(57)【要約】本発明は、胎盤組織由来の胎盤細胞及びその他の胎盤成分を含む、治療用の胎盤組成物を提供する。冷凍保存された胎盤組成物をまた、提供する。当該胎盤組成物は、特に、血管新生を刺激し及び促進し、炎症を抑え、ならびに瘢痕形成を減らすために使用できる。当該胎盤組織は、任意で、羊膜、絨毛膜、栄養膜枯渇の絨毛膜、臍帯、ホウォートンゼリー、胎盤葉、及び／または母体脱落膜であり得る。本発明の胎盤組成物は、組織傷害（例えば、創傷または火傷）を持つ患者の治療において、当該胎盤組成物を、その傷害またはその近隣部分に適用することによる治療に有用である。胎盤組成物はまた、組織の再生を促進しまたは増加させるために使用しても良い。同様の適用は、靭帯及び腱の修復、ならびに骨生着などの生着手術に対して有用である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
冷凍保存された胎盤組織組成物であって、
（ｉ）１つ以上の胎盤細胞、
（ｉｉ）１つ以上の治療因子、
（ｉｉｉ）１つ以上の細胞外基質成分、及び
（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）またはそれらの組み合わせ、
を含む破壊された胎盤組織を含み、ここで、前記冷凍保存された胎盤組織組成物の、それに続く解凍後に、その胎盤細胞の４０％を上回る細胞が生存しており、且つその組成物が、機能性免疫原性細胞を枯渇している、前記冷凍保存された胎盤組織組成物。
【請求項２】
前記胎盤組織組成物の冷凍保存及びそれに続く解凍後に、その生存細胞が、少なくとも１，０００細胞／ｍＬである、請求項１に記載の冷凍保存された胎盤組織組成物。
【請求項３】
前記胎盤組織組成物の冷凍保存及びそれに続く解凍後に、その生存細胞が、少なくとも１０，０００細胞／ｍＬである、請求項１に記載の冷凍保存された胎盤組織組成物。
【請求項４】
前記胎盤組織組成物の冷凍保存及びそれに続く解凍後に、その生存細胞が、少なくとも２０，０００細胞／ｍＬである、請求項１に記載の冷凍保存された胎盤組織組成物。
【請求項５】
前記胎盤組織組成物の冷凍保存及びそれに続く解凍後に、その胎盤細胞の７０％を上回る細胞が生存している、請求項１に記載の冷凍保存された胎盤組織組成物。
【請求項６】
前記胎盤組織が、大幅に減らされた量の栄養膜細胞を有する絨毛膜胎盤組織である、請求項１に記載の冷凍保存された胎盤組織組成物。
【請求項７】
前記胎盤組織が、羊膜組織である、請求項１に記載の冷凍保存された胎盤組織組成物。
【請求項８】
前記胎盤組織組成物が、創傷治癒を促進する、請求項１に記載の冷凍保存された胎盤組織組成物。
【請求項９】
前記胎盤組織組成物が、組織再生を促進する、請求項１に記載の冷凍保存された胎盤組織組成物。
【請求項１０】
前記組織組成物が、大幅に減らされた量の機能性ＣＤ１４＋マクロファージを有する、請求項１に記載の冷凍保存された胎盤組織組成物。
【請求項１１】
前記胎盤組織組成物が、冷凍保存剤をさらに含む、請求項１に記載の冷凍保存された胎盤組織組成物。
【請求項１２】
前記冷凍保存剤が、ＤＭＳＯ、グリセリン、グリセロール、糖、グリコール、プロピレングリコール、エチレングリコール、プロパンジオール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、１，２−プロパンジオール（ＰＲＯＨ）ポリビニルピロリドン、ヒドロキシエチル澱粉、多糖類、単糖類、アルギン酸、トレハロース、ラフィノース、デキストラン、ヒト血清アルブミン、フィコール、リポタンパク質、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシエチルストラーチ（ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ  ｓｔｒａｒｃｈ）、自己血漿、及びそれらの混合物から成る群から選ばれる、請求項１１に記載の冷凍保存された胎盤組織組成物。
【請求項１３】
前記冷凍保存剤が、前記組成物の最終容積の約３％から約１００％から成る、請求項１１に記載の冷凍保存された胎盤組織組成物。
【請求項１４】
前記冷凍保存剤が、前記組成物の最終容積の約３％から約５０％から成る、請求項１１に記載の冷凍保存された胎盤組織組成物。
【請求項１５】
前記冷凍保存剤が、前記組成物の最終容積の約３％から約１０％から成る、請求項１４に記載の冷凍保存された胎盤組織組成物。
【請求項１６】
前記組成物が、アルブミンをさらに含む、請求項１１に記載の冷凍保存された胎盤組織組成物。
【請求項１７】
前記組成物が、薬学的に許容されるキャリアをさらに含む、請求項１１に記載の冷凍保存された胎盤組織組成物。
【請求項１８】
前記組成物が、薬学的に許容される容器中に包装された、請求項１に記載の冷凍保存された胎盤組織組成物。
【請求項１９】
前記容器が、バイアル瓶、パウチ袋、袋、瓶、試験管、及びシリンジから選ばれる、請求項１８に記載の冷凍保存された胎盤組織組成物。
【請求項２０】
前記枯渇した機能性免疫原性細胞が、母体血液細胞、新生児血液細胞、組織マクロファージ、栄養膜である、請求項１に記載の冷凍保存された胎盤組織組成物。
【請求項２１】
前記免疫原性細胞の枯渇した量が、免疫応答を産生するのに十分なレベル以下の量で、少なくとも１つの免疫原性因子を産生する、請求項１に記載の冷凍保存された胎盤組織組成物。
【請求項２２】
前記免疫原性細胞の枯渇した量が、検出限界を下回る量で、少なくとも１つの免疫原性因子を産生する、請求項２１に記載の冷凍保存された胎盤組織組成物。
【請求項２３】
前記免疫原性細胞の枯渇した量が、３５０ｐｇ／ｃｍ２以下の量のＴＮＦ−αを産生する、請求項２１に記載の冷凍保存された胎盤組織組成物。
【請求項２４】
前記免疫原性細胞の枯渇が、前記組成物を、約２℃から約８℃の温度に、約２分から約２４０分間静置することからもたらされる、請求項１に記載の冷凍保存された胎盤組織組成物。
【請求項２５】
前記組成物を、約２℃から約８℃の温度に、約１０分から約６０分間静置する、請求項２４に記載の冷凍保存された胎盤組織組成物。
【請求項２６】
前記１つ以上の胎盤細胞が、上皮細胞、間充織幹細胞、線維芽細胞、またはそれらの組み合わせの１つ以上を含む、請求項１に記載の冷凍保存された胎盤組織組成物。
【請求項２７】
冷凍保存された胎盤組織組成物であって、
ａ．破壊された胎盤組織組成物で、
（ｉ）１つ以上の胎盤細胞、
（ｉｉ）１つ以上の治療因子、
（ｉｉｉ）１つ以上の細胞外基質成分、及び
（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）またはそれらの組み合わせ、
を含み、且つ
ｂ．１つ以上の冷凍保存剤、
を含み、ここで、前記冷凍保存された胎盤組織組成物の、それに続く解凍後に、その胎盤細胞の４０％を上回る細胞が生存しており、且つ、前記組成物が、機能性免疫原性細胞を枯渇しており、ここで、前記１つ以上の胎盤細胞、治療因子、細胞外基質成分、またはそれらの組み合わせが、治療の有効性を提供するのに効果的な量で存在する、前記冷凍保存された胎盤組織組成物。
【請求項２８】
冷凍保存された胎盤組織組成物であって、
ａ．破壊された胎盤組織組成物で、
（ｉ）１つ以上の胎盤細胞、
（ｉｉ）１つ以上の治療因子、
（ｉｉｉ）１つ以上の細胞外基質成分、及び
（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）またはそれらの組み合わせ、
を含み、且つ
ｂ．１つ以上の冷凍保存剤、
を含み、ここで、前記胎盤組織組成物の、冷凍及びそれに続く解凍後に、その胎盤細胞の４０％を上回る細胞が生存しており、及び前記組成物が、機能性免疫原性細胞を枯渇しており、ならびに前記１つ以上の胎盤細胞、治療因子、細胞外基質成分またはそれらの組み合わせが、
（ｉ）炎症性サイトカインの量及び／または活性を低下させる、
（ｉｉ）抗炎症サイトカインの量及び／または活性を増加させる、
（ｉｉｉ）活性酸素種の量及び／または活性を低下させる、
（ｉｖ）抗酸化物質の量及び／または活性を増加させる、
（ｖ）プロテアーゼの量及び／または活性を低下させる、
（ｖｉ）細胞増殖を増加させる、
（ｖｉｉ）血管新生を増加させる、及び／または
（ｖｉｉｉ）細胞移行を増加させる、
ことに有効な量で提供される、前記冷凍保存された胎盤組織組成物。
【請求項２９】
前記１つ以上の胎盤細胞、治療因子、細胞外基質成分またはそれらの組み合わせが、生体外の細胞において、
（ｉ）炎症性サイトカインの量及び／または活性の低下、
（ｉｉ）抗炎症サイトカインの量及び／または活性の増加、
（ｉｉｉ）活性酸素種の量及び／または活性の低下、
（ｉｖ）抗酸化物質の量及び／または活性の増加、
（ｖ）プロテアーゼの量の低下、
（ｖｉ）細胞増殖の増加、
（ｖｉｉ）血管新生の増加、及び／または
（ｖｉｉｉ）細胞移行の増加、
を促進するのに効果的な量で存在する、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記１つ以上の胎盤細胞、治療因子、細胞外基質成分またはそれらの組み合わせが、生体内において、
（ｉ）炎症性サイトカインの量及び／または活性の低下、
（ｉｉ）抗炎症サイトカインの量及び／または活性の増加、
（ｉｉｉ）活性酸素種の量及び／または活性の低下、
（ｉｖ）抗酸化物質の量及び／または活性の増加、
（ｖ）プロテアーゼの量及び／または活性の低下、
（ｖｉ）細胞増殖の増加、
（ｖｉｉ）血管新生の増加、及び／または
（ｖｉｉｉ）細胞移行の増加、
を促進するのに効果的な量で存在する、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３１】
前記組成物が、治療の有効性が必要な対象者に適用され、ここで、前記１つ以上の胎盤細胞、治療因子、細胞外基質成分またはそれらの組み合わせが、
（ｉ）炎症性サイトカインの量及び／または活性の低下、
（ｉｉ）抗炎症サイトカインの量及び／または活性の増加、
（ｉｉｉ）活性酸素種の量及び／または活性の低下、
（ｉｖ）抗酸化物質の量及び／または活性の増加、
（ｖ）プロテアーゼの量及び／または活性の低下、
（ｖｉ）細胞増殖の増加、
（ｖｉｉ）血管新生の増加、及び／または
（ｖｉｉｉ）細胞移行の増加、
をすることに効果的な量で存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３２】
前記組成物が、創傷または組織欠損の治療に使用される、請求項３１に記載の冷凍保存された胎盤組織組成物。
【請求項３３】
前記創傷が、裂傷、擦り傷、火傷、切開、穿刺、発射に起因する傷、表皮の傷、皮膚の傷、慢性の傷、急性の傷、外部の傷、内部の傷、先天性の傷、潰瘍、褥瘡、糖尿病性潰瘍、トンネル傷、外科手術中またはそれに付随して生じた傷、静脈の潰瘍、脊髄損傷、眼の外傷または炎症、耳鼻科の傷害、及び虚血壊死から成る群から選ばれる、請求項３２に記載の冷凍保存された胎盤組織組成物。
【請求項３４】
前記組成物が、組織移植手術、腱手術、靭帯手術、骨手術、脳神経外科、及び脊髄外科から成る群から選ばれる外科手術に使用される、請求項３２に記載の冷凍保存された胎盤組織組成物。
【請求項３５】
前記組成物が、直接または間接的に組織再生を刺激する、請求項３２に記載の冷凍保存された胎盤組織組成物。
【請求項３６】
前記組織が、ヒト組織である、請求項３５に記載の冷凍保存された胎盤組織組成物。
【請求項３７】
前記ヒト組織が、軟骨、皮膚、靭帯、腱、または骨である、請求項３６に記載の冷凍保存された胎盤組織組成物。
【請求項３８】
冷凍保存された胎盤組織組成物であって、
ａ．ミンチ化された胎盤組織分散液で、
（ｉ）１つ以上の胎盤細胞、
（ｉｉ）１つ以上の治療因子、及び
（ｉｉｉ）１つ以上の細胞外基質成分、
（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）またはそれらの組み合わせ、
を含み、且つ
ｂ．冷凍保存剤、
を含み、ここで、前記冷凍保存された胎盤組織組成物の、それに続く解凍後に、その胎盤細胞の４０％を上回る細胞が生存しており、ここで、前記組成物が、機能性免疫原性細胞を大幅に枯渇している、前記冷凍保存された胎盤組織組成物。
【請求項３９】
前記冷凍保存された胎盤組成物が、室温で１０分を下回る時間で解凍できる、請求項１から３８のいずれか１項に記載の冷凍保存された胎盤組織組成物。
【請求項４０】
前記冷凍保存された胎盤組成物が、室温で３分を下回る時間で解凍できる、請求項３９に記載の冷凍保存された胎盤組成物。
【請求項４１】
前記冷凍保存された胎盤組成物が、室温で１分を下回る時間で解凍できる、請求項４０に記載の冷凍保存された胎盤組成物。
【請求項４２】
前記１つ以上の組織断片が、約０．０１ｍｍ２から約５ｍｍ２のサイズである、請求項３８に記載の冷凍保存された胎盤組織組成物。
【請求項４３】
前記組織断片が、約０．２ｍｍ２から約２ｍｍ２のサイズである、請求項４２に記載の冷凍保存された胎盤組織組成物。
【請求項４４】
前記組織断片が、約１００μｍから約５μｍの長さである、請求項３８に記載の冷凍保存された胎盤組織組成物。
【請求項４５】
前記細胞の生存率が、冷凍貯蔵された際に、少なくとも２４ヶ月間維持される、請求項１から４４のいずれか１項に記載の冷凍保存された胎盤組織組成物。
【請求項４６】
前記冷凍保存された胎盤組織組成物が、解凍前に長期間貯蔵される、請求項１から４４のいずれか１項に記載の冷凍保存された胎盤組織組成物。
【請求項４７】
前記長期間が、約６ヶ月から約３６ヶ月である、請求項１から４４のいずれか１項に記載の冷凍保存された胎盤組織組成物。
【請求項４８】
前記細胞の生存率が、解凍されても実質的に維持されている、請求項４６または４７のいずれかに記載の冷凍保存された胎盤組織組成物。
【請求項４９】
対象者のトンネル状態の傷の治療方法であって、請求項１または３８のいずれかに記載の冷凍保存された胎盤組成物を、そのトンネル傷の部位に必要に応じて投与することを含む、前記治療方法。
【請求項５０】
対象者の創傷または組織欠損の治療方法であって、請求項１または３８のいずれかに記載の冷凍保存された胎盤組成物を必要に応じて投与することを含む、前記治療方法。
【請求項５１】
前記投与が、その投与で炎症性サイトカインの量または活性を減らすのに効果的な量である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記投与が、その投与で抗炎症性サイトカインの量または活性を増やすのに効果的な量である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記投与が、その投与で炎症を抑えるのに効果的な量である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記投与が、その投与で血管新生を促進するのに効果的な量である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５５】
前記量が、投与でＶＥＧＦ発現または活性を増加させるのに効果的である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記量が、投与でｂＦＧＦ発現または活性を増加させるのに効果的である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記量が、投与で抗酸化症状を提供するのに効果的である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５８】
前記創傷が、裂傷、擦り傷、火傷、切開、穿刺、発射に起因する傷、表皮の傷、皮膚の傷、慢性の傷、急性の傷、外部の傷、内部の傷、先天性の傷、潰瘍、褥瘡、糖尿病性潰瘍、トンネル傷、外科手術中またはそれに付随して生じた傷、静脈の潰瘍、脊髄損傷、眼の外傷、及び虚血壊死から成る群から選ばれる、請求項５０から５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記創傷または組織欠損が、トンネル傷である、請求項５０から５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記創傷または組織欠損が、外科手術によりまたはその間にできた、請求項５０から５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記外科手術が、骨修復手術である、請求項６０に記載の前記方法。
【請求項６２】
創傷または組織欠損における、血管新生の促進方法であって、請求項１または３８のいずれかに記載の冷凍保存された胎盤組成物を、血管新生を促進するのに効果的な量で投与するステップを含む、前記方法。
【請求項６３】
前記創傷または組織欠損が、トンネル傷である、請求項６２に記載の前記方法。
【請求項６４】
前記冷凍保存された胎盤組成物が、ＶＥＧＦの発現増加を促進するのに効果的な量で投与される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
前記冷凍保存された胎盤組成物が、少なくとも投与後１４日間でＶＥＧＦの発現増加を促進するのに効果的な量で投与される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記冷凍保存された胎盤組成物が、ｂＦＧＦの発現増加を促進するのに効果的な量で投与される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
瘢痕形成の予防または低減方法であって、請求項１または３８のいずれかに記載の冷凍保存された胎盤組成物を、瘢痕形成を予防または低減するのに効果的な量で、必要に応じてその部位に投与することを含む、前記瘢痕形成の予防または低減方法。
【請求項６８】
前記冷凍保存された胎盤組成物が、ＩＦＮ−２αの発現を増加させるのに効果的な量で、瘢痕形成を低減するのに効果的な量で投与される、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記冷凍保存された胎盤組成物が、ＴＧＦ−β３の発現を増加させるのに効果的な量で投与される、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
前記ＴＧＦ−β３の発現を増加させる量が、瘢痕形成を低減するのに効果的である、請求項６７に記載の方法。
【請求項７１】
創傷治癒の改善方法であった、請求項１または３８のいずれかに記載の冷凍保存された胎盤組成物を必要に応じて投与することを含み、ここで前記冷凍保存された胎盤組成物が、１つ以上の治療因子の発現増加を促進させるのに効果的な量で与えられる、前記創傷治癒の改善方法。
【請求項７２】
組織再生の直接または間接的な刺激方法であって、請求項１または３８のいずれかに記載の冷凍保存された胎盤組成物を必要に応じて投与することを含み、ここで前記冷凍保存された胎盤組成物が、１つ以上の治療因子の発現増加を促進させるのに効果的な量で与えられる、前記組織再生の直接または間接的な刺激方法。
【請求項７３】
創傷における炎症の抑制方法であって、請求項１または３８のいずれかに記載の前記冷凍保存された胎盤組成物の、その創傷に効果的な量を投与することを含む、前記創傷における炎症の抑制方法。
【請求項７４】
前記冷凍保存された胎盤組成物が、投与でＴＮＦ−αの発現または活性を低下させるのに効果的な量で投与される、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
必要に応じた、部位でのプロテアーゼ活性の低減方法であって、その部位への投与で前記プロテアーゼ活性を減らすのに効果的な、請求項１または３８のいずれかに記載の前記冷凍保存された胎盤組成物の量を投与することを含む、前記部位でのプロテアーゼ活性の低減方法。
【請求項７６】
前記部位が、創傷または組織欠損である、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記量が、少なくとも１つのマトリックスメタロプロテアーゼの活性または放出を阻害若しくは減らす、請求項７５に記載の方法。
【請求項７８】
皮膚潰瘍の治療法であって、請求項１から４８のいずれか１項に記載の前記組成物を、その皮膚潰瘍の治療に効果的な量で投与することを含む、前記皮膚潰瘍の治療法。
【請求項７９】
組成物であって、ａ）請求項１から４４のいずれか１項に記載の、解凍された冷凍保存胎盤組織組成物、及びｂ）キャリアを含む、前記組成物。
【請求項８０】
前記キャリアが、生体適合性足場である、請求項７９に記載の組成物。
【請求項８１】
前記生体適合性足場が、海綿、コラーゲン、自家移植、同種移植、異種移植、セラミック、サンゴ、複合材料、または脱灰骨基質である、請求項８０に記載の組成物。
【請求項８２】
前記組成物が、外科手術に使用される、請求項７９に記載の組成物。
【請求項８３】
創傷治療のキットであって、
ａ．薬学的に許容される容器に収められた、請求項１から４８のいずれか１項における胎盤組織組成物、及び
ｂ．前記創傷治療のための、前記胎盤組織組成物の投与説明書、
を含む、前記キット。
【請求項８４】
前記胎盤組織組成物がさらに添加物を含む、請求項８３に記載のキット。
【請求項８５】
前記添加物が、抗生物質、皮膚軟化剤、角質溶解剤、保湿剤、抗酸化物質、防腐剤、治療薬、救急絆創膏、注射器、カテーテル、医療用具、ハサミ、メス、洗面器、接着剤、及びそれらの組み合わせから選ばれる、請求項８４に記載のキット。
【請求項８６】
前記薬学的に許容される容器が、バイアル瓶、パウチ袋、瓶、袋、試験管及びシリンジである、請求項８４に記載のキット。
【請求項８７】
胎盤組織組成物の調合プロセスであって、
ａ．胎盤細胞、治療因子、及び細胞外基質成分を含む胎盤組織を提供すること、
ｂ．前記胎盤組織の少なくとも一部分を破壊して、胎盤細胞、治療因子、及び細胞外基質成分を含む胎盤懸濁液を形成すること、
ｃ．前記胎盤懸濁液を冷凍保存して、冷凍保存された胎盤組織組成物を形成すること、
のステップを含み、ここで、前記冷凍保存された胎盤組織組成物の冷凍及びそれに続く解凍後に、その胎盤細胞の約４０％を上回る細胞が生存しており、ここで、前記組成物は、機能的免疫原性細胞が枯渇している、前記プロセス。
【請求項８８】
前記破壊ステップに先立ち、さらに
ａ１．前記胎盤組織を少なくとも１つの酵素で消化して、胎盤細胞及び胎盤組織断片の懸濁液を形成すること、及び
ａ２．前記胎盤細胞及び胎盤組織断片を分離すること、
のステップをさらに含み、ここでステップ（ｂ）において、その破壊ステップが、ステップ（ａ２）において分離された前記胎盤組織断片を破壊することを含み、次に、ステップ（ｂ）の後のステップ（ｃ）において、ステップ（ａ２）で分離された前記胎盤細胞と破壊された組織断片を組み合わせて、前記胎盤分散液を形成して成る、請求項８７に記載のプロセス。
【請求項８９】
胎盤組織組成物の調合プロセスであって、
ａ．胎盤細胞、治療因子、及び細胞外基質成分を含む胎盤組織を提供すること、
ｂ．前記胎盤組織を少なくとも１つの酵素で消化して、胎盤細胞及び細胎盤組織断片の懸濁液を形成すること、
ｃ．前記胎盤細胞及び前記胎盤組織断片を分離すること、
ｄ．前記胎盤組織断片を破壊して、胎盤分散液を形成すること、
ｅ．前記胎盤細胞と前記胎盤分散液を組み合わせて、胎盤組織組成物を形成すること、及び
ｆ．その胎盤組織組成物を冷凍保存すること、
のステップを含み、ここで前記冷凍保存された胎盤組織組成物のそれに続く解凍後に、その胎盤細胞の４０％を上回る細胞が生存しており、ここで、前記組成物が、機能的免疫原性細胞を枯渇している、前記プロセス。
【請求項９０】
前記冷凍保存のステップが、冷凍保存剤の添加を含む、請求項８７から８９のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項９１】
前記冷凍保存剤が、当該最終組成物の容積に対して、約３％から約１００％の量である、請求項９０に記載のプロセス。
【請求項９２】
前記冷凍保存剤が、当該最終組成物の容積に対して、約３％から約５０％の量である、請求項９０に記載のプロセス。
【請求項９３】
前記冷凍保存剤が、当該最終組成物の容積に対して、約５％から約１０％の量である、請求項９０に記載のプロセス。
【請求項９４】
前記組成物が、ａ．冷凍保存剤の容積で約５％から約２０％、ｂ．血清アルブミンの容積で約５％から約１５％、及びｃ．任意で、薬学的に許容されるキャリアを含む、請求項９０に記載のプロセス。
【請求項９５】
前記冷凍保存のステップが、ａ．前記胎盤組成物に、冷凍保存剤を添加し、ｂ．前記胎盤組成物を、約２℃から約８℃の温度で、約２分から約２４０分間静置し、及びｃ．前記胎盤組成物を、約−２０℃から約−１９６℃の温度で冷凍することを含む、請求項８７から９４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項９６】
ステップが、前記胎盤組成物に血清アルブミンを添加することをさらに含む、請求項９０に記載のプロセス。
【請求項９７】
前記機能性免疫原性細胞が、母体血液細胞、新生児血液細胞、マクロファージ、栄養膜から選択される、請求項８７から９６のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項９８】
前記免疫原性細胞の枯渇量が、免疫応答を産生するのに十分な量を下回って、少なくとも１つの免疫原性因子を産生する、請求項８７から９６のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項９９】
前記少なくとも１つの免疫原性因子が、検出限界を下回った量で産生される、請求項９８に記載のプロセス。
【請求項１００】
前記少なくとも１つの免疫原性因子が、３５０ｐｇ／ｃｍ２以下の量のＴＮＦ−αである、請求項９８に記載のプロセス。
【請求項１０１】
前記胎盤組織が、ミンチ化により破壊される、請求項８７に記載のプロセス。
【請求項１０２】
ミンチ化が、ハーブミンチ器またはメッザルーナによる、請求項１００に記載のプロセス。
【請求項１０３】
前記胎盤組織が、均質化により破壊される、請求項８７に記載のプロセス。
【請求項１０４】
前記胎盤組織が、栄養膜が枯渇した絨毛膜である、請求項８７に記載のプロセス。
【請求項１０５】
前記胎盤組織が、シリンジを通り抜けるのに十分に小さい組織断片部にミンチ化される、請求項１０１に記載のプロセス。
【請求項１０６】
前記組成物中の生存細胞量が、少なくとも１，０００／ｍＬである、請求項８７から１０５のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１０７】
前記組成物中の生存細胞量が、少なくとも１０，０００／ｍＬである、請求項８７から１０６のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１０８】
前記胎盤組織組成物の冷凍保存及びそれに続く解凍後に、その胎盤細胞の５０％を上回る細胞が生存している、請求項８７から１０７のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１０９】
前記胎盤組織組成物の冷凍保存及びそれに続く解凍後に、その胎盤細胞の７０％を上回る細胞が生存している、請求項８７から１０７のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１１０】
先行請求項８７から１０９のいずれか１項に記載の前記プロセスによりつくられる産物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年、５月７日に、出願名「Ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  Ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ」及び「Ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  Ａｍｎｉｏｔｉｃ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ」と共出願されており、それらの全体を参照により本明細書に組み込む。
【０００２】
本発明技術は、一般に、胎盤組成物、胎盤組成物を使用する医学的治療法、及び胎盤組成物の製造法に関する。本発明技術は、例えば、血管新生、炎症の低減、瘢痕形成の抑制、プロテアーゼ活性の低減、細胞移行の促進、組織再生の促進、及び遊離活性酸素による酸化の阻害の1つ以上を促進する、組成物、冷凍保存組成物、方法を含む、創傷治癒を促進または改善する方法及び産物に関する。
【背景技術】
【０００３】
組織の構造的な整合性は、各部分での、生理活性分子、細胞外基質、及び細胞の種類による宿主を伴う組織の動的相互作用によって達成される。そのような相互作用はまた、組織の老化、損傷、及び／または修復ならびに再生治療の間において、極めて重要である。例えば、火傷は、局所組織の損傷を生み出すだけでなく、全身に及ぶ重大な結果をもたらす。現在、例えば、火傷の治療は、傷の治癒を促進すること及び感染症のリスクを低減することに焦点を当てる。臨床分野においては、火傷は、依然として気遣いが必要で深刻な問題であり、及びこれらの傷はしばしば高い疾病率ならびに死亡率を伴う。火傷の標準的な治療には、例えば、消毒薬及びガーゼの創傷包帯の使用が含まれる。しかしながら、重度で大面積の火傷においては、この治療法では十分ではない。重症な火傷治療のための従来の標準的な処置は、依然として自己の生体皮膚移植である。しかしながら、皮膚移植に利用可能な量は、しばしば非常に限られ、そしてこの処置は常にドナー側に傷を残す結果となる。
【０００４】
火傷の治療を改善する試みには、生物学的な皮膚交換と同様に、単一の増殖因子または混合した増殖因子の使用が含まれてきた。上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、及びその他の単一要因などの増殖因子が、火傷治癒に試験されてきたが、しかしながらその結果は、一様ではない。
【０００５】
火傷及びその他の傷への胎盤膜の利用は、１００年以上前に起源がある（Ｋｅｓｔｉｎｇらの報告、２００８年）。胎盤膜は、例えば、創傷治癒プロセスの調整を担うＭＳＣ（間充織幹細胞）を含む、細胞外基質、増殖因子、及び細胞などの、皮膚に含まれ、そして創傷の治癒に必要な成分を含む。火傷に対する羊膜など胎盤膜の有効性は、多数の報文に記録されたが、しかしながら、大面積の火傷に対する胎盤膜の使用は、大面積を覆うのに十分な胎盤膜を提供することが難しく、制約されている。
【０００６】
治療が困難な他のタイプの創傷には、トンネル状の傷がある。トンネル状の傷は、筋肉または皮下組織の中に若しくは貫通している傷の繋がりで、そして多様な長さまたは深さをもった複数のトンネルになった、「トンネル状態」により特徴づけられる。トンネル傷が発達する理由は、感染症、慢性傷の炎症、不適切な傷の保護による不十分な水分の排出吸収、及び過剰な創傷保護による新しい粒状組織の分解が起こり、組織層が集まる場所に集中する圧力及びせん断力を含んでいる。シート状の包帯は、その包帯が、傷表面を覆っていない場合があり、そして、もしそのトンネルが内部にあれば、高い圧力をかけ、新しい粒状組織を分解する場合があるので、トンネル傷には、不適切である。
【０００７】
本分野で必要なものは、胎盤膜ではあるが、液体状で適用可能な、その利点を提供する治療用組成物、治療法及び／または産物である。さらに、創傷修復段階、すなわち、炎症、増殖、及び再生段階の１つ以上の、好ましくは全ての段階において、動的治療を提供する産物が必要である。
【発明の概要】
【０００８】
本発明技術は、胎盤細胞、例えば、胎盤全体またはその一部に由来する胎盤細胞及びその他の胎盤成分を含む１つ以上の胎盤組成物を提供する。当該その他胎盤成分は、１つ以上の治療因子、細胞外基質成分などを含んでも良い。当該組成物は、機械的な操作（例えば、解体またはミンチ化若しくは均質化）、酵素による消化、またはそれらの組み合わせにより取得できる。胎盤組織は、任意で、羊膜、絨毛膜、羊膜と絨毛膜の混合物、または、例えば、臍帯の組織及びホウォートンゼリーを含む、本明細書に記載のその他の組織であり得る。本発明技術はまた、１つ以上の胎盤組成物の製造法を提供する。
【０００９】
さらに、本発明技術はまた、本発明技術の１つ以上の胎盤組成物を必要に応じて患者（ヒトまたは動物）へ投与することを含む、細胞全体または部分的な組織損傷若しくは欠損（例えば、創傷または火傷）を治療する、１つ以上の方法を提供する。いくつかの態様において、本発明技術はまた、本発明技術の１つ以上の胎盤組成物を必要に応じて患者（ヒトまたは動物）へ投与することを含む、細胞再生の１つ以上の方法を提供する。
【００１０】
任意で、本発明技術の胎盤組成物は、例えば、とりわけ表１、表２、または表５において明記される、１つ以上の治療因子を含む。
【００１１】
任意で、本発明技術の実践で活用される胎盤細胞は、ＭＳＣ（間充織幹細胞）などの間質細胞を含む。
【００１２】
少なくとも１つの実施形態において、本発明技術の組成物は、
ｉ）第一胎盤（例えば、羊膜または絨毛膜）組織を取得すること、
ｉｉ）その第一胎盤組織から、胎盤細胞を取得すること、
ｉｉｉ）第二胎盤（例えば、羊膜または絨毛膜）組織を取得すること、
ｉｖ）第二胎盤組織を破壊して、細胞外基質、治療因子、胎盤細胞及び組織断片を含む分散液を形成すること、及び
ｖ）前記の胎盤細胞と分散液を組み合わせて、１つ以上の胎盤組成物及び／または産物を形成すること、
を含む平行プロセス法により生産される。
【００１３】
任意で、その第一胎盤組織及び第二胎盤組織は、例えば、同じドナー由来の、互いに自己性である。
【００１４】
他の実施形態において、本発明技術の組成物は、当該第二胎盤組織が、当該第一胎盤組織から胎盤細胞を取得した後の、第一胎盤組織由来である連続プロセス法により生産される。例えば、第一絨毛膜組織は、それらの細胞集団が単離され、そして次に分散液を形成するために破壊された後に、保持されても良い。この分散液は、次に当該胎盤細胞と組み合わされても良い。
【００１５】
任意で、その胎盤細胞を単離するステップは、当該第一胎盤組織（例えば、羊膜または絨毛膜若しくは栄養膜の無い絨毛膜）を、とりわけＩＩ型コラゲナーゼなどの、消化酵素と接触するステップを含むことができる。任意で、当該第一胎盤組織は、ＩＩ型コラゲナーゼなどの消化酵素に限定的に曝露される（例えば、１時間を下回る曝露；あるいは約２０分、または約１０分）。
【００１６】
任意で、いくつかの実施形態において、当該胎盤組織（本発明技術の胎盤組成物が生産される胎盤である）は、ディスパーゼなどの消化酵素による処理、それに次ぐその栄養膜の物理的除去により、栄養膜が枯渇した絨毛膜組織である。
【００１７】
そのうえ他の実施形態において、本発明技術の１つ以上の胎盤組成物の製造法は、
（ｉ）胎盤（例えば、羊膜または絨毛膜）組織を取得すること、
（ｉｉ）その胎盤組織をコラゲナーゼに曝露すること、
（ｉｉｉ）その胎盤組織を、第一部分と第二部分に分けること、
（ｉｖ）第一胎盤部から胎盤細胞を単離すること、
（ｖ）第二胎盤部を破壊して、治療因子、細胞外基質、胎盤細胞、及び組織断片部を含む分散液を形成すること、及び
（ｖｉ）前記の胎盤細胞と胎盤分散液を組み合わせて、当該胎盤組成物を形成すること、
のステップを含む。
【００１８】
さらに１つの実施形態において、本発明技術の１つ以上の胎盤組成物の製造法は、
（ｉ）少なくとも１つの胎盤（例えば、羊膜または絨毛膜）組織を取得すること、
（ｉｉ）その胎盤組織を、胎盤細胞を放出するのに十分な時間で、少なくとも１つのコラゲナーゼに曝露すること、
（ｉｉｉ）そのコラゲナーゼに曝露された胎盤組織から、放出された胎盤細胞を単離すること、
（ｉｖ）そのコラゲナーゼに曝露された胎盤組織を破壊して、１つ以上の治療因子、細胞外基質、胎盤細胞、及び組織断片部を含む分散液を形成すること、及び
（ｖ）前記の胎盤細胞と胎盤分散液を組み合わせて、少なくとも１つの胎盤組成物を形成すること、
のステップを含む。
【００１９】
１つの態様において、当該破壊ステップは、そのコラゲナーゼに曝露された胎盤組織の均質化を含む。他の態様において、当該破壊ステップは、そのコラゲナーゼに曝露された胎盤組織のミンチ化を含む。破壊のその他の形態はまた、本発明技術の実践及び施行とみなされる。
【００２０】
いくつかの態様において、本発明技術の１つ以上の方法はさらに、解凍後に、当該胎盤組成物における胎盤細胞の少なくとも４０％が生存している、当該胎盤組成物の冷凍保存法を含む。
【００２１】
本発明技術のいくつかの態様において、１つ以上の冷凍保存された胎盤組織は、
（ｉ）１つ以上の胎盤細胞、
（ｉｉ）１つ以上の治療因子、
（ｉｉｉ）１つ以上の細胞外基質成分、及び
（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）またはそれらの組み合わせを含む組織断片部、
を有する、少なくとも１つの破壊された胎盤組織を含んで提供され、ここで、その冷凍保存された胎盤組織組成物のそれに続く解凍後に、その胎盤細胞の約４０％を上回る細胞が生存しており、及びその組成物は、機能的免疫原性細胞（例えば、冷凍保存及びそれに続く解凍の前の、当該胎盤組織組成物と比較して）が枯渇している。
【００２２】
さらに他の態様において、１つ以上の冷凍保存された胎盤組織組成物は、
ａ．少なくとも１つの破壊された胎盤組織で、
（ｉ）１つ以上の胎盤細胞、
（ｉｉ）１つ以上の治療因子、
（ｉｉｉ）１つ以上の細胞外基質成分、及び
（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）またはそれらの組み合わせを含む組織断片部、
を含み、
ｂ．１つ以上の冷凍保存剤、
を含んで提供され、ここで、その冷凍保存された胎盤組織組成物のそれに続く解凍後に、その胎盤細胞の約４０％を上回る細胞が生存しており、そして、その組成物は、機能的免疫原性細胞が枯渇しており、そしてここで、１つ以上の胎盤細胞、治療因子、細胞外基質成分、またはそれらの組み合わせが、少なくとも１つの治療的な利点を与えるのに効果的な量で存在する。
【００２３】
さらにそのうえ１つの態様において、本発明技術は、（ａ）胎盤細胞、治療因子、及び細胞外基質成分を含む胎盤組織を提供し、（ｂ）その胎盤組織の少なくとも一部を破壊して、胎盤組織断片部、胎盤細胞、治療因子、及び細胞外基質成分を含む胎盤分散液を形成し、及び（ｃ）その胎盤分散液を凍結保存して、凍結保存された胎盤組織組成物を形成するステップを含む１つ以上の胎盤細胞の調合に対する、少なくとも１つのプロセスを提供し、ここで、それに続くその凍結保存された胎盤組織組成物の解凍後に、その胎盤細胞の約４０％を上回る細胞が生存しており、そしてここで、その組成物は、機能的免疫原性細胞が枯渇している。
【００２４】
さらに他の実施形態において、本発明技術は、
ａ．胎盤細胞、治療因子、及び細胞外基質成分を有する胎盤組織を提供すること、
ｂ．少なくとも１つの酵素でその胎盤組織を消化して、胎盤細胞及び胎盤組織断片部の懸濁液を形成すること、
ｃ．その胎盤細胞及び胎盤組織断片部を単離すること、
ｄ．その胎盤組織を破壊して、胎盤分散液を形成すること、
ｅ．前記の胎盤細胞と胎盤分散液を組み合わせて、胎盤組織組成物を形成すること、及び
ｆ．その胎盤組織組成物を冷凍保存すること、
のステップを含む胎盤組織組成物の調合に対する、少なくとも１つのプロセスを提供し、ここで、それに続くその凍結保存された胎盤組織組成物の解凍後に、その胎盤細胞の約４０％を上回る細胞が生存しており、そしてここで、その組成物は、機能的免疫原性細胞が枯渇している。
【００２５】
その他の態様において、本発明技術は、本明細書に開示するプロセスの１つ以上により作られる組成物を提供する。
【００２６】
そのうえさらなる態様において、冷凍保存された胎盤組織組成物を提供する。当該胎盤組織組成物は、
ａ．破壊された胎盤組織で、
（ｉ）１つ以上の胎盤細胞、
（ｉｉ）１つ以上の治療因子、
（ｉｉｉ）１つ以上の細胞外基質成分、及び
（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）またはそれらの組み合わせを含む１つ以上の組織断片部、
を含み、及び
ｂ．１つ以上の冷凍保存剤、
を含み、ここで、冷凍保存及びそれに続くその胎盤組織組成物の解凍後に、その胎盤細胞の約４０％を上回る細胞が生存しており、そしてその組成物は、機能的免疫原性細胞が枯渇しており、そしてここで、１つ以上の胎盤細胞、治療因子、細胞外基質成分またはそれらの組み合わせが、
（ｉ）炎症性サイトカインの量及び／または活性を低下させる、
（ｉｉ）抗炎症サイトカインの量及び／または活性を増加させる、
（ｉｉｉ）活性酸素種の量及び／または活性を低下させる、
（ｉｖ）抗酸化物質の量及び／または活性を増加させる、
（ｖ）プロテアーゼの量及び／または活性を低下させる、
（ｖｉ）細胞増殖を増加させる、
（ｖｉｉ）血管新生を増加させる、及び／または
（ｖｉｉｉ）細胞移行を増加させる、
ことの１つ以上を実施するのに効果的な量で提供される。
【００２７】
さらに追加の態様において、本発明技術は、
ａ．ミンチ化された胎盤組織分散液で、
（ｉ）．１つ以上の胎盤細胞、
（ｉｉ）．１つ以上の治療因子、及び
（ｉｉｉ）．１つ以上の細胞外基質成分、
（ｉｖ）．（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）またはそれらの組み合わせを含む１つ以上の組織断片部を含み、及び
ｂ．少なくとも１つの冷凍保存剤、
を含む、１つ以上の冷凍保存された胎盤組織組成物を提供し、ここで、続くその凍結保存された胎盤組織組成物の解凍後に、その胎盤細胞の約４０％を上回る細胞が生存しており、そしてここで、その組成物は、機能的免疫原性細胞が大幅に枯渇している。
【００２８】
上記態様の多様な実施形態において、当該組成物は、後に続く解凍の前に、長時間にわたり貯蔵されても良い。上記態様のいくつかの実施形態において、当該長期間とは、本明細書に記載の多様な期間に対応したその他の月数及び日数を含み、約６ヶ月から約３６ヶ月またはそれ以上、あるいは約６ヶ月から少なくとも約２４ヶ月またはそれ以上、あるいは約６ヶ月から少なくとも約１２ヶ月またはそれ以上、あるいは約６ヶ月から約１０ヶ月、あるいは約６ヶ月から、あるいは約３ヶ月から約６ヶ月、あるいは約１ヶ月から約３ヶ月であり得る。これらの実施形態において、当該組織細胞の生存率は、続く解凍において大幅に保持される。さらなる実施形態において、当該組織細胞の生存率は、冷凍貯蔵から少なくとも２４ヶ月の間、大幅に保持される。
【００２９】
さらにいくつかの態様において、本発明技術は、必要に応じて、本明細書に記載の１つ以上の胎盤組成物を、そのトンネル傷の部位に投与することを含む、少なくとも１つの、対象者（ヒトまたは動物）のトンネル傷の治療法を提供する。
【００３０】
さらに他の態様において、本発明技術は、必要に応じて、本明細書に記載の少なくとも１つの胎盤組成物の投与のステップを含む、少なくとも１つの、対象者（ヒトまたは動物）の傷または組織欠損の治療法を提供する。特定の非限定的な態様及び実施形態において、当該組成物の量は、投与により炎症を低減するのに効果的である。その他の態様において、当該組成物の量は、投与により血管新生を増加するのに効果的である。そのうえさらなる態様において、当該組成物の量は、投与により抗酸化状態を与えるのに効果的である。
【００３１】
さらなる態様において、本発明技術は、血管新生を促進するのに効果的な量で、本明細書に記載の胎盤組成物を投与するステップを含んで、傷の全体または一部分若しくは組織欠損において、血管新生を促進する方法を提供する。
【００３２】
そのうえさらなる態様において、本発明技術は、瘢痕の形成を防ぎまたは減らすのに効果的な量で、本明細書に記載の１つ以上の胎盤組成物を投与するステップを含んで、瘢痕の形成を防ぎまたは低減する方法を提供する。
【００３３】
さらにその他の態様において、本発明技術は、必要に応じ、対象者（ヒトまたは動物）への、本明細書に記載の１つ以上の胎盤組成物の投与を含み、そしてここで、その胎盤組成物が、１つ以上の治療因子の発現増加を促進するのに効果的な量で与えられる、創傷治癒の促進法を提供する。
【００３４】
さらなる態様において、本発明技術は、必要に応じて、対象者（ヒトまたは動物）への、本明細書に記載の１つ以上の胎盤組成物の投与を含み、そしてここで、その胎盤組成物が、１つ以上の治療因子の発現増加を促進するのに効果的な量で与えられる、組織再生を直接及び間接的に刺激する方法を提供する。
【００３５】
そのうえさらなる態様において、本発明技術は、部位への投与によりプロテアーゼ活性を低減するのに効果的な１つ以上の胎盤組成物の量を、その部位へ投与することを含む、必要に応じた部位のプロテアーゼ活性を低減する方法を提供する。
【００３６】
そのうえさらなる態様において、本発明技術は、ａ）解凍された冷凍保存の胎盤組成物、及びｂ）キャリアを含む、少なくとも１つの組成物を提供する。
【００３７】
他の態様において、本発明技術は、ａ）少なくとも１つの、薬学的に許容される容器の中に、またはその容器と組み合わされた、少なくとも１つの冷凍保存された胎盤組織組成物、ｂ）傷の全体または一部分若しくは組織欠損の治療に対応した、当該胎盤組織組成物の投与説明書を含む、傷の全体または一部分若しくは組織欠損の治療のための、少なくとも１つのキットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】消化により単離された、絨毛膜組織のグラム当たりの生存細胞の回収状況を描写している。
【図２】消化により単離された、生存及び非生存細胞の量を描写している。
【図３】胎盤産物の冷凍−解凍サイクルの前後での、細胞生存率を描写している。
【図４】均質化前の、本発明技術の消化ステップの有無により作られた胎盤産物における、生存細胞のレベルを描写している。
【図５】アイソタイプのコントロール（図５Ａ）と比較した、細胞表面マーカーＣＤ１６６（図５Ｂ）、ＣＤ１０５（図５Ｃ）、及びＣＤ４５（図５Ｄ）での染色による、本発明技術の胎盤組成物における細胞の細胞表現型を描写している。
【図６】様々な冷凍保存剤を使用した、細胞生存率を描写している。
【図７】異なる冷凍保存溶液中及び貯蔵後の異なる冷凍期間での、本発明技術の胎盤組成物の細胞生存率を描写している。
【図８】様々な培養時間でのコラゲナーゼ処理の後、回収した胎盤組織重量及び生存細胞の量を描写している。
【図９】羊膜の消化及び均質化により単離された、生存細胞の回収量を描写している。
【図１０】１４日間培養に対する、本発明技術の胎盤組成物におけるｂＦＧＦ（図１０Ａ）及びＶＥＧＦ（図１０Ｂ）の発現を描写している。
【図１１】本発明技術の胎盤組成物が、低酸素状況に曝露された場合の、ＶＥＧＦ産生の増加を描写している。
【図１２】冷凍前及び冷凍／解凍後の、本発明技術の胎盤組成物におけるＶＥＧＦ（図１２Ａ）及びｂＦＧＦ（図１２Ｂ）の含有量を描写している
【図１３】本発明技術の胎盤組成物における、ＩＦＮ−２α（図１３Ａ）及びＴＧＦ−β３（図１３Ｂ）の発現を描写している。
【図１４】本発明技術の胎盤組成物の複数ロットにおける、ＴＧＦ−β３を描写している。
【図１５】絨毛膜由来の本発明技術の胎盤組成物における、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７、ＰＬＡＢ、及びＰＬＧＦの検出を描写している（図１５Ａ）。また、ＩＧＦ−１の検出を描写している（図１５Ｂ）。
【図１６】骨誘導後に、絨毛膜由来の胎盤組成物から単離及び増殖した細胞（図１６Ｃ）との比較における、骨髄（図１６Ａ）または絨毛膜由来の胎盤組成物（図１６Ｂ）から単離及び増殖した二継代細胞を描写している。
【図１７】ミンチ化した本発明技術の胎盤組成物の複数ロットにおける、生存細胞量（図１７Ａ）及び細胞生存率％（図１７Ｂ）を描写している。
【図１８】ミンチ化及び消化された本発明技術の胎盤組成物の、ＴＮＦ−α阻害による炎症性環境への応答を描写している。
【図１９】ミンチ化された本発明技術の胎盤組成物による、エラスターゼの阻害を描写している。
【図２０】ミンチ化及び消化された本発明技術の胎盤組成物における、ＶＥＧＦ含有量を描写している。
【図２１】グアニジン塩酸に溶解後の、ミンチ化及び消化された本発明技術の胎盤組成物における、ＶＥＧＦ含有量を描写している。
【図２２】組織抽出緩衝液に溶解後の、ミンチ化及び消化された本発明技術の胎盤組成物における、ｂＦＧＦ含有量を描写している。
【図２３】ミンチ化及び消化された本発明技術の胎盤組成物の、保持された増殖因子の放出を描写している。
【図２４】培養１４日後での、Ｓｅｒｖａ社のコラゲナーゼ（図２４Ａ）またはＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ社のコラゲナーゼ（図２４Ｂ）での消化による、単離後の本発明技術の胎盤組成物の増殖能力を描写している。
【図２５】ミンチ化された胎盤組成物の、様々な骨誘導足場との相溶性を描写している。ＨＡ−ＴＣＰ−コラーゲンフォーム上の胎盤組成物を示す（図２５Ａ及び図２５Ｂ）。また、ＴｒａｎｓＺ移植上の胎盤組成物を示している（図２５Ｃ）。
【図２６】メッザルーナでミンチにされた絨毛膜由来の、組織断片部のサイズを描写している。図上部の左右の大きな四角は、０．２５ｍｍ角である（注記）。
【図２７】様々な膜調合物−羊膜＋絨毛膜＋栄養膜（ＡＣＴ）、絨毛膜＋栄養膜（ＣＴ）、栄養膜（Ｔ）、羊膜（ＡＭ）、及び絨毛膜（ＣＭ）から放出された、リポ多糖類（ＬＰＳ）刺激のＴＮＦ−αを描写している。
【図２８】高いレベルのＴＮＦ−αを分泌した絨毛膜＋栄養膜（ＣＴ）により刺激された、Ｔ細胞由来のＩＬ−２Ｒαの発現を示している。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本明細書での使用に際して、以下の定義及び略語を適用する。
【００４０】
「絨毛膜組織」または「絨毛膜」は、胎盤組織、例えば、栄養膜、体細胞の中胚葉、またはそれらの組み合わせ由来の絨毛部分またはそれらの一部分を意味する。
【００４１】
「羊膜組織」または「羊膜」は、胎盤組織、例えば、上皮層、基底膜、緻密層、線維芽細胞層、及び中間（海綿）層由来の羊膜またはそれらの一部分を意味する。
【００４２】
「例示的な（ｅｘｅｍｐｌａｒｙ）」（または「例えば（ｅ．ｇ．，）」若しくは「例示により（ｂｙ  ｅｘａｍｐｌｅ）」）は、非限定的な事例を意味する。
【００４３】
用語「胎盤産物」及び「胎盤組成物」は、互換的に使用され、そして本明細書に記載され、そして請求される組成物である。「胎盤組成物」または「胎盤産物」は、非限定的に、胎盤細胞、細胞外基質成分及び／または治療因子、及び／またはそれらの組み合わせを含む、細胞、細胞外基質成分、治療因子、及び組織断片部／成分を含む。当該胎盤組成物はまた、１つ以上の冷凍保存剤を含んでも良い。本発明技術の当該胎盤産物または胎盤組成物はまた、例えば、同種移植または異種移植などの移植に対応したものであり得る。
【００４４】
「胎盤分散液」は、物理的／機械的な胎盤組織の分散液を形成している成分または産物を意味する。この胎盤分散液は、胎盤細胞の一部分を単離し及び除去した胎盤組織から形成され得る。あるいは、この胎盤分散液は、胎盤細胞の単離及び除去をしない胎盤組織から形成され得る。例えば、分散液は、特に、均質状、ブレンド状、懸濁状、コロイド状、または溶液の形態であっても良い。
【００４５】
「細胞断片部」は、酵素での消化後及びその組織断片部の除去後に残る、消化された胎盤組織の一部を指す。この細胞断片部は、胎盤細胞、細胞外基質成分、治療因子、フラグメント及びそれらの組み合わせを含むことができる。
【００４６】
「組織断片部」は、酵素での消化後、その細胞断片部からの除去後に残った、消化された胎盤組織の一部を指す。この組織断片部は、細胞、細胞外基質成分、治療因子及びそれらの組み合わせを含む、組織フラグメントを含むことができる。
【００４７】
「組織断片部」または「組織フラグメント」は、胎盤組織の一部分を意味し、及びその組織断片部の一部であるかまたはその中に組み込まれている、胎盤細胞、治療因子、細胞外基質成分、またはそれらの組み合わせを含む。
【００４８】
「胎盤組織」または「胎盤膜」は、広い意味での胎盤由来の組織を意味する。胎盤組織は、胎盤の全体またはその任意の部分であり得る。「胎盤部分」は、絨毛膜、羊膜、絨毛膜と羊膜由来の膜（例えば、羊−絨毛膜）、ホウォートンゼリー、臍帯、胎盤葉、母体の脱落膜、及び／またはそれらの組み合わせを含むことを意図している。当該胎盤組織は、部分、膜、または構造を取り除くために、解体または消化（若しくはそれらの組み合わせ）されても良い。
【００４９】
「胎盤細胞」は、遺伝的起源（例えば、胎児と母体）、発達的起源（例えば、内胚葉、外胚葉、または中胚葉性）、または分化とは無関係に、胎盤から取得できる任意の細胞を意味する。胎盤細胞は、当分野で公知の任意の胎盤細胞、例えば、間充織幹細胞（ＭＳＣｓ）、子宮内膜間質細胞（ＥＳＣｓ）、胎盤由来間葉系前駆細胞、線維芽細胞、上皮細胞、マクロファージなどを含んでも良い。
【００５０】
「胎盤細胞」は、１つ以上の代謝活性、構造健全性（例えば、トリパンブルーなどの生存判別染色を除外）、細胞分裂の活動、シグナル伝達などの、生存細胞のいくつかの特徴を持っていることを意図している。
【００５１】
「組織損傷」は、任意の組織の損傷を意味する。組織損傷は、例えば、結合組織（例えば、特に、皮膚、軟骨、腱、及び／または靭帯）、骨、またはその他の組織、若しくは任意の臓器などの、組織に対する損傷を含むことができる。損傷により、機械的損傷、代謝障害、病気や障害、炎症やその他の損傷、欠損から引き起こされまたはもたらされる病理を意味する。そのような組織損傷の例示は、火傷に限らず、特に、創傷（トンネル傷を含む）、潰瘍、及び裂傷、切除（レーザー、凍結、低温電子顕微鏡手術、熱および電気の切除を含む）、及び／または外科的切開などを含む。
【００５２】
「免疫原性が枯渇している」、若しくは「免疫原性細胞が枯渇している」、若しくは「免疫原性因子が枯渇している」状態の胎盤組成物、または「機能性免疫原性細胞の枯渇した量」、若しくは「機能性免疫原性細胞の１つ以上の種類の枯渇した量」である組成物は、または「機能性免疫原性の量が枯渇している」状態の組成物は、損傷が未だに無い、実質的に無い、または免疫原性細胞の種類（例えば、ＣＤ１４＋マクロファージ、栄養膜、及び／または母体血液細胞）及び／または、さもなければ天然の胎盤、羊膜または絨毛膜には存在している免疫原性因子の少なくとも１つが枯渇している組織（または欠損）の治療に対して、生存している治療細胞を保持している及び／または治療効果を保持している、本発明技術の１つ以上の胎盤組成物を意味する。免疫原性細胞の種類及び／または免疫原性因子が、無い、実質的に無い、または枯渇している組成物（本明細書に記載の技術によるものなど）は、免疫原性細胞／因子のいくらかの量を保持するが、しかし、その保持された量が、機能的応答（例えば、検出限界を下回る量、無視できるほどわずかな量、機能的免疫応答を産生するには不十分な量）を産生するには不十分なレベルである組成物を含む。
【００５３】
「ＭＳＣ」は、間充織幹細胞を意味し、そして胎児、新生児、大人、または出生後を含む。「ＭＳＣｓ」は、羊膜ＭＳＣｓ（ＡＭＳＣｓ）及び絨毛膜ＭＳＣｓ（ＣＭＳＣｓ）を含む。ＭＳＣｓは一般に、ＣＤ７３、ＣＤ７０、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、及びＣＤ１６６の１つ以上を発現し、そして一般に、ＣＤ４５ならびにＣＤ３４を発現しない。ＭＳＣｓは、中胚葉性の系統（骨、軟骨細胞、及び脂肪細胞）に分化する。
【００５４】
本明細書で使用する「細胞外基質」または「ＥＣＭ」は、例えば、羊膜、絨毛膜、及び／または絨毛羊膜を含む胎盤組織などの組織と関連する、細胞外基質の任意の１つ以上の成分を指す。当該用語は、そのＥＣＭ（例えば、タンパク質及びそれらのフラグメント）に存在する水溶性／機能性治療因子と同様に、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸、デルマタン硫酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、デコリン、及びスチンなどの、ＥＣＭの構造成分を含むことができる。
【００５５】
「天然細胞」または「組織細胞」は、その胎盤膜に本来生じ、居住する、または内因性の細胞、すなわちその胎盤膜に細胞外から加えられていない細胞を意味する。
【００５６】
「天然因子」は、その胎盤膜に本来生じ、居住する、または内因性の胎盤膜因子、すなわちその胎盤膜に細胞外から加えられていない因子を意味する。
【００５７】
「治療細胞」または「有益細胞」は、その胎盤の間質細胞層、及び／または上皮層に存在する細胞及び成分を含み、ならびに、例えば、ＭＳＣｓ、線維芽細胞、及び上皮細胞を含む。
【００５８】
「治療因子」は、傷の治癒を促進する、胎盤、絨毛膜、または羊膜に由来する因子を意味する。治療因子はまた、細胞増殖因子ならびにタンパク質、組織修復因子ならびにタンパク質、それらと同様に一般に傷の治癒を促進するその他の因子及びタンパク質として分類される分子を含む。治療因子の非限定的な例示は、抗菌因子、化学誘引物質、プロテアーゼ及びプロテアーゼ阻害因子、免疫制御因子、ケモカイン、サイトカイン、増殖因子、及びその他因子などの再形成タンパク質を含む。治療因子は、また、血管新生、細胞増殖、及び上皮形成を促進する因子を含む。そのような因子の非限定的例示は、ＴＧＦα、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＥＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＨＧＦ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＩＧＦ、ＰＥＤＦ、Ａｎｇ−２、ＩＧＦ、ＩＧＦＢＰ１、ＩＧＦＢＰ２、ＩＧＦＢＰ３、アディポネクチン、α２−マクログロブリン、ＦＧＦｓ（例えば、ＦＧＦ−２／ｂＦＧＦ、ＫＧＦ、ＫＤＧ／ＦＧＦ−７）、マトリックスメタロプロテアーゼ（例えば、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１０、ＭＭＰ−１３）、メタロプロテアーゼの組織阻害タンパク質（例えば、ＴＩＭＰ１、ＴＩＭＰ２）、トロンボスポンジン（例えば、ＴＳＰ１、ＴＳＰ２）、フィブロネクチン、ＩＬ−１ＲＡ、ＮＧＡＬ、ディフェンシン、Ｇ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、ＩＦＮ２、ＰＬＡＢ、及びＳＤＦ１ｂを含む。用語「治療因子」は、用語「胎盤因子」と互換的に使用しても良い。例示的な治療因子を、表１、表２、または表５に網羅する。
【００５９】
「間質細胞」は、新生児の間充織幹細胞及び新生児線維芽細胞から成って存在する（任意で、自然な割合で）細胞の混合集団を指す。新生児の間充織幹細胞及び線維芽細胞の両細胞は、免疫特権を備わっており、どちらも、免疫反応を誘発する免疫細胞型に存在する表面タンパク質を発現する。
【００６０】
「間質層」は、上皮層を含まない、胎盤膜内の層を指す。
【００６１】
「インビトロ」は、非限定的に、細胞の培養増殖を含み、生きた有機体の外部で行われる実験及び／または処置（例えば、人工的な培養培地を使用する組織培養条件下において）を示す。
【００６２】
「インビボ」は、有機体、例えば動物またはヒトの内部で行われる実験及び／または処置を示す。
【００６３】
「冷凍保存試薬」または「冷凍保存料」若しくは「冷凍保存剤」は、本明細書では互換的に使用し、そしてその冷凍過程において損傷（例えば、細胞損傷）を防ぐ手助けする物質である。適切な冷凍保存試薬は、非限定的に、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、グリコール、プロピレングリコール、エチレングリコール、プロパンジオール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、１，２−プロパンジオール（ＰＲＯＨ）またはそれらの組み合わせを含む。その他の冷凍保存試薬は、例えば、ポリピロリドン、ヒドロキシエチル澱粉、多糖類、単糖類、アルギン酸塩、トレハロース、ラフィノース、デキストラン、ヒト血清アルブミン、フィコール、リポタンパク質、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシエチルストラーチ（ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ  ｓｔｒａｒｃｈ）、自己血漿、またはそれらの組み合わせから選ばれる、例えば１つ以上の非細胞浸透性の冷凍保存料を含む。有用な冷凍保存料のその他の例示は、Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ（ＢｉｏＦｉｌｅｓ、５巻、４号、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）社、データシート）に記載される。
【００６４】
「冷凍保存液」または「冷凍保存媒体」は、少なくとも１つの冷凍保存試薬を含む組成物を指す。冷凍保存液または媒体は、さらに、例えば、血清アルブミン、薬学的に許容されるキャリア、緩衝液、電解質溶液、または生理食塩水（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）などの成分を含んでも良い。この冷凍保存液または媒体は、溶液、スラリー、懸濁液などであっても良い。
【００６５】
ヒトの羊膜（ＡＭ）は、羊膜嚢に由来し、そして羊膜腔の粘膜を構成する胎児膜の最深部である。その厚さは、約０．０２から０．５ｍｍである。当該ＡＭは、５層から成り、上皮細胞の単一層が、基底膜の上にあり、そして羊水に接触する。結合組織の下層が、この基底膜に付着している。これらの結合組織は、緻密層、線維芽細胞層（時々、間葉層とも呼ばれる）、及び海綿層の、３つの構造層から成る。この海綿層は、絨毛の細胞層に隣接する。羊膜は、本質的に血管を持たない。
【００６６】
ヒトの絨毛膜（ＣＭ）は、妊娠期間中に、成長胎児と母親の間に存在する膜の１つである。それは、胚の中胚葉と栄養膜の２つの層で形成され、そして胚ならびにその他の膜を囲んでいる。その絨毛は、絨毛膜から出現し、子宮内膜に侵入し、そして母体血から胎児血へ栄養素の移送を可能にする。
【００６７】
胎盤組成物または産物
概要
本発明技術の１つ以上の胎盤組成物が、機械的／物理的破壊または酵素による消化若しくは両者の組み合わせにより生産でき、全体または部分的な組織損傷若しくは組織欠損に対する投与に際し、実質的かつ優れた治療価値を持つ医薬品を生産できることが、意外にも発見されている。本発明技術の胎盤組成物はまた、予期せぬ複数の有利な性質を示した。
【００６８】
繰り返すが、一般的な意味において、本明細書に記載の技術は、操作を加えた胎盤組織を含む胎盤組成物に対応して、提供される。例えば、当該胎盤組成物は、凍結保存した羊膜組成物、凍結保存した絨毛膜組成物、及び／または凍結保存した絨毛羊膜組成物を含むことができる。特定の態様において、当該冷凍保存法は、生存する胎盤組織を多量に保持し（すなわち、その胎盤細胞に自然に生じた細胞）、そして免疫原性細胞ならびに免疫原性細胞に関連する因子が枯渇した状態を提供する。そのため、本開示は、胎盤組成物に関し、そして様々な有益な治療法における活用を見出された、生存細胞、治療因子、細胞外基質、ならびに低減された免疫原性の組み合わせを含む、冷凍保存され、破壊された羊膜、絨毛膜、及び／または絨毛羊膜を含む特定の組成物に関する。特定の態様において、以下に詳述するように、当該組成物は、創傷または組織欠損に適用でき、及び当該膜が適用される（例えば、適応薬）領域において、直接または間接的に変化を起こすことができる、生存細胞、治療因子、細胞外基質の必要量を提供する。例えば、組成物は、創傷治癒の正常段階を提供しそして促進できる量で、生存細胞、治療因子、及び細胞外基質を与えることにより、（ｉ）炎症性サイトカインの量及び／または活性の低減、（ｉｉ）炎症性サイトカインの量及び／または活性の増加、（ｉｉｉ）活性酸素種の量及び／または活性の低減、（ｉｖ）抗酸化物質の量及び／または活性の増加、（ｖ）プロテアーゼの量及び／または活性の低減、（ｖｉ）細胞増殖の増加、（ｖｉｉ）血管新生の増加、及び／または（ｖｉｉｉ）傷への細胞移行の増加のいずれかを促進し、慢性創傷やトンネル傷などの傷が改善した治癒を提供できる。慢性の創傷環境には、１）高レベルの炎症性サイトカイン、２）低レベルの抗炎症性サイトカイン、３）高レベルのプロテアーゼ及び低レベルのそれらの阻害タンパク質、同時に４）高レベルの酸化物質及び低レベルの抗酸化物質の対抗バランスの、任意の１つ以上を含むことができ、本明細書に開示の冷凍保存された組成物の性質及び機能性は、そのような用途に非常に適している。
【００６９】
流動性
本発明技術の胎盤組成物は、作用圧力下で変形する能力などの流体の特定の特徴を共有し、そして粘度の尺度で定量化できる。したがって、そのような本発明の胎盤組成物は、適用されるものの表面上に広げることができる。例えば、胎盤組成物の１ｍＬを、皮膚の約１ｃｍ２を超えて、約１０ｃｍ２を超えて、約２５ｃｍ２を超えて、約５０ｃｍ２を超えて、または約１００ｃｍ２を超えて、局所的に覆うように広げることができる。この流体（すなわち、流動性である）の性質は、シート状の産物（例えば、皮膚移植）では、治療が必要な様々な部分（例えば、トンネル傷、穿刺傷、大きな圧力傷、曲面など）への用途が限定されるという問題を解決する。それはまた、迅速な応用手段を提供する。拡散適用に加えて、当該胎盤組成物は、例えば、注射でまたは移植としての適用が可能である。本発明技術の本胎盤組成物の流動性は、トンネル傷、関節の咬合及び曲面への適用などの、新しい利用に対応した実践を可能にする。
【００７０】
動的応答
理論に捉われずに記述すれば、本発明者らは、生存する胎盤細胞の存在が、それらが存在する場所で、内因性の細胞と多少類似した方法で、当該胎盤組成物に、生理学的刺激に応答する能力を与えていると考える。動的応答の証拠は、投与後の様々な時点での、刺激を受けた治療因子の放出またはその治療因子プロファイルにおける変化を含むことができる。
【００７１】
胎盤細胞
胎盤細胞は、任意の胎盤組織（例えば、絨毛膜または羊膜）から取得しても良い。胎盤細胞は、少なくとも１つの細胞型（例えば、ＭＳＣｓ）の細胞の生存を維持する任意の方法で、胎盤組織を加工することにより取得しても良い。例えば、胎盤細胞は、胎盤組織から単離または精製（例えば、絨毛膜のコラゲナーゼによる消化により）しても良く、または１つ以上の胎盤成分（例えば、細胞外基質）から、単離なしで取得しても良い。
【００７２】
胎盤細胞は、当技術分野で公知の任意の方法で取得しても良い。胎盤細胞を取得する有用な方法は、例えば、Ｐｏｒｔｍａｎｎ−Ｌａｎｚらにより記述されている。（“Ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｓ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｒａｆｔ  ｆｏｒ  ｐｒｅ−ａｎｄ  ｐｅｒｉｎａｔａｌ  ｎｅｕｒｏｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ”；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ（２００６）１９４，６６４−７３）（“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｆｅｔａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ”；Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ａｎｄ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２００７；１：２９６−３０５．）及び（Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｒｅｖｉｅｗ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｅｒｍ  Ｐｌａｃｅｎｔａ：Ｏｕｔｃｏｍｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｉｒｓｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ｏｎ  Ｐｌａｃｅｎｔａ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ）。
【００７３】
本発明技術の１つの実施形態において、胎盤細胞は、胎盤組織を１つ以上の消化酵素と接触させることにより、例えば、胎盤組織（例えば、絨毛膜、または栄養膜の無い胎盤組織）をその消化酵素を含む溶液中に浸漬することにより取得する。当該消化酵素は、当技術分野で公知の任意の消化酵素であっても良い。当該消化酵素はまた、酵素の組み合わせであっても良い。例示的な消化酵素は、コラゲナーゼ（例えば、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、及びＩＶ型コラゲナーゼ）、マトリックスメタロプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、パパイン、デオキシリボヌクレアーゼ、セリンプロテアーゼ（例えば、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ）、またはそれらの任意の組み合わせの１つ以上を含む。
【００７４】
本発明技術の他の実施形態において、胎盤細胞は、絨毛膜（例えば、栄養膜の無い絨毛膜）をコラゲナーゼ（例えば、ＩＩ型コラゲナーゼ）と接触させることにより、絨毛膜から取得する。当該コラゲナーゼは、例えば、約１０Ｕ／ｍＬから約１０００Ｕ／ｍＬの任意の適切な濃度で、そしてＤＭＥＭなどの任意の適切なコラゲナーゼ溶液で、そして例えば３７℃などの任意の適切な温度で存在しても良い。当該絨毛膜は、任意の適切な時間の間、その消化酵素と接触させても良い。任意で、当該絨毛膜は、約１６時間、約１２時間、約８時間、約３時間、約２時間、または約１時間のいずれかより少ない時間で、コラゲナーゼ（例えば、ＩＩ型コラゲナーゼ）と接触させる。任意で、当該絨毛膜は、約１時間より少ない時間で、例えば、約６０分、約５０分、約４０分、約３０分、約２０分、約１５分、約１０分、または約５分のいずれかより少ない時間で、コラゲナーゼ（例えば、ＩＩ型コラゲナーゼ）と接触させる。任意で、当該絨毛膜は、その胎盤組織のかなりの部分が、１００ミクロンフィルター上に残るような限定した時間で、コラゲナーゼと接触させる。任意で、当該胎盤細胞を取得後に、その絨毛膜を、分散液を形成するように破壊し、そしてその細胞集団を、その分散液（例えば、加えて）と組み合わせる。
【００７５】
本発明技術のその他の実施形態において、当該胎盤組織を、その胎盤組織とコラゲナーゼまたは類似の消化酵素との接触無しで、例えば、ミンチ化して破壊する。消化ステップの無い当該胎盤組織の破壊は、消化ステップを含むプロセスより短い時間で行い、そして冷凍保存とそれに続く解凍後に、細胞の高い生存率を伴った、最短時間の操作で胎盤組成物を提供する。
【００７６】
本発明技術に従って調合した当該胎盤組成物は、その胎盤細胞の生体外での増殖の必要が無く、生存細胞の治療に効果的な量を提供する。生体外の増殖は、集団中の生存細胞の数を増加させる公知の方法であって、そのようなステップは、しばしば、その集団構成または細胞表現型の分布に変化をもたらす。例えば、集団中の多様な細胞は、異なる割合で拡大するかもしれず、そして増殖はまた、分化を含む可能性がある。したがって、本発明技術の少なくとも１つの実施形態は、胎盤組織由来の胎盤細胞を含む胎盤組成物を提供し、ここでその胎盤細胞が、その胎盤組織の細胞の本来の姿と実質的に類似した細胞の表現型分布を示す。
【００７７】
胎盤分散液
胎盤分散液は、胎盤（例えば、絨毛膜）を破壊することにより、提供されても良い。この胎盤組織の破壊は、組織を破壊する任意の物理的／機械的方法（すなわち、「組織破壊体」または「破壊手段」の使用）により達成されても良い。例えば、破壊は、特に、均質化、浸軟、ブレンダーの使用、粉砕、またはミンチ化などを含んでも良い。破壊は、加えてまたは互換的に、せん断破壊、さいの目カット、またはみじん切りを含んでも良い。破壊は、加えてまたは互換的に、超音波処理を含んでも良い。
【００７８】
当該胎盤組織は、その胎盤から分散液を生産する任意の適切な時間で破壊しても良い。例えば、当該胎盤は、約１分、約３０秒、約２０秒、約１５秒、約１０秒、または約５秒を下回る時間で、破壊（例えば、均質化）しても良い。いくつかの態様において、例えば、当該胎盤は、少なくとも約１分間、少なくとも約５分間、少なくとも約１５分間で、ミンチ化により破壊しても良い。
【００７９】
さらなる実施形態において、本発明技術の胎盤組織は、その胎盤分散液を形成するために、その胎盤組織をミンチ化によって、大まかに均質なサイズの断片部に破壊することができる。当該ミンチ化のステップは、その胎盤組織を、その胎盤分散液を形成するために、適切な小さなサイズの断片部に刻むのに効果的な１つ以上のブレードを備えた道具を使用して、簡便に達成できる。例えば、当該胎盤組織をミンチ化するのに適切な道具は、非限定的に、ナイフ、メス、ハーブミンチ器、またはメッザルーナを含む。１つの実施形態において、当該ミンチ化された組織断片部は、その胎盤片を、胎盤分散液中で均質に分散させるために、粉砕する（ピペットを介して、ピペットで吸引し、排出したりして）。
【００８０】
そのうえさらなる態様において、本発明技術は、ミンチにされた胎盤組織を含み、ここでその組織断片部の平均サイズが、約０．４２ｍｍ２から約１．１３７ｍｍ２である、１つ以上の胎盤組成物を提供する。いくつかの態様において、その平均サイズは、少なくとも約０．４２ｍｍ２である。その他の態様において、その平均サイズは、約１００μｍ２から約２５ｍｍ２である。当該組織断片部の平均サイズは、依然としてシリンジを通り抜けることができる。いくつかの態様において、当該組織断片部の平均サイズは、１８ゲージの注射針またはそれ以上の太さを通り抜けることができる。その他のシリンジゲージもまた、想定内である。
【００８１】
当該胎盤組織は、流体の特徴を有し、そして依然として生存細胞を保持する胎盤組成物を形成するために、適切に破壊できる。したがって、本発明技術の胎盤組成物中の生存細胞は、その胎盤分散液由来の胎盤細胞をさらに含むことができる。
【００８２】
治療因子
本発明技術の胎盤組成物は、その治療因子が、その胎盤分散液の成分またはその胎盤細胞またはそれらの組み合わせによりその胎盤組成物に放出された成分である、１つ以上の治療因子を含んでも良い。
【００８３】
本発明技術において作られた胎盤組成物中の治療因子の含有量が、予期しない治療価値を有することが、驚くことに発見されている。本明細書に教示される治療因子のそのような含有量は、適切に「治療プロファイル」と呼び、そしてその細胞、治療因子及び細胞外基質成分またはそれらの組み合わせによって、提供できる。
【００８４】
本発明技術の少なくとも１つの実施形態において、治療プロファイルは、表１、表２、及び表５に掲載れた、２つ以上の、または３つ以上の、または４つ以上の、またはそれ以上の治療因子を与えるものの１つである。任意で、当該治療因子は、表１、表２、及び表５に明記された平均濃度の、約２０％から約５００％の量で存在する。任意で、当該治療因子は、表１、表２、及び表５に明記された最小及び最大（各々）値の、約２０％から約５００％の量で存在する。本発明技術において、治療因子は、特に、血管新生因子、ケモカイン、サイトカイン、増殖因子、マトリックスメタロプロテアーゼ、プロテアーゼ、プロテアーゼ阻害タンパク質、そしてそれらの組み合わせなどの、胎盤由来の因子であり得ることは理解されよう。本発明の胎盤組成物は、これら治療因子のいずれかを含むことができる。したがって、本発明技術の有用な胎盤組成物は、表１、表２、または表５に明記された治療プロファイルを有することができ、そして例えば、少なくとも２つ以上の治療因子、少なくとも３つ以上の治療因子、または少なくとも４つ以上の治療因子、若しくは前述のようにそれ以上を含んだ治療プロファイルを有することができる。いくつかの実施形態において、当該組成物はさらに、少なくとも１つの細胞外基質成分または細胞外基質成分の組み合わせを含むことができる。
【００８５】
本発明の胎盤組成物は任意で、ＰＤＧＦ（例えば、ＰＤＧＦ−ＢＢ）、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β３、及びＶＥＧＦの１つ以上、及び／またはＩＬ−８、ＩＬ−６、及びＭＣＰ−１の１つ以上の治療プロファイルを含むことができる。
【００８６】
本発明技術の胎盤組成物は、例えば、任意でＴＧＦ−β１などの増殖因子と組み合わせて、創傷部（例えば、ＨＧＦ及びＫＧＦ）への細胞の移行を促進する、１つ以上の治療因子の治療プロファイルを含むことができる。その創傷部に移行する適切な細胞は、非限定的に、上皮細胞、血管内皮細胞、線維芽細胞、ＭＳＣ、またはそれらの組み合わせを含む。任意で、そのような治療因子の濃度は、表１に明示される最小値の約２５％である。
【００８７】
いくつかの実施形態において、本発明技術の胎盤組成物は、例えば、治癒過程で、例えば、ＩＬ−１０及びＰＧＥ−２を再始動させ、刺激し、または高める抗炎症性サイトカインを与える、１つ以上の治療因子の治療プロファイルを含むことができる。
【００８８】
本発明技術の胎盤組成物は、同様に、細胞分裂または増殖を促進させる治療因子の治療プロファイルを含むことができる。本発明技術の胎盤組成物は、ＨＧＦ及びＫＧＦを含むことができる。
【００８９】
本発明技術の胎盤組成物はまた、１つ以上の血管新生因子（例えば、ＶＥＧＦ及び／またはｂＦＧＦ）を含む治療因子の治療プロファイルを含むことができ、そして任意で、追加的に１つ以上の増殖因子（例えば、ＴＧＦ−β１及び／またはＴＧＦ−β２）を含むことができる。
【００９０】
例示的な本発明技術の胎盤組成物は、約１０ｐｇ／ｍＬを上回り、または約５０ｐｇ／ｍＬを上回り、若しくは約１００ｐｇ／ｍＬを上回るＶＥＧＦレベルの治療プロファイルを含む。例えば、１つの例示的な胎盤産物は、詳細を実施例９に示すように、約２００ｐｇ／ｍＬを上回るＶＥＧＦを含むことができる。いくつかの実施形態において、本発明技術の胎盤産物は、約１０００ｐｇ／ｍＬを上回り、または約２０００ｐｇ／ｍＬを上回り、例えば、約２０００ｐｇ／ｍＬから約３０００ｐｇ／ｍＬのＶＥＧＦレベルの治療プロファイルを含む。例示的な本発明技術の胎盤組成物は、約１０または１００若しくは１，０００または１０，０００ｐｇ／ｍＬのいずれかを上回るｂＦＧＦレベルの治療プロファイルを含む。１つの例示的な胎盤産物は、約１１，０００ｐｇ／ｍＬを上回るｂＦＧＦを含むことができる。ＶＥＧＦ及び／またはｂＦＧＦの適切な量は、実施例９、２６、２７及び２８に例示される。任意で、ｂＦＧＦを含む本発明技術の胎盤組成物は、火傷の治癒に有益である。
【００９１】
本発明技術の胎盤組成物は、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、及び／またはＴＧＦ−β３の治療プロファイルを含むことができる。１つの例示的な胎盤組成物は、ｂＦＧＦ、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、及びＴＧＦ−β３を含む。任意で、そのような本発明技術の胎盤組成物は、治療中の皮膚病変が、炎症性または瘢痕性病変を引き起こした場合に有用である。いくつかの例示的な実施形態において、当該胎盤産物は、瘢痕組織の形成を減らしまたは防ぐために効果的な割合で、ＴＧＦ−β１、及びＴＧＦ−β３を産生する。本発明技術の胎盤組成物は、組織阻害タンパク質のマトリックスメタロプロテアーゼ、アルファ−２マクログロブリン、及び／またはトロンボスポンジンなどの、１つ以上のプロテアーゼ阻害タンパク質の治療プロファイルを含んでも良い。
【００９２】
少なくとも１つの実施形態において、胎盤組成物（例えば、絨毛膜由来の）は、１つ以上のプロテアーゼ阻害タンパク質を含む。
【００９３】
他の１つの実施形態において、胎盤組成物（例えば、絨毛膜由来の）は、１つ以上のプロテアーゼ阻害タンパク質及び細胞外基質タンパク質を含む。
【００９４】
少なくとも１つのさらなる実施形態において、胎盤組成物（例えば、絨毛膜由来の）は、１つ以上のプロテアーゼ阻害タンパク質及び生存細胞を含む。
【００９５】
そのうえさらなる実施形態において、胎盤組成物（例えば、絨毛膜由来の）は、１つ以上のプロテアーゼ阻害タンパク質、細胞外基質タンパク質、及び生存細胞を含む。
【００９６】
理論に捉われずに記述すれば、本発明者らは、本発明技術の胎盤組成物は、その胎盤細胞及び治療因子が、その受入れ環境と相互作用しまたは適応するので、非生存性の創傷治癒産物に比べて、その効果を高めたと考える。そのような相互作用または適応性は、治療因子の放出を刺激し、または投与後の長期にわたり当該胎盤因子プロファイルにおいて変化を起こし、従来の創傷及び／または非動的な創傷の治療とは異なり、創傷修復の全ての段階において効果的である、動的な治療をもたらす。
【００９７】
したがって、本発明技術のそのような胎盤組成物は、任意で、例えば特に、火傷及び創傷などの組織損傷（または欠損）への、頻度の低い適用で優れた治療を必要とする胎盤組成物をもたらして、長期間にわたり驚くほどの完全性を維持できる。意外にも、そのような胎盤組成物中の増殖因子は、羊膜由来細胞サイトカイン溶液（ＡＣＣＳ）などのその他の増殖因子治療と比較して、より長い半減期を示すことができる。
【００９８】
処方
本発明技術の胎盤組成物は、皮膚科学的に許容される医薬品として投与できる。任意で、医薬品有効成分または賦形剤若しくはそれらの組み合わせは、胎盤組成物との併用または添加若しくはそれらとの組み合わせで、加えることができる。
【００９９】
粘度
粘度は、治療が進行している兆候の関数として変動する、本発明技術において有用で望ましい値である。例えば、胎盤組成物の広い対象範囲（すなわち、皮膚の広い部分）またはより低い濃度が望ましい場合、低い粘度の処方物が有利である。低い粘度の処方物の例示としては、約１，０００ｃＰから約５０，０００ｃＰ、または約２，０００ｃＰから約２５，０００ｃＰ、若しくは約２，０００ｃＰから約１０，０００ｃＰ、または約５，０００ｃＰから約１５，０００ｃＰのものである。そのような低い粘度の処方物は、適用される本発明技術の胎盤組成物の拡散を容易にすることができる。
【０１００】
胎盤組成物のより制限された適用範囲またはより高いレベルが望ましい場合、より粘性の高い処方物が有利である。より粘性の高い処方物の例示は、約２０，０００ｃＰから約２００，０００ｃＰまたは約５０，０００ｃＰから約１００，０００ｃＰである。
【０１０１】
当業者は、本発明技術における、その望ましい粘度は、その分散法の調整により（本明細書の他の場所で詳述する）、または生理食塩水、または皮膚科学的に許容される増粘剤などのキャリアの選択、及び望ましい粘度または流動特性を達成するのに必要な濃度を経験的に決定することにより得られることを、容易に認識するであろう。当該組成物は、特に、液体、溶液、ゲル、スラリー、または懸濁液に処方化できる。
【０１０２】
本発明技術の胎盤組成物は、任意で、１つ以上の抗生物質、皮膚軟化剤、角質溶解剤、保湿剤、抗酸化物質、防腐剤、またはそれらの組み合わせを含むことができる。その他の添加剤もまた、想定内である。
【０１０３】
少なくとも１つの実施形態において、胎盤組成物は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などのアルブミンを含む。任意で、当該胎盤組成物は、例えば、生理浸透圧及びｐＨを与えるために、電解質溶液を含む（例えば、Ｐｌａｓｍａ−ＬｙｔｅＡ）。任意で、当該胎盤組成物は、ＤＭＳＯ、グリセロール、グリセリン、糖、またはそれらの混合物などの冷凍保存剤を含む。
【０１０４】
他の実施形態において、胎盤組成物は、その最終組成物中に、少なくとも１つの冷凍保存剤の容積として約３％から約１００％、好ましくは約３％から約９０％、あるいは約５％から約５０％、あるいは約５％から約２０％、あるいは、少なくとも１つの冷凍保存剤、例えばＤＭＳＯの容積として約３％から約１０％を含む。いくつかの態様において、当該胎盤組成物は、冷凍保存剤の容積として約５％から約２０％、及びアルブミンの容積として約０％から約１５％を含む。さらに、当該胎盤組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容されるキャリア、例えば、生理食塩水または電解質溶液を含む。
【０１０５】
さらなる実施形態において、胎盤組成物は、アルブミン、電解質溶液、及び冷凍保存剤を含む。任意で、当該胎盤組成物は、その最終組成物における容積で、約１％から約１５％のアルブミン、及び約５％から約２０％（例えば、約１０％）の冷凍保存剤を含む。任意で、当該アルブミンは、ＨＳＡであり、当該電解質溶液は、Ｐｌａｓｍａ−ＬｙｔｅＡであり、及び冷凍保存剤は、ＤＭＳＯである。いくつかの実施形態において、当該胎盤組成物は、その最終組成物における容積で約３％から約１００％の、より好ましくはその最終組成物における容積で約３％から約２０％の冷凍保存剤を含む。
【０１０６】
製造
概要
本発明技術の胎盤組成物は、本明細書に教示される技術的特徴を与える任意の適切な方法で、胎盤から製造されても良い。本発明技術に従う任意の胎盤組織は、有用である。本明細書に説明される、本発明技術のいくつかの実施形態は、その胎盤分散液が、栄養膜成分を枯渇しているかまたは欠いている絨毛膜の分散液である胎盤組成物を、特に受け入れることを意図している。別の選択肢もまた、想定内である。
【０１０７】
例えば、本発明技術の１つの実施形態において、当該胎盤分散液及びその胎盤細胞は、異なる胎盤または異なる胎盤部分から誘導される。当該分散液は、治療要素（例えば、薬剤または生物学的な）を含むことができることは理解されよう。他のケースにおいて、当該胎盤分散液及びその胎盤細胞は、同じ胎盤または同じ胎盤部分から誘導される（例えば、逐次処理）。
【０１０８】
１つの実施形態において、当該胎盤組成物は、
（ｉ）胎盤（例えば、絨毛膜または羊膜）組織を取得すること、
（ｉｉ）その胎盤組織を、１つ以上の基質分解酵素（例えば、コラゲナーゼ、任意でＩＩ型コラゲナーゼ）で消化すること、
（ｉｉｉ）その消化された胎盤組織から胎盤細胞を取得すること、
（ｉｖ）その消化された胎盤組織を、組織破壊体で破壊して、治療因子、細胞外基質、胎盤細胞、及び組織断片部を含む胎盤分散液を形成すること、及び
（ｖ）前記の胎盤細胞と胎盤分散液を組み合わせて、当該胎盤組成物を形成すること、
を含むステップにより製造される。
【０１０９】
１つの態様において、当該破壊ステップは、この消化された胎盤組織を均質化することを含む。その他の態様において、当該破壊ステップは、この消化された胎盤組織をミンチ化することを含む。
【０１１０】
他の実施形態において、胎盤組成物は、
（ｉ）第一胎盤（例えば、絨毛膜または羊膜）組織を取得すること、
（ｉｉ）その第一胎盤組織を、１つ以上の基質分解酵素（例えば、コラゲナーゼ、任意でコラゲナーゼタイプＩＩ）で消化すること、
（ｉｉｉ）その消化された第一胎盤組織から胎盤細胞を取得すること、
（ｉｖ）第二胎盤組織を取得すること、
（ｖ）その第二胎盤組織を、組織破壊体で破壊して、治療因子、細胞外基質、胎盤細胞、及び組織断片部を含む胎盤分散液を形成すること、及び
（ｖｉ）前記の胎盤細胞と胎盤分散液を組み合わせて、当該胎盤組成物を形成すること、
を含むステップにより製造される。
【０１１１】
そのうえさらなる実施形態において、胎盤組成物は、
（ｉ）胎盤組織を取得すること、
（ｉｉ）その組織を、おおまかに均一なサイズの断片部にミンチ化して、胎盤細胞、治療因子、及び細胞外基質成分を含む胎盤分散液を形成すること、
を含むステップにより製造される。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、本発明技術における胎盤組織組成物を調合するプロセスは、
ａ．胎盤細胞、治療因子、及び細胞外基質成分を含む胎盤組織を与えること、
ｂ．少なくともその胎盤組織の一部分を破壊して、胎盤組織断片部、胎盤細胞、治療因子、及び細胞外基質成分を含む胎盤分散液を形成すること、及び
ｃ．その胎盤分散液を冷凍保存して、胎盤組織組成物を形成し、ここで、その胎盤組織組成物の冷凍保存及びそれに続く解凍の後に、その胎盤細胞の４０％を上回る細胞が生存しており、そしてここで、その組成物が、機能的な免疫原性細胞を枯渇していること、
のステップを含む。
【０１１３】
さらにその他の実施形態において、本発明技術における胎盤組織組成物を調合するプロセスは、
ａ．胎盤細胞、治療因子、及び細胞外基質成分を含む胎盤組織を与えること、
ｂ．少なくともその胎盤組織を、少なくとも１つの酵素で消化して、胎盤細胞及び胎盤組織断片部の懸濁液を形成すること、及び
ｃ．その胎盤細胞と胎盤組織断片部を分離すること、ならびに
ｄ．その胎盤組織断片部を破壊して、分散液を形成すること、及び
ｅ．その胎盤細胞とその分散液を組み合わせて、胎盤組織組成物を形成すること、ならびに
ｆ．その胎盤組織組成物を冷凍保存し、ここで、その胎盤組織組成物の冷凍保存そしてそれに続く解凍の後に、その胎盤細胞の４０％を上回る細胞が生存しており、そしてここでその組成物が、機能的免疫原性細胞を枯渇していること、
のステップを含む。
【０１１４】
いくつかの態様において、冷凍保存そしてそれに続く解凍の後に、当該胎盤細胞の少なくとも７０％が生存しており、あるいは少なくとも約７５％、あるいは少なくとも約８０％、あるいは少なくとも約８５％、あるいは少なくとも約９０％が生存している。そのような生存率パーセントは、非網羅的であり、そして与えられたパーセントの間に存在することと、それらを超えて大きい増分を含んでいることは、当業者には理解されるはずである。
【０１１５】
その他の実施形態において、本発明技術の方法はさらに、当該胎盤組成物を冷凍保存するステップを含む。当該冷凍保存の方法は、少なくとも１つの冷凍保存剤を当該組成物に加え、その組成物を約２℃から約８℃の温度範囲に、約３分から約２４０分、例えば、１０分から約６０分間置き、そして次にそれに続き、その組成物を約−２０℃から約−１９６℃（あるいは約−４５℃から約−８０℃）の温度範囲で冷凍することを、含むことができる。
【０１１６】
当該製造法のいずれに対しても、当該胎盤組織は、栄養膜細胞の数を減らすように加工された絨毛膜組織などの、絨毛膜組織であり得る。
【０１１７】
さらに、本発明技術の例示的な胎盤組成物は、絆創膏または創傷包帯を使用して、製造されまたは与えられることができる。
【０１１８】
免疫互換性及び選択的枯渇
１つの実施形態において、当該胎盤組成物は、免疫的に互換性である。免疫互換性は、胎盤または胎盤由来組織（若しくはそれらの羊膜）からの免疫原性細胞または因子若しくは免疫原性を排除する、任意の選択的枯渇ステップにより達成できる。
【０１１９】
１つの実施形態において、当該胎盤組成物は、機能的免疫原性細胞の選択的枯渇により、免疫互換性で製造される。胎盤は、免疫原性細胞を、治療細胞に関連する胎盤（またはそれらの羊水膜）から選択的に減らすまたは除去することにより、免疫互換的に製造できる。例えば、免疫原性細胞は、その免疫原性細胞を死滅させるかまたはその胎盤の精製により、除去できる。
【０１２０】
他の実施形態において、当該胎盤組成物は、栄養膜を選択的に枯渇させることにより、例えば、その栄養膜層の除去により、免疫互換的に製造される。
【０１２１】
さらなる実施形態において、当該胎盤組成物は、機能性ＣＤ１４＋マクロファージの選択的枯渇により、任意でＴＮＦα放出のリポ多糖類（ＬＰＳ）刺激の実質的な低減により示されるように、または混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにより、免疫互換的に製造される。
【０１２２】
そのうえさらなる実施形態において、当該胎盤組成物は、母体血液細胞の選択的枯渇により、免疫互換的に製造される。
【０１２３】
そのうえさらなる実施形態において、当該胎盤組成物は、機能性ＣＤ１４＋マクロファージ、栄養膜、及び／または母体血液細胞の選択的枯渇により、免疫互換的に製造される。
【０１２４】
さらなる実施形態において、当該胎盤組成物は、栄養膜及び／またはＣＤ１４＋マクロファージの選択的枯渇により、任意でＴＮＦα放出のリポ多糖類（ＬＰＳ）刺激の実質的な低減により示されるように、またはＭＬＲアッセイにより、免疫互換的に製造される。
【０１２５】
上記態様のいくつかの実施形態において、機能的免疫原性細胞の枯渇量は、免疫反応を産生するのに十分低いレベルの量において、免疫原性因子を産生する。いくつかの実施形態において、機能的免疫原性細胞の枯渇量は、検出限界を下回る量において、免疫原性因子を産生する。
【０１２６】
栄養膜の除去
少なくとも１つの実施形態において、栄養膜は、枯渇または実質的に除去されて、当該胎盤細胞または胎盤分散液若しくはその両方を誘導する当該胎盤組織が生産される。驚くことに、そのような胎盤組成物は、
ａ．実質的に非免疫原性であり、
ｂ．顕著な治癒効果を提供し、及び
ｃ．高められた治療効果を提供する、
ことの（特に）優れた性質の１つ以上を有する。
【０１２７】
栄養膜は、その胎盤組成物の栄養膜含有量を大幅に減らす、任意の適切な方法で除去しても良い。１つの実施形態において、当該栄養膜は、選択的に除去する。任意で、当該栄養膜は、選択的に除去または、その絨毛膜由来の１つ以上の治療成分（例えば、ＭＳＣｓ、治療因子、細胞外基質など）の大部分を排除すること無しに除去する。任意で、当該栄養膜は、細胞集団を単離する及び／またはその胎盤組織を破壊する前に、除去する。
【０１２８】
栄養膜を除去する１つの方法は、当該胎盤を、ディスパーゼなどの消化酵素で、約３０分から４５分間処理し、そしてその胎盤から栄養膜を分離することを含む。任意で、その分離ステップは、スクレーピングなどの機械的分離を含む。スクレーピングの適切な方法は、指のような柔らかな道具によるそぎ落としを含む。
【０１２９】
胎盤（例えば、絨毛膜）からの栄養膜除去の有用な方法は、Ｐｏｒｔｍａｎｎ−Ｌａｎｚらによって記述されている（“Ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｓ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｒａｆｔ  ｆｏｒ  ｐｒｅ−  ａｎｄ  ｐｅｒｉｎａｔａｌ  ｎｅｕｒｏｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ”；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ（２００６）１９４，６６４−７３）、（“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｆｅｔａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ”；Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ａｎｄ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２００７；１：２９６−３０５．）、及び（Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｒｅｖｉｅｗ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｅｒｍ  Ｐｌａｃｅｎｔａ：Ｏｕｔｃｏｍｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｉｒｓｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ｏｎ  Ｐｌａｃｅｎｔａ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ）。
【０１３０】
１つの実施形態において、栄養膜は、当該羊膜の基底層、網状層、及び／または間質細胞層を維持しながら、除去する。
【０１３１】
１つの実施形態において、栄養膜は、冷凍保存の前に除去する。
【０１３２】
マクロファージの除去
１つの実施形態において、機能性マクロファージは、当該胎盤組成物から枯渇させまたは除去する。意外なことに、そうような胎盤組成物は、
実質的に非免疫原性であり、
顕著な治癒効果を提供し、及び
高められた治療効果を提供する、
ことの優れた特徴の１つ以上を有する。
【０１３３】
機能性マクロファージは、当該胎盤組成物のマクロファージ含有量を大幅に減らす、任意の適切な方法で、除去できる。任意で、当該マクロファージは、選択的に除去または、その胎盤由来の１つ以上の治療成分（例えば、ＭＳＣｓ、治療因子、細胞外基質成分など）の大部分を排除すること無しに除去する。任意で、当該マクロファージの大部分（例えば、実質的にすべて）を除去する。マクロファージは、非限定的に、ＣＤ１４＋、ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ１８＋、ＣＤ４０＋及びＣＤ８６＋を含む。
【０１３４】
マクロファージなどの免疫細胞を除去する１つの方法は、６０−１００℃／分などの急速冷凍で、その免疫細胞を死滅させることを含む。免疫細胞を除去する他の方法は、当該免疫細胞を、ある温度（例えば、約２℃から約８℃、例えば、「冷蔵庫」温度）に一定時間保持し、そして次に約１℃／分の速度で、その免疫細胞を冷凍することにより死滅させることを含む。
【０１３５】
免疫細胞は、急速冷凍により排除できるが、そのような方法はまた、間質細胞（例えば、ＭＳＣｓ）などの治療細胞に対して有害でもあり得る。本発明者らは、当該胎盤を一定時間（例えば、少なくとも約３分から約２４０分、例えば、約１０分から約６０分）、冷凍以上の温度（例えば、約２℃から約８℃を含む）に置き、そして次にその胎盤を冷凍する（例えば、約―２０℃から約―１９６℃、例えば、約―８０℃±５℃を含む）ことで、ＣＤ１４＋マクロファージを選択的に死滅させることが可能である方法を発見した。任意で、この冷凍ステップは、１０℃／分を下回る速度の冷凍（例えば、約１℃／分などの５℃／分を下回る速度）を含む。
【０１３６】
１つの実施形態において、その冷蔵のステップは、少なくとも１つの冷凍保存剤（例えば、ＤＭＳＯ）を含む当該組成物を、その胎盤組織にその冷凍保存剤が浸透する（例えば、平衡になる）ことが可能な適切な期間で、培養することを含む。いくつかの実施形態において、当該組成物はさらにアルブミン、そして任意で、薬学的に許容されるキャリア、例えば、生理食塩水または電解質溶液を含む。任意で、その冷凍ステップは、約１℃／分の速度で温度を下げることを含む。任意で、その冷凍ステップは、約１０℃／分を下回る速度（例えば、約１℃／分などの約５℃／分を下回る速度）で冷凍することを含む。
【０１３７】
１つの実施形態において、少なくとも１つの冷凍保存剤（例えば、ＤＭＳＯ）を含む当該組成物を培養するステップは、約−１０℃から約１５℃（例えば、約２℃から約８℃）の温度で、少なくとも約３分から約２４０分、例えば、約１０分、約２０分、約３０分、約４０分、約５０分、約６０分、約１０９分、約１２０分、約１８０分、約２４０分のいずれかの間、その組成物を静置することを含む。他の実施形態において、少なくとも１つの冷凍保存剤（例えば、ＤＭＳＯ）を含む当該組成物を培養するステップは、約−１０℃から約１５℃（例えば、約２℃から約８℃）の温度で、約１０−１２０分、約２０−９０分、または約３０−６０分、約１０−２４０分のいずれかの間、その組成物を静置することを含む。任意で、その冷凍ステップは、１０℃／分を下回る速度（例えば、約１℃／分などの約５℃／分を下回る速度）で冷凍することを含む。
【０１３８】
母体血液細胞の除去
１つの実施形態において、母体血液細胞は、当該胎盤組成物から枯渇させまたは除去する。意外なことに、そのような胎盤組成物は、
実質的に非免疫原性であり、
顕著な治癒効果を提供し、及び
高められた治療効果を提供する、
ことの優れた特徴の１つ以上を有する。
【０１３９】
母体血液細胞は、当該胎盤組成物のそのような細胞含有量を大幅に減らす、任意の適切な方法で、除去できる。任意で、当該母体血液細胞は、選択的に除去または、その胎盤由来の１つ以上の治療成分（例えば、治療細胞（例えば、ＭＳＣｓ）、治療因子、抗酸化物質、抗炎症性物質など）の大部分を排除すること無しに除去する。
【０１４０】
１つの実施形態において、母体血液細胞の除去は、総血栓及びいずれの過剰な血液細胞をも取り除くための羊膜の洗い流し（例えば、ＰＢＳなどの緩衝液で）を含む。
【０１４１】
１つの実施形態において、母体血液細胞の除去は、羊膜の抗凝固剤（例えば、クエン酸デキストロース溶液）での処理を含む。
【０１４２】
１つの実施形態において、母体血液細胞の除去は、総血栓及びいずれの過剰な血液細胞をも取り除く羊膜の洗い流し（例えば、ＰＢＳまたはＤ−ＰＢＳなどの緩衝液で）、ならびに羊膜の抗凝固剤（例えば、クエン酸デキストロース溶液）での処理を含む。
【０１４３】
１つの実施形態において、当該絨毛膜は残し、そして母体血液細胞の除去は、臍帯の反対側にある胎盤の周縁を切り取ることによる、当該胎盤からの絨毛膜の分離を含む。当該胎盤の臍帯側にある絨毛膜は、その側の血管新生のために、除去しない。
【０１４４】
１つの実施形態において、当該絨毛膜は残し、そして母体血液細胞の除去は、臍帯の反対側にある胎盤の周縁を切り取ることによって、当該胎盤から絨毛膜を分離し、そして総血栓及びいずれの過剰な血液細胞をも取り除くために、その羊膜及び絨毛膜を洗い流すこと（例えば、ＰＢＳまたはＤ−ＰＢＳなどの緩衝液で）を含む。
【０１４５】
１つの実施形態において、当該絨毛膜は残し、そして母体血液細胞の除去は、臍帯の反対側にある胎盤の周縁を切り取ることによって、当該胎盤から絨毛膜を分離し、そしてその羊膜及び絨毛膜を抗凝固剤（例えば、クエン酸デキストロース溶液）で処理することを含む。
【０１４６】
１つの実施形態において、当該絨毛膜は残し、そして母体血液細胞の除去は、臍帯の反対側にある胎盤の周縁を切り取り、総血栓及びいずれの過剰な血液細胞をも取り除くために、その羊膜及び絨毛膜を（例えば、ＰＢＳ緩衝液で）洗い流し、そしてその羊膜を抗凝固剤（例えば、クエン酸デキストロース溶液）で処理することを含む。
【０１４７】
１つの実施形態において、当該胎盤組成物は、ＬＰＳに刺激されたＴＮＦ−α放出の低減で示される免疫原性を、選択的に枯渇させる。１つの実施形態において、当該胎盤組成物は、マクロファージを選択的に枯渇させる。
【０１４８】
１つの実施形態において、ＴＮＦ−αは、マクロファージの死滅または除去により枯渇させる。
【０１４９】
いくつかの実施形態において、ＴＮＦ−αのレベルは、約３５０ｐｇ／ｃｍ２を下回るか、あるいは約２２５ｐｇ／ｃｍ２を下回るか、あるいは約１００ｐｇ／ｃｍ２を下回るか、または約７０ｐｇ／ｃｍ２を下回る。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、ＴＮＦ−αは、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％阻害される。
【０１５１】
免疫互換性は、当業者にはよく知られている任意の手段で証明でき、そのような証明は、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）、及びリポ多糖（ＬＰＳ）誘発の腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α分泌により実施できる。
【０１５２】
保存料
本発明技術の胎盤組成物は、新鮮な状態で使用されても良く、または一定期間保存されても良い。
【０１５３】
１つの実施形態において、当該胎盤組成物は、冷凍保存される。当該胎盤組成物は、少なくとも１つの冷凍保存剤及び冷凍による保存で（例えば、約−８０℃などの、約−２０℃から約−１９６℃で）、冷凍保存温度に耐えられる薬学的に許容される容器に収められる。当該胎盤組成物の冷凍保存に適切な容器は、生物適合性、非免疫原性であり、そして約−１９６℃から約２０５℃の温度に耐えることができ、バイアル瓶、パウチ袋、瓶、及び袋を含む。当該胎盤組成物（その容器中の）は、その冷凍速度を調節するために、発泡スチロール箱の中で冷凍されても良い。冷凍は、非限定的に、例えば、ＤＭＳＯ、グリセロール、糖、またはそれらの混合物などを含み、少なくとも１つの冷凍保存剤を含み、冷凍保存媒体中での貯蔵を含んでも良い。冷凍は、例えば、約２℃から約８℃の温度で、例えば、約４℃で、約３分から約２４０分、例えば、１０分から６０分または３０−６０分間、当該胎盤組成物を培養すること、そして次に約−４５℃から約−１９６℃、例えば、−８０℃で使用時まで培養することを含んでも良い。当該胎盤組成物は次に、使用に際して解凍しても良い。
【０１５４】
本発明技術の胎盤組成物は、冷凍保存及びそれに続く解凍後に、多量の生存細胞を維持している。いくつかの実施形態において、解凍後、その胎盤細胞の少なくとも４０％は生存している。いくつかのその他の実施形態において、当該胎盤組成物は、約７０％生存率、あるいは約７５％生存率、あるいは約８０％生存率、あるいは約８５％生存率、あるいは約９０％生存率、あるいは約１００％生存率を保持している。
【０１５５】
胎盤組成物は、冷凍保存の前に、少なくとも１つの冷凍保存剤を含むように処方されても良い。例示的な冷凍保存剤は、ＤＭＳＯ、グリセロールなどを含む。当該組成物はさらに、アルブミン（例えば、ＨＳＡまたはＢＳＡ）、電解質溶液（例えば、Ｐｌａｓｍａ−ＬｙｔｅＡ）、またはそれらの組み合わせなどの追加の成分を伴い、処方されても良い。任意で、当該胎盤組成物は、容積で０％から１５％のアルブミン及び容積で約３％から約１００％、より適切には３％から約５０％の少なくとも１つの冷凍保存剤、例えば、容積で約１％から１５％のアルブミン及び容積で約５％から約１００％（例えば、約５％から約１０％）の冷凍保存剤を含む。
【０１５６】
任意で、胎盤組成物は、新鮮な胎盤分散液へのまたは冷凍された胎盤分散液への若しくは冷凍乾燥された胎盤分散液への、本発明技術の冷凍保存された胎盤細胞の添加により形成できる。
【０１５７】
任意で、胎盤組成物は、冷凍された胎盤分散液へのまたは冷凍乾燥された胎盤分散液への、本発明技術の新鮮な胎盤細胞の添加により形成できる。
【０１５８】
冷凍保存された胎盤組成物を、使用前に解凍しても良い。適切な解凍法は、関連分野の業者には理解されよう。当該冷凍保存された胎盤組成物は、室温または約３７℃で解凍しても良い。適切には、当該冷凍保存された胎盤組成物は、細胞の生存率を高く保持する（例えば、少なくとも４０％の生存細胞、より好ましくは少なくとも７０％の生存細胞）のに十分な速い速度で解凍する。例えば、０．３ｍＬの冷凍保存胎盤組成物は、室温で１分を下回る間に解凍する一方で、１ｍＬの冷凍保存胎盤組成物は、室温で約３分の間に解凍する。当該胎盤産物の容積を増加するには、解凍時間を増やすことは、当業者には理解されよう。さらに、より高い温度で（例えば、約３７℃で）当該組成物を解凍することにより、その解凍時間を減らしてよいことは、当業者には理解されよう。
【０１５９】
当該冷凍保存組成物は、長期間冷凍された場合、生存細胞を保持するのに驚くほど長い貯蔵寿命または安定性を有する。当該冷凍保存産物は、解凍に際して高い生存率（少なくとも生存細胞を７０％保持）を維持しながら、約−２０℃から約−１９６℃（例えば、約−４５℃から約−８０℃）で２年間またはそれ以上の期間、貯蔵しても良い。いくつかの態様において、当該冷凍保存された組成物は、解凍前に高い生存率（少なくとも４０％の生存細胞、あるいは少なくとも５０％の生存細胞、あるいは少なくとも約７０％の生存細胞、あるいは少なくとも約８０％の、約８５％の、９０％の、または９５％の生存細胞）を維持しながら、約−２０℃から約−１９６℃（例えば、約−４５℃から約−８０℃）で少なくとも約３か月、少なくとも約６か月、少なくとも約９か月、少なくとも約１２か月、少なくとも約１５か月、少なくとも約２４か月、少なくとも約３６か月貯蔵できる。
【０１６０】
使用法
前述で考察のように、本明細書に記載の当該胎盤組成物及び特に冷凍保存された組成物（例えば、羊膜、絨毛膜、及び／または絨毛羊膜組成物）は、多数の有益な治療活性及び効果を促進するのに効果的な、一定量の生存細胞、治療因子、及び細胞外基質成分を提供する。本明細書に記載の方法において、当該組成物を適用しても良く、及び一定量の治療因子、生存細胞、及び細胞外基質成分を提供し、ならびに同様のまたは類似の治療有益性を提供する任意の数の治療因子を産生するために、内因性細胞を成長させる環境を提供する。
【０１６１】
本発明技術の胎盤組成物は、任意の組織損傷の治療に使用しても良い。例えば、本発明技術の胎盤組成物を、必要に応じて、対象者へ投与することによる、治療法を提供する。本発明技術の胎盤組成物はまた、直接または間接的に、組織を再生するために使用しても良い。
【０１６２】
本発明技術の投与法は、局所投与である。本発明技術の投与は、また、外科手術により捕捉が可能な場所における、内部組織への投与を含むことができる。あるいは、当該胎盤組成物を、シリンジまたは注射針を通して注入できる。胎盤組成物は、自己性、同種性、または異種性である。
【０１６３】
１つの実施形態において、胎盤組成物は、創傷または組織欠損の治療を行う対象者へ投与する。任意で、その創傷は、裂傷、こすり傷、熱や化学火傷、切開、穿刺、または投射物によって引き起こされる傷である。任意で、その創傷は、表皮の傷、皮膚の傷、慢性の傷、急性創傷、外部の傷、内部の傷、眼の傷、先天性の傷、潰瘍や褥瘡である。いくつの態様において、当該創傷は、トンネル傷である。トンネル傷は、例えば、感染に限定されずに、慢性傷の長期化した炎症、組織層が集まる場所に集中した圧力とせん断力、不適切な傷の包装による不十分な排水吸収、及び過剰な傷の包装による新しい粒状組織の分解などにより起こされる。そのような傷は、事故や故意によるものであっても良く、例えば、外科手術の間にまたは付随して起こされた傷であっても良い。任意で、当該創傷は、投与の前に手術で縫合される。
【０１６４】
１つの実施形態において、当該損傷は、Ｉ度熱傷、ＩＩ度熱傷（部分的な深さのやけど）、ＩＩＩ度熱傷（完全な深さの熱傷）、熱傷の感染、切除及び非切除の火傷の熱傷の感染、以前に移植した、または治癒後の上皮の損失、熱傷の膿痂疹などの火傷である。
【０１６５】
１つの実施形態において、この損傷は、潰瘍、例えば、圧力潰瘍、糖尿病性潰瘍、静脈の潰瘍、または足若しくは下肢の潰瘍である。
【０１６６】
１つの実施形態において、胎盤組成物は、その胎盤組成物を、直接その対象者の皮膚を覆うように、例えば、傷を覆うように、その傷部分の角質層の上に適用し、投与する。いくつかの実施形態において、当該胎盤組織は、非接着性の包帯で覆われる。さらに、あるいは当該胎盤組織を、例えば、皮下移植などの移植として投与しても良い。
【０１６７】
１つの実施形態において、胎盤組成物は、老化肌のしわまたはその他の特徴を減らすために、その表皮に投与する。そのような治療はまた、いわゆる美容整形（例えば、鼻形成術、しわ取り、育毛など）と組み合わせても有用である。
【０１６８】
１つの実施形態において、胎盤組成物は、皮膚切除術または皮膚削り術（例えば、レーザー切除、熱剥離、電気焼灼、深い皮膚切除、皮下組織切除、小部分切除、及び微小部分切除）に関連する治癒を促進するために、表皮に投与する。
【０１６９】
本発明技術の胎盤組成物で治療しても良いその他の疾患は、外傷性の傷（例えば、民間で発生した及び軍事的な創傷）、手術の瘢痕及び傷、脊髄の傷害、無血管性壊死、切除及び局所貧血を含む。
【０１７０】
１つの実施形態において、本発明技術の胎盤組成物は、組織移植の処置に使用する。任意で、当該胎盤組成物は、生物基質に付着した（例えば、その基質の治癒及び／または付着を促進するために）移植部分に適用する。非限定的な例示として、皮膚、軟骨、靭帯、腱、骨膜、軟骨膜、心膜、滑膜、筋膜、腸間膜及び筋などの組織は、移植組織（例えば、生体適合性である任意の天然または合成移植）として使用できる。
【０１７１】
１つの実施形態において、胎盤組成物は、腱または靭帯の手術で、腱または靭帯の治癒を促進するために使用する。任意で、当該胎盤組成物は、骨に付着した腱または靭帯部分に適用する。当該手術は、例えば、膝の手術、肩、下肢の手術、腕の手術、肘の手術、指の手術、手の外科、手首の手術、つま先の手術、足の手術、足首の手術などを含む、任意の腱または靭帯の手術であり得る。例えば、当該胎盤組成物は、腱または靭帯の骨への固定を促進するために、移植または再生の処置における腱または靭帯に適用できる。
【０１７２】
本発明者らの考察を通して、本発明技術の胎盤組成物が、任意の組織、軟骨及び骨の損傷及び欠損に対して、優れた治療（例えば、治癒、治癒時間及び／または治癒強度において）を与えることが、意外にも発見されている。いくつかの実施形態において、その組織は、結合組織または神経組織である。いくつかの実施形態において、当該胎盤組成物は、腱及び靭帯などの結合組織の治癒に使用する。腱及び靭帯の手術は、腱または靭帯の骨への固定を不可欠に含むことができる。理論に縛られずに記述すれば、本発明者らは、本発明の胎盤組成物において、ＭＳＣｓの骨形成及び／または軟骨形成の潜在力が、骨または軟骨の治癒過程及び治癒強度を促進する、と考える。いくつかの実施形態において、当該胎盤組成物は、任意のタイプの組織（例えば、骨、靭帯、腱、軟骨または軟部組織）の損傷及び障害または任意のタイプの欠損を治療しても良い。本発明者らは、当該胎盤組成物が、骨膜に基づく治療に対する代替のまたは補助的な治療を提供すると考える。例えば、有用な骨膜を基にした治療は、Ｃｈｅｎら（“Ｅｎｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｔｈｅ  ｔｅｎｄｏｎ  ｇｒａｆｔ  ｗｉｔｈ  ｐｅｒｉｏｓｔｅｕｍ  ｔｏ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｔｅｎｄｏｎ−ｂｏｎｅ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｉｎ  ａ  ｂｏｎｅ  ｔｕｎｎｅｌ：  Ａ  ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ  ｓｔｕｄｙ  ｉｎ  ｒａｂｂｉｔｓ”；Ａｒｔｈｒｏｓｃｏｐｙ．２００３  Ｍａｒ；１９（３）：２９０−６）、Ｃｈｅｎら（“Ｅｎｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｏｆ  ｐｅｒｉｏｓｔｅｕｍ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｈａｍｓｔｒｉｎｇ  ｔｅｎｄｏｎ  ｇｒａｆｔ  ｉｎ  ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｃｒｕｃｉａｔｅ  ｌｉｇａｍｅｎｔ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ”；Ａｒｔｈｒｏｓｃｏｐｙ．２００２  Ｍａｙ−Ｊｕｎ；１８（５）：２７Ｅ）、  Ｃｈａｎｇら（“Ｒｏｔａｔｏｒ  ｃｕｆｆ  ｒｅｐａｉｒ  ｗｉｔｈ  ｐｅｒｉｏｓｔｅｕｍ  ｆｏｒ  ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｔｅｎｄｏｎ−ｂｏｎｅ  ｈｅａｌｉｎｇ：ａ  ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｔｕｄｙ  ｉｎ  ｒａｂｂｉｔｓ”；Ｋｎｅｅ  Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｓｐｏｒｔｓ  Ｔｒａｕｍａｔｏｌｏｇｙ，Ａｒｔｈｒｏｓｃｏｐｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  １７，Ｎｕｍｂｅｒ  １２，１４４７−１４５３）により記述され、その各々を参照として組み入れる。
【０１７３】
腱または靭帯手術の方法の非限定的な例示として、当該胎盤組成物を、その腱または靭帯の周辺部に注入する。任意で、当該腱を、それを骨に付着させる前に、骨の管孔内に配置する。
【０１７４】
１つの実施形態において、腱または靭帯手術は、移植の処置であり、ここで、当該胎盤組成物を、その移植に適用する。任意で、その移植は、同種移植、異種移植、または、自家移植である。
【０１７５】
１つの実施形態において、腱または靭帯手術は、靭帯または腱損傷の修復であり、ここで、当該胎盤組成物を、その靭帯または腱損傷に適用する。
【０１７６】
胎盤組成物が適用できる腱の非限定的な例示は、総指伸筋腱、ハムストリング腱、二頭筋腱、アキレス腱、伸筋腱、及び腱板腱を含む。
【０１７７】
１つの実施形態において、本発明技術の胎盤組成物は、その胎盤組成物を創傷部に適用することにより、線維化を抑えるために使用する。
【０１７８】
他の態様において、本開示は、その対象者に本明細書に開示の組成物を投与することを含む、対象者における組織の修復及び／または組織再生を促進する方法を提供し、ここでその投与が、組織修復及び／または組織再生を促進するのに効果的な量で、生存する治療細胞、細胞外基質、及び１つ以上の治療因子を含む。いくつかの本態様の実施形態において、当該方法は、組織移植処置、腱手術、靭帯手術、骨手術、及び脊髄手術から成る群から選ばれる外科手術との組み合わせで使用する。いくつかの実施形態において、当該組織は、ヒトの組織である。さらなる実施形態において、当該ヒト組織は、軟骨、皮膚、靭帯、腱、または骨である。この態様及び前述の実施形態において、当該組成物は、直接または間接的に組織再生を刺激しても良い。
【０１７９】
１つの実施形態において、本発明技術の胎盤組成物は、傷口癒着バリアとして使用し、ここで当該胎盤組成物を、創傷部分へ、例えば、繊維化（例えば、手術後の繊維化）を減らすために適用する。
【０１８０】
当該胎盤組成物を適用できる創傷部の非限定的な例示は、脊椎（脊髄融合など）、形成手術、椎弓切除術、膝、肩、または出産、外傷関連の傷や傷害、心臓血管の処置、血管新生刺激、脳／神経学的な処置、ヘルニア修復、腱の修復、膀胱の修復、及び眼の処置に関わる手術で誘導されまたは関連するものを含んで適用できる。当該胎盤組成物をまた、非限定的に、変形性関節症、炎症性状態（テニス肘など）、骨の欠損、骨の修復、及び結合組織の修復を含む、その他の兆候に関連する創傷または傷害の治療のために、適用または投与しても良い。例えば、任意で、その創傷部が、脊椎の手術に関連しており、及び当該胎盤組成物の間質部分を、その硬膜（例えば、その硬膜に面している間質部分）に適用する。創傷部位の選択及び／または方法論を含む、そのような処置の説明は、例えば、ＷＯ２００９／１３２１８６及び米国特許第２０１０／００９８７４３号に見出すことができ、それらを参照として、本明細書に組み込む。本発明技術の胎盤組成物は任意で、創傷の癒着または繊維化を減らすために使用できる。手術後の繊維化は、全ての外科創傷の治癒の自然な帰結である。例示として、術後硬膜外癒着は、包膜嚢及び神経根の連結、摩擦、及び圧縮をもたらし、通常、椎弓切除術の手術後数か月で現れる知覚過敏を再発させる。瘢痕組織の除去のための度重なる手術は、瘢痕組織に囲まれた神経構造を識別するのが困難なために、予後不良及び損傷リスクの増加に関連する。したがって、実験的及び臨床的研究では、瘢痕組織の、硬膜と神経根への癒着を防ぐことに主として焦点を当てた。脊髄癒着は、脊椎手術の障害における主要な要因として関与していた。線維化した瘢痕組織は、神経根の圧縮及び連結を引き起こすことが可能で、再発痛及び物理的な障害に関与する可能性がある。
【０１８１】
本明細書に開示の胎盤組成物は、腱の修復、軟骨修復（例えば、大腿骨外側顆、脛骨プラトー）、トンネル／骨界面でのＡＣＬの交換、ＰＣＬ腱修復、歯牙組織増強、瘻孔（例えば、クローン病、Ｇ袋、気管食道）、癒着バリアで不足している組織（例えば、鼻中隔修理、膣壁の修復、腹壁修復、腫瘍切除）、真皮の傷（例えば、部分的深さの火傷、中毒性表皮壊死症、先天性表皮水疱症、壊疽性膿皮症、糖尿病性潰瘍などの潰瘍（足など）、静脈性下腿潰瘍）、手術の傷、骨膜の交換、ケロイド、臓器裂傷、上皮欠損、鼓膜の修復または交換を含む、多数の創傷の治療に有効である。
【０１８２】
当該組成物は、目の傷または傷害の治療に使用しても良い。目の傷は、炎症、傷害または手術の結果であっても良い。他の態様において、本開示は、その対象者に本明細書に開示の組成物を投与すること含む、対象者における炎症性眼疾患の治療法を提供し、ここで、その投与は、生存する治療細胞、細胞外基質、及び１つ以上の治療因子を、その炎症性眼疾患を治療するのに効果的な量で与える。この態様の実施形態において、当該方法は、上皮形成を促進し、痛みを軽減し、及び／または一般に眼組織の炎症を軽減するために指示されても良い任意の技術を使用した、膜の投与を含むことができる。一般に、当該方法は、炎症または眼組織においてある程度の炎症をもたらすかもしれない治療により特徴づけられる、目の手術（例えば、レーザー屈折矯正角膜切除術角膜（ＰＲＫ））、目の外傷（例えば、裂傷、火傷、または擦り傷）、または眼疾患に関与しても良い。当該方法に含まれる「炎症性眼疾患」を含む兆候の非限定的な例示は、角膜または結膜表面の一般的な修復／再生、例えば、永続的な上皮の欠損、角膜潰瘍、角膜移植、デスメ膜瘤、角膜穿孔、上皮または上皮病変若しくは腫瘍の切除後の欠損（結膜腫瘍、結膜上皮内腫瘍、上皮病変、帯状角膜変性、傷跡、まぶたの縁に沿った結膜ひだ）、急性の化学火傷、急性角膜炎、痛みを伴う水疱性角膜症、部分的または完全な輪部幹細胞欠損症（幹細胞移植に伴う）、急性スティーブンス−ジョンソン症候群、瞼球癒着、脳弓の再生、無眼球、濾過胞修復、強膜薄化、及び翼状片などを含む（例えば、Ｍｅｌｌｅｒ，Ｄ．，ら、Ｄｔｓｃｈ．Ａｒｚｔｅｂｌ．Ｉｎｔ．，（２０１１）；１０８（１４）：２４３−２４８を参照のこと。これらを参照として本明細書に組み込む）。
【０１８３】
本開示の組成物は、生体内または生体外で、
（ｉ）炎症性サイトカインの量及び／または活性の低減、
（ｉｉ）抗炎症性サイトカインの量及び／または活性の増加、
（ｉｉｉ）活性酸素種の量及び／または活性の低減、
（ｉｖ）抗酸化物質の量及び／または活性の増加、
（ｖ）プロアテーゼ量及び／または活性の低減、
（ｖｉ）細胞増殖の増加、
（ｖｉｉ）血管新生の増加、及び／または
（ｖｉｉｉ）細胞移行の増加、
を促進するのに効果的な、組織成分（例えば、細胞、治療因子、細胞外基質成分及びそれらの組み合わせ）の治療に必要な量を提供する。
【０１８４】
インビトロは、非限定的に、細胞の培養増殖を含む、生きた有機体の外側で実施される実験及び／または処置を示す（例えば、人工的な培養培地を使用した組織培養条件下で）。インビボは、有機体、例えば、動物またはヒトの体内で実施される実験及び／または処置を示す。
【０１８５】
当該組成物の記述はまた、治療の利点を提供し、ここで、その組成物は、
（ｉ）炎症性サイトカインの量及び／または活性を減らし、
（ｉｉ）抗炎症性サイトカインの量及び／または活性を増やし、
（ｉｉｉ）プロアテーゼ量及び／または活性を減らし、
（ｉｖ）血管新生を増やし、及び／または
（ｖｉ）細胞移行を増やす、
ことに効果的な量で、１つ以上の胎盤細胞、治療因子、細胞外基質成分またはそれらの組み合わせを提供する。
【０１８６】
いくつかの態様において、当該組成物は、組織再生を刺激するのに効果的である。組織再生は、本明細書に記載の組成物の適用により、直接または間接的に現れても良い。組織再生は、傷、傷害または欠損で損傷した組織の、直接的な再生であっても良い。理論に束縛されずに記述すれば、組織再生はまた、治療因子の発現を刺激し、次に新組織の産生を刺激することによる、組織の間接的な再生を含む。組織再生は、創傷または組織損傷部分の周辺で出現しても良い。
【０１８７】
当該組成物はまた、例えば、創傷または組織損傷部の近傍で、周辺で、その中でまたはその部分で、必要に応じて、対象者における血管新生を促進するために、使用しても良い。組成物は、例えば、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）及び塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）などの血管新生により成長させる増殖因子の、上方調節または分泌を促進しても良い。
【０１８８】
当該組成物は、炎症を抑えるために使用しても良い。炎症の低減は、１つ以上の抗炎症性サイトカインの発現を増加させることにより、示されても良い。さらに、炎症の低減は、炎症性サイトカインの減少により、示されても良い。
【０１８９】
当該組成物はまた、活性酸素種の量及び／または活性の低減、または抗酸化物質の量及び／または活性の増加を提供する。
【０１９０】
創傷の治癒法に関連する前述の態様の実施形態において、当該組成物は、（ｉ）炎症性サイトカインの量及び／または活性の低減、（ｉｉ）抗炎症性サイトカインの量及び／または活性の増加、（ｉｉｉ）活性酸素種の量及び／または活性の低減、（ｉｖ）抗酸化物質の量及び／または活性の増加、（ｖ）プロアテーゼ量及び／または活性の低減、（ｖｉ）細胞増殖の増加、（ｖｉｉ）血管新生の増加、及び／または（ｖｉｉｉ）当該創傷への細胞移行の増加、の１つ以上を、直接または間接的に促進しても良い。
【０１９１】
本明細書に開示の胎盤組成物はまた、組成物、例えば、生体適合性足場を形成するためにキャリアと共に使用できる。いくつかの態様において、本明細書に開示の胎盤組成物は、キャリアに応用できる。任意の適切な生体適合性足場、キャリアまたは骨移植物質を使用しても良いことは、当業者には理解されよう。適切な生体適合性足場及び／または適切なキャリアは、非限定的に、例えば、同種移植、自家移植、異種移植、セラミックス、バイオガラス、カルシウム硫酸塩、脱灰骨マトリックス、サンゴ、コラーゲン、移植複合材、軟骨の足場、すべてのタイプの合成足場、すべてのタイプの天然／生物足場など（例えば、リン酸カルシウム、水酸アパタイト及びリン酸三カルシウム、コラーゲン／セラミック複合材、ＰＣＬ、ＰＬＬＡ、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＰＧＡ、アルギン酸塩、シルク、コラーゲン、デキストランゼラチン、エラスチン、アガロース、キトサン、ヒアルロン酸、ＨＡ−ＴＣＰ−コラーゲン、ＧｒａｆｔＪａｃｋｅｔ（登録商標）、Ａｌｌｏｄｅｒｍ（登録商標）、ＰｒｉＭａｔｒｉｘ（登録商標）及びその他）を含む。それらのタイプは、非限定的に、スポンジ、フォーム、フィルム、シート、ゲルなどのその他の構成を含む。
【０１９２】
適切なキャリアは、非限定的に、骨形成タンパク質（例えば、Ｉｎｆｕｓｅ（ｒｈＢＭＰ−２）、Ｉｎｆｕｓｅ（登録商標）Ｂｏｎｅ  Ｇｒａｆｔ）などの遺伝子組換え分子を含む。
【０１９３】
適切な自家移植は、非限定的に、骨（局所の骨またはその他）、多血小板血漿（ＰＲＰ）、骨髄穿刺液（ＢＭＡ）、脂肪組織などを含む。
【０１９４】
キャリアを含む当該組成物は、適切に、組織の外科的修復、例えば、骨修復（例えば、骨髄融合）、腱の修復、軟骨修復などに使用しても良い。
【０１９５】
本発明技術はまた、組織の傷または欠損の治療用キットを提供する。このキットには、薬学的に許容される容器に収められた、本発明技術の胎盤組成物の少なくとも１回の投与量を含む。適切な容器は、バイアル瓶、パウチ袋、袋、瓶、試験管及びシリンジを含む。当該キットはさらに、例えば、抗生物質、皮膚軟化剤、保湿剤、抗酸化物質、防腐剤、治療薬、またはそれらの組み合わせなどの、添加物を含むことができる。当該キットはさらに、このキットの使用説明書を含む。当該キットのその他の構成品は、例えば、洗面具、救急絆創膏、包帯、接着剤、医療用具、ハサミ、メス、カテーテル、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０１９６】
本明細書に記載の技術及びその利点は、以下の例示を参照することで、よりよく理解されるであろう。これらの例示を、本発明技術の特定の実施形態を記述するために提供する。これら特定の例示により、本発明技術の範囲及び主旨を限定することを意図してはいない。本明細書に記載の技術は、この明細書に付属する請求項により定義される主題、及び任意の変更、修正、またはそれら請求項と同等の事項を含む。
【０１９７】
本明細書に与えられる引用は、その引用の主題を、参照として本明細書に組み入れる。
【０１９８】
本明細書において、単数形の使用は、特に指示されたところを除き、複数形を含む。
【実施例】
【０１９９】
実施例１  胎盤組織の取得
無傷胎盤を、インフォームドコンセントの後に、登録された組織バンクから取得した。この胎盤を、その母体表面（ザラザラの面）を下向きにして、滅菌トレイに乗せた。その羊−絨毛膜を切り取り、その胎盤から取り出した。次に、その絨毛膜を羊膜から分離し、そしてＤ−ＰＢＳで２回洗浄した。
【０２００】
次に、この絨毛膜を、血栓を取り除くため、抗凝固剤（ＡＣＤ−Ａ）溶液に浸漬し、次にＤ−ＰＢＳで再洗浄した。
【０２０１】
次に、この絨毛膜を、３７℃で３０分間、ディスパーゼと共に培養し、消化した。栄養膜を、指でそぎ取るようにして、機械的に取り除き、そしてその絨毛膜を、Ｄ−ＰＢＳで再び洗浄した。
【０２０２】
次に、その絨毛膜の重量を計り、そして抗生物質カクテル中で２４時間培養し、そしてＤ−ＰＢＳで再び洗浄した。
【０２０３】
実施例２  消化及び均質化による胎盤組成物の取得
絨毛膜（実施例１で取得した）を、ＩＩ型コラゲナーゼ溶液（ＤＭＥＭ中に３００Ｕ／ｍＬ）の２００ｍＬで、３７℃で１０分間の培養により、消化した。次に、残った未消化の絨毛膜を除去し（その組織断片部）、コラゲナーゼ及び胎盤細胞（その細胞断片部）を含む消化懸濁液を残した。
【０２０４】
振とう器に一旦配置した当該組織に、適切な消化環境を与えるために必要な、消化のための容積及び容器を決定した。３７℃の細胞培養器中で、中速度の標準的なプレートシェーカーに乗せ、その消化を実施した。
【０２０５】
当該胎盤細胞から消化酵素（ＩＩ型コラゲナーゼ）を分離するために、胎盤細胞を含むその細胞断片部を、９１３ｒｃｆの速度で５分間遠心分離した。この遠心分離ステップは、過消化を防ぎ、そしてその酵素を、当該組織の均質化の前に洗い流すことを確認することにより、細胞生存率を高めるであろう。この遠心分離ステップは、細胞の損傷無しに細胞をペレット化し、ＩＩ型コラゲナーゼを上清として除去することを可能にする。
【０２０６】
次に、その細胞断片部からの細胞を、Ｄ−ＰＢＳ中で再懸濁し、そして再度遠心分離し、上清を注き出し、そして胎盤細胞を、小容積（２ｍＬ）の冷凍保存剤（生理食塩水中に、５％ＤＭＳＯ）中に再懸濁した。２ｍＬは、その均質化された組織断片部を過剰希釈しない一方で、その断片部からの細胞を添加し、再懸濁するのに適切な容積を与える。
【０２０７】
残った消化酵素を除去するために、その組織断片部を、Ｄ−ＰＢＳ中で二度洗浄し、そして絨毛膜の１グラム当たり１ｍＬの冷凍保存剤（生理食塩水中に、５％ＤＭＳＯ）と共に、均質化用の容器に静置した。この容積は、臨床的に著しいレベルのタンパク質濃度を維持しながら、理想的に調和した分散液を生産するのに十分な状態に、その絨毛膜を希釈するには適切であるとして、決定した。１０分を超えてさらに長く、その容器を氷上に置き、当該絨毛膜の温度を下げた。次に、組織ホモジナイザーを使用して、高速で５秒間、当該絨毛膜を２回均質化し、絨毛膜ホモジネートを得た。
【０２０８】
このホモジネート（当該組織断片部からの）を、生存している単離胎盤細胞（当該細胞断片部からの）と組み合わせ、そして胎盤組成物を提供するために、十分に攪拌混合した。この胎盤組成物は、新鮮な状態で（例えば、治療に）使用されても良く、または、最初に一定期間保存（例えば、冷凍保存で）されても良い。
【０２０９】
当該胎盤組成物を、バイアル瓶に分取し、そして４℃で３０−６０分間培養した。次に、このバイアル瓶を、−８０℃で、使用するまで冷凍した。
【０２１０】
実施例３  消化及びミンチ化による胎盤組成物の取得
絨毛膜（１８−８４時間の抗生物質処理後、実施例１から取得した）を、３７℃で１０±２分間、２００ｍＬのＩＩ型コラゲナーゼ溶液（ＤＭＥＭ中に３００Ｕ／ｍＬ）中で培養することにより、消化した。次に、未消化で残った絨毛膜を除去し（その組織断片部）、コラゲナーゼ及び胎盤細胞（その細胞断片部）を含む消化懸濁液を残した。
【０２１１】
振とう器に一旦配置した当該組織に対して、適切な消化環境を与えるために必要な、消化のための容積及び容器を決定した。３７℃の細胞培養器中で、中速度の標準的なプレートシェーカーに乗せ、その消化を実行した。
【０２１２】
胎盤細胞を含む細胞断片部を、冷蔵したＤ−ＰＢＳと組み合わせ、そして９１３ｒｃｆの速度で５分間遠心分離し、その消化酵素（ＩＩ型コラゲナーゼ）をその胎盤細胞から分離した。この遠心分離ステップは、過消化を防ぎ、そしてその酵素を、洗い流すことを確認することにより、細胞生存率を高めるであろう。この遠心分離ステップは、細胞の損傷無しに細胞をペレット化し、ＩＩ型コラゲナーゼを上清として除去することを可能にする。
【０２１３】
次に、その細胞断片部からの細胞を、冷蔵したＤ−ＰＢＳ中で再懸濁し、そして再度遠心分離し、上清を注き出し、そして当該胎盤細胞を、２ｍＬの冷蔵したＤ−ＰＢＳ中で再懸濁し、そしてアイスパック上の遠心分離袋に移した。
【０２１４】
この組織断片部を、残った消化酵素を除去するために、冷蔵したＤ−ＰＢＳで２回洗浄し、そして冷蔵したガラス皿に移した。この絨毛膜を、組織バサミで小さく切り、次に２つの手術用メスで、みじん切りで小片にし、ミンチ化した。
【０２１５】
冷蔵した生理食塩水（実施例１で計測したｇ量と等量のｍＬ量で）を、ミンチ化した組織断片部に加え、そしてピペットで吸引し、排出して、十分に混合した。
【０２１６】
そのミンチ化した組織断片部を、大きなシリンジに詰め、１８ケージの注射針をそのシリンジに取り付け、そしてそのミンチ化した組織断片部を皿に戻した。そのミンチ化した組織断片部を、大きなシリンジに詰め戻し、そのシリンジに１８ゲージの注射針を取り付け、そしてそのミンチ化した組織断片部を、その細胞断片部と共に袋の中に出した。そのミンチ化した組織断片部及び細胞断片部を、十分に攪拌混合し、胎盤組成物を提供した。
【０２１７】
冷凍保存のために、穏やかに旋回している当該胎盤組成物に、５％ＤＭＳＯを滴下することで添加し、次に、穏やかに旋回しているその胎盤組成物に、５％ＨＳＡを滴下することで添加した。
【０２１８】
その胎盤組成物を混合し、そしてバイアル瓶に分取し、そして４℃で３０−６０分間培養した。そのバイアル瓶を、−８０℃で、使用するまで冷凍した。
【０２１９】
実施例４  ハーブミンチ器でのミンチ化による、胎盤組成物の取得
絨毛膜（抗生物質で１８−８４時間処置後、実施例１から取得した）を、冷蔵したガラス皿に移し、残った抗生物質溶液を除去するために洗浄し、そしてハーブミンチ器で６分間ミンチ化し、小さく、均等なサイズの断片部を得た。
【０２２０】
そのミンチ化した組織に、実施例１からの絨毛膜（ＣＭ）の重量を用いて、以下の計算式に沿って、冷蔵した生理食塩水を加えた。このミンチ化した組織を、生理食塩水と十分に混合するように、ピペットで吸引し排出した。
［ＣＭ重量（ｇ）×１．８（ｍｌ／ｇ）−懸濁液の容積（ｍＬ）＝添加する生理食塩水の容積（ｍＬ）］
【０２２１】
そのミンチ化した組織を、大きなシリンジに詰め込み、そのシリンジに１８ゲージの注射針を取り付け、そしてそのミンチ化した組織断片部を、その皿に出し戻した。そのミンチ化した組織断片部を、大きなシリンジに詰め戻し、そのシリンジに１８ゲージの注射針を取り付け、そしてそのミンチ化した組織断片部を、アイスパックを伴った袋の中に出した。
【０２２２】
冷凍保存のために、穏やかに旋回している当該胎盤組成物に、５％ＤＭＳＯを滴下することで添加し、次に、穏やかに旋回しているその胎盤組成物に、５％ＨＳＡを滴下することで添加した。
【０２２３】
その胎盤組成物を混合し、そしてバイアル瓶に分取し、そして４℃で３０−６０分間培養した。そのバイアル瓶を、−８０℃で、使用するまで冷凍した。
【０２２４】
実施例５  メッザルーナでのミンチ化による、胎盤組成物の取得
絨毛膜（抗生物質で１８−８４時間処置後、実施例１から取得した）を、冷蔵したガラス皿に移し、そして６分間ミンチ化し、小さく、均等なサイズの断片部を得た。
【０２２５】
そのミンチ化した組織を、大きなシリンジに詰め込み、そのシリンジに１６ゲージの注射針を取り付け、そしてそのミンチ化した組織断片部を、その皿に出し戻した。そのミンチ化した組織断片部を、大きなシリンジに詰め戻し、そのシリンジに１８ゲージの注射針を取り付け、そしてそのミンチ化した組織断片部を、アイスパックを伴った袋の中に出した。
【０２２６】
冷凍保存のために、穏やかに旋回している当該胎盤組成物に、５％ＤＭＳＯを滴下することで添加し、次に、穏やかに旋回しているその胎盤組成物に、５％ＨＳＡを滴下することで添加した。
【０２２７】
その胎盤組成物を混合し、そしてバイアル瓶に分取し、そして４℃で３０−６０分間培養した。そのバイアル瓶を、使用するまで、−８０℃で冷凍した。
【０２２８】
実施例６  完全消化していない胎盤組織の細胞の単離
限定的なＩＩ型コラゲナーゼによる消化が、生存細胞を含んだ懸濁液を得るために機能しているか、そして当該胎盤細胞の完全性を未だ保っている（例えば、治療因子を保持しそして生存細胞を残している）かどうかを、本発明において試験した。ＩＩ型コラゲナーゼによる１０分間の短い消化は、部分的に無傷組織を残し、そしてさらなる処理を可能にした。加えて、１０分間のコラゲナーゼによる消化は、多数の生存細胞を生産できた。
【０２２９】
胎盤（Ｄ１３６、Ｄ１３７）を取得し、２４４Ｕ／ｍＬのＩＩ型コラゲナーゼ濃度の場合以外は、前述の実施例１及び実施例２に詳細に説明された手順に従い加工した。各細胞断片部の細胞計数を、トリパンブルー染色及び血球計数器を使用した計数により、消化後直ちに実施し、各組織のグラム当たりの生存細胞数を決定した。そのデータを表１に提供する。
【０２３０】
意外にも、相当量の細胞が、１時間を下回る（例えば、１０分）消化により、単離された。わずか１０分間の当該組織の消化が、その組織を完全に分解することなく、その組織状態を緩めそして組織から細胞を除去することを可能にした。この方法において、消化により膜全体を損なうことなく、当該絨毛膜からＩＩ型コラゲナーゼ／細胞の混合物（細胞断片部）を分離することが可能となった。本発明者らは、１０分が、消化に適切な時間であり、そしてドナー変動の結果として導入される偏差を可能にする、ことを発見した。この消化プロセスは、その組織の完全性を全体的に破壊せずに、多数の生存細胞の単離を可能にする。次に、未消化の絨毛膜を、治療因子が豊富なホモジネートを生産するために破壊でき、その一方で、当該細胞を、その消化酵素から分離し、そして次にそのホモジネートと組み合わせることで、当該胎盤組成物を形成することができる。
【０２３１】
実施例７  消化後の生存及び非生存細胞の分析
複数の胎盤を加工し（Ｄ１５３、Ｄ１５４、Ｄ１５５、Ｄ１５６）、そして実施例６のように胎盤組成物を調合した。消化直後に、生存及び非生存細胞の細胞計数を実施した（図２）。冷凍及び解凍前後で、生存細胞の細胞計数を実施した（図３）。細胞を、血球計数器を使用して計数し、そして生存細胞を区別するために、トリパンブルー染色を利用した。細胞数のデータを集計し、そして平均値を求めた。
【０２３２】
図２に描写するように、本明細書に教示する無傷膜の消化は、意外なほどの細胞数を生産し、そしてその膜の機械的な破壊をせずに、その数を生産する。また図２に描写するように、本明細書に教示する膜の消化は、非生存細胞に対して驚くほど高率で、生存細胞を生産する。
【０２３３】
図３に描写するように、本発明技術の新鮮な胎盤組成物は、驚くほど高い細胞生存率を含む。また図３に描写するように、冷凍−解凍のサイクルを被る、本発明技術の胎盤組成物は、驚くほど高い細胞生存率を含む。また図３に描写するように、本発明技術の胎盤組成物において、生存細胞は、冷凍−解凍のサイクル後に驚くほど良好に保持される。
【０２３４】
実施例８  均質化前の、消化の有無での胎盤細胞の単離
当該胎盤分散液中の生存細胞の優れた回収を行うための、製造法を検討した。特に、均質化前に、消化による細胞単離のステップの有無で製造される、胎盤組成物における生存細胞のレベルを決定する実験を行った。簡単に言えば、実施例１に記載の手順に従い、胎盤を準備した。次に、得られた絨毛膜を、半分に分割した。その半分の組織を、実施例２に記載のように加工した。その他の半分を、その均質化ステップに先立ち、ＩＩ型コラゲナーゼでの消化により、細胞単離なしで、実施例２における組織断片部と同じ方法で加工した。細胞を、血球計数器を使用して数え、そして生存細胞を区別するために、トリパンブルー染色を利用した。そのデータを、図４に提供する。
【０２３５】
その結果は、当該消化組織中に、細胞をより容易に検出することを示している。
【０２３６】
実施例９  胎盤組成物プロファイル
異なるドナーからの胎盤で、実施例１及び実施例２に詳細に記された手順に従い、複数の胎盤組成物を調合し、そして治療因子を分析した。簡単に記述すると、各胎盤組成物からの１ｍＬのホモジネートを、１６，０００ｒｃｆの速度のマイクロ遠心分離機で、１０分間遠心分離した。
【０２３７】
各サンプルから得られた上清を集め、試験サンプルとした。ネガティブコントロールサンプルを、生理食塩水中の５％ＤＭＳＯ（冷凍保存溶液）で構成し、そしてポジティブコントロールサンプルを、スパイク組換えタンパク質（ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、及びＶＥＧＦ）の公知濃度での冷凍保存溶液で構成した。治療因子の一覧は、表３に示される。表１に網羅した、治療因子を含むタンパク質プロファイルは、ＳｅａｒｃｈＬｉｇｈｔタンパク質アレイアッセイ（Ａｕｓｈｏｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を利用して取得した。その結果を、４ドナーで１グループからの最小及び最大発現レベル（ｐｇ／ｍＬ）として、表１に示した。完全な胎盤組成物ではなく、上清の分析なので、タンパク質レベルの予測値は、実際濃度を下回っているであろう。各サンプルにおけるＶＥＧＦ及びｂＦＧＦのレベルは、ＥＬＩＳＡにて確認した。
【０２３８】
意外にも、多数の治療因子が、その他の症状の治療と同様に、火傷及び創傷治癒に対して効果的であるとされる公知のレベルで検出された。
【０２３９】
表１のデータに見られるように、本発明技術の胎盤組成物は、治療因子の治療プロファイルを含む。
【０２４０】
ここに至り、本明細書に教示のように、当業者は、当該治療因子を実験でき、表２に明示されるようにその機能的役割を考慮でき、そして創傷修復における治療因子の価値を評価できる。
【０２４１】
【表１】
2017514876.tif 000003
2017514876.tif 000004
【０２４２】
【表２】
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【０２４３】
【表３】
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【０２４４】
実施例１０  細胞表現型
本発明技術の複数の胎盤組成物における、細胞表現型を決定するために、蛍光活性化細胞ソーティング法（ＦＡＣＳ）を実施した。胎盤組成物を、実施例１及び実施例２に詳細に記される手順に従い調合した。当該組成物を解凍し、そしてそれに続いて細胞破片を取り除くために、１００μｍのフィルターを通してろ過した。次に、単一細胞懸濁液を、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＴＪ−６を使用して、２０００ｒｐｍの速度で１０分間遠心分離し、そしてＤ−ＰＢＳで２回洗浄した。各洗浄の後、上清を捨て、そして細胞を、２ｍＬのＦＡＣＳ染色緩衝液（Ｄ−ＰＢＳ＋０．０９％ＮａＮ３＋１％ＦＢＳ）中に再懸濁した。
【０２４５】
一旦単一細胞懸濁液を調合し、１００μＬのＦＡＣＳ染色緩衝液中で、最小で１×１０５の細胞を、蛍光染料で標識化された抗体で処理した。表４に、その抗体及び使用量の記述を提供する。細胞表面マーカーに対応して、細胞を、抗体と共に室温暗所で３０分間培養し、続いてＦＡＣＳ染色緩衝液で２回洗浄し、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＴＪ−６遠心分離機を使用して、１３００ｒｐｍの速度で５分間の遠心分離を行った。次に、細胞を、４００μＬのＦＡＣＳ染色緩衝液に再懸濁し、そしてＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを使用して分析した。結果は、絨毛膜由来の胎盤組成物は、ＭＳＣ様細胞の存在を暗示する、ＭＳＣマーカーに対してポジティブに染色された（図５）生存細胞を含むことを示した。
【０２４６】
【表４】
2017514876.tif 000008
【０２４７】
実施例１１  冷凍保存剤の最適化
実施例１に詳細に記載の手順に従い、３つの胎盤（Ｄ１３８、Ｄ１３９、及びＤ１４０）を加工し、そして各絨毛膜を、半分に分割した。絨毛組織の各断片部を、実施例２に詳細に記載の手順に従い、
Ｐｌａｓｍａ−ＬｙｔｅＡ（ＣＴＲ溶液）中に、１０％ＤＭＳＯ及び５％ＨＳＡ、
Ｐｌａｓｍａ−ＬｙｔｅＡ中に、５％ＤＭＳＯ及び５％ＨＳＡ、
生理食塩水中に、５％ＤＭＳＯ、
生理食塩水中に、１０％のグリセロール、
の冷凍保存剤の１つと共に加工した。
【０２４８】
冷凍前に、各新鮮な胎盤組成物を、血球計数器を使用し、そして死滅細胞を生存細胞と区別するために、トリパンブルー染色で生存細胞を数えた。冷凍とそれに次ぐ解凍後に、各胎盤組成物の生存細胞を数えた。その結果を、図６に描写した。
【０２４９】
図６に描写するように、新鮮及び冷凍／解凍の胎盤組成物の両方に対して、ＤＭＳＯは、グリセロールに比べて優れた冷凍保存剤であった。Ｐｌａｓｍａ−ＬｙｔｅＡ中に、５％のＨＳＡと共に、１０％対５％ＤＭＳＯの使用比較では、より多くの細胞数をもたらさなかった。５％ＤＭＳＯは、冷凍及び解凍後に生存細胞を保存するのに適切で、そして患者の安全にとってより良好な濃度を表わしている。
【０２５０】
実施例１２  冷凍後、３日から最長３か月までの細胞生存率
最終組成物の細胞生存率を、異なる冷凍保存溶液及び異なる絨毛組織の加工ステップ（ミンチ化対均質化）を使用して比較した。
【０２５１】
３つの胎盤を、実施例１に詳細に記載の手順に従い加工し、そして各絨毛膜を、抗体処理に先立ち、おおよそ等量（±１ｇ）の４分割にした。４分割の１つを使用し、実施例２に従い（コントロール）、そして生理食塩水中の５％ＤＭＳＯでの冷凍で、当該組成物を製造した。残りの３つを、その組織断片部をハサミで小片に刻み、そして次に流動性のある濃度になるようにメスでミンチ化したこと以外は、実施例２に従って加工した。生理食塩水を加え、そしてそのサンプルを、生理食塩水中の５％ＤＭＳＯ、生理食塩水中の５％ＤＭＳＯ及び１％ＨＳＡ、または生理食塩水中の１０％ＤＭＳＯ及び５％ＨＳＡで冷凍した。
・グループ１＝コントロールグループ（均質化した組織断片部）、生理食塩水中の５％ＤＭＳＯ
・グループ２＝試験グループ（ミンチ化した組織断片部）、生理食塩水中の５％ＤＭＳＯ
・グループ３＝試験グループ（ミンチ化した組織断片部）、生理食塩水中の５％ＤＭＳＯ及び１％ＨＳＡ
・グループ４＝試験グループ（ミンチ化した組織断片部）、生理食塩水中の１０％ＤＭＳＯ及び５％ＨＳＡ
【０２５２】
各グループの胎盤組成物を、冷凍後３日、１ヶ月、２ヶ月、及び３ヶ月で解凍し、そして血球計数器ならびにトリパンブルー染色を使用して、生存及び死滅細胞を数えた。細胞生存率を計算し、そしてその３つの胎盤の結果を平均化した（図７）。
【０２５３】
図７に描写するように、当該細胞断片部のミンチ化は、その組織断片部の均質化と比べて、より高い細胞生存率をもたらした。さらに、ＨＳＡを含む冷凍保存溶液（１％から５％のＨＳＡを伴うグループ３及び４）で冷凍された胎盤組成物に、より高い生存率が観察された。
【０２５４】
実施例１３  絨毛膜組織のコラゲナーゼ消化の経過時間の最適化
ＩＩ型コラゲナーゼにおける絨毛膜などの、胎盤組織を消化するのに最適な時間を決定するために、３つの異なるドナーからの絨毛膜を分析した。実施例１の手順に従い、当該絨毛膜を加工した。次に、抗生物質溶液を除去するために、各絨毛膜組織を２回洗浄し、そして３分割した。初期重量を得るために（０分）、各組織片を計量し、次にＩＩ型コラゲナーゼ溶液（３００Ｕ／ｍＬ）中で１０分、２０分、または３０分間消化した。
【０２５５】
各消化時間の終点で、残っている組織を、１００μｍ細孔の細胞フィルターを通してろ過し、その単離細胞を含むＩＩ型コラゲナーゼ溶液から分離した。次に、その分離した組織を計量し、一方で消化された細胞を含むＩＩ型コラゲナーゼ溶液を、遠心分離した。その結果得られた細胞ペレットを、Ｄ−ＰＢＳで再懸濁し、そしてトリパンブルーを排除して、血球計数器を使用して計数した。
【０２５６】
その細胞フィルター上に残った組織重量を含む、各残分組織断片部の重量を、ＩＩ型コラゲナーゼによる消化により失った重量％を計算するために使用した。
【０２５７】
図８に示すように、消化の１０分後には、元の組織重量の約１０％が、減少した。さらなる培養で、より劇的で重要な減少がもたらされた。３０分までには、元重量のほぼ半分が、失われた。１０分以上長く消化された組織は、そのＩＩ型コラゲナーゼ溶液型からの分離が、非常に困難になることを、さらに留意した。
【０２５８】
図８はまた、コラゲナーゼ消化により放出された細胞数を示す。培養の１０分後には、少なくともいくらかの細胞が、放出された。
【０２５９】
実施例１４  羊膜のコラゲナーゼによる消化
実施例３の限定的な消化法を、当該胎盤組織が羊膜の場合に適用して、試験した。以下の手順を実施した。
１．胎盤の加工。
ａ．羊膜を取り出し、そしてＤ−ＰＢＳで２回洗浄する。
ｂ．羊膜を、ほぐれた赤血球に浸す。
ｉ．必要ならば、指で、組織から無い赤血球を取り除く。
ｃ．羊膜組織を、抗生物質カクテル中で２４時間培養する。
２．抗生物質カクテルから羊膜組織を取り出し、そしてＤ−ＰＢＳで２回洗浄する。
３．羊膜組織を、３７℃で２００ｍＬのトリプシン溶液（０．２５％）中で、３０分間培養する。
４．トリプシン溶液から羊膜組織を取り出し、そしてＤ−ＰＢＳで２回洗浄する。
５．羊膜組織を、３７℃で２００ｍＬのＩＩ型コラゲナーゼ溶液（ＤＭＥＭ中に３００Ｕ／ｍＬ）中で、１０分間培養する。
６．ＩＩ型コラゲナーゼ溶液から羊膜組織を取り出し、そしてＤ−ＰＢＳで２回洗浄する。
７．ＩＩ型コラゲナーゼ及びトリプシンでの生存細胞懸濁液の加工。
ａ．各懸濁液を、９１３ｒｃｆの速度で５分間、遠心分離する。
ｂ．各上清を注ぎ出し、そして１０ｍＬのＤ−ＰＢＳに交換する。
ｉ．細胞を、洗浄のためＤ−ＰＢＳに再懸濁する。
ｃ．細胞懸濁液を、９１３ｒｃｆの速度で５分間、遠心分離する。
ｄ．上清を注ぎ出し、そして細胞を、２ｍＬの冷凍保存剤（生理食塩水中に５％ＤＭＳＯ）中で再懸濁する。
ｅ．ペレットを組み合わせる。
８．羊膜組織の加工。
ａ．羊膜組織を、その羊膜重量（ｇ）と等量の容積の冷凍保存剤（ｍＬ）と共に、均質化容器に収める。例えば、その羊膜の重量が、２５ｇであれば、冷凍保存剤の２５ｍＬと共に、均質化容器に収める。
ｂ．その羊膜組織及び冷凍保存剤を、氷上に少なくとも１０分置く。
ｃ．組織ホモジナイザーを使用して、５秒間の高速で２回均質化する。
９．単離した生存細胞をホモジネートと組み合わせ、そして十分に混合する（当該「胎盤組成物」）。
１０．バイアル瓶に等分し、そして４℃で３０−６０分間静置する。
１１．使用するまで、−８０℃で冷凍する。
【０２６０】
その羊膜ホモジネート中の生存細胞の平均数を決定するために、複数の胎盤を調合した。各羊膜を、１つの断片部に加工し、そして冷凍保存（４℃での培養そしてそれに続く−８０℃の冷凍）後の解凍の後、細胞数を得た。全ての細胞数を集計し、そして平均値を求めた。
【０２６１】
各ドナーからのサンプルをまた、タンパク質アレイ分析用に調合した。簡単に記述すると、各ドナーからの１ｍＬのホモジネートを、１６，０００ｒｃｆの速度のマイクロ遠心分離機で１０分間、遠心分離した。その結果得られた各サンプルからの上清を集めた。上清を、ポジティブ及びネガティブコントロールと共に、ＳｅａｒｃｈＬｉｇｈｔタンパク質アレイアッセイを使用した分析のために、Ａｕｓｈｏｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社に送った。このアッセイは、各サンプルの対象となる３７タンパク質のレベルを測定する。この実験のために、ネガティブコントロールサンプルを、生理食塩水中の５％ＤＭＳＯ（冷凍保存溶液）で構成し、そしてポジティブコントロールサンプルを、スパイク組換えタンパク質（ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、及びＶＥＧＦ）の公知濃度での冷凍保存溶液で構成した。
【０２６２】
図９に示すように、羊膜組織の限定されたコラゲナーゼによる消化は、相当な数の生存胎盤細胞の放出をもたらした。
【０２６３】
表５に示すように、羊膜組織の限定されたコラゲナーゼによる消化は、その組織から作られた胎盤分散液中に、治療因子を保存していた。
【０２６４】
実施例１４及び７を共に考慮した場合、胎盤組織の限定されたコラゲナーゼ消化は、たとえそれが絨毛膜、羊膜、または胎盤に元来あるその他の組織であったとしても、
放出される相当数の生存胎盤細胞、
保存された内因性の治療因子、
保存された内因性の胎盤タンパク質（例えば、基質タンパク質）、及び
治療に効果的な成分、
という予期せぬ結果をもたらす、と結論づけられる。
【０２６５】
【表５】
2017514876.tif 000009
【０２６６】
実施例１５  胎盤組成物の細胞断片部及び組織断片部由来の生存細胞
本明細書に教示される製造ステップ（例えば、限定されたコラゲナーゼによる消化、胎盤組織の破壊前の胎盤細胞の取り出し、そして限定された破壊の方法）は、非常に効果的な治療組成物をもたらす。当該細胞断片部及び均質化された組織断片部由来の、最終胎盤組成物中の生存細胞数を評価した。
【０２６７】
９の対象者の胎盤組織から、絨毛膜組織を取得し、そしてその細胞断片部（例えば、コラゲナーゼによる放出）及び均質化された組織断片部に対して、血球計数器及びトリパンブルー排除を利用して生存細胞数を評価した。
【０２６８】
【表６】
2017514876.tif 000010
【０２６９】
表６に示すように、当該胎盤組成物における細胞の２１％から９８％は、その均質化組織断片部由来であった。したがって、本発明の方法は、予期せずに、その均質化組織断片部中に、重要な治療因子及び生存細胞を保存し、そしてまた、その細胞断片部由来の相当数の生存細胞を提供する。
【０２７０】
実施例１６  最短１４日間で、血管新生増殖因子を発現する
本発明技術の胎盤組成物は、創傷の治癒治療に対して望ましい、耐久性のある効果を発揮する。本技術に記載の当該絨毛膜由来の胎盤組成物内の、細胞外基質及び生存細胞の存在は、少なくとも１４日間存在する、創傷治癒及び血管新生にとり、重要であるとして知られるタンパク質カクテルを可能にする。
【０２７１】
当該絨毛膜由来でありそして実施例１ならびに実施例２の手順に従い加工した胎盤組成物を、解凍しそして組織培養ウェルに配置し、そして３７℃±２℃で、３、７、及び１４日間培養した。各時間で、当該組成物のサンプルを集め、そして１６，０００ｒｃｆの速度で１０分間、遠心分離し、その上清を集めた。次に、その上清を、ｂＦＧＦ及びＶＥＧＦに対して、ＥＬＩＳＡで評価した。図１０は、３、７、及び１４日での、２つの主要な創傷治癒タンパク質、ｂＦＧＦ及びＶＥＧＦの持続性を描写している。ｂＦＧＦの発現は、時間と共に低下しているが、１４日間でさえ、著しいレベルのｂＦＧＦが存在したことは、留意されるべきである。興味深いことに、ＶＥＧＦの発現は、時間と共に増加したが、当該絨毛膜由来の胎盤組成物内の生存細胞からの、ＶＥＧＦ発現が継続的に活性化したため可能となったのであろう。
【０２７２】
実施例１７  低酸素症に対する胎盤組成物の応答
実施例１及び実施例３に詳細に記載の手順に従って加工した胎盤組成物を、慢性創傷に見られる低酸素症状を模倣した、低酸素環境への応答に対して試験した。
【０２７３】
冷凍保存した胎盤組成物を解凍し、そしてＤＭＥＭを伴った２つの４８ウェルプレートのウェルに配置した。一つ目のプレートを、酸素正常状態下（３７℃、５％ＣＯ２、約２０％Ｏ２）に置き、そして２つ目のプレートを、低酸素状態下（３７℃、５％ＣＯ２、１％Ｏ２）に置いた。これらの条件下で４８時間培養後、そのプレートを集め、そしてサンプルを収集した。そのサンプルを、マイクロ遠心分離機において、１６，０００ｒｃｆの速度で１０分間遠心分離した。その上清のＶＥＧＦ含有量を、ＥＬＩＳＡで測定した。結果を、図１１に示した。
【０２７４】
図１１に示すように、当該胎盤組成物は、２００％まで血管新生増殖因子ＶＥＧＦの産生を増加させたことによって、低酸素環境に応答した。
【０２７５】
実施例１８  新鮮対冷凍保存の胎盤組成物における、血管新生増殖因子含有量
実施例１及び実施例２に記載の手順に従って加工した、３ロットの胎盤組成物（Ｄ１４４、Ｄ１４５、Ｄ１４６）に対して、冷凍保存前後に、その血管新生増殖因子ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦの含有量を測定した。
【０２７６】
加工の間に、当該消化した胎盤組成物の各ロットに１つのバイアル瓶を、−８０℃での冷凍保存前に確保し、そして、新鮮サンプルとしてラベル付けした。この新鮮サンプルを、マイクロ遠心分離機において、１６，０００ｒｃｆの速度で１０分間遠心分離した。そのＶＥＧＦ及びｂＦＧＦ濃度を、ＥＬＩＳＡで測定した。その同じロットから、冷凍保存した胎盤組成物の１つのバイアル瓶を、少なくとも−８０℃で１２時間後に解凍した（冷凍保存サンプル）。その冷凍保存サンプルを、前述の新鮮サンプルで記述したように処置した。そのＥＬＩＳＡの結果を、図１２に示し、そして試験した全ロットに対して、ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦの両含有量が、冷凍保存により変化がなかったことを示す。
【０２７７】
実施例１９  胎盤組成物における、インターフェロン−２α及び形質転換増殖因子−β３含有量
インターフェロン−２α（ＩＦＮ−２α）及び形質転換増殖因子−β３（ＴＧＦ−β３）は、瘢痕と拘縮形成の防止に重要な役割を果たすと文献に記述されている（Ｋｗａｎら、Ｈａｎｄ  Ｃｌｉｎ，２００９，２５：５１１、Ｔｒｅｄｇｅｔら、Ｓｕｒｇ  Ｃｌｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ  １９９７，７７：７０１）。ＩＦＮ−２αは、コラーゲン及びフィブロネクチン合成ならびに線維芽細胞を介した傷の拘縮を減らすとして知られている。臨床的には、ＩＦＮ−２αが皮下投与され、そして瘢痕の質を改善したことが示されている（Ｎｅｄｅｌｅｃら、Ｌａｂ  Ｃｌｉｎ  Ｍｅｄ  １９９５，１２６：４７４）。ＴＧＦ−β３は、細胞外基質の沈着を調節し、そして齧歯動物の皮膚創傷モデルにおいて注射をした場合、瘢痕形成を減少させることが示されている。臨床的には、ＴＧＦ−β３を創傷部に注射した場合、瘢痕の外観の改善が示されている（Ｏｃｃｌｅｓｔｏｎ  ｅｔら、Ｊ  Ｂｉｏｍａｔｅｒ  Ｓｃｉ  Ｐｏｌｙｍ  Ｅｄ  ２００８，１９：１０４７）。
【０２７８】
実施例１及び実施例２で記載のように調合した胎盤組成物を、ＩＦＮ−２α及びＴＧＦ−β３の存在に対して、分析した。簡単に記述すると、当該絨毛膜由来の胎盤組成物を解凍し、そして上清を集めるために、１６，０００ｒｃｆの速度で遠心分離した。上清を、ＭａｂＴｅｃｈ社（ＩＦＮ−２α）及びＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社（ＴＧＦ−β３）から市販されているＥＬＩＳＡキットで分析した。図１３は、当該絨毛膜由来の胎盤組成物における、ＩＦＮ−２α及びＴＧＦ−β３の著しい発現を示す。
【０２７９】
実施例２０  複数ロットの胎盤組成物における、ＴＧＦ−β３含有量
実施例１及び実施例２で記載のように調合した、複数ロットの胎盤組成物のＴＧＦ−β３含有量を測定した。４ロットの冷凍保存した胎盤組成物を解凍し、そしてマイクロ遠心分離機において、１６，０００ｒｃｆの速度で１０分間遠心分離した。上清中のＴＧＦ−β３濃度を、ＥＬＩＳＡで測定した。胎盤組成物におけるＴＧＦ−β３発現を示している結果を、図１４に表す。
【０２８０】
実施例２１  絨毛膜胎盤組成物における組織修復タンパク質
当該絨毛膜由来でそして実施例１及び実施例２で記載のように加工した胎盤組成物を、組織修復に重要であるタンパク質（例えば、治療因子または組織修復タンパク質）の存在に対して、分析した。
【０２８１】
本発明に記載の絨毛膜由来の胎盤組成物を、これら組織の修復タンパク質に対して分析した。簡単に記述すると、当該絨毛膜由来の胎盤組成物を、３７℃±２℃で７２時間培養した。その組成物を遠心分離し、そしてその上清を、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社から市販されているＥＬＩＳＡキットで分析した。
【０２８２】
図１６は、複数ドナーの絨毛膜由来の胎盤組成物において、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７、ＰＬＡＢ、ＰＬＧＦ、及びＩＧＦ−１の著しい発現を示している。
【０２８３】
理論に捉われずに記述すれば、本発明者らは、創傷修復に対する本発明の胎盤組成物の有効性は、重要な細胞プロセスを調整することによって、多様な組織の発達及び恒常性において、部分的に、ＢＭＰｓ、ＩＧＦ−１、及びＰＬＧＦが果たす役割のためである、と考える。ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−４は、細胞成長を促進させることに加えて、ＭＳＣｓの骨芽細胞への分化を刺激し、胎盤のＢＭＰまたはＰＬＡＢは、萌芽期の発達を仲介すると示唆されるＢＭＰファミリーの新規メンバーである。インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）は、骨原性細胞の増殖及び分化を促進させるであろう。胎盤由来の増殖因子（ＰＬＧＦ）は、骨芽細胞に対する分裂促進因子として作用するであろう。
【０２８４】
実施例２２  絨毛膜由来細胞の分化能力
本発明の任意の実施形態において、胎盤細胞は、接着性であり、特にＣＤ１０５などの細胞マーカーを発現し、そしてＣＤ４５などのその他のマーカーの発現を欠き、そして脂肪細胞、骨芽細胞、及び軟骨細胞への分化能力を示す。
【０２８５】
特定細胞マーカーの発現は、実施例９にすでに記載した。当該絨毛膜由来の胎盤組成物内の細胞が、プラスチックに接着しそして血統の１つに分化できるかどうかを決定するために、細胞を、本発明で記述する絨毛膜由来の胎盤組成物から単離し、そして３７℃±２℃で培養し、そして増殖した。
【０２８６】
図１６Ａは、二継代骨髄ＭＳＣｓの代表的なイメージを示し、組織培養プラスチックに接着する細胞の能力を証明している。比較として、ヒト絨毛膜から単離し、そして増殖した細胞の代表的なイメージを、図１６Ｂに示す。
【０２８７】
培養細胞を、製造者の助言に従い（ＢＣＩＰ／ＮＢＴアルカリホスファターゼキットＩＶ、  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ＳＫ−５４００）、アルカリホスファターゼ標識で染色することにより、骨分化能力を示した。アルカリホスファターゼは、骨石灰化に関与する酵素であり（Ａｌｌｏｒｉら、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐａｒｔ  Ｂ，２００８，８：２７５）、そして細胞内のその発現は、骨前駆細胞の兆候である（Ｍａｊｏｒｓら、Ｊ  Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ  Ｒｅｓ，１９９７，１５：５４６）。アルカリホスファターゼに対する染色は、ブロモ−４−クロロ−３’−インドリホスファタｐ−トルイジン塩（ＢＣＩＰ）とニトロブルーテトラゾリウムクロライド（ＮＢＴ）との酵素反応を介して実施される。ＢＣＩＰは、アルカリホスファターゼにより加水分解され、インジゴ染料を生成する二量体化を受けた中間体を形成する。このＮＢＴは、二量体化により生成した２つの還元等量体によりＮＢＴ−ホルマザンに還元される。これら反応が一緒になり、アルカリホスファターゼと反応して、強烈に不溶性の黒紫色沈殿物を生成する。
【０２８８】
図１６Ｃは、骨誘導後に、アルカリホスファターゼに対してポジティブに染色された当該絨毛膜由来の胎盤組成物から単離及び増殖された、二継代細胞の代表的イメージを示す。
【０２８９】
実施例２３  複数ロットのミンチ化された胎盤組成物における、生存細胞含有量
実施例１及び実施例４で記載のように加工した、２９ロットの胎盤組成物中の、生存細胞量を測定した。実施例４に記載のように作った胎盤組成物は、ミンチ化により生成した小組織片内に、当該胎盤細胞を含んでいる。これらの胎盤細胞を、血球計数器及びトリパンブルー排除を利用して定量化するためには、その細胞を最初に、コラゲナーゼ消化により、その組織断片部から分離せねばならない。
【０２９０】
各ロットに１つのバイアル瓶を解凍し、そしてＤＭＥＭ中に２５０Ｕ／ｍＬのＩＩ型コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ社）で、３７℃で４０分間振とうし、消化した。次に、この消化懸濁液を、１００μｍの細胞ろ過器に通してろ過し、そしてそのろ過器を、ＤＭＥＭで洗浄した。そのろ過物を、４１１ｒｃｆの速度で８−１０分間、遠心分離した。その上清を除去し、そしてそのペレットを、ＤＭＥＭ中に再懸濁した。その上清を、トリパンブルー排除により血球計数器を使用して、計数した（図１７に示す結果）。
【０２９１】
図１７の結果は、当該絨毛膜を、コラゲナーゼによる消化をせずに、ミンチ化だけで加工した胎盤組成物における、高い胎盤細胞量及び生存率％を示している。
【０２９２】
実施例２４  ミンチ化及び消化の胎盤組成物による、炎症性ＴＮＦ−αの阻害
慢性創傷に見られる炎症状態を模倣した、炎症への応答に対して、胎盤組成物を試験した。当該胎盤組成物の免疫調節能力を決定するために、ＰＢＭＣｓ（末梢血単核細胞）によるＴＮＦ−α産生の阻害を測定した。
【０２９３】
実施例１に記載のように加工した２つの胎盤を、抗生物質処理の前に、各々を半分に分割した。各々の１／２を、実施例３に記載のような胎盤組成物に加工し（消化した胎盤組成物）、そして半分を、実施例４に記載のような胎盤組成物に加工した（ミンチ化した胎盤組成物）。異なる構成を持つそのミンチ化及び消化の胎盤組成物を、炎症を調節するそれら各々の能力に対して比較した。
【０２９４】
ＣＤ３及びＤＦ２８は、ＰＢＭＣｓに加えられ、ＴＮＦ−αなどの炎症性サイトカインの産出を刺激した。次に、そのＰＢＭＣｓを、ミンチ化または消化の胎盤組成物のどちらかと培養した。ポジティブコントロールとして、刺激されたＰＢＭＣｓを、ＤＭＥＭ中で培養した。ネガティブコントロールとして、刺激因子ＣＤ３及びＣＤ２８の無いＰＢＭＣｓを、ＤＭＥＭ中で培養した。そのポジティブコントロール培養が、ＰＭＢＳ凝集体を現すまで、その培養を６０−８４時間養生した。その培養サンプルを集め、そして１６，０００ｒｃｆの速度で１０分間遠心分離した。その上清を集め、そしてＥＬＩＳＡでＴＮＦ−α含有量を試験した（図１８に示す結果）。
【０２９５】
図１８に示す結果は、ミンチ化及び消化の胎盤組成物の両ロットが、そのポジティブコントロールとの関係において、ＴＮＦ−α産生を著しく阻害したことを示した。ミンチ化した胎盤組成物中の胎盤細胞が、消化した胎盤組成物中の胎盤細胞のほとんどとは異なり、それらの天然組織に組み込まれて残っているという事実により、ミンチ化した胎盤組成物は、消化した胎盤組成物に比べて、潜在的に炎症性サイトカインをより確実に阻害した。
【０２９６】
実施例２５  ミンチ化した胎盤組成物によるエラスターゼ阻害
慢性創傷はしばしば、再生段階への進展に際して、傷を防ぐＭＭＰｓ（マトリックスメタロプロテアーゼ）及びエラスターゼなどのタンパク質分解酵素を、不釣り合いなほど高いレベルで有する。実施例１及び実施例４により加工した、ミンチ化した胎盤産物を、プロテアーゼ活性を媒介するその能力に対して、エラスターゼ阻害アッセイを試験した。
【０２９７】
ミンチ化した胎盤組成物の１つのバイアル瓶を解凍し、そして、最終濃度が０．０１ｍＭになるＨＥＰＥＳ緩衝液中のヒト好中球エラスターゼと、最終濃度が５．７ｍＭになるエラスターゼ基質（Ｎ−メトキシサクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐ−ニトロアニリド、Ｓｉｇｍａ＃Ｍ４７６５）を組み合わせた。ポジティブコントロールに対して、冷凍保存剤（生理食塩水中に５％ＤＭＳＯ、５％ＨＳＡ）を、胎盤組成物の代わりに使用した。そのサンプルを、３７℃の培養器で一晩振とうし、培養した。
【０２９８】
基質の分解を、４０５ｎｍでのＯＤの測定によって評価した。その結果を、図１９に示した。酵素による基質の加水分解は、吸光度における増加をもたらした。酵素による基質の加水分解は、そのポジティブコントロールと比べて、ミンチ化した胎盤組成物においてより低く、プロテアーゼの阻害を介した慢性創傷環境を調整するための、ミンチ化した胎盤組成物の能力を確認した。
【０２９９】
実施例２６  ミンチ化及び消化の胎盤組成物のＶＥＧＦ含有量
ミンチ化及び消化の胎盤組成物中の、血管新生増殖因子ＶＥＧＦの量を、２ロットに対して決定した。
【０３００】
実施例１に記載のように加工した２つの胎盤を、抗生物質処理の前に、各々半分に分割した。各々の１／２を、実施例３に記載のような胎盤組成物に加工し（消化した胎盤組成物）、そして半分を実施例４に記載のような胎盤組成物に加工した（ミンチ化した胎盤組成物）。
【０３０１】
ミンチ化及び消化した胎盤組成物を解凍し、そして１６，０００ｒｃｆの速度で１０分間遠心分離した。その上清を、ＶＥＧＦ  ＥＬＩＳＡキットを使用して、ＶＥＧＦ発現に対して試験した（図２０に示す）。
【０３０２】
その結果を図２０に示し、そしてミンチ化した組成物が、両試験ロットに対して、より多くの量を含むが、ミンチ化及び消化の両胎盤組成物が、ＶＥＧＦを含むことを表している。ミンチ化した胎盤組成物は、実施例２または実施例３に記載のように調合した胎盤組成物のように、コラゲナーゼにより部分的に消化はされていないので、ミンチ化した胎盤組成物は、天然の増殖因子及び細胞外基質タンパク質のより多くの量を残していると考えられる。
【０３０３】
実施例２７  グアニジン塩酸に溶解後の、ミンチ化及び消化の胎盤組成物のＶＥＧＦ含有量
当該ミンチ化された組織断片部に埋め込まれている、ミンチ化及び消化の胎盤組成物のＶＥＧＦを捉えるために、胎盤組成物を、グアニジン塩酸中での溶解に供した。
【０３０４】
実施例１に記載のように加工した２つの胎盤を、抗生物質処理の前に、各々を半分に分割した。各々の１／２を、実施例３に記載のような胎盤組成物に加工し（消化した胎盤組成物）、そして半分を、実施例４に記載のような胎盤組成物に加工した（ミンチ化した胎盤組成物）。
【０３０５】
プロテアーゼ阻害錠剤（完全なプロテアーゼ阻害カクテル錠、Ｒｏｃｈｅ社、＃０４６９３１２４００１）を、１０ｍＬの冷蔵した８Ｍのグアニジン塩酸（以降ここでは、ＧｕＨＣｌとする）に添加した。ミンチ化及び消化の胎盤組成物を解凍し、そして１６，０００ｒｃｆの速度で、１２分間遠心分離した。上清を取り除き、そして新鮮な試験管に移し、そして氷上に静置した。その細胞／組織ペレットを含む試験管を、液体窒素中に５分間並べて、簡単に冷凍した。４Ｍの最終濃度になった冷蔵溶解ビーズ及びＧｕＨＣｌを、各ペレットに添加した。このペレットを、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｌｙｓｅｒ冷蔵チャンバー内に置き、そしてそのサンプルを、５０Ｈｚで６分間溶解した。それに対応する冷蔵上清を、その溶解ペレットに添加して戻し、そして回転させながら、４℃で一晩培養した。プロテアーゼ阻害錠剤を、１０ｍＬの冷蔵Ｄ−ＰＢＳに加えて、交換緩衝液を調合した。この溶解胎盤組成物を、マイクロ遠心分離機において、１６，０００ｒｃｆの速度で、４℃で１２分間遠心分離し、そしてその上清を集めた。各サンプルに対して、製造者の指示に従い、交換緩衝液を使用して、脱塩カラム（Ｚｅｂａ脱塩カラム、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、＃８９８９２）を調合し、貯蔵緩衝液をそのカラムから洗い流した。各上清を、カラムに適用し、そして９１３ｒｃｆの速度で、１２分間遠心分離した。その脱塩された上清中のＶＥＧＦ濃度を、ＥＬＩＳＡで測定した（図２１に示す）。
【０３０６】
図２１の結果は、そのサンプルがＧｕＨＣｌ溶解を行なわない場合に通常試験するより高いＶＥＧＦ含有量を示し、その胎盤組成物の組織断片部に埋め込まれたまま残されたＶＥＧＦが存在することを示している。図２０に表された結果のように、両試験ロットに対して、ミンチ化の胎盤組成物は、消化の胎盤組成物に比べて、より多くのＶＥＧＦを含んでいた。
【０３０７】
実施例２８  組織抽出緩衝液中での溶解後の、ミンチ化胎盤組成物のｂＦＧＦ含有量
当該ミンチ化の組織断片部に埋め込まれている、ミンチ化胎盤組成物のｂＦＧＦを捉えるために、胎盤組成物を、組織抽出緩衝液中で溶解に供した。前述の実験では、ＥＬＩＳＡによるｂＦＧＦは、グアニジンＨＣｌ処理との互換性がないことを示したので、互換的な溶解緩衝液を検討した。
【０３０８】
１つのプロテアーゼ阻害錠剤を、１０ｍＬの冷蔵組織抽出緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、＃７８５１０）に添加し、抽出溶液を調合した。実施例１及び実施例４に記載のように調合した、ミンチ化胎盤組成物を解凍し、そして１６，０００ｒｃｆの速度で、１２分間遠心分離した。その上清を、新しい試験管に移し、氷上に保存した。その細胞／組織ペレットを、液体窒素中に５分間並べて、簡単に冷蔵した。胎盤組成物及び冷蔵溶解ビーズと等量の抽出緩衝液の量を、各試験管に添加した。試験管を、冷蔵組織溶解チャンバーに静置し、そしてそのサンプルを、５０Ｈｚで６分間溶解した。対応する溶解組織に対して、その上清を加えて、そして１６，０００ｒｃｆの速度で、１２分間遠心分離した。その上清を集め、そしてＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ  ＭＮ）でｂＦＧＦに対して試験した。図２２に、その結果を示す。
【０３０９】
ミンチ化胎盤組成物の両ロットにおいて、高レベルのｂＦＧＦが見出された。
【０３１０】
実施例２９  ミンチ化及び消化の胎盤組成物からの、持続的な増殖因子の放出
ミンチ化及び消化の胎盤組成物が、増殖因子の放出を、経時的に持続することを証明するために、その組成物を２週間培養し、そしてＶＥＧＦ含有量を測定した。
【０３１１】
実施例１に記載のように調合した２つの胎盤を、抗生物質処理の前に、各々を半分に分割した。各々の１／２を、実施例３に記載のような胎盤組成物に加工し（消化した胎盤組成物）、そして半分を、実施例４に記載のような胎盤組成物に加工した（ミンチ化した胎盤組成物）。
【０３１２】
ミンチ化及び消化の胎盤組成物を解凍し、そしてＤＭＥＭ、１％ＦＢＳと共に、６ウェルの培養プレートに加えた。そのプレートを、３７℃で、５％ＣＯ２の培養器に静置した。０日、８日、１１日、及び１４日後に、そのプレートを培養器から取り出し、そしてサンプルを集めた。その集めたサンプルを、マイクロ遠心分離機において、１６，０００ｒｃｆの速度で、１２分間遠心分離した。上清を、新鮮な試験管に移し、そしてそのペレットと各サンプルの上清の両方を、次の加工まで−８０℃で貯蔵した。各サンプルを、実施例２８に記載のように、グアニジンＨＣｌ処理で加工した。脱塩サンプル中のＶＥＧＦ濃度を、ＥＬＩＳＡにより測定し、そしてその結果を、図２３に描写した。
【０３１３】
ミンチ化及び消化の両胎盤組成物は、２週間経過後も、持続的なＶＥＧＦ放出を維持していた。ミンチ化胎盤組成物は、消化盤組成物に比べて、より多量のＶＥＧＦを放出した。
【０３１４】
実施例３０  ミンチ化胎盤組成物の細胞増殖
ミンチ化胎盤組成物の細胞増殖能力を試験した。胎盤細胞を播種し、そして１４日間培養した。
【０３１５】
実施例１及び実施例４に記載のように調合した、胎盤組成物のバイアル瓶を解凍し、そして２０分間３７℃で揺動し、消化した。各サンプルを、２５０Ｕ／ｍＬのＳｅｒｖａ社のＩＩ型コラゲナーゼまたは２５０Ｕ／ｍＬのＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ社のＩＩ型コラゲナーゼのどちらかで消化した。その消化組成物を、１００μｍの細胞ろ過器に投入し、そしてそのろ過器をＤＭＥＭで洗浄した。その消化組成物を、４１１ｒｃｆの速度で、１０±分間遠心分離した。その上清を取り出し、そしてＤＭＥＭで再懸濁した。各細胞懸濁液を、トリパンブルー排除により、血球計数器で計数した。
【０３１６】
加工細胞の各グループを、Ｔ２５フラスコに播種し、そして培養器中で１４日間培養した。結果を、図２４Ａ及びＢにみることができる。当該ミンチ化した胎盤組成物由来の細胞は、細胞培養において、１４日後に細胞コロニーを確立した。
【０３１７】
実施例３１  ミンチ化胎盤組成物のキャリア付着
骨再生における、ミンチ化胎盤組成物の使用に対応する、異なるキャリアの互換性を試験した。
【０３１８】
キャリア材料を、２４ウェルＮｕｎｃｌｏｎマルチ皿の個別のウェルに配置した。そのキャリア材料は、ＨＡ−ＴＣＰ−コラーゲンフォーム（１ｃｍ×１ｃｍ片）及びＴｒａｎＺｇｒａｆｔの海綿状顆粒を含んでいた。実施例１及び実施例４に記載のように調合した、ミンチ化胎盤組成物を解凍し、そして異なるキャリア材料の各々に添加した。Ｄ−ＰＢＳを、そのサンプルに加え、そしてキャリアと混合した胎盤組成物を静置するのに、外科医が推奨する最大時間を模倣して、そのサンプルを室温で１時間静置した。液体を、ウェルから除去した。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）アッセイ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を使用して、生存及び非生存細胞に対して、その物質を染色した。１０μＬのエチジウムホモダイマー−１溶液（成分Ｂ、２ｍＭのＥｔｈＤ−１原液）及び５μＬのカルセインＡＭ溶液（成分Ａ、４ｍＭのカルセインＡＭ原液）を、１０ｍＬのＤ−ＰＢＳ  に添加した。この染色溶液を、サンプルが完全に覆われるまで、そのサンプルに添加した。サンプルを光から保護し、そして室温で３０分間静置した。この染色溶液を、そのウェルから取り出し、そしてＤ−ＰＢＳで洗浄し、そしてそのサンプルを、蛍光顕微鏡で観察した。生存細胞を緑で蛍光させ、そして死滅細胞を赤で蛍光させた。図２５Ａ及びＢは、ＨＡ−ＴＣＰ−コラーゲンフォーム上の胎盤組成物を示し、そして図２５Ｃは、ＴｒａｎＺｇｒａｆｔ上の胎盤組成物を示している。生存及び死滅細胞の写真を、同じ場所の各々の時間で撮影した。
【０３１９】
ミンチ化の胎盤組成物は、多様な一般的に使用される骨誘導足場と高い互換性があり、そして１時間後に、これらのキャリアとの組み合わせにおいて生存細胞を残していることを、結果が示している。
【０３２０】
実施例３２  最終絨毛膜胎盤組成物の安定性試験
−８０℃で２４ヶ月の長期間における、産物劣化の可能性を評価するために、当該最終組成物の安定性を試験した。産物劣化の指標は、生存細胞数の減少及び細胞生存率の低下である。生存細胞及び細胞生存率の数値を、３ロットの胎盤組成物に対して、初期の冷凍温度の完全低下後及び冷凍２４か月後で決定した。さらに、冷凍後１２ヶ月及び２４か月の無菌試験を実施した。
【０３２１】
実施例１及び２に記載の手順に従い、３つの胎盤を別々に加工し、次に、ホウケイ酸ガラス瓶に封入し、そして−８０℃で、生理食塩水中に５％のＤＭＳＯ中で冷凍した。３ロットの各々の胎盤組成物を、初期の冷凍温度の完全低下後及び冷凍２４か月後に解凍し、そして血球計数器とトリパンブルー排除を利用して、生存及び死滅細胞を数えた。各サンプルについて、細胞生存率を計算した。表７の結果は、初期の冷凍温度の完全低下後及び冷凍２４か月後の、最終組成物の生存細胞数及びその細胞生存率を示す。
【０３２２】
当該最終組成物は、−８０℃で２４ヶ月貯蔵後に、劣化無しに対して最小の値を示した。初期冷凍保存後２年で、試験した最終組成物の全ロットは、依然として、ｍＬ当たり１００，０００を上回る生存細胞を含み、少なくとも７０％の細胞生存率を有していた。
【０３２３】
【表７】
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【０３２４】
各ロットのサンプルをまた、冷凍後の２回の異なる時点（１２ヶ月及び２４ヶ月）での無菌状態に対する試験を行った。試験は、認証された試験機関で実施した。全てのサンプルは、陰性であった（表８）。
【０３２５】
【表８】
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【０３２６】
実施例３３  ミンチ化した胎盤組成物の組織断片部サイズ
実施例１及び実施例４に記載の手順（ハーブミンチ器でのミンチ化）に従い調合した胎盤組成物の組織断片部のサイズを、実施例１及び実施例５に記載の手順（メッザルーナでのミンチ化）で調合した胎盤組成物と比較した。最終組成物を解凍し、及び１０μＬを血球計数器に移した。５μＬのトリパンブルーを加え、そして丸いカバーガラスを、その細胞懸濁液の表面に置いた。ハーブミンチ器またはメッザルーナを使用して調合した最終組成物の組織断片部のサイズを比較した。ハーブミンチ器でミンチ化した絨毛膜の組織断片部の平均サイズは、０．４２１ｍｍ２（ｎ＝１４）であり、そしてメッザルーナでミンチ化した絨毛膜に対しては、１．１３７ｍｍ２（ｎ＝１４）であった。メッザルーナでミンチ化した絨毛膜の組織断片部は、ハーブミンチ器でミンチ化した絨毛膜の組織断片部に比べて、著しく大きかった（図２６を参照）。
【０３２７】
実施例３４  脊椎固定手術における胎盤組織組成物の使用
背景
３４才の女性は、傷害の後、７．５ヶ月間も解消せずに残る、日常的な腰痛、臀部痛、及び彼女の右下肢の後方から両足側面に広がる知覚障害を持っていた。
【０３２８】
評価
身体検査で、１＋の両側アキレス腱反射を伴う、２＋の両側膝蓋反射、少ない右足背屈及びポジティブな真っ直ぐな右側の足上げが、明らかになった。Ｘ線及びＣＴで、右椎間孔の狭小化及び崩壊があること、ならびに脊椎症の証拠はないことが、明らかになった。
【０３２９】
診断
Ｌ５−Ｓ１  ヘルニア右椎間孔の狭小化と崩壊。
Ｌ５−Ｓ１の機械的不安定を伴う右Ｌ５及びＳ１の神経根障害。右の足首の弱さは、椎間板ヘルニア及び右下肢の脊髄神経根障害に一致。
【０３３０】
外科手術
傷害の約１２か月後、右側のＬ５−Ｓ１の脚間窩を、マイクロ手術により解剖し、そして不具合物質を、脊椎関節突起切除術、椎間孔拡大術、及びマイクロ椎間板切除術により除去した。１ｍＬの胎盤組成物と共に、１５ｃｃの脱灰骨基質（ＤＢＭ）から成る、骨移植の準備を完了した。両移植物質は、移植において放射線透過性である。一旦減圧が完了したら、その端板を皮膚から剥がし、そして斜めの８ｍｍのＴ−ＰＡＬのＰＥＥＫスペーサーを、ＤＢＭ＋胎盤組成物の５ｃｃと共に封入し、そして脊椎用に配置した。Ｌ５−Ｓ１の左背外側塊に沿って広範な剥皮術を、マイクロ手術の解剖を介して、完了した。ＤＢＭ＋胎盤組成物の残りの１０ｃｃを、アンレー融合のために、左背瘤に適用した。ロッド及びキャップアセンブリを完了した。
【０３３１】
フォローアップ
手術後６ヶ月での、冠状断面及び矢状断面ＣＴは、左面関節を介した早期融合及び早期の椎体間骨梁形成の証拠を示している。椎体間骨移植およびハードウェアは、最適な位置にある。早期時点での、ＣＴの薄層断面像は、非一体化を特定はできるが、しかし融合の特定に十分な感度ではない。早期の骨融合は、通常は、最短で６−１２ヶ月で、ＣＴで可視化できる（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ａ，Ｇｏｒｎｅｔ  Ｍ，Ｂｕｒｋｕｓ  Ｋ．ＣＴ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｕｍｂａｒ  Ｉｎｔｅｒｂｏｄｙ  Ｆｕｓｉｏｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ．ＡＪＮＲ  Ａｍ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｒａｄｉｏｌ  ２００５；２６：２０５７−２０６６）。
【０３３２】
実施例３５  トンネル傷の治療に使用する組成物
トンネル傷を伴っている患者を、少なくとも４から６週間の間、１ｍＬの冷凍保存の胎盤組成物を週１回投与し、治療する。その傷の再上皮化及び閉鎖がある場合、治療を停止する。
【０３３３】
実施例３６  胎盤膜細胞による、ＬＰＳ誘発のＴＮＦ−α分泌
本明細書に記載のように、当該羊膜及び絨毛膜に存在する胎生マクロファージは、組織免疫原性の主要な供給源である。理論に捉われずに記述すれば、本発明者らは、胎盤膜及び組成物からのＣＤ１４＋胎生マクロファージの除去は、リンパ球の活性化を防止し、そして炎症性サイトカインのレベル及び組織の免疫原性を低下させる、と考える。胎生胎盤膜中のマクロファージは、ＴＮＦ−αなどの炎症性の分泌により、細菌由来のＬＰＳに対応する。したがって、各々の重要な生産段階で、胎盤膜の組織免疫原性を特徴づけるために、ＬＰＳ応答に対するＴＮＦ−αの分泌を本明細書で使用する。各生産段階からのサンプルは、栄養膜（Ｔ）、絨毛栄養膜を伴う羊膜（ＡＣＴ）、絨毛栄養膜（ＣＴ）、絨毛膜（ＣＭ）、及び羊膜（ＡＭ）を含んでいた。
【０３３４】
中間体及び最終産物を代表する、胎盤膜の断片部（２ｃｍ×２ｃｍ）を、組織培養培地に置き、そして細菌由来のＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）に２０〜２４時間、曝露した。次に、組織培養による上清を集め、そして製造者の手順に従って、ＴＮＦ−αＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用し、ＴＮＦ−αの存在を試験した。高レベルのＴＮＦ−αの分泌により、ＬＰＳに応答する単球を含むことで知られるヒトｈＰＢＭＣｓ（ＳｅｒａＣａｒｅ社）を、ポジティブコントロールとして使用した。ｈＰＢＭＣｓ及びＬＰＳを含まない胎盤組織をまた、この分析のコントロールとして含めた。このアッセイにおいて、自然なそしてＬＰＳ−誘発の両ＴＮＦ−α分泌に対して、７０ｐｇ／ｃｍ２（２８０ｐｇ／ｍＬに相当）を上回る量で、その培養培地中に検出されたＴＮＦ−αは、免疫原性であると考えられた（Ｆｏｒｔｕｎａｔｏら、１９９６）。
【０３３５】
図２７Ａ及び２７Ｂに描写するように、その製造プロセスは、当該胎盤産物の免疫原性を連続的に減らす。ＡＭ及びＣＭは、ＡＣＴ及びＣＴの各々１３９７．１及び９１７．２ｐｇ／ｍｌと比較して、わずかに２３．５及び４０ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ−α分泌量であった。ＬＰＳ無しの培地で培養した組織は、ＴＮＦ−α分泌の基底レベルを示す。高レベルのＴＮＦを分泌することで知られるＰＢＭＣｓを、ポジティブコントロールとして使用した。
【０３３６】
絨毛栄養膜（ＣＴ）は、完全なままの栄養層を伴った絨毛膜を含んでいる。高レベルのＴＮＦ−αを分泌するＣＴ膜を、２つの異なるＰＢＭＣドナーに対するＭＬＲ中で試験した（図２８）。ＣＴ細胞を、ＰＢＭＣｓと共に４日間培養した。Ｔ細胞活性化のマーカーとして、細胞溶解物中のＩＬ−２Ｒαを測定した。ポジティブコントロール：２つの異なるドナーから誘導したＰＢＭＣｓの混合物。図２８に見られるように、このアッセイの結果は、ＭＬＲデータとの相関を示した。すなわち、ＬＰＳに応答して高レベルのＴＮＦ−αを産生する組織は、このＭＬＲアッセイにおいて免疫原性である。
【０３３７】
結論として、ＡＭ及びＣＭによる、低いレベルのＴＮＦ−α及びＬＰＳへの応答の欠如は、本技術で記載した例示的な冷凍保存法が、生存している機能性マクロファージを、羊膜及び絨毛膜から排除しており、そのような同種産物の安全性を保証していることを示している。
【図１】
2017514876.tif 000013
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【国際調査報告】
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