(57)【要約】  本開示は、細胞を培養するための装置、システム、及び方法に関する。特に、３Ｄ細胞凝集体の生成及び培養のための装置及び方法が提供される。
2017532974.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロウェルのアレイを含む細胞培養基材であって、各マイクロウェルが、丸みを帯びた上部ウェルエッジ、少なくとも１つのマイクロウェル側壁、及び丸みを帯びたウェル底部によって画成された前記マイクロウェル内への開口部を備えている、細胞培養基材。
【請求項２】
各マイクロウェルの断面が、正弦波のウェル形状を有することを特徴とする、請求項１に記載の細胞培養基材。
【請求項３】
１つ以上のリッジをさらに備えており、該リッジが、円形状、角形状、針状、又は六角形の形状であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の細胞培養基材。
【請求項４】
１つ以上の割れ目をさらに備えており、該割れ目が、円形状、角形状、針状形状又は六角形の形状であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の細胞培養基材。
【請求項５】
前記丸みを帯びたウェル底部が１０〜１００μｍの厚さを有することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞培養基材。
【請求項６】
前記マイクロウェルの壁が、前記マイクロウェル内への前記開口部の最も近くで相対的により厚くなり、前記マイクロウェルの前記底部で相対的により薄くなることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞培養基材。
【請求項７】
前記基材が、前記細胞培養基材の表面１平方センチメートル当たり、前記マイクロウェルを２〜１００００個含むことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞培養基材。
【請求項８】
少なくとも前記丸みを帯びたウェル底部が非接着性の表面を含むことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の細胞培養基材。
【請求項９】
少なくとも前記丸みを帯びたウェル底部がガス透過性材料を含むことを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の細胞培養基材。
【請求項１０】
前記マイクロウェル側壁が不連続であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の細胞培養基材。
【請求項１１】
前記マイクロウェル側壁が波形状であることを特徴とする、請求項１０に記載の細胞培養基材。
【請求項１２】
前記細胞培養基材が、細胞培養容器の少なくとも一部を含むことを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の細胞培養基材。
【請求項１３】
前記細胞培養容器が、マルチウェルプレート、皿、フラスコ、管、多層フラスコ、側部軟質性のフラスコ、及びバッグからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１２に記載の細胞培養基材。
【請求項１４】
前記マイクロウェルが、該マイクロウェルの少なくとも１つと単一の液体貯槽との間の流体連通を可能にするように構成されることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の細胞培養基材。
【請求項１５】
前記細胞培養容器がさらに、前記マイクロウェルのアレイの上部に配置されたメッシュを備えていることを特徴とする、請求項１２又は１３に記載の細胞培養基材。
【請求項１６】
前記マイクロウェル内への前記開口部が有効直径Ｄ上部を有し、前記丸みを帯びたウェル底部が底を有し、各マイクロウェルが１つ以上の側壁を有しており、
前記１つ以上の側壁が、前記丸みを帯びたウェル底部の前記底から前記マイクロウェル内への前記開口部まで延びる高さＨを有し、
各マイクロウェルが、前記マイクロウェル内への前記開口部と前記丸みを帯びたウェル底部の前記底との間の有効直径の中間点Ｄ中間を有し、
Ｄ上部：Ｄ中間の比が１．５：２．５である
ことを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の細胞培養基材。
【請求項１７】
Ｄ上部が２００μｍ〜５００μｍであることを特徴とする、請求項１６に記載の細胞培養基材。
【請求項１８】
高さＨが１００μｍ〜５００μｍであることを特徴とする、請求項１６に記載の細胞培養基材。
【請求項１９】
Ｈ＝０．７〜１．３Ｄ中間であることを特徴とする、請求項１６に記載の細胞培養基材。
【請求項２０】
Ｄ中間が２００〜１０００μｍであることを特徴とする、請求項１６に記載の細胞培養基材。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、各々の全体がここに参照することによって本願に援用される、２０１４年１０月２９日出願の米国仮特許出願第６２／０７２０１５号、２０１４年１０月２９日出願の同第６２／０７２１０３号、２０１４年１０月２９日出願の同第６２／０７２０８８号、及び、２０１４年１２月１９日出願の同第６２／０９４４７１号の優先権を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本開示は、細胞を培養するための装置、システム、及び方法に関する。特に、３Ｄ細胞凝集体の生成及び培養のための装置及び方法が提供される。
【背景技術】
【０００３】
三次元（３Ｄ）細胞培養は、細胞が、三次元のすべての次元において、増殖及び／又は主として互いに対する相互作用を可能にする、人工的に作り出された環境における細胞の増殖である。３Ｄ細胞培養は、少なくとも、３Ｄ条件がインビボ環境をより正確に具現化するという理由で、２Ｄ（例えば、ペトリ皿上）での細胞の増殖方法に対する改善を示す。
【０００４】
スフェロイドなどの三次元で培養された細胞は、単層として二次元で培養されたそれらの対応物よりもさらにインビボ様の機能を呈しうる。二次元の細胞培養システムでは、細胞は、それらがその上で培養される基材に付着しうる。しかしながら、スフェロイドなど、細胞が三次元で増殖される場合、細胞は、基材に付着するよりはむしろ、互いに相互作用する。スフェロイドをベースとしたアッセイの問題の１つは、アッセイの結果が、典型的にはスフェロイドの寸法によって変動することである。例えば、システムごとの播種密度及び増殖時間などの変数の変動は、所与のシステム内のシステムごとに又はウェルごとに、アッセイの再現性に影響を及ぼしうる。したがって、別々のウェル内で増殖させたスフェロイド間の一貫性のあるスフェロイド寸法の維持は、課題を提示しうる。
【０００５】
細胞培養装置内で増殖する細胞の密度が増加するにつれて、より大きい容積の細胞培養培地、又は、細胞培養培地のより頻繁な交換が、細胞を維持するために必要とされうる。しかしながら、培地交換の頻度の増加は不便でありうる。加えて、細胞培養培地の容積の増加は、培養される細胞の上の培地の高さの望ましくない増加につながりうる。培地の高さが増加するにつれて、培地を通じた細胞のためのガス交換速度は低下する。
【０００６】
細胞は、波状のバッグ、スピナ及び振とう機においてスフェロイド塊として高密度で増殖されている。しかしながら、このような装置内で増殖させたスフェロイドの寸法は一貫性がなく、このような装置に特有の剪断は、スフェロイドをより小さい塊へと破壊する傾向がある。さらには、このような装置は、顕在需要を満たすのに十分に高い細胞密度を達成することはできないであろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本開示は、細胞を培養するための装置、システム及び方法に関する。特に、３Ｄ細胞凝集体の生成及び培養のための装置及び方法が提供される。例えば、装置及び方法は、細胞の３Ｄ培養にとって有害な、当技術分野で知られた又は知られていない問題に対処するために提供される。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
スフェロイドなどの三次元で培養された細胞は、単層として二次元で培養されたそれらの対応物よりも高いインビボ様の機能を示しうる。二次元の細胞培養システムでは、細胞は、それらがその上で培養される基材に付着しうる。しかしながら、スフェロイドなど、細胞が三次元で増殖される場合、細胞は、基材に付着するよりはむしろ、互いに相互作用する。三次元で培養された細胞は、細胞間コミュニケーション及び細胞外基質の発現の観点から、インビボ組織によく似ている。よって、スフェロイドは、細胞の移動、分化、生存、及び増殖の優れたモデルを提供し、したがって、研究、診断、並びに、薬効、薬理、及び毒性を試験するためのより良好なシステムを提供する。
【０００９】
幾つかの実施形態では、マイクロウェル又はウェルのアレイを備えた又は含む基材が提供される。基材は、細胞培養装置又はデバイスの一部を形成しうる。例えば、基材は、マルチウェルプレート、フラスコ、皿、管、多層細胞培養フラスコ、バイオリアクタ、若しくは、細胞又はスフェロイドの増殖を意図した他の研究用容器などの一部を形成しうる。マイクロウェル又はウェル（用語「マイクロウェル」及び「ウェル」は、本開示において同じ意味で用いられる）は、培養におけるスフェロイドの形成を促進する環境を提供するように構造化及び配置される。すなわち、実施形態において、マイクロウェルは、スフェロイドを誘発する幾何学形状を有する。加えて、ウェルは、基材とウェル内に取り込まれた液体又は液滴との間に空気を閉じ込めることなく、ウェルの内外への液体の移動をもたらすように構造化及び配置される。すなわち、実施形態において、マイクロウェルは毛管構造を有する。例えば、細胞がその中で増殖されるウェルは、ウェル内の細胞が互いに会合して球状物を形成するように、細胞に対して非接着性でありうる。スフェロイドは、ウェルの幾何学形状によって課せられた寸法の許容限界まで拡大する。幾つかの実施形態では、ウェルは、ウェルを細胞に対して非接着性にするために超低結合性の材料でコーティングされる。
【００１０】
幾つかの実施形態では、細胞培養装置は、該装置の設置面積を含むフレームを有しており、該装置の基材は、装置内で培養された細胞がスフェロイドを形成するように構成されている。例えば、装置内の細胞培養基材は、細胞が基材の代わりに互いに会合するように、細胞に対して非接着性である。細胞培養基材はさらに、その幾何学形状によって、ウェル内で増殖した細胞が同様の大きさの細胞凝集体又はスフェロイドを形成可能にする、複数のマイクロウェル（又はウェル）から構成される。スフェロイドは、マイクロウェルの幾何学形状によって課せられた寸法の許容限界まで拡大する。幾つかの実施形態では、ウェルは、該ウェルを細胞に対して非接着性にするために、低結合化処理を有するか、又は、超低結合性の材料でコーティングされる。
【００１１】
非接着性の材料の例としては、パーフルオロ化ポリマー、オレフィン、又は同様のポリマー、若しくはそれらの混合物が挙げられる。他の例としては、アガロース、ポリアクリルアミドなどの非イオン性ヒドロゲル、ポリエチレンオキシドなどのポリエーテル及びポリビニルアルコールなどのポリオール、又は同様の材料、若しくはそれらの混合物が挙げられる。例えば、非接着性のウェル、ウェルの幾何学形状（例えば、寸法及び形状）、及び／又は重力の組合せは、ウェル内で培養された細胞を、スフェロイドへと自己組織化するように誘発する。一部のスフェロイドは、単層で増殖させた細胞と比較して、よりインビボ様の応答を示す、分化された細胞機能を維持する。間葉系間質細胞などの他の細胞型は、スフェロイドとして培養された場合、それらの多能性を保持する。
【００１２】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載のシステム、装置、及び方法は、１つ以上の細胞を含む。幾つかの実施形態では、細胞は冷凍保存される。幾つかの実施形態では、細胞は、三次元培養におけるものである。幾つかのこのような実施形態では、システム、装置、及び方法は、１つ以上のスフェロイドを含む。幾つかの実施形態では、１つ以上の細胞は、活発に分裂する。幾つかの実施形態では、システム、装置、及び方法は、培養培地（例えば、栄養素（例えば、タンパク質、ペプチド、アミノ酸）、エネルギー（例えば、炭水化物）、必須金属及びミネラル（例えば、カルシウム、マグネシウム、鉄、リン酸塩（phosphates）、硫酸塩（sulphates））、緩衝剤（例えば、リン酸塩、酢酸塩）、ｐＨ変化の指示薬（例えば、フェノールレッド、ブロモクレゾールパープル）、選択剤（例えば、化学薬剤、抗微生物剤）等を含む）を含む。幾つかの実施形態では、１つ以上の試験化合物（例えば、薬物）が、システム、装置、及び方法に含まれる。
【００１３】
多種多様の細胞型が培養されうる。幾つかの実施形態では、スフェロイドは単一の細胞型を含む。幾つかの実施形態では、スフェロイドは２つ以上の細胞型を含む。幾つかの実施形態では、２つ以上のスフェロイドが増殖される場合、各スフェロイドは同じ型のものであるが、他の実施形態では、２つ以上の異なる型のスフェロイドが増殖される。スフェロイド内で増殖した細胞は、天然の細胞又は改変された細胞（例えば、１つ以上の非天然型の遺伝子改変を含む細胞）でありうる。幾つかの実施形態では、細胞は体細胞である。幾つかの実施形態では、細胞は、分化の所望の状態（例えば、多能性（pluripotent、multi-potent）、運命が決定された、不死化した等）にある、幹細胞又は前駆細胞（例えば、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞）である。幾つかの実施形態では、細胞は疾患細胞又は疾患モデル細胞である。例えば、幾つかの実施形態では、スフェロイドは、１つ以上の型のがん細胞又は過剰増殖性の状態へと誘発されうる細胞（例えば、形質転換細胞）を含む。細胞は、任意の所望の組織又は臓器の種類に由来するか、又はそれらから誘導されてよく、副腎、胆嚢（bladder）、血管、骨、骨髄、脳、軟骨、頸部、角膜、子宮内膜、食道、胃腸、免疫システム（例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、白血球、マクロファージ、及び樹状細胞）、肝臓、肺、リンパ腺、筋肉（例えば、心筋）、神経、卵巣、膵臓（例えば、膵島細胞）、下垂体、前立腺、腎臓、唾液腺、皮膚、腱、精巣、及び甲状腺が挙げられるが、それらに限られない。幾つかの実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ニワトリ、ヤギ、ウマ等）である。
【００１４】
培養された細胞は、多種多様な研究、診断、薬物のスクリーニング及び試験、治療及び産業上の用途における利用が見出されている。
【００１５】
幾つかの実施形態では、細胞は、タンパク質又はウイルスの産生に用いられる。多数のスフェロイドを並行して培養するシステム、装置、及び方法は、タンパク質の産生にとって特に有効である。三次元培養は、細胞増殖表面積１平方センチメートル当たりの細胞密度の増加、及びタンパク質収量の増加を可能にする。ワクチン生産のための所望のタンパク質又はウイルスは、細胞内で増殖させることができ、所望の用途のために単離又は精製されうる。幾つかの実施形態では、タンパク質は、細胞にとって天然型のタンパク質である。幾つかの実施形態では、タンパク質は、非天然型である。幾つかの実施形態では、タンパク質は、組換え的に発現される。好ましくは、タンパク質は、非天然型プロモータを使用して過剰発現される。タンパク質は、融合タンパク質として発現されてもよい。幾つかの実施形態では、精製又は検出用のタグが、対象とするタンパク質の融合パートナーとして発現されて、その精製及び／又は検出を促進する。幾つかの実施形態では、融合は、精製後の融合パートナーの分離を可能にするための開裂可能なリンカーを伴って発現される。
【００１６】
幾つかの実施形態では、タンパク質は、治療用タンパク質である。このようなタンパク質としては、欠乏している又は異常なタンパク質を置換する（例えば、インスリン）、既存経路を増強する（例えば、阻害剤又はアゴニスト）、新規の機能又は活性を提供する、分子又は有機体に干渉する、又は他の化合物又はタンパク質を送達する（例えば、放射性核種、細胞傷害性薬物、エフェクタータンパク質等）、タンパク質及びペプチドが挙げられるが、それらに限られない。幾つかの実施形態では、タンパク質は、任意の種類（例えば、ヒト化、二重特異性、多特異性等）の抗体（例えば、モノクローナル抗体）など、免疫グロブリンである。治療用タンパク質の分類としては、抗体ベースの薬物、Ｆｃ融合タンパク質、抗凝固剤、抗原、血液因子、骨形成タンパク質、改変タンパク質足場、酵素、増殖因子、ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、及び血栓溶解剤が挙げられるが、それらに限られない。治療用タンパク質は、がん、免疫異常、代謝異常、遺伝性遺伝病（inherited genetic disorders）、感染症、及び他の疾患及び状態の予防又は治療に使用されうる。
【００１７】
幾つかの実施形態では、タンパク質は、診断用タンパク質である。診断用タンパク質としては、抗体、親和性結合パートナー（例えば、レセプタ結合リガンド）、阻害剤、アンタゴニストなどが挙げられるが、それらに限られない。幾つかの実施形態では、診断用タンパク質は、検出用部分（例えば、蛍光部分、発光部分（例えば、ルシフェラーゼ）、比色分析用部分等）であるか、又はそれらを伴って発現される。
【００１８】
幾つかの実施形態では、タンパク質は産業用タンパク質である。産業用タンパク質としては、食物成分、産業用酵素、農業用タンパク質、分析用酵素等が挙げられるが、これらに限られない。
【００１９】
幾つかの実施形態では、細胞は、創薬、特性付け、有効性試験、及び毒性試験に用いられる。このような試験としては、薬理効果評価、発癌性評価、医療用造影剤特性評価、半減期評価、放射線安全評価、遺伝毒性試験、免疫毒性試験、生殖及び発生試験、薬物相互作用評価、用量評価、吸着性評価、体内動態評価（disposition assessment）、代謝評価、除去研究等が挙げられるが、それらに限られない。特定の細胞型が、特定の試験に用いられうる（例えば、肝毒性には肝細胞、腎毒性には腎臓近位尿細管上皮細胞、血管毒性には血管内皮細胞、神経毒性には神経細胞及びグリア細胞、心毒性には心筋細胞、横紋筋融解には骨格筋細胞等）。処理された細胞は、膜統合性、細胞内代謝物含量、ミトコンドリア機能、リソソーム機能、アポトーシス、遺伝子変異、遺伝子発現の差異などを含むがそれらに限られない、あらゆる所望のパラメータについて評価されうる。
【００２０】
幾つかの実施形態では、細胞培養装置は、より大きいシステムの構成要素である。幾つかの実施形態では、システムは、複数（例えば、２、３、４、５、…、１０、…、２０、…、５０、…、１００、…、１０００等）のこのような細胞培養装置を含んでいる。幾つかの実施形態では、システムは、最適な培養条件（例えば、温度、雰囲気、湿度等）に培養装置を維持するためのインキュベータを備えている。幾つかの実施形態では、システムは、細胞を撮像又は他の方法で解析するための検出器を備えている。このような検出器としては、蛍光光度計、照度計、カメラ、顕微鏡、プレートリーダ（例えば、ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ社のＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダ；ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ社のＶｉｅｗＬｕｘプレートリーダ）、細胞分析器（例えば、ＧＥ社のＩＮセルアナライザー２０００及び２２００；ＴＨＥＲＭＯ社のＣＥＬＬＯＭＩＣＳ  ＣＥＬＬＮＳＩＧＨＴハイコンテントスクリーニングプラットフォーム）、及び共焦点結像システム（例えば、ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ社のＯｐｅｒａＰｈｅｎｉｘハイスループットコンテントスクリーニングシステム；ＧＥ社のＩＮＣＥＬＬ６０００細胞結像システム）が挙げられるが、それらに限られない。幾つかの実施形態では、システムは、培養細胞に、培養培地又は他の成分を供給、再供給、及び循環させるための灌流システム又は他の構成要素を備えている。幾つかの実施形態では、システムは、培養装置の取り扱い、使用、及び／又は解析を自動化するためのロボット構成要素（例えば、ピペット、アーム、プレートムーバー等）を備えている。
【００２１】
マイクロウェルフォーマットのマイクロプレート又はマイクロウェルを有する他の容器の取り扱いにおいて、及び、特にマイクロウェルへの液体の添加の際には、水性液体の導入時にマイクロウェルからの空気の完全な排除を確実にすることに配慮すべきである。ウェルを含む容器に液体を添加する際に、空気は、特にウェルが円形の断面を有する場合には、液下で、かつ、ウェル（例えば、マイクロウェル）内に閉じ込められうる。ウェルに加えられる水性液体の表面張力は強力であるため、液滴は球形を保持しやすい。球形液滴は、同様の寸法の円形孔を容易に閉塞することができ、空気を孔（例えば、マイクロウェル）内に閉じ込めてしまう。
【００２２】
幾つかの実施形態では、ウェルの細胞培養特性（例えば、３Ｄ細胞培養における有用性）を維持しつつ、空気がマイクロウェル内に閉じ込められる可能性を低下させるウェルの幾何学形状が、本明細書において提供される。幾つかの実施形態では、ウェルの幾何学形状（例えば、マイクロウェルの幾何学形状）は、ウェルへの液体の導入の際に、空気の効率的な排除を可能にする。幾つかの実施形態では、ウェルの幾何学形状は、ウェルからの空気の抜けを遮断することなく、ウェル内への液体の流れのための経路を提供する。幾つかの実施形態では、ウェルの幾何学形状は、閉じ込められた空気を逃がすための経路を提供する。幾つかの実施形態では、細胞の凝集のための閉じ込め寸法を維持すると同時に、マイクロウェル内の空気の排除を促進し、かつ、マイクロウェル内への液体の流入を可能にする、さまざまなウェルの幾何学形状が、本明細書に提供される。
【００２３】
実施形態において、本開示は、例えば、スフェロイド細胞塊又は他の凝集細胞群を、培養及び評価するための装置（例えば、マルチウェルプレート、ペトリ皿、フラスコ、多層フラスコ、又はＨｙｐｅｒＳｔａｃｋ）を提供する。幾つかの実施形態では、装置は、開口部（例えば、開口）、１つ又は複数の側壁、及び、１つ以上のマイクロウェルを有する底面を備えた、少なくとも１つのチャンバ（例えば、ウェル（例えば、マクロウェル）、フラスコ等）を備えている。幾つかの実施形態では、開口部、側壁、及び底部の幾何学形状は、チャンバ内での細胞（例えば、細胞凝集体、スフェロイド等）の３Ｄ培養、並びに、次のうち１つ以上（例えば、すべて）を可能にする：（１）チャンバへの試薬（例えば、液体試薬）の分配の際のチャンバからの空気の排除（例えば、空気が液下又は液体内に閉じ込められることなく）、（２）マイクロウェル内の液体の表面下の空気の閉じ込めの可能性を低下させる、マイクロウェルへの液体の流れのルート、（３）マイクロウェルへの液体の導入の際の空気の抜けのための経路、及び／又は（４）液面下に閉じ込められた空気の抜けのための経路。
【００２４】
幾つかの実施形態では、装置は、ウェル（例えば、マイクロウェル）及び表面が多角形の角度（例えば、９０度の角度）を有しない、１つ以上のウェル（例えば、マイクロウェル）を含む表面を伴って準備される。
【００２５】
幾つかの実施形態では、ウェル（例えばマイクロウェル）は、正弦波に似た断面形状を有する。このような実施形態では、ウェルの底部は丸みを帯び（例えば半球円形）、側壁はウェルの底部から上部へと直径が増大し、ウェル間の境界は丸みを帯びている。このように、ウェルの上部は直角には終結しない。幾つかの実施形態では、ウェルは、底部と上部との間の中間点における直径Ｄ（Ｄ中間ともいわれる）、ウェルの上部における直径Ｄ上部、及び、ウェルの底部から上部までの高さＨを有する。これらの実施形態では、Ｄ上部は、Ｄよりも大きい。ウェルの相対寸法及び絶対寸法は両方とも、所望の培養条件について選択されうる。スフェロイドの増殖では、直径Ｄは、好ましくは、ウェル内で培養される３Ｄ細胞凝集体の所望の直径の１〜３倍である。高さＨは、Ｄの０．７〜１．３倍である。直径Ｄ上部は、Ｄの１．５〜２．５倍である。Ｄは、好ましくは、１００マイクロメートル（μｍ）〜約２０００マイクロメートルである（以下の値のうちのいずれか２つの値の間の範囲（例えば、２００〜１０００μｍ、２００〜７５０μｍ、３００〜７５０μｍ、４００〜６００μｍ等）を含む、例えば、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、又は２０００マイクロメートル）。しかしながら、代替的な相対寸法又は絶対寸法を使用してもよい。例えば、Ｄは、細胞凝集体の所望の直径の１〜１０倍（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９）、若しくは、それらの間の任意の値又は範囲（例えば、１、１〜１．５、１〜２、２、１〜２．５、１〜３、２〜３、１〜５、３〜５、２〜７等）でありうる。Ｄは、１００μｍ〜１０，０００μｍ、若しくは、それらの間の任意の値（例えば、１００、２００、５００、１０００、２０００、５０００）又は範囲（例えば、１００〜２０００、２００〜１０００、３００〜７００、４００〜６００、５００等）でありうる。Ｈは、Ｄの０．５〜１０倍（例えば、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、４、５、６、７、８、９、１０、若しくは、それらの間の任意の値又は範囲）でありうる。Ｄ上部は、Ｄの１．１〜５倍（例えば、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、若しくは、それらの間の任意の値又は範囲）でありうる。
【００２６】
隣接するウェル（例えば、マイクロウェル）間の障壁は、隣接したウェルとは逆の同一形状を有してもよく、より大きい又はより小さい直径ＤＢを有してもよく、あるいは、別の方式で形状が異なっていてもよい（例えば、ウェル底部の形状は、ウェル／障壁上部の形状とは異なっていてもよい、例えば、図２参照）。所与の表面におけるウェルの数を最大化するため、ＤＢは、Ｄ未満であることが好ましい。ＤＢは、Ｄより１．１〜５倍（例えば、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、若しくは、それらの間の任意の値又は範囲）、大きくても小さくてもよい。
【００２７】
ある特定の実施形態では、本明細書の細胞培養装置は、ウェル内で培養された細胞が特定の直径のスフェロイドを形成するように各々が構成された、複数のウェルを備えている。細胞培養装置は、複数のウェルを画成する構造を含みうる。幾つかの実施形態では、複数のウェルの各々は、上部開口、ウェル底部、及び上部開口からウェル底部まで延びる側壁表面を画成する。側壁表面は、上部開口とウェル底部との間のペン先領域を画成する。細胞培養容積は、底面、側壁表面の一部、及びペン先領域によって画成される。幾つかの実施形態では、ペン先領域は、５０マイクロメートル〜７００マイクロメートルの範囲（例えば、５０μｍ、７５μｍ、１００μｍ、２００μｍ、３００μｍ、４００μｍ、５００μｍ、６００μｍ、７００μｍ、及びそれらの間の任意の範囲）のウェル底部からの高さにおいて、１００マイクロメートル〜７００マイクロメートルの範囲（例えば、１００μｍ、２００μｍ、３００μｍ、４００μｍ、５００μｍ、６００μｍ、７００μｍ、及びそれらの間の任意の範囲）の直径寸法によって画成される。側壁表面又は細胞培養容積は、各ウェル内で増殖するスフェロイドの寸法を制御するように寸法決めされる。ペン先領域は、スフェロイドを誘発する幾何学形状をしている。
【００２８】
実施形態は、例えば：細胞の播種又は培地交換の間の気泡の取り込みがないこと、培地交換の間の３Ｄ細胞凝集体の高い保持性、大面積の表面からのスフェロイドの採取の容易性、ガス透過性、複数のウェルの上の培地リザーバ、スフェロイド含有ウェル、及び／又は、大量かつ均一寸法でのスフェロイド生成能を含む、多くの特徴を提供する。
【００２９】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載のウェルは、ウェル内部の上部開口部から延びる、１つ以上の毛管構造（例えば、リッジ、割れ目、角部、鋭角、波形、ピラー等）を備えており、この毛管構造は、上部開口部からウェル底部へ又は上部開口部から口部の底部へと延びてよく、これが、ウェル内への液体の流入の際に空気を逃がすためのルートを提供する。本明細書に記載の実施形態の範囲内の適切なウェルの幾何学形状としては、次のものが挙げられる：（ａ）正方形の断面の上部開口部、丸みを帯びた（例えば、凹形）ウェル底部、及び、ウェルの上部の正方形の断面からウェル底部の円形の断面へと移行する側壁を有するウェル；（ｂ）上部開口部（例えば、円形の断面の上部開口部）からウェル底部（例えば、丸みを帯びた（例えば、凹形）ウェル底部）まで延びる１つ以上の突出するリッジ線を有するウェル（例えば、図１Ｂ参照）；（ｃ）上部開口部（例えば、円形の断面の上部開口部からウェル底部（例えば、丸みを帯びた（例えば、凹形）ウェル底部）まで延びる１つ以上の割れ目を有するウェル（例えば、図２Ｂ参照）；（ｄ）ウェルを完全には取り囲まない、第１及び第２の側壁によって画成される上部と、丸底を有し、側壁が完全にウェルを囲む、ウェルの下部を有する、ウェル（例えば、図２７又は図２８参照）；（ｅ）１つ以上の側壁が凸状断面を有し、それによって、ピラーによって形成されうる、２つの側壁の間に鋭角を生じる、ウェル（例えば、図５参照）。幾つかの実施形態では、ウェルは、上記幾何学形状のバリエーション及び／又は組合せを含む。
【００３０】
実施形態において、本明細書に記載のウェルを備えた細胞培養装置を製造する方法が本明細書に提供される。
【００３１】
実施形態において、例えば、スフェロイド細胞培養又は細胞アッセイにおける、本明細書に記載のウェルを備えた細胞培養装置の使用方法が、本明細書に提供される。
【００３２】
幾つかの実施形態では、その中に配置されたウェルを有するフレームを備えた細胞培養装置が、本明細書に提供され、該ウェルは、（ａ）上部開口部；（ｂ）丸みを帯びた断面形状を有するウェル底部；（ｃ）ウェル底部から上部開口部まで延びる１つ又は複数の側壁；（ｄ）必要に応じて、口部；及び（ｅ）必要に応じて、液体の表面下に持続的な空気溜まりを形成することなく、ウェル内への液体の導入及びウェルからの空気の抜けを促進する毛管構造を備えている。
【００３３】
幾つかの実施形態では、ウェル底部は円形の断面形状を有し、ここで、上部開口部は、多角形の断面形状を有し、側壁は、円形から多角形の断面形状へと移行し、それによって、ウェル内への液体の導入及びウェルからの空気の抜けを促進する毛管構造としての役割をする角部を側壁間に生じる。幾つかの実施形態では、側壁の断面形状の移行は、ウェル内外への流体の流れに障害をもたらさない。幾つかの実施形態では、上部開口部は正方形又は六角形の断面形状を有する。
【００３４】
幾つかの実施形態では、ウェル内への液体の導入及びウェルからの空気の抜けを促進する構造的特徴は、１つ又は複数の側壁から突出し、ウェル底部から上部開口部まで延びるリッジである。幾つかの実施形態では、ウェルは、１つ又は複数の側壁から突出し、ウェル底部から上部開口部まで延びる、又は略そのような形状の１〜２０のリッジ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０）を備えている。幾つかの実施形態では、ウェル底部は円形の断面形状を有し、上部開口部は円形又は多角形の断面形状を有する。幾つかの実施形態では、リッジは、ウェルの外周の周りに対称的に離間されている。幾つかの実施形態では、リッジは、ウェルの外周の周りに非対称的に離間されている。幾つかの実施形態では、リッジは、上部開口部からウェル底部までの距離全体には及ばない。
【００３５】
幾つかの実施形態では、ウェル内への液体の導入及びウェルからの空気の抜けを促進する構造的特徴は、１つ又は複数の側壁内かつウェル底部から上部開口部まで延びる割れ目である。幾つかの実施形態では、ウェルは、１つ又は複数の側壁内かつウェル底部から上部開口部まで延びる１〜２０の割れ目（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０）を備えている。幾つかの実施形態では、ウェル底部は円形の断面形状を有し、上部開口部は円形又は多角形の断面形状を有する。幾つかの実施形態では、割れ目は、ウェルの外周の周りに対称的に離間されている。幾つかの実施形態では、割れ目は、ウェルの外周の周りに非対称的に離間されている。幾つかの実施形態では、割れ目は、上部開口部からウェル底部までの距離全体には及ばない。
【００３６】
幾つかの実施形態では、ウェルは、３つ以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０）の隣接するピラーによって画成され、各ピラーの側部の一部は、ウェルの側壁を形成し；ここで、隣接するピラー同士の間の限定空間は、ウェル内への液体の導入及びウェルからの空気の抜けを促進する構造的特徴を形成する。幾つかの実施形態では、ウェル底部は、円形の断面形状を有し、ピラーの下に延びる。
【００３７】
幾つかの実施形態では、その中に配置された複数のウェルを有するフレームを備えた細胞培養装置が、本明細書に提供され；ここで、ウェルは、少なくとも一列に配置され；該列は、側壁同士の間の間隙が各波形に伴って拡大狭小するように位置合わせされた２つの波形状の側壁によって画成され；各ウェルの上部は、隣接するウェルの上部が流体連通するように、側壁の２つの狭くなった間隙の間の拡大した間隙によって画成され；各ウェルの下部は、波形状の側壁の下に延び、円形のウェル底部を形成する。幾つかの実施形態では、装置は、複数の列のウェルを備えている。
【００３８】
幾つかの実施形態では、１つの側壁、複数の側壁、及び／又はウェル底部は、ガス透過性かつ液体非透過性である。すなわち、幾つかの実施形態では、ウェルを形成する基材は、ガス透過性かつ液体非透過性である。
【００３９】
幾つかの実施形態では、１つ又は複数の側壁は不透明であり、ウェル底部は透明である。
【００４０】
幾つかの実施形態では、ウェル底部は、凹状のアーチ形表面を含む。
【００４１】
幾つかの実施形態では、１つの側壁、複数の側壁、及び／又はウェル底部は、低接着性又は非接着性の材料を含む、及び／又は、低接着性又は非接着性の材料でコーティングされる。
【００４２】
幾つかの実施形態では、細胞培養装置は、８〜約１０，０００のウェル（８、１６、２４、３２、４８、６４、９６、１２８、２５６、３８４、５００、６００、７００、８００、１０００、１５３６、２０００、２４００、３２００、４０００、１００００、又はそれらの中のいずれかの範囲）を備えている。
【００４３】
幾つかの実施形態では、マイクロウェルパターンを有する表面は、幅広い細胞培養製品に導入される。幾つかの実施形態では、例えば、１２−、２４−、及び６−ウェルプレートにおける、ウェル（例えば、マクロウェル）の底部は、マイクロウェル表面を伴ってパターン化される。幾つかの実施形態では、マイクロウェル表面は、Ｔ２５、Ｔ７５、Ｔ１２５、Ｔ１７５及びＴ２５０フラスコなどの大表面積の細胞培養容器、並びに、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ及びＨＹＰＥＲＳｔａｃｋラインの製品に導入される。幾つかの実施形態では、前記マイクロウェルを多数有する大表面積の容器内での細胞の培養は、細胞療法用途、クローン培養、幹細胞ニッチ、又はニッチ細胞の共培養に適用可能な大量の３Ｄ細胞凝集体を産生する。
【００４４】
幾つかの実施形態では、本明細書の細胞培養装置は、主面を画成する底部プレート、リザーバを画成する、底部プレートから延びる１つ以上の側壁、及び、主面に形成された複数のウェルを備えている。各ウェルは、主面と同一平面上にあり、かつリザーバに対して開放された上部開口、及び、主面の下に位置合わせされたウェル底部の底（nadir）を画成する。通常のウェルプレートとは対照的に、本明細書に記載のプレートは、ウェルの表面の上のリザーバを画成し、これが、使用される細胞培養培地の容積の増加を可能にし、よって、頻繁な培地交換をより少なくする。例えば、図２８を参照。
【００４５】
さまざまな実施形態において、１つ以上の細胞培養コンパートメントを有する細胞培養装置が記載される。幾つかの実施形態では、細胞培養コンパートメントは積層される。幾つかの実施形態では、各細胞培養コンパートメントは、複数のガス透過性のウェルを画成する構造化された表面を画成する基材を備えている。幾つかの実施形態では、ウェルは、ガス透過性材料を通じて直接、若しくは、通気孔又は導管空間を介して、のいずれかによって装置の外部とガス連通する。幾つかの実施形態では、少なくとも一部に、ウェルがガス透過性材料から作られたマイクロウェルのアレイを有する基材を有する、細胞培養装置が記載される。したがって、幾つかの実施形態では、装置は、効率的な代謝ガスの交換のために、既存の細胞培養装置では高すぎるであろう、ある高さの細胞培養培地を、培養された細胞上に有しつつ、ウェル内で細胞を培養するために用いられる。細胞は、装置の外部とガス連通するガス透過性のウェル内で培養されることから、ガス交換はウェルを通じて行われ、細胞の上の培地の高さに起因する細胞培養培地を通じたガス交換の不足を克服する。
【００４６】
ある特定の実施形態では、細胞培養装置は、１つ以上の細胞培養コンパートメントを備えている。幾つかの実施形態では、各細胞培養コンパートメントは内部を有し、第１の主面と、反対側の第２の主面とを有する基材を備えており；第１の主面は、コンパートメントの内部の構造化された表面を画成する。幾つかの実施形態では、構造化された表面は、複数のガス透過性のウェルを画成する。幾つかの実施形態では、ウェルは、装置の外部とガス連通している。
【００４７】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載の細胞培養装置に培養培地を充填する工程；及び、スフェロイド形成細胞を培養培地に加える工程を含む、スフェロイドを培養する方法が本明細書に提供される。幾つかの実施形態では、方法は、培地を置換／交換（例えば、毎日、連続的に等）する工程をさらに含む。
【００４８】
幾つかの実施形態では、スフェロイドの培養のための本明細書に記載の細胞培養装置の使用が本明細書に提供される。
【００４９】
本開示の主題の追加の特徴及び利点は、以下の詳細な説明において記載され、一部にはその説明から当業者に容易に明らかになり又は以下の詳細な説明、特許請求の範囲、並びに添付の図面を含む本明細書に記載される開示の主題を実施することによって認識されよう。
【００５０】
前述の概要及び以下の詳細な説明は両方とも、本開示の主題の実施形態を提示するものであり、特許請求の範囲に記載される本開示の主題の性質及び特徴を理解するための概観又は枠組みを提供することが意図されているものと解されたい。添付の図面は、本開示の主題のさらなる理解をもたらすために含まれ、本明細書に取り込まれてその一部を構成する。図面は、本開示の主題のさまざまな実施形態を例証しており、その説明とともに本開示の主題の原理及び動作を説明する役割を果たす。加えて、図面及び説明は単に例証することが意図されており、いかなる方法によっても特許請求の範囲を限定することは意図されていない。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１Ａ】ウェルのアレイ１００の例示的な実施形態の概略図。図１Ａは断面図である。
【図１Ｂ】ウェルのアレイ１００の例示的な実施形態の概略図。図１Ｂは、図１Ａの線Ｂ−Ｂで切り取ったウェルのアレイの例示的な実施形態の上視図である。
【図２Ａ】ウェルのアレイ１００の別の例示的な実施形態の概略図。図２Ａは断面図である。
【図２Ｂ】ウェルのアレイ１００の別の例示的な実施形態の概略図。図２Ｂは、図２Ａの線Ｂ−Ｂで切り取ったウェルのアレイの例示的な実施形態の上視図である。
【図３Ａ】ウェルのアレイ１００の別の例示的な実施形態の概略図。図３Ａは断面図である。
【図３Ｂ】ウェルのアレイ１００の別の例示的な実施形態の概略図。図３Ｂは、図３Ａの線Ｂ−Ｂで切り取ったウェルのアレイの例示的な実施形態の上視図である。
【図３Ｃ】ウェルのアレイ１００の別の例示的な実施形態の概略図。図３Ｃは、正弦波又は放物面の形状を有するウェルのアレイの図である。
【図３Ｄ】ウェルのアレイ１００の別の例示的な実施形態の概略図。図３Ｄは、ある実施形態における、スフェロイドを含むウェルのアレイの側面図である。
【図４Ａ】波形状の実施形態における、スフェロイド含有細胞培養コンパートメント又はウェルのアレイの別の例示的な実施形態を示す概略図。図４Ａは、ウェルのアレイを有する基材の波形状の実施形態の上視図である。
【図４Ｂ】波形状の実施形態における、スフェロイド含有細胞培養コンパートメント又はウェルのアレイの別の例示的な実施形態を示す概略図。図４Ｂは、同じ実施形態の部分切り取り図である。
【図４Ｃ】波形状の実施形態における、スフェロイド含有細胞培養コンパートメント又はウェルのアレイの別の例示的な実施形態を示す概略図。図４Ｃは、ウェルのアレイを有する基材の波形状の実施形態の上視図である。
【図４Ｄ】波形状の実施形態における、スフェロイド含有細胞培養コンパートメント又はウェルのアレイの別の例示的な実施形態を示す概略図。４Ｄは、同じ実施形態の部分切り取り図である。
【図５Ａ】一連のピラーがウェルを画成する、追加の例示的な実施形態の概略図。図５Ａは上視図である。
【図５Ｂ】一連のピラーがウェルを画成する、追加の例示的な実施形態の概略図。図５Ｂは上視図である。
【図５Ｃ】一連のピラーがウェルを画成する、追加の例示的な実施形態の概略図。図５Ｃは、例示的な実施形態の部分的な切り取り斜視図である。
【図５Ｄ】一連のピラーがウェルを画成する、追加の例示的な実施形態の概略図。図５Ｄは、例示的な実施形態の部分的な切り取り斜視図である。
【図５Ｅ】一連のピラーがウェルを画成する、追加の例示的な実施形態の概略図。図５Ｅは、例示的な実施形態の部分的な切り取り斜視図である。
【図６Ａ】側壁から突出するリッジの断面形状の例示的かつ非限定的な例
【図６Ｂ】側壁から突出するリッジの断面形状の例示的かつ非限定的な例
【図６Ｃ】側壁から突出するリッジの断面形状の例示的かつ非限定的な例
【図６Ｄ】側壁から突出するリッジの断面形状の例示的かつ非限定的な例
【図６Ｅ】側壁から突出するリッジの断面形状の例示的かつ非限定的な例
【図７Ａ】側壁内の割れ目の断面形状の例示的かつ非限定的な例
【図７Ｂ】側壁内の割れ目の断面形状の例示的かつ非限定的な例
【図７Ｃ】側壁内の割れ目の断面形状の例示的かつ非限定的な例
【図７Ｄ】側壁内の割れ目の断面形状の例示的かつ非限定的な例
【図７Ｅ】側壁内の割れ目の断面形状の例示的かつ非限定的な例
【図８】マイクロウェルのアレイでマイクロパターン化された底面を有する培養フラスコ
【図９】図８に示されるフラスコの底面を形成する、マイクロウェルのアレイでマイクロパターン化された基材の拡大図
【図１０Ａ】図８に示されるマイクロパターン化されたＴ２５スフェロイド形成フラスコのマイクロウェルの内部のＨＴ２９細胞のスフェロイド
【図１０Ｂ】マイクロパターン化されたＴ２５スフェロイド形成フラスコから採取されたスフェロイド
【図１１Ａ】Ｎｕｎｃ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社から市販されるＮＵＮＣＬＯＮ  ＳＰＨＥＲＡ（商標）低結合表面上に形成された、ヒトＥＳＣ細胞のスフェロイド又は３Ｄ凝集体の顕微鏡写真
【図１１Ｂ】Ｎｕｎｃ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社から市販されるＮＵＮＣＬＯＮ  ＳＰＨＥＲＡ（商標）低結合表面上に形成された、マウスＥＳＣ細胞のスフェロイド又は３Ｄ凝集体の顕微鏡写真
【図１２】実施形態に従ったマルチウェルアレイを有する基材の作製方法を示す図
【図１３】異なる底部厚さを有するマイクロウェルにおける、マイクロウェルのアレイを有する基材（実施例１に記載されるような）を有する６ウェルプレート内で細胞を増殖後に測定した生細胞カウント数を示すグラフ
【図１４Ａ】平坦な表面に対し、マイクロウェルのアレイを有する基材についての生細胞カウント数を比較したグラフ
【図１４Ｂ】平坦な表面に対し、マイクロウェルのアレイを有する基材についての細胞増殖率を比較したグラフ
【図１５】平坦な表面に対し、マイクロウェルのアレイを有する基材上で培養されたＭＨ６７７細胞から排出されたタンパク質の全力価を示すグラフ
【図１６】構造化された表面の実施形態の画像
【図１７】構造化された表面の実施形態のウェル内で増殖した細胞の写真
【図１８】多孔膜支持体を含む細胞培養装置の実施形態を示す側面図
【図１９】多孔膜支持体を含む細胞培養装置の追加的な実施形態を示す側面図
【図２０】細胞の共培養を示す、多孔膜支持体を含む細胞培養装置の追加的な実施形態を示す側面図
【図２１】細胞培養装置の実施形態の概略的な斜視図
【図２２】細胞培養装置の実施形態の概略的な断面図
【図２３】細胞培養装置の実施形態の概略的な断面図
【図２４Ａ】図２１〜２３のいずれかに示される装置の一部を形成するために利用可能なトレイの実施形態の概略的な底面図
【図２４Ｂ】図２４Ａに示されるトレイの実施形態の概略的な斜視図
【図２５】細胞培養装置の実施形態の概略的な側面図
【図２６】ウェルを有する細胞培養装置の実施形態の斜視図
【図２７】複数のウェルの実施形態の概略的な断面図
【図２８】複数のウェルの実施形態の概略的な断面図
【図２９】複数のウェルの実施形態の拡大した概略的な断面図
【図３０】プレート及びウェルを有する細胞培養装置の実施形態の概略的な斜視図
【図３１】プレート及びウェルを有する細胞培養装置の実施形態の概略的な斜視図
【図３２】細胞培養装置及びメッシュを備えたインサートの実施形態の概略的な斜視図
【図３３】入口及び出口を有する装置の実施形態の概略的な斜視図
【図３４Ａ】ＣＨＯ５／９アルファ細胞における、９６ウェルスフェロイドマイクロウェルプレートでの１ｃｍ２あたりのタンパク質の産生を示すグラフ
【図３４Ｂ】ＢＨＫ−２１  ｐｃ．ＤＮＡ３−１ＨＣ細胞における、９６ウェルスフェロイドマイクロウェルプレートでの１ｃｍ２あたりのタンパク質の産生を示すグラフ
【発明を実施するための形態】
【００５２】
本開示のさまざまな実施形態は、図面を参照して詳細に説明される。さまざまな実施形態への言及は、本発明の範囲を限定するものではない。加えて、本明細書に記載される例は、限定するものではなく、単に、特許請求の範囲に記載される発明の多くの可能な実施形態の幾つかを記載するに過ぎない。図面内で用いられる同様の番号は、同様の要素、工程などを示している。しかしながら、所与の図面中の要素について言及するためのある番号の使用は、同じ番号が付された別の図におけるその要素を限定することは意図されていないことが理解されよう。加えて、要素について言及するための異なる番号の使用は、その異なる番号が付された要素が、他の番号が付された要素と同一又は同様でありえないことを示すことは意図されていない。
【００５３】
本明細書で用いられるすべての科学及び技術用語は、他に明記されない限り、当技術分野で通常用いられる意味を有する。本明細書に提供される定義は、本明細書において頻繁に用いられるある特定の用語の理解を容易にするためのものであって、本開示の範囲を限定することは意図されていない。
【００５４】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の装置並びにこのような装置の製造及び使用方法は、例えば以下に論じられるものを含む、１つ以上の有利な特徴又は態様を提供する。特許請求の範囲に列挙される特徴又は態様は、概して、本発明のすべての態様に適用可能である。任意の１つの請求項における任意の記述された単一又は複数の特徴又は態様は、任意の他の請求項における任意の他の記述された特徴又は態様と組み合わせる、又は、それらの特徴又は態様で置き換えることができる。
【００５５】
「含む（Include, includes）」などの用語は、すなわち、包含的であって排他的ではないことを含むが、それらに限られないことを意味する。
【００５６】
本開示の実施形態の説明に用いられる、例えば、組成物中の成分の量、濃度、容積、処理温度、処理時間、収量、流量、圧力、粘度等の値及びそれらの範囲、又は、構成要素の寸法等の値及びそれらの範囲を修飾する「約」とは、例えば：材料、組成物、複合体、濃縮物、構成部品、製造物品、又は使用配合物（use formulations）の調製に用いられる典型的な測定及び取り扱い手順を通じて；これらの手順における不注意による誤りを通じて；製造、供給源、又は、方法の実施に用いられる出発材料又は原料の純度における差異を通じて；などによって生じうる数量の変動のことを指す。用語「約」はまた、特定の初期濃度を有する組成物又は配合物若しくは混合物の劣化に起因して異なる量、及び、特定の初期濃度を有する組成物又は配合物若しくは混合物の混合又は加工に起因して異なる量も包含する。
【００５７】
「随意的な」又は「必要に応じて」は、その後に記載される工程、特徴、状態、特性、又は構造が、記載される範囲内にありつつも、生じる／存在する、又は、生じない／存在しないことを意味する。
【００５８】
語句「好ましい」及び「好ましくは」は、ある特定の状況下において、ある特定の利益を提供しうる本開示の実施形態を指す。しかしながら、同一又は他の状況下において、他の実施形態が好ましい場合もありうる。さらには、１つ以上の好ましい実施形態についての記述は、他の実施形態が有用ではないという意味を含蓄せず、本発明に係る技術の範囲から他の実施形態を除外することは意図されていない。
【００５９】
本明細書に記載の装置、その作製方法、及びその使用方法は、本明細書に記載の構成要素又は工程に加えて、本明細書に記載されない他の構成要素又は工程も含みうる。
【００６０】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において用いられる場合、用語「又は」は、別段の明確な指示がない限り、概して、「及び／又は」を含む意味で用いられる。用語「及び／又は」は、列挙された要素の１つ又はすべて、若しくは、列挙された要素の任意の２つ以上の組合せを意味する。
【００６１】
本明細書で用いられる場合には、「有する（have、has、having）」、「含む（include、includes、including、comprise、comprises、comprising）」などは、非限定的な（open ended）包含的意味で用いられ、概して、「〜を含むが、それらに限られない（include, but not limited to; includes, but not limited to; including, but not limited to）」ことを意味する。
【００６２】
範囲は、本明細書では、「約」１つの特定の値から、及び／又は、「約」別の特定の値までとして表されうる。このような範囲が表される場合、例には、その１つの特定の値から、及び／又は、他の特定の値までが含まれる。同様に、値が、先行詞「約」を用いて近似値として表される場合、その特定の値は別の態様を形成すると解される。範囲の各々の端点は、他の端点に関連して、及び、他の端点とは無関係に、の両方の意味を表すこともさらに理解されよう。
【００６３】
本明細書で用いられる名詞は、他に明記されない限り、少なくとも１つ、又は１つ以上の対象を指す。
【００６４】
当業者によく知られている略語が、使用されうる（例えば、時間についての「ｈ」又は「ｈｒｓ」、グラムについての「ｇ」又は「ｇｍ」、ミリリットルについての「ｍＬ」、及び、室温についての「ｒｔ」、ナノメートルについての「ｎｍ」など）。
【００６５】
構成要素、成分、添加剤、寸法、状態、及び同様の態様についての特定の値及び好ましい値、並びにそれらの範囲は、単に例証のためであって；それらは、他に記載されない限り、他の定められた値又は定められた範囲内の他の値を除外しない。本開示の装置及び方法は、明示又は黙示の中間値及びそれらの間の範囲を含む、本明細書に記載される任意の値又は、その値、特定の値、さらに特定の値、及び好ましい値の任意の組合せを含む。
【００６６】
同様に本明細書において、端点による数値範囲の記述は、その範囲内に含まれるすべての数を含む（例えば、１〜５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５等を含む）。値の範囲が、ある特定の値「より大きい」、ある特定の値「より小さい」等の場合、その数値はその範囲内に含まれる。
【００６７】
「上部」、「底部」、「左」、「右」、「上方」、「下方」、「上」、「下」、及び他の方向及び方向付けなど、本明細書において言及される方向は、図面に関して明確性の目的で本明細書に記載され、実際の装置又はシステム、若しくは、その装置又はシステムの使用を限定するものではない。本明細書に記載される多くの装置、物品、又はシステムは、多くの方向及び方向付けにおいて使用されうる。細胞培養装置に関して本明細書で用いられる方向記述子は、多くの場合、装置内で細胞を培養する目的でその装置が方向付けされる場合の方向のことを指す。
【００６８】
他に明記されない限り、本明細書に記載されるいかなる方法も決して、その工程が特定の順番で実施されることを要すると解釈されることを意図していない。したがって、方法の請求項が、その工程が従うべき順番について実際に記述していない場合、又は工程がある特定の順番に限定されるべきであることが、特許請求の範囲又は説明において他に明示されていない場合、任意の特定の順番が推測されることは、決して意図されていない。任意の１つの請求項における任意の記述された単一又は複数の特徴又は態様は、任意の他の請求項における任意の他の記述された特徴又は態様と組み合わせる、又は、それらの特徴又は態様で置き換えることができる。
【００６９】
本明細書における記述とは、特定の方法において機能するように「構成」又は「適合」された構成要素を指すことにも留意されたい。この点において、このような記述が、意図される用途の記述とは対照的に、構造的な記述である場合、このような構成要素は、特定の態様における特定の特性又は機能を具体化するように「構成」又は「適合」される。より詳細には、本明細書において、ある構成要素が「構成」又は「適合」された態様についての言及は、その構成要素の存在する物理的条件を意味し、このように、その構成要素の構造的な特徴の明確な記述と捉えられるべきである。
【００７０】
特定の実施形態のさまざまな特徴、要素、又は工程は、移行句「〜を含む」を用いて開示されうるが、移行句「〜からなる」又は「〜から本質的になる」を使用して記載されうるものを含む代替的な実施形態が含蓄されるものと解されたい。よって、例えば、複数のウェルを画成する構造を含む細胞培養装置に含蓄された代替的な実施形態は、細胞培養装置が複数のウェルを画成する構造からなる実施形態、及び、細胞培養装置が複数のウェルを画成する構造から本質的になる実施形態を含む。
【００７１】
さまざまな実施形態において、本開示は、ウェル（例えば、マイクロウェル）を画成する基材を備えた、細胞培養装置などの装置について記載する。ウェルは、１つの側壁（又は複数の側壁）、ウェル底部（又は底）、及び開放された上部（例えば、上部開口）を備えている。実施形態において、ウェルは、例えば、細胞培養又は細胞アッセイに用いられる組成物などの水性液体組成物を含むように構成される。例えば、水性液体組成物は、細胞アッセイに用いられる細胞培養培地、バッファ又は他の溶液又は混合物を含みうる。
【００７２】
本明細書に記載の実施形態は、例えば、液体を含むように構成された小さい（例えば、マイクロスケール）ウェル又は他の容器、若しくはチャンバを備えた、任意の装置を用いる用途を見出す。特定の実施形態では、本明細書に記載の装置のウェルは、細胞の培養における用途を見出す。より詳細には、装置及びその内部のマイクロウェルは、細胞凝集体又はスフェロイドの３Ｄ細胞培養における用途を見出す。
【００７３】
凝集体としての細胞の培養に使用されている幾つかの異なる形状が存在する。幾つかの実施形態では、細胞凝集体は、細胞の塊、胚様体、又はスフェロイドである。細胞凝集体を形成するための一般的な幾何学形状は、丸みを帯びたウェル底部のマイクロプレート上に見られる半球である。幾つかの実施形態では、細胞が表面に付着するのを防ぐために、非接着性表面が用いられる。非接着性の材料は、ウェル又はチャンバ（例えば、マイクロプレート内）が製造された後に施されてもよく、あるいは、ウェル又はチャンバ材料は、生来の非付着特性を有していてもよい。
【００７４】
図１は、個々のウェル１１５を示す、ウェルのアレイ１００の例示的な実施形態の概略図である。図１に示される実施形態では、ウェル１１５は口部１１０を有する。口部１１０は、ウェルが縮小されて、細胞が沈降してスフェロイドを形成する、ウェルの底部を形成する前に、より大きい開放領域をもたらす、ウェル１１５の上部開口部１１１に隣接したウェルの上部の領域である。実施形態において、口部１１０は、円錐状（口部の底部より口部の上部の方が幅広い）及び環形状（ウェルが円形である図１Ａ及び図２Ａに示されるように）でありうる。追加の実施形態では、例えば、図３Ａに示されるように、ウェルが、円形の開口部を有するが、放物面の形状である場合、口部１１０は放物面でありうるか、又は図２７及び図２８に示されるように、口部は各ウェル１１５内へと延びうる。実施形態において、口部は存在しない。口部構造の存在は、２つの機能をもたらしうる。第一に、口部はウェルの開口部を拡大し、液体がウェルの開口部内に導入されて、ウェルの底部へと流れ落ちることを可能にする。これは、ウェルの底部における細胞の凝集を促進し、かつ、培養におけるスフェロイドの形成を促進する。加えて、口部は、口部の環状の内面からウェルの内面への移行を作り出し、それによって、ウェル内への空気の閉じ込めを防ぐことができる幾何学形状の特徴を提供する。ウェルの上部とウェルの側壁との間の９０度の角度の存在は、気泡の形成のための場所を提供しうる。口部は、９０度の角度ではない、ウェルの上部と側壁との間の移行をもたらし、それによって、口部構造を有するウェル内における気泡の形成を低減する。
【００７５】
凝集体細胞培養法における使用のためのウェルの寸法は、おおよそマイクロメートル〜ミリメートル（例えば、１００μｍ〜５０ｍｍ）でありうる。細胞培養のためのウェルを備えた装置は、多くのさまざまな製造業者（例えば、Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｎｕｎｃ、Ｇｒｅｉｎｅｒ等）から市販されている。「マイクロウェル」は、概して、約マイクロメートル（例えば、≦１ｍｍ、≦５００μｍ、≦４００μｍ、≦２００μｍ）又は数ミリメートル（例えば、≦１０ｍｍ、≦５ｍｍ、≦３ｍｍ等）の寸法を有し、凝集体としての細胞の増殖にも使用されうるウェルである。幾つかの実施形態では、マイクロウェルは、３Ｄ細胞培養のための閉じ込めを提供する。本明細書の適切な実施形態では、用語「ウェル」は、文脈がそうでないことを説明又は示唆している場合（例えば、ウェルが複数のマイクロウェルを備えたウェル底部を有すると記載される場合）を除き、マイクロウェルの使用を包含する。マイクロウェル寸法以外であることが意図されたウェルは、「マクロウェル」又は単に「ウェル」と称されうる。幾つかの実施形態では、ウェルの高さ又はウェルの深さ（例えば、上部開口からウェル底部まで）は、上部開口におけるウェルの直径の１００％以上（例えば、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２２５％、２５０％、２７５％、３００％、３２５％、３５０％、３７５％、４００％、又はそれらの間の任意の範囲）である。幾つかの実施形態では、ウェルの深さ（例えば、上部開口からウェル底部まで）は、上部開口とウェル底部との間の中間点におけるウェルの直径の１００％以上（例えば、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２２５％、２５０％、２７５％、３００％、３２５％、３５０％、３７５％、４００％、又はそれらの間の任意の範囲）である。
【００７６】
最も一般的に用いられるマイクロウェル製品の１つは、標準フォーマットのマイクロプレートウェルの底部に配列された、直径４００又は８００マイクロメートルの逆ピラミッド型の形状の幾何学形状を提示する、市販の「Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ」プレート（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から市販される）である。細胞を凝集体として増殖させるための別の幾何学形状は、「微細空間細胞培養」を用いた「Ｅｌｐｌａｓｉａ」マイクロプレート（Ｋｕｒａｒａｙ社）である；これらのプレートは、細胞を凝集可能にする、標準フォーマットのマイクロプレートウェルの底部に配列された直径２００マイクロメートルの正方形のマイクロウェルを有する。細胞を凝集体として培養するためのマイクロウェルを作製するためのさまざまなパラメータ、寸法、及び方法は、当技術分野で理解されている（参照することによってそれらの全体が本明細書に取り込まれる、米国特許出願公開第２００４／０１２５２６６号；米国特許出願公開第２０１２／００６４６２７号；米国特許出願公開第２０１４／０２２７７８４号；国際公開第２００８／１０６７７１号；国際公開第２０１４／１６５２７３号）。米国特許第６，３４８，９９９号には、微細な凹凸要素、及びそれらがどのように構築されるかについて、ポリマーレンズアレイとして以外のこれらの構築物の目的について言及することなく記載されている。米国特許第５，１５１，３６６号、同第５，２７２，０８４号、及び同第６，３０６，６４６号の各明細書には、基材上の細胞付着のための表面積を増加させるためにさまざまな種類の微細な凹凸パターンを有する容器、及び、培養パターンの作製方法について記載されているが、そのパターン自体は、細胞凝集体の形成を促進しないであろう。他の装置、組成物、試薬及び方法は、当技術分野において、例えば、参照することによってそれらの全体が本明細書に取り込まれる、米国特許出願公開第２０１４／０３２２８０６号；米国特許第８，９０６，６８５号明細書；Haycock. Methods Mol Biol. 2011; 695: 1-15；米国特許出願公開第２０１４／０２２１２２５号明細書；国際公開第２０１４／１６５２７３号；米国特許出願公開第２００９／００１８０３３号明細書に記載されている。
【００７７】
幾つかの市販されるウェルの幾何学形状は、細胞凝集体の形成を促進するが、必ずしも「閉じ込め」を促進しない。凝集体化された細胞が閉じ込められない場合、それらは、通常、それらの環境が許す限り大きく成長する。直径１５０超〜４００マイクロメートル（細胞型に応じて決まる）の細胞凝集体は、壊死性のコアを形成しうる。壊死は、例えば、細胞塊が大きすぎて、凝集体の中心への栄養素の拡散及び凝集体の中心の外への代謝廃棄物の排出が制限されることから生じる。幾つかの実施形態では、閉じ込めを生じさせるために、細胞凝集体の所望される最大直径寸法に非常に似ている（例えば、５０％以内、４０％以内、３０％以内、２０％以内、１５％以内、１０％以内、５％以内、２％以内、１％以内、又はそれらの中の適切な範囲内）が、深さが直径の少なくとも１．５〜２倍（例えば、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５２．６、２．６、２．８、３．０、３．５、４．０、又はそれらの中の適切な範囲内）である、マイクロウェルの幾何学形状が用いられる。幾つかの実施形態では、閉じ込めウェルの幾何学形状はまた、該閉じ込めウェルの外に細胞スフェロイドを持ち上げることなく、灌流又は手動のピペット操作を通じた液体培養培地の交換も可能にする。
【００７８】
既存の装置（例えば、マイクロウェルフォーマットのマイクロプレート又はマイクロウェルを有する他の容器）は、３Ｄ細胞凝集構造の形成のためのこのような装置の使用に悪影響を及ぼす、設計上の欠陥を示す。マイクロウェルフォーマットのマイクロプレートの取り扱いは、かなり簡単ではあるが、液体（例えば、培地）の導入の際にマイクロウェルから空気が排除されないと、多くの場合、問題が生じる。空気の取り込みは、特にウェルが円形の場合における、３８４−ウェルフォーマットの大きさの幾何学形状を有するマイクロプレートウェルにおける一般的な問題である。水性液体の表面張力は強力であるため、液滴は球状のまま保たれる。球状の液滴は、同様の寸法の円形孔（例えば、ウェル断面形状）を塞ぐことができる。ウェル内の空気の存在は、そのウェル内の細胞の培養に悪影響を及ぼす、及び／又は、細胞の培養を抑制する。
【００７９】
非接着性の表面を有するスフェロイド形成ウェルのアレイを有する基材上に高密度で細胞培養容器内のスフェロイドを増殖させるためには、多くの変数の平衡を保つ培養表面が必要とされる。例えば、達成可能な最大スフェロイド密度、流体交換作業の間のスフェロイドの位置を維持すると同時に所望される場合にはそれらを取り出すことを可能にする能力、及び、容器が充填されるときにスフェロイド形成ウェル内の空気の取り込みの回避などのバランスをとることができる設計は、このような容器を扱う際の問題を避けるためには非常に望ましい。本明細書の実施形態は、閉じ込め寸法を維持するとともに、マイクロウェル内の空気の排除を助け、かつ、マイクロウェル内への液体の流入を可能にするウェルの幾何学形状を提供することによって、従来のウェルの空気の取り込みの問題に対処する。例えば、丸みを帯びたウェル底部の幾何学形状を有する、正方形の上部ウェルは、空気が水性液滴の周りのウェルの角部を伝って上ることができるため、液体を加えるときに空気を取り込む可能性がかなり低い。幾つかの実施形態では、ウェルの開口部からウェル底部まで延びるさまざまな構造（例えば、ピラー、波形、角部、リッジ、割れ目等）を包含することにより、ウェルに液体を導入する際に空気を逃がすための経路がもたらされる。幾つかの実施形態は、本明細書に記載の特徴に加えて、当技術分野に記載される及び／又は当技術分野で理解される幾何学形状、材料等も含む。
【００８０】
高密度スフェロイド増殖基材における空気の取り込みの問題を回避するために、一般的に用いられている設計特徴の１つは、鋭角の角部又は基材の幾何学形状の階段状の変化の回避、特に、表面を横切る液体の流路に対して直角に走るものの回避である。例えば、ＡｇｇｒｅＷｅｌｌプレートは、９０度に近い角度で傾斜する壁を有する。これは、空気で満たされたウェルを残して容器が満たされる際に、表面からの液切りを促進する。
【００８１】
個別のスフェロイドの増殖及び高密度の維持を促進するウェル特徴（例えば、丸みを帯びたウェル底部）を維持する、液体の導入の間の空気の取り込みの問題に対処する表面幾何学形状が、本明細書に提供される。
【００８２】
幾つかの実施形態では、ウェル形状の移行は、ウェルに液体を導入する際に空気を逃がす問題を軽減するために用いられる。例えば、幾つかの実施形態では、円形断面のウェル底部（又はウェルの底部部分）がスフェロイド形成に用いられる。しかしながら、円形の断面は、ポケットの形成なしに空気を逃がすためには特に問題でありうる。この問題を軽減するため、円形のウェル底部断面及び非円形（例えば、三角形、正方形、矩形、五角形、六角形等）の上部開口部を有するウェルが形成される。このような実施形態では、側壁は、非円形（例えば、多角形）の上部開口部から円形のウェル底部へと移行する。幾つかの実施形態では、移行は、ウェルに液体を導入する際に、ウェルから逃げる気泡の「ハングアップ（hanging up）」を生じうるような、干渉する、ギザギザした、又は水平を呈する側壁特徴を導入しないように、漸進的に移行する。幾つかの実施形態では、移行する壁及び上部開口部の非円形（例えば、多角形）の形状によって作り出された側壁の角部は、液体の流入及び／又は空気の抜けのための経路を提供する。
【００８３】
幾つかの実施形態では、ウェルの幾何学形状は、ウェルに液体を導入する際に空気の抜けを促進するために、ウェル壁内に毛管構造（例えば、口部、リッジ、割れ目、丸みを帯びた又は放物面の上部開口部等を含む）を含む。図１Ｂは、リッジ１７０を示す、図１Ａの線Ｂ−Ｂで切り取った上視図である。図１Ｂに示されるように、リッジは、ウェルの口部１１０又は側壁１１３からの隆起（bump）又は突起である。実施形態において、リッジは、上部開口部１１１からウェル底部１１６までのマイクロウェルの長さを延長する。追加の実施形態では、リッジは、口部の上部１１１から口部の底部１１２まで延びる。リッジ１７０のいずれかの側に形成される鋭角は、水性流体に毛管力を作り出して、空気溜まりのない、マイクロウェルへの流体の流入をもたらす。図２Ｂは、図２Ａにおける断面を示す、ウェルのアレイ１００の上視図である。図２Ｂは、割れ目２７０を示している。図２Ｂに示されるように、割れ目は、ウェル１１５の側壁１１３における刻み目（indentation）である。割れ目２７０のいずれかの側に形成される鋭角は、水性流体がマイクロウェル内へ流入可能にする毛管力を作り出す。
【００８４】
図３Ａ及びＢは、ウェルのアレイ１００の別の例示的な実施形態の概略図である。図３Ａは断面図である。図３Ｂは、図３Ａの線Ｂ−Ｂで切り取ったウェルのアレイの例示的な実施形態の上視図である。図３Ａ及びＢは、各ウェル１１５が２つ以上のリッジ１７０又は割れ目２７０を有しうること、及び、リッジ１７０又は割れ目２７０がウェル１１５内にアレイ状に配置されうることを示している。図３Ａ及びＢに示されるように、実施形態において、リッジ及び／又は割れ目の径方向分布が想定されている。毛管構造の数は、１マイクロウェルあたり１つに限られない。幾つかの実施形態では、毛管の数が多いほうが、マイクロウェル内への流体の流入速度を低下させる。
【００８５】
図３Ａ〜Ｄは、単一のウェル内に複数の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１６、２０、２４、２８、３２、又はそれらの中のいずれかの範囲）垂直に方向づけられた毛管構造を包含することを実証している。特徴は、一定間隔で離間されてよく（図３に示すように）、不規則な間隔で離間されてもよく、集団化（grouped）／隆起等であってもよい。幾つかの実施形態では、毛管構造は、ウェルの上部開口部からウェル底部まで延びる。単一のウェル内に複数の毛管構造が存在する場合、その複数の特徴は、異なる種類（例えば、リッジ線及び／又は割れ目）のものであってよく、異なる形状（例えば、方形、円形等）を含んでいてもよい。
【００８６】
図３Ｃは、ウェルのアレイ１００が、正弦波又は放物面の形状を有しうることを示している。この形状は、丸みを帯びた上部エッジ又はウェルエッジを作り出し、このことにより、実施形態において、ウェルの上部の鋭角の角部又は９０度の角度における空気の取り込みを低減する。この正弦波又は放物面のウェル形状、又は丸みを帯びた上部ウェルエッジもまた、毛管構造である。図３Ｃに示されるように、ウェル１１５は、上部直径Ｄ上部、ウェルの底部１１６からウェルの上部までの高さＨ、及びウェルの上部とウェルの底部１１６との間の高さの中間点におけるウェルの直径Ｄ中間を有する、上部開口部を有する。
【００８７】
図３Ｄは、上記図１〜３、及び実施形態に記載されるウェルのアレイの概略図である。図３Ｄは、基材１１１４内にアレイ状に配置された複数のマイクロウェル１１５を示している。複数のマイクロウェル１１５内に存在する複数のスフェロイド５００もまた図３Ｄに示されている。
【００８８】
図４Ａ及び４Ｂは、スフェロイド含有細胞培養コンパートメント、又はウェルのアレイの別の例示的な実施形態を示す概略図である。図４Ａは、ウェルのアレイの波形状の実施形態の上視図であり、図４Ｂは、同じ実施形態の部分切り取り図である。図４Ａ及び４Ｂに示される実施形態では、ウェルは隔離されておらず、ウェル同士間の液体の流れを可能にする。図４Ａ〜Ｂに示されるように、波形状の側壁４０３が該波形状の側壁４０３同士の間の間隙にマイクロウェル４０１を生成するように位置合わせされた、例示的な実施形態が示されている。図４Ａ及び４Ｂに示された波形状の側壁は、フレーム４０２によって取り囲まれ、マイクロウェル４０１の列が作り出す周期でそれらが遠く離れ、次には互いに近づく（例えば、接触して又は接触せずに）領域を有する。幾つかの実施形態では、マイクロウェルのくぼみは、より遠く離れた壁によって画成される、各セグメントのベースに位置している（例えば、スフェロイド５００を収容するため）。図４Ｃ及び４Ｄは、波形状のマイクロウェルアレイの実施形態の追加の概略図である。図４Ｃは実施形態の上視図であり、図４Ｄは実施形態の斜視図である。図４Ｄに示されるように、実施形態において、フレームは存在しない。図４Ｃ及び４Ｄは、スフェロイド形成を誘発するのに適した幾何学形状を有する空間４０１を形成する、波形状又は波状の側壁４０３を示している。ウェル内に存在するスフェロイド５００もまた図４Ｃ及び４Ｄに示されている。図４Ａ及びＢに示される実施形態に液体が導入される場合、排除された空気は、壁が互いに近づく領域を通じて局所領域の外に移動することができる。より幅広いウェルの領域の内外への流体及び空気の移動は、狭隘部によって促進され、空気の取り込みを回避する。これらの波形はまた、縮小された増殖領域をもたらすことによってスフェロイドの形成を促進する。すなわち、波形は、毛管構造であり、かつ、スフェロイドを誘発する幾何学形状である。
【００８９】
図５Ａ及び５Ｂは、一連のピラーがウェルを画定する、ウェルのアレイ１００の例示的な実施形態の概略的な上視図を示している。図５Ｃ〜５Ｅは、ウェル５１５を形成するようにアレイ状に配置されたピラー５０１を示すマイクロウェルのアレイの実施形態の斜視図である。実施形態において、ピラー５０１の上部５１０は、平坦でありうる（図５Ａに示される）。この実施形態では、ピラー５０１によって作り出される凸面壁は、ピラー形成側壁間の接合部に非常に鋭角又は不連続性を作り出す。図５Ｂは、培養においてスフェロイド５００の形成を誘発するのに適した閉じ込めの幾何学形状を作り出すようにピラーによって取り囲まれたマイクロウェルのくぼみを示している。ピラー５０１間の空間５０５を通って、空気は逃げ、流体が入る。ピラー５０１は上部５１０を有する。実施形態において、ピラー上部５１０は、図５Ｂ、５Ｄ及び５Ｅに示されるように、図３Ａに示される放物面又は正弦波の形状を有するウェルを生じるであろう、丸みを帯びうる。ピラーはまた、縮小された増殖領域をもたらすことによってスフェロイドの形成も促進する。すなわち、ピラーは毛管構造であり、かつ、スフェロイドを誘発する幾何学形状である。
【００９０】
例えば、リッジ、割れ目、隆起、ディボット、上部開口又は口部構造の開放環構造、ピラー、不連続な壁、口部構造、放物面又は正弦波のウェル形状、丸みを帯びたウェル開口部、又はウェルの側壁の滑らかな内面における中断、若しくは、これらの特徴の任意の組合せを含む、これらの構造は、毛管構造である。毛管構造はまた、液体を加えた後に閉じ込められうる空気を逃がすルートも提供する。幾つかの実施形態では、不連続な壁、リッジ又は割れ目を含む壁、若しくは、ウェルの側壁の滑らかさを中断する他の特徴は、充填の間に、ウェル内に通気場所を設けることによって、空気の取り込みを回避するために使用される。
【００９１】
幾つかの実施形態では、毛管構造は、ウェルの壁の垂直方向の長さに沿って延びる。幾つかの実施形態では、毛管構造は、ウェルの上部開口部まで又はその上まで延びる。他の実施形態では、毛管構造は、ウェルの上部開口部の近くに延びる（例えば、上部開口部から＜０．１μｍ、０．１μｍ、０．２μｍ、０．５μｍ、１μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、１０μｍ、又は２０μｍ（又はそれらの間の範囲））。幾つかの実施形態では、毛管構造は、ウェル底部まで延びる。他の実施形態では、毛管構造は、ウェル底部の近くまで延びる（例えば、ウェル底部から＜０．１μｍ、０．１μｍ、０．２μｍ、０．５μｍ、１μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、１０μｍ、又は２０μｍ（又はそれらの間の範囲））。
【００９２】
幾つかの実施形態では、毛管特徴は、ウェルに入る液体が、ウェル内に空気を取り込むことなく移動するための経路をもたらすという利益を提供する。幾つかの実施形態では、毛管構造は、ウェルに入る液体の導入に応答してウェルを出る空気のための経路を提供する。技術は、空気の取り込みを防ぐための特定の作用機構に限られず、また、本発明の実施するためには機構の理解は必要ではない。
【００９３】
急速な容器の充填又は別の流体導入事象が空気の取り込みにつながる場合には、このような取り込みを防ぐように構成されたウェルの幾何学形状にもかかわらず、毛管特徴は、閉じ込められた空気下での液体の移動を可能にし、それによってウェルから空気を放出する。例えば、図４に示される波形状の実施形態では、液体及び空気は、アレイの狭隘部を通じて、１つのウェル領域から次のウェル領域へと開放ウェル構造を通って流れることができる。あるいは、図５に示されるピラーの実施形態では、液体又は閉じ込められた空気は、ピラー間の空間を通じてウェルから出ることができる。幾つかの実施形態では、毛管構造を通る液体の下向きの力は、ウェル壁から空気を分離し、空気を液体で取り囲み、それによって空気溜まりを泡としてウェルの外へと上昇させる役割をする。
【００９４】
さまざまな異なる垂直に方向づけられた構造は、毛管特徴としての用途を見出す。例えば、ある特定の実施形態では、特徴は、隆起したリッジ（例えば、図１Ａ及び図１Ｂに示すように）、若しくは、隠れ溝又は割れ目（例えば、図２Ａ及びＢに示されるように）である。本明細書の実施形態における用途を見出すリッジ線及び割れ目は、図示される物理的な幾何学形状に限られない。幾つかの実施形態では、特徴は、水平に移動することなく、ウェルの側壁に沿って垂直に延びる。大抵の場合、水平な構造特徴は、既存のウェル幾何学形状に用いられる急角度と同様の方式でウェル内の空気の取り込みを促進する。リッジの適切な断面形状は図６に示されており、丸みを帯びた（図６Ａ）、角のある（図６Ｂ）、針状（図６Ｃ）、半六角形（図６Ｄ及び６Ｅ）の形状等が挙げられる。割れ目の適切な断面形状は図７に示されており、丸みを帯びた（図７Ａ）、角のある（図７Ｂ）、針状（図７Ｃ）、半六角形（図７Ｄ及び７Ｅ）の形状等が挙げられる。リッジ及び／又は割れ目は、任意の適切な断面寸法のものでありうる（例えば、０．１〜２０マイクロメートル（例えば、０．１、０．２、０．５、１、２、５、１０、１５、２０、又はそれらの間のいずれかの適切な範囲）の幅、長さ等を有する）。リッジ及び／又は割れ目の形状及び寸法を最適化して、液面下に空気溜まりを形成することなく、液体の導入及び空気の排出を促進するため、及び／又は、閉じ込められた空気溜まりの除去を促進するために、工学的原理及びマイクロ流体原理を本明細書の実施形態と組み合わせて使用してもよい。
【００９５】
幾つかの実施形態では、ウェル内への液体の移動及びウェル外への空気の移動は、不連続な側壁の幾何学形状を介して行われる。不連続なウェルの幾何学形状は、ウェルの側壁の不連続性という形態を取る。不連続な側壁の形状の例は、図４の「波状の壁」又は「波形状」の幾何学形状、及び図５の「ピン壁」又は「ピラー壁」の幾何学形状に示されるようなものである。これらの形状は単なる例証にすぎず、側壁の一部分（例えば、上部）に間隙又は他の不連続性を導入する他の側壁の方向性は、本明細書の実施形態における用途を見出しうる。これらの幾何学形状において、壁における中断は、流体が容器に入る際に、空気を、その低粘着性によって、ウェルの外へと急速に移動可能にする。幾つかの実施形態では、不連続な幾何学形状は、基材の壁の特徴における鋭角での変化の回避（例えば、水平の障害物（obstructions）を作り出す特徴の回避）を維持する。幾つかの実施形態では、不連続な側壁の幾何学形状は、ウェル形状の移行及び／又は毛管の壁構造とともに用いられて、液体の導入の際に泡の放出及び／又は空気の排出を助ける。
【００９６】
幾つかの実施形態では、１つ以上のウェルは、半球面又は丸底を有する円錐面、及び同様の表面形状又はそれらの組合せなど、凹曲面を有する。ウェル及びウェル底部は、くぼみ又はウェル、及び同様の凹形円錐台状の起伏表面など、丸みを帯びた面又は曲面、若しくはそれらの組合せにおいて、最終的に終結、終端、又は底付き（bottom-out）しうる。スフェロイドを助長するウェルの他の形状及び構成は、本開示と矛盾しない限り、その全体がここに参照することによって本明細書に取り込まれる、本発明の譲受人に譲渡された米国特許出願第１４／０８７，９０６号明細書に記載されている。実施形態において、ウェル底部は平坦であるか、又は先が細くなっている。ウェル底部は、任意の他の適切な形状又は寸法を有していてもよい。例えば、実施形態において、ウェル底部は丸みを帯びた面又は曲面を有し、あるいは、ウェル底部は、縮小された増殖領域をもたらすことによってスフェロイドの形成を促進する、くぼみ、凹み、及び同様の凹形円錐台状の起伏表面、複数のくぼみ又はペン先領域、若しくはそれらの組合せなどの構造を有しうる。すなわち、丸みを帯びた又は曲面状の又はくぼみのあるウェル底部若しくはペン先領域若しくは波形若しくはピラーは、スフェロイドを誘発する幾何学形状である。
【００９７】
例示的なウェルの幾何学形状及び寸法は、例えば、図１及び２に示されている。幾つかの実施形態では、本明細書に記載のウェル１００は、下記の値のうちのいずれか２つの値の間の範囲（例えば、２００〜１０００μｍ、２００〜７５０μｍ、３００〜７５０μｍ、４００〜６００μｍ等）を含む、例えば、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、又は２０００マイクロメートルなど、約１００マイクロメートル〜約２０００マイクロメートルの範囲のウェル底部直径１３０／２３０を有する。このような直径寸法は、スフェロイドの内部の細胞が健康な状態に維持されるように、その中で増殖するスフェロイドの寸法を制御する。すなわち、これらの寸法は、縮小された増殖領域をもたらすことによって、スフェロイドの形成を促進する。すなわち、これらの寸法は、スフェロイドを誘発する幾何学形状である。
【００９８】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載のウェル１００／２００は、下記の値のうちのいずれか２つの値の間の範囲を含む、例えば、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、又は２０００マイクロメートルなど、約１００マイクロメートル〜約２０００マイクロメートルの範囲の上部開口部の断面寸法１２０／２２０（例えば、直径又は幅）を有する。幾つかの実施形態では、ウェル１００は、下記の値のうちのいずれか２つの値の間の範囲を含む、例えば、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００マイクロメートルなど、約５００マイクロメートル〜約１５００マイクロメートルの範囲の上部開口部からウェル底部までの深さ１６０／２６０を有する。幾つかの実施形態では、ウェル１００／２００は、下記の値のうちのいずれか２つの値の間の範囲を含む、例えば、５０、６０、７０、８０、９０，１００、２００、３００、４００、又は５００マイクロメートルなど、約５０マイクロメートル〜約５００マイクロメートルの範囲の深さ１４０／２４０を有する上部を有する。幾つかの実施形態では、ウェル１００は、下記の値のうちのいずれか２つの値の間の範囲を含む、例えば、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２００、又は１４００マイクロメートルなど、約１００マイクロメートル〜約１４００マイクロメートルの範囲の深さ１５０／２５０を有する下部を有する。当然ながら、他の適切な寸法もまた用いられうる。
【００９９】
幾つかの実施形態では、移行ウェルの構造及び特性、並びに、ウェルへの液体の導入の際に空気の抜けを可能にするように構成された１つ以上の設計要素及び／又は物理的特徴に加えて、本明細書に記載の装置及びウェル（例えば、マイクロウェル）は、例えば、マイクロウェル内での細胞の３Ｄ培養に関する特化された機能を提供するように、追加の特徴を備えうる。以下の段落は、上述の実施形態と組み合わせた用途を見出しうる、このような特徴に対処するものである。
【０１００】
幾つかの実施形態では、ウェルの側壁及び／又はウェル底部のすべて又は一部は、ガス透過性である。幾つかの実施形態では、ガス透過性は、ウェル内に含まれる液体又は培地に溶解する酸素及び他のガスのウェル内への移動を可能にする。透過性の側壁、ウェル底部、又はそれらの一部は、ウェル液体内に空気溜まり又は泡を形成させない。
【０１０１】
幾つかの実施形態では、複数のガス透過性のウェルを画成する構造化された表面を有する細胞培養装置が提供される。幾つかの実施形態では、ウェルは、装置の外部表面を画成する外面を備えうる。幾つかの実施形態では、ウェルは、装置の外部と連通した外部又は非培養表面を含みうる。幾つかの実施形態では、とりわけ、各々が複数のガス透過性のウェルを画成する構造化された表面を有する、複数の積層された細胞培養コンパートメントを有する細胞培養装置が、本明細書に提供される。幾つかの実施形態では、さまざまな実施形態におけるウェルは、通気孔を通じて又は導管空間を通じて間接的に、若しくは、外部壁を通じて直接的になど、装置の外部とガス連通している。
【０１０２】
幾つかの実施形態では、ウェルは、ウェル内で培養された細胞がスフェロイドを形成するように構成される。例えば、幾つかの実施形態では、ウェルは、該ウェル内の細胞を互いに会合させる（例えば、スフェロイドを形成する）ように、細胞に対して非接着性である。スフェロイドは、ウェルの幾何学形状によって課せられた寸法の許容限界まで拡大する。幾つかの実施形態では、ウェルは、該ウェルを細胞に対して非接着性にするために超低結合性の材料でコーティングされる。
【０１０３】
スフェロイドなどの三次元（３Ｄ）細胞凝集体の形成は、細胞が表面に単層を形成する二次元細胞培養とは対照的に、細胞培養装置内で増殖する細胞の密度を増加させるが、それにより、装置内で培養される細胞の栄養要求も増大させうる。代謝ガスの交換は、細胞がその中で培養されるガス透過性のウェルを通じて生じうることから、細胞培養装置内の培地容積は、代謝ガスの交換が、細胞培養培地を通じた拡散に本質的に制限される装置を用いた場合に可能な容積よりも大きくすることができる。したがって、本明細書に記載の細胞培養装置に用いる細胞培養培地の高さをより高くすることができ、したがって、容積もより大きくできる。
【０１０４】
幾つかの実施形態では、細胞は、細胞培養培地が細胞の上２ｍｍ以上の高さにある、本明細書に記載の装置のウェル内で培養される。幾つかの実施形態では、細胞培養培地は、細胞の上５ｍｍ以上の高さにある。細胞が培養される基材又はその表面、又はその近くが、代謝ガスに対して非透過性又は比較的非透過性である場合（例えば、細胞培養培地と比較して）など、代謝ガスの交換が本質的に培地を通した交換に制限される場合には、細胞培養培地の最大高さ２ｍｍ〜５ｍｍは、概して、培地の高さの上限と考えられる。
【０１０５】
効率的な代謝ガス交換の目的で、幾つかの実施形態では、装置内の細胞培養培地が、細胞の上２ｍｍ以上、細胞の上５ｍｍ以上、又は細胞の上１０ｍｍ以上など、細胞の上の任意の高さにある場合、細胞は、本明細書に記載の装置のウェルの培養物内で維持される。しかしながら、当業者は、装置内の細胞培養培地の高さが細胞の上に増加するにつれて、細胞に与えられる静水圧も増加することを理解するであろう。したがって、細胞の上の細胞培養培地の高さには実施上の制限が存在しうる。幾つかの実施形態では、本明細書に記載の物品のウェル内で培養される細胞の上の細胞培養培地の高さは、以下のいずれか２つの間の範囲を含む、例えば５、６、７、８、９、１０、１５又は２０ｍｍなど、例えば５ｍｍ〜１５ｍｍ、６ｍｍ〜１５ｍｍ、５ｍｍ〜１０ｍｍ又は６ｍｍ〜１０ｍｍなどの５ｍｍ〜２０ｍｍの範囲内にある。
【０１０６】
ある特定の実施形態では、装置の外部とガス連通した非培養表面を有する細胞培養基材又は層は、本明細書に記載のガス透過性のウェルを画成する構造化された表面を有するように適合されうる。このような細胞培養装置の例としては、Ｔフラスコ、ＴＲＩＰＬＥ−ＦＬＡＳＫ細胞培養容器（Ｎｕｎｃ．，Ｉｎｔｌ．社）、ＨＹＰＥＲＦＬＡＳＫ細胞培養容器（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃ．社）、ＣＥＬＬＳＴＡＣＫ培養チャンバ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃ．社）、ＣＥＬＬＣＵＢＥモジュール（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃ．社）、ＣＥＬＬ  ＦＡＣＴＯＲＹ培養装置（Ｎｕｎｃ，Ｉｎｔｌ．社）、及び、本明細書に提示される開示と矛盾しない限りにおいて、それぞれの全体がここに参照することによって本明細書に取り込まれる、国際公開第２００７／０１５７７０号、米国特許出願公開第２０１４／０３１５２９６号、米国特許第８，８４６，３９９号、米国特許第８，１７８，３４５号、及び米国特許第７，７４５，２０９号の各明細書に記載の細胞培養物品が挙げられる。
【０１０７】
幾つかの実施形態では、ガス透過性／液体不透過性の材料は、本明細書の細胞培養装置、又はそれらの一部（例えば、ウェル、微細構造等）の構成に用いられる。任意の適切なガス透過性／液体不透過性の材料、例えば、ポリスチレン、ポリカーボネート、エチレン酢酸ビニル、ポリスルホン、ポリメチルペンテン（ＰＭＰ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）又は相容性のフッ素ポリマー、シリコーンゴム又は共重合体、ポリ（スチレン−ブタジエン−スチレン）、若しくは、ポリエチレン又はポリプロピレンなどのポリオレフィン、若しくは、これらの材料の組合せなどが用いられうる。基材は、ウェルの少なくとも一部に適切なガス透過性を有する、任意の適切な材料から形成されうる。適切な基材の例としては、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、（ポリ）４−メチルペンテン（ＰＭＰ）、ポリエチレン（ＰＥ）、及びポリスチレン（ＰＳ）が挙げられる。ＰＤＭＳは、高度のガス透過性を有することができ、最大４０ｍｍの厚さにおいて十分なガス透過性を達成することができる。ＰＭＰは、最大約０１ｍｍの厚さにおいて十分なガス透過性を達成することができる。幾つかの実施形態では、ＰＭＰは、約０．０２〜１ｍｍの範囲の厚さを有する。より薄い基材は十分な構造健全性を有しない可能性があるが、ＰＥ又はＰＳは、最大０．２ｍｍの厚さにおいて十分なガス透過性を達成することができる。乏しい構造健全性を補償するために、開口フレーム、スタンドオフなどが、底部から基材を支持するために用いられうる。実施形態において、ウェルの厚さは、下記のいずれか２つの間の範囲を含む、０．０２、０．０５、０．１、０．２、０．５、１、２、５、１０、２０又は４０ｍｍでありうる。実施形態において、ウェルは、２０００ｃｍ３／ｍ２／日以上のガス透過性のポリマー材料を通る酸素透過速度を有する。幾つかの実施形態では、ウェルは、３０００ｃｍ３／ｍ２／日以上の基材を通るガス透過性を有する。幾つかの実施形態では、ウェルは、５０００ｃｍ３／ｍ２／日以上の基材を通るガス透過性を有する。
【０１０８】
このような材料は、外側と内部コンパートメントとの間の有効なガス交換を可能にし、液体又は汚染物質の通過を防ぐと同時に、酸素及び他のガスの進入を可能にする。
【０１０９】
幾つかの実施形態では、ウェル基材材料の厚さは、最適化されたガス交換を可能にするように調整される。幾つかの実施形態では、ウェルの厚さは、１０〜１００μｍ（例えば、１０μｍ、１５μｍ、２０μｍ、２５μｍ、３０μｍ、３５μｍ、４０μｍ、４５μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、１００μｍ、及びそれらの間のいずれかの範囲）である。本明細書の実施形態の開発中に行われた実験は、厚さがより薄いウェルを用いると、産生される生細胞数がより多くなることを実証した（例えば、１７μｍ＞３０μｍ＞５７μｍ）。
【０１１０】
図８は、細胞培養装置の表面として含まれる、マイクロウェルのアレイを有する基材を包含する実施形態を示す図である。図８では、細胞培養装置はフラスコ８００である。しかしながら、実施形態において、基材は、限定はしないが、マルチウェルプレート、フラスコ、皿、管、多層細胞培養フラスコ、バイオリアクタ、若しくは、細胞又はスフェロイドの増殖が意図されている任意の他の研究用容器を含む、任意の種類の細胞培養装置の一部を形成しうるものと解されたい。マイクロウェルのアレイを有する基材は、ガス透過性材料でありうる。図９は、図８に示されるフラスコの底面を形成する、マイクロウェルのアレイでマイクロパターン化された、９で示される基材の拡大図を示している。
【０１１１】
図８及び図９に示される実施形態に関して、図示される装置は、細胞培養チャンバ８５０を備えたフラスコ又は筐体である。筐体は、マイクロウェルのアレイを有する基材（図９に示される）を含む。筐体はまた、上面８１５、及び構造化された表面１１０から上面８１５まで延びる１つ以上の側壁８２０も有する。幾つかの実施形態では、筐体８００は、円筒型の壁など、単一の取り囲む側壁を備えている。このような装置の追加の例は、例えば、本開示と矛盾しない限り、その全体が参照することによって本明細書に取り込まれる、本発明の譲受人に譲渡された米国仮特許出願第６２／０７２，０１５号に記載されている。
【０１１２】
筐体はポート８６０を備えている。ねじぶた８６１を有する開口部が図８に示されている。しかしながら、実施形態において、筐体は、液体及び細胞を筐体に出し入れ可能にするための任意の種類のポートを有しうる。ポート８６０は、側壁、上面８１５又は細胞培養表面１１０に存在しうる。ポート８６０は、細胞培養チャンバ８５０内へ細胞及び細胞培養培地を導入する又は取り出すために、管又は他の連結部に連結されうる。
【０１１３】
図８に示される筐体は固定された側壁８２０を示しているが、実施形態において、側壁は、細胞培養チャンバ８５０内に入る細胞培養培地の可変容積を可能にするように、可撓性又は拡張性かつ折り畳み式でありうる。追加の細胞培養培地がポート８６０を介して細胞培養チャンバ８５０内へ導入される際に、可撓性の側壁８２０は伸長可能であり、また、細胞培養培地がポート８６０を介して細胞培養チャンバ８５０から取り出される際には、可撓性の側壁８２０はしぼみうる。幾つかの実施形態では、側壁８２０及び上部８１５は、バッグから形成される。加えて、細胞培養チャンバ８５０は、最大で筐体の固定容積まで、細胞培養培地の容積で満たされうる。幾つかの実施形態では（図示せず）、内部容積全体又はそれに近い容積が細胞培養培地で満たされる。
【０１１４】
図８に示される実施形態では、細胞培養チャンバ８５０内の細胞培養培地の容積は、細胞の上の培地の高さＨｍで存在する。上述のように、本明細書に記載される筐体内の培養された細胞の上の培地の高さＨｍは、ウェルがガス透過性ではない場合に可能であろう高さよりも高くできる。幾つかの実施形態では、細胞培養チャンバ８５０は、装置内で細胞を培養する目的で、その限度容量まで満たされる。
【０１１５】
図１０Ａは、図９に示されるマイクロパターン化されたＴ２５スフェロイド形成フラスコのマイクロウェル１１０内のＨＴ２９細胞のスフェロイド５００を示している。図１０Ｂは、マイクロパターン化されたＴ２５スフェロイド形成フラスコから採取されたスフェロイド５００を示しており、両方とも、後述する実施例２に従っている。図１１Ａ及びＢは、Ｎｕｎｃ社から市販されるＮＵＮＣＬＯＮ  ＳＰＨＥＲＡ（商標）低結合表面上で形成された３Ｄ凝集体（図１１ＡのヒトＥＳＣ細胞及び図１１ＢのマウスＥＳＣ）の広範囲のサイズ分布を示す顕微鏡写真である。ＮＵＮＣＬＯＮ  ＳＰＨＥＲＡ（商標）低結合表面は、低細胞結合表面処理を有するが、均一なスフェロイドの形成を可能にする本明細書に開示される幾何学形状を欠いている。
【０１１６】
図１２は、実施形態に従い、かつ、下記実施例１に記載される、マルチウェルアレイ基材の作製方法の図である。図１２は、熱エンボス／熱成形法を示しているが、コイニング、射出成形、エンボス加工及び当技術分野で知られた他の方法を含む、実施形態に従ったマイクロウェルアレイを製造する他の方法も予定されている。
【０１１７】
図１３、図１４Ａ及びＢ、及び図１５は、平坦な表面に対し、マイクロウェルのアレイを有する基材についての生細胞カウント数（図１３及び図１４Ａ）及び細胞増殖率（図１４Ｂ及び図１５）を比較するグラフである。ウェルのガス透過性は、基材の材料及びウェルに沿った基材の厚さに部分的に依存しうる。実施形態において、ウェルのマイクロアレイを有する基材におけるウェルの側壁及び底部の厚さは一定であって差し支えなく、比較的薄くてよい。あるいは、実施形態において、マイクロウェルのアレイにおけるウェルの壁は、ウェル内への開口部の最も近くで比較的厚く、ウェルの底部で比較的薄くなっていてもよい。あるいは、実施形態において、マイクロウェルのアレイにおけるウェルの壁は、ウェル内への開口部の最も近くで比較的薄く、ウェルの底部で比較的厚くなっていてもよい。使用される材料及び採用される厚さに応じて、マイクロウェルのアレイを有する基材は、本開示の目的でガス透過性でありうる。
【０１１８】
図１５は、平坦な表面に対し、マイクロウェルのアレイを有する基材の上で培養されたＭＨ６７７細胞から排出されたタンパク質の全力価を表すグラフを示している。これらのデータは下記実施例２で論じられる。
【０１１９】
図８に示される装置は、側部硬質性のフラスコ又は側部軟質性の細胞培養フラスコでありうるが、細胞培養装置の外面を画成する、又は、装置の外部とガス連通した、表面を有する構造化されたマイクロウェルアレイを備えた任意の他の細胞培養装置は、本明細書に記載のガス透過性材料から形成されるマイクロウェルのアレイを有する基材を有しうることが理解されよう。
【０１２０】
本明細書に記載のマイクロウェルのアレイを有する細胞培養装置の構造化された表面は、適切な寸法又は形状を有しうる、適切な数のウェルを画成しうる。ウェルは、その寸法及び形状に基づいて容積を定める。多くの実施形態では、１つ以上又はすべてのウェルは、対称であり、及び／又は、長手方向軸の周りに対称に回転可能である。幾つかの実施形態では、１つ以上又はすべてのウェルの長手方向軸は、互いに平行である。ウェルは、均一又は不均一に離間されうる。幾つかの実施形態では、ウェルは、均一に離間される。１つ以上又はすべてのウェルは、同一の寸法及び形状を有していても、異なる寸法及び形状を有していてもよい。
【０１２１】
幾つかの実施形態では、ウェルの周りの基材の厚さ及び形状は、内面に入り、外面から出る光の反射を補正するように構成される。幾つかの実施形態では、補正は、ウェルを形成する基材材料の厚さを調整することによって達成される。幾つかの実施形態では、ウェル底部（又は底）の最も近くにおける基材材料の厚さは、側壁及び／又は上部開口の最も近くの基材材料の厚さより大きい。幾つかの実施形態では、基材材料の厚さは、ウェル底部の底における最大から上部開口における最小まで、漸進的に低下する。例えば、形状及び厚さは、本開示と矛盾しない限り、その全体がここに参照することによって取り込まれる、本発明の譲受人に譲渡された米国仮特許出願第６２／０７２，０１９号明細書に記載されるものでありうる。
【０１２２】
例えば、非接着性のウェル、スフェロイドを誘発するウェルの幾何学形状、及び重力の組合せは、ウェル内で培養される細胞の増殖が制限される閉じ込め容積を画成することができ、それにより、結果的に、閉じ込め容積によって画成される寸法を有するスフェロイドの形成を生じる。
【０１２３】
幾つかの実施形態では、ウェル２１１５の内面は、細胞に対して非接着性である。ウェルは、非接着性の材料から形成されて差し支えなく、あるいは、非接着性の材料でコーティングされて、非接着性のウェルを形成してもよい。非接着性の材料の例としてはパーフルオロ化ポリマー、オレフィン、又は同様のポリマー、若しくはそれらの混合物が挙げられる。他の例としては、アガロース、ポリアクリルアミドなどの非イオン性ヒドロゲル、ポリエチレンオキシドなどのポリエーテル及びポリビニルアルコールなどのポリオール、又は同様の材料、若しくはそれらの混合物が挙げられる。例えば、非接着性のウェル、ウェルの幾何学形状、及び重力の組合せは、ウェル内で培養された細胞を、スフェロイドへと自己組織化するように誘発しうる。一部のスフェロイドは、単層において増殖させた細胞と比較してより大きいインビボ様応答を示す、分化された細胞機能を維持することができる。
【０１２４】
幾つかの実施形態では、１つ以上のウェルは、半球面などの凹曲面、丸底を有する円錐面などの表面幾何学形状、又はそれらの組合せを有する。ウェル及びウェル底部は、最終的には、くぼみ、凹み、及び同様の凹形円錐台状の起伏表面、又はそれらの組合せなど、スフェロイドを助長する丸みを帯びた面又は曲面に終結、終端、又は底付きしうる。ガス透過性のスフェロイドを助長するウェルの他の形状及び構成は、本開示と矛盾しない限り、その全体がここに参照することによって本明細書に取り込まれる、本発明の譲受人に譲渡された米国特許出願第１４／０８７，９０６号明細書に記載されている。
【０１２５】
幾つかの実施形態では、ウェル底部は平坦であるか、又は先が細くなっている。ウェル底部は、任意の他の適切な形状又は寸法を有しうる。
【０１２６】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載のウェル１１５は、下記の値のうちのいずれか２つの値の間の範囲を含む、例えば、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０又は５００マイクロメートルなど、約２００マイクロメートル〜約５００マイクロメートルの範囲の直径寸法ｗを有する。このような直径寸法によって、スフェロイドの内部の細胞が健康な状態に維持されるように、その中で増殖するスフェロイドの寸法を制御することができる。幾つかの実施形態では、ウェル１１５は、下記の値のうちのいずれか２つの値の間の範囲を含む、例えば、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０又は５００マイクロメートルなど、約１００マイクロメートル〜約５００マイクロメートルの範囲の高さＨを有する。当然ながら、他の適切な寸法もまた使用されうる。
【０１２７】
幾つかの実施形態では、ウェルを画成する構造化された表面は、六方最密充填型のウェル構造のアレイを含む。六角形のマイクロウェルのアレイ１００を有するこのような基材の実施形態の画像が、六角形のウェル１６０１のアレイを有する基材を示す図１６に示されている。図１７は、六方最密充填型のウェル構造を有するマイクロウェルのアレイ１００を有する基材の実施形態のウェル１６０１内で増殖させた細胞（スフェロイド）５００を示す概略図である。幾つかの実施形態では、各ウェル１６０１内の細胞は、図示されるように、単一のスフェロイド５００を形成する。
【０１２８】
図１８は、多孔膜支持体を含む細胞培養装置の実施形態を示す側面図である。多孔膜支持体２５００を取り込む細胞培養装置２１００のさまざまな実施形態が図１８〜２０に示されている。多孔膜支持体２５００は、筐体の内部を別々の培養チャンバ２１５２及び２１５４へとコンパートメント化するように、筐体を横断して（例えば、１つ以上の側壁２１２０に連結されて）装置に配置される。第１の培養チャンバ２１５２は、装置の外部とガス連通したガス透過性のウェル２２００を画成する構造化された表面を形成する基材を備えている。チャンバ２１５２の上部は、多孔膜２５００によって画成される。第２の培養チャンバ２１５４の底部は、多孔膜２５００によって画成される。したがって、細胞の第１の集団２２００は、第１のチャンバ２１５２における、基材２１１０によって形成された構造化された表面のウェル２１１５内で培養されてよく、細胞の第２の集団２２０２は、第２のチャンバ２１５４内の多孔膜２５００上で培養されうる。
【０１２９】
図１８〜２０に示される装置は、第１のチャンバ２１５２と連通した第１のポート２１６２、及び、第２のチャンバ２１５４と連通した第２のポート２１６４を備えている。追加の実施形態では、第１のチャンバ２１５２又は第２のチャンバ２１５４は、チャンバを通って液体が流れることができるように、必要に応じて、追加のポート（出口ポート、図示せず）を有しうる。ポート２１６２、２１６４は、例えば、下記図２１〜２３に関して図示及び論述されるポート（例えば、ポート２１６０）と同様のポートでありうる。ポート２１６２、２１６４は、図示されるように、装置２１００の同一の側にあって差し支えなく、両側にあってもよく、又は、チャンバ又はチャンバ２１５２、２１５４を通る流れに対して別のアクセスを提供するために、任意の他の適切な方式で方向づけられてもよい。
【０１３０】
図１８では、装置は、上部空間がない（限度容量まで細胞培養培地で満たされている）状態で操作されるように示されている。図１９〜２０では、装置は、上部空間を有する（限度容量までは培養培地で満たされていない）状態で操作されるように示されている。支持体２５００の多孔性の性質に起因して、チャンバ２１５２は、培養培地で満たされたままの状態にあるが、チャンバ２１５４は、上部空間を有する又は有しない状態で操作されうる。ウェル２１１５のガス透過性の性質に起因して、細胞２２００の上の培地の高さは、例えば上述のように、重大な懸念事項ではないかもしれない。しかしながら、筐体が他の方法でガス透過性ではない場合、多孔膜支持体２５００上で培養された細胞の上の培地の高さを制限することが望ましいことがある。図２０に示されるように、多孔膜支持体２５００は、例えば上述のように、マイクロウェルのアレイを有する基材を形成しうる。
【０１３１】
図１８〜２０に示される実施形態によれば、細胞の２つ以上の集団の共培養が予定されている。例えば、細胞の第１の集団は第１のチャンバ２１５２内に存在しうると同時に、細胞の第２の集団は第２のチャンバ２１５４内に存在しうる。これらの細胞集団は、透過性の膜２５００によって隔てられうる。この膜は、細胞の第１の集団と細胞の第２の集団との化学連通を可能にする。実施形態において、これらの細胞集団のうちの１つ又は両方は、スフェロイドでありうる。例えば、図２０に示されるように、スフェロイド細胞２２００の第１の集団は、細胞培養基材のスフェロイドを誘発する幾何学形状に起因してスフェロイドを形成する第１のチャンバ２１５２内で増殖しうるとともに、第２の細胞培養チャンバ内に存在する細胞培養基材のスフェロイドを誘発する幾何学形状に起因してスフェロイドを形成するスフェロイド細胞２２０２の第２の集団もまた、第２のチャンバ２１５４内で増殖しうる。多孔膜２５００を通じて、スフェロイド細胞２２０２の第２の集団は、スフェロイド細胞２２００の第１の集団と化学連通している。このように、スフェロイド細胞の２つの別々の集団を互いに化学連通可能にしつつ、スフェロイド細胞の２つの別々の集団を共培養することが可能である。あるいは、実施形態において、図１８に示されるように、細胞の第１の集団は、第１の細胞培養チャンバ２１５２内で増殖するスフェロイド細胞であってよく、スフェロイド細胞ではない細胞の第２の集団（第２の細胞培養チャンバはスフェロイドを誘発する幾何学形状を有しないため）は、第２の細胞培養チャンバ２１５４内で増殖されうると同時に、多孔膜２５００の存在が細胞の第１及び第２の集団を互いに化学連通可能にする。図１９に示されるように、細胞の第２の集団は、上部空間の存在下で増殖されてよく、あるいは、図１８に示されるように、細胞の第２の集団は、上部空間の不存在下で増殖されてもよい。同様に、上部空間は、第１の細胞培養チャンバに存在してもしていなくてもよい。あるいは、スフェロイドを誘発する幾何学形状は、第１の細胞培養チャンバに存在してもしていなくてもよい。当業者は、これらの特徴の多くの組合せが、ユーザの細胞培養要求に応じて、望ましい場合があることを認識するであろう。
【０１３２】
幾つかの実施形態では、装置の筐体はガス透過性である。例として、ガス透過性のフィルム又はバッグは、筐体の少なくとも一部を形成しうる。
【０１３３】
幾つかの実施形態では、１つ以上のウェルは、少なくとも一部には、それらの画定された寸法及び形状に基づいて、画定された寸法の単一のスフェロイドを増殖するように構成される。スフェロイドは、それらがその中で培養されるウェルの幾何学形状によって課せられた寸法の許容限界まで拡大しうる。例えば、各ウェルは、スフェロイドをある特定の直径まで増殖可能にするマイクロウェル又は細胞培養容積を含みうる。言い換えれば、マイクロウェル又は細胞培養容積の幾何学的寸法は、スフェロイドの直径が最大値に達し、その最大値にとどまるように、スフェロイドの増殖を強制しうる。一貫した寸法のスフェロイドの産生は、アッセイ結果の再現性の改善にとって理想的でありうる、組織様の、非膨張性スフェロイドを生じうる。一貫性のあるスフェロイドの産生は、１つ以上のウェルの内部によって画成されるさまざまな形作られ、寸法決めされた容積（例えば、マイクロウェル又は細胞培養容積）の結果として生じうる。例えば、マイクロウェル又は細胞培養容積は、約２００マイクロメートル〜５００マイクロメートル又は前述の値内のいずれかの範囲（例えば、１００マイクロメートル〜２００マイクロメートル、１００マイクロメートル〜５００マイクロメートル、又は２００マイクロメートル〜７００マイクロメートル）など、約１００マイクロメートル〜約７００マイクロメートルの範囲の直径寸法を有しうる。マイクロウェル又は細胞培養容積は、約１００マイクロメートル〜５００マイクロメートル、又は前述の値内のいずれかの範囲など、約５０マイクロメートル〜約７００マイクロメートルの範囲の深さを有しうる。
【０１３４】
図１９は、多孔膜支持体を含む細胞培養装置の追加的な実施形態を示す側面図である。図２０は、細胞の共培養を示す、多孔膜支持体を含む細胞培養装置の追加的な実施形態を示す側面図である。
【０１３５】
図２１に関して、複数の積層された細胞培養コンパートメント１４１０Ａ、１４１０Ｂ、１４１０Ｃを有する細胞培養装置１４００の実施形態が示されている。各細胞培養コンパートメントは、本明細書に記載のマイクロウェルのアレイを有する基材を備えうる。装置１４００は、そこを通って細胞培養培地が導入及び除去されうる開口部１４３５を有する充填マニホルド１４３０を備えている。充填マニホルド１４３０は、複数の開口（図示せず）を備えている。各細胞培養コンパートメント１４１０Ａ、１４１０Ｂ、１４１０Ｃは、開口部１４３５を通して導入される細胞培養培地が細胞培養コンパートメント１４１０Ａ、１４１０Ｂ、１４１０Ｃ内へと流れることができるように、マニホルド１４３０の開口と流体連通した少なくとも１つの開口（図示せず）を有する。装置１４００が細胞培養位置に方向づけられる場合、開口部１４３５は、キャップ（図示せず）などで覆われてよい。装置１４００はまた、必要に応じて、そこを通って空気、代謝ガスなどが流れうる開口部１４２５を画成する通気マニホルド１４２０を備えている。通気マニホルド１４２０は、複数の開口（図示せず）を備えている。各細胞培養コンパートメント１４１０Ａ、１４１０Ｂ、１４１０Ｃは、細胞培養代謝ガスが開口部１４２５を介して細胞培養チャンバの内部と装置の外部１４００との間で交換可能なように、マニホルド１４２０の開口とガス連通した少なくとも１つの開口（図示せず）を有する。装置１４００が細胞培養位置に方向づけられる場合、開口部１４２５は、通気キャップ（図示せず）、フィルタ（図示せず）などで覆われうる。
【０１３６】
次に、図２２を参照すると、図２１に示されるタイプの装置でありうる、細胞培養装置１４００の断面図が示されている。装置１４００は、各々が上述のガス透過性のウェルのアレイを有する構造化された表面を画成する基材１１１０を有する、複数の積層された細胞培養コンパートメント１４１０Ａ、１４１０Ｂ、１４１０Ｃを有する。図２２に示す実施形態では、積層における最上部のコンパートメント１４１０Ａを除き、各コンパートメント（例えば、１４１０Ｂ、１４１０Ｃ）は、隣接するコンパートメントの構造化された基材１１１０の第２の主面によって画成される上面１４５０を有する。例えば、コンパートメント１４１０Ｂの基材１１１０の第２の主面は、コンパートメント１４１０Ｃの上部内面としての役割をする。したがって、隣接するコンパートメントの内部は、底部の構造化された表面／上面を形成する一般的な基材１１１０を通じて、互いにガス連通する。最上部のコンパートメント１４１０は、プレートでありうる、上部によって形成された上部内面１４５０を有している。
【０１３７】
コンパートメント（例えば、コンパートメント１４１０Ａ、１４１０Ｂ、１４１０Ｃ）の内部は、マイクロウェルのアレイを有する基材（例えば、図９に示されるアレイ１００）、上記コンパートメントの基材の外部の第２の主面によって画成される上面、及び、１つ以上の側壁１４４０によって画成される。１つ以上の側壁１４４０は、マニホルド１４２０によって画成された１つ以上の開口部１４２５、１４２６を介して装置の外部と連通した、マニホルド１４２０によって画成された通気カラム１４２９と連通した通気開口１４４２を有する。通気開口１４４２は、装置が細胞培養に方向付けられる場合（例えば、図２２に示されるように）、細胞培養チャンバの内部に存在しうる細胞培養培地１３００の最大容積を画成する。コンパートメント内の細胞培養培地の容積は、最大未満でありうる。通気開口１４４２はまた、細胞培養コンパートメントの内部の最小上部空間容積も画成する。コンパートメントの内部の上部空間の容積は、最小上部空間容積より大きくなりうる（細胞培養培地容積が最大の培地容積未満の場合）。
【０１３８】
したがって、隣接するチャンバ（例えば、チャンバ１４１０Ｃ）の上のチャンバ（例えば、チャンバ１４１０Ｂ）の基材１１１０によって画成される構造化された表面のウェル内で培養される細胞は、ガス透過性のウェルを介して、隣接するチャンバ（例えば、チャンバ１４１０Ｃ）の上部空間１４４１とガス連通する。上部空間１４４１は、１つ以上の開口部１４２５、１４２６を介して装置の外部と連通した、マニホルドによって画成されるカラム１４２９と連通している。
【０１３９】
随意的なフィルタ１４２７は、代謝ガスを通気するために、開口部１４２５又はキャップ１４２２内に導入されうる。装置の底部に通気孔を有することは、幾つかの実施形態では有利でありうる。例えば、代謝廃棄物ガスの二酸化炭素は大気よりも高密度であり、底部の通気孔を有しない培養装置の底部において最高濃度となる勾配を形成する傾向にある。したがって、装置の底部における通気孔の存在（例えば、通気カラム１４２９及び開口部１４２６によって形成される）は、廃棄物二酸化炭素の装置外への移動を促進しうる。
【０１４０】
次に、図２３を参照すると、図２１に示されるタイプの装置でありえ、かつ、図２２に示される装置の一部でありうる、細胞培養装置１４００の断面図が示されている。図２３における各参照番号が明確に論じられない限り、図２２に関して上に述べた同様に番号付けされた構成要素の説明を参照されたい。例証される実施形態において、コンパートメント（例えば、コンパートメント１４１０Ａ、１４１０Ｂ、１４１０Ｃ）の内部は、基材１１１０の内部の構造化された表面、上記コンパートメントの基材の外面によって画成される上面、及び１つ以上の側壁１４４０によって画成される。１つ以上の側壁１４４０は、装置が細胞培養に方向付けられる場合、キャップ１４３２によって覆われうる、マニホルド１４３０によって画成される開口部１４３５を介して装置の外部と連通した、充填マニホルド１４３０によって画成されるカラム１４３９と連通した開口１４４３を有する。細胞培養培地１３００は、装置の操作によって、カラム１４３９及び開口部１４３５を介して、細胞培養コンパートメント（例えば、コンパートメント１４１０Ａ、１４１０Ｂ、１４１０Ｃ）内に導入又は細胞培養コンパートメントから除去されうる。
【０１４１】
次に、図２４Ａ及び２４Ｂを参照すると、複数のトレイが互いの上部に積層される場合に、細胞培養コンパートメント（例えば、図２１〜２３に示されるコンパートメント１４１０Ａ、１４１０Ｂ、１４１０Ｃ）を形成する役割をしうる、トレイ１４１５の概略的な底面図（２４Ａ）及び概略的な斜視図（２４Ｂ）が示されている。トレイ１４１５は、マイクロウェルのアレイを有する基材を画成する、基材１１１０から延びる側壁１４４０Ａ、１４４０Ｂ、１４４０Ｃ、１４４０Ｄを備えている。幾つかの実施形態では、トレイは、単一の取り囲む側壁（図示せず）を備えている。部分的な高さの壁１４７２は、側壁１４４０Ａ及び側壁１４４０Ｄに連結している。部分的な高さの壁１４７２及び側壁１４４０Ａ、１４４０Ｄは、通気開口１４４２を取り囲み、それを画成する。細胞培養装置が積層されたトレイから組み立てられる場合、トレイ１４１５によって形成されたチャンバの内部の代謝ガスは、部分的な壁１４７２を越えて、開口１４４２を通って流れうる。積層されたトレイ１４１５の通気開口１４４２、部分的な壁１４７２及び連結する側壁は、通気カラム（例えば、図２２に示される通気カラム１４２９）の少なくとも一部を形成しうる。
【０１４２】
トレイ１４１５はまた、側壁１４４０Ａ及び側壁１４４０Ｂに連結した部分的な高さの壁１４７３も備えている。部分的な高さの壁１４７３及び側壁１４４０Ａ、１４４０Ｂは、充填開口１４４３を取り囲み、それを画成する。細胞培養装置が積層されたトレイから組み立てられる場合、培養培地は、組み立てられた装置の操作によって、部分的な壁１４７３を越えて、充填開口１４４３を通って、トレイ１４１５によって形成されたチャンバの内部に導入され又はそこから除去されうる。積層されたトレイ１４１５の充填開口１４４３、部分的な壁１４７３及び連結する側壁は、充填カラム（例えば、図２３に示される充填カラム１４３９）の少なくとも一部を形成しうる。
【０１４３】
部分的な壁１４７３の高さは、トレイ１４１５によって形成された細胞培養コンパートメント内に含まれうる、細胞培養培地の最大の高さ及び容積を画成する。部分的な壁１４７３の上部は、構造化された表面を形成する基材１１１０から任意の適切な距離にありうる。幾つかの実施形態では、距離は、下記のいずれか２つの間の範囲を含む、６、７、８、９、１０、１２、１５、又は２０ｍｍなど、５ｍｍ以上である。このようなトレイから組み立てられた細胞培養装置の構造化された表面のガス透過性のウェルが、装置の外部と連通していることから、細胞の上の細胞培養培地の高さは、ガス交換が主に細胞培養培地を通して生じる、通常の細胞培養装置を用いた場合に利用できる高さよりも高くなりうる。
【０１４４】
部分的な壁１４７２の上部から基材１１１０までの距離は、部分的な壁１４７３の上部から基材１１１０までの距離と同一又はそれ以上でありうる。したがって、コンパートメントが培養培地を過充填される場合、過剰の培地は、通気開口１４４２よりはむしろ、充填開口１４４３を通して排出される。通気カラムに底部フィルタ（図２２のフィルタ１４２７など）を採用する実施形態では、底部フィルタは、培地で汚染されないであろう。当然ながら、組み立てられた装置の適切な操作によっても、底部フィルタの培地による汚染を防ぐことができよう。
【０１４５】
次に、図２５を参照すると、複数の積層された細胞培養コンパートメント１４１０Ａ、１４１０Ｂ、１４１０Ｃを有する細胞培養装置１４００の実施形態の概略的な側面図が示されている。各コンパートメントは、上述の構造化された表面を画成する基材１１１０を含みうる。装置１４００は、構造化された表面を形成する基材１１１０に隣接して位置づけられ、かつ、チャンバの外部への空気流のための通路を提供する、スペーサ１５００を備えており、該通路は「導管空間」（例えば、導管空間１４６０Ａ、１４６０Ｂ、１４６０Ｃ）と称される。構造化された表面は、細胞がその中で培養されうるガス透過性のウェルを画成することから、代謝ガスはウェルを通して、装置の外部１４００までスペーサ１５００によって画成される導管空間１４６０Ａ、１４６０Ｂ、１４６０Ｃへと交換されうる。装置１４００はまた、細胞培養培地がそこを通って導入又は除去されうる開口部を画成するマニホルド１４３０も備えている。マニホルド１４３０は、複数の開口（図示せず）を備えている。各細胞培養コンパートメント１４１０Ａ、１４１０Ｂ、１４１０Ｃは、マニホルド１４３０を通って導入される細胞培養培地が細胞培養コンパートメント１４１０Ａ、１４１０Ｂ、１４１０Ｃ内に流れうるように、マニホルド１４３０の開口と流体連通した少なくとも１つの開口（図示せず）を有する。
【０１４６】
図２５における細胞培養装置１４００の底部は、スペーサ１５００がその上に配置されたプレート１５１０を備えている。実施形態において、プレート１５１０及びスペーサ１５００は、成形されたパーツなど、単一化されたパーツである。このようなプレートは、他の細胞培養コンパートメント（例えば、コンパートメント１４１０Ａ、１４１０Ｂ、１４１０Ｃ）の上面を形成しうる。各コンパートメントについて、１つ以上の側壁１４４０は、構造化された表面を画成する基材１１００から上面まで延び、この上面は、スペーサを備えたプレートから形成されうる。ポート１４３０の開口（図示せず）と連通した開口（図示せず）は、側壁によって画成されうる。
【０１４７】
積層された細胞培養トレイ又はチャンバは、任意の適切な方式で組み立てられうる。例えば、このような構成要素は、溶接技法（例えば、熱、レーザ、長波ＩＲ又は超音波溶接など）、接着、溶剤接合などを使用して接合されうる。
【０１４８】
幾つかの実施形態では、構造化された表面は、バッグに連結される。細胞培養に適したバッグは、加熱封止、レーザ溶接、接着剤の塗布、又は膨張式のバッグ製造の分野で知られたいずれかの他の方法によって、フィルムから形成されうる。バッグの壁又はそれらの一部は、壁を横切るガスの効率的な移動を可能にする厚さを有しうる。所望の厚さは、壁を形成する材料に応じて変化しうると解されたい。例として、壁又は壁を形成するフィルムは、約０．０２ミリメートル〜０．８ミリメートルの厚さでありうる。バッグは、細胞の培養に適した任意の材料から作製されうる。さまざまな実施形態において、バッグは、該バッグ内で培養された細胞の目視検査を可能にするために、場合に応じて透明な材料から形成される。バッグの形成に用いられうる、場合に応じて透明な、ガス透過性材料の例としては、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリ（エチレン−酢酸ビニル）、ポリスルホン、ポリメチルペンテン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）又は相容性のフッ素ポリマー、シリコーンゴム又は共重合体、ポリ（スチレン−ブタジエン−スチレン）；又は、ポリエチレン又はポリプロピレンなどのポリオレフィン；若しくはこれらの材料の組合せが挙げられる。
【０１４９】
本明細書に記載される細胞培養装置は、構造化された表面のウェル内で細胞を培養するために用いられうる。上述のように、装置内の細胞培養培地は、細胞の上の任意の適切な高さで存在しうる。幾つかの実施形態では、細胞の上（例えば、ウェルの上部又は底の上）の装置における細胞培養培地の高さは、約５ｍｍ以上である。幾つかの実施形態では、細胞の上（例えば、ウェルの上部又は底の上）の装置における細胞培養培地の高さは、約６ｍｍ以上、約７ｍｍ以上、約８ｍｍ以上、約９ｍｍ以上又は約１０ｍｍ以上である。
【０１５０】
ウェルのガス透過性の理由から、細胞培養培地のこのような高さは、細胞を健康な状態に維持するために用いられうる。したがって、本明細書に記載の装置内で培養された細胞は、このような高さの細胞培養培地とともに、長期間、培養されうる。例えば、細胞は、このような高さの培地とともに、２４時間以上、４８時間以上、７２時間以上、９６時間以上、又は、培地が交換されるまで、連続的に培養されうる。
【０１５１】
ウェルが細胞に対して非接着性の実施形態では、細胞は、重力によって細胞をウェルから移動可能にするために装置を反転させることによって、採取されうる。
【０１５２】
幾つかの実施形態では、多孔膜は、同一装置内であるが、装置の外部とガス連通した構造化された表面上で培養された第１の細胞型とは分離して、第２の細胞型の増殖を支援するために（又は、同一の型の追加の細胞の増殖を支援するために）、本明細書に記載される細胞培養装置内に配置される。幾つかの実施形態では、幹細胞は、装置の外部と連通したガス透過性のウェルを有する構造表面で培養され、支持細胞が、多孔膜上で培養される。当然ながら、このような装置を使用して、細胞とコンパートメント化の任意の他の所望される組合せも採用されうる。
【０１５３】
多孔膜は、筐体を２つの増殖チャンバへとコンパートメント化するために、細胞培養装置の筐体内に配置されうる。好ましくは、透過性の膜は、膜を通じた細胞移動を制限するが、生体分子の通過を可能にする。多孔膜の形成に用いられうる材料の例としては、トラックエッチドメンブレン若しくは、織られた又は織られていない多孔質の材料が挙げられる。多孔膜の材料は、細胞に対してより接着性又はより非接着性にするために処理又はコーティングされうる。処理は、プラズマ放電、コロナ放電、ガスプラズマ放電、イオン衝撃、電離放射、及び高輝度ＵＶ光線を含む、当技術分野で知られたあらゆる方法によって達成されうる。コーティングは、印刷、噴霧、凝縮（condensation）、放射エネルギー、イオン化法又は浸漬を含む、当技術分野で知られた任意の適切な方法によって導入することができる。コーティングは、次に、共有又は非共有のいずれかの結合部位を提供しうる。このような部位は、細胞培養成分（例えば、増殖又は接着を促進するタンパク質）などの部分を結合させるために用いられうる。さらには、コーティングはまた、細胞（例えば、ポリリシン）の結合を高めるために用いられうる。あるいは、上述の細胞非接着性のコーティングは、細胞結合を防止又は抑制するために用いられうる。幾つかの実施形態では、多孔膜は、複数のガス透過性のウェルを画成する構造化された表面を形成する基材に関して上述されるような複数のウェルを有する構造化された表面を有するように製作されうる。しかしながら、この事例では、多孔膜材料は、構造化された表面を有するように形成される。
【０１５４】
構造化された表面のガス透過性のウェル（例えば、上述のもの）は、細胞増殖を可能にするように装置を配置したインキュベータ内のガス濃度を調節することによって、酸素張力を制御可能にする。透過性の膜支持体は、生物学的に活性な成分の移動を可能にしつつ、異なる細胞集団を物理的に分離する方法を提供する。
【０１５５】
多孔膜は、任意の適切な方式で装置の筐体（例えば、側壁等）に取り付けられうる。例えば、多孔膜は、上述の複数のガス透過性のウェルを有する構造化された表面を画成する基材を形成する基材の導入と同様の方式で装置内に導入されうる。
【０１５６】
図２６に示す実施形態では、細胞培養装置３１００は、フレーム３１１３によって取り囲まれたプレート３１１１内にウェル３１１５を有する９６−ウェルマルチウェルプレートである。しかしながら、上述のように、細胞培養装置は、適切な数のウェルを有しうる（例えば、３、６、１２、９６、又は任意の他の数のウェルが提供されうる）。図示された実施形態では、複数のウェル３１１５の各々の少なくとも一部は、マイクロウェルのアレイを有する基材を備え、かつ、上述のスフェロイドを形成するための位置を提供する。細胞の培養に使用されるウェルを有する、ほとんどあらゆる種類の細胞培養装置は、幾つかの実施形態では、ウェルの全容積を形成することができ、あるいは、幾つかの実施形態では、ウェルの細胞培養部分容積（sub-volume）を形成することができる、マイクロウェルのアレイを有する基材を採用することによって、設計されうる。幾つかの実施形態では、マイクロウェルの設計がそれを用いて実施されうる細胞培養装置は、例えば、９６−ウェルマルチウェルプレート、３８４−ウェルマルチウェルプレート、１５３６−ウェルマルチウェルプレートなどのマルチウェルプレートでありうる。幾つかの実施形態では、マルチウェルプレートの少なくとも表面はガス透過性である。
【０１５７】
スフェロイドが形成されるように細胞を凝集可能にする複数のウェルの能力、並びに、複数のウェルにわたって一貫性のある寸法を維持するようにスフェロイドを複数のウェルの各々内に形成可能にする能力は、任意の適切な方式で達成されうる。例えば、複数のウェル３１１５は、細胞がその中でスフェロイド５００として増殖する図１〜５、又は１６に示されるマイクロウェルのように構造化及び配置されたマイクロウェルのアレイを備えうる。
【０１５８】
幾つかの実施形態では、１つ以上のウェルは、少なくとも一部には、それらの画定された寸法及び形状に基づいて、画定された寸法の単一のスフェロイドを増殖させるように構成される。スフェロイドは、それらがその中で培養されるウェルの幾何学形状によって課せられた寸法の許容限界まで拡大しうる。例えば、各ウェルは、スフェロイドをある特定の直径まで成長可能にするマイクロウェル又は細胞培養容積を備えうる。言い換えれば、マイクロウェル又は細胞培養容積の幾何学的寸法は、スフェロイドの直径が最大値に達し、その最大値にとどまるように、スフェロイドの成長を強いることができる。一貫した大きさのスフェロイドの生成は、アッセイ結果の再現性を改善するために理想的でありうる、組織様の非膨張性スフェロイドを結果的に生じうる。一貫性のあるスフェロイドの生成は、１つ以上のウェルの内部によって画成された、さまざまな形作られ、かつ寸法決めされた容積（例えば、マイクロウェル又は細胞培養容積）の結果でありうる。例えば、マイクロウェル又は細胞培養容積は、約２００マイクロメートル〜５００マイクロメートル又は前述の値内のいずれかの範囲（例えば、１００マイクロメートル〜２００マイクロメートル、１００マイクロメートル〜５００マイクロメートル、又は２００マイクロメートル〜７００マイクロメートル）など、約１００マイクロメートル〜約７００マイクロメートルの範囲の直径寸法を有しうる。マイクロウェル又は細胞培養容積は、約１００マイクロメートル〜５００マイクロメートル、又は前述の値内のいずれかの範囲など、約５０マイクロメートル〜約７００マイクロメートルの範囲の深さを有しうる。
【０１５９】
本明細書に記載の複数のウェルの各々は、その中に堆積された細胞がスフェロイドを形成するように補助しうる。複数のウェルの各々はまた、各スフェロイドの直径を、約、例えば、５００マイクロメートル以下、４００マイクロメートル以下、３００マイクロメートル以下、２５０マイクロメートル以下、１５０マイクロメートル以下等又は前述の値内のいずれかの範囲（例えば、１５０〜２５０、１５０〜３００、１５０〜４００、１５０〜５００、２５０〜３００、２５０〜４００等）の値に制限又は強いることができる。幾つかの実施形態では、複数のウェルの各々は、該複数のウェル内で増殖したすべてのスフェロイドの平均直径とは、約、例えば、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、２％以下等又は前述の値内のいずれかの範囲だけ異なる直径によって画成されたスフェロイドを形成する。
【０１６０】
図２７〜２９に示される実施形態では、マイクロウェル３１１５のアレイは、基材３１１０内に形成される。複数のウェル３１１５の各々は、上部開口３１１８、底面３１１２、及び、上部開口３１１８から底面３１１２まで延びる側壁表面３１２０を有しうる。加えて、側壁表面３１２０は、上部開口３１１８と底面３１１２の間に、ウェルの底部における縮小された領域がペンの先端のように見えるためにそのように呼ばれる、ペン先領域３１１６（図２９参照）を画成しうる。ペン先領域は、スフェロイドを誘発する幾何学形状をしている。
【０１６１】
複数のウェル３１１５の各々の上部開口３１１８は、そこを通って細胞を複数のウェル３１１５の各々に播種するための開口部として利用されうる。上部開口３１１８は、さまざまな異なる形状及び寸法を有しうる。例えば、上部開口３１１８は、円形、楕円形、正方形、矩形、六角形、四辺形等である、形状によって画成されうる。上部開口３１１８はまた、直径寸法（形状に応じて、例えば、直径、幅等）によっても画成されうる。上部開口３１１８の直径寸法は、最も幅の広い地点における、上部開口を横切る距離として定義されうる。上部開口３１１８の直径寸法は、約、例えば、３００マイクロメートル以上、５００マイクロメートル以上、８００マイクロメートル以上、１０００マイクロメートル以上、１５００マイクロメートル以上、２０００マイクロメートル以上等、又は、７０００マイクロメートル以下、６０００マイクロメートル以下、４０００マイクロメートル以下、２５００マイクロメートル以下、１７００マイクロメートル以下、１２００マイクロメートル以下等、若しくは前述の値内のいずれかの範囲でありうる。
【０１６２】
複数のウェル３１１５の各々の底面３１１２は、それらの上又はそれらの上方での細胞の培養を可能にするように促しうる。底面３１１２は、さまざまな異なる形状及び寸法を有しうる。例えば、底面３１１２は、円形、半球状、平坦、円錐状等でありうる。さらなる例として、底面３１１２はまた、円形、楕円形、正方形、矩形、六角形、四辺形等の形状によっても画成されうる。図２７〜２９に示されるように、底面３１１２は平坦であり、直径寸法によって画成される。底面の直径寸法は、約、例えば、０マイクロメートル以上、５０マイクロメートル以上、７５マイクロメートル以上、１００マイクロメートル以上、２００マイクロメートル以上、２７５マイクロメートル以上等、又は、７００マイクロメートル以下、５００マイクロメートル以下、４００マイクロメートル以下、３００マイクロメートル以下、２５０マイクロメートル以下、１５０マイクロメートル以下等、若しくは、前述の値内のいずれかの範囲でありうる。底が最下点に位置づけられた、丸底又は同様の表面（例えば、半球状、円錐状等）を有する底面３１１２については、底面３１１２の直径寸法は、ゼロと見なされる。幾つかの実施形態では、上部開口３１１８の直径寸法は、底面３１１２の直径寸法より大きい。他の実施形態では、上部開口３１１８の直径寸法は、底面３１１２の直径寸法に等しい。
【０１６３】
幾つかの実施形態では、複数のウェル３１１５の各々の底面３１１２は、ウェルのマイクロアレイを有する基材を伴って、均一に構築されうる（図２９も参照）。他の実施形態では、底面３１１２は、基材３１１０の形成に用いられる材料とは異なる材料から製造されうる。複数のウェルを製造するさまざまな方法について以下にさらに記載する。底面３１１２又は側壁表面３１２０は、ウェル３１１５内で培養される細胞又はスフェロイド３１３０への酸素の供給を助けるためにガス透過性でありうる。幾つかの実施形態では、底面３１１２を画成する基材３１５０は、ガス透過性の基材でありうる。幾つかの実施形態では、基材３１５０は、ガス透過性のフィルムを含みうる。外部に対する底面３１１２のガス透過性は、該底面３１１２の材料及び底面３１１２の厚さに部分的に依存する。例えば、ウェルのガス透過性は、本開示と矛盾しない限り、その全体がここに参照することによって取り込まれる、２０１４年１０月２９日に出願した、「ガス透過性の培養フラスコ（GAS PERMEABLE CULTURE FLASK）」という発明の名称の米国仮特許出願第６２／０７２，０８８号に記載されうる。
【０１６４】
ペン先領域３１１６（図２９参照）は、上部開口３１１８と底面３１１２との間の側壁表面３１２０によって画成されうる。ペン先領域３１１６の位置は、ウェルの他の構成要素によって画成されてもよい。例えば、ペン先領域３１１６は、側壁表面３１２０を横切る直径寸法３１４４によって画成されうる。ペン先領域３１１６の直径寸法３１４４は、ペン先領域３１１６における側壁表面３１２０を横切る距離として定義されうる。ペン先領域３１１６は、約、例えば、５０マイクロメートル以上、１００マイクロメートル以上、２００マイクロメートル以上、３００マイクロメートル以上、４００マイクロメートル以上、５５０マイクロメートル以上等、又は、８００マイクロメートル以下、７００マイクロメートル以下、６００マイクロメートル以下、５００マイクロメートル以下、４５０マイクロメートル以下、３５０マイクロメートル以下等、若しくは、前述の値内のいずれかの範囲の直径寸法３１４４によって画成されうる。ペン先領域３１１６はまた、約、例えば、５０マイクロメートル以上、１００マイクロメートル以上、１５０マイクロメートル以上、２５０マイクロメートル以上、３５０マイクロメートル以上、４５０マイクロメートル以上等、又は、８００マイクロメートル以下、７００マイクロメートル以下、６００マイクロメートル以下、５００マイクロメートル以下、４００マイクロメートル以下、３００マイクロメートル以下等、若しくは、前述の値内のいずれかの範囲の底面３１１２からの高さ３１４２によっても画成されうる。高さ３１４２は、底面３１１２の最下点から測定されうる。このような実施形態では、ウェル３１１５の全容積は細胞培養容積３１４０である。
【０１６５】
上部開口３１１８の直径寸法は、ペン先領域３１１６の直径寸法３１４４以上でありうる。ペン先領域３１１６の直径寸法３１４４は、底面３１１２の直径寸法以上でありうる。底面３１１２の直径寸法は、ペン先領域３１１６の直径寸法３１４４以下である、あるいは、ペン先領域３１１６の直径寸法３１４４は、上部開口３１１８の直径寸法以下でありうると記載することもできる。幾つかの実施形態では、上部開口３１１８はペン先領域３１１６でありうる。
【０１６６】
複数のウェルの各々の側壁表面３１２０は、上部開口３１１８から底面３１１２まで延びる。側壁表面３１２０は、上部側壁表面３１２４及び下部側壁表面３１２２を含みうる。上部側壁表面３１２４は、上部開口３１１８とペン先領域３１１６との間に画成されうる。下部側壁表面３１２２は、ペン先領域３１１６と底面３１１２との間に画成されうる。幾つかの実施形態では、複数のウェル３１１５の各々の側壁表面３１２０は、細胞非接着性の表面を画成しうる。細胞非接着性の表面は、先に述べた細胞培養容積３１４０におけるスフェロイド３１３０への細胞の増殖を促進する。細胞非接着性の上部側壁表面３１２４は、細胞培養容積３１４０内への播種された細胞の沈降を促進しうる。上部側壁表面３１２４が細胞非接着性であるかどうかにかかわらず、上部側壁表面３１２４は、幾つかの実施形態では、ウェル内に播種された細胞のペン先領域３１１６内への沈降を生じさせ、重力の結果として細胞培養容積３１４０を形成するように構成されうる。
【０１６７】
幾つかの実施形態では、上部側壁表面３１２４及び下部側壁表面３１２２は、例えば、放物面、円錐状、階段状、さまざまな角度、曲線状等の形状によって画成されうる。上部及び下部側壁表面３１２４、３１２２は、同一又は異なる形状を有しうる。幾つかの実施形態では、側壁表面３１２０は、上部及び下部側壁表面３１２４、３１２２が出会う位置に、変曲点３１２１を有しうる（例えば、図２９に示される）。他の実施形態では、側壁表面３１２０は、上部及び下部側壁３１２４、３１２２の表面が出会う変曲点３１２１に、連続した傾斜を有しうる。
【０１６８】
幾つかの実施形態では、底面１１２と隣接している側壁３１２０の一部は、底面３１１２に対して垂直又は底面３１１２に対してある角度で存在しうる。底面３１１２と隣接する側壁３１２０の一部は、下部側壁表面３１２２として記載されうる。側壁３１２０の一部が底面３１１２と交差する角度は、底面３１１２に対して、例えば、９０度以上、９２度以上、９５度以上、１００度以上等、又は、１１０度以下、１０５度以下、１０２度以下、９７度以下等、若しくは、前述の値内のいずれかの範囲で画成されうる。幾つかの実施形態では、側壁表面３１２０を横切る直径寸法は、底面３１１２から上部開口３１１８の方へと増加するように説明されうる。側壁の幾何学形状は、細胞を複数のウェル３１１５の各々内に十分に沈降可能にするような幾何学形状でありうる。
【０１６９】
平坦な表面を有しない底面３１１２に関しては、側壁３１２０の角度は、底面３１１２の底の接線方向にある仮想平面に対するものと考えられる。他の実施形態では、仮想平面はまた、仮想平面が底の接線方向であるかどうかにかかわらず、上部開口３１１８と同一平面上にあるものとして定められうる。
【０１７０】
底面３１１２、ペン先領域３１１６及び側壁表面３１２０の一部の組合せは、細胞培養容積３１４０を画成しうる。細胞培養容積３１４０を画成する側壁表面３１２０の一部は、下部側壁表面３１２２とも説明されうる。細胞は、細胞培養容積３１４０内でのみ培養されるように限定されない。しかしながら、複数のウェル３１１５の各々内に堆積された細胞は、スフェロイド３１３０を形成及び増殖するように、細胞培養容積３１４０内で凝集しうる。また、スフェロイド３１３０の寸法は、細胞培養容積３１４０の形状及び寸法の結果でありうる。例えば、複数のウェル３１１５の各々の細胞培養容積３１４０は、スフェロイド３１３０が、約、例えば、５００マイクロメートル以下、４００マイクロメートル以下、３００マイクロメートル以下、２５０マイクロメートル以下、１５０マイクロメートル以下等又は前述の値内のいずれかの範囲の直径まで増殖するように構成される。幾つかの実施形態では、複数のウェル３１１５の各々の細胞培養容積３１４０は、複数のウェル３１１５内で増殖したすべてのスフェロイド３１３０の平均直径とは、約、例えば、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、２％以下等だけ異なる、又は前述の値内のいずれかの範囲だけ異なる直径によって画成される、スフェロイド３１３０を形成する。
【０１７１】
上部開口３１１８、ペン先領域３１１６及び側壁表面３１２０の一部の組合せは、第２の容積３１４５を画成する。第２の容積３１４５を画成する側壁表面３１２０の一部は、上部側壁表面３１２４としても説明されうる。第２の容積３１４５は、細胞培養容積３１４０よりも大きくてよい。例えば、第２の容積３１４５は、細胞培養容積３１４０の約、１００％以上、２００％以上、５００％以上、１，０００％以上、１０，０００％以上、１００，０００％以上、２００，０００％以上等、又は前述の値内のいずれかの範囲でありうる。例として、９６−ウェルプレートは、０．１マイクロリットルの容積によって画成される細胞培養容積と、２００マイクロリットルの容積によって画成される、結果的に細胞培養容積よりも２，０００倍大きい容積を生じうる、第２の容積とを有しうる。
【０１７２】
細胞培養装置３１００の一実施形態が図２７に示されている。図２７に示されるように、複数のウェル３１１５の各々の側壁表面３１２０は、上部開口３１１８から底面３１１２へと次第に細くなっている。特に、側壁表面３１２０は、ほぼ上部開口３１１８に垂直な方向であるが、側壁表面３１２０が底面３１１２の方へと延びるにつれて側壁表面３１２０を横切る直径寸法を低下させる僅かな角度で、上部開口３１１８から延びている。上部開口３１１８とペン先領域３１１６との間の側壁表面３１２０に沿った点３１２３において、側壁表面３１２０の角度は、側壁表面３１２０が底面３１１２の方へ延びるにつれて、側壁表面３１２０を横切る直径寸法をさらに低下させるように変化する。ペン先領域３１１６において、側壁表面３１２０の角度は、この場合も変化し、かつ底面３１１２の方へと延びる。側壁表面３１２０のこの最後の部分は、時折、下部側壁表面３１２２と記載される。図２７に示されるように、実施形態において、下部側壁表面３１２２は、底面３１１２に対して垂直から僅かに角度をなしてよく、側壁表面３１２０を横切る直径寸法は、側壁表面３１２０が底面３１１２の方に延びるにつれて低下する。スフェロイド３１３０は、下部側壁表面３１２２内かつ底面３１１２に対して位置づけられるように示されている（すなわちペン先領域３１１６内）。下部側壁表面３１２２は、スフェロイド３１３０が増殖可能な寸法を制限又は限定しうる。
【０１７３】
細胞培養装置３１００の一実施形態が図２８に示されている。図２８に示されるように、複数のウェル３１１５の各々の側壁表面３１２０は、上部開口３１１８から底面３１１２へと次第に細くなっている。詳細には、側壁表面３１２０は、最初に、上部開口３１１８から該上部開口３１１８に垂直な角度で伸び、次に、ペン先領域３１１６の方へ放物線軌道に沿って延びる。ペン先領域３１１６では、側壁表面３１２０の角度は変化し、かつ底面３１１２の方へと延びる。側壁表面３１２０のこの最後の部分は、時折、下部側壁表面３１２２と記載される。図２９に示されるように、下部側壁表面３１２２は、底面３１１２に対して垂直から僅かに角度をなし、側壁表面３１２０を横切る直径寸法は、側壁表面３１２０が底面３１１２の方に延びるにつれて低下する。スフェロイド３１３０は、ペン先領域３１１６内において下部側壁表面３１２２内かつ底面３１１２に対して位置づけられるように示されている。下部側壁表面３１２２は、スフェロイド３１３０が成長可能な寸法を制限又は限定しうる。ペン先領域は、スフェロイドを誘発する幾何学形状をしている。
【０１７４】
次に、図３０に着目すると、幾つかの実施形態では、細胞培養装置３６５０は、図３０に示されるように、底部プレート３６１０と１つ以上の側壁３６２０とを備えうる。底部プレート３６１０は主面３６１１を画成することができ、１つ以上の側壁３６２０は、底部プレート３６１０から延びうる。底部プレート３６１０は、全体的に又は部分的に、マイクロウェル３６１５のアレイを有する基材から形成されうる。図３０は、底部プレートがマイクロウェル３６１５の複数のアレイのうちの１つのアレイを有しうることを示している。すなわち、図３０に示されるマイクロウェル３６１５のアレイとして識別される領域の各々は、はるかに小さいマイクロウェルのアレイを含みうる。実施形態において、細胞培養装置３６５０はまた、底部プレート３６１０の主面３６１１に形成された複数のウェル３６１５も備えうる。マイクロウェル３６１５の複数のアレイの各ウェルは、スフェロイドの増殖を促進又は誘発する、先に記載したマイクロウェル又は細胞培養容積を画成しうる。底部プレート３６１０の主面３６１１及び１つ以上の側壁３６２０は、リザーバの容積を画成する。本明細書に記載のリザーバプレートは、培養培地の添加を可能にし、その過剰分が典型的にはマイクロウェルプレートの個々の浅いウェルを満たすのに用いられ、流体連通する異なるウェル内での細胞培養を可能にする。
【０１７５】
幾つかの実施形態では、１つ以上の側壁３６２０は、幾つかの現行の市販される細胞培養装置よりも、底部プレート３６１０からさらに遠くに（例えば、側壁の高さ）延伸でき、リザーバが培地の通常の容積より多くの培地を保持可能にする。リザーバにとってより大きい限度容量の条件により、スフェロイドが、各個々のウェル内の培地の量にのみに依拠する必要がなくなりうるように、過剰の培養培地をリザーバに加えることを可能になりうる。言い換えれば、スフェロイドは、該スフェロイドが標準的なマイクロプレートウェル内で増殖する場合ほど頻繁には、細胞培養培地を供給する必要がなくなりうる。図３０に示されるように、リザーバ内の細胞培養培地はリザーバ内のすべてのウェルと連通していることから、栄養素及び代謝物は、細胞培養培地全体を通じて交換されうる。
【０１７６】
幾つかの実施形態では、細胞培養組立体３６００は、細胞培養装置３６５０及び流体透過性のメッシュ３６７０を備えうる。流体透過性のメッシュ３６７０は、細胞がウェル内に播種された後に、ウェル３６１５の上部に配置されうる。複数のウェル３６１５間で共通に連通する細胞培養培地は、ウェル内の細胞をかき乱すことなく、手動のバッチ供給プロセスの間に隔離及び置換されうる。細胞は、幾つかの実施形態では、ウェルの表面に対して非接着性でありうることから、スフェロイドをかき乱す又は失うことのない細胞培養培地の交換は困難でありうる。しかしながら、上述のメッシュ３６７０を使用することにより、このような困難さが緩和されうる。例えば、細胞培養装置と流体透過性のメッシュとの組合せは、本開示と矛盾しない限り、その全体がここに参照することによって取り込まれる、「リザーバ・スフェロイド・プレート（RESERVOIR SPHEROID PLATE）」という発明の名称で２０１４年１０月２９日に出願の、米国仮特許出願第６２／０７２，１０３号明細書に記載されるようなものでありうる。
【０１７７】
本明細書に記載の細胞培養装置３６５０のウェル３６１５は、任意の寸法、形状又は構成でありうることが理解されよう。幾つかの実施形態では、ウェルは、図１７に示されるように六方最密充填型のウェル構造から形成される。小さい容積のウェルは、追加のリザーバ容積のない、細胞培養培地の頻繁な交換を必要とするであろうことから、密に充填された小さい容積のウェルを有する構造化された表面を有するリザーバプレート装置は、特に有利でありうる。
【０１７８】
本明細書に記載のリザーバプレートは、例えば、培養培地の添加を可能にし、その過剰分は、典型的にはマイクロウェルプレートの個々の浅いウェルを満たすのに用いられ、かつ、異なるウェル内で培養された細胞を流体連通可能にする。
【０１７９】
図３１に示されるように、細胞培養装置４１００は、底部プレート４１１０及び１つ以上の側壁４１２０を備えうる。底部プレートは主面を画成してよく、１つ以上の側壁４１２０は、底部プレートから延びうる。底部プレートと１つ以上の側壁との組合せは、リザーバを画成しうる。細胞培養装置はまた、底部プレートの主面に形成されたマイクロウェル４１１５のアレイを有する基材を、全体又は一部に含みうる。マイクロウェルアレイ内の複数のウェルの各ウェルは、上部開口及び底を画成しうる。上部開口は、主面と同一平面上にあってよく、底は、主面の下に位置づけされうる、すなわち、底は、１つ以上の側壁が底部プレートから延びる方向とは逆の方向に位置づけされうる。上部プレート（図示せず）は、細胞をインキュベートする間に、所望されるリザーバ上に配置されうる。
【０１８０】
幾つかの実施形態では、１つ以上の側壁は、典型的なものよりも底部プレートから遠くに延伸でき、したがって、リザーバを培地の通常の容積より大きい容積を保持可能にする。リザーバにとってより大きい限度容量の条件は、スフェロイドが、各個々のウェル内の培地の量にのみ依拠する必要がなくなりうるように、過剰の培養培地をリザーバに添加可能にしうる。言い換えれば、スフェロイドは、該スフェロイドが標準的なマイクロプレートウェル内で増殖する場合ほど頻繁には、細胞培養培地を供給する必要をなくしうる。図３１に示されるように、リザーバ内の細胞培養培地はリザーバ内のすべてのウェルと連通していることから、栄養素及び代謝物は、細胞培養培地全体を通じて交換されうる。
【０１８１】
幾つかの実施形態では、細胞培養組立体４２００は本明細書に記載される。組立体は、装置４１００（例えば、図３１に関して示しかつ述べたような装置）及び流体透過性のメッシュ４５７０を備えうる。流体透過性のメッシュ４５７０は、細胞がウェル内に播種された後に、ウェル４１１５の上部に配置されうる。共通に連通する細胞培養培地は、ウェル内の細胞をかき乱すことなく、手動のバッチ供給プロセスの間に隔離及び置換されうる。
【０１８２】
幾つかの実施形態（例えば、図３２に示される）では、フレーム４５６０は、図示されるようにメッシュ４５７０に連結しうる。フレーム４５６０は、メッシュ４５７０をウェルの第１のウェル４５１５上の適所に維持するように構成されうる。幾つかの実施形態では、メッシュ４５７０は、装置４１００の側壁４１２０の上部エッジ上に配置されるように構成されうる。フレーム４５６０は、締まり嵌め、スナップ嵌め、又はメッシュをプレート４１１０の主面上に保持するための任意の他の適切な機構を介して、１つ以上の側壁４１２０を係合することができる。幾つかの実施形態では、ユーザは、メッシュがウェル４１１５上のプレート４１１０の主面に保持されるように、フレーム４５６０を適所に手動で保持することができる。
【０１８３】
流体透過性のメッシュ４５７０は、任意の適切な材料から形成されうる。幾つかの実施形態では、流体透過性のメッシュは、細孔を画成する。細孔は、任意の適切な寸法のものでありうる。幾つかの実施形態では、細孔は、１０マイクロメートル〜１００マイクロメートルの範囲の平均細孔寸法を画成する。幾つかの実施形態では、細孔は、４０マイクロメートル以下の平均細孔寸法を画成する。好ましくは、メッシュの細孔は、スフェロイドがメッシュを通り抜けるのを防ぐのに十分に小さい寸法のものである。
【０１８４】
幾つかの実施形態では、メッシュは、本開示と矛盾しない限り、その全体がここに参照することによって取り込まれる、例えば、本発明の譲受人に譲渡された米国仮特許出願第６２／０７２０９４号明細書に記載されている。
【０１８５】
幾つかの実施形態では、細胞培養培地を手動で置換する代わりに、本明細書に記載のリザーバプレートは、細胞培養培地をウェルの主面上のリザーバを越えて流すことができる、灌流装置として製作されうる。
【０１８６】
例えば及び図３３を参照すると、図３１に記載され、かつ図３１に関して論じられる細胞培養装置４１００は、１つ以上の側壁が入口４１４０を形成し、かつ、１つ以上の側壁が出口４１４５を形成するように、適合されうる。細胞培養流体は、入口から出口までリザーバ全体に灌流されうる。図３３に示される装置の形状因子は、開放された上部の形状因子であってよく、あるいは、閉じられた上部であってもよい。形状因子が開放された上部である場合、図２に関して論じられたフレーム及びメッシュを含むインサートは、そうでなければ高い灌流速度がスフェロイドなどの細胞をウェルから移動させてしまうかもしれない場合に、細胞をウェル４１１５内に保持するために用いられうる。
【０１８７】
本明細書に記載される細胞培養装置は、任意の適切な方式で製造されうる。さまざまな実施形態において、細胞培養装置の製造方法は、ポリマー材料、又は本明細書に記載の任意の他の適切な材料を成形して、細胞培養装置を形成する工程を含む。ポリマー材料は、細胞培養装置の複数のウェルを画成しうる。複数のウェルの各々は、上部開口、底面、及び、上部開口から底面まで延びる側壁表面を画成しうる。側壁表面はまた、上部開口と底面との間のペン先領域も画成しうる。ポリマー材料は、ピンの周りに成形されたポリマー材料が本明細書に記載の複数のウェルの特性を有するように、ピンを有する鋳型内へと注がれうる。
【０１８８】
幾つかの実施形態では、ポリマー材料は、基材上に被覆成形されて細胞培養装置を形成する。基材は底面を画成し、ポリマー材料と基材との組合せは複数のウェルを画成する。ポリマー材料は、ピンの周りに成形されたポリマー材料が本明細書に記載の複数のウェルの特性を有するように、ピンを有する鋳型内へと注がれうる。
【０１８９】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載の細胞培養装置がどのように製造されるかにかかわらず、複数のウェルの各々の側壁表面は、本明細書にさらに記載される細胞非接着性の材料でコーティングされうる。
【０１９０】
幾つかの実施形態では、ウェルは、側壁の一部又は側壁に付け加えられた、さまざまな特徴を含む。このような基材の特徴は、直接射出成形されてもよく、あるいは、それらは、形成された基材上に型押しされてもよい。特徴の材料は、任意のポリマー、ポリマーブレンド、共重合体、ガラス、金属、若しくは、本明細書に記載の又は当技術分野で理解されている任意の他の材料でありうる。
【０１９１】
本明細書に記載の装置、ウェル、側壁、ウェル底部、及び他の特徴は、任意の適切な材料で形成される。好ましくは、細胞又は培養培地との接触が意図される材料は、細胞及び培地と相容性である。典型的には、細胞培養構成要素は、ポリマー材料から形成される。適切なポリマー材料の例としては、ポリスチレン、ポリメタクリル酸メチル、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリスチレン共重合体、フッ素ポリマー、ポリエステル、ポリアミド、ポリスチレンブタジエン共重合体、完全水素化スチレンポリマー、ポリカーボネートＰＤＭＳ共重合体、並びに、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン、ポリプロピレン共重合体及び環状オレフィン共重合体などのポリオレフィンなどが挙げられる。
【０１９２】
実施形態において、ウェルの内面は細胞に対して非接着性である。ウェルは、非接着性の材料から形成されて差し支えなく、あるいは、非接着性の表面を形成するように非接着性の材料でコーティングされてもよい。例となる非接着性の材料としては、パーフルオロ化ポリマー、オレフィン、又は同様のポリマー、若しくはそれらの混合物が挙げられる。他の例としては、アガロース、ポリアクリルアミドなどの非イオン性ヒドロゲル、ポリエチレンオキシドなどのポリエーテル、及びポリビニルアルコールなどのポリオール、又は同様の材料、若しくはそれらの混合物が挙げられる。幾つかの実施形態では、例えば、非接着性のウェル、ウェルの幾何学形状、及び／又は重力のうちの２つ以上の組合せにより、ウェル内で培養された細胞がスフェロイドへと自己組織化するように誘発される。一部のスフェロイドは、単層において増殖した細胞と比較して、より大きいインビボ様応答を示す、分化された細胞機能を維持する。ウェルが細胞に対して非接着性の実施形態では、細胞は、重力によって細胞をウェルから移動可能にするように、装置を逆さまにすることによって採取されうる。
【０１９３】
幾つかの実施形態では、材料の表面改質は、所望の特性を達成するために用いられる。このような改質は、表面化学の改質を含み、機械的特性は、生物学的コーティング（例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）、コラーゲン、ラミニン等）及び合成コーティング（例えば、Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ（登録商標）、シリコーンハイドロゲル等）を使用して利用されうる。材料に対する他の表面改質（例えばウェル又は微細構造内）は、本発明の範囲内にある。
【０１９４】
本明細書に記載される構造化された表面を有する基材は、任意の適切な方式で、細胞培養チャンバ又はトレイへと組み立てられうる。例えば、細胞培養チャンバ又はトレイの構造化された表面及び１つ以上の他の構成要素は、単一のパーツとして成形されうる。幾つかの実施形態では、構造化された表面又はその一部は、底部及び１つ以上の構成要素を形成するように被覆成形され、該構造化された表面は、細胞培養装置の１つ以上の他の構成要素に、溶接（例えば、熱、レーザ、長波ＩＲ又は超音波溶接など）、接着、溶剤結合等がなされる。
【０１９５】
さまざまな実施形態において、細胞培養システムは、上述の細胞培養装置の構成要素を２つ以上備えうる。例として、装置の構成要素は、細胞培養システムを形成するように積層されうる。本明細書に記載の細胞培養装置の構成要素を取り込みうる積層された細胞培養システムの例としては、例えば、それらが本開示と矛盾しない限り、それぞれの全体がここに参照することによって本明細書に取り込まれる、（ｉ）「多層培養容器（MULTILAYER CULTURE VESSEL）」という発明の名称で２０１４年１０月２９日出願の米国仮特許出願第６２／０７２，０１５号明細書；（ｉｉ）「灌流バイオリアクタプラットフォーム（PERFUSION BIOREACTOR PLATFORM）」という発明の名称で２０１４年１０月２９日出願の米国仮特許出願第６２／０７２，０３９号明細書が挙げられる。
【０１９６】
本明細書に記載される細胞培養装置は、装置のウェル内の細胞を任意の適切な方式で培養するために用いられうる。例えば、細胞を培養するための方法は、本明細書に記載される細胞培養装置の複数のウェルの１つ以上に細胞及び細胞培養培地を導入する工程を含む。細胞培養培地は、細胞培養容積のみに、又は、細胞培養容積及び第２の容積を含む、複数のウェルの各々の全体に、含まれうる。本方法はまた、複数のウェルの１つ以上における培地内で細胞を培養する工程も含む。複数のウェルの１つ以上において細胞を培養する工程は、１つ以上のウェル内でスフェロイドを形成する工程を含みうる。１つ以上のウェル内で培養されたスフェロイドは、約、例えば、５００マイクロメートル以下、４００マイクロメートル以下、３００マイクロメートル以下、２５０マイクロメートル以下、１５０マイクロメートル以下等、又は前述の値内のいずれかの範囲の直径によって画成されうる。１つのスフェロイドの直径は、複数のウェル内で増殖したすべてのスフェロイドの平均直径とは、約、例えば、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、２％以下等又は前述の値内のいずれかの範囲で異なりうる。
【０１９７】
幾つかの実施形態では、ウェル底部は、凹状のアーチ形表面又は「カップ」の幾何学形状、例えば、半球面、丸底を有する円錐面、及び同様の表面形状、又はそれらの組合せなどを含む。ウェル（例えば、マイクロウェル）及びウェル底部は、くぼみ、凹形円錐台状の起伏表面、又はそれらの組合せなど、スフェロイドに「フレンドリー」な丸みを帯びた面又は曲面内で最終的には終結、終端、又は底付きしうる。
【０１９８】
ある特定の実施形態では、側壁の一部及び／又はウェル底部は、可視及び／又はＵＶスペクトル内の波長に対してさまざまな度合いの不透明性／透明性のものである。例えば、不透明な側壁は、透明なマイクロウェル底部と組み合わせられうる。不透明な部分から透明な部分への移行は、漸進的又は激的でありうる。
【０１９９】
幾つかの実施形態では、ウェル（例えば、マイクロウェル）は、少なくとも１つの凹状のアーチ形表面上など、ウェルの一部の上に、低接着性、非接着性、又は高接着性のコーティングを含む。
【０２００】
幾つかの実施形態では、本装置はさらに、吸引用のピペットの先端を受け入れるため、例えば、ウェル付属部（well annex）、ウェル拡張領域、又は補助サイドチャンバを備えている。幾つかの実施形態では、ウェル付属部又はウェル拡張部（例えば、サイドポケット）は、例えば、ウェル（例えば、マイクロウェル）に隣接し、かつ、流体連通した一体型表面である。幾つかの実施形態では、ウェル付属部は、ウェルのガス透過性の透明な底部から離間された底部を有する。ウェル付属部及びチャンバウェルの第２の底部は、例えば、より高い位置又は比較的高所など、ガス透過性の透明な底部から離間されている。幾つかの実施形態では、ウェル付属部の第２の底部は、スフェロイドの分裂又はかく乱を避けるために、ピペットから分配される流体を透明な底部から離すように偏向させる。
【０２０１】
ある特定の実施形態では、装置はさらに、ウェルの一部の内部に位置した、ウェル付属部の一部の内部に位置した、又はウェル及びウェル付属部分の両方の内部に位置した、ライナ又はメンブレンインサートなどの多孔膜を備えている。多孔膜は、底部近くの１つ又は両方のウェルの下部の第１の細胞材料から、ウェルの上部に位置した、多孔膜によって形成されたウェルの上部に位置した、又は両方のウェルの上部に位置した、異なる細胞型又は異なる細胞状態などの第２の細胞材料の単離又は分離を提供しうる。
【０２０２】
装置及びウェルの幾何学形状は、当技術分野で知られた任意の適切な技法によって製造される。幾つかの実施形態では、熱エンボス加工、熱変形、及び／又は射出成形法が、細胞培養と相容性のプラスチックにおけるマイクロパターン化された表面の生成に使用される。図１２は、本明細書において使用される熱エンボス／熱成形の製造プロセスの図式を示している。幾つかの実施形態では、特定の厚さのポリスチレンフィルム（又は別の適切なポリマーフィルム）が耐熱性のシリコーン支持体上に配置される。次に、鋳型が下向きのマイクロポストを有するフィルム上に配置される。組立体全体が、１３０℃で１０分間、予備加熱したプレートの間で、５Ｎの荷重下で押圧される。１０分後、プレートが１００℃未満に冷却されて、マイクロパターン化され、型押し／熱成形されたフィルムが組立体から取り外され、３Ｄ凝集促進表面として標準的な（regular）細胞培養容器内に取り込まれる。他の温度、時間、圧力、及び材料は、本発明の範囲内でありうる。
【０２０３】
細胞付着を防ぐために、幾つかの実施形態では、マイクロパターン化された表面は、ｐｏｌｙ−ＨＥＭＡ、プルロニック（Pluronic）、又は商標名ＵＬＡ（超低接着表面）処理など、細胞付着を抑制するポリマーを用いて処理される。初期のポリマーフィルムの厚さ及び処理パラメータに応じて、異なる底部厚さを有するマイクロウェルを有する表面が生成される。幾つかの実施形態では、マイクロウェル底部のポリマーの厚さは、酸素透過性に直接的影響を有する。より薄いマイクロウェル底部は、マイクロウェル内部に位置する細胞へのより良好な酸素供給を可能にする。上記作製方法は、高度に酸素透過性のマイクロウェルを有する表面をもたらす。
【０２０４】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載の装置及びシステムは、このような装置におけるさまざまなコンパートメント、ウェル等の内外への流体（例えば、培地）及び細胞（例えば、スフェロイド）の移動のためのマイクロ流体要素を備えている。マイクロ流体要素としては、チャネル、リザーバ、弁、ポンプ等が挙げられうる。
【０２０５】
インビトロ３Ｄ腫瘍細胞培養は、単純な二次元細胞単層よりも正確な複合インビボ微小環境を反映する。幾つかの実施形態では、本明細書に記載のマイクロウェルパターン化表面を有する細胞培養フォーマットは、日常的なハイスループットの薬物開発及び前臨床研究と相容性の均一寸法の３Ｄ培養物（例えば、腫瘍スフェロイド）の大量の生成をもたらす。
【０２０６】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載の培養容器は、均一かつ容易な大規模の凝集体形成を可能にする、誘発された多能性幹（ｉＰＳ）細胞及び胚性幹細胞（ＥＳＣ）からの胚様体（ＥＢ）の形成に用いられる。幾つかの実施形態では、培地交換は、ＥＢが連続的に数週間、増殖するように行われる。幾つかの実施形態では、寸法は、播種された細胞の数及び培養時間に応じて決まることから、各凝集体の寸法は制御される。幾つかの実施形態では、凝集体は、より大きい培地容積又はスフェロイドの解析が可能な従来のウェルプレートへと移される。幾つかの実施形態では、多数形成されたＥＢは、単一のプレート内でのトランスフェクトされた標的又は小分子のハイスループット解析に由来する統計的に重要なデータを提供する。１つの培養容器内での多数の３Ｄ細胞凝集体の形成を支援する能力は、例えば改変されたペトリ皿などのこれらの容器を、細胞の再プログラミングのためのＥＢ形成クローンの選択に適用可能にする。幾つかの実施形態では、本明細書に記載の容器はまた、肝細胞及び胚性幹細胞など、毒性に関連するさまざまな細胞型の３Ｄ細胞凝集体の形成を支援する。幾つかの実施形態では、マイクロウェル表面の容器は、例えば、生体処理工学の分野におけるタンパク質生成の目的で、３Ｄ凝集体の細胞培養に用いられる。幾つかの実施形態では、本明細書に記載のマイクロウェルパターン化された表面を有する細胞培養フォーマットは、幹細胞ニッチ共培養、特に、クローン培養の単一の幹細胞とニッチの共培養を可能にする手段を提供する。幹細胞表面マーカー又は幹細胞分化マーカーについての確立された染色プロトコル、並びに画像処理と組み合わせて、単一の幹細胞とニッチの共培養のコンピュータによる同定が行われうる。
【０２０７】
マイクロパターン化された容器はまた、３Ｄフォーマットで細胞を保存するための細胞の保管目的でも用いられる。幾つかの実施形態では、スフェロイドがひとたび特定の寸法まで増殖されると（典型的には、安定状態以前の過渡的状態において）、それらはマイクロウェルから移され、回収されたスフェロイドは冷凍保存され、後日使用するために保管される。過渡的スフェロイドとは、スフェロイドの寸法が連続的に成長可能であることを意味し、一方、安定なスフェロイドとは、スフェロイドが、その固有の寸法の許容限界に達した時点で、寸法の成長を停止することを意味する。さまざまな凍結保存方法が本発明の範囲内にあり、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）等が挙げられるがこれらに限られない。
【実施例】
【０２０８】
実施例１：基材の製造
実施形態に従った基材を、図１２に示されるエンボス加工法を使用して製造した。図１２は、ポリマーフィルムにおけるマイクロウェル形成の熱エンボス／熱成形法を示している。ホットプレート１を提供する。ホットプレートを１３０℃まで予備加熱した。所望のウェルプロファイルを反映する、エンボス加工の鋳型２を提供した。ポリマーフィルム３の層を提供し、シリコーンマット４をポリマーフィルムの後ろに提供した。ホットプレートを加熱し、シリコーン層で支えられたポリマーフィルムに対して押圧した。ホットプレートを取り外したときに、その内部で型押しされた所望のウェルプロファイルを有するマイクロウェルのアレイを有するポリマーフィルムを得た。
【０２０９】
実施例２：細胞培養
本明細書に記載の実施形態の開発中に行われた実験は、例えば、３Ｄ細胞凝集体の所望の直径の約１〜３倍の直径（Ｄ）を有する、各々が半球形の円形底部及び丸みを帯びた上部を有する、個別の空間的に離間されたマイクロウェルのアレイにおいて、均一な直径の３Ｄ細胞培養凝集体が形成及び培養されることを実証するものである。マイクロウェル高さ（Ｈ）は、円形の底部部分の直径の約０．７〜１．３倍に等しく、マイクロウェルの上部開口部の直径（Ｄ上部）は、円形の底部の直径の約１．５〜２．５倍に等しい。
【０２１０】
マイクロウェルパターン化された表面を有するＴ２５細胞培養フラスコのプロトタイプを製造し、提示された設計のスフェロイド形成の一様性、及び、保持／採取の利益について検証するために、細胞培養用途において試験される、実験を行った。図８は、円形の底部幾何学形状を有するＴ２５プロトタイプのマイクロウェル断面の逆複製（reverse replica）の画像を含む。プロトタイプのＴ２５フラスコ内でＨＴ２９細胞によって形成されたスフェロイドの画像が図１０Ａに示されている。図１０Ｂは、フラスコから採取されたスフェロイドを示しており、これは、図１１に示される、Ｎｕｎｃ  Ｎｕｎｃ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社から市販される、市販のＮＵＮＣＬＯＮ  ＳＰＨＥＲＡ（商標）低結合表面フラスコを用いて増殖させたものと比較可能であり、低結合表面を有するがスフェロイドの生成を画成及び制御するためのウェルを有しない市販の対照と比較して、本明細書に記載のウェルの優れた性能が、実施形態において生成されたスフェロイドの均一性に表れている。円形の底部幾何学形状は、スフェロイドを誘発する幾何学形状である。本明細書の実施形態の開発中に、細胞培養性能におけるマイクロウェルの酸素透過性の影響を実証するための実験を行った。上記実施例１に記載されるように、異なる厚さのマイクロウェルを有する、６ウェル及び１２ウェルプレートを製造した。図１３は、異なる底部厚さを有するマイクロウェルにおける、マイクロウェルのアレイを備えた基材（実施例１に記載される）を有する６ウェルプレートで細胞を増殖させた後に測定した生細胞カウント数を実証するグラフを示している。図１３に示されるように、Ａは７０μｍの厚さであり、Ｂは１２０μｍの厚さであり、Ｃは３２０μｍである。対照は、ＴＣＴ処理された１ｍｍ厚の平坦なポリスチレンであった。図１３に示される結果から分かるように、より薄い材料（よりガス透過性を示す）は、実施形態において、より力強い細胞増殖を支援した。
【０２１１】
図１３は、異なる底部厚さを有するマイクロウェルにおける、マイクロウェルのアレイを備えた基材（実施例１に記載される）を有する６ウェルプレート内で細胞を増殖させた後に測定した生細胞カウント数を実証するグラフを示している。図１４Ａ及びＢは、平坦な表面に対し、マイクロウェルのアレイを有する基材についての生細胞カウント数及び細胞増殖率を比較するグラフを示している。図１５は、平坦な表面に対し、マイクロウェルのアレイを有する基材上で培養されたＭＨ６７７細胞から排出されたタンパク質の全力価を示すグラフを示している。
【０２１２】
ＭＨ６７７細胞の培養を、２日ごとに培地交換しつつ、７日間又は９日間の間、行った。図１３に提示される結果は、マイクロウェル底部の厚さに対する全生細胞カウント数の依存を実証している。酸素透過性のマイクロウェル（カラムＡ、７０μｍ厚の底部）内で培養された細胞は、より低酸素透過性のカラムＣの３２０μｍ厚の底部と比較して８２％高い生細胞カウント数を得た。全体的に、マイクロウェルパターン化された表面での培養は、標準的な平坦な非接着性の表面と比較して、より高い生細胞カウント数（図１４Ａ）及び、１細胞当たりのより高い増殖率（図１４Ｂ）を生じる（図１４）。これは、８５％高いタンパク質収率を生じる（図１５）。
【０２１３】
本明細書の実施形態の開発中に、本明細書に記載の細胞培養装置及びウェルを使用して、２Ｄ培養に対し３Ｄ培養での細胞の有利な増殖を実証するために、実験を行った。ＣＨＯ５／９アルファ細胞（図３４Ａ）及びＢＨＫ−２１細胞（図３４Ｂ）の両方において、２Ｄと比較した場合に、３Ｄ培養では１ｃｍ２あたり、はるかに多いタンパク質（図３４Ａのｈｍ−ＣＳＦ；図３４ＢのＥＰＯ）を生成した。
【０２１４】
本明細書で言及した及び／又は以下に列挙するすべての刊行物及び特許文献は、参照することによって本明細書に取り込まれる。本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、本明細書に記載される特徴及び実施形態のさまざまな改質、組み換え、及びバリエーションは、当業者にとって明白であろう。特定の実施形態について記載してきたが、特許請求の範囲に記載される発明は、このような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないと解されたい。実際、当業者にとって自明な、記載されるモード及び実施形態のさまざまな修正は、以下の特許請求の範囲内にあることが意図されている。
【０２１５】
以下、本発明の好ましい実施形態を項分け記載する。
【０２１６】
実施形態１
少なくとも１つの毛管構造と、スフェロイドを誘発する幾何学形状とを含むマイクロウェルのアレイを有する細胞培養基材。
【０２１７】
実施形態２
前記少なくとも１つの毛管構造が、リッジ、割れ目、ピラー、不連続な壁、波形状の壁、口部、放物面又は正弦波のウェル形状、若しくは組合せからなる群より選択されることを特徴とする、実施形態１に記載の細胞培養基材。
【０２１８】
実施形態３
前記リッジが、円形状、角形状、針状、又は六角形の形状であることを特徴とする、実施形態２に記載の細胞培養基材。
【０２１９】
実施形態４
前記割れ目が、円形状、角形状、針状、又は六角形の形状であることを特徴とする、実施形態２に記載の細胞培養基材。
【０２２０】
実施形態５
前記スフェロイドを誘発する幾何学形状が、ピラー、不連続な壁、波形状の壁、丸みを帯びたセル底部、くぼみのあるウェル底部、凹み、ペン先領域、不連続な壁、又は組合せを含むことを特徴とする、実施形態１〜４のいずれかに記載の細胞培養基材。
【０２２１】
実施形態６
前記基材が、前記細胞培養基材の表面１平方センチメートル当たり、前記マイクロウェルを２〜１００００個含むことを特徴とする、実施形態１〜５のいずれかに記載の細胞培養基材。
【０２２２】
実施形態７
前記マイクロウェルの少なくとも前記底部が、非接着性の表面を含むことを特徴とする、実施形態１〜６のいずれかに記載の細胞培養基材。
【０２２３】
実施形態８
前記マイクロウェルの少なくとも前記底部が、ガス透過性材料を含むことを特徴とする、実施形態１〜７のいずれかに記載の細胞培養基材。
【０２２４】
実施形態９
前記基材が、前記細胞培養基材の表面１平方センチメートル当たり、前記マイクロウェルを２〜１００００個含むことを特徴とする、実施形態１〜８のいずれかに記載の細胞培養基材。
【０２２５】
実施形態１０
前記細胞培養基材が、細胞培養容器の少なくとも一部を含むことを特徴とする、実施形態１〜９のいずれかに記載の細胞培養基材。
【０２２６】
実施形態１１
前記細胞培養容器が、マルチウェルプレート、皿、フラスコ、管、多層フラスコ、側部軟質性のフラスコ及びバッグからなる群より選択されることを特徴とする、実施形態１０に記載の細胞培養基材。
【０２２７】
実施形態１２
前記細胞培養容器が、透過性の膜によって互いに分離された少なくとも２つの細胞培養チャンバを備えていることを特徴とする、実施形態１０に記載の細胞培養基材。
【０２２８】
実施形態１３
前記マイクロウェルが、該マイクロウェルの少なくとも１つと単一の液体貯槽との間の流体連通を可能にするように構成されることを特徴とする、実施形態１〜１２のいずれかに記載の細胞培養基材。
【０２２９】
実施形態１４
前記細胞培養容器が、前記マイクロウェルの上部に配置されたメッシュを備えていることを特徴とする、実施形態１〜１０のいずれかに記載の細胞培養基材。
【０２３０】
実施形態１５
各マイクロウェルが、上部開口、ウェル底部、及び、１つ以上の側壁を備えており、
前記上部開口が有効直径Ｄ上部を有し、前記１つ以上の側壁が前記ウェル底部から前記上部開口まで延びる高さＨを有し、前記マイクロウェルが前記上部開口とウェル底部との間の有効直径の中間点Ｄ中間を有し、Ｄ上部：Ｄ中間の比が１．５：２．５である
ことを特徴とする、実施形態１〜１４のいずれかに記載の細胞培養基材。
【０２３１】
実施形態１６
Ｄ上部＝１．５〜２．５Ｄ中間であることを特徴とする、実施形態１５に記載の細胞培養基材。
【０２３２】
実施形態１７
Ｈ＝０．７〜１．３Ｄ中間であることを特徴とする、実施形態１５に記載の細胞培養基材。
【０２３３】
実施形態１８
Ｄ中間が２００〜１０００μｍであることを特徴とする、実施形態１５に記載の細胞培養基材。
【０２３４】
実施形態１９
実施形態１０〜１２のいずれかに記載の細胞培養容器に培養培地を充填する工程；及び、
スフェロイド形成細胞を前記培養培地に加える工程
を含む、スフェロイドを培養する方法。
【０２３５】
実施形態２０
前記培養培地を置換又は交換する工程をさらに含むことを特徴とする、実施形態１９に記載の方法。
【参照文献】
【０２３６】
1.  H. Dolznig, A. Walzl, Organotypic spheroid cultures to study tumor- stroma interactions during cancer development. Drug discovery today, V 8., No 2-3, 2011, 113-118
2.  J. Engelberg, G. Ropella, Essential operating principles for tumor spheroid grwth. BMC Systems Biology 2008, 2, 110
3.  Y. Tung, A. Hsiao, S. Alen. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using 384 hanging drop array. Analyst, 2011, 136, 473-478
4.  J. Friedrich, C. Seidel, R. Ebner. Spheroid ■based drug screen: considerations and practical approach. Nature protocols, 2009, vol4 no3, 309-323
5.  F. Hirschhaeuser, H. Menne, C. Dittfeld, Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology, 2010, 148, 3-15
6.  T. Bartosh, J. Ylostalo, A. Mohammadipoor. Aggregation of human mesenchymal stromal cells into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. PNAS,2010, 107, no 31, 13724-13729
7.  J. Frith, M. Res, B. Thomson. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue engineering, 2010, 16, no 4, 735-749
8.  S. Sart, A.Tsai, Y. Li. Three-dimensional aggregates of mesenchymal stem cells: cellular mechanisms, biological properties and applications. Tissue engineering, 2013, Part B, 00, no 00, 1-16
【符号の説明】
【０２３７】
１００  ウェルのアレイ
１１０  口部
１１１  上部開口部／口部の上部
１１２  口部の底部
１１３  側壁
１１５  ウェル
１１６  ウェルの底部
１７０  リッジ
２７０  割れ目
４０１  マイクロウェル
４０２  フレーム
４０３  側壁
５００  スフェロイド
５０１  ピラー
５０５  空間
５１０  上部
５１５  ウェル
８００  フラスコ
８１５  上面
８２０  側壁
８５０  細胞培養チャンバ
８６０  ポート
８６１  ねじぶた
１１１０  基材
１１１４  基材
１３００  細胞培養培地
１４００  細胞培養装置
１４１０Ａ〜Ｃ  細胞培養コンパートメント
１４１５  トレイ
１４２０  通気マニホルド
１４２２  キャップ
１４２５  開口部
１４２６  開口部
１４２７  フィルタ
１４２９  通気カラム
１４３０  充填マニホルド
１４３２  キャップ
１４３５  開口部
１４３９  列
１４４０  側壁
１４４１  上部空間
１４４２  通気開口
１４４３  充填開口
１４５０  上部内面／上面
１４６０Ａ〜Ｃ  通路／導管空間
１５００  スペーサ
１５１０  プレート
１６０１  六角形のウェル
２１００  細胞培養装置
２１１０  基材
２１１５  ウェル
２１２０  側壁
２１５２  培養チャンバ
２１５４  第２のチャンバ
２１６２  第１のポート
２１６４  第２のポート
２２０２  スフェロイド細胞
３１００  細胞培養装置
３１１０  基材
３１１１  プレート
３１１３  フレーム
３１１５  ウェル
３１１６  ペン先領域
３１１８  上部開口
３１２０  側壁表面
３１２１  変曲点
３１２２  下部側壁表面
３１２３  点
３１２４  上部側壁表面
３１３０  スフェロイド
３１４０  細胞培養容積
３１４２  高さ
３１４４  直径寸法
３１４５  第２の容積
３１５０  基材
３６００  細胞培養組立体
３６１０  底部プレート
３６１１  主面
３６１５  マイクロウェル／ウェル
３６２０  側壁
３６５０  細胞培養装置
３６７０  メッシュ
４１００  細胞培養装置
４１１０  底部プレート
４１１５  マイクロウェル／ウェル
４１２０  側壁
４１４０  入口
４１４５  出口
４２００  細胞培養組立体
４５６０  フレーム
４５７０  メッシュ
【図１Ａ】
2017532974.tif 000003
【図１Ｂ】
2017532974.tif 000004
【図２Ａ】
2017532974.tif 000005
【図２Ｂ】
2017532974.tif 000006
【図３Ａ】
2017532974.tif 000007
【図３Ｂ】
2017532974.tif 000008
【図３Ｃ】
2017532974.tif 000009
【図３Ｄ】
2017532974.tif 000010
【図４Ａ】
2017532974.tif 000011
【図４Ｂ】
2017532974.tif 000012
【図４Ｃ】
2017532974.tif 000013
【図４Ｄ】
2017532974.tif 000014
【図５Ａ】
2017532974.tif 000015
【図５Ｂ】
2017532974.tif 000016
【図５Ｃ】
2017532974.tif 000017
【図５Ｄ】
2017532974.tif 000018
【図５Ｅ】
2017532974.tif 000019
【図６Ａ）】
2017532974.tif 000020
【図６Ｂ）】
2017532974.tif 000021
【図６Ｃ）】
2017532974.tif 000022
【図６Ｄ）】
2017532974.tif 000023
【図６Ｅ）】
2017532974.tif 000024
【図７Ａ）】
2017532974.tif 000025
【図７Ｂ）】
2017532974.tif 000026
【図７Ｃ）】
2017532974.tif 000027
【図７Ｄ）】
2017532974.tif 000028
【図７Ｅ）】
2017532974.tif 000029
【図８】
2017532974.tif 000030
【図９】
2017532974.tif 000031
【図１０Ａ】
2017532974.tif 000032
【図１０Ｂ】
2017532974.tif 000033
【図１１Ａ】
2017532974.tif 000034
【図１１Ｂ】
2017532974.tif 000035
【図１２】
2017532974.tif 000036
【図１３】
2017532974.tif 000037
【図１４Ａ】
2017532974.tif 000038
【図１４Ｂ】
2017532974.tif 000039
【図１５】
2017532974.tif 000040
【図１６】
2017532974.tif 000041
【図１７】
2017532974.tif 000042
【図１８】
2017532974.tif 000043
【図１９】
2017532974.tif 000044
【図２０】
2017532974.tif 000045
【図２１】
2017532974.tif 000046
【図２２】
2017532974.tif 000047
【図２３】
2017532974.tif 000048
【図２４Ａ】
2017532974.tif 000049
【図２４Ｂ】
2017532974.tif 000050
【図２５】
2017532974.tif 000051
【図２６】
2017532974.tif 000052
【図２７】
2017532974.tif 000053
【図２８】
2017532974.tif 000054
【図２９】
2017532974.tif 000055
【図３０】
2017532974.tif 000056
【図３１】
2017532974.tif 000057
【図３２】
2017532974.tif 000058
【図３３】
2017532974.tif 000059
【図３４Ａ】
2017532974.tif 000060
【図３４Ｂ】
2017532974.tif 000061
【国際調査報告】
2017532974.tif 000062
2017532974.tif 000063
2017532974.tif 000064