(57)【要約】  パルス光エネルギービームのソースと、ビームとサンプル中の粒子との相互作用から生じる光信号（例えば、蛍光信号）を検出し、光信号を各電気信号に変換する多数のスペクトル検出チャネルを備えたディテクタと、ソースからサンプルへ及びサンプルからディテクタへの光路と、光路、粒子懸濁物のための流路に接続されたフローセルと、電気信号をディテクタから受け取り、信号の個々の減衰曲線を減衰スーパーカーブに数学的に結合し、スーパーカーブの個々の成分を既定の時定数の異なるビンに割り当て、個々の成分のスーパーカーブへの相対的コントリビューションを定量化できる信号処理モジュールと、粒子選別アクチュエータと、アクチュエータドライバと少なくとも１つの粒子回収容器とを備えた粒子アナライザ。【選択図】  図５
2017535764.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
パルス光エネルギービームのソースと、
サンプルを前記ビームに曝露するように構成されたサンプルホルダと、
多数のスペクトル検出チャネルを備えたディテクタと、
前記ビームソースから前記サンプルまでの第１光路と、
前記サンプルから前記ディテクタまでの第２光路と、
信号処理モジュールとを備え、
前記スペクトル検出チャネルは電磁スペクトルの異なる波長セクションに感受性があり且つ前記ビームと前記サンプルとの相互作用から生じる光信号を検出するように構成され、さらに前記光信号を各電気信号に変換するように構成され、
前記信号処理モジュールは、
前記ディテクタから前記電気信号を受け取り、
前記電気信号の個々の減衰曲線を減衰スーパーカーブへと数学的に結合し、ここで前記スーパーカーブは多数の成分を含み、各成分は時定数及び前記スーパーカーブへの相対的コントリビューションを有し、
時定数を前記スーパーカーブから抽出し、
前記スーパーカーブへの個々の成分の相対的コントリビューションを定量化可能である、
光信号の減衰を分析するための装置。
【請求項２】
前記パルス光エネルギービームのソースが内部変調レーザである、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記信号処理モジュールが、ＦＰＧＡ、ＤＳＰチップ、ＡＳＩＣ、ＣＰＵ、マイクロプロセッサ、マイクロコントローラ、シングルボードコンピュータ、スタンドアロンコンピュータ及びクラウドベースのプロセッサの１つを含む、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記光信号が蛍光信号を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項５】
前記サンプルが粒子懸濁物を含み、
さらに
前記粒子懸濁物のための流路と、
前記光信号を前記パルス光エネルギービームと前記粒子との相互作用から生成するための光励起チャンバとして構成されたフローセルを備え、
前記フローセルが前記流路、前記第１光路及び前記第２光路に接続されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項６】
フローサイトメータを備える、請求項５に記載の装置。
【請求項７】
前記流路に接続された粒子選別アクチュエータと、
アクチュエーション信号を前記信号処理モジュールから受け取るように構成された、前記アクチュエータに接続されたアクチュエータドライバと、
前記流路に接続された少なくとも１つの粒子回収容器をさらに備える、請求項６に記載の装置。
【請求項８】
前記粒子選別アクチュエータが前記流路における少なくとも１回の流れの進路変更をベースとする、請求項７に記載の装置。
【請求項９】
前記粒子選別アクチュエータが、一時的な気泡、加圧式チャンバ、加圧式／減圧式チャンバ対及び圧力変換器の１つをベースする、請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
パルス光エネルギービームのソースと、
サンプルを前記ビームに曝露するように構成されたサンプルホルダと、
多数のスペクトル検出チャネルを備えたディテクタと、
前記ビームソースから前記サンプルまでの第１光路と、
前記サンプルから前記ディテクタまでの第２光路と、
信号処理モジュールとを備え、
前記スペクトル検出チャネルは、電磁スペクトルの異なる波長セクションに感受性があり且つ前記ビームと前記サンプルとの相互作用から生じる光信号を検出するように構成され、さらに前記光信号を各電気信号に変換するように構成され、
前記信号処理モジュールは、
前記ディテクタから前記電気信号を受け取り、
前記電気信号の個々の減衰曲線を減衰スーパーカーブへと数学的に結合し、ここで前記スーパーカーブは多数の成分を含み、各成分は時定数及び前記スーパーカーブへの相対的コントリビューションを有し、
前記スーパーカーブの個々の成分を既定の時定数の異なるビンに割り当て、
個々の成分の前記スーパーカーブへの相対的コントリビューションを定量化可能である、
光信号の減衰を分析するための装置。
【請求項１１】
前記パルス光エネルギービームのソースが内部変調レーザである、請求項１０に記載の装置。
【請求項１２】
前記信号処理モジュールが、ＦＰＧＡ、ＤＳＰチップ、ＡＳＩＣ、ＣＰＵ、マイクロプロセッサ、マイクロコントローラ、シングルボードコンピュータ、スタンドアロンコンピュータ及びクラウドベースのプロセッサの１つを含む、請求項１０に記載の装置。
【請求項１３】
前記光信号が蛍光信号を含む、請求項１０に記載の装置。
【請求項１４】
前記サンプルが粒子懸濁物を含み、
さらに
粒子懸濁物のための流路と、
前記光信号を前記パルス光エネルギービームと前記粒子との相互作用から生成するための光励起チャンバとして構成されたフローセルを備え、
前記フローセルが前記流路、前記第１光路及び前記第２光路に接続されている、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１５】
フローサイトメータを備える、請求項１４に記載の装置。
【請求項１６】
前記流路に接続された粒子選別アクチュエータと、
アクチュエーション信号を前記信号処理モジュールから受け取るように構成された、前記アクチュエータに接続されたアクチュエータドライバと、
前記流路に接続された少なくとも１つの粒子回収容器をさらに備える、請求項１５に記載の装置。
【請求項１７】
前記粒子選別アクチュエータが前記流路における少なくとも１回の流れの進路変更をベースとする、請求項１６に記載の装置。
【請求項１８】
前記粒子選別アクチュエータが、一時的な気泡、加圧式チャンバ、加圧式／減圧式チャンバ対及び圧力変換器の１つをベースする、請求項１７に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１４年１０月９日に出願の「Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｒｔｉｎｇ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄ」と題された米国仮特許出願第６２／０６２１３３号の優先権を主張する２０１５年１０月８日に出願の「Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｓｏｒｔｉｎｇ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」と題された米国特許出願第１４／８７９０７９号の優先権を主張するものであり、これらの文献は共に参照により本願に援用される。
【０００２】
本発明は粒子分析及び粒子選別の分野に関する。特に、本発明の実施形態は、フローサイトメトリ及び細胞選別における高度多重化が可能である。
【背景技術】
【０００３】
細胞分析及び選別は高度に洗練され、生命科学研究及び医療診断で等しく広く用いられるようになった。テクノロジーとしてのその成功はまさに瞠目すべきものであるが、応用という観点からすると多大なニーズに応えるための課題は多く残されている。
【０００４】
依然としてニーズが満たされていない領域が多重化のそれである。多重化とは、細胞、ビーズ又は他の粒子を複数種の生化学的又は生物物理学的「タグ」で同時に標識し、これらのタグを独自に検出することで各分析でより多くの情報を得ることである。顕微鏡検査法及びフローサイトメトリで最も一般的に使用されるタグは蛍光分子すなわちフルオロフォアである。フルオロフォアは天然のフルオロフォアになり得る。フルオロフォアは添加試薬になり得る。フルオロフォアは遺伝子操作で発現する蛍光タンパク質［例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等］になり得る。フルオロフォアは化学反応又は生化学的反応等の副産物になり得る。フルオロフォアは、特定の細胞内構造、例えばＤＮＡ又はＲＮＡに対するその生得の親和性に応じてそのままで使用し得る。あるいは、コンジュゲーションと称されるプロセスにおいて、抗体として知られる特異性が高い生化学的実体に結合させ得る。特定の抗体はマッチする抗原に多くの場合細胞の表面で結合するため、その抗体にコンジュゲートさせたフルオロフォアはその細胞にとっての「タグ」となる。次に、このフルオロフォア（ひいてはフルオロフォアをコンジュゲートさせた抗体を特異的に結合させようとする抗原）の存在又は不在を、光学的手段によるサンプル中の細胞の励起及びフルオロフォアからの蛍光発光の検出（存在するならば）により証明することができる。特定の範囲の光スペクトル又はバンドでの蛍光発光を当該分野では「色」と称することもあるため、多重分析を行う能力を、検出に同時に用いることができる色の数でランク付けする場合がある。
【０００５】
複数の異なるタグ（及び関連した色の検出）を同時に使用することで、１つのタグの使用で可能なものよりはるかに詳しく各細胞をキャラクタライズすることができる。特に免疫学において、細胞は表面抗原の発現に基づいて分類される。多種多様な細胞上の多数の異なる表面抗原を同定しようと豊かな細胞型分類法が編み出された。このため、分析下の細胞の精確な型を独自に同定するためには、細胞表面上の特定のタイプの抗原の存在を同定するように各自特異的にデザインした多数の異なる抗体コンジュゲートタグを同時に扱う細胞分析プロトコルを行う必要があることが多い。
【０００６】
先行技術のフローサイトメトリでは、最高２０種以上の異なる蛍光タグで細胞を同時に標識し、そのそれぞれの色を検出する方法が考案された。一般に、市販の機器では１５色以下、最も一般的には約１０色未満の同時検出に限られる。高度多重分析（約１２を超える異なる色を同時に検出することをそう呼ぶことがある）をルーチンで行うにあたっての主な課題の１つは、それぞれの色（及びその関連するタグ）を残り全てとは分けて検出し続けることが技術的に困難なことである。図１に、先行技術における蛍光の多重測定の難点の１つの重要な側面を示す。この図１のグラフは、波長（λ）の関数としての強度（Ｉ）の様々な蛍光発光曲線（細い実線）を示し、全ての曲線はそれぞれのピーク強度に正規化されている。蛍光検出の応用例においては、電磁スペクトルの幾つかの異なる色又はスペクトルバンドを用い、各バンドを異なるフルオロフォアに帰属させることが極めて一般的に望ましい。異なるフルオロフォアは、その平均発光スペクトルに基づいて、特定の範囲の電磁スペクトルを比較的密にカバーし、それによって１回の実験又は分析「ラン」で抽出できる情報量を最大化できるように選択できる。しかしながら、スペクトル範囲を最大化しようとすると、一般的な望ましくない結果の１つはスペクトルのオーバーラップである。図１の影をつけた部分は、隣り合う蛍光スペクトル間でのスペクトルオーバーラップにより引き起こされる問題を示す。この特定の実例においては、５つの蛍光「バンド」又は色（異なる波長でピークを示す５つの発光曲線）は特定の所望の範囲の電磁スペクトル、例えば波長約４００〜約７５０ｎｍのスペクトルの可視部分にまたがる。影を付けた部分は、信号がオーバーラップ領域に隣接している２つのバンドの一方から来るのかもう一方から来るのかをスペクトル手段だけで判断するのは不可能なスペクトル部である。したがって、通常、オーバーラップが著しいスペクトル部分は切り捨てられ、スペクトルを十分に利用できない。加えて、そのような部分を除外したあとであっても残留オーバーラップが残りの部分に残り、他のバンドからの信号で１つのバンドが汚染される。そのような汚染による有害な作用をなくそうとする試みが「補償」にあたる。このスペクトルのオーバーラップ問題は文献及び当業者間で「クロストーク」、「スピルオーバー」、「補償問題」等として様々に記述されており、蛍光検出実験で同時に用いることができるスペクトルバンド又は色の最大数が限定される主因である。
【０００７】
したがって、スペクトルのクロストークの影響を抑えつつ又は排除しながら粒子又は細胞の高度多重化分析を行う方法を提供することが望まれる。
【０００８】
先行技術の細胞分析においては、細胞を同時に最高３０種のさらに異なるタグで標識し、それぞれの特徴を検出する方法も考案されている。例えば、当該分野においてマスサイトメトリとして知られる技法では蛍光を異なるタグを区別する手段として用いず、質量分析では、タグにフルオロフォアではなく質量スペクトルで同定可能な様々な希土類のアイソトープを組み込む。このアプローチの１つの主な欠点は、この分析プロトコルではサンプル、細胞及びタグが破壊され、質量スペクトルを生成する過程で要素が蒸発することである。したがって、このアプローチは、分析による同定に続いて細胞又は他の粒子を選択及び選別するのに適していない。
【０００９】
したがって、スペクトルのクロストークの影響を抑えつつ又は排除しながら非破壊の高度多重化分析に基づいて粒子又は細胞を選択及び選別する方法を提供することがさらに望まれる。
【発明の概要】
【００１０】
パルス光エネルギービームのソースと、
サンプルをこのビームに曝露するように構成されたサンプルホルダと、
多数のスペクトル検出チャネルを備えたディテクタと、
ビームソースからサンプルまでの第１光路と、
サンプルからディテクタまでの第２光路と、
信号処理モジュールとを備え、
スペクトル検出チャネルは電磁スペクトルの異なる波長セクションに感受性があり且つビームとサンプルとの相互作用から生じる光信号を検出するように構成され、さらに光信号を各電気信号に変換するように構成され、
信号処理モジュールは、
ディテクタから電気信号を受け取り、
電気信号の個々の減衰曲線を減衰スーパーカーブ（ｓｕｐｅｒｃｕｒｖｅ）へと数学的に結合し、ここでスーパーカーブは多数の成分を含み、各成分は時定数及びスーパーカーブへの相対的コントリビューションを有し、
時定数をスーパーカーブから抽出し、
スーパーカーブへの個々の成分の相対的コントリビューションを定量化可能である、
光信号の減衰を分析するための装置。
【００１１】
パルス光エネルギービームのソースと、
粒子懸濁物を含むサンプルをこのビームに曝露し且つ光信号をビームと粒子との相互作用から生成するための光励起チャンバとして構成されたフローセルと、
多数のスペクトル検出チャネルを備えたディテクタと、
ビームソースからサンプルまでの第１光路と、
サンプルからディテクタまでの第２光路と、
信号処理モジュールと、
フローサイトメータと、
粒子懸濁物のための流路と、
流路に接続された粒子選別アクチュエータと、
アクチュエータに接続されたアクチュエータドライバと、
流路に接続された少なくとも１つの粒子回収容器とを備え、
パルス光エネルギービームのソースは内部変調レーザであり、
スペクトル検出チャネルは電磁スペクトルの異なる波長セクションに感受性があり且つ光信号を検出するように構成され、さらに光信号を各電気信号に変換するように構成され、光信号は蛍光信号を含み、
第１光路はフローセルに接続され、
第２光路はフローセルに接続され、
信号処理モジュールはＦＰＧＡ、ＤＳＰチップ、ＡＳＩＣ、ＣＰＵ、マイクロプロセッサ、マイクロコントローラ、シングルボードコンピュータ、スタンドアロンコンピュータ及びクラウドベースのプロセッサの１つを含み、信号処理モジュールはさらに、
ディテクタから電気信号を受け取り、
電気信号の個々の減衰曲線を減衰スーパーカーブへと数学的に結合し、ここでスーパーカーブは多数の成分を含み、各成分は時定数及びスーパーカーブへの相対的コントリビューションを有し、
時定数をスーパーカーブから抽出し、
個々の成分のスーパーカーブへの相対的コントリビューションを定量化可能であり、
流路はフローセルに接続され、
粒子選別アクチュエータは流路における少なくとも１回の流れの進路変更をベースとして、さらに一時的な気泡、加圧式チャンバ、加圧式／減圧式チャンバ対及び圧力変換器の１つをベースとし、
アクチュエータドライバはアクチュエーション信号を信号処理モジュールから受け取るように構成された、
光信号の減衰を分析するための装置。
【００１２】
パルス光エネルギービームのソースと、
サンプルをビームに曝露するように構成されたサンプルホルダと、
多数のスペクトル検出チャネルを備えたディテクタと、
ビームソースからサンプルまでの第１光路と、
サンプルからディテクタまでの第２光路と、
信号処理モジュールとを備え、
スペクトル検出チャネルは、電磁スペクトルの異なる波長セクションに感受性があり且つビームとサンプルとの相互作用から生じる光信号を検出するように構成され、さらに光信号を各電気信号に変換するように構成され、
信号処理モジュールは、
ディテクタから電気信号を受け取り、
電気信号の個々の減衰曲線を減衰スーパーカーブへと数学的に結合し、ここでスーパーカーブは多数の成分を含み、各成分は時定数及びスーパーカーブへの相対的コントリビューションを有し、
スーパーカーブの個々の成分を既定の時定数の異なるビンに割り当て、
個々の成分のスーパーカーブへの相対的コントリビューションを定量化可能である、
光信号の減衰を分析するための装置。
【００１３】
パルス光エネルギービームのソースと、
粒子懸濁物を含むサンプルをこのビームに曝露し且つ光信号をビームと粒子との相互作用から生成するための光励起チャンバとして構成されたフローセルと、
多数のスペクトル検出チャネルを備えたディテクタと、
ビームソースからサンプルまでの第１光路と、
サンプルからディテクタまでの第２光路と、
信号処理モジュールと、
フローサイトメータと、
粒子懸濁物のための流路と、
流路に接続された粒子選別アクチュエータと、
アクチュエータに接続されたアクチュエータドライバと
流路に接続された少なくとも１つの粒子回収容器とを備え、
パルス光エネルギービームのソースは内部変調レーザであり、
スペクトル検出チャネルは、電磁スペクトルの異なる波長セクションに感受性があり且つ光信号を検出するように構成され、さらに光信号を各電気信号に変換するように構成され、光信号は蛍光信号を含み、
第１光路はフローセルに接続され、
第２光路はフローセルに接続され、
信号処理モジュールはＦＰＧＡ、ＤＳＰチップ、ＡＳＩＣ、ＣＰＵ、マイクロプロセッサ、マイクロコントローラ、シングルボードコンピュータ、スタンドアロンコンピュータ及びクラウドベースのプロセッサの１つを含み、信号処理モジュールはさらに、
ディテクタから電気信号を受け取り、
電気信号の個々の減衰曲線を減衰スーパーカーブへと数学的に結合し、ここでスーパーカーブは多数の成分を含み、各成分は時定数及びスーパーカーブへの相対的コントリビューションを有し、
スーパーカーブの個々の成分を既定の時定数の異なるビンに割り当て、
個々の成分のスーパーカーブへの相対的コントリビューションを定量化可能であり、
流路はフローセルに接続され、
粒子選別アクチュエータは流路における少なくとも１回の流れの進路変更をベースとして、さらに一時的な気泡、加圧式チャンバ、加圧式／減圧式チャンバ対及び圧力変換器の１つをベースとし、
アクチュエータドライバはアクチュエーション信号を信号処理モジュールから受け取るように構成された、
光信号の減衰を分析するための装置。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は先行技術の多重化アプローチにおけるスペクトルのオーバーラップ（スピルオーバー）を描いた波長図である。
【図２】図２は先行技術の単一指数関数的蛍光寿命を測定するための頻度ベースのアプローチを描いた時間−領域図である。
【図３】図３は先行技術の蛍光寿命を測定するための時間相関単一光子計数アプローチを描いた時間−領域図である。
【図４】図４(ａ）はパルス励起で生じる単一指数関数的減衰曲線を描いた線形−線形時間−領域図である。  図４(ｂ）はパルス励起で生じる単一指数関数的減衰曲線を描いた対数−線形時間−領域図である。  図４(ｃ）はパルス励起で生じる二重指数関数的減衰曲線を描いた線形−線形時間−領域図である。  図４(ｄ）はパルス励起で生じる二重指数関数的減衰曲線を描いた対数−線形時間−領域図である。
【図５】図５は一実施形態によるスペクトルバンド及び寿命ビンの両方においてデンスな多重化アプローチを描いた波長図に連結した波長−寿命図である。
【図６】図６は一実施形態によるスペクトルバンド及び寿命ビンの両方においてスパースな多重化アプローチを描いた波長図に連結した波長−寿命図である。
【図７】図７は一実施形態によるサンプル中の１つの粒子を分析するための装置のシステム構成の概略図である。
【図８】図８は一実施形態によるサンプル中の１つの粒子を分析及び選別するための装置のシステム構成の概略図である。
【図９】図９は一実施形態による１つのスペクトル検出バンドでの粒子アナライザ／ソータの集光及び検出サブシステムの概略図である。
【図１０】図１０は一実施形態による複数のスペクトル検出バンドでの粒子アナライザ／ソータの集光及び検出サブシステムの概略図である。
【図１１】一実施形態による信号処理シーケンスを描いた時間−領域図であり、（ａ）ビームを横切る流れる粒子による相互作用エンベロープ、（ｂ）励起パルス、（ｃ）有効励起パルス、（ｄ）蛍光発光パルス及び減衰曲線、（ｅ）個々のパルス信号のセグメント化、（ｆ）スーパーカーブの構築である。
【図１２】図１２（ａ）はパルス励起で得られた個々のパルス信号から構築した三重指数関数的減衰スーパーカーブを描いた対数−線形時間−領域図である。  図１２（ｂ）は連続したインデックスペア差を計算し、スーパーカーブのニー点を決定し、スーパーカーブの時定数ブランチを決定するプロセスを描いた対数−線形時間−領域図である。
【図１３】図１３（ａ）及び（ｂ）は一実施形態による選別アクチュエータを使用する粒子分析／選別方法の２つのステップ又は状態の概略平面図である。
【図１４】図１４（ａ）及び（ｂ）は一実施形態による２つの選別状態と片側作動の粒子分析／選別方法の２つのステップ又は状態の概略断面図である。
【図１５】図１５（ａ）及び（ｂ）は一実施形態による２つの選別状態及び片側作動の粒子分析／選別方法の２つのステップ又は状態の概略断面図である。
【図１６】図１６（ａ）及び（ｂ）は一実施形態による２つの選別状態及び両側作動の粒子分析／選別方法の２つのステップ又は状態の概略断面図である。
【図１７−１】図１７（ａ）〜（ｄ）は一実施形態による複数の選別チャネルを使用する５つの選別状態及び片側作動の粒子分析／選別方法の４つの状態の概略断面図である。
【図１７−２】同上。
【図１８−１】図１８（ａ）は一実施形態による寿命分析方法の実行に関わる主なオペレーションのシーケンスを描いたフロー図である。
【図１８−２】図１８（ｂ）は一実施形態による粒子分析方法の実行に関わる主なオペレーションのシーケンスを描いたフロー図である。
【図１８−３】図１８（ｃ）は一実施形態による高度多重化粒子分析方法の実行に関わる主なオペレーションのシーケンスを描いたフロー図である。
【図１９】一実施形態によるアナライザ／ソータを得るためのデータ処理システムの概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
高度多重化粒子及び細胞分析におけるスペクトルオーバーラップ問題の１つの考えられ得る解決策では、スペクトル情報に加えて、別のタイプの情報を用いて細胞の特徴を標識するのに使用するタグをインデックス又はコードする。検出及び測定可能な独立量を追加することで、細胞型を標識及び同定するのに利用可能な組み合わせの数を大幅に増やすことができる。そのため、多数の独立したスペクトルバンドを電磁スペクトルの限られた領域にフィットさせる必要性が低下するが、これは利用可能な組み合わせの総数を１つだけでなく２つの独立量に基づいて割り当てることができるからである。
【００１６】
本発明の１つの目的は、その独立量として、スペクトルの標識と組み合わせる蛍光寿命を求め、スペクトルのクロストークの影響を抑制又は排除しながら異なる細胞の特徴又は細胞型を独自にタグ付けするための高度に多重化された独立した組み合わせセットを生成することである。
【００１７】
本発明の別の目的は、蛍光寿命とスペクトル蛍光標識とを組み合わせることで、スペクトルのクロストークの影響を抑制又は排除しながら、細胞又は他の粒子の高度多重化分析だけでなく細胞又は他の粒子の選択及び選別を支援することである。
【００１８】
蛍光寿命は、量子力学的法則に支配される蛍光発光過程の１つの局面である。蛍光は、特定の波長の光エネルギー（光子）のパケットの原子又は分子による吸収とそれに続くより長い波長での光エネルギー（別の光子）のパケットの同じ原子又は分子による発光である。吸収から発光までにかかる時間の量は確率的に異なるが、単離された同一の原子又は分子の集合であると仮定すると、集合全体のそのような経過時間の頻度分布は指数関数的減衰曲線を描く。そのような曲線（１／ｅ時間）の時定数は、その原子又は分子の場合のその蛍光遷移の寿命と呼ばれる。
【００１９】
異なる分子実体は異なる蛍光遷移を示し、異なる光吸収最適波長、異なる発光ピーク波長及び異なる蛍光寿命を特徴とする。特定の分子実体は、同様のスペクトル特性（図１に概略的に示す波長の関数としての発光のプロファイル）ではあるが蛍光寿命が異なる蛍光遷移を示す。また、他の分子実体は、スペクトル特性は異なるが同様の蛍光寿命を有する蛍光遷移を示す。したがって、分子実体は、本質的に独立した量としてのスペクトル特性（スペクトル発光プロファイル）及び蛍光寿命に基づいて選択し得る。
【００２０】
粒子分析において蛍光寿命を多重化パラメータとして使用するためには、それを測定する手段を得る必要がある。図２に、先行技術における１つのアプローチで行われた蛍光寿命の測定の一態様を示す。この図２のグラフは、時間（ｔ）の関数としての光強度（Ｉ）の２つの曲線を描いたものである。このアプローチにおいては、光励起の強度（太い実線）を特定の頻度で変調させており、得られた蛍光信号（細い波線）を分析する。限定された蛍光寿命の影響が主に変調励起曲線と変調発光曲線との位相ずれに表れている。このアプローチ（いわゆる「位相感応性」又は「頻度−領域」蛍光寿命）の主な欠点は、１度に１つの蛍光寿命成分しか調べることができず、同時に２つ以上の寿命成分を測定すべきサンプル分析にはあまり適していないことである。本発明の目的はこの限界を克服することである。
【００２１】
図３は、先行技術における蛍光寿命を測定するための別のアプローチの背後にある原理を描いたものである。このアプローチは文献において時間相関単一光子計数（ＴＣＳＰＣ）と呼ばれており、特には蛍光寿命撮像用途（ＦＬＩＭ）で用いられている。この図３のグラフには、共に単位ピーク強度に正規化された時間（ｔ）の関数としての強度（Ｉ）の２つの曲線及びヒストグラムとその関連ビンが描かれている。第１曲線（太い実線）はサンプルの一部をインタロゲートするのに使用する多くの同一励起パルスの任意の１つを表す。第２曲線（細い波線）はインタロゲーション下のサンプルの一部からの推定蛍光発光応答を表す。この第２曲線は直接測定されず、その代わりにヒストグラムに数値的にフィットさせることで推定される。典型的な仮説的ヒストグラムを、第２曲線に重ねた一連のボックスとして示す。このヒストグラムは、パルスによる励起に続く単一蛍光発光光子の到着時間の頻度分布を表す。サンプルの同じ部分を何度も励起させることで、その下の蛍光減衰曲線を忠実に反映したヒストグラムが得られる。このアプローチの主な欠点は、ベースとしている原理、すなわち単一光子計数そのものである。この方法は、励起の結果として平均して１つの光子が放出される場合にしか使えない。典型的な減衰曲線の場合、結果を許容可能な精確さでもって得るには、何万回及び何百万回も励起を繰り返してヒストグラムにするのに十分な統計値を得る必要があることが珍しくない。高いパルス繰り返し率であっても、このアプローチでは必ずミリ秒〜秒のオーダーでドエル時間（サンプルの一部についてデータを取得するのにかかる時間）が生じる。したがって、ＴＣＳＰＣは静止したサンプルではうまくいくアプローチであるが、急速に変化し、不安定で流れている又は一般に迅速に分析する必要があるサンプルにはあまり適していない。本発明の目的は、この限度を克服することである。
【００２２】
図４（ａ）〜（ｄ）は、蛍光寿命の直接時間−領域測定の重要性を示す。図４（ａ）〜（ｄ）のそれぞれにおいて、グラフは、共に単位ピーク強度に正規化された２つの曲線：光励起パルス（４つのグラフにおいてそれぞれ太い実線４１０、４３０、４５０及び４７０で示す）及び発光曲線（４つのグラフにおいてそれぞれ細い波線４２５、４４５、４６５及び４８５で示す）の強度（Ｉ）の時間（ｔ）における推移を示す。図４（ａ）及び４（ｃ）において、各グラフ４２０及び４６０の２つの曲線のそれぞれを線形−線形スケールでプロットする。図４（ｂ）及び４（ｄ）においては、各グラフ４４０及び４８０の２つの曲線のそれぞれを対数−線形スケールでプロットする（「片対数」スケールとしても知られる）。図４（ａ）及び４（ｂ）のグラフ４２０及び４４０は同じ曲線を異なるスケールでプロットしただけである。同様に、図４（ｃ）及び４（ｄ）のグラフ４６０及び４８０は同じ曲線を異なるスケールでプロットしただけである。蛍光過程において、分子（特定の染料のような天然の分子、あるいは現在使用されているフルオロフォアの大多数のような人工の分子になり得る）には特定の波長範囲（その吸収スペクトルと呼ばれる）内の光エネルギーを吸収する傾向があり、続いて光エネルギーを異なる波長範囲（その発光スペクトルと呼ばれる）で放出する。この蛍光における吸収及び放出の過程は量子力学に支配され、幾つかの因子の影響を受ける。これらの因子の一部はその分子に本来備わったものであり、他の因子は環境的なものである。蛍光光子の放出は確率的に起きる。同一分子の十分に大きな集まり（集合）があるとすると、この集合による全体としての発光は時間の経過に伴って減衰して見える。均質な集合の場合［図４（ａ）及び４（ｂ）に示す］、蛍光発光の積算曲線は１つの減衰寿命（この場合はτａ４２１として概略的に示す）で表すことができる。図４（ｂ）の片対数プロット４４０において、破線の発光曲線４４５の単一減衰性は、１つの直線的な傾き（プロット４２０の４２１と同じτａに対応するその対応する寿命τａ４４１で示す）の存在により立証される。２種の異なる母集団から成る不均一な集合の場合［図４（ｃ）及び４（ｄ）に示す］、蛍光発光の積算曲線は２つの異なる減衰寿命（この場合はτｂ４６１及びτｃ４６２として概略的に示す）を含む合成関数でより良く表すことができる。図４（ｄ）の片対数プロット４８０において、破線の発光曲線４８５の二重減衰性は、「ニー」でつながった２本の傾斜した直線ブランチ（それぞれプロット４６０のτｂ４６１及びτｃ４６２に対応しているそのそれぞれの寿命τｂ４８１及びτｃ４８２として示す）の存在で実証される。減衰曲線の形状から、集合における分子の環境に関する情報が得られる。図４（ｃ）及び４（ｄ）の集合が１種類の分子実体から成ると仮定すると、２つの異なる寿命の登場は集合中の分子が２つの異なる環境的な影響に曝され、その一方が分子が本来持つ蛍光寿命を大きく変化させたことを示唆し得る。蛍光分子の集合の発光減衰曲線の実際の形状をリアルタイムで直接記録しないと、図４（ａ）〜（ｂ）と図４（ｃ）〜（ｄ）に描かれたケース間の違いが、分子種の環境に関する情報と共に失われる可能性がある。この直接時間−領域アプローチで可能となった分析は多成分又は多指数関数的蛍光減衰分析と様々に呼ばれる。
【００２３】
多指数関数的又は多成分蛍光減衰の分析原理の実際の応用例は細胞分析に見られる。真核細胞は主に膜、細胞質、核及び多様な細胞内細胞質構造から成る。細胞内の分子が経験する生化学的ミクロ環境は、電解質の局所濃度、局所ｐＨ、局所温度等の因子に大きく影響される。フルオロフォアが細胞に進入する場合、そのミクロ環境はそのフルオロフォアが細胞質中に遊離浮遊しているか、分子（例えば、ＲＮＡ）若しくは酵素若しくは細胞質中の他の細胞内構造に結合するか又は例えば核膜を通過して核内のＤＮＡに結合するかに応じて大きく異なり得る。光励起に曝露されると、核内のＤＮＡに結合したフルオロフォアの部分集合は例えば細胞質中に遊離浮遊しているフルオロフォアの部分集合とは大きく異なる寿命を示し得る。集合全体の複合減衰曲線を分析することで、寿命への２つ（以上）の異なるコントリビューションを区別できるようになるが、これは平均的な１つの寿命では所望の情報が曖昧になり、状況がよくわからなくなるからである。
【００２４】
分析対象である細胞が静止しているならば（例えば、基質に接着している又は基質上で成長しており、顕微鏡下に置くのに適している）、既存の顕微鏡検査ツールを使用して細胞内での物理的な位置を空間分解し（例えば、細胞の極めて小さい部分にまたがる単一ピクセル（又はボクセル）上で実験を多数繰り返す）、これらの測定を細胞を形作る全てのピクセル（又はボクセル）について繰り返すことができる。しかしながら、このアプローチが望ましくなく、分析対象の細胞がインタロゲーション地点を動いて素早く通過することが有利になる場合も多い。その１つの例が、細胞又は細胞群についての一連の測定を極めて短い時間で完了することが望ましい場合であり、一般には、結果がでるまでの時間が重要なパラメータであり、患者の健康又は生命がそれにかかっている臨床診断用途の場合などである。臨床診断並びに創薬及び開発にも大きく関わるが基礎的な科学研究においても重要であると認識されつつある関連例は、個々の異常値の影響でゆがんでいない統計的に関係した結果が得られるように実用的な時間内で大量の細胞について特定の測定一式を完了させることが望ましい場合である。別の例は、その本来の生理学的な状態にある細胞の環境を最大限模した環境において細胞の測定を行うことが望ましい場合である。例えば、流れる液体中を自然に浮遊している細胞、例えば全ての血球の場合、基質への接着はその細胞形象をひどく損なう極めて不自然な状態である。細胞内の物理的な位置の詳細（高分解能の顕微鏡検査法により時間とお金の両方を代償として得られる詳細）が単に重要でなく、（事前のインターネットを使用せずに行った調査又は文献から得られた結果をベースとした）特定の細胞位置と代用物測定値との相関関係について事前の情報があるならば、細胞内での特定の位置に関する代用物で十分な場合もある。
【００２５】
測定を行う速度に関係なく、またそれゆえに測定をフローサイトメータで、顕微鏡下で又は何か別のまだ実験的な条件下で行うかに関係なく、スペクトルクロスオーバー問題を軽減又は排除することが望ましい場合もある。細胞生物学研究、創薬、免疫学研究及び臨床診断における多くの分析プロトコルが、起源又は系譜が不確かな場合もある多様な細胞母集団から成る極めて不均一なサンプルの様々な性質を明らかにするために、複数種のフルオロフォアの同時使用を基本としている。現在、利用可能なフルオロフォアのそのような同時使用につきもののスペクトルのクロスオーバーが、セルソータ、細胞分析装置、画像ベースの共焦点走査型顕微鏡又は他のプラットフォームであれ、現行のツールの多重化能を制限している。スペクトルのクロスオーバーの有害な影響を定量化及び軽減するために様々な案が出されており、一般に補償補正方式と呼ばれる。しかしながら、このやり方は複雑になりすぎ、再現性に欠け、オペレータを適切に訓練するのが困難である。したがって、現在起きているものと同じスペクトルクロスオーバー問題を起こすことなく複雑な測定を多重化する方法を多様な分析プラットフォームに提供することが有利であろう。
【００２６】
蛍光寿命測定を、調査中の系由来の分子種に行うことが望ましい細胞分析例もある。この場合、蛍光の過程は自己蛍光又は自家蛍光と呼ばれることもあり、外部フルオロフォアの導入には依存しないが分析対称の細胞に（概して天然で）既に存在する分子が本来備えた蛍光に依存する。自家蛍光は外部から導入したフルオロフォアの蛍光に似ており、分子ミクロ環境が蛍光寿命に及ぼす影響等の同様の作用の影響を受けやすい。したがって、異なる状態の自家蛍光をある分析プラットフォーム上で分解し、１種以上の自然に存在する化合物の自家蛍光寿命の様々な値と相関関係にあることが知られている様々な母集団に属する細胞同士を単純且つ直接的に区別できるようなるのが有利であろう。自家蛍光の原理の１つの実際的な応用例は、代謝情報に基づいた正常な細胞からのがん細胞の鑑別同定である。
【００２７】
図５は本発明の原理、すなわち蛍光寿命情報を用いることで分析機器の多重化容量を改善する能力を概略的に描いている。図５の下部は、波長（λ）の関数としての強度（Ｉ）の様々な蛍光発光曲線５６１〜５６５（細い実線）を描いたグラフ５５０であり、全ての曲線はそのそれぞれの単位ピーク強度に正規化されている。細胞標識又は「マーカー」としての異なるフルオロフォア間の区別をスペクトル手段だけで行う先行技術とは対照的に（グラフ５５０の水平方向の波長軸λ）、本発明においては、別の直交次元の分析：上のグラフ５００の縦方向の寿命τ軸を追加する。各蛍光発光曲線を「バンド」として表し、図においては影をつけた縦方向の帯５１１〜５１５：ＦＬ１（５１１）、ＦＬ２（５１２）、ＦＬ３（５１３）、ＦＬ４（５１４）、ＦＬ５（５１５）・・・として示す。同様に、異なる蛍光寿命値を、図においては影を付けた水平方向の帯５２１〜５２５：τ１（５２１）、τ２（５２２）、τ３（５２３）、τ４（５２４）、τ５（５２５）・・・として示される「ビン（ｂｉｎ）」にまとめられた様々なτ値で表す。各ビンは、比較的似た寿命群を概略的に表そうとしたものである：τ１ビン内の様々な寿命値間の違いは概してτ１及びτ２ビンの平均寿命間の差より小さく、τ２ビン内の様々な寿命値間の違いは概してτ１及びτ２ビンの平均寿命間の差より小さく、また概してτ２及びτ３ビンの平均寿命間の差より小さい等である。
【００２８】
図５から、波長軸及びその関連したバンドがここでは仮想平面の１つの次元しか表していないことがわかる。この仮想平面の第２の追加された次元をグラフ５００の蛍光寿命軸τ及びその関連したビンで表している。波長バンドと寿命ビンとの概略的な交差部をグラフ５００ではλ−τ平面においてより濃く影を付けた領域５３０（一部しか符号をつけていない）として示す。本発明の高度多重化は、現行の分析プラットフォームで一般に利用可能なスペクトル（波長）バンドの全てについて、本発明では幾つかの考え得られ得る多重化寿命が得られるという事実により実証される。例えば、蛍光バンドＦＬ２（５１２）は複数の蛍光寿命ビンτ１（５２１）、τ２（５２２）、τ３（５２３）、τ４（５２４）、τ５（５２５）・・・をサポートする。ｎ個の異なる蛍光バンドとｍ個の異なる寿命ビンを有する系の場合、独立した組み合わせの理論上の総数はｎｘｍであり、実例を用いると、６つの異なる蛍光バンドと４つの異なる寿命ビンを有する系の場合、６ｘ４＝２４の相互に独立した多重化組み合わせが利用可能である。
【００２９】
図５は、多重化組み合わせの具体例をどのようにして本発明で分解するかも示している。波長軸から、特定のスペクトルバンド（例えば、ＦＬ３バンド５１３）を分析のために選択する。実際にはこの特定のスペクトルバンドをスペクトル光学手段、例えば１つ以上の薄膜フィルタ、二色ビームスプリッタ、色ガラスフィルタ、回折格子、ホログラフィック回折格子又はこのタスクに適し且つ全てに優先してこの波長バンドを通すようにデザインされた他のスペクトル分散手段で選択し得る。得られた光信号は依然として、機器のデザイン及びサンプルの性質に応じて多数の蛍光寿命のいずれかを含む。ＦＬ３としてフィルタされたスペクトル光信号を検出し、電子形態に変換し、デジタル化及び更なる処理のために電子信号処理ユニットに送る。図１０を参照のこと。信号処理ユニット（図７及び１９との関連でのちに詳述する）は調査中の粒子に対応する光信号の減衰特性分析を行い、様々なコントリビューションを各考えられ得る寿命値バンドからの全体信号に割り当てる。寿命の特定のビンτ４（５２４）に対応する仮想電子「ビン」は、τ４バンドに関する許容可能な範囲内の寿命減衰を原因とし得る信号の一部に対応する値を受け取る。放出された信号に光学的に行ったＦＬ３についてのスペクトルフィルタリングと電子的に変換した光信号にデジタル的に行ったτ４についての寿命フィルタリングとを組み合わせることで、分析は１つの多重化要素：図５のグラフ５００において太い実線で描かれた正方形でしるしをつけた影のついた交差部５４０に絞られる。
【００３０】
ＦＬ３及びτ４の具体的な選択は、検出可能なスペクトル蛍光バンドと分解可能な寿命ビンとの交差部はどれも潜在的に分析により同時アクセス可能であり、上記の高度多重化能が望ましく得られるという意味で例にすぎない。図５は、５つの異なる蛍光バンド及び５つの異なる寿命ビンを含む仮想例に関する許容可能な多重化交差部セットを明示し、得られるセットは最高５ｘ５＝２５の別々の相互に独立した組み合わせである。この例は例にすぎず、考えられ得る組み合わせの数は２５に限定されず、個々に分離可能な蛍光スペクトルバンドの数に個々に分離可能な寿命値ビンの数を掛けることで得られる。個々に分離可能な寿命ビンの理論上の最大数はデジタル化のサンプリング頻度、励起パルスの繰り返し率及び各励起パルスの継続時間（幅）に関係する。対象の寿命よりはるかに短い励起パルスの限界において（典型的には数十ピコ秒〜数十ナノ秒、場合によってはマイクロ秒レベル以上に達する）、分離可能な寿命ビンの最大数は、パルス繰り返し時間をデジタル化サンプリング時間の２倍で割ることで得られる。実際の系における電子的、光学的及び他のノイズ効果はこの理論上の最大値を大幅に低下させ得る。
【００３１】
実際には、利用可能な多重化組み合わせの理論上の最大数より少ない数で実行することが望ましいであろう。そのような選択の基準に盛り込み得る実際的な理由の幾つか（設計時にハードコードし得る、あるいは機器のオペレータにまかせる）には、考えられ得る組み合わせの完全実施に必要な計算の複雑さを低減したいという要望、考えられ得る組み合わせの数に対して行う統計的に許容可能な分析の実行に必要な計算時間を短縮したいという要望、考えられ得る組み合わせの理論上の最大数の完全実施に必要なものより単純で小さく低コストの機器を製造したい又は得たいという要望、最小限の専門的な訓練でもってオペレータが分析プラットフォームを操作できるようにしたいという要望、高度に最適化された形でより少ないオペレーションセットを行うようにデザインされたロバストな機器への要望が含まれ得る。動機がなんであれ、考えられ得る多重化選択肢の一部が取り除かれた「スパース」な多重化構成が得られるように選択し得る。
【００３２】
本発明の一実施形態においては、そのようなスパース性を寿命領域に導入する。考えられ得る寿命ビンのごく一部だけを用意し、残りは取り除く及び用意した寿命ビン間のギャップで置き換える［例えば、図５のビンτ２（５２２）及びτ４（５２４）を取り除く］。デンスな寿命構成と比較してのこの構成の利点は、寿命ビンの相対的なスパース性により発光信号への残りのビンの寿命コントリビューションをデジタル的に区別するプロセスが単純化されることである。
【００３３】
本発明の別の実施形態においては、多重化のスパース性をスペクトル領域に導入する。考えられ得る波長バンドのごく一部だけを用意し、残りは取り除く及び用意したスペクトルバンド間のギャップで置き換える［例えば、図５のバンドＦＬ２（５１２）及びＦＬ４（５１４）を取り除く］。デンスなスペクトル構成と比較してのこの構成の利点は、スペクトルバンドの相対的なスパース性により残留スペクトルオーバーラップの取り扱いが単純化されることである。
【００３４】
図６は本発明のさらに別の実施形態の実例（グラフ６００）を示し、多重化のスパース性をスペクトル（下のグラフ６５０）及び寿命領域の両方に同時に導入している。考えられ得る波長バンドのごく一部だけを用意し、残りは取り除き、図においては用意したスペクトルバンド間のギャップで示し［例えば、バンドＦＬ１（６１１）及びＦＬ３（６１３）間、バンドＦＬ３（６１３）及びＦＬ５（６１５）間］、考えられ得る寿命ビンのごく一部だけを用意し、残りは取り除き、図においては用意した寿命ビン間のギャップで示している［例えば、ビンτ１（６２１）及びτ３（６２３）間、ビンτ３（６２３）及びτ５（６２５）間］。得られた構成は、理論上の最大値より大幅に少ない交差点を有するものの、ハードウェアコンポーネント数の減少、信号処理アルゴリズムの複雑さの低下、信号処理結果のロバストネス及び正確さの相対的な向上並びに関連する機器プラットフォームの操作に関する訓練プロトコルが相対的に単純であるという点でデンスなスペクトル及び寿命構成より有利である。
【００３５】
図７は本発明の実施形態例のシステム構成を概略的に描いたものであり、サンプルにおける高度多重化粒子分析のための装置が得られる。別の実施形態においては、サンプル中の粒子の寿命を分析するための装置が得られる。１つ以上の光源７５０、例えばレーザは１つ以上の光エネルギー（光）ビーム７２２を所望の波長、出力、次元及び断面特性で発生する。１つ以上の変調ドライバ７５２は１つ以上のそれぞれの光源について変調信号７０２を送り、結果としてビーム７２２はパルス化される。変調ドライバは任意で光源内に置き得る。パルスビームは一連にリレー光学素子７５４（例えばレンズ、鏡、プリズム又は光ファイバを含み得る）に指向され、リレー光学素子は任意でビーム成形機能を果たし得る。ここでリレー光学素子とは１つ以上のビームをシステム内の一点から別の一点へと伝送する手段を表すものとし、また１つ以上のビームを次元、収束、拡散又はコリメーションに関して成形する手段を表すものとする。ビーム成形リレー光学素子から出力されたパルスビーム７３２は別の任意のリレー光学素子７５８（例えば、レンズ、鏡、プリズム又は光ファイバを含み得る）に指向され、任意で集束機能を果たし得る。あるいは、ビーム成形光学素子、集束光学素子又はその両方を光源モジュールに組み込み得る。２組のリレー光学素子（ビーム成形光学素子及び集束光学素子）が光源からの入力ビームに及ぼす複合作用は、粒子のインタロゲーションに適した所望の出力ビーム伝播特性がビームに付与されることである。次に、第２のリレー光学素子はパルスビーム７０８をフローセル７００に指向させる。フローセル７００は、後述するように、懸濁物としての粒子を含むサンプル流７４０及びサンプル流を取り囲み且つ閉じ込めるシース液７４２の流れを運ぶことで、分析対象である粒子（例えば、細胞、細菌、エキソソーム、リポソーム、マイクロベシクル、マイクロ粒子、ナノ粒子及び天然又は合成マイクロスフィアを含み得る）を通過させる。フローセルの投入部は例えば流体力学的手段でもってサンプル流及びそれを取り囲むシース流を、シース液に取り囲まれた、フローセルのマイクロチャネル部を流れるタイトなサンプルコア流へと集束させる。フローセルのインタロゲーション領域を通過して流れるタイトなサンプルコア流は典型的には、平均して、インタロゲーションのために１回に１粒子未満をビームに曝露する（これは当該分野において「一列縦隊」粒子インタロゲーションと呼ぶ場合もある）。シース液及びサンプルコア流は、フローセルのインタロゲーション部を通過した後、１つの出口７４４に指向される（そして一般には廃棄物として処分される）。光エネルギー（光）のインタロゲーション用パルスビームがサンプルコア流中の粒子と散乱、吸収、蛍光及び他の形で相互作用するにつれて、光信号７１０が生成される。これらの光信号を、フローセルの周囲に位置決めされたボックス７６０のリレー光学素子（例えば、一重レンズ、二重レンズ、多重レンズ素子、鏡、プリズム、光ファイバ又は導波管）で回収し、次にボックス７６０のフィルタリング光学素子（例えば、色フィルタ、二色フィルタ、二色ビームスプリッタ、バンドパスフィルタ、ロングパスフィルタ、ショートパスフィルタ、マルチバンドフィルタ、回折格子、プリズム、ホログラフィック光学素子を含み得る）に送り、次にボックス７６０の別のリレー光学素子によりフィルタリングされた光信号７１２として１つ以上のディテクタ７７０（例えば、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、光電子増倍管、シリコン光電子増倍管又はアバランシェフォトダイオードマイクロセルアレイ）に送る。ディテクタは光信号７１２を電子信号７７２に変換し、これらを任意でさらに増幅、整えて不要なノイズの影響を低減する。電子信号は電子信号処理ユニット７９０［一般に各信号流についてのアナログ／デジタルコンバータ、異なるアナログ及びデジタルフィルタユニットを備えたデジタル化フロントエンドを備え、またフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）チップ又はモジュール、デジタル信号処理（ＤＳＰ）チップ又はモジュール、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）チップ又はモジュール、シングルコア又はマルチコア中央処理ユニット（ＣＰＵ）、マイクロプロセッサ、マイクロコントローラ、スタンドアロンコンピュータ、「デジタルクラウド」ベースのサーバ上に位置し且つデータネットワーク又は有線若しくはセル式電話手段でアクセスするリモートプロセッサの１つ以上を備え得る］に送られ、電子信号によりさらなる処理ステップが実行される。次に、処理された信号７７４はデータストレージユニット７９２（例えば、読み取り専用メモリユニット、フラッシュメモリユニット、ハードディスクドライブ、光学的記憶ユニット、外部ストレージユニット、あるいは有線データ又は電気通信網、Ｗｉｆｉリンク、赤外線通信リンク若しくはセル式電話ネットワークリンクの手段により機器に接続されたリモート又はバーチャルストレージユニットを含み得る）に送られる。保存された若しくは予備的に処理されたデータ又はその両方を、任意で結果を点検するためにオペレータが使用できるようにすることもできる。
【００３６】
図８は本発明の実施形態例のシステム構成を概略的に描いたものであり、サンプル中の粒子を高度多重化分析及び選別するための装置が得られる。別の実施形態においては、サンプル中の粒子の寿命分析及び選別を行うための装置を提供する。その構成は図７のシステム構成と似ているが、追加で特徴に基づいて粒子を選別及び回収することができる。信号処理ユニット８９０は分析対象である粒子の既定の特徴の存在又は不在又は度合い又は性質に基づいてリアルタイムで選別制御信号８７６を生成する。例えば、インタロゲーション用パルス光ビームで励起すると既定の閾値より高いレベルで既定のスペクトルバンドで蛍光を発する粒子を同定及び選別するのが望ましいであろう。別の例として、インタロゲーション用パルスビームで励起すると特定の値域内の寿命成分の蛍光減衰曲線を既定の閾値より高いパーセンテージで示す粒子を同定及び選別するのが望ましいであろう。様々な基準を独立して用い得て、あるいは組み合わせて複合論理形式（例えば、ＡＮＤ、ＯＲ、ＮＯＴ、また異なる量を数値的に比較した複素形式、例えば「〜より大きい」、「〜より小さい」等）にし得る。処理ユニット８９０は、所与の粒子からの処理された信号が既定の選別基準セットを一旦満たしたら、アクチュエータ８９４に送られる信号８７６をトリガする。アクチュエータドライバは、１つ以上の選別アクチュエータ８８０に接続された電子制御モジュールである。選別アクチュエータは、インタロゲーション領域付近及び下流にあるフローセル内、上、隣又は近くに位置決めされ得る。選別アクチュエータ８８０の１つ以上は一時的に、処理ユニット８９０からのトリガ信号８７６に応答したアクチュエータドライバ８９４からの駆動信号８７８によりアクティベートされ、サンプルコア流又はサンプルコア流の一部がデフォルトの選別チャネル８４６から１つ以上の選別チャネル８４８へと一時的に進路変更される。デフォルトの選別チャネル８４６は任意で、受け取った流体をデフォルトの容器８４７に指向させる。次に、選別チャネル８４８はサンプルコア流をそれぞれの受け取り用選別容器８４９に指向させる。選別アクチュエータ８８０の１つ以上の一時的なアクティベーションが一旦完了したら、アクチュエータはその静止状態に戻り、サンプルコア流はそのデフォルトの選別チャネル８４６に戻る。選別アクチュエータ８８０は、例えばアクチュエータドライバ８９４、内臓制御装置、処理ユニット８９０からの直接的な電圧若しくは電流制御又は１つ以上のディテクタ８７０に接続された論理回路から直接来る電気信号で制御して複数の作動状態を達成可能である。
【００３７】
図９及び１０において、流体流、光伝搬及び横断方向の相対的な向きをそれぞれｘ、ｚ及びｙの軸セットとして示す。本発明の一部の実施形態の実行に関わるプロセスステップを本明細書において図９及び１０との関係で説明し、また図１８（ａ）においてフローチャートの形でまとめる。
【００３８】
図９は、本発明の考えられ得る集光構成の流体流に垂直な方向での断面図である。図においてその内部を概略的に描いたフローセル９００は流体流のためのチャネルを提供する。シース液９２０を用いて分析対象である粒子９５５を運ぶ流体９３０を閉じ込める。シース液及びサンプル担持流体をフローセルの管腔内へと、任意で流体力学的手段により集束させる。そのような集束によりシース液に取り囲まれたタイトなサンプルコア流が生じる。インタロゲーション用光ビーム９４０を照射することでサンプルコア流中の粒子と相互作用させる。ガウス強度プロファイルを通常有するビームは一般に、サンプルコア流の面にある比較的タイトな点へと集束される。サンプルコア流中の分析対象の粒子はビーム９４０の光と相互作用し、例えば散乱、吸収又は蛍光を含めた光学的プロセスにより光信号９１０が生成される。光信号９１０を回収光学素子９６０により回収する。次に、回収した光信号９１２をスペクトルフィルタリング光学素子９６２に送り（リレーし）、検出に適した光信号のスペクトルバンドを選択する。スペクトルフィルタリング光学素子９６２は例えば本質的に反射型、透過型、吸収型、回折型若しくはホログラフィ型になり得て又は干渉をベースにし得て又はこれらの組み合わせである。次に、得られた空間的にフィルタリングした光信号９１４を信号９１６として光学素子９６４をディテクタ９７０に集束させることで送る（リレーする）。ディテクタは光信号９１６を電気信号９７２に変換し、次に信号はさらに分析、処理及び任意で保存するための処理ユニット９９０に送られ、図７及び８に関連して上述し、また詳しく後述する通りである。回収光学素子９６０及び集束光学素子９６４はまとめてリレー光学素子と称し得る。
【００３９】
幾つかの実施形態においては、２つ以上のスペクトルバンド出力を生成し得る。例えば、図１０は、本発明の別の考えられ得る集光構成の、流体流の方向に垂直な方向での断面図である。図９の構成とコンセプトは似ているが、スペクトルフィルタリング光学素子１０６２は、スペクトル特性にしたがって分離された１つ以上のスペクトルバンド出力１０１４（Ａ及びＢ）を生成する。次に、各スペクトルバンドを別の集束光学素子１０６４（Ａ及びＢ）セット及び別のディテクタ１０７０（Ａ及びＢ）に送る（リレーする）と、それぞれ別の電気的に変換された信号１０７２（Ａ及びＢ）が得られる。次に、得られた電気信号をさらなる処理のために信号処理ユニット１０９０に送る。図１０では、明瞭化のために、２組のスペクトルバンド、集束光学素子及びディテクタを描いている。任意の数のそのようなセットが本発明の範囲に含まれることは当業者には明白である。
【００４０】
図１１（ａ）〜（ｆ）、１２（ａ）及び１２（ｂ）と共に後述するプロセスステップも図１８（ｃ）においてフローチャートの形でまとめる。
【００４１】
図１１は、本発明をフローサイトメトリプラットフォームに実装させる特定のケースに関して、励起、発光、検出及び分析下の粒子からの蛍光寿命信号の分析に関わる原理を描いたものである。以下の本文で図中の様々なパネルに言及することで信号伝達プロセスの様々なステップについてわかりやすく説明する。各パネル（ａ）〜（ｆ）において、グラフは特定の光学強度（Ｉ）の時間の経過（ｔ）に伴う推移を示す。注記がない限り、全てのケースにおいて、光強度はそれぞれ単位ピーク値に正規化される。
【００４２】
図１１（ａ）のグラフ１１１０は、常にＯＮの励起光源（当該分野においては連続波又はＣＷ源と呼ぶ場合もある）とインタロゲーション領域（典型的にはフローセル又は同様の機能を有する他のコンポーネント）を通過する粒子との相互作用から得られる光信号の正準挙動を示す。粒子がインタロゲーション領域に進入し、続いて出ると、励起相互作用信号（一点短鎖線１１１５）は粒子の通過線に沿って測定される、インタロゲーション用光ビームの空間プロファイルに呼応して上下する。この正準で教育学的な図において、粒子は粒子の通過方向に沿った光ビームの寸法と比較して小さいとみなされ、任意のサイズの粒子の場合へとこれを一般化するこのフレームワークの修正も可能ではあるが、目の前の目的には関係ないため、ここでは取り上げない。典型的な光ビームは、分析対象である粒子の通過線に沿って、１０未満から１００ミクロンを超える寸法を有し、典型的なフローサイトメータにおいて粒子はインタロゲーション領域を０．１未満から１０ｍ／秒を超える流速で通過し、励起相互作用エンベロープの考えられ得る継続時間の範囲は、図１１（ａ）の曲線１１１５の形状に言及することもあるように、極めて広く、１マイクロ秒未満からミリ秒を超えて広がる。しかしながら、現行のやり方では殆どの場合、励起相互作用エンベロープの半値全幅（ＦＷＨＭ）は約数マイクロ秒である。
【００４３】
図１１（ｂ）のグラフ１１２０では、説明を目的として、図１１（ａ）の正準相互作用エンベロープ１１１５（一点短鎖線）を光エネルギー変調ソースからの励起パルスの１つの考えられ得る波形に並べている。パルスは均一に繰り返される本質的に同じユニット（太い実線のシャープな特徴部１１２２）の列で示される。各パルスは正準相互作用エンベロープのＦＷＨＭと比較すると短く、各パルスは隣接するパルスから概してパルス自身の幅より広い時間で隔てられている。このパネル１１（ｂ）で注目される本発明の１つの重要な点は、光エネルギー源の変調により一連の本質的に同じパルスが生じ、それぞれが典型的な相互作用時間と比較して短く、また隣のパルスから十分に離れていることである。
【００４４】
図１１（ｃ）のグラフ１１３０は、図１１（ｂ）に示した励起パルス１１２５の列をフローセルを流れる粒子へと当該分野で既知のフローサイトメータ構成に典型的なデザイン及び動作パラメータにしたがって送ることの仮想的な結果を示す。得られた励起相互作用は高さの異なる一連のパルス（太い実線の特徴部１１３２）として示され、全体のエンベロープ（一点短鎖線）と一致し、光ビームがパルスでなく連続的であり他が全て同じであるならば、このエンベロープは得られる相互作用エンベロープに対応する。相互作用シーケンスの細部は一般に粒子ごとに異なるが［例えば、全体のエンベロープの下にある図１１（ｃ）の個々の相互作用パルス１１３２の詳細な時間的位置は粒子の到着に対するパルス列の相対的なタイミングの関数である］、「キャリア」エンベロープで変調される一連のパルスから成るような励起相互作用の一般的な性質は装置のデザイン及び動作パラメータにより決定される。図１１（ｃ）のこのグラフ１１３０において、個々の相互作用パルスは単位強度に正規化されていない。
【００４５】
図１１（ｄ）のグラフ１１４０は本発明の別の重要な要素、すなわち蛍光減衰曲線の時間的推移を測定する能力を全体像に加える。全体のキャリアエンベロープ（一点短鎖線）及び個々の励起相互作用パルス（太い実線の特徴部）は図１１（ｃ）に示した通りである。蛍光減衰曲線は細い波線１１４７で示す。各蛍光減衰曲線はそのすぐ前の相互作用パルスに関わる光励起のすぐ後に続く。蛍光減衰曲線は概して非対称的であることがわかる。上昇している部分は励起ソースからの光エネルギーの吸収に支配され、弱化している部分（減衰）は蛍光発光の量子力学的過程によって動かされ、分子によって異なり、加えて分子のミクロ環境に影響され、一般に減衰側のテールが長い曲線となる。図１１（ｄ）のこのグラフ１１４０において、個々の相互作用パルス及び個々の蛍光減衰曲線は単位強度に正規化されていない。
【００４６】
曲線の形状が任意の一定のスケーリング因子に影響されないことが線形関数の基本的な特性である。例えば、ガウス鐘形曲線はたとえ固定乗法スケーリング因子を適用しようともガウス鐘形曲線であり続ける。当然ことながら、２つの曲線を同じ関数から生成すると適切なスケーリング因子を選択することができ、一方の曲線に適用するともう一方の曲線となる。同じ寿命過程がグラフ１１（ｄ）の減衰曲線のそれぞれに作用しているため、単位ピーク強度に正規化することができる。この任意の正規化ステップは減衰の性質に影響せず（すなわち、減衰時間は一定のままである又は寿命に影響しない）、それでいて全ての曲線が比較し易い同じスケールとなる。幾つかのケースにおいては、信号上に存在するノイズの性質及び程度に応じて、正規化ステップを省略することで最適な結果を得る。残りのプロセスをここではこの正規化ステップを省略して説明する。
【００４７】
寿命分析アルゴリズムの次のプロセスステップでは、信号シーケンスを個々の減衰曲線にセグメント化する。図１１（ｄ）のグラフ１１４０の破線の曲線１１４７は発光信号を表し、例えば蛍光減衰曲線である。これらの光信号は１つ以上のディテクタで検出され、電気信号に変換され、さらなる処理のためにデジタル化される。図１１（ｅ）のグラフ１１５０において、パルス信号のシーケンス（変換元の光信号に対応するデジタル化電気信号を表す破線の曲線）は個々のパルス信号セグメント１１５１〜１１５６（Ａ、Ｂ、Ｃ・・・）に数学的に分割され、それでいてシーケンス全体を通して位相は一貫したままである。すなわち、各パルスの選択された特徴部（例えば、ピーク、その上昇した稜の中点等）を基準として選択し、シーケンスを等しいセグメントに切断すると［図１１（ｅ）において軸の下に示す］、全ては実質的に同じ数のデジタル化要素から成り、また全ては実質的に同じ数Ｌのデジタル化要素をそれぞれの基準点の左側で開始し、そのような数Ｌは、図１１（ｅ）で概略的に示されるように、それぞれが（可能な時はいつでも）隣接するセグメント間で分断されない減衰曲線全体を含むセグメントが得られるように選択される。セグメントの長さは励起パルス繰り返し時間によくマッチするように選択される。
【００４８】
図１１（ｆ）のグラフ１１６０は、各セグメント内のそれぞれの時間的関係を変化させずに重ねてコヒーレントに加算した図１１（ｅ）の減衰曲線セグメント１１５１〜１１５６（Ａ、Ｂ、Ｃ・・・）のそれぞれを示すことで以下の信号処理ステップを描いたものである。このような加算は個々のデジタル化要素をベースとしてコヒーレントに行われる。各セグメントにおける第１デジタル化インデックス（＃０）の値を加算し（Ａ０＋Ｂ０＋Ｃ０・・・）、各セグメントの第２デジタル化インデックス（＃１）の値を加算し（Ａ１＋Ｂ１＋Ｃ１・・・）、これを全てのセグメントの全てのデジタル化インデックスについて行う。結果として「スーパーカーブ」が得られ［図１１（ｆ）の太い曲線１１６５］、各デジタル化インデックスは、全てのセグメントからの対応するデジタル化インデックス全ての合計に等しい値を有する。次に、このスーパーカーブを、さらに処理するために片対数スケールに変換する。
【００４９】
この信号処理方法では、パルスからパルスへとコヒーレントな信号のコントリビューションを押し上げつつ、結果からインコヒーレントなノイズコントリビューションを除去する。図１１（ｆ）のグラフ１１６０のスーパーカーブ１１６５は依然としてある程度のインコヒーレントなノイズを示し得て、これは減衰過程の確率的性質及び信号上に様々な測定ノイズ源が存在することを考えると予測できる。しかしながら、減衰の一般的な性質は所与のフルオロフォア母集団内で一定であり続けると予測され、スーパーカーブのプロセスは、迷光信号、電子ノイズ及び行う分析と密接な関係がある情報内容を欠いた他のイベントからの影響を最小限に抑えながらそのような通常の減衰からの信号を最大化することを目的としている。
【００５０】
図１２（ａ）及び１２（ｂ）は、本発明の分析方法の幾つかのステップの実施形態例を描いたものである。図１２（ａ）及び１２（ｂ）は共に、測定強度の自然（又は代替案として底−１０）対数軸対時間の直線軸の片対数スケール上にプロットした曲線を示す。図１２（ａ）のグラフ１２５０において、励起パルス（太い実線曲線１２０１）及び例えば蛍光に因る得られる発光スーパーカーブ（破線の曲線１２１０）はそれぞれ単位ピーク値に正規化される。図示の対数スケール上で、１の線形値はゼロの対数値に対応する。図示したスーパーカーブ１２１０は、スーパーカーブ１１６５について図１１（ａ）〜（ｆ）と関連させて上述したように得られる。例示を目的として、図１２（ａ）のグラフ１２５０のスーパーカーブ１２１０を、３つの異なる寿命成分［ここではそれぞれ「成分」、「寿命」、「寿命値」、「１／ｅ値」、「時定数」、「減衰定数」又は「指数関数的減衰」とも呼び、標準的な指数関数的減衰式Ｉ（ｔ）＝Ｉ０ｅｘｐ（−ｔ／τ）のτの値に対応し、ここでＩ０は開始時強度であり、Ｉ（ｔ）は時間ｔ後の強度である］：τａ、τｂ及びτｃを含むものとして示す。この例において、τａは３つの中で最も小さい時定数であり、τｃは最大であり、τｂはこの２つの中間である。τａ、τｂ及びτｃの相対値はスーパーカーブ１２１０の３つのブランチａ（１２２１）、ｂ（１２２２）及びｃ（１２２３）の傾きに反映され、ブランチａ１２２１の傾きが最も急であり、ブランチｃ１２２３の傾きが最も緩やかであり、ブランチｂ１２２２の傾きがこの２つの中間である。図１２（ａ）及び１２（ｂ）に描かれた種類の片対数プロット上のブランチの傾きは対応する時定数の値に反比例する。図１２（ａ）のスーパーカーブ１２１０の３つのブランチ１２２１〜１２２３は以下のように定義される。第１ブランチａ１２２１はスーパーカーブのピーク１２３１から始まり、スーパーカーブの第１「ニー」１２３２で終了し（ここで「ニー」とは白丸で示した傾きにおける実質的な変化を意味する）、第２ブランチｂ１２２２は第１ニー１２３２から始まり次のニー（次の白丸１２３３）で終了し、第３ブランチｃ１２２３はこの次のニー１２３３から始まり、スーパーカーブが測定ノイズフロア（図１２（ａ）においては概略的に時間軸ｔで示す）と接する１２３４で終了する。各ブランチの傾きは慣例的に、ブランチの一部又は全体に対する縦座標及び横座標の比として定義され、例えば、ブランチｂの場合、傾き値はＳｂ＝ｙｂ／ｔｂである。次に、そのような傾きに対応する時定数を傾きの逆数により得る：τｂ＝１／Ｓｂ。
【００５１】
当然のことながら、例えばノイズ、バックグラウンド、不確かさ、計器誤差又はドリフト、成分可変性及び環境からの影響に曝される実際の測定では、本明細書の図及び記述から場合によってはかなり逸脱し得る。そのような影響が少ない又は最小限に抑えられたとしても、他の作用が本明細書で触れた様々な数学的及び物理的量間の関係を隠す、ゆがめる、変化させる、修正する又は別の形で変えるように働き得る。一例として、図１２（ａ）のスーパーカーブが始まりまた終了するノイズフロアは、上で挙げたばかりのものを含めた幾つかの因子に応じて特定のケースでは高く、他のケースでは低く成り得る。ノイズフロアにおける可変性はスーパーカーブのブランチの傾きの１つ以上を求めるのに影響し得る。同様に、スーパーカーブ上の２つのブランチ間のニーの精確な位置は、スーパーカーブ上の残留ノイズレベルによっては不確かなものになり得る。物理的な作用で生じるゆがみの別の例を図１２（ａ）に示し、ここでブランチａ１２２１はスーパーカーブ１２１０のピーク１２３１から始まるように描かれている。しかしながら、この第１ブランチの傾きは、ピークからのロールオフにより安定した値へとすぐには収束しない。ロールオフの度合いは励起パルスの形状、第１ブランチ寿命の値及び他の因子次第である。本発明の１つの目的は、これらの作用にもかかわらず、そのような作用の影響を最小限に抑えることである。多数の個々のパルス信号からのスーパーカーブの構築は、それに伴って信号対ノイズが改善されるため、そのような最小限化に貢献する１つの要素である。
【００５２】
別の要素は、スーパーカーブからの所望のパラメータ、例えば時定数の値の抽出が比較的単純なことである。これは図１２（ｂ）のグラフ１２８０により説明される。グラフ１２８０は図１２（ａ）のスーパーカーブ１２１０の細部１２１１を示し、ブランチａ１２８１（グラフ１２５０のブランチａ１２２１に対応）が終了し、ブランチｂ１２８２（グラフ１２５０のブランチｂ１２２２に対応）が始まる。（例示を目的として、グラフはオフセットされ、横座標及び縦座標の両方で再スケーリングしている）。２つのブランチは白丸で示されるニー１２９２で交わり、グラフ１２５０のニー１２３２に対応する。図１２（ｂ）ではスーパーカーブの個々のデジタル化点もプロットされ、小さい黒丸で示され、実線が時間軸に向かって延びている。ニー（すなわち、ある寿命の値が支配するブランチから異なる寿命の値が支配する別のブランチへの移行）の位置を決定するプロセスステップは、デジタル化されたスーパーカーブの連続した値間の差を計算することを含む。ブランチａについての４つのそのような差がδａとして示されている。スーパーカーブ上の残留ノイズが最小限である場合、デジタル化点ペアからデジタル化点ペアへの値δａは殆ど変化しない。しかしながら、一旦ニーを越えると、次の計算された差はδｂへとジャンプし、連続した差はまた、この新しい値前後で実質的に均一であり続ける。本発明の主な目的の１つ、すなわち粒子の分析及び選別を高度多重化する手段の提供にとって、図示した連続したδａ値が厳密に一定であることは重要でなく、δｂ値も同様である。示したニー点での傾きの変化を検出できるようにするのに十分なだけδａがδｂから異なっているなら十分である。δａとδｂとの十分な差が、測定システムの精密さ及び正確さ、ノイズの数、タイプ及び厳しさ又は誤差源並びに他の因子に関係している。しかしながら、傾きにおける不連続な変化の検出は、傾きの値の絶対測定より本質的に機器的にも計算的にも単純である。
【００５３】
一旦ニーが見つかったら、スーパーカーブ全体を調べるまでプロセスは続く。各ニーの位置は、第１ブランチの開始位置及び最後のブランチの終了位置と共に、スーパーカーブの全てのブランチを規定する。次の処理ステップでは各ブランチについて傾きの平均を計算し、これは図１２（ａ）と関連して上述しており、そのような傾きの値から各ブランチの時定数を計算する。続く処理ステップでは各ブランチを既定の寿命（又は時定数）ビンのセットの１つに割り当てる。図５及び６で図示したように、本発明の１つの態様は、限られたセットの寿命ビンを提供することであり、どのビンの寿命にも若干の変動が、その変動が隣接するビン間の差を超えるものでない限り、許されている。スーパーカーブを分析する及びスーパーカーブを構築するのに用いた信号を生み出したのはどの寿命なのかを判断するには、（１）どの寿命ビンが測定した粒子又はイベントにおいて存在したか（すなわち、どのフルオロフォアが又は他の分子種が用意した寿命ビンのいずれか１つの範囲内の蛍光減衰値で存在したか）及び（２）検出された各寿命の相対的コントリビューションの程度を明らかにするだけで十分である。（１）ついては、上述したようにスーパーカーブのブランチから計算した時定数セットを許容された寿命ビンセットと比較する。場合によっては、スーパーカーブにはビンと同じ数だけ別々の検出されたブランチがある。例えば許容されたビンの数が３であるならば図１２（ａ）のケースとなる。他のケースにおいてブランチの数は少なく、特定のビンが存在しないことを示す（すなわち、そのビンの値の範囲内の寿命を持ったフルオロフォア又は分子種が検出されなかった）。測定された時定数のセットを許容されたビンのセットと比較することで、どのビンが測定で存在するかがわかる。検出された各寿命の相対的コントリビューション（今度は許容された寿命ビンの１つに関連づけられる）を各ブランチの縦座標の値［図１２（ａ）のグラフ１２５０の値ｙａ、ｙｂ、ｙｃ］を装置の製造中に作成された較正ルックアップ表と比較することで求める。そのような較正ルックアップ表は、スーパーカーブを既知のインプットから生成する、すなわち１００％の１つの寿命ビン、１００％の別のビンと装置で利用可能となるように選択された全ての寿命ビンについて、次に様々なビンが混ざったもの、例えば１０％のビン１及び９０％のビン２、２０％のビン１及び８０％のビン２と９０％のビン１及び１０％のビン２までと、これを装置で利用可能なビンの各ペアについて繰り返すことで作成する。得られたデータは、測定された寿命縦座標（例えば、ｙａ、ｙｂ、ｙｃ）と比較し、検出された各寿命の相対的コントリビューションを求めるためのルックアップ表となる。
【００５４】
図１３（ａ）及び１３（ｂ）は、本発明の分析及び選別方法の２つのステップの例示的な実施形態を示す。図１３（ａ）及び（ｂ）において、流体流、光伝搬及及び横断方向の相対的な向きはそれぞれｘ、ｚ及びｙの軸のセットとして示される。軸及び方向の割り当ては図９及び１０のものと同様であるが、ページに対して軸の向きは図９及び１０と比較して回転させられ、光伝搬及び流れ方向が図１３（ａ）及び（ｂ）のページの平面にある。２つの図のそれぞれは、フローセル１３００のインタロゲーション領域１３３１及び選別領域１３３２の概略側面図である。例えば流体力学的手段（設ける場合は）によるフローセルの集束領域は図の左側である。シース液１３２０に取り囲まれたサンプルコア流１３３０は左から来て右へ流れる。シース液１３２０はフローセル１３００の内壁に囲まれ、サンプルコア流１３３０はシース液１３２０に囲まれる。左側のインタロゲーション領域１３３１において、パルス光エネルギーの１つ以上のビーム１３４０がフローセルへとリレー／集束光学素子により送られ、サンプルコア流１３３０と交差する。右側の選別領域において、１つ以上のアクチュエータ（図においてはアクチュエータ１３８０として示す）をフローセルと接触させて又はフローセル付近に設置し、サンプルコア流１３３０の位置を覆うように位置決めされる。
【００５５】
図１３（ａ）はサンプルの処理における最初のステップを示し、サンプルコア流１３３０中の１つの粒子１３５５はインタロゲーション領域１３３１（ビーム１３４０がサンプルコア流１３３０と交差する場所）に進入する。光／粒子相互作用により図９又は１０に関連して上述したように光信号が生成され、この光信号は回収され、１つ以上のディテクタにリレーされる。ディテクタは粒子１３５５により生成された光相互作用信号を記録し、その情報を、図８で概略的に示した信号処理ユニットへ送る。図８との関連で上述したように、処理ユニットはその情報を用いて、特定の既定の基準が満たされたならば、アクチュエータドライバのためのトリガ信号を生成し、このドライバが今度は図１３（ａ）のアクチュエータ１３８０をアクティベートする。図１３（ｂ）はサンプルの処理の第２ステップを示し、図１３（ａ）のステップで検出された粒子１３５５は、フローセル内の経路１３６５をｘ方向に沿って辿った後、フローセルの選別領域１３３２にあるアクチュエータ１３８０近くの地点に到達する。フローセル、アクチュエータの光学的レイアウト並びに検出、処理及び制御電子機器のデザインは、通過する粒子が、較正時又は機器の設計若しくは組み立て中に経験的に求められた、アクチュエータのアクティベーションによりコア流が１つ以上の選別チャネルの１つへと望み通りに進路変更される位置に最も近くなると計算、推定、予測又は発見されるタイミングでアクチュエータがアクティベートされるようなものである。トリガ信号のタイミング（すなわち、粒子の検出から選別開始までの相対的な遅延）は、フローセル内の流体流の平均速度及びフローセルの断面のその空間的プロファイルの両方を考慮に入れ、当該分野で既知のポワズイユの流れの特性にしたがって、また経験的又はモデリング情報に基づいて修正を加え、デザインされる。
【００５６】
図１４（ａ）及び（ｂ）、１５（ａ）及び（ｂ）、１６（ａ）及び（ｂ）並びに１７（ａ）〜（ｄ）において、流体流、光伝搬及び横断方向の相対的な向きはそれぞれｘ、ｚ及びｙの軸のセットとして示される。軸及び方向の割り当ては図９及び１０のものと同様であるが、ページに対する軸の向きは図９及び１０と比較して回転させられ、流体流及び横断方向が図１４（ａ）及び（ｂ）、１５（ａ）及び（ｂ）、１６（ａ）及び（ｂ）並びに１７（ａ）〜（ｄ）のページの平面にある。図１４（ａ）及び１４（ｂ）、１５（ａ）及び（ｂ）、１６（ａ）及び（ｂ）並びに１７（ａ）〜（ｄ）に描かれた断面は、サンプルコア流を含む平面である。
【００５７】
図１４（ａ）及び１４（ｂ）は、本発明の粒子分析及び選別方法の２つの状態の一実施形態を示す。２つの図のそれぞれは、フローセルの選別領域の概略断面図である。図１３（ａ）及び（ｂ）に描かれた状況と同様に、例えば流体力学的手段（設ける場合は）によるフローセルの集束領域は図の左側である。シース液１４２０に取り囲まれたサンプルコア流１４３０は左から来て右へ流れる。シース液１４２０はフローセル１４００の内壁に囲まれ、サンプルコア流１４３０はシース液１４２０に囲まれる。フローセル１４００は選別領域において２つのチャネル：デフォルトの選別チャネル１４４６及び選別チャネル１４４８に分かれる。アクチュエータ１４８０が、デフォルト選別チャネル側でフローセル１４００の内壁に接触して又は近接して描かれている。図１４（ａ）はデフォルトの状態の配置を示し、アクチュエータ１４８０はＯＦＦ状態にあり、サンプルコア流１４３０中の選択されていない粒子１４５０は計画通りデフォルトの選別チャネル１４４６へと流れる。図１３（ｂ）に示した状態と同様に、図１４（ｂ）は選別状態の配置を示し、ＯＮ状態にあるアクチュエータ１４８０により一時的なガス、蒸気若しくはガス／蒸気気泡又は加熱若しくは冷却されたシース液が少ない領域１４９５が発生し（例えば熱的手段、電気分解的手段及びガス注入手段を含めた手段により）、図示の断面及びその近くでは局所的な流れの進路変更が起き、この進路変更によりサンプルコア流１４３１は選別チャネル１４４８へと一時的にそらされ、このサンプルコア流は、上流で検出され、選別の開始をトリガする解析アルゴリズムにより自動的に選択された粒子１４５５を含む。アクチュエータ１４８０のアクティベーションが解除されると、一時的なガス、蒸気、ガス／蒸気気泡又は流体が少ない領域１４９５は収縮し又は消え、フローパターンは図１４（ａ）の元のデフォルト状態に戻る。
【００５８】
図１５（ａ）及び１５（ｂ）は本発明の粒子分析及び選別方法の２つの上体の別の実施形態を示す。作動のデザイン及び性質を除いて、図１４（ａ）及び１４（ｂ）の実施形態と同様である。ここでアクチュエータ１５８０は、フローセル内壁に隣接し且つ可撓性膜１５９６によりシース液１５２０から分離された膨張性チャンバ１５９７に近接して位置する。図１５（ａ）に示すようにアクチュエータ１５８０がＯＦＦ又はデフォルト状態にある時、膨張性チャンバ１５９７は、膜の位置でフローセル内側の流体の圧力とマッチするようにデザインされた圧力でそのデフォルトの配置にあり、膜はフローセル内壁の形状にマッチする平坦な形状となり、サンプルコア流１５３０中の選択されていない粒子１５５０は計画通りデフォルトの選別チャネル１５４６へと流れる。アクチュエータ１５８０が図１５（ｂ）に示すようにＯＮ又は選別状態にある時、膨張性チャンバ１５９７は、デフォルトの配置より高い圧力まで加圧される（例えば熱的手段、機械的手段、流体力学的及びガス注入手段を含めた手段により）。この差圧により膜１５９６は、新たな均衡に達するまで、フローセル内へと曲がる。突き出た膜によりフローパターンは図１４（ｂ）に関して上で示したものと同様の形でシフトし、サンプルコア流１５３１は一時的に選別チャネル１５４８へと進路変更され、このサンプル流は、上流で検出され、選別の開始をトリガする解析アルゴリズムにより自動的に選択された粒子１５５５を含む。アクチュエータ１５８０のアクティベーションが解除されると、膨張性チャンバ１５９７はそのデフォルトの圧力状態に戻り又は戻るようになっており、膜１５９６はそのデフォルトの平坦な形状に戻り、フローパターンは図１５（ａ）の元のデフォルトの配置に戻る。
【００５９】
図１６（ａ）及び１６（ｂ）は、本発明の粒子分析及び選別方法の２つの上体のさらに別の実施形態を示す。作動のデザインを除いて、図１５（ａ）及び１５（ｂ）の実施形態と同様である。ここで選別は、フローセルの両側に位置決めされた２つのアクチュエータにより開始され、各アクチュエータは、フローセル内壁に隣接し且つ可撓性膜（デフォルト側は１６９６、選別側は１６９８）によりシース液１６２０から分離された膨張性／圧縮性チャンバ（デフォルト側は１６９７、選別側は１６９９）に近接して位置する。図１６（ａ）に示すデフォルト状態において、デフォルト側及び選別側アクチュエータの両方の膨張性チャンバ１６９７及び１６９９は、膜１６９６及び１６９８の位置でフローセル内側の流体の圧力とマッチするようにデザインされた圧力でそのデフォルトの配置にあり、膜はフローセル内壁の形状にマッチする平坦な形状となる。この非選別状態において、サンプルコア流１６３０中の選択されていない粒子１６５０は計画通りデフォルトの選別チャネル１６４６へと流れる。図１６（ｂ）に示す選別状態にある時、デフォルト側アクチュエータ１６８０の膨張性チャンバ１６９７は、図１５（ｂ）との関連で示したものと同様の形で、アクチュエーションを通して、加圧される（例えば熱的手段、機械的手段、流体力学的及びガス注入手段を含めた手段により）。シース液における局所圧力に対するこの差圧により、膜１６９６は、新たな均衡に達するまで、フローセル内へと突き出る。同時に、選別側アクチュエータ１６８１の圧縮性チャンバ１６９９は、アクチュエータ１６８１のアクティベーションを通して、デフォルトの配置より低い圧力まで減圧される（例えば熱的手段、機械的手段、流体力学的及びガス吸引手段を含めた手段により）。シース液における局所圧力に対するこの差圧により膜１６９８は、新たな均衡に達するまで、フローセルから遠ざかる方向へと曲がる。内側に突き出るデフォルト側の膜１６９６と外側に曲がる選別側の膜１６９８との組み合わせにより、フローパターンは図１４（ｂ）及び１５（ｂ）に関して上で示したものと同様の形でシフトし、サンプルコア流１６３１は一時的に選別チャネル１６４８へと進路変更され、このサンプル流は、上流で検出され、選別の開始をトリガする解析アルゴリズムにより自動的に選択された粒子１６５５を含む。アクチュエータ対のアクティベーションが解除されると、デフォルト側及び選別側の両方の膨張性／圧縮性チャンバ１６９７及び１６９９はそのデフォルトの圧力状態に戻り又は戻るようになっており、デフォルト側及び選別側の両方の膜１６９６及び１６９８はそのデフォルトの平坦な形状に戻り、フローパターンは図１６（ａ）の元のデフォルトの配置に戻る。
【００６０】
図１７（ａ）〜（ｄ）は、本発明の粒子分析及び選別方法のマルチウェイ選別実施形態を描いたものである。４つの図のそれぞれは、フローセルの選別領域の概略断面図である。構成は図１４（ａ）及び（ｂ）との関連で描いたものと同様である。ただし、１本の選別チャネルの代わりに複数の選別チャネル１７４１〜１７４４が横断方向ｙに沿って設けられている。この実施形態の１つの利点は、インタロゲーション用光ビーム、信号ディテクタ並びに関連する電子及び論理トリガ回路部品による上流での分析の結果に応じて、その中にサンプルを選別していく複数の異なる容器を有する能力である。例えば、サンプルの上流でのインタロゲーションに応答して検出された信号は、粒子、例えば粒子１７５１が選択にあたってのターゲットである特定の特性セットＡ（例えば、特定の種類のがん細胞に関わる表面抗原又は細胞内マーカーの存在）でもって検出されたことを示し得る。図１７（ｂ）に示すように、これらの特性を有する粒子を特定の回収容器、例えば選別チャネル１７４１からの流出物を受け取るように設けられたものへと選別することが望ましいであろう。別の粒子、例えば粒子１７５２はインタロゲーション地点を越え、選択にあたってのターゲットである別の特性セットＢ（例えば、特定の種類の幹細胞に関わる表面抗原又は細胞内マーカーの存在）の存在を示す信号を生成し得る。特性セットＢを有する粒子１７５２等の粒子を特性セットＡを有する粒子を回収するようにデザインされたものとは異なる容器、例えば図１７（ｃ）に示すような、選別チャネル１７４２からの流出物を受け取るように設けられた容器に選別することが望ましいであろう。さらに別の特性セットＤの場合も同様に、粒子１７５４等の粒子はそれらの特性を有するものとして検出され、選別チャネル１７４４はそのような粒子を回収するための容器に流れ込むようにデザインされる。したがって、図１７（ａ）〜（ｄ）に図示の実施形態は本発明のそのようなマルチウェイ選別能の例となるものであり、デフォルトの選別チャネル１７４６に加えて多数の選別チャネル１７４１〜１７４４を備える。図１７（ａ）〜（ｄ）は４つのそのような選別チャネルを例示的に明示している。デフォルトの選別チャネルに加えて４より多い又は少ない選別チャネルを有する追加の構成が開示の発明の範囲から逸脱しないことは当業者には明白である。
【００６１】
各選別チャネル１７４１〜１７４４（及びデフォルトの選別チャネル１７４６）は任意で、それぞれのチャネルからの流体流を回収するようにデザインされた受け取り容器に接続し得る。アクチュエータ１７８０が作動することで、サンプルコア流の所望の選別分を受け取るためのターゲットとして特定の選別チャネル（又はデフォルトの選別チャネル）が選択される。２ウェイ選別においては、２つの主要な選別状態があり、図１４（ａ）〜（ｂ）、１５（ａ）〜（ｂ）及び１６（ａ）〜（ｂ）に関して上述したようにＯＦＦ（デフォルト）及びＯＮ（選別）と表現することができる。その一方で、マルチウェイ選別においては、概して、選別「路」又は考えられ得る選別チャネルの数だけ選別状態が存在し得る。図１７（ａ）〜（ｄ）に関しては、５つの考えられ得る選別チャネルを示している（デフォルトの選別チャネル１７４６＋４つの選別チャネル１７４１〜１７４４）。したがって、これは５ウェイ選別と呼ばれる。意図した異なる選別チャネルの選択に対応してサンプルコア流部を異なる度合いで逸らすような作動プロセスを用意する。
【００６２】
図１７（ａ）において、アクチュエータ１７８０は、デフォルトの選別チャネル側のフローセル１７００の内壁と接触する又は近接するように描かれている。図１４（ａ）に図示の状態と同様に、図１７（ａ）はデフォルトの状態の配置を示し、アクチュエータ１７８０がＯＦＦ状態にあると、サンプルコア流１７３０中の選択されていない粒子１７５０は計画通りデフォルトの選別チャネル１７４６に流れ込む。図１４（ｂ）に図示の状態と同様に、図１７（ｂ）〜（ｄ）は様々な選別状態の配置を示し、アクチュエータ１７８０がそれぞれレベル１、２及び４のＯＮ状態にあると、それぞれ一時領域１７９１、１７９２及び１７９４（例えば、ガス、蒸気、ガス／蒸気気泡又はシース液が少ない領域を含む）が発生し（例えば熱的手段、電気分解的手段及びガス注入手段を含めた手段により）、図示の断面及びその近くでそれぞれ局所的な流れの進路変更が起き、この進路変更によりサンプルコア流は一時的に逸れてそれぞれ１７３１、１７３２及び１７３４の配置となり、対応する粒子１７５１、１７５２及び１７５４はそれぞれの選別チャネル１７４１、１７４２及び１７４４に流れ込む。アクチュエータのアクティベーションが解除されると、一時的なガスの気泡が収縮し又は消え、フローパターンは図１７（ａ）の元のデフォルトの状態に戻る。図１７（ｃ）及び１７（ｄ）の選別状態の中間となる選別状態の配置は図示しておらず、これは作動レベル３に対応し、領域１７９２と１７９４との中間のサイズの一時領域が一時的にサンプルコア流を選別チャネル１７４３へと進路変更させる。
【００６３】
本開示全体を通して、「デフォルトの選別チャネル」と語はアクチュエータのＯＦＦ状態に関わり、粒子選別が行われていない受動的な状態を示し、サンプルコア流及びその中の粒子は典型的には不要な廃棄物として流出し、捨てられる。「選別チャネル」という語はアクチュエータのＯＮ状態に関わり、アクチュエータがアクティベートされた状態を示し、所望の粒子の能動的な選別が行われる。一部の実施形態ではこれが好ましい構成であるが、本発明はそれに限定されず、本発明の範囲には、アクチュエータの受動的状態が所望の粒子の回収に関わり、アクチュエータの能動的な状態が粒子アナライザ／ソータからの不要な粒子の廃棄物流の発生に関わる実施形態も含まれる。
【００６４】
図１８（ｂ）を参照するが、本発明の実施形態による粒子分析のステップを行うのに含まれる主要なステップのシーケンスを描いたフローチャートである。第１ステップ１８４０は、サンプル中の粒子を光学的にインタロゲートするために１列以上の光パルス（又は１つ以上のソースからの他の変調された光出力）を発生させることを含む。第２ステップ１８４２は、ユーザ又はオペレータによる装置へのサンプルの提示又はサンプルの導入を含む。第３の任意のステップ１８４４は、サンプルの１種以上の試薬との混合、反応及びインキュベーションを含み、試薬は事前に装置内部に装填し得て、あるいはユーザ又はオペレータが導入し得る。第４ステップ１８４６は、シース液でサンプルを流体力学的に集束させることで、光学的にインタロゲートするためのフローセルのマイクロチャネル部を本質的に一列縦隊で流れる粒子のコア流を形成することを含む。第５ステップ１８４８は、光学的相互作用により、サンプルコア流中の１つの粒子を１列以上の光パルスでインタロゲートすることを含み、光学的相互作用信号が生成される。第６ステップ１８５０は光学的相互作用信号の回収、回収した光信号の光学的フィルタリング及びフィルタリングした光信号のスペクトル分離を含む。第７ステップ１８５２はスペクトル分離した光信号の検出、その信号のアナログ電気信号への変換、アナログ電気信号のデジタル信号へのデジタル化及びデジタル信号の処理を含む。第８ステップ１８５４は、デジタル信号処理アルゴリズムを分離された各スペクトルバンドに対応するデジタル信号にさらに適用することで各信号への１つ以上の蛍光寿命成分の別々のコントリビューションを分離することを含む。第９の任意のステップ１８５６は、異なるパルスから来るが全てインタロゲーション下にある同じ粒子に由来する寿命信号のアベレージングを含む。第１０ステップ１８５８は、検出、処理した信号パラメータ、例えば、以下に限定するものではないが、１つ以上のスペクトルバンドにおける蛍光強度、その１つ以上のスペクトルバンドのそれぞれにおける１つ以上の蛍光寿命値、位相、シフト、散乱強度及び吸収の記録及び保存を含む。第１１ステップ１８６０は、自動化し得る又は処理ユニットを介して追加の粒子を分析するか否かについてユーザ又はオペレータに次の行動への呼びかけとしてシステムにより提示し得る決定を含む。選択が正であるならば、方法のワークフローは上記の第５ステップに戻り、選択が負であるならば、方法のワークフローは後述する次の（第１２）ステップに続く。任意の第１２ステップ１８６２は、特定の基準（以下に限定するものではないが、当該分野において「トリガ」、「閾値」及び「ゲート」と一般に称される実体を含み得る）にしたがって検出及び分析されたイベントの一部又は全体の分類を含み、基準は事前に決定し、装置にロードし得る、あるいはユーザにより選択又は修正又は作成され得る。第１３ステップ１８６４は、ユーザーインターフェース、例えばスクリーン、コンピュータのモニタ、印刷したもの又は他のそのような手段による、処理したデータ（以下に限定するものではないが、検出した生の時変信号、検出した粒子−インタロゲーションイベントのリスト並びに例えば蛍光寿命、蛍光強度及び散乱等の特徴にしたがって表示される検出されたイベントのグラフ又はプロットを含み得る）のユーザ又はオペレータへの提示を含む。
【００６５】
図１９は、本明細書に記載されるような粒子分析及び選別システムを提供するためのデータ処理システム１９００の実施形態例のブロック図である。ある実施形態において、データ処理システム１９００は、本明細書に記載されるように、光パルスを用意し、分析するためのサンプルを用意し、サンプルを光パルスに曝露し、光学減衰曲線を検出し、時定数を光学減衰曲線から抽出することを含む方法を行うための制御システムの一部である。幾つかの実施形態において、データ処理システム１９００は、図７、８、９及び１０にそれぞれ図示された信号処理ユニット７９０、８９０、９９０及び１０９０のいずれかによって表され、任意で図７及び８にそれぞれ図示されたデータストレージユニット７９２及び８９２のいずれかをさらに取り込む。
【００６６】
データ処理システム１９００は、マイクロプロセッサ又はマイクロコントローラ、例えばＩｎｔｅｌのマイクロプロセッサ（例えば、Ｃｏｒｅ  ｉ７、Ｃｏｒｅ２  Ｄｕｏ、Ｃｏｒｅ２  Ｑｕａｄ、Ａｔｏｍ）、Ｓｕｎ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓのマイクロプロセッサ（例えば、ＳＰＡＲＣ）、ＩＢＭのマイクロプロセッサ（例えば、ＩＢＭ７５０）、Ｍｏｔｏｒｏｌａのマイクロプロセッサ（例えば、Ｍｏｔｏｒｏｌａ６８０００）、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍｉｃｒｏ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（「ＡＭＤ」）のマイクロプロセッサ、Ｔｅｘａｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔのマイクロコントローラ及び他のマイクロプロセッサ又はマイクロコントローラを含み得る処理ユニット１９０１を含む。
【００６７】
処理ユニット１９０１はパーソナルコンピュータ（ＰＣ）、例えばＭａｃｉｎｔｏｓｈ（登録商標）（Ａｐｐｌｅ  Ｉｎｃ．、クパチーノ、カリフォルニア州）、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）ベースのＰＣ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、レッドモンド、ワシントン州）又はＵＮＩＸ(登録商標)オペレーティングシステム若しくは他のオペレーティングシステムが動く多様なハードウェアプラットフォームを含み得る。少なくとも幾つかの実施形態に関して、処理ユニット１９０１は、Ｉｎｔｅｌ、ＡＭＤ、Ｍｏｔｏｒｏｌａ、ＩＢＭ、Ｓｕｎ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＩＢＭプロセッサ系又は他のプロセッサ系をベースにした汎用又は特殊用途データ処理システムを含む。図１９に示すように、メモリ１９０３は、バス１９２３により処理ユニット１９０１に連結される。メモリ１９０３には命令及びデータ１９０４が保存されており、処理ユニット１９０１がアクセスすると処理ユニット１９０１は方法を実行して、本明細書に記載するように、高度多重化粒子分析又は寿命分析、任意で選別を行う。
【００６８】
メモリ１９０３はダイナミックランダムアクセスメモリ（「ＤＲＡＭ」）になり得て、またスタティックランダムアクセスメモリ（「ＳＲＡＭ」）も含み得る。バス１９２３は処理ユニット１９０１をメモリ１９０３、また不揮発性ストレージ１９０９及びディスプレイコントローラ１９０５（ディスプレイを使用する場合）及び入力／出力（Ｉ／Ｏ）コントローラ１９１１に連結する。ディスプレイコントローラ１９０５は、ブラウン管（ＣＲＴ）、液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）、発光ダイオード（ＬＥＤ）モニタ、プラズマモニタ又は他のディスプレイ装置になり得るディスプレイ装置１９０７上のディスプレイを慣用のやり方で制御する。入力／出力デバイス１９１７はキーボード、ディスクドライブ、プリンタ、スキャナ、カメラ並びにマウス又は他のポインティングデバイスを含めた他の入力及び出力デバイスを含み得る。Ｉ／Ｏコントローラ１９１１は１つ以上の音声入力装置１９１３、例えば１つ以上のマイクロフォンに連結される。
【００６９】
ディスプレイコントローラ１９０５及びＩ／Ｏコントローラ１９１１は慣用で周知の技術でもって実装させることができる。例えば１つ以上のスピーカー等の音声出力１９１５をＩ／Ｏコントローラ１９１１に連結し得る。不揮発性ストレージ１９０９は磁気ハードディスク、光ディスク又は大量のデータ向けの別の形態のストレージであることが多い。このデータの一部は直接メモリアクセスプロセスにより、本明細書に記載の方法を行うデータ処理システム１９００におけるソフトウェアの実行中にメモリ１９０３に書き込まれることが多い。
【００７０】
当業者ならば、「コンピュータ可読性媒体」及び「機械可読性媒体」という語には処理ユニット１９０１によりアクセス可能な全てのタイプのストレージデバイスが含まれることを速やかに認識できる。データ処理システム１９００はモデム又はネットワークインターフェース１９２１を介して外部のシステムにインターフェース接続できる。当然のことながら、モデム又はネットワークインターフェース１９２１はデータ処理システム１９００の一部と見なせる。このインターフェース１９２１はアナログモデム、ＩＳＤＮモデム、ケーブルモデム、トークンリングインターフェース、衛星伝送インターフェース、Ｗｉ−Ｆｉ、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ(登録商標)、セルラーネットワーク通信インターフェース又はデータ処理システムを他のデータ処理システムに連結するための他のインターフェースになり得る。
【００７１】
当然のことながら、データ処理システム１９００は、異なるアーキテクチャを有する数多くの考えられ得るデータ処理システムの一例である。例えば、Ｉｎｔｅｌのマイクロプロセッサをベースとしたパーソナルコンピュータは複数のバスを有することが多く、その１つは周辺機器用の入力／出力（Ｉ／Ｏ）バス及び処理ユニット１９０１とメモリ１９０３とを直接接続するもの（メモリバスと呼ばれることが多い）になり得る。これらのバスは、バスプロトコルが異なることで必要になるトランスレーションを行うブリッジコンポーネントを介して接続される。
【００７２】
ネットワークコンピュータは、本明細書に記載の実施形態で用いることができる別のタイプのデータ処理システムである。ネットワークコンピュータは通常、ハードディスク又は他の大容量記憶装置を含まず、実行可能なプログラムはネットワーク接続からメモリ１９０３へと、処理ユニット１９０１により実行するためにロードされる。典型的なデータ処理システムは通常、少なくともプロセッサ、メモリ及びメモリとプロセッサとを連結するバスを含む。
【００７３】
また、当然のことながら、データ処理システム１９００は、ファイル管理システム、例えばオペレーティングシステムソフトウェアの一部であるディスクオペレーティングシステムを含むオペレーティングシステムにより制御できる。オペレーティングシステムソフトウェアは、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ（登録商標）オペレーティングシステム（Ｍａｃ  ＯＳ（登録商標））又はＭａｃ  ＯＳ  Ｘ（登録商標）（Ａｐｐｌｅ  Ｉｎｃ．、クパチーノ、カリフォルニア州）として知られるオペレーティングシステム類、あるいはＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、レッドモンド、ワシントン州）として知られるオペレーティングシステム類及びその関連ファイル管理システムになり得る。ファイル管理システムは典型的には不揮発性ストレージ１９０９に保存され、処理ユニット１９０１に、データを入力、出力し、不揮発性ストレージ１９０９にファイルを保存することを含め、データをメモリに保存する、オペレーティングシステムが要求する様々な動作を実行させる。
【００７４】
様々な実施形態において、ハードウェア回路部品をソフトウェア命令と組み合わせて用いることで本明細書に記載の方法を実装させ得る。固定機械可読性媒体を使用してソフトウェア及びデータを保存することができ、データ処理システムが実行するとシステムは本明細書に記載の様々な方法を行う。この実行可能なソフトウェア及びデータは、例えばＲＯＭ、揮発性ＲＡＭ、不揮発性メモリ及び／又はキャッシュを含めた様々な場所に保存し得る。このソフトウェア及び／又はデータの一部はこれらのストレージデバイスのいずれにも保存し得る。
【００７５】
したがって、機械可読性媒体は機械（例えば、コンピュータ、ネットワークデバイス又は１つ以上のプロセッサのセットを備えた任意のデバイス等）でアクセス可能な形態で情報を提供する（すなわち、保存する及び／又は伝送する）全ての機構を含む。例えば、機械可読性媒体は記録可能／記録不可能媒体（例えば、読み出し専用メモリ（ＲＯＭ）、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、磁気ディスク記憶媒体、光記憶媒体、フラッシュメモリデバイス等）を含む。
【００７６】
また、当然のことながら、データ処理システム１９００は、その機能の幾つかを中央システムとは別の分散ユニット又はモジュールに割り当てることで機能的に実装させ得る。幾つかの実施形態においては、例えば図７〜１０に描き、図１１（ａ）〜（ｆ）及び１２（ａ）〜（ｂ）で例示し、図１８（ａ）〜（ｃ）で説明した信号処理機能の一部又は全てを、データ処理システム１９００からは物理的に分離されているが依然として他の機能、例えば入力／出力、表示、データ保存、メモリ使用、バス使用、追加の信号処理機能並びに特殊用途及び汎用データ処理機能の両方を果たすために接続されている信号処理ユニット又はモジュールにより実行し得る。幾つかの実施形態において、例えば図７〜８に描き、図１１（ａ）〜（ｆ）及び１２（ａ）〜（ｂ）で例示し、図１８（ａ）〜（ｃ）で説明したデータストレージ機能の一部又は全てを、データ処理システム１９００からは物理的に分離されているが依然として上述したように接続はされているデータストレージユニット又はモジュールにより果たし得る。幾つかの実施形態においては、上記の信号処理機能の一部又は全てをデータ処理システム１９００内部の処理ユニット１９０１で果たし得て、幾つかの実施形態においては、上記のデータストレージ機能の一部又は全てを、データ処理システム１９００内の不揮発性ストレージユニット１９０９及び／又はメモリユニット１９０３により果たし得る。
【００７７】
本明細書に記載の方法は、機械可読性媒体に保存されたプログラム命令の制御下にある専用ハードウェア（例えば、フィールドプログラマブルゲートアレイ、デジタル信号処理チップ又は特定用途向け集積回路を使用して）又は共有回路部品（例えば、マイクロプロセッサ、マイクロコントローラ、シングルボードコンピュータ、スタンドアロンコンピュータ又はリモートサーバ上のクラウドベースのプロセッサ）を使用して実装させることができる。本明細書に記載の方法はデータ処理システム、例えば図１９のシステム１９００上で実行するためのコンピュータ命令としても実装させることができる。
【００７８】
粒子分析及び選別、特にはフローサイトメトリへの応用に関連させて例示してきたが、当業者ならば、本発明の態様が他の応用分野でも有利であることがわかる。寿命測定の実行を単純化することで例えば現行のものより高い度合いで多重化することを可能にする手段としての寿命のビンニングの概念は、撮像分野、特には顕微鏡検査法の分野、より具体的には蛍光顕微鏡検査法の分野でも有利である。フローサイトメータにおいて、「イベント」は粒子がインタロゲーション領域を通過することと定義されるが、顕微鏡法においてインタロゲーション領域とほぼ同等の要素は「ピクセル」であり、画像の最小分解単位と定義される。フローサイトメトリにおいて問題であるのと同様に、スペクトルスピルオーバー及びクロストークは蛍光顕微鏡検査法でも問題であり、本発明は、より高い度合いの多重化、低いレベルのスペクトルスピルオーバー又はこれら２つの組み合わせを提供することで両者に解決策を提供する。本発明には、蛍光顕微鏡のフレームワーク内での、フローベースの粒子分析のケースで挙げた具体例に極めてよく似たやり方での実装の余地がある。例えば、本発明を顕微鏡検査法に応用する場合、図７のものに極めてよく似たシステム構成に頼ることになり、流体要素７４０、７４２、７００及び７４０は、当該分野で周知のような、サンプルをビームに曝露するための適切なサンプルホルダに置き換えられ、図９及び１０についても同様である。言い換えると、本明細書の新規な装置及び方法についての記載内容を考えると、本発明を顕微鏡検査法分野に適合させることは完全に本開示の範囲内である。本発明が有益となり得る蛍光顕微鏡検査法の１つの具体的な応用が生体内でのイメージング、例えば医学的診断に用いる方法及び装置である。これらには、外部から光学的にアクセス可能な器官、例えば皮膚及び目、また内視鏡を使用して光学的にアクセス可能な器官、例えば気道、消化管並びに手術での身体の他の器官又は部位の分析及び診断が含まれる。実験室ベースの蛍光顕微鏡検査法の場合と同様に、本明細書に記載の装置及び方法を適合させることは完全に本発明の範囲内であり、装置及びプロセスステップを挙げた実例から少し変更することしか必要としない。したがって、本発明の有用性は挙げた例及び図に限定されず、請求の全範囲に及ぶものとする。
【００７９】
パルス光エネルギービームのソースを設けるステップと、
サンプルをこのビームに曝露するように構成されたサンプルホルダを設けるステップと、
多数のスペクトル検出チャネルを備えたディテクタを設けるステップと、
ビームソースからサンプルまでの第１光路を設けるステップと、
サンプルからディテクタまの第２光路を設けるステップと、
信号処理モジュールを設けるステップと、
サンプルをビームに曝露するステップと、
信号処理モジュールを、
ディテクタから電気信号を受け取り、
電気信号の個々の減衰曲線を減衰スーパーカーブへと数学的に結合し、ここでスーパーカーブは多数の成分を含み、各成分は時定数及びスーパーカーブへの相対的コントリビューションを有し、
時定数をスーパーカーブから抽出し、
スーパーカーブへの個々の成分の相対的コントリビューションを定量化するために使用するステップとを含み、
スペクトル検出チャネルは電磁スペクトルの異なる波長セクションに感受性があり且つビームとサンプルとの相互作用から生じる光信号を検出するように構成され、さらに光信号を各電気信号に変換するように構成される、
粒子アナライザを使用してサンプル中の粒子を分析する方法を開示する。
【００８０】
パルス光エネルギービームのソースとして内部変調レーザを設けるステップと、
粒子懸濁物を含むサンプルをこのビームに曝露し且つ光信号をビームと粒子との相互作用から生成するための光励起チャンバとして構成されたフローセルを設けるステップと、
多数のスペクトル検出チャネルを備えたディテクタを設けるステップと、
ビームソースからサンプルまでの第１光路を設けるステップと、
サンプルからディテクタまでの第２光路を設けるステップと、
粒子懸濁物のための流路を設けるステップと、
フローセルと流路、第１光路及び第２光路のそれぞれとを接続するステップと、
ＦＰＧＡ、ＤＳＰチップ、ＡＳＩＣ、ＣＰＵ、マイクロプロセッサ、マイクロコントローラ、シングルボードコンピュータ、スタンドアロンコンピュータ及びクラウドベースのプロセッサの１つを含む信号処理モジュールを設けるステップと、
サンプル中の粒子をビームに曝露するステップと、
信号処理モジュールを
ディテクタから電気信号を受け取り、
電気信号の個々の減衰曲線を減衰スーパーカーブへと数学的に結合し、ここでスーパーカーブは多数の成分を含み、各成分は時定数及びスーパーカーブへの相対的コントリビューションを有し、
時定数をスーパーカーブから抽出し、
個々の成分のスーパーカーブへの相対的コントリビューションを定量化するために使用するステップと、
流路における少なくとも１回の流れの進路変更に基づいた、さらに一時的な気泡、加圧式チャンバ、加圧式／減圧式チャンバ対及び圧力変換器の１つをベースとした、流路に接続された粒子選別アクチュエータを設けるステップと、
アクチュエータに接続されたアクチュエータドライバを設けるステップと、
少なくとも１つの粒子回収容器を設けるステップと、
粒子回収容器に粒子懸濁物からの少なくとも１つの粒子を回収するステップとを含み、
スペクトル検出チャネルは電磁スペクトルの異なる波長セクションに感受性があり且つビームと粒子との相互作用から生じる蛍光信号を検出するように構成され、さらに光信号を各電気信号に変換するように構成され、
ドライバはアクチュエーション信号を信号処理モジュールから受け取るように構成される、
粒子アナライザ／ソータを使用してサンプル中の粒子を分析及び選別する方法を開示する。
【００８１】
パルス光エネルギービームのソースを設けるステップと、
サンプルをこのビームに曝露するように構成したサンプルホルダを設けるステップと、
多数のスペクトル検出チャネルを備えたディテクタを設けるステップと、
ビームソースからサンプルまでの第１光路を設けるステップと、
サンプルからディテクタまでの第２光路を設けるステップと、
信号処理モジュールを設けるステップと、
サンプルをビームに曝露するステップと、
信号処理モジュールを、
ディテクタから電気信号を受け取り、
電気信号における個々の減衰曲線を減衰スーパーカーブへと数学的に結合し、ここでスーパーカーブは多数の成分を含み、各成分は時定数及びスーパーカーブへの相対的コントリビューションを有し、
スーパーカーブの個々の成分を既定の時定数の異なるビンに割り当て、
個々の成分のスーパーカーブへの相対的コントリビューションを定量化するために使用するステップとを含み、
スペクトル検出チャネルは電磁スペクトルの異なる波長セクションに感受性があり且つビームとサンプルとの相互作用から生じる光信号を検出するように構成され、さらに光信号を各電気信号に変換するように構成される、粒子アナライザを使用してサンプル中の粒子を分析する方法を開示する。
【００８２】
パルス光エネルギービームのソースとして内部変調レーザを設けるステップと、
粒子懸濁物を含むサンプルをこのビームに曝露し且つビームと粒子との相互作用から光信号を生成するための光励起チャンバとして構成されたフローセルを設けるステップと、
多数のスペクトル検出チャネルを備えたディテクタを設けるステップと、
ビームソースからサンプルまでの第１光路を設けるステップと、
サンプルからディテクタまでの第２光路を設けるステップと、
粒子懸濁物のための流路を設けるステップと、
フローセルと流路、第１光路及び第２光路のそれぞれとを接続するステップと、
ＦＰＧＡ、ＤＳＰチップ、ＡＳＩＣ、ＣＰＵ、マイクロプロセッサ、マイクロコントローラ、シングルボードコンピュータ、スタンドアロンコンピュータ及びクラウドベースのプロセッサの１つを含む信号処理モジュールを設けるステップと、
サンプル中の粒子をビームに曝露するステップと、
信号処理モジュールを、
ディテクタから電気信号を受け取り、
電気信号における個々の減衰曲線を減衰スーパーカーブへと数学的に結合し、ここでスーパーカーブは多数の成分を含み、各成分は時定数及びスーパーカーブへの相対的コントリビューションを有し、
スーパーカーブの個々の成分を既定の時定数の異なるビンに割り当て、
個々の成分のスーパーカーブへの相対的コントリビューションを定量化するために使用するステップと、
流路における少なくとも１回の流れの進路変更に基づいた、さらに一時的な気泡、加圧式チャンバ、加圧式／減圧式チャンバ対及び圧力変換器の１つをベースとした、流路に接続された粒子選別アクチュエータを設けるステップと、
アクチュエータに接続されたアクチュエータドライバを設けるステップと、
少なくとも１つの粒子回収容器を設けるステップと、
粒子回収容器に粒子懸濁物からの少なくとも１つの粒子を回収するステップとを含み、
スペクトル検出チャネルは電磁スペクトルの異なる波長セクションに感受性があり且つビームとサンプルとの相互作用から生じる蛍光信号を検出するように構成され、さらに光信号を各電気信号に変換するように構成され、
ドライバはアクチュエーション信号を信号処理モジュールから受け取るように構成された、
粒子アナライザ／ソータを使用してサンプル中の粒子を分析及び選別する方法を開示する。
【００８３】
上記の明細書において、本発明の実施形態をその具体的な実施形態例を参照しながら説明してきた。しかしながら、本発明の広い趣旨及び範囲から逸脱することなく様々な改変及び変更を加え得ることは明白である。したがって、明細書及び図面は限定というよりは説明の便宜上のものであるとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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