(57)【要約】  本発明は、組換えタンパク質生産およびワクチン製剤の分野に関する。特定には、本発明は、ＣＭＶの五量体ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１Ａ複合体を生産するための手段および方法を提供する。より具体的には、本発明は、ＣＭＶに対するワクチンとして使用することができるバキュロウイルス系で生産されたＣＭＶの五量体ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１Ａ複合体を提供する。【選択図】  図９
2017515503.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＭＶタンパク質であるＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１Ａ、ｇＨ（ＵＬ７５）およびｇＬ（ＵＬ１１５）で構成される五量体複合体であって、
（ｉ）バキュロウイルスを使用することによって、ＣＭＶタンパク質であるＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１Ａ、ｇＨ（ＵＬ７５）およびｇＬ（ＵＬ１１５）を宿主細胞中で共発現させること；
（ｉｉ）前記共発現により得られた宿主細胞および／または上清から、五量体複合体を精製すること；および
（ｉｉｉ）任意選択で、精製された五量体複合体を、キレート剤および／または安定化剤を含む緩衝溶液中で貯蔵すること
を含む方法によって入手可能である、上記五量体複合体。
【請求項２】
前記宿主細胞が、昆虫細胞または哺乳動物細胞である、請求項１に記載の五量体複合体。
【請求項３】
前記昆虫細胞が、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、ＨｉｇｈＦｉｖｅ、Ｓ２、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｆ９−１、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｆ９−２、またはＳｕｐｅｒ  Ｓｆ−９−３である、請求項２に記載の五量体複合体。
【請求項４】
前記共発現の工程が、
（ｉ）感染時に細胞約２×１０６個／ｍＬの細胞数を有する前記宿主細胞を感染させる際に、前記タンパク質を発現し、約１０７ｐｆｕ／ｍＬまたはそれより高い力価を有するバキュロウイルスで宿主細胞を感染させること；
（ｉｉ）前記宿主細胞を好適な条件下で培養すること、および
（ｉｉｉ）感染後５６から６５時間の間に前記宿主細胞および／または上清を回収すること
を包含する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の五量体複合体。
【請求項５】
前記宿主細胞を、融解および培養の後、１５日目から５０日目の間、好ましくは１５日目から３０日目の間、好ましくは１８日目に感染させる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の五量体複合体。
【請求項６】
精製が、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよび／またはアフィニティークロマトグラフィーを包含する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の五量体複合体。
【請求項７】
前記キレート剤が、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の五量体複合体。
【請求項８】
ＥＤＴＡが、２０ｍＭまたはそれ未満、例えば３ｍＭまたはそれ未満の濃度で前記緩衝溶液中に存在する、請求項７に記載の五量体複合体。
【請求項９】
前記安定化剤が、ポリエチレングリコール、アルギニン、ソルビトール、グリセロール、スクロースおよび／またはＮＰ−４０である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の五量体複合体。
【請求項１０】
前記緩衝溶液が、トリス緩衝液、ＮａＣｌ、ＫＣｌを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の五量体複合体。
【請求項１１】
ＣＭＶタンパク質であるＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１Ａ、ｇＨおよびｇＬをコードする前記オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が、１つまたはそれより多くのベクターにあり、好ましくは単一のベクターにある、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の五量体複合体。
【請求項１２】
前記ベクターが、細菌（大腸菌）、酵母（Ｓ．セレビジエ）、昆虫細胞および／または哺乳動物細胞における繁殖のためのエレメントを含有する、請求項１１に記載の五量体複合体。
【請求項１３】
前記ＯＲＦが、前記ベクター中に５’から３’に以下の順番：
（ｉ）ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１Ａ；または
（ｉｉ）ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１Ａ、ｇＨ
で配置されている、請求項１１または１２に記載の五量体複合体。
【請求項１４】
（ａ）（ｉ）において、ｇＨのＯＲＦは、３’方向で転写され、ｇＬのＯＲＦは５’方向で転写され、ＵＬ１２８のＯＲＦは３’方向で転写され、ＵＬ１３０のＯＲＦは３’方向で転写され、ＵＬ１３１ＡのＯＲＦは３’方向で転写され；
（ｂ）（ｉ）において、ｇＨのＯＲＦは３’方向で転写され、ｇＬのＯＲＦは３’方向で転写され、ＵＬ１２８のＯＲＦは３’方向で転写され、ＵＬ１３０のＯＲＦは３’方向で転写され、ＵＬ１３１ＡのＯＲＦは３’方向で転写され；
（ｃ）（ｉｉ）において、ｇＬのＯＲＦは５’方向で転写され、ＵＬ１２８のＯＲＦは３’方向で転写され、ＵＬ１３０のＯＲＦは３’方向で転写され、ＵＬ１３１ＡのＯＲＦは３’方向で転写され、ｇＨのＯＲＦは３’方向で転写される、請求項１３に記載の五量体複合体。
【請求項１５】
前記ＯＲＦのそれぞれが、ｐ１０プロモーター、ｐｏｌｈプロモーター、ＩＥ−１プロモーター、ｍＣＭＶプロモーター、ｖｐ３９プロモーター，ｌｅｆ２プロモーター、ＣＡＧプロモーター、またはＨｅｐＢ  ＳＶ４０プロモーター、およびそれに続いてターミネーター配列、例えばＨＳＶｔｋターミネーターまたはＳＶ４０ターミネーターによって駆動される、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の五量体複合体。
【請求項１６】
前記タンパク質の少なくとも１つが、タグを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の五量体複合体。
【請求項１７】
前記タグが、Ｈｉｓ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−タグ、Ｈｉｓ−Ｓｔｒｅｐ−タグ、ＳｔｒｅｐＩＩ−タグ、Ｓｏｆｔａｇ  １、ＴＣ−タグ、ｍｙｃ−タグ、ＦＬＡＧ−タグ、ＨＡ−タグ、Ｖ５−タグ、Ａｖｉ−タグ、カルモジュリン−タグ、ポリグルタメート−タグ、アミロイドベータ−タグ、ＧＳＴ−タグ、ＭＢＰ−タグまたはＳ−タグである、請求項１６に記載の五量体複合体。
【請求項１８】
前記タンパク質の１種またはそれより多くが、プレシジョンプロテアーゼまたはプレシジョンおよびＴＥＶプロテアーゼを含み、好ましくは、ｇＨおよび／またはｇＬタンパク質が、プレシジョンプロテアーゼまたはプレシジョンおよびＴＥＶプロテアーゼを含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の五量体複合体。
【請求項１９】
前記バキュロウイルスにおいて、ｖ−ｃａｔｈおよび／またはＣｈｉＡ活性が、機能的に破壊されている、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の五量体複合体。
【請求項２０】
組成物の形態である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の五量体複合体。
【請求項２１】
上皮／内皮（Ｅｐｉ／ＥＣ）および線維芽細胞の感染を両方とも阻害する中和活性を誘導することが可能な、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の五量体複合体。
【請求項２２】
ＣＭＶタンパク質であるＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１Ａ、ｇＨ（ＵＬ７５）およびｇＬ（ＵＬ１１５）で構成される五量体複合体を生産するための方法であって、
（ｉ）バキュロウイルスを使用することによって、ＣＭＶタンパク質であるＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１Ａ、ｇＨ（ＵＬ７５）およびｇＬ（ＵＬ１１５）を宿主細胞中で共発現させること；
（ｉｉ）前記共発現により得られた宿主細胞および／または上清から、五量体複合体を精製すること；および
（ｉｉｉ）任意選択で、精製された五量体複合体を、キレート剤および／または安定化剤を含む緩衝溶液中で貯蔵すること
を含む、上記方法。
【請求項２３】
前記タンパク質の１種またはそれより多くが、追加のＢおよび／またはＴ細胞エピトープを含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の五量体複合体。
【請求項２４】
前記Ｔ細胞エピトープが、ＣＤ４Ｔ細胞エピトープまたはＣＤ８Ｔ細胞エピトープである、請求項２３に記載の五量体複合体。
【請求項２５】
前記エピトープが、配列番号２２〜６６に示されるエピトープのいずれか１つである、請求項２３または２４に記載の五量体複合体。
【請求項２６】
請求項１〜２１および２３〜２５のいずれか一項に記載の五量体複合体または請求項２２に記載の方法によって入手可能な五量体複合体、および任意選択で医薬的に許容される担体またはアジュバントを含む、医薬組成物またはワクチン組成物。
【請求項２７】
前記タンパク質の少なくとも１種、２種、３種または４種が、残りのタンパク質の由来となったＣＭＶ株以外のＣＭＶ株である、請求項１〜２１および２３〜２５のいずれか一項に記載の五量体複合体または請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記ＣＭＶタンパク質が、以下のＣＭＶ株、すなわちＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋに受託番号ＦＪ６１６２８５．１で寄託されたゲノムを有するタウン、トレド（ＧＵ９３７７４２．１）、ＡＤ１６９（ＦＪ５２７５６３）、マーリン（ＡＹ４４６８９４．２）、ＴＢ４０／Ｅ（ＫＦ２９７３３９．１）、ＶＲ１８１４（ＧＵ１７９２８９）由来である、請求項２７に記載の五量体複合体。
【請求項２９】
ｇＢタンパク質、ｇＭタンパク質、ｐｐ６５タンパク質、ＩＥ−１タンパク質、ｇＬ／ｇＨタンパク質の二量体、ｇＭ／ｇＮタンパク質の二量体、ｇＬ／ｇＨ／ｇＯの三量体、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）であって１つまたはそれより多くのキャプシドもしくはキャプシド前駆タンパク質、ＣＭＶ由来の１つまたはそれより多くの表面タンパク質、および／または１つまたはそれより多くの外被タンパク質を含むＶＬＰ、をさらに含む、請求項２６に記載のワクチン組成物。
【請求項３０】
ｇＢ、ｇＭ、ｐｐ６５、ＩＥ−１またはＩＥ−２をコードする核酸分子をさらに含む、請求項２６に記載のワクチン組成物。
【請求項３１】
請求項１〜２５のいずれか一項に記載の五量体複合体をコードするベクターを含むワクチン組成物。
【請求項３２】
前記ベクターが、ＤＮＡベースであるか、またはＲＮＡベースである、請求項３１に記載のワクチン組成物。
【請求項３３】
ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１、ｇＨ（ＵＬ７５）およびｇＬ（ＵＬ１１５）で構成されるＣＭＶ五量体複合体の１つまたはそれより多くのタンパク質を含む改変ワクシニアウイルス  アンカラ（ＭＶＡ）、をさらに含む、請求項２６〜３２のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項３４】
対象にＣＭＶに対するワクチン接種をする方法で使用するための、請求項２６〜３３のいずれか一項に記載のワクチン組成物であって、
該方法は、プライミング組成物として前記ワクチン組成物を、
ブースティング組成物として（ｉ）ｇＨ／ｇＬ二量体、（ｉｉ）ＵＬ１３０／ＵＬ１３１Ａ−二量体、（ｉｉｉ）ｇＭ／ｇＮ二量体、（ｉｖ）ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１Ａ−五量体、（ｖ）ｇＢ、（ｖｉ）ｇＭ、（ｖｉｉ）ｐｐ６５、（ｖｉｉｉ）ＩＥ−１、（ｉｘ）ＩＥ−２、（ｘ）ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１、ｇＨ（ＵＬ７５）およびｇＬ（ＵＬ１１５）で構成されるＣＭＶ五量体複合体の１つまたはそれより多くのタンパク質を含む改変ワクシニアウイルス  アンカラ（ＭＶＡ）、（ｘｉ）ｇＢ、ｇＨ／ｇＬ二量体、ｐｐ６５タンパク質またはＩＥ−１タンパク質を含む改変ワクシニアウイルス  アンカラ（ＭＶＡ）、（ｘｉｉ）１つまたはそれより多くのキャプシドもしくはキャプシド前駆タンパク質、ＣＭＶ由来の１つまたはそれより多くの表面タンパク質、または１つまたはそれより多くの外被タンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）、（ｘｉｉｉ）（ｉ）から（ｘｉｉ）で規定された化合物のいずれか１種をコードする核酸配列、（ｘｉｖ）フラジェリン由来のペプチド、（ｘｖ）ＣｐＧモチーフ、および／または（ｘｖｉ）ＬＣＭＶを、
前記対象に投与することを含む、前記ワクチン組成物。
【請求項３５】
前記ブースティング組成物が、プライミング組成物として使用され、前記プライミング組成物が、ブースティング組成物として使用される、請求項３４に記載のワクチン組成物。
【請求項３６】
ＣＭＶタンパク質であるＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１、ｇＨおよびｇＬをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む１つまたはそれより多くのベクター。
【請求項３７】
前記ベクターが、細菌（例えば大腸菌）、酵母（例えばＳ．セレビジエ）、昆虫細胞および／または哺乳動物細胞における繁殖のためのエレメントを含有する、請求項３６に記載のベクター。
【請求項３８】
前記ベクターが、バキュロウイルスベクターまたはバキュロウイルスＢａｃＭａｍベクターである、請求項３６または３７に記載のベクター。
【請求項３９】
前記バキュロウイルスベクターにおいて、ｖ−ｃａｔｈおよび／またはＣｈｉＡ遺伝子が、機能的に破壊されている、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載のベクター。
（ａ）前記ＯＲＦが、前記ベクター中に５’から３’に以下の順番で配置されている、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載のベクター：
（ｂ）ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１；または
（ｃ）ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１、ｇＨ。
【請求項４０】
（ａ）（ｉ）において、ｇＨのＯＲＦは、３’方向で転写され、ｇＬのＯＲＦは５’方向で転写され、ＵＬ１２８のＯＲＦは３’方向で転写され、ＵＬ１３０のＯＲＦは３’方向で転写され、ＵＬ１３１のＯＲＦは３’方向で転写され；
（ｂ）（ｉ）において、ｇＨのＯＲＦは３’方向で転写され、ｇＬのＯＲＦは３’方向で転写され、ＵＬ１２８のＯＲＦは３’方向で転写され、ＵＬ１３０のＯＲＦは３’方向で転写され、ＵＬ１３１のＯＲＦは３’方向で転写され；
（ｃ）（ｉｉ）において、ｇＬのＯＲＦは５’方向で転写され、ＵＬ１２８のＯＲＦは３’方向で転写され、ＵＬ１３０のＯＲＦは３’方向で転写され、ＵＬ１３１のＯＲＦは３’方向で転写され、ｇＨのＯＲＦは３’方向で転写される、請求項３９に記載のベクター。
【請求項４１】
前記ＯＲＦのそれぞれが、ｐ１０プロモーター、ｐｏｌｈプロモーター、ＩＥ−１プロモーター、ｍＣＭＶプロモーター、ｖｐ３９プロモーター，ｌｅｆ２プロモーター、ＣＡＧプロモーター、またはＨｅｐＢ  ＳＶ４０プロモーター、およびそれに続いてターミネーター配列、例えばＨＳＶｔｋターミネーターまたはＳＶ４０ターミネーターによって駆動される、請求項３６〜４０のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項４２】
請求項３６〜４１のいずれか一項に記載のベクターおよび任意選択で医薬的に許容される担体またはアジュバントを含むワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
【背景技術】
【０００２】
[01]サイトメガロウイルスは、ヘルペスウイルス科またはヘルペスウイルスとして知られているウイルスファミリーのウイルスの属である。サイトメガロウイルスは、典型的にはＣＭＶと略記される。ヒトに感染する種は、一般的にはヒトＣＭＶ（ＨＣＭＶ）またはヒトヘルペスウイルス−５（ＨＨＶ−５）として知られており、全てのサイトメガロウイルスのなかでも最も研究されている種である。地方病性の感染は、すでに成人集団の約６０％および一部の国々では１００％に達している。感染は通常、免疫が正常な対象では無症状であるが、時には単核球増加症のような疾患を引き起こす可能性がある。感染は、生涯にわたる潜伏が確立される原因となり、潜伏は、再活性化により時々中断される場合がある。しかしながら、がんもしくは移植患者、新生児またはＨＩＶ患者などの免疫不全の対象の場合、ＣＭＶ感染は深刻な脅威であり、結果として死にも至る可能性がある。ＣＭＶは、宿主中で存続することが可能であり、これはなぜならウイルスゲノムは、ウイルス抗原のＭＨＣクラスＩ提示に干渉する複数のタンパク質をコードするためである。１種のウイルスタンパク質が、ペプチドの小胞体内腔への移動をブロックし、同時に他の２種のウイルスタンパク質が、ＭＨＣクラスＩタンパク質が細胞表面に到達する前にそれらの分解を引き起こす。
【０００３】
[02]現在の処置は、ガンシクロビル、フォスカーネット、アシクロビル、シドフォビルまたはレフルノミドなどの抗ウイルス剤を採用している。これらの薬剤は、移植患者や免疫不全患者には適する可能性があるものの、これらは、妊娠した女性には使用することができない。それに関して、高免疫グロブリン療法が好ましい。これまでに、従来技術において、弱毒化ワクチン、サブユニットタンパク質ワクチン、サブユニットウイルスベクターによってコードされたワクチンなどのワクチンを実現するために様々な試みがなされてきたが、利用可能なワクチンは未だない。
【０００４】
[03]サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）は、ヒト疾患の原因となる公知のウイルスのなかでも最も大きく最も複雑なウイルスである。２３５ｋｂのゲノムは、少なくとも１６５種のタンパク質をコードするが、ＣＭＶワクチンの調査では、自然感染中に細胞または体液性免疫応答に影響を及ぼす限られた数のウイルスタンパク質に焦点が当てられてきた。ｐｐ６５タンパク質は、細胞傷害性Ｔ細胞応答の主要な標的である。ｐｐ６５は、キャプシドとウイルスエンベロープとの間の外被内に配置されており、ＣＭＶビリオンにおいて最も豊富なタンパク質である。ＩＥ１タンパク質も、ビリオン中には存在しないが感染後に細胞中で豊富に発現される重要な細胞傷害性Ｔ細胞の標的である。宿主細胞への侵入を媒介する数種のグリコプロテイン複合体が、ビリオン表面でエンベロープ中に埋め込まれている。グリコプロテインＭおよびグリコプロテインＮで構成されるヘテロ二量体は、ヘパリンに結合することによって宿主細胞との相互作用を開始させると考えられている。グリコプロテインＨおよびグリコプロテインＬで構成される第二のヘテロ二量体（ｇＨ／ｇＬ）は、ウイルスエンベロープと標的細胞膜との融合を促進するグリコプロテインＢ（ｇＢ）のコンフォメーション変化の開始においてピークに達する受容体相互作用を媒介する可能性がある。ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１Ａで構成されるＣＭＶの五量体複合体は、上皮および内皮細胞への侵入を媒介する。これらの複合体はいずれも、中和抗体として知られている特別な抗体クラスと結合するエピトープを含有するため、体液性免疫にとって重要な標的である。ワクチン開発における全体的な目標は、ＣＭＶによる上皮／内皮細胞感染と線維芽細胞感染の両方に対して中和活性を誘導することである。
【０００５】
[04]目下、単純なペプチドまたはサブユニット；ｇＨ／ｇＬなどの組換えマルチサブユニット複合体、または完全な五量体複合体；天然五量体複合体、ｇＢ、ｐｐ６５、および他のウイルス抗原を含有する不活性化ＣＭＶビリオン；ワクチンの免疫原性と不活性化ワクチンの安全性とを組み合わせることができる、遺伝学的に機能しないＣＭＶを発現する天然五量体複合体；複製欠損ウイルスベクター（例えば、ｐｏｘ、アデノウイルス、アルファウイルス等）を発現するサブユニットまたはマルチサブユニット複合体；および上記のもののプライム／ブーストの組合せを包含する様々なワクチンアプローチが研究中である。
【０００６】
[05]魅力的なワクチン候補は、上皮および内皮細胞への侵入を媒介するＣＭＶ五量体複合体である。しかしながら、コンフォメーションおよび／またはマルチサブユニット依存性エピトープが五量体複合体の「中和エピトープ（epitome）」にどの程度の影響を及ぼすかは、不明確なままである。コンフォメーション的にその天然の状態の完全な五量体複合体を具体化する現実的な必要性が、１７種の五量体複合体特異的な中和抗体のうち１種を除いて全てがマルチサブユニット依存性エピトープを認識したという自然感染した対象から単離されたモノクローナル抗体の研究によって示唆されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
[06]従来技術において、ＣＭＶ五量体複合体、特定にはＨＣＭＶを提供するための多くの試みがなされたが、本発明者らの知見の限りでは、これまでに、安定な形態且つ十分な量で、加えて理想的には高い純度も有する五量体複合体を提供することができなかった。しかしながら、ワクチン提供のために、高純度で十分な量の、免疫応答を誘導するために免疫原性を有する安定な五量体複合体が必要とされている。したがって本発明の根底にある技術的な問題は、この必要性を満たすことである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
[07]本発明は、ＣＭＶ五量体複合体を生産するための新規の手段および方法を提供することによってこの問題を解決する。本発明は、特定には、五量体複合体は、昆虫細胞などの好適な宿主細胞中でバキュロウイルスベクターを使用して、高い収量で安定して発現させることができるという驚くべき発見に基づく。さらに本発明者らは、意外なことに、本発明の方法により得られた五量体複合体は、医薬および／またはワクチン組成物として特に有用であることを見出した。昆虫細胞で生産された組換えタンパク質は、免疫応答を調節する重要なパラメーターであるそれらの糖付加パターンの点でそれらの「天然の」対応物とは異なっているため、これは明らかに予想外であった。さらに、本発明者らは、高度に純粋で免疫原性の五量体複合体の大規模生産を可能にする発現系、特にバキュロウイルス系で生産された安定なＣＭＶ五量体複合体を提供することに初めて成功した。
【０００９】
概要（Summary）
[08]本発明者らは、安定な形態且つ高い収量および純度でＣＭＶ五量体複合体の生産を可能にする新しい手段および方法の確立の先駆けとなった。本発明者らは初めて、バキュロウイルスベクターを使用して大量にＣＭＶ五量体複合体のタンパク質成分を発現させ、機能的な五量体複合体の集合を観察した。
【００１０】
[09]したがって、第一の形態では、本発明は、ＣＭＶタンパク質であるＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１Ａ、ｇＨ（ＵＬ７５）およびｇＬ（ＵＬ１１５）で構成される五量体複合体であって、
（ｉ）バキュロウイルスを使用することによって、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１Ａ、ｇＨ（ＵＬ７５）およびｇＬ（ＵＬ１１５）を宿主細胞中で共発現させること；
（ｉｉ）前記共発現により得られた宿主細胞および／または上清から、五量体複合体を精製すること；および
（ｉｉｉ）任意選択で、精製された五量体複合体を、キレート剤および／または安定化剤を含む緩衝溶液中で貯蔵すること
を含む方法によって入手可能である、上記ＣＭＶタンパク質に関する。
【００１１】
[010]宿主細胞は、昆虫細胞または哺乳動物細胞であり得る。
[011]本発明の好ましい産生細胞株は、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｆ９−１（ＶＥ−１）、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｆ９−２（ＶＥ−２）、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｆ９−３（ＶＥ−３）、Ｈｉ−５、Ｍｉｍｉｃ  Ｓｆ９、Ｖａｎｋｙｒｉｎ、Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｓｆ＋、およびＳ２シュナイダー細胞などの昆虫細胞系であり、好ましくはＳｕｐｅｒ  Ｓｆ９−２である［オックスフォードエクスプレッションテクノロジーズ（Oxford Expression Technologies）、カタログ番号600103、およびFath-Goodinら（2006）、Adv. Virus Res. 68、75〜90；Kroemerら（2006）、J. Virol.80（24）、12291〜12228、およびＵＳ２００６０１３４７４３］。Ｓｕｐｅｒ  Ｓｆ−９細胞は、カンポレチス・ソノレンシス（Camoletis sonorensis）のイクノウイルス（ichnovirus）Ｐ−ｖａｎｋ−１タンパク質を安定して発現するように操作されている。哺乳動物細胞、特定にはヒト細胞での発現のために、例えばＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｆ、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＨＵＶＥＣ、ＨＵＡＥＣ、Ｈｕｈ７、ＨｅｐＧ２、ＢＨＫ、ＭＴ−２、Ｃｏｓ−７、Ｃｏｓ−１、Ｃ１２７、３Ｔ３、ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）、骨髄線維芽細胞、ボウズ（Bowes）黒色腫、初代神経細胞、または上皮細胞が使用される、
[012]共発現の工程は、感染時に細胞約２×１０６個／ｍＬの細胞数を有する前記宿主細胞を感染させる場合に、前記タンパク質を発現し、約１０７ｐｆｕ／ｍＬまたはそれより高い力価を有するバキュロウイルスで宿主細胞を感染させること；前記宿主細胞を好適な条件下で培養すること、および感染後５６から６５時間の間に前記宿主細胞および／または上清を回収することを包含していてもよい。
【００１２】
[013]宿主細胞、特定には昆虫細胞は、融解および培養の後、１５日目から５０日目の間、好ましくは１５日目から３０日目の間、好ましくは１８日目に感染させてもよい。
[014]精製は、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよび／またはアフィニティークロマトグラフィーを包含し得る。
【００１３】
[015]キレート剤は、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡであり得る。好ましくは、ＥＤＴＡは、２０ｍＭまたはそれ未満、例えば３ｍＭまたはそれ未満の濃度で前記緩衝溶液中に存在する。
【００１４】
[016]安定化剤は、ポリエチレングリコール、アルギニン、グリシン、ソルビトール、トレハロース、グリセロール、スクロース、グルコース、ＤＭＳＯ、ＴＭＡＯおよび／またはＮＰ−４０であり得る。
【００１５】
[017]さらに、緩衝溶液は、トリス緩衝液、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、および／またはＫＣｌを含んでいてもよい。
[018]ＣＭＶタンパク質であるＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１Ａ、ｇＨおよびｇＬをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、１つまたはそれより多くのベクターに、好ましくは単一のベクターに存在していてもよい。
【００１６】
[019]ベクターは、細菌（大腸菌（E. coli））、酵母（Ｓ．セレビジエ（S. cerevisiaer））、昆虫細胞および／または哺乳動物細胞における繁殖のためのエレメントを含有していてもよい。
【００１７】
[020]ＯＲＦは、前記ベクター中で５’から３’に以下の順番：
（ｉ）ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１；
または（ｉｉ）ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１、ｇＨ
で配置されていてもよい。
【００１８】
[021]好ましくは、
（ａ）（ｉ）において、ｇＨのＯＲＦは、３’方向で転写され、ｇＬのＯＲＦは５’方向で転写され、ＵＬ１２８のＯＲＦは３’方向で転写され、ＵＬ１３０のＯＲＦは３’方向で転写され、ＵＬ１３１ＡのＯＲＦは３’方向で転写され；
（ｂ）（ｉ）において、ｇＨのＯＲＦは３’方向で転写され、ｇＬのＯＲＦは３’方向で転写され、ＵＬ１２８のＯＲＦは３’方向で転写され、ＵＬ１３０のＯＲＦは３’方向で転写され、ＵＬ１３１ＡのＯＲＦは３’方向で転写され；
（ｃ）（ｉｉ）において、ｇＬのＯＲＦは５’方向で転写され、ＵＬ１２８のＯＲＦは３’方向で転写され、ＵＬ１３０のＯＲＦは３’方向で転写され、ＵＬ１３１ＡのＯＲＦは３’方向で転写され、ｇＨのＯＲＦは３’方向で転写される。
【００１９】
[022]前記ＯＲＦのそれぞれは、ｐ１０プロモーター、ｐｏｌｈプロモーター、ＩＥ−１プロモーター、ｍＣＭＶプロモーター、ｖｐ３９プロモーター、ｌｅｆ２プロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＨｅｐＢＳＶ４０プロモーターまたは本明細書で説明される他のあらゆるプロモーター、およびそれに続いてターミネーター配列、例えばＨＳＶｔｋターミネーターまたはＳＶ４０ターミネーターまたは本明細書で説明される他のあらゆるターミネーターによって駆動されてもよい。
【００２０】
[023]前記タンパク質の少なくとも１つはタグを含んでいてもよく、ここでタグは、Ｈｉｓ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−タグ、Ｈｉｓ−Ｓｔｒｅｐ−タグ、ＳｔｒｅｐＩＩ−タグ、Ｓｏｆｔａｇ  １、ＴＣ−タグ、ｍｙｃ−タグ、ＦＬＡＧ−タグ、ＨＡ−タグ、Ｖ５−タグ、Ａｖｉ−タグ、カルモジュリン−タグ、ポリグルタメート−タグ、アミロイドベータ−タグ、ＧＳＴ−タグ、ＭＢＰ−タグまたはＳ−タグであり得る。好ましくは、ｇＨタンパク質は、Ｈｉｓ−タグ、好ましくは８個のＨｉｓ残基を含むＨｉｓ−タグを備えている。
【００２１】
[024]前記タンパク質の１種またはそれより多くは、プレシジョン（PreScission）プロテアーゼまたはプレシジョンおよびＴＥＶプロテアーゼを含んでいてもよく、好ましくは、ｇＨおよび／またはｇＬタンパク質は、プレシジョンプロテアーゼまたはプレシジョンおよびＴＥＶプロテアーゼを含む。
【００２２】
[025]バキュロウイルス遺伝子ｖ−ｃａｔｈおよび／またはＣｈｉＡ活性は、機能的に破壊されていてもよい。
[026]本発明の五量体複合体はまた、組成物の形態であってもよい。
【００２３】
[027]本発明の五量体複合体はまた、上皮／内皮（Ｅｐｉ／ＥＣ）および線維芽細胞の感染を両方とも阻害する中和活性を誘導することも可能である。
[028]第二の形態では、本発明はまた、ＣＭＶタンパク質であるＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１Ａ、ｇＨ（ＵＬ７５）およびｇＬ（ＵＬ１１５）で構成される五量体複合体を生産するための方法であって、（ｉ）バキュロウイルスＣＭＶタンパク質であるＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１Ａ、ｇＨ（ＵＬ７５）およびｇＬ（ＵＬ１１５）を宿主細胞中で共発現させること；（ｉｉ）前記共発現により得られた宿主細胞および／または上清から、五量体複合体を精製すること；および（ｉｉｉ）任意選択で、精製された五量体複合体を、キレート剤および／または安定化剤を含む緩衝溶液中で貯蔵することを含む、上記方法も提供する。
【００２４】
[029]第三の形態では、本発明の五量体複合体または本発明の方法によって入手可能な五量体複合体および任意選択で医薬的に許容される担体またはアジュバントを含む、医薬組成物またはワクチン組成物が提供される。
【００２５】
[030]第四の形態では、本発明の五量体複合体において、前記タンパク質の少なくとも１種、２種、３種または４種は、残りのタンパク質が誘導されたＣＭＶ株以外のＣＭＶ株から誘導されてもよい。
【００２６】
ＣＭＶタンパク質は、以下のＣＭＶ株、すなわちＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋに受託番号ＦＪ６１６２８５．１で寄託されたゲノムを有するタウン（Towne）、トレド（Toledo）（ＧＵ９３７７４２．１）、ＡＤ１６９（ＦＪ５２７５６３）、マーリン（Merlin）（ＡＹ４４６８９４．２）、ＴＢ２０／Ｅ（ＫＦ２９７３３９．１）、ＶＲ１８１４（ＧＵ１７９２８９）から誘導されてもよい。Patroneら、J. Virol.、2005、79、8361〜8373によれば、２０４位のアミノ酸Ｙは、アミノ酸Ｆで置換されており、ＵＬ１３０の発現の主要な問題は、次のＯＲＦへのアミノ酸の拡張を引き起こす同じ位置におけるフレームシフトである。第五の形態では、本発明は、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋに受託番号ＦＪ６１６２８５．１で寄託されたゲノムを有し、ＵＬ１３０のＯＲＦのアミノ酸配列の２０４位にアミノ酸Ｆを有し、加えて結果として機能的なアミノ酸Ｙが生じるタウン実験株（ヒト包皮線維芽細胞で成長させた）の同じ位置におけるフレームシフトが修復された、改変ＣＭＶタウン株を提供する。
【００２７】
[031]単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」および「その（the）」は、本明細書で使用される場合、文脈上明らかに別段の指示がない限り複数形の対象物を包含することに留意されたい。したがって、例えば、「試薬（a reagent）」への言及は、そのような様々な試薬の１種またはそれより多くを包含し、「方法」への言及は、等価な工程や、改変できる、または本明細書で説明される方法と置換できる当業者公知の方法への言及を包含する。
【００２８】
[032]特に他の指定がない限り、一連の要素の前に付けられる用語「少なくとも」は、その一連の要素それぞれに対して言及されていると理解されるものとする。当業者であれば、本明細書で説明される本発明の具体的な実施態様の多くの等価物を理解しているか、または慣例的な実験のみを使用して確認できると予想される。このような等価物は、本発明に包含されることが意図される。
【００２９】
[033]用語「および／または」は、本明細書のどこで使用されていても、「および」、「または」および「前記用語で接続される要素の全てまたは他のあらゆる組合せ」の意味を包含する。
【００３０】
[034]用語「約」または「およそ」は、本明細書で使用される場合、所与の値または範囲の２０％以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内を意味する。しかしながらこれは、特定された数値も包含し、例えば約２０は、２０を包含する。
【００３１】
[035]用語「以下（less than）」または「以上（greater than）」は、特定された数値を包含する。例えば、２０以下は、それ未満かまたはそれに等しいことを意味する。同様に、以上（more than）、または以上（greater than）は、それぞれ〜より多くかまたはそれに等しい、または〜より大きいかまたはそれに等しいことを意味する。
【００３２】
[036]以下に記載される明細書および特許請求の範囲全体にわたって、文脈からそうでないことが求められない限り、言葉「含む（comprise）」、ならびに「含む（comprises）」および「含むこと」などの変化形は、述べられている整数もしくは工程または整数もしくは工程の群の包含を必然的に伴うが、他のあらゆる整数もしくは工程または整数もしくは工程の群を排除しないと理解されるものとする。用語「含む」は、本明細書で使用される場合、用語「含有する」または「包含する」で置き換えることができ、または本明細書で使用される場合、時には用語「有する」で置き換えることもできる。
【００３３】
[037]本明細書で使用される場合「からなる」は、特許請求の範囲の要素で特定されていない全ての要素、工程、または成分を排除する。「から本質的になる」は、本明細書で使用される場合、特許請求の範囲の基礎的な新規の特徴に著しく影響を与えない材料または工程を排除しない。
【００３４】
[038]本明細書におけるあらゆる場合において、用語「含む」、「本質的にからなる」および「からなる」のいずれも、他の２つの用語のいずれかで置き換えることができる。
[039]本発明は、本明細書で説明される特定の手法、プロトコール、材料、試薬、および物質などに限定されず、そのようなものとして変更が可能であることが理解されるものとする。本明細書において使用される用語は、特定の実施態様を説明することのみを目的とし、発明の範囲を限定することは意図されず、発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ定義される。
【００３５】
[040]本明細書の文章全体にわたり引用された全ての出版物および特許（全ての特許、特許出願、科学出版物、製造元の仕様書、説明書などを包含する）は、上に記載されているかまたは下に記載されているかにかかわらず、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。本発明が先行発明のためにこのような開示に先行する権利がないことの承認として解釈されないものとする。参照により組み入れられる資料が本明細書と矛盾するかまたは一致しない程度に、本明細書が全てのこのような資料に優先すると予想される。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１−１】図１は、ＣＭＶ五量体複合体および可溶性ＣＭＶタンパク質を発現させるための組換えベクターの概略図である。バキュロウイルス発現系（ＢＥＶＳ）を使用しており、２つのプロモーターＰ１およびＰ２（＜＿ｐ１０、＞＿ｐｏｌｈ）ならびにＳＶ４０およびＨＳＶｔｋである２つのターミネーター配列Ｔ１およびＴ２（Ｔ）を含有する組換えタンパク質発現を目的としたベクター骨格ｐＲＢＴ１３６に、様々なバリアントが挿入される。酵母における繁殖のために、ベクターは、複製起点（Ｏ）、例えば２ミクロン、およびマーカー遺伝子（ｍ）、例えばＵＲＡ３を含有する。さらにベクターは、トランスファーベクターからバクミドに導入遺伝子を転位させるためのトランスポゾン部位左（ＴＬ）および右（ＴＲ）、部位特異的な相同組換え（プラスミド融合）のためのｌｏｘＰ部位（Ｌ）、複製起点（Ｏ）、アンピシリン（Ａ）、クロラムフェニコール（Ｃ）およびゲンタマイシン（Ｇ）耐性遺伝子、ならびに規定された制限部位を含有する。バキュロウイルスを用いた形質導入または一過性発現のいずれかによる哺乳動物細胞での発現のために、ベクター骨格ｐＲＢＴ３９３は加えて、ｐＣＭＶ、ｉｅ１およびｌｅｆ２から選択されるプロモーター、ならびにＳＶ４０ｐＡ、ＢＨＧｐＡおよびＨＳＶｔｋから選択されるターミネーターを含有する。略語：ｃ：コンセンサス配列；Ｈ：Ｈｉｓ−タグ；ＳＨ：ストレプトアビジン−Ｈｉｓ−タグ；Ｖ：ＶＲ１８１４株、ｐｃＩ：プレシジョン（precission）プロテアーゼ、ｐｃＩＩ：プレシジョンおよびＴＥＶプロテアーゼ、ＤＴ：二量体化ツール、Ｔ：ターミネーター、Ｏ：複製起点、Ｇ：ゲンタマイシン耐性、Ｃ：クロラムフェニコール耐性、Ｌ：ｌｏｘＰ部位、ＴＬ：左側のトランスポゾン、ＴＲ：右側のトランスポゾン。
【図１−２】図１−１の説明と同じ。
【図１−３】図１−１の説明と同じ。
【図２Ａ】図２は、Ｈｉｓ−タグを有する可溶性ＣＭＶ五量体複合体のアフィニティークロマトグラフィー工程、それに続くサイズ排除クロマトグラフィーからなる精製プロセスの分析である。表面タンパク質ＵＬ７５（Ｈｉｓ−タグを有する、ｇＨ）−ＵＬ１１５（ｇＬ）−ＵＬ１２８−ＵＬ１３０−ＵＬ１３１Ａ（配列番号１８）を含む五量体複合体を、Ｈｉｓ−トラップカラム、それに続いてサイズ排除クロマトグラフィー（ＸＫ１６／６０スーパーデックス（Superdex）２００ｐｇ）を使用した親和性ベースのクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって精製した。（Ａ）２回目のＩＭＡＣ精製を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜１２％ビストリスゲル）、それに続くクーマシー染色によって分析した。タンパク質標準（レーン１）のサイズ（ｋＤａ）は、左側にマークされる。レーン２：１回目のＩＭＡＣのプール（２回目のＩＭＡＣプロセスのロード）、レーン３：通過画分、レーン４：洗浄液であり、レーン５〜１４は、イミダゾール濃度を５００ｍＭまで増加させた溶出画分を表す。
【図２Ｂ】（Ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜１２％ビストリスゲル）、それに続くクーマシー染色によるサイズ排除クロマトグラフィー精製の分析。タンパク質標準（レーン１）のサイズ（ｋＤａ）は、左側にマークされる。レーン１：溶出プールＩＶ−２、沈殿あり；レーン２：溶出プールＩＶ−２、沈殿なし；レーン３：溶出プールＩＶ−３；レーン４：溶出プールＶ；レーン５：溶出プールＶＩ；レーン６：サイズマーカー。五量体複合体のタンパク質（ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１Ａ）は矢印によって示される。
【図２Ｃ】（Ｃ）ｇＨのＨｉｓ−タグに対する抗体を使用した免疫ブロット。レーン１は、溶出プールＩＶ−２（沈殿あり）を表し、レーン２は、溶出プールＩＶ−２（沈殿なし）を表し、レーン３は、溶出プールＩＶ−３を表し、レーン４は、溶出プールＶを表し、レーン５は、溶出プールＶＩを表し、レーン６は、ポジティブコントロールを表す。Ｈｉｓ−タグを有するｇＨタンパク質は、右側にマークされる。
【図２Ｄ】（Ｄ）精製された可溶性ヒトＣＭＶ（ＨＣＭＶ）五量体複合体（配列番号１８）のクーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜１２％ビストリスゲル）（レーン６）。濃度測定分析によってタンパク質濃度を決定するために、様々な量のＢＳＡをローディングした（レーン２：０．１ｍｇ／ｍＬ；レーン３：０．２ｍｇ／ｍＬ；レーン４：０．３ｍｇ／ｍＬ；レーン５：０．５ｍｇ／ｍＬ）。タンパク質標準（レーン１）のサイズ（ｋＤａ）は、左側にマークされる。
【図２Ｅ】（Ｅ）表面タンパク質ＵＬ７５（Ｈｉｓ−タグを有する、ｇＨ）−ＵＬ１１５（ｇＬ）−ＵＬ１２８−ＵＬ１３０−ＵＬ１３１Ａ（配列番号１８）を含む五量体複合体を、Ｎｉ２＋を充填したカラム（スケールはバルクのサイズに依存する）を使用した１工程の親和性ベースのクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、それに続くＰＡＬＬマイクロセップ（macrosep）遠心デバイスでの濃縮、および２５ｍＭトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣＬ、ｐＨ６．５、０．２％Ｂｒｉｊ−３５を含有する貯蔵緩衝液に対する透析によって精製した。精製された可溶性複合体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜１２％ビストリスゲル）、それに続く様々な量のＢＳＡ（レーン２：０．１ｍｇ／ｍＬ；レーン３：０．２ｍｇ／ｍＬ；レーン４：０．３ｍｇ／ｍＬ；レーン５：０．５ｍｇ／ｍＬ；レーン６：精製された五量体複合体）に沿ったクーマシー染色および濃度測定分析によって分析した。タンパク質標準（レーン１）のサイズ（ｋＤａ）は、左側にマークされる。
【図３】図３は、配列番号１８に基づき体液性免疫応答を検証するための中和アッセイである。ヒトＣＭＶ血液ドナーおよびマウス血清の中和抗体力価の比較。２倍の連続希釈（１：２０から１：２５６０）での５つの陽性（グループＧ２、Ｄ６〜Ｄ１０）および５つの陰性（グループＧ１、Ｄ１〜Ｄ５）ＨＣＭＶ血液ドナーからの血清を、細胞ベースの蛍光中和アッセイに供した。五量体複合体（配列番号１８）で事前に免疫化した８匹のマウスから得られたプールされた血清の１：３２０希釈物と同じ阻害作用を与える血清希釈物（ｓ．ｄ．）が示される。マウスの免疫化に使用された抗原混合物中の１つの構成要素としての可溶性五量体複合体の別の分析から、ヒト血液ドナーと比較して中和抗体が誘導されたことが示された。ＰＲ：五量体での免疫前、ＰＯ：五量体での免疫後、Ｇ１：陰性の血液ドナー、Ｇ２：陽性の血液ドナー。
【図４】図４は、ワクチン候補としての可溶性複合体、配列番号１８の品質コントロールを示す。様々な量のイミダゾールで溶出させた画分が、ＩＭＡＣベースの精製に供した後に示される。それらをＵＬ７５（ｇＨ）およびｇＨ上のＨｉｓタグの存在に関して試験した。シグナル強度における類似性は、ｇＨの完全性、したがってＵＬ７５−ＵＬ１１５−ＵＬ１２８−ＵＬ３０−ＵＬ１３１Ａで構成される複合体全体の完全性を示す。１：ロード、２：通過画分、３：洗浄液、４：２５０ｍＭのイミダゾール、５〜８：３００ｍＭイミダゾール、９〜１３：３５０ｍＭのイミダゾール、１４：陽性対照、１５：陰性対照
【図５】図５は、コンフォメーション依存性抗体を使用した、ワクチン候補としての可溶性複合体、配列番号１８の品質コントロールである。複合体の様々な生産バッチを、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを用いて、指定されたタンパク質の共存に関して試験した。サンプルを抗ｇＨ１（ＵＬ７５）抗体で捕獲し、抗ｇＨ２および抗Ｈｉｓ、加えて抗ＵＬ１３０／１３１Ａおよび抗ＵＬ１３０コンフォメーション依存性（ＵＬ１３０／ＵＬ１３１Ａ）抗体で検出した。シグナルから、複合体中のタンパク質の共存、複合体の完全性、加えてその生産の再現性が確認される。１：バッチ４５１−プール１、２：バッチ４５９−プール２、３：バッチ４５９−プール１（１５ｍＭのＥＤＴＡ）、４：バッチ４５９−プール１（２０ｍＭのＥＤＴＡ）、５：バッチ４５８（１５ｍＭのＥＤＴＡ）、６：陽性対照、７：陰性対照、８：内部標準。
【図６】図６は、ＣＭＶのｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａタンパク質に関する参照アミノ酸配列である。ｇＨ（配列番号１）、ｇＬ（配列番号２）、ＵＬ１２８（配列番号３）、ＵＬ１３０（配列番号４）、ＵＬ１３１Ａ（配列番号５）。
【図７−１】図７は、配列番号１８および配列番号６７に基づく細胞性免疫応答の定性的な概要である。（Ａ）マウスの免疫化に使用される抗原に依存するＴｈ−１およびＴｈ−２応答を示すサイトカイン分泌の比較。
【図７−２】（Ｂ、Ｃ、Ｄ）脾臓細胞をＡＤ１６９ウイルス溶解産物で再度刺激し、一方でサイトカイン分泌を、マルチプレックスアッセイによって製造元のプロトコールに従い検証した。アジュバントがＩＬ−４分泌の増加をもたらしたが、アジュバントは、ＩＦＮ−ガンマまたはＩＬ−５分泌の刺激作用を有していなかった。サイトカイン分泌は、五量体複合体の用量依存性であり、投薬量が低い程有益であった。Ｐ１：五量体複合体（タウン株）；Ｐ２：五量体複合体（タウンおよびＶＲ１８１４株）；ａｄｊ：アジュバント；ＶＬＰ：ウイルス様粒子；ｇＢ：可溶性グリコプロテインｇＢ（ＵＬ５５）；ＢＶ：バキュロウイルス。
【図７−３】図７−１、７−２の説明と同じ。
【図８Ａ】図８は、配列番号１８および配列番号６７に基づき体液性免疫応答を検証するための中和アッセイである。ヒトＣＭＶ血液ドナーおよびマウス血清の中和抗体力価の比較。２倍の連続希釈（１：２０から１：２５６０）での５つの陽性（血清陽性）および５つの陰性（血清陰性）ＨＣＭＶ血液ドナーからの血清を、細胞ベースの蛍光中和アッセイに供した。ＶＬＰ、ｇＢおよびアジュバントと組み合せた五量体複合体（配列番号１８、配列番号６７）で事前に免疫化した８匹のマウスのうち４匹から得られたプールされた血清の１：１００希釈物と同じ阻害作用を与える血清希釈物（ｓ．ｄ．）が示される。マウスの免疫化に使用された抗原混合物中の１つの構成要素としての可溶性五量体複合体の別の分析から、血清陽性および血清陰性のヒト血液ドナーと比較して中和抗体が誘導されたことが示された。線維芽細胞（ＭＲＣ−５）および上皮細胞（ＡＲＰＥ−１９）の中和を、２種の異なるウイルス株、ＶＲ１８１４およびＴＢ４０Ｅ株を用いて調査した。Ｐ１：五量体複合体（タウン株）；Ｐ２：五量体複合体（タウンおよびＶＲ１８１４株）；ａｄｊ：アジュバント；ＶＬＰ：ウイルス様粒子；ｇＢ：可溶性グリコプロテインｇＢ（ＵＬ５５）；ＢＶ：バキュロウイルス；免疫前：免疫化される前；免疫：免疫化された後。
【図８Ｂ】図８Ａの説明と同じ。
【図８Ｃ】図８Ａの説明と同じ。
【図８Ｄ】図８Ａの説明と同じ。
【図９】図９は、Ｈｉｓ−タグを有する可溶性ＣＭＶ五量体複合体のアフィニティークロマトグラフィー工程、およびイオン交換クロマトグラフィーからなる精製プロセスの分析である。可溶性ヒトＣＭＶ（ＨＣＭＶ）五量体複合体（バッチＥ０７１３、レーン６およびバッチＥ０７１４、レーン７）のクーマシーブルー（シンプリーブルー（SimplyBlue）、インビトロジェン（Invitrogen））で染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥ、インビトロジェン）を、純度および濃度の濃度測定分析（ＩｍａｇｅＪソフトウェア）に使用した。図１で観察された３つのバンドは、ｇＨ−Ｈｉｓ、加えて共に移動するｇＬ／ＵＬ１３０およびＵＬ１２８／ＵＬ１３１Ａタンパク質（全て前のバッチで質量分析により同定された）を表す。３つのバンドの合計を、ＢＳＡ標準（濃度測定分析；ＩｍａｇｅＪソフトウェア）と比較した。濃度測定分析によってタンパク質濃度を決定するために、様々な量のＢＳＡをローディングした（レーン２：０．２ｍｇ／ｍＬ；レーン３：０．４ｍｇ／ｍＬ；レーン４：０．６ｍｇ／ｍＬ）。最終サンプル（レーン６および７）でのＨＣＭＶ五量体複合体の濃度を、それぞれＥ０７１３およびＥ０７１４について測定した。＊ＭＭ：プレジションプラスプロテイン（Precision Plus Protein）（商標）オールブルースタンダード（バイオ−ラッド（Bio-Rad）、番号１６１−０３７３、レーン１）。
【図１０】図１０は、配列番号１８に基づく精製された五量体複合体の特徴付けである。ＤＳＰプロセス（ＩＭＡＣ−ＡＥＸ−ＩＭＡＣ）の最後における生成物の同一性を直接のＥＬＩＳＡを介して確認した。α−ｇＨ−抗体（サンタクルズ（Santa Cruz）、ｓｃ−５８１１３）およびα−Ｈｉｓ−抗体（ＡｂＤセロテック（AbD Serotec）、ＭＣＡ１３９６）で複合体を検証し、α−マウス−ＨＲＰ抗体（セルシグナリング（Cell Signaling）、７０７６Ｓ）で検出した。シグナルから、ｇＨとタグの共存が確認され、それゆえに可溶性ＨＣＭＶ五量体複合体の完全性が指摘される。陰性対照（neg.ctrl.）は、目的の遺伝子が欠失したバキュロウイルスサンプルを反映している。
【図１１Ａ】図１１は、配列番号１８に基づく五量体複合体の収量に関する安定化剤の影響である。五量体複合体の安定度の検証は、緩衝液、ｐＨおよびＥＤＴＡなどの安定化試薬に関する。精製の後、様々な緩衝液およびｐＨと組み合せた安定化剤の影響を検証するために、以前のサーモフルオロ−シフトアッセイに基づく様々な緩衝液を用いた透析を行った。濃度測定分析によってタンパク質濃度を決定するために、様々な量のＢＳＡをローディングした（レーン１：０．２ｍｇ／ｍＬ；レーン２：０．４ｍｇ／ｍＬ；レーン３：０．６ｍｇ／ｍＬ）。様々な緩衝液で透析した後の上清およびペレット中に、ＨＣＭＶ五量体複合体が示された。レーン５：ＰＢＳ、２０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．０（上清）；レーン６：ＰＢＳ、２０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．０（ペレット）；レーン７：トリス、２０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４（上清）；レーン８：トリス、２０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４（ペレット）；レーン９：トリス、２０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．０（上清）；レーン１０：トリス、２０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．０（ペレット）；＊ＭＭ：プレジションプラスプロテイン（商標）オールブルースタンダード（バイオ−ラッド、番号１６１−０３７３、レーン４）。
【図１１Ｂ】（Ｂ、Ｃ）透析中の様々な量のＥＤＴＡの検証。１０ｍＭのＥＤＴＡの使用量から、生成物のおよそ半分が沈殿（ペレット）によって失われ、ＥＤＴＡの量を増加させると複合体が安定化されたことが明らかに示された。（Ｂ）少量のＥＤＴＡを用いた五量体複合体、レーン２：トリス、１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４（上清）；レーン３：トリス、１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４（ペレット）。
【図１１Ｃ】（Ｃ）濃度測定分析によってタンパク質濃度を決定するために、様々な量のＢＳＡをローディングした（レーン１：０．２ｍｇ／ｍＬ；レーン２：０．４ｍｇ／ｍＬ；レーン３：０．６ｍｇ／ｍＬ）。様々な緩衝液で透析した後の上清およびペレット中に、ＨＣＭＶ五量体複合体が示された。レーン５：トリス、２０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４（上清）；レーン６：トリス、２０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４（ペレット）；レーン７：トリス、１５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４（上清）；レーン８：トリス、１５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４（ペレット）；レーン９：トリス、２５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．０（ペレット）；レーン１０：トリス、２５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．０（上清）；＊ＭＭ：プレジションプラスプロテイン（商標）オールブルースタンダード（バイオ−ラッド、番号１６１−０３７３、レーン４）。１回目の透析工程に関して沈殿の作用が最小であった緩衝液は、トリス、２０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４のようである。
【図１２】図１２は、インビボでの研究に関するスケジュールである。用量の作用、五量体複合体バリアント、およびアジュバント含有または非含有のいずれかの様々なＣＭＶタンパク質との組合せを検証するために、さらなるインビボでの研究を行った。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
詳細な説明（Detailed Description）
[053]現在、ＣＭＶに対する免疫応答の予防的な中和を惹起する有力なＣＭＶ抗原を同定すること、および高い保護レベルを達成するＣＭＶワクチンを開発することが求められている。ＣＭＶの五量体のｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１Ａ複合体は、新規のＣＭＶワクチンを開発するための有望なツールである。しかしながら、五量体複合体の大規模生産は、非効率的なタンパク質発現系により妨げられてきた。本発明者らは、タンパク質成分を共発現するためにバキュロウイルス系を初めて使用し、インビボで免疫原性応答を惹起できる機能的な五量体複合体が構築されたことを報告した。
【００３８】
[054]したがって、第一の形態では、本発明は、ＣＭＶタンパク質であるＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１Ａ、ｇＨ（ＵＬ７５）およびｇＬ（ＵＬ１１５）で構成される五量体複合体であって、
（ｉ）バキュロウイルスを使用することによって、ＣＭＶタンパク質であるＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１ａ、ｇＨ（ＵＬ７５）およびｇＬ（ＵＬ１１５）を宿主細胞中で共発現させること；
（ｉｉ）前記共発現により得られた宿主細胞および／または上清から、五量体複合体を精製すること；および
（ｉｉｉ）任意選択で、精製された五量体複合体を、キレート剤および／または安定化剤を含む緩衝溶液中で貯蔵すること
を含む本方法によって入手可能である、上記五量体複合体を提供する。
【００３９】
[055]用語「ＣＭＶ」は、ヘルペスウイルス科またはヘルペスウイルスのウイルス属であるサイトメガロウイルスを指す。一般的に、この用語は、とりわけヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）を含むＣＭＶの全ての種を包含し、ヒトサイトメガロウイルスはまた、ヒトヘルペスウイルス５（ＨＨＶ−５）、チンパンジーサイトメガロウイルス（ＣＣＭＶ）、サルサイトメガロウイルス（ＳＣＣＭＶ）およびアカゲザルサイトメガロウイルス（ＲｈＣＭＶ）としても知られている。好ましくは、本発明に係るＣＭＶは、ＨＣＭＶである。多数のＨＣＭＶ株が公知であり、例えば、これらに限定されないが、ＴＲ、タウン、ＡＤ１６９、トレド、マーリン、ＴＢ４０、デービスなどが挙げられる。
【００４０】
[056]典型的には、ＣＭＶは、少なくとも５個のキャプシドタンパク質（ＵＬ４６、ＵＬ４８Ａ、ＵＬ８５、ＵＬ８６、ＵＬ１０４の遺伝子産物）、１９個の調節タンパク質、１７個の外被タンパク質（ＵＬ２５、ＵＬ４５、ＵＬ４７、ＵＬ４８、ＵＬ６９、ＵＬ７１、ＵＬ７２、ＵＬ７６、ＵＬ７７、ＵＬ８３［ｐｐ６５］、ＵＬ８８、ＵＬ９３、ＵＬ９４、ＵＬ９５、ＵＬ９７、ＵＬ９９、ＵＬ１０３の遺伝子産物）、５個の表面またはエンベロープタンパク質（ＵＬ５５［ｇＢ］、ＵＬ７３［ｇＮ］、Ｕ７４［ｇＯ］、ＵＬ７５［ｇＨ］、ＵＬ１００［ｇＭ］、ＵＬ１１５［ｇＬ］の遺伝子産物）、オープンリーディングフレームＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１Ａからの未分類の遺伝子産物；１５個のベータ−ヘルペスウイルス特異的な遺伝子からのタンパク質（ＵＬ２３、ＵＬ２４、ＵＬ３２、ＵＬ３３、ＵＬ３５、ＵＬ３６、ＵＬ３８、ＵＬ４３、ＵＬ７４［ｇＯ］、ＵＬ７８、ＵＬ８２、ＵＬ９６、ＩＲＳ１、ＵＳ２２、ＴＲＳ１）およびオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）からのいわゆる機能性タンパク質、ＵＬ５０、ＵＬ８０．５を含む。
【００４１】
[057]用語「五量体複合体」は、本明細書では「複合体」のようにその短縮形でも使用されるが、標的細胞、特定には内皮、上皮および線維芽細胞へのウイルス侵入を容易にすると考えられる５種のＣＭＶタンパク質であるＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１Ａ、ｇＨ（ＵＬ７５）およびｇＬ（ＵＬ１１５）を含むタンパク質複合体を指す。五量体複合体およびそのタンパク質−タンパク質相互作用のモデルが、Ryckmann BJ らJ Virol. 2008；82（1）：60〜70によって提唱されてきた。本発明の五量体複合体において、ｇＨ、ｇＬおよびｐＵＬ１２８は、典型的にはジスルフィド結合を介して連結されると考えられ、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａは、典型的には、非共有結合の相互作用によって五量体複合体に取り込まれる（および／または五量体複合体と相互連結される）。五量体複合体の化学量論は、１：１：１：１：１と推定される（Ryckmann BJら、J Virol.2008；82（1）：60〜70）。好ましくは、本発明の五量体複合体は、インビボで免疫学的にＣＭＶビリオンと交差反応する抗体を惹起することができる。五量体複合体は、好ましくは可溶性である。しかしながら、本発明の五量体複合体はまた、膜に結合した形態であってもよいが、これはそれほど好ましくない。溶解性は、好ましくはｇＨの膜貫通ドメインを欠失させることによって達成される。用語「〜で構成される」は、本発明の五量体複合体の文脈で使用される場合、五量体複合体は、本明細書で説明されるような５種のタンパク質、すなわちｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａを包含し／含み、加えて、さらなるＣＭＶタンパク質を包含し得ることを意味する。しかしながら、好ましくは、五量体複合体は、５種のＣＭＶタンパク質、すなわちｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａのみを含有する。本発明の五量体複合体は、組成物の形態であってもよい。したがって、１種またはそれより多くの追加の薬剤が五量体複合体に添加されるかまたはそれと混合されることにより、結果として組成物がもたらされる。このような追加の薬剤、例えば緩衝液、キレート剤および／または安定化剤が本明細書で説明される。好適な組成物が本明細書でさらに説明される。
【００４２】
[058]本発明の五量体複合体において、タンパク質の１種またはそれより多くは、追加のＢおよび／またはＴ細胞エピトープを含んでいてもよい。前記Ｔ細胞エピトープは、ＣＤ４Ｔ細胞エピトープまたはＣＤ８Ｔ細胞エピトープであってもよい。好ましくは、前記エピトープは、配列番号２２〜６６に示されるエピトープのいずれか１つである。
【００４３】
[059]「エピトープ」は、免疫系、例えばＢ細胞またはＴ細胞によって認識される抗原の一部である。この用語は、コンフォメーショナルエピトープとリニア（または連続）エピトープの両方を包含する。コンフォメーショナルエピトープは、抗原のアミノ酸配列の不連続なセクションを含むが、それに対してリニアエピトープは、抗原のアミノ酸配列の連続的なセクションで構成される。この用語はさらに、クリプトトープおよびネオトープ（neotope）を包含する。「クリプトトープ」は、天然に存在する抗原、例えばウイルス中に隠れているが、抗原がその天然のコンフォメーションで存在していない場合に接近可能になり得るエピトープである。「ネオトープ」は、タンパク質単量体では見出されないがタンパク質の４次構造でのみで見出されるエピトープである。
【００４４】
[060]追加のエピトープが、五量体複合体の１つまたはそれより多くのタンパク質成分のアミノ酸配列に融合され得ることが想定される。本発明の複合体の望ましいタンパク質成分へのアミノ酸配列の融合は、当業者周知の遺伝子操作の標準的な方法によって達成することができる。
【００４５】
[061]本発明によれば、エピトープは、Ｂ細胞および／またはＴ細胞エピトープであってもよい。
[062]Ｂ細胞エピトープは、特定の膜結合型Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）または抗体のいずれかによって認識される抗原（例えば、天然タンパク質）の領域である。Ｂ細胞エピトープを同定または選択するのに多数の方法が容易に利用することができ、このような方法としては、Ｘ線結晶学、アレイベースのオリゴペプチドスキャニング、部位特異的変異誘発、変異誘発マッピング、およびファージディスプレイ、加えてSunら、Comput Math Methods Med.2013；2013：943636によって概説されているようなコンピューターによる方法が挙げられる。例えば、好適な方法としては、構造ベースの予測モデルが挙げられ、これは、幾何学的な特性および特異的な物理化学的特性などの抗原およびエピトープに関連する傾向性スケールの３次元構造に頼っている。構造ベースのアルゴリズムおよびウェブサーバー（プログラム）としては、例えば、ＥＰＳＶＲおよびＥＰＭｅｔａ（http：//sysbio.unl.edu/services/）、ＥＰＣＥＳ（http：//sysbio.unl.edu/services/EPCES/）、およびＥｐｉｔｏｐｉａ（http：//epitopia.tau.ac.il/）が挙げられる。ミモトープベースの予測方法は、入力値として抗体親和性により選択されたペプチドと抗原の３次元構造の両方を必要とするコンビナトリアル方法である。ミモトープベースの予測モデルに基づく例示的なアルゴリズムおよびプログラムとしては、例えば、ＭｉｍｏＰｒｏ（http：//informatics.nenu.edu.cn/MimoPro）、ＰｅｐＳｕｒｆ（http：//pepitope.tau.ac.il）およびＥｐｉＳｅａｒｃｈ（http：//curie.utmb.edu/episearch.html）が挙げられる。さらに、Sunら、Comput Math Methods Med.2013；2013：943636で概説されているように、例えばＢＥＳＴおよびＺｈａｎｇの方法などの抗原の一次配列のみに頼る配列ベースの予測モデルが利用可能である。加えて、例えばＰｒｏＭａｔｅ、ＣｏｎＳｕｒｆ、ＰＩＮＵＰ、およびＰＩＥＲなどの、抗原と抗体の相互作用であるタンパク質−タンパク質相互作用の結合部位予測に的を絞った方法を推論する結合部位予測モデルを使用することができる。
【００４６】
[063]具体的な理論に縛られることは望まないが、本発明の複合体における１つまたはそれより多くのＢ細胞エピトープの存在は、好ましくは、例えばＢ細胞の活性化および／または分化をもたらし、例えば中和抗体の生成をもたらし得る免疫原性応答を惹起するＢ細胞への免疫刺激作用を有することが想定される。Ｂ細胞は、エピトープの免疫を刺激する可能性を決定するための当業界において公知の標準的なプロトコールに従って様々な方法で試験することができる。好適なアッセイとしては、リンパ球増殖アッセイ、特異的Ｔ細胞で誘導された活性化マーカーの検出、ＥＬＩｓｐｏｔ、細胞質内サイトカイン染色（ＩＣＳ）、およびサイトカイン分泌が挙げられる。
【００４７】
[064]Ｔ細胞エピトープは、典型的にはプロセシングされたタンパク質抗原から誘導される。本発明の内容において、Ｔ細胞エピトープは、ＣＤ４−Ｔ細胞エピトープまたはＣＤ８Ｔ細胞エピトープであり得る。細胞毒性（ＣＤ８）Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子によってディスプレイされた細胞内ペプチド（ＣＤ８Ｔ細胞エピトープ）を認識するが、Ｔヘルパー細胞は、細胞外空間から取り込まれてＭＨＣクラスＩＩ分子によってディスプレイされたペプチド（ＣＤ４Ｔ細胞エピトープ）を認識する。ペプチド：ＭＨＣ複合体（ｐＭＨＣ）はＴ細胞受容体と相互作用し、その活性化とそれに続く細胞性免疫応答の誘導をもたらす。
【００４８】
[065]Ｔ細胞エピトープ予測および／または選択のための多数のインシリコ方法が利用可能である。ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ予測の場合、Larsenら、BMC Bioinformatics 2007、8：424で概説されているように、ＮｅｔＣＴＬ−１．２（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/）、ＥｐｉＪｅｎ（http：//www.ddg-pharmfac.net/epijen/EpiJen/EpiJen.htm）、またはＭＡＰＰＰ（http：//www.mpiib-berlin.mpg.de/MAPPP/）を使用することができる。ＣＤ４＋Ｔ細胞の場合、エピトープ予測のためのコンピューターによるモデルは、OyarzunPら、BMC Bioinformatics 2013、14：52によって概説されており、例えば、結合モチーフを同定するのにペプチド配列の比較を頼るデータ駆動型の方法、例えばＲａｎｋｐｅｐ（http：//imed.med.ucm.es/Tools/rankpep.html）、ＴＥＰＩＴＯＰＥ、およびＮＮ−ａｌｉｇｎ（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NNAlign/）、加えて、結合エネルギーを推測するために分子モデリングの計算を行うことにより実験上の結合データへの非依存性をもたらす構造ベースの方法、例えばＮｅｔＭＨＣＩＩＰａｎ−２．０（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCIIpan-2.0/）、ＴＥＰＩＴＯＰＥｐａｎ（http：//www.biokdd.fudan.edu.cn/Service/TEPITOPEpan/）、およびＰｒｅｄｉｖａｃ（http：//predivac.biosci.uq.edu.au/）が挙げられる。
【００４９】
[066]具体的な理論に縛られることは望まないが、本発明の複合体における１つまたはそれより多くのＴ細胞エピトープの存在は、好ましくは、例えばＴ細胞の活性化および／または分化をもたらし、好ましくは免疫原性応答を惹起するＴ細胞への免疫刺激作用を有することが想定される。Ｔ細胞に対するエピトープの免疫を刺激する可能性を決定するための好適なとしては、ＭＨＣペプチド多量体アッセイ、固相ＭＨＣ−ペプチド複合体アッセイ、リンパ球増殖アッセイ、特異的なＴ細胞で誘導された活性化マーカーの検出、ＥＬＩｓｐｏｔ、細胞質内サイトカイン染色（ＩＣＳ）、サイトカイン分泌および細胞表面捕獲（ＣＳＣ）、ならびにLi Pira Gら、J Biomed Biotechnol. 2010；2010：325720で概説されているようなサイトカイン分泌およびウェル表面捕獲（Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ）が挙げられる。
【００５０】
[067]本明細書で説明されるような五量体複合体の代替として、他のＣＭＶ複合体が本発明の手段および方法によって生産され、したがって本発明の形態および実施態様で適用されることも想定される。例えば、ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａの２、３または４つで構成される複合体を生産することが想定される。二量体複合体の好ましい例は、ｇＨとｇＬまたはＵＬ１３０とＵＬ１３１Ａの複合体である。五量体複合体の代替物の別の好ましい例は、ｇＨ／ｇＬ／ｇＯの三量体複合体である。したがって、五量体複合体に関連する本明細書で説明される全ての形態および実施態様は、必要な変更を加えれば、前に記載した二量体または三量体複合体に十分適用可能である。本明細書で説明される他のＣＭＶ複合体は、追加のＢおよび／またはＴ細胞エピトープを含み得ることも想定される。前記Ｔ細胞エピトープは、本明細書で説明されるようなＣＤ４Ｔ細胞エピトープまたはＣＤ８Ｔ細胞エピトープであってもよい。
【００５１】
[068]本発明の複合体は、好ましくは、単離した形態で調製され使用される。用語「単離した」は、本明細書で使用される場合、その天然環境から取り出されていることを意味する。したがって、「単離した五量体複合体」または「単離した複合体」は、好ましくは、ＣＭＶ感染細胞表面上または感染性ＣＭＶビリオン内のＣＭＶ膜タンパク質複合体を包含しない。
【００５２】
[069]用語「ｇＨ」は、本明細書で使用される場合、時には「ＵＬ７５」または「ｐＵＬ７５」と称される場合もある。これらの用語のそれぞれは他のものと置き換えることができることから、これらの用語は同義的に使用される。用語「ｇＨ」は、配列番号１に示される参照配列と比べて突然変異を有するｇＨポリペプチドを包含し、さらに、本明細書で説明されるような配列番号１に示されるアミノ酸配列と所定の程度の同一性を共有するアミノ酸配列を有するポリペプチドも包含する。前記用語はまた、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、または７００個のアミノ酸の長さを有するｇＨポリペプチドのフラグメントも包含し、それによって前記フラグメントは、好ましくは、本明細書で説明されるように他の４つのタンパク質と五量体複合体を形成することことが可能である。好ましいｇＨポリペプチドは、膜貫通ドメイン（ＴＭ）を欠失している。ＴＭドメインの非存在は、この改変されたポリペプチドが脂質二重層内に存在できないことを意味する。一部の実施態様において、ｇＨポリペプチドは、全長天然ＴＭドメインを欠失しており、他の実施態様において、ｇＨポリペプチドは、天然ＴＭドメインの一部を保持していてもよいが、脂質二重層中にタンパク質を存在させるには不十分な程度である。したがってポリペプチドは、天然ｇＨのＴＭドメインの最大１０個のアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸）を含有していてもよい。ＴＭドメインの一部または全部が欠失していることに加えて、ポリペプチドはまた、ＣＭＶのｇＨの天然Ｃ末端ドメインを欠失していてもよいし、またはＣ末端ドメインの一部を欠失していてもよい。
【００５３】
[070]ｇＨの細胞外ドメインは、疎水性膜貫通ドメイン（ＴＭ）を欠失しているｇＨの一部に対応する。細胞外ドメイン、シグナル配列およびＴＭドメインの配置および長さは、所与のｇＨタンパク質配列の長さに沿った疎水性のコンピューター分析に基づき予測することができる。シグナル配列およびＴＭドメインは、最大レベルの疎水性を有し、これらの２つの領域は、それより低い疎水性を有する細胞外ドメインの両側にある。
【００５４】
[071]用語「ｇＬ」は、本明細書で使用される場合、時には「ＵＬ１１５」または「ｐＵＬ１１５」と称される場合もある。これらの用語のそれぞれは他のものと置き換えることができることから、これらの用語は同義的に使用される。用語「ｇＬ」は、配列番号２に示される参照配列と比べて突然変異を有するｇＬポリペプチドを包含し、さらに、本明細書で説明されるような配列番号２に示されるアミノ酸配列と所定の程度の同一性を共有するアミノ酸配列を有するポリペプチドも包含する。前記用語はまた、５０、１００、１５０、２００、または２５０個のアミノ酸の長さを有するｇＬポリペプチドのフラグメントも包含し、それによって前記フラグメントは、好ましくは、本明細書で説明されるように他の４つのタンパク質と五量体複合体を形成することことが可能である。
【００５５】
[072]用語「ＵＬ１２８」は、本明細書で使用される場合、時には「ｐＵＬ１２８」と称される場合もある。これらの用語のそれぞれは他のものと置き換えることができることから、これらの用語は同義的に使用される。用語「ＵＬ１２８」は、配列番号３に示される参照配列と比べて突然変異を有するＵＬ１２８ポリペプチドを包含し、さらに、本明細書で説明されるような配列番号３に示されるアミノ酸配列と所定の程度の同一性を共有するアミノ酸配列を有するポリペプチドも包含する。前記用語はまた、５０、１００、または１５０個のアミノ酸の長さを有するＵＬ１２８ポリペプチドのフラグメントも包含し、それによって前記フラグメントは、好ましくは、本明細書で説明されるように他の４つのタンパク質と五量体複合体を形成することことが可能である。
【００５６】
[073]用語「ＵＬ１３０」は、本明細書で使用される場合、時には「ｐＵＬ１３０」、または「ＵＬ１３０Ａ」と称される場合もある。これらの用語のそれぞれは他のものと置き換えることができることから、これらの用語は同義的に使用される。用語「ＵＬ１３０」は、配列番号４に示される参照配列と比べて突然変異を有するＵＬ１３０ポリペプチドを包含し、さらに、本明細書で説明されるような配列番号４に示されるアミノ酸配列と所定の程度の同一性を共有するアミノ酸配列を有するポリペプチドも包含する。前記用語はまた、５０、１００、１５０、または２００個のアミノ酸の長さを有するＵＬ１３０ポリペプチドのフラグメントも包含し、それによって前記フラグメントは、好ましくは、本明細書で説明されるように他の４つのタンパク質と五量体複合体を形成することことが可能である。
【００５７】
[074]用語「ＵＬ１３１Ａ」は、本明細書で使用される場合、時には「ｐＵＬ１３１Ａ」、「ＵＬ１３１」または「ｐＵＬ１３１」と称される場合もある。これらの用語のそれぞれは他のものと置き換えることができることから、これらの用語は同義的に使用される。用語「ＵＬ１３１ａ」は、配列番号５に示される参照配列と比べて突然変異を有するＵＬ１３１Ａポリペプチドを包含し、さらに、本明細書で説明されるような配列番号５に示されるアミノ酸配列と所定の程度の同一性を共有するアミノ酸配列を有するポリペプチドも包含する。前記用語はまた、５０、または１００個のアミノ酸の長さを有するＵＬ１３１Ａポリペプチドのフラグメントも包含し、それによって前記フラグメントは、好ましくは、本明細書で説明されるように他の４つのタンパク質と五量体複合体を形成することことが可能である。
【００５８】
[075]述べられているように、本発明の各タンパク質、特定には、ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０およびＵＬ１３１Ａそれぞれ、またはそれらのフラグメントは、これらの突然変異が抗原としてのタンパク質の使用にとって有害ではない限り、特定には、少なくとも五量体複合体に結合できる抗体および／または前記五量体複合体の生物学的作用を中和できる抗体の生産を惹起することができる１つまたはそれより多くのエピトープをそれらが保持する限りは、配列番号１（ｇＨ）、配列番号２（ｇＬ）、配列番号３（ＵＬ１２８）、配列番号４（ＵＬ１３０）、および配列番号５（ＵＬ１３１Ａ）それぞれに示される参照配列と比べて、突然変異、例えば挿入、欠失および置換を含有していてもよい。加えて、このような突然変異は、本発明の五量体複合体を形成するタンパク質の能力を妨害しないものであるべきである。本発明の五量体複合体を形成する能力は、タンパク質精製を行い、例えば非還元ＰＡＧＥ、ウェスタンブロットおよび／またはサイズ排除クロマトグラフィーによってタンパク質を分析することによって試験することができる。特定には、各タンパク質は、例えば、検出、精製を容易にする、および／または溶解性を強化する可能性があるタグを含んでいてもよい。本発明に従って使用することができる例示的なタグとしては、Ｈｉｓ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−タグ、Ｈｉｓ−Ｓｔｒｅｐ−タグ、ＳｔｒｅｐＩＩ−タグ、Ｓｏｆｔａｇ  １、ＴＣ−タグ、ｍｙｃ−タグ、ＦＬＡＧ−タグ、ＨＡ−タグ、Ｖ５−タグ、Ａｖｉ−タグ、カルモジュリン−タグ、ポリグルタメート−タグ、アミロイドベータ−タグ、ＧＳＴ−タグ、ＭＢＰ−タグまたはＳ−タグが挙げられ、好ましくはＨｉｓ−タグである。Ｈｉｓ−タグは、６または８個のＨｉｓ残基で構成されていてもよく、好ましくは８個のＨｉｓ残基である。またタンパク質は、それらの成熟型にトランケートおよび／またはプロセシングされていてもよく、例えば、タンパク質は、それらの天然型および／または膜貫通ドメイン中に存在するシグナル配列を欠失していてもよい。
【００５９】
[076]前述したように、本発明のｇＨタンパク質またはそれらのフラグメントは、配列番号１への様々な程度の同一性を有していてもよく、例えば少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％が、配列番号１に列挙された配列に同一である。好ましいｇＨタンパク質は、（ｉ）ＣＭＶのｇＬと二量体化することができ；（ｉｉ）三量体ｇＨ／ｇＬ／ｇＯ複合体の一部を形成することができ；（ｉｉｉ）五量体ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１Ａ複合体の一部を形成することができ；（ｉｖ）膜貫通ドメインを欠失していてもよく；および／または（ｉｖ）インビボで免疫学的にＣＭＶビリオンと交差反応する抗体を惹起することができる。
【００６０】
[077]前述したように、本発明のｇＬタンパク質またはそれらのフラグメントは、配列番号２への様々な程度の同一性を有していてもよく、例えば少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％が、配列番号２に列挙された配列に同一である。好ましいｇＬタンパク質は、（ｉ）ＣＭＶのｇＨと二量体化することができ；（ｉｉ）三量体ｇＨ／ｇＬ／ｇＯ複合体の一部を形成することができ；（ｉｉｉ）五量体ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１Ａ複合体の一部を形成することができ；および／または（ｉｖ）インビボで免疫学的にＣＭＶビリオンと交差反応する抗体を惹起することができる。
【００６１】
[078]前述したように、本発明のＵＬ１２８タンパク質またはそれらのフラグメントは、配列番号３への様々な程度の同一性を有していてもよく、例えば少なくとも６０％、７０％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％が、配列番号３に列挙された配列に同一である。好ましいＵＬ１２８タンパク質は、（ｉ）五量体ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１Ａ複合体の一部を形成することができ、および／または（ｉｉ）インビボで免疫学的にＣＭＶビリオンと交差反応する抗体を惹起することができる。
【００６２】
[079]前述したように、本発明のＵＬ１３０タンパク質またはそれらのフラグメントは、配列番号４への様々な程度の同一性を有していてもよく、例えば少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％が、配列番号４に列挙された配列に同一である。好ましいｐＵＬ１３０タンパク質は、（ｉ）五量体ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１複合体を形成することができ；および／または（ｉｉ）インビボで免疫学的にＣＭＶビリオンと交差反応する抗体を惹起することができる。
【００６３】
[080]前述したように、本発明のＵＬ１３１Ａタンパク質またはそれらのフラグメントは、配列番号５への様々な程度の同一性を有していてもよく、例えば少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％が、配列番号５に列挙された配列に同一である。好ましいＵＬ１３１Ａタンパク質は、（ｉ）五量体ｇＨ／ｇＬ／ｐＵＬ１２８／ｐＵＬ１３０／ｐＵＬ１３１Ａ複合体を形成することができ、および／または（ｉｉ）インビボで免疫学的にＣＭＶビリオンと交差反応する抗体を惹起することができる。
【００６４】
[081]「配列同一性」または「％同一性」は、標準化したアルゴリズムを使用して並べられた少なくとも２つのポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の残基のマッチングのパーセンテージを指す。このようなアルゴリズムは、２つの配列間のアライメントを最適化することによって２つの配列のより有意義な比較を達成するために、標準化され再現可能な方法で比較される配列中にギャップを挿入する場合がある。本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列またはヌクレオチド間の配列同一性は、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴプログラムバージョン２．２．２９（２０１４年１月６日）（Altschulら、Nucleic Acids Res.（1997）25：3389〜3402）を使用して決定される。２つのアミノ酸配列の配列同一性は、以下のパラメーターに設定されたｂｌａｓｔｐを用いて決定することができる：マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２、文字サイズ：３；期待値：１０；ギャップコスト：存在＝１１、伸長＝１；フィルター＝低複雑度、活性化；フィルターストリング：Ｌ；組成調整：条件付きの組成スコアマトリックス調整。本発明の目的のために、２つのヌクレオチド配列間の配列同一性は、以下の例示的なパラメーターに設定されたｂｌａｓｔｎと共にＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴプログラムバージョン２．２．２９（２０１４年１月６日）を使用して決定される：文字サイズ：１１；期待値：１０；ギャップコスト：存在＝５、伸長＝２；フィルター＝低複雑度、活性化；マッチ／ミスマッチスコア：２、−３；フィルターストリング：Ｌ；ｍ。
【００６５】
[082]用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、同義的に使用される。用語「ポリペプチド」は、２個またはそれより多くのアミノ酸、典型的には少なくとも３個、好ましくは少なくとも２０個、より好ましくは少なくとも３０個、例えば少なくとも５０個のアミノ酸を含有するタンパク質またはペプチドを指す。したがって、ポリペプチドはアミノ酸配列を含み、したがって時にはアミノ酸配列を含むポリペプチドは、本明細書では「ポリペプチド配列を含むポリペプチド」と称される。したがって、本明細書において用語「ポリペプチド配列」は、用語「アミノ酸配列」と同義的に使用される。
【００６６】
[083]用語「アミノ酸」または「ａａ」は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、加えて天然に存在するアミノ酸と類似の方式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝子コードによってコードされたものであり、加えて後で修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、およびＯ−ホスホセリンでもある。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ、すなわち炭素が水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基と結合している基礎的な化学構造を有する化合物を指し、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムである。このような類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基礎的な化学構造を保持する。アミノ酸模倣物は、アミノ酸の一般的な化学構造と異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と類似の方式で機能する化学物質を指す。
【００６７】
[084]本発明はまた、本明細書で説明されるようなｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０および／またはＵＬ１３１Ａタンパク質またはフラグメントをコードする核酸分子も提供する。これらの核酸分子は、例えば、前記タンパク質の１種またはそれより多くを発現する場合に使用されるか、または例えばワクチン接種用のもののような、核酸分子として使用される。前記タンパク質の１種またはそれより多くを発現する目的のために、それらは、一般的に公知であり本明細書で説明されるベクターにクローニングされる。
【００６８】
共発現（Co-expression）の工程
[085]「共発現」は、バキュロウイルス、例えば、バキュロウイルス発現系またはＢａｃＭａｍ発現系を使用することによって、宿主細胞、好ましくは昆虫細胞または哺乳動物細胞中で１種またはそれより多くのＣＭＶタンパク質が発現されることについて使用される用語である。「発現ベクター」は、本明細書では、遺伝物質を発現させることができる標的宿主細胞に遺伝物質を移動させるのに使用される運搬手段と定義される。特定には、バキュロウイルス発現系でＣＭＶタンパク質を発現させることが想定される。「発現系」は、宿主細胞中での外来遺伝子発現を可能にするコンテクストを提供する、発現ベクターおよびベクターのための宿主細胞の組合せである。
【００６９】
[086]本発明の複合体は、一時的に発現させてもよいし、または安定して発現させてもよい。
[087]バキュロウイルスは、主として昆虫で見出された棒状の二本鎖ＤＮＡウイルスである。
【００７０】
[088]バキュロウイルス発現系は、典型的には、例えば標的遺伝子を含有するトランスファーベクターとの相同組換えを介した必須ではないウイルスゲノム領域への外来遺伝子の導入に基づく。結果得られた組換えバキュロウイルスは、好適な宿主細胞中で発現させることができる異種タンパク質をコードする外来遺伝子で置き換えられた必須ではない遺伝子（例えばｐｏｌｈ、ｖ−ｃａｔｈ、ＣｈｉＡ）の１つを欠失していてもよい。これらの技術は、一般的に当業者公知であり、例えばKostaら、Nat Biotechnol. 2005；23（5）：567〜75によって概説されている。組換えバキュロウイルスベクターを調製するための具体的なアプローチは、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ（登録商標）バキュロウイルス系（インビトロジェン）である。
【００７１】
[089]本発明の組換えバキュロウイルス発現ベクターは、優先的には、宿主細胞中での、任意選択で大腸菌（E. coli）などの原核細胞中での複製が可能である。本発明によれば、タンパク質の組換え発現に一般的に使用されるバキュロウイルスから誘導されたあらゆるバキュロウイルス発現ベクターを使用することができる。例えば、バキュロウイルスベクターは、例えば、ＡｃＭＮＰＶ、カイコ（Bombyx mori；Ｂｍ）ＮＰＶ、オオタバコガ（Helicoverpa armigera；Ｈｅａｒ）ＮＰＶ、またはシロイチモジヨトウ（Spodoptera exigua；Ｓｅ）ＭＮＰＶから誘導されてもよい。バキュロウイルスベクターは、バクミドであり得る。
【００７２】
[090]哺乳動物細胞におけるＣＭＶタンパク質の発現は、生産されたＣＭＶタンパク質が本来の哺乳動物の糖付加パターンを有し、したがって感染性ＣＭＶに提示されるエピトープを有することが公知であるため好ましいということは、従来技術における一般的な先入観である。したがって、免疫化に使用された場合、このようなタンパク質だけが感染中に天然に存在するＣＭＶ粒子に結合できる抗体の生成を可能にすることが予測された。
【００７３】
[091]驚くべきことに、本発明者らは、免疫原性五量体複合体は、哺乳動物細胞由来のバキュロウイルスベクターだけでなく、昆虫細胞由来のバキュロウイルスベクターを使用しても得られることを見出した。同時に、バキュロウイルス系の使用は、本発明の五量体複合体を、大量に高純度で生産することを可能にする。好ましくは、本発明の手段および方法により生産された五量体複合体は、特異的な糖付加パターン、すなわち昆虫の糖付加を示しており（HarrisonおよびJarvis（2006）、Adv. Virus Res.68、159〜191を参照）、それが五量体複合体をユニークなものにしており、したがって哺乳動物の糖付加とは異なっている。
【００７４】
[092]したがって、宿主細胞は、一般的に、昆虫細胞または哺乳動物細胞であり得る。一般的に、好ましくは、本発明の五量体複合体を生産するために核酸分子を発現するのに好適なあらゆる宿主細胞を使用することができる。本発明に従って使用される宿主細胞は、特定には昆虫細胞であってもよく、好ましくはＳｆ９、Ｓｆ２１、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｆ９−１（ＶＥ−１）、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｆ９−２（ＶＥ−２）、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｆ９−３（ＶＥ−３）、Ｈｉ−５、エクスプレスＳｆ＋、およびＳ２シュナイダー細胞であり、好ましくはＳｕｐｅｒ  Ｓｆ−９−２である［オックスフォードエクスプレッションテクノロジーズ（Oxford Expression Technologies）、カタログ番号600103、オックスフォード、英国；Fath-Goodinら（2006）、Adv. Virus Res.68、75〜90；Kroemerら（2006）、J. Virol.80（24）、12291〜12228およびＵＳ２００６０１３４７４３］。本発明に従って使用するのに好適な例示的な哺乳動物の宿主細胞は、当業界において公知であり、例えば、これらに限定されないが、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｆ、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＨＵＶＥＣ、ＨＵＡＥＣ、Ｈｕｈ７、ＨｅｐＧ２、ＢＨＫ、ＭＴ−２、Ｃｏｓ−７、Ｃｏｓ−１、Ｃ１２７、３Ｔ３、ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）、骨髄線維芽細胞、ボウズ（Bowes）黒色腫、一次神経細胞、または上皮細胞などのアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）より入手可能な不死化細胞株が挙げられる。哺乳動物細胞での発現は、生産されたタンパク質が本来の哺乳動物の糖付加パターンを有し、したがって感染性ＣＭＶ粒子に提示されるエピトープを有することの原因となり得る。したがって、理論に縛られることはないが、哺乳動物細胞における本発明の五量体複合体の生産は、感染中に天然に存在するＣＭＶ粒子に結合できる抗体の生産をもたらすと予想される。しかしながら、本発明者らは、五量体複合体が昆虫細胞で生産された場合に中和活性を誘導することから、特に中和抗体は、上皮／内皮細胞および線維芽細胞へのＣＭＶ侵入を理想的にはブロックするかまたは少なくとも減少させることを観察した。
【００７５】
[093]しかしながら、本明細書で記載されるように、宿主細胞も、哺乳動物細胞であってもよい。例えば、ＢａｃＭａｍ系、バキュロウイルス発現ベクターは、哺乳動物細胞に遺伝子を送達するのに使用される。
【００７６】
[094]本発明者らは、意外なことに、例えば、高い収量の本発明の五量体複合体の生産を可能にする具体的なパラメーターを発見した。例えば、本発明の五量体複合体は、増殖培地１リットル当たり１．０ｍｇ以上（more than）（例えば、増殖培地１リットル当たり、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０１００、２００、３００、４００、５００、６００、６５０、６８０、７００、８００、９００、１０００ｍｇまたはそれより高い）レベルに累積する可能性がある。
【００７７】
[095]前述のことに従って、共発現の工程は、宿主細胞を、本発明の五量体複合体のタンパク質を発現するバキュロウイルスに感染させることを含むことが想定される。好ましくは感染時に細胞約２×１０６個／ｍＬの細胞数を有する前記宿主細胞を感染させる場合に、バキュロウイルスは、約１０７ｐｆｕ／ｍＬまたはそれより高いの力価を有することがさらに想定される。
【００７８】
[096]次いで、宿主細胞は、好適な条件下で培養される。好ましくは、感染後５６〜６５時間に、宿主細胞および／またはそれらの上清が回収される。代替として、宿主細胞の少なくとも８０％（合計１００％に対して）が生存可能である場合に、宿主細胞および／またはそれらの上清が回収される。宿主細胞の生存率は、例えば、細胞をトリパンブルーで染色することによって決定することができる。生存可能な細胞は色が付かず、一方で生存可能ではない細胞は色が付くと予想される。トリパンブルー染色は、以下のように行うことができる：１ｍｌの細胞懸濁液を、０．４％トリパンブルー色素に約５分間晒し、続いて、全てのカウントされた細胞に対する生存可能な細胞／生存可能ではない細胞のパーセンテージを決定するために（すなわち全てのカウントされた細胞が１００％と設定される）、好ましくは血球計算器を使用することにより顕微鏡観察する。
【００７９】
[097]「回収する」は、全てのその文法上の形態で、宿主細胞および／または上清を得る行為またはプロセスを意味し、例えば、トリプシン処理、ろ過、および／または遠心分離などを含み得る。本発明の五量体複合体をそれらの無傷のまたは機能的な形態で得ることができる限りは、どのような方法も考慮することができる。
【００８０】
[098]本発明の方法において、宿主細胞を、融解および培養の後、１５日目から５０日目の間、好ましくは１５日目から３０日目の間、好ましくは１８日目に感染させることがさらに想定される。
【００８１】
[099]一部の実施態様において、本発明の五量体複合体は、それが発現される細胞から分泌される。本発明の他の実施態様において、本発明の五量体複合体は、分泌されない。好ましい実施態様は、五量体複合体のタンパク質のいずれも追加の分泌シグナルを含有しないことである。理論に縛られることはないが、宿主細胞、特に昆虫細胞中で五量体複合体が構築されたら、ｇＨタンパク質は、複合体全体の分泌を媒介することが想定される。
【００８２】
精製
[0100]「精製すること」は、全てのその文法上の形態で、望ましくない化合物、例えば細胞、死細胞片、培養培地、バキュロウイルス、無傷のまたは無傷ではないバキュロウイルスのいずれかなどを除去することを意味する。発現系、収量などに応じた好適な精製方法は、従来技術において容易に利用することができる。例えば、精製は、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよび／またはアフィニティークロマトグラフィーを包含していてもよく、これらは全て、これまでに詳細に説明されている。前述したように、精製工程は、とりわけバキュロウイルスを除去することを包含する。このようなバキュロウイルスは、バキュロウイルスベクターまたはＢａｃＭａｍベクターで感染させた宿主細胞から入手可能な培養培地および／または上清中に含有されている可能性がある。本発明の五量体複合体を精製する場合、このようなバキュロウイルスは除去されることが好ましい。本発明者らは、本明細書で説明されるような宿主細胞から入手可能な培養培地および／または上清からバキュロウイルスを除去するために、特定にはイオン交換クロマトグラフィー、より特定にはイオン交換クロマトグラフィーが適用され得ることを見出した。
【００８３】
[0101]精製はまた、本明細書で使用される場合、ＣＭＶタンパク質であるＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１Ａ、ｇＨ（ＵＬ７５）およびｇＬ（ＵＬ１１５）を共に発現する宿主細胞が培養培地から除去され得ることも包含する。前記宿主細胞が好ましくは前記五量体複合体を分泌するため、前記培養培地は、好ましくは本発明の五量体複合体を含む。培養培地からの宿主細胞の除去は、機械的な力によって、例えば遠心分離またはろ過によって行われてもよい。ろ過は、好ましくは、ろ過媒体、例えば精密ろ過フィルターまたはデプスフィルターを使用することによってによって行われる。精密ろ過フィルターは、ポリエーテルスルホンまたは再生セルロースで構成されていてもよい。デプスフィルターは、ポリプロピレンまたはガラス繊維で構成されていてもよい。
【００８４】
[0102]しかしながら、前記宿主細胞が必ず前記五量体複合体を分泌しなければならない訳ではないことも想定される。そのような場合、前記宿主細胞が回収されてもよい。回収後、五量体複合体を放出させて本明細書で説明されるように精製できるように、前記宿主細胞は、例えば酵素的または機械的に破壊されていてもよい。
【００８５】
[0103]精製後、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡなどのキレート剤を複合体に添加することが好ましい。好ましくは、ＥＤＴＡは、２０ｍＭの最終濃度で存在する。その後、２０ｍＭのＥＤＴＡの最終濃度を、本明細書で説明されるように透析によって３ｍＭの最終濃度またはそれ未満に低下させることが好ましい。
【００８６】
貯蔵
[0104]「貯蔵すること」は、全てのその文法上の形態で、好ましくは本発明の五量体複合体をその無傷のまたは機能的な形態で維持する条件下で保存すること（将来的な使用のために）を意味し、すなわち五量体複合体は、好ましくはその天然に存在する形態に類似しているか、および／または中和抗体を誘導することができる。したがって、貯蔵条件は、本発明の五量体複合体の崩壊を促進しない（または予防もする）ことが想定される。用語「崩壊」は、本明細書においてその最も広い意味で理解されるものとし、「分解」および／または「変性」を意味する場合もある。本発明の五量体複合体の貯蔵は、キレート剤および／または安定化剤を含む緩衝溶液中であることが想定される。
【００８７】
[0105]一般的に、本発明の五量体複合体の貯蔵を可能にし、その崩壊を促進しない限りは、どのようなキレート剤および／または安定化剤でも好適である。本発明の内容において例示的な有用なキレート剤は、ＥＤＴＡである。ＥＤＴＡは、２０ｍＭまたはそれ未満、例えば１５ｍＭ、１０ｍＭ、９ｍＭ、８ｍＭ、７ｍＭ、６ｍＭ、５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、または１ｍＭの濃度で前記緩衝溶液中に存在していてもよい。特定には、ＥＤＴＡは、３ｍＭまたはそれ未満の濃度で存在していてもよい。本発明に従って使用するための例示的な安定化剤としては、グリコール、アルギニン、ソルビトール、グリセロールおよび／またはスクロースが挙げられる。特定には、緩衝溶液は、１００〜２００ｍＭのアルギニン、１００ｍＭのソルビトール、２０％グリセロール（ｗ／ｖ）、２０％スクロース（ｗ／ｖ）、０．５％ＮＰ−４０、０．２％Ｂｒｉｊ−３５および０．５％Ｃｈａｐｓを含んでいてもよい。
【００８８】
[0106]本発明に係る緩衝溶液は、トリス緩衝液、ＮａＣｌ、ＫＣｌを含んでいてもよく、ｐＨ６．５を有していてもよい。特定には、緩衝溶液は、２５ｍＭのトリス緩衝液、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣｌを含んでいてもよい。また緩衝溶液も、リン酸ナトリウム／カリウム緩衝液であってもよい。前記緩衝液は、６．０から７．０の間のｐＨを有していてもよい。
【００８９】
ベクター設計
[0107]本発明は、ＣＭＶタンパク質であるＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１、ｇＨおよびｇＬをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む１つまたはそれより多くのベクターを提供する。
【００９０】
[0108]ベクターは、細菌（例えば大腸菌）、酵母（例えばＳ．セレビジエ（S. cerevisiae））、昆虫細胞および／または哺乳動物細胞における繁殖のためのエレメントを含有していてもよい。好ましくは、前記ベクターは、バキュロウイルスベクターまたはバキュロウイルスＢａｃＭａｍベクターである。
【００９１】
[0109]ＢａｃＭａｍ系において、哺乳動物細胞に遺伝子を送達するのにバキュロウイルスベクターが使用される。ＢａｃＭａｍ系は、宿主細胞として広範囲の細胞株および初代細胞に遺伝子送達するのに使用することができ、宿主細胞の例示的な列挙は本明細書の他所に記載されている。改変されていないバキュロウイルスは哺乳動物細胞に入ることができるが、その遺伝子は、哺乳動物の認識可能なプロモーターが目的の遺伝子上流に取り込まれていない限り発現されない。したがって、本発明のＢａｃＭａｍベクターは、本発明の五量体複合体のタンパク質をコードする遺伝子の上流に哺乳動物プロモーターを含むことが想定される。ベクターは、本明細書の他所で説明されるような追加のエレメント、例えば抗生物質耐性遺伝子、大腸菌、Ｓ．セレビジエなどにおける繁殖のためのエレメントを含んでいてもよい。
【００９２】
[0110]前記バキュロウイルスベクターにおいて、ｖ−ｃａｔｈおよび／またはＣｈｉＡ遺伝子が機能的に破壊されていてもよい。
[0111]一般的に、本発明の五量体複合体のＣＭＶタンパク質であるＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１Ａ、ｇＨおよびｇＬをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が、１つまたはそれより多くのベクター、例えば２つのベクターに存在していてもよい。したがって、ＯＲＦの１、２、３、または４つが第一のベクターにあり、一方で残りのＯＲＦ／ＯＲＦ（複数）が第二のベクターにある。しかしながら、前記ＯＲＦが単一のベクターに存在することが好ましい。またＯＲＦは、多遺伝子性の形態で存在していてもよい（ＥＰ１９４５７７３）。
【００９３】
[0112]ＯＲＦは、例えば、前記ベクター中に５’から３’に以下の順番：
（ｉ）ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１Ａ；
または（ｉｉ）ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１Ａ、ｇＨ
で配置されていてもよい。
【００９４】
[0113]特定には、
（ａ）（ｉ）において、ｇＨのＯＲＦは、３’方向で転写され、ｇＬのＯＲＦは５’方向で転写され、ＵＬ１２８のＯＲＦは３’方向で転写され、ＵＬ１３０のＯＲＦは３’方向で転写され、ＵＬ１３１ＡのＯＲＦは３’方向で転写され；
（ｂ）（ｉ）において、ｇＨのＯＲＦは３’方向で転写され、ｇＬのＯＲＦは３’方向で転写され、ＵＬ１２８のＯＲＦは３’方向で転写され、ＵＬ１３０のＯＲＦは３’方向で転写され、ＵＬ１３１ＡのＯＲＦは３’方向で転写され；
（ｃ）（ｉｉ）において、ｇＬのＯＲＦは５’方向で転写され、ＵＬ１２８のＯＲＦは３’方向で転写され、ＵＬ１３０のＯＲＦは３’方向で転写され、ＵＬ１３１ＡのＯＲＦは３’方向で転写され、ｇＨのＯＲＦは３’方向で転写される
ことが想定される。
【００９５】
[0114]ベクターのさらなる例は、ＣＭＶの五量体複合体を生成するための以下のベクター（ｐＲＢＴ１３６−ｘ）であり（前記ベクターの構築およびプロセシングは、ＰＣＴ／ＥＰ２０１３／０７２７１７の実施例１で説明されている）、したがって本発明の五量体複合体の発現に適用できる好ましいベクターである。したがって、以下の表１に列挙したベクターは、五量体複合体のタンパク質の１つまたはそれより多くの共発現に使用されるベクターの好ましい例示的なベクターである。注目すべきことに、以下の表の左の列に示される具体的なヌクレオチド配列とは別に、以下の表１で示されたような五量体複合体のタンパク質をコードする遺伝子のアレンジメントも、本発明の実施態様である好ましいアレンジメントである。略語：ｃ：コンセンサス配列；Ｈ：Ｈｉｓ−タグ；ＳＨ：ストレプトアビジン−Ｈｉｓ−タグ；Ｖ：ＶＲ１８１４、ｐｃＩ：プレシジョンプロテアーゼ、ｐｃＩＩ：プレシジョンおよびＴＥＶプロテアーゼ、ＤＴ：二量体化ツール。表１における遺伝子の説明には、より短いＣＭＶの学術名（ｇＢ、ｇＨ、ｇＬ、ｇＯ、加えて接頭辞のない「ＵＬ」および接尾辞「Ａ」のないＵＬ４８）が使用される。
【００９６】
【表１】
2017515503.tif 000003
【００９７】
[0115]本発明のために好ましく使用されるベクター骨格ｐＲＢＴ１３６は、大腸菌のための複製起点、例えばｐＢＲ３２２ｏｒｉ、および酵母、例えば２ミクロンｏｒｉ、昆虫細胞での発現のためのｐｏｌｈおよびｐ１０プロモーター、ターミネーターＳＶ４０およびＨＳＶｔｋ、数種の耐性マーカー（アンピシリン、ゲンタマイシン）、酵母選択マーカー（ＵＲＡ３）、トランスポゾン部位（Ｔｎ）、ならびに多重クローニング部位（ＭＣＳ）を含有する。
【００９８】
[0116]一例として、プロモーター−目的の遺伝子−ターミネーターを含有する発現カセットは、３５〜４０ｎｔのオーバーハングを有する５’部位、およびさらなる異なる３５〜４０ｎｔのオーバーハングを有する３’部位で、ＰＣＲにより増幅される。同じ構成を有する第二の発現カセットとの相同組換えのために、ＰＣＲ産物は、５’部位に、前のＰＣＲ産物の３’部位に対する３５〜４０ｎｔのオーバーハングの相補的配列を含有する。第一のＰＣＲ産物の５’部位および第二のＰＣＲ産物の３’部位における残りのオーバーハングは、それぞれ直線状にしたベクター（ｐＲＢＴ１３６）の３’および５’末端に相同である。次いで酵母、好ましくはサッカロミセス・セレビジエ中で配列における相同組換えが実行される。以前に説明された戦略と平行して構築しようとする発現カセット／ＰＣＲ産物の数は、構築しようとする遺伝子の必要な数に従って増加する。この手段によって、複数の遺伝子／発現カセットが平行して構築される。構築された遺伝子は、トランスポゾン部位を両側に有する。これらは、バキュロウイルスゲノムへの遺伝子の転位に使用される。結果得られたバキュロウイルス共発現ベクターは、同じ単一の細胞から遺伝子が確実に共発現されるようにする。収量および生成物の組成は、タンパク質および生産パラメーターの数によって様々である。細胞株、感染時の細胞数（ＣＣＩ）、組換えウイルス接種材料の量（重複感染度、ＭＯＩ）および回収時間（ＴＯＨ）などの生産パラメーターは、マトリックスシステムおよびスモールスケールの生産システムを使用した収量および早期回収に関して決定される（２〜２０ｍｌ; Ries, C.、John C.、Eibl R.（2011）、A new scale down approach for the rapid development of Sf21/BEVS based processes - a case study. In Eibl R.、Eibl D.（編集者）：Single-use technology in Biopharmaceutical Manufacture、207〜213、ジョン・ワイリー＆サンズ（John Wiley & Sons）、ニュージャージー州ホーボーケン）。次いで規定されたパラメーターは、それぞれの生成物をより大きいスケールで生産するのに使用される。本発明の五量体複合体は、高い製造能力を可能にする現行の使い捨ての組織培養技術を使用して製造される。
【００９９】
[0117]ベクターは、例えば、複製起点、プロモーター、クローニング部位、遺伝子マーカー、抗生物質耐性遺伝子、エピトープ、レポーター遺伝子、標的配列および／またはタンパク質精製タグなどの１つまたはそれより多くのさらなるエレメントを含有していてもよい。当業者は、具体的な発現系にとってどのエレメントが適切であるかを容易に理解するものと予想される。
【０１００】
[0118]特定には、本発明に係るベクターはさらに、細菌（大腸菌）、酵母（Ｓ．セレビジエ）、昆虫細胞および／または哺乳動物細胞における繁殖のためのエレメント、例えば複製起点、選択マーカーなどを含有していてもよい。
【０１０１】
[0119]ベクターは、遺伝子発現のためのプロモーターを含むことが想定される。本明細書で説明されるＯＲＦのそれぞれは、プロモーターによって駆動される。プロモーターは、好ましくは、ｐｏｌｈ、ｐ１０およびｐＸＩＶ超後期（very late）バキュロウイルスプロモーター、ｖｐ３９バキュロウイルス後期プロモーター、ｖｐ３９ｐｏｌｈバキュロウイルス後期／超後期ハイブリッドプロモーター、ｐｃａ／ｐｏｌｈ、ｐｃｎａ、ｅｔｌ、ｐ３５、ｅｇｔ、ｄａ２６バキュロウイルス初期プロモーター；ＣＭＶ−ＩＥ１、ＵＢｃ．ＥＦ−１、ＲＳＶＬＴＲ、ＭＴ、シミアンウイルス４０プロモーター、ＣＡＧプロモーター（ＣＭＶ−ＩＥ１エンハンサーを含むベータ−アクチンプロモーター）、Ｂ型肝炎ウイルスプロモーター／エンハンサー、ヒトユビキチンＣプロモーター、ハイブリッドニューロンプロモーター、ｐＤＳ４７、Ａｃ５、ならびにＰＧＡＬおよびＰＡＤＨからなる群より選択される。本明細書で説明されるＯＲＦのそれぞれの後に、ターミネーター配列、例えばＨＳＶｔｋターミネーター、ＳＶ４０ターミネーター、またはウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ターミネーターが続く。
【０１０２】
[0120]本発明の五量体複合体のタンパク質の１つまたはそれより多くは、プレシジョンプロテアーゼまたはプレシジョンおよびＴＥＶプロテアーゼを含んでいてもよい。例えば、ｇＨおよび／またはｇＬタンパク質は、プレシジョンプロテアーゼまたはプレシジョンおよびＴＥＶプロテアーゼを含み得ることが特に想定される。
【０１０３】
[0121]バキュロウイルスｖ−ｃａｔｈおよび／またはＣｈｉＡ活性は、機能的に破壊され得ることがさらに想定され、これは、好ましくは機能的なｖ−ｃａｔｈおよび／またはＣｈｉＡが存在しない、および／または発現されないことを意味する。ほとんどのバキュロウイルスは、キチナーゼ（ｃｈｉＡ）およびウイルスカテプシン様プロテアーゼ（ｖ−ｃａｔｈ）をコードしており、これは、細胞中に保持されており、感染の最後に宿主の死骸を液化するためにウイルスによって誘導された溶解の際に放出される（Hawtin, REら、Virology.1997；238、243〜253）。これらの遺伝子はバキュロウイルス複製に必須ではないため、例えば、部分的または完全な欠失、挿入変異誘発によって、または１つまたはそれより多くの不活性化する点突然変異によって不活性化されてもよい。
【０１０４】
[0122]本発明の五量体複合体は、例えばゲル電気泳動によって決定されたような質量に基づき、総タンパク質の例えば少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の様々なレベルの純度で調製することができる。これらの高いレベルの純度は、複合体を、例えば診断用途における免疫原としての使用またはワクチン製剤における抗原としての使用にとって好適にする。このようなレベルの純度は、好ましくは、（ｉ）本明細書で説明されるような培養培地から宿主細胞を取り出すこと、（ｉｉ）本明細書で説明されるようなクロマトグラフィーを適用すること、例えば、五量体複合体のタグを有するバージョンが宿主細胞によって発現される場合、アフィニティークロマトグラフィーを適用すること、それに続いて（ｉｉｉ）バキュロウイルス発現系が使用される場合、イオン交換クロマトグラフィー、特定にはイオン交換クロマトグラフィーを介してバキュロウイルスを取り出すことによって得ることができる。これらの工程はいずれも繰り返すことができ、好ましくは工程（ｉｉ）が最後の工程として繰り返される。これらの工程は、（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉ）および（ｉｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｉ）；（ｉｉｉ）、（ｉｉ）および（ｉ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉ）；または（ｉｉｉ）、（ｉ）および（ｉｉ）の順番であってもよい。好ましくは、工程（ｉｉ）が最後の工程として繰り返される。
【０１０５】
組成物
[0123]本発明の五量体複合体はまた、組成物の形態であってもよい。本発明の組成物は、緩衝液、還元剤、安定化剤、キレート剤、増量剤、浸透圧調整剤（osmotic balancing agent）（等張化剤）；界面活性剤、ポリオール、抗酸化剤；凍結乾燥保護剤（lyoprotectant）；消泡剤；保存剤；ならびに着色剤、洗浄剤、ナトリウム塩、および／または抗微生物剤などをさらに含んでいてもよい。組成物は、ポリアクリルアミド非含有でもよい。
【０１０６】
[0124]一部の実施態様において、組成物は、ポリアクリルアミドを含有しない。一部の実施態様において、組成物は、液体、例えば水性の液体であり、ゲルではない。一部の実施態様において、タンパク質複合体は、組成物内に固定されていない。例えば、前記五量体複合体は、ゲル中、またはフィルム、膜、ペーパーもしくはスライド上に存在していなくてもよい。
【０１０７】
[0125]組成物は、滅菌されていてもよいし、および／またはパイロジェンフリーであってもよい。組成物は、ヒトに関して等張であってもよい。
中和活性
[0126]本発明者らは、本発明の五量体複合体は、免疫原性応答を誘導できることを発見した。用語「免疫原性応答」は、「適応免疫応答」を意味し、一般的に、好ましくはインビボでの体液性および／または細胞性免疫応答を包含する。免疫原性応答は、好ましくは中和活性の誘導を含み、ここで中和活性は、好ましくは中和抗体の形態である。
【０１０８】
[0127]「中和抗体」は、抗原の生物学的作用、例えば宿主において感染を開始および／または持続させる病原体の能力を中和する（消滅または減少させる）ことができる抗体である。好ましくは、本発明の五量体のタンパク質複合体に応答して生成した中和抗体は、ＣＭＶビリオン粒子と交差反応することによって、ＣＭＶ感染に対する免疫性を付与する。理論に縛られることはないが、本発明の五量体のタンパク質複合体に応答して生成した中和抗体は、上皮、内皮（Ｅｐｉ／ＥＣ）および／または線維芽細胞に入るＣＭＶビリオン粒子の能力を消滅させるか、または少なくとも減少させると考えられ、「および」の組合せが好ましい。細胞への侵入効率は、当業者に公知の標準化した試験によって決定した場合、少なくとも約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９または１００％減少することが想定される。「効率」は、本明細書で使用される場合、抗体の非存在下で感染した数に対するパーセンテージとしての、抗体の存在下で感染した細胞数と定義される。特定の中和抗体においてスクリーニング／同定／決定するための中和アッセイは、図３の凡例および実施例３で説明されるようにして行うことができる。
【０１０９】
[0128]したがって、本発明の五量体複合体は、ＣＭＶ感染に対する免疫性を誘導する可能性があることが想定される。これらの２つの機能（すなわち、免疫原性応答の誘導と免疫性の誘導）は、中和抗体を包含する抗体の生産を惹起することができる本発明の五量体複合体上におけるエピトープの保持に依存する。五量体複合体に関する様々なコンフォメーショナルエピトープが公知である；Macagno（2010）、Journal of Virology 84（2010）：1005〜13を参照されたい。
【０１１０】
[0129]前述したことを考慮すれば、本発明は、好ましくは、上皮／内皮（Ｅｐｉ／ＥＣ）および線維芽細胞の感染を両方とも阻害する中和活性を誘導することが可能な五量体複合体を提供する。
【０１１１】
生産方法
[0130]第二の形態では、本発明はまた、ＣＭＶタンパク質であるＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１Ａ、ｇＨ（ＵＬ７５）およびｇＬ（ＵＬ１１５）で構成される五量体複合体を生産するための方法であって、
（ｉ）バキュロウイルスＣＭＶタンパク質であるＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１Ａ、ｇＨ（ＵＬ７５）およびｇＬ（ＵＬ１１５）を宿主細胞中で共発現させること；
（ｉｉ）前記共発現により得られた宿主細胞および／または上清から、五量体複合体を精製すること；および
（ｉｉｉ）任意選択で、精製された五量体複合体を、キレート剤および／または安定化剤を含む緩衝溶液中で貯蔵すること
を含む、上記方法も提供する。
【０１１２】
[0131]本発明の五量体複合体の文脈で説明される実施態様は、必要な変更を加えて本発明の方法にも適用されることに留意されたい。
医薬／ワクチン組成物
[0132]第三の形態では、治療有効量の本発明の五量体複合体または本発明の方法によって入手可能な五量体複合体および任意選択で医薬的に許容される担体またはアジュバントを含む、医薬組成物またはワクチン組成物が提供される。また本発明の医薬組成物またはワクチン組成物は、本明細書で説明されるベクターを含んでいてもよい。
【０１１３】
[0133]「治療有効量」は、望ましい治療効果を惹起するのに十分な量である。例えばワクチン組成物において、治療有効量は、免疫応答、例えば対象における中和抗体の生産を誘導するのに十分な量であり得る。対象は、好ましくは哺乳動物であってもよく、哺乳動物は、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、または霊長類であってもよい。好ましくは、対象は、ヒトである。
【０１１４】
[0134]用語「医薬的に許容される」は、特定には、動物、より特定にはヒトでの使用に関する管理機関または他の一般的に認められた薬局方によって承認されていることを意味する場合がある。
【０１１５】
[0135]本発明の医薬／ワクチン組成物は、対象の治療的処置のためであることが想定される。用語「治療的処置」は、全てのその文法上の形態で、処置的または予防的処置を包含する。「処置的または予防的処置」は、臨床的および／もしくは病理学的な兆候の完全な予防を目的とした予防的処置、または臨床的および／もしくは病理学的な兆候の緩和もしくは寛解を目的とした治療的処置を含む。
【０１１６】
[0136]先天性疾患に罹る機会を低減するためには、母親の最初のＣＭＶ感染を予防するための予防ワクチンが望ましく、それに対して母親が活動性ＣＭＶ感染と診断されているケースでは、有効な療法が必要である。本発明の五量体複合体は、例えば妊婦、子供または移植前の移植患者のための予防ワクチンとして適用されることが特に想定される。
【０１１７】
[0137]ワクチン組成物は、ｇＢタンパク質、ｇＭタンパク質、ｐｐ６５タンパク質、ＩＥ−１タンパク質、ｇＬ／ｇＨタンパク質の二量体、ｇＭ／ｇＮタンパク質の二量体、ｇＬ／ｇＨ／ｇＯの三量体、１つまたはそれより多くのキャプシドもしくはキャプシド前駆タンパク質、ＣＭＶ由来の１つまたはそれより多くの表面タンパク質、および／または１つまたはそれより多くの外被タンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）をさらに含み得る。「ｇＢ」は、本明細書においてＵＬ５５と同義的に使用される。「ｇＭ」は、本明細書においてＵＬ１００と同義的に使用される。「ｐｐ６５」は、本明細書においてＵＬ８３と同義的に使用される。「ＩＥ−１」は、本明細書においてＵＬ１２３と同義的に使用される。「ｇＯ」は、本明細書においてＵＬ７４と同義的に使用される。上述のタンパク質は、具体的な配列に限定されないことが理解されると予想される。上述のタンパク質の突然変異およびトランケートされた形態も想定され、本発明のワクチン組成物に包含される。上述のタンパク質はまた、改変された形態で本発明のワクチン中に存在していてもよい。例示的な改変は、本発明の五量体複合体のタンパク質の文脈で説明されており、ｇＢ、ｇＭ、ｐｐ６５、ＩＥ−１およびｇＯにも適用可能である。
【０１１８】
[0138]本発明のワクチンまたはベクターワクチンはそれぞれ、可溶性の形態の補体受容体１型（ｓＣＲ１）をさらに含んでいてもよい。
[0139]「ウイルス様粒子（ＶＬＰ）」は、ウイルス構造タンパク質（例えば、表面タンパク質）の複合体であり、これは、ウイルスに類似しているが、いかなるウイルス遺伝物質も含有せず、したがって非感染性である。本発明に従って使用されるＶＬＰは、原則的に、免疫応答が惹起されることが望ましいあらゆるウイルスタンパク質を含んでいてもよい。例えば、本発明に従って使用されるＶＬＰは、ＣＭＶキャプシドもしくはキャプシド前駆タンパク質、表面タンパク質および／もしくは外被タンパク質、Ｂ細胞および／もしくはＴ細胞エピトープ、および／もしくは追加の外来抗原配列の群より選択されるタンパク質、サイトカイン、ＣｐＧモチーフ、ｇ−ＣＭＳＦ、ＣＤ１９およびＣＤ４０リガンドならびに／もしくは蛍光タンパク質、粒子の精製目的または標識の結合に有用なタンパク質、ならびに／または輸送プロセスに必要なタンパク質様の構造を含んでいてもよい。
【０１１９】
[0140]さらにワクチン組成物は、ｇＢ、ｇＭ、ｐｐ６５、ＩＥ−１またはＩＥ−２をコードする核酸分子を含んでいてもよい。例えば、核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。例えば、核酸は、ベクターまたはプラスミドの形態であってもよい。複合体化され安定化された形態も想定される。
【０１２０】
[0141]本発明はまた、本発明の五量体複合体または本明細書で説明されるような他のあらゆるＣＭＣ複合体をコードするベクターを含むワクチン組成物も提供する。前記ベクターは、ＤＮＡベースであってもよいし、またはＲＮＡベースであってもよい。ワクチン組成物に従って使用するのに好適なベクターとしては、ＤＮＡベースのベクター、例えばバキュロウイルスベクター、ＢａｃＭａｍベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ＡＡＶベクター、ヘルペスウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、およびエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）ベクターが挙げられる。また裸のＤＮＡの使用も、例えばプラスミドの形態で、任意選択で複合体化および／または安定化された形態（例えばリポプレックス、ポリプレックス、デンドリマー、ビロソームおよび無機ナノ粒子との複合体）で想定される。好適なＲＮＡベースのベクターとしては、レトロウイルスベクター、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）ベクターが挙げられる。
【０１２１】
[0142]本発明のワクチン組成物は、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１、ｇＨ（ＵＬ７５）およびｇＬ（ＵＬ１１５）で構成されるＣＭＶ五量体複合体の１つまたはそれより多くのタンパク質を含む改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）をさらに含んでいてもよい。
【０１２２】
[0143]さらに、本発明は、プライミング組成物として前記ワクチン組成物を投与し、ブースティング組成物として（ｉ）ｇＨ／ｇＬ二量体、（ｉｉ）ＵＬ１３０／ＵＬ１３１Ａ−二量体、（ｉｉｉ）ｇＭ／ｇＮ二量体（ｉｖ）ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１Ａ−五量体、（ｖ）ｇＢ、（ｖｉ）ｇＭ、（ｖｉｉ）ｐｐ６５、（ｖｉｉｉ）ＩＥ−１、（ｉｘ）ＩＥ−２、（ｘ）ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１、ｇＨ（ＵＬ７５）およびｇＬ（ＵＬ１１５）で構成されるＣＭＶ五量体複合体の１つまたはそれより多くのタンパク質を含む改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）、（ｘｉ）ｇＢ、ｇＨ／ｇＬ二量体、ｐｐ６５タンパク質またはＩＥ−１タンパク質を含む改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）、（ｘｉｉ）１つまたはそれより多くのキャプシドもしくはキャプシド前駆タンパク質、ＣＭＶ由来の１つまたはそれより多くの表面タンパク質、または１つまたはそれより多くの外被タンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）、（ｘｉｉｉ）（ｉ）から（ｘｉｉ）で規定された化合物のいずれか１種をコードする核酸配列、（ｘｉｖ）フラジェリン由来のペプチド、（ｘｖ）ＣｐＧモチーフ、および／または（ｘｖｉ）ＬＣＭＶを前記対象に投与することを含む、対象にＣＭＶに対するワクチン接種をする方法で使用するためのワクチン組成物を提供する。
【０１２３】
[0144]前記ブースティング組成物はまた、プライミング組成物としても使用でき、前記プライミング組成物は、ブースティング組成物として使用される。
[0145]プライムブーストレジメンにおいて、プライム／ブーストワクチンが使用され、これは、一次免疫化に使用されるワクチン（プライムまたはプライミング）およびブースター免疫化に使用されるワクチン（ブーストまたはブースティング）を包含する２種またはそれより多くのタイプのワクチンで構成される。通常、一次免疫化に使用されるワクチンおよびブースター免疫化に使用されるワクチンは、互いに異なる。一次免疫化およびブースティング免疫化は逐次的に行ってもよいが、これは必須ではない。プライム／ブーストレジメンとしては、これらに限定されないが、例えばＤＮＡプライム／タンパク質ブースト、ＤＮＡプライム／ウイルスベクターブースト（例えばＭＶＡを使用）が挙げられる。
【０１２４】
担体
[0146]用語「担体」および「賦形剤」は、本明細書において同義的に使用される。医薬的に許容される賦形剤としては、これらに限定されないが、希釈剤（フィラー、増量剤、例えばラクトース、微結晶性セルロース）、崩壊剤（例えばデンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウム）、結合剤（例えばＰＶＰ、ＨＰＭＣ）、潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム）、滑剤（例えばコロイダルＳｉＯ２）、溶媒／共溶媒（例えば水性媒体、プロピレングリコール、グリセロール）、緩衝剤（例えばクエン酸塩、グルコン酸塩、乳酸塩）、保存剤（例えば安息香酸Ｎａ、パラベン（Ｍｅ、ＰｒおよびＢｕ）、ＢＫＣ）、抗酸化剤（例えばＢＨＴ、ＢＨＡ、アスコルビン酸）、湿潤剤（例えばポリソルベート、ソルビタンエステル）、消泡剤（例えばシメチコン）、増粘剤（例えばメチルセルロースまたはヒドロキシエチルセルロース）、甘味剤（例えばソルビトール、サッカリン、アスパルテーム、アセスルファム）、矯味矯臭剤（例えばペパーミント、レモン油、バタースコッチなど）、潤滑剤（例えばプロピレン、グリコール、グリセロール、ソルビトール）が挙げられる。当業者であれば、例えば医薬組成物の製剤および投与経路に応じて好適な医薬的に許容される賦形剤を容易に選択できるものと予想される。
【０１２５】
[0147]例示的な医薬的に許容される賦形剤の限定的な列挙としては、（生分解性）リポソーム；生分解性ポリマーのポリ（Ｄ，Ｌ）−乳酸−ｃｏ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）で作製されるマイクロスフェア、アルブミンマイクロスフェア；合成ポリマー（可溶性）；ナノ繊維、タンパク質−ＤＮＡ複合体；タンパク質コンジュゲート；赤血球；またはビロソームが挙げられる。様々な担体ベースの剤形は、固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）、高分子ナノ粒子、セラミックナノ粒子、ヒドロゲルナノ粒子、共重合ペプチドナノ粒子、ナノ結晶およびナノサスペンジョン、ナノ結晶、ナノチューブおよびナノワイヤー、官能化したナノキャリアー、ナノスフェア、ナノカプセル、リポソーム、脂質エマルジョン、脂質マイクロチューブ／マイクロシリンダー、脂質マイクロバブル、リポスフェア、リポポリプレックス、逆脂質ミセル（inverse lipid micelle）、デンドリマー、エトソーム（ethosome）、多成分の超薄カプセル、アクアソーム（aquasome）、ファーマコソーム（pharmacosome）、コロイドソーム（colloidosome）、ニオゾーム（niosome）、ディスコーム（discome）、プロニオソーム（proniosome）、マイクロスフェア、マイクロエマルジョンおよび高分子ミセルを含む。他の好適な医薬的に許容される賦形剤は、とりわけRemington’s Pharmaceutical Sciences、第15版、マック・パブリッシング社（Mack Publishing Co.）、ニュージャージー州（1991）およびBauerら、Pharmazeutische Technologie、第5版、Govi-Verlag、フランクフルト（1997）で説明されている。
【０１２６】
アジュバント
[0148]本発明の医薬またはワクチン組成物は、五量体複合体への免疫系の応答を刺激するためにアジュバントをさらに含んでいてもよい。本発明に従って使用するための例示的なアジュバントとしては、無機化合物、例えばアラム、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、水酸化リン灰石（calcium phosphate hydroxide）、鉱油、例えばパラフィン油、ビロソーム、細菌産物、例えば死菌の百日咳菌（Bordetella pertussis）、ウシ型結核菌、トキソイド、非細菌性の有機物質、例えばスクアレン、チメロサール、洗浄剤（Ｑｕｉｌ  Ａ）、サイトカイン、例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２、ならびに複合組成物、例えばフロイント完全アジュバント、およびフロイント不完全アジュバントが挙げられる。一般的に、本発明に従って使用されるアジュバントは、好ましくは、本発明の五量体複合体に対する免疫応答の効能を高めたり、および／またはそれを望ましい免疫応答の方向に調節したりする。
【０１２７】
[0149]本発明の医薬またはワクチン組成物を投与するために様々な経路を適用することができ、このような経路としては、これらに限定されないが、経口的、局所、経皮、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内または眼内などが挙げられる。しかしながら、他のあらゆる経路も必要に応じて当業者により容易に選択することができる。
【０１２８】
[0150]それらを必要とする対象に投与される本発明の医薬／ワクチン組成物の正確な用量は、処置の目的（例えば急性疾患の処置、それに対して予防ワクチン接種）によって決まると予想される。投与経路、年齢、体重、全体的な健康状態、性別、食事、投与時間、薬物の相互作用および状態の重症度を適合させることが必要な場合があり、当業者により慣例的な実験で確認が可能であると予想される。
【０１２９】
供給源（Source）
[0151]第四の形態では、本発明の五量体複合体において、前記タンパク質の少なくとも１種、２種、３種または４種は、残りのタンパク質の由来となったＣＭＶ株以外のＣＭＶ株由来であってもよい。
【０１３０】
[0152]本発明に係る「株」は、ＣＭＶ遺伝子型バリアントを指す。「ＣＭＶ株由来の」という表現は、本明細書において「ＣＭＶ株から誘導された」という表現と同義的に使用され、本明細書におけるその最も広い意味で理解されるものとし、これは、ＣＭＶ株に「戻ることができる」、すなわちＣＭＶ株において天然に存在する対応物または祖先を有することをいう。この用語はまた、改変タンパク質、例えばそれらの天然に存在する対応物と比べてアミノ酸の欠失、挿入または変換などの突然変異を有する改変タンパク質、またはタグを有するタンパク質も包含する。
【０１３１】
[0153]例えば、ＣＭＶタンパク質は、以下のＣＭＶ株、すなわちＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋに受託番号ＦＪ６１６２８５．１で寄託されたゲノムを有するタウン、トレド（ＧＵ９３７７４２．１）、ＡＤ１６９（ＦＪ５２７５６３）、マーリン（ＡＹ４４６８９４．２）、ＴＢ２０／Ｅ（ＫＦ２９７３３９．１）、ＶＲ１８１４（ＧＵ１７９２８９）から誘導されてもよい。Patroneら、J．Virol.、2005、79、8361〜8373によれば、２０４位のアミノ酸Ｙは、アミノ酸Ｆで置換されており、ＵＬ１３０の発現の主要な問題は、次のＯＲＦへのアミノ酸の拡張を引き起こす同じ位置におけるフレームシフトである。注目すべきことに、ＣＭＶ株タウン（ＡＣＣＮ：ＦＪ６１６２８５．１）それ自身は機能的な五量体複合体を発現しないが、本発明者らは、驚くべきことに、遺伝子合成のためにＧｅｎＢａｎｋに受託番号ＦＪ６１６２８５．１で寄託されたタウンからのヌクレオチド配列を使用した場合、機能的な五量体複合体をタウンから得ることができることを見出した（ＯＲＦ  ＵＬ７５（タンパク質番号：ＡＣＭ４８０５３．１）、ＵＬ１１５（ＡＣＭ４８０８５．１）、ＵＬ１２８（ＡＡＲ３１４５１．１）、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１Ａ（ＡＡＲ３１４５３．１））。このような五量体複合体は、マウスにおいて線維芽細胞へのＣＭＶの侵入を予防することができる中和抗体の生成を惹起した。したがって、ＧｅｎＢａｎｋに受託番号ＦＪ６１６２８５．１で寄託されたＣＭＶタウン株のＵＬ７５、ＵＬ１１５、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１ＡをコードするＯＲＦが好ましい。同様に、前記ＯＲＦによってコードされたタンパク質が好ましい。
【０１３２】
[0154]加えて、本発明者らは、ＵＬ１３０のＯＲＦのアミノ酸配列の２０４位にアミノ酸Ｆ（Ｐｈｅ）を有し、加えて結果として機能的なアミノ酸Ｙ（Ｔｙｒ）が生じるタウン実験株（ヒト包皮線維芽細胞で成長させた）の同じ位置におけるフレームシフトが修復されたＣＭＶ株タウン中に存在するＯＲＦの使用が可能であることも見出した。改変ｐＵＬ１３０を使用することも、機能的な五量体複合体を提供する。
【０１３３】
ウイルス
[0155]第五の形態では、本発明は、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋに受託番号ＦＪ６１６２８５．１で寄託されたゲノムを有し、ＵＬ１３０のＯＲＦのアミノ酸配列の２０４位にアミノ酸Ｆを有し、加えて結果として機能的なアミノ酸Ｙが生じるタウン実験株（ヒト包皮線維芽細胞で成長させた）の同じ位置におけるフレームシフトが修復された、改変されたＣＭＶタウン株を提供する。
【０１３４】
[0156]単に例示的な目的のために記載された以下の実施例から、本発明およびその利点のより十分な理解が得られると予想される。実施例は、発明の範囲を限定することを決して意図していない。
【実施例】
【０１３５】
[0157]実施例１：五量体ＣＭＶ複合体の発現、精製および特徴付け
系統的な最適化に基づき規定されたタンパク質発現パラメーターに従って（ＰＣＴ／ＥＰ２０１３／０７２７１７の実施例１を参照）、ｇｐＵＬ７５（ｇＨ−Ｈｉｓ）−ｇｐＵＬ１１５（ｇＬ）−ｇｐＵＬ１２８−ｇｐＵＬ１３０−ｇｐＵＬ１３１Ａを含む五量体ＣＭＶ複合体を、使い捨ての２Ｌ振盪フラスコ（７００ｍｌの培養体積）中、ヨトウムシであるスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞（Ｓｆ９）で、単一のバキュロウイルス（配列番号１８）からの共発現によって生産する。生産パラメーターは以下の通りであった：細胞２×１０６個／ｍｌの感染時における最初の細胞数（ＣＣＩ）、０．２５ｐｆｕ／ｍｌの重複感染度（ＭＯＩ）、１００ｒｐｍで２７℃のインキュベーション。感染後（ｐ．ｉ．）３日目に回収を約８０％の生存率で行った。毎日のサンプリング、細胞数および生存率を決定することによって生産を制御した。複合体を含有する上清を２×５ｍｌのＨｉｓＴｒａｐカラム（ＧＥヘルスケア（GE Healthcare））にローディングした。複合体を、５００ｍｌに等しいカラム体積（ＣＶ）の５０倍量にわたりゼロから５００ｍＭのイミダゾールの直線状の勾配を使用して精製した。異なるクロマトグラフ画分を生化学方法によって分析した。１５０μｌの異なる画分をアセトンで沈殿させ、３０μｌの２０ｍＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４に再懸濁した。４〜１２％ビストリスＮｕＰＡＧＥゲル（インビトロジェン）へのローディングのために、４×ローディング色素を製造元のプロトコールに従って添加し、続いてＭＯＰＳランニング緩衝液を使用して１５０Ｖで１５分間および１８０Ｖで４５分間電気泳動した。ゲルをシンプリーブルー・セーフステイン（SafeStain）試薬（インビトロジェン）で一晩染色し、水で脱色した。濃縮とさらなる精製のため、２回目のＩＭＡＣクロマトグラフィーを、１ｍｌのＨｉｓＴｒａｐカラムを使用して、カラム体積の５０倍量にわたり０から５００ｍＭのイミダゾールの直線状の勾配によって行った。異なる画分を、１回目のＩＭＡＣ工程のようにクーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗Ｈｉｓ抗体を使用した免疫ブロッティングによって分析した。全ての複合体を含有する画分をプールし、５０ｋＤａのカットオフのアミコン（Amicon）フィルターユニット（ミリポア（Millipore））を使用して５ｍｌの最終容量になるまで濃縮し、最終的な精製工程のためにサイズ排除カラム（ＸＫ１６／６９、スーパーデックス２００ｐｇ）にローディングし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとそれに続くクーマシー染色および抗Ｈｉｓ抗体を使用した免疫ブロッティングによって分析した。総タンパク質は、９６−ウェルプレートフォーマットに適合させたブラッドフォードアッセイ（ＢＣＡ、ピアース（Pierce））により決定される。２０μｌの未知または標準サンプルを１８０μｌの緩衝液で希釈した。標準（純粋なウシ血清アルブミン）または未知のサンプルを３連で連続的に２倍希釈した。１ウェル当たり１００μｌの２×ストックのブラッドフォード試薬（ピアース）を添加した。次いでプレートを混合し、マイクロタイタープレートリーダーにおいて５９５ｎｍで吸光度を測定した。クロマトグラフィーベースの精製からの異なる画分に含有さ��る五量体ＣＭＶ複合体を、ｇｐＵＬ７５に付加したＨｉｓ−タグ（ｇＨ、マウス抗Ｈｉｓ、ＡｂＤセロテック）およびｇｐＵＬ７５それ自身（ｇＨ、マウス抗ｇＨ、サンタクルズ）に対する特異的な抗体の結合を調査することによってさらに分析する。それゆえに、９６ウェルの予備吸収させたＥＬＩＳＡプレート中、１００μｌ／ウェルのコーティング緩衝液（０．１ＭのＮａ２ＨＰＯ４、ｐＨ９）で、異なるサンプルを１：１０に希釈し、４℃で一晩インキュベートした。その後プレートを１９５μｌ／ウェルの洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ、０．０５％トウィーン（Tween）２０）で３回洗浄し、続いて１×ＰＢＳ溶液中の１９５μｌ／ウェルの３％ＢＳＡを用いて室温で１時間ブロックした。３回の洗浄工程の後、特異的な抗体、抗Ｈｉｓ抗体（抗Ｈｉｓ）、加えて抗ｇｐＵＬ７５（抗ｇＨ）を、３％ＢＳＡ、１×ＰＢＳ、０．０５％トウィーン２０（ｐＨ７）中１μｇ／ｍｌの濃度で添加し（１００μｌ／ウェル）、室温で１時間インキュベートし、続いてさらに３回洗浄工程を行った。検出のために、適切な二次抗体（抗マウス−ＩｇＧ−ＨＲＰ、３％ＢＳＡ、１×ＰＢＳ、０．０５％トウィーン２０、ｐＨ７で１：１０００希釈）と共に１時間インキュベートした。五量体複合体への特異的な抗体の結合を、１００μｌ／ウェルのＴＭＰ基質試薬（ＢＤバイオサイエンス（BD Biosciences）、サンディエゴ、米国；製造元のプロトコールに従って）を使用して検出するために、３〜１５分後に１００μｌの１ＭのＨＣｌで反応を止め、続いてマイクロプレートリーダーにおいて４５０ｎｍでＯＤを測定した。広い適用範囲の質量分析法によって五量体複合体のタンパク質を同定し、五量体複合体のタンパク質の分子量を以下のように決定した：ＵＬ１２８（ＭＷ：１９７０２．９８２）、ＵＬ１３０（ＭＷ：２４６１８．４６６、ＵＬ１３１Ａ（ＭＷ：１４８６５．５０２）、ｇＬ８ＭＷ：３０８９４．８９２）、ｇＨ（ＭＷ：８３２０３．２９２）。
【０１３６】
上記の表１に、五量体ＣＭＶ複合体を生成するための例示的な発現ベクター（ｐＲＢＴ１３６−ｘ）を例示する。
発現および精製後、五量体複合体は、例えば本明細書で説明されるようなキレート剤および／または安定化剤と混合されてもよい。
【０１３７】
[0158]実施例２：マウスにおけるインビボでの研究
インビボでの研究のために、プライム−ブースト−ブーストレジメンでＢａｌｂ／Ｃマウスを使用した。各グループは８匹のマウスを含有しており、各マウスに注射１回当たり２０μｇのタンパク質を与えた。マウスの１４日の検疫後に（０日目）、免疫前血清を採取した。１０日後に第一の注射を行い、続いて４２日目にブースター注射を行った。４９日目に第一の採血を行った。６１日目に２回目のブースター注射を行い、続いて７０日目にさらに採血した。８５日目に最後の採血を行い、続いて体液性および細胞性免疫応答の調査を行った。
【０１３８】
[0159]実施例３：中和アッセイに基づく体液性免疫応答
五量体複合体（配列番号１８）に基づくワクチン候補の体液性免疫応答を、ＣＭＶ陰性およびＣＭＶ陽性ヒト血液ドナーからの血清と比較した実施例２からのマウス血清の中和アッセイによって調査した。分析上の理由のためのＧＦＰ分子を有するＢＡＣ（細菌人工染色体）再構成ＶＲ１８１４株（固定ＥＧＦＰ）を、線維芽細胞（ＭＲＣ−５）および上皮（ＡＲＰＥ−１９）細胞の感染に使用して、実施例９からのマウス血清の中和可能性を可視化した。細胞２×１０４個／ウェルを、１０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）を含有するＲＰＭＩ培地中の９６ウェルプレートに植え付けた。８匹のマウスの血清プールを作製し、１００μｌ／ウェルのＲＰＭＩ／ＦＣＳ培地での２倍連続希釈液（１：２０から１：２５６０）に添加した。上述した固定ＥＧＦＰ  ＶＲ１８１４ウイルスを、事前のアッセイで決定されたウイルス分子１０００個／ウェルの組織培養感染量（ＴＣＩＤ）で添加した。９６ウェルプレートを、ＣＯ２が制御された雰囲気中で３７℃で８日間インキュベートした。プレートリーダーで以下のパラメーターを用いて緑色細胞の決定を行った：フルオレセインフィルター［励起４８５／２０、放出５３０／２５）、ボトムの読み取りモード、時間：０．１秒、９６時間のインキュベーション後に測定２５回／ウェル。中和効力を、５０％のウイルス感染阻害を示すことができる血清の希釈率として決定した。以下の対照：細胞対照（細胞＋ＰＢＳ）、ウイルス対照（感染細胞のみ）ならびにヒト血液ドナーからの５つのＣＭＶ陽性および５つのＣＭＶ陰性血清を用いた。
【０１３９】
[0160]実施例４：ＥｌｉＳｐｏｔデータ（マルチプレックスアッセイ）に基づく細胞性免疫応答
インビボでの研究（実施例２）の８５日目にマウスを殺し、１０種の異なるサイトカインの分析のために脾臓細胞を準備した。脾臓細胞の再刺激のために、複合体に加えて合成ペプチドの混合物を使用した。以下のタンパク質：ＨＩＶｇａｇ、ｐＵＬ８３、ｇｐＵＬ７５、ｇｐＵＬ１１５、ｇｐＵＬ５５、ｇｐＵＬ１２８、ｇｐＵＬ１３０およびｇｐＵＬ１３１Ａを検証した。各タンパク質のエピトープ予測を数種のバイオインフォマティクスアルゴリズムを使用して行った。各タンパク質につき４種のペプチドの混合物を脾臓細胞の再刺激のために生成した。ＨＩＶｇａｇの場合、１３０種のペプチドの市販のペプチド混合物（ＪＰＴ、ベルリン）を使用した。サイトカイン（ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ｇＣＭＳＦおよびＴＮＦアルファ）を、インビトロジェンからのマルチプレックスアッセイキットにより製造元のプロトコールに従って調査した。
【０１４０】
[0161]実施例５：ＥｌｉＳｐｏｔデータ（マルチプレックスアッセイ）に基づく細胞性免疫応答
インビボでの研究（実施例２）の８５日目にマウスを殺し、１０種の異なるサイトカインの分析のために脾臓細胞を準備した。脾臓細胞の再刺激のために、複合体［２μｇ／ｍＬ］およびｒｅ−ＣＭＶ−ＶＬＰ［２μｇ／ｍＬ］を使用して、同種および／または異種プライム−ブーストレジメンのための最初のデータを得た。以下のタンパク質：ｇｐＵＬ７５、ｇｐＵＬ１１５、ｇｐＵＬ１２８、ｇｐＵＬ１３０およびｇｐＵＬ１３１Ａを複合体に関して検証した。サイトカイン（ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ｇＣＭＳＦおよびＴＮＦアルファ）を、インビトロジェンからのマルチプレックスアッセイキットにより製造元のプロトコールに従って調査した。複合体で免疫化されたマウスのｒｅＣＭＶ−ＶＬＰでの再刺激は、ＩＬ−４、ｇＣＭＳＦおよびＩＬ−５の分泌によって検証されたＴ細胞応答の誘導をもたらした。同じ血清の複合体で再刺激された後のサイトカイン分泌は、前述のものと比較してより低かった。これらの結果に基づけば、複合体（１〜１０μｇ／マウスの範囲で）でプライミングし、ｒｅＣＭＶ−ＶＬＰ（さらなるタンパク質、例えばｇｐＵＬ８３、ｇｐＵＬ５５を含む）でブースティングすることは、有望なアプローチであり得る。
【０１４１】
[0162]実施例６：２種の異なる株からのタンパク質を含む五量体ＣＭＶ複合体の発現、精製および特徴付け
系統的な最適化に基づき規定されたタンパク質発現パラメーターに従って（ＰＣＴ／ＥＰ２０１３／０７２７１７の実施例１を参照）、ｇｐＵＬ７５（ｇＨ−Ｈｉｓ）−ｇｐＵＬ１１５（ｇＬ）−ｇｐＵＬ１２８−ｇｐＵＬ１３０−ｇｐＵＬ１３１Ａを含む五量体ＣＭＶ複合体を、使い捨ての振盪フラスコまたはウェーブバッグ（最大２５Ｌの培養体積）中、ヨトウムシであるスポドプテラ・フルギペルダ細胞のバリアント（Ｓｕｐｅｒ−Ｓｆ９）で、単一のバキュロウイルス（配列番号６７）からの共発現によって生産する。この複合体は、２種の異なるＨＣＭＶ株（タウン［ＮＣＢＩ  ＦＪ６１６２８５．１およびＶＲ１８１４［ＮＣＢＩ  ＧＵ１７９２８９）由来のタンパク質を含有する。生産パラメーターは以下の通りであった：細胞２×１０６個／ｍｌの感染時における最初の細胞数（ＣＣＩ）、０．２５ｐｆｕ／ｍｌの重複感染度（ＭＯＩ）、１００ｒｐｍで２７℃のインキュベーション。感染後３日目に（感染後５５〜６５時間）回収を約８０％の生存率で行った。毎日のサンプリング、細胞数、平均細胞直径、凝集および生存率を決定することによって生産を制御した。複合体を含有する上清をＮｉ２＋充填済みセファロースカラム（ＧＥヘルスケア）にバルクの体積に応じた異なるスケールでローディングした。複合体を、約４６０ｍｌに等しいカラム体積（ＣＶ）の２３倍量にわたりゼロから５００ｍＭのイミダゾールの段階的な勾配を使用して精製した。異なるクロマトグラフ画分を生化学方法によって分析した。１５０〜３００μｌの異なる画分をアセトンで沈殿させ、３３μｌの２０ｍＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４に再懸濁した。４〜１２％ビストリスＮｕＰＡＧＥゲル（インビトロジェン）へのローディングのために、４×ローディング色素を製造元のプロトコールに従って添加し、続いてＭＯＰＳランニング緩衝液を使用して１５０Ｖで１５分間および１８０Ｖで４５分間電気泳動した。ゲルをシンプリーブルー・セーフステイン試薬（インビトロジェン）で少なくとも１時間染色し、水で脱色した。濃縮とさらなる精製のため、２回目のＩＭＡＣクロマトグラフィーを、さらなるセファロースカラム（５ｍＬのＨｉｓＴｒａｐ）およびカラム体積（ＣＶ）の３１倍量にわたり０から５００ｍＭのイミダゾールの段階的な勾配を使用して行った。異なる画分を、１回目のＩＭＡＣ工程のようにクーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。全ての複合体を含有する画分を統合し、ＰＡＬＬマイクロセップ遠心デバイスで濃縮して、２５ｍＭトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ６．５、３ｍＭのＥＤＴＡを含有する貯蔵緩衝液に対して透析した。精製された可溶性複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（上述の通り）、それに続くクーマシー染色および様々な量のＢＳＡと比較した濃度測定分析によって分析した。
【０１４２】
[0163]上記の表１に、五量体ＣＭＶ複合体を生成するための例示的な発現ベクター（ｐＲＢＴ１３６−ｘ）を例示する。
[0164]発現および精製後、五量体複合体は、例えば本明細書で説明されるようなキレート剤および／または安定化剤と混合されてもよい。
【０１４３】
[0165]実施例７：異なる抗原を含むマウスにおけるインビボでの研究
インビボでの研究のために、プライム−ブースト−ブーストレジメンでＢａｌｂ／Ｃマウスを使用した。各グループは８匹のマウスを含有しており、各マウスに、アジュバント含有または非含有のいずれかで注射１回当たり５μｇ、１０μｇまたは２０μｇのタンパク質を与えた。陰性対照としてＰＢＳを使用し、陽性対照は、不活性化ＡＤ１６９溶解産物であり、残りのバキュロウイルス（ＢＶ）の調査のために、精製後に残りのバキュロウイルスの一致した力価を有する生産ウイルスを同様に注射した。マウスの６日の検疫後に（０日目）、免疫前血清を採取した。１０日後に第一の注射を行い、続いて２８日目にブースター注射を行った。３６日目に第一の採血を行った。４８日目に２回目のブースター注射を行い、続いて５５日目にさらに採血した。６０日目に最後の採血を行い、続いて体液性および細胞性免疫応答の調査を行った。体重を毎週測定した（図１２を参照）。
【０１４４】
[0166]実施例８：中和アッセイに基づく体液性免疫応答
五量体複合体バリアント（配列番号１８；配列番号６７、加えてウイルス様粒子と組み合せた［ＶＬＰ；配列番号６、ＵＬ８６、ＵＬ８５、ＵＬ４８、ＵＬ８３およびＵＬ７４を含む担体上］）に基づくワクチン候補の体液性免疫応答を、ＣＭＶ陰性およびＣＭＶ陽性ヒト血液ドナーからの血清と比較した実施例７からのマウス血清の中和アッセイによって調査した。分析上の理由のためのＧＦＰ分子を有するＢＡＣ（細菌人工染色体）再構成ＶＲ１８１４株（固定ＥＧＦＰ）、加えてＴＢ４０Ｅ株を、線維芽細胞（ＭＲＣ−５）および上皮（ＡＲＰＥ−１９）細胞の感染に使用して、実施例からのマウス血清の中和可能性を可視化した。細胞２×１０４個／ウェルを、１０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）を含有するＲＰＭＩ培地中の９６ウェルプレートに植え付けた。８匹のマウスのうち４匹マウスの血清プールを作製し、１００μｌ／ウェルのＲＰＭＩ／ＦＣＳ培地での２倍連続希釈液（１：２０から１：２５６０）に添加した。上述した固定ＥＧＦＰ  ＶＲ１８１４ウイルス、加えてＴＢ４０Ｅを、事前のアッセイで決定されたウイルス分子１０００個／ウェルの組織培養感染量（ＴＣＩＤ）で添加した。９６ウェルプレートを、ＣＯ２が制御された雰囲気中で３７℃で８日間インキュベートした。プレートリーダーで以下のパラメーターを用いて緑色細胞の決定を行った：フルオレセインフィルター［励起４８５／２０、放出５３０／２５）、ボトムの読み取りモード、時間：０．１秒、９６時間のインキュベーション後に測定２５回／ウェル。中和効力を、５０％のウイルス感染阻害を示すことができる血清の希釈率として決定した。以下の対照：細胞対照（細胞＋ＰＢＳ）、ウイルス対照（感染細胞のみ）ならびにヒト血液ドナーからの５つのＣＭＶ陽性および５つのＣＭＶ陰性血清を用いた。興味深いことに、五量体複合体での免疫化により放出された中和抗体は、ウイルス株とは無関係に線維芽細胞を介したウイルス侵入を低減または阻害する能力を同様に有する。これらのデータから、五量体複合体を含有するワクチンに基づく広範な免疫応答の達成が可能になることが期待される（図８を参照）。
【０１４５】
[0167]実施例９：ＥｌｉＳｐｏｔデータ（マルチプレックスアッセイ）に基づく細胞性免疫応答
インビボでの研究（実施例２）の６０日目にマウスを殺し、脾臓細胞を３種の異なるサイトカインの分析のために調製した。脾臓細胞の再刺激のために、ＡＤ１６９ウイルス溶解産物を使用した。サイトカイン（ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−４、ＩＬ−５）を、インビトロジェンからのマルチプレックスアッセイキットにより製造元のプロトコールに従って調査した。機能的ではない五量体複合体を含有するウイルス溶解産物での再刺激後のサイトカイン分泌は、Ｔｈ−１およびＴｈ−２応答を引き起こした。機能性タンパク質での再刺激は、有望なサイトカイン誘導を引き起こすことが可能であった。アジュバントは、ＩＬ−４分泌を介した測定された特異的なＴｈ−２応答の増加を引き起こした。低い五量体複合体の投薬量（５μｇ）のほうが、高い投薬量（１０μｇ）より有益のようである。バキュロウイルス抗原は、ごくわずかなサイトカイン分泌のみを引き起こした（図７を参照）。
【０１４６】
[0168]実施例１０：タウン株由来のタンパク質を含む五量体ＣＭＶ複合体の改善された発現、精製および特徴付け
系統的な最適化に基づき規定されたタンパク質発現パラメーターに従って（ＰＣＴ／ＥＰ２０１３／０７２７１７の実施例１を参照）、ｇｐＵＬ７５（ｇＨ−Ｈｉｓ）−ｇｐＵＬ１１５（ｇＬ）−ｇｐＵＬ１２８−ｇｐＵＬ１３０−ｇｐＵＬ１３１Ａを含む五量体ＣＭＶ複合体を、使い捨ての振盪フラスコまたはウェーブバッグ（最大２５Ｌの培養体積）中、ヨトウムシであるスポドプテラ・フルギペルダ細胞のバリアント（Ｓｕｐｅｒ−Ｓｆ９）で、単一のバキュロウイルス（配列番号６７）からの共発現によって生産する。この複合体は、ＨＣＭＶ株タウン（［ＮＣＢＩ  ＦＪ６１６２８５．１）由来のタンパク質を含有する。生産パラメーターは以下の通りであった：細胞２×１０６個／ｍｌの感染時における最初の細胞数（ＣＣＩ）、０．１から１の範囲の重複感染度（ＭＯＩ）、１００ｒｐｍで２７℃のインキュベーション。感染後２〜３日目に（感染後４８〜６５時間）回収を約８０％の生存率で行った（表３を参照）。毎日のサンプリング、細胞数、平均細胞直径、凝集および生存率を決定することによって生産を制御した。ウェーブバッグ中での生産のために、異なるパラメーター：１９から２２ｒｐｍの間の回転数、６の角度および制御された酸素供給との組合せが選択された。複合体を含有する上清をＮｉ２＋充填済みセファロースカラム（ＧＥヘルスケア）にバルクの体積に応じた異なるスケールでローディングした。複合体を、カラム体積（ＣＶ）の７〜１５倍量にわたりゼロから５００ｍＭのイミダゾールの段階的な勾配を使用して精製した。１５μｌの直接のローディング、または１５０〜３００μｌの様々な画分のアセトン沈殿（３３μｌの２０ｍＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４に再懸濁した）のいずれかによって、異なるクロマトグラフ画分を生化学方法によって分析した。４〜１２％ビストリスＮｕＰＡＧＥゲル（インビトロジェン）へのローディングのために、４×ローディング色素を製造元のプロトコールに従って添加し、続いてＭＯＰＳランニング緩衝液を使用して１５０Ｖで１５分間および１８０Ｖで４５分間電気泳動した。ゲルをシンプリーブルー・セーフステイン試薬（インビトロジェン）で少なくとも１時間染色し、水で脱色した。残りのバキュロウイルスの量を少なくするために、陰イオン交換クロマトグラフィーをネガティブモードで行った。さらなるセファロースカラム（スケールは体積に依存する）とカラム体積（ＣＶ）の１５〜３０倍量にわたり０から５００ｍＭのイミダゾールの段階的な勾配を使用した２回目のアフィニティークロマトグラフィーによって、五量体複合体を含有する通過画分をさらに濃縮し、精製した。異なる画分を、１回目のＩＭＡＣ工程のようにクーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。全ての複合体を含有する画分を統合し、品質をコントロールした。ＰＡＬＬマイクロセップ遠心デバイスを用いた濃縮物は、統合することができた。イミダゾールの排出を数種の透析工程によって行った。第一の透析緩衝液は、２０ｍＭのＥＤＴＡを含有しており、次いでそれより少量の０〜３ｍＭのＥＤＴＡに低減される。例えばＰＢＳへの完全な緩衝液の切り替えも可能である。複合体の貯蔵および安定化のために、トウィーン２０、トウィーン８０、グリセロールなどの様々な化学物質が添加されてもよい。精製された可溶性複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（上述の通り）、それに続くクーマシー染色および様々な量のＢＳＡと比較した濃度測定分析によって分析した。タンパク質濃度を、ＢＣＡアッセイ、同様に残りのバキュロウイルスによって決定した。残りのバキュロウイルスのゲノムは、ウイルス参照遺伝子（ＩＥ−１）に基づくｑＰＣＲに加えて、平衡色素（equilibrium dye）の組合せを使用したウイルスカウンター（ヴィロサイト（Virocyt））でのウイルスキャプシド中のウイルスゲノム（および一般的には核酸）およびタンパク質の蛍光測定によって決定される。核酸およびウイルス膜タンパク質の同時の吸光度決定によるこの「組合せ」のアプローチはウイルス粒子総量の検出を可能にし、それに対して感染性の粒子は、プラークアッセイによって測定した。ＬＡＬアッセイをベースとしたチャールスリバー（Charles River）製のエンドセーフ（Endosafe）デバイス（ＰＴＳ２０Ｆ）を、認証を受けた使い捨てのカートリッジを使用した内毒素決定に使用した。インビトロジェン製のＱｕａｎｔ−ｉＴ（商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）アッセイ（Ｐ７５８９）を、最終産物中のｄｓＤＮＡ含量決定に使用した。
【０１４７】
ＤＳＰプロセス（ＩＭＡＣ−ＡＥＸ−ＩＭＡＣ）の最後における生成物の同一性を直接のＥＬＩＳＡを介して確認した。α−ｇＨ−抗体（サンタクルズ、ｓｃ−５８１１３）およびα−Ｈｉｓ−抗体（ＡｂＤセロテック、ＭＣＡ１３９６）で複合体を検証し、α−マウス−ＨＲＰ抗体（セルシグナリング、７０７６Ｓ）で検出した（図９および１０を参照）。
【０１４８】
発現および精製後、五量体複合体は、例えば本明細書で説明されるようなキレート剤および／または安定化剤と混合されてもよい（図１１を参照）。
【図１−１】
2017515503.tif 000004
【図１−２】
2017515503.tif 000005
【図１−３】
2017515503.tif 000006
【図２Ａ】
2017515503.tif 000007
【図２Ｂ】
2017515503.tif 000008
【図２Ｃ】
2017515503.tif 000009
【図２Ｄ】
2017515503.tif 000010
【図２Ｅ】
2017515503.tif 000011
【図３】
2017515503.tif 000012
【図４】
2017515503.tif 000013
【図５】
2017515503.tif 000014
【図６】
2017515503.tif 000015
【図７−１】
2017515503.tif 000016
【図７−２】
2017515503.tif 000017
【図７−３】
2017515503.tif 000018
【図８Ａ】
2017515503.tif 000019
【図８Ｂ】
2017515503.tif 000020
【図８Ｃ】
2017515503.tif 000021
【図８Ｄ】
2017515503.tif 000022
【図９】
2017515503.tif 000023
【図１０】
2017515503.tif 000024
【図１１Ａ】
2017515503.tif 000025
【図１１Ｂ】
2017515503.tif 000026
【図１１Ｃ】
2017515503.tif 000027
【図１２】
2017515503.tif 000028
【配列表】
2017515503000001.app
【国際調査報告】
2017515503.tif 000029
2017515503.tif 000030
2017515503.tif 000031
2017515503.tif 000032