(57)【要約】  カルパインのアイソフォームの活性を選択的に阻害するまたは刺激する分子が提示される。そのような分子をスクリーニングし、特徴付ける方法も提示される。長期増強（ＬＴＰ）、学習および記憶、神経変性およびシナプス機能障害におけるカルパイン−１カルパイン−の特異的機能は、新規カルパイン阻害剤、基質および関連する方法を使用して特徴付けられる。本明細書中に記載される化合物、組成物および方法は、神経変性疾患およびシナプス機能の他の疾患を治療するのに、およびそれを必要とする患者の認知を調節するのに有用であることが期待される。
2017538681.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬学的に許容可能な賦形剤および以下の式の分子を含む組成物：
【化１】
2017538681.tif 000025
ここで、Ｍ１は、Ｙ１−ＰｈＣＨ２−、Ｙ１−Ｐｈ(ＣＨ２)２−、ＰｈＣＨ２−Ｙ１、またはＰｈ(ＣＨ２)２−Ｙ１−から選択されるブロッキング基を共有結合するように置換される−Ｏ、−Ｎ、−Ｓ、または−Ｃであり、
Ｙ１は、半減期、生物学的利用能またはターゲティングを改善するために共有結合されるポリペプチド、または修飾ポリペプチドであり；
またはＹ１は、−Ｈ、半減期、生物学的利用能またはターゲティングを改善するための小分子、ポリペプチド、または修飾ポリペプチド部分を結合するための置換であり；または
Ｙ１は、（配列番号：１９５〜２００）から選択される膜透過性、血液脳関門通過を改善するポリペプチド、トランスフェリンポリペプチド断片、インスリン断片、ＬＤＬ結合タンパク質断片、狂犬病ウイルス糖タンパク質断片を結合するＯ、−Ｎ、−Ｓ、または−Ｃ置換であり、
またはＭ１は、膜透過性または血液脳関門通過を改善する小分子、ポリペプチド、または修飾ポリペプチド、配列番号：（１９５〜２００）から選択されるポリペプチド、トランスフェリンポリペプチド断片、インスリン断片、ＬＤＬ結合タンパク質断片、狂犬病ウイルス糖タンパク質断片を共有結合する置換される−Ｏ、−Ｎ、−Ｓ、または−Ｃであり、；
Ｒ１は、Ｌ配向性を有し、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、バリン、イソロイシン、メチオニン、アラニンのアミノ酸側鎖、または修飾アミノ酸側鎖を有するα炭素に共有結合される官能基であり；および
Ｒ２は、−ＣＨ３、-ＣＨ２ＣＨ３、-(ＣＨ２)２ＣＨ３、-ＣＨ(ＣＨ３)２、−ＣＨ２ＣＨ(ＣＨ３)２、-ＣＨ(ＣＨ３)ＣＨ２ＣＨ３、-Ｃ６Ｈ５、−Ｃ６Ｈ４(４−ＯＨ)、Ｃ６Ｈ４(３−ＯＨ)、Ｃ６Ｈ４(２−ＯＨ)、Ｃ６Ｈ４(２−ＣＨ３)、Ｃ６Ｈ４(３−ＣＨ３)、Ｃ６Ｈ４(４−ＣＨ３)、Ｃ6Ｈ４(２−ＯＣＨ３)、Ｃ６Ｈ４(３−ＯＣＨ３)、Ｃ６Ｈ４(４−ＯＣＨ３)、Ｃ６Ｈ４(２−ＮＨ２)、Ｃ６Ｈ４(３−ＮＨ２)、Ｃ６Ｈ４(４−ＮＨ２)、Ｃ６Ｈ４(２−ＮＨＣＨ３)、Ｃ６Ｈ４(３−ＮＨＣＨ３)、Ｃ６Ｈ４(４−ＮＨＣＨ３)、Ｃ６Ｈ４(２−Ｎ(ＣＨ３)２)、Ｃ６Ｈ４(３−Ｎ(ＣＨ３)2)、またはＣ６Ｈ４(４−Ｎ(ＣＨ３)２)であり；
Ｒ３は、-Ｈ、-ＯＣＨ３、＝ＮＨ、-ＮＨ２、-ＳＨ、＝Ｏ、＝Ｓ、-ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｏ(ＣＨ２)２ＣＨ３、−ＯＣＨ(ＣＨ３)２、−ＳＣＨ３、−ＳＣＨ２ＣＨ３、−Ｓ（ＣＨ２)２ＣＨ３、−ＳＣＨ（ＣＨ３）２、−ＯＨ、−ＣＨ３、−Ｆ、−Ｃｌ、-Ｂｒ、−Ｉであり；
Ｘ１は、−Ｃ６Ｈ３（３，５−Ｒ４，Ｒ５）、−ＣＨＲ６−Ｃ６Ｈ３−（３，５−Ｒ４，Ｒ５）、−２−ピリジル、−２−ピリジル(３，５，Ｒ４，Ｒ５)、−ＣＨＲ６−２−ピリジル(３，５，Ｒ４，Ｒ５)、−３−ピリジル(３，５，Ｒ４，Ｒ５)、−ＣＨＲ６−３−ピリジル（３，５，Ｒ４，Ｒ５）、−４−ピリジル(３，５，Ｒ４，Ｒ５)、または−ＣＨＲ６−４−ピリジル(３，５，Ｒ４，Ｒ５)であり；ここで
Ｒ４は、−Ｈ、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｏ(ＣＨ２)２ＣＨ３、−ＯＣＨ(ＣＨ３)２、−ＳＣＨ３、ＳＣＨ２ＣＨ３、Ｓ(ＣＨ２)２ＣＨ３、−ＳＣＨ(ＣＨ３)２、-ＯＨ、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＮ、−ＣＨＮＨ、−ＮＨ２、−ＮＨＣＨ３、−Ｎ(ＣＨ３) ２、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、または−Ｉであり；
Ｒ５は、−Ｈ、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｏ(ＣＨ２)２ＣＨ３、−ＯＣＨ(ＣＨ３)２、−ＳＣＨ3、ＳＣＨ２ＣＨ３、−Ｓ(ＣＨ２)２ＣＨ３、−ＳＣＨ(ＣＨ３)２、−ＯＨ、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＮ、−ＣＨＮＨ、−ＮＨ２、−ＮＨＣＨ３、−Ｎ(ＣＨ３)２、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、または−Ｉであり；および
Ｒ６は、−Ｈ、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｏ(ＣＨ２)２ＣＨ３、−ＯＣＨ(ＣＨ３)２、−ＳＣＨ3、−ＳＣＨ２ＣＨ３、−Ｓ(ＣＨ２)２ＣＨ３、−ＳＣＨ(ＣＨ３)２、−ＯＨ、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＮ、−ＣＨＮＨ、−ＮＨ２、−ＮＨＣＨ３、−Ｎ(ＣＨ３)２、−Ｆ、−Ｃｌ、−Br, または−Ｉである。
【請求項２】
薬学的に許容可能な賦形剤および以下の式の分子を含む組成物：
【化２】
2017538681.tif 000026
ここで、Ｒ１は、Ｘ１−ＰｈＣＨ２−、またはＸ１−Ｐｈ(ＣＨ２)２−であり；
Ｘ１は、−Ｈ、または小分子、ポリペプチド、修飾ポリペプチド部分を結合するための置換であり、小分子、ポリペプチド、修飾ポリペプチド部分は、半減期、生物学的利用能またはターゲティングを改善し；
Ｒ２は、Ｌ配向性を有し、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、バリン、イソロイシン、メチオニン、アラニンのアミノ酸側鎖、または修飾アミノ酸側鎖を有するα炭素に共有結合される官能基であり；
Ｒ３は、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、−(ＣＨ２)２ＣＨ３、−ＣＨ(ＣＨ３)２、−ＣＨ２ＣＨ(ＣＨ３)２、−ＣＨ(ＣＨ３)ＣＨ２ＣＨ３、−Ｃ６Ｈ５、−Ｃ６Ｈ４(４−ＯＨ)、Ｃ６Ｈ４(３−ＯＨ)、Ｃ６Ｈ４(２−ＯＨ)、Ｃ６Ｈ４(２−ＣＨ３)、Ｃ６Ｈ４(３−ＣＨ３)、Ｃ６Ｈ４(４−ＣＨ３), Ｃ６Ｈ４(２−ＯＣＨ３)、Ｃ６Ｈ４(３−ＯＣＨ３)、Ｃ６Ｈ４(４−ＯＣＨ３)、Ｃ６Ｈ４(２−ＮＨ２)、Ｃ６Ｈ４(３−ＮＨ２)、Ｃ６Ｈ４(４−ＮＨ２)、Ｃ６Ｈ４(２−ＮＨＣＨ３)、Ｃ６Ｈ４(３−ＮＨＣＨ３), Ｃ６Ｈ４(４−ＮＨＣＨ３)、Ｃ６Ｈ４(２−Ｎ(ＣＨ３)２)、Ｃ６Ｈ４(3-Ｎ(ＣＨ3)2)、またはＣ６Ｈ４(４−Ｎ(ＣＨ３)２であり；
Ｒ４は、−Ｈ、または−ＯＣＨ３、＝ＮＨ、−ＮＨ２、−ＳＨ、＝Ｏ、＝Ｓ、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｏ(ＣＨ２)２ＣH3、−ＯＣＨ(ＣＨ３)２、−ＳＣＨ３、ＳＣＨ２ＣＨ３、−Ｓ(ＣＨ２)２ＣＨ３、-ＳＣＨ(ＣＨ３)2、-ＯＨ、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、または−Ｉであり；
Ｒ５は、−Ｈ、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｏ(ＣＨ２)２ＣＨ３、−ＯＣＨ(ＣＨ３)２、−ＳＣＨ3、ＳＣＨ２ＣＨ３、−Ｓ(ＣＨ２)２ＣＨ３、−ＳＣＨ(ＣＨ３)２、−ＯＨ, −ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＮ、−ＣＨＮＨ、−ＮＨ２、−ＮＨＣＨ３、−Ｎ(ＣＨ３)２、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉであり；および
Ｒ６は、−Ｈ、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｏ(ＣＨ２)２ＣＨ３、−ＯＣＨ(ＣＨ３)２、−ＳＣＨ3、ＳＣＨ２ＣＨ３、−Ｓ(ＣＨ２)２ＣＨ３、−ＳＣＨ(ＣＨ３)２、−ＯＨ、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣH3、−ＣＮ、−ＣＨＮＨ、−ＮＨ２、−ＮＨＣＨ３、−Ｎ(ＣＨ３)２、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、または−Ｉである。
【請求項３】
薬学的に許容可能な賦形剤および以下の式の分子を含む組成物：
【化３】
2017538681.tif 000027
ここで、Ｒ７は、
【化４】
2017538681.tif 000028
【化５】
2017538681.tif 000029
であり、
Ｚは、ＣＨまたはＮである。
【請求項４】
薬学的に許容可能な賦形剤および以下の式の分子を含む組成物：
【化６】
2017538681.tif 000030
ここで、Ｒ８は、
【化７】
2017538681.tif 000031
である。
【請求項５】
そのカルパイン−２阻害定数（Ｋｉ）が、カルパイン−１に対するそのＫｉに等しい、またはより大きい、１０倍より低い、請求項１〜４に記載の分子のいずれかを含む組成物。
【請求項６】
分子は、神経細胞死を阻害する、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
分子は、記憶を増強する、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
請求項５に係る組成物を投与することを含む、緑内障を治療する方法。
【請求項９】
請求項５に係る組成物を投与することを含む、神経疾患を治療する方法。
【請求項１０】
薬学的に許容可能な賦形剤および配列番号１〜６８のいずれか１つの全体と少なくとも９５％の同一性を有する合成ポリペプチドを含む組成物であって、合成ポリペプチドは、カルパイン−１に対するその阻害定数（Ｋｉ）と同一、またはより大きい、１０倍より低いカルパイン−２のＫｉを有する、上記組成物。
【請求項１１】
合成ポリペプチドは、膜形質導入合成ポリペプチドをさらに含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１２】
配列番号７４〜１９４のいずれか１つの全体と少なくとも９５％の同一性を有する合成ポリペプチドを含む組成物。
【請求項１３】
合成ポリペプチドは、膜形質導入合成ポリペプチドをさらに含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１４】
配列番号２０１〜２２のいずれか１つの全体と少なくとも９５％の同一性を有する合成ポリペプチドを含む組成物。
【請求項１５】
合成ポリペプチドは、膜形質導入合成ポリペプチドをさらに含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１６】
分子は、神経細胞死を阻害する、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１７】
分子は、記憶を増強する、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１８】
請求項１０に係る組成物を投与することを含む、緑内障を治療する方法。
【請求項１９】
請求項１０に係る組成物を投与することを含む、神経疾患を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１４年１１月１１日に出願された米国特許出願第６２／０７８，２２１号の優先権を主張し、参照により本明細書中にその開示を含む。
本発明の技術分野
本発明は、カルパイン−１またはカルパイン−２機能を阻害する、生成物、生成物を同定する方法、およびカルパイン−１またはカルパイン−２活性化または活性を特異的に阻害する方法、またはカルパイン−１を活性化する方法、ならびにカルパイン−１またはカルパイン−２機能を阻害する分子を用いる治療に感受性であるか、またはカルパイン−１活性を活性化または増大させる疾患を治療および予防する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的なカルパイン阻害剤および疾患を治療するためのそれらの使用は、治療薬として成功していない（Ｄｏｎｋｏｒ、２０１１年、参照により組み込まれる）。本明細書中で、証拠は、カルパイン−２選択的阻害剤、または別々にカルパイン−１阻害剤、またはカルパイン−２選択的阻害剤および／またはカルパイン−１活性化剤の特定の使用について提供される。文献は、別のものに対して１つのカルパインにより高い選択性を示す阻害剤のいくつかの例を記載するが（Ｌｉら，１９９６年；Ｌｉら, １９９３年、両方が参照により組みこまれる）、これらの開示は、カルパイン−１またはカルパイン−２選択的阻害剤の有用性が未知であり、これらの化合物が実際に治療的価値を有するかどうかを決定するためのさらなる実験を必要とされたことを認める。
【０００３】
実際に、カルパイン−１とカルパイン−２の間の区別がないにもかかわらず、当該技術は、カルパインの選択的阻害剤を開発する一般化された必要性を認識している。一般的カルパイン阻害剤（１０を超える変異体を含む）は、様々な疾患の動物モデルにおいて治療として成功裏に使用されているが、選択性の欠如のために、臨床試験に進展していない。したがって、カルパイン−１およびカルパイン−２の機能のより良い理解のために、選択的カルパイン阻害剤に対する長い間感じられているが、十分に理解されていない必要性が存在する。そのような結論を導き出す証拠は、カルパイン−１とカルパイン−２の区別性への洞察を持たないカルパインの間のいくつかの他の区別に基づく。例えば、カルパイン−１０遺伝子（ＣＡＰＮ１０）多形は、２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）に関連し；カルパイン−１（μ−カルパイン）、カルパイン−２（ｍ−カルパイン）、カルパイン−３、およびカルパイン−５はまた、Ｔ２ＤＭ関連代謝経路に関連している（Ｄｏｎｋｏｒ、２０１１年）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
この開示まで、カルパイン−１およびカルパイン−２は、ＬＴＰ、学習および記憶、神経変性、シナプス機能障害の疾患、細胞保護シグナル伝達カスケード（カルパイン−１）および細胞死カスケード（カルパイン−２）に差別的に関連することは認識されなかった。カルパイン−１活性化は、シナプスＮＭＤＡ受容体刺激に関連し、ＬＴＰ誘発にその必要な役割を果たす。それはまた、長期シナプスＮＭＤＡ受容体刺激によって誘発される神経保護にも関与する（図１参照）。一方、カルパイン−２は、シナプス外のＮＭＤＡ受容体刺激に関連し、神経変性に関与する（図１参照）。カルパイン−２はまた、ＢＤＮＦ→ＥＲＫ媒介性リン酸化によって活性化され、θ−連射刺激（ＴＢＳ）後のＬＴＰの程度を制限する。したがって、選択的カルパイン−２阻害剤は、神経保護および認知増強の両方であることができる。
【０００５】
選択性の有意な改善が、カテプシン（Ｃｕｅｒｒｉｅｒら、２００７年、参照によって組み込まれる）または他のプロテイナーゼ（Ｓｏｒｉｍａｃｈｉら、２０１２年、参照によって組み込まれる）などのシステインプロテイナーゼに対するカルパインでされている。文献は、カルパイン−２に対するある程度の選択性を有しかつカルパイン−１に対する選択性有さない阻害剤を記載するが、または逆に、これまで特定の基質の利益を受けて作製されたものではなかった。カルパイン阻害剤ＩＶ（カルボキシベンジル−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−ＣＨ２−Ｆ）は、カルパイン−１に対するいくつかの選択性を示すが、その効果は、細胞型によって変化するようである（Ｐｏｗｅｒｓら、２００２年、参照によって組み込まれる）。ＰＴＥＮ特異性に寄与する構造要素の完全なレンダリングは、小分子で捕捉するのが難しいかもしれないが、特異性の完全な説明は、カルパイン−２の高い特異性阻害剤を設計するための強固な構造的基礎を提供するだろう。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書中に記載されるのは、アイソフォーム選択的カルパイン阻害剤に関連する組成物および方法である。アイソフォーム選択的カルパイン阻害剤は、カルパイン−１またはカルパイン−２のいずれかに向けられ、したがって、選択性は、他のアイソフォームと比較して、１つのアイソフォームの活性を減少させる。カルパイン−１またはカルパイン−２の選択的阻害剤は、触媒活性を阻害し、発現を低下させ、選択的に分解し、化学修飾を阻害し、または促進し、またはカルパイン−１とカルパイン−２および１つ以上のその結合タンパク質の間のタンパク質相互作用に影響を与え得る。カルパインアイソフォームの選択的阻害剤はまた、阻害剤のターゲティング、安定化、移動性、浸透性、生物学的利用能、または濃度に影響を及ぼす薬剤に結合され得る。
【０００７】
選択的カルパイン阻害剤は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣薬、炭水化物、脂質または他の有機または無機分子を含む多数の異なるフォームの形態で存在し得る。本発明に係るカルパイン−２の様々な選択的阻害剤は、カルパイン−２ポリペプチド基質、ＰＴＥＮ（配列番号１）に由来し得る。
【０００８】
また本明細書中で記載されるのは、カルパイン−１およびカルパイン−２は、特異的基質特異性および分化した細胞内足場の両方によって、別個の細胞経路に差異的に結合されるという知見である。特に、出願人は、本明細書中に記載されるカルパイン−２阻害剤の投与は、細胞死を阻害し、認知を高めるのに有用であるという証拠を提供する。実際に、カルパイン−１とカルパイン−２は、カルパイン−１は、ＬＴＰの誘発に直接関連する点で、学習と記憶の生理学的基質である長期増強（ＬＴＰ）の誘発に示唆的に関連する。したがって、神経学的障害の治療に関連する本発明の側面において、カルパイン−１活性化は、ＬＰＴの誘発において、確実に機能する。同じプロセス中のカルパイン−２活性化は、ＬＴＰの統合におけるブレーキのように働き、したがって、ＬＴＰの閾値を作成し、強化期間中のＬＴＰの範囲を制限する。細胞保護および細胞死におけるカルパイン−１およびカルパイン−２の特異的および差異的機能も、本明細書中に開示される。
【０００９】
様々な側面において、本発明はまた、カルパイン−２に選択的な阻害剤を同定する方法を提供する。これらの阻害剤は、Ｉ）細胞死および病理に関連する細胞活性を阻害する、ＩＩ）ＬＴＰを維持する閾値を下げる、ＩＩＩ）ＬＴＰを増加させる、ＩＶ）ニューロンのシナプス可塑性、学習、記憶、および認知を増強する、および／またはＶ）特定の神経変性疾患を治療するのに有用である。出願人は、カルパイン−１が神経保護およびシナプス可塑性の誘導おいて、カルパイン−２と比較して、特異的に含まれることを発見したので、本発明の方法において、カルパイン−２を選択的に阻害する小分子阻害剤、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、修飾ペプチドおよびポリペプチド、および核酸は、単独で、またはカルパイン−２機能の他の阻害剤、またはカルパイン−１の活性化剤と組み合わせて投与され得る。別の側面において、本発明は、カルパイン−２単独でまたはカルパイン−２を選択的に阻害する他の分子と組み合わせて選択的に阻害する小分子阻害剤、ポリペプチド、ペプチド、修飾ペプチドド、および核酸などの生成物および組成物に関し、カルパイン−１に対する効果の低下、少ない効果、または測定可能でない効果を有する。さらに別の側面において、本発明は、単独でまたは他の活性化剤または選択的阻害剤と組み合わせて、カルパイン−１の機能を選択的に活性化または阻害する小分子阻害剤、ポリペプチド、ペプチド、修飾ポリペプチド、および核酸などの物質の生成物および組成物に関する。全体として、本発明は、カルパイン−２選択的阻害剤、またはカルパイン−１選択的活性化剤、またはそれらの組み合わせによって阻害、緩和、遅延、逆転、または予防されやすい疾患を治療する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１：ＬＴＰおよび神経変性におけるカルパイン−１およびカルパイン−２のそれぞれの役割を示す概略図。
【００１１】
【図２】図２：一般的カルパイン阻害剤、カルパイン阻害剤ＩＩＩ（Ｚ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−ＣＨＯ）の存在下または非存在下で急性ラット海馬スライスにおけるフィールドＣＡ１の放射状層で行われた興奮性シナプス後電位（ＥＰＳＰ）のフィールド記録。結果は、１０分のベースライン期間にわたる平均値のパーセントとして表され、実験の示された数の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である。カルパイン阻害剤ＩＩＩは、ＬＴＰ誘発前に投与されるときにＬＴＰをブロックする。閉じた円（カルパイン阻害剤ＩＩＩ）を閉じた円（対照）と比較する。
【００１２】
【図３Ａ】図３Ａ：２００ｎＭのカルパイン−２選択的阻害剤、式Ｉ、（図中のｍＣａｌｐ−Ｉ）の存在下または非存在下での急性ラット海馬スライスにおけるフィールドＣＡ１の放射状層で行われた興奮性シナプス後電位（ＥＰＳＰ）のフィールド記録。ｍＣａｌｐ−Ｉとのプレインキュベーションは、ＬＴＰを強化する。結果は、１０分間のベースライン期間にわたる平均値のパーセントとして表され、実験の示された数の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である。
【００１３】
【図３Ｂ】図３Ｂ：θ−連射刺激（ＴＢＳ）後の高い選択的カルパイン−２阻害剤、式Ｉ（図中のｍＣａｌｐ−Ｉ）との海馬スライスのインキュベーションは、１０分後ＴＢＳ〜１時間後ＴＢＳを適用した場合、ＬＴＰ硬化相中にＬＴＰを強化する。結果は、１０分のベースライン期間にわたる平均値のパーセントとして表され、実験の示された数の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である。
【００１４】
【図４】図４：２００ｎＭのカルパイン−２選択的阻害剤、式Ｉ（図中のｍＣａｌｐ−Ｉ）の存在下または非存在下での雄のＵＢＥＡ変異体マウス（アンジェルマン症候群のモデル）またはそれらの野生型同腹子から調製された急性海馬スライスにおいてフィールドＣＡ１の放射状層で行われた興奮性シナプス後電位（ＥＰＳＰ）のフィールド記録。結果は、１０分のベースライン期間にわたる平均値のパーセントとして表され、実験の示された数の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である。
【００１５】
【図５】図５：高い選択的カルパイン−２阻害剤、式Ｉ（図中のｍＣａｌｐ−Ｉ）の適用は、２００ｎＭ〜５μＭの用量依存的方法でシナプス外ＮＭＤＡ受容体活性化に関連する神経細胞死を減少させた。結果は、ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）試薬で陽性に染色されたニューロンのパーセントとして表され、３〜４実験の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である（＊ｐ＜０．０１、スチューデントのｔ検定）。
【００１６】
【図６】図６：一般的なカルパイン阻害剤、カルパイン阻害剤ＩＩＩ（Ｚ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−ＣＨＯ）は、高選択性カルパイン−２阻害剤、式Ｉ（図中のｍＣａｌｐ−Ｉ）ではなく、培養された皮質神経において、飢餓に対してＢｉｃ−および４−ＡＰ誘導性神経保護をブロックした。神経細胞死を観察し、ヘキスト染色によって定量化した。３００〜５００ニューロンを、３〜６の独立した実験で各群について計数した。＊ｐ＜０．０５；ｎｓ、有意差なし；一元配置ＡＮＯＶＡ、次にボンフェローニ検定。ｎ＝３〜６．エラーバーは、ＳＥＭを示す。
【００１７】
【図７Ａ】図７Ａ：恐怖条件付けに対するカルパイン−２の選択的阻害剤の効果。式Ｉ（図中のｍＣａｌｐ−Ｉ）は、恐怖条件付けプロトコルにおいて学習および記録に対する二相性効果を有することが見出された。式Ｉ（図中のｍＣａｌｐ−Ｉ）の化合物の様々な用量は、痛みを伴う刺激との文脈またはトーンとの関係を学ぶ訓練の３０分前に腹腔内注射された。動物は、２４時間後に文脈に対するそれらの恐怖応答を試験され、記憶力は、マウスが凍る時間（恐怖に対するそれらの生物学的応答）の量によって定量化された。増強および減少を生じる用量間の比は、カルパイン−２とカルパイン−１を阻害するＫｉ間の比に一致する。結果を分析する人は、グループ治療を知らなかったので、実験は、盲検的に行われた。結果は、８〜１０実験の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である。＊ｐ＜０．０５（ＡＮＯＶＡに続いてボンフェローニ事後検定）。
【００１８】
【図７Ｂ】図７Ｂ：恐怖条件付けに対するカルパイン−２の選択的阻害剤の効果。式１（図中のｍＣａｌｐ−Ｉ）は、恐怖条件付けプロトコルにおいて学習および記録に対する二相性効果を有することが見出された。式１（ｍ−Ｃａｌｐｌ）の化合物の様々な用量は、痛みを伴う刺激との文脈またはトーンとの関係を学ぶ訓練の３０分前に腹腔内注射された。動物は、４８時間後にトーンに対するそれらの恐怖応答を試験され、記憶力は、マウスが凍る時間（恐怖に対するそれらの生物学的応答）の量によって定量化された。増強および減少を生じる用量間の比は、カルパイン−２とカルパイン−１を阻害するＫｉ間の比に一致する。結果を分析する人は、グループ治療を知らなかったので、実験は、盲検的に行われた。結果は、８〜１０実験の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である。＊ｐ＜０．０５（ＡＮＯＶＡに続いてボンフェローニ事後検定）。
【００１９】
【図８Ａ】図８Ａ：代表的な画像は、次のＨ＆Ｅ染色された神経節細胞および網状層（Ｐｌｅｘｉｆｏｒｍ ｌａｙｅｒ）を示す：ｉ）実験に使われていない網膜；ｉｉ）ＮＭＤＡ注射の３０分前および６時間後に賦形剤（２０％ＤＭＳＯ）、式Ｉ（図中Ｃ２Ｉ、０．３ｍｇ／ｋｇ）またはパンカルパイン阻害剤カルペプチン（１０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射された野生型マウスからＰＢＳ処理（硝子体内に、２μｌ）またはＮＭＤＡ処理（硝子体内に、２．５ｍＭの２μｌ）された網膜。Ｈ＆Ｅ染色は、ＮＭＤＡ注射の７日後に行われた。
【００２０】
【図８Ｂ】図８Ｂ：２μｌのＰＢＳまたは２μｌのＮＭＤＡ（２．５ｍＭ）のいずれかを７日前に腹腔内投与された野生型マウスのＧＣＬにおける細胞数の定量分析。マウスは、ＮＭＤＡ注射の３０分前および６時間後に、賦形剤（２０％ＤＭＳＯ）、式Ｉ（図中Ｃ２Ｉ、０．３ｍ／ｋｇ）またはパンカルパイン阻害剤カルペプチン（１０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与された。柱状のものは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。ｎ＝４〜６。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐｐ＜０．００１対ＮＭＤＡ＋賦形剤注射群。一元配置ＡＮＯＶＡ、それに続くボンフェローニ検定。
【００２１】
【図８Ｃ】図８Ｃ：２μｌのＰＢＳまたは２μｌのＮＭＤＡ（２．５ｍＭ）のいずれかを７日前に腹腔内投与された野生型マウスのＩＰＬの厚さの定量分析。マウスは、ＮＭＤＡ注射の３０分前および６時間後に、賦形剤（２０％ＤＭＳＯ）、式Ｉ（図中Ｃ２Ｉ、０．３ｍ／ｋｇ）またはパンカルパイン阻害剤カルペプチン（１０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与された。柱状のものは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。ｎ＝４〜６。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１対ＮＭＤＡ＋賦形剤注射群。一元配置ＡＮＯＶＡ、それに続くボンフェローニ検定。
【００２２】
【図９Ａ】図９Ａ：ＰＢＳ（対照）またはＮＭＤＡ（２．５ｍＭの２μｌ）の硝子体注射後６時間のマウス網膜抽出物中のスペクトリン分解産物（ＳＢＤＰ）、全長ＰＨドメインおよびロイシンリッチリピートタンパク質ホスパターゼ（ＰＨＬＰＰ１）αおよびＡｋｔのレベルの代表的な免疫ブロット法。マウスは、硝子体内注射の３０分前に賦形剤（１０％ＤＭＳＯ）またはＣ２Ｉ（０．３ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射された。
【００２３】
【図９Ｂ】図９Ｂ：ＮＭＤＡまたはＰＢＳ注射の６時間後の網膜抽出物で決定したＳＢＤＰ／Ａｋｔの比の定量。データは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。ｎ＝４。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．０００１。一元配置ＡＮＯＶＡ、それに続くボンフェローニ検定。
【００２４】
【図９Ｃ】図９Ｃ：ＮＭＤＡまたはＰＢＳ注射の６時間後の網膜抽出物で決定したＰＨＬＰＰ１α／Ａｋｔの比の定量。データは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。ｎ＝４。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１。一元配置ＡＮＯＶＡ、それに続くボンフェローニ検定。
【００２５】
【図９Ｄ】図９Ｄ：実験に使われていない代表的なＨ＆Ｅ染色、ＮＭＤＡ注射前３０分および６時間後の賦形剤（１０％ＤＭＳＯ）またはＣ２Ｉ（０．３ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内と注射されたＷＴマウスからの網膜をＰＢＳ（対照）またはＮＭＤＡ（２．５ｍＭの２μｌ）処理された代表的なＨ＆Ｅ染色。Ｈ＆Ｅ染色は、ＮＭＤＡ注射の７日後に行われた。スケールバー＝３０μ。
【００２６】
【図９Ｅ】図９Ｅ：ＮＭＤＡ注射の７日後の野生型マウスからのＧＣＬにおける細胞数の定量分析。各眼からの視神経頭を切断した６つの切片を分析した。視神経頭から５００と１０００μｍの間の距離のＧＣＬで細胞数を数えた。各眼からの６つの切片からの細胞密度を平均した。データは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。ｎ＝４〜８。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。一元配置ＡＮＯＶＡ、それに続くボンフェローニ検定。
【００２７】
【図９Ｆ】図９Ｆ：ＮＭＤＡ注射の７日後の野生型マウスからのＩＰＬの厚さの定量分析。各眼からの視神経頭を切断した６つの切片を分析した。視神経頭から５００と１０００μｍの間の距離のＧＣＬで細胞数を数えた。各眼からの６つの切片からの細胞密度を平均した。データは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。ｎ＝４〜８。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。一元配置ＡＮＯＶＡ、それに続くボンフェローニ検定。
【００２８】
【図９Ｇ】図９Ｇ：ＮＭＤＡ注射の３０分前および６時間後の賦形剤（１０％ＤＭＳＯ）またはＣ２Ｉ（０．３ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内と注射されたカルパイン−１ＫＯマウスからのＰＢＳ（対照）またはＮＭＤＡ（２．５ｍＭの２μｌ）処理された網膜の代表的なＨ＆Ｅ染色。Ｈ＆Ｅ染色は、ＮＭＤＡ注射の７日後に行われた。スケールバー＝３０μ。
【００２９】
【図９Ｈ】図９Ｈ：ＮＭＤＡ注射の７日後のカルパイン−１ＫＯマウスからのＧＣＬ中の細胞数の定量分析。各眼からの視神経頭を切断された６つの切片を分析した。視神経頭から５００と１０００μｍの間の距離のＧＣＬで細胞数を数えた。各眼からの６つの切片からの細胞密度を平均した。データは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。ｎ＝６。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。一元配置ＡＮＯＶＡ、それに続くボンフェローニ検定。
【００３０】
【図９Ｉ】図９Ｉ：ＮＭＤＡ注射の７日後のカルパイン−１マウスのＩＰＬの厚さの定量分析。各眼からの視神経頭を切断された６つの切片を分析した。視神経頭から５００と１０００μｍの間の距離のＧＣＬで細胞数を数えた。各眼からの６つの切片からの細胞密度を平均した。データは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。ｎ＝６。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。一元配置ＡＮＯＶＡ、それに続くボンフェローニ検定。
【００３１】
【図９Ｊ】図９Ｊ：Ｃ２Ｉ処理なしのおよびＣ２Ｉ処理を有するＮＭＤＡ処理ＷＴおよびＫＯマウスにおけるＧＬＣ細胞数の比較。ｎ＝６。＊＊ｐ＜０．０１。両側ｔ検定。
【００３２】
【図１０Ａ】図１０Ａ：急性ＩＯＰ上昇後の網膜におけるカルパイン−１およびカルパイン−２活性の時間経過。急性ＩＯＰ上昇の０、２、４および６時間後のＷＴ、カルパイン−１ＫＯおよびＣ２Ｉ注射ＷＴマウスの網膜のＧＣＬおよびＩＰＬにおけるＳＢＤＰ（緑色）の免疫染色。切片をＤＡＰＩ（青色）で対比染色した。Ｃ２Ｉを、ＩＯＰ上昇２時間後にＷＴマウスに注射した。スケールバー＝２０μｍ。
【００３３】
【図１０Ｂ】図１０Ｂ：急性ＩＯＰ上昇後の網膜におけるカルパイン−１およびカルパイン−２活性の時間経過。急性ＩＯＰ上昇の０、２、４および６時間後のＷＴ、カルパイン−１ＫＯおよびＣ２Ｉ注射ＷＴマウスの網膜のＧＣＬおよびＩＰＬにおける全長ＰＴＥＮ（ｂ、赤色）の免疫染色。切片を、ＤＡＰＩ（青色）で対比染色した。Ｃ２Ｉを、ＩＯＰ上昇２時間後にＷＴマウスに注射した。スケールバー＝２０μｍ。（ｃ）ＩＰＬ層にけるＳＢＤＰ染色の定量、各地点でのｎ＝３〜５（眼）。各眼について、３つの網膜切片を定量のために使用した。各切片について、ＩＰＬ層中の３つの５０×２５μｍ領域を選択し、ＭＦＩ（平均蛍光強度）を測定し、平均した。同じ群において対照に対して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。一元配置ＡＮＯＶＡ、それに続くボンフェローニ検定。データは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。（ｄ）ＰＴＥＮ染色の定量、各時点でｎ＝３〜５。同じ群において対照に対して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。一元配置ＡＮＯＶＡ、それに続くボンフェローニ検定。
【００３４】
【図１０Ｃ】図１０Ｃ：急性ＩＯＰ上昇の０、２、４および６時間後のＷＴ、カルパイン−１ＫＯおよびＣ２Ｉ注射ＷＴマウスで網膜ＩＰＬにおける急性ＩＯＰ上昇後の網膜でカルパイン−１およびカルパイン−２活性化の経時変化の間のＩＰＬ層のＳＢＤＰ染色の定量。Ｃ２Ｉを、ＩＯＰ上昇の２時間後にＷＴマウスに注射した。各時点でｎ＝３〜５眼。各眼について、３つの網膜切片を定量のために使用した。各切片について、ＩＰＬ層中の３つの５０×２５μｍ領域を選択し、ＭＦＩ（平均蛍光強度）を測定し、平均した。同じ群において対照に対して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。一元配置ＡＮＯＶＡ、それに続くボンフェローニ検定。データは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。
【００３５】
【図１０Ｄ】図１０Ｄ：急性ＩＯＰ上昇０、２、４および６時間後のＷＴ、カルパイン−１ＫＯおよびＣ２Ｉ注射ＷＴマウスで網膜ＩＰＬにおける急性ＩＯＰ上昇後の網膜でカルパイン−１およびカルパイン−２活性化の経時変化の間のＩＰＬ層のＰＴＥＮ染色の定量。Ｃ２Ｉを、ＩＯＰ上昇の２時間後にＷＴマウスに注射した。各時点でｎ＝３〜５眼。同じ群において対照に対して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。一元配置ＡＮＯＶＡ、それに続くボンフェローニ検定。
【００３６】
【図１１Ａ】図１１Ａ：カルパイン−１ノックアウトは、急性ＩＯＰ上昇によって誘導される神経節細胞層における細胞死を悪化させる一方、カルパイン−２阻害は、低減する。賦形剤またはＣ２Ｉ注射された野生型およびカルパイン−１ＫＯマウスの右眼および偽手術がされた左眼からの網膜切片のＨ＆Ｅ染色。ＰＢＳ中１０％ＤＭＳＯの賦形剤を、ＩＯＰ上昇の３０分前および２時間後に腹腔内注射した。注射前および注射後Ｃ２Ｉ（０．３ｇ／ｋ）を、急性ＩＯＰ上昇の３０分前および２時間後に腹腔内投与した。１ポスト注射群について、Ｃ２Ｉを、ＩＯＰ上昇の２時間後に注射した。２ポスト注射群について、Ｃ２Ｉを、ＩＯＰ上昇の２および４時間後に注射した。Ｈ＆Ｅ染色を、手術後３日に実施した。スケールバー＝３０μｍ。
【００３７】
【図１１Ｂ】図１１Ｂ：図１１Ａで示されるＨ＆Ｅ染色の定量。各眼の視神経頭を切断された６つの切片を分析した。視神経頭から５００と１０００μｍの間の距離のＧＣＬで細胞数を数えた。各眼からの６つの切片で細胞密度を平均した。データは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。賦形剤についてｎ＝７、注射前および注射後についてｎ＝３、１ポスト注射についてｎ＝１０、２ポスト注射についてｎ＝６、ＫＯについてｎ＝４。ｎｓ、有意差なし。＊＊＊ｐ＜０．００１、両側ｔ検定。
【００３８】
【図１１Ｃ】図１１Ａで記載されるように、賦形剤またはＣ２Ｉ注射された野生型およびカルパイン−１Ｋマウスの右眼および偽手術が実施された左眼からのＧＣＬ細胞生存率の比較。各マウスの生存率は、偽眼のＧＣＬの細胞密度に対するＩＯＰ上昇眼のＧＣＬの細胞密度の比として算出された。賦形剤に対して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、一元配置ＡＮＯＶＡ、それに続くボンフェローニ検定。
【００３９】
【図１１Ｄ】図１１Ｄ：賦形剤またはＣ２Ｉ注射されたＷＴマウスの網膜におけるＢｒｎ−３ａ免疫染色。急性ＩＯＰ上昇を、右眼で行い、一方偽手術を、左眼で行った。賦形剤、１０％ＤＭＳＯ、またはＣ２Ｉ、Ｃ２Ｉ（０．３ｍｇ／ｋ）を、急性ＩＯＰ上昇の２時間後に腹腔内注射した。Ｂｒｎ３ａ染色を手術３日後に実施した。スケールバー＝６０μｍ。
【００４０】
【図１１Ｅ】図１１Ｅ：図１１Ｄで記載されるように、ｂｒｎ３ａ染色の定量。ＧＣＬ中ｂｒｎ３ａ陽性細胞を計数した。データは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。賦形剤についてｎ＝４、Ｃ２Ｉについてｎ＝５。Ｎｓ、有意差なし、＊＊ｐ＜０．０１偽対ＩＯＰ上昇、両側ｔ検定。
【００４１】
【図１１Ｆ】図１１Ｆ：生存率の比較。賦形剤についてｎ＝４、Ｃ２Ｉについてｎ＝５。＊＊ｐ＜０．０１賦形剤対Ｃ２Ｉ、両側ｔ検定。
【００４２】
【図１１Ｇ】図１１Ｇ：偽手術または急性ＩＯＰ上昇の３時間後に収集されたＷＴ、カルパイン−１ＫＯおよびＣ２Ｉ注射されたマウスの網膜組織におけるＰＨＬＰＰ１およびＳＴＥＰ３３の代表的な免疫ブロット法。Ｃ２Ｉ（０．３ｍ／ｋｇ）を、偽手術またはＩＯＰ上昇の２時間後に全身注射した。
【００４３】
【図１１Ｈ】図１１Ｈ：各群についてＰＨＬＰＰ１およびＳＴＥＰ３３のレベルおよびｐＡＫｔ／Ａｋｔの比の定量分析。結果は、４つの実験の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎｓ有意差なし、一元配置ＡＮＯＶＡ、それに続くボンフェローニ検定。
【００４４】
【図１２Ａ】図１２Ａ：カルパイン−２選択的阻害剤の硝子体内注射は、急性ＩＯＰ上昇によって誘導される神経節細胞層における細胞死を減少させる。急性ＩＯＰ上昇および賦形剤またはＣ２Ｉの異なる用量の硝子体内注射後のカルパイン−１ＫＯマウスの網膜におけるＳＢＤＰ免疫染色。賦形剤（ＰＢＳ中１０％ＤＭＳＯ、１μｌ）またはＣ２Ｉ（２〜８０μＭ、１μｌ）を、ＩＯＰ上昇の２時間後に硝子体内注射した。眼をＳＢＤＰ染色のためにＩＯＰ上昇の４時間後に採取した。スケールバー＝２０μｍ。
【００４５】
【図１２Ｂ】図１２Ｂ：図１２Ａで記載されるように、ＩＰＬ層におけるＳＢＤＰ染色の定量。各濃度でｎ＝３（眼）。各眼において、３つの網膜切片を定量化した。各切片において、ＩＰＬ層中の３つの５０×２５μｍ領域を選択し、ＳＢＤＰシグナルのＭＦＩを測定し、平均した。ＳＢＤＰシグナルの阻害を、（ＭＦＩ賦形剤−ＭＦＩＣ２Ｉ）／ＭＦＩ賦形剤％によって計算した。データは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。
【００４６】
【図１２Ｃ】図１２Ｃ：ＩＯＰ上昇および賦形剤またはＣ２Ｉの硝子体内注射後のＷＴマウスの網膜切片におけるＨ＆Ｅ染色。賦形剤またはＣ２Ｉ（２０μＭ、１μｌ）をＩＯＰ上昇または偽手術の２時間後に注射した。眼を、Ｈ＆Ｅ染色のために手術の３日後に採取した。スケールバー＝３０μｍ。
【００４７】
【図１２Ｄ】図１２Ｄ：図１２Ｃで記載されるように、Ｈ＆Ｅ染色に基づくＧＣＬ細胞数の定量。データは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す、実験に使われていないについてｎ＝７、賦形剤についてｎ＝４、Ｃ２Ｉについてｎ＝６。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、両側ｔ検定。
【００４８】
【図１２Ｅ】図１２Ｅ：図１２Ｄで記載されるように、Ｈ＆Ｅ染色に基づく対照のパーセンテージとしてのＧＣＬ生存率の比較。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、一元配置ＡＮＯＶＡ、それに続くボンフェローニ検定。
【００４９】
【図１２Ｆ】図１２Ｆ：ＩＯＰ上昇または偽手術の３日後に測定された眼のＯＫＲ空間周波数閾値。賦形剤またはＣ２Ｉ（２０μＭ、１μｌ）を、手術の２時間後に硝子体内注射した。手術および注射は、右眼（ＯＤ）で常に行われた。左眼（ＯＳ）のＯＫＲを対照として測定した。データは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。ｎ＝７。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１偽＋賦形剤対ＩＯＰ上昇＋賦形剤、＊＊ｐ＜０．０１ＩＯＰ上昇＋賦形剤対ＩＯＰ上昇＋Ｃ２Ｉ、一元配置ＡＮＯＶＡ、それに続くボンフェローニ検定。
【００５０】
【図１２Ｇ】図１２Ｇ：図１２Ｆで記載されるように、ＯＫＲを、手術後２１日目に再測定した。ｎ＝７。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊ｐ＜０．０５。一元配置ＡＮＯＶＡ、それに続くボンフェローニ検定。
【００５１】
【図１２Ｈ】図１２Ｈ：図１２Ｆで記載されるように、手術後２１日目に眼の網膜におけるＲＧＣ密度。眼を、手術後２１日目のＯＫＲ試験後に採取した。Ｂｒｎ−３ａ免疫染色を、眼の網膜切片で行った。ＧＣＬ中のＢｒｎ−３ａ陽性細胞を数えた。データは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。ＩＯＰ上昇＋Ｃ２Ｉについてｎ＝７。他の群についてｎ＝４。＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、一元配置ＡＮＯＶＡ、それに続くボンフェローニ検定。
【００５２】
【図１３】図１３：急性ＩＯＰ上昇後のＷＴおよびカルパイン−１ＫＯマウスの網膜ＯＣＴ。上昇した眼内圧を受けた動物の眼の代表的な画像。左上パネルは、上昇したＩＯＰ（０日目）の前に麻酔したマウスで得られた画像を示す。白い矢印は、正常な角膜生体構造および前房との開き角を示す。右上パネルは、１時間ＩＯＰ上昇を誘導した１日後の前房画像を示し；前房癒着は、血液水性障壁の破壊を示す前房（赤色の矢印）で増加した超反射率とともに見え（白色の矢印）、これは、前房でタンパク質および細胞によって引き起こされる。また、増加した角膜の厚さ（黄色の矢印）に留意されたい。これらの特徴は、典型的には、急性閉塞隅角緑内障発作で見られる。左下パネルは、２日目の画像を示し；角膜の厚さおよび前房の反射率は、１日目と比較して減少するが、虹彩前癒着（ａｎｔｅｒｉｏｒ ｓｙｎｅｃｈａｅ）は、依然として存在する。右下パネルは、３日目の画像であり、角膜の厚さおよび全房の反射率の顕著な低下を示し；癒着は、今や壊れている。
【００５３】
【図１４Ａ】図１４Ａ：急性ＩＯＰ上昇後のＷＴおよいカルパイン−１ＫＯマウスの網膜ＯＣＴ。ＩＯＰ上昇前（０日目）およびＩＯＰ上昇後（３日目）のＷＴおよびカルパイン−１ＫＯマウスからＩＯＰ上昇眼の代表的な網膜ＯＣＴ画像。スケールバー＝２００μｍ。
【００５４】
【図１４Ｂ】図１４Ｂ：手術後０〜３日目のＷＴマウスにおけるＩＯＰ上昇および偽眼の網膜の厚さの定量。データは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。ｎ＝６。＊ｐ＜０．０５  ２または３日目対０日目、一元配置ＡＮＯＶＡ、それに続くボンフェローニ検定。
【００５５】
【図１４Ｃ】図１４Ｃ：手術後０〜３日目のカルパイン−１ＫＯマウスにおけるＩＯＰ上昇および偽眼の網膜の厚さの定量。データは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。ｎ＝４。＊ｐ＜０．０５  ２または３日目対０日目、一元配置ＡＮＯＶＡ、それに続くボンフェローニ検定。
【００５６】
【図１５Ａ】図１５Ａ：マウスにおけるＯＫＲ試験。マウスにおけるＯＫＲ分析のためのセットアップ。左パネル、マウス頭部は、回転格子の中央に位置する自家製頭抑制物に固定された。右パネル、回転格子によって起こる衝動性瞳孔運動を、赤外線カメラによって記録した。
【００５７】
【図１５Ｂ】図１５Ｂ：手術後２１日目に測定されたＯＫＲ空間周波数閾値およびＲＧＣ密度の線形回帰分析。黒色の記号、偽＋賦形剤群からのデータ；青色、偽＋Ｃ２Ｉ。赤色、ＩＯＰ上昇＋賦形剤。緑色、ＩＯＰ上昇＋Ｃ２Ｉ。Ｎ＝１９。Ｒ２＝０．８６
【００５８】
【図１６Ａ】図１６Ａ：カルパイン−１Ｃ末端ペプチドで培養された皮質神経の処理は、ＡｋｔおよびＥＲＫ活性化および飢餓および酸化ストレスに対する神経保護を生じる。代表的な免疫ブロット法は、３０分間、カルパイン−１Ｃ末端ペプチド（１．５μＭ）との培養皮質神経の処理は、ＡｋｔおよびＥＲＫリン酸化を増加させたことを示す。カルパイン阻害剤ＩＩＩ（１０μＭ）での前処理は、ＡｋｔおよびＥＲＫに対するカルパイン−１ペプチドの効果をブロックする。
【００５９】
【図１６Ｂ】図１６Ｂ：次の総ＥＲＫに対する全ＡｋｔおよびｐＥＲＫに対するｐＡｋｔの比の定量分析：（ｉ）カルパイン−１Ｃ末端ペプチド（１．５μＭの３０分間）との培養された皮質神経の処理；（ｉｉ）カルパイン阻害剤ＩＩＩ（１０μＭ）との前処理；または（ｉｉｉ）カルパイン−２Ｃ末端ペプチド（１．５μＭ）。カルパイン−２Ｃ末端ペプチドとの前処理は、ＡｋｔおよびＥＲＫレベルに影響を及ぼさなかった。柱状のものは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。ｎ＝３〜６。＊ｐ＜０．０５。一元配置ＡＮＯＶＡ、それに続くボンフェローニ検定。
【００６０】
【図１６Ｃ】図１６Ｃ：カルパイン−１Ｃ末端ペプチド（１．５μＭ）との培養された皮質神経のイキュベーションは、飢餓に対する神経保護をもたらす。柱状のものは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。ｎ＝４。＊ｐ＜０．０５;＊＊ｐ＜０．０１; ＊＊＊ｐ＜０．００１。一元配置ＡＮＯＶＡ、それに続くボンフェローニ検定。
【００６１】
【図１６Ｄ】図１６Ｄ：でカルパイン−１Ｃ末端ペプチド（１．５μＭとの培養された皮質神経のインキュベーションは、Ｈ２Ｏ２傷害に対する神経保護をもたらす。柱状のものは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。ｎ＝４。＊ｐ＜０．０５;＊＊ｐ＜０．０１; ＊＊＊ｐ＜０．００１。一元配置ＡＮＯＶＡ、それに続くボンフェローニ検定。
【００６２】
【図１７】図１７：Ｓｔａｒｇａｚｉｎγ−２のアミノ酸配列における潜在的なカルパイン−２切断部位は、下線を引いて太字である。
【００６３】
【図１８】図１８：ＰＴＥＮのアミノ酸配列における潜在的なカルパイン−２切断部位は、下線を引いて太字である。
【発明を実施するための形態】
【００６４】
上記のように、アイソフォーム選択的カルパイン阻害剤に関連する組成物および方法が、本明細書中に記載される。本発明の様々な態様において、アイソフォーム選択的阻害剤は、カルパイン−１（これは、その代替学名命名法によって、μ−カルパインとも称される）またはカルパイン−２（これは、その代替学名命名法によって、ｍ−カルパインとも称される）のいずれかで言われる。特に、カルパイン−１およびカルパイン−２は、配列番号（２〜６）のカルパイン−１の例および配列番号：（６９〜７３）のカルパイン−２の例またはそれらの触媒断片を含む哺乳類の形態を指す。カルパインは、カルシウム活性中性プロテアーゼとして当該分野で公知であり、関連する分子のファミリーを含む（Ｂａｕｄｒｙら、２０１３年）。触媒断片は、カルパイン−１またはカルパイン−２の最初の３００のアミノ酸以上を含む。
【００６５】
一般的に、用語「阻害剤」は、小分子、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸またはそれらの修飾に関する。例えば、カルパイン−２の選択的阻害剤は、その活性を低下させ、カルパイン−１に対する少ない阻害を減少させる。一方、カルパイン−１の選択的阻害剤は、その活性を低下させ、カルパイン−２に対する減少された阻害効果を有する。カルパイン−１またはカルパイン−２の阻害剤は、競合的に触媒活性を選択的に阻害する分子を含み、非競合的に、それらの発現を選択的に低減し、それらの分解を選択的に促進し、それらの化学修飾を阻害または促進し、カルパイン−１またはカルパイン−２およびその相互作用タンパク質の１つ以上の間のタンパク質相互作用に選択的に影響を及ぼす。阻害剤はまた、カルパイン−１または−２の有効な機能的空間に到達する阻害剤のターゲティング、安定性、移動性、浸透性、生物学的利用能、または濃度に影響を及ぼすコンジュゲート、組成物、または処方を含み得る。
【００６６】
特に、「カルパイン−２選択的阻害剤」または「選択的カルパイン−２阻害剤」は、カルパイン−１のＫｉよりも１０倍以上低いカルパイン−２阻害定数（Ｋｉ）を有する小分子、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、またはそれらの修飾である。例えは、０．１μＭ以下のカルパイン−２のＫｉおよび１μＭ以上のカルパイン−１のＫｉは、「カルパイン−２選択的阻害剤」の定義を満たすだろう。「高度に選択的カルパイン−２阻害剤」は、好ましくは、カルパイン−１よりもカルパイン−２に対して少なくとも２０倍低いＫｉを示すだろう。カルパイン−１選択的阻害剤は、カルパイン−２に対するＫｉよりも７倍以上低いカルパイン−１阻害定数（Ｋｉ）を有する小分子、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、またはそれらの修飾である。高度に選択的カルパイン−１阻害剤は、カルパイン−２に対するＫｉよりも２０倍以上低いカルパイン−１阻害定数（Ｋｉ）を有する小分子、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、またはそれらの修飾である。少なくとも４つの高度に選択的カルパイン−２阻害剤は、当該分野で開示される。Ｌｉら、１９９６年は、分子１８、１９、および５６を開示し、ｚ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ＣＯＮＨ−ｎＰｒは、米国特許第６，２３５，９２９号の第１４欄、表１で、１５μＭのカルパイン−１に対するＫｉおよび０．０５μＭとしてカルパイン−２に対するＫｉを有する最も高度に選択的カルパイン−２阻害剤として開示される。しかしながら、文献はまた、０．３５μＭであるカルパイン−２のｚ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ＣＯＮＨ−ｎＰｒのＫｉおよび０．０５μＭとしてカルパイン−１に対するＫｉを開示する（米国特許第６，２３５，９２９号およびＬｉら、１９９６年）。したがって、高度に選択的カルパイン−２阻害剤について文献で開示される構造情報は、いくらか予測不能であり、４つの公知の高度に選択的カルパイン−２阻害剤の１つは、不定の選択性を有する。
【００６７】
本発明の様々な態様において、カルパイン阻害剤は、「小分子」である。「小分子」は、５ｋＤ未満、より好ましくは約４ｋＤ未満の分子量を有する組成物を指す。小分子は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣薬、炭水化物、脂質または他の有機分子であることができる。
【００６８】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、互換性があり、ペプチド結合によって結合されたアミノ酸からなる生体分子を意味すると定義される。これは、一方の末端上でアミンまたはアミド結合を有する結合されるまたは個々の化合物、２つの水素原子または水素原子およびＲ基または２つのＲ基を可変的に有するα炭素、他方の末端上でα−炭素に結合されるカルボン酸基、または前記アミノ酸と別のアミノ酸を結合する追加のアミド結合を含む。本発明のポリペプチドは、アミノ酸を天然に存在するアミノ酸のＲ基を収容し、グリシン、アラニン、システイン、メチオニン、セリン、スレオニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、ヒスタミン、アルギニン、リジン、フェニルアラニン、チロシン、プロリン、トリプトファン、グルタミン、およびアスパラギンを含む。
【００６９】
本発明の様々なタンパク質の態様において、選択的カルパイン阻害剤は、カルパイン−２を阻害する抗体である。例えば、本発明は、カルパイン−２に結合する基質を阻害する抗体を収容し、これは、基質へのカルパイン−２の接近を阻止するか、またはこれは、カルパイン−２の立体的マスキングまたはアロステリック調節によりセリン５０でカルパイン−２のリン酸化を阻害するか（Ｓｈｉｒａｈａら, ２００２年； Ｚａｄｒａｎら, ２０１０年、参照により組み込まれる）、または阻害されるようにカルパイン−２を結合する。抗体は、そのような抗体またはその断片のポリクロナール、モノクロナール、一本鎖、抗イディオタイプ、キメラ、またはヒト化バージョンであることができる。抗体は、免疫応答が惹起されることができる任意の種からのものであり得る。
【００７０】
ｍ−カルパインのセリン５０のリン酸化を選択的にブロックする抗体、ペプチド、ポリペプチド、および修飾ペプチドは、ＵＳＰＰＮ２００３／０１４８２６４で記載されるものなども熟考され、これは、参照により組み込まれる。これらは、ファージディスプレイ、バクテリオファージ粒子の表面上に提示されるタンパク質コート上に融合タンパク質として高度に変異したペプチドライブラリーを発生する技術（Ｃｌａｃｋｓｏｎら、１９９１年；Ｃｗｉｒｌａら, １９９０年）などの技術分野で定義される技術を使用してされることができる。ファージディスプレイライブラリーから同定される融合タンパク質は、カルパイン−２の非リン酸化セリン５０など、ペプチド標的に対してスクリーニングされることができる。そのようなポリペプチドは、リン酸化部位に結合し、立体的にマスキングすることによってセリン５０のリン酸化を選択的にブロックし、それによって、本明細書中に開示されるＬＴＰ傷害の疾患を治療するために使用されることができる。
【００７１】
「修飾」は、自然に存在するアミノ酸のいずれかまたは全ての結合または非結合の特徴を有するペプチドまたはポリペプチドに存在しないペプチドおよびポリペプチドへの変化を指す。アミノ末端、またはカルボキシル末端、またはＲ基に対する修飾は、カルパイン−１またはカルパイン−２に対するペプチドまたはポリペプチドの親和性を増加または減少させるか、または半減期を増加または減少させるか、または生物学的利用能を増加させるか、またはカルパイン−１またはカルパイン−２標的空間におけるそれらの濃度を増加させる。
【００７２】
変異体は、突然変異生成によるアミノ酸配列が異なるポリペプチドを含む。本発明により包含される変異体タンパク質は、生物学的に活性であり、すなわち、それらは、天然タンパク質の所望の生物学的活性、すなわち、保持活性を保持し続ける。いくつかの態様において、変異体は、天然のタンパク質と比べて改善された活性を有する。さらに「変異体」の観念に関して、タンパク質のＤＮＡ配列は、様々な方法によって変更され得、これらの変更は、本発明のタンパク質によってコードされるより異なるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列をもたらし得ることが認識される。
実際に、本発明の様々な態様において、ポリペプチド阻害剤は、１個以上のアミノ酸のアミノ酸置換、欠失、切断、および挿入を含む様々な方法で変更され得る。例えば、特定の態様において、配列番号１〜６および６９〜７３のポリペプチドは、１個まで、約２個、約３個、約４個、約５個、約６個、約７個、約８個、約９個、約１０個、約１５個、約２０個、約２５個、約３０個、および約３５個以上のアミノ酸置換、欠失、切断、オーム挿入（ｏｒｍｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）を含み得る。また別の側面において、本明細書中で記載される配列は、本明細書中で記載される配列上のＣおよび／またはＮ末端領域に対する１個、約２個、約３個、約４個、約５個、約１０個、または２０個の付加または切断を含む。非限定的な側面において、それらの開示は、配列番号１〜６および６９〜７３の１つ以上のＣおよび／またはＮ末端領域に対する１個、約２個、約３個、約４個、約５個、約１０個、または約２０個の付加または欠失を含む配列を提供する。当業者は、変化は、本発明のヌクレオチド配列の突然変異によって誘導されることができ、それによって、タンパク質の生物学的活性を変化させることなく、コードされたタンパク質のアミン酸配列の変化を導くことをさらに理解するだろう。したがって、変異体単離核酸分子は、１つ以上のアミノ酸置換、付加、または欠失がコードされたタンパク質に誘導されるように、１つ以上のヌクレオチド置換、付加、または欠失を本明細書中で開示される対応するヌクレオチド配列に誘導することによって、作製されることができる。突然変異は、部位特異的突然変異生成およびＰＣＲ媒介突然変異生成などの標準技術によって導入されることができる。そのような変異体ヌクレオチド配列はまた、本発明に包含される。
【００７３】
保存的アミノ酸置換は、本発明に係るポリペプチドカルパイン阻害剤の１つ以上の予測された非必須アミノ酸残基でされ得る。「非必須」アミノ酸残基は、生物学的活性を変更することなくタンパク質の野生型配列から変更されることができる残基であり、一方、「必須」アミノ酸残基は、生物学的活性に必要である。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術で定義されている。これらのファミリーは
塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アルパラギンン酸、グルタミン酸）、帯電していない極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。
【００７４】
１つの側面において、アミノ酸置換は、機能を保持する非保存領域においてされ得る。一般的に、そのような置換は、保存されるアミン酸残基、または保存されたモチーフ内に存在するアミノ酸について作製され得、そのような残基は、タンパク質活性に必須である。保存され、タンパク質活性に必須であり得る残基の例には、例えば、本発明の配列に対して類似又は関連する毒素のアライメントに含まれる全てのタンパク質間で同一である残基を含む。保存されるが、保存的アミノ酸置換を可能にし、活性をまだ保持し得る残基の例は、例えば、本発明の配列に類似または関連する毒素のアライメントに含まれる全てのタンパク質間で保存的置換のみを有する残基が含まれる（例えば、アライメント相同タンパク質で含まれる全てのタンパク質間の保存的置換のみを有する残基）。しかしながら、当業者は、機能的変異体が、保存された残基で軽度に保存されたか、または保存されていない変化を有し得ることを理解するだろう。
【００７５】
１つの側面において、本開示は、本明細書中で記載される配列のいずれかのアミノ酸配列に少なくとも約６０％、６５％、約７０％、７５％、約８０％、８５％、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質またはポリペプチドを提供する。別の側面において、本開示は、配列番号１〜１９４および２０１〜２２を記載される配列のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも約６０％、６５％、約７０％、７５％、約８０％、８５％、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質またはポリペプチドを提供する。
【００７６】
別の側面において、変異体は、厳しい条件の下で、本明細書中で記載される核酸分子、またはその相補体にハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドを含むことができる。変異体は、突然変異生成によるアミノ酸配列が異なるポリペプチドを含む。本発明に包含される変異体タンパク質は、生物学的活性であり、すなわち、それらは、天然タンパク質の所望の生物学的活性、すなわち、保持活性を保持し続ける。いくつかの態様において、変異体は、天然タンパク質と比べて改善された活性を有する。
【００７７】
タンパク質のＤＮＡ配列は、様々な方法によって変更され得、これらの変更は、本発明のタンパク質によってコードされるものと異なるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列をもたらし得ることが認識される。このタンパク質は、配列番号１〜６および６９〜７３の１個以上のアミノ酸のアミノ酸置換、欠失、切断、および挿入を含む様々な方法で変更され得、１個まで、約２個、約３個、約４個、約５個、約６個、約７個、約８個、約９個、約１０個、約１５個、約２０個、約２５個、約３０個、および約３５個以上のアミノ酸置換、欠失、切断、または挿入を含む。さらに別の態様において、本明細書中で記載される配列は、本明細書中で記載される配列上のＣおよび／またはＮ末端領域に対する１個、約２個、約３個、約４個、約５個、約１０個、または約２０個の付加または切断を含む。非限定的な側面において、本開示は、配列番号１〜６および６９〜７３の１つ以上のＣおよび／またはＮ末端領域への１個、約２個、約３個、約４個、約５個、約１０個、または約２０個の付加または欠失を含む配列を提供する。
【００７８】
核酸配列の修飾
本発明の１つの側面は、タンパク質またはポリペプチドまたはそれらの生物学的に活性な部分をコードするヌクレオチド配列、並びに配列相同性の流域を有するタンパク質をコードする核酸分子を同定するハイブリダイゼーションプローブとしての使用に十分な核酸分子を含む単離または組換え核酸分子に関する。本明細書中で使用される場合、用語「核酸分子」は、ヌクレオチド類似体を使用して発生されたＤＮＡ分子（例えば、組換えＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）およびＤＮＡまたはＲＮＡの類似体を含むことを意図される。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であることができるが、好ましくは、二本鎖ＤＮＡである。「単離された」または「組換え」核酸配列（またはＤＮＡ）は、本明細書中で使用されて、もはやその天然の環境、例えば、インビトロまたは組換え細菌または植物宿主に存在しない核酸配列（またはＤＮＡ）に言及する。いくつかの態様において、単離されたまたは組換え核酸は、核酸が由来する生物体のゲノムＤＮＡにおいて、核酸の天然に側面に位置する配列（好ましくはたんぱく質コード配列）（すなわち、核酸の５’および３’末端に位置する配列）がない。本発明の目的のために、核酸分子に言及すために使用される場合、「単離された」は、単離された染色体を排除する。
【００７９】
カルパイン−２基質、スターガジン（Ｓｔａｒｇａｚｉｎ）
α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオン酸（ＡＭＰＡ）受容体輸送に関与するタンパク質であるスターガジン（Ｓｔａｒｇａｚｉｎ）γ−２は、別のカルパイン−２特異的基質である。特に、図１７に示される細胞質Ｃ末端は、カルパイン−１より約１００倍多くのカルパイン−２を競合的に阻害する。
【００８０】
カルパイン−２基質、ＰＴＥＮ
ヒト腫瘍抑制タンパク質ＰＴＲＮ（配列番号１）は、カルパイン−２特異的切断部位を有するものとして本明細書中で開示される。したがって、ＰＴＥＮは、カルパイン−２特異的基質である。文献は、カルパイン−１またはカルパイン−２特異的基質のいくつかの例（すなわち、１０倍を超える異なるＫｉ）を開示するが、一般的に、カルパイン−１とカルパイン−２の違いがないことが教示されており、カルパインが、それらの基質の広い領域を必要とするか、または「読む」という事実の代わりに、構造情報を欠く小さなペプチドを切断しない（Ｇｏｌｌら、２００３年、参照により組み込まれる）。ＰＴＥＮは、カルパイン−１に対するカルパイン−２への有意に示差感受性の部分を有する最初のカルパイン基質である。潜在的なＰＴＥＮカルパイン−２切断部位は、図１７で下線が引かれており、太字である。
【００８１】
本開示まで、カルパイン−１とカルパイン−２の間の標的タンパク質／基質特異性は、一般的に、認識されなかった。カルパイン−１の結晶構造（Ｐａｌら、２００３年、参照により組み込まれる）およびカルパイン−２の結晶構造（Ｈｏｓｆｉｅｌｄら、１９９９年、参照により組み込まれる）は、カルパイン阻害剤の設計を提供したが、阻害剤で共結晶化される前記結晶構造を使用するカルパイン−１またはカルパイン−２選択的阻害剤の開示は、選択性を教示していない（Ｃｕｅｒｒｉｅｒら、２００６年、参照により組み込まれる）。インビボおよびインビトロの両方でカルパイン−１に感受性がないがカルパイン−２に感受性であるポリペプチド切断部位が、本明細書中で開示される。他の態様において、ＰＴＥＮ、またはＰＴＥＮのポリペプチド断片、またはＰＴＥＮの修飾ポリペプチド断片は、カルパイン−２選択的阻害剤である。あるいは、配列番号１、または配列番号１４６〜１９４で記載されるようなＰＴＥＮのポリペプチド断片は、本発明の態様である。
【００８２】
ポリペプチドの好ましい態様の発明は、配列番号１、１４６〜１９４のペプチドに少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。ペプチドは、ＢＢＢを越えたターゲティングを増加させるか、またはインビトロまたはインビボでの半減期を増加させるか、生物学的利用能、または修飾またはそれらの他のポリペプチドドメインの組み合わせを増加させるものなどのさらなる修飾またはドメインを含むことができ；例えば、トランスフェリンポリペプチド断片、インスリン断片、ＬＤＬ結合タンパク質断片、狂犬病ウイルス糖タンパク質断片である。ＰＴＥＮのカルパイン−２選択的切断部位のペプチドまたはポリペプチド断片、または修飾ポリペプチド断片が、Ｋｉによって測定されるように、カルパイン−１より大きい、Ｋｉによって測定されるように、カルパイン−２を阻害するだろうと予想される。
【００８３】
様々な他の態様において、ポリペプチドカルパイン阻害剤は、カルパイン−１またはカルパイン−２の少なくとも３５０個の連続アミノ酸を含み、ここで、断片は、完全長天然型よりも小さく、タンパク質分解活性を有する。様々な他の態様において、ポリペプチドカルパイン阻害剤は、カルパイン−１またはカルパイン−２の少なくとも４個の連続するアミノ酸を含む。
【００８４】
本発明のポリペプチド阻害剤の様々な態様において、ポリペプチドは、基Ｒ１およびＲ２で置換され、Ｒ１およびＲ２は、共有結合によって結合される。様々な他の態様において、Ｒ１は、カルパイン−１またはカルパイン−２の選択的阻害剤、またはカルパイン−１またはカルパイン−２の高度に選択的阻害剤であるポリペプチド断片または修飾ポリペプチド断片、または吸収、生物学的利用能、半減期、またはターゲティングを改善する分子（トランスフェリンポリペプチド断片、インスリン断片、ＬＤＬ結合タンパク質断片、狂犬病ウイルス糖タンパク質断片など）であり；およびＲ２は、カルパイン−１またはカルパイン−２の選択的阻害剤、またはカルパイン−１またはカルパイン−２の高度に選択的阻害剤であるポリペプチドまたは修飾ポリペプチド、または吸収、生物学的利用能、半減期、またはターゲティングを改善するポリペプチド断片または修飾ポリペプチド断片、例えば（トランスフェリンポリペプチド断片、インスリン断片、ＬＤＬ結合タンパク質断片、狂犬病ウイルス糖タンパク質断片）である。
【００８５】
様々な態様において、本発明に係るカルパイン−２の選択的阻害剤は、以下の式に基づく分子であり：
【化１】
2017538681.tif 000003
ここで、Ｍ１は、Ｙ１−ＰｈＣＨ２−、Ｙ１−Ｐｈ（ＣＨ２）２−、ＰｈＣＨ２−Ｙ１, またはＰｈ（ＣＨ２）２−Ｙ１−から選択されるブロッキング基を共有結合する置換される−Ｏ、−Ｎ、−Ｓ、または−Ｃであり、Ｙ１は、（トランスフェリンポリペプチド断片、インスリン断片、ＬＤＬ結合タンパク質断片、狂犬病ウイルス糖タンパク質断片）など吸収、生物学的利用能、半減期、またはターゲティングを改善する分子に共有結合されるポリペプチド、または修飾ポリペプチドであり；またはＹ１は、−Ｈ、（トランスフェリンポリペプチド断片、インスリン断片、ＬＤＬ結合タンパク質断片、狂犬病ウイルス糖タンパク質断片）など半減期、生物学的利用能、またはターゲティングを改善する小分子、ポリペプチドまたは修飾ポリペプチを結合するための置換であるであり；またはＹ１は、（配列番号１９５〜２００）から選択される膜透過性または血液脳関門通過を改善するポリペプチド、（トランスフェリンポリペプチド断片、インスリン断片、ＬＤＬ結合タンパク質断片、狂犬病ウイルス糖タンパク質断片）などの吸収、生物学的利用能、半減期、またはターゲティングを改善する分子を結合する−Ｏ、−Ｎ、−Ｓ、または−Ｃ置換であり、またはＭ１は、膜透過性または血液脳関門通過を改善する小分子、ポリペプチド、または修飾ポリペプチド、配列番号（１９５〜２００）から選択されるポリペプチド、（トランスフェリンポリペプチド断片、インスリン断片、ＬＤＬ結合タンパク質断片、狂犬病ウイルス糖タンパク質断片）などの吸収、生物学的利用能、半減期、またはターゲティングを改善する分子を共有結合する置換される−Ｏ、−Ｎ、−Ｓ、または−Ｃであり；Ｒ１は、Ｌ配向性を有し、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、バリン、イソロイシン、メチオニン、アラニンのアミン酸側鎖、または修飾アミノ酸側鎖を有するα炭素に共有結合される官能基であり；およびＲ２は、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、−（ＣＨ２）２ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、−Ｃ６Ｈ５、−Ｃ６Ｈ４(４−ＯＨ)、Ｃ６Ｈ４（３−ＯＨ）、Ｃ６Ｈ4（２−ＯＨ）、Ｃ６Ｈ４（２−ＣＨ３）、Ｃ６Ｈ４(３−ＣＨ３)、Ｃ６Ｈ４（４−ＣＨ３）、Ｃ６Ｈ4（２−ＯＣＨ３）、Ｃ６Ｈ４（３−ＯＣＨ３）、Ｃ６Ｈ４（４−ＯＣＨ３）、Ｃ６Ｈ４（２−ＮＨ２）、Ｃ６Ｈ４（３−ＮＨ２）、 Ｃ６Ｈ４（４−ＮＨ２）、Ｃ６Ｈ４（２−ＮＨＣＨ３）、Ｃ６Ｈ４（３−ＮＨＣＨ３）、Ｃ６Ｈ４（４−ＮＨＣＨ３）、Ｃ６Ｈ４(２−Ｎ(ＣＨ３)２)、Ｃ６Ｈ４（３―Ｎ（ＣＨ３）2）、またはＣ６Ｈ４（４−Ｎ(ＣＨ３)２）であり；Ｒ３は、−Ｈ、−ＯＣＨ３、＝ＮＨ、−ＮＨ２、−ＳＨ、＝Ｏ、＝Ｓ、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｏ(ＣＨ2)２ＣＨ３、−ＯＣＨ(ＣＨ３)２、−ＳＣＨ３、−ＳＣＨ２ＣＨ３、−Ｓ(ＣＨ２)２ＣＨ３、−ＳＣＨ(ＣＨ３)２、−ＯＨ、−ＣＨ３、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉであり；Ｘ１は、−Ｃ６Ｈ３(３，５−Ｒ４，Ｒ５)、−ＣＨＲ６−Ｃ６Ｈ３−（３，５−Ｒ４，Ｒ５）、−２−ピリジル、−２−ピリジル（３，５，Ｒ４，Ｒ５）、−ＣＨＲ６−２−ピリジル（３，５，Ｒ４，Ｒ５）、−３−ピリジル（３，５，Ｒ４，Ｒ５）、−ＣＨＲ６−３−ピリジル（���，５，Ｒ４，Ｒ５）、−４−ピリジル（３，５，Ｒ４，Ｒ５）、または−ＣＨＲ６−４−ピリジル（３，５，Ｒ４，Ｒ５）であり；ここで、Ｒ４は、−Ｈ、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）２ＣＨ３、−ＯＣＨ（ＣＨ３）２、−ＳＣＨ3、ＳＣＨ２ＣＨ３、Ｓ（ＣＨ２）２ＣＨ３、−ＳＣＨ（ＣＨ３）２、−ＯＨ、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＮ、−ＣＨＮＨ、−ＮＨ２、−ＮＨＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、または−Ｉであり；Ｒ５は、−Ｈ、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｏ(ＣＨ２)２ＣＨ３、−ＯＣＨ(ＣＨ３)２、−ＳＣＨ３、ＳＣＨ２ＣＨ３、−Ｓ（ＣＨ２）２ＣＨ３、−ＳＣＨ（ＣＨ３）２、−ＯＨ、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＮ、−ＣＨＮＨ、−ＮＨ２、−ＮＨＣＨ３、−Ｎ(ＣＨ３)２、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、または−Ｉであり；およびＲ６は、−Ｈ、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｏ(ＣＨ２)２ＣＨ３、−ＯＣＨ(ＣＨ３)２、−ＳＣＨ3、−ＳＣＨ２ＣＨ３、−Ｓ(ＣＨ２)２ＣＨ３、−ＳＣＨ(ＣＨ３)２、−ＯＨ、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＮ、−ＣＨＮＨ、−ＮＨ２、−ＮＨＣＨ３、−Ｎ(ＣＨ３)２、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、または−Ｉである。
【００８６】
様々な他の態様において、本発明に係るカルパイン−２の選択性は、以下の式に基づく分子であり：
【化２】
2017538681.tif 000004
ここで、Ｒ１は、Ｘ１−ＰｈＣＨ２−、またはＸ１−Ｐｈ（ＣＨ２）２であり；Ｘ１は、−Ｈであるか、または（トランスフェリンポリペプチド断片、インスリン断片、ＬＤＬ結合タンパク質断片、狂犬病ウイルス糖タンパク質断片）など吸収、生物学的利用能、半減期、またはターゲティングを改善する分子を結合するための置換であり；Ｒ２は、Ｌ配向性を有し、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、バリン、イソロイシン、メチオニン、アラニンのアミン酸側鎖、または修飾アミノ酸側鎖を有するα炭素に共有結合される官能基であり；Ｒ３は、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、−（ＣＨ２）２ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＨ３）２−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、−Ｃ６Ｈ５、−Ｃ６Ｈ４（４−ＯＨ）、−Ｃ６Ｈ４（３−ＯＨ）、−Ｃ６Ｈ4（２−ＯＨ）、−Ｃ６Ｈ４（２−ＣＨ３）、−Ｃ６Ｈ４（３−ＣＨ３）、−Ｃ６Ｈ４（４−ＣＨ３）、−Ｃ６Ｈ4（２−ＯＣＨ３）、Ｃ６Ｈ４（３−ＯＣＨ３）、Ｃ６Ｈ４（４−ＯＣＨ３）、Ｃ６Ｈ４（２−ＮＨ２）、Ｃ６Ｈ４（３−ＮＨ２）、Ｃ６Ｈ４（４−ＮＨ２）、Ｃ６Ｈ４（２−ＮＨＣＨ３）、Ｃ６Ｈ４（３−ＮＨＣＨ３）、Ｃ６Ｈ４（４−ＮＨＣＨ３）、Ｃ６Ｈ４（２−Ｎ（ＣＨ３）２）、Ｃ６Ｈ４（３−Ｎ（ＣＨ3）2）、またはＣ６Ｈ４（４−Ｎ（ＣＨ３）２）であり；Ｒ４は、−Ｈ、または−ＯＣＨ３、＝ＮＨ、−ＮＨ２、−ＳＨ、＝Ｏ、＝Ｓ、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｏ(ＣＨ２)２ＣＨ３、−ＯＣＨ（ＣＨ３）２、−ＳＣＨ３、ＳＣＨ２ＣＨ３、−Ｓ（ＣＨ２）２ＣＨ３、−ＳＣＨ（ＣＨ３）２、−ＯＨ、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、または−Ｉであり；Ｒ５は、−Ｈ、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）２ＣＨ３、−ＯＣＨ（ＣＨ３）２、−ＳＣＨ3、ＳＣＨ２ＣＨ３、−Ｓ（ＣＨ２）２ＣＨ３、−ＳＣＨ（ＣＨ３）２、−ＯＨ、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＮ、−ＣＨＮＨ、−ＮＨ２、−ＮＨＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉであり；およびＲ６は、−Ｈ、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）２ＣＨ３、−ＯＣＨ（ＣＨ３）２、−ＳＣＨ3、ＳＣＨ２ＣＨ３、−Ｓ（ＣＨ２）２ＣＨ３、−ＳＣＨ（ＣＨ３）２、−ＯＨ、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＮ、−ＣＨＮＨ、−ＮＨ２、−ＮＨＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、または−Ｉである。
【００８７】
特定の態様において、本発明に係るカルパイン−２の選択的阻害剤は、式Ｉの以下の構造に基づく分子であり：
【化３】
2017538681.tif 000005
ここで、円で示されたキラル中心は、左旋性（Ｌ）であり、キラル中心２は、Ｄ−またはＬ−、またはラセミ混合物である。式１の分子の２つの態様は、キラル中心１にＬ−およびキラル中止２にＬ−形態、または別々にキラル中心１にＬ−形態およびキラル中心２にＤ−形態を有する精製された形態である。
【００８８】
特定の態様において、本発明に係るカルパイン−２の選択的阻害剤は、式ＩＩの以下の構造に基づく分子であり：
【化４】
2017538681.tif 000006
ここで、円で示されるキラル中心１は、左旋性（Ｌ）であり、キラル中心２は、Ｄ−またはＬ−、またはラセミ混合物であり、キラル中心３は、Ｄ−またはＬ−、またはラセミ混合物である。分子の４つの好ましい態様は、キラル中心１でＬ−、キラル中心２でＬ−形態、およびキラル中心３でＬ−形態；または別々に、キラル中心１でＬ−形態およびキラル中心２でＤ−形態、およびキラル中心３でＬ−形態；または別々に、キラル中心１でＬ−形態およびキラル中心２でＤ−形態、およびキラル中心３でＤ−形態；または別々に、キラル中心１でＬ−形態およびキラル中心２でＬ−形態、およびキラル中心３でＤ−形態を有する精製形態である。
【００８９】
上記のように、本発明は、カルパイン−１に対してよりもカルパイン−２に対して少なくも１０倍低いＫｉを有するカルパイン−２を選択的に阻害する能力を有する化合物を収容する。例えば、様々な態様において、カルパイン−１に対してよりもカルパイン−２に対して少なくとも１０倍低いＫｉを有するカルパイン−２を阻害することができる化合物は、式ＩＩＩの以下の構造を有する構造を有し：
【化５】
2017538681.tif 000007
ここで、円で示されるキラル中心１は、左旋性（Ｌ）であり、キラル中心２は、Ｄ−またはＬ−、またはラセミ混合物であり、キラル中心３は、Ｄ−またはＬ−、またはラセミ混合物である。上記分子の４つの好ましい態様は、キラル中心１でＬ−、キラル中心２でＬ−形態、およびキラル中心３でＬ−形態；または別々に、キラル中心１でＬ−形態およびキラル中心２でＤ−形態、およびキラル中心３でＬ−形態；または別々に、キラル中心１でＬ−形態およびキラル中心２でＤ−形態、およびキラル中心３でＤ−形態；または別々に、キラル中心１でＬ−形態およびキラル中心２でＬ−形態、およびキラル中心３でＤ−形態を有する精製形態である。
【００９０】
カルパイン−１に対してよりもカルパイン−２に対して少なくとも１０倍低いＫｉを有するカルパイン−２を阻害することができる化合物の別の態様においては、式ＩＶの以下の構造を有する構造を有し：
【化６】
2017538681.tif 000008
ここで、円で示されるキラル中心１は、左旋性（Ｌ）であり、キラル中心２は、Ｄ−またはＬ−、またはラセミ混合物である。上記の分子の２つの好ましい態様は、キラル中心１でＬ−およびキラル中心２でＬ−形態、または別々に、キラル中心１でＬ−形態およびキラル中心２でＤ−形態を有する精製形態である。
【００９１】
カルパイン−１に対してよりもカルパイン−２に対して少なくも１０倍低いＫｉを有するカルパイン−２を選択的に阻害する能力を有する化合物の別の態様においては、式Ｖの以下の構造を有する構造を有し：
【化７】
2017538681.tif 000009
ここで、Ｒ１は、Ｘ１−ＰｈＣＨ２−、またはＸ１−Ｐｈ（ＣＨ２）２であり；Ｘ１は、−であるか、または（トランスフェリンポリペプチド断片、インスリン断片、ＬＤＬ結合タンパク質断片、狂犬病ウイルス糖タンパク質断片）など吸収、生物学的利用能、半減期、またはターゲティングを改善する分子であり；Ｒ２は、Ｌ配向性を有し、ロイシン、またはフェニルアラニン、またはチロシン、またはバリン、またはイソロイシン、メチオニン、またはアラニンのアミノ酸側鎖、または修飾アミノ酸側鎖を有するα炭素に共有結合される官能基であり；およびＲ３は、−ＣＨ３、または−ＣＨ２ＣＨ３、または−（ＣＨ２）２ＣＨ３、または−ＣＨ（ＣＨ３）２または−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、または−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、または−Ｃ６Ｈ５、−Ｃ６Ｈ４（４−ＯＨ）、Ｃ６Ｈ４（３−ＯＨ）、またはＣ６Ｈ4（２−ＯＨ）、またはＣ６Ｈ４（２−ＣＨ３）、またはＣ６Ｈ４（３−ＣＨ３）、Ｃ６Ｈ４（４−ＣＨ３）、またはＣ６Ｈ4（２−ＯＣＨ３）、またはＣ６Ｈ４（３−ＯＣＨ３）、またはＣ６Ｈ４（４−ＯＣＨ３）、またはＣ６Ｈ４（２−ＮＨ２）、またはＣ６Ｈ４（３−ＮＨ２）、またはＣ６Ｈ４（４−ＮＨ２）、またはＣ６Ｈ４（２−ＮＨＣＨ３）、またはＣ６Ｈ４（３−ＮＨＣＨ３）、またはＣ６Ｈ４（４−ＮＨＣＨ３）、またはＣ６Ｈ４（２−Ｎ（ＣＨ３）２）、またはＣ６Ｈ４（３−Ｎ（ＣＨ3）2）、またはＣ６Ｈ４（４−Ｎ（ＣＨ３）２）であり；およびＲ４は、−Ｈ、または−ＯＣＨ３、＝ＮＨ、または−ＮＨ２、または−ＳＨ、または＝Ｏ、または＝Ｓ、または−ＯＣＨ２ＣＨ３、または−Ｏ(ＣＨ２)２ＣＨ３、または−ＯＣＨ（ＣＨ３）２、−ＳＣＨ３、またはＳＣＨ２ＣＨ３、または−Ｓ（ＣＨ２）２ＣＨ３、または−ＳＣＨ（ＣＨ３）２、または−ＯＨ、または−ＣＨ３、または−ＣＨ２ＣＨ３、または−Ｆ、または−Ｃｌ、または−Ｂｒ、または−Ｉであり；およびＲ５は、−Ｈ、または−ＯＣＨ３、または−ＯＣＨ２ＣＨ３、または−Ｏ（ＣＨ２）２ＣＨ３、または−ＯＣＨ（ＣＨ３）２、−ＳＣＨ3、またはＳＣＨ２ＣＨ３、または−Ｓ（ＣＨ２）２ＣＨ３、または−ＳＣＨ（ＣＨ３）２、または−ＯＨ、または−ＣＨ３、または−ＣＨ２ＣＨ３、または−ＣＮ、または−ＣＨＮＨ、または−ＮＨ２、または−ＮＨＣＨ３、または−Ｎ（ＣＨ３）２、または−Ｆ、または−Ｃｌ、または−Ｂｒ、または−Ｉであり；およびＲ６は、−Ｈ、または−ＯＣＨ３、または−ＯＣＨ２ＣＨ３、または−Ｏ（ＣＨ２）２ＣＨ３、または−ＯＣＨ（ＣＨ３）２、−ＳＣＨ3、またはＳＣＨ２ＣＨ３、または−Ｓ（ＣＨ２）２ＣＨ３、または−ＳＣＨ（ＣＨ３）２、または−ＯＨ、または−ＣＨ３、または−ＣＨ２ＣＨ３、または−ＣＮ、または−ＣＨＮＨ、または−ＮＨ２、または−ＮＨＣＨ３、または−Ｎ（ＣＨ３）２、または−Ｆ、または−Ｃｌ、または−Ｂｒ、または−Ｉである。
【００９２】
カルパイン−１に対してよりもカルパイン−２に対して少なくとも１０倍低いＫｉを有するカルパイン−２を選択的に阻害することができる化合物の別の態様においては、式ＶＩの以下の構造を有する構造を有し：
【化８】
2017538681.tif 000010
ここで、Ｒ１は、ＰｈＣＨ２−、またはＰｈ（ＣＨ２）２であり；Ｒ２は、Ｌ配向性を有し、ロイシン、またはフェニルアラニン、またはチロシン、またはバリン、またはイソロイシン、メチオニン、またはアラニンのアミノ酸側鎖、または修飾アミノ酸側鎖を有するα炭素に共有結合される官能基であり；およびＲ３は、−ＣＨ３、または−ＣＨ２ＣＨ３、または−（ＣＨ２）２ＣＨ３、または−ＣＨ（ＣＨ３）２または−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、または−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、または−Ｃ６Ｈ５、−Ｃ６Ｈ４（４−ＯＨ）、−Ｃ６Ｈ４（３−ＯＨ）、または−Ｃ６Ｈ4（２−ＯＨ）、または−Ｃ６Ｈ４（２−ＣＨ３）、またはＣ６Ｈ４（３−ＣＨ３）、Ｃ６Ｈ４（４−ＣＨ３）、または−Ｃ６Ｈ4（２−ＯＣＨ３）、またはＣ６Ｈ４（３−ＯＣＨ３）、またはＣ６Ｈ４（４−ＯＣＨ３）、またはＣ６Ｈ４（２−ＮＨ２）、またはＣ６Ｈ４（３−ＮＨ２）、またはＣ６Ｈ４（４−ＮＨ２）、またはＣ６Ｈ４（２−ＮＨＣＨ３）、またはＣ６Ｈ４（３−ＮＨＣＨ３）、またはＣ６Ｈ４（４−ＮＨＣＨ３）、またはＣ６Ｈ４（２−Ｎ（ＣＨ３）２）、またはＣ６Ｈ４（３−Ｎ（ＣＨ3）2）、またはＣ６Ｈ４（４−Ｎ（ＣＨ３）２）であり；およびＲ４は、−Ｈ、または−ＯＣＨ３、＝ＮＨ、または−ＮＨ２、または−ＳＨ、または＝Ｏ、または＝Ｓ、または−ＯＣＨ２ＣＨ３、または−Ｏ(ＣＨ２)２ＣＨ３、または−ＯＣＨ（ＣＨ３）２、−ＳＣＨ３、またはＳＣＨ２ＣＨ３、または−Ｓ（ＣＨ２）２ＣＨ３、または−ＳＣＨ（ＣＨ３）２、または−ＯＨ、または−ＣＨ３、または−ＣＨ２ＣＨ３、または−Ｆ、または−Ｃｌ、または−Ｂｒ、または−Ｉであり；およびＲ５は、−Ｈ、または−ＯＣＨ３、＝ＮＨ、または−ＮＨ２、または−ＳＨ、または＝Ｏ、または＝Ｓ、または−ＯＣＨ２ＣＨ３、または−Ｏ(ＣＨ２)２ＣＨ３、または-ＯＣＨ(ＣＨ３)２、−ＳＣＨ３、またはＳＣＨ２ＣＨ３、または−Ｓ(ＣＨ２)２ＣＨ３、または−ＳＣＨ(ＣＨ３)２、または−ＯＨ、または−ＣＨ３、または−ＣＨ２ＣＨ３、または−Ｆ、または−Ｃｌ、または−Ｂｒ、または−Ｉであり；Ｒ６は、−Ｈ、または−ＯＣＨ３、または−ＯＣＨ２ＣＨ３、または−Ｏ(ＣＨ２)２ＣＨ３、または−ＯＣＨ(ＣＨ３)２、−ＳＣＨ３、またはＳＣＨ２ＣＨ３、または−Ｓ(ＣＨ２)２ＣＨ３、または−ＳＣＨ(ＣＨ３)２、または−ＯＨ、または−ＣＨ３、または−ＣＨ２ＣＨ３、または−ＣＮ、または−ＣＨＮＨ、または−ＮＨ２、または−ＮＨＣＨ３、または−Ｎ(ＣＨ３)２、または−Ｆ、または−Ｃｌ、または−Ｂｒ、または−Ｉであり；Ｒ７は、−Ｈ、または−ＯＣＨ３、または−ＯＣＨ２ＣＨ３、または−Ｏ(ＣＨ２)２ＣＨ３、または−ＯＣＨ(ＣＨ３)２、−ＳＣＨ３、またはＳＣＨ２ＣＨ３、または−Ｓ(ＣＨ２)２ＣＨ３、または−ＳＣＨ(ＣＨ３)２、または−ＯＨ、または−ＣＨ３、または−ＣＨ２ＣＨ３、または−ＣＮ、または−ＣＨＮＨ、または−ＮＨ２、または−ＮＨＣＨ３、または−Ｎ(ＣＨ３)２、または−Ｆ、または−Ｃｌ、または−Ｂｒ、または−Ｉ、またはプリンである。
【００９３】
カルパイン−１に対してよりもカルパイン−２に対して少なくとも１０倍低いＫｉを有するカルパイン−２を選択的に阻害することができる化合物の別の態様においては、式ＶＩＩの以下の構造を有する構造を有し：
【化９】
2017538681.tif 000011
ここで、Ｒ１は、ＰｈＣＨ２−、またはＰｈ（ＣＨ２）２であり；Ｒ２は、Ｌ配向性を有し、ロイシン、またはフェニルアラニン、またはチロシン、またはバリン、またはイソロイシン、メチオニン、またはアラニンのアミノ酸側鎖、または修飾アミノ酸側鎖を有するα炭素に共有結合される官能基であり；およびＲ３は、−ＣＨ３、または−ＣＨ２ＣＨ３、または−（ＣＨ２）２ＣＨ３、または−ＣＨ（ＣＨ３）２または−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、または−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、または−Ｃ６Ｈ５、−Ｃ６Ｈ４（４−ＯＨ）、Ｃ６Ｈ４（３−ＯＨ）、またはＣ６Ｈ4（２−ＯＨ）、またはＣ６Ｈ４（２−ＣＨ３）、またはＣ６Ｈ４（３−ＣＨ３）、Ｃ６Ｈ４（４−ＣＨ３）、またはＣ６Ｈ4（２−ＯＣＨ３）、またはＣ６Ｈ４（３−ＯＣＨ３）、またはＣ６Ｈ４（４−ＯＣＨ３）、またはＣ６Ｈ４（２−ＮＨ２）、またはＣ６Ｈ４（３−ＮＨ２）、またはＣ６Ｈ４（４−ＮＨ２）、またはＣ６Ｈ４（２−ＮＨＣＨ３）、またはＣ６Ｈ４（３−ＮＨＣＨ３）、またはＣ６Ｈ４（４−ＮＨＣＨ３）、またはＣ６Ｈ４（２−Ｎ（ＣＨ３）２）、またはＣ６Ｈ４（３−Ｎ（ＣＨ3）2）、またはＣ６Ｈ４（４−Ｎ（ＣＨ３）２）であり；およびＲ４は、−Ｈ、または−ＯＣＨ３、＝ＮＨ、または−ＮＨ２、または−ＳＨ、または＝Ｏ、または＝Ｓ、または−ＯＣＨ２ＣＨ３、または−Ｏ(ＣＨ２)２ＣＨ3、または−ＯＣＨ（ＣＨ３）２、−ＳＣＨ３、またはＳＣＨ２ＣＨ３、または−Ｓ（ＣＨ２）２ＣＨ３、または−ＳＣＨ（ＣＨ３）２、または−ＯＨ、または−ＣＨ３、または−ＣＨ２ＣＨ３、または−Ｆ、または−Ｃｌ、または−Ｂｒ、または−Ｉであり；およびＲ４は、−Ｈ、または−ＯＣＨ３、＝ＮＨ、または−ＮＨ２、または−ＳＨ、または＝Ｏ、または＝Ｓ、または−ＯＣＨ２ＣＨ３、または−Ｏ(ＣＨ２)２ＣＨ3、または−ＯＣＨ（ＣＨ３）２、−ＳＣＨ３、またはＳＣＨ２ＣＨ３、または−Ｓ（ＣＨ２）２ＣＨ３、または−ＳＣＨ（ＣＨ３）２、または−ＯＨ、または−ＣＨ３、または−ＣＨ２ＣＨ３、または−Ｆ、または−Ｃｌ、または−Ｂｒ、または−Ｉであり；およびＲ５は、−Ｈ、または−ＯＣＨ３、＝ＮＨ、または−ＮＨ２、または−ＳＨ、または＝Ｏ、または＝Ｓ、または−ＯＣＨ２ＣＨ３、または−Ｏ(ＣＨ２)２ＣＨ３、または−ＯＣＨ(ＣＨ３)２、または−ＳＣＨ３、またはＳＣＨ２ＣＨ３、または−Ｓ(ＣＨ２)２ＣＨ３、または−ＳＣＨ(ＣＨ３)２、または−ＯＨ、または−ＣＨ３、または−ＣＨ２ＣＨ３、または−Ｆ、または−Ｃｌ、または−Ｂｒ、または−Ｉであり；Ｒ６は、−Ｈ、または−ＯＣＨ３、＝ＮＨ、または−ＮＨ２、または−ＳＨ、または＝Ｏ、または＝Ｓ、または−ＯＣＨ２ＣＨ３、または−Ｏ(ＣＨ２)２ＣＨ３、または−ＯＣＨ(ＣＨ３)２、または−ＳＣＨ３、またはＳＣＨ２ＣＨ３、または−Ｓ(ＣＨ２)２ＣＨ３、または−ＳＣＨ(ＣＨ３)２、または−ＯＨ、または−ＣＨ３、または−ＣＨ２ＣＨ３、または−Ｆ、または−Ｃｌ、または−Ｂｒ、または−Ｉであり；およびＲ７は、−Ｈ、または−ＯＣＨ３、または−ＯＣＨ２ＣＨ３、または−Ｏ(ＣＨ２)２ＣＨ３、または−ＯＣＨ(ＣＨ３)２、−ＳＣＨ３、またはＳＣＨ２ＣＨ３、または−Ｓ(ＣＨ２)２ＣＨ３、または−ＳＣＨ(ＣＨ３)２、または−ＯＨ、または−ＣＨ３、または−ＣＨ２ＣＨ３、または−ＣＮ、または−ＣＨＮＨ、または−ＮＨ２、または−ＮＨＣＨ３、または−Ｎ(ＣＨ３)２、または−Ｆ、または−Ｃｌ、または−Ｂｒ、または−Ｉであり；およびＲ８は、−Ｈ、または−ＯＣＨ３、または−ＯＣＨ２ＣＨ３、または−Ｏ(ＣＨ２)２ＣＨ３、または−ＯＣＨ(ＣＨ３)２、または−ＳＣＨ３、またはＳＣＨ２ＣＨ３、または−Ｓ(ＣＨ２)２ＣＨ3、または−ＳＣＨ(ＣＨ３)２、または−ＯＨ、または−ＣＨ３、または−ＣＨ２ＣＨ３、または−ＣＮ、または−ＣＨＮＨ、または−ＮＨ２、または−ＮＨＣＨ３、または−Ｎ(ＣＨ３)２、または−Ｆ、または−Ｃｌ、または−Ｂｒ、または−Ｉ、またはプリンである。
【００９４】
カルパイン−１に対してよりもカルパイン−２に対して少なくとも１０倍低いＫｉを有するカルパイン−２を選択的に阻害することができる化合物の別の態様においては、式ＶＩＩＩの以下の構造を有する構造を有し：
【化１０】
2017538681.tif 000012
ここで、Ｍ１は、Ｙ１−ＰｈＣＨ２−、またはＹ１−Ｐｈ（ＣＨ２）２−、またはＰｈＣＨ２−Ｙ１, またはＰｈ（ＣＨ２）２−Ｙ１−であり、Ｙ１は、（トランスフェリンポリペプチド断片、インスリン断片、ＬＤＬ結合タンパク質断片、狂犬病ウイルス糖タンパク質断片）など吸収、生物学的利用能、半減期、またはターゲティングを改善するポリペプチド、または修飾ポリペプチドを共有結合され；またはＹ１は、−Ｈ、またはトランスフェリンポリペプチド断片、インスリン断片、ＬＤＬ結合タンパク質断片、狂犬病ウイルス糖タンパク質断片など、半減期、生物学的利用能、またはターゲティングを改善する小分子、ポリペプチド、または修飾ポリペプチ部分を結合するための置換であり；またはＹ１は、配列番号１９５〜２００のものなど、膜透過性、または血液脳関門通過を改善するポリペプチド、または（トランスフェリンポリペプチド断片、インスリン断片、ＬＤＬ結合タンパク質断片、狂犬病ウイルス糖タンパク質断片）などの吸収、生物学的利用能、半減期、またはターゲティングを改善する分子を結合する−Ｏ、−Ｎ、−Ｓ、または−Ｃ置換であり；Ｒ２は、Ｌ配向性を有し、ロイシン、またはフェニルアラニン、またはチロシン、またはバリン、またはイソロイシン、メチオニン、またはアラニンのアミノ酸側鎖、または修飾アミノ酸側鎖を有するα炭素に共有結合される官能基であり；およびＲ３は、−ＣＨ３、または−ＣＨ２ＣＨ３、または−（ＣＨ２）２ＣＨ３、または−ＣＨ（ＣＨ３）２または−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、または−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、または−Ｃ６Ｈ５、−Ｃ６Ｈ４（４−ＯＨ）、Ｃ６Ｈ４（３−ＯＨ）、またはＣ６Ｈ4（２−ＯＨ）、またはＣ６Ｈ４（２−ＣＨ３）、またはＣ６Ｈ４（３−ＣＨ３）、Ｃ６Ｈ４（４−ＣＨ３）、またはＣ６Ｈ4（２−ＯＣＨ３）、またはＣ６Ｈ４（３−ＯＣＨ３）、またはＣ６Ｈ４（４−ＯＣＨ３）、またはＣ６Ｈ４（２−ＮＨ２）、またはＣ６Ｈ４（３−ＮＨ２）、またはＣ６Ｈ４（４−ＮＨ２）、またはＣ６Ｈ４（２−ＮＨＣＨ３）、またはＣ６Ｈ４（３−ＮＨＣＨ３）、またはＣ６Ｈ４（４−ＮＨＣＨ３）、またはＣ６Ｈ４（２−Ｎ（ＣＨ３）２）、またはＣ６Ｈ４（３−Ｎ（ＣＨ3）2）、またはＣ６Ｈ４（４−Ｎ（ＣＨ３）２）であり；およびＲ４は、−Ｈ、または−ＯＣＨ３、＝ＮＨ、または−ＮＨ２、または−ＳＨ、または＝Ｏ、または＝Ｓ、または−ＯＣＨ２ＣＨ３、または−Ｏ（ＣＨ２）２ＣＨ3、または−ＯＣＨ（ＣＨ３）２、−ＳＣＨ３、またはＳＣＨ２ＣＨ３、または−Ｓ（ＣＨ２）２ＣＨ３、または−ＳＣＨ（ＣＨ３）２、または−ＯＨ、または−ＣＨ３、または−ＣＨ２ＣＨ３、または−Ｆ、または−Ｃｌ、または−Ｂｒ、または−Ｉであり；Ｒ５は、−Ｈ、または−ＯＣＨ３、＝ＮＨ、または−ＮＨ２、または−ＳＨ、または＝Ｏ、または＝Ｓ、または−ＯＣＨ２ＣＨ３、または−Ｏ（ＣＨ２）２ＣＨ３、または−ＯＣＨ（ＣＨ３）２、または−ＳＣＨ３、またはＳＣＨ２ＣＨ３、または−Ｓ（ＣＨ２）２ＣＨ３、または−ＳＣＨ（ＣＨ３）２、または−ＯＨ、または−ＣＨ３、または−ＣＨ２ＣＨ３、または−Ｆ、または−Ｃｌ、または−Ｂｒ、または−Ｉであり；Ｘ１は、−Ｃ６Ｈ３（３，５−Ｒ６，Ｒ７）、または−２−ピリジル、または−２−ピリジル（３，５，Ｒ６，Ｒ７）、または−３−ピリジル（３，５，Ｒ６，Ｒ７）、または−４−ピリジル（３，５，Ｒ６，Ｒ７）であり；Ｒ６は、−Ｈ、または−ＯＣＨ３、または−ＯＣＨ２ＣＨ３、または−Ｏ（ＣＨ２）２ＣＨ３、または−ＯＣＨ（ＣＨ３）２、−ＳＣＨ３、またはＳＣＨ２ＣＨ３、または−Ｓ（ＣＨ２）２ＣＨ３、または−ＳＣＨ（ＣＨ３）２、または−ＯＨ、または−ＣＨ３、または−ＣＨ２ＣＨ３、または−ＣＮ、または−ＣＨＮＨ、または−ＮＨ２、または−ＮＨＣＨ３、または−Ｎ（ＣＨ３）２、または−Ｆ、または−Ｃｌ、または−Ｂｒ、または−Ｉであり；およびＲ７は、−Ｈ、または−ＯＣＨ３、または−ＯＣＨ２ＣＨ３、または−Ｏ（ＣＨ２）２ＣＨ３、または−ＯＣＨ（ＣＨ３）２、または−ＳＣＨ３、またはＳＣＨ２ＣＨ３、または−Ｓ（ＣＨ２）２ＣＨ３、または−ＳＣＨ（ＣＨ３）２、または−ＯＨ、または−ＣＨ３、または−ＣＨ２ＣＨ３、または−ＣＮ、または−ＣＨＮＨ、または−ＮＨ２、または−ＮＨＣＨ３、または−Ｎ（ＣＨ３）２、または−Ｆ、または−Ｃｌ、または−Ｂｒ、または−Ｉである。
【００９５】
カルパイン−１に対してよりもカルパイン−２に対して少なくとも１０倍低いＫｉを有するカルパイン−２を選択的に阻害することができる化合物の別の態様においては、式ＩＸの以下の構造を有する構造を有する：
【化１１】
2017538681.tif 000013
【００９６】
ここで、Ｍ１は、Ｙ１−ＰｈＣＨ２−、またはＹ１−Ｐｈ（ＣＨ２）２−、またはＰｈＣＨ２−Ｙ１−、またはＰｈ（ＣＨ２）２−Ｙ１−などのブロッキング基を結合する置換される−Ｏ、−Ｎ、−Ｓ、または-Ｃであり、Ｙ１は、（トランスフェリンポリペプチド断片、インスリン断片、ＬＤＬ結合タンパク質断片、狂犬病ウイルス糖タンパク質断片）などの吸収、生物学的利用能、半減期、またはターゲティングを改善するポリペプチドを共有結合され；またはＹ１は、−Ｈであるか、または（トランスフェリンポリペプチド断片、インスリン断片、ＬＤＬ結合タンパク質断片、狂犬病ウイルス糖タンパク質断片）などの吸収、生物学的利用能、半減期、またはターゲティングを改善する分子を結合するための置換であり；またはＹ１は、配列番号１９５〜２００のものなど、膜透過性、または血液脳関門通過を改善するポリペプチド、または（トランスフェリンポリペプチド断片、インスリン断片、ＬＤＬ結合タンパク質断片、狂犬病ウイルス糖タンパク質断片）などの吸収、生物学的利用能、半減期、またはターゲティングを改善する分子を結合する−Ｏ、−Ｎ、−Ｓ、または−Ｃ置換であるか、またはＭ１は、配列番号１９５〜２００のものなど、膜透過性、または血液脳関門通過を改善する他の小分子、ポリペプチドまたは修飾ポリペプチド、または（トランスフェリンポリペプチド断片、インスリン断片、ＬＤＬ結合タンパク質断片、狂犬病ウイルス糖タンパク質断片）などの吸収、生物学的利用能、半減期、またはターゲティングを改善するトランスフェリンポリペプチド断片、またはインスリン断片、またはＬＤＬ結合タンパク質断片、または狂犬病ウイルス糖タンパク質断片、または分子を共有結合する置換される−Ｏ、−Ｎ、−Ｓ、または−Ｃであり；Ｒ１は、Ｌ配向性を有し、ロイシン、またはフェニルアラニン、またはチロシン、またはバリン、またはイソロイシン、メチオニン、またはアラニンのアミノ酸側鎖、または修飾アミノ酸側鎖を有するα炭素に共有結合される官能基であり；およびＲ２は、−ＣＨ３、または−ＣＨ２ＣＨ３、または−（ＣＨ２）２ＣＨ３、または−ＣＨ（ＣＨ３）２または−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、または−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、または−Ｃ６Ｈ５、−Ｃ６Ｈ４（４−ＯＨ）、Ｃ６Ｈ４（３−ＯＨ）、またはＣ６Ｈ4（２−ＯＨ）、またはＣ６Ｈ４（２−ＣＨ３）、またはＣ６Ｈ４（３−ＣＨ３）、Ｃ６Ｈ４（４−ＣＨ３）、またはＣ６Ｈ4（２−ＯＣＨ３）、またはＣ６Ｈ４（３−ＯＣＨ３）、またはＣ６Ｈ４（４−ＯＣＨ３）、またはＣ６Ｈ４（２−ＮＨ２）、またはＣ６Ｈ４（３−ＮＨ２）、またはＣ６Ｈ４（４−ＮＨ２）、またはＣ６Ｈ４（２−ＮＨＣＨ３）、またはＣ６Ｈ４（３−ＮＨＣＨ３）、またはＣ６Ｈ４（４−ＮＨＣＨ３）、またはＣ６Ｈ４（２−Ｎ（ＣＨ３）２）、またはＣ６Ｈ４（３−Ｎ（ＣＨ3）2）、またはＣ６Ｈ４（４−Ｎ（ＣＨ３）２）であり；およびＲ３は、−Ｈ、または−ＯＣＨ３、＝ＮＨ、または−ＮＨ２、または−ＳＨ、または＝Ｏ、または＝Ｓ、または−ＯＣＨ２ＣＨ３、または−Ｏ（ＣＨ２）２ＣＨ3、または−ＯＣＨ（ＣＨ３）２、−ＳＣＨ３、またはＳＣＨ２ＣＨ３、または−Ｓ（ＣＨ２）２ＣＨ３、または−ＳＣＨ（Ｃ���３）２、または−ＯＨ、または−ＣＨ３、または−ＣＨ２ＣＨ３、または−Ｆ、または−Ｃｌ、または−Ｂｒ、または−Ｉであり；Ｒ４は、−Ｈ、または−ＯＣＨ３、＝ＮＨ、または−ＮＨ２、または−ＳＨ、または＝Ｏ、または＝Ｓ、または−ＯＣＨ２ＣＨ３、または−Ｏ（ＣＨ２）２ＣＨ３、または−ＯＣＨ（ＣＨ３）２、−ＳＣＨ３、またはＳＣＨ２ＣＨ３、または−Ｓ（ＣＨ２）２ＣＨ３、または−ＳＣＨ（ＣＨ３）２、または−ＯＨ、または−ＣＨ３、または−ＣＨ２ＣＨ３、または−Ｆ、または−Ｃｌ、または−Ｂｒ、または−Ｉであり； Ｘ１は、−Ｃ６Ｈ３（３，５−Ｒ５，Ｒ６）、または−２−ピリジル、または−２−ピリジル（３，５，Ｒ５，Ｒ６）、または−３−ピリジル（３，５，Ｒ５，Ｒ６）、または−４−ピリジル（３，５，Ｒ５，Ｒ６）であり；Ｒ５は、−Ｈ、または−ＯＣＨ３、または−ＯＣＨ２ＣＨ３、または−Ｏ（ＣＨ２）２ＣＨ３、または−ＯＣＨ（ＣＨ３）２、−ＳＣＨ３、またはＳＣＨ２ＣＨ３、または−Ｓ（ＣＨ２）２ＣＨ３、または−ＳＣＨ（ＣＨ３）２、または−ＯＨ、または−ＣＨ３、または−ＣＨ２ＣＨ３、または−ＣＮ、または−ＣＨＮＨ、または−ＮＨ２、または−ＮＨＣＨ３、または−Ｎ（ＣＨ３）２、または−Ｆ、または−Ｃｌ、または−Ｂｒ、または−Ｉであり；およびＲ６は、−Ｈ、または−ＯＣＨ３、または−ＯＣＨ２ＣＨ３、または−Ｏ（ＣＨ２）２ＣＨ３、または−ＯＣＨ（ＣＨ３）２、または−ＳＣＨ３、またはＳＣＨ２ＣＨ３、または−Ｓ（ＣＨ２）２ＣＨ３、または−ＳＣＨ（ＣＨ３）２、または−ＯＨ、または−ＣＨ３、または−ＣＨ２ＣＨ３、または−ＣＮ、または−ＣＨＮＨ、または−ＮＨ２、または−ＮＨＣＨ３、または−Ｎ（ＣＨ３）２、または−Ｆ、または−Ｃｌ、または−Ｂｒ、または−Ｉである。
【００９７】
カルパイン−１に対してよりもカルパイン−２に対して少なくとも１０倍低いＫｉを有するカルパイン−２を選択的に阻害することができる化合物の別の態様においては、式Ｘの以下の構造を有する構造を有する：
【化１２】
2017538681.tif 000014
ここで、Ｍ１は、Ｙ１−ＰｈＣＨ２−、またはＹ１−Ｐｈ（ＣＨ２）２−、またはＰｈＣＨ２−Ｙ１−、またはＰｈ（ＣＨ２）２−Ｙ１−などのブロッキング基を結合する置換される−Ｏ、−Ｎ、−Ｓ、または-Ｃであり、Ｙ１は、（トランスフェリンポリペプチド断片、インスリン断片、ＬＤＬ結合タンパク質断片、狂犬病ウイルス糖タンパク質断片）などの吸収、生物学的利用能、半減期、またはターゲティングを改善する分子に共有結合されるポリペプチドであり；またはＹ１は、−Ｈであるか、または（トランスフェリンポリペプチド断片、インスリン断片、ＬＤＬ結合タンパク質断片、狂犬病ウイルス糖タンパク質断片）などの吸収、生物学的利用能、半減期、またはターゲティングを改善する分子を結合するための置換であり；またはＹ１は、配列番号１９５〜２００のものなど、膜透過性、または血液脳関門通過を改善するポリペプチド、または（トランスフェリンポリペプチド断片、インスリン断片、ＬＤＬ結合タンパク質断片、狂犬病ウイルス糖タンパク質断片）などの吸収、生物学的利用能、半減期、またはターゲティングを改善する分子を結合する−Ｏ、−Ｎ、−Ｓ、または−Ｃ置換であるか、またはＭ１は、配列番号１９５〜２００のものなど、膜透過性、または血液脳関門通過を改善する他の小分子ポリペプチドまたは修飾ポリペプチド、または（トランスフェリンポリペプチド断片、インスリン断片、ＬＤＬ結合タンパク質断片、狂犬病ウイルス糖タンパク質断片）などの吸収、生物学的利用能、半減期、またはターゲティングを改善する分子を共有結合する置換される−Ｏ、−Ｎ、−Ｓ、または−Ｃであり；Ｒ１は、Ｌ配向性を有し、ロイシン、またはフェニルアラニン、またはチロシン、またはバリン、またはイソロイシン、メチオニン、またはアラニンのアミノ酸側鎖、または修飾アミノ酸側鎖を有するα炭素に共有結合される官能基であり；およびＲ２は、−ＣＨ３、または−ＣＨ２ＣＨ３、または−（ＣＨ２）２ＣＨ３、または−ＣＨ（ＣＨ３）２または−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、または−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、または−Ｃ６Ｈ５、−Ｃ６Ｈ４（４−ＯＨ）、Ｃ６Ｈ４（３−ＯＨ）、またはＣ６Ｈ4（２−ＯＨ）、またはＣ６Ｈ４（２−ＣＨ３）、またはＣ６Ｈ４（３−ＣＨ３）、Ｃ６Ｈ４（４−ＣＨ３）、またはＣ６Ｈ4（２−ＯＣＨ３）、またはＣ６Ｈ４（３−ＯＣＨ３）、またはＣ６Ｈ４（４−ＯＣＨ３）、またはＣ６Ｈ４（２−ＮＨ２）、またはＣ６Ｈ４（３−ＮＨ２）、またはＣ６Ｈ４（４−ＮＨ２）、またはＣ６Ｈ４（２−ＮＨＣＨ３）、またはＣ６Ｈ４（３−ＮＨＣＨ３）、またはＣ６Ｈ４（４−ＮＨＣＨ３）、またはＣ６Ｈ４（２−Ｎ（ＣＨ３）２）、またはＣ６Ｈ４（３−Ｎ（ＣＨ3）2）、またはＣ６Ｈ４（４−Ｎ（ＣＨ３）２）であり；およびＲ３は、−Ｈ、または−ＯＣＨ３、＝ＮＨ、または−ＮＨ２、または−ＳＨ、または＝Ｏ、または＝Ｓ、または−ＯＣＨ２ＣＨ３、または−Ｏ（ＣＨ２）２ＣＨ3、または−ＯＣＨ（ＣＨ３）２、−ＳＣＨ３、またはＳＣＨ２ＣＨ３、または−Ｓ（ＣＨ２）２ＣＨ３、または−ＳＣＨ（ＣＨ３）２、または−ＯＨ、または−ＣＨ３、または−ＣＨ２ＣＨ３、または−Ｆ、または−Ｃｌ、または−Ｂｒ、または−Ｉであり；Ｘ���は、−Ｃ６Ｈ３（３，５−Ｒ４，Ｒ５）、または−ＣＨＲ６−Ｃ６Ｈ３−（３，５，Ｒ４，Ｒ５）、または−２−ピリジル、または−２−ピリジル（３，５，Ｒ４，Ｒ５）、または -ＣＨＲ６−２−ピリジル（３，５，Ｒ４，Ｒ５）、または−３−ピリジル（３，５，Ｒ４，Ｒ５）、−ＣＨＲ６−３−ピリジル（３，５，Ｒ４，Ｒ５）、または−４−ピリジル（３，５，Ｒ４，Ｒ５）、または−ＣＨＲ６−４-ピリジル（３，５，Ｒ４，Ｒ５）であり；Ｒ４は、−Ｈ、または−ＯＣＨ３、または−ＯＣＨ２ＣＨ３、または−Ｏ（ＣＨ２）２ＣＨ３、または−ＯＣＨ（ＣＨ３）２、−ＳＣＨ３、またはＳＣＨ２ＣＨ３、または−Ｓ（ＣＨ２）２ＣＨ３、または−ＳＣＨ（ＣＨ３）２、または−ＯＨ、または−ＣＨ３、または−ＣＨ２ＣＨ３、または−ＣＮ、または−ＣＨＮＨ、または−ＮＨ２、または−ＮＨＣＨ３、または−Ｎ（ＣＨ３）２、または−Ｆ、または−Ｃｌ、または−Ｂｒ、または−Ｉであり；およびＲ５は、−Ｈ、または−ＯＣＨ３、または−ＯＣＨ２ＣＨ３、または−Ｏ（ＣＨ２）２ＣＨ３、または−ＯＣＨ（ＣＨ３）２、または−ＳＣＨ３、またはＳＣＨ２ＣＨ３、または−Ｓ（ＣＨ２）２ＣＨ３、または−ＳＣＨ（ＣＨ３）２、または−ＯＨ、または−ＣＨ３、または−ＣＨ２ＣＨ３、または−ＣＮ、または−ＣＨＮＨ、または−ＮＨ２、または−ＮＨＣＨ３、または−Ｎ（ＣＨ３）２、または−Ｆ、または−Ｃｌ、または−Ｂｒ、または−Ｉであり；Ｒ６は、−Ｈ、または−ＯＣＨ３、または−ＯＣＨ２ＣＨ３、または−Ｏ（ＣＨ２）２ＣＨ３、または−ＯＣＨ（ＣＨ３）２、−ＳＣＨ３、またはＳＣＨ２ＣＨ３、または−Ｓ（ＣＨ２）２ＣＨ３、または−ＳＣＨ（ＣＨ３）２、または−ＯＨ、または−ＣＨ３、または−ＣＨ２ＣＨ３、または−ＣＮ、または−ＣＨＮＨ、または−ＮＨ２、または−ＮＨＣＨ３、または−Ｎ（ＣＨ３）２、または−Ｆ、または−Ｃｌ、または−Ｂｒ、または−Ｉである。
【００９８】
カルパイン−１に対してよりもカルパイン−２に対して少なくとも１０倍低いＫｉを有するカルパイン−２を選択的に阻害することができる化合物の別の態様においては、式ＸＩの以下の構造を有する構造を有し：
【化１３】
2017538681.tif 000015
ここで、Ｍ１は、Ｙ１−ＰｈＣＨ２−、またはＹ１−Ｐｈ（ＣＨ２）２−、またはＰｈＣＨ２−Ｙ１−、またはＰｈ（ＣＨ２）２−Ｙ１−などのブロッキング基を結合する置換される−Ｏ、−Ｎ、−Ｓ、または-Ｃであり、Ｙ１は、半減期、生物学的利用能、またはターゲティングを改善するために共有結合されるポリペプチド、または修飾ポリペプチドであり；またはＹ１は、−Ｈであるか、または（トランスフェリンポリペプチド断片、インスリン断片、ＬＤＬ結合タンパク質断片、狂犬病ウイルス糖タンパク質断片）などの半減期、生物学的利用能、またはターゲティングを改善するための小分子、ポリペプチド、または修飾ポリペプチド部分を結合するための置換であり；またはＹ１は、配列番号１９５〜２００のものなど、膜透過性、または血液脳関門通過を改善するポリペプチド、または（トランスフェリンポリペプチド断片、インスリン断片、ＬＤＬ結合タンパク質断片、狂犬病ウイルス糖タンパク質断片）などの吸収、生物学的利用能、半減期、またはターゲティングを改善する分子を結合する−Ｏ、−Ｎ、−Ｓ、または−Ｃ置換であるか、またはＭ１は、配列番号１９５〜２００のものなど、膜透過性、または血液脳関門通過を改善する他の小分子ポリペプチドまたは修飾ポリペプチド、または（トランスフェリンポリペプチド断片、インスリン断片、ＬＤＬ結合タンパク質断片、狂犬病ウイルス糖タンパク質断片）などの吸収、生物学的利用能、半減期、またはターゲティングを改善する分子を共有結合する置換される−Ｏ、−Ｎ、−Ｓ、または−Ｃであり；Ｒ１は、Ｌ配向性を有し、ロイシン、またはフェニルアラニン、またはチロシン、またはバリン、またはイソロイシン、メチオニン、またはアラニンのアミノ酸側鎖、または修飾アミノ酸側鎖を有するα炭素に共有結合される官能基であり；およびＲ２は、−ＣＨ３、または−ＣＨ２ＣＨ３、または−（ＣＨ２）２ＣＨ３、または−ＣＨ（ＣＨ３）２または−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、または−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、または−Ｃ６Ｈ５、−Ｃ６Ｈ４（４−ＯＨ）、Ｃ６Ｈ４（３−ＯＨ）、またはＣ６Ｈ4（２−ＯＨ）、またはＣ６Ｈ４（２−ＣＨ３）、またはＣ６Ｈ４（３−ＣＨ３）、Ｃ６Ｈ４（４−ＣＨ３）、またはＣ６Ｈ4（２−ＯＣＨ３）、またはＣ６Ｈ４（３−ＯＣＨ３）、またはＣ６Ｈ４（４−ＯＣＨ３）、またはＣ６Ｈ４（２−ＮＨ２）、またはＣ６Ｈ４（３−ＮＨ２）、またはＣ６Ｈ４（４−ＮＨ２）、またはＣ６Ｈ４（２−ＮＨＣＨ３）、またはＣ６Ｈ４（３−ＮＨＣＨ３）、またはＣ６Ｈ４（４−ＮＨＣＨ３）、またはＣ６Ｈ４（２−Ｎ（ＣＨ３）２）、またはＣ６Ｈ４（３−Ｎ（ＣＨ3）2）、またはＣ６Ｈ４（４−Ｎ（ＣＨ３）２）であり；Ｘ１は、−Ｃ６Ｈ３（３，５−Ｒ３，Ｒ４）、または−２−ピリジル、または−２−ピリジル（３，５，Ｒ３，Ｒ４）、または−３−ピリジル（３，５，Ｒ３，Ｒ４）、または−４−ピリジル（３，５，Ｒ３，Ｒ４）であり；Ｒ３は、−Ｈ、または−ＯＣＨ３、または−ＯＣＨ２ＣＨ３、または−Ｏ（ＣＨ２）２ＣＨ３、または−ＯＣＨ（ＣＨ３）２、−ＳＣＨ３、またはＳＣＨ２ＣＨ３、または−Ｓ（ＣＨ２）２ＣＨ３、または−ＳＣＨ（ＣＨ３）２、または−ＯＨ、または−ＣＨ３、��たは−ＣＨ２ＣＨ３、または−ＣＮ、または−ＣＨＮＨ、または−ＮＨ２、または−ＮＨＣＨ３、または−Ｎ（ＣＨ３）２、または−Ｆ、または−Ｃｌ、または−Ｂｒ、または−Ｉであり；およびＲ４は、−Ｈ、または−ＯＣＨ３、または−ＯＣＨ２ＣＨ３、または−Ｏ（ＣＨ２）２ＣＨ３、または−ＯＣＨ（ＣＨ３）２、または−ＳＣＨ３、またはＳＣＨ２ＣＨ３、または−Ｓ（ＣＨ２）２ＣＨ３、または−ＳＣＨ（ＣＨ３）２、または−ＯＨ、または−ＣＨ３、または−ＣＨ２ＣＨ３、または−ＣＮ、または−ＣＨＮＨ、または−ＮＨ２、または−ＮＨＣＨ３、または−Ｎ（ＣＨ３）２、または−Ｆ、または−Ｃｌ、または−Ｂｒ、または−Ｉである。
【００９９】
カルパイン−１に対してよりもカルパイン−２に対して少なくとも１０倍低いＫｉを有するカルパイン−２を阻害することができる化合物の別の態様においては、式ＸＩＩの以下の構造を有する構造を有する：
【化１４】
2017538681.tif 000016
【０１００】
この実施例の化合物は、６，２３５，９２９の第１４欄の表１の１５μのカルパイン−１のＫｉおよび０．０５μＭのカルパイン−２のＫｉを有することを特徴とし、同じ化合物が、Ｌｉら、１９９６年で開示され、０．３５μＭのμ−カルパインＫｉおよび０．０５μＭのｍ−カルパインＫｉを有するように、これは同じ発明者を特徴とする（Ｌｉら、１９９６年の４０９２頁の化合物５３）。
【０１０１】
カルパイン−１に対してよりもカルパイン−２に対して少なくとも１０倍低いＫｉを有するカルパイン−２を阻害することができる化合物の別の態様においては、式ＸＩＩＩの以下の構造を有する構造を有し：
【化１５】
2017538681.tif 000017
ここで、Ｒ７は、
【化１６】
2017538681.tif 000018
であり、
Ｚは、炭素または窒素である。
【０１０２】
カルパイン−１に対してよりもカルパイン−２に対して少なくとも１０倍低いＫｉを有するカルパイン−２を選択的に阻害することができる化合物の別の態様においては、式ＸＶＩの以下の構造を有する構造を有し：
【化１７】
2017538681.tif 000019
ここで、Ｒ８は、
【化１８】
2017538681.tif 000020
である。
【０１０３】
アイソフォーム特異的カルパイン基質を同定する方法
ｍ−カルパイン特異的基質を同定する方法は、本明細書中にも開示される。その方法は、カルパイン−１またはカルパイン−２、または両方によって切断され得る活性μ−カルパイン、または別の予測タンパク質で基質ＰＴＥＮ（配列番号１）またはその断片または修飾断片を接触すること、および基質がカルパイン−１またはカルパイン−２に対して特異的であるかを決定することを含む。カルパイン−２ではなくカルパイン−１が基質を切断する場合、基質は、カルパイン−１特異的基質である。カルパイン−１ではなくカルパイン−２が基質を切断する場合、基質は、カルパイン−２特異的基質である。基質切断速度はまた、基質は、カルパイン−１またはカルパイン−に特異的、または高度に特異的であることを示し得る。例えば、Ｋｃａｔ、またはＫｍ、またはＫｉは、標識された基質予測基質の存在下で、または潜在的に特異的な基質および第２の標識された非特異的基質の存在下で決定されることができる。Ｋｃａｔ、またはＫｍ、または阻害定数（Ｋｉ）、または基質切断の速度を定義する当該分野で公知の別の手段が使用されて、カルパイン−１またはカルパイン−２に選択的でない別の基質の存在下で、基質切断速度、または基質の阻害特性を示すことができる。
【０１０４】
１つの態様において、基質のＫｍは、カルパイン−２に対してよりカルパイン−１に対して少なくとも約７倍低く、それは、カルパイン−１特異的基質であると決定される。そのような基質は、カルパイン−１の特異的阻害剤として役立つ可能性を有する。別の態様において、触媒作用Ｋｍの速度は、カルパイン−１に対してよりカルパイン−２に対して少なくとも約２０倍低い場合、それは、高度に特異的カルパイン−２基質であると決定される。そのような基質は、カルパイン−２の高度に特異的阻害剤として役立つ可能性を有する。別の態様において、基質のＫｍは、カルパイン−２に対してよりもカルパイン−１に対して少なくとも約１０倍低い場合、それは、カルパイン−１特異的基質であると決定される。そのような基質は、カルパイン−１の特異的阻害剤として役立つ可能性を有する。別の態様において、Ｋｍは、カルパイン−２に対してよりもカルパイン−１に対して少なくとも約２０倍低い場合、それは、高度に特異的カルパイン−１基質であると決定される。そのような基質は、カルパイン−１の高度に選択的阻害剤として役立つ可能性を有する。
【０１０５】
本発明の様々な側面において、カルパイン−１ではなく、カルパイン−２に対して高度に選択的な化合物阻害剤が、ＰＥＴＮ切断部位（複数可）に基づいて同定され、または設計されることができる。したがって、カルパイン−２選択的阻害剤を同定する方法も、本明細書中に開示される。これらの方法は、活性カルパイン−１（配列番号２〜６）、またはカルパイン−２（配列番号６９〜７３）、またはその断片と基質、例えば、ＰＴＥＮ（配列番号１）またはその断片または修飾断片を接触させること、および切断速度、またはＫｃａｔを決定することを含む。精製タンパク質、ポリペプチド、または修飾ポリペプチドは、カルパイン−１またはカルパイン−２、または精製または精製された組換えカルパイン−１またはカルパイン−２を含む組成物と接触されることができる。タンパク質分解後、断片が、ゲル電気泳動によって分析され、収集され、エドモンド分解に供され、またはあるいは、質量分析法により本発明のポリペプチドの正確な切断部位を決定する。ポリペプチド断片、ポリペプチド断片を模倣する小分子、切断部位を模倣する構造を含むポリペプチド断片の修飾または切断部位に隣接するペプチドまたはポリペプチドは、阻害剤として使用されることができる。
【０１０６】
カルパイン切断部位を同定する様々な方法は、当該分野で公知である。例えば、部位特異的突然変異生成は、カルパイン切断部位の必須要素を決定するために使用されることができる（Ｓｔａｂａｃｈら、１９９７年、明細書中に組み込まれる）。切断された断片の単離および続くエドモンド分解（Ｘｕら、２００７年）または質量分析が使用されることができる（Ｃｈｏｕら、２０１１年）。カルパイン−１によってよりも急速にカルパイン−２によって切断される断片が同定される場合、そのような断片は、特異的基質の切断を阻害するために使用されることができる（Ｘｕら、２００７年）。別の態様において、そのような断片は、特異的カルパインアイソフォームの阻害剤として使用されることができる。
【０１０７】
カルパイン−１およびカルパイン−特異性を有するタンパク質を同定する方法
組換えＰＴＥＮを、ＩＰＴＧ（ＰＥＴ１５ベクター）の存在下で大腸菌ＢＬ−２１細胞中のＧＳＴ−タグで発現し、グルタチオン結合ビーズまたはカラムで精製することができる。様々な態様において、組換えＰＴＥＮを精製し、単離し、およびカルパイン−１およびカルパイン−２を別々に曝露することができ、それぞれの切断速度を、切断生成物の出現を測定することによって決定することができ、あるいは切断速度を、スクシニル−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−ＡＭＣまたはカルパイン−２若しくはカルパイン−１に対して選択的ではない別の蛍光または二重蛍光ポリペプチド配列の存在下で、測定することができる。カルパイン−１またはカルパイン−２特異性を示すことが疑われるタンパク質のＫｉは、カルパイン−２またはカルパイン−１に曝露される非選択的基質の変化を比較することによって試験されることができる。
【０１０８】
文献は、カルパインが、シナプス外ＮＭＤＡ受容体を介した細胞死関連シグナル伝達の媒介において、直接役割を果たすが、予備データは、ＬＴＰを誘発するＮＭＤＡ受容体のシナプス活性化が、ＥＲＫ経路の活性化および神経保護にもつながることを示す。したがって、カルパインは、競合するおよび反対の経路に関与する。これらの二重の異なる役割の説明は、他のシグナル変換経路のように、カルパイン活性は、カルパインおよびそれらの様々な基質の別々の足場を通じて特異的にされる。したがって、例えば、共通のシグナル変換タンパク質でさえも、別々のシグナル変換経路を作り出すために差異的にスキャッフォールドされることができる。この影響力の大きな例は、共通のＭＡＰＫＫＫタンパク質を含む、酵母高オスモル濃度および交配ＭＡＰＫ経路に記載された。各経路へのＭＡＰＫＫＫの差異的足場は、クロストークのないそれぞれ独立した応答を媒介した（Ｐａｒｋら、２００３年）。さらに、ＰＤＺタンパク質は、シグナル伝達経路を分離し、クロストークを排除するために中心的であることが見出されている（Ｇｏｏｄら、２０１１年、参照により組み込まれる）。
【０１０９】
様々な細胞型におけるシグナル伝達経路の足場は、特定のシグナルまたはシグナル伝達カスケードが互いに離散される手段であることが示されている。クロストークを起こさない別々のシグナル伝達カスケードを作成するためのシグナル変換要素の物理的会合による足場、またはバンドルは、ＰＤＺドメイン含有タンパク質を介して媒介されることが示されている（Ｇｏｏｄら、２０１１年）。カルパイン−１およびカルパイン−２は、ＰＤＺ結合ドメインを有し、カルパイン−１およびカルパイン−２のための別々のシグナル伝達カスケードを作成するためにスキャッフォールドされることは認識されない。本発明はまた、カルパインをそれらのそれぞれのタンパク質足場から置換するカルパイン−１およびカルパイン−２ＰＤＺ結合ドメイン特異的ペプチドを同定する：カルパイン−２、ＴＩＱＬＤＬＩＳＷＬＳＦＳＶＬ、またはそれらの断片若しくは修飾：カルパイン−１ＰＦＺ結合ドメイン特異的ペプチド：ＶＴＦＤＬＦＫＷＬＱＬＴＭＦＡ、またはその断片若しくは修飾。
【０１１０】
上記のように、カルパイン−１およびカルパイン−２の両方は、ＰＤＺ結合ドメインを有する。カルパイン−１に対するカルパイン−２のＰＤＺ結合ドメインは、クラスＩＩＰＤＺ結合ドメインの要件に適合するクラスＩＰＤＺ結合ドメインおよびカルパイン−１ドメインであるカルパイン−２を伴い、互いに有意に異なり、したがって、それらは、ＰＤＺ結合ドメイン結合パートナーを共有しない可能性が高い。１９９０年代のそれらの発見（Ｋｏｒｎａｕら、１９９５年； Ｗｏｏｄｓ ＆ Ｂｒｙａｎｔ, １９９１年、参照により全て組み込まれる）から、ＰＤＺタンパク質は、真核生物においてほぼ偏在的になっているが、脊椎動物においてはるかに一般的である。カルパイン−２およびカルパイン−１アミノ酸配列の試験は、カルパイン−２において、例えば、Ｉ型ＰＤＺ結合ドメインが、広範囲の脊椎動物にわたって保存されることを示す。例えば、ニジマス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｍｙｋｉｓｓ）、およびゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ)は、示された哺乳類および鳥類の脊椎動物とは異なるＣ末端配列を示すが、それらは依然として、Ｉ型ＰＤＺ結合ドメイン（Ｓ／Ｔ−Ｘ−ψ；（Ｋａｎｇら、２００３年、参照により組み込まれる））に対する要件を保持する。カルパイン−１のＩＩ型ＰＤＺ結合ドメインの強い保存は、種間にわたることにも留意されたい（表１参照）。したがって、これらの配列は、脊椎動物で強く保存されており、重要な機能的役割を示す。
【０１１１】
【表１】
2017538681.tif 000021
【０１１２】
カルパインＰＤＺタンパク質会合に干渉するペプチドを、容易に設計することができ、本明細書中の本発明の態様である。カルパイン−１およびカルパイン−２足場のペプチド阻害剤の例は、配列番号７〜６８および７４〜１４５として本明細書中で含まれ、本明細書中で開示される投与方法で有用ある。
【０１１３】
本発明の様々な態様において、カルパイン−２のＰＤＺ結合ドメインは、非足場カルパイン−２、またはカルパイン−２のＰＤＺ結合ドメインのリン酸模倣体（アスパラギン酸塩またはグルタミン酸塩によるセリン／トレオニンの置換）の方法で使用される。別の態様において、カルパイン−２ＰＤＺ結合ドメイン（配列番号７４〜１４５）、またはそのペプチド模倣薬、またはカルパイン−２のＰＤＺ結合ドメインのホスホ模倣体を含むポリペプチドは、本明細書中に記載される治療方法で使用されることができる生成物である。ペプチド模倣体が、従来のポリペプチドではなく、高い特異性を有する特定のポリペプチドの同じたんぱく質に特異的に結合される分子として当該分野で理解される。カルパイン−２およびカルパイン−１の両方の足場は、増強されるシナプス後区画空間を定義するのに役立つ。アンテザリングカルパイン−２の方法およびカルパイン−２ＰＤＺドメインの投与方法は、本明細書中に記載される。他の態様において、カルパイン−２ＰＤＺ結合ドメインは、本明細書中に記載されるＬＴＰ傷害の疾患を治療する方法において有用である。カルパイン−２またはペプチド模倣薬のＰＤＺ結合ドメインを含むポリペプチドを投与することによってＰＴＳＤを治療する方法は、本発明の好ましい態様である。本明細書中で教示される疾患および傷害の治療のための生成物は、カルパイン−２のＰＤＺ結合ドメインのペプチド、その修飾体、またはペプチド模倣薬である。ＰＤＺ結合ドメインは、臓器ターゲティング、細胞内ターゲティング、生物学的利用能、半減期、または効力を増強するポリペプチドおよび修飾ポリペプチド、または小分子の組み合わせまたはリポソームまたはカプセル化剤と組み合わせられる。ＰＤＺ結合ドメインはまた、選択的阻害剤または高度に選択的阻害剤に結合されるか、または選択的阻害剤若しくは高度に選択的阻害剤と処方されることができる。
【０１１４】
アンテザリングカルパイン−１
様々な態様において、カルパイン−１のＰＤＺ結合ドメインは、カルパイン−１をアンスキャッフォールディングする方法で使用される。別の態様において、ポリペプチドは、カルパイン−１ＰＤＺ結合ドメイン（配列番号７〜６８）またはそのペプチド模倣薬、またはカルパイン−１のＰＤＺ結合ドメインのホスホ模倣体を含んだ。ペプチド模倣薬は、従来のポリペプチドではなく、高い特異性を有する特定のポリペプチドの同じたんぱく質に特異的に結合する分子として当該分野で理解される。カルパイン−２およびカルパイン−１の両方の足場は、増強されるシナプス後区画を定義する。事実上、足場は、活性化されたカルパイン−２に対する活性化されたカルパイン−１によって作成されるＬＴＰ空間の定義に関与する。カルパイン−１ＰＤＺペプチドとのカルパイン−１の非スキャッフォールリングは、ラット海馬スライスにおけるより大きなＬＴＰ、ＥＲＫ／ＡＫＴ経路の活性化による神経保護、および培養における血清飢餓および過酸化水素からの保護をもたらす（図１５、実施例１０）。本明細書中で教示される疾患および傷害の治療のための生成物は、ｍ−カルパインのＰＤＺ結合ドメインのペプチド、ポリペプチド、その修飾、またはペプチド模倣薬である。カルパイン−１ＰＤＺ結合ドメインまたはペプチド模倣薬は、ＬＴＰ傷害によって特徴付けられる疾患の治療で有用であるだろう。
【０１１５】
他のポリペプチドドメイン
本発明の融合タンパク質を含む他のポリペプチドは、本発明の小分子ポリペプチド、核酸、修飾ポリペプチドまたは修飾核酸の血液脳関門を通過する送達、生物学的利用能および安定性を改善する。カルパインアイソフォーム選択的阻害剤のさらなる態様は、ペプチド結合、または他の修飾を介して結合される小分子修飾およびポリペプチド配列である。細胞への通過を改善する小分子、ポリペプチド、または修飾ポリペプチドは、本発明のカルパイン−１の選択的またはカルパイン−２選択的阻害剤の生物学的利用能を改善するために発明に任意に添加される。血液脳関門を通過して送達を改善する小分子、ポリペプチド、または修飾ポリペプチドは、同様に任意に添加される。ペプチド結合または他の修飾いずれかによって任意に添加されることができるポリペプチドは、配列番号１９５〜２００のポリペプチドを含むが、これらに限定されない。脳への送達を最大にするアプローチは、任意に、同様に本発明のアイソフォーム選択的カルパイン阻害剤の一部であり（Ｂｅｒｔｒａｎｄら、２０１０年 Ｄｕｆｅｓら、２０１３年；Ｇａｂａｔｈｕｌｅｒ、２００９年；Ｇａｂａｔｈｕｌｅｒ、２０１０ａ；Ｇａｂａｔｈｕｌｅｒ, ２０１０ｂ）、参照により本明細書中に組み込まれる。そのようなポリペプチドは、インスリン、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、およびトランスフェリン、ＬＤＬ結合ペプチド、狂犬病ウイルス糖タンパク質からのポリペプチド断片を含む。
【０１１６】
リポソーム、カプセル化剤、それらの容器およびコンジュゲート
本発明の小分子、ポリペプチド、または修飾ポリペプチドを含む細胞または器官のターゲティングを改善するコンジュゲートを有するまたは有さないリポソーム、ナノコンテナ、およびカプセル化製剤も、本発明の態様である。血液脳関門を越えてターゲティングするためのリポソーム、およびコンジュゲートは、当該分野で、例えば、米国特許第６，７５９，０５８号；第６，７６１，９０１号；第６，８４９，２６９号；第７，３８７，７９１号；ＵＳＰＮ ２０１１/０３０５７５１ Ａ１；および（Ｓｃｈｎｙｄｅｒ ＆ Ｈｕｗｙｌｅｒ、２００５年、これらの全ては、参照により組み込まれる）に記載され、これらの内容は、本明細書中に参照により組み込まれる。別の態様において、本発明の小分子、ポリペプチドおよび修飾ポリペプチドは、記載されるリポソームまたは他の容器またはカプセル化剤などの担体分子と組み合わされる。さらに別の態様において、本発明の小分子、ポリペプチド、核酸、修飾核酸、または修飾ポリペプチドは、血液脳関門を通過するためのグルタチオントランスポーターに対するリガンド、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）断片、トランスフェリンタンパク質断片、トランスフェリン受容体に対するヒト化抗体、ヒト化抗Ｅセレクチン抗体、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体結合タンパク質断片、または狂犬病糖タンパク質ポリペプチド断片を含む薬学的に許容可能なナノコンテナと組み合わせられる。
【０１１７】
カルパイン−２の核酸阻害剤
カルパイン−２ｍＲＮＡのコード領域または非翻訳５’若しくは３’領域とハイブリダイズする核酸も、本発明の態様である。核酸は、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ，アンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはそれらの修飾である。脳におよびカルパイン−２ｍＲＮＡの作動スペースの座に核酸の送達を付与する修飾は、好ましい修飾であり、本明細書中で開示されるポリペプチドおよびリポソームコンジュゲートを含むが、それらに限定されない。前記核酸で治療する方法はまた、本発明の態様であり、ＬＴＰを強化し、ＬＴＰの強化を強化し、通常、ＬＴＰを誘発しない刺激の強化を強化し、記憶を改善し、記憶傷害を治療し、本明細書中に開示される前記精神医学的および神経学的疾患を治療する方法を含む。
【０１１８】
治療法
カルパイン−２選択的阻害剤は、培養ニューロンにおいて神経保護性であり、急性海馬スライスにおいて、学習および記憶の細胞モデルである長期増強（ＬＴＰ）を促進する。カルパイン−２阻害剤は、ＬＴＰのを増強する方法、およびＬＴＰ強化を増強する方法として有用である。本発明に係るカルパイン−２阻害剤は、学習の改善および神経変性の減少に有用である。したがって、それらは、アルツハイマー病およびパーキンソン病のイディオタイプおよびファミリー形態、および認知症、ハンチトン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、発作、脳炎、脳卒中、血管けいれん、血液量減少性ショック、外傷性ショック、外傷性脳損傷、再かん流傷害、多発性硬化症、エイズによる認知症、神経毒性、頭部外傷、および脊椎損傷、緑内障、開放隅角緑内障、閉塞隅角緑内障、正常眼圧緑内障、先天性緑内障、色素性緑内障、偽落屑緑内障、外傷性緑内障、血管新生緑内障、虹彩角膜内皮症候群、眼の虚血、網膜の虚血を含む、シナプス機能不全、シナプス変性、または神経変性に関連する疾患の治療に効果的に使用されることが期待される。
【０１１９】
様々な態様において、本発明に係るカルパイン−２阻害剤は、例えば、薬物または毒の副作用として、聴覚神経の障害による中毒性難聴の結果としての難聴を含む、難聴を効果的に治療するために有用である。様々な他の態様において、本発明に係るカルパイン−２阻害剤は、神経変性の結果として難聴を効果的に治療するのに有用である。
【０１２０】
様々な態様において、本発明に係るカルパイン−２阻害剤は、ウォルフラム症候群１を効果的に治療するのに有用であるが、他の態様において、本発明に係るカルパイン−２阻害剤は、ウォルフラム症候群２を効果的に治療するのに有用である。特定の態様において、本発明に係るカルパイン−２阻害剤は、ＷＳＦ１またはＷＳＦ２のいずれの遺伝子発現の調節不全の結果として増加するカルパイン−２活性を含む、カルパイン−２活性を阻害することによって、ウォルフラム症候群１または２に関連する神経変性を治療する。
【０１２１】
様々な態様において、本発明に係るカルパイン−２阻害剤の有効量を、それを必要とする患者に投与して、神経細胞死を阻害する。様々な他の態様において、本発明に係るカルパイン−２阻害剤の有効量を、それを必要とする患者に投与して、記憶を増強する。さらに他の態様にいて、本発明に係るカルパイン−２阻害剤の有効量を、それを必要とする患者に投与して、神経学的傷害を治療する。さらに別の態様において、本発明に係るカルパイン−２阻害剤の有効量を、それを必要とする患者に投与して、緑内障を治療する。
【０１２２】
本発明の様々な他の態様において、本発明に係るカルパイン−２選択的阻害剤の有効量は、シナプスおよび行動機能障害の疾患を効果的に治療するために使用され、これは、統合失調症、自閉症スペクトラム障害、双極性疾患、薬物誘発精神病、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、うつ病および自殺思考、恐怖症、強迫障害、トリソミー２１、ＡＤＨＤ、およびＡＤＤを含むが、これらに限定されない。自閉症スペクトラム障害は、自閉性障害、（古典的自閉症）、アンジェルマン症候群、アスペルガー障害（アスペルガー症候群）、他に特定されない広汎性発達障害（ＰＤＤ−ＮＯＳ）、レット障害（レット症候群）、小児期崩壊性障害（ＣＤＤ）を含むが、これらに限定されない。
【０１２３】
組成物
本発明の医薬組成物は、医薬製剤分野で公知の方法によって調製され得、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（レミントンの薬学化学）、第２２版、（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ、２０１２年）を参照されたく、これは、参照によって本明細書中に組み込まれる。固体剤形において、本発明の化合物は、例えば、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウムなどの少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤または（ａ）例えば、デンプン、ラクト−ス、スクロース、グルコース、マンニトール、およびケイ酸などの充填剤または増量剤、（ｂ）例えば、セルロース誘導体、デンプン、アルギナート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、およびアカシアゴムなどの結合剤、（ｃ）例えば、グリセロールなどの湿潤剤、（ｄ）例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、クロスカルメロースナトリウム、複合ケイ酸塩および炭酸ナトリウムなどの崩壊剤、（ｅ）例えば、パラフィンなどの輸液リターダー、（ｆ）例えば、第四級アンモニウム化合物などの吸収促進剤、（ｇ）例えば、セチルアルコール、およびグリセロールモノステアレート、ステアリン酸マグネシウムなどの湿潤剤、（ｈ）例えば、カリオンおよびベントナイトなどの吸着剤、および（ｉ）例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムなどの潤滑剤、またはそれらの混合物、と混合され得る。カプセル、錠剤、および丸薬の場合、剤形はまた、緩衝剤を含み得る。
【０１２４】
医薬製剤分野で公知の薬学的に許容可能なアジュバントはまた、本発明の医薬組成物で使用され得る。これらは、保存剤、湿潤剤、懸濁剤、甘味剤、香味剤、芳香剤、乳化剤、および調合剤を含むが、これらに限定されない。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などを含めることによって保証され得る。また、等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウムなどを含むことが望まれ得る。所望の場合、本発明の医薬組成物はまた、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、抗酸化剤など、例えば、クエン酸、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン、ブチル化ヒドロキシトルエン等などの少量の補助物質を含み得る。
【０１２５】
上記の固体剤形は、製薬分野で知られているように、腸溶コーティングなどのコーティグおよびシェルで調製され得る。それらは、鎮静剤を含んでもよく、それらが、遅延して腸管の特定の部分で活性化合物（複数可）を放出するそのような組成物であることもできる。使用され得る組み込まれる組成物の非限定的な例は、ポリマー物質およびワックスである。活性化合物はまた、必要な場合、１つ以上の上記賦形剤とマイクロカプセル化された形態であってもよい。
【０１２６】
懸濁液は、活性化合物に加えて、例えば、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天およびトラガカント、またはこれらの物質の混合物などを含み得る。液体剤形は、水性であってもよく、薬学的に許容可能な溶媒並びに緩衝剤、風味剤、甘味剤、防腐剤、および安定化剤を含むが、これらに限定されない当該分野で公知の伝統的な液体剤形を含み得る。
【０１２７】
上記の局所投与方法に加えて、本発明の化合物を局所的に肺に投与する様々な方法がある。１つのそのような手段は、治療される患者が吸入する、本発明の化合物を含む呼吸可能な粒子の乾燥粉末吸入器製剤を含むことができる。乾燥粉末製剤が、化合物粒子が付着することができる単体粒子を含むことは一般的である。担体粒子は、任意の許容可能な薬理学的に不活性な材料または材料の組み合わせであってもよい。例えば、担体粒子は、糖アルコール；ポリオール、例えば、ソルビトール、マンニトールまたはキシリトール、および単糖類および二糖類を含む結晶糖類；塩化ナトリウムおよび炭酸カルシウムなどの無機塩類；乳酸ナトリウムなどの有機塩；および尿素、多糖類、例えばシクロデキストリンおよびデキストリンなどの他の有機化合物から選択される１つ以上の材料から構成され得る。担体粒子は、結晶糖、例えば、グルコースまたはアラビノースなどの単糖類、またはマルトース、サッカロース、デキストロースまたはラクトースなどの二糖類であってもよい。本発明の化合物は、気道に分散されて、続いて薬学的に有効な量で下肺に接触するだろう。
【０１２８】
上記の局所投与方法に加えて、そのような方法によって本発明の化合物を全身投与する様々な方法がある。１つのそのような手段は、治療される患者が吸入する、本発明の化合物を含む呼吸域粉塵のエアロゾル懸濁液を含むだろう。その化合物は、薬学的有効量で肺を介して血流に吸収されるだろう。呼吸域粉塵は、吸入の際に口および喉頭を通過するのに十分小さい粒径を有する、液体または固体であることができる。
【０１２９】
カプセル、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、および懸濁剤を含む経口投与の剤形を使用し得る。定量吸入器、ドライパウダー吸入器またはエアロゾル製剤を含む肺投与のための剤形を使用し得る。そのような固体剤形において、活性化合物は、少なくとも１つの不活性な薬学的に許容可能な賦形剤（薬学的に許容可能な担体としても知られる）と混合され得る。
【０１３０】
本発明に係る化合物は、液体または注射可能な医薬組成物を処方するためにも使用され得る。純粋な形態でまたは適切な医薬組成物で本発明の化合物の投与は、許容可能な投与様式のいくつかまたは類似の用途に役立つための薬剤を介して行われ得る。したがって、投与は、例えば、固体、半固体、凍結乾燥粉末、または液体剤形、例えば、錠剤、坐剤、丸剤、軟カプセル剤および硬質ゼラチンカプセル、粉末、溶液、懸濁液、またはエアロゾルなどの形態で、例えば、正確な用量の簡単な投与に適した単位剤形で、経口、口腔、経鼻、肺、非経口（静脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下）、局所的に、経皮的に、膣内、膀胱内、全身的、眼科用にまたは直腸内であり得る。投与の１つの経路は、治療される状態の重篤度に応じて調整されることができる便利な毎日の投与計画を使用して、経口投与であり得る。
【実施例】
【０１３１】
実施例１。カルパイン−２に対して高度に選択的な小分子／修飾ポリペプチド。
【化１９】
2017538681.tif 000022
【０１３２】
この実施例において、キラル中心１は、Ｌ型であり、キラル中心２は、Ｄ−およびＬ−のラセミ混合物である式１が、様々な濃度（１ｎＭ〜１０μＭ）で、コハク酸−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−ＡＭＣおよびカルパイン−１またはカルパイン−２を含むインビトロ混合物に導入され（Ｓａｓａｋｉら、１９８４年）、蛍光消失の動態をカルパインのそれぞれについて決定した（Ｐｏｗｅｒｓら、２０００年）。文献で化合物について得られるＫｉ値は、カルパイン−１について２．３μＭおよびカルパイン−２について０．０２２μＭである（Ｌｉら、１９９６年）。しかしながら、カルパイン−１に対するＫｉは、１．２９μＭ±０．７μＭであることあ本明細書中で再決定され、カルパイン−２に対するＫｉは、０．０２５μＭ±０．０２μＭであると決定された。したがって、本明細書中で記載される選択性の評価は、以前の教示とは異なっていた。この化合物は、そのＫｉがカルパイン−１に対してよりもカルパイン−２に対して５０倍以上低いため、カルパイン−２に対して高度に選択的な阻害剤である。
【０１３３】
実施例２：ＬＴＰ誘発前に投与される場合、一般的なカルパイン阻害剤は、ＬＴＰをブロックする。急性ラット海馬スライスにおいて、興奮性シナプス後電位（ＥＰＳＰ；図２）のフィールド記録は、フィールドＣＡ１の放射状層で実施された。カルパイン−１およびカルパイン−２の両方を阻害する１０μＭのカルパイン阻害剤ＩＩＩ（Ｚ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−ＣＨＯ；カルパイン−１およびカルパイン−２の両方に対するＫｉ:約８ｎＭ）を、θ−連射刺激前に添加し（ＴＢＳ：バースト間２００ｍｓの１００Ｈｚで４パルスの１０バースト）、これは、ＬＴＰを誘発するために使用されることができる（Ｃａｐｏｃｃｈｉら、１９９２年）。非選択的カルパイン阻害剤、カルパイン阻害剤ＩＩＩとのプレインキュベーションは、対照と比較した場合（白丸と黒丸を比較）、短期増強をブロックせず、ＴＢＳに続くｆＥＰＳＰを増加させるが、ＬＴＰの形成を妨げた。
【０１３４】
実施例３：カルパイン−２選択的阻害剤は、ＬＴＰを増強する。急性海馬スライスを調製し、ＡＣＳＦで浸した。カルパイン−１に対してより５０〜１００倍多くカルパイン−２を阻害する、式１の２００ｎＭのカルパイン−２選択的阻害剤を、θ−連射刺激の前に投与し、これは、ＬＴＰを誘発する能力を有する（投与時間経過については、図３Ａのライン＃１参照）。カルパイン阻害剤ＩＩＩなどの非選択的カルパイン阻害剤の投与と予想外の対照をなして、カルパイン−２選択的阻害剤とのプレインキュベーションは、ＬＴＰを阻害せず（図３Ａ）；それは、それを高める。θ−連射刺激（ＴＢＳ）後の同じ高度に選択的カルパイン−２阻害剤との海馬スライスのインキュベーションはまた、ＴＢＳの１０分後からＴＢＳの１時間後に適用した場合、ＬＴＰの強化段階の間、増強されたＬＴＰをもたらす。
【０１３５】
実施例４：カルパイン−２特異的阻害剤は、アンジェルマン症候群のマウスモデルからの海馬スライスでＬＴＰ障害を救済する。興奮性シナプス後電位（ＥＰＳＰ）のフィールド記録は、雄のＵＢＥＡ突然変異体マウスまたはそれらの野生型同腹子から調製された急性海馬スライスでフィールドＣＡ１の放射状層で実施された。ベースライン記録の２０分後、θ連射刺激（ＴＢＳ、図４の矢印）を、Ｓｃｈａｆｆｅｒの側副路に適用してＬＴＰを誘発した。実線の水平線（図４）によって示されるように、特異的カルパイン−２阻害剤（ｍＣａｌ−Ｉ；実施例１）を適用した（２００ｎＭ）。それは、ＴＢＳによって誘導されるｆＥＰＳＰの初期増加に影響を及ぼさないが、野生型マウスのスライスに見られるレベルまでＬＴＰの大きさを回復させた。結果は、３〜４匹の動物から６〜７枚のスライスの平均±Ｓ.Ｅ.Ｍ.である。
【０１３６】
実施例５：選択的カルパイン−２阻害剤は、ＮＭＤＡ受容体活性化によって媒介される神経細胞死をブロックする。皮質神経細胞培養（１４ＤＩＶ）を処理して、シナプス外ＮＭＤＡ受容体の選択的活性化を誘導し、神経細胞死を引き起こす。式１の高度に選択的なカルパイン−２の適用は、２００ｎＭ〜５μＭの用量依存的方法でシナプス外ＮＭＤＡ受容体活性化に関連する神経細胞死を減少させた（図５）。
【０１３７】
実施例６：高度に選択的カルパイン−２阻害剤は、神経保護をもたらすシナプス活性を妨害しない。カルパイン阻害剤−ＩＩＩ（選択的カルパイン阻害剤ではない）は、ｍＣａｌｐ−Ｉ（２００ｎＭ）ではなく、培養皮質神経における飢餓に対するＢｉｃ−および４−ＡＰ誘発神経保護をブロックした。神経細胞死を観察し、ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）染色によって定量化した。３〜６の独立した実験において、３００〜５００神経を、各群について計数した。＊ｐ＜０．０５；ｎｓ、有意差なし；一元配置ＡＮＯＶＡ、次にボンフェローニ検定。ｎ＝３〜６．エラーバーは、ＳＥＭを示す（図６）。
【０１３８】
実施例７：式１は、記憶を増強する。式１は、恐怖条件付けプロトコルにおける学習および記憶に二層性効果を有することが見出された。このプロトコルにおいて、マウスを、痛みを伴う刺激と一緒に文脈またはトーンの間の関連を学習するために訓練した。式１の化合物（ｍＣａｌｐ−Ｉ）の様々な用量を、訓練の３０分前に腹腔内注射した。動物を、文脈の２４時間後（図７Ａ）およびトーンで４８時間後（図７Ｂ）で試験した。文脈またはトーンのいずれかに対するそれらの恐怖応答で２４時間または４８時間後に試験した場合、記憶の強さは、マウスが凍る（恐怖に対するそれらの生物学的応答）時間の量によって定量化された。増強および減少を生じる用量の間の比は、カルパイン−２とカルパイン−１を阻害するＫｉの間の比に一致する。結果を分析している人が、グループ治療を知らなかったので、実験は、盲検的に実施された。結果は、８〜１０実験の平均±Ｓ.Ｅ.Ｍ.である。＊ｐ＜０．０５（ＡＮＯＶＡに続いてボンフェローニ事後検定）。
【０１３９】
実施例８：カルパイン−２選択的阻害剤の腹腔内注射は、ＮＭＤＡ誘発網膜損傷に対して保護的である。２μｌＰＢＳまたは２μＮＭＤＡ（２．５ｍＭ）のいずれかを、ＮＭＤＡ注射の３０分前および６時間後に、賦形剤（２０％ＤＭＳＯ）、カルパイン−２選択的阻害剤（Ｃ２Ｉ、Ｚ−Ｌｅｕ−Ａｂｕ−ＣＯＮＨ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ３ （３, ５−（ＯＭｅ）２）１３，１４ − ０．３ ｍｇ／ｋｇ）またはパンカルパイン阻害剤カルペプチン（１０ｍｇ／ｋｇ）と一緒に腹腔内注射した野生型マウスの網膜に硝子体内注射した。Ｈ＆Ｅ染色を、ＮＭＤＡ注射の７日後に行った。図８Ａ参照。ＮＭＤＡ注射の７日後のＧＣＬおよびＩＰＬにおける細胞数の定量分析も行った。それぞれ図７Ｂおよび図７Ｃ参照。
【０１４０】
実施例９：カルパイン−１およびカルパイン−２は、硝子体内ＮＭＤＡ注射によって誘導される網膜損傷において、反対の役割を果たす。カルパイン活性は、ＮＭＤＡ受容体（Ｒ）活性化によって誘導される網膜細胞死に関与する。実施例８に記載されるように、ＮＭＤＡ硝子体内注射の３０分前に、このプロセスで、カルパイン−１およびカルパイン−２の特異的な役割を試験するために、野生型（ＷＴ）マウスは、カルパイン−２選択的阻害剤（Ｃ２Ｉ）、Ｚ−Ｌｅｕ−Ａｂｕ−ＣＯＮＨ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ３ (３, ５−(ＯＭｅ)２)１３,１４を全身注射された。カルパイン−１および−２の両方によるスペクトリンの切断生成物である、スペクトリン分解生成物（ＳＢＤＰ）のレベル、並びにＮＭＤＡＲ活性化後のカルパイン−１によって分解されたタンパク質である、ＰＨドメインおよびロイシンリッチリピートタンパク質ホスファターゼ１（ＰＨＬＰＰ１）のレベルは、ＮＭＤＡ注射の６時間後の網膜抽出物で決定された（図８（Ａ〜Ｃ））。Ａｋｔレベルもまた、ローディングコントロールとして測定された。ＳＢＤＰのレベルは、対照（ＰＢＳ硝子体注射）と比較して、有意に上昇し、ＰＨＬＰＰ１のものは、ＮＭＤＡ注射後に減少し、カルパインは、ＮＭＤＡ注射後に活性化されたことを示唆する。Ｃ２Ｉの全身（腹腔内；ｉ.ｐ.）注射は、ＰＨＬＰＰ１中ではなくＳＢＤＰ中でＮＭＤＡ誘発性の変化を有意に抑制したが、Ｃ２Ｉ全身注射は、硝子体内ＮＭＤＡ注射後の網膜でカルパイン−１活性ではなくカルパイン−２を選択的に阻害した。
【０１４１】
ＷＴマウスへのＮＭＤＡまたはＰＢＳの硝子体内注射の６日後、凍結網膜切片を調製し、Ｈ＆Ｅ染色を実施して、神経節細胞層（ＧＣＬ）および内部網状層（ＩＰＬ）の厚さで細胞密度を評価し、これは、ＲＧＣ樹状突起を含む。ＮＭＤＡ注射（ＮＭＤＡ＋賦形剤）は、ＧＣＬおよびＩＰＬの厚さで細胞密度を有意に低下させるが、ＰＢＳ注射（ＰＢＳ＋賦形剤）は、これらのパラメータに影響を及ぼさなかった（新規図９Ｄ）。ＮＭＤＡ注射の３０分前および６時間後にＣ２Ｉの全身注射は、ＧＣＬ細胞密度およびＩＰＬの厚さの減少を有意に抑制し（新規図９Ｅ〜Ｆ）、カルパイン−２活性化が、ＧＣＬでＮＭＤＡ誘発細胞死に寄与することを示唆する。
【０１４２】
カルパイン−１ＫＯマウスにおいて、ＧＣＬ細胞密度およびＩＰＬ厚さは、賦形剤注射によって影響を受けなかった。しかしながら、ＧＣＬ細胞密度およびＩＰＬ厚さのＮＭＤＡ注射の効果は、ＷＴマウスよりも大きかった（新規図９Ｄを新規図９Ｇと比較する）。ＮＭＤＡ注射後のカルパイン−１ＫＯマウスのＧＣＬ細胞死は、ＷＴマウスのそれより有意に重篤であり（新規図９Ｈと図９Ｊを比較する）、カルパイン−１は、ＮＭＤＡ注射後のＧＣＬにおける細胞生存を支持することを示唆している。カルパイン−１ＫＯマウスへのＣ２Ｉの全身注射は、ＧＣＬ細胞密度およびＩＰＬ厚さのＮＭＤＡ誘発性の減少を部分的だが有意に逆転させた（それぞれ、図８Ｉおよび８Ｊ）。ＧＣＬ細胞の生存に対するＣ２Ｉの効果は、ＷＴマウスよりＫＯマウスにおいて低く（図９Ｊ）、網膜におけるＮＭＤＡ誘発興奮毒性障害におけるカルパイン−１の生存促進性の役割をさらに支持する。
【０１４３】
実施例１０：急性ＩＯＰ上昇後の網膜におけるカルパイン−１およびカルパイン−２の逐次的活性化。以下のＩＯＰ上昇研究は、生理食塩水の上昇した容器に接続した針を前房に挿入することによって、６０分間、１１０ｍｍＨｇまで眼内圧（ＩＯＰ）を上昇させることからなる急性閉塞隅角緑内障のモデルを使用して行った。このモデルは、光に対する赤色反射および動向応答がないことによって示される網膜および虹彩の虚血を含む急性鋭角閉塞のいくつかの特徴を再現した。虹彩と角膜の間の狭い角度および癒着をもたらす前房癒着は、前房で細胞および炎症を増加させ、角膜浮腫による角膜の厚さを増加させた。これらの変化のいくつかは、観察の３日間続いた。眼は、ＩＯＰ上昇の０、２、４および６時間後に採取され、網膜凍結切片を調製し、ＳＢＤＰ抗体を用いた免疫組織化学のために処理した。ＷＴマウスにおいて、ＳＢＤＰは、ＩＯＰ上昇後の２、４および６時間後に明らかに存在した。しかしながら、カルパイン−１ＫＯマウスにおいて、ＳＢＤＰは、４および６時間でのみ明らかであったが、２時間では明らかでなかった（図１０ＡおよびＣ）。これらの結果は、カルパイン−２の活性化が、ＩＯＰ上昇後のＩＰＬにおけるカルパイン−１活性化よりも遅いことを示唆する。Ｃ２Ｉの効果を試験するために、Ｃ２Ｉの０．３ｍｇ／ｋｇを、ＩＯＰ上昇２時間後にＷＴマウスに腹腔内注射した。Ｃ２Ｉ注射は、４および６時間でＩＰＬにおけるＳＢＤＰシグナルを有意に減少させ（図１０ＡおよびＣ９）、網膜のＩＰＬにおけるカルパイン−２活性化は、Ｃ２Ｉの全身注射によって阻害されたことを示す。この結果はまた、ＷＴマウスのＩＰＬにおける４および６時間でのカルパイン活性が、主にカルパイン−２活性化の結果であったことを示唆する。
【０１４４】
ＩＯＰ増加後の網膜においてカルパイン−２活性化の時間経過を検証するために、網膜切片は、カルパイン−２の基質ではあるが、カルパイン−１１７の基質ではない全長ＰＴＥＮに対する抗体で免疫染色した。ＷＴおよびカルパイン−１ＫＯマウスの両方において、ＩＰＬにおけるＰＴＥＮ免疫反応性は、２時間で変化しなかったが、ＩＯＰ上昇４および６時間後に有意に低下し（図１０ＡおよびＤ）、カルパイン−２は、ＩＯＰ上昇の２時間後ではなく４および６時間後に活性化されたことを確認する。Ｃ２Ｉを、ＩＯＰ上昇の２時間後にＷＴマウスに注射した場合、４および６時間でのＰＴＥＮ分解は、完全にブロックされた（図１０ＡおよびＤ）。完全に、これらの結果は、カルパイン−１が、急性ＩＯＰ上昇後にＲＧＣ樹状突起で簡単に活性化される一方、同じ樹状突起におけるカルパイン−２活性化が遅延および延長されることを示唆する。
【０１４５】
実施例１１：カルパイン−１およびカルパイン−２は、急性ＩＯＰ上昇によって誘発されるＲＧＣ死において反対の役割を果たす。上昇したＩＯＰ誘発性網膜損傷を評価するために、右眼のＩＯＰを６０分間、１１０ｍｍＨｇまで上昇させ、一方、偽手術を、左目で行った。網膜切片を、手術の３日後にＨ＆Ｅ染色のために収集した（図１１ＡおよびＢ）。賦形剤（ＰＢＳ中１０％ＤＭＳＯ）を注射（腹腔内）したマウスにおいて、左眼で１１３．４±７．１細胞／ｍｍ（ｎ＝７）と比較して、右ＧＣＬで細胞数は、６２．１±５．６細胞／ｍｍであった。我々は、Ｃ２Ｉの効果を調べるために、３つの異なるプロトコルを使用した。第１に、Ｃ２Ｉ（０．３ｍｇ／ｋｇ）を、急性ＩＯＰ上昇の３０分前および２時間後（注射前および注射後）に注射（腹腔内）した。偽眼およびＩＯＰ上昇眼のＧＣＬにおける細胞数は、それぞれ１２５．１±１０．５および１０５．８±４．５細胞／ｍｍであった（ｎ＝３、有意差なし（ｎｓ）の偽対ＩＯＰ）。第２に、Ｃ２Ｉを、ＩＯＰ上昇の２時間後に注射（腹腔内）した（１ポスト注射）。偽およびＩＯＰ上昇眼における細胞数は、１１０．６±３．６および８６．４±７．０細胞／ｍｍであった（ｎ＝１０、ｎｓ）。第３に、Ｃ２Ｉを、ＩＯＰ上昇後２および４時間に注射（腹腔内）した（２ポスト注射）。偽およびＩＯＰ上昇眼の細胞数は、１１８．６±３．７および９６．１±６．３細胞／ｍｍであった（ｎ＝６、ｎｓ）。全ての３つのＣ２Ｉ注射群において、細胞生存率（偽眼の細胞数に対するＩＯＰ上昇眼の細胞数の比）が、賦形剤注射群と比較して、有意に増加した（図１１Ｃ）。これらの結果は、カルパイン−２活性化が、ＩＯＰ上昇後のＧＣＬ細胞死で重要な役割を果たし、Ｃ２Ｉ全身注射が、ＩＯＰ誘発性細胞死に対する保護効果を有することを示唆する。
【０１４６】
カルパイン−１ＫＯマウスにおいて、ＩＯＰ上昇眼のＧＣＬにおける細胞数は、偽眼のものよりも有意に低かった（３７．７±１０．４対１３０．３±７．０細胞／ｍｍ、ｎ＝４）。重要なことに、カルパイン−１ＫＯマウスにおける細胞生存率は、ＷＴマウスにおける細胞生存率よりも有意に低く（図１１Ｃ）、カルパイン−１は、ＩＯＰ上昇後に、ＧＣＬにおいて細胞生存を支持することを示唆している。ＷＴおよびＫＯマウスにおけるＩＯＰ誘発性網膜損傷をさらに評価するために、ＳＤ−ＯＣＴは、手術後０〜３日のＷＴマウスおよびカルパイン−１ＫＯマウスのＩＯＰ上昇および偽眼で実施された。一般的に、３日目の網膜構造は、ＷＴおよびＫＯマウスの両方で０日目のものとわずかに異なっていた（図１４Ａ）。網膜ＯＣＴ画像における網膜の厚さの定量化は、ＩＯＰ上昇眼の網膜の厚さが、ＫＯマウスにおける０日目と比較して、２および３日目で有意に減少したが、差は、ＷＴマウスにおいて統計的に有意ではなく（図１４ＢおよびＣ）、ＷＴマウスと比較して、カルパイン−１ＫＯマウスにおける悪化した網膜損傷を再び示唆している。
【０１４７】
マウスＧＣＬ１８の細胞の約４０％を構成するＲＧＣに対するＣ２Ｉの効果を特異的に調べるために、急性ＩＯＰ上昇の２時間後に賦形剤またはＣ２Ｉを注射されたＷＴマウスからの網膜切片を、ｂｒｎ−３ａ、選択的ＲＧＣマーカー１９に対する抗体で免疫染色した（図１１Ｄ）。賦形剤を注射されたＷＴマウスにおいて、偽眼およびＩＯＰ上昇眼におけるＲＧＣ数は、４０．９±５．２および１９．９±３．４細胞／ｍｍであった（ｐ＜０．０１偽対ＩＯＰ、ｎ＝４）。Ｃ２Ｉを注射されたＷＴマウスにおいて、偽眼およびＩＯＰ上昇眼におけるＲＧＣ数は、４５．２±５．０および３７．１±２．５細胞／ｍｍであった（偽対ＩＯＰ、ｎ＝５）（図１１Ｅ）。Ｃ２Ｉ注射によるＲＧＣの生存率は、賦形剤注射と比較して、有意に改善され（図１１Ｆ）、Ｃ２Ｉ全身注射は、ＩＯＰ誘発性細胞死に対してＲＧＣを保護することを示唆している。
【０１４８】
カルパイン−１およびカルパイン−２のシグナル伝達経路下流の性質を調べるために、ＷＴ、カルパイン−１ＫＯおよびＣ２Ｉ注射ＷＴマウスの網膜を、ＩＯＰ上昇または偽手術後の３時間後に収集し、ホモジナイズし、アリコートを、ウェスタンブロットのために処理した（図１１Ｇ〜Ｈ）。ＷＴマウスにおいて、ＰＨＬＰＰ１、カルパイン−１のホスファターゼ下流のレベルが、有意に低下したが、ＰＨＬＰＰ１によって脱リン酸化されることができるホスホ−Ａｋｔ  Ｓｅｒ４７３（ｐＡｋｔ）のレベルは、ＩＯＰ上昇後に有意に増加した。ＰＨＬＰＰ１およびｐＡｋｔのこれらの変化は、カルパイン−１ＫＯマウスで存在しなかったが、Ｃ２Ｉ注射ＷＴマウスに存在し、カルパイン−２ではなくカルパイン−１は、ＩＯＰ上昇後の網膜において、ＰＨＬＰＰ１分解およびＡｋ活性化を媒介することを示唆している。線状体に富むタンパク質チロシンホスファターゼ（ＳＴＥＰ）１３のカルパイン−媒介切断の生成物であるＳＴＥＰ３３は、ＷＴおよびカルパイン−１ＫＯマウスに存在したが、ＩＯＰ増加に続いてＣ２Ｉ注射ＷＴマウスには存在せず、カルパイン−１ではなくカルパイン−２は、ＩＯＰ上昇後のＳＴＥＰ切断を媒介することを示唆している。これらの結果は、カルパイン−１／ＰＨＬＰＰ１／Ａｋｔ生存促進性経路およびカルパイン−２／ＳＴＥＰ死滅促進性（ｐｒｏ−ｄｅａｔｈ）経路１３の両方は、ＩＯＰ上昇後の網膜に存在し、Ｃ２Ｉは、カルパイン−２／ＳＴＥＰ死滅促進性経路を選択的に阻害することを示唆する。
【０１４９】
実施例１２：Ｃ２Ｉの硝子体内注射は、ＧＣＬにおける細胞死を減少させ、急性ＩＯＰ上昇によって引き起こされる視力の喪失を防ぐ。我々は、網膜にＣ２Ｉを局所的に送達するために、硝子体内Ｃ２Ｉ注射を使用した。第１に、我々は、カルパイン−１ＫＯマウスにおけるＩＯＰ上昇の２時間後にＣ２Ｉの異なる用量を硝子体内に注射し、４時間でＩＰＬにおけるＳＢＤＰレベルを分析することによって、送達効率を試験した（図１２ＡおよびＢ）。ＳＢＤＰ形成の明確な用量依存的阻害が観察され、Ｃ２Ｉについて８μＭの見かけのＩＣ５０を提供した。全てのその後の実験において、２０μＭ（１μｌ）を使用して、硝子体内Ｃ２Ｉ注射の神経保護効果を調べた。Ｈ＆Ｅ染色のための手術の３日後に、眼を採取した。賦形剤注射（ＰＢＳ中１０％ＤＭＳＯ）後、偽眼およびＩＯＰ上昇眼におけるＲＧＣ数は、１３２．３±４．５および６２．０±５．７細胞／ｍｍであった（ｐ＜０．００１偽対ＩＯＰ、ｎ＝４）。Ｃ２Ｉ処理眼において、偽眼およびＩＯＰ上昇眼におけるＲＧＣ数は、１２８．１±７．２および１０１．３±９．２細胞／ｍｍであった（有意差なし、偽対ＩＯＰ、ｎ＝５）（図１２ＣおよびＤ）。Ｃ２Ｉ注射での生存率は、賦形剤注射と比較して、有意に改善され（８０．８±８．４％対４７．２±５．４％、ｐ＜０．０１）（図５ｅ）、ＩＯＰ上昇の２時間後の硝子体内Ｃ２Ｉ注射は、ＧＣＬにおけるＩＯＰ誘発性細胞死に対して神経保護作用であることを示唆している。
【０１５０】
緑内障後の視力を調べるために、我々は、マウスにおける視覚性運動反射（ＯＫＲ）を試験した（図１５Ａ）。ＯＫＲは、マウスの眼の前でグレーティングの動きによって引きこされる衝動性眼運動である。グレーティングの周波数を変更し、ＯＫＲを引き起こす最低周波数を決定することは、各眼の視力を分析することを可能にする。急性ＩＯＰ上昇または偽手術を、右眼（ＯＤ）で行った。左眼（ＯＳ）は、実験に使われていない対照として役立った。硝子体内Ｃ２Ｉまたは賦形剤注射を、手術２時間後に行った。手術の３および２１日後、ＯＫＲを、両方の眼で決定した（図５ｆ、ｇ）。賦形剤注射で偽眼の視力は、３日目で０．４７±０．１１ｃｐｄ（平均±ＳＥＭ、ｎ＝７）、２１日目で０．４１±０．１６（ｎ＝７）であり、公表された結果２０、２１とよく一致した。両方の時点で、ＩＯＰ上昇後、視力は劇的に低下し、これは、Ｃ２Ｉ注射によって有意に改善された。偽眼におけるＣ２Ｉ注射は、賦形剤注射と比較して、視力に影響を与えなかった。２１日目のＯＫＲ試験後にマウスを屠殺し、ＲＧＣ密度を網膜切片におけるｂｒｎ−３ａ免疫染色で分析した（図１２Ｈ）。予想通り、ＲＧＣ密度は、賦形剤注射によるＩＯＰ上昇眼において有意に減少したが、Ｃ２Ｉ注射によるＩＯＰ上昇眼で回復した。さらに、視力は、生存しているＲＧＣの数と高度に相関し（図１５Ｂ）、ＩＯＰ増加後のＲＧＣ死の誘発におけるカルパイン−２の顕著な役割をさらに支持している。
【０１５１】
実施例１３：式１のジアステレオ異性体は、著しく異なる阻害活性を有する。
【化２０】
2017538681.tif 000023
【０１５２】
キラル中心１がＳ型であり、キラル中心２がＳ型である式１Ａは、ジアステレオ異性体を分離するための周知の方法である方法を使用して、Ｓ−Ｒ型から分離された（式１Ｂ）。この実施例において、化合物１８Ａとして本明細書中でも言及される式１Ａは、様々な濃度で、コハク酸−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−ＡＭＣおよびμ−カルパインまたはｍ−カルパインを含むインビトロ混合物に導入され（Ｓａｓａｋｉら、１９８４年）、蛍光消失の動態を、カルパインのそれぞれについて決定した。μ−カルパインの式１Ａに対するＫｉは、カルパイン−１について１８１±７３ｎＭであることが決定され、カルパイン−２に対するＫｉは、７．８±２．５ｎＭであることが決定された（表１参照）。対照的に、カルパイン−１に対する式１Ｂ（化合物１８Ａとも呼ぶ）のＫｉが、５１４±１５１μＭであると本明細書中で決定され、カルパイン−１に対するＫｉは、１５．６±９．２μＭであると決定された。これは、カルパイン−２の阻害に関して、２つのジアステレオマー間の活性で予想外の２０００倍の差を表す。
【表２】
2017538681.tif 000024
【０１５３】
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【０１５４】
配列：
PTEN Homo Sapiens、配列番号１：
MTAIIKEIVSRNKRRYQEDGFDLDLTYIYPNIIAMGFPAERLEGVYRNNIDDVVRFLDSKHKNHYKIYNLCAERHYDTAKFNCRVAQYPFEDHNPPQLELIKPFCEDLDQWLSEDDNHVAAIHCKAGKGRTGVMICAYLLHRGKFLKAQEALDFYGEVRTRDKKGVTIPSQRRYVYYYSYLLKNHLDYRPVALLFHKMMFETIPMFSGGTCNPQFVVCQLKVKIYSSNSGPTRREDKFMYFEFPQPLPVCGDIKVEFFHKQNKMLKKDKMFHFWVNTFFIPGPEETSEKVENGSLCDQEIDSICSIERADNDKEYLVLTLTKNDLDKANKDKANRYFSPNFKVKLYFTKTVEEPSNPEASSSTSVTPDVSDNEPDHYRYSDTTDSDPENEPFDEDQHTQITKV
μ-カルパインHomo Sapiens、配列番号２：
MSEEIITPVYCTGVSAQVQKQRARELGLGRHENAIKYLGQDYEQLRVRCLQSGTLFRDEAFPPVPQSLGYKDLGPNSSKTYGIKWKRPTELLSNPQFIVDGATRTDICQGALGDCWLLAAIASLTLNDTLLHRVVPHGQSFQNGYAGIFHFQLWQFGEWVDVVVDDLLPIKDGKLVFVHSAEGNEFWSALLEKAYAKVNGSYEALSGGSTSEGFEDFTGGVTEWYELRKAPSDLYQIILKALERGSLLGCSIDISSVLDMEAITFKKLVKGHAYSVTGAKQVNYRGQVVSLIRMRNPWGEVEWTGAWSDSSSEWNNVDPYERDQLRVKMEDGEFWMSFRDFMREFTRLEICNLTPDALKSRTIRKWNTTLYEGTWRRGSTAGGCRNYPATFWVNPQFKIRLDETDDPDDYGDRESGCSFVLALMQKHRRRERRFGRDMETIGFAVYEVPPELVGQPAVHLKRDFFLANASRARSEQFINLREVSTRFRLPPGEYVVVPSTFEPNKEGDFVLRFFSEKSAGTVELDDQIQANLPDEQVLSEEEIDENFKALFRQLAGEDMEISVKELRTILNRIISKHKDLRTKGFSLESCRSMVNLMDRDGNGKLGLVEFNILWNRIRNYLSIFRKFDLDKSGSMSAYEMRMAIESAGFKLNKKLYELIITRYSEPDLAVDFDNFVCCLVRLETMFRFFKTLDTDLDGVVTFDLFKWLQLTMFA
μ-カルパインMus Musculus、配列番号３：
MTEELITPVYCTGVSAQVQKKRDKELGLGRHENAIKYLGQDYETLRARCLQSGVLFQDEAFPPVSHSLGFKELGPHSSKTYGIKWKRPTELMSNPQFIVDGATRTDICQGALGDCWLLAAIASLTLNETILHRVVPYGQSFQDGYAGIFHFQLWQFGEWVDVVIDDLLPTKDGKLVFVHSAQGNEFWSALLEKAYAKVNGSYEALSGGCTSEAFEDFTGGVTEWYDLQKAPSDLYQIILKALERGSLLGCSINISDIRDLEAITFKNLVRGHAYSVTGAKQVTYQGQRVNLIRMRNPWGEVEWKGPWSDSSYEWNKVDPYEREQLRVKMEDGEFWMSFRDFIREFTKLEICNLTPDALKSRTLRNWNTTFYEGTWRRGSTAGGCRNYPATFWVNPQFKIRLEEVDDADDYDNRESGCSFLLALMQKHRRRERRFGRDMETIGFAVYQVPRELAGQPVHLKRDFFLANASRAQSEHFINLREVSNRIRPPPGEYIVVPSTFEPNKEGDFLLRFFSEKKAGTQELDDQIQANLPDEKVLSEEEIDDNFKTLFSKLAGDDMEISVKELQTILNRIISKHKDLRTNGFSLESCRSMVNLMDRDGNGKLGLVEFNILWNRIRNYLTIFRKFDLDKSGSMSAYEMRMAIEAAGFKLNKKLHELIITRYSEPDLAVDFDNFVCCLVRLETMFRFFKLLDTDLNGVVTFDLFKWLQLTMFA
μ-カルパイン、Bos Taurus、配列番号４：
MAEEFITPVYCTGVSAQVQKQRAKELGLGRHENAIKYLGQDYEQLRVHCLQRGALFRDEAFPPVPQSLGFKELGPNSSKTYGIKWKRPTELFSNPQFIVDGATRTDICQGALGDCWLLAAIASLTLNDTLLHRVVPHGQSFQDGYAGIFHFQLWQFGEWVDVVVDDLLPTKDGKLVFVHSAQGNEFWSALLEKAYAKVNGSYEALSGGSTSEGFEDFTGGVTEWYELRKAPSDLYNIILKALERGSLLGCSIDISSILDMEAVTFKKLVKGHAYSVTGAKQVNYQGQMVNLIRMRNPWGEVEWTGAWSDGSSEWNGVDPYMREQLRVKMEDGEFWMSFRDFMREFTRLEICNLTPDALKSQRFRNWNTTLYEGTWRRGSTAGGCRNYPATFWVNPQFKIRLEETDDPDPDDYGGRESGCSFLLALMQKHRRRERRFGRDMETIGFAVYEVPPELMGQPAVHLKRDFFLSNASRARSEQFINLREVSTRFRLPPGEYVVVPSTFEPNKEGDFVLRFFSEKSAGTQELDDQVQANLPDEQVLSEEEIDENFKSLFRQLAGEDMEISVKELRTILNRIISKHKDLRTTGFSLESCRSMVNLMDRDGNGKLGLVEFNILWNRIRNYLSIFRKFDLDKSGSMSAYEMRMAIEFAGFKLNKKLYELIITRYSEPDLAVDFDNFVCCLVRLETMFRFFKTLDTDLDGVVTFDLFKWLQLTMFA
μ-カルパイン、Rattus norvegicus、配列番号５：
MAEELITPVYCTGVSAQVQKQRDKELGLGRHENAIKYLGQDYENLRARCLQNGVLFQDDAFPPVSHSLGFKELGPNSSKTYGIKWKRPTELLSNPQFIVDGATRTDICQGALGDCWLLAAIASLTLNETILHRVVPYGQSFQEGYAGIFHFQLWQFGEWVDVVVDDLLPTKDGKLVFVHSAQGNEFWSALLEKAYAKVNGSYEALSGGCTSEAFEDFTGGVTEWYDLQKAPSDLYQIILKALERGSLLGCSINISDIRDLEAITFKNLVRGHAYSVTDAKQVTYQGQRVNLIRMRNPWGEVEWKGPWSDNSYEWNKVDPYEREQLRVKMEDGEFWMSFRDFIREFTKLEICNLTPDALKSRTLRNWNTTFYEGTWRRGSTAGGCRNYPATFWVNPQFKIRLEEVDDADDYDSRESGCSFLLALMQKHRRRERRFGRDMETIGFAVYQVPRELAGQPVHLKRDFFLANASRAQSEHFINLREVSNRIRLPPGEYIVVPSTFEPNKEGDFLLRFFSEKKAGTQELDDQIQANLPDEKVLSEEEIDDNFKTLFSKLAGDDMEISVKELQTILNRIISKHKDLRTNGFSLESCRSMVNLMDRDGNGKLGLVEFNILWNRIRNYLTIFRKFDLDKSGSMSAYEMRMAIEAAGFKLNKKLHELIITRYSEPDLAVDFDNFVCCLVRLETMFRFFKILDTDLDGVVTFDLFKWLQLTMFA
μ-カルパイン、Sus Scrofa、配列番号６：
MAEEVITPVYCTGVSAQVQKLRAKELGLGRHENAIKYLGQDYEQLRAHCLQSGSLFRDEAFPPVPQSLGFKELGPNSSKTYGVKWKRPTELFSNPQFIVDGATRTDICQGALGDCWLLAAIASLTLNDTLLHRVVPHGQSFQNGYAGIFHFQLWQFGEWVDVVVDDLLPTKDGKLVFVHSAQGNEFWSALLEKAYAKVNGSYEALSGGSTSEGFEDFTGGVTEWYELRKAPSDLYSIILKALERGSLLGCSIDISSVLDMEAVTFKKLVKGHAYSVTGAKQVNYQGQMVNLIRMRNPWGEVEWTGAWSDGSSEWNGVDPYQRDQLRVRMEDGEFWMSFRDFLREFTRLEICNLTPDALKSQRVRNWNTTLYEGTWRRGSTAGGCRNYPATFWVNPQFKIRLEETDDPEDDYGGRESGCSFVLALMQKHRRRERRFGRDMETIGFAVYEVPPELVGQPVHLKRDFFLANASRARSEQFINLREVSTRFRLPPGEYVVVPSTFEPNKEGDFVLRFFSEKKAGTQELDDQVQAILPDEQVLSEEEIDENFKALFRQLAGEDMEISVRELRTILNRIISKHKDLRTKGFSLESCRSMVNLMDRDGNGKLGLVEFNILWNRIRNYLSIFRKFDLDKSGSMSAYEMRMAIESAGFKLNKKLFELIITRYSEPDLAVDFDNFVCCLVRLETMFRFFKTLDTDLDGVVTFDLFKWLQLTMFA
μ-カルパイン断片、配列番号７：LDTDLDGVVTFDLFKWLQLTMFA
μ-カルパイン断片、配列番号８：DTDLDGVVTFDLFKWLQLTMFA
μ-カルパイン断片、配列番号９：TDLDGVVTFDLFKWLQLTMFA
μ-カルパイン断片、配列番号１０：DLDGVVTFDLFKWLQLTMFA
μ-カルパイン断片、配列番号１１：LDGVVTFDLFKWLQLTMFA
μ-カルパイン断片、配列番号１２：DGVVTFDLFKWLQLTMFA
μ-カルパイン断片、配列番号１３：GVVTFDLFKWLQLTMFA
μ-カルパイン断片、配列番号１４：VVTFDLFKWLQLTMFA
μ-カルパイン断片、配列番号１５：VTFDLFKWLQLTMFA
μ-カルパイン断片、配列番号１６：TFDLFKWLQLTMFA
μ-カルパイン断片、配列番号１７：FDLFKWLQLTMFA
μ-カルパイン断片、配列番号１８：DLFKWLQLTMFA
μ-カルパイン断片、配列番号１９：LFKWLQLTMFA
μ-カルパイン断片、配列番号２０：FKWLQLTMFA
μ-カルパイン断片、配列番号２１：KWLQLTMFA
μ-カルパイン断片、配列番号２２：WLQLTMFA
μ-カルパイン断片、配列番号２３：LQLTMFA
μ-カルパイン断片、配列番号２４：QLTMFA
μ-カルパイン断片、配列番号２５：LTMFA
μ-カルパイン断片、配列番号２６：TMFA
μ-カルパイン断片、配列番号２７：LDTDLDGVVTFDLFKWLQLDMFA
μ-カルパイン断片、配列番号２８：DTDLDGVVTFDLFKWLQLDMFA
μ-カルパイン断片、配列番号２９：TDLDGVVTFDLFKWLQLDMFA
μ-カルパイン断片、配列番号３０：DLDGVVTFDLFKWLQLDMFA
μ-カルパイン断片、配列番号３１：LDGVVTFDLFKWLQLDMFA
μ-カルパイン断片、配列番号３２：DGVVTFDLFKWLQLDMFA
μ-カルパイン断片、配列番号３３：GVVTFDLFKWLQLDMFA
μ-カルパイン断片、配列番号３４：VVTFDLFKWLQLDMFA
μ-カルパイン断片、配列番号３５：VTFDLFKWLQLDMFA
μ-カルパイン断片、配列番号３６：TFDLFKWLQLDMFA
μ-カルパイン断片、配列番号３７：FDLFKWLQLDMFA
μ-カルパイン断片、配列番号３８：DLFKWLQLDMFA
μ-カルパイン断片、配列番号３９：LFKWLQLDMFA
μ-カルパイン断片、配列番号４０：FKWLQLDMFA
μ-カルパイン断片、配列番号４１：KWLQLDMFA
μ-カルパイン断片、配列番号４２：WLQLDMFA
μ-カルパイン断片、配列番号４３：LQLDMFA
μ-カルパイン断片、配列番号４４：QLDMFA
μ-カルパイン断片、配列番号４５：LDMFA
μ-カルパイン断片、配列番号４６：LDTDLDGVVTFDLFKWLQLEMFA
μ-カルパイン断片、配列番号４７：DTDLDGVVTFDLFKWLQLEMFA
μ-カルパイン断片、配列番号４８：TDLDGVVTFDLFKWLQLEMFA
μ-カルパイン断片、配列番号４９：DLDGVVTFDLFKWLQLEMFA
μ-カルパイン断片、配列番号５０：LDGVVTFDLFKWLQLEMFA
μ-カルパイン断片、配列番号５１：DGVVTFDLFKWLQLEMFA
μ-カルパイン断片、配列番号５２：GVVTFDLFKWLQLEMFA
μ-カルパイン断片、配列番号５３：VVTFDLFKWLQLEMFA
μ-カルパイン断片、配列番号５４：VTFDLFKWLQLEMFA
μ-カルパイン断片、配列番号５５：TFDLFKWLQLEMFA
μ-カルパイン断片、配列番号５６：FDLFKWLQLEMFA
μ-カルパイン断片、配列番号５７：DLFKWLQLEMFA
μ-カルパイン断片、配列番号５８：LFKWLQLEMFA
μ-カルパイン断片、配列番号５９：FKWLQLEMFA
μ-カルパイン断片、配列番号６０：KWLQLEMFA
μ-カルパイン断片、配列番号６１：WLQLEMFA
μ-カルパイン断片、配列番号６２：LQLEMFA
μ-カルパイン断片、配列番号６３：QLEMFA
μ-カルパイン断片、配列番号６４：LEMFA
μ-カルパイン断片、配列番号６５：EMFA
μ-カルパイン断片、配列番号６６：DMFA
μ-カルパイン断片、配列番号６７：LEMFA
μ-カルパイン断片、配列番号６８：LDMFA
Ｍ−カルパインHomo Sapiens、配列番号６９：
MAGIAAKLAKDREAAEGLGSHERAIKYLNQDYEALRNECLEAGTLFQDPSFPAIPSALGFKELGPYSSKTRGIEWKRPTEICADPQFIIGGATRTDICQGALGDCWLLAAIASLTLNEEILARVVPLNQSFQENYAGIFHFQFWQYGEWVEVVVDDRLPTKDGELLFVHSAEGSEFWSALLEKAYAKINGCYEALSGGATTEGFEDFTGGIAEWYELKKPPPNLFKIIQKALQKGSLLGCSIDITSAADSEAITFQKLVKGHAYSVTGAEEVESNGSLQKLIRIRNPWGEVEWTGRWNDNCPSWNTIDPEERERLTRRHEDGEFWMSFSDFLRHYSRLEICNLTPDTLTSDTYKKWKLTKMDGNWRRGSTAGGCRNYPNTFWMNPQYLIKLEEEDEDEEDGESGCTFLVGLIQKHRRRQRKMGEDMHTIGFGIYEVPEELSGQTNIHLSKNFFLTNRARERSDTFINLREVLNRFKLPPGEYILVPSTFEPNKDGDFCIRVFSEKKADYQAVDDEIEANLEEFDISEDDIDDGFRRLFAQLAGEDAEISAFELQTILRRVLAKRQDIKSDGFSIETCKIMVDMLDSDGSGKLGLKEFYILWTKIQKYQKIYREIDVDRSGTMNSYEMRKALEEAGFKMPCQLHQVIVARFADDQLIIDFDNFVRCLVRLETLFKIFKQLDPENTGTIELDLISWLCFSVL
Ｍ−カルパイン、Mus Musculus、配列番号７０：
MAGIAIKLAKDREAAEGLGSHERAIKYLNQDYETLRNECLEAGALFQDPSFPALPSSLGYKELGPYSSKTRGIEWKRPTEICADPQFIIGGATRTDICQGALGDCWLLAAIASLTLNEEILARVVPPDQSFQENYAGIFHFQFWQYGEWVEVVVDDRLPTKDGELLFVHSAEGSEFWSALLEKAYAKINGCYETLSGGATTEGFEDFTGGIAEWYELRKPPPNLFKIIQKALEKGSLLGCSIDITSAADSEAVTYQKLVKGHAYSVTGAEEVESSGSLQKLIRIRNPWGQVEWTGKWNDNCPSWNTVDPEVRANLTERQEDGEFWMSFSDFLRHYSRLEICNLTPDTLTC
DSYKKWKLTKMDGNWRRGSTAGGCRNYPNTFWMNPQYLIKLEEEDEDEEDGGRGCTFLVGLIQKHRRRQRKMGEDMHTIGFGIYEVPEELTGQTNIHLGKNFFLTTRARERSDTFINLREVLNRFKLPPGEYVLVPSTFEPHKDGDFCIRVFSEKKADYQAVDDEIEANIEEIDANEEDIDDGFRRLFVQLAGEDAEISAFELQTILRRVLAKRQDIKSDGFSIETCKIMVDMLDEDGSGKLGLKEFYILWTKIQKYQKIYREIDVDRSGTMNSYEMRKALEEAGFKLPCQLHQVIVARFADDELIIDFDNFVRCLVRLETLFKIFKQLDPENTGTIQLNLASWLSFSVL
Ｍ−カルパイン、Sus Scrofa、配列番号７１：
MAGIAAKLAKDREAAEGLGSHERAVKYLNQDYAELRDQCLEAGALFQDPSFPALPSSLGFKELGPYSGKTRGIEWKRPTEICDNPQFIIGGATRTDICQGALGDCWLLAAIASLTLNEEVLARVVPLDQSFQENYAGIFRFQFWQYGEWVEVVVDDRLPTKDGELLFVHSAEGSEFWSALLEKAYAKINGCYEALSGGATTEGFEDFTGGIAEWYELRKAPPNLFKIIQKALQKGSLLGCSIDITSAADSEAVTFQKLVKGHAYSVTGAEEVESRGSLQKLIRIRNPWGEVEWTGQWNDNCPNWNTVDPEVRESLTRRHEDGEFWMSFSDFLRHYSRLEICNLTPDTLTSDSYKKWKLTKMDGNWRRGSTAGGCRNYPNTFWMNPQYLIKLEEEDEDQEDGESGCTFLVGLIQKHRRRQRKMGEDMHTIGFGIYEVPEELTGQTNIHLSKNFFLTHRARERSDTFINLREVLNRFKLPPGEYILVPSTFEPNKDGDFCIRVFSEKKADYQVVDDEIEADLEENDASEDDIDDGFRRLFAQLAGEDAEISAFELQTILRRVLAKRQDIKSDGFSIETCKIMVDMLDSDGSAKLGLKEFYILWTKIQKYQKIYREIDVDRSGTMNSYEMRKALEEAGFKLPCQLHQVIVARFADDQLIIDFDNFVRCLVRLETLFRISKQLDSENTGTIELDLISWLCFSVL
Ｍ−カルパイン、Rattus norvegicus、配列番号７２：
MAGIAMKLAKDREAAEGLGSHERAIKYLNQDYETLRNECLEAGALFQDPSFPALPSSLGFKELGPYSSKTRGIEWKRPTEICADPQFIIGGATRTDICQGALGDCWLLAAIASLTLNEEILARVVPLDQSFQENYAGIFHFQFWQYGEWVEVVVDDRLPTKDGELLFVHSAEGSEFWSALLEKAYAKINGCYEALSGGATTEGFEDFTGGIAEWYELRKPPPNLFKIIQKALEKGSLLGCSIDITSAADSEAVTYQKLVKGHAYSVTGAEEVESSGSLQKLIRIRNPWGQVEWTGKWNDNCPSWNTVDPEVRANLTERQEDGEFWMSFSDFLRHYSRLEICNLTPDTLTC
DSYKKWKLTKMDGNWRRGSTAGGCRNYPNTFWMNPQYLIKLEEEDEDDEDGERGCTFLVGLIQKHRRRQRKMGEDMHTIGFGIYEVPEELTGQTNIHLSKNFFLTTRARERSDTFINLREVLNRFKLPPGEYVLVPSTFEPHKNGDFCIRVFSEKKADYQTVDDEIEANIEEIEANEEDIGDGFRRLFAQLAGEDAEISAFELQTILRRVLAKREDIKSDGFSIETCKIMVDMLDEDGSGKLGLKEFYILWTKIQKYQKIYREIDVDRSGTMNSYEMRKALEEAGFKLPCQLHQVIVARFADDELIIDFDNFVRCLVRLEILFKIFKQLDPENTGTIQLDLISWLSFSVL
Ｍ−カルパイン、Bos Taurus、配列番号７３：
MAGIAAKLAKDREAAEGLGSHERAVKYLNQDYAALRDECLEAGALFQDPSFPALPSSLGFKELGPYSSKTRGIEWKRPTEICDNPQFITGGATRTDICQGALGDCWLLAAIASLTLNEEILARVVPLDQSFQENYAGIFHFQFWQYGEWVEVVVDDRLPTKDGELLFVHSAEGSEFWSALLEKAYAKINGCYEALSGGATTEGFEDFTGGIAEWYELRKAPPNLFRIIQKALQKGSLLGCSIDITSAADSEAITFQKLVKGHAYSVTGAEEVESRGSLQKLIRIRNPWGEVEWTGQWNDNCPNWNTVDPEVRETLTRQHEDGEFWMSFNDFLRHYSRLEICNLTPDTLTSDSYKKWKLTKMDGNWRRGSTAGGCRNYPNTFWMNPQYLIKLEEEDEDQEDGESGCTFLVGLIQKHRRRQRKMGEDMHTIGFGIYEVPEELTGQTNIHLSKKFFLTTRARERSDTFINLREVLNRFKLPPGEYIVVPSTFEPNKDGDFCIRVFSEKKADYQVVDDEIEANIDEIDISEDDIDDGFRRLFAQLAGEDAEISAFELQTILRRVLAKRQDIKSDGFSIETCKIMVDMLDSDGSGKLGLKEFYILWTKIQKYQKIYREIDVDRSGTMNSYEMRKALEEAGFKMPCQLHQVIVARFADDDLIIDFDNFVRCLIRLETLFRIFKQLDPENTGMIQLDLISWLSFSVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号７４：KQLDPENTGTIELDLISWLCFSVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号７５：QLDPENTGTIELDLISWLCFSVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号７６：LDPENTGTIELDLISWLCFSVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号７７：DPENTGTIELDLISWLCFSVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号７８：PENTGTIELDLISWLCFSVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号７９：ENTGTIELDLISWLCFSVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号８０：NTGTIELDLISWLCFSVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号８１：TGTIELDLISWLCFSVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号８２：GTIELDLISWLCFSVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号８３：TIELDLISWLCFSVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号８４：IELDLISWLCFSVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号８５：IELDLISWLCFDVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号８６：IELDLISWLCFEVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号８７：ELDLISWLCFSVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号８８：LDLISWLCFSVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号８９：DLISWLCFSVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号９０：LDLISWLCFDVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号９１：LDLISWLCFEVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号９２：LISWLCFSVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号９３：ISWLCFSVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号９４：KQLDPENTGTIELDLISWLCFDVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号９５：QLDPENTGTIELDLISWLCFDVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号９６：LDPENTGTIELDLISWLCFDVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号９７：DPENTGTIELDLISWLCFDVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号９８：PENTGTIELDLISWLCFDVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号９９：ENTGTIELDLISWLCFDVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号１００：NTGTIELDLISWLCFDVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号１０１：TGTIELDLISWLCFDVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号１０２：GTIELDLISWLCFDVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号１０３：TIELDLISWLCFDVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号１０４：IELDLISWLCFDVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号１０５：IELDLISWLCFDVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号１０６：ELDLISWLCFDVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号１０７：LDLISWLCFDVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号１０８：DLISWLCFDVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号１０９：KQLDPENTGTIELDLISWLCFEVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号１１０：QLDPENTGTIELDLISWLCFEVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号１１１：LDPENTGTIELDLISWLCFEVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号１１２：DPENTGTIELDLISWLCFEVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号１１３：PENTGTIELDLISWLCFEVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号１１４：ENTGTIELDLISWLCFEVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号１１５：NTGTIELDLISWLCFEVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号１１６：TGTIELDLISWLCFDVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号１１７：GTIELDLISWLCFEVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号１１８：TIELDLISWLCFEVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号１１９：IELDLISWLCFEVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号１２０：IELDLISWLCFEVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号１２１：ELDLISWLCFDVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号１２２：LDLISWLCFDVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号１２３：DLISWLCFDVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号１２４：LISWLCFSVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号１２５：ISWLCFSVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号１２６：ISWLCFDVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号１２７：ISWLCFEVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号１２８：SWLCFSVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号１２９：SWLCFDVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号１３０：SWLCFEVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号１３１：WLCFSVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号１３２：ISWLCFDVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号１３３：ISWLCFEVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号１３４：SWLCFSVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号１３５：SWLCFDVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号１３６：SWLCFEVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号１３７：WLCFSVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号１３８：LCFDVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号１３９：LCFEVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号１４０：CFSVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号１４１：CFDVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号１４２：CFEVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号１４３：FSVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号１４４：FDVL
Ｍ-カルパイン断片、配列番号１４５：FEVL
ホスファターゼドメインと脂質結合ドメインとの間の結合：
PTEN断片、配列番号１４６：IPSQRRYVYYYSYLLKNHLDYRPV
下線は、αへリックスであり；青は、曝露されたリンカーであり；赤は、Ｍ−カルパイン切断部位である。
PTEN断片、配列番号１４７：SQRRYVYYYSYLLKNHLDYRP
PTEN断片、配列番号１４８：PSQRRYVYYYSYLLKNHLDYRP
PTEN断片、配列番号１４９：PSQRRYVYYYSYLLKNHLDYR
PTEN断片、配列番号１５０：PSQRRYVYYYSYLLKNHLDY
PTEN断片、配列番号１５１：SQRRYVYYYSYLLKNHLD
PTEN断片、配列番号１５２：PSQRRYVYYYSYLLKNHLD
PTEN断片、配列番号１５３：PSQRRYVYYYSYLLKNHL
PTEN断片、配列番号１５４：PSQRRYVYYYSYLLKNH
PTEN断片、配列番号１５５：PSQRRYVYYYSYLLKN
PTEN断片、配列番号１５６：PSQRRYVYYYSYLLK
PTEN断片、配列番号１５７：SQRRYVYYYSYLLKNHL
PTEN断片、配列番号１５８：QRRYVYYYSYLLKNHL
PTEN断片、配列番号１５９：QRRYVYYYSYLLKNH
PTEN断片、配列番号１６０：QRRYVYYYSYLLKN
PTEN断片、配列番号１６１：QRRYVYYYSYLLK
PTEN断片、配列番号１６２：RRYVYYYSYLLK
PTEN断片、配列番号１６３：QRRYVYYYSYLLKNHLDY
PTEN断片、配列番号１６４：RRYVYYYSYLLKNHLDY
PTEN断片、配列番号１６５：YVYYYSYLLKNHLDY
PTEN断片、配列番号１６６：YYYSYLLKNHLDY
PTEN断片、配列番号１６７：YYSYLLKNHLDY
PTEN断片、配列番号１６８：YSYLLKNHLDY
PTEN断片、配列番号１６９：SYLLKNHLDY
PTEN断片、配列番号１７０：YLLKNHLDY
PTEN断片、配列番号１７１：LLKNHLDY
PTEN断片、配列番号１７２：YYSYLLKNHLD
PTEN断片、配列番号１７３：YSYLLKNHL
PTEN断片、配列番号１７４：SYLLKNH
PTEN断片、配列番号１７５：YLLKN
PTEN断片、配列番号１７６：YLLKNHLD
PTEN断片、配列番号１７７：YLLK
PTEN断片、配列番号１７８：LLKN
PTEN断片、配列番号１７９：ERADNDKEYLVLTLTKNDLDKANKDKANRYFSPNFKVKLYFTKTVEEPSNPE
下線は、脂質結合ドメインであり；赤は、Ｍ−カルパイン切断部位である。
PTEN断片、配列番号１８０：NRYFSPNFKVKLYFTKTVEEPSNPE
PTEN断片、配列番号１８１：
KEYLVLTLTKNDLDKANKDKANRYFSPNFKVKLYFTKTVEE
PTEN断片、配列番号１８２：ERADNDKEYLVLTLTKNDLDKANKD
PTEN断片、配列番号１８３：KEYLVLTLTKND
PTEN断片、配列番号１８４：EYLVLTLTKN
PTEN断片、配列番号１８５：EYLVLTLTK
PTEN断片、配列番号１８６：KEYLVLTLTK
PTEN断片、配列番号１８７：YLVLTLTK
PTEN断片、配列番号１８８：LVLTLT
PTEN断片、配列番号１８９：VLTLT
PTEN断片、配列番号１９０：VLTL
PTEN断片、配列番号１９１：LTLT
PTEN断片、配列番号１９２：EYLVL
PTEN断片、配列番号１９３：EYLV
膜変換ドメイン
7−mer、配列番号１９４：−RRMKWKK−
Transportan配列番号１９５：−GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKISIL−amide
Penatrin、配列番号１９６：−RQIKIWFQNRRMKWKK−
polyArginine、配列番号１９７：−RRRRRRRRRR−
MAP、配列番号１９８：−LLIILRRRIRKQAHAHSK−
RDP、配列番号１９９：−KSVRTWNEIIPSKGCLRVGGRCHPHVNGGGRRRRRRRRR−
HIV−TAT配列番号２００：−RKKRRQRRR
より多くのＰＴＥＮ由来ｍ−カルパイン選択的ペプチド
配列番号２０１：NRYFSPNFKVKLYFTKTVEEPSNP
配列番号２０２：RYFSPNFKVKLYFTKTVEEPSNP
配列番号２０３：RYFSPNFKVKLYFTKTVEEPSN
配列番号２０４：YFSPNFKVKLYFTKTVEEPSN
配列番号２０５：YFSPNFKVKLYFTKTVEEPS
配列番号２０６：FSPNFKVKLYFTKTVEEPS
配列番号２０７：FSPNFKVKLYFTKTVEEP
配列番号２０８：SPNFKVKLYFTKTVEEP
配列番号２０９：SPNFKVKLYFTKTVEE
配列番号２１０：PNFKVKLYFTKTVEE
配列番号２１１：PNFKVKLYFTKTVE
配列番号２１２：NFKVKLYFTKTVE
配列番号２１３：NFKVKLYFTKTV
配列番号２１４：FKVKLYFTKTV
配列番号２１５：FKVKLYFTKT
配列番号２１６：KVKLYFTKT
配列番号２１７：KVKLYFTK
配列番号２１８：VKLYFTK
配列番号２１９：VKLYFT
配列番号２２０：KLYFT
配列番号２２１：KLYF
配列番号２２２：LYF
【図１】
2017538681.tif 000032
【図２】
2017538681.tif 000033
【図３Ａ】
2017538681.tif 000034
【図３Ｂ】
2017538681.tif 000035
【図４】
2017538681.tif 000036
【図５】
2017538681.tif 000037
【図６】
2017538681.tif 000038
【図７Ａ】
2017538681.tif 000039
【図７Ｂ】
2017538681.tif 000040
【図８Ａ】
2017538681.tif 000041
【図８Ｂ】
2017538681.tif 000042
【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
2017538681.tif 000044
【図９Ｂ】
2017538681.tif 000045
【図９Ｃ】
2017538681.tif 000046
【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
2017538681.tif 000050
【図９Ｈ】
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【図９Ｉ】
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【図９Ｊ】
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【図１０Ａ】
2017538681.tif 000054
【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１１Ｇ】
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【図１１Ｈ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１２Ｇ】
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【図１２Ｈ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
2017538681000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年5月12日(2017.5.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2017538681.tif 000089
【図４】
2017538681.tif 000090
【図５】
2017538681.tif 000091
【図６】
2017538681.tif 000092
【図７Ａ】
2017538681.tif 000093
【図７Ｂ】
2017538681.tif 000094
【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
2017538681.tif 000096
【図８Ｃ】
2017538681.tif 000097
【図９Ａ】
2017538681.tif 000098
【図９Ｂ】
2017538681.tif 000099
【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図９Ｈ】
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【図９Ｉ】
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【図９Ｊ】
2017538681.tif 000107
【図１０Ａ】
2017538681.tif 000108
【図１０Ｂ】
2017538681.tif 000109
【図１０Ｃ】
2017538681.tif 000110
【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１１Ｇ】
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【図１１Ｈ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１２Ｇ】
2017538681.tif 000126
【図１２Ｈ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
2017538681.tif 000129
【図１４Ｂ】
2017538681.tif 000130
【図１４Ｃ】
2017538681.tif 000131
【図１５Ａ】
2017538681.tif 000132
【図１５Ｂ】
2017538681.tif 000133
【図１６Ａ】
2017538681.tif 000134
【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
2017538681.tif 000136
【図１６Ｄ】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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