(57)【要約】  本発明は、二次リンパ器官ケモカイン（ＳＬＣ）が生体内で同系腫瘍の増殖を阻害するという本明細書に提供される開示に基づくものである。したがって、本発明は、治療有効量のＳＬＣを、モノクローナル抗体及び小分子阻害剤を含めたチェックポイント阻害剤と組み合わせて哺乳動物に投与することによって哺乳動物被験体における癌を治療する方法を提供する。例示的なチェックポイント分子としては、ＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ−４受容体、ＰＤ−１、ＰＤ１−Ｌ１、ＰＤ１−Ｌ２、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３又はそれらの組合せが挙げられる。本発明の方法において有用なＳＬＣとしては、ＳＬＣのポリペプチド、変異体及びフラグメント並びに関連する核酸が挙げられる。
2017538680.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体において癌又は固形腫瘍を治療する方法であって、
ａ．該被験体に、（ｉ）ＳＬＣポリペプチド、（ｉｉ）該ＳＬＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）該ポリヌクレオチドを含む細胞、又は（ｉｖ）それらの組み合わせを投与し、及び
該被験体に免疫チェックポイント阻害剤を投与すること
を含む方法。
【請求項２】
前記免疫チェックポイント阻害剤がＣＴＬＡ−４阻害剤、ＣＴＬＡ−４受容体阻害剤、ＰＤ−１阻害剤、ＰＤ１−Ｌ１阻害剤、ＰＤ１−Ｌ２阻害剤、４−１ＢＢ阻害剤、ＯＸ４０阻害剤、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ−３）阻害剤、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン３（ＴＩＭ−３）阻害剤又はそれらの組み合わせよりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記免疫チェックポイント阻害剤が抗体、任意にモノクローナル抗体である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記免疫チェックポイント阻害剤がＣＴＬＡ−４阻害剤、任意にイピリムマブ又はトレミリムマブである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記免疫チェックポイント阻害剤がニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピジリズマブ、ラムブロリズマブ、ＢＭＳ−９３６５５９、アテゾリズマブ並びにＡＭＰ−２２４、ＡＭＰ２２４、ＡＵＮＰ１２、ＢＧＢ１０８、ＭＣＬＡ１３４、ＭＥＤＩ０６８０、ＰＤＲ００１、ＲＥＧＮ２８１０、ＳＨＲ１２１０、ＳＴＩＡ１１０Ｘ、ＳＴＩＡ１１１０及びＴＳＲ０４２よりなる群から選択されるＰＤ１阻害剤である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記免疫チェックポイント阻害剤がＢＭＳ−９３６５５９、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＥＤＩ−４７３６、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、ＡＬＮ−ＰＤＬ、ＢＧＢＡ３１７、ＫＤ０３３、ＫＹ１００３、ＳＴＩＡ１００Ｘ、ＳＴＩＡ１０１０、ＳＴＩＡ１０１１、ＳＴＩＡ１０１２及びＳＴＩＡ１０１４よりなる群から選択されるＰＤ１−Ｌ１阻害剤である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記ＳＬＣポリペプチドが配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記ＳＬＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをベクターに挿入し、そして該ベクターを前記被験体に投与する、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記ベクターがアデノウイルスベクターである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記アデノウイルスベクターが複製欠損アデノウイルスベクターである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＳＬＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む細胞が抗原提示細胞（ＡＰＣ）である、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記ＡＰＣが樹状細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記樹状細胞が前記被験体に対して自己由来である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＳＬＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む少なくとも又は約１×１０6個の細胞を前記被験体に投与する、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞が２４時間以内に１×１０6個の細胞当たり少なくとも又は約０．２５ｎｇのＣＣＬ２１を産生する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記被験体が固形腫瘍を含み、前記細胞を前記被験体に腫瘍内投与する、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記固形腫瘍が非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）固形腫瘍である、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
（ｉ）ＳＬＣポリペプチド、（ｉｉ）該ＳＬＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）該ポリヌクレオチドを含む細胞又は（ｉｖ）それらの組み合わせを、免疫チェックポイント阻害剤の前に前記被験体に投与する、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
（ｉ）ＳＬＣポリペプチド、（ｉｉ）該ＳＬＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）該ポリヌクレオチドを含む細胞又は（ｉｖ）それらの組み合わせを、免疫チェックポイント阻害剤の約２週間前に前記被験体に投与する、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
（ｉ）ＳＬＣポリペプチド、（ｉｉ）該ＳＬＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）該ポリヌクレオチドを含む細胞又は（ｉｖ）それらの組み合わせを前記被験体に２回以上投与する、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
（ｉ）ＳＬＣポリペプチド、（ｉｉ）該ＳＬＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）該ポリヌクレオチドを含む細胞又は（ｉｖ）それらの組み合わせを１ヶ月に１回前記被験体に投与する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記免疫チェックポイント阻害剤を前記被験体に２回以上投与する、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記免疫チェックポイント阻害剤を２週間に１回被験体に投与する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
（ｉ）ＳＬＣポリペプチド、（ｉｉ）該ＳＬＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）該ポリヌクレオチドを含む細胞又は（ｉｖ）それらの組み合わせと免疫チェックポイント阻害剤とを含むキット。
【請求項２５】
前記免疫チェックポイント阻害剤がＣＴＬＡ−４阻害剤、ＣＴＬＡ−４受容体阻害剤、ＰＤ−１阻害剤、ＰＤ１−Ｌ１阻害剤、ＰＤ１−Ｌ２阻害剤、４−１ＢＢ阻害剤、ＯＸ４０阻害剤、ＬＡＧ−３阻害剤、ＴＩＭ−３阻害剤又はそれらの組み合わせよりなる群から選択される、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
前記免疫チェックポイント阻害剤が抗体、任意にモノクローナル抗体である、請求項２４又は２５に記載のキット。
【請求項２７】
前記免疫チェックポイント阻害剤がＣＴＬＡ−４阻害剤、任意にイピリムマブ又はトレミリムマブである、請求項２４〜２６のいずれかに記載のキット。
【請求項２８】
前記免疫チェックポイント阻害剤がニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピジリズマブ、ラムブロリズマブ、ＢＭＳ−９３６５５９、アテゾリズマブ並びにＡＭＰ−２２４、ＡＭＰ２２４、ＡＵＮＰ１２、ＢＧＢ１０８、ＭＣＬＡ１３４、ＭＥＤＩ０６８０、ＰＤＲ００１、ＲＥＧＮ２８１０、ＳＨＲ１２１０、ＳＴＩＡ１１０Ｘ、ＳＴＩＡ１１１０及びＴＳＲ０４２よりなる群から選択されるＰＤ１阻害剤である、請求項２４〜２７のいずれかに記載のキット。
【請求項２９】
前記免疫チェックポイント阻害剤がＢＭＳ−９３６５５９、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＥＤＩ−４７３６、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、ＡＬＮ−ＰＤＬ、ＢＧＢＡ３１７、ＫＤ０３３、ＫＹ１００３、ＳＴＩＡ１００Ｘ、ＳＴＩＡ１０１０、ＳＴＩＡ１０１１、ＳＴＩＡ１０１２及びＳＴＩＡ１０１４よりなる群から選択されるＰＤ１−Ｌ１阻害剤である、請求項２４〜２７のいずれかに記載のキット。
【請求項３０】
前記ＳＬＣポリペプチドが配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項２４〜２９のいずれかに記載のキット。
【請求項３１】
前記ＳＬＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがベクターに挿入され、そして該ベクターが被験体に投与されるものである、請求項２４〜３０のいずれかに記載のキット。
【請求項３２】
前記ベクターがアデノウイルスベクターである、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
前記アデノウイルスベクターが複製欠損アデノウイルスベクターである、請求項３２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１４年１１月５日に出願された米国仮特許出願第６２／０７５，５３２号の優先権を主張する。その内容は参照により本明細書において援用する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、癌などの病理学的状態に関連するものを含めた哺乳動物生理学的プロセスを調節するために二次リンパ器官ケモカインを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
発癌性、癌退行、再発及び転移に影響を与える免疫機構を理解することは、新規免疫療法の開発の重要な側面である。この状況において、当業者であれば、免疫応答の基本的な側面は、生物の免疫細胞が自己免疫抗原と非自己抗原とを区別することができることであると理解する。したがって、癌における免疫機構を解明しようとする臨床関連モデルは、腫瘍細胞が宿主免疫系の細胞と遺伝的背景を共有する（すなわち、同系である）という事実を考慮しなければならない。残念ながら、動物に癌細胞系を導入する癌の多くの動物モデルは、宿主動物の遺伝的背景と評価されている癌細胞系との間の差異に影響を受ける免疫応答によって混乱を来してしまう。具体的には、宿主動物及び癌細胞株が本質的に同一の遺伝的背景を共有しない癌モデルでは、個体間での移植臓器の拒絶反応に見られるものに類似する宿主の免疫系による「非自己」免疫応答に関連する問題を含めて、様々な問題がある。自発癌細胞上の非自己抗原（癌では当然には生じない現象）の宿主免疫系認識から生じる場合のある非自己免疫応答は、ヒト癌では起こらない癌細胞に対する免疫応答を生じさせる。したがって、癌の発生及び進行を忠実に模倣し、それによって免疫機構の臨床的に関連する分析を行うことができるようにする癌モデルが絶えず必要とされている。
【０００４】
腫瘍細胞に対する効果的な免疫応答は、ＡＰＣエフェクター及びリンパ球エフェクターの両方を必要とする（例えば、Ｈｕａｎｇ外，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６４：９６１−９６５，１９９４参照）。腫瘍細胞は、ＭＨＣ抗原の発現が制限され、共刺激分子を欠失する場合が多いため、それらは効果的でないＡＰＣである（例えば、Ｒｅｓｔｉｆｏ外，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７７：２６５−２７２，１９９３参照）。さらに、腫瘍細胞は、宿主免疫監視の回避に寄与する免疫抑制メディエーターを分泌する（例えば、Ｈｕａｎｇ外，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５８：１２０８−１２１６，１９９８；Ｓｈａｒｍａ外，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６３：５０２０−５０２８，１９９９；及びＵｚｚｏ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．，１０４：７６９−７７６，１９９９参照）。この問題を回避するために、研究者は、生体外で生成されたＤＣを使用して生体内で抗腫瘍免疫応答を刺激している。実験マウスモデルでは、腫瘍関連抗原ペプチドがパルスされたＤＣ（Ｎａｉｒ外，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７：５８９−５９７，１９９７）や腫瘍ＲＮＡがトランスフェクトされたＤＣは、生体内で抗原特異的抗腫瘍応答を誘導することが示されている（Ｂｏｃｚｋｏｗｓｋｉ外，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８４：４６５−４７２，１９９６）。同様に、ＤＣと腫瘍細胞との融合又はサイトカイン修飾ＤＣの腫瘍内注射も、抗腫瘍免疫を増強することが示されている（Ｇｏｎｇ外，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，３：５５８−５６１，１９９７；Ｃｅｌｌｕｚｚｉ外，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６０：３０８１−３０８５，１９９８；Ｍｉｌｌｅｒ外，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１１：５３−６５，２０００）。結果として、効果的な抗癌免疫は、腫瘍抗原提示のために特殊分化宿主ＡＰＣを動員して特異的Ｔ細胞活性化を促進することによって達成できることが示唆されている（Ｓｏｔｏ外，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５：６７５−７０５，１９９７）。したがって、ＤＣ及びリンパ球エフェクターの両方をリンパ節及び腫瘍部位に引きつけるケモカインは、癌免疫療法において強力な薬剤として機能することがきると考えられる。
【０００５】
相同であるが機能的に異なるタンパク質の一群であるケモカインは、白血球の移動及び活性化を直接仲介し、血管新生の調節に所定の役割を果たす（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ外，Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５：６７５−７０５，１９９７）。また、ケモカインは、免疫ホメオスタシス及び二次リンパ器官の構造を維持するように機能する（Ｊｕｎｇ外，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１：３１９−３２５，１９９９）。いくつかのケモカインは、抗腫瘍活性を有することが知られている。腫瘍細胞がＭＩＰ１α、ＲＡＮＴＥＳ、リンホタクチン、ＴＣＡ３、ＪＥ／ＭＣＰ−１／ＭＣＡＦ、ＭＩＰ３α、ＭＩＰ３β及びＩＰ−１０を含めたケモカインで修飾された様々なマウス腫瘍モデルにおいて腫瘍拒絶が注目されている（Ｌｕｓｔｒｅ外，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７８：１０５７−１０６５，１９９３；Ｂｏｔｔａｚｚｉ外，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：１２８０−１２８５，１９９２；Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎ外，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６２：３８５９−３８６４，１９９９；Ｓａｌｌｕｓｔｏ外，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８：２７６０−２７６９，１９９８；Ｓｏｚｚａｎｉ外，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１：１０８３−１０８６，１９９８；Ｄｉｅｕ外，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８８：３７３−３８６，１９９８；Ｃａｍｐｅｌｌ外，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１４１：１０５３−１０５９，１９９８；Ｓａｅｋｉ外，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６２：２４７２−２４７５，１９９１；Ｎａｇｉｒａ外，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８：１５１６−１５２３，１９９８）。
【０００６】
二次リンパ組織ケモカイン（ＳＬＣ、Ｅｘｏｄｕｓ２又は６Ｃｋｉｎｅとも呼ばれる）は、ナイーブＴ細胞及びＤＣを強力に誘引する、高内皮細静脈並びに脾臓及びリンパ節のＴ細胞ゾーンで通常発現される高内皮由来ＣＣケモカインである（Ｃｙｓｔｅｒ外，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８９：４４７−４５０，１９９９．２４；Ｏｇａｔａ外，Ｂｌｏｏｄ，９３：３２２５−３２３２，１９９９；Ｃｈａｎ外，Ｂｌｏｏｄ，９３：３６１０−３６１６，１９９９；Ｈｅｄｒｉｃｋ外，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５９：１５８９−１５９３，１９９７；Ｈｒｏｍａｓ外，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５９：２５５４−２５５８，１９９７；Ｎａｇｉｒａ外，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：１９５１８−１９５２４，１９９７；Ｔａｎａｂｅ外，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５９：５６７１−５６７９，１９９７；Ｗｉｌｌｉｍａｎｎ外，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８：２０２５−２０３４，１９９８）。ＳＬＣは、２つの特異的Ｇタンパク質共役型７回膜貫通ドメインケモカイン受容体のＣＣＲ７及びＣＸＣＲ３を介してその効果を仲介する（Ｙｏｓｈｉｄａ外，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：７１１８；Ｊｅｎｈ外，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：３７６５）。ＣＣＲ７はナイーブＴ細胞及び成熟ＤＣ上で発現されるのに対し、ＣＸＣＲ３は記憶表現型を有するＴｈ１サイトカイン産生リンパ球上で優先的に発現される（Ｙｏｓｈｉｄａ外，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：７１１８；Ｊｅｎｈ外，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：３７６５）。
【０００７】
ＤＣを化学結合させるＳＬＣの能力（Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎ外，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６２：３８５９−３８６４，１９９９）は、他のケモカインと共有される特性である（Ｓａｌｌｕｓｔｏ外，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８：２７６０−２７６９，１９９８；Ｓｏｚｚａｎｉ外，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１：１０８３−１０８６，１９９８；Ｄｉｅｕ外，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８８：３７３−３８６，１９９８）。しかし、ＳＬＣは、生体内での１型サイトカイン応答を誘発することができるため、明らかに有利な場合がある（Ｓｈａｒｍａ外，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６４：４５５８−４５６３，２０００）。ＤＣは、免疫応答の開始に関与するユニークに強力なＡＰＣである（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ外，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄ．），３９２：２４５−２５２，１９９８）。免疫系のセンチネルとして機能するＤＣは、末梢における抗原の獲得、その後、特異的な免疫応答を開始するリンパ器官におけるＴ細胞領域への輸送を担当する。ＳＬＣは、ナイーブリンパ球及び抗原刺激ＤＣの両方を二次リンパ器官のＴ細胞ゾーンに動員し、これらの初期免疫応答成分を共局在化させ、同族Ｔ細胞活性化を達成する（Ｃｙｓｔｅｒ外，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８９：４４７−４５０，１９９９．２４）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
当該技術分野においては、例えば宿主サイトカインプロファイルがＳＬＣによってどのように調節されるのかのみならず、ＳＬＣが同系癌細胞に対する効果的な細胞仲介免疫応答を編成する能力を試験するために癌における免疫機構を忠実に模倣する癌モデルが必要とされている。さらに、このような臨床関連モデルに基づく免疫機能並びに免疫療法モダリティの新たなアッセイが必要とされている。ここで提供される発明は、これらのニーズを満たすものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の概要
本明細書に開示される発明は、本質的に同一の遺伝的背景を有する宿主動物及び癌細胞を利用することによって、癌における免疫機構を忠実に模倣する動物モデルを提供する。これらのモデルは、ＳＬＣが同系癌細胞に対する効果的な細胞仲介免疫応答を編成する能力を実証するために使用される。さらに、これらのモデルを使用して、同系癌細胞に対するＳＬＣ調節免疫応答に関連する宿主サイトカインプロファイルを評価することができる。
【００１０】
本明細書に開示するように、二次リンパ器官ケモカインの抗腫瘍効率を、腫瘍を自発的に発生するトランスジェニックマウスを含めた多数の同系モデルにおいて評価した。これらのトランスジェニックマウスでは、両側多巣性肺腺癌が臓器特異的に発生する。当該技術分野において知られている同種モデルと比較して、このトランスジェニックマウスモデルにおいて生じる自発性腫瘍は非自己抗原を発現しないため、ヒト癌に似ている。
【００１１】
本明細書で開示される同系モデルにおいて、腫瘍内及び／又は腋窩リンパ節領域内における組換えＳＬＣの注入により、腫瘍の広範囲にわたるリンパ球及びＤＣ浸潤が著しく減少し、生存率が向上した。これらの同系ネズミモデルにＳＬＣ注射をすると、腫瘍部位、リンパ節及び脾臓でＣＤ４及びＣＤ８リンパ球並びにＤＣが有意に増加した。細胞浸潤は、１型サイトカイン及び抗血管新生ケモカインＩＦＮ−γ誘導性タンパク質１０、及びＩＦＮ−γ（ＭＩＧ）によって誘導されるモノカインの同化作用の向上を伴った。対照的に、免疫抑制性サイトカイン形質転換増殖因子βのリンパ節及び腫瘍部位産生は、ＳＬＣ処置に応答して減少した。試験管内では、照射自己腫瘍による刺激後に、ＳＬＣ処置マウスからの脾細胞は、より多くのＩＦＮ−γ及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を有意に分泌したが、インターロイキン１０のレベルを低下させた。腫瘍が器官特異的に発生するモデルにおける腫瘍負荷の有意な減少は、腫瘍免疫及び癌免疫療法を調節する際のＳＬＣの使用方法を提供する。
【００１２】
本明細書で開示される発明は多数の実施形態を有する。本発明の典型的な実施形態は、哺乳動物に、癌細胞の増殖を阻害するのに十分な量の二次リンパ組織ケモカイン（ＳＬＣ）ポリペプチドを投与することによって哺乳動物における自発癌の増殖を阻害する方法である。好ましい方法では、ＳＬＣは配列番号１で示されるポリペプチド配列を有する。これらの方法では、ＳＬＣポリペプチドは、典型的には、腫瘍内注射又はリンパ節注射によって哺乳動物に全身的に投与される。さらに別の投与態様では、ＳＬＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する発現ベクターを哺乳動物に投与し、ＳＬＣポリペプチドは、ＳＬＣ発現ベクターで形質導入された哺乳動物細胞によって産生される。
【００１３】
本発明の関連する実施形態は、哺乳動物に二次リンパ組織ケモカイン（ＳＬＣ）を投与することを含む、哺乳類における同系癌細胞（最も好ましくは自発的癌細胞）の増殖を阻害する方法であって、配列番号１に示されるＳＬＣをコードするポリヌクレオチドを哺乳類の細胞に形質導入することによってＳＬＣを哺乳動物に投与し、それによって、該形質導入された細胞が癌細胞の増殖を阻害するのに十分な量でＳＬＣポリペプチドを発現するする方法である。好ましくは、ベクターは、腫瘍内注射又はリンパ節内注射によって哺乳動物に全身的に投与される。
【００１４】
本発明の別の実施形態は、哺乳動物又は哺乳動物に由来する細胞の集団におけるサイトカイン発現を、同系の腫瘍細胞の増殖を阻害するのに十分な量の二次リンパ系組織ケモカイン（ＳＬＣ）ポリペプチドに該細胞集団を曝露することによって達成する又は調節する（例えば、既存のサイトカインプロファイルを変化させる）方法である。本明細書に開示されるように、本明細書中に開示される同系モデルは、ＳＬＣの添加がどのようにサイトカイン発現を協調的に調節し、かつ、腫瘍細胞の増殖を阻害するのかを実証するため、これらの現象の観察（サイトカイン発現の調節及び腫瘍増殖の阻害）は、潜在的な免疫刺激性化合物又は免疫阻害性試験化合物の効果を評価するように設計された細胞系アッセイで使用できる。
【００１５】
本発明の別の実施形態は、同系哺乳動物細胞の集団におけるインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）ポリペプチドの発現の増加及び形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）ポリペプチドの発現の減少を、ＣＤ８陽性Ｔ細胞、ＣＤ４陽性Ｔ細胞、抗原提示細胞及び腫瘍細胞を含む腫瘍細胞の増殖を阻害するのに十分な量の二次リンパ組織ケモカイン（ＳＬＣ）ポリペプチドに該細胞集団を曝露することによって達成する方法である。好ましい方法では、酵素結合免疫吸着（ＥＬＩＳＡ）アッセイによって測定したときに、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）ポリペプチドの発現の増加は少なくとも約２倍であり、形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）ポリペプチドの発現の減少は少なくとも約２倍である。
【００１６】
様々な実施形態では、本発明は、被験体に（ｉ）ＳＬＣポリペプチド、（ｉｉ）ＳＬＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドを含む細胞、又は（ｉｖ）それらの組み合わせを投与し、そして該被験体に免疫チェックポイント阻害剤を投与し、それによって該被験体において癌又は固形腫瘍を治療することを含む、被験体において癌又は固形腫瘍を治療する方法も提供する。
【００１７】
また、腫瘍増殖若しくは腫瘍体積を減少させる方法、腫瘍進行を緩徐化若しくは低下させる方法、又は被験体における腫瘍再発を予防又は改善する方法であって、（ｉ）ＳＬＣポリペプチド、（ｉｉ）ＳＬＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドを含む細胞、又は（ｉｖ）それらの組み合わせを投与することを含む方法も意図される。
【００１８】
様々な実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４阻害剤、ＣＴＬＡ−４受容体阻害剤、プログラム細胞死１（ＰＤ−１）阻害剤、ＰＤ１−Ｌ１阻害剤、ＰＤ１−Ｌ２阻害剤、４−１ＢＢ阻害剤、ＯＸ４０阻害剤、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ−３）阻害剤、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン３（ＴＩＭ−３）阻害剤又はそれらの組み合わせよりなる群から選択される。
【００１９】
様々な実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ−４受容体、ＰＤ−１、ＰＤ１−Ｌ１、ＰＤ１−Ｌ２、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３又はそれらの組み合わせの１種以上に特異的な抗体、任意にモノクローナル抗体である。
【００２０】
様々な実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ−４受容体、ＰＤ−１、ＰＤ１−Ｌ１、ＰＤ１−Ｌ２、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３又はそれらの組み合わせの１種以上の活性を阻害する小分子阻害剤である。
【００２１】
様々な実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４阻害剤、任意にイピリムマブ又はトレミリムマブである。
【００２２】
様々な実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピジリズマブ、ラムブロリズマブ、ＢＭＳ−９３６５５９、アテゾリズマブ並びにＡＭＰ−２２４、ＡＭＰ２２４、ＡＵＮＰ１２、ＢＧＢ１０８、ＭＣＬＡ１３４、ＭＥＤＩ０６８０、ＰＤＲ００１、ＲＥＧＮ２８１０、ＳＨＲ１２１０、ＳＴＩＡ１１０Ｘ、ＳＴＩＡ１１１０及びＴＳＲ０４２よりなる群から選択されるＰＤ１阻害剤である。
【００２３】
様々な実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＢＭＳ−９３６５５９、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＥＤＩ−４７３６、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、ＡＬＮ−ＰＤＬ、ＢＧＢＡ３１７、ＫＤ０３３、ＫＹ１００３、ＳＴＩＡ１００Ｘ、ＳＴＩＡ１０１０、ＳＴＩＡ１０１１、ＳＴＩＡ１０１２及びＳＴＩＡ１０１４よりなる群から選択されるＰＤ１−Ｌ１阻害剤である。
【００２４】
様々な実施形態において、４−１ＢＢの免疫チェックポイント阻害剤は、４−１ＢＢに特異的に結合するモノクローナル抗体であり、ＢＭＳ−６６３５１３及びＰＦ−０５０８２５６６が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２５】
様々な実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤はＯＸ４０の阻害剤である。例示的な態様では、ＯＸ４０の阻害剤は、ＯＸ４０に特異的に結合するモノクローナル抗体である。
【００２６】
様々な実施形態において、ＳＬＣポリペプチドは、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を含む。
【００２７】
様々な実施形態では、ＳＬＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをベクターに挿入し、このベクターを被験体に投与する。様々な実施形態では、ベクターはアデノウイルスベクターである。様々な実施形態では、アデノウイルスベクターは、複製欠損アデノウイルスベクターである。
【００２８】
様々な実施形態では、ＳＬＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む細胞は抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。様々な実施形態において、ＡＰＣは樹状細胞である。様々な実施形態において、樹状細胞は、被験体に対して自己由来である。
【００２９】
様々な実施形態では、ＳＬＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む少なくとも又は約１×１０6個の細胞を被験体に投与する。様々な実施形態では、細胞は、２４時間以内に１×１０6個の細胞当たり少なくとも約０．２５ｎｇのＣＣＬ２１を産生する。
【００３０】
様々な実施形態では、被験体は固形腫瘍を含み、細胞を該被験体に腫瘍内投与する。様々な実施形態では、固形腫瘍は非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）固形腫瘍である。
【００３１】
様々な実施形態において、（ｉ）ＳＬＣポリペプチド、（ｉｉ）ＳＬＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドを含む細胞、又は（ｉｖ）それらの組み合わせを、免疫チェックポイント阻害剤の前に被験体に投与する。様々な実施形態では、（ｉ）ＳＬＣポリペプチド、（ｉｉ）ＳＬＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドを含む細胞、又は（ｉｖ）それらの組み合わせを、免疫チェックポイント阻害剤の約２週間前に被験体に投与する。
【００３２】
様々な実施形態において、（ｉ）ＳＬＣポリペプチド、（ｉｉ）ＳＬＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドを含む細胞、又は（ｉｖ）それらの組み合わせを被験体に２回以上投与する。
【００３３】
様々な実施形態において、（ｉ）ＳＬＣポリペプチド、（ｉｉ）ＳＬＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドを含む細胞、又は（ｉｖ）それらの組み合わせを１ヶ月に１回被験体に投与する。
【００３４】
様々な実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤を被験体に２回以上投与する。様々な実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤を２週間に１回被験体に投与する。
【００３５】
また、（ｉ）ＳＬＣポリペプチド、（ｉｉ）ＳＬＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドを含む細胞又は（ｉｖ）それらの組み合わせと免疫チェックポイント阻害剤とを含むキットも意図される。
【００３６】
様々な実施形態において、キットは、ＣＴＬＡ−４阻害剤、ＣＴＬＡ−４受容体阻害剤、ＰＤ−１阻害剤、ＰＤ１−Ｌ１阻害剤、ＰＤ１−Ｌ２阻害剤、４−１ＢＢ阻害剤、ＯＸ４０阻害剤、ＬＡＧ−３阻害剤、ＴＩＭ−３阻害剤又はそれらの組み合わせよりなる群から選択される免疫チェックポイント阻害剤を提供する。
【００３７】
様々な実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ−４受容体、ＰＤ−１、ＰＤ１−Ｌ１、ＰＤ１−Ｌ２、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３又はそれらの組み合わせの１種以上に特異的な抗体、任意にモノクローナル抗体である。
【００３８】
様々な実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ−４受容体、ＰＤ−１、ＰＤ１−Ｌ１、ＰＤ１−Ｌ２、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３又はそれらの組み合わせの１種以上の活性を阻害する小分子阻害剤である。
【００３９】
様々な実施形態では、キット中の免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４阻害剤、任意にイピリムマブ又はトレミリムマブである。
【００４０】
様々な実施形態では、キット中の免疫チェックポイント阻害剤は、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピジリズマブ、ラムブロリズマブ、ＢＭＳ−９３６５５９、アテゾリズマブ並びにＡＭＰ−２２４、ＡＭＰ２２４、ＡＵＮＰ１２、ＢＧＢ１０８、ＭＣＬＡ１３４、ＭＥＤＩ０６８０、ＰＤＲ００１、ＲＥＧＮ２８１０、ＳＨＲ１２１０、ＳＴＩＡ１１０Ｘ、ＳＴＩＡ１１１０及びＴＳＲ０４２よりなる群から選択されるＰＤ１阻害剤である。
【００４１】
様々な実施形態では、キット中の免疫チェックポイント阻害剤は、ＢＭＳ−９３６５５９、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＥＤＩ−４７３６、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、ＡＬＮ−ＰＤＬ、ＢＧＢＡ３１７、ＫＤ０３３、ＫＹ１００３、ＳＴＩＡ１００Ｘ、ＳＴＩＡ１０１０、ＳＴＩＡ１０１１、ＳＴＩＡ１０１２及びＳＴＩＡ１０１４よりなる群から選択されるＰＤ１−Ｌ１阻害剤である。
【００４２】
様々な実施形態において、４−１ＢＢの免疫チェックポイント阻害剤は、４−１ＢＢに特異的に結合するモノクローナル抗体であり、ＢＭＳ−６６３５１３及びＰＦ−０５０８２５６６が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４３】
様々な実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤はＯＸ４０の阻害剤である。様々な態様では、ＯＸ４０の阻害剤は、ＯＸ４０に特異的に結合するモノクローナル抗体である。
【００４４】
様々な実施形態では、チェックポイント阻害剤はＬＡＧ−３阻害剤である。様々な実施形態では、ＬＡＧ−３の阻害剤は、ＬＡＧ−３に特異的に結合するモノクローナル抗体である。
【００４５】
様々な実施形態では、チェックポイント阻害剤はＴＩＭ−３阻害剤である。様々な実施形態では、ＴＩＭ−３の阻害剤は、ＴＩＭ−３に特異的に結合するモノクローナル抗体である。
【００４６】
様々な実施形態において、ＳＬＣポリペプチドは、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を含む。
【００４７】
様々な実施形態では、ＳＬＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをベクターに挿入し、このベクターを被験体に投与する。様々な実施形態では、ベクターはアデノウイルスベクターである。様々な実施形態では、アデノウイルスベクターは、複製欠損アデノウイルスベクターである。
【００４８】
また、ＳＬＣ（例えば、ＳＬＣポリペプチド、ＳＬＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含む細胞若しくはそれらの組合せ）及び／又はチェックポイントタンパク質シグナル伝達を調節する上記抗体若しくはポリペプチド、例えばＣＴＬＡ−４阻害剤、ＣＴＬＡ−４受容体阻害剤、プログラム細胞死１（ＰＤ−１）阻害剤、ＰＤ１−Ｌ１阻害剤、ＰＤ１−Ｌ２阻害剤、４−１ＢＢ阻害剤、ＯＸ４０阻害剤、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ−３）阻害剤、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン３（ＴＩＭ−３）阻害剤若しくはそれらの組み合わせなどのチェックポイント阻害剤のいずれかの、本明細書に記載の障害のいずれかを治療するための医薬品の製造における使用も意図される。様々な実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ−４受容体、ＰＤ−１、ＰＤ１−Ｌ１、ＰＤ１−Ｌ２、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３又はそれらの組み合わせの１種以上に特異的な抗体、任意にモノクローナル抗体である。
【００４９】
また、上記抗体又はポリペプチドのいずれかを任意に適切な使用説明書と共に含むシリンジ、例えば、一回使用シリンジ又は予め充填されたシリンジ、滅菌密封容器、例えば、バイアル、ボトル、容器、及び／又はキット若しくはパッケージも意図される。
【００５０】
本明細書に記載された上記抗体又はポリペプチドのいずれかを、補助療法として当該分野において知られている又は本明細書に記載されている任意の化学療法剤と同時に投与することができる。また、本発明の上記抗体又はポリペプチドのいずれかを化学療法剤と共に含む組成物も意図される。
【００５１】
本明細書に記載される各特徴若しくは実施形態又は組み合わせは、本発明の態様のいずれかの非限定的で例示的な実施形態であり、それ自体本明細書に記載された他の任意の特徴若しくは実施形態又は組み合わせと組み合わせることが可能であることを意味すると解される。例えば、特徴が「一実施形態」、「いくつかの実施形態」、「さらなる実施形態」、「特定の例示的実施形態」及び／又は「別の実施形態」などの用語で記載される場合には、これらのタイプの実施形態のそれぞれは、可能な全ての組み合わせを列挙することなく、本明細書に記載される任意の他の特徴又は特徴の組み合わせと組み合わせられることを目的とした特徴の非限定的な例である。
【００５２】
このような特徴又は特徴の組み合わせは、本発明のいずれの態様にも適用される。同様に、所定の方法において、所定の特徴によって特徴付けられる抗体などのポリペプチド結合剤を同定する記載がある場合には、それらの特徴によって特徴付けられるポリペプチド結合剤も本発明によって企図される。範囲内に入る値の例が開示されている場合には、これらの例のいずれも範囲の可能な終点として考えられ、そのような終点間の任意の数値及び全ての数値が考慮され、上限値及び下限値の任意かつ全ての組み合わせが想定される。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】ＳＬＣは、免疫コンピテントマウスにおける抗腫瘍応答を仲介する：ＣＤ４及びＣＤ８リンパ球サブセットについての要件。３ＬＬ（Ｈ−２ｄ）又はＬ１Ｃ２（Ｈ−２ｂ）細胞（１０5）を、Ｃ５７ＢＬ／６マウス及びＢＡＬＢ／ｃマウスの上肩甲上部領域に皮下注射した。腫瘍形成５日後に、注射当たり０．５μｇのマウス組換えＳＬＣ又はＰＢＳ希釈剤（１×）を週３回腫瘍内投与した。等量のマウス血清アルブミンを対照注射用の無関係なタンパク質として使用したところ、これは腫瘍体積を変化させなかった。腫瘍体積を週３回（ｎ＝１０〜１２マウス／群）監視した。腫瘍内ＳＬＣ投与により、未処置の腫瘍保有マウスと比較して腫瘍体積が有意に減少した（ｐ＜０．０１）。ＳＬＣ治療群では、マウスの４０％が完全な腫瘍撲滅（Ａ及びＤ）を示した。ＳＬＣ仲介抗腫瘍応答は、この療法がＳＣＩＤマウスにおける腫瘍増殖を変化させなかったという事実によって立証されるように、リンパ球依存性である（図１Ｅ）。また、ＣＤ４及びＣＤ８ノックアウトマウスで行われた研究から、ＳＬＣ仲介腫瘍退縮に関するＣＤ４及びＣＤ８エフェクターサブセットの両方の要件が示された（図１Ｂ及びＣ）。
【図２】腫瘍内ＳＬＣ投与は、リンパ節（ＬＮ）由来リンパ球の細胞溶解能力を増大させる。照射３ＬＬ腫瘍による刺激の１週間後に、ＳＬＣ処置及び希釈剤対照腫瘍保有マウス由来のリンパ節由来リンパ球の細胞溶解能力を決定した。リンパ節由来リンパ球（５×１０6細胞／ｍｌ）を、照射３ＬＬ（１０5細胞／ｍｌ）腫瘍と共に総体積５ｍｌ中５０：１の割合で培養した。５日間培養した後に、リンパ節由来リンパ球の細胞溶解能力を51Ｃｒ標識３ＬＬ腫瘍標的に対して評価した。腫瘍内ＳＬＣ投与後に、ＬＮＤＬの細胞溶解能力は、希釈剤処理腫瘍保有マウス由来のリンパ球のそれよりも有意に高かった。*ｐ＜０．０１。
【図３】図３Ａ〜３Ｅ。ＳＬＣは、自発性肺癌のネズミモデルにおいて強力な抗腫瘍応答を仲介する。ＳＶ４０の大きなＴＡｇがネズミクララ細胞特異的プロモーターであるＣＣ−１０（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ外，Ｂｌｏｏｄ，９２：４１５０−４１６６，１９９８）の制御下で発現されるトランスジェニックマウスにおける自発気管支癌モデルにおいてＳＬＣの抗腫瘍効果を評価した。導入遺伝子を発現するマウスは、びまん性両側気管支肺胞癌を発症し、４ヶ月の平均寿命を有する。４週齢のトランスジェニックマウスの腋窩リンパ節領域にＳＬＣ（０．５μｇ／注射）又は同濃度のネズミ血清アルブミンを１週間に３回８週間にわたって注射した。対照マウスが進行性肺腫瘍の増殖のため死亡し始めた４ヵ月目に、全ての処置群のマウスを屠殺し、肺を単離し、そしてパラフィンに包埋した。対照処置マウスからのパラフィン包埋肺腫瘍切片のＨ＆Ｅ染色により、検出可能なリンパ球浸潤なしに両肺全体にわたって大きな腫瘍塊が明らかになった（３Ａ及び３Ｃ）。これに対し、ＳＬＣ療法群は、腫瘍負荷の顕著な低下を伴う広範囲のリンパ球浸潤が明らかになった（３Ｂ及び３Ｄ）。３Ｄに示した矢印は、腫瘍（*１）及び浸潤（*２）を示す（３Ａ及び３Ｂ、×３２；３Ｃ及びＤ、×３２０）。３Ｅは、ＳＬＣ処置マウスにおける腫瘍負荷を低減した。腫瘍負荷は、較正された目盛り（１−ｃｍ2グリッドを１００個の１−ｍｍ2の正方形に細分した）でＨ＆Ｅ染色パラフィン包埋切片の顕微鏡検査によって肺内で定量した。その領域の＞５０％を占める腫瘍を有する格子の正方形を陽性としてスコア化し、陽性の正方形の総数を決定した。肺の４つの組織学的切片からの１０個の別個の視野を高出力（２０倍の対物レンズ）で検査した。ＳＬＣ処置ＣＣ−１０マウスでは、希釈剤処置対照群と比較して腫瘍負荷が減少した。対照処置マウスの生存期間中央値は１８±２週間であった。対照的に、ＳＬＣで処置したマウスの生存期間中央値は３４±３週間であった。（Ｐ＜０．００１；ｎ＝１０マウス／群）。
【図４Ａ】Ａｄ−ＳＬＣの腫瘍内投与は、生体内で肺癌の増殖を低下させる。マウスに１０００００個のＬ１Ｃ２腫瘍細胞を接種し、５日後に１０8ｐｆｕのＡｄ−ＣＶ又はＡｄ−ＳＬＣのいずれかで３週間週にわたって１週間に１回腫瘍内処置した。このＭＯＩでは、生体内で形質導入されたＡｄ−ＳＬＣ、Ｌ１Ｃ２腫瘍細胞は、１０ｎｇ／ｍｌ／１０6細胞／２４時間のＳＬＣを分泌した。経時的な腫瘍体積の減少を図４Ａにグラフ形式で示す。
【図４Ｂ】Ａｄ−ＳＬＣの腫瘍内投与は、生体内で肺癌の増殖を低下させる。マウスに１０００００個のＬ１Ｃ２腫瘍細胞を接種し、５日後に１０8ｐｆｕのＡｄ−ＣＶ又はＡｄ−ＳＬＣのいずれかで３週間週にわたって１週間に１回腫瘍内処置した。このＭＯＩでは、生体内で形質導入されたＡｄ−ＳＬＣ、Ｌ１Ｃ２腫瘍細胞は、１０ｎｇ／ｍｌ／１０6細胞／２４時間のＳＬＣを分泌した。治療後に完全に腫瘍撲滅したマウスの数を図４Ｂに表形式で示す。
【図５】図５Ａ及び５Ｂは、それぞれ表１Ａ及び１Ｂを示す。表１Ａは、腫瘍内ＳＬＣ投与がＴｈ１サイトカイン及び抗血管新生ケモカインの放出及び免疫抑制性メディエーターの減少を促進させることを示す。腫瘍におけるサイトカインプロファイルをＳＬＣで腫瘍内処置されたマウスにおいて決定し、そして腫瘍を有する希釈剤処置対照マウスにおけるサイトカインプロファイルと比較した。非壊死性腫瘍を採取し、小片に切断し、そしてふるいに通した。腫瘍を、一晩培養した後の上清中においてＥＬＩＳＡによってＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＴＧＦ−β、ＶＥＧＦ、ＭＩＧ及びＩＰ−１０の存在について評価し、またＥＩＡによってＰＧＥ2の存在について評価した。腫瘍由来のサイトカイン、ＰＧＥ2及びＶＥＧＦの決定を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイによって全タンパク質について補正した。結果を、総タンパク質１ミリグラム当たりのピコグラム／２４時間として表す。希釈剤処置腫瘍保有コントロールからの腫瘍結節と比較すると、ＳＬＣで腫瘍内処置したマウスは、ＰＧＥ2、ＶＥＧＦ、ＩＬ−１０及びＴＧＦ−βが有意に減少したが、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、ＭＩＧ及びＩＰ−１０は増加した。実験を２回繰り返した。表１Ｂは、ＣＣ−１０タグマウスのＳＬＣ処置がどのように１型サイトカイン及び抗血管新生ケモカイン放出を促進し、免疫抑制性及び血管形成性サイトカインＴＧＦ−βとＶＥＧＦの低下を促進するかを示す。ＳＬＣの腋窩リンパ節領域注射後に、ＣＣ−１０タグマウスにおける肺、リンパ節及び脾臓サイトカインプロファイルを測定し、希釈剤処置腫瘍を有する対照マウス及び非腫瘍性同系対照のものと比較した。肺を採取し、小片に切断し、ふるいに通し、そして２４時間培養した。脾細胞及びリンパ節由来リンパ球（５×１０6細胞／ｍｌ）を２４時間培養した。培養後、上清を回収し、サイトカインをＥＬＩＳＡで定量し、ＰＧＥ−２をＥＩＡで定量した。肺由来の全ての決定を、ブラッドフォードアッセイによって全タンパク質について補正し、結果をｐｇ／ミリグラム総タンパク質／２４時間で表す。脾臓及びリンパ節からのサイトカイン及びＰＧＥ−２決定値をｐｇ／ｍｌで表す。希釈剤処置ＣＣ−１０腫瘍保有マウスの肺と比較して、ＳＬＣ処置ＣＣ−１０マウスは、ＶＥＧＦ及びＴＧＦ−βが有意に減少したが、ＩＦＮ−γ、ＩＰ−１０、ＩＬ−１２、ＭＩＧ及びＧＭ−ＣＳＦが有意に増加した。希釈剤処置ＣＣ−１０タグマウスと比較して、ＳＬＣ処置ＣＣ−１０マウスの脾細胞はＩＦＮ−γ、ＩＰ−１０、ＭＩＧ及びＩＬ−１２のレベルが減少したが、希釈処置ＣＣ−１０マウスと比較してＴＧＦ−βレベルが低下した。与えた値は、６匹のマウス／群についての平均±ＳＥを反映する。
【図６Ａ】図６Ａは表２Ａを示す。表２Ａは、ＣＤ４及びＣＤ８リンパ球サブセットがＩＦＮ−γ及びＧＭ−ＣＳＦとＣＤ１１ｃ＋ＤＥＣ２０５発現ＤＣを分泌する頻度をＳＬＣが増加させることを示す。ＳＬＣ及び希釈剤処置腫瘍保有マウス由来の腫瘍結節及びリンパ節の単一細胞懸濁液を調製した。ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮ−γについての細胞質内染色並びにＣＤ４及びＣＤ８Ｔリンパ球についての細胞表面染色をフローサイトメトリーによって評価した。また、リンパ節及び腫瘍結節単一細胞懸濁液における細胞表面マーカーＣＤ１１ｃ及びＤＥＣ２０５に対して陽性に染色されたＤＣも評価した。細胞を、順方向及び側方散乱プロファイルに基づいてゲーティングすることによってリンパ球又はＤＣとして同定した：細胞探索ソフトウェアを使用して１５，０００のゲートイベントを収集し分析した。ゲートされたＴリンパ球集団の中で、ＳＬＣの腫瘍内注射は、希釈剤処置腫瘍を有する対照マウスと比較して、ＣＤ４及びＣＤ８細胞が腫瘍結節及びリンパ節においてＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮ−γを分泌する頻度の増加をもたらした。ゲートされたＤＣ集団内では、希釈剤処置対照腫瘍保有マウスと比較して、ＳＬＣ処理腫瘍保持マウスにおけるＤＣの頻度の有意な増加があった。ＤＣ染色について、ＭＣＦはＤＥＣ２０５に対するものである。ＭＣＦは平均チャネル蛍光である。実験を２回繰り返した。
【図６Ｂ】図６Ｂは表２Ｂを示す。表２Ｂは、ＣＣ−１０タグマウスのＳＬＣ処置により、腫瘍部位、リンパ節及び脾臓の樹状細胞及びＴ細胞の浸潤が増強することを示す。ＳＬＣ及び希釈剤処置腫瘍保持マウス由来の腫瘍結節、リンパ節及び脾臓の単細胞懸濁液を調製した。ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮ−γについての細胞質内染色並びにＣＤ４及びＣＤ８Ｔリンパ球についての細胞表面染色をフローサイトメトリーによって評価した。リンパ節、腫瘍結節及び脾臓単細胞懸濁液中における細胞表面マーカーＣＤ１１ｃ及びＤＥＣ２０５に対して陽性に染色されたＤＣも評価した。細胞を、順方向及び側方散乱プロファイルに基づいてゲーティングすることによってリンパ球又はＤＣとして同定した；１５，０００のゲートイベントを収集し、Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔソフトウェアを使用して分析した。ＳＬＣで処置されたマウス由来のゲートＴリンパ球集団内で、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞が腫瘍部位、リンパ節及び脾臓においてＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮ−γを分泌する頻度が希釈剤処置腫瘍保持対照マウスと比較して増加した。ゲートされたＤＣ集団内では、希釈剤対照腫瘍保持マウスと比較してＬＬＣ処理腫瘍保持マウスにおけるＤＣの頻度の有意な増加があった。
【図７Ａ】図７Ａは、表３Ａを示す。図３Ａは、ＳＬＣ処置後の１型サイトカインの特異的全身誘導及びＩＬ−１０の下方調節を示す。脾臓細胞又はリンパ節由来リンパ球（５×１０6細胞／ｍｌ）を、照射３ＬＬ（１０5細胞／ｍｌ）腫瘍と共に総体積５ｍｌ中５０：１の割合で培養した。一晩培養した後に、上清を採取し、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２及びＩＬ１０をＥＬＩＳＡによって決定した。照射腫瘍細胞で刺激した後、ＳＬＣ処置マウスの脾細胞及びリンパ節由来細胞は、有意に増強したレベルのＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−１２のレベルを分泌したが、希釈剤処置保有マウスと比較してＩＬ−１０のレベルは低下した。結果を１ミリリットル当たりのピコグラムとして表す。実験を２回繰り返した。
【図７Ｂ】図７Ｂは、表３Ｂを示す。表３Ｂは、ＳＬＣ処置後の１型サイトカインの全身誘導及びＩＬ−１０の下方調節を示す。脾臓リンパ球（５×１０6細胞／ｍｌ）を、照射ＣＣ−１０（１０5細胞／ｍｌ）腫瘍と共に総容量５ｍｌ中において５０：１の割合で培養した。一晩培養した後、上清を採取し、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、及びＩＬ−１０をＥＬＩＳＡによって決定した。照射腫瘍細胞で刺激した後に、脾細胞は、希釈剤腫瘍保持マウスと比較して有意に多いＩＦＮ−γ及びＧＭ−ＳＣＦを分泌したが、ＳＬＣ処置マウスからＩＬ−１０のレベルが低下した。結果をｐｇ／ｍｌで表す（希釈剤処置マウス並びにＳＬＣ処置構成的レベルと比較してαＰ＜０．０１）。与えられた値は、５匹のマウス／群の平均±ＳＥを反映する。
【図８】図８は、ＳＬＣ及びチェックポイント阻害剤での処置前後の被験体において調査される例示的な免疫細胞マーカーのチャートである。
【図９】図９は、ＣＣＬ２１−ＤＣ処置マウスが、対照抗体と比較してＰＤ−１抗体の存在下で自己腫瘍に対して有意に大きな細胞溶解活性を有することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
発明の詳細な説明
本発明は、ＣＣＬ２１（ＳＬＣ）をチェックポイント阻害剤と組み合わせて投与して、腫瘍進行に関与する免疫系を調節することを含む、腫瘍の治療方法、腫瘍体積の減少方法及び癌の進行の減少方法を提供する。
【００５５】
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語、表記及び他の科学用語又は表現は、本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者によって一般的に理解される意味を有するものとする。場合によっては、一般的に理解される意味を有する用語は、明瞭化及び／又は参照を容易にするために本明細書で定義され、このような定義の包含は、必ずしも当該技術分野で一般的に理解されるものに対して実質的な相違を表すものと解釈すべきではない。本明細書において記載されている又は参照されている技術及び手順の多くはよく理解されており、当業者により従来の方法、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ外，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，（１９９５）及びＳａｍｂｒｏｏｋ外，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ第２版（１９８９）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙに記載された幅広く使用されている分子クローニング方法などを使用して一般的に採用されている。必要に応じて、市販のキット及び試薬の使用を含む手順を、特記しない限り、一般に、製造者が定めたプロトコール及び／又はパラメーターに従って実施する。
【００５６】
本明細書で使用される略語としては次のものが挙げられる：ＡＰＣ、抗原提示細胞；ＳＬＣ、二次リンパ器官ケモカイン；ＤＣ、樹状細胞；ＩＰ−１０、ＩＦＮ−γ誘導性タンパク質１０；ＴＧＦ−β、形質転換増殖因子β；ＧＭ−ＣＳＦ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子；ＩＬ、インターロイキン；ＦＢＳ、ウシ胎仔血清；ｍＡｂ、モノクローナル抗体；ＶＥＧＦ、血管内皮増殖因子；ＥＩＡ、酵素イムノアッセイ；ＳＶ４０  ＴＡｇ、シミアンウイルス４０ラージＴ抗原；Ａｇ、抗原；ＰＧＥ２、プロスタグランジンＥ２；ＰＥ、フィコエリトリン；ＬＮ、リンパ節。
【００５７】
Ａ．本発明の特徴の簡単なキャラクタリゼーション
本発明は、二次リンパ組織−組織ケモカイン（ＳＬＣ）が、同系腫瘍細胞に対する免疫応答におけるサイトカインプロファイルを調節し、これらの細胞の増殖を阻害することができるという本明細書で開示された発見に基づくものである。ここで提供される開示は、マウスが自発的に腫瘍を発生させる臨床関連マウスモデルにおけるＳＬＣの抗腫瘍効率を実証するものである。例えば、組換えＳＬＣの注射（例えば、腋窩リンパ節領域内）により、腫瘍の広範なリンパ球及びＤＣ浸潤と生存の延長とを伴ってこの同系腫瘍負荷が有意に減少する。ＳＬＣ注射により、腫瘍部位、リンパ節及び脾臓におけるＣＤ４及びＣＤ８リンパ球並びにＤＣが有意に増加する。
【００５８】
後述するように、同系腫瘍の部位で観察された細胞浸潤には、１型サイトカインと抗血管新生ケモカインＩＦＮ−γ誘導性タンパク質１０との同化作用の増強と、ＩＦＮ−γ（ＭＩＧ）によって誘導されるモノカインとを伴った。対照的に、免疫抑制性サイトカイン形質転換増殖因子βのリンパ節及び腫瘍部位産生は、ＳＬＣ処置に応答して減少した。試験管内では、照射自己腫瘍による刺激後に、ＳＬＣ処置マウスからの脾細胞は、ＩＦＮ−γ及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を有意に分泌したが、インターロイキン１０のレベルは低下した。器官特異的に腫瘍が発生するモデルにおける腫瘍負荷の有意な減少は、腫瘍免疫の調節及び肺癌免疫療法におけるその使用におけるＳＬＣの追加評価のための強力な理論的根拠を提供する。
【００５９】
本明細書で提供される開示を考慮すると、ＤＣはＴ細胞の主要な活性化因子として機能する強力なＡＰＣであるため、ＳＬＣがＤＣ及びＴ細胞の両方の共局在化を促進させることができることは、腫瘍仲介免疫抑制を逆転させ、同系の状況において有効な細胞仲介免疫応答を組織化することを示す。その免疫療法の可能性に加えて、ＳＬＣは強力な血管新生抑制作用を有することが分かっているため（Ｓｏｔｏ外，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５：６７５−７０５，１９９７）、癌治療での使用に対する追加の根拠となる。
【００６０】
本出願人は、移植可能なマウス肺癌モデルを使用して、ＳＬＣの抗腫瘍効果がＴ細胞依存性であることを示す。これらの移植モデルでは、ＳＬＣの抗腫瘍効果を、皮下注射部位で増殖した移植可能な腫瘍を使用して決定した。この移植可能なモデルでは、腫瘍内投与された組換えＳＬＣは、処置されたマウスの４０％において完全な腫瘍根絶をもたらした。ＳＬＣ仲介抗腫瘍応答は、ＣＤ４及びＣＤ８リンパ球サブセットの両方に依存し、かつ、腫瘍のＤＣ浸潤を伴った。このケモカインの抗血管形成能力を直接的に支持する最近の研究において、Ａｒｅｎｂｅｒｇ外（Ａｒｅｎｂｅｒｇ外，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，４９：５８７−５９２，２０００）は、ＳＬＣがＳＣＩＤマウスモデルにおいてヒト肺癌成長及び血管形成を阻害することを報告している。
【００６１】
本明細書で検討する自発腫瘍モデルは、腺癌が臓器特異的に発症する癌の臨床関連モデルにおいてＳＬＣの抗腫瘍特性を実証する。具体的には、このモデルでは、ネズミクララ細胞特異的プロモーターＣＣ−１０の制御下でＳＶ４０の大きなＴＡｇ導入遺伝子を発現するトランスジェニックマウスは、びまん性両側気管支肺胞癌を発症し、平均寿命が４ヶ月である（Ｍａｇｄａｌｅｎｏ外，Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．，８：１４５−１５５，１９９７）。ＳＬＣの抗腫瘍活性は、トランスジェニックマウスの腋窩リンパ節領域に組換えＳＬＣを注射することによって肺癌のための自発的モデルで決定される。リンパ節領域にＳＬＣを注射することに対する理論的根拠は、特異的な抗腫瘍免疫応答を開始することができるリンパ節のＴ細胞領域にＤＣを共局在化させることである。多くの臨床状況において、注射のためのリンパ節部位へのアクセスは、腫瘍内投与よりも容易に達成できる場合もある。これらの結果は、このアプローチが全身性抗腫瘍応答を生成する際に有効であることを示す。ＣＣ−１０  ＴＡｇマウスの腋窩リンパ節領域に注射されたＳＬＣは、希釈剤対照注射を受けたＣＣ−１０  ＴＡｇマウスと比較して、腫瘍負荷の減少及び生存利益を伴う強力な抗腫瘍応答を示した。ＳＬＣ処置マウスにおける腫瘍負荷の減少は、腫瘍部位、リンパ節及び脾臓の広範なリンパ球浸潤のみならずＤＣ浸潤を伴った。
【００６２】
ＳＬＣ治療の結果として、ＣＣ−１０  ＴＡｇマウスの腫瘍部位、リンパ節及び脾臓からのサイトカイン産生も変化した。次のサイトカイン：ＶＥＧＦ、ＩＬ−１０、ＰＧＥ−２、ＴＧＦ−β、ＩＦＮ−γ、ＧＭＣＳＦ、ＩＬ−１２、ＭＩＧ及びＩＰ−１０を測定した（表１Ｂ）。これらのサイトカインの産生は、腫瘍部位がＰＧＥ−２、ＶＥＧＦ、ＩＬ−１０及びＴＧＦ−βの豊富な供給源であることが明らかにされており、これらの分子の腫瘍部位における存在により免疫応答が抑制されることが示されている（Ｈｕａｎｇ外，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５８：１２０８−１２１６，１９９８；Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ外，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，２：１０９６−１１０３，１９９６；Ｂｅｌｌｏｎｅ外，Ａｍ  Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１５５：５３７−５４７，１９９９）。また、ＶＥＧＦ、ＰＧＥ−２及びＴＧＦ−βは、以前に血管形成を促進することが実証されている（Ｆａｊａｒｄｏ外，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．，７４：６００−６０８，１９９６；Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ．  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．，３６：１２７−１３７，１９９５；Ｔｓｕｊｉｉ外，Ｃｅｌｌ，９３：７０５−７１６，１９９８）。ＶＥＧＦ、ＴＧＦ−β、ＰＧＥ−２及びＩＬ−１０に対する抗体は、生体内モデル系において腫瘍増殖を抑制する能力を有する。また、ＶＥＧＦはＤＣ成熟を妨げることも示されている（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ外，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，２：１０９６−１１０３，１９９６）。ＩＬ−１０及びＴＧＦ−βの両方は、Ａｇ提示を強力に抑制し、かつ、ＣＴＬ生成及びマクロファージ活性化に拮抗することのできる免疫抑制性サイトカインである（Ｓｈａｒｍａ外，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６３：５０２０−５０２８，１９９９；Ｂｅｌｌｏｎｅ外，Ａｍ  Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１５５：５３７−５４７，１９９９）。より高い薬理学的濃度では、ＩＬ−１０は腫瘍の減少を引き起こすことができるが、このサイトカインの生理学的濃度は抗腫瘍応答を抑制する（Ｓｈａｒｍａ外，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６３：５０２０−５０２８，１９９９；Ｓｕｎ外，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８０：６２４−６２９，１９９９；Ｈａｌａｋ外，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５９：９１１−９１７，１９９９；Ｓｔｏｌｉｎａ外，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６４：３６１−３７０，２０００）。トランスジェニック腫瘍保持マウスにおけるＳＬＣ処置の前に、免疫抑制タンパク質ＶＥＧＦ、ＰＧＥ−２及びＴＧＦ−βのレベルは、正常対照マウスでのレベルと比較して上昇した。ＩＬ−１０に関してはこのような増加はなかった。同様に、ＳＬＣ治療後のＩＬ−４及びＩＬ−５の有意な変化はなかった。ＳＬＣ処置ＣＣ−１０  ＴＡｇマウスは、ＶＥＧＦ及びＴＧＦ−βの有意な減少を示した。免疫抑制性サイトカインの減少は肺に限定されず、全身的に明らかであった。ＣＣ−１０  ＴＡｇトランスジェニックマウスのＳＬＣ処置により、リンパ節由来細胞においてＴＧＦ−βが減少し、脾細胞からのＰＧＥ−２及びＶＥＧＦのレベルが減少した。したがって、これらのサイトカインにおけるＳＬＣ仲介減少の利点としては、抗原提示及びＣＴＬ生成の促進（Ｓｈａｒｍａ外，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６３：５０���０−５０２８，１９９９；Ｂｅｌｌｏｎｅ外，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１５５：５３７−５４７，１９９９）並びに血管形成の制限（Ｆａｊａｒｄｏ外，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．，７４：６００−６０８，１９９６；Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ．Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．，３６：１２７  −１３７，１９９５；Ｔｓｕｊｉｉ外，Ｃｅｌｌ，９３：７０５−７１６，１９９８）が挙げられる。
【００６３】
成功した免疫療法は、腫瘍特異的Ｔ細胞応答を２型から１型サイトカインプロファイルにシフトさせることが十分に立証されている（Ｈｕ外，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１：３０３３−３０４１，１９９８）。応答は、抗癌免疫を促進する一連の生物学的効果を仲介するＩＬ−１２及びＩＦＮ−γに依存する。マクロファージによって産生されるサイトカインであるＩＬ−１２（Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ外，７０：８３−２４３，１９９８）及びＤＣ（Ｊｏｈｎｓｏｎ外，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８６：１７９９−１８０２，１９９７）は、細胞免疫応答の誘導に重要な役割を果たす（Ｍａ外，Ｃｈｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６８：１，１９９７）。ＩＬ−１２は、ＣＴＬの誘導、１型仲介免疫応答及びナチュラルキラー活性化（Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ外，７０：８３−２４３，１９９８）並びに腫瘍血管新生の障害（Ｖｏｅｓｔ外，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，８７：５８１−５８６，１９９５）を伴ういくつかの作用の結果である強力な抗腫瘍効果を仲介することが分かっている。ＩＰ−１０及びＭＩＧは、ＣＸＣＲ３ケモカイン受容体を発現する活性化Ｔ細胞を化学誘引するＣＸＣケモカインである（Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒ外，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８４：９６３−９６９，１９９６）。ＩＰ−１０及びＭＩＧの両方は、強力な抗腫瘍特性及び抗血管新生特性を有することが知られている（Ｌｕｓｔｒｅ外，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７８：１０５７−１０６５，１９９３；Ｂｒｕｎｄａ外，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７８：１２２３−１２３０，１９９３；Ａｒｅｎｂｅｒｇ外，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８４：９８１−９９２，１９９６；Ｓｇａｄａｒｉ外，Ｂｌｏｏｄ，８９：２６３５−２６４３，１９９７）。ＳＬＣ処置ＣＣ−１０  ＴＡｇマウスの肺は、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２、ＩＰ−１０、ＭＩＧ及びＧＭ−ＣＳＦの有意な増加を示した。ＭＩＧ及びＩＰ−１０は、ＩＦＮ−γによって誘導される強力な血管新生抑制因子であり（Ａｒｅｎｂｅｒｇ外，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８４：９８１−９９２，１９９６；Ｓｔｒｉｅｔｅｒ外，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２１０：５１−５７，１９９５；Ｔａｎｎｅｎｂａｕｍ外，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１：９２７−９３２，１９９８）、ＳＬＣ投与後のＣＣ−１０  ＴＡｇマウスの腫瘍減少の一部を担う可能性がある。ＳＬＣは、直接的な抗血管新生効果を有することが立証されているため（Ｓｏｔｏ外，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５：６７５−７０５，１９９７；Ａｒｅｎｂｅｒｇ外，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．，１５９：Ａ７４６，１９９９）、このモデルで観察された腫瘍減少は、Ｔ細胞依存性免疫並びに血管新生を阻害する際にＩＦＮ−γを分泌するＴ細胞による関与に起因する可能性がある（Ｔａｎｎｅｎｂａｕｍ外，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１：９２７−９３２，１９９８）。したがって、ＳＬＣ処置マウスの腫瘍部位でのＩＦＮ−γの増加は、ＩＰ−１０及びＭＩＧの相対的増加を説明するものであろう。ＭＩＧ及びＩＰ−１０の両方は、腫瘍部位でＩＦＮ−γをさらに増幅することのできる刺激ＣＸＣＲ３発現Ｔリンパ球に対して走化性である（Ｆ���ｒｂｅｒ外，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．，６１：２４６−２５７，１９９７）。フローサイトメトリー測定から、ＣＤ４及びＣＤ８細胞の両方がＳＬＣ処置マウスにおけるＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮ−γの分泌の増加の原因であることが明らかになった。ＳＬＣ処置マウスにおけるＧＭ−ＣＳＦの増加は、ＤＣの成熟及び抗原提示を増強することができた（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ外，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄ．），３９２：２４５−２５２，１９９８）。ＳＬＣ仲介抗腫瘍応答にとって重要な宿主サイトカインを正確に定義するためには、さらなる研究が必要である。
【００６４】
１型サイトカインの増加は肺に限定されず、全身的に明らかであった。ＣＣ−１０  ＴＡｇトランスジェニックマウスのＳＬＣ処置により、Ｉ型サイトカイン及び抗血管新生ケモカインが全身的に増加した。したがって、ＳＬＣ処置ＣＣ−１０  ＴＡｇマウス由来の脾細胞は、希釈剤処置ＣＣ−１０  ＴＡｇマウスと比較して、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、ＭＩＧ及びＩＰ−１０が増加した。同様に、ＳＬＣ処置マウスからのリンパ節由来細胞は、有意に増強したＩＦＮ−γ、ＩＰ−１０、ＭＩＧ及びＩＬ−１２レベルを分泌した。最近の研究から、ＬＮ部位での１型応答の評価により、免疫療法を受けている患者の抗腫瘍応答についての洞察が得られる可能性があることが示唆されている（Ｃｈｕ外，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｕｃ．Ｍｅｄ．，２６：ｓ５０−５３，１９９９）。ＳＬＣ処置マウスの脾臓及びリンパ節におけるＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮ−γの増加は、ＣＤ４及びＣＤ８細胞がこれらのサイトカインを分泌する頻度の増加によって部分的に説明できた。１型サイトカインの増加は、部分的には、自己腫瘍に対する特異性の増加に起因していた；照射されたＣＣ−１０  ＴＡｇ腫瘍細胞と共に培養した場合に、ＳＬＣ処置ＣＣ−１０  ＴＡｇマウス由来の脾細胞は有意に増加した量のＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮ−γを分泌したが、ＩＬ−１０のレベルは低下した。ＣＣ−１０細胞の細胞表面染色、その後のフローサイトメトリーからは、検出可能なレベルのＭＨＣクラスＩＩ分子が示されなかった。腫瘍はＭＨＣクラスＩＩ発現を示さなかったが、アッセイにおいて脾臓ＡＰＣが存在したためにＣＤ４＋１型サイトカイン産生が生じた可能性がある。ＳＬＣ処置マウス由来の試験管内腫瘍刺激脾臓Ｔ細胞はＩＬ−１０の発現の減少を示したが、ＳＬＣ治療は生体内でのＩＬ−１０レベルの低下をもたらさなかった。ｉｎ  ｓｉｔｕ微小環境は、ＩＬ−１０の全レベルを決定するＴ細胞に加えて、細胞構成要素からの他の重要な因子を与えることができる。
【００６５】
まとめると、本明細書で提供される開示は、ＳＬＣ、例えば臨床的に関連する自発性肺癌モデルにおける腋窩リンパ節領域に注射されたＳＬＣの投与がどのようにして全身性抗腫瘍応答を生じさせるのかを実証する。特定の理論に限定されないが、ＳＬＣの抗腫瘍特性は、ＤＣ及びＴ細胞の共局在化におけるその走化性能力並びにＩＦＮ−γ、ＩＰ−１０、ＭＩＧ及びＩＬ−１２などの重要なサイトカインの誘導に起因する場合がある。本明細書に開示されるモデルを使用して、さらなる研究は、ＳＬＣ仲介抗腫瘍応答におけるこれらのサイトカインのそれぞれの重要性を説明することができる。この自発性気管支肺胞癌のモデルで実証された強力な抗腫瘍特性は、腫瘍免疫のＳＬＣ調節のさらなる評価及び肺癌などの癌に対する免疫療法におけるその使用に関する強力な理論的根拠となる。
【００６６】
以下に詳細に説明するように、本明細書に記載の発明は多数の実施形態を有する。典型的な実施形態としては、哺乳動物において同系の生理学的過程を調節する方法、例えば、ＣＤ８陽性Ｔ細胞、ＣＤ４陽性Ｔ細胞、抗原提示細胞及び腫瘍細胞を含む同系哺乳類細胞の集団中におけるインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）ポリペプチドなどの可溶性サイトカインの発現の増加及び形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）ポリペプチドなどの可溶性サイトカインの発現の低下を、該細胞集団を腫瘍細胞の増殖を阻害するのに十分な量の二次リンパ組織ケモカイン（ＳＬＣ）ポリペプチドにさらすことによって達成する方法が挙げられる。密接に関連する実施形態は、哺乳動物にＳＬＣの治療有効量を投与することによって哺乳動物における癌又は過剰増殖性細胞増殖を治療する方法である。
【００６７】
治療又は治療の目的のための「哺乳動物」とは、ヒト、飼育動物及び家畜、並びにイヌ、ウマ、ネコ、ウシなどの動物園の動物、スポーツ用動物又はペット動物を含めた哺乳類として分類される任意の動物をいう。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００６８】
用語「癌」、「癌性」又は「悪性」とは、典型的には調節されていない細胞増殖を特徴とする哺乳動物の生理学的状態をいう又は説明する。癌の例としては、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫及び白血病が挙げられるが、これらに限定されない。このような癌の具体的な例としては、腺癌、乳癌、卵巣癌、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫、肝臓癌、膀胱癌、肝臓癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、甲状腺癌、前立腺癌、前立腺癌、肝癌及び各種の頭頸部癌が挙げられる。
【００６９】
能動的癌免疫療法を設計する際の重大な問題の１つは、癌細胞が正常な宿主細胞に由来することである。したがって、癌細胞の抗原性プロフィールは、正常細胞のそれをよく模倣する。さらに、腫瘍抗原は真に外来のものではなく、腫瘍抗原は、感染症及び臓器移植で認識される抗原に対する非自己パラダイムと比較して、自己／改変自己パラダイムとより多く適合する（例えば、Ｌｅｗｉｓ外，Ｓｅｍｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  ６（６）：３２１−３２７（１９９５））。これに関連して、本発明の重要な側面は、癌細胞が自発的であり、癌細胞に応答する免疫細胞が同系である動物モデルにおけるＳＬＣの効果の特徴づけである。これに関連して、同系とは、特に抗原又は免疫学的反応に対して極めて近い遺伝的類似性又は同一性をいうことが当該技術分野において知られている。同系システムとしては、例えば、器官と細胞（例えば、癌細胞及びその非癌性対応物）が同じ個体に由来するモデル、及び／又は器官と細胞が同系交配株のものである異なる個々の動物に由来するモデルが挙げられる。同系モデルは、腫瘍形成及び化学療法分子の研究に特に有用である。同系モデルの具体例は、本明細書に記載の自発性気管支肺胞癌のＣＣ−１０  ＴＡｇトランスジェニックマウスモデルである。これに関して、免疫学の分野における当業者であれば、哺乳類の発育中に、免疫系が自己抗原（例えば、動物の生殖系列ＤＮＡにおける遺伝子によってコードされるもの）に対して寛容であることが分かる。Ｔ−Ａｇがトランスジェニック動物の生殖系列に存在すると、トランスジェニック動物の免疫系は、免疫系の成熟中にこのタンパク質に対して寛容される。
【００７０】
同系とは対照的に、用語「同種異系」とは、組織又は細胞間の遺伝的相違であってそれぞれの組織又は細胞に存在する異なる抗原に対する所定のタイプの免疫学的メカニズム又は応答を達成するのに十分なものを暗示するために使用される。同種異系モデルの具体例は、マウスの一方の系統由来の癌細胞がマウスの他方の系統に移植されたものである。同種異系モデルは、移植免疫の研究と、移植組織上に存在する非自己抗原に対する免疫応答を抑制することができる分子の評価とに特に有用である。
【００７１】
免疫系を含む様々な病態を研究するための臨床関連パラダイムを提供するために、免疫応答を評価するように設計された動物モデルは、外来（非自己）組織に対する免疫系応答の理解を前提としなければならない。これに関連して、移植免疫の分野の当業者であれば、同種異系組織に対する動物の免疫応答が同系組織に対する動物の免疫応答とは非常に異なること（すなわち応答がさらに生じることになるかどうか）を理解する。これは、例えば、同種異系臓器移植における免疫抑制剤の必要性（免疫抑制剤は、移植組織上に存在する非自己抗原に対する応答を阻害するために必要とされる）によって示される。したがって、臨床関連モデルは、このことが免疫応答に及ぼす深い意味を考慮しかつ特徴付けることなく異なる免疫表現型を混合することはできない。腫瘍細胞は、本明細書に記載された自発性気管支肺胞癌のＣＣ−１０  ＴＡｇトランスジェニックマウスモデルにおいて同系であるため、このモデルは、異なる免疫表現型を混合することに起因する交絡免疫応答に関連する問題を特に回避する。
【００７２】
当該技術分野で知られているように、サイトカインは免疫応答の重要なメディエーターである。これに関連して、様々なサイトカイン、様々な濃度のサイトカイン及び／又はサイトカインの様々な組み合わせを使用して、特定の状況において特異的免疫応答を生成する。これに関して、当該技術分野では、様々な免疫応答が様々なサイトカインプロファイルを伴うことが知られている。したがって、自己組織に対する免疫応答と比較した非自己組織に対する免疫応答の固有の相違は、各応答に関与するサイトカインプロファイルの内在的な相違に部分的に起因する。
【００７３】
免疫応答の一般的な検査に関する臨床関連パラダイムも、多数の他の要因を考慮しなければならない。例えば、当該技術分野では、所定のネズミ株は、同一の薬剤に対するそれらの免疫応答が高い変動性を示すことが知られている。例えば、マウス株Ｃ５７ＢＬ６、ＢＡＬＢ／ｃ及びＢＤＦ（１）が２−デオキシ−Ｄ−グルコース誘発ストレスに対する免疫応答において高い変動性を示すことを教示する、Ｄｒｅａｕ外、Ｐｈｙｓｉｏｌｏ  Ｂｅｈａｖ  ２０００  ７０（５）：５１３−５２０を参照されたい。さらに、一般的なマウス株間の遺伝的多型が、刺激された未感作ＣＤ４  Ｔ細胞における早期サイトカイン産生に有意に影響を及ぼす場合があることが知られている（例えば、Ｌｏ外，Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９５，１３（２）：１４７−１６０参照）。したがって、免疫応答性の臨床関連モデルは、異なるマウス株からの組織及び細胞を混合するモデルによって生じる免疫応答が有する重大な示唆を考慮し特徴づけることなく、免疫応答において高い変動性を示すことが知られているマウス株由来の組織及び細胞を混合してはならない。このモデルは、本明細書に記載の自発性気管支肺胞癌のＣＣ−１０  ＴＡｇトランスジェニックマウスモデルにおいて異なるマウス株由来の組織及び細胞の混合がないため、このモデルは、異なる免疫表現型の混合に起因する混乱した免疫応答に関連する問題を特に回避する。
【００７４】
また、癌細胞に対する免疫応答の特異的評価のための臨床関連パラダイムは、いくつかの要因も考慮しなければならない。例えば、多くの腫瘍細胞株は、浸潤性及び転移性の挙動の向上などの特定の特徴を有するように選択されてきた（例えば、Ｐｏｓｔｅ外，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４２（７）：２７７０−２７７８（１９８２）参照）。当該技術分野で知られているように、このような特性の選択は、このような細胞株の免疫原性などの因子を変化させる場合があり、同様に、当該細胞系は、このような細胞株を利用する免疫応答のモデルを混乱させる可能性がある（例えば、Ｄｅ  Ｂａｅｔｓｅｌｉｅｒ外，Ｎａｔｕｒｅ  １９８０  １３；２８８（５７８７）：１７９−１８１）。また、当該技術分野で知られているように、組織培養における細胞系の増殖は、生体内での腫瘍細胞増殖とは必ずしも一致しない特性である、培地中の最大の適合性に関連する特徴を有するクローンの派生物を選択する。本明細書に記載のＣＣ−１０  ＴＡｇトランスジェニックマウスモデルは自発性癌細胞を産生するので（細胞系と比較して）、このモデルは、組織培養におけるその期間中に特異的（及び非特異的）選択圧に供された細胞株の使用に関連する問題を特に回避する。
【００７５】
腫瘍細胞に関する上記の問題に加えて、多くの培養腫瘍系が腫瘍増殖を促進するようなサイトカインを産生することができることに関連するこのようなモデルにおける細胞系の使用に関連する問題がある。具体的には、当該技術分野において、所定の腫瘍細胞株が、非癌性の対応物によっては産生されないサイトカイン又は正常組織において多量に産生されるサイトカインを発現することが知られている（例えば、Ｂ１６メラノーマクローンのオートクリン増殖を検討するＳｔａｃｋｐｏｌｅ外，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  Ａｎｉｍ  １９９５，３１（３）：２４４−２５１及び結腸癌結腸２６クローンの自己分泌増殖を検討する清水外，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９６，５６（１４）：３３６６−３３７０）。免疫応答において免疫応答を評価する又は免疫応答におけるサイトカインプロファイルを測定する状況において、癌モデルにおける細胞系の使用は、細胞系（これはこれらの細胞の環境においてサイトカインプロファイルを変化させることができる）によって産生されるサイトカインの存在によって混乱する場合がある。したがって、例えば免疫応答性の臨床関連モデルにおいてサイトカインプロファイルを評価及び／又は調節しようとする方法では、当業者は、サイトカインによって生じた細胞株の存在がモデルによって生成された免疫応答を示すという深刻な影響を考慮及び特徴付けることなく、サイトカイン生成細胞株をマウスに使用すべきではない。
【００７６】
上記のように、当業者であれば、免疫系は、自己組織（例えば、同系移植）に対するものとは異なって非自己組織（例えば、同種移植）に応答することを理解する。自己と非自己とを区別する能力は免疫の基本的な側面であるので、当業者であれば、外来組織に応答する際に観察される免疫反応は自己組織に対する免疫応答を予測する（すなわち、免疫応答がさらに起こることになる場合）ものではないことを理解する。これは、例えば、免疫抑制剤を摂取するために同種異系臓器移植を受けた個人の必要性によって説明される。結果として、免疫応答の臨床関連モデルは、この免疫の基本的な側面、特に、自己組織の異常増殖によって特徴付けられる病気である癌に対する免疫応答を評価するように設計されたものを考慮しなければならない。ここで使用されるトランスジェニックマウスモデルは動物の免疫系を非自己抗原に曝露せず、異なる免疫学的特徴を有することが観察されたマウス株由来の細胞及び組織を混合せず、しかもその代わりに自発性腫瘍に対する免疫応答を評価することに関連するため、このモデルによって提供されるデータは、ヒト癌の状況において臨床的に関連する。
【００７７】
「中和抗体」とは、結合する標的抗原の生物学的機能を排除し又は有意に低下させることができる抗体分子のことである。したがって、「中和」抗標的抗体は、酵素活性、リガンド結合又は細胞内シグナル伝達などの生物学的機能を排除する又は有意に低下させることができる。
【００７８】
「特異的に結合する」、「標的特異的」である、標的「に特異的な」又は標的抗原と「免疫反応性」である抗体とは、同様の抗原よりも高い親和性で標的抗原に結合する抗体又は抗体物質をいう。本発明の一態様では、標的結合ポリペプチド又はその断片、変異体若しくは誘導体は、他の種、すなわち非ヒト種の標的に対するその結合親和性と比較して、ヒト標的に対してより大きな親和性で結合するが、標的の相同分子種を認識し結合する結合ポリペプチドは、提供される範囲内にある。
【００７９】
例えば、その同族抗原に「特異的」な抗体又はその断片は、抗体の可変領域が検出可能な選択物で目的のポリペプチドを認識して結合させることを示す（すなわち、ファミリーメンバー間の局在配列同一性、相同性又は類似性の存在が可能性にもかかわらず、結合親和性における測定可能な相違に起因して同じファミリーの他の既知のポリペプチドから目的のポリペプチドを区別することができる）。また、特異的抗体は、抗体の可変領域の外側、特にその分子の定常領域内の配列との相互作用を介して、他のタンパク質（例えば、黄色ブドウ球菌プロテインＡ又はＥＬＩＳＡ技術における他の抗体）と相互作用することもできることが分かる。本発明の方法で使用するための抗体の結合特異性を決定するためのスクリーニングアッセイは、当該分野において周知でありかつ日常的に実施されている。このようなアッセイの包括的な議論については、Ｈａｒｌｏｗ外（著者），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８８）、第６章を参照されたい。
【００８０】
ここで、用語「治療有効量」は、治療される疾患の症状又は徴候を改善又は軽減するのに有効な本発明の標的特異的組成物の量を示すために使用される。
【００８１】
本明細書における方法に関して使用するときに、用語「治療する」、「治療される」、「治療用」及び「治療」とは、事象、疾患又は状態の臨床的症状、兆候又は進行を一時的又は永久的に部分的に又は完全に無くす、低減する、抑制する又は改善することをいう。このような治療は絶対的に有用である必要はない。
【００８２】
Ｂ．本発明の実施形態を実施するための典型的な方法
本明細書中に開示されるいくつかの方法は、当該技術分野において、宿主動物に投与された遺伝的に非同一の癌細胞などの非自己（すなわち、同種異系）組織に対する免疫応答の状況においてＳＬＣの効果を研究するために使用できることが知られている一般的な方法に関する。
【００８３】
本明細書に開示される方法は、哺乳動物における病的状態、例えば癌や免疫関連疾患を処置するためのプロトコールにおいて使用できる。典型的な方法では、ＳＬＣポリペプチドを哺乳動物に単独で又はさらに他の治療剤や技術と組み合わせて投与する。当業者であれば、本明細書に記載の様々な病的状態の哺乳動物における診断を行うことができる。例えば、哺乳動物における癌や免疫関連疾患の診断又は検出を可能にする診断技術が当該技術分野で利用可能である。例えば、癌は、触診、血液分析、Ｘ線、ＮＭＲなどを含めた（ただしこれらに限定されない）技術によって同定できる。例えば、悪性腫瘍に関連する遺伝子の発現（ＰＳＡ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭ及びヒト腺カリクレインの発現を含む）並びに肉眼的な細胞学的な検査といった、癌に関連することが当該技術分野において知られている多種多様な診断因子を利用することができる（例えば、Ｂｏｃｋｉｎｇ外，Ａｎａｌ  Ｑｕａｎｔ  Ｃｙｔｏｌ．６（２）：７４−８８（１９８４）；Ｅｐｔｓｅｉｎ，Ｈｕｍ  Ｐａｔｈｏｌ．１９９５  Ｆｅｂ；２６（２）：２２３−９（１９９５）；Ｔｈｏｒｓｏｎ外，Ｍｏｄ  Ｐａｔｈｏｌ．１９９８  Ｊｕｎ；１１（６）：５４３−５１；Ｂａｉｓｄｅｎ外，Ａｍ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｐａｔｈｏｌ．２３（８）：９１８−２４  ９１９９９））。
【００８４】
本発明の方法は、過剰増殖性障害及び癌の治療に有用であり、特に固形腫瘍の治療に特に有用である。本発明の方法に従って治療できる固形腫瘍のタイプとしては、肺癌、黒色腫、乳癌、頭頸部腫瘍、卵巣癌、子宮内膜癌、尿路癌、胃癌、白血病、リンパ腫、骨癌、肝臓癌、結腸癌、直腸癌、上記の転移及び原発不明の転移が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、本発明の好ましい実施形態では、ＳＬＣを投与してサイトカインプロファイルを調節し、及び／又は腺癌系統の自発性腫瘍細胞の増殖を阻害する（本明細書においてトランスジェニックマウスモデルにおいて実証されるように）。当該技術分野で知られているように、腺癌系統の腫瘍細胞は、多数の異なる臓器系において自発的に生じることがある（例えば、Ｙａｇｉ外，Ｇａｎ  Ｎｏ  Ｒｉｎｓｈｏ  １９８４  ３０（１１）：１３９２−１３９７参照）。
【００８５】
本発明の方法において有用なポリペプチドは、天然に存在するタンパク質並びにその変異及び修飾形態の両方を包含する。上記のように、「ＳＬＣポリペプチド又はタンパク質」は、二次リンパ系組織ケモカインを意味する。ＳＬＣとしては、以下で定義するように、天然に存在する哺乳類ＳＬＣ、並びにその変異体及び断片が挙げられる。好ましくは、ＳＬＣは、ヒト又はマウス由来のものである（例えば、それぞれ表４の配列番号１及び２参照）。最も好ましくは、ＳＬＣはヒトＳＬＣである。  ヒトＳＬＣはクローニングされかつ配列決定されている（例えば、Ｎａｇｉｒａ外（１９９７）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２：１９５１８；その内容は参照により援用される）。その結果、ヒトＳＬＣのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列は当該技術分野において知られている（例えば受託番号ＢＡＡ２１８１７及びＡＢ００２４０９参照）。また、マウスＳＬＣもクローニングされかつ配列決定されている（例えば受託番号ＮＰ＿０３５４６５及びＮＭ＿０１１３３５参照）。Ｈｒｏｍａｓ外（１９９７）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １．５９：２５５４；Ｈｅｄｒｉｃｋ外（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５９：１５８９；及びＴａｎａｂｅ外（１９９７）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １．５９：５６７１；その内容は参照により本明細書において援用する。
【００８６】
本明細書に開示される方法における使用のためのＳＬＣポリペプチドは、ＳＬＣ変異体、ＳＬＣ断片、アナログ及び誘導体とすることができる。「アナログ」は、１個以上のアミノ酸の置換、挿入又は欠失を有する天然のＳＬＣ配列及び構造を含むＳＬＣ又はＳＬＣ断片のいずれかのアナログを意図する。また、１個以上のペプトイド（ペプチド模倣物）を有するペプチドも用語「アナログ」に包含される（ＷＯ９１／０４２８２）。「誘導体」は、所望の活性が保持される限り、グリコシル化、リン酸化又は外来部分の他の付加（例えば、以下に記載されるようなペグ化）といったＳＬＣ、ＳＬＣ断片又はそれらのそれぞれのアナログの任意の好適な修飾を意図する。当該技術分野では、ＳＬＣ断片、アナログ及び誘導体をマスキングする方法が利用可能である。
【００８７】
例示的なＳＬＣ誘導体では、例えばＷＯ９３／００１０９号に開示されているように、ポリオールがリシン残基を含めた１個以上のアミノ酸残基でＳＬＣ分子に結合することができる。使用されるポリオールは、任意の水溶性ポリ（アルキレンオキシド）重合体とすることができ、直鎖又は分岐鎖を有することができる。好適なポリオールとしては、１個以上のヒドロキシル位で化学基、例えば１個〜４個の炭素を有するアルキル基で置換されたものが挙げられる。典型的には、ポリオールは、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）などのポリ（アルキレングリコール）であるため、説明を容易にするために、この議論の残りの部分は、使用されるポリオールがＰＥＧであり、ポリオールをＳＬＣタンパク質又は変異体に結合させるプロセスを「ペグ化」という例示的な実施形態に関する。しかし、当業者であれば、例えばポリ（プロピレングリコール）及びポリエチレン・ポリプロピレングリコール共重合体などの他のポリオールを、本明細書においてＰＥＧについて記載したコンジュゲーション技術を用いて採用することができることが分かる。本発明のＳＬＣ変異体のペグ化度は、対応する非ペグ化タンパク質と比較して、望ましく増加した生体内半減期（以下、「半減期」）を与えるように調節できる。
【００８８】
タンパク質をペグ化するための様々な方法が記載されている。例えば、生理学的に活性な非免疫原性組成物を産生するためにＰＥＧ及びポリプロピレングリコールに対して多数のホルモン及び酵素を結合させることが記載される米国特許第４，１７９，３３７号（Ｄａｖｉｓ外に対して発行）を参照されたい。一般に、少なくとも１個の末端ヒドロキシ基を有するＰＥＧをカップリング剤と反応させて末端反応性基を有する活性化ＰＥＧを形成する。次いで、この反応性基はタンパク質のα−及びε−アミンと反応して共有結合を形成することができる。都合のよいことに、ＰＥＧ分子の他の末端をメトキシ基などの非反応性化学基で「ブロック」してタンパク質分子のＰＥＧ架橋複合体の形成を減少させることができる。
【００８９】
ここで使用するときに、ＳＬＣ遺伝子及びＳＬＣタンパク質には、本明細書に具体的に記載されるネズミ及びヒトＳＬＣ遺伝子及びタンパク質、並びにこれらの生物学的に活性な構造的及び／又は機能的に類似の変異体又はアナログが含まれる。ＳＬＣペプチドアナログは、一般に、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％以上のアミノ酸相同性を共有する（ＢＬＡＳＴ基準を用いて）。例えば、％同一性値は、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２によって生成できる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ外，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２６６：４６０−４８０）。
【００９０】
ＳＬＣヌクレオチドアナログは、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％以上の核酸相同性を共有することが好ましい（ＢＬＡＳＴ基準を使用）。しかし、いくつかの実施形態では、当業者であれば分かるように、種特異的コドン選好及び／又は特定の標的集団に合わせた最適ペプチドエピトープの観点から好ましい残基を選択するために、より低い相同性が好ましい。異なるＳＬＣタンパク質又はその断片の部分、並びにＳＬＣタンパク質及び異種ポリペプチドの融合タンパク質を組み合わせた融合タンパク質も含まれる。このようなＳＬＣタンパク質をまとめてＳＬＣ関連タンパク質、本発明のタンパク質又はＳＬＣという。
【００９１】
用語「変異体」とは、具体的に記載されたタンパク質の対応する１以上の位置に１個以上の異なるアミノ酸残基を有するタンパク質などの、記載されたタイプ又は基準からの変化を示す分子をいう。アナログが変異体タンパク質の例である。ここで使用するときに、ＳＬＣ関連遺伝子及びＳＬＣ関連タンパク質には、本明細書において具体的に記載されるＳＬＣ遺伝子及びタンパク質、並びにこれらの構造的及び／又は機能的に類似する変異体又はアナログが含まれる。ＳＬＣペプチドアナログは、一般に、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％以上のアミノ酸相同性を共有する（ＢＬＡＳＴ基準を使用）。ＳＬＣヌクレオチドアナログは、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％以上の核酸相同性を共有することが好ましい（ＢＬＡＳＴ基準を使用）。しかし、いくつかの実施形態では、当業者であれば分かるように、種特異的コドン選好及び／又は特定の標的集団に合わせた最適ペプチドエピトープの観点から好ましい残基を選択するために、より低い相同性が好ましい。
【００９２】
本明細書に開示される本発明の実施形態は、アミノ酸の挿入、欠失及び置換を有するポリペプチドなどのＳＬＣタンパク質の広範囲の技術的に許容される変位体又はアナログを含む。ＳＬＣ変異体は、部位特異的突然変異誘発、アラニンスキャニング、及びＰＣＲ突然変異誘発などの当該技術分野に知られている方法を用いて作製できる。部位特異的突然変異誘発（Ｃａｒｔｅｒ外，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３：４３３１（１９８６）；Ｚｏｌｌｅｒ外，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１０：６４８７（１９８７））、カセット突然変異誘発（Ｗｅｌｌｓ外，Ｇｅｎｅ，３４：３１５  （１９８５））、制限選択突然変異誘発（Ｗｅｌｌｓ外，Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ  ＳｅｒＡ，３１７：４１５（１９８６））又は他の技術をクローニングされたＤＮＡに対して実施して又は他の公知の技術を実施してＳＬＣ変異体ＤＮＡを生成させることができる。得られた突然変異体について生物学的活性を試験することができる。結合に重要な部位は、結晶化、光親和性標識、核磁気共鳴などの構造分析によって決定される。ｄｅＶｏｓ外（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：３０６及びＳｍｉｔｈ外（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９参照。
【００９３】
当該技術分野で知られているように、タンパク質の機能的活性を変化させることなく保存的アミノ酸置換をタンパク質内で行うことができる場合が多い。本発明のタンパク質は、保存的置換を含むことができる。このような変化は、典型的には、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）及びロイシン（Ｌ）のいずれかをこれらの疎水性アミノ酸のいずれか他のものに置換すること；アスパラギン酸（Ｄ）をグルタミン酸（Ｅ）に置換すること及びその逆；グルタミン（Ｑ）をアスパラギン（Ｎ）に置換すること及びその逆；セリン（Ｓ）をスレオニン（Ｔ）に置換すること又はその逆を含む。また、他の置換も、特定のアミノ酸の環境及びタンパク質の三次元構造におけるその役割に依存して保存的であるとみなすことができる。例えば、アラニン（Ａ）及びバリン（Ｖ）がそうであるように、グリシン（Ｇ）及びアラニン（Ａ）は交換可能とすることができる場合が多い。比較的疎水性であるメチオニン（Ｍ）は、ロイシン及びイソロイシンと、場合によってはバリンと交換することができる場合が多い。リシン（Ｋ）及びアルギニン（Ｒ）は、アミノ酸残基の重要な特徴がその電荷であり、これら２つのアミノ酸残基の異なるｐＫが重要でない場所で交換可能な場合が多い。さらに他の変化は、特定の環境において「保存的」とみなすことができる。
【００９４】
また、スキャニングアミノ酸分析を使用して、タンパク質・タンパク質相互作用などの特定の生物学的活性に関与する連続配列に沿って１個以上のアミノ酸を同定することもできる。好ましいスキャニングアミノ酸の中には比較的小さな中性アミノ酸がある。このようなアミノ酸としては、アラニン、グリシン、セリン及びシステインが挙げられる。この群のうち、アラニンが典型的に好ましいスキャニングアミノ酸である。というのは、このものは、ベータ炭素を超える側鎖を排除し、変異体の主鎖立体配座を変更する可能性が低いからである。また、アラニンは、最も一般的なアミノ酸であるため、典型的に好ましい。さらに、このものは、埋め込まれた位置及び露出した位置の両方に見出される場合が多い（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０：１（１９７６））。アラニン置換が適切な量の変異体を生じさせない場合には、等価アミノ酸を使用することができる。
【００９５】
本発明の方法において有用な変異体ＳＬＣタンパク質及びＳＬＣポリペプチド断片は、ＳＬＣ生物活性を有していなければならない。具体的には、これらのものは、本来のタンパク質の所望の生物学的活性、すなわち、本明細書に記載の樹状細胞化学誘引物質活性、血管新生抑制活性又は抗腫瘍活性を有していなければならない。本発明の目的のために、「ＳＬＣ変異体」は、ＳＬＣの樹状細胞・化学誘引物質活性、腫瘍阻害活性又は血管新生抑制活性の少なくとも３０％を示す。より典型的には、変異体は、これらの活性の少なくとも１つの６０％超を示す；より典型的には、変異体は、これらの活性の少なくとも１つの８０％超を示す。ここで開示されるように、ＳＬＣタンパク質の生物学的活性は、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）ポリペプチドの発現の増加とＣＤ８陽性Ｔ細胞、ＣＤ４陽性Ｔ細胞、抗原提示細胞及び腫瘍細胞を含めた同系哺乳類細胞の集団における形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）ポリペプチドの発現の減少とをもたらすといった、ＳＬＣが生体内でサイトカイン発現を調節する能力を試験することによっても評価できる。あるいは、ＳＬＣタンパク質の生物学的活性は、所定量の二次リンパ組織ケモカイン（ＳＬＣ）ポリペプチドに細胞集団を曝露し、そしてこの分子が同系腫瘍細胞の増殖を阻害しなければならない能力を試験することによっても評価できる。
【００９６】
ＳＬＣは、ＳＬＣポリペプチド、ＳＬＣ変異体又はＳＬＣ断片を被験体に又は被験体上に導入することによって直接投与できる。あるいは、ＳＬＣを、ＳＬＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの投与後にその場で生成させることができ、ＳＬＣ変異体又はＳＬＣ断片を被験体に導入することができる。
【００９７】
本発明のＳＬＣ剤は、天然ＳＬＣポリペプチド、天然ＳＬＣ核酸配列、ポリペプチド及び核酸変異体、抗体、モノクローナル抗体、並びにＳＬＣ発現、活性及び受容体結合の操作によって免疫応答をブロックすることができる他の成分を含む。このような成分としては、例えば、ＳＬＣプロモーター活性を妨害又は増強するタンパク質又は小分子；転写調節因子を誘引するタンパク質又は小分子；ＳＬＣ  ｍＲＮＡを安定化又は分解するポリヌクレオチド、タンパク質又は低分子；受容体結合を妨害するタンパク質又は小分子などが挙げられる。
【００９８】
本発明は任意の特定の方法に限定されないと認められる。ＳＬＣが成熟樹状細胞及びＴ細胞に対して走化性であると認識すると、例えば受容体結合を妨害すること、ＳＬＣプロモーター活性を妨害すること、遺伝子発現、ｍＲＮＡ安定性又はタンパク質安定性を妨げることなどによってＳＬＣ活性を抑制又は増強する任意の手段を使用して、一次免疫応答を調節することができ、これらは本発明に包含される。ＳＬＣのアミノ酸及びＤＮＡ配列は当該技術分野において知られている。例えば、Ｐａｃｈｙｎｓｋｉ外（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：９５２；Ｙｏｓｈｉｄａ外（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：７１１８，Ｎａｇｉｒａ外（１９９８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：１５１６−１５２３；Ｎａｇｉｒａ外（１９９７）Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２：１９５１８を参照。これらの全ては、参照により本明細書で援用する。
【００９９】
本明細書に開示される方法で使用するためのポリヌクレオチドは、対立遺伝子変異体、ホモログ、オーソログなどの天然型であることができ、又は組換えＤＮＡ法や化学合成によって構築できる。あるいは、変異体ポリペプチドは、非天然型とすることができ、突然変異誘発を含めた当該技術分野で知られている技術によって作製できる。ポリヌクレオチド変異体は、ヌクレオチド置換、欠失、逆位及び挿入を含むことができる。
【０１００】
実施例８に示すように、ＳＬＣをコードする核酸分子をベクターに挿入し、これを遺伝子治療ベクターとして使用することができる。本明細書に開示される例示的なアデノウイルスベクターの他に、ＳＬＣタンパク質又はその断片の発現に適した広範囲の他の宿主・ベクター系が利用可能である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他，１９８９，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５前出参照）。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号）、移植又は定位注射（例えば、Ｃｈｅｎ外，ＰＮＡＳ  ９１：３０５４−３０５７（１９９４）を参照）によって被験体に送達できる。哺乳動物宿主における発現用のベクターは、Ｗｕ外（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１４３３８；  Ｗｕ及びＷｕ（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１；並びにＺｅｎｋｅ外（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：３６５５に記載されている。遺伝子治療ベクターの医薬製剤は、許容できる希釈剤中の遺伝子治療ベクターを含むことができ、又は遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれた徐放性マトリックスを含むことができる。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターを組換え細胞から無傷で製造することができる場合、例えば、レトロウイルスベクターの場合には、医薬製剤は、遺伝子送達系を産生する１種以上の細胞を含むことができる。
【０１０１】
本発明における使用には、アデノウイルスベクター、特にテトラサイクリン制御アデノウイルスベクターが好ましい。これらのベクターは、様々な遺伝子を送達及び発現させるために使用でき、インターロイキン遺伝子ファミリー及びインターロイキン遺伝子ファミリーのものなどのサイトカイン遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０２】
発現構築物の送達のための好ましい方法は、アデノウイルス発現ベクターの使用を伴う。アデノウイルスベクターは、ゲノムＤＮＡへの組込みの能力が低いことが知られているが、この特徴は、これらのベクターによってもたらされる高い遺伝子導入効率によって相殺される。「アデノウイルス発現ベクター」とは、（ａ）相補的パッケージング機能を有する宿主細胞において構築物のパッケージングを支持する及び（ｂ）その中でクローン化された目的の異種遺伝子を最終的に発現するのに十分なアデノウイルス配列を含む構築物を含むことを意味する。
【０１０３】
発現ベクターは、アデノウイルスの遺伝子操作された形態を含む。３６ｋｂの線状二本鎖ＤＮＡウイルスであるアデノウイルスの遺伝子構成の知識から、アデノウイルスＤＮＡの大きな断片を外来配列で置換することが可能になる（Ｇｒｕｎｈａｕｓ及びＨｏｒｗｉｔｚ，１９９２）。レトロウイルスとは対照的に、宿主細胞のアデノウイルス感染は、野生型アデノウイルスＤＮＡが潜在的な遺伝毒性なしにエピソーム的に複製することができるため、染色体には組み込まれない。また、アデノウイルスは構造的に安定であり、広範な増幅後にゲノム再編成は検出されていない。
【０１０４】
アデノウイルスは、その中型サイズのゲノム、操作の容易さ、高い力価、広い標的細胞範囲及び高い感染力のため、遺伝子導入ベクターとしての使用に特に好適えある。ウイルスゲノムの両末端は、ウイルスＤＮＡの複製及びパッケージングに必要なシスエレメントである１００〜２００塩基対の逆方向反復配列（ＩＴＲ）を含む。ゲノムの初期（Ｅ）及び後期（Ｌ）領域は、ウイルスＤＮＡ複製の開始によって分割される異なる転写単位を含む。Ｅ１領域（Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ）は、ウイルスゲノム及び少数の細胞遺伝子の転写の調節を担うタンパク質をコードする。Ｅ２領域（Ｅ２Ａ及びＥ２Ｂ）の発現により、ウイルスＤＮＡ複製のためのタンパク質が合成される。これらのタンパク質は、ＤＮＡ複製、後期遺伝子発現及び宿主細胞の遮断に関与する（Ｒｅｎａｎ，１９９０）。ウイルスカプシドタンパク質の大部分を含めた後期遺伝子産物は、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）によって生じる単一の一次転写物の有意なプロセシングの後にのみ発現される。ＭＬＰ（１６．８ｍ．ｕ．に位置する）は、感染後期の間に特に有効であり、このプロモーターから生じる全てのｍＲＮＡは、それらを翻訳のための好ましいｍＲＮＡにする５’−三成分リーダー（ＴＰＬ）配列を有する。
【０１０５】
現在の系では、シャトルベクターとアデノウイルスゲノム骨格を含むマスタープラスミドとの間の相同組換えから組換えアデノウイルスが生成される。アデノウイルスゲノムの骨格とウイルスゲノムの欠損部分を含むヘルパー細胞の細胞ＤＮＡとの間の起こり得る組換えにより、このプロセスから野生型アデノウイルスが生成され得る。したがって、ウイルスの単一のクローンを個々のプラークから単離し、そのゲノム構造を調べることが重要である。
【０１０６】
複製欠損である大部分のアデノウイルスベクターの生成及び増殖は、Ａｄ５  ＤＮＡ断片によってヒト胚腎細胞から形質転換され、かつ、Ｅ１タンパク質を構成的に発現する独特のヘルパー細胞株２９３に依存する。Ｅ３領域はアデノウイルスゲノム（Ｊｏｎｅｓ及びＳｈｅｎｋ，１９７８）からは不要であるため、現在のアデノウイルスベクターは、２９３細胞の助けを借りて、Ｅ１、Ｅ３又は両方の領域に外来ＤＮＡを保持する。本来、アデノウイルスは野生型ゲノムの約１０５％をパッケージングすることができ、約２ｋｂの余分なＤＮＡの容量を与えることができる。Ｅ１及びＥ３領域内で置換可能な約５．５ｋｂのＤＮＡと組み合わせると、大部分のアデノウイルスベクターの最大容量は、少なくとも７．５ｋｂ、又はベクターの全長の約１５％である。アデノウイルスのウイルスゲノムの８０％超がベクターの骨格に残存する。
【０１０７】
組換えＥ１欠損アデノウイルスを用いた生体内での遺伝子導入により、宿主免疫応答を誘発することのできる早期及び後期ウイルス遺伝子発現が生じ、それにより遺伝子治療のための導入遺伝子発現の持続期間及びアデノウイルスの使用が制限される。これらの潜在的な問題を回避するために、原核生物Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ組換え系は、免疫原性及び／又は細胞傷害性ウイルスタンパク質の発現を最小限に抑えるために、ウイルスゲノムにおいて広範囲の欠失を有する組換えアデノウイルスを生成するように適合されてきた。
【０１０８】
ヘルパー細胞株は、ヒト胚性腎臓細胞、筋肉細胞、造血細胞又は他のヒト胚間葉又は上皮細胞などのヒト細胞に由来することができる。あるいは、ヘルパー細胞は、ヒトアデノウイルスに対して寛容な他の哺乳動物種の細胞に由来することができる。このような細胞としては、例えば、ベロ細胞又は他のサル胚間葉系細胞若しくは上皮細胞が挙げられる。上記のように、好ましいヘルパー細胞株は２９３である。
【０１０９】
近年、Ｒａｃｈｅｒ外（１９９５）は、２９３細胞を培養し、アデノウイルスを増殖させるための改良方法を開示した。一方の形式では、１００〜２００ｍｌの培地を含む１リットルのシリコーン処理スピナーフラスコ（Ｔｅｃｈｎｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）に個々の細胞を接種することにより天然細胞凝集物を増殖させる。４０ｒｐｍで撹拌した後に、トリパンブルーで細胞生存率を評価する。他方の形式では、以下のように、Ｆｉｂｒａ−Ｃｅｌマイクロキャリア（Ｂｉｂｂｙ  Ｓｔｅｒｌｉｎ，Ｓｔｏｎｅ，ＵＫ）（５ｇ／ｌ）を使用する。５ｍｌの培地に再懸濁した細胞接種物を２５０ｍｌ三角フラスコ中のキャリア（５０ｍｌ）に添加し、時々攪拌しながら１〜４時間静置する。次いで、培地を５０ｍｌの新たな培地と交換し、振盪を開始する。ウイルス産生のために、細胞を約８０％コンフルエンスまで増殖させ、その後培地を交換し（最終容量の２５％まで）、アデノウイルスを０．０５のＭＯＩで添加する。培養物を一晩静置し、その後容量を１００％に増加させ、振盪をさらに７２時間開始する。
【０１１０】
場合によっては、複数の細胞型へのアデノウイルス仲介性遺伝子送達は、上皮由来細胞と比較してはるかに効率が低いことが分かっている。新たなアデノウイルスＡｄＰＫを構築してこの非効率性が克服されており（Ｗｉｃｋｈａｍ外，１９９６）、ＡｄＰＫは、多くの細胞型で広範に発現するヘパリン含有細胞受容体に対するウイルスを標的とするヘパリン結合ドメインを含む。したがって、ＡｄＰＫは、未修飾アデノウイルスよりも高い効率で複数の細胞型に遺伝子を送達し、それによって遺伝子導入効率を改善し、効率的なアデノウイルス仲介遺伝子治療に適した組織を拡大する。
【０１１１】
アデノウイルスベクターが複製欠損である又は少なくとも条件付きで欠損しているという要件以外に、アデノウイルスベクターの性質は、本発明の成功のために重要であるとは考えられていない。アデノウイルスは、４２種の異なる既知の血清型又はサブグループＡ〜Ｆのいずれかのものであることができる。サブグループＣのアデノウイルス５型は、本発明で使用するための条件付き複製欠損アデノウイルスベクターを得るために好ましい出発物質である。これは、アデノウイルス５型が多くの生化学的及び遺伝的情報が知られているヒトアデノウイルスであり、アデノウイルスをベクターとして使用する大部分の構築のために歴史的に使用されているからである。
【０１１２】
上記のように、本発明の典型的なベクターは複製欠損であり、アデノウイルスＥ１領域を有さない。したがって、Ｅ１コード配列が除去された位置に外来遺伝子発現カセットを導入することが最も便利であろう。しかしながら、アデノウイルス配列内への構築物の挿入位置は、本発明にとって重要ではない。また、目的の遺伝子をコードするポリヌクレオチドは、Ｋａｒｌｓｓｏｎ外（１９８６）によって記載されるようにＥ３置換ベクター中の欠失Ｅ３領域の代わりに又はヘルパー細胞株若しくはヘルパーウイルスがＥ４欠損を補完するＥ４領域にも挿入できる（Ｂｒｏｕｇｈ外，１９９６）。
【０１１３】
アデノウイルスの増殖及び操作は当業者に知られており、試験管内及び生体内で広い宿主範囲を示す。このウイルス群は、高い力価、例えば１ｍｌあたり１０9〜１０11のプラーク形成単位で得ることができ、これらは高度に感染性である。アデノウイルスのライフサイクルは、宿主細胞ゲノムへの組み込みを必要としない。アデノウイルスベクターによって送達される外来遺伝子はエピソーム性であるため、宿主細胞に対する遺伝毒性が低い。野生型アデノウイルスによるワクチン接種の研究において重篤な副作用は報告されていない（Ｃｏｕｃｈ外，１９６３；Ｔｏｐ外，１９７１）が、これは、ビバ遺伝子伝達ベクターと同様にそれらの安全性及び治療可能性を示すものである。
【０１１４】
アデノウイルスベクターは、真核生物の遺伝子発現（Ｌｅｖｒｅｒｏ外，１９９１；Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘ外，１９９２）及びワクチン開発（Ｇｒｕｎｈａｕｓ及びＨｏｒｗｉｔｚ，１９９２；Ｇｒａｈａｍ及びＰｒｅｖｅｃ，１９９２）に使用されてきた。近年、動物実験により、遺伝子治療のために組換えアデノウイルスを使用できることが示唆された（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ及びＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，１９９１；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ外，１９９１；Ｒｉｃｈ外，１９９３）。組換えアデノウイルスを異なる組織に投与する研究としては、気管注入（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ外，１９９１；１９９２）、筋肉注射（Ｒａｇｏｔ外，１９９３）、末梢静脈注射（Ｈｅｒｚ及びＧｅｒａｒｄ，１９９３）及び脳への定位的接種（Ｌｅ  Ｇａｌ  Ｌａ  Ｓａｌｌｅ外，１９９３）が挙げられる。組換えアデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス（下記参照）は、分裂していないヒト初代細胞に感染し、形質導入することができる。
【０１１５】
また、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、遺伝子の送達及び発現のためのベクターの構築に使用するのに魅力的な系である。というのは、ＡＡＶは高頻度の組込みを有し、非分裂細胞に感染することができ、それによって、例えば組織培養（Ｍｕｚｙｃｚｋａ，１９９２）又は生体内において哺乳類細胞に遺伝子を送達するのを有用にするからである。ＡＡＶは、感染性のための広い宿主範囲を有する（Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ外，１９８４；Ｌａｕｇｈｌｉｎ外，１９８６；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ外，１９８８；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ外，１９８８）。ｒＡＡＶベクターの生成及び使用に関する詳細は、米国特許第５，１３９，９４１号及び米国特許第４，７９７，３６８号に記載されており、それぞれ参照により本明細書で援用する。
【０１１６】
遺伝子送達におけるＡＡＶの使用を実証する研究としては、ＬａＦａｃｅ外（１９８８）；Ｚｈｏｕ外（１９９３）；Ｆｌｏｔｔｅ外（１９９３）；及びＷａｌｓｈ外（１９９４）が挙げられる。組換えＡＡＶベクターは、マーカー遺伝子（Ｋａｐｌｉｔｔ外，１９９４；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ外，１９８８；Ｓａｍｕｌｓｋｉ外，１９８９；Ｙｏｄｅｒ外，１９９４；Ｚｈｏｕ外，１９９４；Ｈｅｒｍｏｎａｔ及びＭｕｚｙｃｚｋａ，１９８４；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ外，１９８５；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ外，１９８８）並びにヒト疾患に関与する遺伝子（Ｆｌｏｔｔｅ外，１９９２；Ｌｕｏ外，１９９４；Ｏｈｉ外，１９９０；Ｗａｌｓｈ外，１９９４；Ｗｅｉ外，１９９４）の試験管内及び生体内形質導入に使用することが成功している。近年、嚢胞性線維症の治療のための第Ｉ相ヒト試験についてＡＡＶベクターが承認されている。
【０１１７】
ＡＡＶは、培養細胞において生産的感染を受けるために別のウイルス（アデノウイルス又はヘルペスウイルスファミリーのメンバー）との同時感染を必要とするという点で依存性のパルボウイルスである（Ｍｕｚｙｃｚｋａ，１９９２）。ヘルパーウイルスとの共感染がない場合には、野生型ＡＡＶゲノムは、その末端を介してヒト１９番染色体に組み込み、そこでプロウイルスとして潜伏状態で存在する（Ｋｏｔｉｎ外，１９９０；Ｓａｍｕｌｓｋｉ外，１９９１）が、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質も発現しない限り、組込みについて１９番染色体に限定されない（Ｓｈｅｌｌｉｎｇ及びＳｍｉｔｈ，１９９４）。ＡＡＶプロウイルスを保有する細胞がヘルパーウイルスに重複感染すると、ＡＡＶゲノムは染色体又は組換えプラスミドから「レスキュー」され、正常な生産的感染が確立される（Ｓａｍｕｌｓｋｉ外，１９８９；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ外，１９８８；Ｋｏｔｉｎ外，１９９０；Ｍｕｚｖｃｚｋａ，１９９２）。
【０１１８】
典型的には、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ウイルスは、２つのＡＡＶ末端反復（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ外，１９８８：Ｓａｍｕｌｓｋｉ外，１９８９；それぞれ本明細書において参照により援用される）に隣接する目的の遺伝子を含むプラスミドと、末端反復を伴わない野生型ＡＡＶコード配列を含むプラスミド、例えば、ｐｌＭ４Ｓ（ＭｃＣａｒｔｙ外，１９９１；参照により本明細書において援用される）とを同時トランスフェクトすることによって作製される。また、細胞に、ＡＡＶヘルパー機能のために必要とされるアデノウイルス遺伝子を保有するアデノウイルス又はプラスミドも感染又はトランスフェクトすると、このようにして作製されたｒＡＡＶウイルスストックは、熱ショックによって不活性化されなければならない又はｒＡＡＶ粒子から物理的に分離されなければならない（例えば、塩化セシウム密度遠心分離によって）アデノウイルスで汚染される。あるいは、ＡＡＶコード領域を含むアデノウイルスベクター又はＡＡＶコード領域とアデノウイルスヘルパー遺伝子のいくつか若しくは全てとを含む細胞株を使用することができるであろう（Ｙａｎｇ外，１９９４；Ｃｌａｒｋ外，１９９５）。また、組み込まれたプロウイルスとしてのｒＡＡＶ  ＤＮＡを保有する細胞株も使用することができる（Ｆｌｏｔｔｅ外，１９９５）。
【０１１９】
本発明の特定の態様では、レトロウイルス感染の使用を通した標的細胞への選択された遺伝子の送達が望まれる。レトロウイルスは、逆転写プロセスによって感染細胞内においてそれらのＲＮＡを二本鎖ＤＮＡに変換することができることを特徴とする一本鎖ＲＮＡウイルス群である（Ｃｏｆｆｉｎ，１９９０）。その後、得られたＤＮＡはプロウイルスとして細胞染色体に安定に組み込まれ、ウイルスタンパク質の合成を指示する。この組み込みにより、レシピエント細胞及びその子孫にウイルス遺伝子配列が保持される。レトロウイルスゲノムは、カプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素及びエンベロープ成分をそれぞれコードする３種の遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖを含む。ｇａｇ遺伝子の上流に見出される配列は、ゲノムをビリオンにパッケージングするためのシグナルを含む。ウイルスゲノムの５’及び３’末端には２つの長い末端反復配列（ＬＴＲ）が存在する。これらは強力なプロモーター及びエンハンサー配列を含み、また宿主細胞ゲノムへの組込みに必要である（Ｃｏｆｆｉｎ，１９９０）。
【０１２０】
レトロウイルスベクターを構築するために、目的の遺伝子をコードする核酸を所定のウイルス配列の代わりにウイルスゲノムに挿入して複製欠損型ウイルスを産生する。ビリオンを産生するために、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子を含むがただしＬＴＲ及びパッケージング成分を含まないパッケージング細胞株を構築する（Ｍａｎｎ外，１９８３）。レトロウイルスＬＴＲ及びパッケージング配列と共にｃＤＮＡを含む組換えプラスミドをこの細胞株に導入すると（例えばリン酸カルシウム沈殿によって）、パッケージング配列により、組換えプラスミドのＲＮＡ転写産物をウイルス粒子にパッケージングすることができ、その後、これは培養培地中に分泌される（Ｎｉｃｏｌａｓ及びＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ，１９８８：Ｔｅｍｉｎ，１９８６；Ｍａｎｎ外，１９８３）。次いで、組換えレトロウイルスを含む培地を収集し、任意に濃縮し、そして遺伝子導入のために使用する。レトロウイルスベクターは広範囲の細胞型に感染することができる。しかしながら、組込み及び安定発現は、宿主細胞の分裂を必要とする（Ｐａｓｋｉｎｄ外，１９７５）。
【０１２１】
欠損レトロウイルスベクターの使用に関連する懸念は、パッケージング細胞において野生型複製コンピテントウイルスが出現する可能性である。これは、組換えウイルスからのインタクトな配列が、宿主細胞ゲノムに組み込まれたｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ配列の上流に挿入される組換え事象により生じる場合がある。しかし、現在では、新たなパッケージング細胞株が利用可能であり、これは組換えの可能性を大幅に減少させるはずである（Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ外，１９８８；Ｈｅｒｓｄｏｒｆｆｅｒ外，１９９０）。
【０１２２】
場合によっては、限定的な宿主細胞範囲及び低力価のレトロウイルスベクターは、これらを真核細胞における安定した遺伝子伝達のために使用することを制限する場合がある。これらの潜在的な困難を克服するために、レトロウイルスエンベロープ糖タンパク質が水疱性口内炎ウイルスのＧ糖タンパク質によって完全に置換されたネズミ白血病ウイルス由来ベクターが開発されている（Ｂｕｒｎｓ外，１９９３）。これらのベクターは、非常に高い力価（１０9コロニー形成単位／ｍｌ）に濃縮することができ、かつ、通常はレトロウイルスエンベロープタンパク質を含むベクターによる感染に対して耐性の細胞に感染することができる。これらのベクターは、遺伝子治療モデル研究及び生体内でのベクターの直接送達を必要とする他の遺伝子導入研究を促進させることができる。
【０１２３】
本発明における発現ベクターの構築には、他のウイルスベクターを用いることができる。ワクシニアウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８；Ｂａｉｃｈｗａｌ及びＳｕｇｄｅｎ，１９８６；Ｃｏｕｐａｒ外，１９８８）、シンドビスウイルス及びヘルペスウイルスなどのウイルス由来のベクターを用いることができる。これらは、様々な哺乳動物細胞にいくつかの魅力的な特徴を与える（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ，１９８９；Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８；Ｂａｉｃｈｗａｌ及びＳｕｇｄｅｎ，１９８６；Ｃｏｕｐａｒ外，１９８８；Ｈｏｒｗｉｃｈ外，１９９０）。
【０１２４】
Ｂ型肝炎ウイルスの欠損が最近認識され、様々なウイルス配列の構造・機能関係に新たな洞察が得られた。試験管内研究から、このウイルスは、そのゲノムの８０％まで欠失しているにもかかわらず、ヘルパー依存性パッケージング及び逆転写の能力を保持することができることが示された（Ｈｏｒｗｉｃｈ外，１９９０）。このことは、ゲノムの大部分が外来遺伝物質と置換され得ることを示唆した。近年、Ｃｈａｎｇ外（１９９１）は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を、ポリメラーゼ、表面及びプレ表面コード配列の代わりにアヒルＢ型肝炎ウイルスゲノムに導入した。鳥類の肝癌細胞株に野生型ウイルスを共トランスフェクトした。高力価の組換えウイルスを含有する培養培地を使用して一次アヒル肝細胞に感染させた。トランスフェクション後少なくとも２４日間にわたって、安定したＣＡＴ遺伝子発現が検出された（Ｃｈａｎｇ外，１９９１）。
【０１２５】
本発明の方法は、患者が示す特定の疾患又は障害の治療において一般的に使用されている任意の他の方法と組み合わせることができる。例えば、固形腫瘍の治療に関連して、本発明の方法は、手術、放射線療法などの古典的アプローチと組み合わせて使用することができる。特定の治療アプローチがそれ自体有害であることが知られていない限り又はＳＬＣ療法の有効性を妨げる限り、それと本発明との組み合わせが意図される。１種以上の薬剤をＳＬＣ療法と組み合わせて使用する場合には、明らかに望ましいものの、各治療を別々に行われた場合に観察される効果を組み合わせた結果に加味する必要はなく、また、確かに可能であり有利であるものの、組み合わせた治療が相乗効果を発揮する必要は特にない。
【０１２６】
外科手術に関しては、任意の外科的介入を本発明と組み合わせて実施することができる。放射線療法に関しては、ｙ線照射、Ｘ線、ＵＶ照射、マイクロ波、さらには電子放射などの腫瘍細胞内で局所的にＤＮＡ損傷を誘発するための任意のメカニズムが企図される。また、腫瘍細胞への放射性同位元素の指向性送達も意図されており、これは、標的化抗体その他の標的化手段に関連して使用できる。また、サイトカイン療法は、併用療法レジメンのための有効なパートナーであることも証明されている。様々なサイトカインをこのような併用アプローチで使用できる。サイトカインの例としては、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＴＧＦ−β、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＬＡＦ、ＴＣＧＦ、ＢＣＧＦ、ＴＲＦ、ＢＡＦ、ＢＤＧ、ＭＰ、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＴＭＦ、ＰＤＧＦ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γが挙げられる。サイトカインは、患者の状態及びサイトカインの相対毒性のような臨床適応と一致する標準的なレジメンに従って投与される。以下は、本発明の所定の実施形態で使用するためのサイトカイン遺伝子の例示的な表であるが、ただしこれらに限定されない。
【０１２７】
【表１−１】
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【表１−２】
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【０１２８】
本発明の組成物は、本明細書に記載のチェックポイント阻害剤及び／又は以下に例示するような化学療法剤である化合物（第２薬剤）の有効量と組み合わせた治療投与のための操作されたウイルス又は細胞の有効量を有することができる。このような組成物は、一般に、薬学的に許容されるキャリア又は水性媒体に溶解又は分散される。多種多様な化学療法剤を本発明の治療遺伝子と併用することができる。これらのものは、例えば、ＤＮＡを直接架橋する薬剤、ＤＮＡにインターカレートする薬剤、及び核酸合成に影響を与えることによって染色体及び有糸分裂異常を引き起こす薬剤であることができる。
【０１２９】
様々な化学療法剤を、本明細書に開示される併用治療方法において使用することが意図される。例示の化学療法剤としては、エトポシド（ＶＰ−１６）、アドリアマイシン、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、カンプトテシン、アクチノマイシンＤ、マイトマイシンＣ、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、さらには過酸化水素が挙げられる。
【０１３０】
当業者であれば分かるように、化学療法剤の適切な用量は、一般に、化学療法剤が単独で又は他の化学療法剤と組み合わせて投与される臨床療法において、およそ既に使用されている量であろう。ほんの一例として、シスプラチンなどの薬剤及び他のＤＮＡアルキル化剤を使用することができる。シスプラチンは癌の治療に広く使用されており、臨床応用において使用される有効用量は、合計３コースで３週間毎に５日間にわたって２０ｍｇ／ｉｎ2である。シスプラチンは経口吸収されないため、静脈内注射、皮下注射、腫瘍内注射又は腹腔内注射によって送達されなければならない。
【０１３１】
核酸、具体的にはＤＮＡを直接架橋する薬剤は、ＤＮＡ損傷を生じさせ、相乗的な抗新生物の組み合わせをもたらすことが想定され、これは本明細書に示されている。シスプラチンなどの薬剤及び他のＤＮＡアルキル化剤を使用することができる。
【０１３２】
さらに有用な薬剤としては、ＤＮＡ複製、有糸分裂及び染色体分離を妨害する化合物が挙げられる。このような化学療法化合物としては、ドキソルビシン、エトポシド、ベラパミル、ポドフィロトキシンなどとしても知られるアドリアマイシンが挙げられる。新生物の治療のための臨床現場で広く使用されているこれらの化合物は、アドリアマイシンについては２１日間隔で２５〜７５ｍｇ／ｉｎ2の範囲の用量で静脈内ボーラス投与によって投与され、エトポシドについては３５〜５０ｍｇ／ｉｎ2まで静脈内投与され又は静脈内投与量の２倍経口で投与される。
【０１３３】
ポリヌクレオチド前駆体の合成及び忠実度を破壊する薬剤も使用することができる。特に有用なのは、広範な試験を受け、かつ、容易に入手可能な薬剤である。このように、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの薬剤が新生物組織によって優先的に使用され、この薬剤を新生細胞に対する標的化のために特に有用なものにする。非常に毒性であるが、５−ＦＵは、局所を含めて広範囲のキャリアに適用できるが、３〜１５ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の用量を用いた静脈内投与が一般的に使用されている。
【０１３４】
また、タキソールのなどの植物アルカロイドも本発明の所定の態様において使用することが考えられる。タキソールは、トネリコであるタクサス・ブレビフォリア（Ｔａｘｕｓ  ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ）の樹皮から単離される実験的な有糸分裂阻害剤である。このものはチューブリンに結合し（ビンカアルカロイドによって使用される部位とは異なる部位に）、微小管の集合を促進する。タキソールは現在臨床的に評価されている；このものは悪性黒色腫及び卵巣癌に対して活性を有する。最大投与量は、５日間にわたって１日当たり３０ｍｇ／ｍ2又は３週間ごとに１回２１０〜２５０ｍｇ／ｍ2である。言うまでもなく、これらの投薬量の全ては例示的なものであり、これらの点間の任意の投薬量も本発明での使用であると予想される。
【０１３５】
併用療法に関連して有用な例示的な化学療法剤を表Ｂに列挙する。ここに列挙されている薬剤のそれぞれは例示的なものであり、限定ではない。「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」第１５版、第３３章、特に６２４〜６５２ページを参照されたい。治療される被験体の状態によって投薬量のいくらかの変動が必然的に生じるであろう。いずれにしても、投与を担当する者は、個々の被験体に適切な用量を決定するであろう。さらに、ヒトへの投与について、製剤は、ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ基準で要求されるように、無菌性、発熱原性、一般的安全性及び純度基準を満たさなければならない。
【０１３６】
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【０１３７】
チェックポイントタンパク質
細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）（ＣＤ１５２）は、Ｔ細胞活性化のＢ７−１／Ｂ７−２調節経路に関与する周知の共刺激分子である。ＣＴＬＡ−４は、ヘルパーＴ細胞の表面上で発現し、Ｔ細胞に阻害シグナルを伝達する（例えば、Ｋｒｕｍｍｅｌ外，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２（２）：４５９−６５，１９９５参照）。ＣＴＬＡ−４に結合する抗体としては、イピリムマブ及びトレミリムマブが挙げられる。
【０１３８】
分化クラスター２７９（ＣＤ２７９）としても知られているプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）は、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞及びマクロファージ上で発現する細胞表面共抑制性受容体であり、免疫チェックポイント封鎖の成分である（Ｓｈｉｎｏｈａｒａ外，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．，２３（３）：７０４（１９９４）；Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ外，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．，２３６：２１９（２０１０））。ＰＤ−１は、その２つのリガンドＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１；ＣＤ２７４としても知られる）及びＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣ；ＣＤ２７３）との相互作用によりＴ細胞の活性を制限する（Ｐｏｓｔｏｗ外，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．３３：９（２０１５））。ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２との相互作用は、Ｔ細胞増殖、サイトカイン産生及び細胞傷害活性を低下させる（Ｆｒｅｅｍａｎ  ＧＪ外，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．，１９２：１０２７−３４（２０００）；Ｂｒｏｗｎ  ＪＡ外．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７０：１２５７−６６（２００３））。
【０１３９】
２種のモノクローナル抗体がＰＤ−１免疫療法の阻害について米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認されている。転移性黒色腫での使用についてペムブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）、Ｍｅｒｃｋ  Ｓｈａｒｐ＆Ｄｏｈｍｅ  Ｃｏｒｐ．）が承認され、転移性黒色腫及び転移性扁平上皮性非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）での使用についてニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）が承認されている。これらの抗体の両方はＰＤ−１受容体に結合し、そのリガンドであるＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２とのその相互作用を遮断する。
【０１４０】
また、ＰＤ−Ｌ１の阻害剤は、膀胱癌、頭頸部癌及び胃腸癌における固形腫瘍の阻害に有効であることが示されている（Ｈｅｒｂｓｔ  ＲＳ外，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．，３１：３０００（２０１３）；Ｈｅｅｒｙ  ＣＲ外，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．，３２：５ｓ，３０６４（２０１４）；Ｐｏｗｌｅｓ  外，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ，３２：５ｓ，５０１１（２０１４）；Ｓｅｇａｌ  ＮＨ外，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．，３２：５ｓ，３００２（２０１４））。
【０１４１】
４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）は、ＴＮＦスーパーファミリーの２型細胞表面受容体であり、活性化Ｔリンパ球及び樹状細胞上で発現する。４−１ＢＢは、Ｔ細胞増殖を引き起こす共刺激分子として作用する。
【０１４２】
リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ−３、ＣＤ２２３）は、活性化Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞及び形質細胞様樹状細胞上で発現する細胞表面分子チェックポイントである。ＬＡＧ−３は、ＣＴＬＡ−４及びＰＤ−１と同様に、Ｔ細胞の細胞増殖、活性化及びホメオスタシスを負に調節する（Ｗｏｒｋｍａｎ外，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １７２：５４５０−５，２００４）。ＬＡＧ−３モノクローナル抗体ＢＭＳ−９８６０１６は、臨床試験の対象となっている。
【０１４３】
ＴＩＭ−３は、ＩＦＮ−γ産生ＣＤ４＋Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）及びＣＤ８＋Ｔ細胞傷害性１（Ｔｃ１）Ｔ細胞上で発現する受容体である（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ａ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ  ２；３９３，２０１４）。
【０１４４】
例示的な実施形態では、ＳＬＣポリペプチド、ＳＬＣ変異体、ＳＬＣ断片、ＳＬＣアナログ、ＳＬＣ誘導体、前記ポリペプチド、変異体又は断片をコードするＳＬＣポリヌクレオチド、及び／又は本明細書に記載のＳＬＣ剤を免疫チェックポイント阻害剤と併用する。細胞性免疫は、Ｔ細胞が特定の混合組織適合複合体（ＭＨＣ）分子に結合したＡＰＣの被験体で発現する細胞内タンパク質の特異的ペプチド断片を認識するときに始まる。この相互作用は、ＣＤ２８に結合する共刺激分子であるＢ７の存在を必要とする。この活性化の結果は、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）のアップレギュレーションである。ＣＴＬＡ−４がＴリンパ球上のその受容体に結合すると、Ｔ細胞活性化の負の調節に至る。別の同時阻害経路は、活性化Ｔ細胞上に存在する別の阻害性受容体であるプログラム細胞死１受容体（ＰＤ−１）を使用する。ＰＤ−１がそのリガンド（ＰＤ−Ｌ１）に結合すると、有効な免疫応答を生成する活性化Ｔ細胞の能力が下方調節される。
【０１４５】
したがって、本発明は、（ａ）被験体に、（ｉ）ＳＬＣポリペプチド、（ｉｉ）ＳＬＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドを含む細胞、又は（ｉｖ）それらの組み合わせを投与し、及び（ｂ）被験体に免疫チェックポイント阻害剤を投与することを含む。例示的な態様では、本方法は、被験体における癌又は固形腫瘍の治療方法である。
【０１４６】
免疫チェックポイント阻害剤は、当該技術分野において知られており（例えばＢｒａｈｍｅｒ  ａｎｄ  Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ  １；８５（２０１３）及びそこに引用されている参考文献を参照）、また、免疫チェックポイント阻害剤のいずれか１種又はそれらの組合せは、ＳＬＣポリペプチド、ＳＬＣ変異体、ＳＬＣ断片、ＳＬＣアナログ、ＳＬＣ誘導体、前記ポリペプチド、変異体若しくは断片をコードするＳＬＣポリヌクレオチド、及び／又は本明細書に記載のＳＬＣ剤との併用療法に有用である。
【０１４７】
様々な実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ−４受容体、ＰＤ−１、ＰＤ１−Ｌ１、ＰＤ１−Ｌ２、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３又はそれらの組み合わせのうちの１種以上に特異的な抗体、任意にモノクローナル抗体である。
【０１４８】
例示的な態様において、免疫チェックポイント阻害剤はＣＴＬＡ−４の阻害剤である。例示的な態様において、免疫チェックポイント阻害剤はＣＴＬＡ−４受容体の阻害剤である。例示的な態様において、免疫チェックポイント阻害剤はＰＤ−１の阻害剤である。例示的な態様において、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ１−Ｌ１及びＰＤ１−Ｌ２を含めた任意のＰＤ−１リガンドの阻害剤である。例示的な態様において、免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４又はＣＴＬＡ−４受容体に特異的に結合するモノクローナル抗体である。例示的な態様において、ＣＴＬＡ−４に特異的に結合するモノクローナル抗体は、イピリムマブ及びトレミリムマブである。モノクローナル抗体を作製する方法は当該技術分野において知られている。例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ著，ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８を参照されたい。
【０１４９】
例示的な態様において、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１又はそのリガンドのいずれか１種に特異的に結合するモノクローナル抗体である。例示的な態様において、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合するモノクローナル抗体である。例示的な態様において、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ１−Ｌ２に特異的に結合するモノクローナル抗体である。
【０１５０】
例示的な態様では、ＰＤ−１に特異的に結合するモノクローナル抗体は、ニボルマブ（ＢＭＳ９３６５５８；Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｅｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、ペムブロリズマブ（ＭＫ−３４７５；Ｍｅｒｃｋ）、ピジリズマブ（ＣＴ−０１１；ＣｕｒｅＴｅｃｈ）、ラムブロリズマブ、ＢＭＳ−９３６５５９、アテゾリズマブ又はＡＭＰ−２２４（ＧＳＫ／Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ）、ＡＭＰ２２４（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）；ＡＵＮＰ１２（Ｄｒ．  Ｒｅｄｄｙ’ｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．）；ＢＧＢ１０８（ＢｅｉＧｅｎｅ）；ＭＣＬＡ１３４（Ｍｅｒｕｓ  ＢＶ）；ＭＥＤＩ０６８０（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）；ＰＤＲ００１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；ＲＥＧＮ２８１０（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ／Ｓａｎｏｆｉ）；ＳＨＲ１２１０（Ｊｉａｎｇｓｕ  Ｈｅｎｇｒｕｉ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ／Ｉｎｃｙｔｅ）；ＳＴＩＡ１１０Ｘ（Ｓｏｒｒｅｎｔｏ）；ＳＴＩＡ１１１０（Ｓｏｒｒｅｎｔｏ）；ＴＳＲ０４２（ＡｎａｐｔｙｓＢｉｏ／Ｔｅｓａｒｏ）である。典型的な態様において、ＰＤ１−Ｌ１に特異的に結合するモノクローナル抗体は、ＢＭＳ−９３６５５９（ＢＭＳ／Ｏｎｏ）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、又はＭＥＤＩ−４７３６（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ（Ｍｅｒｃｋ／Ｓｅｒｏｎｏ）、ＡＬＮ−ＰＤＬ（Ａｌｎｙｌａｍ）；ＢＧＢＡ３１７（ＢｅｉＧｅｎｅ）；ＫＤ０３３（Ｋａｄｍｏｎ  Ｃｏｒｐ．）；ＫＹ１００３（Ｋｙｍａｂ  Ｌｔｄ．）；ＳＴＩＡ１００Ｘ（Ｓｏｒｒｅｎｔｏ）；ＳＴＩＡ１０１０（Ｓｏｒｒｅｎｔｏ）；ＳＴＩＡ１０１１（Ｓｏｒｒｅｎｔｏ）；ＳＴＩＡ１０１２（Ｓｏｒｒｅｎｔｏ）及びＳＴＩＡ１０１４（Ｓｏｒｒｅｎｔｏ）である。
【０１５１】
例示的な態様において、免疫チェックポイント阻害剤は、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７としても知られている）の阻害剤である。例示的な態様において、４−１ＢＢの免疫チェックポイント阻害剤は、４−１ＢＢに特異的に結合するモノクローナル抗体であり、ＢＭＳ−６６３５１３（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）及びＰＦ−０５０８２５６６（ＰＦ−２５６６）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５２】
例示的な態様において、免疫チェックポイント阻害剤はＯＸ４０の阻害剤である。例示的な態様において、ＯＸ４０の阻害剤はＯＸ４０に特異的に結合するモノクローナル抗体である。例示的なＯＸ４０モノクローナル抗体は、Ｃｕｒｔｉ外，Ａ  ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ＯＸ４０  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｃａｎｃｅｒ  （要約）．  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，２００７に記載されている。
【０１５３】
例示的な実施形態では、チェックポイント阻害剤はＬＡＧ−３阻害剤である。例示的な態様において、ＬＡＧ−３の阻害剤は、ＬＡＧ−３に特異的に結合するモノクローナル抗体である。
【０１５４】
例示的な実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＴＩＭ−３阻害剤である。例示的な態様において、ＴＩＭ−３の阻害剤は、ＴＩＭ−３に特異的に結合するモノクローナル抗体である。
【０１５５】
様々な実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ−４受容体、ＰＤ−１、ＰＤ１−Ｌ１、ＰＤ１−Ｌ２、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３又はそれらの組み合わせの１種以上の活性を阻害する小分子阻害剤である。
【０１５６】
例示的な態様において、免疫チェックポイント阻害剤、例えばＰＤ１又はＰＤ−Ｌ１阻害剤は、約１〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲内の用量で投与される。例示的な態様において、免疫チェックポイント阻害剤、例えばＰＤ１又はＰＤ−Ｌ１阻害剤は、約１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で投与される。例示的な態様において、免疫チェックポイント阻害剤、例えばＰＤ１又はＰＤ−Ｌ１阻害剤は、静脈内など非経口的に投与される。例示的な態様において、免疫チェックポイント阻害剤、例えばＰＤ１又はＰＤ−Ｌ１阻害剤は、１〜２週間ごとに投与される。例示的な態様では、免疫チェックポイント阻害剤、例えばＰＤ１又はＰＤ−Ｌ１を２週間に１回投与する。用量及びレジメンを調節して、被験体が例えば疲労、発疹、下痢、皮膚疾患、胃腸事象、内分泌障害を含めた有害事象を経験するのを防止する又は最小限に抑える。
【０１５７】
例示的な態様において、ＳＬＣポリペプチドは、免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与され、任意に、ＳＬＣポリペプチドは、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を含む。
【０１５８】
例示的な態様において、ＳＬＣポリペプチドをコードするＳＬＣポリヌクレオチドを免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与する。任意に、コードされたＳＬＣポリペプチドは、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を含む。例示的な態様では、ＳＬＣポリヌクレオチドは、ベクター、例えば組換え発現ベクターに挿入され、すなわちその一部であり、このベクターが免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて被験体に投与される。例示的な態様において、ベクターはアデノウイルスベクターである。アデノウイルスベクターは、本明細書中に記載されるベクターのうちの任意のものであることができる。例示的な態様において、アデノウイルスベクターは、複製欠損アデノウイルスベクターである。例示的な態様では、被験体は固形腫瘍を含み、ＳＬＣポリヌクレオチドは被験体に腫瘍内投与される。別の態様において、ＳＬＣポリヌクレオチドは、被験体に対して非経口的に、例えば、静脈内又は皮下投与される。
【０１５９】
例示的な態様において、ＳＬＣポリペプチドをコードするＳＬＣポリヌクレオチドを含み、発現する細胞は、免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与される。例示的な態様において、細胞は細胞集団の一部であり、細胞集団はＳＬＣポリペプチドをコードするＳＬＣポリヌクレオチドを含み、これを発現する。例示的な態様において、細胞の集団は、免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与される。例示的な態様において、細胞又は細胞集団は、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を含むＳＬＣポリペプチドをコードするＳＬＣポリヌクレオチドを含み、これを発現する。例示的な態様において、ＳＬＣポリヌクレオチドを含みかつこれを発現する細胞又は細胞集団は、ＡＰＣ又はその集団である。例示的な態様において、ＳＬＣポリヌクレオチドを含みかつこれを発現する細胞又は細胞集団は、樹状細胞又はその集団である。例示的な態様において、ＡＰＣ、例えば樹状細胞又はその集団は、治療される被験体に対して自己由来である。このような態様では、この方法はｅｘ  ｖｉｖｏ法である。
【０１６０】
例示的な態様において、ＳＬＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含みかつこれを発現する少なくとも約１×１０5個又は少なくとも約１×１０6個の細胞を被験体に投与する。例示的な態様では、ＳＬＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含みかつこれを発現する少なくとも約２×１０6個の細胞、少なくとも約３×１０6個の細胞、少なくとも約４×１０6個の細胞、少なくとも約５×１０6個の細胞、少なくとも約６×１０6個の細胞、少なくとも約７×１０6個の細胞、８×１０6個の細胞、少なくとも約９×１０6個の細胞、少なくとも約１×１０7個の細胞、少なくとも約２×１０7個の細胞、又は少なくとも約３×１０7個の細胞を被験体に投与する。例示的な態様では、細胞は所定の時間内に十分な量のＳＬＣを産生する。例示的な態様では、細胞は、２４時間内に１×１０6個の細胞当たり少なくとも約０．１０ｎｇのＳＬＣを産生する。例示的な態様では、細胞は、２４時間以内に１×１０6個の細胞当たり少なくとも約０．１５ｎｇのＳＬＣを産生する。例示的な態様では、細胞は、２４時間以内に１×１０6個の細胞当たり少なくとも約０．２０ｎｇのＳＬＣを産生する。例示的な態様では、細胞は、２４時間以内に１×１０6個の細胞当たり少なくとも約０．２５ｎｇのＳＬＣを産生する。例示的な態様では、細胞は、２４時間以内に１×１０6個の細胞当たり少なくとも約０．３０ｎｇのＳＬＣを産生する。例示的な態様では、細胞は、２４時間以内に１×１０6個の細胞当たり少なくとも約０．３５ｎｇのＳＬＣを産生する。例示的な態様では、細胞は、２４時間以内１×１０6個の細胞当たり少なくとも約０．４０ｎｇのＳＬＣを産生する。例示的な態様では、細胞は、２４時間以内に１×１０6細胞当たり少なくとも約０．４５ｎｇのＳＬＣを産生する。例示的な態様では、細胞は、２４時間以内に１×１０6個の細胞当たり少なくとも約０．５０ｎｇのＳＬＣを産生する。例示的な態様では、１〜３０００万個の細胞は、２４時間以内に１×１０6個の細胞当たり約０．２〜０．４５ｎｇ（例えば、０．２９２ｎｇ〜約０．４１３ｎｇ）のＳＬＣを産生する。
【０１６１】
例示的な態様では、本明細書に記載されたＳＬＣポリペプチド、ＳＬＣ変異体、ＳＬＣ断片、ＳＬＣアナログ、ＳＬＣ誘導体、該ポリペプチド、変異体若しくは断片をコードするＳＬＣポリヌクレオチド及び／又はＳＬＣ剤を、免疫チェックポイント阻害剤の投与前に投与する。例示的な態様では、本明細書に記載されたＳＬＣポリペプチド、ＳＬＣ変異体、ＳＬＣ断片、ＳＬＣアナログ、ＳＬＣ誘導体、該ポリペプチド、変異体若しくは断片をコードするＳＬＣポリヌクレオチド及び／又はＳＬＣ剤を、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約１週間、約２週間、約３週間又は約４週間投与することができる。
【０１６２】
例示的な態様では、本明細書に記載されたＳＬＣポリペプチド、ＳＬＣ変異体、ＳＬＣ断片、ＳＬＣアナログ、ＳＬＣ誘導体、該ポリペプチド、変異体若しくは断片をコードするＳＬＣポリヌクレオチド及び／又はＳＬＣ剤は、免疫チェックポイント阻害剤の投与後に投与される。例示的な態様では、本明細書に記載されたＳＬＣポリペプチド、ＳＬＣ変異体、ＳＬＣ断片、ＳＬＣアナログ、ＳＬＣ誘導体、該ポリペプチド、変異体若しくは断片をコードするＳＬＣポリヌクレオチド及び／又はＳＬＣ剤は、免疫チェックポイント阻害剤の投与の約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約１週間、約２週間、約３週間又は約４週間後に投与される。
【０１６３】
例示的な態様では、本明細書に記載されたＳＬＣポリペプチド、ＳＬＣ変異体、ＳＬＣ断片、ＳＬＣアナログ、ＳＬＣ誘導体、該ポリペプチド、変異体若しくは断片をコードするＳＬＣポリヌクレオチド及び／又はＳＬＣ剤は、免疫チェックポイント阻害剤と同時に投与される。様々な実施形態において、これらの薬剤は、別々の処方で投与され、かつ、同時に投与され、ここで、「同時に」とは、複数の薬剤を互いに３０分以内に投与することをいう。また、ＳＬＣ組成物及びチェックポイント阻害剤を、第２薬剤、例えば、  ＳＬＣ組成物及び／又はチェックポイント阻害剤のいずれかと共に投与する前に、ＳＬＣ組成物及び／又はチェックポイント阻害剤のいずれかと共に投与した後に、又はＳＬＣ組成物及び／又はチェックポイント阻害剤のいずれかと同時に投与することができる化学療法剤と共に投与する方法も提供する。
【０１６４】
様々な実施形態において、ＳＬＣ剤及びチェックポイント阻害剤は、同じ処方で同時に与えることができると考えられる。
【０１６５】
例示的な態様では、本明細書に記載されたＳＬＣポリペプチド、ＳＬＣ変異体、ＳＬＣ断片、ＳＬＣアナログ、ＳＬＣ誘導体、該ポリペプチド、変異体若しくは断片をコードするＳＬＣポリヌクレオチド及び／又はＳＬＣ剤を、免疫チェックポイント阻害剤の投与前後に投与する。例示的な態様では、本明細書に記載されたＳＬＣポリペプチド、ＳＬＣ変異体、ＳＬＣ断片、ＳＬＣアナログ、ＳＬＣ誘導体、該ポリペプチド、変異体若しくは断片をコードするＳＬＣポリヌクレオチド及び／又はＳＬＣ剤を、免疫チェックポイント阻害剤の投与前、免疫チェックポイント阻害剤の投与後、及び免疫チェックポイント阻害剤と同時に投与する。
【０１６６】
例示的な態様では、（ｉ）ＳＬＣポリペプチド、（ｉｉ）ＳＬＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドを含む細胞又は（ｉｖ）それらの組み合わせを、被験体に２回以上投与する。典型的な態様では、（ｉ）ＳＬＣポリペプチド、（ｉｉ）ＳＬＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドを含む細胞又は（ｉｖ）それらの組み合わせを、被験体に対して、１週間に２回、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回又は毎月１回投与する。例示的な態様では、免疫チェックポイント阻害剤を被験体に２回以上投与する。典型的な態様では、免疫チェックポイント阻害剤を、被験体に対して１週間に２回、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回又は毎月１回投与する。
【０１６７】
例示的な態様において、被験体は固形腫瘍を含み、細胞は被験体に腫瘍内投与される。別の態様では、細胞は、被験体に対して非経口的に、例えば静脈内又は皮下投与される。
【０１６８】
典型的な態様では、この方法は、被験体に対して、免疫チェックポイント阻害剤を約１〜約２０ｍｇ／ｋｇの用量で約２週間に１回静脈内投与し、被験体に対して、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を含むＳＬＣポリペプチドをコードするＳＬＣポリヌクレオチドを含みかつこれを発現する約１〜約３，０００万個の細胞を腫瘍内投与することを含む。典型的な態様では、この方法は、被験体に対して、免疫チェックポイント阻害剤を約１〜約２０ｍｇ／ｋｇの用量で約２週間に１回静脈内投与し、及び、被験体に対して、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を含むＳＬＣポリペプチドをコードするＳＬＣポリヌクレオチドを腫瘍内投与することを含む。例示的な態様において、細胞又はＳＬＣポリペプチドを、被験体に対して、免疫チェックポイント阻害剤の最初の投与の約２週間前に投与する。典型的な態様において、細胞又はＳＬＣポリペプチドを、被験体に対して、細胞又はＳＬＣポリペプチドの最初の投与後毎月投与する。例示的な態様において、免疫チェックポイント阻害剤を、免疫チェックポイント阻害剤の最初の投与後の２週間目に初めて２週間毎に投与する。
【０１６９】
例示的な態様において、この方法は、被験体において癌又は固形腫瘍を治療する方法である。癌は、本明細書に記載される又は当該分野において知られている癌のいずれかとすることができる。例示的な態様において、癌は、急性リンパ球性癌、急性骨髄性白血病、肺胞性横行性肉腫、骨癌、脳腫瘍、乳癌、肛門癌、肛門管又は肛門直腸癌、眼癌、  肝内胆管癌、関節の癌、頸部、胆嚢又は胸膜の癌、鼻、鼻腔又は中耳の癌、口腔癌、外陰部の癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸癌、食道癌、子宮頸癌、胃腸カルチノイド腫瘍、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、腎臓癌、喉頭癌、肝癌、肺癌、悪性中皮腫、メラノーマ、多発性骨髄腫、鼻咽頭癌、非ホジキンリンパ腫、卵巣癌、膵臓癌、腹膜、大網及び腸間膜癌、咽頭癌、前立腺癌、直腸癌、腎臓癌（例えば、腎細胞癌（ＲＣＣ））、小腸癌、軟組織癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、尿管癌、及び膀胱癌よりなる群から選択される。特定の態様において、癌は、頭部及び頸部癌、卵巣癌、子宮頸癌、膀胱癌及び食道癌、膵臓癌、胃腸癌、乳癌、子宮内膜癌及び結腸直腸癌、肝細胞癌、グリア芽細胞腫、膀胱癌、肺癌、例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、気管支肺胞癌よりなる群より選択される。
【０１７０】
典型的な態様における固形腫瘍は、次の固形腫瘍である：腫瘍型データの状況急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、乳癌（ＢＲＣＡ）、発色団腎細胞癌（ＫＩＣＨ）、明確な細胞腎癌（ＫＩＲＣ）、結腸及び直腸腺癌（ＣＯＡＤ、ＲＥＡＤ）、皮膚黒色腫（ＳＫＣＭ）、多形性膠芽腫（ＧＢＭ）、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣ）、低悪性度グリアーマ（ＬＧＧ）、肺腺癌（ＬＵＡＤ）、肺扁平上皮癌（ＬＵＳＣ）、卵巣漿液性嚢胞腺腫（ＯＶ）、乳頭状甲状腺癌（ＴＨＣＡ）、胃腺癌（ＳＴＡＤ）、前立腺腺癌（ＰＲＡＤ）、子宮体部子宮体癌（ＵＣＥＣ）、尿路上皮膀胱癌（ＢＬＣＡ）、乳頭状腎癌（ＫＩＲＰ）、肝臓肝細胞癌（ＬＩＨＣ）、子宮頸癌（ＣＥＳＣ）、子宮癌肉腫（ＵＣＳ）、副腎皮質癌（ＡＣＣ）、食道癌（ＥＳＣＡ）、褐色細胞腫及びパラガングリオーマ（ＰＣＰＧ）、膵管腺癌（ＰＡＡＤ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣ）、胆管癌（ＣＨＯＬ）、中皮腫（ＭＥＳＯ）、肉腫（ＳＡＲＣ）、精巣生殖細胞癌（ＴＧＣＴ）、白質黒色腫（ＵＶＭ）。例示的な態様において、固形腫瘍は肺腫瘍である。例示的な態様において、固形腫瘍は非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）固形腫瘍である。
【０１７１】
本発明の方法において有用なＳＬＣポリペプチド、ＳＬＣポリペプチド変異体、ＳＬＣポリペプチド断片、該ポリペプチド、変異体及び断片をコードするＳＬＣポリヌクレオチド並びにＳＬＣ剤は、哺乳動物への投与に適した医薬組成物に配合できる。ここで使用するときに、用語「哺乳動物」とは、ヒト、ウシ、ウマ、イヌ及びネコを含めて、哺乳動物として分類される任意の哺乳動物をいう。本発明の好ましい実施形態では、哺乳動物はヒトである。このような組成物は、典型的には、少なくとも１種のＳＬＣポリペプチド、ＳＬＣポリペプチド変異体、ＳＬＣポリペプチド断片、該ポリペプチド、変異体若しくは断片をコードするＳＬＣポリヌクレオチド、ＳＬＣ剤、又はその組み合わせと、薬学的に許容されるキャリアとを含む。薬学的投与のために本発明のＳＬＣ化合物を処方するための方法は当業者に知られている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，第１９版、Ｇｅｎｎａｒｏ（著）１９９５，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡを参照されたい。
【０１７２】
ここで使用するときに、用語「薬学的に許容されるキャリア」には、薬学的投与に適合する任意の及び全ての溶媒、分散媒、被覆剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが含まれるものとする。薬学的に活性な物質のために当該媒体及び薬剤を使用することは当該技術分野において周知である。任意の従来の媒体又は薬剤が活性化合物と不相溶性である場合を除いて、このような媒体は、本発明の組成物において使用できる。追加の活性化合物も組成物に配合できる。本発明の医薬組成物は、その目的の投与経路に適合するように処方される。
【０１７３】
投与経路は所望の結果に応よって変わる。一般に、免疫応答の開始のために、炎症又は応答の所望の部位又はその付近での薬剤の注入が利用される。あるいは、疾患の状態に応じて他の投与経路を確保することもできる。すなわち、新生物又は腫瘍増殖の抑制のために、腫瘍部位又は付近での医薬組成物の注入が好ましい。あるいは、移植片拒絶の予防のために、全身投与を使用してもよい。
【０１７４】
同様に、自己免疫疾患の治療又は予防のためには、全身投与が好ましい場合がある。全身投与の経路の例としては、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所）、経粘膜及び直腸投与が挙げられる。非経口、皮内又は皮下適用に使用される溶液又は懸濁液は、次の成分を含むことができる：注射用水、生理食塩水などの滅菌希釈剤；固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールその他の合成溶媒；ベンジルアルコール又はメチルパラベンなどの抗菌剤；  アスコルビン酸又は重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤；ＥＤＴＡなどのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩などの緩衝剤、及び塩化ナトリウム又はデキストロースのような張性調整剤が挙げられる。
【０１７５】
一実施形態では、医薬組成物は、ＳＬＣタンパク質又はＳＬＣタンパク質の発現に適したＤＮＡ構築物を含む徐放性製剤又はマトリックスを介して、身体内の部位又はその周囲に送達できる。このようにして、所望の移植部位に一時的にリンパ節を作製して免疫応答を開始する樹状細胞及びＴ細胞を誘引することができる。
【０１７６】
医薬組成物を、投与のための説明書と共に容器、パック又はディスペンサーに含めることができる。その結果、疾患の兆候、症状若しくは原因が軽減し及び／又は生物学的系の任意の他の所望の改変が生じることができる。ＳＬＣポリペプチド、ＳＬＣポリペプチド変異体、ＳＬＣポリペプチド断片、該ＳＬＣポリペプチド、変異体及び断片をコードするポリヌクレオチド、並びにＳＬＣ剤を含む本発明の薬学的組成物は、治療上有効な量で投与される。「治療有効量」とは、所望の生物学的結果（例えば、免疫応答の増強）を誘導するのに十分な非毒性投与量レベルをいう。癌の場合、薬剤の治療有効量は、癌細胞の数を減少させることができ；腫瘍のサイズを縮小させることができ；末梢器官への癌細胞の浸潤を阻害する（すなわち、ある程度まで遅らせ、好ましくは停止させる）ことができ；腫瘍転移を阻害する（すなわち、ある程度まで遅らせさせ、好ましくは停止させる）ことができ；腫瘍成長をある程度阻害することができ；及び／又は疾患に関連する１以上の症状をある程度緩和することができる。薬剤が既存の癌細胞の増殖を防止し及び／又は死滅させることができる範囲で、該薬剤は細胞増殖抑制性及び／又は細胞傷害性とすることができる。癌治療の場合、生体内での有効性は、例えば、腫瘍の負荷又は量、疾患進行までの時間（ＴＴＰ）及び／又は応答率（ＲＲ）の決定によって測定できる。
【０１７７】
投与量は、所望の活性、治療される哺乳動物の疾患状態、投与形態、投与方法、患者の因子、例えば年齢、性別、及び疾患の重篤度に基づいて変更できる。治療有効量は、広範囲の濃度で提供されると認められる。このような範囲は、結合アッセイ、走化性アッセイ及び生体内アッセイに基づいて決定できる。
【０１７８】
投与レジメンは様々であることができる。薬剤の単回注射や複数回注射を使用することができる。同様に、発現ベクターは、薬剤の連続発現のために標的部位で使用できる。このようなレジメンは、疾患の重篤度及び所望の結果に依存して変化する。好ましい実施形態では、ＳＬＣ又はＬＣ組成物は、腫瘍又は腫瘍部位に直接注射される。腫瘍周囲部位とは、腫瘍の外縁から約１５ｃｍ未満の部位を意味する。非常に好ましい実施形態において、ＳＬＣ又はＳＬＣ組成物は、腫瘍の近位にあるリンパ節に注射される。ＳＬＣ投与は、１以上の部位に行うことができる。好ましくは、ＳＬＣ投与は、腫瘍内及び／又は腫瘍周辺の複数の部位で行う。
【０１７９】
ＳＬＣポリペプチドは、好ましくはキャリア、好ましくは薬学的に許容されるキャリア中で哺乳動物に投与される。好適なキャリア及びそれらの処方物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，１９８０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｏｓｌｏ外編に記載されている。典型的には、適量の薬学的に許容される塩を製剤に使用して製剤を等張にする。キャリアの例としては、生理食塩水、リンゲル液及びデキストロース溶液が挙げられる。溶液のｐＨは、好ましくは約５〜約８、より好ましくは約７〜約７．５である。さらなるキャリアとしては、例えばＳＬＣポリペプチドを含む固体疎水性重合体の半透性マトリックスなどの徐放性製剤が挙げられ、このマトリックスは成形品、例えばフィルム、リポソーム又は微粒子の形態である。当業者であれば、所定のキャリアが、例えば投与経路及び投与されるＳＬＣポリペプチドの濃度に依存することがさらに好ましいことは明らかであろう。
【０１８０】
ＳＬＣポリペプチドは、注射（例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、門脈内）によって、又は効果的な形態で血流への送達を確実にする注入などの他の方法によって哺乳動物に投与できる。ＳＬＣポリペプチドを単離組織灌流などの単離灌流技術によって投与して、局所治療効果を発揮することもできる。局所又は静脈内注射が好ましい。
【０１８１】
ＳＬＣポリペプチドを投与するのに有効な投薬量及びスケジュールは経験的に（例えば、本明細書に開示されるモデルを使用して）決定でき、このような決定を行うことは当業者の範囲内である。当業者であれば、投与されなければならないＳＬＣポリペプチドの投与量は、例えば、ＳＬＣポリペプチドを受け入れる哺乳動物、投与経路、使用される特定のタイプの分子（例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチド等）及び哺乳動物に投与される他の薬物に依存して変化する。
【０１８２】
上記のように、ＳＬＣポリペプチドは、連続的に又は１種以上の他の治療剤と同時に投与できる。この分子及び治療剤の量は、例えば、使用される薬物のタイプ、治療される病理学的状態、投与スケジュール及び投与経路に依存するが、一般的に、個々に使用される場合よりも少ないであろう。また、アンタゴニスト又はブロッキングＳＬＣ抗体も治療において使用できると考えられる。例えば、ＳＬＣ抗体を哺乳動物（上記のようなもの）に投与してＳＬＣ受容体結合をブロックすることができる。
【０１８３】
哺乳動物へのＳＬＣポリペプチドの投与後に、哺乳動物の生理学的状態を当業者に周知の様々な方法でモニターすることができる。本発明のＳＬＣポリペプチドの治療効果は、試験管内アッセイにおいて及び生体内動物モデルを使用して試験できる。様々な周知の動物モデルを用いて、例えば免疫関連疾患や癌の発症及び病因におけるＳＬＣの役割をさらに理解し、候補治療剤の有効性を試験することができる。このようなモデルの生体内での性質は、ヒト患者における応答を特に予測するのを可能にする。免疫関連疾患の動物モデルとしては、非組換え動物及び組換え（トランスジェニック）動物の両方が挙げられる。非組換え動物モデルとしては、例えば、ネズミモデルなどのげっ歯類が挙げられる。このようなモデルは、標準的な技術、例えば皮下注射、尾静脈注射、脾臓移植、腹腔内移植及び腎被膜下の移植を使用して同系マウスに細胞を導入することによって生成できる。
【０１８４】
本発明のさらなる実施形態では、病理学的状態の治療又はＳＬＣの検出若しくは精製に有用な物質を含有する製品及びキットが提供される。製品は、ラベル付きの容器を備える。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル及び試験管が挙げられる。容器は、ガラスやプラスチックなどの様々な材料から形成できる。容器は、癌などの病的状態の治療に有効な活性剤を有する組成物を保持する。組成物中の活性剤は、好ましくはＳＬＣである。容器上のラベルは、組成物が病理学的状態の治療又はＳＬＣの検出若しくは精製に使用されることを示し、また、上記のような生体内又は試験管内使用のための指示を示すこともできる。
【０１８５】
本発明のキットは、上記の容器と、緩衝剤を含む第２容器とを備える。このものは、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、シリンジ及び使用説明書付きの添付文書を含めて、商業的観点及びユーザーの観点から望ましい他の物質をさらに含むことができる。
【０１８６】
例示的な態様において、キットは、（ｉ）ＳＬＣポリペプチド、（ｉｉ）該ＳＬＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）該ポリヌクレオチドを含む細胞又は（ｉｖ）それらの組み合わせ、及び免疫チェックポイント阻害剤を含む。例示的な態様において、免疫チェックポイント阻害剤はＣＴＬＡ−４の阻害剤である。例示的な態様において、免疫チェックポイント阻害剤はＣＴＬＡ−４受容体の阻害剤である。例示的な態様において、免疫チェックポイント阻害剤はＰＤ−１の阻害剤である。例示的な態様において、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ１−Ｌ１及びＰＤ１−Ｌ２を含む任意のＰＤ−１リガンドの阻害剤である。
【０１８７】
様々な実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ−４受容体、ＰＤ−１、ＰＤ１−Ｌ１、ＰＤ１−Ｌ２、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３又はそれらの組み合わせの１種以上に対して特異的な抗体、任意にモノクローナル抗体である。
【０１８８】
様々な実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ−４受容体、ＰＤ−１、ＰＤ１−Ｌ１、ＰＤ１−Ｌ２、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３又はそれらの組み合わせの１種以上の活性を阻害する小分子阻害剤である。
【０１８９】
例示的な態様において、免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４又はＣＴＬＡ−４受容体に特異的に結合するモノクローナル抗体である。例示的な態様において、ＣＴＬＡ−４に特異的に結合するモノクローナル抗体は、イピリムマブ又はトレミリムマブである。
【０１９０】
例示的な態様において、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１に特異的に結合するモノクローナル抗体又はそのリガンドのいずれか１種である。例示的な態様において、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合するモノクローナル抗体である。例示的な態様において、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ１−Ｌ２に特異的に結合するモノクローナル抗体である。
【０１９１】
例示的な態様では、ＰＤ−１に特異的に結合するモノクローナル抗体は、ニボルマブ（ＢＭＳ９３６５５８；Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｅｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、ペムブロリズマブ（ＭＫ−３４７５；Ｍｅｒｃｋ）、ピジリズマブ（ＣＴ−０１１；ＣｕｒｅＴｅｃｈ）、ラムブロリズマブ、ＢＭＳ−９３６５５９、アテゾリズマブ又はＡＭＰ−２２４（ＧＳＫ／Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ）、ＡＭＰ２２４（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）；ＡＵＮＰ１２（Ｄｒ．  Ｒｅｄｄｙ’ｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．）；ＢＧＢ１０８（ＢｅｉＧｅｎｅ）；ＭＣＬＡ１３４（Ｍｅｒｕｓ  ＢＶ）；ＭＥＤＩ０６８０（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）；ＰＤＲ００１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；ＲＥＧＮ２８１０（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ／Ｓａｎｏｆｉ）；ＳＨＲ１２１０（Ｊｉａｎｇｓｕ  Ｈｅｎｇｒｕｉ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ／Ｉｎｃｙｔｅ）；ＳＴＩＡ１１０Ｘ（Ｓｏｒｒｅｎｔｏ）；ＳＴＩＡ１１１０（Ｓｏｒｒｅｎｔｏ）；ＴＳＲ０４２（ＡｎａｐｔｙｓＢｉｏ／Ｔｅｓａｒｏ）である。
【０１９２】
例示的な態様において、ＰＤ１−Ｌ１に特異的に結合するモノクローナル抗体は、ＢＭＳ−９３６５５９（ＢＭＳ／Ｏｎｏ）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、又はＭＥＤＩ−４７３６（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ（Ｍｅｒｃｋ／Ｓｅｒｏｎｏ）、ＡＬＮ−ＰＤＬ（Ａｌｎｙｌａｍ）；ＢＧＢＡ３１７（ＢｅｉＧｅｎｅ）；ＫＤ０３３（Ｋａｄｍｏｎ  Ｃｏｒｐ．）；ＫＹ１００３（Ｋｙｍａｂ  Ｌｔｄ．）；ＳＴＩＡ１００Ｘ（Ｓｏｒｒｅｎｔｏ）；ＳＴＩＡ１０１０（Ｓｏｒｒｅｎｔｏ）；ＳＴＩＡ１０１１（Ｓｏｒｒｅｎｔｏ）；ＳＴＩＡ１０１２（Ｓｏｒｒｅｎｔｏ）及びＳＴＩＡ１０１４（Ｓｏｒｒｅｎｔｏ）である。
【０１９３】
例示的な態様において、免疫チェックポイント阻害剤は、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７としても知られている）の阻害剤である。例示的な態様において、４−１ＢＢの免疫チェックポイント阻害剤は、４−１ＢＢに特異的に結合するモノクローナル抗体であり、ＢＭＳ−６６３５１３が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９４】
例示的な態様において、免疫チェックポイント阻害剤はＯＸ４０の阻害剤である。例示的な態様において、ＯＸ４０の阻害剤はＯＸ４０に特異的に結合するモノクローナル抗体である。例示的なＯＸ４０モノクローナル抗体は、Ｃｕｒｔｉ外，Ａ  ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ＯＸ４０  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｃａｎｃｅｒ（要約）．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，２００７に記載されている。
【０１９５】
例示的な実施形態では、チェックポイント阻害剤はＬＡＧ−３阻害剤である。例示的な態様において、ＬＡＧ−３の阻害剤は、ＬＡＧ−３に特異的に結合するモノクローナル抗体である。
【０１９６】
例示的な実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＴＩＭ−３阻害剤である。例示的な態様において、ＴＩＭ−３の阻害剤は、ＴＩＭ−３に特異的に結合するモノクローナル抗体である。
【０１９７】
例示的な態様において、免疫チェックポイント阻害剤、例えばＰＤ１又はＰＤ−Ｌ１阻害剤は、約１〜２０ｍｇ／ｋｇの用量でキットに提供される。例示的な態様では、免疫チェックポイント阻害剤、例えばＰＤ１又はＰＤ−Ｌ１阻害剤は、約１〜１０ｍｇ／ｋｇの用量でキットに提供される。例示的な態様において、免疫チェックポイント阻害剤、例えばＰＤ１又はＰＤ−Ｌ１阻害剤は、非経口、例えば、静脈内投与に適した形態でキットに提供される。
【０１９８】
典型的な態様において、キットは、ＳＬＣポリペプチド及び免疫チェックポイント阻害剤を含み、必要に応じて、ＳＬＣポリペプチドは、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を含む。
【０１９９】
例示的な態様において、キットは、ＳＬＣポリペプチドをコードするＳＬＣポリヌクレオチド及び免疫チェックポイント阻害剤を含む。場合により、コードされたＳＬＣポリペプチドは、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を含む。例示的な態様において、ＳＬＣポリヌクレオチドは、ベクター、例えば組換え発現ベクターに挿入されるため、ベクターの一部であり、このベクターは本発明のキットの一部である。例示的な態様において、ベクターはアデノウイルスベクターである。アデノウイルスベクターは、本明細書に記載されるベクターのうちの任意のものであることができる。例示的な態様において、アデノウイルスベクターは、複製欠損アデノウイルスベクターである。例示的な態様において、ＳＬＣポリヌクレオチドは、腫瘍内投与に適した形態でキットに提供される。別の態様では、ＳＬＣポリヌクレオチドは、非経口、例えば、静脈内投与に適した形態でキットに提供される。
【０２００】
例示的な態様において、キットは、ＳＬＣポリペプチドをコードするＳＬＣポリヌクレオチドを含みかつこれを発現する細胞と免疫チェックポイント阻害剤とを含む。例示的な態様において、細胞は細胞集団の一部であり、細胞集団はＳＬＣポリペプチドをコードするＳＬＣポリヌクレオチドを含みかつこれを発現する。例示的な態様において、細胞の集団は、免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与される。例示的な態様において、細胞又は細胞集団は、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を含むＳＬＣポリペプチドをコードするＳＬＣポリヌクレオチドを含みかつ発現する。例示的な態様において、ＳＬＣポリヌクレオチドを含みかつ発現する細胞又は細胞集団は、ＡＰＣ又はその集団である。例示的な態様において、ＳＬＣポリヌクレオチドを含みかつ発現する細胞又は細胞集団は、樹状細胞又はその集団である。
【０２０１】
例示的な局面では、ＳＬＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含みかつ発現する少なくとも約１×１０5個又は少なくとも約１×１０6個の細胞がキットに提供される。例示的な態様では、ＳＬＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含みかつ発現する少なくとも約２×１０6個の細胞、少なくとも約３×１０6個の細胞、少なくとも約４×１０6個の細胞、少なくとも約５×１０6個の細胞、少なくとも約６×１０6個の細胞、少なくとも約７×１０6個の細胞、８×１０6個の細胞、少なくとも約９×１０6個の細胞、少なくとも約１×１０7個の細胞、少なくとも約２×１０7個の細胞、又は少なくとも約３×１０7個の細胞がキットに提供される。例示的な態様では、細胞は所定の時間内に十分な量のＳＬＣを産生する。
【０２０２】
例示的な態様において、細胞は、２４時間以内に１×１０6個の細胞あたり少なくとも約０．１０ｎｇのＳＬＣを産生する。例示的な態様において、細胞は、２４時間以内に１×１０6個の細胞あたり少なくとも約０．１５ｎｇのＳＬＣを産生する。例示的な態様において、細胞は、２４時間以内に１×１０6個の細胞あたり少なくとも約０．２０ｎｇのＳＬＣを産生する。例示的な態様において、細胞は、２４時間以内に１×１０6個の細胞あたり少なくとも約０．２５ｎｇのＳＬＣを産生する。例示的な態様において、細胞は、２４時間以内に１×１０6個の細胞あたり少なくとも約０．３０ｎｇのＳＬＣを産生する。例示的な態様において、細胞は、２４時間以内に１×１０6個の細胞あたり少なくとも約０．３５ｎｇのＳＬＣを産生する。例示的な態様において、細胞は、２４時間以内に１×１０6個の細胞あたり少なくとも約０．４０ｎｇのＳＬＣを産生する。例示的な態様において、細胞は、２４時間以内に１×１０６個の細胞あたり少なくとも約０．４５ｎｇのＳＬＣを産生する。例示的な態様において、細胞は、２４時間以内に１×１０6個の細胞あたり少なくとも約０．５０ｎｇのＳＬＣを産生する。
【０２０３】
本発明の例示的な実施形態
本明細書で開示される発明は多くの実施形態を有する。本発明の好ましい実施形態は、哺乳動物又は哺乳動物由来の細胞集団において、細胞集団を、本明細書に記載されるトランスジェニックマウスモデルにおいて生じる自発性癌腫細胞などの同系腫瘍細胞の増殖を阻害するのに十分な量の二次リンパ組織ケモカイン（ＳＬＣ）に曝露することによってサイトカイン発現を達成又は調節する（例えば、既存のサイトカインプロファイルを変化させる）方法である。ここに開示されるように、本明細書に開示される同系モデルは、ＳＬＣの添加がどのようにサイトカイン発現を協調的に調節し、かつ、腫瘍細胞の増殖を阻害するかを示すため、これらの現象の観察（サイトカイン発現の調節及び腫瘍増殖の阻害）は見込まれる免疫刺激性又は免疫阻害性試験化合物の効果を評価するように設計された細胞系アッセイで使用できる。例えば、本明細書で提供される開示は、試験化合物がＳＬＣのサイトカイン発現調節能力に及ぼす影響を試験すること、及び有利な態様でサイトカインプロファイルを調節する化合物を同定することを可能にする。
【０２０４】
本明細書に記載の方法は、多くの状況で使用することができる。例えば、上記の方法は、サイトカインプロファイルを調節する能力を有する化合物の効果を調査したときに連続的に実施できる。このような本発明の一実施形態では、所定の癌モデルにおけるＳＬＣに応答するサイトカインプロファイル（及び／又は腫瘍増殖の阻害）を最初に調査して、その特定の状況におけるＳＬＣの効果を決定する。その後、そのモデルにおけるＳＬＣの効果を確認するために、このようなアッセイの結果を、ＳＬＣが既知の癌モデル（例えば、本明細書に記載のトランスジェニックマウスモデル）に及ぼす影響と比較することができる。次に、ＳＬＣの代わりに試験化合物を使用してこの方法の変形を繰り返し、次いでモデルにおける試験化合物に対する応答を有するサイトカインプロファイルを調べて、ＳＬＣと類似又は非類似の生理学的効果を生じることのできる分子を同定する（例えば、特定の方法でサイトカインプロファイル及び／又は腫瘍増殖の阻害を調節する）。関連する実施形態では、試験化合物がいくつかの臨床的適用性を有することができるようにＳＬＣの効果を調節して、例えば、サイトカインプロファイルを、腫瘍増殖の阻害を向上させ、より少ない副作用で成長の阻害を可能にするように調節する場合には、ＳＬＣ及び試験化合物を同時に添加することができる。これらのモデルがサイトカインプロファイル及び／又は腫瘍増殖の阻害を測定しかつ比較するときに、これらのものがリンクされていることが示されているので、モデルは新たな興味のある分子の同定及び解剖が細胞生理学に及ぼす影響を容易にする内部基準を提供する。
【０２０５】
これらの方法は、治療法と平行しているため、特に有用な臨床モデルを提供する。具体的には、ＳＬＣによる癌の治療は、哺乳動物又は哺乳類由来の所定の細胞集団において、細胞集団を、同系腫瘍細胞の増殖を阻害するのに十分な量の二次リンパ組織ケモカイン（ＳＬＣ）ポリペプチドに曝露することによってサイトカイン発現を達成又は調節する（例えば、既存のサイトカインプロファイルを変化させる）方法を必要とする。このような臨床状況において、所定の系におけるＳＬＣの効果は、多数の方法で観察又は監視でき、例えば、ＳＬＣの効果を、サイトカインプロファイルの変化の評価、腫瘍増殖又は腫瘍死滅の阻害の評価（例えば、腫瘍サイズの減少及び／又は腫瘍及び／又は腫瘍増殖に伴う症状の重症度の低下を観察することによる）、生存率の増加（本明細書に開示されるトランスジェニックマウスモデルで観察されるときの）などによって観察できる。
【０２０６】
本発明のこの実施形態の特定の実施形態は、腫瘍細胞の増殖を阻害するのに十分な量の二次リンパ系組織ケモカイン（ＳＬＣ）ポリペプチドに細胞集団を曝露し、その後この方法を繰り返し、小分子又はポリペプチド剤からなる試験化合物に細胞集団を暴露することすることを含む、ＣＤ８陽性Ｔ細胞、ＣＤ４陽性Ｔ細胞、抗原提示細胞、及び腫瘍細胞を含めた同系哺乳動物細胞の集団におけるインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）ポリペプチドの発現の増加及び形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）ポリペプチドの発現の減少を達成する方法である。次いで、これらのアッセイからのデータを比較して、試験化合物がＩＦＮ−γポリペプチドの発現又はＴＧＦ−βポリペプチドの発現に及ぼす効果を観察することができる。
【０２０７】
当該分野で知られている任意の分子は、所定のサイトカインのレベルの変化によって検出されるＳＬＣの活性を模倣又は調節（増加又は減少）するその能力について試験できる。ＳＬＣ活性を模倣又は調節する分子を同定するために、サイトカイン発現の変化を検出するために候補分子を生体内又は試験管内で細胞又は被験体に直接与えることができる。さらに、当該分野で公知の任意の鉛活性化剤又は阻害剤構造を、本発明のスクリーニング及び治療方法と組み合わせて使用することができる。このような構造は、例えば、ＳＬＣの活性化剤及び／又は阻害剤の開発を助けるために使用できる。
【０２０８】
この本発明の態様は、サイトカインレベルの変化によって測定されるＳＬＣの活性を調節する、例えば、阻害する、拮抗する、又は作用する、又は模倣する分子の化学的ライブラリーをスクリーニングするのに適している。この化学ライブラリーは、ペプチドライブラリー、ペプチド模倣ライブラリー、化学合成ライブラリー、組換え、例えばファージディスプレイライブラリー、及び試験管内翻訳ベースライブラリー、他の非ペプチド合成有機ライブラリーなどとすることができる。
【０２０９】
例示的なライブラリーは、いくつかの供給元（ＡｒＱｕｌｅ、Ｔｒｉｐｏｓ／ＰａｎＬａｂｓ、ＣｈｅｍＤｅｓｉｇｎ、Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）から市販されている。場合によっては、これらの化学的ライブラリーは、メンバー化合物が結合している基質上のライブラリーの各メンバーの同一性をコードするコンビナトリアルストラテジーを用いて生成されるため、有効なモジュレーターである分子の直接的かつ即時の同定が可能になる。したがって、多くのコンビナトリアルアプローチにおいて、化合物のプレート上の位置は、その化合物の組成を特定する。また、一例では、単一のプレート位置は、目的の相互作用を含むウェルへの投与によってスクリーニングできる１〜２０種の化学物質を有することができる。したがって、調節が検出された場合には、相互作用対の一層小さなプールを調節活性についてアッセイすることができる。このような方法により、多くの候補分子をスクリーニングすることができる。
【０２１０】
使用に適した多くの多様性ライブラリーが当該分野において公知であり、かつ、本発明に従って試験される化合物を提供するために使用できる。あるいは、標準的な方法を用いてライブラリーを構築することができる。化学（合成）ライブラリー、組換え発現ライブラリー、又はポリソーム系ライブラリーは、使用できる例示的なタイプのライブラリーである。
【０２１１】
ライブラリーは、拘束性若しくは半剛性（ある程度の構造剛性を有する）又は線状若しくは非拘束性であることができる。ライブラリーは、ｃＤＮＡ又はゲノム発現ライブラリー、ランダムペプチド発現ライブラリー又は化学的に合成されたランダムペプチドライブラリー、又は非ペプチドライブラリーとすることができる。発現ライブラリーはアッセイが行われる細胞に導入され、そこでライブラリーの核酸が発現してそのコードされたタンパク質を産生する。
【０２１２】
一実施形態では、本発明で使用することができるペプチドライブラリーは、試験管内で化学的に合成されるライブラリーとすることができる。このようなライブラリーの例としては、各ペプチド中の第１及び第２残基が個々に及び特異的に定義された遊離のヘキサペプチドの混合物を記載するＨｏｕｇｈｔｅｎ外，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８４−８６；収集中に各ビーズがその上にアミノ酸残基の単一のランダムな配列を固定したペプチドライブラリーを固相スプリット合成スキームが産生する「１ビーズ、１ペプチド」アプローチを記載するＬａｍ外，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４；スプリット合成法及びＴ−バッグ合成法を記載するＭｅｄｙｎｓｋｉ，１９９４，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：７０９−７１０；Ｇａｌｌｏｐ外，１９９４，Ｊ．Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７（９）：１２３３−１２５１が挙げられる。単なる他の例として、コンビナトリアルライブラリーは、Ｏｈｌｍｅｙｅｒ外，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１０９２２−１０９２６；Ｅｒｂ外，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１４２２−１１４２６；Ｈｏｕｇｈｔｅｎ外，１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２；Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅ外，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１６１４−１６１８；又はＳａｌｍｏｎ外，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１１７０８−１１７１２の方法に従って使用のために調製できる。ＰＣＴ出願公開第ＷＯ９３／２０２４２及びＢｒｅｎｎｅｒ及びＬｅｒｎｅｒ、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５３８１−５３８３には、各化学重合体ライブラリーメンバーについてのオリゴヌクレオチド識別子を含む「コードされたコンビナトリアル化学ライブラリー」が記載されている。
【０２１３】
好ましい実施形態では、スクリーニングされたライブラリーは、ランダムペプチドファージディスプレイライブラリーである生物学的発現ライブラリーであり、その際、ランダムペプチドは制約される（例えば、ジスルフィド結合を有することにより）。
【０２１４】
さらに、より一般的な構造的に制約された有機多様性（例えば、非ペプチド）ライブラリーも使用することができる。一例として、ベンゾジアゼピンライブラリー（例えば、Ｂｕｎｉｎ外，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：４７０８−４７１２を参照）を使用することができる。
【０２１５】
立体構造的に制約されたライブラリーとしては、酸化環境においてジスルフィド結合によって架橋してシステインを形成する不変システイン残基を含むもの、修飾ペプチド（例えば、フッ素、金属、同位体標識を取り込む、リン酸化されるなど）、１種以上の非天然アミノ酸を含むペプチド、非ペプチド構造、及びカルボキシグルタミン酸の有意な画分を含むペプチドを使用することができるが、これらに限定されない。
【０２１６】
非ペプチド、例えばペプチド誘導体（例えば、１種以上の非天然アミノ酸を含む）のライブラリーを使用することもできる。これらの一例はペプトイドライブラリーである（Ｓｉｍｏｎ外，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：９３６７−９３７１）。ペプトイドは、アルファ炭素ではなく主鎖アミノ窒素に結合した天然型側鎖を有する非天然アミノ酸の重合体である。ペプトイドはヒトの消化酵素によって容易には分解されないので、有利には薬物使用に容易に適合できる。ペプチド中のアミド官能基がペルメチル化されて化学的に変性されたコンビナトリアルライブラリーを生成した、使用できるライブラリーの別の例は、Ｏｓｔｒｅｓｈ外，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１１３８−１１１４２に記載されている。
【０２１７】
本発明に従ってスクリーニングすることができるペプチドライブラリーのメンバーは、２０種の天然アミノ酸を含むことに限定されない。特に、化学的に合成されたライブラリー及びポリソーム系ライブラリーは、２０種の天然アミノ酸のほかにアミノ酸を使用することを可能にする（ライブラリー産生で使用される前駆体プールに含ませることによって）。特定の実施形態では、ライブラリーメンバーは、１種以上の非天然又は非古典的アミノ酸又は環状ペプチドを含む。非古典的アミノ酸としては、一般的なアミノ酸のＤ−異性体、”−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸；（−Ａｂｕ、−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸；Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸；３−アミノプロピオン酸；オルニチン；ノルロイシン；ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、デザイナーアミノ酸、例えば一般にβ−メチルアミノ酸、Ｃ”−メチルアミノ酸、Ｎ”−メチルアミノ酸、フルオロアミノ酸及びアミノ酸アナログが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、アミノ酸はＤ（右旋性）又はＬ（左旋性）であることができる。
【０２１８】
特定の実施形態では、本発明のタンパク質の断片及び／又はアナログ、特にペプチド模倣体は、活性の競合的又は非競合的阻害剤としての活性についてスクリーニングされる。
【０２１９】
本発明の別の実施形態では、コンビナトリアルケミストリーを用いてモジュレーターを同定することができる。コンビナトリアル化学は数十万の化合物を含むライブラリーを作成することができ、その多くは構造的に類似している場合がある。ハイスループットスクリーニングプログラムは、これらの巨大なライブラリーを既知の標的に対する親和性についてスクリーニングすることができるとともに、より小さな次元のライブラリーを達成するが、最大の化学的多様性をもたらす新規アプローチが開発されている。（例えば、Ｍａｔｔｅｒ，１９９７，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４０：１２１９−１２２９を参照）。
【０２２０】
従来、コンビナトリアルケミストリーの１つの方法である親和性フィンガープリンティングを使用して、規定されたタンパク質パネルに対する結合親和性のための小分子の別個のライブラリーが試験されていた。スクリーニングによって得られたフィンガープリントを用いて、個々のライブラリーメンバーの、他のタンパク質又は目的の受容体に対する親和性を予測する。フィンガープリントと、目的のタンパク質と反応することが知られている他の化合物から得られたフィンガープリントと比較して、ライブラリー化合物が同様に反応する場合があるかどうかを予測する。例えば、複合体又はタンパク質成分との相互作用について大きなライブラリー中における全てのリガンドを試験するのではなく、その活性を有することが知られている他の化合物と同様のフィンガープリントを有するリガンドのみを試験することができる。（例えば、Ｋａｕｖａｒ外，１９９５，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２：１０７−１１８；Ｋａｕｖａｒ，１９９５，Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ．８：２５−２８及びＫａｕｖａｒ，  Ｔｏｘｉｃ−Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｎｅｗ  Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ａｇｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｄ．Ｋｕｒｔｚ．Ｌ．Ｓｔａｎｋｅｒ  ａｎｄ  Ｊ．Ｈ．Ｓｋｅｒｒｉｔｔ．Ｅｄｉｔｏｒｓ，１９９５，ＡＯＡＣ：Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，３０５−３１２。）。
【０２２１】
Ｋａｙ外，１９９３，Ｇｅｎｅ  １２８：５９−６５（Ｋａｙ）には、従来の任意のライブラリーよりも長い完全にランダムな配列のペプチドをコードするペプチドライブラリーを構築する方法が開示されている。Ｋａｙに開示されたライブラリーは、約２０アミノ酸長を超える完全に合成されたランダムペプチドをコードする。このようなライブラリーは、複合モジュレーターを同定するために有利にスクリーニングできる（１９９６年３月１２日付の米国特許第５，４９８，５３８号及び１９９４年８月１８日付けのＰＣＴ公開第ＷＯ９４／１８３１８も参照）。
【０２２２】
様々のタイプのペプチドライブラリーの包括的な概説がＧａｌｌｏｐ外，１９９４，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３−１２５１に記載されている。
【０２２３】
これらの方法で使用される同系哺乳類細胞の集団としては、典型的には、ＣＤ８陽性Ｔ細胞（すなわち、ＣＤ８抗原を発現するＴ細胞）、ＣＤ４陽性Ｔ細胞（すなわちＣＤ８抗原を発現するＴ細胞）、抗原提示細胞（ＡＰＣ）及び腫瘍細胞が挙げられる。用語「抗原提示細胞」とは、クラスＩＩ  ＭＨＣ分子を構成的に発現し、かつ、ＴＨ細胞に刺激性抗原を提示する細胞をいう。ＡＰＣとして機能する３つの主要クラスの細胞がある。これらのクラスは、マクロファージ、樹状細胞及びＢリンパ球である。樹状細胞は、抗原提示細胞の中で最も強力であり、一次免疫応答の開始に不可欠であると考えられている（例えば、Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９３７及びＧｒａｂｂｅ外（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １６：１１７）。腫瘍細胞は、典型的には多種多様な技術によって同定され、当該技術としては触診、血液分析、Ｘ線、ＮＭＲなどが挙げられるが、これに限定されない。さらに、悪性に関連する遺伝子の発現（例えば、ＰＳＡ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭ及びヒト腺カリクレイン発現）並びに総体的な細胞学的観察といった、癌に関連することが当該技術分野において知られている多種多様な診断因子を利用して腫瘍細胞を同定することができる（Ｂｏｃｋｉｎｇ外，Ａｎａｌ  Ｑｕａｎｔ  Ｃｙｔｏｌ．６（２）：７４−８８（１９８４）；Ｅｐｔｓｅｉｎ，Ｈｕｍ  Ｐａｔｈｏｌ．１９９５  Ｆｅｂ；２６（２）：２２３−９（１９９５）；Ｔｈｏｒｓｏｎ外，Ｍｏｄ  Ｐａｔｈｏｌ．１９９８  Ｊｕｎ；１１（６）：５４３−５１；Ｂａｉｓｄｅｎ外，Ａｍ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｐａｔｈｏｌ．２３（８）：９１８−２４（１９９９））。
【０２２４】
本明細書に開示されるモデル及び方法を使用して、免疫反応におけるＳＬＣの投与がサイトカインプロファイルをどのように調節するか、及び／又は様々な自発性腫瘍の増殖をどのように阻害するかを容易に評価することができる。本発明の好ましい実施形態において、ＳＬＣは、本明細書で実証されるように、サイトカインプロファイルを調節し及び／又は腺癌系統の自発性腫瘍細胞の増殖を阻害するために投与される。当該技術分野で知られているように、腺癌、扁平上皮細胞癌、小細胞癌及び大細胞癌を含めた肺癌の主要な形態は、共通の細胞系統内の分化の連続を表し、多数の腫瘍関連抗原を発現する（例えば、Ｂｅｒｇｅｒ外，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  １９８１  ５３（２）：４２２−４２９及びＮｉｈｏ外，Ｇａｎ  Ｔｏ  Ｋａｇａｋｕ  Ｒｙｏｈｏ  ２００１：２８（１３）：２０８９−９３；Ｏｈｓｈｉｏ外，Ｔｕｍｏｒｉ  １９９５  ８１（１）：６７−７３及びＨａｍａｓａｋｉ外，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００１  ２１（２Ａ）：９７９−９８４）。その結果、共通の系統関係及び抗原プロファイルは、ＳＬＣが肺のこれらの癌（すなわち、腺癌関連肺癌）の増殖に対して非常に類似した効果を及ぼすことの証拠を提供する。
【０２２５】
好ましくは、サイトカイン発現を達成する又は調節するこの方法は、同系哺乳動物細胞の集団におけるインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ、例えば受託番号ＡＡＢ５９５３４及びＰ０１５８０参照）ポリペプチドの発現の増加及び／又は形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β、例えば、受託番号ＡＡＡ５０４０５及びＡＡＫ５６１１６を参照）ポリペプチドの発現の減少を伴う。好ましい方法では、酵素結合免疫吸着（ＥＬＩＳＡ）アッセイによって測定したときに、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）ポリペプチドの発現の増加は少なくとも約２倍であり、形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）ポリペプチドの発現の減少は少なくとも約２倍である。所定の系におけるＳＬＣの効果は、本明細書に記載されるＥＬＩＳＡアッセイに加えて、多数の他の方法で観察できる。例えば、ＳＬＣの効果は、腫瘍増殖又は腫瘍死の阻害を評価し（腫瘍サイズの減少を観察することによって）、及び生存率の増加（本明細書に開示されるトランスジェニックマウスモデルで観察されるときの）などを評価することによって観察できる。
【０２２６】
本明細書に開示されるように、この細胞集団に対するＳＬＣの添加は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、例えば受託番号：２１４４６９２及びｇｉ：６９７０８参照）ポリペプチド、ＩＦＮ−γ（ＭＩＧ、例えば受託番号Ｐ１８３４０及びＱ０７３２５参照）ポリペプチドによって誘導されるモノカイン、  インターロイキン−１２（ＩＬ−１、例えば受託番号ＮＰ＿０３２３７７  ＡＡＤ５６３８５及びＡＡＤ５６３８６参照）ポリペプチド又はＩＦＮ−γ誘導性タンパク質１０（例えば、受託番号Ｐ０２７７８及び  ＡＡＡ０２９６８参照）ポリペプチドの増加；プロスタグランジンＥ（２）ポリペプチド又は血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ、例えば受託番号ＮＰ＿００３３６７及びＮＰ＿０３３５３１参照）ポリペプチドの減少に影響を及ぼす。したがって、好ましい方法としては、ＳＬＣの投与を介してこれらの分子のサイトカインプロファイルの変化を生じさせる方法が挙げられる。このポリペプチド発現の調節は、本明細書で開示されるＥＬＩＳＡアッセイのような遺伝子発現を評価するために当該技術分野で使用される多種多様な方法のいずれか１つによって決定できる。好ましい方法では、ポリペプチドの発現の増加及び／又は減少は、酵素結合免疫吸着（ＥＬＩＳＡ）アッセイによって測定して少なくとも約２倍である。追加のプロファイリング技術は、当該技術分野で公知である（例えば、Ｐｅａｌｅ外，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ  ２００１；１９５（１）：７−１９参照）。
【０２２７】
腫瘍増殖の阻害は、当該技術分野で知られている様々な方法のいずれか１つによって測定できる。好ましくは、同系腫瘍細胞の増殖の阻害は、腫瘍表面積の定量によって測定される。好ましい方法では、同系腫瘍細胞は自発性癌細胞である。本明細書に開示するように、ネズミクララ細胞特異的プロモーター制御下でＳＶ４０の大きなＴＡｇ導入遺伝子を発現するトランスジェニックは、びまん性両側気管支肺胞癌を発症する。このモデルは、本明細書に記載の方法に従って利用することができる当該技術分野において知られている多くの同系癌モデル動物モデルの１つである（Ｈａｋｅｍ外，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｅｔ．２００１；３５：２０９−４１；Ｍｕｎｄｙ  Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２００１  ２８（４  Ｓｕｐｐｌ  １１）：２−８；Ｓｉｌｌｓ外，Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｌｅｔｔ  ２００１  １２０（１−３）：１８８７−１９８；Ｋｉｔｃｈｉｎ，Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２００１；１７２（３）：２４９−６１；及びＤ’Ａｎｇｅｌｏ外，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ  ２０００；  ５０（１−２）：８９−９８）。
【０２２８】
上記に開示した方法において、同系細胞は、様々な方法、例えば、腫瘍内注射を介して哺乳動物にＳＬＣポリペプチドを投与することによって、又はリンパ節内注射によってＳＬＣポリペプチドを哺乳動物に投与することによってＳＬＣに曝露できる。さらに別の投与様式では、ＳＬＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する発現ベクターが哺乳動物に投与され、ＳＬＣポリペプチドは、ＳＬＣポリペプチドをコードする発現ベクターで形質導入された同系哺乳動物細胞によって産生される。
【０２２９】
本発明のさらに別の実施形態は、同系のＣＤ８陽性Ｔ細胞、ＣＤ４陽性Ｔ細胞及び抗原提示細胞の集団における自発的哺乳動物癌細胞の増殖を、癌細胞の増殖を阻害するのに十分な量の二次リンパ組織ケモカイン（ＳＬＣ）ポリペプチドに曝露することによって阻害する方法である。本発明の密接に関連した実施形態は、哺乳類被験体における同系癌を治療する方法であって、ＳＬＣの治療有効量を被験体に投与することを含む。好ましい方法において、ＳＬＣはヒトＳＬＣである。非常に好ましい方法において、ＳＬＣは配列番号１に示されるポリペプチド配列を有する。好ましくは、ＳＬＣポリペプチドは、腫瘍内注射又はリンパ節内注入を介して哺乳動物に投与される。さらに別の投与様式では、ＳＬＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する発現ベクターが哺乳動物に投与され、ＳＬＣポリペプチドは、ＳＬＣポリペプチドをコードする発現ベクターで形質導入された同系哺乳動物細胞によって産生される。非常に好ましい実施形態において、細胞は、ＳＬＣポリペプチドをコードする発現ベクターで形質導入された哺乳動物細胞によって発現するＳＬＣポリペプチドに曝露される。本発明の関連する実施形態は、ＳＬＣポリペプチドをコードする発現ベクターで形質導入された同系宿主細胞からなる。この本発明の態様の非常に好ましい実施形態において、同系宿主細胞は、生体内でＳＬＣポリペプチドをコードする発現ベクターで形質導入されている。
【０２３０】
本発明のさらに別の実施形態は、哺乳動物に二次リンパ組織ケモカイン（ＳＬＣ）を投与することを含む、哺乳動物における癌細胞（最も好ましくは自発性癌細胞）の増殖を阻害する方法である。ここで、ＳＬＣは、形質導入された細胞が癌細胞の増殖を阻害するのに十分な量でＳＬＣポリペプチドを発現するように、配列番号１に示されるＳＬＣをコードするポリヌクレオチドを哺乳動物の細胞に形質導入することによって哺乳動物に投与される。好ましくは、ベクターは、腫瘍内注射によって、又はその代わりにリンパ節内注射によって哺乳動物に投与される。
【０２３１】
本発明のさらに別の実施形態は、哺乳動物細胞に二次リンパ組織ケモカイン（ＳＬＣ）をｅｘ  ｖｉｖｏで投与することを含む、哺乳動物における癌細胞（最も好ましくは自発性癌細胞）の増殖を阻害する方法である。実施例１０に示すように、好ましい実施形態において、ＳＬＣは、形質導入細胞が同系癌細胞の増殖を阻害するのに十分な量のＳＬＣポリペプチドを発現するようにＳＬＣをコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号１に示すＳＬＣ）を哺乳動物の細胞に形質導入することによって哺乳動物に投与される。このような実施形態では、細胞の集団は、当該技術分野で公知の様々な方法のいずれか１つによって哺乳動物から除去できる。典型的には、細胞を腫瘍細胞の近位部位（例えば、腫瘍の部位又は腫瘍の近位のリンパ節）で哺乳動物から取り出し、続いてＳＬＣの投与後に哺乳動物に再導入する（典型的には、腫瘍の部位又は腫瘍の近位のリンパ節などの癌細胞の近位部位に）。
【０２３２】
本発明のこのような一実施形態は、治療有効量のＳＬＣを被験体に投与することを含む、哺乳動物被験体における同系の癌の生体外治療方法であり；ＳＬＣは、配列番号１又は３に示されるＳＬＣポリペプチドをコードする発現ベクターを形質導入した哺乳動物細胞によって発現され、発現ベクターは、哺乳動物被験体に由来するＤＣ細胞に形質導入された後に投与される。
【０２３３】
本発明の関連する実施形態は、治療有効量のＳＬＣを被験体に投与することを含む、哺乳動物被験体における同系の癌を治療する生体外方法であって、このように投与されたＳＬＣは、配列番号１のＳＬＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが形質導入された自己細胞であり；該自己細胞を哺乳動物被験体に投与する方法である。
【０２３４】
本発明のさらに別の実施形態は、配列番号１のＳＬＣポリペプチドをコードするベクターを同系細胞に形質導入し、それによってＳＬＣポリペプチドを同系細胞によって発現させ、及び腫瘍抗原を発現する同系腫瘍細胞の近位に同系細胞を配置することを含む、哺乳動物被験体における抗原提示細胞による生体内腫瘍抗原取り込み及び提示を促進する生体外方法である。同系細胞は自己ＤＣ細胞であることが好ましいが、当該分野で公知の類似の抗原提示細胞の使用も考えられる。
【０２３５】
本発明の別の実施形態は、Ｔリンパ球又は成熟宿主樹状細胞を哺乳類の同系腫瘍（例えば、腺癌）の部位に誘引する方法であって、次の工程：該哺乳動物から樹状細胞を得；該樹状細胞に、配列番号１に示す二次リンパ組織ケモカインをコードする外因性ポリヌクレオチドを導入し（例えば、この配列を含むベクターによる形質導入を介して）、それによって該細胞が二次リンパ組織ケモカインを発現するようにし；その後、このようにして生成された樹状細胞を哺乳類の同系腫瘍の部位に配置する（例えば、腫瘍内注射を介して）ことを含み；その後、該樹状細胞によって発現された二次リンパ組織ケモカインは、Ｔリンパ球又は成熟宿主樹状細胞を、走化性を介して哺乳動物の同系腫瘍の部位に引きつける方法である。実施例１０に示すように、この方法は、生体内で末梢血リンパ球及び樹状細胞の腫瘍部位への有意な走化性を誘発させるために首尾よく使用できる。これに対応して、この方法で処置したマウスの６０％は、この方法で処置した同系腫瘍の完全撲滅を示したが、未修飾又は対照樹状細胞で処置したマウスのわずか１２％しか応答しなかった。この方法には多くの用途がある。例えば、この方法は、治療状況に（例えば、癌に罹患している個体の治療に）適用することができる。さらに、この方法は、免疫監視に関連する様々な生理学的プロセス、特に哺乳動物が癌に応答しなければならない自然の能力を解剖するためのモデルを提供する。さらに、このモデルは、様々な既知の化学療法剤の協調的使用、例えば、特定の化学療法剤が試験管内で末梢血リンパ球及び樹状細胞の腫瘍部位への走化性に関連する免疫応答に対して奏する効果を研究するために使用できる。
【０２３６】
このような方法において、内因性ＳＬＣを発現する自己細胞は、当該技術分野で公知の様々な方法によって哺乳動物被験体に投与できる。好ましくは、内因性ＳＬＣを発現する自己細胞は、腫瘍内注射によって被験体に投与される。あるいは、内因性ＳＬＣを発現する自己細胞は、リンパ節内注射によって被験体に投与される。このような方法は、様々な癌、最も好ましくは腺癌の治療に使用できる。
【０２３７】
本発明の別の実施形態では、ＳＬＣは、標的細胞における生理学的プロセスを調節する（例えば、免疫監視に関連するポリペプチドの発現をアップレギュレートする）のに十分な量のＳＬＣポリペプチドとして投与され、このように調節された生理学的プロセスは、標的細胞の同系癌細胞の増殖の阻害を促進する。
【０２３８】
本発明の他の実施形態は、病理学的状態を有する哺乳動物に投与するためのＳＬＣ組成物を製造することによって、癌を含む病理学的状態を治療するための薬剤の製造方法を含む。関連する方法は、癌の治療のための医薬の製造における有効量のＳＬＣの使用であり、癌細胞は同系癌細胞である。このような方法は、典型的には、上記のサイトカインプロファイルを調節し及び／又は生体内での同系（好ましくは自発的）癌細胞の増殖を阻害するのに十分な量のＳＬＣと、生理学的に許容されるキャリアの適切な量とを含める工程を伴う。当該技術分野で知られているように、場合により他の薬剤をこれらの製剤に含めることができる。
【０２３９】
この出願を通して、様々な刊行物を参照する（例えば括弧内）。これらの刊行物の開示は、参照によりその全体を本明細書で援用する。例えば、本明細書に開示される本発明で使用される方法に関連する所定の一般的方法は、国際特許出願公開第ＷＯ００／３８７０６号に記載されており、その内容は参照により本明細書で援用する。本発明の様々な典型的な態様の理解を容易にするために、これらの援用された材料の所定の態様をここに再現する。
【０２４０】
本発明は、本発明の個々の態様の単なる例示を目的とする本明細書に開示される実施形態によって範囲が限定されるべきものではなく、機能的に均等なもののいずれも本発明の範囲内にある。本明細書に記載されたものに加えて、本発明のモデル及び方法に対する様々な改変は、当業者であれば上記の説明及び教示から明らかになるであろうし、同様に本発明の範囲内にあると考えられる。このような改変又は他の実施形態は、本発明の真の範囲及び精神から逸脱することなく実施できる。ただし、本発明は、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０２４１】
実施例１：同系移植性腫瘍モデルでＳＬＣなどの免疫調節性分子を検査するための方法及び材料
【０２４２】
１．細胞培養及び腫瘍形成モデル
生体内での抗腫瘍応答の評価のために、２種の弱免疫原性肺癌、ライン１肺胞癌（Ｌ１Ｃ２、Ｈ−２ｄ）及びルイス肺癌（３ＬＬ、Ｈ−２ｂ）を利用した。これらの細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｃａｌａｂａｓａｓ、ＣＡ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン、２ｍＭグルタミン（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎｔａ  Ａｎａ、ＣＡ）を含む２５ｃｍ3組織培養フラスコ中で単層として従来通り培養し、空気中５％ＣＯ2を含む加湿雰囲気中で３７℃に維持した。細胞系はマイコプラズマ無添加であり、細胞を、液体Ｎ２から凍結ストック細胞を解凍する前に１０継代まで使用した。腫瘍形成実験のために、１０5個の３ＬＬ又はＬ１Ｃ２腫瘍細胞に、Ｃ５７ＢＬ／６又はＢＡＬＢ／ｃマウスの右上顎尖部領域に皮下注射によって接種し、腫瘍体積を週に３回監視した。５日齢の確立腫瘍を０．５μｇのネズミ組換えＳＬＣ又はＰＢＳ希釈液（Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ）の腫瘍内注射により２週間にわたって週３回処置した。製造業者によって報告されたエンドトキシンレベルは、＜０．１ｎｇ／μｇ（１ＥＵ／μｇ）のＳＬＣであった。注射に使用されたＳＬＣの量（０．５μｇ）は、製造業者によって提供された試験管内生物活性データによって決定された。総ネズミＴ細胞についてのＳＬＣの最大走化活性は１００ｎｇ／ｍｌであった。ＳＬＣ仲介性抗腫瘍特性の生体内評価のために、出願人は、各腫瘍内注射に対してこの量よりも５倍多く利用した。同量のマウス血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を対照注射用の無関係なタンパク質として利用した腫瘍形成実験も行った。腫瘍接種時にＳＬＣを投与する実験も行った。ＳＬＣ投与後の抗腫瘍応答を仲介する際の免疫系の重要性を決定するために、ＳＣＩＤベージュＣＢ１７マウスにおいて腫瘍形成実験を行った。ＳＬＣを腫瘍接種の時点で、続いて週に３回皮下注射により投与した。ＣＤ４及びＣＤ８ノックアウトマウスを利用して、腫瘍撲滅におけるＣＤ４及びＣＤ８細胞の寄与を決定した。各腫瘍の２つの二等分線直径をキャリパーで測定した。容積は、式（０．４）（ａｂ２）を用いて計算し、ここでａはより大きい直径であり、ｂはより小さな直径である。
【０２４３】
２．腫瘍結節、リンパ節及び脾臓からのサイトカイン決定
腫瘍、リンパ節及び脾臓におけるサイトカインプロファイルを、以前に記載されたように（Ｓｈａｒｍａ外，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：５０２０）ＳＬＣ及び希釈剤処置マウスの両方で測定した。非壊死性腫瘍を採取し、小片に切断し、ふるい（Ｂｅｌｌｃｏ  Ｇｌａｓｓ、Ｖｉｎｅｌａｎｄ、ＮＪ）を通過させた。腫瘍排出性リンパ節及び脾臓を、ＳＬＣ処置腫瘍保有腫瘍、対照腫瘍保有マウス及び正常対照マウスから採取した。リンパ節と脾臓とを解きほぐし、ＲＢＣを二重蒸留水で枯渇させ、１×ＰＢＳで張性にした。腫瘍結節について、一晩培養した後の上清中においてＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＴＧＦ−β、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＩＦＮ−γ（ＭＩＧ）によって誘導されるモノカインの産生、並びにＥＬＩＳＡによりＩＰ−１０及び酵素免疫測定法（ＥＩＡ）によりＰＧＥ２について評価した。腫瘍由来サイトカイン及びＰＧＥ２濃度をブラッドフォードアッセイ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）により総タンパク質に対して補正した。照射腫瘍細胞（５×１０6細胞／ｍｌ）による二次刺激後のサイトカイン測定のために、脾臓又はリンパ節由来のリンパ球を５ｍｌの総容量で照射３ＬＬ（１０5細胞／ｍｌ）と共に５０：１の比で共培養した。一晩培養した後に上清を回収し、ＥＬＩＳＡによってＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２及びＩＬ−１０を決定した。
【０２４４】
３．サイトカインＥＬＩＳＡ
腫瘍結節、リンパ節及び脾臓由来のサイトカインタンパク質濃度を、以前に記載されたように（Ｈｕａｎｇ外，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：１２０８）ＥＬＩＳＡによって決定した。簡潔に説明すると、９６ウェルＣｏｓｔａｒ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）プレートを、測定されるサイトカインに対する４μｇ／ｍｌの適切な抗マウスｍＡｂで一晩被覆した。このプレートのウェルをＰＢＳ中の１０％ウシ胎仔血清（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）で３０分間ブロックした。次いで、プレートをＡｇと共に１時間インキュベートし、過剰のＡｇをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗い流した。プレートを適切なサイトカインに対する２μｇ／ｍｌのビオチン化ｍＡｂ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）と共に３０分間インキュベートし、そして過剰のＡｂをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗い流した。プレートをアビジンペルオキシダーゼと共にインキュベートし、ＯＰＤ基質中で所望の消光までインキュベートした後、その後の色の変化をＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いて４９０ｎｍで読み取った。アッセイの標準物質として使用された組換えサイトカインはＰｈａｒＭｉｎｇｅｎから得た。ＩＬ−１２（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）及びＶＥＧＦ（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）を製造者の指示に従ってキットにより決定した。ＭＩＧ及びＩＰ−１０を、以前に記載されたような二重リガンド法の改変によって定量した（Ｓｔａｎｄｉｆｏｒｄ外，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８６：１９４５）。ＭＩＧ及びＩＰ−１０抗体及びタンパク質は、Ｒ＆Ｄ（ミネソタ州ミネアポリス）から入手した。  ＩＬ−１０、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＴＧＦ−β、ＭＩＧ及びＩＰ−１０  ＥＬＩＳＡの感受性は１５ｐｇ／ｍｌであった。ＩＬ−１２及びＶＥＧＦについて、感受性は５μｇ／ｍｌであった。
【０２４５】
４．ＰＧＥ２  ＥＩＡ
ＰＧＥ  ２濃度を、以前に記載されたように（Ｈｕａｎｇ外，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：１２０８）、メーカーの指示に従ってＣａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）製のキットを用いて決定した。ＥＩＡプレートをＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒで読み取った。
【０２４６】
５．細胞溶解実験
細胞溶解活性を以前に記載されているように評価した（Ｓｈａｒｍａ外，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：５０２０）。照射された腫瘍細胞による二次刺激後の腫瘍細胞溶解を定量するために、ＳＬＣ処置及び希釈剤腫瘍保持マウスからのリンパ節由来リンパ球（５×１０6細胞／ｍｌ）を、照射３ＬＬ（１０5細胞／ｍｌ）と共に５ｍｌの総体積中において５０：１の比で培養した。５日間の培養後、リンパ節由来リンパ球の溶解能を、９６ウェルプレートにおいて様々なＥ：Ｔでクロム標識した（５１Ｃｒ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ、Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ；ｓｐ．ａｃｔ．２５０−５００ｍＣｉ／ｍｇ）３ＬＬ標的に対して４時間にわたって決定した。５％トリトンＸによる自然放出及び最大放出も評価した。４時間のインキュベーション後に上清を除去し、ガンマカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）で活性を測定した。％特異的溶解を次式：％溶解＝１００×（実験ｃｐｍ−自然放出）／（最大放出−自然放出）によって算出した。
【０２４７】
６．フローサイトメトリー
フローサイトメトリー実験のために、２種又は３種の蛍光色素（ＰＥ、ＦＩＴＣ及びＴｒｉ−ｃｏｌｏｒ）（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を使用して腫瘍結節単一細胞懸濁液のＣＤ３  Ｔリンパ球集団をゲートした。ＤＣを、腫瘍結節及びリンパ節内のＣＤ１１ｃ及びＤＥＣ２０５の明るい集団として定義した。順方向及び側方散乱プロファイルに基づいてゲーティングすることにより、細胞をリンパ球又はＤＣとして同定した。フローサイトメトリー分析は、カリフォルニア大学ロサンゼルス校のＪｏｎｓｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｃｏｒｅ  ＦａｃｉｌｉｔｙのＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で行った。５，０００〜１５，０００個のゲートイベントを収集し、Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析した。
【０２４８】
７．細胞内サイトカイン分析
ＳＬＣ処置及び希釈剤処置３ＬＬ腫瘍保有マウスの腫瘍結節及びリンパ節の単一細胞懸濁液からのＴリンパ球を、蒸留し脱イオンしたＨ2ＯでＲＢＣを枯渇させ、細胞質内ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮ−γの存在について評価した。細胞懸濁液を、製造者の指示に従ってタンパク質輸送阻害剤キットＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）で処理した。細胞を採取し、２％ＦＢＳ−ＰＢＳで２回洗浄した。細胞（５×１０5）を、細胞表面抗原であるＣＤ３、ＣＤ４及びＣＤ８に特異的な０．５μｇのＦＩＴＣ結合ｍＡｂと共に２００μｌの２％ＦＢＳ−ＰＢＳ中に４℃で３０分間再懸濁した。２％ＦＢＳ−ＰＢＳで２回洗浄した後に細胞を固定し、透過処理し、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍキット（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を用いて製造業者のプロトコールに従って洗浄した。細胞ペレットを１００μｌのＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ溶液に再懸濁し、細胞内染色のために０．２５μｇのＰＥ結合抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体及び抗ＩＦＮ−γｍ抗体で染色した。細胞を暗所において室温で３０分間インキュベートし、２回洗浄し、３００μｌのＰＢＳ、２％パラホルムアルデヒド溶液に再懸濁し、そしてフローサイトメトリーで分析した。
【０２４９】
典型的なＳＬＣポリペプチド
以下の表４は、例示的なヒト及びネズミＳＬＣポリペプチド配列を与える。
【０２５０】
【表３】
2017538680.tif 000009
【０２５１】
実施例２：例示的な分子としてＳＬＣを使用した同系移植性腫瘍モデルにおける免疫調節性分子の試験
ここで与える開示は、２種の同系移植マウス肺癌モデルを利用してＳＬＣの抗腫瘍特性を試験する。いずれのモデルにおいても、腫瘍内ＳＬＣ投与は、希釈剤処置腫瘍保有対照マウス（ｐ＜０．０１）と比較して腫瘍体積の有意な減少をもたらし、４０％のマウスが完全な腫瘍撲滅を示した（図１Ａ及びＤ）。腫瘍体積の減少がＬ１Ｃ２及び３ＬＬに及ぼすＳＬＣの直接的な影響に起因するかどうかを決定するために、腫瘍細胞の試験管内増殖をＳＬＣの存在下で評価した。１２ウェルＣｏｓｔａｒプレートに播種された１０5個のＬ１Ｃ２細胞及び３ＬＬ細胞にＳＬＣ（２００ｎｇ／ｍｌ）を添加し、細胞数を３日間にわたって毎日モニターした。ＳＬＣはこれらの腫瘍細胞の生体内増殖速度を変化させなかった。
【０２５２】
ＳＬＣ仲介性抗腫瘍応答における宿主免疫の役割を評価するために、腫瘍を有するＳＣＩＤベージュＣＢ１７マウスにＳＬＣを腫瘍内注射した。ＳＬＣ投与はＳＣＩＤマウスの腫瘍体積を変化させなかった（図１Ｅ）。同様に、ＣＤ４及びＣＤ８ノックアウトマウスでは、ＳＬＣは腫瘍体積を減少させることができなかったが、これは、ＳＬＣ仲介性抗腫瘍応答がＣＤ４及びＣＤ８依存性であることを示す（図１Ｂ及びＣ）。
【０２５３】
腫瘍の進行は、宿主サイトカインプロファイル（Ａｌｌｅｖａ外，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：１６７４；Ｒｏｈｒｅｒ外，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：５７１９）によって改変される場合があるため、腫瘍内ＳＬＣ投与後の腫瘍結節からのサイトカイン産生を調べた。次のサイトカインを測定した：ＶＥＧＦ、ＩＬ−１０、ＰＧＥ２、ＴＧＦ−β、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、ＭＩＧ及びＩＰ−１０（表１Ａ）。これらのサイトカインの産生は、以下の理由で評価した。腫瘍部位は、ＰＧＥ−２、ＶＥＧＦ、ＩＬ−１０及びＴＧＦ−βの豊富な供給源であることが証明されており、腫瘍部位におけるこれらの分子の存在は免疫応答を抑制することが示されている（Ｈｕａｎｇ外，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：１２０８；Ｂｅｌｌｏｎｅ外，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５５：５３７；Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ外，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：１０９６）。また、ＶＥＧＦ、ＰＧＥ２及びＴＧＦ−βは、以前に、血管新生を促進することが証明されている（Ｆａｊａｒｄｏ外，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７４：６００；Ｆｅｒｒａｒａ外，Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．３６：１２７；２８；Ｔｓｕｊｉｉ外，Ｃｅｌｌ  ９３：７０５）。ＶＥＧＦ、ＴＧＦ−β、ＰＧＥ−２及びＩＬ−１０に対する抗体は、生体内モデル系において腫瘍増殖を抑制する能力を有する。ＶＥＧＦはＤＣの成熟を妨げることも示されている（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ外，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：１０９６）。ＩＬ−１０及びＴＧＦβの両方は、抗原提示を強力に抑制し、ＣＴＬ生成及びマクロファージ活性に拮抗することのできる免疫抑制性サイトカインであるため、腫瘍が免疫検出を免れることを可能にする（Ｓｈａｒｍａ外，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：５０２０；Ｂｅｌｌｏｎｅ外，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５５：５３７）。ＳＬＣで腫瘍内処置したマウスは、希釈剤処置腫瘍保有対照からの腫瘍結節と比較して、ＰＧＥ２（３．５倍）、ＶＥＧＦ（４倍）、ＩＬ−１０（２倍）及びＴＧＦ−β（２．３倍）が有意に減少した（表１Ａ）。ＳＬＣ投与後の腫瘍部位におけるＩＬ−１０及びＴＧＦβの全体的な減少は、抗原提示及びＣＴＬ生成を促進した可能性がある。ＳＬＣ投与後の腫瘍部位におけるＶＥＧＦ及びＴＧＦ−βの減少は、血管新生の阻害に寄与した可能性がある。これに対し、ＳＬＣ投与後には、ＩＦＮ−γ（５倍）、ＧＭ−ＣＳＦ（１０倍）、ＩＬ−１２（２倍）、ＭＩＧ（６．６倍）及びＩＰ−１０（２倍）が有意に減少した（表１Ａ）。
【０２５４】
ＩＬ−１２は１型サイトカインの重要な誘導物質であるが、ＩＦＮ−γは細胞仲介性免疫を促進する１型サイトカインである。ＩＬ−１２の増加（２倍）は、ＳＬＣ処置マウスの腫瘍部位におけるＩＦＮ−γの相対的増加（５倍）を説明することができた（表１Ａ）。この研究に用いた腫瘍細胞は検出可能なレベルのＩＬ−１２を作らない。したがって、本発明者は、マクロファージ及びＤＣが腫瘍部位におけるＩＬ−１２の主要な供給源であること推測する。
【０２５５】
ＭＩＧ及びＩＰ−１０は、ＩＦＮ−γによって誘導される強力な血管新生抑制因子であり、部分的にはＩＬ−１２仲介性腫瘍の縮小に関与する場合がある（Ｓｔｒｉｅｔｅｒ外，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２１０：５１；Ｔａｎｎｅｎｂａｕｍ外，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：９２７；Ａｒｅｎｂｅｒｇ外，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：９８１）。したがって、ＳＬＣ処置マウスの腫瘍部位におけるＩＦＮ−γの増加は、ＭＩＧ（６．６倍）及びＩＰ−１０（２倍）の相対的増加を説明することができた（表１Ａ）。ＭＩＧとＩＰ−１０の両方は、刺激されたＣＸＣＲ３発現Ｔリンパ球に対して走化性であり、また、これは、腫瘍部位でＩＦＮ−γを増加させる可能性もある（Ｆａｒｂｅｒ外，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌ．６１：２４６）。ＳＬＣ処置マウスの腫瘍結節におけるＧＭ−ＣＳＦの増加（１０倍）は、ＤＣ成熟及び抗原提示を増強する可能性がある（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ外，Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：２４５）。
【０２５６】
現在の結果に基づけば、免疫抑制サイトカインの減少及び１型サイトカインの付随的増加は、腫瘍結節内に存在する細胞に及ぼすＳＬＣの直接的な効果の可能性がある。あるいは、これらの変化は、ＳＬＣ補充Ｔ細胞及びＤＣの結果の可能性がある。この問題に取り組むために、試験管内でＳＬＣに応答した腫瘍及びリンパ節由来細胞からの１型及び免疫抑制性サイトカインの産生を評価した。腫瘍細胞（１×１０6）又はリンパ節由来細胞（５×１０6）をサイトカイン測定のためにＳＬＣ（２００ｎｇ／ｍｌ）と２４時間共培養した。ＳＬＣは、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１０又はＰＧＥ−２の腫瘍細胞産生に影響を与えなかった。対照未処置リンパ節細胞と比較して、ＳＬＣは、試験管内培養で一晩、リンパ節由来ＩＬ−１２を有意に増加させた（２８８±１５ｐｇ／ｍｌ対４００±７ｐｇ／ｍｌ）のに対し、ＩＬ−１０（１１０±５ｐｇ／ｍｌ対６７±１ｐｇ／ｍｌ）、ＰＧＥ２（２１０±４ｐｇ／ｍｌ対７０±２ｐｇ／ｍｌ）及びＴＧＦ−β（２５８±９ｐｇ／ｍｌ対１５８±７ｐｇ／ｍｌ）の産生を減少させた。ＳＬＣは、試験管内でＩＦＮ−γ及びＧＭ−ＣＳＦのリンパ節由来リンパ球産生を変化させなかった。ＳＬＣは抗血管新生効果を有することが証明されているので（Ｓｏｔｏ外，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：８２０５；Ａｒｅｎｂｅｒｇ外，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１５９：Ａ７４６）、これらのモデルで観察された腫瘍の減少は、Ｔ細胞依存性免疫並びに血管新生の阻害におけるＴ細胞の関与によるものである可能性がある（Ｔａｎｎｅｎｂａｕｍ外，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：９２７）。ＳＬＣ投与後の免疫抑制性サイトカインの減少及び１型サイトカインの増加に重要な細胞型及びタンパク質を描き出すためには、さらなる研究が必要であろう。
【０２５７】
ＳＬＣに応答した腫瘍結節中のＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮ−γの増加がこれらのサイトカインを分泌するＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞サブセットの頻度の増加によって説明できるかどうかを決定するために、フローサイトメトリー分析を行った。細胞表面マーカーＣＤ４又はＣＤ８に対して陽性に染色されたＣＤ３  Ｔ細胞を、腫瘍結節からの単一細胞懸濁液で評価した。ゲートされたＴリンパ球集団内のＳＬＣ処置マウスの腫瘍結節では、希釈剤処置マウスと比較してＣＤ４及びＣＤ８  Ｔリンパ球の頻度が有意に増加した（それぞれ２５及び３３％対１５％及び１１％；ｐ＜０．０１）。腫瘍部位及びリンパ節におけるＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞のＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮ−γプロファイルを細胞質内染色によって決定した。ＳＬＣ投与により、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮ−γを分泌する腫瘍結節及びリンパ節からのＣＤ４及びＣＤ８  Ｔリンパ球の頻度が増加した（表２Ａ）。
【０２５８】
ＤＣは、免疫応答の開始に関与する独特の強力なＡＰＣであり、ＳＬＣが成熟ＤＣを強く引きつけることが十分に実証されている（Ｃｈａｎ外，Ｂｌｏｏｄｈｅｒｅ  ９３：３６１０；Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ外，Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：２４５）。腫瘍内ＳＬＣ投与により腫瘍が有意に縮小したため、腫瘍内ＳＬＣ投与により腫瘍結節及びリンパ節のＤＣ浸潤が促進されるかどうかが疑われた。ＤＣ表面マーカーＣＤ１１ｃ及びＤＥＣ２０５に対して、ＳＬＣ及び希釈剤処置腫瘍保有マウス由来の腫瘍結節及びリンパ節の単一細胞懸濁液を染色した。ＳＬＣ処置腫瘍保有マウスでは、希釈剤処置３ＬＬ保有腫瘍と比較して、腫瘍結節及びリンパ節におけるＣＤ１１ｃ及びＤＥＣ２０５の細胞表面染色についてＤＣの頻度及び平均チャネル蛍光強度の両方が増加した（表２Ａ）。これらの知見は、腫瘍内ＳＬＣ投与が腫瘍部位にＤＣを効果的に動員したことを示している。
【０２５９】
次に、腫瘍内ＳＬＣ投与が有意な全身免疫反応を誘導するかどうかを検討した。この問題に対処するために、ＳＬＣ及び希釈剤で処置した腫瘍を有するマウスからのリンパ節及び脾細胞を２４時間にわたって照射腫瘍細胞と共培養し、そしてＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０及びＩＬ−１２レベルをＥＬＩＳＡで決定した。照射腫瘍細胞による二次刺激の後に、ＳＬＣ処置腫瘍保有マウスからの脾細胞及びリンパ節由来細胞は、有意に増加したレベルのＩＦＮ−γ（１３倍〜２８倍）、ＧＭ−ＣＳＦ（３倍脾臓のみ）及びＩＬ−１２（１．３〜４倍）を分泌した。対照的に、ＩＬ−１０分泌は、ＳＬＣ処置マウスにおいて減少した（６〜９倍）（表３Ａ）。さらに、腫瘍内ＳＬＣ投与により、親腫瘍細胞に対するリンパ節由来リンパ球細胞溶解活性が増強された（図２）。本発明者は、ＳＬＣがＳＣＩＤマウスの腫瘍増殖に影響を与えなかったので、細胞溶解実験におけるエフェクター細胞集団の表現型がＣＤ８＋Ｔリンパ球であると推測する。しかしながら、ＣＤ４及びＣＤ８ノックアウトマウスを利用した腫瘍形成実験から、効果的な腫瘍縮小のためにはＣＤ４及びＣＤ８  Ｔリンパ球サブセットが重要であることが示されている。ＣＤ４  Ｔリンパ球は、細胞溶解性エフェクターとしても働くことができるので（Ｓｕｎ外，Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９５：８１；Ｓｅｍｉｎｏ外，Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９６：８７）、ＳＬＣ仲介性腫瘍減少におけるＣＤ４  Ｔリンパ球の役割を描き出すためにはさらなる研究が必要となるであろう。
【０２６０】
この研究の結果は、腫瘍内ＳＬＣ投与により腫瘍結節及びＴ細胞依存性腫瘍拒絶反応内におけるＤＣ及びＴリンパ球が共局在することを示す。これらの知見は、腫瘍免疫におけるＳＬＣのさらなる評価及び癌免疫療法におけるその使用のための強力な理論的根拠を提供する。
【０２６１】
実施例３：自然発生腫瘍モデルにおけるＳＬＣなどの免疫調節性分子を検査するための方法及び材料
１．細胞培養
１０％ＦＢＳ（ＧｅｍｉｎｉＢｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｃａｌａｂａｓａｓ、ＣＡ）、ペニシリン（１００単位／ｍｌ）、ストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍｌ）及び２ｍＭグルタミン（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎｔａ  Ａｎａ、ＣＡ）で増殖させた新たに切除した肺腫瘍からクララ細胞肺腫瘍細胞（ＣＣ−１０タグ及びＨ−２ｑ）から誘導し、空気中５％ＣＯ2を含む加湿雰囲気において３７℃で維持した。２回の生体内継代後に、ＣＣ−１０  ＴＡｇ腫瘍クローンを単離した。細胞株はマイコプラズマフリーであり、液体窒素から凍結ストック細胞を解凍する前に細胞を１０継代まで使用した。
【０２６２】
２．  ＣＣ１０ＴＡｇマウス
これらの研究では、ＳＶ４０ｌａｒｇｅ  ＴＡｇがネズミクララ細胞特異的プロモーターの制御下で発現するトランスジェニックＣＣ−１０  ＴＡｇマウスを使用した（Ｍａｇｄａｌｅｎｏ外，Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．，８：１４５−１５５，１９９７）。導入遺伝子を発現する全てのマウスは、びまん性両側気管支肺胞癌を発症した。腫瘍は、４週齢程度の早い段階で顕微鏡検査によって両側的に明らかであった。３ヵ月後、腫瘍増殖の気管支肺胞パターンが合体して、複数の両側性腫瘍結節を形成した。ＣＣ−１０  ＴＡｇトランスジェニックマウスの平均寿命は４ヶ月であった。胸腔内転移は認められなかった。これらのマウスの繁殖ペアは、寛大にもＦｒａｎｃｅｓｃｏ  Ｊ．ＤｅＭａｙｏ（Ｂａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、ＴＸ、Ｈｏｕｓｔｏｎ）によって提供された。トランスジェニックマウスをＷｅｓｔ  Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ  Ｖｅｔｅｒａｎ  Ａｆｆａｉｒｓ動物施設で飼育し、動物研究施設で維持した。ＣＣ−１０  ＴＡｇトランスジェニックマウスを用いた各実験の前に、導入遺伝子の存在をマウス尾生検のＰＣＲによって確認した。５’プライマー配列は、ＳＭ１９−ＴＡＧ：５’−ＴＧＧＡＣＣＴＴＣＴＡＧＧＴＣＴＴＧＡＡＡＧＧ−３’（配列番号３）であり、３’プライマー配列は、ＳＭ３６−ＴＡＧ：５’−ＡＧＧＣＡＴＴＣＣＡＣＣＡＣＴＧＣＴＣＣＣＡＴＴ−３’（配列番号４）であった。得られたＰＣＲフラグメントのサイズは６５０ｂｐである。１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、２００μＭの各デオキシヌクレオチドトリホスフェート、０．１μＭのプライマー、２．５ｍＭのＭｇＣｌ2及び２．５単位のＴａｑポリメラーゼを含有する総容量５０μｌでＤＮＡ（１μｇ）を増幅させた。ＰＣＲはＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製ＤＮＡサーマルサイクラー（Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）で行った。ＳＶ４０導入遺伝子についての増幅プロファイルは、９４℃で３分間の変性、５８℃で１分間のアニーリング、７２℃で１分間の伸長の４０サイクル、続いて９４℃で１分間の変性及び同じアニーリング及び伸長条件の３９サイクルからなるものであった。最後のサイクルの伸長工程は１０分であった。増幅後、臭化エチジウムで染色した１．５％アガロースゲル上で生成物を分子量基準に対して視覚化した。全ての実験では、病原体を含まないＣＣ−１０  ＴＡｇトランスジェニックマウスを４〜５週齢で使用した。
【０２６３】
３．ＣＣ−１０  ＴＡｇマウスにおけるＳＬＣ治療モデル
ＣＣ−１０  ＴＡｇトランスジェニックマウスの腋窩リンパ節に、ネズミ組換えＳＬＣ（０．５μｇ／注射；Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ）又は等量のマウス血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、ミズーリ州セントルイス）を対照注射のための無関係のタンパク質として含有する通常の生理食塩水希釈剤を注射した。４〜５週齢から始めて、ＳＬＣ又は対照注射液を８週間にわたって週に３回投与した。製造業者によって報告されたエンドトキシンレベルは、ＳＬＣの＜０．１ｎｇ／μｇ（１エンドトキシン単位／μｇ）であった。ＳＬＣの用量は（０．５μｇ／注射）を、本発明者の以前の研究（Ａｒｅｎｂｅｒｇ外，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：９８１）及び製造業者によって提供された試験管内生体活性データに基づいて選択した。総ネズミＴ細胞についてのＳＬＣの最大走化活性は１００ｎｇ／ｍｌであることが分かった。ＳＬＣ仲介性抗腫瘍特性の生体内評価のために、各注射についてこの量よりも５倍多く使用した。４ヶ月後にマウスを屠殺し、肺を腫瘍表面積の定量のために単離した。腫瘍負荷は、較正された目盛り（１ｃｍ2の格子を１００個の１ｍｍ２の正方形に細分した）でＨ＆Ｅ染色切片の顕微鏡検査によって評価した。腫瘍がその面積の＞５０％を占めるグリッド正方形を陽性としてスコア化し、陽性の正方形の総数を以前に記載されたように決定した（Ｓｈａｒｍａ外，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６３：５０２０−５０２８，１９９９）。肺の４つの組織学的切片からの１０個の別々の視野を高倍率（×２０対物レンズ）で検査した。各群の１０匹のマウスを屠殺しなかったので、生存を評価することができた。
【０２６４】
４．腫瘍結節、リンパ節及び脾臓からのサイトカイン決定
腫瘍、リンパ節及び脾臓におけるサイトカインプロファイルを、以前に記載されたように（Ｓｈａｒｍａ外，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６３：５０２０−５０２８，１９９９）ＳＬＣ及び希釈剤処置マウスの両方で測定した。非壊死性腫瘍を採取し、小片に切断し、ふるい（Ｂｅｌｌｃｏ、Ｖｉｎｅｌａｎｄ、ＮＪ）を通過させた。腋窩リンパ節及び脾臓を、ＳＬＣ処置腫瘍保有マウス、対照腫瘍保有マウス及び正常対照マウスから採取した。リンパ節及び脾臓を解きほぐし、ＲＢＣをｄｄＨ2Ｏで枯渇させ、１×ＰＢＳで張性にした。２４時間の培養期間後に、腫瘍小結節の上澄をＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＴＧＦ−β、ＶＥＧＦ、ＭＩＧ及びＩＰ−１０の産生についてＥＬＩＳＡによって評価し及びＥＩＡによってＰＧＥ−２の産生について評価した。腫瘍由来サイトカイン及びＰＧＥ−２濃度をブラッドフォードアッセイ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）により全タンパク質について補正した。照射腫瘍細胞による二次刺激後のサイトカイン測定のために、脾臓細胞（５×１０6細胞／ｍｌ）を照射（１００Ｇｙ、Ｃｓ137Ｘ線）ＣＣ−１０  ＴＡｇ腫瘍細胞（１０5細胞／ｍｌ）と共に全量５ｍｌにおいて５０：１の比で共培養した。２４時間培養した後に上清を回収し、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−１０をＥＬＩＳＡによって決定した。
【０２６５】
５．サイトカインＥＬＩＳＡ
腫瘍結節、リンパ節及び脾臓由来のサイトカインタンパク質濃度を、以前に記載されているように（Ｓｈａｒｍａ外，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，４：１３６１−１３７０，１９９７）ＥＬＩＳＡによって決定した。簡潔に説明すると、９６ウェルＣｏｓｔａｒ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）プレートを、測定されるサイトカインに対する４μｇ／ｍｌの適切な抗マウスｍＡｂで一晩被覆した。プレートのウェルをＰＢＳ中１０％ＦＢＳ（ジェミニバイオプロダクツ社）で３０分間ブロックした。次いで、プレートを抗原と共に１時間にわたってインキュベートし、過剰の抗原をＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０で洗い流した。プレートを適切なサイトカインに対する２μｇ／ｍｌビオチン化ｍＡｂ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）と３０分間インキュベートし、余分な抗体をＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０で洗い流した。プレートをアビジンペルオキシダーゼと共にインキュベートし、Ｏ−フェニレンジアミン基質中で所望の消光までインキュベートした後、後の色の変化をＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いて４９０ｎｍで読み取った。アッセイにおいて基準物質として使用された組換えサイトカインはＰｈａｒＭｉｎｇｅｎから得た。ＩＬ−１２（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）及びＶＥＧＦ（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、マサチューセッツ州ケンブリッジ）を、製造者の指示に従ってキットを用いて決定した。ＭＩＧ及びＩＰ−１０を、以前に記載されているような二重リガンド法の改変を用いて定量した（Ｓｔａｎｄｉｆｏｒｄ外，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．，８６：１９４５−１９５３，１９９０）。ＭＩＧ及びＩＰ−１０の抗体及びタンパク質をＲ＆Ｄ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から得た。ＩＬ−１０、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＴＧＦ−β、ＭＩＧ及びＩＰ−１０のＥＬＩＳＡ感受性は１５ｐｇ／ｍｌであった。ＩＬ−１２及びＶＥＧＦについて、ＥＬＩＳＡ感受性は５μｇ／ｍｌであった。
【０２６６】
５．ＰＧＥ２  ＥＩＡ
ＰＧＥ２濃度を、以前に記載されているように（Ｈｕａｎｇ外，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５８：１２０８−１２１６，１９９８）メーカーの指示に従ってＣａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）製のキットを用いて決定した。ＥＩＡプレートを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅリーダー（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）によって読み取った。
【０２６７】
６．フローサイトメトリー
フローサイトメトリー実験のために、２種又は３種の蛍光色素（ＰＥ、ＦＩＴＣ及びＴｒｉ−ｃｏｌｏｒ）（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を使用して腫瘍結節、リンパ節及び脾臓単一細胞懸濁液のＣＤ３  Ｔリンパ球集団をゲートした。ＤＣを、腫瘍結節、リンパ節及び脾臓内のＣＤ１１ｃ及びＤＥＣ２０５の明るい集団として定義した。順方向及び側方散乱プロファイルに基づいてゲーティングすることにより、細胞をリンパ球又はＤＣとして同定した。フローサイトメトリー分析は、カリフォルニア大学ロサンゼルス校のＪｏｎｓｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｃｏｒｅ  ＦａｃｉｌｉｔｙのＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で行った。５，０００〜１５，０００個のゲートイベントを収集し、Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析した。
【０２６８】
７．細胞内サイトカイン分析
ＳＬＣ処置及び希釈剤処置ＣＣ−１０  ＴＡｇトランスジェニックマウスの腫瘍結節、リンパ節及び脾臓の単一細胞懸濁液からのＴリンパ球を、蒸留し脱イオンしたＨ2ＯでＲＢＣを枯渇させ、細胞質内ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮ−γの存在について評価した。細胞懸濁液を、製造者の指示に従ってタンパク質輸送阻害剤キットＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）で処理した。細胞を採取し、２％ＦＢＳ−ＰＢＳで２回洗浄した。細胞（５×１０5）を、細胞表面抗原であるＣＤ３、ＣＤ４及びＣＤ８に特異的な０．５μｇのＦＩＴＣ結合ｍＡｂと共に２００μｌの２％ＦＢＳ−ＰＢＳ中に４℃で３０分間再懸濁した。２％ＦＢＳ−ＰＢＳで２回洗浄した後に細胞を固定し、透過処理し、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍキット（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を用いて製造業者のプロトコールに従って洗浄した。細胞ペレットを１００μｌのＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ溶液に再懸濁し、細胞内染色のために０．２５μｇのＰＥ結合抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体及び抗ＩＦＮ−γｍ抗体で染色した。細胞を暗所において室温で３０分間インキュベートし、２回洗浄し、３００μｌのＰＢＳ、２％パラホルムアルデヒド溶液に再懸濁し、そしてフローサイトメトリーで分析した。
【０２６９】
実施例４：ＳＬＣは自発気管支癌のマウスモデルにおいて強力な抗腫瘍応答を仲介する
実施例３に記載の材料及び方法を使用して、ＳＶ４０の大きなＴＡｇがネズミクララ細胞特異的プロモーターの制御下で発現するトランスジェニックマウスにおける自発気管支肺胞細胞癌モデルにおけるＳＬＣの抗腫瘍効力を評価した（Ｍａｇｄａｌｅｎｏ外，Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．，８：１４５−１５５，１９９７）。導入遺伝子を発現するマウスは、びまん性両側気管支肺胞癌を発症し、平均寿命は４ヶ月である。ＳＬＣ（０．５μｇ／注射）又は同濃度のネズミ血清アルブミンを４週齢から始めて１週間あたり３回、８週間継続して腋窩リンパ節領域に注射した。対照マウスが進行性の肺腫瘍の増殖のため死亡し始めた４ヶ月目に、マウスを全ての処置群で屠殺し、肺を単離し、パラフィン包埋した。対照処置マウスからのパラフィン包埋肺腫瘍切片のＨ＆Ｅ染色から、両肺全体に大きな腫瘍塊が明らかになり、リンパ球浸潤は最小限であった（図３Ａ及びＣ）。対照的に、ＳＬＣ処置マウスは、広範なリンパ球浸潤を伴う有意に小さな腫瘍結節を有していた（図３Ｂ及びＤ）。ＳＬＣで処置したマウスは、希釈剤処置した対照マウスと比較して、肺腫瘍の負荷が著しく減少した（図３Ｅ）。ＳＬＣ処置マウスは対照注射を受けたマウスと比較して生存期間が延長した。対照処置マウスについて生存期間の中央値は１８±２週間であったが、ＳＬＣで処置したマウスの生存期間の中央値は３４±３週間であった（Ｐ＜０．００１）。
【０２７０】
実施例５：ＣＣ−１０タグマウスのＳＬＣ処置は１型サイトカイン及び抗血管形成性ケモカイン放出と免疫不全性細胞質ＴＧＦ−β及びＶＥＧＦの衰退を促進する。
腫瘍進行が宿主サイトカインプロファイルによって改変され得ることを示す以前の報告に基づいて（Ａｌｌｅｖａ外，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５３：１６７４−１６８６，１９９４；Ｒｏｈｒｅｒ外，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５５：５７１９−  ５７２７，１９９５）、ＳＬＣ療法後の腫瘍部位、リンパ節及び脾臓からのサイトカイン産生を評価した。組換えＳＬＣで処置したＣＣ−１０  ＴＡｇマウスの肺、脾臓及びリンパ節におけるサイトカインプロファイルを、腫瘍を有する希釈剤処置対照マウス及び非腫瘍保有対照のマウスと比較した。ＣＣ−１０  ＴＡｇマウスのＳＬＣ処置は１型サイトカインの全身性誘導をもたらしたが、免疫抑制性メディエーターの産生を減少させた。肺、リンパ節及び脾臓を採取し、２４時間の培養期間後に、上清をＶＥＧＦ、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、ＭＩＧ、ＩＰ−１０及びＴＧＦ−βの存在についてＥＬＩＳＡにより評価し、ＰＧＥ−２の存在についてＥＩＡにより評価した。ＳＬＣで処置したＣＣ−１０  ＴＡｇマウスは、希釈剤処置群の肺と比較して、ＶＥＧＦ（３．５倍）及びＴＧＦ−β（１．８３倍）の有意な減少を示したが、ＩＦＮ−γ（１６０．５倍）、ＩＰ−１０（１．７倍）、ＩＬ−１２（２．１倍）、ＭＩＧ（２．１倍）及びＧＭ−ＣＳＦ（８．３倍；表１Ｂ）の増加を示した。希釈剤処置群と比較して、ＳＬＣ処置ＣＣ−１０  ＴＡｇマウス由来の脾細胞は、ＰＧＥ−２（１４．６倍）及びＶＥＧＦ（２０．５倍）のレベルの減少を示したが、ＧＭ−ＣＳＦ（２．４倍）、ＩＬ−１２（２倍）、ＭＩＧ（３．４倍）及びＩＰ−１０（４．１倍；表１Ｂ）の増加を示した。ＳＬＣで処置したマウス由来のリンパ節由来細胞は、希釈剤処置したＣＣ−１０  ＴＡｇマウスと比較して、有意に向上したレベルのＩＦＮ−γ（２．２倍）、ＩＰ−１０（２．３倍）、ＭＩＧ（２．３倍）及びＩＬ−１２倍（２．５倍）を分泌したが、ＴＧＦ−βのレベルは低下した（１．８倍；表１Ｂ）。免疫抑制メディエーターＰＧＥ−２及びＩＬ−１０は、ＳＬＣ処置マウスの腫瘍部位では変化しなかった。しかし、ＳＬＣ処置マウスの脾臓におけるＰＧＥ−２レベルの有意な減少があった。ＳＬＣ投与が有意な特異的全身性免疫応答を誘導するかどうかを決定するために、ＳＬＣ及び希釈剤処置ＣＣ−１０  ＴＡｇマウスからの脾臓細胞を、放射線照射したＣＣ−１０  ＴＡｇ腫瘍細胞と共に試験管内で２４時間共培養し、そしてＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−１０をＥＬＩＳＡによって決定した。照射腫瘍細胞による二次刺激の後、ＳＬＣ処置腫瘍保有マウス由来の脾細胞は、有意に増加したレベルのＩＦＮ−γ（５．９倍）及びＧＭ−ＣＳＦ（２．２倍）を分泌した。対照的に、ＩＬ−１０分泌は５倍減少した（表３Ｂ）。
【０２７１】
実施例６：ＣＣ−１０タグマウスのＳＬＣ処置は腫瘍部位、リンパ節及び脾臓のＤＣ及びＴ細胞浸潤が向上する。
ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮ−γの細胞供給源を決定するために、腫瘍、リンパ節及び脾臓の単一細胞懸濁液をＳＬＣ及び希釈剤対照処置ＣＣ−１０  ＴＡｇマウスから単離した。Ｔリンパ球浸潤及び細胞内サイトカイン産生をフローサイトメトリーによって評価した。細胞を染色して、各部位のＤＣ浸潤を定量した。希釈剤処置対照群と比較して、ＳＬＣ処置ＣＣ−１０ＴＡｇマウスは、腫瘍部位、リンパ節及び脾臓で細胞がＤＣ表面マーカーのＣＤ１１ｃ及びＤＥＣ２０５を発現する頻度の有意な増加を示した（表２Ｂ）。同様に、希釈剤処置対照群と比較して、ＳＬＣ処置ＣＣ−１０  ＴＡｇの腫瘍部位、リンパ節及び脾臓でＣＤ４及びＤ８細胞がＩＦＮ−γ及びＧＭ−ＣＳＦを発現する頻度の有意な増加があった（表２Ｂ）。
【０２７２】
実施例７：ＳＬＣ仲介抗腫瘍応答はＩＦＮ−γ、ＭＩＧ及びＩＰ−１０を必要とする
ここで提示される研究は、ＳＬＣ仲介抗腫瘍応答が腫瘍部位でのＩＦＮ−γ、ＩＰ−１０及びＭＩＧの同化作用の向上を伴うことを教示する。ＩＰ−１０、ＭＩＧ及びＩＦＮ−γは生体内で強力な抗腫瘍活性を有することが知られている。この文脈において、これらのサイトカインの増大がＳＬＣ仲介腫瘍減少におけるエフェクター分子として役立つかどうかを決定するために研究を行った。ここでは、ＳＬＣ仲介抗腫瘍応答がサイトカインＩＰ−１０、ＭＩＧ及びＩＦＮ−γを必要とすることを示す。
【０２７３】
生体内ＳＬＣ仲介抗腫瘍応答におけるＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−γ誘導性タンパク質ＩＰ−１０（ＩＰ−１０）及びＩＦＮ−γ（ＭＩＧ）によって誘導されるモノカインの役割を決定した。生体内でのＩＰ−１０、ＭＩＧ及びＩＦＮ−γの枯渇は、ＳＬＣの抗腫瘍効果を有意に減少させた。腫瘍部位でのサイトカイン産生の評価から、ＩＦＮ−γ、ＭＩＧ及びＩＰ−１０の相互依存性が示された。これらのサイトカインのいずれか１つを生体内で中和すると、３つのサイトカインの全てが同時に減少した。これらの知見は、ＳＬＣ仲介抗腫瘍応答が腫瘍部位でＩＰ−１０、ＭＩＧ及びＩＦＮ−γの誘導を必要とすることを示す。
【０２７４】
材料及び方法
細胞培養及び腫瘍形成モデル
弱い免疫原性肺癌であるＬｅｗｉｓ肺癌（３ＬＬ、Ｈ−２b）を、生体内でのＳＬＣ仲介抗腫瘍応答に重要なサイトカインの評価に利用した。細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｃａｌａｂａｓａｓ、ＣＡ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍｌ）、２ｍＭグルタミン（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎｔａ  Ａｎｎａ、ＣＡ）を含む２５ｃｍ3組織培養フラスコ中で単層として通常通り培養し、空気中５％ＣＯ2を含む加湿雰囲気中で３７℃に維持した。細胞系はマイコプラズマフリーであり、液体Ｎ2から凍結ストック細胞を解凍する前に１０継代まで使用した。腫瘍形成実験のために、１０5個の３ＬＬ腫瘍細胞をＣ５７Ｂｌ／６の右上肩甲上領域に皮下注射し、腫瘍体積を週に３回モニターした。５日目に、確立された腫瘍を、０．５μｇのネズミ組換えＳＬＣ又はＰＢＳ希釈液（Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ）の腫瘍内注射で週に３回２週間にわたって投与して処置した。製造業者によって報告されたエンドトキシンレベルは、１μｇ（１ＥＵ／μｇ）あたり０．１ｎｇ未満のＳＬＣであった。注射に使用したＳＬＣの量（０．５μｇ）を、製造業者によって提供された試験管内生物活性データによって決定した。総ネズミＴ細胞に対するＳＬＣの最大走化活性は１００ｎｇ／ｍｌであることが分かった。ＳＬＣ仲介抗腫瘍特性の生体内評価のために、各腫瘍内注射についてこの量よりも５倍多く利用した。同量のマウス血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を対照注射のために無関係なタンパク質として利用した腫瘍形成実験も行った。ＳＬＣ処置の２４時間前、次いで週３回、マウスを実験期間中に３５ｍｇ／用量の抗ＩＰ−１０又は抗ＭＩＧ、及び１００μｇ／用量の精製ＩＦＮ−γ（ＡＴＣＣ  Ｒ４５６２）又は３５ｍｇ／用量の対照抗体で腹腔内投与により処置した。そこで投与された抗体の用量では、腫瘍部位でのそれぞれのサイトカインの有意な生体内枯渇があった。各腫瘍の２つの二等分線直径をキャリパーで測定した。容量は、式（０．４）（ａｂ2）を用いて計算した。ここで、「ａ」はより大きい直径、「ｂ」をより小さい直径とした。
【０２７５】
サイトカインＥＬＩＳＡ
ＭＩＧ、ＩＰ−１０及びＩＦＮ−γを、上記二重リガンド法の改変を用いて定量した。ＭＩＧ及びＩＰ１０抗体並びに組換えサイトカインタンパク質は、Ｒ＆Ｄ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から得た。ＩＦＮ−γ抗体対及び組換えサイトカインはＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ製であった。ＩＦＮ−γ、ＭＩＧ及びＩＰ−１０のＥＬＩＳＡ感受性は１５ｐｇ／ｍｌであった。
【０２７６】
結果
ＳＬＣは直接的な抗血管新生効果を有することが証明されているため、本発明のモデルで観察された腫瘍の減少は、血管新生を阻害する際におけるＩＦＮ−γを分泌するＴ細胞によるＴ細胞依存性免疫並びに関与が原因である可能性がある。ＩＦＮ−γは、抗癌免疫を促進する一連の生物学的効果を仲介する。ＭＩＧ及びＩＰ−１０は、ＩＦＮ−γによって誘導される強力な血管新生抑制因子であるため、本発明者は、これらがＩＦＮ−γに加えてＳＬＣ投与後の腫瘍縮小の一部を担うと推定した。
【０２７７】
腫瘍部位へのＤＣ及びＴ細胞の共局在がＳＬＣ仲介抗腫瘍応答にとって十分であったかどうか、及び／又は、腫瘍部位でのサイトカインＭＩＧ、ＩＰ−１０及びＩＦＮ−γの付随的な相対的増加が腫瘍縮小の役割を果たすかどうかを決定するために、これらのサイトカインを、ＳＬＣ処置マウスにおいて抗体で枯渇させた。抗ＩＰ−１０、ＭＩＧ及びＩＦＮ−γ抗体は、ＳＬＣの有効性を有意に阻害した（対照抗体群と比較して＊ｐ＜０．０１）。腫瘍部位でのサイトカイン測定は、ＩＦＮ−γの中和がこれらのサイトカインの減少を引き起こしたため、腫瘍部位でのＭＩＧ及びＩＰ−１０の相対的増加がＩＦＮ−γ依存性であることを示した。したがって、ＳＬＣ処置マウスの腫瘍部位でのＩＦＮ−γの増加により、ＩＰ−１０及びＭＩＧの相対的増加を説明することができた。また逆も観察された。これらのサイトカインの中和はＩＦＮ−γの減少を引き起こしたため、腫瘍部位におけるＩＦＮ−γ産生はＭＩＧ及びＩＰ−１０に依存することが分かった。したがって、ＳＬＣ処置マウスにおけるＩＦＮ−γ、ＭＩＧ及びＩＰ−１０は相互依存性を示した。というのは、これらのサイトカインのいずれか１種の生体内での中和は、３種のサイトカインの全ての付随する減少を引き起こしたからである。ＭＩＧとＩＰ−１０の両方は、腫瘍部位でさらにＩＦＮ−γを増幅することができる刺激ＣＸＣＲ３発現活性化Ｔリンパ球に対して走化性である。本発明の結果は、ＳＬＣの抗腫瘍特性がＤＣ及びＴ細胞の共局在化におけるその走化性能力のみならずＩＦＮ−γ、ＩＰ−１０、ＭＩＧなどの重要なサイトカインの誘導に起因する可能性があることを示唆する。
【０２７８】
１０5個の３ＬＬ腫瘍をＣ５７Ｂｌ／６マウスに移植した。腫瘍移植の５日後に、マウスを０．５μｇの組換えマウスＳＬＣで週３回腫瘍内処置した。ＳＬＣ投与の１日前に、マウスにそれぞれのサイトカイン抗体を腹腔内注射した。抗体を週に３回投与した。ＳＬＣ処置マウスは、希釈剤処置対照腫瘍保有マウスと比較して、ＩＦＮ−γ、ＭＩＧ及びＩＰ−１０を有意に誘導した（ｐ＜０．００１）。生体内でのＩＦＮ−γの中和はＩＦＮ−γ、ＩＰ−１０及びＭＩＧを減少させたが、ＭＩＧ及びＩＰ−１０の中和はこれらのサイトカインの相対的な減少をもたらした。また、ＭＩＧの中和は、ＩＦＮ−γ及びＩＰ−１０の減少に至った。結果を総タンパク質のｐｇ／ｍｇとして表す。総タンパク質はＢｒａｄｆｏｒｄアッセイによって決定した。これらの実験の結果を以下の表５に示す。
【０２７９】
【表４】
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【０２８０】
実施例８：遺伝子療法系アプローチのマウスモデルにおけるＳＬＣ仲介抗腫瘍応答
上記の実施例で提供されたデータは、ＳＬＣポリペプチドが生体内で同系Ｔ細胞依存性抗腫瘍応答をどのように仲介するのかを実証するものである。直接注射可能なベクターを使用した遺伝子治療系抗腫瘍アプローチを探索するために、本発明者はネズミＳＬＣ  ｃＤＮＡ（Ａｄ−ＳＬＣ）を発現するアデノウイルス構築物を作製した。これらの構築物では、ネズミ二次リンパ系ケモカインのｃＤＮＡをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製ｐＭＨ４プラスミドのＣＭＶプロモーターの下流にクローニングし、シャトルベクターとして使用した。
【０２８１】
全Ｅ１欠損Ａｄ−５ゲノムを含むｐＪＭ１７プラスミドを組換えベクターとして使用した（例示的な方法については、例えば、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １９９７  Ｊａｎ−Ｆｅｂ；４（１）：１７−２５を参照されたい）。マウスＡｄＳＬＣを、マウスＳＬＣ  ｃＤＮＡを含むシャトルプラスミドｐＭＨ４とｐＪＭ１７プラスミドとの間の組換え事象を介した２９３細胞における試験管内組換え事象によって調製した。
【０２８２】
Ａｄ  ＳＬＣのクローンを、２９３細胞に及ぼす細胞変性効果を誘導する培地能力の希釈分析を制限することによって得、本発明者の研究室で開発したネズミＳＬＣ特異的ＥＬＩＳＡによって確認した。ウイルスストックを、２９３細胞の増幅、その後ＣｓＣｌ精製、透析及び−８０℃でのグリセロール（１０％ｖｏｌ／ｖｏｌ）ストックとして保存によって得た（例えば、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １９９７  Ｊａｎ−Ｆｅｂ；４（１）：１７−２５）。
【０２８３】
１系統肺胞癌細胞（Ｌ１Ｃ２）及びルイス肺癌細胞（Ｃ５７ＢＬ／６由来の３ＬＬ）の試験管内形質導入は、これらの細胞系により、ＳＬＣ特異的ＥＬＩＳＡにより決定される時に１００：１のＭＯＩで１０ｎｇ／ｍｌ／１０6細胞／２４時間ＳＬＣの産生に至った。次に、移植可能なネズミＬ１Ｃ２肺腫瘍モデルを使用してＡｄ−ＳＬＣ構築物の生体内抗腫瘍効果を決定した。ウイルスストックの１０8ｐｆｕをＣ５７ＢＬ／６マウスへの腫瘍内注射のために１００μｌのＰＢＳに添加した。１０5個の細胞をマウスの上肩甲上部領域に注射し、５日後にＡｄ−ＳＬＣ又は対照Ａｄベクターの腫瘍内注射で、１０7〜１０9のｐｆｕ範囲で３週間にわたって１週間に１回処置した。インスリン注射器を用いてウイルスを腫瘍に注射し、その際、注射液をゆっくりと送達して、腫瘍内にウイルス粒子を均一に分布させた。
【０２８４】
図４に示すように、Ａｄ−ＳＬＣベクターの腫瘍内注入により、マウスの６０％において腫瘍が完全に退縮したが、対照Ａｄベクターはこの効果を示さなかった。また、本発明者は、１０8ｐｆｕでのＡｄ−ＳＬＣの単一腫瘍内用量の抗腫瘍効果を決定し、そして、これが３用量程度に有効であることを見出した。Ａｄ−ＳＬＣ療法に応答して腫瘍を拒絶するマウスは、５×１０5の親腫瘍の二次的チャレンジを拒絶することができた。これらの結果は、生体内ＳＬＣ遺伝子治療戦略により、同系肺癌モデルにおいて腫瘍を有意に縮小させることができることを示す。
【０２８５】
本明細書に開示される生体内遺伝子導入方法は、癌を治療するための臨床関連モデルを提供する。特に、これらの生体内モデルは、癌が自発的に発生する（したがって、同系である）ため、直接的に関連する癌モデルである。さらに、本明細書に開示される遺伝子治療法は、臨床モデル、すなわちＳＬＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの投与と直接並行する。この遺伝子治療ベクターの投与が腫瘍負荷を低減することが示されるという事実は、癌を治療するための臨床的方法における当該ベクターの使用を強力に支持する直接的な証拠を提供する。結果として、このモデルは、ＳＬＣ系遺伝子療法を最適化し特徴付けるのに特に有用なツールとなる。
【０２８６】
実施例９：ヒト遺伝子治療系アプローチにおけるＳＬＣ仲介抗腫瘍応答
ヒトＳＬＣ  ｃＤＮＡを発現するアデノウイルス構築物などのベクターを使用して、ヒト遺伝子治療系抗腫瘍アプローチを採用できる。これらの構築物において、ヒト二次リンパ系ケモカイン用のｃＤＮＡを、ＣＭＶプロモーターなどの適切な程度の発現を可能にするプロモーターの下流にクローニングすることができる。
【０２８７】
全Ｅ１欠損Ａｄ−５ゲノムを含むｐＪＭ１７プラスミドなどのプラスミドを組換えベクターとして使用することができる（例示方法については、例えば、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １９９７  Ｊａｎ−Ｆｅｂ；４（１）：１７−２５を参照されたい）。ヒトＡｄＳＬＣを、ヒトＳＬＣｃＤＮＡを含むシャトルプラスミドと組換えプラスミドとの間の組換え事象を介した２９３細胞における試験管内組換え事象によって調製することができる。
【０２８８】
Ａｄ  ＳＬＣのクローンを、２９３細胞などの細胞に及ぼす細胞変性効果を誘導する培地能力の希釈分析を制限することによって得、本発明者の研究室で開発したヒトＳＬＣ特異的ＥＬＩＳＡによって確認することができる。ウイルスストックを、細胞の増幅、その後ＣｓＣｌ精製、透析及び−８０℃でのグリセロール（１０％ｖｏｌ／ｖｏｌ）ストックとして保存によって得ることができる（例えば、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １９９７  Ｊａｎ−Ｆｅｂ；４（１）：１７−２５）。
【０２８９】
１系統肺胞癌細胞（Ｌ１Ｃ２）及びルイス肺癌細胞（３ＬＬ）などの系統の試験管内形質導入は、これらの細胞系により、ＳＬＣ特異的ＥＬＩＳＡにより決定されるときに１００：１のＭＯＩでＳＬＣの産生に使用できる。移植可能なネズミＬ１Ｃ２肺腫瘍モデルと同等の細胞を使用してＡｄＳＬＣ構築物の生体内抗腫瘍効果を決定することができる。ウイルスストックの１０8ｐｆｕを腫瘍内注射のために１００μｌのＰＢＳに添加することができる。１０5個の細胞を腫瘍近傍に注射し、５日後に腫瘍を、１０7〜１０9のｐｆｕ範囲で３週間にわたって１週間に１回のＳＬＣベクターの腫瘍内注射で処置した。一方法では、インスリン注射器を用いてウイルスを腫瘍に注射し、その際、注射液をゆっくりと送達して、腫瘍内にウイルス粒子を均一に分布させた。
【０２９０】
実施例１０：ＮＳＣＬＣにおける典型的な腫瘍内樹状細胞（ＤＣ）ベースのエクスビボ療法におけるアデノウイルスＣＣＬ−２１／ＳＬＣの使用
この例では、ｅｘ  ｖｉｖｏで生成された遺伝子改変ＤＣの腫瘍内投与を利用して、その場での腫瘍抗原取り込み及び提示を達成する方法を実証する。この実施例では、成熟宿主ＤＣを腫瘍部位に引きつけるために、ＤＣにＣＣＬ−２１（二次リンパ組織ケモカイン（ＳＬＣ））を発現するアデノウイルスベクター構築物を形質導入した。ＣＣＬ−２１は成熟ＤＣ及び活性化Ｔ細胞を強力に引きつけるので、ＣＣＬ−２１を発現するＤＣの腫瘍内注射（ｉ．ｔ．）により肺癌モデルにおいて強力な抗腫瘍応答が得られる。
【０２９１】
この例示的なモデルでは、１０5個の系統１肺胞細胞癌（Ｌ１Ｃ２）細胞を利用して同系ＢＡＬＢ／ｃマウスに皮下腫瘍を確立させた。確立された腫瘍を１週間間隔で１０6個のＤＣ−Ａｄ−ＣＣＬ−２１（ＣＣＬ−２１の１０ｎｇ／ｍｌ／１０6細胞／２４時間）で３週間にわたって処置した。ＤＣ−Ａｄ−ＣＣＬ−２１で腫瘍内処置したマウスの６０％が完全な腫瘍撲滅を示した。対照的に、非改変ベクター又は対照ベクター改変ＤＣ（ＤＣ−Ａｄ−ＣＶ）で処置したマウスの１２％しか応答しなかった。これらの結果に基づいて、本発明者は、ヒトＣＣＬ−２１（Ａｄ−ＣＣＬ−２１）を発現するアデノウイルスベクターを構築し特徴付けた。ヒト単球由来のＤＣを、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を含む培地で培養した。６日目の形質導入後に、ＣＣＬ−２１タンパク質産生をＥＬＩＳＡによって８日目に評価した。５０：１又は１００：１のＭＯＩでＡｄ−ＣＣＬ−２１が形質導入されたＤＣは、７１±１５ｎｇ／ｍｌ及び９１±５ｎｇ／ｍｌ／１０6細胞／４８時間を生じた。評価されたＭＯＩでは、ＤＣは、ＣＤ８３又はＣＣＲ７Ｒ発現を有意に上方調節することなく細胞生存率及び未成熟表現型を維持した。さらに、ＤＣ−Ａｄ−ＣＣＬ−２１は１０5個よりも少なくても末梢血リンパ球及びＬＰＳ刺激ＤＣの有意な走化性を引き起こした。
【０２９２】
これらの研究は、ＮＳＣＬＣにおける腫瘍内ＤＣ−Ａｄ−ＣＣＬ−２１療法の使用が成功することに関する証拠となる。
【０２９３】
実施例１１：ＰＤＬ１発現はＣＣＬ２１遺伝子改変樹状細胞の第１相試験における免疫応答と相関する
背景
患者がＣＣＬ２１を受けた（細胞仲介免疫応答を刺激しかつ血管新生を阻害することによって抗腫瘍応答を誘発するためにＴｅｃｈ  ＩＤ：２０５３８／ＵＣ  Ｃａｓｅ  ２００１−３８１−０ケモカインに記載されたＣＣＬ２１遺伝子修飾ＤＣの注射による腫瘍への導入を介して）最初の試験において、治療の開始時に肺癌細胞上でＰＤＬ１表面発現を上方調節した患者は、ＣＣＬ２１療法に対する特異的免疫応答が限られている又は全くないことが分かった。また、ＣＣＬ２１療法後にＰＤＬ１がさらに上昇した患者もいた。これは、抗体その他の手段によってＰＤ１／ＰＤＬ１経路を遮断することが、ＣＣＬ２１又はＰＤ１／ＰＤＬ１経路療法のいずれかを改善するための有効な手段であるという証拠となる。これは、併用療法が非常に有効であることを示している。
【０２９４】
肺癌患者の抗腫瘍免疫応答は、二次リンパ系ケモカイン（ＳＬＣ／ＣＣＬ２１）遺伝子を発現するために複製欠損アデノウイルス（Ａｄ）ベクターが形質導入された自己樹状細胞（ＤＣ）の腫瘍内（ＩＴ）投与によって誘発できる。ここで、腫瘍ＰＤ−Ｌ１発現の状況におけるＣＣＬ２１遺伝子改変ＤＣ（Ａｄ−ＣＣＬ２１−ＤＣ）投与後の腫瘍特異的免疫応答を分析した。
【０２９５】
方法
第Ｉ相非ランダム化用量漸増マルチコホート試験を実施してステージＩＩＩＢ／ＩＶのＮＳＣＬＣ患者を登録した。１６人の患者がＩＴ注射（０日目及び７日目）によりＡｄ−ＣＣＬ２１−ＤＣの用量で２回のワクチン接種を受けた（Ａ、Ｂ、Ｃ又はＤ；１×１０6、５×１０6、１×１０7又は３×１０7個の細胞／注射）。末梢血を抗原特異的ＥＬＩＳＰＯＴアッセイのために収集し、そして原発性肺癌のＣＴ誘導針生検を、リアルタイムＰＣＲ及び免疫組織化学による細胞浸潤の評価によってＰＤ−Ｌ１発現のために得た。
【０２９６】
結果
１６人の被験体の末梢血をＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって評価した。陽性応答は、＞２０スポット／２×１０5細胞の絶対数（ポジティブレスポンダー；ＰＲ）を有するバックグラウンドを超えるスポット数の２倍の増加として定義した。混合応答は、ワクチン接種後の時点（混合レスポンダー；ＭＲ）と比較して０日目に高いＩＦＮ−γバックグラウンド発現を有する陽性応答として定義した。全レスポンダーの３８％（６／１６）に対して１９％（３／１６）のＭＲ及び１９％（３／１６）ＭＲがあった。平均ＰＤ−Ｌ１遺伝子コピー数は、７日目に３９４（ＭＲ）及び６８４（ＰＲ）と比較して１３４４（非レスポンダー；ＮＲ）であった。腫瘍ＣＤ８のＴ細胞浸潤は、４０％（６／１５；全被験者）、３３％（３／９；ＮＲ）及び５０％（３／６；ＭＲ及びＰＲ）で誘導された。
【０２９７】
結論
ＳＬＣ／ＣＣＬ２１遺伝子を発現する自己樹状細胞の腫瘍内投与は、（１）抗腫瘍特異的免疫応答が誘発され、かつ、より低いＰＤ−Ｌ１発現と相関すること、及び（２）腫瘍へのＣＤ８  Ｔ細胞浸潤が誘導されることを実証した。
【０２９８】
実施例１２：腫瘍内ＣＣＬ２１及びチェックポイント遮断療法の生体内モデル
組換えネズミＣＣＬ２１（ｒｍＣＣＬ２１、ＳＬＣ）又は関連する対照を、ＮＳＣＬＣ肺腫瘍（それぞれ３ＬＬ又はＬＫＲ１３）を有する同系マウス（Ｃ５７／Ｂｌ６又は１２９／ｓｖ）に注射する。ＳＬＣを、腫瘍サイズが８×８ｍｍ（典型的には約ｄ１０）に達したときに腫瘍内に注射し、そして８日後に再度腫瘍内に注射して天然に存在する宿主抗腫瘍免疫応答を増大させる。以前の知見に基づいて、ＳＬＣはＴ細胞（ヘルパー及び細胞傷害性）及び有益なマクロファージを化学走性化するであろう。宿主の抗腫瘍免疫応答が上昇するにつれて、肺腫瘍は、Ｔ細胞上のＰＤ−１受容体との結合についてのＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２のアップレギュレーションを含めた免疫回避シグナル伝達事象を開始してＴ細胞を失活させ、かつ、腫瘍に対するＴ細胞の将来の動員を阻害するという証拠がある。このため、抗ＰＤ１（ネズミ）を、ＣＣＬ２１の最初の注射の２日後、その後実験の期間中４日ごとに腹腔内注射する。全体として、宿主抗腫瘍免疫応答はＳＬＣで補強され、腫瘍の免疫回避は、抗ＰＤ１の適切なタイミングでの送達によって防止されることが予想される。これらのマウス研究の主要評価項目は腫瘍増殖率である。二次エンドポイントは、治療前浸潤（ｎ＝２マウス／群）に対する治療後（ｎ＝４マウス／群）の免疫細胞浸潤である。未処置対照群の腫瘍が２２×２２ｍｍ（典型的にはｄ２８）に達したときに全ての処置後マウスを安楽死させる。これらの最初の併用研究の完了後に、抗ＰＤ１処置と組み合わせたときの同腹仔に適合したマウスからのＣＣＬ２１遺伝子改変自己樹状細胞の腫瘍内注射の有効性を評価する。これらの前臨床試験の結果を使用して、進行期のＮＳＣＬＣ患者におけるこの組み合わせの安全性及び有効性を試験するように現在設計されている第Ｉ／ＩＩ相臨床試験をガイドする。
【０２９９】
図８は、各群から処置前及び処置後のマウスにおいて調査される例示的な免疫細胞マーカーのチャートである。これらのマーカーは、ＩＨＣ及び他の手段による腫瘍浸潤免疫細胞における測定値であることができる。
【０３００】
実施例１３：腫瘍内ＣＣＬ２１及びチェックポイント遮断はＮＳＣＬＣ腫瘍増殖を協同的に阻害する
ＣＣＬ２１−ＤＣは、肺癌のよく特徴付けられた同系ＫＲＡＳＧ１２Ｄネズミモデルにおいて、単独療法として以前に評価されていた。このモデルでは、腫瘍成長の減少、自己腫瘍に対する腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）細胞溶解活性の増加、並びに腫瘍における及び脾臓における全身的にＩＦＮγ及びＴＮＦαの増加が観察された。同じＬＫＲ１３マウスモデルを使用して、ＣＣＬ２１療法とチェックポイントインヒビター療法との組み合わせを分析した。抗ＰＤ−１抗体（１μｇ／ｍｌ）又は対照抗体（１μｇ／ｍｌ）ｎ＝８マウス／群の存在下で、自己腫瘍に対する試験管内Ｔ細胞細胞溶解活性を評価した。ＴＩＬは、希釈剤ＣＣＬ２１−ＤＣ処置群の腫瘍由来であった。
【０３０１】
抗ＰＤ−１単独療法も腫瘍の増殖を阻害し、自己腫瘍に対するＴＩＬ細胞溶解活性を増加させ、そして腫瘍内において及び脾臓において全身的にＩＦＮγ及びＴＮＦαを増加させることが観察された。ＣＣＬ２１−ＤＣ処置群からのＴＩＬ活性がＰＤ−１遮断によって増強され得るかどうかを決定するために、試験管内細胞溶解アッセイを実施した。ＣＣＬ２１−ＤＣ群からのＴＩＬは、対照抗体と比較してＰＤ−１抗体の存在下で自己腫瘍に対して有意に大きな細胞溶解活性を有していた（図９、希釈剤に対して＊ｐ＜０．０５、ＣＣＬ２１−ＤＣ＋対照抗体に対して＊＊ｐ＜０．０５）。
【０３０２】
組み合わせて投与した腫瘍内（ＩＴ）ＣＣＬ２１及び腹腔内抗ＰＤ−１を、ＬＫＲ１３腫瘍保有マウスにおいても評価した。両単独療法は、最終腫瘍体積を約３倍に減少させ、その組み合わせは、いずれかの薬剤単独よりも有効であることが判明した。同系３ＬＬマウス肺癌モデルを利用して同様の結果が得られた。両単独療法は、腫瘍の増殖を有意に低下させ、それによって、剖検時の最終腫瘍体積は対照群の約半分であり、チェックポイント遮断とＣＣＬ２１との併用は抗腫瘍活性をほぼ２倍に増強した。まとめると、これらのデータは、腫瘍内ＣＣＬ２１及びチェックポイント遮断がいずれかの単独療法よりもＮＳＣＬＣ腫瘍増殖を協同的に阻害するという仮説を支持するものである。
【０３０３】
当業者であれば、上記の例示的な実施例に示された本発明の多くの変更及び変形が想起されると予想される。結果として、本発明は、特許請求の範囲においてのみ限定されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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