(57)【要約】  本発明は、血管系疾患を治療及び／又は予防する方法に関する。本発明はまた、血管系治療を受けている患者において移植するための医療用デバイスに関し、該デバイスは、内皮一酸化窒素合成酵素と相互作用することができる、治療量のＦＸＹＤ１又はその誘導体を含む。本発明はまた、血管系疾患を治療又は予防するための内皮一酸化窒素合成酵素と相互作用することができるＦＸＹＤ１ならびにその誘導体及び改変体の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管系のレドックス誘導性機能不全を治療又は予防するための方法であって、血管系のレドックス誘導性機能不全を有する又はその危険性を有する患者に、内皮一酸化窒素合成酵素と相互作用することができる、治療的有効量のＦＸＹＤ１又はその誘導体若しくは改変体を投与することを含む、上記方法。
【請求項２】
患者が、内皮機能不全に関連する状態を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
内皮一酸化窒素合成酵素と相互作用することができるＦＸＹＤ１又はその誘導体若しくは改変を投与することが、患者の選択された血管系に、内皮一酸化窒素合成酵素と相互作用することができるＦＸＹＤ１又はその誘導体若しくは改変体をコードする核酸配列の送達を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
内皮一酸化窒素合成酵素と相互作用することができるＦＸＹＤ１又はその誘導体若しくは改変体を投与することが、患者の選択された血管系に、内皮一酸化窒素合成酵素と相互作用することができるＦＸＹＤ１又はその誘導体若しくは改変体をコードするウイルスベクターの送達を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記患者の手術中又は介入処置中に血管に、内皮一酸化窒素合成酵素と相互作用することができるＦＸＹＤ１又はその誘導体若しくは改変体の投与を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
患者への投与が、内皮一酸化窒素合成酵素と相互作用することができるＦＸＹＤ１又はその誘導体若しくは改変体を含む組成物において、手術中の吻合前に冠状動脈バイパス移植片をインキュベートすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
患者への投与が、コーティングされた血管又はコーティングされたステントを患者に移植することを含み、該コーティングは、内皮一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）と相互作用することができるＦＸＹＤ１又はその誘導体若しくは改変体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
患者が、心筋梗塞、糖尿病、例えば、糖尿病性末梢血管系疾患、冠状動脈疾患、冠状動脈、末梢又は脳循環における機能不全、慢性腎不全、例えば、動脈−静脈瘻、急性脳血管障害（脳卒中）、虚血−再灌流傷害、慢性血管系疾患、肺高血圧症、神経筋疾患からなる群から選択される状態を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
患者が、冠動脈バイパス手術を受けている、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
治療が、１つ以上の動脈ステントの配置を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
血管系が、冠動脈、末梢又は脳循環の血管系である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
治療が、慢性腎不全を有する患者の透析に必要とされる動脈−静脈瘻の治療である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
患者が、ｅＮＯＳ脱共役、血管周囲線維症、及び媒体の肥大を特徴とする、肺高血圧症（特発性、又は強皮症又は関連する結合組織疾患状態に続発する）を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
内皮一酸化窒素合成酵素と相互作用することができる、治療量のＦＸＹＤ１又はその誘導体若しくは改変体を含む、血管系治療を受けている患者に移植するための医療用デバイス。
【請求項１５】
内皮一酸化窒素合成酵素と相互作用することができる、ＦＸＹＤ１又はその誘導体若しくは改変体をコードする核酸配列を含む、血管系治療を受けている患者に移植するための医療用デバイス。
【請求項１６】
デバイスが天然に存在する成分（単数又は複数）を含む、請求項１４又は１５に記載の医療用デバイス。
【請求項１７】
デバイスが血管組織又は血管を含む、請求項１４又は１５に記載の医療用デバイス。
【請求項１８】
デバイスが合成成分（単数又は複数）を含む、請求項１４又は１５に記載の医療用デバイス。
【請求項１９】
デバイスが、冠状動脈ステントなどのコーティングされた血管ステントである又はそれを含む、請求項１４又は１５に記載の医療用デバイス。
【請求項２０】
デバイスが、製造されたステント、血管グラフト、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１４又は１５に記載の医療用デバイス。
【請求項２１】
デバイスが薬物溶出ステント又は移植片を含む、請求項１４又は１５に記載の医療用デバイス。
【請求項２２】
血管系のレドックス誘導性機能不全の治療又は予防のための内皮一酸化窒素合成酵素と相互作用することができるＦＸＹＤ１又はその誘導体。
【請求項２３】
血管系のレドックス誘導性機能不全の治療又は予防のための、内皮一酸化窒素合成酵素と相互作用することができるＦＸＹＤ１又はその誘導体を含む組成物。
【請求項２４】
血管系のレドックス誘導性機能不全の治療又は予防のための薬物の製造のための、内皮一酸化窒素合成酵素と相互作用することができるＦＸＹＤ１又はその誘導体。
【請求項２５】
血管系のレドックス誘導性機能不全の治療又は予防のための内皮一酸化窒素合成酵素と相互作用することができるＦＸＹＤ１又はその誘導体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その内容が参照により援用される、２０１４年９月５日に出願された、「血管系疾患を治療及び予防する方法」と題するオーストラリア仮特許出願第２０１４９０３５４７号の優先権を主張する。
【０００２】
分野
本発明は、血管系疾患を治療及び／又は予防する方法に関する。本発明はまた、血管系治療を受けている患者において移植するための医療用デバイスに関し、該デバイスは、内皮一酸化窒素合成酵素と相互作用することができる、治療量のＦＸＹＤ１又はその誘導体を含む。本発明はまた、血管系疾患の治療又は予防のための、内皮一酸化窒素合成酵素と相互作用することができるＦＸＹＤ１ならびにその誘導体及び改変体の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
異常な血管機能は、高血圧、アテローム性動脈硬化症、糖尿病及び老化の主要な特徴であり、例えば、罹患率及び死亡率の主な原因である。これらの疾患状態における血管機能不全を引き起こす共通の因子は、反応性酸素種（ＲＯＳ）の過剰生成である。スーパーオキシドアニオン（Ｏ2・-）及び関連するＲＯＳは、一酸化窒素（ＮＯ）をクエンチするだけでなく、翻訳後の酸化的修飾を介した細胞タンパク質の機能を直接損ない、炎症、細胞増殖、線維症、アテローム性動脈硬化症及び膜輸送の障害を駆動する。血管系疾患におけるこのＲＯＳの上昇の主な原因は、レニン−アンジオテンシン系の活性化であり、これは、ＮＡＤＰＨオキシダーゼのアンジオテンシンＩＩ（Ａｎｇ  ＩＩ）活性化、並びに内皮一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）の脱共役をもたらす。
【０００４】
異常な血管機能を予防又は低下させるための、及び異常な血管機能に関連する医学的な状態を治療又は予防するための新規な又は改善された方法及び薬物が必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
本発明者らは、驚くべきことに、ＦＸＹＤ１が、レドックス誘導の脱共役に対する内皮一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）の内因性プロテクターであり、これは、一酸化窒素（ＮＯ）バイオアベイラビリティの急速な改善、レドックスストレスの減少、ならびに医学的肥大及び血管周囲線維症の慢性的ＮＯ依存性表現型の改善をもたらすことを特定した。例えば、（天然のＦＸＹＤ１若しくは遺伝子操作された誘導体の）組換えタンパク質投薬又は遺伝子移入を介したＦＸＹＤ１の補充は、新規な治療であり、酸化的ストレスによって特徴付けられる広範囲の血管系疾患状態におけるレドックス誘導性機能不全から動脈を保護する（図１に要約される）。
【０００６】
したがって、一態様において、本発明は、血管系のレドックス誘導性機能不全を治療又は予防するための方法を提供し、該方法は、血管系のレドックス誘導性機能不全を被っている又はその危険性を有する患者に、内皮一酸化窒素合成酵素と相互作用することができる、治療有効量のＦＸＹＤ１又はその誘導体若しくは改変体を投与することを含む。
【０００７】
一実施形態において、内皮一酸化窒素合成酵素と相互作用することができるＦＸＹＤ１又はその誘導体の投与は、内皮一酸化窒素合成酵素と相互作用することができるＦＸＹＤ１又はその誘導体をコードする核酸配列を上記患者の選択された血管系に送達することを含む。ある実施形態において、内皮一酸化窒素合成酵素と相互作用することができるＦＸＹＤ１又はその誘導体の投与は、上記患者の選択された血管系へのウイルスベクターの送達、内皮一酸化窒素合成酵素と相互作用することができるＦＸＹＤ１又はその誘導体をコードするウイルスベクターの送達を含む。
【０００８】
一実施形態において、本方法は、上記患者の手術中又は介入処置中に血管に、内皮一酸化窒素合成酵素と相互作用することができるＦＸＹＤ１又はその誘導体の投与を含む。一実施形態において、上記患者への投与は、内皮一酸化窒素合成酵素と相互作用することができるＦＸＹＤ１又はその誘導体若しくは改変体を含む組成物において、手術中の吻合前に冠動脈バイパス移植片をインキュベートすることを含む。一実施形態において、上記患者への投与は、コーティングされた血管又はコーティングされたステントの上記患者に移植することを含み、該コーティングは、内皮一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）と相互作用することができるＦＸＹＤ１又はその誘導体を含む。
【０００９】
一態様において、本発明は、血管系治療を受けている患者において移植するための医療用デバイスを提供し、該デバイスは、内皮一酸化窒素合成酵素と相互作用することができる、治療量のＦＸＹＤ１又はその誘導体を含む。一態様において、本発明は、血管系治療を受ける患者において移植するための医療用デバイスを提供し、該デバイスは、内皮一酸化窒素合成酵素と相互作用することができるＦＸＹＤ１又はその誘導体をコードする核酸配列を含む。
【００１０】
一実施形態において、デバイスはステントである。一実施形態において、デバイスはコーティングされたステントであり、該コーティングは、内皮一酸化窒素合成酵素と相互作用することができるＦＸＹＤ１又はその誘導体を含む。一実施形態において、デバイスは、冠状動脈ステントなどのコーティングされた血管ステントである。医療用デバイスは、血管組織又は血管などの天然に存在する成分（単数又は複数）、製造されたステントなどの合成成分（単数又は複数）、又はそれらの組み合わせを含み得る。一実施形態において、デバイスは、血管移植片であり、これは、天然に存在する材料、合成材料、又はそれらの組み合わせを含み得る。一実施形態において、デバイスは、薬物溶出ステント又は移植片を含むことができる。
【００１１】
一実施形態において、患者は、内皮機能不全に関連する状態を有する。一実施形態において、患者は、心筋梗塞、糖尿病、例えば、糖尿病性末梢血管系疾患、冠状動脈疾患、冠状動脈、末梢又は脳循環における機能不全、慢性腎不全、例えば、動脈−静脈瘻、急性脳血管障害（脳卒中）、虚血−再灌流傷害、慢性血管系疾患、肺高血圧症、神経筋疾患からなる群から選択される状態を有する。
【００１２】
さらなる態様において、本発明は、血管系のレドックス媒介性機能障害の治療又は予防のための、内皮一酸化窒素合成酵素と相互作用することができるＦＸＹＤ１又はその誘導体を提供する。
【００１３】
さらなる態様において、本発明は、血管系のレドックス仲介性機能障害を治療又は予防するための医薬の製造のための、内皮一酸化窒素合成酵素と相互作用することができるＦＸＹＤ１又はその誘導体を提供する。
【００１４】
上述の本発明の概要は限定的ではなく、好ましい実施形態の以下の詳細な説明、及び特許請求の範囲から明らかとなる。
【００１５】
ここで、本発明の好ましい実施形態は、添付の図面を参照して、単なる例として以下に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】内皮細胞におけるｅＮＯＳの脱共役に対するＦＸＹＤ１の保護作用の典型図。Ａｎｇ  ＩＩは、内皮細胞において、グルタチオン化を介して、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ依存性ｅＮＯＳ脱共役を誘導する（Ｇａｌｏｕｇａｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。ＮＡＤＰＨオキシダーゼ（ＮＯＸ）由来のＯ2・-は、Ａｎｇ  ＩＩ  タイプ１受容体（ＡＴ１Ｒ）−共役活性化下、レダクターゼドメイン（Ｇとして示す）の重要なＣｙｓ残基（Ｃ６８９及びＣ９０８）のグルタチオン化によるｅＮＯＳ脱共役を開始し、ＮＯの減少及びＯ2・-産生の増幅をもたらす（上段パネル）。これは、「キンドリング」として作用するＮＯＸ由来のＯ2・-のパラダイム、及び「ボンファイア（ｂｏｎｆｉｒｅ）」として作用する脱共役されたｅＮＯＳのパラダイムを指示し、ｅＮＯＳグルタチオン化は重要な分子スイッチである。ＦＸＹＤ１は、グルタチオン化からｅＮＯＳを保護し（下段パネル）、結果として脱共役し、ＮＯバイオアベイラビリティを劇的に改善し、内皮における細胞の酸化的ストレスを減少させる。
【図２】ＦＸＹＤ１は、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ−全溶解物−ＴＬに見られる）において発現され、ｅＮＯＳと共免疫沈降する。ＩＰ＝免疫沈降物。陰性ＩｇＧのＩＰを対照として示す。
【図３】ＦＸＹＤ１の内因性発現がサイレンシングされると、ｅＮＯＳグルタチオン化が増加する。
【図４】ＦＸＹＤ１発現は、ｅＮＯＳ活性化にとって重要である。ＦＸＹＤ１がサイレンシングされ、又は「ノックダウン」（ＫＤ）されると、ＨＵＶＥＣによるＮＯ産生は、ＮＯ感受性蛍光剤ＤＡＦ−２ＤＡによって評価されるように劇的に減少する。
【図５】Ａｎｇ  ＩＩ（５００ｎＭ）に曝露された細胞におけるスーパーオキシド感受性ジヒドロエチジウム（ＤＨＥ）蛍光に対するｓｉＲＮＡでのＦＸＹＤ１発現のサイレンシングの効果を示すヒストグラムである。
【図６Ａ】ＦＸＹＤ１ノックアウト（マウスモデル）は、インビボでアンジオテンシンＩＩ誘導性のｅＮＯＳ−グルタチオン化の増加をもたらす（１ｍｇ／ｋｇ／日でのＡｎｇ  ＩＩ注入の１週間）。ｅＮＯＳグルタチオン化は、ＧＳＨエピトープＩＰ及びｅＮＯＳイムノブロット（ＩＢ）を用いて決定される。これは、心臓（Ａ）と大動脈（Ｂ）の両方で観察される。図６Ａの左側に示されるサイズマーカーは、１０、１５、２０、２５、３７、５０、７５、１００、１５０及び２５０ｋＤａを表す。
【図６Ｂ】ＦＸＹＤ１ノックアウト（マウスモデル）は、インビボでアンジオテンシンＩＩ誘導性のｅＮＯＳ−グルタチオン化の増加をもたらす（１ｍｇ／ｋｇ／日でのＡｎｇ  ＩＩ注入の１週間）。ｅＮＯＳグルタチオン化は、ＧＳＨエピトープＩＰ及びｅＮＯＳイムノブロット（ＩＢ）を用いて決定される。これは、心臓（Ａ）と大動脈（Ｂ）の両方で観察される。
【図７】ＦＸＹＤ１のノックアウト（ＦＸＹＤＫＯ）は、アンギオテンシンＩＩの投与により悪化する、増大した中央厚をもたらす。
【図８】ＦＸＹＤ１ノックアウトは、血管周囲線維症の増加、及びアンジオテンシンＩＩ誘導性血管周囲線維症の実質的な増大をもたらす。
【図９】ＦＸＹＤ１ノックアウト（マウスモデル）は、基底間質線維症の増加をもたらし、心臓におけるアンジオテンシンＩＩ誘導性間質線維症を増大させる。線維化は、固定された心筋組織上のＭｉｌｌｉｇａｎｓトリクローム染色を用いて視覚化される。**はｐ＜０．０１の有意性を反映する。
【図１０】ＦＸＹＤ１ノックアウト（マウスモデル）は、心エコー検査（肺加速時間）によって測定されるように上昇した肺動脈圧をもたらす。**はｐ＜０．０１の有意性を反映する。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
定義
本明細書で使用される用語「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、主に含むことを意味するが、必ずしも唯一であることを意味しない。さらに、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などの単語「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の変形は、対応して変化する意味を有する。
【００１８】
「対象」及び「患者」という用語は、本明細書において互換的に使用され、ヒトを含み、限定されないが、ヒツジ属、ウシ属、ウマ属、ブタ属、ネコ属、イヌ属、霊長類属、げっ歯類属のメンバーを含む、社会的、経済的又は研究に重要である任意の種の個体が含まれる。
【００１９】
本明細書で使用される用語「治療すること」及び「治療」は、障害、疾患、傷害又は状態に関連する症状を予防、治癒、緩和、改善又は予防するための療法を投与することを含む。
【００２０】
本明細書の文脈において、「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合によって一緒に連結されたアミノ酸から構成されるポリマーを意味する。ポリペプチドは、任意の長さであり得る。文脈がそうでないことを示す場合を除いて、ポリペプチドという用語はまた、ペプチド及びタンパク質も含むことが理解される。
【００２１】
選択可能な要素のグループの文脈において使用される場合、用語「少なくとも１つの」は、グループのメンバーのいずれか１つ、２つ以上、最大すべてのメンバーを含み、個々に選択され、グループのメンバーの任意の組み合わせを含む。同様に、選択可能な要素のグループの文脈において使用される場合、「少なくとも２つの」という用語は、任意の組み合わせのグループの２つ以上のメンバーの任意の選択を含む。
【００２２】
本明細書の文脈において、用語「レドックス誘導性機能不全」及び「レドックス媒介性機能不全」は、同じ意味を有すると理解される。
【００２３】
許容されている範囲で、本明細書に引用されている全ての参考文献は、それらの全体が参照により援用される。
【００２４】
詳細な説明及び実施例
本発明者らは、驚くべきことに、血管恒常性における重要な酵素である、内皮におけるＦＸＹＤ１と内皮一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳとの新規な相互作用を同定し、広範囲の急性及び慢性の血管系疾患状態に対して実質的な治療効果を含む。
【００２５】
ＦＸＹＤタンパク質は、細胞外ドメイン中の不変ＦＸＹＤシグネチャー配列にちなんで名付けられた小さなＩ型膜タンパク質のファミリーである。組織特異的な様式で発現された哺乳動物ＦＸＹＤ（「ｆｉｘｉｔ」）タンパク質（Ｓｗｅａｄｎｅｒ及びＲａｅｌ、２０００）は、クローニングされた日付に従って時間順に番号が付けられている。ＦＸＹＤ１（ホスホレマンとも呼ばれる）は、内皮細胞及び血管平滑筋において発現される小さな膜タンパク質である。心臓のＮａ+−Ｋ+ポンプと機能的に関連していることが知られ、この場合、以前に、Ｎａ+−Ｋ+ポンプの酸化的ストレス誘導性阻害に対する保護効果を有することが実証されている（Ｂｉｂｅｒｔら、２０１１）。また、ＦＸＹＤ１は、血管平滑筋細胞において発現され、Ｎａ+−Ｋ+ポンプの急性制御、及び酸化的ストレスに応答する収縮性緊張において役割を果たすことが示されている（Ｌｉｕら、２０１３）。
【００２６】
ヒトＦＸＹＤ１（Ｐａｌｍｅｒら、１９９１）の例示的なアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアクセッション番号０００１６８（配列番号１）で提供される。ヒトＦＸＹＤ１をコードする例示的な核酸配列は、ＥＭＢＬ−ＥＢＩアクセッション番号Ｕ７２２４５（配列番号２）である。
【００２７】
ｅＮＯＳは、内皮生理学において重要であり、血管緊張を制御し、ならびに血小板凝集及び好中球−内皮の相互作用を弱める（Ｂｒｕｎｎｅｒら、２００３）。しかしながら、酸化的ストレスの条件下では、ｅＮＯＳは「脱共役」となり、酸化的ストレスを増幅し、損傷を悪化させるＯ2・-及びＯＮＯＯ-を優先的に生成する（Ｂｕｒｇｏｙｎｅら、２００５）。病態生理学的傷害（例えば、糖尿病、高血圧）中にｅＮＯＳを脱共役から保護することは、増幅プロセスを停止させ、動脈の健康に重要な膜タンパク質を保護し得る。ｅＮＯＳレダクターゼドメインのこの脱共役がグルタチオン化によって媒介されるという発見（Ｃｈｅｎら、２０１０）は、ｅＮＯＳ制御の理解においてパラダイムシフトをもたらし、心臓血管系疾患における酸化的ストレスを制限する新規な治療戦略の道を開く。
【００２８】
本明細書に記載されるように、ここで、驚くべきことに、本発明者らは、ＦＸＹＤ１とｅＮＯＳの機能的相互作用が存在することを同定した。これは、本発明者らによって得られ、本明細書に記載されている以下の実験結果によって支持される。
【００２９】
方法
細胞培養及びｓｉＲＮＡノックダウン：ヒト冠状動脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣＳ）を内皮増殖培地で培養した。ＦＸＹＤ１又はスクランブル対照に対するｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ）；及びＦＸＹＤ１発現プラスミドを用いて、ＦＸＹＤ１の内皮細胞機能及びｅＮＯＳ活性ならびにそのグルタチオン化における効果を調べた。フルオレセイン標識されたｄｓＲＮＡオリゴマーを用いて、トランスフェクション効率を視覚化した。
【００３０】
グルタチオン化タンパク質の免疫検出及びタンパク質共免疫沈降。共免疫沈降実験におけるｅＮＯＳのグルタチオン化を検出するために、グルタチオン化タンパク質に対する市販の抗体（抗ＧＳＨ抗体−ビオジェン）を用いて、グルタチオン化を検出した。大動脈は、１５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、５０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２ｍＭのＥＤＴＡ、及びプロテアーゼ阻害剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＥＧＴＡ−ｆｒｅｅ、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を含む氷冷された溶解緩衝液中でホモジナイズされ、続いて１６，０００ｇで２０分間遠心分離された。上清（０．５〜１ｍｇのタンパク質）は、１ｍｇのタンパク質と２．５μｇの抗ｅＮＯＳ抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）：１ｍｇのタンパク質の比で適切な抗体とともに４℃で１時間インキュベートされ、次に、プロテインＡ／Ｇ−Ｐｌｕｓアガロースビーズとともにインキュベートされた。回収されたビーズに結合したタンパク質は、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液中に溶出され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供され、抗ＧＳＨ抗体でプローブされた。ウェスタンブロット化学発光をＬＡＳ−４０００イメージリーダーで読み取り、Ｍｕｌｔｉ  Ｇａｕｇｅ  ３．１ソフトウェア（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を用いて濃度測定によって定量した。露光時間は、シグナル強度の変動が線形ダイナミックレンジにあることを確実にするように調整された。ＦＸＹＤ１及びｅＮＯＳ発現を評価するために標準的なウェスタンブロット技術を使用した。
【００３１】
共焦点蛍光顕微鏡によるＮＯ検出。ＨＵＶＥＣの細胞内ＮＯは、固定前にアセチルコリンとプレインキュベートすることなしに、４−アミノ−５−メチルイノ−２’，７’−ジフルオロフルオレセインジアセテート（ＤＡＦ−ＦＭジアセテート）（１０μＭ、３０分３７℃）を用いて検出された。核を４’、６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、１μＭ）で染色した。ＮＯ蛍光は、それぞれ４９５ｎｍ及び５１５ｎｍの励起波長及び発光波長を用いて検出され、ＩｍａｇｅＪソフトウェアによって分析された。
【００３２】
共焦点蛍光顕微鏡によるスーパーオキシド検出。細胞内Ｏ2・-の変化は、固定前の３０分間、Ｏ2・-感受性色素ジヒドロエチジウム（ＤＨＥ）を負荷したＨＵＶＥＣ中で調べた。核を４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、１μＭ）で染色し、細胞をＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ具備培地でガラススライド上に載せ、共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ５）で観察した。
【００３３】
ＦＸＹＤ１  ＫＯ及びＷＴマウスにおける心エコー検査：３０ＭＨｚのトランスデューサ（Ｖｅｖｏ  ７７０；Ｖｉｓｕａｌｓｏｎｉｃｓ、Ｔｏｒｏｎｔｏ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）を使用して、軽く鎮静させたマウス（イソフルラン１％）を自発的に呼吸させて経胸腔心エコーを得た。低酸素環境下にマウスを３週間及び６週間、曝露する前（ベースライン）及び曝露後に肺動脈圧を非侵襲的に評価するために肺動脈加速時間（ＰＡＴ）を測定した。
【００３４】
ＦＸＹＤ１は、ヒト内皮細胞（ＨＵＶＥＣ；図２）における共免疫沈降アッセイによって示されるように発現され、ｅＮＯＳと物理的に相互作用する。
【００３５】
ヒト内皮細胞における内因性ＦＸＹＤ１発現のサイレンシングは、ｅＮＯＳのグルタチオン化の増加をもたらす（図３）。これがｅＮＯＳのレドックス脱共役の分子メカニズムであるため、これはＮＯのバイアベイラビリティを低下させ、スーパーオキシド生成を増加させると予測される。
【００３６】
ヒト内皮細胞における内在性ＦＸＹＤ１発現のサイレンシングは、ベースライン時；アセチルコリンによって刺激された場合（図４及び図５）；及び神経ホルモンであるアンギオテンシンＩＩへの曝露により引き起こされるより高い酸化的ストレスの条件下で、ＮＯバイオアベイラビリティの実質的な低下を導く。
【００３７】
ＦＸＹＤ１のノックアウト（インビボ−ノックアウトマウス）は、ベースライン条件下でｅＮＯＳのグルタチオン化の増加をもたらし、心臓（図６Ａ）及び大動脈（図６Ｂ）におけるアンジオテンシンＩＩ誘発グルタチオン化に対するｅＮＯＳの感受性を増強する。これは、心臓血管系における重要な膜タンパク質に対するレドックス損傷に対するＦＸＹＤ１の保護的役割をさらに支持する。
【００３８】
ＦＸＹＤ１のノックアウト（インビボ−ノックアウトマウス）は、ｅＮＯＳ脱共役と一致して、内側肥大及び血管周囲線維症の慢性的な血管変化、及び過剰なＲＯＳ生成をもたらす。これらの表現型は、アンギオテンシンＩＩ投与によって悪化する（図７及び図８）。
【００３９】
ＦＸＹＤ１のノックアウト（インビボノックアウトマウス）は、心筋間質線維症、及びアンギオテンシンＩＩ誘発性心筋線維症の悪化をもたらす（図９）。本発明者らは、このメカニズムが、変化した心筋ＲＯＳ生成、続く改善されたｅＮＯＳ共役に関連し得ると考える。
【００４０】
ｅＮＯＳ脱共役に対するＦＸＹＤ１の内因性の保護的役割は、肺血管系における血管動脈血管運動神経性緊張及び血管リモデリングの制御における潜在的役割を指摘した。ノックアウトマウスにおけるインビボ研究は、肺加速時間（ＰＡＴ、図１０に示されるように、マウスあたりｎ＝７）の心エコー測定によって反映されるような上昇した肺動脈圧を示す。
【００４１】
したがって、この新しいデータは、血管細胞におけるＦＸＹＤ１の役割がＮａ+ポンプ機能の維持に限定されず、酸化的ストレス誘導性のグルタチオン化及び脱共役に対するｅＮＯＳの保護も含むことを示す。これは、血管の健康に重要な急性及び慢性の影響を有する。この機能的相互作用の同定は、広範囲の血管系疾患状態に治療上の意味を有する。ＦＸＹＤ１サイレンシングがまた心筋線維症の増加をもたらすという知見は、ＲＯＳ依存性の心筋線維症を特徴とする心筋疾患状態における標的療法の可能な有益な効果を指す。
【００４２】
本明細書に開示された知見に基づいて、内皮へのＦＸＹＤ１の送達は、レドックス誘導性脱共役に対する保護を提供すると予測され、したがって、活性酸素種によって誘導される活性酸素種の生成の「ボンファアー（ｂｏｎ−ｆｉｒｅ）」陽性フィードバックを停止又は改善する（図１参照）。これは、血管系疾患の病態生理学における重要な統合ステップである。
【００４３】
３つの送達アプローチは、以下のように、異なる臨床シナリオに対する様々な適合性を伴って明らかである。
【００４４】
組換えＦＸＹＤ１又は遺伝子操作された誘導体の送達。組換え親油性タンパク質の自発的膜挿入を達成する実現可能性は、以下の公表された知見によって支持されている：（１）ｒＦＸＹＤタンパク質は、人工膜において正しい向きで自発的に挿入する（Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ；Ｔｅｒｉｅｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７によって評価されている）；ＦＸＹＤタンパク質は、Ｎａ+ポンプサブユニットと会合する（Ｃｒａｍｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）；（２）外因性で精製されたＦＸＹＤ１を膜断片に分け、その共免疫沈降及びαサブユニットとのシステイン架橋によって示されるように５分以内にＮａ+ポンプと会合する（Ｍａｈｍｍｏｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｃｏｒｎｅｌｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）；及び（３）（心臓に内因性ではない免疫検出の目的のために使用される）ｒＦＸＹＤ３タンパク質を含有する溶液中の心筋細胞のインキュベーションは、Ｎａ+ポンプとのｒＦＸＹＤ３タンパク質の機能的会合をもたらす（Ｂｉｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。
【００４５】
組換えＦＸＹＤ１タンパク質の投与は、内皮の酸化的ストレスの急激な逆転が有益であり、理想的には、血管が外科手術又は介入処置などの送達のために直接アクセス可能な状況に対して最も適切である。
【００４６】
例としては、手術中の吻合前に冠状動脈バイパス移植片をインキュベートすること；冠状動脈ステントを含む血管ステントのコーティング；特に虚血性糖尿病性脚の設定における末梢血管バイパス移植への送達；閉塞した瘻孔の最初の手術時又は手術矯正中のいずれかでの慢性腎不全患者の動脈−静脈瘻への送達；及び急性心筋梗塞又は脳卒中の設定における虚血−再灌流傷害から冠動脈又は脳循環のいずれかを保護するための動脈内送達が含まれる。
【００４７】
遺伝子移入。上記の用途では、ＦＸＹＤ１のウイルスベクターの送達が可能である。
【００４８】
転写制御。ＦＸＹＤ１発現に関与する因子を特定することにより、糖尿病又は高血圧の患者の全身動脈疾患又は喫煙する者などの慢性血管系疾患にさらに適した治療法を開発することができる。
【００４９】
ＦＸＹＤ１又はその誘導体の治療的使用のそれぞれの場合において、治療的有効量のＦＸＹＤ１又はその誘導体が、典型的には対象に投与される。本明細書で使用される用語「治療的有効量」は、その意味内に、所望の治療効果を提供するのに十分な量の化合物又は組成物を含む。必要とされる正確な量は、処置される種、対象の年齢及び全身状態、共存症、処置される状態の重症度、投与される特定の薬物、及び投与の様式などの因子に依存して対象によって異なる。したがって、任意の所与の症例について、適切な「治療的有効量」は、通常の方法のみを用いて当業者によって決定され得る。同様に、治療が、活性薬物の前駆体の投与、例えば、ＦＸＹＤ１又はその誘導体などの治療薬物を発現することが意図される遺伝子構築物の投与を含む場合、そのように送達される遺伝子構築物は、治療的有効量の活性物質を提供することができる。
【００５０】
本発明によるｅＮＯＳと相互作用することができるＦＸＹＤ１又はその誘導体を用いた対象の治療は、対象に与えられる唯一の治療であってもよく、又はＦＸＹＤ１ベースの治療がその状態の他の治療と組み合わせられる対象にとって組み合わせられたレジメン治療の１つの成分であってもよい。治療レジメンとの関連で、本明細書で使用される用語「〜と組み合わせて」などの用語「組み合わせられた（併用された）」及び類似した用語は、薬物及び他の治療薬（単数又は複数）のそれぞれが対象の治療に使用され、「併用された」治療レジメンにおける薬物及び他の治療薬のそれぞれが治療レジメンにおける１つ以上の他の薬物と同時に対象に投与されてもよく、又は治療レジメンにおける１つ以上の他の薬物とは異なる時間に対象に投与されてもよいことを意味する。
【００５１】
治療レジメンとの関連で、本明細書で使用される用語「〜と組み合わせて」などの用語「組み合わせられた（併用された）」及び類似した用語は、異なる様式（例えば、１つは経口的に投与され、別のものは注射によって投与されてもよい）を介して、それぞれの薬物（単数又は複数）及び他の治療薬（単数又は複数）の意味する投与内に包含されることが理解される。治療レジメンとの関連で使用される場合、「〜と組み合わせて」などの用語「組み合わせられた（併用された）」及び類似した用語は、薬物及び又は他の薬物の任意の１つ以上が、対象に投与される前に物理的に組み合わせられ得ることを意味し、その用語はまた、１つ以上の薬物及び他の治療薬を、以前の物理的組み合わせではない別個の薬物として投与することを含むことが理解される。
【００５２】
ＦＸＹＤ１が酸化的ストレスの条件下でｅＮＯＳ脱共役から内皮を保護する本明細書の開示に基づいて、本発明は、動脈疾患を有する患者に対して、例えば、このような患者にＦＸＹＤ１、又は遺伝子工学的若しくは天然に存在するその誘導体又は改変体の送達による、新規な治療戦略を提供する。
【００５３】
本発明のＦＸＹＤ１タンパク質に関連して使用される場合、「誘導体」という用語は、一体的に（例えば、組換え手段によって）産生されるか、又は合成後に（例えば化学的手段によって）添加される任意の融合分子を含む任意の機能的に同等なＦＸＹＤ１タンパク質を含む。そのような融合物は、ポリペプチド（例えば、ピューロマイシン又は他のポリペプチド）、小分子（例えば、ソラレン）又は抗体にコンジュゲートした本発明のＦＸＹＤ１タンパク質を含み得る。本明細書に記載されるように、本発明者らは、ＦＸＹＤ１がｅＮＯＳと相互作用し、そのようにして酸化的ストレスにより誘導されるグルタチオン化及び脱共役化に対するｅＮＯＳの保護に役割を果たすことを実証した。
【００５４】
この文脈において、融合タンパク質又はポリペプチドは、本発明の複数のＦＸＹＤタンパク質、例えば、２つ以上のＦＸＹＤタンパク質が単一のポリペプチド上に存在するポリペプチドを含み得ることが理解される。
【００５５】
本発明の１つ以上のＦＸＹＤ１タンパク質を含む融合タンパク質又はポリペプチドは、１つ以上の無関係な配列をさらに含み得る。このような配列は、一般的に、融合タンパク質又はポリペプチドとの関連で、「融合パートナー」として本明細書において言及される。典型的には、融合パートナーはアミノ酸配列であり、ポリペプチドであってもよい。融合パートナーは、例えば、ペプチド（単数又は複数）の製造を補助するために選択され得る。このような融合パートナーの例には、ペプチド、又はペプチドを含むポリペプチドの組換え発現を増強することができるもの；ペプチド、又は親和性タグなどのペプチドを含むポリペプチドの精製を促進又は補助することができるものが含まれる。あるいは又は加えて、融合パートナーは、ペプチド、又はペプチドを含むポリペプチドの溶解性を増加させ、ペプチドの免疫原性を増加させ、ペプチド、又はペプチドを含むポリペプチドが特定の又は所望の細胞内コンパートメントに標的化され得るようにするために選択されてもよい。
【００５６】
融合タンパク質を調製するための方法は、当該技術分野において公知である。典型的には、融合タンパク質は、化学的結合、ペプチド合成又は組換え手段などの標準的な技術によって作製され得る。融合タンパク質は、タンパク質の成分部分間、例えば、１つ以上の成分ペプチド間、及び／又は１つ以上の融合パートナー及び／又は成分ペプチド間に、１つ以上のリンカー（単数又は複数）、例えばペプチドリンカー（単数又は複数）を含むことができる。このようなペプチドリンカー（単数又は複数）は、融合タンパク質の成分部分が適切な二次構造及び三次構造を維持又は達成できるように選択され得る。
【００５７】
本発明のＦＸＹＤタンパク質は、任意の適切な手段、例えば、天然に存在する形態からの単離によって、化学合成によって、又は組換え手段によって調製することができる。当業者は、このような調製のための標準的な方法を認識し、例えば酵素的切断により天然に存在するより長いアミノ酸配列からの単離によるもの、例えば化学合成によるもの、例えば組換えＤＮＡ技術によるものなどが挙げられる。
【００５８】
本発明のＦＸＹＤタンパク質、又はその成分部分として本発明のＦＸＹＤタンパク質を含む融合タンパク質若しくはポリペプチドは、可溶性ペプチド、融合タンパク質又はポリペプチドであってもよい。
【００５９】
本発明はまた、ＦＸＹＤ１の「改変体」の使用も包含する。本発明のＦＸＹＤ１タンパク質に関して使用される場合、用語「改変体」は、任意の機能的に同等のＦＸＹＤ１タンパク質を含む。「改変体」という用語はまた、ＦＸＹＤ１タンパク質又はポリペプチド又はオリゴペプチドの機能的断片を包含し、また、機能的同族体も包含する。例えば、本発明は、特定のＦＸＹＤ１アミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列（配列番号１及び２に表されるものなど）に関して本明細書に記載されているが、酸化的ストレスにより誘導されるグルタチオン化及び脱共役化に対するある程度のｅＮＯＳの保護をもたらす、ＦＸＹＤ１と類似の様式でｅＮＯＳと相互作用する能力を有する又はコードするＦＸＹＤ１ポリペプチド若しくはポリヌクレオチドが存在してもよいし、又は合成されたＦＸＹＤ１ポリペプチド若しくはポリヌクレオチドであってもよいことが理解される。
【００６０】
改変体又は同族体は、アミノ酸配列中に１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、付加及び／又は挿入を有することができる。本発明のＦＸＹＤ１タンパク質の改変体又は同族体は、好ましくは、天然のＦＸＹＤ１タンパク質と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、又は少なくとも約９０％の同一性を示し、より好ましくは、天然のＦＸＹＤ１タンパク質に対する改変体又は相同体の長さ全体で少なくとも約９２％、又は少なくとも薬９４％の同一性、又は少なくとも約９５％の同一性、又は少なくとも約９６％の同一性、又は少なくとも約９７％の同一性、又は少なくとも約９８％の同一性、又は少なくとも約９９％の同一性を示す。
【００６１】
ＦＸＹＤ１タンパク質又は改変体は、例えば、アミノ酸の欠失又は付加によって修飾され得る。アミノ酸置換には、必ずしも限定されないが、当該技術分野において「保存的」として知られているアミノ酸置換が含まれる。「保存的」置換は、ペプチド化学分野の当業者がポリペプチドの二次構造及び疎水性を実質的に変えないことが期待されるように、アミノ酸が、同様の特性を有する別のアミノ酸で置換されたものである。アミノ酸置換は、一般的に、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性及び／又は両親媒性の類似性に基づいて行うことができる。例えば、負に帯電したアミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる；正に帯電したアミノ酸には、リジン及びアルギニンが含まれる；類似の親水性値を有する非電荷極性頭部基を有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン及びバリン；グリシン及びアラニン；アスパラギン及びグルタミン；セリン、スレオニン、フェニルアラニン及びチロシンが含まれる。保存的変化を表すことができるアミノ酸の他のグループには、（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；（３）ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；及び（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓが含まれる。改変体はまた、又は代わりに、非保存的変化を含むことができる。
【００６２】
典型的には、改変型ＦＸＹＤ１タンパク質は、天然型ＦＸＹＤ１タンパク質とは、５個以下のアミノ酸、例えば、４個、３個、又は２個、又は１個のアミノ酸の置換、欠失又は付加によって異なる。
【００６３】
典型的には、本発明のＦＸＹＤ１タンパク質は単離されたタンパク質である。この文脈における「単離された」という用語は、タンパク質が天然系において見出される他の成分のいくつか又は全てから除かれた又はそれらの成分と会合していないことを意味することが理解される。例えば、「単離された」ペプチドは、ＦＸＹＤ１ポリペプチド配列内の他のアミノ酸配列から除かれ得て、又は無関係なタンパク質などの天然成分から除かれ得る。明確にするために、「単離された」ＦＸＹＤ１タンパク質は、化学的に合成されたＦＸＹＤ１タンパク質を含み、組換え方法によって調製されたポリペプチド又はオリゴペプチドを含む。本明細書に記載されるように、本発明の単離されたＦＸＹＤ１タンパク質は、より長いポリペプチド又は融合タンパク質の成分部分として含まれてもよい。
【００６４】
したがって、本明細書で使用されるＦＸＹＤ１の「誘導体」又は「改変体」は、ｅＮＯＳと相互作用することができ、それにより酸化的ストレスによって誘導されるグルタチオン化及び脱共役に対するｅＮＯＳの保護において役割を果たすことができる機能的要件を組み込む。「誘導体」及び「改変体」の文脈における「機能的に同等な」は、ＦＸＹＤ１で見られるのと同じ定量的結果を必要としないことが理解される。誘導体又は改変体は、参照ＦＸＹＤ１と比較して、所望の結果を達成するのにより活性であり得るか、又はそれほど活性でない場合がある。
【００６５】
本明細書を通じて、治療方法において、又はこのような使用の文脈において（例えば、治療における使用のためのＦＸＹＤ１の医薬組成物への参照に関して）ＦＸＹＤ１の使用は、ＦＸＹＤ１だけでなく、その誘導体、改変体、断片などにも言及される。単に、意味よりもむしろ言語の簡潔さのために、ＦＸＹＤ１という用語を使用することができる場合である。
【００６６】
本発明は、本発明の１つ以上のＦＸＹＤ１タンパク質（単数又は複数）をコードするポリヌクレオチド、及び本明細書に記載される、本発明のＦＸＹＤ１タンパク質（単数又は複数）を含む１つ以上の融合タンパク質（単数又は複数）又はポリペプチド（単数又は複数）をコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明の特定の実施形態において、本発明のペプチド又はその融合タンパク質若しくは機能的同等物をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片は、適切な宿主細胞中でポリペプチドの発現を指示するために組換えＤＮＡ分子に用いることができる。遺伝コードの固有の縮重のために、実質的に同一又は機能的に同等なアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列を生成することができ、これらの配列を用いて所与のポリペプチドをクローニングし、発現させることができる。
【００６７】
当業者に認識されるように、ポリヌクレオチドは、一本鎖（コード又はアンチセンス）又は二本鎖であり得て、ＤＮＡ分子（ゲノム、ｃＤＮＡ若しくは合成）又はＲＮＡ分子であり得る。ＲＮＡ分子には、イントロンを含み、ＤＮＡ分子に一対一で対応するＨｎＲＮＡ分子、及びイントロンを含まないｍＲＮＡ分子が含まれる。付加的なコード配列又は非コード配列は、本発明のポリヌクレオチド内に存在してもよいが、必ずしもそうである必要はなく、ポリヌクレオチドは他の分子及び／又は担体材料に連結されていてもよいが、必ずしもそうである必要はない。ポリヌクレオチドは、天然配列（すなわち、ＦＸＹＤ１タンパク質又はその一部をコードする内因性配列）を含むことができ、あるいはこのような配列の改変体又は生物学的若しくは抗原性のある機能的に同等物を含み得る。ポリヌクレオチド改変体は、以下にさらに記載されるように、好ましくは、コードされたポリペプチドの免疫原性が天然のＦＸＹＤ１タンパク質と比較して減少しないように、１つ以上の置換、付加、欠失及び／又は挿入を含み得る。コードされるポリペプチドの免疫原性における効果は、一般的に、本明細書に記載されるように評価され得る。用語「改変体」はまた、異種起源の相同遺伝子を包含する。
【００６８】
所望のポリペプチドを発現させるために、ペプチド、融合タンパク質若しくはポリペプチド、又は機能的同等物をコードするヌクレオチド配列を適切な発現ベクター、すなわち挿入されたコード配列の転写及び翻訳に必要なエレメントを含むベクターに挿入することができる。当業者に周知の方法を用いて、目的のポリペプチドをコードする配列、ならびに適切な転写及び翻訳調節エレメントを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びインビボ遺伝子組換えが含まれる。このような技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．、及びＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．Ｎ．Ｙ．、ならびのこれらの更新版に記載されている。
【００６９】
したがって、本発明は、本発明のポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。一実施形態において、ベクターは発現ベクターであってもよい。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞を提供する。本発明はまた、本発明のペプチドの調製方法を提供し、このような方法は、コードされたペプチドの発現に資する条件下で、本発明のポリヌクレオチド又は発現ベクターを含む宿主細胞を培養することを含む。一実施形態において、本方法は、発現されたペプチドを精製することをさらに含む。
【００７０】
本発明の方法の実施において、ＦＸＹＤ１は、典型的には、ｅＮＯＳと接触させるか、又はｅＮＯＳと接触させて、酸化的ストレスにより誘導されるグルタチオン化及び脱共役に対するある程度のｅＮＯＳの程度を達成する。あるいは又はさらに、細胞又は組織に内在性であるＦＸＹＤ１は、内在性ＦＸＹＤ１の発現を増加又は減少させることができる薬物（単数又は複数）の投与によって変化させることができ、例えば、追加のＦＸＹＤ１をｅＮＯＳと接触させる。本明細書で使用される「接触」又は「接触させること」とは、ｅＮＯＳと相互作用することができるように、組織、臓器又は細胞を本発明のＦＸＹＤ１タンパク質（単数又は複数）又はプロドラッグに曝露することをいう。接触は、例えば、診断又は研究目的のために、あるいはＦＸＹＤ１タンパク質又はプロドラッグに対する組織若しくは細胞若しくは血管組織若しくは移植片の感受性を試験するために、ＦＸＹＤ１タンパク質又はプロドラッグを培養組織又は細胞又は血管組織又は移植片に添加することによってインビトロでなされてもよい。接触は、例えば、望ましくない状態の治療又は予防のために、例えば、ＦＸＹＤ１タンパク質又はプロドラッグを対象に投与することによりインビボでなされてもよい。接触は、ＦＸＹＤ１を含む組成物に血管移植片を暴露することなどによりエクスビボでなされてもよい。
【００７１】
本明細書に記載されるように、対象へのＦＸＹＤ１の投与は、任意の適切な形態又は様式であってもよく、例えば、ＦＸＹＤ１を含む医薬組成物を投与すること、ＦＸＹＤ１に曝露された血管移植片を投与すること、例えば、ＦＸＹＤ１を含む組成物に移植片を浸すことによること、ＦＸＹＤ１を発現することができるベクターにＦＸＹＤ１をコードするプロドラッグ又は核酸配列などのＦＸＹＤ１タンパク質の前駆体を投与すること、ＦＸＹＤ１を送達することができるステントなどの医療用デバイスを投与することが挙げられる。
【００７２】
血管系への治療物質の送達のためのステントなどのデバイスは、当該技術分野において公知である。結果として、ＦＸＹＤ１を送達することができるステントなどの医療用デバイスは、任意の適切な方法によって調製することができる。適切な方法は、例えば、「Ｄｒｕｇ−ｅｌｕｔｉｎｇ  ｓｔｅｎ」題する米国特許第５，６９７，９６７号；Ｔ．Ｃｏｏｐｅｒ  Ｗｏｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｎｄｒｅｗ  Ｒ．Ｍａｒｋｓ，Ｄｒｕｇ−Ｅｌｕｔｉｎｇ  Ｓｔｅｎｔｓ，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．５５：１６９−１７８；「Ｄｒｕｇ  ｅｌｕｔｉｎｇ  ｓｔｅｎｔ」と題する米国特許第７，１３５，０３８号に見出すことができ、これらの内容は各々、参照により本明細書に援用される。
【００７３】
ＦＸＹＤタンパク質は脂質であり、したがって膜に可溶である。したがって、急性虚血性傷害の設定におけるＦＸＹＤ１タンパク質の投与を使用することができ；例えば、梗塞及び虚血再灌流傷害の治療におけるＦＸＹＤ１が挙げられる。タンパク質は、静脈内に投与されてもよく、又は、例えば、血管形成術手法による急性介入の設定において、梗塞関連動脈に直接注入されてもよい。他の実施形態において、ＦＸＹＤ１タンパク質の注入は、数分から数時間の時間スケールで投与することができる。
【００７４】
いくつかの実施形態において、本発明のＦＸＹＤ１タンパク質は、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、抗体又はその断片、放射性粒子、ナノ粒子又は微粒子とともに生成されてもよく、又はこれらにコンジュゲートされてもよい。
【００７５】
本明細書中に記載されるように、本発明の方法は、細胞中の機能的ＦＸＹＤ１レベルを増加させることができ、それにより、ｅＮＯＳと相互作用するように引き起こすことができる機能的ＦＸＹＤ１の量に影響を与える薬物の使用を含む。本発明の方法はまた、ＦＸＹＤ１及びｅＮＯＳの機能的相互作用を改善するための小分子の使用を包含する。例えば、標的遺伝子の発現に影響を与える小分子を使用するための方法は、当該技術分野において公知であり、そのため、標的遺伝子の発現は、所望の場合であるように増加又は減少される。典型的には、本発明の方法において、標的遺伝子は、ＦＸＹＤ１又はＦＸＹＤ１発現の内因性制御因子をコードする。典型的には、本発明は、標的細胞又は組織におけるＦＸＹＤ１の発現を増加させることを含む。標的遺伝子産物の量の制御はまた、転写後プロセシング又は翻訳のレベルで影響され得る。本発明の方法はまた、ＦＸＹＤ１発現の制御に影響し得るマイクロＲＮＡの使用を包含する。ｍｉＲＮＡはまた、心臓及び心臓血管系疾患に関与することも知られ、したがって、本発明の方法はまた、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス、リボザイム又はｓｈＲＮＡ構築物の使用を想定している。
【００７６】
本発明の方法は、インビボ、エクスビボ又はインビトロの方法であってもよい。インビトロ法の一例は、研究又は開発目的のための方法である。インビボ法の例は、治療又は予防を必要とする患者の疾患を治療又は予防する方法である。
【００７７】
一実施形態において、本方法は、糖尿病性末梢血管系疾患（この場合、治療は、外科的に処置された血管又は移植片に浸漬することによって、及び関連する領域に動脈内に注射することによって直接投与することができる）の治療を含む。一実施形態において、本方法は、冠状動脈バイパス手術を受けている患者（移植片を直接インキュベートすることができる）の治療を含む。一実施形態において、本方法は、例えば、冠動脈、末梢又は脳循環のための動脈ステントを受けている患者の治療を含み、この場合、ステントをＦＸＹＤ１送達剤でコーティングすることができる。
【００７８】
一実施形態において、本方法は、透析に必要な動脈−静脈（動静脈としても知られている）瘻を有する慢性腎不全患者の治療を含み、この場合、瘻の損傷が主要な臨床的問題である。ＦＸＹＤ１送達は、瘻形成の時点、又は閉塞のための外科手術介入時に送達される場合に有益であると予測される。
【００７９】
一実施形態において、本方法は、急性心筋梗塞に罹患している患者の治療を含み、部分的に、内皮機能不全によって駆動される心筋虚血−再灌流傷害を減少させる。
【００８０】
一実施形態において、本方法は、虚血再灌流傷害が内皮機能障害によって引き起こされる急性脳血管障害（脳卒中）に罹患している患者の治療を含む。
【００８１】
一実施形態において、本方法は、血管系におけるＦＸＹＤ１の発現を増加させる治療が血管イベントを減少させると予測される慢性血管系疾患の患者の治療を含む。
【００８２】
一実施形態において、本方法は、ｅＮＯＳ脱共役、血管周囲線維症、及び媒体の肥大によって特徴付けられる肺高血圧症（例えば、特発性、又は続発する強皮症若しくは関連結合組織疾患状態）を有する患者の治療を含む。この場合、遺伝子治療の吸入は最適な送達方法であり、他の肺疾患状態において成功する。
【００８３】
任意の特定の患者のための最も適切な治療レジメンは、治療する医師によって決定されてもよく、様々な因子に依存し、例えば、治療される障害及び障害の重症度；採用される化合物又は薬物の活性；採用される組成物；患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別及び食事；投与の時期；投与経路；薬物又は化合物の隔離速度；治療の持続時間；治療と組み合わせて又は同時に使用される薬物、ならびに医学において周知の他の関連因子を含む、などが挙げられる。
【００８４】
本発明の１つの態様において、ＦＸＹＤ１の投与は、患者が従来の薬物で治療され得る「アドオン（ａｄｄ−ｏｎ）」であり得る。例えば、ＦＸＹＤ１は、例えば、より一般的な治療薬又は血管系疾患のためのレジメンを用いた治療前、治療中又は治療後に投与することができる。結果として、この文脈では、「アドオン」という用語は、追加の治療整数（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｎｔｅｇｅｒ）（ＦＸＹＤ１）を指すことが理解される；ＦＸＹＤ１が最後の薬物として追加されなければならないことを意味しない。併用療法における特定の薬物及び薬物クラスの順序及び組成は、当業者によって決定されてもよく、例えば、治療レジメンが複数の薬物クラスの投与を含む場合、ＦＸＹＤ１は、レジメン中の任意の状況で投与されてもよいことを含み得る。
【００８５】
本発明の方法の治療レジメンのさらなる例として、心筋梗塞に罹患している患者の状態は、ＦＸＹＤ１の投与前に少なくとも部分的に安定化され得る。さらに、患者の状態は、本発明の方法の開始前に少なくとも部分的に安定化され得る。このような治療レジメンのいずれかを、患者を最初に安定化させると称することができる。
【００８６】
治療レジメンのさらなる例として、ＦＸＹＤ１は、いずれもの以前の投薬又は安定化なしに血管系疾患の治療において投与される第１薬物であり得る。本発明のために提案されたＦＸＹＤ１タンパク質は、治療的に又は予防的に組成物として投与することができる。治療用途において、組成物は、患者を効果的に治療するのに十分な量で、血管系のレドックス誘導性機能不全によって特徴付けられる状態を既に有する患者に投与される。
【００８７】
任意の特定の患者に対する治療的に有効な用量レベルは、様々な因子に依存し、例えば、治療される障害及び障害の重症度；採用される化合物又は薬物の活性；採用される組成物；患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別及び食事；投与の時期；投与経路；薬物又は化合物の隔離速度；治療の持続時間；治療と組み合わせて又は同時に使用される薬物、ならびに医学において周知の他の関連因子を含む、などが挙げられる。当業者は、日常的な実験により、ＦＹＸＤ１タンパク質の有効量、及び必要に応じて、状態を治療するために必要とされる他の薬物を決定することができる。
【００８８】
さらに、個々の投薬の最適な量及び間隔、ならびに併用療法が使用される場合、併用療法の様々な薬物の投与の最適な量及び間隔は、当業者には明らかであり、治療される疾患状態又は病状の性質及び程度、投与の形態、投与の経路及び部位、ならびに治療される特定の個体の性質によって決定され得る。また、このような最適条件は、従来技術によって決定することができる。
【００８９】
一般的に、ＦＸＹＤ１を含む適切な組成物は、当業者に公知の方法に従って調製することができ、したがって、医薬として許容される担体、希釈剤、賦形剤及び／又はアジュバントを含むことができる。
【００９０】
これらの組成物は、標準的な経路によって投与することができる。一般的に、組成物は、非経口（例えば、静脈内、脊髄内、皮下又は筋肉内）経路によって投与することができる。組成物は、関連ゾーンに動脈内注射することによって投与することができる。組成物は、例えば、ＦＸＹＤ１を含む組成物に血管移植片を浸すなどして、ＦＸＹＤ１を含む組成物に血管系を曝露することによって投与されてもよい。ＦＸＹＤ１は、コーティングされたステントであってもよい、ＦＸＹＤ１を含むステントなどの医療用デバイスの使用によって投与されてもよく、ここで、コーティングはＦＸＹＤ１を含み、その場合、組成物は医療用デバイスを調製するために使用され得る。したがって、ＦＸＹＤ１を含む組成物は、例えば、移植前に血管移植片に浸漬又は注入するなどして、例えば、ステント上若しくはステント内でコーティングするのに適した形態、又は血管系に接触させるのに適した形態であり得る。
【００９１】
担体、希釈剤、賦形剤及びアジュバントは、組成物の他の成分と適合性があり、そのレシピエントに有害でないという点で「許容される」ものでなければならない。医薬として許容される担体又は希釈剤の例は、脱塩水又は蒸留水；生理食塩水；ピーナッツ油、サフラワー油、オリーブ油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油、落花生油又はヤシ油などの植物系油；メチルポリシロキサン、フェニルポリシロキサン及びメチルフェニルシロキサンなどのポリシロキサンを含むシリコーン油；揮発性シリコーン；流動パラフィン、軟パラフィン又はスクアランなどの鉱油；メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム又はヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのセルロース誘導体；ＤＭＳＯ、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、低級アルカノール、例えば、エタノール又はイソプロパノール；低級アラルカノール；低級ポリアルキレングリコール又は低級アルキレングリコール、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール又はグリセリン；パルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸イソプロピル又はオレイン酸エチルなどの脂肪酸エステル；ポリビニルピリドン；寒天；カラギーナン；トラガカントゴム又はアカシアガム、及び石油ゼリーである。典型的には、担体は、１０重量％〜９９．９重量％の組成物を形成する。
【００９２】
組成物は、活性化合物又は複数の活性化合物のバイオアベイラビリティ又は治療期間を増加させる薬物を含み得る。
【００９３】
本発明の組成物は、皮下、筋肉内若しくは静脈内の注射又は注入などの非経口投与に適した形態であり得る。
【００９４】
注射用溶液又は懸濁液として投与するために、非毒性の非経口的に許容される希釈剤又は担体は、リンゲル液、等張食塩水、リン酸緩衝食塩水、エタノール及び１，２プロピレングリコールを含み得る。
【００９５】
アジュバントは、典型的には、皮膚軟化剤、乳化剤、増粘剤、防腐剤、殺菌剤及び緩衝剤を含む。
【００９６】
ＦＸＹＤ１タンパク質は脂溶性であるため、組成物はまたリポソームの形態で投与することができる。リポソームは、一般的に、リン脂質又は他の脂質物質から誘導され、水性媒体中に分散された単層状又は多層状の水和液晶によって形成される。リポソームを形成することができる任意の非毒性の生理学的に許容され、代謝可能な脂質を使用することができる。リポソーム形態の組成物は、安定化剤、防腐剤、賦形剤などを含んでもよい。好ましい脂質は、天然と合成の両方のリン脂質及びホスファチジルコリン（レシチン）である。リポソームを形成するための方法は当該技術分野で公知であり、これに関しては、特定の参考文献：Ｐｒｅｓｃｏｔｔ編、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅ  ＸＩＶ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９７６）３３頁以降が利用され、その内容は参照により本明細書に援用される。
【００９７】
本発明は、実験結果を参照して本明細書に記載されている。この実験は、本発明を説明するためのものであり、本明細書を通じて記載の開示を一般性を限定するものと解釈されるべきではない。
【００９８】
許容される範囲で、本明細書中に引用されている全ての参考文献は、それらの全体が参照により援用される。
【００９９】
参考文献
Bibert S, Liu CC, Figtree GA, Garcia A, Hamilton EJ, Marassi FM, Sweadner KJ, Cornelius F, Geering K, Rasmussen HH. Fxyd proteins reverse inhibition of the na+-k+ pump mediated by glutathionylation of its β1 subunit. J Biol Chem. 2011;286:18562-18572.
Liu C-C, Karimi Galougahi K, Weisbrod RM, Hansen T, Ravaie R, Nunez A, Liu YB, Fry N, Garcia A, Hamilton EJ, Sweadner KJ, Cohen RA, Figtree GA. Oxidative inhibition of the vascular na+-k+ pump via nadph oxidase-dependent β1-subunit glutathionylation: Implications for angiotensin ii-induced vascular dysfunction. Free Radical Biology and Medicine. 2013;65:563-572.
Brunner F, Maier R, Andrew P, Wolkart G, Zechner R, Mayer B. Attenuation of myocardial ischemia/reperfusion injury in mice with myocyte-specific overexpression of endothelial nitric oxide synthase. Cardiovascular Research. 2003;57:55-62.
Burgoyne JR, Mongue-Din H, Eaton P, Shah AM. Redox signaling in cardiac physiology and pathology. Circ Res. 2012;111:1091-1106.
Chen CA, Wang TY, Varadharaj S, Reyes LA, Hemann C, Talukder MA, Chen YR, Druhan LJ, Zweier JL. S-glutathionylation uncouples enos and regulates its cellular and vascular function. Nature. 2010;468:1115-1118.
Teriete P, Franzin CM, Choi J, Marassi FM. Structure of the na,k-atpase regulatory protein fxyd1 in micelles. Biochemistry. 2007;46:6774-6783.
Crambert G, Li C, Swee LK, Geering K. Fxyd7, mapping of functional sites involved in endoplasmic reticulum export, association with and regulation of na,k-atpase. J Biol Chem. 2004;279:30888-30895.
Mahmmoud YA, Vorum H, Cornelius F. Identification of a phospholemman-like protein from shark rectal glands. Evidence for indirect regulation of na,k-atpase by protein kinase c via a novel member of the fxyd family. J Biol Chem. 2000;275:35969-35977.
Cornelius F, Mahmmoud YA, Meischke L, Cramb G. Functional significance of the shark na,k-atpase n-terminal domain. Is the structurally variable n-terminus involved in tissue-specific regulation by fxyd proteins? Biochemistry. 2005;44:13051-13062.
Galougahi KK, Liu CC, Gentile C, Kok C, Nunez A, Garcia A, Fry NA, Davies MJ, Hawkins CL, Rasmussen HH, Figtree GA. Glutathionylation mediates angiotensin ii-induced enos uncoupling, amplifying nadph oxidase-dependent endothelial dysfunction. Journal of the American Heart Association. 2014;3:e000731.
Palmer, C.J., Scott, B.T., and Jones, L.R. (1991). Purification and complete sequence determination of the major plasma membrane substrate for cAMP-dependent protein kinase and protein kinase C in myocardium. J Biol Chem 266, 11126-11130.
Sweadner, K.J., and Rael, E. (2000). The FXYD gene family of small ion transport regulators or channels: cDNA sequence, protein signature sequence, and expression. Genomics 68, 41-56.
【図１】
2017532370.tif 000002
【図２】
2017532370.tif 000003
【図３】
2017532370.tif 000004
【図４】
2017532370.tif 000005
【図５】
2017532370.tif 000006
【図６Ａ】
2017532370.tif 000007
【図６Ｂ】
2017532370.tif 000008
【図７】
2017532370.tif 000009
【図８】
2017532370.tif 000010
【図９】
2017532370.tif 000011
【図１０】
2017532370.tif 000012
【配列表】
2017532370000001.app
【国際調査報告】
2017532370.tif 000013
2017532370.tif 000014
2017532370.tif 000015