(57)【要約】  本発明は、コレステロール低下剤、抗微生物剤、および抗酸化剤として、並びに、被験者の生まれつきの防御機能を強化するために使用される、微生物株、ラクトバチルス・プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９に関するものである。Ｌ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａは、血中のＬＤＬ−コレステロールレベルを低下させるために、コレステロール代謝障害および継続的な心臓血管疾患の予防するために使用される。Ｌ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａは、生まれつきの防御機能および細胞の免疫性を強化し、並びに、酸化低密度リポタンパク質（ｏｘ−ＬＤＬ）のレベルを低下させることによるヒトの体の抗酸化活性を抗酸化剤として、同時に強化する。この株は、クロストリジウム・ディフィシレ胞子の発芽を予防すること、およびクロストリジウム・ディフィシレ栄養細胞の増殖を抑制することにより、クロストリジウム・ディフィシレ関連下痢症（ＣＤＡＤ）のリスクを減少させるための抗微生物剤としても使用される。Ｌ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａを含む組成物は、血中のコレステロール、およびｏｘ−ＬＤＬレベルを減少させ、生まれつきの防御機能および、ＣＤＡＤのリスク低減を強化する。この組成物は、キシリトールをさらに含むことができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血中のＬＤＬ−コレステロールレベルを低下させることによるコレステロール代謝障害および継続的な心臓血管疾患の予防において使用、並びに、同時に、酸化低密度リポタンパク質（ｏｘ−ＬＤＬ）、および酸化ストレス度（ＯＳＩ）のレベルを低下させることによるヒトの体の抗酸化活性の強化において使用する、プロバイオティク微生物、ラクトバチルス・プランタルムＩｎｄｕｃｉａ株  ＤＳＭ２１３７９を含む組成物。
【請求項２】
クロストリジウム・ディフィシレ胞子の発芽を予防すること、およびクロストリジウム・ディフィシレ栄養細胞の増殖を抑制することによって、クロストリジウム・ディフィシレ関連下痢症（ＣＤＡＤ）のリスクを減少させることに使用する、プロバイオティク微生物、ラクトバチルス・プランタルムＩｎｄｕｃｉａ株  ＤＳＭ２１３７９を含む組成物。
【請求項３】
さらにキシリトールを含む請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
医薬組成物、食品組成物、および動物用組成物から成る群から選択される、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項５】
請求項１または２に記載の組成物を含む食品。
【請求項６】
食品が乳製品である、請求項５に記載の食品。
【請求項７】
食品が発酵乳製品である、請求項６に記載の食品。
【請求項８】
食品がチーズである、請求項７に記載の食品。
【請求項９】
食品がヨーグルトである、請求項７に記載の食品。
【請求項１０】
請求項１または２または３に記載の組成物を含む補助食品。  
【請求項１１】
請求項１または２または３に記載の組成物を含む医薬品または動物用品
【請求項１２】
血中のＬＤＬ−コレステロールレベルを低下させることによるコレステロール代謝障害および継続的な心臓血管疾患の予防におけるコレステロール低下剤として使用する、Ｌ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９。
【請求項１３】
酸化低密度リポタンパク質（ｏｘ−ＬＤＬ）のレベルを低下させることによるヒトの体の抗酸化活性の強化において抗酸化剤として使用する、Ｌ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９。
【請求項１４】
内因性および／または外因性由来のクロストリジウム・ディフィシレ関連下痢症（ＣＤＡＤ）のリスクを減少させるために、クロストリジウム・ディフィシレ胞子の発芽を予防し、およびクロストリジウム・ディフィシレ栄養細胞の増殖を抑制するために、抗微生物剤として使用する、ラクトバチルス・プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９。  
【請求項１５】
キシリトールと一緒に抗微生物剤として使用する、請求項１４に記載のラクトバチルス・プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物工学の分野において様々な用途を有するラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）Ｉｎｄｕｃｉａ（ＤＳＭ２１３７９）株に関する微生物学および栄養学の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
（ＬＤＬ−コレステロール）
心臓血管疾患（ＣＶＤ）を引き起こす要因の１つは、異常に高いコレステロールレベルである。近年、高コレステロールの有害物質としての見解が、その粒子、特に低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−ｃ）およびアポリポタンパク質Ｂ（アポＢ）の異常性に戻りつつある。ＬＤＬ−ｃは、総コレステロールの６０〜７０％を占める。ＬＤＬ−ｃ粒子は、コレステロール、トリグリセリド、脂溶性ビタミンおよび抗酸化剤を運ぶ。ＬＤＬ−コレステロールは、アテローム性動脈硬化症の予防および心臓血管の健康状態の維持のための重要なモジュレーターである。酸化低密度リポタンパク質（Ｏｘ−ＬＤＬ）は、ＬＤＬ粒子に特異的な酸化ストレスのマーカーである。Ｏｘ−ＬＤＬは、冠動脈心疾患に関する生化学的なリスクマーカーの１つとみなすことができる。したがって、ＬＤＬ−ｃは、冠動脈心疾患の発生と進行を独立して引き起こすＬＤＬ−ｃの能力を実証する多数の臨床試験の結果に従って確立された心臓血管系のリスクマーカーとして、広く認識されている（例えば、非特許文献１を参照、２０１４年３月１４日検索）。
【０００３】
プロバイオティクスの胆汁酸塩ヒドロラーゼ（ＢＳＨ）活性は、コレステロール低下作用の主要なメカニズムの１つとみなされてきた（例えば、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４を参照。）。ＢＳＨ（ＥＣ３．５．１．２４；コリルグリシンヒドロラーゼ）は、アミノ酸残基および遊離胆汁酸へのグリシンおよび／またはタウリン抱合型胆汁酸塩の加水分解を触媒する酵素である。乳酸菌におけるＢＳＨ活性は、天然の生息環境と強く相関しており、主として乳酸杆菌属種などの消化管に関連する種で観察される。しかしながら、株間で多様なバリエーションが存在する。
【０００４】
宿主消化管の粘膜上皮細胞と微生物叢との密接な関係は、健康状態にとって最大の重要性を有する。消化管（ＧＩＴ）に固有の微生物叢のなかでも乳酸菌は、食品由来のコレステロールを消化する（例えば、非特許文献５を参照。）。Ｃｕｎｅ  Ｃａｓｔｅｌｌａｎａ、２００９年の特許（例えば、特許文献１を参照；ＡＢ  Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ  Ｓ．Ａ．）において、単一でのまたは組成物中のラクトバチルス・プランタルム株ＣＥＣＴ７５２８、ＣＥＣＴ７５２６およびＣＥＣＴ７５２９は、インビトロとインビボの両方でコレステロールを減少させる能力を示した。これらの株は、胆汁酸塩ヒドロラーゼ（ＢＨＳ）活性を有し、さらに病原性株（サルモネラ腸炎菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、偽結核菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジウム・ラムノサス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｍｎｏｓｕｓ）、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ））の成長を阻害するためにアンタゴニスト活性も有し、プロバイオティクス細菌として使用することができる。
【０００５】
Ｐｅｒｅｉｒａら（例えば、非特許文献６を参照。）は、Ｌ．ファーメンタム（Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）のコレステロールを減少させるといわれている特性に関与する主要なメカニズムとして、短鎖脂肪酸濃度、具体的にはプロピオネートおよび／または胆汁酸塩脱抱合のモル比の役割を実証した。
【０００６】
しかしながら、血清コレステロールのレベル（およびコレステロールの割合）への乳酸杆菌属種の株の作用は株特異的であり、特定の株の由来および特性に依存する（例えば、非特許文献７を参照。）。
【０００７】
（プロバイオティクス）
プロバイオティクスは、適切な量で与えられる場合にヒトの健康状態への利益が実証された生存可能な微生物の食物成分である（食物中のプロバイオティクス評価に関するガイドライン起草のＦＡＯ／ＷＨＯ合同作業部会、非特許文献８を参照、２０１４年３月１４日検索）。
【０００８】
より狭い定義では、プロバイオティクスは、腸の微生物バランスを改善することにより宿主に有利に影響を与える生きた微生物として受け入れられている。現在では、プロバイオティクス製品は、健康状態を改善するために、宿主の生理学的な活性をサポートすること、または疾患のリスクを低下させることのいずれかによって、数々の宿主の機能（抗感染性の、形態学的な、免疫学的な、代謝の機能）を標的とする株特異的な調製物である。一般的に、同じ種の異なる株のプロバイオティクスの可能性は、異なるプロバイオティクス作用を有する可能性があることが認められてきた（例えば、非特許文献９、非特許文献１０を参照。）。
【０００９】
最も広く適用されているプロバイオティクスは、ビフィドバクテリウム属および乳酸杆菌属種に属する。プロバイオティクスは、一般的に、発酵食物、例えばヨーグルト、ケフィア、チーズまたは栄養補助食品の一部として消費される。結腸の微生物叢は、十分安定化されており、粘膜の微生物叢のために容易に変化しない。しかしながら、十分な量（少なくとも１０9ＣＦＵの１日用量）で与えられれば、プロバイオティクス介入の作用を示す可能性がある。
【００１０】
プロバイオティクスを用いた治療コンセプトは、潜在的な病原体および毒素を低減させるかまたは取り除くこと、栄養素、抗酸化剤、成長因子を放出すること、消化管の運動を刺激すること、および先天および適応免疫を調節することである。
【００１１】
ラクトバチルス・プランタルムは、自然界では発酵した植物性材料、乳製品および肉製品から、さらにはヒトＧＩＴにおいても広く分布している（例えば、非特許文献１１を参照。）。
【００１２】
Ｌ．プランタルム種の株がプロバイオティクス食物または補助食品として利用可能であり（Ｌ．プランタルム２９９ｖ、ＤＳＭ９８４３、Ｐｒｏｂｉ  ＡＢ、Ｓｗｅｄｅｎ）、これらは、多菌種混合（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｅｓ）のプロバイオティクス補助食品ＶＳＬ＃３（ＶＳＬ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．ＵＳＡ）に属する。
【００１３】
ラクトバチルス・プランタルムＩｎｄｕｃｉａ（ＤＳＭ２１３７９）株は、抗微生物性ペプチドであるプランタリシンの分泌、サイトカインＩＬ−６の誘導、プトレシンの産生を介して消化管粘膜の天然の細胞の免疫性およびバリア機能を強化し、腸におけるリンパ組織の量を増加させるプロバイオティクスとして開示されている（Ｍｉｋｅｌｓａａｒら、特許文献２を参照、２００９、Ｂｉｏ−Ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈｙ  Ｄａｉｒｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）。
【００１４】
（消化管の微生物生態の乱れ）
感染および炎症性合併症を処置するための広域スペクトル抗微生物性調製物の適用は、ＧＩ微生物叢間で深刻な不均衡を引き起こす可能性があることは周知である。
（クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の感染）
１９７０年代に、クロストリジウム・ディフィシレは、抗生物質関連下痢症の原因因子として同定された。嫌気性の胞子形成性腸内病原体であるクロストリジウム・ディフィシレは、病院および老人ホームで蔓延している（例えば、非特許文献１２を参照。）。外来源のＣ．ディフィシレ感染は、Ｃ．ディフィシレの胞子の形態での感染がきっかけとなる。Ｃ．ディフィシレは、胞子ではなく栄養細胞によって産生される分泌毒素の作用を介して疾患を誘発する。内生胞子産生は、クロストリジウム・ディフィシレ感染の蔓延にとって不可欠である。これらの胞子は、疾患を引き起こすためには、発芽して栄養細胞成長に戻らなければならない（例えば、非特許文献１３を参照。）。
【００１５】
Ｃ．ディフィシレに感染した患者の４分の１（２５％）において、偽膜性腸炎（ＰＭＣ）などの重篤な後遺症が発症する。クロストリジウム・ディフィシレ関連下痢症（ＣＤＡＤ）は、死亡率を増加させ、入院を長引かせ、全体の医療費を劇的に増加させる。これまでの処置ガイドラインは、中程度および重度の偽膜性腸炎の場合、バンコマイシンの使用に重点を置いている（例えば、非特許文献１４を参照、２０１４年３月１４日検索）。
【００１６】
クロストリジウム・ディフィシレ感染は、患者の約２０％において再発し、それに続く再発は４０％から６０％に増加する（例えば、非特許文献１５を参照。）。抗微生物処置は、多様な微生物の複雑なバランスを崩壊させ、Ｃ．ディフィシレ定着および内因性由来の疾患の病因の主要な要因である。再発性Ｃ．ディフィシレ感染（ＣＤＩ）を有する患者は、対照と比較して著しく減少した細菌多様性を有する（例えば、非特許文献１６を参照。）。微生物多様性の維持および回復は、新規の戦略の代表といえる。この疾患の予防および処置の正念場は、プロバイオティクス投与を含む様々なレジメンでの抗生物質療法の間およびその後に腸の微生物叢の変更を元に戻す可能性を見出すことである。ほとんどのプロバイオティクスは、一時的に消化管に定着し、殺菌性の酸およびペプチドを産生して、栄養素および上皮への付着に関する競合により微生物間の「競合」を促進する。これらの作用は、Ｃ．ディフィシレについての環境の好ましさを低下させるようである。以前の研究は、ＣＤＩ予防のためのプロバイオティクスは、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓおよびＬ．カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）、Ｓ．ブラウディ（Ｓ．ｂｏｕｌａｒｄｉｉ）、またはＬ．ラムノサス（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）の組合せを含むことを示唆している。加えて、１０9ＣＦＵ／日より多くの投薬が、それより低い用量よりも有効である。
【００１７】
プロバイオティクス株の抗微生物活性は、Ｃ．ディフィシレとの競合に関して示唆されたメカニズムの１つである。乳酸菌は、局所的な消化管環境のｐＨを下げ、加えてＣ．ディフィシレの付着を予防する短鎖脂肪酸を産生する（例えば、非特許文献１７を参照。）。次に、プロバイオティクスによる腸のバリア保護の可能性は、結腸上皮細胞へのＣ．ディフィシレの毒素ＡおよびＢの結合を妨害することによる消化管の透過性の安定化、および消化管上皮上での偽膜の発生の阻害をもたらし得る。
【００１８】
しかしながら、全てのプロバイオティクスが上述した作用機序を生じる能力を有するとは限らない。
【００１９】
乳酸杆菌の株特異性は、Ｃ．ディフィシレ感染またはＣ．ディフィシレ毒素結合の予防において見込みのあるプロバイオティクスを探すときに考慮する重要な要因である（例えば、非特許文献１８を参照。）。
【００２０】
さらに、一部の臨床試験は、特定のプロバイオティクスのＣＤＡＤ予防に関する作用を実証する統計学的な証拠を得ることができなかった。抗生物質への曝露を受けた２９４１人の高齢の成人を含む、プロバイオティクス（好酸性乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）およびビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）の複数株混合（ｍｕｌｔｉｓｔｒａｉｎ）調製物）を受けた者がわかっている大規模な無作為化試験の著者は、ＣＤＩに関するリスクの低減を示さなかった（ＲＲ０．７１；９５％ＣＩ０．３４〜１．４７；ｐ＝０．３５）（例えば、非特許文献１９を参照。）。数年にわたりＣＤＩを処置するための様々なプロバイオティクスを用いて試験した後でも、プロバイオティクスの株、用量、および持続時間は、なお議論中である（例えば、非特許文献２０を参照。）。
【００２１】
（キシリトールの適用）
キシリトールは、５−Ｃ糖アルコール、例えばペンチトールであり、植物、菌類および藻類中に見出される。キシリトールは、哺乳動物の炭水化物代謝において重要な中間生成物であり、すなわちヒト血液は、最大８×１０-5Ｍのキシリトールを含有する。
【００２２】
消費されたキシリトールは、完全には吸収されず、吸収されなかった部分が細菌発酵のための食物繊維として使用されて、エネルギー経路で利用される短い脂肪酸鎖にキシリトールを変換することができる。キシリトールは、大腸における消化管微生物叢の一部の種の成長に影響を与え、固有の微生物叢の成長および活性を刺激する。１グラムのグルコースが３．８７ｋｃａｌを有するのと比較して、１グラムのキシリトールは２．４ｋｃａｌを有する。キシリトールは、糖尿病や高血糖症を有する個体にとって「安全」であると宣伝されている（例えば、非特許文献２１を参照。）。本発明者らの以前のＣＡＣＯ−２細胞株に対する研究において、本発明者らは、１％キシリトールが、Ｃ．ディフィシレ参照株ＶＰＩ１０４６３の栄養細胞の付着を予防し、細胞上で受容体をブロックするようであることを発見した。適用されたハムスターモデルにおいて（例えば、非特許文献２２を参照。）、ラクトバチルス・ラムノサスＧＧを共に含む２０％キシリトール溶液１ｍｌは、重度の小腸結腸炎の発症から動物を有意に保護した（例えば、非特許文献２２を参照。）。これらのプロバイオティクスであるＬ．ラムノサスＧＧと組み合わせたキシリトールを用いた実証研究では、クロストリジウム・ディフィシレの栄養細胞を嫌気性環境の実験室中で前もって培養して、細胞培養またはハムスターへの接種に適用した。
【００２３】
逆に、実際の臨床の場または老人ホームでは、これらの施設の好気性環境で生存するＣ．ディフィシレの極めて高い耐性を有する胞子と接触することにより感染が起こる。胞子は宿主の腸の内部で発芽し始める。
【００２４】
一部の著者は、動物モデルにおいて、糖の一部が、グルコースと同様にＣ．ディフィシレの毒素ＡおよびＢの発現をブロックすることができると仮定している（例えば、非特許文献２３を参照。）。
【００２５】
したがって、ＬＤＬ−コレステロール、特にｏｘ−ＬＤＬを低下させること、同様にクロストリジウム・ディフィシレ感染のリスクを減少させることにおいて有効なプロバイオティクス株がそれでもなお求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２６】
【特許文献１】欧州特許第２４８５７４３号明細書
【特許文献２】欧州特許第２２８８３６０号明細書
【非特許文献】
【００２７】
【非特許文献１】ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｙｏｍｅｄｉｃａｌｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ｃｏｍｍｕｎｉｑｕｅ／２０１１／１１．ｈｔｍｈ
【非特許文献２】Ｐｅｒｅｉｒａ，Ｄ．Ｉ．，ＭｃＣａｒｔｎｅｙ，Ａ．Ｌ．，Ｇｉｂｓｏｎ，Ｇ．Ｒ  Ａｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ａ  ｂｉｌｅ−ｓａｌｔ−ｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ｓｔｒａｉｎ，ａｎｄ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ−ｌｏｗｅｒｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００３：６９：４７４３−４７５２
【非特許文献３】Ｌｉｏｎｇ，Ｍ．Ｔ．，Ｓｈａｈ，Ｎ．Ｐ．Ｂｉｌｅ  ｓａｌｔ  ｄｅｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｂｉｌｉｔｙ，ｂｉｌｅ  ｓａｌｔ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｃｏ−ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  ａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ  ｓｔｒａｉｎｓ．Ｉｎｔ  Ｄａｉｒｙ  Ｊ．２００５：１５：３９１−３９８
【非特許文献４】Ｌｙｅ，Ｈ．Ｓ．，Ｒａｈｍａｔ−Ａｌｉ，Ｇ．Ｒ．，Ｌｉｏｎｇ，Ｍ．Ｔ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｒｅｍｏｖａｌ  ｂｙ  ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ  ｕｎｄｅｒ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｔｈａｔ  ｍｉｍｉｃ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｒａｃｔ，Ｉｎｔ  Ｄａｉｒｙ  Ｊ．２０１０：２０（３）：１６９−１７５
【非特許文献５】Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ，Ｓ．Ｅ．，Ｎｅｌｓｏｎ，Ｃ．Ｒ．，Ｍａｘｗｅｌｌ，Ｃ．，Ａｓｓｉｍｉｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｂｙ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ．Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９８５：４９，３７７−３８１
【非特許文献６】Ｐｅｒｅｉｒａ，Ｄ．Ｉ．，ＭｃＣａｒｔｎｅｙ，Ａ．Ｌ．，Ｇｉｂｓｏｎ，Ｇ．Ｒ．，Ａｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ａ  ｂｉｌｅ−ｓａｌｔ−ｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ｓｔｒａｉｎ，ａｎｄ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ−ｌｏｗｅｒｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００３：６９，４７４３−４７５２
【非特許文献７】Ｔａｎａｋａ，Ｈ．，Ｋ．Ｄｏｅｓｂｕｒｇ，Ｔ．Ｉｗａｓａｋｉ  ａｎｄ  Ｉ．Ｍｉｒｅａｕ，Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  ｂｉｌｅ  ｓａｌｔ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．１９９９：８２：２５３０−２５３５
【非特許文献８】ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｆａｏ．ｏｒｇ／ｄｏｃｒｅｐ／ｆａｏ／００９／ａ０５１２ｅ／ａ０５１２ｅ００．ｐｄｆ
【非特許文献９】Ｏｕｗｅｈａｎｄ，Ａ．Ｃ，Ｓａｌｍｉｎｅｎ，Ｓ．，Ｉｓｏｌａｕｒｉ，Ｅ．，Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ：ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ．Ａｎｔｏｎｉｅ  Ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ．２００２：８２，２７９−２８９
【非特許文献１０】Ｌｊｕｎｇｈ，Ａ．，Ｗａｄｓｔｒｏｍ，Ｔ．，Ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｓ  ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ．Ｃｕｒｒ  Ｉｓｓｕｅｓ  Ｉｎｔｅｓｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００６：７，７３−８９
【非特許文献１１】Ｈａｍｍｅｓ，Ｗ．Ｐ．，Ｗｅｉｓｓ，Ｎ．ａｎｄ  Ｈｅｒｔｅｌ，Ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｄ  Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ．Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ．２００６：４：３２０−４０３
【非特許文献１２】Ｂｒｉｔｔｏｎ，Ｒ．Ａ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｖ．Ｂ．，Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ  ａｎｄ  ｈｏｓｔ  ｉｎ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１２：２０，３１３−３１９
【非特許文献１３】Ｂｕｒｎｓ  Ｄ．Ａ，Ｈｅａｐ  Ｊ．Ｔ．Ｍｉｎｔｏｎ  Ｎ．Ｐ．Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｓｐｏｒｅ  ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ：ａｎ  ｕｐｄａｔｅ．Ｒｅｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１０；１６１（９）：７３０−４
【非特許文献１４】ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｐｔｏｄａｔｅ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔｓ／ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ−ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ−ｉｎ−ａｄｕｌｔｓ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
【非特許文献１５】Ｋｅｌｌｙ，Ｃ．Ｐ．，ＬａＭｏｎｔ，Ｊ．Ｔ．，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ−ｍｏｒｅ  ｄｉｆｆｉｃｕｌｔ  ｔｈａｎ  ｅｖｅｒ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２００８：３５９，１９３２−１９４０
【非特許文献１６】Ｃｈａｎｇ，Ｊ．Ｙ．，Ａｎｔｏｎｏｐｏｕｌｏｓ，Ｄ．Ａ．，Ｋａｌｒａ，Ａ．，Ｔｏｎｅｌｌｉ，Ａ．，Ｋｈａｌｉｆｅ，Ｗ．Ｔ．，Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｔ．Ｍ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｖ．Ｂ．Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｅｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ  ｉｎ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｄｉａｒｒｈｅａ．Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．２００８：１９７，４３５−４３８
【非特許文献１７】ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｌ．Ｖ．，Ｂｅｎｅｄａ，Ｈ．Ｗ．，Ｃｌａｒｒｉｄｇｅ，Ｊ．Ｅ．，Ｒａｕｇｉ，Ｇ．Ｊ．Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｈａｎｇｉｎｇ  ｆａｃｅ  ｏｆ  Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｆｏｒ  ｈｅａｌｔｈ  ｃａｒｅ  ｐｒａｃｔｉｔｉｏｎｅｒｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｃｏｎｔｒｏｌ．２００７：３５，２３７−２５３
【非特許文献１８】Ｔｅｊｅｒｏ−Ｓａｒｉｎｅｎａ  Ｓ．，Ｂａｒｌｏｗ  Ｊ．，Ｃｏｓｔａｂｉｌｅ  Ａ，Ｇｉｂｓｏｎ  Ｇ．Ｒ．，Ｒｏｗｌａｎｄ  Ｉ．Ａｎｔｉｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ａｎｄ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｉｎ  ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ｂａｔｃｈ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ：Ｉｓ  ｉｔ  ｄｕｅ  ｔｏ  ｓｙｎｅｒｇｉｅｓ  ｉｎ  ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ  ｏｒ  ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｉｎｓ？Ａｎａｅｒｏｂｅ．２０１３：２４；６０−６５
【非特許文献１９】Ａｌｌｅｎ，Ｓ．Ｊ．，Ｗａｒｅｈａｍ，Ｋ．，Ｗａｎｇ，Ｄ．，Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｃ，Ｈｕｔｃｈｉｎｇｓ，Ｈ．，Ｈａｒｒｉｓ，Ｗ．，Ｄｈａｒ，Ａ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｈ．，Ｆｏｄｅｎ，Ａ．，Ｇｒａｖｅｎｏｒ，Ｍ．Ｂ．，Ｍａｃｋ，Ｄ．Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ  ａｎｄ  ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｄｉａｒｒｈｏｅａ  ａｎｄ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｄｉａｒｒｈｏｅａ  ｉｎ  ｏｌｄｅｒ  ｉｎｐａｔｉｅｎｔｓ（ＰＬＡＣＩＤＥ）：ａ  ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ，ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ，ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ，ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｒｅ  ｔｒｉａｌ．Ｌａｎｃｅｔ．２０１３：３８２，１２４９−１２５７
【非特許文献２０】Ｎａａｂｅｒ，Ｐ．，Ｍｉｋｅｌｓａａｒ，Ｍ．，Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ  ａｎｄ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｄｉａｒｒｈｅａ．Ａｄｖ  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００４：５４  ２３１−２６０
【非特許文献２１】Ｔａｌｂｏｔ  Ｊ．Ｍ．，Ｋ．Ｐ．Ｆｉｓｈｅｒ  Ｔｈｅ  Ｎｅｅｄ  ｆｏｒ  Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｆｏｏｄｓ  ａｎｄ  Ｓｕｇａｒ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｂｙ  Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ  ｗｉｔｈ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｌｌｉｔｕｓ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  １９７８：１；２３１−２４０
【非特許文献２２】Ｎａａｂｅｒ，Ｐ．，Ｌｅｈｔｏ，Ｅ．，Ｓａｌｍｉｎｅｎ，Ｓ．，Ｍｉｋｅｌｓａａｒ，Ｍ．，Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｔｏ  Ｃａｃｏ−２  ｃｅｌｌｓ．ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９６：１４，２０５−２０９
【非特許文献２３】Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｓ．，Ｂｕｒｍａｎ，Ｌ．Ｇ．，Ａｋｅｒｌｕｎｄ，Ｔ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｏｘｉｎｓ  ｉｎ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｄｒａｍａｔｉｃ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．２００８：１５４，３４３０−３４３６
【非特許文献２４】ＷＨＯ．Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔａｓｋ  Ｆｏｒｃｅ．Ｏｂｅｓｉｔｙ：Ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｎａｇｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｅｐｉｄｅｍｉｃ．Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ａ  ＷＨＯ  Ｃｏｎｓｕｌｔａｔｉｏｎ  ｏｎ  Ｏｂｅｓｉｔｙ．Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ．ＷＨＯ／Ｎｕｔ／ＮＣＤ／９８．１９９８；１
【非特許文献２５】ＮＯＲＩＰ，Ｒｕｓｔａｒｄ  Ｐ．，Ｆｅｌｄｉｎｇ  Ｐ．，Ｆｒａｎｓｚｏｎ  Ｌ．，Ｋａｉｒｉｓｔｏ  Ｖ．，Ｌａｈｔｉ  Ａ．，Ｍａｒｔｅｎｓｓｏｎ  Ａ．，Ｈｙｌｔｏｆｔ  Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  Ｐ．，Ｓｉｍｏｎｓｓｏｎ  Ｐ．，Ｓｔｅｅｎｓｌａｎｄ  Ｈ，Ｕｌｄａｌｌ  Ａ．Ｔｈｅ  Ｎｏｒｄｉｃ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｉｎｔｅｒｖａｌ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  ２０００：ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｒｖａｌｓ  ｆｏｒ  ２５  ｃｏｍｍｏｎ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．２００４：６４：２７１−２８４
【非特許文献２６】ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ
【発明の概要】
【００２８】
本発明は、血中のＬＤＬ−コレステロールレベルを低下させることによるコレステロール代謝障害および継続的な心臓血管疾患の予防におけるコレステロール低下剤として、同時に、酸化ストレスマーカーである酸化低密度リポタンパク質（ｏｘ−ＬＤＬ）、酸化ストレス度（ＯＳＩ）および総過酸化物カウント（ＴＰＸ）のレベルを低下させることによるヒトの体の抗酸化活性の強化において使用するための抗酸化剤として使用するための、２００８年４月１６日にＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨに登録番号ＤＳＭ２１３７９で寄託された、Ｌ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ株ＤＳＭ２１３７９を含む組成物を提供する。
【００２９】
そのため、Ｌ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９を含む組成物および食品は、心臓保護的な作用を有する。
【００３０】
本発明の別の目的は、クロストリジウム・ディフィシレ胞子の発芽を予防すること、およびクロストリジウム・ディフィシレ栄養細胞の増殖を抑制することによって、内因性および／または外因性由来のクロストリジウム・ディフィシレ関連下痢症（ＣＤＡＤ）のリスクを減少させることにおける、抗微生物剤としてのＬ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ株ＤＳＭ２１３７９を含む組成物を提供することである。Ｌ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａは、抗生物質処置と同時に使用することができる。
【００３１】
クロストリジウム・ディフィシレに耐性を有する組成物は、キシリトールをさらに含んでいてもよい。
【００３２】
Ｌ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａを含む組成物は、食品、食物補助食品、または医薬もしくは動物用製品の生産に使用することができる。食品は、乳製品または肉製品、甘味料などであり得る。乳製品は、発酵乳製品、チーズ、およびヨーグルトなどであり得る。
【００３３】
食物補助食品は、粉末（カプセル、ロゼンジ、錠剤、粉末小袋など）または液体（アンプル）の形態で使用されてもよい。株は、凍結乾燥させた形態で使用される場合もある。
【００３４】
Ｌ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ株ＤＳＭ２１３７９の有効な用量は、１日当たり約１×１０9ＣＦＵから１×１０10ＣＦＵ、好ましくは５×１０9ＣＦＵである。
【００３５】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、本明細書では「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えばＬ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａを含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）組成物は、その株のみからなる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｅｘｃｌｕｓｉｖｅｌｙ）場合もあり、または追加のものを含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）場合もある。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】微好気性および嫌気性環境におけるキシリトール含有および対照改変ＭＲＳ培地中のＩｎｄｕｃｉａのｐＨ値を示す図である。
【図２】逆転写（ＲＴ）およびリアルタイムＰＣＲ増幅（ｑＰＣＲ）により、Ｃ．ディフィシレＶＰＩ１０６４３におけるｔｏｘＡおよびＢ遺伝子の存在を示す図である。
【図３】逆転写（ＲＴ）およびリアルタイムＰＣＲ増幅（ｑＰＣＲ）により、アンピシリンおよびＣ．ディフィシレで処置したハムスターの肝臓および小腸におけるｔｏｘＢ遺伝子の存在を示す図である。
【図４】ａ）プロバイオティクス投与後の大腸の正常な粘膜およびｂ）Ｃ．ディフィシレが感染した粘膜を示す図である。
【図５】実験的なＣＤＡＤ感染における形態学的な変化を示す図である。ａ）小腸およびｂ）大腸における中程度の充血、ならびにｃ）膵臓およびｄ）脾臓における強い充血。ｅ）小腸における偽膜およびｆ）大腸における偽膜でのＰＭＮ浸潤。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
［実施例］
以下の実施例で本発明をさらに例示するが、これらは本発明の範囲を限定すると解釈されないものとする。
Ｉ．血中のＬＤＬ−コレステロールを減少させることによるコレステロール低下剤としてのＬ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９の使用
【００３８】
（実施例１）
Ｌ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９の胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性
以下のインビトロにおける試験の目的は、Ｌ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９の胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性の存在を評価することであった。
【００３９】
方法。Ｌ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９の胆汁酸塩ヒドロラーゼ（ＢＳＨ）活性の査定は、Ｃｕｎｅ  Ｃａｓｔｅｌｌａｎａ、２００９（例えば、特許文献１を参照；ＡＢ  Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ  Ｓ．Ａ．）に従って行われた。
【００４０】
３種の乳酸杆菌属種株を、微好気性条件、３７℃で、ＭＲＳ寒天上で一晩培養した。インキュベートした後、培養物をＭｃＦａｒｌａｎｄ  ３．０に標準化した。単一株培養物をＢＳＨ活性に関してアッセイした。４％（ｗ／ｖ）のタウロデオキシコール酸のナトリウム塩（ＴＤＣＡ、Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）および０．３７ｇ／ｌのＣａＣｌ2が補充されたＭＲＳ寒天プレート上で滅菌したペーパーディスクの周りに培養物を含浸させた。プレートを、３７℃で７２時間、嫌気的にインキュベートし、ディスクの周りの沈殿ゾーンの直径を測定した。次いで、阻害ゾーン直径（ＩＺＤ、ｍｍ）からディスク直径（ＤＤ、ｍｍ）を引き、この差を２で割ることによって、ＢＳＨ活性＝（ＩＺＤ−ＤＤ）／２という式に従いＢＳＨ活性を計算した（表１）。
【００４１】
【表１】
2017515799.tif 000002
【００４２】
Ｌ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９のＢＳＨ活性は、参照Ｌ．プランタルム株ＢＡＡ７９３およびＬ．ガセリ（Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ）ＤＳＭ２３８８２よりも高かった（表１）。
【００４３】
（実施例２）
Ｌ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９のＬＤＬ−コレステロールを減少させる能力
ヒトが介入する試験ＩＳＲＣＴＮ７９６４５８２８「健康な志願者の血液指標および腸のミクロフローラへのプロバイオティクスヨーグルトの作用」の目的は、その株を含むヨーグルトと共に消費された場合の血中におけるＬ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９の短期間（３週間）のＬＤＬ−コレステロールを減少させる能力を査定することであった。
【００４４】
ヨーグルト調製物。補助的なスターターとして（接種用量は牛乳１ｔ当たり１ｇ）Ｌ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９（２×１０11ＣＦＵ／ｇ）を使用して調整済みの低温殺菌（＋９２〜＋９５℃で５分）牛乳からプロバイオティクスヨーグルトを得た。低温殺菌した牛乳を短時間で＋３５〜＋４３℃に冷却し、その後、スターター培養物およびプロバイオティクス株と混合した。牛乳をｐＨ４．２〜４．５に達するまで発酵させ、＋２３〜＋２７℃に冷却した。ヨーグルトを５％の糖で加糖し、プラスチックカップに入れ、＋２〜＋６℃に冷却した。補助的なプロバイオティクスを含まないヨーグルトを対照として利用した。
【００４５】
ヒト志願者の試験の設計。二重盲検プラセボ対照（ＤＢＰＣ）交差探索的試験を、ヘルシンキ宣言のガイドラインに従って実行した。試験は、エストニアのタルトゥ大学のヒトへの調査に関する倫理審査委員会（プロトコール番号１９０Ｔ−１１、２０１０）によって承認された。全ての参加者は、登録時に彼らの書面によるインフォームドコンセントに署名し、いつでも研究を辞退する機会が与えられた。健康な成人（ｎ＝４９）における健康状態のバイオマーカーに対するＬ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９を含むヨーグルトの作用を調査するために研究を行った。研究前の１ヶ月以内は、参加者は、彼らの通常の食事を継続して、プロバイオティクス製品（例えば食物補助食品、ヨーグルト、チーズ、ケフィアなど）を回避するように求められた。
【００４６】
参加者の２つの群が、同時に、毎日１５０ｇの試験ヨーグルト、すなわちＬ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９（４×１０7ＣＦＵ／ｇ）を含むヨーグルトまたは対照ヨーグルトを３週間消費することから始めた。プロバイオティクスＬ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａの１日用量は、６×１０9ＣＦＵであった。２週間のウォッシュアウト期間後、志願者を交差させて、さらに３週間、プロバイオティクスヨーグルトまたは対照ヨーグルトを消費させた。
【００４７】
（臨床調査）
対象を臨床的に調査し、一晩断食してあらゆる薬物、タバコ、アルコールおよび茶またはコーヒーを断った後に血漿サンプルを収集した。各参加者を人体測定的な指標に関して評価した。肥満指数（ＢＭＩ）を、身長の二乗（ｍ2）で割った重量（ｋｇ）として計算した。ＢＭＩを使用して、健康な志願者における正常な体重の範囲（１８．５〜２４．９ｋｇ／ｍ2）、過体重（≧２５．０ｋｇ／ｍ2）および肥満（≧３０．０ｋｇ／ｍ2）に分類した（例えば、非特許文献２４を参照。）。
【００４８】
空腹時血液のサンプルを、４回、すなわち加入時、Ｌ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９を含む製品または対照製品のいずれかの投与後、ウォッシュアウト期間後、および試験終了時の対照またはプロバイオティクス製品の投与後に収集した。
【００４９】
血液学的指標：血漿脂質：総コレステロール、ＬＤＬ−コレステロール（ＬＤＬ−ｃ）、ＨＤＬ−コレステロール（ＨＤＬ−ｃ）およびトリグリセリドを、その地域の臨床実験室（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ｏｆ  Ｔａｒｔｕ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｌｉｎｉｃｓ、Ｅｓｔｏｎｉａ）において認定されたアッセイを使用した標準的な実験方法によって決定した。Ｎｏｒｄｉｃ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｉｎｔｅｒｖａｌ  Ｐｒｏｊｅｃｔによって提唱された慣例的な実験室試験に関するインターバル（例えば、非特許文献２５を参照。）を参考として使用した。
【００５０】
（統計的分析）
Ｒ２．１０．１（例えば、非特許文献２６を参照、２０１４年３月２５日検索）およびウィンドウズ用のＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン４．００（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用することによって統計的分析を行った。全てのデータを平均および標準偏差（平均±ＳＤ）として表した。データ分布に従った対応のあるｔ検定またはウィルコクソンの順位和検定によりベースラインと介入データとを比較した。
【００５１】
値がｐ＜０．０５の場合に差を統計学的に有意とみなした。
【００５２】
交差試験の健康な志願者の２つの群は、それらの臨床データの点で異なっていなかった（表２）。
【００５３】
【表２】
2017515799.tif 000003
【００５４】
【表３】
2017515799.tif 000004
【００５５】
Ｌ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９消費後の主要な変化は、ＬＤＬ−コレステロール粒子の含量で明らかにされた。Ｌ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９を含むヨーグルトの消費後に、ＬＤＬ−コレステロール含量は減少した
（表３）。
【００５６】
したがって、３週間にわたるＬ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９ヨーグルトの消費は、血中のＬＤＬ−コレステロールレベルを９．１％低下させた。
【００５７】
（実施例３）
酸化ストレスマーカーである酸化低密度リポタンパク質（ｏｘＬＤＬ）、酸化ストレス度（ＯＳＩ）および総過酸化物カウント（ＴＰＸ）に対する、Ｌ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９を含むヨーグルトの作用。
【００５８】
並行群間二重盲検試験ＩＳＲＣＴＮ２６３４４２５５中に、軽度の高コレステロール血症（ＬＤＬ−コレステロールが≧３．０ｍｍｏｌ／Ｌ）の成人（ｎ＝１３６）が、８週間にわたり毎日１５０ｇのプロバイオティクス（Ｌ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９の１日用量は５×１０9ＣＦＵ）または対照ヨーグルトを消費した。介入の４週間後にプロバイオティクス製品の短期間の作用を測定し、試験の最後に、すなわち介入の８週間後に持続的な作用を測定した。
【００５９】
試験は、エストニアのタルトゥ大学のヒトへの調査に関する倫理審査委員会（プロトコール番号２０７／Ｍ−１１  １９．０９．２０１１）によって承認された。
【００６０】
平均５×１０9ＣＦＵの１日用量でのＬ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９を含むヨーグルト１５０ｇの消費は、第４週から第８週の間（−０．１２ｍｍｏｌ／Ｌ；ｐ＝０．０４）およびベースラインから第８週までに（−０．０９ｍｍｏｌ／Ｌ；ｐ＝０．０２９）プロバイオティクス群において安定した群内でのＬＤＬ−コレステロール低減をもたらした（表４ａおよび４ｂ）。
【００６１】
ｏｘ−ＬＤＬは、ＬＤＬ粒子に特異的な酸化ストレスのマーカーであることから、ｏｘ−ＬＤＬは、冠動脈心疾患に関する生化学的なリスクマーカーの１つとみなすことができる。Ｌ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９を含むヨーグルトの投与は、８週間の介入の間中ずっとプロバイオティクスヨーグルト群において安定した群内でのｏｘ−ＬＤＬの低減をもたらした（表５ａおよび５ｂ）。ベースラインから第８週まで、変化は統計学的に有意であった（−４．１０Ｕ／Ｌ；ｐ＝０．００３）。プラセボに対しても変化は有意であった（ｐ＝０．０２６）。プラセボ群においてｏｘＬＤＬへの作用は記録されなかった。
【００６２】
Ｌ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９を含むプロバイオティクスヨーグルトの投与はまた、プロバイオティクス群においてベースラインから第８週までに酸化ストレス度（ＯＳＩ）の有意な低減（−５．３７；ｐ＜０．００１）ももたらした（表６ａおよび６ｂ）。プラセボに対しても変化は有意であった（ｐ＝０．０４）。プラセボ群において作用は記録されなかった。
【００６３】
【表４】
2017515799.tif 000005
【００６４】
【表５】
2017515799.tif 000006
【００６５】
【表６】
2017515799.tif 000007
【００６６】
【表７】
2017515799.tif 000008
【００６７】
【表８】
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【００６８】
【表９】
2017515799.tif 000010
【００６９】
【表１０】
2017515799.tif 000011
【００７０】
研究全体で、プロバイオティクス（すなわちＬ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａを含むプロバイオティクス）群において総過酸化物カウント（ＴＰＸ）の安定した有意な群間の低減が記録された（表７ａおよび７ｂ）。プラセボ群において作用は記録されなかった。総抗酸化能において有意な変化は検出されなかった（表８ａおよび８ｂ）。
【００７１】
【表１１】
2017515799.tif 000012
【００７２】
【表１２】
2017515799.tif 000013
【００７３】
【表１３】
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【００７４】
結論。ヒト介入試験によれば、Ｌ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９を含む組成物は、血中のＬＤＬ−コレステロールの低減を介して心臓保護的な作用を有し、同時に、酸化損傷からヒトの体を保護し、酸化ストレスマーカーであるｏｘＬＤＬ、ＯＳＩおよびＴＰＸを低下させることによって抗酸化活性を強化する。
ＩＩ．Ｃ．ディフィシレ胞子の発芽および栄養細胞の増殖を予防することによる抗微生物剤としてのＬ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ株ＤＳＭ２１３７９の使用
【００７５】
（実施例４）
インビトロでの嫌気性環境におけるＣ．ディフィシレ参照株の栄養細胞に対するＬ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９のアンタゴニスト活性
研究の目的は、嫌気性環境におけるＣ．ディフィシレ参照株に対するＬ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９のアンタゴニスト活性を評価することであった。
【００７６】
方法。試験された株は、Ｌ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９およびＣ．ディフィシレＶＰＩ１０４６３（ＡＴＣＣ４３２５５）、Ｍ１３０４２高毒性株であった。
【００７７】
株を固体培地上に植え付け、嫌気性環境中でインキュベートした。生理食塩水中の細菌の懸濁液を、ＭａｃＦａｒｌａｎｄ標準３に従って（１０8ＣＦＵ／ｍｌに）調整した。２００ｍｌのＢＨＩ培地中の懸濁液（０．２ｍｌ）を１０5ＣＦＵ／ｍｌの濃度に達するように植え付けた。
【００７８】
様々な時間スケールで、ＭＲＳおよびＬＡＢ１６０培地に成長のための細菌のシーディングを行った（０．１ｍｌ）。プレートを嫌気性および微好気性条件でインキュベートした。２〜５日後に成長をチェックし、結果をｌｏｇ10ＣＦＵ／ｍｌとして表した。
【００７９】
【表１４】
2017515799.tif 000015
【００８０】
Ｌ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９によるＣ．ディフィシレ栄養細胞の完全な抑制がＢＨＩ培地中の共培養後に見出され、ＭＲＳおよびＣＤ  ＬＡＢ１８０選択培地にさらに植え付けたところ、４８時間のインキュベーション後、Ｌ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９は、ＢＨＩ培地中２４時間で最大値を示した。４８時間後、Ｌ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９の成長量は、単一培養物（６．３ｌｏｇＣＦＵ／ｇ）またはＣ．ディフィシレ株と組み合わされた場合（７．３および６．０ｌｏｇＣＦＵ／ｇ）で等しく中程度に抑制された（表９）。
【００８１】
（実施例５）
インビトロにおけるクロストリジウム・ディフィシレ参照および臨床株の栄養細胞に対するラクトバチルス・プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９の上清の作用
以下のインビトロでの実験の目的は、参照および臨床用Ｃ．ディフィシレ株に対するＬ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９栄養細胞の抗微生物作用を決定することであった。Ｌ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９の天然型（酸性）の上清と中和された上清（阻害物質、例えばペプチド）との抑制作用の区別は、２つのメカニズム、すなわち有機酸の影響またはバクテリオシンの存在のいずれかを識別するのに役立つ。
材料（株）（表１０）
Ｌ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９
クロストリジウム・ディフィシレ参照株ＶＰＩ１０４６３およびＭ１３０４２
クロストリジウム・ディフィシレ臨床株（１１株）
方法。マイクロタイタープレート（ＭＴＰ）アッセイによって、参照および臨床Ｃ．ディフィシレ株に対するＬ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９の上清の抗微生物活性を決定した。
【００８２】
Ｌ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９を、ガラスビーズ上のマイクロチューブ中で、−８０℃で維持し、０．１５％寒天を含むＭＲＳ液体培地中で、短時間で活性化し、微好気性条件（１０％ＣＯ2）下、３７℃で２４時間インキュベートした。一晩のＬ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９培養物を使用して、ＢＨＩ液体培地に１％ｖ／ｖで植え付け、微好気性条件中で２４時間インキュベートした。Ｌ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９の抗微生物活性を検出するために、２４時間経過したＢＨＩ液体培地培養物から遠心分離によって細胞外の無細胞上清（ＣＦＳ）を収集した。無細胞上清のｐＨを測定し、半分に分割した。その半分を酸性のままにし、他方の半分を６ＮのＮａＯＨでｐＨ６．０に中和し、両方の上清をろ過滅菌した。
【００８３】
Ｃ．ディフィシレ株を、ガラスビーズ上、マイクロチューブ中で、−８０℃で維持し、嫌気性環境（嫌気性のグローブボックス、ガスは９０％Ｎ：５％ＣＯ2：５％Ｈ2）中で、ウマ血液が補充された難培養嫌気性菌寒天（ＦＡＡ：Ｆａｓｔｉｄｉｏｕｓ  Ａｎａｅｒｏｂｅ  Ａｇａｒ）で２４時間にわたり短時間で活性化した。一晩のＣ．ディフィシレ培養物を、ＭａｃＦａｒｌａｎｄ３．０に従った密度を有する懸濁液に使用した。Ｌ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９の抗微生物活性を評価するために、２０μｌのＣ．ディフィシレ細胞懸濁液を、１８０μｌ：（１）ＢＨＩ液体培地（対照として）、（２）無細胞ＢＨＩ上清、（３）無細胞で中和されたＢＨＩ上清、（４）希釈された無細胞上清（滅菌ＢＨＩ液体培地で１：１）および（５）希釈され中和された無細胞上清（滅菌ＢＨＩ液体培地で１：１）に添加した。
【００８４】
Ｃ．ディフィシレの成長（光学密度値における変化）を、ＭＴＰリーダーを使用して４８時間後にＯＤ620nmで測定し、成長速度を計算した。
【００８５】
クラスカル−ウォリスの検定を用いてＬ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９の抑制活性を試験し、Ｃ．ディフィシレ対照の成長密度（ＯＤ620nm）を、天然型および中和された上清、ならびに希釈液中でのＣ．ディフィシレの成長密度のデータと比較した。ＰＡＳＴ統計ウェブ提供のプログラムを使用してデータの統計的分析を行った。
【００８６】
【表１５】
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【００８７】
臨床株：Ｃ．ディフィシレＣＤＥ、ＣＤＰ１−９；参照株：Ｃ．ディフィシレＶＰＩ１０４６３（ＡＴＣＣ４３２５５）およびＣ．ディフィシレＭ１３０４２（リボタイプ０２７に属するカナダからの流行性株）の栄養細胞。
【００８８】
したがって、Ｌ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９株は、天然型の製品における酸産生（ｐＨを減少させる）と、それより程度は低いものの上清の中和後（中和された製品）でも、なお活性ないくつかの抗微生物性タンパク質様の物質の両方のために、Ｃ．ディフィシレに対して抗微生物活性を有する（表１０）。
【００８９】
（実施例６）
キシリトール含有培地中でのＬ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９の成長およびｐＨ値の試験
研究の目的は、キシリトールがＣ．ディフィシレに対するＬ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９のアンタゴニスト活性に影響を与えるのかどうかを見出すことであった。
【００９０】
Ｉｎｄｕｃｉａ（１０5ＣＦＵ／ｍｌ）を、グルコースを５％キシリトールで置き換えたＭＲＳ培地中でインキュベートするか、または微好気性および嫌気性環境で糖なしで使用した。乳酸杆菌数を培地１ｍｌ当たりのＣＦＵとして記録した。本発明者らは、インビトロで、Ｌ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９が微好気性および嫌気性条件中で成長のためにキシリトールを使用するかどうかを２、６、２４、および４８時間で試験した。
【００９１】
２４時間で、キシリトール含有またはキシリトール非含有で供給された培地を使用したところ、Ｌ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９の成長に差はなく、微好気性環境では２４時間で５％キシリトール培地中での成長が最良であったが、嫌気性環境ではグルコース含有培地より２ｌｏｇ低かった（表１１）。
【００９２】
【表１６】
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【００９３】
この実験から、Ｌ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９は、ＭＲＳ培地中でキシリトールを効果的に代謝しないことが証明された。５％キシリトール含有改変ＭＲＳ培地中でのＬ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９の成長後におけるｐＨ変化を試験した。
【００９４】
有機酸産生による最も低いｐＨ値は、嫌気性環境でインキュベートしたグルコース含有対照培地中で見られた。キシリトール含有培地において、それでもなお微好気性および嫌気性条件の両方でｐＨ６．２からｐＨ５．０のｐＨ低下が見られたが、それでもなおｐＨ７．５からｐＨ＝３．２のグルコース含有対照培地のｐＨとは実質的に異なっていた（図１）。
Ｌ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９の代謝におけるキシリトールの使用
この研究の目的は、微好気性および嫌気性環境におけるＬ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９によるキシリトールの使用を測定することであった。
【００９５】
方法：２から１２０時間にわたる微好気性および嫌気性環境での５％キシリトール含有ＭＲＳ培地中でのＬ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９の培養により、二重の実験を行った。マススペクトロメトリーＱＴＲＡＰ３２００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）を用いてキシリトールを検出した。サンプルを１００００ｇで３分間遠心分離し、１００倍に希釈し、５０μｌを、５０μｌの内部標準（アセトニトリル中５ｍＭのＤ４−コハク酸、５０μｌ）と混合した。５μｌの希釈液を、５０％アセトニトリル／水の溶離剤を使用してマススペクトロメトリーに注入した。多重反応モニタリング（ＭＲＭ）イオン対１５１／１０１（キシリトール）および１２１／７７（内部標準）によって物質を同定した。市販のキシリトール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の濃度が公知の溶液で作製した検量線から濃度を計算した。
【００９６】
繰り返しの実験によれば、糖含量が基底値±最大０〜０．６ｍＭの変化で維持されたことから、Ｉｎｄｕｃｉａはキシリトールを極めて低い量で使用した（表１２）。
【００９７】
【表１７】
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【００９８】
したがって、本発明者らは、マススペクトロメトリー（質量分析法）によって、Ｌ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａはキシリトールを極めて低い量で代謝することを確認した。
キシリトールおよびアンピシリンを含有する環境におけるＣ．ディフィシレ参照株の成長
この研究の目的は、シリアンハムスターにおける精巧なＣ．ディフィシレ感染モデルに類似した消化管の環境をインビトロで模擬することであった。
【００９９】
インビトロにおけるブレーンハート培地（ＢＨＩ）中でのＬ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９およびＣ．ディフィシレの参照株（ＶＰＩ１０４６３および強毒性リボタイプ０２７株Ｍ１３０４２）の成長へのキシリトールおよびアンピシリンの影響を試験した。
【０１００】
【表１８】
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【０１０１】
Ｌ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９および２種のＣ．ディフィシレの参照株は、対照ＢＨＩ培地で４８時間培養した後、ＣＦＵ数をほぼ２から４ｌｏｇ増加させた。Ｃ．ディフィシレ株にキシリトールおよびアンピシリンを作用させた後、変化は見られなかった（表１３）。
【０１０２】
Ｌ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９株の成長が、５％のキシリトールおよび０．７５μｌ／ｍｌのアンピシリン両方のもとで約２ｌｏｇ抑制された。したがって、抗生物質アンピシリンおよび最大５％のキシリトールが投与された消化管の微環境において、ＬプランタルムＩｎｄｕｃｉａの生存が認められた。
【０１０３】
（実施例７）
キシリトールおよびアンピシリンの異なる濃度での共培養によるＬ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９およびＣ．ディフィシレ参照株の成長
この研究の目的は、キシリトールおよびアンピシリンの異なる濃度での共培養によるＬ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９およびＣ．ディフィシレ参照株の成長を評価することであった。
【０１０４】
５％キシリトールおよび０．７５μｌ／ｍｌアンピシリンが補充されたＢＨＩ培地を、２４および４８時間にわたる嫌気性環境（ワークステーションＣｏｎｃｅｐｔ  ４００、ＵＫ）中でのＬ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９およびＣ．ディフィシレ参照株の共培養に適用した。
【０１０５】
アンピシリンおよびキシリトール５％含有ＢＨＩ培地における単一でのＬ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９、Ｃ．ディフィシレＶＰＩおよびＭ参照株の共培養後の生存率を試験した（１、２ａ、２ｂ）。その後、Ｌ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ数を決定するためのＭＲＳ液体培地での１０倍連続希釈液をＣＯ2環境において培養し、Ｃ．ディフィシレの場合は嫌気性環境においてＬＡＢ１６０培地で培養した。
【０１０６】
【表１９】
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【０１０７】
インビトロにおけるキシリトールおよびアンピシリン含有ＢＨＩ培地中でのＬ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９（３）およびＣ．ディフィシレの参照株（４、５）の共培養の間に（ハムスターモデルを模擬）、両方のＣ．ディフィシレ株の栄養細胞の成長が抑制された。ＶＰＩ株では完全な抑制を検出することができ、Ｃ．ディフィシレ株Ｍのケースでは５ｌｏｇの実質的な低減（５．０から２．０ｌｏｇＣＦＵ／ｍｌ）を検出した。
【０１０８】
したがって、抗生物質処置後の実験用ハムスターモデルの消化管環境を模擬するインビトロでの実験から、Ｌ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９を単独で（表５）またはそれとキシリトールとを組み合わせて用いることでＣ．ディフィシレ成長の完全なまたは高い抑制のいずれかが示された（表１４）。
【０１０９】
（実施例８）
ラクトバチルス・プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９およびキシリトールの組合せは、クロストリジウム・ディフィシレ参照株ＶＰＩ胞子の発芽を阻害する。
【０１１０】
この実験の目的は、Ｌ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９を培地中でプレインキュベートした場合に、クロストリジウム・ディフィシレの発芽を予防するＬ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９の能力を評価することであった。クロストリジウム・ディフィシレ胞子の発芽へのキシリトールおよびタウロコール酸塩の作用を試験した。タウロコール酸塩は、クロストリジウム・ディフィシレ胞子の発芽を促進する小腸内の天然物質である。
【０１１１】
Ｌ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９を、嫌気性条件中、２４時間で、様々な薬剤を含有するブレーンハートインフュージョン（ＢＨＩ）液体培地と共にインキュベートした。Ｌ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９のインキュベーション後、クロストリジウム・ディフィシレ胞子を混合物に添加し、ＢＨＩ液体培地を１：１０の比率で濃縮した。
【０１１２】
実験および対照混合物を嫌気性条件中で４８時間までインキュベートした。２４および４８時間後、実験開始時にFastiodious嫌気性菌寒天およびヒトＲｏｇｏｓａ  Ｓｈａｒｐｅ寒天に混合物を植え付けた。Ｌ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９およびクロストリジウム・ディフィシレの数を計算した。
【０１１３】
【表２０】
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【０１１４】
キシリトールまたはキシリトールとタウロデオキシコール酸との組合せを含有する培地中でのＬ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９のプレインキュベーションは、クロストリジウム・ディフィシレの発芽を阻害する（表１５）。Ｌ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９は、キシリトールおよび／またはタウロデオキシコール酸の存在により影響を受けなかった。これらの結果は、動物実験の結果を裏付けている。
【０１１５】
（実施例９）
動物実験
この研究の目的は、Ｃ．ディフィシレ胞子で攻撃したハムスターの腸管におけるクロストリジウム・ディフィシレ参照株ＶＰＩ１０４６３によって引き起こされた感染へのＬ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９の影響を評価することであった。
【０１１６】
シリアンハムスター（Ｍｅｓｏｃｒｉｃｅｔｕｓ  ａｕｒａｔｕｓ）は、よく特徴付けられたクロストリジウム・ディフィシレ感染のモデルを提供する。抗生物質で処置されたハムスターの結腸の微生物叢は破壊され、その後Ｃ．ディフィシレ胞子に晒されると、動物は４８時間未満でＣ．ディフィシレ関連下痢症（ＣＤＡＤ）を発症させ、死亡率は１００％である。
【０１１７】
本発明者らは、本発明者らのインビトロでの結果に従ってＬ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９を投与することによって、Ｃ．ディフィシレで攻撃したハムスターの死亡率を減少させることができるのかどうかを試験した。まず本発明者らは、アンピシリン（３０ｍｇ／ｋｇ）の投与前に連続して５日間、１ｍｌの２０％キシリトール含有／非含有の１０10ｃｆｕ／ｍｌ濃度のＬ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９を胃管栄養によってハムスターに事前に毎日与えた。上述の濃度のＬ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９の投与を、実験の全ての間継続した。７日目に、ハムスターにＣ．ディフィシレＶＰＩ１０４６３１の１０〜３０個の胞子を感染させた。次の５日間、ハムスターの健康状態を追跡し、ＣＤＡＤ：ウェットテイルを示す症状の場合、Ｃ．ディフィシレＡ／Ｂ毒素試験を行った（Ｘ／ｐｅｃｔ  Ｒｅｍｅｌ試験）。Ｃ．ディフィシレＶＰＩ株で感染させたハムスターの群を対照群として利用した。
【０１１８】
【表２１】
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【０１１９】
したがって、Ｃ．ディフィシレ胞子で攻撃する前に、Ｌ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９とキシリトール溶液との組合せを事前に与えた場合に、最大の生存が見出された（表１６）。この場合、生存したハムスター（７／９）において毒素試験は全て陰性であり、すなわちＣ．ディフィシレ胞子の発芽が抑制された。キシリトール単独を適用した場合、生存した動物５匹のうち４匹の毒素試験が陰性であり、１匹の生存した動物でのみ毒素試験が陽性であった。
【０１２０】
したがって、キシリトールとＬ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９との組合せは、毒素を生産することができるＣ．ディフィシレの栄養細胞への胞子発芽を抑制することにより機能する。
【０１２１】
本発明者らは、Ｉｎｄｕｃｉａおよびキシリトールが介入した後でもＣ．ディフィシレの成長が示されるかどうか、さらにＣ．ディフィシレのＡおよびＢ毒素が見出されるかどうか（表１７）を試験した。Ｌ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９およびキシリトールの組合せが事前に与えられた生存したハムスターにおいて、Ｃ．ディフィシレ栄養細胞は、７ケースのうち６ケースで空腸および回腸に見出されなかった（１ケースにおいてのみＣ．ディフィシレの成長が見られた）。空腸および回腸において固有の乳酸杆菌と置き換えられた嫌気性菌およびＬ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９の数が両方とも高かったことから、アンピシリン投与、Ｃ．ディフィシレ胞子での攻撃、ならびにＬ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９およびキシリトールでの処置の使用後に腸の微生物叢が再構築および安定化されたことが示される。
【０１２２】
【表２２】
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【０１２３】
ハムスターの生存率は、Ｌ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９のために２２％高かった（表１６）。これは、大腸の腸内容物に毒素が存在していなかったことによっても証明された（表１７）。
【０１２４】
Ｌ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９の成長は、空腸において高かった（０〜６．０の範囲、中央値４．０ＣＦＵｌｏｇ10／ｇであり、回腸では６．０〜７．６、中央値６．７であった）。Ｌ．プランタルムＩｎｄｕｃｉａ  ＤＳＭ２１３７９は、そのＳＣＦＡプロファイルによれば見たところその酸産生によって作用していた。
Ｃ．ディフィシレに感染したハムスターの形態学的な評価
Ｃ．ディフィシレ感染において毒素による臓器損傷は主要な病原性モジュレーターであることから、ハムスターモデルにおいて典型的なＣＤＡＤ感染をモデル化した。
【０１２５】
本発明者らの研究において、Ｃ．ディフィシレＶＰＩ１０６４３株は毒素ＡおよびＢの両方を有し、これらは肝臓および小腸にも存在する（図２および３）。
【０１２６】
Ｃ．ディフィシレ感染から生存し、病理解剖中に大規模な粘膜損傷が検査されなかったハムスターにおいて、偽膜および多形核細胞での重度の浸潤は見られなかった（図４ａ）。
【０１２７】
死亡する数時間前におけるＣ．ディフィシレ感染により障害を受けたハムスターの特徴的な形態学的発見は、粘膜における多形核細胞の浸潤による炎症および偽膜の存在であった。
【０１２８】
重度の小腸結腸炎は、赤血球および多形核白血球による消化管粘膜、肝臓および脾臓への浸潤を引き起こし、動物は死に至った。臓器では、充血が起こっていた（図５ａ〜ｆ）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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