(57)【要約】  本発明は、α−グルカン合成に関与する２つ以上のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが不活性化された、目的のポリペプチドを産生する突然変異糸状真菌宿主細胞；前記突然変異体におけるポリペプチドの生成方法並びにそのような突然変異体の構築方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象のポリペプチドを産生する突然変異糸状真菌宿主細胞であって、ここで、α−グルカン合成に関与する２つ以上のポリペプチドをコードする２つ以上のポリヌクレオチドが不活性化され、前記２つ以上のポリペプチドは、以下：
（ａ）配列番号３のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＡｇｓＡポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、α−グルカン合成に関与するポリペプチド、および配列番号６のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＡｇｓＥポリペプチドと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、α−グルカン合成に関与するポリペプチド；
（ｂ）（ｉ）配列番号１のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ａｇｓＡゲノムヌクレオチド配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むゲノムポリペプチド、および配列番号４のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ａｇｓＥゲノムヌクレオチド配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むゲノムポリヌクレオチドによりコードされる、α−グルカン合成に関与するポリペプチド；または
（ｉｉ）（ｉ）配列番号２および配列番号５にそれぞれ示すｃＤＮＡヌクレオチド配列；ならびに
（ｃ）中度の緊縮条件下で、以下：
（Ｉ）それぞれ、配列番号１のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ａｇｓＡゲノムヌクレオチド配列および配列番号４のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ａｇｓＥゲノムヌクレオチド配列と；
（ＩＩ）（Ｉ）配列番号２および配列番号５にそれぞれ示すｃＤＮＡヌクレオチド配列と、または
（ＩＩＩ）（Ｉ）もしくは（ＩＩ）の完全長補体と
ハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる、α−グルカン合成に関与する２つのポリペプチド
からなる群から選択される、突然変異糸状真菌宿主細胞。
【請求項２】
アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ブエルカンデラ属（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ）、セリポリオプシス属（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、コプリヌス属（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、コリオルス属（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィリバシジウム属（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスチクス属（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、パエシロマイセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ファネロケーテ属（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、フレビア属（Ｐｈｌｅｂｉａ）、ピロマイセス属（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、プレウロツス属（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、シゾフィルム属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、テルモアスクス属（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、トラメテス属（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）、またはトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞である、請求項１に記載の突然変異糸状真菌宿主細胞。
【請求項３】
アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、ヤケイロタケ（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ  ａｄｕｓｔａ）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ａｎｅｉｒｉｎａ）、セリポリオプシス・カレギエア（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｃａｒｅｇｉｅａ）、セリポリオプシス・ギルベスセンス（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｇｉｌｖｅｓｃｅｎｓ）、セリポリオプシス・パンノシンタ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｐａｎｎｏｃｉｎｔａ）、セリポリオプシス・リブロサ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｒｉｖｕｌｏｓａ）、セリポリオプシス・スブルファ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｓｕｂｒｕｆａ）、セリポリオプシス・スブベルミスポラ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｓｕｂｖｅｒｍｉｓｐｏｒａ）、クリソスポリウム・イノプス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｉｎｏｐｓ）、クリソスポリウム・ケラチノフィルム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｋｅｒａｔｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）、クリソスポリウム・ルクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、クリソスポリウム・メルダリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｍｅｒｄａｒｉｕｍ）、クリソスポリウム・パンニコラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｐａｎｎｉｃｏｌａ）、クリソスポリウム・クイーンスランジクム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・トロピクム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｔｒｏｐｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・ゾナツム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｚｏｎａｔｕｍ）、コプリヌス・シネレウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｃｉｎｅｒｅｕｓ）、クリオルス・ヒルスツス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｈｉｒｓｕｔｕｓ）、フザリウム・バクテリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウム・クロークウェレンス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・グラミヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウム・ヘテロスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ネグンディ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・レチクランツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム・ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム・サムブシヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウム・サルコクロウ���（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウムス・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウム・トルロスム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウム・トリコテシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、ミセリオフトラ・テルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム・プルプロゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ファネロケーテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フレビア・ラジアタ（Ｐｈｌｅｂｉａ  ｒａｄｉａｔａ）、プレウロツス・エリンギイ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｅｒｙｎｇｉｉ）、チエラビア・テルレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トラメテス・ビロサ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｖｉｌｌｏｓａ）、トラメテス・ベルシコロル（Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、トリコデルマ・ハルジアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアツム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、またはトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）細胞である、請求項１または２に記載の突然変異糸状真菌宿主細胞。
【請求項４】
前記対象のポリペプチドが、前記宿主細胞に対して相同的または異種であり；好ましくは、前記対象のポリペプチドは、分泌されたポリペプチドであり；より好ましくは、これは、ホルモン、酵素、受容体もしくはその一部、抗体もしくはその一部、またはリポータであり；さらに好ましくは、前記対象のポリペプチドは、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼもしくはトランスフェラーゼであり；最も好ましくは、前記対象のポリペプチドは、α−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンドグルカナーゼ、エステラーゼ、グルコアミラーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、またはキシラーゼである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の突然変異糸状真菌宿主細胞。
【請求項５】
前記２つ以上のポリヌクレオチドの不活性化が、前記２つ以上のポリヌクレオチドおよび／またはそれぞれのプロモータの突然変異により；好ましくは、前記宿主細胞のゲノムからの前記２つ以上のポリヌクレオチドおよび／またはそれぞれのプロモータの部分的もしくは完全な欠失により、実施される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の突然変異糸状真菌宿主細胞。
【請求項６】
前記２つ以上のポリヌクレオチドが、配列番号３のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＡｇｓＡポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、またはそれから構成されるα−グルカン合成に関与するポリペプチド、および配列番号６のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＡｇｓＥポリペプチドと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、またはそれから構成されるα−グルカン合成に関与するポリペプチドをコードする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の突然変異糸状真菌宿主細胞。
【請求項７】
突然変異糸状真菌宿主細胞において対象のポリペプチドを生成する方法であって、前記方法が、以下：
（ａ）前記対象のポリペプチドの産生を促す条件下で、請求項１〜６のいずれか１項に記載の突然変異糸状真菌宿主細胞を培養するステップ；および、任意選択で、
（ｂ）前記対象のポリペプチドを回収するステップ
を含む方法。
【請求項８】
突然変異した糸状真菌宿主細胞を構築する方法であって、前記方法は、糸状真菌宿主細胞において２つ以上のポリペプチドをそれぞれコードする２つ以上のポリヌクレオチドを不活性化するステップを含み、前記２つ以上のポリペプチドが、以下：
（ａ）配列番号３のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＡｇｓＡポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、α−グルカン合成に関与するポリペプチド、および配列番号６のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＡｇｓＥポリペプチドと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、α−グルカン合成に関与するポリペプチド；
（ｂ）（ｉ）配列番号１のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ａｇｓＡゲノムヌクレオチド配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むゲノムポリペプチド、および配列番号４のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ａｇｓＥゲノムヌクレオチド配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むゲノムポリヌクレオチドによりコードされる、α−グルカン合成に関与するポリペプチド；または
（ｉｉ）（ｉ）配列番号２および配列番号５にそれぞれ示すｃＤＮＡヌクレオチド配列；ならびに
（ｃ）中度の緊縮条件下で、以下：
（Ｉ）それぞれ、配列番号１のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ａｇｓＡゲノムヌクレオチド配列および配列番号４のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ａｇｓＥゲノムヌクレオチド配列と；
（ＩＩ）（Ｉ）配列番号２および配列番号５にそれぞれ示すｃＤＮＡヌクレオチド配列と、または
（ＩＩＩ）（Ｉ）もしくは（ＩＩ）の完全長補体と
ハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる、α−グルカン合成に関与する２つのポリペプチド
からなる群から選択される方法。
【請求項９】
前記糸状真菌宿主細胞が、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、ヤケイロタケ（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ  ａｄｕｓｔａ）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ａｎｅｉｒｉｎａ）、セリポリオプシス・カレギエア（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｃａｒｅｇｉｅａ）、セリポリオプシス・ギルベスセンス（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｇｉｌｖｅｓｃｅｎｓ）、セリポリオプシス・パンノシンタ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｐａｎｎｏｃｉｎｔａ）、セリポリオプシス・リブロサ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｒｉｖｕｌｏｓａ）、セリポリオプシス・スブルファ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｓｕｂｒｕｆａ）、セリポリオプシス・スブベルミスポラ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｓｕｂｖｅｒｍｉｓｐｏｒａ）、クリソスポリウム・イノプス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｉｎｏｐｓ）、クリソスポリウム・ケラチノフィルム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｋｅｒａｔｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）、クリソスポリウム・ルクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、クリソスポリウム・メルダリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｍｅｒｄａｒｉｕｍ）、クリソスポリウム・パンニコラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｐａｎｎｉｃｏｌａ）、クリソスポリウム・クイーンスランジクム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・トロピクム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｔｒｏｐｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・ゾナツム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｚｏｎａｔｕｍ）、コプリヌス・シネレウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｃｉｎｅｒｅｕｓ）、クリオルス・ヒルスツス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｈｉｒｓｕｔｕｓ）、フザリウム・バクテリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウム・クロークウェレンス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・グラミヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウム・ヘテロスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ネグンディ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・レチクランツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム・ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム・サムブシヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、���ザリウム・サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウムス・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウム・トルロスム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウム・トリコテシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、ミセリオフトラ・テルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム・プルプロゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ファネロケーテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フレビア・ラジアタ（Ｐｈｌｅｂｉａ  ｒａｄｉａｔａ）、プレウロツス・エリンギイ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｅｒｙｎｇｉｉ）、チエラビア・テルレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トラメテス・ビロサ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｖｉｌｌｏｓａ）、トラメテス・ベルシコロル（Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、トリコデルマ・ハルジアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアツム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、またはトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記糸状真菌宿主細胞が、対象のポリペプチドを産生し；好ましくは、前記対象のポリペプチドは、宿主細胞に対して相同的または異種であり；より好ましくは、前記対象のポリペプチドは、分泌されたポリペプチドであり；さらに好ましくは、これは、ホルモン、酵素、受容体もしくはその一部、抗体もしくはその一部、またはリポータであり；さらに好ましくは、前記対象のポリペプチドは、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼもしくはトランスフェラーゼであり；最も好ましくは、前記対象のポリペプチドは、α−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンドグルカナーゼ、エステラーゼ、グルコアミラーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、またはキシラーゼである、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記２つ以上のポリヌクレオチドの不活性化が、前記２つ以上のポリヌクレオチドおよび／またはそれぞれのプロモータの突然変異により；好ましくは、前記宿主細胞のゲノムからの前記２つ以上のポリヌクレオチドおよび／またはそれぞれのプロモータの部分的もしくは完全な欠失により、実施される、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表の参照
本出願は、コンピュータ読み取り可能な形態の配列表を含んでおり、これは本明細書において参照により援用される。
【背景技術】
【０００２】
リポータタンパク質の発現を駆動する細胞壁ストレス誘導プロモータによる、糸状真菌における抗真菌化合物の同定のためのリポータ系が開示されており；このような誘導プロモータの１つが、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ａｇｓＡプロモータであり；変性プライマーを用いた完全長ａｇｓＡ遺伝子ならびに他の真菌からのａｇｓ相同体の単離が記載されている（国際公開第０３／０２０９２２号パンフレット）。また、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ａｇｓＡにおけるａｇｓＡの不活性化も記載されている（Ｄａｍｖｅｌｄ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．２００４．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｇｓＡ，ｏｎｅ  ｏｆ  ｆｉｖｅ  １，３−ａｌｐｈａ−Ｄ−ｇｌｕｃａｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ−ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ，ｉｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｃｅｌｌ  ｗａｌｌ  ｓｔｒｅｓｓ．Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４２（２００５）１６５−１７７）。
【０００３】
また、５つの１，３−α−Ｄ−グルカンシンターゼコード遺伝子のもう１つのａｇｓＥが欠失したアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）突然変異体も開示されている；このような突然変異体において、グルコースオキシダーゼ、ホスホリパーゼＡ２およびリパーゼ発現が改善されることが報告されている（国際公開第２０１４／０１３０７４号パンフレット）。
【０００４】
本発明は、α−グルカン合成に関与する２つ以上のポリペプチドが不活性化された糸状真菌発現宿主に関する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、対象の酵素の生産性を高めることに関心を有し、文献に報告されていることとは反対に、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）のＡｇｓＡまたはＡｇｓＥを不活性化した単一突然変異体が、彼らが試験したプロテアーゼの低い発現をもたらすことを見出した（以下に示す）。しかし、本発明者らが驚いたことに、二重突然変異体は、有意に高いプロテアーゼ発現をもたらした（以下に示す）。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
従って、第１の態様では、本発明は、対象のポリペプチドを産生する突然変異糸状真菌宿主細胞に関し、ここで、α−グルカン合成に関与する２つ以上のポリペプチドをコードする２つ以上のポリヌクレオチドが不活性化され、前記２つ以上のポリペプチドは、以下のものからなる群から選択される：
（ａ）配列番号３のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＡｇｓＡポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、α−グルカン合成に関与するポリペプチド、および配列番号６のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＡｇｓＥポリペプチドと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、α−グルカン合成に関与するポリペプチド；
（ｂ）（ｉ）配列番号１のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ａｇｓＡゲノムヌクレオチド配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むゲノムポリペプチド、および配列番号４のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ａｇｓＥゲノムヌクレオチド配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むゲノムポリヌクレオチドによりコードされる、α−グルカン合成に関与するポリペプチド；または
（ｉｉ）（ｉ）配列番号２および配列番号５にそれぞれ示すｃＤＮＡヌクレオチド配列；ならびに
（ｃ）中度の緊縮条件下で、以下：
（Ｉ）それぞれ、配列番号１のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ａｇｓＡゲノムヌクレオチド配列および配列番号４のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ａｇｓＥゲノムヌクレオチド配列と；
（ＩＩ）（Ｉ）配列番号２および配列番号５にそれぞれ示すｃＤＮＡヌクレオチド配列と、または
（ＩＩＩ）（Ｉ）もしくは（ＩＩ）の完全長補体と
ハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる、α−グルカン合成に関与する２つのポリペプチド。
【０００７】
第２の態様では、本発明は、突然変異糸状真菌宿主細胞において対象のポリペプチドを生成する方法に関し、前記方法は、以下：
（ａ）対象のポリペプチドの産生を促す条件下で、本発明の第１の態様で定義した通りの突然変異糸状真菌宿主細胞を培養するステップ；および、任意選択で、
（ｂ）対象のポリペプチドを回収するステップ
を含む。
【０００８】
第３の態様では、本発明は、突然変異した糸状真菌宿主細胞を構築する方法に関し、前記方法は、糸状真菌宿主細胞において２つ以上のポリペプチドをそれぞれコードする２つ以上のポリヌクレオチドを不活性化するステップを含み、上記２つ以上のポリペプチドは、以下のものからなる群から選択される：
（ａ）配列番号３のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＡｇｓＡポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、α−グルカン合成に関与するポリペプチド、および配列番号６のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＡｇｓＥポリペプチドと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、α−グルカン合成に関与するポリペプチド；
（ｂ）（ｉ）配列番号１のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ａｇｓＡゲノムヌクレオチド配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むゲノムポリペプチド、および配列番号４のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ａｇｓＥゲノムヌクレオチド配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むゲノムポリヌクレオチドによりコードされる、α−グルカン合成に関与するポリペプチド；または
（ｉｉ）（ｉ）配列番号２および配列番号５にそれぞれ示すｃＤＮＡヌクレオチド配列；ならびに
（ｃ）中度の緊縮条件下で、以下：
（Ｉ）それぞれ、配列番号１のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ａｇｓＡゲノムヌクレオチド配列および配列番号４のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ａｇｓＥゲノムヌクレオチド配列と；
（ＩＩ）（Ｉ）配列番号２および配列番号５にそれぞれ示すｃＤＮＡヌクレオチド配列と、または
（ＩＩＩ）（Ｉ）もしくは（ＩＩ）の完全長補体と
ハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる、α−グルカン合成に関与する２つのポリペプチド。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】以下の実施例で使用される株の構築戦略の図を示す。
【図２】プラスミドｐＨＵｄａ１６８５の概略マップを示す。
【図３】プラスミドｐＨＵｄａ１７０１の概略マップを示す。
【図４】プラスミドｐＨＵｄａ１６５７の概略マップを示す。
【図５】プラスミドｐＨＵｄａ１６９４の概略マップを示す。
【００１０】
定義
ｃＤＮＡ：「ｃＤＮＡ」という用語は、真核細胞または原核細胞から得られる成熟したスプライシングされたｍＲＮＡ分子からの逆転写により調製されることが可能であるＤＮＡ分子を意味する。ｃＤＮＡは、対応するゲノムＤＮＡ中に存在し得るイントロン配列を欠いている。初期の一次ＲＮＡ転写物は、成熟型のスプライシングされたｍＲＮＡとして出現する前にスプライシングを含む一連のステップを介して処理されるｍＲＮＡの前駆体である。
【００１１】
コード配列：「コード配列」という用語は、ポリペプチドのアミノ酸配列を直接規定するポリヌクレオチドを意味する。コード配列の境界は、一般に、オープンリーディングフレームによって決定されるが、これは、ＡＴＧ、ＧＴＧ、またはＴＴＧなどの開始コドンで開始し、ＴＡＡ、ＴＡＧ、またはＴＧＡなどの終止コドンで終了する。コード配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはこれらの組合せのいずれであってもよい。
【００１２】
核酸構築物：「核酸構築物」という用語は、一本鎖または二本鎖いずれかの核酸分子を意味し、これは、天然の遺伝子から単離されるか、もしくは、そうでなければ自然に存在しないであろう様式で核酸のセグメントを含有するよう修飾されるか、または、合成物であり、これは、１つまたは複数の制御配列を含む。
【００１３】
作動可能にリンクされた：「作動可能にリンクされた」という用語は、制御配列がコード配列の発現を指令するように、ポリヌクレオチドのコード配列に対して適切な位置に制御配列を配置する構造を意味する。
【００１４】
制御配列：「制御配列」という用語は、本発明の成熟型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現に必要な核酸配列を意味する。各制御配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して在来（すなわち、同じ遺伝子に由来する）もしくは外来の（すなわち、異なる遺伝子に由来する）ものであっても、または、相互に在来もしくは外来のものであってもよい。このような制御配列としては、これらに限定されないが、リーダ、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモータ、シグナルペプチド配列、および転写ターミネータが挙げられる。少なくとも、制御配列は、プロモータ、ならびに、転写および翻訳終止シグナルを含む。制御配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコード領域と制御配列の連結を促進させる特定の制限部位を導入する目的で、リンカーを備えていてもよい。
【００１５】
発現：「発現」という用語は、限定するものではないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾および分泌物を含むポリペプチドの生成に関与するいずれかのステップを含む。
【００１６】
発現ベクター：「発現ベクター」という用語は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、また、その発現をもたらす制御配列に作動可能にリンクされている直鎖または環状ＤＮＡ分子を含む。
【００１７】
宿主細胞：「宿主細胞」という用語は、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸構築物または発現ベクターによる形質転換、形質移入、形質導入などに対する感受性を有するあらゆる細胞型を意味する。「宿主細胞」という用語は、複製の最中に生じる突然変異による親細胞と同じではない親細胞のあらゆる子孫を包含する。
【００１８】
単離された：「単離された」という用語は、自然界においては生じない形態または環境にある物質を意味する。単離された物質の非限定的な例としては、（１）いずれかの非天然物質、（２）限定するものではないが、自然界において関連している天然構成成分の１種または複数種もしくは全てから少なくとも部分的に取り出されたいずれかの酵素、変異体、核酸、タンパク質、ペプチドもしくは補因子を含むいずれかの物質；（３）自然界において見出される物質に対して人為的に修飾されたいずれかの物質；または、（４）自然界で関連する他の成分に対して物質量の増加により修飾されたいずれかの物質（例えば、宿主細胞中の組み換え産物；物質をコードする遺伝子の複数のコピー；物質をコードする遺伝子と自然界で関連するプロモータより強力なプロモータの使用）が挙げられる。単離された物質は、発酵ブロスサンプル中に存在してもよい。
【００１９】
非常に高度の緊縮条件：「非常に高度の緊縮条件」という用語は、長さが少なくとも１００ヌクレオチドのプローブに関して、１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング法に続く、４２℃、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ断片処理および修飾済みのサケ精子ＤＮＡ、ならびに、５０％ホルムアミドでのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを意味する。キャリア材料は、最終的に、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて、７０℃で１５分間ずつ３回洗浄される。
【００２０】
高度の緊縮条件：「高度の緊縮条件」という用語は、長さが少なくとも１００ヌクレオチドのプローブに関して、１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング法に続く、４２℃、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ断片処理および修飾済みのサケ精子ＤＮＡ、ならびに、５０％ホルムアミドでのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを意味する。キャリア材料は、最終的に、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて、６５℃で１５分間ずつ３回洗浄される。
【００２１】
中度−高度の緊縮条件：「中−高度の緊縮条件」という用語は、長さが少なくとも１００ヌクレオチドのプローブに関して、１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング法に続く、４２℃、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ断片処理および修飾済みのサケ精子ＤＮＡ、ならびに、３５％ホルムアミドでのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを意味する。キャリア材料は、最終的に、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて、６０℃で１５分間ずつ３回洗浄される。
【００２２】
低度の緊縮条件：「低度の緊縮条件」という用語は、長さが少なくとも１００ヌクレオチドのプローブに関して、１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング法に続く、４２℃、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ断片処理および修飾済みのサケ精子ＤＮＡ、ならびに、２５％ホルムアミドでのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを意味する。キャリア材料は、最終的に、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて、５０℃で１５分間ずつ３回洗浄される。
【００２３】
中度−高度の緊縮条件：「中−高度の緊縮条件」という用語は、長さが少なくとも１００ヌクレオチドのプローブに関して、１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング法に続く、４２℃、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ断片処理および修飾済みのサケ精子ＤＮＡ、ならびに、３５％ホルムアミドでのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを意味する。キャリア材料は、最終的に、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて、６０℃で１５分間ずつ３回洗浄される。
【００２４】
極めて低度の緊縮条件：「極めて低度の緊縮条件」という用語は、長さが少なくとも１００ヌクレオチドのプローブに関して、１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング法に続く、４２℃、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ断片処理および修飾済みのサケ精子ＤＮＡ、ならびに、２５％ホルムアミドでのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを意味する。キャリア材料は、最終的に、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて、４５℃で１５分間ずつ３回洗浄される。
【００２５】
配列同一性：２つのアミノ酸配列間または２つのヌクレオチド配列間の関連性は、「配列同一性」というパラメータによって表される。
【００２６】
本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度は、好ましくはバージョン５．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６−２７７）のＮｅｅｄｌｅプログラムにおいて実装されている、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を用いて判定される。用いられるパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップエクステンションペナルティおよびＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識された「最長の同一性」（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）の出力が同一性割合として用いられ、以下のように算出される：
（同等の残基×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップの総数）
【００２７】
本発明の目的のために、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の配列同一性の程度は、好ましくはバージョン５．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ（前述のＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）のＮｅｅｄｌｅプログラムにおいて実装されている、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（前述のＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０）を用いて判定される。用いられるパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップエクステンションペナルティおよびＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ  ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識された「最長の同一性」（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）の出力が同一性割合として用いられ、以下のように算出される：
（同等のデオキシリボヌクレオチド×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップの総数）
【００２８】
α−グルカン合成に関与する：「α−グルカン合成に関与する」という用語は、このように関与するポリヌクレオチドが、α−グルカン、特にα−Ｄ−グルカンの合成に参加する酵素をコードすることを意味する。本発明に関連して、好ましいコードされたポリペプチドは、１，３α−Ｄ−グルカンシンターゼ、最も好ましくは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来のＡｇｓＡおよびＡｇｓＥまたはそれらの対立遺伝子相同体もしくは変異体である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
上の発明の概要に既に概説したように、本発明の第１の態様は、対象のポリペプチドを産生する突然変異糸状真菌宿主細胞に関し、ここで、α−グルカン合成に関与する２つ以上のポリペプチドをコードする２つ以上のポリヌクレオチドが不活性化されており、第２の態様は、第１の態様で定義した通りの突然変異宿主細胞において対象のポリペプチドを生成する方法に関し、また、第３の態様は、突然変異糸状真菌宿主細胞を構築する方法に関する。
【００３０】
本発明の態様は全て、糸状真菌宿主細胞においてα−グルカン合成に関与する２つ以上のポリペプチドをコードする２つ以上のポリヌクレオチドの不活性化を必要とし、前記２つ以上のポリペプチドは、以下のものからなる群から選択される：
（ａ）配列番号３のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＡｇｓＡポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、α−グルカン合成に関与するポリペプチド、および配列番号６のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＡｇｓＥポリペプチドと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、α−グルカン合成に関与するポリペプチド；好ましくは、各ポリペプチドは、それぞれ、配列番号３または６に対して、少なくとも６５％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有する。一態様では、ポリペプチドは、それぞれ、配列番号３または６のポリペプチドと、１０以下、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０アミノ酸だけ異なる。アミノ酸変異は、副次的な性質のものであってもよく、すなわち、タンパク質の折り畳みおよび／もしくは活性に顕著に影響しない保存的アミノ酸置換もしくは挿入；小さな欠失、アミノ−端子メチオニン残基などの小さなアミノ−もしくはカルボキシル−末端伸長；小さなリンカーペプチド；あるいは、正味電荷または他の機能、例えば、ポリヒスチジン配列、抗原性エピトープもしくは結合性ドメインなどを変化させることによって精製を促進させる小さな伸長であってもよく；
（ｂ）（ｉ）配列番号１のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ａｇｓＡゲノムヌクレオチド配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むゲノムポリペプチド、および配列番号４のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ａｇｓＥゲノムヌクレオチド配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むゲノムポリヌクレオチドによりコードされる、α−グルカン合成に関与するポリペプチド；好ましくは、各ゲノムポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号１または４に対して、少なくとも６５％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有する。一態様では、ポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号１または４のポリヌクレオチドと、１０以下、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０ヌクレオチドだけ異なり、または
（ｉｉ）（ｉ）配列番号２のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ａｇｓＡ  ｃＤＮＡヌクレオチド配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するｃＤＮＡヌクレオチド配列、および配列番号５のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ａｇｓＥ  ｃＤＮＡヌクレオチド配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる、α−グルカン合成に関与するポリペプチド；好ましくは、各ｃＤＮＡポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号２または５に対して、少なくとも６５％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の配列同一性を有する。一態様では、ポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号２または５のポリヌクレオチドと、１０以下、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０ヌクレオチドだけ異なり；ならびに
（ｃ）極めて低度、低度、中度、中−高度、高度もしくは極めて高度の緊縮条件下で、以下：
（Ｉ）それぞれ、配列番号１のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ａｇｓＡゲノムヌクレオチド配列および配列番号４のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ａｇｓＥゲノムヌクレオチド配列と；
（ＩＩ）（Ｉ）配列番号２および配列番号５にそれぞれ示すｃＤＮＡヌクレオチド配列と、または
（ＩＩＩ）（Ｉ）もしくは（ＩＩ）の完全長補体と
ハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる、α−グルカン合成に関与する２つのポリペプチド。（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。
【００３１】
本発明の好ましい実施形態では、２つ以上のポリヌクレオチドは、配列番号３のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＡｇｓＡポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列若しくはその対立遺伝子変異体を含むか、またはそれから構成される、α−グルカン合成に関与するポリペプチド、および配列番号６のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＡｇｓＥポリペプチドと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列若しくはその対立遺伝子変異体を含むか、またはそれから構成される、α−グルカン合成に関与するポリペプチドをコードする。別の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３もしくは６の成熟型ポリペプチドを含むか、またはそれから構成される。
【００３２】
配列番号１または２のポリヌクレオチドもしくはそのサブ配列および配列番号３のポリペプチドもしくはその断片、ならびに配列番号４または５のポリヌクレオチドもしくはそのサブ配列、配列番号６のポリペプチドもしくはその断片は、当技術分野で公知の方法に従い、様々な属または種の株由来のα−グルカン合成に関与するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定し、クローン化するための核酸プローブの設計に用いられ得る。特に、このようなプローブは、標準的なサザンブロッティング法の後に、含まれる対応する遺伝子を同定および単離するために、対象の細胞のゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションに用いられることができる。このようなプローブは、配列全体よりかなり短くてよいが、少なくとも１５、例えば、少なくとも２５、少なくとも３５、または少なくとも７０ヌクレオチドと、少なくとも１５ヌクレオチドの長さであるべきである。好ましくは、核酸プローブは、例えば、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも６００ヌクレオチド、少なくとも７００ヌクレオチド、少なくとも８００ヌクレオチド、または少なくとも９００ヌクレオチドといった、少なくとも１００ヌクレオチドの長さである。ＤＮＡおよびＲＮＡのいずれを用いてもよい。プローブは、典型的には、対応する遺伝子を検出するために標識化される（例えば、３２Ｐ、３Ｈ、３５Ｓ、ビオチンまたはアビジンで）。このようなプローブは本発明によって包含される。
【００３３】
このような他の系統から調製したゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリは、上記のプローブとハイブリダイズし、α−グルカン合成に関与するポリペプチドをコードするＤＮＡについてスクリーニングされ得る。このような他の系統由来のゲノムまたは他のＤＮＡは、アガロースもしくはポリアクリルアミドゲル電気泳動、または、他の分離技術によって分離され得る。これらのライブラリからのＤＮＡまたは分離されたＤＮＡが、ニトロセルロースもしくは他の好適なキャリア材料に移され、固定化され得る。ハイブリダイズするクローンまたはＤＮＡを同定するために、キャリア材料がサザンブロッティングに用いられる。
【００３４】
本発明の目的に関して、ハイブリダイゼーションとは、極めて低度〜極めて高度の緊縮条件下で、（ｉ）配列番号１もしくは４；（ｉｉ）配列番号１もしくは４の成熟型ポリペプチドコード配列；（ｉｉｉ）配列番号２もしくは５に示されるｃＤＮＡ配列；（ｉｖ）その完全長相補体；または（ｖ）そのサブ配列に対応する標識核酸プローブに、ポリヌクレオチドがハイブリダイズすることを意味する。核酸プローブがこれらの条件下でハイブリダイズする分子は、例えば、Ｘ線フィルムまたは当技術分野では公知の他のいずれかの検出手段によって検出することができる。
【００３５】
保存的アミノ酸置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リシンおよびヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸およびアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミンおよびアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシンおよびバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン）、および、小さいアミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、スレオニンおよびメチオニン）の群の範囲内である。特異活性を一般に改変しないアミノ酸置換は技術分野において公知であり、例えば、Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ  ａｎｄ  Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，１９７９，Ｉｎ，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。頻繁に生じる置換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／ＧｌｕおよびＡｓｐ／Ｇｌｙである。
【００３６】
単一もしくは複数のアミノ酸置換、欠失、および／または挿入は、Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：５３−５７；Ｂｏｗｉｅ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：２１５２−２１５６；国際公開第９５／１７４１３号パンフレット；または、国際公開第９５／２２６２５号パンフレットにより開示されているものなどの公知の突然変異誘発方法、組換え法、および／または、シャッフリング法、これに続く関連するスクリーニング法を用いて行い、テストすることが可能である。用いられることが可能である他の方法としては、エラープローンＰＣＲ、ファージディスプレイ（例えば、Ｌｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：１０８３２−１０８３７；米国特許第５，２２３，４０９号明細書；国際公開第９２／０６２０４号パンフレット）、および、領域特異的突然変異誘発（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｇｅｎｅ  ４６：１４５；Ｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，ＤＮＡ  ７：１２７）が挙げられる。
【００３７】
突然変異誘発／シャッフリング法は、宿主細胞によって発現されたクローン化突然変異誘発ポリペプチドの活性を検出するために、高スループット自動スクリーニング法と組み合わせることが可能である（Ｎｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：８９３−８９６）。活性ポリペプチドをコードする突然変異誘発ＤＮＡ分子は、宿主細胞から回収可能であり、技術分野における標準的な方法を用いて直ぐに配列決定されることが可能である。これらの方法では、ポリペプチドにおける個別のアミノ酸残基の重要性を直ぐに判定することが可能である。
【００３８】
ポリヌクレオチド
本発明は、また、本明細書に記載される通り、α−グルカン合成に関与するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの不活性化に関する。
【００３９】
ポリヌクレオチドの単離またはクローン化に用いられる技術は技術分野において公知であり、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡからの単離、または、これらの組み合わせが含まれる。ゲノムＤＮＡからのポリヌクレオチドのクローン化は、例えば、発現ライブラリの周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または抗体スクリーニングを用いて共有される構造機構を伴うクローン化されたＤＮＡ断片を検出することにより実施されることが可能である。例えば、Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，ＰＣＲ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと。リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、連結活性化転写（ＬＡＴ）およびポリヌクレオチドベース増幅（ＮＡＳＢＡ）などの他の核酸増幅法が用いられ得る。ポリヌクレオチドは、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の系統、または、関連する生体からクローン化され得、それ故、例えば、ポリヌクレオチドの領域をコードするポリペプチドの対立形質もしくは種変異体であり得る。
【００４０】
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの修飾は、ポリペプチドに実質的に類似するポリペプチドを合成するのに必要であり得る。ポリペプチドに「実質的に同様」という用語は、ポリペプチドの非天然形態を指す。これらのポリペプチドは、天然のソースから単離されたポリペプチドとはいくらかの操作法で異なっていてもよく、例えば、特異活性、耐熱性、至適ｐＨなどが異なる変異体である。変異体は、配列番号１もしくは４のポリペプチドコード配列として表されるポリヌクレオチドに基づいて；または配列番号２もしくは５（例えば、そのサブ配列）におけるｃＤＮＡに基づいて構築され得、および／または、ポリペプチドのアミノ酸配列に変化をもたらさないが、酵素の生成のために意図される宿主生体のコドン利用に対応するヌクレオチド置換の導入により、または、異なるアミノ酸配列をもたらし得るヌクレオチド置換の導入により構築され得る。ヌクレオチド置換の概要については、例えば、Ｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ２：９５−１０７を参照のこと。
【００４１】
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの不活性化または除去
本発明の様々な態様および実施形態は全て、糸状真菌宿主細胞においてα−グルカン合成に関与する２つ以上のポリペプチドをコードする２つ以上のポリヌクレオチドの不活性化を必要とする。
【００４２】
このような不活性化は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもしくはその一部を破壊するか、または欠失させることにより達成することができ、これによって、同じ条件下で培養したとき、親細胞より少ないポリペプチドを産生する突然変異細胞が得られる。
【００４３】
突然変異細胞は、当技術分野で公知の方法、例えば、挿入、破壊、置換、または欠失を用いて、ポリヌクレオチドの発現を排除することによって構築することができる。好ましい態様では、ポリヌクレオチドは不活性化される。不活性化しようとするポリヌクレオチドは、例えば、活性に不可欠なコード領域もしくはその部分、またはコード領域の発現に必要な調節エレメントであってもよい。このような調節または制御配列の例は、プロモータ配列またはその機能性部分、すなわち、ポリヌクレオチドの発現に作用する上で十分な部分であってよい。不活性化が考えられる他の制御配列として、限定するものではないが、リーダ、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、シグナルペプチド配列、転写ターミネータ、および転写アクチベータが挙げられる。
【００４４】
ポリヌクレオチドの不活性化は、親配列を突然変異誘発に付し、ポリヌクレオチドの発現が排除された突然変異細胞を選択することにより実施され得る。突然変異誘発は、特異的またはランダムのいずれであってもよく、例えば、物理的もしくは化学的突然変異誘発因子の使用、好適なオリゴヌクレオチドの使用、またはＤＮＡ配列をＰＣＲ突然変異誘発に付すことにより、実施され得る。さらに、突然変異誘発は、これらの突然変異誘発因子の任意の組み合わせの使用により実施してもよい。
【００４５】
本発明の目的に好適な物理的または化学的突然変異誘発因子の例としては、紫外線（ＵＶ）照射、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、Ｏ−メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、亜硫酸水素ナトリウム、ギ酸、およびヌクレオチド類似体が挙げられる。
【００４６】
このような因子が使用される場合、突然変異誘発は、典型的に、好適な条件下、突然変異誘発しようとする親細胞を最適な突然変異誘発因子の存在下でインキュベートし、当該遺伝子の発現を示さない突然変異細胞をスクリーニングおよび／または選択することにより、実施される。
【００４７】
ポリヌクレオチドの不活性化は、当該遺伝子、またはその転写もしくは翻訳に必要な調節エレメントにおける１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、置換、もしくは欠失によって達成され得る。例えば、終止コドンの導入、開始コドンの除去、またはオープンリーディングフレーム内の変更をもたらすように、ヌクレオチドを挿入または除去することができる。このような不活性化は、当技術分野で公知の方法に従って、部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ突然変異誘発により達成され得る。原則として、不活性化は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、すなわち、不活性化しようとするポリヌクレオチドを発現する細胞に対し直接、実施してよいが、以下に例示するように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施するのが好ましい。
【００４８】
ポリヌクレオチドの発現を排除するための好都合な方法の一例は、遺伝子置換、遺伝子欠失、または遺伝子破壊の技術に基づく。例えば、遺伝子破壊方法では、内因性ポリヌクレオチドに対応する核酸配列をｉｎ  ｖｉｔｒｏで突然変異させて、欠陥核酸配列を生成した後、これを親細胞に形質転換することにより、欠陥遺伝子を生成する。相同組換えにより、内因性ポリヌクレオチドを欠陥核酸配列で置換する。欠陥ポリヌクレオチドもマーカをコードするのが望ましい場合もあり、ポリヌクレオチドが修飾または破壊されている形質転換体の選択のために、このマーカを使用することができる。一態様では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載するものなどの選択マーカによって破壊する。
【００４９】
本発明はさらに、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその制御配列の破壊もしくは欠失、またはポリペプチドをコードする抑制遺伝子を含む親細胞の突然変異細胞に関し、これにより、親細胞と比較して少ないポリペプチドを産生するか、またはポリペプチドを一切産生しない突然変異細胞が得られる。
【００５０】
ポリペプチド欠失突然変異細胞は、ネイティブおよび異種ポリペプチドの発現のための宿主細胞として特に有用である。従って、本発明はさらに、ネイティブまたは異種ポリペプチドを生成する方法にも関し、これは、（ａ）ポリペプチドの産生を促す条件下で突然変異細胞を培養するステップ；および（ｂ）ポリペプチドを回収するステップを含む。「異種ポリペプチド」という用語は、宿主細胞に対してネイティブではないポリペプチド、例えば、ネイティブタンパク質の変異体を意味する。宿主細胞は、ネイティブまたは異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの２つ以上のコピーを含み得る。
【００５１】
本発明の好ましい実施形態では、２つ以上のポリヌクレオチドの不活性化は、２つ以上のポリヌクレオチドおよび／またはそれぞれのプロモータの突然変異により；好ましくは、宿主細胞のゲノムからの２つ以上のポリヌクレオチドおよび／またはそれぞれのプロモータの部分的もしくは完全な欠失により、実施する。
【００５２】
核酸構築物
本発明はまた、制御配列と適合性の条件下で、好適な宿主細胞におけるコード配列の発現を指令する１つまたは複数の制御配列に作動可能にリンクされた、本発明の対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物にも関する。
【００５３】
ポリヌクレオチドは、対象のポリペプチドの発現をもたらすために様々な方法で操作してもよい。ベクターに挿入する前のポリヌクレオチドの操作は、発現ベクターに応じて望ましいか、または必要となり得る。組換えＤＮＡ法を使用してポリヌクレオチドを修飾する技術は、当技術分野で公知である。
【００５４】
制御配列は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現のための宿主細胞によって認識されるポリヌクレオチドであるプロモータであり得る。プロモータは、ポリペプチドの発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモータは、ミュータント、切断およびハイブリッドプロモータを含む宿主細胞において転写活性を示すいずれかのポリヌクレオチドであり得、ならびに、宿主細胞に対して相同性または非相同性である細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られ得る。
【００５５】
糸状真菌宿主細胞において本発明の核酸構築物の転写を指令する好適なプロモータの例としては、以下：アスペルギルス・ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）中性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）酸安定α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）またはアスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）アルカリ性タンパク分解酵素、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ、フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼ（国際公開第９６／００７８７号パンフレット）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）アミログルコシダーゼ（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、フザリウム・ベネナツム・ダリア（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ  Ｄａｒｉａ）（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、フザリウム・ベネナツム・クイン（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ  Ｑｕｉｎｎ）（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）β−グルコシダーゼ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＩＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＶ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩＩＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）β−キシロシダーゼ、およびトリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）翻訳伸長因子、ならびに、ＮＡ２−ｔｐｉプロモータ（非翻訳リーダが、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子由来の非翻訳リーダで置換された、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）中性α−アミラーゼ遺伝子由来の修飾プロモータ；非限定的例としては、非翻訳リーダがアスペルギルス・ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）またはアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子由来の非翻訳リーダで置換された、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）中性α−アミラーゼ遺伝子由来の修飾プロモータが挙げられる）の遺伝子から得られるプロモータ；ならびに、その突然変異体、切断およびハイブリッドプロモータがある。その他のプロモータは、米国特許第６，０１１，１４７号明細書に記載されている。
【００５６】
制御配列はまた、宿主細胞によって認識されて転写を終結させる転写ターミネータであり得る。ターミネータは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの３’−末端に作動可能にリンクする。本発明においては、宿主細胞において機能するいずれかのターミネータが用いられ得る。
【００５７】
糸状真菌宿主細胞の好ましいターミネータは、下記の遺伝子から得られる：アスペルギルス・ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼ、アスペルギルス・ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）アントラニル酸シンターゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）α−グルコシダーゼ、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）β−グルコシダーゼ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＩＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＶ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩＩＩ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）β−キシロシダーゼ、ならびに、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）翻訳伸長因子。
【００５８】
制御配列は、プロモータの下流で、かつ遺伝子のコード配列の上流のｍＲＮＡ安定化領域であってもよく、これは、遺伝子の発現を増大させる。
【００５９】
制御配列はまた、リーダ、すなわち、ｍＲＮＡの非翻訳領域であってもよく、これは、宿主細胞による翻訳にとって重要である。リーダは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’−末端に作動可能にリンクさせる。宿主細胞において機能性であれば、どんなリーダを用いてもよい。
【００６０】
糸状真菌宿主細胞の好ましいリーダは、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼおよびアスペルギルス・ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）トリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られる。
【００６１】
制御配列はまた、ポリヌクレオチドの３’−末端に作動可能にリンクし、転写された場合に、ポリアデノシン残基を転写ｍＲＮＡに負荷するシグナルとして宿主細胞により認識される配列であるポリアデニル化配列であり得る。宿主細胞において機能するポリアデニル化配列のいずれかが用いられ得る。
【００６２】
糸状真菌宿主細胞の好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギルス・ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）アントラニル酸シンターゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）α−グルコシダーゼ、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、およびフザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られる。
【００６３】
制御配列はまた、ポリペプチドのＮ−末端にリンクしたシグナルペプチドをコードし、および、ポリペプチドを細胞の分泌経路に送るシグナルペプチドコード領域であり得る。ポリヌクレオチドのコード配列の５’−末端は、ポリペプチドをコードするコード配列のセグメントと共に、翻訳読み枠に元々リンクしたシグナルペプチドコード配列を本質的に含有し得る。または、コード配列の５’−末端は、コード配列に対して外来性のシグナルペプチドコード配列を含有し得る。コード配列がシグナルペプチドコード配列を元々含有していない場合には、外来性のシグナルペプチドコード配列が必要とされる場合がある。または、外来性のシグナルペプチドコード配列は単に、ポリペプチドの分泌を増強するために天然シグナルペプチドコード配列を置き換えてもよい。しかしながら、発現ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に送るいずれかのシグナルペプチドコード配列がもちいられてもよい。
【００６４】
糸状真菌宿主細胞の効果的なシグナルペプチドコード配列は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）中性アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）セルラーゼ、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）エンドグルカナーゼＶ、フミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）リパーゼおよびリゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード配列である。
【００６５】
制御配列はまた、ポリペプチドのＮ−末端でプロペプチド位置をコードするプロペプチドコード配列であり得る。得られたポリペプチドは、酵素原またはプロポリペプチド（または、いくつかの場合においてチモーゲン）として公知である。プロポリペプチドは、一般に非活性であり、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒または自己触媒切断によって活性ポリペプチドに転換されることが可能である。プロペプチドコード配列は、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）アルカリ性タンパク分解酵素（ａｐｒＥ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中性タンパク分解酵素（ｎｐｒＴ）、ミセリオフトラ・テルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）ラッカーゼ（国際公開第９５／３３８３６号パンフレット）、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼおよびサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α−因子の遺伝子から得られ得る。
【００６６】
シグナルペプチドおよびプロペプチド配列の両方が存在する場合、プロペプチド配列はポリペプチドのＮ−末端に隣接して位置されており、また、シグナルペプチド配列は、プロペプチド配列のＮ−末端に隣接して位置されている。
【００６７】
宿主細胞の増殖に対してポリペプチドの発現を調節する調節配列を付加することが望ましい場合もある。調節配列の例は、調節化合物の存在を含む化学的または物理的刺激に応じて、遺伝子の発現をオンオフさせるものである。糸状菌においては、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼプロモータ、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡα−アミラーゼプロモータ、およびアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）グルコアミラーゼプロモータ、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩプロモータおよびトリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩＩプロモータが用いられ得る。調節配列の他の例は、遺伝子増幅を可能とするものである。真核系において、これらの調節配列は、メトトレキセートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、および、重金属を伴って増幅されるメタロチオネイン遺伝子を含む。これらの事例において、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、調節配列と作動可能にリンクしているであろう。
【００６８】
本発明の好ましい実施形態では、対象のポリペプチドは、宿主細胞に対して相同的または異種であり；好ましくは、対象のポリペプチドは、分泌されたポリペプチドであり；より好ましくは、これは、ホルモン、酵素、受容体もしくはその一部、抗体もしくはその一部、またはリポータであり；さらに好ましくは、対象のポリペプチドは、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼもしくはトランスフェラーゼであり；最も好ましくは、対象のポリペプチドは、α−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンドグルカナーゼ、エステラーゼ、グルコアミラーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、またはキシラーゼである。
【００６９】
発現ベクター
本発明はまた、本明細書に定義した通りの対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、プロモータ、ならびに、転写および翻訳終止シグナルを含む組換え発現ベクターに関する。種々のヌクレオチドおよび制御配列が一緒になって、このような部位でポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの挿入または置換を可能とするために１つまたは複数の好都合な制限部位を含み得る組換え発現ベクターが生成される。または、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む核酸構築物を発現に適切なベクターに挿入することにより発現され得る。発現ベクターの形成において、コード配列は、コード配列が、発現に適切な制御配列と作動可能にリンクするようベクター中に位置されている。
【００７０】
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ法に簡便に供されることが可能であり、ポリヌクレオチドの発現をもたらすことが可能であるいずれかのベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であり得る。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入される宿主細胞に対するベクターの親和性に応じることとなる。ベクターは、直鎖または閉鎖された環状プラスミドであり得る。
【００７１】
ベクターは、例えばプラスミド、染色体外要素、微小染色体または人工染色体といった、自己複製ベクター（すなわち、染色体外のエンティティとして存在し、その複製が染色体複製とは無関係なベクター）であり得る。ベクターは、自己複製を確実とするための何らかの手段を含有し得る。または、ベクターは、宿主細胞に導入された際に、ゲノム中に統合され、および、中に統合された染色体と一緒に複製されるものであり得る。しかも、単一のベクターもしくはプラスミド、または、一緒になって、宿主細胞のゲノムに導入される全ＤＮＡを含有する２つ以上のベクターもしくはプラスミド、または、トランスポゾンが用いられてもよい。
【００７２】
ベクターは、形質転換、形質移入、形質導入などされた細胞の選択を容易とする１つまたは複数の選択マーカを含有することが好ましい。選択マーカは、その生成物が、殺生剤またはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求体に対する原栄養性などをもたらす遺伝子である。
【００７３】
糸状真菌宿主細胞に使用される選択マーカとして、限定するものではないが、ａｄｅＡ（ホスホリボシルアミノイミダゾール−スクシノカルボキサミドシンターゼ）、ａｄｅＢ（ホスホリボシル−アミノイミダゾールシンターゼ）、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ならびにこれらの同等物が挙げられる。アスペルギルス・ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）またはアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ａｍｄＳおよびｐｙｒＧ遺伝子ならびにストレプトマイセス・ハイグロスコピクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）ｂａｒ遺伝子が、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞での使用に好ましい。ａｄｅＡ、ａｄｅＢ、ａｍｄＳ、ｈｐｈ、及びｐｙｒＧ遺伝子が、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞での使用に好ましい。
【００７４】
選択マーカは、国際公開第２０１０／０３９８８９号パンフレットに記載されている通り、二重選択マーカ系であってもよい。一態様では、二重選択マーカは、ｈｐｈ−ｔｋ二重選択マーカ系である。
【００７５】
ベクターは、宿主細胞のゲノムへのベクターの統合、または、ゲノムとは無関係の細胞中のベクターの自律複製を許容する要素を含有することが好ましい。
【００７６】
宿主細胞ゲノムへの統合に関して、ベクターは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列、または、相同的もしくは非相同的組換えによるゲノムへの統合に係るベクターのいずれかの他の要素に依存し得る。または、ベクターは、染色体における正確な位置での宿主細胞のゲノムへの相同的組換えによる統合をもたらす追加のポリヌクレオチドを含有していてもよい。正確な位置で統合される可能性を高めるために、統合要素は、相同的組換えの確率を高めるために対応する標的配列に対して高度の配列同一性を有する、１００〜１０，０００塩基対、４００〜１０，０００塩基対および８００〜１０，０００塩基対などの十分な数の核酸を含有しているべきである。統合要素は、宿主細胞のゲノム中の標的配列と相同的であるいずれかの配列であり得る。さらに、統合要素は、非コーディングまたはコーディングポリヌクレオチドであり得る。他方で、ベクターは、非相同的組換えにより宿主細胞のゲノムに統合され得る。
【００７７】
自律複製に関して、ベクターは、対象の宿主細胞におけるベクターの自律的な複製を可能とする複製起点をさらに含んでいてもよい。複製起点は、細胞において機能する自律複製を媒介するいずれかのプラスミドレプリケータであり得る。「複製起点」または「プラスミドレプリケータ」という用語は、インビボでのプラスミドまたはベクターの複製を可能とするポリヌクレオチドを意味する。
【００７８】
糸状真菌細胞において有用な複製起点の例は、ＡＭＡ１およびＡＮＳ１（Ｇｅｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｇｅｎｅ  ９８：６１−６７；Ｃｕｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：９１６３−９１７５；国際公開第００／２４８８３号パンフレット）である。ＡＭＡ１遺伝子の単離およびＡＭＡ１遺伝子を含むプラスミドまたはベクターの構築は、国際公開第００／２４８８３号パンフレットに開示されている方法に従って達成可能である。
【００７９】
本発明のポリヌクレオチドの２つ以上のコピーが宿主細胞に挿入されて、ポリペプチドの生成が高められてもよい。ポリヌクレオチドのコピーの数は、配列の少なくとも１つの追加のコピーを宿主細胞ゲノムに統合することにより、または、増幅可能な選択マーカ遺伝子をポリヌクレオチドに含めることにより増加させることが可能であり、ここで、選択マーカ遺伝子の増幅されたコピー、従って、ポリヌクレオチドの追加のコピーを含有する細胞は、適切な選択可能な薬剤中で細胞を培養することにより選択可能である。
【００８０】
上記の要素を連結して本発明の組換え発現ベクターを構築するために用いられる手法は、当業者に周知である（例えば、前述のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９を参照のこと）。
【００８１】
宿主細胞
本発明はまた、本発明のポリペプチドの生成をもたらす１つまたは複数の制御配列に作動可能にリンクした本発明のポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞に関する。ポリヌクレオチドを含む構築物もしくはベクターは、構築物もしくはベクターが染色体性組み込み体として、もしくは、既述の自己複製余剰−染色体性ベクターとして維持されるよう宿主細胞に導入される。「宿主細胞」という用語は、複製の最中に生じる突然変異により親細胞と同等ではない親細胞のいずれかの子孫を包含する。宿主細胞の選択は、ポリペプチドをコードする遺伝子およびそのソースに大きく依存することとなる。
【００８２】
突然変異糸状真菌宿主細胞は、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ブエルカンデラ属（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ）、セリポリオプシス属（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、コプリヌス属（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、コリオルス属（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィリバシジウム属（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスチクス属（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、パエシロマイセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ファネロケーテ属（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、フレビア属（Ｐｈｌｅｂｉａ）、ピロマイセス属（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、プレウロツス属（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、シゾフィルム属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、テルモアスクス属（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、トラメテス属（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）またはトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞であり得る。
【００８３】
例えば、糸状真菌宿主細胞は、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、ヤケイロタケ（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ  ａｄｕｓｔａ）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ａｎｅｉｒｉｎａ）、セリポリオプシス・カレギエア（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｃａｒｅｇｉｅａ）、セリポリオプシス・ギルベスセンス（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｇｉｌｖｅｓｃｅｎｓ）、セリポリオプシス・パンノシンタ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｐａｎｎｏｃｉｎｔａ）、セリポリオプシス・リブロサ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｒｉｖｕｌｏｓａ）、セリポリオプシス・スブルファ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｓｕｂｒｕｆａ）、セリポリオプシス・スブベルミスポラ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｓｕｂｖｅｒｍｉｓｐｏｒａ）、クリソスポリウム・イノプス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｉｎｏｐｓ）、クリソスポリウム・ケラチノフィルム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｋｅｒａｔｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）、クリソスポリウム・ルクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、クリソスポリウム・メルダリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｍｅｒｄａｒｉｕｍ）、クリソスポリウム・パンニコラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｐａｎｎｉｃｏｌａ）、クリソスポリウム・クイーンスランジクム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・トロピクム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｔｒｏｐｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・ゾナツム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｚｏｎａｔｕｍ）、コプリヌス・シネレウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｃｉｎｅｒｅｕｓ）、クリオルス・ヒルスツス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｈｉｒｓｕｔｕｓ）、フザリウム・バクテリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウム・クロークウェレンス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウムグラミヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウム・ヘテロスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ネグンディ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・レチクランツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム・ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム・サムブシヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）���フザリウム・サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウムス・ポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウム・トルロスム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウム・トリコテシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、ミセリオフトラ・テルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム・プルプロゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ファネロケーテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フレビア・ラジアタ（Ｐｈｌｅｂｉａ  ｒａｄｉａｔａ）、プレウロツス・エリンギイ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｅｒｙｎｇｉｉ）、チエラビア・テルレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トラメテス・ビロサ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｖｉｌｌｏｓａ）、トラメテス・ベルシコロル（Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、トリコデルマ・ハルジアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアツム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）またはトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）細胞であり得る。
【００８４】
真菌細胞は、それ自体公知の様式でのプロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、および、細胞壁の再生を含むプロセスにより形質転換され得る。アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）およびトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）宿主細胞の形質転換に好適な手法は、欧州特許第２３８０２３号明細書、Ｙｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：１４７０−１４７４、ならびにＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１４１９−１４２２に記載されている。フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種の形質転換に好適な方法は、Ｍａｌａｒｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｇｅｎｅ  ７８：１４７−１５６および国際公開第９６／００７８７号パンフレットに記載されている。
【００８５】
生成方法
本発明は、本発明のポリペプチドを生成する方法に関し、この方法は、（ａ）ポリペプチドの産生を促す条件下で、本発明の第１または第３の態様で定義した通りの組換えもしくは突然変異糸状真菌宿主細胞を培養するステップ；および、任意選択で、（ｂ）ポリペプチドを回収するステップを含む。
【００８６】
宿主細胞は、技術分野において既知である方法を用いてポリペプチドの生成に好適な栄養培地中で培養される。例えば、細胞は、好適な培地中ならびにポリペプチドの発現および／または単離が許容される条件下で行われる、振盪フラスコ培養により、および、実験用もしくは産業用発酵槽における小規模もしくは大規模発酵（連続式、バッチ式、フェドバッチ式または固体状発酵を含む）により培養され得る。培養は、炭素および窒素源および無機塩を含む好適な栄養培地において、技術分野において公知である手法を用いて行われる。好適な媒体は、商業的な供給者から入手可能であるか、または、公開された組成に従って調製され得る（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログ）。ポリペプチドが栄養培地に分泌される場合、ポリペプチドは培地から直接回収可能である。ポリペプチドが分泌されない場合、細胞ライセートから回収可能である。
【００８７】
ポリペプチドは、ポリペプチドに特異的な技術分野において公知である方法を用いて検出され得る。これらの検出方法として、限定するものではないが、特定の抗体の使用、酵素産物の形成、または、酵素基質の消失などが挙げられる。例えば、酵素アッセイを用いてポリペプチドの活性を判定してもよい。
【００８８】
ポリペプチドは技術分野において公知である方法を用いて回収され得る。例えば、ポリペプチドは、特にこれらに限定されないが、収集、遠心分離、ろ過、抽出、噴霧乾燥、蒸発または沈殿を含む従来の手法により栄養培地から回収され得る。一態様では、ポリペプチドを含む発酵ブロスを回収する。
【００８９】
ポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチドを得るために、特にこれらに限定されないが、クロマトグラフィ（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシングおよびサイズ排除）、電気泳動的手法（例えば、分取等電点電気泳動）、較差溶解度（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、または、抽出（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＪａｎｓｏｎおよびＲｙｄｅｎ編，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９を参照のこと）を含む技術分野において公知である多様な手法によって精製され得る。
【００９０】
代替的な態様においては、ポリペプチドは回収されず、ポリペプチドを発現する本発明の宿主細胞がポリペプチドのソースとして用いられ得る。
【００９１】
培養および対象の産物の回収に用いる方法は、当技術分野で公知の方法により実施してよい。
【実施例】
【００９２】
Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）α−グルカンシンターゼ遺伝子及び遺伝子産物
アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）α−グルカンシンターゼ（ａｇｓＡ）遺伝子は、配列番号１（ゲノムＤＮＡ）および配列番号２（ｃＤＮＡ）に示される。コードされたＡｇｓＡシンターゼのアミノ酸は、配列番号３に示される。
【００９３】
アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）α−グルカンシンターゼ（ａｇｓＥ）遺伝子は、配列番号４（ゲノムＤＮＡ）および配列番号５（ｃＤＮＡ）に示される。コードされたＡｇｓＡシンターゼのアミノ酸は、配列番号６に示される。
【００９４】
材料および方法
分子クローニング技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄｎ．）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。
【００９５】
酵素
ＤＮＡ操作のための酵素（例えば、制限エンドヌクレアーゼ、リガーゼなど）は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．から入手可能であり、製造者の指示に従って使用した。
【００９６】
培地および溶液
ＡＭＧ微量金属溶液は、０．３ｇのクエン酸、０．６８ｇのＺｎＣｌ２、０．２５ｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０２４ｇのＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１．３９ｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．３５６ｇのＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、および１リットルまでの脱イオン水から構成された。
【００９７】
ＣＯＶＥ−Ｎ−ｇｌｙプレートは、２１８ｇのソルビトール、１０ｇのグリセロール、２．０２ｇのＫＮＯ３、５０ｍｌのＣＯＶＥ塩溶液、２５ｇのノーブル（Ｎｏｂｌｅ）寒天、および１リットルまでの脱イオン水から構成された。
【００９８】
ＣＯＶＥ培地は、３４２．３ｇのスクロース、２０ｍｌの５０×ＣＯＶＥ塩溶液、１０ｍｌの１Ｍアセトアミド、１０ｍｌの１．５Ｍ  ＣｓＣｌ２、２５ｇのノーブル寒天、および１リットルまでの脱イオン水から構成された。
【００９９】
ＣＯＶＥ２培地は、３０ｇのスクロース、２０ｍｌの５０×ＣＯＶＥ塩溶液、１０ｍｌの１Ｍアセトアミド、２５ｇのノーブル寒天、および１リットルまでの脱イオン水から構成された。
【０１００】
ＣＯＶＥ−Ｎプレートは、３４２．３ｇのスクロース、２０ｍｌのＣＯＶＥ塩溶液、３ｇのＮａＮＯ３、３０ｇのノーブル寒天、および１リットルまでの脱イオン水から構成された。
【０１０１】
ＣＯＶＥ−Ｎトップアガロースは、３４２．３ｇのスクロース、２０ｍｌのＣＯＶＥ塩溶液、３ｇのＮａＮＯ３、１０ｇの低融点アガロース、および１リットルまでの脱イオン水から構成された。
【０１０２】
ＣＯＶＥ−Ｎ  ＪＰプレートは、３０ｇのスクロース、２０ｍｌのＣＯＶＥ塩溶液、３ｇのＮａＮＯ３、３０ｇのノーブル寒天、および１リットルまでの脱イオン水から構成された。
【０１０３】
ＣＯＶＥ塩溶液は、２６ｇのＫＣｌ、２６ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、７６ｇのＫＨ２ＰＯ４、５０ｍｌのＣＯＶＥ微量金属溶液、および１リットルまでの脱イオン水から構成された。
【０１０４】
ＣＯＶＥ微量金属溶液は、０．０４ｇのＮａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ、０．４ｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、１．２ｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．０ｇのＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．８ｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、１０ｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、および１リットルまでの脱イオン水から構成された。
【０１０５】
ＬＢ培地は、１０ｇのトリプトン、５ｇの酵母エキス、５ｇの塩化ナトリウム、および１リットルまでの脱イオン水から構成された。
【０１０６】
ＬＢプラスアンピシリンプレートは、１０ｇのトリプトン、５ｇの酵母エキス、５ｇの塩化ナトリウム、１５ｇのバクト（Ｂａｃｔｏ）寒天、１ｍｌ当たり１００μｇのアンピシリン、および１リットルまでの脱イオン水から構成された。
【０１０７】
ＭＳＳ培地は、７０ｇのスクロース、１００ｇのダイズ粉末、３滴のプロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）消泡剤、および１リットルまでの脱イオン水から構成され；ｐＨを６．０に調節した。
【０１０８】
尿素を含まないＭＵ−１ｇｌｕ培地は、２６０ｇのグルコース、３ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、６ｇのＫ２ＳＯ４、５ｇのＫＨ２ＰＯ４、０．５ｍｌのＡＭＧ微量金属溶液、数滴の消泡剤、および１リットルまでの脱イオン水から構成され；ｐＨを４．５に調節した。
【０１０９】
５０％尿素は、５００ｇの尿素と１リットルまでの脱イオン水から構成された。
【０１１０】
ＹＰＧ培地は、１０ｇの酵母エキス、２０ｇのバクト（Ｂａｃｔｏ）ペプトン、２０ｇのグルコース、および１リットルまでの脱イオン水から構成された。
【０１１１】
ＳＴＣは、０．８Ｍソルビトール、２５ｍＭまたは５０ｍＭトリスｐＨ８、および２５ｍＭまたは５０ｍＭＣａＣｌ２から構成された。
【０１１２】
ＳＰＴＣは、ＳＴＣバッファー中４０％ポリエチレングリコール４０００（ＰＥＧ４０００）から構成された。
【０１１３】
ＳＯＣ培地は、２０ｇのトリプトン、５ｇの酵母エキス、０．５ｇのＮａＣｌ、１０ｍｌの２５０ｍＭ  ＫＣｌ、および１リットルまでの脱イオン水から構成された。
【０１１４】
ＴＡＥバッファーは、４．８４ｇのトリス塩基、１．１４ｍｌの氷酢酸、２ｍｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡｐＨ８．０、および１リットルまでの脱イオン水から構成された。
【０１１５】
購入した材料
プラスミド構築および増幅のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５−α（Ｔｏｙｏｂｏ）を使用した。ＰＣＲ断片のクローニングのために市販のプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ＃２１２２０６）を使用した。Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で、増幅プラスミドを回収した。ＤＮＡ連結キット（Ｔａｋａｒａ）またはＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて、連結反応を実施した。Ｅｘｐａｎｄ（商標）ＰＣＲシステム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施した。ＰＣＲ断片の精製およびアガロースゲルからのＤＮＡ断片の抽出のために、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用した。
【０１１６】
株
ノボザイム（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ）により発現宿主株アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）を単離し、これを、アミログリコシダーゼ活性およびαアミラーゼ活性の発現を破壊するように遺伝子改変した後、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）シトシンデアミナーゼ遺伝子（ｆｃｙ１）を導入した。
【０１１７】
プラスミド
プラスミドｐＨＵｄａ８０１は、国際公開第２０１２１６００９３号パンフレットの実施例４に記載されている。
【０１１８】
プラスミドｐＨＵｄａ１０１９は、国際公開第２０１２１６００９３号パンフレットの実施例２に記載されている。
【０１１９】
酵素遺伝子の発現のベクター用のプラスミドｐＲｉｋａ１４７は、国際公開第２０１２１６００９３号パンフレットの実施例９に記載されている。
【０１２０】
アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）の形質転換
親アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）宿主細胞の形質転換は、Ｙｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｔｒｐＣ  ｐｌａｓｍｉｄ，“Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９８４  Ｍａｒ；８１（５）：１４７０−４に記載されているように、糸状真菌での形質転換のための公知の一般的方法を用いて、下記の通り達成した：
宿主株がｐｙｒＧ欠失突然変異体である場合には、１０ｍＭウリジンで補充した１００ｍｌのＹＰＧ培地に、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）宿主株を接種し、３２℃、８０ｒｐｍで１６時間インキュベートした。ペレットを収集し、０．６Ｍ  ＫＣｌで洗浄した後、１ｍｌ当たり２０ｍｇの最終濃度で市販のβ−グルカナーゼ製品（ＧＬＵＣＡＮＥＸ（商標）、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ，Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を含有する２０ｍｌの０．６Ｍ  ＫＣｌに再懸濁させた。プロトプラストが形成されるまで、懸濁液を３２℃、８０ｒｐｍでインキュベートし、続いてＳＴＣバッファーで２回洗浄した。プロトプラストをヘマトメータで計数してから、ＳＴＣ：ＳＴＰＣ：ＤＭＳＯの８：２：０．１溶液に再懸濁させ、最終濃度２．５×１０７プロトプラスト／ｍｌに調節した。約４μｇのプラスミドＤＮＡを１００μｌのプロトプラスト懸濁液に添加し、穏やかに混合した後、氷上で３０分間インキュベートした。１ｍｌのＳＰＴＣを添加し、プロトプラスト懸濁液を３７℃で２０分間インキュベートした。１０ｍｌの５０℃のＣＯＶＥ−Ｎトップアガロースを添加後、混合物を最少培地に注ぎ、これらのプレートを３０℃で５日間インキュベートした。
【０１２１】
ＰＣＲ増幅
５×ＰＣＲバッファー（ＭｇＣｌ２を含む）                  ２０μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰミックス                              １０μｌ
フォワードプライマー（１００μＭ）                          １μｌ
リバースプライマー（１００μＭ）                            １μｌ
エキスパンド  ハイフィディリティポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）    １μｌ
鋳型ＤＮＡ（５０〜１００ｎｇ／μｌ）                          １μｌ
蒸留水                                                  １００μｌまで
【０１２２】
【表１】
2017532055.tif 000002
【０１２３】
リポータ酵素生成のための振盪フラスコ培養
選択した形質転換体の胞子を１００ｍｌのＭＳＳ培地に接種し、３０℃で３日間培養した。１０％のシード培養物を実験室規模のタンク内のＭＵ−１ｇｌｕ培地に移し、ここに適切な量のグルコースおよびアンモニウムを供給し、３４℃で６日間培養した。上清を遠心分離により取得した。遠心分離後の培養物上清を酵素アッセイに用いた。
【０１２４】
サザンハイブリダイゼーション
選択した形質転換体の菌糸体を、３ｍｌのＹＰＧ培地中の一晩培養物から採取し、蒸留水で洗浄した。粉砕した菌糸体を、ＦａｓｔＤＮＡ  ＳＰＩＮ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｓｏｉｌ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を用いたゲノムＤＮＡ調製に、製造者の指示に従って供した。ＰＣＲ  ＤＩＧプローブ合成キット（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ  ＩＮ）を用い、製造者の指示に従って非放射性プローブを合成した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用い、製造者の指示に従ってＤＩＧ標識プローブをゲル精製した。
【０１２５】
５マイクログラムのゲノムＤＮＡを適切な制限酵素で１６時間完全に消化した（４０μｌ総量、４Ｕ酵素／μｌＤＮＡ）後、０．８％アガロースゲル上で泳動させた。ＤＮＡは、０．２Ｍ  ＨＣｌで処理することによりゲル中で断片化し、変性させ（０．５Ｍ  ＮａＯＨ、１．５Ｍ  ＮａＣｌ）、中和した（１Ｍトリス、ｐＨ７．５；１．５Ｍ  ＮａＣｌ）後、２０×ＳＳＣ中でＨｙｂｏｎｄ  Ｎ＋膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に転移した。ＤＮＡを膜にＵＶ架橋させてから、２０ｍｌのＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において４２℃で１時間プレハイブリダイズした。変性プローブをＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂバッファーに直接添加し、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションを実施した。ハイブリダイゼーション後の洗浄（各々、２×ＳＳＣ、室温で５分を２回、および０．１×ＳＳＣ、６８℃で１５分を２回）に続いて、ＤＩＧ検出システムおよびＣＰＤ−Ｓｔａｒ（Ｒｏｃｈｅ）を用いた化学発光検出を製造者のプロトコルに従って実施した。ＤＩＧ標識ＤＮＡ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｒｋｅｒ  ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ）を標準的マーカに用いた。
【０１２６】
ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）アッセイ（全タンパク質判定）
ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）アッセイ、すなわち比色タンパク質分析は、色素Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ  Ｇ−２５０の吸光度シフトに基づき、この場合、酸性条件下で、色素の赤色形態が、より青色の形態に変換されて、アッセイ対象のタンパク質に結合する。色素とタンパク質の結合は、青色のアニオン形態を安定化させる。５９５ｎｍでの吸光度の増加は、結合した色素の量、従って、サンプル中に存在するタンパク質の量（濃度）に比例する。
【０１２７】
酵素サンプルを蒸留水で適度に希釈してから、それらのタンパク質の量をＱｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ（商標）ブラッドフォードタンパク質アッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｉｎｃ．）の使用により、製造者の指示に従って測定した。
【０１２８】
実施例１：アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ａｇｓＡ遺伝子の標的遺伝子破壊のためのベクターである、プラスミドｐＨＵｄａ１６８５の構築
プラスミドｐＨＵｄａ１６８５は、ターミネータ反復配列を有する選択マーカとしてのＡ．ニズランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＧ）により分離されるアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）α−グルカンシンターゼ（ａｇｓＡ）遺伝子の５’および３’フランキング領域と、ヒト単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ−１）チミジンキナーゼ遺伝子を含むように構築した。ＨＳＶ−１チミジンキナーゼ遺伝子は、ａｇｓＡ遺伝子の３’フランキング領域の３’側に位置し、これによって、ａｇｓＡ遺伝子座への組み込みを正しくターゲティングしないアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）形質転換体の対抗選択が可能になる。プラスミドは、以下に記載する通り、いくつかのステップで構築した。
【０１２９】
Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ａｇｓＡの５’フランキング領域を含有するＰＣＲ産物は、下記のプライマーを用いて作製した。
プライマーａｇｓＡ１（センス）：５’ｇｇｔｇｇｃｇｇｃｃｇｃｃｔｇｔｇａａｔａｇｃｔａｃｃａｇｃ（配列番号７）
プライマーａｇｓＡ２（アンチセンス）：５’ｃｔｃｃａｃｔａｇｔｔｇｃｔａａｔｇｔａｔｔａｔｃｃａｔｇａ（配列番号８）
【０１３０】
約１００ｎｇのアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）Ｃ３１０５のゲノムＤＮＡ、１μｌのＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、１００μＭのプライマーａｇｓＡ１、１００μＭのプライマーａｇｓＡ２、５×ＰＣＲバッファー（ＭｇＣｌ２を含む）、２０μｌの２．５ｍＭ  ｄＮＴＰミックス（総量；１００μｌ）から構成される反応物中のＰＣＲにより、所望の断片を増幅した。反応物をＢｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）Ｃ１０００  Ｔｏｕｃｈ（商標）Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒにおいてインキュベートしたが、これは、９４℃で２分を１サイクル；各々が９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、および７２℃で２分を３０サイクル；７２℃で７分を１サイクル；ならびに４℃での保持のようにプログラムした。得られた２，５０９ｂｐのＰＣＲ断片は、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動により精製し、ゲルから切除した後、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて抽出した。精製した２，５０９ｂｐのＰＣＲ断片は、ＮｏｔＩおよびＳｐｅＩにより消化した。
【０１３１】
プラスミドｐＨＵｄａ８０１（国際公開第２０１２１６００９３Ａ１号パンフレットの実施例４）は、ＮｏｔＩおよびＳｐｅＩで消化した後、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動により精製したが、ここでは、９，５５８ｂｐ断片をゲルから切除し、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて抽出した。１μｌの上記９，５５８ｂｐ断片、３μｌの上記２，５０９ｂｐＰＣＲ断片、１μｌの５×リガーゼバッファー、５μｌの２×リガーゼバッファー、および１μｌのリガーゼから構成される反応物中で、９，５５８ｂｐ断片を２，５０９ｂｐ断片と連結させた（Ｒｏｃｈｅ  Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）。連結反応物を室温で１０分間インキュベートした。５μｌの連結混合物をＤＨ５−αケミカルコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に形質転換した。形質転換体をＬＢプラスアンピシリンプレート上に延ばし、３７℃で一晩インキュベートした。ＱＩＡミニ−プレップキットを用いて、いくつかの形質転換体からプラスミドＤＮＡを精製した。適切な制限酵素の使用により、プラスミドＤＮＡを適切な連結反応についてスクリーニングした後、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動に付した。１つのプラスミドをｐＨＵｄａ８０１−５’ａｇｓＡと称した。
【０１３２】
Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ａｇｓＡの３’フランキング領域を含むＰＣＲ産物は、下記のプライマーを用いて作製した。
プライマーａｇｓＡ３（センス）：５’ｃｔｔｃｔａｇａｇｔｔｔａａａｃａａｃｃｇｃｃｔｃａｇｃａｇ（配列番号９）
プライマーａｇｓＡ４（アンチセンス）：５’ｔｔａａｔｔａａａｇａａｇｇｇｃａｔｔｃｔａｔｇｇａｃｇｔａ（配列番号１０）
【０１３３】
約１００ｎｇのアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）Ｃ３１０５のゲノムＤＮＡ、１μｌのＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、１００μＭのプライマーａｇｓＡ３、１００μＭのプライマーａｇｓＡ４、５×ＰＣＲバッファー（ＭｇＣｌ２を含む）、２０μｌの２．５ｍＭ  ｄＮＴＰミックス（総量；１００μｌ）から構成される反応物中のＰＣＲにより、所望の断片を増幅した。反応物をＢｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）Ｃ１０００  Ｔｏｕｃｈ（商標）Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒにおいてインキュベートしたが、これは、９４℃で２分を１サイクル；各々が９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、および７２℃で２分を３０サイクル；７２℃で７分を１サイクル；ならびに４℃での保持のようにプログラムした。得られた２，２９９ｂｐのＰＣＲ断片は、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動により精製し、ゲルから切除した後、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて抽出した。精製した２，２９９ｂｐのＰＣＲ断片は、ＸｂａＩおよびＰａｃＩにより消化した。
【０１３４】
プラスミドｐＨＵｄａ８０１−５’ａｇｓＡは、ＸｂａＩおよびＰａｃＩで消化した後、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動により精製し、ここで、１０，０３０ｂｐ断片をゲルから切除し、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて抽出した。１μｌの上記１０，０３０ｂｐ断片、３μｌの上記２，２９９ｂｐ断片、１μｌの５×リガーゼバッファー、５μｌの２×リガーゼバッファーおよび１μｌのリガーゼから構成される反応物中で、１０，０３０ｂｐ断片を２，２９９ｂｐＰＣＲ断片と連結させた（Ｒｏｃｈｅ  Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）。連結反応物を室温で１０分間インキュベートした。５μｌの連結混合物をＤＨ５−αケミカルコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に形質転換した。形質転換体をＬＢプラスアンピシリンプレート上に延ばし、３７℃で一晩インキュベートした。ＱＩＡミニ−プレップキットを用いて、いくつかの形質転換体からプラスミドＤＮＡを精製した。適切な制限酵素の使用により、プラスミドＤＮＡを適切な連結反応についてスクリーニングした後、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動に付した。１つのプラスミドをｐＨＵｄａ１６８５と称した（図２）。
【０１３５】
実施例２：アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ａｇｓＥ遺伝子の標的遺伝子破壊のためのベクターである、プラスミドｐＨＵｄａ１７０１の構築
プラスミドｐＨＵｄａ１７０１は、選択マーカとしてのＡ．ニズランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼ遺伝子（ａｍｄＳ）により分離されるアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）α−グルカンシンターゼ（ａｇｓＥ）遺伝子の５’および３’フランキング領域と、ヒト単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ−１）チミジンキナーゼ遺伝子を含むように構築した。ＨＳＶ−１チミジンキナーゼ遺伝子は、ａｇｓＥ遺伝子の３’フランキング領域の３’側に位置し、これによって、ａｇｓＥ遺伝子座に正しくターゲティングしないアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）形質転換体の対抗選択が可能になる。プラスミドは、以下に記載する通り、いくつかのステップで構築した。
【０１３６】
Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ａｇｓＥの５’フランキング領域を含むＰＣＲ産物は、下記のプライマーを用いて作製した。
プライマーａｇｓＥ１（センス）：５’ａｃｃｇｃｇｇｔｃｔｔｔｃａｇｃｃａｇｇｇａａｔｇｇｃｔ（配列番号１１）
プライマーａｇｓＥ２（アンチセンス）：５’ｔｔａｃｔａｇｔａｃａｃａａｔａｇｔｇｃａｇｇｔｇａｔｇｔｃ（配列番号１２）
【０１３７】
約１００ｎｇのアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）Ｃ３１０５のゲノムＤＮＡ、１μｌのＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、１００μＭのプライマーａｇｓＥ１、１００μＭのプライマーａｇｓＥ２、５×ＰＣＲバッファー（ＭｇＣｌ２を含む）、２０μｌの２．５ｍＭ  ｄＮＴＰミックス（総量；１００μｌ）から構成される反応物中で、所望の断片をＰＣＲにより増幅した。反応物をＢｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）Ｃ１０００  Ｔｏｕｃｈ（商標）Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒにおいてインキュベートしたが、これは、９４℃で２分を１サイクル；各々が９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、および７２℃で２分を３０サイクル；７２℃で７分を１サイクル；ならびに４℃での保持のようにプログラムした。得られた２，３００ｂｐのＰＣＲ断片は、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動により精製し、ゲルから切除した後、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて抽出した。精製した２，３００ｂｐのＰＣＲ断片は、ＳａｃＩＩおよびＳｐｅＩにより消化した。
【０１３８】
プラスミドｐＨＵｄａ８０１（国際公開第２０１２１６００９３Ａ１号パンフレットの実施例４）は、ＳａｃＩＩおよびＳｐｅＩで消化した後、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動により精製し、ここで、９，５６１ｂｐ断片をゲルから切除し、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて抽出した。１μｌの上記９，５６１ｂｐ断片、３μｌの上記２，３００ｂｐ断片、１μｌの５×リガーゼバッファー、５μｌの２×リガーゼバッファーおよび１μｌのリガーゼから構成される反応物中で、９，５６１ｂｐ断片を２，３００ｂｐＰＣＲ断片と連結させた（Ｒｏｃｈｅ  Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）。連結反応物を室温で１０分間インキュベートした。５μｌの連結混合物をＤＨ５−αケミカルコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に形質転換した。形質転換体をＬＢプラスアンピシリンプレート上に延ばし、３７℃で一晩インキュベートした。ＱＩＡミニ−プレップキットを用いて、いくつかの形質転換体からプラスミドＤＮＡを精製した。適切な制限酵素の使用により、プラスミドＤＮＡを適切な連結反応についてスクリーニングした後、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動に付した。１つのプラスミドをｐＨＵｄａ８０１−５’ａｇｓＥと称した。
【０１３９】
Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ａｇｓＥの３’フランキング領域を含有するＰＣＲ産物は、下記のプライマーを用いて作製した。
プライマーａｇｓＥ３（センス）：５’ｔｔｔｃｔａｇａｃｇｃｃｔｔａａｔｇａｔｇｔｇｇｔｇｇｔｇ（配列番号１３）
プライマーａｇｓＥ４（アンチセンス）：５’ｔｔａａｔｔａａａｔｇｇｃｇｃｃｃａｃｔｇｃｔａｃａｇｇ（配列番号１４）
【０１４０】
約１００ｎｇのアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）Ｃ３１０５のゲノムＤＮＡ、１μｌのＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、１００μＭのプライマーａｇｓＥ３、１００μＭのプライマーａｇｓＥ４、５×ＰＣＲバッファー（ＭｇＣｌ２を含む）、２０μｌの２．５ｍＭ  ｄＮＴＰミックス（総量；１００μｌ）から構成される反応物中のＰＣＲにより、所望の断片を増幅した。反応物をＢｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）Ｃ１０００  Ｔｏｕｃｈ（商標）Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒにおいてインキュベートしたが、これは、９４℃で２分を１サイクル；各々が９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、および７２℃で２分を３０サイクル；７２℃で７分を１サイクル；ならびに４℃での保持のようにプログラムした。得られた２，２８０ｂｐのＰＣＲ断片は、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動により精製し、ゲルから切除した後、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて抽出した。精製した２，２８０ｂｐのＰＣＲ断片をＸｂａＩおよびＰａｃＩにより消化した。
【０１４１】
プラスミドｐＨＵｄａ８０１−５’ａｇｓＥは、ＸｂａＩおよびＰａｃＩで消化した後、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動により精製し、ここで、９，８３０ｂｐ断片をゲルから切除し、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて抽出した。１μｌの上記９，８３０ｂｐ断片、３μｌの上記２，２８０ｂｐ断片、１μｌの５×リガーゼバッファー、５μｌの２×リガーゼバッファーおよび１μｌのリガーゼから構成される反応物中で、９，８３０ｂｐ断片を２，２８０ｂｐＰＣＲ断片と連結させた（Ｒｏｃｈｅ  Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）。連結反応物を室温で１０分間インキュベートした。５μｌの連結混合物をＤＨ５−αケミカルコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に形質転換した。形質転換体をＬＢプラスアンピシリンプレート上に延ばし、３７℃で一晩インキュベートした。ＱＩＡミニ−プレップキットを用いて、いくつかの形質転換体からプラスミドＤＮＡを精製した。適切な制限酵素の使用により、プラスミドＤＮＡを適切な連結反応についてスクリーニングした後、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動に付した。１つのプラスミドをｐＨＵｄａ８０１−５’ａｇｓＥ−３’ａｇｓＥと称した。
【０１４２】
プラスミドｐＨＵｄａ８０１−５’ａｇｓＥ−３’ａｇｓＥは、ＸｂａＩおよびＳｐｅＩで消化した後、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動により精製し、ここで、９，９４６ｂｐ断片をゲルから切除し、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて抽出した。プラスミドｐＨＵｄａ１０１９（国際公開第２０１２１６００９３号パンフレットの実施例２に記載）は、ＸｂａＩおよびＡｖｒＩＩで消化した後、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動により精製し、ここで、ａｍｄＳ遺伝子、Ａ．オリゼー（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ｔｅｆ１（翻訳伸長因子１）プロモータおよびＡ．オリゼー（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）ターミネータを含む３，１１４ｂｐ断片をゲルから切除し、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて抽出した。１μｌの上記９，９４６ｂｐ断片、３μｌの上記３，１１４ｐ断片、１μｌの５×リガーゼバッファー、５μｌの２×リガーゼバッファーおよび１μｌのリガーゼから構成される反応物中で、９，９４６ｂｐ断片を３，１１４ｂｐ断片と連結させた（Ｒｏｃｈｅ  Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）。連結反応物を室温で１０分間インキュベートした。５μｌの連結混合物をＤＨ５−αケミカルコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に形質転換した。形質転換体をＬＢプラスアンピシリンプレート上に延ばし、３７℃で一晩インキュベートした。ＱＩＡミニ−プレップキットを用いて、いくつかの形質転換体からプラスミドＤＮＡを精製した。適切な制限酵素の使用により、プラスミドＤＮＡを適切な連結反応についてスクリーニングした後、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動に付した。１つのプラスミドをｐＨＵｄａ１７０１と称した（図３）。
【０１４３】
実施例３：アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）Ｃ３１０５ａｇｓＡ遺伝子の破壊
Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）Ｃ３１０５のｐｙｒＧ遺伝子を以下の通りレスキューした。株Ｃ３１０５を、１０ｍＭウリジンおよび１ｇ／Ｌの５−フルオロ−オロチン酸（５−ＦＯＡ）を含有するＣｏｖｅ−Ｎ  ＪＰ培地に３０℃で５日かけて接種した。ｐｙｒＧ遺伝子を欠失した株は、５−ＦＯＡの存在下で増殖するであろう；この遺伝子を保持する株は、５−ＦＯＡを、毒性中間体である５−フルオロ−ＵＭＰに変換するであろう。増殖したコロニーを、無菌爪楊枝を用いて、１０ｍＭウリジンで補充したＣＯＶＥ−Ｎ−ｇｌｙプレートに移し、３０℃で７日間増殖させた。単離した株をＭ１４０５と称した。
【０１４４】
アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）株Ｍ１４０５のプロトプラストは、１０ｍＭウリジンで補充した１００ｍｌのＹＰＧ培地においてこの株を３２℃で１６時間にわたり８０ｒｐｍで穏やかに攪拌しながら培養することにより調製した。ペレットを収集し、０．６Ｍ  ＫＣｌで洗浄した後、１ｍｌ当たり２０ｍｇの最終濃度で市販のβ−グルカナーゼ製品（ＧＬＵＣＡＮＥＸ（商標）、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ，Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を含有する２０ｍｌの０．６Ｍ  ＫＣｌに再懸濁させた。プロトプラストが形成されるまで、懸濁液を３２℃、８０ｒｐｍでインキュベートした。ＭＩＲＡＣＬＯＴＨ（登録商標）でライニングした漏斗を介して５０ｍｌの無菌プラスチック製遠心管中にプロトプラストを濾過した後、０．６Ｍ  ＫＣｌで洗浄して、捕捉したプロトプラストを抽出した。合わせた濾過物および上清を２，０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離により収集した。上清を廃棄し、ペレットを１０〜２５ｍｌのＳＴＣで洗浄し、２，０００ｒｐｍで１０分間再度遠心分離し、続いてＳＴＣバッファーで２回洗浄した。プロトプラストをヘマトメータで計数してから、ＳＴＣ：ＳＴＰＣ：ＤＭＳＯの８：２：０．１溶液に再懸濁させ、最終濃度２．５×１０７プロトプラスト／ｍｌに調節した。
【０１４５】
約１０μｇのｐＨＵｄａ１６８５を０．３ｍｌのＭ１４０５プロトプラスト懸濁液に添加し、穏やかに混合した後、氷上で３０分間インキュベートした。３ｍｌのＳＰＴＣを添加し、プロトプラスト懸濁液を３７℃で２０分間インキュベートした。１２ｍｌの５０℃のＣＯＶＥ−Ｎトップアガロースを添加後、混合物をＣＯＶＥ−Ｎプレートに注ぎ、これらのプレートを３０℃で７日間インキュベートした。増殖した形質転換体を、ｐＨＵｄａ１６８５に存在する単純ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ）（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ）を発現する細胞を殺傷する薬剤である、１．５μＭ５−フルオロ−２−デオキシウリジン（ＦｄＵ）で補充したＣＯＶＥ−Ｎ  ＪＰプレートに無菌爪楊枝で移した。単一の胞子単離物をＣＯＶＥ−Ｎ−ｇｌｙプレートに移した。
【０１４６】
ａｇｓＡ遺伝子を破壊する、ｐＨＵｄａ１６８５を含有するアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）株Ｍ１４０５の形質転換体候補をサザン分析によりスクリーニングした。胞子精製形質転換体の各々を３ｍｌのＹＰＧ培地で培養し、２００ｒｐｍで振盪しながら３０℃で２日間インキュベートした。ＭＩＲＡＣＬＯＴＨ（登録商標）でライニングした漏斗を用いて、バイオマスを収集した。粉砕した菌糸体を、ＦａｓｔＤＮＡ  ＳＰＩＮ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｓｏｉｌ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を用いたゲノムＤＮＡ調製に製造者の指示に従って供した。
【０１４７】
ａｇｓＡ遺伝子座の破壊を確認するために、サザンブロット分析を実施した。各形質転換体からの５μｇのゲノムＤＮＡをＳｐｅＩで消化した。ゲノムＤＮＡ消化反応物は、５μｇのゲノムＤＮＡ、１μｌのＳｐｅＩ、２μｌの１０×ＮＥＢｕｆｆｅｒ４、および２０μｌまでの水から構成された。ゲノムＤＮＡ消化物を３７℃で約１６時間インキュベートした。消化物は、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動に付し、ＴＵＲＢＯＢＬＯＴＴＥＲ（登録商標）を用いて、ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＨ，ＵＳＡ）上に、製造者の推奨事項に従い約１時間ブロッティングした。この膜を５００ｂｐジゴキシゲニン標識アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ｇａｓＡプローブとハイブリダイズしたが、このプローブは、以下に示すプライマーａｇｓＡ５（センス）およびａｇｓＡ６（アンチセンス）を用いたＰＣＲによるジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰの組み込みにより合成したものである。
フォワードプライマー（ａｇｓＡ５）：５’ａｇｃａｇｔｃｔｃｇｇｃｇｇｃｇａｇｇａ（配列番号１５）
リバースプライマー（ａｇｓＡ６）：５’ａｔｔｇｃｃｃａａｇｃｇｇｃｇｔｃｔｃａ（配列番号１６）
【０１４８】
増幅反応物（１００μｌ）は、最終容量１００μｌで、２００μＭのＰＣＲ  ＤＩＧ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｍｉｘ（バイアル２）（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、０．５μＭのプライマー、ＥＸＰＡＮＤ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｅｎｚｙｍｅミックス（バイアル１）（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、および鋳型としての１μｌ（１００ｐｇ／μｌ）のｐＨＵｄａ１６８５から構成された。増幅反応物をＢｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）Ｃ１０００  Ｔｏｕｃｈ（商標）Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒにおいてインキュベートしたが、これは、９４℃で２分を１サイクル；各々が９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、および７２℃で２分を３０サイクル、ならびに４℃での保持のようにプログラムした。ＰＣＲ産物は、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動により精製し、ここで、０．５ｋｂ断片をゲルから切除した後、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて抽出した。変性プローブをＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂバッファーに直接添加し、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションを実施した。ハイブリダイゼーション後の洗浄（各々、２×ＳＳＣ、室温で５分を２回、および０．１×ＳＳＣ、６８℃で１５分を２回）に続いて、ＤＩＧ検出システムおよびＣＰＤ−Ｓｔａｒ（Ｒｏｃｈｅ）を用いた化学発光検出を製造者のプロトコルに従って実施した。ＤＩＧ標識ＤＮＡ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｒｋｅｒ  ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ）を標準的マーカに用いた。
【０１４９】
ａｇｓＡ遺伝子座における正しい組み込み（１１．９ｋｂから４．７ｋｂにシフトしたハイブリダイズバンド）を有する形質転換体ａｇｓＡ突然変異株Ｍ１４０５−１６８５−１６を後の実験のために選択した。図１を参照されたい。
【０１５０】
実施例４：Ｃ３１０５およびＭ１４０５−１６８５−１６におけるアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ａｇｓＥ遺伝子の破壊
アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）株Ｃ３１０５およびＭ１４０５−１６８５−１６のプロトプラストは、１００ｍｌのＹＰＧ培地においてこの株を３２℃で１６時間にわたり８０ｒｐｍで穏やかに攪拌しながら培養することにより調製した。ペレットを収集し、０．６Ｍ  ＫＣｌで洗浄した後、１ｍｌ当たり２０ｍｇの最終濃度で市販のβ−グルカナーゼ製品（ＧＬＵＣＡＮＥＸ（商標）、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ，Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を含有する２０ｍｌの０．６Ｍ  ＫＣｌに再懸濁させた。プロトプラストが形成されるまで、懸濁液を３２℃、８０ｒｐｍでインキュベートした。ＭＩＲＡＣＬＯＴＨ（登録商標）でライニングした漏斗を介して５０ｍｌの無菌プラスチック製遠心分離管中にプロトプラストを濾過した後、０．６Ｍ  ＫＣｌで洗浄して、捕捉したプロトプラストを抽出した。合わせた濾過物および上清を２，０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離により収集した。上清を廃棄し、ペレットを１０〜２５ｍｌのＳＴＣで洗浄し、２，０００ｒｐｍで１０分間再度遠心分離し、続いてＳＴＣバッファーで２回洗浄した。プロトプラストをヘマトメータで計数してから、ＳＴＣ：ＳＴＰＣ：ＤＭＳＯの８：２：０．１溶液に再懸濁させ、最終濃度２．５×１０７プロトプラスト／ｍｌに調節した。
【０１５１】
約１０μｇのｐＨＵｄａ１７０１を０．３ｍｌのプロトプラスト懸濁液に添加し、穏やかに混合した後、氷上で３０分間インキュベートした。３ｍｌのＳＰＴＣを添加し、プロトプラスト懸濁液を３７℃で２０分間インキュベートした。１２ｍｌの５０℃のＣＯＶＥトップアガロースを添加後、混合物をＣＯＶＥプレートに注ぎ、これらのプレートを３０℃で７日間インキュベートした。増殖した形質転換体を、ｐＨＵｄａ１７０１に存在する単純ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ）（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ）を発現する細胞を殺傷する薬剤である、１．５μＭ５−フルオロ−２−デオキシウリジン（ＦｄＵ）で補充したＣＯＶＥ−２プレートに無菌爪楊枝で移した。単一の胞子単離物をＣＯＶＥ−Ｎ−ｇｌｙプレートに移した。
【０１５２】
ａｇｓＥ遺伝子を破壊する、ｐＨＵｄａ１７０１を含有するアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）株Ｃ３１０５およびＭ１４０５−１６８５−１６の形質転換体候補をサザン分析によりスクリーニングした。胞子精製形質転換体の各々を３ｍｌのＹＰＧ培地で培養し、２００ｒｐｍで振盪しながら３０℃で２日間インキュベートした。ＭＩＲＡＣＬＯＴＨ（登録商標）でライニングした漏斗を用いて、バイオマスを収集した。粉砕した菌糸体を、ＦａｓｔＤＮＡ  ＳＰＩＮ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｓｏｉｌ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を用いたゲノムＤＮＡ調製に製造者の指示に従って供した。
【０１５３】
ａｇｓＥ遺伝子座の破壊を確認するために、サザンブロット分析を実施した。各形質転換体からの５μｇのゲノムＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩで消化した。ゲノムＤＮＡ消化反応物は、５μｇのゲノムＤＮＡ、０．５μｌのＨｉｎｄＩＩＩ、０．５μｌのＸｂａＩ、２μｌの１０×ＮＥＢｕｆｆｅｒ４、および２０μｌまでの水から構成された。ゲノムＤＮＡ消化物を３７℃で約１６時間インキュベートした。消化物は、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動に付し、ＴＵＲＢＯＢＬＯＴＴＥＲ（登録商標）を用いて、ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＨ，ＵＳＡ）上に、製造者の推奨事項に従い約１時間ブロッティングした。この膜を５００ｂｐジゴキシゲニン標識アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ａｇｓＥプローブとハイブリダイズしたが、このプローブは、以下に示すプライマーａｇｓＥ５（センス）およびａｇｓＥ６（アンチセンス）を用いたＰＣＲにより、ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰの組み込みにより合成したものである。
フォワードプライマー（ａｇｓＥ５）：５’ａｃｃｇｇｇｃａｔｇａａｃａｔｔｔａａｃ（配列番号１７）
リバースプライマー（ａｇｓＥ６）：５’ａａｇｔａｔｔｔａｔｔｇｔａｔｔｔｔｇｇ（配列番号１８）
【０１５４】
増幅反応物（１００μｌ）は、最終容量１００μｌで、２００μＭのＰＣＲ  ＤＩＧ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｍｉｘ（バイアル２）（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、０．５μＭのプライマー、ＥＸＰＡＮＤ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｅｎｚｙｍｅミックス（バイアル１）（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、および鋳型としての１μｌ（１００ｐｇ／μｌ）のｐＨＵｄａ１６８５から構成された。増幅反応物をＢｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）Ｃ１０００  Ｔｏｕｃｈ（商標）Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒにおいてインキュベートしたが、これは、９４℃で２分を１サイクル；各々が９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、および７２℃で３０秒を３０サイクル、ならびに４℃での保持のようにプログラムした。ＰＣＲ産物は、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動により精製し、ここで、０．５ｋｂ断片をゲルから切除した後、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて抽出した。変性プローブをＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂバッファーに直接添加し、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションを実施した。ハイブリダイゼーション後の洗浄（各々、２×ＳＳＣ、室温で５分を２回、および０．１×ＳＳＣ、６８℃で１５分を２回）に続いて、ＤＩＧ検出システムおよびＣＰＤ−Ｓｔａｒ（Ｒｏｃｈｅ）を用いた化学発光検出を製造者のプロトコルに従って実施した。ＤＩＧ標識ＤＮＡ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｒｋｅｒ  ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ）を標準的マーカに用いた。
【０１５５】
ａｇｓＥ遺伝子座での正しい組み込みを付与する（５．４ｋｂから３．２ｋｂにシフトしたハイブリダイズバンドにより示される）Ｃ３１０５およびＭ１４０５−１６８５−１６からそれぞれ作製された２つの株、Ｍ１４０５−１７０１−１および１６８５−１７０１−１１を後の実験のために選択した。図１を参照されたい。
【０１５６】
実施例５：サーモアスカス・オーランティアカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）金属−プロテアーゼ遺伝子（ａｐ０２５）発現ベクターｐＨＵｄａ１６５７およびｐＨＵｄａ１６９４の構築
プラスミドｐＨＵｄａ１６５７は、タンデムで配置されたアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）中性アミラーゼプロモータＩＩ（Ｐｎａ２）およびグルコアミラーゼターミネータ（Ｔａｍｇ）により駆動されるサーモアスカス・オーランティアカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）金属−プロテアーゼ遺伝子（ａｐ０２５）の２コピー、選択マーカとしてのＡ．ニズランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼ遺伝子（ａｍｄＳ）、ならびにアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）酸安定性アミラーゼプロモータ（ＰａｓａＡ）およびＡ．オリゼー（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）硝酸レダクターゼターミネータ（Ｔｎｉａｄ）により駆動される酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒａｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＦＬＰ組換え遺伝子（ｆｌｐ）を含有するように構築した。プラスミドｐＨＵｄａ１６９４は、選択マーカとして、ａｍｄＳ選択マーカではなく、Ａ．ニズランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＧ）を有する以外は、ｐＨＵｄａ１６５７と同じ構築物である。プラスミドは、以下に記載するようにいくつかのステップで構築した。
【０１５７】
ｐＨＵｄａ１２６０の構築
プラスミドｐＨＵｄａ１２６０は、ｐＲｉｋａ１４７においてＡ．ニズランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＧ）からＡ．ニズランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼ遺伝子（ａｍｄＳ）に変更することにより構築した。
【０１５８】
プラスミドｐＲｉｋａ１４７（国際公開第２０１２１６００９３号パンフレットの実施例９に記載）をＳｐｈＩおよびＳｐｅＩで消化した後、その末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼの使用により、製造者のプロトコル（ＮＥＢ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）に従って充填した。この断片を、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動により精製し、ここで、９，２４１ｂｐ断片をゲルから切除した後、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて抽出した。
【０１５９】
プラスミドｐＨＵｄａ１０１９（国際公開第２０１２１６００９３号パンフレットの実施例２に記載）をＸｂａＩおよびＡｖｒＩＩで消化した後、その末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼの使用により、製造者のプロトコル（ＮＥＢ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）に従って充填した。この断片を、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動により精製したが、ここで、ａｍｄＳ遺伝子、Ａ．オリゼー（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ｔｅｆ１（翻訳伸長因子１）プロモータおよびＡ．オリゼー（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）ターミネータを含有する３，１１４ｂｐ断片をゲルから切除した後、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて抽出した。１μｌの上記９，２４１ｂｐ断片、３μｌの上記３，１１４ｐ断片、１μｌの５×リガーゼバッファー、５μｌの２×リガーゼバッファーおよび１μｌのリガーゼから構成される反応物中で、９，２４１ｂｐ断片を３，１１４ｂｐ断片と連結させた（Ｒｏｃｈｅ  Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）。連結反応物を室温で１０分間インキュベートした。５μｌの連結混合物をＤＨ５−αケミカルコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に形質転換した。形質転換体をＬＢプラスアンピシリンプレート上に延ばし、３７℃で一晩インキュベートした。ＱＩＡミニ−プレップキットを用いて、いくつかの形質転換体からプラスミドＤＮＡを精製した。適切な制限酵素の使用により、プラスミドＤＮＡを適切な連結反応についてスクリーニングした後、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動に付した。１つのプラスミドをｐＨＵｄａ１２６０と称した（ＰＷＬ：プラスミドマップおよび全配列？）。
【０１６０】
プラスミドｐＨＵｄａ１６５７の構築
サーモアスカス・オーランティアカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）金属−プロテアーゼ遺伝子（ａｐ０２５）を含有するＰＣＲ産物は、下記のプライマーを用いて作製した。
プライマーａｐ０２５−１（センス）：５’ｔｔｔｇｇａｔｃｃａｃｃａｔｇｃｇｔｔｔｃａｔｔｔｃｔｇｔｃｔｃｃ（配列番号１９）
プライマーａｐ０２５−２（アンチセンス）：５’ｃｃａｃｇｔｇｔｔａｇｃａａｃｃａａｇｇｔａｔａｔｇｇｃａｔ（配列番号２０）
【０１６１】
国際公開第２００３０４８３５３号パンフレットに記載のａｐ０２５ｃＤＮＡ遺伝子を有するプラスミドＤＮＡ約１００ｎｇ、１μｌのＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、１００μＭのプライマーａｐ０２５−１、１００μＭのプライマーａｐ０２５−２、５×ＰＣＲバッファー（ＭｇＣｌ２を含む）、２０μｌの２．５ｍＭ  ｄＮＴＰミックス（総量；１００μｌ）から構成される反応物中のＰＣＲにより、所望の断片を増幅した。反応物をＢｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）Ｃ１０００  Ｔｏｕｃｈ（商標）Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒにおいてインキュベートしたが、これは、９４℃で２分を１サイクル；各々が９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、および７２℃で１分を３０サイクル；７２℃で７分を１サイクル；ならびに４℃での保持のようにプログラムした。得られた１，０７３ｂｐのＰＣＲ断片は、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動により精製し、ゲルから切除した後、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて抽出した。精製した１，０７３ｂｐのＰＣＲ断片をＢａｍＨＩおよびＰｍＩＩにより消化した。
【０１６２】
プラスミドｐＨＵｄａ１２６０は、ＢａｍＨＩおよびＰｍＩＩで消化した後、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動により精製したが、ここでは、１０，５１２ｂｐ断片をゲルから切除し、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて抽出した。１μｌの上記１０，５１２ｂｐ断片、３μｌの上記１，０７３ｂｐ断片、１μｌの５×リガーゼバッファー、５μｌの２×リガーゼバッファーおよび１μｌのリガーゼから構成される反応物中で、１０，５１２ｂｐ断片を１，０７３ｂｐＰＣＲ断片と連結させた（Ｒｏｃｈｅ  Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）。連結反応物を室温で１０分間インキュベートした。５μｌの連結混合物をＤＨ５−αケミカルコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に形質転換した。形質転換体をＬＢプラスアンピシリンプレート上に延ばし、３７℃で一晩インキュベートした。ＱＩＡミニ−プレップキットを用いて、いくつかの形質転換体からプラスミドＤＮＡを精製した。適切な制限酵素の使用により、プラスミドＤＮＡを適切な連結反応についてスクリーニングした後、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動に付した。１つのプラスミドをｐＨＵｄａ１５５５と称した。
【０１６３】
プラスミドｐＨＵｄａ１５５５をＳｐｅＩで消化した後、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動により精製し、ここで、１１，５８５ｂｐ断片をゲルから切除し、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて抽出した。
【０１６４】
プラスミドｐＨＵｄａ１５５５をＮｈｅＩおよびＳｐｅＩで消化した後、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動により精製し、ここで、ａｐ０２５遺伝子、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）中性アミラーゼプロモータＩＩ（Ｐｎａ２）およびグルコアミラーゼターミネータ（Ｔａｍｇ）を含有する２，６９９ｂｐ断片をゲルから切除し、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて抽出した。１μｌの上記１１，５８５ｂｐ断片、３μｌの上記２，６９９ｂｐ断片、１μｌの５×リガーゼバッファー、５μｌの２×リガーゼバッファーおよび１μｌのリガーゼから構成される反応物中で、１１，５８５ｂｐ断片を２，６９９ｂｐ断片と連結させた（Ｒｏｃｈｅ  Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）。連結反応物を室温で１０分間インキュベートした。５μｌの連結混合物をＤＨ５−αケミカルコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に形質転換した。形質転換体をＬＢプラスアンピシリンプレート上に延ばし、３７℃で一晩インキュベートした。ＱＩＡミニ−プレップキットを用いて、いくつかの形質転換体からプラスミドＤＮＡを精製した。適切な制限酵素の使用により、プラスミドＤＮＡを適切な連結反応についてスクリーニングした後、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動に付した。１つのプラスミドをｐＨＵｄａ１６５７と称した（図４）。
【０１６５】
プラスミドｐＨＵｄａ１６９４の構築
プラスミドｐＲｉｋａ１４７をＮｈｅＩおよびＳｐｅＩで消化した後、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動により精製したが、ここで、７，２６８ｂｐ断片をゲルから切除し、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて抽出した。
【０１６６】
プラスミドｐＨＵｄａ１６５７をＮｈｅＩおよびＳｐｅＩで消化した後、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動により精製したが、ここでは、ａｐ０２５遺伝子のタンデム構築物、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）中性アミラーゼプロモータＩＩ（Ｐｎａ２）およびグルコアミラーゼターミネータ（Ｔａｍｇ）を含有する５，０３６ｂｐ断片をゲルから切除し、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて抽出した。１μｌの上記７，２６８ｂｐ断片、３μｌの上記５，０３６ｂｐ断片、１μｌの５×リガーゼバッファー、５μｌの２×リガーゼバッファーおよび１μｌのリガーゼから構成される反応物中で、７，２６８ｂｐ断片を５，０３６ｂｐ断片と連結させた（Ｒｏｃｈｅ  Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）。連結反応物を室温で１０分間インキュベートした。５μｌの連結混合物をＤＨ５−αケミカルコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に形質転換した。形質転換体をＬＢプラスアンピシリンプレート上に延ばし、３７℃で一晩インキュベートした。ＱＩＡミニ−プレップキットを用いて、いくつかの形質転換体からプラスミドＤＮＡを精製した。適切な制限酵素の使用により、プラスミドＤＮＡを適切な連結反応についてスクリーニングした後、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動に付した。１つのプラスミドをｐＨＵｄａ１６９４と称した（図５）。
【０１６７】
実施例６：アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）株Ｃ３１０５およびＭ１４０５−１６８５−１６へのサーモアスカス・オーランティアカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）金属−プロテアーゼ遺伝子（ａｐ０２５）発現ベクターｐＨＵｄａ１６５７の導入
ａｐ０２５発現プラスミドは、ｆｌｐリコンビナーゼにより、４つの事前に指定された遺伝子座、すなわち、中性アミラーゼＩ（ａｍｙＡ）、中性アミラーゼＩＩ（ａｍｙＢ）、酸安定性アミラーゼ（ａｓａＡ）および推定アルカリスルファターゼ（ｐａｙＡ）に導入すべきである。
【０１６８】
アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）株Ｃ３１０５およびＭ１４０５−１６８５−１６のプロトプラストは、１００ｍｌのＹＰＧ培地においてこの株を３２℃で１６時間にわたって８０ｒｐｍで穏やかに攪拌しながら培養することにより調製した。ペレットを収集し、０．６Ｍ  ＫＣｌで洗浄した後、１ｍｌ当たり２０ｍｇの最終濃度で市販のβ−グルカナーゼ製品（ＧＬＵＣＡＮＥＸ（商標）、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ，Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を含有する２０ｍｌの０．６Ｍ  ＫＣｌに再懸濁させた。プロトプラストが形成されるまで、懸濁液を３２℃、８０ｒｐｍでインキュベートした。ＭＩＲＡＣＬＯＴＨ（登録商標）でライニングした漏斗を介して５０ｍｌの無菌プラスチック製遠心管中にプロトプラストを濾過した後、０．６Ｍ  ＫＣｌで洗浄して、捕捉したプロトプラストを抽出した。合わせた濾過物および上清を２，０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離により収集した。上清を廃棄し、ペレットを１０〜２５ｍｌのＳＴＣで洗浄し、２，０００ｒｐｍで１０分間再度遠心分離した後、ＳＴＣバッファーで２回洗浄した。プロトプラストをヘマトメータで計数してから、ＳＴＣ：ＳＴＰＣ：ＤＭＳＯの８：２：０．１溶液に再懸濁させ、最終濃度２．５×１０７プロトプラスト／ｍｌに調節した。
【０１６９】
約１０μｇのｐＨＵｄａ１６５７を０．３ｍｌのプロトプラスト懸濁液に添加し、穏やかに混合した後、氷上で３０分間インキュベートした。３ｍｌのＳＰＴＣを添加し、プロトプラスト懸濁液を３７℃で２０分間インキュベートした。Ｃ３１０５およびＭ１４０５−１６８５−１６に存在するアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）シトシンデアミナーゼ（ｆｃｙ１）遺伝子を発現する細胞を殺傷する薬剤である、５０マイクログラム／ｍｌの５’フルオロシトシン（５ＦＣ）で補充した１２ｍｌの５０℃のＣＯＶＥトップアガロースを添加後、混合物をＣＯＶＥプレートに注ぎ、これらのプレートを３０℃で１０日間インキュベートした。増殖した形質転換体を、１０μｇ／ｍｌの５’フルオロシトシン（５ＦＣ）で補充したＣＯＶＥ−２プレートに無菌爪楊枝で移した。単一の胞子単離物をＣＯＶＥ−Ｎ−ｇｌｙプレートに移した。
【０１７０】
ａｐ０２５遺伝子を導入する、ｐＨＵｄａ１６５７を含有するアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）株Ｃ３１０５およびＭ１４０５−１６８５−１６の形質転換体候補をサザン分析によりスクリーニングした。胞子精製形質転換体の各々を３ｍｌのＹＰＧ培地で培養し、２００ｒｐｍで振盪しながら３０℃で２日間インキュベートした。ＭＩＲＡＣＬＯＴＨ（登録商標）でライニングした漏斗を用いて、バイオマスを収集した。粉砕した菌糸体を、ＦａｓｔＤＮＡ  ＳＰＩＮ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｓｏｉｌ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を用いたゲノムＤＮＡ調製に製造者の指示に従って供した。
【０１７１】
４つの事前に指定された遺伝子座（ａｍｙＡ、ａｍｙＢ、ａｓａＡ、ｐａｙＡ）でのａｐ０２５遺伝子の導入を確認するために、サザンブロット分析を実施した。各形質転換体からの５μｇのゲノムＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化した。ゲノムＤＮＡ消化反応物は、５μｇのゲノムＤＮＡ、０．５μｌのＨｉｎｄＩＩＩ、２μｌの１０×ＮＥＢｕｆｆｅｒ４、および２０μｌまでの水から構成された。ゲノムＤＮＡ消化物を３７℃で約１６時間インキュベートした。消化物は、ＴＡＥバッファーを用いた０．５％アガロースゲル電気泳動に付し、ＴＵＲＢＯＢＬＯＴＴＥＲ（登録商標）を用いて、ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＨ，ＵＳＡ）上に、製造者の推奨事項に従い約１時間ブロッティングした。この膜を５００ｂｐジゴキシゲニン標識ａｐ０２５プローブとハイブリダイズしたが、このプローブは、以下に示すプライマーａｐ０２５−３（センス）およびａｐ０２５−４（アンチセンス）を用いたＰＣＲによるジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰの組み込みにより合成したものである。
フォワードプライマー（ａｐ０２５−３）：５’ａｇｇａｔｃａｇｔｔｃｃｔｇｃｔｃｃｇｇ（配列番号２１）
リバースプライマー（ａｐ０２５−４）：５’ｇｇｔａｔａｔｇｇｃａｔｔｃｇｃａｔａｇ（配列番号２２）
【０１７２】
増幅反応物（１００μｌ）は、最終容量１００μｌで、２００μＭのＰＣＲ  ＤＩＧ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｍｉｘ（バイアル２）（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、０．５μＭのプライマー、ＥＸＰＡＮＤ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｅｎｚｙｍｅミックス（バイアル１）（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、および鋳型としての１μｌ（１００ｐｇ／μｌ）のｐＨＵｄａ１５５５から構成された。増幅反応物をＢｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）Ｃ１０００  Ｔｏｕｃｈ（商標）Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒにおいてインキュベートしたが、これは、９４℃で２分を１サイクル；各々が９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、および７２℃で３０秒を３０サイクル、ならびに４℃での保持のようにプログラムした。ＰＣＲ産物は、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動により精製し、ここで、０．５ｋｂ断片をゲルから切除した後、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて抽出した。変性プローブをＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂバッファーに直接添加し、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションを実施した。ハイブリダイゼーション後の洗浄（各々、２×ＳＳＣ、室温で５分を２回、および０．１×ＳＳＣ、６８℃で１５分を２回）に続いて、ＤＩＧ検出システムおよびＣＰＤ−Ｓｔａｒ（Ｒｏｃｈｅ）を用いた化学発光検出を製造者のプロトコルに従って実施した。ＤＩＧ標識ＤＮＡ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｒｋｅｒ  ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ）を標準的マーカに用いた。
【０１７３】
親株Ｃ３１０５およびＭ１４０５−１６８５−１６からそれぞれ作製され、各々が４つの遺伝子座での正しい組み込み（６．６ｋｂ、７．０ｋｂ、８．６ｋｂおよび１０．１ｋｂのサイズの４つのハイブリダイズバンド）を有する、２つの株Ｃ３１０５−１６５７−８および１６８５−１６５７−１６を後の実験のために選択した。図１を参照されたい。
【０１７４】
実施例７：アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）株、Ｍ１４０５−１７０１−１および１６８５−１７０１−１１へのサーモアスカス・オーランティアカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）金属−プロテアーゼ遺伝子（ａｐ０２５）発現ベクターｐＨＵｄａ１６９４の導入
ａｐ０２５発現プラスミドは、ＦＬＰリコンビナーゼにより、４つの事前に指定された遺伝子座、すなわち、中性アミラーゼＩ（ａｍｙＡ）、中性アミラーゼＩＩ（ａｍｙＢ）、酸安定性アミラーゼ（ａｓａＡ）および推定アルカリスルファターゼ（ｐａｙＡ）に導入すべきである。
【０１７５】
Ｍ１４０５−１７０１−１および１６８５−１７０１−１１のｐｙｒＧ遺伝子を以下の通りレスキューした。両方の株を、１０ｍＭウリジンおよび１ｇ／Ｌの５−フルオロ−オロチン酸（５−ＦＯＡ）を含有するＣｏｖｅ−Ｎ  ＪＰ培地に３０℃で５日かけて接種した。ｐｙｒＧ遺伝子を欠失した株は、５−ＦＯＡの存在下で増殖し；この遺伝子を保持する株は、５−ＦＯＡを、毒性中間体である５−フルオロ−ＵＭＰに変換するであろう。増殖したコロニーを、１０ｍＭウリジンで補充したＣＯＶＥ−Ｎ−ｇｌｙプレートに無菌爪楊枝で移し、３０℃で７日間増殖させた。Ｍ１４０５−１７０１−１、１６８５−１７０１−１１から単離した株をそれぞれＭ１４０５−１７０１−Ｐ２および１６８５−１７０１−１１−Ｐ１と称した。
【０１７６】
アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）株Ｍ１４０５−１７０１−Ｐ２および１６８５−１７０１−１１−Ｐ１のプロトプラストは、１０ｍＭウリジンで補充した１００ｍｌのＹＰＧ培地においてこの株を３２℃で１６時間にわたり８０ｒｐｍで穏やかに攪拌しながら培養することにより、調製した。ペレットを収集し、０．６Ｍ  ＫＣｌで洗浄した後、１ｍｌ当たり２０ｍｇの最終濃度で市販のβ−グルカナーゼ製品（ＧＬＵＣＡＮＥＸ（商標）、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ，Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を含有する２０ｍｌの０．６Ｍ  ＫＣｌに再懸濁させた。プロトプラストが形成されるまで、懸濁液を３２℃、８０ｒｐｍでインキュベートした。ＭＩＲＡＣＬＯＴＨ（登録商標）でライニングした漏斗を介して５０ｍｌの無菌プラスチック製遠心管中にプロトプラストを濾過した後、０．６Ｍ  ＫＣｌで洗浄して、捕捉したプロトプラストを抽出した。合わせた濾過物および上清を２，０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離により収集した。上清を廃棄し、ペレットを１０〜２５ｍｌのＳＴＣで洗浄し、２，０００ｒｐｍで１０分間再度遠心分離した後、ＳＴＣバッファーで２回洗浄した。プロトプラストをヘマトメータで計数してから、ＳＴＣ：ＳＴＰＣ：ＤＭＳＯの８：２：０．１溶液に再懸濁させ、最終濃度２．５×１０７プロトプラスト／ｍｌに調節した。
【０１７７】
約１０μｇのｐＨＵｄａ１６９４を０．３ｍｌのプロトプラスト懸濁液に添加し、穏やかに混合した後、氷上で３０分間インキュベートした。３ｍｌのＳＰＴＣを添加し、プロトプラスト懸濁液を３７℃で２０分間インキュベートした。Ｍ１４０５−１７０１−Ｐ２および１６８５−１７０１−１１−Ｐ１に存在するアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）シトシンデアミナーゼ（ｆｃｙ１）遺伝子を発現する細胞を殺傷する薬剤である、５０μｇ／ｍｌの５’フルオロシトシン（５ＦＣ）で補充した１２ｍｌの５０℃のＣＯＶＥ−Ｎトップアガロースを添加後、混合物をＣＯＶＥ−Ｎプレートに注ぎ、これらのプレートを３０℃で１０日間インキュベートした。増殖した形質転換体を、１０マイクログラム／ｍｌの５’フルオロシトシン（５ＦＣ）で補充したＣＯＶＥ−Ｎ  ＪＰプレートに無菌爪楊枝で移した。単一の胞子単離物をＣＯＶＥ−Ｎ−ｇｌｙプレートに移した。
【０１７８】
ａｐ０２５遺伝子を導入する、ｐＨＵｄａ１６９４を含有するアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）株Ｍ１４０５−１７０１−Ｐ２および１６８５−１７０１−１１−Ｐ１の形質転換体候補をサザン分析によりスクリーニングした。胞子精製形質転換体の各々を３ｍｌのＹＰＧ培地で培養し、２００ｒｐｍで振盪しながら３０℃で２日間インキュベートした。ＭＩＲＡＣＬＯＴＨ（登録商標）でライニングした漏斗を用いて、バイオマスを収集した。粉砕した菌糸体を、ＦａｓｔＤＮＡ  ＳＰＩＮ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｓｏｉｌ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を用いたゲノムＤＮＡ調製に製造者の指示に従って供した。
【０１７９】
４つの事前に指定された遺伝子座（ａｍｙＡ、ａｍｙＢ、ａｓａＡ、ｐａｙＡ）でのａｐ０２５遺伝子の導入を確認するために、サザンブロット分析を実施した。各形質転換体からの５μｇのゲノムＤＮＡをＡｖｒＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。ゲノムＤＮＡ消化反応物は、５μｇのゲノムＤＮＡ、０．５μｌのＨｉｎｄＩＩＩ、２μｌの１０×ＮＥＢｕｆｆｅｒ４、および２０μｌまでの水から構成された。ゲノムＤＮＡ消化物を３７℃で約１６時間インキュベートした。消化物は、ＴＡＥバッファーを用いた０．５％アガロースゲル電気泳動に付し、ＴＵＲＢＯＢＬＯＴＴＥＲ（登録商標）を用いて、ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＨ，ＵＳＡ）上に、製造者の推奨事項に従い約１時間ブロッティングした。この膜を５００ｂｐジゴキシゲニン標識ａｐ０２５プローブとハイブリダイズしたが、このプローブは、以下に示すプライマーａｐ０２５−３（センス）およびａｐ０２５−４（アンチセンス）を用いたＰＣＲによる、ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＰの組み込みにより合成したものである。
フォワードプライマー（ａｐ０２５−３）：５’ａｇｇａｔｃａｇｔｔｃｃｔｇｃｔｃｃｇｇ（配列番号２３）
リバースプライマー（ａｐ０２５−４）：５’ｇｇｔａｔａｔｇｇｃａｔｔｃｇｃａｔａｇ（配列番号２４）
【０１８０】
増幅反応物（１００μｌ）は、最終容量１００μｌで、２００μＭのＰＣＲ  ＤＩＧ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｍｉｘ（バイアル２）（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、０．５μＭのプライマー、ＥＸＰＡＮＤ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｅｎｚｙｍｅミックス（バイアル１）（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、および鋳型としての１μｌ（１００ｐｇ／μｌ）のｐＨＵｄａ１５５５から構成された。増幅反応物をＢｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）Ｃ１０００  Ｔｏｕｃｈ（商標）Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒにおいてインキュベートしたが、これは、９４℃で２分を１サイクル；各々が９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、および７２℃で３０秒を３０サイクル、ならびに４℃での保持のようにプログラムした。ＰＣＲ産物は、ＴＡＥバッファーを用いた０．８％アガロースゲル電気泳動により精製し、ここで、０．５ｋｂ断片をゲルから切除した後、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて抽出した。変性プローブをＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂバッファーに直接添加し、４２℃で一晩のハイブリダイゼーションを実施した。ハイブリダイゼーション後の洗浄（各々、２×ＳＳＣ、室温で５分を２回、０．１×ＳＳＣ、６８℃で１５分を２回）に続いて、ＤＩＧ検出システムおよびＣＰＤ−Ｓｔａｒ（Ｒｏｃｈｅ）を用いた化学発光検出を製造者のプロトコルに従って実施した。ＤＩＧ標識ＤＮＡ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｒｋｅｒ  ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ）を標準的マーカに用いた。
【０１８１】
Ｍ１４０５−１７０１および１６８５−１７０１−１１からそれぞれ作製され、各々が４つの遺伝子座での正しい組み込み（６．０ｋｂ、６．３ｋｂ、７．３ｋｂおよび９．４ｋｂのサイズの４つのハイブリダイズバンド）を有する、２つの株１７０１−１６９４−１および１６８５−１７０１−１８を後の実験のために選択した。図１を参照されたい。
【０１８２】
実施例８：振盪フラスコ培養物中のＡＰ０２５プロテアーゼ発現評価
アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）株Ｃ３１０５−１６５７−８、１６８５−１６５７−１６、１７０１−１６９４−１および１６８５−１７０１−１６９４−１８をＣＯＶＥ−Ｎ−ｇｌｙプレート上で３０℃にて約１週間培養した。無菌のトランスファーピペットを用いて、各プレートから小さな栓子の一片をつまみ、これらを各々５００ｍｌフラスコ内の１００ｍｌのＭＳＳ培地に接種した。これらのフラスコを３０℃、２００ｒｐｍで３日間インキュベートした。次に、１０ｍｌの培養ブロスを５００ｍｌフラスコ内の１００ｍｌのＭＵ１ｇｌｕ培地に移した。これらのフラスコを３０℃、２００ｒｐｍで６日間インキュベートした。各培養物を１０ｍｌの試験管中、５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、プロテアーゼ生産性を決定するために培養上清を回収した。プロテアーゼ生産性アッセイは、Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ（商標）ブラッドフォードタンパク質アッセイキット（Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｉｎｃ．）を用いて実施した。培養上清は、蒸留水で適度に希釈した。ウシ血清アルブミン（ＷＡＫＯカタログ番号５１９−８３９２１）は、蒸留水中０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で出発し、０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で終了するいくつかのステップで希釈した。標準を含む各希釈物５μｌずつを９６ウェル平底プレートに移した。２５０μｌの１×Ｄｙｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ溶液を各ウェルに添加し、室温で５分間インキュベートした。反応の終点を５９５ｎｍで測定した。作成した標準曲線からの外挿により、全タンパク質生産性を決定し、１００％に設定したアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）株Ｃ３１０５−１６８５−８と比較した。
【０１８３】
振盪フラスコ内で、単一のａｇｓＡまたはａｇｓＥ遺伝子破壊株は、親参照株アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）株Ｃ３１０５−１６５７−８と同等か、またはそれより若干低いプロテアーゼＡＰ０２５生産性を示したものの、ａｇｓＡおよびａｇｓＥ二重遺伝子破壊株は、参照株アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）株Ｃ３１０５−１６５７−８より２３％高いＡＰ０２５生産性を付与した（表１）。
【０１８４】
【表２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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