(57)【要約】【課題】標準的な構造生物学的手法を補完することができる新規の技術に対する強い要望が、今なお存在する。【解決手段】  本明細書に提供されるのは、標的内の長距離の距離を決定することによって個々の標的の構造を決定するための組成及び方法である。基準ドメイン及び標的ドメインを有する一本鎖核酸キャリパーと、一本鎖核酸キャリパーに相補的な部分配列と、当該基準スプリントが一本鎖核酸キャリパーに結合されている場合に一本鎖を維持するＲＳトーホールド配列と、を有する基準スプリントと、一本鎖核酸キャリパーに相補的な部分配列と、当該標的スプリントが一本鎖核酸キャリパーに結合されている場合に一本鎖を維持するＴＳトーホールド配列と、を有する標的スプリントと、２つの一本鎖核酸ハンドルＲＨ１及びＲＨ２が横に位置する基準分子と、を備えるシステムが提供される。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基準ドメイン及び標的ドメインを有する一本鎖核酸キャリパーであって、
前記基準ドメインが、基準スプリントに相補的な非連続ヌクレオチド配列ＲＳ１及びＲＳ２と、基準分子の横に位置する別個の一本鎖核酸ハンドルＲＨ１及びＲＨ２にそれぞれ相補的な非連続ヌクレオチド配列ＲＲ１及びＲＲ２とを備え、
前記標的ドメインが、標的スプリントに相補的な非連続ヌクレオチド配列ＴＳ１及びＴＳ２と、標的の横に位置する別個の一本鎖核酸ハンドルＴＨ１及びＴＨ２にそれぞれ相補的な非連続ヌクレオチド配列ＴＴ１及びＴＴ２とを備える、一本鎖核酸キャリパーと、
基準スプリントであって、前記一本鎖核酸キャリパーに相補的な部分配列と、当該基準スプリントが前記一本鎖核酸キャリパーに結合されている場合に一本鎖を維持するＲＳトーホールド配列と、を有する一本鎖オリゴヌクレオチドである基準スプリントと、
標的スプリントであって、前記一本鎖核酸キャリパーに相補的な部分配列と、当該標的スプリントが前記一本鎖核酸キャリパーに結合されている場合に一本鎖を維持するＴＳトーホールド配列と、を有する一本鎖オリゴヌクレオチドである標的スプリントであって、前記基準及び当該標的スプリントが前記一本鎖核酸キャリパーの別個の配列に結合する、標的スプリントと、
２つの一本鎖核酸ハンドルＲＨ１及びＲＨ２が横に位置する基準分子と、
を備えるシステム。
【請求項２】
２つの一本鎖核酸ハンドルＴＨ１及びＴＨ２が横に位置する標的を更に備える、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記一本鎖キャリパーが第１の端部でビーズに共役される、請求項１又は２に記載のシステム。
【請求項４】
前記一本鎖キャリパーが第１の端部でビーズに、第２の端部で表面に共役される、請求項１、２、又は３に記載のシステム。
【請求項５】
前記ビーズがマイクロビーズである、請求項３又は４に記載のシステム。
【請求項６】
前記ビーズが磁気ビーズである、請求項３、４、又は５に記載のシステム。
【請求項７】
前記キャリパーが固定表面に結合される、請求項１から６のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項８】
前記ＲＳトーホールド配列の配列に相補的なＲＳ置換鎖を更に備える、請求項１から７のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項９】
前記ＴＳトーホールド配列の配列に相補的なＴＳ置換鎖を更に備える、請求項１から８のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１０】
前記標的がタンパク質である、請求項１から９のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１１】
前記標的が既知の一次アミノ酸配列のタンパク質である、請求項１から９のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１２】
前記標的が未知の一次アミノ酸配列のタンパク質である、請求項１から９のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１３】
前記標的が結合パートナーに結合されたタンパク質である、請求項１から１２のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１４】
前記一本鎖ハンドルＴＳ１及びＴＳ２が未修飾表面リシンで前記標的に結合される、請求項１から１３のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１５】
前記標的が核酸ナノ構造である、請求項１から９のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１６】
前記一本鎖ハンドルＴＳ１及びＴＳ２が各々、ヘアピンバーコード配列及びループ配列を備え、前記ヘアピンバーコード配列がＴＳ１とＴＳ２の間で同一であり、前記ループ配列がＴＳ１とＴＳ２の間で異なる長さである、請求項１から１５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１７】
前記一本鎖ハンドルＴＳ１及びＴＳ２が各々バーコード配列を備える、請求項１から１６のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１８】
前記バーコード配列が鎖置換を介してアクセス可能である、請求項１７に記載のシステム。
【請求項１９】
前記バーコード配列が入れ子状ループで存在する、請求項１７に記載のシステム。
【請求項２０】
前記基準分子、前記基準スプリント、前記ＲＳ１、ＲＳ２、ＲＨ１、ＲＨ２、ＲＲ１、ＲＲ２、ＴＳ１、ＴＳ２、ＴＴ１、ＴＴ２、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＳトーホールド、及びＲＳトーホールドが、複数の種間で同一である、請求項１から１９のいずれか１項に記載の複数のシステム。
【請求項２１】
前記一本鎖核酸キャリパーが、第１の端部で表面に、第２の端部でビーズに結合される、請求項１から１９のいずれか１項に記載の複数のシステム。
【請求項２２】
前記一本鎖核酸キャリパーが各々、一意の長さのループ状構造を形成する一意の配列を備える、請求項１から１９のいずれか１項に記載の複数のシステム。
【請求項２３】
（ａ）請求項１の核酸キャリパーが、基準分子、一本鎖核酸ハンドルが横に位置する標的、及び標的スプリントに結合されているが基準スプリントに結合されていない場合に、第１の端部で表面に、第２の端部でビーズに結合させた前記核酸キャリパーのビーズ−表面距離（ＢＳＤ−ｒｅｆ）を張力をかけた状態で測定することと、
（ｂ）前記核酸キャリパーから前記標的スプリントを除去し、前記基準スプリントを前記核酸キャリパーにハイブリダイズすることと、
（ｃ）前記核酸キャリパーが、基準分子、一本鎖核酸ハンドルが横に位置する標的、及び基準スプリントに結合されているが標的スプリントに結合されていない場合に、前記核酸キャリパーの前記ビーズ−表面距離（ＢＳＤ−ｔａｒｇｅｔ）を張力をかけた状態で測定することと、
（ｄ）前記標的がそのネイティブ（非変性）コンフォメーションである場合に前記標的に結合された前記一本鎖核酸ハンドルの結合ポイント間の距離の大きさとして、ＢＳＤ−ｔａｒｇｅｔとＢＳＤ−ｒｅｆとの差を決定することと、
を備える方法。
【請求項２４】
前記核酸キャリパーが、前記標的、前記基準、及び前記基準スプリントに結合されている場合に、張力をかけた状態かつ変性条件下で、前記核酸キャリパーの前記ビーズ−表面距離を測定して、前記標的がその変性コンフォメーションである場合に前記標的に結合された前記一本鎖核酸ハンドルの結合ポイント間の距離を得ることを更に備える、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記標的がタンパク質である、請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記標的が既知の一次アミノ酸配列のタンパク質である、請求項２３から２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記標的が未知の一次アミノ酸配列のタンパク質である、請求項２３から２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記標的が核酸ナノ構造である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記核酸キャリパーが、前記標的、前記基準、前記基準スプリント、及び第１の置換核酸に結合されている場合に、張力をかけた状態かつ前記第１の置換核酸の存在下で、前記核酸キャリパーの前記ビーズ−表面距離を測定して、前記標的に対する前記一本鎖核酸ハンドルの第１の結合ポイントを識別することを更に備える、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記核酸キャリパーが、前記標的、前記基準、前記基準スプリント、及び第２の置換核酸に結合されている場合に、張力をかけた状態かつ前記第２の置換核酸の存在下で、前記核酸キャリパーの前記ビーズ−表面距離を測定して、前記標的に対する前記一本鎖核酸ハンドルの第２の結合ポイントを識別することを更に備える、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
張力をかけた状態が、遠心力をかけた状態を意味する、請求項２３から３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ビーズ−表面距離が、反射干渉コントラストを組み込んだ遠心力顕微鏡法（ＲＩＣ−ＣＦＭ）を用いて測定される、請求項２３から３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
張力をかけた状態が、磁力をかけた状態を意味する、請求項２３から３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記ハンドルが前記標的に共有結合されている、請求項２３から３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
張力をかけた状態が、約３００〜１０００ｐＮの力を意味する、請求項２３から３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
張力をかけた状態が、約１０ｐＮ未満の力を意味する、請求項２３から３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
（ａ）核酸キャリパーが、多ユニット標的の第１のユニットのＸａａ残基及び第２のユニットのＸａａ残基に結合されている場合に、第１の端部で表面に、第２の端部でビーズに結合させた前記核酸キャリパーのビーズ−表面距離を張力をかけた状態で測定することであって、前記第１及び第２のユニットの前記Ｘａａ残基が、同一の配列の一本鎖核酸ハンドルに結合されている、ことと、
（ｂ）前記第１のユニットの第２のＹａａ残基を前記核酸キャリパーに結合させ、前記核酸キャリパーが前記第１のユニットの前記Ｘａａ及びＹａａ残基に結合されている場合に、張力をかけた状態かつ変性条件下で、前記核酸キャリパーの前記ビーズ−表面距離を測定して、前記第１のユニット上の前記Ｘａａ及びＹａａ残基を識別することと、
（ｃ）前記核酸キャリパーから前記第１のユニットを分離させ、前記第２のユニットの第２のＹａａ残基を前記核酸キャリパーに結合させ、前記核酸キャリパーが前記第２のユニットの前記Ｘａａ及びＹａａ残基に結合されている場合に、張力をかけた状態かつ変性条件下で、前記核酸キャリパーの前記ビーズ−表面距離を測定して、前記第２のユニット上の前記Ｘａａ及びＹａａ残基を識別することと、
を備える方法。
【請求項３８】
前記核酸キャリパーが基準ドメインを備え、（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）の前記測定が、前記核酸キャリパーが基準及び基準スプリントに結合されている場合に実施される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記多ユニット標的が多ユニットタンパク質である、請求項３７又は３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記第１及び第２のユニットが既知の一次アミノ酸配列のタンパク質である、請求項３７から３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記第１及び第２のユニットが未知の一次アミノ酸配列のタンパク質である、請求項３７から４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
Ｘａａがリシンであり、Ｙａａが変異システインである、請求項３７から４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
張力をかけた状態が、遠心力をかけた状態を意味する、請求項３７から４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記ビーズ−表面距離が、反射干渉コントラストを組み込んだ遠心力顕微鏡法（ＲＩＣ−ＣＦＭ）を用いて測定される、請求項３７から４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
張力をかけた状態が、磁力をかけた状態を意味する、請求項３７から４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記第１のユニットが鎖置換を用いて前記核酸キャリパーから分離される、請求項３７から４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記変性条件がＳＤＳの存在である、請求項３７から４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記ハンドルが前記標的に共有結合されている、請求項３７から４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
ループドメインを有する核酸キャリパーであって、前記ループドメインの横に、基準スプリント配列ＲＳＳ１及びＲＳＳ２に相補的な配列がある、核酸キャリパーと、
第１の基準スプリント配列ＲＳＳ１及び第２の基準スプリント配列ＲＳＳ２を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを備えた基準スプリントであって、標的分子が、前記ＲＳＳ１及びＲＳＳ２配列間で第１の位置において前記基準スプリントに、第２の位置において第３の基準スプリント配列ＲＳＳ３に結合し、前記第２及び第３の基準スプリント配列ＲＳＳ１及びＲＳＳ３は配列が同一である、基準スプリントと、
を備えるシステムであって、
前記核酸キャリパーが、前記第２の基準スプリント配列ＲＳＳ２にハイブリダイズされた場合及び前記第３の基準スプリント配列ＲＳＳ３にハイブリダイズされた場合に２つの異なるループ状態を形成する、
システム。
【請求項５０】
前記核酸キャリパーが部分的に二本鎖である、請求項４９に記載のシステム。
【請求項５１】
前記核酸キャリパーが第１の端部でビーズに共役される、請求項４９又は５０に記載のシステム。
【請求項５２】
前記核酸キャリパーが第１の端部でビーズに、第２の端部で表面に共役される、請求項４９、５０、又は５１に記載のシステム。
【請求項５３】
前記ビーズがマイクロビーズである、請求項５１又は５２に記載のシステム。
【請求項５４】
前記ビーズが磁気ビーズである、請求項５１、５２、又は５３に記載のシステム。
【請求項５５】
前記核酸キャリパーが固定表面に結合される、請求項４９から５４のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項５６】
前記標的がタンパク質である、請求項４９から５５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項５７】
前記標的が既知の一次アミノ酸配列のタンパク質である、請求項４９から５６のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項５８】
前記標的が未知の一次アミノ酸配列のタンパク質である、請求項４９から５７のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項５９】
前記ループ状態が二本鎖ループ状態である、請求項４９から５８のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項６０】
前記ループ状態が、一度力を低減又は除去したら再生することができる、請求項４９から５９のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項６１】
（ａ）請求項４９の核酸キャリパーが、基準スプリントの第１の基準スプリント配列ＲＳＳ１及び第２の基準スプリント配列ＲＳＳ２にハイブリダイズされている場合に、第１の端部で表面に、第２の端部でビーズに結合させた前記核酸キャリパーのビーズ−表面距離（ＢＳＤ−ＲＳ）を張力をかけた状態で測定することと、
（ｂ）前記核酸キャリパーが、前記基準スプリントの前記第１の基準スプリント配列ＲＳＳ１及び第３の基準スプリント配列ＲＳＳ３にハイブリダイズされている場合に、前記核酸キャリパーのビーズ−表面距離（ＢＳＤ−ｔａｒｇｅｔ）を張力をかけた状態で測定することと、
（ｃ）前記核酸キャリパーが、前記基準スプリントの前記第１の基準スプリント配列ＲＳＳ１にハイブリダイズされているが前記第２の基準スプリント配列ＲＳＳ２又は前記第３の基準スプリント配列ＲＳＳ３にハイブリダイズされていない場合に、前記核酸キャリパーのビーズ−表面距離を張力をかけた状態で測定することと、
（ｄ）前記標的の長さの大きさとして、ＢＳＤ−ｔａｒｇｅｔとＢＳＲ−ＲＳとの差を決定することと、
を備える方法。
【請求項６２】
前記標的がタンパク質である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記標的が既知の一次アミノ酸配列のタンパク質である、請求項６１又は６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記標的が未知の一次アミノ酸配列のタンパク質である、請求項６１、６２、又は６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記標的が核酸ナノ構造である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６６】
張力をかけた状態が、遠心力をかけた状態を意味する、請求項６１から６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
前記ビーズ−表面距離が、反射干渉コントラストを組み込んだ遠心力顕微鏡法（ＲＩＣ−ＣＦＭ）を用いて測定される、請求項６１から６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
張力をかけた状態が、磁力をかけた状態を意味する、請求項６１から６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
（ａ）核酸キャリパーが、標的のＸａａ残基及び第１のＹａａ残基に結合されている場合に、第１の端部で表面に、第２の端部でビーズに結合させた前記核酸キャリパーのビーズ−表面距離を張力をかけた状態で測定することとであって、前記Ｘａａ及びＹａａ残基が一本鎖核酸ハンドルに結合されている、ことと、
（ｂ）前記第１のＹａａ残基から前記核酸キャリパーを分離させ、前記核酸キャリパーを第２のＹａａ残基に結合させることと、
（ｃ）前記核酸キャリパーが前記標的の前記Ｘａａ残基及び第２のＹａａ残基に結合されている場合に、張力をかけた状態で、前記核酸キャリパーの前記ビーズ−表面距離を測定することと、
（ｄ）ステップ（ａ）〜（ｃ）を繰り返すことと、
を備える方法。
【請求項７０】
張力をかけた状態が、約３００〜１０００ｐＮの力を意味する、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記標的がタンパク質である、請求項６９又は７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記方法が変性条件下で行われる、請求項６９、７０、又は７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記変性条件がＳＤＳの存在を含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記ハンドルがバーコード配列を備える、請求項７１から７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
前記バーコード配列が鎖置換を介してアクセス可能である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記バーコード配列が核酸ループに存在し入れ子状である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
前記標的が未知の一次アミノ酸配列のタンパク質である、請求項７１から７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７８】
Ｘａａがリシンであり、Ｙａａが変異システインである、請求項７１から７７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】
張力をかけた状態が、遠心力をかけた状態を意味する、請求項７１から７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８０】
前記ビーズ−表面距離が、反射干渉コントラストを組み込んだ遠心力顕微鏡法（ＲＩＣ−ＣＦＭ）を用いて測定される、請求項７１から７９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８１】
張力をかけた状態が、磁力をかけた状態を意味する、請求項７１から７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８２】
前記第１のＹａａが鎖置換を用いて前記核酸キャリパーから分離される、請求項７１から８１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８３】
ステップ（ａ）から（ｃ）が約１０ｐＮ未満の力で多数回行われ、次いでステップ（ａ）から（ｃ）が約３００〜１０００ｐＮの力で多数回行われる、請求項７１に記載の方法。
【請求項８４】
前記ハンドルが前記標的に共有結合されている、請求項７１から８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８５】
前記標的が巨大分子複合体である、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記巨大分子複合体がプロテオームである、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記巨大分子複合体がトランスクリプトームである、請求項８５に記載の方法。
【請求項８８】
前記標的が多糖であり、前記残基が糖である、請求項７１に記載の方法。
【請求項８９】
（ａ）各々がテンプレート鎖を備えた複数の標的核酸を提供することと、
（ｂ）デオキシウリジンの存在下で前記複数の標的核酸に制限されたポリメラーゼ反応を実施し、これによって、テンプレート鎖及びデオキシウリジンを備えた相補的な鎖を有する二本鎖標的核酸を生成することと、
（ｃ）前記複数の二本鎖標的核酸をウラシルＤＮＡグリコシラーゼに露呈させて１ヌクレオチドのギャップを生成することと、
（ｄ）前記複数の二本鎖標的核酸をエキソヌクレアーゼに露呈させて前記１ヌクレオチドのギャップを拡大することと、
（ｅ）前記拡大したギャップに、バーコード化した架橋性の末端保護したオリゴヌクレオチドをライゲーションすることと、
（ｆ）前記オリゴヌクレオチドを前記テンプレート鎖に架橋することと、
（ｇ）得られた個々のバーコード化標的核酸を第１及び第２のバーコード化位置で核酸キャリパーに接触させることと、
（ｈ）前記第１及び第２のバーコード化位置間の距離を測定し、前記第１及び第２のバーコード化位置におけるバーコードを識別することと、
（ｉ）前記第２のバーコード化位置から前記キャリパーを解放し、前記キャリパーを第３のバーコード化位置に再び関連付けることと、
（ｊ）ステップ（ｇ）から（ｉ）を反復し、毎回、１つの位置で前記標的核酸に対する前記キャリパーの結合を維持し、新しい位置で前記標的核酸に前記キャリパーを結合させることと、
を備える方法。
【請求項９０】
位置Ｃ１及びＣ２を含む核酸キャリパーを標的に位置Ｘ１及びＹ１で結合させ、これによってＣ１がＸ１に、Ｃ２がＹ１に結合することと、
張力をかけた状態かつ非変性条件下で、Ｘ１とＹ１との間の距離を測定することと、
Ｃ２からＹ１を解放し、任意選択として前記キャリパー上の別の位置Ｃ３でＹ１を結合又は維持することと、
前記キャリパー上の位置Ｃ４を前記標的上の追加の位置Ｘ２に結合させ、張力をかけた状態で、任意選択として変性条件下で、Ｘ１とＸ２との間の距離を測定し、Ｘ２からＣ４を解放し、Ｘ１の充分な一次配列情報が得られるまで反復することと、
Ｃ１からＸ１を解放することと、
前記キャリパー上の位置Ｃ５を前記標的上の追加の位置Ｙ２に結合させ、張力をかけた状態で、任意選択として変性条件下で、Ｙ１とＹ２との間の距離を測定し、Ｙ２からＣ５を解放し、Ｙ１の充分な一次配列情報が得られるまで反復することと、
を備える方法であって、
前記標的上の各位置が一意のバーコードを有する、
方法。
【請求項９１】
Ｃ２及びＣ４が同一の位置である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
Ｃ１及びＣ５が同一の位置である、請求項９０から９１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９３】
前記バーコードが線状又は入れ子状バーコードである、請求項９０から９２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９４】
張力をかけた状態及び非変性条件下が、１０ｐＮ未満の力を含む、請求項９０から９３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９５】
張力をかけた状態及び変性条件下が、３００〜１０００ｐＮの範囲の力を含む、請求項９０から９４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９６】
前記キャリパーが第１の端部で表面に、第２の端部でビーズに結合される、請求項９０から９５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項９７】
前記キャリパー内の結合が共有結合である、請求項９０から９６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９８】
前記標的上の位置が一本鎖核酸ハンドルでラベリングされている、請求項９０から９７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９９】
前記一本鎖核酸ハンドルが一意のバーコードを含む、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記標的がタンパク質である、請求項９０から９９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記標的が多成分標的である、請求項９０から９９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年４月２３日に出願された米国仮出願第６１／９８２，９１４号の利益を主張する。この出願の全体的な内容は参照により本願にも含まれるものとする。
【０００２】
本発明は、単一分子ベースで分子間及び分子内の距離を測定するための組成、デバイス、及び方法に関し、これらを提供する。
【背景技術】
【０００３】
Ｘ線結晶構造解析法及び溶液ＮＭＲは、巨大分子構造決定のための強力なツールを提供する成熟した分野である。それにもかかわらず、構造的な特徴付けは、多くの標的について難しい問題を提起する。例えば、多タンパク質複合体の非同期的な集団によって調べられる多様な配座転移（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）は、バルク解析手法を混乱させることがある。低温電子顕微鏡法（ＣｒｙｏＥＭ）には、単一分子撮像の利点がある。しかしながら、高分解能構造を得る（ｒｅｃｏｖｅｒｙ）には、計算による平均化が必要である。構造的な不均質性（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）を示すサンプルでは、低線量撮像のもとで信号対雑音比が不良であると、粒子のクラス分けの間にエラーが生じ、これによって再構成（ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）の有効分解能が損なわれる。したがって、標準的な構造生物学的手法を補完することができる新規の技術に対する強い要望が、今なお存在する。そのような追加データの貴重なソースは、長距離の距離制限（ｌｏｎｇ−ｒａｎｇｅ  ｄｉｓｔａｎｃｅ  ｒｅｓｔｒａｉｎｔ）であり、これらのセットは、構造決定の計算方法のための構造探索空間を大幅に簡略化する。短期的には、長距離の距離制限を用いて、以前に決定されたｘ線又はＮＭＲ研究から導出された明確なサブユニットをドッキングしてもっと大きい複合体にするモデルを改良することができる。長期的には、これらのデータを、新たな計算による折り畳み構造予測を導くための実験的制限の主なソースとして用い得る。単一分子ＦＲＥＴは、長距離の距離制限を生成するための有望な手法であるが、現在は、比較的少数のこれらの距離を得るためにさえ、広範なシステイン工学と共に複雑な機器及び解析が必要である。このため、現時点では、単一分子レベルで低コストかつ高スループットで長距離の距離制限を収集するための方法は存在しない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、とりわけ、タンパク質、核酸、又は多数のタンパク質及び／又は核酸の複合体のような巨大分子を含む対象標的の高スループット構造決定のための方法を提供する。この方法は、例えば力分光法によって対象標的上のランダムに選択したポイント間の長い距離を測定し、次いで第２の測定によって結合ポイントを識別することを含む。これらの方法では、長距離の距離制限を測定するための従来技術の方法に比べ、大幅に高いスループット及び容易な実施が得られる。また、これらの方法は、これがなければ一過性であり、したがって実際には観察不可能であった構造中間体を、張力によって安定化させて、その特徴付けを可能とする。これらの方法を用いて、既知の一次配列の標的の構造を決定することができ、又は、新たに設計されたかもしくは単離された標的の構造を解明することができる。
【０００５】
したがって、１つの態様において本開示は、
（１）標的ドメインを有する一本鎖核酸キャリパーであって、標的ドメインが、標的スプリントに相補的な非連続ヌクレオチド配列ＴＳ１及びＴＳ２と、標的の横に位置する別個の一本鎖核酸ハンドルＴＨ１及びＴＨ２にそれぞれ相補的な非連続ヌクレオチド配列ＴＴ１及びＴＴ２とを備える、一本鎖核酸キャリパーと、
（２）標的スプリントであって、一本鎖核酸キャリパーに相補的な部分配列と、この標的スプリントが一本鎖核酸キャリパーに結合されている場合に一本鎖を維持するＴＳトーホールド配列と、を有する一本鎖オリゴヌクレオチドである標的スプリントと、を備え、基準及び標的スプリントが一本鎖核酸キャリパーの別個の配列に結合するシステムを提供する。
【０００６】
別の態様において本開示は、
（１）基準ドメイン及び標的ドメインを有する一本鎖核酸キャリパーであって、
（ａ）基準ドメインが、基準スプリントに相補的な非連続ヌクレオチド配列ＲＳ１及びＲＳ２と、基準分子の横に位置する別個の一本鎖核酸ハンドルＲＨ１及びＲＨ２にそれぞれ相補的な非連続ヌクレオチド配列ＲＲ１及びＲＲ２とを備え、（ｂ）標的ドメインが、標的スプリントに相補的な非連続ヌクレオチド配列ＴＳ１及びＴＳ２と、標的の横に位置する別個の一本鎖核酸ハンドルＴＨ１及びＴＨ２にそれぞれ相補的な非連続ヌクレオチド配列ＴＴ１及びＴＴ２とを備える、一本鎖核酸キャリパーと、
（２）基準スプリントであって、一本鎖核酸キャリパーに相補的な部分配列と、この基準スプリントが一本鎖核酸キャリパーに結合されている場合に一本鎖を維持するＲＳトーホールド配列と、を有する一本鎖オリゴヌクレオチドである基準スプリントと、
（３）標的スプリントであって、一本鎖核酸キャリパーに相補的な部分配列と、この標的スプリントが一本鎖核酸キャリパーに結合されている場合に一本鎖を維持するＴＳトーホールド配列と、を有する一本鎖オリゴヌクレオチドである標的スプリントであって、基準及び標的スプリントが一本鎖核酸キャリパーの別個の配列に結合する、標的スプリントと、
（４）２つの一本鎖核酸ハンドルＲＨ１及びＲＨ２が横に位置する基準分子と、
を備えるシステムを提供する。
【０００７】
いくつかの実施形態では、前述のシステムのいずれかは、２つの一本鎖核酸ハンドルＴＨ１及びＴＨ２が横に位置する標的を更に備える。
【０００８】
いくつかの実施形態では、一本鎖キャリパーは第１の端部でビーズに共役される。いくつかの実施形態では、一本鎖キャリパーは第１の端部でビーズに、第２の端部で表面に共役される。いくつかの実施形態では、ビーズはマイクロビーズである。いくつかの実施形態では、ビーズは磁気ビーズである。いくつかの実施形態では、一本鎖核酸キャリパーは固定表面に結合される。
【０００９】
いくつかの実施形態では、システムは、ＲＳトーホールド配列の配列に相補的なＲＳ置換鎖を更に備える。
【００１０】
いくつかの実施形態では、システムは、ＴＳトーホールド配列の配列に相補的なＴＳ置換鎖を更に備える。
【００１１】
いくつかの実施形態では、標的はタンパク質である。いくつかの実施形態では、標的は既知の一次アミノ酸配列のタンパク質である。いくつかの実施形態では、標的は未知の一次アミノ酸配列のタンパク質である。いくつかの実施形態では、標的は結合パートナーに結合されたタンパク質である。
【００１２】
いくつかの実施形態では、一本鎖ハンドルＴＳ１及びＴＳ２は、未修飾表面リシンで標的に結合される。いくつかの実施形態では、一本鎖ハンドルＴＳ１及びＴＳ２は、変異表面システインで標的に結合される。いくつかの実施形態では、一本鎖ハンドルＴＳ１及びＴＳ２は、未修飾表面トリプトファンで標的に結合される。
【００１３】
いくつかの実施形態では、標的は核酸ナノ構造である。
【００１４】
いくつかの実施形態では、一本鎖ハンドルＴＳ１及びＴＳ２は各々、ヘアピンバーコード配列及びループ配列を備え、ヘアピンバーコード配列はＴＳ１とＴＳ２の間で同一であり、ループ配列はＴＳ１とＴＳ２の間で異なる長さである。
【００１５】
いくつかの実施形態では、一本鎖ハンドルＴＳ１及びＴＳ２は各々バーコード配列を備える。いくつかの実施形態では、バーコード配列は鎖置換を介してアクセス可能である。いくつかの実施形態では、バーコード配列は入れ子状ループで存在する。バーコードは線状又は入れ子状バーコードとすることができる。
【００１６】
別の態様において本開示は、前述のシステムのいずれかを複数提供する。いくつかの実施形態では、基準分子、基準スプリント、ＲＳ１、ＲＳ２、ＲＨ１、ＲＨ２、ＲＲ１、ＲＲ２、ＴＳ１、ＴＳ２、ＴＴ１、ＴＴ２、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＳトーホールド、及びＲＳトーホールドは、複数の種間で同一である。
【００１７】
いくつかの実施形態では、一本鎖核酸キャリパーは第１の端部で表面に、第２の端部でビーズに結合される。
【００１８】
いくつかの実施形態では、複数のシステムは遠心力顕微鏡に存在する。いくつかの実施形態では、遠心力顕微鏡は反射干渉コントラスト遠心力顕微鏡（ＲＩＣ−ＣＦＭ）である。
【００１９】
いくつかの実施形態では、一本鎖核酸キャリパーは各々、一意の長さのループ状構造を形成する一意の配列を備える。
【００２０】
別の態様において本開示は、
（ａ）前述の核酸キャリパーのいずれかが、一本鎖核酸ハンドルが横に位置する標的、及び標的スプリントに結合されている場合に、第１の端部で表面に、第２の端部でビーズに結合させたこの核酸キャリパーのビーズ−表面距離（ＢＳＤ−ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）を張力をかけた状態で測定することと、
（ｂ）核酸キャリパーから標的スプリントを除去することと、
（ｃ）核酸キャリパーが、一本鎖核酸ハンドルが横に位置する標的に結合されているが標的スプリントに結合されていない場合に、張力をかけた状態で、核酸キャリパーのビーズ−表面距離（ＢＳＤ−ｔａｒｇｅｔ）を測定することと、
（ｄ）標的がそのネイティブ（非変性）コンフォメーション（ｎａｔｉｖｅ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）である場合に標的に結合された一本鎖核酸ハンドルの結合ポイント間の距離の大きさとして、ＢＳＤ−ｔａｒｇｅｔとＢＳＤ−ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄとの差を決定することと、
を備える方法を提供する。
【００２１】
別の態様において本開示は、
（ａ）前述の核酸キャリパーのいずれかが、基準分子、一本鎖核酸ハンドルが横に位置する標的、及び標的スプリントに結合されているが基準スプリントに結合されていない場合に、第１の端部で表面に、第２の端部でビーズに結合させたこの核酸キャリパーのビーズ−表面距離（ＢＳＤ−ｒｅｆ）を張力をかけた状態で測定することと、
（ｂ）核酸キャリパーから標的スプリントを除去し、核酸キャリパーに基準スプリントをハイブリダイズすることと、
（ｃ）核酸キャリパーが、基準分子、一本鎖核酸ハンドルが横に位置する標的、及び基準スプリントに結合されているが標的スプリントに結合されていない場合に、核酸キャリパーのビーズ−表面距離（ＢＳＤ−ｔａｒｇｅｔ）を張力をかけた状態で測定することと、
（ｄ）標的がそのネイティブ（非変性）コンフォメーションである場合に標的に結合された一本鎖核酸ハンドルの結合ポイント間の距離の大きさとして、ＢＳＤ−ｔａｒｇｅｔとＢＳＤ−ｒｅｆとの差を決定することと、
を備える方法を提供する。
【００２２】
いくつかの実施形態では、この方法は、核酸キャリパーが標的に結合され、キャリパーが基準ドメインを含むならば任意選択的に基準及び基準スプリントにも結合されている場合に、張力をかけた状態かつ変性条件下で核酸キャリパーのビーズ−表面距離を測定して、標的がその変性コンフォメーションである場合に標的に結合された一本鎖核酸ハンドルの結合ポイント間の距離を得ることを更に備える。
【００２３】
いくつかの実施形態では、標的はタンパク質である。いくつかの実施形態では、標的は既知の一次アミノ酸配列のタンパク質である。いくつかの実施形態では、標的は未知の一次アミノ酸配列のタンパク質である。いくつかの実施形態では、標的は核酸ナノ構造である。
【００２４】
いくつかの実施形態では、この方法は、核酸キャリパーが標的に結合され、核酸キャリパーが基準ドメインを含むならば任意選択的に基準及び基準スプリントにも結合され、さらに第１の置換核酸に結合されている場合に、張力をかけた状態かつ第１の置換核酸の存在下で、核酸キャリパーのビーズ−表面距離を測定して、標的に対する一本鎖核酸ハンドルの第１の結合ポイントを識別することを更に備える。
【００２５】
いくつかの実施形態では、この方法は、核酸キャリパーが標的に結合され、キャリパーが基準ドメインを含むならば任意選択的に基準及び基準スプリントにも結合され、さらに第２の置換核酸に結合されている場合に、張力をかけた状態かつ第２の置換核酸の存在下で、核酸キャリパーのビーズ−表面距離を測定して、標的に対する一本鎖核酸ハンドルの第２の結合ポイントを識別することを更に備える。
【００２６】
いくつかの実施形態では、張力は遠心力を含む。
【００２７】
いくつかの実施形態では、ビーズ−表面距離は、反射干渉コントラストを組み込んだ遠心力顕微鏡法（ＲＩＣ−ＣＦＭ）を用いて測定される。
【００２８】
いくつかの実施形態では、張力をかけた状態は、磁力をかけた状態を含む。いくつかの実施形態では、張力をかけた状態は、重力をかけた状態を含む。
【００２９】
いくつかの実施形態では、ハンドルは標的に共有結合される。いくつかの実施形態では、張力をかけた状態は、約３００〜１０００ｐＮの力を意味する。いくつかの実施形態では、張力をかけた状態は、約１０ｐＮ未満の力を意味する。
【００３０】
別の態様において本開示は、
（ａ）核酸キャリパーが、多ユニット標的の第１のユニットのＸａａ残基及び第２のユニットのＸａａ残基に結合されている場合に、第１の端部で表面に、第２の端部でビーズに結合させた核酸キャリパーのビーズ−表面距離を張力をかけた状態で測定することであって、第１及び第２のユニットのＸａａ残基が同一の配列の一本鎖核酸ハンドルに結合されている、ことと、
（ｂ）第１のユニットの第２のＹａａ残基を核酸キャリパーに結合させ、さらに、核酸キャリパーが第１のユニットのＸａａ及びＹａａ残基に結合されている場合に、張力をかけた状態かつ変性条件下で核酸キャリパーのビーズ−表面距離を測定して、第１のユニット上のＸａａ及びＹａａ残基を識別することと、
（ｃ）核酸キャリパーから第１のユニットを分離させ（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅ）、第２のユニットの第２のＹａａ残基を核酸キャリパーに結合させ、さらに、核酸キャリパーが第２のユニットのＸａａ及びＹａａ残基に結合されている場合に、張力をかけた状態かつ変性条件下で核酸キャリパーのビーズ−表面距離を測定して、第２のユニット上のＸａａ及びＹａａ残基を識別することと、
を備える方法を提供する。
【００３１】
いくつかの実施形態では、核酸キャリパーは基準ドメインを備え、（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）の測定は、核酸キャリパーが基準及び基準スプリントに結合されている場合に実施される。
【００３２】
いくつかの実施形態では、多ユニット標的は多ユニットタンパク質である。いくつかの実施形態では、第１及び第２のユニットは既知の一次アミノ酸配列のタンパク質である。いくつかの実施形態では、第１及び第２のユニットは未知の一次アミノ酸配列のタンパク質である。
【００３３】
いくつかの実施形態では、Ｘａａはリシンであり、Ｙａａは変異システインである。
【００３４】
いくつかの実施形態では、張力は遠心力を含む。いくつかの実施形態では、ビーズ−表面距離は、反射干渉コントラストを組み込んだ遠心力顕微鏡法（ＲＩＣ−ＣＦＭ）を用いて測定される。
【００３５】
いくつかの実施形態では、張力は磁力を含む。いくつかの実施形態では、張力は重力を含む。いくつかの実施形態では、第１のユニットは鎖置換を用いて核酸キャリパーから分離される。
【００３６】
いくつかの実施形態では、変性条件はＳＤＳの存在である。
【００３７】
いくつかの実施形態では、ハンドルは標的に共有結合されている。
【００３８】
別の態様において本開示は、
（１）ループドメインを有する核酸キャリパーであって、ループドメインの横に、基準スプリント配列ＲＳＳ１及びＲＳＳ２に相補的な配列がある、核酸キャリパーと、
（２）第１の基準スプリント配列ＲＳＳ１及び第２の基準スプリント配列ＲＳＳ２を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを備えた基準スプリントであって、標的分子が、ＲＳＳ１及びＲＳＳ２配列間で第１の位置において基準スプリントに、第２の位置において第３の基準スプリント配列ＲＳＳ３に結合し、第２及び第３の基準スプリント配列ＲＳＳ１及びＲＳＳ３は配列が同一である、基準スプリントと、を備えるシステムを提供する。核酸キャリパーは、第１及び第２の基準スプリント配列（ＲＳＳ１及びＲＳＳ２）にハイブリダイズされた場合と、第１及び第３の基準スプリント配列（ＲＳＳ１及びＲＳＳ３）にハイブリダイズされた場合に、２つの異なるループ状態を形成する。
【００３９】
いくつかの実施形態では、核酸キャリパーは部分的に二本鎖である。
【００４０】
いくつかの実施形態では、核酸キャリパーは第１の端部でビーズに共役される。いくつかの実施形態では、核酸キャリパーは第１の端部でビーズに、第２の端部で表面に共役される。いくつかの実施形態では、ビーズはマイクロビーズである。いくつかの実施形態では、ビーズは磁気ビーズである。いくつかの実施形態では、核酸キャリパーは固定表面に結合される。
【００４１】
いくつかの実施形態では、標的はタンパク質である。いくつかの実施形態では、標的は既知の一次アミノ酸配列のタンパク質である。いくつかの実施形態では、標的は未知の一次アミノ酸配列のタンパク質である。
【００４２】
いくつかの実施形態では、ループ状態は二本鎖ループ状態である。いくつかの実施形態では、ループ状態は、一度力を低減又は除去したら再生することができる。
【００４３】
別の態様において本開示は、
（ａ）前述の核酸キャリパーが、基準スプリントの第１の基準スプリント配列ＲＳＳ１及び第２の基準スプリント配列ＲＳＳ２にハイブリダイズされている場合に、第１の端部で表面に、第２の端部でビーズに結合させた核酸キャリパーのビーズ−表面距離（ＢＳＤ−ＲＳ）を張力をかけた状態で測定することと、
（ｂ）核酸キャリパーが、基準スプリントの第１の基準スプリント配列ＲＳＳ１及び第３の基準スプリント配列ＲＳＳ３にハイブリダイズされている場合に、核酸キャリパーのビーズ−表面距離（ＢＳＤ−ｔａｒｇｅｔ）を張力をかけた状態で測定することと、
（ｃ）核酸キャリパーが、基準スプリントの第１の基準スプリント配列ＲＳＳ１にハイブリダイズされているが第２の基準スプリント配列ＲＳＳ２又は第３の基準スプリント配列ＲＳＳ３にハイブリダイズされていない場合に、核酸キャリパーのビーズ−表面距離を張力をかけた状態で測定することと、
（ｄ）標的の長さの大きさとして、ＢＳＤ−ｔａｒｇｅｔとＢＳＲ−ＲＳとの差を決定することと、
を備える方法を提供する。
【００４４】
いくつかの実施形態では、標的はタンパク質である。いくつかの実施形態では、標的は既知の一次アミノ酸配列のタンパク質である。いくつかの実施形態では、標的は未知の一次アミノ酸配列のタンパク質である。いくつかの実施形態では、標的は核酸ナノ構造である。
【００４５】
いくつかの実施形態では、張力をかけた状態は、遠心力をかけた状態を意味する。
【００４６】
いくつかの実施形態では、ビーズ−表面距離は、反射干渉コントラストを組み込んだ遠心力顕微鏡法（ＲＩＣ−ＣＦＭ）を用いて測定される。
【００４７】
いくつかの実施形態では、張力をかけた状態は、磁力をかけた状態を意味する。いくつかの実施形態では、張力をかけた状態は、重力をかけた状態を意味する。
【００４８】
別の態様において本開示は、
（ａ）核酸キャリパーが、標的のＸａａ残基及び第１のＹａａ残基に結合されている場合に、第１の端部で表面に、第２の端部でビーズに結合させた核酸キャリパーのビーズ−表面距離を張力をかけた状態で測定することとであって、Ｘａａ及びＹａａ残基が一本鎖核酸ハンドルに結合されている、ことと、
（ｂ）第１のＹａａ残基から核酸キャリパーを分離させ、核酸キャリパーを第２のＹａａ残基に結合させることと、
（ｃ）核酸キャリパーが標的のＸａａ残基及び第２のＹａａ残基に結合されている場合に、核酸キャリパーのビーズ−表面距離を張力をかけた状態で測定することと、
（ｄ）ステップ（ａ）〜（ｃ）を繰り返すことと、
を備える方法を提供する。
【００４９】
いくつかの実施形態では、張力をかけた状態は、約３００〜１０００ｐＮの力を意味する。
【００５０】
いくつかの実施形態では、標的はタンパク質である。
【００５１】
いくつかの実施形態では、この方法は変性条件下で行われる。いくつかの実施形態では、変性条件はＳＤＳの存在を含む。
【００５２】
いくつかの実施形態では、ハンドルはバーコード配列を備える。いくつかの実施形態では、バーコード配列は鎖置換を介してアクセス可能である。いくつかの実施形態では、バーコード配列は核酸ループに存在し入れ子状である。バーコードは線状バーコード又は入れ子状バーコードである。
【００５３】
いくつかの実施形態では、標的は未知の一次アミノ酸配列のタンパク質である。
【００５４】
いくつかの実施形態では、Ｘａａはリシンであり、Ｙａａは変異システインである。
【００５５】
いくつかの実施形態では、張力をかけた状態は、遠心力をかけた状態を意味する。いくつかの実施形態では、ビーズ−表面距離は、反射干渉コントラストを組み込んだ遠心力顕微鏡法（ＲＩＣ−ＣＦＭ）を用いて測定される。
【００５６】
いくつかの実施形態では、張力をかけた状態は、磁力をかけた状態を意味する。いくつかの実施形態では、張力をかけた状態は、重力をかけた状態を意味する。
【００５７】
いくつかの実施形態では、第１のＹａａは鎖置換を用いて核酸キャリパーから分離される。
【００５８】
いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）から（ｃ）は約１０ｐＮ未満の力で多数回行われ、次いでステップ（ａ）から（ｃ）は約３００〜１０００ｐＮの力で多数回行われる。
【００５９】
いくつかの実施形態では、ハンドルは標的に共有結合されている。
【００６０】
いくつかの実施形態では、標的は巨大分子複合体である。いくつかの実施形態では、巨大分子複合体はプロテオームである。いくつかの実施形態では、巨大分子複合体はトランスクリプトームである。
【００６１】
いくつかの実施形態では、標的は多糖であり、残基は糖である。
【００６２】
別の態様において本開示は、
（ａ）各々がテンプレート鎖を備えた複数の標的核酸を提供することと、
（ｂ）デオキシウリジンの存在下で複数の標的核酸に制限されたポリメラーゼ反応を実施し、これによって、テンプレート鎖及びデオキシウリジンを備えた相補的な鎖を有する二本鎖標的核酸を生成することと、
（ｃ）複数の二本鎖標的核酸をウラシルＤＮＡグリコシラーゼに露呈させて１ヌクレオチドのギャップを生成することと、
（ｄ）複数の二本鎖標的核酸をエキソヌクレアーゼに露呈させて１ヌクレオチドのギャップを拡大することと、
（ｅ）拡大したギャップに、バーコード化した架橋性の末端保護したオリゴヌクレオチドをライゲーションする（ｌｉｇａｔｅ）ことと、
（ｆ）オリゴヌクレオチドをテンプレート鎖に架橋することと、
（ｇ）得られた個々のバーコード標的核酸を第１及び第２のバーコード位置で核酸キャリパーに接触させることと、
（ｈ）第１及び第２のバーコード位置間の距離を測定し、第１及び第２のバーコード位置におけるバーコードを識別することと、
（ｉ）第２のバーコード位置からキャリパーを解放し、キャリパーを第３のバーコード位置に再び関連付けることと、
（ｊ）ステップ（ｇ）から（ｉ）を反復し、毎回、１つの位置で標的核酸に対するキャリパーの結合を維持し、新しい位置で標的核酸にキャリパーを結合させることと、
を備える方法を提供する。
【００６３】
別の態様において本開示は、
位置Ｃ１及びＣ２を含む核酸キャリパーを標的に位置Ｘ１及びＹ１で結合させ、これによってＣ１がＸ１に、Ｃ２がＹ１に結合することと、
張力をかけた状態かつ非変性条件下で、Ｘ１とＹ１との間の距離を測定することと、
Ｃ２からＹ１を解放し、任意選択としてキャリパー上の別の位置Ｃ３でＹ１を結合又は維持することと、
キャリパー上の位置Ｃ４を標的上の追加の位置Ｘ２に結合させ、張力をかけた状態で、かつ任意選択として変性条件下で、Ｘ１とＸ２との間の距離を測定し、Ｘ２からＣ４を解放し、Ｘ１の充分な一次配列情報が得られるまで反復することと、
Ｃ１からＸ１を解放することと、
キャリパー上の位置Ｃ５を標的上の追加の位置Ｙ２に結合させ、張力をかけた状態で、かつ任意選択として変性条件下で、Ｙ１とＹ２との間の距離を測定し、Ｙ２からＣ５を解放し、Ｙ１の充分な一次配列情報が得られるまで反復することと、を備え、標的上の各位置が一意のバーコードを有する方法を提供する。
【００６４】
いくつかの実施形態では、Ｃ２及びＣ４は同一の位置である。いくつかの実施形態では、Ｃ１及びＣ５は同一の位置である。
【００６５】
いくつかの実施形態では、バーコードは線状又は入れ子状バーコードである。
【００６６】
いくつかの実施形態では、張力をかけた状態及び非変性条件下は１０ｐＮ未満の力を含む。いくつかの実施形態では、張力をかけた状態及び変性条件下は３００〜１０００ｐＮの範囲の力を含む。
【００６７】
いくつかの実施形態では、キャリパーは第１の端部で表面に、第２の端部でビーズに結合される。
【００６８】
いくつかの実施形態では、キャリパー内の結合は共有結合である。
【００６９】
いくつかの実施形態では、標的上の位置は一本鎖核酸ハンドルでラベリングされている。いくつかの実施形態では、一本鎖核酸ハンドルは一意のバーコードを含む。
【００７０】
いくつかの実施形態では、標的はタンパク質である。いくつかの実施形態では、標的は多成分標的である。
【００７１】
キャリパーは、本明細書に記載するキャリパーのいずれかとすればよい。
【００７２】
様々な前述のシステム及びキャリパーの実施形態において、様々な配列及びドメイン間の結合は共有結合であり得る。
【００７３】
本明細書で提供されるこれら及びその他の態様及び実施形態については、本明細書でさらに詳しく記載する。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】長距離の距離制限を測定するためのキャリパーのブラックボックス概略図である。
【図２Ａ】ＤＮＡベースのナノキャリパーＣＬＰ−Ｉ。スプリント鎖の除去は、そのスプリント鎖に対して完全に相補的な鎖のマイクロ流体導入によって達成される。必要な場合、不要な二次構造を最小限に抑えるため、ｓｓＤＮＡバックボーンの露出領域に相補的なオリゴヌクレオチド（図示せず）をアニーリングすることができる。
【図２Ｂ】核酸ナノ構造の構造決定。鎖のマイクロ流体導入によって、１つの状態から次の状態へとアセンブリを作動させる。状態１では、基準（緑）（例えば既知の長さのｄｓＤＮＡ）を係合させ、「基準」ビーズ高を決定する。状態２では、標的（赤）（例えばＤＮＡナノ構造）を係合させ、ビーズ高を決定する。状態３では、表面対向ハンドルでバーコードループを開放して、ビーズを上昇させる。状態４では、ビーズ対向ハンドルでバーコードループを開放する。ビーズ高の正確な上昇量が、バーコードの素性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を明らかにする。右側はバーコードループの構造である。鎖置換によってループが開放する。同一の鎖を用いて全ての表面対向ハンドルを開放することができる。同一の鎖を用いて全てのビーズ対向ハンドルを開放することができる。表面対向ハンドルの開放に用いる鎖は、ビーズ対向ハンドルの開放に用いる鎖とは異なる。
【図３】ＤＮＡベースのナノキャリパーＣＬＰ−ＩＩを用いた標的複合体距離制限の測定と、多タンパク質複合体の結合ポイントの識別。マスク鎖の除去は、そのマスク鎖に完全に相補的な鎖のマイクロ流体導入によって達成される。簡潔さ及び明確さのため、図２Ａにおけると同様、基準（緑）ドメイン全体及び標的複合体ドメインをアイドルにするための外側のループはここでは省略するが、これらは実際のデバイスに含ませることができる。
【図４】遠心力顕微鏡法（ＣＦＭ）における超並列単一分子測定。ＣＦＭの概略図。回転顕微鏡撮像アームによって観察中にサンプルに遠心力を加えることができる。単一生体分子によってカバースリップに連結された（ｔｅｔｈｅｒ）官能化ビーズを引っ張ることで、単一分子複合体に力を加える。
【図５Ａ】３Ｄ反射干渉コントラスト顕微鏡法の概要。単色源（ｓ）、偏光子（ｐ１及びｐ２）、ビームスプリッタ（ｂｓ）、対物レンズ（ｏ）、及び４分の１波長板（ｑｗ）を有する撮像光路の概略図。下部に、３つの異なる高さ（１０μｍスケールバー）における７．５μｍビーズのＲＩＣＭパターンを示す。
【図５Ｂ】動作原理を示す単純なモデル。
【図５Ｃ】本明細書に提供するモデルによるミクロスフェア及び取り付け（ｆｉｔ）からの半径方向強度プロファイルの例。
【図５Ｄ】力を加えない状態（下部）及び２つのレーザパワーで光トラップから張力を加えた状態（上部）の、連結されたビーズの高分解能３Ｄ位置マップ。
【図６】力を加えると破れて開く多数の入れ子状ループから成る力−バーコードＤＮＡナノスイッチの想定される設計。これによって、最大で百万の異なるナノキャリパー複合体の一意の識別が可能となる。
【図７Ａ】ＤＮＡキャリパーシステムのための実験設計。（Ａ）基準スプリントが係合されている。（Ｂ）標的が係合されている。（Ｃ）ループが開放している。
【図８】２光学トラップ設定で行われる予備実験の実験設計である。スプリントの２つの異なる部分が別個に係合されてループを形成し（Ａ及びＢ）、力によって開放ループに遷移することができる（Ｃ）。単一のテザーでの測定の繰り返しから得られたループ長測定値のヒストグラム（Ｄ）。この設定は、画像ベースの位置追跡のため、ＲＩＣＭにおける干渉ベースの測定に対して空間分解能が低い。
【図１０Ａ】２００ｎｍ  ｄｓＤＮＡテザーを用いてビーズが表面に連結された設定におけるビーズ下部位置について算出した分布。
【図１０Ｂ】同一の設定についてのシミュレーションデータ。
【図１１】基準長が５０ｎｍであり標的長が４０ｎｍである、図２Ｂに概説した実験設定のシミュレーション時系列データ。青（周辺）の点はシミュレーションデータであり、オレンジ（中央）の点は２０フレーム移動平均である。プラトーは異なる状態を表す。左から右へ（及び最下部から最上部へ）向かって、以下の通りである。状態１は係合した基準を表す。状態２は係合した標的を表す。状態３は、解放されて拡張した、カバースリップに面したバーコードを表す。状態４は、解放されて拡張した双方のバーコードを表す。
【発明を実施するための形態】
【００７５】
本明細書で提供される方法は、対象標的の完全な３Ｄ構造を含む構造的特徴を決定するために用いられる。このような標的は、限定ではないが、核酸ナノ構造、タンパク質、多タンパク質複合体、タンパク質−核酸複合体等を含む。ある方向で（すなわち非ランダムに）核酸への結合を介して表面修飾することが可能ないかなる標的も、本明細書に提供する方法に従って解析することができる。
【００７６】
本明細書で提供されるいくつかの方法は、タンパク質及び多タンパク質複合体のような個々の標的を、ナノスケールの核酸キャリパーを用いて伸張し、限定ではないが遠心力顕微鏡法等の高スループットかつ高分解能の手段を用いて、そのようなキャリパーの伸張時の距離を測定する。重要なことは、これらの方法が単一分子レベルで実施可能であり、したがって、いくつかの既存の方法のバルク集団解析によって妨げられないことである。
【００７７】
これらの方法を用いて、様々な張力レベルで伸張されているか、又は例えば結合パートナーとの結合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）又は分離（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）を含む別の方法で操作されている標的上の距離を測定することができる。また、これらの方法を用いて、以前に分解したサブユニット成分から大きい多成分複合体のダイナミクスをモデル化することができ、又は、場合によっては新たな構造を予測することも可能である。
【００７８】
以下でさらに具体的に説明するこれらの方法は、ごく少量のみのサンプル（又は標的）を用い、そのようなサンプル又は標的の調製又は修飾を最小限に抑えて実施することができる。例えばタンパク質の構造決定の状況では、システイン工学は最小限しか必要でないか又は全く必要ない。２Å空間分解能の測定値を、１時間当たり数百万の標的装着キャリパーで収集して、その各々を１００ｍｓ期間で積分するか、又は、１時間当たり数千の標的装着キャリパーでミリ秒の時間分解能で収集することができる。
【００７９】
本明細書で提供される様々な方法は、ＲＩＣ（Ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  Ｃｏｎｔｒａｓｔ：反射干渉コントラスト）−ＣＦＭを組み込んだＣＦＭ（Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  Ｆｏｒｃｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：遠心力顕微鏡法）を用いて実施すればよい。ＲＩＣ−ＣＦＭを用いて、各々がビーズと表面との間に結合された個別の標的装着ナノキャリパーの並行かつ高分解能の解析を達成し、これによって高いスループット及び容易な実施を提供することができる。ＲＩＣ−ＣＦＭは、オングストロームの空間分解能とミリ秒の時間分解能を達成することができる。
【００８０】
一般的な長距離の距離測定
図１に、本明細書で提供される長距離の距離測定方法の基本的な論理を示す。また、この方法をもっと具体的に概説する図２から図７も参照することができる。
【００８１】
標的タンパク質、核酸、又は複合体のような標的は、その表面残基の２つが、本明細書でキャリパー又はナノキャリパーとも称することがある核酸に固定されている。核酸自体は、一端が表面に、他端がマイクロビーズ等のビーズに結合されている。ビーズは、遠心力を用いて（又は、磁気ビーズの場合は磁力を用いて）表面から離れる方向に移動させることができる。ビーズは、重力を用いて表面から離れる方向に移動させてもよい。この方法の様々な時点でビーズ−表面距離を測定し、そのような距離の変化を用いて標的上の２つの結合ポイント間の距離を決定し、したがって標的の構造を決定する。
【００８２】
いくつかの実施形態では、以下で説明するように、ビーズ−表面距離（ＢＳＤ）は基準状態に対して測定される。基準状態とは、取り付けられた標的がＢＳＤを決定する状態に対して、取り付けられた較正基準がＢＳＤを決定する状態である。この測定値の差を用いて、標的上の２つの結合ポイント間の距離を推測することができる。
【００８３】
本開示では、双方の結合ポイントが既知であるケースを想定している。例えば、結合ポイントは、タンパクの一次構造内の位置が既知である２つの特定の残基である場合がある。
【００８４】
本開示では、結合が行われる残基が既知のタイプであるが未知の位置であるケースも想定している。例えば、結合ポイントは２つのリシンである（使用する結合の化学的性質のため）が、これらのリシンは、標的タンパク質の一次アミノ酸配列内の位置が未知である場合がある。換言すると、いくつかの例では、結合ポイントはリシンであるが、標的タンパク質内のどの特定のリシンであるかは既知でない。
【００８５】
こういった後者のケースでは、変性条件下で輪郭長まで延伸させた標的について、追加のＢＳＤを測定する。この距離は一次配列内の介在残基の数によって決まるので、これを用いて結合対の素性（すなわち標的タンパク質という文脈における一次アミノ酸配列内の位置）を推定することができる。重要なことは、この変性による結合ポイント識別は、標的タンパク質の部位特異的な標識の必要性を劇的に軽減することである。
【００８６】
本明細書で検討するように、第２のケースは、核酸ナノ構造上の一本鎖（ｓｓ）核酸「ハンドル」の位置及び距離の決定にも適用することができる。
【００８７】
本明細書でさらに詳しく検討するように、この方法を多タンパク質複合体に拡張することも可能である。この場合、複合体の個々のサブユニットを単一システイン変異体として表すことができ、その各々を２つの別個の一本鎖核酸「ハンドル」で標識し、次いで完全な多成分アセンブリに再構成する（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅ）。これにより、複合体の異なるサブユニット上の残基間の距離を決定することができる。
【００８８】
単一ユニット標的の高スループット構造解析
解析対象の標的は、特定の部位で、一本鎖核酸ハンドル（簡潔さのため、また一例として、これらをｓｓＤＮＡ「ハンドル」と称することがある）の結合によって修飾されている。これらの部位は、標的の表面上の部位サブセットとすることができる（例えば全表面リシン）。
【００８９】
この方法を用いて、標的タンパク質上の２つの部位に結合させたこれらの短いｓｓＤＮＡ「ハンドル」間の距離を測定する。ハンドルは、各々がアミノ酸特異性を有する多種多様な化学的性質を用いて標的タンパク質に結合させることができる。一例として、標的タンパク質の表面上の２つのランダムに選択したリシンは、ＮＨＳ−官能化オリゴヌクレオチドと反応して、表面アクセス可能であるランダムなリシンに２つのｓｓＤＮＡハンドルが結合した標的タンパク質を形成する。同様に、他の化学的性質を用いて他の表面残基に結合することができる。例えば、チオール特異的試薬を用いてシステインに結合することができ、アミン特異的試薬を用いてタンパク質のアミノ末端又はリシン）に結合することができ、カルボキシル特異的試薬を用いてタンパク質のカルボキシル末端又はアスパラギン酸塩又はグルタミン酸塩に結合することができ、グアニジン特異的試薬を用いてアルギニンに結合することができ、イミダゾール特異的試薬を用いてヒスチジンに結合することができ、フェノール特異的試薬を用いてチロシンに結合することができ、インドール特異的試薬を用いてトリプトファンに結合することができ、アミノ末端特異的試薬を用いてタンパク質のアミノ末端に結合することができ、カルボキシ末端特異的試薬を用いてカルボキシ末端に結合することができる。Ｂａｓｌｅ等のＣｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１７：２１３は、そのような様々な化学的性質について記載しており、援用により本明細書にも含まれるものとする。
【００９０】
第１の測定は２つのハンドル間の距離であり、これは２つの表面残基間の距離を表す。第２の測定は変性条件下での２つのハンドル間の距離である。この後者の測定は、標的タンパク質の一次アミノ酸配列内でのこれらの残基の位置を識別する。
【００９１】
図２Ａに、ＣＬＰ−Ｉと称するナノキャリパーの一例を示す。このナノキャリパーは、外力（例えば５〜３０ｐＮの光学トラップ又は遠心力の牽引）によってぴんと張られた、表面とビーズとの間に取り付けた長いｓｓＤＮＡから成る。この鎖は、２つの別個のドメインに構成され（「標的」（赤）ドメインと「基準」（緑）ドメイン）、各々は入れ子状ループから成る。各内側ループの狭窄部は、ゲスト分子によって橋渡しされている。標的内側ループは標的に結合されている。基準内側ループは既知の長さの較正標準に結合されている（限定ではないがｄｓＤＮＡ等）。ｓｓＤＮＡハンドル及びナノキャリパーは相補的配列を有するように設計され、これによってナノキャリパーの特定領域で標的の結合を可能とし、結果としてループ形成を可能とする。また、標的スプリントも、ナノキャリパーに対して相補的配列を有するように設計されている。標的スプリントは、標的のナノキャリパーへの結合を容易にし、及び／又は標的装着ナノキャリパーを安定化するように機能することができる。標的スプリントは、標的における距離を測定するため、例えば鎖置換プロセスによって除去することができる。
【００９２】
いくつかの例では、図２Ａに示すようにナノキャリパーは基準領域を備えている。他の例では、ナノキャリパーは基準領域を備えていない。
【００９３】
基準領域を備えたナノキャリパーを用いる場合、基準分子も同様にｓｓＤＮＡハンドルを有する。これらのハンドル及びナノキャリパーも相補的配列を有するように設計され、これによってナノキャリパーの特定領域で基準分子の結合を可能とし、結果としてループ形成を可能とする。また、ナノキャリパーに対して相補的配列を有するように設計された基準スプリントも用いることができる。基準スプリントは、基準分子のナノキャリパーへの結合を容易にし、及び／又は基準装着ナノキャリパーを安定化するように機能することができる。基準スプリントは、基準における距離を測定し、これによってナノキャリパーを較正するため、例えば鎖置換プロセスによって除去することができる。
【００９４】
このように、各標的について、キャリパーと、標的に結合させた（かつ、キャリパーに対して相補的配列を有する）一本鎖オリゴヌクレオチドと、標的スプリントとして用いられる一本鎖オリゴヌクレオチドと、を備えるシステムが存在する。さらに、このシステムは、基準に結合させた（又は基準の一部である）（かつ、キャリパーに対して相補的配列を有する）一本鎖オリゴヌクレオチドと、基準スプリントとして用いられる一本鎖オリゴヌクレオチドと、を備え得る。また、このシステムは基準分子自体も備え得る。このシステムは、標的スプリント及び基準スプリントを置換するために用いられる一本鎖オリゴヌクレオチドも備え得る。標的スプリントと基準スプリントのヌクレオチド配列は異なるので、これに応じて、標的スプリント及び基準スプリントを置換するために用いられるオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列も異なる。同様に、標的ｓｓＤＮＡハンドルのヌクレオチド配列は、基準ｓｓＤＮＡハンドルとは異なる。図２Ａから容易に明らかであるように、各スプリントはキャリパー上の非連続配列に結合し、これによってループを形成する。同様に、各標的及び基準はキャリパー上の非連続配列に結合し、これによってループを形成する。
【００９５】
簡潔さのため、ｓｓＤＮＡという用語は、本開示において非限定的に用いられ、限定ではないが一本鎖ＤＮＡを含む一本鎖核酸を概ね表すことを意図していることは理解されよう。同様に、ナノキャリパーという用語は、本開示において非限定的に用いられ、本明細書に記載するように機能するのに充分な長さの一本鎖核酸を表すことを意図している。キャリパー及びナノキャリパーという用語は交換可能に用いられる。
【００９６】
スプリント鎖が存在する場合、ドメインは「アイドル」である。これを図２Ａでは「状態０」と示す。ＢＳＤは、ゲスト分子からの干渉が存在しないキャリパー自体の長さを表す（すなわち、結合させたゲストの長さはドメイン又はキャリパー全体の長さに影響を及ぼさない）。
【００９７】
基準スプリントを（例えば鎖置換によって）除去した場合、ＢＳＤの変化は、基準分子上のｓｓＤＮＡハンドル間の距離を表す。これを図２Ａでは「状態１」と示す。典型的に、基準分子は、結合したｓｓＤＮＡ間の距離として明らかになる。基準分子はタンパク質とすることができ、場合によっては輪郭長まで伸張させる。一度基準スプリントが存在しないＢＳＤを測定したら、基準スプリントをキャリパーに再投入し、リハイブリダイズすることで、基準ループを再形成することができる。
【００９８】
次いで、標的スプリントを（例えば鎖置換によって）除去し、再びＢＳＤを測定する。これを図２Ａでは「状態２」と示す。標的（赤）ドメインの外側ループのみが解放されている状態２と、基準（緑）ドメインの外側ループのみが解放されている状態１との間で、ＢＳＤの差を測定する。この差を本明細書ではΔｚ２→１と示す。次いで、図２Ａに示すように、非変性形態の標的上のハンドル間の未知の距離を表す距離ｄｔａｒｇｅｔを、既知の距離ｄｒｅｆｅｒｅｎｃｅからのオフセット測定値として得ることができる。
【００９９】
このため、キャリパーと混合する際に、キャリパー上でドッキングするため、各標的からハンドル官能化リシンの２つをランダムに選択する。次いで、Δｚ２→１を記録した後、図２Ａに示すように状態３を形成するため、標的を変性条件下とすることができる。変性条件は標的の性質によって決まる。例えば、タンパク質変性はＳＤＳの存在下で実施することができる。次いで、Δｚ３→２と称する状態３と状態２との間のＢＳＤの差を測定することができる。これは、変性後の標的の輪郭長までの延伸を表す。したがって、標的タンパク質の場合の一次アミノ酸配列内の残基の数ｎを、以下のように推論することができる。
【数１】
2017514467.tif 000003
ここで、ｄｃα−ｃαは、外力を加えて延伸させたポリペプチド鎖における隣接したα炭素間の距離である。介在残基のこの数ｎは、リシン対を一意に識別するか、又は少なくとも起こり得る対合を大幅に制限する。
【０１００】
本開示に基づいて理解されるように、モノマータンパク質等のモノマー標的では、標的のシステイン工学は必要ない。しかしながら、単一システイン変異体を有する標的を発生させ、次いでこれらの標的の各々に１つのマレイミド−ｓｓＤＮＡハンドル（システイン変異体に特異的）及び１つのＮＨＳ−ｓｓＤＮＡハンドル（リシンに特異的）を結合させることを伴う中間ハンドル標識手法が用いられる場合がある。ｎの決定を用いると、どのシステイン−リシン対がｓｓＤＮＡハンドルで標識されているか推論できるので、ネイティブシステインを除去する必要はない。
【０１０１】
標的上の他のいずれかの化学的に不安定な位置（例えば標的タンパク質の状況におけるアミノ末端又はチロシン）を、ｓｓＤＮＡハンドルの結合ポイントとして用いることができる。標的タンパク質の様々な残基を標的とするために使用可能な反応部分又は反応基については、Ｂａｓｌｅらの「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ」（Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．  １７．２１３〜２２７、２０１０年）を参照することができる。
【０１０２】
核酸ナノ構造の高スループット構造解析
核酸ナノ構造ベースのデバイスは、多くの用途に有望である（Ｐｉｎｈｅｉｒｏ等、Ｎａｔ．  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．６：７６３〜７７２、２０１１年）。本開示の方法を用いて、核酸ナノ構造の原子分解能構造を決定することができる。上述の態様と同様、本開示のこの態様は、折り紙合成手法を用いて形成されたＤＮＡナノ構造のような核酸ナノ構造の表面に示された核酸（例えばｓｓＤＮＡ）ハンドル対間の距離をオングストロームの分解能で測定する高スループットの方法を提供する。この方法では、２つのハンドルは長いｓｓＤＮＡのセグメントに結合してループを形成する。このｓｓＤＮＡは、表面と、遠心力（又は磁力又は重力）によって離れる方向に引っ張られるマイクロビーズ等のビーズとの間に懸架されている。各ビーズの静止高（ｒｅｓｔｉｎｇ  ｈｅｉｇｈｔ）はハンドル間の距離を反映し、１時間当たり数百万のビーズの位置を得ることができる。これらの単一ビーズ（したがって単一ナノ構造）測定により、ＤＮＡナノ構造の静的及び動的な不均質性に関する詳細が得られる。
【０１０３】
この方法を用いて、標的核酸ナノ構造（ＮＮＳ：ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）の表面に示された２つのｓｓＤＮＡハンドル間の距離を測定する（図２Ｂの上部又は赤の矩形）。これを可能とするため、ｓｓＤＮＡハンドルを一本鎖核酸（本明細書でキャリパーと称する）にハイブリダイズすることで、図２Ｂに示すようにキャリパーのセグメントをループ状にする。次いで、キャリパーの一端を表面に結合させ、他端をマイクロビーズ等のビーズに結合させる。力を加えて、表面から離れる方向にビーズを伸張させた後、ビーズの位置を決定し、これを用いて標的上の２つのハンドル間の距離を推論することができる。この方法は、較正又は基準を用いても又は用いなくても実施し得る。図２Ｂは、（図２Ａと同様に）標的及び基準ドメインを備えるキャリパーを示す。基準分子上のハンドル間の距離は既知である。このような基準の一例は、規定の長さのｄｓＤＮＡである（図２Ｂの下部又は緑の矩形）。
【０１０４】
本開示は、標的ＮＮＳが一回だけ折り畳まれて、多数の表面対向ハンドル及び多数のビーズ対向ハンドルが同時に示されていることを想定する。個々のキャリパーに対する個々の標的の結合は、単一の表面対向ハンドル及び単一のビーズ対向ハンドルをランダムに選択する。これら２つのハンドル間の距離を決定した後、２つのハンドルの素性（すなわち、各々がどのステープル鎖（ｓｔａｐｌｅ  ｓｔｒａｎｄ）に結合されているか）を、ハンドルに埋め込んだバーコードを読み取ることで識別することができる。ここで、各ハンドルは、例えば鎖置換によって解放することができるループ状の「バーコード」ドメインを有する。ハンドルは、全ての表面対向ハンドルが同一の鎖で開き、同様に全てのビーズ対向ハンドルがその鎖で開くように設計することができる。このため、表面対向ハンドルは同一のヘアピンドメインを有するが、ループ状配列の長さは相互に異なる。同様に、ビーズ対向ハンドルは同一のヘアピンドメインを有するが、ループ状配列の長さは相互に異なる。ハンドルを「識別する」のは、ループ状配列の長さである。図２Ｂでは、まず表面対向ハンドルを開放し（状態３）、次いでビーズ対向ハンドルを開放する（状態４）。ループ開放が起こると、ビーズは新しい位置まで上昇して、解放によるたるみをなくす。
【０１０５】
図２Ｂに説明するシステムの性能を推定するため、実験を行って、表面結合ビーズテザーシステムの熱雑音分布をシミュレーションした。このシミュレーションは、テザーのための現実的なポリマーモデルを用い、ビーズの並進及び回転の双方の自由度についても行った。図９Ａは、輪郭長が２００ｎｍ、ビーズ半径が１．５μｍ、力が８ｐＮであるｄｓＤＮＡテザーについて、室温での熱的効果によるビーズ下部の典型的な位置分布を示す。ＲＩＣＭパターンから測定される高さの標準偏差は１．８ｎｍと計算される。図９Ｂは、この分布からサンプリングしたシミュレーションデータを示す。１００Ｈｚのフレームレート及び１秒の観察時間で、２オングストローム未満の標準誤差を達成することができた。以前の研究から、機器の分解能は１〜２オングストロームであると予想される（Ｗｏｎｇ等、ＭＲＳ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  Ｖｏｌ７９０、Ｐ５  １、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖ  Ｐｒｅｓｓ２００３年）。また、画像ぶれ解析を利用する以前開発された撮像技法を用いて、位置特定（ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）を更に改善することが考えられる（Ｗｏｎｇ  及び  Ｈａｌｖｏｒｓｅｎ、Ｏｐｔｉｃｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ、１４、１２５１７〜１２５３１、２００６年）。
【０１０６】
これらの計算を用いて、図２Ｂに説明するような完全な実験をシミュレーションした。図１０Ｂに、シミュレーション時系列データセットを示す（データ：青（散らばった周辺部の点）、２０フレーム移動平均：オレンジ（中央部の点））。これは、別個のｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、基準領域、及び標的領域を考慮に入れている。これらのいっそう詳細な計算により、図２Ｂの設計のオングストローム分解能の能力が裏付けられる。
【０１０７】
多成分標的のための長距離の距離測定
多タンパク質複合体では、２つの別個のサブユニットがキャリパーに結合されている場合、（例えばＳＤＳによる）変性によってこれら２つのサブユニット間の接続が壊れる。しかしながら、図３に概要を示すように、組み換え型サブユニットから複合体を再構成することができる場合は、結合残基を識別するための変性方法を依然として用いることができる。このケースにおいて、複合体は、赤、グレー、及びオレンジで示す３つのサブユニットから成る。赤及びオレンジのサブユニットは、各々が一意のシステイン（又は他のいずれかの一意の反応性、例えばアミノ末端）を有する変異体として別個に表される。次いで、「薄い赤」のマレイミドハンドルを赤のサブユニットの一意のシステインに結合させ、「濃い赤」のＮＨＳ−ハンドルを赤のサブユニットのランダムなリシンに結合させる。同様に、「薄いオレンジ」のマレイミドハンドル及び「濃いオレンジ」のＮＨＳハンドルをそれぞれオレンジのタンパク質の一意のシステイン及びランダムなリシンに結合させる。４つのハンドルは全て別個の配列を有する。次に、官能化した赤のサブユニット、グレーのサブユニット、及び官能化したオレンジのサブユニットを完全な複合体に再構成し、ＣＬＰ−ＩＩと称するナノキャリパー上で、「濃い赤」の（赤のサブユニットのリシンに結合した）ハンドル及び「濃いオレンジ」の（オレンジのサブユニットのリシンに結合した）ハンドルを介してドッキングして、図３に示す状態２を達成する。
【０１０８】
前のパラグラフで説明したように係合させた標的複合体（状態２）と、係合させた較正基準（状態１、簡潔さ及び明確さのため図３では省略している）との間のビーズｚ位置の比較を用いて、「濃い赤」の（赤のサブユニットのリシンに結合した）ハンドルと「濃いオレンジ」の（オレンジのサブユニットのリシンに結合した）ハンドルとの間の距離ｄｔａｒｇｅｔ  ｃｏｍｐｌｅｘを得ることができる。
【数２】
2017514467.tif 000004
【０１０９】
次のステップは、「濃い赤」の（赤のサブユニットのリシンに結合した）ハンドルに結合したリシン残基を識別することである。まず、複合体を（例えばＳＤＳによって）変性させ、「薄い赤」の（赤のサブユニットのシステインに結合した）ハンドルを、鎖置換によって除去（ｄｅｍａｓｋ）し、続いて、「濃いオレンジ」の（オレンジのサブユニットのリシンに結合した）ハンドルが結合されている部位よりも下でナノキャリパーにドッキングして、状態３を達成する。ここで、「濃い赤」の（赤のサブユニットのリシンに結合した）ハンドルと「薄い赤」の（赤のサブユニットのシステインに結合した）ハンドルとの間の残基の数を、以下のように得ることができる。
【数３】
2017514467.tif 000005
ここで、Δｚ＋は、状態３又は状態４と比較して状態２に存在する余分の長さによる補正率である。
【０１１０】
最後のステップは、「濃いオレンジ」の（オレンジのサブユニットのリシンに結合した）ハンドルに結合したリシン残基を識別することである。「薄いオレンジ」の（オレンジのサブユニットのシステインに結合した）ハンドルを、鎖置換によって除去し、「濃い赤」の（赤のサブユニットのリシンに結合した）ハンドルよりも上の位置にドッキングし、次いで赤の標的を鎖置換によって完全に除去して、状態４を達成する。ここで、「薄いオレンジ」の（オレンジのサブユニットのシステインに結合した）ハンドルと、「濃いオレンジ」の（オレンジのサブユニットのリシンに結合した）ハンドルとの間の残基の数を、以下のように得ることができる。
【数４】
2017514467.tif 000006
【０１１１】
力によって作動するＤＮＡキャリパー
本開示はさらに、力によって作動する再構成可能なＤＮＡテザーを用いて巨大分子の距離測定を行うために用いられる別のＤＮＡキャリパー設計を想定し、これを提供する。この実施形態では鎖置換が機能する必要はないので、一体型の流体交換システムを実施することなく、我々の既存の単一分子機器を用いてＤＮＡキャリパー測定を行うことができる。この手法の１つの例示を図７Ａ〜図７Ｃに示す。簡潔に述べると、ビーズを表面に結び付けるＤＮＡテザーは、２つの異なるループ状態を形成することができる。その一方は、標的分子（又は標的）が力線内にあり、もう一方は、標的分子が存在しない。力を加えてこれら２つの異なるループ状態を開放し、さらにこれら２つの状態間の長さの変化を比べることで、標的分子上の２つの結合ポイント間の距離を決定することができる。
【０１１２】
図７Ａ〜図７Ｃにおいて、上方向の静止力（〜８ｐＮ）をビーズに加えて、ＤＮＡテザーを伸張する。テザーに結合している構造は、２つの別個の配列（青−緑で示す）のｓｓＤＮＡスプリントから成り、これらが相補的なハイブリダイゼーションによってテザー上の２つの領域にラッチしてループを形成する（図７Ａでは、この構造を、ループの上流及び下流の配列にハイブリダイズさせた２つの配列として示す。）標的分子（赤の矩形）は、２つの配列間でスプリントの内側ポイントに結合されている。標的分子上の別のポイントは、配列がスプリントの一方側（緑で示す）と同一であるｓｓＤＮＡハンドルを有する（赤で示し、本明細書では標的ハンドルと称する）。標的分子又はその一部に結合されたｓｓＤＮＡハンドルは、図７Ａでは矩形から延出して図示され、したがってテザーにハイブリダイズされていないが、図７Ｂではテザーにハイブリダイズされている。この時点で鎖はすでに置換され、ハイブリダイズされずに延出して図示されている。測定は、以下のステップを実施することで行われる。
【０１１３】
ステップ１：  テザーがループ状態である場合のビーズ−表面距離を測定する（ｚ１又はｚ２）。
ステップ２：  力を加えることによってループを壊し、ループでない状態でビーズ−表面距離を再び測定する（ｚ３）。
ステップ３：  これら２つの測定値間の差を、このサイクルのループ長測定値として取得する（ΔＬ。図７Ａ〜図７Ｃの式を参照のこと）。
ステップ４：  テザーを緩め、ループを再形成してサイクルを繰り返す。ランダムに、標的ハンドル又はスプリントの一方側を結合させる。
解析：  ループ長測定値（ΔＬ１及びΔＬ２）の２つの集団を分解する。平均値間の距離が、標的の長さ（すなわち矩形の長さ）を与える。ビーズは全サイクルで高さｚ３に達し、これによってエンドユーザは測定値間のドリフトをチェックすることができる。
【０１１４】
図７Ａ〜図７Ｃに示すものよりも低い空間分解能設定（すなわち、ＲＩＣＭを用いて達成できる分解能よりも低い分解能）を用いて、前述の設計の変形である予備実験を行った。この実験の設計を図８Ａ〜図８Ｃに示し、データを図８Ｄに示す。簡潔に述べると、Ｍ１３ＤＮＡの形態のテザーが、２つの光学トラップによって保持された２つのビーズ間に捕獲されている。テザーは、一端でビオチン−ストレプトアビジン相互作用によって、他端でジゴキシゲニン−抗ジゴキシゲニン抗体相互作用によって、ビーズに結合させた。テザー上のループ形成ｓｓＤＮＡスプリントは３つの部分から成る。すなわち、テザー上の特定領域に対して相補的な４０塩基長のアンカー部（シアン、最も左側の配列で示す）と、テザー上の異なる領域に対して相補的な２つの同一の２０ベース長の部分（赤及び緑、中央及び最も右側の配列で示す）である。テザーの残り部分は、二次構造を除去するように、ＤＮＡの相補的な断片で覆った（ループ形成スプリントの配列５’及び３’）。
【０１１５】
実験は以下のように行った。
ステップ１：テザーがループ状態である場合のビーズ間距離を測定する（Ｄ１又はＤ２）。
ステップ２：  力を加えることにより（〜５０ｐＮ）、スプリントの２０塩基対側を切断して、テザーの全長を測定する（Ｄ３）。
ステップ３：  これら２つの測定値間の差を、このサイクルのループ長測定値として取得する（ΔＬ。図８Ａ〜図８Ｃの式を参照のこと）。
ステップ４：  ビーズを近付けてテザーを緩め、２０塩基長断片の一方のハイブリダイゼーションによって急速に（〜３０秒）ループを再形成する。
【０１１６】
このサイクルは、１つのテザーにつき多数回（例えば１０〜２０回以上）、又は典型的に構造内の他の場所で構造的な欠陥が観察されるまで、繰り返すことができる。そのような構造的な欠陥は、共有結合を用いることで回避され得る。図８Ｄは、こういった予備実験の１つからの長さ測定値のヒストグラムである。この少数の測定値だけでもわかるように、約１５ｎｍ離間した２つのピークを分解することができ、これは、この特定の２ビーズ光学トラップ設定の〜２ｎｍの予想される分解能内で２０塩基対ｓｓＤＮＡ分子について予想される長さである。この分解能は、例えば公開特許出願ＵＳ２０１３０２８８３４９号に記載されているＲＩＣＭの使用によって上げることができる。この実験の結果によって、ある部分が他の部分よりも結合する確率が高くなる、使用する特定の構造内の立体効果も明らかになる。
【０１１７】
バーコード
本明細書に記載する核酸システムを、「ＤＮＡ操作（ＤＮＡ−Ｐｕｐｐｅｔｅｅｒｅｄ）キャリパー」又はＤＰＣと称することができる。ＤＰＣは多種多様な用途に使用され得る。そのような用途について説明する前に、以下にＤＰＣの機能について簡潔な説明を行う。
【０１１８】
ＤＰＣの動作は、２つの基本的な操作を繰り返すこと含む。
（１）新しい配向の標的（又はアナライト）を力支持経路に係合し、他の標的（又はアナライト）を非力支持経路又は各デバイスの分岐に離脱させる（ｄｉｓｅｎｇａｇｅ）ための再構成（鎖置換又は他の摂動（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）による）。
（２）各デバイスの力支持経路の力−延伸曲線の高スループットかつ高分解能のサンプリング。
【０１１９】
ＤＰＣを用いて、生体高分子及びそれらの複合体についての３種類の情報を決定することができる。
（１）１Ｄ配列指紋。これは、規定の側鎖タイプの残基についての生体高分子鎖の一次配列内の対距離セットである（例えばレシン−レシン距離、システイン−レシン距離）。
（２）３Ｄ表面指紋。これは、ネイティブ標的の表面上の残基間の対距離セットであると共に、それらの各残基の一次配列素性の識別である。
（３）バーコード読み取り値。これは、標的アナライトに結合させたｓｓＤＮＡバーコード内に埋め込まれた情報の復号である。
【０１２０】
以下で説明するように、３Ｄ表面指紋は、バーコード読み取り値及び１Ｄ配列指紋の双方によって支援される。
【０１２１】
指紋法は、キャリパーに対する潜在的な結合ポイントとして機能するｓｓＤＮＡハンドルによってランダムにサンプリングした残基における標的のラベリングを行うことで実施される。ｓｓＤＮＡハンドルはさらに、結合される残基タイプ（例えばシステイン、リシン等）のような情報をデジタル符号化するＤＰＣ復号可能バーコードを含むことができる。別の重要な情報タイプは、キャリパーによって以前にサンプリングしたハンドルを識別するために使用可能である、ランダムに選択した一意のバーコードである（迷路を横切る際に交差点で使われる一意の色付けのフラグに似ている）。他の種類の情報には、標的の履歴が含まれ得る。これは例えば、組み換え型で生成された場合にどの変異体を有するか（すなわち、その相対的な遺伝子型）、どの環境条件を経験したか（例えば過去に応力を受けた）、いつどこで標識されたか等である。
【０１２２】
１Ｄ配列指紋を決定するには、２脚分子クローラ（ｃｒａｗｌｅｒ）（すなわちキャリパー）によって、一本鎖上の２つのハンドルをランダムに把持し、比較的大きい力（例えば３００〜１０００ｐＮ）で引っ張ってその介在セグメントをほぼ輪郭長まで伸張し、次いでその長さを報告して一次配列における距離の推論を可能とすればよい。残基のタイプ（例えばシステイン、リシン等）は、ハンドルに埋め込まれたバーコードを復号することによって読み取り可能となる。また、この時に一意の識別子バーコードも読み取ることができる。次いで、クローラは一方のハンドルを解放し、同じ生体高分子鎖上の別のハンドルをランダムに把持して、サイクルが繰り返す。このように、鎖の部分配列と同等の、多数の一次配列の相関性を得ることができる。
【０１２３】
３Ｄ表面指紋は、標的上の２つのハンドルをランダムに把持する２脚分子クローラ（すなわちキャリパー）によって決定することができるが、この時、比較的小さい力（すなわち１０ｐＮ未満、例えば８ｐＮを含む）を用いるので、標的を変性させない。この時に一意の識別子バーコードを読み取ることができる。次いで、クローラは一方のハンドルを解放し、同じ標的上の別のハンドルをランダムに把持して、サイクルが繰り返す。このように、単一の標的の表面をサンプリングするポイントについて、多数の対距離測定を行うことができる。以降の段階で、同じ標的に対して大きい力で解析を繰り返して、複合体の各成分鎖（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｃｈａｉｎ）の１Ｄ配列指紋を決定する。ＩＤ指紋法段階の間に読み取った識別子バーコードのインデックス作成によって、３Ｄ表面指紋法の間に把持された各ハンドルの配列識別の割り当てが可能となる。キャリパーは、構成標的鎖を変性させる条件下で動作している間に解放させない鎖上で１Ｄ配列指紋を取得できるだけであることに留意すべきである。したがってキャリパーは、１Ｄシーケンス指紋法によって所与の標的の多数の鎖を順次解析できるように、多数の鎖を保持する多数のアームを持たなければならない。
【０１２４】
このため、一例として、本明細書に記載するキャリパーを使用して、２ステッププロセスを用いて多成分標的等の標的をマッピングすることができる。まず、キャリパーを、標的上の第１の位置Ｘ１及び第２の位置Ｙ１にランダムに結合させる。キャリパーは、Ｃ１及びＣ２においてＸ１及びＹ１に結合する（すなわちＣ１及びＣ２はキャリパー上の位置又はロケーションである）。通常は非変性条件下で、Ｘ１とＹ１との間の距離を測定する。位置Ｘ１及びＹ１の各々は、線状又は入れ子状バーコード等のバーコードを用いて識別することができる。キャリパーは、Ｘ１に対する結合を維持しながら、Ｙ１から離脱する。キャリパーは、Ｙ１から完全に又は部分的に離脱することができる。部分的な離脱とは、キャリパーがＣ２キャリパー位置からＹ１を解放するが、キャリパーはＹ１を全体的に解放するのではなく、別のキャリパー位置Ｃ３ではＹ１に係合していることを意味する。次いで、キャリパーを用いて、Ｘ１又はＹ１から始めて追加の部位に順次係合する。例えば、キャリパーは（Ｃ１を介して）Ｘ１に対する結合を維持し、次いで追加の位置Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５等に結合し、Ｘ１とこれらの位置の各々との間の距離を測定する。これによって、Ｘ１位置の周りの一次配列に関する情報が得られる。次いでキャリパーは、Ｙ１位置に対する追加の位置（すなわち追加の位置Ｙ２、Ｙ３、Ｙ４、Ｙ５等）に結合し、Ｙ１とこれらの追加の位置との間の距離を測定する。これによって、Ｙ１位置の周りの一次配列に関する情報が得られる。Ｘ１とＹ１との間の最初の測定は、複合体のネイティブ状態を維持する条件下で実施すればよい。それ以降の、Ｘ１とＸ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５等との間、Ｙ１とＹ２、Ｙ３、Ｙ４、Ｙ５等との間の測定は、（例えば反応チャンバに変性剤を流すことにより）変性条件下で実施すればよい。
【０１２５】
段階的伸長バーコード：  ここで、置換鎖の流体導入によって各々が作動される、ｓｓＤＮＡ鎖の一連の予めプログラムされた長さの増大として読み取ることができるバーコードアーキテクチャについて説明する。これを図１１に示す。１つのアーキテクチャは、長い骨格鎖（ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｓｔｒａｎｄ）の一連のセグメントの各々が、ステープル鎖によってループ状になっている。我々は、ステープル鎖の流体導入によってセグメントの半分の長さ又は全長のどちらかでループを形成することで、各セグメント上で「０」又は「１」のどちらかを符号化する。例えば、セグメント長を１００ｎｔとする。そして、「１」のステープル鎖について、６０ｎｔエンドループによって２つの２０ｎｔサブセグメントを橋渡しすることで端部間セグメント距離が０ｎｔプラス橋の長さに短縮されたものと定義する。そして、「０」のステープル鎖について、すでに定義した６０ｎｔエンドループ内で入れ子になった、１０ｎｔのエンドループによって別の２つの２０ｎｔサブセグメントを橋渡しするものと定義する。この「０」のステープル鎖（「１」のステープル鎖が存在しない状態）では、端部間セグメント距離は、５０ｎｔプラス橋の長さに短縮される。各ステープル鎖は一意の配列を有するので、各ループは、ステープル鎖の半分に対して相補的である置換鎖の流体導入によって個別に開放することができ、さらに、置換鎖に対して相補的な回復鎖の流体導入によって置換鎖を除去することで再び閉じることができる。
【０１２６】
例えば、連続したｎ個の一意のセグメントがあるとする。各セグメントに、一意の「０」のステープル鎖及び一意の「１」のステープル鎖がある。特定のバーコードを生成するため、各セグメントについて、折り畳み内に含ませる「０」又は「１」のいずれかのステープル鎖を選択する。このため、２ｎの潜在的なバーコードが存在する。バーコードの読み取りは、置換鎖を流体導入しながら長さの変化を観察することによって行う。ステープル鎖による橋が破壊された場合はいつでも長さの増大を観察することができるが、この破壊は、そのステープル鎖を初期の構築中にそのバーコード上に含ませた場合にのみ起こり得る。
【０１２７】
簡略化した代替的な設計では、ステープル鎖の存在によって「１」を表し、その不在によって「０」を表す。
【０１２８】
代替的な読み取り手法は、バーコード内の長さの変化を引き起こすために鎖置換でなく力を用いる。各ビット（ループ及びステープル鎖）は、例えば最下位ビットから最上位ビットまで達するのに必要な力レベルが増大し、ステープル鎖が特定の力レベルで折れるように設計することができる。各ステープル鎖を一方側において他方側よりも強くし、力が低下したらリアニーリングを可能とすることで、読み取りプロセスを可逆的とすることができる。この設計の１つの利点は、バーコードの読み取りに流動が必要なく、標準的な単一分子力プローブ機器によってこのバーコードを使用できることである。
【０１２９】
第２の考えられるアーキテクチャは、入れ子状ループを備えている。これも図１１に示す（右側パネル）。第１の設計と同様、バーコードは、鎖置換による一連の長さ増大として読み取ることができる。これらの入れ子状ループは１つの大きいループの形態をとり、多数のステープル鎖が異なるサイズでそのループを閉じる。各ステープル鎖の存在又は不在によって、「１」又は「０」を符号化することができる。第１のアーキテクチャと同様、読み取りは、鎖置換を用いて各ビットを順番に調べるか、又は力を用いて最下位ビットから最上位ビットまでループを開くことによって達成可能である。
【０１３０】
従来のＤＮＡベースのバーコードとは異なり、情報は、その幾何学的形状でなくバーコードの配列に直接記憶される。このため、バーコードの書き込み及び読み取りのためにＤＮＡ合成及びシークエンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）は必要ない。代わりに、バーコードの書き込みに必要なのはハイブリダイゼーションだけであり、バーコードの読み取りに必要なのは幾何学的形状及び長さの変化を観察することだけである。
【０１３１】
段階的伸長バーコードの組み合わせライブラリの生成：
分割及び組み合わせ合成手法を用いて、バーコードのライブラリを生成することができる。まず、ビーズに骨格鎖を結合させる。次いで各セグメントについて、ビーズのプールを２つに分割し、一方のサブプールに「０」のステープル鎖を追加し、他方のサブプールに「１」のステープル鎖を追加する。次いで各サブプールから余分なステープル鎖を洗い流し、サブプールを組み合わせる。各セグメントについて分割及び組み合わせサイクルを繰り返す。
【０１３２】
あるいは、「１」がステープル鎖の存在を表し、「０」がその不在を表す設計では、各バーコードがステープル鎖の１つのサブセットにのみ結合するようにバーコードをステープル鎖の集合と混合することで、バーコードの集合を確率的に発生することができる。充分な一意の組み合わせが行われた場合、これは所与の巨大分子上の各ハンドルを一意に識別するのに充分である。これはハッシュタグのようなものであり、結局のところ、同一の分子上で同一バーコードのハンドルが２つ生じる確率は小さいがゼロでない（「衝突」として知られる）。
【０１３３】
撮像及び測定技法
ＢＳＤは、遠心力顕微鏡法（ＣＦＭ）、磁気ピンセット、前方散乱照明、光学ピンセット、音響ピンセット等の多種多様な技法を用いて決定することができる。ＣＦＭについては、公開特許出願第ＵＳ２０１３０２８８３４９号及びその親特許にさらに詳しく記載されている。それら双方は援用により本願にも含まれるものとする。図４にＣＦＭを概略的に示す。ＣＦＭを用いて、数千の単一分子力実験を並行して実施することができる。
【０１３４】
ＲＩＣ−ＣＦＭと称されるＣＦＭの１つの変形は、ＣＦＭに反射干渉コントラスト顕微鏡法（ＲＩＣＭ）を組み込んでいる。図５に、サブナノメートル（オングストローム）の精度で個々のミクロスフェアを３Ｄで追跡するために用いられる撮像光学部品、光学モデル、及びアルゴリズムを示す。ＣＦＭに必要な光学部品を組み込むことで、この手法は、１００Ｈｚで２オングストロームの分解能で最大４００ビーズ（例えば最新の４メガピクセル、１００Ｈｚ  ｓＣＭＯＳカメラを用いる）、又は高速低分解能カメラにより１０，０００Ｈｚ以上で２オングストロームの分解能で１ビーズ等、サブナノメートルレベルの分解能で同時に多数のビーズを追跡する。
【０１３５】
さらに、本明細書に記載する方法で用いられる核酸及び変性剤の導入及び除去を容易にするため、使用するＣＦＭ又はいずれかの撮像技法を、マイクロ流体制御システム等の流体制御システムと結び付けることができる。また、ＣＦＭに高速並進ステージを追加して、サンプルの迅速なスキャンを行うことも可能である。
【０１３６】
本開示はさらに、高分解能ＣＦＭアッセイを拡張して、ナノキャリパー構造物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）の状態を特徴付けるための極めて多重化されたプラットフォームを生成することも想定する。ＣＦＭアッセイは、同一構造物の多数のコピーとは対照的に、単一アッセイ内で多くの異なるナノキャリパー構造物（例えば異なる一意のシステイン変異体）を特徴付けるため、本質的に高度に並列であるが、この方法は、それぞれ一意の相互作用を識別する手段を提供する。これは、予めプログラムされたＤＮＡナノスイッチの力−延伸挙動を利用するバーコード技法を用いて実施される。
【０１３７】
各々がその力−延伸挙動によって一意に識別可能であるＤＮＡナノスイッチ構造物の大きいファミリを構築する。最も単純な形態では、この構造物のファミリは、規定の機械的な力を加えると壊れて開くように設計された様々なサイズのループを、ナノキャリパー構造物と直列に追加することによって生成可能である。様々なループサイズは、例えばＣＦＭを用いて区別することができる。あるいは、単一のＤＮＡループを、力を増大すると壊れて開くように設計された入れ子状ループの集合で置き換えることができる（図６）。この手法は、全てリアルタイムでＣＦＭにおいて観察可能である数百万の一意のバーコードを可能とする（例えば１００を超える異なるループサイズを区別できる場合、３つの入れ子状ループによって１０６のオーダーの異なる組み合わせが可能となる）。この入れ子状ループ構造は、本明細書に記載するＣＬＰ−Ｉキャリパーの代替的な設計として機能することができる。較正ループは、標的タンパク質と直列でなく並列に配置することができる。キャリパー構造の再構成は、鎖置換でなく、力を介して実施される鎖融解によって引き起こすことができる。
【０１３８】
標的
本開示の方法を用いて多種多様な標的を解析することができる。標的に対する限定は、直接又は間接的に核酸に結合可能でなければならないことである。標的は、限定ではないが、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸、ウィルス様粒子、ステロイド、プロテオグリカン、脂質、炭水化物、及びそれらの類似体、誘導体、混合物、溶解物、組み合わせ、又は共役とすればよい。
【０１３９】
標的の１つのクラスは、（一本鎖又は多鎖）タンパク質及びペプチド等のペプチドベースの標的である。ペプチドベースの標的の例は、限定ではないが、抗体、一本鎖抗体、抗体フラグメント、酵素、共同因子、受容体、リガンド、転写因子、及びその他の調節因子、いくつかの抗原（以下に検討するような）、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン等を含む。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、無機剤又は合成剤を解析することができる。そのような無機剤又は合成剤は、無機非粒子及び合成ポリマーを含む。
【０１４１】
標的の修飾
標的（例えば多タンパク質複合体）の表面を、ｓｓＤＮＡハンドルとの共有結合で装飾して（ｄｅｃｏｒａｔｅ）、キャリパーに対する結合ポイントを生成することができる。アスパラギン酸塩及びグルタミン酸塩残基の特定の修飾のために、カルボジイミド活性化後のアミンとの反応を利用することができるが、好ましくは予めリシンを消費するか又は保護して不要な交差反応を防ぐ。Ｍｅｎｄｏｚａ及びＶａｃｈｅｔの「Ｐｒｏｂｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｂｙ  Ａｍｉｎ  Ａｃｉｄ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」（Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ  Ｒｅｖ、２８（５）：７８５〜８１５、２００９年）は、以下のように、８種類の残基のアミノ酸特異的な修飾のための方法を報告している。
Ａ．アルギニン（例えばフェニルグリオキサールとの反応）
Ｂ．カルボン酸塩（アスパラギン酸塩及びグルタミン酸塩）（例えばカルボジイミドと活性化させ、次いでアミノ−オキシと反応）
Ｃ．システイン（例えばマレイミドとの反応）
Ｄ．ヒスチジン（例えばジエチルピロカルボネートとの反応）
Ｅ．リシン（例えばＮＨＳエステルとの反応）
Ｆ．トリプトファン（例えば２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジルブロミドとの反応）
Ｇ．チロシン（例えばテトラニトロメタン、ヨウ素、又はＮ−アセチルイミダゾールとの反応）
【０１４２】
変性状態のみの標的の解析が望まれる場合、ｓｓＤＮＡハンドルによる装飾は、例えば６ＭのＧｕＣｌ、８Ｍの尿素、又は１％のＳＤＳの存在下のような変性条件下で実施することができる。したがって、ネイティブ構造の内部に埋め込まれた位置は、ラベリングによってアクセス可能であり得る。
【０１４３】
応用及び用途
本明細書に提供される方法を用いて、既知の一次アミノ酸配列のタンパク質の表面構造を決定する（又はマッピングする）ことができる。こういった例では、標的タンパク質に対する結合ポイントが明らかになる（結合に用いる試薬の反応性及び特異性が既知であるため）。例えば、ＮＨＳ反応基を結合に用いるので、結合ポイントがリシンであることがわかる。最初に、標的タンパク質がそのネイティブコンフォメーションである場合にリシン間の距離を決定する。この距離を用いて標的タンパク質の表面構造をマッピングする。標的タンパク質に対する結合はランダムであり、反応に利用可能なあらゆる表面リシンであり得るので、どの特定のリシンが関与しているかはわからない。しかしながら、次いで標的タンパク質を変性条件下（限定ではないがＳＤＳの存在下）で伸張することで、標的タンパク質が変性した場合の２つのリシン間の距離を決定することができる。この後者の距離を用いて、既知の一次アミノ酸配列との比較により、どのリシンが関与しているかを識別する。
【０１４４】
また、これらの方法を用いて、未知の一次アミノ酸配列のタンパク質の表面構造を決定する（又はマッピングする）ことも可能である。プロセスのもっと多くの繰り返しが必要となる可能性があることを除いて、上述したものと同様の手法を用いることができる。プロセスにおいて、一次アミノ酸配列も部分的に決定される。
【０１４５】
標的を識別する能力によって、サンプル内で又はイベントの結果としてその存在を決定することができる。したがって、これらの方法を検出又は診断方法として用いて、標的の存在（又は不在）を決定することができる。これは、臨床用途を含む広範囲の用途を有し得る。
【０１４６】
また、これらの方法を用いて、既知の又は未知の結合パートナーに結合した結果として起こる標的の構造の変化を決定することができ、又は加えた力（複数の力）に応じた構造の変化を決定することができる。典型的に、非結合状態にある場合の標的構造は既知であるか又は決定されている。結合パートナーの例は、アロステリック阻害剤又は活性剤（例えばキナーゼ等の酵素の活性剤）等、推定される薬剤の候補を含む。このように、これらの方法は、超並列薬剤スクリーニングアッセイで用いることができる。また、これらの方法は、例えばウィルスの識別等、単一粒子検出又はプロテオミクス（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）に用いることも可能である。それらは、人工タンパク質マシン等の合成生物学デバイスの迅速な構造の特徴付けに使用可能である。さらに具体的な用途について以下で説明する。
【０１４７】
単一細胞プロテオミクス
ＤＰＣを用いて、細胞生物学についての重要な技術的問題、すなわち、単一細胞のプロテオームのランダムサンプリングの計数、時空間追跡、及び構造的な決定に取り組むことができる。現在、これは、単一細胞内の個々の核酸のプローブハイブリダイゼーション又はシークエンシングベースの識別により、その程度まで実施することができる。一方でタンパク質については、質量分析又は他の方法は、プロテオームスケールの単一分子感度にはほど遠い。これに対してＤＰＣは、各ポリペプチド（又は核酸）上の１Ｄ配列指紋を収集することによって、単一分子の識別及び計数をプロテオームスケールのタンパク質まで拡張することができる。これには、ｓｓＤＮＡハンドルによって特異的にラベリングすることができる個々のタンパク質上に存在する単一分子レベルの翻訳後修飾（又は個々のＲＮＡ上の転写後修飾）が含まれる。例えば、セリン／トレオニンリン酸化反応は、アルカリ性ｐＨにおけるβ脱離（ｂｅｔａ−ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ）の後にチオールラベリングｓｓＤＮＡハンドルのマイケル付加を行うことで標的とすることができる。脱アセチル化リシンは、ＮＨＳラベリングｓｓＤＮＡハンドルによって監視することができる。抗体又はアプタマーは、標的部位に対するｓｓＤＮＡハンドルの結合を誘導するためにも使用可能である。さらに、ＤＰＣは、各標的の３Ｄ表面指紋を収集することによって、プロテオーム（及びトランスクリプトーム）における個々の巨大分子複合体の素性に関する情報だけでなく、そのネイティブ構造に関する情報も戻すことができ、このため、化学組成とは無関係の構造的な不均質性も監視することができる。したがってＤＰＣは、巨大分子の構造に関する情報を含む単一標的単一細胞プロテオミクスを可能とすることができる。
【０１４８】
翻訳後修飾の単一分子指紋法は、それだけで前例のないものであり、それ自体貴重な応用である。バルク方法は、単一生体高分子鎖上の相関修飾（ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）でなく、翻訳後修飾の統計的な状態（ｐｉｃｔｕｒｅ）を提供する。
【０１４９】
空間分解単一細胞プロテオミクス
それぞれに一意のｓｓＤＮＡタグでランダムにバーコードを付けた多数のランダムに選択した標的を、ＤＰＣを用いて単一細胞内で空間及び時間について追跡することができる。時間符号化バーコードを用いたパルスラベリングによって、時間分解能も可能となり得る。一意の識別子として機能するランダムに選択したバーコードを用いて単一細胞内のタンパク質に標識し、超分解能顕微鏡を用いてこれらのバーコードの空間及び時間の位置を追跡することができる。次いで、その細胞から全てのタンパク質を抽出し、ＤＰＣを用いて各バーコードを識別すると共に、そのバーコードが標識した３Ｄ表面プロファイル、及びその標的に存在するポリペプチドの１Ｄ配列指紋を識別することができる。したがって、ＤＰＣにより、空間時間的に分解した単一細胞プロテオミクスが可能となる。
【０１５０】
反復領域のシークエンシングを含む単一分子核酸シークエンシング
本明細書で提供されるキャリパー及び方法は、核酸（例えばＤＮＡ）シークエンシングに用いることができる。以下に、核酸のシークエンシングに使用することができるプロセスを示す。このシークエンシング方法を用いて、ゲノムの「暗い領域（ｄａｒｋ  ｒｅｇｉｏｎｓ）」を検出し識別することができる。ゲノムの「暗い領域」は、典型的に高レベルの反復を有するので、ＤＮＡシークエンシングの対象となりにくい領域である。ＤＰＣは、特に反復領域の読み取りのため、単一分子ＤＮＡシークエンシングにおける２つの重要な動作に使用可能である。これらの重要な動作とは、（１）標的ＤＮＡに結合させたバーコード配列タグ間の正確な距離の読み取り、及び（２）バーコード配列タグの配列素性の読み取りである。これは以下のように達成することができる。
【０１５１】
１．標的ＤＮＡの集団（又は複数の標的ＤＮＡ）を提供する。
２．デオキシウリジンを一方の鎖に組み込むが他方には組み込まないポリメラーゼコピーを１ラウンド（又は１サイクル）実施する。
３．核酸をウラシルＤＮＡグリコシラーゼで処理することによって１ｎｔのギャップを導入する。
４．ギャップの１つ以上をエキソヌクレアーゼによって拡大する。
５．ギャップの１つ以上に、バーコード化した架橋性の末端保護した５ｍｅｒをライゲーションする。
６．５ｍｅｒをテンプレート鎖に架橋して、バーコード付き（ｂａｒｃｏｄｅ−ｓｔｕｄｄｅｄ）標的ＤＮＡを生成する。
７．バーコード付き標的ＤＮＡをキャリパー上に捕獲する（すなわち各キャリパーがランダムに２つのバーコードを把持する）。
８．バーコード間の距離を読み取り、次いで各バーコードの素性を読み取る。
９．１つのバーコードを解放し、別のバーコードを把持し、反復する。このように、単一のバーコード付き標的ＤＮＡ上の多くのバーコードの対距離及び素性を取得する。
１０．所望の場合、５ｍｅｒの末端の脱保護によりバーコード５ｍｅｒのライゲーションの別のラウンドを行い、次いで別のセットのライゲーションを行う。
【０１５２】
ＤＰＣを用いて、１ｋｂ当たり１ｂｐの精度までバーコードを位置特定することができる。これは、例えば大きい力を加えることによって達成可能である（例えば１ｎＮまで、又はさらに具体的には、力で結合される（ｆｏｒｃｅ−ｃｏｕｐｌｅｄ）加水分解を防ぐために空気又は有機溶剤のような乾燥条件下で）。そうすることで、５ｍｅｒバーコード間の距離について０．１％の精度を達成することができる（例えば１キロベース標的上の１塩基内）。
【０１５３】
多糖の単一分子指紋法
本出願では、多糖内の個々のサッカリド（又は糖）モノマーを、糖の種類についての情報やランダムに選択した識別子等を符号化するバーコードを埋め込んだハンドルによってラベリングする。次いで、ハンドル間の対距離を測定する。
【０１５４】
指紋法を用いた標的識別
ＤＰＣを用いて、サンプル内のタンパク質、ＤＮＡ構造物、ウィルス、その他の巨大分子のような対象標的（小さい対象標的を含む）の距離指紋を発生させることにより、標的の素性及び／又は品質を決定することができる。各指紋は、単一の標的上で行った多数の距離測定から成る。これらの測定は、構造決定用途について前述したものと同様に行うことができる。例えば、以下のステップを実施可能である。
ｉ）サンプル内の対象の標的に多数の核酸（例えばＤＮＡ）ハンドルを結合させる。各ハンドルはバーコードを含む場合がある。
ｉｉ）ハンドルでラベリングした標的をＤＰＣ構造物に結合させる。
ｉｉｉ）標的を結合させたＤＰＣ構造物をビーズと表面との間のテザーとして結合させて、単一分子距離測定を可能とする。
ｉｖ）ハンドル結合、距離測定、及びハンドル取り外しの繰り返しサイクルによって、多数の距離測定を各キャリパー上で行う。
【０１５５】
これらのステップは上述の順序で行う必要はない。例えば、キャリパーを識別対象の標的に結合する前にビーズに結合させてもよい。
【０１５６】
本出願は、構造決定のための上述した方法に比べて簡略化された方法である。その理由の１つは、新しい構造を決定することでなく単に標的を識別することが目標である（構造又は「指紋」はすでに既知であり得る）ために、各サンプルからあまり多くの情報を取得する必要がないことである。さらに、この方法では、標的を識別するために指紋のデータベースに対して各サンプル標的の距離指紋を比較する必要があるので、計算の必要性は構造決定よりもはるかに小さい。識別データベースは、本明細書で提供される方法を用いて多種多様な既知の標的上で実際に測定を行うことによって、又は既知の構造に基づく計算方法によって生成することができる。
【０１５７】
タンパク質指紋法及び識別は、折り畳みネイティブ構造、及び変性構造の双方で実施可能である。変性タンパク質に指紋法を行う場合、多くの点で実験の要件は緩くなる。すなわち、（１）タンパク質はすでに変性しているので、本明細書に記載する方法の実施時に加える力で変性することについての問題はない。このため、さらに大きい力を使用することができ、結果として熱雑音を低減することができる。（２）必要なのは単一アミノ酸分解能（３〜４オングストロームまで）だけであるので分解能の要求が低くなり、さらに低い分解能で確率的識別を行うことができる。（３）多種多様なバッファ及び環境条件を使用可能であり（例えば塩、ｐＨ、温度等）、ペプチドを変性状態に保つため、ＳＤＳ又は尿素等の何らかの変性剤を含む場合がある。（４）タンパク質をフラグメント化した場合であっても、質量分析プロテオミクスに用いるものと同様のアルゴリズムを使用してタンパク質を識別することが潜在的に可能である。
【０１５８】
本明細書で提供される手法は単一分子レベルで機能するので、ｉ）単一細胞からの溶解物、及びｉｉ）限定ではないが血液、尿、及び唾液のような体液等の少容量のサンプルを含む、極めて小さい体積に対して標的の識別及びプロファイリングを実施することができる。このように、ＤＰＣを単細胞プロテオミクス及び超微量検出に適用することができる。
【０１５９】
また、本明細書に記載する全ての鎖置換操作は、除去対象の鎖にトーホールドドメインを組み込むことによって実施し得ることに留意すべきである。
【０１６０】
高スループットの単一分子巨大分子構造決定
ＤＰＣにより測定される巨大分子複合体の３Ｄ表面指紋を用いて、これらの複合体のバックボーン構造モデルを改良することができ、場合によっては追加の実験データなしで新しいバックボーン構造決定のための充分な実験的制限を提供することが可能となる。さらに、表面ポイント対に加える力について剛性及び力に依存した配座転移を測定することができる。このように、巨大分子複合体に関する追加情報を得ることができる。
【０１６１】
ＤＰＣは高スループットであるので、これを用いて標的の複合体混合物の３Ｄ表面指紋を測定することができる。例えば、各々が異なる変異体セットを有し、遺伝子型に関する情報を符号化するバーコードを結合させた、タンパク質の組み換えバージョンのライブラリを生成することができる。さらに、ｐＨ、温度、塩濃度、洗剤の存在、変性剤の存在、外部場、様々なリガンドの存在、巨大分子結合パートナーの存在等の様々な環境条件のもとで、混合物の３Ｄ表面指紋法を反復することができる。これは、ＤＰＣのように、充分に高いスループットを有する方法においてのみ可能である。
【０１６２】
本明細書で部分的に記載するように、構造決定は、標的上の様々なハンドルにキャリパーを結合させることを想定している。いくつかのそのような測定は、同じタンパク質に結合させたハンドル間で行うことができる。ハンドルは、各ハンドルを識別し位置決めすることができるようにバーコードを含み得る。タンパク質の構造が既知である場合、その既知の構造に対して結合部位をマッピングすることができる。さらに、ＤＰＣを用いて得られる高分解能の構造の詳細により、巨大分子（又は複合体）の集団における構造的な不均質性（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）を解析し識別することができる。
【０１６３】
また、解析の高スループット特性によって、例えば全ての単一突然変異又は二重突然変異等、ライブラリに関する構造情報を得ることが容易になる。これは特に、ライブラリの各メンバの素性をバーコード化できるからである。また、解析を進めるために変更され得る変形もある。これらには、塩、温度、圧力、リガンド、化学的修飾、結合パートナー、分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）、力等の変化が含まれる。
【０１６４】
また、本明細書で提供される方法は、構造モデルを適合させるためにも使用可能である。そのようなモデルは、限定ではないが、本明細書で提供されるもの等の構造決定プロセスを用いて生成することができる。次いでそのようなモデルを、本明細書で提供される方法を用いて取得した実験データに対して記録する（ｓｃｏｒｅ）ことができる。このプロセスでは、静的構造には存在しない、記録される追加データが生じ得る。例えばこれは、タンパク質又は巨大分子構造のような標的の折り畳み及びほどけ（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）に関する情報を提供し得る。また、本明細書で提供される方法を用いて発生させたデータは、力又は他の環境条件下で標的の応答及びコンプライアンスに関する情報も生じる。これらは、静的構造解析を用いて研究することができない特性である。また、本明細書で提供される方法を用いて測定することができる材料特性に対する適合に基づいて、正しい静的モデルとデコイ静的モデル（すなわち同様のモデルであるが微妙な欠陥を有する）とを、より良く区別することが可能である。
【０１６５】
フットプリント法
本明細書で用いる場合、フットプリント法は、ＤＰＣで用いられるハンドル等のプローブによる修飾に利用できない標的上の領域の識別を可能とするプロセスである。どの残基がハンドルによってラベリングできないかを観察することにより、どの残基が、場合によっては標的の内部に位置するために、又は場合によっては化学的ブロッキング（例えばリシンのアセチル化）のために利用できないかを推測することができる。ＤＰＣは単一分子のフットプリント法を可能とし、これによって単一標的内の又は単一標的上の隠れた残基を識別する。
【０１６６】
アロステリック界面及び転移のマッピング
本明細書で提供される方法を用いて、力を加えることで引き起こされる構造変化又は他のいずれかの摂動（例えばリガンド、塩、温度等）を調査及び／又は識別することができる。これによって、様々な構造状態及びそれらのインデューサを識別して相関付けることが可能となる。また、これらの方法を用いて、標的の１つ以上の点突然変異の構造効果を含む効果を調査及び／又は識別することができる。次いでこれを用いて、治療標的上のアロステリックな薬剤又は薬品のための部位を識別することができる。
【０１６７】
単一分子プルダウン：  リガンドの結合パートナー及び形成された複合体の構造の決定
薬剤発見における重要な問題は以下の通りである。（１）薬剤の治療標的（オフターゲット（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ）を含む）の素性の決定、（２）薬剤：標的相互作用の動力学及び熱力学の決定、（３）薬剤：標的複合体の構造の決定、（４）標的において薬剤が引き起こす構造変化の決定。
【０１６８】
標的の素性を決定するための典型的な戦略は、薬剤を固体支持体に結合し、標的を結合し、標的を溶離し、次いで質量分析又は関連する方法を用いて標的を識別することである。しかしながらこの方法は、単一分子検出限界で標的を識別することができない。また、これは、残りの問題に関する情報を提供しない。一方、ＤＰＣは、４つ全てのステップを達成することができる。ＤＰＣでは、キャリパーを薬剤及び標的上のランダムな部位の双方に連結し、これら２つの結合間の距離を決定し、次いで標的及び標的上のランダムな部位を識別する。本明細書の「指紋法による標的識別」の項に記載したように、小さい力又は大きい力での結合及び伸張の多数のラウンドを用いて、３Ｄネイティブ指紋又は１Ｄ配列指紋をそれぞれ決定することができる。これを行うため、薬剤を核酸（例えばＤＮＡ）ハンドルで標識することができる。あるいは、薬剤−標識の結合との干渉が問題となる場合、薬剤をもっと小さいタグ（例えばアジ化物クリックタグ）及び薬剤を標的に架橋するために用いる架橋性部分（例えばアミン反応性テザー）で標識すればよい。テザーを介して薬剤を標的に架橋した後、アジ化物クリックタグにハンドルを結合させることができる。
【０１６９】
超分解能顕微鏡法
ＤＰＣは、超分解能撮像のための標準的な手法の代替案として用いることができる。フルオロフォアの位置特定を用いて対象のフィーチャの位置を識別する代わりに、対象のフィーチャに結合させた小さいビーズの位置を、核酸（例えばＤＮＡ）ハンドルを介して追跡する。これは、標準的な蛍光アッセイに比べて多数の利点を提供する。ビーズの位置は、３Ｄで高分解能の測定が可能である。我々はすでに、現在の超分解能技法の分解能を上回る、１００ｆｐｓビデオフレーム当たりｘ及びｙで〜１ｎｍ、ｚで〜０．２ｎｍのビーズ追跡分解能を実証している。これは、蛍光撮像に対してビーズ追跡は信号対雑音比が高いこと、色あせ（ｂｌｅａｃｈｉｎｇ）がないこと等によるものである。各ビーズは、１つのＤＮＡラベリング部位からの取り外しと別のＤＮＡラベリング部位への結合のサイクルを多数行うことで、多くの異なるＤＮＡラベリング部位の位置を報告することができる。
【０１７０】
さらに、ビーズ位置は、力を加えた状態で（又は力を変化させて）測定することができる。これは、ビーズの熱雑音を低減することで分解能を上げるように、かつ、観察下の物体のコンプライアンス及び力に依存した変形を測定するように機能することができる。また、異なるバーコードをハンドルに一体化して、異なるタイプの部位の識別及び位置特定を可能とする。さらに、非常に多くの異なるバーコードを生成及び識別できるので（例えば百万超）、現時点で蛍光撮像によって達成可能であるよりもはるかに多くのフィーチャを区別することができる。
【０１７１】
一般的な核酸ナノ構造方法論
本明細書に記載する構造決定方法論は、いかなる数及びタイプの核酸ナノ構造にも適用することができる。核酸ナノ構造は、限定ではないが、ＤＮＡ折り紙及びＤＮＡ一本鎖タイル（ＳＳＴ）を含む様々な核酸折り畳み方法を用いて合成され得る。１つのそのような手法はＤＮＡ折り紙である（Ｒｏｔｈｅｍｕｎｄ、２００６年、Ｎａｔｕｒｅ、４４０：２９７〜３０２、これは援用によりその全体が本願にも含まれるものとする）。ＤＮＡ折り紙手法では、長い「骨格」核酸鎖を複数の短い「ステープル」オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせて折り畳むことで、構造を生成する。各オリゴヌクレオチドは、骨格鎖内の２つ以上の非連続領域にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、骨格鎖は長さが少なくとも１００ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、骨格鎖は長さが少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも２０００、少なくとも３０００、少なくとも４０００、少なくとも５０００、少なくとも６０００、少なくとも７０００、少なくとも８０００のヌクレオチドである。骨格鎖は、自然に又は非自然的に発生し得る。骨格は典型的に、約７ｋｂであるＭ１３ｍｐ１８ウィルスゲノムＤＮＡで用いられる。例えばラムダゲノムＤＮＡを含む他の一本鎖骨格も使用され得る。ステープル鎖は、典型的には長さが１００ヌクレオチド未満であるが、用途に応じて、及び骨格鎖の長さに応じて、もっと長いか又はもっと短い場合もある。いくつかの実施形態では、ステープル鎖は長さが約１５から約１００ヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では、ステープル鎖は長さが約２５から約５０ヌクレオチドである。
【０１７２】
これらの技法は当技術分野において既知であり、米国特許第７，７４５，５９４号、第７，８４２，７９３号、米国特許公報第２０１０／００６９６６２１号、及びＧｏｏｄｍａｎ等のＮａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙにさらに詳しく記載されている。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、骨格鎖なしで核酸構造をアセンブルすることができる（例えば骨格なし構造（ｓｃａｆｆｏｌｄ−ｆｒｅｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ））。例えば、多数のオリゴヌクレオチド（例えば長さが＜２００ヌクレオチド又は１００ヌクレオチド未満）をアセンブルして核酸ナノ構造を形成することができる。この手法は、ＷＯ２０１３／０２２６９４号及びＷＯ２０１４／０１８６７５号に記載されている。これらは各々、援用によりその全体が本願にも含まれるものとする。
【０１７４】
核酸構造をアセンブルするための他の方法も当技術分野において既知であり、それらのいずれか１つを本明細書で用いることができる。（例えばＫｕｚｕｙａ及びＫｏｍｉｙａｍａ、２０１０年、Ｎａｎｏｓｃａｌｅ、２：３１０〜３２２を参照のこと。）また、これらの方法の組み合わせ又はハイブリッドを用いて本明細書に開示する核酸構造を生成可能であることは理解されよう。
【０１７５】
核酸
核酸構造は、自然に発生する及び／又は非自然的に発生する核酸を含み得る。自然に発生する場合、核酸は自然源から単離するか、又は自然発生源とは別に合成することができる。非自然的に発生する核酸は合成である。
【０１７６】
「核酸」、「オリゴヌクレオチド」、及び「鎖」という言葉は、相互に連続して結合させた多数のヌクレオチドを意味するために交換可能に用いられる。ヌクレオチドは、リン酸基及び交換可能な有機塩基に結合した糖（例えばデオキシリボース）を含む分子である。この塩基は、ピリミジン（例えばシトシン（Ｃ）、チミジン（Ｔ）、又はウラシル（Ｕ））、又はプリン（例えばアデニン（Ａ）又はグアニン（Ｇ））のいずれかである。いくつかの実施形態では、核酸はＬ−ＤＮＡとすればよい。いくつかの実施形態では、核酸はＲＮＡ又はオリゴヌクレオチドでない。これらの実施形態では、核酸構造をＤＮＡ構造と称することがある。しかしながらＤＮＡ構造は、やはり塩基、糖、及びバックボーン修飾を含み得る。
【０１７７】
修飾
核酸構造は、ＤＮＡ、修飾ＤＮＡ、及びそれらの組み合わせから生成することができる。核酸構造を生成するために用いられるか、又は核酸構造内に存在するオリゴデオキシリボヌクレオチド（本明細書ではオリゴヌクレオチドとも称し、ステープル鎖、コネクタ鎖等であり得る）は、同種又は異種（すなわちキメラ）バックボーンを有し得る。バックボーンは、リン酸ジエステルバックボーン等の自然発生バックボーンであるか、又はバックボーン修飾（複数の修飾）を含み得る。場合によっては、バックボーン修飾の結果として、ヌクレアーゼを介した分解の低減のためにオリゴヌクレオチドの半減期が長くなる。これにより、半減期が長くなる。適切なバックボーン修飾の例は、限定ではないが、ホスホロチオエート修飾、ホスホロジチオエート修飾、ｐ−エトキシ修飾、メチルホスホン酸修飾、メチルホスホロチオ酸、アルキル−及びアリル−リン酸（荷電ホスホン酸酸素はアルキル又はアリル基により置換されている）、アルキルリン酸トリエステル（荷電酸素部分はアルキル化されている）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）バックボーン修飾、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）バックボーン修飾等を含む。これらの修飾は、相互に組み合わせて及び／又はリン酸ジエステルバックボーン結合と組み合わせて用いることができる。
【０１７８】
この代わりに又はこれに加えて、オリゴヌクレオチドは、塩基又は糖部分の修飾を含む他の修飾を含み得る。この例は、３’位でヒドロキシル基以外、及び５’位でリン酸基以外の低分子量有機基に共有結合した糖（例えば２’−Ｏ−アルキル化リボース）を有する核酸、リボースの代わりにアラビノースのような糖を有する核酸を含み得る。また、核酸は、Ｃ−５プロピン修飾塩基等の置換プリン及びピリミジンを含む（Ｗａｇｎｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１４：８４０〜８４４、１９９６年）。他のプリン及びピリミジンは、限定ではないが、５−メチルシトシン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチンを含む。他のそのような修飾も当業者には周知である。
【０１７９】
ホスホロチオエート等の修飾バックボーンは、ホスホロアミド酸又はＨ−ホスホン酸化学成分のいずれかを利用した自動化技法を用いて合成することができる。アリル−及びアルキル−ホスホン酸は、例えば米国特許第４，４６９，８６３号に記載されているように生成可能であり、アルキルリン酸トリエステル（荷電酸素部分は米国特許第５，０２３，２４３号及び欧州特許第０９２５７４号に記載されているようにアルキル化されている）は、市販の試薬を用いた自動化固相合成によって調製することができる。他のＤＮＡバックボーン修飾及び置換を実施するための方法も記載されている（Ｕｈｌｍａｎｎ，  Ｅ及びＰｅｙｍａｎ，  Ａ．、Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．９０：５４４、１９９０年、Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，  Ｊ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１：１６５、１９９０年）。
【０１８０】
核酸は、例えばｂ−シアノエチルホスホロアミド酸法（Ｂｅａｕｃａｇｅ及びＣａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｔｅｔ．  Ｌｅｔ．２２：１８５９、１９８１年）、及びヌクレオシドＨ−ホスホン酸法（Ｇａｒｅｇｇ等、Ｔｅｔ．  Ｌｅｔ．２７：４０５１〜４０５４、１９８６年、Ｆｒｏｅｈｌｅｒ等、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ．  Ｒｅｓ．１４：５３９９〜５４０７、１９８６年、Ｇａｒｅｇｇ等、Ｔｅｔ．  Ｌｅｔ．２７：４０５５〜４０５８、１９８６年、Ｇａｆｆｎｅｙ等、Ｔｅｔ．  Ｌｅｔ．２９：２６１９〜２６２２、１９８８年）を含む、当技術分野において既知である多数の手順のいずれかを用いて新しく合成することができる。これらの化学反応は、市販の様々な自動化核酸合成剤によって実施可能である。これらの核酸は合成核酸と称される。修飾核酸及び未修飾核酸も、ＩＤＴ及びＢｉｏｎｅｅｒ等の供給元から購入することができる。
【０１８１】
本明細書で用いる場合、単離とは、所望のエンティティ（例えば核酸構造等）を、これが通常又は自然に存在する環境又はこれが発生された環境から物理的に分けることを指す。単離は部分的なもの又は完全なものであり得る。単離された核酸とは一般に、自然界で通常関連している成分から分けられた核酸を指す。一例として、単離された核酸は、細胞、細胞核、ミトコンドリア、又はクロマチンから分けられたものであり得る。
【０１８２】
核酸ナノ構造は、単離及び／又は精製することができる。核酸ナノ構造の単離を行うには、ゲル上にハイブリダイゼーション反応混合物を流し、特定の分子量で移動することで核酸基板及びハイブリダイゼーション反応のスプリアス生成物から区別される核酸構造を単離すればよい。別の例として、核酸構造の単離は、浮遊密度勾配、沈降勾配遠心分離を用いて、又は濾過手段によって実施可能である。
【０１８３】
参考文献
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【図１】
2017514467.tif 000007
【図２Ａ】
2017514467.tif 000008
【図２Ｂ】
2017514467.tif 000009
【図３】
2017514467.tif 000010
【図４】
2017514467.tif 000011
【図５Ａ】
2017514467.tif 000012
【図５Ｂ】
2017514467.tif 000013
【図５Ｃ】
2017514467.tif 000014
【図５Ｄ】
2017514467.tif 000015
【図６】
2017514467.tif 000016
【図７】
2017514467.tif 000017
【図８Ａ−８Ｃ】
2017514467.tif 000018
【図８Ｄ】
2017514467.tif 000019
【図９Ａ】
2017514467.tif 000020
【図９Ｂ】
2017514467.tif 000021
【図１０】
2017514467.tif 000022
【図１１】
2017514467.tif 000023
【国際調査報告】
2017514467.tif 000024
2017514467.tif 000025
2017514467.tif 000026
2017514467.tif 000027