(57)【要約】  Ｄ−エリトロースおよびアセチルリン酸の生成方法であって、ホスホケトラーゼを使用することによる、Ｄ−フルクトースのＤ−エリトロースおよびアセチルリン酸への酵素的変換を含む生成方法について記載される。生成したＤ−エリトロースは、グリコールアルデヒドの生成方法であって、アルドラーゼを使用することによる、Ｄ−エリトロースのグリコールアルデヒドへの酵素的変換を含み、前記アルドラーゼが２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．４）またはフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．１３）である、生成方法により、グリコールアルデヒドにさらに変換されうる。生成したグリコールアルデヒドは、ホスホケトラーゼまたはスルホアセトアルデヒドアセチルトランスフェラーゼを使用することによる、このように生成したグリコールアルデヒドのアセチルリン酸への酵素的変換により、アセチルリン酸に最終的に変換されうる。
2017516475.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｄ−エリトロースおよびアセチルリン酸の生成方法であって、ホスホケトラーゼを使用することによる、Ｄ−フルクトースのＤ−エリトロースおよびアセチルリン酸への酵素的変換を含む生成方法。
【請求項２】
前記ホスホケトラーゼが、
（ａ）ホスホケトラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．９）または
（ｂ）フルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．２２）
である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
グリコールアルデヒドの生成方法であって、アルドラーゼを使用することによる、Ｄ−エリトロースのグリコールアルデヒドへの酵素的変換を含み、前記アルドラーゼが２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．４）またはフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．１３）である、生成方法。
【請求項４】
Ｄ−フルクトースからのグリコールアルデヒドおよびアセチルリン酸の生成方法であって、
（ａ）請求項１または２に記載の方法による、Ｄ−フルクトースからのＤ−エリトロースおよびアセチルリン酸の生成
を含み；
（ｂ）請求項３に記載の方法による、このように生成した前記Ｄ−エリトロースのグリコールアルデヒドへの酵素的変換
をさらに含む生成方法。
【請求項５】
アセチルリン酸の生成方法であって、
（ａ）請求項３または４に記載の方法による、グリコールアルデヒドの生成
を含み；
（ｂ）ホスホケトラーゼまたはスルホアセトアルデヒドアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．３．３．１５）を使用することによる、このように生成した前記グリコールアルデヒドのアセチルリン酸への酵素的変換
をさらに含む生成方法。
【請求項６】
前記ホスホケトラーゼが、
（ｉ）ホスホケトラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．９）、または
（ｉｉ）フルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．２２）
である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
グルコース−フルクトースイソメラーゼを使用することによる、Ｄ−グルコースの前記Ｄ−フルクトースへの酵素的変換をさらに含む、請求項１、２および４から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記グルコース−フルクトースイソメラーゼがキシロースイソメラーゼ（ＥＣ  ５．３．１．５）である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
Ｄ−フルクトースからのアセチルリン酸の生成のための、
（ｉ）ホスホケトラーゼ；および
（ｉｉ）２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．４）またはフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．１３）
を発現する生物または微生物の使用。
【請求項１０】
前記生物または微生物が、
Ｄ−グルコースからのアセチルリン酸の生成のための、
（ｉｉｉ）フルクトース−グルコースイソメラーゼ
をさらに発現する、請求項９に記載の生物または微生物の使用。
【請求項１１】
（ｉ）Ｄ−フルクトース；および
（ｉｉ）ホスホケトラーゼ；
ならびに場合によって
（ｉｉｉ）２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．４）もしくはフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．１３）
または
（ｉ）Ｄ−エリトロース；および
（ｉｉ）２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．４）もしくはフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．１３）；
ならびに場合によって
（ｉｉｉ）ホスホケトラーゼもしくはスルホアセトアルデヒドアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．３．３．１５）；
または
（ｉ）Ｄ−グルコース；
（ｉｉ）グルコース−フルクトースイソメラーゼ；および
（ｉｉｉ）ホスホケトラーゼ；
ならびに場合によって
（ｉｖ）２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．４）もしくはフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．１３）
を含む組成物。
【請求項１２】
（ｉ）Ｄ−フルクトース；ならびに
（ｉｉ）ホスホケトラーゼを発現するか、ホスホケトラーゼおよび２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．４）を発現するか、ホスホケトラーゼおよびフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．１３）を発現する生物もしくは微生物；
または
（ｉ）Ｄ−エリトロース；ならびに
（ｉｉ）２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．４）を発現するか、フルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．１３）を発現するか、２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．４）、およびホスホケトラーゼもしくはスルホアセトアルデヒドアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．３．３．１５）を発現するか、フルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．１３）、およびホスホケトラーゼもしくはスルホアセトアルデヒドアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．３．３．１５）を発現する生物もしくは微生物；
または
（ｉ）Ｄ−グルコース；および
（ｉｉ）グルコース−フルクトースイソメラーゼを発現し、かつホスホケトラーゼを発現し、かつ場合によって、２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．４）もしくはフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．１３）を発現する生物もしくは微生物
を含む組成物
【請求項１３】
Ｄ−フルクトースからのＤ−エリトロースおよび／またはアセチルリン酸の生成のための、ホスホケトラーゼの使用、またはホスホケトラーゼを発現する生物もしくは微生物の使用。
【請求項１４】
Ｄ−エリトロースからのグリコールアルデヒドの生成のための、２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．４）の使用、または２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．４）もしくはフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．１３）を発現する生物もしくは微生物の使用。
【請求項１５】
アセチル−ＣｏＡの生成方法であって、
（ａ）請求項１、２および５から８のいずれか一項に記載の方法によるアセチルリン酸の生成；
を含み、
（ｂ）補酵素Ａ（ＣｏＡ）存在下でホスホトランスアセチラーゼを使用することによる、このように生成した前記アセチルリン酸のアセチル−ＣｏＡへの酵素的変換
をさらに含む生成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｄ−エリトロースおよびアセチルリン酸の生成方法であって、ホスホケトラーゼを使用することによる、Ｄ−フルクトースのＤ−エリトロースおよびアセチルリン酸への酵素的変換を含む生成方法に関する。生成したＤ−エリトロースは、グリコールアルデヒドの生成方法であって、アルドラーゼを使用することによる、Ｄ−エリトロースのグリコールアルデヒドへの酵素的変換を含み、前記アルドラーゼが２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．４）またはフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．１３）である、生成方法によりグリコールアルデヒドにさらに変換されうる。生成したグリコールアルデヒドは、ホスホケトラーゼまたはスルホアセトアルデヒドアセチルトランスフェラーゼを使用することによる、このように生成したグリコールアルデヒドのアセチルリン酸への酵素的変換により、アセチルリン酸に最終的に変換されうる。
【背景技術】
【０００２】
過去数十年間、代謝工学の専門家は、化学物質を生成するための生物的な解決策を探索し、それによってより伝統的な化学的プロセスの代替となるものを提供しようと努めてきた。一般的には、生物的解決策は、再生可能な原料（例えば糖）の利用を可能にし、石油化学ベースの既存のプロセスと競合する。化学物質を生成するための複数ステップの生物的解決策は、典型的には、原料を目標分子に変換する触媒として微生物を含む。特定の目標分子を生成するための酵素反応の完全なセットは、中心炭素経路に属するものと産物特異的経路に属するものとに分類可能である。中心炭素経路および産物特異的経路に属する反応は、各酵素反応の酸化還元的（典型的には、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ）およびエネルギー的（典型的には、ＡＴＰ）制約が、プロセスの優位性に寄与する全体の均衡において満たされていなければならないという点で関連している。歴史的には、糖を摂取して成長する従属栄養生物の中心炭素経路は、エムデンマイヤーホフパルナス経路（ＥＭＰＰ；すなわち「解糖系」）、ペントースリン酸経路（ＰＰＰ）、エントナードウドロフ経路（ＥＤＰ）およびホスホケトラーゼ経路（ＰＫＰ）（Gottschalk (1986), Bacterial Metabolism, 2nd Edition, Springer-Verlag, New Yorkを参照のこと）として記載されてきた。各中心経路または中心経路の組み合わせは、特定の目標分子に関して利点および欠点を呈する。優位なバイオプロセスを提供するために、ＥＭＰＰ、ＰＰＰおよびＥＤＰに関する改変を有する組換え微生物が記載されてきた（M. Emmerling et al., Metab. Eng. 1:117 (1999)；L. O. Ingram et al., Appl. Environ. Microbiol. 53: 2420 (1987)；C. T. Trinh et al., Appl. Environ. Microbiol. 74:3634 (2008)）。より最近では、ＰＫＰに関する改変を有する組換え微生物が記載されている（Sonderegger et al. Appl. Environ. Microbiol. 70 (2004), 2892-2897、米国特許第７，２５３，００１号明細書、Chinen et al. J. Biosci. Bioeng. 103 (2007), 262-269、米国特許第７，７８５，８５８号明細書；Fleige et al., Appl. Microbiol. Cell Physiol. 91 (2011), 769-776を参照のこと）。
【０００３】
ＥＭＰＰ（解糖系）は、グルコース１ｍｏｌをピルビン酸（ＰＹＲ）２ｍｏｌに変換する。アセチル−ＣｏＡが求められる場合、ＰＹＲ１ｍｏｌがアセチル−ＣｏＡ（ＡｃＣｏＡ）１ｍｏｌに変換され、ＣＯ２１ｍｏｌおよびＮＡＤＨ１ｍｏｌが同時に発生しうる。反応の概要は、方程式１で与えられる。
グルコース＋２ＡＤＰ＋２Ｈ３ＰＯ４＋２ＣｏＡ＋４ＮＡＤ＋→
２アセチル−ＣｏＡ＋２ＣＯ２＋２ＡＴＰ＋２Ｈ２Ｏ＋４ＮＡＤＨ＋４Ｈ＋
（方程式１）
【０００４】
ＰＰＰは、グルコース１ｍｏｌをＣＯ２１ｍｏｌおよびＮＡＤＰＨ２ｍｏｌに変換し、フルクトース−６−リン酸（Ｆ６Ｐ）０．６７ｍｏｌおよびグリセルアルデヒド−３−リン酸（ＧＡＰ）０．３３ｍｏｌが同時に発生する手段をもたらす。このように形成されたＦ６ＰおよびＧＡＰは、その他の反応経路、例えばＥＭＰＰにより代謝されなければならない。ＥＤＰは、グルコース１ｍｏｌをＧＡＰ１ｍｏｌおよびＰＹＲ１ｍｏｌに変換し、ＮＡＤＰＨ１ｍｏｌが同時に発生する。ＰＰＰと同様に、このように形成されたＧＡＰはその他の反応経路により代謝されなければならない。ＰＫＰはグルコース１ｍｏｌをＧＡＰ１ｍｏｌおよびアセチルリン酸（ＡｃＰ）１．５ｍｏｌに変換する手段をもたらす。アセチル−ＣｏＡが求められる場合、１当量のＡｃＰおよび１当量の補酵素Ａ（ＣｏＡ）が、ホスホトランスアセチラーゼの作用により１当量のアセチル−ＣｏＡおよび１当量の無機リン酸（Ｐｉ）に変換されうる。
【０００５】
ＰＫＰにより発生するＡｃＣｏＡ部分に由来し、ＡｃＣｏＡ部分に酸化還元中性度（redox neutrality）が近い特定の目標分子については、全体のエネルギー均衡を欠いている。ＰＫＰでは（ＰＰＰおよびＥＤＰも同様に）、グルコースのグルコース−６−リン酸への変換においてＡＴＰが発生しない。ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）依存性のグルコース取り込みの場合、ＰＥＰをその他の手段、例えばＥＭＰＰによって発生させなければならない。ＰＫＰによるＧＡＰの再利用により、特に産物特異的経路がほとんどＡＴＰを産生しない場合、事態は悪化する。
【０００６】
Sonderegger（前に引用）および米国特許第７，２５３，００１号明細書は、グルコース／キシロース混合物のエタノールへの変換における収量を増加させるように、過剰発現させたホスホトランスアセチラーゼとともに、天然のまたは過剰発現させたホスホケトラーゼ活性を含む、組換えサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）株について開示している。これらの株は、ＥＭＰＰおよびＰＰＰの両方が作用する、ＰＥＰ−非依存性のグルコース取り込みを特徴とする。
【０００７】
Chinen（前に引用）および米国特許第７，７８５，８５８号明細書は、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−プロリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−システイン、コハク酸およびポリヒドロキシ酪酸からなる群を含む、中間体アセチル−ＣｏＡを経て生成する目標分子にグルコースを変換する、増大したホスホケトラーゼ活性を含む腸内細菌（Enterobacteriaceae）科、コリネ型細菌およびバチルス（Bacillus）細菌からなる群から選択される組換え細菌について開示している。これらの株は、ＥＭＰＰが作用する、ＰＥＰ−依存性のグルコース取り込みを特徴とする。特に、米国特許第７，７８５，８５８号明細書の細菌におけるホスホフルクトキナーゼ活性は、野生型または非改変株と比較して低下する（３３ページを参照のこと）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
酵素反応の酸化還元的およびエネルギー的制約に最も良好に対処し、それにより、多くの生物、具体的には再生可能な資源から数多くの産業上重要な化合物を生成するために使用可能な微生物の異化における、最も中心的な代謝物の１つであるアセチル−ＣｏＡの前駆体をエネルギー的に効率良く生成することにより、原料の産物への変換を最大にする、中心炭素経路および産物特異的経路を含む方法を提供する必要性がある。出願者は、特許請求の範囲において定義される実施形態を提供することにより、この必要性に取り組んできた。
【０００９】
さらに、バイオテクノロジー分野においては、アセチル−ＣｏＡの前駆体をエネルギー的に効率良く生成する必要性だけでなく、エリスリトールおよびその前駆体であるＤ−エリトロースを生成する必要性もある。エリスリトールは、食品および医薬品産業において使用される生物的甘味料として使用される、四炭素ポリオールである。エリスリトールは、糖尿病および肥満の人々のための特別食において、機能性の糖代用品としても使用される。さらに、エリスリトールは、虫歯を引き起こす細菌により発酵されないため、食品における非う食性甘味料として安全に使用可能である。エリスリトールは、その他の糖の生成のための出発物質としても機能する。エリスリトールは、ニッケル触媒存在下で高温での化学反応によりジアルデヒドデンプンがエリスリトールに変換される化学的プロセスによって生成可能であるが、この化学的プロセスは収量が低いため工業化に至らなかった。したがって、現時点では、エリスリトールは主に好浸透圧性酵母を使用して微生物的方法により商業的に生成している。エリスリトールは人気が増加しつつあり、食品産業における需要が増加している。したがって、大量のエリスリトール、特に、生物的プロセスを使用することによりその前駆体を生成することがますます重要になりつつある。Ｄ−エリトロースはエリスリトールの直接の前駆体であり、下記の通りエリスリトールに容易に変換可能である；Moon et al., Appl Microbiol. Biotechnol, 86:1017-1025 (2010)を参照のこと。したがって、エリスリトールの前駆体であるＤ−エリトロースを生成する必要性が増大している。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、Ｄ−エリトロースおよびアセチルリン酸の生成方法であって、ホスホケトラーゼを使用することによる、Ｄ−フルクトースおよびリン酸のＤ−エリトロースおよびアセチルリン酸への酵素的変換を含む生成方法を提供する。次いで、アセチル−ＣｏＡの前駆体である生成したアセチルリン酸は、有益なことには、以下にさらに記載の通りアセチル−ＣｏＡに変換され、生成したＤ−エリトロースは当技術分野で既知の酵素を利用する方法により、エリスリトールに変換されうる。実際、真核生物は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−依存性還元反応によりエリスリトールを生じる、エリトロースの還元を触媒するエリトロースレダクターゼを含む；Moon et al., Appl Microbiol. Biotechnol, 86:1017-1025 (2010)を参照のこと。
【００１１】
生成したＤ−エリトロースは、グリコールアルデヒドの生成方法であって、アルドラーゼを使用することによる、Ｄ−エリトロースのグリコールアルデヒドへの酵素的変換を含み、前記アルドラーゼが２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼまたはフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼである、生成方法により、グリコールアルデヒドにさらに変換されうる。生成したグリコールアルデヒドは、ホスホケトラーゼまたはスルホアセトアルデヒドアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．３．３．１５）を使用することによる、このように生成したグリコールアルデヒドのアセチルリン酸への酵素的変換により、アセチルリン酸に最終的に変換されうる。Ｄ−グルコースから出発すると、上記Ｄ−フルクトースが、グルコース−フルクトースイソメラーゼを使用することによる、Ｄ−グルコースのＤ−フルクトースへの酵素的変換により得られる。対応する反応を図１に図式的に示す。したがって、上記方法を行うことによりアセチルリン酸が生成し、次いでこれがホスホトランスアセチラーゼによりアセチル−ＣｏＡに変換され、次いで代謝物、例えば、アセチル−ＣｏＡ由来のアルケンまたはアセトンなどを生成するために有益に使用されうる。アセチル−ＣｏＡ生成のための上記の人工の代謝経路には、アセチルリン酸（したがってアセチル−ＣｏＡ）の収量が、天然の代謝経路と比較して増加するという利点がある。これは、最終的に、基質としてグルコースから出発すると、アセチル−ＣｏＡが３分子（ＡＴＰを消費することなく）生成するが、天然に存在するＥＭＭＰ経路（解糖系）ではアセチル−ＣｏＡが２分子しか生じないためである。
【００１２】
したがって、一態様において、本発明は、Ｄ−エリトロースおよびアセチルリン酸の生成方法であって、反応:
Ｄ−フルクトース＋リン酸→Ｄ−エリトロース＋アセチルリン酸＋Ｈ２Ｏ
による、ホスホケトラーゼを使用することによる、Ｄ−フルクトースおよびリン酸のＤ−エリトロースおよびアセチルリン酸への酵素的変換を含む生成方法に関する。
【００１３】
本発明者は、驚くべきことに、ホスホケトラーゼに分類される酵素が、上記反応に従って、Ｄ−フルクトースおよびリン酸のＤ−エリトロースおよびアセチルリン酸への酵素的変換を触媒することができることを発見した。非リン酸化型Ｄ−フルクトースがホスホケトラーゼの基質となることは知られていなかったため、このことは驚くべきことである。
【００１４】
様々な種類のホスホケトラーゼが知られており、それら全てが本発明による方法において使用可能である。一般的に、ホスホケトラーゼは、それらの天然における触媒反応での基質選択性に基づき、２種類に分類される：ＥＣ  ４．１．２．９に分類され、基質としてキシルロース−５−リン酸（Ｘ５Ｐ）およびフルクトース−６−リン酸（Ｆ６Ｐ）を天然に使用するが、Ｘ５Ｐをより好むキシルロース−５−リン酸（Ｘ５Ｐ）ホスホケトラーゼ、ならびに４．１．２．２２に分類され、Ｘ５ＰおよびＦ６Ｐ両方を基質として同等の活性で使用可能であるＸ５Ｐ／フルクトース−６−リン酸（Ｆ６Ｐ）ホスホケトラーゼ（Suzuki et al., J. Biol. Chem. 44 (2010), 34279-34287）。以下では、「ホスホケトラーゼ」という語は常に両方の種類を指す。
【００１５】
したがって、Ｘ５Ｐホスホケトラーゼは、ＥＣ  ４．１．２．９に分類され、以下の反応を触媒することができる酵素である：
Ｄ−キシルロース−５−リン酸＋リン酸→Ｄ−グリセルアルデヒド−３−リン酸＋アセチルリン酸＋Ｈ２Ｏ
【００１６】
ＥＣ  ４．１．２．２２に分類されるもう一方の種類のホスホケトラーゼは、一般的にフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼと称され、以下の反応：
Ｄ−フルクトース−６−リン酸＋リン酸→アセチルリン酸＋Ｄ−エリトロース４−リン酸＋Ｈ２Ｏ
を天然に触媒することができる。
【００１７】
ホスホケトラーゼが両方の種類のホスホケトラーゼに割り当てられる場合、例えば、ニトロランセトゥス・ホランディクス（Nitrolancetus hollandicus）Ｌｂ由来のホスホケトラーゼの場合、または同定されたホスホケトラーゼが２種類のいずれにも未だ割り当てられておらず、一般的にホスホケトラーゼに分類されているのみである場合もある。「ホスホケトラーゼ」という語は、本明細書ではこれらのホスホケトラーゼも指す。
【００１８】
したがって、本発明による方法の一実施形態において、Ｄ−フルクトースおよびリン酸のＤ−エリトロースおよびアセチルリン酸への酵素的変換は、ＥＣ  ４．１．２．９のホスホケトラーゼに分類されるホスホケトラーゼを使用することにより実現される。この酵素は様々な生物、特に細菌および菌類などの微生物で確認されている。好ましい一実施形態において、ホスホケトラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．９）は原核生物、好ましくは細菌由来である。この酵素は、例えば、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ｑ８８Ｓ８７；Ｑ８８Ｕ６７)、ラクトバチルス・ペントーサス（Lactobacillus pentosus）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ｑ９３７Ｆ６）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ａ０ＰＡＤ９）、ビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクティス（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ｑ９ＡＥＭ９）、ブチロビブリオ・フィブリソルベンス （Butyrovibrio fibrisolvens）、フィブロバクター・インテスティナリス（Fibrobacter intestinalis）、フィブロバクター・スクシノゲネス（Fibrobacter succinogenes）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）、オエノコッカス・オエニ（Oenococcus oeni）、スタルケヤ・ノベラ（Starkeya novella）、チオバチルス属の種（Thiobacillus sp.）、サーモビスポラ・ビスポラ（Thermobispora bispora）（株ＡＴＣＣ  １９９９３／ＤＳＭ４３８３３／ＣＢＳ１３９．６７／ＪＣＭ１０１２５／ＮＢＲＣ１４８８０／Ｒ５１；Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｄ６ＹＡＤ９）、サーモバキュラム・テレヌム（Thermobaculum terrenum）（株ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−７９８／ＹＮＰ１；Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｄ１ＣＩ６３）およびニトロランセトゥス・ホランディクス（Nitrolancetus hollandicus）Ｌｂ（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｉ４ＥＪ５２）に存在することが記載されている。
【００１９】
別の好ましい実施形態において、ホスホケトラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．９）は真核生物、好ましくは菌類、例えばＳ・セレビシア（S. cerevisia）などの酵母由来である。この酵素は、例えば、エメリセラ・ニデュランス（Emericella nidulans）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ｑ５Ｂ３Ｇ７）、メタリジウム・アニソプリエ（Metarhizium anisopliae）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ｃ１Ｋ２Ｎ２）、キャンディダ・ボイディニ（Candida boidinii）、キャンディダ・クルバタ（Candida curvata）、キャンディダ・ファマータ（Candida famata）、キャンディダ・フミコラ（Candida humicola）、キャンディダ・パラプシロシス（Candida parapsilosis）、キャンディダ・パラプシロシス（Candida parapsilosis）ＮＣＹＣ９２６、キャンディダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、サイバリンドネラ・ジャディニ（Cyberlindnera jadinii）、サイバリンドネラ・サツルヌス（Cyberlindnera saturnus）、デバロマイセス・ロベルトシエ（Debaromyces robertsiae）、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）、クリベロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）、クリベロマイセス・ファゼオロスポラス（Kluyveromyces phaseolosporus）、リポマイセス・スターケイ（Lipomyces starkeyi）、オガタエ・アングスタ（Ogataea angusta）、パキソレン・タンノフィラス（Pachysolen tannophilus）、プリセオマイセス・メディウス（Priceomyces medius）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ロドスピリジウム・トルロイデス（Rhodospiridium toruloides）、ロドトルラ・グルチニス（Rhodotorula glutinis）、ロドトルラ・グラミニス（Rhodotorula graminis）、ペニシリウム・クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）、トリコスポロン・クタネウム（Trichosporon cutaneum）およびヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）に存在することが記載されている。
【００２０】
ホスホケトラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．９）の酵素活性は、当業者に既知の方法で評価可能である。このような方法は、例えば、Meile et al. (J. Bacteriol. 183 (2001), 2929-2936)およびSuzuki et al (Acta Cryst. F66 (2010), 941-943)に記載されている。
【００２１】
ホスホケトラーゼ（上記の通りそれぞれ、キシルロース  ５−リン酸ホスホケトラーゼおよびフルクトース  ６−リン酸ホスホケトラーゼと一般的に称されるＥＣ  ４．１．２．９およびＥＣ  ４．１．２．２２）は、構造的にも機能的にも十分に規定されている。例えば、ＥＣ  ４．１．２．９およびＥＣ  ４．１．２．２２のホスホケトラーゼの代表例として、Petrareanu et al. (Acta Crystallographica F66 (2010), 805-807)は、基質としてのキシルロース  ５−リン酸およびフルクトース  ６−リン酸の両方に対し活性であることが示された酵素である、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）由来のキシルロース−５−リン酸ホスホケトラーゼのＸ線結晶解析について記載している。
【００２２】
本発明による方法の別の実施形態において、Ｄ−フルクトースおよびリン酸のＤ−エリトロースおよびアセチルリン酸への酵素的変換は、ＥＣ  ４．１．２．２２のフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼに分類されるホスホケトラーゼを使用することにより実現される。この酵素は、様々な生物、特に細菌および菌類などの微生物で確認されている。好ましい一実施形態において、フルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．２２）は原核生物、好ましくは細菌由来である。この酵素は、例えば、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（Bifidobacterium adolescentis）、ビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクティス（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ｑ９ＡＥＭ９）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム（Bifidobacterium pseudolongum）、特にビフィドバクテリウム・シュードロンガム亜種グロボサム（Bifidobacterium pseudolongum subsp. globosum）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）、ビフィドバクテリウム・デンティウム（Bifidobacterium dentium）、ビフィドバクテリウム・モンゴリエンス（Bifidobacterium mongoliense）、ビフィドバクテリウム・ボンビ（Bifidobacterium bombi）、カプリアビダス・ネカトール（Cupriavidus necator）、ガードネレラ・バジナリス（Gardnerella vaginalis）、グルコンアセトバクター・キシリナス（Gluconacetobacter xylinus）、ラクトバチルス・パラプランタラム（Lactobacillus paraplantarum）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）およびニトロランセトゥス・ホランディクス（Nitrolancetus hollandicus）Ｌｂ（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｉ４ＥＪ５２）に存在することが記載されている。
【００２３】
別の好ましい実施形態において、フルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．２２）は真核生物、好ましくは菌類、例えばＳ・パストリアヌス（S. pastorianus）などの酵母由来である。この酵素は、例えば、キャンディダ属の種（Candida sp.）、キャンディダ属の種（Candida sp.）１０７、キャンディダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、ロドトルラ・グルチニス（Rhodotorula glutinis）、ロドトルラ・グラミニス（Rhodotorula graminis）およびサッカロマイセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）に存在することが記載されている。
【００２４】
この酵素は、構造的にも機能的にも十分に規定されている。例えば、Suzuki et al. (Acta Crystallographica F66 (2010), 941-943；J. Biol. Chem. 285 (2010), 34279-34287)は、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）由来のホスホケトラーゼの過剰発現、結晶化およびＸ線解析について記載している。ビジフォバクテリウム・ラクティス（Bidifobacterium lactis）由来のキシルロース−５−リン酸／フルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼをコードする遺伝子が、例えばMeile et al. (J. Bacteriol. 183 (2001), 2929-2936)に記載されている。
【００２５】
フルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．２２）の酵素活性は、当業者に既知の方法で評価可能である。このような方法は、例えば、Meile et al. (J. Bacteriol. 183 (2001), 2929-2936)およびSuzuki et al. (Acta Cryst. F66 (2010), 941-943)に記載されている。
【００２６】
ＥＣ  ４．２．１．９またはＥＣ  ４．２．１．２２に未だ分類されておらず、本発明による方法において使用可能であるその他のホスホケトラーゼは、例えば、サーモシネコッカス・エロンガトゥス（Thermosynechococcus elongatus）（株ＢＰ−１；Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ｑ８ＤＪＮ６）由来のホスホケトラーゼ、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）３６Ｄ１（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ｇ２ＴＩＬ０）由来のホスホケトラーゼ、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス（Lactococcus lactis subp. lactis）（株ＫＦ１４７；Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ａ９ＱＳＴ６）由来のホスホケトラーゼ、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム亜種グロボサム（Bifidobacterium pseudolongum subsp. globosum）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ｑ６Ｒ２Ｑ６）由来のホスホケトラーゼ、およびクロストリジウム・アセトブチリクム（Clostridium acetobutylicum）（株ＡＴＣＣ  ８２４；Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ｑ９７ＪＥ３；Servisky et al. (J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 39 (2012), 1859-1867)；配列番号２)由来のホスホケトラーゼである。
【００２７】
添付の実施例において、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム亜種グロボサム（Bifidobacterium pseudolongum subsp. globosum）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ｑ６Ｒ２Ｑ６；配列番号１）、クロストリジウム・アセトブチリクム（Clostridium acetobutylicum）（株ＡＴＣＣ  ８２４；Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ｑ９７ＪＥ３；配列番号２）およびラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス（Lactococcus lactis subp. lactis）（株ＫＦ１４７；Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ａ９ＱＳＴ６；配列番号３）のホスホケトラーゼが、Ｄ−フルクトースおよびリン酸をＤ−エリトロースおよびアセチルリン酸に変換できることが示される。
【００２８】
好ましい実施形態において、本発明の方法において使用されるホスホケトラーゼは、配列番号１〜３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するか、配列番号１〜３のいずれか１つに対し少なくともｘ％相同なアミノ酸配列を示し、かつホスホケトラーゼ活性を有し、ここで、ｘは３０〜１００の間の整数、好ましくは３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９であり、このような酵素は、本明細書で上記に示す通り、Ｄ−フルクトースおよびリン酸をＤ−エリトロースおよびアセチルリン酸に変換することができる。好ましくは、同一性の程度は、各配列を上記の配列番号のいずれか１つのアミノ酸配列と比較することにより決定される。比較される配列が同じ全長でない場合、同一性の程度は、好ましくは、より長い配列中のアミノ酸残基と同一である、より短い配列中のアミノ酸残基のパーセンテージ、またはより短い配列中のアミノ酸残基と同一である、より長い配列中のアミノ酸残基のパーセンテージのいずれかを指す。配列同一性の程度は、当技術分野で周知の方法により、好ましくはＣＬＵＳＴＡＬなどの適切なコンピュータアルゴリズムを使用して決定可能である。
【００２９】
特定の配列が、例えば、参照配列に対し８０％同一であるかどうかを決定するためＣｌｕｓｔａｌ解析法を使用する場合、デフォルト設定を使用してもよく、または設定を好ましくは以下の通りにする：アミノ酸配列の比較においては、マトリクス：ｂｌｏｓｕｍ３０；オープンギャップペナルティ：１０．０；伸長ギャップペナルティ：０．０５；ディレイディバージェント（Delay divergent）：４０；ギャップ分離距離（Gap separation distance）：８。ヌクレオチド配列の比較においては、伸長ギャップペナルティが好ましくは５．０に設定される。
【００３０】
好ましくは、同一性の程度は配列の全長にわたって算出される。
【００３１】
ホスホケトラーゼ配列の多重アラインメントにより、高度に保存されたいくつかの領域が示され、これらの領域のうち２つが、ホスホケトラーゼのシグネチャーパターンとして使用されることが記載されている（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｓｉｔｅ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ＰＤＯＣ６０００２）。第１のシグネチャーパターンはＥ−Ｇ−Ｇ−Ｅ−Ｌ−Ｇ−Ｙであり、第２のシグネチャーパターンはＧ−ｘ（３）−［ＤＮ］−ｘ−Ｐ−ｘ（２）−［ＬＩＶＦＴ］−ｘ（３）−［ＬＩＶＭ］−ｘ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｅである。第１のシグネチャーパターンの機能は未だ不明であるが、第２のシグネチャーパターンはチアミンピロリン酸結合部位に相当する。したがって、好ましい実施形態において、本明細書で上記に定義されるホスホケトラーゼは、上記２つのシグネチャーパターンのうち少なくとも１つ、好ましくは少なくとも第２のシグネチャーパターン、さらにより好ましくは両方のシグネチャーパターンを含むアミノ酸配列を有する。
【００３２】
配列の比較により、様々な起源のホスホケトラーゼ間の全体の配列同一性が、約２６％と低い場合があることが示されている。例えば、Meile et al. (J. Biol. Chem. 183 (2001), 2929-2936)は、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis）のＤ−キシルロース  ５−リン酸／Ｄ−フルクトース  ６−リン酸ホスホケトラーゼ遺伝子（ｘｆｐ）が、その他の生物のゲノムにおける配列に対し２６％〜５５％の同一性を示したことを報告している。
【００３３】
選択されたホスホケトラーゼが、Ｄ−フルクトースおよびリン酸のＤ−エリトロースおよびアセチルリン酸への変換を触媒することができるかどうかは、例えば、添付の実施例に示すアッセイにより評価可能である。
【００３４】
「リン酸」という語は、本発明の方法に関して、Ｄ−フルクトースおよびリン酸のＤ−エリトロースおよびアセチルリン酸への変換方法において使用される酵素のための、リン酸供給源として許容される化合物を指す。リン酸、すなわちＨ３ＰＯ４の形態でリン酸を用意することが可能である。しかし、その他の形態、特に、水素原子のうち１つ、２つまたは３つが、ナトリウムイオンなどのその他のイオンで置き換えられたリン酸（Ｈ３ＰＯ４）塩も想定可能である。
【００３５】
ホスホケトラーゼはチアミン二リン酸依存性酵素である、すなわち補因子としてチアミン二リン酸（ＴｈＤＰまたはＴＰＰとも称される）が必要である。したがって、本発明による方法において、反応中にＴＰＰを供給することが有利である。さらに、一部のホスホケトラーゼには、補因子としてＭｇ２＋またはＣａ２＋などのイオンが必要である。このような場合、本発明による方法は、上記の変換中にこのようなイオンが存在することも含む。
【００３６】
ホスホケトラーゼによるＤ−フルクトースおよびリン酸の上記変換の産物、すなわちＤ−エリトロースおよびアセチルリン酸は、目的の化合物にさらに変換されうる重要な代謝物である。アセチルリン酸の目的の化合物へのさらなる変換については、これより下に記載する。
【００３７】
以下で、Ｄ−エリトロースの変換、特に、第１の態様における、最終的にアセチルリン酸２分子をさらに生じるＤ−エリトロースの変換についてさらに記載する。この文脈において、Ｄ−エリトロース１分子をグリコールアルデヒド２分子に変換させる方法が提供される。したがって、別の態様において、本発明は、グリコールアルデヒドの生成方法であって、アルドラーゼを使用することによる、Ｄ−エリトロース１分子のグリコールアルデヒド２分子への酵素的変換を含む方法にも関する。適切なアルドラーゼの例は、２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．４）およびフルクトース-ビスリン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．１３）である。
【００３８】
本発明者は、驚くべきことに、アルドラーゼ、例えば２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．４）またはフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．１３）を、Ｄ−エリトロース１分子をグリコールアルデヒド２分子に変換するのに使用することができることを発見した。これらの酵素により天然に触媒される反応は全く異なるものであり、リン酸化基質を伴い、これらの酵素が、Ｄ−エリトロースをグリコールアルデヒドに変換するために、基質としてＤ−エリトロースを使用できることは知られていなかったため、この発見は驚くべきものである。
【００３９】
２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．４）に分類されるアルドラーゼは、デオキシリボース−リン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．４）とも称され、以下の反応を触媒する酵素である：
【００４０】
【化１】
2017516475.tif 000003
【００４１】
この酵素はリアーゼ、具体的にはアルデヒドリアーゼのグループに属し、炭素−炭素結合を切断する。この酵素クラスの系統名は、２−デオキシ−Ｄ−リボース−５−リン酸アセトアルデヒドリアーゼ（Ｄ−グリセルアルデヒド−３−リン酸形成性）である。この酵素はしばしば、ホスホデオキシリボアルドラーゼ、デオキシリボアルドラーゼ、デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ、２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼおよび２−デオキシ−Ｄ−リボース−５−リン酸アセトアルデヒドリアーゼとも称される。この酵素はペントースリン酸経路に関与する。
【００４２】
２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．４）は様々な生物、特に細菌などの微生物で確認されている。好ましい一実施形態において、２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．４）は、原核生物、好ましくは細菌由来である。この酵素は、例えば、大腸菌（Escherichia coli）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ｐ０Ａ６Ｌ０）、アエロピュルム・ペルニクス（Aeropyrum pernix）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ｑ９Ｙ９４８）、枯草菌（Bacillus subtilis）、クレブシエラ・ブチリカス（Klebsiella butylicus）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ａ２ＢＬＥ９）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受入番号：Ｑ７ＷＴ４４）、パエニバチルス属の種（Paenibacillus sp.）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ｃ７Ｅ７１９）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受入番号：Ｑ９ＡＩＰ７）、サーモコッカス・コダカラエンシス（Thermococcus kodakarensis）（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受入番号：Ｑ８７７Ｉ０）およびエルシニア属の種（Yersinia sp）ＥＡ０１５（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ｃ０ＬＳＫ９）に存在することが記載されている。
【００４３】
別の好ましい実施形態において、２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．４）は真核生物由来である。この酵素は、例えば、ウシ（Bos Taurus）およびヒト（Homo sapiens）に存在することが記載されている。
【００４４】
さらに、２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．４）は、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）（株ＨＢ８）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ｑ５ＳＪ２８）、クロストリジウム・アセトブチリクム（Clostridium acetobutylicum）（株ＡＴＣＣ  ８２４）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ｑ９７ＩＵ５）、アセトバクター属の種（Acetobacter sp.）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ｒ５Ｑ５Ｋ８）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）（株ＡＴＣＣ  ７００３９６）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ｑ５ＦＬＺ２）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）（株ウシＲＦ１２２）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ｑ２ＹＵＵ４）、バクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ｋ１ＧＴＰ０）、アセトバクテリウム・ウッディ（Acetobacterium woodii）（株ＡＴＣＣ  ２９６８３）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ｈ６ＬＦＹ１）、ストレプトコッカス・ゴルドニ（Streptococcus gordonii）（株Ｃｈａｌｌｉｓ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ａ８ＡＸ５９）、シェワネラ・オネイデンシス（Shewanella oneidensis）（株ＭＲ−１）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ｑ８ＥＨＫ４）、ネオサルトリア・フミガタ（Neosartorya fumigata）(アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）)（株ＡＴＣＣ  ＭＹＡ−４６０９）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ａ４Ｄ９Ｇ０）およびハイパーサーマス・ブチリカス（Hyperthermus butylicus）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ａ２ＢＬＥ９）でも確認されている。
【００４５】
２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．４）の酵素活性は、当業者に既知の方法で評価可能である。このような方法は、例えば、DeSantis et al., Biorg. Med. Chem. 11: 43-52 (2003)およびSakuraba et al., Appl. Environ. Microbiol. 73: 7427-7434 (2007)に記載されている。そこに記載される通り、２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼの酵素活性は、例えば、２−デオキシリボース−５−リン酸切断（逆アルドール）アッセイまたはアルドール縮合（アルドール）アッセイにより評価可能である。
【００４６】
２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．４）は、構造的にも機能的にも十分に規定されている。例えば、Heine et al. (J. Mol. Biol. (2004) 343: 1019-1034)は、分解能０．９９ÅでのＳｅ−Ｍｅｔ多波長異常分散（ＭＡＤ）法により、大腸菌（E. coli）の細菌性クラスＩ  ２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼの結晶構造について記載している。Heine et al.およびその中の文献は、一次配列解析から予測される通り、大腸菌（E.coli）由来の２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼが、典型的なＴＩＭ（α/β）８バレルフォールドを示すことを記載している。アルドラーゼに見られるＴＩＭβ／αバレルからなる構造ドメインは、ＩｎｔｅｒＰｒｏにおいて、ＩｎｔｅｒＰｒｏ  ＩＰＲ０１３７８５として参照される（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｔｅｒｐｒｏ／ｅｎｔｒｙ／ＩＰＲ０１３７８５）。
【００４７】
その化学的機構に従って、アルドラーゼは、２つのクラスに分けられる。デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＤＥＲＡ、ＥＣ  ４．１．２．４）は、クラスＩアルドラーゼの１つである。クラスＩアルドラーゼは補因子非依存性であり、厳密に保存された活性部位のリジンとシッフ塩基を形成することにより、供与体基質を活性化する（Dean et al. Adv.Synth.Catal. 349 (2007), p. 1308-1320）。
【００４８】
Heine et al.により示される通り、大腸菌（E.coli）２−デオキシリボース  ５−リン酸アルドラーゼは、活性部位に２つのリジン残基を含む。Ｌｙｓ１６７がシッフ塩基中間体を形成する一方、反応性のリジン残基のすぐ近くにあるＬｙｓ２０１は、Ｌｙｓ１６７のｐＫａ撹乱の原因となり、したがって、これも重要な残基である。
【００４９】
様々な生物由来の２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼを大腸菌（E.coli）−２デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼと比較すると、以下の配列同一性が明らかとなった（Heine et al., 前に引用）：
サーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）由来の２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼとは３０％、アエロピュルム・ペルニクス（Aeropyrum pernix）由来の２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼとは２３％、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）由来の２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼとは３２％、およびアクイフェックス・エオリカス（Aquifex aeolicus）由来の２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼとは２７％。
【００５０】
しかし、配列同一性レベルが低いにもかかわらず、活性部位環境はこれらの 酵素全てにおいて類似している。
【００５１】
Kullartz and Pietruzska (Journal of Biotechnology 161 (2012) p.174-180)は、ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）由来の新規の２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼを特定し、この酵素と大腸菌（E. coli）由来の２−デオキシリボース  ５−リン酸アルドラーゼとの間の配列アラインメントを与えている。配列は低い同一性（２８％）、および５９％の類似性しか共有していなかったが、大腸菌（E.coli）由来の２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼの触媒活性部位の非常に重要な残基（DeSantis et al., Biorg. Med. Chem. 11 (2003) p. 43-52）が、Ｒ・エリスロポリス（R. erythropolis）由来の２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼにおける対応する残基と完全に一致する。大腸菌（E.coli）由来の２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼにおける、シッフ塩基を形成する残基Ｌｙｓ１６７は、Ｒ・エリスロポリス（R. erythropolis）由来のＤＥＲＡにおけるＬｙｓ１５５に相当し、大腸菌（E. coli）におけるＡｓｐ１０２およびＬｙｓ１７６のプロトンシャッフリング系（proton shuffling system）は、Ｒ・エリスロポリス（R.erythropolis）におけるＡｓｐ９２およびＬｙｓ１７６と一致する。
【００５２】
Ａ・ブーネイ（A. boonei）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ｂ５ＩＥＵ６）、Ａ・ペルニクス（A.pernix）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ｑ９Ｙ９４８）、Ｐ・アエロフィラム（P. aerophilum）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ｑ８ＺＸＫ７）およびＴ・マリティマ（T.maritime）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ｑ９Ｘ１Ｐ５）を含む好熱性微生物の代表的な２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼタンパク質の配列アラインメントにより、２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼにおいて、シッフ塩基を形成するのに不可欠な残基Ｌｙｓ１２７が高度に保存されていることが示された。さらに、プロトンリレーにおいて重要であることが知られる残基Ａｓｐ９２およびＬｙｓ１８５も、これらの酵素全てにおいて高度に保存されていた（Yin et al, African journal of Biotechnology, 10 (2011) p.16260-16266）。
【００５３】
本発明の方法において、Ｄ−エリトロースのグリコールアルデヒドへの変換において使用される２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．４）は、原核生物または真核生物由来の任意の２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．４）であってよい。実施例のセクションにおいては、原核生物の２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ、すなわち、大腸菌（E. coli）、株Ｋ１２の２−デオキシ−Ｄ−リボース−５−リン酸アルドラーゼ（配列番号４）；Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０Ａ６Ｌ０が記載されている。添付の実施例に示される通り、２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．４）が基質としてＤ−エリトロースを使用でき、これをグリコールアルデヒドに変換できることが判明した。基本的には、任意の２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．４）、特に原核生物または真核生物由来の２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．４）が、本発明による方法において使用可能である。
【００５４】
好ましい実施形態において、本発明の方法においてＤ−エリトロースのグリコールアルデヒドへの変換において使用される２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．４）は、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）（株ＨＢ８／ＡＴＣＣ  ２７６３４／ＤＳＭ５７９）由来のデオキシリボース−リン酸アルドラーゼ；Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｑ５ＳＪ２８（配列番号５）、クロストリジウム・アセトブチリクム（Clostridium acetobutylicum）（株ＡＴＣＣ  ８２４／ＤＳＭ７９２／ＪＣＭ１４１９／ＬＭＧ５７１０／ＶＫＭ  Ｂ−１７８７）由来のデオキシリボース−リン酸アルドラーゼ；Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｑ９７ＩＵ５（配列番号６）、アセトバクター属の種（Acetobacter sp.）由来のデオキシリボース−リン酸アルドラーゼ；Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｒ５Ｑ５Ｋ８（配列番号７）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）（株 ＡＴＣＣ  ７００３９６／ＮＣＫ５６／Ｎ２／ＮＣＦＭ）由来のデオキシリボース−リン酸アルドラーゼ；Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｑ５ＦＬＺ２（配列番号８）、ハイパーサーマス・ブチリカス（Hyperthermus butylicus）（株ＤＳＭ５４５６／ＪＣＭ９４０３）由来のデオキシリボース−リン酸アルドラーゼ；Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ａ２ＢＬＥ９（配列番号９）、ストレプトコッカス・ゴルドニ（Streptococcus gordonii）（株Ｃｈａｌｌｉｓ／ＡＴＣＣ  ３５１０５／ＣＨ１／ＤＬ１／Ｖ２８８）由来のデオキシリボース−リン酸アルドラーゼ；Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ａ８ＡＸ５９（配列番号１０）、バクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis）由来のデオキシリボース−リン酸アルドラーゼ；Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｋ１ＧＴＰ０（配列番号１１）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）（株ウシＲＦ１２２／ＥＴ３−１）由来のデオキシリボース−リン酸アルドラーゼ；Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｑ２ＹＵＵ４（配列番号１２）、アセトバクテリウム・ウッディ（Acetobacterium woodii）（株ＡＴＣＣ  ２９６８３／ＤＳＭ１０３０／ＪＣＭ２３８１／ＫＣＴＣ１６５５）由来のデオキシリボース−リン酸アルドラーゼ；Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｈ６ＬＦＹ１（配列番号１３または配列番号３２）、ネオサルトリア・フミガタ（Neosartorya fumigata）（株ＡＴＣＣ  ＭＹＡ−４６０９／Ａｆ２９３／ＣＢＳ１０１３５５／ＦＧＳＣ  Ａ１１００）（アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus））由来のデオキシリボース−リン酸アルドラーゼ；Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ａ４Ｄ９Ｇ０（配列番号１４）またはシェワネラ・オネイデンシス（Shewanella oneidensis）（株ＭＲ−１）由来のデオキシリボース−リン酸アルドラーゼ；Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｑ８ＥＨＫ４（配列番号１５）であってよい。
【００５５】
したがって、好ましい実施形態において、Ｄ−エリトロースをグリコールアルデヒドに変換するための、本発明の方法において使用される２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．４）は、配列番号４〜１５のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するか、配列番号４〜１５のいずれかに対し少なくともｘ％相同なアミノ酸配列を示し、かつＤ−エリトロースのグリコールアルデヒドへの変換を触媒する活性を有し、ここで、ｘは３０〜１００の間の整数、好ましくは３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９である。好ましくは、同一性の程度は、各配列を上記配列番号のいずれか１つのアミノ酸配列と比較することにより決定される。比較される配列が同じ全長でない場合、同一性の程度は、好ましくは、より長い配列中のアミノ酸残基と同一である、より短い配列中のアミノ酸残基のパーセンテージ、またはより短い配列中のアミノ酸残基と同一である、より長い配列中のアミノ酸残基のパーセンテージのいずれかを指す。配列同一性の程度は、当技術分野で周知の方法により、好ましくはＣＬＵＳＴＡＬなどの適切なコンピュータアルゴリズムを使用して決定可能である。
【００５６】
特定の配列が、例えば、参照配列に対し８０％同一であるかどうかを決定するためＣｌｕｓｔａｌ解析法を使用する場合、デフォルト設定を使用してもよく、または設定を好ましくは以下の通りにする：アミノ酸配列の比較においては、マトリクス：ｂｌｏｓｕｍ３０；オープンギャップペナルティ：１０．０；伸長ギャップペナルティ：０．０５；ディレイディバージェント：４０；ギャップ分離距離：８。ヌクレオチド配列の比較においては、伸長ギャップペナルティが好ましくは５．０に設定される。
【００５７】
好ましくは、同一性の程度は配列の全長にわたって算出される。
【００５８】
選択された２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．４）が、Ｄ−エリトロースのグリコールアルデヒドへの変換を触媒することができるかどうかは、例えば、添付の実施例に示すアッセイにより評価可能である。
【００５９】
上記の通り、Ｄ−エリトロース１分子のグリコールアルデヒド２分子への変換は、フルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．１３）により触媒される酵素反応によっても実現されうる。フルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．１３）は、以下の反応を触媒することができる酵素である：
【００６０】
【化２】
2017516475.tif 000004
【００６１】
この酵素は様々な生物で確認されており、フルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼは、異なる反応機構に依存する２つのクラスに分けられる。クラスＩのフルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼは主に動物および高等植物に見られ、クラスＩＩのフルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼは主に藻類、細菌および酵母に見られる。クラスＩＩに属する酵素には、補因子として二価の金属イオンが必要である。
【００６２】
タイプＩおよびタイプＩＩの両方のフルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼが様々な原核生物および真核生物起源から単離されており、そのため、フルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼは、解糖系、糖新生およびフルクトース代謝において非常に重要な役割を果たす、普遍的な解糖酵素である（Brovetto M. et al. Chem. Rev. 111 (2011), 4346-4403）。
【００６３】
したがって、好ましい実施形態において、フルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．１３）は原核生物、好ましくは細菌由来である。この酵素は、例えば、ペプトニフィラス・アサッカロリチカス（Peptoniphilus asaccharolyticus）、大腸菌（Escherichia coli）、サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、ニホンコウジカビ（Aspergillus oryzae）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、枯草菌（Bacillus subtilis）、クロストリジウム属の種（Clostridium sp.）、コリネバクテリウム属の種（Corynebacterium sp.）、ヘリコバクター・ピロリ（Heliobacter pylori）、ラクトバチルス属の種（Lactobacillus sp.）、マイコバクテリウム属の種（Mycobacterium sp.）、ペニシリウム属の種（Penicillinum sp.）、シュードモナス属の種（Pseudomonas sp.）、熱帯性マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、サッカロマイセス属の種（Saccharomyces sp.）およびメチロコッカス・クニクルス（Methylococcus cuniculus）に存在することが記載されている。
【００６４】
さらに、好ましい実施形態において、フルクトース  １，６−ビスリン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．１３）は真核生物由来である。この酵素は、例えば、ヒト（Homo sapiens）、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）、アナウサギ（Oryctolagus cuniculus）、セキショクヤケイ（Gallus gallus）、トウモロコシ（Zea mays）、ウシ（Bos Taurus）、ハツカネズミ（Mus musculus）およびアルファルファ（Medicago sativa）に存在することが記載されている。
【００６５】
Siebers et al.の研究はまず、伝統的なクラスＩおよびクラスＩＩ酵素をコードする遺伝子が、配列決定された古細菌ゲノムのいずれにおいても確認されないことを明らかにした（Siebers B. et al., J Bol.Chem. 276 (2001), 28710-28718）。後に、２種類の超好熱性古細菌、サーモプロテウス・テナックス（Thermoproteus tenax）およびパイロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来のアルドラーゼの生化学的および構造的特性決定により、これらの酵素がシッフ塩基機構を使用しており、そのためクラスＩアルドラーゼに属することが示された（Siebers et al., 前に引用；Lorentzen E. et al., Biochem. Soc. Trans. 32 (2004), 259-263）。
【００６６】
クラスＩフルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼは、免疫反応性、ならびにフルクトース−１，６−二リン酸およびフルクトース  １−リン酸基質についての代謝回転に基づいて区別される、３つのアイソザイム型に分類されうる（Blonski et al., Biochem. J. 323 (1997), 71-77）。ウサギの筋肉由来のアイソザイムＡは、クラスＩのフルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼのうち最も広く研究されているものである（Gefflaut et al., Prog. Biophys. Mol. Biol. 63 (1995), 301-340）。数十の異なるアイソザイムが配列決定されており、ウサギの筋肉由来のもの（Sygusch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 84 (1987), 7846-7850）、ヒトの筋肉由来のもの（Gamblin et al., FEBS Lett. 262 (1987), 282-286、Arakaki et al., Protein Sci. 13 (2004), 3077-3084）およびショウジョウバエ由来のもの（Hester et al., FEBS Lett. 292 (1991), 237-242）を含む、いくつかのアルドラーゼアイソザイムの構造が決定されている。Ｃ末端領域を構成する２０個のアミノ酸残基を除いて、これらのアイソザイムの分子構造は高度に保存されている。ホモ四量体の各酵素サブユニットのポリペプチドフォールドはβ−バレルに相当し、活性部位はβ−バレルの中心に位置する（Sygusch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 84 (1987), 7846-7850）。その他のβ−バレルアイソザイムとは異なり、活性部位が相当数の荷電アミノ酸残基、すなわちＡｓｐ−３３、Ｌｙｓ−１０７、Ｌｙｓ−１４６、Ｇｌｕ−１８７およびＬｙｓ−２２９から構成されている（Blonski et al., Biochem. J. 323 (1997), 71-77）。
【００６７】
クラスＩＩのＦＢＰ−アルドラーゼには、二価カチオン、通常Ｚｎ２＋が必要であり、一価カチオンにより活性化される（Horecker et al., In The Enzymes (Boyer, P. D.,ed.), 1972, 3rd edit., vol. 7, 213-258, Academic Press, New York）。クラスＩＩのＦＢＰ−アルドラーゼは、クラスＩの酵素と約１５％の配列同一性を共有している（Naismith et al., J. Mol. Biol. 225 (1992), 1137-1141）。したがって、好ましい実施形態において、本発明の方法において使用されるフルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼは、二価カチオン、好ましくはＺｎ２＋存在下で供給され、一価カチオンにより活性化される。
【００６８】
クラスＩＩのＦＢＰ酵素は、クラスＩＩＡおよびクラスＩＩＢファミリーにさらに分類されうる。伝統的に、クラスＩＩＡおよびクラスＩＩＢのＦＢＰ酵素は、配列相同性およびオリゴマー状態に従って分類されていた。クラスＩＩＡのＦＢＰ酵素は二量体と考えられ、クラスＩＩＢのＦＢＡは二量体、四量体または八量体である可能性があった（Izard and Sygush, J. Biol. Chem 279 (2004), 11825-11833；Galkin et al., Biochemistry 48 (2009), 3186-3196；Nakahara et al., Plant Cell Physiol. 44 (2003), 326-333）。ＦＢＰ−タンパク質の配列アラインメントにより、各ファミリーに属するメンバーが４０％の配列類似性を示し、タイプＡおよびＢのクラスＩＩＦＢＰアルドラーゼ間のアミノ酸配列同一性が２５〜３０％程度であることが示された（Plaumann et al., Curr. Genet. 31 (1997), 430-438）。その後、８つの既知のクラスＩＩＦＢＰアルドラーゼの配列アラインメントにより、Ａｒｇ−３３１が高度に保存された残基の１つであることが示された。化学修飾および部位特異的突然変異誘発により、活性部位におけるこのアミノ酸の不可欠な役割が確認された（Qamar et al., Protein Sci. 5 (1996), 154-161）。
【００６９】
いくつかの酵素、すなわち大腸菌（E.coli）由来（Hall et al., J. Mol. Biol. 287 (1999), 383-394）、サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来（Izard and Sygush; 前に引用）、サーマス・カルドフィラス（Thermus caldophilus）由来（Lee et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 347 (2006), 616-625）、ランブル鞭毛虫（Giardia lamblia）由来（Galkin et al.; 前に引用）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）由来（Pegan et al., J. Mol.Biol. 386 (2009), 1038-1053）の酵素についての結晶構造が決定されている。結核菌（Mycobacterium tuberculosis）ＦＢＰアルドラーゼの二次構造は、その他の細菌性クラスＩＩアルドラーゼと類似している（Pegan et al., 前に引用）。酵素は８本鎖のβ−シートコアを有し、一般的には各β鎖（β１〜β８）にα−ヘリックス（α１〜α８ａ）が続き、ＴＩＭバレルフォールドとしても知られる全体の（β／α）８−バレルフォールドを生じる（ＩｎｔｅｒＰｒｏデータベースでの参照番号はＩＰＲ０１３７８５）。
【００７０】
基本的には、本発明の方法によるＤ−エリトロースのグリコールアルデヒドへの変換において、任意のフルクトース  １，６−ビスリン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．１３）が使用可能である。
【００７１】
好ましい実施形態において、本発明による方法において使用されるフルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．１３）は、
配列番号２６に示されるアミノ酸配列を示す、アナウサギ（Oryctolagus cuniculus）由来のフルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼ（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ００８８３）、または配列番号２７に示されるアミノ酸配列を示す、大腸菌（Escherichia coli）（株Ｋ１２）由来のフルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼ（すなわち、クラスＩＩフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０ＡＢ７１）、または配列番号２８に示されるアミノ酸配列を示す、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）（株ＡＴＣＣ  ２０４５０８／Ｓ２８８ｃ）由来のフルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼ（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ１４５４０）、または配列番号２９に示されるアミノ酸配列を示す、サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来のフルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼ（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｑ９ＲＨＡ２）、または配列番号３０に示されるアミノ酸配列を示す、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）由来のフルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼ（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ６７４７５）、または配列番号３１に示されるアミノ酸配列を示す、メチロコッカス・カプスラタス（Methylococcus capsulatus）（株ＡＴＣＣ  ３３００９／ＮＣＩＭＢ１１１３２／Ｂａｔｈ）由来のフルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼ（すなわち、クラスＩＩフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｑ６０２Ｌ６）である。
【００７２】
したがって、好ましい実施形態において、本発明の方法において使用されるフルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．１３）は、配列番号２６〜３１のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するか、配列番号２６〜３１のいずれか１つに対し少なくともｘ％相同なアミノ酸配列を示し、かつフルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼ活性を有し、ここで、ｘは３０〜１００の間の整数、好ましくは３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９であり、このような酵素は、本明細書で上記に示す通り、Ｄ−エリトロースをグリコールアルデヒドに変換することができる。好ましくは、同一性の程度は上記の通り決定される。
【００７３】
フルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．１３）の酵素活性は、当業者に既知の方法で評価可能である。このような方法は、例えばBlonski K. et al., Biochem. J. 323 (1997), 71-77およびSzwergold et al., Arch. Biochem. Biophys. 317 (1995), 244-252に記載されている。
【００７４】
本発明は、Ｄ−フルクトースからグリコールアルデヒドおよびアセチルリン酸の生成をもたらすその後の反応において、上記２つの酵素的変換が組み合わされる方法にも関する。したがって、本発明は、Ｄ−フルクトースからのグリコールアルデヒドおよびアセチルリン酸の生成方法であって、（ａ）上記の本発明の方法による、ホスホケトラーゼを使用することによるＤ−フルクトースおよびリン酸からのＤ−エリトロースおよびアセチルリン酸の生成；を含み、（ｂ）上記の本発明の方法による、２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．４）またはフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．１３）を使用することによる、このように生成したＤ−エリトロースのグリコールアルデヒドへの酵素的変換をさらに含む生成方法を提供する。ホスホケトラーゼ、２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．４）およびフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．１３）に関しては、各変換に関して上記に示すものと同じものが適用される。
【００７５】
２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼまたはフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．１３）を使用することによる、Ｄ−エリトロースのグリコールアルデヒドへの上記変換により生成するグリコールアルデヒドは、有利なことには、アセチルリン酸にさらに変換されうる。それにより、Ｄ−フルクトースから出発する全体の反応は、アセチルリン酸３分子を生じる。
【００７６】
したがって、本発明のさらなる態様において、本明細書で上記される任意の方法に従って生成するグリコールアルデヒドはアセチルリン酸にさらに変換され、これ自体が下記の通り、例えば、アセチル−ＣｏＡなどの生成のための基質として機能しうる。
【００７７】
グリコールアルデヒドのアセチルリン酸への変換は、当業者に既知の方法、特に、ホスホケトラーゼにより触媒される酵素反応により実現されうる。グリコールアルデヒドのアセチルリン酸への変換は、不可逆的な以下の反応によって発生する：
グリコールアルデヒド＋リン酸→アセチルリン酸＋Ｈ２Ｏ
【００７８】
この変換は、Melvin et al., J. Biol. Chem. 237: 3841-3842 (1962)に記載されている。
【００７９】
「リン酸」という語は、本発明の方法に関して、グリコールアルデヒドおよびリン酸のアセチルリン酸への変換方法において使用される酵素のための、リン酸供給源として許容される化合物を指す。リン酸、すなわちＨ３ＰＯ４の形態でリン酸を用意することが可能である。しかし、その他の形態、特に、水素原子のうち１つ、２つまたは３つが、ナトリウムイオンなどのその他のイオンで置き換えられたリン酸（Ｈ３ＰＯ４）塩も想定可能である。
【００８０】
したがって、上記の本発明による方法は、ホスホケトラーゼを使用することによる、生成したグリコールアルデヒドのアセチルリン酸への酵素的変換のステップをさらに含みうる。ホスホケトラーゼについては、Ｄ−フルクトースおよびリン酸のＤ−エリトロースおよびアセチルリン酸への酵素的変換についての文脈において、上に既に記載されている。Ｄ−フルクトースおよびリン酸をＤ−エリトロースおよびアセチルリン酸に変換することができるホスホケトラーゼについて、ならびに補助基質リン酸について上記に示すものと同じものが、グリコールアルデヒドおよびリン酸のアセチルリン酸への変換に使用可能なホスホケトラーゼについても適用される。
【００８１】
したがって、グリコールアルデヒドおよびリン酸のアセチルリン酸への変換において使用されるホスホケトラーゼは、任意のホスホケトラーゼ、特に（ａ）ホスホケトラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．９）または（ｂ）フルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．２２）に分類されるホスホケトラーゼであってよい。グリコールアルデヒドおよびリン酸をアセチルリン酸に変換するのに使用されるホスホケトラーゼは、原核生物または真核生物由来のホスホケトラーゼであってよい。実施例のセクションにおいては、この変換に関して、原核生物ホスホケトラーゼ、例えば、（ａ）ビフィドバクテリウム・シュードロンガム亜種グロボサム（Bifidobacterium pseudolongum subsp. globosum）のホスホケトラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．２２）（配列番号１）、または（ｂ）クロストリジウム・アセトブチリクム（Clostridium acetobutylicum）（株ＡＴＣＣ８２４）由来のホスホケトラーゼ（配列番号２）、または（ｃ）ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス（Lactococcus lactis subp. lactis）のホスホケトラーゼ（株ＫＦ１４７；Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ａ９ＱＳＴ６；配列番号３）が記載されている。
【００８２】
好ましい実施形態において、グリコールアルデヒドおよびリン酸をアセチルリン酸に変換するための、本発明の方法において使用されるホスホケトラーゼは、配列番号１〜３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するか、配列番号１〜３のいずれかに対し少なくともｘ％相同なアミノ酸配列を示し、かつグリコールアルデヒドおよびリン酸のアセチルリン酸への変換を触媒する活性を有し、ここで、ｘは３０〜１００の間の整数、好ましくは３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９である。同一性の程度の決定に関しては、上記に示すものと同じものが適用される。
【００８３】
選択されたホスホケトラーゼが、グリコールアルデヒドおよびリン酸のアセチルリン酸への変換を触媒することができるかどうかは、例えば、添付の実施例に示すアッセイにより決定可能である。
【００８４】
グリコールアルデヒドのアセチルリン酸への変換は、スルホアセトアルデヒドアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．３．３．１５）により触媒される酵素反応によっても実現されうる。スルホアセトアルデヒドアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．３．３．１５）は、以下の反応を触媒することができる酵素である：
２−スルホアセトアルデヒド＋リン酸→アセチルリン酸＋亜硫酸
【００８５】
「リン酸」という語は、本発明の方法に関して、２−スルホアセトアルデヒドおよびリン酸のアセチルリン酸および亜硫酸への変換方法において使用される酵素のための、リン酸供給源として許容される化合物を指す。リン酸、すなわちＨ３ＰＯ４の形態でリン酸を用意することが可能である。しかし、その他の形態、特に、水素原子のうち１つ、２つまたは３つが、ナトリウムイオンなどのその他のイオンで置き換えられたリン酸（Ｈ３ＰＯ４）塩も想定可能である。
【００８６】
この酵素は様々な生物、特に細菌で確認されている。好ましい一実施形態において、スルホアセトアルデヒドアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．３．３．１５）は原核生物、好ましくは細菌由来である。この酵素は、例えば、カステラニエラ・デフラガンス（Castellaniella defragans）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ｑ８４Ｈ４４；以前はアルカリゲネス・デフラガンス（Alcaligenes defragans）（Ruff et al., Biochem. J. 369 (2003), 275-285））、アルカリゲネス・キシロソキシダンス・キシロソキシダンス（Alcaligenes xylosoxydans xylosoxydans）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ｑ８４Ｈ４１）、デスルフォニスポラ・チオスルファティゲネス（Desulfonispora thiosulfatigenes）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ｑ９３ＰＳ３）、リゾビウム・メリロティ（Rhizobium meliloti）（株１０２１）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ｑ９２ＵＷ６）、ルエゲリア・ポメロイ（Ruegeria pomeroyi）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ｑ５ＬＭＫ２）、カプリアビダス・ネカトール（Cupriavidus necator）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ｑ０Ｋ０２２）、ロゼオバリウス・ヌビンヒベンス（Roseovarius nubinhibens）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ａ３ＳＲ２５）、アシネトバクター属の種（Acinetobacter sp.）および緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）に存在することが記載されている。
【００８７】
基本的には、任意のスルホアセトアルデヒドアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．３．３．１５）が、本発明の方法によるグリコールアルデヒドおよびリン酸のアセチルリン酸への変換において使用可能である。
【００８８】
スルホアセトアルデヒドアセチルトランスフェラーゼは、ホスホケトラーゼと同様に、チアミンピロリン酸（ＴＰＰ）依存性酵素であり、したがってＴＰＰ結合ドメインを含むことを特徴とする。既知のスルホアセトアルデヒドアセチルトランスフェラーゼの間では、ＴＰＰ結合ドメインが高度に保存されている（例えば、Ruff et al., Biochem. J. 369 (2003), 275-285を参照のこと）。総じて、既知のスルホアセトアルデヒドアセチルトランスフェラーゼは、ＴＰＰ結合ドメインを含むＮ末端付近に高度の配列保存を示す（Ruff et al., 前に引用、を参照）。酵素自体のＮ末端、およびＣ・デフラガンス（C. defragans）酵素のアミノ酸４００付近の領域において、配列相違が観察される場合がある。Ruff et al.（前に引用）は、スルホアセトアルデヒドアセチルトランスフェラーゼが３つのサブグループを形成することを記載している（前記公開の図４を参照のこと）。サブグループ２および３は、ＰＲＯＳＩＴＥコンセンサス配列（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｍ／Ｆ）（Ｇ／Ｓ／Ａ）Ｘ５ＰＸ４（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｍ／Ｆ／Ｙ／Ｗ）Ｘ（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｍ／Ｆ）ＸＧＤ（Ｇ／Ｓ／Ａ）（Ｇ／Ｓ／Ａ／Ｃ）と一致するＴＰＰ結合ドメインを示すと言われているが、サブグループはこのコンセンサス配列とわずかに異なる：（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｍ／Ｆ）（Ｇ／Ｓ／Ａ）Ｘ５ＰＸ４（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｍ／Ｆ／Ｙ／Ｗ）Ｘ（Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｍ／Ｆ／Ｙ）ＸＧＤ（Ｇ／Ｓ／Ａ）（Ｇ／Ｓ／Ａ／Ｃ）。
【００８９】
これらの領域以外では、異なるスルホアセトアルデヒドアセチルトランスフェラーゼ間の配列同一性はかなり低い場合がある（約４４％まで減少)。
【００９０】
好ましい実施形態において、本発明による方法において使用されるスルホアセトアルデヒドアセチルトランスフェラーゼは、配列番号２１に示されるアミノ酸配列を示す、Ｃ・デフラガンス（C. defragans）のスルホアセトアルデヒドアセチルトランスフェラーゼ、または配列番号２２に示されるアミノ酸配列を示す、アルカリゲネス・キシロソキシダンス・キシロソキシダンス（Alcaligenes xylosoxydans xylosoxydans）のスルホアセトアルデヒドアセチルトランスフェラーゼ、または配列番号２３に示されるアミノ酸配列を示す、デスルフォニスポラ・チオスルファティゲネス（Desulfonispora thiosulfatigenes）のスルホアセトアルデヒドアセチルトランスフェラーゼ、または配列番号２４に示されるアミノ酸配列を示す、リゾビウム・メリロティ（Rhizobium meliloti）（株１０２１）のスルホアセトアルデヒドアセチルトランスフェラーゼ、または配列番号２５に示されるアミノ酸配列を示すか、関連アミノ酸配列を示す、ロゼオバリウス・ヌビンヒベンス（Roseovarius nubinhibens）のスルホアセトアルデヒドアセチルトランスフェラーゼである。
【００９１】
したがって、好ましい実施形態において、本発明の方法において使用されるスルホアセトアルデヒドアセチルトランスフェラーゼは、配列番号２１〜２５のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するか、配列番号２１〜２５のいずれか１つに対し少なくともｘ％相同なアミノ酸配列を示し、かつスルホアセトアルデヒドアセチルトランスフェラーゼ活性を有し、ここで、ｘは３０〜１００の間の整数、好ましくは３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９であり、このような酵素は、本明細書で上記に示す通り、グリコールアルデヒドおよびリン酸をアセチルリン酸に変換することができる。好ましくは、同一性の程度は、上記の通り決定される。
【００９２】
スルホアセトアルデヒドアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．３．３．１５）の酵素活性は、当業者に既知の方法で評価可能である。このような方法は、例えば、Ruff et al.（Biochem. J. 369 (2003), 275-285）に記載されている。
【００９３】
上記の通り、本発明は、ホスホケトラーゼを使用することによる、Ｄ−フルクトースのＤ−エリトロースおよびアセチルリン酸への酵素的変換に関し、Ｄ−エリトロースが場合により、アルドラーゼ（２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．４）またはフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．１３））を使用することによりグリコールアルデヒドにさらに変換されてよく、このように生成したグリコールアルデヒドが場合により、アセチルリン酸にさらに変換されてよい。Ｄ−エリトロースおよびアセチルリン酸生成のための基質として使用されるＤ−フルクトースは、外部から、すなわちこれを基質として添加するか、Ｄ−フルクトースを含む炭素供給源を使用することにより供給されてよく、またはＤ−フルクトース自体が酵素的変換により供給されてもよい。この点における１つの選択肢は、当業者に既知の方法によるＤ−グルコースのＤ−フルクトースへの酵素的変換である。例えば、グルコース−フルクトースイソメラーゼを使用することにより、Ｄ−グルコースがＤ−フルクトースに酵素的に変換されうることが周知である。
【００９４】
したがって、別の実施形態において、本発明は、本明細書で上記される方法であって、上記反応のための基質を形成する前記Ｄ−フルクトース自体が、グルコース−フルクトースイソメラーゼを使用することによる、Ｄ−グルコースの酵素的変換により生成するさらなるステップが、上記のステップに先行する、方法にも関する。Ｄ−グルコースのＤ−フルクトースへの酵素的変換は、天然に発生しグルコース−フルクトースイソメラーゼを利用する酵素的ステップである。この文脈で使用されうるグルコース−フルクトースイソメラーゼは、当業者に既知である。このように、本発明において、Ｄ−グルコースは、グルコース−フルクトースイソメラーゼを使用することにより、インビトロまたはインビボで、酵素的にＤ−フルクトースに変換されうる。
【００９５】
「グルコース−フルクトースイソメラーゼ」または「グルコース−フルクトースイソメラーゼ活性」 は、本発明では、Ｄ−グルコースをＤ−フルクトースに変換することができる酵素または酵素活性を意味する。このようなグルコース−フルクトースイソメラーゼは、通常キシロースイソメラーゼ（ＥＣ  ５．３．１．５）に分類される。キシロースイソメラーゼ（ＥＣ  ５．３．１．５）は以下の反応を触媒する酵素である：
【００９６】
【化３】
2017516475.tif 000005
【００９７】
グルコース−フルクトースイソメラーゼ（またはキシロースイソメラーゼ）酵素は、イソメラーゼファミリー、具体的にはアルドースおよびケトースを相互変換する、分子内オキシドレダクターゼに属する。この酵素クラスの系統名は、Ｄ−キシロースアルドース−ケトース−イソメラーゼである。これらの酵素は、Ｄ−キシロースイソメラーゼ、Ｄ−キシロースケトイソメラーゼおよびＤ−キシロースケトール−イソメラーゼとも称される。この酵素は、ペントースおよびグルクロン酸の相互変換、ならびにフルクトースおよびマンノースの代謝に関与する。この酵素は、高フルクトースコーンシロップの製造において、グルコースをフルクトースに変換するために工業的に使用される。この酵素は、「グルコースイソメラーゼ」と称されることもある。
【００９８】
グルコース−フルクトースイソメラーゼ（またはキシロースイソメラーゼ）酵素は、多様な生物、特に原核生物、真核生物および古細菌に存在する。このように、本発明による方法の好ましい実施形態において、上記に示され図１に図示される反応図式による、Ｄ−グルコースのＤ−フルクトースへの酵素的変換は、キシロースイソメラーゼ（ＥＣ  ５．３．１．５）に分類されるグルコース−フルクトースイソメラーゼ（またはキシロースイソメラーゼ）酵素を使用することにより実現される。好ましい一実施形態において、グルコース−フルクトースイソメラーゼは、原核生物、好ましくは細菌由来である。この酵素は、例えば、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス属の種（Bacillus sp.）および大腸菌（E. coli）に存在することが記載されている。別の好ましい実施形態において、グルコース−フルクトースイソメラーゼは真核生物、好ましくは菌類、例えば、サッカロマイセス・セレビシア（Sacharomyces cerevisia）などの酵母由来である。この酵素は、例えば、ストレプトマイセス・オリボクロモゲネス（Streptomyces olivochromogenes）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ｐ１５５８７）、サーモアナエロバクター・エタノリカス（Thermoanaerobacter ethanolicus）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ｄ２ＤＫ６２）、ビブリオ属の種（Vibrio sp.）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ｃ７Ｇ５３２）、アクチノプラネス・ミズーリエンシス（Actinoplanes missouriensis）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ｐ１２８５１）、バークホレリア・サッカリ（Burkholeria sacchari）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ｂ６ＶＣＷ７）、オルピノマイセス属の種（Orpinomyces sp.）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ｂ７ＳＬＹ１）、ストレプトマイセス・ルビジノサス（Streptomyces rubiginosus）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号：Ｐ２４３００）およびサーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）（Ｐ２６９９７）に存在することが記載されている。
【００９９】
本発明の方法において、グルコースのフルクトースへの変換に使用されるグルコース−フルクトースイソメラーゼは、任意のグルコース−フルクトースイソメラーゼ、特に原核生物または真核生物由来のグルコース−フルクトースイソメラーゼであってよい。例として、（配列番号１６）のアミノ酸配列を有する、大腸菌（E. coli）由来のグルコース−フルクトースイソメラーゼ（またはキシロースイソメラーゼ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ００９４４）が使用可能である。
【０１００】
好ましい実施形態において、本発明の方法においてグルコースのフルクトースへの変換に使用されるグルコース−フルクトースイソメラーゼ（またはキシロースイソメラーゼ）は、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）（株ＤＳＭ１３／ＡＴＣＣ  １４５８０）由来のキシロースイソメラーゼ；Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ７７８３２（配列番号１７）、ストレプトマイセス・オリボクロモゲネス（Streptomyces olivochromogenes）由来のキシロースイソメラーゼ；Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ１５５８７（配列番号１８）、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）（株ＨＢ８／ＡＴＣＣ  ２７６３４／ＤＳＭ５７９）由来のキシロースイソメラーゼ；Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ２６９９７（配列番号１９）またはキャンディダ・ボイディニ（Candida boidinii）由来のキシロースイソメラーゼ；Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｉ１ＶＸ３９（配列番号２０）であってよい。
【０１０１】
したがって、好ましい実施形態において、本発明の方法において使用されるグルコース−フルクトースイソメラーゼ（またはキシロースイソメラーゼ）は、配列番号１６〜２０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するか、配列番号１６〜２０のいずれかに対し少なくともｘ％相同なアミノ酸配列を示し、かつＤ−グルコースのＤ−フルクトースへの変換を触媒する活性を有し、ここで、ｘは３０〜１００の間の整数、好ましくは３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９である。同一性の程度の決定に関しては、上記に示すものと同じものが適用される。
【０１０２】
上記の通り、本発明は、Ｄ−エリトロースの生成方法を提供する。Ｄ−エリトロースはエリスリトールの直接の前駆体であり、下記の通りエリスリトールに変換可能である；Moon et al., Appl Microbiol. Biotechnol, 86:1017-1025 (2010)を参照のこと。したがって、本発明は、本発明の上記方法により生成するＤ−エリトロースからのエリスリトールの生成方法も提供する。したがって、本発明は、その後のステップとして、Ｄ−エリトロースをエリスリトールに変換することができる対応する酵素を使用することによる、生成したＤ−エリトロースのエリスリトールへの酵素的変換を含む、エリスリトールの生成方法を提供する。Ｄ−エリトロースのエリスリトールへの変換のための酵素は、当技術分野で既知である。例として、真核生物は、エリトロースの還元を触媒し、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性還元反応によりエリスリトールを生じるエリトロースレダクターゼを含む；Moon et al., Appl Microbiol. Biotechnol, 86:1017-1025 (2010)を参照のこと。このような酵素が、Ｄ−エリトロースのエリスリトールへの変換において使用可能である。
【０１０３】
このように生成したエリスリトールは、次いで、食品および医薬品産業において使用される生物的甘味料として使用可能である。エリスリトールは、糖尿病および肥満の人々のための特別食において、機能性の糖代用品としても使用可能である。さらに、生成したエリスリトールは、食品における非う食性甘味料として使用可能であり、その他の糖の生成のための出発物質としても機能しうる。
【０１０４】
上記の通り、上記の人工の代謝経路（図１にまとめる）は、基質としてのグルコース１分子から出発して最終的にアセチルリン酸３分子の生成をもたらしうる。本発明によれば、本発明の方法に従ってこのように生成したアセチルリン酸は、大部分の生物における中心的な代謝物である、酢酸またはアセチル−補酵素Ａ（アセチル−ＣｏＡとも称される）などの望ましい分子にさらに変換されうる。
【０１０５】
したがって、好ましい実施形態において、本発明は、上記の本発明の方法のいずれかによるアセチルリン酸の生成を含み、このように生成したアセチルリン酸の酢酸への変換をさらに含む酢酸の生成方法に関する。
【０１０６】
アセチルリン酸はかなり不安定であるため、インビトロでのアセチルリン酸の酢酸への加水分解は自然に発生する。アセチルリン酸は、例えば酢酸キナーゼ（ＥＣ  ２．７．２．１）、プロピオン酸キナーゼ（ＥＣ  ２．７．２．１５）、酪酸キナーゼ（ＥＣ  ２．７．２．７）または酢酸キナーゼ（二リン酸）（ＥＣ  ２．７．２．１２）を使用することにより、インビトロまたはインビボで、酵素的に酢酸に変換されてもよい。
【０１０７】
酢酸キナーゼは、以下の反応を触媒する酵素である：
【０１０８】
【化４】
2017516475.tif 000006
【０１０９】
この反応は可逆性であるため、この酵素は、アセチルリン酸を酢酸に変換するために使用可能である。反応からＡＴＰを継続的に除去すること、例えば、さらなる酵素的変換または当業者に既知の手段および方法により反応から除去することにより、反応を酢酸の側に押し進めることができる。この酵素は、多様な生物、特に原核生物、真核生物および古細菌に存在する。これは解糖系における重要な酵素であり、酵素レベルは過剰量のグルコース存在下で通常増大する。基本的には、任意の酢酸キナーゼ（ＥＣ  ２．７．２．１）が、本発明による方法においてアセチルリン酸を酢酸に変換するために使用可能である。
【０１１０】
プロピオン酸キナーゼ（ＥＣ  ２．７．２．１５）も、反応図式：
【０１１１】
【化５】
2017516475.tif 000007
に従ってアセチルリン酸を酢酸に変換可能であることが記載されている。
【０１１２】
この酵素は、大腸菌（E. coli）またはサルモネラ・エンテリック亜種エントリカ血清型チフィムリウム（Salmonella enteric subsp. enterica serovar. thyphimurium）などの腸内細菌科（Enterobacteriaceae）に見られる。
【０１１３】
アセチルリン酸の酢酸への変換は、酪酸キナーゼ（ＥＣ  ２．７．２．７）を使用することによっても実現可能である。酪酸キナーゼは、以下の反応を触媒する酵素である：
【０１１４】
【化６】
2017516475.tif 000008
【０１１５】
しかし、一部の酪酸キナーゼ、例えばクロストリジウム・ブチリクム（Clostridium butyricum）およびクロストリジウム・アセトブチリクム（Clostridium acetobutylicum）由来の酪酸キナーゼについては、反応：
【０１１６】
【化７】
2017516475.tif 000009
も触媒することができることが示されている。
【０１１７】
したがって、ＡＴＰ＋酢酸のＡＤＰ＋アセチルリン酸への可逆的な変換も触媒することができる任意の酪酸キナーゼが、アセチルリン酸を酢酸に変換するために、本発明の方法において使用可能である。
【０１１８】
さらに、アセチルリン酸の酢酸への変換は、酢酸キナーゼ（二リン酸）（ＥＣ  ２．７．２．１２）を使用することによっても実現可能である。酢酸キナーゼ（二リン酸）（ＥＣ  ２．７．２．１２）は、以下の反応を触媒する酵素である：
【０１１９】
【化８】
2017516475.tif 000010
【０１２０】
この酵素は、赤痢アメーバ（Entamoeba histolytica）に存在することが記載されている。
【０１２１】
アセチルリン酸の酢酸およびＨ３ＰＯ４への酵素的加水分解は、アシルホスファターゼ（ＥＣ  ３．６．１．７）を使用することによっても実現可能である。アシルホスファターゼ（ＡｃＰ；ＥＣ  ３．６．１．７）は、真核生物および原核生物（中温性および極限環境性の両方）に広く発現する細胞質酵素（分子量約１０ｋＤａ）である。ＡｃＰは、筋肉型ＡｃＰ（ＭＴ−ＡｃＰ）として骨格筋および心臓において、（器官）一般型ＡｃＰ（ＣＴ−ＡｃＰ）として赤血球、脳および精巣において、脊椎動物種の多くの組織に見られる（Zuccotti et al., Acta Cryst. 61 (2005), 144-146）。アシルホスファターゼは以下の反応を触媒する：
アセチルリン酸＋Ｈ２Ｏ→酢酸＋Ｈ３ＰＯ４
【０１２２】
この酵素は多様な生物において記載されている。好ましくは、本発明による方法において使用されるアシルホスファターゼは、セキショクヤケイ（Gallus gallus）、モルモット（Cavia porcellus）（Liguri et al.、Biochem. J. 217 (1984), 499-505）、ヒト（Homo sapiens）、イノシシ（Sus scrofa）、ウシ（Bos Taurus）、アナウサギ（Oryctolagus cuniculus）、エクウス・アカルス（Equus acallus）またはパイロコッカス・ヒロコシ（Pyrococcus hirokoshii）（Miyazoo et al., Acta Crystallographica D60 (2004), 1135-1136）由来である。
【０１２３】
これらの酵素の構造的および機能的特性は、既に詳細に研究され、例えば、Liguri et al. (Biochem. J. 217 (1984), 499-505)、Miyazoo et al. (Acta Crystallographica D60 (2004), 1135-1136)およびTaddei et al. (FEBS Letters 362 (1995), 175-179)に記載されている。
【０１２４】
別の好ましい実施形態において、生成したアセチルリン酸は、ホスホトランスアセチラーゼによってアセチル−ＣｏＡにも変換可能であり、アセチル−ＣｏＡは、例えば、アセチル−ＣｏＡ由来のアルケンまたはアセトンなどの、多くのさらなる代謝物生成の開始点として機能しうる。したがって、本発明は、アセチル−ＣｏＡの生成方法であって、上記の本発明の方法のいずれかによるアセチルリン酸の生成を含み、（ｂ）補酵素Ａ（ＣｏＡ）存在下でホスホトランスアセチラーゼを使用することによる、このように生成したアセチルリン酸のアセチル−ＣｏＡへの酵素的変換をさらに含む生成方法に関する。
【０１２５】
（インビトロまたはインビボでの）アセチルリン酸のアセチル−ＣｏＡへの変換は、例えばリン酸アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．３．１．８）の使用により、酵素的に実現可能である。この酵素はホスホトランスアセチラーゼ、ホスホアシラーゼまたはＰＴＡとも称される。この酵素は以下の反応を天然に触媒する：
【０１２６】
【化９】
2017516475.tif 000011
【０１２７】
この酵素は数多くの生物、すなわち原核生物、真核生物および古細菌に存在する。基本的には任意の既知のリン酸アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．３．１．８）がこの変換に使用可能である。
【０１２８】
アミノ酸またはヌクレオチド配列に関して「相同性」に言及する場合、言及は好ましくは配列同一性についてなされる。配列同一性の程度は当技術分野で周知の方法により、好ましくはＣＬＵＳＴＡＬなどの適切なコンピュータアルゴリズムを使用して決定可能である。
【０１２９】
特定の配列が、例えば、参照配列に対し少なくとも６０％同一であるかどうかを決定するためＣｌｕｓｔａｌ解析法を使用する場合、デフォルト設定を使用してよく、または設定を好ましくは以下の通りにする：アミノ酸配列の比較においては、マトリクス：ｂｌｏｓｕｍ３０；オープンギャップペナルティ：１０．０；伸長ギャップペナルティ：０．０５；ディレイディバージェント：４０；ギャップ分離距離：８。ヌクレオチド配列比較においては、伸長ギャップペナルティが好ましくは５．０に設定される。
【０１３０】
好ましい実施形態において、ＣｌｕｓｔａｌＷ２がアミノ酸配列の比較に使用される。ペアワイズ比較／アラインメントの場合、好ましくは以下の設定が選択される：タンパク質重量マトリクス：ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップオープン：１０；ギャップ伸長：０．１。多重比較／アラインメントの場合、好ましくは以下の設定が選択される：タンパク質重量マトリクス：ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップオープン：１０；ギャップ伸長：０．２；ギャップ距離：５；エンドギャップなし。
【０１３１】
好ましくは、同一性の程度は配列の全長にわたって算出される。比較される配列が同じ全長でない場合、同一性の程度は、より長い配列中の残基と同一である、より短い配列中の残基のパーセンテージ、またはより短い配列中の残基と同一である、より長い配列中の残基のパーセンテージのいずれかを指す。好ましくは、同一性の程度は、より長い配列中の残基と同一である、より短い配列中の残基のパーセンテージを指す。
【０１３２】
本発明による方法は、インビトロまたはインビボで実施されてよい。インビトロでの反応は、細胞が使用されない反応、すなわち無細胞反応であると理解される。このように、インビトロは好ましくは無細胞系内であることを意味する。一実施形態における「インビトロでの」という語は、単離された酵素（または場合によって必要な補因子を含む酵素系のこともある）の存在下であることを意味する。一実施形態において、この方法において使用される酵素は、精製された形態で使用される。
【０１３３】
インビトロでの方法を実施するため、酵素を活性化し、酵素的変換を発生させる条件（緩衝液、温度、補助基質、補因子など）下で、反応用の基質および酵素がインキュベートされる。反応を、各産物を生成するのに十分な時間進行させる。各産物の生成は、場合により質量分析（ＭＳ）検出と連動させた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの、当技術分野で既知の方法により測定可能である。
【０１３４】
酵素は、酵素反応を行わせるのに適切な任意の形態であってよい。これらは精製されていても部分的に精製されていても、粗細胞抽出物または部分的に精製された抽出物の形態であってもよい。酵素が適切な担体に固定化されることも可能である。
【０１３５】
実施例では、様々な起源に由来するホスホケトラーゼおよび／またはアルドラーゼを使用する、本発明によるインビトロでの反応について例示する。
【０１３６】
本発明によるインビトロでの方法は、ワンポット反応、すなわち、基質が望ましい変換に必要な上記酵素と１つの反応混合物中で組み合わされ、反応を、各産物を生成するのに十分な時間進行させる反応において実施されうる。あるいはこの方法は、連続的に１種または複数の酵素的ステップを行うことにより、すなわち、まず基質を１種または複数の酵素と混合し、反応を中間体へ進行させ、次いで１種または複数のさらなる酵素を添加して中間体をさらに中間体または最終産物のいずれかに変換することにより実施されてもよい。
【０１３７】
本発明によるインビトロでの方法は、当技術分野で既知の方法を使用して望ましい産物を回収することにより、これを収集するステップをさらに含みうる。
【０１３８】
別の実施形態において、本発明による方法は、Ｄ−フルクトース、および／もしくはＤ−エリトロース、および／もしくはグリコールアルデヒド、および／もしくはアセチルリン酸を生成するのに必要な、または生成したアセチルリン酸を、本明細書で上記される通り、酢酸もしくはアセチル−ＣｏＡなどのその他の化合物にさらに変換するのに必要な上記の酵素のうち、少なくとも１つを生成する生物、好ましくは微生物の存在下で、培養物中で実施される。したがって、別の実施形態において、本発明による方法は、本発明の方法のうち１つによるＤ−フルクトースを生成するのに必要な少なくとも１つの上記酵素を生成する生物、好ましくは微生物の存在下で、培養物中で実施される。さらに、別の実施形態において、本発明による方法は、本発明の方法のうち１つによる、Ｄ−エリトロースおよびアセチルリン酸を生成するのに必要な上記酵素を生成する生物、好ましくは微生物の存在下で、培養物中で実施される。さらに、別の実施形態において、本発明による方法は、本発明の方法のうち１つによる、グリコールアルデヒドを生成するのに必要な上記酵素を生成する生物、好ましくは微生物の存在下で、培養物中で実施される。さらに、別の実施形態において、本発明による方法は、本発明の方法のうち１つによる、アセチルリン酸を生成するのに必要な上記酵素のうち少なくとも１つを生成する生物、好ましくは微生物の存在下で、培養物中で実施される。本発明による方法を実施するための微生物を使用する方法は、「インビボでの」方法と称される。
【０１３９】
各基質は外部から供給されても、上記各基質の生成のための対応する酵素を発現する、使用される微生物により生成されてもよい。このような微生物は、上記の酵素的変換のうち１つのための少なくとも１つの酵素を発現する。
【０１４０】
したがって、本発明のこのような実施形態において、上記で指定される酵素のうち少なくとも１つを生成する生物、好ましくは微生物が使用される。必要な酵素のうち１種または複数を天然に生成する（微）生物を使用すること、およびこのような（微）生物を、これが天然に発現しない酵素も発現するように遺伝子改変することも可能である。
【０１４１】
必要な酵素活性のうち１つを天然に発現する（微）生物が使用される場合、この活性が（微）生物において過剰発現するように、このような（微）生物を改変することができる。これは、例えば、遺伝子を確実により高度に発現するプロモーターが生じるように、対応する遺伝子のプロモーター領域に突然変異を起こすことにより実現可能である。あるいは、より高い活性を示す酵素が生じるように遺伝子を突然変異させることもできる。
【０１４２】
上記の酵素的変換を実現するのに必要な酵素を発現する（微）生物を使用することにより、酵素を分離または精製する必要なく、培養培地において直接、本発明による方法を実施することができる。
【０１４３】
一実施形態において、本発明による方法において使用される生物は、上記酵素のうち１種または複数をコードする、１種または複数の外来性の核酸分子を含むように遺伝子改変された生物、好ましくは微生物である。「外来性の」という語は、この文脈において、核酸分子が前記生物／微生物に天然に存在しないことを意味する。これは、核酸分子が同じ構造で、またはその生物／微生物の同じ位置に存在しないことを意味する。好ましい一実施形態において、外来性の核酸分子は、プロモーターおよび各酵素をコードするコード配列を含み、コード配列の発現を推進するプロモーターがコード配列に関して異種である、組換え分子である。この文脈において、異種の、はプロモーターが、前記コード配列の発現を天然に推進するプロモーターではなく、異なるコード配列の発現を天然に推進するプロモーターである、すなわち、プロモーターが別の遺伝子由来であるか、合成プロモーターまたはキメラプロモーターであることを意味する。好ましくは、プロモーターは生物／微生物に対し異種のプロモーター、すなわち、各生物／微生物に天然に存在しないプロモーターである。さらにより好ましくは、プロモーターは誘導性プロモーターである。異なる種類の生物、特に微生物における発現を推進するプロモーターが、当業者に周知である。
【０１４４】
さらなる実施形態において、核酸分子は、コードされる酵素がその生物／微生物にとって内因性でない、すなわち、その生物／微生物が遺伝子改変されていない場合、その生物／微生物によって天然に発現されないという点で、その生物／微生物にとって外来性である。言い換えれば、コードされる酵素がその生物／微生物に関して異種である。外来性の核酸分子は、染色体外の形態、例えばプラスミドとして生物／微生物に存在していても、染色体に安定に組み込まれていてもよい。安定な組み込みが好ましい。したがって、遺伝子改変は、例えば、酵素をコードする対応する遺伝子を染色体に組み込むこと、または酵素コード配列の上流にプロモーターを含むプラスミドであって、プロモーターおよびコード配列が好ましくは異なる生物由来であるプラスミドから酵素を発現させること、または当業者に既知の任意のその他の方法からなることがある。
【０１４５】
本発明で使用される生物は、原核生物または真核生物であってよく、好ましくは、細菌、酵母、菌類もしくはカビなどの微生物、または植物細胞、または動物細胞である。特定の実施形態において、微生物は細菌、好ましくはエシェリキア（Escherichia）またはバチルス（Bacillus）属の細菌、さらにより好ましくは大腸菌（Escherichia coli）または枯草菌（Bacillus subtilis）種の細菌である。
【０１４６】
サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）などの極限環境性細菌、またはクロストリジア（Clostridiae）科の嫌気性細菌を使用することもできる。
【０１４７】
一実施形態において、微生物は菌類、より好ましくはサッカロマイセス（Saccharomyces）、シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）、アスペルギルス（Aspergillus）、トリコデルマ（Trichoderma）、ピキア（Pichia）またはクリベロマイセス（Kluyveromyces）属の菌類、さらにより好ましくはサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クロコウジカビ（Aspergillus niger）、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）またはクリベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）種の菌類である。
【０１４８】
別の実施形態において、本発明による方法は、少なくとも１つの、上記の酵素的変換を実現するのに必要な酵素を発現する光合成微生物を使用する。好ましくは、微生物は光合成細菌または微細藻類である。さらなる実施形態において、微生物は藻類、より好ましくは珪藻類に属する藻類である。
【０１４９】
本発明による方法において、異なる（微）生物が上記の異なる酵素を発現する、（微）生物の組み合わせを使用することも想定できる。
【０１５０】
別の実施形態において、本発明による方法は、上記の酵素的変換を実現するのに必要な酵素のうち、少なくとも１つを発現する多細胞生物を使用する。このような生物の例は植物または動物である。
【０１５１】
特定の実施形態において、本発明による方法は、標準的な培養条件（３０〜３７℃、１ａｔｍ、細菌を好気的に増殖させる発酵槽内）または非標準的な条件（例えば好熱性生物の培養条件に相当するより高い温度）において微生物を培養することを伴う。
【０１５２】
本発明による方法が、各酵素活性をもたらす生物／微生物を使用することによりインビボで実施される場合、生物、好ましくは微生物が、酵素反応を発生させる適切な培養条件下で培養される。特定の培養条件は、使用される特定の生物／微生物によって決まるが、当業者に周知である。培養条件は一般的に、各反応のための酵素をコードする遺伝子が発現されるように選択される。化学的誘導因子または温度変化による遺伝子発現の誘導など、培養の特定の段階で特定の遺伝子発現を改善および微調整するための各種方法が、当業者に既知である。
【０１５３】
別の実施形態において、本発明による方法において使用される生物は植物である。基本的には、可能性のある任意の植物、すなわち単子葉植物または双子葉植物が使用可能である。農学的に有意義な規模で栽培可能であり、多量のバイオマスを生成する植物を使用することが好ましい。例は、ドクムギ属（Lolium）などのイネ科草本、ライムギ、コムギ、オオムギ、エンバク、アワ、トウモロコシなどの穀物、ジャガイモなどのその他のデンプン貯蔵植物、またはサトウキビもしくはテンサイなどの糖貯蔵植物である。タバコ、またはトマト、コショウ、キュウリ、ナスなどの野菜植物の使用も想定可能である。別の可能性は、ナタネ、オリーブなどの油貯蔵植物の使用である。樹木、特にユーカリ、ポプラまたはゴムノキ（パラゴムノキ（Hevea brasiliensis））などの生育の早い樹木の使用も想定可能である。
【０１５４】
別の実施形態において、本発明の方法は、（細胞)培養物の形態で、好ましくは液体の細胞培養物の形態で、各々の酵素活性（単数または複数）を有する生物、好ましくは微生物を用意するステップ、各酵素を発現させる適切な条件下で、発酵槽（しばしばバイオリアクターとも称される）において生物、好ましくは微生物を培養するその後のステップを含み、本明細書で上記される本発明の方法での酵素的変換を行うステップをさらに含む。適切な発酵槽またはバイオリアクター装置、および発酵条件が当業者に既知である。バイオリアクターまたは発酵槽は、生物的に活性な環境を支持する、当技術分野で既知の製造または設計された任意の装置または系を指す。したがって、バイオリアクターまたは発酵槽は、本発明の方法などの化学的／生化学的プロセスが実施され、生物、好ましくは微生物、および／または生化学的に活性な物質、すなわち、このような生物または上記酵素を含有する生物由来の上記酵素を内包する容器であってよい。バイオリアクターまたは発酵槽において、このプロセスは好気的でも嫌気的でもよい。これらのバイオリアクターは、一般的に円筒状であり、リットル〜立方メートルのサイズの範囲であってよく、しばしばステンレス鋼製である。この点において、理論に拘束されることなく、発酵槽またはバイオリアクターは、例えば、当技術分野で全てが一般的に既知であるバッチ培養、流加培養、灌流培養またはケモスタット培養において、生物、好ましくは微生物を培養するのに適切であるように設計されてよい。
【０１５５】
培養培地は、各生物または微生物を培養するのに適切な任意の培養培地であってよい。好ましい実施形態において、培養培地は、フルクトース、またはフルクトース（スクロースなど）を含み、そこからフルクトースが遊離されうる化合物、またはその他のヘキソース、例えばグルコースなどの、フルクトースに変換されうる化合物を含む。
【０１５６】
上記の通り、本発明による方法において、上記の酵素的変換を実現するのに必要な酵素のうち、少なくとも１つをコードする核酸分子を含むように遺伝子改変された（微）生物を使用することができる。上記酵素をコードするこのような核酸分子は、単独でまたはベクターの一部として使用可能である。核酸分子は、核酸分子に含まれるポリヌクレオチドに作動可能に連結させた発現制御配列をさらに含んでいてよい。「作動可能に（operatively）連結させた」または「作動可能に（operably）連結させた」という語は、本明細書を通して、発現制御配列に適合する条件下で発現が実現されるような、１種または複数の発現制御配列と発現されるべきポリヌクレオチドのコード領域との間の連結を指す。
【０１５７】
発現は、異種のＤＮＡ配列の、好ましくは翻訳可能なｍＲＮＡへの転写を含む。菌類および細菌における発現を確実にする調節エレメントが当業者に周知である。これらは、プロモーター、エンハンサー、終結シグナル、ターゲティングシグナルなどを包含する。ベクターについての説明に関して、例をこれより下に示す。
【０１５８】
核酸分子と連結して使用するプロモーターは、その起源に関しておよび／または発現されるべき遺伝子に関して相同または異種であってよい。適切なプロモーターは、例えば構成的発現に適したプロモーターである。しかし、外的影響により決定されるある時点でのみ活性化されるプロモーターが使用されてもよい。人工および／または化学的誘導性プロモーターがこの文脈で使用されてもよい。
【０１５９】
ベクターは、ベクターに含まれる前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結させた発現制御配列をさらに含んでいてよい。これらの発現制御配列は、細菌または菌類において、翻訳可能なＲＮＡを確実に転写および合成するのに適していてよい
【０１６０】
本発明による方法において使用される酵素は、天然に存在する酵素（すなわち、ホスホケトラーゼ、アルドラーゼ、グルコース−フルクトースイソメラーゼおよび／またはホスホトランスアセチラーゼ）、または例えば、突然変異、もしくは例えば酵素活性、安定性などを変化もしくは改善するその他の変化の導入による、天然に存在する酵素由来の酵素であってよい。
【０１６１】
タンパク質の望ましい酵素活性を改変および／または改善する方法は当業者に周知であり、例えば、ランダム突然変異誘発もしくは部位特異的突然変異誘発、およびその後の、望ましい特性を有する酵素の選択、またはいわゆる「定向進化」手法を含む。
【０１６２】
さらに、分子生物学における通常の方法により（例えばSambrook and Russell (2001), Molecular Cloning：A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USAを参照のこと）、ポリヌクレオチドに様々な突然変異を挿入することができ、場合により改変された生物的特性を有するポリペプチドの合成がもたらされる。例えばアミノ酸配列の改変がポリペプチドの生物活性または調節に影響を及ぼす位置での、点突然変異の導入が想定可能である。
【０１６３】
さらに、改変された基質または産物特異性を有する突然変異体が調製可能である。好ましくは、このような突然変異体は活性の増大を示す。さらに、上記で定義される酵素をコードするポリヌクレオチドに突然変異を導入することで、前記ポリヌクレオチドによりコードされる酵素の遺伝子発現率および／または活性を最適化することができる。
【０１６４】
細菌または菌類を遺伝子改変するため、上記で定義される酵素をコードするポリヌクレオチドまたはこれらの分子の一部が、突然変異誘発、またはＤＮＡ配列の組換えによる配列改変を可能にするプラスミドに導入されてよい。標準的な方法（Sambrook and Russell (2001), Molecular Cloning：A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USAを参照のこと）により、塩基置換を行い、または天然もしくは合成配列を加えることができる。断片にアダプターおよびリンカーを適用することにより、ＤＮＡ断片を互いに連結することができる。さらに、適切な制限部位をもたらすか、過剰なＤＮＡまたは制限部位を除去する工学的操作手段（engineering measure）が使用可能である。挿入、欠失または置換が可能である場合、インビトロでの突然変異誘発、「プライマー修復」、制限またはライゲーションが使用可能である。一般的に、配列解析、制限解析、ならびにその他の生化学的および分子生物学的方法が解析方法として実施される。
【０１６５】
本発明の文脈において、「活性の増大」は、酵素の、特に、遺伝子改変された微生物におけるホスホケトラーゼ、アルドラーゼ、グルコース−フルクトースイソメラーゼおよび／またはホスホトランスアセチラーゼの発現および／または活性が、対応する非改変微生物よりも少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％または５０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％または８０％、特に好ましくは少なくとも９０％または１００％高いことを意味する。さらにより好ましい実施形態において、発現および／または活性の増大は少なくとも１５０％、少なくとも２００％または少なくとも５００％であってよい。特に好ましい実施形態において、発現は、対応する非改変微生物よりも少なくとも１０倍、より好ましくは少なくとも１００倍、さらにより好ましくは少なくとも１０００倍高い。
【０１６６】
発現／活性の「増大」という語は、対応する非改変微生物が対応する酵素を発現しないため、非改変微生物における対応する発現／活性がゼロである状態も包含する。
【０１６７】
細胞における所定のタンパク質の発現レベルを測定する方法は、当業者に周知である。一実施形態において、発現レベルの測定は、対応するタンパク質の量を測定することにより行われる。対応する方法は当業者に周知であり、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡなどが含まれる。別の実施形態において、発現レベルの測定は、対応するＲＮＡの量を測定することにより行われる。対応する方法は当業者に周知であり、例えばノザンブロットが含まれる。
【０１６８】
本発明による方法において使用される酵素の酵素活性を測定する方法は、当技術分野で既知であり、既に上記されている。
【０１６９】
（微）生物に導入されたポリヌクレオチドは、上記の活性のうちいずれかを有するポリペプチドの生成をもたらすように発現される。様々な発現系の概要が、例えば、Methods in Enzymology 153 (1987), 385-516、Bitter et al. (Methods in Enzymology 153 (1987), 516-544)およびSawers et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 46 (1996), 1-9)、Billman-Jacobe (Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 500-4)、Hockney (Trends in Biotechnology 12 (1994), 456-463)、Griffiths et al., (Methods in Molecular Biology 75 (1997), 427-440)に含まれる。酵母発現系の概要が、例えば、Hensing et al. (Antonie van Leuwenhoek 67 (1995), 261-279)、Bussineau et al. (Developments in Biological Standardization 83 (1994), 13-19)、Gellissen et al. (Antonie van Leuwenhoek 62 (1992), 79-93)、Fleer (Current Opinion in Biotechnology 3 (1992), 486-496)、Vedvick (Current Opinion in Biotechnology 2 (1991), 742-745)およびBuckholz (Bio/Technology 9 (1991), 1067-1072)で与えられる。
【０１７０】
発現ベクターは、文献に広く記載されている。概して、これらは、選択マーカー遺伝子、および選択された宿主における複製を確実にする複製起点だけでなく、細菌またはウイルスプロモーター、およびほとんどの場合、転写のための終結シグナルも含む。プロモーターと終結シグナルとの間には、一般的に少なくとも１つの制限部位、またはコーディングＤＮＡ配列の挿入を可能にするポリリンカーが存在する。対応する遺伝子の転写を天然に制御するＤＮＡ配列は、選択された宿主生物において活性であれば、プロモーター配列として使用可能である。しかし、この配列はその他のプロモーター配列と置換されてもよい。遺伝子の構成的発現を確実にするプロモーター、および遺伝子発現の意図的な制御を可能にする誘導性プロモーターを使用することができる。これらの特性を有する細菌およびウイルスプロモーター配列が、文献に詳細に記載されている。微生物（例えば大腸菌（E. coli）、Ｓ・セレビシエ（S. cerevisiae））における発現のための制御配列も文献に十分に記載されている。下流の配列を特に高度に発現させるプロモーターは、例えば、Ｔ７プロモーター（Studier et al., Methods in Enzymology 185 (1990), 60-89）、ｌａｃＵＶ５、ｔｒｐ、ｔｒｐ−ｌａｃＵＶ５（DeBoer et al., in Rodriguez and Chamberlin (Eds), Promoters, Structure and Function; Praeger, New York, (1982), 462-481；DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983), 21-25）、ｌｐ１、ｒａｃ（Boros et al., Gene 42 (1986), 97-100）である。誘導性プロモーターは、好ましくはポリペプチドの合成に使用される。これらのプロモーターはしばしば、構成的プロモーターよりも高いポリペプチド収量をもたらす。最適な量のポリペプチドを得るため、２段階プロセスがしばしば使用される。まず、比較的高い細胞密度になるまで、最適な条件下で宿主細胞を培養する。第２のステップでは、使用されるプロモーターの種類に応じて転写が誘導される。この点において、ラクトースまたはＩＰＴＧ（＝イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）により誘導されうるｔａｃプロモーターが特に適切である（deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 21-25）。転写の終結シグナルについても文献に記載されている。
【０１７１】
本発明による、ポリヌクレオチドまたはベクターによる宿主細胞の形質転換は、例えばSambrook and Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USA；Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990に記載される通り、標準的な方法により実施することができる。宿主細胞は、特にｐＨ値、温度、塩濃度、エアレーション、抗生物質、ビタミン、微量元素などに関して、使用される特定の宿主細胞の必要条件を満たす栄養培地において培養される。
【０１７２】
本発明は、Ｄ−フルクトースからのＤ−エリトロースおよび／またはアセチルリン酸の生成のための、ホスホケトラーゼの使用またはホスホケトラーゼを発現する（微）生物の使用にも関する。ホスホケトラーゼおよび（微）生物に関しては、本発明による方法に関して上記に示すものと同じものが適用される。
【０１７３】
本発明は、Ｄ−エリトロースからのグリコールアルデヒドの生成のための、上記、２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．４）またはフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．１３）、または２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．４）を発現する（微）生物またはフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．１３）を発現する（微）生物の使用にも関する。２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．４）、フルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．１３）および（微）生物に関しては、本発明による方法に関して上記に示すものと同じものが適用される。
【０１７４】
好ましい実施形態において、本発明は、Ｄ−フルクトースからのアセチルリン酸の生成のための、生物または微生物の使用にも関する。したがって、好ましい実施形態において、本発明は、Ｄ−フルクトースからのアセチルリン酸の生成ための生物または微生物の使用であって、前記生物または微生物が（ｉ）上記で定義されるホスホケトラーゼ；および（ｉｉ）上記で定義される２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．４）またはフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．１３）を発現する、使用にも関する。ホスホケトラーゼ、２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．４）、フルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．１３）および（微）生物に関しては、本発明による方法に関して上記に示すものと同じものが適用される。
【０１７５】
本発明が、Ｄ−グルコースからのアセチルリン酸の生成のための、生物または微生物の使用に関することも好ましい。したがって、好ましい実施形態において、本発明は、Ｄ−グルコースからのアセチルリン酸の生成のための生物または微生物の使用であって、前記生物または微生物が、（ｉ）上記で定義されるホスホケトラーゼ；および（ｉｉ）２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ （ＥＣ  ４．１．２．４）またはフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．１３）を発現し、前記生物または微生物が、（ｉｉｉ）フルクトース−グルコースイソメラーゼ、好ましくはキシロースイソメラーゼ（ＥＣ  ５．３．１．５）をさらに発現する、使用にも関する。ホスホケトラーゼ、２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．４）、フルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．１３）、フルクトース−グルコースイソメラーゼおよび（微）生物に関しては、本発明による方法に関して上記に示すものと同じものが適用される。
【０１７６】
本発明は、Ｄ−フルクトースからのＤ−エリトロースおよび／またはアセチルリン酸の生成のための、ホスホケトラーゼの使用またはホスホケトラーゼを発現する（微）生物の使用だけでなく、Ｄ−フルクトースからのグリコールアルデヒドおよびアセチルリン酸の生成のための、ホスホケトラーゼ、または上記ホスホケトラーゼを発現する（微）生物、および２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．４）もしくはフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．１３）、または上記２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．４）を発現するかフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．１３）を発現する（微）生物の組み合わせの使用にも関する。ホスホケトラーゼ、２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．４）、フルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．１３）および（微）生物に関しては、本発明による方法に関して上記に示すものと同じものが適用される。
【０１７７】
本発明は、Ｄ−グルコースからのアセチルリン酸およびＤ−エリトロースの生成のための、ホスホケトラーゼ、または上記ホスホケトラーゼを発現する（微）生物、およびグルコース−フルクトースイソメラーゼ、または上記グルコース−フルクトースイソメラーゼを発現する（微）生物の組み合わせの使用にも関する。ホスホケトラーゼ、グルコース−フルクトースイソメラーゼおよび（微）生物に関しては、本発明による方法に関して上記に示すものと同じものが適用される。
【０１７８】
本発明は、Ｄ−フルクトースからのアセチルリン酸の生成のための、ホスホケトラーゼ、または上記ホスホケトラーゼを発現する（微）生物、および２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．４）もしくはフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．１３）、または上記２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．４）を発現するかフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．１３）を発現する（微）生物の組み合わせの使用にも関する。ホスホケトラーゼ、２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．４）、フルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．１３）および（微）生物に関しては、本発明による方法に関して上記に示すものと同じものが適用される。
【０１７９】
本発明は、Ｄ−グルコースからのアセチルリン酸の生成のための、ホスホケトラーゼ、または上記ホスホケトラーゼを発現する（微）生物、２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．４）もしくはフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．１３）、または上記２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．４）を発現するか、フルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．１３）を発現する（微）生物、およびグルコース−フルクトースイソメラーゼ、または上記グルコース−フルクトースイソメラーゼを発現する（微）生物の組み合わせの使用にも関する。ホスホケトラーゼ、２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．４）、フルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．１３）、グルコース−フルクトースイソメラーゼおよび（微）生物に関しては、本発明による方法に関して上記に示すものと同じものが適用される。
【０１８０】
本発明は、Ｄ−フルクトースおよびホスホケトラーゼを含む組成物にも関する。本発明は、Ｄ−フルクトースおよびホスホケトラーゼ、および２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．４）またはフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．１３）を含む組成物にも関する。
【０１８１】
本発明は、Ｄ−エリトロース、および２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．４）またはフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．１３）を含む組成物にも関する。本発明は、Ｄ−エリトロース、および２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．４）またはフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．１３）、およびホスホケトラーゼを含む組成物にさらに関する。
【０１８２】
本発明は、Ｄ−グルコース、グルコース−フルクトースイソメラーゼおよびホスホケトラーゼを含み、場合によって、２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．４）またはフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．１３）も含む組成物にも関する。
【０１８３】
さらに、本発明は、
（ｉ）Ｄ−フルクトース；および
（ｉｉ）上記ホスホケトラーゼを発現する生物または微生物
を含む組成物にも関する。
【０１８４】
好ましくは、生物または微生物は、２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．４）またはフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．１３）も発現する。
【０１８５】
さらに、本発明は、
（ｉ）Ｄ−エリトロース；および
（ｉｉ）上記２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．４）またはフルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．１３）を発現する生物または微生物
を含む組成物にも関する。
【０１８６】
好ましくは、生物または微生物は、上記で定義されるホスホケトラーゼまたはスルホアセトアルデヒドアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．３．３．１５）も発現する。
【０１８７】
本発明は、
（ｉ）Ｄ−グルコース；ならびに
（ｉｉ）上記グルコース−フルクトースイソメラーゼを発現し、かつホスホケトラーゼを発現する生物または微生物
を含む組成物にも関する。
【０１８８】
好ましくは、生物または微生物は、２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．４）、フルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．１３）も発現し、さらにより好ましくはスルホアセトアルデヒドアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．３．３．１５）も発現する。
【０１８９】
上記組成物の成分の好ましい実施形態に関しては、本発明による方法に関して上記に示すものと同じものが適用される。
【図面の簡単な説明】
【０１９０】
【図１】（天然に存在する）グルコース−フルクトースイソメラーゼ（「第１酵素ステップ」）、ホスホケトラーゼ（「第２酵素ステップ」）、アルドラーゼ（「第３酵素ステップ」）およびホスホケトラーゼ（「第４酵素ステップ」）を使用することによる、Ｄ−エリトロースおよびグリコールアルデヒドを介した、Ｄ−グルコース（またはＤ−フルクトース）からのアセチルリン酸生成の人工の代謝経路を示す図である。
【図２】ａ）ビフィドバクテリウム・シュードロンガム（Bifidobacterium pseudolongum）由来のホスホケトラーゼ、および基質としてＤ−フルクトースを用いたホスホケトラーゼアッセイにおける反応混合物；ｂ）酵素なしでの反応混合物のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図３】ビフィドバクテリウム・シュードロンガム（Bifidobacterium pseudolongum）のホスホケトラーゼにより触媒されたホスホケトラーゼ反応における、基質濃度の関数としての速度のプロットを示す図である。初速度は反応の１００分間の動態から算出した。
【図４】ａ）ビフィドバクテリウム・シュードロンガム（Bifidobacterium pseudolongum）由来のホスホケトラーゼ、および基質としてグリコールアルデヒドを用いたホスホケトラーゼアッセイにおける反応混合物；ｂ）酵素なしでの反応混合物のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図５】スルホアセトアルデヒドアセチルトランスフェラーゼ（Ｘｓｃ）により触媒されて、リン酸存在下でグリコールアルデヒドから生成したアセチルリン酸の加水分解による、酢酸の生成を示す図である。
【図６】示される通り、様々な２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼにより触媒されて、Ｄ−エリトロースから生成したグリコールアルデヒドの生成を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０１９１】
本発明のその他の態様および利点を、限定のためではなく例示のために与えられる、以下の実施例に記載する。
【０１９２】
本出願で引用される各公開、特許、特許出願またはその他の文書は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
[実施例]
【実施例１】
【０１９３】
ホスホケトラーゼのクローニング、発現および精製
組換え酵素の遺伝子合成、クローニングおよび発現
原核生物のゲノムから推測されるホスホケトラーゼの配列を、大腸菌（E. coli）のコドン使用に適合するように、オリゴヌクレオチドの連結により作り出した（遺伝子はＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）により商業的に合成した）。精製のためのアフィニティタグを与えるため、ヒスチジンコドン６つのストレッチを、メチオニン開始コドンの後に挿入した。このように合成された遺伝子を、改変マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を含む改変ｐＵＣ１８発現ベクター（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）にクローニングした。目的の遺伝子をＰａｃＩおよびＮｏｔＩ制限部位にクローニングした。
【０１９４】
コンピテントなＭＧ１６５５大腸菌（E. coli）細胞を、標準的な熱ショック法を使用して、これらのベクターにより形質転換した。形質転換された細胞を、３０℃で２４時間、１６０ｒｐｍで振とうしてＬＢ−アンピシリン培地において増殖させた。
【０１９５】
４℃、１０，０００ｒｐｍ、２０分間の遠心処理により細胞を収集し、ペレットを−８０℃で保存した。
【０１９６】
タンパク質精製および濃縮
培養された細胞２００ｍｌからペレットを氷上で解凍し、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴおよび１０ｍＭ  イミダゾールを含むｐＨ７．５の５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ３ｍｌ中で再懸濁させた。ｌｙｓｏｎａｓｅ（Ｍｅｒｃｋ）１０μｌを添加した。細胞を室温で１０分間インキュベートし、次いで２０分間氷上に戻した。２ｘ３０秒のソニケーションにより細胞溶解を完了させた。次いで細菌抽出物を、４℃、１０，０００ｒｐｍ、２０分間の遠心処理により清澄にした。清澄にした細菌ライセートを、６−Ｈｉｓ標識タンパク質を吸着するＰＲＯＴＩＮＯ−１０００  Ｎｉ−ＴＥＤカラム（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）にローディングした。カラムを洗浄し、目的の酵素を３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、２５０ｍＭ  イミダゾールを含むｐＨ７．５の５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ４ｍｌで溶出させた。次いで溶出液をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４  １０ｋＤａフィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮、脱塩し、酵素をｐＨ７．５の５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ中で再懸濁させた。酵素調製物を、長期保存の前に１０％グリセロールを補充した。ＮａｎｏＤｒｏｐ１０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）での、ＵＶ２８０ｎｍでの直接の測定により、タンパク質濃度を定量した。このように精製されたタンパク質の純度は、７０％〜９０％と様々であった。
【実施例２】
【０１９７】
基質としてＤ−フルクトースを用いた、ホスホケトラーゼ活性についての研究
酵素反応
酵素反応を以下の条件で実施した：
５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５
５０ｍＭ  リン酸ナトリウム  ｐＨ７．５
５ｍＭ  チアミンピロリン酸（ＴＰＰ）
５ｍＭ  ＭｇＣｌ２
２３ｍＭ  フッ化ナトリウム
１．９ｍＭ  Ｌ−システイン塩酸塩
５０ｍＭ  フルクトース（Ｓｉｇｍａ）
ｐＨを７．５に調整した
酵素濃度は３〜５ｍｇ／ｍｌの範囲であった。
【０１９８】
酵素が添加されないか、基質が添加されない対照アッセイを行った。
【０１９９】
ホスホケトラーゼが基質としてＤ−フルクトースを使用する能力を、最大３つの解析方法：ＨＰＬＣベースの解析を使用する酢酸およびＤ−エリトロースの検出、ならびにアセチルリン酸の化学的測定を使用することにより確認した。
【０２００】
ＨＰＬＣベースの方法
ホスホケトラーゼ存在下でのＤ−フルクトースからの酢酸およびＤ−エリトロースの形成を、ＨＰＬＣベースの方法を使用して観察した。アセチルリン酸は加水分解に対し特に不安定であり、酢酸を遊離する。したがって、酢酸の観察を分析方法の一部として選択した。
【０２０１】
酵素反応（上記を参照のこと）を、３７℃で振とうしながら１８時間、総体積０．１５ｍｌ中で行い、８０℃での５分間のインキュベーションにより停止させた。次いでアッセイチューブを遠心処理し、清澄にした上清１００μｌを清潔なバイアルに移した。市販の酢酸ナトリウム、Ｄ−フルクトースおよびＤ−エリトロース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を基準として使用した。屈折率検出器（refractometer detector）およびカラム加熱モジュールを備えた１２６０  Ｉｎｉｆｉｎｉｔｙ  ＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、ＨＰＬＣ解析を行った。ＰＬ  Ｈｉ−Ｐｌｅｘ  Ｈ  Ｇｕａｒｄ  Ｃｏｌｕｍｎ（５０ｘ７．７ｍｍ）を備えたＨｉ−Ｐｌｅｘ  Ｈ  ｃｏｌｕｍｎ（３００ｘ７．７ｍｍ、粒径８μｍ、カラム温度６５℃）で試料１０μｌを分離した。移動相は硫酸水溶液（５．５ｍＭ）からなっており、流速０．６ｍｌ／分で流した。これらの条件下でのＤ−フルクトース、Ｄ−エリトロースおよび酢酸ナトリウム保持時間は、それぞれ１２．５、１４．４および１８．５分であった。ビフィドバクテリウム・シュードロンガム（Bifidobacterium pseudolongum）由来の組換えホスホケトラーゼにより得られた典型的なクロマトグラムを図２に示す。
【０２０２】
ＨＰＬＣ解析結果を表１に示す。酢酸およびＤ−エリトロースの収量は、Ｄ−フルクトースの炭素部分の定量的回収を示す。
【０２０３】
【表１】
2017516475.tif 000012
【０２０４】
ヒドロキサム酸ベースの比色分析アッセイを使用する、Ｄ−フルクトースからのアセチルリン酸形成の動態解析
酵素反応の組成は、上記と同一であった。様々なＤ−フルクトース濃度（０〜５００ｍＭ）および一定のリン酸ナトリウム濃度（５０ｍＭ）を使用して、動態パラメータを決定した。
【０２０５】
精製された３ｍｇ／ｍｌホスホケトラーゼを添加することにより、各酵素反応を開始させた。３７℃で振とうしながら、２０、４０、６０、８０、１００分間インキュベーションを行った。以下の手順を使用するアセチル−ヒドロキサム酸鉄（ＩＩＩ）の検出によって、アセチルリン酸濃度を決定した（Racker E., Methods Enzymol. 5, 1962, 276-280）：
ヒドロキシルアミン塩酸塩（２Ｍ、ｐＨ６．５）０．１ｍｌを反応混合物０．１ｍｌに添加した。室温での１０分間のインキュベーション後、３０％トリクロロ酢酸３５μｌで試料を酸性化した。次いで８Ｍ  ＨＣｌ３５μｌおよびＦｅＣｌ３試薬（０．１Ｍ  ＨＣｌ中１０％ＦｅＣｌ３）３５μｌを添加した。遠心処理により試料をさらに清澄にし、アセチル−ヒドロキサム酸鉄（ＩＩＩ）錯体の５０５ｎｍでの吸光度を測定した。市販のアセチルリン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して較正曲線を作成した。精製された組換えホスホケトラーゼについて得られた動態パラメータを表２に示す。
【０２０６】
【表２】
2017516475.tif 000013
【０２０７】
図３は、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム（Bifidobacterium pseudolongum）由来のホスホケトラーゼについて収集されたデータに対応する、ミカエリス−メンテンプロットの例を示す。
【実施例３】
【０２０８】
基質としてグリコールアルデヒドを用いた、ホスホケトラーゼの活性解析
酵素反応
酵素反応を以下の条件下で実施した：
５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５
５０ｍＭ  リン酸ナトリウム  ｐＨ７．５
５ｍＭ  チアミンピロリン酸（ＴＰＰ）
５ｍＭ  ＭｇＣｌ２
２３ｍＭ  フッ化ナトリウム
１．９ｍＭ  Ｌ−システイン塩酸塩
５０ｍＭ  グリコールアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）
ｐＨを７．５に調整した
酵素濃度は３〜５ｍｇ／ｍｌの範囲であった。
【０２０９】
酵素が添加されないか、基質が添加されない対照アッセイを行った。
【０２１０】
ホスホケトラーゼが基質としてグリコールアルデヒドを使用する能力を、最大２つの解析方法：ＨＰＬＣベースの解析を使用する酢酸の検出、およびアセチルリン酸の化学的測定を使用することにより確認した。
【０２１１】
ＨＰＬＣベースの方法
酵素反応（上記を参照のこと）を、３７℃で振とうしながら４８時間行い、８０℃での５分間のインキュベーションにより停止させた。次いでアッセイチューブを遠心処理し、清澄にした上清１００μｌを清潔なバイアルに移した。実施例２に記載される手順に従って、Ｈｉ−Ｐｌｅｘ  ＨカラムでＨＰＬＣ解析を行った。市販の酢酸ナトリウムおよびグリコールアルデヒド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を基準として使用した。これらの条件下でのグリコールアルデヒドの保持時間は１５．４分であった。
【０２１２】
ホスホケトラーゼ存在下での酵素アッセイでは相当量の酢酸が生成し、酵素なしの対照反応では酢酸シグナルは検出されなかった。
【０２１３】
ビフィドバクテリウム・シュードロンガム（Bifidobacterium pseudolongum）由来のホスホケトラーゼにより得られた典型的なクロマトグラムを、図４に示す。
【０２１４】
ヒドロキサム酸ベースの比色分析アッセイを使用する、グリコールアルデヒドからのアセチルリン酸形成の動態解析
酵素反応の組成は、上記と同一であった。様々なグリコールアルデヒド濃度（０〜１００ｍＭ）および一定のリン酸ナトリウム濃度（５０ｍＭ）を使用して、動態パラメータを決定した。
【０２１５】
精製された３ｍｇ／ｍｌホスホケトラーゼを添加することにより、各アッセイを開始させた。３７℃で振とうしながら、２０、４０、６０、８０、１００分間インキュベーションを行った。実施例２に記載される手順によるアセチルヒドロキサム酸鉄（ＩＩＩ）の検出によって、アセチルリン酸濃度を化学的に決定した。
【０２１６】
精製された組換えホスホケトラーゼについて得られた動態パラメータを、表３に示す。
【０２１７】
【表３】
2017516475.tif 000014
【実施例４】
【０２１８】
大腸菌（E. coli）２−デオキシ−Ｄ−リボース−５−リン酸アルドラーゼの発現および精製
タンパク質発現
大腸菌（E.coli）２−デオキシ−Ｄ−リボース−５−リン酸アルドラーゼ（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０Ａ６Ｌ０）をコードする遺伝子を含むベクターｐＣＡＮを、ＮＡＩＳＴ（奈良先端科学技術大学院大学、日本、ＡＳＫＡコレクション）より購入した。提供されたベクターは、メチオニン開始コドンの後にヒスチジンコドン６つのストレッチを含んでいた。
【０２１９】
コンピテントな大腸菌（E. coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）を、標準的な熱ショック法を使用して、このベクターにより形質転換した。形質転換された細胞を、３７℃で７時間、クロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）を添加したＺＹＭ−５０５２オートインダクション培地（Studier FW, Prot. Exp. Pur. 41 (2005), 207-234）で、振とう（１６０ｒｐｍ）しながら増殖させた。タンパク質発現を１８℃で一晩（約１２時間）継続させた。４℃、１０，０００ｒｐｍ、２０分間の遠心処理により細胞を収集し、ペレットを−８０℃で凍結した。
【０２２０】
タンパク質精製
培養された細胞２００ｍｌからペレットを氷上で解凍し、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴおよび１０ｍＭ  イミダゾールを含む５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ６ｍｌ中で再懸濁させた。ｌｙｓｏｎａｓｅ（Ｍｅｒｃｋ）１０μｌを添加した。細胞を室温で１０分間インキュベートし、次いで２０分間氷上に戻した。２ｘ３０秒のソニケーションにより細胞溶解を完了させた。次いで細菌抽出物を、４℃、１０，０００ｒｐｍ、２０分間の遠心処理により清澄にした。
【０２２１】
２−デオキシ−Ｄ−リボース−５−リン酸アルドラーゼを、製造業者の推奨に従って、ＰＲＯＴＩＮＯ−１０００  Ｎｉ−ＴＥＤカラム（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）で精製した。次いで、目的の酵素を含む溶出液を、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４  １０ｋＤａフィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮、脱塩し、５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび１０％  グリセロールを補充した、ｐＨ７．５の５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ中で酵素を再懸濁させた。ＮａｎｏＤｒｏｐ１０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）での、ＵＶ２８０ｎｍでの直接の測定により、タンパク質濃度を定量した。このように精製されたタンパク質の純度は、７０％〜９０％と様々であった。
【実施例５】
【０２２２】
Ｄ−エリトロースからのグリコールアルデヒドの酵素的生成についての研究
酵素反応を以下の条件下で実施した：
５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５
５０ｍＭ  ＮａＣｌ
１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
１ｍＭ  ＤＴＴ
５０ｍＭ  Ｄ−エリトロース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）
ｐＨを７．５に調整した。
精製された２−デオキシ−Ｄ−リボース−５−リン酸アルドラーゼ１ｍｇを、反応混合物０．２ｍｌに添加した。酵素が添加されないか、基質が添加されない対照アッセイを行った。反応混合物を３７℃で一晩（約１８時間）インキュベートし、８０℃での１０分間のインキュベーションにより反応を停止させた。
【０２２３】
次いでアッセイチューブを遠心処理および濾過し、清澄にした上清１００μｌを清潔なバイアルに移した。実施例２に記載される手順に従って、Ｈｉ−Ｐｌｅｘ  ＨカラムでＨＰＬＣ解析を行った。
【０２２４】
基質なしではグリコールアルデヒドの形成が観察されなかった。酵素なしの反応をＨＰＬＣ解析すると、おそらくＤ−エリトロースの自然分解から生じた、微量のグリコールアルデヒドのみが示された。触媒試験により、大腸菌（E.coli）由来の精製された２−デオキシ−Ｄ−リボース−５−リン酸アルドラーゼ存在下で、グリコールアルデヒド生成の有意な増大が示された。酵素存在下で１８時間インキュベーションした後に生成したグリコールアルデヒド対酵素非存在下で生成したグリコールアルデヒドの比は、グリコールアルデヒドピーク面積（表４）から判断して約９倍である。これらの結果は、２−デオキシ−Ｄ−リボース−５−リン酸アルドラーゼが、Ｄ−エリトロースのグリコールアルデヒドへの変換を触媒することを明らかに示している。
【０２２５】
【表４】
2017516475.tif 000015
【実施例６】
【０２２６】
基質としてグリコールアルデヒドを用いた、スルホアセトアルデヒドアセチルトランスフェラーゼ活性についての研究
遺伝子クローニングおよびタンパク質発現
原核生物のゲノムから推測されるスルホアセトアルデヒドアセチルトランスフェラーゼ（Ｘｓｃ）の配列を、大腸菌（E. coli）のコドン使用に適合するように、オリゴヌクレオチドの連結により作り出した（遺伝子はＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）により商業的に合成した）。精製のためのアフィニティタグを与えるため、ヒスチジンコドン６つのストレッチを、メチオニン開始コドンの後に挿入した。このように合成された遺伝子を、ｐＥＴ−２５ｂ（＋）発現ベクター（ベクターはＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）により構築した）にクローニングした。
【０２２７】
コンピテントな大腸菌（E. coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）を、標準的な熱ショック法に従って、これらのベクターにより形質転換した。形質転換された細胞を、３０℃で７時間、ＺＹＭ−５０５２オートインダクション培地（Studier FW, Prot. Exp. Pur. 41 (2005), 207-234）を使用して、振とう（１６０ｒｐｍ）しながら増殖させ、タンパク質発現を１８℃で一晩（約１６時間）継続させた。４℃、１０，０００ｒｐｍ、２０分間の遠心処理により細胞を収集し、ペレットを−８０℃で保存した。
【０２２８】
タンパク質精製
実施例１で指定された手順に従い、ＰＲＯＴＩＮＯ−１０００  Ｎｉ−ＴＥＤカラム（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を使用し、トリス−ＨＣｌ緩衝液の代わりにｐＨ７．５の５０ｍＭ  リン酸ナトリウムを使用して、スルホアセトアルデヒドアセチルトランスフェラーゼを精製した。ＮａｎｏＤｒｏｐ１０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）での、ＵＶ２８０ｎｍでの直接の測定により、タンパク質濃度を定量した。このように精製されたタンパク質の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により推定して、７５％〜９０％と様々であった。
【０２２９】
酵素アッセイ
酵素アッセイを以下の条件下で実施した：
５０ｍＭ  リン酸ナトリウム  ｐＨ７．５
１ｍＭ  チアミンピロリン酸（ＴＰＰ）
５ｍＭ  ＭｇＣｌ２
５０ｍＭ  グリコールアルデヒド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）
ｐＨを７．５に調整した。
精製された５ｍｇ／ｍｌ酵素を添加することにより、各アッセイを開始させた。３７℃で振とうしながら１時間、インキュベーションを行った。酵素が添加されないか、基質が添加されない対照アッセイを行った。
【０２３０】
スルホアセトアルデヒドアセチルトランスフェラーゼ（Ｘｓｃ）が、基質としてグリコールアルデヒドを使用する能力を、２つの解析方法：アセチルリン酸の化学的測定、およびＨＰＬＣベースの解析を使用する酢酸の検出を使用することにより確認した。
【０２３１】
ヒドロキサム酸ベースの比色分析アッセイ
実施例２に記載される手順に従って、アセチル-ヒドロキサム酸鉄の検出により、アセチルリン酸を測定した。
【０２３２】
様々なスルホアセトアルデヒドアセチルトランスフェラーゼによる酵素アッセイにおいて生成したアセチルリン酸濃度を表５に示す。
【０２３３】
【表５】
2017516475.tif 000016
【０２３４】
ＨＰＬＣベースの方法
酵素反応を、３７℃で振とうしながら１時間行い（上記を参照のこと）、８０℃での５分間のインキュベーションにより停止させた。次いでアッセイチューブを遠心処理し、清澄にした上清の分量を清潔なバイアルに移した。実施例２に記載される手順に従って、Ｈｉ−Ｐｌｅｘ  ＨカラムでＨＰＬＣ解析を行った。スルホアセトアルデヒドアセチルトランスフェラーゼ（Ｘｓｃ）によるアッセイでは相当量の酢酸が生成し（図５）、酵素なしの対照および基質なしのアッセイでは酢酸シグナルは観察されなかった。
【０２３５】
総じて、これらのデータは、様々な起源由来のスルホアセトアルデヒドアセチルトランスフェラーゼが、グリコールアルデヒドおよびリン酸からのアセチルリン酸の形成を触媒することができたことを示している。
【実施例７】
【０２３６】
様々な２−デオキシ−Ｄ−リボース−５−リン酸アルドラーゼにより触媒される、Ｄ−エリトロースのグリコールアルデヒドへの変換
各種原核生物および真核生物由来の２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＤｅｏＣ、ＤＥＲＡ）ファミリーの代表例をコードする１１の遺伝子のライブラリーを構築、試験した。
【０２３７】
遺伝子クローニング、タンパク質発現および精製
実施例６に記載される通り、２−デオキシ−Ｄ−リボース−５−リン酸アルドラーゼＥＣ  ４．１．２．４をコードする遺伝子を合成し、ｐＥＴ−２５ｂ（＋）発現ベクター（ベクターは、ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）により構築した）にクローニングした。
【０２３８】
実施例４に指定される通り、対応する酵素を大腸菌（E.coli）で発現させ、精製した。以下のアッセイを使用して、各酵素を、Ｄ−エリトロースからのグリコールアルデヒドの生成を触媒する能力について試験した：
５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５
５０ｍＭ  Ｄ−エリトロース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）
１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
５０ｍＭ  ＮａＣｌ
１ｍＭ  ＤＴＴ
酵素  ５ｍｇ／ｍｌ
酵素が添加されないか、基質が添加されない対照アッセイを行った。３７℃で４時間アッセイを行い（上記を参照のこと）、９５℃での１０分間のインキュベーションにより停止させた。次いでアッセイチューブを遠心処理し、清澄にした上清の分量を清潔なバイアルに移した。屈折率検出器およびカラム加熱モジュールを備えた１２６０  Ｉｎｉｆｉｎｉｔｙ  ＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、ＨＰＬＣ解析を行った。以下の通り連続して結合されたカラム３本を使用して試料１０μｌを分離した：
１．Ｈｉ−Ｐｌｅｘガードカラム（５０ｘ７．７ｍｍ、粒径８μｍ）（Ａｇｉｌｅｎｔ）
２．Ｈｉ−Ｐｌｅｘカラム（１００ｘ７．７ｍｍ、粒径８μｍ）（Ａｇｉｌｅｎｔ）
３．Ｈｉ−Ｐｌｅｘカラム（３００ｘ７．７ｍｍ，粒径８μｍ、カラム温度７０℃）（Ａｇｉｌｅｎｔ）
【０２３９】
移動相は硫酸水溶液（８．４ｍＭ）からなっており、０．５ｍｌ／分で流した。解析は７０℃で行った。
【０２４０】
市販のグリコールアルデヒド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を基準として使用した。これらの条件下でのエリトロースおよびグリコールアルデヒドの保持時間は、それぞれ２０．２および２２分であった。
【０２４１】
基質なしのアッセイではグリコールアルデヒドシグナルは観察されなかった。一定量のグリコールアルデヒドが、商業的に用意されたＤ−エリトロースで見られた（例えば、図６「酵素なし」のバーを参照のこと)。２−デオキシ−Ｄ−リボース−５−リン酸アルドラーゼアッセイは、グリコールアルデヒドピーク面積から判断して、エリトロースからのグリコールアルデヒド生成が酵素に依存して増大することを示した（図６)。これらのデータは、Ｄ−エリトロースのグリコールアルデヒドへの切断が、２−デオキシ−Ｄ−リボース−５−リン酸アルドラーゼにより触媒されうることを示している。
【図１】
2017516475.tif 000017
【図２】
2017516475.tif 000018
【図３】
2017516475.tif 000019
【図４】
2017516475.tif 000020
【図５】
2017516475.tif 000021
【図６】
2017516475.tif 000022
【配列表】
2017516475000001.app
【国際調査報告】
2017516475.tif 000023
2017516475.tif 000024
2017516475.tif 000025