(57)【要約】免疫適合性のある絨毛膜を含む胎盤膜生成物が本明細書に提供される。そのような胎盤膜生成物は、凍結保存され、解凍後、治療的因子及び生存細胞を含有し得る。胎盤膜生成物は、血管新生を促進し、炎症を低減させ、瘢痕形成を低減させることができ、治癒を促進する他の方法を可能にする場合に、創傷治癒または組織修復／再生に有用である。本技術は、損傷若しくは負傷した組織を保護するための生成物、または細菌を排除する、細菌活性を阻害する、または組織の治癒若しくは成長を促進するための被覆剤としての生成物に関する。本分野はまた、そのような膜由来生成物の製造の方法及びその使用の方法に関する。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
凍結保存された絨毛膜を含む膜であって、凍結保存及びその後の解凍後、前記絨毛膜が、
Ａ）組織細胞であって、前記絨毛膜に対して天然であり、前記組織細胞の４０％超が生存している、組織細胞と、
Ｂ）前記絨毛膜に対して天然である１つ以上の治療的因子と、
Ｃ）前記絨毛膜に対して天然である細胞外マトリックスと、
Ｄ）枯渇量の１種以上の機能的免疫原性細胞と、を含む、前記膜。
【請求項２】
前記枯渇量の１種以上の機能的免疫原性細胞が、母体血細胞、新生児血細胞、組織マクロファージ、及び栄養膜細胞から選択される、請求項１に記載の前記膜。
【請求項３】
前記枯渇量の１種以上の機能的免疫原性細胞が、ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ１８＋、ＣＤ４０＋、及びＣＤ８６＋からなる群から選択される１つ以上の組織マクロファージを含む、請求項２に記載の前記膜。
【請求項４】
前記枯渇量の１種以上の機能的免疫原性細胞が、免疫応答を生じるのに十分なレベルよりも低い量で免疫原性因子を産生する、請求項１に記載の前記膜。
【請求項５】
前記１種以上の機能的免疫原性細胞が、３５０ｐｇ／ｃｍ２以下の量でＴＮＦ−αを産生する、請求項４に記載の前記膜。
【請求項６】
前記枯渇量の１種以上の機能的免疫原性細胞が、検出可能限界より低い量で免疫原性因子を産生する、請求項１に記載の前記膜。
【請求項７】
前記膜は、胎盤栄養膜細胞が実質的に枯渇している、請求項２に記載の前記膜。
【請求項８】
前記細胞外マトリックスが、１つ以上の細胞外マトリックスタンパク質を含む、請求項１に記載の前記膜。
【請求項９】
前記生存細胞が、１つ以上の上皮細胞、間葉幹細胞、線維芽細胞、またはその組み合わせを含む、請求項１に記載の前記膜。
【請求項１０】
前記組織細胞の約５０％〜約１００％が生存している、請求項１に記載の前記膜。
【請求項１１】
前記組織細胞の約６０％〜約１００％が生存している、請求項１に記載の前記膜。
【請求項１２】
前記組織細胞の約７０％〜約１００％が生存している、請求項１に記載の前記膜。
【請求項１３】
生存細胞の１０％未満が、機能的ＣＤ１４＋マクロファージである、請求項１に記載の前記膜。
【請求項１４】
生存細胞の１％未満が、機能的ＣＤ１４＋マクロファージである、請求項１に記載の前記膜。
【請求項１５】
凍結保存された絨毛膜を含む膜であって、凍結保存及びその後の解凍後、前記絨毛膜が、
Ａ）生存細胞、１つ以上の治療的因子、及び細胞外マトリックスを含む間質細胞層と、
Ｂ）枯渇量の１種以上の機能的免疫原性細胞と、を含み、
前記間質細胞層中の前記細胞の４０％超が生存細胞である、前記膜。
【請求項１６】
凍結保存された胎盤膜を含む膜であって、凍結保存及びその後の解凍後、前記胎盤膜が、
Ａ）組織細胞であって、前記胎盤膜に対して天然であり、前記組織細胞の４０％超が生存している、組織細胞と、
Ｂ）前記胎盤膜に対して天然である１つ以上の治療的因子と、
Ｃ）前記胎盤膜に対して天然である細胞外マトリックスと、
Ｄ）枯渇量の１種以上の機能的免疫原性細胞と、を含む、前記膜。
【請求項１７】
前記胎盤膜が、羊膜及び絨毛膜を含む、請求項１６に記載の前記膜。
【請求項１８】
前記枯渇量の１種以上の機能的免疫原性細胞が、母体血細胞、新生児臍帯血細胞、組織マクロファージ、及び栄養膜細胞から選択される、請求項１６に記載の前記膜。
【請求項１９】
前記枯渇量の１種以上の機能的免疫原性細胞が、ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ１８＋、ＣＤ４０＋、及びＣＤ８６＋からなる群から選択される１つ以上の組織マクロファージを含む、請求項１８に記載の前記膜。
【請求項２０】
前記枯渇量の１種以上の機能的免疫原性細胞が、免疫応答を生じるのに十分なレベルよりも低い量で免疫原性因子を産生する、請求項１６に記載の前記膜。
【請求項２１】
前記１種以上の機能的免疫原性細胞が、３５０ｐｇ／ｃｍ２以下の量でＴＮＦ−αを産生する、請求項２０に記載の前記膜。
【請求項２２】
前記枯渇量の１種以上の機能的免疫原性細胞が、検出可能限界より低い量で免疫原性因子を産生する、請求項１６に記載の前記膜。
【請求項２３】
前記膜は、胎盤栄養膜細胞が実質的に枯渇している、請求項１６に記載の前記膜。
【請求項２４】
前記細胞外マトリックスが、１つ以上の細胞外マトリックスタンパク質を含む、請求項１６に記載の前記膜。
【請求項２５】
前記生存細胞が、１つ以上の上皮細胞、間葉幹細胞、線維芽細胞、またはその組み合わせを含む、請求項１６に記載の前記膜。
【請求項２６】
前記組織細胞の約５０％〜約１００％が生存している、請求項１６に記載の前記膜。
【請求項２７】
前記組織細胞の約６０％〜約１００％が生存している、請求項１６に記載の前記膜。
【請求項２８】
前記組織細胞の約７０％〜約１００％が生存している、請求項１６に記載の前記膜。
【請求項２９】
生存細胞の１０％未満が、機能的ＣＤ１４＋マクロファージである、請求項１６に記載の前記膜。
【請求項３０】
生存細胞の１％未満が、機能的ＣＤ１４＋マクロファージである、請求項１６に記載の前記膜。
【請求項３１】
１つ以上の組織成分を有する凍結保存された絨毛膜を含む膜であって、凍結保存及びその後の解凍後、前記１つ以上の組織成分が、
Ａ）組織細胞であって、前記絨毛膜に対して天然であり、前記組織細胞の４０％超が生存している、組織細胞と、
Ｂ）前記絨毛膜に対して天然である１つ以上の治療的因子と、
Ｃ）前記絨毛膜に対して天然である細胞外マトリックスと、を含み、
前記絨毛膜が、枯渇量の機能的免疫原性細胞を有し、
前記１つ以上の組織成分が、治療利益を提供するのに有効な量で存在する、前記膜。
【請求項３２】
１つ以上の組織成分を有する凍結保存された絨毛膜を含む膜であって、凍結保存及びその後の解凍後、前記１つ以上の組織成分が、
Ａ）組織細胞であって、前記絨毛膜に対して天然であり、前記組織細胞の４０％超が生存している、組織細胞と、
Ｂ）前記絨毛膜に対して天然である１つ以上の治療的因子と、
Ｃ）前記絨毛膜に対して天然である細胞外マトリックスと、を含み、
前記絨毛膜が、枯渇量の機能的免疫原性細胞を有し、
前記１つ以上の組織成分が、
（ｉ）炎症性サイトカインの量及び／若しくは活性を低減させる、
（ｉｉ）抗炎症性サイトカインの量及び／若しくは活性を増大させる、
（ｉｉｉ）反応性酸素種の量及び／若しくは活性を低減させる、
（ｉｖ）抗酸化剤の量及び／若しくは活性を増大させる、
（ｖ）プロテアーゼの量及び／若しくは活性を低減させる、
（ｖｉ）細胞増殖を増大させる、
（ｖｉｉ）血管新生を増大させる、ならびに／または
（ｖｉｉｉ）細胞遊走を増大させるのに有効な量で存在する、前記膜。
【請求項３３】
前記１つ以上の組織成分が、インビトロで、
（ｉ）炎症性サイトカインの量及び／若しくは活性の低減、
（ｉｉ）抗炎症性サイトカインの量及び／若しくは活性の増大、
（ｉｉｉ）反応性酸素種の量及び／若しくは活性の低減、
（ｉｖ）抗酸化剤の量及び／若しくは活性の増大、
（ｖ）プロテアーゼの量及び／若しくは活性の低減、
（ｖｉ）細胞増殖の増大、
（ｖｉｉ）血管新生の増大、ならびに／または
（ｖｉｉｉ）細胞遊走の増大を促進するのに有効な量で存在する、請求項３２に記載の前記膜。
【請求項３４】
前記１つ以上の組織成分が、インビボで、
（ｉ）炎症性サイトカインの量及び／若しくは活性の低減、
（ｉｉ）抗炎症性サイトカインの量及び／若しくは活性の増大、
（ｉｉｉ）反応性酸素種の量及び／若しくは活性の低減、
（ｉｖ）抗酸化剤の量及び／若しくは活性の増大、
（ｖ）プロテアーゼの量及び／若しくは活性の低減、
（ｖｉ）細胞増殖の増大、
（ｖｉｉ）血管新生の増大、ならびに／または
（ｖｉｉｉ）細胞遊走の増大を促進するのに有効な量で存在する、請求項３２に記載の前記膜。
【請求項３５】
前記膜が治療利益を必要とする対象に適用されるとき、前記１つ以上の組織成分が、
（ｉ）炎症性サイトカインの量及び／若しくは活性を低減させる、
（ｉｉ）抗炎症性サイトカインの量及び／若しくは活性を増大させる、
（ｉｉｉ）反応性酸素種の量及び／若しくは活性を低減させる、
（ｉｖ）抗酸化剤の量及び／若しくは活性を増大させる、
（ｖ）プロテアーゼの量及び／若しくは活性を低減させる、
（ｖｉ）細胞増殖を増大させる、
（ｖｉｉ）血管新生を増大させる、ならびに／または
（ｖｉｉｉ）細胞遊走を増大させるのに有効な量で存在する、請求項３１に記載の前記膜。
【請求項３６】
前記絨毛膜が、送達基質に固定されている、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の前記膜。
【請求項３７】
前記送達基質がニトロセルロースを含む、請求項３６に記載の前記膜。
【請求項３８】
前記凍結保存された絨毛膜が、その後の解凍の前に長期間保存される、請求項１〜３５のいずれかに記載の前記膜。
【請求項３９】
前記長期間が、約６カ月〜少なくとも約３６カ月間である、請求項３８に記載の前記膜。
【請求項４０】
前記組織細胞の前記生存率が、解凍時に実質的に維持される、請求項３８に記載の前記膜。
【請求項４１】
前記組織細胞の前記生存率が、凍結保存されるとき、少なくとも約２４カ月間実質的に維持される、請求項１〜３５のいずれかに記載の前記膜。
【請求項４２】
前記凍結保存された絨毛膜が、解凍され、解凍方法の開始から３０分以内に使える状態であり得る、請求項１〜３５のいずれかに記載の前記膜。
【請求項４３】
対象における創傷の治療方法であって、前記創傷の部位に、凍結保存された絨毛膜を含む膜を投与することを含み、凍結保存及びその後の解凍後、前記絨毛膜が、
Ａ）組織細胞であって、前記絨毛膜に対して天然であり、前記組織細胞の４０％超が生存している、組織細胞と、
Ｂ）前記絨毛膜に対して天然である１つ以上の治療的因子と、
Ｃ）前記絨毛膜に対して天然である細胞外マトリックスと、
Ｄ）枯渇量の１つ以上の１種以上の機能性免疫原性細胞と、を含み、
投与時、前記膜が、
（ｉ）炎症性サイトカインの量及び／若しくは活性の低減、
（ｉｉ）抗炎症性サイトカインの量及び／若しくは活性の増大、
（ｉｉｉ）反応性酸素種の量及び／若しくは活性の低減、
（ｉｖ）抗酸化剤の量及び／若しくは活性の増大、
（ｖ）プロテアーゼの量及び／若しくは活性の低減、
（ｖｉ）細胞増殖の増大、
（ｖｉｉ）血管新生の増大、ならびに／または
（ｖｉｉｉ）細胞遊走の増大、のうちの１つ以上を促進するのに有効な量で前記生存細胞、細胞外マトリックス、及び／または１つ以上の治療的因子を提供する、前記方法。
【請求項４４】
前記創傷が、裂傷、擦り傷、火傷、切開、刺し傷、発射体に起因する創傷、表皮創傷、皮膚創傷、慢性創傷、急性創傷、外部創傷、内部創傷、先天性創傷、潰瘍、褥瘡、糖尿病性潰瘍、トンネル創傷、外科的処置中若しくはそれに付属するものとして生じる創傷、静脈皮膚潰瘍、脊髄損傷、眼創傷、眼損傷、耳損傷、耳鼻咽喉創傷若しくは損傷、眼損傷、及び虚血壊死の群から選択される、請求項４３に記載の前記方法。
【請求項４５】
前記創傷が、裂傷、火傷、慢性創傷、急性創傷、糖尿病性潰瘍、外科的処置中若しくはそれに付属するものとして生じる創傷、及び静脈皮膚潰瘍からなる群から選択される、請求項４３に記載の前記方法。
【請求項４６】
前記膜が、
（ｉ）炎症性サイトカインの量及び／若しくは活性の低減、
（ｉｉ）抗炎症性サイトカインの量及び／若しくは活性の増大、
（ｉｉｉ）反応性酸素種の量及び／若しくは活性の低減、
（ｉｖ）抗酸化剤の量及び／若しくは活性の増大、
（ｖ）プロテアーゼの量及び／若しくは活性の低減、
（ｖｉ）細胞増殖の増大、
（ｖｉｉ）血管新生の増大、ならびに／または
（ｖｉｉｉ）細胞遊走の増大、のうちの１つ以上を直接的または間接的に促進する、請求項４３に記載の前記方法。
【請求項４７】
治癒を必要とする創傷を有する対象における創傷治癒の加速方法であって、
ａ）前記創傷の部位に、請求項１〜３５のいずれかに記載の膜を投与することを含み、
前記投与が、初期投与ステップから１２週間後までに創傷閉口を促進するのに有効である、前記方法。
【請求項４８】
治癒を必要とする創傷を有する対象における創傷治癒の加速方法であって、
ａ）前記創傷の部位に、請求項１〜３５のいずれかに記載の膜を投与することを含み、
前記投与が、初期投与ステップから５〜６週間後までに創傷閉口を促進するのに有効である、前記方法。
【請求項４９】
治癒を必要とする創傷を有する対象における創傷治癒の加速方法であって、
ａ）前記創傷の部位に、請求項１〜３５のいずれかに記載の膜を投与することを含み、
前記投与が、初期投与ステップから２８日後に５０％以上の創傷サイズの低減を促進するのに有効である、前記方法。
【請求項５０】
治癒を必要とする創傷を有する対象における創傷閉口速度の改善方法であって、
ａ）前記創傷の部位に、請求項１〜３５のいずれかに記載の膜を投与することを含み、
前記投与が、標準的な創傷治療と比較して、創傷閉口速度を少なくとも約４４％改善するのに有効である、前記方法。
【請求項５１】
これまでの創傷治癒では効果がない創傷に対する対象の治療方法であって、
ａ）前記創傷の部位に、請求項１〜３５のいずれかに記載の膜を投与することを含み、
前記投与が、初期投与ステップから１２週間後までに創傷閉口を促進するのに有効である、前記方法。
【請求項５２】
慢性創傷を治療するための方法であって、前記創傷の部位に、凍結保存された絨毛膜を含む膜を投与することを含み、凍結保存及びその後の解凍後、前記絨毛膜が、
Ａ）組織細胞であって、前記絨毛膜に対して天然であり、前記組織細胞の４０％超が生存している、組織細胞と、
Ｂ）前記絨毛膜に対して天然である１つ以上の治療的因子と、
Ｃ）前記絨毛膜に対して天然である細胞外マトリックスと、
Ｄ）枯渇量の１つ以上の１種以上の機能的免疫原性細胞と、を含み、
前記投与が、前記慢性創傷の治癒を促進するのに有効な量で、前記生存治療的細胞、細胞外マトリックス、及び１つ以上の治療的因子を提供する、前記方法。
【請求項５３】
対象における炎症性眼状態の治療方法であって、前記対象に、凍結保存された絨毛膜を含む膜を投与することを含み、凍結保存及びその後の解凍後、前記絨毛膜が、
Ａ）組織細胞であって、前記絨毛膜に対して天然であり、前記組織細胞の４０％超が生存している、組織細胞と、
Ｂ）前記絨毛膜に対して天然である１つ以上の治療的因子と、
Ｃ）前記絨毛膜に対して天然である細胞外マトリックスと、
Ｄ）枯渇量の１つ以上の１種以上の機能的免疫原性細胞と、を含み、
前記投与が、前記炎症性眼状態を治療するのに有効な量で、前記生存治療的細胞、細胞外マトリックス、及び１つ以上の治療的因子を提供する、前記方法。
【請求項５４】
前記炎症性眼状態が、炎症によって特徴付けられる創傷または疾患である、請求項５３に記載の前記方法。
【請求項５５】
対象における組織修復及び／または組織再生の促進方法であって、前記対象に、凍結保存された絨毛膜を含む膜を投与することを含み、凍結保存及びその後の解凍後、前記絨毛膜が、
Ａ）組織細胞であって、前記絨毛膜に対して天然であり、前記組織細胞の４０％超が生存している、組織細胞と、
Ｂ）前記絨毛膜に対して天然である１つ以上の治療的因子と、
Ｃ）前記絨毛膜に対して天然である細胞外マトリックスと、
Ｄ）枯渇量の１種以上の機能的免疫原性細胞と、を含み、
前記投与が、組織修復及び／または組織再生を促進するのに有効な量で、前記生存治療的細胞、細胞外マトリックス、及び１つ以上の治療的因子を提供する、前記方法。
【請求項５６】
前記方法が、組織移植片処置、腱手術、靱帯手術、骨手術、及び脊髄手術からなる群から選択される外科的処置と組み合わせて使用される、請求項５５に記載の前記方法。
【請求項５７】
前記組織が、ヒト組織である、請求項５５に記載の前記方法。
【請求項５８】
前記ヒト組織が、軟骨、皮膚、靱帯、腱、または骨である、請求項５７に記載の前記方法。
【請求項５９】
前記膜が、組織再生を直接的または間接的に刺激する、請求項５５に記載の前記方法。
【請求項６０】
炎症応答の調節方法であって、前記創傷に、凍結保存された絨毛膜を含む膜を投与することを含み、凍結保存及びその後の解凍後、前記絨毛膜が、
Ａ）組織細胞であって、前記絨毛膜に対して天然であり、前記組織細胞の４０％超が生存している、組織細胞と、
Ｂ）前記絨毛膜に対して天然である１つ以上の治療的因子と、
Ｃ）前記絨毛膜に対して天然である細胞外マトリックスと、
Ｄ）枯渇量の１種以上の機能的免疫原性細胞と、を含み、
前記投与が、炎症性サイトカインの量を低減させ、及び／または抗炎症性サイトカインの量を増大させるのに有効な量で、前記生存細胞、細胞外マトリックス、及び／または１つ以上の治療的因子を提供する、前記方法。
【請求項６１】
前記炎症性サイトカインが、本質的には、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１αの阻害、またはその組み合わせからなる、請求項６０に記載の前記方法。
【請求項６２】
前記抗炎症性サイトカインが、本質的には、ＩＬ−１０若しくはＰＧＥ２、またはそれらの組み合わせからなる、請求項６０に記載の前記方法。
【請求項６３】
プロテアーゼ活性の調節方法であって、前記創傷に、凍結保存された絨毛膜を含む膜を投与することを含み、凍結保存及びその後の解凍後、前記絨毛膜が、
Ａ）組織細胞であって、前記絨毛膜に対して天然であり、前記組織細胞の４０％超が生存している、組織細胞と、
Ｂ）前記絨毛膜に対して天然である１つ以上の治療的因子と、
Ｃ）前記絨毛膜に対して天然である細胞外マトリックスと、
Ｄ）枯渇量の１種以上の機能的免疫原性細胞と、を含み、
前記投与が、プロテアーゼ活性を低減させ、及び／またはプロテアーゼ阻害剤の量を増大させるのに有効な量で、前記生存細胞、細胞外マトリックス、及び／または１つ以上の治療的因子を提供する、前記方法。
【請求項６４】
前記プロテアーゼが、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）及びエラスターゼ、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項６３に記載の前記方法。
【請求項６５】
前記１つ以上のプロテアーゼ阻害剤が、マトリックスメタロプロテアーゼの組織阻害剤（ＴＩＭＰ）を含む、請求項６３に記載の前記方法。
【請求項６６】
反応性酸素種（ＲＯＳ）の量及び／または活性の低減方法であって、前記創傷に、凍結保存された絨毛膜を含む膜を投与することを含み、凍結保存及びその後の解凍後、前記絨毛膜が、
Ａ）組織細胞であって、前記絨毛膜に対して天然であり、前記組織細胞の４０％超が生存している、組織細胞と、
Ｂ）前記絨毛膜に対して天然である１つ以上の治療的因子と、
Ｃ）前記絨毛膜に対して天然である細胞外マトリックスと、
Ｄ）枯渇量の１種以上の機能的免疫原性細胞と、を含み、
前記投与が、ＲＯＳの量及び／若しくは活性を低減させ、ならびに／または抗酸化剤の量及び／若しくは活性を増大させるのに有効な量で、前記生存細胞、細胞外マトリックス、及び／または１つ以上の治療的因子を提供する、前記方法。
【請求項６７】
前記生存治療的細胞、細胞外マトリックス、及び１つ以上の治療的因子が、２５０ｍＭのアスコルビン酸溶液に相当する抗酸化能力を提供するのに有効な量で提供される、請求項６６に記載の前記方法。
【請求項６８】
血管新生の増大方法であって、創傷に、凍結保存された絨毛膜を含む膜を投与することを含み、凍結保存及びその後の解凍後、前記絨毛膜が、
Ａ）組織細胞であって、前記絨毛膜に対して天然であり、前記組織細胞の４０％超が生存している、組織細胞と、
Ｂ）前記絨毛膜に対して天然である１つ以上の治療的因子と、
Ｃ）前記絨毛膜に対して天然である細胞外マトリックスと、
Ｄ）枯渇量の１種以上の機能的免疫原性細胞と、を含み、
前記投与が、血管新生を増大させるのに有効な量で、前記生存細胞、細胞外マトリックス、及び／または１つ以上の治療的因子を提供する、前記方法。
【請求項６９】
前記生存治療的細胞、細胞外マトリックス、及び１つ以上の治療的因子が、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）若しくは塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、またはそれらの組み合わせの量及び／または活性を増大させるのに有効な量で提供される、請求項６８に記載の前記方法。
【請求項７０】
創傷の部位への細胞遊走の増大方法であって、創傷に、凍結保存された絨毛膜を含む膜を投与することを含み、凍結保存及びその後の解凍後、前記絨毛膜が、
Ａ）組織細胞であって、前記絨毛膜に対して天然であり、前記組織細胞の４０％超が生存している、組織細胞と、
Ｂ）前記絨毛膜に対して天然である１つ以上の治療的因子と、
Ｃ）前記絨毛膜に対して天然である細胞外マトリックスと、
Ｄ）枯渇量の１種以上の機能的免疫原性細胞と、を含み、
前記投与が、細胞遊走を増大させるのに有効な量で、前記生存細胞、細胞外マトリックス、及び／または１つ以上の治療的因子を提供する、前記方法。
【請求項７１】
前記細胞遊走が、内皮細胞、線維芽細胞、及び上皮細胞、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される細胞を含む、請求項７０に記載の前記方法。
【請求項７２】
細胞増殖の増大方法であって、創傷に、凍結保存された絨毛膜を含む膜を投与することを含み、凍結保存及びその後の解凍後、前記絨毛膜が、
Ａ）組織細胞であって、前記絨毛膜に対して天然であり、前記組織細胞の４０％超が生存している、組織細胞と、
Ｂ）前記絨毛膜に対して天然である１つ以上の治療的因子と、
Ｃ）前記絨毛膜に対して天然である細胞外マトリックスと、
Ｄ）枯渇量の１種以上の機能的免疫原性細胞と、を含み、
前記投与が、細胞増殖を増大させるのに有効な量で、前記生存細胞、細胞外マトリックス、及び／または１つ以上の治療的因子を提供する、前記方法。
【請求項７３】
対象における瘢痕または拘縮形成の防止または低減方法であって、前記対象に、凍結保存された絨毛膜を含む膜を投与することを含み、凍結保存及びその後の解凍後、前記絨毛膜が、
Ａ）組織細胞であって、前記絨毛膜に対して天然であり、前記組織細胞の４０％超が生存している、組織細胞と、
Ｂ）前記絨毛膜に対して天然である１つ以上の治療的因子と、
Ｃ）前記絨毛膜に対して天然である細胞外マトリックスと、
Ｄ）枯渇量の機能性ＣＤ１４＋マクロファージと、を含み、
前記投与が、瘢痕または拘縮形成を防止するまたは低減させるのに有効な量で、前記生存治療的細胞、細胞外マトリックス、及び１つ以上の治療的因子を提供する、前記方法。
【請求項７４】
前記生存治療的細胞、細胞外マトリックス、及び１つ以上の治療的因子が、瘢痕形成を予防するまたは低減させるのに有効な量で、ＩＦＮ−２αを増大させるのに有効な量で提供される、請求項７３に記載の前記方法。
【請求項７５】
前記生存治療的細胞、細胞外マトリックス、及び１つ以上の治療的因子が、瘢痕形成を予防するまたは低減させるのに有効な量で、ＴＧＦ−β３を増大させるのに有効な量で提供される、請求項７３に記載の前記方法。
【請求項７６】
前記創傷への前記膜の投与が、前記方法を直接的または間接的に刺激するまたは誘導させる、請求項５５〜７５のいずれかに記載の前記方法。
【請求項７７】
創傷または組織欠損を治療するためのキットであって、
Ａ）薬学的に許容される容器中の請求項１〜３５のいずれかに記載の膜と、
Ｂ）前記創傷または前記組織欠損を治療するための前記膜を投与するための取扱説明書と、を備える、前記キット。
【請求項７８】
前記キットが、添加剤をさらに含む、請求項７７に記載の前記キット。
【請求項７９】
前記添加剤が、１種以上の抗生物質、皮膚軟化剤、角質溶解剤、保湿剤、抗酸化剤、保存剤、治療剤、救急絆、ツール、裁断装置、緩衝液、解凍媒体、処理媒体、鉗子、容器、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項７８に記載の前記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、表題「Ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  Ａｍｎｉｏｔｉｃ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ」ならびに治療的胎盤組成物、その作製の方法、及びその使用の方法で、２０１４年５月７日に同時出願されており、参照によりその全体が組み込まれる。
【０００２】
本技術は、創傷治癒または組織修復／再生を促進または改善する方法及び生成物に関し、これには、例えば、胎盤膜由来生成物及び凍結保存された胎盤生成物、ならびに血管新生の刺激、成長因子の分泌、プロテアーゼ及びフリーラジカル酸化の阻害のうちの１つ以上の組み合わせ等の創傷におけるまたは創傷の部位付近若しくは部位での治癒を促進する方法が含まれる。本技術は、損傷若しくは負傷した組織を保護するための生成物、または細菌を排除する、細菌活性を阻害する、または組織の治癒若しくは成長を促進するための被覆剤としての生成物に関する。そのような胎盤膜の一例は、絨毛膜である。本分野はまた、そのような膜由来生成物の製造の方法及びその使用の方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌが皮膚塗布のために胎盤膜の使用を報告した少なくとも１９１０年以降、新鮮なまたは脱細胞化した胎盤膜は、外科的適用において局所的に使用されている。それに続いて、分離していない羊膜及び絨毛膜は、火傷または潰瘍のある表面を治療するために使用された。１９５０年代及び６０年代には、Ｔｒｏｅｎｓｅｇａａｒｄ−Ｈａｎｓｅｎ氏が、煮沸した羊膜を慢性下腿潰瘍に塗布した。
【０００４】
ヒト絨毛膜（ＣＭ）は、発育中の胎児と母親との間で妊娠中に存在する膜のうちの１つである。それは、胚外中胚葉によって形成され、胚及びその他の膜を取り囲む。絨毛膜絨毛は、絨毛膜から出現し、子宮内膜に侵入し、母体血から胎児血への栄養物の運搬を可能にする。
【０００５】
新鮮な及び凍結したＣＭの両方が、創傷治癒治療法に使用されている。ＣＭは、例えば、細胞外マトリックス、成長因子、及び生存細胞等の創傷治癒に貢献し得る、多くの因子を含有する。いくつかの保存方法がマトリックスまたは成長因子等の因子のいくつかのレベルを維持し得るが、生存細胞の保存レベルは、課題をもたらす。新鮮なＣＭが使用される場合、疾患伝播リスクの増加がある。公開された報告書によれば、新鮮な胎盤組織、例えば、絨毛膜組織は、高い細胞生存率を示すが、０℃を超える２８日以内の保存で細胞生存率は１５％から３５％に減少する。３週間にわたる凍結は、温度または培地にかかわらず、細胞生存率を１３％から１８％に低減させた。ＣＭは、免疫原性があると考えられているが、市販の創傷治癒製品に使用されていない。
【０００６】
現在、（新生児包皮由来の）生体細胞を含有する２つの市販の遺伝子操作された組織移植片生成物である、Ａｐｌｉｇｒａｆ及びＤｅｒｍａｇｒａｆｔがある。Ａｐｌｉｇｒａｆ及びＤｅｒｍａｇｒａｆｔは両方とも、培養拡張された細胞を含む。ＡｐｌｉｇｒａｆまたはＤｅｒｍａｇｒａｆｔはいずれも、自然創傷治癒プロセスと関連する因子である、例えば、インスリン様成長因子結合タンパク質−１（ＩＧＦＢＰ−１）等の検出可能なレベルのある特定の因子を含まない。加えて、ＡｐｌｉｇｒａｆまたはＤｅｒｍａｇｒａｆｔはいずれも、創傷治癒に適し得る、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）対組織マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤（ＴＩＭＰＳ）のある特定の比率（ＭＭＰ対ＴＩＭＰの比率、または概して、プロテアーゼ対プロテアーゼ阻害剤の比率）を示さない。創傷治癒が多因子の生物学的プロセスである場合、多くの因子が創傷を適切に治療するために必要とされ、低量の生存細胞を有する生成物は、皮膚中に存在する増加した生存細胞集団を有する生成物と比較して、創傷をあまり治癒することができない。創傷治癒、創傷包帯剤、化粧用途のような適用、またはより高いパーセンテージの生存細胞、及び例えば、成長因子、抗酸化剤、抗炎症性薬剤、血管新生及びサイトカインを促進する薬剤を含む増加した量の因子を表す細胞集団を含む生物学的代用皮膚として使用することができる、絨毛膜由来の生成物を提供することは当該技術分野で進歩を表し得る。
【０００７】
Ａｐｌｉｇｒａｆは、ウシのＩ型コラーゲンと組み合わせた新生児の包皮ケラチノサイト及び線維芽細胞を用いて製造された生きている２層の代用皮膚である。本出願で使用される、Ａｐｌｉｇｒａｆは、１９９８年にＦＤＡにより承認された委託販売で入手可能である生成物を指す。
【０００８】
Ｄｅｒｍａｇｒａｆｔは、合成細胞外マトリックス、及び生体吸収性ポリグラクチンメッシュ足場上に播種した新生児の包皮組織に由来する凍結保存されたヒト線維芽細胞である。その生成物の文献によれば、Ｄｅｒｍａｇｒａｆｔは、使用前に３回の洗浄ステップを必要とし、３回未満の洗浄ステップを必要とする生成物と比較して、創傷包帯剤としてＤｅｒｍａｇｒａｆｔの実用的な実装を制限する。本出願で使用される、Ｄｅｒｍａｇｒａｆｔは、２００１年にＦＤＡにより承認された委託販売で入手可能である生成物を指す。
【０００９】
Ａｐｌｉｇｒａｆ及びＤｅｒｍａｇｒａｆｔ等の遺伝子操作された創傷包帯剤は、準最適な細胞組成物を含むため、創傷治癒の最良の可能性を提供せず、したがって、適切な創傷治癒を提供しない。例えば、Ａｐｌｉｇｒａｆ及びＤｅｒｍａｇｒａｆｔは、ＭＳＣまたは固有組織細胞外マトリックスを含まず、結果として、細胞によって分泌される異なる因子間の比率は、効率的な創傷治癒を可能にしない。さらに、ＥＧＦ、ＩＧＦＢＰ１、及びアジポネクチンを含む創傷治癒に重要であるいくつかの因子は、検出できないか、またはＡｐｌｉｇｒａｆ及びＤｅｒｍａｇｒａｆｔの両方に不在である。さらに、ＭＭＰ及びＴＩＭＰを含むいくつかの因子は、天然創傷治癒プロセスにおいて見出される割合とは大いに異なる割合で存在し、この差は、とりわけ、上流の炎症性サイトカイン経路を著しく変更し、同様に、創傷部位で準最適な微小環境を可能にする。これらの遺伝子操作された生成物におけるマトリックス組成物は、コラーゲンＩ型のみを含み、これはまた、ヒアルロン酸も含んでもよい。これは、様々なコラーゲン（例えば、コラーゲンＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ等）、エラスチン、糖タンパク質、及びプロテオグリカン等の成分を含む皮膚の複合体構造マトリックスとは異なる。皮膚はまた、真皮中に間葉幹細胞を含み、これは、遺伝子操作された生成物であるＡｐｌｉｇｒａｆ及びＤｅｒｍａｇｒａｆｔの代表的な例には欠いている。
【００１０】
Ｐａｑｕｅｔ−Ｆｉｆｉｅｌｄらは、間葉幹細胞及び線維芽細胞が創傷治癒に重要であることを報告している（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，２００９，１１９：２７９５）。間葉幹細胞及び線維芽細胞を含む生成物は依然として説明されていない。
【００１１】
ＭＭＰ及びＴＩＭＰの両方は、創傷治癒に重要である因子の中にある。しかしながら、これらのタンパク質の発現は、高度に調節され、適合させなければならない。過剰なＭＭＰ対ＴＩＭＰは、不良な慢性創傷治癒のマーカーである（Ｌｉｕら，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ，２００９，３２：１１７、Ｍｗａｕｒａら，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｖａｓｃ  Ｅｎｄｏｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ，２００６，３１：３０６、Ｔｒｅｎｇｏｖｅら，Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐ  Ｒｅｇ，１９９９，７：４４２、Ｖａａｌａｍｏら，Ｈｕｍ  Ｐａｔｈｏｌ，１９９９，３０：７９５）。
【００１２】
α２−マクログロブリン及び／またはその受容体は、セリンプロテイナーゼ、システインプロテイナーゼ、アスパラギン酸プロテイナーゼ、及びメタロプロテイナーゼの４つすべての機構的クラスからのプロテアーゼを不活性化する血漿タンパク質として知られている（Ｂｏｒｔｈら，ＦＡＳＥＢ  Ｊ，１９９２，６：３３４５、Ｂａｋｅｒら，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ，２００２，１１５：３７１９）。このタンパク質のもう１つの重要な機能は、サイトカイン及び成長因子の貯蔵所としての役割を果たすことであり、これらの例には、ＴＧＦ、ＰＤＧＦ、及びＦＧＦが含まれる（Ａｓｐｌｉｎら，Ｂｌｏｏｄ，２００１，９７：３４５０、Ｈｕａｎｇら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，１９８８；２６３：１５３５）。糖尿病性潰瘍または静脈性潰瘍等の慢性創傷では、豊富な量のプロテアーゼの存在は、成長因子の急速分解をもたらし、創傷治癒を遅延させる。それ故に、α２−マクログロブリンを含む胎盤生成物は、当該技術分野において進歩を成し得る。
【００１３】
ｂＦＧＦは、血管新生、組織修復、及び創傷治癒を含む様々な細胞プロセスを調節する（Ｐｒｅｓｔａら，２００５、Ｒｅｕｓｓら，２００３、及びＳｕら，２００８）。創傷治癒モデルでは、ｂＦＧＦは、創傷の部位で創傷閉口を増大させ、血管形成を増強することが示されている（Ｇｒｅｅｎｈａｌｇｈら，１９９０）。
【００１４】
インビトロの細胞遊走アッセイは、生成物の創傷治癒の可能性を評価するために重要である。創傷治癒プロセスは、非常に複雑であり、成長因子により制御された一連の構造化事象を含む（Ｇｏｌｄｍａｎ，Ａｄｖ  Ｓｋｉｎ  Ｗｏｕｎｄ  Ｃａｒｅ，２００４，１：２４）。これらの事象は、血管新生の増加、炎症性免疫細胞による浸透、及び細胞増殖の増加を含む。創傷治癒の開始段階は、創傷領域を閉鎖し、周辺組織を再建するために、創傷に向かって個々の細胞の能力が分極し、創傷した領域に遊走することを中心に展開する。細胞遊走と創傷治癒との間の相関関係を試験することによって、創傷治療薬の創傷治癒の可能性を評価することができるアッセイが当該技術分野において進歩を表し得る。後に続く本開示で論じられるように、本技術の態様は、血管新生を促進し、抗炎症活性を促進し、抗酸化活性を促進し、増加した量の様々な成長因子を提供する生成物及び方法に関するように、当該技術分野において飛躍的な進歩を表す。以下により詳述するように、これらの生成物及び方法は、多くの創傷治癒適用、軟組織の修復、または骨形成の修復で使用することができる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
一態様では、本開示は、凍結保存された絨毛膜を含む膜を提供し、凍結保存及びその後の解凍後、該絨毛膜は
Ａ）組織細胞であって、絨毛膜に対して天然であり、該組織細胞の約４０％超が生存している、組織細胞と、
Ｂ）絨毛膜に対して天然である１つ以上の治療的因子と、
Ｃ）絨毛膜に対して天然である細胞外マトリックスと、
Ｄ）枯渇量の１種以上の機能的免疫原性細胞と、を含む。
【００１６】
別の態様では、本開示は、凍結保存された絨毛膜を含む膜を提供し、凍結保存及びその後の解凍後、該絨毛膜は、
Ａ）生存細胞、１つ以上の治療的因子、及び細胞外マトリックスを含む間質細胞層と、
Ｂ）枯渇量の１種以上の機能的免疫原性細胞と、を含み、間質細胞層中の細胞の約４０％超は生存細胞である。
【００１７】
一態様では、本開示は、１つ以上の組織成分を有する凍結保存された絨毛膜を含む膜を提供し、凍結保存後及びその後の解凍後、１つ以上の組織成分が、
Ａ）組織細胞であって、絨毛膜に対して天然であり、該組織細胞の約４０％超が生存している、組織細胞と、
Ｂ）絨毛膜に対して天然である１つ以上の治療的因子と、
Ｃ）絨毛膜に対して天然である細胞外マトリックスと、を含み、
絨毛膜が、枯渇量の機能的免疫原性細胞を有し、１つ以上の組織成分が、治療利益を提供するのに有効な量で存在する。
【００１８】
一態様では、本開示は、１つ以上の組織成分を有する凍結保存された絨毛膜を含む膜を提供し、凍結保存後及びその後の解凍後、１つ以上の組織成分が、
Ａ）組織細胞であって、絨毛膜に対して天然であり、該組織細胞の約４０％超が生存している、組織細胞と、
Ｂ）絨毛膜に対して天然である１つ以上の成長の治療的因子と、
Ｃ）絨毛膜に対して天然である細胞外マトリックスと、を含み、
絨毛膜が、枯渇量の機能的免疫原性細胞を有し、１つ以上の組織成分が、
（ｉ）炎症性サイトカインの量及び／若しくは活性を低減させる、
（ｉｉ）抗炎症性サイトカインの量及び／若しくは活性を増大させる、
（ｉｉｉ）反応性酸素種の量及び／若しくは活性を低減させる、
（ｉｖ）抗酸化剤の量及び／若しくは活性を増大させる、
（ｖ）プロテアーゼの量及び／若しくは活性を低減させる、
（ｖｉ）細胞増殖を増大させる、
（ｖｉｉ）血管新生を増大させる、ならびに／または
（ｖｉｉｉ）細胞遊走を増大させるのに有効な量で存在する。
【００１９】
別の態様では、本開示は、凍結保存された胎盤膜を含む膜を提供し、凍結保存及びその後の解凍後、胎盤膜が、
Ａ）組織細胞であって、該組織細胞が胎盤膜に対して天然であり、該組織細胞の４０％超が生存している、組織細胞と、
Ｂ）胎盤膜に対して天然である１つ以上の治療的因子と、
Ｃ）胎盤膜に対して天然である細胞外マトリックスと、
Ｄ）枯渇量の１種以上の機能的免疫原性細胞と、を含む。
【００２０】
この態様のいくつかの実施形態では、胎盤膜は、羊膜及び絨毛膜を含む。
【００２１】
上記の態様のいくつかの実施形態では、枯渇量の機能的免疫原性細胞は、免疫応答を生じるのに十分なレベルよりも低い量で免疫原性因子を産生する。いくつかの実施形態では、枯渇量の機能的免疫原性細胞は、検出可能限界より低い量で免疫原性因子を産生する。
【００２２】
上記の態様の実施形態では、膜は、組織細胞を含み、該組織細胞の約５０％〜約１００％が生存している。いくつかの実施形態では、該組織細胞の約６０％〜約１００％が生存している。さらなる実施形態では、該組織細胞の約７０％〜約１００％が生存している。
【００２３】
上記の態様の様々な実施形態では、膜は、インビトロまたはインビボで（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）の活性のうちのいずれかを促進するのに有効である量で１つ以上組織成分（例えば、生存細胞、１つ以上の治療的因子、及び／または細胞外マトリックス）を提供する。
【００２４】
上記の態様の様々な実施形態は、送達基質をさらに含んでもよく、そのため、膜が送達基質に固定される。
【００２５】
上記の態様の実施形態では、膜は、その後の解凍の前に長期間保存されてもよい。いくつかの実施形態では、長時間は、約６カ月〜約２４カ月若しくはそれ以上、あるいは約６カ月〜少なくとも約１２カ月若しくはそれ以上、あるいは約６カ月〜約１０カ月、あるいは約６カ月、あるいは約３カ月〜約６カ月、あるいは約１カ月〜約３カ月であり、これには本明細書に記載される様々な期間のその他の毎月及び日の導出が含まれる。これらの実施形態では、組織細胞の生存率は、解凍時に実質的に維持される。いくつかの実施形態では、組織細胞の生存率は、冷凍で保存されるとき、少なくとも約２４カ月間またはそれ以上実質的に維持される。
【００２６】
上記の態様の実施形態では、膜は、解凍され、解凍方法の開始から３０分以内に使える状態であり得る。
【００２７】
上記の態様のうちのいくつかの実施形態では、膜は、解凍してから最長１時間生理食塩水中で保存することができ、依然として、約７０％の生存細胞を維持することができる。
【００２８】
別の態様では、本開示は、対象における創傷の治療方法を提供し、本方法は、凍結保存された絨毛膜を含む膜を投与することを含み、凍結保存及びその後の解凍後、該絨毛膜は、
Ａ）組織細胞であって、該絨毛膜に対して天然であり、該組織細胞の４０％超が生存している、組織細胞と、
Ｂ）絨毛膜に対して天然である１つ以上の治療的因子と、
Ｃ）絨毛膜に対して天然である細胞外マトリックスと、
Ｄ）枯渇量の１種以上の機能的免疫原性細胞と、を含み、
投与時、該膜が、
（ｉ）炎症性サイトカインの量及び／若しくは活性の低減、
（ｉｉ）抗炎症性サイトカインの量及び／若しくは活性の増大、
（ｉｉｉ）反応性酸素種の量及び／若しくは活性の低減、
（ｉｖ）抗酸化剤の量及び／若しくは活性の増大、
（ｖ）プロテアーゼの量及び／若しくは活性の低減、
（ｖｉ）細胞増殖の増大、
（ｖｉｉ）血管新生の増大、ならびに／または
（ｖｉｉｉ）細胞遊走の増大、のうちの１つ以上を促進するのに有効な量で生存細胞、細胞外マトリックス、及び／または１つ以上の治療的因子を提供する。
【００２９】
別の態様では、本開示は、創傷治癒を加速させるための方法を提供し、本方法は、本明細書に記載される態様及び実施形態のうちのいずれかに従って、膜を投与することを含む。いくつかの実施形態では、投与は、初期投与ステップから１２週間後までに創傷閉口を促進するのに有効である。いくつかの実施形態では、投与は、初期投与ステップから５〜６週間後までに創傷閉口を促進するのに有効である。いくつかの実施形態では、投与は、初期投与ステップから２８日後に５０％以上の創傷サイズの低減を促進するのに有効である。実施形態では、投与は、標準的な創傷治療と比較して、創傷閉口速度を少なくとも約４４％改善するのに有効である。
【００３０】
別の実施形態では、本開示は、これまでの創傷治癒では効果がない創傷に対する対象の治療方法を提供し、本方法は、本明細書に記載される態様及び実施形態のうちのいずれかに従って、創傷の部位に、膜を投与することを含む。いくつかの実施形態では、投与は、初期投与ステップから１２週間後までに創傷閉口を促進するのに有効である。いくつかの実施形態では、投与は、初期投与ステップから５〜６週間後までに創傷閉口を促進するのに有効である。いくつかの実施形態では、投与は、初期投与ステップから２８日後に５０％以上の創傷サイズの低減を促進するのに有効である。
【００３１】
別の態様では、本開示は、慢性創傷を治療するための方法を提供し、本方法は、凍結保存された絨毛膜を含む膜を投与することを含み、凍結保存及びその後の解凍後、該絨毛膜は、
Ａ）組織細胞であって、該絨毛膜に対して天然であり、該組織細胞の４０％超が生存している、組織細胞と、
Ｂ）絨毛膜に対して天然である１つ以上の治療的因子と、
Ｃ）絨毛膜に対して天然である細胞外マトリックスと、
Ｄ）枯渇量の１種以上の機能的免疫原性細胞と、を含み、
投与が、慢性創傷の治癒を促進するのに有効な量で、生存治療的細胞、細胞外マトリックス、及び１つ以上の治療的因子を提供する。
【００３２】
別の態様では、本開示は、急性創傷を治療するための方法を提供し、本方法は、凍結保存された絨毛膜を含む膜を投与することを含み、凍結保存及びその後の解凍後、該絨毛膜は、
Ａ）組織細胞であって、該絨毛膜に対して天然であり、該組織細胞の４０％超が生存している、組織細胞と、
Ｂ）絨毛膜に対して天然である１つ以上の治療的因子と、
Ｃ）絨毛膜に対して天然である細胞外マトリックスと、
Ｄ）枯渇量の１種以上の機能的免疫原性細胞と、を含み、
該投与が、急性創傷の治癒を促進するのに有効な量で、生存治療的細胞、細胞外マトリックス、及び１つ以上の治療的因子を提供する。
【００３３】
創傷治療、創傷治療の加速、及び／または慢性創傷治療に関する上記の態様の実施形態では、創傷は、裂傷、擦り傷、火傷、切開、刺し傷、発射体に起因する創傷、表皮創傷、皮膚創傷、慢性創傷、急性創傷、外部創傷、内部創傷、先天性創傷、潰瘍、褥瘡、糖尿病性潰瘍、トンネル創傷、外科的処置中若しくはそれに付属するものとして生じる創傷、静脈皮膚潰瘍、及び虚血壊死からなる群から選択されてもよい。
【００３４】
方法に関する上記の態様の実施形態では、膜は、（ｉ）炎症性サイトカインの量及び／若しくは活性の低減、（ｉｉ）抗炎症性サイトカインの量及び／若しくは活性の増大、（ｉｉｉ）反応性酸素種の量及び／若しくは活性の低減、（ｉｖ）抗酸化剤の量及び／若しくは活性の増大、（ｖ）プロテアーゼの量及び／若しくは活性の低減、（ｖｉ）細胞増殖の増大、（ｖｉｉ）血管新生の増大、ならびに／または（ｖｉｉｉ）細胞遊走の増大、のうちの１つ以上を直接的または間接的に促進し得る。
【００３５】
別の態様では、本開示は、対象における炎症性眼状態の治療方法を提供し、本方法は、対象に、凍結保存された絨毛膜を含む膜を投与することを含み、凍結保存及びその後の解凍後、該絨毛膜は、
Ａ）組織細胞であって、該絨毛膜に対して天然であり、該組織細胞の４０％超が生存している、組織細胞と、
Ｂ）絨毛膜に対して天然である１つ以上の治療的因子と、
Ｃ）絨毛膜に対して天然である細胞外マトリックスと、
Ｄ）枯渇量の１種以上の機能的免疫原性細胞と、を含み、
この投与は、炎症性眼状態を治療するのに有効な量で、生存治療的細胞、細胞外マトリックス、及び１つ以上の治療的因子を提供する。
【００３６】
この態様のいくつかの実施形態では、炎症性眼状態は、炎症によって特徴付けられる創傷または疾患である。
【００３７】
別の態様では、本開示は、対象における組織修復及び／または組織再生の促進方法を提供し、本方法は、対象に、凍結保存された絨毛膜を含む膜を投与することを含み、凍結保存及びその後の解凍後、該絨毛膜は、
Ａ）組織細胞であって、該絨毛膜に対して天然であり、該組織細胞の４０％超が生存している、組織細胞と、
Ｂ）絨毛膜に対して天然である１つ以上の治療的因子と、
Ｃ）絨毛膜に対して天然である細胞外マトリックスと、
Ｄ）枯渇量の１種以上の機能的免疫原性細胞と、を含み、
この投与は、組織修復及び／または組織再生を促進するのに有効な量で、生存治療的細胞、細胞外マトリックス、及び１つ以上の治療的因子を提供する。
【００３８】
この態様のいくつかの実施形態では、本方法は、組織移植片処置、腱手術、靱帯手術、骨手術、及び脊髄手術からなる群から選択される外科的処置と組み合わせて使用される。いくつかの実施形態では、該組織は、ヒト組織である。さらなる実施形態では、ヒト組織は、軟骨、皮膚、靱帯、腱、または骨である。この態様及び様々な実施形態では、膜は、組織再生を直接的または間接的に刺激してもよい。
【００３９】
別の態様では、本開示は、炎症応答の調節方法を提供し、本方法は、創傷に、凍結保存された絨毛膜を含む膜を投与することを含み、凍結保存及びその後の解凍後、該絨毛膜は、
Ａ）組織細胞であって、該絨毛膜に対して天然であり、該組織細胞の４０％超が生存している、組織細胞と、
Ｂ）絨毛膜に対して天然である１つ以上の治療的因子と、
Ｃ）絨毛膜に対して天然である細胞外マトリックスと、
Ｄ）枯渇量の１種以上の機能的免疫原性細胞と、を含み、
この投与は、炎症性サイトカインの量及び／若しくは活性を低減させ、ならびに／または抗炎症性サイトカインの量及び／若しくは活性を増大させるのに有効な量で、生存細胞、細胞外マトリックス、及び／または１つ以上の治療的因子を提供する。
【００４０】
一態様では、本開示は、膜を含むプロテアーゼ活性の調節方法を提供し、本方法は、創傷に、凍結保存された絨毛膜を含む膜を投与することを含み、凍結保存及びその後の解凍後、該絨毛膜は、
Ａ）組織細胞であって、該絨毛膜に対して天然であり、該組織細胞の４０％超が生存している、組織細胞と、
Ｂ）絨毛膜に対して天然である１つ以上の治療的因子と、
Ｃ）絨毛膜に対して天然である細胞外マトリックスと、
Ｄ）枯渇量の１種以上の機能的免疫原性細胞と、を含み、
この投与は、プロテアーゼの量及び／若しくは活性を低減させ、ならびに／またはプロテアーゼ阻害剤の量及び／若しくは活性を増大させるのに有効な量で、生存細胞、細胞外マトリックス、及び／または１つ以上の治療的因子を提供する。
【００４１】
さらなる態様では、本開示は、反応性酸素種（ＲＯＳ）の量及び／または活性の低減方法ならびに抗酸化剤の量及び／または活性の増大方法を提供し、本方法は、創傷に、凍結保存された絨毛膜を含む膜を投与することを含み、凍結保存及びその後の解凍後、該絨毛膜は、
Ａ）組織細胞であって、該絨毛膜に対して天然であり、該組織細胞の４０％超が生存している、組織細胞と、
Ｂ）絨毛膜に対して天然である１つ以上の治療的因子と、
Ｃ）絨毛膜に対して天然である細胞外マトリックスと、
Ｄ）枯渇量の１種以上の機能的免疫原性細胞と、を含み、
この投与は、ＲＯＳの量及び／若しくは活性を低減させ、ならびに／または抗酸化剤の量及び／若しくは活性を増大させるのに有効な量で、生存細胞、細胞外マトリックス、及び／または１つ以上の治療的因子を提供する。
【００４２】
別の態様では、本開示は、血管新生の増大方法を提供し、本方法は、創傷に、凍結保存された絨毛膜を含む膜を投与することを含み、凍結保存及びその後の解凍後、該絨毛膜は、
Ａ）組織細胞であって、該絨毛膜に対して天然であり、該組織細胞の４０％超が生存している、組織細胞と、
Ｂ）絨毛膜に対して天然である１つ以上の治療的因子と、
Ｃ）絨毛膜に対して天然である細胞外マトリックスと、
Ｄ）枯渇量の１種以上の機能的免疫原性細胞と、を含み、
この投与は、血管新生を増大させるのに有効な量で、生存細胞、細胞外マトリックス、及び１つ以上の治療的因子を提供する。
【００４３】
別の態様では、本開示は、細胞遊走の増大方法を提供し、本方法は、創傷に、凍結保存された絨毛膜を含む膜を投与することを含み、凍結保存及びその後の解凍後、該絨毛膜は、
Ａ）組織細胞であって、該絨毛膜に対して天然であり、該組織細胞の４０％超が生存している、組織細胞と、
Ｂ）絨毛膜に対して天然である１つ以上の治療的因子と、
Ｃ）絨毛膜に対して天然である細胞外マトリックスと、
Ｄ）枯渇量の１種以上の機能的免疫原性細胞と、を含み、
この投与は、細胞遊走を増大させるのに有効な量で、生存細胞、細胞外マトリックス、及び１つ以上の治療的因子を提供する。
【００４４】
さらに別の態様では、本開示は、細胞増殖の増大方法を提供し、本方法は、創傷に、凍結保存された絨毛膜を含む膜を投与することを含み、凍結保存及びその後の解凍後、該絨毛膜は、
Ａ）組織細胞であって、該絨毛膜に対して天然であり、該組織細胞の４０％超が生存している、組織細胞と、
Ｂ）絨毛膜に対して天然である１つ以上の治療的因子と、
Ｃ）絨毛膜に対して天然である細胞外マトリックスと、
Ｄ）枯渇量の１種以上の機能的免疫原性細胞と、を含み、
この投与は、細胞増殖を増大させるのに有効な量で、生存細胞、細胞外マトリックス、及び１つ以上の治療的因子を提供する。
【００４５】
一態様では、本開示は、対象における瘢痕または拘縮形成の防止または低減方法を提供し、本方法は、該対象に、凍結保存された絨毛膜を含む膜を投与することを含み、凍結保存及びその後の解凍後、該絨毛膜が、
Ａ）組織細胞であって、該絨毛膜に対して天然であり、該組織細胞の４０％超が生存している、組織細胞と、
Ｂ）絨毛膜に対して天然である１つ以上の治療的因子と、
Ｃ）絨毛膜に対して天然である細胞外マトリックスと、
Ｄ）枯渇量の１種以上の機能的免疫原性細胞と、を含み、
この投与は、瘢痕または拘縮形成を防止または低減させるのに有効な量で、生存治療的細胞、細胞外マトリックス、及び１つ以上の治療的因子を提供する。
【００４６】
炎症応答の調節方法、プロテアーゼ活性の調節方法、抗酸化剤の量及び／若しくは活性の増大方法、血管新生の増大／促進方法、細胞遊走の増大方法、細胞増殖の増大方法、または瘢痕若しくは拘縮形成の低減方法に関する上記の態様のうちのいずれかでは、膜の投与は、直接的若しくは間接的に刺激的に誘発し得るか、または本方法を誘発し得る。
【００４７】
別の態様では、本開示は、創傷または組織欠損を治療するためのキットを提供し、該キットは、
Ａ）薬学的に許容される容器中に本明細書に記載される態様及び実施形態のうちのいずれかに従う膜と、
Ｂ）創傷または組織欠損を治療するために膜を投与するための取扱説明書と、を備える。
【００４８】
実施形態では、該キットは、添加剤をさらに含んでもよい。さらなる実施形態では、添加剤は、１種以上の抗生物質、皮膚軟化剤、角質溶解剤、保湿剤、抗酸化剤、治療剤、救急絆、ツール、裁断装置、緩衝液、解凍媒体、処理媒体、鉗子、容器、及びそれらの組み合わせから選択されてもよい。
【００４９】
本開示は、他の態様及び実施形態を提供し、これらは、続き説明及び非限定的実施例から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１Ａ】様々な冷凍方法の冷凍速度及び様々な量の凍結保存溶液を示す。図１Ａは、−８０℃で冷凍する前に４℃での３０分間の冷蔵ステップを含んだ。
【図１Ｂ】様々な冷凍方法の冷凍速度及び様々な量の凍結保存溶液を示す。図１Ｂは、−８０℃で冷凍する前に４℃での３０分間の冷蔵ステップを含んだ。
【図１Ｃ】様々な冷凍方法の冷凍速度及び様々な量の凍結保存溶液を示す。図１Ｃは、−８０℃で冷凍する前に４℃での３０分間の冷蔵ステップを含んだ。
【図１Ｄ】様々な冷凍方法の冷凍速度及び様々な量の凍結保存溶液を示す。図１Ｄは、−８０℃で冷凍する前に４℃での３０分間の冷蔵ステップを含んだ。
【図１Ｅ】様々な冷凍方法の冷凍速度及び様々な量の凍結保存溶液を示す。図１Ｅは、−８０℃での直接冷凍を示す。
【図１Ｆ】様々な冷凍方法の冷凍速度及び様々な量の凍結保存溶液を示す。図１Ｆは、−８０℃での直接冷凍を示す。
【図１Ｇ】様々な冷凍方法の冷凍速度及び様々な量の凍結保存溶液を示す。図１Ｇは、−８０℃での直接冷凍を示す。
【図１Ｈ】様々な冷凍方法の冷凍速度及び様々な量の凍結保存溶液を示す。図１Ｈは、−８０℃での直接冷凍を示す。
【図２Ａ】様々な量の凍結保存溶液で保存した場合の羊膜の細胞処理回復率（Ａ）及び細胞生存率（Ｂ）を示す。
【図２Ｂ】様々な量の凍結保存溶液で保存した場合の細胞生存率（Ｂ）を示す。
【図３Ａ】様々な量の凍結保存溶液で保存した場合の絨毛膜の細胞処理回復率（Ａ）及び細胞生存率（Ｂ）を示す。
【図３Ｂ】様々な量の凍結保存溶液で保存した場合の細胞生存率（Ｂ）を示す。
【図４】絨毛羊膜の細胞生存率における凍結保存の効果を示す。
【図５Ａ】羊膜（Ａ）及び絨毛膜（Ｂ）の膜の処理（凍結保存）での細胞回復率における冷蔵時間及び冷凍パラメータの効果を示す。
【図５Ｂ】絨毛膜（Ｂ）の膜の処理（凍結保存）での細胞回復率における冷蔵時間及び冷凍パラメータの効果を示す。
【図６】羊膜の細胞生存率における冷蔵時間及び冷凍パラメータの効果を示す。
【図７】生／死滅染色で染色された、新鮮な羊膜（Ａ及びＣ）ならびに絨毛膜（Ｅ）の膜、ならびに凍結保存された羊膜（Ｂ及びＤ）ならびに絨毛膜（Ｆ）の膜の代表的な画像を示す。生細胞は緑色に見えるが、死滅細胞は赤色に見える。
【図８】中間体−栄養膜、絨毛栄養膜（ＣＴ）、絨毛栄養膜を含む羊膜（ＡＣＴ）、羊膜（ＡＭ）、絨毛膜（ＣＭ）、及び絨毛膜を含む羊膜（Ａ／Ｃ）を製造することから様々な胎盤膜によって刺激されるＴ細胞からのＩＬ−２Ｒαの発現を測定する混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイからの結果を示す。
【図９】中間体の製造による様々な胎盤膜及び凍結保存後の胎盤膜である、羊膜（ＡＭ）、絨毛膜（ＣＭ）、羊膜＋絨毛膜（Ａ／Ｃ）によって刺激されるＴ細胞からのＩＬ−２Ｒαの発現を測定するＭＬＲアッセイからの結果を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、様々な膜調製、羊膜＋絨毛膜＋栄養膜（ＡＣＴ）、絨毛膜＋栄養膜（ＣＴ）、栄養膜（Ｔ）、羊膜（ＡＭ）、及び絨毛膜（ＣＭ）から放出されたリポ多糖類（ＬＰＳ）で刺激したＴＮＦ−αを示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、様々な膜調製、羊膜＋絨毛膜＋栄養膜（ＡＣＴ）、絨毛膜＋栄養膜（ＣＴ）、栄養膜（Ｔ）、羊膜（ＡＭ）、及び絨毛膜（ＣＭ）から放出されたリポ多糖類（ＬＰＳ）で刺激したＴＮＦ−αを示す。
【図１１】高レベルのＴＮＦ−αを分泌した絨毛栄養膜（ＣＴ）によって刺激されるＴ細胞からのＩＬ−２Ｒαの発現を示す。
【図１２Ａ】プラスチック接着を示す、羊膜（Ａ）から単離される培養細胞の画像を示す。
【図１２Ｂ】プラスチック接着を示す、絨毛膜（Ｂ）から単離される培養細胞の画像を示す。
【図１２Ｃ】ヒト骨髄吸引から単離されるＭＳＣを比較（Ｃ）として示す。
【図１２Ｄ】胎盤由来細胞の骨形成能を、アルカリホスファターゼにおける紫色染色によって示す（Ｄ）。
【図１３】凍結保存された羊膜と比較した、新鮮な羊膜におけるＶＥＧＦの発現を示す。
【図１４Ａ】図１４Ａは、羊膜ホモジネートにおけるＩＦＮ−２α及びＴＧＦ−β３の発現を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、絨毛膜ホモジネートにおけるＩＦＮ−２αの発現を示す。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、絨毛膜ホモジネートにおけるＴＧＦ−β３の発現を示す。
【図１４Ｄ】図１４Ｄ及びＥは、細分化した絨毛膜の胎盤組成物の調製時におけるＩＦＮ−２α及びＴＧＦ−β３の発現を示す。
【図１４Ｅ】図１４Ｅは、細分化した絨毛膜の胎盤組成物の調製時におけるＴＧＦ−β３の発現を示す。
【図１５Ａ】図１５Ａは、羊膜ホモジネートにおけるＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＰＬＡＢ、ＰＬＧＦ（Ａ）の発現を示す。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、羊膜ホモジネートにおけるＩＧＦ−１（Ｂ）の発現を示す。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、絨毛膜ホモジネートにおけるＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７、ＰＬＡＢ、ＰＬＧＦ（Ｃ）の検出を示す。
【図１５Ｄ】図１５Ｄは、絨毛膜ホモジネートにおけるＩＧＦ−１（Ｄ）の検出を示す。
【図１５Ｅ】図１５Ｅは、絨毛膜由来の胎盤組成物におけるＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７、ＰＬＡＢ、ＰＬＧＦ（Ｅ）の検出を示す。
【図１５Ｆ】図１５Ｆは、絨毛膜由来の胎盤組成物におけるＩＧＦ−１（Ｆ）の検出を示す。
【図１６Ａ】羊膜（ＡＭ）、絨毛膜（ＣＭ）中のＥＧＦ（Ａ）ならびに市販の製品の発現を示す。
【図１６Ｂ】羊膜（ＡＭ）、絨毛膜（ＣＭ）中のＩＧＦＢＰ１（Ｂ）ならびに市販の製品の発現を示す。
【図１６Ｃ】羊膜（ＡＭ）、絨毛膜（ＣＭ）中のアジポネクチン（Ｃ）ならびに市販の製品の発現を示す。
【図１７】羊膜、絨毛膜、及び市販の製品におけるＭＭＰ対ＴＩＭＰの比率を示す。
【図１８Ａ】羊膜（ＡＭ）及び絨毛膜（ＣＭ）におけるｂＦＧＦレベル（Ａ）を示す。
【図１８Ｂ】組織抽出物または２人の別々の胎盤ドナーからの上清に由来する絨毛膜（ＣＭ）試料におけるｂＦＧＦの発現（Ｂ）を示す。
【図１９】羊膜がＴＮＦ−αに曝露される場合に、高レベルの抗炎症性サイトカインＰＧＥ２を産生することを実証する。
【図２０Ａ】凍結保存された羊膜が活性化した免疫細胞と共培養された場合に、ＩＬ−１α（Ａ）等の可溶性炎症性サイトカインの放出を阻害することを示す。
【図２０Ｂ】凍結保存された羊膜が活性化した免疫細胞と共培養された場合に、ＴＮＦ−α（Ｂ）等の可溶性炎症性サイトカインの放出を阻害することを示す。
【図２０Ｃ】凍結保存された羊膜が活性化した免疫細胞と共培養された場合に、抗炎症性ＩＬ−１０（Ｃ）の放出を上方調節することを示す。
【図２１】放出された紫色染色の減少によって見られるように、羊膜生成物がＭＭＰ活性を阻害する統計学的に有意な（＊ｐ＜０．０５）能力を示すことを示す。
【図２２Ａ】図２２Ａは、凍結保存された羊膜によるエラスターゼの阻害を示す。
【図２２Ｂ】図２２Ｂは、処理された（細分化された）絨毛膜組成物によるエラスターゼの阻害を示す。
【図２３】凍結保存された羊膜及びアスコルビン酸（強力な抗酸化剤）の抗酸化能力を示す。
【図２４】凍結保存された羊膜は早期アポトーシスヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）を救助することができることを示す。アポトーシス細胞は、クロマチンの凝縮及び核フラグメンテーションにより鮮やかな青色の点のように見える。
【図２５Ａ】図２５Ａは、凍結保存された羊膜がヒト臍血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を促進して、管（羊膜）を形成し、形成された管の数が陰性対照（Ｎｅｇ  Ｃｔｒｌ）よりも著しく多いことを示す。
【図２５Ｂ】図２５Ｂは、最大１４日間培養中の胎盤組成物におけるｂＦＧＦ（Ｂ）の発現を示す。
【図２５Ｃ】図２５Ｃは、最大１４日間培養中の胎盤組成物におけるＶＥＧＦ（Ｃ）の発現を示す。
【図２５Ｄ】図２５（Ｄ）は、胎盤組成物が低酸素状態に供されるときのＶＥＧＦ産生の増加を示す。
【図２６】Ｃｅｌｌ  ＢｉｏｌａｂｓのＣｙｔｏｓｅｌｅｃｔ  ２４ウェル創傷治癒アッセイを示す。
【図２７】羊膜、絨毛膜、または羊膜／絨毛膜の調製物の組み合わせからの５％  馴化培地で処理されたヒト皮膚微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）の代表的な画像を示す。
【図２８】凍結保存された羊膜（羊膜）による内皮細胞遊走の促進を示す。
【図２９】凍結保存された羊膜（羊膜）による線維芽細胞遊走の促進を示す。
【図３０】凍結保存された羊膜（羊膜）による罹患したケラチン生成細胞遊走の促進を示す。
【図３１】図３１Ａ及びＢは、本技術の胎盤組成物の増殖能を示す。
【図３２Ａ】図３２Ａは、患者１における糖尿病性足潰瘍を治療するための胎盤生成物の驚くべき有効性を示す。
【図３２Ｂ】図３２Ｂは、患者１における糖尿病性足潰瘍を治療するための胎盤生成物の驚くべき有効性を示す。
【図３２Ｃ】図３２Ｃは、患者１における糖尿病性足潰瘍を治療するための胎盤生成物の驚くべき有効性を示す。
【図３２Ｄ】図３２Ｄは、患者１における糖尿病性足潰瘍を治療するための胎盤生成物の驚くべき有効性を示す。
【図３２Ｅ】図３２Ｅは、患者１における糖尿病性足潰瘍を治療するための胎盤生成物の驚くべき有効性を示す。
【図３３Ａ】図３３Ａは、患者２における糖尿病性足潰瘍を治療するための胎盤生成物の驚くべき有効性を示す。
【図３３Ｂ】図３３Ｂは、患者２における糖尿病性足潰瘍を治療するための胎盤生成物の驚くべき有効性を示す。
【図３３Ｃ】図３３Ｃは、患者２における糖尿病性足潰瘍を治療するための胎盤生成物の驚くべき有効性を示す。
【図３３Ｄ】図３３Ｄは、患者２における糖尿病性足潰瘍を治療するための胎盤生成物の驚くべき有効性を示す。
【図３４】完全な創傷閉口が、対照（４７人のうちの１０人の患者、２１．０％  創傷閉口、ｐ＝０．０００１）と比較して、胎盤生成物（５０人のうちの３１人の患者、６２．０％  創傷閉口）を受容した患者において有意に高かったことを示す臨床研究の結果を示す。
【図３５】対照と比較した、胎盤生成物に対して１２週間の評価期間中の完全な創傷治癒の統計学的により高い確率を示すカプランマイヤー分析を示す（ｐ＜０．０００１）。
【図３６】胎盤生成物による治療を受けた患者が、対照アームと比較して、完全な創傷閉口を達成するために統計学的により少ない適用が必要としたことを示す（ｐ＝０．０００１）。
【図３７】クロスオーバーして、最大１２週間の胎盤生成物治療法を受ける対照患者（ｎ＝２６）が、６７．８％の創傷閉口の確率を有したことを示すカプランマイヤー分析を示す。
【図３８Ａ】図３８Ａは、本明細書に開示される凍結保存された膜を組み入れる腱の外科的修復のための方法の総括を示す。
【図３８Ｂ】図３８Ｂは、本明細書に開示される凍結保存された膜を組み入れる腱の外科的修復のための方法の総括を示す。
【図３８Ｃ】図３８Ｃは、本明細書に開示される凍結保存された膜を組み入れる腱の外科的修復のための方法の総括を示す。
【図３８Ｄ】図３８Ｄは、本明細書に開示される凍結保存された膜を組み入れる腱の外科的修復のための方法の総括を示す。
【図３８Ｅ】図３８Ｅは、本明細書に開示される凍結保存された膜を組み入れる腱の外科的修復のための方法の総括を示す。
【図３８Ｆ】図３８Ｆは、本明細書に開示される凍結保存された膜を組み入れる腱の外科的修復のための方法の総括を示す。
【図３９Ａ】図３９Ａは、本明細書に開示される凍結保存された膜を組み入れる腱症の外科的修復のための方法の総括を示す。
【図３９Ｂ】図３９Ｂは、本明細書に開示される凍結保存された膜を組み入れる腱症の外科的修復のための方法の総括を示す。
【図３９Ｃ】図３９Ｃは、本明細書に開示される凍結保存された膜を組み入れる腱症の外科的修復のための方法の総括を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
本明細書で使用される場合、以下の定義を適用する：
【００５２】
「例示的な」（または「例えば」若しくは「例示による」とは、非限定的な実施例を意味する。
【００５３】
「絨毛組織」または「絨毛膜（Ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）」とは、絨毛膜（ｃｈｏｒｉｏｎ）、または胎盤組織、例えば、栄養膜、体中胚葉、またはそれらの組み合わせからの一部を意味する。
【００５４】
「羊膜組織」または「羊膜（Ａｍｎｉｏｔｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）」とは、羊膜、または胎盤組織、例えば、上皮層、基底膜、緻密層、線維芽細胞層、及び中間（海綿）層からの一部を意味する。
【００５５】
「胎盤生成物」または「胎盤膜」とは、本明細書に開示され、かつ特許請求される胎盤生成物を意味する。この用語は、胎盤膜、凍結保存された胎盤膜、凍結保存され絨毛羊膜、凍結保存された絨毛膜、及び凍結保存された羊膜を含み、これらを含む用語と互換可能に使用することができる。胎盤生成物は、組織再生及び創傷修復に対して使用してもよい。
【００５６】
「免疫原性が枯渇した」、「免疫原性細胞が枯渇した」、若しくは「免疫原性因子が枯渇した」膜及び胎盤生成物、または「機能的免疫原性細胞の枯渇量」若しくは「機能的免疫原性細胞のうちの１種以上の枯渇量」を含有する膜及び胎盤生成物は、概して、生存する治療細胞を保持する、ならびに／または組織傷害（若しくは欠損）の治療のための治療効果を保持するが、依然として、少なくとも１つの免疫原性細胞型（例えば、ＣＤ１４＋マクロファージ、栄養膜、及び／若しくは母体血細胞）がない、それらが実質的にない、若しくはそれらが枯渇した、本技術の１つ以上の胎盤生成物、ならびに／またはそうでなければ、天然胎盤、羊膜、または絨毛膜中に存在する免疫原性因子を指す。免疫原性細胞型及び／または免疫原性因子がない、それらが実質的にない、またはそれらが枯渇した膜（本開示された技術のもの等）には、ある量の免疫原性細胞／因子を保持するが、保持された量が、機能的応答をもたらすには不十分な量で（例えば、検出可能な量を下回る、ごく少量で、機能的免疫応答をもたらすには不十分な量で）ある膜が含まれる。
【００５７】
本明細書で使用される「細胞外マトリックス」または「ＥＣＭ」は、例えば、羊膜、絨毛膜、及び／または絨毛羊膜を含む胎盤組織等の組織と関連する細胞外マトリックスの任意の１つ以上の成分を指す。この用語は、ＥＣＭの構造成分、例えば、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ヒアルロナン、デルマタン硫酸塩、ヘパリン硫酸塩、コンドロイチン硫酸塩、デコリン、及びエラスチン、ならびにＥＣＭ（例えば、タンパク質及びそれらの断片を含む）中に存在し得る可溶性／機能的治療的因子を含むことができる。
【００５８】
「ＭＳＣ」は、間葉幹細胞を意味し、胎児、新生児、成人、または出生後が含まれる。「ＭＳＣ」には、羊膜のＭＳＣ（ＡＭＳＣ）及び絨毛膜のＭＳＣ（ＣＭＳＣ）が含まれる。ＭＳＣは、概して、ＣＤ７３、ＣＤ７０、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、及びＣＤ１６６のうちの１つ以上を発現し、概して、ＣＤ４５及びＣＤ３４を発現しない。ＭＳＣは、中胚葉系統（骨形成、軟骨形成、及び脂質生成）に分化する。
【００５９】
「天然細胞」または「組織細胞」は、胎盤膜に天然である、常在する、または内在する細胞、すなわち、羊膜または絨毛膜を含む胎盤膜に体外から加えられない細胞を意味する。
【００６０】
「天然因子」は、胎盤膜に天然である、常在する、または内在する胎盤膜因子、すなわち、胎盤膜に体外から加えられない因子を意味する。
【００６１】
「実質的にない」は、ごく少量のみ存在するまたは全く存在しないことを意味する。例えば、細胞が、未処理のサンプル中の量の約２０％未満、または約１０％未満、または約１％未満で濃縮される場合。
【００６２】
「治療的細胞」または「有益な細胞」は、（羊膜、例えば、細胞、ＭＳＣ、線維芽細胞、及び／または上皮細胞を含む膜のための胎盤膜の間質細胞層及び／または上皮層に存在する細胞及び成分を含むことを意味する。
【００６３】
「治療的因子」は、創傷治癒を促進する、胎盤、絨毛膜、または羊膜由来の因子を意味する。治療的因子はまた、細胞成長因子／タンパク質、組織修復因子／タンパク質、ならびに概して、創傷治癒を促進する他の因子及びタンパク質として分類され得る分子も包含する。治療的因子の非限定的な例には、因子抗微生物因子、化学誘引物質、プロテアーゼ及びプロテアーゼ阻害剤等のリモデリングタンパク質、免疫調節因子、ケモカイン、サイトカイン、成長因子、または他の因子が含まれる。治療的因子はまた、血管新生、細胞増殖、及び上皮形成を促進する因子も含む。そのような因子の非限定的な例には、ＴＧＦα、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＥＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＨＧＦ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＬＧＦ、ＰＥＤＦ、Ａｎｇ−２、ＩＧＦ、ＩＧＦＢＰ１、ＩＧＦＢＰ２、ＩＧＦＢＰ３、アジポネクチン、α２−マクログロブリン、ＦＧＦ（例えば、ＦＧＦ−２／ｂＦＧＦ、ＫＧＦ、ＫＤＧ／ＦＧＦ−７）、マトリックスメタロプロテアーゼ（例えば、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１０、ＭＭＰ−１３）、メタロプロテアーゼの組織阻害剤（例えば、ＴＩＭＰ１、ＴＩＭＰ２）、トロンボスポンジン（例えば、ＴＳＰ１、ＴＳＰ２）、フィブロネクチン、ＩＬ−１ＲＡ、ＮＧＡＬ、ディフェンシン、Ｇ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、ＩＦＮ２α、ＰＬＡＢ、及びＳＤＦ１ｂが含まれる。「治療的因子」という用語は、「胎盤因子」という用語と互換可能に使用してもよい。
【００６４】
「間質細胞」とは、新生児の間葉幹細胞及び新生児の線維芽細胞からなる（任意に天然比率で）存在する混合の細胞集団を指す。新生児の間葉幹細胞及び新生児の線維芽細胞は両方とも免疫特権があり、いずれも免疫応答を誘発する免疫原性細胞型に存在する表面タンパク質を発現しない。
【００６５】
「間質細胞層」とは、上皮層を含有しない胎盤膜中の層を指す。
【００６６】
「インビトロ」は、細胞の培養拡張を含むが、これに限定されない、生物の外側で（例えば、人工培養培地を用いた組織培養条件下で）行われた実験及び／または手順を説明する。
【００６７】
「インビボ」は、生物、例えば、動物またはヒト内で行われた実験及び／または手順を説明する。
【００６８】
「凍結保存剤」または「低温保存法」または「抗凍結剤」は、本明細書では互換可能に使用され、凍結プロセス中、傷害（例えば、細胞傷害）を防ぐのに役立つ物質である。好適な凍結保存剤としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、グリコール、プロピレングリコール、エチレングリコール、プロパンジオール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、１，２−プロパンジオール（ＰＲＯＨ）、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。他の凍結保存剤は、例えば、ポリビニルピロリジオン、ヒドロキシエチルスターチ、単糖類、アルギン酸塩、トレハロース、ラフィノース、デキストラン、ヒト血清アルブミン、フィコール、リポタンパク質、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシエチルストラーチ、自己血漿、またはそれらの組み合わせから選択される、例えば、１つ以上の非細胞透過性の凍結保存剤を含む。有用な凍結保存剤の他の例は、凍結保存において説明されている（ＢｉｏＦｉｌｅｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  ５，Ｎｕｍｂｅｒ  ４  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）データシート）。
【００６９】
「凍結保存溶液」または「凍結保存培地」とは、少なくとも１つの凍結保存剤を含む組成物を指す。凍結保存溶液または培地は、さらなる成分、例えば、血清アルブミン、薬学的に許容される担体、緩衝液、電解質溶液、または生理食塩水（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）を含有してもよい。凍結保存溶液または培地は、溶液、スラリー、懸濁液等であり得る。
【００７０】
一般的な意味では、本明細書に記載される技術は、操作された胎盤組織を含む胎盤生成物を提供する。例えば、胎盤生成物は、凍結保存された絨毛膜、凍結保存された羊膜、及び／または凍結保存された羊膜を含むことができる。ある特定の態様では、凍結保存法は、高量の生存している胎盤細胞（すなわち、胎盤組織（複数を含む）に天然である細胞）を保持し、免疫原性細胞及び免疫原性細胞に関連した因子の枯渇を提供する。したがって、本開示は、胎盤生成物、具体的には、生存細胞、治療的因子、細胞外マトリックス、及び低減した免疫原性の組み合わせを含む、凍結保存羊膜、絨毛膜、及び／または絨毛羊膜を含む膜に関し、あらゆる有益な治療方法での使用を見出す。以下に論じられる特定の態様では、膜は、創傷または組織欠損に適用され、膜が適用される領域の変化を直接的または間接的に誘起することができる、ある量の生存細胞、治療的因子、細胞外マトリックス（例えば、適応型薬剤）を提供することができる。例えば、膜は、（ｉ）炎症性サイトカインの量及び／若しくは活性の低減、（ｉｉ）抗炎症性サイトカインの量及び／若しくは活性の増大、（ｉｉｉ）反応性酸素種の量及び／若しくは活性の低減、（ｉｖ）抗酸化剤の量及び／若しくは活性の増大、（ｖ）プロテアーゼの量及び／若しくは活性の低減、（ｖｉ）細胞増殖の増大、（ｖｉｉ）血管新生の増大、ならびに／または（ｖｉｉｉ）細胞遊走の増大、の促進のうちの任意の１つ以上によって創傷治癒の正常段階を提供または促進し得る量で生存細胞、治療的因子、及び細胞外マトリックスを提供することによって、慢性創傷等の創傷の改善された治癒を提供することができる。慢性創傷環境が、平衡させるために１）高レベルの炎症性サイトカイン、２）低レベルの抗炎症性サイトカイン、３）高レベルのプロテアーゼ及び低レベルのそれらの阻害剤、ならびに４）高レベルの酸化剤及び低レベルの酸化防止剤のうちの任意の１つ以上を含むことができる場合、本明細書に開示される凍結保存された膜の特徴及び機能性は、そのような適用に適切である。
【００７１】
いくつかの実施形態では、本技術は、糖尿病性足潰瘍、静脈下肢潰瘍、及び火傷等の創傷治癒の使用を含む、臨床用途のための胎盤生成物を開示する。製造プロセスは、任意に、胎盤膜からすべての潜在的な免疫原性細胞を本質的に排除するが、創傷治癒における重要な役割を果たす特定の細胞を保存する。
【００７２】
いくつかの実施形態では、本技術は、選択的に失活させる胎盤生成物を開示する。いくつかの実施形態では、胎盤生成物は、実質的にすべての免疫原性細胞が選択的に枯渇してもよい。実施形態では、膜は、培養拡張した細胞を含有しない。
【００７３】
いくつかの実施形態では、本技術は、本明細書に開示される、またはそうでなければ、例えば、インスリン様成長因子結合タンパク質１（ＩＧＦＢＰ１）若しくはアジポネクチン等の知られている、少なくとも１つの治療的因子、または任意の２つ以上の治療的因子の組み合わせを含む胎盤生成物を提供する。実施形態では、胎盤生成物は、上皮成長因子（ＥＧＦ）及び／またはＩＧＦＢＰ１を含んでもよい。実施形態では、本開示は、抗炎症性活性を増大させるために使用することができる胎盤生成物を提供する。実施形態では、本開示は、抗酸化活性を増大させるために使用することができる胎盤生成物を提供する。実施形態では、本開示は、接着及び線維症を低減させ、概して、抗瘢痕活性を促進するために使用することができる胎盤生成物を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、細胞遊走を増大させるために使用することができる胎盤生成物を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、脈管構造の形成を増大させるために使用することができる胎盤生成物を提供する。
【００７４】
いくつかの実施形態では、本技術は、免疫原性細胞を選択的に枯渇させ（例えば、非免疫原性を死滅させるまたは表し）ながら、創傷治癒の促進のための因子の主要な源である特定の有益な細胞の生存を保つ胎盤生成物の凍結保存方法を開示する。
【００７５】
いくつかの実施形態では、本技術は、製造した胎盤生成物の免疫原性を試験するためにバイオアッセイを開示する。
【００７６】
いくつかの実施形態では、本技術は、インビボで示されたものと比較して、ＭＭＰ対ＴＩＭＰの治療可能比を示す胎盤生成物を開示する。本発明者らは、約７〜１０対１のＭＭＰ−９とＴＩＭＰ１の比率を示す胎盤生成物の開発の必要性を特定した。
【００７７】
いくつかの実施形態では、本技術は、α２−マクログロブリンを含む胎盤生成物を開示する。
【００７８】
いくつかの実施形態では、今回、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、及びメタロプロテイナーゼを不活性化することができる胎盤生成物を提供する。他の実施形態では、今回、セリンプロテアーゼを不活性化する胎盤生成物を提供する。今回、システインプロテアーゼを不活性化する胎盤生成物を提供する。さらなる実施形態では、今回、アスパラギン酸プロテアーゼを不活性化する胎盤生成物を提供する。いくつかの実施形態では、今回、メタロプロテイナーゼを不活性化する胎盤生成物を提供する。
【００７９】
いくつかの実施形態では、本技術は、ｂＦＧＦを含む胎盤生成物を開示する。
【００８０】
いくつかの実施形態では、本技術は、創傷治癒に適したＭＭＰ対ＴＩＭＰの比率を示す胎盤生成物を開示する。
【００８１】
いくつかの実施形態では、本技術は、胎盤生成物の創傷治癒の可能性を評価する細胞遊走アッセイを開示する。
【００８２】
因子のうちで、ＩＧＦＢＰ１及びアジポネクチンは、創傷治癒に重要であることが本明細書で企図される。本開示の技術に従って調製された胎盤生成物由来のタンパク質の評価は、ＥＧＦがこれらの組織によってより高い量で分泌された主要な因子のうちの１つであることを示す。さらに、本開示の羊膜において検出された高レベルのＥＧＦを伴う創傷治癒のためのＥＧＦの重要性は、本開示に従って臨床用途のために製造された膜生成物の評価のための効力マーカーとしてＥＧＦの選択を支持する。
【００８３】
本技術は、免疫原性細胞を選択的に枯渇させ、他の有益な細胞（間葉幹細胞、上皮細胞、及び線維芽細胞のうちの少なくとも１つ以上を含む）の生存を保つ胎盤生成物のための凍結保存の手順を開示する。いくつかの実施形態では、有益な細胞は、治癒の促進のための因子の主要な源である。
【００８４】
胎盤生成物、それらの有用性、及びそれらの免疫適合性は、母体の栄養膜の枯渇及びＣＤ１４＋胎児マクロファージの選択的除去によって驚くほど強化される。免疫適合性は、当業者によって一般的に知られている任意の手段によって実証され得、そのような実証は、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）によって及びリポ多糖（ＬＰＳ）誘導性腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α分泌によって行われ得る。
【００８５】
本胎盤生成物は、任意に実質的な濃縮で塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含有する。
【００８６】
本胎盤生成物は、細胞遊走及び／または創傷治癒を刺激する因子を提供する及び／または任意に分泌する。そのような因子の存在は、任意に一般的に認められている方法によって実証され得る。
【００８７】
例えば、市販の創傷治癒アッセイ（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ）が存在し、細胞遊走は、ヒト皮膚微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ−ｄ）（Ｌｏｎｚａ  Ｉｎｃ．）を使用することによって評価され得る。一実施形態では、本胎盤生成物からの馴化培地は、細胞遊走を増強する。
【００８８】
本明細書に開示される胎盤生成物は、腱修復、軟骨修復（例えば、大腿顆、脛骨プラトー）、トンネル／骨界面でのＡＣＬ置換、歯科組織の増大、瘻孔（例えば、クローン病、Ｇ管、気管食道）、癒着バリアでの欠落した組織（例えば、鼻中隔修復、膣壁修復、腹壁修復、腫瘍の切除）、皮膚創傷（例えば、部分的厚さの火傷、中毒性表皮剥離症、表皮水疱症、壊疽性膿皮症、潰瘍、例えば、糖尿病性潰瘍（例えば、足部）及び静脈下肢潰瘍）、外科創傷、ヘルニア修復、腱修復、膀胱修復、骨膜置換、ケロイド、臓器裂傷、上皮欠損、及び鼓膜の修復または置換、を含む、多くの創傷を治療するのに有用である。
【００８９】
本明細書に開示される胎盤生成物は、創傷治癒プロセスに有益である以下の特性のうちの１つ以上を示す：
ａ．１ｃｍ２当たりのおよその数が、約５００〜約３６０，０００、約１０，０００〜約３６０，０００、約１０，０００〜約２００，０００、または約２０，０００、約２５，０００、約３０，０００、約３５，０００、約４０，０００、約４５，０００、約５０，０００、約５５，０００、約６０，０００、約６５，０００、約７０，０００、約７５，０００、約８０，０００、約８５，０００、約９０，０００、約９５，０００、約１００，０００、約１０５，０００、約１１０，０００、約１１５，０００、約１２０，０００、約１２５，０００、約１３０，０００、約１３５，０００、約１４０，０００、約１４５，０００、約１５０，０００、約１５５，０００、約１６０，０００、約１６５，０００、約１７０，０００、約１７５，０００、約１８０，０００、約１８５，０００、約１９０，０００、または約１９５，０００個である。
ｂ．約４０〜約５００μｍの厚さ、
ｃ．薄基底膜、
ｄ．低免疫原性、
ｅ．凍結保存された／凍結保存可能、及び
ｆ．ヒト絨毛膜幹細胞（ｈＣＭＳＣ）。
【００９０】
本発明者らは今回、培養拡張した細胞を含有しない胎盤生成物の開発の必要性を特定した。
【００９１】
本発明者らは今回、ＩＧＦＢＰ１を含む胎盤生成物の開発の必要性を特定した。
【００９２】
本発明者らは今回、アジポネクチンを含む胎盤生成物の開発の必要性を特定した。
【００９３】
本発明者らは今回、創傷治癒に適したプロテアーゼ対プロテアーゼ阻害剤の比率を示す胎盤生成物の開発の必要性を特定した。
【００９４】
本発明者らは今回、絨毛膜からの免疫原性細胞を選択的に枯渇させつつ、創傷治癒プロセスでの治癒の促進のための因子の主要な源である有益な細胞の生存を保つ胎盤生成物の凍結保存方法の開発の必要性を特定した。
【００９５】
本発明者らは今回、製造した胎盤生成物の免疫原性を試験するためにバイオアッセイの開発の必要性を特定した。
【００９６】
本発明者らは今回、インビボで示されたものと比較して、ＭＭＰ対ＴＩＭＰの比率を示す胎盤生成物の開発の必要性を特定した。本発明者らは今回、約７〜１０対１のＭＭＰ−９とＴＩＭＰ１の比率を示す胎盤生成物の開発の必要性を特定した。
【００９７】
本発明者らは今回、α２−マクログロブリンを含む胎盤生成物の開発の必要性を特定した。
【００９８】
本発明者らは今回、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、及びメタロプロテイナーゼを不活性化する胎盤生成物の開発の必要性を特定した。本発明者らは今回、セリンプロテアーゼを不活性化する胎盤生成物の開発の必要性を特定した。本発明者らは今回、システインプロテアーゼを不活性化する胎盤生成物の開発の必要性を特定した。本発明者らは今回、アスパラギン酸プロテアーゼを不活性化する胎盤生成物の開発の必要性を特定した。本発明者らは今回、メタロプロテイナーゼを不活性化する胎盤生成物の開発の必要性を特定した。
【００９９】
本発明者らは今回、ｂＦＧＦを含む胎盤生成物の開発の必要性を特定した。
【０１００】
本発明者らは今回、胎盤生成物の潜在性を評価するために細胞遊走アッセイの開発の必要性を特定した。
【０１０１】
本発明者らは今回、間葉幹細胞及び線維芽細胞を含む創傷治癒のための胎盤生成物の開発の必要性を特定した。
【０１０２】
胎盤生成物
概説
一態様では、本開示は、凍結保存された絨毛膜を含む膜を提供し、凍結保存及びその後の解凍後、該絨毛膜は
Ａ）組織細胞であって、該絨毛膜に対して天然であり、該組織細胞の４０％超が生存している、組織細胞と、
Ｂ）絨毛膜に対して天然である１つ以上の治療的因子と、
Ｃ）絨毛膜に対して天然である細胞外マトリックスと、
Ｄ）枯渇量の１種以上の機能的免疫原性細胞と、を含む、前記膜。
【０１０３】
別の態様では、本開示は、凍結保存された絨毛膜を含む膜を提供し、凍結保存及びその後の解凍後、該絨毛膜は、
Ａ）生存細胞、１つ以上の治療的因子、及び細胞外マトリックスを含む間質細胞層と、
Ｂ）枯渇量の１種以上の機能性免疫原性細胞と、を含み、細胞中の４０％超の細胞は生存細胞である。
【０１０４】
別の態様では、本開示は、１つ以上の組織成分を有する凍結保存された絨毛膜を含む膜を提供し、凍結保存後及びその後の解凍後、１つ以上の組織成分が、
Ａ）組織細胞であって、該絨毛膜に対して天然であり、該組織細胞の４０％超が生存している、組織細胞と、
Ｂ）絨毛膜に対して天然である１つ以上の治療的因子と、
Ｃ）絨毛膜に対して天然である細胞外マトリックスと、を含み、
絨毛膜が、枯渇量の機能的免疫原性細胞の型を有し、１つ以上の組織成分が、治療利益を提供するのに有効な量で存在する。
【０１０５】
一態様では、本開示は、１つ以上の組織成分を有する凍結保存された絨毛膜を含む膜を提供し、凍結保存後及びその後の解凍後、１つ以上の組織成分が、
Ａ）組織細胞であって、該絨毛膜に対して天然であり、該組織細胞の４０％超が生存している、組織細胞と、
Ｂ）絨毛膜に対して天然である１つ以上の治療的因子と、
Ｃ）絨毛膜に対して天然である細胞外マトリックスと、を含み、
絨毛膜が、枯渇量の機能的免疫原性細胞の型を有し、１つ以上の組織成分が、
（ｉ）炎症性サイトカインの量及び／若しくは活性を低減させる、
（ｉｉ）抗炎症性サイトカインの量及び／若しくは活性を増大させる、
（ｉｉｉ）反応性酸素種の量及び／若しくは活性を低減させる、
（ｉｖ）抗酸化剤の量及び／若しくは活性を増大させる、
（ｖ）プロテアーゼの量及び／若しくは活性を低減させる、
（ｖｉ）細胞増殖を増大させる、
（ｖｉｉ）血管新生を増大させる、ならびに／または
（ｖｉｉｉ）細胞遊走を増大させるのに有効な量で存在する。
【０１０６】
別の態様では、本開示は、凍結保存された胎盤膜を含む膜を提供し、凍結保存及びその後の解凍後、胎盤膜が、
Ａ）組織細胞であって、前記胎盤膜に対して天然であり、該組織細胞の４０％超が生存している、組織細胞と、
Ｂ）胎盤膜に対して天然である１つ以上の治療的因子と、
Ｃ）胎盤膜に対して天然である細胞外マトリックスと、
Ｄ）枯渇量の１種以上の機能的免疫原性細胞と、を含む、前記膜。
【０１０７】
凍結保存された胎盤膜を含む態様のいくつかの実施形態では、胎盤膜は、羊膜及び絨毛膜を含む。
【０１０８】
上記の態様のいくつかの実施形態では、枯渇量の機能的免疫原性細胞は、免疫応答を生じるのに十分なレベルよりも低い量で免疫原性因子を産生する。いくつかの実施形態では、枯渇量の機能的免疫原性細胞は、検出可能限界より低い量で免疫原性因子を産生する。本明細書に記載される場合、枯渇量の機能的免疫原性細胞が、母体血細胞、新生児血細胞、臍帯血細胞、栄養膜、及び組織マクロファージのうちの任意の１つ以上から選択されてもよい。さらなる実施形態では、枯渇量の機能的免疫原性細胞は、１つ以上の組織マクロファージを含む。組織マクロファージは、例えば、ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ１８＋、ＣＤ４０＋、及びＣＤ８６＋、ならびに／またはそれらの組み合わせからなる群から選択される組織マクロファージ等のマクロファージの任意の特徴付けられた型からものであり得る。さらなる実施形態では、枯渇量の機能的免疫原性細胞は、免疫応答を生じるのに十分なレベルよりも低い量で１つ以上の免疫原性因子（例えば、ＴＮＦ−α、及び／または本明細書に記載されるまたはそうでなければ、知られている他の免疫原性因子）をもたらす。さらなる実施形態では、免疫原性因子は、ごくわずかなまたは検出可能限界より低い量で生じ得る。いくつかの実施形態では、１０％未満の生存細胞は、機能的免疫原性細胞である（例えば、生存細胞の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％より低い）。
【０１０９】
上記の態様の実施形態では、膜は、組織細胞を含み、該組織細胞の約５０％〜約１００％が生存している。いくつかの実施形態では、該組織細胞の約６０％〜約１００％が生存している。さらなる実施形態では、該組織細胞の約７０％〜約１００％が生存している。さらなる実施形態では、生存細胞は、間葉幹細胞（ＭＳＣ）、線維芽細胞、及び／または上皮細胞を含んでもよい。
【０１１０】
上記の態様の様々な実施形態では、膜は、インビトロまたはインビボで（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）の活性のうちのいずれかを促進するのに有効である量で１つ以上組織成分（例えば、生存細胞、１つ以上の治療的因子、及び／または細胞外マトリックス）を提供する。
【０１１１】
インビトロは、生物の外側で（例えば、人工培養培地を用いた組織培養条件下で）行われた実験及び／または手順を説明する。インビボは、生物、例えば、動物またはヒト内で行われた実験及び／または手順を説明する。
【０１１２】
上記の態様の様々な実施形態は、送達基質をさらに含んでもよく、そのため、膜が送達基質に固定される。
【０１１３】
上記の態様の実施形態では、膜は、その後の解凍の前に長期間保存されてもよい。いくつかの実施形態では、長時間は、約６カ月〜約３６カ月若しくはそれ以上、あるいは約６カ月〜約２４カ月若しくはそれ以上、あるいは約６カ月〜約２５カ月若しくはそれ以上、あるいは約６カ月〜約１２カ月若しくはそれ以上、あるいは約６カ月〜約１０カ月、あるいは約６カ月から、あるいは約３カ月〜約６カ月、あるいは約１カ月〜約３カ月であり、これには本明細書に記載される様々な期間のその他の毎月及び日の導出が含まれる。これらの実施形態では、組織細胞の生存率は、解凍時に実質的に維持される。いくつかの実施形態では、組織細胞の生存率は、凍結保存されるとき、少なくとも約２４カ月間実質的に維持される。
【０１１４】
上記の態様の実施形態では、膜は、解凍され、本明細書に記載されるまたは一般的に知られている方法から改変される解凍方法の開始から３０分以内に使える状態であり得る。
【０１１５】
上記の態様のうちのいくつかの実施形態では、膜は、解凍してから最長１時間生理食塩水中で保存することができ、依然として、約７０％の生存細胞を維持することができる。
【０１１６】
本技術の一実施形態は、凍結保存溶液及び絨毛膜を含む胎盤生成物を提供し、絨毛膜は、生存している天然治療的細胞及び天然治療的因子を含み、凍結保存溶液は、凍結保存生成物を提供するのに有効であるある量の凍結保存剤を含む。この実施形態によれば、絨毛膜は、実質的には、栄養膜、ＣＤ１４＋マクロファージ、及び母体血細胞等の少なくとも１つの少なくとも１つ以上の免疫原性細胞型がない。
【０１１７】
一実施形態では、絨毛膜は、（例えば、コラゲナーゼで均質化されないまたは処理されない）天然絨毛膜の構造を示す１つ以上の層を含む。
【０１１８】
一実施形態では、胎盤生成物は、創傷への皮膚塗布に適している。
【０１１９】
本明細書で提供される教示により、当業者は、これで本発明の胎盤生成物を産生することができる。本開示は、本発明の胎盤生成物の技術的特徴を引き起こす製造方法を提供する。したがって、一実施形態では、胎盤生成物は、本明細書で教示されるステップによって製造される。本発明の胎盤生成物は、ここで教示される方法によって製造される生成物に限定されない。例えば、本発明の技術の生成物は、スクリーニングステップ、例えば、記載される技術的特徴及び優れた特性を有する調製物をスクリーニングするためのステップに依存する方法を通して生成され得る。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、凍結保存された絨毛膜は、以下の技術的特徴のうちの１つ以上を含んでもよい：
ａ．１つを超える系統（例えば、骨形成、脂質生成、及び／または軟骨形成系統）の細胞に分化することができる生存している治療的天然細胞、
ｂ．天然治療的因子はＩＧＦＢＰ１を含む、
ｃ．天然治療的因子はアジポネクチンを含み、天然治療的因子はα２−マクログロブリンを含む、
ｄ．天然治療的因子はｂＦＧＦを含む、
ｅ．天然治療的因子は、ＭＭＰ−９及びＴＩＭＰ１を含む、
ｆ．天然治療的因子は、約７対約１０の比率でＭＭＰ−９及びＴＩＭＰ１を含む、
ｇ．胎盤生成物は、細胞拡張細胞を含まない、
ｈ．凍結保存培地は、約１５ｍＬ、または約１５ｍＬ超の量で存在する、
ｉ．凍結保存剤は、ＤＭＳＯを含む、
ｊ．凍結保存剤は、存在する凍結保存剤の量の大部分でＤＭＳＯを含む、
ｋ．凍結保存溶液は、アルブミンをさらに含み、任意にこのアルブミンは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である、
ｌ．凍結保存剤は、ＤＭＳＯ及びアルブミン（例えば、ＨＳＡ）を含む、
ｍ．絨毛膜は、約５，０００〜約５００，０００個の細胞／ｃｍ２、約５，０００〜約２４０，０００個の細胞／ｃｍ２、または約２０，０００〜約６０，０００個の細胞／ｃｍ２を含む、
ｎ．絨毛膜は、少なくとも約７０％の細胞生存率を有する、５，０００〜約５００，０００個の細胞／ｃｍ２、約２０，０００〜約２００，０００個の細胞／ｃｍ２を含む、
ｏ．絨毛膜の１ｃｍ２当たり少なくとも約７，４００または約１５，０００または約２３，２１７、または約３５，０００、または約４０，０００、または約４７，８００個の間質細胞を含む、
ｐ．絨毛膜の１ｃｍ２当たり約５，０００〜約５０，０００個の間質細胞を含む、
ｑ．胎盤生成物の１ｃｍ２当たり約４％〜約４６％の生存している非培養的に拡張した線維芽細胞を含む、
ｒ．間質細胞のうちの少なくとも約４０％、または約５０％、または約６０％、または約７０％、または約７４．３％、または約８３．４、または約９０％、約９２．５％、または約１００％が、冷凍融解サイクル後生存している間質細胞を含む、
ｓ．絨毛膜が約４０μｍ〜約４００μｍの厚さを有する、
ｔ．およそ３５０ｐｇ／ｃｍ２、２２５ｐｇ／ｃｍ２、１００ｐｇ／ｃｍ２、または７０ｐｇ／ｃｍ２若しくはそれ以下のうちのいずれかよりも少ないＴＮＦ−αを、組織培養培地中に２ｃｍ×２ｃｍの組織生成物の断片を設置し、組織生成物を細菌性リポ多糖に約２０〜約２４時間曝露する際に、組織培養培地に分泌する、
ｕ．冷蔵、凍結保存、及び解凍後、およそ３５０ｐｇ／ｃｍ２、２２５ｐｇ／ｃｍ２、１００ｐｇ／ｃｍ２、または７０ｐｇ／ｃｍ２若しくはそれ以下のうちのいずれかよりも少ないＴＮＦ−αを、組織培養培地中に２ｃｍ×２ｃｍの組織生成物の断片を設置し、組織生成物を細菌性リポ多糖に約２０〜約２４時間曝露する際に、組織培養培地に分泌する、
ｖ．絨毛膜の母体側は、細胞外マトリックスタンパク質の断片を含み、任意に、絨毛膜は、ディスパーゼＩＩで処理されるか、またはタンパク質断片のかなりの部分が末端ロイシンまたはフェニルアラニンを含む、
ｗ．羊膜をさらに含む、
ｘ．羊膜をさらに含み、この羊膜が一層の羊膜上皮細胞を含む、
ｙ．羊膜をさらに含み、この羊膜及び絨毛膜が天然配置において互いに会合する、
ｚ．羊膜をさらに含み、この羊膜及び絨毛膜が、天然配置において互いに結合しない、
ａａ．羊膜をさらに含み、この絨毛膜が、羊膜と比較して約２〜約４倍以上の間質細胞を含む、
ｂｂ．羊膜を含まない、
ｃｃ．絨毛膜が、同じ胎盤から由来する同じ領域の羊膜と比較して、約２〜約４倍以上の間質細胞を含む、
ｄｄ．創傷への皮膚塗布に適している。
【０１２１】
細胞
本技術に従って、胎盤生成物は、絨毛膜の天然の治療的細胞を含む。細胞は、１つ以上の線維芽細胞を含む。
【０１２２】
一実施形態では、天然の治療的細胞は、生存している間質細胞を含む。
【０１２３】
一実施形態では、天然の治療的細胞は、生存しているＭＳＣを含む。
【０１２４】
一実施形態では、天然の治療的細胞は、生存している線維芽細胞を含む。
【０１２５】
一実施形態では、天然の治療的細胞は、生存しているＭＳＣ及び生存している線維芽細胞を含む。
【０１２６】
一実施形態では、治療的天然細胞は、１つを超える系統（例えば、骨形成、脂質生成、及び／または軟骨形成系統）の細胞に分化することができる生存細胞である。
【０１２７】
一実施形態では、絨毛膜は、約１０，０００〜約３６０，０００個の細胞／ｃｍ２、または約４０，０００〜約９０，０００個の細胞／ｃｍ２を含む。
【０１２８】
一実施形態では、絨毛膜は、絨毛膜の１ｃｍ２当たり少なくとも約７，４００または約１５，０００または約０，０００、または約３５，０００、または約４０，０００または約４７，８００個の間質細胞を含む。
【０１２９】
一実施形態では、絨毛膜は、絨毛膜の１ｃｍ２当たり約５，０００〜約５０，０００個の間質細胞を含む。
【０１３０】
一実施形態では、絨毛膜は、間質細胞のうちの少なくとも約４０％または約５０％または約６０％または約７０％または約７４．３％または約８３．４または約９０％、約９２．５％、または約１００％が、冷凍融解サイクル後に生存している間質細胞を含む。
【０１３１】
一実施形態では、絨毛膜は、間質細胞の約４０％〜約９２．５％が、冷凍融解サイクル後に生存している間質細胞を含む。
【０１３２】
一実施形態では、（胎盤生成物の）絨毛膜は、総細胞の５０％〜約９０％の線維芽細胞を含む。
【０１３３】
一実施形態では、絨毛膜は、任意に、ＬＰＳ刺激のＴＮＦα放出の実質的減少によって実証されるように、約５％未満または約１％未満または約０．５％未満の量でＣＤ１４＋マクロファージを含む。
【０１３４】
一実施形態では、胎盤生成物は、同じ胎盤から由来する羊膜と比較して、約２〜約４倍以上の間質細胞を含む。
【０１３５】
一実施形態では、胎盤生成物は、羊膜をさらに含み、この胎盤生成物は、羊膜と比較して約２〜約４倍以上の間質細胞を含有する。
【０１３６】
一実施形態では、胎盤生成物は、羊膜をさらに含み、この羊膜が一層の羊膜上皮細胞を含む。
【０１３７】
一実施形態では、胎盤生成物は、実質的には、栄養膜がない。
【０１３８】
一実施形態では、胎盤生成物は、実質的には、機能的ＣＤ１４＋マクロファージがない。
【０１３９】
一実施形態では、胎盤生成物は、実質的には、母体血細胞がない。
一実施形態では、胎盤生成物は、実質的には、栄養膜、機能的ＣＤ１４＋マクロファージ、及び母体血細胞がない。任意に、胎盤生成物は、生存間質細胞を含む。任意に、胎盤生成物は、生存ＭＳＣを含む。任意に、胎盤生成物は、生存線維芽細胞を含む。任意に、胎盤生成物は、生存ＭＳＣ及び生存線維芽細胞を含む。
【０１４０】
一実施形態では、胎盤生成物は、実質的には、母体血細胞がない。
【０１４１】
一実施形態では、胎盤生成物は、実質的には、母体血細胞及び／または栄養膜細胞がない。
【０１４２】
一実施形態では、（胎盤生成物の）絨毛膜は、絨毛膜中の細胞の総数に対して、約５％〜約１００％、約５％〜約３０％、約５％〜約２５％、約５％〜約２０％、約５％〜約１５％、約３％〜約１２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、または少なくとも約１５％の量でＭＳＣを含む。任意に、ＭＳＣの少なくとも約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、または約１００％が、冷凍融解サイクル後、生存している。
【０１４３】
一実施形態では、（胎盤生成物の）絨毛膜は、絨毛膜中の細胞の総数に対して、約５０％〜約９５％、約６０％〜約９０％、または約７０％〜約８５％の量で線維芽細胞を含む。任意に、線維芽細胞の少なくとも約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、または約１００％が、冷凍融解サイクル後、生存している。
【０１４４】
一実施形態では、（胎盤生成物の）絨毛膜は、約５％、４％、３％、２％、１％、または０．１％のうちのいずれかより少ない量で機能的マクロファージを含む。
【０１４５】
一実施形態では、（胎盤生成物の）絨毛膜は、約９：２〜約１７：３の比率で線維芽細胞及びＭＳＣを含む。
【０１４６】
一実施形態では、（胎盤生成物の）絨毛膜は、少なくとも約１，５００個の細胞／ｃｍ２、少なくとも約３，０００個の細胞／ｃｍ２、約１５，０００〜約９，０００個の細胞／ｃｍ２、または約３，０００〜約９，０００個の細胞／ｃｍ２の量でＭＳＣを含む。任意に、ＭＳＣの少なくとも約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、または約１００％が、冷凍融解サイクル後、生存している。
【０１４７】
一実施形態では、（胎盤生成物の）絨毛膜は、少なくとも約７，０００個の細胞／ｃｍ２、少なくとも約１４，０００個の細胞／ｃｍ２、約７，０００〜約５１，０００個の細胞／ｃｍ２、または約１４，０００〜約５１，０００個の細胞／ｃｍ２の量で線維芽細胞を含む。任意に、線維芽細胞の少なくとも約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、または約１００％が、冷凍融解サイクル後、生存している。
【０１４８】
一実施形態では、（胎盤生成物の）絨毛膜は、約３，０００個の細胞／ｃｍ２未満、または約１，０００個の細胞／ｃｍ２未満の量で機能的マクロファージを含む。
【０１４９】
一実施形態では、胎盤生成物は、実質的には、培養拡張した細胞がない。
【０１５０】
胎盤因子
本技術従って、胎盤生成物は、上で定義されるまたはそうでなければ、実施例を含む様々な態様及び実施形態において本明細書に記載されるような絨毛膜の天然治療的因子を含む。表１１は、試験された治療的因子及びそれらの機能の一覧表を提供する。
【０１５１】
一実施形態では、これらの因子は、ＶＥＧＦ、ＰＤＦＧ、ＨＧＦ、ＳＤＦ−１、ＫＧＦ、ＩＧＦＢＰ１、アジポネクチン、α２−マクログロブリン、ｂＦＧＦ、ＭＭＰ−９、及びＴＩＭＰ１等を含む。任意に、これらの因子は、天然絨毛膜またはその層のものと実質的には同様である量／ｃｍ２（例えば、±１０％または２０％）で存在する。
【０１５２】
一実施形態では、これらの因子は、約７対約１０（例えば、約７）の比率でＭＭＰ−９及びＴＩＭＰ１を含む。任意に、これらの因子は、天然絨毛膜またはその層のものと実質的には同様である量／ｃｍ２（例えば、±１０％または２０％）で存在する。
【０１５３】
一実施形態では、これらの因子は、表１１中に列挙される因子のうちの１つ以上（例えば、大部分またはすべて）を含む。任意に、これらの因子は、天然絨毛膜またはその層のものと実質的には同様である比率で存在する。任意に、これらの因子は、天然絨毛膜またはその層のものと実質的には同様である量／ｃｍ２（例えば、±１０％または２０％）で存在する。
【０１５４】
一実施形態では、胎盤生成物は、天然の未処理の絨毛膜よりも実質的には少ないＴＮＦ−α／ｃｍ２を分泌する。
【０１５５】
一実施形態では、胎盤生成物は、ＬＰＳによる刺激時に、天然の胎盤生成物よりも実質的には少ないＴＮＦ−α／ｃｍ２を分泌する。
【０１５６】
一実施形態では、胎盤生成物は、約４２０ｐｇ／ｍＬ、３５０ｐｇ／ｍＬ、２８０ｐｇ／ｍＬ、または７０ｐｇ／ｍＬのうちのいずれかより少ないＴＮＦ−αを、組織培養培地中に２ｃｍ×２ｃｍの組織生成物の断片を設置し、組織生成物を細菌性リポ多糖に約２０〜約２４時間曝露する際に、組織培養培地に分泌する。
【０１５７】
一実施形態では、冷蔵、凍結保存、及び解凍後、胎盤生成物は、約４０ｐｇ／ｍＬ、３５０ｐｇ／ｍＬ、２８０ｐｇ／ｍＬ、または７０ｐｇ／ｍＬのうちのいずれかより少ないＴＮＦ−αを、組織培養培地中に２ｃｍ×２ｃｍの組織生成物の断片を設置し、組織生成物を細菌性リポ多糖に約２０〜約２４時間曝露する際に、組織培養培地に分泌する。
【０１５８】
一実施形態では、胎盤生成物は、体外から添加されたＴＮＦ−αの阻害剤をさらに含む。任意に、ＴＮＦ−αの阻害剤は、ＰＧＥ２である。
【０１５９】
一実施形態では、生成物は、抗生物質または抗生物質カクテルで処理されてもよい。抗生物質カクテルのある非限定的な例は、硫酸ゲンタマイシン、バンコマイシンＨＣｌ、及びアンフォテリシンＢを含む。
【０１６０】
構造
本技術の胎盤生成物は、天然絨毛膜の構造を示す間質細胞層を含む。本明細書で提供される教示により、当業者であれば、天然構造を示す胎盤層、例えば、実質的に層を分裂させるコラゲナーゼまたは他の酵素で均質化または処理されていない層を理解するであろう。
【０１６１】
一実施形態では、胎盤生成物は、天然構造を有する間質細胞層を含む。
【０１６２】
一実施形態では、胎盤生成物は、天然構造を有する基底膜を含む。
【０１６３】
一実施形態では、胎盤生成物は、天然構造を有する網状層を含む。
【０１６４】
一実施形態では、胎盤生成物は、天然構造を有する網状層及び基底膜を含む。
【０１６５】
一実施形態では、胎盤生成物は、実質的には、栄養膜がない。一実施形態では、胎盤生成物は、天然構造を有する基底膜を含み、絨毛膜は、実質的には、栄養膜がない。任意に、絨毛膜と接触する母体の部分は、細胞外マトリックスタンパク質の断片を含む。任意に、胎盤生成物は、ディスパーゼ（例えば、ディスパーゼＩＩ）で処理される、及び／または細胞外マトリックスタンパク質断片の実質的な部分は、末端ロイシン若しくはフェニルアラニンを含む。
【０１６６】
一実施形態では、胎盤生成物は、約４０μｍ〜約４００μｍの厚さを有する。
【０１６７】
一実施形態では、胎盤生成物は、羊膜をさらに含む。任意に、胎盤生成物中の羊膜及び絨毛膜は、天然配置において互いに会合される。あるいは、羊膜及び絨毛膜は、天然配置において互いに会合されない。
【０１６８】
一実施形態では、胎盤生成物は、羊膜を含まない。
【０１６９】
製剤
本技術に従って、胎盤生成物は、凍結保存培地で配合され得る。
【０１７０】
一実施形態では、１つ以上の細胞透過性凍結保存剤、１つ以上の非細胞透過性凍結保存剤、またはそれらの組み合わせを含む凍結保存溶液。
【０１７１】
任意に、凍結保存溶液は、ＤＭＳＯ、グリセロール、グリコール、プロピレングリコール、エチレングリコール、またはそれらの組み合わせから選択される１つ以上の細胞透過性凍結保存剤を含む。
【０１７２】
任意に、凍結保存培地は、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシエチルスターチ、多糖類、単糖類、糖アルコール、アルギン酸塩、トレハロース、ラフィノース、デキストラン、またはそれらの組み合わせから選択される１つ以上の非細胞透過性凍結保存剤を含む。
【０１７３】
有用な凍結保存剤の他の例は、「凍結保存」において説明されている（ＢｉｏＦｉｌｅｓ  Ｖｏｌｕｍｅ  ５  Ｎｕｍｂｅｒ  ４−Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）データシート）。
【０１７４】
一実施形態では、凍結保存培地は、細胞透過性凍結保存剤を含み、細胞透過性凍結保存剤の大部分はＤＭＳＯである。任意に、凍結保存培地は、かなりの量のグリセロールを含まない。
【０１７５】
一実施形態では、凍結保存培地は、ＤＭＳＯを含む。任意に、凍結保存培地は、多量のグリセロールを含まない。任意に、凍結保存培地は、かなりの量のグリセロールを含まない。
【０１７６】
一実施形態では、凍結保存培地は、アルブミン（例えば、ＨＳＡ若しくはＢＳＡ）、電解質溶液（例えば、Ｐｌａｓｍａ−Ｌｙｔｅ）、またはそれらの組み合わせ等のさらなる成分を含む。
【０１７７】
一実施形態では、凍結保存培地は、１重量％〜約１５重量％のアルブミン及び約５重量％〜約２０重量％（例えば、約１０重量％）の凍結保存剤を含む。任意に、凍結保存剤は、ＤＭＳＯを含む。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、約５％〜約１００％の凍結保存剤、あるいは、約５％〜約２０％の凍結保存剤を含む。
【０１７８】
一実施形態では、胎盤生成物は、約２０ｍＬまたは約５０ｍＬ超の凍結保存培地中に配合される。任意に、凍結保存溶液は、少なくとも１つの凍結保存剤（または凍結保存薬剤）を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つの凍結保存剤は、ＤＭＳＯ（例えば、１つを超える凍結保存剤がある場合、ＤＭＳＯは、多量の総凍結保存剤で見出される）を含む。任意に、凍結保存培地は、かなりの量のグリセロールを含まない。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、組成物は、凍結保存溶液を含む。凍結保存溶液は、任意に、（例えば、ニトロセルロース上の）膜に取り付けられた組成物として、胎盤生成物を含有する容器に入れられてもよい。好ましくは、十分な量の凍結保存溶液を入れて、その後の凍結ステップ中の膜を保護する。凍結保存溶液を用いた膜の注入は、膜内に含有した細胞の生存を維持する。一実施形態では、好適な凍結保存溶液が当該技術分野で知られているが、凍結保存剤は、１つ以上の細胞透過性凍結保存剤、１つ以上の非細胞透過性凍結保存剤、またはそれらの組み合わせを含む凍結保存培地中での保存を含む。好適な凍結保存剤としては、ＤＭＳＯ、グリセロール、グリコール、プロピレングリコール、エチレングリコール、プロパンジオール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、１，２−プロパンジオール（ＰＲＯＨ）、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、凍結保存溶液は、ポリビニルピロリジオン、ヒドロキシエチルスターチ、単糖類、アルギン酸塩、トレハロース、ラフィノース、デキストラン、ヒト血清アルブミン、フィコール、リポタンパク質、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシエチルストラーチ、自己血漿、またはそれらの組み合わせから選択される１つ以上の非細胞透過性凍結保存剤を含有してもよい。有用な凍結保存剤の他の例は、凍結保存において説明されている（ＢｉｏＦｉｌｅｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  ５，Ｎｕｍｂｅｒ  ４  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）データシート）。
【０１８０】
例えば、好適な凍結保存溶液は、溶液、少なくとも約０．００１重量％〜１００重量％の量で、好適には、約２重量％〜約２０重量％、好ましくは約５重量％〜約１０重量％の量で凍結保存剤、例えば、ＤＭＳＯを含んでもよい。場合によっては、凍結保存溶液は、少なくとも約２％の凍結保存剤（例えば、ＤＭＳＯ）を含む。さらに、凍結保存溶液は、血清アルブミンまたは他の好適なタンパク質を含んでもよい。いくつかの実施形態では、凍結保存溶液は、約１％〜約２０％、あるいは、約１％〜約１０％の血清アルブミンまたは他の好適なタンパク質を含む。血清アルブミンまたは他の好適なタンパク質は、凍結融解プロセス中、膜を安定させ、細胞への損傷を低減させるのに役立ち、生存率を維持するために存在する。血清アルブミンは、ヒト血清アルブミンまたはウシ血清アルブミンであり得る。凍結保存溶液は、生理学的緩衝液または生理食塩水、例えば、リン酸緩衝生理食塩水をさらに含んでもよい。
【０１８１】
凍結保存プロセス中、容器は、胎盤膜を覆うために、十分な量の凍結保存溶液で充填してもよい。必要な凍結保存溶液の量は、例えば、使用される容器及び台の種類、ならびに保存される膜の大きさにより異なり得る。組成物／デバイスを覆う（または被覆する）のに必要な凍結保存溶液の量が少ないほど、組成物をより速く解凍させることができる。それ故に、凍結融解中、細胞の生存率を低下させることなく、膜の上部の被覆を可能にするより少ない量の凍結保存溶液を使用することが望ましい。さらに、使用される膜が小さく、容器が小さいほど、より少ない凍結保存溶液が使用可能である。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、約７ｍＬ〜約５０ｍｌ、あるいは約１０ｍＬ〜約５０ｍｌ、あるいは約１５ｍＬ〜約５０ｍｌ、あるいは約１５ｍＬ〜約２５ｍｌの量で凍結保存溶液を含有するバッグが使用される。ある好ましい実施形態では、約１５ｍＬの凍結保存溶液を容器またはバッグに入れる。凍結保存溶液の量は、膜を完全に浸潰するのに十分であり得る。この量は、使用されるバッグの大きさ及び凍結保存された膜の大きさによって異なるであろう。小さいバッグが小さな物（例えば、２ｃｍ×２ｃｍよりも小さい膜）で使用される場合、約３ｍＬ〜約１０ｍｌ、あるいは３ｍＬ〜約７ｍＬの凍結保存溶液を使用してもよい。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、約７ｍＬ〜約５０ｍｌ、あるいは約５ｍＬ〜約２０ｍｌ、あるいは約７ｍＬ〜約２０ｍｌ、あるいは約７ｍＬ〜約１５ｍｌを含有する容器が、使用される。凍結保存溶液の量は、容器内で膜を完全に浸潰するのに十分であり得る。この量は、使用される容器の大きさ及び凍結保存された膜の大きさによって異なるであろう。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、凍結保存溶液の量は、凍結及びその後の解凍の手順中に細胞を保護するのに十分である。いくつかの実施形態では、少なくとも７０％の細胞生存率が凍結融解後維持される。いくつかの態様では、少なくとも７５％の細胞生存率が維持される、あるいは約８０％の細胞生存率が維持される、あるいは約８５％の細胞生存率が維持される、あるいは約９０％の細胞生存率が維持される、あるいは約９５％の細胞生存率が維持される、あるいは約１００％の細胞生存率が維持される。いくつかの実施形態では、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７５％、少なくとも７８％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、及びその中間のパーセンテージが、膜の生存率である。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、凍結保存溶液の量は、構造の、構造上の、及びまたは三次元構造の膜を保護するのに十分である。これらの事例では、凍結保存溶液は、０．０１％〜約１００％、あるいは約２％〜約１００％の量で凍結保存剤を含有する。いくつかの実施形態では、凍結保存溶液は、多糖類または単糖類を含有する。
【０１８６】
一実施形態では、胎盤生成物は、ニトロセルロース紙上に置かれる。
【０１８７】
一実施形態では、膜は、複数の切片に切断されてもよい。任意に、膜は、任意に好適な大きさであってもよく、膜の種類、及びその膜の特定のエンドアプリケーションまたは使用法に応じてカスタマイズ可能である。好適な膜の大きさとしては、約１．５ｃｍ×約１．５ｃｍ、約２ｃｍ×約２ｃｍ、約３ｃｍ×約３ｃｍ、約４ｃｍ×約４ｃｍ、約５ｃｍ×約５ｃｍ、約６ｃｍ×約６ｃｍ、約７ｃｍ×約７ｃｍ、約８ｃｍ×約８ｃｍ、約７．５ｃｍ×約１５ｃｍ、約１．５ｃｍ×約２ｃｍ、約１．５ｃｍ×約３ｃｍ、約２ｃｍ×約３ｃｍ、約３ｃｍ×約４ｃｍ、約２ｃｍ×約５ｃｍ、約３ｃｍ×約５ｃｍ、約４ｃｍ×約５ｃｍ、約５ｃｍ×約７ｃｍ、約５ｃｍ×約１０ｃｍ、約５ｃｍ×約１５ｃｍ、約７．５ｃｍ×約１５ｃｍが挙げられるが、これらに限定されず、０．１ｃｍ〜１ｃｍ単位で、任意の変動または大きさ及びそれらの間の範囲を含む。
【０１８８】
凍結保存された膜は、意外にも長い保存期間または安定性を有し、長期間凍結される場合に生存細胞を保持する。凍結保存生成物は、一旦解凍されると、細胞生存の高い保持率（生存細胞の少なくとも４０％、５０％、６０％、または７０％若しくはそれ以上の保持率）を有する、最長２年間若しくはそれ以上の間、約−２０℃〜約−１９６℃（例えば、−４５〜約−８０℃）で保存されてもよい。いくつかの態様では、凍結保存された膜は、生存細胞の高い保持率（例えば、少なくとも４０％の生存細胞、あるいは少なくとも５０％の生存細胞、あるいは少なくとも約７０％の生存細胞、あるいは少なくとも約８０％、約８５％、９０％、または１００％の生存細胞）を有する解凍前、少なくとも約３カ月、少なくとも約６カ月、少なくとも約９カ月、少なくとも約１２カ月、少なくとも約１５カ月、少なくとも約２４カ月、少なくとも約２５カ月、少なくとも約３６カ月若しくはそれ以上の間、約−２０℃〜約−１９６℃（例えば、−４５〜約−８０℃）で保存され得る。
【０１８９】
別の態様では、本開示は、創傷または組織欠損を治療するためのキットを提供し、該キットは、
Ａ）薬学的に許容される容器中に本明細書に記載される態様及び実施形態のうちのいずれかに従う膜と、
Ｂ）創傷または組織欠損を治療するための膜を投与するための取扱説明書と、を備える。
【０１９０】
実施形態では、キットは、１種以上の抗生物質、皮膚軟化剤、角質溶解剤、保湿剤、抗酸化剤、治療剤、救急絆、ツール、裁断装置、緩衝液、解凍媒体、処理媒体、鉗子、容器、及びそれらの組み合わせから選択される添加剤を含んでもよい。
【０１９１】
製造
概説
本技術の胎盤生成物は、本明細書で教示される技術特性を提供する任意の好適な様式で胎盤から製造され得る。本技術に従って、胎盤生成物は、少なくとも１つの免疫適合性のある絨毛膜を含む。
【０１９２】
一実施形態では、胎盤生成物は、
ａ．胎盤を獲得することと、
ｂ．免疫原性の胎盤を選択的に枯渇させることと、
ｃ．胎盤膜を凍結保存させることと、を含む方法によって製造される。
【０１９３】
一実施形態では、胎盤生成物は、
ａ．胎盤を獲得することと、
ｂ．胎盤膜から栄養膜の実質的な一部を除去することと、
ｃ．胎盤膜を凍結保存させることと、を含む方法によって製造される。
【０１９４】
任意に、本方法は、胎盤から絨毛膜または羊膜またはそれらの一部を除去するステップを含む。任意に、本方法は、胎盤膜から上皮細胞の実質的な一部を除去することなく、胎盤から羊膜または絨毛膜を除去するステップを含む。
【０１９５】
任意に、胎盤膜から栄養膜の実質的な一部を除去するステップは、プロテアーゼ（例えば、ディスパーゼまたはディスパーゼＩＩ）等の消化酵素で胎盤を処理すること、胎盤膜から栄養膜を機械的に除去すること（例えば、掻爬による）、またはそれらの組み合わせを含む。
【０１９６】
任意に、本方法は、例えば、赤血球を溶解することによって、血栓を除去することによって、またはそれらの組み合わせによって、胎盤から母体血細胞を除去するステップを含む。
【０１９７】
任意に、本方法は、１つ以上の抗生物質で胎盤膜を処理するステップを含む。
【０１９８】
任意に、本方法は、任意に、ＬＰＳ刺激のＴＮＦα放出の実質的減少によって実証されるように、ＣＤ１４＋マクロファージの選択的枯渇のステップを含む。
【０１９９】
任意に、胎盤膜を凍結保存させるステップは、１つ以上の細胞透過性凍結保存剤、１つ以上の非細胞透過性凍結保存剤、またはそれらの組み合わせを含む凍結保存培地中の胎盤を凍結させることを含む。
【０２００】
任意に、胎盤膜を凍結保存させるステップは、約２℃〜約８℃である期間中設置し、次いで、凍結させ、それによって、任意に、ＬＰＳ刺激のＴＮＦα放出の実質的減少によって実証されるように、ＣＤ１４＋マクロファージを選択的に枯渇させることを含む。
【０２０１】
本技術の例示的な胎盤生成物は、救急絆または包帯剤で製造または提供され得る。
【０２０２】
免疫適合性及び選択的枯渇
一実施形態では、本技術の胎盤生成物は、免疫適合性がある。免疫適合性は、胎盤（またはその絨毛膜）から免疫原性細胞若しくは因子または免疫原性を除去する任意の選択的枯渇ステップによって達成され得る。
【０２０３】
一実施形態では、胎盤生成物は、機能的免疫原性細胞の免疫原性細胞を選択的に枯渇させることによって免疫適合させる。胎盤は、治療的細胞を保持しながら、胎盤（またはその絨毛膜）から免疫原性細胞を選択的に除去することによって免疫適合させ得る。例えば、免疫原性細胞は、免疫原性細胞を死滅させることによってまたはそこから胎盤の精製によって除去され得る。
【０２０４】
一実施形態では、胎盤生成物は、例えば、栄養膜の除去によって、栄養膜を選択的に除去することによって免疫適合させる。
【０２０５】
一実施形態では、胎盤生成物は、任意に、ＬＰＳ刺激のＴＮＦα放出の実質的減少によってまたはＭＬＲアッセイによって実証されるように、機能的ＣＤ１４＋マクロファージの選択的枯渇によって免疫適合させる。
【０２０６】
一実施形態では、胎盤生成物は、母体血細胞の選択的枯渇によって免疫適合させる。
【０２０７】
一実施形態では、胎盤生成物は、機能ＣＤ１４＋マクロファージ、栄養膜、及び母体血細胞の選択的枯渇によって免疫適合させる。
【０２０８】
一実施形態では、胎盤生成物は、任意に、ＬＰＳ刺激のＴＮＦα放出の実質的減少によってまたはＭＬＲアッセイによって実証されるように、栄養膜及び／またはＣＤ１４＋マクロファージの選択的枯渇によって免疫適合させる。
【０２０９】
栄養膜の除去
一実施形態では、免疫適合（または選択的枯渇）は、胎盤生成物からの栄養膜の除去または枯渇によって達成される。驚くべきことには、そのような胎盤生成物は、以下の優れた特性のうちの１つ以上を有する：
ａ．実質的には、非免疫原性である、
ｂ．驚くべき治癒をもたらす、
ｃ．増強した治療効果を提供する。
【０２１０】
一実施形態では、栄養膜は、除去されるが、絨毛膜の間質細胞層を保持する。
【０２１１】
栄養膜は、胎盤生成物の栄養膜の含量を実質的に減少させる任意の好適な様式で除去され得る。任意に、栄養膜は、選択的に除去されるか、またはそうでなければ、絨毛膜（例えば、ＭＳＣ、治療的因子等）から１つ以上の治療的成分の実質的な一部を排除することなく、除去される。任意に、栄養膜の大部分（例えば、実質的にはすべて）が除去される。
【０２１２】
栄養膜を除去する１つの方法は、ディスパーゼ（例えば、ディスパーゼＩＩ）等の消化酵素で胎盤（例えば、絨毛膜または羊膜絨毛膜）を処理することと、胎盤から栄養膜を分離させることと、を含む。任意に、分離ステップは、剥離または掻爬等の機械的分離を含む。任意に、掻爬は、指等の柔らかい道具で掻爬することを含む。
【０２１３】
栄養膜を除去する１つの方法は、約３０〜約４５分間ディスパーゼで絨毛膜を処理し、胎盤から栄養膜を分離することを含む。任意に、ディスパーゼは、約１％（例えば、約０．５％）未満の溶液中に提供される。任意に、分離ステップは、剥離または掻爬等の機械的分離を含む。任意に、掻爬は、指等の柔らかい道具で掻爬することを含む。
【０２１４】
胎盤（例えば、絨毛膜）から栄養膜を除去する有用な方法は、Ｐｏｒｔｍａｎｎ−Ｌａｎｚら（“Ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｓ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｒａｆｔ  ｆｏｒ  ｐｒｅ−  ａｎｄ  ｐｅｒｉｎａｔａｌ  ｎｅｕｒｏｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ”、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ（２００６）  １９４，６６４−７３）、（“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｆｅｔａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ”、Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ａｎｄ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２００７；１：２９６−３０５．）、及び（Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｒｅｖｉｅｗ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｅｒｍ  Ｐｌａｃｅｎｔａ：Ｏｕｔｃｏｍｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｉｒｓｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ｏｎ  Ｐｌａｃｅｎｔａ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ”）によって説明されている。
【０２１５】
一実施形態では、栄養膜は、凍結保存前に除去される。
【０２１６】
マクロファージの除去
一実施形態では、機能的マクロファージは、胎盤生成物から枯渇または除去される。驚くべきことには、そのような胎盤生成物は、以下の優れた特性のうちの１つ以上を有する：
ａ．実質的には、非免疫原性である、
ｂ．驚くべき治癒をもたらす、
ｃ．増強した治療効果を提供する。
【０２１７】
機能的マクロファージは、胎盤生成物のマクロファージ含量を実質的に減少させる任意の好適な様式で除去され得る。任意に、マクロファージは、選択的に除去されるか、またはそうでなければ、胎盤（例えば、ＭＳＣ、治療的因子等）からの１つ以上の治療的成分の実質的な一部を排除することなく、除去される。任意に、マクロファージの大部分（例えば、実質的にはすべて）が除去される。
【０２１８】
マクロファージ等の免疫細胞を除去する１つの方法は、６０〜１００℃／分のような急速凍結速度によって免疫細胞を死滅させることを含む。免疫細胞を除去する別の方法は、ある期間中、約２℃〜約８℃、任意に約４℃で細胞を保持し、次いで、１℃／分の速度で、（例えば、約−２０℃以下、例えば、約−２０℃〜約−１９６℃で）免疫細胞を凍結することによって免疫細胞を死滅させることを含む。
【０２１９】
免疫細胞が急速凍結速度によって排除され得るが、そのような方法はまた、間質細胞（例えば、ＭＳＣ）等の治療的細胞に悪影響を及ぼされ得る。本発明者らは、ＣＤ１４＋マクロファージを選択的に死滅させる方法が、ある期間中（約３分〜約２４０分間、例えば、少なくとも約１０分間、例えば、約３０〜６０分間）、凍結を上回る温度で胎盤膜を設置（例えば、約２℃〜約８℃をインキュベート）し、次いで、胎盤を凍結すること（例えば、約−２０〜約−１９６、例えば、−８０℃±５℃でインキュベートすること）によって選択的に死滅され得ることを発見している。任意に、冷凍ステップは、１０℃／分未満の速度で（例えば、約５℃／分未満、例えば、約１℃／分で）凍結することを含む。
【０２２０】
一実施形態では、約２℃〜約８℃で胎盤膜を設置するステップは、凍結保存培地が胎盤組織を浸透させる（例えば、平衡を保つ）のに十分な期間中、（例えば、ＤＭＳＯを含有する）凍結保存培地中に胎盤膜を浸漬させることを含む。任意に、冷凍ステップは、約１℃／分の速度で温度を低減させることを含む。任意に、冷凍ステップは、１０℃／分未満の速度で（例えば、約５℃／分未満、例えば、約１℃／分で）凍結することを含む。
【０２２１】
一実施形態では、約２℃〜約８℃で胎盤膜を設置するステップは、約−１０℃〜約１５℃（例えば、約２℃〜約８℃）の温度で、少なくとも約３分〜約２４０分間、例えば、１０分、２０分、３０分、４０分、または５０分のうちのいずれか、（例えば、ＤＭＳＯを含有する）凍結保存培地中の胎盤膜を浸漬させることを含む。別の実施形態では、約２℃〜約８℃で胎盤膜を設置するステップは、約−１０℃〜約１５℃（例えば、約２℃〜約８℃）の温度で、約１０〜１２０、２０〜９０分、または３０〜６０分のいずれかで、（例えば、ＤＭＳＯを含有する）凍結保存培地中の胎盤膜を浸漬させることを含む。任意に、冷凍ステップは、１０℃／分未満の速度で（例えば、約５℃／分未満、例えば、約１℃／分で）凍結することを含む。
【０２２２】
母体血細胞の除去
一実施形態では、母体血細胞（または血管組織）は、胎盤生成物から枯渇または除去される。驚くべきことには、そのような胎盤生成物は、以下の優れた特性のうちの１つ以上を有する：
ａ．実質的には、非免疫原性である、
ｂ．驚くべき治癒をもたらす、
ｃ．増強した治療効果を提供する。
【０２２３】
母体血細胞は、胎盤生成物のそのような細胞含量を実質的に減少させる任意の好適な様式で除去され得る。任意に、母体血細胞は、選択的に除去されるか、またはそうでなければ、胎盤（例えば、血管新生因子、抗酸化剤、抗炎症剤等を含む、ＭＳＣ、治療的因子）からの１つ以上の治療的成分の実質的な一部を排除することなく、除去される。
【０２２４】
一実施形態では、母体血細胞の除去は、臍帯の反対側の胎盤縁の周囲を切断することによって、胎盤から絨毛膜を分離することを含む。胎盤の臍帯側の絨毛膜は、こちら側の血管新生により除去されない。
【０２２５】
一実施形態では、母体血細胞の除去は、（例えば、ＰＢＳ等の緩衝液を用いて）絨毛膜を洗浄し、大きな血栓及びあらゆる過剰な血球を除去することを含む。
【０２２６】
一実施形態では、母体血細胞の除去は、抗凝血剤（例えば、クエン酸デキストロース溶液）で絨毛膜を処理することを含む。
【０２２７】
一実施形態では、母体血細胞の除去は、臍帯の反対側の胎盤縁の周囲を切断し、（例えば、ＰＢＳ等の緩衝液を用いて）絨毛膜を洗浄し、全体的な血栓及びあらゆる過剰な血球を除去することによって胎盤から絨毛膜を分離することを含む。
【０２２８】
一実施形態では、母体血細胞の除去は、臍帯の反対側の胎盤縁の周囲を切断し、抗凝血剤（例えば、クエン酸デキストロース溶液）で絨毛膜を処理することによって胎盤から絨毛膜を分離することを含む。
【０２２９】
一実施形態では、母体血細胞の除去は、臍帯の反対側の胎盤縁の周囲を切断し、（例えば、ＰＢＳ等の緩衝液を用いて）絨毛膜を洗浄し、全体的な血栓及びあらゆる過剰な血球を除去し、抗凝血剤（例えば、クエン酸デキストロース溶液）で絨毛膜を処理することによって胎盤から絨毛膜を分離することを含む。
【０２３０】
ＬＰＳ刺激のＴＮＦα放出の実質的減少によって実証されるように、免疫原性の選択的枯渇。
一実施形態では、胎盤生成物は、ＬＰＳ刺激のＴＮＦα放出の減少によって実証されるように、免疫原性を選択的に枯渇させる。一実施形態では、胎盤生成物は、マクロファージを選択的に枯渇させる。
【０２３１】
一実施形態では、ＴＮＦ−αは、マクロファージを死滅させるまたは除去することによって枯渇させる。
【０２３２】
一実施形態では、ＴＮＦ−αは、抗ＴＮＦ−α抗体による処理によって枯渇させる。
【０２３３】
一実施形態では、ＴＮＦ−αは、ＴＮＦ−αの分泌を抑える、ＰＧＥ２による処理によって機能的に枯渇させる。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、ＴＮＦ−αは、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％阻害される。
【０２３５】
保存
本技術の胎盤生成物は、未使用で使用されてもよい、またはある期間中保存してもよい。驚くべきことには、本技術の凍結保存は、免疫適合性のある胎盤生成物をもたらす。
【０２３６】
一実施形態では、胎盤生成物は、凍結保存される。胎盤生成物は、凍結保存溶液中で凍結温度での（約−２０℃〜約−１９６℃、例えば、約−８０℃±５℃での）インキュベーションによって凍結保存されてもよい。
【０２３７】
凍結保存は、例えば、胎盤生成物を、約２℃〜約８℃で、３分〜約２４０分間、例えば、３０〜６０分間インキュベートし、次いで、使用するまで約−２０℃〜約−１９６℃で、例えば、約−８０℃でインキュベートすることを含むことができる。次いで、胎盤生成物は、使用するために解凍してもよい。任意に、胎盤生成物は、細胞生存が、冷凍融解サイクル後に、驚くほど良好に保持されるような様式で凍結保存される。
【０２３８】
一実施形態では、凍結保存は、１つ以上の細胞透過性凍結保存剤、１つ以上の非細胞透過性凍結保存剤、またはそれらの組み合わせを含む凍結保存培地中での保存を含む。任意に、凍結保存培地は、ＤＭＳＯ、グリセロール、グリコール、プロピレングリコール、エチレングリコール、またはそれらの組み合わせから選択される１つ以上の細胞透過性凍結保存剤を含む。任意に、凍結保存培地は、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシエチルスターチ、多糖類、単糖類、糖アルコール、アルギン酸塩、トレハロース、ラフィノース、デキストラン、またはそれらの組み合わせから選択される１つ以上の非細胞透過性凍結保存剤を含む。有用な凍結保存剤の他の例は、「凍結保存」において説明されている（ＢｉｏＦｉｌｅｓ  Ｖｏｌｕｍｅ  ５  Ｎｕｍｂｅｒ  ４−Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）データシート）。
【０２３９】
一実施形態では、凍結保存培地は、細胞透過性凍結保存剤を含み、細胞透過性凍結保存剤の大部分はＤＭＳＯである。任意に、凍結保存培地は、かなりの量のグリセロールを含まない。
【０２４０】
一実施形態では、凍結保存培地は、ＤＭＳＯを含む。任意に、凍結保存培地は、多量のグリセロールを含まない。任意に、凍結保存培地は、かなりの量のグリセロールを含まない。
【０２４１】
一実施形態では、凍結保存培地は、アルブミン（例えば、ＨＳＡ若しくはＢＳＡ）、電解質溶液（例えば、Ｐｌａｓｍａ−Ｌｙｔｅ）、食塩溶液、またはそれらの組み合わせ等のさらなる成分を含む。
【０２４２】
いくつかの実施形態では、組成物は、凍結保存溶液を含む。凍結保存溶液は、膜に取り付けられたデバイスまたは組成物を含有する容器に入れられる。好ましくは、十分な量の凍結保存溶液を容器に入れて、その後の凍結ステップ中の膜を保護する。好適な凍結保存溶液は、当該技術分野で周知である。一実施形態では、凍結保存は、凍結保存培地は、１つ以上の細胞透過性凍結保存剤、１つ以上の非細胞透過性凍結保存剤、またはそれらの組み合わせを含む凍結保存培地中での保存を含む。好適な凍結保存剤としては、ＤＭＳＯ、グリセロール、グリコール、プロピレングリコール、エチレングリコール、プロパンジオール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、１，２−プロパンジオール（ＰＲＯＨ）、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、凍結保存溶液は、ポリビニルピロリジオン、ヒドロキシエチルスターチ、単糖類、アルギン酸塩、トレハロース、ラフィノース、デキストラン、ヒト血清アルブミン、フィコール、リポタンパク質、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシエチルスターチ、自己血漿、またはそれらの組み合わせから選択される１つ以上の非細胞透過性凍結保存剤を含有してもよい。有用な凍結保存剤の他の例は、凍結保存において説明されている（ＢｉｏＦｉｌｅｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  ５，Ｎｕｍｂｅｒ  ４  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）データシート）。
【０２４３】
例えば、好適な凍結保存溶液は、少なくとも約０．００１重量％〜１００重量％の量で、好適には、約２重量％〜約２０重量％、好ましくは約５重量％〜約１０重量％の量で少なくとも１つの凍結保存剤（例えば、ＤＭＳＯ）を含む。場合によっては、凍結保存溶液は、少なくとも約２％の細胞透過性凍結保存剤を含む。さらに、凍結保存溶液は、血清アルブミンまたは他の好適なタンパク質を含んでもよい。いくつかの実施形態では、凍結保存溶液は、約１％〜約２０％、あるいは、約１％〜約１０％の血清アルブミンまたは他の好適なタンパク質を含む。一実施形態では、凍結保存培地は、１重量％〜約１５重量％のアルブミン及び約５重量％〜約２０重量％（例えば、約１０重量％）の凍結保存剤を含む。任意に、凍結保存溶液は、ＤＭＳＯ（例えば、１つを超える凍結保存剤を含む溶液では、ＤＭＳＯは、多量の総凍結保存剤で見出される）を含む。血清アルブミンまたは他の好適なタンパク質は、凍結融解プロセス中、膜を安定させ、細胞への損傷を低減させるのに役立ち、生存率を維持するために存在する。血清アルブミンは、ヒト血清アルブミンまたはウシ血清アルブミンであり得る。凍結保存溶液は、生理学的緩衝液または生理食塩水、例えば、リン酸緩衝生理食塩水をさらに含んでもよい。一実施形態では、凍結保存は、ニトロセルロース紙上に胎盤膜を設置することを含む。
【０２４４】
一実施形態では、胎盤膜は、凍結保存前、複数の切片に切断される。任意に、約２℃〜約８℃で胎盤膜の切片を設置する前に、切片は、ニトロセルロース紙上に設置される。
【０２４５】
使用方法
上で論じられるように、胎盤生成物、具体的には、本明細書に記載される凍結保存膜（例えば、羊膜、絨毛膜、及び／または絨毛羊膜）は、ある量の生存細胞、治療的因子、及び細胞外マトリックスを提供し、これらは多くの有益な治療活性及び効果を促進するのに有効である。本明細書に開示される方法では、膜は、細胞を促進して、任意の数の治療的因子を産生し、同じまたは同様の治療利益を提供する量の治療的因子、生存細胞、及び細胞外マトリックスを提供し得る環境に適用され、提供され得る。
【０２４６】
それ故に、一態様では、本開示は、対象における創傷の治療方法を提供し、本方法は、創傷の部位に、本明細書に記載される凍結保存された絨毛膜を含む膜を投与することを含み、投与時、該膜は、
（ｉ）炎症性サイトカインの量及び／若しくは活性の低減、
（ｉｉ）抗炎症性サイトカインの量及び／若しくは活性の増大、
（ｉｉｉ）反応性酸素種の量及び／若しくは活性の低減、
（ｉｖ）抗酸化剤の量及び／若しくは活性の増大、
（ｖ）プロテアーゼの量及び／若しくは活性の低減、
（ｖｉ）細胞増殖の増大、
（ｖｉｉ）血管新生の増大、ならびに／または
（ｖｉｉｉ）細胞遊走の増大、のうちの１つ以上を促進するのに有効な量で、生存細胞、細胞外マトリックス、及び／または１つ以上の治療的因子を提供する。
【０２４７】
別の態様では、本開示は、創傷治癒を加速させるための方法を提供し、本方法は、本明細書に記載される態様及び実施形態のうちのいずれかに従って、創傷の部位に、膜を投与することを含む。いくつかの実施形態では、投与は、初期投与ステップから１２週間後までに創傷閉口を促進するのに有効である。いくつかの実施形態では、投与は、初期投与ステップから５〜６週間後までに創傷閉口を促進するのに有効である。いくつかの実施形態では、投与は、初期投与ステップから２８日後に５０％以上の創傷サイズの低減を促進するのに有効である。実施形態では、投与は、標準的な創傷治療と比較して、創傷閉口速度を少なくとも約４４％改善するのに有効である。
【０２４８】
標準的な創傷治療または創傷治療のための標準的治療は、本明細書に記載される膜または生成物を組み込まない任意の治療を指し、含んでもよい。好適な標準的な創傷治療は、当該技術分野で周知であり、包帯（例えば、ガーゼ、救急絆、障害物、または検出不可能な若しくは低数の生存細胞を含有する遺伝子操作膜）、創傷清拭、抗生物質、軟膏、軟膏剤等、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。標準的な創傷治療は、創傷包帯または救急絆及びオフロードデバイスと併せた創傷清拭を含んでもよい。
【０２４９】
別の実施形態では、本開示は、これまでの創傷治癒では効果がない創傷に対する対象の治療方法を提供し、本方法は、本明細書に記載される態様及び実施形態のうちのいずれかに従って、創傷の部位に、膜を投与することを含む。いくつかの実施形態では、投与は、初期投与ステップから１２週間後までに創傷閉口を促進するのに有効である。いくつかの実施形態では、投与は、初期投与ステップから５〜６週間後までに創傷閉口を促進するのに有効である。いくつかの実施形態では、投与は、初期投与ステップから２８日後に５０％以上の創傷サイズの低減を促進するのに有効である。
【０２５０】
別の態様では、本開示は、慢性創傷の治療方法を提供し、本方法は、創傷の部位に、本明細書に開示される膜を投与することを含み、該投与は、慢性創傷の治癒を促進するのに有効な量で生存治療的細胞、細胞外マトリックス、及び１つ以上の治療的因子を提供する。
【０２５１】
創傷治療、創傷治療の加速、及び／または慢性創傷治療に関する上記の態様の実施形態では、創傷は、裂傷、擦り傷、火傷、切開、刺し傷、発射体に起因する創傷、表皮創傷、皮膚創傷、慢性創傷、急性創傷、外部創傷、内部創傷、先天性創傷、潰瘍、褥瘡、糖尿病性潰瘍、トンネル創傷、外科的処置中若しくはそれに付属するものとして生じる創傷、静脈皮膚潰瘍、及び虚血壊死からなる群から選択される。
【０２５２】
創傷治癒方法に関する上記の態様の実施形態では、膜は、（ｉ）炎症性サイトカインの量及び／若しくは活性の低減、（ｉｉ）抗炎症性サイトカインの量及び／若しくは活性の増大、（ｉｉｉ）反応性酸素種の量及び／若しくは活性の低減、（ｉｖ）抗酸化剤の量及び／若しくは活性の増大、（ｖ）プロテアーゼの量及び／若しくは活性の低減、（ｖｉ）細胞増殖の増大、（ｖｉｉ）血管新生の増大、ならびに／または（ｖｉｉｉ）細胞遊走の増大、のうちの１つ以上を直接的または間接的に促進し得る。
【０２５３】
別の態様では、本開示は、対象における炎症性眼状態の治療方法を提供し、本方法は、対象に、本明細書に開示される膜を投与することを含み、該投与は、炎症性眼状態を治療するのに有効な量で生存治療的細胞、細胞外マトリックス、及び１つ以上の治療的因子を提供する。この態様の実施形態では、本方法は、上皮形成を促進し、疼痛を低減させ、及び／または眼組織の炎症を一般的に低減させるために行われ得る任意の技術を用いて膜の投与を含むことができる。例えば、膜は、外科的インレー若しくは移植技術を介して、オンレー若しくはパッチング技術を介して、またはインレー若しくはオンレー技術の組み合わせを介して投与され得る。概して、本方法は、眼の手術（例えば、レーザー屈折矯正角膜切除（ＰＲＫ））、眼外傷（例えば、裂傷、火傷、若しくは擦り傷）、または炎症によって特徴付けられるか、若しくはその治療が眼組織においてある量の炎症をもたらす可能性のある眼の疾患と関連し得る。本方法によって含まれる「炎症性眼状態」を含む兆候の非限定的な例には、角膜若しくは結膜表面（複数を含む）の一般修復／再建、例えば、持続性上皮欠損；角膜潰瘍；角膜移植；デスメ膜瘤；角膜穿孔；上皮若しくは上皮下病変若しくは腫瘍（結膜腫瘍、結膜上皮内癌、上皮下病変、帯状角膜症、瘢痕、眼瞼の端に平行である結膜のひだ）の異常その後の切除；急性化学火傷；急性角膜炎；痛みを伴う水疱性角膜症；部分的若しくは完全な輪部幹細胞欠損（幹細胞移植に伴う）；急性スティーブンス・ジョンソン症候群；瞼球癒着；円蓋再建；無眼球症；胞再建術（ｂｌｅｂ  ｒｅｖｉｓｉｏｎｓ）；強膜菲薄化；及び翼状片（例えば、Ｍｅｌｌｅｒ，Ｄ．，ら，Ｄｔｓｃｈ．Ａｒｚｔｅｂｌ．Ｉｎｔ．，（２０１１）；１０８（１４）：２４３−２４８を参照されたく、参照により本明細書に組み込まれる）が含まれる。
【０２５４】
別の態様では、本開示は、対象における組織修復及び／または組織再生の促進方法を提供し、本方法は、対象に、本明細書に開示される膜を投与することを含み、該投与は、組織修復及び／または組織再生を促進するのに有効な量で生存治療的細胞、細胞外マトリックス、及び１つ以上の治療的因子を提供する。この態様のいくつかの実施形態では、本方法は、組織移植片処置、腱手術、靱帯手術、骨手術、及び脊髄手術からなる群から選択される外科的処置と組み合わせて使用される。いくつかの実施形態では、該組織は、ヒト組織である。さらなる実施形態では、ヒト組織は、軟骨、皮膚、靱帯、腱、または骨である。この態様及び様々な実施形態では、膜は、組織再生を直接的または間接的に刺激してもよい。
【０２５５】
別の態様では、本開示は、炎症応答の調節方法を提供し、本方法は、創傷に、本明細書に開示される膜を投与することを含み、該投与は、炎症性サイトカインの量及び／または活性を低減させ、ならびに／または抗炎症性サイトカインの量及び／若しくは活性を増大させるのに有効な量で、生存細胞、細胞外マトリックス、及び／または１つ以上の治療的因子を提供する。実施形態では、炎症性サイトカインは、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１α、またはそれらの組み合わせから選択される。他の実施形態では、炎症性サイトカインは、ＩＬ−１０若しくはＰＧＥ２、またはそれらの組み合わせから選択され得る。
【０２５６】
一態様では、本開示は、プロテアーゼ活性の調節方法を提供し、創傷に、本明細書に開示される膜を投与することを含み、該投与は、プロテアーゼ活性を低減させ、ならびに／またはプロテアーゼ阻害剤の量及び／または活性を増大させるのに有効な量で、生存細胞、細胞外マトリックス、及び／または１つ以上の治療的因子を提供する。実施形態では、プロテアーゼは、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）及びエラスターゼ、またはそれらの組み合わせからなる群から選択されてもよい。いくつかの実施形態では、１つ以上のプロテアーゼ阻害剤は、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＴＩＭＰ）の組織阻害剤を含む。
【０２５７】
さらなる態様では、本開示は、反応性酸素種（ＲＯＳ）の量及び／または活性の低減方法を提供し、本方法は、創傷に、本明細書に開示される膜を投与することを含み、該投与は、ＲＯＳの量及び／または活性を低減させ、ならびに／または抗酸化剤の量及び／または活性を増大させるのに有効な量で、生存細胞、細胞外マトリックス、及び／または１つ以上の治療的因子を提供する。いくつかの実施形態では、膜によって提供される抗酸化能力は、最大約２５０ｍＭのアスコルビン酸溶液に相当し得る。いくつかの実施形態では、膜は、オキシダント誘導アポトーシスから細胞を救助し得る。いくつかの実施形態では、膜は、オキシダントに曝露された後、アポトーシスを受けること、及び／または酸化損傷を受けることを低減させ得る、またはそのことから細胞を保護し得る。いくつかの態様では、生成物は、オキシダント誘導アポトーシスを受ける細胞の量を少なくとも約５０％、あるいは少なくとも約６０％、あるいは少なくとも約７０％、あるいは少なくとも約８０％、あるいは少なくとも約９０％低減させることができる。
【０２５８】
別の態様では、血管新生の増大方法を提供し、本方法は、創傷に、本明細書に開示される膜を投与することを含み、該投与は、血管新生を増大させるのに有効な量で、生存細胞、細胞外マトリックス、及び／または１つ以上の治療的因子を提供する。いくつかの実施形態では、膜は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）若しくは塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、またはそれらの組み合わせの量及び／または活性の増大を提供する。いくつかの実施形態では、膜は、血管形成を促進する。いくつかの実施形態では、膜は、組織中の閉鎖した管または血管の形成を促進及び／または増強することができる。インビトロで、膜は、ＨＵＶＥＣにより閉鎖した管の形成を促進する。
【０２５９】
別の態様では、本開示は、細胞遊走の増大方法を提供し、本方法は、創傷に、本明細書に記載される膜を投与することを含み、該投与は、細胞遊走を増大させるのに有効な量で、生存細胞、細胞外マトリックス、及び／または１つ以上の治療的因子を提供する。いくつかの実施形態では、膜は、内皮細胞、線維芽細胞、及び上皮細胞、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される細胞の細胞遊走を誘導する。
【０２６０】
さらに別の態様では、本開示は、細胞増殖の増大方法を提供し、本方法は、創傷に、本明細書に記載される膜を投与することを含み、該投与は、細胞増殖を増大させるのに有効な量で、生存細胞、細胞外マトリックス、及び／または１つ以上の治療的因子を提供する。
【０２６１】
さらなる態様では、本開示は、対象における瘢痕または拘縮形成の防止または低減方法を提供し、本方法は、該対象に、本明細書に開示される膜を投与することを含み、該投与は、瘢痕または拘縮形成を防止するまたは低減させるのに有効な量で、生存治療的細胞、細胞外マトリックス、及び１つ以上の治療的因子を提供する。本方法の実施形態では、膜は、瘢痕形成を防止するまたは低減させるのに有効な量で、ＩＦＮ−２α及び／またはＴＧＦ−β３の量または活性を増大させ得る。
【０２６２】
炎症応答の調節方法、プロテアーゼ活性の調節方法、抗酸化剤の量及び／若しくは活性の増大方法、血管新生の増大／促進方法、細胞遊走の増大方法、細胞増殖の増大方法、または瘢痕若しくは拘縮形成の低減方法に関する上記の態様のうちのいずれかでは、膜の投与は、直接的若しくは間接的に刺激的に誘発し得るか、または本方法を誘発し得る。
【０２６３】
本技術の胎盤生成物は、任意の組織損傷を治療するために使用してもよい。治療方法は、例えば、治療を必要とする対象に、本技術の胎盤生成物を投与することによって提供されてもよい。
【０２６４】
本技術の典型的な投与方法は、局所投与である。本技術の投与は、任意に、アクセスが外科的処置によって得られる内部組織への投与を含み得る。
【０２６５】
胎盤生成物は、自己移植、同種、または異種で投与され得る。
【０２６６】
一実施形態では、本胎盤生成物は、創傷を治療するために対象に投与される。任意に、創傷は、裂傷、擦り傷、熱または化学火傷、切断、刺し傷、または発射体により生じた創傷である。任意に、創傷は、表皮創傷、皮膚創傷、慢性創傷、急性創傷、外部創傷、内部創傷、先天性創傷、潰瘍、または褥瘡である。そのような創傷は、例えば、外科的処置中またはそれに付属するものとして生じた創傷のような偶発的または意図的であり得る。任意に、創傷は、投与前に外科的に閉口される。
【０２６７】
一実施形態では、本胎盤生成物は、火傷を治療するために対象に投与される。任意に、火傷は、第１度火傷、第２度火傷（部分的厚み火傷）、第３度火傷（完全厚み火傷）、火傷創傷の感染、切除及び非切除火傷創傷の感染、既に移植若しくは治癒した火傷からの上皮の喪失、または火傷創傷膿痂疹である。
【０２６８】
一実施形態では、本胎盤生成物は、潰瘍、例えば、糖尿病性潰瘍（例えば、足部潰瘍）を治療するために対象に投与される。
【０２６９】
一実施形態では、胎盤生成物は、例えば、粘着テープを用いて、創傷が覆われるように、対象の皮膚の上、例えば、角質層上、創傷の部位に直接的に胎盤生成物を設置することによって投与される。さらにまたは代替として、胎盤生成物は、移植として、例えば、皮膚移植として投与され得る。
【０２７０】
一実施形態では、胎盤生成物は、老化した皮膚のしわまたは他の特性を低減させるために表皮に投与される。そのような治療はまた、いわゆる美容整形外科（例えば、鼻形成術、しわ切除術等）と有用に組み合わせられる。
【０２７１】
一実施形態では、胎盤生成物は、皮膚アブレーション処置または皮膚剥削処置（例えば、レーザーアブレーション、熱アブレーション、電気的アブレーション、真皮深部アブレーション、皮下アブレーション、部分アブレーション、及びマイクロ皮膚剥削を含む）と関連する治癒を加速させるために表皮に投与される。
【０２７２】
本技術の胎盤生成物で処置され得る他の病変は、外傷性創傷（例えば、民間及び軍事創傷）、外科的瘢痕及び創傷、脊椎固定術、脊髄損傷、乏血壊死、再建手術、アブレーション、及び虚血を含む。
【０２７３】
一実施形態では、本技術の胎盤生成物は、組織移植片処置に使用される。任意に、胎盤生成物は、移植片に適用され、次いで、（例えば、治癒及び／または基質への付着を促進するために）生体基質へ付着される。非限定的な例によって、皮膚、軟骨、靱帯、腱、骨膜、軟骨膜、滑膜、筋膜、中腸、及び筋肉等の組織は、組織移植片として使用することができる。
【０２７４】
一実施形態では、胎盤生成物は、腱または靱帯の治癒を促進するために腱または靱帯手術において使用される。任意に、胎盤生成物は、骨に付着される腱または靱帯の部分に適用される。手術は、例えば、膝の手術、肩、下肢の手術、腕の手術、肘の手術、指の手術、手の手術、手首の手術、足指の手術、足の手術、足首の手術等を含む任意の腱または靱帯の手術であり得る。例えば、胎盤生成物は、骨への腱または靱帯の固定を促進するために移植片または再建処置において腱または靱帯に適用され得る。
【０２７５】
本発明者らの識見によって、驚くべきことには、本技術の胎盤生成物が腱または靱帯の手術のために優れた治療（例えば、治癒、治癒時間、及び／または治癒強度）を提供することが見出された。腱または靱帯の手術は、骨への腱または靱帯の固定を含むことができる。理論によって拘束されるものではないが、本発明者らは、本胎盤生成物におけるＭＳＣの骨形成及び／または軟骨形成の潜在性が腱または靱帯の治癒プロセス及び治癒強度を促進すると考えている。本発明者らは、本胎盤生成物が骨膜に基づいた治療への代替または補助治療を提供すると考えている。例えば、有用な骨膜に基づいた治療は、Ｃｈｅｎら（“Ｅｎｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｔｈｅ  ｔｅｎｄｏｎ  ｇｒａｆｔ  ｗｉｔｈ  ｐｅｒｉｏｓｔｅｕｍ  ｔｏ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｔｅｎｄｏｎ−ｂｏｎｅ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｉｎ  ａ  ｂｏｎｅ  ｔｕｎｎｅｌ：Ａ  ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ  ｓｔｕｄｙ  ｉｎ  ｒａｂｂｉｔｓ”；Ａｒｔｈｒｏｓｃｏｐｙ．２００３  Ｍａｒ；１９（３）：２９０−６）、Ｃｈｅｎら（“Ｅｎｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｏｆ  ｐｅｒｉｏｓｔｅｕｍ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｈａｍｓｔｒｉｎｇ  ｔｅｎｄｏｎ  ｇｒａｆｔ  ｉｎ  ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｃｒｕｃｉａｔｅ  ｌｉｇａｍｅｎｔ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ”；Ａｒｔｈｒｏｓｃｏｐｙ．２００２  Ｍａｙ−Ｊｕｎ；１８（５）：２７Ｅ）、Ｃｈａｎｇら（“Ｒｏｔａｔｏｒ  ｃｕｆｆ  ｒｅｐａｉｒ  ｗｉｔｈ  ｐｅｒｉｏｓｔｅｕｍ  ｆｏｒ  ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｔｅｎｄｏｎ−ｂｏｎｅ  ｈｅａｌｉｎｇ：ａ  ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｔｕｄｙ  ｉｎ  ｒａｂｂｉｔｓ”；Ｋｎｅｅ  Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｓｐｏｒｔｓ  Ｔｒａｕｍａｔｏｌｏｇｙ，Ａｒｔｈｒｏｓｃｏｐｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  １７，Ｎｕｍｂｅｒ  １２，１４４７−１４５３）において説明されており、これらの各々は、参照により組み込まれる。
【０２７６】
腱または靱帯手術の方法の非限定的な例として、腱を、胎盤膜に縫合し、及び／または巻きつけるか、若しくは覆い、腱を骨に付着させる。任意に、骨に付着させる前に、腱を、骨トンネルに入れる。
【０２７７】
一実施形態では、腱または靱帯手術は、移植片処置であり、胎盤生成物は移植片に適用される。任意に、移植片は、同種移植片、異種移植片、または自己移植片である。
【０２７８】
一実施形態では、腱または靱帯手術は、靱帯または腱の損傷の修復であり、胎盤生成物は靱帯または腱の損傷に適用される。
【０２７９】
胎盤生成物が適用され得る腱の非限定的な例は、指伸筋腱、膝腱、２頭筋腱、アキレス腱、伸筋腱、及び腱板を含む。
【０２８０】
一実施形態では、本技術の胎盤生成物は、創傷部位に胎盤生成物を適用することによって線維症を低減させるために使用される。
【０２８１】
一実施形態では、本技術の胎盤生成物は、抗癒着創傷バリアとして使用され、胎盤生成物は、例えば、線維症（例えば、術後線維症）を低減させるために、創傷部位に適用される。
【０２８２】
胎盤生成物が適用され得る創傷部位の非限定的な例は、脊髄、椎弓切除術、膝、肩、または出産、外傷性関連の創傷若しくは負傷、心臓血管外科手術、血管新生刺激を必要とする、脳／神経学的処置、火傷及び創傷のケア、ならびに眼の外科手術を含む、外科的に誘発されるまたは外科手術と関連するものを含む。例えば、任意に、創傷部位は、脊髄の外科手術と関連し、胎盤生成物の間質側が、硬膜（例えば、硬膜に面する間質側）に適用される。創傷部位及び／または手法の選択を含むそのような外科的処置における指示は、例えば、ＷＯ  ２００９／１３２１８６及びＵＳ  ２０１０／００９８７４３において見出され得、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
【０２８３】
本技術の胎盤生成物は、任意に、創傷の癒着または線維症を低減させるために使用することができる。術後線維症は、すべての手術創傷治癒の当然の帰結である。例として、術後硬膜癒着は、莢膜嚢及び神経根のけん引、引張、及び圧迫をもたらし、これにより、一般的には、椎弓切除術から数か月後に現れる知覚過敏症の再発を引き起こす。瘢痕組織の除去のための度重なる手術は、瘢痕組織によって囲まれている神経構造を特定するのが困難であるため、不良転帰及び負傷のリスクの増加と関連している。したがって、実験及び臨床研究は、主に、硬膜及び神経根の癒着を防止することに焦点を絞っている。脊髄の癒着は、脊髄手術の失敗での主な要因に関与している。線維性瘢痕組織は、神経根の圧迫及びけん引を生じ得、これは再発性疼痛及び身体障害と関連し得る。
【０２８４】
理論によって拘束されるものではないが、本発明者らは、本胎盤生成物が、免疫細胞の数の低下、及び細胞因子（例えば、ＴＧＦ−β３、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＥ、ヒアルロン酸等）の数の増加を含む環境を提供するように原位置で機能を果たし得るため、少なくとも一部分において、創傷の癒着または線維症を低減させるのに有用であると考えている。本技術の創傷包帯及びプロセスのある利点は、抗癒着バリアが提供されることであり、これは、手術後、具体的には、背中の手術後の癒着を防止するために使用することができる。
【０２８５】
前述の段落において、単数形の使用は、特記される場合を除き、複数形を含んでもよい。本明細書で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という用語は、特に指定されない限り、「１つ以上」を意味する。さらに、本技術の態様は、代替物の一覧表を参照して記載される場合、この技術は、代替物の一覧表の任意の個々のメンバーまたはサブグループ、及びそれらのうちの１つ以上の任意の組み合わせを含む。
【０２８６】
刊行された特許出願を含むすべての特許及び刊行物の開示は、各特許及び刊行物が参照により具体的かつ個別的に組み込まれるのと同じ程度に全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【０２８７】
本技術の範囲は、上記の特定の実施形態に限定されるものではないことを理解されるべきである。本技術は、特に記載されるもの以外で実行され得るが、依然として、添付の特許請求の範囲内であり得る。
【０２８８】
同様に、以下の実施例は、本技術をより十分に説明するために示される。しかしながら、これらは本明細書に開示される技術の広範な範囲を限定すると決して解釈されるべきではない。
【０２８９】
本発明に記載される技術及びその利点は、以下の実施例を参照することによりさらに良好に理解されるであろう。これらの実施例は、本技術の特定の実施形態を説明するために提供される。これらの特定の実施例を提供することにより、本技術の範囲及び趣旨を制限することが意図されない。当業者であれば、本発明に記載される技術の全範囲が本出願に添付される特許請求の範囲、及びこれらの特許請求の範囲の任意の変更、修正、または等価物によって定義される主題を包含することを理解するであろう。本技術の他の特性及び実施形態は、その意図される範囲を限定するというよりむしろ本技術の例示のために与えられる以下の実施例から明らかであろう。
【実施例】
【０２９０】
製造プロセス
実施例１  羊膜生成物の例示的な製造プロセス
一実施形態では、本明細書で論じられるように、本開示は、産後の胎盤からの羊膜を含む胎盤生成物（または代替として、続く実施例では、「膜」）の製造方法に関する。１つのそのような方法は、以下を含む：
ａ．胎盤表面に近い臍帯を除去する、
ｂ．胎盤縁に対して羊膜を鈍的切開する、
ｃ．胎盤をひっくり返し、羊膜を完全に除去する、
ｄ．ＰＢＳ中で羊膜をすすいで、赤血球を除去する、
ｅ．１１％のＡＣＤ−Ａ溶液で羊膜を１回すすいで、赤血球の除去を助ける、
ｆ．ＰＢＳで羊膜をすすいで、ＡＣＤ−Ａ溶液を除去する、
ｇ．ＰＢＳを使用して、羊膜からあらゆる残りの血液を除去する、
ｈ．羊膜の上皮または間質細胞層の一部ではないあらゆる他の成分を緩やかに除去する、
ｉ．ＰＢＳ中に羊膜を入れ、取っておく、
ｊ．抗生物質溶液の入っている瓶に羊膜を入れ、３７℃±２℃で２４〜２８時間インキュベートする、
ｋ．インキュベーターから瓶を取り出し、ＰＢＳで膜をすすいで、抗生物質溶液を除去する、
ｌ．強化ニトロセルロース紙上に（上皮側を上向きに）羊膜を取り付け、大きさに切断する、
ｍ．ＦＰ−９０クリオバッグに入れ、熱融着する、
ｎ．５０ｍＬの凍結保存溶液を、注射器によってバッグに入れ、注射器でバッグ内に閉じ込められたあらゆる空気を除去する、
ｏ．ＦＰ−９０バッグ上の溶液ラインを封管する、
ｐ．充填したバッグを第２のバッグに入れ、熱融着する、
ｑ．ユニットを包装カートンに入れる、
ｒ．２〜８℃で３０〜６０分間冷蔵し、スタイロフォーム容器中で、−８０℃±５℃で凍結する。
【０２９１】
実施例２  絨毛膜生成物の例示的な製造プロセス
絨毛膜及び任意に産後の胎盤からの羊膜を含む胎盤生成物を製造する１つの方法は、以下を含む：
ａ．胎盤表面に近い臍帯を除去する、
ｂ．胎盤縁に対して羊膜を鈍的切開する、
ｃ．胎盤をひっくり返し、羊膜を完全に除去する、
ｄ．胎盤縁の周囲を切断することによって絨毛膜を除去する、
ｅ．ＰＢＳ中の両方の膜をすすいで、赤血球を除去する、
ｆ．１１％のＡＣＤ−Ａ溶液で両方の膜を１回すすいで、赤血球の除去を助ける、
ｇ．ＰＢＳで両方の膜をすすいで、ＡＣＤ−Ａ溶液を除去する、
ｈ．２００ｍｌの０．５％  ディスパーゼ溶液中の絨毛膜を３７℃±２℃で３０〜４５分間処理する、
ｉ．ディスパーゼ処理が完了したら、ＰＢＳで絨毛膜をすすいで、ディスパーゼ溶液を除去する、
ｊ．絨毛膜から栄養膜層を緩やかに除去する、
ｋ．抗生物質溶液の入っている瓶に絨毛膜を入れ、３７℃±２℃で２４〜２８時間インキュベートする、
ｌ．インキュベーターから瓶を取り出し、ＰＢＳで絨毛膜をすすいで、抗生物質溶液を除去する、
ｍ．強化ニトロセルロース紙上に絨毛膜を取り付け、大きさに切断する、
ｎ．ＦＰ−９０クリオバッグに各切片を入れ、熱融着する、
ｏ．５０ｍＬの凍結保存溶液を、注射器によってバッグに入れ、注射器でバッグ内に閉じ込められたあらゆる空気を除去する、
ｐ．ＦＰ−９０バッグ上の溶液ラインを封管する、
ｑ．充填したバッグを第２のバッグに入れ、熱融着する、
ｒ．ユニットを包装カートンに入れる、
ｓ．２〜８℃で３０〜６０分間冷蔵する、
ｔ．スタイロフォーム容器中で、−８０℃±５℃で凍結する。
【０２９２】
実施例３  絨毛羊膜生成物の例示的な製造プロセス
本開示は、羊膜及び産後の胎盤からの絨毛膜を含む胎盤生成物の製造方法を提供し、本方法は、以下を含む：
ａ．胎盤表面に近い臍帯を除去する、
ｂ．胎盤縁に対して羊膜を鈍的切開する、
ｃ．胎盤をひっくり返す、
ｄ．胎盤縁の周囲を切断することによって絨毛膜及び付着した羊膜（絨毛羊膜）を除去する、
ｅ．ＰＢＳ中の両方の膜をすすいで、赤血球を除去する、
ｆ．１１％のＡＣＤ−Ａ溶液で両方の膜を１回すすいで、赤血球の除去を助ける、
ｇ．ＰＢＳで両方の膜をすすいで、ＡＣＤ−Ａ溶液を除去する、
ｈ．抗生物質溶液の入っている瓶に膜を入れ、３７℃±２℃で２４〜２８時間インキュベートする、
ｉ．インキュベーターから瓶を取り出し、ＰＢＳですすいで、抗生物質溶液を除去する、
ｊ．絨毛膜から栄養膜層を緩やかに除去する、
ｋ．強化ニトロセルロース紙上に絨毛羊膜を取り付け、大きさに切断する、
ｌ．ＦＰ−９０クリオバッグに各切片を入れ、熱融着する、
ｍ．５０ｍＬの凍結保存溶液を、注射器によってバッグに入れ、注射器でバッグ内に閉じ込められたあらゆる空気を除去する、
ｎ．ＦＰ−９０バッグ上の溶液ラインを封管する、
ｏ．充填したバッグを第２のバッグに入れ、熱融着する、
ｐ．ユニットを包装カートンに入れる、
ｑ．２〜８℃で３０〜６０分間冷蔵する、
ｒ．スタイロフォーム容器中で、−８０℃±５℃で凍結する。
【０２９３】
実施例４  例示的な膜製造プロセス
本開示の製造手順に従って絨毛膜を含む胎盤生成物膜を製造するための１つの方法に関するさらなる詳細を、以下に提供する。
【０２９４】
胎盤を生物学的安全キャビネット内で処理した。臍帯をまず除去し、鈍的切開を用いて、羊膜を下層の絨毛膜から剥離した。その後、臍帯の反対側の胎盤縁の周囲を切断することによって、絨毛膜を除去した。胎盤の臍帯側の絨毛膜は、こちら側の血管新生により除去されなかった。絨毛膜をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）ですすいで、肉眼的血栓及びあらゆる過剰な血球を除去した。次いで、膜を、生理食塩水（Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）中の１１％の抗凝固剤クエン酸デキストロース溶液（ＵＳＰ）処方Ａ（ＡＣＤ−Ａ）（Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）で洗浄し、残りの血球を除去した。
【０２９５】
次いで、絨毛膜を、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ（Ｌｏｎｚａ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）中の２００ｍＬの０．５％  ディスパーゼ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）溶液中で３７℃±２℃で３０〜４５分間インキュベートして、絨毛膜と隣接した栄養膜層との間の接続部を消化させた。絨毛膜のインキュベーション期間が完了したら、絨毛膜をＰＢＳですすいで、ディスパーゼ溶液を除去した。その後、栄養膜層を緩やかに剥離または掻爬することによって除去した。
【０２９６】
次いで、絨毛膜を、ＤＭＥＭ中の硫酸ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍＬ）（Ａｂｒａｘｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｓｃｈａｕｍｂｕｒｇ，ＩＬ）、バンコマイシンＨＣl５０μｇ／ｍＬ）（Ｈｏｓｐｉｒａ  Ｉｎｃ．，Ｌａｋｅ  Ｆｏｒｅｓｔ，ＩＬ）、及びアンフォテリシンＢ（２．５μｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）からなる５００ｍＬの抗生物質溶液中で、３７℃±２℃で２４〜２８時間殺菌した。ベント型キャップをインキュベーションフラスコで使用した。インキュベーション期間後、膜をＰＢＳで洗浄して、あらゆる残りの抗生物質溶液を除去した。
【０２９７】
膜は、Ｏｐｔｉｔｒａｎ  ＢＡ−Ｓ  ８５強化ニトロセルロース紙（Ｗｈａｔｍａｎ，Ｄａｓｓｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上に取り付け、ＦＰ−９０クリオバッグ（Ｃｈａｒｔｅｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌｔｄ．，Ｗｉｎｓｔｏｎ−Ｓａｌｅｍ，ＮＣ）中に包装する前に、適切な大きさに切断した。膜ユニットをＦＰ−９０クリオバッグに入れ、クリオバッグを熱融着させた時点で、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ−Ａ（Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）中の１０％  ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｂｉｏｎｉｃｈｅ  Ｔｅｏ．Ｉｎｖｅｒｉｎ  Ｃｏ．，Ｇａｌｗａｙ，Ｉｒｅｌａｎｄ）及び５％  ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（Ｂａｘｔｅｒ，Ｗｅｓｔ  Ｌａｋｅ  Ｖｉｌｌａｇｅ，ＣＡ）を含有する５０ｍＬの凍結保存溶液を中心チューブラインを通して添加した。あらゆる過剰な空気を除去し、続いて、チューブラインを密閉した。
【０２９８】
ＦＰ−９０クリオバッグをｍａｎｇａｒバッグ（１０インチ×６インチ）（Ｍａｎｇａｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｎｅｗ  Ｂｒｉｔａｉｎ，ＰＡ）中に入れ、次いで、これを熱融着させた。ｍａｎｇａｒバッグを包装カートン（１０．５インチ×６．５インチ×０．６インチ）（Ｄｉａｍｏｎｄ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）中に入れた。すべてのカートンを、スタイロフォーム容器中で、−８０℃±５℃で凍結させる前に、２〜８℃で３０〜６０分間冷蔵した。
【０２９９】
実施例４．１  ニトロセルロース紙上に取り付けられた膜における解凍時間
本明細書に記載される凍結保存された膜は、他の凍結保存生成物よりも急速な解凍特性を示し得る。急速解凍プロファイルは、本明細書に記載される膜がオンデマンド使用及び適用に対してより効率よく有効に使用することを可能にする。１つの解凍プロトコルを以下に論じる。
−冷凍庫（−８０℃）から取り出したニトロセルロース紙上で包装された２ロットの胎盤組織から２つの試料を取る。
−室温の水で充填した解凍容器中に胎盤組織を含有するクリオバッグを入れる。
−観察可能な氷晶がなくなったときの解凍時間を記録する。
【０３００】
【表１】
2017514507.tif 000003
【０３０１】
完了した解凍とは、すべての氷晶がなくならなければならない。そうでなければ、氷の重量により、膜を裂くか、またはニトロセルロース紙から剥がれ落ちて、解凍が完了したときに自己折り畳みを生じる恐れがある。結果を上の表１に示し、平均解凍時間が２６分であることを示し、それ故に、本明細書に記載される凍結保存された膜における「オンデマンド」使用及び適用を円滑にした。
【０３０２】
実施例５．絨毛羊膜生成物の例示的な製造プロセス
本開示の製造手順に従って羊膜生成物及び絨毛膜生成物を含む胎盤生成物を製造する１つの方法は、以下の通りである：
【０３０３】
胎盤を生物学的安全キャビネット内で処理した。臍帯をまず除去し、付着した羊膜を有する絨毛膜を胎盤縁から切り取った。両方の膜をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）ですすいで、肉眼的血栓及びあらゆる過剰な血球を除去した。次いで、膜を、生理食塩水（Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）中の１１％の抗凝固剤クエン酸デキストロース溶液（ＵＳＰ）処方Ａ（ＡＣＤ−Ａ）（Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）で洗浄し、残りの血球を除去した。
【０３０４】
次いで、絨毛羊膜を、ＤＭＥＭ中の硫酸ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍＬ）（Ａｂｒａｘｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｓｃｈａｕｍｂｕｒｇ，ＩＬ）、バンコマイシンＨＣＩ（５０μｇ／ｍＬ）（Ｈｏｓｐｉｒａ  Ｉｎｃ．，Ｌａｋｅ  Ｆｏｒｅｓｔ，ＩＬ）、及びアンフォテリシンＢ（２．５μｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）からなる５００ｍＬの抗生物質溶液を入れたベント型フラスコ中で、３７℃±２℃で２４〜２８時間殺菌した。インキュベーション期間後、膜をＰＢＳで洗浄して、あらゆる残りの抗生物質溶液を除去した。絨毛膜の栄養膜層を、鈍的切開を用いて、緩やかに除去した。
【０３０５】
膜は、Ｏｐｔｉｔｒａｎ  ＢＡ−Ｓ  ８５強化ニトロセルロース紙（Ｗｈａｔｍａｎ，Ｄａｓｓｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上に取り付け、ＦＰ−９０クリオバッグ（Ｃｈａｒｔｅｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌｔｄ．，Ｗｉｎｓｔｏｎ−Ｓａｌｅｍ，ＮＣ中に包装する前に、適切な大きさに切断した。膜ユニットをＦＰ−９０クリオバッグに入れ、クリオバッグを熱融着させた時点で、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ−Ａ（Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）  中の１０％  ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｂｉｏｎｉｃｈｅ  Ｔｅｏ．Ｉｎｖｅｒｉｎ  Ｃｏ．，Ｇａｌｗａｙ，Ｉｒｅｌａｎｄ）及び５％  ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（Ｂａｘｔｅｒ，Ｗｅｓｔ  Ｌａｋｅ  Ｖｉｌｌａｇｅ，ＣＡ）を含有する５０ｍＬの凍結保存溶液を中心チューブラインを通して添加した。あらゆる過剰な空気を除去し、続いて、チューブラインを密閉した。
【０３０６】
ＦＰ−９０クリオバッグをｍａｎｇａｒバッグ（１０インチ×６インチ）（Ｍａｎｇａｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｎｅｗ  Ｂｒｉｔａｉｎ，ＰＡ）中に入れ、次いで、これを熱融着させた。ｍａｎｇａｒバッグを包装カートン（１０．５インチ×６．５インチ×０．６インチ）（Ｄｉａｍｏｎｄ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）中に入れた。すべてのカートンを、スタイロフォーム容器中で、−８０℃±５℃で凍結させる前に、２〜８℃で３０〜６０分間冷蔵した。
【０３０７】
実施例６  胎盤膜の酵素消化後の細胞数及び細胞生存率の定量的評価
羊膜及び絨毛膜ならびに本胎盤生成物（上記からの）を、この処理を通じて細胞数及び細胞生存率について評価した。これらの分析は、新鮮な胎盤組織（抗生物質による治療ステップ前）、抗生物質による治療後の胎盤組織、及び解凍後の生成物ユニットにおいて行われた。細胞は、酵素消化を用いて、胎盤膜から単離された。凍結保存された生成物ユニットについては、ＦＰ−９０クリオバッグをまず、包装カートン及びｍａｎｇａｒバッグから取り出した。次いで、ＦＰ−９０クリオバッグを室温の水槽中で２〜３分間解凍した。初期実験は、３７℃±２℃の水槽の使用を含んだ。解凍後、胎盤膜をＦＰ−９０クリオバッグから取り出し、最低１分間、及び最大６０分間、生理食塩水（Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）中に入れた。各膜を、消化前に、強化ニトロセルロース紙から取り外した。
【０３０８】
羊膜を、揺動機上で、４０ｍＬの０．７５％  コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｌａｋｅｗｏｏｄ，ＮＪ）溶液を３７℃±２℃で２０〜４０分間消化させた。コラゲナーゼ消化後、試料を２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を除去し、３０ｍＬの０．０５％  トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｌｏｎｚａ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を添加し、揺動機上で、３７℃±２℃でさらに５〜１５分間インキュベートした。トリプシンを、使用前に、水槽中で３７℃±２℃に加温した。トリプシン消化後、懸濁液を１００μｍの細胞濾過器のナイロンフィルタを通して濾過して、あらゆる破片を除去した。１５ｍｌのＤＭＥＭを、この濾過器を通して同じ円錐管に通過させる。２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行い、上清を除去した。細胞ペレットをペレットサイズにに比例したある体積のＤＭＥＭで再構成し、２０μＬの再懸濁した細胞懸濁液を、計数のために、８０μＬのトリパンブルー（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と混合した。細胞計数試料を、血球計中に入れ、顕微鏡を用いて評価した。
【０３０９】
絨毛膜を、揺動機上で、２５ｍＬの０．７５％  コラゲナーゼ溶液で、３７℃±２℃で２０〜４０分間消化させた。コラゲナーゼ消化後、懸濁液を１００μｍの細胞濾過器のナイロンフィルタを通して濾過して、あらゆる破片を除去した。２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行い、上清を除去した。細胞ペレットをペレットサイズに比例したある体積のＤＭＥＭで再構成し、２０μＬの再懸濁した細胞懸濁液を、計数のために、８０μＬのトリパンブルーと混合した。細胞計数試料を、血球計中に入れ、顕微鏡を用いて評価した。
【０３１０】
胎盤膜を、あらゆる処理の前に分析して、膜の初期特性を決定した。表２は、３２個の胎盤ロットからの羊膜及び絨毛膜における１ｃｍ２当たりの平均細胞及び細胞生存率を含む。
【０３１１】
平均して、羊膜については、１ｃｍ２当たり９１，３８１個の生存細胞があり、８４．５％の対応する平均細胞生存率を有した。絨毛膜については、１ｃｍ２当たり５１，６１４個の生存細胞があり、８６．０％の対応する平均細胞生存率を有した。
【０３１２】
【表２】
2017514507.tif 000004
【０３１３】
これらのデータは、本技術のある特定の実施形態、例えば、約１０，０００〜約３６０，０００個の細胞／ｃｍ２を含有する羊膜を含む胎盤生成物で用いるのに有用である細胞数を示す。羊膜が上皮細胞及び間質細胞からなるため、実験は、上皮細胞対間質細胞の比率を決定するために行われた。３個の胎盤ロットからの羊膜が分析された。第１に、５ｃｍ×５ｃｍの切片の羊膜が、水槽中で約２５ｍＬの０．０５％  トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｌｏｎｚａ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）で３７℃±２℃で３０分間消化された。インキュベーションステップ後、上皮細胞を、膜から細胞を緩やかに掻爬することによって除去した。ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）ですすいだ後、続いて、膜は、絨毛膜（上述の）と同じ様式で消化された。加えて、別の無傷の５ｃｍ×５ｃｍの切片の羊膜が、標準的な手順（上述の）を用いて消化され、細胞の総数を決定した。次いで、間質細胞のパーセンテージが、除去された上皮細胞を有する羊膜からの細胞係数を無傷膜から細胞計数で除算することによって決定された。
【０３１４】
結果は、総細胞のうちの１９％が間質細胞であったことを示す。したがって、約１７，３６２個の間質細胞が、約７４，０１９個の上皮細胞を有する羊膜中に存在した。これらのデータは、羊膜と比較して、絨毛膜中に約３倍以上の間質細胞があることを示した。この比率は、絨毛膜が羊膜と比較して、約２〜約４倍以上の間質細胞を含む、絨毛膜及び羊膜を含む胎盤生成物を提供する本技術のある特定の実施形態と一致している。
【０３１５】
１ｃｍ２当たりの生存細胞及び細胞生存率が、抗生物質による治療ステップ後に評価された。処理細胞回復率は、（本発明に記載される技術においてこれまでに記載されるように）抗生物質による処理前及びその後の生存細胞を比較することによって計算された。表３は、これらの分析からの結果を提供する。
【０３１６】
【表３】
2017514507.tif 000005
【０３１７】
実施例７  胎盤生成物の凍結保存手順の開発
凍結保存は、組織及び生体細胞の源を提供する方法である。凍結保存の主な目的は、低温凍結及び保存中の生物物質への損傷を最小限に抑えることである。一般的な凍結保存則がすべての細胞、組織、及び臓器に適用可能であるが、特定の凍結保存溶液及び手順は、各種の生物物質に対して開発されなければならない。本適用は、胎盤膜からの免疫原性細胞を選択的に枯渇させ、治癒の促進のための主な因子源であるその他の有用な細胞の生存率を保つことができる胎盤膜生成物のための凍結保存手順を開示する。
【０３１８】
胎盤膜の凍結保存方法の開発中、本発明者らは、凍結保存溶液の体積、凍結前の組織平衡の効果、及び凍結手順のための冷却速度を含む、凍結保存の主要パラメータを評価した。
【０３１９】
免疫抑制の不在下、組織同種移植片の受容は、組織中に存在する衛星免疫細胞の数によって異なるであろう。凍結保存は、組織免疫原性を低減させるために利用され得るアプローチである。このアプローチは、ＤＭＳＯの存在下で、凍結負傷への異なる細胞型の微分磁化率に基づいており、白血球は、高速冷却速度に対して感受性がある。１℃／分の凍結速度は、免疫細胞を含む細胞及び組織に最適であると考えられる。６０〜１００℃／分等の高速凍結速度は、免疫細胞を排除する。しかしながら、この種の手順は、本技術による保存に対して望ましいその他の組織細胞には有害である。開発された凍結保存手順は、１０％  ＤＭＳＯを含有する凍結保存培地に利用され、これは、水が低温で結晶を形成する場合に破壊から細胞を保護する主な要素である。凍結保存の第２のステップは、凍結保存培地中の胎盤膜の完全な平衡であり、これは、４℃で３０〜６０分間凍結保存培地中の細胞を浸漬させることによって達成された。このステップは、ＤＭＳＯが胎盤組織に浸透するのを可能にする。いくつかのデータは、凍結前の組織平衡がリンパ球の生存に影響を及ぼし得ることを示す（例えば、Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｂａｎｋ，Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９８８，２５：１）が、このデータは、相当な数のマクロファージが組織均衡後でさえ生存する。
【０３２０】
意外なことには、ＤＭＳＯ含有溶液中、２〜８℃で３０〜６０分間の胎盤膜平衡が、これらの細胞型が約１℃／分の速度でさえ凍結に耐えることができないため、凍結へのマクロファージ等の免疫細胞の感受性を増強することが見出された。
【０３２１】
温度マッピング実験は、膜生成物に対する潜在的な凍結保存条件の温度プロファイルを分析するために行われた。これらの結果を図１に示す。８つのＦＰ−９０クリオバッグを、２０ｍＬまたは５０ｍＬの凍結保存溶液で充填し、温度プローブを各クリオバッグに設置した。第１のセットのパラメータ（それぞれ、図１Ａ〜図１Ｄの条件１〜４）は、凍結（−８０℃±５℃）前の３０分間の冷却（２〜８℃）ステップを含んだ。加えて、この分析は、スタイロフォーム容器内またはフリーザー棚上のクリオバッグの凍結を含んだ。第２のセットのパラメータ（それぞれ、図１Ｅ〜図１Ｈの条件５〜８）は、スタイロフォーム容器内またはフリーザー棚上のクリオバッグの直接凍結（−８０℃±５℃）を含んだ。結果は、条件６及び条件２が最も段階的な温度低下を示した。段階的な温度低下は、典型的には、細胞生存率を保つために所望される。条件６と条件２との違いは、条件２が３０分間の冷蔵ステップを含んだことであった。したがって、凍結の開始から−４℃までの温度の低下は、凍結時に潜在的な熱発生が生じる場合に、さらに試験された。条件６における冷却速度は、この期間中、約−１℃／分であった。条件２における冷却速度は、同じ期間中、約−０．４℃／分であった。したがって、より遅い冷却速度が概して最適な細胞生存率を維持することが所望されるため、非限定的な凍結保存プロセスに組み込むために、条件２が選択された。
【０３２２】
図２Ａは、羊膜の処理（凍結保存）の細胞回復率における凍結保存溶液の体積の効果を示す。図２Ｂは、羊膜の細胞生存率における凍結保存溶液の体積の効果を示す。
【０３２３】
処理（凍結保存）の細胞回復率は、（本明細書でこれまでに記載されるように）凍結保存による処理前及びその後の生存細胞を比較することによって計算された。この目的は、最大の細胞回復を提供する凍結保存条件を特定することであった。しかしながら、利用されたアッセイ（トリパンブルー排除）は、胎盤の異なる部分から組織試料を得ることを必要とし、各組織試料が異なる細胞計数を含むため、正確な細胞回復測定を得ることは不可能である。このことは、我々が直面する広範囲の処理細胞回復率（１０％〜４１０％）を説明する。一方、細胞生存率は、同じ組織片中の生存細胞数を総細胞数と比較することによって計算された。したがって、細胞生存率は、凍結保存手順のパラメータを最適化するために使用された。
【０３２４】
図２Ｂに示されるように、５０ｍＬの体積の凍結保存溶液体積は、５×５の胎盤膜における１０ｍＬ及び２０ｍＬのものと比較して同等の細胞回収率を提供した。これらのデータは、１０ｍＬの凍結保存培地体積が本技術に従って７０％超の細胞生存率を有する胎盤生成物を提供するのに十分であることを示す。同じ結果が、図３Ａ及び３Ｂに見られるように、絨毛膜に対して得られた。
【０３２５】
実験は、凍結保存方法が無傷絨毛羊膜の保存に適用され得るかどうかを評価するために行われた。絨毛羊膜は、新鮮な胎盤から切り取られ、抗生物質中で一晩インキュベートされた。次いで、栄養膜層を除去し、この膜を２ｃｍ×２ｃｍの切片に切断した。２つの膜が無傷で維持されるように、全過程を通して注意が払われた。新鮮な及び凍結保存された胎盤膜が調製され、細胞生存率が、細胞生存率を測定するために、ＭＴＴアッセイ（Ｂｉｏｔｉｕｍ  ３０００６）、比色アッセイを用いて測定された。アッセイの機構は、ブルーホルマザンの沈殿物への可溶性テトラゾリウム塩の代謝還元が無傷ミトコンドリア機能を有する生存細胞の存在に応じて異なるという事実に基づいている。試料を、ＭＴＴアッセイ培地中で３〜４時間インキュベートした。転化期間の終了時に、試料を、ＤＭＳＯ中、３７℃で１時間抽出した。抽出期間の終了時に、０．２ｍＬの各抽出物を９６ウェルプレートの１つのウェルに移した。細胞生存率に比例する呼吸度は、ブランクとしてＤＭＳＯ抽出緩衝液を用いて、プレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  ３４０ＰＣ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）上で、５７０ｎｍで読み出した。図４は、新鮮な及び解凍した凍結保存された試料から得られたＭＴＴ値を示す。データから示されるように、細胞生存率は、新鮮な凍結保存された絨毛羊膜の試料と解凍後のされた絨毛羊膜の試料との有意な差異を示さなかった。
【０３２６】
実験は、凍結保存処理後の細胞回復率を最大限にするための異なる潜在的な凍結条件を評価するために行われた。図５Ａ（羊膜）及び図５Ｂ（絨毛膜）は、これらの結果が絨毛膜の処理（凍結保存）の細胞回復率における冷蔵時間及び冷凍パラメータの効果を示すことを示す。３つの条件が分析された。これらの条件はまた、温度マッピング研究にも関連があった。第１の条件は、フリーザー（−８０℃±５℃）内の棚上の生成物ユニットを直接凍結させることを含んだ。第２の条件もまた、直接凍結を含んだが、生成物ユニットは、フリーザー内のスタイロフォーム容器内に設置された。第３の条件は、凍結ステップ前の３０分間の冷蔵（２〜８℃）期間を含んだ。羊膜については、３つの胎盤ロットが評価された。２つの胎盤ロットは、絨毛膜について分析された。結果は、第３の条件が両方の膜型に対して最適であったことを示した。
【０３２７】
羊膜の細胞生存率における冷蔵時間及び冷凍パラメータの効果もまた試験された。細胞生存率は、吸光度が細胞生存率に比例する、上述のＭＴＴアッセイを用いて測定された。４つの温度平衡時間が試験された：直接凍結（０時間）、冷蔵庫（４℃）中での１時間または４時間の平衡、及び室温で４時間の平衡。各条件については、フリーザー棚上またはスタイロフォーム箱内での直接的な生成物の凍結もまた、試験された。図６は、研究の結果を示し、羊膜が４℃で最長１時間保存され、次いで、スタイロフォーム箱内で凍結させた場合に、最高細胞生存率が得られたことを示す。この条件が、最高の処理された細胞回復率及び細胞生存率を提供したため、さらなる開発のために選択された。
【０３２８】
羊膜及び絨毛膜について評価された凍結保存パラメータのすべてを表４及び表５に要約する。
【０３２９】
これらの実験からの細胞生存率の評価は、製造過程のための最終パラメータの選択をもたらした。加えて、すべての平均細胞生存率は、７０％以上であった。
【０３３０】
【表４】
2017514507.tif 000006
【０３３１】
【表５】
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【０３３２】
これらのデータは、約４０，０００〜約９０，０００個または〜約２６０，０００個の細胞／ｃｍ２を含有する羊膜を含む胎盤生成物を提供する本技術のある特定の実施形態と一致する。
【０３３３】
実施例８．最終絨毛膜組成物の安定性試験
【０３３４】
本技術のある特有の態様は、この凍結保存方法が、長期間、細胞生存を保つことができることである。細胞生存が保存から２年後維持され得るかどうかを試験するために、絨毛膜を処理し（例えば、細分化し、任意に消化させ）、凍結保存した。
【０３３５】
凍結保存処理された絨毛膜組成物の安定性は、−８０℃で２４カ月の長期保存中、可能な生成物劣化を評価するために試験された。生成物劣化の指標は、生存細胞数の減少及び細胞生存率の低下である。生存細胞数及び細胞生存率は、３つのロットの胎盤組成物における初期凍結の完了後及び凍結から２４カ月後に決定された。加えて、無菌試験は、凍結から１２カ月後及び２４カ月後に行われた。
【０３３６】
３つの胎盤は、絨毛膜がシートとして包装化されず、細分化する代わりに、ホウケイ酸ガラスのバイアル中で包装化され、−８０℃で生理食塩水中の５％  ＤＭＳＯで凍結されたことを除いては、実施例２に記載される手順に従って別々に処理した。３つのロットのそれぞれの胎盤組成物を、初期凍結の完了後及び凍結から２４カ月後、直接解凍し、血球計及びトリパンブルー染色を用いて、生存及び死滅細胞を計数した。それぞれの試料における細胞生存率を計算した。結果を表６中に示す。
【０３３７】
最終組成物は、−８０℃で保存してから２４カ月後、最小限の劣化から劣化がないことを示した。初期凍結保存から２年後、それぞれのロットは、依然として、１ｍＬ当たり１００，０００個超の生存細胞を含有し、少なくとも７０％の細胞生存率を有した。
【０３３８】
【表６】
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【０３３９】
それぞれのロットの試料はまた、凍結後の２つの異なる時点（１２カ月及び２４）での無菌性についても試験した。試験は、承認された試験設備によって行われた。試験したすべての試料が、陰性であった（表７）。
【０３４０】
【表７】
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【０３４１】
実施例９  組織染色による細胞生存の定量的評価
羊膜及び絨毛膜は、細胞生存率を定量的に評価するために、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）生存率／細胞毒性キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて染色した。染色は、製造業者のプロトコルのように行われた。約０．５ｃｍ×０．５ｃｍの膜切片を使用した。染色した膜の評価は、蛍光顕微鏡を用いて行われた。強力な一定の緑色蛍光は、生細胞の存在を示し、鮮赤色蛍光は、死滅細胞の存在を示した。新鮮な羊膜及び絨毛膜ならびに凍結保存された羊膜及び絨毛膜の画像は、製造処理が解凍後の膜の表現型の特徴を変化させなかったことを実証した。
【０３４２】
図７は、新鮮な羊膜の上皮層（Ａ）、凍結保存された羊膜の上皮層（Ｂ）、新鮮な羊膜の間質細胞層（Ｃ）、凍結保存された羊膜の間質細胞層（Ｄ）、新鮮な絨毛膜（Ｅ）、及び凍結保存された絨毛膜（Ｆ）の代表的な画像を含む。生細胞は緑色であり、死滅細胞は赤色である。これらの画像は、製造処理が解凍後の膜中の膜の表現型の特徴及び生存細胞型（上皮及び間質細胞）の比率を変化させなかったことを実証した。
【０３４３】
実施例１０  例示的な製造処理は、胎盤膜から免疫原性要素を除去する
ヒト羊膜及び絨毛膜のある特有の特性は、胎児の血液循環から白血球の動員を防ぐ胎児血管の不在である。胎児側では、絨毛羊膜中胚葉層中に常在するマクロファージは、免疫細胞の唯一の集団を表す。そのため、羊膜及び絨毛膜中に存在する胎児マクロファージは、組織免疫原性の主要な源である。しかしながら、羊膜中のマクロファージの数は、絨毛膜よりも著しく少なく（Ｍａｇａｔｔｉら，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，２００８，２６：１８２）、このことは、羊膜の低い免疫原性及びドナーと受容者との間で適合することなく、ＨＬＡバリアを越えてそれを使用する能力を説明する（Ａｋｌｅら，Ｌａｎｃｅｔ，１９８１，８２５４：１００３、Ｕｃａｋｈａｎら，Ｃｏｒｎｅａ，２００２，２１：１６９）。対照的に、絨毛膜は、免疫原性であると見なされている。羊膜が結膜欠損部の形成修復とともに使用される研究では、成功率は低かった（Ｄｅ  Ｒｏｔｈ  Ａｒｃｈ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ，１９４０，２３：５２２）。理論によって拘束されるものではないが、本発明者らは、他の免疫原性細胞型の中で、胎盤膜からの、母体の栄養膜及びＣＤ１４＋胎児マクロファージの除去がインビトロでリンパ球の活性化を阻止すると考えている。母体の栄養膜の除去は、直接洗浄によって達成され得るが、一方、本技術において記載される凍結保存処理は、ＣＤ１４＋細胞を排除する。
【０３４４】
免疫原性試験は、安全な臨床治療薬として胎盤生成物膜を特徴付けるために使用された。２つのバイオアッセイ（混合リンパ球反応（ＭＬＲ）及びリポ多糖（ＬＰＳ）誘発性腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−αの分泌）は、異なる製造ステップで胎盤生成物の免疫原性を試験するために使用された。
【０３４５】
実施例１０．１  混合リンパ球反応（ＭＬＲ）
ＭＬＲは、細胞及び組織免疫原性を試験するために、一般に使用されている種類のインビトロアッセイである。このアッセイは、実験用組織培養プレートのウェル中で一緒に混合した場合に、同種ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）と、別の個体に由来する同種細胞及び組織（スティミュレーター）の表面上に発現した他の抗原分子とを認識するために、ある個体に由来する免疫細胞（レスポンダー）の能力に基づいている。同種細胞及び組織による刺激への免疫細胞の応答は、特定のサイトカイン（例えば、インターロイキン（ＩＬ−２）の分泌、ある受容体（例えば、ＩＬ−２Ｒ）の発現、または細胞増殖等の様々な方法を用いて測定することができ、これらのすべてが活性化した免疫細胞の特徴である。
【０３４６】
本開示された製造処理の異なるステップを表す胎盤組織試料は、免疫原性試験のために使用された。これらの試料は、出発物質として絨毛膜栄養膜を有する羊膜（ＡＣＴ）、別々の絨毛膜栄養膜（ＣＴ）、絨毛膜（ＣＭ）、栄養膜（Ｔ）、羊膜（ＡＭ）、ならびに羊膜及び絨毛膜（Ａ／Ｃ）を含んだ。新たに精製された組織及び結保存された（最終生成物）組織の両方が試験された。
【０３４７】
ＭＬＲアッセイについては、胎盤組織からの細胞が、２８０Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼＩＩ型（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ、カタログ番号４２０２）を用いて単離された。組織は、３７℃±２℃で６０〜９０分間酵素で処理し、結果として生じる細胞懸濁液を１００μｍのフィルタを通して濾過して、組織残屑を除去した。次いで、単一細胞懸濁液は、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＴＪ−６を用いて２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ＤＰＢＳで２回洗浄した。それぞれの洗浄後、上清を破棄し、細胞を２ｍＬのＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１８８５）中で再懸濁し、トリパンブルー染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１５２５０−０６１）の存在下で細胞を計数することによって細胞数及び細胞生存率について評価した。胎盤由来細胞は、２４ウェル培養プレートで、５％  ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を添加したＤＭＥＭ中で、１：５の比率で同種ｈＰＢＭＣと混合し、５％  ＣＯ２を含有するインキュベーター中で、湿度９５％、３７℃±２℃で４日間インキュベートした。ヒト末梢血単核細胞（ｈＰＢＭＣ）のみが、陰性対照として使用され、２つの異なるドナーに由来する２セットのｈＰＢＭＣの混合物が陽性ＭＬＲ対照として使用された。４日間のインキュベーション後、細胞は、ウェルから回収し、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１１８３６１５３００１）を添加した溶解緩衝液（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｃ２９７８）を用いて溶解し、ＩＬ−２Ｒαは、製造業者のプロトコルに従って、ＩＬ−２Ｒα  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＳＲ２Ａ００）を用いて細胞溶解物中で測定された。
【０３４８】
ＩＬ−２Ｒαのレベルは、同種細胞によって発現された免疫原性分子に応答するＴ細胞の活性化の尺度である。図８及び９中に表された結果は、最終生成物の低い免疫原性をもたらす、胎盤膜の製造方法を示す。
【０３４９】
図８は、この製造処理が、胎盤生成物の免疫原性を連続的に低減させることを実証する。製造処理の異なるステップを表す試料は、ｈＰＢＭＣで４日間共培養された。ＩＬ−２Ｒαは、Ｔ細胞の活性化のマーカーとして細胞溶解物中で測定された。陰性対照は、免疫細胞の活性化の基礎レベルを示す：１人のドナーに由来するＰＢＭＣは単独で培養された。溶性対照：２人の異なるドナーに由来するＰＢＭＣの混合物。
【０３５０】
図９は、凍結保存時の免疫原性の有意な減少によって証明されるように、本胎盤生成物を産生する本凍結保存処理によって生じる免疫原性の選択的枯渇を示す。
【０３５１】
実施例１０．２  胎盤膜細胞によるＬＰＳ誘発性ＴＮＦ−αの分泌
本明細書に記載される場合、羊膜及び絨毛膜中に存在する胎児マクロファージは、組織免疫原性の主要な源である。理論によって拘束されるものではないが、本発明者らは、胎盤膜からのＣＤ１４＋胎児マクロファージの除去が、リンパ球の活性化を阻止し、炎症性サイトカイン分泌のレベル及び組織免疫原性を減少させると考えている。胎児の胎盤膜におけるマクロファージは、ＴＮＦ−α等の炎症性サイトカインの分泌による細菌性ＬＰＳに応答する。したがって、ＬＰＳに応答するＴＮＦ−αの分泌は、本明細書では、それぞれの重要な製造ステップでの胎盤膜の組織免疫原性を特徴付けるために使用される。それぞれの製造ステップからの使用は、栄養膜（Ｔ）、絨毛膜栄養膜を有する羊膜（ＡＣＴ）、絨毛膜栄養膜（ＣＴ）、絨毛膜（ＣＭ）、及び羊膜（ＡＭ）を含んだ。
【０３５２】
中間体及び最終生成物を示す胎盤膜の切片（２ｃｍ×２ｃｍ）を、組織培養培地中に設置し、細菌性ＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）に２０〜２４時間曝露した。次いで、組織培養上清を回収し、製造業者のプロトコルに従って、ＴＮＦ−α  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＴＮＦ−αの存在について試験した。高レベルのＴＮＦ−αの分泌によるＬＰＳに応答するある特定の単球に知られているヒトｈＰＢＭＣ（ＳｅｒａＣａｒｅ）は、陽性対照として使用された。ｈＰＢＭＣ及びＬＰＳを含まない胎盤組織もまた、分析における対照として含まれた。このアッセイでは、自然及びＬＰＳ誘発性ＴＮＦ−αの両方の分泌における７０ｐｇ／ｃｍ２超（２８０ｐｇ／ｍＬに対応する）からの培養培地中で検出されたＴＮＦ−αは、免疫原性であると見なされた（Ｆｏｒｔｕｎａｔｏ，ら１９９６を参照のこと）。
【０３５３】
図１０Ａ及び１０Ｂ中に示されるように、この製造処理は、胎盤生成物の免疫原性を連続的に低減させる。ＡＭ及びＣＭは、１３９７．１及び９１７．２ｐｇ／ｍｌのＡＣＴ及びＣＴと比較して、それぞれ、わずかに２３．５及び４０ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ−αの分泌を有した。ＬＰＳを含まない培地中で培養された組織は、基礎レベルのＴＮＦ−αの分泌を示す。高レベルのＴＮＦを分泌することで知られているＰＢＭＣは、陽性対照として使用された。
【０３５４】
絨毛膜栄養膜（ＣＴ）は、無傷栄養膜層を有する絨毛膜を含む。高レベルのＴＮＦ−αを分泌したＣＴ膜は、２人の異なるＰＢＭＣドナーに対するＭＬＲについて試験した（図１１）。ＣＴ細胞は、ＰＢＭＣで４日間培養された。ＩＬ−２Ｒαは、Ｔ細胞の活性化のマーカーとして細胞溶解物中で測定された。溶性対照：２人の異なるドナーに由来するＰＢＭＣの混合物。図１１中に見られるように、このアッセイの結果は、ＭＬＲデータとの相関性を示した：ＬＰＳに応答する高レベルのＴＮＦ−αを産生する組織は、ＭＬＲアッセイにおいて免疫原性である。
【０３５５】
結論として、低レベルのＴＮＦ−αならびにＡＭ及びＣＭによるＬＰＳへの応答の不在は、本技術において記載される例示的な凍結保存方法が羊膜及び絨毛膜からの生存可能な機能的マクロファージを排除し、このことは、そのような同種生成物の安全性を確保する。
【０３５６】
胎盤膜中に存在する細胞の特徴付け
実施例１１  蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）による胎盤細胞の分析
羊膜及び絨毛膜の細胞構成を知ることは、創傷治癒及び免疫原性における潜在的な機能的役割の完全な理解を深めるために重要である。前述の報告は、羊膜及び絨毛膜の両方が複数の細胞型を含むことを示した。羊膜及び絨毛膜の両方において特定された間質細胞に加えて、羊膜もまた、上皮細胞を含有する。羊膜または絨毛膜のいずれにも胎児血管がないが、両方の膜は、常在する胎児マクロファージを含む。母体の血液循環及び脱落膜への近接近は、免疫原性細胞（母体の白血球及び栄養膜細胞）の潜在的な源を提供し、そのため、免疫原性の潜在的な源である。羊膜及び絨毛膜の細胞構成を精査するために、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）分析が行われた。このデータは、羊膜においては胎児上皮細胞及び線維芽細胞に加えて間質細胞、ならびに絨毛膜においては間質細胞の存在を実証した。本開示の胎盤生成物のある特有の特徴は、創傷治癒において重要である（上皮細胞及び線維芽細胞に加えて）３つの細胞型のうちの１つであることを示す、ＭＳＣの存在である。
【０３５７】
実施例１１．１  ＦＡＣＳ手順：単一の細胞懸濁液の調製
精製した羊膜及び絨毛膜が、ＦＡＣＳを介した細胞表現型分析のために使用された。羊膜及び絨毛膜からの細胞は、２８０Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼＩＩ型（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ，カタログ番号４２０２）を用いて単離された。組織は、３７℃±２℃で６０〜９０分間酵素で処理し、結果として生じる細胞懸濁液を１００μｍのフィルタを通して濾過して、組織残屑を除去した。次いで、単一細胞懸濁液は、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＴＪ−６を用いて２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ＤＰＢＳで２回洗浄した。それぞれの洗浄後、上清を破棄し、細胞を２ｍＬのＦＡＣＳ染色緩衝液（ＤＰＢＳ＋０．０９％  ＮａＮ３＋１％  ＦＢＳ）中で再懸濁した。
【０３５８】
実施例１１．２  特定の細胞マーカーのための免疫標識細胞
単一細胞懸濁液が実施例１１．１に従って調製されると、１００μＬのＦＡＣＳ染色緩衝液中の最小限の１×１０５個の細胞が蛍光染色で標識された抗体で処理された。表８は、使用された抗体の説明を提供する。細胞表面マーカーについては、細胞を、抗体を用いて暗室中で室温で３０分間インキュベートし、続いて、ＦＡＣＳ染色緩衝液で２回洗浄し、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＴＪ−６の遠心分離機を用いて１３００ｒｐｍで５分間遠心分離した。次いで、細胞を４００μＬのＦＡＣＳ染色緩衝液中で再懸濁し、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを用いて分析した。細胞生存を評価するために、１０μＬの７−ＡＡＤ（７−アミノ−アクチノマイシンＤ）試薬（ＢＤ、カタログ番号５５９９２５）を初期ＦＡＣＳ分析直後に添加し、再度分析した。細胞内染色については、細胞を透過処理し、製造業者の推奨（ＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ、カタログ番号５５４７１４）に従って標識し、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを用いて分析した。
【０３５９】
【表８】
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【０３６０】
実施例１２  胎盤細胞の表現型分析
羊膜及び絨毛膜の両方の単一細胞懸濁液のＦＡＣＳ分析は、両方の膜がＭＳＣの存在を関与するＣＤ１０５及びＣＤ１６６（表８を参照）等の間葉幹細胞に特異的な細胞発現マーカーを含有することを実証する。加えて、ＣＤ１４を発現する胎盤マクロファージはほとんど検出されなかった。ＣＤ１４＋胎盤マクロファージ上に発現する可能性が高いいくつかの免疫原性マーカーが検出されたが、これらのマーカーの範囲は非常に広範である。これらの範囲は、１）胎盤ドナー間の細胞数の高い変動性、及び２）技術的な問題（細胞懸濁液中の高く可変な細胞及び組織残屑の存在が含まれる）によって説明され得る。残屑は除外（ｇａｔｅｄ  ｏｕｔ）され得るが、大きさによって細胞と同等である残屑粒子は、それぞれの試験マーカーに対して計算された割合（％）の正確性に影響を及ぼすであろう。加えて、表１０は、コンフルエンシー（継代０細胞）まで、ＤＭＥＭ中の１０％  ＦＢＳ中で３７℃±２℃で培養された羊膜及び絨毛膜から単離した細胞のＦＡＣＳ分析を提供する。
【０３６１】
これらのデータは、羊膜及び絨毛膜に由来する細胞が培養後ＭＳＣと同様の表現型を保持したことを実証した。結果として、胎盤組織中の間質細胞の存在は、ＦＡＣＳ分析によって確認された。
【０３６２】
これらのデータは、ＭＳＣを含有する羊膜を含む胎盤生成物を提供する本技術のある特定の実施形態と一致している。
【０３６３】
【表９】
2017514507.tif 000011
【０３６４】
【表１０】
2017514507.tif 000012
【０３６５】
実施例１３  胎盤生成物に由来する細胞の粘着。
特異的細胞マーカーの存在に加えて、細胞は、通常の培養条件下でプラスチック粘着性を示し、線維芽細胞様形態を有する場合、ＭＳＣとして分類され得る。細胞は、本技術に記載されるように、羊膜及び絨毛膜生成物から単離され、ＭＳＣ培地に播種し、それらがコンフルエンシーに達するまで３７℃±２℃で培養された。次いで、プラスチック培養皿に粘着するそれらの能力を評価した。
【０３６６】
図１２は、羊膜（図１２Ａ）及び絨毛膜（図１２Ｂ）から単離され、培養された細胞のプラスチック粘着性を示し、これは、ヒト骨髄穿刺液から単離され、拡張されたＭＳＣと同様である（図１２Ｃ）。これらのデータは、羊膜及び絨毛膜に由来する細胞がＭＳＣと同様の表現型を保持することを示す。
【０３６７】
加えて、ＭＳＣはまた、異なる結合組織型に分化するそれらの能力によっても定義される。そのため、胎盤由来細胞の骨形成の分化を行う能力が、試験された。胎盤細胞は、単離され、それらがコンフルエンシーに達するまで、３７℃±２℃で培養された。次いで、骨形成媒体を培地に添加し、アルカリホスファターゼの発現を測定した。アルカリホスファターゼは、骨の鉱化に関与する酵素であり、公知の骨形成マーカーである。図１２Ｄは、いくつかの細胞がアルカリホスファターゼ発現を表す紫色染色で染色されることを示す。これは、胎盤膜中に存在するＭＳＣがそれらの分化潜在性を保持することを実証する。
【０３６８】
治療的因子
実施例１４  凍結保存は、胎盤膜における治療的因子のレベルを低下させない
我々は、まず、凍結保存処理が創傷治癒にとって重要である成長因子のレベルに影響を及ぼすかどうかを精査された。血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）が血管新生を促進するために重要であるため、選択した。ＶＥＧＦは、８Ｍ  塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）溶液、ビーズホモジナイザーを用いて抽出し、ＧｕＨＣｌ溶液で２４時間インキュベートした。新鮮な羊膜及び凍結保存された羊膜生成物（本技術によって記載されるように）からのＶＥＧＦ発現は、製造業者のプロトコルのように酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて測定された。図１３中の結果は、本技術において記載された手順を用いて膜を凍結保存することにより、新鮮な膜と比較して、成長因子の発現の消失がないことを示す。
【０３６９】
実施例１５  治療的因子分析
羊膜及び絨毛膜のタンパク質プロファイルは、ＳｅａｒｃｈＬｉｇｈｔ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ化学発光アッセイまたはＥＬＩＳＡを用いて精査された。組織膜抽出物中及び培養培地中の組織によって分泌されたタンパク質の存在が精査された。試験は、創傷治癒のために重要であるタンパク質の分析からなった。特定されたタンパク質の一覧が表１１中に記載される。
【０３７０】
【表１１】
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【０３７１】
実施例１５．１  治療的因子プロファイリングのための羊膜及び絨毛膜の調製
羊膜及び絨毛膜は、実施例１及び２において本明細書に開示される製造プロトコルに従って、単離され、−８０℃±５℃で包装した。次いで、包装膜を、３７℃±２℃の水槽中で解凍し、ＤＰＢＳで３回洗浄した。膜を８ｃｍ２の切片に切断した。組織溶解試料については、膜のうちの１つの８ｃｍ２の切片を、液体窒素中で急速凍結し、続いて、乳鉢及び乳棒を用いて粉砕した。破砕した組織を１．５ｍＬの微小遠心管に移し、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１１８３６１５３００１）を含む５００μＬの溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号９８０３）を添加し、頻繁にボルテックスしながら、氷上で３０分間インキュベートした。次いで、組織溶解物を１６０００ｇで１０分間遠心分離した。上清を回収し、Ａｕｓｈｏｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによるタンパク質アレイ分析のために送付した。上清試料については、膜のうちの１つの８ｃｍ２の切片を１２ウェル皿の１つのウェル上に播種し、２ｍＬのＤＭＥＭ＋１％  ＨＳＡ＋抗生物質／抗真菌薬を添加し、３７℃±２℃で３、７、または１４日間インキュベートした。インキュベーション後、組織及び培養培地を１５ｍＬの円錐管に移し、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。培養上清を回収し、Ａｕｓｈｏｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによるタンパク質アレイ分析のために送付した。
【０３７２】
実施例１５．２  組織溶解物中に存在する治療的因子
胎盤生成溶解物を、組織修復に重要であるタンパク質の存在について分析した。表１２は、本技術の例示的な胎盤組織生成物の溶解物の生化学的プロファイルを示す。
【０３７３】
【表１２】
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【０３７４】
実施例１５．３  １４日間にわたる治療的因子の持続放出
本技術の胎盤生成物はまた、創傷治癒の治療に望ましい耐久性効果を実証する。本明細書に記載される羊膜内の細胞外マトリックス及び生存細胞の存在は、創傷治癒のために重要であることが知られているタンパク質のカクテルが少なくとも１４日間存在することを可能にする。羊膜を、解凍し、組織培養ウェル上に播種し、３７℃±２℃で３、７、及び１４日間インキュベートした。それぞれの時点で、培養上清試料を回収し、実施例１５．１に記載されるように、タンパク質アレイ分析を通じて測定した。表１３は、タンパク質アレイ分析を通じて測定されるように、３、７、及び１４日間羊膜ロットの組織培養上清中の様々な分泌された因子のレベルを示す。
【０３７５】
【表１３】
2017514507.tif 000015
【０３７６】
実施例１５．４  羊膜中のインターフェロン２α（ＩＦＮ−２α）及び形質転換成長因子−β３（ＴＧＦ−β３）の存在
インターフェロン−α及びＴＧＦ−β３は、様々な組織中の線維症を低減させることで知られているサイトカイン／成長因子である。臨床的に、ＩＦＮ−２α及びＴＧＦ−β３は、瘢痕及び拘縮形成の予防によって創傷治癒を調節することが示唆している（Ｉｓｈｉｄａ，Ｋｏｎｄｏら２００４、Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，Ｄｕｎｃａｎら２００９）。ＩＦＮ−２αは、線維芽細胞の増殖を阻害し、コラーゲン及びフィブロネクチンの合成ならびに線維芽細胞媒介性創傷拘縮を低減させる役割を果たし得る（Ｗａｎｇ，Ｃｒｏｗｓｔｏｎら２００７）。臨床的に、ＩＦＮ−２αは、皮下に投与され、瘢痕の品質を改善させることが示されている（Ｎｅｄｅｌｅｃら，Ｌａｂ  Ｃｌｉｎ  Ｍｅｄ  １９９５，１２６：４７４）。ＴＧＦ−β３は、細胞外マトリックスの沈着を調節し、齧歯動物皮膚創傷モデルに注射される場合に瘢痕形成を減少させることが示されている。臨床的に、ＴＧＦ−β３は、創傷部位で注射される場合に瘢痕外観を改善することが示されている（Ｏｃｃｌｅｓｔｏｎら，Ｊ  Ｂｉｏｍａｔｅｒ  Ｓｃｉ  Ｐｏｌｙｍ  Ｅｄ  ２００８，１９：１０４７）。ＴＧＦ−β３は、ＴＧＦ−β１拮抗薬として作用し、線維芽細胞−筋線維芽細胞の分化を調節し、前線維化遺伝子転写を制限する（Ｃｈａｎｇ，Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏら２０１４）。
【０３７７】
本技術に記載される胎盤生成物は、ＩＦＮ−２α及びＴＧＦ−β３の存在について分析された。簡潔に言えば、解凍後、膜は、均一化され、１６，０００ｇで遠心分離して、結果として生じる上清を回収した。上清を、ＭａｂＴｅｃｈ（ＩＦＮ−２α）及びＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＴＧＦ−β３）から市販のＥＬＩＳＡキットで分析した。図１４は、羊膜（Ａ）ならびに絨毛膜（Ｂ及びＣ）ホモジネート中のＩＦＮ−２α及びＴＧＦ−β３の有意な発現を示す。
【０３７８】
さらに、処理された絨毛膜（例えば、細分化し、任意に消化させた）をＩＦＮ−２α及びＴＧＦ−β３の存在について分析した。簡潔に言えば、処理された絨毛膜を解凍し、１６，０００ｒｃｆで遠心分離して、上清を回収した。上清を、ＭａｂＴｅｃｈ（ＩＦＮ−２α）及びＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＴＧＦ−β３）から市販のＥＬＩＳＡキットで分析した。図１４Ｄ及びＥは、絨毛膜に由来する膜及び胎盤組成物中のＩＦＮ−２α及びＴＧＦ−β３の有意な発現を示す。
【０３７９】
実施例１５．５  羊膜中の胎盤成長因子ＰＬＧＦ（ＰＬＧＦ）及びインスリン成長因子−１（ＩＧＦ−１）の存在
理論によって拘束されるものではないが、本発明者らは、創傷修復のための本胎盤生成物の有効性が、一部分において、主要な細胞プロセスを調節することによって様々な組織の発達及び恒常性におけるＢＭＰ、ＩＧＦ−１、及びＰＬＧＦの役割によるものであると考えている。ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−４は、細胞成長を促進するのに加えて骨芽細胞へのＭＳＣの分化を刺激し得、胎盤ＢＭＰまたはＰＬＡＢは、胚発生を媒介することが示唆されているＢＭＰファミリーの新規のメンバーである。インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）は、骨幹細胞の増殖及び分化を促進し得る。胎盤由来成長因子（ＰＬＧＦ）は、骨芽細胞の分裂促進因子としての機能を果たし得る。
【０３８０】
本技術に記載される胎盤生成物は、組織修復タンパク質の存在について分析されている。簡潔に言えば、解凍した生成物をＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ中で７２時間インキュベートした。次いで、膜を培養培地を含むビーズホモジナイザー中で均質化した。ホモジネートを遠心分離し、上清を、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから市販のＥＬＩＳＡキットで分析した。
【０３８１】
実施例１５．６  処理した絨毛膜組成物における組織修復タンパク質の存在
凍結保存された膜を組織修復タンパク質について分析した。簡潔に言えば、羊膜及び絨毛膜に由来する胎盤組成物を、３７℃±２℃で７２時間インキュベートした。膜を、培養培地中でビーズホモジナイザーを用いて均質化した。ホモジネートを遠心分離し、上清を、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから市販のＥＬＩＳＡキットで分析した。
【０３８２】
図１５は、数人のドナーの羊膜（Ａ及びＢ）ならびに絨毛膜（Ｃ及びＤ）中のＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７、ＰＬＡＢ、ＰＬＧＦ、及びＩＧＦ−１の有意な発現を示す。さらに、処理された絨毛膜（例えば、細分化し、任意に消化させた）を組織修復タンパク質の存在について分析した。図１５（Ｅ及びＦ）は、これらの組織修復タンパク質の存在も示す。
【０３８３】
理論によって拘束されるものではないが、本発明者らは、創傷修復のための（例えば、絨毛膜を含むまたはそれらに由来する）本胎盤生成物の有効性が、一部分において、主要な細胞プロセスを調節することによって様々な組織の発達及び恒常性におけるＢＭＰ、ＩＧＦ−１、及びＰＬＧＦの役割によるものであると考えている。ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−４は、細胞成長を促進するのに加えて骨芽細胞へのＭＳＣの分化を刺激し得、胎盤ＢＭＰまたはＰＬＡＢは、胚発生を媒介することが示唆されているＢＭＰファミリーの新規のメンバーである。インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）は、骨幹細胞の増殖及び分化を促進し得る。胎盤由来成長因子（ＰＬＧＦ）は、骨芽細胞の分裂促進因子としての機能を果たし得る。
【０３８４】
実施例１５．７  羊膜中のα２−マクログロブリンの存在
α２−マクログロブリンは、セリンプロテイナーゼ、システインプロテイナーゼ、アスパラギン酸プロテイナーゼ、及びメタロプロテイナーゼの４つすべての機構的クラスからのプロテイナーゼを不活性化する血漿タンパク質として知られている。このタンパク質のもう１つの重要な機能は、サイトカイン及び成長因子の貯蔵所としての役割を果たすことであり、これらの例には、ＴＧＦ、ＰＤＧＦ、及びＦＧＦが含まれる。糖尿病性潰瘍または静脈性潰瘍等の慢性創傷では、豊富な量のプロテアーゼの存在は、成長因子の急速分解をもたらし、創傷治癒を遅延させる。そのため、慢性創傷治癒のために設計された生成物中のα２−マクログロブリンは、有益であろう。タンパク質アレイ分析の結果は、羊膜及び絨毛膜がα２−マクログロブリンを含有することを示した（表１４）。これらの予備データはドナー間で高い生存率を示すが、創傷治癒におけるこのタンパク質の重要性は、タンパク質アレイの代わりに単一検体ＥＬＩＳＡを用いて胎盤組織中のα２−マクログロブリンのさらなる評価を促し、これは、プロファイリングのための１つの試料中の複数のタンパク質の存在を評価するための有用なツールである。
【０３８５】
これらのデータは、α２−マクログロブリンを含有する羊膜を含む胎盤生成物を提供する本技術のある特定の実施形態と一致している。
【０３８６】
【表１４】
2017514507.tif 000016
【０３８７】
実施例１６  例示的な胎盤組織及び２つの市販の製品における治療的因子の比較
比較のために、生細胞を含有する２つの市販の製品である、Ｄｅｒｍａｇｒａｆｔ、及びＡｐｌｉｇｒａｆのタンパク質プロファイルもまた、ＳｅａｒｃｈＬｉｇｈｔ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ化学発光アッセイを用いてアッセイした。
【０３８８】
実施例１６．１  例示的な胎盤組織及び２つの市販の製品の治療的因子の比較のためのプロトコル
Ｄｅｒｍａｇｒａｆｔを試験するために、膜を、製造業者の取扱説明書に従って、解凍し、洗浄した。Ｄｅｒｍａｇｒａｆｔ膜を、７．５ｃｍ２の切片に切断した。組織溶解物については、膜のうちの１つの７．５ｃｍ２の切片を、液体窒素中で急速凍結し、続いて、乳鉢及び乳棒を用いて粉砕した。破砕した組織を１．５ｍＬの微小遠心管に移し、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１１８３６１５３００１）を含む５００μＬの溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号９８０３）を添加し、頻繁にボルテックスしながら、氷上で３０分間インキュベートした。次いで、試料を１６０００ｇで１０分間遠心分離した。上清を回収し、Ａｕｓｈｏｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによるタンパク質アレイ分析のために送付した。組織培養については、膜のうちの１つの７．５ｃｍ２の切片を１２ウェル皿の１つのウェル上に播種し、２ｍＬのＤＭＥＭ＋１％  ＨＳＡ＋抗生物質／抗真菌薬を添加し、３７℃±２℃で３、７、または１４日間インキュベートした。インキュベーション後、組織及び培養培地を１５ｍＬの円錐管に移し、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。培養上清を回収し、Ａｕｓｈｏｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによるタンパク質アレイ分析のために送付した。
【０３８９】
Ａｐｌｉｇｒａｆを試験するために、膜を７．３ｃｍ２の切片に切断した。組織溶解物については、膜のうちの１つの７．３ｃｍ２の切片を、液体窒素中で急速凍結し、続いて、乳鉢及び乳棒を用いて粉砕した。破砕した組織を１．５ｍＬの微小遠心管に移し、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１１８３６１５３００１）を含む５００μＬの溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号９８０３）を添加し、頻繁にボルテックスしながら、氷上で３０分間インキュベートした。次いで、試料を１６０００ｇで１０分間遠心分離した。上清を回収し、Ａｕｓｈｏｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによるタンパク質アレイ分析のために送付した。組織培養については、膜のうちの１つの７．３ｃｍ２の切片を１２ウェル皿の１つのウェル上に播種し、２ｍＬのＤＭＥＭ＋１％  ＨＳＡ＋抗生物質／抗真菌薬を添加し、３７℃±２℃で３、７、または１４日間インキュベートした。インキュベーション後、組織及び培養培地を１５ｍＬの円錐管に移し、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。培養上清を回収し、Ａｕｓｈｏｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによるタンパク質アレイ分析のために送付した。
【０３９０】
実施例１６．２  例示的な胎盤組織及び市販の製品の３日目の上清中に存在する治療的因子
タンパク質アレイデータ分析は、選択された試験因子（表１２を参照）の大部分が羊膜、絨毛膜、Ａｐｌｉｇｒａｆ、及びＤｅｒｍａｇｒａｆｔにおいて発現されたことを示した。３つのタンパク質が、Ａｐｌｉｇｒａｆ及びＤｅｒｍａｇｒａｆｔにおいて検出不能である羊膜及び／または絨毛膜に対して特有であるものとして特定された。これらのタンパク質は、ＥＧＦ、ＩＧＦＢＰ１、及びアジポネクチンである。３つのタンパク質はすべて、創傷治癒のために重要である。図１６は、羊膜（ＡＭ）、絨毛膜（ＣＭ）、及び市販の製品中のＥＧＦ（Ａ）、ＩＧＦＢＰ１（Ｂ）、及びアジポネクチン（Ｃ）の発現を示す。ＡＭ７５及びＡＭ７８は、本技術（例えば、凍結保存された）の凍結保存された胎盤生成物であるが、一方、ＣＭ７５及びＣＭ７８は、凍結保存された絨毛膜生成物である。これらのタンパク質は、本発明者らにより、創傷治癒のための本胎盤生成物の治療効果を促進すると考えられている。
【０３９１】
これらのデータは、ＥＧＦ、ＩＧＦＢＰ１、及び／またはアジポネクチンを含有する羊膜を含む胎盤生成物を提供する本技術のある特定の実施形態と一致している。
【０３９２】
表１５は、本技術の例示的な胎盤生成物膜及び２つの市販の製品（陰性背景の減算後、８ｃｍ２ごとに調整された結果）の上清の生化学的プロファイルを示す。ＡＭ７５及びＡＭ７８は、本技術（例えば、凍結保存された）の胎盤生成物であり、ＣＭ７５及びＣＭ７８は、凍結保存された絨毛膜生成物である。
【０３９３】
【表１５】
2017514507.tif 000017
【０３９４】
ＭＭＰ及びＴＩＭＰの両方は、創傷治癒に重要である因子の中にある。しかしながら、これらのタンパク質の発現は、高度に調節され、適合させなければならない。過剰なＭＭＰ対ＴＩＭＰは、不良な慢性創傷治癒のマーカーである。我々は、羊膜及び絨毛膜中のＭＭＰ及びＴＩＭＰの発現及びその比率を精査し、それをＡｐｌｉｇｒａｆ及びＤｅｒｍａｇｒａｆｔにおける発現プロファイルと比較した。
【０３９５】
表１５及び図１７の結果は、すべての膜がＭＭＰ及びＴＩＭＰを発現するが、解凍した胎盤生成物中の比率が著しく低いことを示した。したがって、これらの膜は、創傷治癒のためにより有益であろう（図１７）。
【０３９６】
累積データは、ＭＭＰ対ＴＩＭＰの比率が創傷を治癒しない場合よりも高いことを示す。例えば、ＭＭＰ−９とＴＩＭＰ１との間の比率は、良好な治癒においては、約７〜１０対１であり、不良な治癒においては、１８〜２０またはそれ以上である。胎盤組織、Ａｐｌｉｇｒａｆ、及びＤｅｒｍａｇｒａｆｔによって分析されたＭＭＰ−９とＴＩＭＰ１との間の比率の分析は、羊膜及び絨毛膜生成物が約７の比率でＭＭＰ及びＴＩＭＰを含有することを示し、これは、創傷治癒には好適である。対照的に、Ｄｅｒｍａｇｒａｆｔは、２０超の比率を有し、Ａｐｌｉｇｒａｆは、２００超の比率を有した。
【０３９７】
これらのデータは、約７〜１０対１の比率でＭＭＰ−９及びＴＩＭＰ１を含有する羊膜を含む胎盤生成物を提供する本技術のある特定の実施形態と一致している。
【０３９８】
実施例１７  羊膜組織の効力のマーカーとしてのＥＧＦの構築
ＥＧＦは、創傷治癒のために重要である因子の中にある（Ｓｃｈｕｌｔｚら，１９９１，Ｋｏｍａｒｃｅｖｉｃ，２０００、及びＨｏｎｇら，２００６）。ＥＧＦの不在またはＥＧＦ量の減少は、慢性創傷のうちの１つの特徴である（Ｈａｒｄｉｎｇら，２００２）。本出願によって開示される開発された製造プロセスに従って調製された羊膜試料に由来するタンパク質の評価は、ＥＧＦがこれらの組織によりさらに高い量で分泌された主要な因子のうちの１つであることを示す。本開示の羊膜において検出された高レベルのＥＧＦを伴う創傷治癒のためのＥＧＦの重要性は、本開示に従って臨床用途のために製造された膜生成物の評価のための効力マーカーとしてＥＧＦの選択を支持する。Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから市販のＥＬＩＳＡキットは、羊膜によって分泌されたＥＧＦを測定するための適合性の評価のために選択された。ＥＬＩＳＡの必要条件は、生物学的分析アッセイ検証のためのＦＤＡ及びＩＣＨガイドラインにより構築された基準を満たす（Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ：Ｔｅｘｔ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ  Ｑ２（Ｒ１），１９９４、ＩＣＨ  Ｈａｒｍｏｎｉｚｅｄ  Ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ  ａｎｄ  Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ，２００１）。本方法によるＥＧＦの発現に対して評価された羊膜は、タンパク質アレイデータを確認し、ＥＧＦがこれらの組織中の臨床的に有意なレベルで発現された独特の因子であったことをさらに実証した。
【０３９９】
実施例１７．１  ＥＧＦの羊膜組織発現
タンパク質アレイデータ分析は、ＥＧＦが羊膜中に独特に発現するが、絨毛膜中には発現しなかったという初期証拠を得た（表１６）。羊膜中で測定されたＥＧＦのレベルは、臨床的有意性を示した。
【０４００】
【表１６】
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【０４０１】
これらのデータは、羊膜が、任意に実質的な量でＥＧＦを含有するが、ＥＧＦは絨毛膜中で検出されないことを示す傾向がある。
【０４０２】
実施例１７．２  絨毛膜組織の効力のマーカーとしてのｂＦＧＦの構築
ｂＦＧＦは、血管新生、組織修復、及び創傷治癒を含む様々な細胞プロセスを調節する（Ｐｒｅｓｔａら，２００５、Ｒｅｕｓｓら，２００３、及びＳｕら，２００８）。創傷治癒モデルでは、ｂＦＧＦは、創傷の部位で創傷閉口を増大させ、血管形成を増強することが示されている（Ｇｒｅｅｎｈａｌｇｈら，１９９０）。本開示の製造プロセスに従って調製された羊膜及び絨毛膜に由来するタンパク質の評価は、ｂＦＧＦが胎盤組織タンパク質抽出物において主要な因子のうちの１つであることを示した。図１８Ａは、２人の別々の胎盤ドナーからの胎盤膜のタンパク質プロファイル評価中に検出された羊膜（ＡＭ）及び絨毛膜（ＣＭ）によるｂＦＧＦの発現を示す。
【０４０３】
創傷治癒のためのｂＦＧＦの重要性は、本開示に従って臨床用途のために製造された絨毛膜生成物の評価のための効力マーカーとしてｂＦＧＦの選択を支持する。Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから市販のＥＬＩＳＡキットは、胎盤膜によって分泌されたｂＦＧＦを測定するための適合性の評価のために選択された。ＥＬＩＳＡ法の適格実験は、生物学的分析アッセイ検証のためのＦＤＡ及びＩＣＨガイドラインに従って設計された（Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ：Ｔｅｘｔ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ  Ｑ２（Ｒ１），１９９４、ＩＣＨ  Ｈａｒｍｏｎｉｚｅｄ  Ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ  ａｎｄ  Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ，２００１）。
【０４０４】
絨毛膜におけるｂＦＧＦの発現
絨毛膜調製におけるｂＦＧＦの測定は、信頼でき、かつ再現可能であることが証明されている。胎盤組織抽出物は、ビーズホモジナイザーを用いて調製された。組織上清試料のために、組織を、培地でインキュベートし、上清を回収した。ｂＦＧＦの分泌を評価した。複数のドナーにおけるｂＦＧＦの測定は、定量化のこの方法が、臨床的設定で用いるために調製された本開示の組織生成物の効力を評価する有益な手段であったことを示した。図１８Ｂは、組織抽出物または２人の別々の胎盤ドナーからの上清に由来する絨毛膜組織試料におけるｂＦＧＦの代表的な発現を示す。結果は、多数の組織調製物において再生されている。
【０４０５】
これらのデータは、本方法がｂＦＧＦを含有する絨毛膜を含む胎盤生成物膜を産生することができることを示す。
【０４０６】
機能研究：
実施例１８  胎盤膜の免疫調節効果
慢性創傷は、正常な治癒段階を通して進展することができず、しばしば、炎症段階において失速する（Ｍａｘｓｏｎ，Ｌｏｐｅｚら２０１２）。慢性創傷環境の特徴には、１）ＴＮＦ−α及びＩＬ−１α等の高レベルの炎症性サイトカイン、２）低レベルの抗炎症性サイトカイン、３）高レベルのプロテアーゼ及び低レベルのプロテアーゼ阻害剤、ならびに４）平衡させるための高レベルの酸化剤及び低レベルの抗酸化剤が含まれる。したがって、損傷部位での炎症制御は、治癒プロセスを再開／進展させるための鍵である。抗炎症性活性における胎盤膜の効果を、創傷治癒のために精査した。
【０４０７】
実施例１８．１  腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）の刺激
組織試料は、１ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α（炎症性因子）を用いて、及びそれを用いずに１８時間培養した。上清を回収し、ＰＧＥ２単クローン性の酵素免疫測定アッセイ（ＥＩＡ）キット（Ｃａｙｍａｎ）を用いて、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の濃度を測定した。図１９は、本胎盤膜生成物（羊膜生成物）が、ＴＮＦ−αに曝露される場合に、高レベルの抗炎症性サイトカインＰＧＥ２を産生することを示した。
【０４０８】
実施例１８．２  末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）アッセイ
ＰＢＭＣをＳｅｒａＣａｒｅ  Ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅｓから得た。すべての実験は、１ウェル当たり１ｍＬのアッセイ培地中の１０６個の単核細胞により２４ウェルプレート中で２重に行った。炎症性サイトカインの阻害効果を試験するために、Ｔ細胞マイトジェン−抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ＣＤ３）及び抗ＣＤ２８モノクローナル抗体（ＣＤ２８）を１μｇ／ｍＬで添加して、免疫細胞を活性化した。次いで、組織試料を、３７℃、５％  ＣＯ２、加湿環境下で、活性化したＰＢＭＣで４８時間インキュベートした。ＴＮＦ−α及びＩＬ−１αの産生を、ＥＬＩＳＡ  Ｄｕｏｓｅｔキット（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて上清中で測定した。抗炎症性因子ＩＬ−１０の放出を試験するために、ＰＢＭＣを１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで４時間予め刺激し、組織試料（１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−αで一晩予め刺激した）を刺激したＰＢＭＣでさらに２４時間インキュベートした。ＩＬ−１０を、ＩＬ−１０  Ｄｕｏｓｅｔキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて上清中で検出した。ＬＰＳ刺激を行わないＰＢＭＣは、陰性対照として含まれた。胎盤膜生成物は、活性化した免疫細胞と共培養された場合（図２０中に示される）に、大部分は、可溶性炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α及びＩＬ−１α）の放出を阻害し、抗炎症性ＩＬ−１０の放出を上方調節した。
【０４０９】
実施例１８．３  羊膜によるプロテアーゼレベルの上昇の調節
慢性創傷における長期の炎症反応は、具体的には、増大したＭＭＰ及び好中球エラスターゼ活性のある増強したプロテアーゼ反応を生じる。ＭＭＰ及びエラスターゼは、正常な生理学的及び病理学的プロセス、例えば、基底膜の劣化、ＥＣＭの再構成、結合組織の反転、血管新生、再生、及び創傷修復に関与している。しかしながら、過剰なＭＭＰ及びエラスターゼは、ＥＣＭの成分を破壊し、治癒に必須である成長因子及びそれらの受容体を損傷する。この研究において、胎盤膜生成物がＭＭＰ及びエラスターゼの阻害を媒介するかどうかを精査した。
【０４１０】
ＭＭＰ活性のためのＡｚｏｃｏｌｌアッセイ
Ａｚｏｃｏｌｌは、不溶性の粉末コラーゲンであり、これに、紫色アゾ染料が浸透している。タンパク質分解時、可溶性アゾ染料が放出され、５５０ｎｍの吸光度によって検出され得る。したがって、ａｚｏｃｏｌｌは、しばしば、この環境下で、プロテアーゼ活性を試験するための非特異的な発色物質として使用される。アッセイは、Ｊｉａｎｇら（Ｊｉａｎｇ，Ｔａｎら,２００７）によって開発された修飾方法を用いて行われた。Ａｚｏｃｏｌｌは、洗浄し、１．５ｍｇ／ｍＬの最終濃度で１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に懸濁した。コラゲナーゼＩＶは、この２つの活性型であるＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９（それぞれ、７２ｋＤ及び９２ｋＤ）が不良な治癒と相関している慢性下肢潰瘍からの創傷流体の発現を上昇させることが示されているため、陽性対照として使用された（Ｔｒｅｎｇｏｖｅ，Ｓｔａｃｅｙら１９９９）。羊膜生成物を、０．１％（ｗ／ｖ）コラゲナーゼＩＶ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びａｚｏｃｏｌｌ懸濁液で、穏やかな全体の回転（ｅｎｄ−ｔｏ−ｅｎｄ  ｒｏｔａｔｉｏｎ）下、３７℃のインキュベーターで５時間インキュベートした。試料を１０，０００ｘｇで８分間遠心分離することにより、反応を停止した。上清溶液の吸光度をＥＬＩＳＡリーダー（ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ）を用いて５５０ｎｍで測定し、両側スチューデントＴ検定を行い、統計学的有意性（ｐ＜０．０５）を決定した。図２１は、凍結保存された羊膜がＭＭＰ活性を有意に阻害することができることを示す。
【０４１１】
好中球エラスターゼアッセイ
羊膜生成物は、１％  ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中の１００ｎｇの精製ヒト好中球エラスターゼ（Ｓｉｇｍａ）で２４時間予め馴化させた。予め馴化させた組織試料及び１００ｎｇの新鮮な好中球エラスターゼを、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１０％  ＤＭＳＯ、及び１ｍＭ  エラスターゼ基質（Ｓｉｇｍａ）を含有する最終容積５００μＬの０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中で、３７℃で４時間インキュベートした。ＯＤ４０５を測定することによって、基質分解を継続的に観察した。図２２Ａは、凍結保存された羊膜がエラスターゼ活性を約９４％阻害したことを示す。
【０４１２】
細分化した絨毛膜組成物の試料を、解凍し、０．０１ｍＭの最終濃度になるまでＨＥＰＥＳ緩衝液中のヒト好中球エラスターゼ及び５．７ｍＭの最終濃度になるまでエラスターゼ基質（Ｎ−メトキシスクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐ−ニトロアニリド、Ｓｉｇｍａ＃Ｍ４７６５）と混合した。陽性対照については、抗凍結剤（生理食塩水中の５％  ＤＭＳＯ、５％  ＨＳＡ）を、胎盤組成物の代わりに使用した。試料は、一晩振とうしながら、３７℃のインキュベーターでインキュベートした。
【０４１３】
４０５ｎｍでＯＤを測定することによって、基質分解を継続的に観察した。結果を図２２Ｂ中に示す。酵素基質の加水分解は、吸光度の増加をもたらす。酵素基質の加水分解は、陽性対照と比較して、細分化した胎盤組成物において低下し、これにより、プロテアーゼの阻害を通して慢性創傷環境を調節する細分化した胎盤組成物の能力を確認した。
【０４１４】
実施例１８．４  創傷におけるＲＯＳの中和反応
好中球及びマクロファージ等の免疫細胞は、反応性酸素種（ＲＯＳ）を産生する。低濃度のＲＯＳは、シグナル伝達を提供し、微生物に対して防御する。しかしながら、多量のＲＯＳは、細胞外の構造タンパク質、脂質、及びＤＮＡを損傷するだけでなく、ＭＭＰ、セリンプロテアーゼ、及び炎症性サイトカインの発現も増強させ、このことは、創傷治癒を損ない得る。まず、抗酸化能力キットを用いて、胎盤膜生成物の全体の抗酸化能力を精査した。さらに、胎盤膜生成物がオキシダントに誘導されたアポトーシスから皮膚線維芽細胞を保護することができるかどうかを試験した。
【０４１５】
抗酸化アッセイ
羊膜生成物からの馴化培地の抗酸化活性は、製造業者の取扱説明書に従って、抗酸化アッセイキット（Ｓｉｇｍａ  ＣＳ０７９０）を用いて測定された。本方法は、ＡＢＴＳからのラジカルカチオンＡＢＴＳ＋の放出に基づいており、酸化条件に曝露される場合に、緑色シグナルを発生する。発生した色彩度の阻害は、試料の抗酸化能と関連し得る。図２３は、羊膜生成物が２５０μＭのアスコルビン酸と同等の有力な抗酸化能を有することを示す。
【０４１６】
細胞生存アッセイ
細胞生存アッセイは、Ｋｉｍら（Ｋｉｍ，Ｐａｒｋら２００８）によって報告された修飾方法を用いて試験された。正常なヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）（Ｌｏｎｚａ）を、２４ウェルプレート中で５×１０４個の細胞／ウェルの密度で播種し、０．１％  ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中で２４時間飢餓させた。続いて、有機ヒドロペルオキシドであるｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド（ｔｂＯＯＨ）を、酸化剤として使用して、ＮＨＤＦへの酸化損傷を３時間誘発した。ｔｂＯＯＨを含有する培地を正常な培養培地と置き換え、羊膜生成物をＨＤＦでインキュベートして、救助プロセスを開始した。陽性対照群を、２５０μＭのアスコルビン酸と置き換えた。４時間後、ＮＨＤＦを１０μｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔで、３７℃で３０分間インキュベートし、極度に凝縮したクロマチン及び／またはＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）を用いた蛍光顕微鏡による断片化した核を有する細胞の割合をスコア化することによって、細胞アポトーシスを決定した。図２４は、羊膜生成物がそれらの早期のアポトーシスＨＤＦを８０％救助することができることを実証する。
【０４１７】
実施例１９．１  胎盤膜生成物は血管新生を増強する
新血管形成は、創傷治癒プロセスにおいて極めて重要なステップである。新たな血管の形成は、仮の造粒マトリックスの生成及びケラチノサイトの生存のための十分な栄養供給量を有する線維芽細胞を提供するために必要である。
【０４１８】
管形成
羊膜生成物の血管由来の可能性を試験するために、ＨＵＶＥＣ（Ｌｏｎｚａ）を、マトリゲル（ＢＤ）でコーティングされた培養ウェル上で１０４個の細胞／ウェルの濃度で、羊膜生成物に由来する馴化培地で播種した。馴化培地を、２％  ＦＢＳを含有する内皮細胞成長培地ＥＢＭ（Ｌｏｎｚａ）中で羊膜生成物を３日間培養することにより得た。成長因子のすべての必要なカクテルを含有するＥＢＭを陽性対照に使用した。８時間のインキュベーション後、それぞれの試料からの領域を、逆顕微鏡によってランダムに撮影し、閉鎖した管の数を計数し、ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）によってプロット化した。
【０４１９】
図２５Ａは、羊膜生成物からの馴化培地が陽性対照と同等である管形成を増強することを実証する。
【０４２０】
実施例１９．２  絨毛膜生成物が、血管生成成長因子を最低１４日間発現する
細分化した絨毛膜組成物は、創傷治癒の治療に望ましい耐久性効果を実証する。絨毛膜に由来する胎盤組成物内の細胞外マトリックス及び生存細胞の存在は、創傷治癒のために重要であることが知られているタンパク質のカクテルが少なくとも１４日間存在することを可能にする。
【０４２１】
処理された凍結保存された絨毛膜組成物を、解凍し、組織培養ウェル上に播種し、３７℃±２℃で３、７、及び１４日間インキュベートした。それぞれの時点で、この組成物の試料を回収し、１６，０００ｒｃｆで１０分間遠心分離して、上清を回収した。次いで、上清を、ｂＦＧＦ及びＶＥＧＦに対してＥＬＩＳＡによって試験した。図２５Ｂ〜Ｃは、２つの創傷治癒タンパク質のｂＦＧＦ及びＶＥＧＦの３、７、及び１４日間の持続時間を示す。ｂＦＧＦの発現は時間とともに低下するが、有意なレベルのｂＦＧＦが１４日を過ぎても存在することに留意すべきである。興味深いことには、ＶＥＧＦの発現は時間とともに増加し、これは、絨毛膜から由来する胎盤組成物内の生存細胞からのＶＥＧＦの継続した活性発現によるものであり得る。
【０４２２】
低酸素状態は、ＶＥＧＦの産生を増大させる
【０４２３】
細分化した絨毛膜は、慢性創傷において見られる低酸素状態を模倣する低酸素環境への反応について試験された。
【０４２４】
処理された（例えば、細分化した）凍結保存された絨毛膜組成物を、解凍し、ＤＭＥＭを含む２つの４８ウェル培養プレートのウェルに播種した。１つのプレートを、酸素正常条件下（３７℃、５％  ＣＯ２、約２０％  Ｏ２）で播種し、第２のプレートを低酸素条件下（３７℃、５％  ＣＯ２、１％  Ｏ２）で播種した。これらのプレートを、これらの条件下で、４８時間のインキュベーション後に回収し、試料を回収した。試料を、微小遠心分離機において、１６，０００ｒｃｆで１０分間遠心分離した。上清のＶＥＧＦ含量を、ＥＬＩＳＡによって測定した。結果を図２５Ｄ中に示す。
【０４２５】
図２５Ｄ中に示されるように、組成物は、血管生成成長因子ＶＥＧＦの生成を２００％増大することによって低酸素環境に対して応答した。
【０４２６】
実施例２０  胎盤組織は、細胞遊走及び創傷治癒を増強する
創傷治癒プロセスは、非常に複雑であり、成長因子により制御された一連の構造化事象を含む（Ｇｏｌｄｍａｎ，２００４）。これらの事象は、血管新生の増加、炎症性免疫細胞による浸透、及び細胞増殖の増加を含む。創傷治癒の開始段階は、創傷に向かって個々の細胞の能力が分極し、創傷した領域に遊走するように回転する。創傷領域を閉鎖するために、周辺組織を再建する。３つの細胞型が、主に、細胞遊走プロセスに関与している。それらは、血管内皮細胞、線維芽細胞、及びケラチノサイトである。血管内皮細胞は、創傷の領域に遊走し、新たな血管を形成し、これは、適切な創傷治癒のために必要不可欠な酸素及び栄養素を提供する。線維芽細胞は、様々な結合組織成分を再構成するために、創傷部位に遊走して、肉芽組織を形成する必要がある。再上皮形成（創傷閉口）は、ケラチノサイトの方向性のある遊走を必要とする。したがって、Ｏｓｉｒｉｓで産生された羊膜及び絨毛膜から分泌された因子がこれらの３種類の細胞遊走及び創傷領域閉鎖を促進するかどうかを決定することを試みた。これを達成するために、図２６中に見られるような市販の創傷治癒アッセイ（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ）及びトランスウェル細胞遊走アッセイを利用した。細胞株は、ヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ、Ｌｏｎｚａ  Ｉｎｃ．）、ヒト臍帯内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、Ｌｏｎｚａ  Ｉｎｃ．）、ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ、Ｌｏｎｚａ  Ｉｎｃ．）、及び罹患したヒトケラチノサイト（Ｄ−ＨＥＫ  Ｌｏｎｚａ  Ｉｎｃ．）を含む。結果は、３つの細胞型の細胞遊走のすべてが胎盤膜からの馴化培地による処理によって増強されることを示す。
【０４２７】
実施例２０．１  胎盤膜の馴化培地は、内皮細胞遊走及び創傷領域閉鎖を支援する
細胞をトリプシン処理を介して回収し、ペレット化し、２×１０５個の細胞／ｍＬの密度で完全なケラチノサイト培地中に再懸濁する。次いで、２５０ｕｌ（５×１０４個の細胞）の細胞懸濁液を、創傷治癒挿入物（Ｃｙｔｏｓｅｌｅｃｔ  ２４ウェル創傷治癒アッセイプレート、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を含有するそれぞれのウェル側にピペット化する。細胞を完全な培地中で２４時間成長させる。２４時間後、創傷挿入物を除去する。同時に、完全なケラチノサイト培地を除去し、実験培地と置き換える。完全なケラチノサイト培地及び基底ケラチノサイト培地をそれぞれ、陽性対照及び陰性対照として使用した。実験培地を生じるために、胎盤膜は、組織培養インキュベーター内で１％  ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含むＤＭＥＭ中で３日間インキュベートする。次いで、結果として生じる組織及び培地を、エッペンドルフ管中に入れ、微小遠心分離機において高速で回転させる。上清を回収し、使用するまで−８０℃で保存する。遊走及び創傷治癒研究のために、胎盤膜からの馴化培地は、実験ウェルに添加される前に基底ケラチノサイト培地中で１：２０に希釈される。１８時間後、培地を除去し、細胞を、４％  パラホルムアルデヒド中で２０分間固定し、クリスタル・バイオレットで染色する。次いで、それぞれのウェル中の創傷領域を撮影する。創傷領域の量により決定される際の創傷治癒は、馴化培地がウェルに添加される前に撮影された対照写真と比較した場合に、実験の終了時に、依然として、明らかである。
【０４２８】
羊膜及び絨毛膜からの馴化培地を使用して、内皮細胞遊走及び創傷領域閉鎖を促進するためのこれらの膜の可能性を評価した。胎盤羊膜、絨毛膜、及び羊膜／絨毛膜の組み合わせからの馴化培地は、実験創傷領域への内皮細胞の遊走を支持した（図２７）。
【０４２９】
実施例２０．２  胎盤膜馴化培地は、内皮細胞、線維芽細胞、及びケラチノサイトの遊走を支持する。
トランスウェル細胞遊走アッセイ
遊走アッセイは、８μｍの孔径を有するＦｌｕｒｏＢｌｏｋトランスウェルシステム（ＢＤ）を用いて、ヒト臍血管内皮細胞、ヒト正常皮膚線維芽細胞、及びヒト罹患ケラチノサイト（ＩＩ型糖尿病）（Ｌｏｎｚａ）において行った。１００，０００個の細胞を、０．１％  ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中に懸濁し、トランスウェルの上部チャンバに添加して、有糸分裂を停止させた。翌日、組織試料からの馴化培地を下部チャンバに添加し、一晩インキュベートした。インキュベーション後、フィルタを通して遊走した細胞を固定し、カルセイン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）染色した。この領域を、蛍光挿入型顕微鏡によって視覚化し、写真を、１０倍の倍率で４つのランダムに選択された領域から撮影した。結果は、羊膜生成物が内皮細胞（図２７及び２８）、線維芽細胞（図２９）、及びケラチノサイト（図３０）の遊走を促進することを実証した。
【０４３０】
実施例２０．３  細分化した胎盤組成物の細胞増殖
細分化した絨毛膜組成物の細胞増殖能が試験された。胎盤細胞を播種し、１４日間培養した。
【０４３１】
処理された絨毛膜（例えば、細分化し、任意に消化させた）組成物を、３７℃で振動させながら、解凍し、２０分間消化させた。それぞれの試料は、２５０Ｕ／ｍＬのＳｅｒｖａ  ＩＩ型コラゲナーゼまたは２５０Ｕ／ｍＬのＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  ＩＩ型コラゲナーゼのいずれかで消化させた。消化組成物を１００μｍの細胞濾過器上にそそぎ、この濾過器をＤＭＥＭで洗浄した。消化組成物を４１１ｒｃｆで１０±分間遠心分離した。上清を除去し、ＤＭＥＭ中に再懸濁した。それぞれの細胞懸濁液をトリパンブルー排除によって血球計数器で計数した。
【０４３２】
処理された細胞のそれぞれの群をＴ２５フラスコ中に播種し、インキュベーター内で１４日間培養した。結果は、図３１Ａ〜Ｂ中に見られ得る。細分化した胎盤組成物に由来する細胞は、細胞培養において１４日後細胞コロニーを構築した。
【０４３３】
臨床研究
実施例２１  糖尿病性足潰瘍を治療するための胎盤生成物の使用
目的：ヒト線維芽細胞またはヒト線維芽細胞及びケラチノサイトの組み合わせを含む遺伝子操作された代用皮膚の代わりに、公開された慢性創傷治癒の速度は、低いままであり、すべての創傷のうちのおよそ半分がこれらのより新しい治療法でさえ難治性である。糖尿病足潰瘍からの罹患率及び死亡率は、下肢切断術後の５年間の死亡率が３９％〜６８％であるようにかなり高い。（Ｐａｇｅ  Ｊ．Ｊ  ｏｆ  Ｆｏｏｔ  ＆  Ａｎｋｌｅ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ２００２；４１（４）：２５１−２５９、Ｉｓｕｍｉ  Ｙ．，らＤｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｓ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ２００９；８３：１２６−１３１）。
【０４３４】
必要な血管新生及び抗炎症性成長因子を提供する凍結保存された胎盤膜生成物は、切断術のリスクがある慢性皮膚潰瘍に罹患している患者の転帰を改善させるために導入された。
【０４３５】
目的：慢性糖尿病足潰瘍に罹患しており、利用可能な治療法に反応せず、切断術のリスクがある患者には、治療が考慮された。凍結保存された胎盤膜の適用前に、すべての創傷が、積極的に創傷清拭された。患者は、定期的に評価され、本技術の膜の適用は、治療担当医の裁量によるものであった。オフロードは、両患者に推奨された。
【０４３６】
導入
米国食品医薬品局（ＦＤＡ）に従って、慢性皮膚潰瘍は、耐久性のある構造的、機能的、及び美容的閉鎖を生じる規則的かつ適時な一連の事象が進行することができない創傷として定義される（２）。最も一般的な慢性創傷は、褥瘡及び下肢潰瘍を含む。末梢神経障害、奇形、及び軽度の外傷の三徴は、足潰瘍をもたらす最も頻繁に引き起こす損傷の原因として出現する。治癒速度の観点から、慢性創傷の適切な基準は、毎週１０％から１５％のサイズの低下、または１カ月にわたる５０％のサイズの低下である。大きな健康維持機構において糖尿病に罹患している８，９０５人の患者のＲａｍｓｅｙらによって行われた３年の回顧的コホート研究は、５．８％の潰瘍の累積発現率を報告した。診断時に、これらの患者のうちの１５％は、骨髄炎を発症し、１６％が下肢の部分的切断を必要とした。
【０４３７】
下肢切断術のうちの約８０％〜８５％は、足潰瘍より始まる。糖尿病足潰瘍からの罹患率及び死亡率は、下肢切断術後の５年間の死亡率が３９％〜６８％であるようにかなり高い。（２）。これらの死亡率は、乳癌、結腸癌、及び前立腺癌に対する５年間の死亡率よりも高い。
【０４３８】
慢性糖尿病性潰瘍の治療のための遺伝子操作した組織のすべての進歩にかかわらず、潰瘍が治療法に耐性を示し、慢性創傷をもたらす多数の患者がいる。治癒速度がこれらのより新しい治療法で唯一５０％に近づくため、再生医療における幹細胞の使用は、最近特に興味深い。究極の目的は、機能的皮膚の再生を促進することである。予備研究は、Ｆｉａｍｉらによって行われ、臍帯血から間葉幹細胞を単離し、上皮除去した皮膚の切片にそれらを接種した。この予備研究の結果は、末梢血幹細胞が生存し、血管新生を発現することができることを示した。組織修復に有望であるのに加えて、間葉幹細胞は、低い免疫原性を示し、ドナーと受容者との間の適合性試験を行う必要なく一般的に移植され得る。
【０４３９】
この研究において、切断術が考えられた２つの慢性創傷の治療のための凍結保存された膜生成物を用いた注目に値する治癒の臨床的証拠。創傷管理の基本は、依然として、十分な創傷清拭、オフロード、湿潤環境の維持、ならびに十分な灌流及び感染対策を含む、任意の治療プロトコルにおける総合的な創傷ケアの基礎である。
【０４４０】
物質
凍結保存された胎盤膜は、本明細書に記載されるように作製され、これには、天然上皮細胞の二重層、ならびに新生児線維芽細胞、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）、及び間葉幹細胞（ＭＳＣ）からなる間質細胞層を含む羊膜に由来する同種移植片が含まれる。
【０４４１】
下肢救済：症例１
病歴及び物理的検査
７０歳の男性が、緊急診療部で第４指と第５指の間の右足の側背面上の水疱形成、浮腫及び疼痛、ならびに第５指の側方にある小さな病変を提示した。この患者は、提示の２週間前にこの領域への軽度の外傷の病歴を報告した。この患者は、ＩＩ型真性糖尿病、高血圧、心不全、慢性閉塞性肺疾患、及び週３回の血液透析により治療される慢性腎疾患の病歴を有した。患者は、大動脈−静脈グラフト置換の手術歴を有した。アルコール、タバコ、または薬物の使用の経歴を一切否定した。理学的検査は、活動性排膿または悪臭、及び触診における圧痛を示さなかった。血管検査は、足背動脈及び後脛骨動脈において触診不可能な脈を示した。ドップラー検査は、二相の後脛骨動脈の脈とともに単相の足背動脈の脈を示した。第５指は、壊疽性変化を有し、触診では冷たかった。第４指の虚血性変化があった。放射線学的評価は、第４指間及び第５指の先端において軟組織ガスを示す散乱した空気密度を示した。
【０４４２】
術前管理
患者は、バンコマイシン及びピペラシリンの抗生物質の静脈内投与ならびに適切な腎臓投与量でのタゾバクタムを開始した。
【０４４３】
術中管理
患者は、第４指間の切開及び排膿が行われた手術室に運ばれ、中足骨頭のレベルまでの部分的第５の光線切断術は、合併症もなく行われた。創傷は、開口した状態で、無菌生理食塩水で湿らせた無菌ガーゼで充填し、無菌圧縮包帯で覆われた。術中所見は、化膿及び悪臭を有する周辺組織の液化壊死を示した。患者は、２回のその後の外科的創傷清拭を受け、２回目は、第４及び第５の中足骨幹のさらなる除去をもたらした。３回目の手術では、壊死の軟組織のさらなる創傷清拭及び第４指の切断術が行われた。２０１０年５月２０日に、凍結保存された胎盤膜による治療が開始された。グラフト置換術前に、患者は、ほぼ残存狭窄なく、膝窩動脈及び腓骨動脈の再疎通に成功した。
【０４４４】
術後経過
患者は、退院してから２日以内に足病学外科医により追加治療が行われた。初期検査時、感染の臨床的兆候がなく、近位背面切開を接合させたように見えた。第３指は、外見が暗褐色で冷感であった。軟組織ガスまたは急性骨髄炎の証拠を示さない放射線写真が撮影された。乾式無菌包帯を適用した。患者は、外来診療室の６回の追加来院で凍結保存された胎盤膜の適用を受けた。それぞれの適用前に、創傷は、膿瘍、蜂巣炎、排膿、血腫形成、及び感染について評価された。それぞれの来院時に、創傷は、前回の来院と比較して、サイズが減少し、実際にはさらに肉芽が出現した。３回目の適用時に、創傷は、サイズが５０％減少した。
【０４４５】
１９週間で、創傷は閉鎖したと見られ、患者は、外科的靴のみの使用で患肢への体重負荷を維持するように指示された。
【０４４６】
図３２中に示される本技術の胎盤生成物により媒介された注目すべき創傷治癒の写真。パネルＡ：凍結保存された胎盤膜生成物の１回目の適用、Ｂ：１回目の凍結保存された胎盤膜の適用から８週間後、Ｃ：１回目の凍結保存された胎盤膜生成物の適用から１０  １／２週間後、Ｄ：１回目の凍結保存された胎盤膜である本膜生成物の適用から１２週間後、Ｅ：１回目の凍結保存された胎盤膜である本膜生成物の適用から１９週間後。
【０４４７】
下肢救済：症例２
病歴及び物理的検査
４４歳の男性が、外来診療室で来院の数週間前に前回の外傷に続発する、左第一趾の足底面上に大きな潰瘍を提示した。この患者は、末梢神経障害、高血圧、脂質異常症、及び骨髄炎を伴う過去５年間真性糖尿病の病歴を有した。過去の術歴は、腹部大動脈瘤の修復及び陰核切除を含んだ。理学的検査では、潰瘍は、４．０ｃｍ×２．０ｃｍ×１．５ｃｍを測定し、露出した腱を伴う末節骨へのプローブ検査を行った。上行性蜂巣炎またはリンパ管炎はなく、温度勾配の増加もなかった。毛細血管充填時間、発毛、及び組織膨圧はすべて正常であった。足背動脈及び後脛骨動脈において触診不可能な脈があった。軟組織ガスについての放射線検査は陰性であった。磁気共鳴画像は、末節骨に隣接した背側軟組織の領域内の小さな軟組織膿瘍を有する母趾の基節骨及び末節骨の遠位面において骨髄炎を示した。
【０４４８】
術前管理
患者は、抗生物質の静脈内投与を開始した。すべての生き残れない組織の切除的創傷清拭及び本膜生成物の適用のために手術室に搬送された。
【０４４９】
術中管理
潰瘍は、鋭的剥離及びＶＥＲＳＡＪＥＴ（商標）の両方の利用で健常な組織に創傷清拭され、足底に露出した基節骨の頭部を残した。次いで、凍結保存された胎盤膜を、創傷床及び露出した骨の上に置いた。患者は、合併症を発症せずに処置に耐えた。患者は、５週間コースの抗生物質の静脈内投与治療において手術の翌日退院した。
【０４５０】
術後経過
この患者は、患肢への非体重負荷を厳重に維持するように指示され、術後６日目に追加治療のために帰院した。包帯は、清浄、乾燥し、無傷であった。膿瘍、蜂巣炎、不快症状、または排膿等の術後合併症もなく、感染の臨床的兆候もなかった。患者は、次の８週間のコースにわたって凍結保存された胎盤膜生成物の合計７回の適用を受けた。それぞれの来院時、創傷は、感染の臨床的兆候について検査された。それぞれの来院時の評価は、創傷基部への肉芽組織の著しい発達及びサイズの有意な減少を示した。同種移植片組織の初期適用から８週間後、創傷は閉鎖した。
【０４５１】
図３３中に示される本技術の胎盤生成物により媒介された注目すべき創傷治癒の写真。パネルＡ：骨髄炎、露出した腱、骨プローブ。１回目の凍結保存された胎盤膜移植片を外科的創傷清拭後に適用された、Ｂ：凍結保存された胎盤膜移植片の１回目の適用後の現状、創傷は、実際には肉芽があり、感染の兆候はない、Ｃ：外科的介入から３週間後、凍結保存された胎盤膜移植片における２回目の適用、創傷は、境界線及び深さがかなり小さくなっている、Ｄ：外科的介入から６週間後、創傷は、ほぼ閉口している、Ｅ：凍結保存された胎盤膜移植片の８週間及び７回目の適用、創傷は閉口している。
【０４５２】
結論
過去数十年間遺伝子操作された皮膚組織の驚異的な進歩にもかかわらず、現行の治療法は、慢性糖尿病性潰瘍の治療における有効性が制限されている。２人の患者のこの症例報告に示されるように、幹細胞を含有する新型治療法の使用は、切断術の代わりにこれらの患者を最終的に治癒し、死亡率を低下させるのに有用であることが分かり、同時に、現在の市場における標準処置への費用効率的な代替物となり得る。この症例報告に示された両患者は、本技術の膜生成物の７回の適用を受けた。完全治癒は、両患者に起こった。治療関連の合併症は報告されなかった、本膜生成物は、切断術のリスクがある糖尿病足潰瘍に罹患している２人の患者の初期評価において安全かつ有効であった。これらの結果は、治療抵抗性のある慢性創傷を有する患者にはこの新規治療法が考慮されるべきであることを示す。
【０４５３】
実施例２２  前向き臨床試験研究における糖尿病足潰瘍の治療のためのＧｒａｆｉｘの有効性及び安全性の評価
糖尿病足潰瘍は、著しく高い死亡率をもたらし、医療費を上昇させる世界的な流行病である。この研究は、慢性糖尿病足潰瘍を治癒するための標準的な創傷ケア（Ｎ＝４７）と比較して、凍結保存された胎盤膜（Ｎ＝５０）の有効性及び安全性を評価した。この実施例は、慢性糖尿病足潰瘍の治療のための羊膜に由来する本明細書に記載されるような凍結保存された胎盤膜生成物（例えば、Ｇｒａｆｉｘ（登録商標）、Ｏｓｉｒｉｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）の安全性及び有効性を評価するための前向き多施設無作為単回盲検臨床試験の一部である。本研究は、１９７５  Ｄｅｃｌａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｌｓｉｎｋｉの倫理指針に適合し、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ（ＮＣＴ０１５９６９２０）に登録された。患者は、登録前に検討し、標準的なＩＲＢ承認の同意書に署名した。患者は、２０１２年５月から２０１３年４月まで登録した。
【０４５４】
含まれた主な試験対象患者基準は、Ｉ型またはＩＩ型糖尿病、１８歳〜８０歳の患者年齢、４週間〜５２週間に存在する創傷指数、足の足底または背面上のくるぶしより下に位置する創傷、及び１ｃｍ２〜１５ｃｍ２の潰瘍を確認した。主な除外基準には、１２％超のヘモグロビンＡ１ｃ、骨髄炎または蜂巣炎を含む活動性感染の証拠、０．７０未満または１．３０超の足関節上腕血圧比または０．５０以下の上肢下肢血圧比によって定義される患足への循環不全、または不十分な動脈の拍動、露出した筋肉、腱、骨、若しくは関節包、スクリーニング期間中の３０％以上の創傷領域の減少を有するドップラー研究が含まれた。
【０４５５】
１週間のスクリーニング期間後、患者は、１：１の比率で凍結保存された胎盤生成物または対照治療アームに無作為化された。胎盤生成物治療に無作為化された患者は、１週間（±３日）に１回、胎盤生成物の適用を最大８４日間受けた（盲検治療相）。対照群の患者は、１週間（±３日）に１回、標準的な創傷治療法を最大８４日間受けた。すべての創傷は、それぞれの週１回の来院時に、適切に清浄し、外科的に創傷清拭して、外科用メス、組織ニッパー、及び／またはキュレットによって、創傷からすべての生き残れない軟組織を除去した。胎盤生成物群に無作為化された患者においては、凍結保存された胎盤膜を、創傷及び端に完全に接触するように置いた。両群の創傷は、外科的創傷清拭、オフロード、及び非粘着性包帯を含んだ標準的な創傷ケアを受けた。すべての患者は、非粘着性包帯：ＡＤＡＰＴＩＣ（登録商標）（Ｓｙｓｔａｇｅｎｉｘ，Ｇａｔｗｉｃｋ，ＵＫ）、及び中等度の排液性創傷に対しては、生理食塩水で湿潤させたガーゼまたはＡＬＬＥＶＹＮ（登録商標）（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｎｅｐｈｅｗ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）を受容した。次いで、外部包帯を適用した。患者には、足底の創傷には歩行用ブーツ、または創傷が足背上または足首にあった場合、術後靴が提供された。特注のオフロードブーツは、施設治験責任医師の裁量により処方され得る。さらに、使用されたオフロードデバイスは、創傷サイズまたは位置の変化に適応する必要がある場合に変化され得る。
【０４５６】
患者は、臨床施設で毎週評価された。次いで、完全な創傷閉口を達成した患者は、追跡期間中、最初の１カ月は２回、次いで、２回のさらなる来院については月１回継続して評価された。創傷が盲検治療期間の終了までに閉鎖しなかった対照患者は、非盲検治療期間で胎盤生成物を受容することができ、胎盤生成物（ＧＲＡＦＩＸ（登録商標））を最大８４日間適用した。成果及び安全性評価は、盲検治療期間中、追加治療の来院時、及び非盲検治療期間中のそれぞれの来院時に行われた。
【０４５７】
本研究の一次エンドポイントは、指標創傷の完全な創傷閉口の評価であった。完全な創傷閉口は、施設担当医によって決定されるように、創傷排膿のない１００％の再上皮形成として定義された。創傷閉口の確認は、最初の追加治療の来院から２週間後になされた。創傷閉口は独立して、デジタル化されたアセテートトレーシング及び写真を介してすべての創傷を検査した２人の盲検創傷ケアの専門家による中央創傷ケア研究室を介して確認された。副次的目的は、カプランマイヤー分析によって測定されるように、胎盤生成物を受容した患者対対照を受容した患者における創傷閉口の初期時間を含んだ。２８日までの創傷サイズの５０％以上の低減を達成した患者の割合、閉鎖のために必要とされる塗布数、及び初期創傷治癒後の創傷再発もまた、確認された。非盲検治療期間中、盲検治療期間中の対照群の患者における胎盤生成物による創傷閉口が評価された。安全性評価は、国立癌研究所（ＮＣＩ）の有害事象共通用語基準（ＣＴＣＡＥ）第３版において概説されるように、有害事象の数、タイプ、及び重症度を含んだ。
【０４５８】
試料サイズ及び統計学的分析：研究試料サイズは、対照アームにおける３０％の想定閉鎖率及び３０％の脱落率を有する胎盤生成物群における５０％の想定閉鎖率に基づいた。このような想定の下で、それぞれの治療アームにおける９４人の完了した患者は、８０％の検出力を有する両側のタイプ１の０．０５の誤差率を満たすことが必要とされた。予め特定された中間分析は、５０％の登録で計画された。中間分析は、Ｏ’Ｂｒｉｅｎ−Ｆｌｅｍｉｎｇの境界形状を用いたＥｍｅｒｓｏｎ−Ｆｌｅｍｉｎｇの対称群の逐次設計に基づく片側の優位性設計を利用した（Ｅｍｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｆｌｅｍｉｎｇ，１９８９）。この分析は、非盲検統計学者によって行われ、盲検審査委員会に報告された。中間分析後、盲検審査委員会は、胎盤生成物アーム対対象アームの高度の優位性により、研究登録を終了するように推奨した。
【０４５９】
統計学的分析は、ＳＡＳバージョン９．２を用いて包括解析基準において行われた。ベースライン人口統計及び臨床的変数は、この研究のそれぞれの治療アームに対して要約された。連続型変数の分布の記述的要約は、平均、標準偏差、中央値、及び被験者の計数を含み、カテゴリ変数は、頻度及び割合に関して要約された。治療群の要約は、すべての研究施設にわたって作成された。治療群間の統計学的比較は、カテゴリ変数についてはカイ二乗検定を用い、連続測定については分散分析（ＡＮＯＶＡ）技法を用いて行われた。コックス比例ハザード回帰分析は、時間事象（創傷閉口）データにおいて行われた。
【０４６０】
結果
【０４６１】
患者の人口統計及びベースライン特徴を表１７中に示す。スクリーニング中、１３９人の患者が評価された。スクリーニングに失敗した４２人の患者がおり、このうちの６人は、３０％以上の創傷領域の減少があったため、実行期間の１週間後に失格となった。９７人の患者は、その後、無作為化され、５０人は、胎盤生成物を受容し、４７人は、標準的な創傷治療を受けた。２つの治療群間のベースライン特徴における有意な差はなかった。計画された中間分析は、対照群と比較した場合に、一次及び二次エンドポイントにおいて胎盤生成物を受容した患者の中で高度の有効性を示した（表１８）。中間分析後、盲検審査委員会は、高度の優位性により、研究登録を終了するように推奨した。
【０４６２】
有効性評価
【０４６３】
盲検治療期間：完全な創傷閉口を達成した患者の割合は、図３４中に示されるように、対照（４７人のうち１０人、２１．０％、ｐ＝０．０００１）と比較して、胎盤生成物を受容した患者（５０人のうち３１人、６２．０％）において有意に高かった。対照と比較した胎盤生成物患者に対する完全治癒のオッズ比は、６．０３７であった（９５％  ＣＩ  ２．４４９−１４．８８２）。胎盤生成物群は、図３５中に示されるように、閉鎖した両群における創傷の中で、対照と比較して完全な創傷閉口のための平均時間が有意に速かった（４２対６９．５日、ｐ＝０．０１９）。カプランマイヤー分析は、胎盤生成物における１２週間の評価期間中、完全な創傷治癒の統計学的に高い確率を示した（図３５）。胎盤生成物群における閉鎖の確率は、標準的なケア群における２７．１％と比較して、６７．１％であった（Ｌｏｇ−Ｒａｎｋ、ｐ＜０．０００１）。胎盤生成物患者はまた、図３６に示されるように、対照アーム（６対１２、ｐ＜０．００１）における患者と比較して、閉鎖を達成するために研究来院（すなわち、塗布）をあまり必要としなかった。２８日目までに少なくとも５０％の創傷サイズの低減を有する患者の比較は、胎盤生成物群の５０人のうちの３１人の患者（６２．０％）が対照群の４７人のうちの１９人（４０．４％）に対してこの低減を達成したことを示した（ｐ＝０．０３５）。対照群から中断した患者が１１人（２３．４％）であったのに対して、胎盤生成物群における完了前に本研究を中断した患者は８人（１６％）であった。
【０４６４】
初めの１２週間の研究期間中に閉鎖したＤＦＵの創傷再発が評価された。２週間、４週間、及び４週間毎の合計１２週間の追加治療は、潰瘍が、対照群の７０．０％（１０人のうちの７人の患者）に対して胎盤生成物群の患者のうちの８２．１％（２８人のうちの２３人の患者）で閉口状態であったことを示した（ｐ＝０．４２）。
【０４６５】
非盲検期間：初めの１２週間の治療期間中、治癒できなかった対照アームの患者は、最大１２週間の胎盤生成物治療を受けるようにクロスオーバーし得る（ｎ＝２６）。胎盤生成物による治療を受けた後、閉口の確率は６７．８％であり、これらの患者において閉口にかかる平均時間は４２日間であった。（図３７）
【０４６６】
回帰分析：コックス比例ハザード回帰分析は、治療群、潰瘍の持続時間、ベースラインの潰瘍領域、グルコース調節（糖化ヘモグロビン）、潰瘍位置、及びＢＭＩを共変量として行われた。これらの変数に対して調節した後、胎盤生成物は、閉口にかかる時間において有意な効果を有することが見出された（ｐ＜０．０００１）。危険率は、４．７７（９５％  ＣＩ  ２．２７９、９．９７１）であり、これは、標準的な創傷治療法に対して胎盤生成物を用いた閉口の優れたオッズを示した。
【０４６７】
安全性評価：概して、少なくとも１つの有害事象を経験した胎盤生成物患者が、対照患者と比較して、少なかった（４４．０％対６６．０％、ｐ＝０．０３１）。胎盤生成物に無作為化された患者のうちで、対照よりも胎盤生成物群において、創傷関連の感染症に罹患している患者が有意に少なく（１８．０％対３６．２％、ｐ＝０．０４４）、創傷感染に関連した重篤な有害事象が少なく（８％対２１．３％、ｐ＝０．０８４）、感染関連の入院が少なかった（６％対１５％、ｐ＝０．１５）。（表１９）。
【０４６８】
考察
【０４６９】
この研究の結果は、本明細書に開示される胎盤生成物の週毎の塗布は、標準的な創傷治療と比較した場合に、糖尿病足潰瘍の治癒速度を改善し、糖尿病足合併症を減少させることを示す。この研究では、すべての一次及び二次エンドポイントは、今まで、多施設ＤＦＵ試験において、統計学的に有意な予め特定された中間分析を満たすために、胎盤生成物の臨床的利益を示した。これはまた、糖尿病足潰瘍の治療のために、ヒト羊膜の使用を精査するために、多施設無作為化制御試験（ＲＣＴ）の第１の報告書である。さらに、著者の知る限りでは、これは、高度な代用皮膚のための第１の大型多施設ＲＣＴであり、一次エンドポイントの１００％の再上皮形成が、第三者の盲検創傷ケア専門家によって確認され、潜在的バイアスをさらに除去し、エンドポイントの結果の信頼性を増大した。胎盤生成物群は、図３４中に示されるように、有意に高い完全な閉鎖速度（１９１％の相対的改善）を有した。
【０４７０】
この研究では、すべての研究来院時にすべての患者において、外科的創傷清拭が行われた。他の研究は、少数のＤＦＵが３期間のＤＦＵ試験において外科的創傷清拭を受け（Ｓｔｅｅｄ，Ｄ．Ｌ．，ら，Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  ｄｅｂｒｉｄｅｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｏｆ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｆｏｏｔ  ｕｌｃｅｒｓ．Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｕｌｃｅｒ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｓｕｒｇ，１９９６．１８３（１）：ｐ．６１−４、Ｓａａｐ，Ｌ．Ｊ．ａｎｄ  Ｖ．Ｆａｌａｎｇａ，Ｄｅｂｒｉｄｅｍｅｎｔ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｉｎｄｅｘ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｃｌｏｓｕｒｅ  ｏｆ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｆｏｏｔ  ｕｌｃｅｒｓ．Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｒｅｇｅｎ，２００２．１０（６）：ｐ．３５４−９）、創傷清拭の頻度が創傷治癒の差と関連したことが報告された（Ｓｔｅｅｄらの上記参照、表２０）。
【０４７１】
【表１７】
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【０４７２】
【表１８】
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【０４７３】
【表１９】
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【０４７４】
【表２０】
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【０４７５】
実施例２３  腱修復方法における凍結保存された膜
凍結保存された膜は、移植の準備が整うまで−８０℃（±５℃）で維持される。凍結した膜を解凍し、包装挿入物に提供されたプロトコルを用いてすすいだ。さらなる情報は、Ｏｓｉｒｉｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓによって提供されるＧｒａｆｉｘ調製ガイドにおいて見出され得る。解凍後、すすぎステップが行われ、移植片は、使用前にすすぎ容器中で最大１時間保持され得る。膜が解凍され、すすがれると、移植の準備が整う。
【０４７６】
凍結保存された膜が方向性（例えば、羊膜）を有するかどうかに応じて、包装は、膜の方向性（例えば、どちらの側が上皮若しくは非接着側であるか、及び／またはどちらの側が間質細胞若しくは膜の接着側であるか）を示し得る。羊膜を使用する場合、間質細胞層は、修復された組織表面と接触するように置かれ得る。
【０４７７】
以下の技術は、腱修復術後に被覆するために、本明細書に開示される凍結保存された膜を使用する場合に成功を証明することが予想される一例を提供する。
【０４７８】
塗布用の膜の調製
塗布処理を開始する前に、創傷及び修復部位のあらゆる洗浄を完了し、あらゆる吸引を行わなければならない。これは、膜が吸引物に捕捉されない、または塗布後に破壊されないことを確実にする。凍結保存された膜とともに含まれた任意の取り付け支持体（例えば、ニトロセルロース）は、解凍が完了した後に慎重に除去される。ニトロセルロース支持体上で凍結保存された羊膜を含む膜が提供される場合、調製方法は、
１．２インチのリボン（可鍛性）を使用し、膜の上皮側を置き、リボンと接触させる。この位置では、膜の間質細胞側を、膜の上部でニトロセルロースフレームと曝露させる。
２．単一または２つの無傷鉗子を使用し、（例えば、指で）膜を安定させながら、ニトロセルロースフレームをゆっくりとひっぱりはじめて、膜から離す。常にリボンと接触するように膜を維持して、球状になる／収縮するのを防ぎ、間質細胞層の適切な選別を確実に行うことが望ましくあり得る。
３．裏部が取り外されると、鉗子の背部、指、またはフリア挺子を用いて膜のしわを慎重に伸ばす。膜は、これで間質細胞側が上に向き、腱に移動させる準備が整う。例えば、図３８Ａ〜Ｂを参照のこと。
【０４７９】
腱への膜の移動
腱の外科的修復後、修復された腱切片を慎重に牽引して、リボンが修復部位の下を通過するようにする。膜の間質細胞側が、これで修復された腱切片に対向しているであろう。（図３８Ｃ）。無傷鉗子を使用して、膜の全片側は腱切片上に膜を置くように慎重に持ち上げるであろう。膜（粘着側）は、自然に腱に付着するが、必要に応じてしわを伸ばし、位置付けし直すことができる。（図３８Ｄ）。鉗子または別の器具で塗布した膜を安定させながら、膜の残りの部分を反対方向に巻き付け、腱切片を包み、とどめる。任意の余分な膜は、予め塗布した膜の断面に重ね合わせてもよい。（図３８Ｅ）。この塗布物は、バリア鞘において修復した腱切片を完全に包囲するであろう。間質細胞層の粘着特性、及び任意の再吸収可能な縫合糸からの潜在的な炎症反応のため、そのような縫合糸は、適切な場所に移植片を維持するために推奨されない場合がある。
【０４８０】
腱が依然として収縮していないが、リボンは、慎重に取り外され、腱は、この鞘に戻して置き換えられるであろう。腱鞘は、閉口部に不注意に膜を組み込むことのないように慎重に注意して閉口される。（図３８Ｆ）。洗浄または吸引の必要性を証明する場合、膜の鋭い観察が膜破壊または消失を避けるために必要であるか、またはＲａｙ−ｔｅｃスポンジで慎重に拭き取ることが推奨される場合がある。吸引の使用を制限することにより、膜を破壊する可能性を低くすることが予想される。
【０４８１】
考察
腱断裂の外科的再建は、大部分の足及び足首外科診療において常識である。最も一般的な術後合併症のうちの１つが周囲の軟組織構造物への修復された腱の粘着である。本明細書に開示される凍結保存された膜、例えば、凍結保存された羊膜を含む膜は、自然に粘着防止及び抗炎症特性を有することが示されている。したがって、炎症及び結果として生じる瘢痕（ｃｉｒｃａｔｒｉｘ）形成の増加が有害であり得る領域において使用することが理想的には適している。膜は、必ずしも増加した構造的完全性を提供せず、そのため、腱断裂の修復における膜の単離された使用は、構造補強が必要でない場合、または構造補強を提供する別の生成物と組み合わせて膜を使用する場合には、適切である。最近の研究では、凍結保存された膜が無細胞皮膚移植片及びＰＲＰとともに使用される場合に、皮膚移植片の宿主取り込み速度が改善されたことを示している。研究は、移植部位の生理学的に同一の組織への移植片の微小血管障害のある再構成を示唆している。さらに、取り込み率の増加、組織分化、及び再構成が観察された。これらの特性は、組織粘着の阻害／防止、術後期間中の瘢痕化の阻害／防止、及び腱修復に関連する適用において凍結保存された膜の使用を可能にする。
【０４８２】
実施例２３．１  腱修復方法における凍結保存された膜
７２歳の女性患者は、有痛性の小結節及び慢性腱炎を患っていることを示す。この患者は、小結節を除去する外科手術を受ける（図３９Ａ）。凍結保存された膜は、上で論じられるように解凍し、針様形態に巻くことができる（図３９Ｂ）。次いで、膜を腱の内側に挿入し、腱を縫合糸で閉口する。（図３９Ｃ）。膜が加速した創傷治癒及び組織修復を促進し、同時に、修復した腱への粘着を防ぐことが予想される。
参考文献
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１５Ｆ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３２Ｃ】
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【図３２Ｄ】
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【図３２Ｅ】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３３Ｃ】
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【図３３Ｄ】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３８Ｃ】
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【図３８Ｄ】
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【図３８Ｅ】
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【図３８Ｆ】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図３９Ｃ】
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【国際調査報告】
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