(57)【要約】  B細胞（樹状細胞又は骨髄系由来集団ではない）が、プラスミドDNAのための一次ヒト抗原提示細胞であるということが本明細書で開示される。この発見に基づいて、DNAワクチンの投与のための改善方法及び組成物が開示される。特に、DNAワクチンは、B細胞標的薬剤、B細胞補充薬剤、又は単球若しくは樹状細胞補充薬剤と共同投与される。DNAワクチンの免疫原性を増加させるために、B細胞標的薬剤又はB細胞補充薬剤は、DNAワクチンが投与される同じ場所に投与される。対照的に、単球又は樹状細胞補充薬剤は異なる場所に投与され、DNA取り込みについてB細胞と競合する細胞をDNAワクチンが投与される場所から離して補充することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト被検体における標的細胞タイプに対する抗原特異的CD8+T細胞を活性化させる方法であって、
（a）抗原をコードするポリヌクレオチドを含む核酸系ワクチンと、B細胞標的薬剤との有効量を前記被検体に投与し、それによって、B細胞による前記ポリヌクレオチドの取り込みが、B細胞標的薬剤の非存在下での前記ポリペプチドの取り込みに比して増加する工程、又は
（b）抗原をコードするポリヌクレオチドを含む核酸系ワクチンの有効量を前記被検体に投与し、かつ
前記核酸系ワクチンが投与される同じ場所にB細胞補充薬剤を前記被検体に共同投与し、それによってB細胞による前記ポリヌクレオチドの取り込みが、B細胞補充薬剤の非存在下での前記ポリペプチドの取り込み又は発現に比して増加する工程、又は
（c）抗原をコードするポリヌクレオチドを含む核酸系ワクチンの有効量を前記被検体に投与し、かつ前記核酸系ワクチンが投与される場所と異なる場所に単球又は樹状細胞補充薬剤を前記被検体に共同投与し、それによって競合細胞集団による前記ポリヌクレオチドの取り込みが、単球又は樹状細胞補充薬剤の非存在下での取り込みに比して低下する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記核酸系ワクチンが、DNAワクチンであり、前記ポリヌクレオチドが、DNAである、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸系ワクチンが、RNAワクチンであり、前記ポリヌクレオチドが、RNAである、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドが、プラスミドベクターに存在する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記抗原が、SSX2、AR LBD、PSA、HER-2/neu又はPAPである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記B細胞補充薬剤が、B細胞化学誘引物質である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記B細胞化学誘引物質が、B細胞誘引ケモカイン１（BCA-1；CXCL-13）である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記B細胞標的薬剤が、CD19又はCD21標的抗体若しくはペプチドを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記B細胞標的薬剤が、ポリヌクレオチドと複合体を形成する、ナノ粒子、脂質系担体分子又は細胞外小胞に結合されたCD19標的抗体を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記脂質系担体分子が、リポソームであるか、又は前記細胞外小胞が、エキソソームである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記B細胞標的薬剤が、細胞外小胞を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞外小胞が、エキソソームである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記CD21標的ペプチドが、配列番号:１を含む配列を有する、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記CD19又はCD21標的ペプチドが、DNA担体に連結される、請求項８〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記DNA担体が、プロタミンである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記標的細胞タイプが、癌細胞である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記癌細胞が、前立腺癌細胞、悪性メラノーマ細胞、結腸癌細胞、肝癌細胞、肺癌細胞、卵巣癌細胞、腎癌細胞、膵癌細胞、又は乳癌細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
（a）抗原をコードするポリヌクレオチド、及び
（b）Ｂ細胞標的薬剤、B細胞補充薬剤、又は両方、
を含む、ヒトにおける標的細胞タイプに対する抗原特異的CD8+T細胞を活性化させる核酸系ワクチン。
【請求項１９】
前記ワクチンが、DNAワクチンであり、更に前記ポリヌクレオチドが、DNAである、請求項１８に記載の核酸系ワクチン。
【請求項２０】
前記ワクチンが、RNAワクチンであり、更に前記ポリヌクレオチドが、RNAである、請求項１８に記載の核酸系ワクチン。
【請求項２１】
前記ポリヌクレオチドが、プラスミドベクターに存在する、請求項１９に記載の核酸系ワクチン。
【請求項２２】
前記抗原が、SSX2、AR LBD、PSA、HER-2/neu又はPAPである、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の核酸系ワクチン。
【請求項２３】
前記B細胞補充薬剤が、B細胞化学誘引物質である、請求項１８〜２２のいずれか1項に記載の核酸系ワクチン。
【請求項２４】
前記B細胞化学誘引物質がB細胞誘引ケモカイン１（BCA-1；CXCL-13）である、請求項23に記載の核酸系ワクチン。
【請求項２５】
前記B細胞標的薬剤が、CD19又はCD21標的抗体若しくはペプチドを含む、請求項１８〜２４のいずれか1項に記載の核酸系ワクチン。
【請求項２６】
前記B細胞標的薬剤が、ポリヌクレオチドと複合体を形成する、ナノ粒子、脂質系担体分子又は細胞外小胞に結合されたCD19標的抗体を含む、請求項１６〜２３のいずれか1項に記載の核酸系ワクチン。
【請求項２７】
前記脂質系担体分子が、リポソームであるか、又は前記細胞外小胞が、エキソソームである、請求項２６に記載の核酸系ワクチン。
【請求項２８】
前記B細胞標的薬剤が、エキソソームを含む、請求項１８〜２７のいずれか１項に記載の核酸系ワクチン。
【請求項２９】
前記CD21標的ペプチドが、配列番号:１を含む配列を有する、請求項２５又は２６に記載の核酸系ワクチン。
【請求項３０】
前記CD19又はCD21標的ペプチドが、DNA担体に連結される、請求項２５〜２９のいずれか１項に記載の核酸系ワクチン。
【請求項３１】
前記DNA担体が、プロタミンである、請求項３０に記載の核酸系ワクチン。
【請求項３２】
前記標的細胞タイプが、癌細胞である、請求項１８〜３１のいずれか１項に記載の核酸系ワクチン。
【請求項３３】
前記癌細胞が、前立腺癌細胞、悪性メラノーマ細胞、結腸癌細胞、肝癌細胞、肺癌細胞、卵巣癌細胞、腎癌細胞、膵癌細胞、又は乳癌細胞である、請求項３２に記載の核酸系ワクチン。
【請求項３４】
ヒト被検体で標的細胞タイプに対する抗原特異的CD8+T細胞を活性化させるDNAワクチンを調製する方法であって、抗原をコードするポリヌクレオチドをB細胞標的薬剤と合体させる工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３５】
前記抗原が、SSX2、AR LBD、PSA、HER-2/neu又はPAPである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記B細胞標的薬剤が、CD19又はCD21標的抗体若しくはペプチドである、請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記CD19標的抗体が用いられ、更に前記CD19標的抗体を、ポリヌクレオチドと複合体を形成するナノ粒子又は脂質系担体分子に結合させることができる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記CD21標的ペプチドが用いられ、更に前記CD21標的ペプチドが、アミノ酸配列RMWPSSTVNLSAGRR（配列番号:1）を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記CD19又はCD21標的ペプチドが用いられ、更に前記標的ペプチドがDNA担体に連結されている、請求項３４〜３８のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４０】
前記DNA担体が、プロタミンである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記B細胞標的薬剤が、細胞外小胞を含む、請求項３４〜３８のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４２】
前記B細胞標的薬剤が、エキソソームを含む、請求項３４〜３８のいずれか1項に記載方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互引用）
本出願は、米国仮特許出願62/076,987（2014年11月7日出願、前記出願は参照によりその全体が本明細書に含まれる）の権利を主張する。
（連邦政府出資研究開発に関する記述）本発明は、国立衛生研究所のCA142608により政府の支援を受けて達成された。前記政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
抗原は、分子であり、常にというわけではないがしばしばポリペプチドであり、前記抗原を含み、標的細胞に対する免疫応答を刺激することができる。抗原をコードするDNA又はRNAを細胞に送達し、問題の抗原を生成して免疫応答を誘引するために、核酸系(nucleic acid-based)ワクチン（例えばDNA又はRNAワクチン）が用いられる。DNAワクチンには、DNAベクター（裸の若しくは直鎖状DNA、通常のプラスミド、ミニ環状ベクター、又はミニイントロンプラスミドが含まれるが、ただしこれらに限定されない）が含まれうる。ポリペプチド抗原をコードする前記ベクターはin vivoで投与され、前記抗原は細胞によって発現されて前記抗原に対する免疫応答を惹起する。例えば、DNAワクチンが特異的に腫瘍細胞に標的を合わせるためには、前記DNAワクチンは、標的腫瘍細胞に特異的であるか又は前記細胞によってより大量に発現される抗原をコードするであろう。そのような抗原の例はアンドロゲン受容体のリガンド結合ドメイン（AR LBD）であり、前記は、前立腺腫瘍細胞で他の正常な組織（例えば肝臓、筋肉、膀胱又は脳組織）よりも大量に発現される。
ワクチンとして送達されるとき、プラスミドDNAは抗原提示細胞によって取り込まれ、前記抗原を産生するために前記抗原提示細胞内で発現される。続いて、前記抗原はT細胞に提示されて細胞性免疫応答を惹起する。特に、抗原提示細胞内で産生される抗原は、主要組織適合性複合体（MHC）クラスI及びクラスII分子と結合し、MHC分子と一緒に抗原提示細胞の表面に運ばれるペプチドエピトープとしてディスプレーされる。続いて、これらの表面抗原は、トランスメンブレン糖タンパク質“クラスタ分類8”を含む未成熟T細胞（CD8+T細胞）及びCD4+T細胞に提示される。例えば、MHCクラスI提示の事例では、これは、未成熟CD8+T細胞の成熟した抗原特異的CD8+T細胞（細胞傷害性T細胞又はキラーT細胞としても知られている）への活性化をもたらすことができ、続いて、前記成熟T細胞は前記ワクチンが標的とする細胞タイプに標的を合わせてこれを殺滅するであろう。これまで長い間、この作業を実行する専門的抗原提示細胞は樹状細胞（DC）であると考えられていて、従って、DNAワクチンの有効性を改善しようとするこれまでの大半の戦法はDCに焦点を当てている。
DNAワクチンは安価で安全であり、前臨床試験は30を超える疾患モデル（乳房、前立腺及び結腸の悪性疾患、多発性ミエローマ、リンパ腫及び線維肉腫の疾患モデルを含む）で顕著な有効性を示してきた。それにもかかわらず、DNAワクチンは多数のヒト臨床試験では不首尾であったが、一方、他の大型動物（例えばイヌ又はウマ）では‘標準治療’状態を達成している。
従って、関連するヒト細胞系におけるプラスミドDNA誘導免疫に関して容認されてきたメカニズムを再試験する必要があり、核酸ワクチン（DNAワクチンを含む）の改善、及び核酸誘導免疫メカニズムのよりいっそうの理解から得られる核酸送達方法が当業界で希求されている。
【発明の概要】
【０００３】
本開示は、ヒトB細胞（樹状細胞又は骨髄系由来集団ではない）が、プラスミドDNAによってコードされる抗原のための一次抗原提示細胞として機能するという発見に基づく。特に、本発明者らは、DNAのB細胞への直接的送達は抗原特異的CD8+T細胞産生をマウスで及びヒトプライミング系で増大できることを示した。更にまた、B細胞におけるDNAの偶発的取り込みは、より大きくかつより食作用性の細胞、例えばマクロファージ及び樹状細胞（DC）（前記細胞はDNA取り込みについてB細胞を凌ぐ能力を有する）の存在によって制限されるように見える。更にまた、これら後者の集団のいくつかはまたDNA取り込みに続いて免疫抑制性サイトカインを発現する。従って、核酸系ワクチン（特にB細胞に標的を合わせるDNAワクチンを含む）を用いること、核酸系ワクチン接種部位にB細胞を補充すること、又は競合マクロファージ及び樹状細胞を核酸系ワクチン接種部位から遠く離して補充することは、核酸系ワクチン接種により生じる標的細胞タイプに対する抗原特異的CD8+T細胞活性化の有効性及び程度を大いに高めることができる。そのような方法は、抗原提示B細胞による核酸系ワクチン（DNAワクチンを含む）の取り込みの増加、及び/又は抗原提示細胞として作用しない他の細胞タイプによる核酸系ワクチンの競合的取り込みの低下によって機能する。
【０００４】
従って、第一の特徴では、本開示は、ヒト被検体(subject)で標的細胞に対して抗原特異的CD8+T細胞を活性化させる方法を包含する。いくつかの実施態様では、前記方法は、抗原をコードするポリヌクレオチドを含む核酸系ワクチンと、B細胞標的薬剤との有効量を被検体に投与し、それによって、B細胞による前記ポリヌクレオチドの取り込みが、B細胞標的薬剤の非存在下での前記ポリペプチドの取り込み又は発現に比して増加する工程を含む。いくつかの実施態様では、ポリヌクレオチドはDNAである。他の実施態様では、ポリヌクレオチドはRNAである。いくつかの実施態様では、前記方法は、（a）抗原をコードするポリヌクレオチドを含む核酸系ワクチンの有効量を被検体に投与する工程、及び（b）前記ワクチンが投与される同じ場所にB細胞補充(recruiting)薬剤を前記被検体に共同投与(co-administering)し、それによって、B細胞によるポリヌクレオチドの取り込みが、B細胞補充薬剤の非存在下でのポリペプチドの取り込みに比して増加する工程；又はワクチンが投与される場所と異なる場所に単球又は樹状細胞補充薬剤を被検体に共同投与し、それによって、B細胞によるポリヌクレオチドの取り込みが、単球又は樹状細胞補充薬剤の非存在下での取り込みに比して増加する工程を含む。
【０００５】
いくつかの実施態様では、ポリヌクレオチドはプラスミドベクターに存在する。本明細書で用いられるように、“プラスミドベクター”という用語は通常のプラスミドベクターに限定されず、操作されてプラスミド骨格の大半を欠く“ミニ環状ベクター”、抗原をコードする領域の上流イントロン内に完全なプラスミド骨格が配置される“ミニイントロンプラスミド”（MIPS）、又は線状DNA片もまた包含される（ただし前記に限定されない）。
いくつかの実施態様では、ポリヌクレオチドはRNA（例えばmRNA）である。いくつかの実施態様では、RNAはプロタミンと複合体を形成し、RNaseから保護される。いくつかの実施態様では、RNA含有量はRNAの安定化のために最適化される。いくつかの実施態様では、ヌクレオチドは、RNAseから前記RNAを保護するために改変されうる。
いくつかの実施態様では、抗原は、癌-精巣抗原滑膜肉腫Xブレークポイント-2（SSX2）、アンドロゲン受容体のリガンド結合ドメイン（AR LBD）、前立腺特異的抗原（PSA）、前立腺酸ホスファターゼ（PAP）、又はヒト表皮増殖因子受容体2（HER-2/neu）である。
いくつかの実施態様では、標的細胞は癌細胞であり、前記には前立腺癌細胞、悪性メラノーマ細胞、結腸癌細胞、肝癌細胞、肺癌細胞、卵巣癌細胞、腎癌細胞、膵癌細胞、又は乳癌細胞が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
いくつかの実施態様では、B細胞補充薬剤はB細胞化学誘引物質である。本方法で用いうるB細胞化学誘引物質の非限定的な例は、B細胞誘引ケモカイン1（BCA-1、CXCL-13とも称される）である。
いくつかの実施態様では、B細胞標的薬剤にはCD19又はCD21標的抗体又はペプチドが含まれる。CD19標的抗体が用いられるいくつかの実施態様では、CD19標的抗体は、ポリヌクレオチドと複合体を形成するナノ粒子、脂質系担体分子、又は細胞外小胞と結合されうる。CD21標的ペプチドが用いられるいくつかの実施態様では、CD21標的ペプチドはアミノ酸配列RMWPSSTVNLSAGRR（配列番号:1）を含む。CD19又はCD21標的ペプチドを用いるいくつかの実施態様では、前記ペプチドはDNA担体に連結される。前記方法で用いうるDNA担体の非限定的な例はプロタミンである。いくつかの実施態様では、細胞外小胞はエキソソームである。
【０００６】
第二の特徴では、本開示は、ヒトで標的細胞に対して抗原特異的CD8+T細胞を活性化させる核酸系ワクチン（例えばDNAワクチン）を包含する。前記ワクチンは、（a）抗原をコードするポリヌクレオチド、及び（b）B細胞標的薬剤、B細胞補充薬剤、又は両方を含む。
いくつかの実施態様では、ポリヌクレオチドはプラスミドベクターに存在する。
いくつかの実施態様では、抗原は、癌-精巣抗原滑膜肉腫Xブレークポイント-2（SSX2）、アンドロゲン受容体のリガンド結合ドメイン（AR LBD）、前立腺特異的抗原（PSA）、ヒト表皮増殖因子受容体2（HER-2/neu）、又は前立腺酸ホスファターゼ（PAP）である。
いくつかの実施態様では、標的細胞は癌細胞であり、前記には前立腺癌細胞、悪性メラノーマ細胞、結腸癌細胞、肝癌細胞、肺癌細胞、卵巣癌細胞、腎癌細胞、膵癌細胞、又は乳癌細胞が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
いくつかの実施態様では、B細胞補充薬剤はB細胞化学誘引物質である。そのようなB細胞化学誘引物質の非限定的な例は、B細胞誘引ケモカイン1（BCA-1、CXCL-13としても知られている）である。
いくつかの実施態様では、B細胞標的薬剤は、Bリンパ球への核酸の送達を高めるエキソソーム又は細胞外小胞である。いくつかの実施態様では、前記には、その表面にBリンパ球結合因子（タンパク質、ペプチド又は糖脂質分子が含まれるがただしこれらに限定されない）を有するエキソソーム又は細胞外小胞を含みうる。いくつかの実施態様では、前記には、その表面にCD21結合糖タンパク質-350/220（gp350）を含み、核酸とともにトランスフェクトされるエキソソームが含まれうる。
【０００７】
第三の特徴では、本開示は、ヒトにおける標的細胞タイプに対して抗原特異的CD8+T細胞を活性化させる医薬の製造のための組成物を包含し、前記組成物は、（a）抗原をコードするポリヌクレオチド及び（b）B細胞標的薬剤、B細胞補充薬剤又は両方を含む。
いくつかの実施態様では、ポリヌクレオチドはRNAである。
いくつかの実施態様では、抗原は、癌-精巣抗原滑膜肉腫Xブレークポイント-2（SSX2）、アンドロゲン受容体のリガンド結合ドメイン（AR LBD）、前立腺特異的抗原（PSA）、ヒト表皮増殖因子受容体2（HER-2/neu）、又は前立腺酸ホスファターゼ（PAP）である。
いくつかの実施態様では、標的細胞は癌細胞であり、前記には前立腺癌細胞、悪性メラノーマ細胞、結腸癌細胞、肝癌細胞、肺癌細胞、卵巣癌細胞、腎癌細胞、膵癌細胞、又は乳癌細胞が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
いくつかの実施態様では、B細胞補充薬剤はB細胞化学誘引物質である。そのようなB細胞化学誘引物質の非限定的な例は、B細胞誘引ケモカイン1（BCA-1、CXCL-13としてもまた知られている）である。
いくつかの実施態様では、B細胞標的薬剤にはCD19又はCD21標的抗体若しくはペプチドが含まれる。C19標的抗体を含むいくつかの実施態様では、C19標的抗体は、ポリヌクレオチドと複合体を形成するナノ粒子、脂質系担体分子、又は細胞外小胞と結合される。CD21標的ペプチドを含むいくつかの実施態様では、前記ペプチドはアミノ酸配列RMWPSSTVNLSAGRR（配列番号:1）を含む。いくつかの実施態様では、細胞外小胞の非限定的な例はエキソソームである。
CD19又はCD21標的ペプチドを含むいくつかの実施態様では、標的ペプチドはDNA担体に連結される。用いることができるDNA担体の非限定的な例はプロタミンである。
【０００８】
第四の特徴では、本開示は、ヒト被検体における標的細胞に対する抗原特異的CD8+T細胞を活性化させる核酸系ワクチンを作製する方法を包含する。前記方法は、抗原をコードするポリヌクレオチドをB細胞標的薬剤と合体させる工程を含む。いくつかの実施態様では、抗原は、癌-精巣抗原滑膜肉腫Xブレークポイント-2（SSX2）、アンドロゲン受容体のリガンド結合ドメイン（AR LBD）、前立腺特異的抗原（PSA）、ヒト表皮増殖因子受容体2（HER-2/neu）、又は前立腺酸ホスファターゼ（PAP）である。いくつかの実施態様では、核酸系ワクチンはDNAワクチンであり、更にポリヌクレオチドはDNAである。
いくつかの実施態様では、B細胞標的薬剤には、CD19又はCD21標的抗体若しくはペプチドが含まれる。CD19標的抗体が用いられるいくつかの実施態様では、CD19標的抗体は、前記ポリヌクレオチドと複合体を形成するナノ球体と結合されうる。CD21標的ペプチドが用いられるいくつかの実施態様では、CD21標的ペプチドはアミノ酸配列RMWPSSTVNLSAGRR（配列番号:1）を含む。CD19又はCD21標的ペプチドを用いるいくつかの実施態様では、前記ペプチドはDNA担体に連結される。前記方法で用いることができるDNA担体の非限定的な例はプロタミンである。いくつかの実施態様では、標的抗体は細胞外小胞（例えばエキソソーム）に結合されうる。他の実施態様では、エキソソームは標的ペプチドに結合されうる。
【０００９】
本特許又は出願ファイルは少なくとも１枚のカラー図面を含む。カラー図面を含む本特許又は特許出願公開の写しは、申請及び必要な料金の支払いにより所轄局によって提供されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ヒトPBMCによるプラスミドDNA（pDNA）の取り込みを示す。融解ヒトPBMCを蛍光ペプチド核酸プローブ（PNA-pDNAけも）で標識したプラスミドDNAと共同インキュベートし、FACSにより分類した。上左パネル：DNAが存在しないコントロール。上右パネル：PNA-DNA分類細胞を種々の細胞のための蛍光マーカーで染色し、フローサイトメトリーで分析した。下左パネル：プラスミド陽性事象の13.5%がCD19+であった。下右パネル：プラスミド陽性事象の66.6%がCD11c+であった。一次ヒトAPCの全てが迅速かつ偶発的なプラスミドDNA取り込みを示した。
【図２】プラスミドが細胞内に運び込まれた後の3つの抗原提示細胞タイプの代表的な画像を示す（上パネルから下パネルの順に、CD19+、CD11c+CD14+、及びCD11c+）。PNA-pDNAをヒトPBMCと12時間共同インキュベートし、種々のAPCサブセットのための表面マーカーで染色し、Amnis ImageSream X(商標)装置で分析した。
【図３】ヒトB細胞が運び込まれたDNAのmRNA転写物を偶発的に生成することを示す。2人の患者（左パネル：患者#1、右パネル：患者#2）のPBMCから陰性選別したAPCサブセットをpEGFPｃ1と24時間インキュベートし、洗浄してRNA抽出に付した。EGFP転写物レベルをqRT-PCRで分析した。
【図４】ヒトB細胞はin vitroでプラスミドコード抗原の抗原提示細胞として機能することを示す。種々の細胞サブセットをStemSep(商標)PE選別を用いて濃縮し、HLA-A2+患者由来のTリンパ球とインキュベートした（前記患者は、HLA-A2拘束性p41及びp103 SSX2-特異的エピトープに特異的なCD8+T細胞を有することが知られている）。続いて、これらの細胞をベクター単独（pTVG4）又はワクチン（pTVG4-SSX2）と、0.5ng/mL IL-1β及び10U/mL IL-2とともに7日間処理し、その後でテトラマー染色を実施した。数は、培養後に検出できるCD3+CD8+ T細胞中のテトラマー陽性細胞の％を示す。テトラマー染色は、コード抗原に特異的であることを提示するT細胞を識別する。表示データは、CD19+ B細胞は（CD11c+樹状細胞又はCD14+単球/マクロファージではなく）、成熟した抗原特異的CD8+ T細胞の数の顕著な増加をもたらすことを示す。
【図５】プラスミドDNAをCy5染料（Mirus）で標識してヒトPBMCと6時間インキュベートし、続いて複数の表面マーカーで標識した。DNA取り込みを有する細胞をCD19+染色によってCD11c+としてゲートコントロールした。数はプラスミド+取り込みを示す細胞のパーセンテージを示す。
【図６】CD19+及びCD11c+細胞を磁性ビーズ分離によって分離した。磁性ビーズ分離は、与えられた細胞タイプに特徴的な表面抗原に対する抗体を被覆した磁性ナノ粒子と細胞をインキュベートし、更にCy5標識プラスミドDNAとともに4−18時間培養することによって細胞の分離を可能にする。細胞取り込みで生じた細胞内分布の画像はAmnis IMAGESTREAMTMサイトメーターを用いて撮影した。プラスミド特異的取り込みを示す2つの代表的なCD19+及びCD11c+細胞を示す。
【図７】CD19+、CD14+及びCD11c+細胞を磁性ビーズ分離で分離し、CD8+細胞及びSSX2コードDNA又はベクター単独（pTVG4）とともに7日間培養した。続いて、HLA-A2-特異的SSX2エピトープ(p41及びp103)の各々に対して特異的なSSX2特異的CD8+ T細胞の頻度について培養を査定した。
【図８】C57Bl/6マウスからCD19+細胞を磁性ビーズ選別で濃縮し、AR LBDコードDNA（pTVG-AR）の存在下で18時間培養した。続いて、細胞を洗浄し、ナイーブな同系マウス（n＝5）の皮内に注射した。2週間後に脾臓細胞を収集し、刺激因子抗原として精製AR LBDタンパク質（AR）又はオボアルブミン（陰性コントロール）を用い、抗原特異的免疫応答を細胞内サイトカイン染色によって査定した。IFNγを発現するCD8+ T細胞の％を示す。
【図９】20ng/mLのIFNγの存在下で、ヒトPBMCを100μg/mLのGMP級プラスミドDNA（又は培養液のみ）とともに42時間培養し、続いて、細胞内サイトカイン染色及びフローサイトメトリーによってIDO産生について査定した。
【図１０】CD14+細胞を枯渇させたヒトPBMCの4ｘ106を、4μgのCy5標識プラスミドDNA単独、又は40μgのプロタミンペプチド若しくは40μgのCD21-プロタミンペプチドとの複合化物とともに共同インキュベートした。1時間後、細胞をCD19のために染色し、CD19+Cy5+細胞の存在をフローサイトメトリーで決定した。
【図１１Ａ】SSX2のp41若しくはp103 HLA-A2拘束性エピトープ又はPMA-ロノマイシン（陽性コントロール）を用いてCD137のための細胞内サイトカイン染色を示す棒グラフである。HHD-IIマウスの脾臓からCD19+（B細胞）及びCD11c+（DC）細胞を磁性ビーズ選別によって濃縮し、SSX2をコードするプラスミドDNA（pSSX2）又はp103ペプチドの存在下で18時間培養した。続いて、細胞を洗浄してナイーブな同系マウス（n＝6/グループ）にi.d.で注射した。2週間後に脾臓細胞を収集し、in vitroでSSX2ペプチドにより刺激し、更に、SSX2のp41若しくはp103 HLA-A2拘束性エピトープ、p81（陰性コントロール）、又はPMA-ロノマイシン（陽性コントロール）を用い細胞内サイトカイン染色によってCD8+ T細胞の抗原特異的IFNγ又はIL-2放出を査定した。CD8+ T細胞におけるCD137の発現（T細胞活性化のマーカーとして）はフローサイトメトリーで直接決定した。
【図１１Ｂ】細胞をグループ毎にプールし、SSX2ペプチドを用いて1週間増殖させ、更に抗原特異的応答について再アッセイした後で、SSX2のp41若しくはp103 HLA-A2拘束性エピトープ、又はPMA-ロノマイシン（陽性コントロール）を用いたIFNγのための細胞内サイトカイン染色を示す棒グラフである。
【図１１Ｃ】細胞をグループ毎にプールし、SSX2ペプチドを用いて1週間増殖させ、更に抗原特異的応答について再アッセイした後で、SSX2のp41若しくはp103 HLA-A2拘束性エピトープ、又はPMA-ロノマイシン（陽性コントロール）を用いたIL2のための細胞内サイトカイン染色を示す棒グラフである。
【図１２Ａ】SSX2を発現する同系の肉腫細胞を移植し、続いて、SSX2をコードするDNA（pTVG-SSX2）又はp41/p103ペプチドの存在下で培養したCD19+（B細胞）又はCD11+（DC）細胞のどちらかで2週間間隔で免疫したマウスの時間の経過における平均腫瘍サイズを示す折れ線グラフである。
【図１２Ｂ】SSX2を発現する同系の肉腫細胞を移植し、更にSSX2をコードするDNA（pTVG-SSX2）の存在下で培養したCD11+（DC）細胞を用い2週間間隔で免疫したマウスの時間の経過における腫瘍サイズを示す折れ線グラフである。
【図１２Ｃ】SSX2を発現する同系の肉腫細胞を移植し、更にSSX2をコードするDNAの存在下（＋pTVG-SSX2）で培養したCD19+（B細胞）で免疫したマウスの時間の経過における腫瘍サイズを示す折れ線グラフである。CR＝完全な応答（腫瘍増殖無し）。
【図１２Ｄ】SSX2を発現する同系の肉腫細胞を移植し、更にp41/p103ペプチドの存在下で培養したCD11+（DC）細胞を用い2週間間隔で免疫したマウスの時間の経過における腫瘍サイズを示す折れ線グラフである。
【図１３Ａ】EBV（エプスタイン-バーウイルス）感染LCL（リンパ芽球株）由来エキソソームはヒトPBMCのB細胞へのプラスミドDNAの送達を高めることを示すフローサイトメトリー図である。全PBMCを、培養液のみ（図13A左）、PNA標識DNA（図13A中央）、又はEBV形質転換細胞株由来のエキソソームのトランスフェクトに用いられるPNA標識DNA（図13A右）の存在下で1時間培養した。特定の細胞集団（CD19+：B細胞（上）、CD11c+CD14-：DC（中央）、又はCD14+CD11-：単球（下））でDNA取り込みについてフローサイトメトリーで細胞を査定した。
【図１３Ｂ】B細胞の取り込みの特異性を示すグラフである。各データの記号は処理条件を通して異なる患者を表す（2つの異なるLCLに由来する裸のDNA又はエキソソームトランスフェクトDNA）。取り込み比率＝プラスミド陽性Bリンパ球の％/プラスミド陽性骨髄系APCの％
【図１３Ｃ】24時間におけるプラスミド陽性B細胞の％を示すグラフである。ｔ＝24時間におけるプラスミド陽性Bリンパ球の絶対的パーセンテージ。
【図１３Ｄ】エキソソームは、与えられた任意のＢ細胞に送達されるプラスミドの量を裸のＤNA単独よりもはるかに多くすることを示すグラフである。裸のpDNA又はpDNAトランスフェクトエキソソームと共同インキュベートしたときのプラスミド結合MFIがプロットされている。
【図１４Ａ】pDNAのエキソソーム媒介送達はCD19+ B細胞のCD80のアップレギュレーションをもたらすことを示すグラフである。
【図１４Ｂ】エキソソーム媒介送達はCD19+ B細胞のCD86のアップレギュレーションをもたらすことを示すグラフである。
【図１５Ａ】患者におけるテトラマー+ CD8 T細胞のエキソソーム-pSSX2増加を示す棒グラフである。全PBMC（図7のような細胞サブセットではなく）を、エキソソームのみ、SSX2をコードするプラスミドDNAのみ、又は上記図7のようにSSX2 DNAをトランスフェクトしたEBV形質転換細胞株由来のエキソソームの存在下で培養した。続いて7日後に、テトラマー染色によってSSX2-特異的（p41及び103エピトープ）CD8+ T細胞の頻度について培養を査定した。基線を超えるテトラマー+細胞の増加％を示す。
【図１５Ｂ】CD137/4-1BBのアップレギュレーションをアッセイすることによってSSX2特異的CD8 T細胞の増加を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本開示は、医薬組成物及び核酸系ワクチン（多数の疾患の治療用プラスミドDNAワクチンを含む）の使用に関する方法を提供する。本開示の方法を立証するモデル系は、癌精巣抗原SSX-2をコードするプラスミドを用いる前立腺癌治療に向けられているが、本開示の方法は、核酸系ワクチン技術（DNAプラスミドワクチン技術を含む）を用いて予防又は治療することができる任意の異常に適用できる。
当業界における一般的な考えは、樹状細胞（DC）がワクチン送達プラスミドDNAのための一次抗原提示細胞として機能するということである。ヒトの細胞に関する研究で、我々は、B細胞と樹状細胞（DC）の両方がプラスミドDNAを取り込むことができることを見出した。しかしながら、我々は、DCはタンパク質をコードしないか又は抗原を直接提示しないことを見出した。それどころか、我々は、B細胞が抗原を転写しかつ抗原をT細胞に提示し、従ってワクチン送達プラスミドDNAのための一次抗原提示細胞として機能することを見出した。
以前にB細胞はDNAワクチンを取り込んで送達することができると認定されたが、B細胞がヒトの系で一次抗原提示細胞として機能するという我々の発見は新規である。更にまた、B細胞は取り込みに関しては単球系列細胞によって実際上“打ち負かされる(outcompeted)”が、後者のような細胞は抗原を提示しないという我々の発見は、in vivoでB細胞を補充するか又はB細胞に標的を合わせることによって核酸系ワクチンの有効性を高める新規なアプローチを提唱させる。更にまた、細胞外小胞（例えばエキソソーム）を核酸系ワクチンとともに用いて、核酸のB細胞への特異的取り込みを改善し、更に抗原の発現及び提示を高めて免疫応答を惹起させることができる。
この発見を用い、例えば以下によってDNAワクチンの有効性を改善できる：（1）核酸ワクチンの標的をB細胞に合わせる（例えば脂質標的方法又は細胞外小胞（すなわちエキソソーム）によって）、（2）B細胞を免疫部位に補充する（例えばワクチンアジュバントとしてB細胞ケモカインを用いることによって）、（3）標的発現のためのB細胞プロモーターを使用する、（4）他の競合細胞集団による取り込みを回避するための薬剤を使用する（例えばDC又は他の食作用性細胞を免疫部位から離して補充することによって）、（5）B細胞に特異的に影響してそれらの取り込み及び提示能力を改善するアジュバントを使用する。
DNA系ワクチンでのDNAベクターの使用は当業界では周知であるが、そのような技術は、本明細書で開示する本発明者らの発見によって提唱される、B細胞標的及び補充の方法及び他の細胞タイプによる競合的取り込みの回避の方法と一緒に用いられたことはこれまでなかった。これらの方法の各々を下記で更に詳細に述べる。
【００１２】
A．核酸系ワクチンの標的をB細胞に合わせる方法
多数の既知の方法を用い、より効率的な取り込み及び抗原提示のために効果的に核酸（DNAを含む）の標的をB細胞に合わせることができる。そのような方法には、Bリンパ球で発現される表面タンパク質に対する抗体、ペプチドリガンド及び/又はアプタマーの使用が含まれ（ただしこれらに限定されない）、前記物質は、プラスミドDNA又はプラスミドDNAに結合する処方物（DNA結合タンパク質若しくはポリペプチド、リポソーム、細胞外小胞、エキソソーム又は他の陽性荷電巨大分子（単独又は組み合わせて用いられる）が含まれるが、ただしこれらに限定されない）に直接結合される。ある種の非限定的な例では、標的を合わせうる方法は下記のように実施できる：（A）CD19/CD20/CD21/CD22又は他のB細胞表面タンパク質を標的とする抗体を、核酸結合ポリペプチド（例えばDNA結合ポリペプチド、例えばヒストン又はプロタミン）に連結して、核酸（例えばプラスミドDNA）と結合させて関心のある細胞に直接送達する；（B）B細胞表面タンパク質（例えばCD19/CD20/CD21/CD22）との特異的結合を示すペプチドを、DNA結合若しくは圧縮剤（例えばプロタミン、リポソーム又は細胞外小胞（例えばエキソソーム））と一緒に用いてプラスミドDNAを送達する；（C）B細胞表面受容体リガンドをリポソーム又は他の同等なDNA結合処方物と組み合わせて用いる；（D）B細胞表面受容体リガンドをエキソソームと組み合わせて用いる；又は（E）B細胞に対する特異性を示す他のタンパク質又はタンパク質処方物（例えばウイルスキャプシド）をDNA/RNA結合処方物と一緒に用いる。
【００１３】
いくつかの実施態様では、脂質を基剤とする担体系を用いて、核酸系ワクチンの標的をBリンパ球に合わせる。脂質を基剤とする担体系には、生理学的脂質（例えばリン脂質、コレステロール、コレステロールエステル及びトリグリセリド）から構成される小胞が含まれる。適切な脂質系担体には例えばリポソーム、固体脂質ナノ粒子、脂質エマルジョン、油状懸濁物、脂質微小管、脂質微小気泡、又は脂質微小球が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
いくつかの実施態様では、適切なリポソームをB細胞標的剤と組み合わせて用いB細胞にポリペプチドを送達することができる。リポソームは、少なくとも1つの脂質二重層を有する人工球体小胞である。本発明の実施に用いることができる適切なリポソームは当業界で公知である。リポソームは、例えば音波処理によって生物学的な膜を破壊して調製できる。リポソームは、リン脂質（例えばホスファチジルコリン、エッグホスファチジルエタノールアミンなど）又はコレステロールから構成されうる。
適切な細胞外小胞（エキソソームを含む）をB細胞標的剤と組み合わせて用い、核酸系ワクチンのポリペプチドをB細胞に送達することができる。細胞外小胞（EV）は、多様な細胞によって細胞外微細環境に放出される膜性小胞である。EVは3つの大まかなクラス、（i）エクトソーム又は微小小胞、（ii）エキソソーム、及び（iii）アポトーシス小体に分類できる。エキソソームは、小胞体（ER）からゴルジ装置への小胞輸送中に生成される、エンドソーム区画を起源とする細胞由来小胞である。エキソソームは、多重小胞小体が形質膜と融合した後で細胞外に放出される。本開示で使用されるエキソソームを誘導するための適切な供給源は、当業界で公知の任意の適切な細胞タイプに由来しうる。適切な細胞タイプには、免疫細胞（例えばBリンパ球、Tリンパ球、樹状細胞など）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。例えば、適切な細胞タイプは、培養細胞株、とりわけ例えばリンパ芽球株、ヒト胎児腎（HEK293）細胞、初代又は不朽化抗原提示細胞株が含まれるが、ただしこれらに限定されない。エキソソームはまた生理学的な液体、例えば血漿、尿、羊水、悪性浸出液などから単離できる。ある好ましい実施態様では、エキソソームは細胞培養液又は組織上清から単離される。適切な細胞外小胞は以下に記載されている：Raposa and Stoorvogel,“Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends,”J Cell Biol. 2013 Feb 18;200(4):373-83. doi: 10.1083/jcb.201211138（前記文献は参照によりその全体が本明細書に含まれる）。
【００１４】
培養液からエキソソームを単離及び収集する適切な方法は当業界で公知である。例えば、エキソソームは、細胞培養又は組織上清から、遠心分離、ろ過又はこれら方法の組み合わせによって調製できる。例えば、エキソソームは弁別遠心分離によって調製できる。ある任意の方法に拘束されるわけではないが、1つの方法は、低速遠心分離（＜20000g）を用いてより大きな粒子をペレットにし、続いて高速遠心分離（＞100000g）でエキソソームをペレットにすることによる弁別遠心分離を利用する。エキソソームを単離する他の方法には、フィルターを用いるサイズろ過、勾配遠心分離（例えばシュクロース勾配を用いる）又はこれらの方法の組み合わせが含まれる。
Bリンパ球に特異的に送達する他の可能な方法は、プラスミドDNAの担体として天然、改変又は組換えウイルスキャプシド（ウイルス粒子又は“偽ビリオン”）の使用を含む。用いることができるいくつかの可能な標的合わせ方法は、例えば以下の文献で極めて詳細に考察されている：David, S., Montier, T., Carmoy, N., Resnier, P., Clavreul, A., Mevel, M., Pitard, B., Benoit, J.-P., and Passirani, C., 2012, Treatment efficacy of DNA lipid nanocapsules and DNA multimodular systems after systemic administration in a human glioma model, J Gene Med 14, 769-775；Deas, O., Angevin, E., Cherbonnier, C., Senik, A., Charpentier, B., Levillain, J.P., Oosterwijk, E., Hirsch, F., and Durrbach, A., 2002, In Vivo-Targeted Gene Delivery Using Antibody-Based Nonviral Vector, Human Gene Therapy 13, 1101-1114；Ding, H., Prodinger, W.M., and Kopecek, J., 2006, Identification of CD21-Binding Peptides with Phage Display and Investigation of Binding Properties of HPMA Copolymer-Peptide Conjugates. Bioconjugate Chem. 17, 514-523；Hyodo, M., Sakurai, Y., Akita, H., and Harashima, H., 2014, “Programmed packaging” for gene delivery, Journal of Controlled Release 14, 241-247；Ye, C., Choi, J.G., Abraham, S., Shankar, P., and Manjunath, N., 2014, Targeting DNA vaccines to myeloid cells using a small peptide, Eur. J. Immunol., doi: 10.1002/eji.201445010（これらの文書の各々は参照によりその全体が本明細書に含まれる）。
【００１５】
B．免疫部位にB細胞を補充する方法
多数の公知の方法を用い、より効率的な取り込み及び抗原提示のために、免疫部位にB細胞を効果的に補充することができる。そのような方法には、特異的にB細胞を誘引及び/又は活性化することが知られている化学誘引物質/サイトカインの使用が含まれるが、ただし前記に限定されない。そのような方法の1つは、核酸又はタンパク質の形態でCXCL13（又はBCA-1/B細胞誘引物質-1）の特性を利用するであろう。CXCL13を用いて免疫部位をプライミングするか、及び/又は前記を関心のあるプラスミドDNAワクチンと共同投与してより強いB細胞のin vivo相互作用が促進されるであろう。BCA-1と同様な態様で用いることができる他の分子には、二次リンパ組織の化学誘引物質（SLC）、間質性細胞由来因子1α及びスフィンゴシン-1-リン酸が含まれるが、ただしこれらに限定されない。これらのケモカインはまた様々な程度の有効性でB細胞及びそれらのサブセットに対して誘引物質として機能し、従ってCXCL13と組み合わせて又は前記の代わりに用いることができる。
【００１６】
C．他の競合細胞集団による取り込みを回避する薬剤の使用
多数の方法を用いて、他の競合細胞集団によるワクチンDNAの取り込みを効果的に回避することができる。そのような方法には、利用可能なDNAに対して競合する細胞タイプ（例えば樹状細胞、ランゲルハンス細胞及び組織在留性マクロファージ）を特異的に誘引することが知られている化学誘引物質/サイトカインの使用が含まれるが、ただし前記に限定されない。そのような薬剤を例えばワクチンが投与される場所とは異なる部位に投与して、競合細胞をワクチン接種部位から離して補充することができる。
これを達成する主要なアプローチの1つは、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）を免疫部位の遠位部位にワクチン接種前に核酸又はタンパク質の形態で投与する工程であろう。GM-CSFと組み合わせて又は前記の代わりに用いることができる他の分子には、マクロファージ炎症性タンパク質(MIP)-1α、1β、3α、fms様チロシンキナーゼリガンド（Flt3L）、CX3CL1、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-5 CXCL8、CXCL10、RANTES、及びCCL22が含まれるが、ただし前記に限定されない。
【００１７】
D．B細胞集団を特異的に活性化するアジュバントの使用
アジュバントを用い、B細胞を特異的に活性化してそれらに活動性及び運動性をもたらすことができる。前記を用いて、B細胞によるプラスミドDNAの取り込みを強化するとともに、それらをより良好な抗原提示細胞にして標的DNAワクチン接種後のより良好な適応免疫を生じることができよう。加えて、前記はまた活性化の程度が低い競合細胞集団による取り込みを削ぐことができよう。これらのアジュバントを、標的合わせ方法を用いてDNAワクチンと一緒に共同送達するか、又は上記のセクションBで述べたようにB細胞補充後にプラスミドDNAと一緒に投与することができる。アジュバントの例には、Toll様受容体（TRL）1、2、3、4、5、6、7、9、10のリガンド又は刺激因子、及びアジュバント活性を示す小ペプチドが含まれるが、ただしこれらに限定されない。他のアジュバントには、ケモカイン若しくはシグナリング分子、CD40リガンド、NF-カッパBサブユニットp65/Rel A、又はB細胞の活性化を引き起こす1型トランスアクチベーターT-betが含まれる。ポリペプチド又はタンパク質分子をアミノ酸又は核酸の形態で送達することができる。
例えば、TLR9活性化CpGアゴニストの使用はB細胞の増殖及び抗原提示機構のアップレギュレーションを引き起こす。本発見の可能な適用は、ペプチド又は抗体媒介標的と併せてプラスミドDNA及びCpG分子を共同送達することである。適切には、ペプチドによる標的は、ペプチドをB細胞に送達するために細胞外小胞（例えばエキソソーム）の使用を含む。
別の実施態様では、活性化因子としてCD40リガンド（CD40L）の使用を利用して、B細胞の増殖及びその抗原提示機構のアップレギュレーションを引き起こすことができる。
【００１８】
例示的実施態様では、TLR9をCXCL13と一緒に送達して、免疫部位をプライミングしDNAワクチンの送達前に化学走性B細胞を活性化することができる。別の例示的実施態様では、ミョウバン又はエマルジョンをプラスミドDNAと一緒に送達して、B細胞が既に誘引されている部位に送達することができる。別の例示的実施態様では、能動的送達又はB細胞化学走性がすでに達成されている部位への送達のために、シグナリング分子又はそれらの活性フラグメントをプラスミドDNAと結合させることができる。
更に別の例示的実施態様では、細胞外小胞（例えばエキソソーム）を用いて、核酸（例えばDNA）をB細胞が既に誘引されている部位へ送達することができる。
本明細書で用いられるように、“有効量”又は“免疫学的に有効な量”は、被検体への（単回服薬又は一続きのうちの部分としての）前記量の投与が、免疫反応を誘発するために有効であり、更に好ましくは標的異常（例えば前立腺癌）の治療又は予防に有効であることを意味する。本開示方法及び組成物によって、多数の具体的な異常に標的を合わせることができ、それら異常には、DNAワクチンがそのために創薬され、前臨床試験で首尾よい評価を得た全ての症状が含まれる。例えば以下の文献を参照されたい：Liu et al., 2011, “DNA vaccines: an historical perspective and view to the future,”Immunol Rev. 239(1): 62-84（前記は参照によりその全体が本明細書に含まれる）。
【００１９】
そのような症状は以下を含む：ウイルス感染（例えばHIV、インフルエンザ、狂犬病、B及びC型肝炎、エボラ、単純疱疹、パピローマ、CMV、ロタウイルス、麻疹、LCMV、セントルイス脳炎、及び西ナイルウイルス）、細菌感染（例えばB.ブルグドルフェリ菌（B. Burgdorferi）、破傷風菌（C. Tetani）、結核菌（M. Tb.）及びネズミチフス菌（S. Typhi））；寄生虫感染（例えばマラリア（malaria）、マイコプラズマ（mycoplasma）、リーシュマニア（leishmania）、トキシプラズマ・ゴンジー（Toxo. Gondii）、ヒツジ条虫（Taenia ovis）及び住血吸虫（schistosoma））；癌（例えば乳癌、結腸癌、メラノーマ、E7誘発癌、リンパ腫及び線維肉腫）；アレルギー症状（例えばハウスダストダニ、実験的気道過敏応答性（喘息）、及びピーナツアレルギー）；及び自己免疫疾患（例えば糖尿病及びEAE（多発性硬化症））。
いくつかの実施態様では、“標的細胞タイプ”又は“標的細胞”は、特異的抗原を発現する細胞又は大量の抗原をその表面に発現する細胞である。標的細胞タイプには、とりわけ癌細胞、ウイルス感染細胞、細菌に感染した細胞が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
医薬的に許容できる担体を本開示の方法及び組成物とともに用いることができ、前記は当業者には周知である（Arnon, R. (Ed.) Synthetic Vaccines I:83-92, CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla., 1987）。それら担体には患者に前記組成物を導入するベヒクルとして使用するために適切な液状媒体が含まれるが、ただしそれらは組成物を受容する個体に有害な抗体の産生をそれら自体で誘発してはならない。そのような液状媒体の例は食塩水溶液である。更にまた、ワクチン処方物はまた免疫応答を刺激するアジュバントを含み、それによってワクチンの効果を強化することができる。アジュバントの非限定的な例には通常のアジュバント（例えばアルミニウム塩）及び遺伝子アジュバント（例えばIL-12遺伝子）が含まれる。
【００２０】
本開示の核酸系ワクチンは、哺乳動物（例えば人間）にin vivoで直接導入されるとき、コードされたポリペプチド抗原の前記哺乳動物内での発現を誘導し、前記哺乳動物の免疫系を前記抗原に対して反応性にさせる。具体的には、発現された抗原は、MHCクラスIの多様な集団で抗原特異的細胞傷害性Tリンパ球（CTL）免疫を惹起する。本開示方法及び組成物でコード/発現されうる抗原には、以下の文献に列挙されたものが含まれる（ただしこれらに限定されない）：M.A. Cheever et al., 2009,“The prioritization of cancer antigens: a national cancer institute pilot project for the acceleration of translational research,”Clin Cancer Res. 15(17):5323-37（前記は参照によりその全体が本明細書に含まれる）。
本発明の核酸系ワクチンをプライム-ブースト手法で用い、前記ワクチンによってコードされる抗原に対して激しくかつ長期持続的な免疫応答を誘導することができる。同じ抗原構築物の反復注射に基づくプライムブーストワクチン免疫プロトコルは周知であり、強力なCTL応答をもたらす。概して、最初の服薬は防御免疫を生じず免疫系を“プライミングする”にとどまる。防御免疫応答は第二又は第三の服薬後に進展する。
ある実施態様では、本発明の核酸系ワクチンは、同じ抗原が複数の服薬で動物に投与される通常のプライム-ブースト手法で動物に投与される。好ましい実施態様では、DNA、RNA又はペプチドワクチンは１回以上の接種で用いられる。これらのブーストは通常の技術に従って実施され、投与スケジュール、投与ルート、アジュバント選択、用量、及び別のワクチン、療法又は同種ワクチンを投与するときの可能な連続性に関しては経験的に更なる最適化を図ることができる。
本発明は、以下の非限定的な実施例を考察するときより完全に理解されるであろう。本開示に引用される刊行物、特許、及び特許公開の各々は、参照によりその全体が本明細書に含まれる。
【実施例１】
【００２１】
プラスミドDNAのBリンパ球媒介抗原提示
本実施例で、我々は、偶発的なプラスミドDNAのin vitro取り込み、運ばれてきたプラスミドDNAによってコードされるmRNAの合成、及びプラスミドDNAによってコードされる抗原に対する細胞溶解性Tリンパ球（CTL）応答のプライミング能力を示すヒト細胞サブセットを表現型により特徴付け同定した。
方法：
初代ヒトPBMCから濃縮した3つの異なる細胞タイプ（B細胞、CD19+；樹状細胞、CD11c+；及び単球/マクロファージ、CD14+）を、偶発的プラスミドDNA取り込み、コードされたmRNAの生成、及びCD8+ T細胞への抗原提示についてアッセイした。蛍光ペプチド核酸（PNA）で標識したプラスミドDNAを用いて、共同インキュベーション後のプラスミドDNA取り込みが蛍光検出によって検出された。共同インキュベーション後のコードmRNA生成を定量的RT-PCR及びフローサイトメトリーを用いて調べた。各細胞タイプの抗原提示潜在能力を、1つ以上の腫瘍抗原（PAP：前立腺酸ホスファターゼ、SSX2：滑膜肉腫Xブレークポイント-2）に対するT細胞応答が既に存在することが知られている患者のT細胞を用いて試験した。3つの潜在的抗原提示細胞（APC）サブセットを濃縮し、一緒に空ベクター又は関連する腫瘍抗原をコードするプラスミドDNAとともに、Tリンパ球と併せて共同インキュベーションを実施し、7−10日後のT細胞増殖についてアッセイした。
フローサイトメトリー：ヒトPBMCの凍結バイアルをハンクス緩衝塩類溶液（Hank's Balanced Salt Solution；HBSS）で2回洗浄し、PNA-APC標識プラスミド（2μg/mL）又はDNA無し（コントロール）とともにRPMI＋10% FCSで12時間培養した。続いて細胞を2回洗浄し、プラスミドの存在についてAPCチャネルで蛍光により分類した。続いて細胞を遠心沈殿させて蛍光性CD3、CD14、CD11c及びCD19抗体を用いて染色し、プラスミドDNAと密接に関係する蛍光を示す細胞タイプを同定した。Amnis Imagestream(商標)を可視化に用いた。
RNA抽出及び定量的PCR分析：Rneasyミニキットを製造業者の指示の下で用いてPBMCの3クラスからRNAを抽出した。定量的PCR（qPCR）のために、RNAを収集し、iScriptTM cDNA合成キット（Bio-Rad, Hercules, CA）を製造業者の指示の下で用いて逆転写した。qPCRは、SsoFastTM EvaGreen(商標)スーパーミックス（Bio-Rad, Hercules, CA）をMyiQTM2 二色リアルタイムPCR検出系（Bio-Rad, Hercules, CA）で用いアニーリング温度は60℃で実施した。全ての結果を、コントロール遺伝子としてのβ-アクチンに対して2-ΔCt法によって分析した。
結果：
プラスミドDNAの取り込みは、もっぱら樹状細胞（CD11c+）、単球/マクロファージ（CD14+）、及びBリンパ球（CD19+）によって示された（図1及び図2参照）。プラスミドの取り込みは、温度依存性反応速度試験及び内在化プラスミドの画像支援サイトメトリーによって立証された。mRNAの生成は、qRT-PCRによる査定の通りBリンパ球でのみ検出できた（図3参照）。Bリンパ球と共同でインキュベートされたTリンパ球もまた抗原特異的増殖及びより大きなテトラマー陽性CD8 T細胞部分を示した（図4参照）。
結論：
プラスミド取り込みは複数の細胞タイプで見られるが、機能的な抗原産生及び提示は特定の細胞セットでのみ生じる。これらの発見は、DNAワクチン接種時の直接的抗原提示はBリンパ球に限定されることを提唱する。樹状細胞は激しいプラスミドDNAの取り込みを示すが、抗原をコードせず免疫応答もプライミングせず、潜在的に免疫原性において有害な役割を果たす。なぜならば、樹状細胞はDNAを取り込み、前記DNAはその後で免疫応答を誘発するために用いられないからである。従って、この試験は、ヒトでDNAワクチン誘発免疫を改善する方法を提唱し、前記方法は、例えば特異的にB細胞に標的を合わせたワクチンを用い、DNAワクチン接種部位にB細胞を補充し、又はDNAワクチン接種部位から離して競合するマクロファージ及び樹状細胞を補充する。
この結論は、CD11+細胞（マクロファージ/単球/DCを含む）はプラスミドDNAへの暴露後にIDO（免疫抑制サイトカイン）を分泌することを示した我々のデータによって更に支持され、従ってワクチン接種後に誘導される適応免疫応答に対して逆効果の可能性がある（図11参照）。
【実施例２】
【００２２】
B細胞はプラスミドDNAの一次抗原提示細胞である
本実施例では、我々は実施例1で報告した研究を拡大し、前記に関して更なる詳細を提供する。本実施例はまた、in vivoで抗原提示細胞として機能するB細胞の能力を示す。
我々は、細胞のどの集団がプラスミド誘発一次抗原提示の能力を有するかを、ウイルス、トランスフェクション薬剤又はエレクトロポレーションを用いることなく査定しようとした。ヒトドナー由来の末梢血単核球を、インターカレート染料又はペプチド核酸プローブで蛍光標識したプラスミドDNAと共同培養し、続いて各細胞集団によるDNA取り込みについて査定した。図5に示すように、取り込み（前記は非標識プラスミドを用いて競合的に阻害される（データは示されていない））はもっぱらCD11c+細胞（CD14+を同時発現する（データは示されていない））によるものであり、CD19+ B細胞は小さな取り込み構成成分であった。プラスミド取り込みに対応する具体的なB細胞集団は成熟ナイーブB細胞（CD19+IgG+）としてその後同定された。これらの集団による取り込みは画像化サイトメトリーによって確認された（図6）。タイムコース試験は、プラスミド取り込みは数時間以内に生じること、及び、プラスミドは、B細胞ではエンドソーム区画と核を、DCでは（データは示されていない）前記区画とリソソームを往復すること示した。
次に我々はどの細胞集団がDNAによって送達された抗原をコードできるかを問うた。図3に示すように、単一個体に由来する磁性分離CD11c+、CD14+、又はCD19+細胞をGFPコードプラスミドDNAと共同培養した。続いて細胞を溶解し、qRT-PCRによってGFP特異的mRNAについてアッセイした。提示したように（更に他の個体由来のサンプルで繰り返された）、mRNAはCD19+ B細胞との共同培養後にのみ検出できた。
次に我々は、B細胞（DCではなく）は続いて抗原提示細胞として機能することができることを示した。このことを示すために、抗原SSX2由来の2つのエピトープ（p41エピトープ又はp103エピトープ）の1つに特異的な検出可能CD8+ T細胞を有することが知られているHLA-A2+患者由来のPBMCを細胞供給源として用いた（以下を参照されたい：Smith, H. A. and McNeel, D. G., 2011,“Vaccines targeting the cancer-testis antigen SSX-2 elicit HLA-A2 epitope-specific cytolytic T cells.”J Immunother 34: 569-80）。前記患者のCD8+ T細胞、CD11c+細胞、CD14+細胞、及びCD19+細胞を磁性ビーズによって分離し、続いてCD11c+細胞、CD14+細胞、及びCD19+細胞の各々を3つの別々の培養でCD8+ T細胞と一緒にした（すなわちCD11c+又はCD14+又はCD19+をCD8+細胞と一緒にする）。これら3つの培養の各々を更に2つのグループに分け、一方は添加されたSSX2コードプラスミドDNAを含み、他方はベクターコントロール（pTVG4）を含む。1週間後に、6つの培養の各々をテトラマー+細胞の頻度についてアッセイした。図7に示すように（1人の患者に由来する代表的なものであるが、他の患者サンプルでも繰り返された）、CD19+ B細胞が抗原提示及び抗原特異的CD8+ T細胞の頻度の増加でもっとも有効であった。
最後に、抗原提示細胞として機能するB細胞の能力をin vivoで直接査定した。具体的には、HHD-II（HLA-A2トランスジェニック）マウスからB細胞及びDCを収集し、無血清培養液でプラスミドDNA（SSX2又はコントロールプラスミドをコードする）とともに18時間培養し、続いて同系マウスの皮内に注射した。脾臓細胞を1週間後に収集し、IFNγELISPOTによって抗原特異的T細胞について査定した。図8に示すように、B細胞はDNAによってコードされる抗原を直接in vivoで効果的に提示できることが見出された。
我々の発見は、B細胞はプラスミドDNAのためのヒト一次抗原提示細胞であり、in vitroでCD8+ T細胞集団を増殖させることができることを初めて示した。我々の発見は、DNA投与に続く抗原提示でDCは関与しないと提唱するものではなく、実際、動物試験の証拠は抗原の相互提示は極めて重要であることを提唱している（例えば以下を参照されたい：Akbari, O., Panjwani, N., Garcia, S., Tascon, R., Lowrie, D. and Stockinger, B. 1999.“DNA vaccination: transfection and activation of dendritic cells as key events for immunity.”J Exp Med 189: 169-78）。しかしながら、我々の発見は、B細胞に標的を合わせることは特に有益であることを確かに示している。更にまた、我々の発見は、ヒトの免疫に続いてDNAの大半は、生産的免疫応答をもたらさない単球由来細胞によって取り込まれることを提唱している。従って、B細胞を補充するか又はB細胞に標的を合わせる戦法は、DCに抗原の相互提示をなお許容するけれどもDNAワクチンのより有効なアプローチとなろう。
【実施例３】
【００２３】
本開示の方法及び組成物の有効性を示すために用いられる動物モデル
いくつかの動物モデルを用いて、本開示の方法及び組成物の有効性を示すことができる。例えば、我々の動物モデルは、2つの抗原、SSX2（ネオアンチゲン）及びAR BLD（そのアミノ酸配列が異なる種で同一である“自己”耐性抗原であり、前立腺腫瘍の関連する腫瘍促進遺伝子である）の1つをコードするDNAワクチンを含む。我々は、各抗原のHLA-A2エピトープを同定し（以下を参照されたい：Smith, H. A. and McNeel, D. G., 2011.“Vaccines targeting the cancer-testis antigen SSX-2 elicit HLA-A2 epitope-specific cytolytic T cells.”J Immunother 34: 569-80；及びOlson, B. M. and McNeel, D. G., 2011.“CD8+ T cells specific for the androgen receptor are common in patients with prostate cancer and are able to lyse prostate tumor cells.”Cancer Immunol Immunother 60: 781-92（前記文献の各々は参照によりその全体が本明細書に含まれる））、SSX2の事例では、ちょうど2つのHLA-A2拘束性CD8+エピトープ（p41及びp103）が存在し、そのうちの1つ（p103）が優勢である。我々は、両抗原に特異的なHLA-A2拘束性テトラマー試薬を有し、前記は本明細書に記載の試験を可能にする。
更にまた、2つの関連するネズミモデルを用いることができる。両モデルは、HHD-IIマウス（C57Bl/6のバックグラウンドを有する）から誘導され、HLA-A2及びHLA-DR1を発現し、ネズミMHCクラスI及びクラスIIはノックアウトされている。このマウスから、我々は、SSX2又はARを発現するメチルコラントレン（MCA）肉腫の腫瘍細胞株を作製した（前記は皮下腫瘍モデルを提供する）。加えて、我々は、HHD-IIマウスを特発性前立腺腫瘍トランスジェニック株（TRAMP）と交配した（TRAMPでは、SV40大T抗原がプロバシン前立腺特異的プロモーターの下流で発現される）。F1世代はHLA-A2（及びネズミクラスI）を発現し、約16週齢で開始する前立腺腫瘍を100％の浸透度で生じる（Olson, B. M., Johnson, L. E. and McNeel, D. G. 2013“The androgen receptor: a biologically relevant vaccine target for the treatment of prostate cancer.”Cancer Immunol Immunother 62: 585-96）。我々はまた、HLA-A2を発現し、かつ同系マウスの皮下で増殖する前立腺腫瘍細胞株をこれらのマウスから作製した。
これらのネズミモデルに加えて、図7（実施例2を参照）に記載するように、我々は、前立腺癌を有する複数のHLA-A2+患者からPBMCを収集し、更にSSX2+ CD8+ T細胞（p41及びp103特異的テトラマー+ T細胞）が後期前立腺癌の患者で同定され、幾人かの患者はSSX2に特異的な1−2％もの循環CD8 T細胞を有しうることを以前に報告した（Smith, H. A. and McNeel, D. G. 2011.“Vaccines targeting the cancer-testis antigen SSX-2 elicit HLA-A2 epitope-specific cytolytic T cells.”J Immunother 34: 569-80）。複数の対照動物由来のPBMCを入手できること及びDNAコード抗原を提示するために（図7）分類細胞をin vitroで使用する能力があるということは、我々がin vitroでのB細胞による取り込み及び提示を試験することができるモデルの提供を効果的にする。
これらのモデルは、当業界で公知の他のモデルと組み合わせて、開示の組成物及び方法を本開示の範囲の端から端まで実施及び使用するために必要なツールを当業者に提供する。
【実施例４】
【００２４】
ワクチン惹起抗原特異的CD8+ T細胞の規模及びエフェクター機能を高めるDNAワクチンのB細胞標的送達
上記の実施例で述べたように、我々は、ナイーブなメモリーB細胞がDNAワクチンのための一次抗原提示細胞として機能することを認定した。ナイーブメモリーB細胞が一次抗原提示細胞であるという発見はヒトの細胞では新発見である。なぜならば、樹状細胞が遺伝子ワクチンのための一次抗原提示細胞として機能すると一般的に考えられていて、多くの努力が、遺伝子ワクチンによってコードされる抗原を提示するDCの有効性を改善するために費やされてきたからである（例えば以下を参照されたい：Moulin, V., Morgan, M. E., Eleveld-Trancikova, D., Haanen, J. B., Wielders, E., Looman, M. W., Janssen, R. A., Figdor, C. G., Jansen, B. J. and Adema, G. J. 2012“Targeting dendritic cells with antigen via dendritic cell-associated promoters.”Cancer Gene Ther 19: 303-11）。我々の発見は、ヒト単球由来集団はまたプラスミドDNAを取り込むことができるが、コードされた抗原をT細胞に提示できないことを示す。
最近の努力は、全体的なトランスフェクション有効性の、典型的には粒子媒介送達又はエレクトロポレーション方法による改善の試みに向けられてきた。相互提示を高めるこれらの努力は有用ではありうるが、一方、DCを直接標的とする努力は限定的であるかもしれない。しかしながら、DNAによってコードされる抗原を直接提示する能力を有する細胞（すなわちナイーブメモリー細胞）への送達を高める努力は見落とされてきたが、そのようなアプローチはDNAワクチンの有効性を補完し又は大きく改善しよう。
図11に示すように、DNAワクチンと予備インキュベートされたB細胞の養子免疫伝達は抗原特異的CD8+ T細胞を惹起することができたが、DNAワクチンと予備インキュベートされたDCの送達では前記細胞を惹起できなかった。この予言的実施例は、B細胞に標的を合わせたDNAの送達が、これらワクチンの免疫原性及び抗腫瘍効果をどのように改善できるかを示している。
実施例1及び2に報告した結果は、他の単球/DC細胞サブセットを排除してB細胞取り込みに特異的に標的を合わせる努力が有用であろうということを示している。これらの一般的アプローチの両方を下記で述べる。
【００２５】
A．DNAワクチンの有効性改善のための免疫部位へのB細胞の補充
GM-CSF（DCの化学誘引物質）は、遺伝子ワクチンのためのアジュバントとして（タンパク質として送達されても又はDNAによってコードされても）機能しうることが観察された（Disis, M. L., Shiota, F. M., McNeel, D. G. and Knutson, K. L. 2003.“Soluble cytokines can act as effective adjuvants in plasmid DNA vaccines targeting self tumor antigens.”Immunobiology 207: 179-86）。しかしながら、我々の実験は、免疫部位へのB細胞（DCではない）の補充は免疫応答惹起を改善するであろうということを示している。
これを調べるために、A2/TRAMPマウスは、タンパク質又は以下をコードするプラスミド又はPBS単独の皮内注射を受けるであろう（前記プラスミドは、DC化学誘引物質としてネズミGM-SCF（National Gene Vector Laboratoryから入手）又はB細胞化学誘引物質としてネズミBCA-1（B細胞誘引ケモカイン1、CXCL13）をコードする）。6時間間隔で48時間まで動物で生検を実施して、免疫組織化学及びフローサイトメトリーによってB細胞又はDCが処置部位へ遊走するか否か、及びこの応答の最適タイミング（最大浸潤時間）が認定されるであろう。その後の試験では、どちらかの薬剤（又はPBSコントロール）で前処置された動物は続いてpTVG-SSX2又はDNAベクターコントロールで免疫されるであろう。7−17日後に、脾臓細胞を収集し、テトラマー染色により抗原特異的CD8+の規模について、及び細胞内サイトカイン染色によりエフェクター機能について（IFNγ、TNFα、IL-2、IL-10、IL-4、IL-17及びグランザイムBのエピトープ特異的放出について）査定されるであろう。
我々は、BCA-1の送達によって免疫部位にB細胞が補充され、更にこのことがより大きな免疫応答規模を生じるであろうと期待する。続いて追跡試験によって、このことがより強い抗腫瘍応答を生じるか否かが上記に記載のHLA-A2拘束性抗原特異的前立腺及び肉腫腫瘍モデルを用いて決定され、更に同じ部位プライミング及び免疫スケジュールを用いる反復プライムブースト免疫の後で生じる免疫応答が精査されるであろう。我々のデータは、ある種のAPC集団はB細胞による取り込みに不利でありかつ競合しうることを示唆しているので、対応する戦法では、例えばGM-CSF又はCXCL10（単球のための化学誘引物質）を免疫部位から離れた部位に送達することによって、それら集団を免疫部位から離して補充することが試みられるべきであろう。
【００２６】
B．抗原特異的免疫を高めるナノ粒子又はペプチド特異的送達によるB細胞標的DNAワクチン送達
上記に記したように、B細胞が一次抗原提示細胞として機能する能力を有するという我々の発見は、特異的にそれらに標的を合わせることができることを示唆する。in vivoでB細胞に直接標的を合わせるために、多数の方法を用いることができよう。非限定的な例として、直接的な細胞内送達を可能にするナノ球体で又はB細胞標的取り込みのためにネズミCD19に対する抗体と結合させたナノ球体で、SSX2をコードするDNAの複合体を形成することができる。第二の非限定的な例では、DNA担体としてプロタミンに連結されたCD21標的小ペプチド（RMWPSSTVNLSAGRR（配列番号:1））（Ding, H., Prodinger, W. M. and Kopecek, J. (2006).“Identification of CD21-binding peptides with phage display and investigation of binding properties of HPMA copolymer-peptide conjugates.”Bioconjug Chem 17: 514-23（前記は参照によりその全体が本明細書に含まれる））をプラスミドDNAとともに培養することができ、前記は骨髄系細胞に標的を合わせるために最近報告されたある方法と同様な方法で実施される（Ye, C., Choi, J. G., Abraham, S., Shankar, P. and Manjunath, N. (2014).“Targeting DNA vaccines to myeloid cells using a small peptide.”Eur J Immunol（前記は参照によりその全体が本明細書に含まれる））。図10は、DNA担体としてプロタミンに連結されたCD21標的小ペプチドと結合したDNAは、B細胞による前記DNAの特異的取り込みが高まること示している。
どちらの試薬によるアプローチでも、A2/TRAMPマウスは、ナノ球体/DNA又はペプチド/DNA複合体の皮内送達によって（又は抗原コードDNAを含むコントロールプラスミドの皮内送達によって、ただしナノ球体若しくはペプチドの皮内送達ではない）1回（又は14日後のブースター免疫で）免疫することができる。SSX2に特異的なCD8+ T細胞は上記のようにテトラマー染色により定量でき、これらの細胞の機能は、細胞内サイトカイン分析によってサイトカイン分泌に関して評価されるであろう。その後の試験は、抗原を発現する腫瘍による免疫の前に移植されたA2/TRAMPマウスを用い、一方又は他方に標的を合わせた送達アプローチによる免疫が、プラスミドDNA単独免疫（コントロール）と比較してより強い抗腫瘍応答を付与するか否かを決定するであろう。
プラスミドDNAのB細胞標的送達はCD8+免疫応答を高め、従って追跡試験によって、B細胞補充方法（例えば免疫部位をプライミングするためにBCA-1コードプラスミドDNAを用いることによる）は標的送達と合体されよう。ナノ球体アプローチによるB細胞の細胞質への直接送達は、細胞内アンピシリン耐性表現型プラスミド（pAMP DNA）センサーの活性化のために特に有利であろう。
【実施例５】
【００２７】
B細胞へのDNA送達のためのCD21ペプチド標的
本実施例で、我々は、CD21ペプチド標的はB細胞へのDNA送達で有効に働きうることを実際に示す。
ヒトPBMCからCD14+細胞を枯渇させ、続いてDNA無し（コントロール）、単独Cy5-標識プラスミド、プロタミンペプチド複合Cy5-標識プラスミド、CD21/プロタミン複合Cy5-標識プラスミドと一緒にインキュベートした。前記4グループの細胞をCD19のために染色し、プラスミド取り込みを示すCD19+細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーによって決定した。
結果は、CD21/プロタミン複合体を用いたときにはるかに多くのプラスミドDNAの取り込みを示した（図10を参照）。これは、標的を合わせたB細胞へのDNA（例えばワクチンDNA）取り込みを高めるために、標的合わせ方法を首尾よく用いることができることを示している。
【実施例６】
【００２８】
プラスミドDNAによる処理に際してB細胞はin vivoで免疫応答をプライミングする
本実施例は、Bリンパ球は（樹状細胞ではない）、プラスミドDNAによる処理に際してin vivoで免疫応答をプライミングできることを示す。A2/DR1+マウス（CD19+単離用ナイーブ動物及びCD11c+単離用B16 Flt3担癌マウス）の脾臓から磁性ビーズ選別によって、未成熟CD19+及びCD11c+細胞を濃縮し、SSX2（pTVG4-SSX2）又はp103ペプチドをコードするプラスミドDNAの存在下で18時間培養した。続いて、細胞を洗浄し、ナイーブな同系マウス（各グループにつきn＝6）の皮内に注射した。2週間後に脾臓細胞を収集し、グループ毎にプールし、SSX2ペプチドとともに1週間増殖させ、SSX2のp41又はp103 HLA-A2拘束エピトープ又はPMA-イオノマイシン（陽性コントロール）を用い細胞内サイトカイン染色によってAg特異的応答を再度アッセイした（図11A−C）。
【実施例７】
【００２９】
B細胞はin vivoで抗原提示細胞として機能する
実施例6に記載したようにA2/DR1+マウスからマウスCD19+及びCD11c+細胞を磁性ビーズ選別によって濃縮し、SSX2コードDNA（pTVG4-SSX2）の25μg又はp41/p103ペプチドの2μg/mLの存在下にて18時間5E6細胞/mLで培養した。続いて細胞を洗浄し、同系マウスの皮内に1E6細胞/mLで注射した（前記マウスの皮下には1日前にSSX2を発現する同系肉腫細胞が移植されてあった）。マウスを二週間間隔で免疫し、時間の経過に従って腫瘍体積を測定した。平均腫瘍体積（図12A）を示し、DC＋pTVG-SSX2（図12B）、B細胞＋pTVG-SSX2（図12C）及びDC＋p41+p103（図12D）を注射したマウスの腫瘍体積を示す。
【実施例８】
【００３０】
エキソソームはB細胞へのpDNAの送達を高める
EBV（エプスタイン-バーウイルス）感染LCL（リンパ芽球細胞株）由来エキソソームは、ヒトPBMCのBリンパ球へのプラスミドDNAの送達を高めた。全PBMCを以下の存在下で1時間培養した：培養液のみ（図13A、左）、PNA標識DNA（図13A、中央）、又はEBV形質転換細胞株由来のエキソソームのトランスフェクトに用いられPNA標識DNA（図13A右）。特定の細胞集団（CD19+：B細胞（上）、CD11c+CD14-：DC（中央）、又はCD14+CD11-：単球（下））でDNA取り込み（APC+）についてフローサイトメトリーで細胞を査定した（図13B、C、及びD）。各データの記号は処理条件を通して異なる患者を表す（2つの異なるLCLに由来する裸のDNA又はエキソソームトランスフェクトDNA）。取り込み比率＝プラスミド陽性Bリンパ球の％/プラスミド陽性骨髄系APCの％（図13B）。24時間のプラスミド陽性B細胞の絶対百分率（図13C）。
エキソソームは、与えられた任意のB細胞に送達されるプラスミドの量を裸のDNA単独よりもはるかに多くする（図13D）。裸のpDNA又はpDNAトランスフェクトエキソソームと共同インキュベートしたときのプラスミド結合MFIがプロットされている。
【実施例９】
【００３１】
B細胞へのプラスミドDNAのエキソソーム媒介送達は細胞表面の抗原提示機構を活性化する
SSX2をコードする蛍光標識プラスミドDNAをトランスフェクトしたエキソソームと一緒に未分離PBMCを24時間インキュベートした。続いて、表面抗原提示機構マーカー（CD80及びCD86）のアップレギュレーションについて、pDNAを保有するB細胞をアッセイした。各データ記号は異なる処置条件下での異なる被検体を表す。蛍光プラスミドDNA由来エキソソームが陽性のB細胞で、全B細胞レベルと比較して表面CD80及びCD86共同刺激性分子のアップレギュレーションが図14A及びBで示されている。
【実施例１０】
【００３２】
エキソソームによって送達されたDNAは抗原特異的T細胞の増殖を引き起こす
SSX2コードプラスミドをトランスフェクトしたエキソソームは、SSX2特異的CD8 T細胞を特異的に増殖させることができる。
SSX2に対し既にCD8応答が存在する患者のPBMCを、IL2とともにエキソソーム単独、pTVG4-SSX2単独、又はpTVG-SSX2トランスフェクトエキソソームのいずれかで1週間処理した。続いて、SSX2特異的CD8 T細胞の増加について、HLA-A2テトラマー分析（図15A）及びCD137/4-1BBアップレギュレーション（図15B）を用いてサンプルをアッセイした。
本開示に引用した各刊行物、特許及び特許公開は、参照によりその全体が本明細書に含まれる。本発明は、上述の実施例に限定することを意図されず、添付の特許請求の範囲内に収まる全ての改変及び変更を包含する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2017535599.tif 000028