、前記核酸サンプルの配列を生成すること
を含む前記方法。
【請求項７６】
前記少なくとも１つのコンタミナント読み取りデータが、コンタミナント核酸分子に関連する複数のコンタミナント読み取りデータを含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記配列を、少なくとも９０％の確度で生成する、請求項７５に記載の方法。
【請求項７８】
前記配列を、少なくとも９５％の確度で生成する、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記配列を、少なくとも９９％の確度で生成する、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記パーティションが流動液滴を含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項８１】
前記流動液滴が、油中水型エマルション内の水性液滴を含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
（１）前記シーケンシング読み取りデータのサブセット中の配列オーバーラップ（複数可）を決定し、かつ（２）前記シーケンシング読み取りデータの所定の１つでのオーバーラップ（複数可）が、前記サブセットのすべてに対して５０％未満であれば、前記コンタミナント読み取りデータと特定することによって、前記コンタミナント読み取りデータを特定する、請求項７５に記載の方法。
【請求項８３】
前記配列読み取りデータの前記所定の１つでの配列オーバーラップ（複数可）が前記サブセットのすべてに対して２５％未満であれば、前記コンタミナント読み取りデータと特定することを、（２）がさらに含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記配列読み取りデータの前記所定の１つでの配列オーバーラップ（複数可）が前記サブセットのすべてに対して１０％未満であれば、前記コンタミナント読み取りデータと特定することを、（２）がさらに含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記配列読み取りデータの前記所定の１つでの配列オーバーラップ（複数可）が前記サブセットのすべてに対して５％未満であれば、前記コンタミナント読み取りデータと特定することを、（２）がさらに含む、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記配列読み取りデータの前記所定の１つでの配列オーバーラップ（複数可）が前記サブセットのすべてに対して１％未満であれば、前記コンタミナント読み取りデータと特定することを、（２）がさらに含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記配列読み取りデータの前記所定の１つでの配列オーバーラップ（複数可）が前記サブセットのすべてに対して０．１％未満であれば、前記コンタミナント読み取りデータと特定することを、（２）がさらに含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記配列読み取りデータの前記所定の１つの配列が前記サブセットのすべてに対してオーバーラップしなければ、前記コンタミナント読み取りデータと特定することを、（２）がさらに含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
（１）前記シーケンシング読み取りデータを参照と比較し、かつ（２）所定のシーケンシング読み取りデータが、前記参照と５０％未満オーバーラップすれば、前記シーケンシング読み取りデータの前記所定のシーケンシング読み取りデータを前記コンタミナント読み取りデータと特定することによって、前記コンタミナント読み取りデータを特定する、請求項７５に記載の方法。
【請求項９０】
前記所定のシーケンシング読み取りデータが前記参照と２５％未満オーバーラップすれば、前記シーケンシング読み取りデータの前記所定のシーケンシング読み取りデータを前記コンタミナント読み取りデータと特定することを、（２）がさらに含む、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記所定のシーケンシング読み取りデータが前記参照と１０％未満オーバーラップすれば、前記シーケンシング読み取りデータの前記所定のシーケンシング読み取りデータを前記コンタミナント読み取りデータと特定することを、（２）がさらに含む、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記所定のシーケンシング読み取りデータが前記参照と５％未満オーバーラップすれば、前記シーケンシング読み取りデータの前記所定のシーケンシング読み取りデータを前記コンタミナント読み取りデータと特定することを、（２）がさらに含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記所定のシーケンシング読み取りデータが前記参照と１％未満オーバーラップすれば、前記シーケンシング読み取りデータの前記所定のシーケンシング読み取りデータを前記コンタミナント読み取りデータと特定することを、（２）がさらに含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記所定のシーケンシング読み取りデータが前記参照と０．１％未満オーバーラップすれば、前記シーケンシング読み取りデータの前記所定のシーケンシング読み取りデータを前記コンタミナント読み取りデータと特定することを、（２）がさらに含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記所定のシーケンシングが前記参照とオーバーラップしなければ、前記シーケンシング読み取りデータの前記所定のシーケンシング読み取りデータを前記コンタミナント読み取りデータと特定することを、（２）がさらに含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
（１）前記シーケンシング読み取りデータを相互に比較して、前記シーケンシング読み取りデータ中の配列オーバーラップ（複数可）を特定し、かつ（２）前記シーケンシング読み取りデータ中の他のシーケンシング読み取りデータとのその配列オーバーラップが５０％未満であれば、前記シーケンシング読み取りデータの所定の１つを前記コンタミナント読み取りデータと特定することによって、前記コンタミナント読み取りデータを特定する、請求項７５に記載の方法。
【請求項９７】
前記シーケンシング読み取りデータ中の他のシーケンシング読み取りデータとのその配列オーバーラップが２５％未満であれば、前記シーケンシング読み取りデータの前記所定の１つを前記コンタミナント読み取りデータと特定することを、（２）がさらに含む、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記シーケンシング読み取りデータ中の他のシーケンシング読み取りデータとのその配列オーバーラップが１０％未満であれば、前記シーケンシング読み取りデータの前記所定の１つを前記コンタミナント読み取りデータと特定することを、（２）がさらに含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記シーケンシング読み取りデータ中の他のシーケンシング読み取りデータとのその配列オーバーラップが５％未満であれば、前記シーケンシング読み取りデータの前記所定の１つを前記コンタミナント読み取りデータと特定することを、（２）がさらに含む、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記シーケンシング読み取りデータ中の他のシーケンシング読み取りデータとのその配列オーバーラップが１％未満であれば、前記シーケンシング読み取りデータの前記所定の１つを前記コンタミナント読み取りデータと特定することを、（２）がさらに含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記シーケンシング読み取りデータ中の他のシーケンシング読み取りデータとのその配列オーバーラップが０．１％未満であれば、前記シーケンシング読み取りデータの前記所定の１つを前記コンタミナント読み取りデータと特定することを、（２）がさらに含む、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
その配列が前記シーケンシング読み取りデータ中の他のシーケンシング読み取りデータの配列とオーバーラップしなければ、前記シーケンシング読み取りデータの前記所定の１つを前記コンタミナント読み取りデータと特定することを、（２）がさらに含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
ａ）が、前記パーティション中で、前記核酸分子のそれぞれに対応するバーコード化断片またはそのコピーを生成することを含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項１０４】
ｃ）において、前記シーケンシング読み取りデータが、前記バーコード化断片またはそのコピーの核酸配列を含むバーコード化断片読み取りデータを含む、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
所定のバーコード化断片読み取りデータがマッピングする配列領域が、前記配列領域にマッピング可能な全バーコード化断片読み取りデータの２０％未満の前記配列領域の間に、共通のバーコード配列を有するバーコード化断片読み取りデータをマッピングすれば、前記バーコード化断片読み取りデータの前記所定の１つを前記コンタミナント読み取りデータと特定することによって、前記コンタミナント読み取りデータを特定する、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
所定のバーコード化断片読み取りデータがマッピングする配列領域が、前記配列領域にマッピング可能な全バーコード化断片読み取りデータの１５％未満の前記配列領域の間に、共通のバーコード配列を有するバーコード化断片読み取りデータをマッピングすれば、前記バーコード化断片読み取りデータの前記所定の１つを前記コンタミナント読み取りデータと特定することによって、前記コンタミナント読み取りデータを特定する、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
所定のバーコード化断片読み取りデータがマッピングする配列領域が、前記配列領域にマッピング可能な全バーコード化断片読み取りデータの１０％未満の前記配列領域の間に、共通のバーコード配列を有するバーコード化断片読み取りデータをマッピングすれば、前記バーコード化断片読み取りデータの前記所定の１つを前記コンタミナント読み取りデータと特定することによって、前記コンタミナント読み取りデータを特定する、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
所定のバーコード化断片読み取りデータがマッピングする配列領域が、前記配列領域にマッピング可能な全バーコード化断片読み取りデータの５％未満の前記配列領域の間に、共通のバーコード配列を有するバーコード化断片読み取りデータをマッピングすれば、前記バーコード化断片読み取りデータの前記所定の１つを前記コンタミナント読み取りデータと特定することによって、前記コンタミナント読み取りデータを特定する、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
所定のバーコード化断片読み取りデータがマッピングする配列領域が、前記配列領域にマッピング可能な全バーコード化断片読み取りデータの３％未満の前記配列領域の間に、共通のバーコード配列を有するバーコード化断片読み取りデータをマッピングすれば、前記バーコード化断片読み取りデータの前記所定の１つを前記コンタミナント読み取りデータと特定することによって、前記コンタミナント読み取りデータを特定する、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
所定のバーコード化断片読み取りデータがマッピングする配列領域が、前記配列領域にマッピング可能な全バーコード化断片読み取りデータの０．１％未満の前記配列領域の間に、共通のバーコード配列を有するバーコード化断片読み取りデータをマッピングすれば、前記バーコード化断片読み取りデータの前記所定の１つを前記コンタミナント読み取りデータと特定することによって、前記コンタミナント読み取りデータを特定する、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記配列読み取りデータをそれらの配列領域（複数可）にマッピングし、かつその配列領域（複数可）にマッピングした場合の所定の配列読み取りデータが、それらの配列領域（複数可）にマッピングした場合の前記配列読み取りデータのうちの１０未満の他の読み取りデータとオーバーラップすれば、前記配列読み取りデータの前記所定の配列読み取りデータを前記コンタミナント読み取りデータと特定することによって、前記コンタミナント読み取りデータを特定する、請求項７５に記載の方法。
【請求項１１２】
前記配列読み取りデータをそれらの配列領域（複数可）にマッピングし、かつその配列領域（複数可）にマッピングした場合の所定の配列読み取りデータが、それらの配列領域（複数可）にマッピングした場合の前記配列読み取りデータのうちの５未満の他の読み取りデータとオーバーラップすれば、前記配列読み取りデータの前記所定の配列読み取りデータを前記コンタミナント読み取りデータと特定することによって、前記コンタミナント読み取りデータを特定する、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
前記配列読み取りデータをそれらの配列領域（複数可）にマッピングし、かつその配列領域（複数可）にマッピングした場合の所定の配列読み取りデータが、それらの配列領域（複数可）にマッピングした場合の前記配列読み取りデータのうちの３未満の他の読み取りデータとオーバーラップすれば、前記配列読み取りデータの前記所定の配列読み取りデータを前記コンタミナント読み取りデータと特定することによって、前記コンタミナント読み取りデータを特定する、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
前記配列読み取りデータをそれらの配列領域（複数可）にマッピングし、かつその配列領域（複数可）にマッピングした場合の所定の配列読み取りデータが、それらの配列領域（複数可）にマッピングした場合の前記配列読み取りデータのうちの１未満の他の読み取りデータとオーバーラップすれば、前記配列読み取りデータの前記所定の配列読み取りデータを前記コンタミナント読み取りデータと特定することによって、前記コンタミナント読み取りデータを特定する、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
前記配列読み取りデータをそれらの配列領域（複数可）にマッピングし、かつその配列領域（複数可）にマッピングした場合の所定の配列読み取りデータが、それらの配列領域（複数可）にマッピングした場合の前記配列読み取りデータの他の読み取りデータとオーバーラップしなければ、前記配列読み取りデータの前記所定の配列読み取りデータを前記コンタミナント読み取りデータと特定することによって、前記コンタミナント読み取りデータを特定する、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
ｂ）において、前記核酸混合物中の前記コンタミナント核酸分子の量が、前記核酸混合物中の前記核酸分子の１％未満である、請求項７５に記載の方法。
【請求項１１７】
ｂ）において、前記核酸混合物中の前記コンタミナント核酸分子の量が、前記核酸混合物中の前記核酸分子の０．１％未満である、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
ｂ）において、前記核酸混合物中の前記コンタミナント核酸分子の量が、前記核酸混合物中の前記核酸分子の０．０１％未満である、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
ｂ）において、前記核酸混合物中の前記コンタミナント核酸分子の量が、前記核酸混合物中の前記核酸分子の０．００１％未満である、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
ｂ）において、前記核酸混合物中の前記コンタミナント核酸分子の量が、前記核酸混合物中の前記核酸分子の０．０００１％未満である、請求項１１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、それらの出願のそれぞれが、あらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれる２０１４年６月２６日出願の米国特許仮出願第６２／０１７，５８０号及び２０１４年１０月１４日出願の米国特許仮出願第６２／０６３，８７０号の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
診断、予後、生物工学、及び法医学的生物学を含む様々な生物医学的状況において情報を得るために、核酸シーケンシングが広く使用されている。シーケンシングには、マクサム−ギルバートシーケンシング及び連鎖終止法を含む基本的な方法、またはショットガンシーケンシング及びブリッジＰＣＲを含むｄｅ  ｎｏｖｏシーケンシング法、またはポロニーシーケンシング、４５４ピロシーケンシング、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシング、ＳＯＬｉＤシーケンシング、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ半導体シーケンシング、ＨｅｌｉＳｃｏｐｅ単一分子シーケンシング、ＳＭＲＴ（登録商標）シーケンシングなどを含む次世代法が含まれ得る。多くのシーケンシング用途は、通常は数百ナノグラムから数十マイクログラムまでで変動する最小量のサンプルインプットを必要とする。出発物質の比較的高いインプットについてのそのような必要条件は、多数の用途、特に、少量の出発物質しか利用することができない用途に対する重大な障害の原因となり得る。そのような用途の例には、少量のＤＮＡのみが胎児起源である非侵襲的出生前診断（ＮＩＰＤ）、及び多くの場合に、サンプルの大部分が正常な健康細胞から構成され、少量のみが腫瘍またはがん細胞に起源するがん診断が含まれる。当技術分野では、相対的に少量であるか、またはサンプル中の問題の核酸が、存在する核酸全体の相対的に低い割合を構成しているサンプル核酸の出発量を用いて、サンプルを核酸シーケンシングするための方法及び組成物を開発する必要がある。本開示は、これら及び様々な他の必要に対処する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
概要
本開示は、特にインプット核酸量が低い場合に、核酸を分析するための方法及びシステムを提供する。一態様では、本開示は、核酸サンプルに由来し、核酸分子を５０ナノグラム（ｎｇ）未満の量で含む核酸コレクションを提供すること；パーティション内で核酸コレクションを増幅させて、核酸コレクションの増幅産物を形成すること；核酸コレクション及び増幅産物を貯留して、貯留混合物を形成すること；及び貯留混合物内で、核酸の少なくとも一部の核酸配列を検出することを含む、核酸を分析する方法を提供する。
【０００４】
一部の実施形態では、核酸コレクションを得た後で、かつ増幅させる前に、上記方法は、核酸コレクションを、ビーズに放出可能に連結されている複数のオリゴヌクレオチドと組み合わせて、混合物を形成すること、混合物をパーティションに分配すること、及びパーティション内で、ビーズからオリゴヌクレオチドを放出することを含む。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドのそれぞれは、少なくとも１つの定常領域及び１つの可変領域を含む。一部の実施形態では、定常領域は、バーコード配列を含む。一部の実施形態では、バーコード配列は、約６ヌクレオチド〜約２０ヌクレオチドの間の長さである。一部の実施形態では、可変領域は、プライマー配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、核酸コレクションの増幅の際に、プライマーとして機能する。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１種または複数種の刺激（例えば、ｐＨ、光、化学種、及び／または還元剤（例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）またはトリス（２−カルボキシルエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ））に曝露されると、ビーズから放出される。
【０００５】
一部の実施形態では、検出を、９０％超の確度で完了する。一部の実施形態では、検出を、９５％超の確度で完了する。一部の実施形態では、検出を、９９％超の確度で完了する。一部の実施形態では、検出は、核酸コレクション内の核酸の少なくとも９０％を検出することを含む。一部の実施形態では、検出は、核酸コレクション内で、その少量集団が核酸コレクションの５０％未満を構成している少量集団の配列を検出することを含む。一部の実施形態では、少量集団は、核酸コレクションの２５％未満を構成している。一部の実施形態では、少量集団は、核酸コレクションの１０％未満を構成している。一部の実施形態では、少量集団は、核酸コレクションの５％未満を構成している。
【０００６】
一部の実施形態では、上記量は、４０ｎｇ未満である。一部の実施形態では、上記量は、２０ｎｇ未満である。一部の実施形態では、上記量は、１０ｎｇ未満である。一部の実施形態では、上記量は、５ｎｇ未満である。一部の実施形態では、上記量は、１ｎｇ未満である。一部の実施形態では、上記量は、０．１ｎｇ未満である。
【０００７】
一部の実施形態では、パーティションは、液滴（例えば、油中水型エマルション内の水性液滴などの流動液滴）、マイクロカプセル、ウェル、またはチューブを含む。一部の実施形態では、パーティションを、微小流体デバイスによって発生させる。
【０００８】
一部の実施形態では、核酸コレクションは、例えば、血液、血漿、血清、または尿を含む体液などの体液に由来する。一部の実施形態では、核酸コレクションの少なくとも１サブセットは、１種または複数種の循環腫瘍細胞（例えば、非保存サンプルから、またはホルムアルデヒド固定及びパラフィン包埋サンプルから得られる１種または複数種の循環腫瘍細胞など）及び／または腫瘍に由来する。一部の実施形態では、核酸コレクションは、組織生検に由来する。一部の実施形態では、核酸コレクションは、胎児核酸を含む。一部の実施形態では、核酸コレクションの核酸の５％未満が、胎児核酸を含む。一部の実施形態では、核酸サンプルは、細胞サンプルを含む。一部の実施形態では、細胞サンプルは、循環腫瘍細胞５％未満を含む。一部の実施形態では、細胞サンプルは、腫瘍細胞５％未満を含む。
【０００９】
一部の実施形態では、核酸サンプルは、生サンプル、非保存サンプル、保存サンプル、防腐処置サンプル、及び／または固定サンプルに由来する。一部の実施形態では、サンプルは、包埋サンプルである。一部の実施形態では、サンプルは、ホルムアルデヒド固定及びパラフィン包埋サンプルである。
【００１０】
別の態様では、本開示は、パーティション内で、核酸サンプルに由来する核酸コレクションを増幅させて、核酸コレクションの増幅産物を形成すること；核酸コレクション及び増幅産物を貯留して、貯留混合物を形成すること；及び貯留混合物中の核酸コレクション内で、核酸コレクションの５０％未満を構成する少量集団の核酸配列を検出することを含む、核酸を分析する方法を提供する。
【００１１】
一部の実施形態では、上記方法は、核酸コレクションを増幅させる前に、核酸コレクションを、ビーズに放出可能に連結されている複数のオリゴヌクレオチドと組み合わせて、混合物を形成すること、混合物をパーティションに分配すること、及びパーティション内で、ビーズからオリゴヌクレオチドを放出することを含む。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドのそれぞれは、少なくとも１つの定常領域及び１つの可変領域を含む。一部の実施形態では、定常領域は、バーコード配列を含む。一部の実施形態では、可変領域は、プライマー配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、核酸コレクションの増幅の際に、プライマーとして機能する。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドを、１種または複数種の刺激（例えば、ｐＨ、光、化学種、及び／または還元剤への曝露で、ビーズから放出する。
【００１２】
一部の実施形態では、少量集団は、４０％未満を構成している。一部の実施形態では、少量集団は、３０％未満を構成している。一部の実施形態では、少量集団は、２０％未満を構成している。一部の実施形態では、少量集団は、１０％未満を構成している。一部の実施形態では、少量集団は、５％未満を構成している。一部の実施形態では、少量集団は、１％未満を構成している。一部の実施形態では、少量集団は、０．１％未満を構成している。一部の実施形態では、少量集団は、腫瘍核酸を含む。一部の実施形態では、少量集団は、胎児核酸を含む。一部の実施形態では、少量集団は、循環腫瘍細胞核酸を含む。
【００１３】
一部の実施形態では、パーティションは、液滴、マイクロカプセル、ウェル、またはチューブを含む。一部の実施形態では、パーティションを、微小流体デバイスによって発生させる。一部の実施形態では、核酸コレクションは、例えば、血液、血漿、血清、または尿を含む体液などの体液に由来する。一部の実施形態では、核酸コレクションは、組織生検に由来する。
【００１４】
別の態様では、本開示は、核酸サンプルに由来し、核酸分子を５０ナノグラム（ｎｇ）未満の量で含む核酸コレクションを提供すること；核酸コレクションを、複数のオリゴヌクレオチドと組み合わせて、混合物を形成し、その際、オリゴヌクレオチドのそれぞれが、少なくとも１つの定常領域及び１つの可変領域を含み、その定常領域がバーコード配列を含むこと；混合物を複数のパーティションに分配し、パーティション内で核酸コレクションを増幅させて、核酸コレクションの増幅産物を形成すること；核酸コレクション及び増幅産物を貯留して、貯留混合物を形成すること；及び貯留混合物内で、核酸の少なくとも一部の核酸配列を、少なくとも９０％の感度で検出することを含む、核酸を分析する方法を提供する。
【００１５】
一部の実施形態では、核酸コレクションは、核酸分子を４０ｎｇ未満の量で含む。一部の実施形態では、核酸コレクションは、核酸分子を２０ｎｇ未満の量で含む。一部の実施形態では、核酸コレクションは、核酸分子を１０ｎｇ未満の量で含む。一部の実施形態では、核酸コレクションは、核酸分子を５ｎｇ未満の量で含む。一部の実施形態では、核酸コレクションは、核酸分子を１ｎｇ未満の量で含む。一部の実施形態では、核酸コレクションは、核酸分子を０．１ｎｇ未満の量で含む。
【００１６】
一部の実施形態では、可変領域は、プライマー配列を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、核酸コレクションの増幅の際に、プライマーとして機能する。一部の実施形態では、検出は、貯留混合物内の核酸の少なくとも一部の核酸配列を少なくとも９５％の感度で検出することを含む。一部の実施形態では、検出は、貯留混合物内の核酸の少なくとも一部の核酸配列を少なくとも９９％の感度で検出することを含む。
【００１７】
別の態様では、本開示は、核酸サンプルから生成する核酸分子を含むパーティションを提供すること；核酸分子をパーティションから核酸混合物に貯留すること；核酸混合物を核酸シーケンシングに掛けて、核酸分子の核酸配列を含むシーケンシング読み取りデータを生成すること；プログラムコンピュータプロセッサを使用して、シーケンシング読み取りデータを分析し、かつ核酸混合物中のコンタミナント核酸分子と関連するシーケンシング読み取りデータにおいて、少なくとも１つのコンタミナント読み取りデータを特定すること；コンタミナント読み取りデータを、シーケンシング読み取りデータから除去すること；及びコンタミナント読み取りデータを除去して、シーケンシング読み取りデータから核酸サンプルの配列を生成することを含む、核酸配列を分析するための方法を提供する。
【００１８】
一部の実施形態では、核酸混合物中のコンタミナント核酸分子の量は、核酸混合物中の核酸分子の５０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、０．１％未満、０．０１％未満、０．００１％未満、または０．０００１％未満である。
【００１９】
一部の実施形態では、少なくとも１つのコンタミナント読み取りデータは、コンタミナント核酸分子と関連する複数のコンタミナント読み取りデータを含む。一部の実施形態では、配列を、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の確度で生成する。一部の実施形態では、パーティションは、例えば、油中水型エマルション内の水性液滴などの流動液滴を含む。
【００２０】
一部の実施形態では、シーケンシング読み取りデータのサブセット中の配列オーバーラップ（複数可）を決定し、かつシーケンシング読み取りデータの所定の１つについてのオーバーラップ（複数可）が、サブセットのすべてに対して５０％未満、サブセットのすべてに対して２５％未満、サブセットのすべてに対して１０％未満、サブセットのすべてに対して５％未満、サブセットのすべてに対して１％未満、またはサブセットのすべてに対して０．１％未満であれば、コンタミナント読み取りデータと特定することによって、コンタミナント読み取りデータを特定する。一部の実施形態では、シーケンシング読み取りデータのサブセット中の配列オーバーラップ（複数可）を決定し、かつ配列読み取りデータの所定の１つの配列がサブセットのすべてに対してオーバーラップしていなければ、コンタミナント読み取りデータと特定することによって、コンタミナント読み取りデータを特定する。
【００２１】
一部の実施形態では、シーケンシング読み取りデータを参照と比較し、かつ所定のシーケンシング読み取りデータが参照と５０％未満、２５％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、または０．１％未満オーバーラップしていれば、シーケンシング読み取りデータの所定のシーケンシング読み取りデータをコンタミナント読み取りデータと特定することによって、コンタミナント読み取りデータを特定する。一部の実施形態では、シーケンシング読み取りデータを参照と比較し、かつ所定のシーケンシングが参照とオーバーラップしていなければ、シーケンシング読み取りデータの所定のシーケンシング読み取りデータをコンタミナント読み取りデータと特定することによって、コンタミナント読み取りデータを特定する。
【００２２】
一部の実施形態では、シーケンシング読み取りデータを相互に比較して、シーケンシング読み取りデータ中の配列オーバーラップ（複数可）を特定し、かつシーケンシング読み取りデータ中の他のシーケンシング読み取りデータとのその配列オーバーラップが、５０％未満であるか、２５％未満であるか、１０％未満であるか、５％未満であるか、１％未満であるか、または０．１％未満であれば、シーケンシング読み取りデータの所定の１つを、コンタミナント読み取りデータと特定することによって、コンタミナント読み取りデータを特定する。一部の実施形態では、シーケンシング読み取りデータを相互に比較して、シーケンシング読み取りデータ中の配列オーバーラップ（複数可）を特定し、かつその配列が、シーケンシング読み取りデータ中の他のシーケンシング読み取りデータの配列とオーバーラップしなければ、シーケンシング読み取りデータの所定の１つをコンタミナント読み取りデータと特定することによって、コンタミナント読み取りデータを特定する。
【００２３】
一部の実施形態では、核酸サンプルから生成された核酸分子を含むパーティションの提供は、パーティション内の核酸分子のそれぞれに対応するバーコード化（ｂａｒｃｏｄｅｄ）断片またはそのコピーの生成を含む。一部の実施形態では、シーケンシング読み取りデータは、バーコード化断片またはそのコピーの核酸配列を含むバーコード化断片読み取りデータを含む。一部の実施形態では、所定のバーコード化断片読み取りデータがマッピングする配列領域が、配列領域にマッピング可能な全バーコード化断片読み取りデータの２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、３％未満、または０．１％未満の配列領域の間に、共通のバーコード配列を有するバーコード化断片読み取りデータをマッピングすれば、バーコード化断片読み取りデータの所定の１つをコンタミナント読み取りデータと特定することによって、コンタミナント読み取りデータを特定する。
【００２４】
一部の実施形態では、配列読み取りデータを、それらの配列領域（複数可）にマッピングし、かつその配列領域（複数可）にマッピングした場合の所定の配列読み取りデータが、それらの配列領域（複数可）にマッピングした場合の配列読み取りデータの１０未満、５未満、３未満、もしくは１未満の他の読取りデータとオーバーラップするか、または他の読み取りデータとオーバーラップしなければ、配列読み取りデータの所定の配列読み取りデータをコンタミナント読み取りデータと特定することによって、コンタミナント読み取りデータを特定する。
【００２５】
本開示の実施形態の単なる実例を表示及び記載する下記の詳細な説明により、本開示の追加の態様及び利点は、当業者には容易に明らかになるであろう。了解されるであろうが、本開示は、他の実施形態及び異なる実施形態が可能であり、そのいくつかの詳細は、すべて本開示から逸脱することなく、様々な明白な点において変更が可能である。したがって、図面及び説明は、本質的に実例とみなされるべきであり、制限とみなされるべきではない。
【００２６】
参照による組み込み
それぞれ個々の刊行物、特許、または特許出願が具体的かつ個別に、参照によって組み込まれると示されている場合と同様に、本明細書において言及するすべての刊行物、特許、及び特許出願は、それらの全体で参照によって本明細書に組み込まれる。
【００２７】
本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲において詳細に記述する。本発明の原理が利用されている実施形態の実例を記述する次の詳細な説明及び添付の図面（本明細書において「図」及び「ＦＩＧ」とも）を参照することによって、本発明の特徴及び利点のより良好な理解が得られるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】シーケンシングのためのサンプル処理例のフローダイアグラムである。
【図２】サンプル及びビーズを同時分配するための微小流体チャネル構造例の図示である。
【図３】サンプルを増幅及びバーコード化するための処理例の図示である。
【図４】配列データをそれらの起源に帰属させる際の、配列バーコード化の使用例の図示である。
【図５】コンピュータ制御システム例の図示である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明の様々な実施形態を本明細書において示し、記載するが、そのような実施形態が例としてのみ提示されていることは、当業者には明白であろう。本発明から逸脱することなく、多数の変形、変化、及び置換が、当業者には思い浮かび得る。本明細書に記載の本発明の実施形態に対する様々な代案を使用してもよいことは理解されるべきである。
【００３０】
Ｉ．概観
本開示は、出発物質が比較的少量である場合か、または対象のターゲットが全出発物質の低いパーセンテージのみを構成している場合に、サンプル処理及び分析において有用な方法及びシステムを提供する。本明細書において提供する方法及びシステムは特に、出発核酸（例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡなど）（または出発ターゲット核酸）が少量で存在するか、または分析のターゲットとされた核酸がサンプル内の全核酸に対して相対的に低い割合で存在する核酸シーケンシング用途のために有用である。本明細書において提供する方法及びシステムは一般に、出発サンプル物質を別個の分離ユニットに分配すること；特定バーコードを別個のユニット中の物質に施与して、物質をユニットごとに特定することができるようにすること；ユニットからの物質を貯留すること；貯留された物質をシーケンシングすること；及び対象の核酸を検出または定量するために、シーケンシング情報を分析することを伴う。
【００３１】
記載の方法及びシステムは、現行の核酸シーケンシング技術及びそれらの関連サンプル調製法に対し著しく有利な点を提供する。例えば、インプット核酸の全量が非常に少ない場合に、核酸を特性決定することができることにおいて、上記方法及びシステムは特に有用である。多くの核酸分析システムにおいて、決定的な限界は、システムが、非常に少量の核酸を分析することができないことにある。稀な事象、個々の細胞を分析するか、またはサンプルを得ることが困難であるか、もしくは処理することが困難である場合に、このことは困難をもたらす。例として、多くの現況技術のシーケンシングシステムは、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングシステムでは５０〜１００ナノグラム（ｎｇ）の範囲、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＳＭＲＴシーケンシングでは、出発核酸５００ｎｇまで、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔシーケンシングシステムでは、１マイクログラム（μｇ）までの分析用核酸の出発量を必要とする。
【００３２】
インプット核酸の量が少ない場合の核酸の分析及び特性決定において価値があることに加えて、本明細書に記載の方法及びシステムはまた、例えば、上記のとおり、サンプル核酸の量が絶対的に低いレベルにある場合、及び低い相対割合で存在する場合の両方で、分析するサンプル中の全核酸に対して低い割合として存在する核酸についてサンプルを分析する場合に重要な利点を提供する。例として、多くのシーケンシング技術は、シーケンシングプロセスに十分な物質を作成するために、サンプル中のターゲット核酸の大幅な増幅に依存している。特に、サンプルが、問題の少量集団を含有する不均一な集団である場合には、例えば、問題のターゲット核酸が全核酸に対して相対的に低い割合（例えば、２０％未満）として存在する場合には、これらの増幅プロセスは、情報喪失の原因となり得る。とりわけ、サンプル内での核酸の大幅な増幅は、多量集団を優先的に増幅させ得、サンプルの少量集団からのシグナルを埋没させる。サンプル内の核酸の多量集団は一部の場合には、増幅プロセスの間に、多量集団が優先的に増幅されるように、少量集団を打ち負かしてしまうことがある。多量及び少量核酸集団を含むサンプルの例は、健康な組織と、ごく少量の罹患組織、例えば、腫瘍からの組織とを主に含有し得る組織生検サンプルである。したがって、そのようなサンプルから抽出された核酸（例えば、ＤＮＡ）のうちの少量のパーセンテージのみが、罹患または異常な集団であり得る（例えば、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、０．１％未満、０．０５％未満、０．０１％未満、０．００５％未満、０．００１％未満など）。ＰＣＲなどの典型的な増幅方法は、健康な組織からのＤＮＡを迅速に増幅させて、腫瘍細胞からのＤＮＡの増幅を損傷させ、その上、増幅を排除することがある。そのような増幅は、例えば、比較的多量から出発するサンプルが少量成分の増幅に急速に勝る、幾何学的増幅の進行を含むいくつかの要因から生じる。これはまた、より迅速に増殖する集団が、増幅のために利用可能な供給源、例えば、プライマー、ポリメラーゼ、及びヌクレオチドに、その多量成分を増幅させるように迅速に命令して、少量成分の増幅を排除する、供給源の利用から生じ得る。さらに、これらの増幅反応は典型的には、貯留状況において実施されるので、増幅配列の起源は、特異的な染色体、ポリヌクレオチド、または生体の点において、プロセスの間に保存され得ない。
【００３３】
ある種の態様では、本明細書において提供する方法及びシステムは、個々の核酸または少数の核酸を、それらが別々の反応容積に、例えば、それらの核酸成分が初めに増幅され得る液滴または他のパーティションに割り当てられるように分配する。この当初増幅の間に、固有のバーコードを、それらの別々の反応容積中にある成分にカップリングさせる。異なる成分の別々の分配増幅、さらには、固有のバーコード配列の適用によって、その後の増幅プロセス、例えば、ＰＣＲまたは他の増幅プロセスを含むシーケンシングプロセスを通じて、各サンプル成分の寄与率、さらには、その起源の帰属の保存が可能である。サンプルを分配し、バーコード化する方法は、それらの全開示があらゆる目的のためにそれらの全体で参照によって本明細書に組み込まれる２０１４年６月２６日出願の米国特許出願第１４／３１６，３８３号、さらには、２０１４年２月７日出願の米国特許仮出願第６１／９４０，３１８号、及び２０１４年５月９日出願の同第６１／９９１，０１８号において詳細に記載されている。
【００３４】
本明細書において開示する方法及びシステムは、幅広い設定において有用である。例えば、上記方法及びシステムは、臨床的診断のために、特に、充実性臓器がん及び血液がんを含むがんを診断する、もしくは示差的に診断するために、または妊婦から得られたサンプルにおいて胎児異数性を検出するために使用することができる。上記方法及びシステムはまた、生物学的研究、特に、生物医学的研究のために使用することができる。上記方法及びシステムはまた、生体の集団（例えば、ミクロビオームなど）を特性決定するために、さらには、法医学的及び環境検査において使用することができる。
【００３５】
ＩＩ．ワークフローの概観
図１は、サンプル核酸をバーコード化し、引き続いてシーケンシングするための方法例を図示しており、この場合、サンプルは、相対的に少量であるか、ターゲット集団は、サンプル内の相対的少量集団である（例えば、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、０．１％未満、０．０５％未満、０．０１％未満、０．００５％未満、０．００１％未満など）。初めに、核酸を含むサンプルを供給源から得ることができ（１００）、バーコード化ビーズのセットも得ることができる（１１０）。ビーズを、１つまたは複数のバーコード配列を含有するオリゴヌクレオチド、さらには、ランダムなＮマーまたは他のプライマーなどのプライマーに連結させることができる。一部の場合には、バーコード配列は、バーコード化ビーズから、例えば、バーコードを放出するバーコードとビーズとの間の連結の切断によって、もしくは基礎をなすビーズの分解によって、またはそれら２つの組合せによって、放出され得る。例えば、一部の場合には、バーコード化ビーズは、還元剤などの薬剤によって分解または溶解して、バーコード配列を放出し得る。この例では、核酸を含む少量のサンプル（１０５）、バーコード化ビーズ（１１５）、及び、一部の場合には、他の試薬、例えば、還元剤（１２０）を合わせ、分配する。例として、そのような分配は、成分を微小流体デバイス（１２５）などの液滴発生システムに導入することを伴ってよい。微小流体デバイス（１２５）を用いて、油中水型エマルション（１３０）を形成してもよく、その際、エマルションは、サンプル核酸（１０５）、還元剤（１２０）、及びバーコード化ビーズ（１１５）を含有する水性液滴を含有する。還元剤は、バーコード化ビーズを溶解または分解して、それによって、液滴（１３５）内で、バーコード及びランダムＮマーを有するオリゴヌクレオチドをビーズから放出し得る。次いで、ランダムＮマーは、サンプル核酸の種々の領域をプライムして、増幅後に、サンプルの増幅コピーを生じさせることができ、その際、各コピーは、バーコード配列（１４０）でタグ付けされている。一部の場合には、各液滴は、同一のバーコード配列及び異なるランダムＮマー配列を含有するオリゴヌクレオチドセットを含有する。引き続いて、エマルションを破壊して（１４５）、追加の配列（例えば、とりわけシーケンシング法を補助する配列、追加のバーコードなど）を、例えば、増幅法（１５０）（例えば、ＰＣＲ）を介して加えてよい。次いで、シーケンシングを行い（１５５）、アルゴリズムを適用して、シーケンシングデータ（１６０）を解釈してよい。シーケンシングアルゴリズムは一般に、例えば、シーケンシング読み取りデータをアラインさせ、かつ／または特定の配列読み取りデータが属するサンプルを特定するために、バーコードの分析を行うことができる。
【００３６】
少ないインプット量で核酸を特性決定するための方法及びシステムを本明細書において記載する。本明細書において使用する場合、かつ下記で記載するとおり、核酸の少ないインプット量は一般に、ワークフローに導入されるサンプル核酸の少ない集合量を指す。一部の実施形態では、この用語は、微小流体デバイスなどのデバイスに導入されるサンプル核酸の集合量を指す。本明細書においてさらに記載するとおり、核酸の量は、質量またはゲノム量、例えば、ゲノムサンプル全体を分析する場合には、例えば、ワークフローに導入されるゲノム当量数の点において表され得る。分かるであろうとおり、これは、分析する生体のゲノムのサイズに応じて、上記の質量をベースとするインプット量数から変動し得る。インプットサンプル核酸はまた、状態（例えば、インタクトな状態、断片化された状態、抽出された状態、抽出及び断片化された状態、断片化及びサイズ選択された状態など）に関わらず、導入されるサンプル核酸の全量を包含する。
【００３７】
例示的な一態様では、本開示に記載の方法及びシステムは、サンプル（例えば、核酸）の個々の量または少量を別個のパーティションに供託または分配することを提供し、この際、各パーティションは、他のパーティション中の内容物からの、それ自体の内容物の分離を維持する。本明細書において使用する場合、パーティションは、様々な種々の形態、例えば、ウェル、チューブ、マイクロウェルもしくはナノウェル、スルーホールを含み得るコンテナまたはベッセルを指す。しかしながら、一部の態様では、パーティションは、流体流内で流動性である。これらのベッセルは、例えば、内側流体中心または核を取り囲む外側バリアを有するマイクロカプセルまたはマイクロベシクルから構成されていてよいか、またはそれらは、そのマトリックス内に物質を閉じ込め、かつ／または保持することができる多孔性マトリックスであってよい。しかしながら、一部の態様では、これらのパーティションは、非水性連続相、例えば、油相内に、水性流体の液滴を含んでよい。様々な異なるベッセルが、例えば、２０１３年８月１３日出願の米国特許出願第１３／９６６，１５０号において記載されている。同様に、非水性または油性連続相中で安定な液滴を作成するためのエマルションシステムは、例えば、その全開示が参照によって本明細書に全体で組み込まれる米国特許出願第２０１０／０１０５１１２号において詳細に記載されている。
【００３８】
エマルション中の液滴の場合には、一般に、水性液滴が、流動している流れ分配流体内で作成され、そのような液滴がサンプル物質を含むように、サンプル含有水性流を、分配流体、例えば、フッ素化油状物の非水性流も流れているジャンクションに流すことによって、別個のパーティションへのサンプル物質、例えば、核酸の分配を達成することができる。下記で記載するとおり、そのような液滴はまた典型的には、同時分配されたバーコードオリゴヌクレオチドを含む。例えば、水性流中のサンプルの濃度、水性流及び／または非水性流の流速などを含む、システムの様々な異なるパラメーターを制御することによって、任意の特定のパーティション内のサンプル物質の相対量を調整してもよい。本明細書に記載のパーティションは多くの場合に、極めて小さい容積を有することによって特徴づけられる。例えば、液滴をベースとするパーティションの場合には、液滴は、１０００ｐＬ未満、９００ｐＬ未満、８００ｐＬ未満、７００ｐＬ未満、６００ｐＬ未満、５００ｐＬ未満、４００ｐＬ未満、３００ｐＬ未満、２００ｐＬ未満、１００ｐＬ未満、５０ｐＬ未満、２０ｐＬ未満、１０ｐＬ未満、またはさらに１ｐＬ未満である全容積を有してよい。ビーズと共に同時分配する場合には、パーティション内のサンプル流体容積は、上記容積の９０％未満、上記容積の８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、またはさらに上記容積の１０％未満であってよいことは分かるであろう。一部の場合には、低反応容積パーティションの使用は、非常に少量の出発試薬、例えば、インプット核酸で反応を行う際に特に有利である。
【００３９】
本明細書に記載の方法及びシステムに従って、サンプルがそれらの個々のパーティションに導入されたら、パーティション内の内容物に一般に、固有の識別子を与えて、これらの内容物の特性決定の際に、それらが、それらの個々の起源に由来しているとおりに帰属され得るようにする。したがって、サンプルを典型的には、固有の識別子（例えば、バーコード配列）と共に同時分配する。一部の態様では、固有の識別子を、それらのサンプルに結合し得る核酸バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドの形態で与える。所定のパーティション中のオリゴヌクレオチドの間では、それらに含有される核酸バーコード配列は同じであるが、異なるパーティションの間では、オリゴヌクレオチドは、異なるバーコード配列を有し得るように、オリゴヌクレオチドを分配する。一部の態様では、１種のみの核酸バーコード配列が、所定のパーティションに付随するが、一部の場合には、２種以上の異なるバーコード配列が存在してもよい。
【００４０】
核酸バーコード配列は、オリゴヌクレオチドの配列内に６〜約２０またはそれ以上のヌクレオチドを含み得る。これらのヌクレオチドは、完全に連続している、すなわち、隣接するヌクレオチドの単一伸長であってもよいし、またはそれらは、１個または複数個のヌクレオチドによって分離されている２つ以上の別々の配列に分離していてもよい。典型的には、分離配列は典型的には、約４〜約１６ヌクレオチドの長さであってよい。
【００４１】
同時分配されるオリゴヌクレオチドはまた典型的には、同時分配細胞からの核酸を処理する際に有用な他の機能性配列を含む。これらの配列には、例えば、関連バーコード配列を結合させながらパーティション内で個々の細胞からのゲノムＤＮＡを増幅させるためのターゲット増幅もしくはランダム／汎用増幅プライマー配列、シーケンシングプライマー、例えば、配列の存在を特定するためか、もしくはバーコード化核酸を除去するためのハイブリッド形成もしくはプロービング配列、またはいくつかの他の有望な機能性配列のいずれかが含まれる。この場合も、サンプル物質と共にオリゴヌクレオチド及び関連バーコード及び他の機能性配列を同時分配することは、例えば、参照によってすでに組み込まれている２０１４年２月７日出願の米国特許出願第６１／９４０，３１８号、２０１４年５月９日出願の同第６１／９９１，０１８号、及び２０１４年６月２６日出願の米国特許出願第１４／３１６，３８３号において記載されている。
【００４２】
簡単には、例示的な一プロセスでは、それぞれ、ビーズに放出可能に結合されている上記オリゴヌクレオチドの多数を含んでよいビーズを提供し、その際、特定のビーズに結合されているオリゴヌクレオチドのすべてが、同じ核酸バーコード配列を含んでもよいが、多様なバーコード配列の多数が、使用されるビーズ集団の全体にわたって示されていてもよい。典型的には、ビーズ集団は、少なくとも１０００種の異なるバーコード配列、少なくとも１０，０００種の異なるバーコード配列、少なくとも１００，０００種の異なるバーコード配列、または一部の場合には、少なくとも１，０００，０００種の異なるバーコード配列を含んでよい多様なバーコード配列ライブラリを提供してよい。加えて、各ビーズを典型的には、結合した多数のオリゴヌクレオチド分子と共に提供してよい。とりわけ、個々のビーズ上の、バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドの分子の数は、少なくとも約１０，０００オリゴヌクレオチド、少なくとも１００，０００オリゴヌクレオチド分子、少なくとも１，０００，０００オリゴヌクレオチド分子、少なくとも１００，０００，０００オリゴヌクレオチド分子、及び一部の場合には少なくとも１億オリゴヌクレオチド分子であってよい。
【００４３】
オリゴヌクレオチドは、ビーズに特定の刺激を適用すると、ビーズから放出され得る。一部の場合には、刺激は、例えば、オリゴヌクレオチドを放出し得る光不安定性連結の切断による光刺激であってよい。一部の場合には、熱刺激を使用することもでき、その際、ビーズ環境の温度の上昇が、連結の切断、またはビーズからのオリゴヌクレオチドの他の放出をもたらしてもよい。一部の場合には、ビーズへのオリゴヌクレオチドの連結を切断するか、または別段に、ビーズからのオリゴヌクレオチドの放出をもたらし得る化学的刺激を使用することもできる。
【００４４】
本明細書に記載の方法及びシステムでは、単一ビーズ及び単一サンプルが個々のパーティション内に含まれるように、結合したオリゴヌクレオチドを含むビーズを、個々のサンプルと同時分配してもよい。単一のビーズパーティションが望ましい一部の場合には、占有されるそれらのパーティションが主に単一占有されることを保証するように、流体の相対流速を、そのパーティションが平均してパーティション１つ当たり１個未満のビーズを含有するように制御することができる。同様に、より高いパーセンテージのパーティションが占有されて、例えば、低いパーセンテージのみの未占有パーティションを可能にするように、流速を制御することを望んでもよい。一部の態様では、所望の数の単一占有パーティション、特定レベル未満の未占有パーティション、特定レベル未満の複数占有パーティションを保証するように、フロー及びチャネル設計を制御する
【００４５】
上記のとおり、単一ビーズ占有率が所望の状態であり得る一方で、複数占有パーティション、または未占有パーティションが多くの場合に、存在し得ることは分かるであろう。サンプルと、バーコードオリゴヌクレオチドを含むビーズとを同時分配するための微小流体チャネル構造の例を図２において図示する。示されているとおり、チャネルセグメント２０２、２０４、２０６、２０８、及び２１０が、チャネルジャンクション２１２での流体コミュニケーションにおいて提示されている。個々のサンプル２１４を含む水性流は、チャネルセグメント２０２を通して、チャネルジャンクション２１２に向かって流される。本明細書の他の所において記載するとおり、これらのサンプルを、分配プロセスの前に、水性流体内に懸濁させてもよい。
【００４６】
同時に、バーコード担持ビーズ２１６を含む水性流が、チャネルセグメント２０４を通して、チャネルジャンクション２１２に向かって流される。非水性分配流体は、側チャネル２０６及び２０８のそれぞれからチャネルジャンクション２１２へと導入され、その合流は、出口チャネル２１０に流される。チャネルジャンクション２１２内で、チャネルセグメント２０２及び２０４からの２つの組み合わさった水性流が合流し、同時分配されるサンプル２１４及びビーズ２１６を含む液滴２１８に分配される。すでに言及したとおり、チャネルジャンクション２１２で合流する流体のそれぞれのフロー特性を制御し、さらに、チャネルジャンクションの形状寸法を制御することによって、発生するパーティション２１８内でのビーズ、サンプル、またはその両方の所望の占有レベルを達成するために、組合せ及び分配を最適化することができる。
【００４７】
分かるであろうとおり、例えば、化学刺激、ポリメラーゼなどの核酸伸長、転写、及び／または増幅試薬、逆転写酵素、ヌクレオシド三リン酸またはＮＴＰ類似体、プライマー配列、及びそのような反応において使用される二価金属イオンなどの追加の補因子、リガーゼ酵素及びライゲーション配列などのライゲーション反応試薬、色素、ラベル、または他のタグ付け試薬を含むいくつかの他の試薬を、サンプル及びビーズと共に同時分配してもよい。
【００４８】
同時分配されたら、ビーズ上に配置されたオリゴヌクレオチドを、分配されたサンプルをバーコード化及び増幅させるために使用してもよい。サンプルの増幅及びバーコード化においてこれらのバーコードオリゴヌクレオチドを使用するための特に優れたプロセスは、参照によってすでに組み込まれている２０１４年２月７日出願の米国特許出願第６１／９４０，３１８号、２０１４年５月９日出願の同第６１／９９１，０１８号、及び２０１４年６月２６日出願の米国特許出願第１４／３１６，３８３号において詳細に記載されている。簡単には、一態様では、ビーズ上に存在するオリゴヌクレオチドを、サンプルと共に同時分配し、それらのビーズから、サンプルを含むパーティションに放出する。オリゴヌクレオチドは典型的には、バーコード配列と共に、その５’末端のプライマー配列を含む。このプライマー配列は、サンプルの多数の異なる領域をランダムにプライムすることを意図されたランダムなオリゴヌクレオチド配列であってよいか、またはこれは、サンプルの特異的なターゲット領域の上流をプライムすることをターゲットとした特異的なプライマー配列であってよい。
【００４９】
放出されると、オリゴヌクレオチドのプライマー部分は、サンプルの相補的領域にアニールし得る。次いで、同じくサンプル及びビーズと共に同時分配される伸長反応試薬、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、補因子（例えば、Ｍｇ２＋またはＭｎ２＋など）が、テンプレートとしてサンプルを使用して、プライマー配列を伸長し、プライマーがアニールするテンプレートの鎖に相補的な断片を生成し、その相補的断片は、オリゴヌクレオチド及びその関連バーコード配列を含むこととなる。サンプルの種々の部分への多数のプライマーのアニーリング及び伸長は、それぞれ、それが作成されたパーティションを示すそれ自体のバーコード配列を持つ、サンプルのオーバーラッピング相補的断片の大量の貯留をもたらし得る。一部の場合には、これらの相補的断片自体を、パーティション中に存在するオリゴヌクレオチドによってプライムされるテンプレートとして使用して、バーコード配列を再び含む補体の補体を生成してもよい。一部の場合には、第１の補体を複製する場合に、これが、２つの相補的配列をその末端で、またはその付近で生成して、ヘアピン構造または部分的ヘアピン構造の形成を可能にし、その分子がさらなる反復コピーを生成するためのベースとなる可能性を低減するように、この複製プロセスを構成する。この一例の略図を図３に示す。
【００５０】
図が示すとおり、バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドは、サンプル核酸３０４と共に、エマルション中で、例えば、液滴３０２に同時分配される。本明細書の他の所で言及するとおり、オリゴヌクレオチド３０８は、サンプル核酸３０４と共に同時分配されるビーズ３０６上に提供されていてよく、そのオリゴヌクレオチドは、パネルＡにおいて示されているとおり、ビーズ３０６から放出され得る。オリゴヌクレオチド３０８は、１種または複数種の機能性配列、例えば、配列３１０、３１４、及び３１６に加えて、バーコード配列３１２を含む。例えば、オリゴヌクレオチド３０８は、バーコード配列３１２、さらには、所定のシーケンシングシステムのための結合または固定化配列として機能し得る配列３１０、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉｓｅｑまたはＭｉｓｅｑシステムのフローセルにおける結合のために使用されるＰ５配列を含むと示されている。示されているとおり、オリゴヌクレオチドはまた、サンプル核酸３０４の部分の複製をプライムするためのランダムまたはターゲットＮマーを含み得るプライマー配列３１６を含む。シーケンシングシステムにおける合成反応によって、ポリメラーゼ媒介性テンプレート指示シーケンシングをプライムするために使用される「リード１」またはＲ１プライミング領域などのシーケンシングプライミング領域を提供し得る配列３１４も、オリゴヌクレオチド３０８内に含まれる。一部の場合には、バーコード配列３１２、固定化配列３１０、及びＲ１配列３１４は、所定のビーズに結合されているオリゴヌクレオチドのすべてに共通してもよい。プライマー配列３１６は、ランダムＮマープライマーのために変動してよいか、または特定のターゲット用途のために、所定のビーズ上のオリゴヌクレオチドに共通してよい。
【００５１】
プライマー配列３１６の存在に基づき、オリゴヌクレオチドは、パネルＢにおいて示されているとおりサンプル核酸をプライムすることができ、これによって、同じくビーズ３０６及びサンプル核酸３０４と共に同時分配されたポリメラーゼ酵素及び他の伸長試薬を使用して、オリゴヌクレオチド３０８及び３０８ａの伸長が可能となる。パネルＣにおいて示されているとおり、ランダムＮマープライマーでは、サンプル核酸３０４の複数の異なる領域にアニールするであろうオリゴヌクレオチドの伸長の後に；核酸の複数のオーバーラッピング補体または断片、例えば、断片３１８及び３２０が作成される。サンプル核酸の一部に相補的である配列部分、例えば、配列３２２及び３２４を含むが、これらのコンストラクトは一般に、結合バーコード配列を有するサンプル核酸３０４の断片を含むと、本明細書において言及される。
【００５２】
次いで、バーコード化核酸断片を、例えば、配列分析による特性決定に掛けてもよいか、またはそれらを、パネルＤにおいて示されているとおり、そのプロセスでさらに増幅させてもよい。例えば、追加のオリゴヌクレオチド、例えば、同じく、ビーズ３０６から放出されるオリゴヌクレオチド３０８ｂが、断片３１８及び３２０をプライムしてもよい。とりわけ、この場合も、オリゴヌクレオチド３０８ｂ中にランダムＮマープライマー３１６ｂ（これは、一部の場合には、所定のパーティション、例えば、プライマー配列３１６における他のランダムＮマーとは異なってもよい）が存在することに基づき、そのオリゴヌクレオチドは、断片３１８とアニールし、伸長して、サンプル核酸配列の一部の複製を含む配列３２８を含む断片３１８の少なくとも一部に対する補体３２６を作成する。断片３１８のオリゴヌクレオチド部分３０８まで複製されるまで、オリゴヌクレオチド３０８ｂの伸長を続ける。本明細書の他の所で言及するとおり、かつパネルＤにおいて例示されているとおり、所望のポイントで、例えば、断片３１８内に含まれるオリゴヌクレオチド３０８の配列３１６及び３１４まで複製した後に、ポリメラーゼによる複製の停止を促進するように、オリゴヌクレオチドを設定してもよい。本明細書に記載のとおり、これは、例えば、使用されるポリメラーゼ酵素によってプロセシングされ得ない種々のヌクレオチド及び／またはヌクレオチド類似体の導入を含む、種々の方法によって達成することができる。例えば、これには、非ウラシル許容性ポリメラーゼを妨げて、その領域の複製を中止するために、配列領域３１２内にウラシル含有ヌクレオチドを含ませることが含まれ得る。結果として、バーコード配列３１２、結合配列３１０、Ｒ１プライマー領域３１４、及びランダムＮマー配列３１６ｂを含み、一方の末端に全長オリゴヌクレオチド３０８ｂを含む断片３２６が作成される。配列の他方の末端には、第１のオリゴヌクレオチド３０８のランダムＮマーに対する補体３１６’、さらには、配列３１４’として示されている、Ｒ１配列の全部または一部に対する補体配列が含まれ得る。次いで、Ｒ１配列３１４及びその補体３１４’を一緒にハイブリダイズさせると、部分ヘアピン構造３２８を形成することができる。分かるであろうとおり、異なるオリゴヌクレオチドでは、ランダムＮマーが異なるので、これらの配列及びそれらの補体は、ヘアピン形成に参加するとは予測されず、例えば、ランダムＮマー３１６に対する補体である配列３１６’は、ランダムＮマー配列３１６ｂに対して相補的であるとは予測されない。このことは、他の適用、例えば、Ｎマーが、所定のパーティション内のオリゴヌクレオチドの間で共通しているターゲットプライマーには当てはまらないであろう。
【００５３】
これらの部分ヘアピン構造を形成することによって、サンプル配列の第１レベルの複製をさらなる複製から除外する、例えば、コピーの反復コピーを防止することが可能となる。部分ヘアピン構造はまた、作成された断片、例えば、断片３２６のその後のプロセシングのために有用な構造をもたらす。
【００５４】
次いで、複数の異なるパーティションからの断片のすべてを、本明細書に記載のとおりのハイスループットシーケンサーでのシーケンシングのために貯留してよい。各断片は、その起源のパーティションに関してコードされているので、その断片の配列は、バーコードの存在に基づきその由来に帰属させることができる。このことが、図４において図示されている。一例で示されているとおり、第１の供給源４００（例えば、正常細胞）に起源する核酸４０４、及び異なる供給源４０２（例えば、腫瘍細胞）に由来する核酸４０６はそれぞれ、上記のとおりのそれら自体のバーコードオリゴヌクレオチドセットと共に分配される。一例では、正常細胞、腫瘍細胞、またはそれら両方を、生サンプル、非保存サンプル、保存サンプル、防腐処置サンプル、包埋サンプル、固定サンプル、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択される、細胞を含む組織または流体から（すなわち、「サンプル」から）得る。一部の例では、組織または細胞は包埋されていて、さらに保存、防腐処理、または固定されている。一部の例では、サンプルは、包埋され、さらに固定されている。一部の例では、正常細胞、腫瘍細胞、またはそれらの両方は、ホルムアルデヒド（例えば、ホルマリン）固定及びパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）されている。
【００５５】
次いで、各パーティション内で、各核酸４０４及び４０６はプロセシングされて、第１の断片（複数可）の第２の断片のオーバーラッピングセット、例えば、第２の断片セット４０８及び４１０を別々に提供する。このプロセシングはまた、特定の第１の断片に由来する第２の断片のそれぞれで同じであるバーコード配列を有する第２の断片を提供する。示されているとおり、第２の断片セット４０８のためのバーコード配列は、「１」によって表示されており、断片セット４１０のためのバーコード配列は、「２」によって表示されている。バーコードの多様なライブラリを使用して、多数の異なる断片セットを示差的にバーコード化してもよい。しかしながら、異なる第１の断片からの第２の断片セットがすべて、異なるバーコード配列でバーコード化される必要はない。一部の場合には、多数の異なる第１の断片を、同じバーコード配列を含むように同時にプロセシングしてもよい。多様なバーコードライブラリを、本明細書の他の所で詳細に記載する。
【００５６】
次いで、例えば、断片セット４０８及び４１０からのバーコード化断片を、例えば、ＩｌｌｕｍｉｎａまたはＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，Ｉｎｃ．から入手可能な合成技術による配列を使用してシーケンシングするために貯留してよい。シーケンシングすると、例えば、集合読み取りデータ４１４及び４１６において示されているとおり、少なくとも部分的に、含まれているバーコードに基づき、かつ一部の場合には、部分的に断片自体の配列に基づき、配列読み取りデータ４１２をそれらの個々の断片セットに帰属させることができる。次いで、各断片セットに帰属する配列読み取りデータをアセンブルして、各サンプル断片でアセンブルされた配列、例えば、配列４１８及び４２０を得、次にこれをさらに、それらの個々の起源、例えば、正常細胞４００及び腫瘍細胞４０２に戻し帰属させてもよい。ゲノムアセンブリのための方法は、例えば、その全開示がその全体で参照によって本明細書に組み込まれる２０１４年６月２６日出願の米国特許仮出願第６２／０１７，５８９号において記載されている。一部の例では、正常細胞、腫瘍細胞、またはそれらの両方を、生サンプル、非保存サンプル、保存サンプル、防腐処置サンプル、包埋サンプル、固定サンプル、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択される、組織または細胞サンプル（すなわち、サンプル）から得る。一部の例では、組織または細胞は包埋されていて、さらに保存、防腐処理、または固定されている。一部の例では、組織または細胞は、包埋されていて、さらに固定されている。一部の例では、正常細胞、腫瘍細胞、またはそれらの両方は、ホルムアルデヒド（例えば、ホルマリン）固定及びパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）された組織である。
【００５７】
包埋は、後で硬化させることができる液体包埋材料（例えば、ゲル、樹脂、ワックス、またはそれらの任意の組合せ）と共に、組織または細胞を型に入れるプロセスである。包埋を、冷却プロセスによって達成してもよい（例えば、少なくとも１種のパラフィンワックスを、包埋媒体として使用する場合）。包埋を、加熱（例えば、硬化）プロセスによって達成してもよい（例えば、少なくとも１種のエポキシ樹脂を、包埋媒体として使用する場合）。包埋で、熱、紫外線、または化学的触媒の使用によって重合し得るアクリル樹脂を使用してもよい。包埋を、水性媒体中で凍結された組織を使用することによって行うことができる。事前凍結組織を、液体包埋材料（例えば、水ベースのグリコール、クリオゲル、または樹脂）と共に型に入れてもよく、次いで、その液体包埋材料を凍結させて、硬化ブロックを形成してもよい。一部の例では、包埋プロセスで、樹脂（複数可）を利用する。一部の例では、包埋プロセスで、ワックスを利用する。ワックスは、動物性ワックス、植物性ワックス、石油系ワックス、合成ワックス、またはそれらの任意の組合せであってよい。動物性ワックスは、獣脂、蜜蝋、鯨蝋、またはラノリンであってよい。植物性ワックスは、エピクチクラ、クチクラワックス、またはそれらの任意の組合せであってよい。植物性ワックスは、カルナウバワックス、カンデリラワックス、オーリクリーワックス、ソイワックス、またはそれらの組合せであり得る。ワックスは、パラフィンなどの石油由来のワックスであってもよい。パラフィンワックスは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、もしくは５０個の炭素原子、及び多くとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、もしくは５５個の炭素原子の炭素鎖長を有するｎ−アルカン、または上述のｎ−アルカンの任意の組合せから構成されてよい。一部の例では、樹脂は、ハードラッカーまたはエナメル様仕上げになる、液体の任意の成分である。樹脂は、コハク、カウリゴム、ロジン、コーパル、ダンマル、マスチック、サンダラック、オリバナム、エレミ、ターペンタイン、コパイバ、アンモニアゴム、アギ、ガンボージ、ミルラ、またはスカモニアなどの天然樹脂を含んでよい。樹脂は、木質供給源（例えば、樹木、例えば、マツなど）に由来してもよい。樹脂は、合成樹脂、例えば、マニキュア液、エポキシ樹脂、熱硬化性プラスチック、またはそれらの任意の組合せであってもよい。ゲルは、定常状態にあるときには流動性を示さない任意の希釈架橋分子配列であってよい。ゲルは、ヒドロゲル、キセロゲル、またはヒドロゲルであってよい。ゲルは、天然に産生しても、合成であっても、またはそれらの任意の組合せであってもよい。ゲルは、アガロース、メチルセルロース、ヒアルロナン、カラギーナン、ゼラチン、またはそれらの任意の組合せを含んでよい。
【００５８】
固定は、生物学的組織または細胞を崩壊から保護し、それによって、自己分解または腐敗を防止するプロセスである。一部の例では、固定組織または固定細胞は、崩壊か保護されているものである。崩壊は、有機物質が、物質のより簡略な形態に壊れるプロセスである分解（すなわち、腐敗）を伴ってよい。崩壊からの保護は、自己分解、腐敗、またはそれら両方を防止することであり得る。固定組織は、その細胞、その組織成分、またはその両方を保護し得る。組織固定は、架橋固定剤を介して、固定する組織または細胞中のタンパク質間に共有結合を形成することによって行ってもよい。固定は、可溶性タンパク質を細胞の細胞骨格に固定してもよい。固定は、剛性の細胞、剛性の組織、またはその両方を形成してもよい。固定は、ホルムアルデヒド（例えば、ホルマリン）、グルタルアルデヒド、エタノール、メタノール、酢酸、四酸化オスミウム、二クロム酸カリウム、クロム酸、過マンガン酸カリウム、ツェンカー固定剤、ピクリン酸塩、Ｈｅｐｅｓ−グルタミン酸緩衝液媒介性有機溶媒保護効果（Ｈｅｐｅｓ−ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ  ｂｕｆｆｅｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｓｏｌｖｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｅｆｆｅｃｔ：ＨＯＰＥ）、またはそれらの任意の組合せなどの薬品の使用によって達成することもできる。ホルムアルデヒドを、重量対重量をベースとして水溶液中にホルムアルデヒドガス約３７％の混合物として使用することもできる。加えて、ホルムアルデヒド水溶液は、アルコール（例えば、メタノール）約１０〜１５％を含み、「ホルマリン」と呼ばれる溶液を形成していてもよい。固定剤濃度（１０％）溶液は、水中３．７％ホルムアルデヒドガス溶液に等しいであろう。ホルムアルデヒドを、少なくとも５％、８％、１０％、１２％、または１５％中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）溶液（すなわち、固定剤濃度）として使用してもよい。ホルムアルデヒドを、リン酸緩衝生理食塩水中３．７％〜４．０％ホルムアルデヒド（すなわち、ホルマリン）として使用してもよい。一部の例では、固定を、少なくとも２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、もしくは１５．０パーセント（％）、またはそれ以上のホルマリンフラッシュもしくは浸漬を使用して行う。一部の例では、固定を、約１０％ホルマリンフラッシュを使用して行う。固定剤体積は、体積当たり重量で、組織の体積の１０、１５、２０、２５、または３０倍であり得る。ホルムアルデヒド中で固定した後に、組織または細胞を、長期貯蔵のためのアルコールに浸してもよい。一部の場合には、アルコールは、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、５個以上の炭素原子を含有するアルコール、またはそれらの任意の組合せである。アルコールは、直鎖または分枝であってよい。アルコールは、水溶液中少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％または９０％アルコールであってよい。一部の例では、アルコールは、水溶液中７０％エタノールである。
【００５９】
防腐処置は、天然の分解から組織または細胞を保護する。防腐処置サンプルは、殺菌サンプル、展示可能な（ｐｒｅｓｅｎｔａｂｌｅ）サンプル、または保存サンプルであってよい。展示可能なサンプルは、その外観を以前のｉｎ  ｖｉｖｏ状態で保護するｉｎ  ｖｉｔｒｏサンプルである。一部の実施形態では、防腐処置組織または防腐処置細胞は、防腐処置液に浸漬された組織、または防腐処置液が注入された組織である。防腐処置液は、分解を少なくとも一時的に遅延させ、天然の外観を復元し得る。防腐処置液は、防腐剤、殺菌剤、消毒剤、またはそれらの任意の組合せを含む。防腐処置液は、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、エタノール、保湿剤、またはそれらの組合せを含んでよい。防腐処置液中のホルムアルデヒド含有率は、５〜３５パーセント（％）の範囲であってよく；防腐処置液中のアルコール含有率は、９〜５６パーセント（％）の範囲であってよい。アルコールは、上述のアルコールのいずれか、またはそれらの任意の組合せであってよい。一部の例では、アルコールは、エタノールである。
【００６０】
保存サンプルは、天然サンプル（すなわち、防腐剤の添加を伴わない）と比較した場合に、分解が遅らされているものである。分解は、微生物の増殖、望ましくない化学変化、またはそれらの両方の結果として生じ得る。保存組織または細胞は、硝酸塩、アンモニア、安息香酸、安息香酸ナトリウム、ヒドロ安息香酸塩、乳酸、プロピオン酸、二酸化硫黄、亜硫酸塩、ソルビン酸、アスコルビン酸、ブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、没食子酸、トコフェロール（類）、二ナトリウムＥＤＴＡ、クエン酸、酒石酸、レシチン、フェノラーゼ、ヒマシ油、アルコール、ホップ、ローズマリー、珪藻土、またはそれらの任意の組合せと接触させた組織または細胞であってよい。
【００６１】
一部の例では、サンプルを包埋し、さらに防腐処置、保存、または固定してもよい。例えば、サンプルを固定し、さらに包埋することができる。上述の固定材料または記述した方法のいずれかを使用して、固定を達成してもよい。上述の包埋材料または記述した方法のいずれかを使用して、包埋を達成してもよい。例えば、サンプルをホルムアルデヒド固定し、さらにパラフィン包埋してもよい。一部の例では、パラフィン包埋組織のための固定剤は、中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）を使用する。ＮＢＦは、緩衝液中の４％パラホルムアルデヒドと同等であり得る。一部の例では、ＮＢＦは、防腐剤（例えば、アルコール）をさらに含む。アルコールは、上述のアルコールのいずれかであってよい。固定には、少なくとも１２、２５、３６、４８、または６０時間がかかり得る。固定には、最高２５、３６、４８、６０、または７２時間がかかり得る。固定を室温で行ってよい。パラフィン包埋は、組織脱水を含んでよい。組織脱水は、水を除去するための一連の段階的アルコール浴、引き続く、ワックスの浸潤によって達成してもよい。次いで、浸潤組織をワックスに包埋してよい。アルコールは、エタノールであってよい。ワックスは、上述のワックスのいずれかであってよい。一部の例では、ワックスは、パラフィンワックスである。パラフィンワックスは、室温では固体であり、少なくとも約４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、または８０摂氏温度（℃）の融点を有してよい。パラフィンワックスは、室温で固体であり、最高約４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、または８０摂氏温度（℃）の融点を有してよい。一部の例では、パラフィンワックスは、最低５６℃から最高５８℃の融点を有する。ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織は、少なくとも５、１０、１５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、５００、１０００年以上の長時間にわたって貯蔵することができる。長時間にわたる貯蔵は、室温においてであってよい。ホルマリン固定、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織は、室温において無期限に貯蔵することができる。一部の例では、固定した後のＦＦＰＥ組織から、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその両方）を回収してもよい。
【００６２】
ＩＩＩ．  サンプル
ａ．  サンプルの種類
微小流体デバイスに導入し、かつ別個のコンパートメントに分配することができる任意の適切なサンプルで、本開示の方法及びシステムを使用してもよい。例示的なサンプルには、ポリヌクレオチド、核酸、オリゴヌクレオチド、循環無細胞核酸、循環腫瘍核酸（例えば、循環腫瘍ＤＮＡ）、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）核酸、核酸断片、ヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチドポリヌクレオチド、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、プラスミドＤＮＡ、コスミドＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ウイルスＤＮＡ、細菌ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）、無細胞ＤＮＡ、無細胞胎児ＤＮＡ（ｃｆｆＤＮＡ）、リボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、ｎＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、ｄｓＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、ｃＲＮＡなどが含まれ得る。一部の場合には、サンプルは、タンパク質またはポリペプチドを含有してもよい。
【００６３】
サンプルは、任意のヌクレオチドの任意の組合せを含んでよい。ヌクレオチドは、天然に存在するか、または合成であってよい。一部の場合には、ヌクレオチドは、酸化またはメチル化されていてもよい。ヌクレオチドには、これらだけに限定されないが、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、チミジン三リン酸（ＴＴＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、５−メチルシチジン一リン酸、５−メチルシチジン二リン酸、５−メチルシチジン三リン酸、５−ヒドロキシメチルシチジン一リン酸、５−ヒドロキシメチルシチジン二リン酸、５−ヒドロキシメチルシチジン三リン酸、環式アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、環式グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシアデノシン二リン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシグアノシン二リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシチミジン二リン酸（ｄＴＤＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）、デオキシウリジン二リン酸（ｄＵＤＰ）、デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）、デオキシシチジン二リン酸（ｄＣＤＰ）及びデオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、５−メチル−２’−デオキシシチジン一リン酸、５−メチル−２’−デオキシシチジン二リン酸、５−メチル−２’−デオキシシチジン三リン酸、５−ヒドロキシメチル−２’−デオキシシチジン一リン酸、５−ヒドロキシメチル−２’−デオキシシチジン二リン酸及び５−ヒドロキシメチル−２’−デオキシシチジン三リン酸が含まれ得る。
【００６４】
サンプルは、任意の合成核酸、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、類似核酸、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、またはヌクレオチド側鎖を含む他の合成ポリマーであってよい。
【００６５】
サンプルは、種々の程度の純度を有してもよい。一部の場合には、サンプルは、サンプルの５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．５％、または９９．９％超がＤＮＡから構成されているＤＮＡサンプルであってよい。一部の場合には、サンプルは、サンプルの０．１％、０．２％、０．３％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．５％、または９９．９％未満がＤＮＡから構成されているＤＮＡサンプルであってよい。一部の場合には、サンプルは、サンプルの５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．５％、または９９．９％超がＲＮＡから構成されているＲＮＡサンプルであってよい。一部の場合には、サンプルは、サンプルの０．１％、０．２％、０．３％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．５％、または９９．９％未満がＲＮＡから構成されているＲＮＡサンプルであってよい。一部の場合には、サンプルは、１００％ＤＮＡであり；一部の場合には、サンプルは、１００％ＲＮＡである。
【００６６】
サンプルは、異なる種類の混合物を含んでもよい。一部の場合には、サンプルは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、及び脂質、またはそれらの任意の組合せ、またはそれらの任意の相対比の混合物を含有する。例えば、サンプルは、１：１：５０の比でＤＮＡ、ＲＮＡ、及びタンパク質を含有してもよい。別の例では、サンプルは、異なる種類のＤＮＡの混合物（例えば、合成及び天然に存在するＤＮＡの混合物；母体及び胎児ＤＮＡの混合物など）を含有してもよい。また別の例では、サンプルは、異なる種類のＲＮＡの混合物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及び／またはｒＲＮＡを含有する混合物）を含有してもよい。例えば、参照によってすでに組み込まれている２０１４年６月２６日出願の米国特許出願第６２／０１７，５５８号において記載されているとおり、サンプルは、パーティション内に配置されるセル内に存在してもよい。
【００６７】
ｂ．  サンプル供給源
核酸を含む任意の物質が、サンプルの供給源であってよい。物質は、流体、例えば、生体液であってよい。流体物質には、これらだけに限定されないが、血液、臍帯血、唾液、尿、汗、血清、精液、膣液、胃及び消化液、脊髄液、胎盤液、腔液、眼液、血清、母乳、リンパ液、またはそれらの組合せが含まれ得る。
【００６８】
物質は、固体組織、例えば、生物学的組織または細胞もしくは生検のコレクションからの物質であってよい。物質は、正常な健康組織を含んでよい。組織は、様々な種類の臓器に関連してよい。臓器の非限定的例には、脳、肝臓、肺、腎臓、前立腺、卵巣、脾臓、リンパ節（扁桃を含む）、甲状腺、膵臓、心臓、骨格筋、小腸、咽頭、食道、胃、またはそれらの組合せが含まれ得る。
【００６９】
物質は、腫瘍を含んでよい。腫瘍は、良性（非がん）または悪性（がん）であってよい。腫瘍の非限定的例には、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮細胞肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、胃腸系がん、結腸がん、膵臓がん、乳がん、尿生殖器系がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮細胞がん腫、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、皮脂腺がん、乳頭状がん、乳頭状腺がん、嚢胞腺がん、髄様がん、気管支がん、腎細胞がん、肝細胞がん、胆管がん、絨毛上皮腫、精上皮腫、胎生がん、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、内分泌系がん、精巣腫瘍、肺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、膀胱がん、上皮がん、膠腫、神経膠星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、またはそれらの組合せが含まれ得る。腫瘍は、様々な種類の臓器に関連してよい。臓器の非限定的例には、脳、肝臓、肺、腎臓、前立腺、卵巣、脾臓、リンパ節（扁桃を含む）、甲状腺、膵臓、心臓、骨格筋、小腸、咽頭、食道、胃、またはそれらの組合せが含まれ得る。
【００７０】
物質は、正常な健康組織または腫瘍組織のミックスを含んでもよい。組織は、様々な種類の臓器に関連してよい。臓器の非限定的例には、脳、肝臓、肺、腎臓、前立腺、卵巣、脾臓、リンパ節（扁桃を含む）、甲状腺、膵臓、心臓、骨格筋、小腸、咽頭、食道、胃、またはそれらの組合せが含まれ得る。
【００７１】
一部の場合には、物質は、これらだけに限定されないが：真核細胞、原核細胞、真菌細胞、心臓細胞、肺細胞、腎臓細胞、肝臓細胞、膵臓細胞、生殖細胞、幹細胞、人工多能性幹細胞、胃腸細胞、血液細胞、がん細胞、細菌細胞、ヒトミクロビオームサンプルから単離された細菌細胞などを含む様々な細胞を含む。一部の場合には、物質は、細胞の内容物、例えば、単細胞の内容物または複数の細胞の内容物などを含んでよい。
【００７２】
一部の場合には、細胞は、正常細胞、腫瘍細胞、またはその両方であり、生サンプル、非保存サンプル、保存サンプル、防腐処置サンプル、包埋サンプル、固定サンプル、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択される組織サンプルまたは細胞サンプル（すなわち、サンプル）から得られる。一部の例では、組織サンプルまたは細胞サンプルは、包埋されていて、さらに保存、防腐処置、または固定されている。一部の例では、組織サンプルまたは細胞サンプルは、両方包埋され、さらに固定されている。一部の例では、組織サンプル、細胞サンプル、またはそれらの両方は、ホルムアルデヒド（例えば、ホルマリン）固定及びパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）されている。
【００７３】
サンプルを、様々な対象から得てよい。対象は、生体対象または死体対象であってよい。一部の場合には、対象は、哺乳動物対象、例えば、ヒト対象などである。対象の例には、これらだけに限定されないが、ヒト、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、げっ歯類、両生類、爬虫類、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ニワトリ、トリ（ａｖｉｎｅｓ）、マウス、ウサギ、昆虫、ナメクジ、微生物、細菌、寄生虫、またはサカナが含まれる。一部の場合には、対象は、健康であり、例えば、健康な男性、女性、小児、または乳児である。一部の場合には、対象は、疾患または障害を有するか、有すると疑われるか、または発症するリスクのある患者であってよい。一部の場合には、対象は、妊婦であってよい。一部の場合には、対象は、正常な健康な妊婦であってよい。一部の場合には、対象は、ある種の先天性欠損を有する胎児を妊娠しているリスクのある妊婦であってよい。
【００７４】
サンプルは、様々な手法によって対象から得てよい。例えば、循環系にアクセスするか（例えば、シリンジまたは他の装置によって静脈内または動脈内で）、分泌された生体サンプル（例えば、唾液、痰、尿、便など）を収集するか、生体サンプルを外科的に（例えば、生検で）得るか（例えば、手術中サンプル、手術後サンプルなど）、スワビング（例えば、頬側スワブ、口咽頭スワブ）もしくはピペット処理することによって、または対象から組織液または他のサンプルを得るための任意の他の手段によって、サンプルを対象から得てもよい。
【００７５】
ＩＶ．  インプットサンプルの量
ａ．  全サンプルインプット
本明細書において提供する方法において使用することができる全インプットサンプル（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡなど）の量は様々であってよい。本明細書において提供する方法及びシステムは、インプットサンプルが少量である場合に特に有用であるが；それらを、多量のインプットサンプルで使用してもよい。一部の場合には、インプットサンプルの量は、約１ｆｇ、５ｆｇ、１０ｆｇ、２５ｆｇ、５０ｆｇ、１００ｆｇ、２００ｆｇ、３００ｆｇ、４００ｆｇ、５００ｆｇ、６００ｆｇ、７００ｆｇ、８００ｆｇ、９００ｆｇ、１ｐｇ、５ｐｇ、１０ｐｇ、２５ｐｇ、５０ｐｇ、１００ｐｇ、２００ｐｇ、３００ｐｇ、４００ｐｇ、５００ｐｇ、６００ｐｇ、７００ｐｇ、８００ｐｇ、９００ｐｇ、１ｎｇ、２．５ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、１５ｎｇ、２０ｎｇ、２５ｎｇ、３０ｎｇ、３５ｎｇ、４０ｎｇ、４１ｎｇ、４２ｎｇ、４３ｎｇ、４４ｎｇ、４５ｎｇ、４６ｎｇ、４７ｎｇ、４８ｎｇ、４９ｎｇ、５０ｎｇ、５１ｎｇ、５２ｎｇ、５３ｎｇ、５４ｎｇ、５５ｎｇ、５６ｎｇ、５７ｎｇ、５８ｎｇ、５９ｎｇ、６０ｎｇ、６５ｎｇ、７０ｎｇ、７５ｎｇ、８０ｎｇ、９０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇ、４００ｎｇ、５００ｎｇ、６００ｎｇ、７００ｎｇ、８００ｎｇ、９００ｎｇ、１μｇ、２μｇ、３μｇ、４μｇ、５μｇ、６μｇ、７μｇ、８μｇ、９μｇ、１０μｇ、１５μｇ、または２０μｇであってよい。一部の場合には、インプットサンプルの量は、少なくとも約１ｆｇ、５ｆｇ、１０ｆｇ、２５ｆｇ、５０ｆｇ、１００ｆｇ、２００ｆｇ、３００ｆｇ、４００ｆｇ、５００ｆｇ、６００ｆｇ、７００ｆｇ、８００ｆｇ、９００ｆｇ、１ｐｇ、５ｐｇ、１０ｐｇ、２５ｐｇ、５０ｐｇ、１００ｐｇ、２００ｐｇ、３００ｐｇ、４００ｐｇ、５００ｐｇ、６００ｐｇ、７００ｐｇ、８００ｐｇ、９００ｐｇ、１ｎｇ、２．５ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、１５ｎｇ、２０ｎｇ、２５ｎｇ、３０ｎｇ、３５ｎｇ、４０ｎｇ、４１ｎｇ、４２ｎｇ、４３ｎｇ、４４ｎｇ、４５ｎｇ、４６ｎｇ、４７ｎｇ、４８ｎｇ、４９ｎｇ、５０ｎｇ、５１ｎｇ、５２ｎｇ、５３ｎｇ、５４ｎｇ、５５ｎｇ、５６ｎｇ、５７ｎｇ、５８ｎｇ、５９ｎｇ、６０ｎｇ、６５ｎｇ、７０ｎｇ、７５ｎｇ、８０ｎｇ、９０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇ、４００ｎｇ、５００ｎｇ、６００ｎｇ、７００ｎｇ、８００ｎｇ、９００ｎｇ、１μｇ、２μｇ、３μｇ、４μｇ、５μｇ、６μｇ、７μｇ、８μｇ、９μｇ、１０μｇ、１５μｇ、２０μｇ以上であってよい。一部の場合には、インプットサンプルの量は、約２０μｇ、１５μｇ、１０μｇ、９μｇ、８μｇ、７μｇ、６μｇ、５μｇ、４μｇ、３μｇ、２μｇ、１μｇ、９００ｎｇ、８００ｎｇ、７００ｎｇ、６００ｎｇ、５００ｎｇ、４００ｎｇ、３００ｎｇ、２００ｎｇ、１００ｎｇ、９０ｎｇ、８０ｎｇ、７５ｎｇ、７０ｎｇ、６５ｎｇ、６０ｎｇ、５９ｎｇ、５８ｎｇ、５７ｎｇ、５６ｎｇ、５５ｎｇ、５４ｎｇ、５３ｎｇ、５２ｎｇ、５１ｎｇ、５０ｎｇ、４９ｎｇ、４８ｎｇ、４７ｎｇ、４６ｎｇ、４５ｎｇ、４４ｎｇ、４３ｎｇ、４２ｎｇ、４１ｎｇ、４０ｎｇ、３５ｎｇ、３０ｎｇ、２５ｎｇ、２０ｎｇ、１５ｎｇ、１０ｎｇ、５ｎｇ、２．５ｎｇ、１ｎｇ、９００ｐｇ、８００ｐｇ、７００ｐｇ、６００ｐｇ、５００ｐｇ、４００ｐｇ、３００ｐｇ、２００ｐｇ、１００ｐｇ、５０ｐｇ、２５ｐｇ、１０ｐｇ、５ｐｇ、１ｐｇ、９００ｆｇ、８００ｆｇ、７００ｆｇ、６００ｆｇ、５００ｆｇ、４００ｆｇ、３００ｆｇ、２００ｆｇ、１００ｆｇ、５０ｆｇ、２５ｆｇ、１０ｆｇ、５ｆｇ、１ｆｇ以下であってよいか、またはそれ未満であってよい。一部の場合には、インプットサンプルの量は、本明細書に記載の値の任意の２つの値の間の範囲内に該当すればよい。
【００７６】
一部の場合には、約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１５０００、２００００、２５０００、３００００、３５０００、４００００、４５０００、または５００００ゲノム当量の核酸を、インプットサンプルとして使用してよい。一部の場合には、約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１５０００、２００００、２５０００、３００００、３５０００、４００００、４５０００、または５００００ゲノム当量未満の核酸を使用してよい。一部の場合には、約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１５０００、２００００、２５０００、３００００、３５０００、４００００、４５０００、または５００００ゲノム当量超の核酸を使用してよい。一部の場合には、使用する核酸のゲノム当量数は、本明細書に記載の値の任意の２つの値の間の範囲内に該当すればよい。
【００７７】
一部の場合には、インプットサンプルは、基礎をなすより多量の遺伝子成分（例えば、ゲノム）の約１Ｘ、２Ｘ、５Ｘ、１０Ｘ、１５Ｘ、２０Ｘ、３０Ｘ、４０Ｘ、または５０Ｘのカバレッジを構成していてよい。一部の場合には、インプットサンプルは、基礎をなすより多量の遺伝子成分の約１Ｘ、２Ｘ、５Ｘ、１０Ｘ、１５Ｘ、２０Ｘ、３０Ｘ、４０Ｘ、または５０Ｘ未満のカバレッジを構成していてよい。一部の場合には、インプットサンプルは、基礎をなすより多量の遺伝子成分の約１Ｘ、２Ｘ、５Ｘ、１０Ｘ、１５Ｘ、２０Ｘ、３０Ｘ、４０Ｘ、または５０Ｘ超のカバレッジを構成していてよい。一部の場合には、インプットサンプルは、本明細書に記載の値の任意の２つの値の間の範囲で、基礎をなすより多量の遺伝子成分をカバーしてよい。
【００７８】
ｂ．  サンプル内のターゲット成分のインプット品質
一部の例では、インプットサンプルは、様々な種類の成分（例えば、核酸）、または異なる供給源に由来する成分を含んでよい。特定のサンプル内のターゲット成分または問題の成分（例えば、疾患または障害に関連する成分）は、全インプットの特定のパーセンテージを構成していてよい。例えば、サンプルは、大量の正常な組織ＤＮＡ（例えば、９５％以上、９９％以上）と、非常に少量（例えば、５％以下、１％以下）の腫瘍またはがん細胞ＤＮＡとから構成され、後者が、対象のものであってよい。本明細書において提供する方法及びシステムは、ターゲット成分（例えば、核酸）がサンプル全体の少ない割合のみを構成している場合に特に有用である。例えば、上記方法及びシステムは、稀な核酸集団（例えば、無細胞核酸、無細胞胎児核酸、無細胞胎児核酸、腫瘍に起源する無細胞核酸など）、または稀な細胞集団に由来する核酸を検出するために特に有用である。一部の場合には、ターゲット成分は、全インプットの高いパーセンテージを構成していてよい。一部の場合には、ターゲット成分は、全インプットの低いパーセンテージを構成していてよい。一部の場合には、ターゲット成分は、全インプットの約０．０００００１％、０．０００００５％、０．０００００７５％、０．００００１％、０．００００５％、０．００００７５％、０．０００１％、０．０００５％、０．０００７５％、０．００１％、０．００５％、０．００７５％、０．０１％、０．０５％、０．０７５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％を構成していてよい。一部の場合には、ターゲット成分は、全インプットの少なくとも約０．０００００１％、０．０００００５％、０．０００００７５％、０．００００１％、０．００００５％、０．００００７５％、０．０００１％、０．０００５％、０．０００７５％、０．００１％、０．００５％、０．００７５％、０．０１％、０．０５％、０．０７５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％を構成していてよい。一部の場合には、ターゲット成分は、全インプットの約０．０００００１％、０．０００００５％、０．０００００７５％、０．００００１％、０．００００５％、０．００００７５％、０．０００１％、０．０００５％、０．０００７５％、０．００１％、０．００５％、０．００７５％、０．０１％、０．０５％、０．０７５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％未満を構成していてよい。一部の場合には、ターゲット成分は、本明細書に記載の値の任意の２つの値に該当するパーセンテージの範囲を構成していてよい。
【００７９】
一部の実施形態では、サンプルは、体液、特に、血液または尿から得られる核酸を含んでよい。サンプルは、循環無細胞核酸、及び／または循環腫瘍細胞に関連する核酸を含んでよい。細胞は、生組織、非保存組織、保存組織、防腐処置組織、包埋組織、固定組織、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択される組織から得てもよい。一部の例では、細胞は、包埋され、さらに保存、防腐処置、または固定されている。一部の例では、細胞は、包埋され、さらに固定されている。一部の例では、細胞は、ホルムアルデヒド（例えば、ホルマリン）固定及びパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）されている。
【００８０】
一部の場合には、対象のターゲット集団（例えば、無細胞核酸、胎児核酸、循環腫瘍細胞に関連する核酸など）は、全サンプルインプットの０．０００１％、０．０００５％、０．０００７５％、０．００１％、０．００５％、０．００７５％、０．０１％、０．０５％、０．０７５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％未満を構成していてよい。一部の実施形態では、インプットサンプルは、サンプル内の全細胞数の０．０００１％、０．０００５％、０．０００７５％、０．００１％、０．００５％、０．００７５％、０．０１％、０．０５％、０．０７５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％未満ががん細胞（例えば、循環腫瘍細胞）から構成される細胞サンプル（例えば、血液サンプル）である。細胞サンプルを分析するための方法及びシステムは、その全開示があらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる２０１４年６月２６日出願の米国特許仮出願第６２／０１７，５５８号において記載されている。
【００８１】
インプットターゲット成分の量は様々であってよい。一部の場合には、ターゲット成分約１ｆｇ、５ｆｇ、１０ｆｇ、２５ｆｇ、５０ｆｇ、１００ｆｇ、２００ｆｇ、３００ｆｇ、４００ｆｇ、５００ｆｇ、６００ｆｇ、７００ｆｇ、８００ｆｇ、９００ｆｇ、１ｐｇ、５ｐｇ、１０ｐｇ、２５ｐｇ、５０ｐｇ、１００ｐｇ、２００ｐｇ、３００ｐｇ、４００ｐｇ、５００ｐｇ、６００ｐｇ、７００ｐｇ、８００ｐｇ、９００ｐｇ、１ｎｇ、２．５ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、１５ｎｇ、２０ｎｇ、２５ｎｇ、３０ｎｇ、３５ｎｇ、４０ｎｇ、４１ｎｇ、４２ｎｇ、４３ｎｇ、４４ｎｇ、４５ｎｇ、４６ｎｇ、４７ｎｇ、４８ｎｇ、４９ｎｇ、５０ｎｇ、５１ｎｇ、５２ｎｇ、５３ｎｇ、５４ｎｇ、５５ｎｇ、５６ｎｇ、５７ｎｇ、５８ｎｇ、５９ｎｇ、６０ｎｇ、６５ｎｇ、７０ｎｇ、７５ｎｇ、８０ｎｇ、９０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇ、４００ｎｇ、５００ｎｇ、６００ｎｇ、７００ｎｇ、８００ｎｇ、９００ｎｇ、１μｇ、２μｇ、３μｇ、４μｇ、５μｇ、６μｇ、７μｇ、８μｇ、９μｇ、１０μｇ、１５μｇ、または２０μｇをインプットしてよい。一部の場合には、ターゲット成分少なくとも約１ｆｇ、５ｆｇ、１０ｆｇ、２５ｆｇ、５０ｆｇ、１００ｆｇ、２００ｆｇ、３００ｆｇ、４００ｆｇ、５００ｆｇ、６００ｆｇ、７００ｆｇ、８００ｆｇ、９００ｆｇ、１ｐｇ、５ｐｇ、１０ｐｇ、２５ｐｇ、５０ｐｇ、１００ｐｇ、２００ｐｇ、３００ｐｇ、４００ｐｇ、５００ｐｇ、６００ｐｇ、７００ｐｇ、８００ｐｇ、９００ｐｇ、１ｎｇ、２．５ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、１５ｎｇ、２０ｎｇ、２５ｎｇ、３０ｎｇ、３５ｎｇ、４０ｎｇ、４１ｎｇ、４２ｎｇ、４３ｎｇ、４４ｎｇ、４５ｎｇ、４６ｎｇ、４７ｎｇ、４８ｎｇ、４９ｎｇ、５０ｎｇ、５１ｎｇ、５２ｎｇ、５３ｎｇ、５４ｎｇ、５５ｎｇ、５６ｎｇ、５７ｎｇ、５８ｎｇ、５９ｎｇ、６０ｎｇ、６５ｎｇ、７０ｎｇ、７５ｎｇ、８０ｎｇ、９０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇ、４００ｎｇ、５００ｎｇ、６００ｎｇ、７００ｎｇ、８００ｎｇ、９００ｎｇ、１μｇ、２μｇ、３μｇ、４μｇ、５μｇ、６μｇ、７μｇ、８μｇ、９μｇ、１０μｇ、１５μｇ、２０μｇ以上をインプットしてよい。一部の場合には、ターゲット成分約２０μｇ、１５μｇ、１０μｇ、９μｇ、８μｇ、７μｇ、６μｇ、５μｇ、４μｇ、３μｇ、２μｇ、１μｇ、９００ｎｇ、８００ｎｇ、７００ｎｇ、６００ｎｇ、５００ｎｇ、４００ｎｇ、３００ｎｇ、２００ｎｇ、１００ｎｇ、９０ｎｇ、８０ｎｇ、７５ｎｇ、７０ｎｇ、６５ｎｇ、６０ｎｇ、５９ｎｇ、５８ｎｇ、５７ｎｇ、５６ｎｇ、５５ｎｇ、５４ｎｇ、５３ｎｇ、５２ｎｇ、５１ｎｇ、５０ｎｇ、４９ｎｇ、４８ｎｇ、４７ｎｇ、４６ｎｇ、４５ｎｇ、４４ｎｇ、４３ｎｇ、４２ｎｇ、４１ｎｇ、４０ｎｇ、３５ｎｇ、３０ｎｇ、２５ｎｇ、２０ｎｇ、１５ｎｇ、１０ｎｇ、５ｎｇ、２．５ｎｇ、１ｎｇ、９００ｐｇ、８００ｐｇ、７００ｐｇ、６００ｐｇ、５００ｐｇ、４００ｐｇ、３００ｐｇ、２００ｐｇ、１００ｐｇ、５０ｐｇ、２５ｐｇ、１０ｐｇ、５ｐｇ、１ｐｇ、９００ｆｇ、８００ｆｇ、７００ｆｇ、６００ｆｇ、５００ｆｇ、４００ｆｇ、３００ｆｇ、２００ｆｇ、１００ｆｇ、５０ｆｇ、２５ｆｇ、１０ｆｇ、５ｆｇ、１ｆｇ以下または未満をインプットしてよい。一部の場合には、インプットされるターゲット成分の量は、本明細書に記載の任意の２つの値の間の範囲に該当すればよい。
【００８２】
一部の場合には、ターゲット成分のインプット量は、約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１５０００、２００００、２５０００、３００００、３５０００、４００００、４５０００、または５００００ゲノム当量であってよい。一部の場合には、ターゲット成分のインプット量は、約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１５０００、２００００、２５０００、３００００、３５０００、４００００、４５０００、または５００００ゲノム当量未満であってよい。一部の場合には、ターゲット成分のインプット量は、約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１５０００、２００００、２５０００、３００００、３５０００、４００００、４５０００、または５００００ゲノム当量以上であってよい。一部の場合には、ターゲット成分中に含有される核酸のゲノム当量数は、本明細書に記載の値の任意の２つの値の間の範囲に該当すればよい。
【００８３】
一部の場合には、インプットされるターゲット成分は、基礎をなすより多量の遺伝子成分（例えば、ゲノム）の約１Ｘ、２Ｘ、５Ｘ、１０Ｘ、１５Ｘ、２０Ｘ、３０Ｘ、４０Ｘ、または５０Ｘのカバレッジを構成していてよい。一部の場合には、インプットされるターゲット成分は、基礎をなすより多量の遺伝子成分の約１Ｘ、２Ｘ、５Ｘ、１０Ｘ、１５Ｘ、２０Ｘ、３０Ｘ、４０Ｘ、または５０Ｘ未満のカバレッジを構成していてよい。一部の場合には、インプットされるターゲット成分は、基礎をなすより多量の遺伝子成分の約１Ｘ、２Ｘ、５Ｘ、１０Ｘ、１５Ｘ、２０Ｘ、３０Ｘ、４０Ｘ、または５０Ｘ超のカバレッジを構成していてよい。一部の場合には、インプットされるターゲット成分は、本明細書に記載の値の任意の２つの値の間の範囲で、基礎をなすより多量の遺伝子成分をカバーしてよい。
【００８４】
ｃ．  サンプル混合物内のターゲットサンプルのインプット量
一部の例では、インプットされるサンプルは、様々な対象または供給源に起源するサンプルのミックスであってよく、ターゲットサンプルは、全インプットの特定のパーセンテージを構成していてよい。例えば、法医学的分析のための生体サンプルは、異なる対象（例えば、被害者、加害者、目撃者、法医学研究施設の分析者など）からの核酸を含み得て、混合物の一部のみがターゲットである。一部の場合には、ターゲットサンプルは、全インプットの高いパーセンテージを構成していてよい。一部の場合には、ターゲットサンプルは、全インプットの低いパーセンテージを構成していてよい。一部の場合には、ターゲットサンプルは、全インプットの約０．０００００１％、０．０００００５％、０．０００００７５％、０．００００１％、０．００００５％、０．００００７５％、０．０００１％、０．０００５％、０．０００７５％、０．００１％、０．００５％、０．００７５％、０．０１％、０．０５％、０．０７５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、または９９．９９％を構成していてよい。一部の場合には、ターゲットサンプルは、全インプットの少なくとも約０．０００００１％、０．０００００５％、０．０００００７５％、０．００００１％、０．００００５％、０．００００７５％、０．０００１％、０．０００５％、０．０００７５％、０．００１％、０．００５％、０．００７５％、０．０１％、０．０５％、０．０７５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、または９９．９９％を構成していてよい。一部の場合には、ターゲットサンプルは、全インプットの約０．０００００１％、０．０００００５％、０．０００００７５％、０．００００１％、０．００００５％、０．００００７５％、０．０００１％、０．０００５％、０．０００７５％、０．００１％、０．００５％、０．００７５％、０．０１％、０．０５％、０．０７５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、または９９．９９％以下または未満を構成していてよい。一部の場合には、ターゲットサンプルは、本明細書に記載の任意の２つの値の間に該当するパーセンテージ範囲を構成していてよい。
【００８５】
含まれるターゲットサンプルの量は、様々であってよい。一部の場合には、多量のターゲットサンプルが含まれてよい。一部の場合には、少量のターゲットサンプルが含まれてよい。一部の場合には、ターゲットサンプル約１フェムトグラム（ｆｇ）、５ｆｇ、１０ｆｇ、２５ｆｇ、５０ｆｇ、１００ｆｇ、２００ｆｇ、３００ｆｇ、４００ｆｇ、５００ｆｇ、６００ｆｇ、７００ｆｇ、８００ｆｇ、９００ｆｇ、１ピコグラム（ｐｇ）、５ｐｇ、１０ｐｇ、２５ｐｇ、５０ｐｇ、１００ｐｇ、２００ｐｇ、３００ｐｇ、４００ｐｇ、５００ｐｇ、６００ｐｇ、７００ｐｇ、８００ｐｇ、９００ｐｇ、１ｎｇ、２．５ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、１５ｎｇ、２０ｎｇ、２５ｎｇ、３０ｎｇ、３５ｎｇ、４０ｎｇ、４１ｎｇ、４２ｎｇ、４３ｎｇ、４４ｎｇ、４５ｎｇ、４６ｎｇ、４７ｎｇ、４８ｎｇ、４９ｎｇ、５０ｎｇ、５１ｎｇ、５２ｎｇ、５３ｎｇ、５４ｎｇ、５５ｎｇ、５６ｎｇ、５７ｎｇ、５８ｎｇ、５９ｎｇ、６０ｎｇ、６５ｎｇ、７０ｎｇ、７５ｎｇ、８０ｎｇ、９０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇ、４００ｎｇ、５００ｎｇ、６００ｎｇ、７００ｎｇ、８００ｎｇ、９００ｎｇ、１マイクログラム（μｇ）、２μｇ、３μｇ、４μｇ、５μｇ、６μｇ、７μｇ、８μｇ、９μｇ、１０μｇ、１５μｇ、または２０μｇが含まれてよい。一部の場合には、ターゲットサンプル少なくとも約１ｆｇ、５ｆｇ、１０ｆｇ、２５ｆｇ、５０ｆｇ、１００ｆｇ、２００ｆｇ、３００ｆｇ、４００ｆｇ、５００ｆｇ、６００ｆｇ、７００ｆｇ、８００ｆｇ、９００ｆｇ、１ｐｇ、５ｐｇ、１０ｐｇ、２５ｐｇ、５０ｐｇ、１００ｐｇ、２００ｐｇ、３００ｐｇ、４００ｐｇ、５００ｐｇ、６００ｐｇ、７００ｐｇ、８００ｐｇ、９００ｐｇ、１ｎｇ、２．５ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、１５ｎｇ、２０ｎｇ、２５ｎｇ、３０ｎｇ、３５ｎｇ、４０ｎｇ、４１ｎｇ、４２ｎｇ、４３ｎｇ、４４ｎｇ、４５ｎｇ、４６ｎｇ、４７ｎｇ、４８ｎｇ、４９ｎｇ、５０ｎｇ、５１ｎｇ、５２ｎｇ、５３ｎｇ、５４ｎｇ、５５ｎｇ、５６ｎｇ、５７ｎｇ、５８ｎｇ、５９ｎｇ、６０ｎｇ、６５ｎｇ、７０ｎｇ、７５ｎｇ、８０ｎｇ、９０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇ、４００ｎｇ、５００ｎｇ、６００ｎｇ、７００ｎｇ、８００ｎｇ、９００ｎｇ、１μｇ、２μｇ、３μｇ、４μｇ、５μｇ、６μｇ、７μｇ、８μｇ、９μｇ、１０μｇ、１５μｇ、２０μｇ以上が含まれてよい。一部の場合には、ターゲットサンプル約２０μｇ、１５μｇ、１０μｇ、９μｇ、８μｇ、７μｇ、６μｇ、５μｇ、４μｇ、３μｇ、２μｇ、１μｇ、９００ｎｇ、８００ｎｇ、７００ｎｇ、６００ｎｇ、５００ｎｇ、４００ｎｇ、３００ｎｇ、２００ｎｇ、１００ｎｇ、９０ｎｇ、８０ｎｇ、７５ｎｇ、７０ｎｇ、６５ｎｇ、６０ｎｇ、５９ｎｇ、５８ｎｇ、５７ｎｇ、５６ｎｇ、５５ｎｇ、５４ｎｇ、５３ｎｇ、５２ｎｇ、５１ｎｇ、５０ｎｇ、４９ｎｇ、４８ｎｇ、４７ｎｇ、４６ｎｇ、４５ｎｇ、４４ｎｇ、４３ｎｇ、４２ｎｇ、４１ｎｇ、４０ｎｇ、３５ｎｇ、３０ｎｇ、２５ｎｇ、２０ｎｇ、１５ｎｇ、１０ｎｇ、５ｎｇ、２．５ｎｇ、１ｎｇ、９００ｐｇ、８００ｐｇ、７００ｐｇ、６００ｐｇ、５００ｐｇ、４００ｐｇ、３００ｐｇ、２００ｐｇ、１００ｐｇ、５０ｐｇ、２５ｐｇ、１０ｐｇ、５ｐｇ、１ｐｇ、９００ｆｇ、８００ｆｇ、７００ｆｇ、６００ｆｇ、５００ｆｇ、４００ｆｇ、３００ｆｇ、２００ｆｇ、１００ｆｇ、５０ｆｇ、２５ｆｇ、１０ｆｇ、５ｆｇ、１ｆｇ以下または未満が含まれてよい。一部の場合には、ターゲットサンプルの量は、本明細書に記載の値の任意の２つの値の間の範囲に該当すればよい。
【００８６】
一部の場合には、ターゲットサンプルのインプット量は、約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１５０００、２００００、２５０００、３００００、３５０００、４００００、４５０００、または５００００ゲノム当量であってよい。一部の場合には、ターゲットサンプルのインプット量は、約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１５０００、２００００、２５０００、３００００、３５０００、４００００、４５０００、または５００００ゲノム当量未満であってよい。一部の場合には、ターゲットサンプルのインプット量は、約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１５０００、２００００、２５０００、３００００、３５０００、４００００、４５０００、または５００００ゲノム当量以上であってよい。一部の場合には、ターゲットサンプルのインプット量は、本明細書に記載の数の任意の２つの数の間であってよい。
【００８７】
一部の場合には、含まれるターゲットサンプルは、基礎をなすより多量の遺伝子成分（例えば、ゲノム）の約１Ｘ、２Ｘ、５Ｘ、１０Ｘ、１５Ｘ、２０Ｘ、３０Ｘ、４０Ｘ、または５０Ｘのカバレッジを構成していてよい。一部の場合には、含まれるターゲットサンプルは、基礎をなすより多量の遺伝子成分の約１Ｘ、２Ｘ、５Ｘ、１０Ｘ、１５Ｘ、２０Ｘ、３０Ｘ、４０Ｘ、または５０Ｘ未満のカバレッジを構成していてよい。一部の場合には、含まれるターゲットサンプルは、基礎をなすより多量の遺伝子成分の約１Ｘ、２Ｘ、５Ｘ、１０Ｘ、１５Ｘ、２０Ｘ、３０Ｘ、４０Ｘ、または５０Ｘ超のカバレッジを構成していてよい。一部の場合には、含まれるターゲットサンプルは、本明細書に記載の値の任意の２つの値の間の範囲で、基礎をなすより多量の遺伝子成分をカバーしてよい。
【００８８】
ｄ．  パーティション中のサンプル
分析の目的を達成するために、所望のレベルのサンプル核酸をパーティションに供給するように、サンプルの分配を実施してよい。例えば、サンプルからのいずれかの重複核酸部分（例えば、ターゲット核酸）が単一パーティション内に存在する確率を最小限にするように、サンプル核酸が分配されることが望まれ得る。これは、特定の量の核酸のみが、任意の単一パーティション内に分配されるために十分に低い濃度で、または限定的な希釈で、サンプル核酸を分配される水性流内に供給することによって、一般に達成され得る。典型的には、約１０キロ塩基（ｋｂ）〜約１００ｋｂ長、または約１０ｋｂ〜約３０ｋｂ長である断片を含むサンプル核酸断片を供給するように、サンプル核酸を処理してよい。そのような場合、パーティション内の核酸が、約１００〜約５００断片を含むことを保証することが、一般に望まれ得る。他の用途では、少なければ、１個のパーティション内に単一核酸断片、多ければ、単一パーティションにゲノム全体または細胞の内容物全体を供給することを含めて、核酸を広く多様な量でパーティション内に供給することが望ましいことがある。
【００８９】
本明細書に記載のシステム及び方法の一部の態様の内容では、一部の場合には、サンプル核酸と共に同時分配されるビーズの数を制御することが望まれ得る。一部の場合には、単一のビーズのみがそこに配置されている、すなわち、「単一占有されている」パーティションを提供することが望まれ得る。上記で言及したとおり、これは一般に、液滴発生ジャンクション内に集合する様々な流体の流速の１つまたは複数を制御し、そのジャンクションの寸法及び構造を制御し、液滴を発生させているシステムまたはデバイス内のチャネル全体の配置を制御することによって達成される。
【００９０】
ある種の例では、パーティションの一定のパーセンテージが、１個以下のビーズを含有するように、ビーズを分配してよい。一部の場合には、パーティションの約１％、２．５％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％は、１個以下のビーズを含有してよい。一部の場合には、パーティションの少なくとも約１％、２．５％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％は、１個以下のビーズを含有してよい。一部の場合には、パーティションの１％、２．５％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％以下は、１個以下のビーズを含有してよい。一部の場合には、１個以下のビーズを含有するパーティションのパーセンテージは、本明細書に記載の値の任意の２つの値の間の範囲に該当していてよい。
【００９１】
特定の例では、サンプルは、ターゲット核酸（またはターゲット核酸集団）を含む核酸サンプルであり、それを、パーティションの一定のパーセンテージが、１個以下のターゲット核酸、２個以下のターゲット核酸、３個以下のターゲット核酸、４個以下のターゲット核酸、または５個以下のターゲット核酸を含有するように分配してよい。一部の場合には、パーティションの約１％、２．５％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％は、１個以下のターゲット核酸を含有してよい。一部の場合には、パーティションの少なくとも約１％、２．５％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％は、１個以下のターゲット核酸を含有してよい。一部の場合には、パーティションの１％、２．５％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％以下は、１個以下のターゲット核酸を含有してよい。一部の場合には、１個以下のターゲット核酸を含有するパーティションのパーセンテージは、本明細書に記載の値の任意の２つの値の間の範囲に該当してよい。一部の場合には、パーティションは、平均して１個未満のターゲット核酸、平均して２個未満のターゲット核酸、平均して３個未満のターゲット核酸、平均して４個未満のターゲット核酸、または平均して５個未満のターゲット核酸を含む。
【００９２】
加えて、または別法では、一部の場合には、過剰な数の空のパーティション、例えば、ビーズを含まないパーティションの作成を回避することが望まれ得る。本明細書の他の所で記載しているとおり、分配帯域に方向づけられている流体、例えば、サンプル流体、ビーズ含有流体、及び／または分配流体の流れを、発生するパーティションの９０％以下、８０％以下、７０％以下、６５％以下、６０％以下、５５％以下、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、２．５％以下、または１％以下が非占有である、すなわち、ビーズが配置されていないように制御してよい。多くの場合に、上記単一占有率のいずれかを提供しながらも、非占有パーティションの上述の範囲は達成され得る。例えば、一部の場合には、本開示のシステム及び方法の使用は、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、及び一部の場合には、５％未満の複数占有率を有しながら、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、及び一部の場合には、５％未満の非占有パーティションを有する結果的なパーティションを作成する。
【００９３】
上記では、実質的単一占有パーティションを提供する点において記載したが、特定の場合には、例えば、単一パーティション内に２個、３個、４個、またはそれ以上のビーズを含有する複数占有パーティションを提供することが望まれ得る。同様に、パーティション内のサンプル量も、様々な目的を達成するために所望に調節してよい。したがって、上記で言及したとおり、サンプル及び／またはビーズ含有流体、ならびに分配流体の流れ特性を、そのような複数占有パーティション、またはそのようなパーティション内での様々なサンプル濃度もしくは量を提供するように制御してよい。とりわけ、流れパラメーターを、パーティションの５０％超、７５％超、及び一部の場合には８０％、９０％、９５％またはそれより高い超の占有率を提供するように制御してよい。
【００９４】
バルク分配法、例えば、バルクエマルション形成システム、例えば、Ｎａｎｏｍｉ,Ｉｎｃ．によって提供されるとおりの大規模液滴形成システム、または微小流体分配システムを含むいくつかの手法を、本明細書に記載のとおりのパーティションを発生させるために使用してよい。一部の態様では、本明細書において使用する分配システムには、その全開示がその全体で参照によって本明細書に組み込まれる２０１４年４月１０日出願の米国特許仮出願第６１／９７７，８０４号に記載のものが含まれる。
【００９５】
Ｖ．  デバイスへのサンプルの導入
本開示の様々な態様のいずれかでは、サンプルを他の試薬（例えば、機能性ビーズ、バーコード化ビーズ、サンプル増幅に必要な試薬、還元剤、プライマー、機能性配列など）とさらに合わせるか、または混合することができるデバイスまたはシステムに、対象から得られるサンプルを導入してよい。デバイスまたはシステムは、統合ボディ構造内に集積されたマイクロスケールチャネルネットワークを含む微小流体デバイスを含んでよいか、またはそれらは、サンプルの処理において使用される流体を提供する構成部品の集合を含んでよい。本明細書に記載のとおり、デバイスという用語を、上述のものを含む、本明細書に記載の流体機能性の任意の配置を記載するために使用する。デバイスは、サンプル装填チャネルを含んでもよいし、または含まなくてもよい。一部の場合には、デバイスは、複数のサンプル装填チャネルを含んでよい。デバイスは、サンプル受容ベッセルを含んでもよいし、または含まなくてもよい。場合によって、デバイスは、１個または複数個のサンプル受容ベッセルを含んでよい。サンプル受容ベッセルは、デバイスに永続的に付随してよい。サンプル受容ベッセルを、デバイスに取り付けてもよい。サンプル受容ベッセルは、デバイスと分離可能であってよい。サンプル受容ベッセルは、様々な形状、サイズ、重量、材料、及び構成のものであってよい。例えば、サンプル受容ベッセルは、規則的な形状、または不規則な形状であってよく、丸型または楕円型管状形状であってよく、長方形、正方形、ダイアモンド型、円形、楕円形、または三角形の形状であってよい。サンプル受容ベッセルは、任意の種類の材料、例えば、ガラス、プラスチック、ポリマー、金属などから作製され得る。サンプル受容ベッセルの種類の非限定的例には、チューブ、ウェル、毛管、カートリッジ、キュベット、遠心管、またはピペット管が含まれ得る。一部の場合には、デバイスは、複数の同一のサンプル受容ベッセルを含んでよい。一部の場合には、デバイスは、サイズ、形状、重量、材料、及び構成を含む因子の少なくとも１個が異なってよい複数の異なるサンプル受容ベッセルを含んでよい。一部の場合には、デバイスは、１個または複数個の他のデバイス（例えば、サーマルサイクラー、シーケンサーなど）と接続していてよい。一部の場合には、デバイスは、別のデバイスの一部であってよい。
【００９６】
一部の場合には、サンプルを、直接導入するか、または特定のツールを使用することによってデバイスに装填してよい。ツールの非限定的例には、ピペット、自動ピペット、電子ピペット、デジタル読取り式ピペット、デジタル調節ピペット、ポジティブディスプレイスメント式ピペット、リピーターピペット、マイクロディスペンサーピペット、ボトルトップディスペンサー、手動シリンジ、オートサンプラーシリンジ、分析用電子シリンジ、ハミルトンシリンジ、またはそれらの組合せが含まれる。一部の場合には、サンプル装填の前に、サンプルを、ある物質に溶かす、懸濁させる、またはそれと混合してもよい。その物質は、液体またはガスであってよい。物質は、デバイスのサンプル装填チャネルの１つまたは複数と連絡していてよい。一部の場合には、サンプルを、第２のデバイス、例えば、シリンジポンプまたはサンプルディスペンサーによってデバイスに導入してよい。
【００９７】
サンプルを、制御下でデバイスに装填してもよい。一部の場合には、装填されるサンプルの量を制御してもよい。一部の場合には、装填されるサンプルの体積を制御してもよい。一部の場合には、装填されるサンプルの量を、サンプル装填速度の調節を介して制御してもよい。一部の場合には、装填されるサンプルの体積を、サンプル装填速度の調節を介して制御してもよい。
【００９８】
サンプルの１種または複数種をデバイスに導入してよい。１種超のサンプルを装填する場合には、それらを、連続的に、または同時に装填してよい。一部の場合には、異なる種類のサンプルを、同じ装填チャネルを介して装填してもよい。一部の場合には、異なる種類のサンプルを、様々な装填チャネルを介して装填してもよい。一部の場合には、異なる種類のサンプルを、同じサンプル受容ベッセルに装填してよい。一部の場合には、異なる種類のサンプルを、それらの対応するサンプル受容ベッセルに装填してよい。一部の態様では、潜在的な相互汚染の問題を低減または除去しつつ、複数の異なるサンプルを処理するために、単一のデバイスまたはシステムが、複数の平行したチャネルまたは流体ネットワークを含んでもよい。
【００９９】
サンプルを、デバイスに装填する前に処理しても、またはしなくてもよい。一部の場合には、サンプルを、あらゆるさらなる処理なしに、デバイスに導入してもよい。一部の場合には、サンプルを、デバイスに導入する前に、１つまたは複数の処理手順に掛けてもよい。例えば、核酸のミックスをサンプルとして使用する場合には、デバイスに導入する前に、ミックス内の１種または複数種の成分を単離、抽出、または精製するように、ミックスを処理してもよい。例えば、一部の場合には、エキソームを、元の核酸サンプルから精製してもよい。別の例では、サンプル装填の前に、核酸の比較的長い配列を様々なより小さい配列に断片化してもよく、それらの断片を、例えば、Ｂｌｕｅ  Ｐｉｐｐｉｎ断片選択システムを使用して、所望のサイズまたはサイズ範囲の断片を富化するための追加の処理に掛けても、または掛けなくてもよい。一部の場合には、デバイスに装填する前に、装填するサンプルを、他の試薬と事前混合してもよい。試薬の非限定的例には、機能性ビーズ、バーコード、オリゴヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、天然のヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、変異プルーフリーディングポリメラーゼ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、プライマー、サンプルインデックス配列、シーケンシングプライマー結合部位、シーケンサープライマー結合部位、還元剤、またはそれらの組合せが含まれ得る。
【０１００】
サンプルを受容し、かつサンプルを、さらなる処理ステップのための特定の試薬と組み合わせることができる、本明細書に記載のとおりの任意のデバイスを使用してよい。そのようなデバイスは、微小流体デバイス（例えば、液滴発生器）であってよい。そのような微小流体デバイスの例には、その全開示があらゆる目的のために、その全体で参照によって本明細書に組み込まれる２０１４年４月１０日出願の米国特許仮出願第６１／９７７，８０４号において詳細に記載されているものが含まれる。
【０１０１】
ＶＩ．  試験の実行
本明細書に記載の方法及びシステムは、少ないインプット量の核酸（例えば、５０ナノグラム（ｎｇ）未満、４９ｎｇ未満、４８ｎｇ未満、４７ｎｇ未満、４６ｎｇ未満、４５ｎｇ未満、４４ｎｇ未満、４３ｎｇ未満、４２ｎｇ未満、４１ｎｇ未満、４０ｎｇ未満、３５ｎｇ未満、３０ｎｇ未満、２５ｎｇ未満、２０ｎｇ未満、１５ｎｇ未満、１０ｎｇ未満、５ｎｇ未満、２．５ｎｇ未満、１ｎｇ未満、０．５ｎｇ未満、０．１ｎｇ未満、０．０５ｎｇ未満、０．０１ｎｇ未満、０．００５ｎｇ未満、０．００１ｎｇ未満など）で、サンプルの検出及び分析について高い確度を提供し得る。そのような確度は、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９５．５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９６．５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９７．５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９８．５％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．９％、少なくとも約９９．９９％、少なくとも約９９．９９９％、または少なくとも約９９．９９９９％であってよい。
【０１０２】
本明細書に記載の方法及びシステムは、少ないインプット量の核酸（例えば、５０ｎｇ未満、４９ｎｇ未満、４８ｎｇ未満、４７ｎｇ未満、４６ｎｇ未満、４５ｎｇ未満、４４ｎｇ未満、４３ｎｇ未満、４２ｎｇ未満、４１ｎｇ未満、４０ｎｇ未満、３５ｎｇ未満、３０ｎｇ未満、２５ｎｇ未満、２０ｎｇ未満、１５ｎｇ未満、１０ｎｇ未満、５ｎｇ未満、２．５ｎｇ未満、１ｎｇ未満、０．５ｎｇ未満、０．１ｎｇ未満、０．０５ｎｇ未満、０．０１ｎｇ未満、０．００５ｎｇ未満、０．００１ｎｇ未満など）で、サンプルの検出及び分析について高い感度を提供し得る。そのような感度は、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９５．５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９６．５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９７．５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９８．５％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．９％、少なくとも約９９．９９％、少なくとも約９９．９９９％、または少なくとも約９９．９９９９％であってよい。
【０１０３】
本明細書に記載の方法及びシステムは、少ないインプット量の核酸（例えば、５０ｎｇ未満、４９ｎｇ未満、４８ｎｇ未満、４７ｎｇ未満、４６ｎｇ未満、４５ｎｇ未満、４４ｎｇ未満、４３ｎｇ未満、４２ｎｇ未満、４１ｎｇ未満、４０ｎｇ未満、３５ｎｇ未満、３０ｎｇ未満、２５ｎｇ未満、２０ｎｇ未満、１５ｎｇ未満、１０ｎｇ未満、５ｎｇ未満、２．５ｎｇ未満、１ｎｇ未満、０．５ｎｇ未満、０．１ｎｇ未満、０．０５ｎｇ未満、０．０１ｎｇ未満、０．００５ｎｇ未満、０．００１ｎｇ未満など）で、サンプルの検出及び分析について高い特異性を提供し得る。そのような特異性は、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９５．５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９６．５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９７．５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９８．５％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．９％、少なくとも約９９．９９％、少なくとも約９９．９９９％、または少なくとも約９９．９９９９％であってよい。
【０１０４】
ＶＩＩ．  用途
ａ．  がん及び他の疾患の診断
本明細書に記載の方法及びシステムは、がんまたは疾患を有するか、有すると疑われるか、またはそのリスクのある対象において、がんまたは疾患（例えば、認知症）を診断する際に有用であり得る。とりわけ、これらの方法、組成物、及びシステムは、がん細胞のシーケンシング及び特性決定によってがんを検出する際に有用である。
【０１０５】
本明細書の他の所で記載しているとおり、がん細胞は、充実性腫瘍から得るか、または循環腫瘍細胞として得てよい（まとめて、「がんサンプル」）。充実性腫瘍は、生がんサンプル、非保存がんサンプル、保存がんサンプル、防腐処置がんサンプル、包埋がんサンプル、固定がんサンプル、またはそれらの任意の組合せから得てよい。がんサンプルは、包埋されていて、さらに、保存、防腐処置、または固定されていてよい。一部の例では、がんサンプルは、包埋されていて、さらに固定されている。一部の例では、がんサンプルは、ホルムアルデヒド固定及びパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）されている。
【０１０６】
循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の分析は、がん患者におけるリアルタイム「液体生検」と考えられ、この生検は、ＣＴＣの特異的なサブ集団の特性決定をさらに可能にし、したがって、これは、がん診断において多大な有望性を持つ。しかしながら、ＣＴＣは非常に低い濃度（百万個の正常細胞の背景に１個のＣＴＣ）でしか生じず、それらの特定及び特性決定は、極めて高感度で特異的な分析法が必要であるので、ＣＴＣの検出は、技術的には困難なままである（その開示全体が、その全体で参照によって本明細書に組み込まれるＰａｎｔｅｌ  Ｋ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｈｏｒａｃｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅ、２０１２、４（５）：４４６〜４４７）。
【０１０７】
多くの核酸シーケンシング技術は、組織または他のサンプルから得られた細胞集団から、配列するＤＮＡを得る。細胞を典型的には、一緒に処理して、細胞集団の平均を表す遺伝子材料を抽出し、次いで、これを、所定のシーケンシング技術のために構成されるシーケンシングレディーＤＮＡライブラリ（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｒｅａｄｙ  ＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）に処理する。この処理以降、細胞特異的マーカーがないので、サンプル中の細胞サブセットまたはすべての細胞が寄与しているとおりの遺伝子材料の帰属は、そのようなアンサンブル手法では、実際に不可能である。
【０１０８】
特性を細胞集団の特定のサブセットに帰属させることができないことに加えて、そのようなアンサンブルサンプル調製法はまた、最初から、細胞のサンプル中の多量の構成成分を主に特定及び特性決定するように事前にしむけられていて、少量構成成分、例えば、サンプル中の全細胞うちの１種の細胞、僅かな細胞、または低いパーセンテージが寄与する遺伝子材料を拾い出すことができるようには設計されていない。
【０１０９】
対照的に、本明細書において提供する方法及びシステムは、個々または少数の核酸、例えば、循環腫瘍関連ＤＮＡを別々の反応容積またはパーティション（例えば、液滴）に分配または配分することができ、その中で、それらの核酸または核酸成分は、ビーズに放出可能に結合されているオリゴヌクレオチド中に含有されるプライマー配列（例えば、ランダムＮマー）によって初めに増幅され得る。さらに、この当初増幅プロセスの間に、固有の識別子（例えば、バーコード配列）を、それらの別々のパーティション中にあるサンプル核酸または核酸成分にカップリングさせてよい。
【０１１０】
本明細書の他の所で記載しているとおり、パーティションを発生させる際に、サンプル流、ビーズ流、もしくはそれらの両方の流速を調節することによって、またはチャネルジャンクションの形状寸法を変更することによって、所望のサンプル（またはターゲット核酸）／ビーズ占有率を有するパーティションを作成してよい。
【０１１１】
固有の識別子の適用と併せての、異なるサンプルまたは成分の別々の分配増幅によって、各サンプル成分の寄与率の保存、さらには、シーケンシングプロセスを介しての、それらの個々の起源（例えば、正常細胞、腫瘍細胞、循環腫瘍細胞など）への帰属が可能となる。一部の場合には、増幅プロセスの追加のラウンドを行ってよい。
【０１１２】
ｂ．  胎児異数性の特定
異数性は、染色体数が、特定の種に特有の数の正確な倍数ではない状態である。過剰か、または欠損した染色体は、ヒト先天性欠損を含む遺伝的障害の共通する原因である。例えば、ダウン症候群（ＤＳ）（本明細書では、「トリソミー２１」とも）は、染色体２１の第３コピーの全部または一部の存在に起因する遺伝的障害である。エドワーズ症候群（本明細書では、「トリソミー１８」とも）は、過剰な第１８番染色体の全部または一部の存在に起因する染色体障害である。パトー症候群、またはトリソミー１３は、身体の細胞の一部または全部が、染色体１３からの過剰な遺伝物質を含有する染色体異常に起因する症候群である。染色体異常を診断する従来の方法、例えば、絨毛採取及び羊水穿刺は、胎児と母体の両方に潜在的に重大なリスクを負わせ得る。母体血清マーカー及び超音波を使用する胎児異数性の非侵襲的スクリーニングが利用可能であるが、信頼性は非常に限定的である（その全開示があらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれるＦａｎら、ＰＮＡＳ、２００８、１０５（４２）：１６２６６〜１６２７１）。
【０１１３】
母体循環中に無細胞胎児核酸が存在するという最近の発見が、異数性についての非侵襲的出生前遺伝子検査の開発につながっている。母体血流中に自由に循環している胎児ＤＮＡである無細胞胎児ＤＮＡ（ｃｆｆＤＮＡ）は、胎盤を構成する栄養芽細胞に起源する。胎児ＤＮＡは、断片化されて、胎盤マイクロ粒子が母体血流へと流れることを介して、母体血流に移動する。しかしながら、母体ＤＮＡの高い背景によって、無細胞胎児ＤＮＡの分析による異数性の測定は、困難なままである。胎児ＤＮＡは多くの場合に、母体無細胞血漿中の全ＤＮＡの１０％未満を構成していると推定される。
【０１１４】
本明細書に記載の方法、組成物、及びシステムは、母体血液または他の体液中の無細胞胎児ＤＮＡをシーケンシング及び分析することによって胎児異数性を検出及び診断する際に有用である。コピー数多型を検出し、ハプロタイプをフェージングするための方法及びシステムは、その全開示があらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれる２０１４年６月２６日出願の米国特許仮出願第６２／０１７，８０８号において記載されている。
【０１１５】
例示的なプロセスでは、異なる起源または供給源を有する個々の、または少数の核酸（例えば、無細胞母体ＤＮＡ、無細胞胎児ＤＮＡなど）を、複数の反応容積、またはパーティション（例えば、液滴）に別々に分配してよい。その間に、各パーティションがビーズ及びサンプル核酸の両方を含有し得るように、放出可能に結合したオリゴヌクレオチドを有する複数のビーズを、同じ別々のパーティションに分配してよい。本明細書の他の所で記載しているとおり、サンプル流、ビーズ流、もしくはそれら両方の流速、またはチャネルジャンクションの形状寸法を変更することによって、各パーティションが一定数のサンプル、及び／またはオリゴヌクレオチド結合ビーズを含有し得るように、パーティションの占有率を調節してよい。加えて、パーティションの一定のパーセンテージが、１個以下のターゲットサンプル核酸（例えば、無細胞胎児ＤＮＡ）を含み得るように、分配プロセスを制御してもよい。例えば、一部の場合には、本明細書において提供するシステム及び方法の使用で、１個以下のターゲット核酸（例えば、無細胞胎児ＤＮＡ）を含有する占有されて生じるパーティション９０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、または５％未満を作成してよい。一部の場合には、占有パーティション全体のかなりのパーセンテージが、少なくとも１個のターゲットサンプル及び１個のビーズを含み得るように、分配プロセスを調節してよい。例えば、パーティションの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９９％がそのように占有されていてよい。一部の場合には、単一ターゲットサンプル及び単一ビーズを１個のパーティション内に供給することが望まれ得、パーティションの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９９％がそのように占有されてよい。
【０１１６】
パーティションを発生させた後に、所定のビーズに付随しているオリゴヌクレオチドをパーティションに放出して、所定のパーティション内で、１つまたは複数のターゲットサンプルに結合させてよい。オリゴヌクレオチドに含まれる共通バーコード配列及びランダムＮマーを使用して、サンプル配列の起源を特定し、当初増幅プロセスの間に、各所定のパーティション内で、サンプル配列の複数の断片をプライムしてよい。次いで、サンプルのこれらの当初増幅断片を貯留し、シーケンシングしてよい（例えば、本明細書の他の所に記載したものを含む、任意の適切なシーケンシング法を使用）。バーコードの同一性は、個々の断片からの配列読み取りデータを整理し、さらには、異なる遺伝的起源（例えば、染色体）を有する断片を識別するために役立ち得る。次いで、各染色体にマッピングされた配列数をカウントすることによって、胎児異数性が寄与する、母体血漿におけるいずれかの染色体の表示過剰または不足を検出する。
【０１１７】
ｃ．  法医学的用途
ＤＮＡプロファイリング（ＤＮＡ検査、ＤＮＡタイピング、または遺伝子指紋法とも呼ばれる）は、それらの個々のＤＮＡプロファイルによる個人の特定を援助するために、法医学者が使用する技術である。ＤＮＡプロファイルは、個人のＤＮＡ構成を反映する文字の暗号化セットであり、これを、個人の識別子として使用することもできる。ＤＮＡプロファイリングは、例えば、親子鑑定及び犯罪捜査において使用される。
【０１１８】
ＤＮＡプロファイリングでは、バリアブルナンバータンデムリピート（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ  ｔａｎｄｅｍ  ｒｅｐｅａｔｓ：ＶＮＴＲ）、とりわけ、ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）と呼ばれる高度に変異する反復（「リピート」）配列を使用する。ＶＮＴＲ遺伝子座は、近親のヒトの間では非常に似ているが、近親ではない個体が同じＶＮＴＲを有する可能性はほとんどないほど変異している。しかしながら、ヒトＤＮＡ配列のほぼ９９．９％は、どのヒトでも同じであり、かつ最も重要なことに、ターゲットＤＮＡは多くの場合に、大量の外部物質（例えば、環境汚染、犠牲者対加害者細胞、及び／または核酸）によって汚染されているので、従来の方法は、一貫した信頼可能な結果を提供することができなかった。
【０１１９】
本明細書に記載の方法、組成物、及びシステムは、多量の核酸サンプル中に少量存在する核酸の特性決定を可能にすることによって、法医学的分析における特異的なＤＮＡサンプルの特定に適用することができる。
【０１２０】
本明細書の他の所で記載しているとおり、遺伝物質（例えば、ＤＮＡ）を、法医学的証拠のミックス（例えば、血液染色液、組織などのミックス）から抽出してよい。次いで、各パーティションが少数のビーズ及び少量のＤＮＡサンプルのみを含み得るような制御プロセスによって、抽出されたＤＮＡサンプル、及び機能性オリゴヌクレオチドを担持する複数のビーズを、複数の反応容積またはパーティションに同時分配する。各パーティションが、異なる生体（例えば、被害者対加害者）からのゲノム物質のオーバーラッピング配列またはセグメントを含む可能性がないレベルで、パーティションにサンプル物質を供給することによって、別々の寄与サンプル核酸の処理及び検出、さらには、２つの異なる起源の間でのそのようなサンプル核酸の帰属を保証することができる。
【０１２１】
ビーズに結合されているオリゴヌクレオチドは、共通配列（例えば、バーコード配列）及びプライム配列（この場合には、ＤＮＡの特異的な領域をターゲットとするターゲットＮマー）を含んでよい。共通バーコード配列を使用して、サンプルを特定し、各所定のパーティション内でサンプルＤＮＡの特異的な領域をプライムする。当初増幅プロセスを各パーティション内で行って、増幅バーコード化配列を生成してよい。次いで、アンプリコンを貯留し、１つまたは複数の追加の増幅プロセス、続いて、最終増幅産物のシーケンシングに掛けてよい。本明細書の他の所で記載しているとおり、アンプリコンに含まれるバーコード配列を使用して、ＤＮＡ配列をそれらの個々の起源に帰属させてよい。ＶＮＴＲ、とりわけ、増幅配列のＳＴＲ遺伝子座を分析することによって、ターゲットＤＮＡが帰属する対象を特定してよい。
【０１２２】
ｄ．  環境検査
上記法医学的検査と同様に、環境サンプルの検査は多くの場合に、例えば、多数の異なる生体、生物学的成分、及び他の物質を含有する高度に不均一なサンプル内で特異的な生物有機体または成分を探すことを伴う。そのような場合に、本明細書に記載の方法及びシステムは、多量の成分が分析を圧倒することなく、例えば、核酸シーケンシングによって、様々な寄与成分の有利な特性決定をサンプルに提供する。そのような分析は、特定の病原体、標識生体、例えば、大腸菌型などについてのサンプルの調査を含んでよい。
【０１２３】
ｅ．  ミクロビオーム特性決定
本明細書に記載の組成物及び方法は、多量及び多様な微生物要素の集団の中で、他の方法では個々の集団メンバーの寄与率を容易に特定し得ない複数の個々の集団成分の特性決定、例えば、ミクロビオーム分析において有用であり得る。とりわけ、典型的なアンサンブルをベースとするシーケンシング手法は、集団のメンバー間の遺伝的構成における微妙な変化が分からないような、混合サンプル集団からの遺伝情報全体の平均または一致をもたらす傾向があり得る。そのような変化は、所定の集団またはミクロビオームの状態を特性決定する際に重要であるミクロビオームメンバーの異なる株、変異体、または種を規定し得る。
【０１２４】
例示的なプロセスでは、１個のパーティションが、出発集団の異なるメンバーからの核酸のオーバーラップ分を含む可能性がないように、細胞集団、例えば、ミクロビオームサンプルから抽出された遺伝物質（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡなど）を別々のパーティション（例えば、液滴）に分配してよい。一部の場合には、これを、そのようなオーバーラッピング配列が同時分配される確率が非常に低い濃度で、集団から抽出された核酸を提供することによって達成する。一部の態様では、これを、それらの核酸を特性決定するために、個々の細胞が、本明細書に記載のとおりに別々に分配され、処理されるように、全細胞を分配することによって達成してよい。放出可能に結合されているオリゴヌクレオチドを有するビーズを、同じパーティションセットに分配してよい。この場合も、各パーティションが、上記のとおり、一定数のビーズまたはターゲット核酸によって占有されていてもよいように、分配プロセスを制御してよい（例えば、サンプル流の制御された流速、ビーズ流の制御された流速、サンプル流及びビーズ流の両方の制御された流速、チャネルジャンクションの形状寸法の規定の構造など）。
【０１２５】
各パーティション内で、サンプルを、共通領域（例えば、バーコード配列）及び可変領域（例えば、ターゲットＮマーまたはランダムＮマー）を含む放出されたオリゴヌクレオチドで当初増幅させてよい。この当初増幅プロセスの後に、それぞれ個々のパーティション内の増幅配列を固有の識別子（すなわち、バーコード配列）でタグ付けしてもよく、その固有の識別子は、次の、例えば、シーケンシングプロセスの間に、生じた配列をそれらの個々のパーティションに帰属させ得る。サンプルを、そのサンプル起源に基づきそのパーティションに割り当てる場合には、それを続いて曝露する処理ステップにおいて、生じた配列をより良好に、特異的なサンプルに起源していると特定することができる。
【０１２６】
次いで、アンプリコンを貯留してよく、１つまたは複数の追加の増幅、続いて、最終増幅産物のシーケンシングに掛けてよい。結合している固有のバーコード配列に基づき、それぞれ生じた配列のサンプル起源を特定し得る。
【０１２７】
ＶＩＩＩ．  コンタミネーションのフィルタリング
非サンプル核酸での核酸サンプルのコンタミネーションは、そのような分析（例えば、配列アセンブリ）へのエラーの導入を含む、シーケンシングデータ分析を複雑にし得る異質なシーケンシング読み取りデータのランダムな生成をもたらし得る。核酸コンタミネーションは一般に、問題の核酸サンプルに由来しない核酸（例えば、「ジャンク」核酸）とみなされ得る。一部の場合には、そのようなコンタミネーションが相対的に低いレベルで存在しても、配列分析の品質及び確度に対して強い影響を有し得る。
【０１２８】
本明細書に記載の方法、組成物、及びシステムは、相対的に低いレベルのそのようなコンタミネーションを含む、核酸コンタミネーションから生成されたシーケンシング読み取りデータ（例えば、核酸またはそのコピーのバーコード化断片で決定される配列）を特定する際に有用であり得る。一部の場合には、そのような核酸コンタミネーションが、相対的に低いレベルで、例えば、サンプル中の全核酸の５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、１％未満、０．１％未満、０．０１％未満、０．００１％未満、０．０００１％未満、または０．００００１％未満で存在する場合に、コンタミネーティングシーケンシング読み取りデータの１つまたは複数の特定及び除去によって、または特定可能なシーケンシング読み取りデータから特定不可能なシーケンシング読み取りデータを消去することによって、本明細書に記載の方法、システム、及び組成物を、コンタミネーション核酸に由来する核酸（例えば、ＤＮＡ）シーケンシング読み取りデータをフィルタリング除去するために使用することができる。
【０１２９】
一態様では、本開示は、核酸配列を分析するための方法を提供する。上記方法は、核酸サンプルから生成した核酸分子を含むパーティション（例えば、ウェル、チューブ、マイクロまたはナノウェル、スルーホール、流動液滴（例えば、油中水型エマルション内の水性液滴））を得ることを含む。核酸分子を、パーティションから核酸混合物に貯留することができ、次いで、その核酸混合物を、核酸シーケンシングに掛けて、核酸分子の核酸配列を含むシーケンシング読み取りデータを生成することができる。プログラムコンピュータプロセッサ（例えば、本明細書に記載のコンピュータ制御システム例のプログラムコンピュータプロセッサなど）を使用して、シーケンシング読み取りデータを分析することができ、存在する場合には、少なくとも１つのコンタミナント読み取りデータ（例えば、核酸混合物中のコンタミナント核酸分子に関連）を特定することができる。特定したら、コンタミナント読み取りデータを、シーケンシング読み取りデータから除去することができ、核酸サンプルの配列を、残りのシーケンシング読み取りデータから生成する。一部の場合には、複数のコンタミナント読み取りデータ（例えば、同じコンタミナント核酸分子に関連するか、または異なるコンタミナント核酸分子に関連する）を特定し、核酸サンプルの配列を生成する前に除去する。
【０１３０】
上記で考察したとおり、核酸混合物中のコンタミナント核酸分子の量は、核酸混合物中の核酸分子の全量と比較して、相対的に低くてよい。例えば、核酸混合物中のコンタミナント核酸分子の量は、核酸混合物中の核酸分子の全量の５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、０．５％未満、０．１％未満、０．０５％未満、０．０１％未満、０．００５％未満、０．００１％未満、０．００５％未満、０．００１％未満、０．０００５％未満、０．０００１％未満、０．００００５％未満、０．００００１％未満、０．０００００５％未満、０．０００００１％未満、０．００００００５％未満、０．００００００１％未満、またはそれ未満であってよい。
【０１３１】
一部の実施形態では、シーケンシング読み取りデータのサブセットの中の配列オーバーラップ（複数可）を決定し、かつシーケンシング読み取りデータの所定の１つでのオーバーラップ（複数可）が、サブセットのすべてに関しての閾値未満であれば、コンタミナント読み取りデータと特定することによって、コンタミナント読み取りデータを特定することができる。一部の実施形態では、シーケンシング読み取りデータのサブセットの中の配列オーバーラップ（複数可）を決定し、かつシーケンシング読み取りデータの所定の１つでのオーバーラップ（複数可）が、サブセットのすべてに関して５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、０．１％未満、０．０５％未満、０．０１％未満、０．００５％未満、０．００１％未満、０．０００５％未満、０．０００１％未満、またはそれ未満であれば、コンタミナント読み取りデータと特定することによって、コンタミナント読み取りデータを特定することができる。一部の実施形態では、シーケンシング読み取りデータのサブセットの中の配列オーバーラップ（複数可）を決定し、かつシーケンシング読み取りデータの所定の１つが、サブセットのすべてに関してオーバーラップしなければ、コンタミナント読み取りデータと特定することによって、コンタミナント読み取りデータを特定することができる。
【０１３２】
一部の実施形態では、配列読み取りデータを参照と比較し、かつ所定のシーケンシング読み取りデータが閾値未満で参照とオーバーラップすれば、配列読み取りデータの所定の配列読み取りデータをコンタミナント読み取りデータと特定することによって、コンタミナント読み取りデータを特定することができる。一部の実施形態では、配列読み取りデータを参照と比較し、かつ所定のシーケンシング読み取りデータが５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、０．１％未満、０．０５％未満、０．０１％未満、０．００５％未満、０．００１％未満、０．０００５％未満、０．０００１％未満、またはそれ未満で参照とオーバーラップすれば、配列読み取りデータの所定の配列読み取りデータをコンタミナント読み取りデータと特定することによって、コンタミナント読み取りデータを特定することができる。一部の実施形態では、配列読み取りデータを参照と比較し、かつ配列読み取りデータの所定の１つが参照とオーバーラップしなければ、コンタミナント読み取りデータと特定することによって、コンタミナント読み取りデータを特定することができる。
【０１３３】
一部の実施形態では、配列読み取りデータを相互に比較して、シーケンシング読み取りデータ中の配列オーバーラップ（複数可）を特定し、かつシーケンシング読み取りデータ中の他のシーケンシング読み取りデータとのその配列オーバーラップが閾値未満であれば、配列読み取りデータの所定の配列読み取りデータをコンタミナント読み取りデータと特定することによって、コンタミナント読み取りデータを特定することができる。一部の実施形態では、配列読み取りデータを相互に比較して、シーケンシング読み取りデータ中の配列オーバーラップ（複数可）を特定し、かつシーケンシング読み取りデータ中の他のシーケンシング読み取りデータとのその配列オーバーラップが５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、０．１％未満、０．０５％未満、０．０１％未満、０．００５％未満、０．００１％未満、０．０００５％未満、０．０００１％未満、またはそれ未満であれば、配列読み取りデータの所定の配列読み取りデータをコンタミナント読み取りデータと特定することによって、コンタミナント読み取りデータを特定することができる。一部の実施形態では、配列読み取りデータを相互に比較して、シーケンシング読み取りデータ中の配列オーバーラップ（複数可）を特定し、かつその配列がシーケンシング読み取りデータ中の他のシーケンシング読み取りデータの配列とオーバーラップしなければ、配列読み取りデータの所定の配列読み取りデータをコンタミナント読み取りデータと特定することによって、コンタミナント読み取りデータを特定することができる。
【０１３４】
一部の実施形態では、配列読み取りデータをそれらの個々の配列領域（複数可）にマッピングし、かつその配列領域（複数可）にマッピングした場合の所定の配列読み取りデータが、それらの配列領域（複数可）にマッピングした場合の他の配列読み取りデータの閾数未満とオーバーラップしたら、配列読み取りデータの所定の配列読み取りデータをコンタミナント読み取りデータと特定することによって、コンタミナント読み取りデータを特定することができる。一部の実施形態では、配列読み取りデータをそれらの個々の配列にマッピングし、かつその配列領域（複数可）にマッピングした場合の所定の配列読み取りデータが、それらの配列領域（複数可）にマッピングした場合の配列読み取りデータのうちの５０未満の他の読み取りデータ、配列読み取りデータのうちの４５未満の他の読み取りデータ、配列読み取りデータのうちの４０未満の他の読み取りデータ、配列読み取りデータのうちの３５未満の他の読み取りデータ、配列読み取りデータのうちの３０未満の他の読み取りデータ、配列読み取りデータのうちの２５未満の他の読み取りデータ、配列読み取りデータのうちの２０未満の他の読み取りデータ、配列読み取りデータのうちの１９未満の他の読み取りデータ、配列読み取りデータのうちの１８未満の他の読み取りデータ、配列読み取りデータのうちの１７未満の他の読み取りデータ、配列読み取りデータのうちの１６未満の他の読み取りデータ、配列読み取りデータのうちの１５未満の他の読み取りデータ、配列読み取りデータのうちの１４未満の他の読み取りデータ、配列読み取りデータのうちの１３未満の他の読み取りデータ、配列読み取りデータのうちの１２未満の他の読み取りデータ、配列読み取りデータのうちの１１未満の他の読み取りデータ、配列読み取りデータのうちの１０未満の他の読み取りデータ、配列読み取りデータのうちの９未満の他の読み取りデータ、配列読み取りデータのうちの８未満の他の読み取りデータ、配列読み取りデータのうちの７未満の他の読み取りデータ、配列読み取りデータのうちの６未満の他の読み取りデータ、配列読み取りデータのうちの５未満の他の読み取りデータ、配列読み取りデータのうちの４未満の他の読み取りデータ、配列読み取りデータのうちの３未満の他の読み取りデータ、配列読み取りデータのうちの２未満の他の読み取りデータ、配列読み取りデータのうちの１つ未満の他の読み取りデータとオーバーラップするか、配列読み取りデータのうちの他の読み取りデータのいずれともオーバーラップしなければ、配列読み取りデータの所定の配列読み取りデータをコンタミナント読み取りデータと特定することによって、コンタミナント読み取りデータを特定することができる。
【０１３５】
本明細書の他の所で記載しているとおり、核酸サンプルを断片化し、その断片を例えば、エマルションの液滴などに分配することができる（例えば、図４において示されているとおり）。各液滴中で、例えば、図３に関する増幅反応などにおいて、かつ本明細書の他の所で記載するとおりに、分配された断片のバーコード化断片またはそのコピーを生成することができる。次いで、バーコード化断片またはそのコピーをシーケンシングして、バーコード化断片読み取りデータを生成することができ、次いでこれを、より大きな配列にアセンブルすることができる。コンタミナント核酸分子（複数可）が核酸サンプル、及び／またはバーコード化断片を生成するパーティション中に存在する場合には、コンタミナント核酸分子（複数可）に対応するバーコード化断片またはそのコピーも生成し得る。そのようなコンタミナントバーコード化断片またはそのコピーもシーケンシングされ得て、異質なシーケンシング読み取りデータを配列分析に導入する。そのような異質なシーケンシング読み取りデータは、核酸サンプルの配列分析を妨害し、かつ／またはそれにエラーを導入し得る。本明細書において提供する方法は、コンタミナント核酸分子に由来するバーコード化断片またはそのコピーから生成されたバーコード化読み取りデータを除去するために有用であり得る。したがって、一部の実施形態では、核酸サンプルから生成した核酸分子を含むパーティションを得ることは、例えば、本明細書に記載の方法などによって、核酸分子のそれぞれに対応するバーコード化断片またはそのコピーを生成することを含み得る。さらに、生成したシーケンシング読み取りデータは、バーコード化断片またはそのコピーの核酸配列を含むバーコード化断片読み取りデータを含み得る。
【０１３６】
核酸サンプルが、ゲノム核酸サンプルである場合には、配列読み取りデータと、ゲノムの既知の隣接部分の配列を含む別の配列読み取りデータとでオーバーラップがないこと（例えば、共通の既知か、または顕著な配列に対するマッピング可能性）を使用して、配列読み取りデータを、コンタミナント配列読み取りデータと特定することができる。しかし一部の場合には、構造変異体（例えば、コピー数多型、挿入、欠失、転座、反転、再編成、リピート伸長、重複）または他の遺伝的変異（例えば、一塩基多型）の場合においてなど、シーケンシング読み取りデータは、ゲノムの既知の隣接部分に連結されないが、なお、連結される配列領域にマッピングすることが可能である（例えば、配列領域間の有意なバーコードオーバーラップによって立証されるとおり）。構造変異体及び他の遺伝的変異を決定する方法及びシステムの例は、例えば、その出願のそれぞれが、あらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれる２０１４年６月２６日出願の米国特許仮出願第６２／０１７，８０８号、及び２０１４年１０月２９日出願の米国特許仮出願第６２／０７２，２１４号において提供されている。
【０１３７】
したがって、所定の配列読み取りデータを、別段にはゲノムの既知の隣接部分に連結されないコンタミナント読み取りデータと特定するために、所定の配列読み取りデータがマッピングする配列領域間の共通バーコード配列に適切な閾値を設定することができる。例えば、所定のバーコード化断片読み取りデータがマッピングする配列領域が、配列領域にマッピング可能な全バーコード化断片読み取りデータの５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１９％未満、１８％未満、１７％未満、１６％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、０．１％未満、０．０５％未満、０．０１％未満、０．００５％未満、０．００１％未満、０．０００５％未満、０．０００１％未満、またはさらにそれ未満の配列領域間に、共通バーコード配列を有するバーコード化断片をマッピングすれば、バーコード化断片読み取りデータの所定の１つをコンタミナント読み取りデータと特定することによって、コンタミナント読み取りデータを特定することができる。
【０１３８】
配列コンストラクションからコンタミナント読み取りデータを除去すると、核酸サンプルの配列を生成する際に改善された確度が生じ得る。例えば、コンタミナント読み取りデータを特定し、かつそれを、核酸サンプルの配列の生成から除去することによって、配列を少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．９％、少なくとも９９．９９％、少なくとも９９．９９９％、少なくとも９９．９９９９％、またはそれより高い確度で生成することができる。
【０１３９】
ＩＸ．  コンピュータ制御システム
本開示は、本明細書において提供する方法、例えば、核酸シーケンシング（例えば、低インプット／少量の核酸の核酸シーケンシング）、得られたシーケンシングデータの分析及び解釈（例えば、本明細書に記載の用途において、例えば、診断疾患の検出、胎児異数性の特定、法医学的用途、ミクロビオーム特性決定、環境検査においてのものを含む）、及び／または配列アセンブリ前か、またはその間のコンタミネーティングシーケンシング読み取りデータの特定及びフィルタリングのための方法などを実施するためにプログラミングされているか、または別段に構成されているコンピュータシステムを提供する。そのようなコンピュータシステムの例を図５において示す。図５において示されているとおり、コンピュータシステム５０１は、シングルコアもしくはマルチコアプロセッサ、または別々の処理のための複数のプロセッサであってよい中央処理装置（ＣＰＵ、本明細書では、「プロセッサ」及び「コンピュータプロセッサ」とも）５０５を含む。コンピュータシステム５０１はまた、メモリまたはメモリロケーション５１０（例えば、ランダムアクセスメモリ、リードオンリーメモリ、フラッシュメモリ）、電子ストレージユニット５１５（例えば、ハードディスク）、１つまたは複数の他のシステムと通信するためのコミュニケーションインターフェース５２０（例えば、ネットワークアダプタ）、及び周辺デバイス５２５、例えば、キャッシュ、他のメモリ、データストレージ、及び／または電子ディスプレイアダプタを含む。メモリ５１０、ストレージユニット５１５、インターフェース５２０、及び周辺デバイス５２５は、コミュニケーションバス（実線）、例えば、マザーボードを介して、ＣＰＵ５０５に通信している。ストレージユニット５１５は、データを記憶するためのデータストレージユニット（またはデータリポジトリ）であってよい。コンピュータシステム５０１を、コミュニケーションインターフェース５２０を用いて、コンピュータネットワーク（「ネットワーク」）５３０に動作的にカップリングすることができる。ネットワーク５３０は、Ｉｎｔｅｒｎｅｔ、インターネット、及び／またはエクストラネット、もしくはイントラネット、及び／またはＩｎｔｅｒｎｅｔと通信しているエクストラネットであってよい。ネットワーク５３０は、一部の場合には、電気通信、及び／またはデータネットワークである。ネットワーク５３０は、クラウドコンピューティングなどの分散型コンピューティングを可能にし得る１つまたは複数のコンピュータサーバーを含んでよい。コンピュータシステム５０１を用いる一部の場合には、ネットワーク５３０は、コンピュータシステム５０１にカップリングされたデバイスがクライアントまたはサーバーとして機能することを可能にし得るピア・トゥ・ピアネットワークを実行することができる。
【０１４０】
ＣＰＵ５０５は、プログラムまたはソフトウェアに組み入れられ得るマシンリーダブルインストラクションの数列を実行することができる。インストラクションは、メモリ５１０などのメモリロケーションに記憶されていてよい。ＣＰＵ５０５によって実行される動作の例には、フェッチ、デコード、エクスキュート、及びライトバックが含まれ得る。ストレージユニット５１５は、ファイル、例えば、ドライバ、ライブラリ、及び保存プログラムを記憶し得る。ストレージユニット５１５は、ユーザーデータ、例えば、ユーザー選択及びユーザープログラムを記憶し得る。コンピュータシステム５０１は、一部の場合には、コンピュータシステム５０１の外部にある、例えば、イントラネットまたはＩｎｔｅｒｎｅｔを介してコンピュータシステム５０１と通信している遠隔サーバーに位置しているような１つまたは複数の追加のデータストレージユニットを含み得る。コンピュータシステム５０１は、ネットワーク５３０を介して、１つまたは複数の遠隔コンピュータシステムと通信し得る。例えば、コンピュータシステム５０１は、ユーザー（例えば、オペレーター）の遠隔コンピュータシステムと通信し得る。遠隔コンピュータシステムの例には、パーソナルコンピュータ（例えば、ポータブルＰＣ）、スレートまたはタブレットＰＣ（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰａｄ（登録商標）、Ｓａｍｓｕｎｇ（登録商標）Ｇａｌａｘｙ  Ｔａｂ）、電話、スマートフォン（例えば、Ａｐｐｌｅ(登録商標）ｉＰｈｏｎｅ（登録商標）、Ａｎｄｒｏｉｄ利用可能なデバイス、Ｂｌａｃｋｂｅｒｒｙ（登録商標））、または携帯情報端末が含まれる。ユーザーは、ネットワーク５３０を介してコンピュータシステム５０１にアクセスすることができる。
【０１４１】
本明細書に記載のとおりの方法を、コンピュータシステム５０１の電子ストレージロケーション、例えば、メモリ５１０または電子ストレージユニット５１５などに記憶されているマシン（例えば、コンピュータプロセッサ）実行可能なコードによって実行することができる。マシン実行可能かまたはマシンリーダブルなコードは、ソフトウェアの形態で提供することができる。使用中に、プロセッサ５０５によってコードは実行され得る。一部の場合には、コードは、ストレージユニット５１５から検索されて、プロセッサ５０５がすぐに利用できるようにメモリ５１０に記憶され得る。一部の状況では、電子ストレージユニット５１５を排除することができ、マシン実行可能なインストラクションは、メモリ５１０に記憶される。コードを事前コンパイルし、コードを実行するためにアレンジされたプロセッサを有するマシンで使用するために構成することができるか、または操作時間中にコンパイルすることができる。事前コンパイルされるか、またはコンパイルされたまま（ａｓ−ｃｏｍｐｉｌｅｄ）の様式でコードを実行することを可能にするように選択することができるプログラミング言語で、コードを供給することができる。
【０１４２】
コンピュータシステム５０１などの、本明細書において提供するシステム及び方法の態様を、プログラミングで具体化することができる。技術の様々な態様を、典型的にはマシンリーダブル媒体の１種で実行または具体化されるマシン（またはプロセッサ）実行可能なコード、及び／または関連データの形態の「プロダクト」または「製品」として考えてよい。マシン実行可能なコードは、電子ストレージユニット、そのようなメモリ（例えば、リードオンリーメモリ、ランダムアクセスメモリ、フラッシュメモリ）またはハードディスクに記憶させることができる。「記憶」型の媒体には、コンピュータ、プロセッサなどの実体的なメモリ、またはそれらの関連モジュール、例えば、ソフトウェアプログラミングのためにいつでも非一時的記憶を供給し得る様々な半導体メモリ、テープドライブ、ディスクドライブなどのいずれか、またはすべてが含まれ得る。ソフトウェアの全部または一部を時々、Ｉｎｔｅｒｎｅｔまたは様々な他の電気通信ネットワークを介して通信することができる。そのような通信は、例えば、あるコンピュータまたはプロセッサから別のものに、例えば、管理サーバーまたはホストコンピュータからアプリケーションサーバーのコンピュータプラットホームにソフトウェアをロードすることを可能にし得る。したがって、ソフトウェア要素を担ってよい媒体の別の種類には、ワイヤオプティカルランドラインネットワーク（ｗｉｒｅｄ  ａｎｄ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｌａｎｄｌｉｎｅ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ）を介して、かつ様々なエアリンクでローカルデバイス間の物理的インターフェースで使用されるような光波、電波、及び電磁波が含まれる。そのような波を運ぶ物理的要素、例えば、ワイヤリンクまたはワイヤレスリンク、オプティカルリンクなどを、ソフトウェアを担う媒体と考えてもよい。本明細書において使用する場合、非一時的有形「記憶」媒体に限定しない限り、コンピュータまたはマシン「リーダブル媒体」などの用語は、実行のためにプロセッサにインストラクションを与えることに関係する任意の媒体を指す。
【０１４３】
したがって、コンピュータ実行可能なコードなどのマシンリーダブル媒体は、これらだけに限定されないが、有形記憶媒体、搬送波媒体、または物理的伝送媒体を含む多くの形態を取ってよい。非揮発性記憶媒体には、例えば、光学ディスクまたは磁気ディスク、例えば、任意のコンピュータ（複数可）中の記憶デバイスのいずれかなどが含まれる。揮発性記憶媒体には、そのようなコンピュータプラットフォームのメインメモリなどのダイナミックメモリが含まれる。有形伝送媒体には、同軸ケーブル；コンピュータシステム内にバスを含むワイヤを含む、銅ワイヤ及び光ファイバーが含まれる。搬送波伝送媒体は、電気もしくは電磁シグナル、または無線周波（ＲＦ）及び赤外（ＩＲ）データ通信中に生成されるものなどの音波もしくは光波の形態を取ってよい。したがって、コンピュータリーダブル媒体の共通形態には、例えば：フロッピー（登録商標）ディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、任意の他の磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、もしくはＤＶＤ−ＲＯＭ、任意の他の光学媒体、パンチカードペーパーテープ、ホールパターンを有する任意の他の物理的記憶媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭ、及びＥＰＲＯＭ、フラッシュ−ＥＰＲＯＭ、任意の他のメモリチップもしくはカートリッジ、データもしくはインストラクションを運搬する搬送波、そのような搬送波を運搬するケーブルもしくはリンク、またはコンピュータがプログラミングコード及び／またはデータを読み取ることできる任意の他の媒体が含まれる。コンピュータリーダブル媒体のこれらの形態の多くが、１つまたは複数のインストラクションの１つまたは複数の数列を、実行のためにプロセッサに運搬することに関係してよい。
【０１４４】
コンピュータシステム５０１は、例えば、コンピュータシステム５０１にカップリングされた核酸シーケンシング機器のアウトプットまたは読出しを提示するためのユーザーインターフェース（ＵＩ）を含み得る電子ディスプレイ５３５を含むか、またはそれと通信し得る。そのような読出しには、核酸シーケンシング読出し、例えば、所定の核酸サンプルの核酸塩基の配列が含まれ得る。ＵＩを、そのような読出しを使用する分析、及びそのような分析に付随する任意の統計データの結果を表示するために使用してもよい。ＵＩの例には、限定ではないが、グラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）及びウェブベースのユーザーインターフェースが含まれる。電子ディスプレイ５３５は、コンピュータモニター、または容量性もしくは抵抗膜方式タッチスクリーンであり得る。
【実施例】
【０１４５】
Ｘ．実施例
実施例１：  無細胞胎児ＤＮＡを分析することによる、異数性のスクリーニング
無細胞胎児ＤＮＡ８％未満を含有する血液サンプルを妊婦から採取する。無細胞血漿ＤＮＡを、その血液サンプルから抽出する。次いで、抽出された無細胞ＤＮＡサンプルを、放出可能な機能性オリゴヌクレオチドに結合したビーズと共に、複数の液滴に同時分配する。各液滴内で、ＤＮＡサンプルは、放出されたオリゴヌクレオチドによって増幅される。次いで、アンプリコンを貯留し、追加の増幅プロセス、続いて、増幅産物の分析及びシーケンシングに掛ける。パーティション内でＤＮＡサンプルに結合した固有のバーコードによって、生じた配列を、それらの個々の遺伝的起源（例えば、染色体）に帰属させることができる。次いで、各染色体にマッピングされた配列の数をカウントすることによって、異数体胎児が寄与する、母体血漿におけるいずれかの染色体の表示過剰または不足を検出する。
【０１４６】
実施例２：  循環腫瘍関連ＤＮＡを検出することによる、がん患者における転移進行のモニタリング
循環腫瘍細胞１％未満を含む血液サンプルを、転移性前立腺がんの患者から採取し、血液サンプルから血漿ＤＮＡを単離する。次いで、各パーティションが１つ以下の個々のターゲットＤＮＡを含有するように、予め決定しておいたサンプル／パーティション比で、抽出したＤＮＡサンプルを多数の反応容積またはパーティションに分配する。次いで、分配したＤＮＡサンプルを、（１）放出可能に連結されているオリゴヌクレオチドタグを有する多数のビーズを、パーティションに分配して、サンプル−ビーズ混合物を形成すること、（２）バーコード配列及びランダムＮマー配列を含む機能性オリゴヌクレオチドをパーティションに放出すること、（３）各パーティション内で、サンプルをランダムＮマーで増幅させること、及び（４）アンプリコンをシーケンシングし、各アプリコンに含まれる固有のバーコード配列に基づき、配列読み取りデータを分析することを含む複数の処理ステップに掛ける。次いで、腫瘍患者の血液中の循環腫瘍関連ＤＮＡの濃度を、対照の濃度と比較する。循環腫瘍関連ＤＮＡ収量の上昇は、がんのさらなる進行を示す。
【０１４７】
実施例３：  リボソームＤＮＡシーケンシングによる、環境細菌分離株の大コレクションの分析
細菌分離株のコレクションを環境供給源から採取し、検査する。ＤＮＡを、各分離株から抽出し、各パーティションが特定の分離株に起源するＤＮＡサンプルを含有するように、複数の反応容積またはパーティションに分配する。次いで、固有のバーコード配列及び１６ｓ  ｒＤＮＡプライマーを含む機能性オリゴヌクレオチドに結合した複数のビーズをパーティションに添加して、各パーティション内で、ＤＮＡサンプルとの混合物を形成する。次いで、各パーティション中の抽出ＤＮＡサンプルを、汎用１６ｓ  ｒＤＮＡプライマーで増幅させる。次いで、増幅産物をシーケンシングし、データベースにおいて利用可能なものと比較する。種のレベルでの特定は、データベース中のプロトタイプ株の配列のものとの≧９９％の配列類似性と定義し、属のレベルでの特定は、データベース中のプロトタイプ株の配列のものとの≧９７％の配列類似性と定義する。シーケンシング情報を使用して、細菌分離株コレクション内の各株のパーセンテージを決定する。
【０１４８】
実施例４：  細胞核酸の分析
Ｑｉａｇｅｎ  Ｈｉｇｈ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  ＭａｇＡｔｔｒａｃｔ  ＤＮＡ  Ｋｉｔを使用して、ゲノムＤＮＡを複数の細胞系（ＮＡ１２８７８、ＮＡ１２８７７、ＮＡ１２８８２、ＮＡ２０８４７）から抽出する。ゲノムＤＮＡを、Ｑｕｂｉｔシステムを使用して定量し、３種の異なるＤＮＡの出発物質をエマルションの液滴に分配するような濃度に滴定する：バーコード化ビーズと共に、２．４ｎｇ、１．２ｎｇ、または０．６ｎｇ。図４において示されていて、かつ本明細書の他の所で記載した手法と同様の手法で、バーコード化シーケンシングライブラリをエマルション液滴中で調製し、エマルションを壊し、液滴内容物を貯留し、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（Ｈｕｍａｎ  Ｖ５）を使用するハイブリッドキャプチャーによって、シーケンシングライブラリを富化する。ライブラリを約１６０Ｘのオンターゲットシーケンシング深度までシーケンシングする。Ｌｏｎｇ  Ｒａｎｇｅｒソフトウェアを使用して、変異呼出を行う。簡単には、シーケンシング読み取りデータを、ＢＷＡ  ＭＥＭを使用してアラインさせ、位置によってソートし、ＰＣＲ重複をマークし、次いで、Ｆｒｅｅｂａｙｅｓソフトウェアパッケージを、呼び出されたＳＮＰ、小さな挿入、及び欠失に対して使用する。サンプルを、以前に樹立しておいたグランドトゥルースに対して、ＳＮＰ、挿入、及び欠失の感度及び陽性的中率（ＰＰＶ）について特性決定する。ＳＮＰでは、感度及びＰＰＶは両方とも＞９５％であり、挿入及び欠失では、ＰＰＶは＞９０％であり、感度は＞７０％である。
【０１４９】
本発明の好ましい実施形態を本明細書において示し、記載してきたが、そのような実施形態が単なる例として提示されていることは、当業者には明白であろう。本発明が、明細書内で提示されている具体的な例によって限定されることは意図されていない。本発明を、上述の明細書を参照して記載してきたが、本明細書における実施形態の記載及び説明は、限定的な意味において、解釈されることを意図したものではない。本発明から逸脱することなく、当業者には、多数の変形、変化、及び置換が思い浮かぶであろう。さらに、本発明のすべての態様が、本明細書において記述した具体的な描写、構成、または相対的割合に限定されず、それらが、様々な条件及び変項に左右されることを理解されたい。本明細書に記載の本発明の実施形態に対する様々な代案を、本発明の実施において使用してもよいことを理解すべきである。したがって、本発明は、任意のそのような代案、変更、変形、または同等の案にも及び得ることが企図されている。下記の特許請求の範囲は、本発明の範囲を規定し、かつこれらの特許請求の範囲内の方法及び構造、ならびにそれらの同等の案は、本発明によってカバーされることが意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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