(57)【要約】  本発明は、対象の標的細胞に送達するためのリポソーム、テロメラーゼ逆転写酵素を発現させるための核酸、および／またはテロメラーゼＲＮＡ構成要素を提供する。活性型テロメラーゼの発現は、細胞内でテロメア長を伸長することができる。このような延長は、短縮したテロメアに関連する疾患を患う対象に有用である可能性がある。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の標的細胞でテロメラーゼを発現させる方法であって、リポソームおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を対象に投与することを含み；
リポソームは、外面を有しかつ内部コンパートメントを画定するペグ化された脂質膜を含み：
ａ）外面は、受容体媒介性エンドサイトーシスまたはマクロピノサイトーシスに関与する標的細胞上の受容体に対するターゲティング剤が付着しており；
ｂ）内部コンパートメントは、標的細胞で作動しテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結している発現調節配列を含む核酸ベクターを含有し；
リポソームは標的細胞によってエンドサイトーシスまたはマクロピノサイトーシスされ、標的細胞は活性型テロメラーゼを発現する前記方法。
【請求項２】
内部コンパートメントは、標的細胞で作動しテロメラーゼＲＮＡ構成要素（ＴＥＲＣ）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結している発現調節配列を含む核酸ベクターを含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
対象は、脊椎動物、例えば哺乳動物、例えばヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
医薬組成物は、静脈内、クモ膜下腔内、関節内、眼内、筋肉内、経口的、非経口的、または局所的に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
医薬組成物は静脈内に投与され、リポソームの外面は、受容体媒介性トランスサイトーシスに関与する内皮障壁の内皮細胞上の受容体に対するターゲティング剤が付着しており、リポソームは、内皮障壁を通過する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
内皮障壁は血液脳関門である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
標的細胞上の受容体に対するターゲティング剤は、内皮細胞上の受容体に対するものでもある、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
標的細胞は神経系の細胞であり、内皮細胞は血液脳関門の細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
標的細胞は、心血管系；消化器系；内分泌系；泌尿器系；免疫系；筋骨格系；神経系；生殖器系；または呼吸器系の細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
リポソームは関節内に投与され、リポソームは軟骨細胞上の受容体のためのターゲティング剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
対象は短縮したテロメアに関連する疾患を患う、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
活性型テロメラーゼは、対象において短縮したテロメア長を伸長する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
短縮したテロメアに関連する疾患を患う対象を処置する方法であって、リポソームを対象に投与することを含み、
リポソームは、外面を有しかつ内部コンパートメントを画定するペグ化された脂質膜を含み：
ａ）外面は、受容体媒介性エンドサイトーシスまたはマクロピノサイトーシスに関与する標的細胞上の受容体に対するターゲティング剤が付着しており；
ｂ）内部コンパートメントは、標的細胞で作動しテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結している発現調節配列を含む核酸ベクターを含有し；
投与は、対象の標的細胞における活性型テロメラーゼの発現をもたらし、活性型テロメラーゼは、標的細胞においてテロメア長を伸長する前記方法。
【請求項１４】
テロメラーゼの発現は一過性（例えば、４時間、８時間、２４時間、２日、４日または８日のいずれかまでの発現）である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
投与により、標的細胞において１００コピーから１００，０００コピーの間のテロメラーゼが産生される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
短縮したテロメアに関連する疾患は、アルツハイマー病、動脈硬化症、骨粗鬆症および早老症から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
対象にリポソームを複数回投与することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
テロメラーゼ逆転写酵素をコードする少なくとも１つの核酸ベクターを標的細胞に送達するためのリポソームであって、
該リポソームは、外面を有しかつ内部コンパートメントを画定するペグ化された脂質膜を含み：
ａ）外面は、受容体媒介性エンドサイトーシスまたはマクロピノサイトーシスに関与する標的細胞上の受容体に対するターゲティング剤が付着しており；
ｂ）内部コンパートメントは、標的細胞で作動しテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結している発現調節配列を含む核酸ベクターを含有する前記リポソーム。
【請求項１９】
標的細胞は、神経系の細胞、例えばニューロン（例えば、錐体細胞、プルキンエ細胞、顆粒細胞または別のレジデントニューロン）、グリア細胞（例えば、ミクログリア細胞、星状グリア細胞、希突起膠細胞または別のレジデントグリア細胞）または神経系に入る一過性の細胞である、請求項１８に記載のリポソーム。
【請求項２０】
標的細胞は、心血管系；消化器系；内分泌系；泌尿器系；免疫系；筋骨格系；神経系；生殖器系；または呼吸器系の細胞である、請求項１８に記載のリポソーム。
【請求項２１】
ターゲティング剤は、インスリン受容体に対するものである、請求項１８に記載のリポソーム。
【請求項２２】
ターゲティング剤は、例えば、低比重脂質受容体のためのトランスフェリン受容体以外の、核以外の細胞目的地を予定されているエンドソームの形成を媒介するもの以外の標的に対するものである、請求項１８に記載のリポソーム。
【請求項２３】
ターゲティング剤は、受容体に対するモノクローナル抗体を含む、請求項２１に記載のリポソーム。
【請求項２４】
ターゲティング剤は、受容体の内因性ペプチドリガンド、内因性ペプチドリガンドのアナログまたは受容体を結合するモノクローナル抗体から選択される、請求項１８に記載のリポソーム。
【請求項２５】
ターゲティング剤は、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）およびレプチンから選択される、請求項１８に記載のリポソーム。
【請求項２６】
外面は、受容体媒介性トランスサイトーシスに関与する内皮障壁の内皮細胞上の受容体に対するターゲティング剤が付着している、請求項１８に記載のリポソーム。
【請求項２７】
内皮障壁は血液脳関門である、請求項１９に記載のリポソーム。
【請求項２８】
標的細胞上の受容体に対するターゲティング剤は、内皮細胞上の受容体に対するものでもある、請求項２７に記載のリポソーム。
【請求項２９】
標的細胞は神経系の細胞であり、内皮細胞は血液脳関門の細胞である、請求項２８に記載のリポソーム。
【請求項３０】
少なくとも１つの核酸ベクターはプラスミドを含む、請求項１８に記載のリポソーム。
【請求項３１】
ＴＥＲＴは、ヒトＴＥＲＴまたはその改変バージョンである、請求項１８に記載のリポソーム。
【請求項３２】
ＴＥＲＴをコードするヌクレオチド配列は、ヒトＴＥＲＴをコードする天然のヌクレオチド配列を含む、請求項１８に記載のリポソーム。
【請求項３３】
発現調節配列は、ＳＶ４０プロモーターを含む、請求項１８に記載のリポソーム。
【請求項３４】
少なくとも１つの発現調節配列は、標的細胞に特異的なプロモーターを含む、請求項１８に記載のリポソーム。
【請求項３５】
内部コンパートメントは、標的細胞で作動しテロメラーゼＲＮＡ構成要素（ＴＥＲＣ）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結している発現調節配列を含む核酸ベクターをさらに含有する、請求項１８に記載のリポソーム。
【請求項３６】
ＴＥＲＣはヒトＴＥＲＣである、請求項３５に記載のリポソーム。
【請求項３７】
ＴＥＲＴをコードするヌクレオチド配列およびＴＥＲＣをコードするヌクレオチド配列は、同一のベクターに含まれる、請求項３５に記載のリポソーム。
【請求項３８】
ＴＥＲＴをコードするヌクレオチド配列およびＴＥＲＣをコードするヌクレオチド配列は、同一の発現調節配列に作動可能に連結している、請求項３５に記載のリポソーム。
【請求項３９】
内部コンパートメントは、標的細胞で作動しテロメラーゼ逆転写酵素またはテロメラーゼＲＮＡ構成要素以外の治療的生体分子をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結している発現調節配列を含む核酸ベクターを含有する、請求項１８に記載のリポソーム。
【請求項４０】
治療的生体分子はＬＭＮＡ  Ａ、例えば、ヒトＬＭＮＡ  Ａである、請求項３９に記載のリポソーム。
【請求項４１】
治療的生体分子は伸長因子１（ＥＬＦ１）である、請求項３９に記載のリポソーム。
【請求項４２】
請求項１８〜４１のいずれか１項に記載のリポソームおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項４３】
静脈、クモ膜下、関節内、眼内、筋内、経口的、非経口的または局所的投与のために製剤化されている、請求項４２に記載の医薬組成物。
【請求項４４】
本発明の請求項１８に記載のリポソームおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を含む容器を含む単位剤形。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年１２月２７日に出願した米国仮出願第６１／９２１，２３５号の利益を主張するものである。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究の記載
なし。
【０００３】
発明の属する技術分野
本明細書では、生物の生細胞に対する、テロメアの伸長のための遺伝子医薬品の全身性送達または標的送達を記載する。より詳細には、生物全体の生細胞に対する、テロメアの伸長のための遺伝子医薬品の全身性送達または標的送達において有用な製剤を提供するための、リポソーム技術、ペグ化技術、受容体媒介性トランスサイトーシス技術、受容体媒介性エンドサイトーシス技術、核シグナリングエンドソーム技術、核膜トランスロケーション技術、治療的遺伝子技術およびプラスミド技術の組合せを記載する。
【背景技術】
【０００４】
関連技術の説明
ここ数十年の間、研究者は、ヒト老化の進行が、生物の細胞のそれぞれにおいて染色体の先端のテロメアと呼ばれる構造が短縮されることによって細胞レベルで支配されると理解するようになった。細胞分裂の繰り返しによってテロメアが短縮するにつれて、細胞内で遺伝子発現が変化し、結果として毎日の消耗の修復過程が漸進的に減速および最終的に停止し、細胞、組織および生物全体の漸進的な機能不全になる。テロメアの短縮は、老化および加齢による障害の構成要素である。
【０００５】
研究は、テロメラーゼによるテロメアの再伸長が、細胞、組織および生物の若い機能の側面を復元できることを示す。（非特許文献１）
【０００６】
そのようなテロメア伸長または再伸長療法を実現することは、現在までに難題であることが分かった。これまでに、内因性テロメラーゼ遺伝子の小分子活性化因子の効果はほんのわずかであることが分かっている。
【０００７】
体全体のかなりの数の細胞へ、ＲＮＡ、ＤＮＡおよびタンパク質のような巨大分子の効果的量を問題なく送達することは難しい。毛細血管壁、血液脳関門、細胞膜および核膜はすべて、巨大分子にとって厄介な障壁となり、血液、血漿および細胞基質はすべて、そのような外来の侵入者を破壊することを目的とする多くの防御機構または免疫機構を含む。
【０００８】
テロメラーゼのテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）構成要素の組換えバージョンのような組換えタンパク質は、外因的に発現された場合、適切に折りたたまれない傾向があり、一般に結果としてコンピテントテロメラーゼを形成しない。ＴＥＲＴタンパク質のコピーを導入することによって、テロメラーゼの十分な細胞濃度を達成することは難しいことが分かっている。
【０００９】
ウイルスベクターは、効率が低いことが分かっている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｒｏｎａｌｄ  Ａ．ＤｅＰｉｎｈｏ、Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｓａｌｔｕｓ、Ｄａｎａ−Ｆａｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、「Ｐａｒｔｉａｌ  ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｏｆ  ａｇｉｎｇ  ａｃｈｉｅｖｅｄ  ｉｎ  ｍｉｃｅ」、Ｈａｒｖａｒｄ  Ｇａｚｅｔｔｅ、２０１０年１１月２８日
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
一態様では、対象の標的細胞でテロメラーゼを発現させる方法であって、リポソームおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を対象に投与することを含み；リポソームは、外面を有しかつ内部コンパートメントを画定するペグ化された脂質膜を含み：ａ）外面は、受容体媒介性エンドサイトーシスまたはマクロピノサイトーシスに関与する標的細胞上の受容体に対するターゲティング剤が付着しており；ｂ）内部コンパートメントは、標的細胞で作動しテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結している発現調節配列を含む核酸ベクターを含有し；リポソームは標的細胞によってエンドサイトーシスまたはマクロピノサイトーシスされ、標的細胞は活性型テロメラーゼを発現する前記方法が本明細書で提供される。一実施形態では、内部コンパートメントは、標的細胞で作動しテロメラーゼＲＮＡ構成要素（ＴＥＲＣ）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結している発現調節配列を含む核酸ベクターを含有する。別の実施形態では、対象は脊椎動物、例えば哺乳動物、例えばヒトである。別の実施形態では、医薬組成物は静脈内、クモ膜下腔内、関節内、眼内、筋肉内、経口的、非経口的、または局所的に投与される。別の実施形態では、医薬組成物が静脈内に投与され、リポソームの外面は、受容体媒介性トランスサイトーシスに関与する内皮障壁の内皮細胞上の受容体に対するターゲティング剤が付着しており、リポソームは、内皮障壁を通過する。別の実施形態では、内皮障壁は血液脳関門である。別の実施形態では、標的細胞上の受容体に対するターゲティング剤は、内皮細胞上の受容体に対するものでもある。別の実施形態では、標的細胞は神経系の細胞であり、内皮細胞は血液脳関門の細胞である。別の実施形態では、標的細胞は心血管系；消化器系；内分泌系；泌尿器系；免疫系；筋骨格系；神経系；生殖器系；または呼吸器系の細胞である。別の実施形態では、リポソームは関節内に投与され、リポソームは軟骨細胞上の受容体のためのターゲティング剤を含む。別の実施形態では、対象は短縮したテロメアに関連する疾患を患う。別の実施形態では、活性型テロメラーゼは、対象において短縮したテロメア長を伸長する。
【００１２】
別の態様では、短縮したテロメアに関連する疾患を患う対象を処置する方法であって、リポソームを対象に投与することを含み、リポソームは、外面を有しかつ内部コンパートメントを画定するペグ化された脂質膜を含み：ａ）外面は、受容体媒介性エンドサイトーシスまたはマクロピノサイトーシスに関与する標的細胞上の受容体に対するターゲティング剤が付着しており；ｂ）内部コンパートメントは、標的細胞で作動しテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結している発現調節配列を含む核酸ベクターを含有し；投与は、対象の標的細胞における活性型テロメラーゼの発現をもたらし、活性型テロメラーゼは、標的細胞においてテロメア長を伸長する前記方法が本明細書で提供される。一実施形態では、テロメラーゼの発現は一過性（例えば、４時間、８時間、２４時間、２日、４日または８日のいずれかまでの発現）である。別の実施形態では、投与により、標的細胞において１００コピーから１００，０００コピーの間のテロメラーゼが産生される。別の実施形態では、短縮したテロメアに関連する疾患は、アルツハイマー病、動脈硬化症、骨粗鬆症および早老症から選択される。別の実施形態では、短縮したテロメアに関連する疾患は、表１の状態から選択される。別の実施形態では、方法は対象にリポソームを複数回投与することを含む。
【００１３】
別の態様では、テロメラーゼ逆転写酵素をコードする少なくとも１つの核酸ベクターを標的細胞に送達するためのリポソームであって、リポソームは、外面を有しかつ内部コンパートメントを画定するペグ化された脂質膜を含み：ａ）外面は、受容体媒介性エンドサイトーシスまたはマクロピノサイトーシスに関与する標的細胞上の受容体に対するターゲティング剤が付着しており；ｂ）内部コンパートメントは、標的細胞で作動しテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結している発現調節配列を含む核酸ベクターを含有する前記リポソームが本明細書で提供される。一実施形態では、標的細胞は神経系の細胞、例えばニューロン（例えば、錐体細胞、プルキンエ細胞、顆粒細胞または別のレジデントニューロン（ｒｅｓｉｄｅｎｔ  ｎｅｕｒｏｎ））、グリア細胞（例えば、ミクログリア細胞、星状グリア細胞、希突起膠細胞または別のレジデントグリア細胞）または神経系に入る一時的な細胞である。別の実施形態では、標的細胞は心血管系；消化器系；内分泌系；泌尿器系；免疫系；筋骨格系；神経系；生殖器系；または呼吸器系の細胞である。別の実施形態では、ターゲティング剤は、インスリン受容体に対するものである。別の実施形態では、ターゲティング剤は、例えば、低比重脂質受容体に対するトランスフェリン受容体以外の、核以外の細胞目的地を予定されているエンドソームの形成を媒介するもの以外の標的に対するものである。別の実施形態では、ターゲティング剤は受容体に対するモノクローナル抗体を含む。別の実施形態では、ターゲティング剤は受容体の内因性ペプチドリガンド、内因性ペプチドリガンドのアナログまたは受容体を結合するモノクローナル抗体から選択される。別の実施形態では、ターゲティング剤は、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）およびレプチンから選択される。別の実施形態では、外面は、受容体媒介性トランスサイトーシスに関与する内皮障壁の内皮細胞上の受容体に対するターゲティング剤が付着している。別の実施形態では、内皮障壁は血液脳関門である。別の実施形態では、標的細胞上の受容体に対するターゲティング剤は、内皮細胞上の受容体に対するものでもある。別の実施形態では、標的細胞は神経系の細胞であり、内皮細胞は血液脳関門の細胞である。別の実施形態では、少なくとも１つの核酸ベクターはプラスミドを含む。別の実施形態では、ＴＥＲＴはヒトＴＥＲＴまたはその改変バージョンである。別の実施形態では、ＴＥＲＴをコードするヌクレオチド配列は、ヒトＴＥＲＴをコードする天然のヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、発現調節配列は、ＳＶ４０プロモーターを含む。別の実施形態では、少なくとも１つの発現調節配列は、標的細胞に特異的なプロモーターを含む。別の実施形態では、内部コンパートメントは、標的細胞で作動しテロメラーゼＲＮＡ構成要素（ＴＥＲＣ）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結している発現調節配列を含む核酸ベクターをさらに含有する。別の実施形態では、ＴＥＲＣはヒトＴＥＲＣである。別の実施形態では、ＴＥＲＴをコードするヌクレオチド配列およびＴＥＲＣをコードするヌクレオチド配列は、同一のベクターに含���れる。別の実施形態では、ＴＥＲＴをコードするヌクレオチド配列およびＴＥＲＣをコードするヌクレオチド配列は、同一の発現調節配列に作動可能に連結している。別の実施形態では、内部コンパートメントは、標的細胞で作動しテロメラーゼ逆転写酵素またはテロメラーゼＲＮＡ構成要素以外の治療的生体分子をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結している発現調節配列を含む核酸ベクターを含有する。別の実施形態では、治療的生体分子はＬＭＮＡ  Ａ、例えば、ヒトＬＭＮＡ  Ａである。別の実施形態では、治療的生体分子は伸長因子１（ＥＬＦ１）である。
【００１４】
本明細書で提供されている別の態様では、本開示のリポソームおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。一実施形態では、医薬組成物は、静脈内、クモ膜下、関節内、眼内、筋肉内、経口的、非経口的または局所的投与のために製剤化されている。
【００１５】
本明細書で提供されている別の態様では、本開示のリポソームおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を含む容器を含む単位剤形である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】血液脳関門上の標的およびグリア細胞上の標的に対するターゲティング剤を運ぶリポソームの静脈内投与を表す図である。リポソームはトランスサイトーシスによって血液脳関門（ＢＢＢ）を通過し、エンドサイトーシスによってグリア細胞にその内容物を置く。
【図２】ターゲティングリポソームで送達される組換えテロメラーゼによるテロメアの延長を表す図である。プラスミドを含み、ターゲティング剤を運ぶリポソームは、標的細胞上で受容体と結合する。リポソームの内容物はエンドサイトーシスを通して細胞に運ばれ、プラスミドは核に移行する。プラスミドは、ＴＥＲＴをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結しているプロモーター（Ｐｒ）を含む。ＴＥＲＴ配列は転写され、ＴＥＲＴ  ｍＲＮＡを産生する。ＴＥＲＴ  ｍＲＮＡは、テロメラーゼ逆転写酵素タンパク質に翻訳される。テロメラーゼ逆転写酵素タンパク質は、テロメラーゼＲＮＡ構成要素と会合して活性型テロメラーゼを産生する。核において、テロメラーゼは染色体のテロメアを延長する。
【図３】本発明のターゲティングリポソームを表す図である。リポソームは、疎水性二重層を含む。リポソーム表面は、ＰＥＧで誘導体化されている。特定のＰＥＧ部分は、ターゲティング剤にカップリングしている。この例では、第１のターゲティング剤は受容体媒介性トランスサイトーシスに関与する受容体に対するものであり、第２のターゲティング剤は受容体媒介性エンドサイトーシスに関与する受容体に対するものである。リポソームの親水性コアは、テロメラーゼ逆転写酵素をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結しているプロモーター（Ｐｒ）と、この例では、テロメラーゼＲＮＡ構成要素をコードする囲まれたヌクレオチド配列に作動可能に連結している第２のプロモーターとを含むプラスミドを含有する。
【図４Ａ】ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）のｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す図である。（配列番号１）。（米国特許第６，３３７，２００号（Ｍｏｒｉｎ）参照）。
【図４Ｂ】図４Ａの続き。
【図５】ヒトテロメラーゼ逆転写酵素のアミノ酸配列を示す図である。（配列番号２）。（米国特許第６，３３７，２００号（Ｍｏｒｉｎ）も参照）。
【図６】テロメラーゼＲＮＡ構成要素のゲノムヌクレオチド配列を示す図である。（配列番号３）。（米国特許第６，０１３，４６８号（Ａｎｄｒｅｗｓら）も参照）。
【図７】テロメラーゼＲＮＡ構成要素（ＴＥＲＣ）のヌクレオチド配列を示す図である。（配列番号４）。（米国特許第６，０１３，４６８号（Ａｎｄｒｅｗｓら）も参照）。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書で提供されているのは、十分な期間、例えば、４時間または２４時間もしくは４８時間にわたって、コンピテントテロメラーゼの高い細胞濃度（１細胞につき少なくとも１００コピー）の一過性の本来の発現をもたらすことができる外因性遺伝子に基づく治療法を、生物全体の標的細胞に送達する方法であり、数千塩基対によって染色体テロメアを再伸長し、細胞を若返らせ、その後テロメラーゼの発現が細胞型の正常な水準に戻り、細胞分裂が起こって、正常な細胞加齢が再開し、がんの予防の働きをする。そのような治療法は、定期的に、必要に応じて、無期限に、対象のために安全に繰り返されることができる。
【００１８】
本発明は、テロメラーゼ逆転写酵素（「ＴＥＲＴ」）および、場合により、テロメラーゼＲＮＡ構成要素（「ＴＥＲＣ」）をコードする核酸分子を標的細胞に送達するための組成物および方法を提供する。細胞では、核酸分子はテロメラーゼ逆転写酵素タンパク質の発現（転写および翻訳）を誘導する。ＴＥＲＴは、ＴＥＲＣと会合して活性型テロメラーゼを産生する。テロメラーゼは、染色体のテロメアを伸長するために、細胞で機能する。細胞の染色体におけるテロメアの長さは、細胞の寿命、機能性および増殖能力と正の相関がみられる。
【００１９】
ＴＥＲＴをコードする核酸分子を標的細胞に送達するための本発明の組成物は、標的を設定できるリポソームを含み、「トロイの木馬リポソーム」とも呼ばれる。リポソームは、外面を有しかつ内部コンパートメントを画定する膜を含む。本発明のリポソームは、それらの表面に１つまたはそれ以上のターゲティング剤、および内部のコンパートメントにＴＥＲＴをコードするヌクレオチド配列を有する１つまたはそれ以上の核酸分子を含む。標的細胞上で受容体と結合するターゲティング剤が選択される。結合は、リポソームおよびその内容物の細胞へのエンドサイトーシス、送達された核酸の細胞核への移行、ならびに細胞で活性なプロモーターの支配下での核酸の発現に影響を及ぼす。
【００２０】
ターゲティング剤が内皮障壁上の部分に対するものでもある場合、または、代替方法として、リポソームがそのような部分に対する異なるターゲティング剤を備えている場合、リポソームは内皮障壁を越えてトランスサイトーシスを受けることができる。したがって、リポソームの標的送達または全身性送達を達成するために、標的細胞を含むコンパートメントにリポソームを直接送達する必要はない。むしろ、内皮障壁を通過することによってコンパートメントにアクセスすることができる場所にリポソームを投与することで十分である。例えば、リポソームは、毛細血管壁の細胞上で受容体と結合するターゲティング剤を運ぶことができる。静脈内に投与されるようなリポソームは、トランスサイトーシスによって毛細血管を通過することができ、それによって、標的細胞が存在するコンパートメントにアクセスすることができる。したがって、例えば、標的細胞が脳内にあるならば、血液脳関門および脳細胞の両方の受容体に対するターゲティング剤を含むリポソームを静脈内に投与し、その内容物を脳細胞に送達することができる。
【００２１】
標的細胞におけるテロメラーゼの発現は、細胞でテロメア長を延長する。したがって、一態様において、本発明は対象の細胞でテロメアを延長する方法を提供する。そのような対象は、短縮したテロメアによって特徴づけられる疾患を患っている人々を含むことができる。
【００２２】
Ｉ．生物の細胞でテロメア長を伸長する方法
本発明は対象の標的細胞でテロメア長を伸長する方法を提供する。これは、標的細胞における活性型テロメラーゼの組換え発現によって達成することができる。テロメラーゼは、テロメラーゼ逆転写酵素および／またはテロメラーゼＲＮＡ構成要素をコードする外因的に供給されたヌクレオチド配列の発現により、組換えによって発現される。ヌクレオチド配列は、その表面にターゲティング部分を持ち、標的細胞の表面の部分と結合するターゲティングリポソームのエンドサイトーシスによって供給され、ターゲティングリポソームは、そのコンパートメント内に、細胞で活性な発現調節配列に作動可能に連結しているテロメラーゼ逆転写酵素をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドベクターを含む。
【００２３】
対象は、テロメアを有するいずれの生物であってもよく、特に、例えば活性型テロメラーゼの発現が欠如した結果として細胞老化を示す細胞を有する生物であってもよい。これは、例えば脊椎動物、哺乳動物、およびヒトを含む。
【００２４】
本発明のリポソームは、短縮したテロメアを有する細胞に送達される。例えば、それらは短縮したテロメアに関連する状態を有する細胞および生物に送達される。本明細書で、これらの状態は、表１に確認される疾患を含むが、これに限定されるものではない。特に、本発明は短縮したテロメアに関連する中枢神経系（ＣＮＳ）障害を有する個体の中枢神経系の細胞で、テロメアを延長することを意図している。
【００２５】
短縮したテロメアに関連する種々の状態は、短縮したテロメアを有するそれら細胞におけるテロメラーゼの発現によって緩和される。そのような状態は、アルツハイマー病、パーキンソン病、動脈硬化症、骨粗鬆症および早老症を含むが、これに限定されるものではない。
【００２６】
外因性ＴＥＲＴ遺伝子が、細胞でテロメラーゼ逆転写酵素の一過性発現と思われるベクター上に供給される場合、テロメラーゼの慢性過剰発現に関連する状態の危険性は減少する。したがって、テロメラーゼ量は、例えば、リポソームの反復投与によって測定される。さらに、テロメラーゼ量は、発現構築物の構成によって制御される。例えば、構築物上のプロモーターは、ＴＥＲＴヌクレオチド配列の高発現のために選択される。テロメラーゼＲＮＡ構成要素を発現させるための発現構築物も、発現を増加することができる。発現の増加は、細胞でテロメアの延長の増加をもたらす。細胞でテロメラーゼを組換えによって発現させる発現構築物の送達は、細胞でテロメラーゼの発現を誘導する他の方法より、テロメアを延長する際に、より持続性があり効果的な活性型テロメラーゼの発現をもたらす。活性型テロメラーゼは、細胞内でテロメア長を伸長するために働く。本発明の方法は、テロメア長の測定可能な増加をもたらすために効果的なレベルで、生物の細胞で、テロメラーゼ活性のレベルを生成する。
【００２７】
本発明の方法は、一過性にテロメラーゼの発現をもたらすことができる（例えば、４時間、８時間、２４時間、２日、４日または８日のいずれかまでの発現）。テロメラーゼは、標的細胞において１００コピーから１００，０００コピーの間のテロメラーゼ量で発現される。
【００２８】
リポソームの治療有効量は、処置される個体と投与される特定の遺伝子によって異なる。適切な用量は、当業者に周知の手順によって確立される。細胞テロメアをさらに伸長するために、または、以前の処置によって効果的に標的とされなかった細胞または組織を標的とするために、治療的処置は、数時間の間隔から数週間の間隔で、例えば４８時間の間隔で繰り返される。数回の反復処置に関して、使用されるターゲティング剤および使用される治療的遺伝子のセットは、標的とされる組織および細胞に対して内因性の受容体によって異なる。
【００２９】
プラスミドは、対象の細胞内で自然に一過性に、数時間から数日間発現し、プラスミド遺伝子のピーク発現は投与のおよそ４８時間後に起こり、それにより、老齢化または老化している細胞の染色体テロメア構造を、数百から数千の塩基対延長するために十分な細胞濃度で、酵素テロメラーゼの複数のコンピテントコピーの形成をもたらし、対象の細胞、組織および生物を表現型的に若返らせ、つまり、複製能力および再生能力を向上させ、機能を向上させ、および老齢化機能のカスケード効果の減少によりストレスを減らし；それによって、加齢による障害およびテロメアに関連する障害を処置し防止する。対象の細胞内のテロメラーゼの高い発現は一過性にすぎないため、処置後、テロメアの正常な短縮および細胞老化が以降の細胞分裂で生じる。
【００３０】
本発明によれば、以前の処置以後に失われたテロメア長を元に戻す、またはさらにテロメアを伸長するために、数カ月から数年の間隔で、治療的処置は定期的に繰り返される。
【００３１】
本発明のターゲティングリポソームは、細胞特異的であるか、または全身的に細胞と結合することができる。したがって、細胞特異的な発現は、他の細胞でではなく、標的細胞で誘導性のプロモーターを使用して達成することができる。
【００３２】
１つの標的は、体性幹細胞（成人幹細胞とも呼ばれる）および始原細胞である。これらの細胞は、全身的に、または、特定の組織で標的とされる。成体の生物において、幹細胞および始原細胞は体の修復系として働き、成体組織を補充する。
【００３３】
リポソームは、標的細胞にリポソームを送達するために効果的などんな経路によってでも投与される。リポソームは、標的細胞の周囲に、直接送達される。しかし、上皮性関門を通過するためにリポソームを構成することができるので、本発明のリポソームを、血流のようなより簡単にアクセスすることができる空間に送達することができる。標的細胞は、心血管系；消化器系；内分泌系；泌尿器系；免疫系；筋骨格系；神経系；生殖器系；または呼吸器系のいずれかに属している細胞である可能性があるが、これに限定されるものではない。
【００３４】
したがって、本発明のリポソームは適切な医薬担体と組み合わせて）、経口的、経皮的、粘膜（例えば、経鼻、舌下、経膣、頬側もしくは直腸）または非経口的（例えば、皮下、静脈内、動脈内、筋肉内、関節内、腹膜内、眼内、クモ膜下の注射）投与を介して提供されることができる。
【００３５】
標的細胞が送達のコンパートメント内にあるならば、標的細胞上で受容体に対するターゲティング剤は十分である。例えば、細胞は経口的、経皮的、粘膜、関節内、または眼内投与によって達することができる。例えば、標的細胞が軟骨細胞であり、その上、リポソームが関節内の空間に送達されるならば、リポソームは軟骨細胞の受容体に対するターゲティング剤を含む。
【００３６】
内皮障壁を通過する本発明のリポソームの能力は、静脈内投与を介さなければ接近できない細胞へのアクセスを可能にする。標的細胞が神経系のような器官系であるならば、そのために注射による直接のアクセスが難しく、リポソームは静脈内に送達される。
【００３７】
本発明のリポソームは、ＴＥＲＴをコードする分子の細胞核への送達および細胞核でのその転写に十分な機能要素を有する１つまたはそれ以上の核酸分子を含むことができる。例えば、本発明のリポソームに含まれる核酸分子は、標的細胞で作動しＴＥＲＴをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結している発現調節配列を含む発現カセットを含むことができる。同様に、同一または異なる核酸分子は、標的細胞で作動しＴＥＲＣのヌクレオチド配列に作動可能に連結している発現調節配列を含む発現カセットを含むことができる。これは、細胞核へ輸送されると核酸分子が発現することにとって十分である。
【００３８】
ＩＩ．標的を設定できるリポソーム
本発明のリポソームは、表面を有しかつ内部コンパートメントを画定するリン脂質膜を有する。表面はペグ化される。ペグ化は生物におけるリポソームの寿命を延長し、ターゲティング剤に連結する連結部分として有用である。内部コンパートメントは、テロメラーゼ逆転写酵素をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結している発現調節配列を有する少なくとも１つの核酸ベクターを含有する。ベクターは、例えば染色体ＤＮＡに取り込まれず、結果としてプラスミド上に含まれるテロメラーゼ逆転写酵素配列が一過性に発現する、プラスミドである。発現調節配列は、標的細胞において活性型であるように選択される。例えば、それは構成型プロモーターまたは標的細胞で特に活性型であるプロモーターを含むことができる。他の発現可能な遺伝子構築物は、コンパートメントに含まれる。それらは、テロメラーゼ逆転写酵素コードするものと同一のベクター上に、または、別々のベクター上に含まれる。他の遺伝子は、テロメラーゼ逆転写酵素の発現を調節する同一のプロモーターまたは別々のプロモーターの転写調節下にあることができる。
【００３９】
Ａ．リポソーム構築
標的を設定できるリポソームの１つのバージョンは、米国特許第６，３７２，２５０号（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ）に記載される。リポソームは、直径２００ナノメートル未満、例えば、５０から１５０ナノメートルの間、または約１００ナノメートルの直径を有することができる。適切な種類のリポソームは、リポソーム中で陰イオン性ＤＮＡを安定化するために、ジドデシルメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）のような少量（１％）の陽イオン脂質とともに、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセリン−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、ジホスファチジルホスホコリン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）またはコレステロールのような中性ホスホリピドで作られる。
【００４０】
リポソームはポリエチレングリコール−（ＰＥＧ−）複合脂質で構築され、リポソーム表面上のＰＥＧ鎖はインビボでリポソームを安定化し、血漿滞流時間を増加させる。例えば、米国特許第６，１３２，７６３号（Ｆｉｓｈｅｒ）参照。例えば１〜２％のＰＥＧ分子のいくつかの画分は、チオール化したターゲティング剤とリポソーム表面のコンジュゲーションを可能にするために、末端のマレイミド官能基を有することができる。
【００４１】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、連結部分として有用である。スフィンゴミエリンのような他の連結部分を、同様に使用することができる。連結部分の分子量は、１０００〜５０，０００Ｄａの間である。約２０００Ｄａの分子量の連結部分、例えば約２０００Ｄａの分子量のＰＥＧもまた有用である。一実施形態では、ターゲティング剤は、ペグ化された脂質に付着するマレイミド基との反応を介して付着する。リポソームは、複数の、例えば５〜１０００または２５〜４０のターゲティング分子が付着していてもよい。
【００４２】
リポソームは、脂質を分散させ、ペグ化された脂質および核酸ベクターを０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．０中に含み、および１０分間音波破砕することによって作ることができる。治療的遺伝子は、周知の薬物カプセル化工程のいずれかにしたがって、リポソーム中に封入することができる。例えば、音波処理によるカプセル化、凍結／融解、蒸発、Ｍｏｚａｆａｒｉ法およびメンブレンフィルターを通した押し出し法。（Ｃｏｌａｓ，ＪＣ；Ｓｈｉ，Ｗ；Ｒａｏ，ＶＳ；Ｏｍｒｉ，Ａ；Ｍｏｚａｆａｒｉ，ＭＲ；Ｓｉｎｇｈ，Ｈ（２００７）、「Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｎｉｓｉｎ−ｌｏａｄｅｄ  ｎａｎｏｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｐｒｅｐａｒｅｄ  ｂｙ  Ｍｏｚａｆａｒｉ  ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ」。Ｍｉｃｒｏｎ（Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ：１９９３）３８（８）：８４１〜７頁）。リポソームカプセル化の有用な方法は、製造の方法によってダメージを受けていないより高い百分率のベクターを含み、所望の直径の単層リポソームをより高収率で提供する方法を含む。
【００４３】
Ｂ．ターゲティング分子
リポソームはその表面に標的細胞上の細胞部分に対するターゲティング剤を持ち、その部分はエンドサイトーシスまたはマクロピノサイトーシスのような方法によって標的細胞へのリポソームの移行を媒介することができる。リポソームが標的細胞へのアクセスのために、内皮障壁または血液脳関門の星状細胞および周細胞のような他の細胞膜障壁の通過を必要とする経路によって投与される場合、リポソーム表面も、内皮細胞または他の膜障壁細胞上の部分に対するターゲティング剤を含むことができ、その部分が、障壁を越えたトランスサイトーシスを媒介する。
【００４４】
生物の内皮障壁および他の細胞膜障壁は、毛細血管壁、血液脳関門、血液−眼障壁、血液網膜障壁、血液−精巣障壁および血液−卵巣障壁を含む心血管系の内膜を含む。
【００４５】
血管系経由の全身性または標的とした送達の場合に関して、受容体分子は、ｉ）標的とされた細胞について、存在が一般的である；ｉｉ）膜障壁を越えたリポソームのトランスサイトーシスおよび標的細胞へのリポソームのエンドサイトーシス両方をもたらす；ｉｉｉ）核シグナリングエンドソーム（ＮＳＥ）の形成をもたらす可能性がある。（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｌ  Ｈｏｗｅ、「Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｅｎｄｏｓｏｍｅ  ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ：Ｗｈｙ  ａ  ｄｒｉｖｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅｕｓ  ｉｓ  ｂｅｔｔｅｒ  ｔｈａｎ  ａ  （ｒａｎｄｏｍ）  ｗａｌｋ」、Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ  ２００５、２：４３頁）。
【００４６】
関節ターゲティング軟骨細胞の軟骨への注入の場合のように、そのために膜障壁を通過する必要がない細胞組織への直接の治療法の標的とされた送達の場合に関して、受容体分子は膜障壁を越えたトランスサイトーシスをもたらす能力を必要としない。
【００４７】
本明細書で記載される組成物および方法において有用な受容体分子の例は、インスリン受容体、インスリン様増殖因子受容体、上皮細胞成長因子受容体および血管系を通して分配される他のホルモンのための受容体である。
【００４８】
特定の実施形態では、結果として核以外の細胞目的地、例えばリソソーム、を予定されているエンドソームを形成する受容体分子は使用されない。そのような受容体分子の例は、低比重脂質受容体またはトランスフェリン受容体であり、それはリソソームを予定されているエンドソームをもたらす。
【００４９】
ターゲティング剤は、受容体の内因性ペプチドリガンド、内因性ペプチドリガンドのアナログまたは受容体を結合するモノクローナル抗体から選択されるが、これに限定されるものではない。内因性リガンドは、例えば、インスリン、インスリン様増殖因子、上皮細胞成長因子および他のホルモンを含む。ＢｏａｄｏおよびＰａｒｄｒｉｄｇｅによって記載されたように、本発明の目的のための有用なリガンドは、ヒトインシュリン受容体モノクローナル抗体（ＨＩＲＭＡｂ）のようなインスリンペプチドまたは同一のアナログを含む。（Ｒｕｂｅｎ  Ｊ．  ＢｏａｄｏおよびＷｉｌｌｉａｍ  Ｍ．  Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ、「Ｔｈｅ  Ｔｒｏｊａｎ  Ｈｏｒｓｅ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  Ｎｏｎｖｉｒａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｃｒｏｓｓ  ｔｈｅ  Ｂｌｏｏｄ−Ｂｒａｉｎ  Ｂａｒｒｉｅｒ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、２０１１巻、論文番号２９６１５１）。
【００５０】
そのような薬剤は、チオール化、および、例えばＰＥＧ上のマレイミドまたはヒドラジド部分への結合によってカップリングされる。あるいは、ターゲティング剤は、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）と反応したリポソームと、ジスルフィドリンカーを介してコンジュゲートできる。あるいは、ターゲティング剤は、１つの分子がアビジンにカップリングし、もう一方がビオチンにカップリングするアビジン−ビオチン相互作用を介して結合することができる。
【００５１】
モノクローナル抗体は、ターゲティング剤として有用である。そのような抗体は、ヒトインシュリン受容体（ＨＩＲＭＡｂ）に対する抗体である。そのような抗体は、脳にリポソームを送達し、核膜を横切って核コンパートメントにプラスミドの移行を促進することが示された。（Ｒ．Ｊ．Ｂｏａｄｏ、「Ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｖｉｒａｌ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ＲＮＡｉ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２４巻、９号、１７７２〜１７８７頁、２００７）。
【００５２】
「抗体」は、対応する抗原と特異的に結合するタンパク質を含む組成物を指し、共通の、一般的な免疫グロブリンの構造を有する。所望の生物学的活性を示す限り、抗体という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、二量体、多量体、多特異的抗体（例えば、二重特異性抗体）および抗体フラグメントを特に網羅する。抗体はヒト化、またはキメラである場合がある。本明細書で使われるように、抗体も抗原を結合する能力を保持する免疫グロブリンの抗原結合部分を含む。これらは、例としてＦ（ａｂ）、ＶＬ  ＣＬおよびＶＨ  ＣＨ抗体ドメインの一価の断片；および、Ｆ（ａｂ）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結される２つのＦａｂフラグメントを含む二価断片を含む。抗体という用語も、組換え型単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）および例えば二量体、三量体および四量体のような二重特異性分子を指す（例えば、米国特許第５，８４４，０９４号参照）。
【００５３】
あるいは、リポソームの表面は２つの異なる「移動可能なペプチド」とコンジュゲートすることができ、１つのペプチドが内因性毛細血管壁受容体またはＢＢＢ受容体を標的とし、他方が内因性細胞膜ペプチドを標的とする。後者は、ニューロン、グリア細胞、周細胞、平滑筋細胞、ミクログリア、繊維芽細胞、ミオサイト、軟骨細胞、骨芽細胞およびヒト病理学で重要な役割を果たす可能性がある他の細胞のような生物内の特定の細胞に特異的であった。
【００５４】
Ｃ．ベクター
本発明のリポソームの核酸分子は、一般的にベクターで運ばれる。ベクターは、例えば、プラスミド、合成染色体またはウイルス、例えば、レンチウイルスベクターである。本発明に有用なプラスミドベクターは、例えばＡｌｄｅｖｒｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｌ）から入手可能である。特定の実施形態では、ベクターは細胞で一過性に存在または活性型であるように選択される。例えば、ベクターは細胞の染色体に統合されないものである。プラスミドベクターは、そのような目的に有用である。
【００５５】
Ｄ．発現カセット
発現細胞のためのヌクレオチド配列は、一般的に発現カセットに含まれる。発現カセットは、標的細胞で作動し発現されるべきヌクレオチド配列に作動可能に連結している発現調節配列を含む。
【００５６】
１．発現調節配列
発現調節配列は、転写および／または翻訳を促進するために有用ないかなる要素でも含むことができる。発現カセットは、一般的にプロモーターを含む。プロモーターは、構成型プロモーターまたは標的細胞で活性型である誘導性プロモーターである可能性がある。有用な構成型プロモーターの例は、シミアン空胞化ウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよび呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターを含む。特定の標的細胞に有用な誘導性プロモーターは、平滑筋細胞における選択的発現のための平滑筋ガンマアクチン（ＳＭＧＡ）プロモーター；骨芽細胞における選択的発現のためのヒトコラーゲンＩ型ａ２（ｈＣｏｌ１ａ２）プロモーター；内皮細胞で選択的発現のためのｆｌｋ−１プロモーター；およびＩＩ型肺胞上皮細胞における選択的発現のためのサーファクタントプロテインＣプロモーター（ＳＰ−Ｃ）を含む。
【００５７】
組織特異的発現調節をもたらす更なる方法は、Ｍｉｌｌｅｒに記載されるように、細胞特異的にプラスミドＤＮＡの核移行を媒介するために、内因性組織特異的転写因子と組み合わさるＤＮＡ核ターゲティング配列（ＤＴＳ）の組み込みによる。（Ｍｉｌｌｅｒ  ＡＭ、Ｄｅａｎ  ＤＡ、「Ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｅｎｔｒｙ  ｏｆ  ＤＮＡ」、Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．２００９年７月２：６１（７−８）：６０３〜１３頁）。Ｍｉｌｌｅｒの６０７〜６０８頁に記載されているように、組織特異的ＤＴＳ配列の例は、平滑筋細胞だけにおけるプラスミドＤＮＡの核移入のための、平滑筋ガンマアクチン（ＳＭＧＡ）プロモーターに由来するＤＴＳ；骨芽細胞だけにおけるプラスミドＤＮＡの核移入のための、ヒトコラーゲンＩ型ａ２（ｈＣｏｌ１ａ２）プロモーターに由来するＤＴＳ；内皮細胞だけにおけるプラスミドＤＮＡの核移入のための、ｆｌｋ−１プロモーターに由来するＤＴＳ；およびＩＩ型肺胞上皮細胞だけにおけるプラスミドＤＮＡの核移入のための、サーファクタントプロテインＣプロモーター（ＳＰ−Ｃ）に由来するＤＴＳを含むことができる。
【００５８】
全身性または非標的とした発現調節の方法は、構成型内因性転写因子と組み合わさるＤＴＳの組み込みによる。Ｍｉｌｌｅｒら（Ｍｉｌｌｅｒら、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、６１：６０３（２００９））の６０７〜６０９頁に記載されているように、ＳＶ４０エンハンサーのわずか７２ｂｐは、プラスミドの核移入を駆動することができる。（Ｄ．Ａ．Ｄｅａｎ、Ｂ．Ｓ．Ｄｅａｎ、Ｓ．Ｍｕｌｌｅｒ、Ｌ．Ｃ．Ｓｍｉｔｈ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｅｎｔｒｙ」、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２５３（１９９９）、７１３〜７２２頁）。
【００５９】
２．発現可能な配列
治療的遺伝子は、リポソーム中に封入され、少なくとも１つのテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）ヌクレオチド配列；および、場合により、少なくとも１つのテロメラーゼＲＮＡ構成要素（ＴＥＲＣ）ヌクレオチド配列；および、場合により、テロメアの伸長のためのコファクターの発現のためのヌクレオチド配列の１つまたはそれ以上のコピーを含む。例示的なコファクター遺伝子は、ハッチンソン−ギルフォード早老症候群の状態、またはコンピテントラミンＡ／Ｃタンパク質の細胞欠乏から生じている他の短いテロメア状態、に有用なＬＭＮＡ；および、テロメア伸長に必要なタンパク質の細胞生産の速度増大のための伸長因子１（ＥＬＦ１）を含む。コード配列も、翻訳のための成熟したメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の生産のために、ポリアデニル化配列（ｐＡ）を含む。
【００６０】
ポリヌクレオチドおよびポリペチドの配列も、ＮＣＢＩウェブサイト（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ）で見つけることができる。
【００６１】
治療的遺伝子は、天然に存在する配列を有することができる、または、進化性を高める、もしくはテロメア伸長の全体的な割合を高める、もしくはテロメア伸長の全体的な範囲を高める、天然に存在する配列の変異である可能性がある。
【００６２】
治療的遺伝子に加えて、ベクターＤＮＡは治療的配列の前または後にヌクレオチド配列を含むこともでき、プラスミドのこれらの付属部分は、特定の細胞でプラスミドの組織特異転写を促進することができ、治療的遺伝子のｍＲＮＡの高められた翻訳および／または安定化を促進することができ、ならびに細胞で導入遺伝子のエピソーム複製を可能にすることができる。
【００６３】
プラスミドはすべて同一の治療的遺伝子を含むことができるかまたは、治療的遺伝子の異なるセットを含むことができる。リポソームに含まれるプラスミドのすべては治療的遺伝子の同一のセットから成ることができ、または、リポソームのいくつかは治療的遺伝子の異なるセットから成るプラスミドを含むことができる。例えば、リポソームの２分の１はＴＥＲＴ遺伝子を含むプラスミドを含むことができ、リポソームの２分の１はＴＥＲＣ遺伝子およびＬＡＭＩＮＡ遺伝子を含むプラスミドを含むことができる。
【００６４】
リポソーム中に封入される異なる治療的遺伝子の数は、処置される疾患によって、１から多数までを変動することができる。限定要因は、リポソーム中に封入される治療的遺伝子の直径である。ヒストン、プロタミンまたはポリリジンのようなポリカチオンタンパク質を使用して、１０〜３０ｎｍの直径を有する構造に、数千ヌクレオチドを含むプラスミドＤＮＡのサイズを圧縮することができる。直径１００のリポソームの体積は、１０ｎｍおよび３０ｎｍのＤＮＡ圧縮球体の体積より、それぞれ１０００倍および３５倍大きい。したがって、同一遺伝子の多くのコピーまたは同義遺伝子の多重コピーをリポソーム中に封入することができる。
【００６５】
ｉ．テロメラーゼ逆転写酵素
テロメラーゼ逆転写酵素は、標的細胞でテロメアを伸長するために機能するいかなるＴＥＲＴでもある可能性がある。一般的に、ＴＥＲＴは標的細胞の種のゲノム由来の天然に存在する分子である。例えば、標的細胞がヒト細胞であれば、ＴＥＲＴはヒトＴＥＲＴになる。あるいは、ＴＥＲＴはＴＥＲＴの修飾型になる。ヒトＴＥＲＴをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、配列番号１として提供される。ヒトＴＥＲＴのアミノ酸配列は、配列番号２として提供される。ＴＥＲＴ配列も、ＮＣＢＩウェブサイトで遺伝子識別番号：７０１５として見つけることができる。完全なゲノム配列は、４１８９８ヌクレオチドとして与えられる。
【００６６】
あるいは、ＴＥＲＴは高活性なＴＥＲＴの修飾型であってもよい。そのようなＴＥＲＴ変異体のバージョンは、例えば、米国特許第６，３３７，２００号（Ｍｏｒｉｎ）に記載されている。
【００６７】
ｉｉ．テロメラーゼＲＮＡ構成要素
ＴＥＲＣは通常、細胞内で、低レベルで発現される。しかし、本発明のある特定の実施形態では、ＴＥＲＣをコードする核酸分子は、細胞に共同送達される。そこで発現してＴＥＲＴと会合し、機能的なテロメラーゼを産生する。ＴＥＲＣを産生する発現カセットは、テロメラーゼＲＮＡ構成要素をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結している発現調節配列を含むことができる。ヒトテロメラーゼＲＮＡ構成要素のゲノムヌクレオチド配列は配列番号３として示される。ヒトテロメラーゼＲＮＡ構成要素のヌクレオチド配列は配列番号４として示される。ＴＥＲＣ配列も、ＮＣＢＩウェブサイトで遺伝子識別番号：７０１２として見つけることができる。
【００６８】
ＴＥＲＣは、同一ベクター上、または、異なるベクター上でＴＥＲＴと共同送達されることができる。同一ベクター上で、ＴＥＲＣは、ＴＥＲＴの発現を調節する同一または異なるプロモーターの転写調節下にあることができる。
【００６９】
ｉｉｉ．ラミンＡ
ＬＭＮＡとしても公知のラミンＡ／Ｃは、ヒトにおいてＬＭＮＡ遺伝子によってコードされるタンパク質である。ラミンＡ／Ｃは、タンパク質のラミンファミリーに属する。プロジェリンとして公知のラミンＡの短縮されたバージョンは、ハッチンソン−ギルフォード早老症候群に関連する。したがって、本発明のリポソームがハッチンソン−ギルフォード早老症候群を有する対象に送達された実施形態では、リポソームは、標的細胞で作動しラミンＡ／Ｃをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結している発現調節配列を含むベクターも含む。また、ラミンＡ／Ｃをコードするヌクレオチド配列は、リポソームによって送達される他のいずれかの配列と同一または異なる核酸ベクターに存在し、同一または異なるプロモーターの転写調節下にある。ヒトラミンＡ／Ｃ（ＬＭＮＡ）配列は、ＮＣＢＩウェブサイトでＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿００８６９２．２として見つけることができる。
【００７０】
ｉｖ．その他の遺伝子
本発明のリポソームも、テロメラーゼの活性および進化性を高めるために有用な配列を含む、他の治療的ヌクレオチド配列を発現させるための他の発現カセットを含むことができる。そのようなタンパク質の例は、伸長因子１（ＥＬＦ１）、テロメア反復結合因子１（ＴＲＦ１）、テロメア反復結合因子２（ＴＲＦ２）、テロメアタンパク質１（ＰＯＴ１）の保護、および副腎皮質異形成症タンパク質（ＡＣＤまたはＴＰＰＩ）を含む。
【００７１】
ＩＩＩ．医薬組成物
本発明は、本発明のリポソームおよび生理学的に（すなわち薬学的に）許容される担体を含む医薬組成物をさらに提供する。「担体」という用語は、診断薬または治療薬のための希釈剤またはビヒクルとして使用される一般的に不活性な物質を指す。用語は、組成物に粘着性の性質を与える一般的に不活性な物質も含む。生理的学に許容される担体は、例えば、生理食塩液、リン酸緩衝液、通常の緩衝食塩水（１３５〜１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）、水、緩衝用水、０．４％食塩水、０．３％グリシン、高い安定性を提供する糖タンパク質（例えば、アルブミン、リポタンパク質、グロブリン、その他）などの液体である。生理学的に許容される担体は、組成物を投与するために使用される特定の方法によってだけでなく、一つには投与される特定の組成物によって決定されるので、本発明の医薬組成物の多種多様な適切な製剤がある（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版、１９８９参照）。
【００７２】
本発明の組成物は、従来の周知の滅菌技術によって滅菌され、または滅菌条件下で製造される。水溶液は使用するために包装されるか、または無菌条件下で濾過される。組成物は、ｐＨ調整剤および緩衝剤、等張化剤、湿潤剤など、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレートおよびトリエタノールアミンオレエートのような薬学的に許容される補助物質を、生理学的条件に近づくために必要に応じて含むことができる。
【００７３】
剤形は、対象に、粘膜（例えば、経鼻、舌下、経膣、頬側もしくは直腸）、非経口的（例えば、皮下、静脈内、筋肉内、または動脈内注射、ボーラス投与もしくは注入のいずれか）、経口的、または経皮的投与のために調製することができる。剤形の例は、分散剤；坐剤；軟膏剤；パップ剤（湿布剤）；ペースト剤；散剤；包帯剤；クリーム剤；貼付剤；液剤；パッチ剤；エアゾール剤（例えば、スプレー式点鼻薬または吸入器）；ゲル剤；懸濁液（例えば、水溶性または非水溶性の液体懸濁液、水中油型乳剤または油中水液体乳剤）、溶液およびエリキシル剤を含む対象への経口的または粘膜投与に適した液体剤形；対象への非経口的投与に適した液体剤形；ならびに対象への非経口的投与に適した液体剤形を提供するために再構成されることができる滅菌した固形物（例えば、結晶性または非結晶性固体）を含むが、これに限定されるものではない。
【００７４】
注射用（例えば、静脈）組成物は、水溶性担体のような許容される担体中に懸濁されるリポソームの液剤を含むことができる。種々の水溶性担体のいずれかが使用可能であり、例えば、水、緩衝水、０．４％生理食塩水、０．９％等張食塩水、０．３％グリシン、５％ブドウ糖、などがあり、アルブミン、リポタンパク質、グロブリン、その他のような高い安定性のために、グリコプロテインを含むことができる。多くの場合、通常の緩衝食塩水（１３５〜１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）が使用される。組成物は、ｐＨ調整剤および緩衝剤、等張化剤、湿潤剤、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート、その他のような薬学的に許容される補助物質を、生理学的条件に近づくために含むことができる。いくつかの実施形態では、リポソーム組成物は、静脈内投与のためのキットとして製剤化されている。
【００７５】
例えば、関節内（関節で）、静脈内、筋肉内、腫瘍内、皮内、腹膜内、および皮下の経路によるような非経口的投与に適した製剤は、水溶性および非水溶性で、等張性の滅菌注射溶液、それは抗酸化剤、緩衝液、細菌発育阻止因子、および対象レシピエントの血液と等張の製剤を与える溶質を含むことができ、ならびに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤および防腐剤を含むことができる水溶性および非水溶性の滅菌懸濁液を含む。
【００７６】
医薬製剤は、単位剤形で包装されるか、または調製されることができる。そのような形状において、例えば、リポソームの用量にしたがって、製剤は有効成分の適切な量を含む単位用量に再分割される。単位剤形は包装された製剤であり、アンプルおよびバイアルのような単位用量または多用量の密封容器中に、個別量の製剤を含むパッケージである。組成物は、必要に応じて、他の互換性治療薬を含むこともできる。
【００７７】
リポソームは、静脈内、皮下、筋肉内、腹膜内の経路を含むがこれに限定されない、いかなる適切な経路によって、注射または注入によって投与される。医薬組成物の投与例は、４℃で注射用の滅菌等張水溶性食塩水中に１０ｍｇ／ｍｌでリポソームを保存すること、および対象への投与前に注射用の１００ｍｌまたは２００ｍｌの０．９％塩化ナトリウムでそれを希釈することを含む。リポソームは、０．２から１０ｍｇ／ｋｇの間の用量で、１時間のコースにわたって、静脈内注入によって投与される。他の実施形態では、リポソームは、１５分から２時間の期間にわたって、静脈内注入によって投与される。さらに他の実施形態では、投与手順は、皮下ボーラス注射を介している。
【００７８】
リポソームの用量は、効果的治療法を対象に提供するために選択され、約０．００１ｍｇ／ｋｇから約１０００ｍｇ／ｋｇの範囲にある。用量を、適切な頻度で繰り返すことができる。
【００７９】
投与は、標的細胞におけるテロメラーゼの発現のレベルおよびタイミングによって定期的であることができる。投与経路によって、用量を、例えば、１、３、５、７、１０、１４、２１または２８日以上に１回（例えば、２、３、４または６カ月ごとに１回）投与することができる。場合によっては、投与はより頻繁に、例えば、１日につき２回または３回である。当業者によって認識されるような、治療的進行およびいかなる有害な副作用によって、対象を投与量および投与の頻度を調節するためにモニターすることができる。
【００８０】
このように一部の実施形態では、追加投与は対象の進行に依存し、例えば、対象は投与の間にモニターされる。
【００８１】
本発明のリポソームは、毎日約０．００１ｍｇ／ｋｇから約１０００ｍｇ／ｋｇの初回投与量で投与され、経時的に調節される。約０．０１ｍｇ／ｋｇから約５００ｍｇ／ｋｇ、または約０．１ｍｇ／ｋｇから約２００ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ、約５から約１０ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇの一日量の範囲を使用することができる。
【００８２】
表１：短縮したテロメアに関連する疾患
神経学的：
−  アルツハイマー病
−  パーキンソン病
−  加齢による神経学的な変化（ＡＤおよびＰＤ以外、調整の失調、低い反射機能、感覚消失または低下、その他を含む）
−  加齢による睡眠機能障害
−  加齢による聴覚変化（老人性難聴、耳鳴、その他を含む）
−  加齢による視覚／眼の変化（黄斑変性、老視、白内障、緑内障、糖尿病関連の眼疾患、ドライアイ症候群、コントラスト認識の損失、その他を含む）
心血管性：
−  アテローム性動脈硬化
−  冠状動脈疾患（心筋梗塞、突然死、その他を含む）
−  頸動脈疾患
−  脳卒中
−  高血圧
−  うっ血性心不全
−  末梢血管疾患
肺性：
−  慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）
−  特発性肺繊維症
胃腸および口腔：
−  歯の変化（歯周疾患、歯肉炎、その他）
−  肝不全（薬物代謝の変化を含む）
−  加齢による胃腸の変化（胃食道逆流障害、その他を含む）
内分泌：
−  ２型糖尿病（および、インシュリン耐性）
−  内分泌老化（性ステロイド、膣粘膜の変化、更年期、男性更年期、甲状腺機能障害、カルシトニン変化、肥満、その他を含む）
泌尿生殖：
−  腎不全
−  泌尿生殖の変化（前立腺肥大症、勃起不全、その他を含む）
整形外科／筋肉：
−  加齢による筋肉組織の変化（筋肉量の損失、筋力の損失など）
−  変形性関節症（股関節、膝、足首、肩、肘、手首、頸椎、胸椎、腰椎、仙椎、手の骨の関節、足の骨の関節、顎関節、を含む）
−  骨粗鬆症（外傷性および非外傷性両方の骨折のリスクの増加を含む）
血液学的、免疫系およびがん：
−  免疫老化（慢性炎症、関節リウマチ、肺炎のリスクの増加、敗血症、蜂巣炎、帯状疱疹、その他を含む）
−  皮膚老化（しわ、弾性の損失、「肝斑」、治癒遅延、真皮および表皮の菲薄化、皮下脂肪の損失、皮脂および油生産の減少、その他を含む）
−  加齢によるがん（および、ゲノム不安定性）
−  加齢による汎血球減少症
−  骨髄損傷
他のテロメア関連疾患：
−  先天性異常角化（ＤＫＣ）
−  ＤＫＣに起因する肝不全（特発性肝硬変、非硬化性門脈圧亢進症、その他を含む）
−  早老症（ハッチンソン−ギルフォード早老症、ウェルナー早老症を含む）
−  肢端早老症
−  早老変性
−  ホイエラール−レイダーソン症候群
−  骨髄損傷
−  後天性再生不良性貧血
−  ＨＩＶ（テロメア損失および二次細胞老化に起因するエイズとして）
【００８３】
個々の出版物、特許または特許出願は、参照によって組み入れることが詳細に、および個々に示されたように、本明細書に記載のすべての出版物、特許、特許出願は、同程度に、参照によって本明細書に組み入れる。
【００８４】
本発明の好ましい実施形態が示され、本明細書に記載された一方で、そのような実施形態が例証として提供されるだけであることは当業者にとって明らかである。多数の変形、変化および置換が、現在、本開示を逸脱しない範囲で当業者の心に浮かぶ。本明細書に記載された本発明の実施形態に対して種々の代替物が本発明を実行する場合に用いられる可能性があることを理解すべきである。以下の請求項が本発明の範囲を定めること、およびこれらの請求項およびそれらの等価物の範囲内で、方法および構造がそれによってカバーされることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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