(57)【要約】  本発明は、一般に微小フルイディクスおよび標識核酸に関する。例えば、ある面は、一般に微小流体液滴内の核酸を標識するシステムおよび方法に関する。ある態様において、核酸は、例えば、核酸が纏めてプールされた後さえ、液滴内の核酸を、他の液滴と区別するのに使用できる、“バーコード”または一意的な配列を含み得る。ある場合、一意的な配列は、粒子を使用して個々の液滴に取り込まれ、液滴内に含まれる核酸(例えば、溶解細胞から遊離された)に結合し得る。ある場合、バーコードを使用して、例えば、異なる細胞または他の源に由来する、数十、数百または数千の核酸を区別できる。
2017515469.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の少なくとも１０,０００の微小流体液滴内に複数の細胞および複数の粒子を封入し、複数の粒子の少なくとも１０,０００の液滴が複数の液滴の他の液滴に含まれるオリゴヌクレオチドタグと区別可能な１以上のオリゴヌクレオチドタグを含むように、粒子の少なくともいくつかがそれに共有結合したオリゴヌクレオチドタグを含み；
細胞から核酸を遊離させるために液滴内で少なくともいくつかの細胞を溶解させ；そして
遊離核酸と液滴の少なくともいくつか内のオリゴヌクレオチドタグを結合させる
ことを含む、方法。
【請求項２】
複数の細胞を、微小流体液滴の少なくとも約９０％が１細胞を含むまたは細胞を含まないように複数の微小流体液滴に封入することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
複数の粒子を、微小流体液滴の少なくとも約９０％が１粒子を含むまたは粒子を含まないように複数の微小流体液滴に封入することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
粒子が、最大約１粒子／液滴で液滴内に封入される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
粒子が、最大約０.１粒子／液滴で液滴内に封入される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
粒子が、最大約０.０１粒子／液滴で液滴内に封入される、請求項４〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
細胞が、最大約１細胞／液滴で液滴内に封入される、請求項４〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
細胞が、最大約０.１細胞／液滴で液滴内に封入される、請求項４〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
少なくとも粒子のいくつかがヒドロゲル粒子である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも粒子のいくつかが高分子粒子である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも粒子のいくつかが微粒子である、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも粒子のいくつかがポリアクリルアミドを含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも粒子のいくつかがアガロースを含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも粒子のいくつかがポリスチレンを含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも粒子のいくつかがポリＮ−イソプロピルアクリルアミドを含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも粒子のいくつかが磁性である、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
複数の粒子が最大約５００μmの平均直径を有する、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
複数の粒子が少なくとも約１μmの平均直径を有する、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
オリゴヌクレオチドタグの少なくともいくつかが、アクリル系ホスホラミダイト結合により粒子に共有結合する、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
オリゴヌクレオチドタグの少なくともいくつかが、アミノ結合により粒子に共有結合する、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
オリゴヌクレオチドタグの少なくともいくつかが、ビオチン−ストレプトアビジン結合により粒子に共有結合する、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
遊離核酸と液滴の少なくともいくつか内のオリゴヌクレオチドタグを共有結合させることを含む、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
酵素を使用して遊離核酸と液滴の少なくともいくつか内のオリゴヌクレオチドタグを結合させることを含む、請求項１〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
さらにオリゴヌクレオチドタグでタグ付された遊離核酸と他の液滴中の他の細胞から遊離された核酸を合わせることを含む、請求項１〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
オリゴヌクレオチドタグが、他の細胞から遊離された核酸から核酸を一意的に特定する、請求項１〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
オリゴヌクレオチドタグの少なくともいくつかが少なくとも一つのバーコード配列を含む、請求項１〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
バーコード配列がバーコード配列のプールから選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
バーコード配列のプールが少なくとも１０,０００のバーコード配列を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
バーコード配列のプールが少なくとも１００,０００バーコード配列を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
オリゴヌクレオチドタグの少なくともいくつかが少なくとも２バーコード配列を含む、請求項１〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
少なくとも２バーコード配列が異なるバーコード配列のプールから選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
オリゴヌクレオチドタグの少なくともいくつかがプライマー配列を含む、請求項１〜３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
オリゴヌクレオチドタグの少なくともいくつかが１超のプライマー配列を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
さらにオリゴヌクレオチドタグの少なくともいくつかを粒子から遊離することを含む、請求項１〜３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
オリゴヌクレオチドタグの少なくともいくつかを粒子から光の適用により遊離することを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
オリゴヌクレオチドタグの少なくともいくつかが開裂可能リンカーを含む、請求項１〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
少なくとも開裂可能リンカーのいくつかが光開裂可能リンカーである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
少なくとも開裂可能リンカーのいくつかが化学的開裂可能リンカーである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
少なくとも開裂可能リンカーのいくつかが酵素開裂可能リンカーである、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
オリゴヌクレオチドタグの少なくともいくつかを、細胞溶解前に粒子から遊離することを含む、請求項１〜３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
オリゴヌクレオチドタグの少なくともいくつかを、細胞溶解後に粒子から遊離することを含む、請求項１〜４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
オリゴヌクレオチドタグの少なくともいくつかがポリＴ配列を含む、請求項１〜４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
オリゴヌクレオチドタグの少なくともいくつかがランダムＤＮＡ配列を含む、請求項１〜４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
オリゴヌクレオチドタグの少なくともいくつかが遺伝子と特異的に結合できる配列を含む、請求項１〜４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
オリゴヌクレオチドタグの少なくともいくつかがプライマーを含み、遊離核酸と液滴の少なくともいくつか内のオリゴヌクレオチドタグの結合が、遊離核酸とオリゴヌクレオチドタグが一緒に結合する配列を産生するためにプライマーを使用して少なくとも核酸のいくつかの増幅を含む、請求項１〜４４のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
細胞の少なくともいくつかの溶解が、細胞からのＤＮＡの遊離を含む、請求項１〜４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
細胞の少なくともいくつかの溶解が、細胞からのＲＮＡの遊離を含む、請求項１〜４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
さらに溶解細胞の少なくともいくつかを抗体に曝すことを含む、請求項１〜４７のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
抗体がＤＮＡタグ付抗体である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
細胞の少なくともいくつかを、細胞溶解剤を使用して溶解する、請求項１〜４９のいずれかに記載の方法。
【請求項５１】
細胞、粒子および細胞溶解剤を一緒に微小流体液滴に封入することを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
さらに液滴の少なくともいくつかを破壊することを含む、請求項１〜５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５３】
オリゴヌクレオチドタグの少なくともいくつかを、液滴破壊前に粒子から遊離することを含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
オリゴヌクレオチドタグの少なくともいくつかを、液滴破壊後に粒子から遊離することを含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
さらに遊離核酸の少なくともいくつかを配列決定することを含む、請求項５２〜５４のいずれかに記載の方法。
【請求項５６】
さらに遊離核酸の少なくともいくつかをオリゴヌクレオチドタグを使用して決定することを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
複数の微小流体液滴が約１０nl未満の体積を有する、請求項１〜５６のいくつかに記載の方法。
【請求項５８】
複数の微小流体液滴が約１mm未満の平均直径を有する、請求項１〜５７のいずれかに記載の方法。
【請求項５９】
細胞の少なくともいくつかが解離組織由来である、請求項１〜５８のいずれかに記載の方法。
【請求項６０】
複数の少なくとも１０,０００の微小流体液滴を含み、液滴の少なくともいくつかが核酸フラグメントを含む細胞溶解物を含むものであり、ここで、液滴内の複数の核酸フラグメントがオリゴヌクレオチドタグに結合し、液滴内のオリゴヌクレオチドタグが複数の１０,０００微小流体液滴の他の液滴内のオリゴヌクレオチドタグと区別可能である、
物品。
【請求項６１】
複数の少なくとも１００,０００微小流体液滴を含む、請求項６０に記載の物品。
【請求項６２】
複数の少なくとも３００,０００微小流体液滴を含む、請求項６０または６１に記載の物品。
【請求項６３】
少なくとも１,０００,０００微小流体液滴を含む、請求項６０〜６２のいずれかに記載の物品。
【請求項６４】
液滴の少なくとも約９０％が１粒子を含むかまたは粒子を含まない、請求項６０〜６３のいずれかに記載の物品。
【請求項６５】
少なくとも粒子のいくつかがヒドロゲル粒子である、請求項６０〜６４のいずれかに記載の物品。
【請求項６６】
少なくとも粒子のいくつかが高分子粒子である、請求項６０〜６５のいずれかに記載の物品。
【請求項６７】
少なくとも粒子のいくつかが微粒子である、請求項６０〜６６のいずれかに記載の物品。
【請求項６８】
少なくとも粒子のいくつかがポリアクリルアミドを含む、請求項６０〜６７のいずれかに記載の物品。
【請求項６９】
少なくとも粒子のいくつかがアガロースを含む、請求項６０〜６８のいずれかに記載の物品。
【請求項７０】
少なくとも粒子のいくつかがポリスチレンを含む、請求項６０〜６９のいずれかに記載の物品。
【請求項７１】
少なくとも粒子のいくつかがポリＮ−イソプロピルアクリルアミドを含む、請求項６０〜７０のいずれかに記載の物品。
【請求項７２】
少なくとも粒子のいくつかが磁性、請求項６０〜７１のいずれかに記載の物品。
【請求項７３】
粒子が最大約５００μmの平均直径を有する、請求項６０〜７２のいずれかに記載の物品。
【請求項７４】
粒子が少なくとも約１μmの平均直径を有する、請求項６０〜７３のいずれかに記載の物品。
【請求項７５】
オリゴヌクレオチドタグの少なくともいくつかが、アクリル系ホスホラミダイト結合により少なくとも粒子のいくつかに共有結合する、請求項６０〜７４のいずれかに記載の物品。
【請求項７６】
オリゴヌクレオチドタグの少なくともいくつかが、アミノ結合により少なくとも粒子のいくつかに共有結合する、請求項６０〜７５のいずれかに記載の物品。
【請求項７７】
オリゴヌクレオチドタグの少なくともいくつかが、ビオチン−ストレプトアビジン結合により少なくとも粒子のいくつかに共有結合する、請求項６０〜７６のいずれかに記載の物品。
【請求項７８】
オリゴヌクレオチドタグの少なくともいくつかが少なくとも一つのバーコード配列を含む、請求項６０〜７７のいずれかに記載の物品。
【請求項７９】
バーコード配列がバーコード配列のプールから選択される、請求項７８に記載の物品。
【請求項８０】
バーコード配列のプールが少なくとも１００,０００バーコード配列を含む、請求項７９に記載の物品。
【請求項８１】
バーコード配列のプールが少なくとも１,０００,０００バーコード配列を含む、請求項８０に記載の物品。
【請求項８２】
オリゴヌクレオチドタグの少なくともいくつかが少なくとも２バーコード配列を含む、請求項６０〜８１のいずれかに記載の物品。
【請求項８３】
オリゴヌクレオチドタグの少なくとも２バーコード配列が異なるバーコード配列のプールから選択される、請求項８２に記載の物品。
【請求項８４】
オリゴヌクレオチドタグの少なくともいくつかがプライマー配列を含む、請求項６０〜８３のいずれかに記載の物品。
【請求項８５】
オリゴヌクレオチドタグの少なくともいくつかが開裂可能リンカーを含む、請求項６０〜８４のいずれかに記載の物品。
【請求項８６】
開裂可能リンカーが光開裂可能リンカーである、請求項８５に記載の物品。
【請求項８７】
開裂可能リンカーが化学的開裂可能リンカーである、請求項８５に記載の物品。
【請求項８８】
開裂可能リンカーが酵素開裂可能リンカーである、請求項８５に記載の物品。
【請求項８９】
オリゴヌクレオチドタグの少なくともいくつかがポリＴ配列を含む、請求項６０〜８８のいずれかに記載の物品。
【請求項９０】
オリゴヌクレオチドタグの少なくともいくつかがランダムＤＮＡ配列を含む、請求項６０〜８９のいずれかに記載の物品。
【請求項９１】
オリゴヌクレオチドタグの少なくともいくつかが遺伝子と特異的に結合できる配列を含む、請求項６０〜９０のいずれかに記載の物品。
【請求項９２】
オリゴヌクレオチドタグの少なくともいくつかがプライマーを含む、請求項６０〜９１のいずれかに記載の物品。
【請求項９３】
微小流体液滴が約１０nl未満の平均体積を有する、請求項６０〜９２のいずれかに記載の物品。
【請求項９４】
微小流体液滴が約１mm未満の平均直径を有する、請求項６０〜９３のいずれかに記載の物品。
【請求項９５】
細胞が解離組織に由来する、請求項６０〜９４のいずれかに記載の物品。
【請求項９６】
細胞を含む複数の少なくとも１０,０００の微小流体液滴を提供し、複数の液滴の少なくとも約９０％は１細胞を含むかまたは細胞を含まず；
細胞から核酸を遊離させるための複数の微小流体液滴内で細胞を溶解させ；そして
遊離核酸とオリゴヌクレオチドタグを結合させることを含み、ここで、液滴の少なくとも約９０％について、液滴内のオリゴヌクレオチドタグは、複数の液滴の他の液滴内のオリゴヌクレオチドタグと区別可能である、
方法。
【請求項９７】
粒子が、最大約１粒子／液滴で液滴内に封入される、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
細胞が、最大約１細胞／液滴で液滴内に封入される、請求項９６または９７に記載の方法。
【請求項９９】
さらにオリゴヌクレオチドでタグ付された遊離核酸と他の液滴中の他の細胞から遊離されたタグ核酸を合わせることを含む、請求項９６〜９８のいずれかに記載の方法。
【請求項１００】
オリゴヌクレオチドタグが他の細胞から遊離した核酸から遊離核酸を一意的に特定する、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
オリゴヌクレオチドタグが少なくとも一つバーコード配列を含む、請求項９６〜１００のいずれかに記載の方法。
【請求項１０２】
オリゴヌクレオチドタグがプライマー配列を含む、請求項９６〜１０１のいずれかに記載の方法。
【請求項１０３】
さらに液滴を破壊することを含む、請求項９６〜１０２のいずれかに記載の方法。
【請求項１０４】
さらにタグ付核酸を配列決定することを含む、請求項９６〜１０３のいずれかに記載の方法。
【請求項１０５】
複数の少なくとも１０,０００の微小流体液滴を含み、細胞溶解物を含む液滴の少なくともいくつかを含み、ここで、複数の１０,０００微小流体液滴の少なくとも約９０％は一粒子のみを含み、粒子はそれに共有結合したオリゴヌクレオチドを含み、液滴内のオリゴヌクレオチドが複数の１０,０００微小流体液滴の他の液滴内のオリゴヌクレオチドから区別可能である、
物品。
【請求項１０６】
少なくとも３０,０００微小流体液滴を含む、請求項１０５に記載の物品。
【請求項１０７】
少なくとも１００,０００微小流体液滴を含む、請求項１０６に記載の物品。
【請求項１０８】
少なくとも１,０００,０００微小流体液滴を含む、請求項１０７に記載の物品。
【請求項１０９】
少なくとも粒子のいくつかがヒドロゲル粒子である、請求項１０５〜１０８のいずれかに記載の物品。
【請求項１１０】
少なくとも粒子のいくつかが高分子粒子である、請求項１０５〜１０９のいずれかに記載の物品。
【請求項１１１】
オリゴヌクレオチドタグの少なくともいくつかが少なくとも一つのバーコード配列を含む、請求項１０５〜１１０のいずれかに記載の物品。
【請求項１１２】
オリゴヌクレオチドタグの少なくともいくつかがプライマー配列を含む、請求項１０５〜１１１のいずれかに記載の物品。
【請求項１１３】
オリゴヌクレオチドタグの少なくともいくつかが開裂可能リンカーを含む、請求項１０５〜１１２のいずれかに記載の物品。
【請求項１１４】
オリゴヌクレオチドタグの少なくともいくつかがポリＴ配列を含む、請求項１０５〜１１３のいずれかに記載の物品。
【請求項１１５】
オリゴヌクレオチドタグの少なくともいくつかがランダムＤＮＡ配列を含む、請求項１０５〜１１４のいずれかに記載の物品。
【請求項１１６】
オリゴヌクレオチドタグの少なくともいくつかが遺伝子と特異的に結合できる配列を含む、請求項１０５〜１１５のいずれかに記載の物品。
【請求項１１７】
複数の粒子を含み、粒子の少なくとも約９０％がそれに共有結合したオリゴヌクレオチドを含み、オリゴヌクレオチドが少なくとも２のプライマー位置および少なくとも２のバーコード領域を含み、
ここで、粒子の少なくとも約９０％がオリゴヌクレオチドのバーコード領域に基づき、複数の粒子の他の粒子から区別可能である、
物品。
【請求項１１８】
複数の粒子が複数の微小流体液滴内に含まれる、請求項１１７に記載の物品。
【請求項１１９】
複数の粒子が複数の少なくとも１００微小流体液滴内に含まれる、請求項１１８に記載の物品。
【請求項１２０】
少なくとも粒子のいくつかがヒドロゲル粒子である、請求項１１７〜１１９のいずれかに記載の物品。
【請求項１２１】
少なくとも粒子のいくつかが高分子粒子である、請求項１１７〜１２０のいずれかに記載の物品。
【請求項１２２】
オリゴヌクレオチドタグの少なくともいくつかが少なくとも一つのバーコード配列を含む、請求項１１７〜１２１のいずれかに記載の物品。
【請求項１２３】
オリゴヌクレオチドタグの少なくともいくつかがプライマー配列を含む、請求項１１７〜１２２のいずれかに記載の物品。
【請求項１２４】
オリゴヌクレオチドタグの少なくともいくつかが開裂可能リンカーを含む、請求項１１７〜１２３のいずれかに記載の物品。
【請求項１２５】
オリゴヌクレオチドタグの少なくともいくつかがポリＴ配列を含む、請求項１１７〜１２４のいずれかに記載の物品。
【請求項１２６】
オリゴヌクレオチドタグの少なくともいくつかがランダムＤＮＡ配列を含む、請求項１１７〜１２５のいずれかに記載の物品。
【請求項１２７】
オリゴヌクレオチドタグの少なくともいくつかが遺伝子と特異的に結合できる配列を含む、請求項１１７〜１２６のいずれかに記載の物品。
【請求項１２８】
複数の粒子を提供し；
第一オリゴヌクレオチドを、粒子の少なくとも約９０％がそれに共有結合した第一オリゴヌクレオチド１個のみを有するように複数の粒子に結合し、ここで、第一オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０の一意的な第一オリゴヌクレオチドのプールから取られるものであり；そして
第二オリゴヌクレオチドを、第一オリゴヌクレオチドの少なくとも約９０％がそれに共有結合した第二オリゴヌクレオチド１個のみを有するように第一オリゴヌクレオチドに結合することを含み、ここで、第二オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０の一意的な第二オリゴヌクレオチドのプールから取られるものである、
方法。
【請求項１２９】
細胞およびヒドロゲル粒子を液滴内に封入し、ヒドロゲル粒子はそれに結合したバーコード化核酸を有し；
細胞から核酸を遊離させるために液滴内で細胞を溶解し；そして
遊離核酸とバーコード化核酸を酵素的に反応させる
ことを含む、方法。
【請求項１３０】
さらにバーコード化核酸をヒドロゲル粒子から開裂することを含む、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
液滴の１０％以下が２以上の細胞を含むように、細胞を含む複数の少なくとも約１０,０００微小流体液滴を提供し；
細胞を複数の液滴内で溶解して核酸を細胞から遊離させ；そして
液滴特異的バーコードで遊離核酸を一意的に標識することを含む、
方法。
【請求項１３２】
液滴の１０％以下が２以上の細胞を含むように細胞含有液滴を提供し；
細胞を複数の液滴内で溶解して核酸を細胞から遊離させ；そして
少なくとも１０,０００の区別可能なバーコードのプールから選択されたバーコードで遊離核酸を一意的に標識することを含む、
方法。
【請求項１３３】
オリゴヌクレオチドを複数の粒子に結合し；
第一バーコードの所定のプールから選択された第一バーコードを用いてオリゴヌクレオチドを酵素的に伸長し；そして
第二バーコードの所定のプールから選択された第二バーコードを用いてオリゴヌクレオチドを酵素に伸長させることを含む、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国仮出願６１／９８２,００１号(２０１４年４月２１日出願)、米国仮出願６２／０６５,３４８(２０１４年１０月１７日出願)、米国仮出願６２／０６６,１８８号(２０１４年１０月２０日出願)および米国仮出願６２／０７２,９４４号(２０１４年１０月３０日出願)に基づく優先権を主張する。これらの各々を引用により本明細書に包含させる。
【０００２】
政府資金
本発明は、国立衛生研究所に出された助成金番号R21DK098818の下の政府支援によりなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
分野
本発明は、一般に微小フルイディクスおよび標識核酸に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
後生動物の生理の多くは、構成細胞の遺伝子発現の時間的および空間的多様性に反影される。この多様性のいくぶんかは安定であり、我々が成体細胞型ならびに多数の発達過程における中間細胞型を定義するのに役立っている。他の多様性は、細胞周期、細胞微小環境の変化、発達、加齢および感染のような動的生理学的事象に起因する。さらに他の発現変化は天然で確率論的であると考えられ、重要な結果を有し得る。発達過程における遺伝子発現および生理を理解するために、全細胞においてＲＮＡレベルだけでなく、タンパク質レベルでも遺伝子発現をマッピングし、さらに翻訳後修飾をモニターすることが生物学者の夢である。
【０００５】
ＲＮＡ配列分析(ＲＮＡ−Ｓｅｑ)のために今日利用可能な方法は、卓越した感度で細胞集団のＲＮＡ分子の存在量を定量する能力を有する。ある相当な努力で、これらの方法は単一細胞における含有ＲＮＡの分析に利用されている。律速であるのは、詳細なＲＮＡ配列決定のための大量の個々の細胞を単離し、処理する効果的な方法であり、定量的にそれを行う方法である。これは、特に臨床サンプルの場合、望ましくは、最小の細胞損失で、均一条件下で細胞を単離することを必要とする。細胞数、対象領域の詳細およびＲＮＡ存在量測定精度に対する要求は、材料を得る難しさ、材料の特有性、細胞集団の複雑さおよび遺伝子発現空間において細胞が多様化している程度のような因子を含む、実験的考察による。大容量単一細胞トランスクリプトームデータが欠けている現状では、必要な対象領域の詳細だけでなく、細胞周期および確率的影響のような不均一性の他の独立したドライバーと組み合わせて、潜在腫瘍細胞または組織幹細胞亜集団のような目的の集団における稀な細胞型の存在を知ることも困難であることは、多数の細胞を分析する必要性を示唆する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＲＮＡ−ｓｅｑによるＲＮＡ存在量分析は十分確立されているが、単一細胞ＲＮＡ−Ｓｅｑの精度は、その酵素工程の効率に、バルクアッセイよりはるかに高感度であり、さらに単一細胞からのＰＣＲまたは線形増幅の必要性は、相当な誤差が生じる危険がある。細胞を数千または数万でさえ並行処理することおよびほぼ全ての細胞が測定されるように効率的に細胞の小サンプルを処理することに大きな障壁がある。ここ１０年で、微小フルイディクスが、これらの困難に立ち向かう可能性を有する単一細胞試験のための有望なテクノロジーとして出現している。しかし、微小流体チップで現在処理できる単一細胞の数は、一度に７０〜９０細胞に留まり、運転費用および細胞を分析のために生存状態に維持し得る時間的制限が、大量細胞の分析に制約を加えている。さらに、微小流体チャンバーへの細胞の捕獲効率はしばしば低く、利用可能な細胞数が限定されている稀なサンプルまたは臨床サンプルで問題となる可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
要約
本発明は、一般に微小フルイディクスおよび標識核酸に関する。本発明の主題は、ある場合、相互に関連する製品、特定の問題の代替解決案および／または１以上のシステムおよび／または物品の多数の異なる使用を含む。
【０００８】
ある面において、本発明は、一般に物品に関する。ある態様において、物品は、複数の少なくとも微小流体１０液滴を含み、液滴の各々は核酸フラグメントを含む細胞溶解物を含む。ある場合、複数の液滴内の核酸フラグメントは各々オリゴヌクレオチドタグに結合する。ある態様において、液滴内のあるオリゴヌクレオチドタグは、複数の液滴の他の液滴内のオリゴヌクレオチドタグと区別可能である。
【０００９】
物品は、他の態様において、複数の少なくとも１０の微小流体液滴を含み、液滴の各々は細胞溶解物を含む。ある態様において、液滴の少なくとも約９０％は１粒子のみを含む。ある場合、粒子は、それに共有結合したオリゴヌクレオチドを含む。
【００１０】
他の態様によって、物品は複数の粒子を含み、粒子の少なくとも約９０％がそれに共有結合したオリゴヌクレオチドを含み、オリゴヌクレオチドは少なくとも２プライマーサイトおよび少なくとも２バーコード領域を含む。ある態様において、粒子の少なくとも約９０％は、オリゴヌクレオチドのバーコード領域に基づき、複数の粒子の他の粒子から区別可能である。
【００１１】
ある態様において、物品は、複数の少なくとも１０,０００の微小流体液滴を含む。ある態様において、細胞溶解物を含む液滴の少なくともいくつかは核酸フラグメントを含む。ある場合、液滴内の複数の核酸フラグメントはオリゴヌクレオチドタグに結合する。液滴内のオリゴヌクレオチドタグは、ある態様において、複数の１０,０００微小流体液滴の他の液滴内のオリゴヌクレオチドタグと区別可能である
【００１２】
物品は、他の態様において、複数の少なくとも１０,０００の微小流体液滴を含む。ある態様において、液滴の少なくともいくつかは細胞溶解物を含む。複数の１０,０００微小流体液滴の少なくとも約９０％は、ある場合、１粒子のみを含み得る。ある態様において、粒子はそれに共有結合したオリゴヌクレオチドを含み得る。液滴内のあるオリゴヌクレオチドは、種々の例で、複数の１０,０００微小流体液滴の他の液滴内のオリゴヌクレオチドと区別可能である。
【００１３】
他の面において、本発明は、一般に方法に関する。ある態様において、方法は、微小流体液滴内に細胞および粒子を封入し、粒子はそれに共有結合したオリゴヌクレオチドタグを含み、細胞から核酸を遊離させるために液滴内で細胞を溶解し、そして遊離核酸と液滴内のオリゴヌクレオチドタグを結合させる行為を含む。
【００１４】
方法は、他の態様において、細胞を含む複数の微小流体液滴を提供し(液滴の少なくとも約９０％は１細胞を含むかまたは細胞を含まない)、細胞から核酸を遊離させるために複数の微小流体液滴内で細胞を溶解し、そして核酸とオリゴヌクレオチドタグを結合する行為を含み、ここで、液滴の少なくとも約９０％についてである。ある場合、液滴内のあるオリゴヌクレオチドタグは、複数の液滴の他の液滴内のオリゴヌクレオチドタグと区別可能であり得る。
【００１５】
さらに他の態様によって、方法は、複数の粒子を提供し、第一オリゴヌクレオチドを、粒子の少なくとも約９０％がそれに共有結合した第一オリゴヌクレオチド１個のみを有するように複数の粒子に結合させ、ここで、第一オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０の一意的な第一オリゴヌクレオチドのプールから取られ、そして、第二オリゴヌクレオチドを、第一オリゴヌクレオチドの少なくとも約９０％がそれに共有結合した第二オリゴヌクレオチド１個のみを有するように第一オリゴヌクレオチドに結合させ、ここで、第二オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０の一意的な第二オリゴヌクレオチドのプールから取られる、行為を含む。
【００１６】
ある態様によって、方法は、細胞およびヒドロゲル微小球体または粒子を液滴内に封入し、ここで、ヒドロゲル微小球体または粒子は、それに結合したバーコード化核酸を有し、細胞からＲＮＡおよび／またはＤＮＡを遊離するために液滴内で細胞を溶解し、そしてＲＮＡおよび／またはＤＮＡとバーコード化核酸を酵素反応させる行為を含む。
【００１７】
方法は、他の態様において、液滴の１０％以下が２以上の細胞を含むように細胞含有液滴を提供し、細胞からＲＮＡおよび／またはＤＮＡを遊離するために複数の液滴内で細胞を溶解し、そして液滴特異的バーコードでＲＮＡおよび／またはＤＮＡを一意的に標識する行為を含む。
【００１８】
さらに他の態様によって、方法は、液滴の１０％以下が２以上の細胞を含むように細胞含有液滴を提供し、細胞からＲＮＡおよび／またはＤＮＡを遊離するために複数の液滴内で細胞を溶解し、そして少なくとも１０,０００のバーコードのプールから選択されたバーコードでＲＮＡおよび／またはＤＮＡを一意的に標識する行為を含む。
【００１９】
さらに別の態様において、方法は、核酸を運搬する複数の微小球体または粒子を提供し、微小球体または粒子にオリゴヌクレオチドを共有結合させ、所定の第一バーコードのプールからランダムに選択された第一バーコードでオリゴヌクレオチドを酵素的に伸長させ、そして所定の第二バーコードのプールからランダムに選択された第二バーコードでオリゴヌクレオチドを酵素的に伸長させる行為を含む。
【００２０】
ある態様において、方法は、複数の少なくとも１０,０００の微小流体液滴内に複数の細胞および複数の粒子を封入し、複数の粒子の少なくとも１０,０００の液滴が、複数の液滴の他の液滴に含まれるオリゴヌクレオチドタグと区別可能な１以上のオリゴヌクレオチドタグを含むように、少なくともいくつかがそれに共有結合したオリゴヌクレオチドタグを含み、細胞から核酸を遊離させるために液滴内で細胞の少なくともいくつかを溶解させ、そして遊離核酸と液滴の少なくともいくつか内のオリゴヌクレオチドタグを結合させることを含む。
【００２１】
他の態様において、方法は、細胞を含む複数の少なくとも１０,０００の微小流体液滴を提供し、複数の液滴の少なくとも約９０％は１細胞を含むかまたは細胞を含まず、細胞から核酸を遊離させるために複数の微小流体液滴内で細胞を溶解し、そして遊離核酸とオリゴヌクレオチドタグを結合させ、ここで、液滴の少なくとも約９０％について、液滴内のオリゴヌクレオチドタグは、複数の液滴の他の液滴内のオリゴヌクレオチドタグと区別可能である。
【００２２】
方法は、他の態様によって、細胞およびヒドロゲル微小球体または粒子を液滴内に封入し、ここで、ヒドロゲル微小球体または粒子はそれに結合したバーコード化核酸を有してよく、細胞から核酸を遊離させるために液滴内で細胞を溶解し、そして遊離核酸とバーコード化核酸を酵素的に反応させることを含む。
【００２３】
方法は、さらに他の態様によって、液滴の１０％以下が２以上の細胞を含むように、細胞を含む複数の少なくとも約１０,０００微小流体液滴を提供し、細胞から核酸を遊離させるために複数の液滴内で細胞を溶解し、そして液滴特異的バーコードで遊離核酸を一意的に標識することに関する。
【００２４】
さらに別の態様において、方法は、液滴の１０％以下が２以上の細胞を含むように細胞含有液滴を提供し、細胞から核酸を遊離させるために複数の液滴内で細胞を溶解し、そして少なくとも１０,０００の区別可能なバーコードのプールから選択されたバーコードで遊離核酸を一意的に標識することを含む。
【００２５】
方法は、他の態様において、液滴の１０％以下が２以上の細胞を含むように、細胞を含む複数の少なくとも約１０,０００微小流体液滴を提供し、細胞から核酸を遊離させるために複数の液滴内で細胞を溶解し、そして液滴特異的バーコードで遊離核酸を一意的に標識することを含む。
【００２６】
さらに別の態様において、方法は、液滴の１０％以下が２以上の細胞を含むように細胞含有液滴を提供し、細胞から核酸を遊離させるために複数の液滴内で細胞を溶解し、そして少なくとも１０,０００の区別可能なバーコードのプールから選択されたバーコードで遊離核酸を一意的に標識することを含む。
【００２７】
他の面において、本発明は、ここに記載する１以上の態様を製造する方法を含む。さらに他の面において、本発明は、ここに記載する１以上の態様を使用する方法を含む。
【００２８】
本発明の他の利点および新規特性は、添付する図面と合わせて考慮したとき、次の本発明の種々の非限定的態様の詳細な記載から明らかとなる。本明細書および引用により本明細書に引用により包含させる文献が矛盾するおよび／または不整合な開示を含むとき、本明細書が支配する。引用により本明細書に包含させる２以上の文献が互いに矛盾するおよび／または不整合な開示を含むとき、発効日が遅い文献が支配する。
【００２９】
図面の簡単な記載
本発明の非限定的態様を、図式的であり、正寸であることを意図しない添付する図面を参照して、例示により説明する。図面において、記載される各々同一のまたはほぼ同一の成分は、一般に一つの数字で表す。明確さを目的として、全図において全ての成分にラベルを付さず、当業者に本発明を理解させるのに説明が必要でないとき、本発明の各態様の全成分を示していない。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、本発明のある態様に従うフローチャートを記載する。
【図２】図２Ａ〜２Ｂは、本発明の他の態様における微小流体デバイスを記載する。
【図３】図３は、本発明のさらに他の態様における液滴内の細胞および粒子を記載する。
【図４】図４は、本発明のさらに別の態様における液滴内に細胞および粒子を含む微小流体チャネルを記載する。
【図５】図５は、本発明のある態様における収集時間の関数としてのサンプル総計を記載する。
【図６】図６は、本発明の他の態様における読込み配列の分布を記載する。
【図７】図７は、本発明のさらに他の態様におけるオリゴヌクレオチドタグの産生を記載する。
【図８】図８は、本発明の他の態様における微小流体デバイスを記載する。
【図９】図９Ａ〜９Ｂは、本発明のさらに他の態様におけるオリゴヌクレオチドタグを含む粒子を記載する。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｃは、本発明のさらに別の態様における液滴に含まれる伸長オリゴヌクレオチドタグを記載する。
【図１１】図１１は、本発明の他の態様におけるＤＮＡフラグメントの配列決定を記載する。
【図１２】図１２は、本発明の他の態様による、液滴サイズの関数としての逆転写効率を記載する。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｈは、本発明のある態様における数千の細胞をＤＮＡバーコーディングするための微小流体液滴を記載する。
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｇは、本発明の他の態様による、液滴完全性およびランダムバーコーディングを記載する。
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｇは、本発明のさらに他の態様におけるあるＥＳ細胞集団の不均一構造を記載する。
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｃは、本発明のさらに別の態様に従い作成した遺伝子相関ネットワークを記載する。
【図１７】図１７Ａ〜１７Ｈは、本発明のさらに他の態様におけるＥＳ細胞区別における一時的不均一性および集団構造を記載する。
【図１８】図１８は、本発明の他の態様における微小流体デバイスを記載する。
【図１９】図１９Ａ〜１９Ｂは、本発明のさらに他の態様におけるある微小流体デバイスを記載する。
【図２０】図２０Ａ〜２０Ｃは、本発明のさらに別の態様における粒子のためのオリゴヌクレオチドタグの合成を記載する。
【図２１】図２１Ａ〜２１Ｈは、本発明のある態様におけるＤＮＡの定量化を記載する。
【図２２】図２２Ａ〜２２Ｅは、本発明の他の態様におけるランダムバーコーディングおよび一意的な分子識別子(ＵＭＩ)フィルタリングを記載する。
【図２３】図２３Ａ〜２３Ｄは、本発明のある態様におけるｍＥＳ細胞の単一細胞遺伝子発現を記載する。
【図２４】図２４Ａ〜２４Ｇは、本発明の他の態様におけるｍＥＳ細胞集団の構造を記載する。
【図２５】図２５は、本発明のさらに別の態様における、主要遺伝子のｔＳＮＥ地図を記載する。
【図２６】図２６は、表２を示す。
【図２７】図２７は、本発明の他の態様における微小流体デバイスを記載する。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
詳細な記載
本発明は、一般に微小フルイディクスおよび標識核酸に関する。例えば、ある面は、一般に微小流体液滴内の核酸を標識するシステムおよび方法に関する。ある態様において、核酸は、例えば、核酸が纏めてプールされた後でも、液滴内の核酸を他の液滴内のものと区別するのに使用できる“バーコード”または一意的な配列を含み得る。ある場合、一意的な配列は、粒子を使用して、個々の液滴に取り込まれ、液滴内に含まれる核酸(例えば、溶解細胞から遊離された)に結合し得る。ある場合、バーコードは、例えば、異なる細胞または他の源から生じる、数十、数百または数千もの核酸の区別に使用できる。
【００３２】
本発明のある面は、一般にオリゴヌクレオチドタグを有する核酸を微小流体液滴または他の適当な区画に包含または封入し、それらを互いに共有結合させるシステムおよび方法に関する。ある場合、核酸は溶解細胞または液滴内の他の物質から生じ得る。液滴内のあるオリゴヌクレオチドタグは、他の液滴、例えば、複数の液滴または液滴集団内のオリゴヌクレオチドタグから区別可能である。例えば、オリゴヌクレオチドタグは、種々の液滴間で異なる１以上の一意的な配列または“バーコード”を含んでよく、従って、各液滴内の核酸は、核酸と結合したバーコードの決定により一意的に特定され得る。例えば、配列決定または他の分析のために、例えば、液滴が“破壊”され、その後異なる液滴からの核酸が実質的に一緒に組み合わされまたは混合されるならば、これは重要であり得る。
【００３３】
ある態様において、オリゴヌクレオチドタグは、最初にオリゴヌクレオチドタグを粒子(例えば、ヒドロゲルまたは高分子粒子)に結合させ、次いで粒子が液滴に取り込まれた後、粒子からそれらを実質的に遊離させることにより、液滴に取り込まれる。粒子は、ある場合、他の区別可能なオリゴヌクレオチドタグを有する他の粒子に対して、粒子の大部分または全てが唯一の一意的に区別可能なオリゴヌクレオチドタグを有するように、製造され得る。粒子が液滴内に１粒子／液滴(またはそれ未満)の密度で存在するならば、オリゴヌクレオチドタグが粒子から遊離されたら、液滴の大部分または全てが一つの一意的なオリゴヌクレオチドタグを含み(または一意的なオリゴヌクレオチドを含まない)、従って、各液滴(およびその中に含まれる核酸)が一意的に特定されることを可能とする。
【００３４】
次に、図１に関して、本発明のある面の一例をここで提供する。しかしながら、これは単なる例示であることは理解されるべきであり、他の例および本発明の態様は、下にさらに詳細に議論される。図１の非限定的例において、細胞集団１０を、例えば、そのＤＮＡの配列決定、少なくとも細胞のいくつかに存在することが疑われ得るあるタンパク質または遺伝子の特定、そのｍＲＮＡまたはトランスクリプトームの決定などにより分析することが望まれる。細胞が本例では核酸物質の源として使用されているが、これは単なる例であり、他の態様において、核酸を、他の源からまたは他の技術を使用して液滴に導入し得る。
【００３５】
細胞は、まず、一連の微小流体液滴４０に封入され得る。当業者は、微小流体液滴内に細胞を封入する技術を知っており、例えば、各々引用により本明細書に包含させる、米国特許７,７０８,９４９号、８,３３７,７７８号、８,７６５,４８５号または国際ＰＣＴ出願公開ＷＯ２００４／０９１７６３号およびＷＯ２００６／０９６５７１号を参照のこと。ある場合、細胞は、１細胞／液滴未満の(そしてある場合、１細胞／液滴よりはるかに少ない)密度で封入され、液滴の大部分または全てが、その中に細胞を含まないか１個のみを含むことを確実とする。従って、図１に示すように、液滴４１、４２、４３...の各々は、その中に存在する細胞を有しないか、１個のみ有する。
【００３６】
粒子３０上に存在するオリゴヌクレオチドタグ２０も液滴に封入される。粒子３０は、例えば、微粒子であってよく、ヒドロゲルもしくは高分子粒子またはここに記載するような他のタイプの粒子であり得る。粒子および細胞は、同時にまたは逐次的に、任意の適当な順番で液滴内に封入され得る。ある態様において、各粒子は一意的なオリゴヌクレオチドタグを含むが、粒子上に存在するタグの複数コピーが存在してよい。例えば、オリゴヌクレオチドタグの各々は、存在する１以上の一意的な配列または“バーコード”を有し得る。従って、例えば、粒子３１はオリゴヌクレオチドタグ２１のコピーのみを含み、粒子３２はオリゴヌクレオチドタグ２２のコピーのみを含み、粒子３３はオリゴヌクレオチドタグ３３のコピーのみを含むなどとなる。ある場合、粒子は、液滴内に１粒子／液滴未満の(そして、ある場合、１粒子／液滴よりはるかに低い)密度で存在し、液滴の大部分または全てがその中に存在する粒子を有しないかまたは１個のみの粒子を有することを確実にする。さらに、ある態様において、オリゴヌクレオチドタグは、開裂可能であるか、他の方法で粒子から遊離可能であり得る。
【００３７】
本発明のある態様によって、オリゴヌクレオチドタグは、図１に示すように、各液滴への一つの一意的なオリゴヌクレオチドタグのみの導入を促進するために、まず粒子に結合されることは注意すべきである。(他の態様において、しかしながら、例えば、同じ一意的なバーコードを含む複数のオリゴヌクレオチドタグが存在し得る。)例えば、粒子が液滴に１粒子／液滴未満の密度で存在するならば、液滴の大部分または全ては、各々単一粒子のみを、そして、存在する単一タイプのオリゴヌクレオチドタグのみを有する。したがって、図１に示すように、オリゴヌクレオチドタグは、例えば、各液滴４１、４２、４３...が、他の液滴に存在し得る他のオリゴヌクレオチドタグと異なる、一意的なオリゴヌクレオチドタグ２１、２２、２３...を含むように、粒子から開裂されるかまたは他の方法で遊離され得る。従って、液滴内に存在する各オリゴヌクレオチドタグは、他の液滴に存在するオリゴヌクレオチドタグと区別可能である。粒子からオリゴヌクレオチドを開裂させるために図１では光(ｈｖ)を使用しているが、これは単なる例示の目的であり、例えば、ここに記載する、開裂または遊離の他の方法も使用できることは理解すべきである。例えば、ある態様において、オリゴヌクレオチドを含む(例えば、物理的に)アガロース粒子を使用してよく、例えば、アガロースが少なくとも一部液化するかまたは軟化するまでアガロースを加熱することにより、オリゴヌクレオチドが遊離され得る。
【００３８】
ある場合、細胞を、細胞から核酸または他の物質５１、５２、５３...を遊離するために溶解する。例えば、細胞を、化学物質または超音波を使用して溶解させ得る。細胞は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質、酵素などを遊離し得る。ある場合、遊離された核酸は、例えば、増幅法に特異的な適当な試薬を包含させることにより、所望により増幅させてよい。当業者に知られる増幅法の例は、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)、逆転写酵素(ＲＴ)ＰＣＲ増幅、インビトロ転写増幅(ＩＶＴ)、多置換増幅(ＭＤＡ)または定量的実時間ＰＣＲ(ｑＰＣＲ)を含むが、これらに限定されない。
【００３９】
核酸または他の物質５１、５２、５３...のいくつかまたは全てを、例えば、共有結合により、液滴に存在するオリゴヌクレオチドタグと結合させ得る。例えば、核酸または他の物質５１、５２、５３を、液滴に存在するオリゴヌクレオチドタグにライゲートまたは酵素結合し得る。従って、図１に示すように、液滴４１は、オリゴヌクレオチドタグ２１に結合した核酸５１を示し、液滴４２はオリゴヌクレオチドタグ２２に結合した核酸５２を示し、液滴４３はオリゴヌクレオチドタグ２３に結合した核酸５３を示すなどする。従って、各液滴内の核酸は、この例において各液滴に一意的であるオリゴヌクレオチドタグを手段として、複数の液滴５０の他の液滴内の核酸と区別可能である。
【００４０】
図１は、細胞の溶解後の粒子からのオリゴヌクレオチドタグの開裂を記載しているが、他の態様において、これらは必ずしもこの順番で起こる必要はないことは理解すべきである。例えば、細胞溶解は開裂後に起きてよく、または両者は同時に起きてよい。
【００４１】
液滴４１、４２、４３...は、その後“破裂”または“破壊”してその内容物を遊離し、ある場合、図１に示すように、各液滴に存在する核酸は、組み合わされまたは一緒にプールされ得る。しかしながら、核酸が異なるオリゴヌクレオチドタグにより標識されているため、一つの液滴からの(すなわち、一つの細胞からの)核酸は、オリゴヌクレオチドタグを使用して、なお他の液滴(または他の細胞)と区別できる。したがって、その後の核酸の組み合わせたプールの分析(例えば、配列決定)を実施でき、各核酸(例えば、個々の細胞)の源を、異なるオリゴヌクレオチドタグの決定により決定し得る。
【００４２】
従って、例えば、正常細胞と癌細胞の集団(例えば、組織サンプルまたは生検由来)をこのような形式で分析でき、癌細胞を、正常細胞が豊富に存在してさえ、異常ＤＮＡとして特定できる。例えば、オリゴヌクレオチドタグを使用して細胞レベルでＤＮＡを追跡する能力により、異常ＤＮＡは、大量の正常ＤＮＡが数で勝ってさえなお特定できる。他の非限定的例として、幹細胞を正常細胞から単離できまたは目的の集団における稀な細胞型の単離を実施できる。
【００４３】
他の面において、本発明は、例えば、細胞集団のプロファイリングの目的でまたはここに記載するような他の目的で、多数の細胞からＤＮＡまたはＲＮＡの並行捕獲およびバーコーディングをするシステムおよび方法を提供する。ある態様において、これは、例えば、細胞および／またはＲＮＡおよび／またはＤＮＡ捕獲および／または増幅に使用し得る他の試薬と共に粒子または微小球体(例えば、ヒドロゲルまたはポリマー微小球体)に結合した、バーコード化核酸または他の適当なオリゴヌクレオチドタグの封入に依存する。
【００４４】
ある態様において、実質的に各個々の細胞から生じる内容物を、例えば、集団の細胞間の不均一性を決定または規定するまたは細胞集団をスクリーニングするなどのために、例えば、ある場合数百、数千、数万または数十万またはそれ以上の異なる細胞を単実験においてバーコードまたは他に標識することを可能にする一意的なバーコード(これは無作為に決定してよくまたはここに記載するように決定する)で標識し得る。他の目的はここに記載されている。
【００４５】
ある態様において、微小流体システムを、例えば、一反応容器中、個々の液滴(例えば、５０pL〜１０nL体積)内に単一細胞を捕獲するために使用する。各細胞を溶解し、そのＲＮＡおよび／またはＤＮＡを、例えば、酵素反応を介して、ライゲーションを介してなど、液滴特異的バーコードで一意的にバーコード化または標識し得る。これら以外の寸法を有するものを含む、微小流体システムの例もここに提供する。ある態様も、例えば、最初に細胞をＤＮＡタグ付抗体で処理することにより、ＲＮＡまたはＤＮＡと並行して単一細胞におけるタンパク質存在量を定量するために、ある態様において使用されるはずであり、この場合、ＤＮＡタグは、液滴特異的バーコードで同様にバーコード化できる。液滴中の細胞成分がバーコード化されたら、液滴を破壊または破裂してよく、サンプルを、ハイスループット配列決定または他の適用のために、例えば、大量に、処理できる。配列決定後、ＤＮＡバーコードによってデータを分けるかまたは他に分析できる。
【００４６】
単一細胞におけるＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ抗体タグの並行バーコーディングを実施するために、単一ヒドロゲルまたはポリマー粒子または微小球体を、ある態様によって、生物学的または化学的試薬および細胞と共に各液滴に封入し得る。高濃度(例えば１〜１００μM)のＤＮＡフラグメント(以後“プライマー”)を運搬する粒子または微小球体は、(ａ)同じバーコードが粒子または微小球体上の全核酸フラグメントに見られるとの条件付で、例えば、少なくとも１０,０００のバーコード(または少なくとも３０,０００バーコード、少なくとも１００,０００バーコード、少なくとも３００,０００バーコードまたは少なくとも１,０００,０００バーコードなど)のプールからランダムに選択されたバーコード配列をコードする；および／または(ｂ)ＤＮＡまたはＲＮＡのハイブリダイゼーションおよび捕獲に使用される１以上のプライマー配列をコードする。異なるバーコーの数は、２以上の細胞が、同じバーコードを運搬する粒子または微小球体を有する異なる液滴で占拠される可能性を減らすために、捕獲する細胞の数より、少なくとも１０倍、ある場合少なくとも１００倍多くてよい。例えば、１５０,０００バーコードおよび１,０００細胞で、平均３細胞のみが重複するバーコードを獲得する(９９７の検出バーコードをもたらす)。
【００４７】
ある態様において、液滴が１粒子(または微小球体)および１細胞を含むような封入条件を存在する。空液滴および／または単一粒子を有するが細胞がない液滴および／または細胞を有するが粒子がない液滴の存在は、実質的に性能に影響し得ない。しかしながら、一液滴中の２以上の粒子または２以上の細胞存在は、制御が困難な誤差をもたらし得て、したがって、このような事象の発生率は、ある場合において最小に、例えば、約１０％未満または約５％未満に維持する。細胞および粒子を除いて、他の生物学的および化学的試薬は、液滴に等しく分布され得る。共封入された細胞および粒子を、特定の適用の目的により、収集し、処理し得る。例えば、ある特定の態様において、単一細胞のＤＮＡまたはＲＮＡを、粒子と共に導入したプライマーにより捕獲し、次いで、逆転写または他のＤＮＡ重合反応によりバーコード化相補的ＤＮＡに変換し得る。
【００４８】
精製および任意のＤＮＡ増幅後、細胞核酸の塩基組成およびバーコード同一性を、例えば、配列決定または他の技術により決定し得る。あるいは、ある態様において、粒子または微小球体と共に導入したプライマーを、ゲノムからの特異的核酸配列の増幅に使用できる。
【００４９】
ある態様において、例えば、液滴中の酵素反応の開始の効率を改善するために、粒子または微小球体を使用して導入したバーコード化プライマーを、例えば、光、化学物質、酵素または他の技術によりそこから開裂し得る。しかしながら、プライマーの開裂は任意の工程または時点で実施してよく、ある場合使用者により決定され得る。このような開裂は、ある状況および／または条件において特に重要であり得て、例えば、単一細胞におけるＲＮＡおよびＤＮＡ分子のあるフラクションは、極めて大きく、または複雑に結合しており、それゆえに、粒子または微小球体の表面または内部に効率的に拡散しない。しかしながら、他の態様において、開裂は必須ではない。
【００５０】
これらのような技術を使用して、例えば、ゲノム、一塩基多型、特異的遺伝子発現レベル、非コードＲＮＡ、全トランスクリプトーム(またはその一部)、遺伝子全体またはそれらのセクションなどを分析できる。しかしながら、本発明は、これらの適用にのみ限定されない。
【００５１】
ある非限定的態様において、バーコード化プライマーの３’末端を、全トランスクリプトームプロファイリングのために細胞ｍＲＮＡを捕獲するのに使用し得るポリＴ配列で終了させる。全ての細胞を合わせた得られたライブラリーを、所望によりＰＣＲベースの方法を使用してまたはハイブリダイゼーション捕獲ベースの方法(例えばAgilent SureSelect)を使用して富化し、例えば、目的の遺伝子のサブセットのみの配列決定を可能とし得る。他の態様において、バーコード化プライマーの３’末端を、細胞内のＲＮＡの捕獲に使用できるランダムＤＮＡ配列で終了させ得る。他の態様において、バーコード化プライマーの３’末端を、例えば、目的のＤＮＡまたはＲＮＡ種(“遺伝子”)の捕獲または例えば、酵素試薬と共に、粒子または微小球体に加えて液滴に送達されたＤＮＡプローブとハイブリダイズするために、特異的ＤＮＡ配列で終了させ得る。他の態様において、粒子または微小球体は、目的の数遺伝子を標的とするために、多数の異なるプライマーを運搬し得る。さらに別の態様は、液滴サイズおよび液滴バーコーディングに必要な反応成分の濃度の最適化に関する。
【００５２】
本発明のさらに別の面は、一般に粒子または微小球体に結合したバーコード化核酸の製造に関する。核酸を粒子または微小球体の表面に結合してよく、またはある場合、粒子内に結合させてまたは取り込ませてよい。例えば、核酸を、例えば、物理的および／または化学的に、粒子の形成中に粒子内に取り込ませ得る。
【００５３】
例えば、ある態様は、一般に核酸フラグメント(各々バーコード、プライマーおよび／または核酸の捕獲、増幅および／または配列決定に恐らく使用される他の核酸をコードする)を運搬する粒子または微小球体の製造に関する。微小球体は、１〜５００μmサイズまたはここに記載するような他の寸法のヒドロゲル粒子(ポリアクリルアミド、アガロースなど)またはコロイド粒子(ポリスチレン、磁性またはポリマー粒子など)と称し得る。微小球体は、ある態様において多孔性であり得る。使用できる他の適当な粒子または微小球体は、ここにさらに詳細に記載する。
【００５４】
ＤＮＡ運搬粒子または微小球体の製造は、ある場合、最初のＤＮＡオリゴヌクレオチドの粒子または微小球体への共有結合または取り込みの他の技術と、続く所定のプールから、例えば、無作為に、選択された１以上のバーコードによる各オリゴヌクレオチドの酵素伸長に依存し得る。可能な一意的なバーコードの最終的な数は、ある場合所定のバーコードプールのサイズおよび／または伸長工程の数に依存し得る。例えば、３８４の所定のバーコードのプールおよび２伸長工程を使用して、各粒子または微小球体は、３８４２＝１４７,４５６の可能なバーコードの一つを運搬し、３伸長工程を使用して、各粒子または微小球体は３８４３＝５６,６２３,１０４の可能なバーコードの一つを運搬する他の。他の多数の工程もある場合使用でき、さらに、各プールは、多様な数の所定のバーコード(３８４のみではない)を有し得て、これらプールは、同一または異なる数の所定のバーコードを有し得る。プールは同一および／または異なる配列を含み得る。
【００５５】
したがって、ある態様において、使用する可能なバーコードは、バーコード要素の１以上の別々の“プール”から形成され、これを、その後、例えば、スプリット・アンド・プール法を使用して結合して最終バーコードを産生する。プールは、例えば、少なくとも約３００、少なくとも約５００、少なくとも約１,０００、少なくとも約３,０００、少なくとも約５,０００または少なくとも約１０,０００の区別可能なバーコードを含み得る。例えば、第一プールはｘ１要素を含んでよく、第二プールはｘ２要素を含んでよく、第一プールからの要素および第二プールからの要素を含むバーコードを形成し、使用できる、例えば、ｘ１ｘ２の可能なバーコードを産生し得る。ｘ１およびｘ２は等しくても等しくなくてもよいことは注意すべきである。この工程を任意の数繰り返してよく、例えば、バーコードは、第一プール、第二プールおよび第三プールからの要素(例えば、ｘ１ｘ２ｘ３の可能なバーコードを産生)または第一プール、第二プール、第三プールおよび第四プールからの要素(例えば、ｘ１ｘ２ｘ３ｘ４の可能なバーコードを産生)を含んでよいなどである。５、６、７、８または任意の他の適当な数のプールが存在し得る。したがって、組み合わせの可能な数により、はるかに多い数の区別可能なバーコードを産生するために、比較的小数のバーコード要素を使用し得る。
【００５６】
ある場合、複数のプールのこのような使用は、組み合わせて、多数のバーコードを個々に製造および合成することなく、実質的に多数の使用可能なバーコードの製造に使用し得る。例えば、多くの先行技術システムにおいて、１００または１,０００バーコードに対する要求は、１００または１,０００バーコードの個々の合成を必要とする。しかしながら、多数のバーコードが、例えば、試験する多数の細胞の試験に必要であるならば、対応して多数のバーコードを合成する必要性がある。このようなシステムは、１０,０００、１００,０００または１,０００,０００のバーコードのような多数では非実用的および実行不可能となる。しかしながら、バーコードの別々の“プール”の使用により、多数のバーコードが、各バーコードの個々の合成を必ずしも必要とせずに達成できる。非限定的例として、１,０００の区別可能なバーコード(または任意の他の適当な数)の第一プールおよび１,０００の区別可能なバーコードの第二プールを、２,０００バーコード(またはバーコードを各プールで再使用するならば１,０００のみ)の合成を必要とし、さらにそれらを組み合わせて１,０００×１,０００＝１,０００,０００の区別可能なバーコードを産生でき、例えば、ここで、各区別可能なバーコードは、第一プールから取った第一バーコードおよび第二プールから取った第二バーコードを含む。バーコードを構築するために３、４またはそれ以上のプールを使用して、合成が必要である区別可能なバーコードの総数を実質的に増加させることなく、製造し得るさらに多数のバーコードをもたらし得る。
【００５７】
ある面において、ＤＮＡフラグメントまたはオリゴヌクレオチドを、光、温度、化学物質および／または酵素処理を含む多様な技術を使用して、粒子または微小球体から遊離できる。例えば、光を用いて、核酸フラグメントを、選択した時点でおよび／または望ましい条件下に遊離でき、従ってその使用に柔軟性を提供する。
【００５８】
ある態様において、粒子または微小球体を長期間保存でき、その後の適用のための試薬として使用できる。
【００５９】
さらに他の面において、本発明は、例えば、細胞集団のプロファイリングの目的または他の目的のための、多数の単一細胞からの一団の数十〜数百またはそれ以上の特異的ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ配列の並行捕獲、バーコーディングおよび定量化のためのシステムおよび方法を提供する。ある態様は、細胞および／または例えば、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ捕獲および増幅のための、他の試薬と共に、例えば、ヒドロゲルまたはポリマー微小球体のような粒子に結合したバーコード化核酸の封入に依存し得る。
【００６０】
ある場合、一意的な、ランダムバーコードを有する個々の細胞に起因する特異的遺伝子セット(例えば、数十または数百の遺伝子またはある場合それ以上)の標識のためのシステムおよび方法は、数百、数千または数十万またはそれ以上の異なる細胞を、集団の細胞間の不均一性を決定するもしくは細胞集団をスクリーニングする目的でまたは他の目的で、例えば、一実験において、標識またはバーコード化することを可能とする。
【００６１】
例えば、多重化ハイスループット配列決定により多数の細胞を分析する状況において、ある態様において、全トランスクリプトームまたは全ゲノム捕獲および配列決定よりも、目的の遺伝子のサブセット、例えば数十〜数百の遺伝子に焦点を絞ることが望ましい可能性がある。
【００６２】
ある態様は、細胞ＤＮＡまたはＲＮＡの特異的配列に焦点を絞った細胞の内容物の並行バーコーディングに関する。これらは、例えば、ＤＮＡバーコード化微小球体(または他の粒子)の合成および／または例えば、一反応容器中、個々の液滴(例えば、５０pL〜１０nL体積またはここに記載する他の体積)中の単一細胞の捕獲およびバーコーディングのためのこのような微小球体の使用に関する。ある場合、実質的に各細胞を溶解し、そのＲＮＡおよび／またはＤＮＡを、例えば、酵素反応により、液滴特異的核酸バーコードで一意的にバーコード化(タグ付)する。ある態様において、ＤＮＡバーコード化微小球体の修飾を、目的の１配列の使用またはランダム配列の使用よりむしろ、それらが特定の一団のＤＮＡ配列のみを標的とするような方法で実施し得る。これは、高濃度の配列特異的バーコード化プライマーが各液滴に送達させることを可能とし、これは、ある場合、酵素バーコーディングを可能とし、相補的ＤＮＡの合成が、主に目的の配列に対して起こる。これは、例えば、一団の配列特異的プライマーを目的の遺伝子の捕獲に使用できるあらゆる酵素法と共に使用し得る。
【００６３】
本発明のある態様を、例えば、最初に細胞をＤＮＡタグ付抗体で処理することにより、ＲＮＡまたはＤＮＡと並行して単一細胞におけるタンパク質存在量を定量するのに使用でき、この場合、粒子または微小球体上の配列またはオリゴヌクレオチドの１以上を、抗体により送達されたＤＮＡタグに相補的とし得る。ある場合、液滴中の細胞成分がバーコード化されたら、液滴を破壊または破裂でき、サンプルを、例えば、大量に、ハイスループット配列決定のような適用のために処理できる。配列決定後、データを、ある態様において、ＤＮＡバーコードに従い分割して、従ってタイプ、配列、分子数、核酸起源および／または目的のタンパク質などに関する情報を提供する。
【００６４】
さらに別の面によって、本発明は、例えば、複数の微小流体デバイスの製造または微小流体デバイスに多数の試験サンプルを流すことが必要であるために、反応を直接試験することが極度に遅い場合、小体積内の細胞の酵素処理のための反応条件の最適化のために提供される。ある場合、これはまた小体積で溶解した単一細胞からの相補的ＤＮＡへのｍＲＮＡの酵素逆転写に必要な理想の体積も特異的に記載し得る。
【００６５】
本発明のある態様は、例えば、微小流体装置なしで、通常の分子生物学試薬を使用して実施できる５μlより大きな体積で反応物を使用する、単一細胞上の微小流体反応物を提供する。これは、ある適用、例えば、本発明以外では複数の試験微小流体デバイスの設計および合成ならびにこのようなデバイスの性能の対照比較を必要とするであろう、数桁を超える反応体積のようなパラメータの試験のために、有用であり得る。異なる反応成分の最適濃度のような、微小流体反応の条件の迅速な最適化のためにも有用であり得る。
【００６６】
ある態様において、微小流体体積に存在する正確な条件を模倣するために、バルク反応を使用する。これは一般的であり、微小流体反応または他の反応の他の面の最適化に適用できる。例えば、これは、逆転写(ＲＴ)反応の阻害を軽減する種々の添加剤の能力の試験に使用でき、ある態様において、小体積で溶解した単一細胞からＲＴ反応を実施するために必要なＤＮＡプライマー濃度を定義し得る。
【００６７】
上記は本発明の種々の態様の非限定的例である。しかしながら、他の態様も可能である。したがって、より一般的には、本発明の種々の面は、下記のとおり、微小流体液滴内の核酸を標識するシステムおよび方法の種々のシステムおよび方法に関する。
【００６８】
ある面において、本発明は、一般に液滴、例えば、微小流体液滴の集団内の核酸を標識するシステムおよび方法に関する。ある場合、微小流体液滴は、例えば、ここに記載するように、約１mm未満の液滴平均直径を有してよくおよび／または微小流体液滴は実質的に単分散であってよい。
【００６９】
ある場合、ＤＮＡおよび／または他の核酸を含むオリゴヌクレオチドタグを粒子に結合し、液滴に送達し得る。ある場合、オリゴヌクレオチドタグを、例えば、液滴が一般に最大でその中に１粒子を有するように、液滴への送達を制御するために粒子に結合する。ある場合、液滴内への送達により、オリゴヌクレオチドタグは、例えば、開裂、粒子分解などにより、粒子から除去され得る。しかしながら、他の態様において、液滴は、同一または異なるオリゴヌクレオチドタグを有し得る２、３または任意の他の数の粒子を含んでよいことは理解されるべきである。
【００７０】
オリゴヌクレオチドタグは任意の適当な長さであってよくまたは任意の適当な数のヌクレオチドを含んでよい。オリゴヌクレオチドタグは、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはＰＮＡのような他の核酸および／またはこれらの組み合わせおよび／または他の核酸を含み得る。ある場合、オリゴヌクレオチドタグは一本鎖であるが、他の場合二本鎖であり得る。例えば、オリゴヌクレオチドタグは、少なくとも約１０nt、少なくとも約３０nt、少なくとも約５０nt、少なくとも約１００nt、少なくとも約３００nt、少なくとも約５００nt、少なくとも約１０００nt、少なくとも約３０００nt、少なくとも約５０００nt、少なくとも約１０,０００ntなどの長さを有し得る。ある場合、オリゴヌクレオチドタグは、約１０,０００nt以下、約５０００nt以下、約３０００nt以下、約１０００nt以下、約５００nt以下、約３００nt以下、約１００nt以下、約５０nt以下などの長さを有し得る。これらの任意の組み合わせも可能であり、例えば、オリゴヌクレオチドタグは約１０nt〜約１００ntであり得る。オリゴヌクレオチドタグの長さは重大ではなく、種々の長さを種々の態様において使用し得る。
【００７１】
オリゴヌクレオチドタグは、多様な配列を含み得る。例えば、オリゴヌクレオチドタグは、１以上のプライマー配列、１以上の一意的なまたは“バーコード”配列、１以上のプロモーター配列、１以上のスペーサー配列などを含み得る。オリゴヌクレオチドタグはまた、ある態様において１以上の開裂可能スペーサー、例えば、光開裂可能リンカーを含み得る。オリゴヌクレオチドタグは、例えば、オリゴヌクレオチドタグが開裂により粒子から除去されるように、化学的に(例えば、リンカー)または物理的に(例えば、リンカーを必ずしも必要としない)粒子に結合し得る。他の例は、オリゴヌクレオチドタグの大部分を増加させる(例えば、特異的配列またはナンセンス配列を使用)、取り扱いを容易にする(例えば、タグはポリＡテイルを含み得る)、結合選択性を高める(例えば、下記のとおり)、酵素による認識を促進する(例えば、適当なリガーゼ)、特定を容易にするなどのために使用し得る部分である。これらのおよび／または他の配列の例は、ここにさらに詳細に記載する。
【００７２】
一例として、ある態様において、オリゴヌクレオチドタグは“バーコード”または一意的な配列を含み得る。配列は、オリゴヌクレオチドタグ(例えば、粒子上および／または液滴内に存在)のいくぶんかまたは大部分が一意的な配列(または一意的である配列の組み合わせ)を有するが、他のオリゴヌクレオチドタグ(例えば、他の粒子または液滴上)は一意的な配列または配列の組み合わせを含まないように選択し得る。従って、例えば、配列を、液滴または液滴(例えば、溶解細胞)に起因する含まれる核酸を一意的に特定するかまたは他の液滴もしくは他の液滴に起因する他の核酸(例えば、他の細胞から遊離)と区別するために使用する。
【００７３】
配列は任意の適当な長さであり得る。バーコード配列の長さは重大ではなく、バーコード配列を他のバーコード配列と区別するのに十分な任意の長さであり得る。１、２またはそれ以上の“バーコード”配列がオリゴヌクレオチドタグに存在し得る。バーコード配列は５nt、６nt、７nt、８nt、９nt、１０nt、１１nt、１２nt、１３nt、１４nt、１５nt、１６nt、１７nt、１８nt、１９nt、２０nt、２１nt、２２nt、２３nt、２４ntまたは２５ntの長さを有し得る。２５を超えるヌクレオチドもある場合存在し得る。
【００７４】
ある場合、一意的なまたはバーコード配列は、可能なバーコード配列の“プール”からとり得る。１を超えるバーコード配列がオリゴヌクレオチドタグに存在するならば、バーコード配列を、可能なバーコード配列の同一または異なるプールからとり得る。配列のプールは、適当な技術を使用して、例えば、無作為にまたは、例えば、バーコード配列の読取におけるエラーが検出でき、ある場合、補正できるように、一定距離(例えば、ハミング距離)離すことにより、配列がエラー検出および／または補正を可能とするように選択し得る。プールは、任意の数の可能なバーコード配列、例えば、少なくとも１００、少なくとも３００、少なくとも５００、少なくとも１,０００、少なくとも３,０００、少なくとも５,０００、少なくとも１０,０００、少なくとも３０,０００、少なくとも５０,０００、少なくとも１００,０００、少なくとも３００,０００、少なくとも５００,０００または少なくとも１,０００,０００バーコード配列を含み得る。
【００７５】
ある場合、オリゴヌクレオチドタグは、例えば、タグの産生を可能にする、酵素増幅を可能にするなどのために、１以上のプロモーター配列を含み得る。当業者は、プライマー配列、例えば、Ｐ５またはＰ７を知っている。多くのこのようなプライマー配列が市販されている。プロモーターの例は、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーターまたはＳＰ６プロモーターを含むが、これらに限定されない。
【００７６】
ある場合、オリゴヌクレオチドタグは１以上のプライマー配列を含み得る。一般に、プライマーは、一本鎖または部分的に二本鎖核酸(例えば、ＤＮＡ)であり、これは核酸合成の出発点として働き、核酸ポリメラーゼのようなポリメラーゼ酵素がプライマーを伸長させ、相補鎖を複製することを可能とする。プライマーは、標的核酸に相補的であり、かつハイブリダイズする。ある態様において、プライマーは合成プライマーである。ある態様において、プライマーは天然に存在しないプライマーである。プライマーは、一般に１０〜５０ヌクレオチドの長さを有する。例えば、プライマーは、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２０、２５〜５０、１５〜４０、１５〜３０、２０〜５０、２０〜４０または２０〜３０ヌクレオチドの長さを有し得る。ある態様において、プライマーは１８〜２４ヌクレオチドの長さを有する。プライマーの例は、Ｐ５プライマー、Ｐ７プライマー、ＰＥ１プライマー、ＰＥ２プライマー、Ａ１９プライマーまたはここに記載する他のプライマーを含むが、これらに限定されない。
【００７７】
ある場合、オリゴヌクレオチドタグは、例えば、オリゴヌクレオチドタグの質量またはサイズを増加させるためのナンセンスまたはランダム配列を含み得る。ランダム配列は、任意の適当な長さであってよく、１以上が存在し得る。非限定的例として、ランダム配列は、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２０、２５〜５０、１５〜４０、１５〜３０、２０〜５０、２０〜４０または２０〜３０ヌクレオチドの長さを有し得る。
【００７８】
ある場合、オリゴヌクレオチドタグは、遺伝子または他のエンティティに特異的に結合できる１以上の配列を含み得る。例えば、ある態様において、オリゴヌクレオチドタグはｍＲＮＡを認識できる配列、例えば、ポリＴ配列(例えば、一列で数Ｔ、例えば、４、５、６、７、８またはそれ以上のＴ)を含むものを含み得る。
【００７９】
ある態様において、オリゴヌクレオチドタグは、例えば、適当な刺激の適用により開裂可能な、１以上の開裂可能リンカーを含み得る。例えば、開裂可能配列は、光または適当な化学物質または酵素の適用により開裂され得る、光開裂可能リンカーであり得る。光開裂可能リンカーの非限定的例は、図２０Ａに見ることができる。ある場合、例えば、複数の粒子(例えば、表面上にオリゴヌクレオチドタグを含む)を製造し、例えば、ある場合、平均、各液滴が１粒子またはそれ未満(またはそれ以上)を含むように、液滴に添加し得る。液滴に添加された後、オリゴヌクレオチドタグは、オリゴヌクレオチドタグを溶液中に、すなわち、液滴内部に存在させるために、例えば、光または他の適当な開裂技術を使用して、粒子から開裂させ得る。このような方法で、オリゴヌクレオチドタグは、ある態様において、粒子の液滴への充填により液滴に容易に充填され、次いで開裂されて、例えば、ヌクレオチドまたはここに記載するような他の種と相互作用するように、オリゴヌクレオチドタグを溶液に存在させることができる。
【００８０】
さらに、ある態様において、オリゴヌクレオチドタグは、例えば、細胞(または液滴)に存在することが疑われるタンパク質と特異的に結合できる、抗体を含み得る。例えば、液滴は、１以上のここに記載のようなオリゴヌクレオチドタグでタグ付された抗体を含み得る。
【００８１】
オリゴヌクレオチドタグは、例えば、ここに記載するように、粒子に結合し得る。ある態様において、粒子はオリゴヌクレオチドタグを１個だけ含み得るが、オリゴヌクレオチドタグの複数コピーが粒子上に存在してよく、他の粒子は例えば、ここに記載するバーコード配列を使用して、区別可能である異なるオリゴヌクレオチドタグを含み得る。
【００８２】
適当な方法のいずれかを使用して、オリゴヌクレオチドタグを粒子に結合してよい。正確な結合法は重大ではなく、例えば、化学的でも物理的でもよい。例えば、オリゴヌクレオチドタグは、ビオチン−ストレプトアビジン結合、アミノ結合またはアクリル系ホスホラミダイト結合により粒子に共有結合し得る。例えば、アクリル系ホスホラミダイト結合の例として図２０Ａを参照のこと。他の態様において、オリゴヌクレオチドは、例えば、物理的に、粒子に取り込まれ得て、そこで、オリゴヌクレオチドは、粒子を改変することにより遊離され得る。従って、ある場合、オリゴヌクレオチドは開裂可能結合を有する必要はない。例えば、ある態様において、オリゴヌクレオチドは、粒子の形成により、アガロース粒子のような粒子に取り込まれ得る。粒子の分解により(例えば、粒子を軟化、分解または液化するまで加熱することにより)、オリゴヌクレオチドは粒子から遊離され得る。
【００８３】
粒子は、本発明のある面において微小粒子である。粒子は、多種多様なタイプのいずれであってもよく、記載のように、粒子を、液滴に特定のオリゴヌクレオチドタグに導入するのに使用でき、オリゴヌクレオチドタグが(例えば、物理的または化学的に)結合できるあらゆる適当な粒子を使用し得る。粒子の正確な形は重大ではない。粒子は、球形でも非球形でもよく、任意の適当な材料製であり得る。ある場合、実質的に同じ組成および／または実質的に同じ平均直径を有する複数の粒子を使用する。複数のまたは一連の粒子の“平均直径”は、粒子の各々の平均直径の算術平均である。当業者は、例えば、レーザー光散乱、顕微鏡検査または他の既知技術を使用して、複数のまたは一連の粒子の平均直径(または他の特徴的寸法)を決定できる。非球形粒子の、単一粒子の平均直径は、非球形粒子と同じ体積を有する完全な球形の直径である。粒子(および／または複数のまたは一連の粒子)の平均直径は、ある場合、例えば、約１mm未満、約５００μm未満、約２００μm未満、約１００μm未満、約７５μm未満、約５０μm未満、約２５μm未満、約１０μm未満または約５μm未満であり得る。平均直径はまた、ある場合、少なくとも約１μm、少なくとも約２μm、少なくとも約３μm、少なくとも約５μm、少なくとも約１０μm、少なくとも約１５μmまたは少なくとも約２０μmであり得る。
【００８４】
粒子は、ある態様において、ヒドロゲル粒子であり得る。例えば、ＤＮＡ含有ヒドロゲル粒子を含む、ヒドロゲル粒子の例について、“液滴を含むアッセイおよび他の反応”なる名称の国際特許出願公開ＷＯ２００８／１０９１７６号(引用により本明細書に包含させる)参照。ヒドロゲルの例は、ポリアクリルアミド、ポリＮ−イソプロピルアクリルアミドまたはポリＮ−イソプロピルポリアクリルアミドのようなアガロースまたはアクリルアミドベースのゲルを含むが、これらに限定されない。例えば、単量体水溶液を液滴に分散させ、次いで、例えば、ゲルを形成するために、重合化し得る。他の例は、カルシウムイオンの添加によりゲル化できる、アルギン酸のようなヒドロゲルである。ある場合、例えば、各々、その全体を引用により本明細書に包含させる、米国特許公開２００７／０００３４２号として２００７年１月４日公開の、Link, et al.の“流体種の電子制御”なる名称の米国特許出願１１／３６０,８４５号(２００６年２月２３日出願)またはAhn, et al.の“流動性液滴合体”なる名称の米国特許出願１１／６９８,２９８号(２００７年１月２４日出願)に記載のように、ゲル化イニシエーター(アクリルアミドについて過硫酸アンモニウムおよびＴＥＭＥＤまたはアルギン酸についてＣａ２＋)を、例えば、水相との共流動により、油相を通す共流動によりまたは２個の異なる液滴の合体により、液滴に添加できる。
【００８５】
他の態様において、粒子は１以上のポリマーを含み得る。ポリマーの例は、ポリスチレン(ＰＳ)、ポリカプロラクトン(ＰＣＬ)、ポリイソプレン(ＰＩＰ)、ポリ(乳酸)、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアクリロニトリル、ポリイミド、ポリアミドおよび／またはこれらの混合物および／またはコポリマーおよび／または他のポリマーを含むが、これらに限定されない。さらに、ある場合、粒子は、粒子の磁性操作を可能にする、磁性であり得る。例えば、粒子は、鉄または他の磁性物質を含み得る。粒子はまた、タンパク質、核酸または小分子のような他の分子が結合されるように、官能化もできる。従って、本発明のある態様は、例えば、核酸、タンパク質、小分子またはここに記載するもののような他の種の、ライブラリーを規定する、一連の粒子に関する。ある態様において、粒子は蛍光であり得る。
【００８６】
ある態様において、細胞または他の核酸源および、例えば、上記のようなオリゴヌクレオチドタグを含む粒子を含む液滴が形成される。あらゆる適当な方法を液滴の製造に選択でき、液滴の形成のための多種多様な異なる技術が当業者には知られる。例えば、チャネル接合部を液滴の製造に使用できる。接合部は、例えば、Ｔ字接合部、Ｙ字接合部、チャネル内チャネル接合部(例えば、同軸性配置または内部チャネルと、内部チャネルの少なくとも一部を囲む外部チャネルを含む)、十字(または“Ｘ”)接合部、流れ集約接合部または液滴の製造のための任意の他の適当な接合部であり得る。例えば、各々を、その全体を引用により本明細書に包含させる、２００４年１０月２８日にＷＯ２００４／０９１７６３号として公開されたLink, et al.の、“流体種の形成および制御”なる名称の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１０９０３号(２００４年４月９日出願)または２００４年１月８日にＷＯ２００４／００２６２７号として公開された、Stone, et al.による、“流体分散のための方法および装置”なる名称の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２０５４２号(２００３年６月３０日出願)参照。ある態様において、接合部を、実質的に単分散液滴を製造するために設計および配置し得る。液滴はまた流動性デバイス上でも製造できおよび／または液滴は別に製造され、その後デバイスに運ばれ得る。
【００８７】
細胞を使用するならば、細胞は、あらゆる適当な源から生じ得る。例えば、細胞は、細胞からの核酸が試験または配列決定などがされることが望まれるあらゆる細胞であってよく、１以上の細胞型を含んでよい。細胞は、例えば、ある臓器または組織(例えば、心臓細胞、免疫細胞、筋肉細胞、癌細胞など)由来のような細胞の特異的集団、特異的個体または種由来の細胞(例えば、ヒト細胞、マウス細胞、細菌など)、異なる生物由来の細胞、天然に存在するサンプル(例えば、池水、土壌など)からの細胞などであり得る。ある場合、細胞は、組織から解離され得る。
【００８８】
さらに、本発明のある態様は、他の分離した区画、例えば、マイクロウェルプレートのマイクロウェル、スライドまたは他の表面上の個々のスポットなどの使用を含む。ある場合、区画の各々は、他の区画と偶発的に混ざらない特異的位置にあり得る。区画は、ある場合相対的に小さく、例えば、各区画は、約１ml未満、約３００μl未満、約１００μl未満、約３０μl未満、約１０μl未満、約３μl未満、約１μl未満、約５００nl未満、約３００nl未満、約１００nl未満、約５０nl未満、約３０nl未満または約１０nl未満の体積を有し得る。
【００８９】
ある態様において、液滴(または他の区画)は、平均、各液滴が、その中に１粒子有するように充填される。例えば、平均充填率は、約１粒子／液滴未満、約０.９粒子／液滴未満、約０.８粒子／液滴未満、約０.７粒子／液滴未満、約０.６粒子／液滴未満、約０.５粒子／液滴未満、約０.４粒子／液滴未満、約０.３粒子／液滴未満、約０.２粒子／液滴未満、約０.１粒子／液滴未満、約０.０５粒子／液滴未満、約０.０３粒子／液滴未満、約０.０２粒子／液滴未満または約０.０１粒子／液滴未満であり得る。ある場合、２以上の粒子をその中に有する液滴が産生される確立を最小化するために、低い粒子充填率が選択され得る。従って、液滴の、例えば、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％が粒子を含まないかまたは粒子を１個しか含まないようにし得る。
【００９０】
同様に、ある態様において、液滴(または他の区画)は、平均、各液滴が、その中に１細胞未満を有するように充填する。例えば、平均充填率は、約１細胞／液滴未満、約０.９細胞／液滴未満、約０.８細胞／液滴未満、約０.７細胞／液滴未満、約０.６細胞／液滴未満、約０.５細胞／液滴未満、約０.４細胞／液滴未満、約０.３細胞／液滴未満、約０.２細胞／液滴未満、約０.１細胞／液滴未満、約０.０５細胞／液滴未満、約０.０３細胞／液滴未満、約０.０２細胞／液滴未満または約０.０１細胞／液滴未満であり得る。ある場合、その中に２以上の細胞を有する液滴が産生される可能性を最小化するために、低い細胞充填率を選択し得る。従って、例えば、液滴の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％が粒子を含まないかまたは粒子を１個しか含まないようにし得る。さらに、液滴内の平均粒子充填率および平均細胞充填率は同一でも異なってもよいことは理解すべきである。
【００９１】
ある場合、比較的多数の液滴、例えば、少なくとも約１０、少なくとも約３０、少なくとも約５０、少なくとも約１００、少なくとも約３００、少なくとも約５００、少なくとも約１,０００、少なくとも約３,０００、少なくとも約５,０００、少なくとも約１０,０００、少なくとも約３０,０００、少なくとも約５０,０００、少なくとも約１００,０００液滴などを製造し得る。ある場合、前記のとおり、液滴のいくぶんかまたは全ては、例えば、液滴に存在する少なくともいくつかのオリゴヌクレオチドタグ(例えば、これは１以上の一意的な配列またはバーコードを含み得る)に基づき、区別可能である。ある場合、液滴の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％は区別可能であり得る。
【００９２】
液滴への粒子および細胞充填後、オリゴヌクレオチドタグは、本発明のある面によって、粒子から遊離または開裂され得る。上記のとおり、光(例えば、オリゴヌクレオチドタグが光開裂可能リンカーを含むならば)、化学物質または酵素などのような、任意の適当な技術を使用して、液滴からオリゴヌクレオチドタグを遊離し得る。化学物質または酵素を使用するならば、化学物質または酵素を、液滴形成後、例えば、ピコインジェクションまたは“流体注入”なる名称の国際特許出願公開ＷＯ２０１０／１５１７７６号(引用により本明細書に包含させる)に記載のもののような他の方法、液滴と化学物質もしくは酵素を含む液滴の融合または当業者に知られる他の技術により、液滴に導入し得る。
【００９３】
記載のように、ある面において、液滴は核酸を含み得る。核酸は細胞または他の適当な源により生じ得る。ある態様において、細胞が存在するならば、細胞は、例えば、細胞からＤＮＡおよび／またはＲＮＡを遊離させるためおよび／または液滴内に細胞溶解物を産生するため、液滴内で溶解され得る。例えば、細胞は、溶解性化学物質または細胞溶解剤(例えば、Triton-XまたはＳＤＳのような界面活性剤、リゾチーム、リゾスタフィン、ザイモラーゼ、セルラーゼ、ムタノリシン、グリカナーゼ、プロテアーゼ、マンナーゼ、プロテイナーゼＫのような酵素など)または物理的条件(例えば、超音波、紫外線、機械的撹拌など)への暴露により、溶解させ得る。溶解性化学物質を使用するとき、溶解性化学物質を、液滴形成後、例えば、ピコインジェクションまたは、引用によりその全体を本明細書に包含させる、２０１２年５月３１日に米国特許出願公開２０１２／０１３２２８８号として公開された、“流体注入”なる名称の米国特許出願１３／３７９,７８２号(２０１１年１２月２１日出願)に記載のもののような他の方法、液滴と化学物質もしくは酵素を含む液滴の融合または当業者に知られる他の技術により、液滴に導入し得る。細胞の溶解は、粒子からのオリゴヌクレオチドタグの遊離前、遊離中または遊離後のいずれでもよい。ある場合、細胞溶解は、細胞がその内容物、例えば、細胞核酸、タンパク質、酵素、糖などを遊離させる原因となる。ある態様において、細胞核酸のいくぶんかはまた、例えば、ここに記載するような、１以上の液滴内に含まれるオリゴヌクレオチドタグと連結もし得る。例えば、ある態様において、一般に細胞内で産生されるＲＮＡ転写物は遊離され、その後核酸タグに連結し得る。
【００９４】
ある態様において、遊離したら、細胞から遊離した核酸(例えば、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ)を、オリゴヌクレオチドタグに、例えば、プライマー伸長、ライゲーションなどにより、共有結合し得る。多種多様な異なる技術のいずれを使用してもよく、当業者は多くのこのような技術を知っている。使用する正確な連結技術は必ずしも重大ではなく、態様毎に変わり得る。
【００９５】
例えば、ある態様において、核酸を、リガーゼを使用してオリゴヌクレオチドタグと連結し得る。リガーゼの非限定的例は、ＤＮＡリガーゼＩ、ＤＮＡリガーゼII、ＤＮＡリガーゼIII、ＤＮＡリガーゼIV、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３  ＤＮＡリガーゼ、大腸菌ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼなどのようなＤＮＡリガーゼを含む。多くのこのようなリガーゼは、商業的に購入できる。さらなる例として、ある態様において、２以上の核酸を、アニーリングまたはプライマー伸長法を使用して、共にライゲートし得る。
【００９６】
さらに別の態様において、核酸を、ＰＣＲ(ポリメラーゼ鎖反応)またはここに引用するあらゆるものを含む他の適当な増幅技術を使用して、オリゴヌクレオチドタグと連結および／または増幅し得る。一般に、ＰＣＲ反応において、核酸を加熱して、核酸を単鎖に解離させ、熱安定ＤＮＡポリメラーゼ(例えばＴａｑ  ポリメラーゼ)を使用して、核酸を増幅する。この工程をしばしば複数回繰り返して、核酸を増幅する。
【００９７】
ある態様において、ＰＣＲまたは核酸増幅を液滴内で実施し得る。例えば、液滴はポリメラーゼ(例えばＴａｑ  ポリメラーゼ)およびＤＮＡヌクレオチドを含んでよく、液滴を、液滴内の核酸を増幅するために処理し得る(例えば、加熱および冷却の反復により)。ポリメラーゼおよびヌクレオチドを任意の適当な時点で、例えば、種々の条件をコードする種々の核酸の液滴への添加前、添加中または添加後添加してよい。例えば、液滴はポリメラーゼおよびＤＮＡヌクレオチドを含み得て、これを液滴に融合して、増幅を生じさせる。当業者は、ある態様において、増幅核酸の産生に使用し得る、アセンブリーＰＣＲまたはポリメラーゼサイクリングアセンブリーのような適当なＰＣＲ技術およびバリエーションを知っている。このような方法の非限定的例を下にも記載する。さらに、ある場合、適当なプライマー、例えば、Ｐ５およびＰ７または当業者に知られる他のプライマーを使用して、重合化を開始し得る。ある態様において、プライマーを液滴に添加してよく、またはプライマーは、液滴内の核酸の１以上に存在し得る。当業者は適当なプライマーを知っており、その多くは、商業的に容易に入手できる。
【００９８】
ある場合、液滴を破裂、破壊または他の方法で崩壊させ得る。液滴を“破壊”または“破裂”させる多種多様な方法が当業者には利用可能であり、選択された正確な方法は重大ではない。例えば、運搬流体に含まれる液滴を、機械的破砕または超音波のような技術を使用して崩壊させ得る。液滴はまた、化学薬剤または界面活性剤、例えば、１Ｈ,１Ｈ,２Ｈ,２Ｈ−ペルフルオロオクタノールを使用して崩壊させ得る。
【００９９】
異なる液滴からの核酸(オリゴヌクレオチドタグで標識)を次いで、一緒にプールされまたは合わせられまたは分析、例えば、配列決定、増幅などされる。異なる液滴からの核酸は、しかしながら、崩壊前に各液滴に存在していた異なるオリゴヌクレオチドタグ(例えば、異なるバーコードを含む)により、区別可能なままである。
【０１００】
例えば、核酸を、ＰＣＲ(ポリメラーゼ鎖反応)または他の増幅技術を使用して増幅し得る。一般に、ＰＣＲ反応において、核酸を加熱して核酸を単鎖に解離させ、熱安定ＤＮＡポリメラーゼ(例えばＴａｑ  ポリメラーゼ)を使用して、核酸を増幅する。この工程をしばしば複数回繰り返して、核酸を増幅する。
【０１０１】
ある態様において、ＰＣＲを核酸の増幅に使用し得る。当業者は、ある態様において、増幅核酸を製造するのに使用し得る、アセンブリーＰＣＲまたはポリメラーゼサイクリングアセンブリーのような適当なＰＣＲ技術およびバリエーションを知っている。このような方法の非限定的例を下にも記載する。さらに、ある場合、適当なプライマー、例えば、Ｐ５およびＰ７または当業者に知られる他のプライマーを使用して、重合化を開始し得る。当業者は適当なプライマーを知っており、その多くは、容易に購入できる。
【０１０２】
使用し得る当業者に知られる増幅法の他の非限定的例は、逆転写酵素(ＲＴ)ＰＣＲ増幅、インビトロ転写増幅(ＩＶＴ)、多置換増幅(ＭＤＡ)または定量的実時間ＰＣＲ(ｑＰＣＲ)を含むが、これらに限定されない。
【０１０３】
ある態様において、核酸を、多様な技術および装置を使用して配列決定でき、その多くは、商業的に容易に入手可能である。このような技術の例は、連鎖停止配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、マクサム・ギルバート配列決定、ダイターミネーター配列決定、連鎖停止方法、大規模並列処理特徴配列決定(Lynx Therapeutics)、ポロニー配列決定、パイロシーケンシング、ライゲーションによる配列決定、イオン半導体配列決定、ＤＮＡナノボール配列決定、単分子実時間配列決定、ナノポア配列決定、微小流体サンガー配列決定、デジタルＲＮＡ配列決定(“デジタルＲＮＡ−ｓｅｑ”)などを含むが、これらに限定されない。選択した正確な配列決定法は重大ではない。
【０１０４】
さらに、ある場合、液滴は、例えば、ＤＮＡでの適当なタグ付けにより、例えば、細胞内のタンパク質を決定するために１以上のＤＮＡタグ付抗体も含み得る。従って、例えば、タンパク質を、タンパク質に特異的なＤＮＡタグ付抗体を使用して、ここに記載するような複数の細胞において検出し得る。
【０１０５】
例えば、液滴(または液滴内の種)の決定、液滴の選別などのための、微小流体システムにおける液滴を操作するためのシステムおよび方法に関するさらなる詳細を次に示す。例えば、液滴のスクリーニングおよび／または選別のための種々のシステムおよび方法は、引用により本明細書に包含させる、２００７年１月４日に米国特許公開２００７／０００３４２号として公開された、Link, et al.の“流体種の電子制御”なる名称の米国特許出願１１／３６０,８４５号(２００６年２月２３日出願)に記載される。非限定的例として、第一電場(またはその一部)の適用(または除去)により、液滴を第一領域またはチャネルに指向させることができ、デバイス(またはその一部)への第二電場の適用(または除去)により、液滴を第二領域またはチャネルに指向させることができ、第三電場をデバイス(またはその一部)に適用することにより、液滴を第三領域またはチャネルに指向させることができるなどであり、ここで、電場はある程度、例えば、強度、方向、周波数、時間などが異なり得る。
【０１０６】
本発明のある態様において、流動性液滴の１以上の特徴を決定することを可能とするような方法で、流動性液滴の１以上の特徴および／または流動性液滴を含む流動性システムの部分の特徴(例えば、流動性液滴を囲む液体)を感知および／または検出できるセンサーが提供される。液滴に関して決定可能なおよび本発明において使用可能な特徴は、当業者により特定され得る。このような特徴の非限定的例は、生物学的物質(例えば、タンパク質、核酸など)のような物質の蛍光、スペクトロスコピー(例えば、光学、赤外、紫外など)、放射活性、質量、体積、密度、温度、粘性、ｐＨ、濃度などを含む。
【０１０７】
ある場合、センサーをプロセッサーに連結してよく、これは、次に、例えば、先に記載のように、例えば、液滴の選別、液滴の電荷の付加または除去、液滴と他の液滴の融合、液滴分割、液滴内での混合誘発などにより、流動性液滴上で実施すべき操作を起こし得る。例えば、流動性液滴のセンサー測定に応答して、プロセッサーは流動性液滴を分裂させ、第二流動性液滴と融合させるなどする。
【０１０８】
１以上のセンサーおよび／またはプロセッサーは、流動性液滴とセンシング・コミュニケーションであるように配置し得る。ここで使用する“センシング・コミュニケーション”は、センサーが、流動性システム内(例えば、チャネル内)の流動性液滴および／または流動性液滴を含む流動性システムの部分が何らかの方法で感知および／または決定され得るようにどこかに位置し得ることを意味する。例えば、センサーは、流動性液滴および／または流動性液滴を含む流動性システムの部分と、流動的に、光学的にまたは視覚的に、熱的に、空気圧に、電子工学的になどでセンシング・コミュニケーションであり得る。センサーは、流動性システムと近接して位置する、例えば、チャネルの壁内に包埋されるかまたは完全に連結して位置するかまたは、流動性液滴および／または流動性液滴を含む流動性システムの部分(例えば、チャネルまたは微小チャネル、流動性液滴含有液体など)の感知および／または決定が可能であるように、流動性システムと物理的、電気的および／または光学的に通信するならば、流動性システムと離れて位置し得る。例えば、センサーは、液滴を含むチャネルと何らかの物理的結合はしていないが、赤外、紫外または可視光のような、液滴または流動性システムに起因する電磁放射が検出可能であるように位置し得る。電磁放射は液滴により産生されてよくおよび／または流動性システムの他の位置(または流動性システムの外部)に起因してよく、流動性液滴および／または流動性液滴を含む流動性システムの部分と、例えば、吸収、反射、回折、屈折、蛍光、リン光、極性変化、相変化、時間に関する変化などにより、流動性液滴の１以上の特徴を示すような方法で相互作用する。一例として、レーザーを流動性液滴および／または流動性液滴を囲む液体に向け、流動性液滴および／または周囲液体の蛍光を決定し得る。ここで使用する“センシング・コミュニケーション”はまた直接的でも間接的でもよい。一例として、流動性液滴からの光をセンサーに向けまたはセンサーに向ける前にまず光ファイバーシステム、導波管などに向けてよい。
【０１０９】
本発明において有用なセンサーの非限定的例は、光学または電磁ベースのシステムを含む。例えば、センサーは、蛍光センサー(例えば、レーザーにより刺激)、顕微鏡システム(これはカメラまたは他の記録デバイスを含み得る)などであり得る。他の例として、センサーは、電子工学的センサー、例えば、電場または他の電気的特徴を決定できるセンサーであり得る。例えば、センサーは、流動性液滴および／または流動性液滴を含む流動性システムの部分のキャパシタンス、インダクタンスなどを検出し得る。
【０１１０】
ここで使用する“プロセッサー”または“マイクロプロセッサー”は、例えば、数式または電子回路もしくは計算回路の使用により、１以上のセンサーからシグナルを受け、シグナルを貯めおよび／または１以上の応答を指示する(例えば、上記のような)ことができる、あらゆる成分またはデバイスである。シグナルは、センサーにより決定される環境因子の指標であるあらゆる適当なシグナル、例えば空気圧シグナル、電子工学的シグナル、光学シグナル、機械的シグナルなどであり得る。
【０１１１】
ある態様において、流動性液滴は、液滴上に電荷および／または電気双極子を作り、ＡＣ場、ＤＣ場などであり得る適用した電場を使用して液滴を操縦することにより指向させ得る。一例として、流動性液滴を特定の領域に指向させる必要性に応じて、電場を選択的に適用および除去し得る(または異なる電場、例えば、逆電場を適用し得る)。電場は、ある態様において、流動性液滴を含む液体の流れを実質的に変えることなく、必要に応じて選択的に適用および除去できる。例えば、液体は、実質的に定常状態原則(すなわち、流動性液滴を含む液体の平均流速は定常流もしくは時間に対する液体の流れの期待値の２０％未満または１５％未満の逸脱であり、ある場合、平均流速は１０％未満または５％未満逸脱し得る)または本発明の流動性システムを介する(例えば、チャネルまたはマイクロチャネルを介する)所定の原則であり、液体内に含まれる流動性液滴は、流動性システムを通る液体の流れを実質的に変えることなく、例えば、電場を使用して、種々の領域に指向させ得る。
【０１１２】
ある態様において、流動性液滴を、液滴を含む液体の流れを変えることにより、本発明の流動性システムでスクリーニングまたは選別し得る。例えば、ある態様において、流動性液滴を、流動性液滴を囲む液体を第一チャネル、第二チャネルなどに向けることにより、操縦または選別し得る。
【０１１３】
他の態様において、流動性システム内、例えば、異なるチャネル内またはチャネルの異なる部分内の圧力を、流動性液滴の流れを指向させるために制御できる。例えば、液滴を、流れのさらなる方向のための複数の選択肢を含む、チャネル接合部に指向させることができる(例えば、任意の下流流路を規定するチャネルにおける、分枝または分岐に向ける)。１以上の任意の下流流路内の圧力を制御して、液滴を、選択的にチャネルの一つに向け、圧力の変化を、各連続的液滴の下流流路が独立して制御され得るように、連続的液滴が接合部に到達するのに必要な時間順に適用できる。一つの配置において、液体リザーバーの拡大および／または収縮を使用して、例えば、流動性液滴を含む液体の直接移動を起こすことにより、流動性液滴をチャネルに操作または選別できる。液体リザーバーは、活性化されたとき、活性化リザーバーによりもたらされる液体の移動が、液体を好ましい方向に流し、その中の流動性液滴を好ましい方向に運搬するように配置し得る。例えば、液体リザーバーの拡大は、液体のリザーバー方向への流れを起こし、液体リザーバーの収縮は、液体のリザーバーから離れる流れを起こし得る。ある場合、液体リザーバーの拡大および／または収縮を、例えば、ここに記載するような、他の流動制御デバイスおよび方法と組み合わせ得る。液体リザーバーの拡大および／または収縮を起こすことができるデバイスの非限定的例は、ピストンおよび圧電性成分を含む。ある場合、圧電性成分が、例えば、電気的シグナルに応答した比較的速い応答時間のために、特に有用であり得る。ある態様において、流動性液滴を、２を超えるチャネルに選別し得る。
【０１１４】
記載のように、ある態様は、一般に液体中の流動性液滴を選別するシステムおよび方法に関し、ある場合、比較的高速である。例えば、液滴の特性を何らかの方法で感知および／または決定でき(例えば、ここにさらに記載するように)、次いで液滴を、例えば、選別目的で、微小流体チャネルのようなデバイスの特定の領域に向け得る。ある場合、高選別速度が、本発明のあるシステムおよび方法を使用して達成可能であり得る。例えば、ある場合少なくとも約１０液滴／秒が決定および／または選別され得て、他の場合において、少なくとも約２０液滴／秒、少なくとも約３０液滴／秒、少なくとも約１００液滴／秒、少なくとも約２００液滴／秒、少なくとも約３００液滴／秒、少なくとも約５００液滴／秒、少なくとも約７５０液滴／秒、少なくとも約１,０００液滴／秒、少なくとも約１,５００液滴／秒、少なくとも約２,０００液滴／秒、少なくとも約３,０００液滴／秒、少なくとも約５,０００液滴／秒、少なくとも約７,５００液滴／秒、少なくとも約１０,０００液滴／秒、少なくとも約１５,０００液滴／秒、少なくとも約２０,０００液滴／秒、少なくとも約３０,０００液滴／秒、少なくとも約５０,０００液滴／秒、少なくとも約７５,０００液滴／秒、少なくとも約１００,０００液滴／秒、少なくとも約１５０,０００液滴／秒、少なくとも約２００,０００液滴／秒、少なくとも約３００,０００液滴／秒、少なくとも約５００,０００液滴／秒、少なくとも約７５０,０００液滴／秒、少なくとも約１,０００,０００液滴／秒、少なくとも約１,５００,０００液滴／秒、少なくとも約２,０００,０００以上の液滴／秒または少なくとも約３,０００,０００以上の液滴／秒が決定および／または選別され得る。
【０１１５】
ある面において、比較的小さい液滴の集団を使用し得る。ある態様において、非限定的例として、液滴の平均直径は、約１mm未満、約５００μm未満、約３００μm未満、約２００μm未満、約１００μm未満、約７５μm未満、約５０μm未満、約３０μm未満、約２５μm未満、約２０μm未満、約１５μm未満、約１０μm未満、約５μm未満、約３μm未満、約２μm未満、約１μm未満、約５００nm未満、約３００nm未満、約１００nm未満または約５０nm未満であり得る。液滴の平均直径はまた少なくとも約３０nm、少なくとも約５０nm、少なくとも約１００nm、少なくとも約３００nm、少なくとも約５００nm、少なくとも約１μm、少なくとも約２μm、少なくとも約３μm、少なくとも約５μm、少なくとも約１０μm、少なくとも約１５μmまたはある場合少なくとも約２０μmであり得る。液滴の集団の“平均直径”は、液滴の直径の算術平均である。
【０１１６】
ある態様において、液滴は、特定の適用によって、実質的に同じ形および／またはサイズ(すなわち、“単分散”)でも、異なる形および／またはサイズでもよい。ある場合、液滴は、断面直径の均質分布を有し得て、すなわち、液滴は、液滴の最大約５％、最大約２％または最大約１％が、複数の液滴の全体的平均直径の約９０％未満(または約９５％未満または約９９％未満)および／または約１１０％超(または約１０５％超または約１０１％超)の直径を有するような、直径の分布を有し得る。断面液滴の直径の均質分布を産生するいくつかの技術は、引用により本明細書に包含させる、２００４年１０月２８日にＷＯ２００４／０９１７６３号として公開された、Link et al.の“流体種の形成および制御”なる表題の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１０９０３号(２００４年４月９日出願)に記載されている。
【０１１７】
当業者は、例えば、レーザー光散乱または他の既知技術を使用して、液滴の集団の平均直径を決定できる。このように形成された液滴は、ある場合球形でも非球形でもよい。非球形液滴の、液滴の直径は、非球形液滴と同じ体積を有する完全な数学的球形の直径としてとり得る。
【０１１８】
ある態様において、１以上の液滴を、流体を別々に液体内の個々の液滴に入らせ得る液体により囲まれる流体上に電荷を作ることにより、チャネル内に作り得る。ある態様において、電場を、液滴形成を起こすように、流体に適用し得る。流体は、液体内の一連の個々の帯電および／または電気的誘導性液滴として存在し得る。任意の適当な技術を使用して、例えば、流体を電場(これはＡＣ、ＤＣなどであり得る)内に置くおよび／または流体が電荷を有するようにさせる反応を起こすことにより、電荷を、液体内の流体に作り得る。
【０１１９】
電場は、ある態様において、電場発生装置、すなわち、流体に適用できる電場を作ることができるデバイスまたはシステムから産生される。電場発生装置は、ＡＣ場(すなわち、時間に関して周期的に変わる、例えば、正弦波、鋸歯状波、矩形波などのようなもの)、ＤＣ場(すなわち、時間に関して一定であるもの)、パルス場などを発生させ得る。適当な電場を産生する技術(これはＡＣ、ＤＣなどであり得る)は、当業者に知られる。例えば、ある態様において、電場は、少なくとも電場の一部がチャネルと相互作用するように、チャネルの近接に配置され得る、電極対を横切る電位の適用により産生される。電極は、銀、金、銅、炭素、白金、銅、タングステン、錫、カドミウム、ニッケル、酸化インジウム錫(“ＩＴＯ”)などならびにこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない、あらゆる適当な電極物質または当業者に知られる物質から形成できる。
【０１２０】
他の態様において、流体の液滴は、流体が個々の液滴を形成することを誘発できる方法で、チャネル寸法を帰ることにより、チャネル内の液体により囲まれる流体から作ることができる。例えば、チャネルは、例えば、流体がチャネル壁に接着せず、その替わり個々の液滴を形成するように、流れの方向に対して拡張するチャネルであるかまたは、例えば、流体が個々の液滴に合体するように流れの方向に対して狭まるチャネルであり得る。ある場合、チャネルの大きさを、個々の液滴の形成を生じるような方法で、時間に関して変え得る(例えば、機械的または電気機械的、空気圧など)。例えば、チャネルを、機械的に収縮(“圧搾”)して液滴形成させるかまたは、例えば、移動調節板、回転ブレードなどの使用により、流体流を機械的に崩壊させて、液滴形成させ得る。液滴を作る他の技術は、例えば流体の混合またはボルテックス処理を含む。
【０１２１】
ある態様は、一般に液滴を２以上の液滴に分割するシステムおよび方法に関する。例えば、液滴を、適用電場を使用して分割できる。液滴は周囲液体より高い導電率を有する可能性があり、ある場合、液滴は、中性に荷電していてよい。ある態様において、適用電場において、電荷は、液滴の内部から分散すべき表面への移動を強いられて、それにより、液滴の内部で生じている電場を打ち消し得る。ある態様において、液滴表面の電荷はまた適用電場により力を受け得て、これは、逆極性を有する電荷を逆方向に移動させる。電荷移動は、ある場合、液滴を２個の別々の液滴に引き裂き得る。
【０１２２】
本発明のある態様は、一般に２以上の液滴を１液滴に融合または凝集するためのシステムおよび方法に関し、例えば、ここで、２以上の液滴は、例えば、組成物、表面張力、液滴サイズ、界面活性剤の存在または不在などにより、通常融合または凝集不可能である。ある場合、液滴サイズに対する液滴の表面張力も、液滴の融合または合体が起こるのを阻止し得る。
【０１２３】
非限定的例として、２液滴は、液滴の融合または合体が逆電荷により生じるように、２液滴の電気的相互作用を増強できる、逆電荷(すなわち、必ずしも同じ強度ではない、正電荷と負電荷)を与えられ得る。例えば、電場を液滴に適用し得る、液滴をコンデンサーに通過させ得る、化学反応が液滴を帯電させ得るなど。液滴、ある場合、界面活性剤を液滴の表面張力を低下させるために適用しても、融合不可能であり得る。しかしながら、液滴が逆電荷で電気的に帯電させたら(これは、同じ強度であってもよいが、必ずしもではない)、液滴は融合または合体可能となり得る。他の例として、液滴は必ずしも逆電荷を与えられず(そして、ある場合、電荷を与えられ得ない)、液滴の凝集を起こす液滴に誘発された双極子の使用により融合させる。また、凝集できる２以上の液滴は、必ずしも“面と向かう”必要はない。少なくとも液滴のいくぶんかの融合が最初に起こるかぎり、あらゆる接触角が十分である。また、例えば、引用によりその全体を本明細書に包含させる、２００７年８月２３日に米国特許公開２００７／０１９５１２７号として公開された、Ahn, et al.の“流動性液滴合体”なる名称の米国特許出願１１／６９８,２９８号(２００７年１月２４日出願)参照。
【０１２４】
ある態様において、流体を液滴に注入し得る。流体を、ある場合、例えば、マイクロニードルまたは他のそのようなデバイスを使用して、液滴にマイクロインジェクションし得る。他の場合において、流体を、液滴が流動性チャネルと接触するようになる流動性チャネルを使用して、液滴に直接注入し得る。流体注入の他の技術は、例えば、各々引用によりその全体を本明細書に包含させる、２０１０年１２月２９日にＷＯ２０１０／１５１７７６号として公開されたWeitz, et al.の“流体注入”なる名称の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４０００６号(２０１０年６月２５日出願)；または２０１０年７月１５日にＷＯ２０１０／０８０１３４号として公開された、Weitz, et al.の“粒子支援核酸配列決定”なる名称の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００９／００６６４９号(２００９年１２月１８日出願)に記載されている。
【０１２５】
本発明のある面によって、多様な物質および方法を使用して、ここに記載のような物品または成分、例えば微小流体チャネルのようなチャネル、チャンバーなどを形成できる。例えば、種々の物品または成分は、チャネルが微細加工、スピンコーティングおよび化学蒸着のようなフィルム沈着、レーザー製作、フォトリソグラフィ技術、湿式化学またはプラズマプロセスを含むエッチング法などにより形成できる、固形物であり得る。例えば、Scientific American, 248:44-55, 1983 (Angell, et al)参照。
【０１２６】
ある態様において、ここに記載する物品の種々の構造または成分は、ポリマー、例えば、ポリジメチルシロキサン(“ＰＤＭＳ”)、ポリテトラフルオロエチレン(“ＰＴＦＥ”またはテフロン(登録商標))などのようなエラストマーポリマー製であり得る。例えば、ある態様によって、微小流体チャネルを、ＰＤＭＳまたは他のソフトリソグラフィー技術(この態様に適するソフトリソグラフィー技術の詳細は、Annual Review of 物質 Science, 1998, Vol. 28, pages 153-184に発表されたYounan Xia and George M. Whitesidesの“ソフトリソグラフィー”およびAnnual Review of Biomedical Engineering, 2001, Vol. 3, pages 335-373に発表されたGeorge M. Whitesides, Emanuele Ostuni, Shuichi Takayama, Xingyu Jiang and Donald E. Ingberの“生物学および生化学におけるソフトリソグラフィー”なる表題の文献に記載されている；これらの引用文献の各々を引用により本明細書に包含させる)を使用して別々んい流動性システムを製作することにより実行し得る。
【０１２７】
適する可能性のあるポリマーの他の例は、ポリエチレンテレブタレート(ＰＥＴ)、ポリアクリル酸、ポリメタクリレート、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、環状オレフィンコポリマー(ＣＯＣ)、ポリテトラフルオロエチレン、フッ化ポリマー、ポリジメチルシロキサンのようなシリコーン、ポリ塩化ビニリデン、ビス−ベンゾシクロブテン(“ＢＣＢ”)、ポリイミド、ポリイミドのフッ化誘導体などを含むが、これらに限定されない。上記のものを含むポリマーが関与する組み合わせ、コポリマーまたはブレンドも考慮される。デバイスはまた複合体物質、例えば、ポリマーと半導体物質の複合体も形成され得る。
【０１２８】
ある態様において、物品の種々の構造または成分は、高分子および／または可撓性および／またはエラストマー物質から製作され、好都合には硬化可能流体の形であってよく、成型(例えばレプリカ成型、射出成型、注加成型など)による製作を容易にする。硬化可能流体は、本質的に固化を誘導または自発的に固化して、流動性ネットワーク内でのまたは該ネットワークと共に使用が意図される流体と接触および／または輸送ができる固体となり得るあらゆる流体であり得る。ある態様において、硬化可能流体は、高分子液体または液体高分子前駆体(すなわち“プレポリマー”)を含む。適当な高分子液体は、例えば、融点より高く加熱された、熱可塑性ポリマー、熱硬化性ポリマー、蝋、金属またはこれらの混合物または複合体を含み得る。他の例として、適当な高分子液体は、適当な溶媒中の１以上のポリマーの溶液を含んでよく、この溶液は、例えば、蒸発による溶媒除去により固体高分子物質を形成する。例えば、融解状態からまたは溶媒蒸発により固化できる、このような高分子物質は当業者に周知である。大部分がエラストマーである多様な高分子物質が適当であり、また型マスターの一方または両方がエラストマー物質からなる態様において、型または型マスターの形成に適する。このようなポリマーの例の非限定的一覧は、一般的クラスのシリコーンポリマー、エポキシポリマーおよびアクリル酸ポリマーのポリマーを含む。エポキシポリマーは、エポキシ基、１,２−エポキシドまたはオキシランと一般に呼ばれる３員環エーテル基の存在により特徴付けられる。例えば、芳香族アミン、トリアジンおよびシクロ脂肪族骨格に基づく化合物に加えて、ビスフェノールＡのジグリシジルエーテルを使用できる。他の例は、周知のNovolacポリマーを含む。本発明により適するシリコーンエラストマーの非限定的例は、メチルクロロシラン、エチルクロロシラン、フェニルクロロシラン、ドデシルトリクロロシランなどのようなクロロシランを含む前駆体から形成されたものを含む。
【０１２９】
シリコーンポリマー、ある態様において、例えば、シリコーンエラストマーポリジメチルシロキサンを使用する。ＰＤＭＳポリマーの非限定的例は、Dow Chemical Co., Midland, MIから商品名Sylgardで販売されているもの、特にSylgard 182、Sylgard 184およびSylgard 186を含む。ＰＤＭＳを含むシリコーンポリマーは、本発明の種々の構造の製作を単純化するいくつかの有益な特性を有する。例えば、このような物質は安価であり、容易に入手可能であり、加熱による硬化によりプレポリマー液体から固化できる。例えば、ＰＤＭＳは、一般に例えば、約６５℃〜約７５℃の温度に、例えば、約１時間の暴露時間、プレポリマー液体を曝すことにより硬化可能である。また、ＰＤＭＳのようなシリコーンポリマーはエラストマーであり得て、それゆえに、本発明のある態様において必要な比較的高い縦横比を有する極めて小さい形の形成に有用であり得る。可撓性(例えば、エラストマー)型またはマスターは、この点で有益であり得る。
【０１３０】
ＰＤＭＳのようなシリコーンポリマーから微小流体構造またはチャネルのような構造を形成する一つの利点は、このようなポリマーが、例えば空気プラズマのような酸素含有プラズマへの暴露により、酸化される能力であり、したがって、酸化構造は、その表面に、他の酸化シリコーンポリマー表面または多様な他の高分子および非高分子物質の酸化表面と架橋できる化学基を含むことである。従って、構造が製作でき、その後酸化され、別の接着剤または他の密封手段を必要とすることなく、他のシリコーンポリマー表面または酸化シリコーンポリマー表面と反応性の他の基質の表面に、本質的に不可逆的に密封される。ほとんどの場合、密封は、単に酸化シリコーン表面を他の表面に接触させることにより、シールを形成するのに補助圧を適用する必要なく、完了できる。すなわち、前以て酸化されたシリコーン表面は、適当な接合表面に対してコンタクト接着剤として作用する。具体的に、それ自体に不可逆的に密閉されるだけでなく、酸化ＰＤＭＳのような酸化シリコーンはまたＰＤＭＳ表面と同様の方法で酸化されている(例えば、酸素含有プラズマへの暴露により)、例えば、ガラス、シリコン、酸化シリコン、石英、窒化シリコン、ポリエチレン、ポリスチレン、ガラス状炭素およびエポキシポリマーを含む、一定範囲の他の酸化物質にも不可逆的に密閉され得る。本発明において有用な酸化および密封方法ならびに成型技術全体は、文献、例えば、引用により本明細書に包含させる、表題“Rapid Prototyping of Microfluidic Systems and Polydimethylsiloxane,” Anal. Chem., 70:474-480, 1998 (Duffy et al.)に記載されている。
【０１３１】
従って、ある態様において、物品の設計および／または製作は、例えば、比較的よく知られたソフトリソグラフィーおよびここに記載のような他の技術の使用により比較的単純であり得る。さらに、ある態様において、物品の迅速および／またはカスタマイズ設計が、例えば、幾何学的条件によっては可能である。ある態様において、物品は、例えば、物品を放射性、毒性、有毒、反応性、バイオハザード等の物質と使用するおよび／または物質のプロファイル(例えば、毒性プロファイル、放射性プロファイルなど)が未知である態様では、使い捨て可能に製造できる。酸化シリコーンポリマーからチャネルまたは他の構造(または内部、流体接触表面)を形成する他の利点は、これらの表面が、典型的エラストマーポリマーの表面よりはるかに親水性となり得ることである(親水性内部表面が望まれるならば)。このような親水性チャネル表面は、一般に、非酸化エラストマーポリマーまたは他の疎水性物質を含む構造で可能であるよりも、はるかに容易に水溶液で充填および湿潤され得る。
【０１３２】
次の文献は、その全体を、全ての目的のために引用により本明細書に包含させる：Weitz, et al.の“液滴タグ付けおよび増幅のための方法およびシステム”なる表題の米国特許出願６１／９８０,５４１号；Bernstein, et al.の“液滴タグ付けのためのシステムおよび方法”なる表題の米国特許出願６１／９８１,１２３号；Link et al.の“流体種の形成および制御”なる表題の国際特許出願公開ＷＯ２００４／０９１７６３号；Stone et al.の“流体分散のための方法および装置”なる表題の国際特許出願公開ＷＯ２００４／００２６２７号；Weitz et al.の“複数のエマルジョン形成のための方法および装置”なる表題の国際特許出願公開ＷＯ２００６／０９６５７１号；Link et al.の“流体種の電子制御”なる表題の国際特許出願公開ＷＯ２００５／０２１１５１号；Weitz, et al.の“液滴製造技術”なる表題の国際特許出願公開ＷＯ２０１１／０５６５４６号；Weitz, et al.の“液滴および関連種のライブラリー製造”なる表題の国際特許出願公開ＷＯ２０１０／０３３２００号；Weitz, et al.の“流体注入”なる表題の米国特許出願公開２０１２−０１３２２８８号；Agresti, et al.の“液滴を含むアッセイおよび他の反応”なる表題の国際特許出願公開ＷＯ２００８／１０９１７６号；およびWeitz, et al.の“流体注入”なる表題の国際特許出願公開ＷＯ２０１０／１５１７７６号。
【０１３３】
また、引用により本明細書に包含させるのは、２０１４年４月２１日出願の米国仮出願６１／９８２,００１号；２０１４年１０月１７日出願の米国仮出願６２／０６５,３４８号；２０１４年１０月２０日出願の米国仮出願６２／０６６,１８８；および２０１４年１０月３０日出願の米国仮出願６２／０７２,９４４号である。
【０１３４】
さらに、次のものを引用によりその全体を本明細書に包含させる：２０１４年４月１７日出願の米国特許出願６１／９８１,１２３号；“液滴タグ付けのためのシステムおよび方法”なる表題の２０１５年４月１７日出願のＰＣＴ出願；２０１４年４月１７日出願の米国特許出願６１／９８１,１０８号；“液滴タグ付けおよび増幅のための方法およびシステム”なる表題の２０１５年４月１７日出願のＰＣＴ出願；“遺伝子解析および他の適用のための固定化ベースのシステムおよび方法”なる表題の２０１５年４月１７日出願の米国特許出願；“遺伝子配列決定および他の適用のためのバーコーディングシステムおよび方法”なる表題の２０１５年４月１７日出願の米国特許出願；および２０１４年１０月３０日出願の米国特許出願６２／０７２,９４４号。
【０１３５】
次の実施例は本発明のある態様を説明することを意図するが、本発明の完全な範囲を例示していない。
【実施例】
【０１３６】
実施例１
この実施例は、各々１〜１００μM濃度でＤＮＡフラグメント(プライマー)を運搬するヒドロゲルまたはポリマー微小球体を使用する。これらのプライマーは、化学物質または光により微小球体から開裂でき、各ＤＮＡフラグメントは、(ａ)同じバーコードが各微小球体上の全核酸フラグメントに付されており、少なくとも１０,０００のバーコード(一般に１００,０００を超えるバーコード)のプールから無作為に選択されたバーコード配列；および(ｂ)ＤＮＡまたはＲＮＡのハイブリダイゼーションおよび捕獲に使用する１以上のプライマー配列；(ｃ)所望により、さらなるＤＮＡ配列、例えば各分子をバーコーディングするランダムヌクレオチド配列またはバーコード化産物の増幅もしくは捕獲に使用する配列をコードする。これらの微小球体の合成を、下にさらに詳述する。
【０１３７】
液滴製造のこの実施例において、ソフトリソグラフィーにより製造された微小流体デバイスを使用する。その概略図を図２に示すが、乳化は、例えば、キャピラリーまたは管のような他のツールを使用しても実施できる。他の微小流体配置も使用できる。この微小流体デバイスを使用して、約４nL体積の液滴を製造したが(図３および４)、液滴サイズは、酵素的バーコーディング反応の条件に基づき容易に調節できた。
【０１３８】
この実施例で使用した微小流体デバイスは、液滴担体油用の一つの入口および液滴水相の成分用のさらなる入口を有する(図１４)。担体油について、約０.７５％(ｖ／ｖ)界面活性剤(２ペルフルオロポリエーテルブロック(ＰＦＰＥ)および１ポリ(エチレン)グリコール(ＰＥＧ)ブロック含有ＰＦＰＥ−ＰＥＧ−ＰＦＰＥトリブロックコポリマー)を含むフッ化油(例えばＨＦＥ−７５００)を使用した。界面活性剤を使用して液滴の合体を阻止し、量を、例えば、その物理化学的特性により調節し得る。乳化に使用する担体油は、フッ素化液状物に限定されず、炭化水素(例えば鉱油、ヘキサンなど)、シリコーンオイルおよび他のタイプの油状物に基づく流体の流体も首尾よく用いることができた。この実施例で使用した３つの導入口は、次の成分を送達した：(１)解離細胞の懸濁液；(２)細胞溶解剤；(３)バーコード化プライマー運搬ヒドロゲルまたはポリマー微小球体の懸濁液；および(４)捕獲ＤＮＡまたはＲＮＡに相補的なバーコード化ＤＮＡを酵素的に産生するために使用する反応混合物。これらの成分のいくつか、ある場合、例えば(２)および(４)を予め組み合わせることが可能である。
【０１３９】
この実施例において、細胞懸濁液を次の考察に基づき製造した。細胞が粘着性であるかまたは組織由来であるならば、細胞をまず解離し、所望により濾過または遠心分離して、２以上の細胞からなる細胞塊を除去する。細胞懸濁緩衝液(一般にＰＢＳ)の質量密度を注入中の細胞沈殿を最小化するように、例えば約１６％(ｖ／ｖ)でOptiprepの添加により、調節した。細胞数密度(細胞／単位体積)を、２以上の細胞が同じ液滴に捕獲されるようになる事象を最小化するように調節し得る。正確な数密度の精密計算は、例えば、耐容可能な多細胞事象頻度のような因子、液滴体積および細胞懸濁液による相対的液滴体積に依存する。例えば、４nL液滴で５０％が細胞懸濁液による液滴体積であるならば、５０細胞／μlの数密度を使用して、０.１細胞／液滴の平均占有率をもたらすことができ、細胞含有液滴約の５％が１個を超える細胞を有するようになる。必要であれば、小型磁気撹拌子を細胞シリンジに入れて、細胞懸濁液の連続的または間欠的混合を可能にする。微小流体デバイスへの注入中、細胞を、氷嚢または他の適当な冷却技術を使用して、冷却状態に維持し得る。
【０１４０】
酵素反応混合物および／または溶解剤を、この実施例で、細胞懸濁液および微小球体と混合後のそれらの最終濃度が、細胞溶解および酵素反応(例えば逆転写反応)の実施に適するように調製した。
【０１４１】
ヒドロゲル微小球体を使用するなら、その球体が、その液滴への送達が秩序立てられ(ordered)、同期化されるように詰め込まれ(濃縮され)、液滴の大部分が正確に１微小球体を取り込むことを確実にする。硬性ポリマー微小球体を使用するなら、これらは、例えば、流れを使用して秩序立てることができる。ある場合には、目的は、単一微小球体を有する液滴の数が、比較的高く、０または２微小球体を有する液滴の数が稀であるかまたは無視できることを確実にすることである。
【０１４２】
細胞および微小球体、例えば、液滴あたり１細胞および１ＤＮＡバーコード化微小球体の共封入事象をさらに高めるために、細胞を、封入前に秩序立て得る。
【０１４３】
一つの非限定的例として、細胞懸濁液、溶解／反応混合物および濃縮ヒドロゲル微小球体懸濁液についてそれぞれ１００μl／時間、１００μl／時間および１０〜１５μl／時間の流速で水相をデバイスに送達する。例えば、細胞懸濁液の数密度を、５,０００細胞が乳化１時間以内にバーコーディングのために捕獲されるように、５０,０００／mLに調製し得る。しかしながら、全ての相の流速を、特定の適用によって、独立して１〜１０,０００μl／時間に調節できる。
【０１４４】
封入工程後(または中)、細胞を溶解してよく、微小球体表面に結合したＤＮＡフラグメントを、例えば、光、化学物質、酵素または他の技術を使用して、液滴内部に遊離させ得る。
【０１４５】
遊離ＤＮＡフラグメントを、細胞コード化核酸増幅のプライマーとして使用し得る。例えば、細胞からのｍＲＮＡを、逆転写を使用してｃＤＮＡに変換でき、または他の例においては、細胞タンパク質をコードする遺伝子をＤＮＡポリメラーゼを使用して合成できる。
【０１４６】
合成核酸(ＤＮＡまたはＲＮＡ)を混合物内に遊離させるために、液滴を、ある場合、例えば、化学的または物理的技術により破壊し得る。遊離ＤＮＡを収集でき、必要であれば、増幅するかまたはさらに処理し得る。分析すべき細胞の数を、例えば、液滴破壊前にまず液滴エマルジョンのフラクションを新規反応管に移すことにより調節できる(図５)。例えば、５,０００細胞を含む２００μlの液滴エマルジョンを収集後、エマルジョンを、各々約１,０００細胞を含む、まず４０μlの５試験管に分けることができる。望ましいならばこれらのサンプルを別々に処理できる。さらに、他の態様において、他の調節を実施してよい。
【０１４７】
バーコードおよび捕獲核酸を含む核酸の塩基組成を、ＤＮＡ配列決定または他の技術により決定できる(図６)。
【０１４８】
診断テストを、例えば、定量的実時間ＰＣＲ(ｑＰＣＲ)を使用して実施し、液滴中の捕獲ＤＮＡまたはＲＮＡバーコード化の存在量と、酵素反応をプールされたバルク反応における液滴の外のような制御条件下で実施したときまたは等しい細胞数からの精製ＤＮＡまたはＲＮＡを使用したときに達成される存在量と比較できる。ｑＰＣＲは、２プライマーを利用し、一方は微小球体により送達されるバーコード化ＤＮＡフラグメントの末端とハイブリダイズし、他方は、捕獲する標的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列にハイブリダイズする。
【０１４９】
上記を、非限定的例として、ゲノム、一塩基多型、特異的遺伝子発現レベル、非コードＲＮＡ、全トランスクリプトーム、遺伝子全体またはそれらのセクションなどの分析に使用できる。
【０１５０】
図２は、本発明の態様の一例による、微小流体デバイスの概略図および操作を示す。他の微小流体デバイス設計も、例えば、ここに記載するように、可能である。図２Ａは、システムの操作を示す概略図を示す。細胞、バーコード化微小球体(バーコード化ビーズ)および試薬を、微小流体デバイスを使用して液滴に封入する。図２Ｂは、３つの導入口と一つの排出口を有するデバイスを示す。入口は、ｉ)細胞、ii)ＤＮＡバーコード化微小球体、iii)生物学的および／または化学的試薬およびiv)担体油の導入に使用する。ゲル、細胞および試薬を、導入口Ｉ、II、IIIのいずれかからデバイスに導入できる。封入が流れ集約接合部で起こり、封入されたサンプルがその後排出口で収集される。各導入口の流速を、細胞およびＤＮＡバーコード化微小球体共封入の最適条件のために調節できる。図３は、共封入された細胞およびＤＮＡバーコード化微小球体のデジタル画像を示す。上矢印は細胞を示し、下矢印は微小球体を示す。第一フレームからの時間を示す。図４は、微小球体および細胞共封入を示すデバイス排出口の例を示す。図５は、本発明の態様により産生した、バーコード化サンプルの数対エマルジョン体積および封入(収集)時間を示す。図６は、本発明のある態様における、大部分は均一なバーコーディングを示す、豊富なバーコードあたりの配列読取データの分布を示す。
【０１５１】
実施例２
この実施例は、微小球体に結合したバーコード化核酸を製造する、ある技術を記載する。まず、ＤＮＡプライマー(Ｐ１)をヒドロゲルに取り込み、微小球体を合成する(図７)。微小球体または種々のタイプのヒドロゲル粒子を製造する、いくつかの技術を使用し得る。この実施例に記載する微小球体はポリアクリルアミド(ｐＡｃ)ヒドロゲルを利用するが、別のヒドロゲル物質(例えばアガロース、ポリＮ−イソプロピルアクリルアミド(ｐＮＩＰＡＭ)およびその他)も使用できる。
【０１５２】
ある態様において、アクリルアミド(Ａｃ)、Ｎ,Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド(ビス−Ａｃ)およびアクリル系ホスホラミダイト修飾ＤＮＡ(Ａｃ−ＤＮＡ)および／または過硫酸アンモニウム(ＡＰＳ)を含む水溶液を、個々の成分を混合することにより製造する。
【０１５３】
ヒドロゲルメッシュの孔経およびその後の適用に必要なプライマーの濃度に基づき、Ａｃおよびビス−Ａｃ成分の量ならびにＡｃ−ＤＮＡ濃度を、適宜調節できる。例えば、一例において、ヒドロゲル微小球体製造のために、約０.０２５８％アクリルアミド、約０.０３６％(ｖ／ｖ)Ｎ,Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、１〜５０μM  Ａｃ−ＤＮＡおよび約０.２％ＡＰＳの混合物を、０.１〜０.６％(ｖ／ｖ)重合誘発剤(ＴＥＭＥＤと呼ばれるＮ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン)含有担体油により乳化する。担体油として、約１.５％(ｖ／ｖ)界面活性剤(２ペルフルオロポリエーテルブロック(ＰＦＰＥ)および１ポリ(エチレン)グリコール(ＰＥＧ)ブロックを含むＰＦＰＥ−ＰＥＧ−ＰＦＰＥトリブロックコポリマー)を含むフッ化油(例えばＨＦＥ−７５００)を使用できる。例えば、液滴の合体を阻止するために、界面活性剤を使用し得る。ある態様において、その量をその物理化学的特性により調節しなければならない。乳化に使用する担体油はフッ化液体に限定されず、炭化水素に基づく別の流体(例えば鉱油、シリコーン油、ヘキサンなど)を、他の態様において使用できる。
【０１５４】
液滴製造のこの実施例において、ソフトリソグラフィーにより製造した微小流体デバイスを使用した。その概略図を図８に示すが、乳化は、例えば、キャピラリーまたは管のような他のツールを使用しても実施できる。さらに、異なる概略図を有する微小流体デバイスも使用できる。
【０１５５】
この微小流体デバイスを使用して、直径約６２μmの液滴を製造したが(図９)、液滴サイズは、他の適用における要求に基づき調節できる。
【０１５６】
この実施例において、液滴をチューブに収集し、次いで約６５℃で＞２時間インキュベートして、ポリアクリルアミドの重合を誘発した。重合に必要なインキュベージョン時間および温度は、適宜変わり得る。液滴の重合はまた光または種々の化学的手段によっても誘導できる。
【０１５７】
重合化後、エマルジョンを、化学物質(例えばペルフルオロオクタノール)または物理的技術(例えば電場)のような技術により破壊でき、これは、エマルジョン(例えば、微小球体)の内容物のバルク溶液への遊離を引き起こし得る。遊離した微小球体を、次いでヘキサンおよび水性緩衝液に洗い入れた。典型的な例示法において、微小球体を、１％(ｖ／ｖ)Ｓｐａｎ  ８０含有ヘキサン、次いで水性緩衝液(例えば１０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.０)、１０mM  ＥＤＴＡおよび０.１％(ｖ／ｖ)Ｔｗｅｅｎ−２０)で３回処理し、次いで望ましい組成の緩衝液(例えば１０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.０)、０.１mM  ＥＤＴＡおよび０.１％(ｖ／ｖ)Ｔｗｅｅｎ−２０)に懸濁した。微小球体の最終体積は合成中に見られたのと異なるかもしれず、ヒドロゲル懸濁緩衝液の条件により変わる。
【０１５８】
微小球体を、長期間、例えば、４℃で、１０mM  ＥＤＴＡ含有溶液または−２０℃で５mM  ＥＤＴＡおよび５０％グリセロール含有溶液で保存できた。
【０１５９】
微小球体内またはその表面上への核酸またはプライマーの取り込みは、例えば、プライマーに存在する官能基および／または微小球体が形成された物質による。非限定的例として、５’末端にアクリル系ホスホラミダイトを含む核酸は、重合工程中、ある微小球体のポリアクリルアミドメッシュに取り込まれ得る。他の例として、acrydite修飾オリゴヌクレオチドはチオール基と共有結合的に反応でき、そうして、チオール基を有する微小球体はacrydite修飾オリゴヌクレオチドに結合できる。他の例においては、アミノ基を有するオリゴヌクレオチドは、ある微小球体のカルボキシ基と共有結合的に反応できる。さらに他の例において、ビオチン基を有するオリゴヌクレオチドは、ストレプトアビジン被覆微小球体に結合できる。さらに他の例において、粒子は、タグに存在するあるオリゴヌクレオチド配列を認識できる抗体または抗体フラグメントを含み得る。[主文に移動]それゆえ、微小球体内／上への核酸の異なるタイプの取り込みが可能である。
【０１６０】
ある態様において、標的核酸(例えばＲＮＡまたはＤＮＡ)の捕獲、増幅(例えばＴ７プロモーター配列またはＰＣＲプライマーのハイブリダイゼーション部位運搬)および／または配列決定のための配列を含むプライマーＰ１を使用し得る。他の態様において、Ｐ１プライマーは光開裂可能部位を有する。
【０１６１】
ある態様において、Ｐ１プライマーの構造(５’から３’方向)は、次のものである。アクリル系ホスホラミダイト−光開裂可能スペーサー−Ｔ７プロモーターのヌクレオチド配列−配列決定用ヌクレオチド配列(ＰＥ１)。
【０１６２】
他の態様において、ＤＮＡプライマーの第一プールからのＤＮＡプライマーＮ１の構造(５’から３’方向)は、次のものである。アダプター配列(Ｐ２)−バーコード配列−ＰＥ１に相補的なヌクレオチド配列。
【０１６３】
他の態様において、ＤＮＡプライマーの第二プールからのＤＮＡプライマーＮ２の構造(５’から３’方向)は、次のものである。目的の配列(Ｐ３)−バーコード配列−Ｐ２に相補的なヌクレオチド配列。
【０１６４】
ある場合、Ｐ１プライマーを運搬する微小球体を、Ｎ１プールに等しく分けてよく、各プールを、Ｎ１の異なるＤＮＡ鋳型の一つとハイブリダイズでき、これは(３’末端から５’末端で連続的に)：ＤＮＡＰ１プライマーとの二本鎖形成を可能とするＰ１プライマーの一部または全てに相補的なＤＮＡ配列；同じプールの全分子について同一である６超の規定したヌクレオチドからなるＮ１の一意的な核酸バーコードの一つ；所望により、同じプールの分子間で異なる５超のランダムヌクレオチドからなるランダム核酸配列；およびその後のバーコーディングのためのハイブリダイゼーション部位として使用できるＤＮＡ配列(Ｐ２)を有する。Ｐ２配列は、後の工程における配列決定反応をプライミングするために使用する配列を含み得る。
【０１６５】
Ｎ１プールの各々で、各プールにおける鋳型ＤＮＡフラグメントのコピーによりＰ１核酸フラグメントの伸長に至る酵素反応を行ってよい。ある場合、例えば、重合反応の代わりに、ライゲーション反応を使用できる。
【０１６６】
酵素反応を、ＥＤＴＡ、バナジウムのような阻害剤の添加または他の手段により停止させ得る。
【０１６７】
微小球体を、一緒にプールしてよく、所望により酵素もしくは何らかの過剰な鋳型分子を除去するために洗浄してよい。
【０１６８】
微小球体上のＤＮＡフラグメントを、例えば、変性による鋳型分子の除去により、例えば０.１Ｍ  水酸化ナトリウムで微小球体を反復洗浄することによりまたは他の技術により、一本鎖ＤＮＡに変換し得る。
【０１６９】
今はＰ２配列で終了する微小球体を、Ｎ２プール(一般にＮ２＝Ｎ１であるが、これは必須ではない)に等しく分けてよく、各プールを、Ｎ２の異なるＤＮＡ鋳型の一つとハイブリダイズでき(工程(２)のように)、これは(３’末端から５’末端で連続的に)：ＤＮＡＰ２プライマーとの二本鎖形成を可能とするＰ２プライマーの一部または全てに相補的なＤＮＡ配列；同じプールの全分子について同一である６超の規定したヌクレオチドからなるＮ２の一意的な核酸バーコードの一つ；同じプールの分子間で異なる５超のランダムヌクレオチドからなるランダム核酸配列；および、例えば、その後の伸長のためのハイブリダイゼーション部位としてまたは単一細胞分析操作(例えばＤＮＡまたはＲＮＡ分子の捕獲)に使用するプライマー配列として使用し得るＤＮＡ配列部位(Ｐ３)。
【０１７０】
ある態様において、これらの工程のいくつかを繰り返してよい。
ある場合、プライマーＰ１、続く第一バーコード、続く配列Ｐ２、続く第二バーコード、続く配列Ｐ３をコードする一本鎖ＤＮＡフラグメントを運搬する微小球体を製造し得る。一意的な微小球体プールの数はＮ１≠Ｎ２である(図１０および１１も参照)。
【０１７１】
ある場合、製造した微小球体を長期間貯蔵し、その後の適用における試薬として使用できる。
必要であれば、Ｎ３,４...バーコード鋳型の付加的プールを用いてさらに繰り返し、各々バーコードおよび配列Ｐ４、Ｐ５などを添加する。一意的な微小球体プールの数は、各工程でＮ１≠Ｎ２≠Ｎ３≠...に増加し得る。
【０１７２】
所望により、微小球体の全てを、(３’末端から５’末端で連続的に)：ＤＮＡＰ３(またはＰ４、Ｐ５など)プライマーと二本鎖の形成を可能にする最終Ｐ３(またはＰ４、Ｐ５など)プライマーの一部または全てに相補的なＤＮＡ配列および単一細胞分析操作(例えば特異的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子の捕獲)のための特異的プライマー配列として使用し得るＭ配列Ｓ１...ＳＭの一つを有するＭ  ＤＮＡ鋳型の混合物と一緒にハイブリダイズできる。これらの工程を繰り返してよい。これは、各々、上記配列であるが、現在、最終のＭの可能な配列Ｓ１...ＳＭ以外同一であるＭ種の分子に属するＤＮＡフラグメントを運搬する、同じ数のＮ１≠Ｎ２≠Ｎ３≠...プールの微小球体を産生し得る。
【０１７３】
ある場合、これは、ｓｓＤＮＡフラグメントで被覆された微小球体の産生に至り、この各々は、次の順番でコードする(５’から３’で)：例えば、核酸増幅および配列決定のために、しかし、これに限定されない用途の部位として使用できるＴ７プロモーター部位およびプライマー部位ＰＥ１を含む、Ｐ１プライマー；単一ビーズをコートする全プライマーについて同一であるが、ビーズ間で異なる２以上のＤＮＡバーコード(各６以上のヌクレオチドからなる)；所望により、分子特異的ＤＮＡバーコード(５以上のランダムヌクレオチドからなる)；逆転写またはＰＣＲ増幅のために単一細胞におけるＤＮＡまたはＲＮＡの配列決定または／およびハイブリダイゼーションのためのプライマーとして使用できるＰ２“プライマー部位２”；逆転写またはＰＣＲ増幅のために単一細胞におけるＤＮＡまたはＲＮＡの配列決定または／およびハイブリダイゼーションに使用できるＰ３“プライマー部位３”。一つのＰ３フラグメントはまた複数の遺伝子特異的プライマー(ＧＳＰ)の一つをコードでき、そうして複数のｓｓＤＮＡフラグメントで被覆された各ビーズはＧＳＰの全てを含む。
【０１７４】
バーコード化ＤＮＡプライマーを運搬する微小球体を、例えば、単一細胞におけるＤＮＡまたはＲＮＡの配列決定または／およびハイブリダイゼーション、逆転写またはＰＣＲ増幅およびＤＮＡ捕獲、増幅および配列決定を含む他の適用のための試薬として使用できる。
【０１７５】
図７は、バーコード配列およびプライマー部位ＰＥ１＊およびＰ２＊を運搬する一本鎖ＤＮＡ(ｓｓＤＮＡ)プライマーのプールとハイブリダイズするＰＥ１プライマーを運搬する微小球体を記載する。この実施例において、プライマーを、次にＤＮＡポリメラーゼを使用して伸長する。次いで、伸長プライマーをｓｓＤＮＡに変換する(例えば温度上昇またはアルカリ溶液を使用)。得られたｓｓＤＮＡプライマーを、次いで、第二バーコード配列およびプライマー部位Ｐ２＊およびＰ３＊を運搬するプライマーの第二プールとハイブリダイズさせる。プライマー伸長およびｓｓＤＮＡへの変換後、微小球体を、異なる適用、例えば、サンプル中の核酸捕獲および配列決定を目的とした適用に使用できる。
【０１７６】
図８は、本発明のある態様による、ＤＮＡ運搬微小球体の製造に使用する微小流体デバイスの概略図および設計を記載する。この実施例におけるデバイスは、担体油用の一つの入口および試薬用の一つの入口を含む。液滴を、２相が合う流れ集約接合部で産生する。液滴を収集物出口で収集する。
【０１７７】
図９Ａおよび９Ｂは、本発明のある態様により製造した、ＤＮＡ運搬微小球体の明視野画像である。この実施例において、微小球体は、ポリアクリルアミドヒドロゲルおよびポリマーメッシュに結合したＤＮＡプライマーからなる。スケールバーは５０μmである。
【０１７８】
図１０は、他の態様における、バーコード化ＤＮＡプライマーを運搬する微小球体のＤＮＡ伸長効率を記載する。図１０Ａは、ＦＡＭ蛍光プローブを有するＰＥ１部位とハイブリダイズしたＤＮＡを有する微小球体を示し、図１０Ｂは、ＦＡＭ蛍光プローブを有するＰ２部位とハイブリダイズしたＤＮＡを有する微小球体を示す。図１０Ｃは、蛍光プローブを有するＰ３部位とハイブリダイズしたＤＮＡを有する微小球体を示す。これらの結果は、ＤＮＡ伸長がヒドロゲル微小球体内で起こり得ることを示す。
【０１７９】
図１１は、さらに別の態様における、１１の個々の微小球体からのＤＮＡフラグメントのハイスループット配列決定を記載する。平均１４０,０００分子を、各微小球体から配列決定した。プロットは、これらの(“プライマー”)フラクションが、３８４２の可能なバーコードから、各微小球体上に同じバーコードを運搬することを示す。バーコードの同一性は、微小球体の各々で異なる。各千は１微小球体に対応する。理想的な条件下、各微小球体上の１００％のＤＮＡフラグメントが同じバーコードを運搬し、０％が第二、第三または他のバーコードを運搬する。このサンプルで達成された平均は、９２％のＤＮＡフラグメントが同じバーコードを運搬する。
【０１８０】
実施例３
この実施例は上記のように合成したＤＮＡバーコード化微小球体を使用し、次の配列要素(５’から３’)を有する次の一本鎖ＤＮＡフラグメントを運搬する微小球体を得た。例えば、核酸増幅および配列決定のために、しかし、これに限定されない用途の部位として使用できるＴ７プロモーター部位およびプライマー部位ＰＥ１を含む、Ｐ１プライマー；単一ビーズをコートする全プライマーについて同一であるが、ビーズ間で異なる２以上のＤＮＡバーコード(各６以上のヌクレオチドからなる)；所望により、分子特異的ＤＮＡバーコード(５以上のランダムヌクレオチドからなる)；逆転写またはＰＣＲ増幅のために単一細胞におけるＤＮＡまたはＲＮＡの配列決定または／およびハイブリダイゼーションのためのプライマーとして使用できるＰ２“プライマー部位２”；逆転写またはＰＣＲ増幅のための単一細胞におけるＤＮＡまたはＲＮＡの配列決定または／およびハイブリダイゼーションのためのプライマーとして使用するＰ３“プライマー部位３”。
【０１８１】
この実施例において、ＤＮＡバーコード化微小球体合成後、微小球体をプールし、次いで(３’末端から５’末端で連続的に)：ＤＮＡＰ３プライマーと二本鎖の形成を可能にする最終Ｐ３プライマーの一部または全てに相補的なＤＮＡ配列および特異的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子の捕獲のような単一細胞分析操作のための特異的プライマー配列として使用するＳ１...ＳＭの一つを有するＭ  ＤＮＡ鋳型の単一混合物とハイブリダイズする。これらの工程を繰り返し、各々、１に特定した配列を運搬するが、現在、最終のＭの可能な配列Ｓ１...ＳＭ以外同一であるＭ種の分子に属するＤＮＡフラグメントを運搬する、同じ数の微小球体のＮ１×Ｎ２プールを生じ得る。
【０１８２】
ある場合、ＤＮＡ微小球体を、他の方法に従って合成してよく、上記と同じ配列を有する微小球体を得る。
【０１８３】
実施例４
この実施例は、溶解細胞からのｍＲＮＡの相補的ＤＮＡへの逆転写(ＲＴ)が、３nL／細胞より少ない反応体積で強く阻害されるようになることを示し、具体的に反応収率Ｙは、液滴体積Ｖの一次阻害に従い、すなわちＹ＝１／(１＋Ｋ５０／Ｖ)であり、ここで、Ｋ５０＝１〜３.３nLが、試験した少なくとも３つの異なる培養株(ＭＣＦ７、Ｋ５６２およびＴＨＰ−１細胞)で５０％阻害が生じる体積である。比較として、液滴微小フルイディクスでの現在の研究のほとんどが、１０〜１００pL体積の体積で液滴に細胞を封入することに焦点を絞っている。そのような体積で、逆転写反応はひどく阻害される。
【０１８４】
図６は、本発明のある態様による、最適液滴体積のバルク試験を記載する。
この実施例において、微小流体体積における単一細胞上の反応有効性の試験を、単一液滴内の条件を模倣するように調節し得る５μl以上の反応混合物を含む反応ウェルにおいて液滴条件を模倣することにより、実施できる。
【０１８５】
サイズＶの微小流体体積を模倣するために、インタクトな細胞を、バルク反応に１細胞／体積Ｖの最終濃度で添加する。従って、４nL液滴内の単一細胞は、２５０細胞／μlの濃度の細胞溶解物を用いる反応の実施に対応する。
【０１８６】
さらに、サイズＶの微小流体体積を模倣するために、各々μMの試薬を運搬する微小球体の使用によるような、液滴に直接投与されるあらゆる試薬について、試薬を、バルク反応に体積ＶあたりμMの最終濃度で添加する。例えば、１fMのＤＮＡフラグメントを、４nL液滴内に微小球体に送達するならば、同じＤＮＡフラグメントを、０.４２μM濃度でバルク反応に添加する。
【０１８７】
バルク反応は、最適反応条件を特定するために、１２ウェル、９６ウェルまたは３８４ウェル形式で並行して実施できる。
このような診断テストは、バーコーディングのための液滴サイズおよび組成の最適化のための迅速方法を提供し得る。例えば、試験した３細胞株で、液滴が３nL体積より少ないとき、バーコーディング反応の強い阻害が観察された。図１２参照。
【０１８８】
実施例５
健常および疾患組織の遺伝子発現を解釈するために、全細胞で遺伝子発現変化をマップすることが生物学者の夢である。このようなデータで、不均一細胞亜集団を特定および追跡し、遺伝子と経路の制御的相関を推測したいと願う。ＲＮＡ配列決定のような“オーミクス”法が、単一細胞の分析に利用されているが、律速的であるのは、徹底的ＲＮＡ配列決定のための多数の個々の細胞を日常的に単離および処理する有効な方法および定量的にそれを行う方法である。この実施例は、その後の次世代配列決定によるプロファイリングのための数千の個々の細胞の並行バーコーディングのための液滴−微小流体法である。これは、低ノイズプロファイルを示し、他の配列決定ベースのアッセイに用意に応用できる。これらの例は、ＥＳ細胞集団構造およびＬＩＦ中止によるＥＳ細胞分化の不均一発生を規定するためのマウス胚性幹(ＥＳ)細胞にこの技術を適用する。これらの結果は、ハイスループット単一細胞データで細胞集団分解および遺伝子発現相関推測するための液滴バーコーディングの適用を示す。
【０１８９】
これらの実施例は、その後の次世代配列決定によるプロファイリングのための数千の個々の細胞の並行バーコーディングの新規技術を開発するために液滴微小フルイディクスを利用する(液滴−Ｓｅｑ)。これらの実施例で使用される実装は、数万の細胞を一ランでバーコードする理論容量を有するが、実際問題としていくつかの実験では、配列決定深さが極めて高細胞数で限定的となるため、ランあたり数百〜数千の細胞のランに焦点を絞っている。これらの実施例は、ＬＩＦ中止前後のマウス胚性幹(ＥＳ)細胞のプロファイリングによる液滴−ＳＥＱを評価する。合計１０,０００を超えるバーコード化細胞および対照液滴をプロファイルし、その後の分析のために大きな深さで配列決定された、約３,０００ＥＳおよび分化細胞を用いる。次の分析は、数百細胞のプロファイリングから分類が困難であろう異なる分化系列のマーカーを発現する稀な亜集団の存在を特定する。重要な多能性因子はＥＳ細胞集団全体で相関的方法で上下することが判明し、このような上下を新規因子と多能性状態の相関させるために使用できるはずである可能性を探索した。分化により、多能性因子の活性化の非同調性に起因する、劇的変化が、遺伝子発現揺らぎの相関構造および新規細胞状態の出現で観察された。合わせて、これらの結果は、細胞集団を分解し、一実験で遺伝子発現相関を推測するための液滴−ＳＥＱの可能性を示す。
【０１９０】
液滴バーコーディングおよび単一細胞の分析のための微小流体プラットフォームの設計および実装。ｍＲＮＡが逆転写反応中にバーコード化され、細胞は、配列決定のために実質的にプールされ、処理されるＲＮＡ配列決定(ＲＮＡ−Ｓｅｑ)のためのプロトコールを使用した(図１３Ａ)。このために、液滴−ＳＥＱプラットフォーム(図１３Ａ〜１３Ｅおよび図１８)は、溶解緩衝液、逆転写(ＲＴ)試薬およびバーコード化オリゴヌクレオチドプライマーと共に細胞を液滴に封入した。各溶解細胞から遊離したｍＲＮＡｄは同じ液滴に捕捉されたままであり、相補的ＤＮＡ(ｃＤＮＡ)合成中にバーコード化された。バーコーディング後、全細胞からの物質を液滴破壊により混合し、ｃＤＮＡライブラリーを配列決定のために処理した(図１３Ａ)。
【０１９１】
この戦略を実行する一つの障壁は、各液滴が、他の液滴におけるバーコードと異ならなければならない、同じ一意的なバーコードをコードするプライマーを運搬することを確実にすることであった。この障壁は、細胞と共封入されたバーコード化ヒドロゲル微小球体(ＢＨＭ)のライブラリーの合成により克服した(図１３Ｂ)。各ヒドロゲルは、３８４２(すなわち１４７,４５６)の所定のバーコードの一つをコードする共有結合した、光遊離可能プライマーを運搬した。このプールサイズは、無作為に３,０００細胞を９９％一意的なに標識し、１０,０００細胞を９７％一意的に標識することを可能とした(下記参照)。図１９〜２１は、スプリット−プール法を使用してＢＨＭを合成するために使用した方法を記載する；下記参照。これは、大規模細胞捕獲、例えば標的配列決定適用のために多数のバーコードを製造するために直接的な方法で拡大できる。
【０１９２】
ＢＨＭと細胞を共封入するために、ｉ)ＢＨＭ、ii)細胞、iii)ＲＴ／溶解剤およびiv)担体油のための４入口および液滴収集物のための１出口を備えた微小流体デバイスを使用した(図１３Ｃ〜１３Ｄ)。デバイスは、入口からのアリコートを同時に混合しながら、秒あたり約１０〜５０液滴の速度で１〜５nLの範囲で変わる単分散液滴を産生した(図１３Ｅ)。最密充填変形可能ヒドロゲル内部チップは効率的に合成され、約１００％ヒドロゲル液滴占有率を可能とした。この特性は、液滴内に到達した無作為に分散した細胞がほぼ常にＢＨＭに暴露されることを確実とした。典型的条件において、細胞濃度を１０％の液滴しか占拠しないように設定し、２細胞事象の低可能性を確実とした(図１３Ｅ)。これらの実験において、液滴は、少なくとも１細胞および１ゲルを含み配列決定のための、バーコード化ライブラリーを製造した。一般に、９０％を超える生産的液滴は、正確に１細胞および１ゲルを含む(図１３Ｆ)。ＲＴ反応の効率も、溶液またはＢＨＭに結合したままのプライマーで試験し、プライマー遊離が液滴中の溶解細胞からの効率的ＲＴ反応に重要であることが判明した(図１３Ｇ)。それゆえ、ＲＴ反応前に、ＢＨＭ結合プライマーを、ＵＶ光に曝すことにより液滴から光遊離させた(図１３Ａ)。
【０１９３】
これらの実施例において、極めて浅い配列決定深さを避けるために数百〜数千細胞のサンプルを配列決定したが、これをまた、例えば、４,０００〜６,０００細胞／時間のスループットで、高細胞数を容易に捕獲およびバーコードためにも使用できた。実際、配列決定後、バーコード化サンプルの数は、一般に収集したエマルジョン体積と直線的に縮尺し(図１３Ｈ)、約２,０００〜３,０００細胞または対照液滴が、エマルジョン１００μl毎にバーコード化された(約３０分収集時間)。
【０１９４】
図１３は、数千の細胞のＤＮＡバーコーディングのための液滴微小流体プラットフォームの実施例を示す。図１３Ａは、液滴−ＳＥＱワークフローの概要を示す；オンチップ操作が第一の３ボックスで起こり、オフチップ操作が次の３ボックスで起こり、配列決定／データ分析が最後の２ボックスで起こる。図１３Ｂは、ＤＮＡバーコード化ヒドロゲル微小球体(ＢＨＭ)(大きな丸)と細胞(小さな丸)およびＲＴ／溶解混合物を合わせる微小流体デバイスの概略図である。ＢＨＭプライマーレジェンド：ＰＣ＝光開裂可能リンカー；Ｔ７＝Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター；ＰＥ１＝配列決定プライマー；ＢＣ＝ＢＨＭ特異的バーコード；ＵＭＩ＝一意的な分子識別子。図１３Ｃは、微小流体デバイス設計を示す。図１３Ｄは、封入(右)および収集物(左)のための微小流体モジュールのスナップショットを示す。細胞およびＢＨＭは下矢印および上矢印でそれぞれ注釈を付ける。他の矢印は流れの方向を示す。スケールバー、１００μm。図１３Ｅは、経時的液滴占有率の統計を示す。図１３Ｆは、細胞およびＤＮＡバーコーディングビーズ共封入事象の統計を示す。９０％超の細胞が、単一ＤＮＡバーコーディングビーズと封入される。図１３Ｇは、逆転写前(上部曲線)または後(下部曲線)にビーズから光遊離されたプライマーで製造したライブラリーのBioAnalyzerトレースを示す。図１３Ｈは、純粋ＲＮＡおよびｍＥＳ細胞で検出されたバーコードの数を示し、２,１５９細胞が１００μlエマルジョンあたり収集された(３０分収集時間)。
【０１９５】
図１８は、この実施例において使用した液滴微小フルイディクスデバイスの設計を示す。デバイスは、ＲＴおよび溶解剤混合物(１)、細胞懸濁液(２)、ＤＮＡバーコーディングビーズ(３)のための３入り口および連続相のための１入口(４)を含む。デバイスに統合された流体レジスターは、シリンジポンプの機械的不安定性に起因する揺らぎを弱める。アリコートサンプルを、６０μm幅広チャネルを経て、主７０μm幅広チャネルに合わせ、そこで、それらは層流状に流れて、その後流れ集約接合部で液滴に封入される(点線四角)。液滴は、出口(５)でエマルジョンの形で収集される。
【０１９６】
図１９は、ＤＮＡバーコーディングヒドロゲルビーズの製造のための液滴微小フルイディクスデバイスの設計を示す。図１９Ａは、デバイスの設計例を示す。デバイスは、水相(試薬)用１入口および連続相(担体油)用１入口を含む。単分散ヒドロゲル液滴は、流れ集約ノズルで製造され、それらの寸法は右の点線四角に示す。液滴を、２０００μm長チャネルで界面活性剤により安定化させ、エマルジョンの形で出口で収集する。図１９Ｂは、ヒドロゲル液滴製造、安定化および収集物のデジタル画像を示す。微小流体チャネルは５０μm深さである。スケールバーは１００μmを意味する。
【０１９７】
図２０は、ＤＮＡバーコーディングビーズの合成を示す。図２０Ａは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター(配列の左)およびＰＥ１プライマー部位(配列の右)を運搬するＤＮＡプライマーの５’末端に結合した、アクリル系ホスホラミダイト部分(左)および光開裂可能スペーサー(右)を含むＤＮＡオリゴヌクレオチドの構造を示す。図２０Ｂは、バーコード化ヒドロゲル微小球体合成の概略図を示す。第一工程において、ポリアクリルアミドヒドロゲルに結合したｓｓＤＮＡプライマーは、ＰＥ１＊およびＷ１＊プライマー位置およびＤＮＡバーコードの最初の半分を運搬する相補的ＤＮＡオリゴヌクレオチドとハイブリダイズした。得られたＤＮＡヘテロ二本鎖を、Ｂｓｔ  ２.０  ＤＮＡポリメラーゼによりｄｓＤＮＡに変換し(点線が新たに合成されたＤＮＡ鎖を示す)、アルカリ処理により変性させてｓｓＤＮＡに戻した。第二工程において、工程を、Ｗ１＊配列、ＤＮＡバーコードの残り半分、一意的な分子識別子(ＵＭＩ)およびポリＡ配列を運搬する第二ＤＮＡオリゴヌクレオチドで繰り返した。プライマー伸長および変性後、ＤＮＡバーコーディングビーズはＴ７プロモーター、ＰＥ１プライマー部位、ＤＮＡバーコード、Ｗ１部位、ＵＭＩおよびポリＴ配列を含んだ。図２０Ｃは、完全に構築されたプライマーのＤＮＡ配列を示す。強調した文字は、Ｔ７プロモーター
【表１】
2017515469.tif 000003
ＰＥ１プライマー部位
【表２】
2017515469.tif 000004
２ＤＮＡバーコード([バーコード１]および[バーコード２])、Ｗ１アダプター部位
【表３】
2017515469.tif 000005
ＵＭＩ
【表４】
2017515469.tif 000006
およびポリＴテイル
【表５】
2017515469.tif 000007
を有するオリゴヌクレオチドの異なるパーツを示す。アクリル系ホスホラミダイトおよび光開裂可能スペーサーの化学部分はそれぞれ／５Ａｃｒｙｄ／および／ｉＳｐＰＣ／で示す。[バーコード１]および[バーコード２]のＤＮＡ配列は各８ヌクレオチド長である。
【０１９８】
図２１は、バーコード化ヒドロゲル微小球体(ＢＨＭ)に取り込まれたＤＮＡプライマーの定量化を示す。図２１Ａ〜２１Ｄは、ＢＨＭ後合成のiImagingを示し、ＢＨＭ  ６３μmサイズの明視野像(図２１Ａ)およびＰＥ１配列を標的とする相補的ＤＮＡプローブでのハイブリダイゼーション後の蛍光共焦点イメージング(図２１Ｂ)、Ｗ１配列(図２１Ｃ)およびポリＴ配列(図２１Ｄ)を示す。スケールバー、１００μm。図２１Ｅは、ＢＨＭから光開裂後のＤＮＡプライマーのBioAnalyzer電気泳動図を示し、完全長バーコード(大ピーク)ならびに合成中間体(２小ピーク)の存在を示す。３５および１０３８０塩基対のピークは、ゲル移動マーカーである。ピーク上の数値は、塩基対の理論的フラグメントサイズを示すが、これらは一本鎖ＤＮＡ産物で正確ではない。図２１Ｆ〜２１Ｈは、１１の個々のＢＨＭのバーコード化産物の深配列決定の結果を示す。図２１Ｆは、各ゲル上のバーコード存在量のランクプロットを示す；図２１Ｇおよび２１Ｈは、図２１Ｇおよび図２１Ｈに詳述する最も豊富なおよび二番目に豊富なバーコードによる各ＢＨＭ上に占拠されたフラクションのヒストグラムを示す。完全合成は、トップバーコードによる１００％占拠および他の全てのバーコードによる０％占拠となる。平均約９２％の各ＢＨＭに結合した全プライマーが同じドミナントバーコードを運搬することが観察された。
【０１９９】
実施例６
ランダムバーコーディングおよび液滴完全性の確認。この実施例において、マウスおよびヒト起源(マウスＥＳ細胞およびＫ５６２赤白血病細胞)由来の細胞の混合物をほぼ等比で適用することにより、液滴−Ｓｅｑプラットフォームが、効率的に細胞を区画化し、バーコードする能力を試験した(図１４Ａ)。この試験において、各バーコードは、マウスまたはヒトマッピング転写物と完全に関連していなければならず、わずかに小フラクションの２細胞事象が、マウスおよびヒト両者と関連するバーコードの見かけに到った。配列決定後、図１４Ａは、液滴−ＳＥＱが複合体細胞混合物中の細胞の明白な特定を提供することを示す：９６％のバーコードタグ付読取データは、マウスまたはヒトトランスクリプトームのいずれかにマッピングされ、９９％を超える純度であり、４％のバーコードしか両成分の混合を示さなかった。この既に低い誤り率は、共封入事象を低下させるために細胞懸濁液を希釈することによりまたは多細胞事象を除去するために収集前の液滴のオンチップ選別によりさらに低減できた。
【０２００】
また明白に試験されたのは、細胞バーコードが、反復バーコードの極めて低い確率を確実にするための３８４２の可能なバーコードの意図したプールから無作為にサンプルされたことであった。計１１,０８５対照液滴および細胞をカバーする８の独立したランでのバーコードアイデンティティの比較は、３８４２バーコードのプールからのランダムサンプリングとの優れた一致を一貫して示した(図２２Ａ)。
【０２０１】
図１４は、液滴完全性およびランダムバーコーディングの試験を示す。図１４Ａは、液滴完全性対照実験の概略図および結果を示す：マウスおよびヒト細胞を共封入して、複数細胞にわたり共有されるバーコードの明白な特定を可能とした；４％のバーコードが、マウス／ヒト読取データで混合されて共有された。
【０２０２】
図２２は、ランダムバーコーディングおよび一意的な分子識別子(ＵＭＩ)フィルタリングを示す。図２１Ａは、１４０〜２,９３０細胞または純粋ＲＮＡ対照液滴をカバーする８液滴−Ｓｅｑランのランダムバーコーディングの対での試験を示す。上部三角は、３８４２ランダムバーコーディングの各対のランについての共有バーコードの観察(左)および予測(右)数を示す。下部三角は、３８４２バーコードのプールからの均一ランダムバーコーディングを仮定するｐ値を示し、これは観察された数の共有バーコードが期待値について超幾何学的分散すべきであることを予測する。ｐ値は、試験した複数の仮説に対して補正していない。図２２Ｂ〜２２ＤはＵＭＩフィルタリングを示す。図２１Ｂは、検出ｍＲＮＡ分子数の関数としての観察ＵＭＩの期待値(黒曲線)が
【数１】
2017515469.tif 000008
を有することを示し得ることを示し、ここで、ｍは検出ｍＲＮＡ分子数であり、ＮＵＭＩ＝４,０９６は利用可能なＵＭＩプールの総サイズである。この関数は理想の直線相関(ほぼ直線)と対照をなし、飽和点を示す。図２２Ｃは、単一ｍＥＳ細胞からのデータのマッピング読取データ数対異なるＵＭＩ数／遺伝子を示し；データ点は一意的な遺伝子記号に対応する。曲線は増幅バイアスがないことを示し、すなわち各マッピング読取データが異なるＵＭＩに対応するところを示す。大部分の遺伝子はいくぶん増幅バイアスを示す。図２２Ｄおよび２２Ｅは、ＵＭＩフィルタリングなし(図２２Ｄ)およびＵＭＩフィルタリング後(図２２Ｅ)の、ｍＥＳ細胞集団において検出された遺伝子の平均転写物存在量の関数としての細胞間ＣＶ(標準偏差／平均)のｌｏｇ−ｌｏｇプロットを示す。各データ点は単一遺伝子記号に対応する。
【０２０３】
実施例７
液滴−ＳＥＱプラットフォームのベースライン技術的ノイズ。単一細胞ＲＮＡ−Ｓｅｑにおける技術的ノイズの２つの源は、(ａ)ｍＲＮＡ捕獲効率の細胞間の可変性、(ｂ)各細胞における有限数のｍＲＮＡ転写物の捕捉に起因する内因性サンプリングノイズである。ＣＥＬ−Ｓｅｑプロトコールは、マイクロタイタープレートで実施するとき、約４％以下の低捕獲効率および純粋ＲＮＡ対照で約２５％および細胞で約５０％の捕獲効率の可変性(サンプル間の変動係数)に悩まされると報告されている。単一細胞配列決定データに対する生物情報学分析の影響についてはほとんど知られていないが、偽遺伝子対相関に至る複数の遺伝子に対する不明瞭な読取に起因する問題が生じ得る可能性がある。技術的ノイズはまたライブラリー増幅中にも生じ得るが、このノイズ源は、重複読取データの生物情報学的除去を可能にするランダムな一意的な分子識別子(ＵＭＩ)配列の使用により大部分排除される。この実施例は、全実験でランダムヘキサマーを使用するＵＭＩベースのフィルタリングの実装が、方法ノイズの有意な減少をもたらすことを説明する(図２２)。
【０２０４】
このシステムにおける技術的ノイズがどのように先のＣＥＬ−Ｓｅｑの適用と匹敵するかを試験するために、既知濃度のＥＲＣＣ  ＲＮＡ添加対照と混合した、単一細胞濃度(１０pg／液滴)に希釈した総ＲＮＡを含む、技術対照サンプルを分析した(図１４Ｂ)。９５３バーコード化対照液滴が、一ランで配列決定され、液滴あたり平均３０×１０３(±２１％)ＵＭＩフィルターマッピング(ＵＭＩＦＭ)読取データであった(図１４Ｂ)。５０００〜１５,０００の一意的な遺伝子記号が各液滴で検出され(計２５,２０９検出)、数はＵＭＩＦＭ数と強く相関した(図１４Ｃ)。これは、平均０.５分子／液滴の濃度まで低下したＥＲＣＣ添加投入濃度(図１４Ｄ)と比較して、ＵＭＩＦＭ数の優れた線形読取情報を示し；この限界以下で、観察転写物が多めに計数される傾向がわずかにあった。
【０２０５】
方法性能の他の重要な指標は感受性、すなわち発現遺伝子を検出する可能性である。感受性は、ほとんど完全に転写物存在量の関数であり(図１４Ｅ)、ｍＲＮＡ分子の全般的捕獲効率に基づき、全遺伝子について果然に良好に予測され(下記参照)、ＥＲＣＣ添加から７.１％であると測定された(図１４Ｄ)。この捕獲効率で、遺伝子を、１０転写物が存在するとき５０％の液滴および＞４５転写物が存在するとき＞９５％の液滴で検出した(図１４Ｅ)。この感受性および捕獲効率は、ＣＥＬ−Ｓｅｑで先に測定されたものより高かった(３.４％)。
【０２０６】
正確には、細胞集団をその平均発現レベルにわたり各遺伝子の変動係数(ＣＶ＝標準偏差／平均)を比較することにより評価できる、極めて低レベルの技術的ノイズを示した(図１４Ｆ)。サンプリングノイズによってのみ制限されるシステムにおいて、全遺伝子は、べき法則曲線ＣＶ＝(平均)−１／２について狭く分散しているべきである(図１４Ｆ)。これは、実際観察された。より公式には、正規化後、９９.５％の検出遺伝子(Ｎ＝２５,２０９)が、ベースライン技術的ノイズ５〜１０％でポアソン分布に一致して分布した(図１４Ｆ、点線の曲線)。
【０２０７】
図１４Ｂは、ＲＮＡ−Ｓｅｑ技術的対照実験のための実験的概略図およびＵＭＩフィルターマッピング(ＵＭＩＦＭ)読取データのヒストグラムを示す。図１４Ｃは、液滴あたりＵＭＩＦＭ読取データの関数として検出された一意的な遺伝子記号数を示す。図１４Ｄは、添加分子の平均ＵＭＩＦＭ読取データは、その投入濃度と直線的に相関し、捕獲効率β(ベータ)＝７.１％であることを示す。図１４Ｅは、投入ＲＮＡ存在量の関数としての方法感受性を示し；曲線は、内因性サンプリングノイズのみの仮定から導かれる理論予測を示す。図１４Ｆは、正規化後平均ＵＭＩＦＭ数に対してプロットした添加および純粋ＲＮＡ転写物の変動係数(ＣＶ)を示す。曲線はサンプリングノイズ限界を示す；点線の曲線は、捕獲効率５％で残留液滴対液滴可変性を有するサンプリングノイズ限界を示す。
【０２０８】
実施例８
単一細胞データのノイズモデリング。単一ＥＳ細胞データの予測において、この実施例は、バルク測定と比較して、細胞あたりベースで測定したときの、転写物の低サンプリング効率の影響をよりよく理解するための技術的ノイズモデルを示す。低効率は、細胞間の遺伝子発現の観察された可変性および細胞間の遺伝子発現の共変動の両者に影響を有する。３つの特徴が影響に起因する：全細胞で平均化した転写物の捕獲効率；捕獲効率における細胞対細胞変動；および正規化スキームの選択。先のノイズモデルを精密化することにより、生物学的量および観察された量の間の相関が、細胞にわたる遺伝子存在量のＣＶ、遺伝子ファノ因子(分散／平均)および遺伝子間の対相関について導かれた(図１４Ｇ；下記参照)。ファノ因子は、ノイズの多い遺伝子発現の測定に一般に使用される計量であり、なお、捕獲効率に極めて感受性である。この分析は、技術的ノイズが広く認められるように単にベースラインノイズを明らかにするだけでなく、既存の生物学的変動を擬似的に増幅させることを確認する(図１４Ｇ、式１)。図１４Ｇは、ＣＶ、ファノ因子および遺伝子対相関について観察されたおよび根底の生物学的量の相関の要約を示す。
【０２０９】
低サンプリング効率が、予測可能な方法で遺伝子対間の相関を顕著に弱め、発見の予測を相対的に弱く、しかし、データにおける顕著な相関を設定する(図１４Ｇ、式２〜３)。相対的に弱い相関が実際であり、単一細胞測定の予測される結果であることを知ることは、非常に価値のある遺伝子の試験を含むデータからの有用な情報の導きを助ける(下記参照)。これらの結果はまた基礎的計数統計に基づく生物学的測定からのノイズの公式デコンヴォルーションのための方法を開発する基礎も提供する。
【０２１０】
さらに、予想外に遭遇および除去は、２以上の遺伝子転写物にマッピングされた読取データに由来する異常遺伝子発現相関の重要な源であった。バルク(非単一細胞)適用を意図された配列分析パイプラインは、不明瞭な読取データを、確率的にそうでなければ独立して発現される遺伝子と擬似的に結合するような方法でマッピングする。この問題は、ＵＴＲ領域が複数の遺伝子で同一であり得るため、単一細胞の３’−配列決定に特に急性であり；および擬似的に作成されたものと同等となる弱い遺伝子発現カップリングの広いネットワークにより特徴付けられるＥＳ細胞のような比較的均一な細胞集団に特に急性である。しかしながら、この問題は、強い生物学的相関があってさえ、弱化に働くため、サンプリング効率が低いときより一般的となる(図１４Ｇ、式３)。これらの実施例は、リード−マッピング問題が、マッピングにおけるあいまいさを最小化するために異なる読取データを通して反復ＵＭＩタグを利用する新規生物情報学パイプライン(下記参照)を使用して、克服された。
【０２１１】
実施例９
マウスＥＳ細胞の単一細胞プロファイリング。単一細胞プロファイリングは、極めて低い配列決定深さでさえ、異なる分化系列からの分化細胞型の特定ができる。あいまいであるのは、確率的揺らぎまたは動的環境に付されている比較的均一な集団の試験から獲得できる情報のタイプである。我々の新規方法で入手可能な情報の種類を探索するために、この実施例は、血清に維持したマウスＥＳ細胞を、これらの細胞が広く試験され、広く特徴付けられた揺らぎを示すが、分化細胞型と比較してなお均一であり、ハイスループット単一細胞配列決定についての障害を提起できたために、選択した。
【０２１２】
液滴−ＳＥＱの行動を探索するために、異なるエマルジョン体積を回収することにより、ＥＳ細胞ランの各々で、異なる数の細胞を異なる配列決定深さで回収した。９３５ＥＳ細胞；ＬＩＦ中止２日後に１４５、３０２および２,１６０細胞；４日後に６８３細胞；および７日後に１６９および７９９細胞を深配列決定のために回収した。これらのランにおける細胞あたりに得られた読取データの平均数を２０８×１０３に拡大し、平均ＵＭＩＦＭ数を２９×１０３に拡大した。ラン統計学は表１に詳述する。
【０２１３】
ＥＳ細胞集団の構造。９３５ＥＳ細胞について、１,５０７遺伝子が特定され、これは、ポアソン統計学(１０％ＦＤＲ、下記参照および表２)から予想されるより有意に可変性であり、また少なくとも１細胞における少なくとも１０ＵＭＩＦＭ数のレベルでも表した(図１５Ａ、１５Ｂ)。１,５０７の豊富なおよび可変性の遺伝子のうち、ＥＳ細胞において先に上下することが報告されていた多能性因子が見られた(Ｎａｎｏｇ、Ｒｅｘ１／Ｚｆｐ４２、Ｄｐｐａ５ａ、Ｓｏｘ２、Ｅｓｒｒｂ)。顕著なことに、最も非常に価値のある遺伝子は、Primitive Endoderm fate(Ｃｏｌ４ａ１、Ｃｏｌ４ａ２、Ｌａｍｂ１、Ｌａｍａ１、Ｓｏｘ１７、Ｓｐａｒｃ)、Epiblast fateのマーカー(Ｋｒｔ８、Ｋｒｔ１８、Ｓ１００ａ６)およびＥＳ細胞状態の後成的制御因子(Ｄｎｍｔ３ｂ)の既知マーカーだけでなく、成人幹細胞運命の制御に役割を有し得る幹細胞抗原Ｓｃａ−１／Ｌｙ６ａのようなＥＳ細胞制御との関係が未知の遺伝子も含まれた。他の遺伝子は、ポアソン統計学と一致して、極めて低いノイズプロファイルを示した(例えばＴｔｎ、図１５Ｂ)。η(イータ)＝ＣＶ２−１／μ(μまたはミューは、平均ＵＭＩＦＭ数の平均である)として定義されるポワソン超ノイズを、選択した一団の遺伝子で評価し(図１５Ｃ)、先の報告と品質的に一致することが判明した。ＣＶまたはファノ因子と異なり、η(イータ)は、サンプリング効率が低くても、その真の生物学的値と直線的に縮尺した(図１４Ｇ、式(１))。
【０２１４】
図１５は、液滴−ＳＥＱプロファイリングが、ＥＳ細胞集団の不均一構造を確認することを示す。図１５Ａは、ｍＥＳ細胞トランスクリプトーム(真ん中および上部の点)および純粋ＲＮＡ技術的対照(下の点)についての平均ＵＭＩＦＭ数に対してプロットしたＣＶを示す。黒で印をつけた遺伝子は、技術的対照より有意に可変性であるとして特定された。黒および点線の曲線は、図１４Ｆのとおりであるが、細胞実験における２０％の残留方法ノイズを伴う。可変性遺伝子のサブセットをアノテートする。図１５Ｂは、低(Ｔｔｎ)、中(Ｔｒｉｍ２８、Ｌｙ６ａ、Ｄｐｐａ５ａ)および高(Ｓｐａｒｃ、Ｓ１００ａ６)発現可変性を示す説明的遺伝子発現分布を示し、ポワソンおよび負の二項分布に適合させる。図１５Ｃは、多能性因子についてプロットし、他の因子と比較した、ポアソン超(ａ.ｐ.)ノイズ、ＣＶ２−１／平均を示す。
【０２１５】
実施例１０
ＥＳ細胞が多能性ＩＣＭ様状態とより分化したエピブラスト様状態の不均一性を示すとの考えを試験するために、この実施例は、単一ＥＳ細胞における候補多能性および分化マーカーの対照的発現を試験した。遺伝子対相関(図１５Ｄ)は、エピブラストマーカーＫｒｔ８および原始的内胚葉マーカーＣｏｌ４ａ１の両者が、Ｐｏｕ５ｆ１(示す)および他の多能性マーカー(示していない)について低い細胞においてのみ発現されたため、最初は別の２状態印象と一致するように見えた。分化傾向状態は、多能性状態と比較して稀であった。相関はまた、ＥＳ細胞における他の既知制御性相互作用も示し、例えば、ＢＭＰシグナル伝達の既知陰性標的であるＳｏｘ２は、ＢＭＰ標的Ｉｄ１と反相関した。さらに驚いたことは、しかしながら、複数の多能性因子(Ｎａｎｏｇ、Ｔｒｉｍ２８、Ｅｓｒｒｂ、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｚｆｐ４２)が細胞集団のバルクを超えてタンデムで上下するとの発見であった(図１５Ｄ、２３、２４)。これらの観察は、合わせて、多能性因子がエピブラスト遺伝子発現と無関係に相関したままであることを示すため、単純２状態モデルで説明できなかった；むしろ、種々の多能性により特徴付けられる状態の連続体であることが示唆された。全ての多能性因が有意な相関を示したわけではないが、しかしながら：Ｏｃｔ４／Ｐｏｕ５ｆ１は、他のコア多能性因子および他の因子よりはるかに弱く相関し、むしろサイクリンＤ３(図１５Ｄおよび２４)と強く相関したが、他のサイクリンとは相関せず、特異的制御性起源と矛盾する揺らぎを示唆する。
【０２１６】
次にデータから推測されるＥＳ細胞集団の構造とは？主成分分析(ＰＣＡ)を、非常に価値のある遺伝子についてＥＳ細胞集団で行い、発現における内因性ノイズによって説明できない、データ内の主成分(ＰＣ)の数に対応する、不均一性の複数の非自明な次元が判明した(９５％信頼を有する１２次元)(図１５Ｅ参照)。この観察は、ＩＣＭ−エピブラスト軸を超える不均一性のさらなる源の存在を確認した。最初の４つの主成分およびそれらの充填の検査(図１５Ｆ)は、少なくとも３つの小さいが、異なる細胞亜集団を確認した：明白に原始的内胚葉(ＰｒＥｎ)様細胞を特定する、極めて低レベルの多能性マーカーおよび高レベルのＣｏｌ４ａ１／２、Ｌａｍａ１／ｂ１／ｃ１、ＳｐａｒｃおよびＣｄ６３を発現する一つの稀な集団(６／９３５細胞)；高レベルのＫｒｔ８、Ｋｒｔ１８、Ｓ１００ａ６、Ｓｆｎおよびエピブラスト細胞系譜の他のマーカーを発現する第二の細胞集団(１５／９３５細胞)。第三集団は、表面上性質不明状態を呈し、ヒートショックタンパク質Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐａ５およびジスルフィドイソメラーゼＰｄｉａ６のような他のＥＲ成分の発現によりマークされた。この集団は、ストレス下の解離したＥＳ細胞を表し得る。
【０２１７】
ＰＣＡ分析は、遺伝子発現のわずか２または３の主要な軸により分画され得る細胞集団の可視化の強力なツールである。しかしながら、３以上の非自明な主成分が存在するならば、高次元データの局所構造を表す次元縮退のための適切な技術がある。この実施例は、t-distributed Stochastic Neighbor Embedding(ｔ−ＳＮＥ)として知られる次元縮退の方法を適用した(図１５Ｇ)。地図は、予想どおりＥＳ細胞の大亜集団を示さなかったが、高多能性から低多能性への連続体を示し、異常値集団が集団周辺部に横たわるＰＣＡにより特定された。地図はまた、Ｐｒｄｍ１／Ｂｌｉｍｐ１、Ｌｉｎ４１／Ｔｒｉｍ７１およびＳＳＥＡ−１／Ｆｕｔ４の高発現によりそれぞれ特徴付けられるさらなる周辺部亜集団も特定した。Ｈｓｐ９０−ｈｉ集団と同様、これらの集団が、異なる機能的行動が付与された異なる細胞状態であるのかまたはこれらが単に細胞アクセス異常値であり、ＥＳ細胞遺伝子発現の正常な状態であるのか、確認が必要なままである。従って、ＥＳ細胞集団における十分に試験されたエピブラスト様状態が特定され、ＩＣＭとエピブラスト様状態間の集団的揺らぎの証拠が見られているが、これらの揺らぎは、単なるＥＳ細胞集団における転写不均一性の軸ではない。
【０２１８】
図１５Ｄは、対遺伝子相関を説明するヒートマップを示す。図１５Ｅは、ｍＥＳ細胞集団の主成分分析から得られた固有値分布を示し、データにおいて検出可能な非自明なモードの細胞不均一性を示す(矢印)。平滑曲線は、遺伝子発現プロファイルのランダム並べ替えの典型的固有値分布を示す；ぎざぎざの曲線は、ランダムマトリクスの予測マルチェンコ・パスツール固有値分布を示す。曲線を超えて横たわる固有値のみが有意であった。図１５Ｆは、ｍＥＳ細胞主要成分およびその充填を示し、ドミナント無相関モードの不均一性を示し、３つの稀なＥＳ細胞亜集団を明らかにする。図１５Ｇは、さらなる周辺部亜集団および多能性対エピブラスト軸を明らかにするｍＥＳ細胞集団のｔＳＮＥ地図である。
【０２１９】
図２３は、ｍＥＳ細胞の単一細胞遺伝子発現を示す。０日、２日、４日および７日の主要に可変性の遺伝子の遺伝子発現(それぞれ図２３Ａ〜２３Ｄ)。各遺伝子の発現はｚスコア標準化した。
【０２２０】
図２４は、ｍＥＳ細胞集団の構造を示す。図２４Ａは、９３５ｍＥＳ細胞の選択した遺伝子の対相関を示す。ここに記載するように、Ｏｃｔ４／Ｐｏｕ５ｆ１はサイクリンＤ３とより強く、そしてＳｏｘ２、Ｋｌｆ４および他の多能性因子と弱く相関した。ここに報告する相関は、サブサンプリングで補正しておらず、観察されたとおりである(図１４Ｇ、式(３)参照)。図２４Ｂ〜２４Ｇは、異なる細胞亜集団を明らかにするｍＥＳ細胞集団の３次元ｔＳＮＥ地図異なる図法を示す；各パネルの細胞は、特定のマーカーの凝集発現に従い着色した。
【０２２１】
実施例１１
遺伝子発現共変動からの推定多能性因子。集団中の遺伝子が共変動するとの観察により、相関が遺伝子制御または機能における共通性を明らかにするはずであるか否かの疑問が生じる。細胞の複雑な混合物において、このような推論の試みは、特定の制御性プログラムよりむしろ大規模エピジェネティック変化を反映する、遺伝子−遺伝子相関が主に細胞型間のささいな差異によるため、混乱させるものであり得る。単一細胞型のみからなる集団で状況は異なり、ここで、細胞状態における揺らぎは、機能的依存性を明らかにするはずであることにより楽観的である。ｍＥＳ細胞集団は、上記小亜集団の存在以外に、相対的にわずかな分離した構造しか示さないため、この要求を満たす。
【０２２２】
遺伝子発現共変動が制御性情報を含むはずであるか否か試験するために、この実施例は、カスタムネットワーク近隣分析(ＮＮＡ)スキームを使用して、既知多能性因子の共変動パートナーを探索する(図１６、下記参照)。このスキームは、ある目的の遺伝子(または遺伝子群)と最も密接に相関し、また互いに最も密接に相関する一連の遺伝子を定義する。サンプリング効率に対する相関の感受性を考慮して(図１４Ｇ、式(３))、ＮＮＡ分析−これは、相関ネットワークトポロジーにのみ感受性である−が、単に高度に相関する遺伝子を関連付けるよりも、より頑強である。注目すべきことに、多能性因子ＮａｎｏｇおよびＳｏｘ２への適応で、ＮＮＡスキームは、Ｎａｎｏｇの２０近傍の他の多能性因子について強力に富化され、その１１は多能性因子として報告されており、さらに３つが多能性と相関し、一つ(Ｓｌｃ２ａ３)がＮａｎｏｇとシンテニーである。一つの遺伝子(Ｒｂｐｊ)のみが多能性に不必要であることが示され、４つの遺伝子が、先に報告されたＥＳ細胞への結合がないままである。これらの遺伝子が多能性状態の維持に機能的役割を有すると予測することは魅惑的である。同様に、Ｓｏｘ２の近隣全体は、多能性と直接的または間接的に関係する因子を含み−コア多能性因子(６／９遺伝子)；ＩＣＭにおいて高レベルで発現されることが最近示され、多能性状態の維持に必要であるスレオニン異化酵素Ｔｄｈを含み；Ｐｃｂｐ１は、多能性因子Ｒｏｎｉｎ／Ｔｈａｐ１１の結合パートナーであることが示され、翻訳開始因子サブユニットＥｉｆ２ｓ２は、Ｓｔａｔ３過発現に応答して上方制御されることが示されている。興味深いことに同じ分析が、他の生物学的経路における洞察を提供し得る。サイクリンＢ(Ｃｃｎｂ１)の近隣は、例えば、小さいが、他のコア細胞周期遺伝子Ｃｄｋ１、Ｕｂｅ２ｃおよびＰｌｋ１を含んだ。
【０２２３】
しかしながら、スキームは一般に全制御性機能に適応可能ではなく、ｍＥＳ細胞生物学と表面上無関係な多くの他の経路が、意味あるＮＮＡ連関を有しないように見える。これは、単一細胞共変動が、試験している細胞の生物学に最も特異的な揺らぎを捕獲し得て、弱い経路特異的摂動により揺らぎを人工的に作製することにより、他の生物学的経路成分の特定により一般に利用できることを示唆する。
【０２２４】
実施例１２
分化ＥＳ細胞の集団動力学。ＬＩＦ中止により、ｍＥＳ細胞は、不均一に、しかし、ほとんど特徴づけされていない工程で分化し、最終的に優位に体性(エピブラスト)分化系列の形成に至る。既存のＰｒＥｎ細胞の運命は、他の細胞系譜が一過性に発現し、その後消滅するか否か疑問であるため、不明である。単一細胞分析において、ＬＩＦ中止後、分化ＥＳ細胞集団は、集団構造の顕著な変化を受け、これは、非常に価値のある遺伝子の発現に従い細胞を階層的にクラスタリングすることにより、定性的に認識できた(図１７Ａ)。これらの変化および次の分析は、無誘導分化プロトコールを反映し、中間細胞型の固有の不均一性および多様性がどのようにシグナル伝達に依存するかを特定するために、将来的に同じ方法を誘導分化プロトコールに適用することは有益であろう。
【０２２５】
細胞集団で生じている変化を精査し、データの質を確認するために、この実施例は、まず、多能性因子および分化マーカーの遺伝子発現動力学を検査した(図１７Ｂ、１７Ｃ)。多能性因子Ｒｅｘ１／Ｚｆｐ４２の平均発現およびＥｓｒｒｂレベルは、迅速に低下した；Ｐｏｕ５ｆ１およびＳｏｘ２は、より徐々に低下した；エピブラストマーカーＫｒｔ８は一定して増加した；そしてＩＣＭからエピブラスト状態への遷移に必要な転写因子であるＯｔｘ２は、２日目まで一過性に増加し、その後減少した。しかしながら、平均発現が各細胞の動力学をあらわさないことが証明された。いくつかの細胞は、エピブラストマーカーの発現ができず、細胞のフラクションは、ＬＩＦ中止７日後でさえ多能性因子を発現し続け(図１７Ｃ)、ＥＳ細胞分化のタイミングがそれ自体不均一であることを示す。
【０２２６】
ＰＣＡ分析を、この不均一性が全般的傾向を反映するか否かを特定するために全時点から凝集させた細胞で行い(図１７Ｄ)、ＬＩＦ中止７日後でさえ、細胞のフラクション(５％、Ｎ＝７９９)がｍＥＳ細胞集団と重複することが判明した。最高の一時的不均一はＬＩＦ後４日で明らかであり、細胞は、ｍＥＳ細胞と分化状態の間の第一の主成分に沿って広範に分布した。ＰＣＡ分析はまた、２日目および４日目の、多能性状態からの覚醒により生じる代謝変化と一致する強い代謝符号(トップＧＯアノテーション：細胞代謝工程、ｐ＝１.４×１０−８)の富化も確認した。
【０２２７】
分化における非同調性に起因する不均一性に加えて、４日および７日後、遺伝子発現の異なるパターンを有する亜集団出現の証拠があり、その全てが必ずしも直ぐに既知細胞型に割り当てられるわけではない。集団構造をこれらの時点でｔ−ＳＮＥにより可視化しており(図１７Ｇおよび図２５)、異なる亜集団マーカーを表３に記載する。ＬＩＦ中止２日および４日後、先に稀な栄養外胚葉形成細胞(ＲＥＦ)として特定されたＺｓｃａｎ４＋細胞の稀な集団が特定され、この集団は、７日目までにもはや検出されなくなった。４日目および７日目に、通常母系性にインプリントされた遺伝子Ｈ１９、Ｒｈｏｘ６／９、Ｐｅｇ１０、Ｃｄｋｎ１およびその他を発現する他の、さらに稀な集団が発現し、広範な脱メチル化が、恐らく、早期始原生殖細胞分化と関係することを示唆する。
【０２２８】
これらの集団に加えて、常在性ＰｒＥｎ細胞が全時点で検出でき(図１７Ｆ、１７Ｇ)、ＰｒＥｎ集団が、ＬＩＦ中止２日および４日後に拡張し、その後ＬＩＦ後７日まで停滞するように見える。全体として、分析は、異なるおよび新規ＥＳ細胞亜集団のＥＳ細胞分化および動力学の時間的不均一性を曝露する。
【０２２９】
図１７は、分化ＥＳ細胞における一時的不均一性および集団構造を示す。図１７Ａは、ＬＩＦ中止後の全般的集団構造における変化が、各時点での非常に価値のある遺伝子の細胞−細胞相関のヒートマップの階層的クラスタリングにより定性的に見られることを示す。図１７Ｂは、ＬＩＦ中止後の遺伝子発現の平均動力学が分化の既知パターンと一致することを示す。図１７Ｃは、ある数のカウントを発現する細胞のフラクションに対する確率密度(violin)プロットにより示される、図１７Ｂにおける遺伝子の動力学を示す。データ点は、トップ５％の細胞を示す。図１７Ｄおよび１７Ｅは、迅速一過性変化(ＰＣ２)および分化における非同調性(ＰＣ１)を示す複数の時点からの３,０３４細胞の最初の二つの主成分(ＰＣ)(図１７Ｄ)およびＰＣ充填(図１７Ｅ)を示す。図１７Ｆは、ＬＩＦ後の時間の関数としてのエピブラストおよびＰｒＥｎ細胞のフラクションの動力学を示す。図１７Ｇは、ＬＩＦ後４日および７日の分化ＥＳ細胞のｔＳＮＥ地図が一過性および出現している集団部分構造を明らかにし、ＬＩＦ４日後の遺伝子のｔＳＮＥ地図(右パネル)が推定集団マーカーを明らかにすることを示す。
【０２３０】
図２５は、ＬＩＦ中止４日後の主要遺伝子のｔＳＮＥ地図を示す。この図は、完全遺伝子アノテーションを伴い図１７Ｇに再現する。
【０２３１】
実施例１３
ｍＥＳ細胞分化中の乱雑な遺伝子発現揺らぎの減少。この実施例は、ｍＥＳ細胞が、分化の過程中に精密にされる多数の遺伝子の弱く結合した発現を含む、乱雑な遺伝子発現により特徴付けられるとの仮説に取り組む。遺伝子発現がより乱雑であるとき、細胞が分散した独立した寸法の数により測定して、細胞が、遺伝子発現のために大きな部分空間を占拠することを予測する。比較として、より制御されたパターン遺伝子発現−複数細胞型の混合物でも−は、細胞を、遺伝子発現の１以上のコヒーレント状態を反映する低次元マニフォールドに制限する。この実施例は、ＥＳ細胞および分化細胞の本質的次元性を評価した。遺伝子発現の本質的次元性は分化後に低下し(図１７Ｈ)、一方純粋ＲＮＡおよび無作為化データの次元性は、ＥＳ細胞のものより有意に高かった。この分析は、ＥＳ細胞不均一性が、分化の非同調性および細胞型の相違に起因するＬｉｆ中止後の不均一性と一致する、乱雑な弱く結合した遺伝子発現と関係するとの仮説を支持する。
【０２３２】
図１７Ｈは、ｍＥＳ細胞およびＬＩＦ後７日の遺伝子発現可変性の本質的次元性の概算を示し、分化中の揺らぎの収縮している部分空間を示す。結果は、相関を欠き、ゆえに最大揺らぎ部分空間を示す純粋ＲＮＡと対照的である。
【０２３３】
実施例１４
これらの実施例は、処理できる細胞数に物理的な制限なしの、単一細胞捕獲、バーコーディングおよびトランスクリプトームプロファイリングのためのプラットフォームの確立を示す。これらの実施例は、サンプリング統計学により科される限界に近づく、高捕獲効率、迅速収集時間、極めて低い液滴間ＣＶおよび技術的ノイズを示した。これらは異なる実験、デバイス、ＢＨＭバッチおよびエマルジョン体積を超えて再現性があった(表１)。これらは、腫瘍サンプルおよび組織マイクロバオプシーを含む小臨床サンプルの単一細胞トランスクリプトミクスに容易に適用でき、組織不均一性の定量的図をもたらす。所望の適用によって、これは、異なるエマルジョン体積を回収することにより、配列決定深さと細胞集団のサイズの交換を可能とする。これらの実施例は、遺伝子発現に基づき、稀な亜集団でさえも、日常的に細胞型を特定することを可能にする。低測定ノイズにより、これらは、ＥＳ細胞における場合のように、遺伝子発現における連続的揺らぎから分離した細胞型を区別することを可能とする。細胞の分類に加えて、このタイプのデータは、例えば、集団における個々の細胞間の自然かつ恐らく微妙な多様性の利用により、共分散に基づき遺伝子間の推定制御性結合を特定するために価値がある。これらの実施例は、この推論の数個の単純な例しか強調していないが(図１６)、このタイプの単一細胞データは、それ自体、リバースエンジニアリングのより公式なアプローチとなる。
【０２３４】
これらの実施例は、多くの生物学的問題についての正確な情報を提供できる。これは、初期分化中のＥＳ細胞不均一性およびその動力学の複雑かつ難解な問題により説明される。ＥＳ細胞は、異なる細胞型の大亜集団の集団を組まず、それゆえ、その不均一性の分析は感受性の方法を必要とする。これらの細胞からのデータを解釈するために、生物学的遺伝子−遺伝子相関がどのように低捕獲効率および液滴間の技術的可変性に影響されるかにの疑問に取り組む単一細胞ノイズの統計学的モデルの開発であり、我々は、遺伝子発現‘空間’における細胞の高次元組織およびこの組織の動力学を可視化するための機械学習ツールを利用した。この分析は、血清およびＬＩＦに維持されたとき、ＥＳ細胞がより多能性の状態およびより分化した状態の間で揺らぐとの仮説の支持を提供する。しかしながら、Ｋｒｔ８／１８、Ｓ１００ａ６およびＦｇｆ５のような分化マーカーを発現するＩＣＭ様集団に加えて、他のＥＳ細胞亜集団もまた、始原生殖細胞マーカーＢｌｉｍｐ１／Ｐｒｄｍ１を発現する他の亜集団である原始的内胚葉運命および高レベルのＥＲ関連タンパク質またはＥ３リガーゼＬｉｎ−４１／Ｔｒｉｍ７１により示されるあまり明白でない運命連関を有する亜集団と関係することが特定された。これらの小細胞亜集団の不偏特定は、液滴−Ｓｅｑにより可能な規模を必要とする。これは、全時点で細胞集団の約１％未満を占め、わずか１００〜２００細胞の小さなサンプルでは自信を持って検出するには少なすぎる、原始的内胚葉様細胞により説明される。
【０２３５】
最前線技術で、液滴−ＳＥＱプラットフォームは、全トランスクリプトームＲＮＡ配列決定のために開発されたが、テクノロジーは高度に可撓性であり、他のＲＮＡ−Ｓｅｑプロトコール、小パネルの遺伝子に焦点を絞った標的配列決定法、チップ−Ｓｅｑ、ゲノム配列決定またはクロマチン近接分析(Ｈｉ−Ｃ)のような、ＲＮＡ／ＤＮＡ分子のバーコーディングを必要とする他の適用に容易に適用可能である。ある実行は、細胞、バーコードおよびＲＴ試薬を合わせるために流れ集約接合部を一つのみ有する(図１３Ｃ)極めて単純な液滴微小流体チップを利用した。他のバージョンのプラットフォームは、既存の液滴への試薬ピコインジェクションによる多工程酵素反応を可能にするまたは液滴のオンチップ選別による配列決定前の標的細胞富化を実行するための、液滴微小流体機能をさらに利用する。さらに、液滴−ＳＥＱは、相対的に低い捕獲効率を標的とする生化学物質革新に結いに組み込まれることができる。
【０２３６】
図１６は、遺伝子相関ネットワーク近隣が多能性関連因子を明らかにすることを示す。少なくとも３つの相互近隣者を有するネットワーク近隣者を選択することにより作製したＮａｎｏｇ(図１６Ａ)、Ｓｏｘ２(図１６Ｂ)およびサイクリンＢ(図１６Ｃ)の接続させた相関ネットワーク近隣(下記参照)。図１６Ａおよび１６Ｂにおいて、灰色四角は、先に確認された多能性因子を示す；四角Ｃａｌｃｏｃｏ２、Ｅｉｆ２ｓ２およびＩｇｆｂｐ２は、先に多能性状態と関係すると報告された因子を示す。
【０２３７】
実施例１５
この実施例は、上記実施例で使用した種々の方法およびシステムを説明する。
微小流体デバイス設計および操作。これらの実施例のいくつかで使用した微小フルイディクスデバイスの設計を図１８に示し、いくつかの特性を統合する。上記のとおり、ｉ)バーコード化ヒドロゲル微小球体(ＢＨＭ)、ii)細胞懸濁液、iii)逆転写(ＲＴ)および溶解剤混合物およびiv)担体油用の４入口および液滴収集物用の１出口を含む。潜在的にシリンジポンプの機構が原因である流動の揺らぎを低下させるために、流体レジスターを蛇行チャネルの形で取り込み、一方各入口の受動フィルターは、チャネルの目詰まりを阻止した。デバイスは、一つは３つの水性投入を合わせるものおよびサンプル封入用の第二接合部である２接合部を含み、そこで、水相と油相が合い、液滴産生が起こる。合体に対して液滴を安定化するために、ＨＦＥ−７５００(３Ｍ)フッ化流体に溶解した０.７５％(ｗ／ｗ)ＥＡ−界面活性剤(RAN Biotechnologies Inc.)を使用した。微小流体チャネルの寸法を、ＢＨＭおよび細胞共封入事象の数が最大となるように注意深く選択した。ＢＨＭ再注入チャネルの幅(６０μm)は、このチャネルを通るＢＨＭ(６３μm直径)がわずかに圧搾され、そうして、その最密充填および縦一列への配置が促進されるように設計した。主チャネル(７０μm幅)に入ったＢＨＭは、次に流れの下流に自由に動き、その後個々の液滴に封入された。その最密充填にために、ＢＨＭの到着は高度に一定となり、１００％近い液滴あたり単一ビーズの充填を可能とする。これは、ｉ)液滴に封入されたほぼ各々の細胞が一つのバーコード化プライマーに曝されるおよびii)非バーコード化細胞の最小限の喪失があったことを確実にした。
【０２３８】
ソフトリソグラフィー。８０μm深さの長方形微小流体チャネルを有する微小流体デバイスを、確立されたプロトコールに従い製造した。簡潔にいうと、３インチサイズシリコンウェーハをＳＵ−８  ３０５０フォトレジスト(MicroChem)で、均一８０μmフィルム厚で被覆し、６５℃で２０分焼き、図１８に示す対応する設計を有するマスクを介して３６５nm  ＵＶ光に４０秒(約８mW cm２)曝し、５分、９５℃で焼いた。非重合化フォトレジストをプロピレングリコールモノメチルエーテルアセテートに溶解し、シリコンウェーハをイソプロパノールで濯ぎ、９５℃ホットプレートで１分乾燥させた。ＰＤＭＳベースおよび架橋剤(Dow Corning)を１０：１比で混合し、約３０mLを展開させたシリコンウェーハを含むペトリ皿に注ぎ、脱気し、一夜、６５℃でインキュベートした。ＰＤＭＳ層を次いで剥ぎ取り、入口−出口孔を１.２mm生検パンチ(Harris Uni Core)でパンチした。次いで、ＰＤＭＳのパターン化側を酸素プラズマで処理し、清潔なガラススライドに結合させた。微小チャネルを撥水Aquapel(PPG Industries)で処理し、その後デバイスを上記実験に使用した。
【０２３９】
微小流体デバイス操作。デバイス操作中、細胞懸濁液およびＲＴ／溶解混合物を氷冷ジャケットで冷却し、液滴を氷冷ラック(IsoTherm System, Eppendorf)に置いた単一１.５mLチューブ(DNALoBind, Eppendorf)に回収した。ＲＴインキュベーション中の蒸発による液滴からの水喪失を避けるために、２００μlの鉱油層(Sigma)をエマルジョンの上部に置いた。実験を通して、細胞懸濁液について１００μl／時間、ＲＴ／溶解混合物について１００μl／時間、ＢＨＭについて１０〜２０μl／時間および担体油について８０μl／時間の流速を使用して、１５液滴／秒の頻度で４nL液滴を形成させた。各水相を、シリンジポンプ(Harvard Apparatus, PC2 70-2226)に置いた無菌１mLシリンジ(Braun)の針に悦族したポリエチレン管(ID 0.38×OD 1.09mm, BB31695-PE/2)を経て微小流体デバイスに注入した。
【０２４０】
バーコード化ヒドロゲル微小球体(ＢＨＭ)の微小流体デバイスへの充填。合成後、ＢＨＭを、１０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ８.０)、１０mM  ＥＤＴＡ、０.１％(ｖ／ｖ)Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴ１０Ｅ１０Ｔ０.１緩衝液に保存した。微小流体チップへの充填前、ＢＨＭを、１０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ８.０)、０.１mM  ＥＤＴＡおよび０.１％(ｖ／ｖ)Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴ１０Ｅ０.１Ｔ０.１緩衝液で洗浄し、次いで、０.５％(ｖ／ｖ)IGEPAL CA-630添加１×ＲＴ緩衝液(Invitrogen Superscript III緩衝液)に再懸濁し、５０００rpmで２分の遠心により濃縮した。上清除去後、ＢＨＭを、２回目の濃縮に付して最密充填を達成し、最終的に微小流体デバイスに注入するための油充填シリンジに接続した管に直接充填した。ＢＨＭサンプルの組成は１００μl濃縮ＢＨＭ、２０μl  １０％(ｖ／ｖ)IGEPAL CA-630、４０μl５×First-Strand緩衝液および４０μl無ヌクレアーゼ水(総アリコート体積２００μl)であった。
【０２４１】
細胞調製および注入。細胞封入工程は、デバイスへの細胞のランダムな到着に依拠する。２以上の細胞が同じ液滴に入ることを最小化するために、希釈した細胞懸濁液(約５０〜１００,０００細胞／mL)を使用して、５〜１０液滴あたり１細胞の平均占有率を得た。シリンジまたはシステムの他のパーツにおける細胞沈降を阻止するために、細胞を、１×ＰＢＳ緩衝液に１６％(ｖ／ｖ)密度勾配溶液Optiprep(Sigma)と共に懸濁した。２０,０００細胞を一般に使用し、総体積２００μl中、１６０μl  ５×ＰＢＳ(Lonza 17-516F)、３２μl  Optiprep(Axis-Shield 1114542)および８μl  １％(ｖ／ｖ)ＢＳＡ(Thermo Scientific B14)に懸濁した。
【０２４２】
逆転写／溶解混合物。ＲＴ／溶解混合物は、総体積１５０μlを有する、２５μl  ５×First-Strand緩衝液(18080-044 Life Technologies)、９μl  １０％(ｖ／ｖ)  IGEPAL CA-630(#18896 Sigma)、６μl２５mM  ｄＮＴＰ(Enzymatics N2050L)、１０μl  ０.１Ｍ  ＤＴＴ(#18080-044, Life Technologies)、１５μl  １Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ８.０)(51238 Lonza)、１０μl  Murine RNase阻害剤(M0314, NEB)、１５μl  SuperScript III RT酵素(２００Ｕ／μl、#18080-044, Life Technologies)および６０μl無ヌクレアーゼ水(AM9937 Ambion)を含んだ。
【０２４３】
液滴製造に髭右した界面活性剤および担体油。担体油は、１％(ｗ／ｗ)  ＥＡ界面活性剤(RAN Biotechnologies)を伴うＨＦＥ−７５００フッ化流体(３Ｍ)であった。ＥＡ−界面活性剤は、平均分子量約１３.０００g mol−１を有するトリブロックコポリマーである。これは、ポリ(エチレン)グリコール(ＭＷ  約６００g mol−１)頭基により連結された２つのペルフルオロポリエーテルテイル(ＭＷ  約６.０００g mol−１)を有する。界面活性剤は、フッ化流体に高度に可溶性であり、水相にほぼ不溶性であり、約２mN／ｍの平衡界面張力を提供した。
【０２４４】
内部液滴バーコーディング。細胞封入後、プライマーを、氷上に維持しながらエマルジョン液滴を含むチューブをＵＶ光(約１０mW／cm２で３６５nm、BlackRay Xenon Lamp)に曝すことによりＢＨＭから遊離させた。次に、チューブを５０℃に加熱し、２時間インキュベートして、ｃＤＮＡ合成を生じさせ、ついで１５分、７０℃で加熱することにより停止させた。次いでエマルジョンを氷で１分冷却し、１体積のＰＦＯ溶液(２０％(ｖ／ｖ)ペルフルオロオクタノールおよび８０％(ｖ／ｖ)ＨＦＥ−７５００)添加により解乳化させた。破壊液滴からの水相を、別々のＤＮＡＬｏ−Ｂｉｎｄチューブ(Eppendorf)に移し、ライブラリー調製物選択に記載した変更を伴うＣＥＬ−ＳＥＱプロトコールに従い処理した。
【０２４５】
バーコード化ヒドロゲル微小球体の合成および品質管理。ＢＨＭ合成は、アクリルアミド重合化によりヒドロゲルメッシュに取り込まれるアクリレート修飾ＤＮＡプライマーを添加したアクリルアミド：ビス−アクリルアミド溶液の微小流体乳化に依拠する。重合化後、ＢＨＭを液滴から遊離させ、数回洗浄し、コンビナトリアルバーコーディングのためのスプリットプール合成により処理する。下記は、このようなヒドロゲルビーズ合成と続くコンビナトリアルバーコーディングを実施する詳細なプロトコールの概略である。
【０２４６】
ＢＨＭ合成は、ゲル前駆体溶液を図１９に示す微小流体チップを使用して６２μmサイズ液滴に乳化させることにより開始する。分散相の組成は、６.２％(ｖ／ｖ)アクリルアミド、０.１８％(ｖ／ｖ)ビス−アクリルアミド、０.３％(ｗ／ｖ)過硫酸アンモニウムおよび５０μMアクリレート修飾ＤＮＡプライマー(ＩＤＴ、配列に関して図２０Ａ参照)を含む１０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.６)、１mM  ＥＤＴＡ、１５mM  ＮａＣｌであった。連続相として、０.４％(ｖ／ｖ)ＴＥＭＥＤおよび１.５％(ｗ／ｗ)ＥＡ−界面活性剤を運搬する、フッ化流体ＨＦＥ−７５００を使用した。流速は、水相について４００μl／時間および油相について９００μl／時間であった。液滴を、２００μl鉱油下に１.５mLチューブに回収し、６５℃で１２時間インキュベートして、ビーズの重合を生じさせた。得られた固化ビーズを、ＨＦＥ−７５００油中１mLの２０％(ｖ／ｖ)１Ｈ,１Ｈ,２Ｈ,２Ｈ−ペルフルオロオクタノール(B20156, Alfa Aesar)で２回およびヘキサン(BDH1129-4LP, VWR)中１mLの１％(ｖ／ｖ)Ｓｐａｎ  ８０(S6760, Sigma)で２回洗浄し、各工程間、０.５〜１分のインキュベーションを行い、最終的に５０００rcfで３０秒遠心分離した。最終遠心分離後、ヘキサン相を吸引し、得られたＢＨＭペレットを１mLのＴＥＢＳＴ緩衝液(１０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ８.０)、１３７mM  ＮａＣｌ、２.７mM  ＫＣｌ、１０mM  ＥＤＴＡおよび０.１％(ｖ／ｖ)Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００)に溶解した。痕跡量のヘキサンを除去するために、ビーズを１mL  ＴＥＢＳＴ緩衝液で、５０００rcfで３０秒、３回洗浄し、最終的に１mL  ＴＥＢＳＴ緩衝液に再溶解し、４℃で保存した。これらのＢＨＭは、約１００nmサイズの孔を含んだ。さらに、約１kPaの弾性係数を有するビーズは、その完全性を失うことなく濃縮ゲル塊に充填されることが可能となる“グニャグニャ”であった。
【０２４７】
ＢＨＭスプリットプールコンビナトリアルバーコーディング。ヒドロゲル微小球体上にバーコード化プライマーを製造するために、図２０Ｂに要約する２工程酵素伸長反応を使用した。始めに、予充填した３８４ウェルプレートを、バーコードの最初の半分をコードする９μlの１５μMプライマー５’−Ｗ１＊−ｂｃ１−ＰＥ１＊(ここで、‘ｂｃ１’は、各ウェルの一意的な配列を意味し、またヌクレオチド配列情報については表１も参照のこと)と共に使用した。約４０,０００ヒドロゲルビーズ(５’−Ａｃ−ＰＣ−Ｔ７ｐ−ＰＥ１プライマー運搬)、２.５×等温増幅緩衝液(ＮＥＢ)および０.８５mM  ｄＮＴＰ(Enzymatics)を含む６μlの反応混合物を各ウェルに添加した(計約１０７ビーズとなる)。８５℃で２分の変性および６０℃で２０分のハイブリダイゼーション後、５μlのＢｓｔ酵素混合物(１×等温増幅緩衝液中１.８ＵのＢｓｔ  ２.０および０.３mM  ｄＮＴＰ)を添加し、各ウェルの最終体積２０μlとした。６０℃で６０分インキュベーション後、反応を、２０μlの停止緩衝液(１００mM  ＫＣｌ、１０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ８.０)、５０mM  ＥＤＴＡ、０.１％(ｖ／ｖ)Ｔｗｅｅｎ−２０)を各ウェルに添加することにより停止させ、３０分、氷上でインキュベートして、ＥＤＴＡがマグネシウムイオンとキレート化し、Ｂｓｔ酵素を不活化することを確実とした。次に、ビーズを５０mLファルコンチューブに回収し、１０００rcfで２分遠心分離し、１０mM  ＥＤＴＡを含む５０mLの停止緩衝液で３回洗浄した。第二鎖を除去するために、ゲルを２０mLの１５０mM  ＮａＯＨ、０.５％(ｖ／ｖ)Ｂｒｉｊ  ３５Ｐに懸濁し、１０mLの１００mM  ＮａＯＨ、０.５％(ｖ／ｖ)Ｂｒｉｊ  ３５Ｐで２回洗浄した。次いでアルカリ溶液を緩衝液１００mM  ＮａＣｌ、１００mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ８.０)、１０mM  ＥＤＴＡ、０.１％(ｖ／ｖ)Ｔｗｅｅｎ−２０で中和し、１０mL  Ｔ１０Ｅ１０Ｔ０.１緩衝液(１０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ８.０)、１０mM  ＥＤＴＡ、０.１％(ｖ／ｖ)Ｔｗｅｅｎ−２０)で１回および１０mL  Ｔ１０Ｅ０.１Ｔ０.１緩衝液(１０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ８.０)、０.１mM  ＥＤＴＡ、０.１％(ｖ／ｖ)Ｔｗｅｅｎ−２０)で２回洗浄し、最後にビーズを１.３mLのＤＳＴ緩衝液に懸濁した。
【０２４８】
第二バーコーディング工程のために、第二の３８４−マイクロタイタープレートを調製し、９μlの１５μMプライマー５’−Ｔ１９Ｖ＊−ＵＭＩ−ｂｃ２−Ｗ１＊(ここで、‘ｂｃ２’は、各ウェルの一意的な配列を意味し、ＵＭＩはランダムヘキサヌクレオチドであり、配列情報についてまた表１も参照のこと)を予充填し、第一の３８４ウェルプレートの工程を繰り返した。
【０２４９】
ビーズ上のｓｓＤＮＡプライマーの定量化。ＢＨＭあたりのｓｓＤＮＡプライマーの量を定量するために、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ)を、非伸長ＤＮＡ“ｓｔｕｂ”(ＰＥ１)、１伸長工程後のバーコード化プライマー(Ｗ１)および２伸長工程後のバーコード化プライマー(Ｔ１９Ｖ)を標的とする相補的ＤＮＡプローブで実施した(配列情報について表１参照)。ハイブリダイゼーションを、４０μl体積で室温で２０分、約４０００  ＤＮＡバーコーディングビーズをハイブリダイゼーション緩衝液(１Ｍ  ＫＣｌ、５mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ８.０)、５mM  ＥＤＴＡ、０.０５％(ｖ／ｖ)Ｔｗｅｅｎ−２０)に１０μM  ＦＡＭ標識プローブと共に懸濁することにより実施した。高塩濃度を使用して、室温でも弱い結合を有するＴ１９Ｖ(ｄＡ２０−ＦＡＭ)を標的とするプローブの融解を避けた。バックグラウンド蛍光の不在を、ＤＮＡプライマーを欠く微小球体で確認した。インキュベーション後、ビーズを１.４mL  ハイブリダイゼーション緩衝液で３回洗浄し、４０μlに再懸濁し、蛍光強度を共焦点顕微鏡(Leica)下に記録した。ＰＥ１＊−ＦＡＭ、Ｗ１＊−ＦＡＭおよびｄＡ２０−ＦＡＭを有するビーズの平均蛍光強度はそれぞれ２２８６±２７１、１１６５±１６０および７１８±１４５であった(図２１Ａ〜２１Ｄ)。これは、Ｗ１／ＰＥ１について約５０％およびポリＴ／Ｗ１について６０％の取り込み効率に対応し、ビーズあたり３１％または約１５μMの完全バーコード化ｓｓＤＮＡプライマーの最終効率をもたらす。ＢＨＭ体積の説明として、これは、単一ビーズあたり約１０９コピーの完全伸長ｓｓＤＮＡプライマーに等しい。
【０２５０】
ヒドロゲルメッシュからのプライマーの遊離を確認するために、約４０００ビーズを２０μlＤＳＴ緩衝液に懸濁し、ＵＶ光(約１０mW／cm２で３６５nm)に８分曝した。BioAnalyzer High Sensitivity DNA Analysis Kit(Agilent Technologies)を使用した１μlの上清のゲル電気泳動図は、３ＤＮＡバンドを確認し(図２１Ｅ)、これは、上記からのＦＩＳＨ結果と一致する。
【０２５１】
単一ＢＨＭからのプライマーの単分子配列決定。合成後のＢＨＭの組成を試験するために、１０のＢＨＭを無作為に選択し、Illumina MiSeq配列決定プラットフォームを使用して配列決定した。この目的のために、ＢＨＭを、最初に上記のとおり蛍光ＦＩＳＨプローブ(ＰＥ１−ＦＡＭ)にハイブリダイズし、蛍光照明下に解剖顕微鏡(Nikon)を使用して手動で選択し、５μlＤＮＡ懸濁液(ＤＳ)緩衝液(１０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８.０、０.１mM  ＥＤＴＡ)を予め充填した０.２mL  ＰＣＲチューブに移した。次いでチューブを、氷上に維持しながらＵＶ光(約１０mW／cm２)に１５分曝した。ＵＶ暴露後、０.５μlの５μM  ＰＥ２−(バーコード)ｎ−Ａ１９プライマー(ここで、ｎは、１０種の異なるバーコードである)をチューブに添加し、４.５μlのＢｓｔ  ２.０使用準備済反応溶液と混合した。次いで、１０μl最終体積を有するサンプルを室温で１０分インキュベートし、３分、９５℃で不活化し、氷で冷却した。次に、５０％(ｖ／ｖ)Kapa HiFi HotStartレディミックス(２×、ＫＫ２６０１)、１５％(ｖ／ｖ)ＰＥ１／ＰＥ２プライマーおよび３５％(ｖ／ｖ)無ヌクレアーゼ水を含む２０μlのマスター混合物を各チューブに添加し、ＤＮＡをＰＣＲ(９５℃で５分、次いで９８℃で２０秒、６０℃で１５秒、７２℃で３０秒３０サイクルおよび最終工程７２℃で５分)で増幅させた。ＰＣＲ産物のサイズをゲル電気泳動で評価し、GenElute PCR CleanUp Kit(Na1020-1KT, Sigma)で精製し、全サンプルを１０ng／μlまで希釈した。最終工程で、全サンプルを一緒にプールし、製造者の推奨に従いMiSeq Illuminaプラットフォームを使用して配列決定した。１０個の個々のビーズからのプライマーの配列決定結果を図２１Ｆ〜２１Ｈに示す。
【０２５２】
一配列決定ランあたりの細胞数の限界。各々Ｎバーコードの一つを運搬するバーコード化ヒドロゲル微小球体(ＢＨＭ)の大プールについて、２以上の細胞が同じバーコードを運搬する前に捕獲できる細胞の最大数はいくらであるか？この疑問は、年内の日に類似するバーコードおよび室内の人に類似するＢＨＭで、いわゆる誕生日問題と同種である。ｎ  ＢＨＭのサンプリングから予測される観察されるバーコード数は
【数２】
2017515469.tif 000009
である。従って、同じバーコードを運搬する細胞のフラクションとして規定される予測される複数バーコーディングエラーは、約
【数３】
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である。エラーは、ｎ≒Ｎのとき大きくなり、したがって実際問題としてサンプリングされた細胞数はバーコード数よりはるかに小さくなければならず、すなわちｎ＜＜Ｎでなければならず、それゆえ得られるバーコード化単一細胞の限度は
【数４】
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である。バーコード化単一細胞ｎの数は許容されるエラーにより、例えば、ｆｅｒｒ＝１％未満のエラーの許容は、ｎ＝Ｎ／５０の上限を必要とする。従って、我々の実験での２個の３８４ウェルプレートに対応するＮ＝３８４２の値について、１％複数バーコーディングエラーは限度ｎ＝２,９４９細胞で生じる。実際問題として、使用する細胞を少なくして、無視してよい複数バーコーディングエラーを生じ得る。
【０２５３】
細胞培養調製物。マウス胚性幹(ｍＥＳ)細胞を、ゼラチンで被覆したＥＳＣベース媒体内部培養フラスコ中、３７℃で５％ＣＯ２および６０〜８０％湿度で密度約３×１０５細胞ml−１で維持した。ＥＳＣ培地は、１５％(ｖ／ｖ)胎児ウシ血清(Gibco)、２mM  Ｌ−グルタミン、１×ＭＥＭ非必須アミノ酸(Gibco)、１％(ｖ／ｖ)ペニシリン−ストレプトマイシン抗生物質、１１０μM  ベータ−メルカプトエタノール、１００μM  ピルビン酸ナトリウム添加フェノールレッド無ＤＭＥＭ(Gibco)を含んだ。誘導分化のために、ＥＳＣベース媒体に白血病阻害性因子(ＬＩＦ)を、最終濃度１０００Ｕ／mLで添加し、無誘導ｍＥＳ分化のために、培地はＬＩＦを含まなかった。ＬＩＦ中止２日以内に、培養物は、ｍＥＳ細胞の分化を示す、顕著な形態学的変化を経験した。
【０２５４】
封入前に、フラスコを１×ＰＢＳ(Ｍｇ２＋イオンおよびＣａ２＋イオン不含)で洗浄し、１×トリプシン／ＥＤＴＡ溶液で３分、３７℃で処理した。トリプシンを等体積のＥＳＣベース培地で消費させた。分離した細胞を、２６０ｇで３分遠心分離し、約３mL新鮮ＥＳＣベース培地に再懸濁した。４０μmサイズストレーナーを通した後、細胞を血球計算器で計数し、０.０４％(ｖ／ｖ)ＢＳＡおよび１６％(ｖ／ｖ)OptiPrep溶液添加０.５×ＰＢＳで希釈して、所望の量の細胞(一般に２００μl中２０,０００細胞)を得た。懸濁液を、微小フルイディクスデバイスに接続した１mLシリンジに移し、１００μl／時間の流速で注入した。この方法に従い、ｍＥＳ細胞を、ＬＩＦを用いて１日目およびＬＩＦを用いずに早期２日目、後期２日目、４日目および７日目に調製した。
【０２５５】
Ｋ−５６２細胞株(ATCC, CCL-243)を、１０％(ｖ／ｖ)胎児ウシ血清および１％(ｖ／ｖ)ペニシリン−ストレプトマイシン添加ＤＭＥＭに、３７℃で５％ＣＯ２および６０〜８０％湿度雰囲気で、密度約３×１０５細胞ml−１で維持した。封入実験のために、Ｋ−５６２細胞を、ＤＭＥＭ培地を使用し、ｍＥＳ細胞と１：１比で混合する以外、上に概説したように製造した。
【０２５６】
ＤＮＡライブラリー調製。ライブラリー調製は、修飾ＣＥＬ−Ｓｅｑプロトコールに基づいた。ＤＮＡライブラリー調製のワークフローは次のとおり要約できる：ＲＴ→ＥｘｏＩ→ＳＰＲＩ精製(ＳＰＲＩＰ)→ＳＳＳ→ＳＰＲＩＰ→Ｔ７インビトロ転写線形増幅→ＳＰＲＩＰ→ＲＮＡフラグメンテーション→ＳＰＲＩＰ→プライマーライゲーション→ＲＴ→ライブラリー富化ＰＣＲ。
【０２５７】
Jaitin DA, et al. (2014) Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science 343(6172):776-779における詳細なプロトコールを参照して、次の修飾をプロトコールに行った：ＲＴプライマーはＰ５／ＰＥ１アダプターを含み、一方ライゲーションプライマーはＰ７／ＰＥ２アダプターを含み、反転した配向はプロトコールにおけるものである；ＥｘｏＩ処理前に、破壊液滴からの水相を、４℃で１５分、１４krcfで遠心分離し、細胞残骸およびゲルをペレット化した；ＥｘｏＩ処理中、１０Ｕ  ＨｉｎＦＩを、ＲＴ反応中に形成され得る消化プライマー二量体に添加した；元のＤＮＡｓｅ消化工程を、線形増幅後省略した；線形増幅後、得られた増幅ＲＮＡライブラリーを、先に進む前にAgilent BioAnalyzerで分析した；プライマーライゲーション前、サンプルをエビアルカリホスファターゼで３０分処理した。最終ライブラリー富化ＰＣＲのために必要な最終ＰＣＲサイクル数は、１０〜１３サイクルの範囲であった。残りの工程その他の点では代えていない。
【０２５８】
生物情報学分析。表１に詳述するように、ペアード・エンド配列決定をIllumina MiSeq、HiSeq 2500およびNextSeq機械で実施した。リード１をサンプルバーコードおよびＵＭＩ配列を得るために使用した；次いで、リード２を欠きのような対照トランスクリプトームに対してマッピングした。読取データを、まず、Ｗ１アダプター配列により分けられる２個のサンプルバーコード成分のリード１の存在に基づき、選別した(図２０および表４参照)。次いで、リード２をTrimomatic (5)(version 0.30; パラメータ: LEADING: 28 SLIDINGWINDOW: 4:20 MINLEN: 19)を使用して調整した。各読取データのバーコードを、３８４２の所定のバーコードの一覧に対してマッチさせ、最大２ヌクレオチドミスマッチまでのエラーを補正した。対照一覧から２ヌクレオチドを超えて分離されるバーコードを有する読取データは切り捨てた。次いで、読取データを、マッピングおよびＵＭＩフィルタリングのためにバーコード特異的ファイルに分けた。
【０２５９】
調整した読取データを、マウストランスクリプトームに対してBowtie(version 0.12.0、パラメータ：-n 1 -l 15 -e 300 -m 200 -best -strata -a)を使用してアラインした。データセットをまた、分析の質的結果を代えることなく、異なるbowtieパラメータセットでも評価した。対照トランスクリプトームを、ＵＣＳＣmm１０ゲノム集合体からの全アノテート転写物(１２５ｂｐポリＡテイルで伸長)を使用して構築した。カスタムＰｙｔｈｏｎおよびＰｙＳＡＭスクリプトを使用して、マッピング読取データを、遺伝子あたりのＵＭＩ選別転写物の数に処理した。bowtieからのアライメントを次の方法で選別した：(１)各読取データについて、我々は、転写物の末端に最も近いアライメントの選択により、全アイソフォームを通して、最大で遺伝子あたり１アライメントを保持した。(２)読取データが複数の遺伝子についてアラインされたら、我々は、転写物の末端から４００bpを超えて離れたあらゆるアライメントを除外した；これはＣＥＬ−ＳＥＱ方法の強い３’バイアスにより動機付けられる。(３)１０を超える遺伝子にマッピングされた読取データを除外し、(４)次の段落に記載するＵＭＩフィルタリング工程を実施した。最後に、(５)読取データが、ＵＭＩフィルタリング後まだ２を超える遺伝子にアラインされるならば、読取データを全体で除外した。数の報告に際し、各遺伝子について、少なくともの一つの読取データに識別されなかったあらゆる他の遺伝子も報告した；これは、マッピング多義性に起因する我々の下流分析における偽相関の除外を可能にした。この最終工程へのパイプラインの頑強性を、読取データあたり最大１〜４アライメントを用いるデータの再処理により確認した。工程(１〜５)を各サンプルで別々に実施した後、得られた遺伝子発現表を連結し、分析のためにＭＡＴＬＡＢに載せた。
【０２６０】
ＵＭＩフィルタリング(上記工程４)を次のとおり行った。各異なるＵＭＩを、ＵＭＩを運搬する一連の読取データを通して、一連の遺伝子と関連付けた。各ＵＭＩについて、このＵＭＩで完全な一連の読取データを構成できる最小の一連の遺伝子を特定した。この問題は、‘Hitting Set Problem’(または‘Set Cover Problem’)として知られる。貪欲法を適用して、各ＵＭＩについて最も貧弱な遺伝子セットを得た。１読取データ／遺伝子／ＵＭＩのみ維持した。この方法で、遺伝子のあるサブセットは、同じ一連の多義にアラインされた読取データにより支持されるため、互いになお区別不可能であり得る。前段落の工程(５)を、ゆえに、使用して、所定の閾値を越える不明瞭な読取データを除いた。ＵＭＩフィルタリング工程を説明するために、ＵＭＩを、一つ目は遺伝子ＡおよびＢにアラインし、二つ目は遺伝子ＢおよびＣにアラインする二つの読取データで考慮する。いずれの読取データも明白にアラインしないが、遺伝子Ｂは、両読取データの存在により説明され、ゆえに、遺伝子ＡおよびＣへのアライメントは無視され、２個の読取データのうち１個のみが遺伝子Ｂについて維持される。
【０２６１】
ＵＭＩ選別カウント正規化。正規化前に、サンプルバーコードあたりの総ＵＭＩフィルターマッピング(ＵＭＩＦＭ)数における多様性は、２１％〜５５％(変動係数)であった、表１参照。ＣＶは分化中に増殖するように見え、総ＵＭＩＦＭ数における多様性のいくつかの差異が、ＲＴ効率における多様性ではなく、細胞サイズの再に起因することを示唆する。全数を、総数正規化により正規化し、すなわち細胞ｉにおける遺伝子ｊの正規化した数は、非正規化数、ｍｉ,ｊの点で、
【数５】
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として与えられ、ここで、
【数６】
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は、全細胞にわたるＭｉの平均である。類似する結果が、サブサンプル正規化を使用しても得られる。
【０２６２】
方法感受性予測。このセクションは、検出限界が、全遺伝子転写物にわたり不偏および均一と仮定される、捕獲効率、βまたはベータのみである場合の予測である図１４Ｅにおける感受性曲線(黒曲線)に由来する。配列特異的または長さ特異的バイアスのような全ての他のバイアスは無視可能と仮定される。優れた適合は、これらの仮定を強化する。ｎを、ある液滴におけるある遺伝子に対する転写物数とする。この液滴における遺伝子の転写物ゼロを検出する確率は
【数７】
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である。次いで、感受性Ｓが、純粋ＲＮＡサンプルである場合、平均値
【数８】
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に関してポワソン−分散する、ｎの分布にわたりｐｏ(ｎ)を疎外化することにより得られる。
【数９】
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を得て、
【数１０】
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を導き、これが、図１４Ｄから測定されたβ(ベータ)の値と共に図１４Ｅにプロットされた曲線である。この曲線は、β(ベータ)で評価したポアソン分布の積率母関数(ＭＧＦ)としても特定できる。適合の品質は、液滴間のβ(ベータ)の多様性が小さいことを要求し、これは、対照液滴間の総数における低ＣＶと一致する。非対照サンプルについて、各遺伝子の投入分布はもはやポアソン分布ではなく、検出頻度
【数１１】
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は、むしろ各遺伝子で異なり、ここに示した仮定下、β(ベータ)で評価した根底の遺伝子発現分布のＭＧＦに等しい。
【０２６３】
ＰＣＡおよびｔＳＮＥ分析のための主要な遺伝子セットの選択およびフィルタリング。各遺伝子が、他の遺伝子と無相関である内因性サンプリングノイズを運搬するため、全トランスクリプトームデータについて、全遺伝子にわたり観察された可変性の大フラクションは、最主要成分により説明されないと予測される。同じ理由で、細胞亜集団間の差異は、多数の“傍観者”遺伝子(これは、集団間でほぼ変わらない)が評価する細胞−細胞相関に含まれるならば、弱く見え得る。これらのサンプリング限界に打ち勝つために、ＥＳ細胞集団構造を、既知ＥＳ細胞生物学を反映することが知られ、同時にまた各時点で最も可変性遺伝子であると報告される遺伝子のサブセットのみを使用して分析した。適切な遺伝子セットを選択する一般的戦略は次のとおりであった：(１)各時点で、遺伝子ファノ因子と密接に相関する、νスコア(表２)により決定して、トップ２００の最も可変性遺伝子を包含した；これらの遺伝子を、ＥＳ細胞生物学に包含される遺伝子の精選リストで補完した。(２)遺伝子セットを減らすために、予備的主成分分析(ＰＣＡ)を、最初の遺伝子セットを使用して細胞集団で行い、結果を“主要遺伝子”、すなわち図１５０Ｅにおけるマトリクス無作為化により決定して非ランダム主成分(ＰＣ)に寄与する遺伝子の選択のみに使用した。主要遺伝子は、各非ランダムＰＣについての最高充填係数を有するものであり、選択閾値は、充填係数分布の構造を反映するために各ＰＣで動的に設定する。(３)セットにおける各遺伝子ｇについて、次いで、セットをｇと最も強く相関する最大２個のさらなる遺伝子を含むように再拡張した。この最終工程は、最初のセットには存在しないが、非常に価値のある遺伝子セットと存在する遺伝子の包含を可能とする。工程(３)の終了時に導かれた最終遺伝子セットを、その後の各時点でのＰＣＡおよびｔＳＮＥ分析に使用した。
【０２６４】
ネットワーク近隣分析。距離メトリックｄ＝(１−(ピアソン相関))を、２遺伝子間の距離の定義に使用し、ここで、相関を全細胞にわたり取る。非加重、有向ネットワークを次のとおり構築した：ある目的の遺伝子Ｇ０について、そのＮ近傍遺伝子Ｇ１(すなわちＧ０と最高相関を有する遺伝子)に対する有向辺を定義した。Ｎのさらなる有向辺を、セットＧ１の各メンバーからそのＮ近傍に添加し、合わせてＧ２のセットを形成した。得られた予備的ネットワークは計(Ｎ＋１)＊Ｎ有向辺およびＧ０、Ｇ１およびＧ２を表す最大１＋(Ｎ＋１)＊Ｎ頂点を有する。次いで、ネットワークを、Ｘより少ない投入エッジを有するあらゆる頂点を除去することにより反復的に調整した。最終ネットワークは、“遺伝子Ｇ０のＸの接続した近隣”である。空セットでなければ、遺伝子Ｇ０；Ｇ１の少なくともＸ−１の他のメンバーも近傍であるＧ１のあるメンバー；およびＧ１の少なくともＸメンバーの近傍であるＧ２のあるメンバーを有する。図１６にプロットしたネットワークについて、パラメータＮ＝５０、Ｘ＝３を使用した。
【０２６５】
【表６】
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【０２６６】
【表７】
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【０２６７】
【表８】
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【０２６８】
実施例１６
この実施例は、細胞を液滴に封入する方法を説明する。この実施例において、液滴バーコーディング−配列決定プラットフォームを使用して、細胞を、溶解緩衝液、逆転写(ＲＴ)試薬およびバーコード化オリゴヌクレオチドプライマーと共に液滴に封入した。各溶解細胞から遊離したｍＲＮＡは、同じ液滴に捕捉されたままであり、相補的ＤＮＡ(ｃＤＮＡ)の合成中にバーコード化された。バーコーディング後、全細胞からの物質を破壊液滴により合わせ、ｃＤＮＡライブラリーを配列決定のために処理した(図２７)。
【０２６９】
この実施例において、細胞と共封入されたバーコード化ヒドロゲル微小球体(ＢＨＭ)のライブラリーを合成した(図２７)。ＢＨＭは、共有結合した、３８４２(すなわち１４７,４５６)の所定のバーコードの一つをコードする光遊離可能プライマーを運搬した。このプールサイズは、９９％一意的な標識で３,０００細胞を無作為に標識し、バーコード化され得る細胞数は、各約３ｋ細胞の収集物チューブに印をするライブラリーバーコードの使用よりはるかに多い。本方法は、単一ライブラリーにおける大規模細胞捕獲が望まれるならば、直接的な方法で拡張可能である。
【０２７０】
図２７は、数千の細胞のＤＮＡバーコーディングのための液滴微小流体プラットフォームを記載する。単一細胞液滴バーコーディングの概略図。細胞を、溶解緩衝液、逆転写(ＲＴ)混合物およびバーコード化ＲＴプライマー運搬ヒドロゲル微小球体と共封入し、封入プライマーがヒドロゲルから遊離された後、液滴内のｃＤＮＡ産物が、逆転写中にＤＮＡバーコードでタグ付される。その後液滴は、破壊され、全細胞からの物質を直線的に増幅させて、その後配列決定する。ＵＭＩ＝ランダムヘキサマーの一意的な分子識別子。
【０２７１】
ここでいくつかの本発明の態様が記載され、説明されているが、当業者は、ここに記載する結果および／または利点の１以上の機能を実施するおよび／または獲得するための、多様な他の手段および／または構造を容易に想起し、このようなバリエーションおよび／または修飾の各々は、本発明の範囲内であると考える。より一般的には、当業者は、ここに記載する全てのパラメータ、寸法、物質および配置が例示を意味するものであり、実際のパラメータ、寸法、物質および／または配置は、本発明の教示が使用される、特定の１以上の適用によることを容易に認識する。当業者は、日常的なものを超えない実験で、ここに記載する具体的な本発明の態様の多くの均等物を認識または確認できる。それゆえ、前記態様は、単なる例示であり、添付する特許請求の範囲およびその均等物の範囲内で、本発明は、具体的に記載し、かつ請求する以外に実施し得ると解釈すべきである。本発明は、ここに記載する各個々の特性、システム、物品、物質、キットおよび／または方法に関する。さらに、２以上のこのような特性、システム、物品、物質、キットおよび／または方法のあらゆる組み合わせは、このような特性、システム、物品、物質、キットおよび／または方法が互いに矛盾しない限り、本発明の範囲内に包含される。
【０２７２】
ここに定義し、使用する全ての定義は、辞書の定義、引用により包含する論文における定義および／または定義された用語の通常の意味を超えて支配的であると解釈すべきである。
【０２７３】
本明細書および特許請求の範囲で使用する単数表現は、明らかに矛盾しない限り、“少なくとも１”を意味すると解釈すべきである。
【０２７４】
本明細書および特許請求の範囲で使用する用語“および／または”は、結合された要素の“いずれかまたは両者”、すなわち、ある場合、結合して存在するおよび他の場合において分離して存在する要素を意味すると解釈すべきである。“および／または”を用いて列記された複数要素は同じ方法で解釈すべきであり、すなわち、要素の“１以上”が結合される。他の要素は、具体的に特定した要素と関連していても、関連していなくても、“および／または”節により具体的に特定された以外の要素は所望により存在してよい。従って、非限定的例として、“Ａおよび／またはＢ”なる記載は、“含む”のようなオープンエンドの用語と連結して使用するとき、ある態様において、Ａのみ(所望によりＢ以外の要素を含み得る)；他の態様において、Ｂのみ(所望によりＡ以外の要素を含み得る)；さらに別の態様において、ＡおよびＢ両者(所望により他の要素を含み得る)などを意味し得る。
【０２７５】
本明細書および特許請求の範囲で使用する“または”は、上記の“および／または”と同じ意味を有すると解釈すべきである。例えば、一覧の中の項目を分けるとき、“または”または“および／または”は包括的であると解釈すべきであり、すなわち、数または要素の一覧の少なくとも一つを包含するが、１超も含み、所望により、さらなる非列記項目も含む。“唯一つの”または“正確に一つの”、または、特許請求の範囲で使用するとき、“からなる”のような、これに明らかに反する用語のみが、数または要素の一覧の正確に１個の要素の包含を意味する。一般に、ここで使用する用語“または”は、“いずれか”、“一方”、“一方のみ”または“正確に一つの”のような排他性の用語を伴うときのみ、排他的代替(すなわち“一方または他方であるが、両者ではない”)を示すとして解釈すべきである。“から本質的になる”は、特許請求の範囲で使用するとき、特許法の分野で使用されるその通常の意味を有する。
【０２７６】
本明細書および特許請求の範囲で使用する用語“少なくとも一つ”は、１以上の要素の一覧を参照して、要素の一覧における要素の任意の１以上から選択される少なくとも１要素を意味するが、要素の一覧内に具体的に列記された各および全ての要素の少なくとも一つを必ずしも含まず、要素の一覧における要素のあらゆる組み合わせを除外しない。この定義はまた、要素が、所望により具体的に特定した要素と関係していても、していなくても、“少なくとも一つ”と言及した要素の一覧内に具体的に特定された以外の要素が所望により存在し得ることも可能とする。従って、非限定的例として、“ＡおよびＢの少なくとも一つ”(または、同等に、“ＡまたはＢの少なくとも一つ”、または、同等に“Ａおよび／またはＢの少なくとも一つ”)は、ある態様において、少なくとも一つ、所望により１超のＡを含み、Ｂが存在しない(そして、所望によりＢ以外の要素を含んでよい)；他の態様において、少なくとも一つ、所望により１超のＢを含み、Ａが存在しない(そして、所望によりＡ以外の要素を含んでよい)；さらに別の態様において、少なくとも一つ、所望により１超のＡおよび少なくとも一つ、所望により１超のＢを含む(および所望により他の要素を含んでよい)などを意味する。
【０２７７】
用語“約”を、数字を参照するときに使用するとき、本発明のさらに別の態様は、用語“約”の存在により修飾されないその数字を含むと解釈すべきである。
【０２７８】
明らかに矛盾する記載がない限り、１を超える工程または行為を含むあらゆる方法において、方法の該工程または行為の順番は、方法の工程または行為が言及されているその順番に必ずしも限定されない。
【０２７９】
特許請求の範囲ならびに上記明細書において、“含む”、“包含する”、“運搬する”、“有する”、“含有する”、“関与する”、“保持する”、“構成される”などのような全ての移行句はオープンエンドである、すなわち、含むが、限定されないと理解すべきである。“からなる”および“から本質的になる”の移行句のみが、それぞれ、United States Patent Office Manual of Patent Examining Procedures, Section 2111.03に示されるように、クローズまたはセミクローズの移行句である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１４−４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１５−４】
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【図１５−５】
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【図１５−６】
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【図１５−７】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１７−４】
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【図１７−５】
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【図１７−６】
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【図１７−７】
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【図１７−８】
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【図１７−９】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２１−３】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２４−３】
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【図２４−４】
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【図２５】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図２６−３】
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【図２６−４】
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【図２６−５】
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【図２６−６】
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【図２６−７】
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【図２６−８】
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【図２６−９】
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【図２６−１０】
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【図２６−１１】
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【図２６−１２】
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【図２６−１３】
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【図２６−１４】
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【図２６−１５】
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【図２６−１６】
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【図２６−１７】
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【図２６−１８】
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【図２６−１９】
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【図２６−２０】
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【図２６−２１】
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【図２６−２２】
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【図２７】
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【配列表】
2017515469000001.app
【国際調査報告】
2017515469.tif 000098
2017515469.tif 000099
2017515469.tif 000100