(57)【要約】  アミロイド−ベータ（Ａβ）の変異体形態、及び変異体Ａβを含むキットが開示される。本発明はまた、Ａβ研究、例えばアルツハイマー病の治療に用いるための新規化合物をスクリーニングするためのアッセイ及び方法における、これらのキット及びＡβ変異体の使用も提供する。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型アミロイド−ベータ（Ａβ）ペプチドの修飾されたアミノ酸配列を含む変異体アミロイド−ベータ（Ａβ）ペプチドであって、前記修飾されたアミノ酸ペプチドは、前記野生型ペプチドと比較して低下した凝集傾向を示す、変異体アミロイド−ベータ（Ａβ）ペプチド。
【請求項２】
前記変異体アミロイド−ベータ（Ａβ）ペプチドは、実質的に配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む、前記野生型Ａβペプチド由来の修飾されたアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の変異体Ａβペプチド。
【請求項３】
前記変異体アミロイド−ベータ（Ａβ）ペプチドは、配列番号１の１６〜２１番目または３７〜４２番目のアミノ酸において１つ以上の修飾を含む、請求項１または２に記載の変異体Ａβペプチド。
【請求項４】
前記変異体アミロイド−ベータ（Ａβ）ペプチドは、配列番号１の１６〜２１番目または３７〜４２番目のアミノ酸において少なくとも２つの修飾を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の変異体Ａβペプチド。
【請求項５】
前記変異体アミロイド−ベータ（Ａβ）ペプチドは、配列番号１の１６〜２１番目のアミノ酸において少なくとも１つの修飾と、配列番号１の３７〜４２番目のアミノ酸において少なくとも１つの修飾とを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の変異体Ａβペプチド。
【請求項６】
前記変異体アミロイド−ベータ（Ａβ）ペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｆ１９またはＧ３７の修飾によって形成される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の変異体Ａβペプチド。
【請求項７】
前記変異体アミロイド−ベータ（Ａβ）ペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｆ１９及びアミノ酸残基Ｇ３７の修飾によって形成される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の変異体Ａβペプチド。
【請求項８】
前記アミノ酸残基Ｆ１９の修飾は、セリンでの置換を含む、請求項２〜７のいずれか一項に記載の変異体Ａβペプチド。
【請求項９】
前記変異体アミロイド−ベータ（Ａβ）ペプチドは、実質的に配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の変異体Ａβペプチド。
【請求項１０】
前記アミノ酸残基Ｇ３７の修飾は、アスパラギン酸での置換を含む、請求項２〜９のいずれか一項に記載の変異体Ａβペプチド。
【請求項１１】
前記変異体アミロイド−ベータ（Ａβ）ペプチドは、実質的に配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の変異体Ａβペプチド。
【請求項１２】
前記変異体アミロイド−ベータ（Ａβ）ペプチドは、Ｆ１９Ｓ置換またはＧ３７Ｄ置換を含む、請求項２〜１１のいずれか一項に記載の変異体Ａβペプチド。
【請求項１３】
前記変異体アミロイド−ベータ（Ａβ）ペプチドは、Ｆ１９Ｓ置換及びＧ３７Ｄ置換を含む、請求項２〜１２のいずれか一項に記載の変異体Ａβペプチド。
【請求項１４】
前記変異体アミロイド−ベータ（Ａβ）ペプチドは、実質的に配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の変異体Ａβペプチド。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の変異体アミロイド−ベータ（Ａβ）ペプチドをコードする、単離された核酸分子。
【請求項１６】
前記単離された核酸分子は、実質的に配列番号５〜７のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、またはその機能的変異体、好ましくは実質的に配列番号７に示されるヌクレオチド配列、またはその機能的変異体を含む、請求項１５に記載の単離された核酸分子。
【請求項１７】
請求項１５または１６に記載の核酸分子を含む、遺伝子コンストラクト。
【請求項１８】
請求項１７に記載の遺伝子コンストラクトを含む、組換えベクター。
【請求項１９】
請求項１７に記載の遺伝子コンストラクト、または請求項１８に記載の組換えベクター、を含む、宿主細胞。
【請求項２０】
請求項１９に記載の少なくとも１つの宿主細胞を含む、トランスジェニック宿主生物。
【請求項２１】
アルツハイマー病の診断に用いる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の変異体アミロイド−ベータ（Ａβ）ペプチド。
【請求項２２】
Ａβ研究における陰性対照として、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の変異体アミロイド−ベータ（Ａβ）ペプチドの使用。
【請求項２３】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の変異体アミロイド−ベータ（Ａβ）ペプチドを含む、アミロイド−ベータ（Ａβ）試験キット。
【請求項２４】
前記キットは、野生型Ａβペプチドを含む、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
前記キットは、任意の予め凝集したペプチドを分解する溶媒、ならびに場合により緩衝液及び／または脱塩カラムを含む、請求項２３または請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
前記溶媒は、ヘキサフルオロイソプロパノール及び／またはジメチルスルホキシドである、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２７】
凝集アッセイ；細胞毒性アッセイ；動物試験、例えば行動試験、分子、細胞または組織の変化；細胞摂取アッセイ；膜透過アッセイ；生存細胞イメージング及び免疫蛍光を用いるＡβ局在化アッセイ；イムノゴールド電子顕微鏡法；から選択されるアッセイ、または野生型Ａβの作用及び挙動を対照変異体Ａβと比較し対比させる分子研究における、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の変異型アミロイド−ベータ（Ａβ）ペプチド、または請求項２３〜２６のいずれか一項に記載のキットの使用。
【請求項２８】
野生型Ａβペプチドの凝集または毒性を調節する化合物をスクリーニングするためのアッセイであって、前記アッセイは、
（ａ）野生型Ａβペプチド及び請求項１〜１４のいずれか一項に記載の変異体Ａβペプチドを含むアッセイ系を提供することと、
（ｂ）前記アッセイ系に試験化合物を導入し、前記野生型Ａβペプチドの凝集及び／または毒性の程度を測定することと、
（ｃ）前記野生型Ａβペプチドの凝集及び／または毒性の程度を前記変異型Ａβペプチドのものと比較することと、を含み、
前記変異体Ａβペプチドのものと比較した、前記試験化合物の存在下での前記野生型Ａβペプチドの凝集及び／または毒性の変化が、前記試験化合物が野生型Ａβペプチドの凝集または毒性の調節因子であることを示す、アッセイ。
【請求項２９】
アルツハイマー病の予防または治療に有用な治療薬のスクリーニング方法であって、前記方法は、
（ａ）野生型Ａβペプチドを含むアッセイ系に試験化合物を導入することと、
（ｂ）前記野生型Ａβペプチドの凝集及び／または毒性の程度を測定することと、を含み、
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の前記変異体Ａβペプチドの凝集及び／または毒性と比較して、前記試験化合物の存在下での前記野生型Ａβペプチドの凝集及び／または毒性の変化が、アルツハイマー病を調節する前記試験化合物の能力の指標である、方法。
【請求項３０】
工程（ａ）で使用される前記アッセイ系は、インビトロ、インビボ、またはエクスビボ系であってもよい、請求項２８に記載のアッセイまたは請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記アッセイ系は、非ヒト動物モデルである、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載のアッセイまたは方法。
【請求項３２】
前記動物は、トランスジェニック類人猿、サル、マウス、ラット、魚、フェレット、ヒツジ、イヌ、ネコ、虫、またはショウジョウバエである、請求項３１に記載のアッセイまたは方法。
【請求項３３】
野生型Ａβペプチドの凝集または毒性を調節する化合物をスクリーニングするためのキットであって、前記キットは、
（ａ）野生型Ａβペプチドと、
（ｂ）請求項１〜１４のいずれか一項に記載の変異体Ａβペプチドと、を含み、
前記キットは、前記変異体Ａβペプチドの凝集及び／または毒性と比較して、試験化合物の存在下で前記野生型Ａβペプチドの凝集及び／または毒性の変化を同定するように構成されており、前記変化は、前記試験化合物が野生型Ａβペプチドの凝集または毒性の調節因子であることを示す、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病（ＡＤ）に関し、具体的には、排他的ではないが、アミロイド−ベータ（ＡβまたはＡベータ）、及びそれらの変異体に関する。本発明はまた、変異体Ａβを含むキット、ならびにＡβ研究、例えばＡＤの治療に用いるための新規化合物のスクリーニングアッセイ及び方法におけるこれらのキット及びＡβ変異体の使用を含む。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、細胞外アミロイドプラーク中のＡβの沈着、ならびに脳内の神経原線維変化におけるタウの細胞内蓄積を特徴とする。Ａβ及びアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の突然変異は、家族性ＡＤに関連しており、したがってＡβは、疾患過程において重要な役割を果たしていると考えられている。ＡＤ患者で観察された神経変性及びＡβの症状に、Ａβがどのように関与しているかをより良く理解するために、多くの研究が行われてきた。これらの研究のいくつかはトランスジェニック動物で行われているが、他ではこれらの系におけるオリゴマー及び原線維Ａβの直接効果を調べるために、生体模倣膜、培養神経細胞または動物注射を使用している。
【０００３】
Ａβは毒性であり、膜欠損、神経細胞死及び機能（ＬＴＰ）に影響を与え、動物の行動及び神経網の変化を引き起こすことが示されている。Ａβペプチドは、アミロイド形成ペプチド及びタンパク質（１）の大きなグループのメンバーであり、これらのアミロイド形成ペプチドの毒性効果は、自己集合βシートリッチオリゴマー種とクロスβ構造化アミロイド繊維を形成するための自己集合能力にリンクすると考えられている。
【発明の概要】
【０００４】
重要なことは、Αβ研究における実験対照は、ビヒクルのみ（すなわちバッファ）、スクランブルΑβペプチド、リバースΑβ、及び野生型Αβの２つの短縮形、すなわちΑβ４０とΑβ１−２８、に限定される。これらのペプチド対照はΑβ研究における実験対照についての手段を提供する一方で、それらの有する問題は、あまり特徴づけられていない、オリゴマー種または原線維を形成するよう集合もするかもしれないということである。また、それらのいくつかは、野生型Αβと組成物全体の類似性を共有しながらも、それらは配列では大きく異なる。したがって、現在使用可能なΑβ対照ペプチドはΑβ研究において不十分である。
【０００５】
したがって、例えば試験キットにおいて、Αβ研究で用いるための適切な陰性対照として作用できる、代替Αβペプチドが必要である。
【０００６】
実施例に記載のように、本発明者らは、Αβ研究のための適切な対照ペプチドを提供するために、非凝集傾向であり、集合、構造、及び毒性効果が十分に特徴づけられた、Αβの非毒性変異体を設計した。
【０００７】
したがって、第１の態様によれば、野生型Ａβペプチドの修飾されたアミノ酸配列を含む変異体アミロイド−ベータ（Ａβ）ペプチドであって、修飾されたアミノ酸ペプチドは野生型ペプチドと比較して凝集低下傾向を示す、ペプチドを提供する。
【０００８】
驚くべきことに、本発明者らは、野生型ペプチドを、細胞傷害性を有する強く凝集するペプチドから、細胞アッセイにおいて集合または毒性を引き起こすことができないペプチドに、驚くべきことに変換する、少なくとも１つのアミノ酸変化を伴う第１の態様によるＡβの変異体を産生することに成功した。変異Αβペプチドは、その配列、ＰＩ、分子量、ならびに他の化学的特性の点で、Αβの毒性野生型の形態と同様であるが、重要なことに、凝集してβシート構造を形成しないように改変されている。好都合なことに、本発明の変異体Αβペプチドは、例えば試験キットで、Αβの任意の効果を検証するため、またはＡＤの治療に用いるための新規化合物のスクリーニングアッセイを実施するため、堅牢な陰性対照として使用することができる。さらに、変異体Αβペプチドは、Ａβの毒性または凝集を標的とする潜在的治療法の有効性を試験するために堅牢な実験を行うことを可能にする。
【０００９】
野生型Ａβ（１−４２）のアミノ酸配列は既知であり、以下のように本明細書において配列番号１として表すことができる。
【００１０】
【化１】
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【００１１】
したがって、好ましくは、第１の態様の変異体アミロイド−ベータ（Αβ）ペプチドが、配列番号１に実質的に示されるアミノ酸配列を含む野生型Αβペプチドに由来する修飾されたアミノ酸配列を含む。図１は、ＷＡＬＴＺを使用して作成されたグラフであり、野生型Αβ（１−４２）ペプチドのアミロイド形成性領域を示す２つのピークを示す（すなわち、太字及び下線で以下に示した、配列番号１の残基１６〜２１及び残基３７〜４２）。
【００１２】
したがって、好ましくは、本発明の変異体アミロイド−ベータ（Αβ）ペプチドは、配列番号１のアミノ酸１６〜２１または３７〜４２内の１つ以上の修飾を含む。好ましくは、変異体アミロイド−ベータ（Αβ）ペプチドは、配列番号１のアミノ酸１６〜２１または３７〜４２において少なくとも２つの修飾を含む。好ましくは、変異体アミロイド−ベータは（Αβ）ペプチドは、配列番号１のアミノ酸１６〜２１において少なくとも１つの修飾と、配列番号１のアミノ酸３７〜４２において少なくとも１つの修飾を含む。それらまたは各々の修飾は、好ましくは置換である。
【００１３】
本発明者らは、野生型Αβ（１−４２）、及びアミノ酸における２つのアミロイド形成領域に導入された多数のアミノ酸置換を試験した。その後アミロイド形成性領域についてのピークを低減する置換を候補リスト化し、表１にまとめた。これらの知見に基づいて、本発明者らは、配列番号１の残基１９及び３７が、Ａβ毒性及び凝集を制御するために特に重要であることを観察して驚いた。したがって、変異体アミロイド−ベータ（Αβ）ペプチドの好ましい実施形態は、配列番号１のアミノ酸残基Ｆ１９またはＧ３７の修飾によって形成されている。最も好ましくは、変異体アミロイド−ベータ（Αβ）ペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｆ１９及びＧ３７の修飾によって形成されている。
【００１４】
好ましくは、アミノ酸残基Ｆ１９での修飾は、セリンでの置換を含む。したがって、好ましい一実施形態では、変異体アミロイド−ベータ（Ａβ）ペプチドは、以下のように、配列番号２に実質的に示されるアミノ酸配列を含む。
【００１５】
【化２】
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【００１６】
好ましくは、アミノ酸残基Ｇ３７における修飾は、アスパラギン酸での置換を含む。したがって、別の好ましい実施形態では、変異型アミロイド−ベータ（Ａβ）ペプチドは、以下のように、配列番号３に実質的に示されるアミノ酸配列を含む。
【００１７】
【化３】
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【００１８】
好ましくは、変異体アミロイド−ベータ（Αβ）ペプチドはＦ１９Ｓ置換またはＧ３７Ｄ置換を含む。しかし最も好ましい変形アミロイド−ベータ（Αβ）ペプチドは、Ｆ１９Ｓ置換及びＧ３７Ｄ置換を含む。したがって、変異型アミロイド−ベータ（Ａβ）ペプチドは、以下のように、配列番号４に実質的に示されるアミノ酸配列を含む。
【００１９】
【化４】
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【００２０】
したがって、好ましくは、変異体アミロイド−ベータ（Αβ）ペプチドは、配列番号１の野生型配列に基づく二重変異体を含む。
【００２１】
本発明はまた、本明細書で定義される変異体アミロイド−ベータ（Αβ）ペプチドの実施形態をコードする核酸を提供する。
【００２２】
したがって、第２の態様において、第１の態様に係る変異体アミロイド−ベータ（Αβ）ペプチドをコードする単離された核酸分子が提供される。
【００２３】
本発明の第２の態様による好ましい核酸分子は、以下を含み得る。
【００２４】
【化５】
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【００２５】
上記核酸配列は、宿主として大腸菌Ｋ１２を用いＢａｃｋｔｒａｎｓｅｑのｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ）を用いて作成した。したがって、好ましくは、第２の態様の単離された核酸分子は、配列番号５〜７のいずれか１つに実質的に示されるヌクレオチド配列、またはその機能的変異体を含む。最も好ましくは、核酸分子は、配列番号７に実質的に示されるヌクレオチド配列、またはその機能的変異体、すなわち二重変異体をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００２６】
核酸分子は、単離または精製された核酸配列であってもよい。核酸配列はＤＮＡ配列であってもよい。核酸分子は、合成ＤＮＡを含んでいてもよい。核酸分子は、ｃＤＮＡを含んでいてもよい。核酸は、異種プロモーターに作動可能に連結されてもよい。核酸配列は、クローニング目的のために遺伝子コンストラクトに組み込むことができる。
【００２７】
第３の態様では、したがって、第２の態様の核酸分子を含む遺伝子コンストラクトが提供される。
【００２８】
本発明の遺伝子コンストラクトは、発現カセットの形態であってもよく、これは宿主細胞中でのコードされた変異体ペプチドの発現に適している可能性がある。遺伝子コンストラクトは、ベクターに組み込まれることなく、宿主細胞に導入してもよい。例えば、遺伝子コンストラクトは核酸分子でもよく、リポソームまたはウイルス粒子内に組み込まれてもよい。あるいは、精製された核酸分子（例えばヒストン遊離ＤＮＡ、または裸のＤＮＡ）は、適切な手段、例えば、直接エンドサイトーシス摂取により宿主細胞内に直接挿入してもよい。遺伝子コンストラクトは、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、プロトプラスト融合または弾道衝撃によって（例えば、細菌、真核細胞または動物細胞）を直接、宿主被験体の細胞に導入してもよい。あるいは、本発明の遺伝子コンストラクトは、パーティクルガンを用いて宿主細胞に直接導入してもよい。あるいは、遺伝子コンストラクトは、適切な宿主細胞中での発現のために、組換えベクター内に保有されてもよい。
【００２９】
したがって、第４の態様では、第３の態様に記載の遺伝子コンストラクトを含む組換えベクターが提供される。
【００３０】
組換えベクターは、プラスミド、コスミドまたはファージであってもよい。このような組換えベクターは、第３の態様の遺伝子コンストラクトで宿主細胞を形質転換するために有用であり、その中に発現カセットを複製する。当業者は、本発明の遺伝子コンストラクトは、発現のための多くのタイプの骨格ベクターと組み合わせ得ることを理解するであろう。組換えベクターは、遺伝子の発現を開始するための適切なプロモーターを含む様々な他の機能要素を含んでいてもよい。例えば、組換えベクターは、自律的に、宿主細胞の細胞質で複製するように設計されてもよい。この場合、誘導またはＤＮＡの複製を調節する要素が組換えベクター内に要求され得る。あるいは、組換えベクターは、宿主細胞のゲノムに組み込まれるように設計されてもよい。この場合、誘導またはＤＮＡの複製を調節する要素が組換えベクター内に要求され得る。
【００３１】
組換えベクターはまた、クローニングプロセスにおいて選択マーカーとして使用され得る遺伝子、すなわちトランスフェクトまたは形質転換された細胞の選択を可能にし、異種ＤＮＡを組み込んだベクターを有する細胞の選択を可能にする遺伝子をコードするＤＮＡを含み得る。あるいは、選択マーカー遺伝子は、対象となる遺伝子を含むベクターと同時に使用される異なるベクターであってもよい。ベクターはまた、コード配列の発現調節に関与するＤＮＡを含むか、または発現されたポリペプチドを宿主細胞の特定の部分に標的化するためのＤＮＡを含み得る。
【００３２】
第５の態様では、第４の態様に係る第３の態様の遺伝子コンストラクトを含む宿主細胞、または組換えベクターが提供される。
【００３３】
宿主細胞は、細菌細胞であってもよい。宿主細胞は、動物細胞であってもよい。宿主細胞は、哺乳動物細胞、例えばマウスまたはラット細胞であってもよい。宿主細胞はヒト細胞ではないことが好ましい。宿主細胞は、公知の技術を用いて、本発明による遺伝子コンストラクトまたはベクターで形質転換され得る。遺伝子コンストラクトを宿主細胞へ導入するための適切な手段は、細胞の種類に依存する。
【００３４】
第６の態様では、第５の態様による少なくとも１つの宿主細胞を含むトランスジェニック宿主生物が提供される。
【００３５】
本発明の宿主細胞またはトランスジェニック宿主生物のゲノムは、第１の態様による変異体ペプチドをコードする核酸配列を含み得る。好ましくは、核酸配列は、配列番号５〜７のいずれか１つに実質的に示されるヌクレオチド配列を含む。核酸配列は、核酸配列の発現によって宿主生物が変化した表現型を示す結果となる、核酸配列の発現を駆動する組織特異的発現制御配列（例えばプロモーター）に作動可能に連結され得る。
【００３６】
宿主生物は、多細胞生物であってもよく、好ましくは非ヒトである。例えば、宿主生物は、マウス、ラットまたはショウジョウバエであってもよい。宿主は、神経変性障害、好ましくはアルツハイマー病の研究に使用され得る。
【００３７】
実施例で論じるように、本発明者らは、第１の態様の変異型アミロイド−ベータ（Ａβ）ペプチドが非毒性であり、通常アミロイド斑を生成するβ−シート構造に凝集しないことを実証している。したがって、変異体ペプチドは、アルツハイマー病の診断において有意な有用性を有する。
【００３８】
したがって、第７の態様では、アルツハイマー病の診断に使用するための、第１の態様の変異体アミロイド−ベータ（Ａβ）ペプチドが提供される。
【００３９】
さらに、本発明の変異体Ａβペプチドは、Ａβの任意の作用を検証するための堅牢な陰性対照として使用することができる。
【００４０】
したがって、第８の態様では、Ａβ試験における陰性対照として、第１の態様の変異体アミロイド−ベータ（Ａβ）ペプチドの使用が提供される。
【００４１】
本発明者らは、広範囲のＡβ研究またはアッセイを実施する際に用いるための変異体アミロイド−ベータ（Ａβ）ペプチドを含むキットを開発した。
【００４２】
したがって、第９の態様において、第１の態様の変異体アミロイド−ベータ（Ａβ）ペプチドを含むアミロイド−ベータ（Ａβ）試験キットが提供される。
【００４３】
キットは、好ましくは、変異型Ａβペプチドが含まれる容器を含む。キットは、好ましくは容器内に、野生型Ａβペプチドを含む。
【００４４】
野生型Ａβ（１−４２）及び変異体Ａβ４２は、同一の方法で実施例に記載のプロトコルを用いて調製され、脱凝集形態の、一貫性のある比較可能な出発ペプチドを確実にし、その後、検出キットの後のアッセイにおいて使用することができる。
【００４５】
したがって、好ましくは、キットは予め凝集したペプチドを分解するための溶媒を含む。溶媒は、好ましくは、その、または各ペプチドが含有されている容器中にある。溶媒はヘキサフルオロイソプロパノールであってもよい。溶媒はジメチルスルホキシドであってもよい好ましくは、キットは、ヘキサフルオロイソプロパノール及びジメチルスルホキシドを含む。
【００４６】
好ましくは、キットは、ＨＥＰＥＳ、リン酸緩衝液またはＭＯＰＳなどの緩衝液を含む。好ましくは、キットは脱塩カラムを含む。
【００４７】
好ましくは、キットは、野生型Ａβと変異型Ａβとを比較することにより、アルツハイマー病のＡβの作用を探索するための様々なアッセイで使用されるように構成される。
【００４８】
したがって、第１０の態様では、凝集アッセイから選択されるアッセイにおいて、第１の態様による変異体アミロイド−ベータ（Ａβ）ペプチドまたは第９の態様のキットの使用が提供される。細胞毒性アッセイ；動物試験、例えば行動試験、分子、細胞または組織の変化；細胞摂取アッセイ；膜透過アッセイ；生存細胞イメージング及び免疫蛍光を用いたＡβ局在アッセイ；イムノゴールド電子顕微鏡法；及び野生型Ａβの作用及び挙動を対照変異体Ａβと比較して対比するための分子研究が含まれる。
【００４９】
このアッセイは、アルツハイマー病におけるその役割を理解するために、野生型Ａβの具体的な作用についての貴重な情報を提供する。これらのアッセイのいずれも試験化合物の添加を含むことができるが、これは必須ではなく、多くのアッセイは標的の発見と、創薬そのものではなく生化学的作用の理解に焦点を当てるであろう。
【００５０】
したがって、第１の態様の変異体Ａβペプチドまたは第９の態様のキットは、Ａβの毒性または凝集を標的とする潜在的治療法の有効性を試験するために堅牢な実験を行うことを可能にする。
【００５１】
したがって、第１１の態様では、野生型Ａβペプチドの凝集または毒性を調節する化合物をスクリーニングするためのアッセイが提供され、本アッセイは、
（ａ）野生型Ａβペプチド及び第１の態様の変異体Ａβペプチドを含むアッセイ系を提供することと、
（ｂ）試験化合物をアッセイ系に導入し、野生型Ａβペプチドの凝集及び／または毒性の程度を測定することと、
（ｃ）野生型Ａβペプチドの凝集及び／または毒性の程度を、第１の態様の変異型Ａβペプチドのものと比較することと、を含み、
試験化合物の存在下での野生型Ａβペプチドの、変異体Ａβペプチドのものと比較した凝集及び／または毒性の変化が、試験化合物が野生型Ａβペプチドの凝集または毒性の調節因子であることを示す。
【００５２】
本発明者らはまた、アルツハイマー病を予防または治療するための有用な治療薬をスクリーニングする方法を設計した。
【００５３】
したがって、第１２の態様では、本発明は、アルツハイマー病の予防または治療に有用な治療薬のスクリーニング方法を提供し、本方法は、
（ａ）野生型Ａβペプチドを含むアッセイ系に試験化合物を導入することと、
（ｂ）試験化合物をアッセイ系に導入し、野生型Ａβペプチドの凝集及び／または毒性の程度を測定することと、を含み、
第１の態様の変異体Ａβペプチドの凝集及び／または毒性と比較して、試験化合物の存在下での野生型Ａβペプチドの凝集及びまたは毒性の変化が、アルツハイマー病を調節する試験化合物の能力の指標である。
【００５４】
本発明のアッセイ及び方法は、好ましくは、キット中で行われる。
【００５５】
したがって、第１３の態様では、野生型Ａβペプチドの凝集または毒性を調節する化合物をスクリーニングするためのキットが提供され、本キットは、
（ａ）野生型Ａβペプチドと、
（ｂ）第１の態様の変異体Ａβペプチドと、を含み
本キットは、変異体Ａβペプチドの凝集及び／または毒性と比較して、試験化合物の存在下で野生型Ａβペプチドの凝集及び／または毒性の変化を同定するように構成されており、この変化は、試験化合物が野生型Ａβペプチドの凝集または毒性の調節因子であることを示す。
【００５６】
有利には、及び好ましくは、第１の態様の変異体Ａβペプチドは対照として作用し、野生型Ａβペプチドの介在毒性作用を目的とする潜在的治療薬または化合物の作用を直接比較する手段を提供する。野生型Ａβが毒性作用を引き起こす任意の実験において、変異体対照ペプチドは、非毒性形態の直接比較を提供するであろう。したがって、活性があり、したがって治療的である薬剤または化合物を、アッセイ系へ導入すると、野生型Ａβペプチド（すなわち、その凝集または毒性）を使用した実験セットアップを戻すことが期待され、それは変異体対照ペプチドのそれに匹敵する。したがって、このような試験化合物は、アルツハイマー病の予防または治療に有用な治療薬として使用することができる。一方、活性がないまたは治療的ではない薬剤または化合物を、アッセイ系またはキットへ導入すると、変異型ペプチドのものと比較して野生型Ａβペプチドの凝集／毒性がより大きくなるであろう。
【００５７】
アッセイまたは方法の工程（ａ）で使用されるアッセイ系は、インビトロ、インビボ、またはエクスビボ系であってもよい。アッセイ系は非ヒト動物モデルであってもよい。例えば、動物は、トランスジェニック類人猿、サル、マウス、ラット、魚、フェレット、ヒツジ、イヌ、ネコ、虫、またはショウジョウバエであってもよい。
【００５８】
キットは、好ましくは、野生型Ａβペプチドが含まれる容器を含む。キットは、好ましくは、変異型Ａβペプチドが含まれる容器を含む。好ましくは、キットは、任意の予め凝集したペプチドを分解するための溶媒、例えばヘキサフルオロイソプロパノール及び／またはジメチルスルホキシドを含む。好ましくは、キットは、ＨＥＰＥＳ、リン酸緩衝液またはＭＯＰＳなどの緩衝液を含む。好ましくは、キットは脱塩カラムを含む。
【００５９】
本発明は、機能的変異体または機能的フラグメントを含む、本明細書で言及される任意の配列のアミノ酸または核酸配列を実質的に含む、任意の核酸またはペプチドまたはその変異体、誘導体もしくは類似体にまで及ぶこと理解されよう。用語「実質的にアミノ酸／ヌクレオチド／ペプチド配列」、「機能的変異体」及び「機能的断片」は、例えば配列番号１〜７として同定された配列と４０％の同一性など、本明細書で言及される配列のいずれか１つのアミノ酸／ヌクレオチド／ペプチド配列と少なくとも４０％の配列同一性を有する配列であり得る。
【００６０】
参照される配列のいずれかと６５％を超える、より好ましくは７０％を超える、さらにより好ましくは７５％を超える、さらにより好ましくは８０％を超える配列同一性を有するアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列も想定される。好ましくは、アミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列は、参照される配列のいずれかと少なくとも８５％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９２％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９７％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９８％の同一性、最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する。
【００６１】
当業者であれば、２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間の同一性の割合をどのように計算するか分かるであろう。２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間のパーセント同一性を計算するために、２つの配列のアライメントを最初に調製し、次に配列同一性値を計算しなければならない。２つの配列の同一性の割合は、次の項目によって異なる値をとることがある。（ｉ）ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ（異なるプログラムで実施される）、または３Ｄ比較からの構造的アライメントなど、配列をアライメントさせるために使用される方法；  そして（ｉｉ）アライメント方法によって使用されるパラメータ、例えば、ローカル対グローバルアライメント、使用されるペアスコアマトリックス（例えば、ＢＬＯＳＵＭ６２、ＰＡＭ２５０、Ｇｏｎｎｅｔ等）、ギャップ−ペナルティ、例えば機能的な形態と定数。
【００６２】
アライメントを行った後、２つの配列間の同一性の割合を計算する多くの異なる方法がある。例えば、（ｉ）最短シーケンスの長さ；（ｉｉ）アライメントの長さ；（ｉｉｉ）配列の平均長さ；（ｉｖ）ギャップのない位置の数。（ｉｖ）オーバーハングを除いた等価ポジションの数、によって同一性数を分けてもよい。さらに、パーセント同一性はまた、強く長さに依存することが理解されるであろう。したがって、対の配列が短いほど、偶然に起こると予想される配列同一性が高くなる。
【００６３】
したがって、タンパク質またはＤＮＡ配列の正確なアライメントは複雑なプロセスであることが理解されるであろう。一般的な多重アライメントプログラムＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２，４６７３−４６８０、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２４，４８７６−４８８２）は、本発明に従ってタンパク質またはＤＮＡの複数のアライメントを生成するための好ましい方法である。ＣｌｕｓｔａｌＷの適切なパラメータは以下の通りである：ＤＮＡアライメントの場合：ギャップオープンペナルティー＝１５．０、ギャップ拡張ペナルティ＝６．６６、及びマトリックス＝アイデンティティ。タンパク質アライメントの場合：ギャップオープンペナルティー＝１０．０、ギャップ拡張ペナルティ＝０．２、及びマトリックス＝ゴネット。ＤＮＡ及びタンパク質アライメントの場合：エンドギャップ＝−１及びギャップディスト＝４。それらの当業者であれば、最適な配列アライメントのためにこれら及び他のパラメータを変更する必要があり得ることを認識するであろう。
【００６４】
好ましくは、２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間のパーセント同一性の計算は、（Ｎ／Ｔ）＊１００のような整列から計算することができ、式中、Ｎは配列が同一残基を共有する位置の数であり、Ｔはギャップを含むがオーバーハングを除く位置の総数である。したがって、２つの配列間のパーセント同一性を計算するための最も好ましい方法は、（ｉ）上記のような適切なパラメータセットを用いてＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを用いて配列アライメントを調製し；そして（ｉｉ）Ｎ及びＴの値を以下の式：−配列同一性＝（Ｎ／Ｔ）＊１００、に挿入すること、を含む。
【００６５】
類似の配列を同定するための代替方法は、当業者に知られているであろう。例えば、実質的に類似のヌクレオチド配列は、ストリンジェントな条件下でＤＮＡ配列またはその相補体にハイブリダイズする配列によってコードされる。ストリンジェントな条件では、ヌクレオチドが、約４５℃で３×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中のフィルター結合ＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリダイズした後、約２０〜６５℃で０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で少なくとも１回洗浄することを意味する。あるいは、実質的に類似のポリペプチドは、配列番号１〜４に示される配列と少なくとも１個、しかし５、１０、２０、５０または１００個未満のアミノ酸が異なっていてもよい。
【００６６】
遺伝コードの縮重のために、本明細書に記載の任意の核酸配列は、それによってコードされるタンパク質の配列に実質的に影響を及ぼすことなく、その機能的変異体を提供し得ることは明らかである。適切なヌクレオチド変異体は、配列内の同じアミノ酸をコードする異なるコドンの置換によって変化した配列を有するものであり、したがってサイレント変化を生じる。他の適切な変異体は、相同ヌクレオチド配列を有するが、置換するアミノ酸と同様の生物物理学的特性の側鎖を有するアミノ酸をコードし、保存的変化を生じさせる、異なるコドンの置換によって変化した、配列の全部または一部を含むものである。例えば、小さな非極性疎水性アミノ酸には、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、及びメチオニンが含まれる。大きな非極性疎水性アミノ酸には、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンが含まれる。極性中性アミノ酸には、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン及びグルタミンが含まれる。正に荷電した（塩基性）アミノ酸には、リジン、アルギニン及びヒスチジンが含まれる。負に帯電した（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。したがって、どのアミノ酸が類似の生物物理学的特性を有するアミノ酸で置き換えられ得るかが理解され、当業者はこれらのアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を知るであろう。
【００６７】
本明細書（添付の特許請求の範囲、要約書及び図面を含む）の全ての特徴、及び／または開示された方法またはプロセスの全てのステップは、そのような特徴及び／またはステップの少なくともいくつかが相互に排他的である組み合わせを除いて、任意の組み合わせで上記態様のいずれかと組み合わせることができる。
【００６８】
本発明をより良く理解し、同一の実施形態がどのように実施され得るかを示すために、ここで例として添付図面を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】ＷＡＬＴＺを用いて作製したグラフであり、野生型「Ａβ（１−４２）」ペプチド中の２つのアミロイド形成領域（残基１６〜２１及び残基３７〜４２）を示す２つのピークを示す。置換のために選択されたアミノ酸は太字で強調表示されており、すなわちＦ及びＧである。
【図２】ＦをＳに、ＧをＤに置換することによるアミロイド形成領域の廃絶を示す、本発明の実施形態による変異体ペプチド「ｖＡβ４２」のＷＡＬＴＺからの出力を示す。
【図３】野生型Ａβ（１−４２）の蛍光の増加を示すチオフラビンＴ蛍光原線維形成アッセイを、変異体、ｖＡβ４２の蛍光変化なしと比較して経時的に示す。
【図４】３００ｎｍで測定したチロシン蛍光を示し、野生型Ａβ（１−４２）及びｖＡβ４２の両方が、チロシン１０残基の環境においていくらかの立体配座変化を受けることを明らかにする。
【図５】野生型Ａβ（１−４２）のＣＤスペクトルを示す図であり、野生型ペプチドがβシート構造を形成してアミロイド斑に急速に至ることを示す。
【図６】ｖＡβ４２が４８時間の最終時点までランダムコイル構造として残っており、βシート構造が形成されていないことを示す、時間経過による変異体ｖＡβ４２のＣＤスペクトルを示す。
【図７】陰性染色透過電子顕微鏡法を示す。図７（ａ）は、図７（ｂ）の変異体ｖＡβ４２によって形成されたアモルファス構造と比較して、４８時間後の野生型Ａβ（１−４２）によって形成された原線維構造を示す。
【図８】ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の代謝活性を測定するＭＴＴアッセイを示し、変異体ｖＡβ４２は緩衝液のみと同じである一方で、オリゴマー野生型Ａβ（１−４２）、１及び１０μＭが２４時間後に細胞に有意な影響を及ぼすことを示している。
【図９】ｖＡβが神経細胞に入るように見えない一方で、Ａβ（１−４２）が神経細胞に入り、プロセス及び細胞体を通して急速に分布することを示す。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５タグ付けＡβ（１−４２）及びｖＡβを神経細胞と共に２４時間インキュベートし、共焦点顕微鏡法を用いて視覚化した。ＡｌｅｘＦｌｕｏｒ５５５タグを示す共焦点赤色チャネルと比較した微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）を示す図である。
【図１０】Ａβ（１−４２）が２４時間のインビボインキュベーション後に長期記憶を破壊するが、一方でｖＡβはそうではないことを示す。一元配置ＡＮＯＶＡ  ｐ＜０．０００１。Ａβ（１−４２）ｎ＝５５、ビヒクルｎ＝１０６、未処理ｎ＝６５、変異体対照ｎ＝２０のカタツムリを、ＣＳに対する摂食反応の尺度である酢酸アミルへのラスプ速度に関して試験した。平均±標準誤差平均（ＳＥＭ）値が示されている。アスタリスクはビヒクル処置群のものより大幅に低い（＊＊＊＝ｐ＜０．０００１、＊＝ｐ＜０．０５）行動反応を示す。一元配置ＡＮＯＶＡ  ｐ＜０．０００１  Ｔｕｋｅｙの複数比較：Ａβ（１−４２）対ビヒクル：ｐ＜０．００１；ビヒクル対未処理：ｐ＜０．００１；変異体対照対未処理：ｐ＜０．０５。その他全てｐ＞０．０５。
【実施例】
【００７０】
材料及び方法
ペプチド設計
ＷＡＬＴＺアルゴリズム（２）を用いて配列ベースの設計を行い、野生型Ａβペプチドの予測されたアミロイド原性に対するアミノ酸置換の作用を調査した。ＷＡＬＴＺを用いて作製したグラフは、野生型Ａβ（１−４２）ペプチド中の２つのアミロイド形成領域（残基１６〜２１及び残基３７〜４２）の位置を示す２つのピークを示す。置換は、予測されたアミロイド形成領域内に導入され、グラフ出力予測に対する作用を調べた。予測されたアミロイド原性を減少させるための多くの変異体が示され、２つは文献研究ならびにＷＡＬＴＺからの出力に基づいて選択された。
【００７１】
Ａβ及び変異体ペプチドの調製及び全身適用
野生型Ａβ（１−４２）ペプチドは、ｒＰｅｐｔｉｄｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｐｅｐｔｉｄｅ．ｃｏｍ）から購入した。合成変異体Ａβペプチド「ｖＡβ４２」は、ＪＰＴ（ｊｐｔ．ｃｏｍ）から購入した。ＨＦＩＰ及びＤＭＳＯを用いてペプチドを可溶化して、その後、溶媒を完全に除去した前述の調製と同じ方法を用いて、両方のペプチドを調製した（３、４）。前述の８、９のように、培養培地を模倣するように設計されたＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．６ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３．５ｍＭ  ＣａＣｌ２）中でペプチドを調製した。簡潔には、０．２ｍｇのＡｂ１〜４２（ｒＰｅｐｔｉｄｅ）を２００μＬのＨＦＩＰ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に可溶化してペプチドを分解させた。次いで、この溶液を１分間高回転でボルテックスし、５０／６０Ｈｚのバスソニケーターで５分間超音波処理した。ＨＦＩＰを低流速の窒素ガスを用いて５〜１０分間完全に乾燥させた。いったん完全に乾燥したら、２００μＬの乾燥ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加え、１分間ボルテックスし、１分間超音波処理した。溶液を、スタッキング緩衝液として４０μＬのＨＥＰＥＳを含むＨＥＰＥＳ緩衝液で平衡化したＺｅｂａ緩衝液交換カラムに添加した。タンパク質溶液を氷上に保ち、モル吸光係数１４９０Ｍ−１ｃｍ−１を用いて、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計で２８０ｎｍの吸光度を測定した。溶液を直ちにＨＥＰＥＳ緩衝液で５０μＭに希釈し、その後の実験で使用する前に、オリゴマーがＡβ１〜４２調製物中で形成することが知られている点で、２時間インキュベートした。
【００７２】
チオフラビンＴ蛍光
試料は、１０μＭのＡβペプチド中に３．１２１μＭのＴｈＴを用いて調製し、１０ｍｍのキュベットに加えた。Ｖａｒｉａｎ  Ｃａｒｙ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒで４６０ｎｍ〜６００ｎｍの波長の間の発光スキャンを実施した。試料区画を２１℃に設定し、６００ｎｍ／分の走査速度を使用し、精度を向上させるために各測定について３つのスペクトルを平均した。
【００７３】
チロシン蛍光
５０μＭのＡβペプチド１３０μｌを１０ｍｍキュベットに加え、Ｖａｒｉａｎ  Ｃａｒｙ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒで波長２９０ｎｍ〜５００ｎｍの間の発光走査を行った。試料区画を２０℃に設定し、３００ｎｍ／分の走査速度を使用し、３つのスペクトルを各測定について平均して精度を改善した。
【００７４】
円二色性
５０μＭのＡβ試料５００μｌを１ｍｍの長さの石英キュベット（Ｈｅｌｌｍａ）に入れ、ＪＡＳＣＯ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｏｌａｒｉｍｅｔｅｒ  Ｊ７１５で１８０ｎｍから２７５ｎｍの間で走査した。３つのスペクトルを各測定について平均して精度を向上させ、試料を水浴を用いて２０℃で平衡化した。
【００７５】
透過電子顕微鏡法
ＴＥＭグリッドは、Ｆｏｒｍｖａｒ／ｃａｒｂｏｎ  ｆｉｌｍ（Ａｇａｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）被覆、４００メッシュ銅グリッドを用いて調製した。４μｌの５０μＭＡβをグリッドの表面上に置き、６０秒間吸収させ、ブロット乾燥させた。ｍｉｌｉＱで濾過した水の４μｌアリコートをグリッドに添加し、６０秒後に吸い取って乾燥させた。この直後、グリッドを２％（ｗ／ｖ）酢酸ウラニル４μｌで６０秒間陰性染色し、ブロット乾燥した。酢酸ウラニル洗浄をもう一度繰り返し、グリッドを風乾させた。
【００７６】
全てのＴＥＭグリッドを１００ｋＶでＨｉｔａｃｈｉ−７１００  ＴＥＭを用いて検査し、画像を軸方向に取り付けた（２０００×２０００ピクセル）Ｇａｔａｎ  Ｕｌｔｒａｓｃａｎ  １０００  ＣＣＤカメラを用いてデジタルで取得した。線維化状態及び形態をモニターするために、Ａβペプチド試料のアリコートを異なる時点で採取した。
【００７７】
細胞代謝アッセイ
Ｖｙｂｒａｎｔ  ＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロミド］細胞増殖アッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、未分化ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に対するＡβ４２オリゴマーの毒性作用を評価するために、製造元のプロトコルに従って使用した。アッセイの１日前に、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（２×１０５細胞／ウェル）を、２４ウェルプレート中の非コーティングまたはコラーゲンＩ被覆ガラスカバースリップ上に播種した。細胞を、１０または２５μｍｏｌ．ｄｍ−３オリゴマーＡβ４２または変異体Ａβと共に、１時間、５時間、または２４時間、３７℃でインキュベートした。特定の時点で、１２ｍｍｏｌ．ｄｍ−３ＭＴＴ溶液を細胞に添加し、さらに３７℃で２時間インキュベートした。得られた不溶性色素を５０μＬのＤＭＳＯで溶解し、６２０ｎｍの参照フィルターで蛍光を５４０ｎｍで測定した。未処理の細胞を対照とし、その値を１００％レドックス活性とし、処理した細胞と比較し、生存率に変換した。
【００７８】
ｖＡβインターナリゼーションと比較したＡβ１〜４２の免疫蛍光比較
前述のように、ＡβをＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５または４８８でタグ付けした８。簡潔には、ＤＭＳＯを添加するまで上記プロトコルに従った。１１３ｎＭのＡｌｅｘａ蛍光色素１０μＬ及び１Ｍ重炭酸ナトリウム２０μＬをＤＭＳＯ中のＡａ４２に添加した。これを１５分間インキュベートし、Ａａ調製のためのプロトコルの残りの段階を行った。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒタグ付けＡβをＰ０−Ｐ１初代ラット海馬神経細胞に添加し、所望の時間インキュベートした後、細胞を加温ＥＢＳ（外部バス溶液：１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍＭ  Ｄ−グルコース、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）に２％パラホルムアルデヒドで１５分間固定し、それぞれＰＢＳで５分間３回洗浄し、Ｐｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にマウントした。
【００７９】
Ａベータとのインキュベーション後にさらに免疫標識された試料について、細胞を先ず洗浄し、上記のように固定し、次いで洗浄緩衝液（ＰＢＳに希釈した２５％Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））で洗浄し、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で１０分間透過処理した。５０ｍＭグリシンを５分間添加し、次いで細胞を洗浄し、３０分間Ｉｍａｇｅ−ｉＴ  ＦＸシグナルエンハンサーでインキュベートし、次いでＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で３０分間ブロックした。抗Ａベータオリゴマー抗体ＮＵ１を添加し、続いて二次抗体抗マウスＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ５５５コンジュゲートをそれぞれ１時間添加した。次いで細胞を洗浄し、上記のようにマウントした。
【００８０】
共焦点顕微鏡法とイメージオーバーレイ
６３×油性対物レンズを用いて、Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ８上に試料を画像化した。Ｚスタックは０．５μｍのステップサイズで撮影され、示された画像はスタックの最大投影である。ＦＩＪＩソフトウェア１０を用いて作成した画像を用いて画像を作成した。
【００８１】
Ｌｙｍｎａｅａ  ｓｔａｇｎａｌｉｓにおける記憶試験
モノアラガイ、Ｌｙｍｎａｅａ  ｓｔａｇｎａｌｉｓは、サセックス大学で飼育され、１８〜２２℃の銅を含まない大規模な貯水槽に１２：１２時間明暗サイクルで維持された。動物にはＴｅｔｒａ−Ｐｈｙｌｌ（ＴＥＴＲＡ  Ｗｅｒｋｅ）を週に２回、レタスは週に３回、餌を与えた。調製後にペプチドを動物に直接投与した。３０ゲージの精度グライドニードル（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を含む１ｍＬシリンジを用いて、１００μＬのＡβ１〜４２または変異体対照ペプチド溶液を各カタツムリの血リンパ（約１ｍＬ容量）に注入した。動物における推定最終濃度は、Ａβ１〜４２及び変異体対照について０．１μＭであった。Ｌｙｍｎａｅａ（Ｓａｔｔｅｌｌｅ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，１９７２）には血液脳関門がないため、注射されたペプチドは動物の中枢神経系に直接アクセスすることができる。ビヒクル注射対照動物については、１００μＬの生理食塩水を注射した。
【００８２】
よく確立された方法を用いて（Ｉ．Ｋｅｍｅｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）、４〜６ヵ月後のカタツムリを、生息地のタンクから取り除き、新しいタンクで２日間、生息地のタンクと同じ温度と明るい暗期で飢えさせた。飢餓期間の後、その動物は、ＣＳ（アミルアセテート：０．００４％最終濃度）及びＵＳ（スクロース：０．６％最終濃度）が対になった単一試行の食料報酬の古典的コンディショニング（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４）を受けた。最初に、個々のカタツムリを１８〜２２℃の無銅水９０ｍＬと共に直径１４ｃｍのペトリ皿に１０分間順化させた。順応期間の後、５ｍＬの酢酸アミルを皿に添加し、３０秒後に５ｍＬのスクロースを添加した。その後、カタツムリをペトリ皿に２分間放置した後、飢餓槽に移した。ビヒクル注射群とＡβ注射群の両方を訓練した。未処理グループは訓練されていないが、同じ飢餓／摂食スケジュールと処理を受けた。
【００８３】
すべての動物をＣＳで試験した。個々のカタツムリを直径１４ｃｍのペトリ皿の中で１８〜２２℃の無銅水９０ｍＬで１０分間順応させた。順化期間の後、１８〜２２℃の無銅水５ｍＬを皿に加えた。その動物の摂食運動である、ラスプ、を２分間手動で数えて、各個体のベースラインラスピング速度（２分あたりのラスプ数）を決定した。２分後、５ｍＬの酢酸アミルを皿に添加した。ラスピングは２分間追跡された。ラスピング速度は、個々の動物のベースラインラスプを、酢酸アミル誘導ラスプから差し引くことによって決定した。
【００８４】
Ｄ’Ａｇｏｓｔｉｎｏ及びＰｅａｒｓｏｎオムニバスの正常性テストに合格したデータは、有意性（基準、ｐ＜０．０５）を確立するために、パラメトリック検定（Ｔｕｋｅｙの複数比較、またはｔ検定による単分散の片側分析［ＡＮＯＶＡ］）を受けた。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアをすべての分析に使用した。
【００８５】
結果
野生型Ａβ（１−４２）に基づく変異体対照ペプチドの設計
図１を参照すると、４２個のアミノ酸を含む野生型Ａβ（１−４２）ペプチドが示されている。残基１６〜２１及び残基３７〜４２として同定されたＷＡＬＴＺから同定されたＡβ４２中の２つのアミロイド形成領域に、全て１９残存アミノ酸置換を導入した。次いで、アミロイド形成領域のピークを減少させたアミノ酸置換をリストアップした（表１参照）。
【００８６】
【表１】
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【００８７】
図２に示すように、機能していた全てのリストアップした置換のうち、二重置換Ｆ１９Ｓ、Ｇ３７Ｄが選択された。位置１９（Ｆ１９）のフェニルアラニンをセリン（Ｓ）に、位置３７（Ｇ３７）のグリシンをアスパラギン酸（Ｄ）に置換することは、変異体Ａβ４２ペプチドのアミロイド形成領域の除去を示す（図２）。このため、疎水性領域にきつく詰め込まれた、位置１９のフェニルアラニンを、より小さくより低疎水性アミノ酸のセリンで置換すること、及び、小さな無極性中性アミノ酸である、位置３７のグリシンを、負に荷電した酸性アスパラギン酸で置換することは、分子間接触を妨害することに多少の影響を及ぼし、したがって変異型ｖＡβ４２がアミロイド斑へ凝集することを防止する、と仮定し得る。
【００８８】
図３を参照すると、チオフラビンＴ蛍光を用いて経時的にアミロイドアセンブリをモニターし、野生型Ａβ（１−４２）が時間の経過と共に蛍光シグナルを示す一方で、変異体ｖＡβ４２については４８３ｎｍで蛍光に変化がないことが示された。このペプチドは自己組織化しないことが示される。
【００８９】
チロシン蛍光は、Ａβペプチドが組織化して位置１０（５）のチロシン残基の環境を変化させるので、蛍光の変化をモニターするために以前から使用されてきた。図４を参照すると、３００ｎｍで測定されたチロシン蛍光が示され、野生型Ａβ（１−４２）及び変異体ｖＡβ４２の両方がチロシン１０残基の環境において立体配座変化を受けることが明らかである。
【００９０】
ＣＤは、ランダムコイルからアミロイド集合を伴うβシート構造への立体配座変化をモニターするために使用される。ＣＤスペクトルは、野生型が急速にβシート構造を形成する一方で、変異体ｖＡβ４２は、図５及び図６に示すように、実験期間中、ランダムコイルコンホメーションのままであることを確認する。このように、ｖＡβ４２はインビボでアミロイド斑を生成するβシートを形成しない。
【００９１】
電子顕微鏡法を用いて、構造の形態を経時的に調べた。図７に示すように、４８時間後、野生型Ａβ（１−４２）は予想通り、線維を形成したが、変異型ｖＡβ４２は５０μＭで４８時間のインキュベーション後に可変で非晶質であるように見える小さな球状構造を形成する。
【００９２】
野生型Ａβ（１−４２）は、培養神経芽腫細胞及び神経細胞に毒性作用を有することが示されている（６、７）。変異体ｖＡβ４２の細胞への影響を調べ、野生型Ａβ（１−４２）と比較するために、ＭＴＴアッセイを行って、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の代謝活性への影響を評価した。図８に示すように、オリゴマー野生型Ａβ（１−４２）は神経芽腫細胞の代謝活性を低下させるが、変異体ｖＡβは作用がなく、ビヒクル緩衝液のみに匹敵することが明らかとなった。
【００９３】
変異型ｖＡβインターナリゼーションと比較した野生型Ａβの免疫蛍光比較
図９に示すように、タグ付けされた野生型Ａβ（１−４２）及び変異体ｖＡβ４２を神経細胞培養物に添加し、次いで２４時間後の時点で共焦点顕微鏡を用いて視覚化した。摂取パターンにおける明らかな差異が、Ａβ（１−４２）とｖＡβ４２との間で観察された。特に、Ａβ（１−４２）は、細胞体に入り、神経細胞のプロセスと会合するようであるが、一方でｖＡβ４２は観察されず、神経細胞に入るようには見えない。
【００９４】
Ｌｙｍｎａｅａ  ｓｔａｇｎａｌｉｓにおける記憶試験
前述の１１のように、Ａβ（１−４２）及びｖＡβ４２を、条件応答性記憶試験でＬｙｍｎａｅａ  Ｓｔａｇｎａｌｉｓに投与した。この試験において、図１０は、ビヒクル（緩衝液のみの対照）と比較した、Ａβ（１−４２）に続くラスプ速度の減少を示す。変異型ｖＡβ４２は、「対照ペプチド」によって示され、ビヒクル対照と同様のラスプ速度を示し、ｖＡβ４２がカタツムリの記憶を変化させる能力を有していないことを示す。
【００９５】
ペプチド調製キット
本発明者らは、対照として変異体ｖＡβ４２ペプチドを含み、次にアルツハイマー病Ａβの作用を探索するために様々なアッセイに使用することができるペプチド調製キットを開発した。これらのアッセイは広範囲に及ぶ可能性があり、これらのアッセイは、
ａ）凝集アッセイ、
ｂ）細胞毒性アッセイ、そして
ｃ）動物試験（行動試験、分子、細胞または組織の変化）
を含むが、これらに限定されない。
【００９６】
キットは、
（ｉ）野生型Ａβ（１−４２）を含むバイアル、
（ｉｉ）変異体ｖＡβ４２（すなわち、本発明のペプチド）を含有するバイアル、
（ｉｉｉ）溶媒（ヘキサフルオロイソプロパノール）、
（ｉｖ）溶媒（ジメチルスルホキシド、乾燥）、
（ｖ）緩衝液（ＨＥＰＥＳ、ＰＢ等）、そして
（ｖｉ）脱塩カラム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
を含む。
【００９７】
野生型Ａβ（１−４２）及び変異体Ａβ４２は、同一の方法でキットを用いて調製され、脱凝集形態の一貫した出発ペプチドを確実にし、その後、検出キット（後記）の後のアッセイで使用することができる。溶媒は、ペプチドが分解されることを確実にするために提供される。
【００９８】
凝集／毒性検出キット
２つのペプチドは、細胞毒性、細胞摂取、膜透過、生存細胞イメージング及び免疫蛍光を用いたＡβ局在化、免疫金電子顕微鏡法、動物行動、分子研究などを含むアッセイにおいて使用され、Ａβを対照変異体Ａβに変換する。これは、アルツハイマー病におけるその役割を理解するための野生型Ａβの特異的作用に関する有益な情報を提供する。これらのアッセイのいずれも試験化合物の添加を含むことができるが、これは必須ではない。多くのアッセイは標的の発見及び創薬そのものではなく生化学的作用の理解に焦点を当てるであろう。
【００９９】
一実施形態において、試験化合物は、調製キット内に含まれるプロトコルの下で２つのペプチドの調製後にキットに添加される。既知の量の試験化合物をアッセイに導入し（細胞毒性など）、凝集及び／または毒性の量を検出及び定量し、比較する。上記のように、変異体アミロイド−ベータ（Ａβ）ペプチドは、野生型ペプチドと比較して凝集傾向の低下を示し、野生型の凝集を測定することができる陰性対照として使用される。試験化合物の存在下での野生型Ａβペプチドの、変異体Ａβペプチドのものと比較した凝集及び／または毒性の変化が、試験化合物が野生型Ａβペプチドの凝集または毒性の調節因子であることを示す。キットは、アルツハイマー病の予防または治療に有用な治療薬をスクリーニングするために使用することができる。
【０１００】
参照文献
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１０．Ｓｃｈｉｎｄｅｌｉｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｆｉｊｉ：ａｎ  ｏｐｅｎ−ｓｏｕｒｃｅ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ−ｉｍａｇｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ９，６７６−６８２，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．２０１９（２０１２）．
１１．Ｆｏｒｄ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ａｂｅｔａ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｏｎ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｖｅ  ｍｅｍｏｒｙ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｉｎ  ａ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｒｅｐｏｒｔｓ  ５，１０６１４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ１０６１４（２０１５）．
【図１】
2017523793.tif 000009
【図２】
2017523793.tif 000010
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2017523793.tif 000017
【図１０】
2017523793.tif 000018
【配列表】
2017523793000001.app
【国際調査報告】
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