(57)【要約】  （６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩の含有量が９８．０％以上であり、関連不純物であるＪＫ１２Ａの含有量が０．１％以下であり、５−メチルテトラヒドロプテロイン酸が検出されてはならない、（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩の組成物及びその調製と応用である。
2017526699.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩の含有量が９８．０％以上であり、関連不純物であるＪＫ１２Ａの含有量が０．１％以下であり、５−メチルテトラヒドロプテロイン酸が検出されてはならないことを特徴とする（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩を含有する組成物。
【化１】
2017526699.tif 000023
【請求項２】
（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩の含有量が９９．０％以上であり、関連不純物であるＪＫ１２Ａの含有量が０．１％以下であり、５−メチルテトラヒドロプテロイン酸が検出されてはならず、
（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩の含有量が９９．５％以上であり、関連不純物であるＪＫ１２Ａの含有量が０．１％以下であり、５−メチルテトラヒドロプテロイン酸が検出されてはならないことが好ましく、
（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩の含有量が９９．８％以上であり、関連不純物であるＪＫ１２Ａの含有量が０．０５％以下であり、５−メチルテトラヒドロプテロイン酸が検出されてはならないことがより好ましいことを特徴とする請求項１に記載の（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩を含有する組成物。
【請求項３】
前記（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸塩は、カリウム塩、ナトリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩、亜鉛塩、Ｄ−グルコサミン塩、Ｄ−ガラクトサミン塩又はアルギニン塩から選ばれ、カルシウム塩、Ｄ−グルコサミン塩、Ｄ−ガラクトサミン塩又はアルギニン塩であることが好ましいことを特徴とする請求項１に記載の（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩を含有する組成物。
【請求項４】
（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸塩の粗製品と逆転還元剤とを水中でｐＨ６〜８、温度５０〜９０℃で直接反応させ、或いは超音波存在下で反応させて、反応後に（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸塩組成物が得られる方法Ａ、又は
（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸の粗製品と、逆転還元剤と、対応する塩とを水中でｐＨ６〜８、温度５０〜９０℃で反応させ、或いは超音波存在下で反応させて、反応後に（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸塩組成物が得られる方法Ｂを含み、
前記逆転還元剤は、アスコルビン酸、アスコルビン酸エステル、アスコルビン酸塩、イソアスコルビン酸、イソアスコルビン酸エステル、イソアスコルビン酸塩、メルカプトエタノール、システイン、メルカプトエチルスルホン酸、ジチオスレイトール、還元型グルタチオン又はチオクト酸から選ばれる一種又は複数種であることを特徴とする請求項１又は２に記載の高純度の（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩の組成物の調製方法。
【請求項５】
前記逆転還元剤は、アスコルビン酸、アスコルビン酸エステル、アスコルビン酸塩、イソアスコルビン酸、イソアスコルビン酸エステル又はイソアスコルビン酸塩から選ばれる一種又は複数種であり、アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸カリウム、アスコルビン酸カルシウム、アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム、アスコルビン酸リン酸エステルナトリウム又はイソアスコルビン酸のうちの一種又は複数種であることが好ましく、アスコルビン酸又はイソアスコルビン酸であることが最も好ましく、前記対応する塩は塩化塩であり、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化亜鉛であることが好ましいことを特徴とする請求項４に記載の高純度の（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩の組成物の調製方法。
【請求項６】
前記方法Ａ又はＢの反応過程において、反応温度が６０〜８０℃であり、ｐＨが７〜７．５であり、水酸化ナトリウムでｐＨを調節することが好ましく、水中における逆転還元剤の重量濃度は２％以上であり、２０％以上であることが好ましく、４０％以上であることがより好ましいことを特徴とする請求項４に記載の高純度の（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩の組成物の調製方法。
【請求項７】
主に（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩と安定剤とを含有する固溶体であって、当該固溶体の液体クロマトグラムにおいて、安定剤と（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩の含有量の和が９９．５％より大きく、前記安定剤は、アスコルビン酸、アスコルビン酸エステル、アスコルビン酸塩、イソアスコルビン酸、イソアスコルビン酸エステル、イソアスコルビン酸塩、ジチオスレイトール、還元型グルタチオン又はチオクト酸から選ばれる一種又は複数種であることを特徴とする（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩と安定剤とを含有する固溶体。
【請求項８】
当該固溶体の液体クロマトグラムにおいて、安定剤と（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩の含有量の和は９９．８％より大きく、９９．９％より大きいことが好ましく、前記（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩は請求項１に記載の高純度の（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩であることを特徴とする請求項７に記載の（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩と安定剤とを含有する固溶体。
【請求項９】
前記安定剤は、アスコルビン酸、アスコルビン酸エステル、アスコルビン酸塩、イソアスコルビン酸、イソアスコルビン酸エステル又はイソアスコルビン酸塩から選ばれる一種又は複数種であり、アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸カリウム、アスコルビン酸カルシウム、アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム、アスコルビン酸リン酸エステルナトリウム、イソアスコルビン酸、イソアスコルビン酸ナトリウム、イソアスコルビン酸カリウム、イソアスコルビン酸カルシウム、イソアスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム、イソアスコルビン酸リン酸エステルナトリウムのうちの一種又は複数種であることが好ましく、アスコルビン酸又はイソアスコルビン酸であることがより好ましく、安定剤と（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸塩との重量比は０．２〜１０００：１であり、１〜１０：１であることが好ましいことを特徴とする請求項７に記載の（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩と安定剤とを含有する固溶体。
【請求項１０】
（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸の粗製品又は請求項１に記載の高純度の（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸と、安定剤とを水中でｐＨ３〜５、温度５０〜９０℃で直接反応させ、或いは超音波存在下で反応させて、反応後に固体が析出してそれを分離する方法Ｃ、又は
（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸の粗製品又は請求項１に記載の高純度の（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸と、安定剤と、対応する塩とを水中でｐＨ６〜８、温度５０〜９０℃で反応させ、或いは超音波存在下で反応させて、反応後に固体が析出してそれを分離する方法Ｄを含み、
前記安定剤は、アスコルビン酸、アスコルビン酸エステル、アスコルビン酸塩、イソアスコルビン酸、イソアスコルビン酸エステル、イソアスコルビン酸塩、ジチオスレイトール、還元型グルタチオン又はチオクト酸から選ばれる一種又は複数種であり、前記対応する塩は塩化塩であり、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化亜鉛であることが好ましいことを特徴とする請求項７に記載の（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩と安定剤とを含有する固溶体の調製方法。
【請求項１１】
前記方法Ｃの反応過程において、反応温度が６０〜８０℃であり、ｐＨが３〜４であり、塩酸でｐＨを調節し、方法Ｄの反応過程において、反応温度が６０〜８０℃であり、ｐＨが７〜７．５であり、水酸化ナトリウムでｐＨを調節することを特徴とする請求項１０に記載の（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩と安定剤とを含有する固溶体の調製方法。
【請求項１２】
ａ）請求項１に記載の（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩を含有する組成物、或いは請求項７に記載の（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩と安定剤とを含有する固溶体と、
ｂ）アスコルビン酸、アスコルビン酸エステル、アスコルビン酸塩、イソアスコルビン酸、イソアスコルビン酸エステル、イソアスコルビン酸塩、メルカプトエタノール、システイン、メルカプトエチルスルホン酸、ジチオスレイトール、還元型グルタチオン又はチオクト酸から選ばれる一種又は複数種である還元剤と、を含むことを特徴とする薬物組成物。
【請求項１３】
普通の錠剤、徐放錠剤、放出制御錠剤、発泡錠剤、顆粒剤、普通のカプセル、徐放カプセル、放出制御カプセル、ドライシロップ剤、経口液剤、経口懸濁液、注射剤又は凍結乾燥注射剤であり、還元剤と（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩との重量比は０．２〜１０００：１であり、１〜１０：１であることが好ましいことを特徴とする請求項１２に記載の薬物組成物。
【請求項１４】
請求項１に記載の高純度の（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩、或いは請求項７に記載の（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩と安定剤とを含有する固溶体の、５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩の欠乏に関わる哺乳動物の疾患を治療又は予防する薬物の調製における用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医薬品製剤の分野に属しており、具体的には、（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩の組成物及びその調製方法、高純度の（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩の固溶体組成物及びその調製方法、並びに（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸及びその塩の応用に関する。その応用は、上記の（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩の組成物或いは固溶体を使用することと、薬学上許容される還元性物質を安定剤として添加することと、を含む。このような安全な使用方法は（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸製品に優れた安全性を付与した。
【背景技術】
【０００２】
近年、５−メチルテトラヒドロ葉酸及びその塩の人体の生理活性への影響についての研究はますます多くなっている。それは、人体の葉酸の補給剤として神経学上の疾患の予防及び／又は治療に用いられ、５−フルオロウラシル又はメトトレキサートと組み合わせて腫瘍の治療に応用され、また、病理生理学上の血管と心血管疾患に応用され、重度の鬱病、重度の老人性認知症の治療と補助治療などに応用され、応用の見通しが明るい。
【０００３】
しかし、５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩は、非常に不安定であり、極めて分解し易く、特に酸素と水分に対して高い感受性を示す。したがって、５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩の組成物、例えば医薬品製剤は、一般的に、安定性が悪く、変色し易く、色が濃くなり、含有量が明らかに低下し、分解生成物が増えるという問題がある。
【０００４】
５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその活性単一異性体である（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸の酸化分解について、数多くの論文が既に発表された。あいにく、本発明者の研究によれば、これまでの多くの５−メチルテトラヒドロ葉酸の一次酸化生成物に関する論述は、一面的であり、ひいては間違っている。これらの結論は、５−メチルテトラヒドロ葉酸の品質に対する要求を低めるようにミスリードした。Ｒａｔａｎａｓｔｈｉｅｎ  ＫらのＳｅｒｕｍ  ｆｏｌａｔｅｓ  ｉｎ  ｍａｎ（Ｒａｔａｎａｓｔｈｉｅｎ  Ｋ．，  Ｂｌａｉｒ  Ｊ．Ａ．，  Ｌｅｅｍｉｎｇ  Ｒ．Ｊ．，  Ｃｏｏｋｅ  Ｗ．Ｔ．  ａｎｄ  Ｍｅｌｉｋｉａｎ  Ｖ．  （１９７７）．．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｐａｔｈ．  ３０：  ４３８−４４８）における論述、Ｂｌａｉｒ  Ｊ．ＡらのＡｕｔｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ５−Ｍｅｔｈｙｌ−５，６，７，８−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌｉｃ  ａｃｉｄ（Ｂｌａｉｒ  Ｊ．Ａ．，  Ｐｅａｒｓｏｎ  Ａ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｒｏｂｂ  Ａ．Ｊ．  （１９７５）．．  Ｊ．Ｃ．Ｓ．  Ｐｅｒｋｉｎ  ＩＩ，  ｐ．  １８−２１．）における論述、欧州食品安全機関のＯｐｉｎｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐａｎｅｌ  ｏｎ  Ｆｏｏｄ  Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ，  Ｆｌａｖｏｕｒｉｎｇｓ，  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ａｉｄｓ  ａｎｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｉｎ  Ｃｏｎｔａｃｔ  ｗｉｔｈ  Ｆｏｏｄ  ｏｎ  ａ  ｒｅｑｕｅｓｔ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｌ−Ｍｅｔｈｙｌｆｏｌａｔｅ  Ｑｕｅｓｔｉｏｎ（Ｔｈｅ  ＥＦＳＡ  Ｊｏｕｒｎａｌ  （２００４）  １３５，  １−２０）における論述によれば、５−メチルテトラヒドロ葉酸は、酸化剤の作用でまず５−メチルジヒドロ葉酸に酸化される。
【０００５】
【化１】
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【０００６】
その他の文献には、一次酸化生成物は４−ヒドロキシ−５−メチルテトラヒドロ葉酸であると定められている。この生成物は、その構造により、毒性と副作用を有していないと推断される。
【０００７】
本発明者は、効率のよい方法を開発して、まず高純度の５−メチルテトラヒドロ葉酸の一次酸化生成物を調製し、且つ一連の研究（ＰＣＴ／ＣＮ２０１３／０７３９５９）を行った結果、予想外に、５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩類の一次酸化生成物がＪＫ１２Ａであることを見出した。その構造式は以下のとおりである。
【０００８】
【化２】
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【０００９】
ＪＫ１２Ａとは、５−メチルテトラヒドロ葉酸の一次酸化生成物を指す。本発明の検出条件で、具体的な条件の差異によって、それとメインピークの相対保持時間は０．３６程度である。関連文献には、それを５−メチル−ジヒドロ葉酸又は４−ヒドロキシ−５−メチル−テトラヒドロ葉酸と称する。
【００１０】
これは新たな構造を有する生成物である。この発見は、上記文献における結論を含むこれまでの結論を覆した。一般的には、構造上の大きな変化は、生理活性の大きな変化を引き起こす。その後の研究により、ＪＫ１２Ａが顕著なＴリンパ球増殖抑制作用を有することを見出した。一般的には、これはヒトの免疫力の低下をもたらすと考えられる。
【００１１】
【表１】
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【００１２】
ＪＫ１２Ａに対する急性毒性研究により、２０００ｍｇ／ｋｇの投与量で、被験体であるラットがいずれも１分間以内にその場で死亡したが、それを解剖した結果、肝臓と腎臓に著しい変化が見られておらず、よって、当該化合物は、その他の毒性ターゲットがあり、かつ急性毒性が著しい可能性があることを見出した。
【００１３】
本発明者の研究により、５−メチルテトラヒドロプテロイン酸が、５−メチルテトラヒドロ葉酸生成物における別の普通の不純物であり、ＪＫ１２Ａの形成に類似して、当該不純物が酸化された後、以下の構造を有するＪＫ１３０３になることを見出した。
【００１４】
【化３】
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【００１５】
その後の研究により、ＪＫ１３０３が強い腎毒性を有することを見出した。ラットに対して、１０００ｍｇ／ｋｇの投与量で、ＪＫ１３０３を単回投与し、１４日後にラットの腎細管がひどく壊死し、それを解剖した結果、その腎細管に大量の空胞が現れたことを見出した。同様に、５−メチルテトラヒドロプテロイン酸の一次酸化生成物の毒性も非常に著しく変化した。
【００１６】
以上の実験により、５−メチルテトラヒドロ葉酸及びその塩を含む製品において、５−メチルテトラヒドロ葉酸及びその塩の酸化分解による不純物であるＪＫ１２Ａ、５−メチルテトラヒドロプテロイン酸の酸化生成物であるＪＫ１３０３がいずれも人体に著しく有害なものであることを無視できず、かつ無視してはならないことが明らかになる。したがって、５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩の安全で信頼できる応用手段を開発することはまことに必要となる。
【００１７】
特許ＣＮ１０２６１２３５８には、結晶５−メチルテトラヒドロ葉酸塩をワックスで包み込むことでその安定性を向上させる、５−メチルテトラヒドロ葉酸塩を含む安定化された顆粒剤が開示されている。
【００１８】
特許ＣＮ１０２８１３６５６には、メルカプトを含まないアミノ酸を一種又は多種含有することで安定性を向上させる、５−メチルテトラヒドロ葉酸塩を含む安定化された組成物が開示されている。
【００１９】
特許ＵＳ６４４１１６８には、５−メチルテトラヒドロ葉酸カルシウムをある結晶形に調製することでその安定性を著しく向上させることが開示されている。しかし、当該結晶形は、粒度が大きく、溶解速度が遅く、製剤の生産過程において常に予め研磨する必要があるので、５−メチルテトラヒドロ葉酸が酸化されるリスクを高める傾向にある。
【００２０】
特許ＣＮ２０１２０８６７９４には、（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸カルシウムの新たな結晶形が開示されている。当該結晶形は、化学的安定性が良好であると同時に、溶解性能も顕著に向上し、製剤の生産過程において研磨する必要がなくなる。しかし、ＪＫ１２Ａなどの不純物の含有量が依然として高く、且つ時間が経つにつれて、これらの不純物の量もだんだん増えていく。
【００２１】
また、その他の文献には、セルロース、セラックなどの材料でマイクロカプセルを製造して５−メチルテトラヒドロ葉酸を包み込むことで、製剤製品における活性成分である５−メチルテトラヒドロ葉酸の安定性を向上させることが開示されている。
【００２２】
しかしながら、これらのすべての手段は相変わらずＪＫ１２Ａを十分に安全なレベルに制御できない。実験により検出した結果、現在市販されている５−メチルテトラヒドロ葉酸の原薬グレードの製品において、結晶形態の５−メチルテトラヒドロ葉酸における不純物の総量が一般的に１〜４％であり、ＪＫ１２Ａが０．３〜３．０％に達しており、また、市販されている無定形の製品において、不純物の総量がひいては１０％以上に達しており、医薬品の安全使用に重大な脅威を与える。これらの事実は、現在、これらのすべての原薬製品におけるＪＫ１２Ａを含む不純物は正しく取り扱われていないことを示した。高い化学的不安定性により、応用の際に投与量を正確に制御することも難しい。例えば、０．４５１ｍｇという通常の投与量で、その不安定性は実際の投与量の大きなずれを引き起こしやすい。
【発明の概要】
【００２３】
本発明の目的は、従来技術に基づいて、高純度の（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩を含有する組成物及びその調製方法を提供することにある。
【００２４】
本発明の別の目的は、（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩と安定剤とを含有する固溶体及びその調製方法を提供することにある。
【００２５】
本発明の第３の目的は、高純度の（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩を含有するか、或いは前記固溶体を含有する薬物組成物を提供することにある。
【００２６】
本発明の第４の目的は、高純度の（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩、或いは（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩と安定剤とを含有する固溶体の医薬用途を提供することにある。
【００２７】
本発明の目的は、以下の手段で達成できる。
（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩の含有量が９８．０％以上であり、関連不純物であるＪＫ１２Ａの含有量が０．１％以下であり、５−メチルテトラヒドロプテロイン酸が検出されてはならない、（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩を含有する組成物である。
【００２８】
【化４】
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【００２９】
本発明に係る（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩を含有する組成物における主な物質は（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩である。当該組成物における（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩の含有量は（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩の質量含有量或いはＨＰＬＣ含有量であり、一般的には、質量含有量である。
【００３０】
一局面において、当該組成物における（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩の含有量が９９．０％以上であり、関連不純物であるＪＫ１２Ａの含有量が０．１％以下であり、５−メチルテトラヒドロプテロイン酸が検出されてはならない。
【００３１】
別の局面において、当該組成物における（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩の含有量が９９．５％以上であり、関連不純物であるＪＫ１２Ａの含有量が０．１％以下であり、５−メチルテトラヒドロプテロイン酸が検出されてはならない。
【００３２】
別の局面において、当該組成物における（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩の含有量が９９．８％以上であり、関連不純物であるＪＫ１２Ａの含有量が０．０５％以下であり、５−メチルテトラヒドロプテロイン酸が検出されてはならない。
【００３３】
本発明における（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸塩は、カリウム塩、ナトリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩、亜鉛塩、Ｄ−グルコサミン塩、Ｄ−ガラクトサミン塩又はアルギニン塩から選ばれ、カルシウム塩、Ｄ−グルコサミン塩、Ｄ−ガラクトサミン塩又はアルギニン塩であることが好ましい。
【００３４】
（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸塩の粗製品と逆転還元剤とを水中でｐＨ６〜８、温度５０〜９０℃で直接反応させ、或いは超音波存在下で反応させて、反応後に（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸塩組成物が得られる方法Ａ、又は
（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸の粗製品と、逆転還元剤と、対応する塩とを水中でｐＨ６〜８、温度５０〜９０℃で反応させ、或いは超音波存在下で反応させて、反応後に（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸塩組成物が得られる方法Ｂを含み、
方法Ａ又は方法Ｂにおける逆転還元剤は、アスコルビン酸、アスコルビン酸エステル、アスコルビン酸塩、イソアスコルビン酸、イソアスコルビン酸エステル、イソアスコルビン酸塩、メルカプトエタノール、システイン、メルカプトエチルスルホン酸、ジチオスレイトール、還元型グルタチオン又はチオクト酸から選ばれる一種又は複数種である、前記（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩の組成物の調製方法である。
【００３５】
好ましい局面において、方法Ａ又は方法Ｂにおける逆転還元剤は、アスコルビン酸、アスコルビン酸エステル、アスコルビン酸塩、イソアスコルビン酸、イソアスコルビン酸エステル又はイソアスコルビン酸塩から選ばれる一種又は複数種であり、アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸カリウム、アスコルビン酸カルシウム、アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム、アスコルビン酸リン酸エステルナトリウム又はイソアスコルビン酸のうちの一種又は複数種であることが好ましく、アスコルビン酸又はイソアスコルビン酸であることが最も好ましい。前記対応する塩は塩化塩であり、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化亜鉛であることが好ましい。
【００３６】
好ましい局面において、前記方法Ａ又はＢの反応過程において、反応温度が６０〜８０℃であり、ｐＨが７〜７．５であり、水酸化ナトリウムでｐＨを調節することが好ましい。水中における逆転還元剤の重量濃度は２％以上であり、２０％以上であることが好ましく、４０％以上であることがより好ましい。
【００３７】
主に（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩と安定剤とを含有する固溶体であって、当該固溶体の液体クロマトグラムにおいて、安定剤と（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩の含有量の和が９９．５％より大きく、前記安定剤は、アスコルビン酸、アスコルビン酸エステル、アスコルビン酸塩、イソアスコルビン酸、イソアスコルビン酸エステル、イソアスコルビン酸塩、ジチオスレイトール、還元型グルタチオン又はチオクト酸から選ばれる一種又は複数種である、（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩と安定剤とを含有する固溶体である。
【００３８】
好ましい局面において、（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩と安定剤とを含有する固溶体の液体クロマトグラムにおいて、安定剤と（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩の含有量の和は９９．８％より大きく、９９．９％より大きいことが好ましく、前記（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩は請求項１に記載の高純度の（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩である。
【００３９】
好ましい局面において、前記安定剤は、アスコルビン酸、アスコルビン酸エステル、アスコルビン酸塩、イソアスコルビン酸、イソアスコルビン酸エステル又はイソアスコルビン酸塩から選ばれる一種又は複数種であり、アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸カリウム、アスコルビン酸カルシウム、アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム、アスコルビン酸リン酸エステルナトリウム、イソアスコルビン酸、イソアスコルビン酸ナトリウム、イソアスコルビン酸カリウム、イソアスコルビン酸カルシウム、イソアスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム、イソアスコルビン酸リン酸エステルナトリウムのうちの一種又は複数種であることが好ましく、アスコルビン酸又はイソアスコルビン酸であることがより好ましい。安定剤と（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸塩との重量比は０．２〜１０００：１であり、１〜１０：１であることが好ましい。
【００４０】
（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸の粗製品又は請求項１に記載の高純度の（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸と、安定剤とを水中でｐＨ３〜５、温度５０〜９０℃で直接反応させ、或いは超音波存在下で反応させて、反応後に固体が析出してそれを分離する方法Ｃ、又は
（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸の粗製品又は請求項１に記載の高純度の（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸と、安定剤と、対応する塩とを水中でｐＨ６〜８、温度５０〜９０℃で反応させ、或いは超音波存在下で反応させて、反応後に固体が析出してそれを分離する方法Ｄを含み、
前記安定剤は、アスコルビン酸、アスコルビン酸エステル、アスコルビン酸塩、イソアスコルビン酸、イソアスコルビン酸エステル、イソアスコルビン酸塩、ジチオスレイトール、還元型グルタチオン又はチオクト酸から選ばれる一種又は複数種であり、前記対応する塩は塩化塩であり、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化亜鉛であることが好ましい、前記（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩と安定剤とを含有する固溶体の調製方法である。
【００４１】
好ましい局面において、前記方法Ｃの反応過程において、反応温度が６０〜８０℃であり、ｐＨが３〜４であり、塩酸でｐＨを調節し、或いは、方法Ｄの反応過程において、反応温度が６０〜８０℃であり、ｐＨが７〜７．５であり、水酸化ナトリウムでｐＨを調節する。
ａ）前記（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩を含有する組成物、或いは前記（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩と安定剤とを含有する固溶体と、
ｂ）アスコルビン酸、アスコルビン酸エステル、アスコルビン酸塩、イソアスコルビン酸、イソアスコルビン酸エステル、イソアスコルビン酸塩、メルカプトエタノール、システイン、メルカプトエチルスルホン酸、ジチオスレイトール、還元型グルタチオン又はチオクト酸から選ばれる一種又は複数種である還元剤と、を含む薬物組成物である。
【００４２】
一局面において、当該薬物組成物は普通の錠剤、徐放錠剤、放出制御錠剤、発泡錠剤、顆粒剤、普通のカプセル、徐放カプセル、放出制御カプセル、ドライシロップ剤、経口液剤、経口懸濁液、注射剤又は凍結乾燥注射剤である。
【００４３】
一局面において、当該薬物組成物における還元剤と（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩との重量比は０．２〜１０００：１であり、１〜１０：１であることが好ましい。
【００４４】
本発明の、高純度の（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩、或いは前記（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩と安定剤とを含有する固溶体の、５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩の欠乏に関わる哺乳動物の疾患を治療又は予防する薬物の調製における用途である。
【００４５】
用語の解釈：
特に断らない限り、本発明の出願書類において使用される以下の用語は以下の意味を持つ。
【００４６】
逆転：（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸及びその塩における不純物であるＪＫ１２Ａが（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸及びその塩に還元し、ＪＫ１３０３が５−メチルテトラヒドロプテロイン酸に還元する現象である。
【００４７】
塩析：固体を溶質とする溶液に一定の濃度の中性塩を添加することで結晶を改善する方法であり、いつも収率と品質を高めることができる。
【００４８】
固溶体：一種又は多種の固体が別の種類の固体に均一に分散して形成された混合物である。
【００４９】
関連物質：（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸及びその塩の生産、使用、貯蔵過程において入り、生じた不純物であり、４−アミノベンゾイルグルタミン酸、ＪＫ１２Ａ、（６Ｓ）−Ｍｅｆｏｘ、ピラジノトリアジン誘導体、テトラヒドロ葉酸、７，８−ジヒドロ葉酸、葉酸、５，１０−メチルテトラヒドロ葉酸、５−メチルテトラヒドロプテロイン酸、Ｎ２−メチルアミノ−テトラヒドロ葉酸とそれらの塩を含む。
【００５０】
純度：液体クロマトグラムにおいて、（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸のピーク面積が（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸とすべての関連物質のピーク面積の総和に占める割合である。
【００５１】
含有量：特に断らない限り、本明細書で言う含有量とは、一般的に、物質の質量含有量を指す。
【００５２】
これまでの研究や報告では、（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸溶液にメルカプトエタノール、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムなどのような脱酸素剤を若干添加して酸素ガスを除去することで、持続的な酸化分解を阻止することを試みた。彼たちの結論は、生産においてこれらの物質を応用することが実行できず、応用する必要もないことである。これらの研究においては、低濃度の還元剤を使用すれば脱酸素の目的を達成できる。しかし、このような濃度では本願に記載される酸化による不純物の十分な逆転を実現できない。金康の手段において、高濃度の還元剤を使用することでこの状況を変えた。
【００５３】
本発明者は、濃度が高く、還元性が適度である還元剤を使用することで、大部分の酸化分解による不純物、例えばＪＫ１２Ａが（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸に逆転し、ＪＫ１３０３が５−メチルテトラヒドロプテロイン酸に逆転することを実現できることを不思議に見出した。その後の塩析作用で高純度の（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸塩が析出でき、これにより、高い収率で思いがけない高純度が得られた。これは従来の文献に報告されていないことである。
【００５４】
【化５】
2017526699.tif 000008
【００５５】
この方法により、純度が９８．０％を超え、ひいては１００．０％に近い（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸及びその塩を調製でき、ＪＫ１２Ａ、ＪＫ１３０３、５−メチルテトラヒドロプテロイン酸を含む関連不純物の量がいずれも大幅に低下し、ひいては液体クロマトグラフの検出限界よりも低くなっている。これは従来技術で実現できないことである。
【００５６】
高純度の（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸及びその塩の調製の実現の重要な意義は、製造技術上の顕著な進歩であるだけでなく、肝心なのは、従来の、研究不足による（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸及びその塩の品質要求に対するミスリードが招いた結果を修正し、回避したことである。（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸の使用量がだんだん増えるにつれて、この意義はより明らかになる。以下のデータはこのことを説明できる。これまでに公開されている急性毒性試験に関するデータによれば、（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸カルシウムのラットＬＤ５０（半数致死量）は２０００ｍｇ／ｋｇであり、本発明者の技術を採用して有害な不純物を抑制した製品については、対照試験において１５０００ｍｇ／ｋｇの投与量でラットはいずれも異常な反応がないので、ＭＴＤ（最大耐量）が１５ｇ／ｋｇより大きいという結論しか得られない。新たな技術の製品の安全性に対する貢献は、いうまでもない。
【００５７】
また、本発明は、（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩の粗製品を予め水又は水含有溶剤に溶解させ、逆転還元剤で処理し、酸化分解による不純物の大部分を（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸塩に逆転させ、次に、塩析作用又はその他の方法により高純度の（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩を析出させる、（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩の組成物の調製方法を提供する。
【００５８】
本発明で用いられる逆転還元剤について、上述したとおり、酸化による不純物の逆転に用いられる当該逆転還元剤は適度な還元性を有する必要があり、還元性が高すぎると、還元分解を引き起こし、低すぎると、効果を得られない。
【００５９】
一実施形態では、方法Ａ、方法Ｂ及び上記組成物の調製において、溶剤における逆転還元剤の重量濃度は２％以上であり、２０％以上であることが好ましく、４０％以上であることがより好ましい。
【００６０】
上記に使用される塩析という用語は、生化学上の通常の意味と少し異なっているが、結晶の収率を向上させることができ、結晶の母液の、不純物への濃縮効果を強めることで製品の純度を思いがけない高度に達させるという類似する効果がある。
【００６１】
本発明に記載される塩析作用を果たす塩析剤は、上述の還元剤以外に、通常の塩類であってもよい。例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウムなどの中性無機塩を添加することにより塩析作用を果たす。本発明では、還元剤の濃度を高めることで塩析の効果を達成することが好ましい。
【００６２】
一方、本発明が提供する（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩と安定剤とで構成される固溶体は、その液体クロマトグラムにおいて、安定剤と（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸塩の含有量の和が９９．５％より大きく、９９．８％より大きいことが好ましく、９９．９％より大きいことがより好ましい。上記含有量は、液体クロマトグラムにおけるピーク面積から計算される。
【００６３】
固溶体は、均一性に優れた分散形式として、本発明の活性成分を効果的に保護することができる。
【００６４】
本発明における固溶体により、（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸と安定剤が高い均一性を保持しており、安定効果を確保できる。典型的な実施例では、（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸カルシウムはＣ型結晶であり、顆粒が均一で細かく、粒度分布の範囲が狭く、安定剤と共に均一性が高い固溶体を形成できる。これは従来技術で実現し難いことである。
【００６５】
好ましい実施形態では、本発明に記載される固溶体は、（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸及びその塩とアスコルビン酸や、イソアスコルビン酸や、チオクト酸や、還元型グルタチオンや、ジチオスレイトール及びそれらの塩との固溶体である。
【００６６】
典型的な場合に、本発明により調製された固溶体は、そのＨＰＬＣクロマトグラムにおいて、典型的な吸収ピークを二つしか有しておらず、高い純度を示す。
【００６７】
安定剤と（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸が固溶体に均一に分散することにより、安定効果をより良く発揮できる。
【００６８】
本発明における固溶体製品には、安定剤を追加でき、必要に応じてその他の助剤も添加できる。
【００６９】
また、本発明は、（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩を予め水又は水含有溶剤に溶解させ、安定剤を入れて不純物を逆転させてから、安定剤を（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸及びその塩と共に析出させ、濾過し、乾燥し、さらに、（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸と安定剤を水に分散させ、水酸化ナトリウムを滴下して撹拌し、溶解させ、次に、対応する塩を入れて晶析させ、濾過し、乾燥する固溶体の別の調製方法を提供する。
【００７０】
また、本発明は、ａ．前記（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩を含有する組成物、或いは前記固溶体を使用することと、ｂ．薬学上許容される還元性物質を安定剤として添加することと、を含む（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩の安全な使用方法をさらに提供する。
【００７１】
好ましい（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩の安全な使用方法において、前記安定剤は、アスコルビン酸及びそのエステルと塩、イソアスコルビン酸及びそのエステルと塩、ジチオスレイトール、還元型グルタチオン、チオクト酸から選ばれ、アスコルビン酸及びそのエステルと塩、イソアスコルビン酸及びそのエステルと塩であることが好ましく、アスコルビン酸とイソアスコルビン酸のナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム、アスコルビン酸リン酸エステルナトリウムであることがより好ましく、アスコルビン酸とイソアスコルビン酸であることが最も好ましい。
【００７２】
好ましい（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩の安全な使用方法において、安定剤と（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸は以下のように組み合わせる。固体で直接混合するか、或いは溶液に溶解させてから共に析出させるか、或いは共晶又は固溶体に調製する。固溶体に調製することが好ましい。
【００７３】
上記（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩の安全な使用方法において、安定剤の使用により、（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸及びその塩の酸化が中断された。この手段により、ＪＫ１２Ａ及びその他の有害な分解生成物の人体への悪い影響を効果的に抑制でき、応用する投与量を正確に制御できる。当該安全な使用方法も金康の手段（ＭＥＴＨＯＤ  ＪＫ）と称される。金康の手段において、二つの部分を単独で使用しても、（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸製品の安全特性を改善できる。
【００７４】
好ましい（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩の安全な使用方法において、前記安定剤と（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸の重量比が０．２〜１０００：１であり、１〜１０：１であることがより好ましい。
【００７５】
本発明に記載される安全な使用方法において、好ましい実施形態は以下のとおりである。アスコルビン酸及びその塩を同時に前記還元剤、塩析剤、安定剤として用いる。言い換えれば、アスコルビン酸及びその塩は、酸化による不純物の逆転を実現する還元剤であると同時に、精製過程における塩析剤でもあり、同時に、（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸の安定剤でもある。調製過程において残されたアスコルビン酸及びその塩は特に除去する必要がない。その後の過程において、必要に応じて必要な量のアスコルビン酸を添加すればよい。同様に、還元型グルタチオン、チオクト酸及びその単一異性体、ジチオスレイトール、イソアスコルビン酸などのいずれを使用しても、類似した効果を達成できる。論理的には、これらの物質は、還元剤、塩析剤、安定剤として単独で用いられることも適切である。
【００７６】
前記（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩の安全な使用方法は、（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸の単剤又はそれとその他の活性成分とで構成された合剤に適用する。普通の錠剤、徐放錠剤、放出制御錠剤、発泡錠剤、顆粒剤、普通のカプセル、徐放カプセル、放出制御カプセル、ドライシロップ剤、経口液剤、経口懸濁液、注射剤、凍結乾燥注射剤などが好ましい。普通の錠剤、普通のカプセル、経口液剤、注射剤、凍結乾燥注射剤がより好ましい。
【００７７】
前記（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩の安全な使用方法は、５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩の欠乏に関わる哺乳動物の疾患を治療又は予防する薬物の調製における用途がある。
【００７８】
また、本発明は、（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩の安全な使用方法の、５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩の欠乏に関わる哺乳動物の疾患を治療又は予防する薬物の調製における用途を提供する。５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩の欠乏に関わる疾患は、例えば、認知症と空胞性脊髄症に関わる亜急性脳炎、脳葉酸欠乏症；早発閉塞性動脈疾患、嬰児期と児童期のひどい血管疾患、進行性動脈狭窄、間歇性跛行、腎血管性高血圧、虚血性脳血管疾患、早発性網膜動脈・網膜静脈閉塞症、脳閉塞性動脈疾患、閉塞性末梢動脈疾患、血栓塞栓疾患及び／又は虚血性心臓病による早期死亡のような病理生理学上の血管と心血管疾患；乾癬、セリアック病、関節炎と炎症病状のような自己免疫疾患；葉酸塩の欠乏による巨赤芽球性貧血、腸吸収不良；鬱病を含み、また、メトトレキサート、ピリメタミン又はトリメトプリムなどのような葉酸拮抗剤の解毒剤として用いられ、過剰又は多い投与量のメトトレキサートによる治療後に生じた強い毒性作用を予防するために用いられ、女性の流産及び／又は神経管の欠陥、唇裂の欠陥及び／又は口蓋裂の欠陥を有する胎児の出産のリスクを低減するために用いられ、ホモシステインの正常のレベル及び／又は代謝を保持するために用いられ、ＤＮＡとＲＮＡの合成及び／又は機能及び／又は変化の変更、細胞合成の変更に用いられる。
【００７９】
本発明に記載される還元剤、塩析剤、安定剤の選択原則としては、まずは、化学的に安全であり、製品の分解を引き起こさないことであり、次は、生理上で比較的に安全であることであり、食品と医薬の分野で安全性が十分に検証された物質を優先的に選択する。還元剤、塩析剤、安定剤の用量について、いずれも最低用量を超える必要があり、さもないと、不純物が十分に還元できず、塩析効果又は／及び安定効果が良くない結果になる可能性があることが理解できる。また、一般的に、還元剤、安定剤の用量には厳しい上限がないことも理解できる。
【００８０】
本発明に記載される（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸及びその塩における不純物は、ＪＫ１２Ａ、５−メチルテトラヒドロプテロイン酸がある。それらの構造はそれぞれ以下のとおりである。
【００８１】
【化６】
2017526699.tif 000009
【００８２】
その中の５−メチルテトラヒドロプテロイン酸は、酸化されると、強い腎毒性を有するＪＫ１３０３に高い収率で転化できるので、厳しく制御する必要もある。
【００８３】
本発明は以下のような有益な効果を持っている。本発明は、高純度の（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩及びその調製方法、高純度の（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩の固溶体及びその調製方法、並びに（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸及びその塩の安全な使用方法を提供し、これらの実施形態では、いずれも薬学上許容される還元剤の巧みな利用により、（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩の製品に生じうる有害な化学品を製品自体に逆転させることで、（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩の製品の安全使用という目的を達成する。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】ＪＫ１３０３を投与してから１４日後にラットの腎細管がひどく壊死した後に大量の空胞が現れたことを示す解剖図の部分拡大図である。
【発明を実施するための形態】
【００８５】
本発明の手段をより良く理解するために、以下、本発明の具体的な実施例を参照しながら本発明の手段をさらに説明するが、本発明はこれらの実施例によって制限されるものではない。
【００８６】
本発明のＨＰＬＣ検出条件は以下のとおりである。
【００８７】
【表２】
2017526699.tif 000010
【００８８】
移動相の調製：
移動相Ａ：ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏを７．８０ｇ秤量し、水１０００ｍｌに溶解させ、３２％ＮａＯＨ溶液でｐＨを６．５に調節する。
【００８９】
移動相Ｂ：ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏを５．０７ｇ秤量し、水６５０ｍｌに溶解させ、メタノール３５０ｍｌを入れて、３２％ＮａＯＨ溶液でｐＨを８．０に調節する。
【００９０】
【表３】
2017526699.tif 000011
【００９１】
サンプル溶液の調製：サンプルを適量取り、２〜８℃の温度で低温の水（窒素ガスの保護下で亜硫酸ナトリウムを加えて蒸留し、収集して保存し、２〜８℃まで放冷する）に窒素雰囲気下で溶解させ、濃度約０．５ｍｇ／ｍｌの溶液とし、調製した後にすぐ使う。
【００９２】
本発明のいくつかの実施例では、超音波を補助手段として使うことで、逆転と結晶の速度を著しく高めることができる。
【００９３】
主な問題を説明しやすくするために、実施例における検出データは、５−メチルテトラヒドロ葉酸及びその塩並びにその関連物質のみに関する。
【実施例１】
【００９４】
ＪＫ１２Ａの調製
窒素ガスの保護下で、６Ｓ−５−メチルテトラヒドロ葉酸１０ｇを取って反応フラスコに入れ、水８０ｇを入れ、撹拌しながら１０％水酸化ナトリウムで溶液のｐＨを７．３に調節し、清澄になるまで固体が完全に溶解した後に、活性炭５ｇを入れ、蓋を閉じずに撹拌して一夜反応させた。ＨＰＬＣで原料の反応が終了したことが検出された後に、濾過し、５０％の酢酸で濾液のｐＨを４．０に調節し、結晶を析出させ、濾過し、ケーキをそれぞれエタノール、アセトンで洗浄し、真空乾燥して、化学的純度が９９．４２％である黄色固体ＪＫ１２Ａ６．０ｇが得られた。
【実施例２】
【００９５】
５−メチルテトラヒドロプテロイン酸の調製
６Ｓ−５−メチルテトラヒドロ葉酸６１ｇを２５％水酸化ナトリウムの水溶液６００ｍｌに徐々に入れ、還流温度まで昇温し、一夜反応させ、原料の反応が終了した後に、室温まで降温し、濾過して不純物を除去し、濾液のｐＨを濃硫酸で９〜１０に調節し、不純物を析出させ、１０〜１５℃まで降温し、濾過し、引き続き濾液のｐＨを濃硫酸で２に調節し、固体を析出させ、６０℃で３０分間撹拌し、熱いうちに濾過し、水洗し、乾燥して、純度が９６％である白色固体４４ｇが得られた。
【実施例３】
【００９６】
ＪＫ１３０３の調製
６Ｓ−５−メチルテトラヒドロプテロイン酸５ｇを取って三つ口フラスコに投入し、水５０ｇを入れ、十分に撹拌し、１０％水酸化ナトリウム溶液でｐＨを９．０に調節し、清澄になるまで完全に溶解した後に、活性炭３ｇを入れ、酸素ガスボールを閉鎖し、撹拌して一夜経つと濾過し、ケーキを水で洗浄し、濾液のｐＨを５０％の酢酸水溶液で４に調節し、撹拌して３０分間晶析させ、濾過し、ケーキを水で二回洗浄し、アセトン３０ｍｌで二回叩解し、３０℃で真空乾燥して、ＨＰＬＣ純度が９４．３％である生成物３．０４ｇが得られた。
【実施例４】
【００９７】
ＪＫ１２Ａの逆転
ＪＫ１２Ａ（ＨＰＬＣ：９５．９１％）０．１ｇを取り、水１０ｇを入れて、撹拌しながら１０％水酸化ナトリウムでｐＨを７．２に調節し、固体を全部溶解させた。次に、ジチオスレイトール０．８ｇを徐々に入れて、１時間撹拌した後に、サンプリングして検出した結果、反応液における５−メチルテトラヒドロ葉酸が９７．５３％であり、０．７２％のＪＫ１２Ａが残っている。
【実施例５】
【００９８】
ＪＫ１２Ａの逆転
ＪＫ１２Ａ（ＨＰＬＣ：９５．９１％）０．１ｇを取り、水１０ｇを入れて、撹拌しながら１０％水酸化ナトリウムでｐＨを７．２に調節し、固体を全部溶解させた。次に、システイン０．５ｇを徐々に入れて、１時間撹拌した後に、サンプリングして検出した結果、反応液における５−メチルテトラヒドロ葉酸が９６．６４％であり、０．８５％のＪＫ１２Ａが残っている。
【実施例６】
【００９９】
ＪＫ１２Ａの逆転
ＪＫ１２Ａ（ＨＰＬＣ：７４．０４％）０．１ｇ、メルカプトエタノール０．２ｇを取り、水５ｍｌに入れ、撹拌しながら３０％水酸化ナトリウムでｐＨを７．５に調節し、溶解させた。引き続き１時間撹拌した後に、サンプリングして検出した結果、反応液における５−メチルテトラヒドロ葉酸が６０．９２％であり、０．５９％のＪＫ１２Ａが残っている。
【実施例７】
【０１００】
ＪＫ１２Ａの逆転
ＪＫ１２Ａ（ＨＰＬＣ：７４．０４％）０．１ｇ、メルカプトエチルスルホン酸ナトリウム０．２ｇを取り、水５ｍｌに入れ、撹拌しながら３０％水酸化ナトリウムでｐＨを７．５に調節し、溶解させた。引き続き１時間撹拌した後に、サンプリングして検出した結果、反応液における５−メチルテトラヒドロ葉酸が７２．８５％であり、０．６１％のＪＫ１２Ａが残っている。
【実施例８】
【０１０１】
６（Ｓ）−ＭｅｆｏｘとＪＫ１２Ａとの混合物の調製と転化
窒素ガスの保護下で、６Ｓ−５−メチルテトラヒドロ葉酸１ｇを取って反応フラスコに入れ、水８ｇを入れ、撹拌し、１０％水酸化ナトリウムで溶液のｐＨを７．３に調節し、清澄になるまで固体が完全に溶解した後に、活性炭３ｇを入れ、蓋を閉じずに撹拌して１０時間反応させ、ＨＰＬＣで反応液の検出を行い（５−メチルテトラヒドロ葉酸：１２．２０％、ＪＫ１２Ａ：８３．５１％、６（Ｓ）−Ｍｅｆｏｘ：０．５７％）、濾過し、濾液にアスコルビン酸１０ｇを入れ、水酸化ナトリウム溶液でｐＨを７．０に調節して保持し、６０℃で３時間撹拌し、サンプリングして反応液の検出を行った（５−メチルテトラヒドロ葉酸：９６．４９％、ＪＫ１２Ａ：０％、６（Ｓ）−Ｍｅｆｏｘ：０％）。
【実施例９】
【０１０２】
ＪＫ１３０３の逆転
ＪＫ１３０３（ＨＰＬＣ：９６．７％）０．１ｇを取り、水１０ｇを入れ、撹拌しながら１０％水酸化ナトリウムでｐＨを７．０に調節し、固体を全部溶解させた。次に、アスコルビン酸ナトリウム１ｇを徐々に入れ、１時間撹拌した後に、サンプリングして検出した結果、反応液における５−メチルテトラヒドロプテロイン酸が９６．６％であり、ＪＫ１３０３が残っていない。
【実施例１０】
【０１０３】
６Ｓ−５−メチルテトラヒドロ葉酸カルシウム組成物
水５０ｍｌ、アスコルビン酸５０ｇを水酸化ナトリウムでｐＨ７．０になるように中和し、透明になるまで溶解させた。６Ｓ−５−メチルテトラヒドロ葉酸カルシウムの粗製品１ｇを分割添加した。６５℃で２時間超音波をかけ、濾過し、洗浄し、真空乾燥して、６Ｓ−５−メチルテトラヒドロ葉酸カルシウム組成物０．７２ｇが得られた。
【０１０４】
【表４】
2017526699.tif 000012
【０１０５】
含有量は質量含有量であり、以下は同様である。
【実施例１１】
【０１０６】
６Ｓ−５−メチルテトラヒドロ葉酸カルシウム組成物
６Ｓ−５−メチルテトラヒドロ葉酸１５ｇ、アスコルビン酸１５０ｇを水２２５ｍｌに入れ、３０％の水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７．０になるように中和し、溶解させた。１時間撹拌した後に、４０％の塩化カルシウム水溶液１５ｇを入れ、７０℃で超音波をかけて晶析させ、３時間後に白色顆粒が析出し、それを濾過し、次に水洗し、ケーキを真空乾燥して、６Ｓ−５−メチルテトラヒドロ葉酸カルシウムの固体組成物１０．１ｇが得られた。
【０１０７】
【表５】
2017526699.tif 000013
【実施例１２】
【０１０８】
６Ｓ−５−メチルテトラヒドロ葉酸カルシウム組成物
６Ｓ−５−メチルテトラヒドロ葉酸１ｇ、アスコルビン酸１ｇ、ＮａＣｌ０．５ｇを水１０ｍｌに入れ、３０％の水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７．０になるように中和し、溶解させた。１時間撹拌した後に、４０％の塩化カルシウム水溶液１ｇを入れ、７０℃で超音波をかけ、１時間後に固体が析出し、それを濾過し、洗浄し、ケーキを真空乾燥し、６Ｓ−５−メチルテトラヒドロ葉酸カルシウムの固体組成物０．５２ｇが得られた。
【０１０９】
【表６】
2017526699.tif 000014
【実施例１３】
【０１１０】
６Ｓ−５−メチルテトラヒドロ葉酸カルシウム組成物
６Ｓ−５−メチルテトラヒドロ葉酸０．５ｇ、アスコルビン酸１０ｍｇ、塩化ナトリウム０．１ｇを水１０ｍｌに入れ、３０％の水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７．５になるように中和し、透明になるまで溶解させた。窒素ガスの保護下で、１時間撹拌し、さらに、２０％の塩化カルシウム水溶液１ｇを入れ、７０℃で超音波で晶析させる段階に入り、１時間後に白色顆粒が析出した。それを濾過し、洗浄し、ケーキを真空乾燥して、６Ｓ−５−メチルテトラヒドロ葉酸カルシウムの固体組成物０．３８ｇが得られた。
【０１１１】
【表７】
2017526699.tif 000015
【実施例１４】
【０１１２】
６Ｓ−５−メチルテトラヒドロ葉酸カルシウム組成物
６Ｓ−５−メチルテトラヒドロ葉酸１ｇ、イソアスコルビン酸３ｇを水２０ｍｌに入れ、３０％の水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７．０になるように中和し、透明になるまで溶解させた。１時間撹拌した後に、４０％の塩化カルシウム水溶液１ｇを入れ、６０℃で超音波をかけ、１時間後に固体が析出し、それを濾過し、洗浄し、ケーキを真空乾燥して、６Ｓ−５−メチルテトラヒドロ葉酸カルシウム組成物０．８０ｇが得られた。
【０１１３】
【表８】
2017526699.tif 000016
【実施例１５】
【０１１４】
６Ｓ−５−メチルテトラヒドロ葉酸組成物
実施例１１の（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸カルシウム組成物０．５ｇを取り、４０℃まで加熱し、塩酸溶液でｐＨを４．０に調節し、システムのｐＨをそのまま保持し、１時間撹拌して晶析させ、室温まで冷却させ、濾過し、洗浄した。２５℃で真空乾燥し、（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸組成物０．２３ｇが得られ、ＨＰＬＣにより検出を行った（（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸：９９．８０％、ＪＫ１２Ａ：０％、６（Ｓ）−Ｍｅｆｏｘ：０．０７％、５−メチルテトラヒドロプテロイン酸：０％）。
【０１１５】
【表９】
2017526699.tif 000017
【実施例１６】
【０１１６】
６Ｒ，Ｓ−５−メチルテトラヒドロ葉酸カルシウム組成物
６Ｒ，Ｓ−５−メチルテトラヒドロ葉酸１ｇ、アスコルビン酸１０ｇを水１５ｍｌに入れ、３０％の水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７．０になるように中和し、透明になるまで溶解させた。４０％の塩化カルシウム水溶液１ｇを入れ、７０℃で超音波をかけて晶析させ、濾過し、次に水洗し、真空乾燥して、６Ｒ，Ｓ−５−メチルテトラヒドロ葉酸カルシウム組成物０．５４ｇが得られた。
【０１１７】
【表１０】
2017526699.tif 000018
【実施例１７】
【０１１８】
６Ｒ，Ｓ−５−メチルテトラヒドロ葉酸ナトリウム組成物
６Ｒ，Ｓ−５−メチルテトラヒドロ葉酸１ｇ、アスコルビン酸５ｇを水２０ｍｌに入れ、３０％の水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７．０になるように中和し、透明になるまで溶解させ、６０℃で酸素を遮断したまま２時間反応を行った。次に、上記反応液をエタノール２００ｍｌに滴下してナトリウム塩を析出させ、それを濾過し、洗浄し、真空乾燥して、６Ｒ，Ｓ−５−メチルテトラヒドロ葉酸ナトリウム組成物０．５２ｇが得られた。
【０１１９】
【表１１】
2017526699.tif 000019
【実施例１８】
【０１２０】
６Ｓ−５−メチルテトラヒドロ葉酸アルギニン塩組成物
アスコルビン酸５ｇを水５ｍｌに入れ、水酸化ナトリウムでｐＨ７．０になるように中和し、透明になるまで溶解させた。６Ｓ−５−メチルテトラヒドロ葉酸アルギニン塩の粗製品０．５ｇを入れ、清澄になるまで溶解させ、６０℃で超音波をかけて２時間撹拌し、上記反応液をエタノール５０ｍｌに滴下し、撹拌して固体を析出させ、それを濾過し、固体の検出を行い、６Ｓ−５−メチルテトラヒドロ葉酸アルギニン塩組成物０．２６ｇが得られた。
【０１２１】
【表１２】
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【実施例１９】
【０１２２】
６Ｓ−５−メチルテトラヒドロ葉酸Ｄ−グルコサミン塩組成物
アスコルビン酸５ｇを水１０ｍｌに入れ、水酸化ナトリウムでｐＨ７．０になるように中和し、透明になるまで溶解させた。６Ｓ−５−メチルテトラヒドロ葉酸Ｄ−グルコサミン塩の粗製品２．０ｇを入れ、清澄になるまで溶解させ、６０℃で超音波をかけて２時間撹拌し、エタノールを徐々に滴下し、固体を析出させ、それを濾過し、エタノールで再結晶させ、６Ｓ−５−メチルテトラヒドロ葉酸Ｄ−グルコサミン塩組成物が得られた。
【０１２３】
【表１３】
2017526699.tif 000021
【実施例２０】
【０１２４】
６Ｓ−５−メチルテトラヒドロ葉酸カルシウムとアスコルビン酸との固溶体
６Ｓ−５−メチルテトラヒドロ葉酸１ｇ、アスコルビン酸２．０ｇを水２０ｍｌに入れ、３０％の水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７．５になるように中和し、溶解させた。１時間撹拌した後に、４０％の塩化カルシウム水溶液１ｇを入れ、７０℃で超音波で晶析させる段階に入り、１時間後に白色顆粒が析出し、それを濾過し、乾燥した。液体検出を行った結果、６Ｓ−５−メチルテトラヒドロ葉酸カルシウムが９４．８９％であり、アスコルビン酸が５．１１％である。
【実施例２１】
【０１２５】
６Ｓ−５−メチルテトラヒドロ葉酸カルシウムとイソアスコルビン酸との固溶体
６Ｓ−５−メチルテトラヒドロ葉酸０．１ｇ、イソアスコルビン酸０．３ｇを水１．５ｍｌに入れ、３０％の水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７．５になるように中和し、溶解させた。１時間撹拌した後に、４０％の塩化カルシウム水溶液１ｇを入れ、９０℃で撹拌して晶析させる段階に入り、１時間後に白色顆粒が析出し、それを濾過し、乾燥した。液体検出を行った結果、６Ｓ−５−メチルテトラヒドロ葉酸カルシウムが２９．２９％であり、イソアスコルビン酸が７０．６６％である。
【実施例２２】
【０１２６】
６Ｓ−５−メチルテトラヒドロ葉酸カルシウムとチオクト酸との固溶体
６Ｓ−５−メチルテトラヒドロ葉酸０．５ｇ、チオクト酸１．０ｇを水１０ｍｌに入れ、３０％の水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７．５になるように中和し、溶解させた。１時間撹拌した後に、２０％の塩化カルシウム水溶液１ｇを入れ、７０℃で超音波で晶析させる段階に入り、１時間後に固溶体が得られ、それを濾過し、乾燥した。ＥＬＳＤ検出器で液体検出を行った結果、６Ｓ−５−メチルテトラヒドロ葉酸カルシウムが２７．６９％であり、チオクト酸が７２．２６％である。
【実施例２３】
【０１２７】
５−メチルテトラヒドロ葉酸カルシウムと還元型グルタチオンとの固溶体
６Ｓ−５−メチルテトラヒドロ葉酸０．５ｇ、還元型グルタチオン１．５ｇを水１０ｍｌに入れ、３０％の水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７．５になるように中和し、溶解させ、１時間撹拌し、２０％の塩化カルシウム水溶液１ｇを入れ、７０℃で超音波で晶析させる段階に入り、１時間後に白色顆粒が析出し、それを濾過し、乾燥した。ＥＬＳＤ検出器で液体検出を行った結果、６Ｓ−５−メチルテトラヒドロ葉酸カルシウムが３７．６２％であり、還元型グルタチオンが６２．３３％である。
【実施例２４】
【０１２８】
（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸とアスコルビン酸との固溶体
６Ｓ−５−メチルテトラヒドロ葉酸０．５ｇ、アスコルビン酸３．０ｇを水１０ｍｌに入れ、３０％の水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７．５になるように中和し、溶解させ、１時間撹拌し、６Ｎの塩酸水溶液を適量滴下してｐＨを４．０に調節し、５０℃で撹拌して晶析させ、１時間後に白色顆粒が析出し、それを濾過し、乾燥した。液体検出を行った結果、６Ｓ−５−メチルテトラヒドロ葉酸が２６．８０％であり、アスコルビン酸が７３．１７％である。
【実施例２５】
【０１２９】
（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸亜鉛とアスコルビン酸との固溶体
６Ｓ−５−メチルテトラヒドロ葉酸０．５ｇ、アスコルビン酸１．５ｇを水１０ｍｌに入れ、２０％の水酸化ナトリウム水溶液で中和し、ｐＨ７．５になったとき、反応液が清澄になるまで溶解した。５０％の塩化亜鉛水溶液０．８ｇを入れ、２時間結晶させ、窒素ガスの保護下で濾過し、真空乾燥した。液体検出を行った結果、８８．７％の（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸亜鉛を含み、１１．０％のアスコルビン酸を含む。
【実施例２６】
【０１３０】
（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸カルシウムとアスコルビン酸リン酸エステルマグネシウムとの固溶体
６Ｓ−５−メチルテトラヒドロ葉酸０．５ｇ、アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム２．０ｇを水１０ｍｌに入れ、２０％の水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７．５になるように中和し、清澄になるまで溶解させた。５０％の塩化カルシウム水溶液０．６ｇを入れ、７０℃で超音波を導入して反応させ、１．５時間後に白色顆粒が析出し、窒素ガスの保護下でそれを濾過し、乾燥した。液体検出を行った結果、６２．４％の（６Ｓ）−５−メチルテトラヒドロ葉酸カルシウムを含み、３７．４％のアスコルビン酸を含む。
【実施例２７】
【０１３１】
金康の手段による製品である６Ｓ−５−メチルテトラヒドロ葉酸カルシウムとアスコルビン酸の組成物の安定性
実施例１１の６Ｓ−５−メチルテトラヒドロ葉酸カルシウム組成物１ｇと重量割合が異なるアスコルビン酸を十分に研磨して混合し、２５℃、湿度４０％のサーモタンクに放置し、定期的に６Ｓ−５−メチルテトラヒドロ葉酸カルシウムとＪＫ１２Ａの検出を行った。
【０１３２】
【表１４】
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【図１】
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【国際調査報告】
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2017526699.tif 000026
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