(57)【要約】  細胞培養装置は、第１の主面及び反対側の第２の主面を有する１つ以上のプレートを備えている。第１の主面は、複数のウェルを画成する構造化された表面を含む。各ウェルは、上部開口及び底を画成する内面を有し、各ウェルの上部開口は、１００マイクロメートル〜２０００マイクロメートルの範囲の直径寸法を有する。装置はまた、底面の長さに沿って第１の主面から延びる複数のスペーサも備えている。複数のフローチャネルは、隣接するレール同士の間に画成される。
2017532970.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の主面及び反対側の第２の主面を有する１つ以上のプレートであって、前記第１の主面が複数のマイクロウェルを備えている、プレート；及び
前記第１の主面から延びる複数のスペーサであって、複数の細胞培養培地フローチャネルが隣接するプレート同士の間に画成される、スペーサ
を備えた、細胞培養装置。
【請求項２】
前記スペーサが、前記プレートの長さに沿って前記第１の主面から延びており、複数の細胞培養培地フローチャネルが、隣接するスペーサ同士の間に画成されることを特徴とする、請求項１に記載の細胞培養装置。
【請求項３】
各ウェルが、上部開口及び底を画成する内面を有しており、各ウェルの前記上部開口が、１００マイクロメートル〜２０００マイクロメートルの範囲の直径寸法を有することを特徴とする、請求項１又は２に記載の細胞培養装置。
【請求項４】
前記細胞培養装置が、互いに積層された複数の前記プレートを備えていることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
【請求項５】
入口及び出口をさらに備えており、前記複数の培地フローチャネルの各々が、前記入口及び前記出口と流体連通していることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
【請求項６】
前記入口を画成し、かつ、複数の入口フローチャネル開口を画成する、入口マニホルドをさらに備えており、前記複数の入口フローチャネル開口の各々が、それぞれの培地フローチャネルと流体連通していることを特徴とする、請求項５に記載の細胞培養装置。
【請求項７】
前記出口を画成し、かつ、複数の出口フローチャネル開口を画成する、出口マニホルドをさらに備えており、出口フローチャネル開口の各々が、それぞれの培地フローチャネルと流体連通していることを特徴とする、請求項５に記載の細胞培養装置。
【請求項８】
隣接する積層されたプレートのうちの少なくとも１つの対が、前記積層されたプレートのうちの１つのプレートの前記第１の主面によって画成された底面と、前記隣接する積層されたプレートの前記第２の主面によって画成された上面とを有する細胞培養チャンバを画成することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
【請求項９】
前記複数の積層されたプレートの最上部の細胞培養プレート上に配置された上部プレートをさらに備えることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
【請求項１０】
少なくとも１つのスペーサが、前記スペーサの長さを延長する空気チャネルを備えており、該空気チャネルが、前記細胞培養装置の外部とガス連通し、かつ、前記スペーサによって画成された前記複数の培地フローチャネルの少なくとも１つとガス連通していることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
【請求項１１】
前記プレートが、隣接するプレートのスペーサを位置合わせするように積層されており、該位置合わせされたスペーサが、最底部のプレートから最上部のプレートまで延びる壁を画成することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
【請求項１２】
少なくとも１つの壁が、前記最底部のプレートから前記最上部のプレートまで延びる空気チャネルを画成しており、該空気チャネルが、前記細胞培養装置の外部とガス連通し、かつ、前記壁の前記スペーサによって画成されたそれぞれの培地フローチャネルとガス連通していることを特徴とする、請求項１１に記載の細胞培養装置。
【請求項１３】
前記該複数のウェルが、六方最密充填されたウェルのアレイを含むことを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
【請求項１４】
前記ウェルが、前記上部開口から前記底まで画成された深さを有しており、該深さが、２００マイクロメートル〜２０００マイクロメートルの範囲内にあることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
【請求項１５】
前記ウェルの各々が、細胞に対して非接着性であることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
【請求項１６】
前記プレートが、前記ウェルを介してガス透過可能であることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の細胞培養装置；及び
前記入口に連結した酸素供給器
を備えた、細胞培養システム。
【請求項１８】
前記入口に連結したポンプをさらに備えていることを特徴とする、請求項１７に記載の細胞培養システム。
【請求項１９】
請求項１に記載の細胞培養装置の前記ウェル内に細胞を導入する工程；及び
前記ウェル内で前記細胞を培養するために、細胞培養培地を第１の速度で前記細胞培養装置の前記培地フローチャネルを通じて灌流させる工程
を含む、方法。
【請求項２０】
前記ウェルから前記細胞を取り出すために、前記細胞培養培地を前記第１の速度より速い第２の速度で前記培地フローチャネルを通じて灌流させる工程
をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ａ）請求項１〜１７のいずれか一項に記載の細胞培養装置の前記ウェル内でタンパク質を発現する細胞を培養する工程；及び
ｂ）前記細胞から前記タンパク質を単離する工程
を含む、タンパク質を産生する方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本開示は、その全体がここに参照することによって本願に援用される、２０１４年１０月２９日出願の米国仮特許出願第６２／０７２０３９号の優先権を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本開示は、細胞を培養するための装置、システム、及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
維持可能な生細胞密度（ＶＣＤ）は、バイオリアクタ容器における生産性及びコストに作用する主要な変数である。培養における細胞の高い密度に起因して、高まる栄養及びガス交換要求を受容するように、バッグは、より速く又はインペラ速度を高めて揺動されることから、バイオリアクタにおいて可能な限り高いＶＣＤを達成することに対する制限の１つは、細胞が被る剪断力である。加えて、スクリーニング、細胞療法、又は再生医療用途のための細胞の産生のためなど、付着依存性細胞が産生物であるような用途については、リアクタから細胞を採取することは困難でありうる。
【０００４】
近年、自動化されたプロセスにおいて一貫した品質を維持すると同時に、生産コストを大幅に低減することを目指して、バイオリアクタを、定常状態において連続灌流モードで稼働させるための努力がなされてきた。この方法は、高い細胞密度を維持するために効果的な方法であることが示されているが、治療用タンパク質の商業生産への適合については困難がある。リスクの１つは、対象とするタンパク質を発現する細胞よりも、最も速い増殖能を示す細胞が、経時的に選択されるとともに、長期にわたる培養後の発現レベルが不安定なことである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、対象とする細胞の安定性の増大、付着依存性細胞の採取の容易化、又は、生細胞密度の増加のうちの１つ以上をもたらす、新しい細胞培養装置が望ましいであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示のさまざまな実施形態によれば、積層可能な１つ以上のプレートを有する細胞培養装置が記載される。プレートは、構造化された表面を画成する主面を有する。構造化された表面は、その中で細胞を培養することができる、複数のウェルを画成する。ウェルは、マイクロメートルスケールの寸法を有していてよく、スフェロイド細胞集塊の形成を促進するように構成されうる。本明細書に記載の装置はまた、積層されたプレート同士の間に空間を維持するために複数のスペーサも有している。実施形態において、このようなスペーサには、柱、又は、プレートの長さに沿って主面から延びる離間されたレールが含まれる。複数のフローチャネルは、細胞培養培地の灌流のために、隣接するプレート同士及び／又はレール同士の間に形成される。構造化された表面は、スフェロイド形成によって促進されうる、非常に高い細胞密度での細胞増殖を支援することができる。スフェロイドは、単層において増殖した細胞と比較して、より多いインビボ様応答を示す、分化された細胞機能を維持できることから、スフェロイドの形成はまた、細胞機能の安定性も高めるはずである。幾つかの実施形態では、細胞が培養されるウェルは、細胞に対して非接着性であり、細胞の採取を促進することができる。本明細書に記載のさまざまな実施形態において、装置は、代謝ガスの受動拡散を可能にするように設計され、それによって、培地灌流速度の低下を可能にし、よって、培養された細胞が供される剪断力をより小さくすることができる。
【０００７】
さまざまな実施形態において、本開示は細胞培養装置について説明する。細胞培養装置は、第１の主面及び反対側の第２の主面を有する１つ以上のプレートを備えている。第１の主面は、複数のウェルを画成する構造化された表面を備えている。各ウェルは、上部開口及び底（nadir）を画成する内面を有しており、各ウェルの上部開口は、２００マイクロメートル〜５００マイクロメートルの範囲、又は１００マイクロメートル〜２０００マイクロメートルの範囲内の直径寸法を有する。本装置はまた、第１の主面の長さに沿って第１の主面から延びる複数の離間されたレール（スペーサ）も備えている。複数のフローチャネルが、隣接するレール同士の間に画成される。
【０００８】
幾つかの実施形態では、ａ）本明細書に記載される細胞培養装置のウェル内でタンパク質を発現する細胞を培養する工程；及びｂ）細胞からタンパク質を単離する工程を含む、タンパク質（例えば、治療用抗体又は抗体断片などの治療用タンパク質）の産生方法が提供される。
【０００９】
幾つかの実施形態では、ウェル（例えば、マイクロウェル）は、正弦波に似た断面形状を有する。このような実施形態では、ウェルの底部は丸みを帯び（例えば半球円形）、側壁は、ウェルの底部から上部へと直径が増大し、ウェル間の境界は丸みを帯びている。このように、ウェルの上部は直角には終結しない。幾つかの実施形態では、ウェルは、底部と上部との間の中間点における直径Ｄ（Ｄ中間ともいう）、ウェルの上部における直径Ｄ上部及びウェルの底部から上部までの高さＨを有する。これらの実施形態では、Ｄ上部は、Ｄよりも大きい。ウェルの幅が隣接するウェル間の障壁の幅より大きい、追加の実施形態が図１５に示されている。このような実施形態は、培養表面の所定の領域内に、より多数のウェルを受容する。
【００１０】
本開示の主題の追加の特徴及び利点は、以下の詳細な説明において記載され、一部にはその説明から当業者に容易に明らかになり又は以下の詳細な説明、特許請求の範囲、並びに添付の図面を含む本明細書に記載される本開示の主題を実施することによって認識されよう。
【００１１】
前述の概要及び以下の詳細な説明は両方とも、本開示の主題の実施形態を提示するものであり、特許請求の範囲に記載される本開示の主題の性質及び特徴を理解するための概観又は枠組みを提供することが意図されていると解されるべきである。添付の図面は、本開示の主題のさらなる理解をもたらすために含まれ、本明細書に取り込まれてその一部を構成する。図面は、本開示の主題のさまざまな実施形態を例証しており、その説明とともに本開示の主題の原理及び動作を説明する役割を果たす。加えて、図面及び説明は単に例証することが意図されており、いかなる方法によっても特許請求の範囲を限定することは意図されていない。
【００１２】
本開示の特定の実施形態の以下の詳細な説明は、同様の構造が同様の参照番号を用いて示される以下の図面と併せて読まれた場合に最もよく理解されうる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】細胞を培養するためのウェルを有する、構造化された表面を有する基材の実施形態の概略的な側面図
【図２】構造化された表面のウェルの実施形態の概略的な断面図
【図３】構造化された表面のウェルの実施形態の概略的な断面図
【図４】構造化された表面を有する基材の実施形態の画像
【図５】構造化された表面の実施形態のウェル内で増殖した細胞の概略的な上面図
【図６Ａ】プレート及びレールの実施形態の概略的な斜視図
【図６Ｂ】プレート及びレールの実施形態の概略的な斜視図
【図６Ｃ】プレート及びレールの実施形態の概略的な斜視図
【図７】細胞培養装置の実施形態の概略的な断面図
【図８】細胞培養装置の実施形態の概略的な側面図
【図９Ａ】マニホルドの実施形態の面の概略図
【図９Ｂ】エキスパンダの実施形態の面の概略図
【図１０Ａ】バッチモードで動作するシステムの実施形態の概略図
【図１０Ｂ】連続モードで動作するシステムの実施形態の概略図
【図１１Ａ】ウェルの実施形態の概略的な断面図
【図１１Ｂ】ウェルの実施形態の概略的な断面図
【図１２】プレート及びレールの積層されたユニットの実施形態の概略的な断面図
【図１３】プレート及びレールの積層されたユニットの実施形態の概略的な切取り斜視図
【図１４】細胞培養装置の実施形態の概略的な側面図
【図１５Ａ】ウェルがガス透過性材料で形成されている、細胞培養装置６００の概略的な切り取り斜視図。この例示的な実施形態では、培地は、入口ポート６２５を通って装置の一端に入り、装置から（出口ポート６３５を通って）出る前に、各チャンバを通る流れを反転させて、装置全体を通って循環する。
【図１５Ｂ】図１５Ａに示される細胞培養装置を通る流れを制御するためのシステム
【図１６Ａ】ウェルがガス透過性材料から形成されている、細胞培養装置６００の概略的な切取り斜視図。この例示的な実施形態では、培地は、入口ポート６２５を通って入り、出口ポート６３５に取り付けられた出口マニホルド６３０を通って反対端を出る前に、すべてのコンパートメントに（入口マニホルド６２０を介して）分配される。
【図１６Ｂ】図１６Ａに示される細胞培養装置を通る流れを制御するためのシステム
【図１７Ａ】ウェルのアレイ１００の例示的な実施形態の概略図。図１７Ａは断面図である。
【図１７Ｂ】ウェルのアレイ１００の例示的な実施形態の概略図。図１７Ｂは、図１７Ａの線Ｂ−Ｂで切り取ったウェルのアレイの例示的な実施形態の上視図である。
【図１８Ａ】ウェルのアレイ１００の別の例示的な実施形態の概略図。図１８Ａは断面図である。
【図１８Ｂ】ウェルのアレイ１００の別の例示的な実施形態の概略図。図１８Ｂは、図１８Ａの線Ｂ−Ｂで切り取ったウェルのアレイの例示的な実施形態の上視図である。
【図１９Ａ】ウェルのアレイ１００の別の例示的な実施形態の概略図。図１９Ａは断面図である。
【図１９Ｂ】ウェルのアレイ１００の別の例示的な実施形態の概略図。図１９Ｂは、図１９Ａの線Ｂ−Ｂで切り取ったウェルのアレイの例示的な実施形態の上視図である。
【図１９Ｃ】ウェルのアレイ１００の別の例示的な実施形態の概略図。図１９Ｃは、正弦波又は放物面の形状を有するウェルのアレイの図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
これより、本開示の主題のさまざまな実施形態についてより詳細な言及がなされ、その幾つかの実施形態は、添付の図面に例証されている。図面内で用いられる同様の番号は、同様の要素、工程などを示している。しかしながら、所与の図面中の要素について言及するためのある番号の使用は、同じ番号が付された別の図におけるその要素を制限することは意図されていないことが理解されよう。加えて、要素について言及するための異なる番号の使用は、その異なる番号が付された要素が、他の番号が付された要素と同一又は同様でありえないことを示すことは意図されていない。
【００１５】
本開示は、とりわけ、各々が第１の主面及び反対側の第２の主面を有する、複数の積層されたプレートを有する細胞培養装置に関する。第１の主面は、複数のマイクロウェル又はマイクロウェルのアレイを画成する構造化された表面を備えている。実施形態では、構造化された表面は、マイクロウェルのアレイを有する基材である。各ウェルは、上部開口及び底を画成する内面を有しており、各ウェルの上部開口は、２００マイクロメートル〜５００マイクロメートルの範囲、又は１００マイクロメートル〜２０００マイクロメートルの範囲内の直径寸法を有する。装置はまた、積層されたプレート間の間隙を維持するために複数のスペーサも備えている。スペーサは、第１の主面の長さに沿って第１の主面から延びる複数の離間されたレールを含みうる。複数のフローチャネルは、隣接するレール同士の間に画成される。
【００１６】
幾つかの実施形態では、ウェルは、該ウェル内で培養された細胞がスフェロイドを形成するように構成されうる。例えば、ウェルの内面は、ウェル内の細胞が互いに会合し、球状物を形成するように、細胞に対して非接着性でありうる。スフェロイドは、ウェルの幾何学形状によって課せられた寸法許容限界まで拡大しうる。幾つかの実施形態では、ウェルは、該ウェルを細胞に対して非接着性にするために超低結合性材料でコーティングされてもよい。
【００１７】
スフェロイドなどの三次元（３Ｄ）細胞凝集体の形成は、細胞が表面に単層を形成する二次元細胞培養とは対照的に、細胞培養装置内で増殖する細胞の密度を増加させることができる。細胞密度の増加は、代謝負担の増加につながりうる。本明細書に記載のさまざまな実施形態では、代謝ガスの拡散は、細胞培養培地の流れに依拠するというよりはむしろ、プレート材料を通じて生じる。このような装置は、高密度で培養された細胞の代謝要求を満たすために、より良好に適合させることができる。
【００１８】
スフェロイドなどの三次元で培養された細胞は、単層として二次元で培養されたそれらの対応物よりも高いインビボ様の機能性を示しうる。二次元の細胞培養システムでは、細胞は、それらがその上で培養される基材に付着しうる。しかしながら、スフェロイドなど、細胞を三次元で増殖させる場合、細胞は、基材に付着するのではなく、互いに相互作用する。三次元で培養された細胞は、細胞間コミュニケーション及び細胞外基質の発現の観点から、インビボ組織によりよく似ている。よって、スフェロイドは、細胞の移動、分化、生存、及び増殖の優れたモデルを提供し、したがって、研究、診断、並びに、薬効、薬理、及び毒性の試験のためのより良好なシステムを提供する。
【００１９】
幾つかの実施形態では、装置は、該装置内で培養された細胞がスフェロイドを形成するように構成される。例えば、細胞がその中で増殖するウェルは、該ウェル内の細胞が互いに会合して球状物を形成するように、細胞に対して非接着性でありうる。スフェロイドは、ウェルの幾何学形状によって課せられた寸法許容限界まで拡大する。幾つかの実施形態では、ウェルは非接着性材料でコーティングされる。実施形態において、非接着性材料は、ウェルを細胞に対して非接着性にする超低結合性材料である。
【００２０】
非接着性材料の例としては、パーフルオロ化ポリマー、オレフィン、又は同様のポリマー、若しくはそれらの混合物が挙げられる。他の例としては、アガロース、ポリアクリルアミドなどの非イオン性ヒドロゲル、ポリエチレンオキシドなどのポリエーテル及びポリビニルアルコールなどのポリオール、又は同様の材料、若しくはそれらの混合物が挙げられる。実施形態において、これらは超低結合性材料でありうる。例えば、非接着性のウェル、ウェルの幾何学形状（例えば、寸法及び形状）、及び／又は重力の組合せは、ウェル内で培養された細胞を、スフェロイドへと自己組織化するように誘発する。一部のスフェロイドは、単層で増殖させた細胞と比較して、よりインビボ様の応答を示す、分化された細胞機能を維持する。間葉系間質細胞などの他の細胞型は、スフェロイドとして培養された場合、それらの多能性を保持する。
【００２１】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載のシステム、装置、及び方法は、１つ以上の細胞を含む。幾つかの実施形態では、細胞は冷凍保存される。幾つかの実施形態では、細胞は、三次元培養によるものである。幾つかのこのような実施形態では、システム、装置、及び方法は、１つ以上のスフェロイドを含む。幾つかの実施形態では、１つ以上の細胞は、活発に分裂する。幾つかの実施形態では、システム、装置、及び方法は、培養培地（例えば、栄養素（例えば、タンパク質、ペプチド、アミノ酸）、エネルギー（例えば、炭水化物）、必須金属及びミネラル（例えば、カルシウム、マグネシウム、鉄、リン酸塩（phosphates）、硫酸塩（sulphates））、緩衝剤（例えば、リン酸塩、酢酸塩）、ｐＨ変化の指示薬（例えば、フェノールレッド、ブロモクレゾールパープル）、選択剤（例えば、化学薬剤、抗微生物剤）等を含む）を含む。幾つかの実施形態では、１つ以上の試験化合物（例えば、薬物）が、システム、装置、及び方法に含まれる。
【００２２】
多種多様の細胞型が培養されうる。幾つかの実施形態では、スフェロイドは単一の細胞型を含む。幾つかの実施形態では、スフェロイドは２種類以上の細胞型を含む。幾つかの実施形態では、２つ以上のスフェロイドが増殖される場合、各スフェロイドは同じ型であるが、一方、他の実施形態では、２種類以上の異なる型のスフェロイドが増殖される。スフェロイドで増殖する細胞は、天然の細胞又は改変された細胞（例えば、１つ以上の非天然型の遺伝子改変を含む細胞）でありうる。幾つかの実施形態では、細胞は体細胞である。幾つかの実施形態では、スフェロイド内で増殖した細胞は、分化の所望の状態（例えば、多能性（pluripotent、multi-potent）、運命決定、不死化等）にある、幹細胞又は前駆細胞（例えば、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞）である。幾つかの実施形態では、細胞は疾患細胞又は疾患モデル細胞である。例えば、幾つかの実施形態では、スフェロイドは、１種類以上のがん細胞又は過剰増殖性の状態へと誘発されうる細胞（例えば、形質転換細胞）を含む。細胞は、任意の所望の組織又は臓器の種類に由来しうるか、又はそれらから誘導されてよく、副腎、膀胱、血管、骨、骨髄、脳、軟骨、頸部、角膜、子宮内膜、食道、胃腸、免疫系（例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、白血球、マクロファージ、及び樹状細胞）、肝臓、肺、リンパ腺、筋肉（例えば、心筋）、神経、卵巣、膵臓（例えば、膵島細胞）、下垂体、前立腺、腎臓、唾液腺、皮膚、腱、精巣、及び甲状腺が挙げられるが、それらに限られない。幾つかの実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ニワトリ、ヤギ、ウマ等）である。
【００２３】
培養された細胞は、多種多様の研究、診断、薬物のスクリーニング及び試験、治療及び産業利用における用途が見出されている。
【００２４】
幾つかの実施形態では、細胞は、タンパク質又はウイルスの産生に用いられる。多数のスフェロイドを並行して培養するシステム、装置、及び方法は、タンパク質の産生にとって特に有効である。三次元培養は、細胞増殖表面積１平方センチメートル当たりの細胞密度の増加、及びタンパク質収量の増加を可能にする。ワクチン産生のための所望のタンパク質又はウイルスは、細胞内で増殖させることができ、所望の用途のために単離又は精製されうる。幾つかの実施形態では、タンパク質は、細胞の天然型のタンパク質である。幾つかの実施形態では、タンパク質は、非天然型である。幾つかの実施形態では、タンパク質は、組換え的に発現される。好ましくは、タンパク質は、非天然型プロモータを使用して過剰発現される。タンパク質は、融合タンパク質として発現されうる。幾つかの実施形態では、精製又は検出用のタグが、対象とするタンパク質の融合パートナーとして発現されて、その精製及び／又は検出を促進する。幾つかの実施形態では、融合は、精製後の融合パートナーの分離を可能にする、開裂可能なリンカーを伴って発現される。
【００２５】
幾つかの実施形態では、タンパク質は、治療用タンパク質である。このようなタンパク質としては、欠乏している又は異常なタンパク質を置換する（例えば、インスリン）、既存経路を増強する（例えば、阻害剤又はアゴニスト）、新規の機能又は活性を提供する、分子又は有機体に干渉する、若しくは、他の化合物又はタンパク質を供給する（例えば、放射性核種、細胞傷害性薬物、エフェクタータンパク質等）、タンパク質及びペプチドが挙げられるが、それらに限られない。幾つかの実施形態では、タンパク質は、任意の種類（例えば、ヒト化、二重特異性、多特異性等）の抗体（例えば、モノクローナル抗体）のような免疫グロブリンである。治療用タンパク質の分類としては、抗体ベースの薬物、Ｆｃ融合タンパク質、抗凝固剤、抗原、血液因子、骨形成タンパク質、改変タンパク質足場、酵素、増殖因子、ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、及び血栓溶解剤が挙げられるが、それらに限られない。治療用タンパク質は、がん、免疫異常、代謝異常、遺伝的遺伝子障害（inherited genetic disorders）、感染症、及び他の疾患及び状態の予防又は治療に使用されうる。
【００２６】
幾つかの実施形態では、タンパク質は、診断用タンパク質である。診断用タンパク質としては、抗体、親和性結合パートナー（例えば、レセプタ結合リガンド）、阻害剤、アンタゴニストなどが挙げられるが、それらに限られない。幾つかの実施形態では、診断用タンパク質は、検出用成分（例えば、蛍光成分、発光成分（例えば、ルシフェラーゼ）、比色分析用成分等）であるか、又はそれらを伴って発現される。
【００２７】
幾つかの実施形態では、タンパク質は産業用タンパク質である。産業用タンパク質としては、食物成分、産業用酵素、農業用タンパク質、分析用酵素等が挙げられるが、これらに限られない。
【００２８】
幾つかの実施形態では、細胞は、創薬、特性付け、有効性試験、及び毒性試験に使用される。このような試験としては、薬理効果評価、発癌性評価、医療用造影剤特性評価、半減期評価、放射線安全評価、遺伝毒性試験、免疫毒性試験、生殖及び開発試験、薬物相互作用評価、用量評価、吸着性評価、体内動態評価（disposition assessment）、代謝評価、消失研究等が挙げられるが、それらに限られない。特定の細胞型が特定の試験に用いられうる（例えば、肝毒性には肝細胞、腎毒性には腎臓近位尿細管上皮細胞、血管毒性には血管内皮細胞、神経毒性には神経細胞及びグリア細胞、心毒性には心筋細胞、横紋筋融解には骨格筋細胞等）。処理された細胞は、膜統合性、細胞内代謝物含量、ミトコンドリア機能、リソソーム機能、アポトーシス、遺伝子変異、遺伝子発現の差異などを含むがそれらに限られない、あらゆる所望のパラメータについて評価されうる。
【００２９】
幾つかの実施形態では、細胞培養装置は、より大きいシステムの構成要素である。幾つかの実施形態では、システムは、複数（例えば、２、３、４、５、...、１０、...、２０、...、５０、...、１００、...、１０００等）のこのような細胞培養装置を備えている。幾つかの実施形態では、システムは、培養装置を最適な培養条件（例えば、温度、雰囲気、湿度等）に維持するためのインキュベータを備えている。幾つかの実施形態では、システムは、細胞を撮像又は他の方法で解析するための検出器を備えている。このような検出器としては、蛍光光度計、照度計、カメラ、顕微鏡、プレートリーダ（例えば、ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ社のＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダ；ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ社のＶｉｅｗＬｕｘプレートリーダ）、細胞分析器（例えば、ＧＥ社のＩＮセルアナライザ２０００及び２２００；ＴＨＥＲＭＯ社のＣＥＬＬＯＭＩＣＳ  ＣＥＬＬＮＳＩＧＨＴハイコンテントスクリーニングプラットフォーム）、及び共焦点結像システム（例えば、ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ社のＯｐｅｒａＰｈｅｎｉｘハイスループットコンテントスクリーニングシステム；ＧＥ社のＩＮＣＥＬＬ６０００細胞結像システム）が挙げられるが、それらに限られない。幾つかの実施形態では、システムは、培養細胞に、培養培地又は他の成分を供給、再供給、及び循環させるための灌流システム又は他の要素を備えている。幾つかの実施形態では、システムは、培養装置の取り扱い、使用、及び／又は解析を自動化するためのロボット要素（例えば、ピペット、アーム、プレートムーバ等）を備えている。
【００３０】
これより、図１を参照すると、第１の主面１１２及び反対側の第２の主面１１４を有する、プレート１１０又はその一部の実施形態の概略的な側面図が示されている。第１の主面１１２は、細胞を培養するための構造化された表面を画成する。第１の主面１１２の構造化された表面は、複数のウェル１１５を有する基材である。ウェル１１５の内部に残留するスフェロイド２００が示されている。
【００３１】
本明細書に記載のプレートの構造化された表面は、適切な寸法又は形状を有しうる、適切な数のウェルを画成してもよい。ウェルは、それらの寸法及び形状に基づいて容積を画成する。多くの実施形態では、１つ以上又はすべてのウェルは、長手方向軸を中心に対称である。幾つかの実施形態では、１つ以上又はすべてのウェルの長手方向軸は、互いに平行である。ウェルは、均一に又は不均一に離間されうる。実施形態において、ウェルは均一に離間される。１つ以上又はすべてのウェルは、同一の寸法及び形状を有していても、異なる寸法及び形状を有していてもよい。
【００３２】
次に、図２及び図３を参照すると、ウェル１１５の幾つかの実施形態の概略的な断面図が示されている。図１に関して先に述べたように、ウェル１１５は、プレート１１０の構造化された表面によって画成される。プレート１１０の第２の主面１１４又は非培養表面は、任意の適切な形状を有しうる。図２に示されるように、ウェル１１５を形成するプレート１１０は、略一定かつ比較的薄い、ウェルに沿った厚さを有する。対照的に、図３のウェル１１５を画成するプレート１１０の厚さは、ウェルの上部開口１１８の最も近くで、厚さが相対的に厚く、底１１６では厚さが相対的に薄くなるように、ウェルに沿って変動する。
【００３３】
幾つかの実施形態では、ウェル１１５は、プレート１１０を通じて、すなわちウェル壁を通じて、ガス透過性である。プレート１１０を通って第２の主面１１４に至るウェル１１５のガス透過性は、一部には、プレートの材料及びウェルに沿ったプレートの厚さに応じて決まる。他の条件が同じならば、図２のウェルは、図３のウェルよりもガス透過性であろう。しかしながら、使用する材料及び採用される厚さに応じて、図２又は図３のいずれかの形状のプレート１１０は、本開示の目的にとって十分にガス透過性でありうる。
【００３４】
実施形態において、ウェル１１５は、２０００ｃｍ３／ｍ２／日以上のプレート１１０を通過する酸素透過速度を有する。実施形態において、ウェルは、３０００ｃｍ３／ｍ２／日以上のプレートを通過するガス透過性を有する。実施形態において、ウェルは、５０００ｃｍ３／ｍ２／日以上のプレートを通過するガス透過性を有する。
【００３５】
プレート１１０は、ウェルの少なくとも一部にわたり適切なガス透過性を有する任意の材料から形成されうる。適切な材料の例としては、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、（ポリ）４−メチルペンテン（ＰＭＰ）、ポリエチレン（ＰＥ）、及びポリスチレン（ＰＳ）が挙げられる。ＰＤＭＳは、高度のガス透過性を有することができ、最大で３〜４センチメートルの厚さにおいて十分なガス透過性を達成することができる。ＰＭＰは、最大で約０．７６２ｍｍ（約０．０３インチ）の厚さにおいて十分なガス透過性を達成することができる。幾つかの実施形態では、約２５．４μｍ（約０．００１インチ）〜約６３５μｍ（約０．０２５インチ）の範囲の厚さを有するＰＭＰがウェルの形成に用いられる。ＰＥ又はＰＳは、約７６．２μｍ（０．００３インチ）以下など、最大約１２７μｍ（０．００５インチ）の厚さにおいて十分なガス透過性を達成することができる。幾つかのより薄いプレートは、十分な構造健全性を有しない可能性がある。乏しい構造健全性を補うために、開口枠、スタンドオフなどを用いて、プレート又はその構造化された表面部分を底部から支持してもよい。
【００３６】
ウェル１１５がプレート１１０を通じてガス透過可能ではない実施形態では、より厚い又は非ガス透過性材料が用いられうる。本明細書に記載のプレート又は他の細胞培養要素を形成するための適切な材料の例としては、ポリスチレン、ポリメタクリル酸メチル、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリスチレン共重合体、フッ素ポリマー、ポリエステル、ポリアミド、ポリスチレンブタジエン共重合体、完全水素化スチレンポリマー、ポリカーボネートＰＤＭＳ共重合体、並びに、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン、ポリプロピレン共重合体及び環状オレフィン共重合体などのポリオレフィンが挙げられる。
【００３７】
図２及び３をさらに参照すると、ウェル１１５は、底１１６から上部開口１１８までの高さによって画成される深さｄを有する。ウェル１１５はまた、上部開口１１８によって画成されるウェルを横切る、直径、幅等の直径寸法ｗも有する。ウェルは、任意の適切な深さｄ及び直径寸法ｗを有しうる。幾つかの実施形態では、ウェルの深さｄ、直径寸法ｗ及び形状は、ウェルを形成する材料とともに、細胞が増殖可能な容積を画成する役割をする。
【００３８】
幾つかの実施形態では、ウェル１１５の内面は、細胞に対して非接着性である。ウェルは、非接着性のウェルを形成するために、非接着性材料から形成されて差し支えなく、あるいは、非接着性材料でコーティングされてもよい。非接着性材料の例としてはパーフルオロ化ポリマー、オレフィン、又は同様のポリマー、若しくはそれらの混合物が挙げられる。他の例としては、アガロース、ポリアクリルアミドなどの非イオン性ヒドロゲル、ポリエチレンオキシドなどのポリエーテル及びポリビニルアルコールなどのポリオール、又は同様の材料、若しくはそれらの混合物が挙げられる。例えば、非接着性のウェル、ウェルの幾何学形状、及び重力の組合せにより、ウェル内で培養された細胞を、スフェロイドへと自己組織化するように誘発することができる。一部のスフェロイドは、単層において増殖された細胞と比較して、より多いインビボ様応答を示す、分化された細胞機能を維持することができる。
【００３９】
例えば、非接着性のウェル、ウェルの幾何学形状、及び重力の組合せは、ウェル内で培養される細胞の増殖が制限される、閉じ込め容積を画成しうる。
【００４０】
幾つかの実施形態では、１つ以上のウェルは、半球面などの凹曲面、丸底を有する円錐面及び同様の表面形状、又はそれらの組合せを有する。ウェル及びウェル底部は、最終的には、くぼみ、凹み、及び同様の凹形円錐台状の起伏表面、又はそれらの組合せなど、スフェロイド誘導性の丸みを帯びた面又は曲面に終結、終端、又は底付き（bottom-out）しうる。ガス透過性のスフェロイド誘導性ウェルの他の形状及び構成は、本開示と矛盾しない限り、その全体がここに参照することによって本明細書に取り込まれる、本発明の譲受人に譲渡された米国特許出願第１４／０８７，９０６号明細書に記載されている。
【００４１】
幾つかの実施形態では、ウェル底部は平坦であるか、又は先が細くなっている。ウェル底部は、任意の他の適切な形状又は寸法を有していてもよい。
【００４２】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載のウェル１１５は、以下の任意の間の範囲を含む、例えば、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０又は５００マイクロメートルなど、約２００マイクロメートル〜約５００マイクロメートルの範囲の直径寸法ｗを有する。このような直径寸法によって、スフェロイドの内部の細胞が健康な状態に維持されるように、その中で増殖するスフェロイドの寸法を制御することができる。幾つかの実施形態では、ウェル１１５は、以下の任意の間の範囲を含む、例えば、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０又は５００マイクロメートルなど、約２００マイクロメートル〜約５００マイクロメートルの範囲の深さｄを有する。当然ながら、他の適切な寸法もまた使用されうる。
【００４３】
幾つかの実施形態では、ウェルを画成する構造化された表面は、六方最密充填されたウェル構造のアレイを含む。ウェル１１５を形成する表面１１２を示す、このような構造化された表面を有する第１の主面１１２の実施形態の画像が図４に示されている。図５は、六方最密充填されたウェル構造を画成する構造化された表面を含む第１の主面１１２を有するプレートの実施形態のウェル１１５内で増殖した細胞２００を示す概略図である。幾つかの実施形態では、各ウェル１１５内の細胞２００は、単一のスフェロイドを形成する。
【００４４】
本明細書に記載される構造化された表面は、任意の適切な態様で形成されうる。例えば、プレート又はフィルムは、構造化された表面を形成するために、成形又は型押しされうる。さらなる例では、加熱された再成形ツール（reform tool）を成形されたプレートに適用してもよい。あるいは、構造化された表面は、射出成形によって形成されてもよい。
【００４５】
上述の構造化された表面を有するプレートは、細胞培養装置内に取り込まれてもよい。プレートは、細胞培養装置を形成するために、積層されうる。実施形態において、積層されたプレートはレールによって分離されるとともに、隣接するレール間の構造化された表面の上にフローチャネルが形成される。
【００４６】
次に、図６Ａ〜Ｃを参照すると、レール３００Ａ、３００Ｂ、３００Ｃ、３００Ｄ及びプレート１１０を有する単一の積層可能なユニット５００の実施形態の概略的な斜視図が示されている。レール３００Ａ、３００Ｂ、３００Ｃ、３００Ｄは、プレートの長さに沿ってプレート１１０から延びる。フローチャネル４００Ａ、４００Ｂ、４００Ｃは、隣接するレール同士の間に形成される。図６Ａに示される実施形態では、レール３００Ａ、３００Ｂ、３００Ｃ、３００Ｄは、プレート１１０の第１の主面上に配置される。図６Ｂに示される実施形態では、レール３００Ａ、３００Ｂ、３００Ｃ、３００Ｄは、プレートの第１の主面の下に延びる。図６Ｃに示される実施形態では、プレート１１０及びレール３００Ａ、３００Ｂ、３００Ｃ、３００Ｄは、一体化されたパーツ（unitary part）を含む。レール及びプレートは、任意の適切な方式で組み立てられうる。例えば、プレート及びレールは、単一のパーツとして成形されうる。実施形態において、プレート又はその一部は、レールを形成するために被覆成形される（over-molded）。実施形態において、プレート及びレールは、溶接（例えば、熱、レーザ、長波ＩＲ又は超音波溶接など）、接着、溶剤結合などに供される。プレート及びレールは、本明細書に記載される細胞培養装置の組立ての間に積層可能なユニット５００を形成しうる。
【００４７】
次に、図７を参照すると、複数の積層されたユニット５００Ａ〜Ｌを有する細胞培養装置６００の実施形態の概略的な断面が示されている。各ユニットは、プレート１１０及び複数のレール３００を備えている。フローチャネル４００は、上記積層されたユニットのプレート１１０の第１の主面１１２の上、かつ、隣接するプレート１１０の反対側の第２の主面１１４の下に、隣接するレール３００同士の間に形成される。上部プレート６１０は、最上部ユニット５００Ａの上に配置されうる。各ユニットは、複数のウェル１１５を有している。
【００４８】
次に、図８を参照すると、入口ポート６２５を画成する入口マニホルド６２０及び出口ポート６３５を画成する出口マニホルド６３０を有する、細胞培養装置６００の実施形態の概略的な側面図が示されている。装置６００は、複数の積層されたユニット５００（例えば、図６Ａ〜Ｃ及び図７に示されるプレート及びレールを有するユニット）を備えている。各ユニットの各フローチャネルは、マニホルド６２０を介して入口ポート６２５と流体連通しており、かつ、マニホルド６３０を介して出口ポート６３５と流体連通している。幾つかの実施形態では、マニホルドではなく、入口ポート６２５を有するエキスパンダが用いられうる。幾つかの実施形態では、マニホルドではなく、出口ポート６３５を有するレデューサが用いられうる。装置の上面６１０も示されている。
【００４９】
例えば、及び図９Ａ〜Ｂを参照すると、マニホルド６２０の実施形態の内面（図９Ａ）及びマニホルド６２０の実施形態の上面６２２（図９Ｂ）の概略図が示されている。図９Ａのマニホルド６２０は、その各々がそれぞれのフローチャネルと位置合わせされ、液密封止を生成するように溶接されうる、複数の開口６２１を画成する。図９Ｂは、ポート６２５を有するマニホルドの上面を示している。あるいは、組み立てられたユニットの面は、各フローチャネルへのアクセスを有するマニホルドを本質的に形成しうることから、簡易化されたエキスパンダ６２０を使用して、入口ポートを介してフローチャネルへと細胞培養流体を供給することができる。
【００５０】
入口ポート及び出口ポートは、細胞培養装置のフローチャネルに細胞培養培地を供給するためのポンプに連結可能な管に連結されうる。
【００５１】
本明細書に記載の細胞培養装置の最終的な組立ては、任意の適切な方式で行われうる。例えば、ユニットは、溶接、接合、接着又は他の方法で結合されうる。マニホルド、レデューサ又はエキスパンダは、組み立てられたユニットへと溶接、接合、接着又は他の方法で結合されうる。例として、ユニットは、その上に入口及び出口マニホルドが結合されたスリーブ内に挿入されてよく；積層され、マニホルド化されたユニットは、組み立てられ、かつ被覆成形されてよく；バッグは、熱収縮されて積層されたユニットの周りに締り嵌めを形成してもよく；ユニットは、積層されて、形成されたチャンバ又は形成されたバッグ内に装填されうる；等が挙げられる。
【００５２】
次に、図１０Ａ〜Ｂを参照すると、本明細書に記載の細胞培養装置６００の実施形態を利用するシステムの実施形態の概略図が示されている。図１０Ａに示される線図は、バッチモードのシステムを示している。培地の流れは、インプット６２５を通って培養装置６００に入る。培地は随意的な酸素供給器６６０によって酸素供給される。流動力は、細胞培養培地源と動作可能に連結した再循環ポンプ６５０によって、生成及び制御される。培地は、アウトプット６３５を通って培養装置６００の外へと流れる。流れ（例えば、流量）は、制御装置６４０（例えば、弁の制御による）によって管理される。制御装置はまた、酸素供給器へのガス流を制御し、かつ、補助栄養又はｐＨ調節剤の流れを、所望される又は要求されるように制御しうる。培養された細胞は、アウトプット６３５から細胞回収カートリッジ６７０へと培地を導くことによって採取される。各要素は、管、チャネル（例えば、マイクロチャネル）又は任意の他の所望の流体連結によって連結される。図１０Ｂの線図は、連続モードのシステムを示している。システムはさらに、流体がそこを通って細胞培養装置６００内に流入するインプットフローチャネル６８０と、流体がそこを通って細胞培養装置６００から流出可能なアウトプットフローチャネル６９０とを備えている。細胞培養装置が代謝ガスを拡散できるように構成された後述する幾つかの実施形態では、酸素供給器は省略されてもよい。
【００５３】
プレートの構造化された表面のウェルの内面が細胞に対して非接着性である実施形態では、装置６００のフローチャネルを通る細胞培養培地の流量を増加させて、スフェロイドでありうる培養された細胞を、細胞培養培地の流れとともに細胞回収カートリッジへと搬送されるように、ウェルから移動させることができる。ウェル内の細胞を増殖及び維持するために、より少ない流量を用いてもよい。ウェル内の細胞の維持のため、又は、ウェルから細胞を移動させるために、ウェルの形状及び寸法を変更して、流量を変化させてもよいことが理解されよう。
【００５４】
例として、及び、図１１Ａ〜１１Ｂを参照すると、代替的なウェル幾何学形状の概略的な断面図が示されている。図１１Ｂのウェル１１５は、図１１Ａのウェル１１５より深く、よって、スフェロイド２００は、図１１Ａのウェル１１５よりも図１１Ｂのウェル１１５において、より深くなる。したがって、図１１Ｂのウェル１１５は、スフェロイド２００を移動させることなく、細胞培養装置を通る流量を増やすことができる。同様に、図１１Ａのウェル１１５は、より少ない流量でのスフェロイド２００の移動を可能にし、採取を容易にする。上述のように、本明細書に記載のプレートの構造化された表面のウェルは、任意の適切な幾何学形状を有しうる。ウェルの形状及び寸法並びに特性は、ユーザのニーズに応じて、細胞の特性（例えば、スフェロイド形成）を調整する目的、細胞の移動を促進する目的、培養された細胞への十分な栄養及びガスの分配を確実にする目的などのために調整されうる。
【００５５】
幾つかの実施形態では、ガスフローチャネルは、プレートと同一空間に広がる（coextend）レール内に形成されうる。このような実施形態では、レールは、該レールに隣接したフローチャネルからの代謝ガスの交換を可能にするのに十分な厚さを有する、ガス透過性材料から形成されうる。適切なガス透過性材料及び厚さの例は、上述した通りである。幾つかの実施形態では、レールは、比較的ガス透過性のＰＤＭＳから形成される。例として、レールは、そこを通って延びる空気チャネルを有する、押出成形されたＰＤＭＳから形成されうる。ＰＤＭＳは、熱硬化性ＰＤＭＳ又は、熱硬化性のＰＤＭＳよりも高いガス交換速度を有しうるＷａｃｋｅｒ社製のＧｅｎｉｏｍｅｒ１４５などの熱可塑性ＰＤＭＳのいずれかでありうる。しかしながら、ＰＤＭＳは、小分子への結合がよく知られており、これは、細胞培養にとって望ましくない可能性がある。これは、多層押出し、被覆成形、コーティング、又は、非細胞接着層としても機能しうる吸収に対する障壁を創出する他の処理によって回避できよう。レール内の空気チャネルは、レールの全長さ又は全高さにわたる。複数の空気チャネルがレール内に形成されてもよい。
【００５６】
例えば及び図１２を参照すると、各々がプレート１１０と、フローチャネル４００（例えば、上述のもの）がレールの間に形成されたレール３００とを有する、積層されたユニット５００Ａ、５００Ｂ、５００Ｃ、５００Ｄの概略的な断面図が示されている。スフェロイド２００は、プレート１１０の構造化された表面のウェル１１５とともに示されている。図示された実施形態では、レール３００は、レールの長さの全長にわたる空気チャネル３１０を画成する。チャネル３１０と隣接する培地フローチャネル４００との間のレール３００の厚さは、レールの材料を通した代謝ガスの交換を可能にするように十分に小さい。
【００５７】
次に図１３を参照すると、各々がプレート１１０と、フローチャネル４００（例えば、上述のもの）がレールの間に形成されたレール（例えば、レール３００Ａ〜Ｄ）とを有する、積層されたユニット５００Ａ、５００Ｂ、５００Ｃ、５００Ｄの概略的な切取り斜視図が示されている。この実施形態では、各レール（例えば、レール３００Ａ〜Ｄ）は、レールの高さを延長する複数の空気チャネル３１０を形成する。それぞれのレール（例えば、レール３００Ａ〜Ｄ）の空気チャネル３１０は、ユニット５００Ａ、５００Ｂ、５００Ｃ、５００Ｄが積層された場合に、空気チャネル３１０が位置合わせするように方向付けられる。ユニット５００Ａ、５００Ｂ、５００Ｃ、５００Ｄが積層された場合、レールは、最底部のユニット（例えば、ユニット５００Ｄ）から最上部のユニット（例えば、ユニット５００Ａ）までの壁３５０を形成する。レール（例えば、レール３００Ａ〜Ｄ）によって形成された、位置合わせされた空気チャネル３１０の列（column）は、組み立てられた装置の高さ全体にわたって延びる。
【００５８】
空気チャネルの方向性（例えば、図１２に示されるようにレールの長さに沿って、又は、図１３に示されるようにレール又は壁の高さに沿って）にかかわらず、空気チャネルは、マニホルド、エキスパンダ、又はレデューサに連結されて、単一の供給及び換気ポートを形成することができ、そこから装置を出る。幾つかの実施形態では、積層されたユニットを通じたガス流の制御を可能にするために、別々のマニホルド、エキスパンダ又はレデューサが、装置の空気チャネルの両端に連結される。
【００５９】
例えば及び図１４を参照すると、第１の換気マニホルド３７０及び第２の換気マニホルド３８０を備えた細胞培養装置６００の実施形態の概略的な側面図が示されている。図１４の装置に示された要素の多くは、図８の装置に示されており、また、図８の装置に関して先に説明されている。図１４に示された装置６００は、レールが、装置の高さにわたる空気チャネルの列を形成する壁を形成している、図１３に示されたユニットの組立体とともに想定されうる。換気マニホルド３７０及び３８０は、それぞれ、ポート３７５及び３８５を形成する。ポートは、大気へと通気されてよく、あるいは、制御されたガス環境を装置に供給するために、管に連結されてもよい。
【００６０】
次に、ウェルがガス透過性材料から形成された、細胞培養装置６００の概略的な切取り斜視図を示す図１５Ａを参照する。この例示的な実施形態では、培地は、入口ポート６２５を通って装置の一端に入り、装置全体にわたって循環し、マイクロウェル１１５内に残留するスフェロイド２００に供給され、装置を出る前に（出口ポート６３５を通じて）、各チャンバを通る流れを反転させる。チャンバ／容器はまた、適切な構造を維持するために、支持突起又は柱（図示せず）を有しうる。空気チャネル３１０は、ガス透過性ウェルの底部に沿って延び、ウェル内のスフェロイドに空気交換を供給可能にする。レール３００は、さまざまな空気チャネル３１０の形成を可能にする。図１５Ｂは、図１５Ａの細胞培養装置を示しており、詳細には、空気チャネル３１０を介して装置内にいかにして空気が浸透しうるか（装置のフロントの白いライン）を示している。これに関して、図１５Ｂに示されるように、空気チャネル３１０（導管空間とも呼ばれる）はガス透過性のウェル材料を通じてガス交換をもたらすことから、酸素供給器は必要とされない。図１５Ｂはさらに、培地を管理するためのシステム要素も示している。コントローラポンプ１６００は、新鮮培地源１６１０から細胞培養装置６００へと新鮮培地を送り出す。廃棄物含有（waste containing）１６２０は、使用済みの培地を回収する。弁１６３０も、培地が装置から出る際に、培地を回収し、培地中に存在しうる化合物を採取するために使用されうる。
【００６１】
次に、ウェルがガス透過性材料から形成される、細胞培養装置６００の概略的な切り取り斜視図を示す図１６Ａを参照する。この例示的な実施形態では、培地は、入口ポート６２５を通って入り、出口ポート６３５に取り付けられた出口マニホルド６３０を通って反対側の端部を出る前に、すべてのコンパートメントに（入口マニホルド６２０を介して）分配される。チャンバ／容器もまた、適切な構造を維持するために、支持ボス又は柱（図示せず）を有しうる。空気チャネル３１０は、ガス透過性ウェルの底部に沿って延び、ウェル内のスフェロイドに空気交換を供給可能にする。レール３００は、さまざまな空気チャネル３１０の形成を可能にする。図１６Ｂは、図１６Ａの細胞培養装置を示しており、詳細には、空気チャネル３１０を介して装置内にいかにして空気が浸透しうるか（装置のフロントの白いライン）を示している。これに関して、図１６Ｂに示されるように、空気チャネル３１０（導管空間とも呼ばれる）はガス透過性のウェル材料を通じてガス交換をもたらすことから、酸素供給器は必要とされない。図１６Ｂはさらに、培地を管理するためのシステム要素も示している。コントローラポンプ１６００は、新鮮培地源１６１０から細胞培養装置６００へと新鮮培地を送り出す。廃棄物含有（waste containing）１６２０は、使用済みの培地を回収する。
【００６２】
追加の実施形態及び幾何学形状が、図１８、１９、及び２０に示されている。図１７は、個々のウェル１１５を示す、ウェルのアレイ１００の例示的な実施形態の概略図である。図１７に示される実施形態では、ウェル１１５は口部１０１を有している。口部１０１は、ウェル１１５の上部開口部１１１に隣接したウェルの上部の領域であり、細胞がスフェロイドを形成して沈降するウェルの底部を形成するためにウェルが縮小される前に、より大きい開放領域を提供する。実施形態において、口部１０１は、円錐状（口部の底部より口部の上部の方が幅広い）及び環形状（ウェルが円形である図１７Ａ及び図１８Ａに示される）でありうる。追加の実施形態では、例えば、図１９Ａに示されるように、ウェルが、円形の開口部を有するが、放物面の形状である場合、口部１０１は放物面でありうる。
【００６３】
幾つかの実施形態では、ウェルの幾何学形状は、ウェルに液体を導入する際の空気の抜けを促進するために、ウェル壁内に毛管構造（例えば、口部、リッジの割れ目、丸みを帯びた又は放物面の上部開口部等を含む）を含む。図１７Ｂは、リッジ１７０を示す、図１７Ａの線Ｂ−Ｂで切り取った上視図である。図１７Ｂに示されるように、リッジは、ウェルの口部１０１又は側壁１１３からの隆起（bump）又は突起である。実施形態において、リッジは、上部開口部１１１からウェル底部１１６までのマイクロウェルの長さを延長する。追加の実施形態では、リッジは、口部の上部１１１から口部の底部１１２まで延びる。リッジ１７０のいずれかの側に形成される鋭角は、空気溜まりのない、マイクロウェルへの流体の流入をもたらすように、水性流体に毛管力を生じさせる。
【００６４】
図１８Ｂは、図１８Ａの断面を示す、ウェルのアレイ１００の上視図である。図１８Ｂは、割れ目２７０を示している。図１８Ｂに示されるように、割れ目は、ウェル１１５の側壁１１３における刻み目（indentation）である。割れ目２７０のいずれかの側に形成される鋭角は、水性流体がマイクロウェル内へ流入可能にする毛管力を生じさせる。
【００６５】
図１９Ａ及びＢは、ウェルのアレイ１００の別の例示的な実施形態の概略図である。図１９Ａは断面図である。図１９Ｂは、図１９Ａの線Ｂ−Ｂで切り取ったウェルのアレイの例示的な実施形態の上視図である。図１９Ａ及びＢは、各ウェル１１５が２つ以上のリッジ１７０又は割れ目２７０を有しうること、及び、リッジ１７０又は割れ目２７０がウェル１１５内にアレイで配置されうることを示している。図１９Ａ及びＢに示されるように、実施形態において、リッジ及び／又は割れ目の径方向分布が想定されている。毛管構造の数は、１マイクロウェルあたり１つに限られない。幾つかの実施形態では、より多数の毛管は、マイクロウェル内への流体の流入速度を増加させる。
【００６６】
図１９Ａ〜Ｃは、単一のウェル内に多くの（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１６、２０、２４、２８、３２、又はそれらの中のいずれかの範囲）垂直に方向づけられた毛管構造を包含することを実証している。特徴は、一定間隔で離間されてよく（図１９に示すように）、不規則な間隔で離間されてもよく、集団化（grouped）／隆起している等であってもよい。幾つかの実施形態では、毛管構造は、ウェルの上部開口部からウェル底部まで延びる。単一のウェル内に多くの毛管構造が存在する場合、多くの特徴は、異なる種類のもの（例えば、リッジ線及び／又は割れ目）であってよく、異なる形状（例えば、方形、円形等）を含みうる。
【００６７】
図１９Ｃは、ウェルのアレイ１００が、正弦波又は放物面の形状を有しうることを示している。この形状は、丸みを帯びた上部エッジ又はウェルエッジを作り出し、このことにより、実施形態では、ウェルの上部における鋭角又は９０度の角度での空気の取り込みを低減する。この正弦波又は放物面のウェル形状、又は丸みを帯びた上部ウェルエッジもまた、毛管構造である。図１９Ｃに示されるように、ウェル１１５は、上部直径Ｄ上部、ウェルの底部１１６からウェルの上部までの高さＨ、及びウェルの上部とウェルの底部１１６との間の高さの中間点におけるウェルの直径Ｄ中間を有する上部開口部を有する。
【００６８】
ウェルの相対寸法及び絶対寸法は両方とも、所望の培養条件について選択されうる。スフェロイドの増殖については、直径Ｄは、好ましくは、ウェル内で培養される３Ｄ細胞凝集体の所望の直径の１〜３倍である。高さＨは、好ましくは、Ｄの０．７〜１．３倍である。直径Ｄ上部は、好ましくは、Ｄの１．５〜２．５倍である。Ｄは、好ましくは、１００マイクロメートル（μｍ）〜約２０００マイクロメートル（例えば、下記の値のうちのいずれか２つの値の間の範囲（例えば、２００〜１０００μｍ、２００〜７５０μｍ、３００〜７５０μｍ、４００〜６００μｍ等）を含む、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、又は２０００マイクロメートルなど）である。しかしながら、代替的な相対寸法又は絶対寸法が使用されてもよい。例えば、Ｄは、細胞凝集体の所望の直径の１〜１０倍（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９）若しくは、それらの間の任意の値又は範囲（例えば、１、１〜１．５、１〜２、２、１〜２．５、１〜３、２〜３、１〜５、３〜５、２〜７等）でありうる。Ｄは、１００μｍ〜１０，０００μｍ、若しくは、それらの間の任意の値（例えば、１００、２００、５００、１０００、２０００、５０００）、又は、それらの間の範囲（例えば、１００〜２０００、２００〜１０００、３００〜７００、４００〜６００、５００等）でありうる。Ｈは、Ｄの０．５〜１０倍（例えば、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、４、５、６、７、８、９、１０、若しくはそれらの間の任意の値又は範囲）でありうる。Ｄ上部は、Ｄの１．１〜５倍（例えば、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、若しくは、それらの間の任意の値又は範囲）でありうる。
【００６９】
ある特定の実施形態では、本開示のガス透過性細胞培養装置（例えば、スフェロイド灌流バイオリアクタ）は、各培養コンパートメントの各表面上のすべてのスフェロイドの連続した培地の補充及びガス交換を可能にする。概して、培地の補充及びガス交換はまた、各培養コンパートメント内のすべてのスフェロイドについて同等又はほぼ同等である。ウェル／コンパートメント内にスフェロイドを形成する幾何学形状を採用することにより、これらのバイオリアクタに加えられた細胞が全て略同一の寸法のスフェロイドを形成可能になる。培養コンパートメントのガス透過性の理由から、典型的にはバイオリアクタにとって必要な酸素供給器は、このシステムが最適に機能するためには必要ではない。
【００７０】
ある特定の実施形態では、ガス透過性の細胞培養装置は、小さい設置面積での大量の細胞の増殖を可能にする。例えば、直径４００マイクロメートルのスフェロイドは、３Ｄで平均３０，０００個の細胞を含みうる。直径４００マイクロメートルの２Ｄ表面では、〜３０５個の細胞が付着可能である。よって、同一のユニット面積で、２Ｄにおいて増殖可能な細胞のおよそ１００倍も多い細胞が、３Ｄにおいて培養可能である。このコンパクトな設置面積での多くの細胞の増殖は、概して、より多くの栄養素を必要とし、かつ、除去が必要な廃棄物をより多く生成する。本明細書に開示される灌流システムは、絶え間のない介入を必要とせずに、このような解決策（solution）を提供する。さらには、３Ｄで増殖する細胞は、インビボの細胞により近い機能を示すことから、それらの品質は、総じて、より高くなる。
【００７１】
ある特定の実施形態では、バイオリアクタチャンバ／ウェルは、ガス透過性材料から成形又は熱成形されうる、あるいは、ガス透過性材料と非ガス透過性材料との組合せで構成されうる。構造支持体は、例えば、ボス及びカラムを含む、多くの形態でもたらされうる。チャンバ／ウェルは、すべてのチャンバに等しく分配するマニホルドを通じて、並行して新鮮培地を受け入れてもよく、あるいは、チャンバは、１つのチャンバから次のチャンバへと流れを反転させながら、順次、供給されてもよい。
【００７２】
概して、容器内の細胞のガス交換要求は、灌流速度を決定づけ、また、構成物のガス透過性材料を通じて呼吸要求の充足を可能にすることにより、灌流速度の大幅な低下を可能にする。このことにより、スフェロイド上の剪断流の低減が可能になり、基材のスフェロイド形成／保持特徴内でのスフェロイドの保持がより容易になる。
【００７３】
ウェルが細胞に対して非接着性の実施形態では、本明細書に記載の装置内で培養された細胞は、装置を逆さまにして、重力により細胞をウェルから移動可能にすることによって、採取されうる。あるいは、培地フローチャネルを通る流体の流量を増加させて、上述のウェルから細胞を移動させてもよい。
【００７４】
本明細書で用いられるすべての科学および技術用語は、他に明記されない限り、当技術分野で通常用いられる意味を有する。本明細書に提供される定義は、本明細書において頻繁に用いられるある特定の用語の理解を容易にするためのものであって、本開示の範囲を限定することは意図されていない。
【００７５】
本明細書で用いられる場合には、名詞は、文脈がそうでないことを明確に指示しない限り、複数の指示対象を指す。よって、例えば、１つの（ａ）「構造化された表面」についての言及は、文脈がそうでないことを明確に示唆しない限り、このような「構造化された表面」を２つ以上有する例を含む。
【００７６】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において用いられる場合、用語「又は」は、別段の明確な指示がない限り、概して、「及び／又は」を含む意味で用いられる。用語「及び／又は」は、列挙された要素の１つ又はすべて、若しくは、列挙された要素の任意の２つ以上の組合せを意味する。
【００７７】
本明細書で用いられる場合には、「有する（have、has、having)」、「含む(include、includes、including、comprise、comprises、comprising）」などは、非限定的な（open ended）包含的意味で用いられ、概して、「〜を含むが、それらに限定されない（include, but not limited to; includes, but not limited to; including, but not limited to）」ことを意味する。
【００７８】
「随意的な」又は「必要に応じて」は、その後に説明される事象、状況、又は構成要素が生じても生じなくてもよいこと、及び、説明は、その事象、状況、又は構成要素が生じる場合の例と、生じない場合の例の両方を含むことを意味する。
【００７９】
語句「好ましい」及び「好ましくは」は、ある特定の状況下において、ある特定の利益を提供しうる、本開示の実施形態を指す。しかしながら、同一又は他の状況下において、他の実施形態が好ましい場合もありうる。さらには、１つ以上の好ましい実施形態についての記述は、他の実施形態が有用ではないという意味を含蓄せず、本発明に係る技術の範囲から他の実施形態を除外することは意図されていない。
【００８０】
範囲は、本明細書では、「約」１つの特定の数値から、及び／又は、「約」別の特定の数値までとして表されうる。このような範囲が示される場合、例には、その１つの特定の数値から、及び／又は、他の特定の数値までが含まれる。同様に、数値が、先行詞「約」を用いて近似値として表される場合、その特定の数値は別の態様を形成すると解されよう。範囲の各々の端点は、他の端点に関連して、及び、他の端点とは無関係に、の両方の意味を表すこともさらに理解されるであろう。
【００８１】
同様に本明細書において、端点による数値範囲の記述は、その範囲内に含まれるすべての数値を含む（例えば、１〜５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５等を含む）。数値の範囲が、ある特定の数値「より大きい／超」、ある特定の数値「より小さい／未満」等である場合、その数値はその範囲内に含まれる。
【００８２】
「上部」、「底部」、「左」、「右」、「上方」、「下方」、「上」、「下」、及び他の方向及び指向など、本明細書において言及される方向は、図面に関して明確性の目的で本明細書に記載され、実際の装置又はシステム、若しくは、その装置又はシステムの使用を限定するものではない。本明細書に記載される多くの装置、物品、又はシステムは、多くの方向及び指向で使用されうる。細胞培養装置に関して本明細書で用いられる方向記述子は、多くの場合、装置内で細胞を培養する目的でその装置が方向付けられる場合の方向のことを指す。
【００８３】
他に明記されない限り、本明細書に記載されるいかなる方法も、その工程が特定の順番で実施されることを要すると解釈されることを、決して意図していない。したがって、方法クレームが、その工程が従うべき順番について実際に記述していない場合、又は工程がある特定の順番に限定されるべきであることが、特許請求の範囲又は説明において他に明示されていない場合、任意の特定の順番が推測されることは、決して意図されていない。任意の１つの請求項における任意の記述された単一又は複数の特徴又は態様は、任意の他の請求項における任意の他の記述された特徴又は態様と組み合わせる、若しくは、それらの特徴又は態様で置き換えることができる。
【００８４】
本明細書における記述とは、特定の方法において機能するように「構成」又は「適合」された構成要素を指すことにも留意されたい。この点において、このような記述が、意図される用途の記述とは対照的に、構造的な記述である場合、このような構成要素は、特定の方式で特定の特性又は機能を具体化するように「構成」又は「適合」される。より詳細には、本明細書において、ある構成要素が「構成された」又は「適合された」方式についての言及は、その構成要素の存在する物理的条件を意味し、このように、その構成要素の構造的な特徴の明確な記述と受け止められるべきである。
【００８５】
特定の実施形態のさまざまな特徴、要素、又は工程は、移行句「〜を含む」を用いて開示されうるが、移行句「〜からなる」又は「〜から本質的になる」を使用して記載されうるものを含む代替的な実施形態が含蓄されるものと解されたい。よって、例えば、構造化された表面を画成するプレート、１つ以上のレール、上部、及び１つ以上のマニホルドを備えた細胞培養装置に対する含蓄された代替的な実施形態には、細胞培養装置が、構造化された表面を画成するプレート、１つ以上のレール、上部、及び１つ以上のマニホルドからなる実施形態、並びに、細胞培養装置が、構造化された表面を画成するプレート、１つ以上のレール、上部、及び１つ以上のマニホルドから本質的になる実施形態が含まれる。
【００８６】
本発明に係る技術に対し、本開示の精神および範囲から逸脱することなく、さまざまな修正及び変形がなされうることは、当業者にとって明らかであろう。本発明に係る技術の精神および実質を取り込む本開示の実施形態の修正、組合せ、部分的組合せ、及びバリエーションは、当業者が想起するであろうことから、本発明に係る技術は、添付の特許請求の範囲及びそれらの等価物の範囲内にあるすべてを含むと解釈されたい。
【００８７】
以下、本発明の好ましい実施形態を項分け記載する。
【００８８】
実施形態１
第１の主面及び反対側の第２の主面を有する１つ以上のプレートであって、前記第１の主面が複数のマイクロウェルを備えている、プレート；及び、
前記第１の主面から延びる複数のスペーサであって、複数の細胞培養培地フローチャネルが隣接するプレート同士の間に画成されている、スペーサ
を備えた、細胞培養装置。
【００８９】
実施形態２
前記スペーサが、前記プレートの長さに沿って前記第１の主面から延び、複数の細胞培養培地フローチャネルが、隣接するスペーサ同士の間に画成されることを特徴とする、実施形態１に記載の細胞培養装置。
【００９０】
実施形態３
各ウェルが、上部開口及び底を画成する内面を有し、各ウェルの前記上部開口が、１００マイクロメートル〜２０００マイクロメートルの範囲の直径寸法を有することを特徴とする、実施形態１又は２に記載の細胞培養装置。
【００９１】
実施形態４
前記細胞培養装置が、互いに積層された複数の前記プレートを備えていることを特徴とする、実施形態１〜３のいずれかに記載の細胞培養装置。
【００９２】
実施形態５
入口及び出口をさらに備えており、前記複数の培地フローチャネルの各々が、前記入口及び前記出口と流体連通していることを特徴とする、実施形態１〜４のいずれかに記載の細胞培養装置。
【００９３】
実施形態６
前記入口を画成し、かつ、複数の入口フローチャネル開口を画成する、入口マニホルドをさらに備えており、前記複数の入口フローチャネル開口の各々が、それぞれの培地フローチャネルと流体連通していることを特徴とする、実施形態５に記載の細胞培養装置。
【００９４】
実施形態７
前記出口を画成し、かつ、複数の出口フローチャネル開口を画成する、出口マニホルドをさらに備えており、出口フローチャネル開口の各々が、それぞれの培地フローチャネルと流体連通していることを特徴とする、実施形態５に記載の細胞培養装置。
【００９５】
実施形態８
隣接する積層されたプレートのうちの少なくとも１つの対が、前記積層されたプレートのうちの１つのプレートの前記第１の主面によって画成された底面と、前記隣接する積層されたプレートの前記第２の主面によって画成された上面とを有する細胞培養チャンバを画成することを特徴とする、実施形態１〜７のいずれかに記載の細胞培養装置。
【００９６】
実施形態９
前記複数の積層されたプレートの最上部の細胞培養プレート上に配置された上部プレートをさらに備えることを特徴とする、実施形態１〜８のいずれかに記載の細胞培養装置。
【００９７】
実施形態１０
少なくとも１つのスペーサが、前記スペーサの長さを延長する空気チャネルを備えており、該空気チャネルが、前記細胞培養装置の外部とガス連通し、かつ、前記スペーサによって画成された前記複数の培地フローチャネルの少なくとも１つとガス連通していることを特徴とする、実施形態１〜９のいずれかに記載の細胞培養装置。
【００９８】
実施形態１１
前記プレートが、隣接するプレートのスペーサを位置合わせするように積層されており、該位置合わせされたスペーサが、最底部のプレートから最上部のプレートまで延びる壁を画成することを特徴とする、実施形態１〜１０のいずれかに記載の細胞培養装置。
【００９９】
実施形態１２
少なくとも１つの壁が、前記最底部のプレートから前記最上部のプレートまで延びる空気チャネルを画成しており、該空気チャネルが、前記細胞培養装置の外部とガス連通し、かつ、前記壁の前記スペーサによって画成されたそれぞれの培地フローチャネルとガス連通していることを特徴とする、実施形態１１に記載の細胞培養装置。
【０１００】
実施形態１３
前記複数のウェルが、六方最密充填されたウェルのアレイを含むことを特徴とする、実施形態１〜１２のいずれかに記載の細胞培養装置。
【０１０１】
実施形態１４
前記ウェルが、前記上部開口から前記底まで画成された深さを有しており、該深さが、２００マイクロメートル〜２０００マイクロメートルの範囲内にあることを特徴とする、実施形態１〜１３のいずれかに記載の細胞培養装置。
【０１０２】
実施形態１５
前記ウェルの各々が、細胞に対して非接着性であることを特徴とする、実施形態１〜１４のいずれかに記載の細胞培養装置。
【０１０３】
実施形態１６
前記プレートが、前記ウェルを介してガス透過可能であることを特徴とする、実施形態１〜１５のいずれかに記載の細胞培養装置。
【０１０４】
実施形態１７
実施形態１〜１６のいずれかに記載の細胞培養装置；及び
前記入口に連結した酸素供給器
を備えた、細胞培養システム。
【０１０５】
実施形態１８
前記入口に連結したポンプをさらに備えていることを特徴とする、実施形態１７に記載の細胞培養システム。
【０１０６】
実施形態１９
実施形態１に記載の細胞培養装置の前記ウェル内に細胞を導入する工程；及び
前記ウェル内で前記細胞を培養するために、細胞培養培地を第１の速度で前記細胞培養装置の前記培地フローチャネルを通じて灌流させる工程
を含む、方法。
【０１０７】
実施形態２０
前記ウェルから前記細胞を取り出すために、前記細胞培養培地を前記第１の速度より速い第２の速度で前記培地フローチャネルを通じて灌流させる工程をさらに含む、実施形態１９に記載の方法。
【０１０８】
実施形態２１
ａ）実施形態１〜１７のいずれかに記載の細胞培養装置の前記ウェル内でタンパク質を発現する細胞を培養する工程；及び
ｂ）前記細胞から前記タンパク質を単離する工程
を含む、タンパク質を産生する方法。
【符号の説明】
【０１０９】
１００  ウェルのアレイ
１０１  口部
１１０  プレート
１１１  上部開口部
１１２  第１の主面／口部の底部
１１３  側壁
１１４  第２の主面
１１５  ウェル
１１６  ウェルの底部
１１８  ウェルの上部開口
１７０  リッジ
２００  スフェロイド
２７０  割れ目
３００，３００Ａ〜Ｄ  レール
３１０  空気チャネル
３５０  壁
３７０  換気マニホルド
３７５  ポート
３８０  換気マニホルド
３８５  ポート
４００，４００Ａ〜Ｃ  フローチャネル
５００  ユニット
５００Ａ〜Ｌ  ユニット
６００  細胞培養装置
６１０  上部プレート／上面
６２０  入口マニホルド
６２１  複数の開口
６２２  上面
６２５  ポート
６３０  出口マニホルド
６３５  出口ポート
６４０  制御装置
６５０  再循環ポンプ
６６０  酸素供給器
６７０  細胞回収カートリッジ
６８０  インプットフローチャネル
６９０  アウトプットフローチャネル
１６００  コントローラポンプ
１６１０  新鮮培地源
１６３０  弁
【図１】
2017532970.tif 000003
【図２】
2017532970.tif 000004
【図３】
2017532970.tif 000005
【図４】
2017532970.tif 000006
【図５】
2017532970.tif 000007
【図６Ａ】
2017532970.tif 000008
【図６Ｂ】
2017532970.tif 000009
【図６Ｃ】
2017532970.tif 000010
【図７】
2017532970.tif 000011
【図８】
2017532970.tif 000012
【図９Ａ】
2017532970.tif 000013
【図９Ｂ】
2017532970.tif 000014
【図１０Ａ】
2017532970.tif 000015
【図１０Ｂ】
2017532970.tif 000016
【図１１Ａ】
2017532970.tif 000017
【図１１Ｂ】
2017532970.tif 000018
【図１２】
2017532970.tif 000019
【図１３】
2017532970.tif 000020
【図１４】
2017532970.tif 000021
【図１５Ａ】
2017532970.tif 000022
【図１５Ｂ】
2017532970.tif 000023
【図１６Ａ】
2017532970.tif 000024
【図１６Ｂ】
2017532970.tif 000025
【図１７Ａ】
2017532970.tif 000026
【図１７Ｂ】
2017532970.tif 000027
【図１８Ａ】
2017532970.tif 000028
【図１８Ｂ】
2017532970.tif 000029
【図１９Ａ】
2017532970.tif 000030
【図１９Ｂ】
2017532970.tif 000031
【図１９Ｃ】
2017532970.tif 000032
【国際調査報告】
2017532970.tif 000033
2017532970.tif 000034
2017532970.tif 000035