(57)【要約】  例えば、フリードライヒ運動失調症を患う対象におけるその治療のための、細胞内のフラタキシン発現／レベルを増加させるための方法及び生成物（例えば、ｇＲＮＡ、組換え融合タンパク質、フラタキシン標的系、組成物、及びキット）、ならびにそのような方法及び生成物の使用が記載される。【選択図】図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）フラタキシンプロモータポリヌクレオチド配列中の標的配列に対応する少なくとも１０個の隣接ヌクレオチドのｇＲＮＡガイド配列と、ｉｉ）Ｃａｓ９認識配列と、を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）であって、前記標的配列は、Ｃａｓ９タンパク質及び／またはヌクレアーゼ活性を欠いた不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）タンパク質を含むリボ核タンパク質複合体によって認識されるプロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する、前記ｇＲＮＡ。
【請求項２】
前記ｄＣａｓ９は、化膿レンサ球菌、ストレプトコッカス・サーモフィルス、または髄膜炎菌に由来する、請求項１に記載のｇＲＮＡ。
【請求項３】
前記ｄＣａｓ９は、化膿レンサ球菌に由来する、請求項１に記載のｇＲＮＡ。
【請求項４】
前記ＰＡＭは、ＮＧＧトリヌクレオチド配列であり、前記ｄＣａｓ９タンパク質は、配列番号３５に記載されるＣａｓ９アミノ酸配列の１０位に対応するアスパラギン酸における、及び配列番号３５に記載されるＣａｓ９アミノ酸配列の８４０位に対応するヒスチジンにおける突然変異を含む、請求項３に記載のｇＲＮＡ。
【請求項５】
前記突然変異は、Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａに対応する、請求項４に記載のｇＲＮＡ。
【請求項６】
前記標的配列の３’末端は、ヌクレオチド位置ｉ）４２６４、ｉｉ）４６７０、ｉｉｉ）４８５９、ｉｖ）５０２３、またはｖ）５１０７で終端し、前記ヌクレオチド位置は、ＮＣＢＩ参照番号ＮＧ＿００８８４５を有するフラタキシンポリヌクレオチド遺伝子配列（配列番号８７）の位置に対応する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ。
【請求項７】
前記標的配列の前記３’末端は、ヌクレオチド位置ｉ）４６７０、ｉｉ）４７０１、ｉｉｉ）４７４２、ｉｉ）４８５９、またはｉｉｉ）５１０７で終端し、前記ヌクレオチド位置は、ＮＣＢＩ参照番号ＮＧ＿００８８４５を有する前記フラタキシンポリヌクレオチド遺伝子配列（配列番号８７）の位置に対応する、請求項６に記載のｇＲＮＡ。
【請求項８】
前記標的配列の前記３’末端は、ヌクレオチド位置ｉｉ）４６７０、ｉｉ）４８５９、またはｉｉｉ）５１０７で終端し、前記ヌクレオチド位置は、ＮＣＢＩ参照番号ＮＧ＿００８８４５を有する前記フラタキシンポリヌクレオチド遺伝子配列（配列番号８７）の位置に対応する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ。
【請求項９】
前記標的配列は、ｉ）ヌクレオチド３９６１〜４２５８、ｉｉ）ヌクレオチド４２６８〜４９５１３、ｉｉｉ）ヌクレオチド４２６８〜４９９６、ｉｖ）ヌクレオチド５０２７〜５１５０、ｖ）ヌクレオチド４２６８〜４５９５、ｖｉ）ヌクレオチド４６２１〜４９９６、ｖｉｉ）ヌクレオチド４５６１〜４９９６、またはｖｉｉｉ）ヌクレオチド４２８０〜５０００、ｉｖ）ｉ）〜ｖｉｉｉ）のうちのいずれか１つの相補体に対応するヌクレオチド配列中に含まれ、前記ヌクレオチド位置は、ＮＣＢＩ参照番号ＮＧ＿００８８４５を有する前記フラタキシンポリヌクレオチド遺伝子配列（配列番号８７）の位置に対応する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ。
【請求項１０】
前記ＲＮＡガイド配列及び前記標的配列は、２つ以上のＮＧＧ配列を含まない、請求項１〜９のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ。
【請求項１１】
前記ＲＮＡガイド配列及び前記標的配列は、ＮＧＧ配列を含まない、請求項１〜９のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ。
【請求項１２】
前記標的配列は、ＮＣＢＩ参照番号ＮＧ＿００８８４５を有する前記フラタキシンポリヌクレオチド遺伝子配列（配列番号８７）の
ｉ）４２４６〜４２６４位、
ｉｉ）４６５２〜４６７０位、
ｉｉｉ）４８４１〜４８５９位、
ｉｖ）５００５〜５０２３位、または
ｖ）５０８９〜５１０７位、
の前記ヌクレオチド配列を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ。
【請求項１３】
前記Ｃａｓ９認識配列は、配列番号６７に記載される配列を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ。
【請求項１４】
ＭＳ２ポリペプチドに結合することが可能である前記ｇＲＮＡのテトラループ内にＭＳ２核酸配列と、ステムループ内にＭＳ２核酸配列とをさらに含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ。
【請求項１５】
前記ＭＳ２核酸配列は、配列番号６８に記載される配列を含むか、またはそれからなる、請求項１４に記載のｇＲＮＡ。
【請求項１６】
配列番号５７〜６１のいずれか１つに記載の配列を含むか、またはそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ。
【請求項１７】
配列番号６２〜６６のいずれか１つに記載の配列を含むか、またはそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ。
【請求項１８】
前記ｇＲＮＡガイド配列は、前記標的配列と同一の１８〜２２個の連続ヌクレオチドからなる、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ。
【請求項１９】
前記ｇＲＮＡガイド配列は、前記標的配列と同一の２０〜２２個の連続ヌクレオチドからなる、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ。
【請求項２０】
フラタキシン標的系であって、
ａ．ａ１）請求項１〜１９のいずれか１項で定義される少なくとも１つのｇＲＮＡ、または
ａ２）前記少なくとも１つのｇＲＮＡに対応し、かつ前記少なくとも１つのｇＲＮＡを発現させるための核酸配列を含むベクターと、
ｂ．ｂ１）ヌクレアーゼ活性を欠いた不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）ポリペプチドドメインを含むｄＣａｓ９融合タンパク質であって、ｉ）少なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）、ならびに／またはｉｉ）（ａ）少なくとも１つの転写活性化ドメイン、及び／もしくは（ｂ）少なくとも１つのペプチドエピトープのポリペプチドドメインをさらに含む、ｄＣａｓ９融合タンパク質、または
ｂ２）前記融合タンパク質の発現のために、前記融合タンパク質をコードする核酸配列を含むベクターと、を含む、前記フラタキシン標的系。
【請求項２１】
前記ｄＣａｓ９ポリペプチドドメインは、化膿レンサ球菌、ストレプトコッカス・サーモフィルス、または髄膜炎菌に由来する、請求項２０に記載のフラタキシン標的系。
【請求項２２】
前記ｄＣａｓ９ポリペプチドドメインは、化膿レンサ球菌に由来する、請求項２１に記載のフラタキシン標的系。
【請求項２３】
前記ｄＣａｓ９ポリペプチドドメインは、配列番号３５に記載されるＣａｓ９アミノ酸配列の位置１０に対応するアスパラギン酸における、及び配列番号３５に記載されるＣａｓ９アミノ酸配列の位置８４０に対応するヒスチジンにおける突然変異を含む、請求項２２に記載のフラタキシン標的系。
【請求項２４】
前記突然変異は、Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａに対応する、請求項２３に記載のフラタキシン標的系。
【請求項２５】
前記ｄＣａｓ９融合タンパク質は、ＶＰ１６、ＶＰ６４、またはＶＰ１６０転写活性化ドメインを含む、請求項２０〜２４のいずれか１項に記載のフラタキシン標的系。
【請求項２６】
前記不活性ｄＣａｓ９融合タンパク質は、配列番号３３に記載される配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する、請求項２０〜２５のいずれか１項に記載のフラタキシン標的系。
【請求項２７】
前記ｄＣａｓ９融合タンパク質は、２〜２４個のＧＣＮ４ペプチドエピトープを含む、請求項２０〜２６のいずれか１項に記載のフラタキシン標的系。
【請求項２８】
前記ｄＣａｓ９融合タンパク質は、１０個のＧＣＮ４ペプチドエピトープを含む、請求項２０〜２７のいずれか１項に記載のフラタキシン標的系。
【請求項２９】
前記ｄＣａｓ９融合タンパク質は、番号６に記載されるｓｕｎＴＡＧポリペプチド配列を含む、請求項２０〜２８のいずれか１項に記載のフラタキシン標的系。
【請求項３０】
前記ｄＣａｓ９融合タンパク質は、少なくとも１つのペプチドエピトープを含むポリペプチドドメインを含み、前記系は、ｉ）前記少なくとも１つのペプチドエピトープに結合する抗原結合領域と、ｉｉ）少なくとも１つの転写活性化ドメインと、を含む融合タンパク質をさらに含む、請求項２０〜２９のいずれか１項に記載のフラタキシン標的系。
【請求項３１】
前記抗原結合領域は、前記少なくとも１つのペプチドエピトープに結合する単鎖可変フラグメントを含む、請求項３０に記載のフラタキシン標的系。
【請求項３２】
前記ｄＣａｓ９融合タンパク質は、少なくとも２つのペプチドエピトープを含むポリペプチドドメインを含む、請求項２０〜３１のいずれか１項に記載のフラタキシン標的系。
【請求項３３】
前記少なくとも１つの転写活性化ドメインは、ＶＰ１６またはＶＰ６４転写活性化ドメインである、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載のフラタキシン標的系。
【請求項３４】
前記系は、ｉ）ａ）少なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）、ならびに／もしくはｂ１）ＭＳ２ポリペプチド及びｂ２）少なくとも１つの転写活性化ドメインを含む、ＭＳ２融合タンパク質、またはｉｉ）前記ＭＳ２融合タンパク質をコードする核酸配列を含むベクターをさらに含み、前記ｇＲＮＡは、前記ＭＳ２ポリペプチドに結合することが可能である前記ｇＲＮＡのテトラループ内にＭＳ２核酸配列と、ステムループ内にＭＳ２核酸配列とを含む、請求項２０〜３３のいずれか１項に記載のフラタキシン標的系。
【請求項３５】
前記ＭＳ２核酸配列は、配列番号６８に記載される配列を含む、請求項３４に記載のフラタキシン標的系。
【請求項３６】
前記少なくとも１つの転写活性化ドメインは、ｐ６５、ＨＳＦ１、または両方である、請求項３４または３５に記載のフラタキシン標的系。
【請求項３７】
前記ＭＳ２融合タンパク質は、ｐ６５及びＨＳＦ１転写活性化ドメインを含む、請求項３６に記載のフラタキシン標的系。
【請求項３８】
前記ＮＬＳは、シミアンウイルス４０ラージＴ抗原由来の哺乳動物核局在化シグナルである、請求項２０〜３７のいずれか１項に記載のフラタキシン標的系。
【請求項３９】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載のｇＲＮＡをコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項４０】
請求項３９に記載の単離ポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項４１】
前記ベクターは、ウイルスベクターである、請求項４０に記載のベクター。
【請求項４２】
前記ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、またはヘルペスウイルスウイルスベクターである、請求項４１に記載のベクター。
【請求項４３】
前記ウイルスベクターは、ＡＡＶＤＪ−８またはＡＡＶ２ＤＪ９アデノ随伴ウイルスベクターである、請求項４１または４２に記載のベクター。
【請求項４４】
請求項３９に記載の単離ポリヌクレオチドまたは請求項４０〜４３のいずれか１項に記載のベクターを含む細胞。
【請求項４５】
ｉ）請求項４０〜４３のいずれか１項に記載のベクター、
ｉｉ）請求項１〜１９のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ、
ｉｉｉ）請求項２０〜３８のいずれか１項に記載のフラタキシン標的系、
ｉｖ）請求項２０〜３８のいずれか１項で定義されるｄＣａｓ９融合タンパク質を発現させるためのベクター、
ｖ）請求項３５〜３７のいずれか１項で定義されるＭＳ２融合タンパク質を発現させるためのベクター、及び
ｖｉ）ｉ）からｖ）のうちのいずれか１つを含む細胞、
のうちの少なくとも１つを含む組成物。
【請求項４６】
生理学的に許容される担体をさらに含む、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
ｉ）請求項４０〜４３のいずれか１項に記載のベクター、
ｉｉ）請求項１〜１９のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ、
ｉｉｉ）請求項２０〜３８のいずれか１項に記載のフラタキシン標的系、
ｉｖ）請求項２０〜３８のいずれか１項で定義されるｄＣａｓ９融合タンパク質を発現させるためのベクター、
ｖ）請求項３５〜３７のいずれか１項で定義されるＭＳ２融合タンパク質を発現させるためのベクター、及び
ｖｉ）ｉ）からｖ）のうちのいずれか１つを含む細胞、
のうちの少なくとも１つを含む組み合わせ。
【請求項４８】
ｉ）請求項４０〜４３のいずれか１項に記載のベクター、
ｉｉ）請求項１〜１９のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ、
ｉｉｉ）請求項２０〜３８のいずれか１項に記載のフラタキシン標的系、
ｉｖ）請求項２０〜３８のいずれか１項で定義されるｄＣａｓ９融合タンパク質を発現させるためのベクター、
ｖ）請求項３５〜３７のいずれか１項で定義されるＭＳ２融合タンパク質を発現させるためのベクター、及び
ｖｉ）ｉ）からｖ）のうちのいずれか１つを含む細胞、
のうちの少なくとも１つを含むキット。
【請求項４９】
細胞内のフラタキシン発現を増加させるための、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ、請求項２０〜３８のいずれか１項に記載のフラタキシン標的系、請求項３９に記載の単離ポリヌクレオチド、請求項４０〜４３のいずれか１項に記載のベクター、請求項４４に記載の細胞、請求項４５もしくは４６に記載の組成物、請求項４７に記載の組み合わせ、または請求項４８に記載のキット。
【請求項５０】
フリードライヒ運動失調症の治療のための、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ、請求項２０〜３８のいずれか１項に記載のフラタキシン標的系、請求項３９に記載の単離ポリヌクレオチド、請求項４０〜４３のいずれか１項に記載のベクター、請求項４４に記載の細胞、請求項４５もしくは４６に記載の組成物、請求項４７に記載の組み合わせ、または請求項４８に記載のキット。
【請求項５１】
細胞内のフラタキシン発現を増加させるための、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ、請求項２０〜３８のいずれか１項に記載のフラタキシン標的系、請求項３９に記載の単離ポリヌクレオチド、請求項４０〜４３のいずれか１項に記載のベクター、請求項４４に記載の細胞、請求項４５もしくは４６に記載の組成物、請求項４７に記載の組み合わせ、または請求項４８に記載のキットの使用。
【請求項５２】
フリードライヒ運動失調症を治療するための、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ、請求項２０〜３８のいずれか１項に記載のフラタキシン標的系、請求項３９に記載の単離ポリヌクレオチド、請求項４０〜４３のいずれか１項に記載のベクター、請求項４４に記載の細胞、請求項４５もしくは４６に記載の組成物、請求項４７に記載の組み合わせ、または請求項４８に記載のキットの使用。
【請求項５３】
フリードライヒ運動失調症を治療するための薬剤の調製のための、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ、請求項２０〜３８のいずれか１項に記載のフラタキシン標的系、請求項３９に記載の単離ポリヌクレオチド、請求項４０〜４３のいずれか１項に記載のベクター、請求項４４に記載の細胞、請求項４７に記載の組み合わせ、または請求項４８に記載のキットの使用。
【請求項５４】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ、請求項２０〜３８のいずれか１項に記載のフラタキシン標的系、請求項４０〜４３のいずれか１項に記載のベクター、請求項４４に記載の細胞、請求項４５もしくは４６に記載の組成物、または請求項４７に記載の組み合わせを対象に投与することを含む、前記対象におけるフリードライヒ運動失調症を治療するための方法。
【請求項５５】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ、請求項２０〜３８のいずれか１項に記載のフラタキシン標的系を発現させること、あるいは請求項２０〜３８のいずれか１項に記載のフラタキシン標的系、請求項４０〜４３のいずれか１項に記載のベクター、請求項４４に記載の細胞、請求項４５もしくは４６に記載の組成物、または請求項４７に記載の組み合わせを投与することを含む、細胞内のフラタキシン発現を増加させるための方法。
【請求項５６】
前記細胞は、フラタキシンを発現させないか、または正常細胞と比較して低いレベルのフラタキシンを発現させる、請求項５１に記載の使用または請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記細胞は、前記フラタキシン遺伝子のイントロン１内に異常な数のＧＡＡトリヌクレオチド反復を含む、請求項５１に記載の使用または請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記細胞は、少なくとも３５、好ましくは少なくとも８０、より好ましくは少なくとも１５０のＧＡＡトリヌクレオチド反復を含む、請求項５７に記載の使用または方法。
【請求項５９】
前記細胞は、ＦＲＤＡを患う対象からである、請求項５７に記載の使用または方法。
【請求項６０】
薬剤の調製のための、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ、請求項２０〜３８のいずれか１項に記載のフラタキシン標的系、請求項３９に記載の単離ポリヌクレオチド、請求項４０〜４３のいずれか１項に記載のベクター、請求項４４に記載の細胞、請求項４７に記載の組み合わせ、または請求項４８に記載のキットの使用。
【請求項６１】
薬剤として使用するための、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のｇＲＮＡ、請求項２０〜３８のいずれか１項に記載のフラタキシン標的系、請求項３９に記載の単離ポリヌクレオチド、請求項４０〜４３のいずれか１項に記載のベクター、請求項４４に記載の細胞、請求項４７に記載の組み合わせ、または請求項４８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる２０１４年３月２０日出願の米国仮出願第６１／９５５，８８２号の利益を主張する。
配列表
【０００２】
本願は、２０１５年３月に作成された表題「１１２２９＿３３７＿ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ」から読み取り可能であり、かつ約２０４ＫＢのサイズを有するコンピュータの配列表を含む。コンピュータ可読形態は、参照により本明細書に組み込まれる。
技術分野
【０００３】
本発明は、例えば、フリードライヒ運動失調症の治療のための、フラタキシン発現及び／またはレベルの増加、ならびにその使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
フラタキシン
【０００５】
フラタキシンは、身体全体にわたって細胞内に見られる小タンパク質（アイソフォーム１：ＮＣＢＩ  ＮＭ＿０００１４４．４、ＮＰ＿０００１３５（２１０  ａａ）、配列番号１、アイソフォーム２：ＮＭ＿１８１４２５、ＮＰ＿８５２０９０（１９６  ａａ）、配列番号２、アイソフォーム３：ＮＭ＿００１１６１７０６、ＮＰ＿００１１５５１７８（１７１  ａａ）、配列番号３、Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｑ１６５９５、ＥＮＴＲＥＺ  ２３９５、Ｅｎｓｅｍｂｌ  ＥＮＳＧ０００００１６５０６０、ＯＭＩＭ：６０６８２９）であり、心臓、ニューロン、脊髄、肝臓、膵臓（ランゲルハンス細胞）、及び随意運動のために使用される筋肉（骨格筋）を含む、高い代謝率を伴う組織において、最も高いレベルとなる。細胞内で、フラタキシンは、ミトコンドリア中に見られる。それは、Ｆｅ２＋をこれらの経路に関与するタンパク質に送達することによって、ヘムの生合成ならびに鉄・硫黄クラスタの組み立て及び修復を促進する。それはまた、Ｆｅ２＋のＦｅ３＋への酸化に触媒作用を及ぼし、かつ水酸化鉄ミネラルの形態で大量の金属を貯蔵するその能力を通して、酸化ストレスに対する保護において主要な役割を果たす。それは、ミトコンドリアプロセシングペプチダーゼ（ＭＰＰ）によって、２つのステップで処理される。ＭＰＰは、最初に前駆体を中間体の形態に開裂し、続いて、中間体を成熟タンパク質に変換する。したがって、細胞内で、３つの形態が存在する。アイソフォーム１に対して、これらの形態は、フラタキシン（５６−２１０）、フラタキシン（７８−２１０）、及び成熟フラタキシンの主要な形態であるフラタキシン（８１−２１０）である（Ｓｃｈｏｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．２００５）。
【０００６】
フリードライヒ運動失調症
【０００７】
常染色体性劣性神経変性及び心臓の疾患であるフリードライヒ運動失調症（ＦＲＤＡ）は、染色体９の長腕に位置する、フラタキシン遺伝子（ＦＸＮ）の最初のイントロン内のトリヌクレオチド反復発現突然変異によって引き起こされる（Ｌｏｃａｔｉｏｎ  ＵＣＳＣ：７１，６５０，１７５〜７１７１５０９４（６４，９２０ｂｐ；９ｑ２１．１１）。突然変異は、フラタキシンｍＲＮＡ及びタンパク質の発現の低下をもたらす。フラタキシンは、ミトコンドリアの適切な機能に不可欠である。上記の通り、それは、鉄の除去に関与し、フラタキシンが低減されるとき、鉄は増大し、フリーラジカルの損傷を引き起こす。神経及び筋肉細胞は、これらの有害作用に特に感受性を有する。ＦＲＤＡは、ヨーロッパ人口において５０，０００人に１人に生じるが、創始者効果により、カナダのケベック州内ではるかに頻度が高い。男性及び女性は、同様に影響を受ける。典型的な形態では、ＦＲＤＡ症状は、１０代の間または前に現れる。それは、運動失調、反射消失、振動感覚及び固有受容の消失、ならびに構音障害を特徴とする（Ｐａｎｄｏｌｆｏ  ２０１２）。さらに、ＦＲＤＡ患者は、多くの場合、心筋症、糖尿病、及び脊柱側弯症を伴う全身性病変を有する。早期死亡は、心筋症または関連する不整脈に起因し得る。後根神経節細胞、それらの上行性脊髄後柱、及び脊髄小脳路の変性は、進行性感覚運動失調をもたらす。多くの患者は、２０代までに車椅子に束縛される。関連する眼球運動障害は、視神経萎縮、矩形波様眼球運動、及び固視障害を含む。重要なことには、認識能力は、比較的残される。しかしながら、多くの患者は、鬱病を患う。
【０００８】
ＦＲＤＡの原因となる突然変異は、フラタキシン遺伝子の最初のイントロン内に位置するＧＡＡトリプレットリピートの不安定過剰伸長である（Ｃａｍｐｕｚａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９６）。正常な対象において、６〜３４の反復がある一方で、ＦＲＤＡ患者においては、１５０以上の反復がある。より少ない反復（１５０〜２００）を有する患者は、より多くのトリプレットリピート（３５０〜６５０）を有するより長い区分を有する患者よりも軽度の症状を有する。一部の深刻な影響を受けた患者において、最大で１７００の反復がある。フラタキシン遺伝子突然変異は、イントロン内に位置するため、それは、フラタキシンタンパク質のアミノ酸配列を変化させない。ミスセンスまたはナンセンスのいずれかの点突然変異を有するＦＲＤＡ患者が２〜３％いる。ミスセンス突然変異を有する一部の患者は、変異タンパク質がなおも機能性であるため、あまり重篤ではない症状を有する。
【０００９】
病理学的機構
【００１０】
病理学的機構は、Ｐａｎｄｏｌｆｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐａｎｄｏｌｆｏ  ２０１２）によって調査された。反復されたＧＡＡトリプレットは、ＤＮＡメチル化及びＤＮＡ中のトリプレックスの形成の変更、すなわち、異常な非Ｂ  ＤＮＡ配座を引き起こし、それは、転写を減少させ、続いて、コードされたタンパク質、フラタキシンのレベルを低減する（発現レベルは、正常なレベルの５〜３５％である（Ｃｏｐｐｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．２００６、Ｃｏｐｐｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．２００９））。ミトコンドリア内の鉄蓄積は、患者の心臓細胞内、及び脳の歯状核内で主に観察される。それは、酸化的損傷と関連する。フラタキシンの減少は、１８５個の異なる遺伝子の遺伝子発現の変化をもたらす（Ｃｏｐｐｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．２００６、Ｃｏｐｐｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．２００９）。したがって、フラタキシンの減少は、いくつかの代謝経路に重大な影響を有し、薬物によるこれらの経路のうちの１つのみの補正は、理想的ではない可能性がある。
【００１１】
フリードライヒ運動失調症を治療するためのいくつかの戦略が開発されてきた。これらは、概して、以下の５つの分類に入る：１）ミトコンドリア内の鉄蓄積によって引き起こされる酸化ストレスを低減するための抗酸化物質の使用、２）ミトコンドリアから鉄を除去するための鉄キレート剤の使用、３）ＤＮＡ凝縮を防止し、より高いフラタキシンの発現を可能にするためのヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣＩ）の使用、４）フラタキシン発現を促進するためのシスプラチン、３−ニトロプロプリオン酸（ｎｉｔｒｏｐｒｏｐｒｉｏｎｎｉｃ  ａｃｉｄ）（３−ＮＰ）、ペンタミジン、またはエリスロポエチン（ＥＰＯ）などの分子の使用、及び５）遺伝子療法。
【００１２】
本記載は、多くの文書を参照し、それらの内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【００１３】
本発明者らは、フラタキシン発現が、修飾ＣＲＩＳＰＲ系を使用して、変異フラタキシン遺伝子を含むフリードライヒ運動失調症患者からの細胞内で直接かつ効率的に増加し得ることを初めて示した。本方法は、転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）を含むタンパク質を内因性フラタキシンプロモータに送達することを含む。驚いたことに、フラタキシン発現は、内因性遺伝子（すなわち、過剰なトリヌクレオチド反復を除去する）またはそのメチル化レベルを補正することなく、実質的に増加し得る。
【００１４】
したがって、本発明は、修飾された規則的な間隔をもってクラスタ化された短鎖反復回文配列（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）系／フラタキシン標的系を使用して、細胞内のフラタキシン発現／レベルを減少または増加させること、及びその使用に関する。一態様では、「ガイドＲＮＡ」（ｇＲＮＡ）は、フラタキシン発現を増加させるために、フラタキシンプロモータを特異的に標的化するために設計及び使用されてもよい。
【００１５】
特定の態様では、本発明は、フラタキシンプロモータを標的化するために、２つの異種ポリペプチドドメイン及び少なくとも１つのｇＲＮＡを含むｄＣａｓ９融合タンパク質を含む（またはそれからなる）、修飾ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース系／フラタキシン標的系を提供する。第１のポリペプチドドメインは、不活性ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼタンパク質（ｄＣａｓ９などのｄＣａｓ）を含み、第２のポリペプチドドメインは、転写活性化活性を有する。少なくとも１つの転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）と融合したこの変異不活性Ｃａｓヌクレアーゼ（ｄＣａｓ９などのｄＣａｓ）は、フラタキシンプロモータ及びそのプロモータ中のヌクレオチド配列を標的化するｇＲＮＡとの複合体を作製し、それによりフラタキシン発現の増加を可能にするために使用される。
【００１６】
さらなる態様では、本発明は、フラタキシンプロモータを標的化するために、２つの異種ポリペプチドドメイン及び少なくとも１つのｇＲＮＡを含む第１の融合タンパク質を含む（またはそれからなる）、修飾ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース系／フラタキシン標的系を提供する。第１のポリペプチドドメインは、変異不活性ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼタンパク質（ｄＣａｓ９などのｄＣａｓ）を含み、第２のポリペプチドドメインは、ペプチドエピトープ（一実施形態では、少なくとも２つのペプチドエピトープ）を含むポリペプチド配列（すなわち、ＴＡＧ）を含む。本系は、同様に２つの異種ポリペプチドドメインを含む第２の融合タンパク質をさらに含む。第２の融合タンパク質の第１のポリペプチドドメインは、第１の融合タンパク質（ｄＣａｓ／ＴＡＧ）のペプチドエピトープに結合することが可能である抗原結合ドメイン（例えば、抗体ｓｃＦｖフラグメント等の抗体の抗原結合ドメインを含む）を含み、第２の融合タンパク質のポリペプチドドメインは、転写活性化活性を有する（例えば、それは、少なくとも１つのＴＡＤを含む）。この系において、第１の融合タンパク質は、実施形態において、ｄＣａｓ９に融合したペプチドエピトープ（例えば、ＧＣＮ４ペプチド、配列番号４）の複数の反復を含んでもよい。このペプチドエピトープは、転写活性化ドメイン（例えば、ＶＰ６４）に融合される、第２の融合タンパク質（抗体／抗体フラグメントなど）の結合ドメインによって認識される。ｄＣａｓ（例えば、ｄＣａｓ９）を含む第１の融合タンパク質上のペプチドエピトープの複数の反復の存在は、フラタキシンプロモータ上の単一の標的部位において転写活性化剤（ＴＡＤを含む）を含む複数の第２の融合タンパク質の動員を可能にし、それによりその発現をさらに増加させる。（Ｔａｎｅｎｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１４からの図１３を参照されたい）。
【００１７】
別の態様では、本発明は、修飾ｇＲＮＡ（ＭＳ２ポリペプチドと結合する１つ以上の（例えば、２つの）ＭＳ２配列を含む）と併用されるためのＭＳ２融合タンパク質、及び転写活性化活性を有するｄＣａｓ９を含む融合タンパク質（１つ以上のＴＡＤを含む）を含む（またはそれからなる）、修飾ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース系／フラタキシン標的系を提供する。ＭＳ２融合タンパク質は、ＭＳ２ドメインを含む（例えば、修飾ｇＲＮＡ中の特定のＭＳ２配列を認識する配列番号７）及び少なくとも１つ（一実施形態では、少なくとも２つ）のＴＡＤを含む（例えば、図１５を参照されたい）。ＭＳ２融合タンパク質は、ＭＳ２ポリペプチド（配列番号７、図１５Ｂ）、ｐ６５ポリペプチド（配列番号８、図１５Ｃ）、及びＨＳＦ１（ヒト熱ショック因子１）ポリペプチド（配列番号９、図１５Ｄ）を含んでもよい。
【００１８】
したがって、一態様では、本発明はまた、ｉ）フラタキシンプロモータポリヌクレオチド配列中の標的配列に対応する少なくとも１０個の隣接ヌクレオチドのｇＲＮＡガイド配列と、ｉｉ）Ｃａｓ９認識配列と、を含む、少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を提供し、標的配列は、Ｃａｓ９タンパク質及び／またはヌクレアーゼ活性を欠いた不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）タンパク質を含むリボ核タンパク質複合体によって認識されるプロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する。
【００１９】
さらなる態様では、本発明は、ａ１）少なくとも１つ（さらなる実施形態では、１つ）のｇＲＮＡ、またはａ２）少なくとも１つのｇＲＮＡに対応し、かつ少なくとも１つのｇＲＮＡを発現させるための核酸配列を含むベクターと、ｂ．ｂ１）ヌクレアーゼ活性を欠いた不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）ポリペプチドドメインを含むｄＣａｓ９融合タンパク質であって、ｉ）少なくとも１つの核局在化シグナル（さらなる実施形態では、１つ）、ならびに／またはｉｉ）（ａ）少なくとも１つの転写活性化ドメイン、及び／もしくは（ｂ）少なくとも１つ（さらなる実施形態では、１つ）のペプチドエピトープのポリペプチドドメインをさらに含む、ｄＣａｓ９融合タンパク質、またはｂ２）融合タンパク質の発現のための、融合タンパク質をコードする核酸配列を含むベクターと、を含む、フラタキシン標的系を提供する。
【００２０】
実施形態では、ｄＣａｓ９タンパク質またはｄＣａｓ９ポリペプチドドメインは、化膿レンサ球菌、ストレプトコッカス・サーモフィルス、または髄膜炎菌に由来する。一実施形態では、ｄＣａｓ９タンパク質またはｄＣａｓ９ポリペプチドドメインは、化膿レンサ球菌に由来する。
【００２１】
一実施形態では、ＰＡＭは、ＮＧＧトリヌクレオチド配列である。
【００２２】
一実施形態では、ｄＣａｓ９タンパク質またはｄＣａｓ９ポリペプチドドメインは、配列番号３５に記載されるＣａｓ９アミノ酸配列の１０位に対応するアスパラギン酸における、及び配列番号３５に記載されるＣａｓ９アミノ酸配列の８４０位に対応するヒスチジンにおける突然変異を含む。一実施形態では、ｄＣａｓ９タンパク質またはｄＣａｓ９ポリペプチドドメインは、Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａに対応する突然変異を含む。
【００２３】
一実施形態では、ｇＲＮＡガイド配列は、特定の標的領域を標的化する１２〜２２個（実施形態では、１０〜２０、１０〜１９、１０〜１８、１８〜２２、１８〜２０、１８〜１９、１９〜２２、または２０〜２２個）、及び好ましくは１８、１９、または２０個のヌクレオチドからなる。実施形態では、ｇＲＮＡガイド配列は、標的領域と完全に同一である。少なくとも１つのｇＲＮＡは、フラタキシン遺伝子のプロモータ領域またはフラタキシン遺伝子のエンハンサ領域を標的化してもよい。
【００２４】
一実施形態では、フラタキシンプロモータ中のｇＲＮＡの標的配列の３’末端は、ヌクレオチド位置ｉ）４２６４、ｉｉ）４６７０、ｉｉｉ）４８５９、ｉｖ）５０２３、またはｖ）５１０７で終端し、ヌクレオチド位置は、ＮＣＢＩ参照番号ＮＧ＿００８８４５を有するフラタキシンポリヌクレオチド遺伝子配列（配列番号８７）の位置に対応する。
【００２５】
一実施形態では、フラタキシンプロモータ中のｇＲＮＡの標的配列の３’末端は、ヌクレオチド位置ｉ）４６７０、ｉｉ）４７０１、ｉｉｉ）４７４２、ｉｉ）４８５９、またはｉｉｉ）５１０７で終端し、ヌクレオチド位置は、ＮＣＢＩ参照番号ＮＧ＿００８８４５を有するフラタキシンポリヌクレオチド遺伝子配列（配列番号８７）の位置に対応する。
【００２６】
一実施形態では、フラタキシンプロモータ中のｇＲＮＡの標的配列は、標的配列の３’末端がヌクレオチド位置ｉｉ）４６７０、ｉｉ）４８５９、またはｉｉｉ）５１０７で終端する位置で終端し、ヌクレオチド位置は、ＮＣＢＩ参照番号ＮＧ＿００８８４５を有するフラタキシンポリヌクレオチド遺伝子配列（配列番号８７）の位置に対応する。
【００２７】
一実施形態では、フラタキシンプロモータ中のｇＲＮＡの標的配列は、ｉ）ヌクレオチド３９６１〜４２５８、ｉｉ）ヌクレオチド４２６８〜４９５１３、ｉｉｉ）ヌクレオチド４２６８〜４９９６、ｉｖ）ヌクレオチド５０２７〜５１５０、ｖ）ヌクレオチド４２６８〜４５９５、ｖｉ）ヌクレオチド４６２１〜４９９６、ｖｉｉ）ヌクレオチド４５６１〜４９９６、またはｖｉｉｉ）ヌクレオチド４２８０〜５０００、ｉｖ）ｉ）〜ｖｉｉｉ）のうちのいずれか１つの相補体に対応するヌクレオチド配列中に含まれ、ヌクレオチド位置は、ＮＣＢＩ参照番号ＮＧ＿００８８４５を有するフラタキシンポリヌクレオチド遺伝子配列（配列番号８７）の位置に対応する。
【００２８】
一実施形態では、ＲＮＡガイド配列及び標的配列は、２つ以上のＮＧＧ配列を含まない。一実施形態では、ＲＮＡガイド配列及び標的配列は、ＮＧＧ配列を含まない。
【００２９】
一実施形態では、フラタキシンプロモータ中のｇＲＮＡの標的配列は、を含むか、またはそれからなる。
【００３０】
一実施形態では、フラタキシンプロモータ中のｇＲＮＡの標的配列は、ＮＣＢＩ参照番号ＮＧ＿００８８４５（配列番号８７、図２も参照されたい）を有するフラタキシンポリヌクレオチド遺伝子配列の
ｉ）４２４６〜４２６４位、
ｉｉ）４６５２〜４６７０位、
ｉｉｉ）４８４１〜４８５９位、
ｉｖ）５００５〜５０２３位、または
ｖ）５０８９〜５１０７位、
のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。
【００３１】
一実施形態では、Ｃａｓ９認識配列は、配列番号６７に記載される配列を含むか、またはそれからなる。一実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号５７〜６１のいずれか１つに記載の配列を含むか、またはそれからなる。
【００３２】
一実施形態では、上記のｄＣａｓ９融合タンパク質は、少なくとも１つのペプチドエピトープを含むポリペプチドドメインを含み、本系は、ｉ）少なくとも１つのペプチドエピトープに結合する抗原結合領域と、ｉｉ）少なくとも１つの転写活性化ドメインと、を含む融合タンパク質をさらに含む。一実施形態では、抗原結合領域は、少なくとも１つのペプチドエピトープに結合する単鎖可変フラグメントを含む。一実施形態では、ｄＣａｓ９融合タンパク質は、少なくとも２つのペプチドエピトープを含むポリペプチドドメインを含む。
【００３３】
一実施形態では、本発明は、ｉ）ａ）少なくとも１つの核局在化シグナルならびに／もしくはｂ．ｂ１）ＭＳ２ポリペプチド及びｂ２）少なくとも１つの転写活性化ドメイン、またはｉｉ）ＭＳ２融合タンパク質をコードする核酸配列を含むベクター、を含む、ＭＳ２融合タンパク質をさらに提供する。一態様では、ＭＳ２融合タンパク質は、ＭＳ２ポリペプチドに結合することが可能であるｇＲＮＡのテトラループ内にＭＳ２核酸配列と、ステムループ内にＭＳ２核酸配列とを含む、ｇＲＮＡと共に使用される。
【００３４】
したがって、上記のｇＲＮＡは、少なくとも１つのＭＳ２核酸配列をさらに含んでもよい。一実施形態では、ｇＲＮＡは、２つのＭＳ２配列、ｇＲＮＡのテトラループ内に１つ、ステムループ内に１つを含む。一実施形態では、ＭＳ２核酸配列は、配列番号６８に記載される配列を含むか、またはそれからなる。一実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号６２〜６６のうちの１つに記載される配列を含むか、またはそれからなる。
【００３５】
一実施形態では、上記の転写活性化ドメインは、ＶＰ１６（配列番号１７）、ＶＰ６４、またはＶＰ１６０（配列番号１８）転写活性化ドメインを含む。別の実施形態では、転写活性化ドメインは、ＶＰ１６  ＴＡＤ（配列番号１７）の１つまたは複数のコピーを含む。実施形態では、転写活性化ドメインは、ＨＳＦ１（配列番号９）またはｐ６５活性化（配列番号８）ドメインを含んでもよい。融合タンパク質は、融合タンパク質の様々な異種ドメインを結合するリンカーをさらに含んでもよい（例えば、ｄＣａｓ９ポリペプチドドメインとＴＡＤまたはペプチドエピトープとの間、ＭＳ２ポリペプチドとＴＡＤとの間、ペプチドエピトープ間、または２つのＴＡＤの間）。本発明の融合タンパク質は、好ましくは、少なくとも１つの核局在化シグナルを含む。一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、２つのＮＬＳを含む。一実施形態では、ＮＬＳは、シミアンウイルス４０ラージＴ抗原由来の哺乳動物核局在化シグナルである。特定の実施形態では、ＮＬＳは、配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１２）を含む。特定の実施形態では、転写活性化ドメインは、ＶＰ１６  ＴＡＤ（ＶＰ１６０）（配列番号１８）の１０個のコピーを含む。
【００３６】
一実施形態では、上記の不活性ｄＣａｓ９融合タンパク質は、図３に記載される配列（配列番号３３）と少なくとも９５％（実施形態において、少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％）同一のアミノ酸配列を有する。
【００３７】
実施形態において、ｄＣａｓ９融合タンパク質は、２〜２４個（一実施形態では、１０個）のＧＣＮ４ペプチドエピトープを含む。一実施形態では、ｄＣａｓ９融合タンパク質は、配列番号５または６に記載されるｓｕｎＴＡＧポリペプチド配列を含む。
【００３８】
別の実施形態では、本発明のｄＣＡｓ／ＴＡＤタンパク質のアミノ酸配列は、図３に記載される配列（配列番号３４）のアミノ酸１０〜１５３８と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、本発明のｄＣＡｓ／ＴＡＤタンパク質のアミノ酸配列は、図３に記載される配列（配列番号３４）のアミノ酸１０〜１５３５（配列番号３４のアミノ酸１〜１５２６）と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、本発明のｄＣａｓ／ＴＡＤタンパク質は、図３の上記のアミノ酸配列（配列番号３２及び３４）と少なくとも９５％（すなわち、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、もしくは１００％）同一の配列を含むか、またはそれからなる。
【００３９】
さらなる実施形態では、上記の不活性融合タンパク質は、タンパク質を細胞内に標的化するためのタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）をさらに含む。特定の実施形態では、ＰＴＤは、ＴＡＴまたはＰｅｐ−１である。一実施形態では、ＴＡＴ−ＰＴＤは、配列ＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＣ（配列番号３６）を含む。
【００４０】
さらなる態様では、本発明の融合タンパク質及び／またはｇＲＮＡは、それらの標的細胞内への侵入を促進するために、リポソームと複合されてもよい。リポソームは、単独で、またはＰＴＤドメインと組み合わせて使用されてもよい。
【００４１】
本発明は、上記のｇＲＮＡのうちの１つ以上を、単独で、または本発明の上記の不活性融合タンパク質と組み合わせてコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。そのようなポリヌクレオチドのうちの１つ以上を含むベクターもまた提供される。ベクターは、いくつかのｇＲＮＡまたは融合タンパク質をコードし得る。特定の実施形態では、ベクターは、図４に記載されるポリヌクレオチド配列（配列番号５５）と、または配列番号９３〜１００のうちのいずれか１つと少なくとも９５％（すなわち、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）同一のポリヌクレオチド配列を含む。
【００４２】
特定の実施形態では、本発明のベクターは、ウイルスベクターである。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、またはヘルペスウイルスに由来する。一実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。一実施形態では、ベクターは、ＡＡＶＤＪ−８またはＡＡＶ２ＤＪ９アデノ随伴ウイルスベクターである。
【００４３】
別の態様では、本発明はまた、
ｉ）上記のベクター、または
ｉｉ）本発明の１つ以上のｇＲＮＡ、
ｉｉｉ）上記のフラタキシン標的系、及び
ｉｖ）ｉ）〜ｉｉｉ）のうちのいずれか１つを含む細胞、
のうちの少なくとも１つを含む組成物または組み合わせに関する。
本組成物は、生理学的に許容される（例えば、薬学的に許容される）担体をさらに含んでもよい。
【００４４】
さらなる態様では、本発明はまた、
ｉ）上記のベクター、または
ｉｉ）上記のｇＲＮＡのうちの１つ以上、
ｉｉｉ）上記のフラタキシン標的系、及び
ｉｖ）ｉ）〜ｉｉｉ）のうちのいずれか１つを含む細胞、
のうちの少なくとも１つを含むキットに関する。
【００４５】
本発明はまた、本発明の上記のｇＲＮＡ、融合タンパク質、フラタキシン標的系、組み合わせ、単離ポリヌクレオチド、及び／またはベクターのうちの１つ以上を含む細胞を提供する。
【００４６】
本発明はさらに、細胞内のフラタキシン発現を増加させるための上記のｇＲＮＡ、フラタキシン標的系、単離ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、組成物、組み合わせ、またはキットのうちの１つ以上に関する。
【００４７】
関連した態様では、本発明は、細胞内のフラタキシン発現を増加させるための上記のｇＲＮＡ、フラタキシン標的系、単離ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、組成物、組み合わせ、またはキットのうちの１つ以上の使用に関する。
【００４８】
実施形態では、本細胞は、フラタキシンを発現させないか、または本細胞は、正常細胞と比較して低レベルのフラタキシンを発現させる。一実施形態では、本細胞は、フラタキシン遺伝子のイントロン１内に異常な数のＧＡＡトリヌクレオチド反復を有する。特定の実施形態では、本細胞は、少なくとも３５、好ましくは少なくとも８０、より好ましくは少なくとも１５０、及びさらにより好ましくは少なくとも２５０以上のＧＡＡトリヌクレオチド反復を含む。一実施形態では、本細胞は、ＦＲＤＡを患う対象からのものである。
【００４９】
本発明はさらに、フリードライヒ運動失調症の治療のための上記のｇＲＮＡ、フラタキシン標的系、単離ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、組成物、組み合わせ、またはキットのうちの１つ以上に関する。
【００５０】
本発明はまた、フリードライヒ運動失調症を治療するための上記のｇＲＮＡ、フラタキシン標的系、単離ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、組成物、組み合わせ、またはキットのうちの１つ以上の使用に関する。
【００５１】
本発明は、フリードライヒ運動失調症を治療するための薬剤の調製のための、１つ以上の上記のｇＲＮＡ、フラタキシン標的系、単離ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、組成物、キット、または組み合わせに関する。
【００５２】
関連した態様では、本発明は、フリードライヒ運動失調症を治療するための薬剤の調製のための、１つ以上の上記のｇＲＮＡ、フラタキシン標的系、単離ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、組成物、キット、または組み合わせの使用に関する。
【００５３】
本発明はまた、上記のｇＲＮＡまたはフラタキシン標的系のうちの少なくとも１つを発現させること、あるいは上記のフラタキシン標的系、ベクター、細胞、組成物、または組み合わせのうちの少なくとも１つを投与することを含む、細胞内のフラタキシン発現を増加させる方法に関する。
【００５４】
本発明はさらに、対象の細胞内の少なくとも１つの上記のｇＲＮＡ、ポリヌクレオチド、ベクター、またはフラタキシン標的系を発現させることを含む、対象におけるフリードライヒ運動失調症を治療するための方法に関する。
【００５５】
本発明はさらに、上記のｇＲＮＡ、フラタキシン標的系、ベクター、細胞、組成物、または組み合わせのうちの１つ以上を対象に投与することを含む、フリードライヒ運動失調症を治療するための方法に関する。
【００５６】
一実施形態では、上記の方法は、細胞内の本発明のｇＲＮＡ及び／またはＣａｓ／ＴＡＤタンパク質を発現させるための１つ以上のウイルスベクターを形質導入することを含む。
【００５７】
本発明の他の目的、利点、及び特徴は、添付の図面を参照して単に一例として示される、その特定の実施形態の以下の非制限的な説明を読むことによって、より明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】染色体上の配列を標的化する単一ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）及びＣａｓ９ヌクレアーゼタンパク質の概略図である（Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１３ｂ）。
【図２】ヒトフラタキシンプロモータの部分配列を示す（配列番号１１、ＬＯＣＵＳＮＧ＿００８８４５７１６１６ｂｐＤＮＡｌｉｎｅａｒＰＲＩ０２−ＪＵＬ−２０１３、ヒトフラタキシン遺伝子ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＮＧ＿００８８４５  ＶＥＲＳＩＯＮ  ＮＧ＿００８８４５．２ＧＩ：２５４８２６７２５）。フラタキシンプロモータの示された部分に沿って潜在的なプロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）は、網掛けされている（ｎｇｇ配列）。５００１及び５１５９に位置付けられる転写開始部位（ａｇｔ及びｃａｃ）の最初の位置は、四角で囲まれる。５２２１〜５２２３位におけるタンパク質コード配列の開始コドン（ＡＴＧ）は、太字の大文字である。フラタキシンプロモータを増幅させるために使用されるプライマは、網掛けされている（４０６３〜４０８６及び５４５４〜５３６２）。本発明の一実施形態に従ったフラタキシンプロモータ上の例示的な標的配列は、太字で、かつ下線が引かれ、実施例１の表４にも示される。
【図３】ｄＣａｓ９−ＶＰ１６０のＮ末端及びＣ末端において２つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）（下線が引かれ、かつ太字、ＰＫＫＫＲＫＶ、配列番号１２）を含むｄＣａｓ９−ＶＰ１６０（配列番号３２）のアミノ酸配列を示す。ｄＣａｓ９−ＶＰ１６０のＣ末端における１０のＶＰ１６転写活性化ドメインＴＡＤ（ＶＰ１６０）の配列は、下線がある（配列番号１８）。ｄＣａｓ９タンパク質の理論等電点は、５．８９であり、その分子量は、１７６８８０．４４ダルトンである。
【図４−１】ｇＲＮＡ  Ａ及びｄＣａｓ９−ＶＰ１６０の発現のためのｐＡＣ１５４−二重ｄＣａｓ９−ＶＰ１６０プラスミド（配列番号５５）の核酸配列を示す。本発明の例示的なｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ  Ａ）によってヒトフラタキシン遺伝子のプロモータ中で標的化される配列は、下線が引かれ、かつ太字である。
【図４−２】ｇＲＮＡ  Ａ及びｄＣａｓ９−ＶＰ１６０の発現のためのｐＡＣ１５４−二重ｄＣａｓ９−ＶＰ１６０プラスミド（配列番号５５）の核酸配列を示す。本発明の例示的なｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ  Ａ）によってヒトフラタキシン遺伝子のプロモータ中で標的化される配列は、下線が引かれ、かつ太字である。
【図４−３】ｇＲＮＡ  Ａ及びｄＣａｓ９−ＶＰ１６０の発現のためのｐＡＣ１５４−二重ｄＣａｓ９−ＶＰ１６０プラスミド（配列番号５５）の核酸配列を示す。本発明の例示的なｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ  Ａ）によってヒトフラタキシン遺伝子のプロモータ中で標的化される配列は、下線が引かれ、かつ太字である。
【図５】１０個のＶＰ１６配列からなる、ＶＰ１６０（配列番号１８）をコードする対応するアミノ酸配列を有するｐＡＣ１５４プラスミドの部分配列を示す。各ＶＰ１６配列（配列番号１７）は、網掛けされている。
【図６】本発明のｇＲＮＡがフラタキシンプロモータ上のそれらの標的配列に効率的に結合することができることを示す。結果は、活性Ｃａｓ９ヌクレアーゼならびにヒトフラタキシン遺伝子のプロモータを標的化する例示的なｇＲＮＡ（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥと名付けられる）のそれぞれが導入された２９３Ｔ細胞から得られる溶解物に関するＳｕｒｖｅｙｏｒ酵素からである（図２及び配列番号１１を参照されたい）。対照レーンは、導入されていない細胞に対応する。ｇＲＮＡがその標的に結合するとき、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ＤＮＡを切断する複合体を形成する。このＤＮＡ切断は、非相同末端結合によって自発的に修復され、それは、ＤＮＡ中の微小挿入または微小欠失（ＩＮＤＥＬ）をもたらす。これらのＩＮＤＥＬは、ＰＣＲ増幅によって検出され、ミスマッチＤＮＡ二重鎖を切断するＳｕｒｖｅｙｏｒ酵素による消化が続く。結果は、ｇＲＮＡ  Ａ、Ｃ、及びＤがフラタキシンプロモータ中のそれらの個々の標的配列に結合することができることを示す。しかしながら、ｇＲＮＡ  Ｂ及びＥは、それらの個々の標的配列に効果的に結合せず、したがって、追加のＤＮＡバンドがＳｕｒｖｅｙｏｒ酵素試験後に検出されなかった。
【図７】ＨＡ−ｄＣａｓ９−ＶＰ１６０タンパク質が細胞内で効率的に発現されることを示す。示される結果は、ＨＡ−ｄｃａｓ９−ＶＰ１６０遺伝子及びｇＲＮＡ  Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥが導入された２９３Ｔ細胞の溶解物上のＨＡ抗体を使用したウエスタンブロット法からである。
【図８】フラタキシン遺伝子のプロモータに付着し、ＶＰ１６０と結合した不活化Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）と複合体を形成する、単一ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の概略図を示す。この複合体は、フラタキシン遺伝子転写の活性化をもたらす転写因子を動員する。
【図９】本発明のｇＲＮＡが細胞内のフラタキシン遺伝子の発現を増加させることを示す。ｄＣａｓ９−ＶＰ１６０及びヒトフラタキシン遺伝子のプロモータを標的化する１つ（またはいくつか）のｇＲＮＡ（複数可）をコードするプラスミドが導入された２９３Ｔ細胞のｍＲＮＡに対するｑＲＴ−ＰＣＲによって、定量的フラタキシン発現レベルを判定した。ｇＲＮＡ  Ａ、Ｃ、及びＤ、ならびにｇＲＮＡの様々な組み合わせは、フラタキシンｍＲＮＡの発現を増加させた。
【図１０】フラタキシンタンパク質発現が、ｇＲＮＡの存在によって増加されることを示す。上のパネルは、ｄＣａｓ９−ＶＰ１６０及びヒトフラタキシン遺伝子のプロモータを標的化するいくつかのｇＲＮＡのうちの１つまたは組み合わせで処理された２９３Ｔ細胞からの溶解物を使用した、フラタキシン及びβアクチンタンパク質に対するウエスタンブロット法を示す。フラタキシンバンドの強度を、同じ試料からのβアクチンバンドの強度で正規化した。下のパネルは、３つのウエスタンブロット法に対する平均結果を示す。フラタキシンタンパク質の正規化された強度を、単独で、または組み合わせて使用されるｇＲＮＡの存在によって増加させた。
【図１１】フラタキシンプロモータを標的化するｇＲＮＡが、フリードライヒ細胞内のフラタキシンｍＲＮＡの発現を増加させることができることを示す。結果は、ｄＣａｓ９−ＶＰ６４及びヒトフラタキシン遺伝子のプロモータを標的化する１つまたはいくつかのｇＲＮＡをコードするプラスミドのヌクレオフェクションの６０時間後のフリードライヒ細胞の溶解物からのフラタキシンｍＲＮＡに対するＧＦＰｑＲＴ−ＰＣＲからである。結果をＧＦＰが導入された細胞で正規化し、また２つの異なる対照ＲＮＡに対して正規化した（左の棒：↓ＧＡＰＤＨ、右の棒：１８Ｓ  ｒＲＮＡ）。
【図１２】フラタキシンプロモータを標的化するｇＲＮＡが、フリードライヒ細胞内のフラタキシンタンパク質の発現を増加させることができることを示す。上のパネル：ｇＲＮＡ及びフリードライヒ線維芽細胞内のｄＣａｓ９−ＶＰ６４をコードするプラスミドのヌクレオフェクションの６０時間後のフラタキシンタンパク質発現のウエスタンブロット法である。下のパネル：フラタキシン発現を定量化し、βアクチン発現で正規化した（フラタキシン抗体は、Ｍｉｔｏｓｃｉｅｎｃｅｓからであり、βアクチン抗体をＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入した）。
【図１３】３成分修飾ＣＲＩＳＰＲ系、すなわち、ｇＲＮＡ、修飾ｄＣａｓ９、及び転写活性化ドメインに結合される抗原結合活性（ｓｃＦｖフラグメント）を有するタンパク質を使用した、本発明の方法の代替の実施形態を示す。この方法で、ペプチドエピトープの複数の反復（例えば、ＧＣＮ４ペプチド、配列番号４）は、ｄＣａｓ９に融合される。このペプチドエピトープは、転写活性化ドメイン（例えば、ＶＰ６４）に連結される抗体／抗体フラグメントによって認識される。ｄＣａｓ９融合タンパク質上のペプチドエピトープの複数の反復の存在は、フラタキシンプロモータ上の単一標的部位における複数の転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）の動員を可能にし、それによりその発現をさらに増加させる。（Ｔａｎｅｎｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１４からの図）。
【図１４】３成分修飾ＣＲＩＳＰＲ系、すなわち、修飾ｇＲＮＡ、ｄＣａｓ９−ＴＡＤ融合タンパク質、及びＭＳ２−ｐ６５−ＨＳＦ１融合タンパク質（配列番号１０）を使用した本発明の方法の代替の実施形態を示す。２つのＭＳ２ヌクレオチド配列、ｇＲＮＡのテトラループ内に１つ及びステムループ内に１つを追加した。ＭＳ２ペプチド（配列番号７）、及び２つのＴＡＤ（例えば、ｐ６５（配列番号８）、及びＨＳＦ１（配列番号９）転写活性化ドメイン（ＴＡＤ））を含む融合タンパク質は、ｇＲＮＡ中に含まれるＭＳ２ヌクレオチド配列のそれぞれに結合する。３つのＴＡＤ（例えば、ｄＣａｓ９タンパク質上のＶＰ６４及びｐ６５及びＨＳＦ１）の存在は、ｇＲＮＡによって標的化される遺伝子（フラタキシン）の転写に対して強い相乗効果を生み出す。（Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１４からの図）。
【図１５】本発明のＭＳ２−ｐ６５−ＨＳＦ１融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。Ａ．核局在化シグナルを含むＭＳ２−ｐ６５−ＨＳＦ１（配列番号１０）融合タンパク質のアミノ酸配列（ＰＫＫＫＲＫＶ、太字（配列番号１２）。Ｂ．ＭＳ２ペプチドのアミノ酸配列（配列番号７）。Ｃ．ｐ６５転写活性化ドメインのアミノ酸配列（配列番号８）。Ｄ．ＨＳＦ１転写活性化ドメインのアミノ酸配列（配列番号９）。
【図１６】本発明の一実施形態で使用されるヌクレアーゼ活性を欠いたＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列（ｄＣａｓ９、配列番号３３）を示す。タンパク質は、ＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＫＶ）を含む。このタンパク質は、そのヌクレアーゼ活性を不活性化する、Ｄ１０Ａ（この配列中の３０位に対応する）及びＨ８４０Ａ（この配列中の８６０位に対応する）（太字）として既知の突然変異を含む。
【図１７】フラタキシン遺伝子の転写を強化するためにｄＣａｓ９タンパク質に融合されてもよい、ＴＡＧペプチド配列のアミノ酸配列（ｓｕｎｔａｇ）を示す。Ａ．ＴＡＧペプチド配列中で１０回反復されるＧＣＮ４ペプチドモチーフ（配列番号４）。Ｂ．ＴＡＧペプチド配列中に存在する核局在化シグナル（ＮＬＳ、配列番号１２）。Ｃ．ＮＬＳを含む完全ＴＡＧアミノ酸配列（配列番号６）、続いて、リンカー配列（ＧＳＧＳＧ（配列番号５６）で間を埋められた１０のＧＣＮ４ペプチド配列。
【図１８】本発明の例示的なｇＲＮＡ配列の核酸配列を示す。Ａ．実施例１及び２で試験されたｇＲＮＡの核酸配列。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を発現ベクター中でクローン化し、Ｕ６プロモータの制御化で発現させた。ＣｒｉｓｐＡ〜ＣｒｉｓｐＥ  ｇＲＮＡ配列は、配列番号５７〜６１にそれぞれ対応する。ｇＲＮＡガイド配列は、下線が引かれている。Ｂ．ＭＳ２ポリペプチドによって認識される２つの核酸配列を含むｇＲＮＡの核酸配列（ＭＳ−２  ＣｒｉｓｐＡ中太字、配列番号６２）。ＭＳ２−ＣｒｉｓｐＡ〜ＭＳ２−ＣｒｉｓｐＥ  ｇＲＮＡ配列は、配列番号６２〜６６に対応する。ｇＲＮＡガイド配列は、下線が引かれている。
【図１９】化膿レンサ球菌からのＣａｓ９ヌクレアーゼのアミノ酸配列（配列番号３５、Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｑ９９ＺＷ２）を示す。
【図２０−１】Ｃａｓ９中の突然変異及びタンパク質機能に対するそれらの効果のリストを示す。突然変異（複数可）は、ヌクレアーゼ活性を欠くが、ｇＲＮＡの存在下で標的フラタキシンＤＮＡ配列になお結合する、不活性Ｃａｓ９ヌクレアーゼを設計及び調製するように選択されてもよい。
【図２０−２】Ｃａｓ９中の突然変異及びタンパク質機能に対するそれらの効果のリストを示す。突然変異（複数可）は、ヌクレアーゼ活性を欠くが、ｇＲＮＡの存在下で標的フラタキシンＤＮＡ配列になお結合する、不活性Ｃａｓ９ヌクレアーゼを設計及び調製するように選択されてもよい。
【図２０−３】Ｃａｓ９中の突然変異及びタンパク質機能に対するそれらの効果のリストを示す。突然変異（複数可）は、ヌクレアーゼ活性を欠くが、ｇＲＮＡの存在下で標的フラタキシンＤＮＡ配列になお結合する、不活性Ｃａｓ９ヌクレアーゼを設計及び調製するように選択されてもよい。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
細菌性免疫の分野における最近の発見は、細胞内の遺伝子発現を制御するための新しい系の開発をもたらした。細菌及び古細菌は、修飾された規則的な間隔をもってクラスタ化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）系と呼ばれる適応的免疫防御を開発し、それらは、侵入ウイルス及びプラスミドＤＮＡ中に存在する相補配列を分解するために、ｃｒＲＮＡ及びＣａｓタンパク質を使用する（Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１３ｂ）。Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）及びＭａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１３ｂ）は、ＤＮＡ中の二重鎖切断を誘発するために、カスタムガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を使用して、ＩＩ型細菌ＣＲＩＳＰＲ系を操作した（図１を参照されたい）。Ｃｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）及びＣｈｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）は、この系を使用して、マウス及びヒト細胞内のいくつかの遺伝子を突然変異した。このＣＲＩＳＰＲ系は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ、及びｈｉＰＳＣ（ヒト人工多能性幹細胞）中で、かつ生成された遺伝子導入マウスに突然変異を誘発するために使用されてきた。しかしながら、ｇＲＮＡと組み合わされた元のＣａｓ９ヌクレアーゼは、頻繁なオフターゲット突然変異をもたらした（Ｆｕ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）。この問題は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをニッカーゼに変異させることによって、かつ両方のＤＮＡ鎖を切断するために２つのｇＲＮＡを使用して、解決されてきた（Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１３ａ）。ＶＰ６４転写活性化ドメインと結合されているか、またはされていない不活性Ｃａｓ９ヌクレアーゼを有するＣＲＩＳＰＲ系もまた、遺伝子発現を低減または強化するために使用されてきた（Ｐｅｒｅｚ−Ｐｉｎｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）。
【００６０】
出願者は、ＣＲＩＳＰＲ系が細胞内でフラタキシンタンパク質発現を効率的に増加させるために使用され得ることを、本明細書で初めて示す。フラタキシンプロモータを標的化する様々なｇＲＮＡは、少なくとも１つの転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）と融合した変異（不活性）Ｃａｓ（例えば、ｄＣａｓ９）ヌクレアーゼを発現させる、細胞内のフラタキシン発現を増加させることが示された。フラタキシン発現は、正常細胞内だけでなく、フラタキシンの低発現と関連したＧＡＡトリプレットリピートの過剰伸長を有するフリードライヒ運動失調症患者からの細胞内でも増加した。フラタキシンプロモータの標的化及びこれらの細胞内の増加したフラタキシン発現は、内因性欠損を補正すること、または（例えば、ＤＮＡメチル化レベルを修正する試薬などを使用して）ＤＮＡトポロジー及び／もしくはそのメチル化レベルを修正することなく、可能であった。
【００６１】
本発明は、細胞内のフラタキシン発現／レベルを誘発することまたは増加させること、及びその使用に関する。一態様では、本発明は、フラタキシンの発現を誘発するための１つ以上のｇＲＮＡの設計に関する。特定の態様では、（ｂ）少なくとも１つの転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）ドメイン（例えば、ＶＰ１６、ＶＰ６４、及びＶＰ１６０）と融合した（ａ）不活性Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、ｄＣａｓ９）を含む組換え融合タンパク質は、フラタキシンプロモータを標的化するｇＲＮＡと合わせて、設計、調製、及び細胞内に導入／発現されて、細胞内のフラタキシン発現を誘発するか、またはフラタキシンタンパク質のレベルを増加させる。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、ＭＳ２ペプチドが結合する核酸配列（例えば、２つのＭＳ２配列）を含むように修飾され、（ｂ）少なくとも１つの転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）ドメイン（例えば、ｐ６５及び／またはＨＳＦ１）と融合した（ａ）ＭＳ２ポリペプチドを含む組換え融合タンパク質が設計及び調製される。融合タンパク質は、フラタキシンプロモータを標的化する少なくとも１つのｇＲＮＡと合わせて、細胞内に導入／発現されて、細胞内のフラタキシン発現を誘発するか、またはフラタキシンタンパク質のレベルを増加させる。
【００６２】
別の態様では、１つ以上の（一実施形態では、少なくとも２つの）ペプチドエピトープ（例えば、ＧＣＮ４）を含む（ｂ）ポリペプチド（ＴＡＧ）と融合した（ａ）不活性Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、ｄＣａｓ９）ポリペプチドを含む組換え融合タンパク質が設計及び調製される。ペプチドエピトープ（抗原結合タンパク質）に結合し、かつ少なくとも１つの転写活性化ドメインと融合されるさらなる融合タンパク質もまた、設計及び調製される。融合タンパク質は、フラタキシンプロモータを標的化するｇＲＮＡと合わせて、細胞内に導入／発現されて、細胞内のフラタキシン発現を誘発するか、またはフラタキシンタンパク質のレベルを増加させる。
【００６３】
本発明はさらに、フリードライヒ運動失調症の治療のためなど、フラタキシンタンパク質の発現の誘発／増加を、それを必要としている対象からの細胞内で行うためなど、細胞内のフラタキシン発現／レベルのそのような誘発または増加の使用に関する。
【００６４】
この項及び本明細書の開示全体で使用される項の見出しは、整理の目的のみであり、限定することを意図していない。
【００６５】
定義
【００６６】
本願の用語の明確かつ一貫した理解を提供するために、以下の定義が提供される。
【００６７】
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合、定義を含む本文書が優先する。好ましい方法及び材料が記載されるが、本明細書に記載されるものと同様または同等の方法及び材料が、本発明の実施または試験で使用され得る。本明細書で言及される全ての出版物、特許出願、特許、配列データベースエントリの参照、及び他の参考文献は、それら全体が参照により組み込まれる。
【００６８】
本明細書及び請求項（複数可）で使用される場合、用語「備えること（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（ならびに「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などの備えることの任意の形態）、「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」（ならびに「有する（ｈａｖｅ）」及び「有する（ｈａｓ）」などの有することの任意の形態）、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」などの含むことの任意の形態）、または「含有すること（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（ならびに「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」などの含有することの任意の形態）は、包括的またはオープンエンドであり、追加の列挙されていない要素または方法ステップを除外せず、「〜を含むがこれらに限定されない」及び「〜を備えるがこれらに限定されない」という句と同義的に使用される。
【００６９】
本明細書における数値範囲の列挙のために、同程度の正確さを有するそれらの間に介在する各数値は、明示的に企図される。例えば、１８〜２０の範囲に関して、数値１８、１９、及び２０が明示的に企図され、６．０〜７．０の範囲に関しては、数値６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、及び７．０が明示的に企図される。
【００７０】
本明細書において同義的に使用される「アデノ随伴ウイルス」または「ＡＡＶ」は、ヒト及びいくつかの他の霊長類種を感染させるパルボウイルス科のディペンドウイルス属に属する小さいウイルスを指す。ＡＡＶは、疾患を引き起こすことが現在知られておらず、その結果としてウイルスが、非常に軽度の免疫反応を引き起こす。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「結合領域」は、ヌクレアーゼによって認識及び拘束される、ヌクレアーゼ標的領域内の領域を指す。
【００７２】
本明細書で使用される場合、「コード配列」または「コー核酸」は、タンパク質またはｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）を意味する。コード配列は、プロモータを含む調節エレメントに動作可能に結合された開始及び終結シグナルと、核酸が投与される個人または哺乳動物の細胞内で発現を誘導することが可能なポリアデニル化シグナルとをさらに含むことができる。コード配列は、コドン最適化されていてもよい。
【００７３】
本明細書で使用される場合、「相補体」または「相補の」は、核酸分子のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体間のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ（例えば、Ａ−Ｔ／Ｕ及びＣ−Ｇ）またはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対合を指す。「相補性」は、２つの核酸配列間で共有される、それらが互いに逆平行に整合されたとき、各位置におけるヌクレオチド塩基が相補的になるようになる性質を指す。
【００７４】
本明細書で使用される場合、「フラタキシン」は、ミトコンドリア（アイソフォーム１：ＮＣＢＩ  ＮＭ＿０００１４４．４、ＮＰ＿０００１３５（２１０  ａａ）、配列番号１、アイソフォーム２：ＮＭ＿１８１４２５、ＮＰ＿８５２０９０（１９６  ａａ）、配列番号２、アイソフォーム３：ＮＭ＿００１１６１７０６、ＮＰ＿００１１５５１７８（１７１  ａａ）、配列番号３、Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｑ１６５９５、ＥＮＴＲＥＺ  ２３９５、Ｅｎｓｅｍｂｌ  ＥＮＳＧ０００００１６５０６０、ＯＭＩＭ：６０６８２９）中に見られるタンパク質を指す。本明細書において同義的に使用されるフラタキシン遺伝子または「ＦＲＸ遺伝子」（ＮＣＢＩ参照番号ＮＧ＿００８８４５、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ  ２３９５）は、遺伝子座９ｑ２１．１にある。
【００７５】
本明細書で使用される場合、「融合タンパク質」は、それぞれが元々別々のタンパク質またはポリペプチドをコードした２つ以上の核酸／遺伝子の結合を通してもたらされるキメラタンパク質を指す。融合核酸／遺伝子の翻訳は、元のタンパク質のそれぞれに由来する機能特性を有する単一のポリペプチドをもたらす。
【００７６】
本発明の文脈における「ＴＡＧ」は、抗原結合活性を有するタンパク質（例えば、抗体または単鎖可変フラグメント）に結合する少なくとも１つのペプチドエピトープ（実施形態において、少なくとも３、４、５、６、７、１０、２０、２４個またはそれ以上のペプチドエピトープ）を含む、ポリペプチド配列である。
【００７７】
本明細書において同義的に使用される「変異遺伝子（Ｍｕｔａｎｔ  ｇｅｎｅ）」または「変異遺伝子（ｍｕｔａｔｅｄ  ｇｅｎｅ）」は、検出可能な突然変異を受けた遺伝子（例えば、フラタキシン遺伝子）を指す。ＦＲＤＡの文脈における変異フラタキシン遺伝子は、フラタキシン遺伝子のイントロン１内に異常な量のＧＡＡトリヌクレオチド反復（約１５０〜１７００超の反復）を含む。これらの反復の存在は、遺伝子の正常な伝達及び発現に影響を及ぼし、それにより機能的フラタキシンタンパク質の発現の低下をもたらす。
【００７８】
本明細書で使用される場合、「正常なフラタキシン遺伝子」は、遺伝物質の喪失、獲得、または交換などの変化を受けていないフラタキシン遺伝子（例えば、ＮＣＢＩ参照番号ＮＧ＿００８８４５、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ  ２３９５、配列番号８７）を指す。正常な遺伝子は、正常な遺伝子伝達及び遺伝子発現を受ける。本発明の文脈における「正常な」フラタキシン遺伝子は、野生型の機能的フラタキシンタンパク質をコードし、かつ健康な対象（例えば、ＦＲＡＤＡを患っていない対象）で通常見られないフラタキシンタンパク質のレベルに実質的に対応するレベルのフラタキシンタンパク質を発現させる、フラタキシン遺伝子である。健康な対象は、フラタキシン遺伝子イントロン１内に３５未満のＧＡＡ反復を含み、健康な対象における平均の反復量は、約６〜３４反復である。
【００７９】
本明細書で使用される場合、「プロモータ」は、細胞内の核酸の発現を付与、活性化、または強化することが可能である合成または天然由来の分子を意味する。プロモータは、１つ以上の特異的転写調節配列を含んで、発現をさらに強化する、かつ／またはその空間的発現及び／もしくは時間的発現を変化させてもよい。プロモータはまた、転写の開始部位から数千の塩基対合と同じ程度に位置し得る、遠位エンハンサまたは抑制エレメントを含んでもよい。プロモータは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、及び動物を含む源に由来してもよい。プロモータは、発現が生じる細胞、組織、もしくは器官に対して、発現が生じる発生段階に対して、または生理学的ストレス、病原体、金属イオン、または誘発剤などの外部刺激に応答して、構成的に、または特異的に遺伝子成分の発現を調節してもよい。プロモータの代表的な例としては、バクテリオファージＴ７プロモータ、バクテリオファージＴ３プロモータ、ＳＰ６プロモータ、ｌａｃオペレータ−プロモータ、ｔａｃプロモータ、ＳＶ４０後期プロモータ、ＳＶ４０初期プロモータ、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモータ、ＣＭＶ  ＩＥプロモータ、ＳＶ４０初期プロモータまたはＳＶ４０後期プロモータ、及びＣＭＶ  ＩＥプロモータが挙げられる。「フラタキシンプロモータ」は、細胞内のフラタキシンタンパク質の発現を可能にする（例えば、ヒトフラタキシンプロモータの部分配列に関して図２（配列番号１１）、及び完全プロモータ配列に関してフラタキシン遺伝子配列（配列番号８７、ＮＧ＿００８４５）を参照されたい）。一実施形態では、Ｕ６プロモータが、細胞内の１つ以上のｇＲＮＡを発現させるために使用される。
【００８０】
本明細書で使用される場合、「対象」及び「患者」は同義的に、哺乳動物（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、及びマウス、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザルまたはアカゲザル、チンパンジーなどのサル）、ならびにヒト）が挙げられるがこれらに限定されない、任意の脊椎動物を指す。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトまたは非ヒトであってもよい。一実施形態では、対象または患者は、ＦＲＤＡを患っている可能性があり、フラタキシン遺伝子のイントロン１内にトリヌクレオチド反復の異常な過剰伸長を有する変異フラタキシン遺伝子を有する。対象または患者は、他の形態の治療を受けていてもよい。
【００８１】
本明細書で使用される場合、「標的遺伝子」は、既知または推定の遺伝子生成物をコードする任意のヌクレオチド配列を指す。標的遺伝子は、遺伝的疾患に関与する変異遺伝子であってもよい。
【００８２】
本明細書で使用される場合、「ベクター」は、複製起点を含む核酸配列を意味する。ベクターは、ウイルスベクター、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または酵母人工染色体であってもよい。ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターであってもよい。ベクターは、自己複製染色体外ベクターであってもよく、好ましくは、ＤＮＡプラスミドである。例えば、ベクターは、ｄＣａｓ９−ＴＡＤ（例えば、ｄＣａｓ９−ＶＰ６４もしくはｄＣａｓ９−ＶＰ１６０）、ｄＣａｓ９−ｐｏｌｙＧＣＮ４（ｓｕｎｔａｇ）、ＭＳ２−ＴＡＤ（例えば、ＭＳ２−ｐ６５−ＨＦＳ１）、もしくは抗原結合タンパク質−ＴＡＤ（例えば、ｓｃＦＶ−ＶＰ６４もしくはｓｃＦＶ−ＶＰ１６０）融合タンパク質などの本発明の融合タンパク質をコードする、または少なくとも１つのｇＲＮＡ（例えば、配列番号５７〜６６）をコードする、核酸配列（複数可）を含んでもよい。代替的に、ベクターは、本発明の上記の融合タンパク質及び少なくとも１つのｇＲＮＡヌクレオチド配列（例えば、ｇＲＮＡ  Ａ、Ｃ、及び／もしくはＤ、または配列番号５７〜６６を含むｇＲＮＡ）のうちの１つ以上をコードする核酸配列（複数可）を含んでもよい。１つ以上のｇＲＮＡを発現させるためのベクターは、ｇＲＮＡの「ＤＮＡ」配列を含む。
【００８３】
［ｆｕｚｚｙ］別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。例えば、本明細書に記載される細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質及び核酸化学及びハイブリット形成に関連して使用される任意の命名法及びそれらの技術は、当該技術分野においてよく知られており、かつ一般的に使用されるものである。用語の意味及び範囲は明確であるべきであるが、任意の潜在的意味不確定の場合、本明細書に提供される定義が、任意の辞書または外部の定義に優先する。さらに、文脈によって別段必要とされない限り、単数形の用語が複数形を含むものとし、複数の用語形が単数形を含むものとする。
【００８４】
ＣＲＩＳＰＲ系
【００８５】
本明細書において同義的に使用される「修飾された規則的な間隔をもってクラスタ化された短鎖反復回文配列」及び「ＣＲＩＳＰＲ」は、約４０％の配列細菌及び９０％の配列古細菌のゲノム中に見られる複数の短い直列反復を含有する遺伝子座を指す。ＣＲＩＳＰＲ系は、獲得された免疫の形態を提供する侵入ファージ及びプラスミドに対する防御に関与する、微生物ヌクレアーゼ系である。この防御経路は、３つのステップを有する。最初に、侵入核酸のコピーがＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に組み込まれる。スペーサと呼ばれる外来ＤＮＡの短い断片が、ＣＲＩＳＰＲ反復間のゲノムに組み込まれ、過去の曝露の記憶として機能する。次に、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（すなわち、ｃｒＲＮＡ、標的特異性を付与する内因性細菌ＲＮＡ）が、このＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。次いで、ｃｒＲＮＡがエフェクタ複合体に組み込まれ、ｃｒＲＮＡは、複合体を侵入核酸に誘導し、Ｃａｓタンパク質は、この核酸を分解する。ＣＲＩＳＰＲ活性化のいくつかの経路があり、それらのうちの１つは、ｃｒＲＮＡの成熟において役割を果たすｔｒａｃｒＲＮＡを必要とする。ＴｒａｃｒＲＮＡは、ＲＮＡ二本鎖を形成するｐｒｅ−ｃｒＲＮＡに相補的であり、それと塩基対合する。これは、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッド（ｇＲＮＡ）を形成するために、ＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼであるＲＮａｓｅ  ＩＩＩによって開裂される。このハイブリッドは、侵入核酸を開裂するエンドヌクレアーゼＣａｓ９のためのガイドとして作用する。
【００８６】
Ｃａｓ９は、ｇＲＮＡの３’末端と複合体を形成し、タンパク質−ＲＮＡの対合は、プロトスペーサとして既知の、ｇＲＮＡ配列の５’末端と所定の２０ｂｐ  ＤＮＡ配列との間の相補的塩基対合によって、そのゲノム標的を認識する。この複合体は、ｃｒＲＮＡ内でコードされる領域を介して病原体ＤＮＡの相同遺伝子座、すなわち、プロトスペーサ、及び病原体ゲノム内のプロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）に誘導される。非コードＣＲＩＳＰＲアレイは、Ｃａｓヌクレアーゼを標的部位（プロトスペーサ）に誘導する、個々のスペーサ配列を含む短いｃｒＲＮＡに転写され、直列反復内で開裂される。発現されたｇＲＮＡの２０ｂｐ認識配列を単純に交換することによって、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、新しいゲノム標的に誘導され得る。ＣＲＩＳＰＲスペーサは、真核生物内のＲＮＡｉに類似した方法で外来遺伝子エレメントを認識及び抑制するために使用される。
【００８７】
３種類のＣＲＩＳＰＲ系（Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩ型エフェクタ系）が既知である。ＩＩ型エフェクタ系は、ｄｓＤＮＡを開裂するために、単一のエフェクタ酵素、Ｃａｓ９を使用して、４つの順次ステップで、標的化されたＤＮＡ二重鎖切断を実施する。複合体として作用する複数の異なるエフェクタを必要とするＩ型及びＩＩＩ型エフェクタ系と比較して、ＩＩ型エフェクタ系は、真核細胞などの代替の背景において機能し得る。ＩＩ型エフェクタ系は、スペーサ含有ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される長いｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ、Ｃａｓ９タンパク質、及びｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ処理に関与するｔｒａｃｒＲＮＡからなる。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡのスペーサを分離する反復領域とハイブリッド形成し、しがたって、内因性ＲＮａｓｅ  ＩＩＩによるｄｓＲＮＡ開裂を開始する。この開裂の後には、Ｃａｓ９による各スペーサ内の第２の開裂事象が続き、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びＣａｓ９と関連した状態のままである成熟ｃｒＲＮＡを生成し、Ｃａｓ９：ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を形成する。
【００８８】
Ｃａｓ９：ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体は、ＤＮＡ二本鎖を巻き戻し、開裂するｃｒＲＮＡとマッチする配列を探す。標的認識は、標的ＤＮＡ中の「プロトスペーサ」配列とｃｒＲＮＡ中の残りのスペーサ配列との間の相補性の検出後に生じる。Ｃａｓ９は、正しいプロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）もまたプロトスペーサの３’末端に存在する場合、標的ＤＮＡの開裂を仲介する。プロトスペーサ標的化のために、配列の後には、ＤＮＡ開裂に必要とされるＣａｓ９ヌクレアーゼによって認識される短配列である、プロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）がすぐに続かなければならない。Ｃａｓ９ファミリーの成員は、異なるプロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）を必要とする（Ｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）。上記の通り、ＰＡＭは、ｇＲＮＡによって標的化されたヌクレオチド配列に続かなければならないヌクレオチドの配列である。異なるＩＩ型系は、異なるＰＡＭ要件を有する。したがって、ｇＲＮＡによる特定のポリヌクレオチド標的配列（例えば、フラタキシンプロモータ上の）の選択は、使用される組換えｄＣａｓタンパク質に基づく。
【００８９】
化膿レンサ球菌ＣＲＩＳＰＲ系は、５’−ＮＲＧ−３’としてこのＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）に対するＰＡＭ配列を有してもよく、ここで、Ｒは、ＡまたはＧのいずれかであり、ヒト細胞内のこの系の特異性を特徴付けた。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の特有の能力は、２つ以上のｓｇＲＮＡ（少なくとも１、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のｇＲＮＡ）と単一のＣａｓ９タンパク質を共発現させることによって、複数の異なるゲノム遺伝子座を同時に標的化する単純な能力である。例えば、化膿レンサ球菌ＩＩ型系は、「ＮＧＧ」配列を使用することを自然に好むが（ここで、「Ｎ」は任意のヌクレオチドであってもよい）、操作された系内の「ＮＡＧ」などの他のＰＡＭ配列も受容する。同様に、髄膜炎菌由来のＣａｓ９（ＮｍＣａｓ９）は、通常、ＮＮＮＮＧＡＴＴの天然ＰＡＭを有するが、高度に変性したＮＮＮＮＧＮＮＮ  ＰＡＭを含む、様々なＰＡＭにわたって活性を有する。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース系
【００９０】
化膿レンサ球菌の操作された形態のＩＩ型エフェクタ系は、ゲノム操作のためにヒト細胞内で機能することが示された。この系において、Ｃａｓ９タンパク質は、概してＲＮａｓｅ  ＩＩＩ及びｃｒＲＮＡ処理の必要性を取り除くｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ融合である、合成的に再構成された「ガイドＲＮＡ」（キメラ単一ガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」）と本明細書において同義的に使用される「ｇＲＮＡ」）によってゲノム標的部位に誘導された。それは、「ｇＲＮＡガイド配列」または「ｇＲＮＡ標的配列」及びＣａｓ９認識配列を含み、それは、標的遺伝子に結合するＣａｓ（例えば、Ｃａｓ９）のために必要である。ｇＲＮＡガイド配列は、特異性を付与する配列である。それは、標的配列の逆鎖とハイブリッド形成する（すなわち、それは、標的配列の逆鎖に相補的である）（すなわち、それは、ＤＮＡ標的配列のＲＮＡ配列に対応する）。
【００９１】
細胞内のフラタキシン発現を増加させるのに使用するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの操作された系が本明細書に提供される。本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの操作された系は、ＦＲＤＡを患う、またはフラタキシン遺伝子の最初のイントロン内の過剰なトリヌクレオチド伸長（それは、イントロ１内の過剰伸長を有しない対象と比較して、フラタキシン発現を低減する）を有する対象からの細胞など、細胞内のフラタキシン遺伝子転写を増加させるために、かつ最終的にフラタキシンタンパク質のレベルを増加させるために、フラタキシンプロモータを標的化するように設計される。本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）ベース系は、不活性Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）融合タンパク質（ヌクレアーゼ活性、ｄＣａｓ（例えば、ｄＣａｓ９）を欠いた）と、少なくとも１つのｇＲＮＡとを含む。
【００９２】
一実施形態では、不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）融合タンパク質は、ヌクレアーゼ活性を欠いた不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）ポリペプチドドメインと、Ｃａｓ９に対して内因性である異なる活性を有するポリペプチドドメインとを含む。
【００９３】
第１の態様では、Ｃａｓ９に対して内因性である異なる活性を有するポリペプチドドメインは、転写活性化活性を有する（ｄＣａｓ９ポリペプチドドメインは、転写活性化剤に融合される）。一実施形態では、ｄＣａｓ９融合タンパク質は、１つ以上の（少なくとも１つの）転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）（ｄＣａｓ９／ＴＡＤ）を含むポリペプチドドメインを含む。ｄＣａｓ９／ＴＡＤが転写活性化活性を有するという事実は、フラタキシンプロモータ配列を標的化するｇＲＮＡと組み合わせて使用されるときにフラタキシン発現の増加を可能にする。
【００９４】
第２の態様では、本発明のＣＲＳＰＲ／ｄＣａｓ９系は、３成分修飾ＣＲＩＳＰＲ系である。それは、ｇＲＮＡと、ｄＣａｓ９融合タンパク質と、転写活性化ドメイン（例えば、ＶＰ１６、ＶＰ６４、ＶＰ１６０）を含む抗原結合活性（例えば、抗体またはｓｃＦｖフラグメント）を有する融合タンパク質とを含む。この系において、ｄＣａｓ９融合タンパク質は、ヌクレアーゼ活性を欠いた不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）ポリペプチドドメインと、少なくとも１つのエピトープを含むポリペプチドドメインとを含む。好ましくは、ペプチドエピトープ（例えば、ＧＣＮ４ペプチド、配列番号４）の複数の反復は、ｄＣａｓ９に融合される。このペプチドエピトープは、抗原結合活性を有する融合タンパク質によって認識される。ｄＣａｓ９融合タンパク質上のペプチドエピトープの複数の反復の存在は、フラタキシンプロモータ上の単一標的部位における複数の転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）を動員することを可能にし、それによりその発現をさらに増加させる。（Ｔａｎｅｎｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１４及び図１３）。
【００９５】
第３の態様では、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース系もまた、３成分系である。それは、修飾ｇＲＮＡ（ＭＳ２−ｇＲＮＡ）と、ｄＣａｓ９−ＴＡＤ融合タンパク質と、ＭＳ２−ＴＡＤ融合タンパク質とを含んでもよい。ＭＳ２／ＴＡＤ融合タンパク質は、ＭＳ２ポリペプチド（配列番号７）と、少なくとも１つの転写活性化ドメインとを含んでもよい。ＭＳ２−ｇＲＮＡは、少なくとも１つのＭＳ２ヌクレオチド配列（配列番号６８、図１８）を含む。一実施形態では、２つのＭＳ２ヌクレオチド配列、ｇＲＮＡのテトラループ内に１つ及びステムループ内に１つがｇＲＮＡに含まれる。一実施形態では、ＭＳ２ペプチドと２つのＴＡＤ（例えば、ｐ６５及びＨＳＦ１転写活性化ドメイン（ＴＡＤ））とを含む融合タンパク質は、ｇＲＮＡに含まれるＭＳ２ヌクレオチド配列のそれぞれに結合する。複数のＴＡＤ（例えば、ｄＣａｓ９／ＴＡＤタンパク質上のＶＰ６４／ＶＰ１６０ならびにＭＳ２／ＴＡＤ融合タンパク質上のｐ６５及びＨＳＦ１）の存在は、ｇＲＮＡによって標的化される遺伝子（フラタキシン）の転写に対して強い相乗効果を生み出す。（Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１４、図１４を参照されたい）。
【００９６】
本発明に従って、標的フラタキシン遺伝子は、イントロン１内のＧＡＡトリプレットの過剰伸長を有してもよく、または有しなくてもよい。一実施形態では、標的フラタキシン遺伝子は、イントロン１内に少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも５００、またはそれ以上のＧＡＡトリプレットを含む変異遺伝子である。一実施形態では、標的フラタキシン遺伝子は、ＦＲＤＡを患う対象からである。一実施形態では、標的遺伝子は、ＦＲＤＡを患っていない健康な対象からの正常な遺伝子である。
ａ．不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ）
【００９７】
野生型Ｃａｓ９タンパク質は、核酸を開裂するエンドヌクレアーゼであり、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座によってコードされ、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系に関与する。Ｃａｓ９タンパク質は、化膿レンサ球菌（Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）、及び髄膜炎菌（Ｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）を含む細菌の多くの種によって生成される。本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース系は、エンドヌクレアーゼ活性がない不活性Ｃａｓ９タンパク質（ｄＣａｓ９）またはｄＣａｓ９融合タンパク質を使用する。本明細書で使用される場合、「ｉＣａｓ９」及び「ｄＣａｓ９」の両方は、そのヌクレアーゼ活性が不活性化されたＣａｓ９タンパク質を指す。本発明に従って使用される不活性Ｃａｓ９タンパク質は、任意の細菌または古細菌種からのＣａｓ９に由来してもよい。したがって、本発明のｄＣａｓ９融合タンパク質（すなわち、ｄＣａｓ９融合タンパク質中のｄＣａｓ９ポリペプチドドメイン）は、ｉ）任意の自然発生のＣａｓに由来し、かつｉｉ）そのようなタンパク質と通常関連するヌクレアーゼ活性を欠いている。ｄＣａｓ９融合タンパク質は、Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性を不活性化する少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含む（図１９、配列番号３５）。
【００９８】
一実施形態では、本発明のｄＣａｓ９融合タンパク質のアミノ酸配列は、図１９に記載されるＣａｓ９配列（配列番号３５）と少なくとも９５％（実施形態において、少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％）同一のアミノ酸配列を含み、Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性を不活性化する少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含む。
【００９９】
いくつかの突然変異は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性の不活性化を引き起こすことが既知である（例えば、図２０を参照されたい）。本発明のｄＣａｓ９融合タンパク質は、それがヌクレアーゼ活性を欠いているが、なお許容できる標的ＤＮＡ結合活性を提供する限り、任意の突然変異または突然変異の組み合わせ（図２０に列挙されるものなど）を含んでもよい。実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸突然変異は、アミノ酸位置１０及び／または８４０にあってもよく、例えば、少なくとも１つのアミノ酸突然変異は、図１９に示されるＣａｓ９配列のアミノ酸位置番号に対してＤ１０Ａ及びＨ８４０Ａのうちの少なくとも１つであってもよい。他の実施形態では、少なくとも１つの突然変異は、図２０に列挙されるものから選択される。一実施形態では、少なくとも１つの突然変異は、図１９に記載されるＣａｓ９アミノ酸配列のアミノ酸位置番号に対してアミノ酸位置１０、１５、６６、７０、７４、７８、８４０、またはこれらの任意の組み合わせにあってもよい。一実施形態では、本発明のｄＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、図１６に記載されるｄＣａｓ９配列（配列番号３３）と少なくとも９５％（実施形態において、少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％）同一のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、本発明のｄＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、図３に記載される配列（配列番号３２）のアミノ酸１０〜１４０７と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。
【０１００】
特定の実施形態では、ｄＣａｓ９融合タンパク質中のｄＣａｓ９ポリペプチドドメインは、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９（配列番号３５）に由来し、アミノ酸位置１０及び／または８４０における突然変異を含む（例えば、突然変異Ｄ１０Ａ及び／またはＨ８４０Ａ）。ｄＣａｓ９タンパク質の一実施例は、図１６に示される（配列番号３３）。
ｄＣａｓ９融合タンパク質及びＭＳ２融合タンパク質
【０１０１】
本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベース系／フラタキシン標的系は、１つ以上の（少なくとも１つの）融合タンパク質を含む。融合タンパク質は、２つの異種ポリペプチドドメインを含んでもよく、第１のポリペプチドドメインは、ヌクレアーゼ活性（ｄＣａｓ９）を欠いている不活性Ｃａｓ９ポリペプチドと、転写活性化活性などのｄＣａｓ９ポリペプチドとは異種の活性を有する第２のポリペプチドドメインとを含むか、または抗原結合活性を有する第２の融合タンパク質（抗原結合タンパク質）と相互作用する少なくとも１つのペプチドエピトープを含む。
【０１０２】
第１の態様では、融合タンパク質は、フラタキシンプロモータを標的化する適切なｇＲＮＡの存在下にあるとき、フラタキシン遺伝子の転写及びフラタキシンタンパク質の発現を誘発するために、転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）などの転写活性化活性を有する第２のポリペプチドドメインに融合した、上記のｄＣａｓ９ポリペプチドドメインを含む、ｄＣａｓ９／ＴＡＤ融合タンパク質である。したがって、一実施形態では、本発明のｄＣａｓ９／ＴＡＤ融合タンパク質は、他のタンパク質（例えば、転写共調節因子）のための結合部位、ならびに標的フラタキシン遺伝子の転写及びフラタキシンタンパク質の発現を活性化するための機能を含む、「転写活性化ドメイン」または「トランス活性化ドメイン」（ＴＡＤ）のうちの１つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を含む。
【０１０３】
例えば、ヒトフラタキシン遺伝子などの内因性哺乳類遺伝子の遺伝子発現は、１つ以上のｇＲＮＡを介して、ｄＣａｓ９／ＴＡＤ融合タンパク質をフラタキシンプロモータに標的化することによって達成されてもよい。トランス活性化ドメインは、ＶＰ４８ドメイン、ＶＰ６４ドメイン、ＶＰ１６０ドメインなど、ＶＰ１６タンパク質、複数のＶＰ１６タンパク質を含んでもよい。例えば、融合タンパク質は、少なくとも１つの好適なｇＲＮＡの存在下にあるときにフラタキシンプロモータの転写を可能にする、ｄＣａｓ９−ＶＰ６４、もしくはｄＣａｓ９−ＶＰ１６０（例えば、配列番号３２もしくは配列番号３３）、またはこれらの機能的な変異体であってもよい。
【０１０４】
別の態様では、融合タンパク質は、不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）ポリペプチドドメインとＴＡＧポリペプチドドメインとを含み、抗原結合活性及び転写活性化活性を有する第２の融合タンパク質またはポリペプチドによって認識される少なくとも１つのポリペプチドエピトープ、例えば、ＧＣＮ４ポリペプチド（配列番号４））を含む、ｄＣａｓ９／ＴＡＧ融合タンパク質である。一実施形態では、ｄＣａｓ／ＴＡＧ融合タンパク質は、１０個のペプチドエピトープを含む。一実施形態では、ｄＣａｓ９融合タンパク質のＴＡＧポリペプチドドメインは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１６、少なくとも２０、または少なくとも２４個のペプチドエピトープを含む。一実施形態では、ｄＣａｓ９／ＴＡＤ融合タンパク質は、１０個のＧＣＮ４エピトープを含む。一実施形態では、ｄＣａｓ９／ＴＡＧ融合タンパク質のＴＡＧポリペプチドドメインは、配列番号５または６）に記載される配列を含む。
【０１０５】
一実施形態では、第２の融合タンパク質（抗原結合融合タンパク質）は、転写活性化活性を有し、少なくとも１つのペプチドエピトープを含むｄＣａｓ９／ＴＡＧ融合タンパク質に結合することが可能である。一実施形態では、抗原結合融合タンパク質は、１つ以上の（少なくとも１つの）ＴＡＤに結合される抗体、または抗原結合タンパク質、またはポリペプチドである（図１３）。一実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＶＰ６４またはＶＰ１６０と結合される単鎖可変フラグメント（ＳｃＦｖ）である（Ｔａｎｅｎｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。１つ以上のトランス活性化ドメインは、フラタキシン発現を増加させるために、フラタキシンプロモータ上の標的部位における転写活性化剤及びエフェクタの動員を可能にする。
【０１０６】
一実施形態では、ｄＣａｓ９／ＴＡＧは、リンカー（例えば、ＧＳＧＳＧ、配列番号５６）で間を埋められた、ペプチドエピトープ（例えば、ＧＣＮ４ペプチドエピトープＥＥＬＬＳＫＮＹＨＬＥＮＥＶＡＲＬＫＫ、配列番号４、図１７を参照されたい）の複数の反復に融合したｄＣａｓ９ポリペプチドを含む。
【０１０７】
第３の態様では、本発明は、転写活性化活性（１つ以上のＴＡＤを含む）を有する修飾ｇＲＮＡ及びｄＣａｓ９／ＴＡＤ融合タンパク質と併用されるＭＳ２／ＴＡＤ融合タンパク質を提供する。ＭＳ２／ＴＡＤ融合タンパク質は、ＭＳ２ドメイン（例えば、配列番号７、修飾ｇＲＮＡ上の特定のヌクレオチド配列を認識する）と、少なくとも２つのＴＡＤ（例えば、図１５を参照されたい）とを含む。一実施形態では、ＭＳ２／ＴＡＤ融合タンパク質は、ＭＳ２ポリペプチドと、ｐ６５ポリペプチド（配列番号８、図１５Ｃ）と、ＨＳＦ１ポリペプチド（配列番号９、図１５Ｄ）とを含む。一実施形態では、ＭＳ２融合タンパク質は、転写活性化活性を有し、かつＭＳ２ヌクレオチド配列（図１８及び配列番号６８）を含む修飾ｇＲＮＡに結合する、図１５Ａに記載される配列（配列番号１０）またはその変異体を含む。好ましくは、ＭＳ２融合タンパク質は、ＭＳ２ドメインとＴＡＤとの間にリンカーを含む。図１５は、本発明の一実施形態に従った、ＭＳ２−ｐ６５−ＨＳＦ１融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。
【０１０８】
ｇＲＮＡ
【０１０９】
ｇＲＮＡは、本発明の標的化特異性を提供する。ｇＲＮＡは、ｄＣａｓ９ベース系に対する標的化特異性及びＣＲＩＳＰＲ／スキャフォールド／結合能力の両方を提供する。本発明のｇＲＮＡは、自然界に存在しない、すなわち、自然発生ではない核酸である。
【０１１０】
本発明のｇＲＮＡは、概して、「ｇＲＮＡガイド配列」または「ｇＲＮＡ標的配列」及びＣａｓ（例えば、Ｃａｓ９）認識配列を含み（またはそれらからなり）、それは、標的フラタキシン遺伝子に結合するＣａｓ／ｄＣａｓ（例えば、Ｃａｓ９／ｄＣａｓ９）のために必要である。特定の実施形態では、Ｃａｓ９認識配列は、配列（配列番号６７）を含む（またはそれからなる）。本発明のｇＲＮＡは、この配列の任意の変異体を含んでもよいが、ただし、それがフラタキシン標的プロモータ配列上の本発明のｄＣａｓ９融合タンパク質の結合を可能にすることを条件とする。
【０１１１】
「ｇＲＮＡ標的配列」または「ｇＲＮＡガイド配列」は、標的フラタキシン遺伝子に結合する核酸配列である。この配列は、ゲノムフラタキシンＤＮＡ中のＰＡＭ配列の直前にある（すなわち、それに対して５’）。それは、ｇＲＮＡ発現構築物（例えば、ベクター／プラスミド／ＡＶＶ）になるものであり、それは、ＰＡＭ配列を含まない。「ＰＡＭ」（プロトスペーサ隣接モチーフ）は、フラタキシン遺伝子上の標的配列のすぐ後に続く（それに隣接する）が、ｇＲＮＡ中にはない、核酸配列である。
【０１１２】
本明細書において同義的に使用される「標的領域」、「標的配列」、または「プロトスペーサ」は、ＰＡＭを伴わない、ＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ９ベース系によって標的化される標的遺伝子の領域を指す。ＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ９ベース系は、少なくとも１つのｇＲＮＡを含んでもよく、ｇＲＮＡは、フラタキシンプロモータ上の異なるＤＮＡ配列を標的化する。標的ＤＮＡ配列は、重複していてもよい。標的配列またはプロトスペーサの後には、プロトスペーサの３’末端におけるＰＡＭ配列が続く（例えば、（それに隣接する）。一実施形態では、標的配列は、ＰＡＭ配列に直接隣接し、ＰＡＭの５’末端に位置する。
【０１１３】
ｇＲＮＡは、ＰＡＭ配列が後に続くフラタキシンＤＮＡプロモータ上の標的配列に対応する、「ｇＲＮＡガイド配列」または「ｇＲＮＡ標的配列」を含む。ｇＲＮＡは、ポリヌクレオチド配列５’末端において「Ｇ」を含んでもよい。本発明のＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ９系は、様々な長さのｇＲＮＡを使用してもよい。ｇＲＮＡは、ＰＡＭ配列が後に続く、少なくとも１０ｎｔ、少なくとも１１ｎｔ、少なくとも１２ｎｔ、少なくとも１３ｎｔ、少なくとも１４ｎｔ、少なくとも１５ｎｔ、少なくとも１６ｎｔ、少なくとも１７ｎｔ、少なくとも１８ｎｔ、少なくとも１９ｎｔ、少なくとも２０ｎｔ、少なくとも２１ｎｔ、少なくとも２２ｎｔ、少なくとも２３ｎｔ、少なくとも２４ｎｔ、少なくとも２５ｎｔ、少なくとも３０ｎｔ、または少なくとも３５ｎｔの標的フラタキシンプロモータＤＮＡ配列を含んでもよい。「ｇＲＮＡガイド配列」または「ｇＲＮＡ標的配列」は、最低で１７個のヌクレオチド（１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３）、好ましくは１７〜３０ｎｔの長さ、より好ましくは１８〜２２個のヌクレオチドの長さであってもよい。一実施形態では、ｇＲＮＡガイド配列は、１０〜４０、１０〜３０、１２〜３０、１５〜３０、１８〜３０、または１０〜２２個のヌクレオチドの長さである。ＰＡＭ配列は、「ＮＧＧ」であってもよく、ここで、「Ｎ」は、任意のヌクレオチドであってもよい。ｇＲＮＡは、フラタキシン遺伝子のエンハンサ領域を含むＰＡＭ（例えば、ＮＧＧ）配列のすぐ上流にある（接触、隣接、５’において）、フラタキシンプロモータの任意の領域を標的化してもよい（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ＥＮＳＧ０００００１６５０６０；ＯＭＩＭ：６０６８２９、図２の部分フラタキシンプロモータ配列も参照されたい）。一実施形態では、ｇＲＮＡは、図２のフラタキシンプロモータ配列（配列番号１１）上で識別されるＰＡＭが後に続く、任意の領域を標的化してもよい。
【０１１４】
「ｇＲＮＡガイド配列」とそれがフラタキシンプロモータ上で結合するＤＮＡ鎖との間の完璧なマッチが好ましいが、ｇＲＮＡガイド配列とフラタキシンプロモータ配列上の標的塩基との間のミスマッチもまた、それがなおフラタキシン発現の増加を可能にする限り、認められる。標的遺伝子配列に完全に相補的なｇＲＮＡ上の８〜１２個の連続ヌクレオチドの「シード」配列は、フラタキシンプロモータ上の標的配列の適切な認識のために好ましい。ガイド配列の残りの部分は、１つ以上のミスマッチを含んでもよい。
【０１１５】
概して、ｇＲＮＡ活性は、ミスマッチの数と逆の相関関係がある。好ましくは、本発明のｇＲＮＡは、対応する標的フラタキシンプロモータ配列と７つのミスマッチ、６つのミスマッチ、５つのミスマッチ、４つのミスマッチ、３つのミスマッチ、より好ましくは２つのミスマッチ、またはそれ以下を含み、さらにより好ましくはミスマッチを含まない。ｇＲＮＡ中のヌクレオチドの数が小さいほど、許容されるミスマッチの数は小さくなる。結合親和性は、マッチするｇＲＮＡ−ＤＮＡの組み合わせの合計に依存すると考えられる。
【０１１６】
ｇＲＮＡガイド配列の非限定的な実施例が図１８に示される。特定の実施形態では、「ｇＲＮＡガイド配列」は、配列番号７１〜７４に記載される核酸配列を含むか、またはそれからなる。一実施形態では、ｇＲＮＡは、ＮＣＢＩ参照番号ＮＧ＿００８８４５を有するフラタキシンプロモータポリヌクレオチド配列のヌクレオチド位置４２４６〜４２６４、位置４６５２〜４６７０、位置４８４１〜４８５９、位置５００５〜５０２３、または位置５０８９〜５１０７の標的配列を含む（図２及び配列番号８７もまた参照されたい）。
【０１１７】
一実施形態では、フラタキシンプロモータ上のｇＲＮＡ標的配列は、図２に示されるヌクレオチド配列に対して５１０７位において終端する（または５１０７位及び上流を含む配列を含む）（すなわち、５１０８位で開始するＮＧＧ配列に隣接する）。一実施形態では、フラタキシンプロモータ上のｇＲＮＡ標的配列は、図２に示されるヌクレオチド配列に対して４８５９位において終端する（または４８５９位及び上流を含む配列を含む）（すなわち、４８６０位で開始するＮＧＧ配列に隣接する）。一実施形態では、フラタキシンプロモータ上のｇＲＮＡ標的配列は、図２に示されるヌクレオチド配列に対して４６７０位において終端する（または４６７０位及び上流を含む配列を含む）（すなわち、４６７１位で開始するＮＧＧ配列に隣接する）。一実施形態では、フラタキシンプロモータ上のｇＲＮＡ標的配列は、図２に示されるヌクレオチド配列に対して４７０１位において終端する（または４７０１位及び上流を含む配列を含む）（すなわち、４７０２位で開始するＮＧＧ配列に隣接する）。一実施形態では、フラタキシンプロモータ上のｇＲＮＡ標的配列は、図２に示されるヌクレオチド配列に対して４７４２位において終端する（または４７４２位及び上流を含む配列を含む）（すなわち、４７４３位で開始するＮＧＧ配列に隣接する）。
【０１１８】
一実施形態では、フラタキシンプロモータ上のｇＲＮＡ標的配列は、ｐｏｌｙＧまたはｐｏｌｙＣが豊富ではない。一実施形態では、フラタキシンプロモータ上のｇＲＮＡ標的配列は、２つ以上のＰＡＭ（例えば、ＮＧＧ配列）を含まない。一実施形態では、フラタキシンプロモータ上のｇＲＮＡ標的配列は、ＮＧＧを含まない（それはＰＡＭには隣接するが）。一実施形態では、ｇＲＮＡ標的配列は、図２に示されるフラタキシンプロモータ配列（ＮＧ＿００８８４５、配列番号８７）の
・ヌクレオチド３９６１〜４２５８、
・ヌクレオチド４２６８〜４９５１３、
・ヌクレオチド４２６８〜４９９６、
・ヌクレオチド５０２７〜５１５０、
・ヌクレオチド４２６８〜４５９５、
・ヌクレオチド４６２１〜４９９６、
・ヌクレオチド４５６１〜４９９６、または
・ヌクレオチド４２８０〜５０００、
の間に位置するＰＡＭ（ＮＧＧ配列）の上流に、かつそれに隣接して、１０〜２２個の連続ヌクレオチド、好ましくは１８〜２２個の連続ヌクレオチドを含む。
【０１１９】
本発明の方法に従って細胞または対象に投与されるか、またはその中で発現するｇＲＮＡの数は、少なくとも１個のｇＲＮＡ、少なくとも２個のｇＲＮＡ、少なくとも３個のｇＲＮＡ  少なくとも４個のｇＲＮＡ、少なくとも５個のｇＲＮＡ、少なくとも６個のｇＲＮＡ、少なくとも７個のｇＲＮＡ、少なくとも８個のｇＲＮＡ、少なくとも９個のｇＲＮＡ、少なくとも１０個のｇＲＮＡ、少なくとも１１個のｇＲＮＡ、少なくとも１２個のｇＲＮＡ、少なくとも１３個のｇＲＮＡ、少なくとも１４個のｇＲＮＡ、少なくとも１５個のｇＲＮＡ、少なくとも１６個のｇＲＮＡ、少なくとも１７個のｇＲＮＡ、または少なくとも１８個のｇＲＮＡであってもよい。細胞に投与されるか、またはその中で発現するｇＲＮＡの数は、少なくとも１個のｇＲＮＡ〜少なくとも１５個のｇＲＮＡ、少なくとも１個のｇＲＮＡ〜少なくとも１０個のｇＲＮＡ、少なくとも１個のｇＲＮＡ〜少なくとも８個のｇＲＮＡ、少なくとも１個のｇＲＮＡ〜少なくとも６個のｇＲＮＡ、少なくとも１個のｇＲＮＡ〜少なくとも４個のｇＲＮＡ、少なくとも１個のｇＲＮＡ〜少なくとも３個のｇＲＮＡ、少なくとも２個のｇＲＮＡ〜少なくとも５個のｇＲＮＡ、少なくとも２個のｇＲＮＡ〜少なくとも３個のｇＲＮＡであってもよい。
【０１２０】
特定の実施形態では、図１８に示されるｇＲＮＡガイド配列（配列番号６９〜７３）を含む少なくとも２つのｇＲＮＡの組み合わせが一緒に使用されて、フラタキシン発現を増加させる。特定の実施形態では、配列ｉ）ＡＧＣＵＧＧＧＡＡＧＵＵＣＵＵＣＣＵＧ（ＣＲＩＳＰ  Ａ、配列番号６９）、ｉｉ）ＡＣＡＣＡＡＧＧＣＡＵＣＣＧＵＣＵＣＣ（ＣＲＩＳＰ  Ｃ、配列番号７１）、またはｉｉｉ）ＵＡＵＵＵＡＵＵＧＵＧＣＡＣＵＵＡＡＣ（ＣＲＩＳＰ  Ｄ、配列番号７２）を含む（またはそれからなる）ｇＲＮＡガイド配列を含む、少なくとも２つのｇＲＮＡの組み合わせが一緒に使用されて、細胞内のフラタキシン発現を増加させる。
トランス活性化ドメイン（ＴＡＤ）
【０１２１】
本発明の文脈で使用される「トランス活性化ドメイン（複数可）」また「は転写活性化ドメイン（複数可）」（ＴＡＤ（複数可））は、転写活性を有する（標的核酸の転写を活性化または強化することが可能である）ポリペプチドを指す。ＴＡＤは、典型的には、それらのアミノ酸組成物にちなんで名付けられる。これらのアミノ酸は、活性に不可欠であるか、または単にＴＡＤ内で最も豊富であるかのいずれかである。Ｇａｌ４転写因子によるトランス活性化が酸性アミノ酸によって仲介される一方で、Ｇｃｎ４中の疎水性残基は、同様の役割を果たす。したがって、Ｇａｌ４及びＧｃｎ４中のＴＡＤは、それぞれ酸性または疎水性活性化ドメインと称される。
【０１２２】
９アミノ酸トランス活性化ドメイン（９  ａａＴＡＤ）は、酵母中のＧａｌ４、Ｏａｆ１、Ｌｅｕ３、Ｒｔｇ３、Ｐｈｏ４、Ｇｌｎ３、Ｇｃｎ４によって、かつ哺乳動物中のｐ５３、ＮＦＡＴ、ＮＦ−κＢ、及びＶＰ１６によって表される、真核転写因子の大きなスーパーファミリーに共通する新規のドメインを定義する。９  ａａ  ＴＡＤに関する（酸性及び親水性トランス活性化ドメインの両方に関する）予測は、ＥｘＰＡＳｙ(商標)及びＥＭＢｎｅｔ(商標)データベースからオンラインで入手可能である。
【０１２３】
一般的な共活性化因子Ｍｅｄ１５（Ｇａｌ１１）のＫＩＸドメインは、９  ａａ  ＴＡＤ転写因子Ｇａｌ４、Ｐｄｒ１、Ｏａｆ１、Ｇｃｎ４、ＶＰ１６、Ｐｈｏ４、Ｍｓｎ２、Ｉｎｏ２、及びＰ２０１と相互作用する。９ａａＴＡＤは、複数の一般的な共活性化因子（例えば、ＴＡＦ９、ＭＥＤ１５、ＣＢＰ／ｐ３００、及びＧＣＮ５）を動員する一般的なトランス活性化ドメインである。したがって、本発明に従って使用され得るＴＡＤの非限定的な例としては、Ｇａｌ４、Ｐｄｒ１、Ｏａｆ１、Ｇｃｎ４、Ｐｈｏ４、Ｍｓｎ２、Ｉｎｏ２、Ｐ２０１、ｐ５３、Ｇｌｉ３、Ｐｄｒ３、ＣＲＥＢ、Ｒｔｇ３、ＶＰ１６、ＭＬＬ、Ｅ２Ａ、ＨＳＦ１、ＮＦ−ＩＬ６、ＮＦＡＴ１、及びＮＦ−ｋβからのＴＡＤが挙げられる。ＴＡＤの他の非限定的な例としては、ＳＲＦ、ＴＦＡＰ２、またはＳＰ１転写因子からのＴＡＤが挙げられ、それらの標的配列がフラタキシンプロモータ中で識別されている（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。当然のことながら、ＴＡＤの選択は、遺伝子が発現する細胞の特定の種類ならびに遺伝子の性質を含む、多くの要因に依存する。さらに、２つ以上のＴＡＤが本発明の本発明の融合タンパク質（例えば、ｄＣａｓ９／ＴＡＤ構築物、ＭＳ２／ＴＡＤペプチド構築物、または抗原結合タンパク質／ＴＡＤ構築物）中に含まれ得ることが理解され得る。同様に、また、同じまたは異なるペプチド配列を有する複数のＴＡＤが本発明に従って使用され得る。一実施形態では、本発明のｄＣａｓ９タンパク質／ＭＳ２融合またはその抗体／フラグメントに融合したＴＡＤは、ＶＰ１６  ＴＡＤの配列の１０回に対応するＶＰ１６０である（図４及び５を参照されたい）。一実施形態では、ＴＡＤは、１〜１５回、好ましくは５〜１２回、より好ましくは１０回反復される配列ＤＡＬＤＤＦＤＬＤＭＬ（配列番号１７）を有する。各ＴＡＤ反復は、通常、小さいリンカー配列（例えば、２つのアミノ酸リンカーＧＳ）で間を埋められている。
表１：転写因子からのＴＡＤの実施例。
【表１】
2017514513.tif 000003
核局在化シグナル
【０１２４】
本発明の融合組換えタンパク質はまた、少なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含んでもよい。したがって、本明細書で使用される場合、「核局在化シグナル」または「ＮＬＳ」という表現は、核輸送による細胞核内への取り込みのためにタンパク質を「誘導する」アミノ酸配列を指す。典型的には、このシグナルは、タンパク質表面上に曝露される正電荷を有するリシンまたはアルギニンの１つ以上の短配列からなる。異なる核局在化タンパク質が同じＮＬＳを共有してもよい。ＮＬＳは、核の外のタンパク質を標的化する核外搬出シグナルの反対の機能を有する。典型的なＮＬＳは、一分または二分のいずれかにさらに分類され得る。発見された最初のＮＬＳは、ＳＶ４０ラージＴ抗原（一分ＮＬＳ）中の配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１２）であった。ヌクレオプラスミンのＮＬＳ、ＫＲ［ＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡ］ＫＫＫＫ（配列番号１３）は、遍在二分シグナル：約１０個のアミノ酸のスペーサによって分離される、塩基性アミノ酸の２つのクラスタの原型である。
【０１２５】
ｈｎＲＮＰ  Ａ１の酸性Ｍ９ドメイン、酵母転写抑制体Ｍａｔα２中の配列ＫＩＰＩＫ、Ｕ  ｓｎＲＮＰの複合体シグナル、ならびにＰＹ−ＮＬＳとして既知の近年識別された種類のＮＬＳなどの「非典型」になるものである、多くの他の種類のＮＬＳがある。したがって、任意の種類のＮＬＳ（典型または非典型）が、それが標的細胞の核内に対象のタンパク質を標的化する限り、本発明に従って使用され得る。好ましくは、ＮＬＳは、シミアンウイルス４０ラージＴ抗原に由来する。一実施形態では、本発明のｄＣａｓ９融合タンパク質のＮＬＳは、以下のアミノ酸配列：ＳＰＫＫＫＲＫＶＥＡＳ（配列番号１４）を含む。一実施形態では、ＮＬＳは、配列ＫＫＫＲＫＶ（配列番号１５）を含む。一実施形態では、ＮＬＳは、配列ＳＰＫＫＫＲＫＶＥＡＳＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１６）を含む。別の実施形態では、ＮＬＳは、配列ＫＫＫＲＫ（配列番号１０９）を含む。
タンパク質形質導入ドメイン
【０１２６】
本発明の本発明の融合組換えタンパク質（例えば、ｄＣａｓ９／ＴＡＤ、ｄＣａｓ９／ＴＡＧ、またはＭＳ２／ＴＡＤ）はまた、標的細胞内へのタンパク質の侵入を確実にするために、タンパク質形質導入ドメインと結合されてもよい。代替的に、ｇＲＮＡ及び本発明の融合タンパク質をコードする遺伝子は、様々なベクター、例えば、ウイルスベクターを使用して細胞に送達されてもよい。
【０１２７】
タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）は、様々な起源を有してもよく、細胞膜、オルガネラ膜、または小胞膜内へのタンパク質／ポリペプチドの転位を促進することによって、所与の治療の細胞内送達を可能にし得る。ＰＴＤは、脂質二重層、ミセル、細胞膜、オルガネラ膜、または小胞膜を横断することを促進するポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、または有機もしくは無機化合物を指す。別の分子に付着したＰＴＤは、膜を横断する、例えば、細胞外空間から細胞内空間、またはサイトゾルからミトコンドリアを含むオルガネラ内へと進む、分子を促進する。一実施形態では、ＰＴＤは、本発明の組換えタンパク質のアミノ末端に共有結合される。別の実施形態では、ＰＴＤは、本発明の組換えタンパク質のカルボキシル末端に共有結合される。例示的なタンパク質形質導入ドメインとしては、最小ウンデカペプチドタンパク質形質導入ドメイン（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号３７）を含むＨＩＶ−１  ＴＡＴの残基４７〜５７に対応する）、細胞内への侵入を誘導するのに十分多くのアルギニンを含むポリアルギニン配列（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０〜５０個のアルギニン）、ＶＰ２２ドメイン（Ｚｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００２）、ショウジョウバエ・アンテナペディアタンパク質形質導入ドメイン（Ｎｏｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．２００３）、切断されたヒトカルシトニンペプチド（Ｔｒｅｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２００４）、ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ（配列番号３８）、トランスポータンＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号３９）、ＫＡＬＡＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＣＥＡ（配列番号４０）、及びＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号４１）が挙げられるがこれらに限定されない。さらなる例示的なＰＴＤとしては、ＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号４２）、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号４３）、または３個のアルギニン残基〜５０個のアルギニン残基のアルギニンホモポリマーが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１２８】
ＰＴＤの他の非限定的な例としてはエンドソーム脱出ペプチドが挙げられる。そのようなエンドソーム脱出ペプチドの非限定的な例は、以下の表２に列挙される。
表２：エンドソーム脱出ペプチド
【表２−１】
2017514513.tif 000004
【表２−２】
2017514513.tif 000005
【０１２９】
一実施形態では、タンパク質形質導入ドメインは、ＴＡＴまたはＰｅｐ−１である。一実施形態では、タンパク質形質導入ドメインは、ＴＡＴであり、配列ＳＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＣ（配列番号３６）を含む。別の実施形態では、タンパク質形質導入ドメインは、ＴＡＴであり、配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号３７）を含む。別の実施形態では、タンパク質形質導入ドメインは、ＴＡＴであり、配列ＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号４２）を含む。別の実施形態では、タンパク質形質導入ドメインは、Ｐｅｐ−１であり、配列ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号５４）を含む。上記のタンパク質形質導入ドメインに加えて、または代替的に、本発明の融合組換えタンパク質は、細胞及びミトコンドリア内への転位をさらに促進するために、リポソームに結合されてもよい。
【０１３０】
本発明に従ってｄＣａｓ／ＴＡＤタンパク質をコードする遺伝子構築物は、従来の遺伝子合成またはモジュールアセンブリのいずれかを使用して作製され得る。ヒト化Ｃａｓ９核酸は、ＡｄｄＧｅｎｅによる公共の非営利的な貯蔵庫において入手可能である（例えば、ＡｄｄＧｅｎｅプラスミドｐＡＣ１５４）。
【０１３１】
一態様では、本発明のｇＲＮＡ、ｄＣａｓ／ＴＡＤ、ｄＣａｓ／ＴＡＧ、及び／またはＭＳ２／ＴＡＤ組換え融合タンパク質は、細胞内のフラタキシン核酸及びフラタキシンタンパク質の発現を増加させる／誘発するために使用されてもよい。本明細書で使用される場合、「細胞内のフラタキシンの発現を増加させる」における「増加させる」という表現は、本発明のｇＲＮＡ及びＣａｓ９組換えタンパク質の非存在下で、フラタキシンタンパク質が細胞内で全く発現しない状況、及び細胞がある特定の量の（基準の量の）フラタキシンタンパク質をすでに発現している状況を含むよう意図とされる。それは、フラタキシンを発現させない、正常なレベルのフラタキシンを発現させる、または（正常な状況と比較して）異常な／より低いレベルのフラタキシンを発現させる細胞内のフラタキシンの発現を増加させる／強化することを含む。
【０１３２】
一実施形態では、本発明のｇＲＮＡ及び組換え融合タンパク質は、フラタキシンプロモータの転写及びフラタキシンタンパク質の発現を増加させることを、それを必要としている対象からの細胞内で行うために使用されてもよい。
【０１３３】
本明細書で使用される場合、「それを必要としている対象」は、フラタキシンタンパク質の発現の増加からの、またはフラタキシンタンパク質のレベルの増加の利益を得ることが可能である対象である。それを必要としている対象の非限定的な例としては、正常な対象からの細胞と比較して、フラタキシン発現または活性のレベルの低減を示す細胞を有する対象が挙げられる。一実施形態では、それを必要としている対象は、フラタキシン遺伝子のイントロン１内に異常な数のトリヌクレオチド反復を有する対象である。一実施形態では、トリヌクレオチド反復の数は、３５もしくはそれ以上、６５もしくはそれ以上、７５もしくはそれ以上、８５もしくはそれ以上、１００もしくはそれ以上、１１０もしくはそれ以上、１２５もしくはそれ以上、１５０もしくはそれ以上、１７５もしくはそれ以上、２００もしくはそれ以上、２２５もしくはそれ以上、２５０もしくはそれ以上、３００もしくはそれ以上、３５０もしくはそれ以上、５００もしくはそれ以上、または１０００もしくはそれ以上である。一実施形態では、それを必要としている対象は、フリードライヒ運動失調症を患っている。一実施形態では、対象は、哺乳動物、好ましくは、ヒトである。
【０１３４】
一実施形態では、本発明は、フラタキシン発現を増加させることを、それを必要としている対象において行う方法に関し、本発明の有効量の少なくとも１つのｇＲＮＡ及び少なくとも１つの（実施形態において、少なくとも２つの）組換え融合タンパク質（例えば、ｄＣａｓ／ＴＡＤ、ｄＣａｓ／ＴＡＧ、抗原結合タンパク質／ＴＡＤ、及び／またはＭＳ２／ＴＡＤ）を、対象に投与することを含む。一実施形態では、組換えタンパク質は、原形質膜を横断し、核に達するように特に製剤化される。一実施形態では、本発明は、薬学的または生理学的に許容される担体と一緒に、本発明の少なくとも１つの（実施形態において、少なくとも２つの）組換え融合タンパク質（例えば、ｄＣａｓ／ＴＡＤ、ｄＣａｓ／ＴＡＧ、抗原結合タンパク質／ＴＡＤ、及び／またはＭＳ２／ＴＡＤ）を含む組成物を提供する。
【０１３５】
一実施形態では、本発明は、フラタキシンレベルを増加させることを、それを必要としている対象において行う方法に関し、フラタキシンプロモータを標的化する少なくとも１つのｇＲＮＡと一緒に、有効量の、本発明の融合タンパク質（例えば、ｄＣａｓ／ＴＡＤ、ｄＣａｓ／ＴＡＧ、抗原結合タンパク質／ＴＡＤ、及び／またはＭＳ２／ＴＡＤ）のうちの少なくとも１つを、対象に投与することを含む。一実施形態では、本発明は、薬学的または生理学的に許容される担体と一緒に、本発明の組換え融合タンパク質を含む組成物を提供する。
【０１３６】
コドンの縮退の最適化
【０１３７】
Ｃａｓヌクレアーゼタンパク質は、細菌中で通常発現するため、Ｃａｓ組換えタンパク質を設計及び調製するとき、真核細胞（例えば、哺乳類細胞）内の最適な発現のためにそれらの核酸配列を修飾することが有利であり得る。これは、本明細書に記載される本発明のｄＣａｓ９／ＴＡＤタンパク質の実施形態に対してすでに行われている。
【０１３８】
したがって、所与の核酸の同じまたはわずかに異なるアミノ酸配列をコードする核酸を生成するために、以下のコドン表（表３）が、部位特異的突然変異誘発スキームで使用されてもよい。
表３：同じアミノ酸をコードするコドン
【表３】
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【０１３９】
配列類似性
【０１４０】
「相同性」及び「相同の」は、２つのペプチドまたは２つの核酸分子間の配列類似性を指す。相同性は、整合された配列中の各位置を比較することによって判定され得る。核酸間またはアミノ酸配列間の相同性の程度は、配列によって共有される位置における同一のまたはマッチするヌクレオチドまたはアミノ酸の数の関数である。その用語が本明細書で使用されるように、核酸配列は、２つの配列が実質的に同一であり、配列の機能活性が保存される場合、別の配列と「実質的に相同」である（本明細書で使用される場合、用語「相同」は、進化的関係を暗示せず、むしろ、実質的な配列同一性を指し、したがって、「同一性」／「同一の」と同義的である。２つの核酸配列は、最適に整合されたとき（間隙が認められて）、それらが少なくとも約５０％配列類似性もしくは同一性を共有するか、または配列が定義された機能的モチーフを共有する場合、実質的に同一と見なされる。代替の実施形態では、最適に整合された実質的に同一の配列における配列類似性は、少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％であってもよい。簡潔にするために、単位（例えば、６６、６７…８１、８２、…９１、９２％…）は、系統的に列挙されていないが、それにもかかわらず、本発明の範囲内と見なされる。
【０１４１】
実質的に相補的な核酸は、一方の分子の相補体がもう一方の分子と実質的に同一である核酸である。２つの核酸またはタンパク質配列は、最適に整合されたとき、それらが少なくとも約７０％の配列同一性を共有する場合、実質的に同一であると見なされる。代替の実施形態では、配列同一性は、例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であってもよい。同一性の比較のための配列の最適なアライメントは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ  ２：４８２の局所的相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アライメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ  １９８８）の類似法の検索、及びこれらのアルゴリズムのコンピュータ化実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，Ｕ．Ｓ．Ａ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡなど）など、様々なアルゴリズムを使用して実施され得る。配列同一性はまた、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９０）１９９０に記載されるＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して判定されてもよい（公開されたデフォルト設定を使用して）。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（インターネットを通してｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／で）を通して入手可能であり得る。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、最初に、データベース配列中の同じ長さのワードと整合されるとき、何らかの正値の閾値スコアＴとマッチするか、またはそれを満たすかのいずれかであるクエリ配列中の同じ長さの短いワードを識別することによって、高スコア配列対（ＨＳＰ）を識別することを伴う。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と称される。初期の隣接ワードヒットは、より長いＨＳＰを見出す検索を開始するためのシードとして機能する。ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方の方向に伸長する。各方向でのワードヒットの伸長は、以下のパラメータが満たされるときに停止される：累積アラインメントスコアが、その最大達成値からの数Ｘ低下する場合、１つ以上の負のスコアリング残基アライメントの蓄積のために累積スコアがゼロまたはそれ以下になる場合、またはいずれかの配列の末端に達する場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、及びＸは、アライメントの感受性及び速度を判定する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用した２つの配列間の統計的類似性の１つの基準は、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のマッチが偶然生じる確率を示す、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。本発明の代替の実施形態では、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、試験配列の比較における最小合計確率が約１未満、好ましくは約０．１未��、より好ましくは約０．０１未満、及び最も好ましくは約０．００１未満である場合、実質的に同一と見なされる。
【０１４２】
２つの核酸配列が実質的に相補敵であるという代替の指示は、２つの配列が適度に厳しい、または好ましくは厳しい条件下で互いとハイブリッド形成することである。適度に厳しい条件下でのフィルタ結合配列とのハイブリッド形成は、例えば、６５℃において０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ  ＥＤＴＡで実施され、４２℃において０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で洗浄し得る（Ａｕｓｕｂｅｌ  ２０１０）。代替的に、厳しい条件下でのフィルタ結合配列とのハイブリッド形成は、例えば、６５℃において０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４、７％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡで実施され得、６８℃において０．１×ＳＳＣ／０．１％中で洗浄し得る（Ａｕｓｕｂｅｌ  ２０１０）。ハイブリッド形成条件は、対象の配列に応じて、既知の方法に従って修正され得る（Ｔｉｊｓｓｅｎ  １９９３）。概して、厳しい条件は、定義されたイオン強度及びｐＨで特定の配列に対する熱的融点よりも約５℃低くなるように選択される。
【０１４３】
別の態様では、本発明は、上記の融合タンパク質（（例えば、ｄＣａｓ／ＴＡＤ、ｄＣａｓ／ＴＡＧ、抗原結合タンパク質／ＴＡＤ、及び／またはＭＳ２／ＴＡＤ）ならびにｇＲＮＡをコードする核酸をさらに提供する。一実施形態では、ｄＣａｓ９をコードする核酸は、配列番号９３に記載される通りである。一実施形態では、ＶＰ１６をコードする核酸は、配列番号９４に記載される通りである。一実施形態では、ＶＰ１６０をコードする核酸は、配列番号９５に記載される通りである。一実施形態では、リンカーを有するＧＣＮ４エピトープをコードする核酸は、配列番号９６に記載される通りである。一実施形態では、ＧＣＮ４エピトープエピトープをコードする核酸は、配列番号９７に記載される。一実施形態では、ＭＳ２ポリペプチドをコードする核酸は、配列番号９８に記載される通りである。一実施形態では、ｐ６５  ＴＡＤをコードする核酸は、配列番号９９に記載される通りである。一実施形態では、ＨＳＦ１ポリペプチドをコードする核酸は、配列番号１００に記載される通りである。本発明はまた、上記の核酸を含むベクターを提供する。一実施形態では、ベクターは、上記の核酸に動作可能に結合される転写調節エレメントをさらに含む。第１の核酸配列は、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的関係に置かれるとき、第２の核酸配列と「動作可能に結合される」。例えば、プロモータは、プロモータがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、コード配列に動作可能に結合される。概して、「動作可能に結合される」ＤＮＡ配列は隣接し、必要な場合、リーディングフレーム内で２つのタンパク質コード領域を結合する。しかしながら、例えば、エンハンサが概して、数キロベースプロモータから離れているときに機能し、イントロン配列が可変的な長さであり得るため、いくつかのポリヌクレオチドエレメントは、動作可能に結合され得るが、隣接しない。「転写調節エレメント」は、それらが動作可能に結合されるタンパク質コード配列の転写を誘発または制御する、開始及び終結シグナル、エンハンサ、ならびにプロモータ、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナルなどのＤＮＡ配列を指す一般名称である。
【０１４４】
前述の通り、本発明のｇＲＮＡ及び融合タンパク質（例えば、ｄＣａｓ／ＴＡＤ、ｄＣａｓ９／ＴＡＧ、ＭＳ２／ＴＡＤ、及び抗原結合タンパク質／ＴＡＤ）は、１つ以上の様々なウイルスベクターを使用して細胞内に送達され得る。したがって、好ましくは、上記のベクターは、標的細胞内に本発明のｇＲＮＡ及び／または融合タンパク質を導入するためのウイルスベクターである。ウイルスベクターの非限定的な例としては、当該技術分野においてよく知られているように、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルスである。
【０１４５】
修飾ＡＡＶベクターは、好ましくは、フラタキシンを発現させ、かつＦＲＤＡ対象において影響を受ける、１つ以上の細胞型を標的化する。したがって、修飾ＡＡＶベクターは、強化された心臓（例えば、心筋細胞）、骨格筋、ニューロン、肝臓、及び／または膵臓（例えば、ランゲルハンス細胞）組織向性を有し得る。修飾ＡＡＶベクターは、哺乳動物の細胞内で本発明の少なくとも１つのｇＲＮＡ及び融合タンパク質を送達し、かつ発現させることが可能であり得る。例えば、修飾ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ−ＳＡＳＴＧベクターであってもよい（Ｐｉａｃｅｎｔｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２３：６３５−６４６）。修飾ＡＡＶベクターは、好ましくは、生体内で、ニューロン、骨格、膵臓（例えば、ランゲルハンス細胞）、及び心臓（例えば、心筋細胞）筋肉にｇＲＮＡ及び融合タンパク質を送達し得る。修飾ＡＡＶベクターは、ＡＡＶｌ、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９を含む、いくつかのカプシド型のうちの１つ以上に基づき得る。修飾ＡＡＶベクターは、全身及び局所送達によって骨格筋または心筋を効率的に形質導入するＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／７、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ２．５、及びＡＡＶ／ＳＡＳＴＧベクターなど、代替の筋肉向ＡＡＶカプシドを有するＡＡＶ２偽型に基づき得る。一実施形態では、修飾ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ−ＤＪである。一実施形態では、修飾ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ−ＤＪ８ベクターである。一実施形態では、修飾ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２−ＤＪ８ベクターである。
【０１４６】
さらに別の態様では、本発明は、上記の核酸及び／またはベクターを含む細胞（例えば、宿主細胞）を提供する。本発明は、例えば、当該技術分野においてよく知られている培養培地、生成、単離、及び精製方法を使用した組換えタンパク質の発現／生成のための上記のような組換え発現系、ベクター、及び宿主細胞をさらに提供する。
【０１４７】
別の態様では、本発明は、上記のｇＲＮＡ及びｄＣａｓ９／ＴＡＤ組換えタンパク質を含む組成物（例えば、医薬組成物）を提供する。一実施形態では、本組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤、及び／または希釈剤をさらに含む。
【０１４８】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」（または「生物学的に許容される」）は、生体内の毒作用または生物学的悪影響の非存在（または制限）を特徴とする材料を指す。それは、信頼できる医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴うことなく、対象（例えば、ヒト及び動物）の体液及び／または組織及び／または器官と接触して使用するのに好適であり、妥当な損益比に見合う、化合物、組成物、及び／または投薬形態を指す。
【０１４９】
本発明は、細胞内のフラタキシン発現もしくはレベルを増加させるための、または対象におけるフリードライヒ運動失調症の治療のための使用説明書と一緒に、上記のｇＲＮＡ、融合タンパク質、ベクター、細胞、フラタキシン標的系、組み合わせ、または組成物のうちの少なくとも１つをその中に配置する、少なくとも１つの容器手段を備える、キットまたはパッケージをさらに提供する。
【０１５０】
本発明は、以下の非限定的な実施例によってさらに詳細に例示される。
実施例１
ｇＲＮＡは、２９３Ｔ細胞内でフラタキシン発現を効率的に促進する
【０１５１】
Ｕ６プロモータ下のｇＲＮＡ及びＣＡＧプロモータ下のｄＣａｓ９ヌクレアーゼのうちの１つをコードする遺伝子を含む発現プラスミドを生成した（以下の表４ならびに図４及び１８を参照されたい）。元のプラスミドをＡｄｄｇｅｎｅから得た（ｐＡＣ１５４−ｄｕａｌ−ｄＣａｓ９ＶＰ１６０−ｓｇＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ−ｐｌａｓｍｉｄ  ｎｏ．４８２４０）。得られるｄＣａｓ９タンパク質は、２つのＮＬＳ、１つのＨＡタグ及びＶＰ１６０トランス活性化ドメインを含む（図３（配列番号３２）を参照されたい）。生成されたｇＲＮＡは、ヒトフラタキシン遺伝子のプロモータ中で異なるヌクレオチド配列を標的化する（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＮＧ＿００８８４５、以下の表４ならびに図２及び１８を参照されたい）。
【０１５２】
表４：ヒトフラタキシンプロモータを標的化するｇＲＮＡ
【表４】
2017514513.tif 000007
【０１５３】
これらのｇＲＮＡによるヒトフラタキシン遺伝子のプロモータの効率的な標的化を、最初に２９３Ｔ細胞内で試験した。これらの細胞に、ｉ）化膿レンサ球菌からの活性Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、及びｉｉ）ｇＲＮＡをコードするプラスミドを導入した。ｇＲＮＡがプロモータ中のその標的配列に正確に結合するとき、それは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼとの複合体を形成する。これは、プロモータ中の二重鎖切断（ＤＳＢ）をもたらす（図１）。このＤＳＢは、いくつかの塩基対合の微小挿入または微小欠失（ＩＮＤＥＬ）をもたらす不完全な修復プロセスである非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって、自発的に修復される。そのようなＩＮＤＥＬの存在または非存在を、ＰＣＲによって増幅することによって検出した（フラタキシンプロモータのオリゴ：ａａｔｃｔａｔｃａａｃａａｔａｇａｇｇｃａａｇｇｃａ（順方向、配列番号７４）及びｃａｇｃｔｃｃｃａｇｃｇｔａｇｃｔａｃａ（逆方向、配列番号７５）部分）。ＩＮＤＥＬがアンプリコンのうちのいくつかに存在した場合、アンプリコンを９５℃まで加熱して２つのＤＮＡ鎖を分離し、ゆっくりと室温で冷却して、ヘテロ二量体の形成に有利に働いた。次いで、これらのアンプリコンを二重鎖ＤＮＡを切断するＳｕｒｖｅｙｏｒ酵素に曝露し、それは、ＲｅｄＳａｆｅ（商標）で染色されたアガロースゲル上で視覚化される追加のバンドをもたらすミスマッチを有する。Ｓｕｒｖｅｙｏｒ酵素の結果は、図６に示される。これらの結果は、ｇＲＮＡ  Ａ、Ｃ、及びＤが、フラタキシンプロモータ上のそれらの標的配列と効果的に結合することが可能であったことを示す。
【０１５４】
異なるｇＲＮＡ、及び転写活性化ドメインとして作用する１０個のＶＰ１６配列と結合した不活性Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（ｄＣａｓ９）である、同じＨＡ−ｄＣａｓ９−ＶＰ１６０をそれぞれがコードする、１つまたはいくつかのプラスミドｐＡＣ１５４を２９３Ｔ細胞に導入することによって、フラタキシン遺伝子発現の誘発を最初に試験した（例えば、ｇＲＮＡ  Ａ及びＶＰ１６０  ＴＡＤをコードするｐＡＣ１５４配列に関して図４、及び複合体の概略図に関して図８を参照されたい）。３．５×１０5個の細胞／ウェルの密度で、導入の前日に６つのプレートに２９３Ｔ細胞を播種した。導入の７２時間後、全タンパク質を細胞から抽出した。ＨＡ−ｄＣａｓ９−ＶＰ１６０の発現を、抗ＨＡ抗体を使用したウエスタンブロット法によって最初に確認した（図７）。
【０１５５】
ｇＲＮＡ及びＨＡ−ｄＣａｓ９−ＶＰ１６０タンパク質がフラタキシンプロモータに付着することが可能である場合、この複合体は、フラタキシン遺伝子の発現を促進するはずである。フラタキシン遺伝子の発現の増加を、ラタキシンｍＲＮＡのｑＲＴ−ＰＣＲ増幅によって最初に調査した。図９は、ｇＲＮＡがｍＲＮＡレベルでフラタキシンの発現を増加させたことを示す（１８Ｓ  ＲＮＡで正規化された結果）。ＨＡ−ｄＣａｓ９−ＶＰ１６０タンパク質よりもむしろｅＧＦＰをコードするプラスミドを導入した細胞に対してもまた、結果を正規化した。増幅のために使用されるプライマは、以下の表５に示される。
【０１５６】
ｇＲＮＡ及びＨＡ−ｄＣａｓ９−ＶＰ１６０タンパク質はまた、１つまたはいくつかのプラスミドｐＡＣ１５４が導入された２９３Ｔ細胞内のフラタキシンタンパク質の発現を増加させることが可能であった（図１０）。フラタキシンタンパク質発現を、内部標準としてβアクチンを使用して正規化した。フラタキシンを検出するために使用されるｍＡｂは、Ｍｉｔｏｓｃｉｅｎｃｅｓからの＃１８Ａ５ＤＢ１であった。
実施例２
ｇＲＮＡ及びｄＣａｓ９−ＶＰ１６０は、フリードライヒ患者の線維芽細胞内のヒトフラタキシン遺伝子の発現を有意に増加させる
【０１５７】
次に、フラタキシン発現を増加させるｇＲＮＡ及びｄＣａｓ９−ＶＰ１６０の能力を、通常低レベルのフラタキシンを発現させるフリードライヒ運動失調症患者の細胞内で評価した。ｇＲＮＡ  Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥの様々な組み合わせもまた、フリードライヒ運動失調症を患う患者からの線維芽細胞内のフラタキシンｍＲＮＡを３０〜４０％増加させた。実際に、ｄＣａｓ９−ＶＰ１６０ならびにｇＲＮＡ  Ａ、Ｂ、及びＣをコードするプラスミドのヌクレオフェクションは、ｅＧＦＰをコードするプラスミドでヌクレオフェクトされた対照と比較して、フラタキシンｍＲＮＡを増加させた（図１１）。フラタキシンｍＲＮＡをＰＣＲによって増幅した（表５で定義されるプライマを使用して、かつ１８Ｓ  ｒＲＮＡまたはＧＡＰＤＨで正規化された）。この実験のために使用されるフリードライヒ線維芽細胞は、Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＧＭ  ０４０７８）から得られ、遺伝子の各対立遺伝子のイントロン１内にそれぞれ５４１及び４２０のトリヌクレオチド反復を有する。
表５：使用されるプライマ
【表５−１】
2017514513.tif 000008
【表５−２】
2017514513.tif 000009
【０１５８】
ｍＲＮＡレベルにおいて得られた結果はまた、タンパク質レベルにおいても確認された。ｇＲＮＡ  Ａ、Ｂ、及びＣの組み合わせもまた、同じフリードライヒ患者からの線維芽細胞内のフラタキシンタンパク質をほぼ２０％増加させた（図１２）。ｇＲＮＡ  Ａ、Ｂ、及びＣをコードするｐＡＣ１５４プラスミドの同時ヌクレオフェクション、またはＢ、Ｃ、及びＤの同時ヌクレオフェクションは、Ａｍａｘａ  ｉｎｃ．からのＧＦＰをコードするプラスミドでヌクレオフェクトされた対照細胞と比較して、フラタキシンタンパク質発現を増加させた。フラタキシンタンパク質発現を、内部標準としてβアクチンを使用して正規化した。フラタキシンを検出するために使用されるｍＡｂは、Ｍｉｔｏｓｃｉｅｎｃｅｓからの＃１８Ａ５ＤＢ１であった。
【０１５９】
対象細胞内のそのようなフラタキシンタンパク質の増加は、フリードライヒ運動失調症と関連する症状を低減または予防するために使用され得る。
実施例３
少なくとも１つのｇＲＮＡ及び融合タンパク質ｄＣＡｓ９／ＴＡＤ、ｄＣａｓ９／ＴＡＧ、ＭＳ２−ＴＡＤ、及び抗原結合タンパク質／ＴＡＤをコードするＡＡＶベクターの生成及び生体内試験
【０１６０】
フラタキシン発現を増加させるためのｇＲＮＡ（単独でまたは組合わせ）及び融合タンパク質のためのＡＡＶ−ＤＪ（またはＡＡＶ−ＤＪ８）などのＡＡＶ構築物が調製され得る。これらのＡＡＶは、Ｃｅｎｔｒｅ  ｄｅ  Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｉｒｅ  ｅｎ  Ｓａｎｔｅ  Ｍｅｎｔａｌｅ  ｄｅ  Ｑｕｅｂｅｃの分子ツールプラットフォームにおいて生成される。ＤＪ血清型ＡＡＶ形態を生成するためのプラスミドは、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ｉｎｃ．から入手可能である。１つまたは複数のＡＡＶベクターが、ｇＲＮＡＦｒａｔ及びＴＡＤを送達するために使用され得る。例えば、ｄＣａｓ９−ＶＰ６４、ｄＣａｓ９−ＶＰ１６０、またはｄＣａｓ９−ＳｕｎＴａｇが、重複配列を共有する２つの部分で分離されてもよい。これは、細胞の感染後の２つの部分の組換えを可能にする。これらの二重ＡＡＶを記載するいくつかの記事が、Ｄｕａｎ  ａｎｄ  ｃｏｌｌｅａｇｕｅｓ（Ｂｏｓｔｗｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｇｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００７、Ｇｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００８、及びＧｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）によって出版されている。Ｕ６及び／または他のプロモータ（複数可）下で１つまたはいくつかのｇＲＮＡＦｒａｔ（またはｇＲＮＡＦｒａｔ−ＭＳ２）を含むさらなるＡＡＶ−ＤＪもまた、調製され得る。ＡＡＶベクターは、１０匹の５日齢のＹＧ８ｓＲマウの群に、異なる用量（初期試験に対して１匹のマウス当たり１〜１０個のＥ１０ベクターゲノム）で浅側頭静脈を介して送達されてもよい（Ｐｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）、Ａｌ−Ｍａｈｄａｗｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）、及びＡｌ−Ｍａｈｄａｗｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）、及びＶｉｒｍｏｕｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１５）。例えば、ストック番号０２４０９７）。対照マウスには、無関係のｇＲＮＡをコードするＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ−ＤＪ）を注射した。ｄＣａｓ９−ＶＰ６４、ｄＣａｓ９−ＶＰ１６０、またはｄＣａｓ９−ＳｕｎＴａｇは、免疫原性であるため、ＹＧ８ｓＲマウスを、この実験のために、タクロリムスで免疫抑制する。マウスを、１ヶ月後に屠殺する。ＲＮＡ及びタンパク質を、フラタキシンｍＲＮＡ及びタンパク質の定量化のために、脳、脊髄、脊髄神経節、心臓、肝臓、及び筋肉から抽出する。この方法は、生体内でのフラタキシン発現の誘発を確認することを可能にする。
実施例４
ＣＲＩＳＰＲ系によって誘発される遺伝子発現の特異性
【０１６１】
ＲＮＡ−Ｓｅｑ技術は、全ヒトまたはマウスゲノムの発現を調査することを可能にする（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｅｐｋｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｕｌｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．、及びＣｉｔｒｕｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．）。簡潔に、この技術は、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換する。次いで、これらのｃＤＮＡは断片化され、オリゴヌクレオチドが付着されて、イルミナシーケンサーを用いた各ＤＮＡフラグメントの１００ｂｐのシーケンシングを可能にする。各試料に対して、約５０００万の１００ｂｐ配列が得られるべきである。したがって、ＲＮＡ−Ｓｅｑは、全ての遺伝子の発現の正確な定量的評価を提供する。ｍＲＮＡでさえ、細胞当たり一度のみ発現し、代替のスプライシングがこの方法によって識別される。
【０１６２】
ＡＡＶベクターで処理される３つの群がこの実験のために使用され得る：１）正常なマウス、２）ＹＧ８ｓＲマウス、及び３）ＹＧ８ｓＲマウス（Ｐｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）、Ａｌ−Ｍａｈｄａｗｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）、及びＡｌ−Ｍａｈｄａｗｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）、及びＶｉｒｍｏｕｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１５））。ＲＮＡ−Ｓｅｑ技術は、脳、脊髄神経節、及び心臓などの特定の組織における全ての遺伝子の発現を比較するために使用される。これは、フラタキシン発現が回復されるかどうか、及び正常な対照のどのレベルまでなのかを検証することを可能にする。この技術はまた、処理が、ＣＲＩＳＰＲ系のオフターゲット効果及び潜在的な毒性が原因であり得る、様々な組織における任意の異常な遺伝子発現を誘発したかどうかを検出することを可能にする。したがって、これは、処理の特異性を評価し、かつフラタキシン発現を回復する代謝結果を識別することを可能にする。
実施例５
ｄＣａｓ９−ＶＰ６４、ｄＣａｓ９−ＶＰ１６０、ｄＣａｓ９−ＳｕｎＴａｇ、またはＭＳ２−ｐ６５−ＨＳＦ１に対する潜在的な免疫反応を調査する
【０１６３】
本発明の融合タンパク質（例えば、ｄＣａｓ９−ＶＰ６４、ｄＣａｓ９−ＶＰ１６０、ｄＣａｓ９−ＳｕｎＴａｇ、及びＭＳ２−ｐ６５−ＨＳＦ１）は、マウス（及びヒト対象）に対して異種タンパク質である。新生マウスは、それらの免疫系が未熟であるため、免疫反応が発達していない可能性がある。しかしながら、これは、成体マウス及びＦＲＤＡ患者には当てはまらない。これらのタンパク質に対する潜在的な免疫反応を調査するために、ＡＡＶベクターを、６ヶ月齢ＹＧ８ｓＲマウスに静脈投与し得る（Ｐｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）、Ａｌ−Ｍａｈｄａｗｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）、及びＡｌ−Ｍａｈｄａｗｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）、及びＶｉｒｍｏｕｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１５））。ＡＡＶ由来ベクター（ＡＡＶ−ＤＪ）の全身送達の１ヶ月後、ウイルスベクターによってコードされるタンパク質に対する液性及び細胞性免疫反応の存在を調査する。
【０１６４】
液性反応を検出するために、血清がＣＲＩＳＰＲ処理の１ヶ月後にマウスから得られる。ＣＲＩＳＰＲで処理した、またはしていないマウスの心臓から抽出されたタンパク質に対する、それらの血清中の抗体の存在を、一次抗体としてマウス血清、及びＨＲＰに結合した第２の抗マウスＩｇＧを使用して、例えば、ウエスタンブロット法によって判定する。
【０１６５】
潜在的な細胞性免疫反応を検出するために、筋生検を、ＣＲＩＳＰＲで処理された、またはされていないマウスから得る。良好な抗原提示細胞である筋芽細胞を、これらの筋生検中に存在する衛星細胞から増殖させる。これらの筋芽細胞を、ＣＲＩＳＰＲ処理で使用される同じＡＡＶに管内で感染させる。異種タンパク質のうちの１つを発現させる筋芽細胞に対する細胞性免疫反応の存在は、ＣＲＩＳＰＲ処理を受けた、または受けていないマウスの脾臓から得られるＴリンパ球を用いたＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用して判定される。
実施例６
ＦＲＤＡのＹＧ８ｓＲマウスモデルにおける長期生体内研究
【０１６６】
本発明のＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ９系ベースの処理はまた、より長い期間（すなわち、１年間）にわたって、ＹＧ８ｓＲマウスにおいて調査され得る（Ｐｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）、Ａｌ−Ｍａｈｄａｗｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、及びＡｌ−Ｍａｈｄａｗｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。これらの実験のために、１０匹のＹＧ８ｓＲマウスに、５日齢で、本発明のＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ９系のＡＡＶベクターを注射する。１０匹の対照ＹＧ８ｓＲマウスが食塩注射を受ける。フラタキシンの発現は、毎月血液細胞内で定量化される。１年の経過観察中２ヶ月毎に、マウス活性を調査する。処理されたマウスの心機能（１回拍出量、心拍出量、収縮期径及び拡張期径）を、（Ｇｅｒａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４）で行われたように、超音波検査で調査する。
【０１６７】
マウス屠殺後に、心臓の重量を心肥大及び処理成功に対して測定する。心臓及び脳内の非存在もまた調査する。すでに記載された方法を使用して、心臓及び脳内のミトコンドリア酵素活性、アコニターゼ活性、酸化ストレスなどもまた判定し得る。各群のマウスの器官は、処理からの任意の潜在的な毒性を検出するための検査のために、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに送る。
【０１６８】
本発明を、その特定の実施形態によって上で記載してきたが、それは、添付の特許請求の範囲で定義されるような本発明の精神及び性質から逸脱することなく、修正され得る。
参照文献
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Ｃａｍｐｕｚａｎｏ，Ｖ．，Ｌ．Ｍｏｎｔｅｒｍｉｎｉ，Ｍ．Ｄ．Ｍｏｌｔｏ，Ｌ．Ｐｉａｎｅｓｅ，Ｍ．Ｃｏｓｓｅｅ，Ｆ．Ｃａｖａｌｃａｎｔｉ，Ｅ．Ｍｏｎｒｏｓ，Ｆ．Ｒｏｄｉｕｓ，Ｆ．Ｄｕｃｌｏｓ，Ａ．Ｍｏｎｔｉｃｅｌｌｉ，Ｆ．Ｚａｒａ，Ｊ．Ｃａｎｉｚａｒｅｓ，Ｈ．Ｋｏｕｔｎｉｋｏｖａ，Ｓ．Ｉ．Ｂｉｄｉｃｈａｎｄａｎｉ，Ｃ．Ｇｅｌｌｅｒａ，Ａ．Ｂｒｉｃｅ，Ｐ．Ｔｒｏｕｉｌｌａｓ，Ｇ．Ｄｅ  Ｍｉｃｈｅｌｅ，Ａ．Ｆｉｌｌａ，Ｒ．Ｄｅ  Ｆｒｕｔｏｓ，Ｆ．Ｐａｌａｕ，Ｐ．Ｉ．Ｐａｔｅｌ，Ｓ．Ｄｉ  Ｄｏｎａｔｏ，Ｊ．Ｌ．Ｍａｎｄｅｌ，Ｓ．Ｃｏｃｏｚｚａ，Ｍ．Ｋｏｅｎｉｇ  ＆  Ｍ．Ｐａｎｄｏｌｆｏ（１９９６）Ｆｒｉｅｄｒｅｉｃｈ’ｓ  ａｔａｘｉａ：ａｕｔｏｓｏｍａｌ  ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ａｎ  ｉｎｔｒｏｎｉｃ  ＧＡＡ  ｔｒｉｐｌｅｔ  ｒｅｐｅａｔ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７１，１４２３−７．
Ｃｈｏ，Ｓ．Ｗ．，Ｓ．Ｋｉｍ，Ｊ．Ｍ．Ｋｉｍ  ＆  Ｊ．Ｓ．Ｋｉｍ（２０１３）Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｃａｓ９  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，３１，２３０−２．
Ｃｉｒｕｌｌｉ，  Ｅ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｅｘｏｍｅ：  ａ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｗｈｏｌｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｎｄ  ｗｈｏｌｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ  １１，Ｒ５７，ｄｏｉ：ｇｂ−２０１０−１１−５−ｒ５７［ｐｉｉ］
１０．１１８６／ｇｂ−２０１０−１１−５−ｒ５７．
Ｃｏｎｇ，Ｌ．，Ｆ．Ａ．Ｒａｎ，Ｄ．Ｃｏｘ，Ｓ．Ｌｉｎ，Ｒ．Ｂａｒｒｅｔｔｏ，Ｎ．Ｈａｂｉｂ，Ｐ．Ｄ．Ｈｓｕ，Ｘ．Ｗｕ，Ｗ．Ｊｉａｎｇ，Ｌ．Ａ．Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ  ＆  Ｆ．Ｚｈａｎｇ（２０１３）Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３９，８１９−２３．
Ｃｏｐｐｏｌａ，Ｇ．，Ｓ．Ｈ．Ｃｈｏｉ，Ｍ．Ｍ．Ｓａｎｔｏｓ，Ｃ．Ｊ．Ｍｉｒａｎｄａ，Ｄ．Ｔｅｎｔｌｅｒ，Ｅ．Ｍ．Ｗｅｘｌｅｒ，Ｍ．Ｐａｎｄｏｌｆｏ  ＆  Ｄ．Ｈ．Ｇｅｓｃｈｗｉｎｄ（２００６）Ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｉｎ  ｆｒａｔａｘｉｎ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ：ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ｄｉｓ，２２，３０２−１１．
Ｃｏｐｐｏｌａ，Ｇ．，Ｄ．Ｍａｒｍｏｌｉｎｏ，Ｄ．Ｌｕ，Ｑ．Ｗａｎｇ，Ｍ．Ｃｎｏｐ，Ｍ．Ｒａｉ，Ｆ．Ａｃｑｕａｖｉｖａ，Ｓ．Ｃｏｃｏｚｚａ，Ｍ．Ｐａｎｄｏｌｆｏ  ＆  Ｄ．Ｈ．Ｇｅｓｃｈｗｉｎｄ（２００９）Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｆｒａｔａｘｉｎ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｔｈｅ  ＰＰＡＲｇａｍｍａ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｓ  ａ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔ  ｉｎ  Ｆｒｉｅｄｒｅｉｃｈ’ｓ  ａｔａｘｉａ．Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ，１８，２４５２−６１．
Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ，Ｅ．，Ｋ．Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ，Ｃ．Ｍ．Ｓｈａｒｍａ，Ｋ．Ｇｏｎｚａｌｅｓ，Ｙ．Ｃｈａｏ，Ｚ．Ａ．Ｐｉｒｚａｄａ，Ｍ．Ｒ．Ｅｃｋｅｒｔ，Ｊ．Ｖｏｇｅｌ  ＆  Ｅ．Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ（２０１１）ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｒａｎｓ−ｅｎｃｏｄｅｄ  ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ｈｏｓｔ  ｆａｃｔｏｒ  ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ．Ｎａｔｕｒｅ，４７１，６０２−７．
Ｅｌ−Ｓａｙｅｄ，Ａ．，Ｓ．Ｆｕｔａｋｉ  ＆  Ｈ．Ｈａｒａｓｈｉｍａ（２００９）Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｗａｙｓ  ｔｏ  ｏｖｅｒｃｏｍｅ  ｅｎｄｏｓｏｍａｌ  ｅｎｔｒａｐｍｅｎｔ．ＡＡＰＳ  Ｊ，１１，１３−２２．
Ｆｏｍｉｎａｙａ，Ｊ．，Ｃ．Ｕｈｅｒｅｋ  ＆  Ｗ．Ｗｅｌｓ（１９９８）Ａ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｖｉａ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  ＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，５，５２１−３０．
Ｆｏｎｆａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ  ｏｆ  Ｃａｓ９  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｘｃｈａｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｄｕａｌ−ＲＮＡ  ａｎｄ  Ｃａｓ９  ａｍｏｎｇ  ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４２：２５７７−２５９０（２０１４）．
Ｆｕ，Ｙ．，Ｊ．Ａ．Ｆｏｄｅｎ，Ｃ．Ｋｈａｙｔｅｒ，Ｍ．Ｌ．Ｍａｅｄｅｒ，Ｄ．Ｒｅｙｏｎ，Ｊ．Ｋ．Ｊｏｕｎｇ  ＆  Ｊ．Ｄ．Ｓａｎｄｅｒ（２０１３）Ｈｉｇｈ−ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，３１，８２２−６．
Ｇｅｒａｒｄ，  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎ  ＡＡＶ９  ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ｆｒａｔａｘｉｎ  ｃｌｅａｒｌｙ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｔｈｅ  ｓｙｍｐｔｏｍｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  ｔｈｅ  ｌｉｆｅ  ｏｆ  Ｆｒｉｅｄｒｅｉｃｈ  ａｔａｘｉａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １，１−１１（２０１４）．
Ｇｈｏｓｈ，Ａ．＆  Ｄｕａｎ，Ｄ．Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｃａｐａｃｉｔｙ：ａ  ｔａｌｅ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＆  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ２４，１６５−１７７（２００７）．
Ｇｈｏｓｈ，Ａ．，Ｙｕｅ，Ｙ．＆  Ｄｕａｎ，Ｄ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｈｙｂｒｉｄ  ｄｕａｌ  ＡＡＶ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｃａｒｒｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｉｎｉｍｉｚｅｄ  ｂｒｉｄｇｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２２，７７−８３（２０１１）．
Ｇｈｏｓｈ，Ａ．，Ｙｕｅ，Ｙ．，Ｌａｉ，Ｙ．＆  Ｄｕａｎ，Ｄ．Ａ  ｈｙｂｒｉｄ  ｖｅｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ  ｅｘｐａｎｄｓ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｉｎ  ａ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍａｎｎｅｒ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １６，１２４−１３０，（２００８）．
Ｈｏｕ，Ｚ．，Ｙ．Ｚｈａｎｇ，Ｎ．Ｅ．Ｐｒｏｐｓｏｎ，Ｓ．Ｅ．Ｈｏｗｄｅｎ，Ｌ．Ｆ．Ｃｈｕ，Ｅ．Ｊ．Ｓｏｎｔｈｅｉｍｅｒ  ＆  Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ  （２０１３）Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｃａｓ９  ｆｒｏｍ  Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，１１０，１５６４４−９．
Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｔｅｍｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：２３３−２３９（２０１３）
Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．，Ｋ．Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ，Ｉ．Ｆｏｎｆａｒａ，Ｍ．Ｈａｕｅｒ，Ｊ．Ａ．Ｄｏｕｄｎａ  ＆  Ｅ．Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ（２０１２）Ａ  ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ｄｕａｌ−ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ＤＮＡ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７，８１６−２１．
Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｃａｓ９  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｒｅｖｅａｌ  ＲＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４３：１２４７９９７−１２４７９９７（２０１４）
Ｋａｋｉｍｏｔｏ，Ｓ．，Ｔ．Ｈａｍａｄａ，Ｙ．Ｋｏｍａｔｓｕ，Ｍ．Ｔａｋａｇｉ，Ｔ．Ｔａｎａｂｅ，Ｈ．Ａｚｕｍａ，Ｓ．Ｓｈｉｎｋａｉ  ＆  Ｔ．Ｎａｇａｓａｋｉ（２００９）Ｔｈｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  ｔｏｘｉｎ  Ｔ  ｄｏｍａｉｎ  ｔｏ  ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ）ｂａｓｅｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｅｎｄｏｓｏｍａｌ  ｅｓｃａｐｅ  ｄｕｒｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，３０，４０２−８．
Ｋａｋｕｄｏ，Ｔ．，Ｓ．Ｃｈａｋｉ，Ｓ．Ｆｕｔａｋｉ，Ｉ．Ｎａｋａｓｅ，Ｋ．Ａｋａｊｉ，Ｔ．Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｋ．Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｈ．Ｋａｍｉｙａ  ＆  Ｈ．Ｈａｒａｓｈｉｍａ（２００４）Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｅｑｕｉｐｐｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｐＨ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ：ａｎ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｖｉｒａｌ−ｌｉｋｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４３，５６１８−２８．
Ｋｉｃｈｌｅｒ，Ａ．，Ｃ．Ｌｅｂｏｒｇｎｅ，Ｊ．Ｍａｒｚ，Ｏ．Ｄａｎｏｓ  ＆  Ｂ．Ｂｅｃｈｉｎｇｅｒ（２００３）Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｉｎｔｏ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，１００，１５６４−８．
Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ−ｓｃａｌｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｎａｔｕｒｅ  ５１７，５８３−５８８，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１４１３６（２０１５）．
Ｋｗｏｎ，Ｅ．Ｊ．，Ｊ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅｎ  ＆  Ｓ．Ｈ．Ｐｕｎ（２００８）Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ＨＩＶ  ｇｐ４１−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｏｒ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｓｉＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｅｈｉｃｌｅｓ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ，１９，９２０−７．
Ｌｉ，Ｋ．，Ａ．Ｓｉｎｇｈ，Ｄ．Ｒ．Ｃｒｏｏｋｓ，Ｘ．Ｄａｉ，Ｚ．Ｃｏｎｇ，Ｌ．Ｐａｎ，Ｄ．Ｈａ  ＆  Ｔ．Ａ．Ｒｏｕａｕｌｔ（２０１０）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｆｒａｔａｘｉｎ  ｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ  ＳＲＦ  ａｎｄ  ＴＦＡＰ２．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，５，ｅ１２２８６．
Ｌｏｒｉｅａｕ，Ｊ．Ｌ．，Ｊ．Ｍ．Ｌｏｕｉｓ  ＆  Ａ．Ｂａｘ（２０１０）Ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｆｕｓｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ  ａｄｏｐｔｓ  ａ  ｔｉｇｈｔ  ｈｅｌｉｃａｌ  ｈａｉｒｐｉｎ  ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ  ａｔ  ｔｈｅ  ｌｉｐｉｄ：ｗａｔｅｒ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，１０７，１１３４１−６．
Ｌｕｎｄｂｅｒｇ，Ｐ．，Ｓ．Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ，Ｔ．Ｓｕｔｌｕ，Ｈ．Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  ＆  Ｕ．Ｌａｎｇｅｌ（２００７）Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ  ｕｓｉｎｇ  ｅｎｄｏｓｏｍｏｌｙｔｉｃ  ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．ＦＡＳＥＢ  Ｊ，２１，２６６４−７１．
Ｍａｌｉ，Ｐ．，Ｊ．Ａａｃｈ，Ｐ．Ｂ．Ｓｔｒａｎｇｅｓ，Ｋ．Ｍ．Ｅｓｖｅｌｔ，Ｍ．Ｍｏｏｓｂｕｒｎｅｒ，Ｓ．Ｋｏｓｕｒｉ，Ｌ．Ｙａｎｇ  ＆  Ｇ．Ｍ．Ｃｈｕｒｃｈ（２０１３ａ）ＣＡＳ９  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｐａｉｒｅｄ  ｎｉｃｋａｓｅｓ  ｆｏｒ  ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，３１，８３３−８．
Ｍａｌｉ，Ｐ．，Ｌ．Ｙａｎｇ，Ｋ．Ｍ．Ｅｓｖｅｌｔ，Ｊ．Ａａｃｈ，Ｍ．Ｇｕｅｌｌ，Ｊ．Ｅ．ＤｉＣａｒｌｏ，Ｊ．Ｅ．Ｎｏｒｖｉｌｌｅ  ＆  Ｇ．Ｍ．Ｃｈｕｒｃｈ（２０１３ｂ）ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｖｉａ  Ｃａｓ９．Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３９，８２３−６．
Ｍａｒｋｕｓｉｃ，Ｄ．Ｍ．＆  Ｈｅｒｚｏｇ，Ｒ．Ｗ．Ｌｉｖｅｒ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ＆  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  １，１−９，ｄｏｉ：１０．４１７２／２１５７−７４１２．Ｓ１−００９（２０１２）．
Ｍａｔｒａｉ，  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｉｎｔｅｇｒａｓｅ−ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ｌｏｗ  ｇｅｎｏｔｏｘｉｃ  ｒｉｓｋ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ５３，１６９６−１７０７，ｄｏｉ：１０．１００２／ｈｅｐ．２４２３０（２０１１）．
Ｍｉｄｏｕｘ，Ｐ．，Ａ．Ｋｉｃｈｌｅｒ，Ｖ．Ｂｏｕｔｉｎ，Ｊ．Ｃ．Ｍａｕｒｉｚｏｔ  ＆  Ｍ．Ｍｏｎｓｉｇｎｙ（１９９８）Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｂｙ  ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｓｅｖｅｒａｌ  ｈｉｓｔｉｄｉｎｅｓ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ，９，２６０−７．
Ｎｉｅｔｕｐｓｋｉ，  Ｊ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＡＡＶ８−ａｌｐｈａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  Ａ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｈｕｍｏｒａｌ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｉｎ  ｎｏｎｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ  ｄｅｓｐｉｔｅ  ｌｏｗ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １９，１９９９−２０１１，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔ．２０１１．１１９（２０１１）．Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｃａｓ９  ｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ｔａｒｇｅｔ  ＤＮＡ，Ｃｅｌｌ  １５６：９３５−４９４（２０１４）
Ｎｏｇｕｃｈｉ，Ｈ．，Ｈ．Ｋａｎｅｔｏ，Ｇ．Ｃ．Ｗｅｉｒ  ＆  Ｓ．Ｂｏｎｎｅｒ−Ｗｅｉｒ（２００３）ＰＤＸ−１  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｉｔｓ  ｏｗｎ  ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｃａｎ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｄｕｃｔ  ａｎｄ  ｉｓｌｅｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ，５２，１７３２−７．
Ｐａｎｄｏｌｆｏ，Ｍ．（２０１２）Ｆｒｉｅｄｒｅｉｃｈ  ａｔａｘｉａ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，１０３，２７５−２９４．
Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．＆  Ｄ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，８５，２４４４−８．
Ｐｅｐｋｅ，Ｓ．，Ｗｏｌｄ，Ｂ．＆  Ｍｏｒｔａｚａｖｉ，Ａ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ＣｈＩＰ−ｓｅｑ  ａｎｄ  ＲＮＡ−ｓｅｑ  ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６，Ｓ２２−３２，（２００９）．
Ｐｅｒｅｚ−Ｐｉｎｅｒａ，Ｐ．，Ｄ．Ｄ．Ｋｏｃａｋ，Ｃ．Ｍ．Ｖｏｃｋｌｅｙ，Ａ．Ｆ．Ａｄｌｅｒ，Ａ．Ｍ．Ｋａｂａｄｉ，Ｌ．Ｒ．Ｐｏｌｓｔｅｉｎ，Ｐ．Ｉ．Ｔｈａｋｏｒｅ，Ｋ．Ａ．Ｇｌａｓｓ，Ｄ．Ｇ．Ｏｕｓｔｅｒｏｕｔ，Ｋ．Ｗ．Ｌｅｏｎｇ，Ｆ．Ｇｕｉｌａｋ，Ｇ．Ｅ．Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｔ．Ｅ．Ｒｅｄｄｙ  ＆  Ｃ．Ａ．Ｇｅｒｓｂａｃｈ（２０１３）ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｇｅｎｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９−ｂａｓｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．
Ｐｏｏｋ，  Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｓｃｕｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｒｉｅｄｒｅｉｃｈ’ｓ  ａｔａｘｉａ  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｍｏｕｓｅ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ＹＡＣ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ．Ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３，１８５−１９３（２００１）．
Ｑｉ，Ｌ．Ｓ．，Ｍ．Ｈ．Ｌａｒｓｏｎ，Ｌ．Ａ．Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｊ．Ａ．Ｄｏｕｄｎａ，Ｊ．Ｓ．Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ａ．Ｐ．Ａｒｋｉｎ  ＆  Ｗ．Ａ．Ｌｉｍ（２０１３）Ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ  ａｓ  ａｎ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｃｅｌｌ，１５２，１１７３−８３．
Ｓａｌｏｍｏｎｅ，Ｆ．，Ｆ．Ｃａｒｄａｒｅｌｌｉ，Ｍ．Ｄｉ  Ｌｕｃａ，Ｃ．Ｂｏｃｃａｒｄｉ，Ｒ．Ｎｉｆｏｓｉ，Ｇ．Ｂａｒｄｉ，Ｌ．Ｄｉ  Ｂａｒｉ，Ｍ．Ｓｅｒｒｅｓｉ  ＆  Ｆ．Ｂｅｌｔｒａｍ（２０１２）Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｗｉｔｈ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｄｉｓｒｕｐｔｉｖｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｅｎｄｏｓｏｍａｌ  ｅｓｃａｐｅ．Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１６３，２９３−３０３．
Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓ，Ｒ．，Ｇ．Ｇａｓｉｕｎａｓ，Ｃ．Ｆｒｅｍａｕｘ，Ｒ．Ｂａｒｒａｎｇｏｕ，Ｐ．Ｈｏｒｖａｔｈ  ＆  Ｖ．Ｓｉｋｓｎｙｓ（２０１１）Ｔｈｅ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，３９，９２７５−８２．
Ｓｃｈｏｅｎｆｅｌｄ，Ｒ．Ａ．，Ｅ．Ｎａｐｏｌｉ，Ａ．Ｗｏｎｇ，Ｓ．Ｚｈａｎ，Ｌ．Ｒｅｕｔｅｎａｕｅｒ，Ｄ．Ｍｏｒｉｎ，Ａ．Ｒ．Ｂｕｃｋｐｉｔｔ，Ｆ．Ｔａｒｏｎｉ，Ｂ．Ｌｏｎｎｅｒｄａｌ，Ｍ．Ｒｉｓｔｏｗ，Ｈ．Ｐｕｃｃｉｏ  ＆  Ｇ．Ａ．Ｃｏｒｔｏｐａｓｓｉ（２００５）Ｆｒａｔａｘｉｎ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ａｌｔｅｒｓ  ｈｅｍｅ  ｐａｔｈｗａｙ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ  ａｎｄ  ｄｅｃｒｅａｓｅｓ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｈｅｍｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ，１４，３７８７−９９．
Ｓｕｌｔａｎ，  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｇｌｏｂａｌ  ｖｉｅｗ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｂｙ  ｄｅｅｐ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２１，９５６−９６０，ｄｏｉ：１１６０３４２［ｐｉｉ］
１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１６０３４２（２００８）．
Ｔｉｊｓｓｅｎ．１９９３．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ”，．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．
Ｔｒｅｈｉｎ，Ｒ．，Ｕ．Ｋｒａｕｓｓ，Ａ．Ｇ．Ｂｅｃｋ−Ｓｉｃｋｉｎｇｅｒ，Ｈ．Ｐ．Ｍｅｒｋｌｅ  ＆  Ｈ．Ｍ．Ｎｉｅｌｓｅｎ（２００４）Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｕｐｔａｋｅ  ｂｕｔ  ｌｏｗ  ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｅｌｌ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｔａｔ（４７−５７）ｔｈｒｏｕｇｈ  ｗｅｌｌ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｍｏｄｅｌｓ．Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ，２１，１２４８−５６．
Ｖｉｒｍｏｕｎｉ，  Ｓ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｎｏｖｅｌ  ＧＡＡ  ｒｅｐｅａｔ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｆｒｉｅｄｒｅｉｃｈ  ａｔａｘｉａ．Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｍｏｄｅｌｓ  ＆ａｍｐ；Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ（２０１５）．
Ｗａｎｇ，Ｚ．，Ｇｅｒｓｔｅｉｎ，Ｍ．＆  Ｓｎｙｄｅｒ，Ｍ．ＲＮＡ−Ｓｅｑ：ａ  ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃｓ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  １０，５７−６３，ｄｏｉ：ｎｒｇ２４８４［ｐｉｉ］
１０．１０３８／ｎｒｇ２４８４（２００９）．
Ｚｈａｎｇ，  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ  ｌｉｖｅｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ｐｏｍｐｅ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２３，４６０−４７２，ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｕｍ．２０１１．０６３（２０１２）．
Ｚｅｎｄｅｒ，Ｌ．，Ｆ．Ｋｕｈｎｅｌ，Ｒ．Ｋｏｃｋ，Ｍ．Ｍａｎｎｓ  ＆  Ｓ．Ｋｕｂｉｃｋａ（２００２）ＶＰ２２−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｏｆ  ｐ５３  ｉｎ  ｈｅｐａｔｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，９，４８９−９６．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２０−３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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