(57)【要約】  本発明は、自然コンピテント細胞を共形質転換する組成物および方法を含む。本発明の１つの態様において、複数の核酸配列を１つまたは複数の自然コンピテント細胞に並行して導入する方法が含まれる。他の態様において、共形質転換された自然コンピテント細胞の異型混交プール、および核酸配列の２つ以上の集団を自然コンピテント細胞の集団に並行して導入するための装置も含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸分子を１つまたは複数の細胞に並行して導入する方法であって、
（ａ）自然コンピテント細胞を２つ以上の核酸分子と接触させるステップであって、核酸配列の少なくとも１つが選択可能マーカーを含む、ステップと、
（ｂ）そのマーカーについて選択するステップと
を含む方法。
【請求項２】
核酸分子を１つまたは複数の細胞に並行して導入する方法であって、
（ａ）自然コンピテント細胞を静的条件でインキュベートするステップと、
（ｂ）細胞を２つ以上の核酸分子と接触させるステップであって、核酸配列の少なくとも１つが選択可能マーカーを含む、ステップと、
（ｃ）そのマーカーについて選択するステップと
を含む方法。
【請求項３】
自然コンピテント細胞が細菌細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
自然コンピテント細胞がグラム陰性またはグラム陽性である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
自然コンピテント細胞がFirmicutes、Chroococcales、Bacteriodia、Chlorobi、Deinococci、Actinobacteria、Proteobacteria、およびEuryarchaeotaからなる群から選択される門に属する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
自然コンピテント細胞が、Bacillus、Cyanobacterium、Lactococcus、Acinetobacter、Neisseria、Haemophilus、Vibrio、またはStreptococcus細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
自然コンピテント細胞が、V. choleraeまたはS. pneumoniaeである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
自然コンピテント細胞が、表１に列挙された種から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
核酸分子の少なくとも１つが、自然コンピテント細胞のゲノムの遺伝子座に対する少なくとも１つのホモロジーアームを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ホモロジーアームが、約４ｋｂ未満の長さを有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
核酸分子の少なくとも１つが少なくとも１つのゲノム編集を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ゲノム編集が自然形質転換に関与する遺伝子に導入される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
２つ以上の核酸分子が非連鎖遺伝子マーカーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
自然コンピテント細胞を２つ以上の核酸分子と接触させるステップが、自然形質転換を最適化する少なくとも１つのゲノム編集を導入することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
選択可能マーカーが、レポーター遺伝子または薬物耐性遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
薬物耐性遺伝子が、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、およびペニシリン耐性遺伝子からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ステップａ）およびｂ）を繰り返すステップをさらに含み、それぞれの繰り返しが異なる選択可能マーカーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
細胞が、グラム陰性またはグラム陽性細菌である、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
核酸分子を１つまたは複数のポリヌクレオチド標的に並行して導入する方法であって、
（ａ）ポリヌクレオチド標的を２つ以上の核酸分子と接触させるステップであって、核酸配列の少なくとも１つが選択可能マーカーを含む、ステップと、
（ｂ）そのマーカーについて選択するステップと
を含む方法。
【請求項２０】
核酸分子が中立座に組み込まれる、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
核酸分子が不要な遺伝子を抗生物質耐性マーカーと置き換える、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
ポリヌクレオチド標的が細菌人工染色体、酵母人工染色体、またはベクターである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
ベクターが哺乳類発現ベクターである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
細胞を形質転換するステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
細胞が、細菌細胞、酵母細胞、または哺乳類細胞である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
細胞のｔｆｏＸ、ｒｅｃＡ、および／またはｔｆｏＸ遺伝子に遺伝子変異を導入するステップを含む、自然コンピテント細胞の形質転換効率を最適化するための方法。
【請求項２８】
細胞がグラム陽性またはグラム陰性細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
細胞が、V. Choleraeである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
共形質転換細胞の異型混交プールであって、
２つ以上の共形質転換された核酸分子を含み、
細胞が、自然コンピテントであり、２つ以上の核酸分子で共形質転換されており、核酸分子の少なくとも１つが選択可能マーカーを含む、異型混交プール。
【請求項３１】
選択可能マーカーが、レポーター遺伝子または薬物耐性遺伝子である、請求項３０に記載の異型混交プール。
【請求項３２】
薬物耐性遺伝子が、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、およびペニシリン耐性遺伝子からなる群から選択される、請求項３０に記載の異型混交プール。
【請求項３３】
自然コンピテント細胞がFirmicutes、Chroococcales、Bacteriodia、Chlorobi、Deinococci、Actinobacteria、Proteobacteria、およびEuryarchaeotaからなる群から選択される、請求項３０に記載の異型混交プール。
【請求項３４】
自然コンピテント細胞が、表１に列挙された種から選択される、請求項３０に記載の異型混交プール。
【請求項３５】
２つ以上の核酸分子が非連鎖遺伝子マーカーを含む、請求項３０に記載の異型混交プール。
【請求項３６】
核酸分子の少なくとも１つが、自然コンピテント細胞のゲノムの遺伝子座に対する少なくとも１つのホモロジーアームを含む、請求項３０に記載の異型混交プール。
【請求項３７】
ホモロジーアームが、約４ｋｂ未満の長さを有する、請求項３０に記載の異型混交プール。
【請求項３８】
核酸分子の少なくとも１つが少なくとも１つのゲノム編集を含む、請求項３０に記載の異型混交プール。
【請求項３９】
ゲノム編集が、自然形質転換に関与する遺伝子に導入される、請求項３０に記載の異型混交プール。
【請求項４０】
２つ以上の共形質転換された核酸分子のすべての組合せを含む、請求項３０に記載の異型混交プール。
【請求項４１】
核酸分子の２つ以上の集団を細胞の集団に並行して導入するための装置であって、
自然コンピテンスを誘導する静的条件を生成するように構成された、１つまたは複数の自然コンピテント細胞を含むレセプタクルと、
核酸分子の２つ以上の集団を含む容器であって、自然コンピテント細胞への共形質転換のために核酸分子の２つ以上の集団をレセプタクルに導入するようにレセプタクルと流体的につながっている、容器と、
自然コンピテンス条件を、共形質転換細胞を選択するための選択的増殖培地と置き換えるために、選択的増殖培地を含む容器と
を含む装置。
【請求項４２】
異なる選択的増殖培地を含む容器をさらに含む、請求項４１に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、その内容が参照により本明細書に組み入れられる、２０１４年５月２日に提出された米国特許仮出願第６１／９８７，９５５号の利益を主張する。
【０００２】
（連邦政府助成研究または開発に関する声明）
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与されたＡＩ０５５，０５８号およびＡＩ０４５，７４６号の下で米国政府の支援を受けてなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
多重ゲノム編集、すなわちゲノムにおける多数の異なる部位での同時編集のためのツールは、数が限られており、現在は、モデル細菌において使用するために開発されているに過ぎない。
【背景技術】
【０００４】
「多重自動ゲノム工学法」またはＭＡＧＥとして知られる方法が、Escherichia coliにおいて開発され、この種の「加速進化」において大いに成功を収めており、代謝工学および表現型工学応用のために利用されている。この技術はまた、すべてのＵＡＧ終始コドンが同義のＵＡＡコドンと交換されたE. coliゲノムを「再コード化」するためにもきわめて重要であった。
【０００５】
ＭＡＧＥは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）オリゴヌクレオチドによる非常に効率的な組み換えに依存している。作用機序の点から、この方法は、ＤＮＡ複製の際にラギング鎖にｓｓＤＮＡオリゴをアニールすることを必要として、約２０％までの効率でゲノムに点突然変異または小さい挿入および欠失を導入することができる。この技術の重要な特徴は、変異に関してシスでの（in cis）選択がないことであり、これにより、得られた変異体プールに多重変異がランダムに分布することが可能となり、この集団における個々の細胞はあらゆる数および組合せのゲノム編集を有する。ＭＡＧＥは、微生物系における多重ゲノム編集方法の有用性を証明するが、この方法は、非モデル微生物には容易に適合しない。
【０００６】
最近、細菌のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに由来するＣａｓ−９エンドヌクレアーゼが、非モデル細菌微生物における標的化ゲノム工学のために利用されている。しかし、この方法は、編集されたゲノム座でのＣａｓ９選択を必要とする。それゆえ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓによるゲノム編集は、ＭＡＧＥに関して上記で述べた複雑な変異体プールを産生することができず、微生物系における表現型の加速進化のためにこの技術を使用することは制限される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
それゆえ、非モデル微生物である微生物系における多重ゲノム編集のための改善された方法が当技術分野において必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、一般的に、２つ以上の核酸分子によって自然コンピテント微生物（自然にコンピテントである微生物）を同時に形質転換するための方法およびこれらの分子を含む細胞を特徴とする。
【０００９】
１つの態様において、本発明は、一般的に、核酸分子を１つまたは複数の自然コンピテント細胞に並行して導入するための方法を提供する。他の態様において、核酸分子を１つまたは複数のポリヌクレオチド標的に並行して導入する方法、および自然コンピテント細胞の形質転換効率を最適化するための方法も含まれる。他の態様において、共形質転換された（co-transformed）自然コンピテント細胞の異型混交（heterogenic）プール、および核酸分子の２つ以上の集団を自然コンピテント細胞の集団に並行して導入するための装置も含まれる。
【００１０】
１つの態様において、本発明は、核酸分子を１つまたは複数の細胞に並行して導入する方法であって、（ａ）自然コンピテント細胞を２つ以上の核酸分子と接触させるステップであって、核酸配列の少なくとも１つが選択可能マーカーを含む、ステップと、（ｂ）そのマーカーについて選択するステップとを含む方法を含む。
【００１１】
別の態様において、本発明は、核酸分子を１つまたは複数の細胞に並行して導入する方法であって、（ａ）自然コンピテント細胞を静的条件でインキュベートするステップと、（ｂ）細胞を２つ以上の核酸分子と接触させるステップであって、核酸配列の少なくとも１つが選択可能マーカーを含む、ステップと、（ｃ）そのマーカーについて選択するステップとを含む方法を含む。
【００１２】
別の態様において、本発明は、核酸分子を１つまたは複数のポリヌクレオチド標的に並行して導入する方法であって、（ａ）ポリヌクレオチド標的を２つ以上の核酸分子と接触させるステップであって、核酸配列の少なくとも１つが選択可能マーカーを含む、ステップと、（ｂ）そのマーカーについて選択するステップとを含む方法を含む。
【００１３】
別の態様において、本発明は、細胞のｔｆｏＸ、ｒｅｃＡ、および／またはｔｆｏＸ遺伝子に遺伝子変異を導入するステップを含む、自然コンピテント細胞の形質転換効率を最適化するための方法を含む。別の態様において、本発明は、共形質転換細胞の異型混交プールであって、２つ以上の共形質転換核酸分子を含み、細胞が自然コンピテントであって２つ以上の核酸配列によって共形質転換されており、核酸分子の少なくとも１つが選択可能マーカーを含む、異型混交プールを含む。
【００１４】
本明細書で述べる本発明の上記態様または他の任意の態様の様々な実施形態において、自然コンピテント細胞は細菌細胞である。１つの実施形態において、自然コンピテント細胞は、グラム陰性またはグラム陽性である。１つの実施形態において、自然コンピテント細胞は、Firmicutes、Chroococcales、Bacteriodia、Chlorobi、Deinococci、Actinobacteria、Proteobacteria、およびEuryarchaeotaからなる群から選択される門に属する。別の実施形態において、自然コンピテント細胞は、Bacillus、Cyanobacterium、Lactococcus、Acinetobacter、Neisseria、Haemophilus、Vibrio、またはStreptococcus細胞である。別の実施形態において、自然コンピテント細胞は、V. cholerae、またはS. pneumoniaeである。別の実施形態において、自然コンピテント細胞は表１に列挙された種から選択される。
【００１５】
別の実施形態において、核酸分子の少なくとも１つは、自然コンピテント細胞のゲノムの遺伝子座に対する少なくとも１つのホモロジーアーム（一続きのホモロジー部分）を含む。いくつかの実施形態において、ホモロジーアームは、約４ｋｂ未満の長さを有する。なお別の実施形態において、核酸分子の少なくとも１つは少なくとも１つのゲノム編集を含む。いくつかの実施形態において、ゲノム編集は、自然形質転換に関与する遺伝子に導入される。なお別の実施形態において、２つ以上の核酸配列は、非連鎖遺伝子マーカーを含む。
【００１６】
別の実施形態において、自然コンピテント細胞を２つ以上の核酸分子と接触させるステップは、自然形質転換を最適化する少なくとも１つのゲノム編集を導入するステップを含む。なお別の実施形態において、核酸分子を１つまたは複数の細胞に並行して導入する方法は、（ａ）自然コンピテント細胞を２つ以上の核酸分子と接触させるステップであって、核酸配列の少なくとも１つが選択可能マーカーを含む、ステップと、（ｂ）そのマーカーについて選択するステップとを、繰り返すステップであって、それぞれの繰り返しが異なる選択可能マーカーを含むステップをさらに含む。
【００１７】
別の実施形態において、核酸分子は中立（ニュートラルな）座に組み込まれる。なお別の実施形態において、核酸分子は不要な遺伝子を抗生物質耐性マーカーと置き換える。別の実施形態において、ポリヌクレオチド標的は、細菌人工染色体、酵母人工染色体、またはベクターである。なお別の実施形態において、ベクターは、哺乳類発現ベクターである。別の実施形態において、核酸分子を１つまたは複数のポリヌクレオチド標的に並行して導入する方法は、細胞を形質転換するステップをさらに含む。なお別の実施形態において、細胞は細菌細胞、酵母細胞、または哺乳類細胞である。
【００１８】
なお別の実施形態において、共形質転換細胞の異型混交プールは、２つ以上の共形質転換された核酸配列のすべての組合せを含む。
【００１９】
別の実施形態において、少なくとも１つの選択可能マーカーは、レポーター遺伝子または薬物耐性遺伝子である。いくつかの実施形態において、薬物耐性遺伝子は、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、およびペニシリン耐性遺伝子からなる群から選択される。
【００２０】
なお別の態様において、本発明は、核酸分子の２つ以上の集団を細胞の集団に並行して導入するための装置であって、自然コンピテンスを誘導する静的条件を生成するように構成され、１つまたは複数の自然コンピテント細胞を含む、レセプタクル（入れ物）と、自然コンピテント細胞への共形質転換のために核酸分子の２つ以上の集団をレセプタクルに導入するためにレセプタクルと流体的につながっている、核酸分子の２つ以上の集団を含む容器と、自然コンピテンス条件を、共形質転換細胞を選択するための選択的増殖培地と置き換えるために、選択的増殖培地を含む容器と、を含む装置を含む。
【００２１】
発明の１つの実施形態において、装置は、異なる選択的増殖培地を含む容器をさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１Ａ】Vibrio choleraeにおける２つの非連鎖ゲノム位置での共形質転換の最適化を示す概略図である。ＡｂＲ（抗生物質耐性）マーカー（選択産物ともいう）との交換の標的とした中立座は、真正のフレームシフトを含むトランスポザーゼ偽遺伝子であるＶＣ１８０７であった。
【００２３】
【図１Ｂ】非選択核酸分子における相同性のサイズを変化させたアッセイにおける共形質転換率を示すグラフである。非選択核酸分子−ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）産物は、ｌａｃＺ遺伝子に未成熟終止コドンを導入するトランスバージョン点突然変異を含んだ。反応は、３０ｎｇ／ｍＬの選択産物、および３μｇ／ｍＬの非選択産物を含んだ。データは少なくとも２回の生物学的反復実験から得て、平均値±標準偏差として示す。
【００２４】
【図１Ｃ】非選択ＰＣＲ産物の濃度を変化させたアッセイにおける共形質転換率を示すグラフである。反応は、３ｋｂのホモロジーアームを有するＰＣＲ産物、および３０ｎｇ／ｍＬの選択産物を含んだ。データは少なくとも２回の生物学的反復実験から得て、平均値±標準偏差として示す。
【００２５】
【図１Ｄ】選択ＰＣＲ産物の相同性サイズを変化させた場合の形質転換効率を示すグラフである。反応は、３０ｎｇ／ｍＬの選択産物、および３μｇ／ｍＬの非選択産物を含んだ。データは少なくとも２回の生物学的反復実験から得て、平均値±標準偏差として示す。
【００２６】
【図１Ｅ】選択産物の相同性のサイズを変化させた場合の共形質転換率を示すグラフである。反応は、３０ｎｇ／ｍＬの選択産物、および３μｇ／ｍＬの非選択産物を含んだ。データは少なくとも２回の生物学的反復実験から得て、平均値±標準偏差として示す。
【００２７】
【図１Ｆ】選択産物の濃度を変化させた場合の形質転換効率を示すグラフである。反応は、３ｋｂのホモロジーアームを有するＰＣＲ産物、および３μｇ／ｍＬの非選択産物を含んだ。データは少なくとも２回の生物学的反復実験から得て、平均値±標準偏差として示す。
【００２８】
【図１Ｇ】選択産物の濃度を変化させた場合の共形質転換率を示すグラフである。反応は、３ｋｂのホモロジーアームを有するＰＣＲ産物、および３μｇ／ｍＬの非選択産物を含んだ。データは少なくとも２回の生物学的反復実験から得て、平均値±標準偏差として示す。
【００２９】
【図１Ｈ】２つの異なる非選択遺伝子マーカーを使用するアッセイにおける共形質転換率を示すグラフであり、１つは、ゲノム上で選択マーカーから約５００ｋｂ離れたｌａｃＺに存在し、もう１つは、選択マーカーとは異なる染色体上に存在するＶＣＡ００６３の上流に存在した。反応は、３ｋｂのホモロジーアームを有するＰＣＲ産物、３０ｎｇ／ｍＬの選択産物、および３μｇ／ｍＬの非選択産物を含んだ。データは少なくとも２回の生物学的反復実験から得て、平均値±標準偏差として示す。
【００３０】
【図１Ｉ】ｌａｃＺ遺伝子において表記のサイズの欠失を生成する非選択産物を使用するアッセイにおける共形質転換率を示すグラフである。反応は、３ｋｂのホモロジーアームを有するＰＣＲ産物、３０ｎｇ／ｍＬの選択産物、および３μｇ／ｍＬの非選択産物を含んだ。データは少なくとも２回の生物学的反復実験から得て、平均値±標準偏差として示す。
【００３１】
【図１Ｊ】ｌａｃＺにおける表記のサイズの欠失を有する株をＷＴ（野生型）に復帰させることによって測定した、挿入変異の共形質転換率を示すグラフである。反応は、３ｋｂのホモロジーアームを有するＰＣＲ産物、３０ｎｇ／ｍＬの選択産物、および３μｇ／ｍＬの非選択産物を含んだ。データは少なくとも２回の生物学的反復実験から得て、平均値±標準偏差として示す。
【００３２】
【図２Ａ】共形質転換によってｌａｃＺ遺伝子における６（Ｎ６）または３０（Ｎ３０）塩基対をランダム化するための、本明細書において記述されるアプローチ、およびＮ６またはＮ３０領域のディープシークエンシングを示す概略図である。
【００３３】
【図２Ｂ】Ｎ６およびＮ３０  ＰＣＲ産物による２つのサイクル（Ｃ１およびＣ２）の共形質転換後のｌａｃＺ遺伝子におけるランダム化塩基の数の頻度を示すグラフである。
【００３４】
【図２Ｃ】ＷＴコンセンサス配列からの配列の逸脱によって測定した、インプットＰＣＲ産物と得られた共形質転換体のプールにおけるＮ６領域の組成を示すグラフである。
【００３５】
【図２Ｄ】ＷＴコンセンサス配列からの配列の逸脱によって測定した、インプットＰＣＲ産物と得られた共形質転換体のプールにおけるＮ３０領域の組成を示すグラフである。
【００３６】
【図２Ｅ】Ｎ６  Ｃ１試料に関して、インプットＰＣＲ産物と得られた共形質転換体プールにおける、ＷＴ配列を除く４０９６個すべてのＮ６量体の量の直線回帰を示すグラフである。
【００３７】
【図３Ａ】共形質転換を使用して複雑な異型混交変異体集団を生成するための戦略、および本明細書において記述される実験において標的とされる５つの遺伝子座を示す概略図である。
【００３８】
【図３Ｂ】V. choleraeの自然形質転換における標的座の役割を描写する概略図である。ＴｆｏＸおよびＨａｐＲは、表記のプロセスを制御する調節因子である。
【００３９】
【図３Ｃ】２つのサイクルの共形質転換（Ｃ１およびＣ２）後、およびＡｂＲ付与選択マーカーだけによる２つのラウンドの選択（Ｒ１およびＲ２）後の集団におけるゲノム編集の分布を示すグラフである。共形質転換を使用して、ゲノム編集を細胞の集団に多重に導入した。形質転換反応において、それぞれの変異のためのＰＣＲ産物を、選択可能マーカーと共に等モル濃度で混合した。それぞれのサイクルで中立座における抗生物質耐性カセットを改変させる選択産物を使用することによって、ＭｕＧＥＮＴの複数のサイクルを行った。マルチプレックス対立遺伝子特異的コロニー（ＭＡＳＣ）ＰＣＲによって形質転換体をスクリーニングしたところ、１サイクルの共選択（Ｃ１）後に集団の約５０％が少なくとも１つの遺伝子編集を有することが見いだされた。２サイクル目の共選択（Ｃ２／Ｒ０）後では、集団の約９０％が少なくとも１つの編集を含み、約４％が５つすべての座で編集を有した。
【００４０】
【図３Ｄ】選択後のそれぞれのゲノム編集の頻度を示すグラフである。
【００４１】
【図３Ｅ】キチン上での最終バイオマスおよび形質転換アッセイの形質転換効率を示すグラフのパネルである。Ｘ軸の下のグリッドは、株の遺伝子型を示す。塗りつぶされた四角はゲノム編集の存在を示し、色は編集されたＲＢＳ（リボソーム結合部位）の強さを示す。ｍｕｔＳに関しては黒色を使用するが、それはこの遺伝子が不活化の標的であったからである。データは、４回の独立した生物学的反復実験から得られ、平均値±標準偏差として示す。
【００４２】
【図４Ａ】１、３、および５ラウンドの共形質転換について、抗生物質耐性マーカーを用いた共形質転換後のＷＴのStreptococcus pneumoniaeの４つのｐｈｔ遺伝子におけるゲノム編集の頻度を示すグラフである。４つのｐｈｔ遺伝子は、それぞれの座にタンデム終止コドンを導入するＰＣＲ産物を使用して標的化された。
【００４３】
【図４Ｂ】ＭＭＲ（ミスマッチ修復）欠損S. pneumoniae株における４つのｐｈｔ遺伝子におけるゲノム編集の頻度を示すグラフである。
【００４４】
【図４Ｃ】野生型バックグラウンドで作製された、可能性がある１６個すべてのｐｈｔ変異体株のＭＡＳＣ（マルチプレックス対立遺伝子特異的コロニー）ＰＣＲを示す電気泳動ゲルである。バンドは、ゲノム編集の存在を示す。
【００４５】
【図５Ａ】ランダム化された塩基を示すｔｆｏＸ、ｒｅｃＡ、ｈａｐＲ、およびｄｐｒＡでのＲＢＳ最適化の概略図である。それぞれの遺伝子に関して示される最初のＲＢＳは、ＷＴ  ＲＢＳを表す。示されるＲＢＳの強さは、ribosome binding site calculatorから得られ、０〜１００，０００の任意の尺度に基づく。
【００４６】
【図５Ｂ】未成熟終止コドンをもたらす、ｌａｃＺにおけるトランスバージョン（ＴＡＡ）およびトランジション（ＴＡＧ）変異の核酸配列設計の略図である。トランジション変異は、トランスバージョン変異と比較してＭＭＲによってより効率的に修復される。
【００４７】
【図５Ｃ】ＷＴおよびＭＭＲ欠損ｍｕｔＳ欠失株におけるこれらの変異に関する共形質転換率を示すグラフであり、V. choleraeの共形質転換に対してＭＭＲがほとんどまたは全く影響を有しないことを証明する。データは、２回の生物学的反復実験から得られ、平均値±標準偏差として示す。
【００４８】
【図６Ａ】ＰＣＲ産物から生成された選択マーカーおよび非選択マーカーによる細菌ゲノムの共形質転換および組み換えを示す概略図である。
【００４９】
【図６Ｂ】ＰＣＲ産物からの非選択マーカーによる細菌ゲノムの組み換え、およびカナマイシン耐性に関する選択可能マーカーを有するプラスミドの共形質転換を示す概略図である。
【００５０】
【図６Ｃ】選択マーカーが、ＶＣ１８０７がカナマイシン耐性遺伝子と交換されるＰＣＲ産物（左）、およびカナマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドｐＢＡＤ１８（右）である、共形質転換率を示すグラフである。非選択マーカーは図６Ａおよび６Ｂに示される。
【００５１】
【図６Ｄ】ＴＧ１（ｒｅｃＡ＋）細胞およびＤＨ５α（ｒｅｃＡ−）細胞の形質転換効率を示すグラフである。
【００５２】
【図７】V. cholerae宿主株における細菌人工染色体の共形質転換変異誘発における共形質転換率を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
（定義）
特に定義されていなければ、本明細書において使用されるすべての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書において記述される方法および材料と類似または同等の任意の方法および材料が、本発明の試験のために実践において使用され得るが、好ましい材料および方法を本明細書において説明する。本発明の説明および特許請求の範囲において、以下の用語が使用される。
【００５４】
「ホモロジーアーム」は、別の核酸配列と相同である核酸配列の部分を意味する。１つの実施形態において、核酸配列は、自然コンピテント細胞のゲノムの一部に対する少なくとも１つのホモロジーアームを含む。
【００５５】
「共形質転換」は、２つ以上の核酸配列を細胞に導入することを意味する。
【００５６】
「ゲノム編集」は、ゲノム座に対する変更を意味する。変更は、付加、欠失、置換、および再構成の１つまたは複数を含み得る。１つの実施形態において、ゲノム編集は、共形質転換を通して導入される。
【００５７】
「ゲノム座」または「複数のゲノム座」とはそれぞれ、ゲノムにおける１つまたは複数の場所、位置、または配列を意味する。１つの実施形態において、ゲノム座の場所、位置、または配列は、遺伝子または遺伝子の調節領域に存在する。
【００５８】
「遺伝子連鎖」または「連鎖遺伝子マーカー」とは、染色体またはゲノムにおいて互いに近位に位置する２つ以上の遺伝子座を意味する。連鎖遺伝子間の交叉頻度の減少は、それら遺伝子座を分離する距離がより小さいことを示している。
【００５９】
「非連鎖遺伝子マーカー」とは、それら遺伝子座を分離する距離に依存しない組み換え頻度を有する、２つ以上の遺伝子座を意味する。
【００６０】
「遺伝子座」または「複数の遺伝子座」はそれぞれ、遺伝子における１つまたは複数の場所、位置、または配列を意味する。
【００６１】
本明細書において使用される「表現型」は、例えば任意の１つの形質または任意の群の形質を有する細胞の物理的、生化学的、および生理的構成全体を意味する。
【００６２】
「相同組み換え」は、核酸配列が、ＤＮＡの２つの類似のまたは同一の分子間で交換される、あるタイプの遺伝子組み換えを意味する。
【００６３】
「自然コンピテント細胞」は、細胞膜を機械的に透過性にすることなく、細胞外核酸配列を取り込むことができる細胞を意味する。コンピテンスは、高密度細胞培養および／または栄養制限によって、ならびに細菌増殖の静止相に関連する条件によって、細胞に導入され得る。
【００６４】
「自然形質転換を最適化する」とは、すでに自然形質転換の能力を有する細胞が、形質転換をより容易にまたはより大きい効率で受けるように、自然形質転換の能力または潜在性を増加させることを意味する。そのような最適化の例には、自然形質転換能もしくは潜在性を促進する遺伝子の発現を増加させること、および／または自然形質転換能もしくは潜在性を阻害もしくは遮断する遺伝子の発現を減少させることが挙げられる。
【００６５】
「選択可能剤」とは、その作用剤に曝露された細胞に選択圧を生じる作用剤を意味する。例えば、選択剤は、カナマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、アンピシリン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、およびペニシリンなどの抗生物質であり、抗生物質耐性遺伝子で形質転換された細胞の曝露は、その抗生物質に対して耐性である。
【００６６】
「選択可能マーカー」とは、その選択可能マーカーを有する細胞に表現型または形質を付与する遺伝子を意味する。選択可能マーカーとしては、レポーター遺伝子（例えば、ｌａｃＺ）および薬物耐性遺伝子（抗生物質耐性遺伝子）が挙げられ得るがこれらに限定されるわけではない。
【００６７】
「選択的増殖培地」とは、１つまたは複数の選択可能剤を含む増殖培地を意味する。
【００６８】
「静的条件」とは、細胞の増殖が最小限であり、増殖に関連する活性が減少するインキュベーションまたは培養の環境を意味する。
【００６９】
本開示において、「含む（comprises）」、「含む（comprising）」、「含有する（containing）」および「有する（having）」などは、米国特許法においてそれらに割り当てられる意味を有し得、「含む（includes）」、「含む（including）」等を意味し得る。「本質的に〜からなる」または「本質的になる」等も同様に、米国特許法で割り当てられる意味を有し、用語は、非制限的であり、列挙されている内容の基本的または新規特徴が、列挙されている内容より多くが存在することによって変化しない限り、引用されている内容より多くの存在を許容するが、先行技術の実施形態は除外する。
【００７０】
「塩基置換」は、相補的ヌクレオチド鎖の間のハイブリダイゼーションの有意な破壊を引き起こさない核酸塩基ポリマーの置換基を意味する。
【００７１】
「断片」は、ポリヌクレオチドまたは核酸分子の一部を意味する。この一部は、好ましくは参照核酸の全長の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％を含む。断片は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，５００、２，０００、または２，５００（およびその間の任意の整数値）ヌクレオチドを含み得る。核酸分子に適用される場合の断片は、より大きい核酸の部分配列を意味する。核酸分子の「断片」は、長さが少なくとも約１５ヌクレオチドであり得て、例えば、少なくとも約５０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、少なくとも約１００〜約５００ヌクレオチド、少なくとも約５００〜約１，０００ヌクレオチド、少なくとも約１，０００ヌクレオチド〜約１，５００ヌクレオチド、または約１，５００ヌクレオチド〜約２，５００ヌクレオチド、または約２，５００ヌクレオチド（およびその間の任意の整数値）であり得る。
【００７２】
「相同な」は、２つのポリペプチド間または２つの核酸分子間の配列類似性または配列同一性を意味する。比較される２つの配列の両方におけるある位置が同じ塩基またはアミノ酸単量体サブユニットで占められている場合、例えば２つのＤＮＡ分子のそれぞれにおけるある位置がアデニンで占められている場合、それらの分子はその位置で相同である。２つの配列間の相同性のパーセントは、２つの配列によって共有されているマッチするまたは相同な位置の数を、比較される位置の数で除して、１００を乗じたものの関数である。例えば、２つの配列における位置の１０個中６個がマッチするまたは相同である場合、２つの配列は６０％相同である。例として、ＤＮＡ配列ＡＴＴＧＣＣおよびＴＡＴＧＧＣは、５０％の相同性を共有する。一般的に、最大の相同性が得られるように２つの配列を整列させて比較を行う。
【００７３】
本発明の文脈において、一般的に存在する核酸塩基に関して以下の略語を使用する。「Ａ」はアデノシンを指し、「Ｃ」はシトシンを指し、「Ｇ」はグアノシンを指し、「Ｔ」はチミジンを指し、および「Ｕ」はウリジンを指す。
【００７４】
「同一性」とは、目標配列と参照配列との間の核酸配列同一性を意味する。配列同一性は典型的に、配列分析ソフトウェア（例えば、Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705, ＢＬＡＳＴ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＧＡＰ、またはＰＩＬＥＵＰ／ＰＲＥＴＴＹＢＯＸプログラム）を使用して測定される。そのようなソフトウェアは、様々な置換、欠失、および／または他の修飾に相同性の程度を割付することによって、同一または類似の配列をマッチさせる。同一性の程度を決定するための例示的なアプローチにおいて、ＢＬＡＳＴプログラムが使用され得るが、そこでは確率スコアｅ−３〜ｅ−１００が近縁の配列を示す。
【００７５】
用語「単離された」、「精製された」、または「生物学的に純粋な」は、その自然の状態で見いだされる場合にそれが通常伴う成分を様々な程度に含まない材料を意味する。「単離する」は、当初の起源または周囲からの分離の程度を示す。「精製する」は、単離より高い程度の分離を示す。すなわち、核酸は、それが組み換えＤＮＡ技術によって産生される場合には、細胞材料、ウイルス材料、もしくは培養培地を実質的に含まないときに、あるいは化学合成される場合には、化学物質前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まないときに、精製されていることになる。純度および均一性は、典型的に分析化学技術、例えばポリアクリルアミド電気泳動または高速液体クロマトグラフィーを使用して決定される。用語「精製された」は、核酸またはタンパク質が、電気泳動ゲルにおいて本質的に１つのバンドを生じることを示し得る。
【００７６】
用語「核酸」は、一本鎖または二本鎖型のいずれかのそのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を指す。特に具体的に制限されていなければ、用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し、天然起源のヌクレオチドと類似の様式で代謝される、天然のヌクレオチドの公知のアナログを含む核酸を包含する。特に示していなければ、特定の核酸配列はまた、明示されている配列の他に、その保存的改変バリアント（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オーソログ、ＳＮＰ、および相補的配列を暗に包含する。詳細には、縮重コドン置換は、１つまたは複数の選択された（またはすべての）コドンの第３の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基に置換されている配列を生成することによって達成され得る（Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); and Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)）。
【００７７】
「参照」とは、標準または対照条件を意味する。
【００７８】
「参照配列」は、配列比較のための基礎として使用される定義された配列である。
【００７９】
本明細書において提供される範囲は、範囲内のすべての値に関する簡略表記であると理解される。例えば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０からなる群から選択される任意の数、数の組合せ、または部分範囲を含むと理解される。
【００８０】
また、本明細書において使用される用語は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、制限的であると意図されないと理解される。
【００８１】
本明細書において使用される冠詞「１つの（a）」および「１つの（an）」は、その冠詞の文法的目的語の１つまたは１つより多く（すなわち少なくとも１つ）を意味するために使用される。例として、「１つの要素」は、１つの要素または１つより多くの要素を意味する。
【００８２】
量、時間の長さ等などの測定可能な値について言及する場合に本明細書において使用される用語「約」は、そのような変化が開示の方法を行うために適切であることから、明記された値の±２０％の変動、または１０％以内、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、もしくは０．０１％以内の変動を包含することを意味する。本文からそれ以外であることが明白である場合を除き、本明細書において提供されるすべての数値は、用語「約」によって修飾される。
【００８３】
本明細書における可変要素または態様に関する実施形態の詳述は、任意の１つの実施形態としての、または他の任意の実施形態もしくはその一部との組合せとしてのその実施形態を含む。
【００８４】
本明細書において提供される任意の組成物または方法は、本明細書において提供される他の組成物および方法のいずれかの１つまたは複数と組み合わせることができる。
【００８５】
（発明の詳細な説明）
本発明は一般的に、２つ以上の核酸分子によって自然コンピテント微生物を形質転換するための方法およびこれらの分子を含む細胞を特徴とする。
【００８６】
本発明は、部分的に、自然コンピテント細胞が多数の核酸配列によって形質転換可能であるという発見に基づいている。
【００８７】
細菌ゲノムの編集は、研究および合成生物学応用において必須のツールである。本明細書において、自然コンピテント微生物における非連鎖遺伝子マーカーの共形質転換に基づく加速進化法である、自然形質転換による多重ゲノム編集（Multiplex Genome Editing by Natural Transformation）（ＭｕＧＥＮＴ）を説明する。選択および非選択核酸分子の自然共形質転換により、約５０％という前例のない頻度で、非選択核酸分子の組み換えを介した痕跡のないゲノム編集が可能となることが見いだされた。ランダム化ヌクレオチドを有する核酸分子を使用することにより、自然共形質転換の際のバイアスの証拠は見いだされず、このことは、この方法を定向進化研究のために使用できることを示している。さらに、自然共形質転換は、多重（マルチプレックス）ゲノム編集にとって有効な方法であることが見いだされた。ＭｕＧＥＮＴは、編集された座においてシス（in cis）の選択を必要としないことから、得られる変異体プールは非常に複雑であり、各株は、多重ゲノム編集のあらゆる数および組合せを有する。本発明者らは、V. choleraeにおける自然形質転換を最適化することによって、代謝工学および表現型工学におけるこの技術の有用性を証明する。これは、遺伝子削除、プロモーター交換、ならびに自然コンピテンスおよび形質転換プロセスに関与する５つの遺伝子の翻訳開始を調節することにより、ゲノムを組合せ編集することによって達成された。ＭｕＧＥＮＴでは、複雑な変異体プールを１週間で生成することができ、自然形質転換の３０倍の改善を有する遺伝子編集株の選択をもたらした。本発明者らはまた、S. pneumoniaeにおいてもこの技術の有効性を証明し、ＭｕＧＥＮＴが多重遺伝子相互作用解析において使用される潜在性を強調する。このため、ＭｕＧＥＮＴは、多様な自然コンピテント種における加速進化および遺伝子相互作用研究のための広く適用可能なプラットフォームである。
【００８８】
（ＭｕＧＥＮＴ）
変異体を作製できることは、微生物研究において必須である。細菌ゲノムにおいて定義された１つの変異を作製する方法は開発されているが、多数の定義された変異を同時に作製するための方法、すなわち、多重ゲノム編集は、E. coliなどのモデル種に限定されている。多様な微生物種が、外部のＤＮＡを自然に取り込んで、そのゲノムの中にそれらを組み込む能力、すなわち自然形質転換として知られるプロセスを有する。自然形質転換は、単一変異を作製するために利用されてきたが、これまで多重ゲノム編集のためには使用されていなかった。
【００８９】
ゲノム編集を通しての定向進化は、微生物が生体分子を産生するまたは老廃物を分解する能力を改善するために薬学および工業研究において使用される、ますます重要な方法である。これは、典型的に、関連する生化学経路における遺伝子の発現の最適化を通して行われる。現在の微生物ゲノムの編集技術は面倒で、単一座の順次的編集に限定されており、それゆえ多数の座の同時編集を可能にする技術の開発は、社会にとって非常に貴重となるであろう。E. coliなどの一握りのモデル細菌における多重ゲノム編集の技術が開発されているが、これらの技術は、産業的に重要な微生物には適していない。本明細書において、Multiplexed Genome Editing via Natural Transformation（MuGENT）と呼ばれる、自然形質転換可能な微生物における多数の座の同時編集を可能にする強力な技術を説明する。
【００９０】
自然形質転換は、外部から添加されたＤＮＡを取り込んで組み込む能力であり、ほとんどの産業的に重要な微生物が共有する形質である。ＭｕＧＥＮＴは、選択可能マーカーと、目標の表現型を改善するように設計された一連の無標の遺伝子改変座との共形質転換に基づく。例えば、最終産物の産生を最適化するために、ゲノム内のそれらの場所とは無関係に、生合成経路におけるそれぞれの遺伝子の発現レベルを同時に変化させることができる。原理証明実験において、５つの非連鎖遺伝子座が同時に編集された。それぞれの遺伝子変化は共形質転換の際に独立して起こることから、１回の実験で、可能なすべての変異の組合せを含む変異体のプールを生じる。これによってＭｕＧＥＮＴは、微生物の定向進化のための非常に強力なプラットフォームとなる。何十もの遺伝子が関わる複雑な表現型の場合、ＭｕＧＥＮＴの繰り返しサイクルを行うことができる。これによって、１回の実験で試験することができるものよりもはるかに大きい変異空間を試験することができる。このようにＭｕＧＥＮＴは、きわめて短い時間の尺度での微生物の加速定向進化にとって非常に有望である。
【００９１】
（自然コンピテンス）
自然コンピテンスおよび形質転換は、多様な微生物種が共有する形質である。これは、細胞外環境からのＤＮＡの取り込み後に、相同組み換えによってこのＤＮＡがゲノムへ組み込まれることを伴う。自然形質転換の間、集団におけるごく一部の細胞のみがコンピテントとなり、形質転換される。非連鎖マーカーを自然コンピテント細菌において共形質転換することが可能であることはすでに証明されており、それぞれのコンピテント細胞が、複数のＤＮＡ分子の取り込み能を有することを示している。しかし、多重ゲノム編集アプリケーションのための共形質転換の使用はこれまで研究されていない。本明細書において、自然共形質転換を最適化して、自然コンピテントV. choleraeおよびS. pneumoniaeにおける多重ゲノム編集のための方法としてのその使用を証明した。
【００９２】
本発明は、一般的に、多数の核酸配列を１つまたは複数の自然コンピテント細胞に並行して導入するための方法を提供する。１つの態様において、本発明は、核酸分子を１つまたは複数の細胞に並行して導入する方法であって、ｉ）自然コンピテント細胞を得るステップと、ｉｉ）自然コンピテント細胞を２つ以上の核酸配列と接触させるステップであって、核酸配列の少なくとも１つが選択可能マーカーを含む、ステップと、ｉｉｉ）選択可能マーカーについて選択的な増殖培地で細胞をインキュベートするステップとを含み、２つ以上の核酸配列が細胞に並行して導入される、方法を含む。１つの実施形態において、方法は、ステップｉｉ）およびｉｉｉ）を繰り返すステップをさらに含み、それぞれの繰り返しは異なる選択可能マーカーを含む。１つの態様において、本発明は、核酸配列を１つまたは複数の細胞に並行して導入する方法であって、ｉ）自然コンピテント細胞を得るステップと、ｉｉ）２つ以上の核酸配列を自然コンピテント細胞に添加するステップであって、核酸配列の少なくとも１つが選択可能マーカーを含む、ステップと、ｉｉｉ）選択可能マーカーについて選択的な増殖培地で細胞をインキュベートするステップとを含み、２つ以上の核酸配列が細胞に並行して導入される、を含む。別の態様において、本発明は、２つ以上の共形質転換核酸配列を含む共形質転換細胞の異型混交プールを作製するために、自然コンピテント細胞を２つ以上の核酸配列と接触させることを含み、ここで核酸配列の少なくとも１つは選択可能マーカーを含む。
【００９３】
多くの細胞が自然コンピテントであるが、細胞は、多数の核酸配列を受容するためにさらに条件を整えられ得る。細胞は、細菌細胞、酵母細胞、または哺乳類細胞であり得る。別の実施形態において、自然コンピテント細胞を得るステップは、静的条件で細胞をインキュベートするステップを含む。静的条件は、細胞の増殖および活性を最小限にする条件であり得る。
【００９４】
いくつかの実施形態において、自然コンピテント細胞は、Firmicutes、Chroococcales、Bacteriodia、Chlorobi、Deinococci、Actinobacteria、Proteobacteria、およびEuryarchaeotaからなる群から選択される。いくつかの他の実施形態において、自然コンピテント細胞は、表１に列挙された種から選択される。
【００９５】
【表１】
2017514488.tif 000002
2017514488.tif 000003
2017514488.tif 000004
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【００９６】
複数遺伝子のゲノム編集は、研究および合成生物学応用において必須のツールである。これは、所望の表現型もしくは形質、または特定の組み換え産物の発現を有する細胞株を産生するために重要である。自然コンピテント微生物における非連鎖遺伝子マーカーの共形質転換に基づく加速進化は、多重ゲノム編集の１つのアプローチである。１つの実施形態において、核酸配列の２つ以上が非連鎖遺伝子マーカーを含む。
【００９７】
１つの実施形態において、自然コンピテント細胞を、その自然コンピテント細胞のゲノムの遺伝子座に対する少なくとも１つのホモロジーアームを含む核酸配列の少なくとも１つと接触させる。ホモロジーアームは、約５ｋｂ未満、４．５ｋｂ未満、４ｋｂ未満、３．５ｋｂ未満、３ｋｂ未満、２．５ｋｂ未満、２ｋｂ未満、１．５ｋｂ未満、１ｋｂ未満、９００塩基未満、８００塩基未満、７００塩基未満、６００塩基未満、５００塩基未満、またはそれ未満の長さを有し得る。例示的な実施形態において、ホモロジーアームは、約４ｋｂ未満の長さを有する。ホモロジーアームは、約１ｋｂ〜約４ｋｂ、および約１．５ｋｂ〜約３ｋｂの範囲の長さを有し得る。
【００９８】
本発明はまた、少なくとも１つのゲノム編集を含む核酸配列の少なくとも１つを含む。ある実施形態において、ゲノム編集は、自然形質転換に関与する遺伝子に導入される。ゲノム編集の導入は、例えば自然形質転換を促進するための発現の増加など、遺伝子の活性を変化させることができる。別の実施形態において、自然コンピテント細胞を２つ以上の核酸配列と接触させるステップは、自然形質転換を最適化する少なくとも１つのゲノム編集を導入することを含む。
【００９９】
選択可能マーカーは、その選択可能マーカーを有する細胞に表現型または形質を付与する遺伝子である。選択可能マーカーとしては、レポーター遺伝子（例えば、ｌａｃＺ）および薬物耐性遺伝子（抗生物質耐性遺伝子）が挙げられ得るがこれらに限定されるわけではない。１つの実施形態において、薬物耐性遺伝子は、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、およびペニシリン耐性遺伝子からなる群から選択される。
【０１００】
（共形質転換された細胞）
また、核酸配列の導入後の自然コンピテント細胞の組成物も本発明に含まれる。１つの態様において、本発明は、２つ以上の共形質転換核酸配列を含む共形質転換細胞の異型混交プールを含み、ここで、細胞は自然コンピテントであって２つ以上の核酸配列によって共形質転換されており、核酸配列の少なくとも１つが選択可能マーカーを含む。
【０１０１】
１つの実施形態において、少なくとも１つの選択可能マーカーは、レポーター遺伝子または薬物耐性遺伝子である。選択可能マーカーが薬物耐性遺伝子である場合、薬物耐性遺伝子は、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、およびペニシリン耐性遺伝子からなる群から選択される。
【０１０２】
共形質転換細胞の異型混交プールは、Firmicutes、Chroococcales、Bacteriodia、Chlorobi、Deinococci、Actinobacteria、Proteobacteria、およびEuryarchaeotaからなる群から選択される自然コンピテント細胞を含む。いくつかの他の実施形態において、共形質転換細胞の異型混交プールは、表１に列挙された種から選択される自然コンピテント細胞を含む。
【０１０３】
共形質転換された自然コンピテント細胞を産生するために使用される核酸配列は、非連鎖または連鎖遺伝子マーカーを含む２つ以上の核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、核酸配列の少なくとも１つは、自然コンピテント細胞のゲノムの遺伝子座に対する少なくとも１つのホモロジーアームを含む。これらの例において、ホモロジーアームは、約５ｋｂ未満、４．５ｋｂ未満、４ｋｂ未満、３．５ｋｂ未満、３ｋｂ未満、２．５ｋｂ未満、２ｋｂ未満、１．５ｋｂ未満、１ｋｂ未満、９００塩基未満、８００塩基未満、７００塩基未満、６００塩基未満、５００塩基未満、またはそれ未満の長さを有し得る。例示的な実施形態において、ホモロジーアームは、約４ｋｂ未満の長さを有する。ホモロジーアームは、約１ｋｂ〜約４ｋｂ、および約１．５ｋｂ〜約３ｋｂの範囲の長さを有し得る。
【０１０４】
共形質転換された自然コンピテント細胞の異型混交プールは、少なくとも１つのゲノム編集を含む核酸配列の少なくとも１つを含み得る。ゲノム編集をさらに、自然形質転換に関与する遺伝子に導入することができる。これが起こる場合、共形質転換された自然コンピテント細胞の異型混交プールは、自然形質転換に関して最適化される。
【０１０５】
別の実施形態において、異型混交プールは、２つ以上の核酸配列の可能なすべての組合せを含む。従って、その共形質転換された細胞は、２つ以上の核酸配列に関するすべての組み換えの可能性を体現する。
【０１０６】
（装置）
別の実施形態において、本発明は、核酸配列の２つ以上の集団を細胞の集団に並行して導入するための装置であって、自然コンピテンスを誘導する静的条件を生成するように構成された、１つまたは複数の自然コンピテント細胞を含むレセプタクルと、自然コンピテント細胞への共形質転換のためにレセプタクルに核酸配列の２つ以上の集団を導入するようにレセプタクルと流体的につながっている、核酸配列の２つ以上の集団を含む容器と、自然コンピテンス条件を、共形質転換細胞を選択するための選択的増殖培地と置き換えるために、選択的増殖培地を含む容器とを含む、装置を含む。１つの実施形態において、装置は、異なる選択的増殖培地を含む容器をさらに含む。
【０１０７】
本発明の実践は、特に示していなければ、十分に当業者の技量の範囲内である分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来技術を使用する。そのような技術は、“Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, fourth edition (Sambrook, 2012); “Oligonucleotide Synthesis” (Gait, 1984); “Culture of Animal Cells” (Freshney, 2010); “Methods in Enzymology” “Handbook of Experimental Immunology” (Weir, 1997); “Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells” (Miller and Calos, 1987); “Short Protocols in Molecular Biology” (Ausubel, 2002); “Polymerase Chain Reaction: Principles, Applications and Troubleshooting”, (Babar, 2011); “Current Protocols in Immunology” (Coligan, 2002)などの文献において十分に説明されている。これらの技術は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に応用可能であり、そのため、本発明の作製および実践において検討され得る。特定の実施形態に関して特に有用な技術を以下の章で考察する。
【０１０８】
以下の実施例は、本発明のアッセイ、スクリーニング、および治療方法をいかに作製し使用するかについての完全な開示および説明を当業者に提供するために記述されており、本発明者らが自らの発明であると考えるものの範囲を制限することは意図されていない。
【実施例】
【０１０９】
（実施例１：自然共形質転換の最適化）
第一段階として、V. choleraeにおける２つの非連鎖マーカーの共形質転換を最適化し、そこでは、一方のマーカーを選択して他方の組み込みに関してスクリーニングした。ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）産物を使用して、中立（ニュートラルな）遺伝子を抗生物質耐性（ＡｂＲ）マーカー（選択）に置き換え、そしてＰＣＲ産物を使用してｌａｃＺにナンセンス点突然変異を導入した（非選択）（図１Ａおよび６Ａ〜６Ｂ）。
【０１１０】
図６Ａは、ＰＣＲ産物由来の２つの選択可能マーカーを用いた細菌ゲノムの共形質転換および組み換えを示す概略図である。図６Ｂは、ＰＣＲ産物由来の１つの選択可能マーカーを用いた細菌ゲノムの組み換え、およびカナマイシン耐性に関する選択可能マーカーを有するプラスミドの共形質転換を示す概略図である。図６Ｃは、ＰＣＲ産物におけるＶＣ１８０７カナマイシン耐性遺伝子およびプラスミドカナマイシン耐性遺伝子のコングレッション（congression）あるいはランダムな取り込みを示すグラフである。図６Ｄは、ＴＧ１（ｒｅｃＡ＋）細胞およびＤＨ５α（ｒｅｃＡ−）細胞の形質転換効率を示すグラフである。
【０１１１】
非選択マーカーが≧２ｋｂのホモロジーアームを有し、高濃度（３μｇ／ｍＬ）で存在する場合に、最高の共形質転換率（約５０〜６０％）が得られた（図１Ｂおよび１Ｃ）。選択マーカーに対する制約はより少なかった。予想されたように、ホモロジーアームの長さまたは選択マーカーの量を増加させると、得られた形質転換体の数は増加したが（図１Ｄおよび１Ｆ）、これは、たとえ選択産物が非選択産物と等モル濃度で存在しても、共形質転換率を実質的に変化させなかった（図１Ｅおよび１Ｇ）。このことは、選択：非選択ＤＮＡの比率ではなくて、形質転換反応における非選択ＤＮＡの濃度を増加させることが、最適な共形質転換にとって重要であることを示した。また、異なる染色体上の非選択マーカーがｌａｃＺマーカーと同様の共形質転換率を示したことから、ゲノムにおける選択マーカーと非選択マーカーの間の距離も、共形質転換率を変化させなかった（図１Ｈ）。５０〜１，１６６ｂｐの欠失および挿入がそれぞれ、約６０％〜２５％の共形質転換率で得られたことから、遺伝子編集は点突然変異に限定されなかった（図１Ｉおよび１Ｊ）。
【０１１２】
（実施例２：自然共形質転換の際のバイアスの評価）
共形質転換実験の結果は、自然共形質転換を、１つの遺伝子座での不偏定向進化のために使用できることを示している。ｌａｃＺ遺伝子においてランダム化された６（Ｎ６）ヌクレオチドまたは３０（Ｎ３０）ヌクレオチドのいずれかを有するＰＣＲ産物による共形質転換実験を行った。ｌａｃＺ座での変異の複雑度を増加させるために、それぞれのサイクルで中立座における抗生物質耐性マーカーを変化させる選択産物を使用することにより、Ｎ６およびＮ３０非選択産物を用いて複数の共形質転換サイクルを行った（図２Ａおよび２Ｂ）。投入した（インプット）ＰＣＲ産物および得られた形質転換体プールのディープシークエンシングに基づくと、Ｎ６またはＮ３０試料のいずれに関しても、ＷＴにより近い配列について共形質転換率の増加は見いだされなかった（図２Ｃおよび２Ｄ）。さらに、投入したＰＣＲプールにおけるＮ６量体の量と、得られた形質転換体プールにおけるＮ６量体の量との間に有意な相関が見いだされ、共形質転換の際にゲノムに組み換えられたＮ６量体においてバイアスがほとんどまたは全く存在しないことをさらに支持した（図２Ｅ）。このように、これらのデータは、自然共形質転換を、１つの遺伝子座での不偏定向進化のために使用できることを示唆している。
【０１１３】
（実施例３：Multiplexed genome editing by natural transformation（MuGENT）は、V. choleraeにおける自然形質転換を最適化する）
選択の不在下で多重にゲノム編集することは、代謝経路および表現型を最適化するための「加速進化」のために使用することができる。従って、自然共形質転換を多重ゲノム編集のために使用することができるかを評価した。ゲノム編集は、選択を必要としないことから、得られた形質転換体はあらゆる数の編集を有し得、複数の共形質転換サイクルを使用することにより、最終形質転換体のプールにおいて遺伝子編集の複雑度は増加した（図３Ａ）。
【０１１４】
概念実証として、自然形質転換およびその調節に関与する遺伝子の多くが十分に特徴づけされていることから、V. choleraeにおける自然形質転換の表現型を最適化した。このアプローチでは、ペリプラスムへの形質転換ＤＮＡ（ｔＤＮＡ）の取り込み（ｔｆｏＸ）、内膜を超えた輸送（ｔｆｏＸおよびｈａｐＲ）、細胞質一本鎖ｔＤＮＡの保護（ｄｐｒＡ）、およびｔＤＮＡの相同性検索／組み込み（ｒｅｃＡ）を含む、自然形質転換の異なるステップに影響を及ぼす遺伝子座を標的とした（図３Ｂ）。ｔｆｏＸ、ｈａｐＲおよびｒｅｃＡ遺伝子は、プロモーター交換（プロモーター構築物＝ＬａｃＩ誘導型Ｐｔａｃ、およびｒｒｎＢアンチターミネーター）およびリボソーム結合部位（ＲＢＳ）調節に関する標的とした一方、ｄｐｒＡは、この遺伝子がオペロン内に存在することから、ＲＢＳ調節のみに関する標的とした。ＲＢＳ調節は、これら４つの遺伝子のＲＢＳ内の２つの重要な位置の半ランダム化変異誘発によって行われた（図５Ａ）。ミスマッチ修復（ＭＭＲ：mismatch repair）システムは、組み込み後の遺伝子編集を阻止または修正し得る。それゆえ、ＭＭＲの重要な成分であるｍｕｔＳも不活化の標的とした。全体で、これらのゲノム編集に関して１０００個の可能な組合せが存在した。
【０１１５】
第一に、共形質転換を使用して、ゲノム編集を細胞の集団に多重に（マルチプレックスで）導入した。それぞれの変異のためのＰＣＲ産物を、形質転換反応において、選択可能マーカーと共に等モル濃度で混合した。それぞれのサイクルで中立座において抗生物質耐性カセットを変化させるよう選択された産物を使用して、複数サイクルのＭｕＧＥＮＴを行った。マルチプレックス対立遺伝子特異的コロニー（ＭＡＳＣ）ＰＣＲによって形質転換体をスクリーニングしたところ、１サイクルの共選択（Ｃ１）後、集団の約５０％が少なくとも１つの遺伝子編集を有することが見いだされた（図３Ｃ）。２サイクルの共選択（Ｃ２／Ｒ０）後、集団の約９０％が少なくとも１つの編集を含み、約４％が５つすべての座で編集を有した。共選択の両方のサイクルが１週間未満で完了した。このように、ＭｕＧＥＮＴは、既定の組の座において複雑な変異体プールを作製するための実現可能で非常に有効な戦略である。
【０１１６】
次に、目標は、改善された自然形質転換の表現型を有する編集された株を選択して特徴づけすることであった。従って、増加した自然形質転換性の表現型を有する株を濃縮するために、Ｃ２／Ｒ０変異体プールを、１つの選択マーカーのみを使用した自然形質転換の追加の２ラウンドに供した（Ｒ１およびＲ２）。これらの追加の２ラウンドの濃縮後、ｔｆｏＸおよびｒｅｃＡでの編集は、それぞれ集団の約１００％および約９０％に存在し、これらの編集が自然形質転換を増強したことを示唆した（図３Ｄ）。実際に、定義された編集株を、野生型ＲＢＳを用いて試験したところ、ｔｆｏＸ、ｒｅｃＡ、およびｔｆｏＸｒｅｃＡ株の形質転換効率は、親株より大きかった（図３Ｅ）。次に、ランダムに選択した７つのコロニーを最終濃縮プールから単離した。選択したコロニーはすべて、親株より高い形質転換効率を有し、多くのものは、あらゆる定義された１個所編集および２個所編集株と比較して改善されていた（図３Ｅ、下のパネル）。一般的に、ｈａｐＲに編集を有する株はキチン上で改善された増殖を示し、このことは、２ラウンドの選択後に、ｔｆｏＡおよびｒｅｃＡのみが編集された株と比較して形質転換効率がより低いにもかかわらず（図３Ｅ）何故ｈａｐＲを含む３〜５個の編集を有する株に関する選択が行われていたかの理由を示す（図３Ｃ）。
【０１１７】
いずれにせよ、ＭｕＧＥＮＴは、親株と比較して約３０倍までの上昇および任意の１個所編集株と比較して約６倍の上昇を表す、改善された自然形質転換表現型を有する多重編集株の迅速な単離を可能にした。これは、これらのＲＢＳ最適化ゲノム編集の組合せ効果におそらく起因した。これらの実験において踏査された組合せ空間を、古典的な技術を使用して順次的態様で評価したとすれば、過大な量の時間と努力を要するであろう。このように、これらの実験は、ＭｕＧＥＮＴが自然コンピテント微生物における加速進化のための優れたプラットフォームであることを証明している。
【０１１８】
（実施例４：ＭｕＧＥＮＴは、Streptococcus pneumoniaeにおいて、定義された遺伝子ファミリーの可能なすべての変異体の組合せを迅速に生成する）
遺伝子の冗長性は、生物において表現型を表出させることを妨害し得る。ＭｕＧＥＮＴを使用して、定義された変異体の組合せを有するプールを生成することによって冗長性を明らかにした。これを試験するために、および別の種においてＭｕＧＥＮＴを実証するために、S. pneumoniaeにおける４つのｐｈｔ遺伝子を不活化の標的とした。これらの遺伝子は冗長な亜鉛結合タンパク質として以前に関連付けられている。ＭｕＧＥＮＴを使用して、未成熟なタンデム終止コドンを、ｐｈｔＡ、ｐｈｔＢ、ｐｈｔＤ、およびｐｈｔＥに組み合わせて導入した。共形質転換率は、S. pneumoniaeではV. choleraeと比較して低かった。これにもかかわらず、実施に要する期間が１週間である５サイクルのＭｕＧＥＮＴ後、可能な１６のすべての組合せがこれらのゲノム編集に関して得られた（図４Ａおよび４Ｃ）。V. choleraeとS. pneumoniaeの間の編集頻度の差は、これらの細菌におけるミスマッチ修復（ＭＭＲ）の効能の差によるものであり得る。このことを試験するために、ＭＭＲを欠損する株において組合せｐｈｔ遺伝子不活化実験を繰り返したところ、編集頻度が劇的に改善することが見いだされた（図４Ｂ）。
【０１１９】
これに対し、ＭＭＲは、V. choleraeにおいて試験した場合には最小の効果を示した（図５Ａおよび５Ｂ）。このように効果が異なる根拠は現在のところ不明である。すなわち、ＭＭＲ欠損S. pneumoniaeを使用するとＭｕＧＥＮＴの速度が増加されたが、しかしながら、これはまた、ゲノムにおけるオフターゲット変異の頻度も増加させ得る。実際に、このことは、ＭＭＲ欠損株において一般的に行われるＭＡＧＥ（多重自動ゲノム編集）の際に観察された。最近、温度感受性ＭＭＲ対立遺伝子を使用すると、オフターゲット変異を制限しながら、効率的なＭＡＧＥが可能となることが証明された。S. pneumoniaeに条件つきＭＭＲ欠損を適用することもまた、オフターゲット効果を制限しながら、効率的なＭｕＧＥＮＴを可能にし得る。
【０１２０】
ＭｕＧＥＮＴは、２つの自然形質転換可能な細菌、すなわちグラム陰性V. cholerae およびグラム陽性S. pneumoniaeにおける多重ゲノム編集のために使用することができる。これらの微生物はいずれもヒト病原菌であり、ＭｕＧＥＮＴは、新規表現型を明らかにし、これらの細菌がどのようにしてその哺乳動物宿主と相互作用するかに関して深い洞察を提供する潜在性を有する。詳細には、ＭｕＧＥＮＴは、多数の定義された変異を有する株を迅速に生成するために必要なツールを提供すると共に、遺伝子相互作用試験のプラットフォームとして新規生物学を明らかにする潜在性を保有する。
【０１２１】
しかし、VibrioおよびStreptococciの非病原性の種もまた、加速進化のプラットフォームとしてのＭｕＧＥＮＴから利益が得られ得る。Vibrio種は、水性環境において天然に見いだされる。キチンは、食品産業の廃棄物であり、水性環境における最も豊富な生体分子であり、Vibrioは、炭素および窒素源としてキチンを天然に分解して利用する。このように、これらの種は、投入炭素源としてキチンを使用する生物工学応用のために利用することができる。加えて、いくつかのVibrio種、すなわち、V. splendidusは、アルギン酸塩を分解および利用することができ、生物工学応用のために利用することができる可能な炭素源をさらに拡大する。現在、これらの種の制限的な特徴は、効率的な代謝および表現型工学のために必要な遺伝子ツールがないことである。今日まで、自然コンピテンスおよび自然形質転換が、多数のVibrio種において証明されている。このように、ＭｕＧＥＮＴは、多様な生物工学応用において使用するためのVibrio種を開発するために必要な遺伝子ツールを提供する。プロバイオティック微生物であるStreptococcus thermophilusは、乳産業において一般的に使用され、自然コンピテントである。このように、ＭｕＧＥＮＴは、乳産業におけるその使用を変革もしくは増強するために、ならびにこの種のプロバイオティック活性を増強するために、S. thermophilusにおける代謝工学のために使用され得る。
【０１２２】
多数の多様な微生物種が、自然形質転換可能であることが公知であるかまたはバイオインフォマティクスに基づいて予測され、従って、ＭｕＧＥＮＴの使用のための候補であろう。これらには、Bacillus、Cyanobacterium、Lactococcus、Acinetobacter、Neisseria、およびHaemophilus種が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。このように、この方法は、多様な研究および生物工学アプリケーションのために広く応用可能となるはずである。
【０１２３】
（実施例５：V. cholerae宿主株における細菌人工染色体の共形質転換変異誘発）
ＭｕＧＥＮＴは、細菌人工染色体の多重ゲノム編集のために使用することができる。細菌人工染色体（ＢＡＣ）は、細菌においてインサートＤＮＡの大きいセグメント（１００ｋｂ〜３５０ｋｂ）のクローニングを可能にする。ＤＮＡをＢＡＣにクローニング後、細菌系において利用可能な遺伝学的ツールを使用して遺伝子改変することができる。この理由から、ＢＡＣは、トランスジェニック動物モデルを作製するためおよび大きいウイルス（ヘルペスウイルス、コロナウイルス、ポックスウイルス、およびフラボウイルス）の変異誘発のために広く使用されている。
【０１２４】
現在、ＢＡＣを維持するために使用される最も一般的な細菌宿主は、Escherichia coliであり、ＢＡＣの変異誘発に利用可能な最善の方法は、「リコンビニアリング」として知られているものである。この方法は、細胞１０，０００〜１００，０００個中に１個の効率でＢＡＣの変異誘発を可能にする（例えば、細胞の０．０１％〜０．００１％が変異を含む）。このようにして、選択可能マーカー（すなわち、抗生物質耐性遺伝子）が、しばしば、所望の変異体ＢＡＣを含有する細菌細胞を単離するために使用される。しかし、多くの場合において、最終的なＢＡＣにおいてこれらの選択可能マーカーを有することは望ましくない。
【０１２５】
得られたＢＡＣが選択可能マーカーを欠くようなＢＡＣ変異誘発を可能にする３つの方法がある。第１の方法においては、１）リコンビナーゼ標的部位が隣接する選択可能マーカーを使用してリコンビニアリングを行う。選択可能マーカーを使用して変異体ＢＡＣを選択した後、次にマーカーを２）部位特異的リコンビナーゼの発現によって特異的に切除する。この技法においては、得られたＢＡＣは選択可能マーカーを欠くが、複数のステップを必要とし、リコンビナーゼ標的配列の「痕跡」配列を含む。第２の方法では、選択可能マーカーとカウンター選択可能マーカーとを含む遺伝子カセットをリコンビニアリングに使用する。この方法もまた、１）リコンビニアリングを行って、このカセットを所望の座に導入して、選択可能マーカーを介して選択するステップ、次に２）遺伝子カセットを所望の変異と置き換える第２ラウンドのリコンビニアリングを行うステップという、２つのステップを有し、この変異は、カウンター選択可能マーカーを介して選択される（すなわち、現時点で遺伝子カセットを欠く細胞を選択する）。ここでは、得られたＢＡＣは、選択可能マーカーを欠き、「痕跡がない」が、編集されたＢＡＣを得るために複数のステップを必要とする。第３の方法においては、１）いかなる選択可能マーカーも使用することなくリコンビニアリングを行って、まれな変異体ＢＡＣ（０．００１％）を、２）リコンビニアリングされた集団の濃縮によって回収する。この濃縮は、これらのまれなＢＡＣを単離するために、多数の希釈ステップおよびＰＣＲステップを必要とする。この方法は、１回のリコンビニアリング反応で、痕跡のないＢＡＣ変異誘発を可能にするが、しかしながらこの手順は、編集されたＢＡＣを濃縮する冗長なプロセスを必要とする。加えて、上記の方法の３つすべてについて、これらのＢＡＣにおいて複数の変異を生成する必要がある場合には、それらは、順次的に（すなわち、一度に一つずつ）作製されなければならない。
【０１２６】
本明細書において、１ステップでＢＡＣの多重変異誘発を可能にする新規変異誘発技法を説明する。結果は、自然共形質転換を、細菌Vibrio choleraeにおける痕跡のないゲノム編集のために使用できることを証明している。この方法は、２つ以上のＤＮＡ産物のＢＡＣへの共形質転換に基づく。１つの産物は、中立座において組み込まれる選択可能マーカーを有し（例えば、不要な遺伝子を抗生物質耐性マーカーと置き換える）、他の産物は、目標の座において組み込まれる、痕跡のない変異を有する。E.coliにおいて使用されるＢＡＣはV. choleraeにおいても増殖させることができる。
【０１２７】
予備試験の結果は、V. choleraeにおける共形質転換を使用して、ＢＡＣが、細胞２．５個あたり約１個の効率で編集されることを示した（例えば、この変異誘発技法後に細胞の４０％が所望の痕跡のない変異を含む）。図７は、V. cholerae宿主株におけるＢＡＣの共形質転換変異誘発における共形質転換率を示すグラフである。V. cholerae宿主株は、不活化ｌａｃＺ遺伝子を有し、ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）誘導プロモーターからｔｆｏＸを過剰発現し、pBluelox（細菌人工染色体ベクター骨格）を有する。この株を、選択マーカー（V. cholerae染色体に組み込まれ、スペクチノマイシンに対する耐性を付与したＰＣＲ産物）、および、３つの点突然変異を導入するかまたはpBlueloxのlacZ遺伝子の５０ｂｐを削除する非選択産物と共に、１００μＭ  ＩＰＴＧを含むＬＢ（Luria培地）において形質転換した。変異特異的コロニーＰＣＲによって、非選択産物の組み込みに関して形質転換体をスクリーニングした。データを２回の独立した生物学的反復実験から得た。
【０１２８】
この新規方法は、V. cholerae株、共形質転換の際の選択のために必要なＤＮＡ、およびＢＡＣ変異誘発のための陽性対照が供給されるＢＡＣ変異誘発キットの作製にふさわしいであろう。キットのユーザーは、編集を必要とするＢＡＣと、ＢＡＣに組み込まれる目標の変異を含むＰＣＲ産物とを供給するだけでよいであろう。
【０１２９】
本明細書において記述される結果は、以下の方法および材料を使用して得られた。
【０１３０】
（細菌株および培養条件）
V. choleraeおよびS. pneumoniaeの親株をすべて、表２に記載する。V. choleraeおよびS. pneumoniaeを、正確に本明細書において記述される通りに、ルーチンで増殖させた。V. choleraeについては、適宜、培地に５０μｇ／ｍＬカナマイシン、１００μｇ／ｍＬスペクチノマイシン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、または１００μｇ／ｍＬアンピシリンを添加した。S. pneumoniaeについては、適宜、培地に２００μｇ／ｍＬスペクチノマイシン、４μｇ／ｍＬクロラムフェニコール、または１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加した。
【０１３１】
【表２】
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【０１３２】
（変異体構築物および株の作製）
本研究の全体を通して、選択および非選択ＰＣＲ産物のための変異体構築物は、他のＰＣＲポリメラーゼと比較して低いエラー率を有するＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Thermo Scientific）を使用して、正確に本明細書において記述される通りにスプライシング・バイ・オーバーラップ伸長（ＳＯＥ：splicing by overlap extension）ＰＣＲにより生成した。すべてのＳＯＥ産物を生成するために使用したプライマーを表３に列挙する。V. choleraeでは、選択産物が標的とする中立座は、真正フレームシフトを有するトランスポザーゼ偽遺伝子であるＶＣ１８０７であり、これをスペクチノマイシン、カナマイシン、またはアンピシリン耐性マーカーと置き換えた。S. pneumoniaeでは、選択産物は、ＳＰ＿１０５１をクロラムフェニコールまたはスペクチノマイシン耐性マーカーと置き換えた。V. choleraeにおけるＭｕＧＥＮＴの際に使用したＰｔａｃおよびｒｒｎＢアンチターミネーターからなるプロモーター構築物は、以前に記述されたＴｎ１０トランスポゾンの末端に由来した。
【０１３３】
【表３】
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【０１３４】
（V. choleraeにおける自然形質転換およびＭｕＧＥＮＴ）
エビの殻由来のキチン上で増殖後のV. choleraeの自然形質転換を、本明細書において記述されるように行った。簡単に説明すると、指数関数的増殖期中期のV. cholera １０８ＣＦＵ（コロニー形成単位）を、定義された人工海水（７ｇ／Ｌ）１ｍＬ中のキチンフレーク８０ｍｇに添加した。培養物を静置して１６〜２４時間インキュベートして、自然コンピテンスを誘導した。次に、上清を丁寧に除去して、新しい人工海水と置き換えて、V. choleraeによって天然に分泌されたＤＮアーゼの存在を減少させた。次に、ＤＮＡを表記の濃度で添加して、３０℃でさらに１６時間静置してインキュベートした。形質転換効率およびキチン上のバイオマスを評価するために、反応をＡｂＲマーカー（すなわち、形質転換体）について選択的な培地に直接播種し、および抗生物質を欠く培地に直接播種して総生存ＣＦＵを評価した（すなわち、キチン上の総バイオマス）。形質転換効率は、
形質転換体のＣＦＵ／総生存ＣＦＵ
として定義された。
【０１３５】
ｌａｃＺへの共形質転換については、細胞を、ＡｂＲマーカーについて選択的であり４０μｇ／ｍＬ  ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）を含む培地に播種して、共形質転換率を評価した。
【０１３６】
ＭｕＧＥＮＴについて、選択マーカーを含む、すべてのＰＣＲ産物は、形質転換反応に３μｇ／ｍＬで添加され、３ｋｂのホモロジーアームを有したが、これは共形質転換に関する最適なホモロジーアームの長さおよび濃度であることが見いだされたものである。これらの条件で、１ｍＬ反応物でのそれぞれのサイクルのＭｕＧＥＮＴによって≧１０５個の形質転換体が生成された。反応物をＤＮＡと共にインキュベートした後、試料を抗生物質の非存在下のＬＢブロスにおいて１時間増殖させた。反応物の少量のアリコート（約１／１０）を播種して形質転換効率を評価し、選択的プレートからの単コロニーを、ＭＡＳＣ  ＰＣＲのために使用した。それぞれの形質転換の残りを、形質転換体を選択するための適切な抗生物質を含むＬＢブロス５０ｍＬに接種して、通気しながら３７℃で終夜増殖させた。翌日、この培養物を、抗生物質を欠く培地で１：１００に希釈して、ＯＤ６００が約１．０となるまで増殖させた。次に、これらの細胞を洗浄して、約１０８ＣＦＵをキチン上に播種して、別のサイクルのＭｕＧＥＮＴを繰り返すか、または変異体プールから形質転換体を選択した。最初のサイクルのＭｕＧＥＮＴの後、この変異体プールを用いたその後のすべての形質転換は、１０μＭ  ＩＰＴＧの存在下で行って、いくつかのゲノム編集において使用されるＰｔａｃプロモーターの発現を誘導した。編集された遺伝子ｈａｐＲのＩＰＴＧ誘導発現によって増殖の欠陥が起こることから、ＬＢでの増殖は常に、ＩＰＴＧの非存在下で行った。
【０１３７】
（S. pneumoniaeにおける自然形質転換およびＭｕＧＥＮＴ）
S. pneumoniaeにおける自然形質転換を、正確に本明細書に記述される通りに行った。簡単に説明すると、細菌を形質転換培地（１３ｍＭ  ＨＣｌおよび０．０５％グリシンを含むＴＨＹブロス）において、開始ＯＤ６００＝０．０２からＯＤ６００＝０．０６となるまで増殖させた。培養物５００μｌを、ガラス試験管中の予め加温したＴＨＹ  ５００μｌに添加した。次に、ＮａＯＨ（１Ｎ保存液）１０μｌ、ＢＳＡ（８％保存液）２５μｌ、ＣａＣｌ２（１Ｍ保存液）１μｌ、およびＣＳＰ２（３５０ｎｇ／μｌ保存液）１．６μｌを記載順に反応物に添加した。次に、反応を３７℃で正確に１４分間インキュベートした後、形質転換ＤＮＡを添加した。ＭｕＧＥＮＴのために、それぞれの非選択産物１．５μｇおよび選択産物３００ｎｇを、１ｍＬ形質転換反応物に添加した。すべての非選択産物は２．５〜３ｋｂのホモロジーアームを有した一方、選択産物は１．５ｋｂのホモロジーアームを有した。ＤＮＡの添加後、反応物を３７℃の５％ＣＯ２インキュベータにおいて１時間インキュベートした。それぞれの反応物の少量のアリコート（約１／１０）を播種して形質転換効率を評価し、選択プレートからの単コロニーをＭＡＳＣ  ＰＣＲのために使用した。形質転換の残りを、形質転換体について選択的な培地において、単コロニーとなるように播種した。翌日、これらのプレートをＴＨＹ培地で浸して、コロニーを再懸濁させた。次に、この細菌スラリーを、新しいＴＨＹ培地１０ｍLにＯＤ６００＝０．０５となるように希釈して、ＯＤ６００＝約０．６となるまで増殖させた。次に、細胞を洗浄して希釈し、再度形質転換して、追加のＭｕＧＥＮＴサイクルを行った。
【０１３８】
（ＭＡＳＣ  ＰＣＲ）
ＭｕＧＥＮＴのそれぞれのサイクルにおいて、２４〜４８個の単コロニーを、本質的に本明細書において記述される通りにＭＡＳＣ  ＰＣＲによってゲノム編集に関して評価した。ＭＡＳＣ  ＰＣＲのために使用したオリゴは、すべて表３に記載されたものである。
【０１３９】
（自然共形質転換の際のバイアスを評価するためのハイスループットシークエンシングデータの分析）
V. choleraeのｌａｃＺ遺伝子における６個（Ｎ６）または３０個（Ｎ３０）の塩基をランダム化したＰＣＲ産物の共形質転換後、得られた形質転換体プールから精製したゲノムＤＮＡから、ならびにインプットのＰＣＲスプライシング・バイ・オーバーラップ伸長（ＳＯＥ）産物から、ディープシークエンシングのためのライブラリを生成した。これは、最初にＡＢＤ４１９およびＡＢＤ４０８を用いたＰＣＲ増幅を行うことによって達成された。次に、このＰＣＲを、ＡＢＤ４２０およびリバースプライマー（IlluminaＨｉＳｅｑの１つのレーンで一緒に移動する試料を区別するために使用された固有の６ｂｐバーコード配列を付加する）を使用する２ラウンド目のＰＣＲの鋳型として使用した。シークエンシングライブラリを調製するために使用したすべてのプライマーは表３に見いだすことができる。
【０１４０】
シークエンシング後、データをTufts University Galaxyサーバーで分析した。最初に、「トリム」ツールを使用して、Ｎ３０試料に関しては最初の６塩基を、あるいはＮ６試料に関しては１７塩基を除去した。次に、クリップツールを使用して、すべての分子の３’末端における一定の配列を除去した（Ｎ６＝5’-CACTGCCGTACACCCCATGTTCCTTTGC-3’ およびＮ３０＝5’-CCCCATGTTCCTTTGC-3’）。フィルターｆａｓｔｑを使用して、６塩基（Ｎ６）または３０塩基（Ｎ３０）の長さのリード、および最小クオリティスコア３４（０〜４１の尺度上）を得た。それらがＷＴコンセンサスからどれほど逸脱しているかに関してこれらのリードの分布を定義するために、ＷＴ配列を参照として使用するバーコードスプリッターツールを使用して、任意の数（ｎ＝１、２、３、、、３０）のミスマッチを許容して、ＷＴ配列との差が１、２、３塩基等々である配列の分布を定義した。インプットおよび得られた形質転換体プールにおけるそれぞれのＮ６量体の正確な量を定義するために、バーコードスプリッターツールを、参照としてそれぞれのＮ６量体の配列を用いて使用して、０個のミスマッチを許容した。
【０１４１】
（Vibrio Choleraeの共形質転換プロトコール）
V. Cholerae培養物をローラードラム内で振とうさせて３０℃で終夜増殖させた。翌朝、２０μＬの二次培養物を５ｍＬの新しいＬＢに移して、ＯＤ６００＝０．４〜１．０に達するまで３０℃で増殖させた。１ｍＬアリコート中の細胞を１８，０００ｒｃｆで１分間沈降させて（微量遠心）、上清を除去した。細胞を、等量の０．５×インスタント海水（ＩＯ）（７ｇ／Ｌ）で１回洗浄した後、０．５×ＩＯ中でＯＤ６００＝１．０となるように再懸濁させた。次に、９００μＬの０．５×ＩＯを採取して、それぞれの形質転換反応のためにキチン（エビ：Sigma-C7170）５０ｍｇの上に載せた。キチン（乾燥）は予め２ｍＬチューブにおいてオートクレーヴした。次に、ステップ４からの洗浄した細胞１００μＬをそれぞれのチューブに添加して、ボルテックスミキサーで混合した。次に細胞を、３０℃で１６〜２４時間静置した。
【０１４２】
エキソおよびエンドヌクレアーゼ活性を最小限にするために、上清約５００μＬを、沈降したキチンを乱さないように除去した。これを新しい０．５×ＩＯ  ３００μＬに置き換えた。次に、非選択ＰＣＲ産物３〜５μｇを添加した後、選択ＤＮＡを添加した。プラスミドに関しては、ｐＢＡＤ１８Ｋａｎ（プラスミドはｒｅｃＡ＋宿主株（すなわち、ＴＧ１）において調製した）の場合、１μｇが約１０４個の形質転換体を生じた。ＰＣＲ産物に関しては、１００ｎｇが約１０３〜１０４個の形質転換体を生じ、３μｇが約１０５個の形質転換体を生じた。より長いホモロジーアームはより多くの形質転換体を生じた。次に反応物を２〜３回穏やかに反転させて反応物を混合した。
【０１４３】
反応物を３０℃の静置状態に戻し、細胞を１６〜２４時間インキュベートした。形質転換反応物をボルテックスミキサーにより十分に混合し、５００μＬを、ＬＢ  １ｍＬを含む２ｍＬエッペンドルフチューブに移した。変異体を解離させて分離するとともに細菌の塊を壊して各コロニーが確実にクローン性となるように、反応物を振とうさせながら３７℃で１〜３時間増殖させた。
【０１４４】
次に、選択マーカーについて選択するための抗生物質を有する培地に培養物を播種して、３０℃で終夜置いた。コロニーを採取して、抗生物質を含むブロス２００μＬ（９６ウェルプレート）で増殖させ、同時に、コロニーＰＣＲによってコロニーを変異に関してスクリーニングした（すなわち、コロニーを滅菌チップで採取して、選択培地２００μＬに軽く漬けた後、コロニーの残りを水５０μＬの中で粉砕して、後者を煮沸して、２〜３μＬをＴａｑポリメラーゼによる２５μＬのコロニーＰＣＲのために使用した）。反応物を９６ウェルプレート中で３７℃にて静置した。陽性ウェル（すなわち、目標の変異を含むウェル）を、再び選択培地上で単コロニーとなるように筋状に再塗付し、この筋状再塗付物からの単コロニーの遺伝子型を再確認した。
【０１４５】
（他の態様）
本明細書における可変要素の任意の定義における要素の列挙の記載は、いずれか単一の要素または列記された要素の組合せ（または部分組合せ）としてのその可変要素の定義を包含する。本明細書における実施形態の列挙は、いずれか単一の実施形態または任意の他の実施形態もしくはその一部との組合せとしてその実施形態を含む。
【０１４６】
本明細書において引用された特許、特許出願、および刊行物の開示はいずれも、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。本発明は、特定の実施形態を参照して開示されているが、本発明の真の趣旨および範囲から逸脱することなく本発明の他の実施形態および変更が当業者によって工夫され得ることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、そのような実施形態および同等の変更のすべてを含むと解釈されることが意図される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図１Ｊ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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