(57)【要約】  野生型生物学的タンパク質を選択する工程と、野生型生物学的タンパク質をコードするＤＮＡを１つ以上の発達的技術を用いて発達させて、変異ＤＮＡを作成する工程と、真核細胞産生宿主で変異ＤＮＡを発現させて、変異タンパク質を得る工程と、変異タンパク質及び野生型タンパク質を正常生理条件下での分析及び異常条件下での分析に供する工程と、（ａ）正常生理条件での分析における野生型タンパク質と比較した活性の低下、及び（ｂ）異常条件下での分析における野生型タンパク質と比較した活性の増加のうちの少なくとも１つを呈する条件的活性型変異タンパク質を選択する工程と、発現工程で使用したのと同じ真核細胞産生宿主で条件的活性型生物学的タンパク質を作製する工程とにより、条件的活性型生物学的タンパク質を調製する方法。
2017532019.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
条件的活性型生物学的タンパク質を作製する方法であって、
ｉ．野生型生物学的タンパク質を選択する工程と、
ｉｉ．前記野生型生物学的タンパク質をコードするＤＮＡを１つ以上の発達的技術を用いて発達させて、変異ＤＮＡを作成する工程と、
ｉｉｉ．真核細胞産生宿主で前記変異ＤＮＡを発現させて、変異タンパク質を得る工程と、
ｉｖ．前記変異タンパク質及び前記野生型タンパク質を正常生理条件下での分析及び異常条件下での分析に供する工程と、
ｖ．工程（ｉｉｉ）で発現した前記変異タンパク質であって、（ａ）前記正常生理条件での前記分析における前記野生型タンパク質と比較した活性の低下、及び（ｂ）前記異常条件下での前記分析における前記野生型タンパク質と比較した活性の増加のうちの少なくとも１つを呈する前記変異タンパク質から条件的活性型生物学的タンパク質を選択する工程と、
ｖｉ．工程（ｉｉｉ）で使用したのと同じ真核細胞産生宿主で前記条件的活性型生物学的タンパク質を作製する工程と
を含む方法。
【請求項２】
前記条件的活性型生物学的タンパク質が、（ａ）前記正常生理条件での前記分析における前記野生型タンパク質と比較した活性の低下、及び（ｂ）前記異常条件下での前記分析における前記野生型タンパク質と比較した活性の増加の両方を呈する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記野生型生物学的タンパク質が抗体である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記野生型生物学的タンパク質が、組織プラスミノーゲン活性化因子、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、レニン、及びヒアルロニダーゼから選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記野生型生物学的タンパク質が、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、サブスタンスＰ、ニューロペプチドＹ、血管作動性腸管ペプチド、バソプレシン、アンジオスタチン、標的細胞上の標的タンパク質と結合するタンパク質、及びＤＮＡ／ＲＮＡ修飾タンパク質から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
前記正常生理条件が、正常生理温度、ｐＨ、浸透圧、重量オスモル濃度、酸化的ストレス及び電解質濃度のうちの１つ以上から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項７】
前記正常生理条件が温度であり、前記条件的活性型生物学的タンパク質が前記正常生理温度で実質的に不活性であり、且つ前記正常生理温度より低い異常温度で活性である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記発達させる工程が、ＰＣＲ、エラープローンＰＣＲ、シャッフリング、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、アセンブリＰＣＲ、セクシャルＰＣＲ突然変異誘発、インビボ突然変異誘発、カセット突然変異誘発、再帰的アンサンブル突然変異誘発、指数関数的アンサンブル突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、遺伝子リアセンブリ、遺伝子部位飽和突然変異誘発、インビトロ突然変異誘発、リガーゼ連鎖反応、オリゴヌクレオチド合成及びこれらの組み合わせからなる群から選択される技法を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項９】
前記真核細胞産生宿主が、真菌細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞、アデノウイルス、及び植物細胞から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１０】
前記真菌細胞が、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｌｙｍｏｒｐｈａ）、及びアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来の細胞から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記昆虫細胞が、ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２細胞及びスポドプテラ属（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９細胞から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記哺乳類細胞が、Ｂｏｗｅｓメラノーマ細胞、ＣＯＳ−７細胞、Ｃ１２７細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、３Ｔ３マウス線維芽細胞、ＢＨＫ２１シリアンハムスター線維芽細胞、ＭＤＣＫイヌ上皮細胞、ＰｔＫ１ネズミカンガルー上皮細胞、ＳＰ２／０マウス形質細胞、ＮＳ０マウス形質細胞、ＨＥＫ  ２９３ヒト胎児腎細胞、ＣＯＳサル腎細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ−Ｓ、Ｒ１マウス胚細胞、Ｅ１４．１マウス胚細胞、Ｈ１ヒト胚細胞、Ｈ９ヒト胚細胞、及びＰＥＲ  Ｃ．６、ヒト胚細胞から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記哺乳類細胞が、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０マウス形質細胞、及びＨＥＫ２９３ヒト胎児腎細胞から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
サイトカイン、インターロイキン、酵素、ホルモン、成長因子、細胞傷害剤、化学療法薬、放射性粒子及び診断用薬剤から選択される分子に前記条件的活性型抗体をコンジュゲートする工程をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１５】
前記コンジュゲートする工程が、前記条件的活性型抗体と前記分子との間に共有結合を形成する工程を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記コンジュゲートする工程が、前記条件的活性型抗体と前記分子との間に非共有結合を形成する工程を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記分子が前記条件的活性型抗体のＦｃ領域にコンジュゲートされる、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記条件的活性型抗体を多重特異性となるように操作する工程をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１９】
前記操作された条件的活性型抗体が少なくとも２つの抗原に結合することができる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記作製する工程が製造することを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
標的細胞上の標的タンパク質と結合する前記タンパク質が、ウイルス粒子によって認識タンパク質として使用される、請求項１〜３又は６〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
標的細胞上の標的タンパク質と結合する前記タンパク質が、キメラ抗原受容体に組み込まれる、請求項１〜３又は６〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記真核細胞産生宿主が細胞傷害性細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞傷害性細胞がＴ細胞である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法によって調製される条件的活性型生物学的タンパク質であって、正常生理条件で可逆的又は不可逆的に不活性化される条件的活性型生物学的タンパク質。
【請求項２６】
少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む、請求項２５に記載の条件的活性型生物学的タンパク質。
【請求項２７】
請求項２５又は２６に記載の条件的活性型生物学的タンパク質を含むキメラ抗原受容体。
【請求項２８】
請求項２７に記載のキメラ抗原受容体を含む細胞傷害性細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、タンパク質の発達及び活性の分野に関する。具体的には、本開示は、野生型タンパク質、詳細には治療的タンパク質から条件的活性型生物学的タンパク質を生成する方法に関し、この生成されたタンパク質は、野生型タンパク質が典型的に直面する正常生理条件では可逆的又は不可逆的に事実上不活性化されるが、他の条件では活性である。例えば、発達させたタンパク質は、体温では事実上不活性であるが、より低い温度では活性である。
【背景技術】
【０００２】
様々な特徴においてタンパク質を発達させるための可能性、例えば、特に酵素を異なる条件下での操作のために安定させることについて記載している相当数の文献がある。例えば、酵素は、活性を変化させることで、より高い温度で安定するために発達した。高温での活性改良に関連して、改良の実質的な部分は、摂氏１０度上昇するごとに代謝回転が倍増する酵素の場合に推定されるＱ１０則により共通して記載される高い動的活性に起因していることがある。加えて、所与の温度における分子の活性など、その正常な動作条件でタンパク質を不安定化させる天然の突然変異の例がある。温度変異体について、これらの変異体は低温で活性であり得るが、典型的にはその由来となった野生型分子と比較して活性レベルが低い。これは、Ｑｌ０又は同様の法則によって導かれる活性の低下によって説明し得る。
【０００３】
条件的活性型である有用な分子の生成が望ましい。例えば、かかる分子は、その由来となった対応する野生型分子が典型的に直面する条件下では事実上不活性であり得るが、他の条件では、対応する野生型分子が典型的に直面する条件下における活性と等しいか若しくはそれより高いレベルで活性であり、又は特定の微小環境で活性化若しくは不活性化されるか、又は時間と共に活性化若しくは不活性化される。温度に加え、それに関してタンパク質を発達させるか又は最適化し得る他の条件としては、ｐＨ、浸透圧、重量オスモル濃度、酸化的ストレス及び電解質濃度が挙げられる。発達させる際に最適化し得る他の望ましい特性としては、化学的抵抗性及びタンパク質分解抵抗性が挙げられる。
【０００４】
分子を発達又は操作するための多くの戦略が既に公開されている。しかしながら、その野生型操作条件において、不活性又は実質的に不活性（１０％活性以下、及び特に１％活性以下）となるようにタンパク質を操作又は発達させることは、新しい条件において、野生型条件と等しいか又はそれよりも良好な活性を維持する一方で、不安定化変異及び不安定化効果に対抗しない変異を増加させる活性と共存する必要がある。不安定化が、Ｑ１０のような標準的規則によって予測された効果よりもタンパク質の活性を大きく減らすことができると推測され、従って低温で効果的に作用するタンパク質を発達させる能力は、例えば、それらの通常操作条件下では不活性であるのに対し、本発明者らがＭｉｒａｃタンパク質と称する予期せぬ新規のタンパク質を創造する。
【０００５】
本出願の全体において、様々な刊行物が著者及び日付により参照されている。その全体におけるこれらの刊行物の開示は、本明細書に記載及び特許請求される本開示の日付以降、当業者に知られている従来技術をより詳細に記載するために、本出願内に参照により組み込まれている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示は、条件的活性型生物学的タンパク質を調製する方法を提供するものであり、方法は、野生型生物学的タンパク質を選択する工程と、野生型生物学的タンパク質をコードするＤＮＡを１つ以上の発達的技術を用いて発達させて、変異ＤＮＡを作成する工程と、真核細胞産生宿主で変異ＤＮＡを発現させて、変異タンパク質を得る工程と、変異タンパク質及び野生型タンパク質を正常生理条件下での分析及び異常条件下での分析に供する工程と、（ａ）正常生理条件での分析における野生型タンパク質と比較した活性の低下、及び（ｂ）異常条件下での分析における野生型タンパク質と比較した活性の増加のうちの少なくとも１つを呈する条件的活性型変異タンパク質を選択する工程と；発現工程で使用したのと同じ真核細胞産生宿主で条件的活性型生物学的タンパク質を作製する工程とを含む。別の態様において、条件的活性型変異タンパク質は、（ａ）正常生理条件での分析における野生型タンパク質と比較した活性の低下、及び（ｂ）異常条件下での分析における野生型タンパク質と比較した活性の増加の両方を呈する。様々な態様において、正常生理条件は、温度、ｐＨ、浸透圧、オスモル濃度、酸化的ストレス及び電解質濃度の１つ以上から選択される。特定の態様において、正常生理条件は温度であり、そこでは、条件的活性型生物学的タンパク質は実質的に正常生理温度では不活性であるが、正常生理温度よりも低い異常温度では活性である。他の態様において、条件的活性型生物学的タンパク質は、野生型正常生理条件において可逆的又は不可逆的に不活性である。１つの特定の態様において、タンパク質は、野生型正常生理条件で可逆的に不活性である。一方で、条件的活性型生物学的タンパク質は、活性における可逆的又は不可逆的な２つ以上の異なる生理条件の変化を示すこれらのタンパク質から選択される。
【０００７】
一実施形態において、野生型生物学的タンパク質は、酵素である。特定の態様において、野生型生物学的タンパク質は、組織プラスミノーゲン活性化因子、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、レニン及びヒアルロニダーゼからなる群から選択される。
【０００８】
他の実施形態において、野生型タンパク質は、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）、サブスタンスＰ（ＳＰ）、ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）、血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）、バソプレッシン、及びアンギオスタチンから選択される。
【０００９】
他の実施形態において、生物学的タンパク質は抗体である。
【００１０】
別の実施形態において、前出の実施形態のいずれかにおける正常生理条件は温度であり、及び条件的活性型生物学的タンパク質は正常生理温度で実質的に不活性であり、且つ正常生理温度より低い異常温度で活性である。
【００１１】
別の実施形態において、前出の実施形態のいずれかにおける発達させる工程は、ＰＣＲ、エラープローンＰＣＲ、シャッフリング、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、アセンブリＰＣＲ、セクシャルＰＣＲ突然変異誘発、インビボ突然変異誘発、カセット突然変異誘発、再帰的アンサンブル突然変異誘発、指数関数的アンサンブル突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、遺伝子リアセンブリ、遺伝子部位飽和突然変異誘発、インビトロ突然変異誘発、リガーゼ連鎖反応、オリゴヌクレオチド合成及びこれらの組み合わせからなる群から選択される技法を含む。
【００１２】
別の実施形態において、前出の実施形態のいずれかにおける真核細胞産生宿主は、真菌細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞、アデノウイルス、及び植物細胞から選択される。
【００１３】
別の実施形態において、前出の実施形態のいずれかにおける哺乳類細胞は、Ｂｏｗｅｓメラノーマ細胞、ＣＯＳ−７細胞、Ｃ１２７細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、３Ｔ３マウス線維芽細胞、ＢＨＫ２１シリアンハムスター線維芽細胞、ＭＤＣＫイヌ上皮細胞、ＰｔＫ１ネズミカンガルー上皮細胞、ＳＰ２／０マウス形質細胞、ＮＳ０マウス形質細胞、ＨＥＫ  ２９３ヒト胎児腎細胞、ＣＯＳサル腎細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ−Ｓ、Ｒ１マウス胚細胞、Ｅ１４．１マウス胚細胞、Ｈ１ヒト胚細胞、Ｈ９ヒト胚細胞、及びＰＥＲ  Ｃ．６、ヒト胚細胞から選択される。
【００１４】
別の実施形態において、前出の実施形態のいずれかの作製工程は製造することを含む。
【００１５】
別の実施形態において、前出の実施形態のいずれかにおける条件的活性型生物学的タンパク質は、ウイルス粒子によって認識タンパク質として使用される。
【００１６】
別の実施形態において、標的細胞上の標的タンパク質と結合する前出の実施形態のいずれかにおける条件的活性型生物学的タンパク質は、キメラ抗原受容体に組み込まれる。
【００１７】
別の実施形態において、前出の実施形態のいずれかの方法によって調製される条件的活性型生物学的タンパク質は、正常生理条件で可逆的又は不可逆的に不活性化される。
【００１８】
別の実施形態において、前段落の条件的活性型生物学的タンパク質は、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む。
【００１９】
別の実施形態において、前の２つの段落の条件的活性型生物学的タンパク質は、キメラ抗原受容体の一部である。
【００２０】
別の実施形態において、本開示は、条件的活性型生物学的タンパク質と薬学的に受容可能な担体とを含む医薬組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の一実施形態におけるキメラ抗原受容体の概略図を示す。ＡＳＴＲは抗原特異的標的領域であり、Ｌはリンカーであり、ＥＳＤは細胞外スペーサードメインであり、ＴＭは膜貫通ドメインであり、ＣＳＤは共刺激ドメインであり、及びＩＳＤは細胞内シグナル伝達ドメインである。
【図２】実施例７の条件的活性型抗体が二価又は一価抗体として発現しても、ｐＨ６．０未満及びｐＨ７．４超でこれらの抗体のその選択性に有意な変化がないことを示す。
【図３】実施例７の条件的活性型抗体が二価又は一価抗体として発現しても、ｐＨ６．０未満及びｐＨ７．４超でこれらの抗体のその選択性に有意な変化がないことを示す。
【図４】実施例８の条件的活性型抗体が凝集しないことを示すサイズ排除クロマトグラフのプロファイルである。
【図５】表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析によって計測したときの実施例８の条件的活性型抗体のオン及びオフ速度を示す。
【図６Ａ】実施例８のＳＰＲ分析によって計測したときの条件的活性型抗体の選択性を示す。
【図６Ｂ】実施例８のＳＰＲ分析によって計測したときの条件的活性型抗体の選択性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
定義
本明細書に提供される実施例の理解を容易にするために、特定のしばしば登場する方法及び／又は用語は以下に定義される。
【００２３】
測定量と関連して本明細書で使用される用語「約」は、測定を行い、測定の目的に相応の注意レベルと使用される測定機器の精度を行使する当業者によって期待される測定量における通常の変動に関連するものである。特に明記しない限り、「約」は、与えられた値の＋／−１０％の変動に関連する。
【００２４】
用語「薬剤」は、化学化合物、化学化合物の混合物、空間的に局所化された化合物の配列（例えば、ＶＬＳＩＰＳペプチド配列、ポリヌクレオチド配列、及び／又はコンビナトリアル小分子配列）、生体高分子、バクテリオファージペプチドディスプレイライブラリ、バクテリオファージ抗体（例えばｓｃＦＶ）ディスプレイライブラリ、ポリソームペプチドディスプレイライブラリ、又はバクテリア、植物、菌類又は動物（特に哺乳類）の細胞又は組織のような生体材料から作られる抽出物を示すのに用いられる。薬剤は、本明細書の以下に記載されているスクリーニング分析に含まれることにより条件的活性型生物学的治療酵素として潜在的酵素活性のために評価される。薬剤は、以下の本明細書の以下に記載されているスクリーニング分析に含まれることにより条件的活性型生物学的治療酵素として潜在的活性のために評価される。
【００２５】
制限部位における「曖昧な塩基要件」は、最大限には特定されないヌクレオチド塩基要件に関連するものである。例えば、特定の塩基（例えば、この例に限定はされないが、Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＴから選択される特定の塩基）ではないが、少なくとも２つ以上の塩基の任意の１つであってもよい。塩基の曖昧性を表すために本明細書と同様に従来技術において用いられる共通に認められた省略形には以下を含む：Ｒ＝Ｇ又はＡ；Ｙ＝Ｃ又はＴ；Ｍ＝Ａ又はＣ；Ｋ＝Ｇ又はＴ；Ｓ＝Ｇ又はＣ；Ｗ＝Ａ又はＴ；Ｈ＝Ａ又はＣ又はＴ；Ｂ＝Ｇ又はＴ又はＣ；Ｖ＝Ｇ又はＣ又はＡ；Ｄ＝Ｇ又はＡ又はＴ；Ｎ＝Ａ又はＣ又はＧ又はＴ。
【００２６】
本明細書で使用される用語「アミノ酸」は、アミノ基（−ＮＨ２）及びカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）を含む任意の有機化合物である、好適には、自由群又はペプチドの部分として縮合後のいずれでも結合する。「アルファ−アミノ酸を形成する２０種の自然にエンコードされたポリペプチド」は従来技術において知られており、アラニン（ａｌａ又はＡ）、アルギニン（ａｒｇ又はＲ）、アスパラギン（ａｓｎ又はＮ）、アスパラギン酸（ａｓｐ又はＤ）、システイン（ｃｙｓ又はＣ）、グルタミン酸（ｇｌｕ又はＧ）、ヒスチジン（ｈｉｓ又はＨ）、イソロイシン（ｉｌｅ又はＩ）、ロイシン（ｌｅｕ又はＬ）、リシン（ｌｙｓ又はＫ）、メチオニン（ｍｅｔ又はＭ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ又はＦ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、セリン（ｓｅｒ又はＳ）、スレオニン（ｔｈｒ又はＴ）、トリプトファン（ｔｉｐ又はＷ）、チロシン（ｔｙｒ又はＹ）及びバリン（ｖａｌ又はＶ）に関連するものである。
【００２７】
用語「増幅」は、ポリヌクレオチドのコピー数が増大することを意味する。
【００２８】
用語「抗体」は、本明細書で使用されるとき、インタクトな免疫グロブリン分子、並びにＦａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、及びＳＣＡフラグメントなどの抗原のエピトープとの結合能を有する免疫グロブリン分子のフラグメントを指す。これらの抗体フラグメントは、それが由来する抗体の抗原（例えばポリペプチド抗原）に選択的に結合するいくらかの能力を保持しているものであり、当該技術分野において周知の方法を用いて作製することができ（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ、前掲を参照）、以下のようにさらに記載される。抗体は、イムノアフィニティークロマトグラフィーによる抗原の調製分量の単離に使用することができる。かかる抗体の他の様々な用途は、疾患（例えば、新生物形成）の診断及び／又はステージ判定、及び例えば新生物形成、自己免疫疾患、ＡＩＤＳ、心血管疾患、感染症などの疾患を治療するための治療適用である。キメラ抗体、ヒト様抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体が、ヒト患者への投与に特に有用である。
【００２９】
Ｆａｂフラグメントは抗体分子の一価抗原結合フラグメントからなり、全抗体分子を酵素パパインで消化して、インタクトな軽鎖と重鎖の一部分とからなるフラグメントを生じさせることによって作製し得る。
【００３０】
抗体分子のＦａｂ’フラグメントは、全抗体分子をペプシンで処理し、続いて還元して、インタクトな軽鎖と重鎖の一部分とからなる分子を生じさせることによって得られ得る。このように処理した抗体分子１つにつき２つのＦａｂ’フラグメントが得られる。
【００３１】
抗体の（Ｆａｂ’）２フラグメントは、続く還元なしに全抗体分子を酵素ペプシンで処理することによって得られ得る。（Ｆａｂ’）２フラグメントは、２つのジスルフィド結合によって一体に保持される２つのＦａｂ’フラグメントの二量体である。
【００３２】
Ｆｖフラグメントは、２本の鎖として発現した軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域とを含む遺伝子操作されたフラグメントとして定義される。
【００３３】
用語「血液脳関門」又は「ＢＢＢ」は、たとえ尿素（６０ダルトン）などの極めて小さい分子であっても脳への分子の輸送を制限する緊密な障壁を作り出す、脳毛細血管内皮細胞膜内にタイトジャンクションによって形成される末梢循環と脳及び脊髄との間の生理的障壁を指す。脳内の血液脳関門、脊髄内の血液脊髄関門、及び網膜内の血液網膜関門は、中枢神経系（ＣＮＳ）内の連続的な毛細血管障壁であり、本明細書ではまとめて「血液脳関門」又は「ＢＢＢ」と称される。ＢＢＢにはまた血液脳脊髄液関門（脈絡叢）も包含され、この関門は毛細血管内皮細胞よりむしろ上衣細胞を含む。
【００３４】
用語「細胞産生宿主」又は「製造宿主」は、タンパク質の産生又は製造に使用される細胞株を指す。限定はされないが、ヒト、マウス、ハムスター、ラット、サル細胞株を含めた哺乳類細胞並びに酵母、昆虫及び植物細胞株などの真核細胞産生宿主である。或いは、原核細胞産生宿主が利用されてもよい。一態様において、哺乳類細胞産生宿主は、３Ｔ３マウス線維芽細胞；ＢＨＫ２１シリアンハムスター線維芽細胞；ＭＤＣＫ、イヌ上皮細胞；Ｈｅｌａヒト上皮細胞；ＰｔＫ１ネズミカンガルー上皮細胞；ＳＰ２／０マウス形質細胞；及びＮＳ０マウスマウス形質細胞；ＨＥＫ  ２９３ヒト胎児腎細胞；ＣＯＳサル腎細胞；ＣＨＯ、ＣＨＯ−Ｓチャイニーズハムスター卵巣細胞；Ｒ１マウス胚細胞；Ｅ１４．１マウス胚細胞；Ｈ１ヒト胚細胞；Ｈ９ヒト胚細胞；ＰＥＲ  Ｃ．６、ヒト胚細胞からなる群のメンバーから選択される。別の態様において、真核細胞産生宿主はＧＳ−ＮＳ０又はＧＳ−ＣＨＯＫ１細胞株である。別の態様において、真核細胞産生宿主は、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母細胞；及びピキア（ｐｉｃｃｈｉａ）酵母細胞から選択される。別の態様において、細胞産生宿主は細菌細胞株である。
【００３５】
用語「癌」及び「癌性」は、本明細書で使用されるとき、典型的には制御されない細胞成長によって特徴付けられる哺乳動物における生理的状態を指し、又はそれを表す。癌の例としては、限定はされないが、Ｂ細胞リンパ腫（ホジキンリンパ腫及び／又は非ホジキンリンパ腫）、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、肺癌、肝細胞癌、胃癌、膵癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、尿路癌、甲状腺癌、腎癌、癌腫、黒色腫、頭頸部癌、脳癌、及び限定はされないがアンドロゲン依存性前立腺癌及びアンドロゲン非依存性前立腺癌を含めた前立腺癌が挙げられる。
【００３６】
用語「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」又は「ＣＡＲｓ」は、本明細書で使用されるとき、細胞傷害性細胞、例えばＴ細胞、ＮＫ細胞及びマクロファージに抗原特異性をグラフトした、操作された受容体を指す。本発明のＣＡＲは、少なくとも１つの抗原特異的標的領域（ＡＳＴＲ）と、細胞外スペーサードメイン（ＥＳＤ）と、膜貫通ドメイン（ＴＭ）と、１つ以上の共刺激ドメイン（ＣＳＤ）と、細胞内シグナル伝達ドメイン（ＩＳＤ）とを含み得る。ある実施形態では、ＥＳＤ及び／又はＣＳＤは任意選択である。別の実施形態において、ＣＡＲは、２つの異なる抗原又はエピトープに特異的な二重特異性ＣＡＲである。ＡＳＴＲが標的抗原に特異的に結合すると、ＩＳＤが細胞内シグナル伝達を活性化する。例えば、ＩＳＤは、抗体の抗原結合特性を利用して、ＭＨＣの制限を受けない方法でＴ細胞特異性及び反応性を選択の標的にリダイレクトすることができる。ＭＨＣの制限を受けない抗原認識により、ＣＡＲを発現するＴ細胞は抗原プロセシングと独立した抗原認識能を得るため、従って主要な腫瘍エスケープ機構を回避する。さらに、Ｔ細胞で発現するとき、ＣＡＲは、有利には、内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖及びβ鎖と二量化しない。
【００３７】
「キメラ特性」を有する分子は１）第１の参照分子と部分的に相同及び部分的に非相同であり、さらに２）第２の参照分子と部分的に相同であると同時に部分的に非相同であり、３）１つ以上の付加的参照分子と部分的に相同であると同時に非相同となる可能性を排除することを含まない。非限定的な実施形態において、キメラ分子は、部分的な分子配列の再集合を組み立てることによって調製されることもある。非限定的な態様において、キメラポリヌクレオチド分子は、複数の分子テンプレートを使用するキメラポリヌクレオチドを合成することによって調製されることもある。それにより結果として、キメラポリヌクレオチドは複数のテンプレートの性質を有する。
【００３８】
本明細書で使用される用語「相同」とは、種間に関して発達的及び機能的である遺伝子配列を意味する。例えば、限定はされないが、ヒトの遺伝子において、ヒトＣＤ４遺伝子はマウス３ｄ４遺伝子と相同遺伝子であり、これら２つの遺伝子の配列及び構造は、高い相同性を示し、及び両遺伝子はＭＨＣクラスＩＩを制限された抗原認識によるＴ細胞活性化の信号を送る際に機能するタンパク質をエンコードする。
【００３９】
用語「工業規模」は、再販売に適切な規模でのタンパク質又は抗体の生産を意味する。
【００４０】
本明細書で用いられるとき、「比較ウィンドウ」は、少なくとも２０の隣接するヌクレオチドの部位の部分概念を意味するものであり、そこでは、ポリヌクレオチド配列は、少なくとも２０の隣接するヌクレオチドの参照配列と比較され、及び比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適な配置のための参照配列（付加又は削除を有さない）と比較して２０％パーセント以下の付加又は削除（すなわちギャップ）を有することもある。比較ウィンドウを配置するための配列の最適な配置は、スミスの局所的相同性アルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１／“Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｓｅｑｕｅｎｃｅｓ”，Ａｄｖ  Ａｐｐｌ  Ｍａｔｈ，２：４８２−４８９；Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，“Ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｔｈｅｏｒｙ”，Ｊ  Ｔｈｅｏｒ  Ｂｉｏｌ，９１：３７９−３８０；Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｍｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅｓ”，１９８１，１４７：１９５−１９７；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，“Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｂｉｏｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｍｅｔｒｉｃｓ”，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ，１８：３８−４６）によって、ニードルマンの相同性アルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，“Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ”Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，４８（３）：４４３−４５３）によって、ピアソンの相似性検索（Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ”，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８５：２４４４−２４４８）によって、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実施（ＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ，ａｎｄ  ＴＦＡＳＴＡ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）によって、又は調査によって導かれることがあり、及び選択された様々な方法によって生成される最高の配置（すなわち、比較ウィンドウ上で相同性の高い割合において結果として生じる）であることもある。
【００４１】
用語「条件的活性型生物学的タンパク質」は、１つ以上の正常生理条件下の親野生型タンパク質よりも活性が多い又は少ない野生型タンパク質の変異体又は変異を意味する。この条件的活性型タンパク質は、体の選択された領域でも活性を示し、又は異常又は感染に対して許容な生理条件下で活性の増加又は減少を示す。正常生理条件は、投与の部位での、又は対象への投与の部位又は作用部位での組織又は器官における通常範囲内で考慮される温度、ｐＨ、浸透圧、オスモル濃度、酸化的ストレス及び電解質濃度である。異常条件は、通常受け入れられる範囲から逸脱する条件のことを指す。一態様において、条件的活性型生物学的タンパク質は、野生型条件において実質的に不活性であるが、野生型条件と等しい又は野生型条件よりも良いレベルにおける他の野生型条件において活性である。例えば、部位の多様において、発達した条件的活性型生物学的タンパク質は体温において実質的に不活性であるが、低温では活性である。他の態様において、条件的活性型生物学的タンパク質は、野生型条件において、可逆的又は不可逆的に不活性である。さらなる態様において、野生型タンパク質は治療タンパク質である。他の態様において、条件的活性型生物学的タンパク質は、薬又は治療薬剤として用いられる。さらにもう１つの態様において、タンパク質は、例えば、肺を通過した後のような高い酸素濃度の血液中において、又は腎臓において見られる低いｐＨにおいて、多い又は少ない活性を示す。
【００４２】
「保存的アミノ酸置換」は、類似の側鎖を有する残基の互換性を意味する。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシン、カルボン酸側鎖を有するアミノ酸の群は、セリン及びトレオニン、アミドを含む側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギン及びグルタミン、芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン、塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、アルギニン、及びヒスチジン、及び含硫側鎖を有するアミノ酸の群は、システイン及びメチオニンである。好適な保存的アミノ酸置換群は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、及びアスパラギン−グルタミンである。
【００４３】
用語「対応する」は、本明細書において、ポリヌクレオチド配列が参照ポリヌクレオチド配列の全て又は一部に対して相同である（すなわち、厳密に発達的に関連がなくても同一である）、又はポリヌクレオチド配列が参照ポリヌクレオチド配列と同一であることを意味する。これと対比的に、用語「相補的」は、本明細書において、相補的配列が参照ポリヌクレオチド配列の全て又は一部に対して相同であることを意味する。例えば、ヌクレオチド配列が「ＴＡＴＡＣ」は参照「ＴＡＴＡＣ」に対応し、参照配列「ＧＴＡＴＡ」に対して相補的である。
【００４４】
用語「共刺激リガンド」は、本明細書で使用されるとき、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、Ｂ細胞など）上の分子であって、Ｔ細胞上のコグネイト共刺激分子に特異的に結合し、それによって、例えばペプチドを担持したＭＨＣ分子とのＴＣＲ／ＣＤ３複合体の結合により提供される一次シグナルに加えて、限定はされないが、増殖、活性化、分化などを含めたＴ細胞応答を媒介するシグナルを提供する分子を含む。共刺激リガンドには、限定はされないが、ＣＤ７、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激リガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−Ｇ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンβ受容体、３／ＴＲ６、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、ＨＶＥＭ、Ｔｏｌｌリガンド受容体に結合するアゴニスト又は抗体及びＢ７−Ｈ３と特異的に結合するリガンドが含まれ得る。共刺激リガンドにはまた、特に、限定はされないが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなど、Ｔ細胞上に存在する共刺激分子と特異的に結合する抗体も包含される。
【００４５】
用語「共刺激分子」は、本明細書で使用されるとき、共刺激リガンドと特異的に結合して、それによりＴ細胞による共刺激応答、例えば、限定はされないが増殖を媒介するＴ細胞上のコグネイト結合パートナーを指す。共刺激分子としては、限定はされないが、ＭＨＣクラス１分子、ＢＴＬＡ及びＴｏｌｌリガンド受容体が挙げられる。
【００４６】
用語「共刺激シグナル」は、本明細書で使用されるとき、ＴＣＲ／ＣＤ３ライゲーションなどの一次シグナルとの組み合わせでＴ細胞増殖及び／又は鍵分子の上方制御若しくは下方制御をもたらすシグナルを指す。
【００４７】
用語「細胞傷害性細胞」は、本明細書で使用されるとき、侵入微生物、腫瘍細胞又は他の罹患組織細胞に傷害を与え、又はそれを破壊することのできる細胞を意味する。この用語は、数ある細胞型の中でも特に、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、活性化ＮＫ細胞、好中球、Ｔ細胞、好酸球、好塩基球、Ｂ細胞、マクロファージ及びリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞を含むことが意図される。細胞傷害性細胞は、抗体、受容体、リガンド又はそのフラグメント／誘導体を介して標的細胞に結合することにより安定複合体を形成し、細胞傷害性細胞を刺激して標的細胞を破壊する。
【００４８】
用語「効果的分解」量は、酵素と接触していない基質と比較して、基質の少なくとも５０％を処理するのに必要な酵素の量に関連する。
【００４９】
本明細書で使用されるとき、「定義された配列枠組」は、ランダムではない塩基、一般的に実験データ又は構造データの塩基から選択された定義された配列のセットに関連する。例えば、定義された配列枠組は、ベータ−シート構造を形成するために予測されるアミノ酸配列のセットから構成されることがあり、また、他の変異において、ロイシンジッパー７つの繰り返しモチーフ、亜鉛フィンガー領域からなることがある。「定義された配列カーネル」は、可変性の限られた範囲を包含する配列のセットである。（１）２０の従来のアミノ酸の完全にランダムな１０塩基長配列は、（２０）１０配列のいずれかであり得る、及び（２）２０の従来のアミノ酸の擬似ランダムな１０塩基長配列は、（２０）１０配列のいずれかであり得るが、特定の部位及び／又は全体において、特定の残基にとってバイアスを示すが、これらに対し、（３）定義された配列カーネルは、各残基部位が許容可能な２０の従来のアミノ酸のいずれかであるようにしている場合、配列のサブセットである。定義された配列カーネルは一般的に変異又は不変異の残基部位を有する、及び／又は個々の選択されたライブラリメンバー配列の長さ全体或いはセグメント的に、アミノ酸残基及びその類の定義されたサブセットから選択された残基を有することがある変異残基部位を有する。定義された配列カーネルは、アミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列に関連することがある。限定はしないが、例として、配列（ＮＮＫ）１０及び（ＮＮＭ）１０を挙げる。ここで、ＮはＡ、Ｔ、Ｇ又はＣを表し、ＫはＧ又はＴを表し、及びＭは、Ａ又はＣを表し、配列（ＮＮＫ）１０及び（ＮＮＭ）１０は、定義された配列カーネルである。
【００５０】
ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡ内の特定の配列のみに作用する制限酵素によるＤＮＡの触媒的開裂に関する。本明細書において使用される様々な制限酵素は市販されているものであり、及びそれらの反応条件、補因子及び他の要件は当業者において既知のものが使用された。分析目的において、典型的には、１マイクログラムのプラスミド又はＤＮＡフラグメントが、約２０マイクロリットルの緩衝液において約２ユニットの酵素と共に用いられる。プラスミド作成のためＤＮＡフラグメントを分離させる目的において、典型的には５から５０マイクログラムのＤＮＡが、２０から２５０ユニットのより大きい体積の酵素によって消化される。特定の制限酵素のための適当な緩衝溶液及び基質の量は、製造業者によって特定される。３７℃で約１時間の培養が通常使用されるが、供給者の指示に従って変化することもある。消化後、反応は所望のフラグメントを分離して取得するために直接電気泳動にかけられる。
【００５１】
「指向性結紮」は、ポリヌクレオチドの５’末端及び３’末端における結紮が、好適な結紮方向を特定するのに十分異なることを意味する。例えば、本来、２つの平滑末端を有する未処理及び未消化のＰＣＲ生成物は、多重クローニング部位において平滑末端を生成するために消化されるクローニングベクター内において結紮される際に、典型的には好適な結紮方向を有さない。従って、指向性結紮は、これらに関連して典型的には示されない。対照的に、５’ＥｃｏＲＩ処理末端及び３’ＢａｍＨＩを有する消化されたＰＣＲ生成物が、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩにより消化された多重クローニング部位を有するクローニングベクター内で結紮される際に、指向性結紮は典型的に示される。
【００５２】
用語「遺伝子修飾された細胞傷害性細胞によって標的化される疾患」は、本明細書で使用されるとき、その遺伝子修飾細胞が治療上有益な結果をもたらすために罹患細胞を標的にするか、それとも健常細胞を標的にするかに関わらず、いかなる方法であれ任意の疾患に関与する任意の細胞を本発明の遺伝子修飾細胞によって標的化することを包含する。遺伝子修飾細胞には、限定はされないが、遺伝子修飾Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及びマクロファージが含まれる。遺伝子修飾細胞は本発明のＣＡＲを発現し、このＣＡＲは、標的細胞の表面上に発現する抗原のいずれかを標的化し得るものである。標的化され得る抗原の例としては、限定はされないが、Ｂ細胞上に発現する抗原；癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病、胚細胞腫瘍、及び芽細胞腫上に発現する抗原；様々な免疫細胞上に発現する抗原；及び様々な血液疾患、自己免疫疾患、及び／又は炎症性疾患に関連する細胞上に発現する抗原が挙げられる。標的化され得る他の抗原が当業者には明らかであろうと共に、本発明の代替的実施形態に関連して本発明のＣＡＲによって標的化され得る。
【００５３】
用語「ＤＮＡシャフリング」は、実質的に相同ではあるが、同一ではない配列間での組換えを示すために本明細書において使用され、実施形態によっては、ＤＮＡシャフリングは、ｃｅｒ／ｌｏｘ及び／又はｆｌｐ／ｆｒｔシステムなどを介してのように、非相同組換えを介しての乗換えを含むことがある。
【００５４】
用語「薬剤」又は「薬剤分子」は、ヒト又は動物の体に投与された際に、ヒト又は動物の体に有益な効果を有する物質を含む治療剤を意味する。好適には、薬剤は、１つ以上の症状、病気、又はヒト又は動物の体における異常条件を治療する、治す又は緩和する、又はヒト又は動物の体の健康を増進させることができるものである。
【００５５】
「有効量」は、若干の期間にわたって投与された者の生存生物における条件を治療する又は防止する、例えば、所望の投薬期間の間に治療的な効果を提供するのに有効的である、条件的活性型生物学的タンパク質又はフラグメントの量のことである。
【００５６】
本明細書で使用されるとき、用語「電解質」は、血液又は電荷を運搬する他の体液内の鉱物を定義するために使用される。例えば、一態様において、正常生理条件及び異常条件は、「電解質濃度」の条件であることがある。一態様において、試験される電解質濃度は、イオン化されたカルシウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、塩化物、重炭酸塩、及びリン酸塩濃度の１つ以上から選択される。例えば、一態様において、血清カルシウムの通常範囲は、８．５〜１０．２ｍｇ／ｄＬである。この態様において、異常血清カルシウム濃度は、通常範囲の上又は下から選択されることがある。他の実施例で、一態様において、血清塩化物は１リットルあたり９６〜１０６ミリグラム当量（ｍＥｑ／Ｌ）である。この態様において、異常血清塩化物濃度は、通常範囲の上又は下から選択されることがある。他の実施例で、一態様において、血清マグネシウム濃度の通常範囲は１．７〜２．２ｍｇ／ｄＬである。この態様において、異常血清マグネシウム濃度は、通常範囲の上又は下から選択されることがある。他の実施例で、一態様において、血清リン酸塩の通常範囲は、２．４〜４．１ｍｇ／ｄＬである。この態様において、異常血清リン酸塩濃度は、通常範囲の上又は下から選択されることがある。他の実施例で、一態様において、血清又は血液のナトリウムの通常範囲は１３５〜１４５ｍＥｑ／Ｌである。この態様において、異常血清又は血液ナトリウム濃度は、通常範囲の上又は下から選択されることがある。他の実施例で、一態様において、血清又は血液カリウムの通常範囲は、３．７〜５．２ｍＥｑ／Ｌである。この態様において、異常血清又は血液カリウム濃度は、通常範囲の上又は下から選択されることがある。さらなる態様において、血清重炭酸塩の通常範囲は２０〜２９ｍＥｑ／Ｌである。この態様において、異常血清又は血液重炭酸塩濃度は、通常範囲の上又は下から選択されることがある。異なる態様において、重炭酸塩レベルは、血液における酸性の通常レベル（ｐＨ）を示すために使用されることがある。用語「電解質濃度」は、組織、又は血液又は血漿以外の体液における特定の電解質濃度を定義するためにも使用されることがある。この場合、正常生理条件は、その組織又は体液において臨床的通常範囲であるように考慮される。この態様において、異常組織又は体液電解質濃度は、通常範囲の上又は下から選択されることがある。
【００５７】
本開示で使用されるとき、用語「抗原決定基」は、酵素ポリペプチドのような抗原上の抗原性決定要素に関連する。また、酵素特異抗体のような抗体の抗原結合部位が結合する。抗原決定基は通常、アミノ酸又は当側鎖のような分子の化学表面活性分属からなり、及び特異３次元構造性質も特異的な電荷性を有することがある。本明細書で使用されるとき、「抗原決定基」は、抗原のその部分又は抗体の本体と結合する可変領域と相互に作用する結合相互佐用を形成することができる他の巨大分子を意味する。典型的には、このような結合相互作用は、１つ以上のＣＤＲのアミノ酸残基との分子間作用として明らかにされる。
【００５８】
本明細書で使用されるとき、「酵素」は特定の触媒作用の性質を有するタンパク質である。例えば、基質濃度、ｐＨ、温度及び阻害剤の有無などの要因は、触媒作用の割合に作用することがある。典型的には、野生型酵素において、Ｑ１０（温度係数）は温度が１０℃上昇するごとに反応割合の増加を記載する。野生型酵素において、Ｑ１０＝２〜３であり、換言すれば、反応割合は、温度が１０℃増加するごとに２倍又は３倍となる。高温にて、タンパク質は変性する。酵素最適値とわずかに異なるｐＨ値で、酵素及びおそらく基質分子の電荷において小さい変化が生じる。イオン化における変化は、基質分子の結合に作用することがある。極端なｐＨレベルで、酵素は変性を生じ、そこでは、活性部位が歪められ、及び基質部位はもはや適合しない。
【００５９】
本明細書で使用されるとき、用語「発達」又は「発達する」は、１つ以上の、新規なポリペプチドをエンコードする新規なポリヌクレオチドを生成する突然変異生成の方法を用いることを意味するものであり、新規なポリペプチドは改良された生体分子そのものであり、及び／又は他の改良された生体分子の生成に貢献する。特定の非限定的な態様において、本開示は親野生型タンパク質から条件的活性型生物学的タンパク質の発達に関するものである。一態様において、例えば、発達は、本明細書に参照により組み込まれた米国特許出願公開第２００９／０１３０７１８号明細書に開示される非確率的なポリヌクレオチドキメラ化及び非確率的に突然変異を指令された部位の両方を実行する方法を意味するものである。より詳しくは、本開示は、正常生理条件において野生型親酵素と比較して活性の減少を示すが、１つ以上の異常条件下では野生型酵素と比較して活性を強化する条件的活性型生物学的酵素の発達のための方法を提供するものである。
【００６０】
用語「フラグメント」、「誘導体」及び「相似器官」は、参照ポリペプチドを参照する際に、少なくとも１つの、少なくとも本質的に参照ポリペプチドと同じ生理機能又は活性を保有するポリペプチドを有する。さらに、用語「フラグメント」、「誘導体」及び「相似器官」は、著しく高い活性を有する成熟した酵素を生成するために開裂により修飾され得る低活性前駆タンパク質のような「前形態」分子によって例示される。
【００６１】
「単一アミノ酸置換の全範囲」が各アミノ酸部位に示されている、テンプレートポリペプチドから子孫ポリペプチドを生成するための方法が本明細書において提供されている。本明細書で使用されるとき、「単一アミノ酸置換の全範囲」は、本明細書に記載されているようにアルファ−アミノ酸を形成する、２０の自然にエンコードされたポリペプチドに関するものである。
【００６２】
用語「遺伝子」はポリペプチド鎖の生成において含まれるＤＮＡセグメントを意味し、個々のコーディングセグメント（エキソン）間に介在配列（ニトロン）と同様にコーディング領域（リーダー及びトレーダー）に先行する及びそれに続く領域を含む。
【００６３】
本明細書で使用されるとき、「遺伝的不安定性」は、反復配列の損失による配列簡易化を通常含む減少事象の工程によって失われる、反復性の高い配列の自然な傾向を意味する。欠失は、反復の１つのコピー及び反復間の全ての損失を含むことがある。
【００６４】
用語「遺伝子修飾細胞」、「リダイレクト細胞」、「遺伝子操作細胞」又は「修飾細胞」は、本明細書で使用されるとき、本発明の条件的活性型ＣＡＲを発現する細胞を指す。
【００６５】
用語「非相同」は、一本鎖核酸配列が、他の一本鎖核酸配列又はその相補的配列にハイブリダイズできないことを意味する。従って、非相同な部分は、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドが、他の核酸又はポリヌクレオチドにハイブリダイズできない配列における部分又は領域を有することを意味する。このような領域又は部分は例えば変異の部分である。
【００６６】
用語「相同」又は「相同」は、一本鎖核酸配列が相補的な一本鎖核酸配列にハイブリダイズできることを意味する。ハイブリダイゼーションの程度は、配列間の同一性の量、及び後述するような温度及び塩濃度のようなハイブリダイゼーション条件を含む要因の数によることがある。好適には、同一の領域が約５ｂｐより大きく、さらに好適には、同一の領域が１０ｂｐよりも大きい。
【００６７】
本開示の利益は「産業的応用」（又は産業的工程）にまで及び、用語は、非商業的な産業的応用（例えば、非営利機関での正医学的調査）と同様に、適切な商業的な産業的（又は単に産業的な）応用を含むために用いられる。関連する応用には、診断、医学、農業、製造及び学究的世界の分野を含む。
【００６８】
「同一の」又は「同一」は、２つの核酸が同じ配列又は相補的な配列を有することを意味する。従って、「同一の部分」は、ポリヌクレオチドの領域又は部分、又はポリヌクレオチド全体が、他のポリヌクレオチドの部分に対して同一又は相補的であることを意味する。
【００６９】
用語「免疫細胞」は、本明細書で使用されるとき、限定はされないが、抗原提示細胞、Ｂ細胞、好塩基球、細胞傷害性Ｔ細胞、樹状細胞、好酸球、顆粒球、ヘルパーＴ細胞、白血球、リンパ球、マクロファージ、マスト細胞、メモリー細胞、単球、ナチュラルキラー細胞、好中球、食細胞、形質細胞及びＴ細胞を含めた哺乳類免疫系の細胞を指す。
【００７０】
用語「免疫応答」は、本明細書で使用されるとき、限定はされないが、自然免疫、体液性免疫、細胞性免疫、免疫、炎症反応、獲得（適応）免疫、自己免疫及び／又は過剰反応免疫を含めた免疫を指す。
【００７１】
用語「分離された」は、その材料が元の環境（例えば、それが自然に発生するものであれば、自然環境）から除去されることを意味する。例えば、自然に発生するポリヌクレオチド又は生きている動物内に存在する酵素は分離されていないが、同じポリヌクレオチド又は酵素でも、自然系において共存する材料のいくつか又は全てから離されたものは、分離されている。このようなポリヌクレオチドはベクターの一部であることがあり、及び／又はこのようなポリヌクレオチド又は酵素は、組成物の一部であることがあり、及びこのようなベクター又は組成物はその自然環境の一部でないという点で依然として分離されている。
【００７２】
用語「分離された核酸」は核酸、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子を定義するのに用いられる。ＤＮＡ又はＲＮＡ分子のような核酸は、それが誘導される有機体の自然発生遺伝子において存在するときに通常直接に隣接する５’及び３’隣接配列に直接隣接しない。従って、用語は、例えば、プラスミド又はウイルスベクター、異種細胞の遺伝子内（又は異種細胞の遺伝子ではあるが、自然発生のものとは異なる部位）に組み込まれた核酸、及び例えばＰＣＲ増幅又は制限酵素消化によって作られたＤＮＡフラグメント、又は生体外転写で作られたＲＮＡ分子のような分離された分子として存在する核酸のように、ベクター内に組み込まれる核酸を言い表す。この用語はまた、例えば溶融タンパク質の製造において用いることができる付加的タンパク質をエンコードする交雑遺伝子の一部を形成する組換え核酸も意味する。
【００７３】
用語「レンチウイルス」は、本明細書で使用されるとき、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）の属を指す。レンチウイルスは、レトロウイルスの中でも、非分裂細胞を感染させることができる点でユニークである。レンチウイルスは宿主細胞のＤＮＡに多量の遺伝情報を送達することができ、従ってレンチウイルスは、最も効率的な遺伝子デリバリーベクター送達方法の１つである。ＨＩＶ、ＳＩＶ、及びＦＩＶは、全てレンチウイルスの例である。レンチウイルスに由来するベクターは、インビボで高い遺伝子導入レベルを実現するための手段を提供する。
【００７４】
本明細書で使用されるとき、「リガンド」はランダムペプチド又は可変セグメント配列のような特異的受容体によって認識される分子を意味する。当業者が認識しているように、分子（又は高分子複合体）は、受容体でもリガンドでもあり得る。一般的に、より小さい分子量を有する結合対はリガンドと呼ばれ、より大きい分子量を有する結合対は受容体と呼ばれる。
【００７５】
「結紮」は２つの二本鎖核酸フラグメント間でリン酸ジエステル結合を形成する方法に関連する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８２）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．，ｐ．１４６；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）。提供された方法でなければ、結紮は、結紮されるＤＮＡフラグメントのほぼ等モル量の０．５マイクログラムにつき１０ユニットのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（「リガーゼ」）を有する既知のバッファー及び条件を使用して達成されることもある。
【００７６】
本明細書で使用されるとき、「リンカー」又は「スペーサー」は、例えば、ランダムペプチドが、タンパク質を結合するＤＮＡから最少の立体障害を有する受容体に結合することができるように、タンパク質及びランダムペプチドを結合するＤＮＡのような２つの分子を結合し、及び好適な立体配置に２つの分子を配置するのに役立つ。
【００７７】
用語「哺乳類細胞表面ディスプレイ」は、スクリーニング目的で（例えば、磁気ビーズと蛍光活性化細胞選別との組み合わせによって特異的抗原結合に関してスクリーニングすることによる）、タンパク質又は抗体、又は抗体の一部分を哺乳類宿主細胞表面に発現させて提示する技法を指す。一態様では、ＤｕＢｒｉｄｇｅらの米国特許出願公開第２００９／０１３６９５０号明細書（参照により本明細書に援用される）にあるように、免疫グロブリンを分泌型及び細胞表面結合型の両方として同時発現させるため哺乳類発現ベクターが用いられる。別の態様では、この技法は、Ｇａｏらの米国特許出願公開第２００７／０１１１２６０号明細書（参照により本明細書に援用される）にあるように、細胞で発現すると細胞膜上に提示される抗体又は抗体フラグメントのライブラリをコードするウイルスベクターに用いられる。哺乳類細胞上の全ＩｇＧ表面ディスプレイが公知である。例えば、Ａｋａｍａｔｓｕｕらは、ＩｇＧ分子をその抗原結合親和性及び生物学的活性に基づき直接単離するのに好適な哺乳類細胞表面ディスプレイベクターを開発した。エプスタイン・バーウイルス由来のエピソームベクターを使用して抗体ライブラリが細胞表面上に全ＩｇＧ分子として提示され、磁気ビーズと蛍光活性化細胞選別との組み合わせによって特異的抗原結合に関してスクリーニングされた。選別された細胞から所望の結合特性を有する抗体をコードするプラスミドが回収され、可溶性ＩｇＧの産生に好適な形態に変換された。Ａｋａｍａｔｓｕｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｖｏｌ．３２７，ｐａｇｅｓ  ４０−５２，２００７（参照により本明細書に援用される）を参照のこと。Ｈｏらは、親和性成熟のための単鎖Ｆｖ抗体の細胞表面ディスプレイに、一過性のタンパク質発現に広く用いられるヒト胎児腎臓２９３Ｔ細胞を使用した。親和性がやや低いＷＴ抗体を発現する大過剰の細胞から、より高い親和性を備えた稀な変異抗体を発現する細胞が１回のパスの細胞選別によって２４０倍エンリッチされた。さらに、固有の抗体ホットスポットをランダム化するコンビナトリアルライブラリの１回の選択後に、ＣＤ２２に対する結合親和性が増加した、高度にエンリッチされた突然変異体が得られた。Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＣＤ２２  Ｆｖ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｂｙ  Ｆｖ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ，”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，ｖｏｌ．１０３，ｐａｇｅｓ  ９６３７−９６４２，２００６（参照により本明細書に援用される）を参照のこと。
【００７８】
抗原に特異的なＢ細胞も使用することができる。かかる細胞は、ヒトドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から直接単離し得る。このＢ細胞プールから組換え抗原特異的単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ライブラリを作成し、シンドビスウイルス発現系を使用することにより哺乳類細胞表面ディスプレイによってスクリーニングする。この方法によれば、１回のＦＡＣＳラウンドによる抗原特異的抗体の単離が可能である。陽性クローンから重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）の可変領域（ＶＲ）が単離され、全ＩｇＧ又はＦａｂフラグメントとして組換え完全ヒト抗体が産生された。このようにして、Ｑβウイルス様粒子（ＶＬＰ）を結合するいくつかの超変異高親和性抗体、モデルウイルス抗原、並びにニコチンに特異的な抗体が単離された。全ての抗体が細胞培養物において高い発現レベルを示した。ヒトニコチン特異的ｍＡｂは、前臨床でマウスモデルにおいてバリデートされた。Ｂｅｅｒｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｄｉｓｐｌａｙ，”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，ｖｏｌ．１０５，ｐａｇｅｓ  １４３３６−１４３４１，２００８（参照により本明細書に援用される）を参照のこと。
【００７９】
酵母細胞表面ディスプレイも本発明において使用することができ、例えば、Ｋｏｎｄｏ  ａｎｄ  Ｕｅｄａ，“Ｙｅａｓｔ  ｃｅｌｌ−ｓｕｒｆａｃｅ  ｄｉｓｐｌａｙ−ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉｓｐｌａｙ，”Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，ｖｏｌ．６４，ｐａｇｅｓ  ２８−４０，２００４を参照されたく、これは、例えば、酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を使用した細胞表面操作系について記載している。酵母Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現用のいくつかの代表的なディスプレイ系が、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ，“Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｃｅｌｌ−ｓｕｒｆａｃｅ  ｄｉｓｐｌａｙ，”ＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ  Ｂｉｔｅｃｈｎｏｌ．，ｖｏｌ．２１，ｐａｇｅｓ  ４５−５２，２００３に記載されている。また、Ｂｏｄｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｔｔｒｕｐ，“Ｙｅａｓｔ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｆｏｒ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，ｖｏｌ．１５，ｐａｇｅｓ  ５５３，１９９７。
【００８０】
用語「製造する」は、治療用タンパク質の少なくとも第Ｉ相臨床試験を可能にするのに十分な分量、又は診断用タンパク質の規制当局の承認に十分な分量でタンパク質を作製することを指す。
【００８１】
本明細書で使用されるとき、「微小環境」は、組織の他の領域又は体の領域とは、一定又は時間的に、物理的又は化学的な差異を有する組織又は体の任意の部分又は領域を意味する。
【００８２】
本明細書で使用されるとき、「発達する分子性質」は、ポリヌクレオチド配列からなる分子、ポリペプチド配列からなる分子、及びポリヌクレオチド配列の一部及びポリペプチド配列の一部からなる分子を参照することを含む。特に関連して、これに限定することは意味しないが、発達する分子性質の実施例は、温度、塩分濃度、浸透圧、ｐＨ、酸化、及びグリセロール、ＤＭＳＯ、洗浄剤及び／又は反応環境において接触させる任意の他の分子の種類の濃度のような特異的条件でのタンパク質活性を含む。加えて特に関連して、これに限定することは意味しないが、発達する分子性質の実施例は、安定性、例えば、指定された環境に指定された露出時間の後にある残余分子性質の量を含む。
【００８３】
用語「多重特異性抗体」は、本明細書で使用されるとき、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。多重特異性抗体は完全長抗体又は抗体フラグメント（例えばＦ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製することができる。操作された抗体は、２つ、３つ又はそれを超える（例えば４つの）抗原に結合し得る（例えば、米国特許出願公開第２００２／０００４５８７  Ａ１号明細書を参照）。１つの条件的活性型抗体が多重特異性となるように操作されてもよく、又は２つの抗体が、２つの抗原に結合するヘテロ二量体を含むように操作されてもよい。多重特異性抗体は多機能性でもあり得る。
【００８４】
用語「変異」は、野生型核酸配列の配列における変化、又はペプチドにおける配列の変化を意味する。このような変異は、転移又は塩基転換のような点変異であることもある。変異には、欠失、挿入、又は複製であることがある。
【００８５】
本明細書で使用されるとき、縮退「Ｎ、Ｎ、Ｇ／Ｔ」ヌクレオチド配列は、３２の可能な三重項を表し、ここで「Ｎ」は、Ａ、Ｃ、Ｇ又はＴであり得る。
【００８６】
用語「自然発生」は、本明細書で使用されるとき、対象が自然において見られるという事実に関連して適用されるものである。例えば、自然において原料から分離され得る有機体（ウイルスを含む）に存在するポリペプチド又はポリヌクレオチド配列で、実験室内で人によって意図的に修飾されたのではないものは自然発生である。一般的に、用語「自然発生」は、種において典型的であるように、非病理学的な（病気ではない）個体において存在するような対象に関連する。
【００８７】
本明細書で使用されるとき、「正常生理条件」又は「野生型操作条件」は、対象への投与の部位又は作用部位での通常範囲内で考慮される温度、ｐＨ、浸透圧、オスモル濃度、酸化的ストレス及び電解質濃度の条件である。
【００８８】
本明細書で使用されるとき、「核酸分子」は、一本鎖又は二本鎖であるかによって、それぞれ少なくとも一塩基又は一塩基対からなる。さらに、核酸分子は、非限定ではあるが、ＲＮＡ、ＤＮＡ、遺伝子核酸、非遺伝子核酸、自然発生及び非自然発生核酸、及び合成核酸など核酸分子の群などのような分子を含むヌクレオチドの任意の群にのみ、又はキメラ的に属することができる。これは、非限定的な実施例として、ミトコンドリア、リボソームＲＮＡ、及び１つ以上の自然発生の成分と自然発生ではない成分からキメラ的になる核酸分子のような任意の細胞小器官に関連した核酸を含む。
【００８９】
加えて、「核酸分子」は、非限定ではあるが、部分的に１つ以上のアミノ酸及び糖などのようなヌクレオチドに基づいていない成分を含むことがある。従って、実施例であり、限定するものではないが、部分的にヌクレオチドに基づき、部分的にタンパク質に基づくリボザイムは「核酸分子」とみなされる。
【００９０】
加えて、これに限定されるわけではないが、実施例として、放射性又は非放射性ラベルのような検出可能な部分によってラベル化される核酸分子は、同様に「核酸分子」とみなされる。
【００９１】
用語「〜をコードする核酸配列」、又は「〜の配列をコードするＤＮＡ」、又は「〜をエンコードするヌクレオチド配列」、特に酵素をエンコードするヌクレオチド配列  −  他の同義の用語と同様に  −  適当な調節配列の制御下におかれた際に、転写され、及び酵素内に転換されたＤＮＡ配列に関するものである。「プロモーター配列」は、細胞内でＲＮＡポリメラーゼを結合し、配列をコード化する下流方向（３’方向）の転写を開始させることができるＤＮＡ調節領域である。プロモーターは、ＤＮＡ配列の一部である。この配列領域は、３’末端に開始コドンを有する。プロモーター配列は、バックグラウンドより高い検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な成分である、最小限の塩基を含む。しかしながら、ＲＮＡポリメラーゼが配列を稀有合資、転写が開始コドン（プロモーターを有する３’末端）で開始された後、転写は３’方向において下流に進行する。プロモーターにおいて、配列は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を負う領域（共通配列）を結合するタンパク質と同様に、転写開始部位（便宜上、ヌクレアーゼＳ１を有するマッピングによって定義される）で見つかる。
【００９２】
用語「酵素（タンパク質）をエンコードする核酸」又は「酵素（タンパク質）をエンコードするＤＮＡ」又は「酵素（タンパク質）をエンコードするポリヌクレオチド」及び他の同義の用語は、酵素のためのコーディング配列のみを含むポリヌクレオチドも付加的コーディング配列及び／又は非コーディング配列を含むポリヌクレオチドも包括するものである。
【００９３】
好適な一実施形態において、「特異的核酸分子種」は、これに限定されるわけではないが、その一時配列によって例示されるように、その化学的構造により定義される。他の好適な実施形態において、「特異的核酸分子種」は、核酸種の機能によって、又は核酸種から誘導された生成物の機能によって定義される。従って、非限定的な実施例として、「特異的核酸分子種」は、その発現した生成物に起因する活性又は性質を含む、１つ以上のそれに起因する活性又は性質によって定義される。
【００９４】
「核酸ライブラリの中に作用核酸試料を構築すること」の即時定義は、ベクター内の結紮及び宿主の変換によるような、収集に基づいたベクター内へ核酸試料を組み込む工程を含む。関連するベクター、宿主及び他の試薬の記載は、それらの特異的非限定の実施例と同様に以下に提供される。「核酸ライブラリの中に作用核酸試料を構築すること」の即時定義はまた、接着体への結紮によるような、収集に基づいた非ベクター内へ核酸試料を組み込む工程も含む。好適には接着体は、ＰＣＲによる増幅を容易にするためのＰＣＲプライマーへアニールすることができる。
【００９５】
また、非限定的な実施形態において、「核酸ライブラリ」は、１つ以上の核酸分子のコレクションに基づいたベクターからなる。他の好適な実施形態において、「核酸ライブラリ」は、核酸分子のコレクションに基づいた非ベクターからなる。さらに他の好適な実施形態において、「核酸ライブラリ」は、部分的にベクターに基づき、部分的に非ベクターに基づく核酸分子のコレクションの結合からなる。好適には、ライブラリからなる分子のコレクションは、個々の核酸分子の種類に応じて検索可能及び分離可能である。
【００９６】
本開示は「核酸構築物」又は「ヌクレオチド構築物」、又は「ＤＮＡ構築物」を提供するものである。用語「構築物」は、ベクター又はベクターの部分のような１つ以上の付加的分子部分に任意に化学結合されることもあるポリヌクレオチド（例えば酵素ポリヌクレオチド）のような分子を記載するのに本明細書において用いられる。特定の態様において、態様の限定を意味するわけではないが、ヌクレオチド構築物は、宿主細胞の形質転換に適したＤＮＡ発現構築物によって例証されている。
【００９７】
「オリゴヌクレオチド」（又は「オリゴ」と同義語）は、一本鎖ポリデオキシヌクレオチド又は化学合成された相補的ポリデオキシヌクレオチド鎖に関するものである。このような合成オリゴヌクレオチドは５’リン酸塩を有することも有さないこともある。これらは、キナーゼの存在下においてＡＴＰとリン酸を加えることなく他のオリゴヌクレオチドに連結することはない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されないフラグメントに連結される。ポリメラーゼに基づいた増幅（例えばＰＣＲによる）を得るため、「連続して少なくとも第１の相同配列、変性Ｎ、Ｎ、Ｇ／Ｔ配列、及び第２の相同配列からなる３２倍変性オリゴヌクレオチド」は言及される。これに関連して用いられているように、「相同」は、オリゴ及びポリメラーゼに基づいた増幅に供される親ポリヌクレオチド間で相同性に参照されるものである。
【００９８】
本明細書で使用されるとき、用語「操作可能な状態で結合」は、機能的関係性におけるポリヌクレオチド要素の結合を意味する。核酸は、他の核酸配列と機能的関係性におかれた際に「操作可能な状態で結合」である。例えば、それがコーディング配列の転写に影響を及ぼす場合、プロモーター又はエンハンサーはコーディング配列に操作可能な状態で結合される。操作可能な状態で結合は、結合されているＤＮＡ配列が、典型的には隣接しており、及び２つのタンパク質コーディング領域を接合するのに必要な場合、隣接し、リーディングフレーム内にあることを意味する。
【００９９】
ＲＮＡポリメラーゼが単一ｍＲＮＡにおいて２つのコーディング配列を転写するときに、コーディング配列は、他のコーディング配列に「操作可能な状態で結合」し、両方のコーディング配列に由来したアミノ酸を有する単一ポリペプチド内に翻訳される。発現された配列が所望のタンパク質を作るために最終的に処理される限り、コーディング配列は、互いに隣接する必要はない。
【０１００】
本明細書で使用されるとき、用語「親のポリヌクレオチドセット」は１つ以上の異なるポリヌクレオチド種からなる。通常、この用語は、好適には親のセットの突然変異生成により得られる子孫ポリヌクレオチドセットを参照するのに用いられ、この場合、用語「親の」、「起動」及び「テンプレート」は、互換性がある。
【０１０１】
用語「患者」又は「対象」は、治療の目的となる、ヒトのような例えば哺乳類などの動物を意味する。対象又は患者には男性でも女性でもあり得る。
【０１０２】
本明細書で使用されるとき、用語「生理条件」は、温度、ｐＨ、浸透圧、イオン化強度、粘度など、生菌に適合できる、及び／又は生存可能な培養酵母又は哺乳類細胞において通常細胞内に存在する生化学的パラメータを意味するものである。例えば、典型的な実験培養条件下で成長した酵母細胞内において細胞内条件とは生理的条件である。生体外転写カクテルにおける適当な生体外反応条件は正常生理的条件である。一般に、インビトロ生理条件は、５０〜２００ｍＭのＮａＣｌ又はＫＣｌ、ｐＨ６．５〜８．５、２０〜４５℃及び０．００１〜１０ｍＭの二価陽イオン（例えばＭｇ＋＋”、Ｃａ＋＋）；好ましくは、約１５０ｍＭのＮａＣｌ又はＫＣｌ、ｐＨ７．２〜７．６、５ｍＭの二価陽イオンを含み、多くの場合に０．０１〜１．０％非特異的タンパク質（例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））を含む。非イオン性界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ、ＮＰ−４０、トリトンＸ−１００）が、通常約０．００１〜２％、典型的には０．０５〜０．２％（ｖ／ｖ）で存在することも多くある。詳細な水溶液条件は、医師が従来方法により選択し得る。一般的な指針として、以下の緩衝水溶液条件を適用することができる：１０〜２５０ｍＭのＮａＣｌ、５〜５０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ５〜８、任意選択で二価陽イオン及び／又は金属キレート剤及び／又は非イオン性界面活性剤及び／又は膜画分及び／又は消泡剤及び／又はシンチラントの添加。一部の実施形態において、緩衝液は、ＢＳＡ、炭酸塩、重炭酸塩、塩化物塩等のうちの少なくとも１つを含有し得る。正常生理条件は、患者の正常範囲と見なし得る、患者又は対象の生体内の投与部位又は作用部位における温度、ｐＨ、浸透圧、オスモル濃度、酸化的ストレス及び電解質濃度を指す。
【０１０３】
標準規定（５’〜３’）は二本鎖ポリヌクレオチドの配列を記載するために本明細書において用いられる。
【０１０４】
用語「個体群」は、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドの部分又はタンパク質のような組成物の収集を意味する。「混合された個体群」は、核酸又はタンパク質の同じ属ではある（すなわち関連している）が、その配列において異なり（すなわち同一ではない）、従ってその生理的知的活性において異なる組成物の収集である。
【０１０５】
「代用形」を有する分子とは、参照代用形分子との比較において、異なる性質（例えば活性の増加）を有するより成熟した分子形態を得るために、１つ以上の共有結合及び非共有結合化学的修飾（例えば、グリコシル化、タンパク質分解開裂、二量体化又はオリゴマー化、温度による誘発又はｐＨによって誘発された高次構造的変化、補助因子との会合など）の任意の組み合わせを途中で経た分子を意味する。２つ以上の化学的修飾（例えば、２つのタンパク質分解開裂、又はタンパク質分解開裂及び非グリコシル化）が成熟した分子の製造への途中で区別されることができるときに、参照前駆体分子は「前駆代用形」分子と称される。
【０１０６】
本明細書で使用されるとき、用語「擬似ランダム」は、限られた可変性を有する配列の組を意味する。例えば、他の位置の残基可変性の程度は、任意の擬似ランダム位置以外の残基変異のある程度を与えられるが、制限される。
【０１０７】
本明細書で使用されるとき、「準繰り返しユニット」は、再集合された繰り返しに関連するものであり、定義上同一ではない。実際この方法は、同一開始配列の突然変異誘発によって製造された実際に同一のエンコーディングユニットだけでなく、いくつかの領域において著しく分岐することのある類似又は関連した配列の再集合も提唱される。それにも関わらず、配列がこの方法によって再集合するのに十分な相同を含む場合、「準繰り返し」ユニットと呼ばれることができる。
【０１０８】
本明細書で使用されるとき、「ランダムペプチドライブラリ」は、ランダムペプチドのセットをエンコードするポリヌクレオチド配列のセット、及びこれらのランダムペプチドを含む溶融タンパク質と同様に、これらのポリペプチド配列によってエンコードされるランダムペプチドのセットを意味する。
【０１０９】
本明細書で使用されるとき、「ランダムペプチド配列」は２つ以上のアミノ酸モノマーからなり、及び確率的又はランダムな工程によって構成されるアミノ酸配列を意味する。ランダムペプチドは、枠組み又は足場材料を含むことがあり、不変配列を有することがある。
【０１１０】
本明細書で使用されるとき、「受容体」は与えられたリガンドに親和性を有する分子を意味するものである。受容体は自然発生又は合成分子であることがある。受容体は、不変状態で使用される、又は他の種との集合体として使用されることがある。受容体は、直接的に又は特異的結合物質を介して結合メンバーに共有結合で、又は非共有結合で結合されることがある。受容体の実施例は、これに限定されないが、単クローン抗体及び特異的抗原決定基（例えばウイルス、細胞、又は他の材料）との抗血清試薬、細胞膜受容体、糖及び糖タンパク質複合体、酵素、及びホルモン受容体を含む。
【０１１１】
用語「組換え抗体」は、本明細書で使用されるとき、抗体をコードする核酸を含む組換え宿主細胞によって発現される抗体（例えばキメラ、ヒト化、若しくはヒト抗体又はそれらの抗原結合フラグメント）を指す。組換え抗体を産生する「宿主細胞」の例としては、以下が挙げられる：（１）哺乳類細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＣＯＳ、骨髄腫細胞（Ｙ０及びＮＳ０細胞を含む）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）、Ｈｅｌａ及びＶｅｒｏ細胞；（２）昆虫細胞、例えば、ｓｆ９、ｓｆ２１及びＴｎ５；（３）植物細胞、例えばタバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）に属する植物（例えばニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ））；（４）酵母細胞、例えば、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に属するもの（例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））又はアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）に属するもの（例えばアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ））；（５）細菌細胞、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞又は枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞等。
【０１１２】
「組換え」酵素は、組換えＤＮＡ技術によって生成される酵素、すなわち、所望の酵素をエンコードする外因性ＤＮＡ構成によって形質転換された細胞から生成される。「合成」酵素は、化学合成によって調製される。
【０１１３】
用語「関連ポリヌクレオチド」は、ポリヌクレオチドの領域又は部分が同一であること、及びポリヌクレオチドの領域又は部分が非相同であることを意味する。
【０１１４】
本明細書で使用されるとき、「減少的再集合」は繰り返し配列によって媒介される欠失（及び／又は挿入）を介して生じる分子多様性における増加を意味するものである。
【０１１５】
以下の用語「参照配列」、「比較ウィンドウ」、「配列同一性」、「配列同一性の割合」及び「実質的に同一」は、２つ以上のポリヌクレオチド間の配列の関係性を記載するのに用いられる。
【０１１６】
「参照配列」は配列比較の基礎として使用される定義された配列である。参照配列は、より大きい配列のサブセット、例えば、全長ｃＤＮＡのセグメント又は配列リストにおいて与えられる遺伝子配列のセグメント、又は完全なｃＤＮＡ又は遺伝子配列からなることがある。一般的に、参照配列は長さにおいて少なくとも２０ヌクレオチドであり、しばしば、長さにおいて少なくとも２５ヌクレオチドであり、及びしばしば、長さにおいて少なくとも５０ヌクレオチドである。２つのポリヌクレオチドが、それぞれ（１）２つのポリヌクレオチド間で類似の配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の部分）からなり、及び（２）さらに、２つのポリヌクレオチド間で分岐する配列からなることがあるため、２つの（又はそれを超える）ポリヌクレオチド間での配列比較は、配列類似性の局所的領域を同定し、及び比較するために、「比較ウィンドウ」上で２つのポリヌクレオチドの配列を比較することによって典型的に実行される。
【０１１７】
「反復インデックス（ＲＩ）」は、本明細書で使用されるとき、クローニングベクター内に含まれる準繰り返しユニットのコピーの平均数である。
【０１１８】
用語「制限部位」は、制限酵素の作用の発現に必要な認識配列を意味し、接触開裂の部位を含む。開裂の部位は、低い曖昧性配列（すなわち、制限部位の発生の頻度の主要な決定要素を含む配列）からなる制限部位の部分において含まれること、又は含まれないことがあると認められる。従って、多くの場合、関連のある制限部位は、内部開裂部位（例えば、ＥｃｏＲＩ部位においてＧ／ＡＡＴＴＣ）又は直接隣接開裂位置（例えば、ＥｃｏＲＩＩ部位において／ＣＣＷＧＧ）を有する低い曖昧性配列のみを含む。他の場合、関連のある制限酵素（例えばＥｃｏＲ  Ｉ部位又はＣＴＧＡＡＧ（１６／１４））は外部開裂部位（例えば、Ｅｃｏ５７Ｉ部位のＮ．Ｓｕｂ．１６部分において）を有する低両義性配列（例えば、ＥｃｏＲ  Ｉ部位のＣＴＧＡＡＧ配列）を含む。酵素（例えば制限酵素）がポリヌクレオチドを「開裂する」というのは、制限酵素がポリヌクレオチドの開裂を触媒する又は容易にすることを意味すると理解されている。
【０１１９】
非限定的な態様において、「選択可能なポリヌクレオチド」は、５’末端領域（又は終止領域）、中間領域（例えば、内部又は中央領域）及び３’末端領域（又は終止領域）からなる。本態様で使用されるとき、５’末端領域は、５’ポリヌクレオチド末端（又は５’ポリヌクレオチド終止）の方に位置する領域である。従って、ポリヌクレオチドの５’半分における部分又は全体である。同様に、３’末端領域は、３’ポリヌクレオチド末端（又は３’ポリヌクレオチド終止）の方に位置する領域である。従って、ポリヌクレオチドの３’半分における部分又は全体である。この非限定的例証で使用されているように、任意の２つの領域間で、又は３つの全ての領域間で配列が重複していることがある。
【０１２０】
本明細書で使用されるとき、用語「一本鎖抗体」は、概してスペーサーペプチドを介して連結された、ポリペプチド連鎖におけるＶＨドメインとＶＬドメインとを含むポリペプチドであり、且つアミノ末端及び／又はカルボキシ末端に追加的なアミノ酸配列を含み得るものを指す。例えば、一本鎖抗体は、コードポリヌクレオチドに連結するための係留セグメントを含み得る。例として、ｓｃＦｖは一本鎖抗体である。一本鎖抗体は、概して、免疫グロブリンスーパーファミリーの遺伝子によって実質的にコードされる（例えば、Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，Ａ．Ｆ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ａ．Ｎ．Ｂａｒｃｌａｙ，Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇｅｎｅｓ，Ｔ．Ｈｏｎｊｏ，Ｆ．Ｗ．Ａｌｔ，ａｎｄ  ＴＨＥ．Ｒａｂｂｉｔｓ，ｅｄｓ．，（１９８９）Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，ｐｐ．３６１−３６８（参照により本明細書に援用される）を参照）、最も多くの場合にはげっ歯類、非ヒト霊長類、トリ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、又はヒト重鎖又は軽鎖遺伝子配列によってコードされる、少なくとも１０連続アミノ酸の１つ以上のポリペプチドセグメントからなるタンパク質である。機能性一本鎖抗体は、概して特異的標的分子、典型的には受容体又は抗原（エピトープ）との結合特性を保持するために十分な免疫グロブリンスーパーファミリー遺伝子産物の一部分を含有する。
【０１２１】
分子対（例えば、抗体−抗原対又は核酸対）のメンバーは、他の非特異的分子に対してよりも強い親和性で互いに結合している際に、互いに「特異的に結合している」といわれる。例えば、抗体は、抗原に対して非特異的タンパク質よりも効率よく結合するため、抗原と特異的に結合すると記載されることができる。（同様に、塩基対相互作用によって標的と特異的に二本鎖を形成している場合、核酸プローブは、標的核酸と特異的に結合すると記載されることができる（上記を参照）。）
【０１２２】
「特異的ハイブリダイゼーション」は、本明細書において、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチド（例えば、第１のポリヌクレオチドと違いを有するが、実質的には同一の配列を有するポリヌクレオチド）間での交雑の形態として定義したものであり、ここで、実質的に無関係なポリヌクレオチド配列は混合物において交雑を形成しない。
【０１２３】
用語「特異的ポリヌクレオチド」は、特定の終末点、及び特定の核酸配列を有するポリヌクレオチドを意味する。２つのポリヌクレオチドにおいて、１つのポリヌクレオチドが第２のポリヌクレオチドの一部として同一の配列を有するが、異なる末端が２つの異なる特異的ポリヌクレオチドからなる。
【０１２４】
用語「刺激」は、本明細書で使用されるとき、刺激分子（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）がそのコグネイトリガンドに結合し、それにより、限定はされないがＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介したシグナル伝達など、シグナル伝達イベントを媒介することによって生じる一次応答を意味する。刺激は、ＴＧＦ−βの下方制御、及び／又は細胞骨格構造の再編成など、ある種の分子の発現の変化を媒介し得る。
【０１２５】
用語「刺激分子」は、本明細書で使用されるとき、抗原提示細胞上に存在するコグネイト刺激リガンドと特異的に結合するＴ細胞上の分子を意味する。
【０１２６】
用語「刺激性リガンド」は、本明細書で使用されるとき、抗原提示細胞上（例えば、樹状細胞、Ｂ細胞など）に存在するとき、Ｔ細胞上のコグネイト結合パートナー（本明細書では「刺激分子」と称される）と特異的に結合して、それにより、限定はされないが、活性化、免疫応答の惹起、増殖などを含めた、Ｔ細胞による一次応答を媒介することのできるリガンドを意味する。刺激性リガンドは当該技術分野において周知であり、特に、ペプチドを担持したＭＨＣクラスＩ分子、抗ＣＤ３抗体、スーパーアゴニスト抗ＣＤ２８抗体、及びスーパーアゴニスト抗ＣＤ２抗体を包含する。
【０１２７】
用語「標的細胞」は、本明細書で使用されるとき、疾患に関与する細胞であって、且つ本発明の遺伝子修飾細胞傷害性細胞（限定はされないが、遺伝子修飾Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及びマクロファージを含む）によって標的化され得る細胞を指す。他の標的細胞が当業者には明らかであろうと共に、本発明の代替的な実施形態に関連して用いられ得る。
【０１２８】
用語「Ｔ細胞」と「Ｔリンパ球」とは互換性があり、本明細書では同義語として用いられる。例としては、限定はされないが、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【０１２９】
用語「形質導入」は、本明細書で使用されるとき、ウイルスベクターを使用した細胞への外来核酸の導入を指す。「トランスフェクション」は、本明細書で使用されるとき、組換えＤＮＡ技術を使用した細胞への外来核酸の導入を指す。用語「形質転換」は、宿主細胞への「外来性」（すなわち外因的な又は細胞外の）遺伝子、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列の導入を意味し、従って宿主細胞は導入された遺伝子又は配列を発現し、導入された遺伝子又は配列によってコードされるタンパク質又は酵素などの所望の物質を産生することになる。導入された遺伝子又は配列はまた、「クローニングされた」又は「外来性の」遺伝子又は配列と呼ばれることもあり、開始、停止、プロモーター、シグナル、分泌、又は他の配列など、細胞の遺伝機構によって用いられる調節又は制御配列を含み得る。遺伝子又は配列は、非機能性配列又は機能不明の配列を含み得る。導入されたＤＮＡ又はＲＮＡを受け入れて発現する宿主細胞は「形質転換」されており、「形質転換体」又は「クローン」である。宿主細胞に導入されるＤＮＡ又はＲＮＡは、宿主細胞と同じ属又は種の細胞、又は異なる属又は種の細胞を含め、任意の供給源に由来することができる。
【０１３０】
「厳密なハイブリダイゼーション条件」は、配列間で少なくとも９０％同一、好適には少なくとも９５％同一、最も好適には少なくとも９７％同一であるときのみハイブリダイゼーションが生じることを意味する。Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９を参照すること、本明細書にその全体は参照によって組み込まれている。
【０１３１】
本開示において、また、酵素ポリペプチドの配列と「実質的に同一の」配列を有するポリペプチドも含まれる。「実質的に同一の」アミノ酸配列は、保存アミノ酸置換によってのみ参照配列と異なる配列であり、例えば、同じ種類の別の１つのアミノ酸の置換である（例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニンのような疎水性アミノ酸から他の疎水性アミノ酸への置換、又はアルギニンからリシンへの置換、グルタミン酸からアスパラギン酸への置換又はグルタミンからアスパラギンへの置換のように、ある極性アミノ酸から他の極性アミノ酸への置換）。
【０１３２】
加えて、「実質的に同一の」アミノ酸配列は、参照配列とは異なる配列、又は非保存的置換、欠失又は挿入のような置換が分子の活性部位ではない部位で発生するとき、１つ以上の非保存的置換、欠失又は挿入によって異なる配列であり、ポリペプチドがその行動性質を基本的に保持すると定めた配列である。例えば、１つ以上のアミノ酸は酵素ポリペプチドから除かれることがあり、結果として、著しくその生物学的活性を変えることなく、ポリペプチドの構造の修飾となる。例えば、酵素生理的活性において必要とされない、アミノ  −  又はカルボキシル  −  末端アミノ酸は除かれることがある。このような修飾は、より小さい活性酵素ポリペプチドの開発につながることがある。
【０１３３】
本開示は「実質的に純粋な酵素」を提供するものである。用語「実質的に純粋な酵素」は、自然に関連付けられる他のタンパク質、脂質、糖、核酸及び他の生理的材料を実質的に含まないポリペプチド（例えば酵素ポリペプチド、又はそれらのフラグメント）のような分子を記載するのに本明細書において用いられる。例えば、ポリペプチドのように、実質的に純粋な分子は、対象の分子において乾燥重量で少なくとも６０％であることがある。ポリペプチドの純度は、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、カラムクロマトグラフィー（例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ））、及びアミノ−末端アミノ酸配列分析を含む標準的な方法を使用して決定される。
【０１３４】
本明細書で使用されるとき、「実質的に純粋」は、対象となる種が、支配的な種であることを意味し（すなわち、モルベースで、組成物において任意の他の個別の分子より豊富である）、及び好適には、実質的に精製された断片は、対象となる種が存在する全ての高分子種の少なくとも約５０％（モルベースで）からなる組成物である。一般的に、実質的に純粋な組成物は、組成物において存在する高分子種の約８０〜９０パーセント以上からなる。最も好適には、対象となる種は、基本的に均質に精製され（汚染物質種は従来の検出方法によって組成物において検出されることができない）、ここで、その構成は基本的に単一の高分子種からなる。溶解種、小さい分子（＜５００ドルトン）及び基本的なイオン種は高分子種とはみなされない。
【０１３５】
用語「治療する」は、（１）状態、疾患又は条件の臨床的又は潜在的症状に苦しむ、又はそれらに罹患しやすいが、状態の臨床的又は潜在的症状、疾患又は条件を依然として経験していない又は示していない動物において進行する状態、疾患又は条件の臨床的症状の出現を防止する又は遅延させること、（２）状態、疾患又は条件を阻害すること（すなわち、疾患又は維持療法の場合ではそれらの逆戻り又は少なくとも１つの臨床的又は潜在性症状の進行を抑制し、減少させ、又は遅延させること）及び／又は（３）状態を楽にすること（すなわち、状態、疾患、又は条件又は臨床又は潜在性症状の少なくとも１つの後退を引き起こすこと）治療される患者の利点は、統計学的にも有意であり、又は少なくとも患者又は医師に少なくとも認知可能である。
【０１３６】
「腫瘍」は、本明細書で使用されるとき、悪性か良性かに関わらず、あらゆる新生物性細胞成長及び増殖、並びにあらゆる前癌性及び癌性細胞及び組織を指す。
【０１３７】
本明細書で使用されるとき、用語「可変性セグメント」は、ランダム、擬似ランダム、又は定義された仁配列からなる発生期のペプチドの部分を意味する。「可変性セグメント」は、ランダム、擬似ランダム、又は定義された仁配列からなる発生期のペプチドの部分を意味する。可変性セグメントは変異体及び不変異体残基位置の両方からなることがあり、及び変異体残基位置における変異体残基の度合いは、限定されることがあり、両方の選択肢は、実行者の裁量で選択される。典型的には可変性セグメントは、長さにおいて約５〜２０アミノ酸残基（例えば８〜１０）であり、しかし、可変性セグメントはそれより長いこともあり、及び抗体フラグメント、タンパク質結合核酸、受容体タンパク質などのような抗体タンパク質又は受容体タンパク質からなることもある。
【０１３８】
用語「変異体」は、１つ以上の野生型タンパク質親分子の塩基対、コドン、イントロン、エキソン又はアミノ酸残基（それぞれ）において修飾された開示のポリヌクレオチド又はポリペプチドを意味する。変異体は、例えば、エラープローンＰＣＲ、シャフリング、オリゴヌクレオチド指定突然変異、アセンブリＰＣＲ、性的ＰＣＲ突然変異、生体内での突然変異、カセット突然変異、再帰的アンサンブル突然変異、指数的アンサンブル突然変異、位置特異的突然変異、遺伝子再構築、飽和突然変異及びそれらの任意の組み合わせのような方法を含む手段の任意の数によって製造される。野生型タンパク質と比較して、正常生理的条件、例えば温度、ｐＨ、浸透圧、オスモル濃度、酸化的ストレス及び電解質濃度の１つ以上の条件において活性が減少し、及び異常条件において活性が増強される変異体タンパク質を製造するための技術は、本明細書に開示される。変異体は、野生型タンパク質と比較して、化学的耐性及びタンパク質分解耐性を増強する性質において付加的に選択される。
【０１３９】
「ベクター」、「クローニングベクター」及び「発現ベクター」は、本明細書で使用されるとき、宿主細胞にポリヌクレオチド配列（例えば外来性遺伝子）を導入して宿主を形質転換し、導入された配列の発現（例えば転写及び翻訳）を促進することができる媒体を指す。ベクターには、プラスミド、ファージ、ウイルス等が含まれる。
【０１４０】
本明細書で使用されるとき、用語「野生型」は、ポリヌクレオチドがいかなる突然変異も含まないことを意味する。「野生型（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）タンパク質」、「野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）タンパク質」、「野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）生物学的タンパク質」、又は「野生型（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）生物学的タンパク質」は、自然から単離することのできる、自然中に見られる活性レベルで活性であり、且つ自然中に見られるアミノ酸配列を含むタンパク質を指す。野生型タンパク質は、ヒトタンパク質、哺乳類タンパク質、ヒトウイルスタンパク質又は哺乳類タンパク質であり得る。用語「親分子」及び「標的タンパク質」も野生型タンパク質を指す。野生型タンパク質は好ましくは、より高い結合親和性及び／又は酵素活性、特定の温度及び／又はｐＨにおけるより良好な安定性、向上した選択性及び／又は溶解度など、何らかの所望の特性を有する。かかる野生型タンパク質は、タンパク質ライブラリを所望の特性に関してスクリーニングして得ることができる。
【０１４１】
例えば「ワーキング試料」にあるような用語「ワーキング」は、単に人が作業している試料である。同様に、例えば「ワーキング分子」は、人が作業している分子である。
【０１４２】
本開示はまた、野生型条件において可逆的に又は不可逆的に不活性であるが、野生型条件と同じ又は等しいレベルの非正常条件において活性である新規な分子を生成するためのタンパク質を操作又は発達させる方法を指示する。これらの新規なタンパク質はまた、「Ｍｉｒａｃ」タンパク質として本明細書に参照される。Ｍｉｒａｃタンパク質は、宿主内において短い又は限定的な期間において活性化する新規な治療薬の開発において特に価値がある。宿主に有害であるが、限定された活性が、所望の治療を実行するのに必要である、投与されるタンパク質の拡張された操作において、これは特に価値がある。有益な適用の実施例は、高濃度においての局所的治療と同様に、高投与量での局所的又は全身的治療を含む。生理的条件下での不活性化は、投与の組み合わせ及びタンパク質の不活性化の割合によって決定されることがある。この条件に基づいた不活性化は、触媒活性が比較的短い期間において実質的に負の影響を引き起こすとき、酵素治療において特に重要である。
【０１４３】
本開示はまた、野生型分子とは異なる新規の分子、経時的に可逆的又は不可逆的に、活性又は不活性である、又は体内の特定の器官（例えば膀胱又は腎臓）を含む体内の特定の微小環境においてのみ活性又は不活性である新規の分子を生成するためのタンパク質を操作する又は発達させる方法を指示する。
【０１４４】
標的野生型タンパク質
任意の治療的タンパク質は、条件的活性型生物学的タンパク質の製造において、標的タンパク質又は野生型タンパク質としての機能を果たす。一態様において、標的タンパク質は野生型酵素である。現在使用されている治療的タンパク質酵素は、凝血塊の治療において使用されるウロキナーゼ及びストレプトキナーゼ、他の薬剤の吸収及び分散を増加させる補助剤として使用されるヒアルロニダーゼを含む。一態様において、条件的活性型生物学的タンパク質の生成のために選択される野生型タンパク質は、野生型タンパク質又は酵素に関連した有害な副作用を回避する又は最小限にするために、現在では治療的タンパク質が使用される。或いは、治療としての使用が現在されていない酵素は、条件的活性型生物学的タンパク質の生成のために選択されることがある。特定の非限定的実施例は、以下に詳細に議論される。
【０１４５】
治療的タンパク質は、単独で、又は様々な疾患又は医学的条件を治療するための他の療法と組み合わせて用いられることがある。本開示の条件的活性型生物学的タンパク質は、循環疾患、関節炎、多発性硬化症、自己免疫疾患、癌、皮膚科学的状態を含む１つ以上の兆候において使用するための適用ができ、及び様々な診断形式で使用できる。タンパク質及び兆候によっては、条件的活性型生物学的酵素タンパク質は、以下に議論されるように、非経口的、局所的又は経口的な剤形で投与されることがある。
【０１４６】
いくつかの代表的な標的野生型タンパク質には、酵素、抗体、サイトカイン、受容体、ＤＮＡ結合タンパク質、キレート剤、及びホルモンが含まれる。さらなる例には、工業用及び医薬用タンパク質、例えば、リガンド、細胞表面受容体、抗原、転写因子、シグナル伝達モジュール、及び細胞骨格タンパク質が含まれる。
【０１４７】
いくつかの好適な酵素クラスは、ヒドロラーゼ、例えば、プロテアーゼ、カルボヒドラーゼ、リパーゼ；イソメラーゼ、例えば、ラセマーゼ、エピメラーゼ、トートメラーゼ、及びムターゼ；トランスフェラーゼ、キナーゼ、オキシドレダクターゼ、及びホファターゼ（ｐｈｏｐｈａｔａｓｅ）である。
【０１４８】
標的野生型タンパク質は、ライブラリを作成し、酵素活性、結合親和性／選択性、熱安定性、高ｐＨ又は低ｐＨ耐性、発現効率、又は任意の他の生物学的活性など、所望の１つ又は複数の特性を有するタンパク質に関してスクリーニングすることにより発見し得る。
【０１４９】
標的野生型タンパク質は、ｃＤＮＡライブラリをスクリーニングすることにより発見してもよい。ｃＤＮＡライブラリは、宿主細胞のコレクションに挿入されたクローニングされたｃＤＮＡ（相補ＤＮＡ）フラグメントの組み合わせであり、一緒になって生物のトランスクリプトームのある一部を構成するものである。ｃＤＮＡは完全に転写されたｍＲＮＡから作製され、従って生物の発現タンパク質のコード配列を含む。
【０１５０】
標的野生型タンパク質が抗体である実施形態において、野生型抗体は、抗体ライブラリを作成してスクリーニングすることにより発見し得る。抗体ライブラリは、ポリクローナル抗体ライブラリ又はモノクローナル抗体ライブラリのいずれであってもよい。ある抗原に対するポリクローナル抗体ライブラリは、その抗原を動物に直接注射することによるか、又はその抗原を非ヒト動物に投与することによって作成し得る。このように得られた抗体は、その抗原に結合するポリクローナル抗体のライブラリに相当する。モノクローナル抗体ライブラリの調製には、連続細胞株培養によって産生される抗体をもたらす任意の技法を用いることができる。例としては、ハイブリドーマ法、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法、及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法が挙げられる（例えば、Ｃｏｌｅ（１９８５），Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６を参照）。一本鎖抗体の作成について記載される技法（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号明細書を参照）は、一本鎖抗体ライブラリの作製に適合させることができる。
【０１５１】
野生型抗体を発見するための抗体ライブラリの作成及びスクリーニング方法は他にもある。例えば、完全ヒト抗体ディスプレイライブラリを利用することができる。かかるライブラリは、１つ又は複数の宿主細胞の表面上に提示された抗体の集合である。好ましくは、抗体ライブラリは、それが多種多様な抗原との幅広い結合能を有する点でヒト抗体レパートリーを代表する。抗体は細胞の表面上に提示されるため、ライブラリにおける各抗体の（アビディティに起因する）有効親和性は増加する。ファージディスプレイライブラリなどの他の一般的なライブラリタイプ（スクリーニング及び同定の目的上、抗体のアビディティがあまり望ましくない）と異なり、本発明における細胞表面ディスプレイによって提供される超アビディティは望ましい。細胞表面ディスプレイライブラリでは、スクリーニング又は選択工程において、結合親和性が低い、中程度の、及び高い抗体の同定、並びに免疫原性がない及び弱いエピトープの同定が可能となる。
【０１５２】
循環障害  −  血栓症及び血栓溶解療法
血栓（凝血塊）は、循環系において形成される血液構成要素に由来する固体の塊として定義される。血栓は、血液凝固因子、血小板、赤血球及び血管壁との相互作用を含む一連の事象により形成される。血小板は、血小板、フィブリン及び脈管障害の原因となることがある補足された血液細胞の血管内凝集である。血流を妨げる、又は遮断することによって、血栓は、組織への酸素供給を奪う。血栓の断片（塞栓）は、剥離することができ、より小さい血管を妨げることができる。動脈血栓形成は、潜在性の狭窄−アテローム性動脈硬化症、低流量状態の心機能、癌における凝固亢進又は凝固因子欠乏、又はステント又はカテーテルなどの異物を含む任意の様々な要因のいずれかによって誘発される。動脈虚血につながる血栓は、肢又は組織の損傷、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、脳卒中、切断又は腸梗塞に結果としてなることがある。疾病率及び死亡率の大きい原因は、動脈血栓（冠状動脈血栓及び脳動脈血栓）及び肺血栓の形成である。静脈血栓形成は、外傷、例えば静止による鬱血、又は凝固亢進などの内皮損傷によって生じることがあるが、アテローム性動脈硬化は要因とはならない。治療法は、機械的血栓摘出術、薬力学的血栓摘出術及び血栓溶解を含む。血栓症の治療は、血栓の形成を最小化し、除去を助けるために用いられる。
【０１５３】
血栓症の治療は、血小板の活性化を阻害する抗血小板薬剤の使用、抗凝固性治療、及び／又は凝血を分解するための血栓溶解治療を含む。抗血小板物質の例としては、アスピリン、ジピリダモール及びチクロピジンが挙げられる。抗凝固剤の例は、ヘパリン、ワルファリン、ヒルジン、及び活性型ヒトタンパク質Ｃを含む。血栓溶解剤の例は、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）／ｔＰＡ変異体、ウロキナーゼ及びストレプトキナーゼを含む。血栓溶解剤は、作用の触媒型を示す。
【０１５４】
急性心筋梗塞における血栓溶解治療は確立されている。血栓溶解剤の使用は、標準的な救急治療となった。効果的であるにも関わらず、これらの製品は、完全な再灌流を患者の約５０％においてのみ達成し、副作用は、高血圧と同様に出血（特に頭蓋内出血）の危険を含む。傷害性又は疾患性血管からの凝血塊の分解は、「線維素溶解」又は「線維素溶解方法」と称される。タンパク質プラスミノーゲンを活性化するプラスミノーゲン活性剤によって、線維素溶解はタンパク質分解方法であり、それによって、プラスミンを形成する。タンパク質分解性プラスミンは、凝血塊を溶かすために、フィブリンストランドを分解する。フィブリン特異性プラスミノーゲン活性剤は、組織プラスミノーゲン活性化因子又は変異体を含む。非特異的プラスミノーゲン活性剤は、ストレプトキナーゼ及びウロキナーゼを含むことがある。
【０１５５】
特定の一般的に用いられる血栓溶解治療は、いくつかの利用できる組織プラスミノーゲン活性剤（ｔＰＡ）変異体の１つを利用する。例えば、以前使用のために承認された製品に基づくｔＰＡ変異体は、Ａｌｔｅｐｌａｓｅ（ｒｔ−ＰＡ）、Ｒｅｔｅｐｌａｓｅ（ｒ−ＰＡ）及びＴｅｎｅｃｔｅｐｌａｓｅ（ＴＮＫ）である。ｔＰＡ変異体の承認された用途は、例えば、ＡＭＩに続く心室機能改善における急性心筋梗塞、鬱血性心不全の発病率の減少、及びＡＭＩと関連した死亡率の減少、神経病学的回復を改善するための成人における虚血性脳卒中の管理及び障害の発病率の減少、急性肺塞栓の溶解のため、及び不安定な血行動態が付随する肺塞栓の溶解のため、成人における急性大量肺塞栓の管理を含む。
【０１５６】
他の一般的に用いられる血栓溶解治療は、ウロキナーゼを利用する。ウロキナーゼは、抹消血管疾患の処置において使用する標準的溶解剤である。
【０１５７】
ストレプトキナーゼは、ヒトプラスミノーゲンを結合及び活性化することができる連鎖球菌のいくつかの種類から分泌されるタンパク質である。ヒトプラスミノーゲンとストレプトキナーゼとの複合体は、プラスミンを生成するための結合開裂で活性化されることによって、他の非結合プラスミノーゲンを加水分解的に活性化することができる。プラスミノーゲンの通常の活性は、Ａｒｇ５６１−Ｖａｌ５６２結合のタンパク質分解によって起こる。Ｖａｌ５６２のアミノ基は、Ａｓｐ７４０と塩橋を形成し、活性プロテアーゼプラスミンを作るため高次構造的な変化を生じさせる。プラスミンは、凝血の主要成分であるフィブリンを分解するために血中で作られる。
【０１５８】
ストレプトキナーゼは、心筋梗塞（心臓発作）、肺塞栓症（肺凝血）及び深部静脈血栓症（脚凝血）のいくつかの場合、有効な凝血塊溶解薬剤として用いられる。ストレプトキナーゼは線維素溶解剤と呼ばれている薬剤の群に帰属する。ストレプトキナーゼは、心臓壁の動脈における凝血塊を溶かし、心筋への損傷を減らすために、心臓発作の発症後、可能な限り早く与えられる。ストレプトキナーゼは、細菌製品であるため、本体はタンパク質に対して免疫を確立する能力を有する。従って、この製品は、最初の投与から４日後以降は、有効ではない可能性があり、及びアレルギー反応を引き起こす可能性があるため、与えないことが推奨される。このため、通常、最初の心臓発作の後のみ与えられ、更なる血栓症は典型的には組織プラスミノーゲン活性剤（ＴＰＡ）により治療される。ストレプトキナーゼは、術後癒着を防止するために用いられることもある。
【０１５９】
ストレプトキナーゼの副作用は、出血（多量及び少量）、低血圧、及び呼吸抑制及びアレルギー反応を含む。加えて、抗凝血剤、血小板機能を変える薬剤（例えば、アスピリン、他のＮＳＡＩＤ、ジピリダモール）は、出血の危険性を高めることがある。
【０１６０】
血栓溶解剤の投与は、通常、注射によって、又は急速静注投与によって、又は機械的注入システムによって行われる。副作用は、重篤には頭蓋内、胃腸、後腹膜、又は心嚢の出血を含むことがある。出血が生じた場合、直ちに投与を中断しなければならない。
【０１６１】
本開示の特定の実施形態において、ｔＰＡ、ストレプトキナーゼ又はウロキナーゼは、標的又は野生型タンパク質として選択される。
【０１６２】
一実施形態において、本開示の方法は、通常の生理的条件よりも低い異常温度条件で高い活性を有し、通常の生理的条件（例えば３７℃）で実質的に非活性又は不活性である、条件的活性型組換え、又は合成ストレプトキナーゼ変異体を選択するのに用いられる。一態様において、異常温度条件は、室温、例えば２０〜２５℃である。他の態様において、本開示は、脳卒中又は心臓発作を治療する方法を提供するものであり、この方法は、凝血塊を消去し、ストレプトキナーゼ変異体の急速な不活性化が過剰な出血を回避できるように、条件的活性型ストレプトキナーゼ変異体の高用量を脳卒中又は心臓発作患者に投与することからなる。
【０１６３】
循環障害  −  レニン／アンギオテンシン
レニン−アンギオテンシン系は、血圧及び水（流体）バランスを調節するホルモン系である。腎臓は、血液量が低いときにレニンを分泌する。レニンは、ペプチドアンギオテンシンＩに肝臓から分泌されるアンギオテンシノーゲンを加水分解する酵素である。アンギオテンシンＩは、アンギオテンシンＩＩに内皮結合したアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）によって、肺においてさらに切断される。アンギオテンシンＩＩは、血管を収縮させ、結果として血圧を増加させる。しかしながら、アンギオテンシンπも副腎皮質からホルモンアルドステロンの分泌を促進する。アルドステロンは、腎細管でのナトリウム及び水の再吸収を増加させる。この増加は、体の流体を増加させ、血圧を増加させる。過剰に活発なレニン−アンギオテンシン系は、血管収縮、及びナトリウム及び水の保持につながる。これらの効果は高血圧につながる。血圧を下げるために、このシステムにおいて異なる工程を中断する多くの薬がある。これらの薬は、高血圧（高血圧症）、心不全、腎不全及び糖尿病の有害な影響を制御するための主要な方法の１つである。
【０１６４】
血液量減少性ショックは緊急状態であり、大量の血液及び／又は流体を失うことにより、心臓は体細胞に酸素を含ませた血液を適切に灌流することができなくなる。失血は、外傷、損傷及び内出血により起こり得る。循環血液の量は、火傷、下痢、過剰な汗又は嘔吐による過剰な流体損失のため減少することがある。血液量減少性ショックの兆候には、不安、冷たくじっとりした肌、混乱、呼吸促迫又は意識消失を含む。検査は低血圧、低体温及び弱い又は弱々しいこともある速い脈拍を含むショックの徴候を示す。治療は、輸液、血液又は血液製剤、ショックの治療、及び血圧及び心拍出量を増加させるためのドーパミン、ドブタミン、エピネフリン及びノルエピネフリンのような薬剤を含む。
【０１６５】
一実施形態において、本開示は、通常の生理的温度では可逆的に不活性化されるが、血液量減少性ショックにより患者が異常低温であるときには再び活性化される条件的組換えレニン変異体を選択するための方法を提供する。条件的活性型タンパク質は、体内の流体量の増加及び血圧の増加を促すために血液量減少性ショックを治療するのに用いられることがある。
【０１６６】
循環障害  −  レイノー現象
レイノー現象（ＲＰ）は、指、つま先及びときには他の末端の変色を引き起こす血管攣縮性疾患である。感情的ストレス及び冷えがこの減少の典型的な引き金である。冷温にさらされると、末端は熱を失う。指及びつま先に供給される血液は、体の核心温度を保つために通常ゆっくりとなる。血流は、末端の皮下の小さい動脈の狭窄によって減少する。ストレスは、体が冷えるのと同じような反応を引き起こす。レイノー現象において、通常の反応が肥大したものである。状態としては、痛み、変色、及び冷え及び麻痺の感覚を引き起こすことがある。この現象は結果としてそれぞれの領域への血液供給を減少させる血管攣縮である。レイノー疾患（初期レイノー現象）において、疾患は突発性である。レイノー症候群（第２レイノー現象）において、現象は、他の扇動因子によって引き起こされる。手の温度勾配の測定は、初期及び第２形態間の識別を行う１つの手段である。初期形態は、第２形態に進行することがあり、極端な場合には第２形態は指先の壊死又は壊疽に進行することがある。
【０１６７】
レイノー現象は、冷え又は感情的ストレスへの反応の肥大したものである。初期のＲＰは、微小血管攣縮によって基本的にもたらされる。交感神経系の過剰活性化は、末梢血管の過度の血管収縮を引き起こし、低酸素症につながる。慢性、再発性の場合、皮膚、皮下組織及び筋肉の萎縮となることがある。稀に潰瘍形成及び虚血性壊疽となることもある。
【０１６８】
レイノー現象のための従来の治療選択肢は、血管を拡張し、循環を促進する処方薬物治療を含む。これらは、ニフェピジン又はジルチアゼムのようなカルシウムチャンネル遮断薬、ノルアドレナリン、血管を収縮させるホルモンの作用を相殺するプラゾシン又はドキサゾシンのようなアルファ遮断薬、及びニトログリセリンクリーム又はアンギオテンシンＩＩ阻害剤ロサルタン、シルデナフィル又はプロスタグランジンのような血管を緩めるための血管拡張薬を含む。フルオキセチン、選択的セロトニン再摂取阻害剤及び他の抗鬱剤は、生理的ストレッサーによる発症の頻度及び重症度を低減することができる。これらの薬剤は、頭痛、潮紅及びくるぶし浮腫のような副作用を引き起こすことがある。薬剤は経時的に効果を失うこともある。
【０１６９】
皮膚血管収縮及び血管拡張の調節は、変更した交感神経活性及び多くの神経調節を含み、ＲＥＤＯＸシグナル伝達及びＲｈｏＡ／ＲＯＣＫ経路のような他のシグナル伝達と同様に、アドレナリン性及び非アドレナリン性を含む。皮膚の血管平滑筋細胞（ｖＳＭＣ）の血管収縮は、アルファ１及びアルファ２アドレナリン受容体によって伝達されるノルエピネフリンによって活性化されると考えられる。アルファ２Ｃ−ＡＲｓは、トランスゴルジから刺激に応答するｖＳＭＣの細胞表面に転座させ、及びこれらの応答のシグナル伝達は、ＲｈｏＡ／Ｒｈｏｋｉｎａｓｅ（ＲＯＣＫ）シグナル伝達経路を含む。皮膚動脈の冷たい刺激は、ｖＳＭＣのミトコンドリアの反応性酸素種（ＲＯＳ）の即時の生成につながる。ＲＯＳは、ＲｈｏＡ／ＲＯＣＫ経路を介したＲＥＤＯＸシグナル伝達に含まれる。ＲｈｏＡは、ｖＳＭＣにおける遊走及び細胞収縮のようなアクチン−ミオシン依存工程の調節の役割を有するＧＴＰ−結合タンパク質である。ＲＰとの可能な包含を有する脈管構造の周知の機能を有する非アドレナリンニューロペプチドは、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）、サブスタンスＰ（ＳＰ）、ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）、血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）を含む。Ｆｏｎｓｅｃａ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，“Ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｒａｙｎａｕｄ’ｓ  ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ  ａｎｄ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ”，Ｃｕｒｒ．Ｖａｓｃｕｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７：３４−３９。
【０１７０】
ＲＰのための新しい治療は、アルファ−２Ｃアドレナリン受容体遮断薬、タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤、Ｒｈｏ−キナーゼ阻害剤及びカルシトニン遺伝子関連ペプチドを含む。
【０１７１】
カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）はペプチドのカルシトニン族のメンバーであり、及びアルファ−ＣＧＲＰ及びベータ−ＣＧＲＰの２つの形態で存在する。アルファ−ＣＧＲＰは、カルシトニン／ＣＧＲＰ遺伝子の選択的スプライシングによって形成された３７−アミノ酸ペプチドである。ＣＧＲＰは、末梢神経及び中枢神経において作られる最もありふれたペプチドの１つである。それは、効能のあるペプチド血管拡張薬であり、痛みの伝導に作用することができる。片頭痛はＣＧＲＰの濃度上昇に関連する共通の神経疾患である。ＣＧＲＰは、脳内血管を拡張し、及び血管痛覚を伝導する。ＣＧＲＰ受容体拮抗薬は、片頭痛の治療として実験された。Ａｒｕｌｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，“Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ  ｇｅｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｉｔ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｍｉｇｒａｉｎｅ  ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ”，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５００（１−３）：３１５−３３０．少なくとも３つの受容体サブタイプが同定され、ＣＧＲＰは、Ｇタンパク質共役型受容体を介して作用し、様々な組織におけるペプチドの作用を調節する機能において変化する。受容体を介したＣＧＲＰの情報伝達は、２つの補助的タンパク質、受容体活性修飾因子タンパク質１（ＲＡＭＰ１）及び受容体構成タンパク質（ＲＣＰ）に依存している。Ｇｈａｔｔａ  ２００４、カルシトニン遺伝子関連ペプチドは、その役割が理解されている。Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３６（５）：２７７−２８３。３つの血管拡張薬、内皮依存性血管拡張薬アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、内皮非依存性血管拡張薬プロスタサイクリン（エポプロステロール、ＰＧＩ２）及びＣＧＲＰのレイノー現象の患者への静注の効果の１つ、及びＣＧＲＰの研究は、レイノー現象を有する患者及びＣＧＲＰ及びレーザードップラー血流測定法（ＬＤＦ）を用いて制御に適合した年齢及び性別の同程度の数に対して、レイノー患者において、皮膚血流増大によって顔及び手の潮赤がＣＧＲＰによって誘導されるが、制御群においてＣＧＲＰは顔のみの潮赤を引き起こしたことを示した。ＰＧ１２は、両群の手及び顔の血流に同様のことを引き起こした。ＡＴＰは、患者の手又は顔の血流にいかなる重大な変化も引き起こさなかったが、制御群の顔における血流は増加させた。Ｓｈａｗｋｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，“Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｓｕｐｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ−ｇｅｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈａｎｄｓ  ｉｎ  Ｒｅｙｎａｕｄ’ｓ  ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ”．Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ，３３４（８６７６）：１３５４−１３５７。一態様において、野生型タンパク質標的分子はＣＧＲＰである。
【０１７２】
一実施形態において、本開示は、通常の生理的温度において可逆的に不活性であるが、指が異常低温であるときには再活性される、レイノー症候群に関連するタンパク質の条件的活性型組換えタンパク質変異体を選択するための方法を提供する。条件的活性型タンパク質は、レイノー現象を治療するため、低循環による指機能の喪失を防止する又は低減させるために用いられることがある。
【０１７３】
循環障害  −  バソプレッシン
アルギニンバソプレッシン（ＡＶＰ、バソプレッシン、抗利尿性ホルモン（ＡＤＨ））は、組織浸透性に関する腎細管での分子の再吸収を制御する多くの哺乳類で見られるペプチドホルモンである。バソプレッシンの最も重要な役割の１つは、体内における水分保持を調節することである。高濃度において、適度な血管収縮が導かれることで血圧を上昇させる。バソプレッシンは、尿浸透圧（高濃度）の上昇及び水分排泄の減少を結果として引き起こす３つの効果を有する。第１に、バソプレッシンは、水分の再吸収及び濃縮尿（抗利尿）のより少ない量の排出を可能とする腎臓において、集合管細胞の水の透過性の増大を引き起こす。これは、集合管細胞の頂端膜において、アクアポリン２水分チャンネルの挿入を介して起こる。第２に、バソプレッシンは、尿素に集合管の内側髄部分透過性の増大を引き起こし、髄質間質において尿の再吸収の増加を可能にする。第３に、バソプレッシンは、Ｎａ＋、Ｋ＋、２Ｃｌ−共輸送体の活性を増加することによって、ナトリウムの刺激及びヘンレ係蹄の厚みのある上肢における塩化物の再吸収が起こる。塩化ナトリウム再吸収は、逆流増加の過程によるものであり、集合管髄質での水分再吸収をもたらすアクアポリンにおいての浸透勾配を提供する。
【０１７４】
腎臓の集合管周辺の高張性間質性流体は、水の除去において高い浸透圧を提供する。アクアポリンと呼ばれるタンパク質によって作られる膜貫通チャンネルは、水への浸透性を非常に高める血漿膜に挿入される。開いているとき、アクアポリンチャンネルは、毎秒３０億分子の水を透過させることができる。アクアポリン２チャンネルの挿入は、バソプレッシンによるシグナル伝達を必要とする。バソプレッシンは、集合管細胞の基底側表面で受容体（Ｖ２受容体と呼ばれる）と結合する。ホルモンの結合は、細胞内におけるｃＡＭＰのレベルを引き上げる引き金となる。この「第２のメッセンジャー」は、集合管細胞の頂端膜でアクアポリン２チャンネルの挿入に結果としてなる連鎖を開始する。アクアポリンは、腎単位の外へ水を排出し、血流に尿を戻すことから水分の再吸収量を増加させる。
【０１７５】
脳下垂体からのバソプレッシンの放出においての主要な刺激は、血漿のオスモル濃度を増加させる。激しい発汗のような体の脱水はどんなものでも血中のオスモル濃度を増加させ、アクアポリン２経路にＶ２受容体へのバソプレッシンを作動させる。結果として、尿の０．５リットル／日と同じくらい少量が、元の腎ろ液１８０リットル／日が残存することがある。尿における塩濃度は血中の４倍であることがある。大量の水を飲むなどして、血液があまりにも希薄となると、バソプレッシン分泌が阻害され、アクアポリン２チャンネルは、エンドサイトーシスによって細胞内に戻される。その結果、血中の４分の１程度の少量の塩濃度で大量の薄い尿が生成される。
【０１７６】
減少させたバソプレッシン放出又は減少させたＡＶＰへの腎臓の感受性は、尿崩症、高ナトリウム血症状態（血中のナトリウム濃度の増加）、多尿症（過剰な尿生成）及び多飲症（口渇）につながる。
【０１７７】
ＡＶＰ分泌の高レベル（不適当な抗利尿ホルモン（ＳＩＡＤＨ）症候群）及び結果として生じる低ナトリウム血症（低い血液ナトリウム濃度）は、脳疾患及び肺（小さい細胞肺癌）の条件において生じる。周術期間において、外科的ストレス及びいくつかの一般的に用いられる薬物（例えば、阿片剤、シントシノン、制吐剤）の作用は、過剰なバソプレッシン分泌の同様の状態につながる。これは、数日間程度の低ナトリウム血症を引き起こすことがある。
【０１７８】
バソプレッシン作動薬は、様々な条件において治療的に使用され、及びその長時間作用性の合成類似デスモプレッシンは、出血（フォン・ウィルブラント病の様々な形態において）の制御及び児童による寝小便の極端な場合の制御と同様に、低バソプレッシン分泌を特徴とする条件において使用される。テルリプレッシン及び関連する類似体は、特定の条件において血管収縮剤として用いられる。バソプレッシン注入は、イノトロープ（例えばドーパミン又はノルエピネフリン）の高投与に応じない感染性ショック患者において、管理の第２ラインとして用いられる。バソプレッシン受容体アンタゴニストは、バソプレッシン受容体で作用を妨げる薬剤である。それらは低ナトリウム血症の治療においても使用されることがある。
【０１７９】
一実施形態において、本開示は、通常の生理的浸透圧において可逆的に不活性であるが、血中における異常浸透圧下において再活性される、バソプレッシン応答において含まれるタンパク質の条件的生物学的組換え又は合成タンパク質のための選択の方法を提供する。他の実施形態において、バソプレッシン応答において含まれるタンパク質の変異体は、ナトリウム欠乏状態において活性化されるが、通常の血清ナトリウム濃度では不活性化される。一態様において、ナトリウム欠乏状態は、血清ナトリウム＜１３５ｍＥｑ／Ｌである。
【０１８０】
癌  −  アンギオスタチン
アンギオスタチンはいくつかの動物種において自然発生するタンパク質である。それは、内因性血管新生阻害剤（すなわち、新しい血管の成長を阻害する）として作用する。アンギオスタチンは、内皮細胞の増殖及び転移を阻害することで腫瘍細胞の成長及び転移を抑制する。アンギオスタチンはプラスミン（それ自体がプラスミノーゲンのフラグメントである）の３８ｋＤフラグメントである。アンギオスタチンは、プラスミノーゲンの１〜３クリングルからなる。アンギオスタチンは、例えば、ホスホグリセリン酸キナーゼによる細胞外ジスルフィド結合還元を含むプラスミノーゲンの自己融解開裂によって作られる。アンギオスタチンは、ＭＭＰ２、ＭＭＰ１２及びＭＭＰ９を含む異なる基質メタロプロテイナーゼ、及びセリンプロテアーゼ（好中級エラスターゼ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ））によるプラスミノーゲンから開裂することができる。生体内において、アンギオスタチンは、腫瘍の成長を阻害し、及び実験的転移を休眠状態に維持する。アンギオスタチンは、初期腫瘍、及び他の炎症性及び変性疾患の動物内で上昇する。
【０１８１】
アンギオスタチンは、アンギオモチン及び内皮細胞表面ＡＴＯシンターゼ、インテグリン、アネキシンＩＩ、Ｃ−ｍｅｔ受容体、ＮＧ２−プロテオグリカン、組織プラスミノーゲン活性体、コンドロイチン表面糖タンパク質、及びＣＤ２６を含む多くのタンパク質と結合することで知られている。ある研究は、強力な抗血管新生活性を有するＩＬ−１２、ＴＨ１サイトカインはアンギオスタチンの活性のメディエーターであることを示している。Ａｌｂｉｎ”．，Ｊ．Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｊａｎ．４，２００９，７：５。アンギオスタチンは、内皮細胞表面で結合し、及びＡＴＰ合成を阻害する。ＡＴＰ合成はまた、様々な癌細胞表面で生じる。腫瘍細胞表面ＡＴＰ合成は、低細胞外ｐＨ、腫瘍微小環境の特徴にてより活発に見られる。アンギオスタチンは、酸性細胞外ｐＨ（ｐＨｅ）での腫瘍細胞表面ＡＴＰ合成活性に作用すると見られる。低細胞外ｐＨで、アンギオスタチンは、直接的に抗腫瘍化である。低ｐＨで、アンギオスタチン及び抗ベータサブユニット抗体は、細胞外ＡＴＰ合成の低レベルな腫瘍細胞において欠けている直接的毒性と同様に、Ａ５４９癌細胞の細胞内酸性化を導く。腫瘍細胞毒性の機構は、細胞表面ＡＴＰ合成の阻害に起因して細胞内ｐＨ調節解除によっていることが仮定されている。Ｃｈｉ  ａｎｄ  Ｐｉｚｚｏ，“Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ  ｉｓ  ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｔｏ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｔ  ｌｏｗ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐＨ：ａ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｎ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ＡＴＰ  ｓｙｎｔｈａｓｅ”，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２００６，６６（２）：８７５−８２。
【０１８２】
一実施形態において、本開示は通常の生理的血液ｐＨにおいて野生型アンギオスタチンよりも活性が低いが、低ｐＨにおいて、活性の増強を示す条件的活性型アンギオスタチン変異体の同定のための方法を提供する。低ｐＨは、通常の生理的ｐＨよりも低いものとして定義される。一態様において、低ｐＨはｐＨ約７．２以下である。特定の態様において、低ｐＨはｐＨ約６．７である。
【０１８３】
一態様において、条件的活性型アンギオスタチン変異体は抗癌剤として処方され、利用されることがある。
【０１８４】
組織浸透性の増進  −  ヒアルロニダーゼ
ヒアルロニダーゼは、ヒアルロン酸を分解させる酵素の一系統である。ヒアルロン酸、格子間障壁の主要構成要素の分解を引き起こすことによって、ヒアルロニダーゼはヒアルロン酸の粘性を低下させ、それによって、組織透過率を上昇させる。薬剤の分散及び運搬を速くするために、薬剤に関連して医学において用いられる。最も一般的な適用は、眼の手術において、局所麻酔約と組み合わせて使用される。動物由来のヒアルロニダーゼは、Ｈｙｄａｓｅ（商標）（ＰｒｉｍａＰｈａｒｍ  Ｉｎｃ．；Ａｋｏｒｎ  ｍｅ）、ビトラーゼ（ＩＳＴＡ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、Ａｍｐｈａｄａｓｅ（Ａｍｐｈａｓｔａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を含む。ヒト組換えヒアルロニダーゼは、他の薬剤の吸収を増加させる補助剤として現在承認されている。Ｈｙｐｏｄｅｒｍｏｃｙｃｌｉｓ（流体の皮下注入）、放射線不透過性薬剤の吸収を改良する、皮下尿路造影における補助剤（Ｈｙｌｅｎｅｘ；Ｈａｌｏｚｙｍｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．；Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｏｒｐ）。一実施形態において、条件的活性型生物学的タンパク質の調製のために、ヒアルロニダーゼは野生型タンパク質（親分子）として使われる。ヒアルロニダーゼは、癌転移及び血管新生において役割を果たすことができる。従って、これらの酵素に対する露出過度は有害であることがある。一態様において、条件的活性型生物学的ヒアルロニダーゼタンパク質は、正常生理的温度において不可逆的又は可逆的に不活性であるが、正常生理的温度よりも低い特定の温度範囲において、野生型ヒアルロニダーゼと等しい又は上回るレベルで活性である。
【０１８５】
自己免疫疾患  −  条件的活性型生物学的応答修飾因子
リウマチ性関節炎は、関節炎及び関節の進行的破壊による腫れにつながる、異常免疫機構によって特徴付けられた自己免疫疾患である。ＲＡ（リウマチ性関節炎）は皮膚、結合組織及び体内の器官にも作用することがある。従来の治療は、非ステロイドの抗炎症薬剤（ＮＳＡＩＤＳ）、ＣＯＸ−２阻害剤及びメトトレキサートのような疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤＳ）を含む。従来の治療方式は、特に長期間の使用において、いずれも理想的ではない。
【０１８６】
炎症メディエーターを標的とする生物学的応答修飾因子は、リウマチ性関節炎及び他の自己免疫疾患の治療に、相対的に新規な手法を提供する。このような生物学的応答修飾因子には、ＩＬ−６、ＩＬ−６受容体、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−２３及びＩＬ−１２のような様々な炎症メディエーターに対する抗体又はそれらの活性部分を含む。
【０１８７】
第１の生物学的応答修飾因子のいくつかは、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−ａ）、ＲＡの病因において含まれる炎症促進性サイトカインを標的とする薬物である。いくつかの抗ＴＮＦアルファ薬剤は、ＲＡの治療のため現在市販されている。例えば、エンブレル（登録商標）（エタネルセプト、アムゲン）はＴＮＦ−アルファ遮断薬である。エタネルセプトは、ヒトＩｇＧＩのＦｃ部分に結合されるヒト７５キロドルトン（ｐ７５）腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）の細胞外連結結合部分からなる二量体溶融タンパク質である。エタネルセプトのＦｃ成分は、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びヒンジ領域を含むが、ＩｇＧＩのＣｈ１ドメインは含まない。エタネルセプトはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）哺乳類細胞発現系で作られる。それは、９３４アミノ酸からなり、見かけの分子量は約１５０キロドルトンである。エンブレル（登録商標）はリウマチ性関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、及び尋常性乾癬の治療に使用される。エンブレル（登録商標）の重大な副作用には、結核、真菌感染、日和見病原体によるウイルス感染を含む感染症を含む。敗血症が生じることもある。リンパ腫又は他の悪性腫瘍も報告されている。
【０１８８】
レミケード（登録商標）（インフリキシマブ）は、ヒト恒常的領域及びネズミ可変領域からなるキメラ抗−ＴＮＦ−アルファＩｇＧＫＩ単一クローン抗体である。レミケードは静注で投与され、及びリウマチ性関節炎、乾癬、クローン病、潰瘍性大腸炎及び強直性脊椎炎の治療に使用される。レミケードの副作用は、重篤な感染症又は敗血症、及び稀に特定のＴ細胞リンパ腫を含む。他の副作用は、肝毒性、特定の重篤な血液学的事象、過敏性反応及び特定の神経学的事象を含む。
【０１８９】
他の生物学的応答修飾因子は、ヒト化抗インターロイキン−６（ＩＬ−６）受容体抗体を含む。ＩＬ−６は、炎症、腫れ、及びＲＡにおける関節損傷に寄与するサイトカインである。１つのヒト化抗ＩＬ−６受容体抗体、アクテムラ（トシリズマブ、Ｒｏｃｈｅ）は、ＦＤＡ及び欧州委員会によって、リウマチ性関節炎の成人患者を治療するとして承認されている。アクテムラはまた、日本においてもＲＡ及び若年性関節リウマチ（ｓＪＩＡ）の治療において承認されている。段階ＩＩＩ研究は、他の治療薬と比較して、アクテムラによる治療は、単独治療としても、また、ＭＴＸ又は他のＤＭＡＲＤとの組み合わせでも、ＲＡの兆候及び症状を減少させると示している。アクテムラは、その受容体にＩＬ−６の結合を競合的に遮断するヒト化ＩＬ−６受容体単クローン抗体である。従って、それは、ＲＡにおける滑膜肥厚及びパンヌス形成につながるＩＬ−６の増殖作用を阻害する。アクテムラの重大な副作用は、重篤な感染症及びアナフィラキシーのいくつかの場合を含む過敏反応を含む。他の副作用は、上気道感染症、頭痛、鼻咽頭炎、高血圧及び増加ＡＬＴが含まれる。
【０１９０】
他の共通の自己免疫疾患は乾癬である。免疫系の過剰活性は、ＩＬ−１２及びＩＬ−２３、乾癬皮膚斑で見られる２つのサイトカインタンパク質の高濃度につながることがある。ＩＬ−１２及びＩＬ−２３は、ナチュラルキラー細胞活性化及びＣＤ４＋Ｔ細胞分化及び活性化のような、炎症性及び免疫性応答において含まれる。
【０１９１】
中程度の又は重症な乾癬における一治療は、ステラーラ（商標）（ウステキマヌブ、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ  Ｏｒｔｈｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）ＩＬ−１２及びＩＬ−２３サイトカインのｐ４０サブユニットに対するヒト化ＩｇＧＩｋ単クローン抗体の皮下注射を含む。ステラーラは、斑肥厚、皮膚のはがれ、赤みなどの乾癬斑に関する特定の症状からの軽減を提供することが示されている。ステラーラ用製剤は、Ｌ−ヒスチジン及びＬ−ヒスチジン塩酸塩水和物、ポリソルベート８０、及び水溶液中のショ糖を含む。ステラーラ（商標）の使用は、免疫系に作用し、及び特定の型の癌の危険性を増すのと同様に、結核及びバクテリア、真菌又はウイルスによって引き起こされる感染症を含む感染症の機会を増やす。
【０１９２】
生物学的応答修飾因子の副作用は、重篤であり、患者への高レベルの注入によって、患者を重篤な感染症又は死に影響されやすくすることがある。これが薬剤のこの重要な種類に関連する大きい副作用である。１つの課題は、注入後に長い治療効果を提供するために必要な抗体の投与から活性の高い初期レベルを回避することである。
【０１９３】
一実施形態において、本開示は条件的活性型生物学的応答メディエーター又はそれらのフラグメントを調製するための方法を提供し、注入後に長い治療効果を提供するために必要な抗体の投与から活性の高いレベルを回避するものである。本開示の方法は、室温のような投与条件では不活性であるが、体温ではゆっくりとリフォールド（可逆的又は不可逆的に）する、ＩＬ−６、ＩＬ−６受容体、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−２３及びＩＬ−１２のような炎症メディエーターに対する抗体を設計するために用いられることがある。これらの抗体又はそのフラグメントは、最初の注入に応じて不活性であるが、血液注入に露出されると、数時間から数日の機関にわたって、リフォールド又は再活性される。これは、副作用の減少による、より高い投与量及びより長い半減期（又は投与期間）を可能にするものである。
【０１９４】
一態様において、本開示は室温のような投与条件では不活性であるが、体温にではゆっくりとタンパク質を（可逆的又は不可逆的に）再び折り畳む、炎症メディエーターへの条件的活性型抗体又はそれらのフラグメントの調製のための方法を提供する。この方法は以下の工程からなる。炎症メディエーターを選択する工程。融合細胞を介して炎症メディエーターへの抗体を同定するためにスクリーニングする工程。抗炎症メディエーター抗体をヒト化する工程。抗炎症メディエーター抗体を発達させて、２つ以上の条件、例えば、室温及び３７℃以上などの２つ以上の温度条件での結合に関して差次的にスクリーニングする工程；（ａ）正常生理条件での分析における野生型タンパク質と比較した活性の低下、及び（ｂ）異常条件下での分析における野生型タンパク質と比較した活性の増加のうちの少なくとも１つを呈する突然変異を選択する工程。次に、重鎖及び軽鎖に同定された上昇変異体を、重鎖及び軽鎖内で、並びに重鎖及び軽鎖のコンビナトリアル結合を介して組み換える。これらの組換え重鎖及び軽鎖のスクリーニングを２つの条件、例えば室温及び３７℃以上で繰り返す。加えて、組換え抗体又はフラグメントを、貯蔵条件下及び生理条件下における活性及び安定性に関してスクリーニングすることができる。
【０１９５】
或いは、炎症メディエーターへの野生型抗体は、抗体又は変異体又はそれらの活性フラグメントが知られている。
【０１９６】
一態様において、第１及び第２の条件は、ｐＨ、浸透圧、オスモル濃度、酸化的ストレス及び電荷濃度から選択される。他の態様において、炎症メディエーターは、ＩＬ−６、ＩＬ−６受容体、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−２３及びＩＬ−１２から選択される。
【０１９７】
別の態様において、本開示は、室温などの投与条件では不活性であるが、体温では（可逆的又は不可逆的に）緩徐にリフォールディングする、ＩＬ−６に対する条件的活性型抗体、又はそのフラグメントを調製する方法を提供する。この方法は以下の工程を含む。ＩＬ−６に対する抗体に関して完全ヒトライブラリをスクリーニングする工程。ＩＬ−６抗体を発達させて、室温及び３７℃以上における分子に関して差次的にスクリーニングする工程；（ａ）正常生理条件での分析における野生型タンパク質と比較した活性の低下、及び（ｂ）異常条件下での分析における野生型タンパク質と比較した活性の増加のうちの少なくとも１つを呈する突然変異を選択する工程。次に、重鎖及び軽鎖に同定された上昇変異体を、重鎖及び軽鎖内で、並びに重鎖及び軽鎖のコンビナトリアル結合を介して組み換える。これらの組換え重鎖及び軽鎖のスクリーニングを室温及びより高温で繰り返す。加えて、貯蔵条件下及び生理条件下における活性及び安定性に関して組換え抗体又はフラグメントを試験する。
【０１９８】
従って同定され、及び製造された条件的活性型抗ＩＬ−６抗体は、それを必要とする患者に有効な量を投与することによって、リウマチ性関節炎又は乾癬のような自己免疫疾患を治療するための方法において使用され、従来の生物学的応答修飾因子抗ＩＬ−６抗体の投与と比較して副作用を低減している。この方法の利点の１つは、数週間又は数カ月にわたって半減期のクリアランスが続く生物学的応答修飾剤の現在の高いレベルと比較して、治療期間にわたっての薬剤量の平滑化及び平準化ができることである。
【０１９９】
１つ以上の突然変異誘発技術は、変異ＤＮＡのライブラリを作るための野生型タンパク質をエンコードするＤＮＡを発達させるのに使用される。変異ＤＮＡは、変異タンパク質のライブラリを作るために発現され、及びこのライブラリは、正常生理的条件下及び１つ以上の異常条件下でスクリーニング分析するために対象とされる。条件的活性型生物学的タンパク質は、（ａ）野生型タンパク質と比較して正常生理的条件下での分析において活性が減少すること、及び（ｂ）野生型タンパク質と比較して異常条件下での分析において活性が増大することのうちの少なくとも１つを示すこれらのタンパク質から選択される。或いは、条件的活性型生物学的タンパク質は、２つ以上の異なる生理的条件において、可逆的に又は不可逆的に活性の変化を示すこれらのタンパク質から選択される。
【０２００】
条件的活性型ウイルス粒子
ウイルス粒子は、長年、タンパク質、核酸分子、化学的化合物又は放射性同位元素を標的細胞又は組織に輸送するための送達媒体として使用されている。送達媒体として一般的に用いられているウイルス粒子としては、レトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、及びアデノ随伴ウイルスが挙げられる。ウイルス粒子は、多くの場合にリガンド−受容体結合系において、標的細胞の標的タンパク質として機能する細胞タンパク質との特異的結合のための認識タンパク質として機能する表面タンパク質を介してその標的細胞を認識する（Ｌｅｎｔｚ，“Ｔｈｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｅｖｅｎｔ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ａｇｅｎｔｓ，”Ｊ．ｏｆ  Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．７１，ｐａｇｅｓ  ７５１−７６５，１９９０（参照により本明細書に援用される））。例えば、ウイルスの認識タンパク質は、標的細胞上の受容体に対するリガンドであり得る。リガンドと受容体との間の特異性により、ウイルス粒子が標的細胞を特異的に認識して、そこにその内容物を送達することが可能となる。
【０２０１】
野生型ウイルスから人工ウイルス粒子を作る技法は当業者に周知である。送達媒体として公知の人工ウイルス粒子には、レトロウイルス（例えば、国際公開第９０／０７９３６号パンフレット；国際公開第９４／０３６２２号パンフレット；国際公開第９３／２５６９８号パンフレット；国際公開第９３／２５２３４号パンフレット；米国特許第５，２１９，７４０号明細書；国際公開第９３／１１２３０号パンフレット；国際公開第９３／１０２１８号パンフレット；米国特許第４，７７７，１２７号明細書；英国特許第２，２００，６５１号明細書；欧州特許第０  ３４５  ２４２号明細書；及び国際公開第９１／０２８０５号パンフレットを参照のこと）、アルファウイルス（例えば、シンドビスウイルスベクター、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４７）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４６）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣ  ＶＲ  １２４９；ＡＴＣＣ  ＶＲ−５３２））、及びアデノ随伴ウイルス（例えば、国際公開第９４／１２６４９号パンフレット、国際公開第９３／０３７６９号パンフレット；国際公開第９３／１９１９１号パンフレット；国際公開第９４／２８９３８号パンフレット；国際公開第９５／１１９８４号パンフレット及び国際公開第９５／００６５５号パンフレットを参照のこと）をベースとするものが含まれる。
【０２０２】
概して、人工ウイルス粒子は、ウイルス粒子への外来性認識タンパク質の挿入、多くの場合に組換え技術による天然認識タンパク質の置換によって構築される。外来性認識タンパク質は、例えば、抗体、受容体、リガンド又はコラーゲン結合ドメインであり得る。本発明は、正常生理条件では細胞に対する結合が不活性又は低活性であり、且つ異常条件では細胞に対する結合が活性又は高活性である条件的活性型認識タンパク質を提供する。従って条件的活性型認識タンパク質は、罹患組織及び／又は疾患部位の標的細胞に対してはこの部位における異常条件の存在に基づき優先的に結合し、且つ正常生理条件が存在する正常組織の細胞との結合は回避するか、又はごく最小限であり得る。条件的活性型認識タンパク質はウイルス粒子の表面上に発現し、提示され得る。
【０２０３】
一部の実施形態において、本発明は、野生型認識タンパク質を発達させて、条件的活性型認識タンパク質に関してスクリーニングする方法を提供する。条件的活性型認識タンパク質は、正常生理条件下では野生型認識タンパク質と比べて細胞に対する結合活性が低く、異常条件下では野生型認識タンパク質と比べて細胞に対する結合活性が高い。かかる条件的活性型認識タンパク質を周知の組換え技術によってウイルス粒子に挿入すると、条件的活性型ウイルス粒子が生成され得る。
【０２０４】
別の実施形態において、本発明は、条件的活性型認識タンパク質を含む条件的活性型ウイルス粒子を提供し、これは、条件的活性型ウイルス粒子が罹患組織又は疾患部位の標的細胞を認識してそれに結合するが、正常組織の細胞は認識及び結合しないことを可能にするものである。かかる条件的活性型ウイルス粒子はウイルス粒子内の療法薬を罹患組織又は疾患部位に優先的に送達することができる一方、この条件的活性型ウイルス粒子は正常組織の細胞にはより少ない治療組成物を送達するか、又は全く送達しない。
【０２０５】
一部の実施形態において、疾患部位における標的細胞は、健常な又は特定の疾患又は病状に罹患していない体の他の部分におけるｐＨ又は温度と比較して異常なｐＨ（例えば、ｐＨ６．５）又は異常な温度を有する領域又は微小環境の内部にある。この実施形態において、条件的活性型認識タンパク質は、正常な生理的ｐＨ又は温度では野生型認識タンパク質と比べて標的細胞の標的タンパク質との結合活性が低く、異常な（ａｂｎｏｒｍａｌ）又は異常な（ａｂｅｒｒａｎｔ）ｐＨ又は温度では野生型認識タンパク質と比べて標的細胞の標的タンパク質との結合活性が高い。このように、この認識タンパク質は異常なｐＨ又は温度が起こる部位に優先的に結合し、それによって治療を疾患部位に送達し得る。
【０２０６】
一実施形態において、ウイルス粒子は本発明の条件的活性型抗体、特に抗体の可変領域（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ）を含み得る。かかる条件的活性型抗体は、正常組織を含む部位で起こり得る正常生理条件下では野生型抗体より低い親和性で、及び疾患部位又は罹患組織で起こり得る異常な（ａｂｎｏｒｍａｌ）又は異常な（ａｂｅｒｒａｎｔ）条件下では野生型抗体より高い親和性で、標的細胞の標的タンパク質（抗原として）に結合し得る。条件的活性型抗体は、本発明の方法に従い野生型抗体から誘導し得る。
【０２０７】
ある実施形態では、標的細胞上の標的タンパク質には、例えば多くの腫瘍において細胞表面上で過剰発現するものなどのチロシンキナーゼ成長因子受容体が含まれる。例示的チロシンキナーゼ成長因子は、ＶＥＧＦ受容体、ＦＧＦ受容体、ＰＤＧＦ受容体、ＩＧＦ受容体、ＥＧＦ受容体、ＴＧＦ−α受容体、ＴＧＦ−β受容体、ＨＢ−ＥＧＦ受容体、ＥｒｂＢ２受容体、ＥｒｂＢ３受容体、及びＥｒｂＢ４受容体である。
【０２０８】
条件的活性型ＤＮＡ／ＲＮＡ修飾タンパク質
新規ゲノム操作ツールの一形態としてＤＮＡ／ＲＮＡ修飾タンパク質、特にＣＲＩＳＰＲと呼ばれるものが発見されており、これらによれば、研究者は遺伝子にマイクロサージェリーを施して、染色体上の正確な位置にあるＤＮＡ配列を精密且つ容易に変化させることが可能となる（ゲノム編集、Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃａｓ９  ａｓ  ａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｂｉｏｌｏｇｙ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｖｏｌ．１０，ｐａｇｅｓ  ９５７−９６３，２０１３）。例えば、鎌状赤血球貧血は単一塩基突然変異によって引き起こされ、これはＤＮＡ／ＲＮＡ修飾タンパク質を使用して修正し得る可能性がある。この技術は、染色体の小片を、一塩基対の変更による場合であっても、精密に欠失させ、又は編集し得る（Ｍａｋａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．９，ｐａｇｅｓ  ４６７−４７７，２０１１）。
【０２０９】
ＣＲＩＳＰＲによるゲノム編集は、細胞に複数の遺伝子変化を迅速且つ同時に作製する能力を有する。多くのヒトの病気は、心疾患、糖尿病、及び神経系疾患を含め、複数の遺伝子における突然変異の影響を受ける。このＣＲＩＳＰＲベースの技術は、疾患を引き起こす突然変異を復帰させ、これらの疾患を治癒し、又は少なくともこれらの疾患の重症度を低減し得る可能性を有する。ゲノム編集は、ゲノムＤＮＡの切断についてＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質（酵素ファミリー）に頼る。典型的には、Ｃａｓタンパク質は、小さいガイドＲＮＡによってゲノム内の標的領域に案内され、ここでガイドＲＮＡは標的領域と一致している。Ｃａｓタンパク質は配列特異性がほとんど又は全くないため、ガイドＲＮＡが、Ｃａｓタンパク質が正確なゲノム編集を達成するための指示者としての役割を果たす。一実施形態では、１つのＣａｓタンパク質を複数のガイドＲＮＡと共に使用して、複数の遺伝子突然変異を同時に修正し得る。
【０２１０】
多くのＣａｓタンパク質が存在する。例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３’、Ｃａｓ３’’、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、及びＣｓｆ４が挙げられる（（Ｍａｋａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．９，ｐａｇｅｓ  ４６７−４７７，２０１１）。
【０２１１】
ゲノム編集を行うには、Ｃａｓタンパク質が標的細胞に侵入する必要がある。対象の細胞は、細胞内部において異なる細胞内ｐＨを有し得る。罹患組織の一部の細胞は異常な細胞内ｐＨを有する。例えば、一部の腫瘍細胞は約７．１２〜７．６５のアルカリ性の細胞内ｐＨを有する傾向があり、一方、正常組織の細胞は６．９９〜７．２０の範囲の中性の細胞内ｐＨを有する。Ｃａｒｄｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｄｉｓｔｕｒｂｅｄ  ｐＨ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｎａ（＋）／Ｈ（＋）ｅｘｃｈａｎｇｅｒ  ｉｎ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，”Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ，ｖｏｌ．５，ｐａｇｅｓ  ７８６−７９５，２００５を参照のこと。慢性低酸素では、罹患組織の細胞は約７．２〜７．５の細胞内ｐＨを有し、これも正常組織の細胞内ｐＨより高い（Ｒｉｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｙｐｏｘｉａ  ｅｌｅｖａｔｅｓ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐＨ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  Ｎａ＋／Ｈ＋  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｉａｌ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ，”Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ−Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２８９，ｐａｇｅｓ  Ｌ８６７−Ｌ８７４，２００５）。さらに、虚血細胞では、細胞内ｐＨは典型的に６．５５〜６．６５の範囲であり、これは正常組織の細胞内ｐＨより低い（Ｈａｑｂｅｒｇ，“Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐＨ  ｄｕｒｉｎｇ  ｉｓｃｈｅｍｉａ  ｉｎ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ：ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｔｏ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ，ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐＨ，ｔｉｓｓｕｅ  ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎｄ  ＡＴＰ，”Ｐｆｌｕｇｅｒｓ  Ａｒｃｈ．，ｖｏｌ．４０４，ｐａｇｅｓ  ３４２−３４７，１９８５）。罹患組織における異常な細胞内ｐＨのさらなる例が、Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐＨ，”Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ．，ｖｏｌ．１１０，ｐａｇｅｓ  ２７０９−２７２８，２０１０において考察されている。
【０２１２】
本発明は、野生型Ｃａｓタンパク質から条件的活性型Ｃａｓタンパク質を作製する方法を提供し、ここで条件的活性型Ｃａｓタンパク質は、正常細胞内部の正常生理条件下で野生型Ｃａｓタンパク質の活性と比べて低下した酵素活性、及び上記で考察した罹患細胞の１つなどの標的細胞内部の異常条件下で野生型Ｃａｓタンパク質の活性と比べて増加した酵素活性のうちの少なくとも１つを有する。一部の実施形態において、正常生理条件はほぼ中性の細胞内ｐＨであり、異常条件は、中性より高いか、又はそれより低い異なる細胞内ｐＨである。ある実施形態では、異常条件は、７．２〜７．６５の細胞内ｐＨ又は６．５〜６．８の細胞内ｐＨである。
【０２１３】
一部の実施形態において、条件的活性型Ｃａｓタンパク質は、本発明の条件的活性型ウイルス粒子を使用して標的細胞に送達し得る。条件的活性型ウイルス粒子は、条件的活性型Ｃａｓタンパク質と、Ｃａｓタンパク質がゲノムＤＮＡを編集することになる位置にＣａｓタンパク質を導くための少なくとも１つのガイドＲＮＡとを含み得る。
【０２１４】
条件的活性型キメラ抗原受容体
一部の実施形態において、本開示は、少なくとも１つの抗原特異的標的領域（ＡＳＴＲ）と、膜貫通ドメイン（ＴＭ）と、細胞内シグナル伝達ドメイン（ＩＳＤ）とを含む、標的抗原に結合するためのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関する。一部の実施形態において、ＣＡＲは、細胞外スペーサードメイン（ＥＳＤ）及び／又は共刺激ドメイン（ＣＳＤ）をさらに含み得る。図１を参照のこと。これらのＣＡＲは、癌細胞などの罹患細胞を攻撃するため細胞傷害性細胞（ＣＡＲを発現する）を疾患部位に仕向けることができる。細胞傷害性細胞は、罹患組織及び／又は病原体の標的化及び破壊に用いられ得る。これらの細胞傷害性細胞を使用して腫瘍などの望ましくない組織（すなわち標的組織）を除去することは、有望な治療手法である。除去の標的とし得る他の組織としては、腺（例えば前立腺）過形成、疣贅、及び望ましくない脂肪組織が挙げられる。
【０２１５】
キメラ抗原受容体を発現する細胞傷害性細胞は、細胞傷害性細胞の特異性及び感受性を大幅に改善し得る。例えば、ＣＡＲを発現するＴ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）は、ＣＡＲを使用して、ＣＡＲに特異的に結合する細胞表面抗原を発現する腫瘍細胞へとＴ細胞を導く能力を有する。かかるＣＡＲ−Ｔ細胞は細胞傷害剤をより選択的に腫瘍細胞に送達することができる。ＣＡＲ−Ｔ細胞は標的分子を直接認識することができ、従って典型的にはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）などの多型性を呈する要素による制限を受けない。このＣＡＲによる標的化戦略の利点は三点からなる。第１に、ＣＡＲ−Ｔ細胞の機能がＨＬＡ状態に依存しないため、同じ標的表面抗原を発現する腫瘍を有するあらゆる患者で同じＣＡＲベースの手法を用いることができる。第２に、抗原プロセシング及び提示機構の改変は腫瘍細胞の一般的な特質であり、免疫エスケープを促進し得る。しかしながら、これがＣＡＲ−Ｔ細胞に対する無防備をもたらす。第３に、このシステムを使用して、タンパク質、炭水化物、及び糖脂質を含めた様々な巨大分子を標的化することができる。
【０２１６】
ＡＳＴＲは、タンパク質、炭水化物、及び糖脂質を含む特定の標的抗原に結合するためのＣＡＲの細胞外領域である。一部の実施形態において、ＡＳＴＲは、抗体、特に一本鎖抗体、又はそのフラグメントを含む。ＡＳＴＲは、完全長重鎖、Ｆａｂフラグメント、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメント、二価一本鎖抗体又はダイアボディを含むことができ、これらの各々が標的抗原に特異的である。
【０２１７】
ＡＳＴＲはまた、標的抗原を認識してそれに結合するための別のタンパク質機能ドメインも含み得る。標的抗原は、受容体又はリガンドとしての役割を果たすなど、他の生物学的機能を有し得るため、或いはＡＳＴＲは、抗原と特異的に結合するための機能ドメインを含み得る。機能ドメインを有するタンパク質のいくつかの例としては、連結サイトカイン（これは、サイトカイン受容体を担持する細胞の認識につながる）、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）、天然に存在する受容体由来のリガンド結合ドメイン、及び例えば腫瘍細胞上の受容体に対する可溶性タンパク質／ペプチドリガンドが挙げられる。当業者は理解するであろうように、事実上、所与の抗原と高親和性で結合する能力を有する、ほぼいずれの分子もＡＳＴＲに使用することができる。
【０２１８】
一実施形態において、本発明のＣＡＲは、少なくとも２つの異なる抗原又は同じ抗原上の２つのエピトープを標的化する少なくとも２つのＡＳＴＲを含む。ある実施形態では、ＣＡＲは、少なくとも３つ以上の異なる抗原又はエピトープを標的化する３つ以上のＡＳＴＲを含む。ＣＡＲに複数のＡＳＴＲが存在するとき、ＡＳＴＲはタンデムに配置されてもよく、且つリンカーペプチドによって隔てられていてもよい（図１）。
【０２１９】
一実施形態において、ＡＳＴＲは、標的抗原に特異的な完全長ＩｇＧ重鎖を含み、抗原特異性を付与するのにＶＨドメイン単独で十分な場合（「シングルドメイン抗体」）、ＶＨ、ＣＨ１、ヒンジ、及びＣＨ２及びＣＨ３（Ｆｃ）Ｉｇドメインを有する。完全に活性なＡＳＴＲの作成にＶＨ及びＶＬドメインの両方が必要な場合、ＶＨ含有ＣＡＲ及び完全長λ軽鎖（ＩｇＬ）が両方ともに同じ細胞傷害性細胞に導入されて、活性ＡＳＴＲが作成される。別の実施形態において、ＣＡＲの各ＡＳＴＲは、各々が異なる標的抗原に特異的な少なくとも２つの一本鎖抗体可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。ｓｃＦｖでは、一方の可変ドメイン（ＶＨ又はＶＬ）のＣ末端が他方の可変ドメイン（それぞれＶＬ又はＶＨ）のＮ末端にポリペプチドリンカーを介してテザリングされている。かかる抗体フラグメントが、抗原結合性又は結合特異性を大きく妨げることなしに開発されている（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ  ｃｏｍｐｏｓｅｄ  ｏｆ  ａｎｔｉ−Ｔａｃ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ａｎｄ  ａ  ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  ｔｏｘｉｎ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ｖｏｌ．８７，ｐａｇｅ  ９４９１，１９９０；Ｂｅｄｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．，”“Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｎｔｉ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２６５，ｐａｇｅ  １８６１５，１９９０）。これらのｓｃＦｖは、天然抗体の重鎖及び軽鎖に存在する定常領域（Ｆｃ）を欠いている。少なくとも２つの異なる抗原に特異的なｓｃＦｖは、タンデムに配置される。ある実施形態では、ＡＳＴＲと膜貫通ドメインとの間に細胞外（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕａｒ）スペーサードメインが連結され得る。
【０２２０】
別の実施形態において、ｓｃＦｖフラグメントは重鎖の定常ドメインの全て又は一部分に融合していてもよい。さらなる実施形態において、ＣＡＲのＡＳＴＲは二価（ｄｉｖａｌｅｎｔ）（又は二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ））の一本鎖可変フラグメント（ｄｉ−ｓｃＦｖ、ｂｉ−ｓｃＦｖ）を含む。ｄｉ−ｓｃＦＶを含むＣＡＲでは、各々抗原に特異的な２つのｓｃＦｖが一体に連結されて、２つのＶＨ領域及び２つのＶＬ領域と共に単一のペプチド鎖を形成する（Ｘｉｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，“ｂｉｎｄｉｎｇＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｎｔｉ−ＭＵＣ−１  ｍｕｌｔｉｍｅｒ：ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｄｉ−ｓｃＦｖ  ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｎ  ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ，”Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ｖｏｌ．１９，ｐａｇｅｓ  ３５９−３６７，２００６；Ｋｕｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  ｒｅｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２２，ｐａｇｅｓ  ２３８−２４４，２００４）。
【０２２１】
さらに別の実施形態において、ＡＳＴＲはダイアボディを含む。ダイアボディでは、ｓｃＦｖは、２つの可変領域が一緒になって折り畳まれるには短過ぎるためｓｃＦｖの二量化を駆動するリンカーペプチドを伴い作成される。さらに短いリンカー（１又は２アミノ酸）は、三量体、いわゆるトリアボディ又はトリボディの形成につながる。トリアボディもＡＳＴＲに使用し得る。
【０２２２】
ＣＡＲに２つ以上のＡＳＴＲが存在するとき、ＡＳＴＲは、オリゴペプチド若しくはポリペプチドリンカー、Ｆｃヒンジ又は膜ヒンジ領域を介して単一のポリペプチド鎖上で互いに共有結合的に結び付く。
【０２２３】
ＣＡＲによって標的化される抗原は、腫瘍、腺（例えば前立腺）過形成、疣贅、及び望ましくない脂肪組織など、除去の標的となる組織の細胞の表面上又は内部に存在する。表面抗原はＣＡＲのＡＳＴＲによってより効率的に認識及び結合されるが、細胞内抗原もＣＡＲによって標的化され得る。一部の実施形態において、標的抗原は、好ましくは、癌、炎症性疾患、ニューロン障害、糖尿病、心血管疾患、又は感染性疾患に特異的である。標的抗原の例には、様々な免疫細胞、癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病、胚細胞腫瘍、芽細胞腫、並びに様々な血液疾患、自己免疫疾患、及び／又は炎症性疾患に関連する細胞によって発現される抗原が含まれる。
【０２２４】
ＡＳＴＲによって標的化され得る癌に特異的な抗原としては、４−ＩＢＢ、５Ｔ４、腺癌抗原、αフェトプロテイン、ＢＡＦＦ、Ｂリンパ腫細胞、Ｃ２４２抗原、ＣＡ−１２５、炭酸脱水酵素９（ＣＡ−ＩＸ）、Ｃ−ＭＥＴ、ＣＣＲ４、ＣＤ１５２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２００、ＣＤ２２、ＣＤ２２１、ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ２８、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）、ＣＤ３３、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４４  ｖ６、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＥＡ、ＣＮＴ０８８８、ＣＴＬＡ−４、ＤＲ５、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３、ＦＡＰ、フィブロネクチンエクストラドメイン−Ｂ、葉酸受容体１、ＧＤ２、ＧＤ３ガングリオシド、糖タンパク質７５、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＧＦ、ヒト散乱因子受容体キナーゼ、ＩＧＦ−１受容体、ＩＧＦ−Ｉ、ＩｇＧｌ、ＬＩ−ＣＡＭ、ＩＬ−１３、ＩＬ−６、インスリン様成長因子Ｉ受容体、インテグリンα５β１、インテグリンανβ３、ＭＯＲＡｂ−００９、ＭＳ４Ａ１、ＭＵＣ１、ムチンＣａｎＡｇ、Ｎ−グリコリルノイラミン酸、ＮＰＣ−１Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｒ  ａ、ＰＤＬ１９２、ホスファチジルセリン、前立腺癌細胞、ＲＡＮＫＬ、ＲＯＮ、ＲＯＲ１、ＳＣＨ  ９００１０５、ＳＤＣ１、ＳＬＡＭＦ７、ＴＡＧ−７２、テネイシンＣ、ＴＧＦβ２、ＴＧＦ−β、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、腫瘍抗原ＣＴＡＡ１６．８８、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ２又はビメンチンの１つ以上が挙げられる。
【０２２５】
ＡＳＴＲによって標的化され得る炎症性疾患に特異的な抗原としては、ＡＯＣ３（ＶＡＰ−１）、ＣＡＭ−３００１、ＣＣＬ１１（エオタキシン−１）、ＣＤ１２５、ＣＤ１４７（ベイシジン）、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ２、ＣＤ２０、ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ２５（ＩＬ−２受容体のａ鎖）、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＩＦＮ−ａ、ＩＦＮ−γ、ＩｇＥ、ＩｇＥ  Ｆｃ領域、ＩＬ−１、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−６受容体、インテグリンａ４、インテグリンα４β７、ラマ・グラマ（Ｌａｍａ  ｇｌａｍａ）、ＬＦＡ−１（ＣＤ１  ｌａ）、ＭＥＤＩ−５２８、ミオスタチン、ＯＸ−４０、ｒｈｕＭＡｂ  β７、スクレロスシン（ｓｃｌｅｒｏｓｃｉｎ）、ＳＯＳＴ、ＴＧＦβ１、ＴＮＦ−ａ又はＶＥＧＦ−Ａの１つ以上が挙げられる。
【０２２６】
本発明のＡＳＴＲによって標的化され得るニューロン障害に特異的な抗原としては、βアミロイド又はＭＡＢＴ５１０２Ａの１つ以上が挙げられる。本発明のＡＳＴＲによって標的化され得る糖尿病に特異的な抗原としては、Ｌ−Ｉβ又はＣＤ３の１つ以上が挙げられる。本発明のＡＳＴＲによって標的化され得る心血管疾患に特異的な抗原としては、Ｃ５、心臓ミオシン、ＣＤ４１（インテグリンα−ｌｉｂ）、フィブリンＩＩ、β鎖、ＩＴＧＢ２（ＣＤ１８）及びスフィンゴシン−１−リン酸の１つ以上が挙げられる。
【０２２７】
本発明のＡＳＴＲによって標的化され得る感染性疾患に特異的な抗原としては、炭疽毒素、ＣＣＲ５、ＣＤ４、クランピング因子Ａ、サイトメガロウイルス、サイトメガロウイルス糖タンパク質Ｂ、エンドトキシン、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎ウイルス、ＨＩＶ−１、Ｈｓｐ９０、インフルエンザＡ型ヘマグルチニン、リポタイコ酸、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、狂犬病ウイルス糖タンパク質、呼吸器合胞体ウイルス及びＴＮＦ−ａの１つ以上が挙げられる。
【０２２８】
標的抗原のさらなる例としては、癌細胞上に特異的な又は増幅された形式で見られる表面タンパク質、例えばＩＬ−１４受容体、Ｂ細胞リンパ腫のＣＤ１９、ＣＤ２０及びＣＤ４０、種々の癌のルイスＹ及びＣＥＡ抗原、乳癌及び結腸直腸癌のＴａｇ７２抗原、肺癌のＥＧＦ−Ｒ、ヒト乳癌及び卵巣癌で増幅されることが多い葉酸結合タンパク質及びＨＥＲ−２タンパク質、又はウイルスタンパク質、例えばＨＩＶのｇｐ１２０及びｇｐ４１エンベロープタンパク質、Ｂ型及びＣ型肝炎ウイルスからのエンベロープタンパク質、ヒトサイトメガロウイルスの糖タンパク質Ｂ及び他のエンベロープ糖タンパク質、並びにカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスなどのオンコウイルスからのエンベロープタンパク質が挙げられる。他の潜在的な標的抗原としては、リガンドがＨＩＶ  ｇｐ１２０エンベロープ糖タンパク質であるＣＤ４、及び他のウイルス受容体、例えばヒトライノウイルスに対する受容体であるＩＣＡＭ、及びポリオウイルスに対する関連受容体分子が挙げられる。
【０２２９】
ＣＡＲの細胞外スペーサードメインは、ＡＳＴＲと膜貫通ドメインとの間に位置する親水性領域である。一部の実施形態において、このドメインは、ＣＡＲに適切なタンパク質フォールディングを促進する。細胞外スペーサードメインはＣＡＲの任意選択の構成要素である。細胞外スペーサードメインは、抗体のＦｃフラグメント、抗体のヒンジ領域、抗体のＣＨ２領域、抗体のＣＨ３領域、人工スペーサー配列又はこれらの組み合わせから選択されるドメインを含み得る。細胞外スペーサードメインの例としては、ＣＤ８ａヒンジ、３個のグリシン（Ｇｌｙ）程の大きさのみのものであり得るポリペプチドで作られた人工スペーサー、並びにＩｇＧ（ヒトＩｇＧ４など）のＣＨ１及びＣＨ３ドメインが挙げられる。
【０２３０】
ＣＡＲの膜貫通ドメインは、細胞傷害性細胞の細胞膜に架かる能力を有する領域である。膜貫通ドメインは、例えばＩ型膜貫通タンパク質などの膜貫通タンパク質の膜貫通領域、人工疎水性配列又はこれらの組み合わせから選択される。膜貫通ドメインの例としては、Ｔ細胞受容体のα鎖、β鎖又はζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４の膜貫通領域が挙げられる。合成膜貫通ドメインは、フェニルアラニンとトリプトファンとバリンとのトリプレットを含み得る。任意選択で、短い、好ましくは２〜１０アミノ酸長さのオリゴペプチド又はポリペプチドリンカーが、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとの間の連結を形成し得る。グリシン−セリンダブレットが、膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとの間の特に好適なリンカーを提供する。
【０２３１】
本発明のＣＡＲはまた、細胞内シグナル伝達ドメインも含む。細胞内シグナル伝達ドメインはエフェクター機能シグナルを伝達し、細胞傷害性細胞にその特殊化した機能、すなわち標的細胞の阻害及び／又は破壊を果たすよう指図する。細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、Ｔ細胞受容体複合体のζ鎖又はその相同体のいずれか、例えば、η鎖、ＦｃｓＲｌｙ及びβ鎖、ＭＢ  １（Ｉｇａ）鎖、Ｂ２９（Ｉｇ）鎖等、ヒトＣＤ３ζ鎖、ＣＤ３ポリペプチド（Δ、δ及びε）、ｓｙｋファミリーチロシンキナーゼ（Ｓｙｋ、ＺＡＰ  ７０等）、ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ（Ｌｃｋ、Ｆｙｎ、Ｌｙｎ等）及びＴ細胞形質導入に関与する他の分子、例えばＣＤ２、ＣＤ５及びＣＤ２８が挙げられる。具体的には、細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３ζ鎖、ＦｃｙＲＩＩＩ、ＦｃｓＲＩ、Ｆｃ受容体の細胞質テール、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を担持する細胞質受容体及びこれらの組み合わせであり得る。
【０２３２】
一部の実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、又はＣＤ６６ｄの細胞質シグナル伝達ドメインを含む。ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達ドメインを含むことが特に好ましい。
【０２３３】
本発明のＣＡＲは共刺激ドメインを含んでもよく、これは、ＣＡＲを発現する細胞傷害性細胞の細胞増殖、細胞生存及びメモリー細胞の発生を増進する役割を有する。本発明のＣＡＲは、ＴＮＦＲスーパーファミリーのタンパク質、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４−ｌＢＢ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＤａｐｌＯ、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ５、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１  ｌａ／ＣＤ１８）、Ｌｃｋ、ＴＮＦＲ−Ｉ、ＰＤ−１、ＴＮＦＲ−ＩＩ、Ｆａｓ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ  ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、又はこれらの組み合わせの共刺激ドメインから選択される１つ以上の共刺激ドメインを含み得る。ＣＡＲが２つ以上の共刺激ドメインを含む場合、これらのドメインは、任意選択でリンカーによって隔てられて、タンデムに配置され得る。共刺激ドメインは、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとの間に位置し得る細胞内ドメインである。
【０２３４】
一部の実施形態において、本発明のＣＡＲの２つ以上の構成要素は１つ以上のリンカーによって隔てられている。例えば、少なくとも２つのＡＳＴＲを含むＣＡＲでは、それらの２つのＡＳＴＲがリンカーによって隔てられていてもよい。リンカーは、約１〜１００アミノ酸長のオリゴペプチド又はポリペプチド領域である。一部の実施形態において、リンカーは、例えば、５〜１２アミノ酸長、５〜１５アミノ酸長又は５〜２０アミノ酸長であり得る。リンカーは、隣接するタンパク質ドメイン同士が互いに自由に動くことができるように、グリシン及びセリンのような可動性の残基で構成されてもよい。より長いリンカー、例えば１００アミノ酸より長いものが本発明の代替的な実施形態に関連して使用されてもよく、例えば２つの隣接するドメインが互いに立体的に干渉しないことが確実になるように選択され得る。本発明で使用し得るリンカーの例としては、限定はされないが、２Ａリンカー（例えばＴ２Ａ）、２Ａ様リンカー又はその機能的等価物が挙げられる。
【０２３５】
本発明は、標的抗原と結合する条件的活性型キメラ抗原受容体を提供し、ここで抗原特異的標的領域は野生型タンパク質又はそのドメインから発達させ、（ａ）正常生理条件での分析における野生型タンパク質と比較した活性の低下、及び（ｂ）異常条件下での分析における野生型タンパク質と比較した活性の増加のうちの少なくとも１つを有する。これは、ＡＳＴＲが条件的活性型タンパク質であることを意味し、これによりＡＳＴＲを含有するＣＡＲが条件的活性型であることが確実となる。本発明の条件的活性型ＣＡＲは、（１）正常生理条件で可逆的又は不可逆的に低下する標的抗原に対するその親和性、及び（２）条件的活性型抗原特異的標的領域を有しない同じＣＡＲとの比較で、腫瘍微小環境又は滑液など、異常条件が存在する疾患部位における親和性の増加の一方又は両方を有する。これらの特性の結果として、条件的活性型ＣＡＲは細胞傷害性細胞を疾患部位に優先的に仕向けることができる。かかる条件的活性型ＣＡＲは副作用が劇的に低下し、より高用量の治療薬の使用が可能となるため、治療有効性が高まり得る。条件的活性型ＣＡＲは、対象の体内にある期間がより短く又は限られていることが必要な新規治療薬の開発に特に有効である。有益な利用の例としては、高投薬量での全身治療、並びに高濃度での局所治療が挙げられる。
【０２３６】
本発明の条件的活性型ＣＡＲは、典型的には、ＣＡＲの種々のドメインをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターによって生成される。標的細胞上の抗原を認識してそれに結合する役割を果たす本発明のＡＳＴＲは条件的活性型であり、対応する野生型タンパク質のＡＳＴＲ又はその結合ドメイン（野生型ＡＳＴＲ）との比較において、標的抗原との結合に関して正常生理条件で活性が低いか又は不活性であり、且つ異常条件で活性が高い。
【０２３７】
本発明によって条件的活性型ＡＳＴＲが同定されると、個々のドメインをコードするポリヌクレオチド配列をライゲートして単一のポリヌクレオチド配列（ＣＡＲ遺伝子、これは条件的活性型ＣＡＲをコードする）を形成することにより、キメラ抗原受容体をアセンブルし得る。個々のドメインには、条件的活性型ＡＳＴＲ、ＴＭ、及びＩＳＤが含まれる。一部の実施形態において、ａｂ  ＥＳＤ及びＣＳＤを含めた他のドメインもＣＡＲに導入され得る（図１）。条件的活性型ＣＡＲが二重特異性ＣＡＲである場合、ＣＡＲ遺伝子は、例えば、Ｎ末端からＣ末端の向きに以下の構成：Ｎ末端シグナル配列−ＡＳＴＲ１−リンカー−ＡＳＴＲ２−細胞外スペーサードメイン−膜貫通ドメイン−共刺激ドメイン−細胞内シグナル伝達ドメインであってもよい。一実施形態において、かかるＣＡＲ遺伝子は２つ以上の共刺激ドメインを含み得る。
【０２３８】
或いは、条件的活性型ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列は、Ｎ末端からＣ末端の向きに以下の構成：Ｎ末端シグナル配列−ＡＳＴＲ１−リンカー−ＡＳＴＲ２−膜貫通ドメイン−共刺激ドメイン−細胞内シグナル伝達ドメインであってもよい。ある実施形態では、かかるＣＡＲは２つ以上の共刺激ドメインを含み得る。ＣＡＲが３つ以上のＡＳＴＲを含む場合、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列は、Ｎ末端からＣ末端の向きに以下の構成：Ｎ末端シグナル配列−ＡＳＴＲ１−リンカー−ＡＳＴＲ２−リンカー−（抗原特異的標的領域）ｎ−膜貫通ドメイン−共刺激ドメイン−細胞内シグナル伝達ドメインであってもよい。かかるＣＡＲは細胞外スペーサードメインをさらに含み得る。各ＡＳＴＲはリンカーによって隔てられていてもよい。ある実施形態では、かかるＣＡＲは２つ以上の共刺激ドメインを含み得る。
【０２３９】
条件的活性型ＣＡＲは発現ベクターによって細胞傷害性細胞に導入される。本発明の条件的活性型ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターも本明細書に提供される。好適な発現ベクターとしては、レンチウイルスベクター、γレトロウイルスベクター、フォーミーウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、操作されたハイブリッドウイルス、ネイキッドＤＮＡ、例えば限定はされないが、トランスポゾン媒介性ベクター、例えばＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ、Ｐｉｇｇｙｂａｋ、及びインテグラーゼ、例えばＰｈｉ３１が挙げられる。一部の他の好適な発現ベクターとしては、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）及びレトロウイルス発現ベクターが挙げられる。
【０２４０】
アデノウイルス発現ベクターはアデノウイルスをベースとし、これはゲノムＤＮＡへの組み込み能力が低く、しかし、宿主細胞のトランスフェクション効率は高い。アデノウイルス発現ベクターは、（ａ）発現ベクターのパッケージングの補助、及び（ｂ）宿主細胞におけるＣＡＲ遺伝子の最終的な発現に十分なアデノウイルス配列を含む。アデノウイルスゲノムは３６ｋｂの線状二本鎖ＤＮＡであり、ここでは本発明の発現ベクターを作製するため外来性ＤＮＡ配列（ＣＡＲ遺伝子など）が挿入されて、アデノウイルスＤＮＡの大きいフラグメントを置換し得る（Ｇｒｕｎｈａｕｓ  ａｎｄ  Ｈｏｒｗｉｔｚ，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｓ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ，”Ｓｅｍｉｎａｒｓ  Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．３，ｐａｇｅｓ  ２３７−２５２，１９９２）。
【０２４１】
別の発現ベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）をベースとし、これはアデノウイルスカップリングシステムを利用するものである。このＡＡＶ発現ベクターは宿主ゲノムへの組込み頻度が高い。これは非分裂細胞さえ感染させることができ、従って例えば組織培養又はインビボでの哺乳類細胞への遺伝子送達に有用となる。ＡＡＶベクターは、感染力に関して広い宿主域を有する。ＡＡＶベクターの作成及び使用に関する詳細は、米国特許第５，１３９，９４１号明細書及び同第４，７９７，３６８号明細書（各々、参照により本明細書に援用される）に記載される。
【０２４２】
レトロウイルス発現ベクターは、宿主ゲノムに組み込まれ、多量の外来性遺伝物質を送達し、広域の種及び細胞型を感染させ、及び特定の細胞株にパッケージングされる能力を有する。レトロウイルスベクターは、核酸（例えば、ＣＡＲをコードするもの）をウイルスゲノムの特定の位置に挿入して複製欠損のウイルスを作製することによって構築される。レトロウイルスベクターは幅広い種類の細胞型を感染させることができるが、ＣＡＲ遺伝子の組込み及び安定発現には宿主細胞の分裂が必要である。
【０２４３】
レンチウイルスベクターはレンチウイルスに由来し、これは、一般的なレトロウイルス遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖに加えて、調節又は構造上の機能を有する他の遺伝子を含有する複合的レトロウイルスである（米国特許第６，０１３，５１６号明細書及び同第５，９９４，１３６号明細書）。レンチウイルスのいくつかの例としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２）及びサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。レンチウイルスベクターはＨＩＶ病原性遺伝子の多重弱毒化によって作成されており、例えば、遺伝子ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ及びｎｅｆを欠失させることで、ベクターが生物学的に安全にされている。レンチウイルスベクターは非分裂細胞を感染させる能力を有し、インビボ及びエキソビボの両方でのＣＡＲ遺伝子の遺伝子導入及び発現に使用することができる（米国特許第５，９９４，１３６号明細書、参照により本明細書に援用される）。
【０２４４】
条件的活性型ＣＡＲ遺伝子を含む発現ベクターは、当業者に公知の任意の手段によって宿主細胞に導入することができる。発現ベクターは、必要であれば、トランスフェクション用のウイルス配列を含み得る。或いは、発現ベクターは、融合、電気穿孔、微粒子銃、トランスフェクション、リポフェクションなどによって導入されてもよい。宿主細胞は発現ベクターの導入前に培養下で成長及び拡大させてもよく、続いてベクターの導入及び組込みに適切な処理が行われ得る。次に宿主細胞を拡大し、ベクターに存在するマーカーによってスクリーニングする。使用し得る様々なマーカーには、ｈｐｒｔ、ネオマイシン耐性、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシン耐性等が含まれる。本明細書で使用されるとき、用語「細胞」、「細胞株」、及び「細胞培養物」は同義的に用いられ得る。一部の実施形態において、宿主細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞及びＮＫＴ細胞である。
【０２４５】
別の態様において、本発明はまた、本発明の条件的活性型ＣＡＲを含んでそれを安定に発現する遺伝子操作細胞傷害性細胞も提供する。一実施形態において、遺伝子操作細胞としては、治療的に関連性のある子孫を生じる能力を有するＴリンパ球（Ｔ細胞）、ナイーブＴ細胞（ＴＮ）、メモリーＴ細胞（例えば、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）、エフェクターメモリー細胞（ＴＥＭ））、ナチュラルキラー細胞、及びマクロファージが挙げられる。別の実施形態において、遺伝子操作細胞は自己細胞である。好適なＴ細胞の例としては、ＣＤ４＋／ＣＤ８−、ＣＤ４−／ＣＤ８＋、ＣＤ４−／ＣＤ８−又はＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞が挙げられる。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋／ＣＤ８−及びＣＤ４−／ＣＤ８＋細胞の混合集団又は単一のクローンの集団であってもよい。本発明のＣＤ４＋Ｔ細胞はまた、標的抗原を発現する細胞（例えばＣＤ２０＋及び／又はＣＤ１９＋腫瘍細胞）とインビトロで共培養すると、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α及び他のＴ細胞エフェクターサイトカインも産生し得る。本発明のＣＤ８＋Ｔ細胞は、標的抗原を発現する細胞を溶解させ得る。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ＋  ＣＤ６２Ｌ＋ナイーブ細胞、ＣＤ４５ＲＯ  ＣＤ６２Ｉ７セントラルメモリー細胞、ＣＤ６２Ｌ”エフェクターメモリー細胞又はこれらの組み合わせのうちの任意の１つ以上であり得る（Ｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ，”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．２１，ｐａｇｅｓ  ２２４−２３２，２００９）。
【０２４６】
遺伝子操作細胞傷害性細胞は、本発明のＣＡＲ遺伝子を含む発現ベクターを細胞に安定にトランスフェクトすることによって作製し得る。発現ベクターを使用して細胞を遺伝子操作するさらなる方法には、化学的形質転換方法（例えば、リン酸カルシウム、デンドリマー、リポソーム及び／又はカチオン性ポリマーの使用）、非化学的形質転換方法（例えば、電気穿孔、光学的形質転換、遺伝子エレクトロトランスファー及び／又は流体力学的デリバリー）及び／又は粒子ベースの方法（例えば、インペールフェクション（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）、遺伝子銃の使用及び／又はマグネトフェクション）が含まれる。再配列されていない組み込まれた単一のベクターの存在を示し且つ条件的活性型ＣＡＲを発現するトランスフェクト細胞が、エキソビボで拡大され得る。
【０２４７】
発現ベクターを宿主細胞に導入するための物理的方法としては、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子ボンバードメント、マイクロインジェクション、電気穿孔などが挙げられる。ベクター及び／又は外因性核酸を含む細胞の作製方法は当該技術分野において周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照のこと。発現ベクターを宿主細胞に導入するための化学的方法としては、コロイド分散系、例えば、巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、及び脂質ベースのシステム、例えば、水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル、及びリポソームが挙げられる。
【０２４８】
様々な実施形態において、本発明は、薬学的に受容可能な賦形剤と本発明の条件的活性型ＣＡＲの治療有効量とを含む医薬組成物を提供する。この組成物中の条件的活性型ＣＡＲは、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、条件的活性型ＣＡＲを含むタンパク質又はＣＡＲタンパク質を発現する遺伝子修飾細胞のうちの任意の１つ以上であり得る。条件的活性型ＣＡＲタンパク質は薬学的に受容可能な塩の形態であってもよい。薬学的に受容可能な塩とは、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウムなどの塩、及びプロカイン、ジベンジルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、メチルグルカミン、タウリンなどのアミン塩、並びに塩酸塩などの酸付加塩、及び塩基性アミノ酸などを含めた、製薬工業において治療的タンパク質の塩として使用し得る塩を指す。
【０２４９】
本発明の遺伝子操作細胞傷害性細胞又は医薬組成物で治療される癌の種類としては、癌腫、芽細胞腫、及び肉腫、及び特定の白血病又はリンパ性悪性腫瘍、良性及び悪性腫瘍、及び悪性疾患、例えば、肉腫、癌腫、及び黒色腫が挙げられる。癌は非固形腫瘍（血液腫瘍など）又は固形腫瘍であってもよい。成人腫瘍／癌及び小児腫瘍／癌も含まれる。
【０２５０】
血液癌は、血液又は骨髄の癌である。血液癌（又は血行性癌）の例としては、白血病、例えば、急性白血病（急性リンパ性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病並びに骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性及び赤白血病など）、慢性白血病（慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性白血病、及び慢性リンパ性白血病など）、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（無痛性型及び高悪性度型）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、ヘアリー細胞白血病及び骨髄形成異常が挙げられる。
【０２５１】
固形腫瘍は、通常は嚢胞又は液体領域を含まない異常な組織塊である。固形腫瘍は良性又は悪性であり得る。固形腫瘍の異なるタイプは、それを形成する細胞のタイプにちなんで命名される（肉腫、癌腫、及びリンパ腫など）。肉腫及び癌腫など、固形腫瘍の例としては、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、及び他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、リンパ性悪性腫瘍、膵癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、肝細胞癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髄様癌、甲状腺乳頭癌、褐色細胞腫、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、セミノーマ、膀胱癌、黒色腫、及びＣＮＳ腫瘍（神経膠腫（脳幹神経膠腫及び混合性神経膠腫など）、膠芽腫（多形性膠芽腫としても知られる）、星状細胞腫、ＣＮＳリンパ腫、胚細胞腫、髄芽腫、シュワン腫、頭蓋咽頭腫（ｃｒａｎｉｏｐｈａｒｙｏｇｉｏｍａ）、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫及び脳転移など）が挙げられる。
【０２５２】
一部の実施形態において、本発明は、対象から細胞傷害性細胞を回収する工程と、本発明のＣＡＲ遺伝子を細胞傷害性細胞に導入することによって細胞傷害性細胞を遺伝子操作する工程と、遺伝子操作細胞傷害性細胞を対象に投与する工程とを含む方法を提供する。一部の実施形態において、細胞傷害性細胞は、Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞、エフェクターＴ細胞、ナチュラルキラー細胞、及びマクロファージから選択される。一実施形態において、細胞傷害性細胞はＴ細胞である。
【０２５３】
一実施形態において、Ｔ細胞は対象から得られる。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位の組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍を含めたいくつもの供給源から得ることができる。本発明の特定の実施形態では、当該技術分野で利用可能なあらゆるＴ細胞株を使用し得る。本発明の特定の実施形態では、Ｔ細胞は、対象から採取された血液から、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）分離など、当業者に公知のあらゆる技法を用いて得ることができる。
【０２５４】
好ましい一実施形態では、個体の循環血液からの細胞がアフェレーシスによって得られる。アフェレーシス産物は典型的には、リンパ球、例えばＴ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、及び血小板を含有する。一実施形態において、アフェレーシスによって収集された細胞は、洗浄して血漿画分を除去し、続く処理工程のため細胞を適切な緩衝液又は培地中に入れることができる。本発明の一実施形態において、細胞はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄する。代替的実施形態において、洗浄溶液はカルシウムを含まず、且つマグネシウムを含まなくてもよく、又は全てではないにしろ多くの二価カチオンを含まなくてもよい。この場合にも、意外にもカルシウムの非存在下における初期活性化工程が活性化の増大につながる。当業者であれば容易に理解するように、洗浄工程は、半自動「フロースルー」遠心機（例えば、Ｃｏｂｅ  ２９９１細胞処理機、Ｂａｘｔｅｒ  ＣｙｔｏＭａｔｅ、又はＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｅｌｌ  Ｓａｖｅｒ  ５）を製造者の指示に従い使用するなど、当業者に公知の方法によって達成し得る。洗浄後、細胞は、種々の生体適合性緩衝液、例えば、Ｃａ２＋不含、Ｍｇ２＋不含ＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａ、又は緩衝液含有若しくは不含の別の生理食塩水中に再懸濁し得る。或いは、アフェレーシス試料の望ましくない成分を除去し、細胞を培養培地中に直接再懸濁してもよい。
【０２５５】
別の実施形態において、Ｔ細胞は、赤血球を溶解して、例えばＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配で遠心するか、又は向流遠心エルトリエーションによって単球を枯渇させることにより、末梢血から単離される。ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、及びＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞などの特定の一部のＴ細胞集団をポジティブ又はネガティブ選択法によってさらに単離することができる。例えば、ネガティブ選択によるＴ細胞集団のエンリッチメントは、ネガティブ選択される細胞にユニークな表面マーカーに対する抗体と組み合わせて達成することができる。１つの方法は、ネガティブ選択される細胞上に存在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体のカクテルを使用するネガティブ磁気免疫粘着又はフローサイトメトリーによる細胞分取及び／又は選択である。ネガティブ選択によってＣＤ４＋細胞をエンリッチするには、モノクローナル抗体カクテルは典型的には、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲ、及びＣＤ８に対する抗体を含む。特定の実施形態では、典型的にＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＧＩＴＲ＋、及びＦｏｘＰ３＋を発現する調節性Ｔ細胞をエンリッチするか又はポジティブ選択することが望ましい場合もある。
【０２５６】
例えば、一実施形態において、Ｔ細胞は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（すなわち、３×２８）コンジュゲートビーズ、例えばＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−４５０  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔと共に、所望のＴ細胞のポジティブ選択に十分な時間にわたってインキュベートすることにより単離される。一実施形態において、この時間は約３０分である。さらなる実施形態において、この時間は３０分〜３６時間又はそれを超える、及びそれらの間にある全ての整数値の範囲である。さらなる実施形態において、この時間は少なくとも１、２、３、４、５、又は６時間である。さらに別の好ましい実施形態において、この時間は１０〜２４時間である。好ましい一実施形態において、インキュベーション時間は２４時間である。白血病患者からのＴ細胞の単離には、２４時間など、より長いインキュベーション時間を用いると、細胞収率が高まり得る。より長いインキュベーション時間は、腫瘍組織又は免疫不全者からの腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の単離など、他の細胞型と比較したときＴ細胞が少ない任意の状況でＴ細胞を単離するために用い得る。さらに、より長いインキュベーション時間を用いると、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の捕捉効率が高まり得る。従って、単純に、Ｔ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ビーズに結合させる時間を短縮又は延長することにより、及び／又はビーズとＴ細胞の比を増加又は減少させることにより（本明細書にさらに記載されるように）、培養開始時又はプロセス中の他の時点で一部のＴ細胞集団の優先的な正又は負の選択を行うことができる。加えて、ビーズ又は他の表面上の抗ＣＤ３及び／又は抗ＣＤ２８抗体の比率を増加又は減少させることにより、培養開始時又はプロセス中の他の時点で一部のＴ細胞集団の優先的な正又は負の選択を行うことができる。当業者であれば、本発明に関連して複数の選択ラウンドも用い得ることを認識するであろう。特定の実施形態において、選択手順を実施し、活性化及び拡大プロセスに「選択されなかった」細胞を使用することが望ましい場合もある。「選択されなかった」細胞もさらなる選択ラウンドに供することができる。
【０２５７】
得られた細胞傷害性細胞は、次に本明細書に記載されるように遺伝子操作される。条件的活性型ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド（典型的には発現ベクターに位置する）は、細胞傷害性細胞がＣＡＲを発現、好ましくは安定に発現するように細胞傷害性細胞に導入される。ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、典型的には細胞傷害性細胞宿主ゲノムに組み込まれる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの導入によって組込みが生じる必要はなく、むしろ導入されたポリヌクレオチドが一過性に維持されるのみで十分であり得る。このようにして短期的な効果を得ることができ、ここで細胞傷害性細胞は宿主に導入され、次に所定の時間後、例えば細胞が特定の治療部位に移動できた後に作動し得る。
【０２５８】
細胞傷害性細胞及び治療される疾患の性質に応じて、遺伝子操作細胞傷害性細胞は多種多様な方法で対象、例えば哺乳動物に導入され得る。遺伝子操作細胞傷害性細胞は腫瘍の部位に導入され得る。一実施形態において、遺伝子操作細胞傷害性細胞は癌まで進み、又は癌まで進むように修飾される。用いられる遺伝子操作細胞傷害性細胞の数は、状況、導入の目的、細胞の寿命、用いるプロトコルなど、いくつもの要因に依存することになる。例えば、投与回数、細胞の増殖能力、及び組換え構築物の安定性。遺伝子操作細胞傷害性細胞は、概して目的の部位又はその近傍に注入される分散液として適用され得る。細胞は生理学的に許容可能な媒体中にあり得る。
【０２５９】
治療方法は、条件的活性型ＣＡＲに対する細胞応答、細胞傷害性細胞による条件的活性型ＣＡＲの発現効率、及び適宜、発現した条件的活性型ＣＡＲの分泌レベル、活性、対象の特定の必要性（これらは時間及び状況に応じて変わり得る）、遺伝子操作細胞傷害性細胞の損失に起因する細胞活性の損失速度又は個々の細胞の発現活性など、多くの変動要因の影響を受けることは理解されなければならない。従って、各個別の患者について、全体としての集団に投与し得る普遍的な細胞があったとしても、その者に適切な投薬量について各患者がモニタされることが予想され、そのような患者をモニタする業務は当該技術分野においてルーチンである。
【０２６０】
親分子からの発達させた分子の生成
条件的活性型生物学的タンパク質は、野生型タンパク質の突然変異誘発プロセスと、非野生型条件での活性が野生型条件での活性と同じに留まるか、又はそれより良好でありながら野生型条件では活性が低下することに関する個々の突然変異のスクリーニングとによって生成することができる。
【０２６１】
任意の化学的合成又は組換え突然変異誘発方法を用いて変異ポリペプチド集団を生成し得る。本発明の実施には、特に指示されない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、及び免疫学の従来技術を用い得る。かかる技法は文献に十分に説明されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９８９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ．，１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ  ｅｄ．，１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓらの米国特許第４，６８３，１９５号明細書；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｂｓ  ｅｄｓ．，１９８７，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４  ａｎｄ  １５５（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  ｌ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６）を参照のこと。
【０２６２】
本開示は酵素活性を有するポリペプチドをエンコードする核酸変異体を生成するための方法を提供するものであって、ここで、この変異体は、自然発生のものから異常生理的活性を有するものであり、この方法は、（ａ）（ｉ）異なるヌクレオチドと１つ以上のヌクレオチドを置換する工程。ここで、ヌクレオチドは自然又は非自然のヌクレオチドからなる。（ｉｉ）１つ以上のヌクレオチドを欠失する工程。（ｉｉｉ）１つ以上のヌクレオチドを付加する工程、又は（ｉｖ）任意のこれらの組み合わせによって核酸を修飾する工程、からなる。一態様において、非自然のヌクレオチドは、イノシンからなる。他の態様において、この方法は、異常酵素活性のために修飾された核酸によってエンコードされたポリペプチドを分析する工程、それによって、異常酵素活性を有するポリペプチドをエンコードする修飾された核酸を同定する工程からなる。一態様において、工程（ａ）の修飾は、ＰＣＲ、エラープローンＰＣＲ、シャフリング、オリゴヌクレオチド指定突然変異、アセンブリＰＣＲ、性的ＰＣＲ突然変異、生体内突然変異、カセット突然変異、再帰的アンサンブル突然変異、指数的アンサンブル突然変異、位置特異的突然変異、遺伝子再構築、遺伝子位置飽和突然変異、リガーゼ鎖反応、生体外突然変異、リガーゼ鎖反応、オリゴヌクレオチド合成、任意の遺伝子生成技術、及びこれらの組み合わせによってなされる。他の態様において、この方法はさらに修飾工程（ａ）の少なくとも１回の繰り返しからなる。
【０２６３】
本開示は、さらに、２つ以上の核酸からポリヌクレオチドを製造するための方法を提供する。この方法は、次の（ａ）〜（ｃ）からなる。（ａ）２つ以上の核酸間で同一の領域及び多様な領域を同定する工程。そこでは、この核酸の少なくとも１つは、本開示の核酸からなる。（ｂ）２つ以上の核酸の少なくとも２つの配列に対応するオリゴヌクレオチドのセットを提供する工程。及び（ｃ）ポリメラーゼでオリゴヌクレオチドを延長し、それにより、ポリヌクレオチドを製造する工程。
【０２６４】
任意の突然変異誘発の技術は、本開示の様々な実施形態において使用されることがある。確率的又はランダムな突然変異誘発は、予定されていない突然変異を有する一連の子孫分子を得るために、親分子が変異する（修飾される又は変えられる）状況によって例証される。従って、生体外確率的突然変異誘発反応は、例えば、その製造が意図されたものではない、特に予定されていない製造物である。むしろ、得られる変異の正確な性質に関して、従って、生成される製造物に関して、不確定、従ってランダムである。確率的突然変異誘発は、エラープローンＰＣＲ及び確率的シャフリングのような、変異がランダム又は予定されていない方法において示される。変異体形成は、エラープローンＰＣＲのようなエラープローン転写や、プルーフリーディング活性が欠けるポリメラーゼの使用（Ｌｉａｏ（１９９０）Ｇｅｎｅ  ８８：１０７−１１１参照）又は変異株（変異宿主細胞は以下にさらに詳細に議論されており、これは一般的によく知られている）において第１の形態の複製によるものである。突然変異誘発因子株は、不整合な修復の機能において欠損される任意の変異体を含むことができる。これらは、ｍｕｔＳ、ｍｕｔＴ、ｍｕｔＨ、ｍｕｔＬ、ｏｖｒＤ、ｄｃｍ、ｖｓｒ、ｕｍｕＣ、ｕｍｕＤ、ｓｂｃＢ、ｒｅｃＪなどの変異遺伝子生成物を含む。欠損は、遺伝子突然変異、対立遺伝子交換、微小化合物又は発現されたアンチセンスＲＮＡ又は他の技術によって得られる。欠損は、記述された遺伝子又は任意の有機体における相同遺伝子であることがある。
【０２６５】
開始分子から選択的タンパク質を作るために、現在、広く使われている突然変異誘発の方法は、オリゴヌクレオチド指定突然変異技術、エラープローンポリメラーゼ鎖反応（エラープローンＰＣＲ）及びカセット突然変異誘発であり、そこでは、最適化される特定の領域は、合成的に突然変異を誘発されたオリゴヌクレオチドと置換される。これらの場合、多くの突然変異部位は元の配列における特定の部位の周辺で発生する。
【０２６６】
オリゴヌクレオチド指定突然変異において、短い配列は、合成的に突然変異を誘発されたオリゴヌクレオチドと置換される。オリゴヌクレオチド指定突然変異において、ポリヌクレオチドの短い配列は、制限酵素消化を使用する合成ポリヌクレオチドから除かれ、様々な塩基が元の配列から変更された合成ポリヌクレオチドと置換される。ポリヌクレオチド配列は化学的突然変異誘発によって変更されることもある。化学的突然変異ゲ原は、例えば、重亜硫酸ナトリウム、亜硝酸、ヒドロキシルアミン、ヒドラジン、又はギ酸を含む。ヌクレオチド前駆体と類似の他の薬剤は、ニトロソグアニジン、５−ブロモウラシル、２−アミノプリン、又はアクリジンを含む。一般的に、これらの薬剤は、それにより配列を変位させるヌクレオチド前駆体の代わりにＰＣＲ反応に加えられる。プロフラビン、アクリフラビン、キナクリンなどのような薬剤の挿入が使用されることもある。ポリヌクレオチド配列のランダムな突然変異誘発は、Ｘ線又は紫外線照射によって得られることがある。一般的に、突然変異誘発されたプラスミドポリヌクレオチドは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内に導入され、交雑プラスミドのプール又はライブラリとして伝播される。
【０２６７】
エラープローンＰＣＲは、長い配列にわたってランダムに点突然変異の低レベルを導入するための低忠実度重合条件を使用する。未知の配列のフラグメントの混合物において、エラープローンＰＣＲは、混合物を突然変異誘発するのに用いられることがある。
【０２６８】
カセット突然変異誘発において、単一テンプレートの配列遮断は、典型的にはランダム配列によって（部分的に）置換される。Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ  Ｊ  Ｆ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ  Ｒ  Ｔ：Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ａｓ  ａ  ｐｒｏｂｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１（４８６１）：５３−５７，１９８８。
【０２６９】
或いは、非確率的又は非ランダムな遺伝子突然誘発の任意の技術も本開示の様々な実施形態において使用することができる。非確率的突然変異誘発は、１つ以上の予め決定された変異を有する分子を得るために、親分子が変異される（修飾される、又は変化される）状況によって例証される。ある程度の量におけるバックグラウンド製造物の存在が、分子プロセシングの起こる多くの反応において実在し、及びバックグラウンド製造物の存在が、予定されていない製造物を有する突然変異誘発工程の非確率的性質から減じないことはよく理解されている。部位−飽和突然変異誘発及び合成結紮リアセンブリは、遺伝子突然変異誘発技術の例であり、そこで意図された製造物の正確な化学的構造は予定されたものである。
【０２７０】
部位−飽和点突然変異誘発の１つの方法は、米国特許出願公開第２００９／０１３０７１８号明細書に記載されており、本明細書に参照により組み込まれている。この方法は、テンプレートポリヌクレオチドのコドンに対応する一連の変性プライマーを提供し、及び変性プライマーに対応する配列を含む子孫ポリヌクレオチドを製造するためのポリメラーゼ伸長を実行する。子孫ポリヌクレオチドは、直接的発達において発現され、及びスクリーニングされる。具体的には、これは、一連の子孫ポリペプチドを製造するための方法であって、工程（ａ）テンプレートポリペプチド配列をエンコードするコドンの複数からそれぞれなるテンプレートポリペプチドのコピーを提供する工程、及び（ｂ）テンプレートポリヌクレオチドの各コドンにおいて、（１）一連の変性プライマーを提供する工程、そこでは、各プライマーはテンプレートポリヌクレオチドのコドンに対応する変性コドンからなり、少なくとも１つの隣接配列は、テンプレートポリヌクレオチドのコドンに隣接する配列に相同である、（２）プライマーがテンプレートポリヌクレオチドのコピーにアニール可能な条件を提供する工程、及び（３）テンプレートに沿ったプライマーからのポリメラーゼ伸長反応を実行する工程の（１）〜（３）の工程を実行し、それによって子孫ポリヌクレオチドを提供し、それぞれがアニールされたプライマーの変性コドンに対応する配列を含み、それによって一連の子孫ポリヌクレオチドを製造する。
【０２７１】
部位−飽和突然変異誘発は、核酸の誘導された発達及び例えば核酸活性及び／又は特異的タンパク質、特に酵素、対象の活性のような結果として生じる対象の活性において発達した核酸を含むクローンのスクリーニングに関するものである。
【０２７２】
この技術によって提供された突然変異誘発された分子は、糖、脂質、核酸及び／又はタンパク質組成物を含む生物学的分子を含む、キメラ分子及び点突然変異を有する分子を有することがあり、及び特異的であるが非限定的なこれらの実施例は、抗生物質、抗体、酵素、及びステロイド及び非ステロイドホルモンを含む。
【０２７３】
部位飽和突然変異誘発は、１）分子の子孫世代を調製する工程（ポリヌクレオチド配列からなる分子、ポリペプチドからなる分子、及びポリヌクレオチド配列の部分及びポリペプチド配列の部分からなる分子を含む）、これは少なくとも１つの点突然変異、付加、欠失及び／又はキメラ化を１つ以上の祖先又は親世代テンプレートから得るための突然変異誘発である、２）子孫生成分子をスクリーニングする工程  −  好適には、対象の少なくとも１つの性質（例えば、酵素活性における改良、又は安定性の増加、又は新規の化学療法的効果）において、高スループット法を使用する工程、３）親及び／又は子孫世代分子に関する構造及び／又は機能的情報を任意選択により得る及び／又は一覧にする工程、及び４）任意の工程１）〜３）を任意選択により繰り返す工程からなる方法を一般的に意味する。
【０２７４】
部位飽和突然変異誘発において、生成された（例えば、親ポリヌクレオチドテンプレートから）「コドン部位飽和突然変異誘発」と称されるポリヌクレオチドの子孫世代は、全てのコドン（又は同じアミノ酸をエンコードする変性コドンの全系統）が各コドン位置で表れるように、それぞれが、３つ以上の隣接点突然変異（すなわち、新しいコドンからなる異なる塩基）の少なくとも１組を有する。このポリヌクレオチドの子孫世代に対応する、及びこのポリヌクレオチドの子孫世代によってエンコードされるのは、それぞれ少なくとも１つの単一アミノ酸点突然変異を有する、生成された一連の子孫ポリペプチドである。好適な態様において、生成された「アミノ酸部位飽和突然変異誘発」と称される一例は、ポリペプチドに沿った各アミノ酸位置及び全アミノ酸位置でアルファアミノ酸置換を形成する、自然にエンコードされる１９のポリペプチドのそれぞれにおける変異ポリペプチドである。この収量は  −  親ポリペプチドに沿った各アミノ酸位置及び全アミノ酸位置  −  元のアミノ酸を含む２０の異なる子孫ポリペプチドの全て、又は付加アミノ酸が、２０の自然にエンコードされたアミノ酸の代わりに、又は付加されてのいずれかで使用される場合、潜在的に２１以上の異なる子孫ポリペプチドである。
【０２７５】
他の突然変異誘発技術は、組換えを含んで用いられることがあり、より具体的には、部分的相同の領域を含むポリヌクレオチド配列の生体内再集合の方法によって、ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドを調製するための方法、少なくとも１つのポリヌクレオチドを形成するためのポリヌクレオチドをアセンブリする方法、有用な性質を有するポリペプチドの製造のためにポリヌクレオチドをスクリーニングする方法を含む。
【０２７６】
他の態様において、突然変異誘発技術は、分子を組換えるため、及び／又は配列及び相同領域を有する反復又は連続した配列の範囲の煩雑さを減らす縮小した方法を伝達するため、細胞の本来の性質を利用する。
【０２７７】
様々な突然変異誘発技術は、活性を強化された生物学的活性交雑ポリペプチドをエンコードする交雑ポリペプチドを生成するための方法を提供するため、単独で、又は組み合わせて用いられることがある。これら及び他の目的を達成することにおいて、本開示の一態様に従って、適当な宿主細胞内にポリペプチドを導入し、交雑ポリヌクレオチドエオ製造するための条件下で宿主細胞を成長させる方法が設けられている。
【０２７８】
キメラ遺伝子は、制限酵素によって生成される互換性のある粘着末端を使用する２つのポリヌクレオチドフラグメントを接合することによって作られる。ここで、各フラグメントは、別々の祖先（親）分子に由来する。他の実施例は、単一部位突然変異誘発されたポリペプチドのためにエンコードする単一子孫ポリヌクレオチドを生成するための親ポリヌクレオチドにおいて、単一コドン位置の突然変異誘発（すなわち、コドン置換、付加、欠失を得るため）である。
【０２７９】
さらに、生体内部位特異的組換え系は、生体内組換えのランダムな方法と同様に、遺伝子の交雑の生成、及び相同であるが、プラスミド上で切断された遺伝子間の組換えの生成のために利用される。突然変異誘発はまた、重複拡張及びＰＣＲによっても報告された。
【０２８０】
非ランダムな方法は、点突然変異及び／又はキメラ化のより大きい数を得るために使用し、例えば、総合的又は包括的な方法は、テンプレート分子において特異的構造群（例えば、特異的単一アミノ酸位置又は２つ以上のアミノ酸位置からなる配列）に機能的に属するために、及び突然変異の特異的な群化を分類し、比較するために、特定の突然変異の群化において全ての分子種を生成するために用いられる。
【０２８１】
これらの、又は他の任意の発達させる方法は、本開示において、１つ以上の親分子から新規な分子の個体群（ライブラリ）を生成する。
【０２８２】
一部の実施形態において、野生型タンパク質をコードするポリヌクレオチド、並びにその変異体は、いくつかの公知の方法によって増幅することができる。最も良く知られた増幅方法の１つは、米国特許第４，６８３，１９５号明細書、同第４，６８３，２０２号明細書及び同第４，８００，１５９号明細書、及び“ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”編者Ｍｉｃｈａｅｌ  Ａ．Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９０（これらの各々は、全体として参照により本明細書に援用される）に詳細に記載されているポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲと称される）である。別の増幅方法は、欧州特許出願公開第０３２０３０８  Ａ２号明細書（全体として参照により本明細書に援用される）に開示されるリガーゼ連鎖反応（「ＬＣＲ」）である。ＬＣＲでは、２つの相補的なプローブ対が調製され、増幅しようとする配列の存在下で、各対が配列の逆相補鎖に隣接するように結合する。リガーゼの存在下では、これらの２つのプローブ対が連結して単一のユニットを形成する。ＰＣＲの場合のような温度サイクル処理により、結合したライゲートユニットが配列から解離し、次に過剰なプローブ対のライゲーションの「標的配列」としての役割を果たす。米国特許第４，８８３，７５０号明細書は、プローブ対を配列に結合するためのＬＣＲと同様の方法を記載している。
【０２８３】
国際公開第１９８７／００６２７０号パンフレットに記載されるＱβレプリカーゼも増幅方法として用いることができる。この方法では、増幅しようとする配列の領域と相補的な領域を有するＲＮＡ複製配列がＲＮＡポリメラーゼの存在下で試料に加えられる。ポリメラーゼが複製配列をコピーし、次にそれを検出することができる。
【０２８４】
制限部位の一方の鎖にヌクレオチド５’−［α−チオ］−三リン酸を含有する配列の増幅を制限エンドヌクレアーゼ及びリガーゼを使用して達成する等温増幅方法も核酸の増幅に有用であり得る（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．８９，ｐａｇｅｓ  ３９２−３９６，１９９２）。
【０２８５】
ストランド置換増幅（ＳＤＡ）は、ポリヌクレオチド配列の等温増幅を実施する別の方法であり、これは複数ラウンドのストランド置換及び合成、すなわちニックトランスレーションを伴う。修復連鎖反応（ＲＣＲ）と呼ばれる同様の方法は、増幅の標的とされる領域の全体にわたっていくつかのプローブをアニールし、続いて４つの塩基のうちの２つのみが存在する修復反応を行うことを伴う。他の２つの塩基は、検出を容易にするためのビオチン化誘導体として加えることができる。ＳＤＡにおいても同様の手法が用いられる。標的特異的配列はまた、サイクリックプローブ反応（ＣＰＲ）を用いて検出することもできる。ＣＰＲでは、非特異的ＤＮＡの３’及び５’配列並びに特異的ＲＮＡの中央配列を有するプローブが、試料中に存在するＤＮＡにハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーション後、反応物がＲＮアーゼＨで処理され、プローブの産物が、消化後に放出される特有の産物として同定される。元の配列が別のサイクリングプローブにアニールされ、反応が繰り返される。
【０２８６】
他の増幅方法は、英国特許出願英国特許第２  ２０２  ３２８号明細書、及び国際公開第１９８９／００９２８４号パンフレット（これらの各々は、本明細書において全体として参照により援用される）に記載され、本発明において用いることができる。前者の適用では、ＰＣＲのようなテンプレート（増幅しようとする配列）及び酵素依存的合成において、「修飾」プライマーが用いられる。これらのプライマーは、捕捉部分（例えばビオチン）及び／又は検出部分（例えば酵素）で標識することによって修飾され得る。後者の適用では、試料に過剰量の標識プローブが加えられる。標的配列の存在下でプローブが結合し、触媒的に切断される。切断後、過剰のプローブが結合するインタクトな標的配列が放出される。標識プローブの切断が標的配列の存在を知らせる。
【０２８７】
他の核酸増幅手順としては、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）及び３ＳＲ（Ｋｗｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．８６，ｐａｇｅｓ  １１７３−１１７７，１９８９）を含めた転写ベースの増幅システム（ＴＡＳ）が挙げられる。ＮＡＳＢＡでは、標準的なフェノール／クロロホルム抽出、臨床試料の熱変性、溶解緩衝液による処理及びミニスピンカラムによるＤＮＡ及びＲＮＡの単離又はＲＮＡの塩化グアニジン抽出により、増幅用のポリヌクレオチドを調製することができる。これらの増幅法は、標的特異的配列を有するプライマーのアニーリングを伴う。重合後、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドをＲＮアーゼＨで消化し、一方で二本鎖ＤＮＡ分子を再び熱変性させる。いずれの場合にも、第２の標的特異的プライマーの添加と、続く重合により、一本鎖ＤＮＡが完全な二本鎖になる。次に二本鎖ＤＮＡ分子がＴ７又はＳＰ６などのポリメラーゼによって多重転写される。等温サイクル反応では、ＲＮＡが二本鎖ＤＮＡに逆転写され、Ｔ７又はＳＰ６などのポリメラーゼでもう一度転写される。得られる産物が、トランケートされているか、それとも完全かに関わらず、標的特異的配列を示す。
【０２８８】
Ｄａｖｅｙらの欧州特許出願公開第０３２９８２２  Ａ２号明細書（参照により本明細書に援用される）は、一本鎖ＲＮＡ（「ｓｓＲＮＡ」）、ｓｓＤＮＡ、及び二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）のサイクル合成を伴う核酸増幅プロセスを開示しており、これは本発明において用いることができる。ｓｓＲＮＡは第１のプライマーオリゴヌクレオチドの第１のテンプレートであり、これは逆転写酵素（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）によって伸長する。次にリボヌクレアーゼＨ（ＲＮアーゼＨ、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれかとの二重鎖のＲＮＡに特異的なＲＮアーゼである）の作用によって、得られたＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖からＲＮＡが除去される。得られたｓｓＤＮＡは第２のプライマーの第２のテンプレートであり、これもテンプレートに対するその相同体の５’側にＲＮＡポリメラーゼプロモーター（Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによって例示される）の配列を含む。次にこのプライマーがＤＮＡポリメラーゼ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩの大型「Ｋｉｅｎｏｗ」フラグメントによって例示される）によって伸長されると、プライマー間に元のＲＮＡと同一の配列を有し、加えて一端にプロモーター配列を有する二本鎖ＤＮＡ（「ｄｓＤＮＡ」）分子が得られる。このプロモーター配列を適切なＲＮＡポリメラーゼが使用することにより、そのＤＮＡの多くのＲＮＡコピーが作製される。次にこれらのコピーが再びサイクルに入ることにより、極めて迅速な増幅につながり得る。酵素を適切に選択すれば、この増幅は、サイクル毎に酵素を添加することなく等温的に行うことができる。このプロセスはサイクルする性質のものであるため、出発配列はＤＮＡ又はＲＮＡのいずれかの形態であるように選択され得る。
【０２８９】
Ｍｉｌｌｅｒらの国際公開第８９／０６７００号パンフレット（全体として参照により本明細書に援用される）は、プロモーター／プライマー配列と標的一本鎖ＤＮＡ（「ｓｓＤＮＡ」）とのハイブリダイゼーションと、続く配列の多くのＲＮＡコピーの転写に基づく核酸配列増幅スキームを開示している。このスキームはサイクルするものではなく、すなわち、得られたＲＮＡ転写物から新規のテンプレートが作られるわけではない。得られる「ジオリゴヌクレオチド」の配列を有し、従ってジオリゴヌクレオチドを増幅する核酸の存在下での２つの（又はそれを超える）オリゴヌクレオチドのライゲーションに基づく方法も増幅工程に用いることができる（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，ｖｏｌ．４，ｐａｇｅ  ５６０，１９８９）。
【０２９０】
構築物は、形成後、既発表のプロトコルに従いアガロースゲルでサイズ分画され、クローニングベクターに挿入され、且つ適切な宿主細胞にトランスフェクトされてもよく、又はされなくてもよい。
【０２９１】
発達させた分子の発現
変異分子のライブラリが生成されると、ＤＮＡは通常の分子生物学的技術を使用して発現されることができる。従って、タンパク質発現は、様々な周知の方法を使用して管理されることができる。
【０２９２】
例えば、簡単には、野生型遺伝子は本明細書において示されるような任意の種々のランダム法又は非ランダム法を使用して発達されることができる。変異ＤＮＡ分子はその後消化され、標準の分子生物学的技術を用いてプラスミドＤＮＡ等のベクターＤＮＡにライゲーションされる。個々の変異体を含むベクターＤＮＡは、標準プロトコルを使用して細菌又は他の細胞に形質転換される。これは、ハイスループットな発現及びスクリーニングのための９６穴トレイ等のマルチウェルトレイの個々のウェルにおいて行われ得る。この方法は、変異分子ごとに繰り返される。
【０２９３】
このようにして選択及び単離されたポリヌクレオチドは、適切な宿主細胞に導入される。適切な宿主細胞は、遺伝子組換え及び／又は減少的再集合を促進することができる任意の細胞である。選択されたポリヌクレオチドは、好ましくは、適切な制御配列を含むベクターに既にあるものである。宿主細胞は、哺乳細胞等の高等真核細胞であり、又は酵母細胞等の下等真核細胞であってもよく、又は好ましくは宿主細胞は、細菌細胞等の原核細胞であってもよい。宿主細胞へのコンストラクトの導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、又はエレクトロポレーションによって遂行されることができる（例えば、Ｅｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ，１９８６，Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｐｌａｎｔ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８３：５３７２−５３７６）。
【０２９４】
使用可能な発現ベクターの代表例として、ウイルス粒子、バキュロウイルス、ファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、フォスミド、細菌人工染色体、ウイルスＤＮＡ（例えば、ワクシニア、アデノウイルス、ｆｏｕｌ  ｐｏｘ  ｖｉｒｕｓ、仮性狂犬病、及びＳＶ４０派生物）ｐｌに基づく人工染色体、酵母プラスミド、酵母人工染色体、及び特定の目的宿主に特異的な任意の他のベクター（例えば桿菌、アスペルギルス、及び酵母）が言及され得る。従って、例えば、ＤＮＡは、ポリペプチドを発現するための様々な発現ベクターのいずれか１つに含まれ得る。このようなベクターは、染色体性のＤＮＡ配列、非染色体性のＤＮＡ配列、及び合成ＤＮＡ配列を含む。多数の適切なベクターは当業者に周知であり、市販されている。例として以下のベクターを挙げる。細菌性：ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド、ｐＮＨベクター、ラムダＺＡＰベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐｔｒｃ９９ａ、ρＫＫ２２３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ２Ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；真核性：ｐＸＴｌ、ρＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。しかしながら、それらが宿主において複製可能であり且つ生存可能である限り、他のいかなるプラスミドも又は他のベクターも使用可能である。低コピー数ベクター又は高コピー数ベクターが、本発明において使用されることができる。
【０２９５】
発現ベクターにおけるＤＮＡ配列は、ＲＮＡ合成を導くための適切な発現制御配列（プロモーター）と操作可能に連結される。特定の名付けられた細菌プロモーターは、ｌａｄ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＰＲ、ＰＬ、及びｔｒｐを含む。真核生物プロモーターは、前初期ＣＭＶ、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期及び後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、及びマウスメタロチオネイン−１を含む。適切なベクター及びプロモーターの選択は、十分に当業者の水準の範囲内にある。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位及び転写ターミネーターを含む。このベクターは、発現を増幅するための適切な配列を含んでもよい。プロモーター領域は、選択可能なマーカーを有するクロラムフェニコールトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）ベクター、又は他のベクターを使用して、任意の所望の遺伝子から選択されることができる。加えて、発現ベクターは、真核細胞培養に対するジヒドロ葉酸還元酵素又はネオマイシン耐性等、又は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるテトラサイクリン又はアンピシリン耐性等の、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型の特徴を提供するために、好ましくは、１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含む。
【０２９６】
発現ベクターは、典型的には、天然に結合した又は異種のプロモーター領域を含め、コード配列に作動可能に連結した発現制御配列を含み得る。好ましくは、発現制御配列は、真核生物宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトする能力を有するベクター中の真核生物プロモーター系であり得る。ベクターが適切な宿主に導入されると、宿主は、変異タンパク質の産生のため、導入されたコード配列の高度な発現に好適な条件下で維持される。
【０２９７】
前述のように、変異タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、その配列が発現制御配列に作動可能に連結された後（すなわち、構造遺伝子の転写及び翻訳が確実な位置に置かれた後）に宿主で発現し得る。これらの発現ベクターは、典型的には宿主生物においてエピソームとして、或いは宿主染色体ＤＮＡの一体部分として、複製可能である。一般には、発現ベクターは選択マーカー、例えばテトラサイクリン又はネオマイシンを含有し、所望のＤＮＡ配列で形質転換された細胞を検出することが可能である（例えば、米国特許第４，７０４，３６２号明細書（参照により本明細書に援用される）を参照）。
【０２９８】
従って、本開示の他の態様において、新規なポリヌクレオチドは、減少的再集合の方法によって生成されることができる。方法は、連続的な配列（オリジナルのコード配列配列）、適切なベクターへのそれらの挿入、及び適切な宿主細胞へのその後のそれらの導入を含むコンストラクトの生成を含む。個々の分子同一性の再集合は、相同領域を有するコンストラクトにおける連続的な配列間での、又は擬似繰り返し単位間での組合せ方法によって発生する。再集合方法は、複雑さ及び反復配列の範囲を再結合させ及び／又は減少させ、新しい分子種の生成をもたらす。様々な処理を、再集合の割合を増強させるために適用することができる。これらは、紫外線処理又はＤＮＡ損害性化学薬品、及び／又は増強した水準の「遺伝的不安定性」を示す宿主細胞株の使用を含むことができる。従って、再集合方法は、それら自体の発達を導くために、相同組換え又は準反復配列の自然の特性を含むことができる。
【０２９９】
一の態様において、宿主生物又は細胞は、グラム陰性細菌、グラム陽性細菌、又は真核生物からなるものである。本発明の他の態様において、グラム陰性細菌は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）又は蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）からなるものである。本発明の他の態様において、グラム陽性細菌は、ストレプトミセス・ディベルサ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｉｖｅｒｓａ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、又は枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からなるものである。本発明の他の態様において、真核生物は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）又はアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）からなるものである。適切な宿主の代表例として、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）等の細菌細胞；酵母等の真菌細胞；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２及びＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９等の昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ又はボーズ黒色腫（Ｂｏｗｅｓ  ｍｅｌａｎｏｍａ）等の動物細胞；アデノウイルス；及び植物細胞が言及され得る。適切な宿主の選択は、本明細書における教示から当業者の範囲内であると考えられる。
【０３００】
酵母などの真核微生物に加えて、哺乳類組織細胞培養物も本発明の変異ポリペプチドの発現に使用し得る（Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，“Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ，”ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎ．Ｙ．，Ｎ．Ｙ．（１９８７）（参照により本明細書に援用される）を参照）。真核細胞は、インタクトな免疫グロブリンの分泌能を有するいくつもの好適な宿主細胞株が当該技術分野において開発されているため好ましく、ＣＨＯ細胞株、様々なＣＯＳ細胞株、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞株、Ｂ細胞又はハイブリドーマが含まれる。これらの細胞の発現ベクターは、発現制御配列、例えば、複製起点、プロモーター、エンハンサー（Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，ｖｏｌ．８９，ｐａｇｅ  ４９，１９８６）、及び必須のプロセシング情報部位、例えば、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写終結配列を含み得る。好ましい発現制御配列は、免疫グロブリン遺伝子、サイトメガロウイルス、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルスなどに由来するプロモーターである。
【０３０１】
真核生物ＤＮＡ転写は、発現ベクターにエンハンサー配列を挿入することによって増加させ得る。エンハンサーは、プロモーターによる転写を増加させる１０〜３００ｂｐのシス作用配列である。エンハンサーは、転写ユニットの５’側又は３’側のいずれにあるときも、転写を有効に増加させることができる。エンハンサーはまた、イントロン内又はコード配列自体の中に位置する場合も有効である。典型的には、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルスエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーを含めたウイルスエンハンサーが用いられる。マウス免疫グロブリン重鎖エンハンサーなど、哺乳類系由来のエンハンサー配列もよく用いられる。
【０３０２】
哺乳類発現ベクター系はまた、典型的には選択可能なマーカー遺伝子も含む。好適なマーカーの例としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ）、又は薬剤耐性を付与する原核生物遺伝子が挙げられる。最初の２つのマーカー遺伝子については、成長培地にチミジンを添加しなければ成長することができない変異細胞株の使用が好ましい。次に、非補足培地で成長する能力によって形質転換細胞を同定することができる。マーカーとして有用な原核生物薬剤耐性遺伝子の例としては、Ｇ４１８、ミコフェノール酸及びハイグロマイシンに対する耐性を付与する遺伝子が挙げられる。
【０３０３】
目的のＤＮＡセグメントを含有する発現ベクターは、細胞産生宿主のタイプに応じて、周知の方法によって宿主細胞に移入することができる。例えば、原核生物宿主細胞には塩化カルシウムトランスフェクションがよく利用され、一方、リン酸カルシウム処理、リポフェクション、又は電気穿孔は真核生物宿主細胞に用いられ得る。哺乳類細胞産生宿主の形質転換に用いられる他の方法としては、ポリブレン、プロトプラスト融合、リポソーム、電気穿孔、及びマイクロインジェクションの使用が挙げられる（一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，前掲を参照）。
【０３０４】
一実施形態において、真核細胞産生宿主は、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＩＭ９、ＤＳ−１、ＴＨＰ−１、Ｈｅｐ  Ｇ２、ＣＯＳ、ＮＩＨ  ３Ｔ３、Ｃ３３ａ、Ａ５４９、Ａ３７５、ＳＫ−ＭＥＬ−２８、ＤＵ  １４５、ＰＣ−３、ＨＣＴ  １１６、Ｍｉａ  ＰＡＣＡ−２、ＡＣＨＮ、Ｊｕｒｋａｔ、ＭＭ１、Ｏｖｃａｒ  ３、ＨＴ  １０８０、Ｐａｎｃ−１、Ｕ２６６、７６９Ｐ、ＢＴ−４７４、Ｃａｃｏ−２、ＨＣＣ  １９５４、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＬｎＣＡＰ、ＮＲＫ−４９Ｆ、及びＳＰ２／０細胞株；並びにマウス脾細胞及びウサギＰＢＭＣから選択される哺乳類系である。一態様において、哺乳類系は、ＣＨＯ又はＨＥＫ２９３細胞株から選択される。具体的な一態様において、哺乳類系はＣＨＯ−Ｓ細胞株である。別の具体的な態様において、哺乳類系はＨＥＫ２９３細胞株である。別の実施形態において、真核細胞産生宿主は酵母細胞系である。一態様において、真核生物系は、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母細胞又はピキア（ｐｉｃｃｈｉａ）酵母細胞から選択される。
【０３０５】
別の実施形態において、哺乳類系は開発業務受託機関又は医薬品製造受託機関によって商業的に作成されてもよい。例えば、組換え抗体又は他のタンパク質については、Ｌｏｎｚａ（Ｌｏｎｚａ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ、Ｂａｓｅｌ、スイス）が、ベクターを作成し、ＧＳ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）技術をＣＨＯＫ１ＳＶ又はＮＳ０細胞産生宿主のいずれかと共に用いてこれらの産物を発現させることができる。
【０３０６】
組換えタンパク質を発現するために使用され得る様々な哺乳細胞培養系に特に関連して、哺乳類の発現系の例は、“ＳＶ４０−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｓｉｍｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｓｕｐｐｏｒｔ  ｔｈｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅａｒｌｙ  ＳＶ４０  ｍｕｔａｎｔｓ”（Ｇｌｕｚｍａｎ、１９８１）に記載されるサル腎臓繊維芽細胞のＣＯＳ−７株、及びＣ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ及びＢＨＫ細胞株等の相性の良いベクターを発現することができる他の細胞株を含む。哺乳類の発現ベクターは複製開始点、適切なプロモーター、及びエンハンサー、及び任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスのドナー及びアクセプター部位、転写終結配列、及び５’隣接非転写配列をも含むであろう。ＳＶ４０スプライシングに由来するＤＮＡ配列、及びポリアデニル化部位は、必要な非転写遺伝因子を提供するために使用されることができる。
【０３０７】
細胞はその後増殖し、「減少的再集合」は達成される。減少的再集合方法の割合は、必要に応じて、ＤＮＡ損傷の導入によって刺激され得る。インビボでの再集合は「遺伝子組換え」とまとめて呼ばれる「分子間の」方法に向けられ、これは細菌において、「ＲｅｃＡ依存性」の現象として通常観察される。本発明は、配列を組換え且つ再集合させるための宿主細胞の遺伝子組換え方法、又は欠損によって細胞における準反復配列の複雑性を減少させるための縮小方法を調節する細胞の能力に依存することができる。「縮小再集合」のこの方法は、「分子内の」、ＲｅｃＡ非依存性の方法によって生じる。最終結果は、全ての可能な組合せへの分子の再集合である。
【０３０８】
目的のポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、プロモーターを活性化させ、形質転換細胞を選択し、又は遺伝子を増幅させるのに適切なように改変された従来の栄養培地で培養されることができる。この培養条件（例えば温度、ｐＨなど）は、発現のために選択される宿主細胞と共に以前使用されたものであり、また当業者にとって明らかである。
【０３０９】
タンパク質発現は様々な周知の方法によって誘導されることができ、多くの遺伝系がタンパク質発現の誘導のために公表されている。例えば、適切な系については、誘導剤品の追加によってタンパク質発現が誘導される。細胞はその後、遠心分離によってペレットにされ、上澄みが取り除かれる。ペリプラズムタンパク質は、ＤＮＡｓｅ、ＲＮＡｓｅ及びリソチームを有する細胞を培養することによって高められ得る。遠心分離後、新規なタンパク質を含む上澄みは、アッセイ前に新しいマルチウェルトレイに移され、保存される。
【０３１０】
本発明の変異タンパク質は、哺乳類細胞産生宿主又は酵母細胞産生宿主などの真核細胞産生宿主において（変異ＤＮＡから）発現され、この宿主は、変異タンパク質のスクリーニングから選択された条件的活性型生物学的タンパク質の下流産生にも用いられる。このように同定された条件的活性型生物学的タンパク質は、このプロセスの先行する発現工程で用いられたのと同じ宿主での発現に使用することができる。
【０３１１】
細胞は一般的には遠心分離によって採取され、物理的又は化学的手段によって分離され、及び得られたクルードの抽出物は更なる精製のために保持される。タンパク質の発現のために使用される微生物細胞は、凍結融解サイクル、音波処理、機械分離、又は細胞溶解剤の使用を含む任意の好都合な方法によって分離されることができる。このような方法は当業者に周知である。発現したポリペプチド又はその断片は、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、及びレクチンクロマトグラフィーを含む方法によって、組換え細胞培養物から回収され、精製され得る。タンパク質のリフォールディング過程が、必要に応じて、ポリペプチドの構造を仕上げる際に用いられることができる。必要に応じて、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が、最終的な精製過程のために使用されることができる。
【０３１２】
所望の活性を有すると特定されるクローンは、その後シーケンスされることができ、増強した活性を有する酵素をコードするポリヌクレオチド配列を特定する。
【０３１３】
このようなライブラリから特定されるポリペプチド、すなわち条件的活性型生物学的タンパク質が、治療、診断、研究、及び関連する目的のために使用されることができ、及び／又はシャッフリング及び／又は選択の１つ以上の追加的なサイクルにさらされることができる。本発明は、少なくとも１０アミノ酸の長さである条件的活性型生物学的タンパク質の断片を提供するものであり、断片は活性を有するものである。
【０３１４】
本開示は、酵素活性を有するコドン最適化ポリペプチド又はその断片を提供するものであり、コドンの使用は特定の生物又は細胞のために最適化される。Ｎａｒｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｏｄｏｎ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｍｅｒｚｏｉｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ｍｉｃｅ”．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．２００１  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ，６９（１２）：７２５０−３には、マウス系におけるコドン最適化が記載される。Ｏｕｔｃｈｋｏｕｒｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｑｕｉｓｔａｔｉｎ  ｉｎ  Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ，ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．２００２  Ｆｅｂｒｕａｒｙ；２４（１）：１８−２４  には、酵母系におけるコドン最適化が記載される。Ｆｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｈｉｇｈ  ｌｅｖｅｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｇｅｎｅ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ”  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０００  Ｄｅｃ．１９，３９（５０）：１５３９９−４０９  には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるコドン最適化が記載される。Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ：ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  ａｔ  ｔｈｅ  ５’ｅｎｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ”，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．，ｖｏｌ．２０，ｐａｇｅｓ，２５２−２６４，２０００には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてコドンの使用がどのように分泌に影響するかが記載される。
【０３１５】
条件的活性型生物学的タンパク質の発達は、好都合なハイスループットスクリーニング又は選択過程の利用によって補助されることができる。
【０３１６】
上記で考察したように、条件的活性型生物学的タンパク質の発現最適化は、用いるベクター（ベクター成分、例えば、プロモーター、スプライス部位、５’及び３’末端及びフランキング配列）の最適化、宿主細胞の遺伝子修飾による遺伝子欠失及び再構成の低減、関連性のある遺伝子をインビボ又はインビトロで発達させる方法による宿主細胞遺伝子活性の発達、関連性のある遺伝子を発達させることによる宿主グリコシル化酵素の最適化によって、及び／又は染色体ワイドな宿主細胞突然変異誘発及び発現能が増進した細胞を選択するための選択戦略によって達成することができる。宿主細胞については本明細書にさらに記載する。
【０３１７】
細胞表面ディスプレイ発現及びスクリーニング技術（例えば、上記に定義する通りのもの）を用いて、変異タンパク質を条件的活性型生物学的タンパク質に関してスクリーニングすることができる。
【０３１８】
一態様において、真核細胞発現を最適化するため抗体の定常領域でコドン突然変異誘発が実施される。エフェクター機能を媒介する能力を保持している向上した発現特性のコドン最適化Ｆｃ変異体は、治療用抗体の産生を改善する。この態様において、例えば、抗体分子の定常領域は、異なる発現宿主におけるスクリーニング用に発達させることができる。例えば、哺乳類細胞株はＣＨＯ、ＨＥＫ２９３及びＣＯＳ−７を利用して発現スクリーニングすることができる。
【０３１９】
変異体のスクリーニングによる可逆的又は非可逆的変異体の同定
望ましい分子の同定は、許容型の条件及び野生型の条件におけるタンパク質活性を測定することによって、非常に直接的に達成される。最も高い活性の比（許容型／野生型）を示す変異体を、次いで選択し、標準的な方法を用いて個々の変異を組み合わせることで、点変異の並べ替え（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）を生成することができる。次いで、この組み合わせた並べ替えタンパク質ライブラリから、許容型と野生型の活性に最も大きい差を示すタンパク質をスクリーニングする。
【０３２０】
上清の活性を、様々な方法、例えば、蛍光アッセイなどのハイスループットな活性アッセイを使ってスクリーニングして、希望する特性（温度、ｐＨなど）に感受性を有する、タンパク質変異体を同定することが可能である。例えば、時間的感受性の変異体をスクリーニングするためには、個々の変異体ごとに、低い温度（２５℃など）と、元のタンパク質が機能する温度（３７℃など）とにおいて、商業的に利用可能な基質を用いて、酵素活性又は抗体活性の測定を行う。反応は、最初は９６ウェルアッセイなどのマルチウェルアッセイの形式で行われ、１４ｍｌチューブ形式などの異なる形式を用いて確認されてもよい。
【０３２１】
本開示は、酵素を同定するためのスクリーニングアッセイをさらに提供するものであって、アッセイは、（ａ）複数の核酸又はポリペプチドを提供する工程と、（ｂ）複数の核酸又はポリペプチドから、酵素活性をテストするためのポリペプチドの候補を得る工程と、（ｃ）候補の酵素活性をテストする工程と、（ｄ）これらのポリペプチドの候補であって、例えば、温度、ｐＨ、酸化的ストレス、浸透圧性、電解質濃度、又は浸透圧の条件が、異常な条件又は非生理的な条件下において、野生型酵素タンパク質に比べてより高い酵素活性を示し、通常の生理的な条件下において、より低い酵素活性を示すものである、ポリペプチドの候補を同定する工程とを有するものである。
【０３２２】
一態様において、本方法は、候補の条件的生物活性をテストする前に、少なくとも１つの核酸又はポリペプチドを修飾する工程をさらに含み、別の態様において、テストする工程（ｃ）は、宿主細胞又は宿主生物におけるポリペプチドの発現の向上をテストする工程をさらに含み、さらなる態様において、テストする工程（ｃ）は、約ｐＨ３〜約ｐＨ１２のｐＨ範囲内で酵素活性をテストする工程をさらに含む。さらなる態様において、テストする工程（ｃ）は、約ｐＨ５〜約ｐＨ１０のｐＨ範囲内で酵素活性をテストする工程をさらに含む。さらなる態様において、テストする工程（ｃ）は、約ｐＨ６〜約ｐＨ８のｐＨ範囲内で酵素活性をテストする工程をさらに含む。さらなる態様において、テストする工程（ｃ）は、約ｐＨ６．７及び約ｐＨ７．５で酵素活性をテストする工程をさらに含む。別の態様において、テストする工程（ｃ）は、約４℃〜約５５℃の温度範囲内で酵素活性をテストする工程をさらに含む。別の態様において、テストする工程（ｃ）は、約１５℃〜約４７℃の温度範囲内で酵素活性をテストする工程をさらに含む。別の態様において、テストする工程（ｃ）は、約２０℃〜約４０℃の温度範囲内で酵素活性をテストする工程をさらに含む。別の態様において、テストする工程（ｃ）は、約２５℃及び約３７℃で酵素活性をテストする工程をさらに含む。別の態様において、テストする工程（ｃ）は、正常な浸透圧下、及び異常な（正又は負の）浸透圧下で酵素活性をテストする工程をさらに含む。別の態様において、テストする工程（ｃ）は、正常な電解質濃度下、及び異常な（正又は負の）電解質濃度下で酵素活性をテストする工程をさらに含む。テストされる電解質濃度は、カルシウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、塩素、重炭酸、及びリン酸濃度の１つから選択され、別の態様において、テストする工程（ｃ）は、安定した反応産物をもたらす酵素活性をテストする工程をさらに含む。
【０３２３】
別の態様において、本開示は、酵素活性を有する本開示のポリペプチド又はそのフラグメントに特異的に結合する精製抗体を提供する。一態様において、本開示は、酵素活性を有するポリペプチドに特異的に結合する抗体のフラグメントを提供する。
【０３２４】
スクリーニング分析の正常生理条件及び異常条件は、温度、ｐＨ、浸透圧、重量オスモル濃度、酸化、及び電解質濃度から選択される任意の条件、並びに２つ以上のかかる条件の組み合わせであり得る。例えば、温度に関する正常生理条件は３７．０℃の正常なヒト体温であってもよく、一方、温度に関する異常条件は、３７．０℃の温度と異なる温度であってもよい。正常生理条件及び異常条件はまた、正常な生理的ｐＨ及び異常なｐＨであってもよい。
【０３２５】
正常生理条件下及び異常条件下の両方とも、分析は、例えば緩衝液を含有し得る媒体、例えば液体媒体を使用して実施され得る。一般的なスクリーニング緩衝液はクレブス緩衝液である。しかしながら、分析に好適であることが当業者に公知の他の緩衝液が用いられてもよい。これらの緩衝液の多くは、血清又はリンパ液などの体液の組成を模擬しようとするものである。本発明の方法で使用される緩衝液は、哺乳動物又はヒトの体液に一般に見出される無機化合物、イオン及び有機分子の１つ以上から選択される少なくとも１つの構成成分を含有し得る。かかる構成成分の例としては、少なくとも栄養素及び代謝産物、並びに体液に見られ得る任意の他の構成成分が挙げられる。これらの実施形態において、緩衝液中の構成成分の濃度は、哺乳動物、好ましくはヒトの天然に存在する体液中に典型的に見られる同じ構成成分の濃度と同じ又は実質的に同じであり得る。これは、体液中のその構成成分の正常生理的濃度と称され得る。
【０３２６】
一実施形態において、正常生理条件下での分析は、正常な生理的ｐＨ、例えばｐＨ７．４の組成物で実施される。この分析は、哺乳動物又はヒトの体液に一般に見出される無機化合物、イオン、及び有機分子から選択される少なくとも１つの構成成分の存在下で行われる。異常条件下での分析は、緩衝液など同じ構成成分の存在下で、ｐＨ６など、正常な生理的ｐＨと異なる異常なｐＨで実施される。従って、この実施形態において両分析が行われる流体は、好ましくは正常な生理的濃度の範囲内であるか又はそれに近いものであるべき同じ濃度の同じ１つ又は複数の構成成分を含む。
【０３２７】
例えば、正常生理条件下での分析は、正常生理温度、例えば３７℃の緩衝流体中において、上記の無機化合物、イオン、及び有機分子から選択される少なくとも１つの構成成分の存在下で実施され得る。異常条件下での分析は、異なる異常な温度、例えば３６℃の緩衝流体中において、同じ１つ又は複数の構成成分の存在下で実施される。この場合にも、両分析が行われる流体は、好ましくは正常な生理的濃度の範囲内にあるべき同じ濃度の同じ１つ又は複数の構成成分を含む。１つ又は複数の正常な生理的濃度での分析に使用される流体中の１つ以上の構成成分の存在は、条件的活性型生物学的タンパク質を選択するための選択プロセスを改善し得る。
【０３２８】
無機化合物又はイオンは、ホウ酸、塩化カルシウム、硝酸カルシウム、リン酸二アンモニウム、硫酸マグネシウム、リン酸一アンモニウム、リン酸一カリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、硫酸銅、硫酸鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸マグネシウム、硝酸カルシウム、カルシウムキレート、銅キレート、鉄キレート、マンガンキレート及び亜鉛キレート、モリブデン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸カルシウム、リン酸マグネシウム、重炭酸カリウム、重炭酸ナトリウム、硝酸カリウム、塩酸、二酸化炭素、硫酸、リン酸、炭酸、尿酸、塩化水素、尿素、リンイオン、硫酸イオン、塩化物イオン、マグネシウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン、アンモニウムイオン、鉄イオン、亜鉛イオン及び銅イオンの１つ以上から選択され得る。
【０３２９】
一部の無機化合物の正常な生理的濃度の例としては、２〜７．０ｍｇ／ｄＬの濃度範囲の尿酸、８．２〜１１．６ｍｇ／ｄＬの濃度範囲のカルシウムイオン、３５５〜３８１ｍｇ／ｄＬの濃度範囲の塩化物イオン、０．０２８〜０．２１０ｍｇ／ｄＬの濃度範囲の鉄イオン、１２．１〜２５．４ｍｇ／ｄＬの濃度範囲のカリウムイオン、３００〜３３０ｍｇ／ｄＬの濃度範囲のナトリウムイオン及び１５〜３０ｍＭの濃度範囲の炭酸が挙げられる。
【０３３０】
有機化合物は、例えば、ヒスチジン、アラニン、イソロイシン、アルギニン、ロイシン、アスパラギン、リジン、アスパラギン酸、メチオニン、システイン、フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニン、グルタミン、トリプトファン、グリシン、バリン、ピロリシン、プロリン、セレノシステイン、セリン、チロシン及びそれらの混合物などのアミノ酸から選択され得る。
【０３３１】
一部のアミノ酸の正常な生理的濃度の例としては、３．９７±０．７０ｍｇ／ｄＬのアラニン、２．３４±０．６２ｍｇ／ｄＬのアルギニン、３．４１±１．３９ｍｇ／ｄＬのグルタミン酸、５．７８±１．５５ｍｇ／ｄＬのグルタミン、１．７７±０．２６ｍｇ／ｄＬのグリシン、１．４２±０．１８ｍｇ／ｄＬのヒスチジン、１．６０±０．３１ｍｇ／ｄＬのイソロイシン、１．９１±０．３４ｍｇ／ｄＬのロイシン、２．９５±０．４２ｍｇ／ｄＬのリジン、０．８５±０．４６ｍｇ／ｄＬのメチオニン、１．３８±０．３２ｍｇ／ｄＬのフェニルアラニン、２．０２±６．４５ｍｇ／ｄＬのスレオニン、１．０８±０．２１ｍｇ／ｄＬのトリプトファン、１．４８±０．３７ｍｇ／ｄＬのチロシン及び２．８３±０．３４ｍｇ／ｄＬのバリンが挙げられる。
【０３３２】
有機化合物は、非タンパク質窒素含有化合物、例えば、クレアチン、クレアチニン、グアニジノ酢酸、尿酸、アラントイン、アデノシン、尿素、アンモニア及びコリンであってもよい。一部のこれらの化合物の正常な生理的濃度の例としては、１．０７±０．７６ｍｇ／ｄＬのクレアチン、０．９〜１．６５ｍｇ／ｄＬのクレアチニン、０．２６±０．２４ｍｇ／ｄＬのグアニジノ酢酸、４．０±２．９ｍｇ／ｄＬの尿酸、０．３〜０．６ｍｇ／ｄＬのアラントイン、１．０９±０．３８５ｍｇ／ｄＬのアデノシン、２７．１±４．５ｍｇ／ｄＬの尿素及び０．３〜１．５ｍｇ／ｄＬのコリンが挙げられる。
【０３３３】
有機化合物は、有機酸、例えば、クエン酸、α−ケトグルタル酸、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸、アセト酢酸、β−ヒドロキシ酪酸、乳酸、ピルビン酸、α−ケトン酸、酢酸、及び揮発性脂肪酸などであってもよい。一部のこれらの有機酸の正常な生理的濃度の例としては、２．５±１．９ｍｇ／ｄＬのクエン酸、０．８ｍｇ／ｄＬのα−ケトグルタル酸、０．５ｍｇ／ｄＬのコハク酸、０．４６±０．２４ｍｇ／ｄＬのリンゴ酸、０．８〜２．８ｍｇ／ｄＬのアセト酢酸、０．５±０．３ｍｇ／ｄＬのβ−ヒドロキシ酪酸、８〜１７ｍｇ／ｄＬの乳酸、１．０±０．７７ｍｇ／ｄＬのピルビン酸、０．６〜２．１ｍｇ／ｄＬのａ−ケトン酸、１．８ｍｇ／ｄＬの揮発性脂肪酸が挙げられる。
【０３３４】
有機化合物は、糖類（炭水化物）、例えば、グルコース、ペントース、ヘキソース、キシロース、リボース、マンノース及びガラクトース、並びに二糖類、例えば、ラクトース、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌ、Ｇａｌα１−４Ｇａｌ、Ｍａｎα１−２Ｍａｎ、ＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌ及びＯ−、Ｎ−、Ｃ−、又はＳ−グリコシドであってもよい。一部のこれらの糖類の正常な生理的濃度の例としては、８３±４ｍｇ／ｄＬのグルコース、１０２±７３ｍｇ／ｄＬの多糖類（ヘキソースとして）、７７±６３ｍｇ／ｄＬのグルコサミン、０．４〜１．４ｍｇ／ｄＬのヘキサウロン酸（グルクロン酸として）及び２．５５±０．３７ｍｇ／ｄＬのペントースが挙げられる。
【０３３５】
有機化合物は、脂肪又はその誘導体、例えば、コレステロール、レシチン、セファリン、スフィンゴミエリン及び胆汁酸であってもよい。一部のこれらの化合物の正常な生理的濃度の例としては、４０〜７０ｍｇ／ｄＬの遊離コレステロール、１００〜２００ｍｇ／ｄＬのレシチン、０〜３０ｍｇ／ｄＬのセファリン、１０〜３０ｍｇ／ｄＬのスフィンゴミエリン及び０２．〜０．３ｍｇ／ｄＬの胆汁酸（コール酸として）が挙げられる。
【０３３６】
有機化合物は、タンパク質、例えば、フィブリノゲン、抗血友病グロブリン、免疫γ−グロブリン、免疫真性グロブリン、同種凝集素、β−偽グロブリン、ウシ血清アルブミン、糖タンパク質、リポタンパク質及びアルブミンであってもよい。例えば、アルブミンの正常な生理的濃度は３．３５ｍｇ／ｄＬである。
【０３３７】
有機化合物は、ビタミン、例えば、ビタミンＡ、カロチン、ビタミンＥ、アスコルビン酸、チアミン、イノシトール、葉酸、ビオチン、パントテン酸、リボフラビンであってもよい。一部のこれらのビタミンの正常な生理的濃度の例としては、０．０１９〜０．０３６ｍｇ／ｄＬのビタミンＡ、０．９０〜１．５９ｍｇ／ｄＬのビタミンＥ、０．４２〜０．７６ｍｇ／ｄＬのイノシトール、０．００１６２〜０．００１９５ｍｇ／ｄＬの葉酸及び０．０００９５〜０．００１６６ｍｇ／ｄＬのビオチンが挙げられる。
【０３３８】
抗体及び抗体ベースのスクリーニング方法
本開示は、本開示の酵素に特異的に結合する、単離された抗体又は組換え抗体を提供する。これらの抗体を用いて、本開示の酵素、又は関連するポリペプチドの酵素を、単離、同定、又は定量化することができる。これらの抗体を用いて、本開示の範囲内の他のポリペプチド、又は他の関連する酵素を単離することができる。抗体は、酵素の活性部位に結合するように設計することができる。従って、本開示は、本開示の抗体を用いて、酵素を抑制する方法を提供する。
【０３３９】
抗体は、免疫沈降、染色、及び免疫親和性カラムなどで用いることができる。必要に応じて、特定の抗原をエンコードする核酸配列は、免疫処置とそれに続くポリペプチド又は核酸の単離、増幅又はクローニング、並びに本開示のアレイへのポリペプチドの固定化によって生成することができる。或いは、本開示の方法を用いて、細胞によって生産された抗体の構造を改変することが可能であり、抗体を改変し、例えば抗体の親和性を上昇又は低下させることが可能である。さらに、抗体を作成又は改変する能力を、本開示の方法により細胞中に設計された表現型とすることができる。
【０３４０】
免疫処置、抗体の作製及び単離（ポリクローナル及びモノクローナル）の方法は、当該技術分野の当業者に公知であり、科学文献及び特許文献に記載されている。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ，ＮＹ（１９９１）；Ｓｔｉｔｅｓ（ｅｄｓ．）ＢＡＳＩＣ  ＡＮＤ  ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（７ｔｈ  ｅｄ．）Ｌａｎｇｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌｏｓ  Ａｌｔｏｓ，Ｃａｌｉｆ．（“Ｓｔｉｔｅｓ”）；Ｇｏｄｉｎｇ，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ（２ｄ  ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８６）；Ｋｏｈｌｅｒ（１９７５）“Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｆｕｓｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｏｆ  ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ”，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５；Ｈａｒｌｏｗ（１９８８）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．を参照のこと。抗体はまた、例えば、従来的な動物を用いたインビボの方法に加えて、組換え抗体の結合部位を発現するファージディスプレイライブラリを用いることで、インビトロで作製することも可能である。例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ（１９９７）“Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：６２−７０；及びＫａｔｚ（１９９７）“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｏｆ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄ  ｏｒ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｂｙ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ”，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２６：２７−４５を参照のこと。
【０３４１】
ポリペプチド又はペプチドを用いて、特異的に本開示のポリペプチド、例えば酵素に結合する抗体を作製することができる。結果得られる抗体は、ポリペプチドを単離又は精製するため、或いはポリペプチドが生体サンプルの中に存在するかどうかを決定するために、免疫親和性クロマトグラフィーの手法の中で用いられてもよい。そうした手法において、抽出物などのタンパク質調製物、又は生体サンプルを、本開示のポリペプチドの中の１つに特異的に結合することができる抗体と接触させる。
【０３４２】
免疫親和性手法において、抗体を、ビーズ又はその他のカラム基材などの固体支持体に結合させる。タンパク質調製物を、本開示のポリペプチドの中の１つに特異的に抗体が結合する条件下で、抗体と接触するように置く。洗浄を行い、非特異的に結合したタンパク質を除去した後、特異的に結合したポリペプチドを溶出する。
【０３４３】
生体サンプル中のタンパク質の、抗体対する結合能力を、当該技術分野の当業者に公知の様々な手法を用いて決定することができる。例えば、蛍光物質、酵素ラベル、放射性同位体などの検出可能な標識を用いて抗体を標識することによって、結合能を決定してもよい。或いは、表面にそうした検出可能な標識を有する二次抗体を用いて検出することによって、サンプルに対する抗体の結合能を決定してもよい。特定のアッセイとしては、ＥＬＩＳＡアッセイ、サンドイッチアッセイ、ラジオイムノアッセイ、及びウェスタンブロットが含まれる。
【０３４４】
本開示のポリペプチドに対して製作されるポリクローナル抗体は、動物へのポリペプチドの直接注射か、又は非ヒト動物へのポリペプチドの投与によって、得ることができる。そうして得られた抗体を、次いでポリペプチド自体に結合させる。この方法において、ポリペプチドの断片のみをエンコードする配列さえ、未変性の全長ポリペプチドに結合する可能性のある抗体を作成するのに用いることができる。次いで、そうした抗体を用いて、ポリペプチドを発現する細胞からポリペプチドを単離することができる。
【０３４５】
モノクローナル抗体を調整するために、継代培養細胞株によって生産される抗体を提供する、任意の手法を用いることができる。例として、ハイブリドーマ法、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法、及びＥＢＶハイブリドーマ法（例えば、Ｃｏｌｅ（１９８５），Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６を参照のこと）が含まれる。
【０３４６】
単鎖抗体を作製するために記載された手法（例えば、米国特許第４９４６７７８号明細書を参照のこと）を、本開示のポリペプチドに対する単鎖抗体を作製するために適応することができる。或いは、トランスジェニックマウスを用いて、ポリペプチド又はその断片に対するヒト化抗体を発現させてもよい。本開示のポリペプチドに対して製作される抗体を用いて、他の生物及びサンプル由来の類似のポリペプチド（例えば、酵素）をスクリーニングすることができる。そうした手法において、生物由来のポリペプチドを抗体と接触させ、抗体と特異的に結合するポリペプチドを検出する。上述した手法から任意のものを、抗体の結合を検出するために用いてもよい。
【０３４７】
スクリーニング方法、及び「オンライン」モニタリング装置
本開示の方法の実施において、様々な装置及び方法を本開示のポリペプチド及び核酸と併せて使用することができる。その装置及び方法には、例えば、酵素活性によるペプチドのスクリーニングするためのもの、酵素活性に対してアクチベーター又はインヒビターなどの潜在モジュレーターとなる化合物のスクリーニングするためのもの、本開示のポリペプチドに結合する抗体のためのもの、本開示の核酸にハイブリダイズする核酸のためのもの、本開示のポリペプチドを発現する細胞をスクリーニングするためのものなどが挙げられる。
【０３４８】
アレイ又は「バイオチップ」
本開示の核酸又はポリペプチドは、アレイに固定化又は適用することができる。アレイを用いることで、組成物（例えば、小分子、抗体、核酸など）のライブラリに対して、本開示の核酸又はポリペプチドに結合する能力、又はそれらの活性を調整する能力によって、スクリーニング又はモニタすることができる。例えば、本開示の一態様において、モニタされるパラメータは酵素遺伝子の転写発現である。ある細胞の転写産物の、１つ又は複数、或いは全てを、その細胞の転写産物或いは細胞の転写産物の代表的又は相補的な核酸を有するサンプルを、アレイ又は「バイオチップ」に固定化した核酸にハイブリダイズすることで、測定することが可能である。マイクロチップ上の核酸の「アレイ」を用いることで、転写産物の一部又は全部を同時に定量化する事ができる。或いは、ゲノム核酸を有するアレイを用いることで、本開示の方法によって作られた、新たに設計された株の遺伝子型を決定することもできる。ポリペプチド「アレイ」を用いることで、同時に複数のタンパク質を定量化することもできる。本開示は、任意の既知の「アレイ」と共に実施することが可能であって、この「アレイ」は、「マイクロアレイ」又は「核酸アレイ」又は「ポリペプチドアレイ」又は「抗体アレイ」又は「バイオチップ」又はそれらの変型とも見なされる。アレイは一般的に、複数の「スポット」又は「標的要素」であって、それぞれの標的要素は、規定の量の１つ又は複数の生体分子、例えば、オリゴヌクレオチドを有するものであり、サンプル分子、例えばｍＲＮＡ転写産物に特異的に結合する基質表面の規定の領域に、固定化されているものである。
【０３４９】
本開示の方法の実施において、以下の文献中に記載されているような、任意の既知のアレイ及び／又はアレイを作成及び使用する方法が、それらの全体又は一部、或いはそれらの変型について援用され得る。例えば、米国特許第６２７７６２８号明細書；同第６２７７４８９号明細書；同第６２６１７７６号明細書；同第６２５８６０６号明細書；同第６０５４２７０号明細書；同第６０４８６９５号明細書；同第６０４５９９６号明細書；同第６０２２９６３号明細書；同第６０１３４４０号明細書；同第５９６５４５２号明細書；同第５９５９０９８号明細書；同第５８５６１７４号明細書；同第５８３０６４５号明細書；同第５７７０４５６号明細書；同第５６３２９５７号明細書；同第５５５６７５２号明細書；同第５１４３８５４号明細書；同第５８０７５２２号明細書；同第５８００９９２号明細書；同第５７４４３０５号明細書；同第５７００６３７号明細書；同第５５５６７５２号明細書；同第５４３４０４９号明細書；例えば、国際公開第９９／５１７７３号パンフレット；国際公開第９９／０９２１７号パンフレット；国際公開第９７／４６３１３号パンフレット；国際公開第９６／１７９５８号パンフレットも参照のこと；例えば、Ｊｏｈｎｓｔｏｎ（１９９８）“Ｇｅｎｅ  ｃｈｉｐｓ：Ａｒｒａｙ  ｏｆ  ｈｏｐｅ  ｆｏｒ  ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ”，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．８：Ｒ１７１−Ｒ１７４；Ｓｃｈｕｍｍｅｒ（１９９７）“Ｉｎｅｘｐｅｎｓｉｖｅ  Ｈａｎｄｈｅｌｄ  Ｄｅｖｉｃｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｉｇｈ−Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｒｒａｙｓ”，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３：１０８７−１０９２；Ｋｅｒｎ（１９９７）“Ｄｉｒｅｃｔ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｒｇｅ−ｉｎｓｅｒｔ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｃｌｏｎｅｓ  ｏｎ  ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｇｒｉｄｄｅｄ  ｃＤＮＡ  ｆｉｌｔｅｒ  ａｒｒａｙｓ”，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３：１２０−１２４；Ｓｏｌｉｎａｓ−Ｔｏｌｄｏ（１９９７）“Ｍａｔｒｉｘ−Ｂａｓｅｄ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｂｉｏｃｈｉｐｓ  ｔｏ  Ｓｃｒｅｅｎ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｉｍｂａｌａｎｃｅｓ”，Ｇｅｎｅｓ，Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  ＆  Ｃａｎｃｅｒ  ２０：３９９−４０７；Ｂｏｗｔｅｌｌ（１９９９）“Ｏｐｔｉｏｎｓ  Ａｖａｉｌａｂｌｅ−Ｆｒｏｍ  Ｓｔａｒｔ  ｔｏ  Ｆｉｎｉｓｈ￣ｆｏｒ  Ｏｂｔａｉｎｉｎｇ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｄａｔａ  ｂｙ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ”，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｕｐｐ．２１：２５−３２も参照のこと。米国特許出願公開第２００１００１８６４２号明細書；米国特許出願公開第２００１００１９８２７号明細書；米国特許出願公開第２００１００１６３２２号明細書；米国特許出願公開第２００１００１４４４９号明細書；米国特許出願公開第２００１００１４４４８号明細書；米国特許出願公開第２００１００１２５３７号明細書；米国特許出願公開第２００１０００８７６５号明細書も参照のこと。
【０３５０】
キャピラリーアレイ
ＧＩＧＡＭＡＴＲＩＸ（商標）（Ｄｉｖｅｒｓａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）などのキャピラリーアレイを、本開示の方法において用いることができる。本開示の核酸又はポリペプチドを、キャピラリーアレイを含むアレイに対して固定化又は適用することができる。アレイを用いることで、組成物（例えば、小分子、抗体、核酸など）のライブラリに対して、本開示の核酸又はポリペプチドに結合する能力、又はそれらの活性を調整する能力によって、スクリーニング又はモニタすることができる。キャピラリーアレイは、サンプルを保持且つスクリーニングするためのもう１つのシステムを提供する。例えば、サンプルスクリーニング装置は、隣接したキャピラリーアレイとして形成される複数のキャピラリーを含むことができ、ここで各キャピラリーは少なくとも１つの、サンプルを保持する管腔を形成する壁を有するものである。装置は、さらに、アレイ中の隣接したキャピラリーの間に配置される間質材を含み得るものであって、その間質剤の中に、１つまた複数の参照指標が形成されているものである。サンプルをスクリーニングするためのキャピラリーは、キャピラリーアレイに結合するように適合されたものであって、サンプルを保持するための管腔を形作る第１の壁と、サンプルを励起するために管腔に与えられる励起エネルギーをフィルターするフィルター材から形成される第２の壁を含み得るものである。ポリペプチド又は核酸、例えばリガンドを、キャピラリーアレイの少なくとも一部のキャピラリーの第１の成分に、導入することができる。キャピラリーアレイの各キャピラリーは、少なくとも１つの、第１の成分を保持する管腔を形作る壁を有することができる。キャピラリー中の第１の成分の後ろに、気泡を導入することができる。第２の成分をキャピラリーに導入することが可能であり、ここでこの第２の成分は気泡によって第１の成分と分離される。対象サンプルは、検出可能粒子で標識された第１の液として、キャピラリーアレイ中の１つのキャピラリーに導入され、このキャピラリーアレイ中の各キャピラリーは、第１の液と検出可能粒子とを保持するための管腔を形作る少なくとも１つの壁を有するものであって、少なくとも１つの壁は、検出可能粒子を結合させるための結合材料で被覆されている。本方法は、さらに、結合した検出可能粒子が保持されているキャピラリーチューブから第１の液を除去する工程と、そのキャピラリーに第２の液を導入する工程とを含むものである。キャピラリーアレイは、管腔を形作る少なくとも１つの外壁を有する、複数の個々のキャピラリーを含むものである。外壁は、互いに融合した１つ又は複数の壁であってもよい。同様に、壁は、その壁が液体又はサンプルを保持する管腔を形成する限り、円筒形、四角形、六角形、又はその他の幾何学的形態の管腔を形作ることができる。キャピラリーアレイ中のキャピラリーは、平面構造を形成するように近接して互いに支え合うことができる。キャピラリーは、隣同士を融合（例えば、ここではキャピラリーはガラス製）、接着、粘結、又は固定することによって、互いに結合することができる。キャピラリーアレイは、任意の数、例えば１００〜４，０００，００��の、個々のキャピラリーから形成することが可能である。キャピラリーアレイは、約１００，０００又はそれより多くの、互いに結合した個々のキャピラリーを有する、マイクロタイタープレートを形成することができる。医薬組成物。
【０３５１】
特定の実施形態において、本発明は、異常条件での活性と正常生理条件での活性との活性比が大きい（例えば、異常条件と正常生理条件との間での選択性がより高い）条件的活性型生物学的タンパク質を作製することを目標とする。異常条件での活性と正常生理条件での活性との比、すなわち選択性は、少なくとも約２：１、又は少なくとも約３：１、又は少なくとも約４：１、又は少なくとも約５：１、又は少なくとも約６：１、又は少なくとも約７：１、又は少なくとも約８：１、又は少なくとも約９：１、又は少なくとも約１０：１、又は少なくとも約１１：１、又は少なくとも約１２：１、又は少なくとも約１３：１、又は少なくとも約１４：１、又は少なくとも約１５：１、又は少なくとも約１６：１、又は少なくとも約１７：１、又は少なくとも約１８：１、又は少なくとも約１９：１、又は少なくとも約２０：１、又は少なくとも約３０：１、又は少なくとも約４０：１、又は少なくとも約５０：１、又は少なくとも約６０：１、又は少なくとも約７０：１、又は少なくとも約８０：１、又は少なくとも約９０：１、又は少なくとも約１００：１であり得る。
【０３５２】
一実施形態において、条件的活性型生物学的タンパク質は抗体であり、これは異常条件での活性と正常生理条件での活性との比が少なくとも約５：１、又は少なくとも約６：１、又は少なくとも約７：１、又は少なくとも約８：１、又は少なくとも約９：１、又は少なくとも約１０：１であり得る。一実施形態において、この条件的活性型生物学的タンパク質は腫瘍部位の標的化に使用され、条件的活性型生物学的タンパク質は腫瘍部位で特別な活性を有し、非腫瘍部位（正常生理条件）では同じ活性に関して活性が大幅に低いか、又は不活性である。
【０３５３】
一実施形態において、条件的活性型生物学的タンパク質は、本明細書中の他の部分に開示されるものなどの別の薬剤とコンジュゲートすることが意図される抗体である。条件的活性型抗体は、異常条件での活性と正常生理条件での活性との比が、その由来である野生型抗体と比べて高いこともある。例えば、別の薬剤とコンジュゲートされる条件的活性型抗体は、異常条件での活性と正常生理条件での活性との比が少なくとも約１０：１、又は少なくとも約１１：１、又は少なくとも約１２：１、又は少なくとも約１３：１、又は少なくとも約１４：１、又は少なくとも約１５：１、又は少なくとも約１６：１、又は少なくとも約１７：１、又は少なくとも約１８：１、又は少なくとも約１９：１、又は少なくとも約２０：１であり得る。これは、コンジュゲートされる薬剤が例えば毒性又は放射性である場合、かかるコンジュゲート薬剤は疾患部位又は治療部位に集中することが望ましいため、特に重要であり得る。
【０３５４】
条件的活性型生物学的タンパク質の作製／製造
スクリーニング工程での同定後、本開示の条件的活性型生物学的タンパク質を合成し、又は組換え生成することができる。本条件的活性型生物学的タンパク質はインビトロ又はインビボで組換え発現することができる。本条件的活性型生物学的タンパク質は当該技術分野において公知の任意の方法を用いて作製及び単離することができる。本条件的活性型生物学的タンパク質はまた、全体として又は部分的に、当該技術分野において周知の化学的タンパク質合成方法を用いて合成することもできる。例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ（１９８０）“Ｎｅｗ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２１５−２２３；Ｈｏｒｎ（１９８０），“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｏｎ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ．Ｐａｒｔ  ＩＩ：ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ２２  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｇａｓｔｒｉｃ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（ＧＩＰ）１，”Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２２５−２３２；Ｂａｎｇａ，Ａ．Ｋ．，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（１９９５）Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，Ｐａを参照のこと。例えば、ペプチド合成は、様々な固相技術を用いて実施することができ（例えば、Ｒｏｂｅｒｇｅ（１９９５）“Ａ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ａ  ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ  ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｎ  ａ  ｓｏｌｉｄ  ｓｕｐｐｏｒｔ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：２０２；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９９７）“Ｃｏｎｃｅｐｔ  ａｎｄ  ｅａｒｌｙ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２８９：３−１３を参照のこと）、例えば、ＡＢＩ  ４３  ＩＡペプチドシンセサイザー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を製造者によって提供される説明書に従い使用して、自動化された合成を実現してもよい。
【０３５５】
固相化学的ペプチド合成方法はまた、ポリペプチド又はフラグメントの合成に用いることができる。かかる方法は１９６０年代初頭から当該技術分野において公知となっており（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．，“Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｉ．Ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ，”Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，８５：２１４９−２１５４，１９６３）（また、Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｊ．Ｍ．ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，Ｊ．Ｄ．，“Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，”２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，１１１．，ｐｐ．１１−１２）も参照のこと）、最近では、市販の研究用ペプチド設計及び合成キット（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）に用いられている。かかる市販の研究用キットは、概してＨ．Ｍ．Ｇｅｙｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｕｓｅ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｔｏ  ｐｒｏｂｅ  ｖｉｒａｌ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｆｏｒ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｔｏ  ａ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１：３９９８（１９８４）の教示を利用しており、全てが単一のプレートに結合した多数の「ロッド」又は「ピン」の先端にペプチドを合成することを提供する。
【０３５６】
かかるシステムの利用時には、ロッド又はピンのプレートが逆さにして対応するウェル又はリザーバーの第２のプレートに挿入され、この第２のプレートは、適切なアミノ酸をピン又はロッドの先端に取り付け又は固定するための溶液を含む。このようなプロセス工程を繰り返すことによって、すなわちロッド及びピンの先端を逆さにして適切な溶液に挿入することにより、アミノ酸が構築されて所望のペプチドとなる。加えて、多くの利用可能なＦＭＯＣペプチド合成システムを利用できる。例えば、ポリペプチド又はフラグメントのアセンブリは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．のモデル４３１Ａ（商標）自動ペプチドシンセサイザーを用いて固体支持体上で行うことができる。かかる装置は、直接合成によるか、或いは他の公知の技法を用いて結合し得る一連のフラグメントの合成によって、本開示のペプチドを容易に入手する機会を提供する。
【０３５７】
本開示の条件的活性型生物学的タンパク質はまた、グリコシル化することもできる。グリコシル化は、化学的に、或いは細胞生合成機構によって、翻訳後に加えることができ、後者は公知のグリコシル化モチーフの使用を包含するものであり、グリコシル化モチーフは配列にとって天然であってもよく、又はペプチドとして加えられるか、若しくは核酸コード配列に加えられてもよい。グリコシル化はＯ結合型又はＮ結合型であってもよい。
【０３５８】
上記に定義するように、本開示の条件的活性型生物学的タンパク質には、あらゆる「模倣体」及び「ペプチド模倣体」の形態が含まれる。用語「模倣体」及び「ペプチド模倣体」は、本開示のポリペプチドと実質的に同じ構造的及び／又は機能的特性を有する合成の化学的化合物を指す。模倣体は、完全に合成非天然アミノ酸類似体で構成されてもよく、又は部分的に天然のペプチドアミノ酸と部分的に非天然のアミノ酸類似体とのキメラ分子である。模倣体はまた、置換が模倣体の構造及び／又は活性も実質的に変化させるものでない限り、任意の量の天然アミノ酸保存的置換を組み込むことができる。保存された変異体である本開示のポリペプチドと同じく、模倣体が本開示の範囲内にあるかどうか、すなわち、その構造及び／又は機能が実質的に改変されないことは、ルーチンの実験によって決定されることになる。
【０３５９】
本開示のポリペプチド模倣体組成物は、非天然構造成分の任意の組み合わせを含有し得る。代替的な態様において、本開示の模倣体組成物は、以下の３つの構造基：ａ）天然アミド結合（「ペプチド結合」）連結以外の残基連結基；ｂ）天然に存在するアミノ酸残基の代わりの非天然残基；又はｃ）二次構造の模倣を誘導する、すなわちそれにより二次構造、例えばβターン、γターン、βシート、αヘリックスコンホメーションなどを誘導し又は安定化させる残基のうちの１つ又は全てを含む。例えば、本開示のポリペプチドは、その残基の全て又は一部が天然のペプチド結合以外の化学的手段によってつなぎ合わされるとき、模倣体として特徴付けることができる。個々のペプチド模倣体残基は、ペプチド結合、他の化学結合又はカップリング手段、例えば、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、二官能性マレイミド、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）又はＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）などによってつなぎ合わされ得る。従来のアミド結合（「ペプチド結合」）連結の代わりとして使用し得る連結基としては、例えば、ケトメチレン（例えば、−Ｃ（．ｄｂｄ．Ｏ）−ＮＨ−に対する−Ｃ（．ｄｂｄ．Ｏ）−ＣＨ２−）、アミノメチレン（ＣＨ．ｓｕｂ．２−ＮＨ）、エチレン、オレフィン（ＣＨ．ｄｂｄ．ＣＨ）、エーテル（ＣＨ２−Ｏ）、チオエーテル（ＣＨ２−Ｓ）、テトラゾール（ＣＮ４−）、チアゾール、レトロアミド、チオアミド、又はエステルが挙げられる（例えば、Ｓｐａｔｏｌａ（１９８３），Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ．７，ｐｐ  ２６７−３５７，“Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ｍａｒｃｅｌｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎ．Ｙ．を参照のこと）。
【０３６０】
本開示のポリペプチドはまた、天然に存在するアミノ酸残基の代わりに全て又は一部の非天然残基を含有することによっても模倣体として特徴付けることができる。非天然残基については、科学文献及び特許文献に十分な記載がなされている；天然アミノ酸残基の模倣体として有用ないくつかの例示的な非天然組成物及びそれらの使用に関する指針は、以下に記載する。芳香族アミノ酸の模倣体は、例えば、Ｄ−又はＬ−ナフィルアラニン（ｎａｐｈｙｌａｌａｎｉｎｅ）；Ｄ−又はＬ−フェニルグリシン；Ｄ−又はＬ−２チエネイルアラニン（ｔｈｉｅｎｅｙｌａｌａｎｉｎｅ）；Ｄ−又はＬ−１，−２、３−、又は４−ピレネイルアラニン（ｐｙｒｅｎｅｙｌａｌａｎｉｎｅ）；Ｄ−又はＬ−３チエネイルアラニン（ｔｈｉｅｎｅｙｌａｌａｎｉｎｅ）；Ｄ−又はＬ−（２−ピリジニル）−アラニン；Ｄ−又はＬ−（３−ピリジニル）−アラニン；Ｄ−又はＬ−（２−ピラジニル）−アラニン；Ｄ−又はＬ−（４−イソプロピル）−フェニルグリシン；Ｄ−（トリフルオロメチル）−フェニルグリシン；Ｄ−（トリフルオロメチル）−フェニルアラニン；Ｄ−ｐ−フルオロ−フェニルアラニン；Ｄ−又はＬ−ｐ−ビフェニルフェニルアラニン；Ｄ−又はＬ−ｐ−メトキシ−ビフェニルフェニルアラニン；Ｄ−又はＬ−２−インドール（アルキル）アラニン；及びＤ−又はＬ−アルキルアニン類（ａｌｋｙｌａｎｉｎｅｓ）［ここで、アルキルは、置換又は非置換メチル、エチル、プロピル、ヘキシル、ブチル、ペンチル、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ−ブッチル（ｂｕｔｔｙｌ）、イソ−ペンチル、又は非酸性アミノ酸であってもよい］による置換によって作成することができる。非天然アミノ酸の芳香環としては、例えば、チアゾリル、チオフェニル、ピラゾリル、ベンズイミダゾリル、ナフチル、フラニル、ピロリル、及びピリジル芳香環が挙げられる。
【０３６１】
酸性アミノ酸の模倣体は、例えば、負電荷を維持する一方での非カルボキシル化アミノ酸；（ホスホノ）アラニン；硫酸化スレオニンによる置換によって作成することができる。カルボキシル側基（例えば、アスパルチル又はグルタミル）も、カルボジイミド（Ｒ’〜Ｎ−Ｃ−Ｎ−Ｒ’）、例えば、１−シクロヘキシル−３（２−モルホリニル（ｍｏφｈｏｌｉｎｙｌ）−（４−エチル）カルボジイミド又はｌ−エチル−３（４−アゾニア−４，４−ジメトールペンチル）カルボジイミドとの反応によって選択的に修飾することができる。アスパルチル又はグルタミルはまた、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニル及びグルタミニル残基に変換することもできる。塩基性アミノ酸の模倣体は、例えば、（リジン及びアルギニンに加えて）アミノ酸オルニチン、シトルリン、又は（グアニジノ）酢酸、又は（グアニジノ）アルキル酢酸（ここで、アルキルは、上記に定義される）による置換によって作成することができる。ニトリル誘導体（例えば、ＣＯＯＨの代わりにＣＮ部分を含む）は、アスパラギン又はグルタミンを置換することができる。アスパラギニル及びグルタミニル残基は、対応するアスパルチル又はグルタミル残基に対して脱アミノ化することができる。アルギニン残基模倣体は、アルギニルと、例えば１つ以上の従来の試薬、例えばフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロ−ヘキサンジオン、又はニンヒドリンとの、好ましくはアルカリ性条件下での反応によって作成することができる。チロシン残基模倣体は、チロシルと、例えば芳香族ジアゾニウム化合物又はテトラニトロメタンとの反応によって作成することができる。Ｎ−アセチルイミジゾール（ａｃｅｔｙｌｉｍｉｄｉｚｏｌ）及びテトラニトロメタンを使用して、それぞれＯ−アセチルチロシル種及び３−ニトロ誘導体を形成することができる。システイン残基模倣体は、システイニル残基と、例えば２−クロロ酢酸又はクロロアセトアミドなどのα−ハロ酢酸及び対応するアミン類との反応によって；カルボキシメチル又はカルボキシアミドメチル誘導体を得て作成することができる。システイン残基模倣体はまた、システイニル残基と、例えばブロモ−トリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル（ｉｍｉｄｏｚｏｙｌ））プロピオン酸；クロロアセチルリン酸塩、Ｎ−アルキルマレイミド類、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド；メチル２−ピリジルジスルフィド；ｐ−クロロメルクリ安息香酸塩；２−クロロメルクリ−４ニトロフェノール；及びクロロ−７−ニトロベンゾ−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応によって作成することもできる。リジン模倣体は、リシニルと、例えばコハク酸又は他のカルボン酸無水物との反応によって作成することができる（及びアミノ末端残基を改変することができる）。リジン及び他のα−アミノ含有残基模倣体はまた、イミドエステル、例えば、メチルピコリンイミデート、ピリドキサールリン酸、ピリドキサール、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソウレア、２，４、ペンタンジオンとの反応、及びグリオキシル酸塩とのトランスアミダーゼ触媒反応によって作成することもできる。メチオニンの模倣体��、例えばメチオニンスルホキシドとの反応によって作成することができる。プロリンの模倣体には、例えば、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、３−又は４−ヒドロキシプロリン、デヒドロプロリン、３−又は４−メチルプロリン、又は３，３，−ジメチルプロリンが含まれる。ヒスチジン残基模倣体は、ヒスチジルと、例えばジエチルプロカーボネート又はパラブロモフェナシルブロミドとの反応によって作成することができる。他の模倣体としては、例えば、プロリン及びリジンのヒドロキシル化；セリル又はスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化；リジン、アルギニン及びヒスチジンのα−アミノ基のメチル化；Ｎ末端アミンのアセチル化；主鎖アミド残基のメチル化又はＮ−メチルアミノ酸による置換；又はＣ末端カルボキシル基のアミド化によって作成されるものが挙げられる。
【０３６２】
本開示のポリペプチドの残基、例えばアミノ酸はまた、逆のキラリティーのアミノ酸（又はペプチド模倣体残基）によって置換されてもよい。従って、Ｌ−配置（化学的実体の構造に応じてＲ又はＳとも称することができる）で天然に存在する任意のアミノ酸は、Ｄ−アミノ酸（Ｒ型又はＳ型とも称することができる）と称される同じ化学構造タイプの、しかし逆のキラリティーのペプチド模倣体のアミノ酸で置換することができる。
【０３６３】
本発明の模倣ポリペプチドは、任意のタンパク質化学合成技術を用いて合成し得る。典型的なインビトロタンパク質合成プロセスでは、ペプチドとアミノ酸との間にペプチド結合が形成されることによってペプチドの長さが１アミノ酸ずつ伸長する。ペプチド結合の形成はライゲーション反応であり、これは天然アミノ酸又は非天然アミノ酸を用い得る。このように、非天然アミノ酸を本発明のポリペプチドに導入して模倣体を作製することができる。
【０３６４】
タンパク質化学合成技術については、Ｎｉｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．，ｖｏｌ．３４，ｐａｇｅ  ９１−１１８，２００５（参照により本明細書に援用される）に記載されている。固相合成法及び半合成法も、新規アミノ酸を含有するいくつもの小タンパク質の合成を可能にしている。例えば、以下の刊行物を参照のこと：Ｃｒｉｃｋ，Ｆ．Ｊ．Ｃ．，Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｌ．Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｓ．Ｗａｔｔｓ−Ｔｏｂｉｎ，Ｒ．“Ｇｅｎｅｒａｌ  ｎａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｎａｔｕｒｅ，１２２７−１２３２（１９６１）；Ｈｏｆｍａｎｎ，Ｋ．，Ｂｏｈｎ，Ｈ．“Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ．ＸＸＸＶＩ．Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｐｙｒａｚｏｌｅ−ｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｓ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ｏｆ  ａｎ  Ｓ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ，”Ｊ．Ａｍ  Ｃｈｅｍ，５９１４−５９１９（１９６６）；Ｋａｉｓｅｒ，Ｅ．Ｔ．“Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｅｎｙｚｍｅｓ，”Ａｃｃ  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ，４７−５４（１９８９）；Ｎａｋａｔｓｕｋａ，Ｔ．，Ｓａｓａｋｉ，Ｔ．，Ｋａｉｓｅｒ，Ｅ．Ｔ．“Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｅｇｍｅｎｔ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅ  ｔｈｉｏｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ，”Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ，３８０８−３８１０（１９８７）；Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ，Ｍ．，Ｋｅｎｔ，Ｓ  Ｂ  Ｈ．“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｄｏｖｅｔａｉｌｉｎｇ  ｕｎｐｒｏｔｅｃｔｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｂａｃｋｂｏｎｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ＨＩＶ  ｐｒｏｔｅａｓｅ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２１−２２５（１９９２）；Ｃｈａｉｋｅｎ，Ｉ．Ｍ．“Ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，２５５−３０１（１９８１）；Ｏｆｆｏｒｄ，Ｒ．Ｅ．“Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｂｙ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｅａｎｓ？”Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，１５１−１５７（１９８７）；及びＪａｃｋｓｏｎ，Ｄ．Ｙ．，Ｂｕｒｎｉｅｒ，Ｊ．，Ｑｕａｎ，Ｃ．，Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｍ．，Ｔｏｍ，Ｊ．，Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．“Ａ  Ｄｅｓｉｇｎｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｇａｓｅ  ｆｏｒ  Ｔｏｔａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ａ  ｗｉｔｈ  Ｕｎｎａｔｕｒａｌ  Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ｒｅｓｉｄｕｅｓ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３（１９９４）。
【０３６５】
本発明の模倣ポリペプチドはまた、組換え技術によって作製されてもよく、組換え技術では、ポリペプチドのコード配列が発現ベクターに挿入され、且つ真核細胞産生宿主のタンパク質翻訳機構を利用してポリペプチドが産生される。タンパク質翻訳機構はコード配列のコドンを読み取り、ｔＲＮＡを使用してコードされたアミノ酸を繰り込んで、ポリペプチドを産生する。タンパク質翻訳機構を改変して組換えポリペプチドへの非天然アミノ酸の組み込みを可能にするために用い得るいくつかの技術がある。立証済みの手法は、アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼによる非天然アミノ酸の認識に依存し、このシンテターゼは一般に、タンパク質翻訳の忠実度を保証するため高い選択性を必要とする。非天然アミノ酸がｔＲＮＡに連結し、次にはｔＲＮＡが非天然アミノ酸をポリペプチドへの組み込みのためタンパク質翻訳機構に持ち込み得るように、これらのシンテターゼを操作して基質特異性を緩和し得る。例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）フェニルアラニル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＰｈｅＲＳ）においてＡｌａ２９４をＧｌｙに置き換えると、基質結合ポケットのサイズが増加し、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン（ｐ−Ｃｌ−Ｐｈｅ）によるｔＲＮＡＰｈｅのアシル化がもたらされることが分かった。Ｍ．Ｉｂｂａ，Ｐ．Ｋａｓｔ  ａｎｄ  Ｈ．Ｈｅｎｎｅｃｋｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３３：７１０７（１９９４）を参照のこと。この変異ＰｈｅＲＳを担持する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株は、フェニルアラニンに代えてｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン又はｐ−Ｂｒ−フェニルアラニンの組み込みを可能にする。例えば、Ｍ．Ｉｂｂａ  ａｎｄ  Ｈ．Ｈｅｎｎｅｃｋｅ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，３６４：２７２（１９９５）；及びＮ．Ｓｈａｒｍａ，Ｒ．Ｆｕｒｔｅｒ，Ｐ．Ｋａｓｔ  ａｎｄ  Ｄ．Ａ．Ｔｉｒｒｅｌｌ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４６７：３７（２０００）を参照のこと。同様に、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）チロシル−ｔＲＮＡシンテターゼのアミノ酸結合部位近傍における点突然変異Ｐｈｅ１３０Ｓｅｒが、チロシンより効率的なアザチロシンの組み込みを可能にすることが示された。Ｆ．Ｈａｍａｎｏ−Ｔａｋａｋｕ，Ｔ．Ｉｗａｍａ，Ｓ．Ｓａｉｔｏ−Ｙａｎｏ，Ｋ．Ｔａｋａｋｕ，Ｙ．Ｍｏｎｄｅｎ，Ｍ．Ｋｉｔａｂａｔａｋｅ，Ｄ．Ｓｏｌｌ  ａｎｄ  Ｓ．Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５：４０３２４（２０００）を参照のこと。
【０３６６】
最初の方法は、センスコドンを割り当てし直すことによって機能し、これは少なくとも１つのアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼを操作するものである。この酵素は、通常、タンパク質合成のためタンパク質翻訳機構に輸送されるようにｔＲＮＡに天然アミノ酸を付加する。しかしながら、特定のｔＲＮＡに対するアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼは、それが非天然アミノ酸を非特異的にｔＲＮＡに変化させてｔＲＮＡを活性化するあるレベルの混乱を有し得るように改変し得る。活性化されたｔＲＮＡは、その非天然アミノ酸をタンパク質翻訳機構（リボソーム）に運び、コード配列のコドンが特定のｔＲＮＡを要求するペプチドに非天然アミノ酸を付加し得る。換言すれば、特定のｔＲＮＡのコドンが非天然アミノ酸に割り当てし直されている。組換えポリペプチドは１９個の天然アミノ酸と少なくとも１個の非天然アミノ酸とを含み、ここではポリペプチドにおける１個の天然アミノ酸が少なくとも１個の非天然アミノ酸に置き換えられている。非天然アミノ酸による天然アミノ酸の置換の成功は、天然アミノ酸の生合成が欠損した栄養要求性の発現宿主の使用に依存する。かかる宿主を用いると、割り当てし直されたセンスコドンに関する天然アミノ酸からの競合が抑えられ、標的タンパク質の組み込み効率及び収率が向上する。多くのアミノ酸（Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ等を含む）のコドンが割り当てし直されており、６０を超える非天然アミノ酸がこの方法によってタンパク質に組み込まれている。Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．７３，ｐａｇｅｓ  １４７−１７６，２００４；Ｖｏｌｏｓｈｃｈｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｆｏｒ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｂｉｏｌｏｇｙ，”Ｍｏｌ．Ｂｉｏｓｙｓｔ．，ｖｏｌ．６，ｐａｇｅｓ  ６５−８０，２０１０（両方ともに参照により本明細書に援用される）を参照のこと。
【０３６７】
この方法の主な制約は、非天然アミノ酸がポリペプチド配列全体にわたって天然アミノ酸を置き換えることであり、かかる大域的置換が望ましくない場合、これによってその適用が限られたものとなり得る。１つの解決法は、望ましくない部位（置換されるべきでない）を他の天然アミノ酸に突然変異させて、所望の置換部位のみを非天然アミノ酸のために取っておくことである。この修飾により、この方法は非天然アミノ酸を任意の所望の部位に部位特異的に導入して模倣ポリペプチドを作製し得る。
【０３６８】
模倣組換えポリペプチドの別の作製方法は、ゆらぎコドンを使用することによる。ゆらぎコドンとは、ｔＲＮＡによって非古典的ワトソン・クリック型塩基対合を用いて解読されるコドンを指す。非古典的（又はゆらぎ）対合は、「ゆらぎ仮説」において提唱されるように、ｔＲＮＡの１番目のアンチコドン塩基（これはコドントリプレットに対して３番目の塩基と対合する）の修飾によって可能となる。例えば、多くの生物がＰｈｅの２つのコドン：ＵＵＵ及びＵＵＣを解読するため唯１つのｔＲＮＡを有する。結果として、ｔＲＮＡ上のＧＡＡアンチコドンがワトソン・クリック型塩基対合でＵＵＣコドンに結合し、「ゆらぎ」塩基対合でＵＵＵコドンに結合する。
【０３６９】
コドンとアンチコドンとの間のゆらぎ対合のため、１つのｔＲＮＡがいくつかのコドンと対合し、所与のコドンが２つ以上のｔＲＮＡと対合し得る。この特性を利用して、ゆらぎコドンを非天然アミノ酸に割り当てて、天然アミノ酸と少なくとも１つの非天然アミノ酸とを含む組換えタンパク質を生成し得る。例えば、Ｐｈｅは通常、２つのコドンＵＵＣ及びＵＵＵによってコードされ、両方のコドンとも単一のｔＲＮＡによって認識される。アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼと、非天然アミノ酸に対して特異性を有し、且つ「ＡＡＡ」アンチコドンを含有するｔＲＮＡとの直交ペアを発現させることにより、ＵＵＵコドンでの非天然アミノ酸の効率的な導入を実現し得る（Ｋｗｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｂｒｅａｋｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ，”Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，ｖｏｌ．１２５，ｐａｇｅｓ  ７５１２−７５１３，２００３、参照により本明細書に援用される）。この方法では、Ｐｈｅが本質的に定量的にＵＵＣコドンに割り当てられ、及び非天然アミノ酸がＵＵＵゆらぎコドンに割り当てられ得る。さらに、非天然アミノ酸の複数のコピーをポリペプチドに部位特異的に導入することができる。
【０３７０】
組換え模倣ポリペプチドを生成するための第３の方法は、バイアスを有するコドンを使用することによる。好ましいコドンは生物間で異なり、さらには同じ生物の異なる組織又は細胞型の間でも異なる。ｔＲＮＡ種の細胞内容が、タンパク質の合成速度及び量の決定要因である。結果として、異種宿主細胞における組換えタンパク質産生は、多くの場合に好ましい宿主細胞コドンバイアスに適合するようにコドンが最適化される（種々の生物のコドン使用データベース及び所与の遺伝子のコドン分析については、以下を参照することができる：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／）。
【０３７１】
バイアスを有するコドン使用は、組換えポリペプチドに非天然アミノ酸を導入するための別の方法をもたらす。例えば、Ａｒｇの６個の縮重コドンのうち、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において、ＡＧＧ及びＡＧＡは稀にのみ使用される。アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼとＡＧＧコドンと対合するｔＲＮＡとの直交ペアを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現宿主に導入すると、非天然アミノ酸をｔＲＮＡに連結することが可能になり得る。従って、非天然アミノ酸が連結しているｔＲＮＡは、通常Ａｒｇがコードされ得るコドンＡＧＧに非天然アミノ酸を持ち込むことができる。この方法は、インビトロ無細胞ベースのシステムで実現可能であることが分かっており、ここではＡＧＧコソン（ｃｏｓｏｎ）と対合するｔＲＮＡに連結した化学合成非天然アミノ酸がＡＧＧコドンに組み込まれた（Ｈｏｈｓａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，ｖｏｌ．３４４，ｐａｇｅｓ  １７１−１７４，１９９４）。この方法は、ｔＲＮＡに非天然直交を連結するようにアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼを操作し得る場合、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞ベースの発現システムに適合させることができる。
【０３７２】
同様に、コドンバイアスを呈する哺乳類細胞においてバイアスコドンを非天然アミノ酸に割り当て得る。例えば、Ｆｒａｚｅｒ及び共同研究者らは、種々の哺乳類細胞におけるヒトパピローマウイルス遺伝子発現の研究を通じて、パピローマウイルスタンパク質発現がコドン使用及びｔＲＮＡの利用可能性によって決まることを見出している。分化及び未分化ケラチノサイト間にｔＲＮＡプールの実質的な違いが発見されており（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｇｅｎｅ  ｃｏｄｏｎ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｖｉｒａｌ  ｃａｐｓｉｄ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ，”Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．２５，ｐａｇｅｓ  ８６４３−８６５５，２００５）、及びそれらのｔＲＮＡに観察されたバイアスが、パピローマウイルスが専ら上皮細胞で複製する理由であり得る。例えば、ＣＨＯ及びＣｏｓ１細胞において、ＴＣＧがバイアスであり、従って非天然アミノ酸に割り当て得るものと見られる。
【０３７３】
コドンバイアス現象は種々の真核生物に広範に存在するため、かかるコドンを利用した非天然アミノ酸の部位特異的組み込みは、多くの真核細胞産生宿主において応用し得る。制約があるとすれば、産生宿主におけるバイアスを有するコドンと対合し得るｔＲＮＡに非天然直交を連結するためのアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼの操作であり得る。
【０３７４】
模倣ポリペプチドを作製する第４の方法は、終止コドンの抑制による。概して、タンパク質翻訳は、タンパク質終結因子（ＲＦ）の作用によって３つの終止コドン（ＵＡＧ（アンバー）、ＵＡＡ（オーカー）及びＵＧＡ（オパール）によってコードされる）のうちの１つで終結する。しかしながら、あるアミノ酸を有する終止コドンの偶発的なリードスルーが様々な種において天然で起こることが観察されている。この抑制は、ｔＲＮＡアンチコドンの突然変異又はコドン−アンチコドンのミスマッチのいずれかによって引き起こされる（Ｂｅｉｅｒ＆Ｇｒｉｍｍ，“Ｍｉｓｒｅａｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｃｏｄｏｎｓ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ  ｂｙ  ｎａｔｕｒａｌ  ｎｏｎｓｅｎｓｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｔＲＮＡｓ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．２９，ｐａｇｅｓ  ４７６７−４７８２，２００１）。終止コドン抑制の利用は、非天然アミノ酸を含有するタンパク質を作製するための別の方法に相当し、概して、終止コドンと対合し得るｔＲＮＡに非天然アミノ酸を連結することのできるアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼの導入が関わる。例えば、アンバーコドンは真核生物ゲノム（ヒトにおいて２３％）及び原核生物ゲノム（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において７％）の両方で使用頻度が最も低い終止コドンであることに伴い、アンバーコドンに部位特異的に非天然アミノ酸を導入するため、アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ及びアンバー終止コドンと対合するｔＲＮＡが開発されている（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ，”Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｖｏｌ．４，ｐａｇｅｓ  ２３９−２４４，２００７）。オーカー及びオパール終止コドンも同様に非天然アミノ酸の導入に使用されている（Ｋｏｅｈｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｓｅｔ  ｏｆ  ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ２１ｓｔ  ａｍｉｎｏａｃｙｌ−ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ−ａｍｂｅｒ，ｏｃｈｒｅ  ａｎｄ  ｏｐａｌ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｔＲＮＡ  ｐａｉｒｓ：ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｃｏｄｏｎｓ  ｉｎ  ａｎ  ｍＲＮＡ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．３２，ｐａｇｅｓ  ６２００−６２１１，２００４）。これまでに、この方法によって７０を超える非天然アミノ酸が組換えタンパク質に部位特異的に組み込まれている（Ｌｉｕ＆Ｓｃｈｕｌｔｚ，“Ａｄｄｉｎｇ  ｎｅｗ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｉｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ，”Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．７９，ｐａｇｅｓ  ４１３−４４４，２０１０）。典型的には、所望の部位において９５％を超える非天然アミノ酸組み込み効率（完全長産物における非天然アミノ酸の占有率として定義される）を達成することができ、非天然アミノ酸の組み込みに最も高頻度で使用される方法の１つとなっている。
【０３７５】
本発明はまた、非天然アミノ酸を組換えポリペプチドに導入するための当業者に公知の任意の他の技術も包含する。１つのかかる技術は、４塩基対コドンの使用を含む（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ  ｗｉｔｈ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｑｕａｄｒｕｐｌｅｔ  ｃｏｄｏｎ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，ｖｏｌ．１０１，ｐａｇｅｓ  ７５６６−７５７１，２００４）。模倣組換えポリペプチドの作製に関するさらなる考察については、米国特許第７，０４５，３３７号明細書及び国際公開第２０１０１３２３４１Ａ２号パンフレット（参照により本明細書に援用される）を参照し得る。
【０３７６】
上記で考察したように、真核細胞産生宿主における条件的活性型生物学的タンパク質の発現最適化はまた、用いるベクター（ベクター成分、例えば、プロモーター、スプライス部位、５’及び３’末端及びフランキング配列）の最適化、宿主細胞の遺伝子修飾による遺伝子欠失及び再構成の低減、関連性のある遺伝子をインビボ又はインビトロで発達させる方法による宿主細胞遺伝子活性の発達、関連性のある遺伝子を発達させることによる宿主グリコシル化酵素の最適化によって、及び／又は染色体ワイドな宿主細胞突然変異誘発及び発現能が増進した細胞を選択するための選択戦略によっても達成することができる。宿主細胞については本明細書にさらに記載する。
【０３７７】
一態様において、真核細胞発現を最適化するため抗体の定常領域でコドン突然変異誘発が実施される。エフェクター機能を媒介する能力を保持している向上した発現特性のコドン最適化Ｆｃ変異体は、治療用抗体の産生を改善する。この態様において、例えば、抗体分子の定常領域は、異なる発現宿主におけるスクリーニング、例えば、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３及びＣＯＳ−７を利用した哺乳類細胞株発現スクリーニング用に発達させることができる。
【０３７８】
本開示はまた、翻訳後プロセシング（例えばリン酸化、アシル化等）などの天然の過程によるか、或いは化学修飾技術による本開示のポリペプチドの修飾方法を提供する。修飾は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖及びアミン又はカルボキシル末端を含むポリペプチドのどこに行われてもよい。同じタイプの修飾が、所与のポリペチドのいくつかの部位に同じ又は様々な程度で存在し得ることは理解されるであろう。また、所与のポリペチドが多くの種類の修飾を有することができる。修飾には、アセチル化、アシル化、ＰＥＧ化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋性環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化（ｍｙｒｉｓｔｏｌｙａｔｉｏｎ）、酸化、ペグ化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイレーション（ｓｅｌｅｎｏｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化、及びアルギニル化等のトランスファーＲＮＡ媒介性のタンパク質へのアミノ酸付加が含まれる。Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１−１２（１９８３）を参照のこと。
【０３７９】
合成ポリペプチド又はそのフラグメントは、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法によって回収し、精製することができる。必要に応じて、ポリペプチドの構造を完成させるにおいて、タンパク質リフォールディング工程を用いることができる。必要であれば、最終的な精製工程に高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いることができる。
【０３８０】
本開示は、少なくとも１つの条件的活性型生物学的タンパク質を含む製剤（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）又は製剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）を提供するものであり、製剤は液状か、又は乾燥している。タンパク質製剤は、任意選択で、緩衝液、補因子、第２の又は追加のタンパク質、及び任意選択で１つ以上の賦形剤を含む。一態様において、製剤は、例えば、温度、ｐＨ、浸透圧、酸化的ストレス及び重量オスモル濃度が異常な又は非生理条件下では活性であるが、正常な生理条件下では低活性又は不活性である、治療用の条件的活性型生物学的タンパク質として利用される。
【０３８１】
組換え又は合成の条件的活性型生物学的タンパク質のいずれにも、標準的な精製技法を用い得る。
【０３８２】
一部の実施形態において、条件的活性型生物学的タンパク質の作製に使用される真核細胞産生宿主は、発達させる工程によって生じた変異ＤＮＡの発現に使用されるものと同じ真核細胞産生宿主である。一実施形態において、真核細胞産生宿主は、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＩＭ９、ＤＳ−１、ＴＨＰ−１、Ｈｅｐ  Ｇ２、ＣＯＳ、ＮＩＨ  ３Ｔ３、Ｃ３３ａ、Ａ５４９、Ａ３７５、ＳＫ−ＭＥＬ−２８、ＤＵ  １４５、ＰＣ−３、ＨＣＴ  １１６、Ｍｉａ  ＰＡＣＡ−２、ＡＣＨＮ、Ｊｕｒｋａｔ、ＭＭ１、Ｏｖｃａｒ  ３、ＨＴ  １０８０、Ｐａｎｃ−１、Ｕ２６６、７６９Ｐ、ＢＴ−４７４、Ｃａｃｏ−２、ＨＣＣ  １９５４、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＬｎＣＡＰ、ＮＲＫ−４９Ｆ、及びＳＰ２／０細胞株；並びにマウス脾細胞及びウサギＰＢＭＣからなる群の１つから選択される哺乳類系である。
【０３８３】
一実施形態において、候補の製造には、線維芽細胞（３Ｔ３、マウス；ＢＨＫ２１、シリアンハムスター）、上皮細胞（ＭＤＣＫ、イヌ；Ｈｅｌａ、ヒト；ＰｔＫ１、ネズミカンガルー）、形質細胞（（ＳＰ２／０及びＮＳ０、マウス）、腎細胞（２９３、ヒト；ＣＯＳ、サル）、卵巣細胞（ＣＨＯ、チャイニーズハムスター）及び胚細胞（Ｒ１及びＥ１４．１、マウス；Ｈ１及びＨ９、ヒト；ＰＥＲ  Ｃ．６、ヒト）を含めた種々の哺乳類細胞産生宿主を使用することができる。
【０３８４】
特定の態様において、組換え条件的活性型生物学的抗体は、ＣＨＯ、ＮＳ０及びＳＰ２／０細胞株で作製される。ある具体的な態様において、哺乳類産生宿主はＣＨＯ−Ｓ細胞株である。最もよく用いられる発現ベクター系は、グルタミンシンテターゼ発現系及びジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子ベースの他のものである。
【０３８５】
別の実施形態において、真核細胞産生宿主は酵母細胞系である。一態様において、酵母細胞系は、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又はピキア（ｐｉｃｃｈｉａ）細胞から選択される。
【０３８６】
本発明の方法において、発達させた分子のスクリーニングに使用される産生宿主は、選択された分子の下流の製造に使用される宿主と同じである。本発明の別の態様において、タンパク質を発見し及び発達させるために使用される遺伝系は、商業用途のタンパク質の製造に使用される遺伝系と全く同じである。
【０３８７】
条件的活性型生物学的タンパク質の操作
本発明の条件的活性型生物学的タンパク質は、本明細書に記載される１つ以上のタンパク質操作技術によって操作し得る。タンパク質操作技術の非限定的な例としては、抗体コンジュゲーション、多重特異性抗体の操作、及び抗体のＦｃ領域の操作が挙げられる。
【０３８８】
コンジュゲート条件的活性型抗体の操作
本発明によって提供される条件的活性型抗体は分子にコンジュゲートし得る。条件的活性型抗体は脳、滑液、腫瘍微小環境、又は幹細胞ニッチで優先的に作用するため、条件的活性型抗体は、条件的活性型抗体と共に脳、滑液又は腫瘍微小環境に輸送されることになる分子（治療剤又は診断剤）にコンジュゲートし得る。一部の実施形態において、分子は毒性を有し、これは疾患部位で優先的に作用するように条件的活性型抗体にコンジュゲートすることによって低減し得る。
【０３８９】
条件的活性型抗体と分子（治療薬又は診断薬）とのコンジュゲーションは、共有結合性であっても又は非共有結合性であってもよい。共有結合性のコンジュゲーションは、直接か、又はリンカーを介するかのいずれかであり得る。特定の実施形態において、直接のコンジュゲーションはタンパク質融合物の構築によって（すなわち、条件的活性型抗体及び例えば神経障害の治療用薬物をコードする２つの遺伝子の遺伝子融合並びに単一のタンパク質としての発現によって）達成される。特定の実施形態において、直接のコンジュゲーションは、条件的活性型抗体の２つの部分のうちの一方の反応基と神経薬／造影剤上の対応する基又はアクセプターとの間の共有結合の形成による。特定の実施形態において、直接のコンジュゲーションは、コンジュゲートされる他方の分子と適切な条件下で共有結合を形成する反応基（非限定的な例として、スルフヒドリル基又はカルボキシル基）を含めるための、コンジュゲートされる２つの分子のうちの一方の修飾（すなわち、遺伝子修飾）による。１つの非限定的な例として、所望の反応基（すなわち、システイン残基）を有する分子（すなわち、アミノ酸）が例えば条件的活性型抗体に導入され、神経薬とジスルフィド結合を形成し得る。核酸とタンパク質との共有結合性のコンジュゲーション方法も当該技術分野において公知である（すなわち、光架橋、例えば、Ｚａｔｓｅｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｒｕｓｓ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，７４：７７−９５（２００５）を参照のこと）。非共有結合性のコンジュゲーションは、当業者が容易に理解するであろうように、疎水結合、イオン結合、静電相互作用などを含めた任意の非共有結合手段によることができる。コンジュゲーションはまた、種々のリンカーを使用して実施してもよい。例えば、条件的活性型抗体と神経薬とは、種々の二機能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステル類の二機能性誘導体（アジプイミド酸ジメチルＨＣｌなど）、活性エステル類（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド類（グルタルアルデヒドなど）、ビスアジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビスジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート類（トルエン２，６−ジイソシアネートなど）、及びビス活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）を使用してコンジュゲートし得る。ペプチド結合によってつながった１〜２０アミノ酸で構成されるペプチドリンカーも使用し得る。特定のかかる実施形態において、アミノ酸は、２０個の天然に存在するアミノ酸から選択される。特定の他のかかる実施形態において、アミノ酸の１つ以上は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン及びリジンから選択される。リンカーは、脳への送達時に神経薬の遊離を促進する「開裂可能なリンカー」であってもよい。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、��解離性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５２：１２７−１３１（１９９２）；米国特許第５，２０８，０２０号明細書）が用いられてもよい。抗体コンジュゲーション用の架橋剤試薬のいくつかの例としては、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＬＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、及びＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）が挙げられる。
【０３９０】
コンジュゲートされた治療剤は、放射性粒子、化学療法薬、又は細胞毒素（すなわちサイトトキシン）など、体にとって毒性であり得る。本発明の条件的活性型抗体を使用してコンジュゲートされた治療剤を疾患部位に送達すると、これらの治療剤の毒性作用が大幅に低下し得る。放射性粒子を抗体にコンジュゲートする技術は当該技術分野において公知である。イブリツモマブチウキセタン（Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標））及びトシツモマブ（Ｂｅｘｘａｒ（登録商標））は、放射性粒子がコンジュゲートされたモノクローナル抗体の例である。両方とも、異なる放射性粒子がコンジュゲートされた、ＣＤ２０抗原に対する抗体である。同様に、化学療法薬を抗体にコンジュゲートする技術も当該技術分野において公知である。化学療法薬がコンジュゲートされた２つの市販の抗体、すなわち、ブレンツキシマブベドチン（Ａｄｃｅｔｒｉｓ（登録商標））及びａｄｏ−トラスツズマブエムタンシン（Ｋａｄｃｙｌａ（商標））がある。ブレンツキシマブベドチンは、ＭＭＡＥと呼ばれる化学療法薬に結合した、ＣＤ３０抗原（Ｂ細胞及びＴ細胞に見られる）を標的化する抗体でできている。ａｄｏ−トラスツズマブエムタンシンは、ＤＭ１と呼ばれる化学療法薬に結合した、ＨＥＲ２タンパク質を標的化する抗体でできている。細胞毒素を抗体にコンジュゲートする技術も当該技術分野において公知である。例えば、デニロイキンジフチトクス（Ｏｎｔａｋ（登録商標）、制癌薬）は、ジフテリアを引き起こす細菌に由来する毒素に結合したインターロイキン−２（ＩＬ−２）として知られる免疫系タンパク質からなる。
【０３９１】
任意の放射性粒子、化学療法薬、及び細胞毒素が、これらの薬剤の副作用を低減するため本発明の条件的活性型抗体にコンジュゲートされ得ることが企図される。
【０３９２】
一部の実施形態において、異常組織の治療のため、放射性粒子が条件的活性型抗体にコンジュゲートされる。放射性粒子は、１つ以上の放射性同位元素を含浸させた粒子を含んでもよく、典型的には異常組織における細胞の局所領域的アブレーションに十分な放射能を有し得る。こうした粒子は、ガラス、金属、樹脂、アルブミン、又はポリマーを含み得る。放射性粒子における金属は、鉄、ガドリニウム、及びカルシウムから選択され得る。放射性粒子における１つ以上の放射性同位元素の例は、ガリウム−６７（６７Ｇａ）、イットリウム−９０（９０Ｙ）、ガリウム−６８（６８Ｇａ）、タリウム−２０１（２０１Ｔ１）、ストロンチウム−８９（８９Ｓｒ）、インジウム−ＩＩＩ（１１１Ｉｎ）、ヨウ素−１３１（１３１Ｉ）、サマリウム−１５３（１５３Ｓｍ）、テクネチウム−９９ｍ（９９ｍＴｃ）、レニウム−１８６（１８６Ｒｅ）、レニウム−１８８（１８８Ｒｅ）、銅−６２（６２Ｃｕ）、及び銅−６４（６４Ｃｕ）からなる群から選択される。好ましくは、組成物中の放射性同位元素は、ベータ線、ガンマ線、及び／又は陽電子を放射する。
【０３９３】
一部の実施形態において、条件的活性型抗体にコンジュゲートされる化学療法薬は、アントラサイクリン類、トポイソメラーゼＩ及び／又はＩＩ阻害薬、紡錘体毒植物性アルカロイド、アルキル化剤、抗代謝産物、プリン又はピリミジン類似体、抗葉酸剤、エリプチシン及びハルミンからなる群から選択される。
【０３９４】
アントラサイクリン類（又はアントラサイクリン系抗生物質）は、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）細菌に由来する。これらの化合物は、例えば、肝細胞癌、白血病、リンパ腫、乳癌、子宮癌、卵巣癌、及び肺癌を含めた多種多様な癌の治療に用いられる。アントラサイクリン類としては、限定はされないが、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、バルルビシン、ピラルビシン、ゾルビシン、アクラルビシン、デトルビシン、カルミノマイシン、モルホリノドキソルビシン、モルホリノダウノルビシン、メトキシモルホリニルドキソルビシン、及びこれらの薬学的に受容可能な塩が挙げられる。
【０３９５】
トポイソメラーゼ類は、ＤＮＡのトポロジーを維持する必須酵素である。Ｉ型又はＩＩ型トポイソメラーゼの阻害は、適切なＤＮＡ超らせん形成を混乱させることによってＤＮＡの転写及び複製の両方を妨げる。一部のＩ型トポイソメラーゼ阻害薬にはカンプトテシン誘導体が含まれる。カンプトテシン誘導体とは、イリノテカン、トポテカン、ヘキサテカン（ｈｅｘａｔｅｃａｎ）、シラテカン、ルトルテカン（ｌｕｔｏｒｔｅｃａｎ）、カレニテシン（ＢＮＰ１３５０）、ギマテカン（ＳＴ１４８１）、ベロテカン（ＣＫＤ６０２）、及びこれらの薬学的に受容可能な塩などのカンプトテシン類似体を指す。ＩＩ型トポイソメラーゼ阻害薬の例としては、限定はされないが、アムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシド及びテニポシドが挙げられる。アメリカミヤオソウ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍａｙａｐｐｌｅ）（ポドフィルム・ペルタツム（Ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｐｅｌｔａｔｕｍ））の根に天然に存在するアルカロイドであるエピポドフィロトキシン類の半合成誘導体がある。
【０３９６】
紡錘体毒植物性アルカロイドは植物に由来し、細胞分裂に必須の微小管機能を妨げることによって細胞分裂を遮断する。これらのアルカロイド類としては、限定はされないが、ビンカアルカロイド類（ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン及びビンポセチンなど）及びタキサン類が挙げられる。タキサン類としては、限定はされないが、パクリタキセル、ドセタキセル、ラロタキセル、カバジタキセル、オルタタキセル、テセタキセル、及びこれらの薬学的に受容可能な塩が挙げられる。
【０３９７】
アルキル化剤は、細胞に存在する条件下で多くの電気陰性基にアルキル基を付加するその能力から、そのように呼ばれる。アルキル化剤は、生物学的に重要な分子におけるアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、及びリン酸基と共有結合を形成することによって細胞機能を損なう。注目すべきことに、その細胞傷害性はＤＮＡ合成の阻害によって生じると考えられている。アルキル化剤としては、限定はされないが、メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、イホスファミド及び白金化合物、例えば、オキサリプラチン、シスプラチン又はカルボプラチンが挙げられる。
【０３９８】
抗代謝産物は、正常な代謝の一部である代謝産物の使用を阻害する化学物質である。かかる物質は、多くの場合、それが妨害する代謝産物と構造が類似している。抗代謝産物が存在すると、細胞成長及び細胞分裂が変化する。
【０３９９】
プリン又はピリミジン類似体は、ＤＮＡへのヌクレオチドの組み込みを妨げて、ＤＮＡ合成、従って細胞分裂を停止させる。これらはまた、ＲＮＡ合成にも影響を及ぼす。プリン類似体の例としては、アザチオプリン、メルカプトプリン、チオグアニン、フルダラビン、ペントスタチン及びクラドリビンが挙げられる。ピリミジン類似体の例としては、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）（これはチミジル酸シンターゼを阻害する）、フロクスウリジン（ＦＵＤＲ）及びシトシンアラビノシド（シタラビン）が挙げられる。
【０４００】
抗葉酸剤は、葉酸の機能を弱める化学療法薬である。周知の例はメトトレキサートであり、これは、酵素ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）を阻害し、従ってテトラヒドロ葉酸塩の形成を妨げる葉酸類似体である。テトラヒドロ葉酸塩はプリン及びピリミジン合成に必須である。これは、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質の産生阻害につながる（テトラヒドロ葉酸塩はアミノ酸セリン及びメチオニンの合成にも関与するため）。他の抗葉酸剤としては、限定はされないが、トリメトプリム、ラルチトレキセド、ピリメタミン及びペメトレキセドが挙げられる。
【０４０１】
エリプチシン及びハルミンなど、他の化学療法薬も条件的活性型抗体にコンジュゲートされ得る。エリプチシンは、キョウチクトウ科（Ａｐｏｃｙｎａｃｅａｅ）の常緑樹から単離された天然の植物性アルカロイド生成物である。エリプチシン及びその誘導体、例えば、９−ヒドロキシエリプチシニウム、Ｎ２−メチル−９−ヒドロキシエリプチシニウム、２−（ジエチアミノ（ｄｉｅｔｈｙｉａｍｉｎｏ）−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムアセテート、２−（ジイソプロピルアミノ−エチル）９−ヒドロキシ−エリプチシニウムアセテート及び２−（βピペリジノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムは、全てが有効な化学療法薬である。
【０４０２】
ハルミンは、ペガヌム・ハルマラ（Ｐｅｇａｎｕｍ  ｈａｒｍａｌａ）の種子から単離された天然の植物性アルカロイド生成物である。ハルミン系化学療法薬としては、ハルミン、ハルマリン、ハルモール、ハルマロール及びハルマン、並びにキナゾリン誘導体：バシシン及びバシシノンが挙げられる。
【０４０３】
一部の実施形態において、条件的活性型抗体にコンジュゲートされる細胞毒素としては、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン（ａｎｔｈｒａｃｉｎｅｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド類、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びピューロマイシン並びにこれらの類似体又は相同体が挙げられる。他の毒素としては、例えば、リシン、ＣＣ−１０６５及び類似体、デュオカルマイシン類が挙げられる。さらに他の毒素としては、ジプテリア（ｄｉｐｔｈｅｒｉａ）毒素、及びヘビ毒（例えばコブラ毒）が挙げられる。
【０４０４】
一部の実施形態において、本発明の条件的活性型抗体は診断用薬剤にコンジュゲートされ得る。本発明で使用される診断用薬剤には、例えば以下の文献に提供されるように、当該技術分野において公知の任意の診断用薬剤が含まれ得る：Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ，“Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ，”５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２００４）；Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ，Ｖ．Ｐ．，Ｅｄ．，“Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ａｇｅｎｔｓ，”ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；Ｖａｌｌａｂｈａｊｏｓｕｌａ，Ｓ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ｆｏｒ  ＰＥＴ  ａｎｄ  ＳＰＥＣＴ，”Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（２００９）。診断用薬剤は、限定はされないが、ガンマ線放射、放射性、エコー源性、光学的、蛍光性、吸収性、磁性又は断層撮影法のシグナルを含めた検出可能なシグナルを提供し、及び／又は増強する薬剤の使用を含め、種々の方法で検出することができる。診断用薬剤のイメージング技法としては、限定はされないが、単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、光学イメージング、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、Ｘ線イメージング、ガンマ線イメージングなどを挙げることができる。
【０４０５】
一部の実施形態において、診断用薬剤には、種々の画像診断法に用いられる、例えば金属イオンに結合したキレーターが含まれ得る。例示的キレーターとしては、限定はされないが、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、［４−（１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカ−１−イル）メチル安息香酸（ｍｅｔｈｙｌｊｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ）（ＣＰＴＡ）、シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）、エチレンビス（オキシエチレンニトリロ）四酢酸（ＥＧＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、クエン酸、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）、トリエチレンテトラアミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ（メチレンホスホン酸）（ＤＯＴＰ）、１，４，８，１１−テトラアザシクロドデカン−１，４，８，１１−四酢酸（ＴＥＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）、及びこれらの誘導体が挙げられる。
【０４０６】
放射性同位元素は、本明細書に記載される一部の診断用薬剤に組み込むことができ、ガンマ線、陽電子、β及びα粒子、及びＸ線を放射する放射性核種を含み得る。好適な放射性核種としては、限定はされないが、Ａｃ、Ａｓ、Ａｔ、ｎＢ、１２８Ｂａ、２１２Ｂｉ、７５Ｂｒ、７７Ｂｒ、１４Ｃ、１０９Ｃｄ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、１８Ｆ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、３Ｈ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３０Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、１３Ｎ、１５０、３２Ｐ、３３Ｐ、２１２Ｐｂ、１０３Ｐｄ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、４７Ｓｃ、１５３Ｓｍ、８９Ｓｒ、９９ｍＴｃ、８８Ｙ及び９０Ｙが挙げられる。特定の実施形態において、放射性薬剤には、ｍＩｎ−ＤＴＰＡ、９９ｍＴｃ（ＣＯ）３−ＤＴＰＡ、９９ｍＴｃ（ＣＯ）３−ＥＮＰｙ２、６２／６４／６７Ｃｕ−ＴＥＴＡ、９９ｍＴｃ（ＣＯ）３−ＩＤＡ、及び９９ｍＴｃ（ＣＯ）３トリアミン（環状又は直鎖状）が含まれ得る。他の実施形態では、これらの薬剤には、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、１５３Ｓｍ、８８／９０Ｙ、６２／６４／６７Ｃｕ、又は６７／６８Ｇａを有するＤＯＴＡ及びその様々な類似体が含まれ得る。一部の実施形態では、以下の文献に提供されるように、例えば、ＤＴＰＡ−脂質など、キレートに結合した脂質の組み込みによってリポソームを放射性標識することができる：Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐｌｉｎａｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ：Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｎａｎｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１，ｐａｇｅｓ  ６９−８３（２００８）；Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ，Ｖ．Ｐ．＆Ｗｅｉｓｓｉｇ，Ｖ．，Ｅｄｓ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ２ｎｄ  Ｅｄ．：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（２００３）；Ｅｌｂａｙｏｕｍｉ，Ｔ．Ａ．＆Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ，Ｖ．Ｐ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｍｏｌ．Ｉｍａｇｉｎｇ，３３：１１９６−１２０５（２００６）；Ｍｏｕｇｉｎ−Ｄｅｇｒａｅｆ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ’ｌ  Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，３４４：１１０−１  １７（２００７）。
【０４０７】
他の実施形態では、診断用薬剤が、蛍光剤、リン光剤、化学発光剤などの光学的薬剤を含み得る。数多くの薬剤（例えば、色素、プローブ、標識、又は指示薬）が当該技術分野において公知であり、本発明において使用することができる。（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、“Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ−Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，”Ｔｅｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（２００５）を参照のこと）。蛍光剤には、種々の有機及び／又は無機小分子又は種々の蛍光タンパク質及びその誘導体が含まれ得る。例えば、蛍光剤としては、限定はされないが、シアニン、フタロシアニン、ポルフィリン、インドシアニン、ローダミン、フェノキサジン、フェニルキサンテン、フェノチアジン、フェノセレナジン、フルオレセイン、ベンゾポルフィリン、スクアライン、ジピロロピリミドン、テトラセン、キノリン、ピラジン、コリン、クロコニウム、アクリドン、フェナントリジン、ローダミン、アクリジン、アントラキノン、カルコゲノピリリウム類似体、クロリン、ナフタロシアニン、メチン色素、インドレニウム色素、アゾ化合物、アズレン、アザアズレン、トリフェニルメタン色素、インドール、ベンゾインドール、インドカルボシアニン、ベンゾインドカルボシアニン、及び４，４−ジフィウオロ（ｄｉｆｉｕｏｒｏ）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセンの一般構造を有するＢＯＤＩＰＹ（商標）誘導体、及び／又はこれらの任意のコンジュゲート及び／又は誘導体を挙げることができる。使用することのできる他の薬剤としては、限定はされないが、例えば、フルオレセイン、フルオレセイン−ポリアスパラギン酸コンジュゲート、フルオレセイン−ポリグルタミン酸コンジュゲート、フルオレセイン−ポリアルギニンコンジュゲート、インドシアニングリーン、インドシアニン−ドデカアスパラギン酸コンジュゲート、インドシアニン（ＮＩＲＤ）−ポリアスパラギン酸コンジュゲート、イソスルファンブルー、インドールジスルホネート、ベンゾインドールジスルホネート、ビス（エチルカルボキシメチル）インドシアニン、ビス（ペンチルカルボキシメチル）インドシアニン、ポリヒドロキシインドールスルホネート、ポリヒドロキシベンゾインドールスルホネート、リジッドヘテロ原子インドールジスルホネート、インドシアニンビスプロパン酸、インドシアニンビスヘキサン酸、３，６−ジシアノ−２，５−［（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス（カルボキシメチル）アミノ］ピラジン、３，６−［（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］ピラジン−２，５−ジカルボン酸、３，６−ビス（Ｎ−アザテジノ（ａｚａｔｅｄｉｎｏ））ピラジン−２，５−ジカルボン酸、３，６−ビス（Ｎ−モルホリノ）ピラジン−２，５−ジカルボン酸、３，６−ビス（Ｎ−ピペラジノ）ピラジン−２，５−ジカルボン酸、３，６−ビス（Ｎ−チオモルホリノ）ピラジン−２，５−ジカルボン酸、３，６−ビス（Ｎ−チオモルホリノ）ピラジン−２，５−ジカルボン酸Ｓ−オキシド、２，５−ジシアノ−３，６−ビス（Ｎ−チオモルホリノ）ピラジンＳ，Ｓ−ジオキシド、インドカルボシアニンテトラスルホネート、クロロインドカルボシアニン、及び３，６−ジアミノピラジン−２，５−ジカルボン酸が挙げられる。
【０４０８】
さらに他の実施形態において、診断用薬剤には、例えば、超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）、ガドリニウム又はマンガンの錯体などを含めた、当該技術分野において概して周知の造影剤が含まれ得る。（例えば、Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ，“Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ，”５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２００４）を参照のこと）。一部の実施形態において、診断用薬剤には、磁気共鳴（ＭＲ）造影剤が含まれ得る。例示的磁気共鳴剤としては、限定はされないが、常磁性薬剤、超常磁性薬剤などが挙げられる。例示的常磁性薬剤としては、限定はされないが、ガドペンテト酸、ガドテル酸、ガドジアミド、ガドリニウム、ガドテリドール、マンガホジピール、ガドベルセタミド、クエン酸鉄アンモニウム、ガドベン酸、ガドブトロール、又はガドキセト酸を挙げることができる。超常磁性薬剤としては、限定はされないが、超常磁性酸化鉄及びフェリステンを挙げることができる。特定の実施形態において、診断用薬剤には、例えば以下の文献に提供されるようなＸ線造影剤が含まれ得る：Ｈ．Ｓ  Ｔｈｏｍｓｅｎ，Ｒ．Ｎ．Ｍｕｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｒ．Ｆ．Ｍａｔｔｒｅｙ，Ｅｄｓ．，“Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｏｎｔｒａｓｔ  Ｍｅｄｉａ，”Ｂｅｒｌｉｎ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９９９）；Ｐ．Ｄａｗｓｏｎ，Ｄ．Ｃｏｓｇｒｏｖｅ  ａｎｄ  Ｒ．Ｇｒａｉｎｇｅｒ，Ｅｄｓ．，“Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒａｓｔ  Ｍｅｄｉａ”（ＩＳＩＳ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ  １９９９）；Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ，Ｖ．Ｐ．，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，ｖｏｌ．１，ｐａｇｅｓ  １８３−２１５（２０００）；Ｂｏｇｄａｎｏｖ，Ａ．Ａ．ｅｔ  ａｌ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．，Ｖｏｌ．３７，ｐａｇｅｓ  ２７９−２９３（１９９９）；Ｓａｃｈｓｅ，Ａ．ｅｔ  ａｈ，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３２，ｐａｇｅｓ  ４４−５０（１９９７）。Ｘ線造影剤の例としては、限定なしに、イオパミドール、イオメプロール、イオヘキソール、イオペントール、イオプロミド、イオシミド、イオベルソール、イオトロラン、イオタスル、イオジキサノール、イオデシモール、イオグルカミド、イオグルニド、イオグラミド、イオサルコール、イオキシラン、イオパミロン、メトリザミド、イオビトリドール及びイオシメノールが挙げられる。特定の実施形態において、Ｘ線造影剤としては、イオパミドール、イオメプロール、イオプロミド、イオヘキソール、イオペントール、イオベルソール、イオビトリドール、イオジキサノール、イオトロラン及びイオシメノールを挙げることができる。
【０４０９】
一部の実施形態において、条件的活性型抗体は、タンパク質、例えば、インターロイキン、サイトカイン、酵素、成長因子、又は他の抗体にコンジュゲートされ得る。かかるタンパク質のいくつかの例としては、例えば、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン（ＥＦＮ−α）、β−インターフェロン（ＩＦＮ−β）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、アポトーシス剤（例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、国際公開第９７／３３８９９号パンフレットに開示されるようなＡＩＭ  Ｉ）、ＡＩＭ  ＩＩ（国際公開第９７／３４９１１号パンフレットを参照）、Ｆａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．６，ｐａｇｅｓ  １５６７−１５７４，１９９４）、及びＶＥＧＩ（国際公開第９９／２３１０５号パンフレット）、抗血栓症剤又は抗血管新生剤（例えば、アンジオスタチン又はエンドスタチン）；又は生物学的反応修飾物質、例えば、リンホカイン（例えば、インターロイキン−１（「ＩＬ−Ｉ」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、及び顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」））、又は成長因子（例えば、成長ホルモン（「ＧＨ」））が挙げられる。
【０４１０】
一部の実施形態では、本発明によって提供されるようなＢＢＢを通過するための条件的活性型抗体が、神経障害の治療用薬物にコンジュゲートされ得る。この薬物は、抗体と共にＢＢＢを通って輸送され、神経障害を治療するため脳内に留まり得る。神経障害とは、ＣＮＳに影響を及ぼし、及び／又はＣＮＳに病因がある疾患又は障害を指す。例示的ＣＮＳ疾患又は障害としては、限定はされないが、ニューロパチー、アミロイドーシス、癌、眼疾患又は眼障害、ウイルス又は微生物感染症、炎症、虚血、神経変性疾患、てんかん発作、行動障害、及びリソソーム蓄積症が挙げられる。本出願の目的上、ＣＮＳは、通常は血液網膜関門によって体の残りの部分から隔絶されている眼を含むものと理解されるであろう。神経障害の具体的な例としては、限定はされないが、神経変性疾患（例えば限定はされないが、レビー小体病、ポリオ後症候群、シャイ・ドレーガー（Ｄｒａｅｇｅｒ）症候群、オリーブ橋小脳萎縮症、パーキンソン病、多系統萎縮症、線条体黒質変性症、タウオパチー（限定はされないが、アルツハイマー病及び核上性麻痺を含む）、プリオン病（限定はされないが、ウシ海綿状脳症、スクレイピー、クロイツフェルト・ヤコブ症候群、クールー、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、慢性消耗病、及び致死性家族性不眠症を含む）、球麻痺、運動ニューロン疾患、及び神経系ヘテロ変性障害（限定はされないが、カナバン病、ハンチントン病、神経セロイドリポフスチン症、アレキサンダー病、トゥレット症候群、メンケス縮れ毛症候群、コケイン症候群、ハラーフォルデン・シュパッツ症候群、ラフォラ病、レット症候群、肝レンズ核変性症、レッシュ・ナイハン症候群、及びウンフェルリヒト・ルントボルク症候群を含む）、認知症（限定はされないが、ピック病、及び脊髄小脳失調症を含む）、癌（例えば、体の別の場所の癌から生じる脳転移を含めた、ＣＮＳ及び／又は脳の癌）が挙げられる。
【０４１１】
神経障害の治療用薬物としては、限定はされないが、抗体、ペプチド、タンパク質、１つ以上のＣＮＳ標的の天然リガンド、１つ以上のＣＮＳ標的の天然リガンドの修飾型、アプタマー、阻害性核酸（すなわち、低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、及び低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））、リボザイム、及び小分子、又は前述のいずれかの活性フラグメントが挙げられる。例示的神経障害薬物としては、限定はされないが、以下が挙げられる：抗体、アプタマー、タンパク質、ペプチド、阻害性核酸及び小分子並びに前述のいずれかの活性フラグメントであって、それら自体であるか、又はＣＮＳ抗原又は標的分子、例えば、限定はされないが、アミロイド前駆体タンパク質又はその一部分、アミロイドβ、β−セクレターゼ、γ−セクレターゼ、τ、α−シヌクレイン、パーキン、ハンチンチン、ＤＲ６、プレセニリン、ＡｐｏＥ、神経膠腫又は他のＣＮＳ癌マーカー、及びニューロトロフィンを特異的に認識し、及び／又はそれに作用する（すなわち、阻害し、活性化し、又は検出する）もの。神経障害薬及びそれらが治療に用いられ得る障害の非限定的な例としては、アルツハイマー病、急性及び慢性脳損傷、脳卒中の治療用の抗ＢＡＣＥ１抗体；アルツハイマー病の治療用の抗Ａβ抗体；脳卒中、急性脳損傷、脊髄損傷の治療用のニューロトロフィン；慢性脳損傷（神経形成）の治療用の脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）及び線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ−２）；脳癌の治療用の抗上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）抗体；パーキンソン病の治療用のグリア細胞株由来神経因子（ＧＤＮＦ）；筋萎縮性側索硬化症及びうつ病の治療用の脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）；脳のリソソーム蓄積障害の治療用のリソソーム酵素；筋萎縮性側索硬化症の治療用の毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）；統合失調症の治療用のニューレグリン−１；及びＨＥＲ２陽性癌からの脳転移の治療用の抗ＨＥＲ２抗体（例えばトラスツズマブ）が挙げられる。
【０４１２】
一部の実施形態において、条件的活性型抗体のコンジュゲーションはこれらの抗体のＦｃ領域上にあり得る。上記に記載したコンジュゲート分子、化合物又は薬物が、米国特許第８，３６２，２１０号明細書（参照により本明細書に援用される）に記載されるように、Ｆｃ領域にコンジュゲートされ得る。例えば、Ｆｃ領域は、条件的活性型抗体が優先的な活性を示す部位に送達されるサイトカイン又は毒素にコンジュゲートされ得る。ポリペプチドを抗体のＦｃ領域にコンジュゲートする方法は、当該技術分野において公知である。例えば、米国特許第５，３３６，６０３号明細書、同第５，６２２，９２９号明細書、同第５，３５９，０４６号明細書、同第５，３４９，０５３号明細書、同第５，４４７，８５１号明細書、同第５，７２３，１２５号明細書、同第５，７８３，１８１号明細書、同第５，９０８，６２６号明細書、同第５，８４４，０９５号明細書、及び同第５，１１２，９４６号明細書；欧州特許第３０７，４３４号明細書；欧州特許第３６７，１６６号明細書；欧州特許第３９４，８２７号明細書；国際公開第９１／０６５７０号パンフレット、国際公開第９６／０４３８８号パンフレット、国際公開第９６／２２０２４号パンフレット、国際公開第９７／３４６３１号パンフレット、及び国際公開第９９／０４８１３号パンフレット；Ａｓｈｋｅｎａｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．８８，ｐａｇｅｓ  １０５３５−１０５３９，１９９１；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．３３１，ｐａｇｅｓ  ８４−８６，１９８８；Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．１５４，ｐａｇｅｓ  ５５９０−５６００，１９９５；及びＶｉＩ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．８９，ｐａｇｅｓ  １１３３７−１１３４１，１９９２（これらは全体として参照により本明細書に援用される）を参照のこと。
【０４１３】
多重特異性条件的活性型抗体の操作
多重特異性抗体は、多エピトープ特異性を有する抗体である。多重特異性抗体には、限定はされないが、ＶＨＶＬ単位が多エピトープ特異性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体、各ＶＨＶＬ単位が異なるエピトープに結合する２つ以上のＶＬ及びＶＨドメインを有する抗体、各単一可変ドメインが異なるエピトープに結合する２つ以上の単一可変ドメインを有する抗体、及び１つ以上の抗体フラグメントを含む抗体並びに共有結合的又は非共有結合的に連結されている抗体フラグメントを含む抗体が含まれる。
【０４１４】
二重特異性抗体を含めた多重特異性抗体を構築するため、少なくとも１つの遊離スルフヒドリル基を有する抗体フラグメントが入手される。抗体フラグメントは完全長条件的活性型抗体から入手されてもよい。条件的活性型抗体を酵素消化すると、抗体フラグメントが生じ得る。例示的酵素消化方法としては、限定はされないが、ペプシン、パパイン及びＬｙｓ−Ｃが挙げられる。例示的抗体フラグメントとしては、限定はされないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ダイアボディ（Ｄｂ）；タンデムダイアボディ（ｔａＤｂ）、線状抗体（米国特許第５，６４１，８７０号明細書；Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，ｖｏｌ．８，ｐａｇｅｓ  １０５７−１０６２（１９９５）を参照）；１アーム抗体、単一可変ドメイン抗体、ミニボディ（Ｏｌａｆｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌ．，ｖｏｌ．１７，ｐａｇｅｓ  ３１５−３２３）、一本鎖抗体分子、Ｆａｂ発現ライブラリによって作製されるフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、相補性決定領域（ＣＤＲ）、及びエピトープ結合フラグメントが挙げられる。抗体フラグメントはまた、ＤＮＡ組換え技術を用いて作製されてもよい。抗体フラグメントをコードするＤＮＡをプラスミド発現ベクター又はファージミドベクターにクローニングし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において直接発現させ得る。抗体酵素消化方法、ＤＮＡクローニング及び組換えタンパク質発現方法は、当業者に周知である。
【０４１５】
抗体フラグメントは従来技術を用いて精製してもよく、還元に供すると遊離チオール基が生成され得る。遊離チオール基を有する抗体フラグメントは架橋剤、例えばビスマレイミドと反応し得る。かかる架橋された抗体フラグメントを精製し、次に遊離チオール基を有する第２の抗体フラグメントと反応させる。２つの抗体フラグメントが架橋された最終産物が精製される。特定の実施形態において、各抗体フラグメントはＦａｂであり、２つのＦａｂがビスマレイミドを介して連結した最終産物は、本明細書ではビスマレイミド−（チオ−Ｆａｂ）２、又はビス−Ｆａｂと称される。かかる多重特異性抗体及び抗体類似体は、ビス−Ｆａｂを含め、多数の抗体フラグメントの組み合わせ、又は天然抗体の構造変異体又は特定の抗体フラグメントの組み合わせを迅速に合成するために利用することができる。
【０４１６】
多重特異性抗体は、多重特異性抗体に追加的な機能性部分が付加され得るように修飾架橋剤と合成することができる。修飾架橋剤は任意のスルフヒドリル反応性部分の結合を可能にする。一実施形態では、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）がビスマレイミドに結合してビスマレイミドアセチルチオアセテート（ＢＭａｔａ）を形成する。マスクされたチオール基の脱保護後、スルフヒドリル反応性（又はチオール反応性）部分を有する任意の官能基が多重特異性抗体に結合し得る。
【０４１７】
例示的チオール反応性試薬としては、多機能性リンカー試薬、捕捉、すなわちアフィニティー標識試薬（例えばビオチン−リンカー試薬）、検出標識（例えばフルオロフォア試薬）、固相固定化試薬（例えばＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）、ポリスチレン、又はガラス）、又は薬物−リンカー中間体が挙げられる。チオール反応性試薬の一例は、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）である。修飾架橋剤を有するかかる多重特異性抗体又は抗体類似体は、薬物部分試薬又は他の標識とさらに反応させてもよい。多重特異性抗体又は抗体類似体と薬物−リンカー中間体との反応は、それぞれ多重特異性抗体薬物コンジュゲート又は抗体類似体薬物コンジュゲートをもたらす。
【０４１８】
多重特異性抗体を作製するための他の多くの技法も本発明において用いることができる。それらの技法について記載している文献（参照により本明細書に援用される）としては、以下が挙げられる：（１）異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖ペアの組換え共発現に関して、Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．３０５，ｐａｇｅ  ５３７（１９８３））、国際公開第９３／０８８２９号パンフレット、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，ｖｏｌ．１０，ｐａｇｅ  ３６５５（１９９１）；（２）「ノブインホール」操作に関して米国特許第５，７３１，１６８号明細書；（３）静電ステアリング効果を操作することによる抗体Ｆｃ−ヘテロ二量体分子の作製に関して国際公開第２００９／０８９００４Ａ１号パンフレット；（４）２つ以上の抗体又はフラグメントの架橋結合に関して米国特許第４，６７６，９８０号明細書、及びＢｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２２９，ｐａｇｅ  ８１（１９８５）；（５）ロイシンジッパーを使用した二重特異抗体の作製に関してＫｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．１４８，ｐａｇｅｓ  １５４７−１５５３（１９９２）；（６）「ダイアボディ」技術を用いた二重特異性抗体フラグメントの作製に関してＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９０，ｐａｇｅｓ  ６４４４−６４４８（１９９３）；（７）単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用に関してＧｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．１５２，ｐａｇｅ  ５３６８（１９９４）；（８）三重特異性抗体の調製に関してＴｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）；及び（９）「オクトパス抗体」又は「デュアル可変ドメイン免疫グロブリン」（ＤＶＤ）を含めた、３つ以上の機能性抗原結合部位を有する操作された抗体に関して米国特許出願公開第２００６／００２５５７６Ａ１号明細書及びＷｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２５，ｐａｇｅｓ  １２９０−１２９７（２００７）。
【０４１９】
本発明の多重特異性抗体はまた、国際公開第２０１１／１０９７２６号パンフレット（全体として参照により本明細書に援用される）に記載されるように生成してもよい。
【０４２０】
一実施形態では、ＢＢＢを通過するための条件的活性型抗体を操作して多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）が作製される。この多重特異性抗体は、ＢＢＢ−Ｒに結合する第１の抗原結合部位と脳抗原に結合する第２の抗原結合部位とを含む。少なくともＢＢＢ−Ｒに対する第１の抗原結合部位は条件的活性型である。脳抗原は、脳で発現する抗原であり、抗体又は小分子によって標的化され得る。かかる抗原の例としては、限定なしに、以下が挙げられる：β−セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）、アミロイドβ（Ａβ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、タウ、アポリポタンパク質Ｅ４（ＡｐｏＥ４）、α−シヌクレイン、ＣＤ２０、ハンチンチン、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、パーキン、プレセニリン１、プレセニリン２、γセクレターゼ、デスレセプター６（ＤＲ６）、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ｐ７５ニューロトロフィン受容体（ｐ７５ＮＴＲ）、及びカスパーゼ６。一実施形態において、抗原はＢＡＣＥ１である。
【０４２１】
一部の実施形態において、多重特異性抗体は、癌治療細胞、例えばＮＫ細胞及び本明細書で言及する他の細胞の関与を招く抗原を標的化して、免疫エフェクター細胞としての役割を果たすことにより、それらの癌治療細胞を活性化させ得る。この一例は、ＣＤ１６Ａ抗原を標的化して、ＣＤ３０を発現する悪性腫瘍と闘うようＮＫ細胞を関与させるＣＡＲである。二重特異性の四価ＡＦＭ１３抗体は、この効果を送達し得る抗体の例である。この種の実施形態のさらなる詳細については、例えば、Ｒｏｔｈｅ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  ｐｈａｓｅ  １  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉ−ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ  ＡＦＭ１３  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｌａｐｓｅｄ  ｏｒ  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  Ｈｏｄｇｋｉｎ  ｌｙｍｐｈｏｍａ，”Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．１２５，ｎｏ．２６，ｐｐ．４０２４−４０３１，２０１５を参照することができる。
【０４２２】
多重特異性抗体は、多重特異性抗体が結合し得る標的（抗原）の全て又はほとんどを含有する優先的標的組織に関して高い選択性を有する。例えば、二重特異性抗体は、抗原のうちの一方のみを発現し得る非標的細胞と比較して、その二重特異性抗体によって認識される抗原の両方を発現する標的細胞により高い選好性を示すことにより、標的細胞に対する選択性を提供し得る。従って、この系のダイナミズムに起因して、平衡状態では非標的細胞と比べてより多くの二重特異性抗体が標的細胞に結合する。
【０４２３】
ＢＢＢ通過のための条件的活性型抗体の操作
ＢＢＢは、ＢＢＢ受容体（ＢＢＢ−Ｒ）によって媒介される内因性の輸送系を有し、ＢＢＢ−Ｒは、ＢＢＢを通る巨大分子の輸送を可能にする特異的受容体である。例えば、ＢＢＢ−Ｒに結合することのできる抗体は、この内因性輸送系を用いることでＢＢＢを通って輸送され得る。かかる抗体は、ＢＢＢを通り抜ける内因性のＢＢＢ受容体媒介性の輸送系を使用することによりＢＢＢを通って薬物又は他の作用物質を輸送するための輸送手段としての役割を果たし得る。かかる抗体は、ＢＢＢ−Ｒに対して高親和性を有する必要はない。米国特許出願公開第２０１２／０１７１１２０号明細書（参照により本明細書に援用される）に記載されるように、ＢＢＢ−Ｒに対する親和性が低い条件的活性型抗体でない抗体が、高親和性抗体より高い効率でＢＢＢを通過するものとして記載されている。
【０４２４】
抗体を操作して脳に入る別の方法は、中枢神経系リンパ管を介して脳に送達されるように抗体を操作することである。従って、抗体は、リンパ管を通って中枢神経系に移動するＴ細胞などの免疫細胞、又は滑液若しくは脳脊髄液に結合するか、又はそれを模倣するように操作することができる。中枢神経系のリンパ管の詳細については、例えば、Ｌｏｕｖｅａｕ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｖｅｓｓｅｌｓ，”Ｎａｔｕｒｅ  ５２３，ｐｐ．３３７−３４１，１６  Ｊｕｌｙ  ２０１５及び本出願の出願日現在で公的に利用可能である、この論文を引用する論文（これらは全て、本明細書によって、中枢神経系リンパ系並びにこの系を通って移動する体液及び細胞の詳細を提供する目的で本明細書に全体として参照により援用される）に記載されている。
【０４２５】
従来の抗体と異なり、条件的活性型抗体は、ＢＢＢを通過するためＢＢＢ−Ｒに対して低親和性を有する必要はなく、脳の内部に留まる。条件的活性型抗体は、ＢＢＢの血液側でＢＢＢ−Ｒに対して高親和性を有し、且つＢＢＢの脳側で親和性がほとんど又は全くないものであり得る。薬物コンジュゲートなどの薬物は条件的活性型抗体にカップリングすることにより、抗体と共にＢＢＢを通って脳内へと輸送し得る。
【０４２６】
ＢＢＢ−Ｒは脳内皮細胞上に発現する膜貫通受容体タンパク質であり、血液脳関門を通じて分子を輸送する能力を有する。ＢＢＢ−Ｒの例としては、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、インスリン受容体、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦ−Ｒ）、低密度リポタンパク質受容体、例えば限定なしに、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１）及び低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（ＬＲＰ８）、及びヘパリン結合上皮成長因子様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）が挙げられる。本明細書における例示的ＢＢＢ−Ｒは、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）である。ＴｆＲは、脊椎動物における鉄の取り込みに関与する２つのジスルフィド結合したサブユニット（各々の見かけの分子量約９０，０００）で構成される膜貫通糖タンパク質（分子量約１８０，０００）である。
【０４２７】
一部の実施形態において、本発明は、ＢＢＢ−Ｒに対する親抗体又は野生型抗体から生成される条件的活性型抗体を提供する。この条件的活性型抗体は、ＢＢＢの血液側ではＢＢＢ−Ｒに結合し、ＢＢＢの脳側ではＢＢＢ−Ｒに対する親和性が親抗体又は野生型抗体より低い。一部の他の実施形態において、この条件的活性型抗体は、ＢＢＢの血液側では野生型抗体又は親抗体と比べてＢＢＢ−Ｒに対する親和性を有し、ＢＢＢの脳側ではＢＢＢ−Ｒに対する親和性を有しない。
【０４２８】
血漿は、脳細胞外液（ＥＣＦ）と大きく異なる体液である。Ｓｏｍｊｅｎ（“Ｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｒａｉｎ：Ｎｏｒｍａｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｓｅｉｚｕｒｅｓ，ａｎｄ  Ｓｔｒｏｋｅ，”Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００４，ｐａｇｅｓ  １６  ａｎｄ  ３３）及びＲｅｄｚｉｃ（“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ−ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ  ｂａｒｒｉｅｒｓ：ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ，”Ｆｌｕｉｄｓ  ａｎｄ  Ｂａｒｒｉｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＮＳ，ｖｏｌ．８：３，２０１１）によって考察されるように、脳細胞外液は血漿と比べてＫ＋が大幅に少なく、Ｍｇ２＋及びＨ＋が多い。血漿と脳ＥＣＦとのイオン濃度の違いにより、これらの２つの体液に浸透圧及び重量オスモル濃度の著しい違いがもたらされる。表１は、血漿及び脳ＥＣＦの両方の共通イオンの濃度（ミリモル単位）を示す。
【０４２９】
【表１】
2017532019.tif 000003
【０４３０】
脳ＥＣＦはまた、血漿と比べて含有する乳酸塩が大幅に多く、血漿と比べてグルコースが大幅に少ない（Ａｂｉ−Ｓａａｂ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｔｒｉｋｉｎｇ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  ａｎｄ  Ｌａｃｔａｔｅ  Ｌｅｖｅｌｓ  Ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｂｒａｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｆｌｕｉｄ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍａ  ｉｎ  Ｃｏｎｓｃｉｏｕｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｕｂｊｅｃｔｓ：Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉａ  ａｎｄ  Ｈｙｐｏｇｌｙｃｅｍｉａ，”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｒｅｂｒａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ＆Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，ｖｏｌ．２２，ｐａｇｅｓ  ２７１−２７９，２００２）。
【０４３１】
従って、ｐＨ、様々な物質の濃度（ラクトース、グルコース、Ｋ＋、Ｍｇ２＋など）、浸透圧及び重量オスモル濃度など、ＢＢＢの両側間で異なるいくつかの生理条件がある。ｐＨの生理条件に関して、ヒト血漿はヒト脳ＥＣＦより高いｐＨを有する。Ｋ＋濃度の生理条件に関して、脳ＥＣＦはヒト血漿より低いＫ＋濃度を有する。Ｍｇ２＋濃度の生理条件に関して、ヒト脳ＥＣＦはヒト血漿より大幅に多いＭｇ２＋を有する。浸透圧の生理条件に関して、ヒト脳ＥＣＦはヒト血漿と異なる浸透圧を有する。一部の実施形態において、脳ＥＣＦの生理条件は、特定の神経障害を有する患者の脳ＥＣＦの組成、ｐＨ、浸透圧及び重量オスモル濃度であってもよく、これは一般集団の脳ＥＣＦの生理条件と異なり得る。
【０４３２】
従って本発明は、ＢＢＢ−Ｒに対するテンプレート抗体をコードするＤＮＡを発達させて変異ＤＮＡライブラリを作成する方法を提供する。次にこの変異ＤＮＡライブラリを発現させると、変異抗体が得られる。これらの変異抗体は、少なくとも１つの血漿生理条件下でＢＢＢ−Ｒに結合し、且つ脳ＥＣＦ中の少なくとも１つの脳生理条件下でテンプレート抗体と比較してＢＢＢ−Ｒに対する親和性が低いか、又はそれを有しない条件的活性型抗体に関してスクリーニングされる。従って、選択された変異抗体は、血漿側ではＢＢＢ−Ｒに対して低親和性又は高親和性を有し、脳ＥＣＦ側ではＢＢＢ−Ｒに対する親和性が低いか、又はそれを有しない。この選択された変異抗体は、ＢＢＢを通って輸送するための条件的活性型抗体として有用である。
【０４３３】
かかる条件的活性型抗体は、ＢＢＢの通過及び脳ＥＣＦへの滞留に有利である。脳側ではＢＢＢ−Ｒに対する親和性が低いため、テンプレート抗体と比べ、条件的活性型抗体がＢＢＢを通って脳から出て血液中へと輸送し戻される速度は低下する（又はそのようなことはなくなる）。
【０４３４】
一部の他の実施形態において、本発明は、ＢＢＢ−Ｒに対するテンプレート抗体をコードするＤＮＡを発達させて変異ＤＮＡライブラリを作成する方法を提供する。次にこの変異ＤＮＡライブラリを発現させると、変異抗体が得られる。これらの変異抗体は、少なくとも１つの血漿生理条件下でＢＢＢ−Ｒに結合し、且つ少なくとも１つの脳生理条件下でＢＢＢ−Ｒに対する親和性がほとんど又は全くない条件的活性型抗体に関してスクリーニングされる。従って、選択された変異抗体は、血漿側ではＢＢＢ−Ｒに対する親和性を有し、且つ脳ＥＣＦ側ではＢＢＢ−Ｒに対する親和性がほとんど又は全くない。この選択された変異抗体が、条件的活性型抗体である。
【０４３５】
かかる条件的活性型抗体は、ＢＢＢの通過及び脳ＥＣＦへの滞留に有利である。血漿側でＢＢＢ−Ｒに結合した後、条件的活性型抗体はＢＢＢを通って輸送され、及び脳ＥＣＦ側ではＢＢＢ−Ｒに対する親和性がほとんど乃至全くなく、これは、すなわち条件的活性型抗体が脳から運び出される可能性が低いことを意味する。
【０４３６】
ＢＢＢ−Ｒに対する条件的活性型抗体の親和性は、その最大半数阻害濃度（ＩＣ５０）によって計測することができ、ＩＣ５０は、ＢＢＢ−Ｒに対する既知のＢＢＢ−Ｒリガンドの結合を５０％阻害するためにどのくらいの抗体が必要かの尺度である。一般的な手法は、競合ＥＬＩＳＡ分析（ａｓｓｙ）などの競合的結合分析を実施することである。ＴｆＲ（ＢＢＢ−Ｒ）に関するＩＣ５０を計測する例示的競合ＥＬＩＳＡ分析は、漸増濃度の抗ＴｆＲ抗体がＴｆＲとの結合についてビオチン化ＴｆＲＡと競合するものである。抗ＴｆＲ抗体競合ＥＬＩＳＡは、ＰＢＳ中２．５μｇ／ｍｌの精製マウスＴｆＲ細胞外ドメインでコートしたＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｅｐｔｕｎｅ、Ｎ．Ｊ．）において４℃で一晩実施し得る。プレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０で洗浄し、ＰＢＳ中のＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋブロッキング緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｈｕｄｓｏｎ、Ｎ．Ｈ．）を使用してブロックする。各個別の抗ＴｆＲ抗体のタイトレーション（１：３段階希釈）をビオチン化抗ＴｆＲＡ（０．５ｎＭ最終濃度）と組み合わせて、室温で１時間プレートに加える。プレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０で洗浄し、プレートにＨＲＰ−ストレプトアビジン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ）を加え、室温で１時間インキュベートする。プレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０で洗浄し、プレートに結合したビオチン化抗ＴｆＲＡをＴＭＢ基質（ＢｉｏＦＸ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｏｗｉｎｇｓ  Ｍｉｌｌｓ）を使用して検出する。
【０４３７】
高いＩＣ５０は、ＢＢＢ−Ｒの既知のリガンドの結合を阻害するためにより多くの条件的活性型抗体が必要であり、従ってＢＢＢ−Ｒに対する抗体の親和性が比較的低いことを示す。逆に、低いＩＣ５０は、既知のリガンドの結合を阻害するために必要な条件的活性型抗体がより少なくてすみ、従ってＢＢＢ−Ｒに対する抗体の親和性が比較的高いことを示す。
【０４３８】
一部の実施形態において、血漿中のＢＢＢ−Ｒからの条件的活性型抗体のＩＣ５０は、約１ｎＭ〜約１００μＭ、又は約５ｎＭ〜約１００μＭ、又は約５０ｎＭ〜約１００μＭ、又は約１００ｎＭ〜約１００μＭ、又は約５ｎＭ〜約１０μＭ、又は約３０ｎＭ〜約１μＭ、又は約５０ｎＭ〜約１μＭであり得る。
【０４３９】
滑液に対する条件的活性型生物学的タンパク質の操作
関節疾患は、工業先進国における身体障害及び早期退職の主な原因である。関節疾患は多くの場合に関節の損傷をもたらし、これは修復が困難である。滑液は、ヒト又は動物の体の関節（例えば、膝、股関節部、肩）の滑膜腔において向かい合う関節表面の軟骨と滑膜との間に見られる体液である。滑液は軟骨に栄養を供給し、また関節の潤滑剤としての役割も果たす。軟骨及び滑膜の細胞は、関節表面間の潤滑剤としての役割を果たす体液を分泌する。ヒト滑液は約８５％の水を含む。これは血漿の透析液に由来し、この透析液自体は、水、溶解したタンパク質、グルコース、凝固因子、無機イオン、ホルモン等からなる。アルブミン及びグロブリンなどのタンパク質が滑液中に存在し、関節領域の潤滑において重要な役割を果たすと考えられる。ヒト滑液中には、α−１−酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）、α−１−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）及びルブリシンなどの糖タンパク質を含め、いくつかの他のタンパク質も見られる。
【０４４０】
滑液は、体の他の部分と極めて異なる組成を有する。従って、滑液は、血漿などの体の他の部分とは異なる生理条件を有する。例えば、滑液は約１０ｍｇ／ｄＬ未満のグルコースを有するが、ヒト血漿の平均正常グルコース値は約１００ｍｇ／ｄＬであり、１日を通じて７０〜１００ｍｇ／ｄＬの範囲内で変動する。加えて、タンパク質などの大型分子が滑膜を通過して滑液中に入ることは容易でなく、従って滑液の全タンパク質レベルは血漿タンパク質レベルの約３分の１である。また、ヒト滑液のｐＨはヒト血漿のｐＨより高いことも分かっている（Ｊｅｂｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｏｎ  ｔｈｅ  ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｐＨ  ｏｆ  ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｆｌｕｉｄ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｐＨ  ｏｆ  ｂｌｏｏｄ，”Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇｅｒｙ，ｖｏｌ．４１  Ｂ，ｐａｇｅｓ  ３８８−４００，１９５９；Ｆａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｉｏｎ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｆｌｕｉｄ  ｉｎ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，”Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３，ｐａｇｅｓ  ９９−１０４，１９８５）。
【０４４１】
従って、滑液は、血漿中の生理条件など、体の他の部分の生理条件と異なるいくつかの生理条件を有する。滑液は、体の他の部分、特に血漿と比べてｐＨが高い。滑液は、血漿などの体の他の部分と比べてグルコースの濃度が低い。滑液はまた、血漿などの体の他の部分と比べてタンパク質の濃度も低い。
【０４４２】
関節疾患を治療するため、滑液に抗体を導入することによっていくつかの抗体が用いられている。例えば、傷害された関節の滑液は、骨関節炎の進行に影響を及ぼす多くの因子を含有することが知られている（例えば、Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，”Ｂｉｏｒｈｅｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３９，ｐａｇｅｓ  ２３７−２４６，２００２を参照）。インターロイキン−１（ＩＬ−Ｉ）及び腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）などのサイトカインは、活性化した滑膜細胞によって産生されるものであり、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）遺伝子発現を上方制御することが知られている。ＭＭＰが上方制御されると、関節におけるマトリックス及び非マトリックスタンパク質の分解が引き起こされる。サイトカインを中和する抗体は、骨関節炎の進行を止めることができる。
【０４４３】
抗体を薬物として使用することは、関節疾患の治療に有望な戦略である。例えば、関節疾患の中で群を抜いて高い罹患率を有する骨関節炎を治療するため、抗体（アグレカン又はアグリカナーゼに対する抗体など）が開発されている（国際公開第１９９３／０２２４２９Ａ１号パンフレット）。関節炎などの炎症性、自己免疫性、神経変性又は悪性疾患／障害である関節疾患の診断又は治療に、アセチル化高移動度グループボックス１（ＨＭＧＢ１）に対する抗体が開発されている。この抗体は、滑液中のアセチル化形態のＨＭＧＢ１を検出するために使用し得る（国際公開第２０１１／１５７９０５Ａ１号パンフレット）。関節の結合組織及び軟骨の損傷を治療するため、別の抗体（ＣＤ２０抗体）も開発されている。
【０４４４】
しかしながら、これらの抗体の抗原は、多くの場合、重要な生理学的機能を有する体の他の部分で発現する。これらの抗原に対する抗体は、関節疾患の治療に有効であるものの、体の他の部分におけるこれらの抗原の正常な生理学的機能も著しく妨げ得る。従って、患者に重度の副作用が起こり得る。このように、副作用を低減するため、滑液中ではより高い親和性でそれらの抗原（タンパク質又は他の巨大分子）に優先的に結合し得る一方、体の他の部分では同じ抗原に結合しないか、又は弱く結合するのみである療法薬、例えばサイトカイン又は他の抗原に対する抗体を開発することが望ましい。
【０４４５】
かかる条件的活性型生物学的タンパク質は、条件的活性型抗体であり得る。一部の実施形態において、本発明はまた、抗体以外のタンパク質である条件的活性型生物学的タンパク質も提供する。例えば、本発明によって、滑液中で免疫応答を優先的に調節するための、体の他の部分では免疫応答に対する効果が低いか、又はないものであり得る条件的活性型免疫調節因子が開発され得る。
【０４４６】
条件的活性型生物学的タンパク質は、サイトカインシグナル伝達（ＳＯＣＳ）の条件的活性型サプレッサーであり得る。これらのＳＯＣＳの多くはＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路の阻害に関与する。サイトカインシグナル伝達の条件的活性型サプレッサーは、滑液中ではサイトカインシグナル伝達を優先的に抑制し得る一方、体の他の部分ではサイトカインシグナル伝達を抑制しないか、又は抑制の程度が低い。
【０４４７】
一部の実施形態において、本発明は、野生型生物学的タンパク質に由来する条件的活性型生物学的タンパク質を提供する。条件的活性型生物学的タンパク質は、血漿などの体の特定の部分における少なくとも１つの生理条件下で野生型生物学的タンパク質より低い活性を有し、滑液における少なくとも１つの生理条件下で野生型生物学的タンパク質より高い活性を有する。かかる条件的活性型生物学的タンパク質は、滑液中で優先的に機能し得るが、体の他の部分には作用せず、又は作用の程度が低い。結果的に、かかる条件的活性型生物学的タンパク質は副作用が低減され得る。
【０４４８】
一部の実施形態において、条件的活性型生物学的タンパク質は、滑液中にあるか、又は滑液に曝露される抗原に対する抗体である。かかる抗原は、関節疾患における免疫応答／炎症に関与する任意のタンパク質であってもよく、しかし、抗原は多くの場合にサイトカインである。条件的活性型抗体は、体の他の部分（血漿など）における少なくとも１つの生理条件下では抗原に対する親和性が同じ抗原に対する野生型抗体と比べて低いが、滑液の少なくとも１つの生理条件下では抗原に対する親和性は野生型抗体より高い。かかる条件的活性型抗体は、体の他の部分では抗原に弱く結合するか、又は全く結合しないが、滑液中では抗原に結合し、例えば強く緊密に結合し、又はより強く結合し得る。
【０４４９】
腫瘍に対する条件的活性型生物学的タンパク質の操作
固形腫瘍の癌細胞は、その周囲に腫瘍微小環境を形成して癌細胞の成長及び転移を支援する能力を有する。腫瘍微小環境は、周囲血管、免疫細胞、線維芽細胞、他の細胞、可溶性因子、シグナル伝達分子、細胞外マトリックス、並びに新生物形質転換を促進し、腫瘍成長及び浸潤を支援し、腫瘍を宿主免疫から保護し、治療抵抗性を助長し、及び潜伏転移が発育するためのニッチを提供することのできる機械的キューを含めた、腫瘍が存在する細胞環境である。腫瘍及びその周囲微小環境は密接に関係し、常に相互作用している。腫瘍は、細胞外シグナルを放出し、腫瘍血管新生を促進し、及び末梢性免疫寛容を誘導することによってその微小環境に影響を与え得る一方、微小環境における免疫細胞が癌性細胞の成長及び発達に影響を及ぼし得る。Ｓｗａｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．“Ｔｕｍｏｒ  Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ：Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｒｏｌｅｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，”Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，ｖｏｌ．，７２，ｐａｇｅｓ  ２４７３−２４８０，２０１２を参照のこと。
【０４５０】
腫瘍微小環境は、多くの場合に低酸素である。腫瘍塊が増加するに従い、腫瘍の内部が成長して既存の血液供給からさらに離れ、腫瘍微小環境に酸素を完全に供給することが困難になる。腫瘍環境における酸素分圧は、局所進行固形腫瘍の５０％超で５ｍｍＨｇ未満であり、対して血漿中では約４０ｍｍＨｇの酸素分圧である。対照的に、体の他の部分は低酸素でない。低酸素環境はヌクレオチド除去修復及びミスマッチ修復経路の下方制御を介して遺伝的不安定性につながり、これは癌の進行に関連する。低酸素はまた、低酸素誘導因子１α（ＨＩＦ１−α）の上方制御も引き起こし、ＨＩＦ１−αは血管新生を誘導し、予後不良及び転移に関連する遺伝子の活性化に関連する。Ｗｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  ｔｕｍｏｒ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，”Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２１，ｐａｇｅｓ  １７２−１７７，２０１２及びＢｌａｇｏｓｋｌｏｎｎｙ，“Ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ，”Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．５，ｐａｇｅｓ  １３−１７，２００４を参照のこと。
【０４５１】
加えて、腫瘍細胞は、酸素を必要としない乳酸発酵によって生成されるエネルギーに頼る傾向がある。そのため腫瘍細胞は、酸素を必要とする通常の好気的呼吸を使用することが少ない。乳酸発酵を使用する結果、腫瘍微小環境は酸性となり（ｐＨ６．５〜６．９）、これは典型的に中性又は弱塩基性のいずれかである体の他の部分と対照的である。例えば、ヒト血漿は約７．４のｐＨを有する。Ｅｓｔｒｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｃｉｄｉｔｙ  Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｔｕｍｏｒ  Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  Ｄｒｉｖｅｓ  Ｌｏｃａｌ  Ｉｎｖａｓｉｏｎ，”Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．７３，ｐａｇｅｓ  １５２４−１５３５，２０１３を参照のこと。腫瘍微小環境において、増殖癌細胞の栄養素要求が比較的高いことに起因して、体の他の部分に位置する細胞と比較して栄養素の利用可能性も低い。
【０４５２】
さらに、腫瘍微小環境はまた、体の他の部分にはあまり見られない多くの特徴的な細胞型も含有する。これらの細胞型には、内皮細胞及びその前駆体、周皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞（Ｗｂｒｏｂｌａｓｔｓ）、癌関連線維芽細胞（Ｗｂｒｏｂｌａｓｔｓ）、筋線維芽細胞（ｍｙｏＷｂｒｏｂｌａｓｔｓ）、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、Ｔ及びＢリンパ球、ナチュラルキラー細胞及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）、例えばマクロファージ及び樹状細胞が含まれる（Ｌｏｒｕｓｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  ｔｕｍｏｒ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｕｍｏｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｔｏｗａｒｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，”Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，ｖｏｌ．１３０，ｐａｇｅｓ  １０９１−１１０３，２００８）。
【０４５３】
従って、腫瘍微小環境は、血漿中における生理条件など、体の他の部分の生理条件と異なる少なくともいくつかの生理条件を有する。腫瘍微小環境は、体の他の部分、特に血漿（ｐＨ７．４）と比べてｐＨ（酸性）が低い。腫瘍微小環境は、血漿などの体の他の部分と比べて酸素濃度が低い。また、腫瘍微小環境は、体の他の部分、特に血漿と比べて栄養素の利用可能性も低い。腫瘍微小環境はまた、体の他の部分、特に血漿にはあまり見られないいくつかの特徴的な細胞型も有する。
【０４５４】
ある種の制癌薬には、腫瘍微小環境内に侵入して、そこで癌細胞に作用することのできる抗体が含まれる。抗体ベースの癌療法は十分に確立されており、血液系悪性腫瘍及び固形腫瘍患者の治療に関して最も成功している重要な戦略の１つになっている。ヒト癌細胞が発現する細胞表面抗原であって、正常組織と比較して癌細胞で過剰発現するか、突然変異するか、又は選択的に発現する細胞表面抗原は多岐にわたる。これらの細胞表面抗原は、抗体癌療法の優れた標的である。
【０４５５】
抗体が標的とし得る癌細胞表面抗原は、いくつかの異なる種類に分類される。造血分化抗原は、通常分化クラスター（ＣＤ）分類に関連付けられる糖タンパク質類であり、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３及びＣＤ５２が含まれる。細胞表面分化抗原は、正常細胞及び腫瘍細胞の両方の表面上に見られる多様な糖タンパク質及び炭水化物の群である。成長及び分化シグナル伝達に関与する抗原は、多くの場合に成長因子及び成長因子受容体である。癌患者において抗体の標的となる成長因子には、ＣＥＡ２、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ；ＥＲＢＢ１としても知られる）１２、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２としても知られる）１３、ＥＲＢＢ３（参考文献１８）、ＭＥＴ（ＨＧＦＲとしても知られる）１９、インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）２０、エフリン受容体Ａ３（ＥＰＨＡ３）２１、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連アポトーシス誘導リガンド受容体１（ＴＲＡＩＬＲ１；ＴＮＦＲＳＦ１０Ａとしても知られる）、ＴＲＡＩＬＲ２（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂとしても知られる）及び核内因子κＢの受容体アクチベーターリガンド（ＲＡＮＫＬ；ＴＮＦＳＦ１１としても知られる）２２が含まれる。血管新生に関与する抗原は、通常、新しい微小血管系の形成を補助するタンパク質又は成長因子であり、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）、インテグリンαＶβ３及びインテグリンα５β１が含まれる（参考文献１０）。腫瘍間質及び細胞外マトリックスは、腫瘍にとって不可欠な支持構造である。治療標的となる間質性及び細胞外マトリックス抗原には、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）及びテネイシンが含まれる。Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ，ｖｏｌ．１２，ｐａｇｅｓ  ２７８−２８７，２０１２を参照のこと。
【０４５６】
抗体に加えて、他の生物学的タンパク質も癌の治療において有望となっている。例としては、腫瘍抑制因子、例えば、網膜芽細胞腫タンパク質（ｐＲｂ）、ｐ５３、ｐＶＨＬ、ＡＰＣ、ＣＤ９５、ＳＴ５、ＹＰＥＬ３、ＳＴ７、及びＳＴ１４が挙げられる。腫瘍サイズを縮小させるため、癌細胞においてアポトーシスを誘導する一部のタンパク質も腫瘍に導入し得る。腫瘍においてアポトーシスを誘導することのできる機構は少なくとも２つある：腫瘍壊死因子によって誘導される機構及びＦａｓ−Ｆａｓリガンドによって媒介される機構。これらの２つのアポトーシス機構のいずれかに関与するタンパク質の少なくとも一部を、治療のため腫瘍に導入し得る。
【０４５７】
癌幹細胞は、特定の癌試料に見られるあらゆる細胞型を生じる能力を有する癌細胞であり、従って腫瘍形成性である。癌幹細胞は、自己再生して複数の細胞型へと分化する幹細胞プロセスを通じて腫瘍を生じさせ得る。癌幹細胞は腫瘍において特徴的な集団として存在し続け、新たな腫瘍を生じさせることによって再発及び転移を引き起こすと考えられる。癌幹細胞を標的とする特異的療法の開発は、癌患者、特に転移性疾患患者について、生存及びクオリティオブライフを向上させ得る。
【０４５８】
これらの腫瘍治療薬は、多くの場合、腫瘍以外の体の他の部分で正常な生理学的機能を妨げる。例えば、腫瘍においてアポトーシスを誘導するタンパク質はまた、体の他の何らかの部分においてもアポトーシスを誘導し、従って副作用を引き起こし得る。抗体を使用して腫瘍を治療する実施形態において、抗体の抗原はまた、正常な生理学的機能を果たす体の他の部分においても発現し得る。例えば、腫瘍血管成長を止めるモノクローナル抗体ベバシズマブ（血管内皮成長因子を標的化する）。この抗体はまた、体の他の部分における血管成長及び修復も阻止し得るため、出血、創傷治癒不良、血餅、及び腎臓損傷を引き起こし得る。より有効性の高い腫瘍治療法には、主に又は専ら腫瘍を標的化することに集中する条件的活性型生物学的タンパク質の開発が極めて望ましい。
【０４５９】
一部の実施形態において、本発明は、腫瘍治療候補であり得る野生型生物学的タンパク質から生成される条件的活性型生物学的タンパク質を提供する。この条件的活性型生物学的タンパク質は、血漿などの腫瘍微小環境以外の体の部分における少なくとも１つの生理条件下で野生型生物学的タンパク質より低い活性を有し、一方、腫瘍微小環境における少なくとも１つの生理条件下で野生型生物学的タンパク質より高い活性を有する。かかる条件的活性型生物学的タンパク質は、腫瘍を治療するため腫瘍微小環境にある癌細胞に優先的に作用することができ、従って副作用を引き起こしにくい。生物学的タンパク質が腫瘍細胞の表面上の抗原（抗原が腫瘍微小環境に曝露している）に対する抗体である実施形態において、条件的活性型抗体は、体の他の部分、例えば非腫瘍微小環境では抗原に対する親和性が野生型抗体より低く、一方、腫瘍微小環境では抗原に対する親和性が野生型抗体より高い。かかる条件的活性型抗体は、体の他の部分では抗原に弱く結合し得るか、又は全く結合せず、しかし、腫瘍微小環境では抗原により高い結合性を有し、又は強力且つ緊密に結合する。
【０４６０】
一部の実施形態において、条件的活性型抗体は、免疫チェックポイントタンパク質に対する抗体であり、免疫チェックポイントの阻害をもたらす。かかる条件的活性型抗体は、（１）その条件的活性型抗体が由来する野生型抗体と比較した、腫瘍微小環境における免疫チェックポイントタンパク質に対する結合親和性の増加、及び（２）その条件的活性型抗体が由来する野生型抗体と比較した、非腫瘍微小環境における免疫チェックポイントタンパク質に対する結合親和性の低下のうちの少なくとも一方を有する。
【０４６１】
免疫チェックポイントは、自己寛容を維持し、且つ抗原刺激、すなわち外来性の分子、細胞及び組織に対する免疫応答の持続時間及び程度を調節する免疫系の内因性阻害経路として機能する。Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ，ｖｏｌ．１２，ｐａｇｅｓ  ２５２−２６４，２０１２を参照のこと。１つ以上のチェックポイントタンパク質を抑制することによる免疫チェックポイントの阻害は、免疫系、特にＴ細胞の過剰な活性化を引き起こし、従って免疫系が誘導されて腫瘍を攻撃し得る。本発明に好適なチェックポイントタンパク質としては、ＣＴＬＡ４及びそのリガンドＣＤ８０及びＣＤ８６、ＰＤ１及びそのリガンドＰＤＬ１及びＰＤＬ２、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンタンパク質−３（ＴＩＭ３）及びそのリガンドＧＡＬ９、Ｂ及びＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）及びそのリガンドＨＶＥＭ（ヘルペスウイルス侵入メディエーター）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）などの受容体、リンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ３）及びアデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）、並びにリガンドＢ７−Ｈ３及びＢ７−Ｈ４が挙げられる。さらなる好適な免疫チェックポイントタンパク質が、Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ，ｖｏｌ．１２，ｐａｇｅｓ  ２５２−２６４，２０１２及びＮｉｒｓｃｈｌ＆Ｄｒａｋｅ，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，ｖｏｌ．１９，ｐａｇｅｓ  ４９１７−４９２４，２０１３（これらの開示は本明細書によって参照により本明細書に援用される）に記載されている。
【０４６２】
ＣＴＬＡ−４及びＰＤ１は、最もよく知られている免疫チェックポイントタンパク質の２つである。ＣＴＬＡ−４は、Ｔ細胞活性化経路を下方制御し得る（Ｆｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６９（２）：６０９−６１５，２００９；及びＷｅｂｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，５８：８２３−８３０，２００９）。ＣＴＬＡ−４を遮断すると、Ｔ細胞活性化及び増殖が増大することが示されている。ＣＴＬＡ−４の阻害薬としては、抗ＣＴＬＡ−４抗体が挙げられる。抗ＣＴＬＡ−４抗体はＣＴＬＡ−４に結合してＣＴＬＡ−４とそのリガンドＣＤ８０又はＣＤ８６との相互作用を遮断し、それによりＣＴＬＡ−４とそのリガンドとの相互作用によって誘発される免疫応答の下方制御を遮断する。
【０４６３】
チェックポイントタンパク質ＰＤ１は、感染に対する炎症反応が起こったときに末梢組織におけるＴ細胞の活性を抑制し、自己免疫を抑えることが知られている。インビトロでＰＤ１を遮断すると、特異的抗原標的によるか、又は混合リンパ球反応における同種細胞による刺激に応答したＴ細胞増殖及びサイトカイン産生が増強され得る。ＰＤ１発現と免疫応答低下との間の強い相関は、ＰＤ１の阻害機能、すなわち免疫チェックポイントの誘導によって生じることが示された（Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ，１２：２５２−２６４，２０１２）。ＰＤ１の遮断は、ＰＤ１又はそのリガンドＰＤＬ１又はＰＤＬ２に結合する抗体を含め、種々の機構によって達成することができる。
【０４６４】
これまでの研究において、いくつかのチェックポイントタンパク質（ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１）に対する抗体が発見されている。これらの抗体は、免疫チェックポイントを阻害して、それにより腫瘍を攻撃するため免疫系、特にＴ細胞を過剰に活性化させることにより、腫瘍の治療に有効となる（Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ，ｖｏｌ．１２，ｐａｇｅｓ  ２５２−２６４，２０１２）。しかしながら、活性化過剰のＴ細胞はまた、宿主細胞及び／又は組織も攻撃し得るため、患者の体に付随的損傷をもたらし得る。従って、免疫チェックポイントを阻害するためのこれらの公知の抗体の使用に基づく治療法は管理が難しく、患者のリスクが重大な懸念事項である。例えば、ＦＤＡが承認済みのＣＴＬＡ−４に対する抗体は、その高い毒性のため黒枠警告を有する。
【０４６５】
本発明は、免疫チェックポイントタンパク質に対する条件的活性型抗体を提供することにより、活性化過剰のＴ細胞による付随的損傷の問題に対処する。これらの条件的活性型抗体は、腫瘍微小環境において免疫チェックポイントを優先的に活性化する。同時に、非腫瘍微小環境、例えば正常な生体組織における免疫チェックポイントは、条件的活性型抗体によって阻害されないか、又は阻害が少なく、従って非腫瘍微小環境では体に対する付随的損傷の可能性が低減される。この目標は、非腫瘍微小環境と比べて腫瘍微小環境においてより高活性となるように条件的活性型抗体（ａｎｔｉｂｏｄ）を操作することによって達成される。
【０４６６】
一部の実施形態において、免疫チェックポイントタンパク質に対する条件的活性型抗体は、非腫瘍微小環境における免疫チェックポイントタンパク質との結合活性に対する腫瘍微小環境における同じ免疫チェックポイング（ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｇ）タンパク質との結合活性の比が、少なくとも約１．１、又は少なくとも約１．２、又は少なくとも約１．４、又は少なくとも約１．６、又は少なくとも約１．８、又は少なくとも約２、又は少なくとも約２．５、又は少なくとも約３、又は少なくとも約５、又は少なくとも約７、又は少なくとも約８、又は少なくとも約９、又は少なくとも約１０、又は少なくとも約１５、又は少なくとも約２０であり得る。抗体の結合活性を計測するための典型的な分析は、ＥＬＩＳＡ分析である。
【０４６７】
高免疫原性腫瘍、例えば悪性黒色腫は、免疫系の操作によって達成される活性化過剰の免疫系に対して最も脆弱である。従って、免疫チェックポイントタンパク質に対する条件的活性型抗体は、かかる高免疫原性腫瘍の治療に特に有効であり得る。しかしながら、他のタイプの腫瘍も活性化過剰の免疫系に対して脆弱である。
【０４６８】
一部の実施形態において、免疫チェックポイントタンパク質に対する条件的活性型抗体は併用療法で用いられ得る。例えば、併用療法は、腫瘍細胞表面分子（腫瘍特異性抗原）に対する条件的活性型抗体と免疫チェックポイントタンパク質に対する条件的活性型抗体とを含み得る。一実施形態において、腫瘍細胞表面分子に対する条件的活性型抗体の結合活性と免疫チェックポイントタンパク質に対する条件的活性型抗体の結合活性との両方が単一のタンパク質に存在してもよく、すなわち、本明細書に開示されるような二重特異性条件的活性型抗体であってもよい。一部のさらなる実施形態において、併用療法は、腫瘍細胞表面分子（腫瘍特異性抗原）に対する条件的活性型抗体と２つ以上の異なる（ｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔ）免疫チェックポイントタンパク質に対する２つ以上の条件的活性型抗体とを含み得る。一実施形態において、これらの結合活性の全てが単一のタンパク質に存在してもよく、すなわち、本明細書に開示されるような多重特異性抗体であってもよい。
【０４６９】
条件的活性型抗体は、その条件的活性型抗体が由来する野生型抗体の活性と比較して、同じ腫瘍細胞表面分子又はチェックポイントタンパク質に対し腫瘍微小環境においてより高活性であるため、これらの併用療法は、有効性の増強及び毒性の大幅な低下の両方をもたらし得る。これらの条件的活性型抗体、特に免疫チェックポイントタンパク質に対する抗体の毒性の低下は、強力な抗体、例えば本明細書に記載されるようなＡＤＣ抗体、並びにより高用量の抗体の安全な使用を可能にし得る。
【０４７０】
一部の実施形態において、チェックポイントタンパク質に対する条件的活性型抗体はプロドラッグ形態であってもよい。例えば、条件的活性型抗体は、開裂されて薬物形態に変わる前は所望の薬物活性を有しないプロドラッグであり得る。プロドラッグは、かかる開裂を触媒する酵素が腫瘍微小環境に優先的に存在するか、又は条件的活性型抗体が非腫瘍微小環境における開裂部位への到達し易さと比較して腫瘍微小環境では開裂部位に到達し易くなるかのいずれかの理由により、腫瘍微小環境で優先的に開裂し得る。
【０４７１】
腫瘍幹細胞を含めた幹細胞ニッチに対する条件的活性型生物学的タンパク質の操作
幹細胞は体の幹細胞ニッチと呼ばれる環境に存在し、幹細胞ニッチは組織生理学の基本的な単位を成し、生物の要求に対する幹細胞の応答を媒介するシグナルを統合する。しかし、ニッチは、幹細胞又は他の標的に異常機能を課すことによって病理も誘導し得る。幹細胞とそれらのニッチとの間の相互作用により、組織の持続及び幹細胞療法の最終設計に必要な動的システムが作り出される（Ｓｃａｄｄｅｎ，“Ｔｈｅ  ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ  ｎｉｃｈｅ  ａｓ  ａｎ  ｅｎｔｉｔｙ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ，”Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．４４１，ｐａｇｅｓ  １０７５−１０７９，２００６）。脊椎動物における一般的な幹細胞ニッチには、生殖細胞系列幹細胞ニッチ、造血幹細胞ニッチ、毛包幹細胞ニッチ、腸幹細胞ニッチ、及び心血管幹細胞ニッチが含まれる。
【０４７２】
幹細胞ニッチは、体の他の部分（例えば血漿）と異なる特殊化した環境である（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ−Ｂａｒｂｏｓａ，“Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，Ｔｈｅｉｒ  Ｎｉｃｈｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ：Ａｎ  Ａｇｉｎｇ  Ｎｅｔｗｏｒｋ，”Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ｖｏｌ．１８０，ｐａｇｅｓ  １７８７−１７９７，２００８；Ｆｕｃｈｓ，“Ｓｏｃｉａｌｉｚｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｎｅｉｇｈｂｏｒｓ：Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｎｉｃｈｅ，”Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．１１６，ｐａｇｅｓ  ７６９−７７８，２００４）。幹細胞ニッチは低酸素であり、酸化的ＤＮＡ損傷が低下している。酸素レベルを直接計測することにより、一般に骨髄が血漿と比較して事実上低酸素である（約１％〜２％Ｏ２）ことが明らかになっている（Ｋｅｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｈｙｐｏｘｉａ−Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｆａｃｔｏｒｓ，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ，”Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．１２９，ｐａｇｅｓ  ４６５−４７２，２００７；Ｍｏｈｙｅｌｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｏｘｙｇｅｎ  ｉｎ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｎｉｃｈｅ，”Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．７，ｐａｇｅｓ  １５０−１６１，２０１０）。加えて、幹細胞ニッチは、ニッチ内で幹細胞特性を調節するためいくつかの他の因子：細胞外マトリックス成分、成長因子、サイトカイン、及び環境の生理化学的性質の因子、例えば、ｐＨ、イオン強度（例えばＣａ２＋濃度）及び代謝産物を有しなければならない。
【０４７３】
従って、幹細胞ニッチは、血漿中の生理条件など、体の他の部分の生理条件と異なる少なくともいくつかの生理条件を有する。幹細胞ニッチは、体の他の部分、特に血漿と比べて酸素濃度が低い（１〜２％）。ｐＨ及びイオン強度を含めた幹細胞ニッチの他の生理条件も体の他の部分と異なり得る。
【０４７４】
幹細胞療法は、疾患又は傷害を治療するため新規の成体幹細胞を損傷組織に導入するインターベンショナルな戦略である。この戦略は、幹細胞が自己再生して、分化能の程度が様々な続く子孫を生じる能力に依存する。幹細胞療法は、拒絶反応及び副作用のリスクを最小限に抑えつつ体の罹患及び損傷範囲を取り替えることが潜在的に可能な組織を再生する大きい潜在的可能性をもたらす。従って、幹細胞の再生及び分化に影響を及ぼすため幹細胞ニッチに薬物（生物学的タンパク質（例えば抗体）又は化学的化合物）を送達することは、幹細胞療法の重要な部分である。
【０４７５】
幹細胞ニッチが哺乳動物における幹細胞の再生及び／又は分化にどのように影響を及ぼすかに関するいくつかの例がある。第１の例は皮膚におけるもので、ここではβ−１インテグリンが原始細胞上で差次的に発現し、且つマトリックス糖タンパク質リガンドとの相互作用を介した幹細胞集団の制約的な局在化に関与することが知られている。第２に、神経系において、テネイシンＣが存在しないことにより脳室下帯の神経幹細胞の数及び機能が変化する。テネイシンＣは、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）及び骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）に対する幹細胞感受性を調節して幹細胞性向の増加をもたらすものと思われる。第３に、別のマトリックスタンパク質、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを含有するシアロタンパク質、オステオポンチン（ＯＰＮ）は、現在、造血幹細胞調節に寄与することが実証されている。ＯＰＮは、造血幹細胞ＣＤ４４、並びにα４及びα５β１インテグリン上にあることが知られるいくつかの受容体と相互作用する。ＯＰＮ産生は、特に骨芽細胞の活性化によって著しく変化し得る。ＯＰＮ欠損動物は、ＯＰＮがないことによって刺激条件下で超生理学的な幹細胞増大が生じるため、ＨＳ細胞数が増加している。従って、ＯＰＮは、恒常条件下又は刺激下で幹細胞の数を制限する造血幹細胞数の制約因子としての役割を果たすものと思われる。Ｓｃａｄｄｅｎ，“Ｔｈｅ  ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ  ｎｉｃｈｅ  ａｓ  ａｎ  ｅｎｔｉｔｙ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ，”Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．４４１，ｐａｇｅｓ  １０７５−１０７９，２００６を参照のこと。
【０４７６】
Ｘｉｅ  ｅｔ  ａｌ．“Ａｕｔｏｃｒｉｎｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｂａｓｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙｉｅｓ  ｔｈａｔ  ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ  ｈｕｍａｎ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ，”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，ｖｏｌ．１１０，ｐａｇｅｓ  ８０９９−８１０４，２０１３）は、抗体を使用して幹細胞分化に影響を及ぼす方法を開示している。この抗体は、顆粒球コロニー刺激因子受容体のアゴニストである。細胞を活性化して所定の経路に沿って分化させる天然の顆粒球コロニー刺激因子と異なり、この単離アゴニスト抗体はヒト骨髄系統ＣＤ３４＋骨髄細胞を神経前駆細胞に分化転換させた。Ｍｅｌｉｄｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（“Ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｈａｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ，”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，ｖｏｌ．１１０，ｐａｇｅｓ  １７８０２−１７８０７，２０１３）も、抗体を使用してＦＧＦ４とその受容体ＦＧＦＲ１βとの間の相互作用に干渉し、従ってオートクリンＦＧＦ４媒介性胚性幹細胞分化を遮断する方法を開示している。
【０４７７】
幹細胞分化におけるリガンド／受容体の機能の理解により、幹細胞分化を調節し、又はさらには指図するため生物学的タンパク質を利用してこれらのリガンド／受容体に干渉する戦略が可能となっている。遺伝子修飾されていないヒト幹細胞の分化を幹細胞ニッチへの抗体の投与によって制御可能であることにより、幹細胞ベースの療法の新規エキソビボ又はインビボ手法がもたらされ得る。一部の実施形態において、本発明は、癌幹細胞を含め、幹細胞ニッチに侵入して幹細胞又は腫瘍の発育を調節する能力を有する野生型生物学的タンパク質から生成される条件的活性型生物学的タンパク質を提供する。この条件的活性型生物学的タンパク質は、体の他の部分における少なくとも１つの生理条件下では野生型生物学的タンパク質より低い活性を有し、一方、幹細胞ニッチ、例えば癌幹細胞環境における少なくとも１つの生理条件下では野生型生物学的タンパク質より高い活性を有する。かかる条件的活性型生物学的タンパク質は副作用を生じにくく、幹細胞ニッチで優先的に作用して幹細胞の再生及び分化を調節する。一部の実施形態において、条件的活性型生物学的タンパク質は抗体である。かかる条件的活性型抗体は、体の他の部分ではその抗原に弱く結合し、又は全く結合せず、しかし、幹細胞ニッチでは抗原に強く緊密に結合し得る。
【０４７８】
本発明の滑液、腫瘍微小環境及び幹細胞ニッチに対する条件的活性型タンパク質は、野生型生物学的タンパク質をコードするＤＮＡを発達させて変異ＤＮＡライブラリを作成する方法によって生成される。次にこの変異ＤＮＡライブラリを発現させると、変異タンパク質が得られる。この変異タンパク質は、滑液、腫瘍微小環境、及び幹細胞ニッチからなる群から選択される体の第１の部分の少なくとも１つの生理条件下で野生型生物学的タンパク質より高い活性を有し、且つ体の第１の部分と異なる体の第２の部分における少なくとも１つの生理条件下で野生型生物学的タンパク質より低い活性を有する条件的活性型生物学的タンパク質に関してスクリーニングされる。体の第２の部分は血漿であってもよい。かかる選択された変異生物学的タンパク質が、体の第１の部分では高い活性を有するが体の第２の部分では低い活性を有する条件的活性型生物学的タンパク質である。
【０４７９】
条件的活性型生物学的タンパク質が作用することが意図されない体の他の部分では条件的活性型生物学的タンパク質の活性はより低いため、かかる条件的活性型生物学的タンパク質は野生型タンパク質の副作用を低下させるのに有利である。例えば、条件的活性型生物学的タンパク質を腫瘍微小環境に導入することが意図される場合、腫瘍微小環境以外の体の部分で条件的活性型生物学的タンパク質の活性が低いということは、かかる条件的活性型生物学的タンパク質が腫瘍微小環境以外の体の部分で正常な生理学的機能に干渉する可能性が低いことを意味する。同時に、条件的活性型生物学的タンパク質は腫瘍微小環境では活性が高く、これにより条件的活性型生物学的タンパク質は腫瘍の治療における有効性がより高いものとなる。
【０４８０】
副作用が低いため、この条件的活性型生物学的タンパク質は、野生型生物学的タンパク質と比較して大幅に高い用量のタンパク質を安全に使用することが可能である。サイトカイン又は成長因子に対する抗体は体の他の部分におけるサイトカイン又は成長因子の正常な生理学的機能を妨げ得るため、これはサイトカイン又は成長因子に対する抗体について特に有益である。副作用が低い条件的活性型生物学的タンパク質を使用することにより、より高用量を用いてより高い有効性を達成し得る。
【０４８１】
滑液、腫瘍微小環境、又は幹細胞ニッチの１つにおいて作用する条件的活性型生物学的タンパク質はまた、新規薬物標的の使用も可能にし得る。従来の生物学的タンパク質を療法薬として使用すると、許容できない副作用が生じ得る。例えば、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の阻害は腫瘍成長の抑制に極めて有効であり得る。しかしながら、ＥＧＦＲを阻害する薬物はまた、皮膚及び胃腸（ＧＩ）管における成長も抑制し得る。この副作用のため、ＥＧＦＲは腫瘍薬標的として不適となる。腫瘍微小環境においてのみＥＧＦＲに高親和性で結合するが、体の任意の他の部分では全く又は極めて低い親和性でのみ結合する条件的活性型抗体を使用すると、副作用を大幅に低減すると同時に腫瘍成長を抑制し得る。この場合、条件的活性型抗体を使用することにより、ＥＧＦＲが有効な新規腫瘍薬標的となり得る。
【０４８２】
別の例では、関節損傷の修復において多くの場合にサイトカインの抑制が有益である。しかしながら、体の他の部分におけるサイトカインの抑制はまた、体の免疫応答も抑制し、免疫不全を引き起こし得る。従って、滑液中のサイトカインは、関節損傷治療用の従来の抗体薬の開発に理想的な標的ではない。しかしながら、滑液中ではサイトカインに優先的に結合する一方で、体の他の部分では同じサイトカインに全く又は弱くのみ結合する条件的活性型抗体を使用することにより、免疫不全の副作用を劇的に低減することができる。従って、条件的活性型抗体を使用することにより、滑液中のサイトカインが関節損傷の修復に好適な標的となり得る。
【０４８３】
条件的活性型生物学的タンパク質によるウイルス粒子の操作
ウイルス粒子は、長年、タンパク質、核酸分子、化学的化合物又は放射性同位元素を標的細胞又は組織に輸送するための送達媒体として使用されている。送達媒体として一般的に用いられているウイルス粒子としては、レトウイルス（ｒｅｔｏｖｉｒｕｓ）、アデノウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、及びアデノ随伴ウイルスが挙げられる。ウイルス粒子は、多くの場合にリガンド−受容体結合系において、標的細胞の標的タンパク質として機能する細胞タンパク質との特異的結合のための認識タンパク質として機能する表面タンパク質を介してその標的細胞を認識する（Ｌｅｎｔｚ，“Ｔｈｅ  ｒｅｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｅｖｅｎｔ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ａｇｅｎｔｓ，”Ｊ．ｏｆ  Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．７１，ｐａｇｅｓ  ７５１−７６５，１９９０（参照により本明細書に援用される））。例えば、ウイルスの認識タンパク質は、標的細胞上の受容体に対するリガンドであり得る。リガンドと受容体との間の特異性により、ウイルス粒子が標的細胞を特異的に認識して、そこにその内容物を送達することが可能となる。
【０４８４】
野生型ウイルスから人工ウイルス粒子を作る技法は当業者に周知である。送達媒体として公知の人工ウイルス粒子には、レトロウイルス（例えば、国際公開第９０／０７９３６号パンフレット；国際公開第９４／０３６２２号パンフレット；国際公開第９３／２５６９８号パンフレット；国際公開第９３／２５２３４号パンフレット；米国特許第５，２１９，７４０号明細書；国際公開第９３／１１２３０号パンフレット；国際公開第９３／１０２１８号パンフレット；米国特許第４，７７７，１２７号明細書；英国特許第２，２００，６５１号明細書；欧州特許第０  ３４５  ２４２号明細書；及び国際公開第９１／０２８０５号パンフレットを参照のこと）、アルファウイルス（例えば、シンドビスウイルスベクター、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４７）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４６）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣ  ＶＲ  １２４９；ＡＴＣＣ  ＶＲ−５３２））、及びアデノ随伴ウイルス（例えば、国際公開第９４／１２６４９号パンフレット、国際公開第９３／０３７６９号パンフレット；国際公開第９３／１９１９１号パンフレット；国際公開第９４／２８９３８号パンフレット；国際公開第９５／１１９８４号パンフレット及び国際公開第９５／００６５５号パンフレットを参照のこと）をベースとするものが含まれる。
【０４８５】
概して、人工ウイルス粒子は、ウイルス粒子への外来性認識タンパク質の挿入、多くの場合に組換え技術による天然認識タンパク質の置換によって構築される。外来性認識タンパク質は、例えば、抗体、受容体、リガンド又はコラーゲン結合ドメインであり得る。本発明は、正常生理条件では細胞に対する結合が不活性又は低活性であり、且つ異常条件では細胞に対する結合が活性又は高活性である条件的活性型認識タンパク質を提供する。従って条件的活性型認識タンパク質は、罹患組織及び／又は疾患部位の標的細胞に対してはその部位における異常条件の存在に基づき優先的に結合し、且つ正常生理条件が存在する正常組織の細胞との結合は回避し、又はごく最小限であり得る。条件的活性型認識タンパク質はウイルス粒子の表面上に発現し、提示され得る。
【０４８６】
一部の実施形態において、本発明は、野生型認識タンパク質を発達させて、条件的活性型認識タンパク質に関してスクリーニングする方法を提供する。条件的活性型認識タンパク質は、正常生理条件下では野生型認識タンパク質と比べて細胞に対する結合活性が低く、異常条件下では野生型認識タンパク質と比べて細胞に対する結合活性が高い。かかる条件的活性型認識タンパク質を周知の組換え技術によってウイルス粒子に挿入すると、条件的活性型ウイルス粒子が生成され得る。
【０４８７】
別の実施形態において、本発明は、条件的活性型認識タンパク質を含む条件的活性型ウイルス粒子を提供し、これは、条件的活性型ウイルス粒子が罹患組織又は疾患部位の標的細胞を認識してそれに結合するが、正常組織の細胞は認識及び結合しないことを可能にするものである。かかる条件的活性型ウイルス粒子はウイルス粒子内の療法薬を疾患組織又は疾患部位に優先的に送達することができる一方、この条件的活性型ウイルス粒子は正常組織の細胞にはより少ない療法薬を送達するか、又は送達しない。
【０４８８】
一部の実施形態において、疾患部位における標的細胞は、健常な又は特定の疾患又は病状に罹患していない体の他の部分におけるｐＨ又は温度と比較して異常なｐＨ（例えば、ｐＨ６．５）又は異常な温度を有する領域又は微小環境の内部にある。この実施形態において、条件的活性型認識タンパク質は、正常な生理的ｐＨ又は温度では野生型認識タンパク質と比べて標的細胞の標的タンパク質との結合活性が低く、異常なｐＨ又は温度では野生型認識タンパク質と比べて標的細胞の標的タンパク質との結合活性が高い。このように、この認識タンパク質は異常なｐＨ又は温度が起こる部位に優先的に結合し、それによって治療を疾患部位に送達し得る。
【０４８９】
一実施形態において、ウイルス粒子は本発明の条件的活性型抗体、特に抗体の可変領域（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ）を含み得る。かかる条件的活性型抗体は、正常組織を含む部位で起こり得る正常生理条件下では野生型抗体より低い親和性で、及び疾患部位又は罹患組織で起こり得る異常条件下では野生型抗体より高い親和性で、標的細胞の標的タンパク質（抗原として）に結合し得る。条件的活性型抗体は、本発明の方法に従い野生型抗体から誘導し得る。
【０４９０】
ある実施形態では、標的細胞上の標的タンパク質には、例えば多くの腫瘍において細胞表面上で過剰発現するチロシンキナーゼ成長因子受容体が含まれる。例示的チロシンキナーゼ成長因子は、ＶＥＧＦ受容体、ＦＧＦ受容体、ＰＤＧＦ受容体、ＩＧＦ受容体、ＥＧＦ受容体、ＴＧＦ−α受容体、ＴＧＦ−β受容体、ＨＢ−ＥＧＦ受容体、ＥｒｂＢ２受容体、ＥｒｂＢ３受容体、及びＥｒｂＢ４受容体である。
【０４９１】
条件的活性型ＤＮＡ／ＲＮＡ修飾タンパク質の操作
新規ゲノム操作ツールの一形態としてＤＮＡ／ＲＮＡ修飾タンパク質、特にＣＲＩＳＰＲと呼ばれるものが発見されており、これらによれば、研究者は遺伝子にマイクロサージェリーを施して、染色体上の正確な位置にあるＤＮＡ配列を精密且つ容易に変化させることが可能となる（ゲノム編集、Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃａｓ９  ａｓ  ａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｂｉｏｌｏｇｙ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｖｏｌ．１０，ｐａｇｅｓ  ９５７−９６３，２０１３）。例えば、鎌状赤血球貧血は単一塩基突然変異によって引き起こされ、これはＤＮＡ／ＲＮＡ修飾タンパク質を使用して修正し得る可能性がある。この技術は、染色体の小片を、一塩基対の変更による場合であっても、精密に欠失させ、又は編集し得る（Ｍａｋａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．９，ｐａｇｅｓ  ４６７−４７７，２０１１）。
【０４９２】
ＣＲＩＳＰＲによるゲノム編集は、細胞に複数の遺伝子変化を迅速且つ同時に作製する能力を有する。多くのヒトの病気は、心疾患、糖尿病、及び神経系疾患を含め、複数の遺伝子における突然変異の影響を受ける。このＣＲＩＳＰＲベースの技術は、疾患を引き起こす突然変異を復帰させ、これらの疾患を治癒し、又は少なくともこれらの疾患の重症度を低減し得る可能性を有する。ゲノム編集は、ゲノムＤＮＡの切断についてＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質（酵素ファミリー）に頼る。典型的には、Ｃａｓタンパク質は、小さいガイドＲＮＡによってゲノム内の標的領域に案内され、ここでガイドＲＮＡは標的領域と一致している。Ｃａｓタンパク質は配列特異性がほとんど又は全くないため、ガイドＲＮＡが、Ｃａｓタンパク質が正確なゲノム編集を達成するための指示者としての役割を果たす。一実施形態では、１つのＣａｓタンパク質を複数のガイドＲＮＡと共に使用して、複数の遺伝子突然変異を同時に修正し得る。
【０４９３】
多くのＣａｓタンパク質が存在する。例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３’、Ｃａｓ３’’、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、及びＣｓｆ４が挙げられる（（Ｍａｋａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．９，ｐａｇｅｓ  ４６７−４７７，２０１１）。
【０４９４】
ゲノム編集を行うには、Ｃａｓタンパク質が標的細胞に侵入する必要がある。対象の細胞は、細胞内部において異なる細胞内ｐＨを有し得る。罹患組織の一部の細胞は異常な細胞内ｐＨを有する。例えば、一部の腫瘍細胞は約７．１２〜７．６５のアルカリ性の細胞内ｐＨを有する傾向があり、一方、正常組織の細胞は６．９９〜７．２０の範囲の中性の細胞内ｐＨを有する。Ｃａｒｄｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｄｉｓｔｕｒｂｅｄ  ｐＨ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｎａ（＋）／Ｈ（＋）ｅｘｃｈａｎｇｅｒ  ｉｎ  ｍｅｔａｔａｓｉｓ，”Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ，ｖｏｌ．５，ｐａｇｅｓ  ７８６−７９５，２００５を参照のこと。慢性低酸素では、罹患組織の細胞は約７．２〜７．５の細胞内ｐＨを有し、これも正常組織の細胞内ｐＨより高い（Ｒｉｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｙｐｏｘｉａ  ｅｌｅｖａｔｅｓ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐＨ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  Ｎａ＋／Ｈ＋  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｉａｌ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ，”Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ−Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２８９，ｐａｇｅｓ  Ｌ８６７−Ｌ８７４，２００５）。さらに、虚血細胞では、細胞内ｐＨは典型的に６．５５〜６．６５の範囲であり、これは正常組織の細胞内ｐＨより低い（Ｈａｑｂｅｒｇ，“Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐＨ  ｄｕｒｉｎｇ  ｉｓｃｈｅｍｉａ  ｉｎ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ：ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｔｏ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ，ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐＨ，ｔｉｓｓｕｅ  ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎｄ  ＡＴＰ，”Ｐｆｌｕｇｅｒｓ  Ａｒｃｈ．，ｖｏｌ．４０４，ｐａｇｅｓ  ３４２−３４７，１９８５）。罹患組織における異常な細胞内ｐＨのさらなる例が、Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐＨ，”Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ．，ｖｏｌ．１１０，ｐａｇｅｓ  ２７０９−２７２８，２０１０において考察されている。
【０４９５】
本発明は、野生型Ｃａｓタンパク質から条件的活性型Ｃａｓタンパク質を作製する方法を提供し、ここで条件的活性型Ｃａｓタンパク質は、（１）正常細胞内部の正常生理条件下で野生型Ｃａｓタンパク質の活性と比べて低下した酵素活性、及び（２）上記で考察した罹患細胞の１つなどの標的細胞内部の異常条件下で野生型Ｃａｓタンパク質の活性と比べて増加した酵素活性のうちの少なくとも一方を有する。一部の実施形態において、正常生理条件はほぼ中性の細胞内ｐＨであり、異常条件は、中性より高いか、又はそれより低い異なる細胞内ｐＨである。ある実施形態では、異常条件は、７．２〜７．６５の細胞内ｐＨ又は６．５〜６．８の細胞内（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｒｌａｒ）ｐＨである。
【０４９６】
一部の実施形態において、条件的活性型Ｃａｓタンパク質は、本発明の条件的活性型ウイルス粒子を使用して標的細胞に送達し得る。条件的活性型ウイルス粒子は、条件的活性型Ｃａｓタンパク質と、Ｃａｓタンパク質がゲノムＤＮＡを編集することになる位置にＣａｓタンパク質を導くための少なくとも１つのガイドＲＮＡとを含む。
【０４９７】
条件的活性型抗体のＦｃ領域の操作
フラグメント結晶化可能領域（Ｆｃ領域）は、Ｆｃ受容体と呼ばれる細胞表面受容体及び補体系の一部のタンパク質と相互作用する抗体のテール領域である。各抗原に特異的なＦａｂ領域と異なり、クラス内の全ての抗体のＦｃ領域が、抗体がどの抗原に結合するかに関わらず、各種について同じである。
【０４９８】
Ｆｃ受容体は、タンパク質の免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのメンバーである。Ｆｃ受容体は、マクロファージ及び単球などの食細胞、好中球及び好酸球などの顆粒球、及び自然免疫系のリンパ球（ナチュラルキラー細胞）又は適応免疫系のリンパ球（例えばＢ細胞）を含めた免疫系のいくつもの細胞に見られる。抗体と結合すると、Ｆｃ受容体によってこれらの細胞が活性化し、これらの細胞が抗体のＦａｂ領域に結合する抗原（微生物病原体など）を同定して取り除くことが可能となる。Ｆｃ受容体によって媒介される死滅機構には、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、及び抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）が含まれる。
【０４９９】
一部の実施形態では、Ｆｃ領域を操作してＦｃ領域にアミノ酸置換などの突然変異が導入される。Ｆｃ領域のかかる置換により、血清中における変異抗体の半減期が増加し得る。例えば、ＩｇＧ抗体の半減期は、内皮細胞の表面上に発現してＩｇＧをｐＨ依存的に分解から保護する新生児受容体ＦｃＲｎとのそのｐＨ依存的結合に相関する。Ｆｃ領域におけるいくつかのアミノ酸置換、例えば、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ及びＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ＋Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆが、ＦｃＲｎに対する抗体の結合親和性の増加を示しており、抗体の半減期を延長するために使用し得る。
【０５００】
アミノ酸置換はまた、エフェクター機能を改変するためＦｃ領域に導入されてもよい。例えば、ＩｇＧクラスのヒト抗体はＦｃγ受容体（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａ）、阻害性ＦｃγＲＩＩｂ受容体、及び補体第１成分（Ｃ１ｑ）に異なる親和性で結合し、これらの抗体の異なるものの間で極めて異なるエフェクター機能を生じる。ＩｇＧ抗体とＦｃγＲ又はＣ１ｑとの結合は、抗体のヒンジドメイン及びＣＨ２ドメインに位置する残基に依存する。２３３〜２３６位のヒト抗体ＩｇＧ１又は（ｏｆ）ＩｇＧ２残基及び３２７、３３０及び３３１位の抗体ＩｇＧ４残基のアミノ酸置換は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣを大きく低減し得る。さらに、Ｋ３２２を含めた、Ｆｃ領域における種々の位置のアラニン置換は、補体活性化を大幅に低減する。Ｆｃ領域を操作するさらに多くの例が、米国特許第８，３６２，２１０号明細書（全体として参照により援用される）に記載されている。
【０５０１】
一部の実施形態において、抗体のＦｃ領域は、抗原の認識が可能となるように操作し得る（米国特許出願公開第２０１０／０２５６３４０号明細書、参照により本明細書に援用される）。少なくとも１つ、好ましくは２つの余分なＦａｂフラグメントが抗体のＦｃ領域に連結され得る。一部の実施形態において、これらの余分なＦａｂフラグメントは条件的活性型である。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過するように設計された本発明の抗体が、血漿側ではＢＢＢ−Ｒに低い親和性を有し、且つ脳側ではＢＢＢ−Ｒに対する親和性が全くないかかる余分なＦａｂフラグメントを含有し得る。この抗体はまた、複数の脳抗原に結合することもでき、従ってこれらの抗原が存在する部位に優先的に作用することに関してより高い選択性を有する。
【０５０２】
本開示は、少なくとも１つの組成物を提供するものであって、この組成物は、（ａ）条件的活性型生物学的タンパク質、及び（ｂ）適当な担体又は希釈剤を有するものである。本開示はまた、少なくとも１つの組成物を提供するものであって、この組成物は、（ａ）本明細書に記載の核酸をエンコードする条件的活性型生物学的タンパク質、及び（ｂ）適当な担体又は希釈剤を有するものである。担体又は希釈剤は、選択的に、既知の担体又は希釈剤に従って、薬学的に許容可能なものにすることができる。組成物はさらに、選択的に、追加して少なくとも１つの化合物、タンパク質、又は組成物を有することができる。
【０５０３】
条件的活性型生物学的タンパク質は、薬学的に受容可能な塩の形態であってもよい。薬学的に受容可能な塩とは、製薬産業において治療用タンパク質の塩として一般的に用いられるものであって、例えばナトリウム、カリウム、カルシウムなどの塩、並びにプロカイン、ジベンジルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、メチルグルカミン、タウリンなどのアミン塩、並びに塩酸塩、及び塩基性アミノ酸などの酸添加塩含むものである。
【０５０４】
本開示は、さらに、当該技術分野に既知である通り、及び／又は本明細書に記載されている通り、細胞、組織、臓器、動物又は患者における、少なくとも１つの親分子が関連する症状を、及び／又は関連症状の前、後、若しくは間に調節又は治療するための、治療有効量を投与するための、少なくとも１つの条件的活性型生物学的タンパク質の方法又は組成物を提供する。従って、本開示は、本開示の少なくとも１つの条件的活性型生物学的タンパク質の有効量を有する組成物を、細胞、組織、臓器又は動物に接触させる工程或いはそれに投与する工程を有する、細胞、組織、臓器又は動物における、野生型タンパク質に関連する症状を、診断又は処置する方法を提供するものである。本方法は選択的に、さらに、細胞、組織、臓器又は動物に対し、有効量である０．００１〜５０ｍｇ／ｋｇの、本開示の条件的活性型生物学的タンパク質を使用する工程を有していてもよい。本方法は選択的に、さらに、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹腔内、嚢内（ｉｎｔｒａｃａｐｓｕｌａｒ）、軟骨内、腔内（ｉｎｔｒａｃａｖｉｔａｒｙ）、腔内（ｉｎｔｒａｃｅｌｉａｌ）、小脳内、脳室内、結腸内、頸内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸内、子宮内、嚢内（ｉｎｔｒａｖｅｓｉｃａｌ）、ボーラス、膣、直腸、口腔内、舌下、鼻腔内、又は経皮から選択される少なくとも１つの形態により、接触させる工程又は投与する工程を、使用する工程を有していてもよい。本方法は選択的に、さらに、条件的活性型生物学的タンパク質の接触又は投与の前に、同時に、又は後に、検出可能な標識又はレポーター、ＴＮＦアンタゴニスト、抗リウマチ剤、筋肉弛緩剤、麻酔薬、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛剤、麻酔剤、鎮静剤、局所麻酔剤、神経筋遮断薬、抗菌薬、乾癬治療薬、コルチコステロイド、タンパク同化ステロイド、エリスロポエチン、免疫化薬、免疫グロブリン、免疫抑制薬、成長ホルモン、ホルモン補充薬、放射性医薬品、抗欝薬、抗精神病薬、興奮剤、喘息薬、ベータアゴニスト、吸入用ステロイド、エピネフリン又はその類似物、細胞毒性薬又は他の抗癌剤、メトトレキセートのような代謝拮抗剤、増殖抑制剤、サイトカイン、或いはサイトカインアンタゴニストの少なくとも１つから選択される、少なくとも１つの化合物又はタンパク質の有効量を有する、少なくとも１つの組成物を投与する工程を有していてもよい。
【０５０５】
本開示はさらに、当該技術分野において既知である通り、及び／又は本明細書に記載されている通り、細胞、組織、臓器、動物又は患者における少なくとも１つの、野生型タンパク質が関連する症状を、及び／又は関連症状の前、後、若しくは間に診断するための、少なくとも１つの条件的活性型生物学的タンパク質の方法を提供する。
【０５０６】
薬学的に受容可能な担体は、投与される特定の組成物によって、及びその組成物を投与するのに使用される特定の方法によって、ある程度決定される。従って、本発明の医薬組成物に好適な製剤は多種多様である。様々な液体担体、例えば緩衝生理食塩水などが使用されてもよい。そうした溶液は、無菌であり、一般的に不都合となる物質は入っていない。そうした溶液は、従来的な既知の滅菌方法によって滅菌されてもよい。組成物は生理学的条件に近付けるのに必要とされる薬学的に受容される、ｐＨ調節剤及び緩衝剤、等張性調節剤などの補助物質、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等を含んでいてもよい。こうした製剤の中での条件的活性型生物学的タンパク質の濃度は幅広く変えてもよく、選んだ特定の投与形態に従って、流体容積、粘度、体重などに主に基づいて選択されるであろう。
【０５０７】
経口投与に適した製剤は、（ａ）水、生理食塩水、又はＰＥＧ４００などの希釈剤中に懸濁された、有効量の放送された核酸のような、液体の液剤、（ｂ）それぞれ予め決定された量の活性成分を、液体、固形物、顆粒又はゼラチンとして含有する、カプセル剤、サシェ剤又は錠剤、（ｃ）適切な液体中の懸濁剤、並びに（ｄ）好適な乳剤からなることができる。本発明の、経口投与のための医薬組成物及び製剤は、当該技術分野で公知の薬学的に受容可能な担体を、適切な用量使用して配合することができる。そうした担体は、医薬品が、錠剤、丸剤、散剤、糖衣剤、カプセル剤、液剤、トローチ剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤など、患者の服用に好適な単位用量形に製剤化されることを可能にする。経口使用のための医薬製剤は、固体賦形剤によって製剤化されるが、場合により、錠剤又は糖衣剤の中核部を得るため、得られた混合物を磨り潰し、好適な追加の化合物を加えた後にその顆粒剤の混合物を処理する。好適な固体賦形剤は炭水化物又はタンパク質充填剤であり、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール又はソルビトールなどの糖；トウモロコシ、コムギ、コメ、ジャガイモ又は他の植物に由来するデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース又はカルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース；並びにアラビア及びトラガカントを含むガム：並びにゼラチン及びコラーゲンなどのタンパク質を含む。架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、又はアルギン酸ナトリウムなどのそれらの塩のような、崩壊剤又は可溶化剤を加えてもよい。錠剤形は、乳糖、ショ糖、マンニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、微晶質セルロース、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、他の賦形剤、着色剤、充填剤、結合剤、希釈剤、緩衝剤、水和剤、保存剤、香味料、色素、崩壊剤、及び薬学的に受容可能な担体の中から１つ又は複数を含むことができる。
【０５０８】
本発明は、水性懸濁剤の製造に適する賦形剤との混合物中に、条件的活性型生物学的タンパク質を有する水性懸濁剤を提供する。そのような賦形剤には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガム及びアラビアガムのような懸濁化剤、及び天然に存在するホスファチド（例えばレシチン）、アルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物（例えばポリオキシエチレンステアレート）、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物（例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール）、エチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトールから誘導された部分エステルとの縮合生成物（例えばポリエチレンソルビトールモノオレート）、又はエチレンオキシドと脂肪酸及び無水ヘキシトールから誘導された部分エステルとの縮合生成物（例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレート）のような核酸剤又は湿潤剤を含むことができる。水性懸濁剤はまた、エチル又はｎ−プロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートなどの１つ又は複数の保存剤、１つ又は複数の着色剤、１つ又は複数の香味料、並びにスクロース、アスパルテーム又はサッカリンなどの１つ又は複数の甘味料を含有することができる。製剤は浸透圧について調整されてもよい。
【０５０９】
トローチ剤形は、活性成分を通常、スクロース及びアカシア又はトラガカントといった香味料中に有し、また、香錠剤は、ゼラチン及びグリセリン又はスクロース及びアカシア乳剤、ゲル剤などの不活性基材中に活性成分を有し、これらの活性成分に加え当該技術分野で既知の担体を有することができる。条件的活性型生物学的タンパク質は、経口投与されるとき、消化から保護されていなければならないと理解されている。これは、一般的には、条件的活性型生物学的タンパク質を、酸性的及び酵素的な加水分解への耐性を付与する組成物と複合体を作ることによって、或いは条件的活性型生物学的タンパク質を、リポソームなどの適切な耐性を有する担体中に包装することによって、達成される。タンパク質を消化から保護する方法は、当該技術分野において公知である。医薬組成物は、例えば、リポソーム中に、又は活性成分を徐放できるようにする製剤中に、封入することができる。
【０５１０】
包装された条件的活性型生物学的タンパク質は、単独で、又は他の好適な成分との組み合わせによって、エアロゾル製剤（例えば、噴霧吸入が可能なもの）に製剤化して、吸入法によって投与することができるエアロゾル製剤は、ジクロロフルオロメタン、プロパン、窒素などの圧縮された許容される噴射剤に入れることができる。直腸投与に好適な製剤は、例えば、包装された核酸と坐剤基材からなる坐剤を含む。好適な坐剤は、天然又は合成のトリグリセリド又はパラフィン炭化水素を含み、さらに、包装された核酸と基材の組合せからなるゼラチンの直腸用カプセルを使うことも可能であり、その基材には、例えば、液体トリグリセリド、ポリエチレングリコール、及びパラフィン炭化水素が含まれる。
【０５１１】
本発明の経皮又は局所の送達組成物は、条件的活性型生物学的タンパク質に加えて、薬学的に受容可能な担体が、クリーム、軟膏、液体又はハイドロゲルの製剤中に含んでもいてもよく、添加成分が治療用タンパク質の送達に悪影響を与えない限り、その他の化合物を含んでいてもよい。従来の薬学的に受容可能な乳化剤、界面活性剤、懸濁化剤、抗酸化剤、浸透圧上昇剤、増量剤、希釈剤、保存剤を、加えてもよい。水に可溶のポリマーも担体として使用することができる。
【０５１２】
非経口投与、例えば、関節内（関節部中）、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、及び皮下の経路などによる投与に好適な製剤は、抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、及び対象の被投与者の血液に対する等張性を製剤に与える溶質を含有し得る水性及び非水性の等張性無菌注射溶液と、懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、保存剤を含有し得る水性及び非水性の無菌懸濁溶液とを含む。本発明の実施において、組成物は、例えば、静脈内注入、経口、局所、腹腔内、又はくも膜下腔内に投与することができる。一態様において、非経口投与の形態は、条件的活性型生物学的タンパク質を有する組成物の投与に好適な方法である。組成物は、便宜的に、単位用量形で投与されてもよく、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．Ｅａｓｔｏｎ  Ｐａ．，１８ｔｈ  Ｅｄ．，１９９０に記載されているような、医薬分野で公知である任意の方法によって調製されてもよい。静脈内投与の製剤は、無菌の水又は生理食塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、野菜由来のオイル、水素化ナフタレンなどの薬学的に受容可能な担体を含有していてもよい。米国特許第４３１８９０５号明細書の記載も参照及び適用のこと。
【０５１３】
条件的活性型生物学的タンパク質を有する、包装された組成物の製剤は、アンプル及びバイアルのような、単位用量又は複数容量を封入された容器に入れることができる。注射用溶液及び懸濁液は、以前に記載した種類の無菌の散剤、顆粒剤、及び錠剤から調製することができる。
【０５１４】
本開示はまた、本開示に従って、少なくとも１つの野生型タンパク質に関連する症状を診断するための、少なくとも１つの条件的活性型生物学的タンパク質の、組成物、装置及び／又は送達方法を提供するものである。
【０５１５】
また提供するものは、少なくとも１つの条件的活性型生物学的タンパク質及び少なくとも１つの薬学的に受容可能な担体又は希釈剤を有する組成物である。組成物は選択的に、さらに、検出可能な標識又はレポーター、細胞毒性薬又は他の抗癌剤、メトトレキセートのような代謝拮抗剤、増殖抑制剤、サイトカイン、又はサイトカインアンタゴニスト、ＴＮＦアンタゴニスト、抗リウマチ剤、筋肉弛緩剤、麻酔薬、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛剤、麻酔剤、鎮静剤、局所麻酔剤、神経筋遮断薬、抗菌薬、乾癬治療薬、コルチコステロイド、タンパク同化ステロイド、エリスロポエチン、免疫化薬、免疫グロブリン、免疫抑制薬、成長ホルモン、ホルモン補充薬、放射性医薬品、抗欝薬、抗精神病薬、興奮剤、喘息薬、βアゴニスト、吸入用ステロイド、エピネフリン又は類似物の少なくとも１つから選択される、少なくとも１つの化合物又はタンパク質の有効量を有することができる。
【０５１６】
また提供するものは、本開示の少なくとも１つの条件的活性型生物学的タンパク質を有する医療装置であり、ここで装置は、少なくとも１つの条件的活性型生物学的タンパク質を、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹腔内、嚢内、軟骨内、腔内（ｉｎｔｒａｃａｖｉｔａｒｙ）、腔内（ｉｎｔｒａｃｅｌｉａｌ）、小脳内、脳室内、結腸内、頸内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸内、子宮内、嚢内、ボーラス、膣、直腸、口腔内、舌下、鼻腔内、又は経皮から選択される、少なくとも１つの形態により接触させる工程又は投与する工程に好適なものである。
【０５１７】
さらなる態様において、本開示は、少なくとも１つの本開示の条件的活性型生物学的タンパク質又は断片を凍結乾燥された形態で有する第１の容器と、場合により、無菌の水、無菌の緩衝化水、或いはフェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、硝酸フェニル水銀、フェノキシエタノール、ホルムアルデヒド、クロロブタノール、塩化マグネシウム（例えば六水和物）、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチルなど）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム及びチメロサール又はそれらの混合物からなる群から選択され、水性希釈剤中に入れられた少なくとも１つの保存剤を有する第２の容器とを有するキットを提供するものである。一態様において、キットの第１の容器中の、条件的活性型生物学的タンパク質又は特定部分又は変異体の濃度は、第２の容器の内容物によって、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５００ｍｇ／ｍｌの濃度に再構成される。別の態様において、第２の容器はさらに等張剤を有する。別の態様において、第２の容器はさらに生理学的に受容可能な緩衝液を有する。一態様において、本開示は、少なくとも１つの野生型タンパク質が介在する症状を治療する方法であって、それを必要とする患者に、キットに提供されている製剤を投与する工程と、投与の前に再構成する工程とを有する、治療する方法を提供する。
【０５１８】
また提供されるものは、ヒトの医薬品又は診断用途のための製品の物品であって、この製品の物品は、包装素材と、溶液又は少なくとも１つの本開示の条件的活性型生物学的タンパク質を凍結乾燥したものとを有する。製品の物品は、選択的に、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹腔内、嚢内（ｉｎｔｒａｃａｐｓｕｌａｒ）、軟骨内、腔内（ｉｎｔｒａｃａｖｉｔａｒｙ）、腔内（ｉｎｔｒａｃｅｌｉａｌ）、小脳内、脳室内、結腸内、頸内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸内、子宮内、嚢内（ｉｎｔｒａｖｅｓｉｃａｌ）、ボーラス、膣、直腸、口腔内、舌下、鼻腔内、又は経皮の、送達装置又は送達システムを、構成要素とする容器を有することができる。
【０５１９】
免疫系と中枢神経系とは直接連絡しているため、本発明の条件的活性型生物学的タンパク質はまた、脳疾患又は他の中枢神経系障害にも使用することができる（Ｌｏｕｖｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｖｅｓｓｅｌｓ，”Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．５２３，ｐｐ．３３７−３４１，２０１５（本明細書によって全体として参照により本明細書に援用される））。この直接の連絡は、硬膜静脈洞の内壁の機能性リンパ管からなる。このように直接連絡していることにより、条件的活性型生物学的タンパク質（特に条件的活性型抗体）は中枢神経系に到達することが可能になり得ると共に、そこにある標的に作用する。
【０５２０】
本開示は、本明細書に記載される任意の開示をさらに提供する。以下の例は本開示の方法を例示するものであり、限定するものではない。当業者には明らかである、現場で通常直面する種々の条件及びパラメータの他の好適な変更形態及び適合形態は、本開示の範囲内である。
【実施例】
【０５２１】
実施例１：温度変異体についてのマルチウォールアッセイ（例えば、９６ウェルアッセイ）についての概要
マルチウォールプレートの各ウェルに蛍光基質を加え、野生型の温度と、新規の型で低い反応温度の両方（例えば、上述の通り３７℃又は２５℃のいずれか）に適切な時間おく。蛍光プレートリーダーによって、適切な励起及び発光スペクトル（例えば、３２０ｎｍの励起スペクトル、４０５ｎｍの発光スペクトル）において、蛍光を測定することによって、蛍光を検出する。相対蛍光ユニット（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｕｎｉｔ：ＲＦＵ）を決定する。野生型分子からの上清及びプラスミド／ベクターで形質転換された細胞を、陽性対照及び陰性対照として用いる。各サンプル、反応温度、陽性対照及び陰性対照において複製反応を行う。
【０５２２】
低い温度（例えば、２５℃で活性化する変異体）で活性化し、野生型の温度（例えば、３７℃で、１０％、２０％、３０％、４０％、又はそれを超えて活性が低下する）で活性が低下し、すなわち活性の比が１．１以上か又はより大きい値以上（例えば２５℃又は３７℃における活性の比（２５℃／３７℃）が１．１以上か又はより大きい値以上）である、変異体を、推定温度感受性の一次ヒットとしてみなすことができる。この温度感受性一次ヒットを、次いで、同じアッセイを用いてスクリーニングし、全ての一次ヒットを確かめることができる。
【０５２３】
実施例２：温度変異体の確認試験のための異なるアッセイ形式（例えば、１４ｍＬアッセイ）についての概要
温度感受性一次ヒットとして同定された変異体を、１４ｍＬの培養チューブで発現させ、それらの酵素活性を野生型の温度（例えば、３７℃）とより低い温度（例えば、２５℃）とにおいて測定する。タンパク質を発現させ、上述の通りにマルチウォール形式で用いるために精製するが、マルチウォール（９６ウェルプレート）でない異なる形式（１４ｍｌチューブ）における発現も別に行う。
【０５２４】
各変異体の上清を、マルチウォールプレート、例えば９６ウェルのマイクロプレートに移動する。各チューブに蛍光基質を加え、指定の温度（野生型の温度、より低い温度）に適切な時間おく。野生型分子を陽性対照として使用し、ベクターのみにより形質転換した細胞からの上清を陰性対照として使用する。蛍光プレートリーダーによって、適切な発光スペクトル（例えば、３２０ｎｍの励起スペクトル、４０５ｎｍの発光スペクトル）において、蛍光を測定することによって、蛍光を検出する。相対蛍光ユニット（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｕｎｉｔ：ＲＦＵ）を決定する。各サンプル、反応温度、陽性対照及び陰性対照において複製反応を行う。
【０５２５】
低い温度（例えば、２５℃）で活性化するが、野生型の温度（例えば、３７℃）で、少なくとも３０％以上の活性の低下を見せ、すなわち野生型の温度（例えば、３７℃）での活性に対する、低い温度（例えば２５℃）での活性の比が１．１以上である変異体を、温度感受性ヒットとして同定する。
【０５２６】
低い温度（例えば、２５℃）における変異体の活性を、野生型の温度（例えば、３７℃）における野生型分子の活性と比較する。低い温度（例えば、２５℃）において野生型分子よりも活性が高いことが、残存活性が１より大きく、好ましくは２以上であることで示される場合、且つ変異体が野生型の温度（３７℃）において野生型分子と比べたときに、全体的な活性の低下を示す場合、変異体の表現型が温度感受性変異体であると確認できる。
【０５２７】
実施例３：発見したヒットのさらなる発達についての概要
必要に応じて、新規のコンビナトリアル変異体ライブラリを、上述において同定した変異体ヒットの全て又は選択したものから作成する。この新規のライブラリを、選択した変異体それぞれについて、可能な全てのアミノ酸変異体を含むようにデザインし、新しいヒットについての記載の通り再度スクリーニングをすることができる。
【０５２８】
実施例４：温度低下後の酵素活性の可逆性についての概要
温度感受性の発達させた変異体に対してさらにアッセイを行い、低い温度（例えば、２５℃）における酵素活性が可逆的か非可逆的か、変異体を高い温度に曝し、続けて低い温度（例えば、２５℃）に戻すことによって、確認することができる。この温度感受性変異体を、所望の形式、例えば、概述のような１４ｍＬ培養チューブにおいて発現させる。この変異体を、野生型の温度（例えば、３７℃）及びその他の温度を含んだ幾つかの条件下においてテストし、続いて、必要な低い温度（例えば、２５℃）に再度曝す。低い温度において活性のある変異体であって、より高い温度又は野生型の温度まで上昇させたとき、活性の低下を示し（すなわち、低い温度における活性の高い温度に対する活性の比が、１、１．５、２、又はそれより高い値以上である）、再度低い温度まで下げられたときにベースラインの活性を示す、変異体を、「可逆性ヒット」と判定する。低い温度において活性のある変異体であって、より高い温度又は野生型の温度まで上昇させたとき、活性の低下を示し（すなわち、低い温度における活性の高い温度に対する活性の比が、１、１．５、２、又はそれより高い値以上である）、再度低い温度まで下げられたときに少なくとも低下した活性と同じ程度の活性を示す、変異体を、「非可逆性ヒット」と判定する。
【０５２９】
実施例５：条件的活性型のアンジオスタチン変異体のスクリーニングについての材料及び方法
条件的活性型のアンジオスタチン変異体のスクリーニングについての材料及び方法は、Ｃｈｉ  ａｎｄ  Ｐｉｚｚｏ，“Ａｎｇｉｏｓａｔｉｎ  ｉｓ  ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｔｏ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｔ  ｌｏｗ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐＨ：ａ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｎ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ＡＴＰ  ｓｙｎｔｈａｓｅ”，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００６；６６（２）：８７５−８８２から適用することが可能であり、この文献は参照することによって本明細書に援用される。
【０５３０】
材料
ヒトのプラスミノーゲン由来の、野生型アンジオスタチンのクリングル１〜３は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（ドイツ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）から入手可能であり、無菌ＰＢＳ中で再構成することができる。過去に記載されているように、ＡＴＰ合成酵素の触媒的βサブユニットに対するポリクローナル抗体は作製可能であり、ウシのＡＴＰ合成酵素Ｆ１サブユニットは精製可能である（（Ｍｏｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ  ｂｉｎｄｓ  ＡＴＰ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ”，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９９；９６：２８１１−６；Ｍｏｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．“Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  Ｆｌ−ＦＯ  ＡＴＰ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｉｓ  ａｃｔｉｖｅ  ｉｎ  ＡＴＰ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ  ｂｙ  ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ”，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ；２００１；９８：６６５６−６１）。カリポリドは、無菌の水に可溶化し、無菌にフィルターすることができる。
【０５３１】
細胞培養
Ａ５４９（肺がん組織由来のヒト上皮細胞株）又は他のがん細胞株（ＤＵ１４５、ＬＮＣａＰ、又はＰＣ−３細胞）は、例えばＡＴＣＣから入手可能である。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、文献に記載されているようにヒト臍帯静脈から単離可能である（Ｇｒａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍａｔｒｉｇｅｌ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｔｈｙｍｏｓｉｎ  ｈ  ４  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ”，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １９９５；１０８：３６８５−９４．）。ＨＵＶＥＣ細胞は、ＡＴＰ合成酵素を細胞表面に発現する細胞株で、陽性対照として使用することができる。細胞は、１％ペニシリンストレプトマイシン及び１０％血清置換培地３（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を入れたＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で培養し、プラスミミノーゲンの存在を最小限にすることができる。低いｐＨ（６．７）の培地は、重炭酸塩を５％ＣＯ２条件下で１０ｍｍｏｌ／Ｌまで減少させ、浸透圧を維持するために３４ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを追加するか、又は２２ｍｍｏｌ／Ｌの重炭酸塩培地を１７％ＣＯ２条件下でインキュベートすることで調製することができる。ｐＨを低下させる方法は、実験的制約及びアッセイによって変化してもよい。
【０５３２】
フローサイトメトリー
ＡＴＰ合成酵素が腫瘍細胞株の細胞表面において機能的であることを確認するために、フローサイトメトリー実験を行うことができる。例えば、Ａ５４９細胞株を、低酸素状態（０．５％Ｏ２、５％ＣＯ２、Ｎ２平衡）対酸素正常状態（２１％Ｏ２、５％ＣＯ２）で、異なるｐＨの培地（１０、２２、及び４４ｍｍｏｌ／Ｌの重炭酸塩ＤＭＥＭ）において、０、１２、２４、４８、お及び７２時間培養することができる。生細胞をブロックし、抗βサブユニット抗体と共にインキュベートし、洗浄し、ブロックし、二次抗体のヤギ抗ウサギ抗体ＦＩＴＣ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）と共にインキュベートし、再度洗浄することができる（全ての工程は４℃で行われる）。ヨウ化プロピジウム（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を、細胞膜を損傷した細胞を識別するために全てのサンプルに含めることができる。１０，０００細胞中のＦＩＴＣの平均蛍光強度を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）によって定量化し、ＣＥＬＬＱｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で、ヨウ化プロピジウムを取り込んだ細胞を取り除くことで、ミトコンドリアＡＴＰ合成酵素の検出を除去することができる。
【０５３３】
細胞表面のＡＴＰ合成アッセイ
９６ウェルプレート中のＡ５４９又は１−ＬＮ細胞（ウェル毎に６０，０００個）を、培地で満たし、アンジオスタチン、アンジオスタチン変異体、抗βサブユニット抗体、ウシ血清アルブミンに対して作成されたウサギＩｇＧ（Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ、Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）、ピセタノール（既知のＡＴＰ合成酵素Ｆ１の阻害剤で陽性対照として用いられる、Ｓｉｇｍａ）、又は培地のみによって、３７℃、５％ＣＯ２で３０分間処理することができる。次いで、細胞を０．０５ｍｍｏｌ／ＬのＡＤＰで２０秒間インキュベートすることができる。上清を除去し、記載（２３）の通り、にＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏルミネセンスアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって、ＡＴＰ産生を分析することができる。細胞溶解物を同様に分析し、ＡＴＰの細胞内プールが全ての条件において変わらないことを確認することができる。記録を、Ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ、Ｈｅｌｓｉｎｋｉ，Ｆｉｎｌａｎｄ）上でとることができる。データは、それぞれの独立した実験において決定された基準に基づいて、細胞毎のＡＴＰのモル数によって表される。
【０５３４】
細胞増殖アッセイ
アンジオスタチンのがん細胞株への効果を、無血清培地において、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、分子内塩（ＭＴＳ）増殖アッセイによって評価することができる。アンジオスタチンの存在下又は非存在下において、３７℃、５％ＣＯ２で２０時間インキュベートした後、９６ウェルマイクロプレートの各ウェルにおける相対的な細胞数を、ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ細胞増殖アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて製品のプロトコルに従って、決定することができる。培地のｐＨを、５％ＣＯ２において重炭酸塩濃度によって調節することができる。
【０５３５】
細胞毒性の評価
細胞死及び細胞溶解を定量化するために、サイトゾルから上清に放出された乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌａｃｔａｔｅ  ｃｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ：ＬＤＨ）の活性を、Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキット（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）によって計測することができる。アンジオスタチン、アンジオスタチン変異体、抗βサブユニット抗体、ウサギＩｇＧ、カリポリド、及びトリトンＸ（細胞を透過処理する界面活性剤で陽性対照として用いる）によって処理したがん細胞（例えば、Ａ５４９細胞）（ウェル毎に５，０００個）を、５％ＣＯ２又は１７％ＣＯ２（それぞれ、中性及び低ｐＨ条件）で、３７℃、１５時間インキュベートすることができる。細胞毒性の指標は、同じｐＨの培地に対応させて、４組の処理したサンプルの平均吸光度を、４組の未処理サンプルの平均吸光度によって除算することで計算することができる。細胞のネクローシス及びアポトーシスの評価アンジオスタチンの細胞死を引き起こす作用を決定するために、ヒストン−ＤＮＡ  ＥＬＩＳＡを行うことができる。Ａ５４９細胞（ウェル毎に５，０００個）に対するアンジオスタチン、アンジオスタチン変異体、抗βサブユニット抗体、ウサギＩｇＧ、カリポリドの効果を、核外のヒストン−ＤＮＡ断片の検出に基づいた、ＥＬＩＳＡアポトーシス及びネクローシスアッセイ（Ｒｏｃｈｅ）を用いることで、決定することができる。試薬の存在下又は非存在下で、３７℃１５時間インキュベートした後、４組のサンプルの細胞溶解物又は上清から、それぞれアポトーシス又はネクローシスを決定することができる。アポトーシス又はネクローシスは、同じｐＨの培地に対応させて、４組の処理したサンプルの平均吸光度を、４組の未処理サンプルの平均吸光度によって除算することで計算することができる。培地のｐＨを、５％ＣＯ２又は１７％ＣＯ２においてインキュベートすることで調節することができる。
【０５３６】
細胞内ｐＨ（ｐＨｉ）の測定
ｐＨｉは、カバーガラス付きの３５ｍｍマイクロウェルディッシュ（ＭａｔＴｅｋ、Ａｓｈｌａｎｄ，ＭＡ）上に乗せた細胞の蛍光によって、測定することができる。細胞を、成長因子を減少させた、フェノールレッドフリーのＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に乗せることができる。一晩培養後、培地を変え、細胞をｐＨ感受性蛍光色素のｃＳＮＡＲＦ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）と共に添加して１５分間おき、続いて新しい培地で２０分間回復させる。次いで、細胞を顕微鏡の台にマウントし、３７℃、５％ＣＯ２で発光スペクトルの収集を１時間行い、記載の通りそれぞれ７〜１５細胞を含む領域からｐＨｉを計算することができる（Ｗａｈｌ  ＭＬ，Ｇｒａｎｔ  ＤＳ．“Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐＨ  ａｎｄ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｎ  ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ’ｓ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｏｎ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐＨ”，Ｇｅｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２００２；３５：２７７−８５）。スペクトル収集の開始時に、培地をディッシュから取り除き、細胞を、アンジオスタチン、抗βサブユニット抗体、ウサギＩｇＧ、カリポリド、ナトリウム−プロトン交換阻害剤を含む又は含まない、１ｍＬの新しい培地によって試すことができる。培地のｐＨを、上述のように、固定した％ＣＯ２において、重炭酸塩濃度によって調節することができる。
【０５３７】
実施例６．最適な抗体発現のためのＦｃコドン変異体ライブラリの作成及びスクリーニング
本例は、親型のＦｃポリペプチドと比較して産生宿主細胞における発現が向上するように最適化されたＦｃ変異体を得るためのＦｃコドン変異体ライブラリの作成方法及びスクリーニング方法を提供する。
【０５３８】
Ｆｃコドン変異体ライブラリの設計及び構築
標的範囲（この場合ヒトＩｇＧ１分子のＦｃ部）の各コドンについて、標的コドン及び両側に２０塩基を含む縮重プライマー（フォワード及びリバース）の対を設計する。標的コドンの３番目の位置（ゆらぎ位置）は、同じコドンを使用した標的位置における全てのサイレント突然変異の発生を可能にする混合塩基（表２）を含有する（例Ａ）。同じコドン位置について、対応するアミノ酸が別のコドンよってコードされ得る場合、第２の縮重プライマーの組を設計する（例Ｂ）。対応するフォワード及びリバース縮重プライマーを１：１混合し、テンプレートにアニールし、且つ耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用したストランド置換によって完全長産物に伸長する。テンプレートをＤｐｎＩで消化し、完全長伸長産物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換する。突然変異誘発反応当たり最大１２個のコロニーを配列決定する。配列が確認された変異体を９６ウェルプレートにアレイ化し、グリセロール保存する。このグリセロールストックを使用して、哺乳類細胞へのトランスフェクション及びスクリーニング用のプラスミドＤＮＡをミニプレップする。
【０５３９】
【表２】
2017532019.tif 000004
【０５４０】
Ｆｃコドン変異体ライブラリの発現及びＥＬＩＳＡベースのスクリーニング
Ｆｃコドン変異体ライブラリからのクローンを哺乳類細胞株にトランスフェクトした。完全長ＩｇＧが産生され、培地中に分泌された。親クローンより高いＩｇＧ発現レベルに関して、発現したＦｃコドン変異体の上清をＥＬＩＳＡ分析を用いてスクリーニングした。ＥＬＩＳＡデータは、トランスフェクション効率を計測することによってβ−ガラクトシダーゼ分析で正規化した。一次スクリーニングで同定された上位ヒットの再トランスフェクション及び再スクリーニングを３回行い、発現レベルの増加を確認した。
【０５４１】
実施例７：ｓｃＦｖ条件的活性型抗体の作成
薬物標的Ｘに対する２つの条件的活性型抗体（ＣＡＢ−ｓｃＦｖ−６３．９−４及びＣＡＢ−ｓｃＦｖ−６３．９−６）を野生型ヒトＩｇＧ１  Ｆｃとのホモ二量体として発現させ（図２〜図３の二価抗体ＣＡＢ−ｓｃＦｖ−６３．９−４−０１及びＣＡＢ−ｓｃＦｖ−６３．９−６−０１が得られた）、並びにノブインホールシステムのヘテロ二量体として発現させて一価ｓｃＦｖを得た（図２〜図３の一価抗体ｓｃＦｖ  ＣＡＢ−ｓｃＦｖ−６３．９−４−０２及びＣＡＢ−ｓｃＦｖ−６３．９−６−０２が得られた）。
【０５４２】
ｐＨ６．０及びｐＨ７．４での薬物標的Ｘに対するこれらの抗体の結合親和性をＥＬＩＳＡ分析によって計測した。図２に示されるように、これらのｓｃＦｖ抗体はｐＨ６．０及びｐＨ７．４の両方で薬物標的Ｘに親和性を示し、この親和性は完全二価抗体と同等であった。さらに、図３に示されるように、ｐＨ７．４と比べたｐＨ６．０でのこれらのｓｃＦｖ抗体の選択性も完全二価抗体と同等であった。この例では、本発明の条件的活性型抗体がｓｃＦｖ抗体又は完全二価抗体のいずれとしても同等の親和性及び選択性を有することが実証された。従って、本発明の条件的活性型抗体は、本発明のＣＡＲ−ＴプラットフォームにおいてＣＡＲをコードするＤＮＡ分子に単一ＤＮＡ鎖として挿入し得る。
【０５４３】
実施例８：条件的活性型抗体の発現
本発明の一実施形態において、選択性及び親和性、並びにｐＨ６．０及びｐＨ７．４の両方での発現レベルに関して同時にスクリーニングすることにより、薬物標的Ｘに対する条件的活性型抗体を生成した。血清中にスクリーニングに関して偽陽性を生じ得るヒト抗体があったため、スクリーニングは血清中でＦＬＡＧタグを使用して行った。スクリーニング緩衝液は、カーボネート緩衝液（リンゲル標準緩衝液を含むがＰＢＳとは異なるクレブス緩衝液）であった。生成された条件的活性型抗体は、両方ともに野生型抗体との比較において、ｐＨ６．０で薬物標的Ｘに対してより高い親和性を有するが、同じ薬物標的Ｘに対してｐＨ７．４では親和性がより低いことが分かった。さらに、これらの条件的活性型抗体は全て、以下の表３に示すように（列「クローン」は抗体を示し、及び発現レベル「ｍｇ／ｍｌ」が２番目の列に示される）、高い発現レベルを有する。
【０５４４】
これらの抗体のクローンを依頼発現レベル（「注文量」、予想発現レベル）と共にサービス提供者に送った。しかしながら、これらの抗体の実際の発現レベル（「納品量」）は極めて高く、予想発現レベルを超えていた。
【０５４５】
【表３】
2017532019.tif 000005
【０５４６】
図４に例としてＢＡＰ０６３．９−１３−１抗体を使用して示すように、条件的活性型抗体は緩衝液中で凝集を示さなかった。ＢＡＰ０６３．９−１３−１抗体はサイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。図４では唯１つのピークが検出され、抗体の凝集がほとんど又は全くないことが実証された。
【０５４７】
条件的活性型抗体はまた、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）も用いて分析し、薬物標的Ｘに対するそのオン及びオフ速度を計測した。ＳＰＲ分析は、条件的活性型抗体のオン及びオフ速度を計測することが知られている。ＳＰＲ分析は重炭酸塩の存在下で実施した。条件的活性型抗体のインビボでの（動物及びヒトにおける）オン及びオフ速度は、条件的活性型抗体にとって極めて重要な特徴である。
【０５４８】
条件的活性型抗体は、陰性対照（ＢＡＰ０６３  １０Ｆ１０、これはｐＨ６．０及びｐＨ７．４の両方で同様のオン速度を有する）との比較において、ｐＨ６．０でオン速度が速く、ｐＨ７．４ではより遅いオン速度であることが観察された（図５）。加えて、室温から６０℃に温度を上げても、ＳＰＲ分析結果が大幅に変わることはない（図５）。ＳＰＲ分析はまた、これらの条件的活性型抗体が、ｐＨ７．４と比較したときｐＨ６．０で極めて選択的であることも示した（図６Ａ〜図６Ｂは例として１つの抗体を示す）。
【０５４９】
条件的活性型生物学的抗体について、表４に要約する。これらの抗体のうちの２つはｓｃＦｖとして発現させた（ＢＡＰ０６３．９−１３．３及びＢＡＰ０６３．９−４８．３）。抗体を６０℃で１時間インキュベートしたが、抗体の多くの親和性は変化しなかった（「熱安定性」）。ＳＰＲを用いたｐＨ６．０及びｐＨ７．４での結合活性の計測データを報告する２つの列において（表４の最後２つのカラム）、「ＢＡＰ０６３．６−ｈｕｍ１０Ｆ１０−ＦＬＡＧ」（陰性対照、表４の第２列）との比較を行った。これらの抗体の選択性は、２つの最終カラムのデータ間の差により決定し得る。２つのｓｃＦｖ抗体は極めて高い選択性（ｐＨ７．４で０％に対し、ｐＨ６で７５％及び５０％）を有した。
【０５５０】
【表４】
2017532019.tif 000006
【０５５１】
実施例９：抗体の軽鎖又は重鎖を発達させる
抗体Ｆ１−１０Ｆ１０の重鎖及び軽鎖をＣＰＥを用いて別個に発達させた。軽鎖変異体をスクリーニングすると、条件的活性を有する２６個の軽鎖変異体が見付かり、この場合、変異体は、ｐＨ６．０では野生型と比べて活性がより高く、且つ変異体はｐＨ７．４で野生型と比べて活性が低かった。２６個の軽鎖変異体は、軽鎖の８つの異なる位置にその突然変異を有した。それらの８つの位置のうちの３つは、２６個の軽鎖変異体のうちの６個以上に見られた。これらの３つの位置を、軽鎖におけるホットスポットと見なした。重鎖変異体をスクリーニングすると、条件的活性を有する２８個の重鎖変異体が見付かった。これらの２８個の重鎖変異体は、重鎖の８つの異なる位置にその突然変異を有した。それらの８つの位置のうちの３つは、２８個の重鎖変異体のうちの６個以上に見られた。これらの３つの位置を、重鎖におけるホットスポットと見なした。軽鎖変異体及び重鎖変異体の条件的活性は、ＥＬＩＳＡ分析によって確認した。
【０５５２】
この例で生成された最良の条件的活性型抗体は、ｐＨ７．４でのその活性に対するｐＨ６．０でのその活性が１７倍の差であった。加えて、条件的活性型抗体の多くが、７．４の正常生理的ｐＨと６．０の異常ｐＨとの間のｐＨで可逆の活性を有した。興味深いことに、ＥＬＩＳＡ分析によって５．０〜７．４のｐＨ範囲で条件的活性型抗体の活性を試験したとき、この例で生成された条件的活性型抗体のほとんどが約５．５〜６．５のｐＨで最適な結合活性を呈した。
【０５５３】
この例で生成された条件的活性型抗体の活性はまた、全細胞を使用したＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）分析によっても確認し、ここではＣＨＯ細胞を使用して、ｐＨ６．０及びｐＨ７．４で抗体の抗原を発現させた。条件的活性型抗体をＣＨＯ細胞に加えることにより、結合活性を計測した。ＦＡＣＳ分析により、ｐＨ７．４と比べたｐＨ６．０での条件的活性型抗体の選択性に関するＥＬＩＳＡ分析の結果に一般的な傾向が確認された。
【０５５４】
実施例１０：特殊緩衝液中における条件的活性型抗体の選択
本発明における発達させる工程によって生成した変異体抗体を、７．４の正常生理的ｐＨでの分析及び６．０の異常なｐＨでの分析に供した。両方の分析とも、ヒト血清に見られる重炭酸塩を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液を使用して実施した。溶液中の重炭酸塩の濃度は、ヒト血清中の典型的な重炭酸塩濃度、すなわち生理的濃度であった。重炭酸塩を含有しない同じＰＢＳ溶液を使用して、比較試験を行った。
【０５５５】
この例の変異体抗体又は条件的活性型抗体の結合活性を計測するための分析は、ＥＬＩＳＡ分析であった。重炭酸塩を含有するＰＢＳ緩衝溶液における分析は、条件的活性型抗体の選択に関して有意に高い成功率をもたらしたことが分かった。加えて、重炭酸塩を含有するＰＢＳ緩衝溶液を使用して選択された条件的活性型抗体は、ｐＨ７．４での活性に対するｐＨ６．０でのその活性の比がはるかに高い傾向があり、従って有意に高い選択性をもたらした。
【０５５６】
さらに、選択された条件的活性型抗体（重炭酸塩を含むＰＢＳ緩衝溶液を使用）を、重炭酸塩を含まないＰＢＳ緩衝溶液中で試験したとき、ｐＨ７．０と比べたｐＨ６．０での条件的活性型抗体の選択性は有意に低下したことが確認された。しかしながら、このＰＢＳ緩衝溶液に生理的量の重炭酸塩を添加すると、同じ条件的活性型抗体の選択性が回復した。
【０５５７】
別の分析において、選択された条件的活性型抗体を、重炭酸塩を添加したクレブス緩衝溶液で試験した。ｐＨ７．４での活性に対するｐＨ６．０での活性のより高い比が、重炭酸塩を添加したこのクレブス緩衝溶液においても観察された。これは、少なくとも部分的には、クレブス緩衝溶液中の重炭酸塩の存在に起因した可能性があるものと思われる。
【０５５８】
ＰＢＳ緩衝溶液中で重炭酸塩濃度をその生理的濃度未満の濃度に低下させると、７．４の正常な生理的ｐＨにおける条件的活性型抗体の活性が増加したことが観察された。ｐＨ７．４での条件的活性型抗体の活性の増加は、ＰＢＳ緩衝溶液中の重炭酸塩濃度の低下に関係することが観察された。
【０５５９】
野生型抗体は、ｐＨ７．４で分析したとき、条件的活性型抗体について試験したＰＢＳ緩衝溶液中の同じ重炭酸塩濃度のいずれにおいてもその活性が同じままであったため、ＰＢＳ緩衝溶液中の重炭酸塩量の違いによる影響は受けなかった。
【０５６０】
実施例１１：異なる緩衝液における条件的活性型抗体の選択
本発明に係る発達させる工程によって生成した変異体抗体を、正常な生理的ｐＨ（７．４）でのＥＬＩＳＡ分析及び異常なｐＨ（６．０）でのＥＬＩＳＡ分析に供した。いずれのＥＬＩＳＡ分析も、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有クレブス緩衝液ベースの緩衝液、並びに重炭酸塩及びＢＳＡ含有ＰＢＳ緩衝液ベースの緩衝液を含む種々の緩衝液を使用して実施した。
【０５６１】
重炭酸塩含有ＰＢＳ緩衝溶液中での分析を用いて選択された条件的活性型抗体は、重炭酸塩を含まないＰＢＳ緩衝溶液中での分析を用いて選択されたものとの比較において、ｐＨ７．４での活性に対するｐＨ６．０での活性の比がはるかに高かった。加えて、重炭酸塩が添加されたクレブス緩衝溶液も、重炭酸塩を含まないＰＢＳ緩衝溶液中での分析と比較したとき、ｐＨ７．４での活性に対するｐＨ６．０での活性の比がより高かった。望ましい条件的活性型抗体の選択に重炭酸塩が重要であるものと思われる。
【０５６２】
本明細書で言及される文献は全て、本明細書によって全体として、或いはそれらの文献が具体的に依拠された開示を提供するため、参照により援用される。
【０５６３】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるとき、文脈上特に明確に指示されない限り、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」には複数形の参照が含まれることに留意しなければならない。さらに、用語「１つの（ａ）」（又は「１つの（ａｎ）」）、「１つ以上」、及び「少なくとも１つ」は、本明細書では同義的に用いられ得る。用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「〜を有する（ｈａｖｉｎｇ）」、及び「〜で構成される（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ  ｆｒｏｍ）」も同義的に用いられ得る。
【０５６４】
特に指示されない限り、本明細書及び特許請求の範囲で使用される、分子量、百分率、比、反応条件など、成分、特性の量を表す全ての数値は、全ての例において、用語「約」が存在するか否かに関わらず、用語「約」によって修飾されているものと理解されるべきである。従って、反する旨が示されない限り、本明細書及び特許請求の範囲に示される数値パラメータは近似であり、本開示によって達成しようとする所望の特性に応じて変わり得る。最低限でも、且つ特許請求の範囲への均等論の適用を限定しようとすることなしに、各数値パラメータは、少なくとも、報告される有効桁の数字を踏まえて、且つ通常の丸め法を適用することによって解釈されなければならない。本開示の広い範囲を示す数値の範囲及びパラメータは近似であるにも関わらず、具体的な例に示される数値は可能な限り正確に報告される。しかしながら、いずれの数値も、そのそれぞれの試験測定値に見られる標準偏差から必然的にもたらされる特定の誤差を本質的に含む。
【０５６５】
本明細書に開示される各成分、化合物、置換基又はパラメータは、単独での使用、又は本明細書に開示される他のあらゆる成分、化合物、置換基又はパラメータの１つ以上と組み合わせた使用について開示されるものと解釈されるべきであることが理解されなければならない。
【０５６６】
また、本明細書に開示される各成分、化合物、置換基又はパラメータの各量／値又は量／値の範囲は、本明細書に開示される任意の他の１つ又は複数の成分、１つ又は複数の化合物、１つ又は複数の置換基又は１つ又は複数のパラメータについて開示される各量／値又は量／値の範囲との組み合わせでも開示されるものと解釈されるべきであること、従って、本明細書に開示される２つ以上の成分、化合物、置換基又はパラメータの量／値又は量／値の範囲の任意の組み合わせも本記載の目的上、互いに組み合わせて開示されることも理解されなければならない。
【０５６７】
さらに、本明細書に開示される範囲の各々は、同じ有効桁数を有する開示される範囲内にある具体的な各値の開示として解釈されるべきであることが理解される。従って、１〜４の範囲は、値１、２、３及び４の明示的な開示と解釈されるべきである。さらに、本明細書に開示される各範囲の各下限は、同じ成分、化合物、置換基又はパラメータについての本明細書に開示される各範囲の各上限及び各範囲内にある具体的な各値と組み合わせて開示されるものと解釈されるべきであることが理解される。従って、この開示は、各範囲の各下限を各範囲の各上限又は各範囲内の具体的な各値と組み合わせることによるか、又は各範囲の各上限を各範囲内の具体的な各値と組み合わせることによって得られる全ての範囲の開示と解釈されるべきである。
【０５６８】
さらに、説明又は例に開示される成分、化合物、置換基又はパラメータの具体的な量／値は、範囲下限又は上限のいずれかの開示として解釈されるべきであり、従って本出願の他の場所に開示される同じ成分、化合物、置換基若しくはパラメータの任意の他の範囲下限若しくは上限、又は具体的な量／値との組み合わせで、成分、化合物、置換基又はパラメータの範囲を形成することができる。
【０５６９】
しかしながら、前述の説明に本発明の数値的な特徴及び利点が本発明の構造及び機能の詳細と共に示されているとしても、本開示は例示的なものに過ぎず、詳細、特に要素の形状、サイズ及び配置の点で、添付の特許請求の範囲を表現している用語の広義の一般的な意味によって示される最大限の範囲まで本発明の原理の範囲内で変更形態をなし得ることが理解されるべきである。
【図１】
2017532019.tif 000007
【図２】
2017532019.tif 000008
【図３】
2017532019.tif 000009
【図４】
2017532019.tif 000010
【図５】
2017532019.tif 000011
【図６Ａ】
2017532019.tif 000012
【図６Ｂ】
2017532019.tif 000013
【手続補正書】
【提出日】平成29年5月12日(2017.5.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１０】
前記真菌細胞が、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、及びアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来の細胞から選択される、請求項９に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
用語「細胞産生宿主」又は「製造宿主」は、タンパク質の産生又は製造に使用される細胞株を指す。限定はされないが、ヒト、マウス、ハムスター、ラット、サル細胞株を含めた哺乳類細胞並びに酵母、昆虫及び植物細胞株などの真核細胞産生宿主である。或いは、原核細胞産生宿主が利用されてもよい。一態様において、哺乳類細胞産生宿主は、３Ｔ３マウス線維芽細胞；ＢＨＫ２１シリアンハムスター線維芽細胞；ＭＤＣＫ、イヌ上皮細胞；Ｈｅｌａヒト上皮細胞；ＰｔＫ１ネズミカンガルー上皮細胞；ＳＰ２／０マウス形質細胞；及びＮＳ０マウス形質細胞；ＨＥＫ  ２９３ヒト胎児腎細胞；ＣＯＳサル腎細胞；ＣＨＯ、ＣＨＯ−Ｓチャイニーズハムスター卵巣細胞；Ｒ１マウス胚細胞；Ｅ１４．１マウス胚細胞；Ｈ１ヒト胚細胞；Ｈ９ヒト胚細胞；ＰＥＲ  Ｃ．６、ヒト胚細胞からなる群のメンバーから選択される。別の態様において、真核細胞産生宿主はＧＳ−ＮＳ０又はＧＳ−ＣＨＯＫ１細胞株である。別の態様において、真核細胞産生宿主は、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母細胞；及びピキア（ｐｉｃｈｉａ）酵母細胞から選択される。別の態様において、細胞産生宿主は細菌細胞株である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４７】
いくつかの好適な酵素クラスは、ヒドロラーゼ、例えば、プロテアーゼ、カルボヒドラーゼ、リパーゼ；イソメラーゼ、例えば、ラセマーゼ、エピメラーゼ、トートメラーゼ、及びムターゼ；トランスフェラーゼ、キナーゼ、オキシドレダクターゼ、及びホファターゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１９】
一実施形態において、ＡＳＴＲは、標的抗原に特異的な完全長ＩｇＧ重鎖を含み、抗原特異性を付与するのにＶHドメイン単独で十分な場合（「シングルドメイン抗体」）、ＶH、ＣＨ１、ヒンジ、及びＣＨ２及びＣＨ３（Ｆｃ）Ｉｇドメインを有する。完全に活性なＡＳＴＲの作成にＶH及びＶLドメインの両方が必要な場合、ＶH含有ＣＡＲ及び完全長λ軽鎖（ＩｇＬ）が両方ともに同じ細胞傷害性細胞に導入されて、活性ＡＳＴＲが作成される。別の実施形態において、ＣＡＲの各ＡＳＴＲは、各々が異なる標的抗原に特異的な少なくとも２つの一本鎖抗体可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。ｓｃＦｖでは、一方の可変ドメイン（ＶH又はＶL）のＣ末端が他方の可変ドメイン（それぞれＶL又はＶH）のＮ末端にポリペプチドリンカーを介してテザリングされている。かかる抗体フラグメントが、抗原結合性又は結合特異性を大きく妨げることなしに開発されている（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ  ｃｏｍｐｏｓｅｄ  ｏｆ  ａｎｔｉ−Ｔａｃ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ａｎｄ  ａ  ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  ｔｏｘｉｎ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ｖｏｌ．８７，ｐａｇｅ  ９４９１，１９９０；Ｂｅｄｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．，”“Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｎｔｉ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２６５，ｐａｇｅ  １８６１５，１９９０）。これらのｓｃＦｖは、天然抗体の重鎖及び軽鎖に存在する定常領域（Ｆｃ）を欠いている。少なくとも２つの異なる抗原に特異的なｓｃＦｖは、タンデムに配置される。ある実施形態では、ＡＳＴＲと膜貫通ドメインとの間に細胞外（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ）スペーサードメインが連結され得る。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２５】
ＡＳＴＲによって標的化され得る炎症性疾患に特異的な抗原としては、ＡＯＣ３（ＶＡＰ−１）、ＣＡＭ−３００１、ＣＣＬ１１（エオタキシン−１）、ＣＤ１２５、ＣＤ１４７（ベイシジン）、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ２、ＣＤ２０、ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ２５（ＩＬ−２受容体のａ鎖）、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＩＦＮ−ａ、ＩＦＮ−γ、ＩｇＥ、ＩｇＥ  Ｆｃ領域、ＩＬ−１、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−６受容体、インテグリンａ４、インテグリンα４β７、ラマ・グラマ（Ｌａｍａ  ｇｌａｍａ）、ＬＦＡ−１（ＣＤ１  ｌａ）、ＭＥＤＩ−５２８、ミオスタチン、ＯＸ−４０、ｒｈｕＭＡｂ  β７、スクレロスシン（ｓｃｌｅｒｏｓｃｉｎ）、ＳＯＳＴ、ＴＧＦβ１、ＴＮＦ−ａ又はＶＥＧＦ−Ａの１つ以上が挙げられる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２６】
本発明のＡＳＴＲによって標的化され得るニューロン障害に特異的な抗原としては、βアミロイド又はＭＡＢＴ５１０２Ａの１つ以上が挙げられる。本発明のＡＳＴＲによって標的化され得る糖尿病に特異的な抗原としては、Ｌ−Ｉβ又はＣＤ３の１つ以上が挙げられる。本発明のＡＳＴＲによって標的化され得る心血管疾患に特異的な抗原としては、Ｃ５、心臓ミオシン、ＣＤ４１（インテグリンα−ｌｌｂ）、フィブリンＩＩ、β鎖、ＩＴＧＢ２（ＣＤ１８）及びスフィンゴシン−１−リン酸の１つ以上が挙げられる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４５】
別の態様において、本発明はまた、本発明の条件的活性型ＣＡＲを含んでそれを安定に発現する遺伝子操作細胞傷害性細胞も提供する。一実施形態において、遺伝子操作細胞としては、治療的に関連性のある子孫を生じる能力を有するＴリンパ球（Ｔ細胞）、ナイーブＴ細胞（ＴN）、メモリーＴ細胞（例えば、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣM）、エフェクターメモリー細胞（ＴEM））、ナチュラルキラー細胞、及びマクロファージが挙げられる。別の実施形態において、遺伝子操作細胞は自己細胞である。好適なＴ細胞の例としては、ＣＤ４+／ＣＤ８-、ＣＤ４-／ＣＤ８+、ＣＤ４-／ＣＤ８-又はＣＤ４+／ＣＤ８+Ｔ細胞が挙げられる。Ｔ細胞は、ＣＤ４+／ＣＤ８-及びＣＤ４-／ＣＤ８+細胞の混合集団又は単一のクローンの集団であってもよい。本発明のＣＤ４+Ｔ細胞はまた、標的抗原を発現する細胞（例えばＣＤ２０+及び／又はＣＤ１９+腫瘍細胞）とインビトロで共培養すると、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α及び他のＴ細胞エフェクターサイトカインも産生し得る。本発明のＣＤ８+Ｔ細胞は、標的抗原を発現する細胞を溶解させ得る。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ+  ＣＤ６２Ｌ+ナイーブ細胞、ＣＤ４５ＲＯ  ＣＤ６２Ｉ７セントラルメモリー細胞、ＣＤ６２Ｌ+エフェクターメモリー細胞又はこれらの組み合わせのうちの任意の１つ以上であり得る（Ｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ，”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．２１，ｐａｇｅｓ  ２２４−２３２，２００９）。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５１】
固形腫瘍は、通常は嚢胞又は液体領域を含まない異常な組織塊である。固形腫瘍は良性又は悪性であり得る。固形腫瘍の異なるタイプは、それを形成する細胞のタイプにちなんで命名される（肉腫、癌腫、及びリンパ腫など）。肉腫及び癌腫など、固形腫瘍の例としては、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、及び他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、リンパ性悪性腫瘍、膵癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、肝細胞癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髄様癌、甲状腺乳頭癌、褐色細胞腫、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、セミノーマ、膀胱癌、黒色腫、及びＣＮＳ腫瘍（神経膠腫（脳幹神経膠腫及び混合性神経膠腫など）、膠芽腫（多形性膠芽腫としても知られる）、星状細胞腫、ＣＮＳリンパ腫、胚細胞腫、髄芽腫、シュワン腫、頭蓋咽頭腫（ｃｒａｎｉｏｐｈａｒｙｎｇｉｏｍａ）、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫（ｍｅｎｉｎｇｉｏｍａ）、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫及び脳転移など）が挙げられる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３３５】
有機化合物は、脂肪又はその誘導体、例えば、コレステロール、レシチン、セファリン、スフィンゴミエリン及び胆汁酸であってもよい。一部のこれらの化合物の正常な生理的濃度の例としては、４０〜７０ｍｇ／ｄＬの遊離コレステロール、１００〜２００ｍｇ／ｄＬのレシチン、０〜３０ｍｇ／ｄＬのセファリン、１０〜３０ｍｇ／ｄＬのスフィンゴミエリン及び０．２〜０．３ｍｇ／ｄＬの胆汁酸（コール酸として）が挙げられる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５９】
本開示のポリペプチド模倣体組成物は、非天然構造成分の任意の組み合わせを含有し得る。代替的な態様において、本開示の模倣体組成物は、以下の３つの構造基：ａ）天然アミド結合（「ペプチド結合」）連結以外の残基連結基；ｂ）天然に存在するアミノ酸残基の代わりの非天然残基；又はｃ）二次構造の模倣を誘導する、すなわちそれにより二次構造、例えばβターン、γターン、βシート、αヘリックスコンホメーションなどを誘導し又は安定化させる残基のうちの１つ又は全てを含む。例えば、本開示のポリペプチドは、その残基の全て又は一部が天然のペプチド結合以外の化学的手段によってつなぎ合わされるとき、模倣体として特徴付けることができる。個々のペプチド模倣体残基は、ペプチド結合、他の化学結合又はカップリング手段、例えば、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、二官能性マレイミド、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）又はＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）などによってつなぎ合わされ得る。従来のアミド結合（「ペプチド結合」）連結の代わりとして使用し得る連結基としては、例えば、ケトメチレン（例えば、−Ｃ（．ｄｂｄ．Ｏ）−ＮＨ−又は−Ｃ（．ｄｂｄ．Ｏ）−ＣＨ2−）、アミノメチレン（ＣＨ．ｓｕｂ．２−ＮＨ）、エチレン、オレフィン（ＣＨ．ｄｂｄ．ＣＨ）、エーテル（ＣＨ2−Ｏ）、チオエーテル（ＣＨ2−Ｓ）、テトラゾール（ＣＮ4−）、チアゾール、レトロアミド、チオアミド、又はエステルが挙げられる（例えば、Ｓｐａｔｏｌａ（１９８３），Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ．７，ｐｐ  ２６７−３５７，“Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ｍａｒｃｅｌｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎ．Ｙ．を参照のこと）。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３６０】
本開示のポリペプチドはまた、天然に存在するアミノ酸残基の代わりに全て又は一部の非天然残基を含有することによっても模倣体として特徴付けることができる。非天然残基については、科学文献及び特許文献に十分な記載がなされている；天然アミノ酸残基の模倣体として有用ないくつかの例示的な非天然組成物及びそれらの使用に関する指針は、以下に記載する。芳香族アミノ酸の模倣体は、例えば、Ｄ−又はＬ−ナフィルアラニン（ｎａｐｈｙｌａｌａｎｉｎｅ）；Ｄ−又はＬ−フェニルグリシン；Ｄ−又はＬ−２チエネイルアラニン（ｔｈｉｅｎｅｙｌａｌａｎｉｎｅ）；Ｄ−又はＬ−１，−２、３−、又は４−ピレネイルアラニン（ｐｙｒｅｎｅｙｌａｌａｎｉｎｅ）；Ｄ−又はＬ−３チエネイルアラニン（ｔｈｉｅｎｅｙｌａｌａｎｉｎｅ）；Ｄ−又はＬ−（２−ピリジニル）−アラニン；Ｄ−又はＬ−（３−ピリジニル）−アラニン；Ｄ−又はＬ−（２−ピラジニル）−アラニン；Ｄ−又はＬ−（４−イソプロピル）−フェニルグリシン；Ｄ−（トリフルオロメチル）−フェニルグリシン；Ｄ−（トリフルオロメチル）−フェニルアラニン；Ｄ−ｐ−フルオロ−フェニルアラニン；Ｄ−又はＬ−ｐ−ビフェニルフェニルアラニン；Ｄ−又はＬ−ｐ−メトキシ−ビフェニルフェニルアラニン；Ｄ−又はＬ−２−インドール（アルキル）アラニン；及びＤ−又はＬ−アルキルアラニン類（ａｌｋｙｌａｌａｎｉｎｅｓ）［ここで、アルキルは、置換又は非置換メチル、エチル、プロピル、ヘキシル、ブチル、ペンチル、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル（ｂｕｔｙｌ）、イソ−ペンチル、又は非酸性アミノ酸であってもよい］による置換によって作成することができる。非天然アミノ酸の芳香環としては、例えば、チアゾリル、チオフェニル、ピラゾリル、ベンズイミダゾリル、ナフチル、フラニル、ピロリル、及びピリジル芳香環が挙げられる。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３６１】
酸性アミノ酸の模倣体は、例えば、負電荷を維持する一方での非カルボキシル化アミノ酸；（ホスホノ）アラニン；硫酸化スレオニンによる置換によって作成することができる。カルボキシル側基（例えば、アスパルチル又はグルタミル）も、カルボジイミド（Ｒ’〜Ｎ−Ｃ−Ｎ−Ｒ’）、例えば、１−シクロヘキシル−３（２−モルホリニル（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｙｌ）−（４−エチル）カルボジイミド又はｌ−エチル−３（４−アゾニア−４，４−ジメトールペンチル）カルボジイミドとの反応によって選択的に修飾することができる。アスパルチル又はグルタミルはまた、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニル及びグルタミニル残基に変換することもできる。塩基性アミノ酸の模倣体は、例えば、（リジン及びアルギニンに加えて）アミノ酸オルニチン、シトルリン、又は（グアニジノ）酢酸、又は（グアニジノ）アルキル酢酸（ここで、アルキルは、上記に定義される）による置換によって作成することができる。ニトリル誘導体（例えば、ＣＯＯＨの代わりにＣＮ部分を含む）は、アスパラギン又はグルタミンを置換することができる。アスパラギニル及びグルタミニル残基は、対応するアスパルチル又はグルタミル残基に対して脱アミノ化することができる。アルギニン残基模倣体は、アルギニルと、例えば１つ以上の従来の試薬、例えばフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロ−ヘキサンジオン、又はニンヒドリンとの、好ましくはアルカリ性条件下での反応によって作成することができる。チロシン残基模倣体は、チロシルと、例えば芳香族ジアゾニウム化合物又はテトラニトロメタンとの反応によって作成することができる。Ｎ−アセチルイミジゾール（ａｃｅｔｙｌｉｍｉｄａｚｏｌ）及びテトラニトロメタンを使用して、それぞれＯ−アセチルチロシル種及び３−ニトロ誘導体を形成することができる。システイン残基模倣体は、システイニル残基と、例えば２−クロロ酢酸又はクロロアセトアミドなどのα−ハロ酢酸及び対応するアミン類との反応によって；カルボキシメチル又はカルボキシアミドメチル誘導体を得て作成することができる。システイン残基模倣体はまた、システイニル残基と、例えばブロモ−トリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミダゾリル（ｉｍｉｄａｚｏｌｙｌ））プロピオン酸；クロロアセチルリン酸塩、Ｎ−アルキルマレイミド類、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド；メチル２−ピリジルジスルフィド；ｐ−クロロメルクリ安息香酸塩；２−クロロメルクリ−４ニトロフェノール；及びクロロ−７−ニトロベンゾ−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応によって作成することもできる。リジン模倣体は、リシニルと、例えばコハク酸又は他のカルボン酸無水物との反応によって作成することができる（及びアミノ末端残基を改変することができる）。リジン及び他のα−アミノ含有残基模倣体はまた、イミドエステル、例えば、メチルピコリンイミデート、ピリドキサールリン酸、ピリドキサール、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソウレア、２，４、ペンタンジオンとの反応、及びグリオキシル酸塩とのトランスアミダーゼ触媒反応によって作成することもできる。メチオニンの模���体は、例えばメチオニンスルホキシドとの反応によって作成することができる。プロリンの模倣体には、例えば、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、３−又は４−ヒドロキシプロリン、デヒドロプロリン、３−又は４−メチルプロリン、又は３，３，−ジメチルプロリンが含まれる。ヒスチジン残基模倣体は、ヒスチジルと、例えばジエチルプロカーボネート又はパラブロモフェナシルブロミドとの反応によって作成することができる。他の模倣体としては、例えば、プロリン及びリジンのヒドロキシル化；セリル又はスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化；リジン、アルギニン及びヒスチジンのα−アミノ基のメチル化；Ｎ末端アミンのアセチル化；主鎖アミド残基のメチル化又はＮ−メチルアミノ酸による置換；又はＣ末端カルボキシル基のアミド化によって作成されるものが挙げられる。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３７１】
バイアスを有するコドン使用は、組換えポリペプチドに非天然アミノ酸を導入するための別の方法をもたらす。例えば、Ａｒｇの６個の縮重コドンのうち、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において、ＡＧＧ及びＡＧＡは稀にのみ使用される。アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼとＡＧＧコドンと対合するｔＲＮＡとの直交ペアを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現宿主に導入すると、非天然アミノ酸をｔＲＮＡに連結することが可能になり得る。従って、非天然アミノ酸が連結しているｔＲＮＡは、通常Ａｒｇがコードされ得るコドンＡＧＧに非天然アミノ酸を持ち込むことができる。この方法は、インビトロ無細胞ベースのシステムで実現可能であることが分かっており、ここではＡＧＧコドン（ｃｏｄｏｎ）と対合するｔＲＮＡに連結した化学合成非天然アミノ酸がＡＧＧコドンに組み込まれた（Ｈｏｈｓａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，ｖｏｌ．３４４，ｐａｇｅｓ  １７１−１７４，１９９４）。この方法は、ｔＲＮＡに非天然直交を連結するようにアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼを操作し得る場合、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞ベースの発現システムに適合させることができる。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３７８】
本開示はまた、翻訳後プロセシング（例えばリン酸化、アシル化等）などの天然の過程によるか、或いは化学修飾技術による本開示のポリペプチドの修飾方法を提供する。修飾は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖及びアミン又はカルボキシル末端を含むポリペプチドのどこに行われてもよい。同じタイプの修飾が、所与のポリペチドのいくつかの部位に同じ又は様々な程度で存在し得ることは理解されるであろう。また、所与のポリペチドが多くの種類の修飾を有することができる。修飾には、アセチル化、アシル化、ＰＥＧ化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋性環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化（ｍｙｒｉｓｔｏｙｌａｔｉｏｎ）、酸化、ペグ化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイレーション（ｓｅｌｅｎｏｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化、及びアルギニル化等のトランスファーＲＮＡ媒介性のタンパク質へのアミノ酸付加が含まれる。Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１−１２（１９８３）を参照のこと。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４０３】
一部の実施形態において、条件的活性型抗体にコンジュゲートされる細胞毒素としては、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラセンジオン（ａｎｔｈｒａｃｅｎｅｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド類、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びピューロマイシン並びにこれらの類似体又は相同体が挙げられる。他の毒素としては、例えば、リシン、ＣＣ−１０６５及び類似体、デュオカルマイシン類が挙げられる。さらに他の毒素としては、ジフテリア（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）毒素、及びヘビ毒（例えばコブラ毒）が挙げられる。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４０５】
一部の実施形態において、診断用薬剤には、種々の画像診断法に用いられる、例えば金属イオンに結合したキレーターが含まれ得る。例示的キレーターとしては、限定はされないが、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、［４−（１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカ−１−イル）メチル安息香酸（ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ）（ＣＰＴＡ）、シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）、エチレンビス（オキシエチレンニトリロ）四酢酸（ＥＧＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、クエン酸、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）、トリエチレンテトラアミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ（メチレンホスホン酸）（ＤＯＴＰ）、１，４，８，１１−テトラアザシクロドデカン−１，４，８，１１−四酢酸（ＴＥＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）、及びこれらの誘導体が挙げられる。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４０７】
他の実施形態では、診断用薬剤が、蛍光剤、リン光剤、化学発光剤などの光学的薬剤を含み得る。数多くの薬剤（例えば、色素、プローブ、標識、又は指示薬）が当該技術分野において公知であり、本発明において使用することができる。（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、“Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ−Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，”Ｔｅｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（２００５）を参照のこと）。蛍光剤には、種々の有機及び／又は無機小分子又は種々の蛍光タンパク質及びその誘導体が含まれ得る。例えば、蛍光剤としては、限定はされないが、シアニン、フタロシアニン、ポルフィリン、インドシアニン、ローダミン、フェノキサジン、フェニルキサンテン、フェノチアジン、フェノセレナジン、フルオレセイン、ベンゾポルフィリン、スクアライン、ジピロロピリミドン、テトラセン、キノリン、ピラジン、コリン、クロコニウム、アクリドン、フェナントリジン、ローダミン、アクリジン、アントラキノン、カルコゲノピリリウム類似体、クロリン、ナフタロシアニン、メチン色素、インドレニウム色素、アゾ化合物、アズレン、アザアズレン、トリフェニルメタン色素、インドール、ベンゾインドール、インドカルボシアニン、ベンゾインドカルボシアニン、及び４，４−ジフルオロ（ｄｉｆｌｕｏｒｏ）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセンの一般構造を有するＢＯＤＩＰＹ（商標）誘導体、及び／又はこれらの任意のコンジュゲート及び／又は誘導体を挙げることができる。使用することのできる他の薬剤としては、限定はされないが、例えば、フルオレセイン、フルオレセイン−ポリアスパラギン酸コンジュゲート、フルオレセイン−ポリグルタミン酸コンジュゲート、フルオレセイン−ポリアルギニンコンジュゲート、インドシアニングリーン、インドシアニン−ドデカアスパラギン酸コンジュゲート、インドシアニン（ＮＩＲＤ）−ポリアスパラギン酸コンジュゲート、イソスルファンブルー、インドールジスルホネート、ベンゾインドールジスルホネート、ビス（エチルカルボキシメチル）インドシアニン、ビス（ペンチルカルボキシメチル）インドシアニン、ポリヒドロキシインドールスルホネート、ポリヒドロキシベンゾインドールスルホネート、リジッドヘテロ原子インドールジスルホネート、インドシアニンビスプロパン酸、インドシアニンビスヘキサン酸、３，６−ジシアノ−２，５−［（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス（カルボキシメチル）アミノ］ピラジン、３，６−［（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］ピラジン−２，５−ジカルボン酸、３，６−ビス（Ｎ−アザテジノ（ａｚａｔｅｄｉｎｏ））ピラジン−２，５−ジカルボン酸、３，６−ビス（Ｎ−モルホリノ）ピラジン−２，５−ジカルボン酸、３，６−ビス（Ｎ−ピペラジノ）ピラジン−２，５−ジカルボン酸、３，６−ビス（Ｎ−チオモルホリノ）ピラジン−２，５−ジカルボン酸、３，６−ビス（Ｎ−チオモルホリノ）ピラジン−２，５−ジカルボン酸Ｓ−オキシド、２，５−ジシアノ−３，６−ビス（Ｎ−チオモルホリノ）ピラジンＳ，Ｓ−ジオキシド、インドカルボシアニンテトラスルホネート、クロロインドカルボシアニン、及び３，６−ジアミノピラジン−２，５−ジカルボン酸が挙げられる。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４０８】
さらに他の実施形態において、診断用薬剤には、例えば、超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）、ガドリニウム又はマンガンの錯体などを含めた、当該技術分野において概して周知の造影剤が含まれ得る。（例えば、Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ，“Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ，”５th  Ｅｄ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２００４）を参照のこと）。一部の実施形態において、診断用薬剤には、磁気共鳴（ＭＲ）造影剤が含まれ得る。例示的磁気共鳴剤としては、限定はされないが、常磁性薬剤、超常磁性薬剤などが挙げられる。例示的常磁性薬剤としては、限定はされないが、ガドペンテト酸、ガドテル酸、ガドジアミド、ガドリニウム、ガドテリドール、マンガホジピール、ガドベルセタミド、クエン酸鉄アンモニウム、ガドベン酸、ガドブトロール、又はガドキセト酸を挙げることができる。超常磁性薬剤としては、限定はされないが、超常磁性酸化鉄及びフェリステンを挙げることができる。特定の実施形態において、診断用薬剤には、例えば以下の文献に提供されるようなＸ線造影剤が含まれ得る：Ｈ．Ｓ  Ｔｈｏｍｓｅｎ，Ｒ．Ｎ．Ｍｕｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｒ．Ｆ．Ｍａｔｔｒｅｙ，Ｅｄｓ．，“Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｏｎｔｒａｓｔ  Ｍｅｄｉａ，”Ｂｅｒｌｉｎ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９９９）；Ｐ．Ｄａｗｓｏｎ，Ｄ．Ｃｏｓｇｒｏｖｅ  ａｎｄ  Ｒ．Ｇｒａｉｎｇｅｒ，Ｅｄｓ．，“Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒａｓｔ  Ｍｅｄｉａ”（ＩＳＩＳ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ  １９９９）；Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ，Ｖ．Ｐ．，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，ｖｏｌ．１，ｐａｇｅｓ  １８３−２１５（２０００）；Ｂｏｇｄａｎｏｖ，Ａ．Ａ．ｅｔ  ａｌ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．，Ｖｏｌ．３７，ｐａｇｅｓ  ２７９−２９３（１９９９）；Ｓａｃｈｓｅ，Ａ．ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３２，ｐａｇｅｓ  ４４−５０（１９９７）。Ｘ線造影剤の例としては、限定なしに、イオパミドール、イオメプロール、イオヘキソール、イオペントール、イオプロミド、イオシミド、イオベルソール、イオトロラン、イオタスル、イオジキサノール、イオデシモール、イオグルカミド、イオグルニド、イオグラミド、イオサルコール、イオキシラン、イオパミロン、メトリザミド、イオビトリドール及びイオシメノールが挙げられる。特定の実施形態において、Ｘ線造影剤としては、イオパミドール、イオメプロール、イオプロミド、イオヘキソール、イオペントール、イオベルソール、イオビトリドール、イオジキサノール、イオトロラン及びイオシメノールを挙げることができる。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４０９】
一部の実施形態において、条件的活性型抗体は、タンパク質、例えば、インターロイキン、サイトカイン、酵素、成長因子、又は他の抗体にコンジュゲートされ得る。かかるタンパク質のいくつかの例としては、例えば、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン（ＩＦＮ−α）、β−インターフェロン（ＩＦＮ−β）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、アポトーシス剤（例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、国際公開第９７／３３８９９号パンフレットに開示されるようなＡＩＭ  Ｉ）、ＡＩＭ  ＩＩ（国際公開第９７／３４９１１号パンフレットを参照）、Ｆａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．６，ｐａｇｅｓ  １５６７−１５７４，１９９４）、及びＶＥＧＩ（国際公開第９９／２３１０５号パンフレット）、抗血栓症剤又は抗血管新生剤（例えば、アンジオスタチン又はエンドスタチン）；又は生物学的反応修飾物質、例えば、リンホカイン（例えば、インターロイキン−１（「ＩＬ−Ｉ」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、及び顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」））、又は成長因子（例えば、成長ホルモン（「ＧＨ」））が挙げられる。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４１０】
一部の実施形態では、本発明によって提供されるようなＢＢＢを通過するための条件的活性型抗体が、神経障害の治療用薬物にコンジュゲートされ得る。この薬物は、抗体と共にＢＢＢを通って輸送され、神経障害を治療するため脳内に留まり得る。神経障害とは、ＣＮＳに影響を及ぼし、及び／又はＣＮＳに病因がある疾患又は障害を指す。例示的ＣＮＳ疾患又は障害としては、限定はされないが、ニューロパチー、アミロイドーシス、癌、眼疾患又は眼障害、ウイルス又は微生物感染症、炎症、虚血、神経変性疾患、てんかん発作、行動障害、及びリソソーム蓄積症が挙げられる。本出願の目的上、ＣＮＳは、通常は血液網膜関門によって体の残りの部分から隔絶されている眼を含むものと理解されるであろう。神経障害の具体的な例としては、限定はされないが、神経変性疾患（例えば限定はされないが、レビー小体病、ポリオ後症候群、シャイ・ドレーガー（Ｄｒａｇｅｒ）症候群、オリーブ橋小脳萎縮症、パーキンソン病、多系統萎縮症、線条体黒質変性症）、タウオパチー（限定はされないが、アルツハイマー病及び核上性麻痺を含む）、プリオン病（限定はされないが、ウシ海綿状脳症、スクレイピー、クロイツフェルト・ヤコブ症候群、クールー、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、慢性消耗病、及び致死性家族性不眠症を含む）、球麻痺、運動ニューロン疾患、及び神経系ヘテロ変性障害（限定はされないが、カナバン病、ハンチントン病、神経セロイドリポフスチン症、アレキサンダー病、トゥレット症候群、メンケス縮れ毛症候群、コケイン症候群、ハラーフォルデン・シュパッツ症候群、ラフォラ病、レット症候群、肝レンズ核変性症、レッシュ・ナイハン症候群、及びウンフェルリヒト・ルントボルク症候群を含む）、認知症（限定はされないが、ピック病、及び脊髄小脳失調症を含む）、癌（例えば、体の別の場所の癌から生じる脳転移を含めた、ＣＮＳ及び／又は脳の癌）が挙げられる。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４２９】
【表１】
2017532019.tif 000014
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４３６】
ＢＢＢ−Ｒに対する条件的活性型抗体の親和性は、その最大半数阻害濃度（ＩＣ５０）によって計測することができ、ＩＣ５０は、ＢＢＢ−Ｒに対する既知のＢＢＢ−Ｒリガンドの結合を５０％阻害するためにどのくらいの抗体が必要かの尺度である。一般的な手法は、競合ＥＬＩＳＡ分析（ａｓｓａｙ）などの競合的結合分析を実施することである。ＴｆＲ（ＢＢＢ−Ｒ）に関するＩＣ５０を計測する例示的競合ＥＬＩＳＡ分析は、漸増濃度の抗ＴｆＲ抗体がＴｆＲとの結合についてビオチン化ＴｆＲAと競合するものである。抗ＴｆＲ抗体競合ＥＬＩＳＡは、ＰＢＳ中２．５μｇ／ｍｌの精製マウスＴｆＲ細胞外ドメインでコートしたＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｅｐｔｕｎｅ、Ｎ．Ｊ．）において４℃で一晩実施し得る。プレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０で洗浄し、ＰＢＳ中のＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋブロッキング緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｈｕｄｓｏｎ、Ｎ．Ｈ．）を使用してブロックする。各個別の抗ＴｆＲ抗体のタイトレーション（１：３段階希釈）をビオチン化抗ＴｆＲA（０．５ｎＭ最終濃度）と組み合わせて、室温で１時間プレートに加える。プレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０で洗浄し、プレートにＨＲＰ−ストレプトアビジン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ）を加え、室温で１時間インキュベートする。プレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０で洗浄し、プレートに結合したビオチン化抗ＴｆＲAをＴＭＢ基質（ＢｉｏＦＸ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｏｗｉｎｇｓ  Ｍｉｌｌｓ）を使用して検出する。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４５２】
さらに、腫瘍微小環境はまた、体の他の部分にはあまり見られない多くの特徴的な細胞型も含有する。これらの細胞型には、内皮細胞及びその前駆体、周皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）、癌関連線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）、筋線維芽細胞（ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、Ｔ及びＢリンパ球、ナチュラルキラー細胞及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）、例えばマクロファージ及び樹状細胞が含まれる（Ｌｏｒｕｓｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  ｔｕｍｏｒ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｕｍｏｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｔｏｗａｒｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，”Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，ｖｏｌ．１３０，ｐａｇｅｓ  １０９１−１１０３，２００８）。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４６５】
本発明は、免疫チェックポイントタンパク質に対する条件的活性型抗体を提供することにより、活性化過剰のＴ細胞による付随的損傷の問題に対処する。これらの条件的活性型抗体は、腫瘍微小環境において免疫チェックポイントを優先的に活性化する。同時に、非腫瘍微小環境、例えば正常な生体組織における免疫チェックポイントは、条件的活性型抗体によって阻害されないか、又は阻害が少なく、従って非腫瘍微小環境では体に対する付随的損傷の可能性が低減される。この目標は、非腫瘍微小環境と比べて腫瘍微小環境においてより高活性となるように条件的活性型抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）を操作することによって達成される。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４６６】
一部の実施形態において、免疫チェックポイントタンパク質に対する条件的活性型抗体は、非腫瘍微小環境における免疫チェックポイントタンパク質との結合活性に対する腫瘍微小環境における同じ免疫チェックポイング（ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ）タンパク質との結合活性の比が、少なくとも約１．１、又は少なくとも約１．２、又は少なくとも約１．４、又は少なくとも約１．６、又は少なくとも約１．８、又は少なくとも約２、又は少なくとも約２．５、又は少なくとも約３、又は少なくとも約５、又は少なくとも約７、又は少なくとも約８、又は少なくとも約９、又は少なくとも約１０、又は少なくとも約１５、又は少なくとも約２０であり得る。抗体の結合活性を計測するための典型的な分析は、ＥＬＩＳＡ分析である。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４６８】
一部の実施形態において、免疫チェックポイントタンパク質に対する条件的活性型抗体は併用療法で用いられ得る。例えば、併用療法は、腫瘍細胞表面分子（腫瘍特異性抗原）に対する条件的活性型抗体と免疫チェックポイントタンパク質に対する条件的活性型抗体とを含み得る。一実施形態において、腫瘍細胞表面分子に対する条件的活性型抗体の結合活性と免疫チェックポイントタンパク質に対する条件的活性型抗体の結合活性との両方が単一のタンパク質に存在してもよく、すなわち、本明細書に開示されるような二重特異性条件的活性型抗体であってもよい。一部のさらなる実施形態において、併用療法は、腫瘍細胞表面分子（腫瘍特異性抗原）に対する条件的活性型抗体と２つ以上の異なる（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ）免疫チェックポイントタンパク質に対する２つ以上の条件的活性型抗体とを含み得る。一実施形態において、これらの結合活性の全てが単一のタンパク質に存在してもよく、すなわち、本明細書に開示されるような多重特異性抗体であってもよい。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４８３】
条件的活性型生物学的タンパク質によるウイルス粒子の操作
ウイルス粒子は、長年、タンパク質、核酸分子、化学的化合物又は放射性同位元素を標的細胞又は組織に輸送するための送達媒体として使用されている。送達媒体として一般的に用いられているウイルス粒子としては、レトウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）、アデノウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、及びアデノ随伴ウイルスが挙げられる。ウイルス粒子は、多くの場合にリガンド−受容体結合系において、標的細胞の標的タンパク質として機能する細胞タンパク質との特異的結合のための認識タンパク質として機能する表面タンパク質を介してその標的細胞を認識する（Ｌｅｎｔｚ，“Ｔｈｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｅｖｅｎｔ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ａｇｅｎｔｓ，”Ｊ．ｏｆ  Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．７１，ｐａｇｅｓ  ７５１−７６５，１９９０（参照により本明細書に援用される））。例えば、ウイルスの認識タンパク質は、標的細胞上の受容体に対するリガンドであり得る。リガンドと受容体との間の特異性により、ウイルス粒子が標的細胞を特異的に認識して、そこにその内容物を送達することが可能となる。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４９４】
ゲノム編集を行うには、Ｃａｓタンパク質が標的細胞に侵入する必要がある。対象の細胞は、細胞内部において異なる細胞内ｐＨを有し得る。罹患組織の一部の細胞は異常な細胞内ｐＨを有する。例えば、一部の腫瘍細胞は約７．１２〜７．６５のアルカリ性の細胞内ｐＨを有する傾向があり、一方、正常組織の細胞は６．９９〜７．２０の範囲の中性の細胞内ｐＨを有する。Ｃａｒｄｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｄｉｓｔｕｒｂｅｄ  ｐＨ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｎａ（＋）／Ｈ（＋）ｅｘｃｈａｎｇｅｒ  ｉｎ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，”Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ，ｖｏｌ．５，ｐａｇｅｓ  ７８６−７９５，２００５を参照のこと。慢性低酸素では、罹患組織の細胞は約７．２〜７．５の細胞内ｐＨを有し、これも正常組織の細胞内ｐＨより高い（Ｒｉｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｙｐｏｘｉａ  ｅｌｅｖａｔｅｓ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐＨ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  Ｎａ＋／Ｈ＋  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｉａｌ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ，”Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ−Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２８９，ｐａｇｅｓ  Ｌ８６７−Ｌ８７４，２００５）。さらに、虚血細胞では、細胞内ｐＨは典型的に６．５５〜６．６５の範囲であり、これは正常組織の細胞内ｐＨより低い（Ｈａｑｂｅｒｇ，“Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐＨ  ｄｕｒｉｎｇ  ｉｓｃｈｅｍｉａ  ｉｎ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ：ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｔｏ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ，ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐＨ，ｔｉｓｓｕｅ  ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎｄ  ＡＴＰ，”Ｐｆｌｕｇｅｒｓ  Ａｒｃｈ．，ｖｏｌ．４０４，ｐａｇｅｓ  ３４２−３４７，１９８５）。罹患組織における異常な細胞内ｐＨのさらなる例が、Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐＨ，”Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ．，ｖｏｌ．１１０，ｐａｇｅｓ  ２７０９−２７２８，２０１０において考察されている。
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４９５】
本発明は、野生型Ｃａｓタンパク質から条件的活性型Ｃａｓタンパク質を作製する方法を提供し、ここで条件的活性型Ｃａｓタンパク質は、（１）正常細胞内部の正常生理条件下で野生型Ｃａｓタンパク質の活性と比べて低下した酵素活性、及び（２）上記で考察した罹患細胞の１つなどの標的細胞内部の異常条件下で野生型Ｃａｓタンパク質の活性と比べて増加した酵素活性のうちの少なくとも一方を有する。一部の実施形態において、正常生理条件はほぼ中性の細胞内ｐＨであり、異常条件は、中性より高いか、又はそれより低い異なる細胞内ｐＨである。ある実施形態では、異常条件は、７．２〜７．６５の細胞内ｐＨ又は６．５〜６．８の細胞内（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ）ｐＨである。
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５００】
アミノ酸置換はまた、エフェクター機能を改変するためＦｃ領域に導入されてもよい。例えば、ＩｇＧクラスのヒト抗体はＦｃγ受容体（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａ）、阻害性ＦｃγＲＩＩｂ受容体、及び補体第１成分（Ｃ１ｑ）に異なる親和性で結合し、これらの抗体の異なるものの間で極めて異なるエフェクター機能を生じる。ＩｇＧ抗体とＦｃγＲ又はＣ１ｑとの結合は、抗体のヒンジドメイン及びＣＨ２ドメインに位置する残基に依存する。２３３〜２３６位のヒト抗体ＩｇＧ１又は（ｏｒ）ＩｇＧ２残基及び３２７、３３０及び３３１位の抗体ＩｇＧ４残基のアミノ酸置換は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣを大きく低減し得る。さらに、Ｋ３２２を含めた、Ｆｃ領域における種々の位置のアラニン置換は、補体活性化を大幅に低減する。Ｆｃ領域を操作するさらに多くの例が、米国特許第８，３６２，２１０号明細書（全体として参照により援用される）に記載されている。
【国際調査報告】
2017532019.tif 000015
2017532019.tif 000016
2017532019.tif 000017
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