(57)【要約】  本発明は、リポアラビノマンナンを含むデクチン−２発現細胞の活性化剤、およびリポアラビノマンナンを含むアジュバントを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポアラビノマンナンを含む、デクチン−２発現細胞の活性化剤。
【請求項２】
前記リポアラビノマンナンがマンノースキャップ型リポアラビノマンナンである、請求項１に記載の活性化剤。
【請求項３】
リポアラビノマンナンを含むアジュバント。
【請求項４】
前記リポアラビノマンナンがマンノースキャップ型リポアラビノマンナンである、請求項３に記載のアジュバント。
【請求項５】
抗原性成分および請求項３または４に記載のアジュバントを含むワクチン。
【請求項６】
抗原性成分への免疫応答を向上させる方法であって、請求項３または４に記載のアジュバントおよび抗原性成分を含むワクチンを対象に投与するステップを含む方法。
【請求項７】
デクチン−２−発現細胞を活性化させる方法であって、リポアラビノマンナンを前記細胞と接触させるステップを含む方法。
【請求項８】
前記リポアラビノマンナンがマンノースキャップ型リポアラビノマンナンである、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リポアラビノマンナンを含むアジュバントおよびリポアラビノマンナンを使用することによりデクチン−２（Ｄｅｔｉｎ−２）発現細胞を活性化させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミコバクテリアは、トレハロース−６，６’−ジミコール酸（ＴＤＭ）、ミコール酸、ホスファチジルミオイノシトールマンノシド（ＰＩＭ）、リポマンナン（ＬＭ）およびリポアラビノマンナン（ＬＡＭ）などの、宿主の免疫応答に影響を及ぼす多彩な細胞壁の成分を持つ。ＬＡＭは、主要なリポグリカンであり、ミコバクテリアの重要な病原性因子であり（Mishra et al., 2011）、これによって、ミコバクテリアが宿主生物に感染し、宿主細胞内で生残することが可能となる。ＬＡＭ合成の阻害剤であるエタンブトールが、抗ミコバクテリア薬物として広く使用されている（Belanger et al., 1996）。ＬＡＭは、マンノシルホスファチジルミオイノシトール（ＭＰＩ）アンカー、マンノース骨格、アラビナンドメインおよびキャップ部分という４つの成分からなる。アラビナンドメインの最終末端に位置するキャップ部分は、例えばマンノースキャップ型ＬＡＭ（Ｍａｎ−ＬＡＭ）、ホスフォイノシトールキャップ型ＬＡＭ（ＰＩ−ＬＡＭ）および非キャップ型ＬＡＭ（Ａｒａ−ＬＡＭ）など、ミコバクテリア種の内で異なっている。なかでも、Ｍａｎ−ＬＡＭは、宿主の免疫に対し多面的な効果を発揮することから、精力的に研究されてきた（Mishra et al., 2011）。
【０００３】
結核菌（Mycobacterium tuberculosis）を含めて、病原性種は、宿主免疫系（Briken et al., 2004）およびファゴソーム−リソソーム融合（Fratti et al., 2003）を抑制すると示されているＭａｎ−ＬＡＭを持つ。様々な阻害機構がこれまでに提案されているが、主要な事象の１つは、免疫抑制サイトカインであるインターロイキン−（ＩＬ−）１０の産生である。他方、Ｍａｎ−ＬＡＭは一酸化窒素放出および炎症性サイトカインの分泌などの、免疫刺激性応答も増強する（Chan et al., 2001; Gringhuis et al., 2009; Mazurek et al., 2012）。
【０００４】
Ｃ型レクチン受容体（ＣＬＲ）が極めて多様な病原体に対するパターン認識受容体（ＰＲＲ）として近年同定された。ＣＬＲのメンバーである、樹状細胞（ＤＣ）特異的細胞接着分子−３結合ノンインテグリン（Dendritic cell （DC）-specific intercellular adhesion molecule-3 grabbing nonintegrin）（ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＣＤ２０９とも称される）ならびにその推定上のマウス相同体とされているＳＩＧＮ−ｒｅｌａｔｅｄ  １（ＳＩＧＮＲ１、ＣＤ２０９ｂとも称される）およびＳＩＧＮＲ３（ＣＤ２０９ｄ）が、Ｍａｎ−ＬＡＭを認識し、その免疫抑制活性を媒介すると報告されている（Geijtenbeek et al., 2003; Schlesinger et al., 1994; Tailleux et al., 2003）。マクロファージマンノース受容体（ＭＭＲ、ＣＤ２０６とも称される）は、負のシグナルを伝達してＤＣ活性化を減弱させることから（Nigou et al., 2001）、ＬＡＭに対する阻害性受容体の候補でもある。阻害機能に関するこれらの報告に加えて、Ｍａｎ−ＬＡＭによるＳＩＧＮＲ３への結合はまた、ＳＩＧＮＲ３をトランスフェクトしたマクロファージにおいてＩＬ−６および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の分泌も誘導する（Tanne et al., 2009）。さらに、スカベンジャー受容体ＣＤ３６は、リポ多糖類（ＬＰＳ）刺激性マクロファージ細胞株においてＴＮＦ放出をもたらすＭａｎ−ＬＡＭの刺激性活性を増強する（Jozefowski et al., 2011）。多数のタンパク質が、Ｍａｎ−ＬＡＭの受容体であると提案されているが、そのいずれの受容体もＭａｎ−ＬＡＭの多様な機能、すなわち刺激性および抑制性の両方の効果を十分には説明しておらず、このことは未同定の分子がＭａｎ−ＬＡＭに対する受容体として機能している可能性を示唆している。
【０００５】
本発明者らは近年、ＣＬＲであるＭｉｎｃｌｅ（遺伝子記号Ｃｌｅｃ４ｅ）およびＭＣＬ（遺伝子記号Ｃｌｅｃ４ｄ）が、ミコバクテリア糖脂質に対するＦｃ受容体γ鎖（ＦｃＲγ、遺伝子記号Ｆｃｅｒ１ｇ）と共役した活性化受容体であることを実証した（Ishikawa et al., 2009; Miyake et al., 2013）。別のＣＬＲ、樹状細胞関連型Ｃ型レクチン２（デクチン−２、遺伝子記号Ｃｌｅｃ４ｎ）は第６染色体上の遺伝子クラスター内においてＭｉｎｃｌｅおよびＭＣＬに隣接している。デクチン−２は、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）の菌糸を認識して、この真菌に対する宿主防御を媒介する、ＦｃＲγと共役したＣＬＲ（Sato et al., 2006）である（Robinson et al., 2009; Saijo et al., 2010）。デクチン−２とＭＣＬは、有胎盤類後、Ｍｉｎｃｌｅから遺伝子重複により生じ、かつ種の内でよく保存されてきたと思われる（Miyake et al., 2013）。これらの知見は、その遺伝子クラスター内のこれらＣＬＲが「ミコバクテリア受容体」として進化をとげた可能性があること、およびデクチン−２もミコバクテリアを認識する可能性あることを暗示している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、鋭意研究し、デクチン−２がＭａｎ−ＬＡＭに対する直接の受容体であることをついに発見した。デクチン−２によるＭａｎ−ＬＡＭ認識により、ＤＣにおいて炎症性サイトカインおよび抗炎症性サイトカイン双方の産生が誘導された。本発明はこの発見に基づくものである。
【０００７】
したがって、本発明は以下を提供する：
（１）リポアラビノマンナンを含む、デクチン−２発現細胞の活性化剤。
（２）リポアラビノマンナンがマンノースキャップ型リポアラビノマンナンである、請求項１に記載の活性化剤。
（３）リポアラビノマンナンを含むアジュバント。
（４）リポアラビノマンナンがマンノースキャップ型リポアラビノマンナンである、（３）に記載のアジュバント。
（５）抗原性成分および（３）または（４）に記載のアジュバントを含むワクチン。
（６）抗原性成分への免疫応答を向上させる方法であって、（３）または（４）に記載のアジュバントおよび抗原性成分を含むワクチンを対象に投与するステップを含む方法。
（７）デクチン−２−発現細胞を活性化させる方法であって、リポアラビノマンナンを前記細胞と接触させるステップを含む方法。
（８）リポアラビノマンナンがマンノースキャップ型リポアラビノマンナンである、（７）に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ＬＡＭは、ＦｃＲγ軸を介してＥＡＥを誘導することを示す図である。（ＡおよびＢ）ＷＴマウス（ｎ＝４）およびＦｃｅｒ１ｇ−／−マウス（ｎ＝４）を、ＬＡＭ（５００μｇ）を含有するＩＦＡ中のＭＯＧ３５〜５５ペプチドで免疫し、続いてＰＴ（５００ｎｇ）をｉ．ｐ．注射した（１、２および３日目）。各マウスの疾患重症度をスコアし、そして指定された時間における平均臨床スコア（Ａ）および疾患発症率（Ｂ）をプロットした。（ＣおよびＤ）免疫して２３日後に腰部リンパ節（Ｃ）および鼠径リンパ節（Ｄ）を採取した。リンパ節細胞をＭＯＧ３５〜５５ペプチドで４日間刺激した。ＩＬ−１７、ＩＦＮ−γおよびＧＭ−ＣＳＦの濃度をＥＬＩＳＡを使用して決定した。（ＥおよびＦ）ＷＴマウス、Ｃｌｅｃ４ｅ−／−マウス、Ｆｃｅｒ１ｇ−／−マウスまたはＭｙＤ８８−／−マウスから得たＢＭＤＣを、プレートにコーティングしたＬＡＭ（０．３μｇ／ウェル）またはＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）で４８時間刺激した。ＭＩＰ−２（Ｅ）およびＴＮＦ（Ｆ）の濃度をＥＬＩＳＡを使用して測定した。（Ａ〜Ｄ）データは個別の２回の実験（ＥおよびＦ）の代表である。全てのデータは、３回反復の平均値±ＳＤとして提示され、個別の３回の実験の代表である。図８も参照されたい。
【図２】デクチン−２は、ＬＡＭを介して病原性ミコバクテリア種を認識すること示す図である。（Ａ）Ｍｉｎｃｌｅ＋ＦｃＲγ（Ｍｉｎｃｌｅ）またはデクチン−２＋ＦｃＲγ（デクチン−２）を発現するＮＦＡＴ−ＧＦＰレポーター細胞を加熱殺菌型結核菌（M. tuberculosis）Ｈ３７Ｒｖまたはウシ型結核菌（M. bovis）ＢＣＧで刺激した。ＴＤＭおよびカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）の細胞壁マンナンを陽性対照としてプレートにコーティングした形態で使用した。（Ｂ）レポーター細胞をプレートにコーティングした水抽出物またはＣ：Ｍ抽出物で２４時間刺激した。（Ｃ）ＦｃＲγ単独をまたはデクチン−２＋ＦｃＲγ発現するレポーター細胞を、プレートにコーティングした形態にある、結核菌（M. tuberculosis）青山Ｂ株に由来するＬＡＭの指定量で２４時間刺激した。ＮＦＡＴ−ＧＦＰの誘導をフローサイトメトリーを使用して分析した。全てのデータは、３回反復アッセイの平均値±ＳＤとして提示され、同様の結果を有する独立した３回の実験からの代表的結果が示されている。図９も参照されたい。
【図３】デクチン−２はマンノースキャップ型ＬＡＭを選択的に認識することを示す図である。（Ａ）Ｍｉｎｃｌｅ＋ＦｃＲγまたはデクチン−２＋ＦｃＲγを発現するＮＦＡＴ−ＧＦＰレポーター細胞を加熱殺菌型ＮＴＭの指定株で刺激した。（Ｂ）デクチン−２＋ＦｃＲγを発現するレポーター細胞を、マンノシダーゼによる前処理ありまたは前処理なしのウシ型結核菌（M. bovis）ＢＣＧで２４時間刺激した。（ＣおよびＤ）デクチン−２ＷＴ＋ＦｃＲγまたはデクチン−２ＱＰＤ＋ＦｃＲγを発現するレポーター細胞を、プレートにコーティングしたＬＡＭ（Ｃ）およびＮＴＭ株（Ｄ）で２４時間刺激した。全てのデータは、３回反復の平均値±ＳＤとして提示され、個別の３回の実験の代表である。図１０も参照されたい。
【図４】ＬＡＭはデクチン−２依存的にサイトカイン産生を誘導することを示す図である。（Ａ〜Ｄ）ＷＴマウスまたはＣｌｅｃ４ｎ−／−マウスから得たＢＭＤＣを、プレートにコーティングしたＬＡＭまたはＴＤＭの指定量で４８時間刺激した（ＡおよびＣ）。ＢＭＤＣを１〜１０×１０９のウシ型結核菌（M. bovis）ＢＣＧで４８時間感染させた（ＢおよびＤ）。ＬＰＳを対照として使用した。ＭＩＰ−２、ＴＮＦ、ＩＬ−６（ＡおよびＢ）、ＩＬ−１０およびＩＬ−２（ＣおよびＤ）の濃度をＥＬＩＳＡを使用して測定した。（Ｅ）ＢＭＤＣを、ウシ型結核菌（M. bovis）ＢＣＧまたは個々の１０人の患者に由来する、加熱殺菌型Ｍ．アブセッサス（M. abscessus）の臨床分離株で４８時間刺激した。ＭＩＰ−２、ＩＬ−１０およびＩＬ−２の濃度をＥＬＩＳＡを使用して測定した。全てのデータは、３回反復の平均値±ＳＤとして提示され、個別の３回の実験の代表である。図１１も参照されたい。
【図５】ＬＡＭは肺において過度の炎症を引き起こさないことを示す図である。（ＡおよびＢ）マウスにＬＡＭ１００μｇ（ＷＴ、ｎ＝１３；Ｆｃｅｒ１ｇ−／−、ｎ＝５）、ＬＰＳ１０μｇ（ＷＴ、ｎ＝９）または対照として滅菌生理食塩水１００μｌ（ＷＴ、ｎ＝７）を気管内投与した。８時間後、ＢＡＬＦを得、次いでＢＡＬＦ中のＴＮＦ濃度をＥＬＩＳＡを使用して決定した（Ａ）。総細胞数は血球計算板にて決定した（Ｂ）。全てのデータは平均値±ＳＤとして提示されている。（Ｃ）対照マウス（Ｃｏｎｔ．、ｎ＝１１）の肺、５０μｇのＬＡＭ注射マウス（ＬＡＭ、ｎ＝１１）の肺または５０μｇのＴＤＭ注射マウス（ＴＤＭ、ｎ＝７）の肺を７日目に分離し、炎症強度について肺の重量指数を算出することにより評価した。各記号は、個々のマウスを表す。データは個別の３回の試験の代表である。（Ｄ）７日目に、対照マウス、ＬＡＭ注射マウス（５０μｇ）またはＴＤＭ注射マウス（５０μｇ）由来の肺について、ヘマトキシリン−エオシン染色による組織学的検査を行った。スケールバーは０．１ｍｍを表す。データは個別の３回の試験の代表である。
【図６】ＬＡＭはデクチン−２を介して獲得免疫応答を誘導することを示す図である。（Ａ）ＷＴマウス、Ｃｌｅｃ４ｎ−／−マウス、Ｃｌｅｃ４ｅ−／−マウス、またはＦｃｅｒ１ｇ−／−マウスから得たＢＭＤＣを、未処理のままとするかまたはプレートにコーティングしたＬＡＭまたはＬＰＳで４８時間刺激した。ＣＤ４０およびＣＤ８０の表面発現をフローサイトメトリーを使用して分析した。（Ｂ）ＢＭＤＣを、ＯＶＡ３２３〜３３９ペプチドでパルスし、プレートにコーティングしたＬＡＭの存在下または非存在下でＣＦＳＥで標識したＣＤ４＋ＯＴ−ＩＩ  Ｔ細胞と３日間共培養した。サイトカイン濃度をＥＬＩＳＡを使用して決定した。細胞増殖は、ＣＤ４＋集団内のＣＦＳＥの希釈についてフローサイトメトリーを使用して分析した。データは、３回反復の平均値±ＳＤとして提示され、個別の３回の実験の代表である。（ＣおよびＤ）ＷＴマウス（ｎ＝１０）およびＣｌｅｃ４ｎ−／−マウス（ｎ＝１０）を図１Ａに記載のように、ＬＡＭ（５００μｇ）を含有するＩＦＡ中のＭＯＧ３５〜５５ペプチドで免疫した。指定された時間における平均臨床スコア（Ｃ）および疾患発症率（Ｄ）をプロットした。（Ｅ）ＥＡＥへ免疫して２３日後にリンパ節を採取し、ＭＯＧ３５〜５５ペプチドで４日間刺激した。サイトカインの濃度をＥＬＩＳＡを使用して決定した。データは平均値±ＳＤとして提示されている。図１２も参照されたい。
【図７】Ｃｌｅｃ４ｎ−／−マウスにおけるミコバクテリア感染に対する免疫応答の図である。（Ａ）肺の重量はＣｌｅｃ４ｎ−／−マウスでより高い。ＭＡＣを感染して２３日後に肺を分離した。ＷＴマウス（ｎ＝１０）およびＣｌｅｃ４ｎ−／−マウス（ｎ＝１０）を使用した。（Ｂ）非感染もしくはＭＡＣ感染のＷＴマウス由来の肺または非感染もしくはＭＡＣ感染のＣｌｅｃ４ｎ−／−マウス由来の肺に関するＨＥ染色による組織学的分析。スケールバーは０．１ｍｍを表す。（Ｃ）センシチン（ｓｅｎｓｉｔｉｎ）またはＭＡＣＡｇ８５で４日間再刺激後の脾細胞におけるサイトカイン産生。脾細胞はＭＡＣで感染して２３日後に得、各群において１０匹のマウスからプールした。データは平均値±ＳＤとして提示されている。図１３も参照されたい。
【図８】マンノースキャップ型ＬＡＭの模式構造の図である（図１に関連して）。結核菌（M. tuberculosis）のＭａｎ−ＬＡＭの典型的構造が示されている。
【図９】デクチン−２はＭａｎ−ＬＡＭに直接に結合することを示す図である（図２に関連して）。指定量のｈＩｇＧ１−Ｆｃ（Ｉｇ）またはデクチン−２−Ｉｇを、プレートにコーティングしたＬＡＭ（０．３μｇ／ウェル）とインキュベートした。結合したタンパク質を抗ｈＩｇＧ−ＨＲＰで検出し、続いて比色基質を添加した。全てのデータは３回反復の平均値±ＳＤとして提示されている。
【図１０】レポーター細胞においてデクチン−２ＱＰＤの表面発現レベルは野生型の表面発現レベルに匹敵することを示す図である（図３に関連して）。野生型デクチン−２またはデクチン−２ＱＰＤを抗デクチン−２ｍＡｂ（クローン：Ｄ２．１１Ｅ４）にて染色し、続いてフィコエリスリン結合ロバ抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）とインキュベートし、次いでそれらの表面発現をフローサイトメトリーにて測定した。
【図１１】ＳＩＧＮＲ１、ＳＩＧＮＲ３およびＭＭＲはＤＣにおけるＭａｎ−ＬＡＭに誘導されるサイトカイン産生には必須ではないことを示す図である（図４に関連して）。（Ａ）ＳＩＧＮＲ１欠損（ＣＤ２０９ｂＤＴＲ／ＤＴＲ）マウスの作出。ゲノムＳＩＧＮＲ１構造およびジフテリア毒素受容体（ＤＴＲ）とネオマイシン耐性との挿入を備える標的指向構築物。Ｃｄ２０９ｂエクソンは黒色のボックスとして示されている。ＴＫ；チミジンキナーゼ、Ｅ；ＥｃｏＲＩ部位、Ｂ；ＢａｍＨＩ部位。（Ｂ）ＷＴマウスおよびＣｄ２０９ｂ−／−マウスから得たＢＭＤＣを、プレートにコーティングしたＬＡＭの指定量で４８時間刺激した。ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−２およびＩＬ−１０の濃度をＥＬＩＳＡを使用して測定した。（Ｃ）脾臓ＤＣおよびＢＭＤＣにおけるＣｌｅｃ４ｎ、Ｃｄ２０９ｄおよびＣｄ２０６のＲＴ−ＰＣＲ分析。（Ｄ）ＷＴマウス由来のＢＭＤＣおよびＣｌｅｃ４ｎ−／−マウス由来のＢＭＤＣをベクター単独で（−）またはレンチウイルスベクターを介してＳＩＧＮＲ３（Ｒ３）で誘導した。ＳＩＧＮＲ３の発現はＲＴ−ＰＣＲおよび抗フラッグ  ｍＡｂでの染色により確認した。細胞をＭａｎ−ＬＡＭで４８時間刺激し、ＴＮＦおよびＩＬ−１０の濃度をＥＬＩＳＡにより決定した。（Ｅ）ＷＴマウスから得たＢＭＤＣを、抗ＭＭＲ  ｍＡｂまたは対照としてラットＩｇＧ１で処理し、次いでプレートにコーティングしたＬＡＭの指定量で４８時間刺激した。ＩＬ−１０およびＩＬ−２の濃度をＥＬＩＳＡを使用して測定した。（Ｆ）ＷＴマウス、Ｆｃｅｒ１ｇ−／−マウス、Ｃｌｅｃ４ｅ−／−マウスまたはＣｌｅｃ４ｄ−／−マウスから得たＢＭＤＣを、プレートにコーティングしたＬＡＭの指定量で４８時間刺激した。ＴＮＦおよびＩＬ−１０の濃度をＥＬＩＳＡを使用して測定した。（Ｇ）ＷＴマウスまたはＭｙＤ８８−／−マウスから得たＢＭＤＣを、プレートにコーティングしたＬＡＭの指定量で４８時間刺激した。ＩＬ−１０の濃度をＥＬＩＳＡを使用して測定した。（Ｈ）ＷＴのＢＭＤＣを、プレートにコーティングした抗デクチン−２  ｍＡｂまたは抗Ｍｉｎｃｌｅ  ｍＡｂで４８時間刺激した。ＩＬ−１０の濃度をＥＬＩＳＡを使用して測定した。（ＢおよびＤ〜Ｈ）全てのデータは、３回反復の平均値±ＳＤとして提示され、個別の３回の実験の代表である。
【図１２】Ｍａｎ−ＬＡＭは結核患者からのＰＢＭＣにおいてＴ細胞応答を促進することを示す図である（図６に関連して）。（Ａ）ＩＬ−２中和抗体の存在下における、Ｍａｎ−ＬＡＭで刺激したＢＭＤＣによるＴ細胞増殖の阻止。ＣＳＦＥ標識Ｔ細胞を抗ＩＬ−２ｍＡｂまたはイソタイプ適合対照Ａｂの存在下においてＭａｎ−ＬＡＭで刺激したＢＭＤＣと３日間共培養した。ＣＦＳＥｌｏｗ（すなわち増殖した細胞）の頻度を示した。データは３回反復の平均値±ＳＤとして提示されている。（Ｂ）ヒトデクチン−２＋ＦｃＲγを発現するＮＦＡＴ−ＧＦＰレポーター細胞を、抗ヒトデクチン−２抗体の存在下または非存在下で、プレートにコーティングした形態にあるＬＡＭの指定量で２４時間刺激した。ＮＦＡＴ−ＧＦＰの誘導をフローサイトメトリーを使用して分析した。全てのデータは、３回反復の平均値±ＳＤとして提示され、個別の３回の実験の代表である。（Ｃ）ヒト単球からのＴＮＦ産生。ヒト単球を健常ドナーのＰＢＭＣから調製し、抗ヒトデクチン−２  ｍＡｂの存在下または非存在下でＬＡＭで９６時間刺激した。（Ｄ）ヒト樹状細胞からのサイトカイン産生。ヒト樹状細胞を、抗ヒトデクチン−２  ｍＡｂの存在下または非存在下でＢＣＧで４８時間刺激した。（Ｅ）抗原ペプチド（ＣＦＰ−１０）に最も強く応答した結核患者由来のＰＢＭＣを、ＣＦＰ−１０由来の合成ペプチドの存在下または非存在下で、プレートにコーティングしたＬＡＭの存在下または非存在下でまたは抗ヒトデクチン−２抗体の存在下または非存在下で、４日間インキュベートした。（Ｆ）３人の結核患者由来のＰＢＭＣを、抗ヒトデクチン−２抗体とともにまたはそれなしで、合成ペプチドおよびプレートにコーティングしたＬＡＭの存在下で４日間（左パネル）または６日間（中央および右パネル）インキュベートした。（Ｃ〜Ｆ）各サイトカインの濃度をＥＬＩＳＡを使用して測定した。データは平均値±ＳＤとして提示されている。＊、ｐ＜０．０５。＊＊、ｐ＜０．０１。
【図１３】肺におけるサイトカイン発現の図である（図７に関連して）。肺ホモジネートを、ＷＴマウス（ｎ＝１０）またはＣｌｅｃ４ｎ−／−（ｎ＝１０）からＭＡＣ感染後０日および２３日目に調製した。ケモカイン濃度をサイトメトリービーズアレイを使用して測定した。各記号は個々のマウスを表し、カラムは各群の平均値を示す。＊、ｐ＜０．０５。Ｗｉｌｃｏｘｓｏｎ検定。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。以下の実施形態は本発明を説明するため例示するものであって、本発明をそれらの実施形態のみに制限するものではない。本発明は、本発明の精神から逸脱することなく様々な形態で実行することができる。
【００１０】
本明細書に記載の全ての刊行物は、先行技術文献、特許公報および他の特許文献を含めて、参照により本明細書に組み込まれることに留意されたい。さらに、本明細書には特願２０１４−１７３０６６（２０１４年、８月２７日出願）の明細書および図面に開示された内容が組み込まれ、本出願はこれに基づく優先権を主張するものである。
【００１１】
本発明においては、アジュバントとは、抗原に対する免疫応答を非特異的に高める物質として定義される。アジュバントは、その特性により、細胞性免疫応答、液性免疫応答、またはこの２つの混合応答のいずれかを促進できる。免疫応答の増強は非特異的であることから、本発明のアジュバントを様々な抗原と使用して様々な標的に対する応答を促進できること、例えば結核菌（Mycobacterium tuberculosis）由来の抗原と使用して結核菌（Mycobacterium tuberculosis）に対する免疫を促進できること、または腫瘍に由来する抗原と使用して、特定種類の腫瘍に対する免疫を促進できることは、当分野でよく理解されている。アジュバントは抗原性成分に添加され、ワクチンとして使用される。
【００１２】
本明細書では、抗原性成分または抗原性物質は、樹状細胞、マクロファージおよび顆粒球上の特異的受容体と反応する分子である。ワクチン接種という意味では、分子は特異的樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞またはＮＫＴ細胞の発生を刺激でき、免疫細胞が抗原と２回目に遭遇した場合に、より迅速な「記憶」反応を促進する、免疫細胞からなる記憶集団を形成できる分子である。記憶集団がクローン性であることは稀であるので、実際的にはこれは、抗原とは、前にその抗原に暴露された個体に由来する免疫細胞がその抗原と再度遭遇した時に免疫応答の上昇を刺激できる、任意の分子または分子の集団であることを意味している。本発明においては、デクチン−２発現細胞の例は、限定されないが、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞またはＮＫＴ細胞である。
【００１３】
抗原性成分は、ポリペプチドまたはポリペプチドの一部分とすることができ、これらは、動物もしくはヒト、および／または生物サンプルにおいていずれかの生物学的検出法によって決定される免疫応答を惹起する。原則として、抗原性成分は純粋な任意の化学種、例えばタンパク質もしくはその断片またはこのような種で調製された人工的混合物とすることができる。しかし、例えば、細胞ホモジネートもしくはその画分、微生物由来の培養濾液または高等動物などの多細胞生物由来の細胞組織などといった、化学種の天然に存在する任意の混合物とすることもできる。具体的には、抗原性物質は、代謝している結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、ウシ型結核菌（Mycobacterium bovis）および例えばミコバクテリウム・アビウム（Mycobacterium avium）およびミコバクテリウム・イントラセルラーレ（Mycobacterium intracellulare）などの他の環境中のミコバクテリアの培養液に由来してもよい。
【００１４】
用語免疫応答とは、例示的には、ワクチン、感染性の生物もしくはそのほかの外部の生物、組織、細胞、抗原、抗体、ヌクレオチド鎖、または当業界において認められている他の免疫刺激物質からのチャレンジに応答した、対象の免疫系に関する任意の変化である。免疫応答の非限定的例としては、樹状細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性化、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１７またはＧＭ−ＣＳＦのｉｎ  ｖｉｔｒｏ分泌；結核菌（M. tuberculosis）または他の感染性微生物の後のチャレンジからの防御；亜硝酸塩レベルの変化；様々な免疫コンパートメントにおけるＴｈ１およびＴｈ２サイトカイン応答；アロ型抗体レベルおよびイソタイプ抗体レベルにおける変化；抗原のｉｎ  ｖｉｔｒｏ認識；Ｂ細胞応答；感染したマクロファージにおける結核菌（M. tuberculosis）の成長阻害；生存率；または当業界で公知の他の応答が挙げられる。
【００１５】
ワクチンとは、疾患に対する免疫を発生するための、死んだ、弱毒化された、もしくはその他改質された微生物（細菌、ウイルスまたはリケッチア）、またはそれらの一部から構成される接種用懸濁物として定義される。ワクチンは、疾患を防止するため予防的に、またはがんもしくは潜在性感染症などの既存の疾患と戦うための治療ワクチンとして、なおまたアレルギーや自己免疫疾患とも関連した治療ワクチンとしていずれかで投与できる。ワクチンは免疫応答を強化するために本発明のアジュバント中で乳化できる。
【００１６】
本発明のワクチン（ワクチン組成物）は、当業界において適した任意の手段に従って凍結乾燥製剤または液体製剤として製剤化することができる。液状形態の製剤の非限定的例としては、液剤、懸濁剤、シロップ剤、スラリー剤、および乳剤が挙げられる。適切な液体担体としては、好ましくは滅菌形態で、適切な任意の有機溶媒または無機溶媒、例えば、水、アルコール、生理食塩水、緩衝生理食塩水、生理的食塩水溶液、ブドウ糖溶液、水−プロピレングリコール溶液等が挙げられる。
【００１７】
ワクチンは、中性または塩の形態いずれかで製剤化されてもよい。薬学的に許容される塩には、酸付加塩が含まれる。それらは、例えば塩酸またはリン酸などの無機酸、または、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等などの有機酸とともに形成される。遊離カルボキシル基から形成される塩も、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化鉄などの無機塩基、および、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノールなどの有機塩基から誘導され得る。
【００１８】
ワクチンは対象への接種または注射用に製剤化されることが好ましい。注射用には、本発明のワクチンは、水もしくはアルコールなどの水溶液中に、またはＨａｎｋｓ溶液、Ｒｉｎｇｅｒ溶液もしくは生理的食塩水緩衝液などの生理的適合緩衝液中に製剤化することができる。溶液は、懸濁化剤、保存剤、安定化剤および／または分散剤などの製剤化剤を含有してよい。注射製剤は個体形態製剤としても調製してもよいが、これは、例えば、滅菌水、生理食塩水、またはアルコールなどの適切な媒体で使用前に構成することにより、注射に適した液体形態製剤へと使用直前に変換することを意図する。
【００１９】
また、本発明のワクチンは徐放媒体中にまたはデポー剤中に製剤化されてもよい。そのような長期作用性製剤は接種もしくは移植（例えば皮下または筋肉内）によりまたは注射により投与することができる。したがって、例えば、ワクチンは、（例えば、許容される油中の乳剤として）適当な重合性材料もしくは疎水性材料またはイオン交換樹脂とともに、または難溶性誘導体として、例えば難溶性塩として製剤化してもよい。リポソームおよび乳剤は、担体としての使用に適した送達媒体の例として周知である。
【００２０】
ワクチンは、投与製剤に適合するように、および治療上効果的かつ免疫原性的になるような量で投与される。ワクチンの投与量は、投与経路に依存するとともに、ワクチン接種を受ける人の年齢、および度合いは低いが、ワクチン接種を受ける人の体格に、免疫応答を高める個々の免疫系の能力に、および所望の保護程度に従って変化するであろう。適当な投与量範囲は、約０．１μｇ／ｋｇ／日から１０００μｇ／ｋｇ／日を好ましい範囲とし、例えば約１μｇ／ｋｇ／日から３００μｇ／ｋｇ／日の範囲で、特に約１０μｇ／ｋｇ／日から５０μｇ／ｋｇ／日の範囲で、１回のワクチン接種につき活性成分数百マイクログラムオーダーである。初回投与およびブースター注射に適したレジメンも様々であるが、初回投与、次いでそれに続く接種または他の投与が典型となっている。
【００２１】
本発明においては、本発明者らはデクチン−２がＭａｎ−ＬＡＭの直接の受容体であることを示す。デクチン−２によるＭａｎ−ＬＡＭ認識は、ＤＣにおいて炎症性サイトカインおよび抗炎症性サイトカイン双方の産生を誘導した。Ｍａｎ−ＬＡＭは、有害な炎症を引き起こすことなくアジュバントとしてＴ細胞媒介獲得免疫を強力に促進した。本発明者らは、さらに、デクチン−２欠損マウスによって、デクチン−２はミコバクテリア感染に対して宿主応答において重要な役割を演じていることを実証する。まとめると、これらの知見は、デクチン−２はミコバクテリアＭａｎ−ＬＡＭに対して機能性ＰＲＲとして働くことを示している。
【００２２】
ミコバクテリアは細胞壁上に様々な免疫調節分子を持つ。マンノースキャップ型リポアラビノマンナン（Ｍａｎ−ＬＡＭ）は、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）の主たるリポグリカンであるが、宿主免疫性に対し抑制性効果と刺激性効果の両方を有することが長く知られている。しかし、その多面的活性を説明する直接のＭａｎ−ＬＡＭ受容体は、はっきりとは同定されていなかった。本明細書で、本発明者らは、Ｃ型レクチン受容体であるデクチン−２（遺伝子記号Ｃｌｅｃ４ｎ）がＭａｎ−ＬＡＭの直接受容体であることを報告する。Ｍａｎ−ＬＡＭは骨髄由来の樹状細胞（ＢＭＤＣ）を活性化して、炎症性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインを産生したが、一方、このことはＣｌｅｃ４ｎ−／−のＢＭＤＣでは完全に阻止されていた。Ｍａｎ−ＬＡＭは、ＤＣ上でデクチン−２を介して抗原特異的Ｔ細胞応答を促進した。さらに、マウスにおいて、Ｍａｎ−ＬＡＭはアジュバントとして、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を誘導したのに対し、Ｃｌｅｃ４ｎ−／−マウスは耐性であった。ミコバクテリアの感染に際して、Ｃｌｅｃ４ｎ−／−マウスは肺の病変の拡張を示した。これらの結果は、デクチン−２はＭａｎ−ＬＡＭの認識を介してミコバクテリア感染に対する宿主の免疫に寄与することを実証している。
【００２３】
ＬＡＭはＦｃＲγを介して実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を促進する。
本発明者らは、ＬＡＭがｉｎ  ｖｉｖｏでアジュバント活性を持つかどうかまず検討した。この目的のため、本発明者らは、Ｔ細胞媒介自己免疫疾患のマウスモデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を実施した（図１Ａ〜図１Ｄ）。マウスを、強毒株である結核菌（M. tuberculosis）青山Ｂ株に由来するＬＡＭと一緒にミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）ペプチドで免疫した。不完全フロインドアジュバント（ＩＦＡ）単独によりＥＡＥは誘導されなかったが、ＬＡＭでの単回注射では、１００％の発症率でＥＡＥが誘発された（図１Ａおよび図１Ｂ）。ＥＡＥの徴候はＦｃｅｒ１ｇ−／−マウスでは完全に阻止され（図１Ａおよび図１Ｂ）、ＦｃＲγと共役した受容体はＬＡＭ誘発ＥＡＥに貢献している可能性が示唆された。さらに、野生型マウスからのリンパ球と対照的に、Ｆｃｅｒ１ｇ−／−マウスからのリンパ球では、ＩＬ−１７インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の産生および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の産生により判断して、ＭＯＧペプチドに対するｅｘ  ｖｉｖｏ再生応答が障害されることが示された（図１Ｃおよび図１Ｄ）。これらの結果は、ＬＡＭは、ＦｃＲγ依存性経路を介してＥＡＥの発症をもたらす強力なアジュバントとして作用する可能性があることを示している。
【００２４】
ＦｃＲγは主としてミエロイド細胞で発現するので、本発明者らは次に、ＤＣをｉｎ  ｖｉｔｒｏにてＬＡＭで処理した。細菌壁上にＬＡＭの均一な構成および多価性を再現するように、ＬＡＭを、骨髄由来のＤＣ（ＢＭＤＣ）の刺激用に培養プレート上にコーティングした。可溶性のＬＡＭはサイトカイン産生を誘導しなかったが、プレートにコーティングしたＬＡＭは、ＢＭＤＣを刺激して、多量の炎症性サイトカイン、すなわちマクロファージ炎症性タンパク質−２（ＭＩＰ−２）およびＴＮＦを分泌することができた（図１Ｅおよび図１Ｆ）。これらのサイトカインは、Ｃｌｅｃ４ｅ−／−のＤＣ（図１Ｅおよび図１Ｆ）およびＣｌｅｃ４ｄ−／−のＤＣにおいて依然として産生されていた。ＭｙＤ８８はこの応答に必須ではなく、トール様受容体（ＴＬＲ）はＬＡＭ認識において主要な役割は演じていない可能性が示された。対照的に、ＬＡＭ誘導のサイトカイン産生はＦｃｅｒ１ｇ−／−のＤＣにおいて阻止された。これらの結果は、未知のあるＦｃＲγと共役した受容体がＢＭＤＣにおいてＬＡＭに対する活性化受容体として機能している可能性を示している。
【００２５】
デクチン−２はミコバクテリアのＬＡＭを認識する。
Ｍｉｎｃｌｅ、ＭＣＬおよびデクチン−２は、同一遺伝子クラスター内のＦｃＲγと共役した活性化受容体であり、これらの受容体のうちの２つ、ＭｉｎｃｌｅおよびＭＣＬはミコバクテリアを認識する（Ishikawa et al., 2009; Miyake et al., 2013）。したがって、本発明者らは、デクチン−２もミコバクテリアに対する受容体として進化をとげた可能性があると仮定した。実際、デクチン−２は、Ｍｉｎｃｌｅと同様に、強毒株である結核菌（M. tuberculosis）Ｈ３７Ｒｖおよびワクチン株であるウシ型結核菌（M. bovis）カルメットとゲランの桿菌（ＢＣＧ）を認識して、レポーター細胞を活性化することが実証された（図２Ａ）。しかし、デクチン−２に対するリガンドは、Ｍｉｎｃｌｅのリガンドであるトレハロース−６，６’−ジミコール酸（ＴＤＭ）とは異なっていた（図２Ａ）。
【００２６】
本発明者らは次に、クロロフォルム：メタノール（Ｃ：Ｍ）および水などの、親油性溶媒および親水性溶媒を使用してウシ型結核菌（M. bovis）ＢＣＧの成分を分画した。両抽出物のそれぞれに対するデクチン−２リガンド活性は、レポーター細胞を使用してプレートにコーティングした形態で評価した。本発明者らは、Ｍｉｎｃｌｅ発現細胞を活性化するＣ：Ｍ相（図２Ｂ、左）とは打って変わって、水性相のみがデクチン−２に対する刺激活性を示すことを見出した（図２Ｂ、右）（Ishikawa et al., 2009）。これらの結果は、ミコバクテリアの親水性成分がデクチン−２リガンドの候補であることを示唆する。ミコバクテリアの親水性成分のうち、ＬＡＭは最も豊富な親水性リポグリカンを構成する（Leopold and Fischer, 1993）（図８）。本発明者らの予測と一致して、結核菌（M. tuberculosis）に由来するＬＡＭはデクチン−２を発現するレポーター細胞を活性化した（図２Ｃ）。可溶性デクチン−２タンパク質（デクチン−２−Ｉｇ）は精製ＬＡＭに用量依存的に結合したことから、デクチン−２はＬＡＭを直接に認識していた（図９）。これらの知見は、デクチン−２はミコバクテリウムのＬＡＭに対する直接の受容体であることを示している。
【００２７】
デクチン−２はマンノースキャップ型ＬＡＭを介してミコバクテリを認識する。
ＬＡＭの構造は、ミコバクテリア種に依存して、特にキャップ部分に従って異なる（Briken et al., 2004）。結核菌（M. tuberculosis）およびウシ型結核菌（M. bovis）ＢＣＧを含む成長の遅い株はＭａｎ−ＬＡＭを持つが、一方、ミコバクテリアの成長の速い株はそれを持たない。Ｍ．スメグマティス（M. smegmatis）はＰＩ−ＬＡＭを持つ。ＬＡＭのどの構造がデクチン−２との相互作用の要因であるか解明するため、本発明者らは非結核性ミコバクテリア（ＮＴＭ）を含め様々な株のミコバクテリアを使用した。
【００２８】
デクチン−２は、Ｍａｎ−ＬＡＭを持つ成長の遅い株、例えばＭ．イントラセルラーレ（M. intracellulare）およびＭ．ゴルドナエ（M. gordonae）を認識した。対照的に、デクチン−２は、マンノースキャップを欠くＭ．アブセサス（M. abscesssus）およびＭ．スメグマティス（M. smegmatis）を認識しなかった（図３Ａ）。重要なことには、Ｍｉｎｃｌｅはこれらの株を認識することができた（図３Ａ）。本発明者らは、これらの株いずれもがＦｃＲγのみを発現するレポーター細胞を活性化しないことを確認した。これらの結果は、デクチン−２は、Ｍａｎ−ＬＡＭを発現するミコバクテリア種を優先的に認識することを示唆している。この見解を支持して、結核菌（M. tuberculosis）に由来するＭａｎ−ＬＡＭの活性は（図２Ｃ）、末端マンノースキャップを取り除くα−マンノシダーゼで処理すると消失した（図３Ｂ）。これらの結果は、キャップ構造はデクチン−２によるＭａｎ−ＬＡＭの認識にとって重要な決定因子であることを示している。
【００２９】
本発明者らは次に、デクチン−２のマンノース結合能力がＭａｎ−ＬＡＭの認識に関与しているかどうか検討した。この目的のため、本発明者らは、ＥＰＮ配列（グルタミン酸−プロリン−アスパラギン）をガラクトース型ＱＰＤ配列（グルタミン−プロリン−アスパラギン酸）に置換することによりマンノース結合活性が取り除かれているデクチン−２ＱＰＤ変異体を用いた（Drickamer, 1992; Ishikawa et al., 2013）。Ｍａｎ−ＬＡＭは、細胞表面上で野生型デクチン−２とデクチン−２ＱＰＤとが類似の蛍光強度であったにもかかわらず（図１０）、デクチン−２ＱＰＤを発現するレポーター細胞を活性化しなかった（図３Ｃ）。デクチン−２による全ミコバクテリアの認識はこのＥＰＮモチーフにも依存していた（図３Ｄ）。まとめると、これらの結果は、デクチン−２とのＭａｎ−ＬＡＭの相互作用にはＭａｎ−ＬＡＭのマンノースキャップとデクチン−２のマンノース認識特性との両方が必要であることを示している。
【００３０】
Ｍａｎ−ＬＡＭはデクチン−２に依存してＤＣによりサイトカイン産生を誘導する。
ミエロイド細胞のうち、ＤＣはデクチン−２を最も豊富に発現する（Ariizumi et al., 2000）。本発明者らは、したがって、ＢＭＤＣにおいてＭａｎ−ＬＡＭに応答したサイトカイン産生について検討した。ＴＤＭと同様に、Ｍａｎ−ＬＡＭは、ＭＩＰ−２、ＴＮＦおよびＩＬ−６などの炎症性サイトカインの発現を用量依存的に誘導した（図４Ａ）。ＬＡＭ誘導のサイトカイン産生はＣｌｅｃ４ｎ−／−のＢＭＤＣにおいて消失したが、一方、ＴＤＭ媒介のサイトカイン産生は変化しなかった（図４Ａ）。Ｍａｎ−ＬＡＭはまたデクチン−２に依存的にＩＬ−１２ｐ４０を若干促進した。ウシ型結核菌（M. bovis）ＢＣＧの感染によるＴＮＦおよびＩＬ−６の産生については、デクチン−２に非依存的なサイトカイン産生は残存したものの、ＷＴのＢＭＤＣと比較して、Ｃｌｅｃ４ｎ−／−のＢＭＤＣにおいては一部減少した（図４Ｂ）。これらのデータは、デクチン−２がＤＣにおけるＭａｎ−ＬＡＭ媒介性の炎症性サイトカインの産生にとって必要不可欠であることを示している。
【００３１】
本発明者らは次に、Ｍａｎ−ＬＡＭに関する免疫抑制作用の重要性を強調する証拠（Geijtenbeek et al., 2003; Wieland et al., 2007）が増えつつあるという事実から、Ｍａｎ−ＬＡＭ−デクチン−２経路の抗炎症性の潜在的能力に焦点をあてた。炎症性サイトカインに加え、Ｍａｎ−ＬＡＭはＢＭＤＣにおいて抗炎症性サイトカインであるＩＬ−１０の産生を強力に誘導した（図４Ｃ、左）。他の病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）であるＴＤＭ（図４Ｃ、右）およびＬＰＳではＩＬ−１０およびＩＬ−２の分泌は誘導されず、Ｍａｎ−ＬＡＭはサイトカイン産生に関して独特のプロファイルを有することが示された。これらのサイトカインのＭａｎ−ＬＡＭ誘導性の放出は、Ｃｌｅｃ４ｎ−／−のＢＭＤＣでは完全に抑制されていた（図４Ｃ）。ウシ型結核菌（M. bovis）ＢＣＧに感染時のＴＮＦ産生は上記のようにデクチン−２に部分的に依存していたが（図４Ｂ）、ＩＬ−１０およびＩＬ−２の産生はウシ型結核菌（M. bovis）ＢＣＧで感染したＣｌｅｃ４ｎ−／−のＤＣではほぼ完全に失われていた（図４Ｄ）。その一方では、マンノースキャップを欠いているＭ．アブセッサス（M. abscessus）は、ＭＩＰ−２の産生は可能であったのと比べ、ＩＬ−１０およびＩＬ−２の産生は誘導できなかった（図４Ｅ）。これらの結果は、ミコバクテリアに応答したＩＬ−１０およびＩＬ−２の産生における、デクチン−２の中心的な役割を示唆している。
【００３２】
デクチン−２媒介性の固有シグナルはＤＣにおけるＭａｎ−ＬＡＭ誘導性のサイトカイン産生を調節する。
Ｍａｎ−ＬＡＭにより誘導されるサイトカイン産生はＣｌｅｃ４ｎ−／−細胞において阻止されることから（図４Ａおよび図４Ｃ）、デクチン−２がこのようなサイトカイン産生にとって必要であることは明らかである。しかし、デクチン−２が媒介する固有のシグナルは、このような応答にとって十分であるのか、または他のある補受容体も必要であるのか依然として不確かである。独特のサイトカインプロファイルは、特にＩＬ−１０およびＩＬ−２の産生は、デクチン−２と他のＭａｎ−ＬＡＭ受容体との共結合により付与されている可能性がある。この可能性を調べるために、本発明者らは、Ｍａｎ−ＬＡＭに対するいくつかの候補受容体の貢献について検討した。ヒトＤＣ−ＳＩＧＮの推定上のマウス相同体であるＳＩＧＮＲ１はＭａｎ−ＬＡＭを認識することから（Koppel et al., 2004）、本発明者らはＳＩＧＮＲ１欠損マウスを確立することによりＳＩＧＮＲ１の役割を評価した（図１１Ａ）。しかし、ＳＩＧＮＲ１を欠くＢＭＤＣは試験を行った全てのサイトカインを、ＷＴのＢＭＤＣにおけるサイトカインに匹敵する量で、産生することが依然として可能であった（図１１Ｂ）。別のＤＣ−ＳＩＧＮ相同体であるＳＩＧＮＲ３はミエロイド細胞の限定された集団において発現するが（Nagaoka et al., 2004）、これは、ＢＭＤＣにおいて検出されなかった（図１１Ｃ）。さらに、ＢＭＤＣにおいてＳＩＧＮＲ３を強制発現しても、Ｍａｎ−ＬＡＭ誘導性のサイトカイン産生は増大しなかった（図１１Ｄ）。とりわけ、Ｃｌｅｃ４ｎ−／−のＢＭＤＣは、ＳＩＧＮＲ３が発現していてもサイトカインを産生することができなかった（図１１Ｄ）。まとめると、これらの結果は、ＳＩＧＮＲ１およびＳＩＧＮＲ３の両方ともがＢＭＤＣにおけるＭａｎ−ＬＡＭにより誘導されるサイトカイン産生にとって必須というわけではないことを示している。
【００３３】
マクロファージマンノース受容体（ＭＭＲ）はまた、Ｍａｎ−ＬＡＭに結合し得る（Nigou et al., 2001）。ＭＭＲ発現がＢＭＤＣにおいて検出されたので（図１１Ｃ）、本発明者らは、抗ＭＭＲ遮断モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を使用してＭａｎ−ＬＡＭ誘導性のサイトカイン放出におけるその役割を評価した。しかし、ｍＡｂ処理は、ＢＭＤＣにおけるＩＬ−１０およびＩＬ−２の産生に影響を及ぼさなかった（図１１Ｅ）。
【００３４】
最近の報告では、デクチン−２はＭＣＬとの会合が可能であることが示された（Zhu et al., 2013）。その一方では、Ｃｌｅｃ４ｄ−／−のＢＭＤＣの分析により、ＭＣＬはＭａｎ−ＬＡＭ誘導のサイトカイン産生にとって必要ではないことが明らかとなった（図１１Ｆ）。Ｍａｎ−ＬＡＭはＴＬＲ２およびＴＬＲ４によって弱く認識される（Mazurek et al., 2012）。しかし、Ｍａｎ−ＬＡＭにより誘導されるＩＬ−１０産生はＭｙＤ８８−／−のＢＭＤＣでは変化せず（図１１Ｇ）、ＴＬＲ−ＭｙＤ８８シグナル伝達はＭａｎ−ＬＡＭの効果において主要な役割を演じていないことが示唆された。最終的には、本発明者らは、抗デクチン−２の架橋によりデクチン−２単独の直接的結合がＩＬ−１０の産生を再現したことを確認した（図１１Ｈ）。
【００３５】
まとめると、これらの結果は、Ｍａｎ−ＬＡＭのＩＬ−１０を誘導する潜在的能力はデクチン−２媒介シグナル伝達の固有の特性に起因する可能性が高いことを示唆している。
【００３６】
Ｍａｎ−ＬＡＭはｉｎ  ｖｉｖｏで最小の炎症を誘導する。
Ｍａｎ−ＬＡＭが炎症応答を惹起するかどうか検討するために、本発明者らはｉｎ  ｖｉｖｏでＭａｎ−ＬＡＭ投与へのマウスの応答を評価した。ＬＡＭまたはＬＰＳを気管内投与して、続いて、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）における炎症細胞の浸潤およびサイトカインの産生について調べた（図５Ａおよび図５Ｂ）。ＷＴマウスにおいてＬＰＳはＴＮＦの産生および細胞の浸潤の有意な増加を誘導したが、対照的に、Ｍａｎ−ＬＡＭは顕著な炎症応答は誘導しなかった。この観察と一致して、ＦｃＲγ欠損はＭａｎ−ＬＡＭ処理のＷＴマウスと比べて明らかな影響を有していなかった。
【００３７】
ＴＤＭの静脈注射により、以前に報告したように（Ishikawa et al., 2009）、肺の重量指数（ＬＷＩ）で評価して炎症性の肺の腫脹（図５Ｃ）と肺における肉芽腫の形成（図５Ｄ、右）とが誘導された。対照的に、同量のＭａｎ−ＬＡＭでは、肺の腫脹（図５Ｃ）も肉芽腫の形成（図５Ｄ、中央）もどちらも誘導されなかった。これらの結果は、Ｍａｎ−ＬＡＭは、ＴＤＭまたはＬＰＳなどの他のＰＡＭと比べ、肺の強い炎症を誘導しないことを示している。
【００３８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＭａｎ−ＬＡＭ刺激はＡＰＣ機能を増強してＩＬ−１７産生を促進する。
本発明者らは、Ｍａｎ−ＬＡＭのアジュバント活性についてｉｎ  ｖｉｔｒｏでさらに評価した。ＤＣ成熟に対するＭａｎ−ＬＡＭの効果を検討するため、本発明者らは、Ｍａｎ−ＬＡＭによる刺激後のＢＭＤＣにおける補助刺激分子の発現について調べた。Ｍａｎ−ＬＡＭ刺激はＷＴのＢＭＤＣにおいてＣＤ４０およびＣＤ８０の発現を上方制御したが、その発現はＬＰＳにより誘導されたものに匹敵していた（図６Ａ）。しかし、そのような補助刺激分子の誘導は、デクチン−２およびそのサブユニットであるＦｃＲγの非存在下では消失していた（図６Ａ）。ＭｉｎｃｌｅはＬＡＭ誘導性の応答にとって必須ではなかった。本発明者らは、ＬＰＳ媒介性の応答はこれらのマウスにおいては変化しなかったことを確認した。これらの結果は、Ｍａｎ−ＬＡＭはＤＣ成熟をデクチン−２依存的に促進することを実証している。
【００３９】
本発明者らは次に、Ｍａｎ−ＬＡＭ刺激に対する抗原提示細胞（ＡＰＣ）の機能ついて調べた。ＢＭＤＣを、卵白アルブミン（ＯＶＡ）抗原ペプチドでパルスし、Ｍａｎ−ＬＡＭの存在下または非存在下で、ＯＶＡ特異的なＯＴ−ＩＩ  ＴＣＲトランスジェニックマウスから得たＴ細胞と共培養した。Ｔ細胞はデクチン−２を発現しないので（Ariizumi et al., 2000）、このシステムにより、Ｔ細胞のプライミングおよび活性化に向けたＡＰＣの機能におけるＭａｎ−ＬＡＭの役割を評価することが可能となる。ＣＤ４＋  ＯＴ−ＩＩ  Ｔ細胞からのＩＬ−１７の抗原特異的分泌は、細胞をＭａｎ−ＬＡＭにより処理したＡＰＣと共培養した際に有意に増強した（図６Ｂ）。しかし、Ｃｌｅｃ４ｎ−/−のＡＰＣを使用すると、この増強は著明に減弱した。抗原誘導性のＴ細胞増殖は、ＣＦＳＥ希釈で評価すると、ＤＣのデクチン−２発現にかかわらず観察された（図６Ｂ、最下）。共培養上清のＩＬ−１０濃度は抗原用量に依存して上昇し、Ｍａｎ−ＬＡＭ−デクチン−２軸により刺激されたＤＣの存在下でＩＬ−１０を産生するＴ細胞が発生したことが示唆された（図６Ｂ）。
【００４０】
Ｍａｎ−ＬＡＭは、抗原の非存在下でもＴ細胞−ＤＣ共培養において弱いＴ細胞増殖を誘導したが、これにはＤＣ上のデクチン−２も必要であった（図６Ｂ）。このような「抗原非依存増殖」は、抗ＩＬ−２中和ｍＡｂを添加するとこの応答は除去されたので（図１２Ａ）、ＤＣ上のデクチン−２を介する多量のＩＬ−２分泌により付与される可能性がある（図４Ｃ）。
【００４１】
ＩＬ−１７産生の増強とは対照的に、Ｍａｎ−ＬＡＭ処置は抗原依存ＩＦＮ−γ産生に対する影響を本質的に有していなかった（図６Ｂ）。ＩＬ−４は本試験のいずれの時点においても検出されなかった。まとめると、これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの結果は、Ｍａｎ−ＬＡＭ刺激はＡＰＣ機能を増強して、デクチン−２に依存してＩＬ−１７の産生を促進することを示唆している。
【００４２】
Ｍａｎ−ＬＡＭはヒトデクチン−２を介して抗原特異的なヒトＴ細胞応答を促進する。
本発明者らは次いで、Ｍａｎ−ＬＡＭはマウスＴ細胞において観察されたようにヒトＴ細胞応答に影響を及ぼすかどうか評価した。重要なことには、Ｍａｎ−ＬＡＭはｈデクチン−２を発現するレポーター細胞を活性化し、そしてこの活性は抗ｈデクチン−２  ｍＡｂの存在下でブロックされた（図１２Ｂ）。ヒト単球および単球由来のＤＣにおけるＭａｎ−ＬＡＭ誘導性のサイトカイン産生も抗ｈデクチン−２  ｍＡｂにより有意に抑制された（図１２Ｃおよび図１２Ｄ）。結核患者由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を結核菌（M. tuberculosis）由来のＣＦＰ−１０（１０ｋＤａ培養濾液抗原）のＣ１０ペプチド（ＶＶＲＦＱＥＡＡＮＫＱＫＱＥＬ（配列番号１））で刺激した。抗原ペプチドのみが、ＰＢＭＣにおいて実質量のＩＦＮ−γ産生を誘導したが、一方、抗原ペプチドと併用でＭａｎ−ＬＡＭで刺激するとＩＦＮ−γ産生は増加した。ＩＦＮ−γ産生に関するＭａｎ−ＬＡＭ誘導性の増加は抗ｈデクチン−２  ｍＡｂの存在下で顕著に損なわれた（図１２Ｅ）。ＩＦＮ−γ産生に関するデクチン−２依存性の増強は、他の個々の３人の患者においても観察された（図１２Ｆ）。これらの結果は、Ｍａｎ−ＬＡＭ−ｈデクチン−２の相互作用により、結核患者由来のＴ細胞のミコバクテリア抗原特異的応答が、おそらくはＰＢＭＣ中のミエロイド細胞の活性化を介して促進されることを示している。
【００４３】
デクチン−２−ＦｃＲγ軸を介するＭａｎ−ＬＡＭ免疫によるＥＡＥの誘導。
本発明者らは次いで、Ｍａｎ−ＬＡＭによるデクチン−２活性化はｉｎ  ｖｉｔｒｏでＩＬ−１７産生を誘導したことから、Ｔヘルパー−１７（Ｔｈ１７）細胞性自己免疫疾患のマウスモデルであるＥＡＥを実施した（図６Ｂ）。際だったことに、Ｃｌｅｃ４ｎ−／−マウスはＭａｎ−ＬＡＭ誘導ＥＡＥに対して完全に耐性を示し（図６Ｃおよび図６Ｄ）、これから、他のＭａｎ−ＬＡＭ受容体は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてデクチン−２の欠損を代償できないことが示された。さらに、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−γおよびＧＭ−ＣＳＦの産生で評価すると、Ｃｌｅｃ４ｎ−／−マウスにおいて、鼠径リンパ節、腰部リンパ節および腋窩リンパ節から採取したリンパ節細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ再生応答は完全に阻止されていた（図６Ｅ）。これは、Ｍａｎ−ＬＡＭはデクチン−２の欠損環境ではＴ細胞を効率的にプライムできないことを示している。一緒にすると、デクチン−２はｉｎ  ｖｉｖｏでＭａｎ−ＬＡＭのアジュバント活性にとって必須の受容体である。
【００４４】
ミコバクテリア感染におけるデクチン−２の役割
最終的に本発明者らは、ミコバクテリアの感染におけるデクチン−２の役割についてｉｎ  ｖｉｖｏで調べた。ＷＴマウスおよびＣｌｅｃ４ｎ−／−マウスをＭ．アビウム（M. avium）コンプレックス（ＭＡＣ）で経鼻的に感染させた。感染して３週間後肺における細菌の量に有意な変化はなかったものの、肺当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）の平均値はＷＴマウスに比べＣｌｅｃ４ｎ−／−マウスにおいて大きかった（ＷＴ、６．５４±６．４７；Ｃｌｅｃ４ｎ−／−、１３．１±８．３２（×１０２））。本発明者らは、したがって、感染マウスの肺の病変を特徴付けた。肺腫瘤から評価した肺腫脹はＣｌｅｃ４ｎ−／−マウスにおいて有意に大きかった（図７Ａ）。また、Ｃｌｅｃ４ｎ−／−マウスでは感染後肺における組織病変が増加していた（図７Ｂ）。ケモカイン濃度は、感染後３週目でＷＴマウスと比べＣｌｅｃ４ｎ−／−マウスの肺において上昇していた（図１３）。それぞれ個々のマウスにおけるケモカイン濃度が肺の細菌量と相関していたことから、これらのケモカインは肺に定着した細菌による誘導が考えられた。ＴＮＦ、ＩＬ−６およびＩＬ−１０などのサイトカイン産生は、感染して２３日後のＷＴマウスおよびＣｌｅｃ４ｎ−／−マウスの肺において上昇していなかった。本発明者らはまた、感染マウスにおいて抗原特異的Ｔ細胞応答について調べた。Ｃｌｅｃ４ｎ−／−マウス由来の脾臓Ｔ細胞では、ミコバクテリア抗原により再生刺激を行ったところ有意に大量のＩＦＮ−γが産生され、一方、ＩＬ−１７産生は変化しなかった（図７Ｃ）。このように、デクチン−２の欠損により、おそらくミコバクテリアの排除が不十分になることから、肺の病変の拡張および獲得免疫がもたらされた。まとめると、これらの結果は、デクチン−２がミコバクテリアに対する宿主の防御に関与していることを示唆する。
【００４５】
考察
本稿では、本発明者らは、デクチン−２はミコバクテリアＭａｎ−ＬＡＭに対する直接のそして機能的な受容体であることを実証した。Ｍｉｎｃｌｅ、ＭＣＬ、およびデクチン−２は同一の遺伝子クラスターに位置するが、本発明者らはこれらのＣＬＲ全てがミコバクテリアを認識することを見出した（Ishikawa et al., 2009; Miyake et al., 2013）。進化の過程で、異なるミコバクテリア成分を認識する様々なＣＬＲを獲得することにより、宿主はこの生命を脅かす細菌に対する安定した免疫応答を発揮することができたのであろう。
【００４６】
デクチン−２は、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）に由来するα−１，２−マンナン（Robinson et al., 2009; Saijo et al., 2010）およびマラセジア属（Malassezia）真菌由来のマンノプロテイン（Ishikawa et al., 2013）などの、真菌の高マンノース構造を認識すると報告されている（McGreal et al., 2006）。ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＳＩＧＮＲ１、ＳＩＧＮＲ３およびＭＭＲに類似して（McGreal et al., 2006）、デクチン−２は高マンノース構造に優先的に結合するが、これらの全てがその炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）内にマンノースを結合するＥＰＮ配列を持つことが（Drickamer, 1992）、グリカンアレイ分析により確認されている。Ｍａｎ−ＬＡＭは、α−１，２−マンノースキャップで終了する多糖類鎖を持つ（Mishra et al., 2011）。Ｍａｎ−ＬＡＭのα−１，２−結合マンノース残基がデクチン−２により認識される直接の決定因子である可能性が極めて高い。
【００４７】
Ｍａｎ−ＬＡＭは特異的な構成でミコバクテリアのエンベロープに高密度に分布し、この結果、その極性マンノースキャップはオリゴマー価数を備えて細菌表面上で露出している。多価性のα−１，２−マンノース残基は、デクチン−２により認識される病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）の特徴と矛盾しない（Ishikawa et al., 2013; Saijo et al., 2010）。本研究におけるデクチン−２媒介性の応答を評価するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでそのような構成を再現するように、Ｍａｎ−ＬＡＭをプレートにコーティングした形態で使用した。先の研究では、可溶性のＭａｎ−ＬＡＭ単独では、ミエロイド細胞におけるサイトカイン産生は誘導されないことが示されているが（Geijtenbeek et al., 2003; Gringhuis et al., 2009; Nigou et al., 2001）、本発明者らはＢＭＤＣを用いてこのことを確かめた。刺激に応じて異なるこのような結果は、リガンドの性質、すなわち単価（可溶性）対多価（不動性）により引き起こされる、受容体の結合における差に起因する可能性がある。可溶性Ｍａｎ−ＬＡＭは、ＴＬＲリガンドなどの他の刺激の存在下でミエロイド細胞の機能に影響を及ぼすことが実証されている（Geijtenbeek et al., 2003; Gringhuis et al., 2007; Nigou et al., 2001）。これらの知見について可能な１つの説明は、ＴＬＲ結合リポタンパク質が水性培地において親水性相互作用を介して可溶性Ｍａｎ−ＬＡＭに対して足場を提供し、これがデクチン−２の結合に十分なリガンドの多量体化をもたらし得るというものである。この着想と一致して、油乳化物中の多量体化Ｍａｎ-ＬＡＭはｉｎ  ｖｉｖｏで強力なアジュバンド活性を示した。まとめると、デクチン−２は「真の」病原体上にある多価性のＰＡＭＰを区別して、おそらくはその標的の誤認を防いでいる可能性がある。
【００４８】
α−１，２−結合マンノース残基はホスファチジルミオイノシトールマンノシド（ＰＩＭ）にも存在する。ＰＩＭはＭＭＲおよびＤＧ−ＳＩＧＮと会合する可能性があることが示されていることから（Torrelles et al., 2006）、デクチン−２はＰＩＭを認識する可能性がある。しかし、Ｍａｎ-ＬＡＭを欠損するがＰＩＭを持つＭ．アブセッサス（M. abscessus）は、デクチン−２を発現するレポーター細胞を活性化しなかったが、このことは、ＰＩＭはデクチン−２にとって強力なリガンドではない可能性を暗示する。また、デクチン−２は長鎖ミコール酸、糖脂質、リポグリカンおよび多糖類などの「高い」細胞壁成分内の「短い」ＰＩＭにアクセスできない可能性もある（Mishra et al., 2011; Torrelles et al., 2006）。
【００４９】
ＳＩＧＮＲ１、ＳＩＧＮＲ３およびＭＭＲはＭａｎ−ＬＡＭに対するマウス受容体として報告されている（Koppel et al., 2004; Schlesinger et al., 1994; Tanne et al., 2009）。Ｃｄ２０９ｂ−／−マウス由来の腹腔内マクロファージは、Ｍａｎ−ＬＡＭに応答してわずかであるが検出可能なＩＬ−１０を産生する（Wieland et al., 2007）。しかし、ＳＩＧＮＲ１の遺伝子破壊および抗ＭＭＲ遮断ｍＡｂはＢＭＤＣにおけるＬＡＭ−誘導のサイトカイン産生に影響を及ぼさなかった。ＳＩＧＮＲ３はＢＭＤＣ上で発現せず、ＳＩＧＮＲ３の強制発現はＣｌｅｃ４ｎ−／−のＢＭＤＣにおけるサイトカイン産生をレスキューしなかった。このように、Ｍａｎ−ＬＡＭにより誘導される特徴的なサイトカイン産生は、ＤＣ中のデクチン−２を介する固有のシグナル伝達により決定されると考えられる。Ｍａｎ−ＬＡＭ誘導性のｉｎ  ｖｉｖｏ応答もＣｌｅｃ４ｎ−／−マウスにおいて完全に消失したが、ＳＩＧＮＲ３が、ＳＩＧＮＲ３を発現する特定の細胞、例えば皮膚ＤＣのＭａｎ-ＬＡＭ応答においてある役割を演じている可能性がある（Nagaoka et al., 2010）。また、Ｍａｎ−ＬＡＭを結合するこれらの分子が、Ｍａｎ−ＬＡＭを保有する細菌へのミエロイド細胞の結合を促進することによって（Tanne et al., 2009）、ミコバクテリアの効率的な食作用が可能となる可能性もある。
【００５０】
本発明者らのデータにより、Ｍａｎ−ＬＡＭはＩＬ−１０産生を惹起するのに十分な成分であることが実証される。しかし、Ｍａｎ−ＬＡＭを欠損するＮＴＭ株Ｍ．アブセッサス（M. abscessus）はＩＬ−１０産生を誘導しなかったが、本発明者らは、Ｍａｎ−ＬＡＭはミコバクテリア全体により誘導されるＩＬ−１０産生にとって必ずしも必要ではないという可能性を除外することはできない。ＬＡＭのマンノースキャップを欠く変異ウシ型結核菌（M. bovis）ＢＣＧからの結果は、ＬＰＳでプライムしたヒトＤＣのＩＬ−１０産生におけるその重複した機能を示唆している（Appelmelk et al., 2008）。ミコバクテリアは、マンノシル化タンパク質などの他の可能性のある未知のデクチン−２リガンドを持ち得ることが報告されている（Pitarque et al., 2005）。そのような成分が、少なくとも部分的には、全細菌により誘導されるＩＬ−１０産生の原因である可能性がある。
【００５１】
感染時のＩＬ−１０産生は結核菌（M. tuberculosis）に対する感受性と相関することが報告されている。大量のＩＬ−１０を、特に結核菌（M. tuberculosis）のハイパー強毒株に対して応答した、活動性結核患者の血清中に検出することができる（O'Garra et al., 2013）。これらの観察と一致して、ミコバクテリアに対する感受性が上昇していることが、ＩＬ−１０を恒常的に過剰発現したマウスにおいて示されている（Feng et al., 2002）。また、別の免疫調節性サイトカインであるトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）の分泌もデクチン−２を介してＭａｎ−ＬＡＭによりわずかに増強された。しかし、ミコバクテリアの毒力に対するＬＡＭのマンノースキャップの正確な貢献については、ｉｎ  ｖｉｖｏでは依然として議論の余地がある（Afonso-Barroso et al., 2013; Appelmelk et al., 2008）。
【００５２】
他方、ＩＬ−１０は宿主組織に対する過剰の損傷を制限し得ることが提案されている（Redford et al., 2011）。ＦｃＲγの下流アダプターであるＣＡＲＤ９を欠損する変異マウスでは、重度の肺の病変を呈し、結核菌（M. tuberculosis）に応答した致死性が増強されたが、このことはＩＬ−１０の分泌が消失したことと相関している（Dorhoi et al., 2010）。ＣＡＲＤ９はＭｉｎｃｌｅを介するシグナル伝達も媒介するが、ミコバクテリア感染時の病変に対するＭｉｎｃｌｅ欠乏の影響は、ＣＡＲＤ９−/−のマウスの病変と比べ中程度であった（Behler et al., 2012; Heitmann et al., 2013; Lee et al., 2012）。Ｃｌｅｃ４ｎ−/−のマウスにおける肺炎症の拡張を考慮すると、デクチン−２−ＦｃＲγ−ＣＡＲＤ９軸は、ミコバクテリア感染の制御に関与していると考えられる。実際、Ｆｃｅｒ１ｇ−/−のマウスではミコバクテリア感染時の肺において免疫病変の増加が示された（Maglione et al., 2008）。
【００５３】
Ｍａｎ−ＬＡＭは、マウスにおいてＴｈ１７細胞応答をいかに効率的に促進しているのであろうか？以前の研究により、デクチン−２リガンドは、可溶性因子の放出を介してＴｈ１７細胞の分化を誘導することができることが実証されている（Saijo et al., 2010）。Ｍａｎ−ＬＡＭ刺激はまた、ＩＬ−６、ＴＮＦおよびＴＧＦ−βの産生も誘導したが、これらの全てはＴｈ１７細胞を誘導するサイトカインである。また、本発明者らは、ＩＬ−２３ｐ１９の転写は、Ｃ．アルビカンス（C. albicans）で刺激したＢＭＤＣにおいて以前に報告されたように（Robinson et al., 2009）、Ｍａｎ−ＬＡＭに対してＢＭＤＣにおいてデクチン−２依存的に上方制御されていることを観察した。最近の報告は、Ｍａｎ−ＬＡＭを保有するＮＴＭ株Ｍ．アビウム（M. avium）はＩＬ−２３産生を誘導することができることを実証している。この活性はその株の親油性抽出物では失われ（Jonsson et al., 2012）、このことにより親水性Ｍａｎ−ＬＡＭはＴｈ１７細胞の分化の促進に関与するという着想が支持される。
【００５４】
結核患者由来のヒトＰＢＭＣにおいて、本発明者らは、Ｍａｎ−ＬＡＭはミコバクテリア抗原により誘導されるＩＦＮ−γ産生を増強することを見出した。検出不可能な濃度のＩＬ−１７分泌については以前の観察と一致するが（Yamashita et al., 2013）、根底にある機序については現在不明である。結核患者におけるＴ細胞は、感染時に繰り返し抗原に暴露することでＴｈ１細胞表現型に既に傾いていた可能性があるということが、１つの可能な説明である。
【００５５】
ＭｉｎｃｌｅのリガンドＴＤＭとは打って変わって、デクチン−２のリガンドＭａｎ−ＬＡＭは、両方のＣＬＲとも同一シグナル伝達サブユニットであるＦｃＲγを共有するという事実にかかわらず、ＩＬ−１０およびＩＬ−２の産生を独特に誘導する。ＤＣからのＩＬ−２産生は、Ｔ細胞のプライミングを促進することによりアジュバント活性に貢献する可能性がある（Granucci et al., 2001）。ＴＬＲ−ＭｙＤ８８経路またはＴＲＩＦ経路によりこれらのサイトカインの分泌は起こらないので（LeibundGut-Landmann et al., 2007）、以前の研究ではＤＣのＩＬ−１０およびＩＬ−２の産生におけるＳｙｋ−ＣＡＲＤ９経路の役割に注目が集まった（LeibundGut-Landmann et al., 2007; Robinson et al., 2009; Saijo et al., 2010）。しかし、ＭｉｎｃｌｅのリガンドＴＤＭはＩＬ−１０とＩＬ−２の両方の産生を可能としなかったことから、Ｓｙｋ−ＣＡＲＤ９経路はこれらのサイトカインを誘導するには不十分である。共通のシグナル伝達サブユニットを介して異なるＣＬＲが様々な細胞応答をどのように引き起こすのかは不明のままである。本発明者らは以前、ＦｃＲγシグナルの量および期間が細胞応答の質を決定することができることを報告した（Yamasaki et al., 2004）。受容体結合の動態、親和性、または価数によってＦｃＲγを介する異なるシグナル伝達が生じる可能性があると仮定することは興味深い。
【００５６】
上記のＭａｎ−ＬＡＭの機能に加えて、Ｍａｎ−ＬＡＭはミコバクテリア感染時に多面発現的な機能を有すると知られている。ミコバクテリアは、ファゴソーム−リソソーム融合を制限して、マクロファージ中で生存するが、これによりミコバクテリアは潜伏感染および持続感染を確立することが可能となる（Pieters, 2008）。Ｍａｎ−ＬＡＭは、このプロセスに関与する候補の１つであるが（Fratti et al., 2003; Vergne et al., 2004）、デクチン−２媒介性のシグナル伝達がファゴソーム−リソソーム融合に影響するかどうか判定するさらに詳細な研究が必要である。最近の研究では、Ｍａｎ−ＬＡＭ処理により流入領域リンパ節からのＴ細胞の移動が阻害されることが実証された（Richmond et al., 2012）。デクチン−２の発現がＴ細胞のいずれのサブセットにおいても検出されなかったことから（Ariizumi et al., 2000）、そのような効果はデクチン−２とはかかわりなく生じると考えられる。
【００５７】
本研究において、本発明者らは、デクチン−２がＭａｎ−ＬＡＭを認識してそのアジュバント活性を媒介することを示した。また、Ｍａｎ−ＬＡＭ−デクチン−２軸により免疫刺激性応答および抑制性応答の両方を同時に誘導することは、宿主生物がバランスのとれた免疫応答を維持するのに有益であり得る。ＥＡＥ発症時に、ＴＤＭをアジュバントとして使用した時、注射部位に皮膚炎症が観察される（Miyake et al., 2013）。しかし、Ｍａｎ−ＬＡＭを注射したマウスの皮膚にはそのような炎症は観察されなかったが、これはＭａｎ−ＬＡＭにより誘導された抗炎症性サイトカインは注射部位の過剰な炎症を制御し得ることを暗示する。このように、Ｍａｎ−ＬＡＭにより誘導される制限された炎症応答は、感染性疾患およびがん用の治療ワクチン向けのアジュバントとして有益である可能性がある。したがって、Ｍａｎ−ＬＡＭアナログは、最小限の有害な炎症を伴う、獲得性免疫の発達を促進する独特な親水性の「調節性」アジュバントであり得ることを提唱する。
実施例
【実施例１】
【００５８】
脂質抽出
ウシ型結核菌（M. bovis）ＢＣＧを５回の繰り返し洗浄で蒸留水により分画した。遠心分離後、可溶性画分を採取した。不溶性画分をＣ：Ｍ（２：１、ｖｏｌ／ｖｏｌ）でさらに脱脂した。各画分を当初のウシ型結核菌（M. bovis）ＢＣＧ重量の０．１ｍｇ当量で大量のイソプロパノールに再懸濁させた。
【００５９】
細胞
ＦｃＲγ単独、Ｍｉｎｃｌｅ、デクチン−２、およびデクチン−２ＱＰＤを発現する２Ｂ４−ＮＦＡＴ−ＧＦＰレポーター細胞を以前に記載のように調製した（Yamasaki et al., 2009）。ＢＭＤＣを以前に記載のように調製した（Miyake et al., 2013）。
【００６０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激
ミコバクテリア脂質抽出物、水溶液のＬＡＭ（１ｍｇ／ｍｌ）、１ｍｇ／ｍｌでＣ：Ｍに溶解したＴＤＭおよびカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）の細胞壁マンノース（５ｍｇ／ｍｌ）をイソプロパノール中に希釈し、２０μｌ／ウェルで９６ウェルプレートに加え、続いて以前に記載のように溶媒を蒸発させた（Ishikawa et al., 2009）。レポーター細胞を２４時間刺激し、フローサイトメトリーを用いてＮＦＡＴ−ＧＦＰの活性化をモニターした。ＢＭＤＣを２日間刺激し、次いで培養上清を採取した。各サイトカインの濃度をＥＬＩＳＡにより決定した。活性化は共刺激分子であるＣＤ４０およびＣＤ８０の表面染色を使用してフローサイトメトリーにより決定した。
【００６１】
ＯＶＡ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答
ＢＭＤＣは上記のようにＷＴマウスおよびＣｌｅｃ４ｎ−／−マウスから作製した。ＢＭＤＣを未処理のままとするかまたはＯＶＡ３２３〜３３９ペプチド（ＡＢＧＥＮＴ）の存在下で、プレートにコーティングしたＬＡＭの指定量で刺激した。ＯＴ−ＩＩ  Ｔｇマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞を抗ＣＤ４結合磁気ビーズで精製し（ＭＡＣＳ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、次いでＣＦＳＥ（同仁化学研究所（ＤＯＪＩＮＤＯ））で標識し、９６ウェルプレート中でＯＶＡパルス化ＤＣとともに共培養した。３日目に、上清を回収し、ＥＬＩＳＡを使用してＩＦＮ−γ、ＩＬ−１７およびＩＬ−１０の濃度を決定した。ＣＦＳＥ標識Ｔ細胞をフローサイトメトリーを使用してＣＤ４＋Ｔ細胞集団内のＣＦＳＥの希釈について分析した。
【００６２】
実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）
マウスを、ＬＡＭ５００μｇを含有するＩＦＡ（Ｄｉｆｃｏ）中で乳化させたＭＯＧ３５〜５５ペプチド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２００μｇで皮下投与により０日目に免疫した。マウスは、１日目から開始する、百日咳毒素（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）５００ｎｇの連日腹腔内投与を３回受けた。以前に記載のように疾患重症度をスコアした（Miyake et al., 2013）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの再刺激分析用に、２３日目に細胞を腋窩リンパ節、鼠径リンパ節および腰部（大動脈周囲）リンパ節から採取した。リンパ細胞（５×１０５細胞／ウェル）をＭＯＧ３５〜５５ペプチド（０、３、１０および３０μｇ／ｍｌ）で４日間刺激した。培養上清中のＩＬ−１７、ＩＦＮ−γおよびＧＭ−ＳＣＦの濃度をＥＬＩＳＡにより決定した。
【００６３】
ミコバクテリア感染
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ感染については、ＢＭＤＣを１〜１０×１０９ＣＦＵのウシ型結核菌（M. bovis）ＢＣＧで感染させた。４８時間後、培養上清を採取し、サイトカイン濃度をＥＬＩＳＡにて決定した。ｉｎ  ｖｉｖｏ感染については、ＷＴマウスおよびＣｌｅｃ４ｎ−／−マウスをイソフルランで麻酔し、次いでそれぞれのマウスをマウス１匹当たり２．５×１０６ＣＦＵのＭ．アビウム（M. avium）コンプレックス（ＭＡＣ）で経鼻的に感染させた。感染の３週間後、肺を分離し、Ｐｈｙｓｃｏｔｒｏｎ  ｈａｎｄｙ  ｍｉｃｒｏ  ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ（Ｍｉｃｒｏｔｅｃ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．）でホモジネートした。ホモジネートの段階希釈物について、ＯＡＤＣおよびペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）で補充した７Ｈ１１寒天プレート上のＣＦＵを決定した。ホモジネートについては、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてケモカインも決定した。他の感染マウス由来の肺をヘマトキシリン−エオシン染色向けに１０％ホルムアルデヒドで固定した。脾細胞の単一細胞懸濁液（５×１０５細胞）をＭ．アビウム（M. avium）センシチンＰＰＤ（５μｇ／ｍｌ）またはＭＡＣ  Ａｇ８５Ａ（１０μｇ／ｍｌ）で４日間刺激し、培養上清のサイトカインおよびケモカインの濃度をＥＬＩＳＡにて決定した。
【００６４】
参考文献
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【実施例２】
【００６５】
追加実験手順
マウス
Ｃ５７ＢＬ／６マウスは日本クレア（Ｊａｐａｎ  Ｃｌｅａ）（東京、日本）または九動（Ｋｙｕｄｏ）（福岡、日本）から入手した。Ｃｌｅｃ４ｎ−／−マウスは少なくとも９世代Ｃ５７ＢＬ／６Ｊへ戻し交雑した（Saijo et al., 2010）。Ｆｃｅｒ１ｇ−／−マウス（Park et al., 1998）、ＭｙＤ８８−／−マウス（Kawai et al., 1999）およびＯＶＡ特異的なＴＣＲ  ＯＴ−ＩＩトランスジェニックマウス（Barnden et al., 1998）はＣ５７ＢＬ／６の背景上で使用した。Ｃｄ２０９ｂＤＴＲ／ＤＴＲマウスは、Ｒ１胚幹細胞（１２９Ｘ１／ＳｖＪおよび１２９Ｓ１／ＳｖマウスのＦ１子孫）で確立し、Ｃ５７ＢＬ／６−１２９混合の遺伝的背景として使用した（図１１Ａ）。全てのマウスは除菌空気の層流エンクロージャに維持され、所与の標準実験室食および水を自由摂取で与えられた。全ての動物プロトコルは、九州大学医学部、千葉大学または東京薬科大学の動物実験に関する倫理委員会により承認された。
【００６６】
ミコバクテリア
Ｍ．スメグマティス（M. smegmatis）ｍｃ２１５５株は依然記載したようにＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ９ブロスで培養した（Morita et al., 2005）。ウシ型結核菌（M. bovis）カルメットとゲランの桿菌（ＢＣＧ）は日本ＢＣＧ研究所（Ｊａｐａｎ  ＢＣＧ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）から購入した。Ｍ．アビウム（M. avium）、Ｍ．イントラセルラーレ（M. intracellulare）、Ｍ．アブセサス（M. abscesssus）およびＭ．ゴルドナエ（M. gordonae）を含む１０種のＮＴＭ株は、鹿児島大学医学部歯学部附属病院呼吸器ストレスケアセンターの呼吸器内科により提供された。これらの株は米国胸部学会の基準に従ってＮＴＭ肺疾患と診断された患者から分離された（Griffith et al., 2007）。強毒性株結核菌（M. tuberculosis）Ｈ３７Ｒｖ株およびＮＴＭ株は使用前に加熱殺菌した。
【００６７】
試薬
結核菌（M. tuberculosis）青山Ｂ株由来のＬＡＭはナカライテスク（Ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ）から購入した。ＴＤＭ、ＬＰＳ（Ｌ４５１６）およびα−マンノシダーゼはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）の細胞壁マンナン（ＭＧ００１）はタカラバイオ株式会社（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．）から入手した。ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）、ＭＩＰ−２およびＩＬ−１７（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｂｉｎｇｄｏｎ、英国）の濃度をＥＬＩＳＡにより決定した。ＰＢＭＣのヒトＩＦＮ−γの濃度は、ヒトＩＦＮ−γ高感度ＥＬＩＳＡキット（Ａｂｃａｍ、米国）を使用して分析した。実験はメーカーの説明に従って実施した。ケモカインの濃度はメーカーの説明に従ってＢＤ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）により測定する。ミコバクテリア抗原であるＭ．アビウム（M. avium）センシチンＰＰＤはＳｔａｔｅｎｓ  Ｓｅｒｕｍ  Ｉｎｓｔｉｔ（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、デンマーク）から購入した。組換えＭＡＣ  Ａｇ８５ＡはＭ．Ｓｕｇｉｔａ（京都大学）から好意で提供いただいた（Matsunaga et al., 2008）。
【００６８】
研究集団
東京病院（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔｏｋｙｏ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）（東京、日本）からの４人の患者を、インフォームドコンセントを与えた後に本研究に登録した（図１２Ｅおよび図１２Ｆ）。活動型疾患の１人の患者（図１２Ｆ、右パネル）および既往疾患の３人の患者（図１２Ｅおよび図１２Ｆ、中央および右パネル）はＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ  Ｇｏｌｄ  ｉｎ−Ｔｕｂｅテストに関して全て陽性反応であったが、これは結核に対する細胞性免疫が残ったままであることを示唆している。患者のＰＢＭＣとＥＳＡＴ−６またはＣＦＰ−１０由来の結核菌（M. tuberculosis）特異的抗原のオーバーラップペプチドとの共培養によるＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴデータは、各々の患者において陽性のウェル（≧６スポット／２．５×１０５ＰＢＭＣ）を示した（Nagai et al., 2014）。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの陽性ウェル由来のオーバーラップペプチドを本研究のＩＦＮ−γＥＬＩＳＡ用に使用した（図１２Ｅおよび図１２Ｆ）。研究手順は、ヒト対象を使用する医学研究のための東京病院の治験審査委員会によりおよび国立感染症研究所の倫理員会により承認された（Nagai et al., 2014）。ＰＢＭＣを結核患者に由来するヘパリン処理静脈血からＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ｕｐｊｏｈｎ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）勾配遠心分離にて分離した。ＰＢＭＣ（２×１０５／ウェル）を、ＥＳＡＴ−６もしくはＣＦＰ−１０由来の合成ペプチド、ＬＡＭまたは抗ヒトデクチン−２  Ａｂとともにまたはこれらなしで、９６ウェルプレート中で４日間インキュベートした。培養上清をサイトカイン滴定用に採取した。ＩＦＮ−γの濃度を、ＥＬＩＳＡを使用して決定した。
【００６９】
抗体
中和用の抗マンノース受容体ｍＡｂ（１５−２）はＡｂｃａｍから購入し（Da Silva et al., 2009）、中和用の抗ヒトデクチン−２  ｍＡｂ（５４５９４３）はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製であった（Gringhuis et al., 2011）。抗マウスデクチン−２  ｍＡｂ（Ｄ２．１１Ｅ４）はＡｂｃａｍから購入した。抗フラッグ  ｍＡｂ（１Ｅ６）は和光純薬工業（Ｗａｋｏ）から購入した。フィコエリスリン結合ロバ抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（７１２−１１６−１５３）およびロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（７１５−１１６−１５１）はＪａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈから入手した。中和抗ＩＬ−２  ｍＡｂ（ＪＥＳ６−１Ａ１２）およびイソタイプ適合対照ｍＡｂラットＩｇＧ２ａ  κ（ｅＢＲ２ａ）はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。
【００７０】
気管内注射
ＷＴマウスおよびＦｃｅｒ１ｇ−／−マウスを麻酔し、次いで水溶液１００μｌ中のＬＡＭ１００μｇおよびＬＰＳ１０μｇをマウスに気管内投与した。対照として滅菌生理食塩水１００μｌをマウスに投与した。投与８時間後に、ＰＢＳ８００μｌで２回肺をフラッシングすることにより気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を採取した。ＢＡＬＦ中のＴＮＦの濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。
【００７１】
静脈内注射
Ｍａｎ−ＬＡＭを水中油中水の乳化物として調製し（Takimoto et al., 2006）、以前に記載のようにＴＤＭを水中油の乳化物として調製した（Ishikawa et al., 2009）。ＬＡＭまたはＴＤＭ５０μｇを含有する乳化物１００μｌを６〜１０週令のマウスに静脈内注射した。ＬＡＭとＴＤＭともなしの乳化物を媒体対照として投与した。７日目に、以前に記載のように肺の重量指数（ＬＷＩ）を算出し（Ishikawa et al., 2009）、肺をヘマトキシリン−エオシン染色向けに１０％ホルムアルデヒドで固定した。
【００７２】
レンチウイルス媒介遺伝子導入
ＳＩＧＮＲ３遺伝子を発現ベクター（ＣＳＩＩ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＩＲＥＳ−Ｂｓｄ）に導入した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、パッケージングベクター（ｐＣＭＶ−ＶＡＶ−Ｇ−ＲＳＶ−ＲｅｖおよびｐＣＡＧ−ＨＩＶｇｐ）と一緒にＳＩＧＮＲ３発現ベクターをトランスフェクトした。トランスフェクトして３日後に培養上清を採取した。ウイルスを超遠心分離（５０，０００×ｇ、２時間、２０℃）により濃縮した。遺伝子導入のため、ＢＭＤＣをポリブレン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）８μ／ｍｌとともにレンチウイルスとインキュベートした。２４時間後、培地を新しい培養培地と代えた。レンチウイルス感染細胞をブラストサイジンＳ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）１０μｇ／ｍｌで選別した。
【００７３】
ヒト単球および単球に由来するＤＣの調製
最初に、ヒトＰＢＭＣをリンパ球分離溶液（ｄ＝１．０７７）（ナカライテスク）の勾配遠心分離により健常ドナーの末梢血から分離した。ヒト単球をＭｏｎｏｃｙｔｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ）を使用してＰＢＭＣから精製した。単球に由来するＤＣ向けに、ヒトＣＤ１４＋単球を抗ヒトＣＤ１４ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ  （Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ）を使用してＰＢＭＣから精製した。樹状細胞を、１０％ＦＢＳ、非必須アミノ酸、抗生物質、ヒトＧＭ−ＣＳＦ１０ｎｇ／ｍｌおよびヒトＩＬ−４の１０ｎｇ／ｍｌを補充したＲＰＭＩ１６４０中で７日間培養した後、ＣＤ１４＋単球から得た。ヒト単球（２．５×１０５／ウェル）を抗ヒトデクチン−２  ｍＡｂの存在下または非存在下でＬＡＭとともに９６ウェルプレート中で４日間インキュベートした。ヒト樹状細胞（２×１０５／ウェル）を抗ヒトデクチン−２ｍＡｂの存在下または非存在下でＢＣＧとともに９６ウェルプレート中で４８時間インキュベートした。培養上清をサイトカイン滴定用に採取した。ＴＮＦ、ＩＬ−１０およびＩＬ−１βの濃度をＥＬＩＳＡを使用して決定した。
【００７４】
ＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡを、Ｓｅｐａｚｏｌ  ＲＮＡ  Ｉ  Ｓｕｐｅｒ  Ｇ（ナカライテスク）を使用してＢＭＤＣおよびＣＤ１１ｃ＋脾細胞から調製し、ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ（東洋紡（ＴＯＹＯＢＯ））でｃＤＮＡ鋳型を作製するために使用した。ＭＭＲ用のプライマー（Dewals et al., 2010）およびＳＩＧＮＲ３のプライマー（Tanne et al., 2009）を前述のように使用した。
【００７５】
統計
対応のない両側検定でのＳｔｕｄｅｎｔのｔ−検定およびＷｉｌｃｏｘｓｏｎ検定（図１Ｃ、図１Ｄ、図７Ａおよび図１３）を統計解析のために使用した。＊、ｐ＜０．０５。＊＊、ｐ＜０．０１。
【００７６】
追加の参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2017526673.tif 000016