(57)【要約】  造血幹細胞の動員は造血幹細胞が骨髄腔外で刺激される工程である。ＨＳＣは動員できる前に、ＨＳＣが存在し、接着相互作用により保持される、ＢＭ幹細胞ニッチから除去かつ放出されなければならない。従って、本発明の一の態様において、  ＨＳＣおよびその先駆細胞ならびにそれらの祖先細胞のＢＭ幹細胞結合リガンドからのインビボまたはエクスビボでの除去を強化する方法であって、効果的な量のα９インテグリンのアンタゴニストまたはその活性な部分をＢＭ幹細胞ニッチにインビボまたはエクスビボにて投与することを含む、方法が提供される。末梢血（ＰＢ）に動員されれば、そのＨＳＣは移植のために収集されてもよい。ＨＳＣの動員を強化する方法もまた、血液疾患の治療を改善しうる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＳＣおよびその先駆細胞ならびにそれらの祖先細胞のＢＭ幹細胞結合リガンドからのインビボまたはエクスビボでの除去を強化する方法であって、効果的な量のα９インテグリンのアンタゴニストまたはその活性な部分をＢＭ幹細胞ニッチにインビボまたはエクスビボにて投与することを含む、方法。
【請求項２】
ＨＳＣおよびその先駆細胞ならびにそれらの祖先細胞のＢＭ幹細胞ニッチからの放出をさらに強化する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＨＳＣのＢＭ幹細胞ニッチからの動員をさらに強化する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
α９インテグリンが、α９β１インテグリンまたはその活性な部分である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
α４インテグリンのアンタゴニストまたはその活性な部分を投与することをさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
α４インテグリンが、α４β１のアンタゴニストまたはその活性な部分である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
アンタゴニストがα９およびα４と交差反応し、望ましくはα９β１およびα４β１と交差反応してもよい、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
アンタゴニストが、式（Ｉ）：
【化１】
2017538715.tif 000039
［式中
Ｘは、結合手および−ＳＯ２−からなる群より選択され；
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、置換されてもよいアリールおよび置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ２は、Ｈおよび置換基からなる群より選択され；
Ｒ３は、ＨおよびＣ１−Ｃ４アルキルからなる群より選択され；
Ｒ４は、Ｈおよび−ＯＲ６からなる群より選択され；
Ｒ５は、Ｈおよび−ＯＲ７からなる群より選択される；
ただし、Ｒ４がＨである場合、Ｒ５は−ＯＲ７であり、Ｒ４が−ＯＲ６である場合、Ｒ５はＨであり；
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）Ｒ９および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１０Ｒ１１からなる群より選択され；
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５からなる群より選択され；
Ｒ８は、置換されてもよいアルキル、置換されてもよいアリール、置換されてもよいヘテロアリール、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）および−ＣＮからなる群より選択され；
Ｒ９は、置換されてもよいシクロアルキル、置換されてもよいヘテロシクロアルキル、置換されてもよいアリールおよび置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ１０およびＲ１１は、それらが結合する窒素と一緒になって、置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し；
Ｒ１２は、置換されてもよいアルキル、置換されてもよいアリール、置換されてもよいヘテロアリール、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）および−ＣＮからなる群より選択され；
Ｒ１３は、置換されてもよいシクロアルキル、置換されてもよいアリールおよび置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ１４およびＲ１５は、各々、Ｃ１−Ｃ４アルキルおよび置換されてもよいアリールからなる群より独立して選択されるか、または
Ｒ１４およびＲ１５は、それらが結合する窒素と一緒になって、置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し；および
ｎは、各々、１〜３の範囲にある整数である］
で示される化合物またはその医薬的に許容される塩である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
Ｒ４がＨであり；および
Ｒ５が−ＯＲ７である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
Ｒ７が、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５からなる群より選択され；
Ｒ１２が、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−ＣＮ、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）および置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ１３が、置換されてもよいシクロアルキル、置換されてもよいアリールおよび置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ１４およびＲ１５が、各々、Ｃ１−Ｃ４アルキルおよび置換されてもよいアリールからなる群より独立して選択されるか、または
Ｒ１４およびＲ１５が、それらが結合する窒素と一緒になって、置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し；および
ｎが１または２である、請求項８または請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
Ｒ７が、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５からなる群より選択され；
Ｒ１２が、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−ＣＮ、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）および５−テトラゾリルからなる群より選択され；
Ｒ１３が２−ピロリルであり；
Ｒ１４およびＲ１５が、各々独立して、Ｃ１−Ｃ４アルキルであるか、または
Ｒ１４およびＲ１５が、それらが結合する窒素と一緒になって、置換されてもよいピロリジニルまたはモルホリニル環を形成し；および
ｎが１または２である、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
式（Ｉ）の化合物が
【化２】
2017538715.tif 000040
の化合物またはその医薬的に許容される塩である、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
Ｒ１が置換されてもよいフェニルである、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
フェニルが、少なくとも１個のハロゲン基で置換されてもよい、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
式（Ｉ）の化合物が
【化３】
2017538715.tif 000041
の化合物またはその医薬的に許容される塩である、請求項８〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
式（Ｉ）の化合物が
【化４】
2017538715.tif 000042
の化合物またはその医薬的に許容される塩である、請求項８〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
アンタゴニストがＧ−ＣＳＦの不在下で投与される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
α９インテグリンアンタゴニストが、静脈内、皮内、皮下、筋肉内、経皮、経粘膜、または腹腔内に投与される；該アンタゴニストは、静脈内または皮下投与されることが望ましい、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
α９インテグリンアンタゴニストが、α４インテグリンアンタゴニストと同時に、連続して、または組み合わせて投与される、請求項５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ＨＳＣが骨髄より誘導される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ＨＳＣが、幹細胞ニッチ、望ましくは骨髄の中心または骨内膜ニッチより誘導される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＨＳＣが、ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ３８＋細胞、ＣＤ９０＋細胞、ＣＤ１３３＋細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞、リニージ委任のＣＤ３４−細胞またはＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞からなる群より選択される、骨内膜先祖細胞である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
ＨＳＣのＢＭ幹細胞結合リガンドからの除去を強化するための組成物であって、α９インテグリンのアンタゴニストまたはその活性な部分を含む、組成物。
【請求項２４】
ＨＳＣのＢＭ幹細胞結合リガンドからの放出をさらに強化する、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
ＨＳＣのＢＭ幹細胞ニッチからＰＢへの動員をさらに強化する、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
α９インテグリンがα９β１インテグリンまたはその活性な部分である、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
α４インテグリンのアンタゴニストまたはその活性な部分を含む、請求項２３ないし２６項のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
α４インテグリンがα４β１またはその活性な部分のアンタゴニストである、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
アンタゴニストがα９およびα４と交差反応し、望ましくはα９β１およびα４β１と交差反応する、請求項２３〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３０】
α９インテグリンアンタゴニストが、式（Ｉ）：
【化５】
2017538715.tif 000043
［式中
Ｘは、結合手および−ＳＯ２−からなる群より選択され；
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、置換されてもよいアリールおよび置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ２は、Ｈおよび置換基からなる群より選択され；
Ｒ３は、ＨおよびＣ１−Ｃ４アルキルからなる群より選択され；
Ｒ４は、Ｈおよび−ＯＲ６からなる群より選択され；
Ｒ５は、Ｈおよび−ＯＲ７からなる群より選択される；
ただし、Ｒ４がＨである場合、Ｒ５は−ＯＲ７であり、Ｒ４が−ＯＲ６である場合、Ｒ５はＨであり；
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）Ｒ９および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１０Ｒ１１からなる群より選択され；
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５からなる群より選択され；
Ｒ８は、置換されてもよいアルキル、置換されてもよいアリール、置換されてもよいヘテロアリール、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）および−ＣＮからなる群より選択され；
Ｒ９は、置換されてもよいシクロアルキル、置換されてもよいヘテロシクロアルキル、置換されてもよいアリールおよび置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ１０およびＲ１１は、それらが結合する窒素と一緒になって、置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し；
Ｒ１２は、置換されてもよいアルキル、置換されてもよいアリール、置換されてもよいヘテロアリール、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）および−ＣＮからなる群より選択され；
Ｒ１３は、置換されてもよいシクロアルキル、置換されてもよいアリールおよび置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ１４およびＲ１５は、各々、Ｃ１−Ｃ４アルキルおよび置換されてもよいアリールからなる群より独立して選択されるか、または
Ｒ１４およびＲ１５は、それらが結合する窒素と一緒になって、置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し；および
ｎは、各々、１〜３の範囲にある整数である］
で示される化合物またはその医薬的に許容される塩である、請求項２３〜２９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３１】
Ｒ４がＨであり；および
Ｒ５が−ＯＲ７である、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
Ｒ７が、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５からなる群より選択され；
Ｒ１２が、−ＣＮ、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）および置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ１３が、置換されてもよいシクロアルキル、置換されてもよいアリールおよび置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ１４およびＲ１５が、各々、Ｃ１−Ｃ４アルキルおよび置換されてもよいアリールからなる群より独立して選択されるか、または
Ｒ１４およびＲ１５が、それらが結合する窒素と一緒になって、置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し；および
ｎが１または２である、請求項２３または３１に記載の組成物。
【請求項３３】
Ｒ７が、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５からなる群より選択され；
Ｒ１２が、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−ＣＮ、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）および５−テトラゾリルからなる群より選択され；
Ｒ１３が２−ピロリルであり；
Ｒ１４およびＲ１５が、各々独立して、Ｃ１−Ｃ４アルキルであるか、または
Ｒ１４およびＲ１５が、それらが結合する窒素と一緒になって、置換されてもよいピロリジニルまたはモルホリニル環を形成し；および
ｎが１または２である、請求項２３〜３２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３４】
式（Ｉ）の化合物が、
【化６】
2017538715.tif 000044
の化合物またはその医薬的に許容される塩である、請求項２３〜３３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３５】
Ｒ１が置換されてもよいフェニルである、請求項２３〜３４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３６】
フェニルが少なくとも１個のハロゲン基で置換されてもよい、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
式（Ｉ）の化合物が
【化７】
2017538715.tif 000045
の化合物またはその医薬的に許容される塩である、請求項２３〜３６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３８】
式（Ｉ）の化合物が
【化８】
2017538715.tif 000046
の化合物またはその医薬的に許容される塩である、請求項２３〜３７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３９】
Ｇ−ＣＳＦの不在下で投与される、請求項３０〜３８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４０】
静脈内、皮内、皮下、筋肉内、経皮、経粘膜、または腹腔内に投与され；静脈内または皮下投与されることが望ましい、請求項３０〜３９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４１】
α９インテグリンアンタゴニストが、α４インテグリンアンタゴニストと同時に、連続して、または組み合わせて投与される、請求項３０〜４０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４２】
ＨＳＣが骨髄より誘導される、請求項３０〜４１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４３】
ＨＳＣが、幹細胞ニッチ、望ましくは骨髄の中心または骨内膜ニッチより誘導される、
請求項３０〜４２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４４】
ＨＳＣが、ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ３８＋細胞、ＣＤ９０＋細胞、ＣＤ１３３＋細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞、リニージ委任のＣＤ３４−細胞またはＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞からなる群より選択される、骨内膜先祖細胞である、請求項３０〜４３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４５】
ＨＳＣを対象から採取する方法であって、
効果的な量のα９インテグリンのアンタゴニストまたはその活性な部分を対象に投与し、ここで該効果的な量で、ＨＳＣおよびその先駆細胞ならびにそれらの祖先細胞のＢＭ幹細胞ニッチにおけるＢＭ幹細胞結合リガンドからの除去が強化され；
その除去されたＨＳＣをＰＢに動員し；
そのＨＳＣをＰＢから採取する
ことを含む、方法。
【請求項４６】
α９インテグリンアンタゴニストがＧ−ＣＳＦの不在下で投与される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
ＨＳＣが、インターロイキン−１７、シクロホスファミド（Ｃｙ）、ドセタキセルおよび顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）などであるが、これらに限定されない、他のＨＳＣ動員剤の使用によってさらに動員される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
インテグリンアンタゴニストの効果的な量が、２５−１０００μｇ／ｋｇ体重、より好ましくは５０−５００μｇ／ｋｇ体重、最も好ましくは５０−２５０μｇ／ｋｇ体重の範囲にある、請求項４５または４６に記載の方法。
【請求項４９】
請求項４５〜４８のいずれか一項に記載の方法より得られるＨＳＣを含む、細胞組成物。
【請求項５０】
血液疾患の治療方法であって、請求項２２〜４４に記載の組成物または請求項４９に記載の細胞組成物を投与することを含む、方法。
【請求項５１】
対象における血液障害を治療するための方法であって、該対象に治療的に効果的な量のα９インテグリンのアンタゴニストまたはその活性な部分を投与し、ＨＳＣの、ＢＭからＰＢへの除去、放出または動員を強化する、方法。
【請求項５２】
α９インテグリンがα９β１インテグリンまたはその活性な部分である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
α４インテグリンのアンタゴニストまたはその活性な部分の投与をさらに含む、請求項５１または５２に記載の方法。
【請求項５４】
α４インテグリンがα４β１のアンタゴニストまたはその活性な部分である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
アンタゴニストがα９およびα４と交差反応し、望ましくはα９β１およびα４β１と交差反応してもよい、請求項５１〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
アンタゴニストが、式（Ｉ）：
【化９】
2017538715.tif 000047
［式中
Ｘは、結合手および−ＳＯ２−からなる群より選択され；
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、置換されてもよいアリールおよび置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ２は、Ｈおよび置換基からなる群より選択され；
Ｒ３は、ＨおよびＣ１−Ｃ４アルキルからなる群より選択され；
Ｒ４は、Ｈおよび−ＯＲ６からなる群より選択され；
Ｒ５は、Ｈおよび−ＯＲ７からなる群より選択される；
ただし、Ｒ４がＨである場合、Ｒ５は−ＯＲ７であり、Ｒ４が−ＯＲ６である場合、Ｒ５はＨであり；
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）Ｒ９および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１０Ｒ１１からなる群より選択され；
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５からなる群より選択され；
Ｒ８は、置換されてもよいアルキル、置換されてもよいアリール、置換されてもよいヘテロアリール、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）および−ＣＮからなる群より選択され；
Ｒ９は、置換されてもよいシクロアルキル、置換されてもよいヘテロシクロアルキル、置換されてもよいアリールおよび置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ１０およびＲ１１は、それらが結合する窒素と一緒になって、置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し；
Ｒ１２は、置換されてもよいアルキル、置換されてもよいアリール、置換されてもよいヘテロアリール、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）および−ＣＮからなる群より選択され；
Ｒ１３は、置換されてもよいシクロアルキル、置換されてもよいアリールおよび置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ１４およびＲ１５は、各々、Ｃ１−Ｃ４アルキルおよび置換されてもよいアリールからなる群より独立して選択されるか、または
Ｒ１４およびＲ１５は、それらが結合する窒素と一緒になって、置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し；および
ｎは、各々、１〜３の範囲にある整数である］
で示される化合物またはその医薬的に許容される塩である、請求項５０〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
Ｒ４がＨであり；および
Ｒ５が−ＯＲ７である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
Ｒ７が、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５からなる群より選択され；
Ｒ１２が、−ＣＮ、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）および置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ１３が、置換されてもよいシクロアルキル、置換されてもよいアリールおよび置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ１４およびＲ１５が、各々、Ｃ１−Ｃ４アルキルおよび置換されてもよいアリールからなる群より独立して選択されるか、または
Ｒ１４およびＲ１５が、それらが結合する窒素と一緒になって、置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し；および
ｎが１または２である、請求項５６または請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
Ｒ７が、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５からなる群より選択され；
Ｒ１２が、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−ＣＮ、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）および５−テトラゾリルからなる群より選択され；
Ｒ１３が２−ピロリルであり；
Ｒ１４およびＲ１５が、各々独立して、Ｃ１−Ｃ４アルキルであるか、または
Ｒ１４およびＲ１５が、それらが結合する窒素と一緒になって、置換されてもよいピロリジニルまたはモルホリニル環を形成し；および
ｎが１または２である、請求項５６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
式（Ｉ）の化合物が
【化１０】
2017538715.tif 000048
の化合物またはその医薬的に許容される塩である、請求項５６〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
Ｒ１が置換されてもよいフェニルである、請求項５６〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
フェニルが、少なくとも１個のハロゲン基で置換されてもよい、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
式（Ｉ）の化合物が
【化１１】
2017538715.tif 000049
の化合物またはその医薬的に許容される塩である、請求項５６〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
式（Ｉ）の化合物が
【化１２】
2017538715.tif 000050
の化合物またはその医薬的に許容される塩である、請求項５６〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
アンタゴニストがＧ−ＣＳＦの不在下で投与される、請求項５１〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
α９インテグリンアンタゴニストが、静脈内、皮内、皮下、筋肉内、経皮、または経粘膜に投与される；該アンタゴニストは、静脈内または皮下投与されることが望ましい、請求項５１〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
α９インテグリンアンタゴニストが、α４インテグリンアンタゴニストと同時に、連続して、または組み合わせて投与される、請求項５１〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
血液障害が、免疫抑制、慢性病、外傷、変性疾患、感染またはそれらの組み合わせ；皮膚、消化器系、神経系、リンパ系、心血管系、内分泌系またはその組み合わせの疾患または症状；骨粗鬆症、アルツハイマー病、心筋梗塞、パーキンソン病、外傷性脳損傷、多発性硬化症、肝硬変またはその組み合わせ；神経芽腫、骨髄異形成、骨髄線維症、乳がん、腎細胞がん、または多発性骨髄腫；造血系新生物障害、自己免疫疾患；または悪性でない障害からなる群より選択される、請求項５１〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
血液障害が、Ｂ−リニージＡＬＬおよびＴ−リニージＡＬＬからなる群より選択される急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、ヘアリー細胞白血病（ＨＬＬ）およびワルデンシュトレーム・マクログロブリン血症（ＷＭ）である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
ＨＳＣを患者に移植する方法であって、
α９インテグリンアンタゴニストを対象に投与し、ＨＳＣをＢＭ幹細胞結合リガンドから除去し；
そのＨＳＣをＢＭから放出させて、ＰＢに動員させ；
ＨＳＣをその対象のＰＢより採取し；および
そのＨＳＣを患者に移植する、ことを含む方法。
【請求項７１】
ＨＳＣが骨内膜祖先細胞であり、ＣＤ３４＋、ＣＤ３８＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞、リニージ委任のＣＤ３４−細胞、またはＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞からなる群より選択される、請求項７０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、造血幹細胞（ＨＳＣ）および前駆細胞ならびにそれらの祖先細胞の骨髄（ＢＭ）幹細胞ニッチからの除去および放出の強化、およびＨＳＣおよびその前駆細胞ならびにそれらの祖先細胞のＢＭおよび幹細胞ニッチからの除去および放出を強化する方法に関する。本発明はまた、ＨＳＣおよびその前駆細胞ならびにそれらの祖先細胞の除去および放出を強化するのに用いるための組成物にも関する。該方法および組成物により除去および放出されたＨＳＣおよびその前駆細胞ならびにそれらの祖先細胞の細胞集団、ならびにその細胞集団の血液障害の治療のための、ＨＳＣ、前駆細胞およびそれらの祖先細胞の移植のための使用も含まれる。
【背景技術】
【０００２】
ＢＭ幹細胞ニッチ内のＨＳＣ調節および保持は、ＨＳＣ表面受容体と、骨芽細胞および類洞内皮細胞などの周囲の細胞により発現されるその各自のリガンドとの間の相互作用を介して媒介される。機能アッセイならびにインビボおよびエクスビボ画像操作を用いてのＢＭ内でのＨＳＣの空間分布分析は、造血幹細胞が骨内膜ニッチ内の骨／ＢＭの最も近くにある接触面に優先的に局部化することを示す。注目すべきは、古典的なＬｉｎ−Ｓｃａ−１＋ｃｋｉｔ＋ＣＤ１５０＋ＣＤ４８−表現型と同じであるが、骨内膜ＢＭから単離されたＨＳＣが、中心髄腔から単離されたＨＳＣと比べて、より大きな帰巣能を有し、強化された長期に及ぶ多リニージ造血再構成を有することである。かくして、骨内膜ＨＳＣを動員用に治療標的化することは移植片のより良い成果をもたらすはずである。
【０００３】
血球形成のＢＭへの局在化は、原始造血細胞と、ＢＭ幹細胞ニッチの間質細胞介在性造血微小環境との間で発生的に調節された接着相互作用を含む。定常状態の条件下、ＨＳＣは、原始的造血祖先細胞のＢＭにおける生理学的保持をもたらす、間質要素（ＶＣＡＭ−１およびオステオポンチン（Ｏｐｎ）など）との接着相互作用によりＢＭニッチで保持される。接着相互作用の動揺は、ＢＭに保持されたＨＳＣの放出をもたらし、動員により幹細胞／祖先細胞を骨髄ニッチから、結局は循環系に放出することを惹起し得る。白血球の骨髄から最終的に末梢血への生理学的退出または動員、ならびに少数の幹細胞／祖先細胞の正常な骨髄環境から循環系への回避は理解に乏しい現象である。細胞が骨髄の血管外腔から循環系に移動するには、可逆的接着の連繋した順序および遊走工程を必要とするかもしれない。このプロセスでは、幹細胞／祖先細胞により、あるいは骨髄中の間質細胞により発現される接着分子のレパートリーが重要である。多様な刺激により引き起こされる祖先細胞の接着および／または遊走における変化は、骨髄と末梢血との間でその除去または再分布をもたらす可能性がある。
【０００４】
ＨＳＣの特定の集団を放出または動員することは、移植、遺伝子療法、白血病、乳がんを含む新生物がんなどのがんを含む疾患の治療、または組織および皮膚の修復を含む、種々の状況での使用を可能とし得る。しかしながら、ＨＳＣを動員するためには、ＨＳＣを最初にＢＭから除去し得る、迅速かつ選択的な動員レジメンを必要とする。ＨＳＣの特定の細胞集団をＢＭ幹細胞ニッチから除去および放出することは、より長期に及ぶ、多リニージ造血再構成を提供し得る。
【０００５】
動員された末梢血（ＰＢ）の造血幹細胞（ＨＳＣ）を血液疾患の治療を受けている患者に移植することが、実質的に、伝統的な骨髄（ＢＭ）移植に取って代わっている。ある臨床診療は、ＨＳＣを動員するのに、プロテアーゼ（ＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１の相互作用を切断する）の産生を刺激すると考えられる、５日間のコースの組換え顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）で達成される。しかしながら、Ｇ−ＣＳＦは、大規模の患者集団では効果がなく、骨疼痛、脾臓肥大、希な症例で脾臓破裂、心筋梗塞および脳虚血などのいくつかの副作用と関連付けられる。
【０００６】
これらのＧ−ＣＳＦに固有の欠点は、小分子に基づいて別の動員手段を同定するように努力してきたことである。例えば、ＦＤＡ承認のＣＸＣＲ４アンタゴニストであるＡＭＤ３１００（Plerixafor；Mozobil（登録商標））は、毒性問題を限定しながら、ＨＳＣを速やかに動員することが示された。それにも拘わらず、ＡＭＤ３１００による臨床的動員はＧ−ＣＳＦとの併用で効果的であるに過ぎず、迅速で選択的なＧ−ＣＳＦと独立した動員レジメンについての研究が依然として臨床的関心の対象となっている。臨床的には、Ｇ−ＣＳＦが最も広範に利用される動員剤であるが、その欠点として、さらには、潜在的に毒性の副作用、相対的に長期に及ぶ治療コース（５−７日の連続注入）、および患者の可変的応答が挙げられる。
【０００７】
しかしながら、動員を行うためには、ＨＳＣは、そのＢＭ幹細胞ニッチとの結合から解放されなければならない。ニッチ機能において重要であり、ＨＳＣをニッチ環境に保持する分子として、ＶＣＡＭ−１、オステオポンチン（Ｏｐｎ）およびテナシン−Ｃが挙げられる。
【０００８】
α４β１などのインテグリンがＨＳＣの動員と関連付けられる。具体的には、ＨＳＣにより発現されるα４β１（ＶＬＡ−４）およびα９β１の両方のインテグリンが、幹細胞の静止およびＶＣＡＭ−１およびオステオポンチン（Ｏｐｎ）との結合を通して骨内膜領域内でのニッチ保持と関連付けられる。α９β１インテグリンのＨＳＣ動員における役割は不明であるが、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を用いるＯｐｎのダウンレギュレーションにより、ならびにインテグリンα４またはＧ−ＣＳＦの選択的阻害により、Ｏｐｎ／ＶＣＡＭ−１とインテグリンとの結合が、ＨＳＣ動員について効果的な標的であること確認した。しかしながら、インテグリンなどの小分子との結合等の様々な特徴は、インテグリンが明らかに異なる分子であることを示す。
【０００９】
Pepinskyら（2002）にて、α４β１とα９β１インテグリンとの間の違いは、その結合特性において明らかである。Pepinskyは、小分子であるＮ−ベンゼン−スルホニル−（Ｌ）−プロリル−（Ｌ）−Ｏ−（１−ピロリジニルカルボニル）チロシン（ＢＯＰ）との結合の違いがＥＧＴＡ処理で明らかであることを示す。該処理はモノクローナル抗体である９ＥＧ７のα４β１との結合を阻害するのに対して、それは９ＥＧ７のα９β１との結合を刺激した。最も注目すべきことは、α４β１と１０ｎＭの見かけＫｄで結合し、α９β１と＞１０μＭの見かけＫｄで結合する、インテグリンのＶＣＡＭ−１に対するアフィニティにて推定して＞１０００倍違うことであった。違いは、α９β１およびα４β１とオステオポンチンとの結合でも見られた。
【００１０】
従って、ＨＳＣを迅速かつ選択的に除去し、かつ放出する化合物、およびＧ−ＣＳＦとは独立して、ＨＳＣの動員の改善をもたらす、ＨＳＣの除去および放出を強化するレジメンを同定することが本発明の目的である。これらの化合物を特定のＨＳＣ集団に対して標的とすることにより、再構成および移植の成果が改善され得る。
【００１１】
文書、行為、材料、装置、物品等の考察は、単に本発明の背景を提供する目的で、本明細書中に含まれるものである。先行技術基準の一部を形成するか、本発明に関連する分野にて共通の一般的知識である、これらのいずれの事項も、それが本願の各請求項の優先日より前に存在するとして、本発明を示唆または開示するものではない。
【発明の概要】
【００１２】
本発明の一の態様において、ＨＳＣおよびその前駆細胞ならびにそれらの祖先細胞の、インビボまたはエクスビボにおいてＢＭ幹細胞結合リガンドからの除去を強化する方法であって、効果的な量のα９インテグリンのアンタゴニストまたはその活性な部分を、Ｇ−ＣＳＦの存在または不在下で、ＢＭ幹細胞ニッチに投与することを含む、方法が提供される。
【００１３】
好ましくは、ＨＳＣの移動は、ＨＳＣをＢＭからＰＢに動員させる、ＨＳＣのＢＭ幹細胞結合リガンドからの放出をもたらし、それによりＨＳＣの動員を促進する。動員のさらなる刺激が、ＨＳＣのＰＢの動員をさらに強化する動員剤の使用により助成され得る。
【００１４】
好ましくは、ＨＳＣは、ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ３８＋細胞、ＣＤ９０＋細胞、ＣＤ１３３＋細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞、リニージ委任のＣＤ３４−細胞、またはＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞からなる群より選択される、骨内膜前駆細胞である。
【００１５】
好ましくは、α９インテグリンのアンタゴニストまたはその活性な部分は、α９β１インテグリンまたはその活性な部分である。
【００１６】
もう一つ別の実施態様において、該方法は、α４インテグリンのアンタゴニストまたはその活性な部分を投与することを含む。好ましくは、α４インテグリンはα４β１アンタゴニストまたはその活性な部分である。.
【００１７】
もう一つ別の実施態様において、該アンタゴニストはα９およびα４と交差反応し、所望によりα９β１およびα４β１と交差反応してもよい。所望により、該アンタゴニストはα９β１／α４β１アンタゴニストまたはその活性な部分であってもよい。
【００１８】
好ましくは、該アンタゴニストは、式（Ｉ）：
【化１】
2017538715.tif 000002
［式中
Ｘは、結合手および−ＳＯ２−からなる群より選択され；
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、所望により置換されてもよいアリールおよび所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ２は、Ｈおよび置換基からなる群より選択され；
Ｒ３は、ＨおよびＣ１−Ｃ４アルキルからなる群より選択され；
Ｒ４は、Ｈおよび−ＯＲ６からなる群より選択され；
Ｒ５は、Ｈおよび−ＯＲ７からなる群より選択される；
ただし、Ｒ４がＨである場合、Ｒ５は−ＯＲ７であり、Ｒ４が−ＯＲ６である場合、Ｒ５はＨであり；
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）Ｒ９および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１０Ｒ１１からなる群より選択され；
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５からなる群より選択され；
Ｒ８は、所望により置換されてもよいアルキル、所望により置換されてもよいアリール、所望により置換されてもよいヘテロアリール、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）および−ＣＮからなる群より選択され；
Ｒ９は、所望により置換されてもよいシクロアルキル、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル、所望により置換されてもよいアリールおよび所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ１０およびＲ１１は、それらが結合する窒素と一緒になって、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し；
Ｒ１２は、所望により置換されてもよいアルキル、所望により置換されてもよいアリール、所望により置換されてもよいヘテロアリール、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）および−ＣＮからなる群より選択され；
Ｒ１３は、所望により置換されてもよいシクロアルキル、所望により置換されてもよいアリールおよび所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ１４およびＲ１５は、各々、Ｃ１−Ｃ４アルキルおよび所望により置換されてもよいアリールからなる群より独立して選択されるか、または
Ｒ１４およびＲ１５は、それらが結合する窒素と一緒になって、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し；および
ｎは、各々、１〜３の範囲にある整数である］
で示される化合物またはその医薬的に許容される塩である。
【００１９】
好ましくは、式（Ｉ）の化合物は：
【化２】
2017538715.tif 000003
であるか、またはその医薬的に許容される塩である。
【００２０】
より好ましくは、式（Ｉ）の化合物は
【化３】
2017538715.tif 000004
であるか、またはその医薬的に許容される塩である。
【００２１】
最も好ましくは、式（Ｉ）の化合物は
【化４】
2017538715.tif 000005
であるか、またはその医薬的に許容される塩である。
【００２２】
もう一つ別の実施態様において、ＨＳＣのＢＭ幹細胞結合リガンドからの移動、放出または動員を強化するための組成物であって、本明細書に記載されるようなα９インテグリンのアンタゴニストまたはその活性な部分を含む、組成物が提供される。
【００２３】
本発明のさらにもう一つ別の態様において、ＨＳＣを対象から採取する方法であって、
Ｇ−ＣＳＦの存在または不在下で、有効量のα９インテグリンのアンタゴニストまたはその活性な部分を対象に投与し、ここで該有効量がＢＭ幹細胞ニッチにおけるＨＳＣおよびその前駆細胞ならびにそれらの祖先細胞のＢＭ幹細胞結合リガンドからの移動を強化し；
その移動したＨＳＣをＰＢに動員し；および
ＨＳＣをＰＢから採取する、ことを含む方法が提供される。
【００２４】
本発明のさらなる態様において、対象における血液障害を治療するための方法であって、Ｇ−ＣＳＦの存在または不在下で該対象に、治療的に効果的な量の本明細書に記載されるようなα９インテグリンのアンタゴニストまたはその活性な部分、あるいは本明細書に記載されるようなα９インテグリンのアンタゴニストまたはその活性な部分を投与した対象から採取したＨＳＣを含む細胞組成物を投与し、ＨＳＣの、ＢＭからＰＢへの移動、放出または動員を強化する、方法が提供される。
【００２５】
さらにもう一つ別の好ましい実施態様において、血液障害が造血腫瘍性障害であり、該方法は、効果的でなくなった化学療法剤がより効果的となるように、ＨＳＣを化学療法に感受的とし、ＨＳＣの感受性を改変することを含む。
【００２６】
さらにもう一つ別の態様において、ＨＳＣを患者に移植する方法であって、
α９インテグリンアンタゴニストを対象に投与し、ＨＳＣをＢＭ幹細胞結合リガンドから移動させ；
そのＨＳＣを放出させてＢＭからＰＢに動員させ；
ＨＳＣを患者から由来のＰＢより採取し；および
該ＨＳＣを該患者に移植する、ことを含む方法が提供される。
【００２７】
本発明の他の態様は、本発明の具体的な実施態様の以下の記載を考慮して、当業者に明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
本発明の態様および利点をさらに具体的に理解するために、添付される図面と一緒に以下の詳細な記載に言及されるべきである。
【００２９】
【図１】ＬＮ１８−誘導細胞株の生成を示す。ヒトインテグリンα４β１およびα９β１を過剰発現する安定したＬＮ１８細胞が、ヒト神経膠芽細胞腫ＬＮ１８細胞株のレトロウイルス形質導入を介して生成される。親およびα９β１形質導入ＬＮ１８細胞におけるバックグラウンドα４発現のサイレンシングがα４ｓｈＲＮＡのレトロウイルスベクターの送達により達成された。
【００３０】
【図２】α４β１およびα９β１  ＬＮ１８細胞の抗体染色を示す。対照のＬＮ１８  ＳｉＡ４、ＬＮ１８  α４β１、およびＬＮ１８  α９β１細胞を、マウスイソ型対照、マウス−抗ヒトα４抗体またはマウス−抗ヒトα９β１抗体で染色し、次にアレキサ・フロウアー５９４接合ヤギ−抗マウスＩｇＧ１で二次標識した。細胞はＤＡＰＩ（青色）で対比染色した。
【００３１】
【図３】化合物２２およびＲ−ＢＣ１５４と対照（インテグリンなし；クロス点線）、α４β１（丸−破線）およびα９β１（四角−実線）ＬＮ１８細胞との、（ａ）１ｍＭ  Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋（白記号）の存在下にある化合物２２、および（ｂ）１ｍＭ  Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋（白記号）または１ｍＭ  Ｍｎ２＋（黒記号）のいずれかの存在下にあるＲ−ＢＣ１５４での飽和結合実験を示す。示されるデータは、平均蛍光強度（ＭＦＩ）±ＳＥＭ（ｎ＝３）で表される。（ｃ）Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋およびＭｎ２＋の条件下にて５０ｎＭ  Ｒ−ＢＣ１５４（赤色）で染色した、過剰発現の、および対照のＬＮ１８細胞の蛍光顕微鏡画像を示す。細胞をＤＡＰＩ（青色）で対比染色された。
【００３２】
【図４】Ｒ−ＢＣ１５４のカチオン依存性結合を示す。ＬＮ１８  α９β１細胞を、ＴＢＳ緩衝液のみ（黒棒）、１ｍＭ  Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋（赤棒）または１ｍＭ  Ｍｎ２＋（青棒）中にて所定の濃度のＲ−ＢＣ１５４で処理した。得られたデータを１回の実験からのものであり、％最大蛍光で表される。
【００３３】
【図５】Ｒ−ＢＣ１５４がＬＮ１８細胞と結合する動力学的測定結果を示す。Ｒ−ＢＣ１５４が（ａ）α４β１（丸−破線）および（ｂ）α９β１（四角−実線）のインテグリンと結合する会合速度を、ＴＢＳ緩衝液中、１ｍＭ  Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋（白記号）および１ｍＭ  Ｍｎ２＋（黒記号）の存在下で、細胞を５０ｎＭ  Ｒ−ＢＣ１５４で０、０.５、１、２、３、５、１０、１５および２０分間にわたって３７℃で処理することにより決定した。（ｃ）Ｒ−ＢＣ１５４とα４β１（丸−破線）およびα９β１（四角−実線）のインテグリンとの結合の解離速度の測定値が、ＴＢＳ緩衝液中、１ｍＭ  Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋（白記号）および１ｍＭ  Ｍｎ２＋（黒記号）の存在下で０、２.５、５、１５、３０、４５および６０分に決定された。示されるデータは最大蛍光の平均％±ＳＥＭ（ｎ＝３）で表され、時間の関数としてプロットされる。オン−レート（on-rate）データをすべての曲線について２相会合関数に適合させた（Ｒ２＞０.９９７）。オフ−レート（off-rate）データをα４β１（Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋）を除いてすべての曲線について１相の指数関数的に減衰する関数に適合させ、それを２相の指数関数的に減衰する関数に適合させた（Ｒ２＞０.９９９）。
【００３４】
【図６】未処理（灰色線）およびＲ−ＢＣ１５４（１０ｍｇ・ｋｇ−１）注射（赤色線）のＣ５７ＢＩ／６マウスより単離した（ａ）骨髄造血前駆細胞（ＬＳＫ）および（ｂ）ＨＳＣ（ＬＳＫＳＬＡＭ）のフローサイトメトリーによるヒストグラムプロットを示す。データは３つの生物試料の代表例である。（ｃ）未処理および（ｄ）Ｒ−ＢＣ１５４注射のマウスより単離したＦＡＣＳソートの前駆細胞（リニージ−Ｓｃａ−１＋ｃ−Ｋｉｔ＋）の蛍光顕微鏡画像（差し込み図）である。Ｓｃａ−１＋（青色）、ｃ−Ｋｉｔ＋（緑色）、Ｒ−ＢＣ１５４＋（赤色）である。
【００３５】
【図７】Ｒ−ＢＣ１５４は、優先的に、ネズミおよびヒト造血前駆細胞とインビトロにて結合することを示す。（ａ）Ｒ−ＢＣ１５４（１）の化学構造を示す。（ｂ）１ｍＭ  Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋の存在下で対照のＳｉＡ４（α４ノックダウン；黒色）、α４β１（赤色）およびα９β１（青色）を形質導入したＬＮ１８細胞株と結合するＲ−ＢＣ１５４の代表的フローサイトメトリーのヒストグラムプロットを示す。（ｃ）骨内膜（赤色）および中心（青色）ＢＭ、およびＢＭ  Ｌｉｎ−Ｓｃａ＋ｃ−ｋｉｔ＋（ＬＳＫ）およびＬＳＫＣＤ１５０＋ＣＤ４８−（ＬＳＫＳＬＡＭ）の代表的なフローサイトメトリーのプロットを示す大腿骨の斜視図を示す。（ｄ）１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（不活性化剤；黒色）および１ｍＭ  Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋（活性化剤；緑色）の存在下でＲ−ＢＣ１５４（１０ｎＭ）で染色されるＬＳＫおよびＬＳＫＳＬＡＭ細胞のヒストグラムプロットを示す。染色されていないＬＳＫおよびＬＳＫＳＬＡＭ細胞は灰色で示される。（ｅ）１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（不活性化剤；黒色）および１ｍＭ  Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋（活性化剤；緑色）の存在下で染色した中心および骨内膜ＢＭから採取したＬＳＫおよびＬＳＫＳＬＡＭ細胞に結合しているＲ−ＢＣ１５４を示す。染色されていない細胞は灰色で示される。データは％最大平均蛍光強度（ＭＦＩ）±ＳＥＭ（ｎ＝３）として表され、少なくとも３回の別個の試験の代表例である。（ｆ）カチオンの不在下にて中心（青色）および骨内膜（赤色）ＬＳＫ細胞に結合するＲ−ＢＣ１５４を示す。点網掛け曲線は染色されていないＬＳＫ細胞を示す。（ｇ）１ｍＭ  Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋の結合の存在下で中心（青色棒）および骨内膜（赤色棒）ＢＭからのリンパ球（Ｂ２２０＋およびＣＤ３＋）および骨髄性細胞（Ｇｒ１Ｍａｃ１＋）、ＬＳＫおよびＬＳＫＳＬＡＭ細胞に結合するＲ−ＢＣ１５４を比較して示す。データは２回の別個の実験の代表例である。一方向性ＡＮＯＶＡ  ｐ＜０.０００１である。（ｈ）ｗｔマウス（黒色棒）およびα４−／−／α９−／−条件付きＫＯマウス（白色棒）からの中心および骨内膜ＬＳＫおよびＬＳＫＳＬＡＭ細胞に結合するＲ−ＢＣ１５４を示す。（ｉ）１ｍＭ  Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋の存在（緑色；活性化されている）下、およびカチオンの不在（黒色；活性化されていない）下でのＲ−ＢＣ１５４とヒト単核細胞（ＭＮＣ）との用量応答結合を示す。（ｊ）ＣＤ３４＋およびＣＤ３８−を発現するヒトＭＮＣの代表的フローサイトメトリーのプロットを示す。ゲーテッド集団はリニージ委任細胞（Ｐ１＝ＣＤ３４−）、造血前駆細胞（Ｐ２＝ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋）および強化幹細胞および前駆細胞（Ｐ３＝ＣＤ３４＋ＣＤ３８−）を示す。（ｋ）１ｍＭ  Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋の存在（緑色；活性化剤）下、およびカチオンの不在（黒色；不活性化剤）下でＣＤ３４−、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−およびＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞に結合するＲ−ＢＣ１５４を示す。染色されていない細胞は灰色で示される。データは３人の臍帯血ドナーより由来し、正規化されたＭＦＩ（平均±ＳＥＭ）として表される。＊ｐ＜０.０５、＊＊ｐ＜０.０１、＊＊＊ｐ＜０.００５および＊＊＊＊ｐ＜０.００１
【００３６】
【図８】１０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１ｍＭ  Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋の存在下で、Ｒ−ＢＣ１５４（１０ｎＭ）で処理したＷＢＭから由来のゲーテッドリンパ球（Ｂ２２０＋およびＣＤ３＋）、骨髄（Ｇｒ１Ｍａｃ１＋）およびリニージ−集団のヒストグラムプロットを示す。染色されていない細胞は灰色で示される。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）である。
【００３７】
【図９】Ｒ−ＢＣ１５４が骨内膜ニッチの中でインサイチュにて本質的に活性化されたα４／α９インテグリンを介してＨＳＣおよび前駆細胞を標的とすることを示す。（ａ）Ｒ−ＢＣ１５４を注射したマウスより獲得された中心（青色）および骨内膜（赤色）ＢＭから由来のゲーテッドＬＳＫ細胞に結合しているＲ−ＢＣ１５４の代表的フローサイトメトリーのヒストグラムを示す。Ｒ−ＢＣ１５４ｈｉ集団が記載される。注射されていないマウスから由来のＬＳＫ細胞は黒色で示される。（ｂ）骨内膜（赤色）および中心（青色）ＢＭ（１時点に付きｎ＝３）より単離されたＬＳＫおよびＬＳＫＳＬＡＭ細胞内にあるＲ−ＢＣ１５４ｈｉ細胞の割合を表すインビボでの経時変化実験を示す。ｐ値（２方向ＡＮＯＶＡ）は所定の時点で中心と骨内膜との間で比較して示される。データは平均値±ＳＥＭである。（ｃ）Ｒ−ＢＣ１５４を注射した５分後に骨内膜（赤色棒）および中心（青色棒）ＢＭ（ｎ＝３）より単離したリンパ球（Ｂ２２０＋およびＣＤ３＋）および骨髄（Ｇｒ１＋およびＭａｃ１＋）先駆体内でのＲ−ＢＣ１５４ｈｉ細胞の％を示す。データは平均値±ＳＥＭであり、２回の独立した実験の代表例である。（ｄ）インビボでのＲ−ＢＣ１５４結合は、ＬＳＫ細胞でのα４およびα９インテグリン発現に依存する。Ｒ−ＢＣ１５４注射のｗｔおよびα４−／−／α９−／−条件付きＫＯマウスから由来のリニージ枯渇のＦＡＣＳソートのＳｃａ−１＋ｃ−Ｋｉｔ＋細胞の蛍光顕微鏡画像（左側）である。Ｒ−ＢＣ１５４（赤色）；Ｓｃａ−１−ＰＢ（青色）；ｃ−ｋｉｔ（緑色）である。Ｒ−ＢＣ１５４を注射したｗｔ（赤色）およびα４−／−／α９−／−条件付きＫＯマウス（灰色）から由来のゲーテッドＬＳＫ細胞のフローサイトメトリーのヒストグラムプロット（右側）を示す。注射されないマウスから由来のＬＳＫ細胞は黒色で示される。データは２回の別個の実験の代表例である。（ｅ）皮下注射した後に、Ｒ−ＢＣ１５４がＰＢおよびＢＭ中のＬＳＫ細胞に結合する経時変化を示す。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）である。＊ｐ＜０.０５、＊＊ｐ＜０.０１、＊＊＊ｐ＜０.００５および＊＊＊＊ｐ＜０.００１である。
【００３８】
【図１０】Ｒ−ＢＣ１５４を注射して処理した１５分および３０分後のマウスの末梢血中の（ａ）ＷＢＣ含有量、（ｂ）ＬＳＫ含有量、および（ｃ）ＬＳＫＳＬＡＭ含有量の分析を示す。データは平均±ＳＥＭであり、有意ではない（一方向性ＡＮＯＶＡ）。
【００３９】
【図１１】小分子のα９β１／α４β１インテグリンアンタゴニストのＢＯＰがＨＳＣおよび前駆細胞を迅速に動員させることを示す。（ａ）α９β１／α４β１インテグリンアンタゴニストのＢＯＰ（２）の化学構造を示す。（ｂ）１ｍＭ  Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋の存在下でＲ−ＢＣ１５４とα４β１（点線）およびα９β１（実線）のＬＮ１８細胞との結合のＢＯＰを用いる競合的阻害を示す。（ｃ）１ｍＭ  Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋の存在下でＲ−ＢＣ１５４と骨内膜ＬＳＫおよびＬＳＫＳＬＡＭ細胞との結合のＢＯＰを用いる競合的置換を示す。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）である。ＢＯＰ（１０ｍｇ／ｋｇ）で９０分間にわたって処理したマウスの末梢血中の（ｄ）ＷＢＣ含有量、（ｅ）ＬＳＫ含有量、および（ｆ）ＬＳＫＳＬＡＭ含有量の分析結果を示す。データは平均±ＳＥＭ（各時点でｎ＝５）である。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
造血幹細胞動員は、造血幹細胞が骨髄腔（例えば、寛骨および胸骨）から血流に刺激され、それでそれらが将来の補液のための収集に利用可能であるか、または骨髄から自然に放出され、体内を通って脾臓などの臓器に留まって血球を提供する、ところの工程である。種々の血液障害に付随して生じることが多い、この興味深い自然現象は、ＨＳＣの血流への動員を人為的に引き起こし、それで該ＨＳＣが移植などの目的のために集められ、使用され得る薬剤の発見をもたらす、療法の有用な成分として適合されるかもしれない。Ｇ−ＣＳＦおよびＦＤＡ承認のＣＸＣＲ−４アンタゴニストであるＡＭＤ３１００などの化合物は、ＨＳＣを動員することが知られている。しかしながら、毒性問題および種々の副作用がこの治療から生じ得る。
【００４１】
ＨＳＣが動員されうる前に、ＨＳＣは、それらが存在し、接着相互作用により保持される、ＢＭ幹細胞ニッチより取り除かれ、放出されなければならない。
【００４２】
従って、本発明の態様において、インビボまたはエクスビボにてＢＭ幹細胞と結合するリガンドからＨＳＣおよびその前駆細胞ならびにそれらの祖先細胞を取り除くことを強化する方法であって、効果的な量のα９インテグリンのアンタゴニストまたはその活性な部分をＢＭ幹細胞ニッチにインビボまたはエクスビボにて投与することを含む、方法が提供される。
【００４３】
定常状態条件にて、ＨＳＣは、ＢＭ幹細胞ニッチと称される、ＢＭの特定の区域に存在する。ここで、該ＨＳＣは、放出される前に、ＰＢに入って、組織に留まり、分化を開始することを容易にする、静止幹細胞として存在する。ＨＳＣは、接着分子または結合リガンド、例えば、限定されないが、ＶＣＡＭ−１、ＯｐｎおよびＴｅｎａｃｉｎ−ＣによりＢＭ幹細胞ニッチに保持される。ＨＳＣ／ＢＭ幹細胞ニッチの相互作用の調整は、ＨＳＣのＢＭ幹細胞ニッチへの、最終的にはＰＢへの除去および放出に役立つ。
【００４４】
かくして、本発明は、ＨＳＣとＢＭ幹細胞ニッチ環境の間の接着相互作用および結合リガンドを中断することにより、ＨＳＣをＢＭ幹細胞ニッチの相互作用から除去および放出するための手段を提供する。次に、該細胞はＰＢに動員するために利用可能となるか、あるいはＢＭに留まってもよい。
【００４５】
ＢＭ幹細胞ニッチは骨内膜ニッチおよび中心髄腔を含む。骨内膜幹細胞ニッチは骨髄の骨内膜にあり、そこでは骨芽細胞が増殖および静止などのＨＳＣ機能の主たる調整物質である。さらには、有意な割合のＨＳＣは、内皮ニッチにある類洞内皮細胞と密接に関連付けられ、そこではＨＳＣが末梢血に入り、分化を開始する準備がなされている。中心髄腔は、赤血球および白血球の形成に関与する、別名骨髄として知られる、骨の中心腔である。
【００４６】
本発明者は、少なくともα９インテグリンを小分子のアンタゴニストで阻害することにより、ＨＳＣおよびその前駆細胞ならびにそれらの祖先細胞をＢＭ幹細胞ニッチから、好ましくは骨内膜ニッチに除去できる、あるいはＰＢに動員し、長期にわたって多リニージ生着の可能性のあることを見出した。意外にも、α９インテグリンまたはその活性な部分に対するアンタゴニストを用いることで、少なくともＣＤ３４＋幹細胞および前駆細胞の血液中への除去および放出が有意に増加することが見出された。
【００４７】
本発明者らは、一連のＮ−フェニルスルホニルプロピンジペプチドをベースに、活性化されたヒトおよびネズミα９β１およびα４β１インテグリンならびにＢＭ  ＨＳＣおよび先駆細胞（図１ａ）と結合する、蛍光小分子のインテグリンアンタゴニスト、Ｒ−ＢＣ１５４（１）（図１ａ）を開発した。本発明者らは、このファミリーの化合物が骨内膜ＢＭ内でα９β１／α４β１およびＯｐｎの間の相互作用の制限に基づき、動員のために強力な骨内膜ＨＳＣを標的とすると仮定した。この度、Ｒ−ＢＣ１５４（１）およびその非標識化誘導体ＢＯＰ（２）が優先的に結合し、インビボにおいて本質的に活性化されたα９β１／α４β１インテグリンを介して、マウスおよびヒトＨＳＣならびに先駆細胞を動員することが見出された。かくして、α９β１／α４β１インテグリン阻害剤を用いて骨内膜ＨＳＣを標的とする療法は、幹細胞の移植適用について、現行の動員手段に代わる有望な手段を提示する。
【００４８】
インテグリンは、第一に細胞粘着および細胞シグナル伝達工程のメディエーターとして機能する、αβヘテロダイマーの膜貫通タンパク質と非共有的に連結する。哺乳動物にて、１８α−鎖および８β−鎖が同定されており、今日まで、少なくとも２４種の異なる、独特なαβの組み合わせが記載されている。
【００４９】
α４β１インテグリン（最晩期抗原−４；ＶＬＡ−４）は主に白血球で発現され、血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）、フィブロネクチンおよびオステオポンチン（Ｏｐｎ）の受容体であることが知られている。α４β１インテグリンは白血球動員、移行および活性化の重要な調整物質であり、炎症および自己免疫疾患にて重要な役割がある。したがって、フェーズＩおよびＩＩの臨床試験にまで進行している数人の対象で、喘息、多発性硬化症およびクローン病を治療するために、著しい努力は、α４β１インテグリン機能の小分子阻害剤を開発することに焦点が当てられてきた。
【００５０】
関連するβ１インテグリンの、α９β１と、α４β１とは、多くの構造的および機能的特性を共有し、ＶＣＡＭ−１およびＯｐｎを含む、同じリガンドのいくつかとも結合するが、インテグリンのα４β１とα９β１との間には両者を区別する違いもある。白血球で大きく発現が制限されるα４β１と異なり、α９β１の細胞発現は広範囲に及ぶ。
【００５１】
例えば、小分子のα９β１およびα４β１インテグリンとの結合は異なることが分かっている。本明細書中の実施例に示されるように、最も大きな違いはオフ−レート反応速度にある。α９β１アンタゴニスト（Ｒ−ＢＣ１５４）ならびにＢＯＰは、α４β１に比べて、α９β１に対するオフ−レートを有意に減少させることが知られている。Ｒ−ＢＣ１５４についての詳細は本明細書の実施例２（図５ｃ）で具体的に示されており、ＢＯＰについての詳細はPepinskyら（2002）（図４ｂ）にて具体的に示される
【００５２】
以前は、α４β１およびα９β１インテグリンは共に造血幹細胞（ＨＳＣ）により発現されることが示された。インテグリンのα４β１およびα９β１は、主として、ＨＳＣを隔離し、それを骨髄に動員すること、ならびにＨＳＣ静止の維持、長期に及ぶ再増殖の幹細胞のための重要な特性と関連付けられる。
【００５３】
α４β１およびα９β１インテグリンによるＨＳＣの調整は、骨ライニング骨芽細胞、内皮細胞および骨髄環境の他の細胞により発現および／または分泌される、ＶＣＡＭ−１およびＯｐｎとの相互作用を通して媒介される。しかしながら、Pepinskyら（2002）により討論されるように、ＶＣＡＭ−１とＯｐｎに対する結合アフィニティの違いはα４β１とα９β１との間で著しく異なる。α４β１の小分子は効果的なＨＳＣ動員剤として関係付けられる。しかしながらα４β１とα９β１との間に構造的および機能的類似性があるにも拘わらず、結合特性は異なり、そこでこの点に関してα９β１インテグリンの役割は未開拓のままである。
【００５４】
本発明の１の好ましい実施態様において、α９インテグリンのアンタゴニストはα９β１インテグリンのアンタゴニストである。インテグリンα９は、ヒトにて、ＩＴＧＡ９遺伝子によりコードされるタンパク質である。この遺伝子はアルファインテグリンをコードする。インテグリンは、細胞の機能を媒介するアルファ鎖とベータ鎖とからなるヘテロダイマーの内在性膜糖タンパク質である。α９サブユニットはβ１サブユニットとヘテロダイマー複合体を形成し、α９β１インテグリンを形成する。従って、α９インテグリンのアンタゴニストは、α９β１インテグリンのアンタゴニストまたはその活性な部分であることが好ましい。
【００５５】
本明細書で使用されるように、α９β１インテグリンまたはα４β１インテグリンの活性な部分は、インテグリンの活性を保持するα９β１タンパク質またはα４β１タンパク質の部分である。すなわち、その部分は、α９β１タンパク質またはα４β１タンパク質の一部であり、完全なタンパク質よりも小さいが、完全なα９β１またはα４β１タンパク質と同じまたは類似する様式にてまだ作用しうる。「α９インテグリン」または「α４インテグリン」あるいは「α９β１インテグリン」または「α４β１インテグリン」なる語が本明細書で使用される場合、それはまたその活性ないずれの部分への言及も包含する。
【００５６】
本発明のもう一つ別の実施態様において、α９インテグリン、好ましくはα９β１インテグリンのアンタゴニストは、α４インテグリン、好ましくはα４β１インテグリンのアンタゴニストでもある。本発明のα９インテグリンアンタゴニストは、α９β１インテグリンおよびα４β１インテグリンの両方の活性を阻害し得ることが望ましい。よって、アンタゴニストはα９β１／α４β１インテグリンアンタゴニストであることが好ましい。
【００５７】
α９インテグリン、好ましくはα９β１インテグリンのアンタゴニストは、α４インテグリン、好ましくはα４β１インテグリンのアンタゴニストと同じであっても、または異なってもよい。そのアンタゴニストが同じであるならば、α９インテグリンおよびα４インテグリンの両方の活性を阻害するのに単一のアンタゴニストが用いられてもよい。α９インテグリン、好ましくはα９β１インテグリンおよびα４インテグリン、好ましくはα４β１インテグリンを阻害するのに、別個のアンタゴニストが、同時または別々のいずれかで使用されてもよい。
【００５８】
本発明のさらにもう一つ別の実施態様において、α９インテグリン、好ましくはα９β１インテグリン、およびα４インテグリン、好ましくはα４β１インテグリンは、インテグリンのアンタゴニストと相互作用させる前に、活性化されるのが好ましい。アンタゴニストは本質的に活性化されたインテグリンと相互作用させるのが好ましい。従って、α９インテグリンは本質的に活性化されているのが望ましい。好ましくは、α９β１インテグリンが本質的に活性化されている。上記に記載されるように、α９β１インテグリン／α４β１インテグリンは共に、ＨＳＣおよび前駆細胞が骨内膜ニッチにある本質的に活性化されたα９／α４インテグリンを介してＨＳＣおよび前駆細胞を標的とするように、同時にまたは連続的に活性化されるのが望ましい。
【００５９】
本発明のもう一つ別の実施態様において、α９インテグリンのアンタゴニスト、好ましくはα９β１インテグリン、より好ましくはα９β１／α４β１インテグリンのアンタゴニストは、式（Ｉ）：
【化５】
2017538715.tif 000006
［式中
Ｘは、結合手および−ＳＯ２−からなる群より選択され；
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、所望により置換されてもよいアリールおよび所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ２は、Ｈおよび置換基からなる群より選択され；
Ｒ３は、ＨおよびＣ１−Ｃ４アルキルからなる群より選択され；
Ｒ４は、Ｈおよび−ＯＲ６からなる群より選択され；
Ｒ５は、Ｈおよび−ＯＲ７からなる群より選択される；
ただし、Ｒ４がＨである場合、Ｒ５は−ＯＲ７であり、Ｒ４が−ＯＲ６である場合、Ｒ５はＨであり；
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）Ｒ９および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１０Ｒ１１からなる群より選択され；
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５からなる群より選択され；
Ｒ８は、所望により置換されてもよいアルキル、所望により置換されてもよいアリール、所望により置換されてもよいヘテロアリール、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）および−ＣＮからなる群より選択され；
Ｒ９は、所望により置換されてもよいシクロアルキル、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル、所望により置換されてもよいアリールおよび所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ１０およびＲ１１は、それらが結合する窒素と一緒になって、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し；
Ｒ１２は、所望により置換されてもよいアルキル、所望により置換されてもよいアリール、所望により置換されてもよいヘテロアリール、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）および−ＣＮからなる群より選択され；
Ｒ１３は、所望により置換されてもよいシクロアルキル、所望により置換されてもよいアリールおよび所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ１４およびＲ１５は、各々、Ｃ１−Ｃ４アルキルおよび所望により置換されてもよいアリールからなる群より独立して選択されるか、または
Ｒ１４およびＲ１５は、それらが結合する窒素と一緒になって、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し；および
ｎは、各々、１〜３の範囲にある整数である］
で示される化合物またはその医薬的に許容される塩を含む。
【００６０】
一連の実施態様において、式（Ｉ）の化合物は、
Ｒ４がＨであり；
Ｒ５が−ＯＲ７であり； および
Ｘ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ７が式（Ｉ）について定義されるとおりである。
【００６１】
かかる実施態様において、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩ）：
【化６】
2017538715.tif 000007
［式中：
Ｘは、結合手および−ＳＯ２−からなる群より選択され；
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、所望により置換されてもよいアリールおよび所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ２は、Ｈおよび置換基からなる群より選択され；
Ｒ３は、ＨおよびＣ１−Ｃ４アルキルからなる群より選択され；
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５からなる群より選択され；
Ｒ１２は、所望により置換されてもよいアルキル、所望により置換されてもよいアリール、所望により置換されてもよいヘテロアリール、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）および−ＣＮからなる群より選択され； 
Ｒ１３は、所望により置換されてもよいシクロアルキル、所望により置換されてもよいアリールおよび所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ１４およびＲ１５は、各々、Ｃ１−Ｃ４アルキルおよび所望により置換されてもよいアリールからなる群より独立して選択されるか、または
Ｒ１４およびＲ１５は、それらが結合する窒素と一緒になって、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し；および
ｎは、各々、１ないし３の範囲にある整数である］
で示される構造を有してもよい。
【００６２】
式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物の一連の実施態様において、
Ｒ７は、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５からなる群より選択され；
Ｒ１２は、−ＣＮ、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）および所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ１３は、所望により置換されてもよいシクロアルキル、所望により置換されてもよいアリールおよび所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ１４およびＲ１５は、各々、Ｃ１−Ｃ４アルキルおよび所望により置換されてもよいアリールからなる群より独立して選択されるか、または
Ｒ１４およびＲ１５は、それらが結合する窒素と一緒になって、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し；および
ｎは１または２である。
【００６３】
式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物のある実施態様において、Ｒ７はＣ１−Ｃ４アルキルより選択される。
【００６４】
式（Ｉ）または式（ＩＩ）の基について本明細書に記載される例示としてのＣ１−Ｃ４アルキルは、直鎖であっても、または分岐してもよい。ある実施態様において、Ｃ１−Ｃ４アルキルは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチルおよびtert−ブチルからなる群より選択されてもよい。
【００６５】
ある実施態様において、Ｒ７はメチルまたはtert−ブチルであってもよく、それで−ＯＲ７は−ＯＣＨ３または−ＯＣ（ＣＨ３）３である。
【００６６】
式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物のある実施態様において、Ｒ７は−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ１２である。かかる実施態様において、Ｒ１２は所望により置換されてもよいアルキル、所望により置換されてもよいアリール、所望により置換されてもよいヘテロアリール、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）および−ＣＮからなる群より選択されてもよく、ｎは１ないし３の範囲にある整数である。
【００６７】
式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物のある実施態様において、Ｒ７は−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ１２であり、ここでＲ１２は−ＣＮ、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）および所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択されてもよく、ｎは１または２である。
【００６８】
式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物のある実施態様において、Ｒ７は−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ１２であり、ここで、
Ｒ１２は−ＯＣＨ３であり、ｎは２であるか、または
Ｒ１２は所望により置換されてもよいテトラゾリル（好ましくは、５−テトラゾリル）であり、ｎは１である。
【００６９】
式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物のある実施態様において、Ｒ７は−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３である。かかる実施態様において、Ｒ１３は所望により置換されてもよいシクロアルキル、所望により置換されてもよいアリールおよび所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択されてもよい。
【００７０】
一連の実施態様において、Ｒ１３は所望により置換されてもよい５または６員のシクロアルキル環であってもよい。典型的なシクロアルキル環はシクロペンチルまたはシクロヘキシルであってもよい。
【００７１】
一連の実施態様において、Ｒ１３は所望により置換されてもよいアリール環であってもよい。典型的なアリール環はフェニルである。
【００７２】
一連の実施態様において、Ｒ１３は所望により置換されてもよいヘテロアリール環であってもよい。典型的なヘテロアリール環はピロリルである。
【００７３】
式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物のある実施態様において、Ｒ７は−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５である
【００７４】
Ｒ７が−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５である、式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物のある実施態様において、Ｒ１４およびＲ１５は、各々、Ｃ１−Ｃ４アルキルおよび所望により置換されてもよいアリールからなる群より独立して選択されてもよい。
【００７５】
Ｒ７が−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５である、式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物のある具体的な実施態様において、Ｒ１４およびＲ１５は、各々、エチルまたはイソプロピルである。
【００７６】
Ｒ７が−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５である、式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物の一の具体的な実施態様において、Ｒ１４およびＲ１５の一方がメチルであり、Ｒ１４およびＲ１５の他方がフェニルである。
【００７７】
Ｒ７が−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５である、式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物のある具体的な実施態様において、Ｒ１４およびＲ１５は、それらが結合する窒素と一緒になって、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成してもよい。一の形態において、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル環は所望により置換されてもよい５〜７員のヘテロシクロアルキル環である。特定のヘテロシクロアルキル環はピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、およびモルホリニル環からなる群より選択されてもよい。
【００７８】
Ｒ７が−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５である、式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物の具体的な実施態様において、Ｒ１４およびＲ１５は、それらが結合する窒素と一緒になって、所望により置換されてもよいピロリジニル環を形成する。
【００７９】
式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物のある具体的な実施態様において、
Ｒ７は、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５からなる群より選択され；
Ｒ１２は、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−ＣＮ、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）および５−テトラゾリルからなる群より選択され；
Ｒ１３は２−ピロリルであり；
Ｒ１４およびＲ１５は、各々独立して、Ｃ１−Ｃ４アルキルであるか、または
Ｒ１４およびＲ１５は、それらが結合する窒素と一緒になって、所望により置換されてもよいピロリジニルまたはモルホリニル環を形成し；および
ｎは１または２である。
【００８０】
式（Ｉ）の化合物の一連の実施態様において、Ｘは−ＳＯ２−である。かかる実施態様において、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩＩ）：
【化７】
2017538715.tif 000008
［式中：
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、所望により置換されてもよいアリールおよび所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ２は、Ｈおよび置換基からなる群より選択され；
Ｒ３は、ＨおよびＣ１−Ｃ４アルキルからなる群より選択され；
Ｒ４は、Ｈおよび−ＯＲ６からなる群より選択され；
Ｒ５は、Ｈおよび−ＯＲ７からなる群より選択される；
ただし、Ｒ４がＨである場合、Ｒ５は−ＯＲ７であって、Ｒ４が−ＯＲ６である場合、Ｒ５はＨであり；
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）Ｒ９および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１０Ｒ１１からなる群より選択され；
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５からなる群より選択され；
Ｒ８は、所望により置換されてもよいアルキル、所望により置換されてもよいアリール、所望により置換されてもよいヘテロアリール、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）および−ＣＮからなる群より選択され；
Ｒ９は、所望により置換されてもよいシクロアルキル、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル、所望により置換されてもよいアリール、および所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ１０およびＲ１１は、それらが結合する窒素と一緒になって、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し；
Ｒ１２は、所望により置換されてもよいアルキル、所望により置換されてもよいアリール、所望により置換されてもよいヘテロアリール、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）および−ＣＮからなる群より選択され；
Ｒ１３は、所望により置換されてもよいシクロアルキル、所望により置換されてもよいアリール、および所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ１４およびＲ１５は、各々、Ｃ１−Ｃ４アルキルおよび所望により置換されてもよいアリールからなる群より独立して選択されるか、または
Ｒ１４およびＲ１５は、それらが結合する窒素と一緒になって、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し；および
ｎは、各々、１〜３の範囲の整数である］
で示される構造を有する。
【００８１】
式（ＩＩＩ）の化合物のある実施態様において、Ｒ４がＨであり、Ｒ５がＯＲ７であって、式（ＩＩＩａ）：
【化８】
2017538715.tif 000009
［式中
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、式（ＩＩＩ）にて定義されるとおりであり；
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５からなる群より選択され；
Ｒ１２は、所望により置換されてもよいアルキル、所望により置換されてもよいアリール、所望により置換されてもよいヘテロアリール、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）および−ＣＮからなる群より選択され；
Ｒ１３は、所望により置換されてもよいシクロアルキル、所望により置換されてもよいアリールおよび所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ１４およびＲ１５は、各々、Ｃ１−Ｃ４アルキルおよび所望により置換されてもよいアリールからなる群より独立して選択されるか、または
Ｒ１４およびＲ１５は、それらが結合する窒素と一緒になって、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し；および
ｎは、各々、１〜３の範囲にある整数である］
で示される化合物を提供する。
【００８２】
式（ＩＩＩａ）のある実施態様において、Ｒ７はＣ１−Ｃ４アルキル（好ましくは、メチルまたはtert−ブチル）、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５からなる群より選択され；ここで
Ｒ１２は、所望により置換されてもよいアルキル、所望により置換されてもよいアリール、所望により置換されてもよいヘテロアリール、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）および−ＣＮからなる群より選択され；
Ｒ１３は、所望により置換されてもよいシクロアルキル、所望により置換されてもよいアリールおよび所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ１４およびＲ１５は、各々、Ｃ１−Ｃ４アルキルおよび所望により置換されてもよいアリールからなる群より独立して選択されるか、または
Ｒ１４およびＲ１５は、それらが結合する窒素と一緒になって、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し；および
ｎは１、２および３からなる群より選択される整数である。
【００８３】
式（ＩＩＩａ）の具体的な実施態様において、Ｒ７は−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５であり、ここでＲ１４およびＲ１５は、それらが結合する窒素と一緒になって、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成する。一の形態にて、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル環は所望により置換されてもよい５〜７員のヘテロシクロアルキル環であってもよい。特定のヘテロシクロアルキル環は、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、およびモルホリニル環からなる群より選択されてもよい。
【００８４】
式（Ｉ）の具体的な実施態様において、Ｘは−ＳＯ２−であり、Ｒ４はＨであり、Ｒ５は−ＯＲ７であって、ここでＲ７は−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５であり、Ｒ１４およびＲ１５は、それらが結合する窒素と一緒になって、ピロリジニル環を形成する。かかる実施態様において、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩＩｂ）：
【化９】
2017538715.tif 000010
［式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、本明細書にて定義されるとおりである］
で示される構造を有してもよい。
【００８５】
本明細書に記載の式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）の化合物の一連の実施態様において、Ｒ１は所望により置換されてもよいアリールである。ある実施態様において、Ｒ１は所望により置換されてもよいフェニルである。
【００８６】
一連の実施態様において、Ｒ１は少なくとも１個のハロゲン基で置換されるフェニルである。ハロゲン置換基は、クロロ、フルオロ、ブロモまたはヨードからなる群より選択されてもよく、好ましくはクロロである。
【００８７】
ある実施態様において、Ｒ１は複数のハロゲンで置換されるフェニルである。ハロゲン置換基はフェニル環の３−および５−位の位置にあってもよい。.
【００８８】
一の実施態様において、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＶａ）または（ＩＶｂ）：
【化１０】
2017538715.tif 000011
［（ＩＶａ）および（ＩＶｂ）の各式中、Ｒ２、Ｒ３およびＲ７は式（Ｉ）にて定義されるとおりである］
で示される構造を有してもよい。
【００８９】
式（ＩＶａ）または（ＩＶｂ）の化合物の一連の実施態様において、
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５からなる群より選択され；
Ｒ１２は、所望により置換されてもよいアルキル、所望により置換されてもよいアリール、所望により置換されてもよいヘテロアリール、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）および−ＣＮからなる群より選択され；
Ｒ１３は、所望により置換されてもよいシクロアルキル、所望により置換されてもよいアリールおよび所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ１４およびＲ１５は、各々、Ｃ１−Ｃ４アルキルおよび所望により置換されてもよいアリールからなる群より独立して選択されるか、または
Ｒ１４およびＲ１５は、それらが結合する窒素と一緒になって、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し；および
ｎは、各々、１〜３の範囲にある整数である。
【００９０】
式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＶａ）または（ＩＶｂ）の化合物のある実施態様において、Ｒ３はＨである。
【００９１】
Ｒ３がＨである実施態様において、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｖ）：
【化１１】
2017538715.tif 000012
［式中：
Ｘは、結合手および−ＳＯ２−からなる群より選択され；
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、所望により置換されてもよいアリール、および所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ２は、Ｈおよび置換基からなる群より選択され；
Ｒ４は、Ｈおよび−ＯＲ６からなる群より選択され；
Ｒ５は、Ｈおよび−ＯＲ７からなる群より選択される：
ただし、Ｒ４がＨの場合、Ｒ５は−ＯＲ７であり、およびＲ４が−ＯＲ６である場合、Ｒ５はＨであり；
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）Ｒ９、および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１０Ｒ１１からなる群より選択され；
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５からなる群より選択され；
Ｒ８は、所望により置換されてもよいアルキル、所望により置換されてもよいアリール、所望により置換されてもよいヘテロアリール、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）および−ＣＮからなる群より選択され；
Ｒ９は、所望により置換されてもよいシクロアルキル、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル、所望により置換されてもよいアリール、および所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ１０およびＲ１１は、それらが結合する窒素と一緒になって、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し；
Ｒ１２は、所望により置換されてもよいアルキル、所望により置換されてもよいアリール、所望により置換されてもよいヘテロアリール、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、および−ＣＮからなる群より選択され；
Ｒ１３は、所望により置換されてもよいシクロアルキル、所望により置換されてもよいアリール、および所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ１４およびＲ１５は、各々、Ｃ１−Ｃ４アルキル、および所望により置換されてもよいアリールからなる群より選択されるか、または
Ｒ１４およびＲ１５は、それらが結合する窒素と一緒になって、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し；および
ｎは、各々、１〜３の範囲にある整数である］
で示される構造を有してもよい。
【００９２】
式（Ｖ）の化合物のある実施態様において、Ｒ４がＨであり、Ｒ５がＯＲ７であって、式（Ｖａ）：
【化１２】
2017538715.tif 000013
［式中
Ｘ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ７は、式（Ｖ）にて定義されるとおりである］
で示される化合物を提供する。
【００９３】
式（Ｖａ）の化合物のある実施態様において、Ｒ７がＣ１−Ｃ４アルキル（好ましくは、メチルまたはtert−ブチル）、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５からなる群より選択され；ここでＲ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５およびｎは式（Ｖ）について本明細書にて定義されるとおりである。
【００９４】
式（Ｖａ）の化合物の具体的な実施態様において、Ｒ７が−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５であり、ここでＲ１４およびＲ１５は、それらが結合する窒素と一緒になって、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成する。一の形態において、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル環は所望により置換されてもよい５〜７員のヘテロシクロアルキル環であってもよい。特定のヘテロシクロアルキル環は、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、およびモルホリニル環からなる群より選択されてもよい。
【００９５】
式（Ｖ）または（Ｖａ）の化合物のある実施態様において、Ｘは−ＳＯ２−である。
【００９６】
式（Ｖａ）の化合物の具体的な実施態様において、Ｘは−ＳＯ２−であり、Ｒ３およびＲ４は、各々、Ｈであり、Ｒ５は−ＯＲ７であって、ここでＲ７は−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５であり、Ｒ１４およびＲ１５は、それらが結合する窒素と一緒になって、ピロリジニル環を形成する。かかる実施態様において、式（Ｖ）の化合物は、式（Ｖｂ）：
【化１３】
2017538715.tif 000014
で示される構造を有してもよい。
【００９７】
式（Ｖ）および（Ｖａ）の化合物の一連の実施態様において、Ｒ１は所望により置換されてもよいアリール、好ましくは所望により置換されてもよいフェニルである。任意の置換基は、好ましくは、クロロ、フルオロ、ブロモまたはヨードからなる群より選択される少なくとも１個のハロゲン基であり、好ましくはクロロである。
【００９８】
一連の実施態様において、Ｒ１は少なくとも１個のハロゲン基で置換されるフェニルである。ある実施態様において、Ｒ１は複数のハロゲン基で置換されるフェニルである。ハロゲン置換基は、フェニル環の３および５位に位置することが好ましい。
【００９９】
１の実施態様において、式（Ｖ）の化合物は、式（ＶＩａ）または（ＶＩｂ）：
【化１４】
2017538715.tif 000015
［（ＶＩａ）および（ＶＩｂ）の各式中、Ｒ２およびＲ７は式（Ｖ）にて定義されるとおりである］
で示される構造を有してもよい。
【０１００】
式（ＶＩａ）または（ＶＩｂ）の化合物の一連の実施態様において、
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３、および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５からなる群より選択され；
Ｒ１２は、所望により置換されてもよいアルキル、所望により置換されてもよいアリール、所望により置換されてもよいヘテロアリール、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、および−ＣＮからなる群より選択され；
Ｒ１３は、所望により置換されてもよいシクロアルキル、所望により置換されてもよいアリール、および所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ１４およびＲ１５は、各々、Ｃ１−Ｃ４アルキルおよび所望により置換されてもよいアリールからなる群より独立して選択されるか、または
Ｒ１４およびＲ１５は、それらが結合する窒素と一緒になって、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し；および
ｎは、各々、１〜３の範囲にある整数である。
【０１０１】
式（ＶＩａ）または（ＶＩｂ）の化合物のもう一つ別の一連の実施態様において、Ｒ７はメチル、tert−ブチル、−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ１２からなる群より選択され、ここでＲ１２は−ＣＮ、−ＣＨ３、−Ｃ（ＣＨ３）３、および所望により置換されてもよいヘテロアリール（好ましくは、５−テトラゾリル）からなる群より選択され、ｎは１または２である。
【０１０２】
式（ＶＩａ）または（ＶＩｂ）の化合物のもう一つ別の一連の実施態様において、Ｒ７は−Ｃ（Ｏ）Ｒ１３であり、ここでＲ１３は所望により置換されてもよいシクロアルキル（好ましくは、シクロペンチルまたはシクロヘキシル）、所望により置換されてもよいアリール（好ましくは、フェニル）および所望により置換されてもよいヘテロアリール（好ましくは、ピロリル）である。
【０１０３】
式（ＶＩａ）または（ＶＩｂ）のもう一つ別の一連の実施態様において、Ｒ７は−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５であり、ここでＲ１４およびＲ１５は、それらが結合する窒素と一緒になって、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成する。１の形態において、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル環は、所望により置換されてもよい５〜７員のヘテロシクロアルキル環であってもよい。特定のヘテロシクロアルキル環は、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、およびモルホリニル環からなる群より選択されてもよい。
【０１０４】
具体的な実施態様において、式（Ｉ）の化合物は、式（ＶＩＩ）：
【化１５】
2017538715.tif 000016
［式中、Ｒ２およびＲ３は式（Ｉ）にて定義されるとおりである］
で示される構造を有する。
【０１０５】
式（Ｉ）の化合物の一連の実施態様において、Ｒ３はＨであり、次式（ＶＩＩＩ）：
【化１６】
2017538715.tif 000017
［式中、Ｒ２は、Ｈおよび置換基からなる群より選択される］
で示される化合物を提供する。
【０１０６】
式（Ｉ）の化合物の１の形態において、Ｒ２はＨであり、次式（ＩＸ）：
【化１７】
2017538715.tif 000018
で示される化合物またはその医薬的に許容される塩を提供する。
【０１０７】
好ましい具体的な実施態様において、式（Ｉ）の化合物は、次式：
【化１８】
2017538715.tif 000019
で示される化合物またはその医薬的に許容される塩である。
【０１０８】
本明細書に記載される式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（Ｖｂ）、（ＶＩａ）、（ＶＩｂ）、（ＶＩＩ）または（ＶＩＩＩ）の化合物中、Ｒ２は、ある実施態様において、置換基であってもよい。
【０１０９】
一連の実施態様において、Ｒ２は、所望により置換されてもよいヘテロアリール、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル、所望により置換されてもよいシクロアルキル、ヒドロキシ、アミノおよびアジドからなる群より選択される置換基であるか、あるいはＲ２は、式（Ａ）：
【化１９】
2017538715.tif 000020
［式中
Ｙは、所望により置換されてもよいヘテロアリールまたは所望により置換されてもよいヘテロアリール−（Ｏ）ＮＨ−であり；
リンカーは、−（ＣＨ２）ｐ−および−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐ−からなる群より選択されるか、またはそのいずれかの組み合わせであり；
ｐは、各々、１〜４の範囲にある整数であり；および
Ｚはフルオロフォール（好ましくは、ロダミン基）である］
で示される構造の置換基である。
【０１１０】
式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（Ｖｂ）、（ＶＩａ）、（ＶＩｂ）、（ＶＩＩ）または（ＶＩＩＩ）の化合物のある実施態様において、Ｒ２は所望により置換されてもよいヘテロアリールである。適切な所望により置換されてもよいヘテロアリールは５〜１０個の環原子と、Ｏ、ＮおよびＳからなる群より選択される少なくとも１個のヘテロ原子とを含んでもよい。所望により置換されてもよいヘテロアリールは単環または二環であってもよい。
【０１１１】
ある実施態様において、Ｒ２は、ピラゾール、イミダゾール、１,２,３−トリアゾール、１,２,４−トリアゾール、テトラゾール、インダゾール、４,５,６,７−テトラヒドロインダゾールおよびベンズイミダゾールからなる群より選択されるヘテロアリールであってもよい。
【０１１２】
式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（Ｖｂ）、（ＶＩａ）、（ＶＩｂ）、（ＶＩＩ）または（ＶＩＩＩ）の化合物のある実施態様において、Ｒ２は所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキルである。適切な所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキルは、３ないし１０個の環原子、好ましくは４ないし８個の環原子と、Ｏ、ＮおよびＳからなる群より選択される少なくとも１個のヘテロ原子とを含んでもよい。所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキルは単環または二環であってもよい。
【０１１３】
ある実施態様において、Ｒ２は、所望により置換されてもよいアゼチジン、ピロリジン、ピペリジニル、アゼパン、モルホリンおよびチオモルホリンからなる群より選択される所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキルであってもよい。
【０１１４】
ある実施態様において、Ｒ２は、所望により置換されてもよいピペリジンであってもよい。ある実施態様において、ピペリジンは少なくとも１個のＣ１−Ｃ４アルキル置換基で置換されてもよい。ある実施態様において、Ｃ１−Ｃ４アルキル置換基はメチルであってもよい。
【０１１５】
ある実施態様において、Ｒ２は２−メチルピペリジン、３−メチルピペリジン、４−メチルピペリジン、３,５−ジメチルピペリジン、および３,３−ジメチルピペリジンからなる群より選択されてもよい。
【０１１６】
Ｒ２が所望により置換されてもよいヘテロアリールまたは所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル基である場合、Ｒ２は、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキル環上のヘテロ原子を介して、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（Ｖｂ）、（ＶＩａ）、（ＶＩｂ）、（ＶＩＩ）または（ＶＩＩＩ）の化合物のピロリジン環と連結してもよい。例えば、Ｒ２がピラゾール、イミダゾール、１,２,３−トリアゾール、１,２,４−トリアゾール、テトラゾール、インダゾール、４,５,６,７−テトラヒドロインダゾールおよびベンズイミダゾールからなる群より選択されるヘテロアリールである場合、あるいはＲ２が所望により置換されてもよいアゼチジン、ピロリジン、ピペリジン、アゼパン、モルホリンおよびチオモルホリンからなる群より選択される所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキルである場合、その場合にはＲ２は、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキル基の窒素（Ｎ）ヘテロ原子を介して該化合物の残りの部分に共有結合する。
【０１１７】
式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（Ｖｂ）、（ＶＩａ）、（ＶＩｂ）、（ＶＩＩ）または（ＶＩＩＩ）の化合物のある実施態様において、Ｒ２は式（Ａ）：
【化２０】
2017538715.tif 000021
［式中
Ｙは、所望により置換されてもよいヘテロアリール、または所望により置換されてもよいヘテロアリール−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−であり；
リンカーは、−（ＣＨ２）ｐ−および−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐ−からなる群より選択されるか、またはそのいずれかの組み合わせであり；
ｐは、各々、１〜４の範囲にある整数であり；および
Ｚはフルオロフォール（好ましくは、ロダミン基）である］
で示される構造の置換基である。
【０１１８】
ある実施態様において、Ｙはトリアゾールまたはトリアゾール−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−からなる群より選択されてもよい。
【０１１９】
ある実施態様において、Ｙはトリアゾールまたはトリアゾール−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−であってもよく、その場合には、式（Ａ）の構造式は、式（Ａ１）または（Ａ２）：
【化２１】
2017538715.tif 000022
で示される。
【０１２０】
ある実施態様において、リンカーは、−（ＣＨ２）ｐ−および−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｐ−からなる群より選択されても、またはそのいずれかの組み合わせであってもよく、ここでｐは、各々、１〜４の範囲にある整数である。
【０１２１】
ある実施態様において、リンカーは、式（Ａ３）または（Ａ４）：
【化２２】
2017538715.tif 000023
［式中、ｐは、各々、１〜４の範囲にある整数である］
で示されてもよい。
【０１２２】
式（Ａ）、（Ａ１）、（Ａ２）、（Ａ３）または（Ａ４）のある実施態様において、Ｚはロダミンフルオロフォールであり、それは以下の群：
【化２３】
2017538715.tif 000024
より選択される。
【０１２３】
具体的な実施態様において、式（Ｉ）の化合物は以下の構造式：
【化２４】
2017538715.tif 000025
で示される。
【０１２４】
もう一つ別の具体的な実施態様において、式（Ｉ）の化合物は以下の構造式：
【化２５】
2017538715.tif 000026
で示される。
【０１２５】
理論により限定されることを望むものではないが、本明細書に記載の式で示される化合物でピロリジンカルバマート部分が、α９インテグリン、より具体的にはα９β１インテグリン、あるいはその活性な部分に対して高い結合アフィニティを確保するのに重要であると考えられる。さらには、カルボン酸官能基はアンタゴニスト活性に不可欠であると考えられる。
【０１２６】
上記において、当業者に周知である多くの用語が使用される。にもかかわらず、明確化を目的として、多数の用語を以下に定義する。
【０１２７】
本明細書で使用する場合、「置換されない」なる語は、置換基がないこと、あるいは置換基が唯一水素であることを意味する。
【０１２８】
明細書を通して使用されるような「所望により置換されてもよい」なる語は、基が、１または複数の水素以外の置換基で、さらに置換または（縮合多環系を形成するように）縮合されてもよいこと、またはされていなくてもよいことを意味する。特定の実施態様において、置換基は、ハロゲン、＝Ｏ、＝Ｓ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルケニル、ハロアルキニル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキル、アリールアルキル、シクロアルキルアルケニル、ヘテロシクロアルキルアルケニル、アリールアルケニル、ヘテロアリールアルケニル、シクロアルキルヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキルヘテロアルキル、アリールヘテロアルキル、ヘテロアリールヘテロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アルキルオキシ、アルキルオキシアルキル、アルキルオキシシクロアルキル、アルキルオキシヘテロシクロアルキル、アルキルオキシアリール、アルキルオキシヘテロアリール、アルキルオキシカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、シクロアルキルオキシ、シクロアルケニルオキシ、ヘテロシクロアルキルオキシ、ヘテロシクロアルケニルオキシ、アリールオキシ、フェノキシ、ベンジルオキシ、ヘテロアリールオキシ、アリールアルキルオキシ、アミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、アミノアルキル、アリールアミノ、スルホニルアミノ、スルフィニルアミノ、スルホニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アミノスルホニル、スルフィニル、アルキルスルフィニル、アリールスルフィニル、アミノスルフィニルアミノアルキル、Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｅ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｅ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｅＲｆ、Ｃ（＝ＮＯＨ）Ｒｅ、Ｃ（＝ＮＲｅ）ＮＲｆＲｇ、ＮＲｅＲｆ、ＮＲｅＣ（＝Ｏ）Ｒｆ、ＮＲｅＣ（＝Ｏ）ＯＲｆ、ＮＲｅＣ（＝Ｏ）ＮＲｆＲｇ、ＮＲｅＣ（＝ＮＲｆ）ＮＲｇＲｈ、ＮＲｅＳＯ２Ｒｆ、−ＳＲｅ、ＳＯ２ＮＲｅＲｆ、−ＯＲｅ、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲｅＲｆ、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒｅおよびアシルからなる群より独立して選択される１または複数の基であり、
ここで、ＲｅおよびＲｆ、ＲｇおよびＲｈは、各々、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ１２ハロアルキル、Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、Ｃ１−Ｃ１０ヘテロアルキル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ１２シクロアルケニル、Ｃ５−Ｃ６ヘテロシクロアルキル、Ｃ１−Ｃ１２ヘテロシクロアルケニル、Ｃ６アリール、およびＣ１−Ｃ５ヘテロアリールからなる群より独立して選択されるか、あるいはＲｅおよびＲｆは、それらが結合する原子と一緒になる場合には、環原子が３ないし１２個の環式またはヘテロ環式環系を形成する。
【０１２９】
特定の実施態様において、任意の置換基は、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒｅ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲｅ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲｅＲｆ、−ＯＲｅ、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲｅＲｆ、ＯＣ（Ｏ）Ｒｅおよびアシルからなる群より選択されてもよく、ここでＲｅおよびＲｆは、各々、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、Ｃ５−Ｃ６ヘテロシクロアルキル、Ｃ６アリール、およびＣ１−Ｃ５ヘテロアリールからなる群より独立して選択されるか、あるいはＲｅおよびＲｆは、それらが結合する原子と一緒になる場合には、環原子が３ないし１２個の環式またはヘテロ環式環系を形成する。
【０１３０】
基として、または基の一部としての「アルキル」は、特記されない限り、直鎖または分岐鎖の脂肪族炭化水素基、好ましくはＣ１−Ｃ１２アルキル、より好ましくはＣ１−Ｃ１０アルキル、最も好ましくはＣ１−Ｃ４アルキルをいう。適切な直鎖および分岐したＣ１−Ｃ４アルキル置換基の例として、メチル、エチル、ｎ−プロピル、２−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチルおよびｔ−ブチルが挙げられる。その基は末端基であっても架橋基であってもよい。
【０１３１】
基として、または基の一部としての「アリール」は、（ｉ）所望により置換されてもよい単環式、または縮合した多環式の芳香族炭素環（環原子のすべてが炭素である環構造）であり、環に付き５ないし１２個の原子を有することが好ましく、アリール基として、フェニル、ナフチル等が挙げられ；（ｉｉ）所望により置換されてもよく、部分的に飽和の二環式芳香族炭素環部分であり、それらはフェニルと、Ｃ５−７シクロアルキルまたはＣ５−７シクロアルケニル基が一緒に縮合して、テトラヒドロナフチル、インデニルまたはインダニルなどの環構造を形成する環を意味する。その基は末端基であっても架橋基であってもよい。典型的には、アリール基はＣ６−Ｃ１８アリール基である。
【０１３２】
「結合手」は化合物または分子にある原子間の結合である。本明細書に記載されるような式（Ｉ）の化合物の一連の実施態様において、結合手は単結合である。
【０１３３】
「シクロアルキル」は、特記されない限り、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル等などの飽和単環式、または縮合もしくはスピロ多環式炭素環、好ましくは環に付き３ないし９個の炭素を含有する炭素環をいう。その環は、単環系（シクロヘキシルなど）、デカリンなどの二環系、およびアダマンタンなどの多環系を包含する。シクロアルキル基は、典型邸には、Ｃ３−Ｃ１２アルキル基である。該基は末端基であっても架橋基であってもよい。
【０１３４】
「ハロゲン」は、塩素、フッ素、臭素またはヨウ素を表す。
【０１３５】
「ヘテロアリール」は、単独または基の一部のいずれかであり、芳香族環の環原子として１または複数のヘテロ原子を有し、環原子の残りが炭素原子である、その芳香族環（好ましくは５員または６員の芳香族環）を含有する基をいう。適切なヘテロ原子は、窒素、酸素および硫黄からなる群より選択されてもよい。該基は単環または二環式ヘテロアリール基であってもよい。ヘテロアリールの例として、チオフェン、ベンゾチオフェン、ベンゾフラン、ベンズイミダゾール、ベンズオキサゾール、ベンゾチアゾール、ベンズイソチアゾール、ナフト［２,３−ｂ］チオフェン、フラン、イソインドリジン、キサントレン、フェノキサチン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、テトラゾール、インドール、イソインドール、１Ｈ−インダゾール、プリン、キノリン、イソキノリン、フタラジン、ナフチリジン、キノキサリン、シンノリン、カルバゾール、フェナントリジン、アクリジン、フェナジン、チアゾール、イソチアゾール、フェノチアジン、オキサゾール、イソオキサゾール、フラザン、フェノキサジン、２−、３−または４−ピリジル、２−、３−、４−、５−または８−キノリル、１−、３−、４−または５−イソキノリニル、１−、２−または３−インドリル、および２−または３−チエニルが挙げられる。ヘテロアリール基は、典型的には、Ｃ１−Ｃ１８ヘテロアリール基である。該基は末端基であっても架橋基であってもよい。
【０１３６】
「ヘテロシクロアルキル」は、窒素、硫黄、酸素から選択される少なくとも１個のヘテロ原子、好ましくは少なくとも１個の環中に１ないし３個のヘテロ原子を含有する、飽和単環式、二環式または多環式環をいう。各環は、好ましくは３ないし１０員、より好ましくは４ないし７員である。適切なヘテロシクロアルキルの例として、ピロリジニル、テトラヒドロフリル、テトラヒドロチオフラニル、ピペリジル、ピペラジル、テトラヒドロピラニルおよびモルホリノが挙げられる。該基は末端基であっても架橋基であってもよい。
【０１３７】
式（Ｉ）の一連の化合物には、ジアステレオマー、エナンチオマーおよび互変異性体、および「Ｅ」または「Ｚ」配置の幾何異性体あるいはＥおよびＺ異性体の混合物を含む異性体が含まれると考えられる。また、ジアステレオマー、エナンチオマー、および幾何異性体などの数種の異性体は物理的および／または化学的方法により、および当業者によって分離され得ると理解される。幾何異性の可能性のあるそれらの化合物では、他の異性体が正しい構造帰属であるかもしれないと認識されるとしても、出願人はその化合物がその構造帰属であると考える異性体を表現する。
【０１３８】
開示される実施態様の化合物のいくつかは、単一の立体異性体、ラセミ体、および／またはエナンチオマーおよび／またはジアステレオマーの混合物として存在してもよい。かかる単一の立体異性体、ラセミ体およびその混合物はすべて、本明細書に記載の、および特許請求の範囲に記載の事項の範囲内にあるものとする。
【０１３９】
さらには、式（Ｉ）は、適用できるならば、該化合物の溶媒和された、ならびに溶媒和されていない形態に及ぶものとする。かくして、各式の化合物は、水和された、ならびに水和されていない形態を含む、指摘された構造を有する化合物を包含する。
【０１４０】
式（Ｉ）の化合物は、さらには、該化合物の医薬的に許容される塩を包含するものとする。
【０１４１】
「医薬的に許容される塩」なる語は、上記される化合物の所望の生物活性を保持する塩をいい、医薬的に許容される酸付加塩および塩基付加塩を包含する。式（Ｉ）の化合物の適切な医薬的に許容される塩は、無機酸または有機酸から調製されてもよい。かかる無機酸の例は、塩酸、硫酸およびリン酸である。適切な有機酸は、脂肪族、脂環式、芳香族、ヘテロ環式、炭素環式およびスルホン基種の有機酸より選択されてもよく、その例が、ギ酸、酢酸、プロパン酸、コハク酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸、アルキルスルホン酸、およびアリールスルホン酸である。同様に、塩基付加塩は、有機または無機塩基を用いて当業者に周知の方法により調製されてもよい。適切な有機塩基の例として、メチルアミン、エチルアミン、トリエチルアミン等などの単純なアミンが挙げられる。適切な無機塩基の例として、ＮａＯＨ、ＫＯＨ等が挙げられる。医薬的に許容される塩のさらなる情報は、R emington’s Pharmaceutical Sciences, 19th Edition, Mack Publishing Co., Easton, PA 1995で見ることができる。試剤が固体である場合には、当業者であれば、本発明の化合物、試剤、および塩は、異なる結晶または多形の形態にて存在してもよく、そのすべてが本発明の化合物および具体的な式で示される化合物の範囲内にあるものとする、ことを理解する。
【０１４２】
本発明のもう一つ別の好ましい実施態様において、ＨＳＣおよびその前駆細胞ならびにそれらの祖先細胞のインビボまたはエクスビボでのＢＭ幹細胞結合リガンドからの放出を強化する方法であって、インビボまたはエクスビボにて、効果的な量のα９インテグリンのアンタゴニストまたはその活性な部分をＢＭ幹細胞ニッチに投与することを含む、方法が提供される。
【０１４３】
ＨＳＣがＢＭ幹細胞結合リガンドより一旦取り除かれると、それらはもはやＢＭに固定されず、ＢＭより放出され、増殖および分化に向かう細胞周期に入ることも利用可能である。あるいはまた、それらはＢＭに残り、ＢＭにて細胞周期に入ることもできる。
【０１４４】
さらに好ましい本発明の実施態様において、ＨＳＣおよびその前駆細胞ならびにそれらの祖先細胞のインビボまたはエクスビボでのＢＭ幹細胞ニッチからの動員を強化する方法であって、インビボまたはエクスビボにて、効果的な量のα９インテグリンのアンタゴニストまたはその活性な部分をＢＭ幹細胞ニッチに投与することを含む、方法が提供される。
【０１４５】
ＨＳＣが除去および放出され始めることで、ＨＳＣはＰＢに動員することが利用可能となる。その除去および放出は動員を可能とするのに不可欠である。ＨＳＣの放出の強化は、結果として、より多くの細胞を動員されるようにするであろう。
【０１４６】
本発明のもう一つ別の好ましい実施態様において、該方法はＧ−ＣＳＦの存在または不在下にて行われる。好ましくは、該方法はＧ−ＣＳＦの不在下にて行われる。
【０１４７】
Ｇ−ＣＳＦは、臨床的に、ＨＳＣのために最も広く使用される動員剤であるが、その欠点として、潜在的に毒性の副作用のあること、治療コースが相対的に長いこと（５−７日間の連続注入）および患者の応答が可変的であることが挙げられる。従って、本発明の利点は、毒性の副作用を実質的に回避することのできる、効果的な動員がＧ−ＣＳＦの不在下で起こり得ることである。
【０１４８】
本発明で使用されるような「造血幹細胞」は、赤血球、白血球、巨核球、および血小板を含め、あらゆる血液細胞に最終的に分化しうる多能性幹細胞を意味する。これは祖先細胞または芽細胞に分化する中間段階を含んでもよい。かくして、「造血幹細胞」、「ＨＳＣ」、「造血祖先細胞」、「ＨＰＣ」、「祖先細胞」または「芽細胞」なる語は、本発明において互換的に使用され、分化能は減少しているが、未だに骨髄またはリンパ球系などの特定のリニージの異なる細胞に成熟する能力を有する、ＨＳＣを記載する。「造血祖先細胞」は、赤芽球バースト形成単位の顆粒球、赤血球、マクロファージ、巨核球コロニー形成単位の顆粒球、赤血球、マクロファージ、および顆粒球マクロファージコロニー形成単位を包含する。
【０１４９】
本発明は、ＨＳＣおよびその先駆細胞ならびにそれらの祖先細胞をＢＭ幹細胞結合リガンドから取り除くことを強化することに関する。一旦取り除かれると、該細胞はＢＭ幹細胞ニッチより放出され、該細胞はそこに留まることもできるが、放出されてＰＢに動員されるのが好ましい。これらの細胞は造血再構築能を有する。本発明は、ＨＳＣを、好ましくは骨内膜ニッチ内の骨／ＢＭの接触面の最も近くにあるＢＭ幹細胞結合リガンドから、あるいは中心髄腔から除去することにより、ＨＳＣの動員を助成的に強化する方法を提供する。より好ましくは、ＨＳＣは骨内膜ニッチ内の骨／ＢＭ接触面より動員される。というのも、これらの細胞は、中心髄腔より単離されたＨＳＣと比べて、より長期にわたって多リニージ造血再構築を付与することが分かっているからである。
【０１５０】
除去、放出または動員される細胞の型はまた、ＢＭ誘導性祖先細胞に富むＬｉｎ−Ｓｃａ−１＋ｃｋｉｔ＋（本明細書にて、「ＬＳＫ」と称される）、あるいは幹細胞に富むＬＳＫＣＤ１５０＋ＣＤ４８−細胞（本明細書にて、「ＬＳＫＳＬＡＭ」と称される）を含む群より選択されるネズミ集団で見つけることもできる。これらの均等なネズミ集団は、α９インテグリンのアンタゴニストまたはその活性な部分を用いることにより、ＢＭ幹細胞ニッチより除去、放出または動員され得る細胞型の適用を提供する。好ましくは、細胞型は幹細胞に富むＬＳＫＣＤ１５０＋ＣＤ４８−細胞（ＬＳＫＳＬＡＭ）に見られる型と均等である。
【０１５１】
好ましくは、除去、放出または動員される細胞は、骨内膜祖先細胞であり、ＣＤ３４＋、ＣＤ３８＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞、リニージ委任のＣＤ３４−細胞、またはＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞からなる群より選択される。
【０１５２】
本発明はインビボまたはエクスビボにて行われてもよい。すなわち、α９のアンタゴニスト、好ましくはα９β１のアンタゴニスト、より好ましくはα９β１／α４β１のアンタゴニストをその必要とする対象にインビボにて、またはエクスビボのサンプルに投与し、ＨＳＣをＢＭから動員させることができる。
【０１５３】
本明細書中で使用される「対象」は、哺乳類および他の動物（ペット、家畜および動物園の動物を含むが、これらに限定されない）を含め、あらゆる動物を包含する。「動物」なる語は、例えば、哺乳類、鳥類、サル、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、げっ歯類等を含むカテゴリーの生きているいずれの多細胞脊椎動物も包含しうる。同様に、「哺乳類」なる語は、ヒトおよびヒト以外の両方の哺乳類を包含する。
【０１５４】
本発明は、ＨＳＣの除去、放出または動員の強化に関する。本明細書中で使用される「強化」、「強化する」または「強化している」は、細胞または有機体の特定のパラメータにおいてその能力を改善すること、または他の生理学的に有益な増加をもたらすことをいう。時には、現象の増加を特定のパラメータの測定値の減少として定量化することができる。例えば、幹細胞の遊走は循環系内を循環する幹細胞の数の減少として評価されてもよいが、これは、それにもかかわらず、これらの細胞の体の領域（該細胞が有益な生理学的結果（限定されないが、喪失または損傷を受けた機能を交換または訂正する細胞に分化することを含む）を成す、または促進し得る領域）に遊走することの強化を示してもよい。同時に、強化は、ＨＳＣのＢＭからＰＢへの遊走の結果として、末梢血中におけるいずれか一つの型の細胞の増加として測定されてもよい。強化とは、循環している幹細胞の数が１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％以上減少していることをいってもよく、別の言い方では、循環している幹細胞の数が１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％以上増加することを示してもよい。幹細胞の遊走の強化は、細胞集団または細胞集団の応答の１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％以上の減少などの、非造血リニージの細胞集団の減少をもたらしてもよく、あるいはそれにより測定されてもよい。言い換えれば、パラメータの強化は、幹細胞のトラフィッキングとして捉えることもできる。一の実施態様において、パラメータの強化はＢＭなどの原発組織からの幹細胞の放出である。一の実施態様において、パラメータの強化は幹細胞の遊走である。もう一つ別の実施態様において、パラメータは幹細胞の分化である。
【０１５５】
一の実施態様において、α９インテグリンアンタゴニストは、静脈内、皮内、皮下、筋肉内、経皮、経粘膜、または腹腔内に投与される；所望により、該アンタゴニストは、静脈内または皮下投与されてもよい。
【０１５６】
本発明のさらにもう一つ別の態様において、ＨＳＣの、対象のＢＭ幹細胞ニッチにあるＢＭ幹細胞結合リガンドからの除去を強化するのに用いるためのものであって、本明細書に記載されるα９インテグリンのアンタゴニストを含む、組成物が提供される。より好ましくは、該アンタゴニストは、本明細書に記載のα９インテグリンアンタゴニストである。最も好ましくは、該アンタゴニストは、本明細書に記載のα４β１／α９β１アンタゴニストである。
【０１５７】
好ましい実施態様において、該組成物は、ＨＳＣの、ＢＭ幹細胞ニッチにあるＢＭ幹細胞結合リガンドからの放出を強化する。より好ましくは、該組成物はＨＳＣのＢＭ幹細胞ニッチからＰＢへの移動または動員を強化する。
【０１５８】
該組成物は、医薬的に許容される担体をさらに含む医薬組成物であってもよい。本明細書に記載のα９インテグリンのアンタゴニストは、組成物中に、単独で、またはα９インテグリン、α４インテグリン、α９β１インテグリン、α４β１インテグリンのさらなるアンタゴニストと組み合わせて提供されてもよく、あるいはそれはα９β１／α４β１インテグリンの併用したアンタゴニストであってもよい。該アンタゴニストは同一であっても異なってもよいが、それらはすべて少なくともα９インテグリンのアンタゴニストとして作用するであろう。
【０１５９】
本発明のもう一つ別の態様において、ＨＳＣおよびその先駆細胞ならびにそれらの祖先細胞の患者内でのＢＭ幹細胞結合リガンドからの除去を強化するための医薬の調製において、本明細書に記載のα９インテグリンのアンタゴニストの使用が提供される。
【０１６０】
本明細書に記載の方法は、組成物および医薬組成物の製造および使用を包含し、それは、ＨＳＣおよびその先駆細胞ならびにそれらの祖先細胞のＢＭ幹細胞結合リガンドからの除去を強化するための活性成分として本明細書に記載のα９インテグリンのアンタゴニストを包含する。好ましくは、ＨＳＣの放出が強化される。より好ましくは、ＨＳＣの動員が強化される。医薬組成物は、典型的には、医薬的に許容される担体を含む。本明細書中で使用されるような「医薬的に許容される担体」なる語は、当業者に公知の薬学的投与と適合しうる、セイライン、溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌および抗真菌剤、等張剤、および吸収遅延剤等を含む。補助的な活性化合物、例えば、Ｇ−ＣＳＦなどの成長因子もまた、組成物中に配合されてもよい。
【０１６１】
医薬組成物は、典型的には、意図する投与経路に適合するように処方される。投与経路の例として、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経皮（局所）、経粘膜、腹腔内、および経直腸投与が挙げられる。好ましくは、本明細書に記載のα９インテグリンのアンタゴニストは皮下投与される。
【０１６２】
ある実施態様において、医薬組成物は、本明細書に記載のα９インテグリンのアンタゴニストを骨髄に、好ましくはＢＭ幹細胞ニッチに、より好ましくはＢＭ幹細胞ニッチの骨内膜ニッチに標的として送達されるように処方される。例えば、ある実施態様において、本明細書に記載のα９インテグリンのアンタゴニストは、リポソーム、ナノ懸濁液および（例えば、シクロデキストリンとの）包摂複合体に処方されてもよく、それは副作用を減らしつつ、ＢＭにより効果的に標的として送達され得る。
【０１６３】
医薬組成物は、投与のための説明書と一緒に、容器、パックまたはディスペンサーに含めることができる。
【０１６４】
本発明のさらにもう一つ別の態様において、ＨＳＣを対象から採取する方法であって、
効果的な量の本明細書に記載のα９インテグリンのアンタゴニストまたはその活性な部分を対象に投与し、ここでその効果的な量はＨＳＣおよびその先駆細胞ならびにそれらの祖先細胞のＢＭ幹細胞ニッチにあるＢＭ幹細胞結合リガンドからの除去を強化し；
その除去されたＨＳＣをＰＢに動員し；および
該ＨＳＣをＰＢから採取する、ことを含む方法が提供される。
【０１６５】
好ましくは、α９インテグリンアンタゴニストはＧ−ＣＳＦの不在下で投与される。
【０１６６】
本明細書に記載のα９β１インテグリンアンタゴニストなどの化合物を用いてＨＳＣおよびその先駆細胞ならびにそれらの祖先細胞のＢＭ幹細胞ニッチでのＢＭ幹細胞結合リガンドからの除去を強化し、最終的に収集のために細胞がＰＢに動員されることを可能とする。その細胞はＢＭから自然に動員または放出されてもよく、あるいはインターロイキン−１７、シクロホスファミド（Ｃｙ）、ドセタキセルおよび顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）などの他のＨＳＣ動員剤の使用により動員するように刺激されてもよいが、これらに限定されない。
【０１６７】
一の実施態様において、一度採取された細胞は、患者の造血前駆細胞集団を補完または補充するために体内に戻すことができ（同種または自家移植）、あるいはまた別の患者の造血前駆細胞集団を補完または補充するためにもう一つ別の患者に移植され得る（異種または同種移植）と考えられる。これは、個体が化学療法を受けていた期間の経過後に、利点がある。さらには、ＨＳＣおよびＨＰＣの数が減少するところの、地中海貧血、鎌状赤血球貧血、先天性異角化症、シュワッハマン・ダイアモンド症候群、およびダイアモンド・ブラックファン貧血などの特定の遺伝子疾患がある。かくして、ＨＳＣの除去、放出または動員の強化における本発明の方法は、有用であり、適用可能である。
【０１６８】
骨髄移植のレシピエントは、対象が高齢者であるか、または以前に化学療法などの免疫枯渇治療に暴露されたことがある、などの限定された骨髄予備能を有してもよい。該レシピエントは、対照となる血球レベルと比べて、血球レベルが低くてもよく、または低血球レベルに発達する危険性がある。本明細書中にて使用されるように、「対照となる血球レベル」なる語は、対象において血球レベルに変化をもたらす事象の前の、あるいはかかる事象が実質的に不在の下での、対象における血球の平均レベルをいう。対象において血球レベルに変化をもたらす事象として、例えば、貧血、外傷、化学療法、骨髄移植および放射線療法が挙げられる。例えば、対象は、外傷に起因して貧血または血液喪失を有する。
【０１６９】
典型的には、効果的な量のα９β１インテグリンアンタゴニスト、より好ましくはα９β１／α４β１インテグリンアンタゴニストなどのα９インテグリンアンタゴニストがドナーに投与され、ＨＳＣのＢＭからの除去、放出または好ましくは動員を誘発し、そしてＰＢに放出かつ動員される。ＨＳＣがＰＢに動員されると、血液の収集およびＧＳＣの分離が、献血にて一般的に利用可能な方法、例えば、限定されないが、血液銀行にて利用される技法を用いて進められ得る。ある実施態様において、ＰＢまたはＢＭが本明細書に記載のα９インテグリンのアンタゴニストを用いて治療されたことのある対象から得られると、ＨＳＣはアフェレーシス療法または白血球除去輸血などの標準的方法を用いて、そこから単離され得る。
【０１７０】
好ましくは、α９インテグリンアンタゴニストの効果的な量は、２５−１０００μｇ／ｋｇ体重、より好ましくは５０−５００μｇ／ｋｇ体重、最も好ましくは５０−２５０μｇ／ｋｇ体重の範囲にある。効果的な量は、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０または２５０μｇ／ｋｇ体重からなる群より選択されてもよい。
【０１７１】
除去、放出、または好ましくは動員は、α９インテグリンアンタゴニストの使用量に応じて、直ちに生じるかもしれない。しかしながら、ＨＳＣは投与した約１時間後に採取されてもよい。実際の時間およびα９インテグリンアンタゴニストの実際の量は、対象の生理学的状態（年齢、性別、疾患の型および段階、一般的身体状態、所定の投与量に対する応答を含む）および投与経路を含む、種々の要因に応じて変化してもよいが、これらに限定されない。臨床および薬理学の分野における当業者は、日常的な実験およびコントロール曲線の使用を通して効果的な量を決定できるであろう。
【０１７２】
本発明において考慮されるように、「コントロール曲線」なる語は、同一の条件下で、異なる濃度のα９インテグリンアンタゴニストのＨＳＣの除去、放出または動員を測定することを通して作成される統計学的および数学的に関連付けられる曲線をいい、そこで細胞は一定間隔で採取かつ計数され得る、と考えられる。本発明において考慮されるこれらの「コントロール曲線」は、後の機会に投与される様々な濃度を推定するための一の方法として使用され得る。
【０１７３】
本発明において考慮されるように、「造血幹細胞の採取」、「造血前駆細胞の採取」、「ＨＳＣの採取」または「ＨＰＣの採取」なる語は、細胞をＰＢから分離することをいうと考えられ、当業者に公知の技法であると考えられる。細胞は、所望により、収集され、分離されてもよく、所望によりさらに拡大してＨＳＣおよび分化した子孫のさらにより大きな集団を生成してもよい。
【０１７４】
本発明のもう一つ別の態様において、本明細書に記載の方法から得られるＨＳＣを含む細胞組成物が提供され、その方法は効果的な量の本明細書に記載のα９インテグリンのアンタゴニストを投与し、ＨＳＣのＢＭからＰＢへの除去、放出または動員を強化することを含む。
【０１７５】
ＨＳＣの除去が強化された結果として、より多くのＨＳＣがその後のＰＢへの動員のためにＢＭ幹細胞ニッチに放出され得ると仮定される。従って、効果的な量のα９インテグリンのアンタゴニストまたはその活性な部分がＢＭ幹細胞ニッチに投与されたことのある対象から採取された細胞組成物は、ＨＳＣに富むであろう。 
【０１７６】
好ましくは、細胞組成物は、骨内膜ニッチの細胞に富み、ＣＤ３４＋、ＣＤ３８＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞、リニージ委任のＣＤ３４−細胞、またはＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞からなる群より選択される骨内膜祖先細胞である。
【０１７７】
本発明のさらにもう一つ別の態様において、血液障害を治療するための方法であって、本明細書に記載の、効果的な量の本明細書に記載されるα９インテグリンのアンタゴニストを投与し、ＨＳＣのＢＭからＰＢへの除去、放出または動員を強化することを含む、方法より得られるＨＳＣを含む細胞組成物を投与することを含む、方法が提供される。
【０１７８】
本発明のさらにもう一つ別の態様において、対象における血液障害を治療するための方法であって、該対象に、治療的に効果的な量の本明細書に記載されるα９インテグリンのアンタゴニストを投与し、ＨＳＣの、ＢＭからＰＢへの除去、放出または動員を強化することを含む、方法が提供される。
【０１７９】
さらにもう一つ別の好ましい実施態様において、血液障害が造血腫瘍性障害であり、該方法は、効果的でなくなった化学療法剤がより効果的となるように、ＨＳＣを化学療法に感受的とし、ＨＳＣの感受性を改変することを含む。
【０１８０】
白血病の治療における長年の問題は、休眠状態にある悪性細胞は細胞傷害薬の作用を回避している可能性があり、該細胞は再発能を有するという、考えである。がん細胞の休眠の制御を理解することに多大な努力が払われてきたが、微小環境、特に骨髄幹細胞ニッチの役割に対してはほとんど集中されなかった。最近になって、骨髄にて正常な造血幹細胞を固定することが知られている、細胞外基質分子のオステオポンチンもまた、骨髄微小環境の重要な領域にこれらの細胞を固定することにより、白血病、特に急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）の細胞の休眠を支持するのに一の役割を果たしていることを証明するデータが出現した。さらには、さらなるデータは再発したＡＬＬが有意に高いインテグリンα４β１レベルを有することを示す。本明細書に示されるこれらのデータは、α９β１とその細胞外基質リガンドとの相互作用と競合する薬剤がこれらの細胞を細胞周期に誘導し、該細胞を細胞傷害性化学療法に対して脆弱なものとすることを示唆する。
【０１８１】
本明細書に記載の方法は、ある実施態様において、幹細胞の数を増やす必要のある血液障害の対象を治療する方法を包含する。他のある実施態様において、対象は、例えば、異種移植または自家移植において使用するために、ＨＳＣなどの幹細胞を提供するように計画されているか、または提供することを意図とする。一般に、該方法は、治療的に効果的な量の本明細書に記載のα９インテグリンのアンタゴニストを、かかる治療を必要とする対象に、あるいはかかる治療が必要であると決定されたことのある対象に、投与することを含む。かかる対象を治療するために本明細書に記載の治療的に効果的な量のα９インテグリンのアンタゴニスト、好ましくはα９β１アンタゴニスト、より好ましくはα９β１／α４β１インテグリンのアンタゴニストを投与することは、ＰＢまたはＢＭでのＨＳＣの数および／または頻度の増加をもたらすであろう。
【０１８２】
本明細書にて使用される「治療する」、「治療している」および「治療」は、治療的処理および予防的または防止的手段の両方をいい、ここでその目的は、仮にその処理が最終的にはうまくいかなかったとしても、標的とする症候、疾患または障害（包括的に「病気」）を防止すること、または鈍化させる（小さくする）ことである。処理を必要とする者として、その病気にすでに罹患している者、ならびにその病気に罹患しやすい者、またはその病気が防止されるべき者が挙げられる。
【０１８３】
「効果的な量」は、ＰＢまたはＢＭでのＨＳＣの数および／または頻度を有意に増加または減少させるのに十分な量である。効果的な量は１または複数の投与、適用または投薬で投与され得る。
【０１８４】
本明細書にて使用される「治療的に効果的な量」は、治療される対象において所望の効果を達成するのに十分な、特定の組成物、または組成物中の活性剤の量をいう。例えば、この量は、ＨＳＣの遊走を強化するために、組織を補充、修復または活性化させる効果的な量とすることができる。もう一つ別の実施態様において、「治療的に効果的な量」は、血流中の幹細胞の循環レベルを上げることにより説明され得るような、ＨＳＣの放出の向上などの、ＨＳＣのトラフィッキングを強化するのに効果的な量である。さらにもう一つ別の実施態様において、「治療的に効果的な量」は、血流中に循環しているＨＳＣのレベルが低いこと、および／またはホーミングおよび遊走と関連付けられる表面マーカーの発現で説明され得るような、ＨＳＣの循環系から種々の組織または器官へのホーミングおよび遊走を強化するのに効果的な量である。治療的に効果的な量は、対象の生理学的状態（年齢、性別、疾患の型および段階、一般的身体状態、所定の投与量に対する応答、所望する臨床効果を含む）および投与経路を含む、種々の要因に応じて変化してもよいが、これらに限定されない。臨床学および薬理学の分野の当業者は、日常的な実験を通して、治療的に効果的な量を決定することができるであろう。
【０１８５】
組成物は、一日に１回または複数回ないし週に１回または複数回（一日おきを含む）で投与され得る。当業者であれば、対象の以前の治療、一般的な健康状態および／または年齢、および現存する他の疾患を含め（これらに限定されないが）、特定の因子が対象を効果的に治療するのに必要とされる投与量および時期に影響を与える可能性のあることを理解するであろう。その上、本明細書に記載の効果的な量の組成物で対象を治療することは、単回治療または一連の治療を含み得る。
【０１８６】
ある実施態様において、かかる投与はＰＢにおいてＨＳＣ数の約１０−２００倍の増加をもたらすであろう。
【０１８７】
組成物の投与量、毒性および治療効果は、例えば、細胞培養での標準的な薬剤操作、または、例えばＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％にて治療的に効果的な用量）を測定するための実験動物により決定され得る。毒性と治療効果の間の用量比が治療指数であり、それはＬＤ５０／ＥＤ５０比として表され得る。治療指数の高い化合物が好ましい。毒性の副作用を示す化合物を用いることもできるが、その場合、非感染細胞に与える損傷の可能性を最小限とし、それによって副作用を減らすために、かかる化合物で罹患組織の部位を標的とするデリバリーシステムを設計するように注意しなければならない。
【０１８８】
細胞培養アッセイおよび動物実験から得られるデータは、ヒトに用いるための投与量の範囲を処方するのに使用できる。かかる化合物の投与量は、毒性がほとんどまたは全くないＥＤ５０を含む、循環濃度の範囲内にあるのが好ましい。投与量は、使用される剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変化してもよい。本発明の方法に使用されるいずれの化合物についても、治療的に効果的な用量は細胞培養アッセイで最初に推定され得る。用量は、細胞培養にて決定されるようにＩＣ５０（すなわち、徴候の最大半量阻害を達成する本明細書に記載のα９インテグリンのアンタゴニストの濃度）を含む、循環血漿中濃度の範囲を達成するために、動物実験にて処方されてもよい。かかる情報を用いてヒトで有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば、高性能液体クロマトグラフィーにより測定されてもよい。
【０１８９】
ある実施態様において、本明細書に記載の方法は、もう一つ別のＨＳＣ動員剤、例えば、限定されるものではないが、インターロイキン−１７、シクロホスファミド（Ｃｙ）、ドセタキセル、および顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）からなる群より選択される薬剤を投与することを含む。好ましくは、α９インテグリンアンタゴニストはＧ−ＣＳＦと一緒に投与されてもよい。
【０１９０】
ある実施態様において、該方法は、単離された幹細胞を同一の対象に再導入するか、または該細胞を別の対象、例えば、ＨＬＡ型適合の第二対象に移植、同種移植するなどの、かかる細胞を対象に投与することを含む。
【０１９１】
本発明は、α９インテグリンアンタゴニストを患者に直接投与し、それ自身のＨＳＣを動員させること、またはα９インテグリンアンタゴニストで処理した別のドナーから由来のＨＳＣを用いて、そこからＨＳＣを採取することを含む。
【０１９２】
ある実施態様において、本明細書に記載のα９インテグリンのアンタゴニストを投与した対象は健康体である。他の実施態様において、対象は免疫抑制、慢性病、外傷、変性疾患、感染またはそれらの組み合わせなどの疾患または生理的症状を患っている。ある実施態様において、対象は、皮膚、消化器系、神経系、リンパ系、心血管系、内分泌系またはその組み合わせの疾患または症候を患ってもよい。
【０１９３】
特定の実施態様において、対象は骨粗鬆症、アルツハイマー病、心筋梗塞、パーキンソン病、外傷性脳損傷、多発性硬化症、肝硬変またはその組み合わせを患う。
【０１９４】
本明細書に記載される治療的に効果的な量のα９インテグリンのアンタゴニストを投与し、上記されるいずれかの症状を防止、治療し、および／またはその重篤度を緩めてもよく、あるいはそうでなければ上記したいずれかの症状について有益な臨床的利益を提供してもよいが、本明細書に記載されるα９インテグリンのアンタゴニストの方法および使用の適用はこれらの使用に限定されない。種々の実施態様において、該組成物および方法は、とりわけ、骨、関節、腱および靱帯などの骨格組織、ならびにパーキンソン病および糖尿病などの退行性疾患の治療にて治療的有用性のあることが分かる。幹細胞が血液から組織に放出、循環、ホーミングおよび／または遊走されることを強化することにより、ＨＳＣを欠陥部位に効果的に送達させ、修復効率を上げることができる。
【０１９５】
ある実施態様において、ＨＳＣ、ＰＢまたはＢＭを用いて治療するのに有用であり得る対象は、骨髄または幹細胞移植で一般的に治療され得るいずれの対象も、例えば、がん、例えば神経芽腫（未成熟神経細胞に生じ、ほとんどが乳幼児を襲うがん）、骨髄異形成、骨髄線維症、乳がん、腎細胞がん、または多発性骨髄腫の対象を包含する。例えば、該細胞は、一例として、がんの治療に、またはＨＳＣを動員するためのＧ−ＣＳＦ処置に対して応答しない者に用いられる高線量の化学療法および／または放射線療法により破壊された幹細胞を修復するのに、放射線療法または化学療法での治療に耐性のあるがんの対象に移植され得る。
【０１９６】
ある実施態様において、対象は造血新生物障害がある。本明細書中で使用される場合、「造血新生物障害」なる語は、例えば、骨髄、リンパまたは赤血球リニージ、あるいはそれらの前駆細胞より生じる、造血起源の過形成／新生細胞に関与する疾患を包含する。ある実施態様において、該疾患は低分化急性白血病、例えば赤芽球性白血病または急性巨核芽球性白血病に起因する。さらなる例示としての骨髄性障害は、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を包含するが、これらに限定されない。リンパ性悪性腫瘍は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）（Ｂ−リニージＡＬＬおよびＴ−リニージＡＬＬを含む）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、ヘアリー細胞白血病（ＨＬＬ）およびワルデンシュトレーム・マクログロブリン血症（ＷＭ）を含むが、これらに限定されない。さらなる形態の悪性リンパ腫として、ホジキン病および中程度／高度（Medium/High grade）（攻撃的な）非ホジキンリンパ腫およびその変種、末梢Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＦ）、ホジキン病、およびリード−スタンバーグ病が挙げられるが、これらに限定されない。一般に、該方法は、細胞組成物を投与すること、あるいは幹細胞を除去、放出または動員させて高線量の化学療法および／または放射線療法、例えば障害を治療するために使用された療法により破壊された幹細胞を修復することを含むであろう。あるいはまた、ＨＳＣはＢＭ幹細胞ニッチより除去、放出または動員され、ＢＭまたはＰＢのいずれかで細胞周期に入る一方で化学療法に感受的とされる。好ましくは、その造血新生物障害はＡＬＬである。
【０１９７】
ある実施態様において、ＢＭ、ＰＢまたはＨＳＣを用い、自己免疫疾患、例えば、多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症、自己免疫性神経障害、強皮症、再生不良性貧血、および全身性エリトマトーゼスの対象を治療する。
【０１９８】
ある実施態様において、治療される対象は、再生不良性貧血、異常ヘモグロビン症（鎌状赤血球貧血を含む）または免疫不全障害などの非悪性障害を有する。
【０１９９】
さらには、本発明は投与計画を提供する。１の実施態様において、その投与計画は、治療される病態の重篤度および応答に依存しており、その治療コースは単回投与から数日および／または数週にわたる繰り返し投与まで続く。もう一つ別の実施態様において、その投与計画は対象の末梢血流を循環するＣＤ３４＋ＨＳＣの数に依存する。もう一つ別の実施態様において、その投与計画は対象の末梢血流を循環する骨髄由来の幹細胞の数に依存する。例えば、ＨＳＣのＢＭからの移動度はＰＢを既に循環しているＨＳＣの数に依存する可能性がある。
【０２００】
本発明は、さらには、対象におけるＨＳＣのトラフィッキングを強化する方法であって、本明細書に記載の治療的に効果的な量のα９インテグリンのアンタゴニストを対象に投与することを含む、方法を提供する。１の実施態様において、ＨＳＣのトラフィッキングレベルは、対象の末梢血を循環するＣＤ３４＋ＨＳＣの数に関連する。もう一つ別の実施態様において、ＨＳＣのトラフィッキングレベルは、対象の末梢血を循環する骨髄由来のＨＳＣの数に関連する。
【０２０１】
本発明はさらには、本明細書に記載のα９インテグリンのアンタゴニストを対象に投与した後に、ＣＤ３４＋、ＣＤ３８＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞、リニージ委任のＣＤ３４−細胞、またはＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞からなる群より選択される、骨内膜前駆細胞などの循環するＨＳＣの個体数の一時的増加を誘発する方法を提供する。１の実施態様において、本明細書に記載のα９インテグリンのアンタゴニストを対象に付与することは、投与した後の１２日未満、６日未満、３日未満、２日未満、１日未満、１２時間未満、６時間未満、約４時間未満、約２時間未満、または約１時間未満などの特定の時間内でその対象のＨＳＣの放出を強化するであろう。
【０２０２】
１の実施態様において、本明細書に記載のα９インテグリンのアンタゴニストの投与は、投与した約３０分ないし約９０分後にＨＳＣを循環系中に放出させる。好ましくは、ＨＳＣの放出は投与から約６０分後であろう。もう一つ別の実施態様において、放出されたＨＳＣは循環系に入り、対象の体内で循環するＨＳＣの数を増加させる。もう一つ別の実施態様において、正常な基線と比べて、ＨＳＣの循環数の増加の割合は、約２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または約１００％であってもよく、あるいは対照と比べて約１００％以上で増加する。１の実施態様において、対照は同じ対象から由来の基線値である。もう一つ別の実施態様において、対照は、未処理の対象中で、あるいはプラセボまたは薬理学的な担体で処理した対象中で循環する幹細胞またはＨＳＣの数である。
【０２０３】
本発明のもう一つ別の態様において、ＨＳＣを患者に移植する方法であって、
α９インテグリンアンタゴニストを対象に投与し、ＨＳＣをＢＭ幹細胞結合リガンドから除去し；
そのＨＳＣをＢＭから放出させて、ＰＢに動員させ；
ＨＳＣをその対象のＰＢより採取し；および
そのＨＳＣを患者に移植する、ことを含む方法が提供される。
【０２０４】
１の実施態様において、一旦採取された細胞は、対象の造血前駆細胞集団を補完または補充するために体内に戻すことのできる、あるいはまた別の対象の造血前駆細胞集団を補充するためにその対象に移植され得る、細胞組成物を提供すると考えられる。このことは、ある場合、個体が化学療法を受けた期間の経過後に有利であり得る。
【０２０５】
１の実施態様において、該方法は、具体的には、ＨＳＣのサブセットを移植することに関する。これらの細胞は造血再構築能を有し、幹細胞ニッチにあるＢＭに存在する。本発明は、ＨＳＣを幹細胞ニッチから、好ましくは骨内膜ニッチ内の最も近い骨／ＢＭ接触面から、あるいは中心髄腔から移植する方法を提供する。より好ましくは、ＨＳＣは骨内膜ニッチ内の骨／ＢＭ接触面から移植される。というのも、これらの細胞は中心髄腔から単離されたＨＳＣと比べてより長期にわたって多リニージ造血再構築能を有することが明らかにされたからである。移植される細胞は、好ましくは、幹細胞ニッチに、より好ましくは中心または骨内膜ニッチにあることが分かる。
【０２０６】
移植され得る細胞の均等な型が、ＢＭ誘導性祖先細胞に富むＬｉｎ−Ｓｃａ−１＋ｃｋｉｔ＋細胞（以下、ＬＳＫと称される）、または幹細胞に富むＬＳＫＣＤ１５０＋ＣＤ４８−細胞（以下、ＬＳＫＳＬＡＭと称される）からなる群より選択されるネズミ集団にて見出すことができる。
【０２０７】
好ましくは、移植される細胞は、骨内膜祖先細胞であり、ＣＤ３４＋、ＣＤ３８＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞、リニージ委任のＣＤ３４−細胞、またはＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞からなる群より選択される。
【０２０８】
文書、行為、材料、装置、物品等の考察は、単に本発明の背景を提供する目的で、本明細書中に含まれるものである。先行技術基準の一部を形成するか、本発明に関連する分野に共通の一般的知識である、これらのいずれの事項も、それが本願の各請求項の優先日より前に存在するとして、本発明を示唆または開示するものではない。
【０２０９】
「含む」、「含んだ」または「含んでいる」なる語が本願明細書（特許請求の範囲を含む）にて使用される場合、それらの用語は、指摘される特徴、整数、工程または成分の存在を具現化するが、１または複数の他の特徴、整数、工程または成分、あるいはそれらのグループの存在を除外するものではない、として解釈されるべきである。
【０２１０】
次に何ら本発明を限定するものではない実施例を用いて、本発明をさらに詳しく説明する。
【０２１１】
実施例
方法
（ｉ）フローサイトメトリー
フローサイトメトリー分析は、J. Grassingerら、Blood, 2009, 114, 49-59において以前に記載されるように、ＬＳＲＩＩ（BD Biosciences）を用いて実施された。Ｒ−ＢＣ１５４を５８５ｎｍで検出し、黄緑レーザー（５６１ｎｍ）で励起した。ＢＭおよびＰＢ分析については、５ｘ１０６個までの細胞を１０−２０ｋ細胞イベント／秒の速度で分析した。ＰＢ  ＬＳＫＳＬＡＭの分析については、１ｘ１０６までのイベントをセーブした。細胞分類は、J. Grassingerらにより以前に記載されるように、C ytopeia Influx（BD）で行われた。
【０２１２】
（ｉｉ）細胞株
インテグリンα４β１（ＬＮ１８  α４β１）またはα９β１（ＬＮ１８  α９β１）を過剰発現する安定したＬＮ１８細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−２６１０）を、J. Grassingerら、Blood, 2009, 114, 49-59において以前に記載されるように、ｐＭＳＣＶ−ｈＩＴＧＡ４−ＩＲＥＳ−ｈＩＴＧＢ１およびｐＭＳＣＶ−ｈＩＴＧＡ９−ＩＲＥＳ−ｈＩＴＧＢ１ベクターを用いるレトロウイルス形質導入により生成し、１０％ＦＢＳ中２ｍＭ  Ｌ−グルタマートを補充したＤＭＥＭに維持した。形質導入した細胞をＰＢＳ−２％ＦＢＳ中２.５μｇ／ｍｌのＰＥ−Ｃｙ５−コンジュゲートマウス−抗ヒトα４抗体（BD Bioscience）または２０μｇ／ｍｌのマウス−抗ヒトα９β１抗体（Millipore）を用い、つづいて０.５μｇ／ｍｌのＰＥ−コンジュゲートヤギ−抗マウスＩｇＧ（BD Bio-science）を用いる、ＦＡＣＳ（２ラウンド）で選別した。ＬＮ１８およびＬＮ１８  α９β１細胞でのα４発現のサイレンシングをｐＳＭ２ｃ−ｓｈＩＴＧＡ４（Open Biosystems）を用いて上記されるように行った。α４−サイレンスのＬＮ１８細胞（対照細胞株；ＬＮ１８  ＳｉＡ４）およびＬＮ１８  α９β１（ＬＮ１８  α９β１ＳｉＡ４）を、ＦＡＣＳを用いてα４発現についてネガティブに選別した。
【０２１３】
（ｉｉｉ）免疫組織化学
（ａ）抗体染色
ＬＮ１８  ＳｉＡ４（対照細胞株）、ＬＮ１８  α４β１およびＬＮ１８  α９β１細胞をＰＢＳ−２％ＦＢＳ中２.５μｇ／ｍｌのマウス−抗ヒトα４抗体（BD Bioscience）、４μｇ／ｍｌのマウス−抗ヒトα９β１抗体（Millipore）または４μｇ／ｍｌのマウスイソ型対照（BD Bio-science）で１時間、つづいて５μｇ／ｍｌのアレキシア・フロアー（Alexa Fluor）５９４コンジュゲートヤギ−抗マウスＩｇＧ１で１時間染色に供し、次にＰＢＳ−２％ＦＢＳで３回洗浄した。
【０２１４】
（ｂ）抗体カクテル療法
ネズミ祖先細胞（ＬＳＫ；リニージ−Ｓｃａ−１＋ｃ−ｋｉｔ＋）およびＨＳＣ（ＬＳＫＳＬＡＭ；ＬＳＫＣＤ１５０＋ＣＤ４８−）に結合するＲ−ＢＣ１５４を分析するために、ＢＭおよびＰＢ細胞をリニージカクテル（抗−Ｔｅｒ１１９、抗−Ｂ２２０、抗−ＣＤ３、抗−Ｇｒ−１、抗−Ｍａｃ−１）、抗−Ｓｃａ−１、抗−ｃ−ｋｉｔ、抗−ＣＤ４８および抗−ＣＤ１５０で免疫標識に供した。リニージ分析では、細胞をＴ−細胞については抗−ＣＤ３を用い、Ｂ−細胞については抗−Ｂ２２０を用い、マクロファージについては抗−Ｍａｃ−１を用い、顆粒球については抗−Ｇｒ−１を用いて別々に染色した。別法として、リニージ分析はまた、抗−ＣＤ３／Ｂ２２０（ＰＢコンジュゲート）および抗−Ｂ２２０／Ｇｒ１／Ｍａｃ−１（ＡＦ６４７コンジュゲート）を含有するカクテルを用いて行われ、それによればＢ２２０＋細胞は＋／＋細胞と、ＣＤ３＋細胞は＋／−と、Ｇｒ１／Ｍａｃ−１＋細胞は−／＋の集団と同定された。臍帯血のＭＮＣからのヒトＷＢＣおよびヒト化ＮＳＧマウスからのＢＭおよびＰＢの分析には、細胞を抗−ｈｕＣＤ３／ＣＤ１４／ＣＤ１５（すべてＡＦ４８８コンジュゲート）、抗−ＣＤ１４／ＣＤ１５／ＣＤ１９／ＣＤ２０（すべてＡＦ６４７コンジュゲート）、抗−ｈｕＣＤ４５−ＰＢ、抗−ｍｕＣＤ４５−ＢＶ５１０および抗ｈｕＣＤ３４−ＰＥＣｙ７を含有するリニージカクテルで免疫標識に供された。使用したコンジュゲート抗体の一覧を表１および２に詳細に示す。
【０２１５】
【表１】
2017538715.tif 000027
【０２１６】
【表２】
2017538715.tif 000028
【０２１７】
【表３】
2017538715.tif 000029
【０２１８】
【表４】
2017538715.tif 000030
【０２１９】
（ｃ）Ｒ−ＢＣ１５４（２５）染色
培養したＬＮ１８  ＳｉＡ４（対照細胞株）、ＬＮ１８  α４β１、およびＬＮ１８  α９β１細胞を、１ｍＭ  ＣａＣｌ２−ＭｇＣｌ２または１ｍＭ  ＭｎＣｌ２を含有するＴＢＳ−２％ＦＢＳ（５０ｍＭ  トリスＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭグルコース、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７.４）中のＲ−ＢＣ１５４（５０ｎＭ）で処理し、３７℃で２０分間インキュベートし、次にＴＢＳ−２％ＦＢＳで３回洗浄した。染色した細胞をＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで５分間固定し、水で３回洗浄し、ついで２.５μｇ／ｍｌのＤＡＰＩで染色した。その細胞をベクターシールド（Vectorshield）にのせ、水で洗浄し、カバースリップで覆い、４℃で一夜貯蔵し、その後で蛍光顕微鏡（オリンパスＢＸ５１）を用いて画像処理に付した。
【０２２０】
（ｉｖ）飽和結合実験
培養したα４β１、α９β１および対照のＬＮ１８細胞（０.５ｘ１０６細胞）を、ＴＢＳ−２％ＦＢＳ（カチオン不含、１ｍＭ  ＣａＣｌ２−ＭｇＣｌ２または１ｍＭ  ＭｎＣｌ２のいずれかを含有する）中０、１、３、１０、３０および１００ｎＭの化合物２２または２５（Ｒ−ＢＣ１５４）のいずれかを１００μｌで用いて処理した。細胞を３７℃で６０分間インキュベートし、ＴＢＳ−２％ＦＢＳで１回洗浄し、乾燥させてペレット状にし、フローサイトメトリー分析と関連付けられる結合バッファーに再懸濁させた。平均チャネル蛍光強度を濃度に対してプロットし、グラフパッド・プリズム６（GraphPad Prism 6）を用いてワン−サイト飽和リガンド結合曲線に適合させた。解離定数Ｋｄをその曲線から決定した。
【０２２１】
（ｖ）オフ−レート速度測定
α４β１またはα９β１  ＬＮ１８細胞（０.５ｘ１０６細胞）を含有するエッペンドルフバイアルを、５０ｎＭのＲ−ＢＣ１５４（１ｍＭ  ＣａＣｌ２−ＭｇＣｌ２または１ｍＭ  ＭｎＣｌ２のいずれかを含有するＴＢＳ−２％ＦＢＳ中１００μｌ）を用いて３７℃で３０分間まで処理し、関連する結合バッファーで１回洗浄し、乾燥させてペレット状にした。その細胞を５００ｎＭの標識化されていない競合阻害剤（１ｍＭ  ＣａＣｌ２−ＭｇＣｌ２または１ｍＭ  ＭｎＣｌ２のいずれかを含有するＴＢＳ−２％ＦＢＳ中１００μｌ）を用いて３７℃で指摘される時間（０、２.５、５、１５、３０、４５、６０分間）処理した。その細胞を冷却ＴＢＳ−２％ＦＢＳ（関連するカチオンを含有する）で希釈し、遠心分離に付してペレット状にし、フローサイトメトリー分析用の結合バッファーで１回洗浄し、該バッファー（約２００μｌ）に再懸濁させた。平均チャネル蛍光強度を時間に対してプロットし、データをグラフパッド・プリズム６を用いて一相または二相のいずれかの指数的減衰関数に適合させた。オフ−レート、ｋｏｆｆは該曲線より推定した。
【０２２２】
（ｖｉ）オン−レート速度測定
α４β１またはα９β１  ＬＮ１８細胞（０.５ｘ１０６細胞）をＴＢＳ−２％ＦＢＳ（１ｍＭ  ＣａＣｌ２−ＭｇＣｌ２または１ｍＭ  ＭｎＣｌ２のいずれかを含有する）（５０μｌ）中に含有するエッペンドルフバイアルをヒーティングブロックにて３７℃で２０分間予め活性化させた。１００ｎＭ  Ｒ−ＢＣ１５４（５０μｌ−最終濃度＝５０ｎＭ）／関連するＴＢＳ−２％ＦBＳ（関連カチオンを含む）を各チューブに加え、３７℃で０、０.５、１、２、３、５、１０、１５および２０分間インキュベーションした後に、該チューブに３ｍｌのＴＢＳ−２％ＦＢＳ（関連カチオンを含む）を添加してクエンチさせた。該細胞をＴＢＳ−２％ＦＢＳ（関連カチオンを含む）で１回洗浄し、遠心分離に付してペレット状にし、サイトメトリー分析用の関連する結合バッファー（２００μｌ）に再び懸濁させた。平均チャネル蛍光強度を時間に対してプロットし、データをグラフパッド・プリズム６を用いて一相または二相のいずれかの結合関数に適合させた。観察されたオン−レート、ｋｏｂｓを該曲線より推定し、ｋｏｎを
（ｋｏｂｓ−ｋｏｆｆ）／［Ｒ−ＢＣ１５４＝５０ｎＭ］
より推定した。
【０２２３】
（ｖｉｉ）マウス
Ｃ５７ＢＩ／６マウスをモナッシュ・アニマル・サービス（Monash Animal Services（Monash University, Clayton, Australia）で繁殖させた。６−８週齢のマウスを実験のために性適合させた。実験はすべてモナッシュ・アニマル・リサーチ・プラットフォーム（Monash Animal Research Platform）倫理委員会（ＭＡＲＰ／２０１２／１２８）によって承認された。
【０２２４】
Ｃ５７ＢＩ／６（Ｃ５７）、ＲＦＰ、ＧＦＰおよびα４flox／flox／α９flox／flox ｖａｖ−ｃｒｅマウスをモナッシュ・アニマル・サービス（Monash University, Clayton, Australia）で繁殖させた。赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）マウスはProfessor Patrick Tam（Children’s Medical Research Institute, Sydney, Australia）より提供された。条件付きα４flox／flox／α９flox／floxマウスは、初めは、α４flox／floxマウス（Thalia Papayannopoulou, University of Washington, Department of Medicine/Hematology, Seattle, WAから寄付）をα９flox／floxマウス（Dean Sheppard, Department of Medicine, University of California, SFから寄付）およびｖａｖ−ｃｒｅマウス（Warren Alexander, WEHI Institute, Melbourneから寄付）と異種交配させることで作製された。ＮＯＤＳＩＬ２Ｒγ−／−（ＮＳＧ）マウスをインハウス（Australian Regenerative Medicine Institute）で入手した。ヒト化ＮＳＧマウスが新たに選別された臍帯血ＣＤ３４＋細胞（＞１５０ｋ）を２ｘ１０６個の放射線照射された単核支持細胞と一緒に尾静脈注射することにより作製された。移植した４−５週間後に、ＮＳＧマウスを眼出血（eyebled）に供し、ｈｕＣＤ４５およびｍｕＣＤ４５、およびＣＤ３４の生着について評価した。Ｃ５７ＢＩ／６マウスを用いる移植実験のために、移植する２４時間前に放射線照射を分割線量（各々、５.２５Ｇｙ）で６時間離して行った。受容する毎に合計で２ｘ１０５個の放射線照射した（１５Ｇｙ）Ｃ５７ＢＭ細胞をキャリア細胞として用いた。実験はすべてモナッシュ・アニマル・リサーチ・サービス倫理委員会によって承認された。
【０２２５】
（ｖｉｉｉ）インビボ骨髄結合アッセイ
ＰＢＳ中Ｒ−ＢＣ１５４（２５）（１０ｍｇ／ｋｇ）をＣ５７マウスに静脈内注射した。５分後、骨髄細胞をD. N. Haylockら、Stem Cells, 2007, 25, 1062-1069およびJ. Grassingerら、Cytokine, 2012, 58, 218-225において以前に記載されるように単離した。簡単には、１の大腿骨、脛骨および腸骨稜を摘出し、筋肉をきれいに取り除いた。骨端および骨幹端領域を除去した後、骨をＰＢＳ−２％ＦＢＳでフラッシュさせて全骨髄を得、それをＰＢＳ−２％ＦＢＳで洗浄し、次にフローサイトメトリーのために免疫標識に供した。Ｒ−ＢＣ１５４結合の分析の場合、発光スペクトルの重なりを最小にするために次の抗体の組み合わせを選択した。祖先細胞（ＬＳＫ；リニージ−Ｓｃａ−１＋ｃ−ｋｉｔ＋）およびＨＳＣ（ＬＳＫＳＬＡＭ；ＬＳＫＣＤ１５０＋ＣＤ４８−）を染色する場合には、細胞をリニージカクテル（ＣＤ３、Ｔｅｒ−１１９、Ｇｒ−１、Ｍａｃ−１、Ｂ２２０；すべての抗体  ＡＰＣ−Ｃｙ７とのコンジュゲートに付す）、抗−Ｓｃａ−１−ＰＢ、抗−ｃ−ｋｉｔ−ＡＦ６４７、抗−ＣＤ４８−ＦＩＴＣおよび抗−ＣＤ１５０−ＢＶ６５０で標識化した。
【０２２６】
（ｉｘ）造血細胞単離
骨内膜および中心ネズミ骨髄細胞の集団を、J. Grassingerら、Cytokine, 2012, 58, 218-225およびD. N. Haylockら、Stem Cells, 2007, 25, 1062-1069にて以前に記載されるように単離した。簡単には、１の大腿骨、脛骨および腸骨稜を摘出し、筋肉をきれいに取り除いた。骨端および骨幹端領域を除去した後、骨をＰＢＳ−２％ＦＢＳでフラッシュさせて中心骨髄細胞を得た。フラッシュに付した長骨、および骨端および骨幹端フラグメントをプールし、乳鉢および乳棒を用いて粉砕した。骨フラグメントをコラゲナーゼＩ（３ｍｇ／ｍｌ）およびジスパーゼＩＩ（４ｍｇ／ｍｌ）と一緒に３７℃でオービタル振盪器にて７５０ｒｐｍで消化させた。５分後、骨フラグメントをＰＢＳで１回、ＰＢＳ２％ＦＢＳで１回洗浄し、骨内膜骨髄細胞を集めた。末梢血をレトロオービタルパンクチャーにより集め、ＮＨ４Ｃｌ溶解バッファーを室温で５分間用いて赤血球を溶解させた。単離した細胞集団をＰＢＳ２％ＦＢＳで洗浄し、次に上記の抗体カクテルにて記載されるようにフローサイトメトリーのために染色させた。
【０２２７】
（ｘ）ヒトＣＤ３４＋細胞の単離
単核細胞（ＭＮＣ）をNilsson, S. K.ら、Blood, 106, 1232-1239（2005）およびGrassinger, J.ら、Blood, 114, 49-59（2009）にて以前に記載されるように臍帯血より単離した。ＭＮＣをマウス抗−ヒトＣＤ３、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ２０、ＣＤ２４およびＣＤ２３５ａ（ＢＤ）を含有するリニージ抗体カクテルと一緒にインキュベートし、次に細胞に付き２ビーズの割合で５分間２ラウンドのダイナル（Dynal）のヒツジ抗マウスＩｇＧビーズ（Invitrogen, Carlsbad, CA）で処理し、ついで一定の回転速度で４℃にて１０分間処理した。濃縮されたＭＮＣをＦＡＣＳで精製したＣＤ３４−フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）ＣＤ３４＋細胞で染色した。
【０２２８】
（ｘｉ）インビトロおよびインビボＲ−ＢＣ１５４結合
インビトロでの標識実験の場合、Ｃ５７マウス、条件付きα４−／−／α９−／−マウスおよびヒト化ＮＯＤＳＣＩＤＩＬ２Ｒγ−／−マウスおよびヒト臍帯血ＭＮＣから由来の５ｘ１０６個のＢＭ細胞を、４０ｘ１０６個の細胞／ｍｌで４℃で２０分間にわたって１ｍＭ  ＣａＣｌ２／ＭｇＣｌ２（活性化剤）または１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（不活性化剤）のいずれかを含有するＲ−ＢＣ１５４（１００ｎＭまで）／ＰＢＳ（０.５％ＢＳＡ）で処理した。細胞をＰＢＳ（２％ＦＢＳ）で洗浄し、次にフローサイトメトリー分析に付す前に「抗体カクテル」に記載されるように免疫標識に供した。インビボ実験の場合、Ｃ５７ＢＬ／６マウス、α４−／−／α９−／−ｖａｖ−ｃｒｅマウスおよびヒト化ＮＯＤＳＣＩＤＩＬ２Ｒγ−／−マウスは、Ｒ−ＢＣ１５４（１０ｍｇ／ｋｇ）を１００μｌ／１０ｇのマウス体重で静脈内または皮下注射のいずれかで投与され、上記されるように分析された。
【０２２９】
祖先細胞（ＬＳＫ細胞）の選別集団に対する蛍光顕微鏡検査法によるＲ−ＢＣ１５４結合分析が、未処理およびＲ−ＢＣ１５４注射のマウスより採取したＢＭ細胞をＢ２２０、Ｇｒ−１、Ｍａｃ−１およびＴｅｒ−１１９についてリニージ枯渇させ、抗−Ｓｃａ−１−ＰＢおよび抗−ｃ−ｋｉｔ−ＦＩＴＣで染色させ、Ｓｃａ１＋ｃ−ｋｉｔ＋で選別した。細胞を選別し、オリンパスＢＸ５１顕微鏡を用いて画像化した。
【０２３０】
（ｘｉｉ）競合的阻害アッセイ
α４β１およびα９β１  ＬＮ１８細胞（１−２ｘ１０５個の細胞）を５０ｎＭのＲ−ＢＣ１５４（８０μｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２／ＭｇＣｌ２を含有するＰＢＳ−２％ＦＢＳ中）で３７℃にて１０分間処理し、ＰＢＳで洗浄し、遠心分離に付してペレット状にし、次にＢＯＰ（８０μｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２／ＭｇＣｌ２を願有するＰＢＳ−２％ＦＢＳ）を用いて０、０.０１、０.１、０.３、１、１０、１００および３００ｎＭで処理した。細胞を３７℃で９０分間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、遠心分離に付してペレット状にし、フローサイトメトリー分析用のＰＢＳ（２００μｌ）に再懸濁させた。％最大平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＢＯＰの対数濃度に対してプロットし、データをリガンド結合のＳ字型用量応答曲線に適合させ、ＩＣ５０値をグラフより得た。ＬＳＫおよびＬＳＫＳＬＡＭ細胞に結合するＲ−ＢＣ１５４の競合的置換については、フローサイトメトリー分析に付す前に、Ｒ−ＢＣ１５４を注射したマウスより単離したＷＢＭ細胞を、ＰＢＳ中５００ｎＭ  ＢＯＰ（０.５％ＢＳＡおよび１ｍＭ  ＣａＣｌ２／ＭｇＣｌ２を含有する）で４５分間にわたって３７℃で処理した。
【０２３１】
（ｘｉｉｉ）動員プロトコル
動員実験については、すべてのマウスを１００μｌ／１０ｇの体重で皮下注射し、咽喉部の出血操作によりＥＤＴＡ被覆のシリンジを用いてＰＢを採取した。
【０２３２】
（ａ）Ｒ−ＢＣ１５４およびＢＯＰ：マウスは、指示される時に咽喉部の出血によりＰＢを採取する前に、Ｒ−ＢＣ１５４およびＢＯＰのセイライン中の新たに調製された溶液を単回注射により指示される用量にて投与された。
【０２３３】
（ｂ）Ｇ−ＣＳＦ：マウスはＧ−ＣＳＦを２５０μｇ／ｋｇで１日に２回（５００μｇ／ｋｇ／日）、６−８時間離して４日間連続して投与された。Ｇ−ＣＳＦおよびＢＯＰを受ける群は上記される標準的なＧ−ＣＳＦ投与計画に付され、つづいて採取の１時間前にＢＯＰの単回注射を受けた。対照となるマウスは等容量のセイラインを受けた。
【０２３４】
（ｘｉｖ）ヒト化ＮＯＤＳＩＬ２Ｒγ（ＮＳＧ）マウスの動員
ヒト化ＮＳＧマウスが、新たに選別された臍帯血ＣＤ３４＋細胞（＞１５０ｋ）を２ｘ１０６個の放射線照射された単核支持細胞と一緒に尾静脈注射することにより作製された。移植した４−５週間後に、ＮＳＧマウスを眼出血に供し、ｈｕＣＤ４５およびｍｕＣＤ４５について評価した。これらの条件下、ＣＤ４５の合計％に対するｈｕＣＤ４５の％に基づき、フローサイトメトリー分析により測定した場合に＞９０％のヒト化が達成された。ヒト化ＮＳＧマウスは回復するのに実験まで少なくとも１週間を要した。マウスを「動員プロトコル」にて特定される関連する条件下で動員させ、その後でＰＢを咽喉部出血により集め、溶解させ、「抗体カクテル」に記載されるように免疫標識に供した。
【０２３５】
（ｘｖ）低−および高−増殖能コロニー形成細胞アッセイ
低−および高−増殖能コロニー形成細胞（各々、ＬＰＰ−ＣＦＣおよびＨＰＰ−ＣＦＣ）を、J. Grassingerら、Cytokine, 2012, 58, 218-225およびBartelmez, S. H.ら、Experimental Hematology 17, 240-245（1989）において以前に記載されるようにアッセイした。簡単には、動員したＰＢを溶解させ、４０００ＷＢＣを３５ｍｍ径ペトリ皿に入れた二層のニュートリエント寒天培養系（組換えマウス幹細胞因子および組換えヒトコロニー刺激因子−１、インターロイキン−１α（ＩＬ−１α）およびＩｌ−３を含有する）に置いた。培養物をヒト化インキュベーター中の５％Ｏ２、１０％ＣＯ２、８５％Ｎ２にて３７℃でインキュベートした。ＬＰＰ−ＣＦＣおよびＨＰＰ−ＣＦＣをJ. Grassingerら（2012）において以前に記載されるように１４日間のインキュベーションで列挙した。
【０２３６】
（ｘｖｉ）長期移植アッセイ
（ａ）限界希釈分析
ＲＦＰマウスをＢＯＰ（ｎ＝１５）で処理し、１時間後にＰＢを採取した。処理群当たりの各ドナーのマウスからのＰＢをプールし、溶解させ、ＰＢＳ中に最初の血液容量の１／３を占めるようにした。放射線照射したＷＢＭフィラー細胞（２ｘ１０５／マウス）を特定された移植片容量で溶解したＰＢのアリコートに加え、次にＰＢＳをいっぱいになるまで注ぎ足し、２００μｌ／マウスとした。放射線照射したＣ５７ＢＬ／６マウスに尾静脈注射を介して投与し、多リニージＲＦＰ生着を移植した６、１２および２０週間後に評価した。
【０２３７】
（ｂ）競合的一次および二次移植アッセイ
ＲＦＰ（ｎ＝５）およびＧＦＰ（ｎ＝５）マウスを、「動員プロトコル」に記載されるように、各々、ＢＯＰ（１時間）およびＧ−ＣＳＦ（１日に２回、４日間）で処理した。次に、ＰＢを採取し、ＲＦＰおよびＧＦＰ群内にある血液をプールし、溶解させ、洗浄し、ＰＢＳ中に最初の血液容量の１／３まで再懸濁させた。等容量のＲＦＰおよびＧＦＰの血液を混合し、マウス当たり５００μｌのＲＦＰおよびＧＦＰの血液を移植させた。放射線照射に付したＷＢＭフィラー細胞（２ｘ１０５／マウス）を加え、その混合物にＰＢＳをいっぱいになるまで注ぎ足し、２００μｌの注射液／マウスとした。放射線照射したＣ５７ＢＬ／６受容者（ｎ＝５）に尾静脈注射を介して投与し、ＲＦＰおよびＧＦＰ生着を移植した６、１２および２０週間後に評価した。２０週間のテイクダウンで、各一次受容者（ｎ＝５）からのＷＢＭ細胞（大腿骨の１０分の１）を放射線照射したＣ５７二次受容者（ｎ＝４／一次受容者）に移植し、多リニージ生着について移植した６、１２および２０週間後に評価した。
【０２３８】
（ｘｖｉｉ）統計解析
データを、そのデータセットに適する、スチューデントｔ−試験、一方向または二方向ＡＮＯＶＡを用いて分析した。幹細胞の再生頻度の測定については、Ｌ−ＣＡＬＣソフトウェア（Stem Cell Technologies）を用いるポアソン解析が行われた。対数ランク（Mantel-Cox）試験は生存曲線と比べるのに使用された。ｐ＜０.０５は有意であると考えられた。
【０２３９】
実施例１：α９β１インテグリンアンタゴニストの調製
（ａ）アンタゴニスト化合物の合成
種々の実施態様の試剤は以下に記載の反応経路および合成スキームを用いて調製され得る。実施態様の特定の化合物の調製は、以下の実施例において詳細に記載されるが、当業者であれば、その記載される化学反応が種々の実施態様の多数の他の試剤を調製するのに容易に適合され得ることを理解するであろう。例えば、例示されていない化合物の合成は、当業者に明らかな修飾により、例えば、干渉基を適宜保護することにより、当該分野にて公知の他の適切な試薬と交換することにより、あるいは反応条件を慣用的に修飾することにより、うまく行うことができる。有機合成における適切な保護基の一覧をT.W. Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Edition, John Wiley & Sons, 1991に見ることができる。あるいはまた、本明細書に記載の、または当該分野にて公知の他の反応は、種々の実施態様の他の化合物を調製するのに適用性のあることが理解されよう。
【０２４０】
化合物の合成に有用な試剤は当該分野にて公知な技法に従って得ること、または調製することができる。
【０２４１】
合成方法、スキームおよび実施例における記号、略語および慣習は、現在の科学文献に使用される記号等と一致するものである。具体的には、限定することを意図するものではなく、以下の略語は、実施例において、および明細書を通して使用されてもよい。
【０２４２】
【表５】
2017538715.tif 000031
【０２４３】
【表６】
2017538715.tif 000032
【０２４４】
特記されない限り、温度はすべて℃（セ氏温度）で表される。反応はすべて、特記されない限り、室温で行われる。
【０２４５】
出発材料、試剤、および溶媒はすべて、特記されない限り、商業的供給源より入手し、さらに精製することなく用いた。Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−Ｌ−プロリル−Ｌ−Ｏ−（tert−ブチルエーテル）チロシンメチルエステル２６はGenscriptより入手した。無水反応はすべて乾燥窒素雰囲気下で行われた。ジエチルエーテル、ジクロロメタン、テトラヒドロフランおよびトルエンは、Grubbsらによる当初の設計に基づき、J. C. Meyerによって構築された、ソルベント・ディスペンシング・システム（Solvent Dispensing System）の活性化中性アルミナの２連カラムを通すことにより乾燥させた。石油スピリットは、沸点が４０−６０℃の留分をいう。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）はMerck製のプレコートされた０.２５ｍｍのシリカアルミニウムで裏打ちされたプレート上でなされ、ＵＶ光および／またはニンヒドリン溶液またはリンモリブデン酸溶液に浸し、つづいて加熱することで可視化された。反応生成物の精製は、Merck Silica Gel 60（２３０−４００メッシュ）または逆相Ｃ１８シリカゲルを用いるフラッシュクロマトグラフィーにより実施された。融点はReichert-Jung Thermovarの加熱段階式顕微鏡融点装置に記録された。旋光度はPerkin Elmer Model 341旋光計に記録された。ＦＴＩＲスペクトルは、ダイヤモンドウィンドーを装備したSmartATR（減衰全反射）を利用するThermo Nicolet 6700分光計を用いて得られた。プロトン（１Ｈ）およびカーボン（１３Ｃ）ＮＭＲスペクトルは、BrukerAV400分光計に各々、４００および１００ＭＨｚで記録された。１Ｈ  ＮＭＲは、溶媒を内部標準（ＣＤＣｌ３、７.２６ｐｐｍ）として用いてｐｐｍで報告される。プロトンデカップルの１３Ｃ  ＮMＲ（１００ＭＨｚ）は、溶媒を内部標準（ＣＤＣｌ３、７７.１６ｐｐｍ）を用いてｐｐｍで報告される。高分解能質量分析は、WATERS QTOF II（CMSE， Clayton, VIC 3168）またはElectrospray Ionisation（ＥＳＩ）を利用する、FinniganハイブリッドLTQ-FT質量分析（Thermo Electron Corp., Bio 21 Institute, University of Melbourne, Parkville, VIC 3010）のいずれかで行われた。
【０２４６】
実施例１Ａ：Ｎ−（ベンゼンスルホニル）−Ｌ−プロリル−Ｌ−Ｏ−（１−ピロリジニルカルボニル）チロシン（ＢＯＰ）の調製
【０２４７】
ＢＯＰの合成は、以下のスキーム１にて示されるように、ジペプチド２６から始まった：
【化２６】
2017538715.tif 000033
【０２４８】
２６のtert−ブチル保護基を、０℃でトリフルオロ酢酸を用いる脱保護に付して、フェノール２７を得、それをさらに精製することなく、水性後処理に供した後、次工程に用いた。フェノール２７と１−ピロリジンカルボニルクロリドとの反応は、炭酸カリウムの存在下でスムーズに進行し、カルバマート２８を２工程にわたって良好な収率（７４％）で得た。Ｃｂｚ保護基の水素化分解は３時間以内に終了し、その結果としてのアミンはフラッシュクロマトグラフィーに付した後に極めて良好な収率（８５％）にて得られた。次にアミン２９を塩基の存在下でベンゼンスルホニルクロリドと反応させ、スルホンアミド３０をフラッシュクロマトグラフィーに付した後で極めて良好な収率（９６％）で得た。最後に、３０のメチルエステル部分を水酸化ナトリウムを用いてケン化し、つづいてアンバーライト樹脂上でイオン交換に供し、フラッシュクロマトグラフィーに付した後にＢＯＰを８１％収率にて得た。
【０２４９】
例示を目的として、本発明者らは、ジペプチド２６より出発して、ＢＯＰを形成するための実際の反応条件を提供する。
【０２５０】
工程１：Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−Ｌ−プロリル−Ｌ−Ｏ−チロシンメチルエステル（２７）
ＴＦＡ（１.２７ｍＬ、１６.６ミリモル）をＮ−（ベンジルオキシカルボニル）−Ｌ−プロリル−Ｌ−Ｏ−（tert−ブチルエーテル）チロシンメチルエステル２６（０.８０ｇ、１.６６ミリモル；Genscriptからカスタムしたペプチド合成）の乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）中０℃での懸濁液に滴下して加えた。その混合物をゆっくりと室温にまで加温し、３時間攪拌した。その時点でＴＬＣ（７０：３０  ＥｔＯＡｃ／石油スピリット）は出発材料が完全に消費されたことを示した。その混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、Ｈ２Ｏ、ブラインで洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）させて、減圧下で濃縮した。残渣をトルエンと一緒に濃縮し（ｘ３）、粗Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−Ｌ−プロリル−Ｌ−Ｏ−チロシンメチルエステル２７（７００ｍｇ）を無色の油状物として得、それをさらに精製することなく、次工程に用いた。
【０２５１】
工程２：Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−Ｌ−プロリル−Ｌ−Ｏ−（１−ピロリジニルカルボニル）チロシンメチルエステル（２８）
１−ピロリジンカルボニルクロリド（１４７μＬ、１.３８ミリモル）を粗フェノール２７（３９３ｍｇ、０.９２２ミリモル）およびＫ２ＣＯ３（２５６ｍｇ、１.８４ミリモル）のＤＭＦ（５ｍＬ）中混合物に添加した。その混合物を５０℃で一夜攪拌し、ＥｔＯＡｃ／Ｈ２Ｏで希釈し、有機相を分離した。有機層を５％ＨＣｌ、飽和水性ＮａＨＣＯ３、ブラインで洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）させ、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（７０％ＥｔＯＡｃ／石油スピリット）に付して精製し、カルバマート２８（３５５ｍｇ、７４％）を無色の泡沫体として得、それをさらに精製することなく、次工程に用いた。
【０２５２】
工程３：Ｌ−プロリル−Ｌ−Ｏ−（１−ピロリジニルカルボニル）チロシンメチルエステル（２９）
Ｃｂｚ保護のジペプチド２８（３５６ｍｇ、０.６８１ミリモル）および１０％Ｐｄ／Ｃ（５０％Ｈ２Ｏ、１５０ｍｇ）のＭｅＯＨ（３０ｍＬ）中混合物をＨ２で３回パージした。該混合物をＨ２雰囲気下で３時間攪拌し、その時点でＴＬＣ（１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）は出発材料が完全に消費されたことを示した。該混合物をセライト層を通して濾過し、濾液を減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（５％→１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）に付して精製し、アミン２９（２２４ｍｇ、８５％）を無色の油状物として得た。δＨ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：１.６４−１.７８（２Ｈ，ｍ）、１.８２−１.９２（５Ｈ，ｍ）、２.１６−２.２５（１Ｈ，ｍ）、２.９７−３.１５（４Ｈ，ｍ）、３.３９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６.５Ｈｚ）、３.４９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６.５Ｈｚ）、３.６５（３Ｈ，ｓ）、４.０３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５.７、８.３Ｈｚ）、４.７２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７.８、１３.３Ｈｚ）、５.６９（１Ｈ，ｂｒｓ）、６.９９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８.３Ｈｚ）、７.１３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８.３Ｈｚ）、８.４１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７.９Ｈｚ）
【０２５３】
工程４：Ｎ−（ベンゼンスルホニル）−Ｌ−プロリル−Ｌ−Ｏ−（１−ピロリジニルカルボニル）チロシンメチルエステル（３０）
ＤＩＰＥＡ（９５μＬ、０.５４６ミリモル）をアミンＤ（７１ｍｇ、０.１８２ミリモル）、ＰｈＳＯ２Ｃｌ（３５μＬ、０.２７３ミリモル）およびＤＭＡＰ（２.２ｍｇ、０.０１８ミリモル）のＣＨ２Ｃｌ２（３ｍＬ）中攪拌溶液に添加した。その混合物を室温で４時間攪拌し、減圧下で濃縮した、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（２.５％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）に付して精製し、生成物Ｅ（９３ｍｇ、９６％）を無色の泡沫体として得た。δＨ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：１.４２−１.５６（３Ｈ，ｍ）、１.９０−２.０５（５Ｈ，ｍ）、３.０３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７.６、１４.０Ｈｚ）、３.１０−３.１６（１Ｈ，ｍ）、３.２６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５.６、１４.０Ｈｚ）、３.３５−３.４０（１Ｈ，ｍ）、３.４５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６.５Ｈｚ）、３.５４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６.５Ｈｚ）、３.７７（３Ｈ，ｓ）、４.０８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２.０、８.０Ｈｚ）、４.８２（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝５.７、１１.６Ｈｚ）、７.０６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８.７Ｈｚ）、７.１３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８.７Ｈｚ）、７.２５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７.５Ｈｚ；溶媒のピークにより遮蔽されている）、７.５２−７.５７（２Ｈ，ｍ）、７.６１−７.６５（１Ｈ，ｍ）、７.８３−７.８５（２Ｈ，ｍ）
【０２５４】
工程５：Ｎ−（ベンゼンスルホニル）−Ｌ−プロリル−Ｌ−Ｏ−（１−ピロリジニルカルボニル）チロシン（ＢＯＰ）
０.１Ｍ  ＮａＯＨ（３.２ｍＬ、０.１６２ミリモル）をそのエステル３０（８６ｍｇ、０.１６２ミリモル）のＭｅＯＨ（１０ｍＬ）中溶液に加え、該混合物を室温で一夜攪拌した。該反応物をアンバーライト樹脂（Ｈ＋形態）でクエンチさせ、濾過し、その濾液を減圧下で濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）に付して精製し、生成物のＢＯＰ（６８ｍｇ、８１％）を無色のガラス状物として得た。δＨ（４００ＭＨｚ、ｄ４−ＭｅＯＨ）：１.４７−１.５５（１Ｈ，ｍ）、１.５９−１.７２（２Ｈ，ｍ）、１.７７−１.８５（１Ｈ，ｍ）、１.９３−２.００（４Ｈ，ｍ）、３.１１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７.８、１３.７Ｈｚ）、３.１８−３.２４（１Ｈ，ｍ）、３.２７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５.０、１３.７Ｈｚ）、３.３５−３.４４（３Ｈ，ｍ）、３.５６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６.５Ｈｚ）、４.１４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４.０、８.５Ｈｚ）、４.６９（１Ｈ，ｍ）、７.０４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８.５Ｈｚ）、７.２７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８.５Ｈｚ）、７.６０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７.６Ｈｚ）、７.６９（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７.４Ｈｚ）、７.８６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７.４Ｈｚ）
【０２５５】
インビトロおよびインビボにおける実験では、ＢＯＰは、ＢＯＰの遊離酸のＭｅＯＨ中溶液を０.９８当量のＮａＯＨ（０.０１Ｍ  ＮａＯＨ）で処理することにより、ナトリウム塩に変換された。その溶液を０.４５μｍのシリンジフィルターユニットを通して濾過し、生成物を凍結乾燥させ、そのナトリウム塩を綿毛のようにフワッとした無色の粉末として得た。δＨ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）：１.４７−１.５９（２Ｈ，ｍ）、１.６８−１.８３（２Ｈ，ｍ）、１.８７−１.９２（４Ｈ，ｍ）、３.０１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７.７、１３.８Ｈｚ）、３.１８−３.２６（２Ｈ，ｍ）、３.３４−３.４０（３Ｈ，ｍ）、３.４８−３.５１（２Ｈ，ｍ）、４.０６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４.４、８.７Ｈｚ）、４.４３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５.０、７.７Ｈｚ）、７.０４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８.５Ｈｚ）、７.２７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８.５Ｈｚ）、７.６１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝８.１Ｈｚ）、７.７３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７.５Ｈｚ）、７.７８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７.５Ｈｚ）
【０２５６】
実施例１Ｂ：ＰＥＧスペーサーを用いて蛍光標識されたインテグリンアンタゴニスト（化合物２２）の調製
【化２７】
2017538715.tif 000034
【０２５７】
ＢＯＰを蛍光標識する一般的方法は、後で蛍光タグをコンジュゲートさせるのに、ＢＯＰのＣ４位にトランス配置の二官能性ＰＥＧリンカーを組み込む、効率的な解決方法を基礎とする。
【０２５８】
ラクトン４は、保護アミノ酸で直接アシル化することを介して、４−シス−ヒドロキシプロリンをベースとするジペプチドを入手するための多用途なシントンとして、これまで報告されている。その後で４−シス−ヒドロキシ基を活性化し、つづいて求核試薬を用いるＳＮ２置換に付し、所望の４−トランス−配置のプロリン誘導体を得る。このように、本発明者らは、ＢＯＰの種々のＣ４−官能基付与した誘導体がラクトン４およびチロシン誘導体７から出発して取得され得る（スキーム２）と考えた。ラクトン４はＮ−フェニルスルホニル−トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンをＤＩＡＤおよびＰＰｈ３を利用するミツノブ条件下で処理することにより容易に調製された。チロシン誘導体７は、保護された５を、Ｋ２ＣＯ３の存在下にてピロリジンカルボニルクロリドで処理することにより中間体６を得、つづいてＣｂｚ保護基を除去することにより合成された。二相条件下でラクトン４をチロシン誘導体７に曝し、ジペプチド８を収率８９％にて単一のジアステレオマーとして得た。この方法は、二環式ラクトンの活性化特性の利点を有し、脱水ペプチドカップリングに頼ることなく、４−シス−ヒドロキシプロリンジペプチドへのクリーンな変換を可能とする。ＰＥＧリンカーを組み込みという最初の試みは、シス−配置されたトリフラート９を、市販の４,７,１０−トリオキサ−１,１３−トリデカンジアミンより容易に得ることができる、アミノＰＥＧ誘導体１０と直接置換することに焦点が当てられた。４−シス−トリフラートのアミンとのＳＮ２置換は対応するトランス−アミノプロリン誘導体を付与すると報告されており、それは所定の現在のコンテキストにおいて、得られるリンケージの立体容積が低く、魅力的であろう。従って、化合物８のヒドロキシル基はＰＥＧ誘導体１０で処理する前に対応するトリフラート９に変換され、たとえ収率が満足する値でないとしても（２工程にわたって２７％）、ＰＥＧ化生成物１１を得た（スキーム２）。 
【０２５９】
トリフラート９またはＰＥＧ誘導体１０のいずれかを形成する間に主たる副生成物は単離されなかったが、Ｎ−アルキル化反応の低収率に対する可能な合理化はトリフルオロメタンスルホニルイミダートの中間体の形成であった。従って、第二アミドを欠く、簡略したシス−ヒドロキシル化合物１２も調査された。
【０２６０】
Ｎ−連結した芳香族ヘテロ環（例えば、イミダゾール、トリアゾール、テトラゾールおよびベンズイミダゾール）のプロリン残基の４−位での導入がこれまでに記載されている。この観察によれば、本発明者らは、トリアゾールを介するＰＥＧリンカーの結合もまたα９β１インテグリン結合に許容され得ると考えた。結果的に、このことは、以下のスキーム３に示されるように、アルキン官能基付与ＰＥＧ誘導体１５と、トランス−アジドインテグリンアンタゴニスト１８との間の、Ｃｕ（Ｉ）触媒のアジドアルキンシクロ付加（ＣｕＡＡＣ）反応を用いて、ＰＥＧリンカーを組み込むことを可能とするであろう。
【０２６１】
【化２８】
2017538715.tif 000035
【０２６２】
アルキン官能基を付与したＰＥＧ誘導体１５は、ＤＣＣカップリング条件下でプロピオン酸と縮合させることにより、１０より一工程で得られる（スキーム３ａ）。トランス−アジド官能基を付与したジペプチド１８の合成はラクトン４から容易に達成された（スキーム３ｂ）。４をＮａ２ＣＯ３とＭｅＯＨ中で処理してシス−ヒドロキシプロリンエステル１２を収率８０％で得た。１２のシス−アルコールを対応するメシラートに変換し、その後でアジ化ナトリウムで置き換え、トランス−アジドプロリンエステル１６を２工程にわたって収率８８％で得た。１６のメチルエステルを加水分解に付し、プロリン酸１７を得、次にそれを標準的ＨＢＴＵカップリング条件下でチロシン誘導体７と反応させジペプチド１８を収率９３％で得た。別法として、ジペプチド１８はシス−アルコール８（スキーム１からの由来）からもアクセス可能である。都合よくは、化合物８のメシル化およびその後のアジド置換はスムーズに進行して生成物１８を供給し、それはクロマトグラフィー精製を必要とすることなく得られた。
【０２６３】
以下のスキーム４に示されるように、ＰＥＧアルキン１５と、アジド１８とを、制御して、注意をＣｕＡＡＣ反応を用いるそのカップリングに向くようにした。
【０２６４】
【化２９】
2017538715.tif 000036
【０２６５】
意外にも、１５と１８とを、ＣｕＳＯ４、アスコルビン酸ナトリウムおよびＣｕ（Ｉ）安定化リガンドトリス［（１−ベンジル−１Ｈ−１,２,３−トリアゾール−４−イル）メチル］アミン（ＴＢＴＡ）を用いて反応させ、実質的には定量的収率で１,４−二置換トリアゾール１９を得た。メチルエステル１９を加水分解に付して酸２０を得、その後で水素化分解によりＣｂｚ基を除去し、完全に脱保護されたＰＥＧ官能基を付与したインテグリンアンタゴニスト２１を良好な収率（２工程にわたって８７％）で得た。最後に、アミン２１を水性条件下でＮＨＳ−ロダミンと反応させ、蛍光標識されたインテグリンアンタゴニスト２２を、Ｃ１８逆相クロマトグラフィーにより精製した後、５−および６−カルボキシテトラメチルロダミンの位置異性体を５：１の混合物（収率３８％）として得た。
【０２６６】
例示を目的として、本発明者らは、Ｎ−フェニルスルホニル−トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンより出発して、蛍光標識されたＢＯＰ誘導体２２を形成するための実際の反応条件を提供する。
【０２６７】
工程１：（１Ｓ,４Ｓ）−５−（フェニルスルホニル）−２−オキサ−５−アザビシクロ［２.２.１］ヘプタン−３−オン（４）
ジイソプロピルアゾカルボキシラート（１.８７ｍＬ、９.４８ミリモル）を、Ｎ−フェニルスルホニル−トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン（２.４５ｇ、９.０３ミリモル）およびトリフェニルホスフィン（２.４９ｇ、９.４８ミリモル）のＣＨ２Ｃｌ２（１５０ｍＬ）中攪拌懸濁液に０℃のＮ２下にて２０分間にわたって滴下して加えた。反応物を室温にまで加温させ、一夜攪拌し、減圧下で濃縮し、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（５０：５０  ＥｔＯＡｃ／石油スピリット）に付して精製し、ラクトン４（１.７７ｇ、７８％）を無色の固体として得た。分光データは前に報告されている値と同じである。
【０２６８】
工程２：（Ｓ）−４−（２−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）−３−メトキシ−３−オキソプロピル）フェニルピロリジン−１−カルボキシラート（６）
１−ピロリジンカルボニルクロリド（３３６μＬ、３.０４ミリモル）をチロシン５（５００ｍｇ、１.５２ミリモル）およびＫ２ＣＯ３（４２０ｍｇ、３.０４ミリモル）のＣＨ３ＣＮ（９ｍＬ）中混合物を含有するバイオタージ（Biotage）（登録商標）マイクロ波バイアルに加えた。該混合物をマイクロ波反応器中にて１００℃で４５分間加熱し、Ｈ２Ｏで希釈し、ついで３０分間攪拌した。水層をＥｔＯＡｃ（２ｘ２０ｍＬ）で抽出し、有機相を合わせ、飽和水性ＮａＨＣＯ３で洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）させ、減圧下で濃縮した。残渣を再結晶（ＥｔＯＡｃ／石油スピリット）に供し、カルバマート６（４８４ｍｇ、７５％）を無色の結晶として得た。融点：１１６−１１７℃；［α］Ｄ  ＋４２.５（ｃ  ０.８１  ＣＨＣｌ３中）；δＨ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  １.９４（４Ｈ，ｍ，（ＣＨ２）２）、３.０９（２Ｈ，ｍ）、３.４７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６.５Ｈｚ）、３.５５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６.５Ｈｚ）、３.７１（３Ｈ，ｓ）、４.６４（１Ｈ，ｍ）、５.１０（２Ｈ，ｓ）、５.２２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８.０Ｈｚ）、７.０３−７.３８（９Ｈ，ｍ）；δＣ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  ２５.０、２５.８、３７.５、４６.３、４６.４、５２.３、５４.８、６７.００、１２１.９（２Ｃ）、１２８.１（２Ｃ）、１２８.１、１２８.５（２Ｃ）、１３０.０（２Ｃ）、１３２.４、１３６.２、１５０.６、１５３.０、１５５.６、１７１.９；ν／ｃｍ−１  ３３３１、２９５４、１７１９、１６９８、１５１１、１４０２、１３４５、１２１６、１０６１、１０２０、８６６、７５４、６９９；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）  ｍ／ｚ  ４４９.１６８６（Ｃ２３Ｈ２６Ｎ２ＮａＯ６として、［Ｍ＋Ｎａ］＋：計算値  ４４９.１６８９）
【０２６９】
工程３：（Ｓ）−４−（２−アミノ−３−メトキシ−３−オキソプロピル）フェニルピロリジン−１−カルボキシラート（７）
保護チロシン６（９５０ｍｇ、１.１３ミリモル）およびＰｄ／Ｃ（１０％、５０ｍｇ）のＭｅＯＨ（４０ｍＬ）中混合物をＨ２で３回パージした。その混合物をＨ２雰囲気下で２時間攪拌し、その時点でＴＬＣは出発材料が完全に消費されたことを示した。該混合物をセライト層を通して濾過し、濾液を減圧下で濃縮し、粗アミン７（６３７ｍｇ、９８％）を無色の油状物として得、放置して固体とした。少量部を特徴付けのためにフラッシュクロマトグラフィー（５：９５→１０：９０  ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）に付してさらに精製した。［α］Ｄ  −１１.６（ｃ  １.０９  ＭｅＯＨ中）；δＨ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  １.９７（４Ｈ，ｍ）、２.９１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７.１、１３.６Ｈｚ）、３.０２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６.１、１３.６Ｈｚ）、３.４２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６.５Ｈｚ）、３.４３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６.５Ｈｚ）、３.６８（３Ｈ，ｓ）、４.８４（２Ｈ，ｂｒｓ）、３.７０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６.２、７.１Ｈｚ）、７.０５（２Ｈ，ｍ）、７.２１（２Ｈ，ｍ）；δＣ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  ２５.９、２６.７、４１.１、４７.５、４７.５、５２.４、５６.７、１２３.０（２Ｃ）、１３１.２（２Ｃ）、１３５.６、１５１.６、１５５.１、１７６.１；ν／ｃｍ−１ ３３１１、２９５４、２８７８、１７１４、１５１０、１３９９、１３４４、１２１４、１１６８、１０８６、１０６２、１０２０、８６４、７５５；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）  ｍ／ｚ  ２９３.１４９７（Ｃ１５Ｈ２０Ｎ２Ｏ４ＳＨとして、［Ｍ＋Ｈ］＋：計算値  ２９３.１４９６）
【０２７０】
工程４：４−（（Ｓ）−２−（（２Ｓ,４Ｓ）−４−ヒドロキシ−１−（フェニルスルホニル）ピロリジン−２−カルボキシアミド）−３−メトキシ−３−オキソプロピル）フェニル ピロリジン−１−カルボキシラート（８）
ラクトン４（４６６ｍｇ、１.８４ミリモル）およびアミン７（５１０ｍｇ、１.７６ミリモル）のトルエン／Ｈ２Ｏ（５：１、６ｍＬ）中混合物を８０℃で２日間加熱し、次にＥｔＯＡｃで希釈し、１Ｍ  ＨＣｌ、飽和水性ＮａＨＣＯ３、ブラインで洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）させ、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（１００％ＥｔＯＡｃ→５％ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ）に付して精製し、アルコール８（８５１ｍｇ、８９％）を無色の泡沫体として得た。［α］Ｄ  −３１.４（ｃ  １.６６  ＭｅＯＨ中）；δＨ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  １.５７（１Ｈ，ｍ）、１.８９−２.００（５Ｈ，ｍ）、２.９４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９.５、１４.０Ｈｚ）、３.１３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４.０、１０.５Ｈｚ）、３.２３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０.５Ｈｚ）、３.３５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５.０、１４.０Ｈｚ）、３.４０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６.５Ｈｚ）、３.５１−３.５６（３Ｈ，ｍ）、３.７８（３Ｈ，ｓ）、４.０３（１Ｈ，ｍ）、４.１２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９.０Ｈｚ）、４.７５（１Ｈ，ｍ）、６.９９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８.３Ｈｚ）、７.０７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７.５Ｈｚ）、７.１９（２Ｈ，８.３Ｈｚ）、７.５１−７.６３（３Ｈ，ｍ）、７.８３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７.５Ｈｚ）；δＣ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  ２５.１、２５.９、３７.０、３７.６、４６.５、４６.６、５２.６、５３.３、５７.８、６１.７、６９.７、１２２.５（２Ｃ）、１２７.９（２Ｃ）、１２９.４（２Ｃ）、１３０.５（２Ｃ）、１３３.４、１３３.８、１３６.３、１５０.２、１５４.１、１７１.６、１７１.７；ν／ｃｍ−１  ３４０８、１７４３、１７１８、１７０１、１６６３；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）  ｍ／ｚ  ５６８.１７２３（Ｃ２６Ｈ３１ＮａＮ３Ｏ８Ｓとして、［Ｍ＋Ｎａ］＋：計算値  ５６８.１７３０）
【０２７１】
工程５：４−（（Ｒ）−３−メトキシ−３−オキソ−２−（（２Ｓ,４Ｒ）−４−（（３−オキソ−１−フェニル−２,８,１１,１４−テトラオキサ−４−アザヘプタデカン−１７−イル）アミノ）−１−（フェニルスルホニル）ピロリジン−２−カルボキシアミド）プロピル）フェニルピロリジン−１−カルボキシラート（１１）
アルコール８（１０５ｍｇ、０.１９ミリモル）をＮ２下の−２０℃で乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（２ｍＬ）に溶かした。ＤＩＰＥＡ（９９μＬ、０.５７ミリモル）を加え、つづいてＴｆ２Ｏ（５０μＬ、０.５７ミリモル）を３０分間にわたって滴下して加えた。反応物を−２０℃で２時間攪拌し、次に飽和水性ＮａＨＣＯ３でクエンチさせ、ＥｔＯＡｃで希釈し、有機相を分離した。その有機相をＨ２Ｏ、２％クエン酸、飽和水性ＮａＨＣＯ３、ブラインで洗浄した。水相をＥｔＯＡｃ（２回）で抽出し、有機相を合わせ、乾燥（ＭｇＳＯ４）させ、残渣を減圧下で濃縮し、粗トリフラート９を得た。この残渣にＰＥＧアミン１０（１４１ｍｇ、０.３９ミリモル）／乾燥ＴＨＦ（２００μＬ）を加え、反応物を室温で一夜攪拌した。その混合物を１０％ブタン−２−オール／ＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）で希釈し、有機相を飽和水性ＮａＨＣＯ３、ブラインで洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）させ、減圧下で濃縮した。粗残渣をフラッシュクロマトグラフィー（２％→３％  ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）に付して精製し、１１（４６ｍｇ、２工程にわたって２７％）を無色の油状物として得た。少量部を特徴付けのためにＣ１８−シリカゲルクロマトグラフィー（４０％Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ）に付してさらに精製した。δＨ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  １.４０（１Ｈ，ｍ）、１.５５（２Ｈ，ｍ）、１.７７（２Ｈ，ｍ）、１.９３（４Ｈ，ｍ）、２.１２（１Ｈ，ｍ）、２.４３（２Ｈ，ｍ）、２.８２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７.８、９.２Ｈｚ）、２.９４（１Ｈ，ｍ）、３.０２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７.８、１４.０Ｈｚ）、３.２３−３.３２（４Ｈ，ｍ）、３.３８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６.１Ｈｚ）、３.４４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６.６Ｈｚ）、３.４６−３.６０（１４Ｈ，ｍ）、３.７６（３Ｈ，ｓ）、４.０９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３.０、８.９Ｈｚ）、４.８５（１Ｈ，ｔｄ，Ｊ＝５.７、７.８Ｈｚ）、５.０７（２Ｈ，ｓ）、５.４２（１Ｈ，ｂｒｓ）、７.０５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８.６Ｈｚ）、７.１４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８.６Ｈｚ）、７.２１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７.８Ｈｚ）、７.２８−７.３５（５Ｈ，ｂｒｍ）、７.５３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７.５Ｈｚ）、７.６０（１Ｈ，ｂｒｔ，Ｊ＝７.０４）、７.８１（１Ｈ，ｂｒｄ，Ｊ＝７.０５Ｈｚ）；δＣ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  ２５.１、２５.９、２９.６、３０.１、３６.５、３７.５、３９.４、４５.９、４６.５、４６.６、５２.６、５３.３、５４.７、５６.５、６１.６、６６.６、６９.８、６９.７、７０.３、７０.３、７０.６７、７０.７２、１２２.０（２Ｃ）、１２８.１（２Ｃ）、１２８.２（２Ｃ）、１２８.６（３ Ｃ）、１２９.４（２Ｃ）、１３０.２（２Ｃ）、１３３.０、１３３.５、１３６.０、１３７.０、１５０.７、１５３.２、１５６.６、１７０.９、１７１.６；ν／ｃｍ−１  ３３３４、２８７７、２３４１、１７０６、１５２１；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）  ｍ／ｚ  ９０４.３７７０（Ｃ４４Ｈ５９ＮａＮ５Ｏ１２Ｓとして、［Ｍ＋Ｎａ］＋：計算値  ９０４.３７７９）
【０２７２】
工程６：メチル  （２Ｓ,４Ｓ）−４−ヒドロキシ−１−（フェニルスルホニル）ピロリジン−２−カルボキシラート（１２）
ラクトン４（１.７４ｇ、６.８８ミリモル）およびＮａ２ＣＯ３（３.６５ｇ、３４.４ミリモル）のＭｅＯＨ（５０ｍＬ）中混合物を室温で一夜攪拌した。残渣を濃縮し、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）に溶かし、Ｈ２Ｏおよび有機相を分離した。水相をＥｔＯＡｃ（２ｘ３０ｍＬ）で抽出し、有機相を合わせ、ブラインで洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）させて減圧下で濃縮し、メチルエステル１２（１.５７ｇ、８０％）を無色の固体として得た。分光データは報告されている値と一致し、その材料をさらに精製することなく用いた。
【０２７３】
工程７：メチル  （２Ｓ,４Ｒ）−４−アジド−１−（フェニルスルホニル）ピロリジン−２−カルボキシラート（１６）
ＭｓＣｌ（３０４μＬ、３.９３ミリモル）を、アルコール１２（９３４ｍｇ、３.２７ミリモル）およびトリエチルアミン（６２０μＬ、４.４８ミリモル）の乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）中混合物にＮ２下の０℃で添加した。その混合物を２時間攪拌し、ＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、５％ＨＣｌ、飽和水性ＮａＨＣＯ３、ブラインで連続して洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）させ、減圧下で濃縮し、粗メシラートを淡黄色の油状物として得た。この残渣をＤＭＳＯ（１３ｍｌ）に溶かし、ＮａＮ３（６３８ｍｇ、９.８１ミリモル）で処理し、該混合物８０℃で一夜攪拌した。反応物をＥｔＯＡｃで希釈し、Ｈ２Ｏ、ブラインで洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）させて濃縮した。その残渣を再結晶（ＭｅＯＨ）により精製して、１６（８７４ｍｇ、２工程にわたって８６％）を無色の針状晶として得た。融点：９８−１００℃、［α］Ｄ  −３３.４（ｃ  １.０２  ＣＨＣｌ３中）；δＨ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  ２.１７−２.２１（２Ｈ，ｍ）、３.４３（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝０.７、３.０、１１.０Ｈｚ）、３.７１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５.０、１１.０Ｈｚ）、３.７６（３Ｈ，ｓ）、４.１８−４.２２（１Ｈ，ｍ）、４.３０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７.５Ｈｚ）、７.５３−７.５８（２Ｈ，ｍ）、７.６１−７.６５（１Ｈ，ｍ）、７.８７−７.８９（２Ｈ，ｍ）；δＣ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  ３６.５、５２.９、５３.２、５９.４５、５９.５１、１２７.６（２Ｃ）、１２９.３（２Ｃ）、１３３.３、１３７.６、１７１.９；ν／ｃｍ−１  ２１０１、１７４７、１４４５、１３４５、１２０７、１１５８、１０９５、１０１７、７５８、７２２、６９６；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）  ｍ／ｚ  ３１１.０８０８（Ｃ１２Ｈ１４Ｎ４Ｏ４ＳＨとして、［Ｍ＋Ｈ］＋：計算値  ３１１.０８０９）；ｍ／ｚ  ３２８.１０７３（Ｃ１２Ｈ１４Ｎ４Ｏ４Ｓ・ＮＨ４として、［Ｍ＋ＮＨ４］＋：計算値  ３２８.１０７４
【０２７４】
工程８：（２Ｓ,４Ｒ）−４−アジド−１−（フェニルスルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸（１７）
３：１  ＥｔＯＨ／ＴＨＦ（４０ｍＬ）中のメチルエステル１６（５８６ｍｇ、１.８９ミリモル）を０.２Ｍ  ＮａＯＨ（１２.３ｍＬ、２.４５ミリモル）で処理した。混合物を室温で３時間攪拌し、次に減圧下で濃縮した。その粗材料をジエチルエーテルで希釈し、水相を分離した。有機層を０.２Ｍ  ＮａＯＨ（２ｘ１０ｍＬ）で抽出し、水性抽出液を合わせ、１０％ＨＣｌで酸性にした。水層をＣＨＣｌ３（４ｘ３０ｍＬ）で抽出し、有機相を合わせ、ブラインで洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）させ、減圧下で濃縮した。その粗材料をフラッシュクロマトグラフィー（５％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２＋０.５％ＡｃＯＨ）に付して精製し、酸１７（４９２ｍｇ、８８％）を無色の油状物として得た。［α］Ｄ  −３４.４（ｃ  ０.８２  ＭｅＯＨ中）；δＨ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  ２.１８−２.３２（２Ｈ，ｍ）、３.４０（１Ｈ，ｍ）、３.７３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４.８、１１.５Ｈｚ、Ｈ５’）、４.２２（１Ｈ，ｍ，Ｈ４）、４.２９（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７.７Ｈｚ）、７.５６（２Ｈ，ｍ）、７.６４（１Ｈ，ｍ）、７.８８（２Ｈ，ｍ）、１０.７２（１Ｈ，ｂｒｓ）；δＣ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  ３６.１、５３.４、５９.５、１２７.６（２Ｃ）、１２９.４（２Ｃ）、１３３.６、１３６.９、１７６.６；ν／ｃｍ−１  ３５００−２５００、２１０７、１７３１；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）  ｍ／ｚ  ３１９.０４７２（Ｃ１１Ｈ１２Ｎ４ＮａＯ４Ｓとして、［Ｍ＋Ｎａ］＋：計算値  ３１９.０４７２）
【０２７５】
工程９：４−（（Ｓ）−２−（（２Ｓ,４Ｒ）−４−アジド−１−（フェニルスルホニル）ピロリジン−２−カルボキシアミド）−３−メトキシ−３−オキソプロピル）フェニル  ピロリジン−１−カルボキシラート（１８）
Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’−テトラメチルウロニウム・ヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）（６９３ｍｇ、１.８３ミリモル）を酸１７（４９１ｍｇ、１.６６ミリモル）およびＮ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（５７８μＬ、３.３２ミリモル）のＤＭＦ（６ｍＬ）中攪拌混合物に０℃で添加し、Ｎ２下で１０分間攪拌した。次に、アミン７（４８４ｍｇ、１.６６ミリモル）／ＤＭＦ（６ｍＬ）を滴下して加え、混合物を合わせ、室温に加温して一夜攪拌した。該混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、５％ＨＣｌ、飽和水性ＮａＨＣＯ３、ブラインで連続して洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）させ、減圧下で濃縮した。その残渣をフラッシュクロマトグラフィー（３％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）に付して精製し、ジペプチド７（９２８ｍｇ、９８％）を淡黄色の泡沫体として得た。［α］Ｄ  −４.６（ｃ  ０.８５  ＣＨＣｌ３中）；δＨ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  １.６７（１Ｈ，ｍ）、１.８６−１.９８（４Ｈ，ｍ）、２.０４（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝５.５、１３.２Ｈｚ）、２.９９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８.５、１４.０Ｈｚ）、３.１９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４.５、１０.９Ｈｚ）、３.３０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５.５、１４.０Ｈｚ）、３.４４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６.５Ｈｚ）、３.４８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５.５、１１.５Ｈｚ）、３.５３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６.５Ｈｚ）、３.７８（３Ｈ，ｓ）、３.８２（１Ｈ，ｍ）、４.０９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５.５、８.４Ｈｚ）、４.８７（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝８.３、８.３、５.５Ｈｚ）、７.０５、７.１５（４Ｈ，２ｘｄ，Ｊ＝８.５Ｈｚ）、７.１９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８.２Ｈｚ）、７.５３−７.５７（２Ｈ，ｍ）、７.６２−７.６６（１Ｈ，ｍ）、７.８３−７.８６（２Ｈ，ｍ）；δＣ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  ２５.１、２５.９、３５.６、３７.５、４６.４、４６.６、５２.７、５３.１、５３.８、５８.９、６１.１、１２２.１（２Ｃ）、１２８.０（２Ｃ）、１２９.５（２Ｃ）、１３０.２（２Ｃ）、１３２.９、１３３.７、１３６.０、１５０.７、１５３.１、１６９.９、１７１.５；ν／ｃｍ−１  ３３１６、２９７５、２８８０、２１０５、１７１６、１６８２；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）  ｍ／ｚ  ５９３.１７８９（Ｃ２６Ｈ３０Ｎ６ＮａＯ７Ｓとして、［Ｍ＋Ｎａ］＋：計算値  ５９３.１７８９）
【０２７６】
１８のアルコール８を介しての合成
メタンスルホニルクロリド（９２μＬ、１.１８ミリモル）をアルコール８（２５１ｍｇ、０.３９４ミリモル）およびトリエチルアミン（１７０μＬ、１.２２ミリモル）の乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中攪拌混合物にＮ２下の０℃で添加した。該反応物を０℃で１時間攪拌し、次に室温に加温し、さらに１時間攪拌した。その反応物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、５％ＨＣｌ、飽和水性ＮａＨＣＯ３およびブラインで続けて洗浄した。有機相を乾燥（ＭｇＳＯ４）させ、減圧下で濃縮し、中間体のメシラート、（４−（（Ｓ）−３−メトキシ−２−（（２Ｓ,４Ｓ）−４−（（メチルスルホニル）オキシ）−１−（フェニルスルホニル）ピロリジン−２−カルボキシアミド）−３−オキソプロピル）フェニル  ピロリジン−１−カルボキシラート）（２７０ｍｇ、定量的収量）を無色の泡沫体として得、それをさらに精製することなく用いた。［α］Ｄ  −１３.５（ｃ  １.０  ＣＨＣｌ３中）；δＨ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  １.８１（１Ｈ，ｍ）、１.８９−１.９６（４Ｈ，ｍ）、２.６３（１Ｈ，ｂｒｄ）、２.８２（３Ｈ，ｓ）、３.０６−３.１８（２Ｈ，ｍ）、３.４４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６.４Ｈｚ）、３.５０−３.５５（３Ｈ，ｍ）、３.６８（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝１.３、１２.５Ｈｚ）、３.７１（３Ｈ，ｓ）、４.６３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２.０、１０.１Ｈｚ）、４.７３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６.７、１３.４Ｈｚ）、５.０２（１Ｈ，ｔｔ，Ｊ＝１.４、４.７Ｈｚ）、７.０７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８.６）、７.１６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８.６Ｈｚ）、７.３９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７.５Ｈｚ）、７.５６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７.６Ｈｚ）、７.６４−７.６８（１Ｈ，ｍ）、７.８１−７.８４（２Ｈ，ｍ）；δＣ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  ２５.１、２５.９、３５.５、３７.４、３８.９、４６.５、４６.５、５２.５、５４.０、５５.４、６１.０、７８.０、１２２.１（２Ｃ）、１２８.０（２Ｃ）、１２９.８（２Ｃ）、１３０.１（２Ｃ）、１３２.８、１３４.１、１３５.４、１５０.７、１５３.１、１６９.８、１７１.３；ν／ｃｍ−１  ３４０９、２９５４、２８８０、１７１５、１６７８、１５１１；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）  ｍ／ｚ  ６４６.１４９７（Ｃ２７Ｈ３３ＮａＮ３Ｏ１０Ｓ２として、［Ｍ＋Ｎａ］＋：計算値  ６４６.１５０５）
【０２７７】
上記のメシラート（９７ｍｇ、０.１６ミリモル）をＤＭＳＯ（１.５ｍＬ）に溶かし、ＮａＮ３（３０.４ｍｇ、０.４７ミリモル）で処理し、その混合物を８０℃で一夜攪拌した。反応物をＥｔＯＡｃで希釈し、Ｈ２Ｏ、ブラインで洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）させ、濃縮してアジド１８（８２ｍｇ、９２％）を得た。分光スペクトルデータは化合物１８について上記に報告されるデータと一致した。
【０２７８】
工程１０：４−（（Ｒ）−３−メトキシ−３−オキソ−２−（（２Ｓ,４Ｒ）−４−（４−（（３−オキソ−１−フェニル−２,８,１１,１４−テトラオキサ−４−アザヘプタデカン−１７−イル）カルバモイル）−１Ｈ−１,２,３−トリアゾール−１−イル）−１−（フェニルスルホニル）ピロリジン−２−カルボキシアミド）プロピル）フェニル  ピロリジン−１−カルボキシラート（１９）
アスコルビン酸ナトリウム（４.４ｍｇ、２２.２マイクロモル）、ＣｕＳＯ４（２２４μＬ、２.２４マイクロモル、Ｈ２Ｏ中０.０１Ｍ）およびＴＢＴＡ（２８１μＬ、２.８１マイクロモル、ＴＨＦ中０.０１Ｍ）を、アジド１８（３２ｍｇ、５６.１マイクロモル）およびアルキン１５（２５ｍｇ、６１.８マイクロモル）のＤＭＦ（１ｍＬ）中混合物に続けて添加した。反応物を６０℃で２時間攪拌し、次にＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）で希釈した。有機相を飽和水性ＮａＨＣＯ３、ブラインで洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）させ、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（２１：２：１：１  ＥｔＯＡｃ／アセトン／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ）に付して精製し、トリアゾール生成物１９（５４ｍｇ、９９％）を無色の油状物として得た。［α］Ｄ  ＋１０.７（ｃ  １.０  ＣＨＣｌ３中）；δＨ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  １.７２−１.９４（８Ｈ，ｍ）、２.１４（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝１２.８、１３.９Ｈｚ）、２.５４（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝２.３、６.５、１２.９Ｈｚ）、２.９２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０.０、１３.９Ｈｚ）、３.２９（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６.０、１２.３Ｈｚ）、３.３８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４.８Ｈｚ、１３.９Ｈｚ）、３.４１−３.６３（１９Ｈ，ｍ）、３.８０（３Ｈ，ｓ）、３.８３（１Ｈ，ｍ）、４.２９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２.０、８.７Ｈｚ）、４.６５（１Ｈ，ｍ）、４.９４（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝４.９、９.８Ｈｚ）、５.０６（２Ｈ，ｂｒｓ）、５.４４（１Ｈ、ｂｒｔ、Ｊ＝５.７Ｈｚ）、７.０４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８.５Ｈｚ）、７.２３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８.５Ｈｚ）、７.２８−７.３３（５Ｈ，ｍ）、７.３８−７.４３（２Ｈ，ｍ）、７.５２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７.７Ｈｚ）、７.６２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７.５Ｈｚ）、７.７９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７.３Ｈｚ）、８.１８（１Ｈ，ｓ）；δＣ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  ２５.１、２５.９、２９.４、２９.５、３３.７、３７.２、３７.９、３９.４、４６.４、４６.６、５２.７、５３.２、５３.６、５７.９、６０.７、６６.５、６９.７、６９.７、７０.３、７０.５、７０.６、７０.７、１２２.２（２Ｃ）、１２６.１、１２７.７（２Ｃ）、１２８.１、１２８.２、１２８.５（３ Ｃ）、１２９.７（２Ｃ）、１３０.３（２Ｃ）、１３３.１、１３３.９、１３５.５、１３６.９、１４３.２、１５０.６、１５３.３、１５６.６、１５９.８、１６９.０、１７１.５；ν／ｃｍ−１  ３３３１、２９５１、２８７５、１７１４、１６６７、１５７５、１５１２；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）  ｍ／ｚ  ９９９.３８９１（Ｃ４７Ｈ６０ＮａＮ８Ｏ１３Ｓとして、［Ｍ＋Ｎａ］＋：計算値  ９９９.３８９３）
【０２７９】
工程１１：（Ｒ）−２−（（２Ｓ,４Ｒ）−４−（４−（（３−（２−（２−（３−アミノプロポキシ）エトキシ）エトキシ）プロピル）カルバモイル）−１Ｈ−１,２,３−トリアゾール−１−イル）−１−（フェニルスルホニル）ピロリジン−２−カルボキシアミド）−３−（４−（（ピロリジン−１−カルボニル）オキシ）フェニル）プロパン酸（２１）
水性ＮａＯＨ（１.１３ｍＬ、０.２２５ミリモル、０.２Ｍ）をメチルエステル１９（１１０ｍｇ、０.１１３ミリモル）のＥｔＯＨ／ＴＨＦ（２：１、３ｍＬ）中攪拌混合物に添加し、室温で一夜攪拌した。反応物を１Ｍ  ＨＣｌでクエンチし、ＥｔＯＡｃで希釈し、有機相を分離した。水相をＣＨＣｌ３で２回抽出し、有機相を合わせ、乾燥（ＭｇＳＯ４）させ、減圧下で濃縮し、粗酸２０（１００ｍｇ）を得た。その粗酸および１０％Ｐｄ／Ｃ（５０ｍｇ、５０％Ｈ２Ｏ）のＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（５：１、１２ｍＬ）中混合物をＨ２雰囲気下にて室温で２時間攪拌した。該混合物をセライト層を通して濾過し、減圧下で濃縮し、残渣をＣ１８逆相カートリッジ（１００％Ｈ２Ｏ→５０％ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ）を用いて精製した。その精製した材料を凍結乾燥させ、アミン２１（８１.３ｍｇ、２工程にわたって８７％）を綿毛のようにフワッとした無色の粉末として得た。［α］Ｄ  −１６.０（ｃ  ０.４９  ＭｅＯＨ中）；δＨ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）  １.８１（４Ｈ，ｍ）、１.９１（４Ｈ，ｍ）、２.３８（１Ｈ，ｍ）、２.９８−３.０９（４Ｈ，ｍ）、３.２１−３.３０（３Ｈ，ｍ）、３.３０（２Ｈ，ｍ）、３.４５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６.８Ｈｚ）、３.５９−３.６６（１２Ｈ，ｍ）、３.８９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２.９Ｈｚ）、４.０４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４.８、１２.９Ｈｚ）、４.４１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝８.２Ｈｚ）、４.５３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５.３、７.４Ｈｚ）、５.００（１Ｈ，ｂｒｓ）、６.９９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８.５Ｈｚ）、７.３０６−７.３５６（４Ｈ，ｍ）、７.４３−７.５０（３Ｈ，ｍ）、７.９９（１Ｈ，ｓ）；δＣ（１００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ＋アセトン）  ２５.２、２５.８、２７.２、２９.１、３５.５、３６.９、３７.２、３８.３、４７.１、４７.１、４９.５、５５.１、５６.７、６０.４、６１.７、６８.９、６９.３、７０.１、７０.２、７０.３、１２２.６（２Ｃ）、１２５.８、１２７.５（２Ｃ）、１３０.２（２Ｃ）、１３１.２（２Ｃ）、１３４.５、１３５.１、１３５.６、１４２.９、１５０.４、１５５.６、１６１.９、１７３.２、１７５.８；ν／ｃｍ−１  ３３８２、３０６４、２９５０、２８７８、１７０６、１６５８、１５１１；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）  ｍ／ｚ  ８２９.３５５０（Ｃ３８Ｈ５２Ｎ８Ｏ１１Ｓとして、［Ｍ＋Ｈ］＋：計算値  ８２９.３５４９）
【０２８０】
工程１２：５（６）−カルボキシテトラメチルロダミン標識の化合物（２２）
アミン２１（９.５ｍｇ、１１.３マイクロモル）の０.２Ｍ  ＮａＨＣＯ３（１ｍＬ）中混合物を５（６）−カルボキシテトラメチルロダミン  Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＮＨＳ−ロダミン、Thermo Scientific）（８.９ｍｇ、１６.９マイクロモル）で処理し、その混合物を室温で一夜攪拌させた。該反応物を酢酸でクエンチさせ、濃縮し、残渣を逆相クロマトグラフィー（５０％ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ→１００％ＭｅＯＨ）に付して精製し、ロダミン標識の化合物２２（５.３ｍｇ、３８％）を凍結乾燥後に紫色粉末として得た。化合物２２を位置異性体の混合物（５：１）として得た。δＨ（４００ＭＨｚ、ｄ４−メタノール）  主たる異性体：１.８０−１.９９（９Ｈ，ｍ）、２.３７（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝６.６、１３.５Ｈｚ）、２.７０（１Ｈ，ｍ）、３.０８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７.５、１３.９Ｈｚ）、３.２２−３.２６（１Ｈ，ｍ）、３.２６（６Ｈ，ｓ）、３.２７（６Ｈ，ｓ）、３.３５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６.３Ｈｚ）、３.４３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６.３Ｈｚ）、３.４８−３.６６（１７Ｈ，ｍ）、３.７４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３.７、１２.０Ｈｚ）、３.９１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６.０、１２.０Ｈｚ）、４.４５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７.１Ｈｚ）、４.６１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５.６Ｈｚ）、４.９４（１Ｈ，ｍ）、６.８６（２Ｈ，ｂｒｓ）、６.９５−６.９９（４Ｈ，ｍ）、７.１６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９.５Ｈｚ）、７.２８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８.１Ｈｚ）、７.３５−７.４２（３Ｈ，ｍ）、７.５１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７.３Ｈｚ）、７.６０−７.６３（２Ｈ，ｍ）、８.０６−８.０８（２Ｈ，ｍ）、８.５６（１Ｈ，ｓ）；δＣ（１００ＭＨｚ、ｄ４−メタノール）  従たる異性体：２５.９、２６.７、３０.４、３６.６、３８.０、３８.１、３８.９、４０.９（４Ｃ）、４７.４７、４７.５３、５５.９、６０.３、６２.３、７０.３、７０.５、７１.３５、７１.４、７１.６（２Ｃ）、９７.３（２Ｃ）、１１４.８（２Ｃ）、１１５.２（２Ｃ）、１２２.７（４Ｃ）、１２６.３、１２８.６（２Ｃ）、１３０.０、１３０.１、１３０.５（２Ｃ）、１３１.１、１３１.７（４Ｃ）、１３２.５（２Ｃ）、１３４.４（２Ｃ）、１３６.０、１３７.２、１３７.３、１３８.１、１４４.０、１５１.６、１５５.１、１５８.７（２Ｃ）、１５９.０（２Ｃ）、１６１.６、１６２.０、１６８.７、１７２.６；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）  ｍ／ｚ  １２４１.４９７０（Ｃ６３Ｈ７２Ｎ１０Ｏ１５ＳＨとして、［Ｍ＋Ｈ］＋：計算値  １２４１.４９７２）
【０２８１】
実施例１Ｃ：Ｒ−ＢＣ１５４（化合物２５）の調製
ＰＥＧ−スペーサーを欠く、化合物２５（Ｒ−ＢＣ１５４）はまた、以下のスキーム５に示されるように合成された：
【０２８２】
【化３０】
2017538715.tif 000037
【０２８３】
このように、メチルエステル１８をＮａＯＨで加水分解に供し、脱保護されたアジド阻害剤２３を得、その後でそれをＣｕＳＯ４、アスコルビン酸ナトリウムおよびＴＢＴＡの存在下でＮ−プロピニルスルホロダミンＢ２４と反応させ、蛍光標識された２５（Ｒ−ＢＣ１５４）をＨＰＬＣにより精製した後に収率４３％で得た（スキーム４）。
【０２８４】
例示を目的として、本発明者らは、メチルエステル１８より出発して、蛍光標識されたＢＯＰ誘導体２５を形成するための実際の反応条件を提供する。
【０２８５】
工程１：（Ｓ）−２−（（２Ｓ,４Ｒ）−４−アジド−１−（フェニルスルホニル）ピロリジン−２−カルボキシアミド）−３−（４−（（ピロリジン−１−カルボニル）オキシ）フェニル）プロパン酸（２３）
メチルエステル１８（４２０ｍｇ、０.７３７ミリモル）／ＥｔＯＨ（１０ｍＬ）を０.２Ｍ  ＮａＯＨ（４.０５ｍＬ、０.８１１ミリモル）で処理し、室温で１時間攪拌した。その混合物を減圧下で濃縮し、ＥｔＯＨを除去し、水相を１０％ＨＣｌで酸性にした。水相をＣＨＣｌ３（４ｘ１０ｍＬ）で抽出し、有機相を合わせ、ブラインで洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）させ、減圧下で濃縮した。その粗材料をフラッシュクロマトグラフィー（１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２＋０.５％ＡｃＯＨ）に付して精製し、酸２３（３８４ｍｇ、９４％）を淡黄色の泡沫体として得た。［α］Ｄ  −０.７（ｃ  １.００  ＣＨＣｌ３中）；δＨ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  １.６７−１.７３（１Ｈ，ｍ）、１.８９−１.９６（５Ｈ，ｍ）、３.１０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８.０、１３.８Ｈｚ）、３.２１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４.０、１１.５Ｈｚ）、３.３８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５.３、１４.０Ｈｚ）、３.４４−３.５５（５Ｈ，ｍ）、３.８１（１Ｈ，ｍ）、４.１１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６.５Ｈｚ）、４.８９（１Ｈ，ｍ）、７.０５、７.２２（４Ｈ、２ｘｄ，Ｊ＝８.０Ｈｚ）、７.４１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６.８Ｈｚ）、７.５３−７.６４（３Ｈ，ｍ）、７.８５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７.５Ｈｚ）；δＣ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  ２５.０、２５.８、３６.１、３６.８、４６.５、４６.６、５３.２、５３.９、５８.９、６１.２、１２２.０（２Ｃ）、１２８.０（２Ｃ）、１２９.４（２Ｃ）、１３０.５（２Ｃ）、１３３.６、１３３.７、１３６.０、１５０.５、１５３.６、１７０.９、１７３.７；ν／ｃｍ−１  ３３２９、２９７７、２８８１、２１０５、１７０６、１６７２；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）  ｍ／ｚ  ５５７.１８１７（Ｃ２５Ｈ２９Ｎ７Ｏ６Ｓとして、［Ｍ＋Ｈ］＋：計算値  ５５７.１８１３）
【０２８６】
工程２：Ｒ−ＢＣ１５４（２５）
アジド２３（１２ｍｇ、２２マイクロモル）およびＮ−プロピニルスルホロダミンＢ２４（１４ｍｇ、２４マイクロモル）／ＤＭＦ（２ｍＬ）をＣｕＳＯ４（８６μＬ、０.８６マイクロモル、Ｈ２Ｏ中０.０１Ｍ）、アスコルビン酸ナトリウム（４３０μＬ、４.３マイクロモル、Ｈ２Ｏ中０.０１Ｍ）およびトリス［（１−ベンジル−１Ｈ−１,２,３−トリアゾール−４−イル）メチル］アミン（ＴＢＴＡ）（１０８μＬ、１.０８マイクロモル、ＤＭＦ中０.０１Ｍ）で処理した。その混合物を６０℃で２時間攪拌し、その時点でＴＬＣは新たな蛍光性生成物の形成を示した。該混合物を減圧下で濃縮し、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（４０：１０：１  ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ＋０.５％ＡｃＯＨ）に付して一部精製した。この材料をＨＰＬＣ（１５分間にわたって５０％−９８％勾配のＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ（ＴＦＡ中０.１％）；Ｒｔ＝１４.９分間）に付してさらに精製し、純生成物２５（１０.６ｍｇ、４３％）を紫色のガラス状物として得た。δＨ（４００ＭＨｚ、ｄ４−メタノール）  １.２７−１.３１（１２Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝７.０、３.５Ｈｚ）、１.９１−１.９８（４Ｈ，ｍ）、２.２９−２.３５（１Ｈ，ｍ）、２.７１−２.７８（１Ｈ，ｍ）、３.０８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７.５、１３.８Ｈｚ）、３.２２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５.３、１３.８Ｈｚ）、３.４１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６.５Ｈｚ）、３.５４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６.５Ｈｚ）、３.６３−３.７０（８Ｈ，ｍ）、３.８５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３.５、１２.０Ｈｚ）、３.９７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５.６、１１.６Ｈｚ）、４.２１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝１.４Ｈｚ）、４.４１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７.３Ｈｚ）、４.７２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５.４、７.５Ｈｚ）、５.０８（１Ｈ，ｍ）、６.９１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝２.２Ｈｚ）、６.９８−７.０４（４Ｈ，ｍ）、７.１１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝９.０Ｈｚ）、７.３０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８.６Ｈｚ）、７.４０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８.０Ｈｚ）、７.４４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７.５Ｈｚ）、７.５８−７.６８（４Ｈ，ｍ）、８.００（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１.９、８.０Ｈｚ）、８.３７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１.８Ｈｚ）；δＣ（１００ＭＨｚ、ｄ４−メタノール）  １２.９（４Ｃ）、２５.９、２６.７、３７.１、３７.６、３９.０、４６.８（４Ｃ）、４７.５、４７.６、５４.８、５５.７、６０.３、６２.１、９７.０（２Ｃ）、１１５.０（２Ｃ）、１１５.２６、１１５.２９、１２２.９（２Ｃ）、１２３.９、１２７.５、１２８.６（２Ｃ）、１２９.３、１３０.５（２Ｃ）、１３１.６（２Ｃ）、１３２.３、１３３.８、１３３.９、１３４.４、１３５.２６、１３５.３４、１３８.３、１４４.１、１４４.８、１４６.９、１５１.７、１５５.２、１５７.１６、１５７.１７、１５７.２、１５７.８、１５９.４、１７３.１、１７３.８；ν／ｃｍ−１  ３０８８−３４１８、２９７７、２８７６、１７１１、１６４９、１５８８；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）  ｍ／ｚ  １１７４.３４４７（Ｃ５５Ｈ６１Ｎ９ＮａＯ１３Ｓ３として、［Ｍ＋Ｎａ］＋；計算値  １１７４.３４４３）。インビトロおよびインビボ試験のために、２５の遊離酸（１１.７ｍｇ、９.９７マイクロモル）を０.０１Ｍ  ＮａＯＨ（９９７μＬ、９.９７マイクロモル）に溶かし、その暗紫色溶液０.４５μｍのシリンジフィルターユニ���トを通して濾過した。生成物を凍結乾燥に供し、２５のナトリウム塩（１１.６ｍｇ、９９％）を綿毛のようにフワッとした紫色の粉末として得た。
【０２８７】
実施例２：化合物２２および２５（Ｒ−ＢＣ１５４）とα４β１およびα９β１とのインビトロでの結合特性
Ｒ−ＢＣ１５４の祖先細胞（ＬＳＫ細胞）の選別集団との結合を評価するために、全骨髄を未処理および処理（Ｒ−ＢＣ１５４；１０ｍｇ／ｋｇ）マウス（一群に付き３匹のマウス）より採取した。リニージ陽性細胞をリニージカクテル（Ｂ２２０、Ｇｒ−１、Ｍａｃ−１およびＴｅｒ−１１９）を用いて免疫標識に付し、次に製造業者の指示に従って、ヒツジ抗ラットのコンジュゲートしたダイナビーズ（Dynabead）（Invitrogen）との免疫磁気選択法により取り出した。得られたリニージ枯渇細胞を抗−Ｓｃａ−１−ＰＢおよび抗−ｃ−ｋｉｔ−ＦＩＴＣを用いて染色した。免疫標識した細胞をCytopeiaインフラックス（BD Biosciences）細胞分別装置を用いてＳｃａ−１−ｃ−ｋｉｔ＋について選別し，オリンパス（Olympus）ＢＸ５１顕微鏡を用いて画像処理に付した。
【０２８８】
手元にある化合物２２および２５（Ｒ−ＢＣ１５４）の蛍光プローブで、α４β１およびα９β１を過剰発現する、生成されたヒトグリア芽腫ＬＮ１８細胞系を用いてインテグリン依存性細胞結合特性を評価した。簡単に言えば、インテグリンのα４β１およびα９β１を過剰発現する安定したＬＮ１８細胞をヒトグリア芽腫のＬＮ１８細胞系のレトロウイルス形質導入を介して生成した。親細胞およびα９β１形質導入ＬＮ１８細胞におけるバックグラウンドとなるα４発現のサイレンシングは、α４ｓｈＲＮＡのレトロウイルスベクター送達により達成された（J Grassingerら、Blood, 2009, 114, 49-59）。（図１および２を参照のこと）
【０２８９】
各ＬＮ１８細胞系を、生理学的模倣条件（１ｍＭ  Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋）下で化合物２２およびＲ−ＢＣ１５４（２５）を用いて処理する場合、両方の化合物がα４β１およびα９β１のＬＮ１８細胞に用量に依存する様式にて結合することが判明した（図３ａおよびｂ）。実質的には、インテグリン発現を欠く対照となる細胞系にて結合は観察されず、結合がインテグリン特異的であることを示した（図３ａおよびｂ）。ＰＥＧ連結の化合物２２およびＲ−ＢＣ１５４（２５）は共に、その解離定数（Ｋｄ）を計算することにより測定されるように、α４β１インテグリンよりも大きな選択性でα９β１インテグリンと結合した。具体的には、化合物２２はα９β１（Ｋｄ＝８.４ｎＭ）とα４β１（Ｋｄ＝２０.１ｎＭ）よりも２.４倍以上大きなアフィニティで結合し、Ｒ−ＢＣ１５４は、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋条件下で、α４β１（Ｋｄ＝３８.０ｎＭ）と比べα９β１（Ｋｄ＝１２.７ｎＭ）について３倍以上大きなアフィニティを有する（図３ａおよびｂ）。
【０２９０】
興味深いことに、化合物２２と比べて、Ｒ−ＢＣ１５４は、α４β１およびα９β１インテグリンとの結合アフィニティにおいて、各々、１.９倍および１.５倍の減少があるだけで結合した。
【０２９１】
これらの結果は、α４β１およびα９β１インテグリンの両方が、実際に、この種のＮ−フェニルスルホニルプロリンをベースとするインテグリンアンタゴニストのプロリン残基の４位での有意な立体障害を容認しうることを示唆する。この観察は、ＰＥＧリンカーを組み込むことについて、最低限の利益があり得ることを示す。
【０２９２】
意外にも、Ｒ−ＢＣ１５４がα９β１／α４β１インテグリンに対して高いアフィニティを有することで、その結合特性についてさらなる調査が惹起された。多数のインテグリンリガンドと同様に、Ｒ−ＢＣ１５４のアフィニティおよび結合速度もまた、インテグリンの活性化状態に依存し、それは二価の金属カチオンにより調節され得る。予測されるように、カチオンが不在の場合には、インテグリン結合は観察されなかった（図４）。しかしながら、インテグリンを誘発し、より高いアフィニティの結合配置を選択することが分かっている条件の、１ｍＭ  Ｍｎ２＋の存在下では、α４β１およびα９β１の両方を過剰発現するＬＮ１８細胞系にて、全体としてより大きな結合が観察された（図３ｂおよびｃ）。さらには、Ｍｎ２＋の活性化の下では、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋条件（Ｋｄ＝３８.０ｎＭ）と比べて、Ｒ−ＢＣ１５４のα４β１に対する結合アフィニティ（Ｋｄ＝１２.４ｎＭ）にて３.１倍の増加が観察された（図３ｂ）。Ｍｎ２＋の添加により誘発されるα９β１インテグリンの全体としての結合レベルはさらに拡大するが、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋条件と比べた場合、その結合アフィニティにおいて微小変化は明らかであった（各々、Ｋｄ＝１４.４ｎＭ  ｖｓ．１２.７ｎＭ）（図３ｂ）。
【０２９３】
α４β１およびα９β１インテグリンの生化学特性における違いが、さらに、Ｒ−ＢＣ１５４結合の速度を測定することによって調査された。結合速度の測定値は、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋条件下にあるＲ−ＢＣ１５４の結合が、Ｍｎ２＋条件と比べて、α４β１およびα９β１インテグリンの両方に対してより速いことを示した（各々、図５ａおよびｂ）。オン−レート定数（ｋｏｎ）の算定は、Ｒ−ＢＣ１５４のα４β１インテグリンとの結合（ｋｏｎ＝０.０９４ｎＭ−１・分−１）が、生理学的条件下で、α９β１結合（ｋｏｎ＝０.０６１ｎＭ−１・分−１）よりも速いことを示した（図３）。にもかかわらず、Ｍｎ２＋活性化の下では、α４β１（ｋｏｎ＝０.０３８ｎＭ−１・分−１）およびα９β１インテグリン（ｋｏｎ＝０.０４ｎＭ−１・分−１）の両方について同様のｋｏｎ値が観察された（表３）。
【０２９４】
Ｒ−ＢＣ１５４結合のオフ−レート速度は、解離試験により測定された。Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋およびＭｎ２＋の両方の状態下で、解離速度は、Ｒ−ＢＣ１５４の一方のα９β１（ｋｏｆｆ＝０.０５４および＜０.０１分−１）と比べて、そのα４β１複合体（ｋｏｆｆ＝０.７１７および０.０１４分−１）について速かった（図５ｃおよび表３）。加えて、Ｒ−ＢＣ１５４のＭｎ２＋の存在下でα４β１およびα９β１インテグリンへの結合に対するｋｏｆｆ値は、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋条件と比べて、６０分後に６０％以上のＲ−ＢＣ１５４がなおも結合しており、有意にゆっくりとしたものであった（図５ｃ）。これらの条件下で観察されるゆっくりとしたオフ−レートは、Ｍｎ２＋がリガンド結合配置を安定化させるように作用し、放射性標識された基質を用いる以前の報告と一致することを示唆する。かくして、より速いオン−レートおよびオフ−レートがＣａ２＋／Ｍｇ２＋条件で観察されるが、Ｍｎ２＋の活性化はよりゆっくりとしたα４β１およびα９β１インテグリン結合と関連付けられる。結果的に、Ｍｎ２＋活性化下の極めて遅いオフ−レートでは、大変長いインキュベーション時間を必要とするため、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋条件下で小分子のインテグリン阻害剤をインビトロにてスクリーニングするためのＲ−ＢＣ１５４を用いる競合的阻害アッセイが好ましい。
【０２９５】
これらの結果は、α４β１インテグリンが、α９β１と比べて、この種のＮ−フェニルスルホニルプロリンをベースとするアンタゴニストと少しだけ速く結合するが、α９β１インテグリンでより長期にわたる結合が観察される（表３）。かくして、生理学的に関連する条件下で、この種の二元的α９β１／α４β１インテグリン阻害剤は、α４β１インテグリンについて観察されるより高い結合速度にも拘わらず、そのα９β１に対する有意にゆっくりとしたオフ−レートに起因して、インビボにてα９β１インテグリン依存性相互作用に対してより大きな効果を発揮すると考えられる。
【０２９６】
表３：Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋またはＭｎ２＋条件の存在下でα４β１およびα９β１を過剰発現するＬＮ１８細胞とＲ−ＢＣ１５４との結合特性の概要
【表７】
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【０２９７】
ａ：観察される結合速度（ｋｏｂｓ）は、Ｒ−ＢＣ１５４と、α４β１およびα９β１インテグリンとの、その各々の結合が＞６０％および＞８０％を占める、結合の急速相を表す。
ｂ：図５ｃにおいて表される解離実験から由来のデータを（特記されない限り）１相の指数関数的に減衰する関数に適合させ、その曲線から解離速度定数（ｋｏｆｆ）を推定した。
ｃ：Ｒ−ＢＣ１５４のＣａ２＋／Ｍｇ２＋の存在下でのα４β１  ＬＮ１８細胞との結合についての解離データを２相解離曲線に適合させ、ｋｏｆｆを解離の＞６０％を占める、その曲線の急速相から決定した。
ｄ：Ｍｎ２＋活性化の下では、Ｒ−ＢＣ１５４−α９β１インテグリン複合体の解離は遅すぎ（１２０分後でもなおも＞５５％が結合したまま；データは示さず）、オフ−レートを正確に算定できなかった；ｋｏｆｆ値はおよそ１００分間の半減期を基礎に推定された。
ｅ：結合速度定数（ｋｏｎ）は式：（ｋｏｂｓ−ｋｏｆｆ）／［Ｒ−ＢＣ１５４濃度＝５０ｎＭ］を用いて算定された。
【０２９８】
実施例３：化合物２５（Ｒ−ＢＣ１５４）と骨髄ＨＳＣおよび祖先細胞とのインビボ結合
インビトロでの結合データは、Ｒ−ＢＣ１５４がα４β１およびα９β１インテグリンアンタゴニストと高いアフィニティを示し、その結合活性はインテグリンの活性化に大きく依存することを示した。この実施例の試験は、Ｒ−ＢＣ１５４がインビボでの結合実験に使用され、ＨＳＣの限定された集団でα９β１／α４β１インテグリン活性を研究することができるかどうかを試験する。今日まで、インテグリンのＨＳＣに対する活性の評価は、主に、骨髄細胞または生成されたＨＳＣの蛍光標識された抗体の、インビトロまたはエクスビボでの染色に依存してきた。エクスビボでの染色はＨＳＣによるインテグリンの発現の確認を提供し、複雑な骨髄の微小環境はインビトロにて正確に再構築できないため、骨髄内のその天然状態のインテグリン活性化の研究はインビボでの結合実験を通してのみ決定され得る。
【０２９９】
Ｒ−ＢＣ１５４およびこの種のＮ−フェニルスルホニルプロリンをベースとするペプチド模倣体がＨＳＣに直接結合し得るかどうかを評価するために、Ｒ−ＢＣ１５４（１０ｍｇ／ｋｇ）をマウスに静脈内注射し、多色フローサイトメトリーを用いて表現型で定義された骨髄祖先細胞（ＬＳＫ細胞；リニージ−Ｓｃａ−１＋ｃ−ｋｉｔ＋）およびＨＳＣ（ＬＳＫＳＬＡＭ細胞；ＬＳＫＣＤ４８−ＣＤ１５０＋）のＲ−ＢＣ１５４標識化について分析した（図６ａおよびｂ）。Ｒ−ＢＣ１５４を注射していないマウスから由来の骨髄と比べて、細胞結合型蛍光の増加が、Ｒ−ＢＣ１５４結合の結果として、Ｒ−ＢＣ１５４を注射したマウスより単離された、祖先細胞およびＨＳＣ集団の両方で観察された。さらには、祖先細胞（リニージ−Ｓｃａ−１＋ｃ−ｋｉｔ＋）の精製された集団を蛍光顕微鏡検査法に供することにより、インビボにてＲ−ＢＣ１５４結合も確認された（図６ｃおよびｄ）。Ｒ−ＢＣ１５４標識された祖先細胞は、Ｒ−ＢＣ１５４結合を示す蛍光ハローが主に細胞表面にあることを提示し、そのことはインテグリン結合とも一致する。インビボでの結合結果は、この種のα９β１／α４β１インテグリンアンタゴニストが、ネズミ骨髄中の単核細胞のわずか０.２％および０.００２％に相当するにすぎない、各々、造血祖先細胞およびＨＳＣの極めて希な集団との結合能を有することを示す。
【０３００】
α４β１およびα９β１インテグリンは、ＶＣＡＭ−１およびＯｐｎとの結合を通して骨髄内でのＨＳＣの堆積を調節する重要な試剤であることが認識される（J. Grassingerら、Blood, 2009, 114, 49-59）。ＢＯＰは、インビトロにおけるナノモルの阻害能で、α４β１およびα９β１インテグリンのＶＣＡＭ−１およびＯｐｎの両方との結合を阻害することが明らかとされた。これらのＲ−ＢＣ１５４を用いるインビボでの結合結果は、ＨＳＣにより発現されるα４β１およびα９β１インテグリンが、インサイチュにて活動的な結合構造にあることを示す。このことは、化合物２２および２５などの小分子のα９β１／α４β１インテグリンアンタゴニストが、骨髄のＨＳＣと直接結合するだけでなく、接着的相互作用に応じてα９β１／α４β１を阻害する能力を有し、以下に示されるように骨髄であるＨＳＣの末梢循環への動員を誘発する効果的な試剤として供する可能性のあることを示唆する。
【０３０１】
実施例４−Ｒ−ＢＣ１５４はインビトロにおいて優先的にマウスおよびヒト造血祖先細胞に結合する
上記した実施例において、Ｒ−ＢＣ１５４（図７ａ）は、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋またはＭｎ２＋などの二価の金属カチオンの存在下においてのみ、ヒトα９β１およびα４β１インテグリンを過剰発現するヒトグリア芽腫ＬＮ１８細胞と結合し（図７ｂ）、それがインビトロにおいて高アフィニティでインテグリン結合するのに必要とされる構造変化を誘発するように作用することが明らかにされた。中心および骨内膜のＢＭ祖先細胞（Ｌｉｎ−Ｓｃａ−１＋ｃｋｉｔ＋細胞；ＬＳＫ）およびＨＳＣ（ＬＳＫＣＤ１５０＋ＣＤ４８−細胞；ＬＳＫＳＬＡＭ）の両方に結合するのにインテグリンの活性化が必要とされるかどうかを決定するのに（図７ｃ）、Ｒ−ＢＣ１５４結合を１ｍＭ  Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋の存在下で評価した（図７ｄ）。これらの条件下にて、中心のＬＳＫおよびＬＳＫＳＬＡＭとの結合が、そお骨内膜のカウンターパートとの関連で、より大きいことが観察された（ｐ＜０.００５）（図７ｅ）。ＥＤＴＡと共同して処置することにより表面にあるインテグリンを不活性化することで、Ｒ−ＢＣ１５４とＨＳＣおよび祖先細胞との効率的な結合のために、インテグリンの活性化の要件を示す活動を完全に除去した（図７ｅ）。活性化カチオンおよびＥＤＴＡの両方の不存在下では、Ｒ−ＢＣ１５４と骨内膜ＬＳＫ細胞とが結合していることは明らかであったが、中心ＬＳＫではそうではなかった（図７ｆ）。これらの結果は、骨内膜ＢＭより単離されたＨＳＣおよび祖先細胞より発現されたインテグリンが、採取後も活性化されたままであったことを示唆する。
【０３０２】
インテグリンα４β１は全白血球で普遍的に発現し、α９β１は好中球で広範囲に発現することが知られているため、Ｒ−ＢＣ１５４とリニージ委任造血細胞との結合が評価された。活性化に依存する結合が、外因的活性化の下で中心および骨内膜の両方のＢＭ領域より単離される、リニージ委任のすべてのリンパ球（Ｂ２２０＋およびＣＤ３＋）および骨髄（Ｇｒ１／Ｍａｃ１＋）子孫細胞で観察されることが判明した（図８）。しかしながら、この結合は、ＬＳＫＳＬＡＭ（ｐ＜０.０００１）およびＬＳＫ（ｐ＜０.０００１）細胞と比べて有意に小さかった（図７ｇ）。ＨＳＣおよび祖先細胞との結合がα４β１およびα９β１インテグリン依存的であるかどうかを確認するために、造血細胞中にα４およびα９インテグリンを欠くＢＭ細胞（α４flox／floxα９flox／flox  ｖａｖ−ｃｒｅマウス）をＲ−ＢＣ１５４で処理した。ＬＳＫ（ｐ＜０.００５）およびＬＳＫＳＬＡＭ（ｐ＜０.００５）のα４−／−／α９−／−細胞では、結合は本質的に存在せず、これらの２つのインテグリンのＲ−ＢＣ１５４活性についての要件を確かめた（図７ｈ）。
【０３０３】
Ｒ−ＢＣ１５４の二価カチオンおよび用量依存的結合もヒト臍帯血単核細胞（ＭＮＣ）で確認された（図７ｉ）。活性化条件下で、より大きな結合がリニージ委任のＣＤ３４−細胞と比べてＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞に富む幹細胞にて観察された。にもかかわらず、ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋祖先細胞と比べて結合度は減少した（図７ｊおよび７ｋ）。これらの結果は、ネズミおよびヒト造血細胞に結合するＲ−ＢＣ１５４が二価金属カチオン依存的であり、また、インビトロにおける外因的活性化の下で、ＨＳＣと比べ、造血祖先細胞に対してバイアスが付されていることを示す。
【０３０４】
実施例５：Ｒ−ＢＣ１５４は、インサイチュにて骨内膜ニッチの範囲内にある本質的に活性化されたα４／α９インテグリンを通してＨＳＣおよび祖先細胞を標的とする
インテグリンは複数の活性化状態で存在し、幹細胞ニッチによるその調節は複雑であり、インビトロにて正確に模倣または再現できない。ＢＭの範囲内でＨＳＣおよび祖先細胞により発現されるα９β１／α４β１インテグリンが、インサイチュにて本質的かつ示差的に活性化されるかどうかを評価するために、ＬＳＫＳＬＡＭについて免疫標識を施す前に、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにＲ−ＢＣ１５４を注射した。中心および骨内膜の両方のＢＭ領域から由来のＬＳＫ細胞は，静脈内投与の後で、Ｒ−ＢＣ１５４で効果的に標識された（図９ａ）。しかしながら、骨内膜ＢＭの範囲内にあるＬＳＫおよびＬＳＫＳＬＡＭの両方の細胞は、その中心ＢＭカウンターパートと比べてＲ−ＢＣ１５４ｈｉ細胞の割合が大きく（図９ｂ）、活性化二価金属カチオンの不在下で行われたインビトロ実験と一致する（図７ｆを参照のこと）。リンパ球（Ｂ２２０＋およびＣＤ３＋）および骨髄細胞（Ｇｒ１＋およびＭａｃ１＋）の子孫もまた、骨内膜ＢＭの範囲内でＲ−ＢＣ１５４ｈｉ細胞の割合が大きく、これはインテグリン活性化の強化が原始的造血集団に限定されないことを示唆する（図９ｃ）。Ｒ−ＢＣ１５４の結合のないことはα４−／−／α９−／−ＬＳＫ細胞で明らかであり、これはインビボで活性させるためにα４およびα９インテグリンが要件であることを確認する（図９ｄ）。これらのデータはα９β１／α４β１インテグリンが必要とされるだけでなく、骨内膜ＢＭ領域内にある細胞に対してインサイチュにて本質的かつ示差的に活性化されることを示唆する。
【０３０５】
実施例６−小分子のα９β１／α４β１インテグリンアンタゴニストはＨＳＣおよび祖先細胞を迅速に動員する
Herbert, K. E.、Biol Blood Marrow Tr 14, 603-621,（2008）に記載されるように、新規な動員剤のＨＳＣのＰＢへの放出を誘発しうるその能力について該動員剤を評価するのに数種のネズミアッセイが存在する。正常なＰＢ中のＬＳＫおよびＬＳＫＳＬＡＭ細胞は、各々、循環ＷＢＣの約０.００５％および約０.０００５％を構成するに過ぎないが、ＰＢより選別されたＬＳＫおよびＬＳＫＳＬＡＭは、コロニー形成細胞（ＣＦＣ）の起源であり、かくして造血再構築能を有する細胞を含むことが分かった。従って、ＰＢ中で測定されたＬＳＫおよびＬＳＫＳＬＡＭの含量は、最初は、幹細胞および祖先細胞の含量の代理尺度として使用された。
【０３０６】
最初に、Ｒ−ＢＣ１５４の静脈内注射後の迅速なクリアランス（＜５分）は、他の投与経路の評価、皮下注射がインビボにおける持続的結合活性を付与し、かくして最大の動員効率を可能とするかどうかの判断を刺激した。静脈内注射とは対照的に、ＢＭおよびＬＳＫとの持続的結合が皮下処理の３０分後に観察された（図９ｅ）。最小の結合が、ＢＭカウンターパートと比べて、ＰＢ中のそのＬＳＫで観察され、それは幹細胞ニッチの効果的な活性化およびインテグリン依存的結合のための要件のさらなる証拠を提供するものである（図９ｅ）。それでも、Ｒ−ＢＣ１５４で処理したマウスにて、ＰＢ中のＷＢＣ、ＬＳＫまたはＬＳＫＳＬＡＭの数が有意に増加することは見いだせなかった（図１０）。ＨＳＣのα９β１／α４β１インテグリン阻害剤による動員が、非蛍光標識のＢＯＰ（２）を用いてさらに研究された（図１１ａ）。Ｒ−ＢＣ１５４を用いる競合阻害アッセイに基づき、ＢＯＰがα９β１およびα４β１インテグリンの強力な阻害剤であり、ＬＮ１８細胞系を過剰発現し（図１１ｂ）、およびＶＣＡＭ−１とのインテグリン依存性付着およびトロンビン切断のＯｐｎを阻害しうることが分かった。加えて、ＢＯＰはα９β１およびα４β１インテグリンのＨＳＣおよび祖先細胞に対する結合を効果的に阻害し、そのことは活性化条件下でのＲ−ＢＣ１５４のＬＳＫおよびＬＳＫＳＬＡＭとの結合の競合的置換により証明された（図１１ｃ）。ＢＯＰ（１０ｍｇ／ｋｇ）をＣ５７ＢＬ／６マウスに最大９０分間まで投与し、セイライン対照と比べて、ＰＢのＷＢＣ（図１１ｄ）、ＬＳＫ（図１１ｅ）およびＬＳＫＳＬＡＭ（図１１ｆ）にて有意な増加を得た。Ｒ−ＢＣ１５４と異なり、おそらくは、そのより高い結合アフィニティおよびよりゆっくりとした分解速度に起因して、ＢＯＰでより大きな、かつより持続される動員が観察された。
【０３０７】
ＨＳＣは、αｖβ３、αＬβ２、α２β１、α５β１、α６β１、α４β１およびα９β１を含め、数種のインテグリン亜型を発現することが知られており、その多くはＢＭ内のＨＳＣの保持に関与している。上記の実施例にて、小分子のアンタゴニストであるＢＯＰを用いるα９β１／α４β１インテグリンの阻害が、インテグリン依存のＶＣＡＭ−１およびＯｐｎとの結合の阻害を通して長期間にわたって再増殖しているＨＳＣの迅速な動員を誘発することを示す証拠が提供される。
【０３０８】
これまでの研究は、中和抗体または小分子の阻害剤を用いてインテグリンα４β１とＶＣＡＭ−１の相互作用を阻害することで、マウスおよび霊長類の両方でＨＳＣが動員されることを確認するものであり、まだＢＭ内でこれら標的細胞の動員および配置について標的とされる特定の細胞型をさらに調査する必要がある。二価の金属カチオンで活性化された場合にだけα４β１およびα９β１インテグリンと結合する蛍光小分子のインテグリンアンタゴニスト（Ｒ−ＢＣ１５４）を用いて、初めて、これら２つのβ１インテグリンのネズミおよびヒトＨＳＣでの活性化状態が骨内膜ニッチによりインビボにて本質的に活性化され、差別的に特異化されることが分かる。
【０３０９】
幹細胞ニッチの概念はSchofieldが１９７８年に最初に主張したため、骨内膜ＢＭの機能特性は十分に研究されてきた。かかる研究は骨内膜ニッチが低酸素環境にあると強調し、その環境では、骨芽細胞およびそれに関連する細胞外マトリックスタンパク質などの細胞成分がＨＳＣの維持および機能の重要なニッチ特異的レギュレータである。これらの例は、ＨＳＣおよび祖先細胞を含む骨内膜ニッチ内のＢＭ細胞が、中心髄質コンパートメント内にて観察される限界を越えてより高いアフィニティの結合状態にある、α９β１／α４β１インテグリンを発現することを示す。この特異的インテグリン活性の生理学的関連性は不明のままであるが、これらの観察はトロンビン切断Ｏｐｎ（ｔｒＯｐｎ）とα４β１およびα９β１インテグリンとの間のＨＳＣ依存性結合が骨内膜骨髄に限定されるというこれまでの報告と一致する。
【０３１０】
骨内膜によるインテグリンの活性化の強化は、原始ＨＳＣおよび祖先細胞に特異的なものではなく、α９β１およびα４β１インテグリンだけに限定されそうにもない。理論により限定されるものではないが、骨内膜ＢＭ内で観察されるインテグリン活性化の強化について可能性のある１つの説明は、それが骨とごく接近してあることである。骨は、その鉱物含量が高いことに基づき、他の微小環境の細胞と区別され、カルシウムおよびマグネシウム、ならびにマグネシウムなどの微量金属の無機塩のプライマリー・ストレージ部位であり、そのいずれもがα９β１およびα４β１インテグリンを誘発し、より高いアフィニティリガンド結合構成を採用する。かくして、骨内膜表面から発出するＣａ２＋（およびおそらくは、Ｍｇ２＋およびＭｎ２＋）の高いイオン勾配が、観察されるインテグリン結合アフィニティの強化と関与しているとの事項は、依然としてもっともらしい。実際、この概念は、これまで、Ｇタンパク質共役型カルシウム感知受容体（ＣａＲ）を通して細胞外Ｃａ２＋を認識することを介し、骨内膜ＢＭ内にあるＨＳＣの優先的局在化を正当化するために用いられてきた。集約すると、これらの観察は、骨内膜ニッチの独特な特性、外見的に表現型が同じ細胞にて付与される特異的影響をさらに定義し、幹細胞療法のために幹細胞ニッチを治療標的とする確認を提供する。
【０３１１】
要約すると、ＢＯＰである、α４β１およびα９β１インテグリンの小分子の阻害剤が、長期に及ぶ多リニージ生着の可能性を持ってＨＳＣを効果的かつ迅速に動員したことが明らかにされる。
【０３１２】
本発明の上記した記載により、当業者であれば、現時点でその最良の態様であると考えられるものを製造し、かつ使用することができるが、当業者は本明細書の特定の実施態様、方法および実施例の変形、組み合わせ、および均等の存在を理解し、認識するであろう。従って、本発明は、上記した実施態様、方法および実施例に限定されるべきではなく、本明細書にて広範囲に記載される発明の範囲および精神の範囲内にあるすべての実施態様および方法を包含するものとする。
【０３１３】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【国際調査報告】
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2017538715.tif 000069
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