(57)【要約】  本発明は、ＳＯＤ１遺伝子に対する低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子、ｓｉＲＮＡ分子をコードするアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、およびｓｉＲＮＡ分子およびＡＡＶベクターを用いた筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の治療方法に関する。
2017535266.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
センス鎖配列およびアンチセンス鎖配列を含む、細胞中のＳＯＤ１の発現を阻害または抑制するための２つの逆方向末端反復（ＩＴＲ）の間に位置する核酸配列を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、前記センス鎖配列は、表３、表１１または表１４に列挙された配列のヌクレオチド配列と３ヌクレオチド以下で異なる少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含み、前記アンチセンス鎖配列は、表３、表１１または表１４に列挙された配列のヌクレオチド配列と３ヌクレオチド以下で異なる少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含み、前記センス鎖配列およびアンチセンス鎖配列は少なくとも４ヌクレオチド長の相補性領域を共有する、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター。
【請求項２】
前記核酸配列が、ｓｉＲＮＡ二本鎖のセンス鎖配列およびアンチセンス鎖配列を含む、請求項１に記載のＡＡＶベクター。
【請求項３】
前記ｓｉＲＮＡ二本鎖が、ｓｉＲＮＡ二本鎖ＩＤ番号Ｄ−２７４１〜ＩＤ番号Ｄ−２９８５からなる群から選択される、請求項２に記載のＡＡＶベクター。
【請求項４】
前記ｓｉＲＮＡ二本鎖が、ｓｉＲＮＡ  ＩＤ：Ｄ−２７５７、Ｄ−２８０６、Ｄ−２８６０、Ｄ−２８６１、Ｄ−２８７５、Ｄ−２８７１、Ｄ−２７５８、Ｄ−２７５９、Ｄ−２８６６、Ｄ−２８７０、Ｄ−２８２３、およびＤ−２８５８の核酸配列からなる群から選択される、請求項２に記載のＡＡＶベクター。
【請求項５】
前記相補性領域が少なくとも１７ヌクレオチドの長さである、請求項１に記載のＡＡＶベクター。
【請求項６】
前記相補性領域が１９から２１ヌクレオチドの長さである、請求項５に記載のＡＡＶベクター。
【請求項７】
前記相補性領域が１９ヌクレオチドの長さである、請求項６に記載のＡＡＶベクター。
【請求項８】
前記センス鎖配列およびアンチセンス鎖配列が、独立して、３０ヌクレオチド以下である、請求項１に記載のＡＡＶベクター。
【請求項９】
前記センス鎖配列およびアンチセンス鎖配列の少なくとも１つが、少なくとも１ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む、請求項１に記載のＡＡＶベクター。
【請求項１０】
前記センス鎖配列およびアンチセンス鎖配列の少なくとも１つが、少なくとも２ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む、請求項９に記載のＡＡＶベクター。
【請求項１１】
前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９（ｈｕ１４）、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ−ＤＪ８およびＡＡＶ−ＤＪおよびそれらの変異体からなる群から選択されるキャプシド血清型を含む、請求項１に記載のＡＡＶベクター。
【請求項１２】
細胞中のＳＯＤ１遺伝子の発現を阻害する方法であって、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターを含む組成物を前記細胞に投与することを含む方法。
【請求項１３】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記哺乳類細胞が運動ニューロンである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記哺乳類細胞が星状細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
治療を必要とする対象における筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の治療および改善の少なくとも一方を行う方法であって、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターを含む組成物の治療有効量を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項１７】
前記ＳＯＤ１の発現が阻害または抑制される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＳＯＤ１が野生型ＳＯＤ１、少なくとも１つの突然変異を有する突然変異ＳＯＤ１、または野生型ＳＯＤ１および少なくとも１つの突然変異を有する突然変異ＳＯＤ１である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＳＯＤ１の発現が、約２０％〜約１００％阻害または抑制される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＡＬＳが、同定されたＳＯＤ１遺伝子突然変異を有する家族性ＡＬＳである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＡＬＳが散発性ＡＬＳである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
ＳＯＤ１遺伝子が細胞内で機能効果をもたらす変異を含む細胞におけるＳＯＤ１遺伝子の発現を抑制する方法であって、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターを含む組成物を前記細胞に投与することを含む方法。
【請求項２３】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記哺乳動物細胞が運動ニューロンである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記哺乳類細胞が星状細胞である、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は、２０１４年１１月１４日に出願されたＳＯＤ−１を標的とするｓｉＲＮＡを用いた筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の治療と題された米国仮特許出願第６２／０７９，５８８号、２０１５年８月３１日に出願された筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を治療する組成物および方法と題された米国仮特許出願第６２／２１１，９９２号、２０１５年９月２９日に出願された筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を治療する組成物および方法と題された米国仮特許出願第６２／２３４，４６６号の権利を主張しており、その各々の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表の参照
本出願は、電子フォーマットの配列表と共に提出されている。配列表は、２０１５年１１月１２日に作成された１２６，８７３バイトのサイズである１０１１ＰＣＴＳＬ．ｔｘｔという名前のファイルとして提供されている。配列表の電子フォーマットでの情報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
発明の分野
本発明は、調節性ポリヌクレオチド、例えばスーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）遺伝子を標的とする低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子の設計、調製、製造、使用および／または製剤のための組成物、方法およびプロセスに関する。本明細書中で使用される「調節ポリヌクレオチド」は、標的遺伝子、例えばｍＲＮＡのレベルまたは量、またはタンパク質レベルを調節（上昇または低下のいずれか）するように機能する任意の核酸配列である。ＳＯＤ１遺伝子の標的化は、ＳＯＤ１遺伝子発現およびＳＯＤ１酵素産生を妨害し得る。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列は、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに挿入される。神経変性疾患（例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ））を有する対象におけるＳＯＤ１遺伝子発現を阻害するためのｓｉＲＮＡ分子の使用方法も開示される。
【背景技術】
【０００４】
ルーゲーリック病としても知られる筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、最も致命的な進行性の神経変性疾患であり、一次運動野、脳幹、および脊髄における運動ニューロン（ＭＮ）の支配的な喪失を特徴とする。運動ニューロンの喪失は、呼吸などの基本的な基礎運動を崩壊させ、典型的には診断後２〜５年以内に患者に死に至らせる。患者の運動機能の進行性悪化は、呼吸能力をひどく低下させるため、患者の生存のために何らかの形の呼吸補助が必要となる。他の症状には、手、腕、脚または嚥下筋肉の筋力低下も含まれる。一部の患者（例えば、ＦＴＤ−ＡＬＳ）はまた、前頭側頭型認知症を発症し得る。
【０００５】
ＡＬＳ協会によると、米国では毎年約５，６００人がＡＬＳと診断されている。ＡＬＳの発生率は１０万人あたり２人であり、常に３万人というアメリカ人がこの疾患に罹患していると推定されている。
【０００６】
ＡＬＳには２つの形態が示されている：１つは散発性ＡＬＳ（ｓＡＬＳ）で米国で最も一般的なＡＬＳ型であり、診断されるすべての症例の９０〜９５％を占める。もう１つは家族性ＡＬＳ（ｆＡＬＳ）であり、これは主に家族間遺伝で、米国内の全症例の約５〜１０％にすぎない。またｓＡＬＳとｆＡＬＳは臨床的に区別できない。
【０００７】
病理学的研究では、疾患の発症後にいくつかの細胞プロセスに障害が起きることが見出
されており、たとえば、特に運動ニューロン（ＭＮ）における、ＥＲストレスの増加、フリーラジカル（すなわち、活性酸素種（ＲＯＳ））の生成、ミトコンドリア機能障害、タンパク質凝集、アポトーシス、炎症およびグルタミン酸興奮毒性を含む。
【０００８】
ＡＬＳの原因は複雑で異質である。一般に、ＡＬＳは、環境曝露と相まって複数の遺伝子が組み合わさり、その人に疾患が起こりやすくなる、複雑な遺伝的疾患であると考えられている。ＡＬＳに関連するものとして、ＳＯＤ−１（Ｃｕ２＋／Ｚｎ２＋スーパーオキシドジスムターゼ）、ＴＤＰ−４３（ＴＡＲＤＢＰ、ＴＡＲ  ＤＮＡ結合タンパク質−４３）、ＦＵＳ（肉腫において融合・転座する）、ＡＮＧ（アンギオゲニン）、ＡＴＸＮ２（アタキシン−２）、バロシン含有タンパク質（ＶＣＰ）、ＯＰＴＮ（オプチニューリン）、染色体９における非コード化ＧＧＧＧＣＣヘキサヌクレオチド反復の拡大、オープンリーディングフレーム７２（Ｃ９ＯＲＦ７２）を含む、十数種以上の遺伝子が発見されている。しかし、運動ニューロン変性の正確なメカニズムはまだ分かっていない。
【０００９】
現在、ＡＬＳの治癒的治療法はない。唯一のＦＤＡ承認薬はリルゾールであり、これはＡＬＳの疾患進行を抑えるためにグルタミン酸応答に拮抗するものである。しかし、早期段階にあるＡＬＳ患者においての約３ヶ月の寿命延長のみが報告されており、後期段階のＡＬＳ患者の治療上の利点は認められず、患者の治療選択肢の欠如を示している（非特許文献１）。したがって、疾患の進行を効果的に予防することができる新しい治療戦略が依然として求められている。
【００１０】
散発性および家族性ＡＬＳの両方の潜在的治療法については多くの異なる戦略が研究されている。１つの戦略は、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、コリベリンおよび活性依存性神経栄養因子（ＡＤＮＦ）由来ペプチドなどの、ニューロン生存を促進することができる神経栄養因子の神経保護および／または再生効果に基づくものである。いくつかの研究は、神経栄養因子が運動ニューロン機能を保存し、それによってＳＯＤ１トランスジェニックマウスにおいて運動能力が改善し得ることを示した。しかしながら、そのような治療は、しばしばＳＯＤ１マウスの生存を延長させることができず、神経栄養因子がニューロンの生存を延長するのに十分ではないことを示唆している（非特許文献２による評価を参照）。
【００１１】
ＡＬＳ治療のもう一つの戦略は、幹細胞に基づく療法に焦点を当てている。幹細胞は運動ニューロンを生成する可能性があり、それによって、ＡＬＳにおける退行運動ニューロン、すなわち一次運動皮質、脳幹および脊髄などの罹患したＣＮＳを置換する。人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）（例えば、骨髄間葉間質細胞（ＢＭＳＣ）と脂肪細胞幹細胞（ＡＳＣ））及び神経組織起源の神経幹細胞（例えば、胎児脊髄神経幹細胞（ＮＳＣ）、多分化能神経前駆細胞（ＮＰＣ））など複数の源から由来する幹細胞が調査されている（例えば、Ｋｉｍ  Ｃらによって評価された非特許文献３）。
【００１２】
スーパーオキシドジスムターゼＩ型遺伝子の突然変異（ＳＯＤ１；Ｃｕ２＋／Ｚｎ２＋スーパーオキシドジスムターゼＩ型）は、ｆＡＬＳの最も一般的な原因で、すべてのｆＡＬＳ症例の約２０〜３０％を占めている。最近の報告では、ＳＯＤ１突然変異はまた、すべてのｓＡＬＳ症例の約４％に関連している可能性が示されている（非特許文献４）。ＳＯＤ１関連ｆＡＬＳは、通常のＳＯＤ１活性の喪失によって引き起こされるのではなく、むしろ毒性機能の増加によって引き起こされる可能性が最も高い。突然変異型ＳＯＤ１関連ｆＡＬＳ毒性の仮説の１つは、異常型ＳＯＤ１酵素が、ペルオキシ亜硝酸または過酸化水素などの小分子に有害なフリーラジカルを生成させる原因となっていると述べている。突然変異ＳＯＤ１神経毒性の他の仮説には、プロテアソーム活性の阻害、ミトコンドリア損傷、ＲＮＡプロセシングの破壊および細胞内凝集物の形成が含まれる。ＡＬＳにおける
突然変異型ＳＯＤ１変異体および／または野生型ＳＯＤ１の異常な蓄積は、病理学的封入体として同定される不溶性原線維凝集体を形成する。凝集したＳＯＤ１タンパク質は、細胞、特に運動ニューロンに対し、ミトコンドリアストレス（非特許文献５）及び他の毒性を誘発し得る。
【００１３】
これらの知見は、ＳＯＤ１が家族性および散発性の両方のＡＬＳの潜在的な治療標的であることを示している。ＡＬＳ患者の中枢神経系において産生されるＳＯＤ１タンパク質を減少させることができる療法は、運動ニューロン変性、筋肉衰弱および萎縮といったＡＬＳ患者の症状を改善し得る。野生型および／または変異型ＳＯＤ１タンパク質凝集の形成を防止することを目的とする薬剤および方法は、疾患の進行を予防し、ＡＬＳ症状の改善を可能にし得る。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）媒介遺伝子サイレンシングは、近年研究者の関心を呼んでいる。ＳＯＤ１遺伝子を標的とする小さな二本鎖ＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）分子は、ＡＬＳの治療におけるそれらの可能性について当該分野で教示されている（例えば、特許文献１および特許文献２を参照。その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許第７，６３２，９３８号明細書
【特許文献２】米国特許公開第２００６０２２９２６８号
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｂｅｎｓｉｍｏｎ  Ｇら，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ）。２００２，２４９，６０９−６１５
【非特許文献２】ＹａｃｉｌａおよびＳａｒｉ，Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．，２０１４，２１（３１），３５８３−３５９３
【非特許文献３】Ｋｉｍ  Ｃら，Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，２０１４，２３（３），２０７−２１４
【非特許文献４】ＲｏｂｂｅｒｅｃｈｔおよびＰｈｉｌｉｐ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２０１３，１４，２４８−２６４
【非特許文献５】Ｖｅｈｖｉｌａｉｎｅｎ  Ｐら，Ｆｒｏｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２０１４，８，１２６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、疾患の治療のためのＡＬＳ患者におけるＳＯＤ１の発現を阻害または防止するための、ＲＮＡ干渉に基づくアプローチを開発する。
本発明は、新規の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）構築物およびｓｉＲＮＡ構築物ならびにそれらの設計方法を提供する。さらに、これらの新規のｓｉＲＮＡ構築物は、合成分子であってもよく、または細胞への投与のために発現ベクター（一方または両方の鎖）にコードされてもよい。そのようなベクターは、例えばＡＡＶ血清型のいずれかのベクターゲノムなどのアデノ関連ウイルスベクター、またはレンチウイルスなどの他のウイルス投与ビヒクルを含むが、これに限定されない。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、遺伝子発現およびタンパク質産生を伴うＲＮＡ分子媒介遺伝子特異的干渉に関する。筋萎縮性側索硬化症などの運動ニューロン変性疾患を治療するための方法も、本発明に含まれる。本明細書で扱っている組成物に含まれるｓｉＲＮＡは、ＳＯＤ１遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部と実質的に相補的である、３０ヌクレオチド以下、概して１９−２４ヌクレオチドの長さの領域を有するアンチセンス鎖（アンチセンス鎖）を
有するｄｓＲＮＡを包含する。
【００１８】
本発明は、ＳＯＤ１発現および／またはＳＯＤ１タンパク質産生を妨げるためにＳＯＤ１  ｍＲＮＡを標的とする、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）二本鎖のような短鎖二本鎖ＲＮＡ分子を提供する。本発明のｓｉＲＮＡ二本鎖は、ＳＯＤ１遺伝子のいずれかの特定の突然変異にかかわらずＳＯＤ１遺伝子の両方の対立遺伝子を阻害し得、特にＡＬＳ疾患に見られるものと相互作用し得る。
【００１９】
いくつかの実施形態では、そのようなｓｉＲＮＡ分子、またはｓｉＲＮＡ分子の一本鎖は、アデノ随伴ウイルスベクターに挿入され、細胞、特に運動ニューロンおよび／または中枢神経系の他の周囲細胞内に入れる。
【００２０】
本発明のｓｉＲＮＡ二本鎖は、二本鎖構造を形成するようにハイブリダイズしたアンチセンス鎖およびセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は標的ＳＯＤ１遺伝子の核酸配列に相補的であり、センス鎖は核酸に対して相同である標的ＳＯＤ１遺伝子の配列である。いくつかの態様では、アンチセンス鎖の５’末端は５’ホスフェート基を有し、センス鎖の３’末端は３’ヒドロキシル基を含む。他の態様において、各鎖の３’末端には、ヌクレオチドオーバーハングは存在しないか、１つまたは２つ存在する。
【００２１】
本発明によれば、ＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二本鎖の各鎖は、長さが約１９−２５ヌクレオチド、好ましくは約１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、または２５ヌクレオチドの長さである。いくつかの態様では、ｓｉＲＮＡは非修飾ＲＮＡ分子であってもよい。
【００２２】
他の態様では、ｓｉＲＮＡは、塩基、糖または主鎖修飾のような少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを含み得る。
一実施形態では、ｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡは、互いに相補的である少なくとも２つの配列を含む。ｄｓＲＮＡは、第１の配列を有するセンス鎖および第２の配列を有するアンチセンス鎖を含む。アンチセンス鎖は、ＳＯＤ１をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、その相補性領域は３０ヌクレオチド以下、且つ少なくとも１５ヌクレオチドの長さである。一般的に、ｄｓＲＮＡは１９〜２４ヌクレオチド、例えば１９〜２１ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは長さが約１５〜約２５ヌクレオチドであり、他の実施形態ではｄｓＲＮＡは長さが約２５から３０ヌクレオチドである。
【００２３】
ｄｓＲＮＡは、ＳＯＤ１を発現する細胞と接触するか、またはＳＯＤ１を発現する細胞内で転写すると、例えば本明細書に記載の方法によってアッセイした場合に、ＳＯＤ１遺伝子の発現を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％または少なくとも４０％またはそれ以上を阻害または抑制する。
【００２４】
本発明によれば、ＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二本鎖、ｓｉＲＮＡ二本鎖の一本鎖、またはｄｓＲＮＡをコードする核酸を含むＡＡＶベクターが産生され、そのＡＡＶベクター血清型はＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９（ｈｕ１４）、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ−ＤＪ８および／またはＡＡＶ−ＤＪ、およびそのバリアントである。
【００２５】
本発明によれば、ＡＬＳにおけるＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二本鎖またはｄｓＲＮＡは、表３，１１または１３に列挙されるｓｉＲＮＡ二本鎖から選択される。好
ましくは、ＡＬＳにおけるＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二本鎖またはｄｓＲＮＡは、以下のｓｉＲＮＡ二本鎖から成る群：Ｄ−２７５７、Ｄ−２８０６、Ｄ−２８６０、Ｄ−２８６１、Ｄ−２８７５、Ｄ−２８７１、Ｄ−２７５８、Ｄ−２７５９、Ｄ−２８６６、Ｄ−２８７０、Ｄ−２８２３及びＤ−２８５８から選択される。
【００２６】
本発明はまた、ＳＯＤ１遺伝子を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ二本鎖および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。いくつかの態様において、ｓｉＲＮＡ二本鎖をコードする核酸配列は、ＡＡＶベクターに挿入される。
【００２７】
いくつかの実施形態において、本発明は、細胞におけるＳＯＤ１遺伝子発現を阻害／サイレンシングするための方法を提供する。したがって、ｓｉＲＮＡ二本鎖またはｄｓＲＮＡを使用して、細胞、特に運動ニューロンにおけるＳＯＤ１遺伝子発現を実質的に阻害することができる。いくつかの態様では、ＳＯＤ１遺伝子発現の阻害は、少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％および１００％の阻害である。したがって、標的遺伝子のタンパク質産物は、少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、および１００％阻害され得る。ＳＯＤ１遺伝子は、野生型遺伝子または少なくとも１つの変異を有する変異型ＳＯＤ１遺伝子のいずれであっても良い。したがって、ＳＯＤ１タンパク質は、野生型タンパク質または少なくとも１つの変異を有する突然変異ポリペプチドのいずれかである。
【００２８】
いくつかの実施形態では、本発明は、治療を必要とする対象に、異常ＳＯＤ１遺伝子および／またはＳＯＤ１タンパク質に関連する筋萎縮性側索硬化症を治療または改善する方法を提供するものであり、当該方法は、ＳＯＤ１遺伝子を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ二本鎖の薬学的に有効な量を対象に投与すること、前記ｓｉＲＮＡ二本鎖を標的細胞に送達すること、ＳＯＤ１遺伝子発現およびタンパク質産生を阻害すること、対象におけるＡＬＳの症状を改善することを含む。
【００２９】
いくつかの実施形態において、ＳＯＤ１遺伝子を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ二本鎖をコードする核酸配列を含むＡＡＶベクターは、ＡＬＳを治療および／または改善する必要がある対象に投与される。ＡＡＶベクターの血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９（ｈｕ１４）、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０およびＡＡＶ−ＤＪおよびその変異体からなる群から選択され得る。
【００３０】
いくつかの態様において、ＡＬＳはＳＯＤ１突然変異に関連する家族性ＡＬＳである。他の態様において、ＡＬＳは、必ずしも遺伝的突然変異の結果としてではないが、ＳＯＤ１タンパク質の異常な凝集またはＳＯＤ１タンパク質の機能または局在の破壊によって特徴付けられる散発性ＡＬＳである。本方法によって改善されるＡＬＳの症状には、運動ニューロンの変性、筋肉の衰弱、筋肉の硬直、痙攣発作および／または呼吸困難が含まれる。
【００３１】
いくつかの実施形態では、ＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二本鎖またはｄｓＲＮＡまたはそのようなｓｉＲＮＡコード分子を含むＡＡＶベクターは、例えば頭蓋内注射によって、対象の中枢神経系に直接導入することができる。
【００３２】
いくつかの実施形態において、本発明の医薬組成物は、単独療法として使用される。他の実施形態では、本発明の医薬組成物は併用療法に使用される。併用療法は、運動ニューロン変性に対する神経保護効果について試験された小分子化合物、成長因子およびホルモンなどの１つまたは複数の神経保護剤と組み合わせてもよい。
【００３３】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載する、治療上有効な量のプラスミドまたはＡＡＶベクターを、それを必要とする対象に投与することによって筋萎縮性側索硬化症を治療または改善する方法を提供する。ＡＬＳは、家族性ＡＬＳまたは散発性ＡＬＳであり得る。
【００３４】
本発明の前述及び他の目的、特徴および利点は、添付の図面に示されるように、本発明の特定の実施形態の以下の説明から明らかにする。添付の図面では、記載されている類似の参照符号が、異なる視点を通して同じ部分を表している。図面は必ずしも縮尺通りではなく、本発明の様々な実施形態の原理を例示することに重点を置いている。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】ＡＡＶベクターにコードされた構築物の活性を示すヒストグラムである。
【図２】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＡＡＶベクターにコードされた調節ポリヌクレオチドのガイド鎖の活性を示すヒストグラムである。
【図３】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＡＡＶベクターにコードされた調節ポリヌクレオチドのパッセンジャー鎖の活性を示すヒストグラムである。
【図４】ＨｅＬａ細胞におけるＡＡＶベクターにコードされた調節ポリヌクレオチドのガイド鎖の活性を示すヒストグラムである。
【図５】ＨｅＬａ細胞におけるＡＡＶベクターにコードされた調節ポリヌクレオチドのパッセンジャー鎖の活性を示すヒストグラムである。
【図６】細胞内ＡＡＶ  ＤＮＡのヒストグラムである。
【図７】ヒト運動ニューロンにおけるＡＡＶベクターにコードされた構築物の活性を示すヒストグラムである。
【図８】Ｕ２５１ＭＧ細胞におけるＳＯＤ１の用量依存的サイレンシングを示すチャートである。
【図９】ヒト星状細胞におけるＳＯＤ１の用量依存的サイレンシングを示すチャートである。
【図１０】Ｕ２５１ＭＧ細胞におけるＳＯＤ１のサイレンシングの経時変化を示すチャートである。
【図１１Ａ】構築物の用量依存性効果を示すチャートであって、相対ＳＯＤ１発現を示す。
【図１１Ｂ】構築物の用量依存性効果を示すチャートであって、ガイド鎖のパーセントを示す。
【図１１Ｃ】構築物の用量依存性効果を示すチャートであって、パッセンジャー鎖のパーセントを示す。
【図１２】ＩＴＲ、イントロン（Ｉ）及びポリＡ（Ｐ）に対する調節ポリヌクレオチド（ＭＰ）の位置を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明は、調節ポリヌクレオチド、例えば、治療剤としてのＲＮＡまたはＤＮＡ分子に関する。ＲＮＡ干渉媒介遺伝子サイレンシングは、標的とする遺伝子の発現を特異的に阻害することができる。次いで、本発明は、ＳＯＤ１遺伝子を標的とする小さな二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子（低分子干渉ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）、そのようなｓｉＲＮＡを含む医薬組成物、およびそれらの設計方法を提供する。本発明はまた、神経変性疾患、特に筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を治療するためのＳＯＤ１遺伝子発現およびタンパク質産生を阻害するためのそれらの使用方法を提供する。
【００３７】
本発明は、ＳＯＤ１  ｍＲＮＡ発現および／またはＳＯＤ１タンパク質産生を妨げるために、ＳＯＤ１  ｍＲＮＡを標的とする低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）二本鎖（および
それらをコードする調節ポリヌクレオチド）を提供する。本発明のｓｉＲＮＡ二本鎖は、ＳＯＤ１遺伝子のいずれかの特定の突然変異にかかわらずＳＯＤ１遺伝子の両方の対立遺伝子を阻害し得、特にＡＬＳ疾患に見られるものと相互作用し得る。
【００３８】
いくつかの実施形態では、そのようなｓｉＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子の一本鎖をコードする核酸配列をアデノ随伴ウイルスベクターに挿入し、細胞、特に運動ニューロンおよび／または中枢神経系の他の周辺細胞に導入する。
【００３９】
本発明の、コードされたｓｉＲＮＡ二本鎖は、二本鎖構造を形成するように互いにハイブリダイズしたアンチセンス鎖およびセンス鎖を含み、アンチセンス鎖が標的ＳＯＤ１遺伝子の核酸配列に相補的であり、またセンス鎖が標的ＳＯＤ１遺伝子の核酸配列と相同である。いくつかの態様では、アンチセンス鎖の５’末端は５’ホスフェート基を有し、センス鎖の３’末端は３’ヒドロキシル基を含む。他の態様において、各鎖の３’末端には、ヌクレオチドオーバーハングは存在しないか、１つまたは２つ存在する。
【００４０】
本発明によれば、ＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二本鎖の各鎖は、長さが約１９−２５、１９−２４または１９−２１ヌクレオチド、好ましくは約１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、または２５ヌクレオチドの長さである。いくつかの態様では、ｓｉＲＮＡは非修飾ＲＮＡ分子であってもよい。
【００４１】
他の態様では、ｓｉＲＮＡは、塩基、糖または主鎖修飾のような少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを含み得る。
一実施形態では、ｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡは、互いに相補的である少なくとも２つの配列を含む。ｄｓＲＮＡは、第１の配列を有するセンス鎖および第２の配列を有するアンチセンス鎖を含む。アンチセンス鎖は、ＳＯＤ１をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、その相補性領域は３０ヌクレオチド以下、また少なくとも１５ヌクレオチドの長さである。一般的に、ｄｓＲＮＡは、１９〜２５、１９〜２４または１９〜２１ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは長さが約１５〜約２５ヌクレオチドであり、他の実施形態ではｄｓＲＮＡは長さが約２５から３０ヌクレオチドである。
【００４２】
本明細書に記載の方法でアッセイした場合に、ｄｓＲＮＡは、直接投与された場合であっても、発現ベクター内にコードされている場合であっても、ＳＯＤ１を発現している細胞と接触すると、ＳＯＤ１の発現の少なくとも１０％、２０％、２５％、３０％、３５％、または４０％以上を阻害する。
【００４３】
本明細書で扱っている組成物に含まれるｓｉＲＮＡ分子は、３０ヌクレオチド以下、一般的には１９−２５、１９−２４または１９−２１ヌクレオチドの長さを有するアンチセンス鎖（当該アンチセンス鎖）を有するｄｓＲＮＡを含み、これは、ＳＯＤ１遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部に実質的に相補的である。
【００４４】
本発明によれば、ＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二本鎖の核酸、ｓｉＲＮＡ二本鎖の一本鎖またはｄｓＲＮＡを含むＡＡＶベクターが産生され、そのＡＡＶベクター血清型はＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９（ｈｕ１４）、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ−ＤＪ８およびＡＡＶ−ＤＪ、およびそれらの変異体であり得る。
【００４５】
本発明によれば、ＡＬＳにおけるＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二本鎖またはコードされたｄｓＲＮＡは、表３に列挙されるｓｉＲＮＡ二本鎖から選択される。いくつ
かの実施形態では、ＡＬＳにおけるＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二本鎖またはｄｓＲＮＡは、以下のようなｓｉＲＮＡ二本鎖から成る群：Ｄ−２７５７、Ｄ−２８０６、Ｄ−２８６０、Ｄ−２８６１、Ｄ−２８７５、Ｄ−２８７１、Ｄ−２７５８、Ｄ−２７５９、Ｄ−２８６６、Ｄ−２８７０、Ｄ−２８２３及びＤ−２８５８から選択される。
【００４６】
本発明はまた、ＳＯＤ１遺伝子を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ二本鎖および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。いくつかの態様においては、ｓｉＲＮＡ二本鎖はＡＡＶベクターによってコードされる。
【００４７】
いくつかの実施形態において、本発明は、細胞におけるＳＯＤ１遺伝子発現を阻害／サイレンシングするための方法を提供する。このようにして、ｓｉＲＮＡ二本鎖またはコードされたｄｓＲＮＡを用いて、細胞、特に運動ニューロンにおけるＳＯＤ１遺伝子発現を実質的に阻害することができる。いくつかの態様では、ＳＯＤ１遺伝子発現の阻害とは、少なくとも約２０％、例えば少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％および１００％、または少なくとも２０〜３０％、２０〜４０％、２０〜５０％、２０〜６０％、２０〜７０％、２０〜８０％、２０〜９０％、２０〜９５％、２０〜１００％、３０〜４０％、３０〜５０％、３０〜６０％、３０〜７０％、３０〜８０％、３０〜９０％、３０〜９５％、３０〜１００％、４０〜５０％、４０〜６０％、４０〜７０％、４０〜８０％、４０〜９０％、４０〜９５％、４０〜１００％、５０〜６０％、５０〜７０％、５０〜８０％、５０〜９０％、５０〜９５％、５０〜１００％、６０〜７０％、６０〜８０％、６０〜９０％、６０〜９５％、６０〜１００％、７０〜８０％、７０〜９０％、７０〜９５％、７０〜１００％、８０〜９０％、８０〜９５％、８０〜１００％、９０〜９５％、９０〜１００％または９５〜１００％の阻害を意味する。したがって、標的遺伝子のタンパク質産物は、少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％および１００％、または少なくとも２０〜３０％、２０〜４０％、２０〜５０％、２０〜６０％、２０〜７０％、２０〜８０％、２０〜９０％、２０〜９５％、２０〜１００％、３０〜４０％、３０〜５０％、３０〜６０％、３０〜７０％、３０〜８０％、３０〜９０％、３０〜９５％、３０〜１００％、４０〜５０％、４０〜６０％、４０〜７０％、４０〜８０％、４０〜９０％、４０〜９５％、４０〜１００％、５０〜６０％、５０〜７０％、５０〜８０％、５０〜９０％、５０〜９５％、５０〜１００％、６０〜７０％、６０〜８０％、６０〜９０％、６０〜９５％、６０〜１００％、７０〜８０％、７０〜９０％、７０〜９５％、７０〜１００％、８０〜９０％、８０〜９５％、８０〜１００％、９０〜９５％、９０〜１００％または９５〜１００％で阻害される。ＳＯＤ１遺伝子は、野生型遺伝子または少なくとも１つの変異を有する変異型ＳＯＤ１遺伝子のどちらかであってよい。したがって、ＳＯＤ１タンパク質は、野生型タンパク質または少なくとも１つの変異を有する突然変異ポリペプチドのいずれかである。
【００４８】
一実施形態では、ｓｉＲＮＡ二本鎖またはコードされたｄｓＲＮＡは、ＳＯＤ１タンパク質の発現を少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％および１００％、または少なくとも２０〜３０％、２０〜４０％、２０〜５０％、２０〜６０％、２０〜７０％、２０〜８０％、２０〜９０％、２０〜９５％、２０〜１００％、３０〜５０％、３０〜６０％、３０〜７０％、３０〜８０％、３０〜９０％、３０〜９５％、３０〜１００％、４０〜５０％、４０〜６０％、４０〜７０％、４０〜８０％、４０〜９０％、４０〜９５％、４０〜１００％、５０〜６０％、５０〜７０％、５０〜８０％、５０〜９０％、５０〜９５％、５０〜１００％、６０〜７０％、６０〜８０％、６０〜９０％、６０〜９５％、６０〜１００％、７０〜８０％、７０〜９０％、７０〜９５％、７０〜１００％、８０〜９０％、８０〜９５％、８０〜１００％、９０〜９５％、９０〜１００％または９５〜１００％減少させるために使用される。非限定的な例として、ＳＯＤ１タンパク質発現の発現を５０〜９０％低下させることができる。
【００４９】
一実施形態では、ｓｉＲＮＡ二本鎖またはコードされたｄｓＲＮＡは、ＳＯＤ１  ｍＲＮＡの発現を少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％および１００％、または少なくとも２０〜３０％、２０〜４０％、２０〜５０％、２０〜６０％、２０〜７０％、２０〜８０％、２０〜９０％、２０〜９５％、２０〜１００％、３０〜５０％、３０〜６０％、３０〜７０％、３０〜８０％、３０〜９０％、３０〜９５％、３０〜１００％、４０〜５０％、４０〜６０％  ４０〜７０％、４０〜８０％、４０〜９０％、４０〜９５％、４０〜１００％、５０〜６０％、５０〜７０％、５０〜８０％、５０〜９０％、５０〜９５％、５０〜１００％、６０〜７０％、６０〜８０％、６０〜９０％、６０〜９５％、６０〜１００％、７０〜８０％、７０〜９０％、７０〜９５％、７０〜１００％、８０〜９０％、８０〜９５％、８０〜１００％、９０〜９５％、９０〜１００％または９５〜１００％減少させるために使用される。非限定的な例として、ＳＯＤ１  ｍＲＮＡ発現の発現を、５０〜９０％低下させることができる。
【００５０】
一実施形態では、ｓｉＲＮＡ二本鎖またはコードされたｄｓＲＮＡを使用して、ＣＮＳの少なくとも１つの領域、例えば、脊髄、前脳、中脳、または後脳のＳＯＤ１タンパク質および／またはｍＲＮＡの発現を低下させることができる。ＳＯＤ１タンパク質および／またはｍＲＮＡの発現は、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％および１００％、２０〜３０％、２０〜４０％、２０〜５０％、２０〜６０％、２０〜７０％、２０〜８０％、２０〜９０％、２０〜９５％、２０〜１００％、３０〜４０％、３０〜５０％、３０〜６０％、３０〜７０％、３０〜８０％、３０〜９０％、３０〜９５％、３０〜１００％、４０〜５０％、４０〜６０％、４０〜７０％、４０〜８０％、４０〜９０％、４０〜９５％、４０〜１００％、５０〜６０％、５０〜７０％、５０〜８０％、５０〜９０％、５０〜９５％、５０〜１００％  ６０〜７０％、６０％〜８０％、６０％〜９０％、６０％〜９５％、６０％〜１００％、７０％〜８０％、７０％〜９０％、７０〜９５％、７０％〜１００％、８０〜９０％、８０〜９５％、８０〜１００％、９０〜９５％、９０〜１００％または９５〜１００％のＣＮＳ範囲で減少させることができる。非限定的な例として、脊髄におけるＳＯＤ１タンパク質およびｍＲＮＡの発現は、５０〜９０％減少する。
【００５１】
いくつかの実施形態では、本発明は、治療を必要とする対象における異常ＳＯＤ１遺伝子および／またはＳＯＤ１タンパク質に関連する筋萎縮性側索硬化症を治療または改善する方法を提供しており、ＳＯＤ１遺伝子を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ二本鎖またはｓｉＲＮＡ二本鎖をコードする核酸の薬学的有効量を対象に投与し、前記ｓｉＲＮＡ二本鎖（またはコードされた二本鎖）を標的細胞に送達し、ＳＯＤ１遺伝子発現およびタンパク質産生を阻害し、対象におけるＡＬＳの症状を改善する。
【００５２】
いくつかの実施形態において、ＳＯＤ１遺伝子を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ二本鎖の核酸配列を含むＡＡＶベクターは、ＡＬＳを治療および／または改善する必要がある対象に投与される。ＡＡＶベクターの血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９（ｈｕ１４）、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ  −ＤＪ８（ＡＡＶＤＪ８）およびＡＡＶ−ＤＪ（ＡＡＶＤＪ）、およびその変異体から成る群から選択される。一実施形態では、ＡＡＶベクター血清型はＡＡＶ２である。別の実施形態では、ＡＡＶベクターはＡＡＶＤＪである。さらに別の実施形態では、ＡＡＶベクター血清型はＡＡＶＤＪ８である。
【００５３】
一実施形態において、本発明において有用であり得る血清型は、ＡＡＶ−ＤＪ８であり得る。ＡＡＶ−ＤＪ８のアミノ酸配列は、ヘパリン結合ドメイン（ＨＢＤ）を除去するために、２つまたはそれ以上の突然変異を含んでいてよい。非限定的な例として、その全体
が参照により本発明に組み込まれている内容である、米国特許第７，５８８，７７２号で配列番号１として記載されるＡＡＶ−ＤＪには、以下の２つの突然変異が含まれる：（１）アミノ酸５８７のアルギニン（Ｒ；ａｒｇ）がグルタミン（Ｑ；Ｇｌｎ）に変化したＲ５８７Ｑと、（２）アミノ酸５９０のアルギニン（Ｒ；Ａｒｇ）がスレオニン（Ｔ；Ｔｈｒ）に変化したＲ５９０Ｔ。別の非限定的な一例として、当該ＡＡＶ−ＤＪ配列は、以下に示す３つの突然変異を含んでよい：（１）アミノ酸４０６のリシン（Ｋ；Ｌｙｓ）がアルギニン（Ｒ；Ａｒｇ）に変化したＫ４０６Ｒ、（２）アミノ酸５８７のアルギニン（Ｒ；Ａｒｇ）がグルタミン（Ｑ；Ｇｌｎ）に変化したＲ５８７Ｑ、（３）アミノ酸５９０のアルギニン（Ｒ；Ａｒｇ）がスレオニン（Ｔ；Ｔｈｒ）に変化したＲ５９０Ｔ。
【００５４】
いくつかの態様において、ＡＬＳはＳＯＤ１突然変異に関連する家族性ＡＬＳである。他の態様において、ＡＬＳは、ＳＯＤ１タンパク質の異常凝集またはＳＯＤ１タンパク質機能および局在における異常を特徴とする散発性ＡＬＳである。本方法によって改善されるＡＬＳの症状は、運動ニューロンの変性、筋力低下、筋肉の硬直、不明瞭な発語および／または呼吸困難を含み得るが、これらに限定されない。
【００５５】
いくつかの実施形態では、ＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二本鎖またはコードされたｄｓＲＮＡまたはそのようなｓｉＲＮＡ分子を含むＡＡＶベクターは、例えば頭蓋内注射によって、対象の中枢神経系に直接導入することができる。
【００５６】
いくつかの実施形態において、本発明の医薬組成物は、単独療法として使用される。他の実施形態では、本発明の医薬組成物は併用療法に使用される。併用療法は、運動ニューロン変性に対する神経保護効果について試験された小分子化合物、成長因子およびホルモンなどの１つまたは複数の神経保護剤と組み合わせてもよい。
【００５７】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載する、治療上有効な量のプラスミドまたはＡＡＶベクターを、それを必要とする対象に投与することによって筋萎縮性側索硬化症を治療または改善する方法を提供する。ＡＬＳは、家族性ＡＬＳまたは散発性ＡＬＳであり得る。
【００５８】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、以下の添付の説明に記載する。本明細書に記載しているものと類似または同等の任意の材料および方法を本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい材料および方法を以下に記載する。本発明の他の特徴、目的及び利点は、明細書から明らかになる。本明細書において、単数形はまた、文脈が明確に別途指示しない限り、複数形も含む。他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合には、本説明が制御する。
【００５９】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）
成人発症の神経変性疾患である筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、運動皮質、脳幹および脊髄における運動ニューロンの選択的死によって特徴付けられる進行性および致命的な疾患である。ＡＬＳの発生率は、１００，０００人に約１．９人である。ＡＬＳと診断された患者は、痙性、反射亢進または反射減弱、線維束性収縮、筋萎縮および麻痺によって特徴付けられる進行性の筋肉表現型を発現する。これらの運動障害は、運動ニューロンの喪失による筋肉の衰弱によって引き起こされる。ＡＬＳの主要な病理学的特徴には、皮質脊髄路の変性および下位運動ニューロン（ＬＭＮ）または前角細胞の広範な喪失（ＧｈａｔａｋＪ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ１９８６，４５，３８５−３９５）、一次運動野におけるベッツ（Ｂｅｔｚ）細胞および他の錐体細胞の変性および消失（ＵｄａｋａＡｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ１９８６，７０，２８９−２９５、ＭａｅｋａｗａＢｒａｉｎ２００４，１２７，１２３７−１２５１）、運動皮質および脊髄
における反応性神経膠症（ＫａｗａｍａｔａＡｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １９９２，１４０，６９１−７０７；およびＳｃｈｉｆｆｅｒＪ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｓｃｉ．  １９９６，１３９，２７−３３）が含まれる。ＡＬＳは、呼吸障害および／または炎症のため、通常は診断後３〜５年以内に致死的である（Ｒｏｗｌａｎｄ  ＬＰおよびＳｈｎｅｉｂｄｅｒ  ＮＡ、Ｎ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，２００１，３４４，１６８８−１７００）。
【００６０】
ＡＬＳの細胞の特徴は、変性運動ニューロンおよび周囲の細胞（例えば、星状細胞）内のタンパク質性のユビキチン化された細胞質封入体の存在である。ユビキチン化封入体（すなわち、レヴィー体様封入体またはスケイン（Ｓｋｅｉｎ）様封入体）は、ＡＬＳにおける最も一般的かつ特定の種類の封入体であり、脊髄および脳幹のＬＭＮおよび皮質脊髄の上位運動ニューロン（ＵＭＮ）に見出される（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ
Ｓｃｉ、１９９３、１１５、２０８−２１３；およびＳａｓａｋおよびＭａｒｕｙａｍａ、Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ、１９９４、８７、５７８−５８５）。いくつかのタンパク質は、ユビキチン、Ｃｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）、ペリフェリンおよびドルフィンを含む、封入体の成分であることが確認されている。ニューロフィラメント封入体は、ＡＬＳの脊髄運動ニューロンにおける硝子体積塊（ＨＣＩ）および軸索の「スフェロイド」においてしばしば見出される。他の種類およびあまり特異的でない封入体には、皮質の上層におけるブニナ小体（Ｂｕｎｉｎａ  ｂｏｄｙ）（シスタチンＣ含有封入体）および三日月形封入体（ＳＣＩ）が挙げられる。ＡＬＳに見られる他の神経病理学的特徴としては、ゴルジ装置の断片化、ミトコンドリア空胞化およびシナプス末端の超微細構造異常が挙げられる（Ｆｕｊｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．２００２，１０３，２４３−２４７）。
【００６１】
加えて、前頭側頭型認知症では、ＦＴＤ−ＡＬＳ患者において認知障害を引き起こす可能性のあるＡＬＳ（ＦＴＤ−ＡＬＳ）皮質萎縮（前頭葉および側頭葉を含む）も観察される。
【００６２】
ＡＬＳは複雑で多因子性の疾患であり、ＡＬＳの病因に関与すると仮定された複数のメカニズムには、タンパク質分解障害、グルタミン酸興奮毒性、ミトコンドリア機能障害、アポトーシス、酸化ストレス、炎症、タンパク質ミスフォールディングおよび凝集、異常なＲＮＡ代謝、および変化した遺伝子発現が含まれるがこれらに限定されない。
【００６３】
ＡＬＳ症例の約１０％〜１５％がこの疾患の家族歴を有しており、これらの患者は家族性ＡＬＳ（ｆＡＬＳ）または遺伝性の患者と呼ばれ、一般にメンデルの支配的な遺伝様式および高い浸透度を有する。報告されている家族歴に関連していない残りの患者（約８５％〜９５％）は散発性ＡＬＳ（ｓＡＬＳ）として分類されるが、その代わりに、環境因子、遺伝子多型、体細胞突然変異、およびおそらくは遺伝子−環境相互作用を含むがそれらに限定されない他の危険因子に起因すると考えられる。ほとんどの場合、家族性（または遺伝性）ＡＬＳは常染色体優性疾患として遺伝するが、常染色体劣性およびＸ連鎖遺伝および不完全浸透性の家系が存在する。散発性および家族性の形態は臨床的に区別できず、共通の病因を示唆している。ＡＬＳにおける運動ニューロンの選択的死の正確な原因は依然として分かっていない。ｆＡＬＳにおける遺伝的要因の理解の進歩が、この疾患の両方の形態を明らかにする可能性がある。
【００６４】
近年、ＡＬＳの遺伝的原因の爆発は、ｆＡＬＳを引き起こすことが知られている１０以上の異なる遺伝子において突然変異を発見した。最も一般的なものは、Ｃｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ１をコードする遺伝子（ＳＯＤ１；約２０％）（Ｒｏｓｅｎ  ＤＲ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９３，３６２，５９−６２）、肉腫に融合／脂肪肉腫に転換される（ＦＵＳ／ＴＬＳ；１−５％）とＴＤＰ−４３（ＴＡＲＤＢＰ；１−５％）である。近年、Ｃ９ｏｒＦ７２遺伝子におけるヘキサヌクレオチド反復の拡大が（Ｇ
ＧＧＧＣＣ）ｎ、西洋人口におけるｆＡＬＳ（約４０％）の最も頻繁な原因として特定された（Ｒｅｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．によるレビュー、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２０１４，１７，１７−２３）。ＬＳで変異した他の遺伝子には、アルシン（ＡＬＳ２）、セナタキシン（ＳＥＴＸ）、小胞関連膜タンパク質（ＶＡＰＢ）およびアンギオゲニン（ＡＮＧ）が含まれる。ｆＡＬＳ遺伝子は異なる細胞機構を制御し、ＡＬＳの病因が複雑であり、運動ニューロン変性に最終的には至るいくつかの異なるプロセスに関連している可能性があることを示唆している。
【００６５】
ＳＯＤ１は、哺乳動物において同定され特徴付けられた以下の３つのヒトスーパーオキシドジスムターゼの１つである：銅−亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ（Ｃｕ／ＺｎＳＯＤまたはＳＯＤ１）、マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（ＭｎＳＯＤまたはＳＯＤ２）、および細胞外スーパーオキシドジスムターゼ（ＥＣＳＯＤまたはＳＯＤ３）。ＳＯＤ１は、ヒト染色体２１上のＳＯＤ１遺伝子によってコードされるサブユニット当たり１つの銅結合部位および１つの亜鉛結合部位を有する１５３残基ポリペプチドの３２ｋＤａホモダイマーである（ＧｅｎｅＢａｎｋ  アクセスＮｏ．：ＮＭ＿０００４５４．４）（表２を参照）。ＳＯＤ１は、スーパーオキサイドアニオン（Ｏ２−）と分子酸素（Ｏ２）と過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の反応を触媒する。ＳＯＤ１の細胞内濃度は高く（１０〜１００μＭの範囲）、中枢神経系（ＣＮＳ）中の全タンパク質含量の１％を占める。このタンパク質は、細胞質だけでなく、真核細胞の核、リソソーム、ペルオキシソームおよびミトコンドリアの膜間隙に局在する（Ｌｉｎｄｅｎａｕ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｉａ，２０００，２９，２５−３４）。
【００６６】
ＳＯＤ１遺伝子の突然変異は、ｆＡＬＳ患者の１５〜２０％およびすべてのＡＬＳ症例の１〜２％に保持される。現在、１５３アミノ酸ＳＯＤ１ポリペプチド全体に分布する少なくとも１７０の異なる突然変異がＡＬＳを引き起こすことが判明しており、ＡＬＳオンライン遺伝データベースで更新リストがある（ＡＬＳＯＤ）（Ｗｒｏｅ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｙｏｔｒｏｐｈ  Ｌａｔｅｒａｌ  Ｓｃｌｅｒ．，２００８，９，２４９−２５０）。表１は、ＡＬＳにおけるＳＯＤ１の変異のいくつかの例を列挙する。これらの突然変異は、欠失、挿入およびＣ末端切断も起こるが、主として単一のアミノ酸置換（すなわちミスセンス突然変異）である。異なるＳＯＤ１突然変異は、異なる地理的分布パターンを示す。例えば、ＳＯＤ１遺伝子突然変異によって引き起こされるＡＬＳを有するすべてのアメリカ人の４０〜５０％は、特定の突然変異Ａｌａ４Ｖａｌ（またはＡ４Ｖ）を有する。Ａ４Ｖ突然変異は、典型的にはより重篤な徴候および症状と関連し、余命期間は通常２〜３年である。Ｉ１１３Ｔ突然変異は、イギリスで最も一般的な突然変異である。ヨーロッパで最も一般的な突然変異はＤ９０Ａ置換であり、生存期間は通常１０年以上である。
【００６７】
【表１】
2017535266.tif 000003
ＳＯＤ１遺伝子欠損に関連するニューロン死のメカニズムを調べるために、ミスセンス変異、小さな欠失または挿入を含む異なる変異を有するヒトＳＯＤ１遺伝子を発現するＳＯＤ１関連ＡＬＳのいくつかのげっ歯動物モデルが当該分野で開発された。ＡＬＳマウスモデルの非限定的な例には、ＳＯＤ１Ｇ９３Ａ、ＳＯＤ１Ａ４Ｖ、ＳＯＤ１Ｇ３７Ｒ、ＳＯＤ１Ｇ８５Ｒ、ＳＯＤ１Ｄ９０Ａ、ＳＯＤ１Ｌ８４Ｖ、ＳＯＤ１Ｉ１１３Ｔ、ＳＯＤ１Ｈ３６Ｒ／Ｈ４８Ｑ、ＳＯＤ１Ｇ１２７Ｘ、ＳＯＤ１Ｌ１２６ＸおよびＳＯＤ１Ｌ１２６ｄｅｌＴＴが含まれる。２つの異なるヒトＳＯＤ１突然変異を有する、以下の２つのトランスジェニックラットモデルが存在する：ＳＯＤ１Ｈ４６ＲおよびＳＯＤ１Ｇ９３Ｒ。これらのげっ歯動物ＡＬＳモデルは、ヒトＡＬＳ患者に類似した筋力低下と、ヒト疾患のいくつかの特徴、特に脊髄運動ニューロンの選択的死、運動ニューロンにおけるタンパク質封入体の凝集およびミクログリア活性化、を反映する他の病原性特徴とを発症し得る。トランスジェニックげっ歯動物は、ヒトＳＯＤ１関連ＡＬＳ疾患の良いモデルであり、疾患病因の研究および疾患治療の開発のためのモデルを提供することが当技術分野でよく知られている。
【００６８】
動物および細胞モデルにおける研究は、ＳＯＤ１病原性変異体が機能獲得によってＡＬＳを引き起こすことを示した。すなわち、スーパーオキシドジスムターゼ酵素は、ＳＯＤ１突然変異によって改変された場合、新規であるが有害な特性を得る。例えば、ＡＬＳ中のいくつかのＳＯＤ１突然変異体は、酸化還元サイクルを破壊することによって、酸化ストレスを増加させる（例えば、毒性スーパーオキシドラジカルの蓄積の増加）。他の研究はまた、ＡＬＳにおけるいくつかのＳＯＤ１突然変異体が、正常な生理機能とは無関係の毒性特性を得る可能性があることも示している（ミスフォールドＳＯＤ１変異体の異常凝集など）。異常なレドックス化学モデルでは、突然変異体ＳＯＤ１は不安定であり、異常
な化学反応により、非活性基質と相互作用し、活性酸素種（ＲＯＳ）の過剰産生を引き起こす。タンパク質毒性モデルでは、不安定でミスフォールドされたＳＯＤ１が細胞質封入体に凝集し、細胞プロセスにとって重要なタンパク質を封鎖する。これらの２つの仮説は互いに排他的ではない。活性部位の金属に結合する選択されたヒスチジン残基の酸化がＳＯＤ１凝集を媒介することが示されている。
【００６９】
凝集した変異型ＳＯＤ１タンパク質はまた、ミトコンドリア機能不全（Ｖｅｈｖｉｌａｉｎｅｎ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２０１４，８，１２６）、軸索輸送の障害、異常なＲＮＡ代謝、グリア細胞病理およびグルタミン酸興奮毒性を誘発し得る。いくつかの散発性ＡＬＳ症例では、ミスフォールドされた野生型ＳＯＤ１タンパク質は、家族性ＡＬＳ結合ＳＯＤ１変異体で見られるものと同様の「毒性コンフォメーション」を形成する病的運動ニューロンに見出されている（Ｒｏｔｕｎｎｏ
ＭＳ  ａｎｄ  Ｂｏｓｃｏ  ＤＡ，  Ｆｒｏｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２０１３，１６，７，２５３）。このような証拠は、ＡＬＳが、アルツハイマー病およびパーキンソン病などの他の神経変性疾患に類似したタンパク質折りたたみ疾患であることを示唆している。
【００７０】
現在、ＡＬＳに罹患している患者に治癒的治療法はない。グルタミン酸放出の阻害薬であるＦＤＡ認可リルゾール（Ｒｉｌｕｚｏｌｅ）のみがＡＬＳに対して中等度の効果を示しており、１８ヶ月間の服用で２〜３カ月のみ生存期間が延長される。残念なことに、リルゾールを服用している患者に、疾患の進行を遅らせるまたは筋肉機能が改善することはない。したがって、リルゾールは治癒的、または効果的な治療法ではない。研究者はより良い治療薬を探し続けている。
【００７１】
ＳＯＤ１凝集を予防または改善し得る治療アプローチは過去に試験されている。例えば、ヒドロキシルアミン誘導体であるアリモクロモールは、これらの凝集体に対する細胞の防御機構である熱ショックタンパク質を標的とする薬である。研究は、ＳＯＤ１マウスモデルにおいて、アルモクロモールによる治療が筋肉機能を改善することを実証した。ＡＬＳにみられる１つまたは複数の細胞性障害を標的とする他の薬剤には、運動ニューロンに対するグルタミン酸誘発興奮毒性を低下させる可能性のある、タルパパネルなどのＡＭＰＡアンタゴニスト、β−ラクタム系抗生物質；酸化的に誘発される運動ニューロン死を阻害し得るブロモクリプチン（例えば、米国特許公開第２０１１０１０５５１７号；その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）；ＳＯＤ１遺伝子発現を低下させる１，３−ジフェニル尿素誘導体またはマルチキナーゼ阻害剤（例えば、米国特許公報第２０１３０２２５６４２号；その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）；ミトコンドリアにおける酸化反応を改善することができるドーパミンアゴニストプラミペキソールおよびその鏡像異性体デクスプラミペキソール；シクロオキシゲナーゼ酵素を阻害するニメスリド（例えば、米国特許公開第２００６００４１０２２号；その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）；フリーラジカルスカベンジャーとして作用する薬剤（例えば、米国特許第６，９３３，３１０号およびＰＣＴ特許公開番号：ＷＯ２００６０７５４３４；これらの各々の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）が含まれる。
【００７２】
異常なＳＯＤ１タンパク質凝集を阻害するための別のアプローチは、ＡＬＳにおけるＳＯＤ１遺伝子発現をサイレンシング／阻害することである。突然変異した対立遺伝子の特定の遺伝子サイレンシングのための低分子干渉ＲＮＡは、ｆＡＬＳの治療に治療的に有益であることが報告されている（例えばＲａｌｇｈ  ＧＳ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００５，１１（４），４２９−４３３；およびＲａｏｕｌ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００５，１１（４），４２３−４２８；およびＭａｘｗｅｌｌ  ＭＭ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，２００４，１０１（９），３１７８−３１
８３；ａｎｄ  Ｄｉｎｇ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｊ．，２０１１，１２４（１），１０６−１１０；およびＳｃｈａｒｚ  ＤＳ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌｏｓ  Ｇｅｎｅｔ．，２００６，２（９），ｅ１４０；これらの各々の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【００７３】
ＳＯＤ１遺伝子を標的とし、ＡＬＳにおけるＳＯＤ１発現を調節する多くの他のＲＮＡ治療剤は、当技術分野で教示されている。このようなＲＮＡに基づく薬剤には、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび二本鎖低分子干渉ＲＮＡが含まれる。例えば、Ｗａｎｇ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００８，２８３（２３），１５８４５−１５８５２）；米国特許第７，４９８，３１６；第７，６３２，９３８；第７，６７８，８９５；第７，９５１，７８４；第７，９７７，３１４；第８，１８３，２１９；第８，３０９，５３３；及び第８，５８６，５５４号明細書；並びに米国特許公開第２００６／０２２９２６８号および米国特許公開第２０１１／０２６３６８０号を参照；これらの各々の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００７４】
本発明は、調節性ポリヌクレオチド、例えばＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ分子、およびそれらの設計および製造方法を提供する。特に、本発明は、本発明のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどのウイルスベクターを使用する。本発明のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含むＡＡＶベクターは、運動ニューロンへの活性剤の投与を増加させることができる。ＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二本鎖またはコードするｄｓＲＮＡは、細胞内のＳＯＤ１遺伝子発現（例えば、ｍＲＮＡレベル）を有意に阻害することができる；したがって、タンパク質の凝集および封入体の形成、フリーラジカルの増加、ミトコンドリアの機能不全およびＲＮＡ代謝のような細胞内のＳＯＤ１発現誘導性ストレスを改善する。
【００７５】
このようなｓｉＲＮＡ媒介性ＳＯＤ１発現阻害は、ＡＬＳの治療に使用することができる。本発明によれば、患者におけるＡＬＳを治療および／または改善する方法は、本発明のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含むＡＡＶベクターの有効量を細胞内に投与することを含む。このような核酸配列のＡＡＶベクターの投与は、ＳＯＤ１遺伝子発現の阻害／サイレンシングを引き起こすｓｉＲＮＡ分子をコードする。
【００７６】
一実施形態では、調節ポリヌクレオチドをコードするベクター、例えばＡＡＶは、対象における変異体ＳＯＤ１の発現を低下させる。突然変異体ＳＯＤ１の減少は、酸化ストレス、ミトコンドリア機能不全、軸索輸送の障害、異常なＲＮＡ代謝、グリア細胞病理および／またはグルタミン酸興奮毒性などを含むがこれら限定されない毒性の機構を引き起こす可能性がある毒性凝集体の形成を減少させることもできる。
【００７７】
一実施形態では、ベクター、例えばＡＡＶベクターは、それを必要とする対象におけるＳＯＤ１の量を減少させ、したがって、本明細書に記載の治療上の利点を提供する。
本発明の組成物
ｓｉＲＮＡ分子
本発明は、神経変性疾患を治療するための遺伝子発現のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）誘発阻害に関する。本明細書において、ＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二本鎖またはコードされたｄｓＲＮＡが提供される（本明細書では集合的に「ｓｉＲＮＡ分子」と呼ぶ）。このようなｓｉＲＮＡ二本鎖またはコードされたｄｓＲＮＡは、例えば運動ニューロンなどの細胞内のＳＯＤ１遺伝子発現を減少またはサイレンシングさせることができ、それによって運動ニューロン死および筋肉萎縮などのＡＬＳの症状を改善する。
【００７８】
ＲＮＡｉ（転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）、クエリング、または共抑制としても知られている）は、ＲＮＡ分子が配列特異的様式で、典型的には特定のｍＲＮＡ分子
の破壊を引き起こすことによって遺伝子発現を阻害する転写後遺伝子サイレンシングプロセスである。ＲＮＡｉの活性成分は、典型的には１５〜３０ヌクレオチドを含む低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる短い／小さい二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）（例えば、１９から２５、１９から２４または１９−２１ヌクレオチド）および２ヌクレオチド３’オーバーハングであり、標的遺伝子の核酸配列と一致する。これらの短いＲＮＡ種は、より大きなｄｓＲＮＡのダイサー仲介切断によってｉｎ  ｖｉｖｏで自然に産生され得、哺乳動物細胞において機能的である。
【００７９】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）と名付けられた自然に発現した小さなＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡの発現を調節することによって遺伝子サイレンシングを誘発する。ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を含むｍｉＲＮＡは、シード領域と呼ばれるｍｉＲＮＡの５’領域のヌクレオチド２−７および他の塩基対とその３’領域で完全な配列相補性を示すｍＲＮＡを標的とする。ｍｉＲＮＡが媒介する遺伝子発現のダウンレギュレーションは、標的ｍＲＮＡの切断、標的ｍＲＮＡの翻訳阻害、またはｍＲＮＡ崩壊によって引き起こされ得る。ｍｉＲＮＡ標的配列は、通常、標的ｍＲＮＡの３’−ＵＴＲに位置する。単一のｍｉＲＮＡは、様々な遺伝子からの１００を超える転写物を標的とすることができ、１つのｍＲＮＡは、異なるｍｉＲＮＡによって標的とされ得る。
【００８０】
特定のｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ二本鎖またはｄｓＲＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏで設計および合成し、ＲＮＡｉプロセスを活性化するために細胞に導入することができる。Ｅｌｂａｓｈｉｒらは、２１ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ二本鎖（低分子干渉ＲＮＡと呼ばれる）が、哺乳動物細胞において免疫応答を誘導することなく、強力かつ特異的な遺伝子ノックダウンを行うことができることを実証した（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ＳＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００１，４１１，４９４−４９８）。この最初の報告以来、ｓｉＲＮＡによる転写後遺伝子サイレンシングは、哺乳類細胞における遺伝子解析のための強力なツールとして急速に登場し、新規治療法を生み出す可能性を秘めている。
【００８１】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成ｓｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡｉを活性化するために細胞に導入することができる。内在性ｄｓＲＮＡと同様に、外因性ｓｉＲＮＡ二本鎖を細胞に導入すると、ｓｉＲＮＡ二本鎖の２つの鎖の１つ（すなわち、アンチセンス鎖）に相補的なＲＮＡ配列のゲノムを介した検索を容易にする多ユニット複合体であるＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を形成することができる。このプロセス中、ｓｉＲＮＡのセンス鎖（またはパッセンジャー鎖）は複合体から失われ、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖（またはガイド鎖）はその相補的ＲＮＡと一致する。特に、ＲＩＳＣ複合体を含むｓｉＲＮＡの標的は、完全な配列相補性を示すｍＲＮＡである。次に、ｓｉＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングが起こり、標的を切断し、放出し、分解する。
【００８２】
標的ｍＲＮＡに相同なセンス鎖および標的ｍＲＮＡに相補的なアンチセンス鎖からなるｓｉＲＮＡ二本鎖は、一本鎖（ｓｓ）−ｓｉＲＮＡ（例えば、アンチセンス鎖ＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド）の使用と比較して、標的ＲＮＡ破壊の効率の面ではるかに有利である。多くの場合、対応する二本鎖の効果的な遺伝子サイレンシング効力を達成するためには、より高い濃度のｓｓ−ｓｉＲＮＡが要求される。
【００８３】
前述の分子のいずれかは、ＡＡＶベクターまたはベクターゲノムによってコードされ得る。
ＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二本鎖の設計と配列
ｓｉＲＮＡを設計するためのいくつかのガイドラインが当該分野で提案されている。これらのガイドラインは、一般に、サイレンシングされる遺伝子中の領域を標的とする１９ヌクレオチド二本鎖領域、対称２−３ヌクレオチド３’オーバーハング、５−リン酸および３−ヒドロキシル基の生成を推奨している。ｓｉＲＮＡ配列選択を支配し得る他の規則
には、以下に限定されないがこれらが含まれる。（ｉ）アンチセンス鎖の５’末端のＡ／Ｕ、（ｉｉ）センス鎖の５’末端のＧ／Ｃ、（ｉｉｉ）アンチセンス鎖の３分の１における５’末端の少なくとも５個のＡ／Ｕ残基、および（ｉｖ）長さが９ヌクレオチドを超えるＧＣストレッチが存在しないこと。このような考察によれば、標的遺伝子の特定の配列と合わせて、哺乳類の標的遺伝子発現を抑制するために必須である、非常に有効なｓｉＲＮＡ分子を容易に設計することができる。
【００８４】
本発明によれば、ヒトＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ二本鎖またはコードされたｄｓＲＮＡ）が設計される。このようなｓｉＲＮＡ分子は、ＳＯＤ１遺伝子発現およびタンパク質産生を特異的に抑制することができる。いくつかの態様において、ｓｉＲＮＡ分子は、細胞、すなわちＡＬＳ疾患を有する患者において同定された突然変異ＳＯＤ１転写物（例えば、表１の突然変異）におけるＳＯＤ１遺伝子変異体を選択的に「ノックアウトする」ために設計および使用される。いくつかの態様において、ｓｉＲＮＡ分子は、細胞中のＳＯＤ１遺伝子変異体を選択的に「ノックダウン」するように設計され、使用される。他の態様では、ｓｉＲＮＡ分子は、ＳＯＤ１遺伝子の任意の特定の突然変異とは無関係に、ＳＯＤ１遺伝子の野生型および突然変異対立遺伝子の両方を阻害または抑制することができる。
【００８５】
一実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ分子は、センス鎖および相補的なアンチセンス鎖を含み、ここで両方の鎖がハイブリダイズして二本鎖構造を形成する。アンチセンス鎖は、標的特異的ＲＮＡｉを誘導するためにＳＯＤ１のｍＲＮＡ配列に対して十分な相補性を有する。すなわち、ｓｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡｉの機構またはプロセスによって標的ｍＲＮＡの破壊を引き起こすのに十分な配列を有する。
【００８６】
いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖および標的ｍＲＮＡ配列は１００％相補的である。アンチセンス鎖は、標的ｍＲＮＡ配列の任意の部分に相補的であり得る。
他の実施形態では、アンチセンス鎖および標的ｍＲＮＡ配列は、少なくとも１つのミスマッチを含む。非限定的な例として、アンチセンス鎖および標的ｍＲＮＡ配列は、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％  、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％または少なくとも２０〜３０％  ２０〜４０％、２０〜５０％、２０〜６０％、２０〜７０％、２０〜８０％、２０〜９０％、２０〜９５％、２０〜９９％、３０〜４０％、３０〜５０％、３０〜６０％、３０〜７０％、３０〜８０％、３０〜９０％、３０〜９５％、３０〜９９％、４０〜５０％、４０〜６０％、４０〜７０％、４０〜８０％、４０〜９０％、４０〜９５％、４０〜９９％、５０〜６０％、５０〜７０％、５０〜８０％、５０〜９０％、５０〜９５％、５０〜９９％、６０〜７０％  ６０〜８０％、６０〜９０％、６０〜９５％、６０〜９９％、７０〜８０％、７０〜９０％、７０〜９５％、７０〜９９％、８０〜９０％、８０〜９５％、８０〜９９％、９０〜９５％、９０〜９９％または９５〜９９％相補的である。
【００８７】
本発明によれば、ｓｉＲＮＡ分子は、約１０〜５０またはそれ以上のヌクレオチド、すなわち各鎖が１０〜５０ヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）を含む長さを有する。好ましくは、ｓｉＲＮＡ分子は、約１５〜３０、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチドの長さを有し、各鎖は、標的領域に対して十分に相補的である。一実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、約１９〜２５、１９〜２４または１９〜２１ヌクレオチドの長さを有する。
【００８８】
いくつかの実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡ分子は、約１９ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドおよび３’末端に２つのオーバーハングヌクレオチドを含む合成ＲＮＡ二
本鎖であり得る。いくつかの態様では、ｓｉＲＮＡ分子は未修飾ＲＮＡ分子であってよい。他の態様では、ｓｉＲＮＡ分子は、塩基修飾、糖修飾、または骨格修飾などの少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含むことができる。
【００８９】
他の実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ分子は、プラスミドベクター、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）、ゲノムまたは細胞への投与のための他の核酸発現ベクターでコードされ得る。
【００９０】
ＤＮＡ発現プラスミドを使用して、本発明のｓｉＲＮＡ二本鎖またはｄｓＲＮＡを細胞中で安定に発現させ、標的遺伝子の長期阻害を達成することができる。ひとつの態様では、ｓｉＲＮＡ二本鎖のセンス鎖およびアンチセンス鎖は、典型的には短いスペーサー配列によって連結され、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）と呼ばれるステム−ループ構造の発現を導く。ヘアピンはダイサー（Ｄｉｃｅｒ）によって認識、切断され、成熟ｓｉＲＮＡ分子を生成する。
【００９１】
本発明によれば、ＳＯＤ１  ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸を含むＡＡＶベクターが産生され、そのＡＡＶベクター血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９（ｈｕ１４）、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ−ＤＪ８およびＡＡＶ−ＤＪ、およびそれらの変異体であり得る。
【００９２】
いくつかの実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ二本鎖またはコードされたｄｓＲＮＡは、標的ｍＲＮＡ（すなわち、ＳＯＤ１）を抑制する（または分解する）。したがって、ｓｉＲＮＡ二本鎖またはコードされたｄｓＲＮＡを使用して、細胞、例えば運動ニューロンにおけるＳＯＤ１遺伝子発現を実質的に阻害することができる。いくつかの態様では、ＳＯＤ１遺伝子発現の阻害は、少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％  ９５％および１００％、または少なくとも２０〜３０％、２０〜４０％、２０〜５０％、２０〜６０％、２０〜７０％、２０〜８０％、２０〜９０％、２０〜９５％、２０  １００％、３０〜４０％、３０〜５０％、３０〜６０％、３０〜７０％、３０〜８０％、３０〜９０％、３０〜９５％、３０〜１００％、４０〜５０％、４０〜６０％、４０〜７０％、４０〜８０％、４０〜９０％、４０〜９５％、４０〜１００％、５０〜６０％、５０〜７０％、５０〜８０％、５０〜９０％、５０〜９５％、５０〜１００％、６０〜７０％、６０〜８０％、６０〜９０％、６０〜９５％、６０〜１００％、７０〜８０％、７０〜９０％、７０〜９５％、７０〜１００％、８０〜９０％、８０〜９５％、８０〜１００％、９０〜９５％、９０〜１００％または９５〜１００％である。したがって、標的遺伝子のタンパク質産物は、少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％および１００％、または少なくとも２０〜３０％、２０〜４０％、２０〜５０％、２０〜６０％、２０〜７０％、２０〜８０％、２０〜９０％、２０〜９５％、２０〜１００％、３０〜４０％、３０〜５０％、３０〜６０％、３０〜７０％、３０〜８０％、３０〜９０％、３０〜９５％、３０〜１００％、４０〜５０％、４０〜６０％  ４０〜７０％、４０〜８０％、４０〜９０％、４０〜９５％、４０〜１００％、５０〜６０％、５０〜７０％、５０〜８０％、５０〜９０％、５０〜９５％、５０〜１００％、６０〜７０％、６０〜８０％、６０〜９０％、６０〜９５％、６０〜１００％、７０〜８０％、７０〜９０％、７０〜９５％、７０〜１００％、８０〜９０％、８０〜９５％、８０〜１００％、９０〜９５％、９０〜１００％または９５〜１００％で阻害される。ＳＯＤ１遺伝子は、野生型遺伝子または少なくとも１つの変異を有する変異型ＳＯＤ１遺伝子のどちらであってもよい。したがって、タンパク質は、野生型タンパク質または少なくとも１つの変異を有する変異ポリペプチドのいずれかである。
【００９３】
本発明によれば、ヒトＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二本鎖またはコードされたｄｓＲＮＡを設計し、培養細胞におけるＳＯＤ１  ｍＲＮＡレベルを低下させる能力について試験した。このようなｓｉＲＮＡ二本鎖には、表３に列挙されたものが含まれる。非限定的な例として、ｓｉＲＮＡ二本鎖は、ｓｉＲＮＡ二本鎖ＩＤ：Ｄ−２７５７、Ｄ−２８０６、Ｄ−２８６０、Ｄ−２８６１、Ｄ−２８７５、Ｄ−２８７１、Ｄ−２７５８、Ｄ−２７５９、Ｄ−２８６６、Ｄ−２８７０、Ｄ−２８２３及びＤ−２８５８であってよい。
【００９４】
一実施形態では、ヒトＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二本鎖またはコードされたｄｓＲＮＡの３’ステムアームは、ガイド鎖の３’末端の下流に１１ヌクレオチドを有し、５’末端ステムのパッセンジャー鎖の５’末端の上流にある１３ヌクレオチドのうちの１１ヌクレオチドと相補性を有する。
【００９５】
一実施形態では、ヒトＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二本鎖またはコードされたｄｓＲＮＡは、調節ポリヌクレオチドの３’末端アームの３’末端の６ヌクレオチド下流にあるシステインを有し得る。
【００９６】
一実施形態では、ヒトＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二本鎖またはコードされたｄｓＲＮＡは、ガイド鎖のｍｉＲＮＡシードマッチを含む。別の実施形態では、ヒトＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二本鎖またはコードされたｄｓＲＮＡは、パッセンジャー鎖のｍｉＲＮＡシードマッチを含む。さらに別の実施形態において、ヒトＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二本鎖またはコードされたｄｓＲＮＡは、ガイドまたはパッセンジャー鎖のシードマッチを含まない。
【００９７】
一実施形態では、ヒトＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二本鎖またはコードされたｄｓＲＮＡは、ガイド鎖について、有意な全長のオフターゲットをほとんど有さない。別の実施形態では、ヒトＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二本鎖またはコードされたｄｓＲＮＡは、パッセンジャー鎖について、有意な全長のオフターゲットをほとんど有さない。ヒトＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二本鎖またはコードされたｄｓＲＮＡは、パッセンジャー鎖について、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％未満、１〜５％、２〜６％、３〜７％、４〜８％、５〜９％、５〜１０％、６〜１０％の全長オフターゲットを有する。さらに別の実施形態では、ヒトＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二本鎖またはコードされたｄｓＲＮＡは、ガイド鎖またはパッセンジャー鎖について、有意な全長のオフターゲットをほとんど有さない。ヒトＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二本鎖またはコードされたｄｓＲＮＡは、ガイド鎖またはパッセンジャー鎖について、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％未満、１〜５％、２〜６％、３〜７％、４〜８％、５〜９％、５〜１０％、６〜１０％の全長オフターゲットを有する。
【００９８】
一実施形態では、ヒトＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二本鎖またはコードされたｄｓＲＮＡはｉｎ  ｖｉｔｒｏで高い活性を有する。別の実施形態では、ヒトＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二本鎖またはコードされたｄｓＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで低活性を有し得る。さらに別の実施形態において、ヒトＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二本鎖またはｄｓＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで高いガイド鎖活性および低いパッセンジャー鎖活性を有し得る。
【００９９】
一実施形態では、ヒトＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二本鎖またはコードされたｄｓＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで高いガイド鎖活性および低いパッセンジャー鎖活性を有する。ガイド鎖による標的ノックダウン（ＫＤ）は、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、９９．５％または１００％で
あり得る。ガイド鎖による標的ノックダウンは、６０−６５％、６０−７０％、６０−７５％、６０−８０％、６０−８５％、６０−９０％、６０−９５％、６０−９９％  、６０−９９．５％、６０−１００％、６５−７０％、６５−７５％、６５−８０％、６５−８５％、６５−９０％、６５−９５％、６５−９９％、６５−９９．５％、６５−１００％、７０−７５％、７０−８０％、７０−８５％、７０−９０％、７０−９５％、７０−９９％、７０−９９．５％、７０−１００％、７５−８０％  、７５−８５％、７５−９０％、７５−９５％、７５−９９％、７５−９９．５％、７５−１００％、８０−８５％、８０−９０％、８０−９５％、８０−９９％、８０−９９．５％、８０−１００％、８５−９０％、８５−９５％、８５−９９％、８５−９９．５％、８５−１００％、９０−９５％、９０−９９％、９０−９９．５％  、９０−１００％、９５−９９％、９５−９９．５％、９５−１００％、９９−９９．５％、９９−１００％、または９９．５−１００％であり得る。非限定的な例として、ガイド鎖による標的ノックダウン（ＫＤ）は７０％より大きい。
【０１００】
一実施形態では、最も近いオフターゲットについてのパッセンジャー鎖のＩＣ５０は、ターゲットについてのガイド鎖のＩＣ５０を１００倍したものより大きい。非限定的な例として、最も近いオフターゲットについてのパッセンジャー鎖のＩＣ５０が、ターゲットについてのガイド鎖のＩＣ５０を１００倍したものを超える場合、ヒトＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二本鎖またはコードされたｄｓＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで高いガイド鎖活性および低いパッセンジャー鎖活性を有すると言われる。
【０１０１】
一実施形態では、ガイド鎖の５’プロセシングは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の割合で、５’末端での正確な開始（ｎ）を有する。非限定的な例として、ガイド鎖の５’プロセシングは正確であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、少なくとも９９％の割合で５’末端での正確な開始（ｎ）を有する。非限定的な例として、ガイド鎖の５’プロセシングは正確であり、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、少なくとも９９％の割合で、５’末端における正確な開始（ｎ）を有する。
【０１０２】
一実施形態において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、発現されるガイド鎖対パッセンジャー鎖（Ｇ：Ｐ）比は、１：９９、５：９５、１０：９０、１５：８５、２０：８０、２５：７５、３０：７０、３５：６５、４０：６０、４５：５５、５０：５０、５５：４５、６０：４０、６５：３５、７０：３０、７５：２５、８０：２０、８５：１５、９０：１０、９５：５または９９：１である。非限定的な例として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ガイド鎖とパッセンジャー鎖の比は、８０：２０である。非限定的な例として、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ガイド鎖とパッセンジャー鎖の比は、８０：２０である。
【０１０３】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡをコードするベクターゲノムの完全性は、構造体の完全長の少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または９９％である。
【０１０４】
ｓｉＲＮＡ修飾
いくつかの実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ分子は、前駆体またはＤＮＡとして送達されない場合、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるｓｉＲＮＡの安定性の増加などを含むがこれに限定されないＲＮＡ分子のいくつかの特徴を調節するために、化学的に修飾することができる。化学的に修飾されたｓｉＲＮＡ分子は、ヒトへの治療用途に使用することができ、ｓｉＲＮＡ分子のＲＮＡｉ活性を損なうことなく改善される。非限定的な例として、ｓｉＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方の３’末端および５’末端の両方で修飾されている。
【０１０５】
いくつかの態様において、本発明のｓｉＲＮＡ二本鎖は、糖修飾ヌクレオチド、核酸塩基修飾および／または骨格修飾を含むがこれらに限定されない、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、ｓｉＲＮＡ分子は、組み合わされた修飾、例えば、組み合わされた核酸塩基および骨格修飾を含み得る。
【０１０６】
一実施形態では、修飾ヌクレオチドは、糖−修飾ヌクレオチドであり得る。糖修飾ヌクレオチドは、２’−フルオロ、２’−アミノおよび２’−チオ修飾リボヌクレオチド、例えば、２’−フルオロ修飾リボヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。修飾されたヌクレオチドは、糖部分上で修飾されてよく、ならびにリボシルではない糖または類似体を有するヌクレオチドもまた修飾されてもよい。例えば、糖部分は、マンノース、アラビノース、グルコピラノース、ガラクトピラノース、４’−チオリボース、および他の糖、複素環、または炭素環であってよく、またはそれらに基づくものであってよい。
【０１０７】
一実施形態では、修飾ヌクレオチドは核酸塩基修飾ヌクレオチドであってよい。
一実施形態では、修飾ヌクレオチドは、骨格修飾ヌクレオチドであってよい。いくつかの実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ二本鎖は、主鎖上に他の修飾をさらに含み得る。本明細書で使用される通常の「骨格」は、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子中の交互に繰り返される糖−リン酸配列を指す。デオキシリボース／リボース糖は、「ホスホジエステル」結合／リンカー（ＰＯ結合）としても知られているエステル結合で、３’−ヒドロキシル基および５’−ヒドロキシル基の両方においてリン酸基に結合する。ＰＯ骨格は、「ホスホロチオエート骨格（ＰＳ結合）」として修飾することができる。いくつかの場合において、天然のホスホジエステル結合はアミド結合によって置換され得るが、２つの糖単位間の４つの原子は維持される。そのようなアミド修飾は、オリゴヌクレオチドの固相合成を促進し、ｓｉＲＮＡ相補体で形成される二本鎖の熱力学的安定性を増加させることができる。例えば、Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｕｒｅ＆Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９７，３，４３７−４４０；を参照せよ。その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０８】
修飾塩基は、１つ以上の原子または基の置換または付加によって修飾された、例えばアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、キサンチン、イノシンおよびクエオシンなどのヌクレオチド塩基を指す。核酸塩基部分の修飾のいくつかの例には、アルキル化、ハロゲン化、チオール化、アミノ化、アミド化またはアセチル化塩基が個々にまたは組み合わせて含まれるが、これらに限定されない。より具体的には、５−プロピニルウリジン、５−プロピニルシチジン、６−メチルアデニン、６−メチルグアニン、Ｎ、Ｎ’−ジメチルアデニン、２−プロピルアデニン、２−プロピルグアニン、２−アミノアデニン、１−メチルイノシン、３−メチルウリジン、５−メチルシチジン、５−メチルウリジン、および５位に修飾を有する他のヌクレオチド、５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ハロシチジン、５−ハロウリジン、４−アセチルシチジン、１−メチルアデノシン、２−メチルアデノシン、３−メチルシチジン、６−メチルウリジン、２−メチルグアノシン、７−メチルグアノシン、２，２−ジメチルグアノシン、５−メチルアミノエチルウリジン、５−メチルオキシウリジン、例えば７−デアザ−アデノシンのようなデアザヌクレオチド、６−アゾウリジン、６−アゾシチジン、６−アゾチミジン、５−メチル−２−チオウリジン、例えば２−チオウリジンおよび４−チオウリジンおよび２−チオシチジンのような他のチオ塩基、ジヒドロウリジン、シュードウリジン、クオシン、アルゲオシン、ナフチルおよび置換ナフチル基、任意のＯ−およびＮ−アルキル化プリンおよびピリミジン、例えばＮ６−メチルアデノシン、５−メチルカルボニルメチルウリジン、ウリジン５−オキシ酢酸、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニルおよびアミノフェノールまたは２，４，６−トリメトキシベンゼンなどの修飾フェニル基、Ｇ−クランプヌクレオチドとして作用する修飾シトシン、８−置換アデニンおよびグアニン、５−置換ウラシ
ルおよびチミン、アザピリミジン、カルボキシヒドロキシアルキルヌクレオチド、カルボキシアルキルアミノアルキルヌクレオチド、およびアルキルカルボニルアルキル化ヌクレオチドが挙げられる。
【０１０９】
一実施形態では、修飾ヌクレオチドは、センス鎖上にのみ存在し得る。
別の実施形態において、修飾ヌクレオチドは、アンチセンス鎖上にのみ存在し得る。
いくつかの実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方に存在し得る。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、化学的に修飾されたヌクレオチドは、ＳＯＤ１  ｍＲＮＡ配列のような標的ｍＲＮＡ配列と対合するアンチセンス鎖の能力に影響を与えない。
ベクター
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｓｉＲＮＡ分子は、プラスミドまたはウイルスベクターのようなベクターによってコードされ得る。一実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、ウイルスベクターによってコードされる。ウイルスベクターは、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどであり得るが、これらに限定されない。いくつかの特定の実施形態では、ウイルスベクターはＡＡＶベクターである。
【０１１１】
レトロウイルスベクター
いくつかの実施形態において、ＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二本鎖は、レトロウイルスベクターによってコードされ得る（例えば、米国特許第５，３９９，３４６号；第５，１２４，２６３号；第４，６５０，７６４号および第４，９８０，２８９号明細書を参照；これらの各々の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１１２】
アデノウイルスベクター
アデノウイルスは、ｉｎ  ｖｉｖｏで様々な細胞タイプに核酸を効率的に送達するように改変することができ、遺伝子を神経細胞に標的化することを含む遺伝子治療プロトコルに広く使用されている真核生物ＤＮＡウイルスである。種々の複製欠損アデノウイルスおよび最小アデノウイルスベクターが核酸治療について記載されている（例えば、ＰＣＴ特許公開番号ＷＯ１９９４２６９１４号、ＷＯ１９９５０２６９７号、ＷＯ１９９４２８１５２号、ＷＯ１９９４１２６４９号、ＷＯ１９９５０２６９７号およびＷＯ１９９６２２３７８号参照；これらの各々の内容は、その全体が参照により組み込まれる）。そのようなアデノウイルスベクターはまた、本発明のｓｉＲＮＡ分子を細胞に送達するために使用され得る。
【０１１３】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、依存性パルボウイルス（他のパルボウイルスのように）であり、約５０００ヌクレオチドの長さのゲノムを有する一本鎖非エンベロープＤＮＡウイルスであるとともに、複製を担うタンパク質（Ｒｅｐ）とキャプシド（Ｃａｐ）の構造タンパク質とをコードする２つのオープンリーディングフレームを含む。オープンリーディングフレームには、ウイルスゲノムの複製起点として機能する２つの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列が隣接している。さらに、ＡＡＶゲノムはパッケージング配列を含み、ウイルスゲノムのＡＡＶキャプシドへのパッケージングを可能にする。ＡＡＶベクターは、感染細胞において生産的感染を受けるために、コヘルパー（例えばアデノウイルス）を必要とする。そのようなヘルパー機能がない場合、ＡＡＶビリオンは本質的に宿主細胞に入り、細胞のゲノムに組み込まれる。
【０１１４】
ＡＡＶベクターはいくつかの独特な特徴のために、そのｓｉＲＮＡ投与について研究されている。特徴の非限定的な例には、（ｉ）分裂細胞および非分裂細胞の両方に感染する
能力；（ｉｉ）ヒト細胞を含む感染性の広範な宿主範囲；（ｉｉｉ）いずれの疾患とも関連しておらず、感染細胞において複製することが示されていない野生型ＡＡＶ；（ｉｖ）ベクターに対する細胞媒介免疫応答の欠如および（ｖ）長期発現の可能性を減少させる、宿主染色体における非組み込み性の性質が含まれる。さらに、ＡＡＶベクターによる感染は、細胞遺伝子発現のパターンの変化に最小の影響しか及ぼさない（Ｓｔｉｌｗｅｌｌ  および  Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２００３，３４，１４８）。
【０１１５】
典型的には、ｓｉＲＮＡ送達のためのＡＡＶベクターは、それらがウイルスゲノム内の機能的ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質をコードする配列を欠いているため、複製欠損である組換えウイルスベクターであり得る。場合によっては、欠損したＡＡＶベクターは、大部分または全てのコード配列を欠いている可能性があり、本質的に１つまたは２つのＡＡＶ  ＩＴＲ配列およびパッケージング配列のみを含有する。
【０１１６】
ＡＡＶベクターはまた、自己相補的ＡＡＶベクター（ｓｃＡＡＶ）からなっていてよい。ｓｃＡＡＶベクターは、双方のＤＮＡ鎖を含み、それらが共にアニーリングし、二本鎖ＤＮＡを形成する。第二鎖合成をスキップすることにより、ｓｃＡＡＶは細胞内での迅速な発現を可能にする。
【０１１７】
一実施形態では、本発明で使用されるＡＡＶベクターはｓｃＡＡＶである。
一実施形態では、本発明で使用されるＡＡＶベクターはｓｓＡＡＶである。
ＡＡＶベクターを産生および／または改変する方法は、偽型ＡＡＶベクターのような当技術分野で開示されている（ＰＣＴ特許公開番号ＷＯ２０００２８００４号；ＷＯ２００１２３００１号；ＷＯ２００４１１２７２７号；ＷＯ２００５００５６１０号およびＷＯ２００５０７２３６４号、これらの各々の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１１８】
ｓｉＲＮＡ分子の核酸配列を含むＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９（ｈｕ１４）、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ−ＤＪ８およびＡＡＶ−ＤＪを含むがこれらに限定されないＡＡＶの様々な血清型から調製または誘導することができる。ある場合には、異なる血清型のＡＡＶを一緒にまたは他のタイプのウイルスと混合して、キメラＡＡＶベクターを産生することができる。
【０１１９】
一実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含むＡＡＶベクターを哺乳動物細胞に導入することができる。
ＡＡＶベクターは、送達効率を高めるために修飾することができる。本発明のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含むそのような改変ＡＡＶベクターは、効率的にパッケージングされ、標的細胞を高い頻度で最小限の毒性でうまく感染させるために使用することができる。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含むＡＡＶベクターは、ヒト血清型ＡＡＶベクターであり得る。そのようなヒトＡＡＶベクターは、任意の既知の血清型、例えば血清型ＡＡＶ１−ＡＡＶ１１のいずれか１つに由来し得る。非限定的な例として、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１由来のキャプシドにＡＡＶ１由来のゲノムを含むベクター、ＡＡＶ２由来ゲノム中にＡＡＶ２由来ゲノムを含むベクター、ＡＡＶ４由来のキャプシドにＡＡＶ４由来のゲノムを含むベクター、ＡＡＶ６由来のキャプシドにＡＡＶ６由来のゲノムを含むベクター、またはＡＡＶ９由来のキャプシドにＡＡＶ９由来のゲノムを含むベクターであってよい。
【０１２１】
他の実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含むＡＡＶベクターは、少なくとも２つの異なるＡＡＶ血清型に由来する配列および／または成分を含む偽型（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ）ハイブリッドまたはキメラＡＡＶベクターであり得る。偽型ＡＡＶベクターは、１つのＡＡＶ血清型に由来するＡＡＶゲノムおよび異なるＡＡＶ血清型に少なくとも部分的に由来するキャプシドタンパク質を含むベクターであり得る。非限定的な例として、このような偽型ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１由来のキャプシドにＡＡＶ２由来のゲノムを含むベクター、またはＡＡＶ２由来のゲノムをＡＡＶ６由来のキャプシドに含むベクター、またはＡＡＶ４由来のキャプシドにＡＡＶ２由来のゲノムを含むベクター、またはＡＡＶ９由来のキャプシドにＡＡＶ２由来のゲノムを含むベクターであってよい。同様の様式で、本発明は任意のハイブリッドまたはキメラＡＡＶベクターを意図する。
【０１２２】
他の実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含むＡＡＶベクターを使用して、ｓｉＲＮＡ分子を中枢神経系に送達することができる（例えば、米国特許第６，１８０，６１３号；その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１２３】
いくつかの態様において、本発明のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含むＡＡＶベクターは、非ウイルス由来のペプチドを含む修飾されたキャプシドをさらに含み得る。他の態様では、ＡＡＶベクターは、コードされたｓｉＲＮＡ二本鎖の脳および脊髄への送達を促進するためのＣＮＳ特異的キメラキャプシドを含み得る。例えば、ＣＮＳ指向性を示すＡＡＶ変異体由来のキャップヌクレオチド配列の整列を、可変領域（ＶＲ）配列および構造を同定するために構築することができる。
【０１２４】
一実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含むＡＡＶベクターは、ポリシストロン分子であるｓｉＲＮＡ分子をコードし得る。ｓｉＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡ分子の領域間に１つ以上のリンカーをさらに含んでいてもよい。
【０１２５】
一実施形態では、コードされたｓｉＲＮＡ分子は、ＣＭＶ、Ｕ６、ＣＢＡまたはＳＶ４０イントロンを有するＣＢＡプロモーターを含むがこれらに限定されない発現ベクター中のプロモーターの下流に位置し得る。さらに、コードされたｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター中のポリアデニル化配列の上流に位置し得る。非限定的な例として、コードされたｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクターにおいて、プロモーターの下流および／またはポリアデニル化配列の上流の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３０超のヌクレオチド内に位置し得る。別の非限定的な例として、コードされたｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクターにおいて、プロモーターの下流および／またはポリアデニル化配列の上流の１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２５、１〜３０、５〜１０、５〜１５、５〜２０、５〜２５、５〜３０、１０〜１５、１０〜２０、１０〜２５、１０〜３０、１５〜２０、１５〜２５、１５〜３０、２０〜２５、２０〜３０または２５〜３０のヌクレオチド内に位置し得る。非限定的な例として、コードされたｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクターにおいて、プロモーターの下流および／またはポリアデニル化配列の上流の最初の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、または２５％超のヌクレオチド内に位置し得る。別の非限定的な例として、コードされたｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクターにおいて、プロモーターの上流および／またはポリアデニル化配列の上流の最初の１〜５％、１〜１０％、１〜１５％、１〜２０％、１〜２５％、５〜１０％、５〜１５％、５〜２０％、５〜２５％、１０〜１５％、１０〜２０％、１０〜２５％、１５〜２０％、１５〜２５％、または２０〜２５％内に位置し得る。
【０１２６】
一実施形態では、コードされたｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター中のポリアデニル化配列の上流に位置し得る。さらに、コードされたｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクターにおいて、ＣＭＶ、Ｕ６、ＣＢＡまたはＳＶ４０イントロンを有するＣＢＡプロモーターを含むがこれに限定されないプロモーターの下流に位置し得る。非限定的な例として、コードされたｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクターにおいて、プロモーターの下流および／またはポリアデニル化配列の上流の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３０超のヌクレオチド内に位置し得る。別の非限定的な例として、コードされたｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクターにおいて、プロモーターの下流および／またはポリアデニル化配列の上流の１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２５、１〜３０、５〜１０、５〜１５、５〜２０、５〜２５、５〜３０、１０〜１５、１０〜２０、１０〜２５、１０〜３０、１５〜２０、１５〜２５、１５〜３０、２０〜２５、２０〜３０または２５〜３０ヌクレオチド内に位置し得る。非限定的な例として、コードされたｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクターにおいて、プロモーター下流および／又はポリアデニル化配列の上流の最初の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、または２５％超のヌクレオチド内に位置し得る。別の非限定的な例として、コードされたｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクターにおいて、プロモーターの下流および／またはポリアデニル化配列の上流の最初の１〜５％、１〜１０％、１〜１５％、１〜２０％、１〜２５％、５〜１０％、５〜１５％、５〜２０％、５〜２５％、１０〜１５％、１０〜２０％、１０〜２５％、１５〜２０％、１５〜２５％、または２０〜２５％内に位置し得る。
【０１２７】
一実施形態では、コードされたｓｉＲＮＡ分子は、ｓｃＡＡＶに位置し得る。
一実施形態では、コードされたｓｉＲＮＡ分子は、ｓｓＡＡＶに位置し得る。
一実施形態では、コードされたｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター中のフリップＩＴＲの５’末端近くに位置し得る。別の実施形態では、コードされたｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター中のフリップＩＴＲの３’末端近くに位置し得る。さらに別の実施形態では、コードされたｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター中のフロップＩＴＲの５’末端近くに位置し得る。さらに別の実施形態では、コードされたｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター中のフロップＩＴＲの３’末端近くに位置し得る。一実施形態では、コードされたｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター中のフリップＩＴＲの５’末端とフロップＩＴＲの３’末端との間に位置し得る。一実施形態では、コードされたｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター内の、フリップＩＴＲの３’末端およびフリップＩＴＲの５’末端の間（例えば、フリップＩＴＲの５’末端とフロップＩＴＲの３’末端またはフロップＩＴＲの３’末端とフリップＩＴＲの５’末端の間の途中）に位置し得る。非限定的な例として、コードされたｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター中のＩＴＲの５’または３’末端（例えば、フリップまたはフロップＩＴＲ）から、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０内または３０ヌクレオチドを超える下流に位置し得る。非限定的な例として、コードされたｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター中のＩＴＲの５’または３’末端（例えば、フリップまたはフロップＩＴＲ）から、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０内、または３０ヌクレオチドを超える上流に位置し得る。別の非限定的な例として、コードされたｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター中のＩＴＲの５’または３’末端（例えば、フリップまたはフロップＩＴＲ）から１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２５、１〜３０、５〜１０、５〜１５、５〜２０、５〜２５、５〜２５、５〜２５、５〜３０、１０〜１５、１０〜２０、１０〜２５、１０〜３０、１５〜２０、１５〜２５、１５〜３０、２０〜２５、２０〜３０または２５〜３０ヌクレオチド内の下流に位置し得る。別の非限定的な例として、コードされたｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター中のＩＴＲの５’または３’末端（例えば、フリップまたはフロッ
プＩＴＲ）から１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２５、１〜３０、５〜１０、５〜１５、５〜２０、５〜２５、５〜２５、５〜２５、５〜３０、１０〜１５、１０〜２０、１０〜２５、１０〜３０、１５〜２０、１５〜２５、１５〜３０、２０〜２５、２０〜３０または２５〜３０上流に位置し得る。非限定的な例として、コードされたｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター中のＩＴＲの５’または３’末端（例えば、フリップまたはフロップＩＴＲ）から最初の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％内または２５％のヌクレオチドを超える上流に位置し得る。別の非限定的な例として、コードされたｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクター中のＩＴＲの５’または３’末端（例えば、フリップまたはフロップＩＴＲ）から最初の１〜５％、１〜１０％、１〜１５％、１〜２０％、１〜２５％、５〜１０％、５〜１５％、５％〜２０％、５％〜２５％、１０％〜１５％、１０％〜２０％、１０％〜２５％、１５％〜２０％、１５〜２５％、または２０〜２５％下流に位置し得る。
【０１２８】
発現ベクター
一実施形態では、発現ベクター（例えば、ＡＡＶベクター）は、本明細書に記載の発現ベクターの少なくとも１つを含む調節性ポリヌクレオチドの少なくとも１つを含み得る。
【０１２９】
一実施形態では、発現ベクターは、ＩＴＲからＩＴＲへ、列挙される５’から３’へ、ＩＴＲ、プロモーター、イントロン、調節ポリヌクレオチド、ポリＡ配列およびＩＴＲを含み得る。
【０１３０】
ゲノムサイズ
一実施形態では、本明細書に記載の調節性ポリヌクレオチドをコードする核酸配列を含むベクターゲノムは、一本鎖または二本鎖ベクターゲノムであり得る。ベクターゲノムのサイズは、小、中、大または最大であり得る。さらに、ベクターゲノムは、プロモーターおよびポリＡテールを含み得る。
【０１３１】
一実施形態では、本明細書に記載の調節性ポリヌクレオチドをコードする核酸配列を含むベクターゲノムは、小さな一本鎖ベクターゲノムであり得る。小さな一本鎖ベクターゲノムは、約２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４および３．５ｋｂのサイズなどの、２．７から３．５ｋｂのサイズであり得る。非限定的な例として、小さな一本鎖ベクターゲノムは、３．２ｋｂのサイズであり得る。さらに、ベクターゲノムは、プロモーターおよびポリＡテールを含み得る。
【０１３２】
一実施形態では、本明細書に記載の調節性ポリヌクレオチドをコードする核酸配列を含むベクターゲノムは、小さな二本鎖ベクターゲノムであり得る。小さな二本鎖ベクターゲノムは、約１．３、１．４、１．５、１．６、１．７ｋｂのサイズなどの、１．３から１．７ｋｂのサイズであり得る。非限定的な例として、小さな二本鎖ベクターゲノムは、１．６ｋｂのサイズであり得る。さらに、ベクターゲノムは、プロモーターおよびポリＡテールを含み得る。
【０１３３】
一実施形態では、本明細書に記載の調節性ポリヌクレオチドをコードする核酸配列、例えばｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡを含むベクターゲノムは、中程度の一本鎖ベクターゲノムであってもよい。中程度の一本鎖ベクターゲノムは、約３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２および４．３ｋｂのサイズなどの、３．６から４．３ｋｂのサイズであり得る。非限定的な例として、中程度の一本鎖ベクターゲノムは、４．０ｋｂのサイズであり得る。さらに、ベクターゲノムは、プロモーターおよびポリＡテールを含み得る。
【０１３４】
一実施形態では、本明細書に記載の調節性ポリヌクレオチドをコードする核酸配列を含
むベクターゲノムは、中程度の二本鎖ベクターゲノムであり得る。中程度の二本鎖ベクターゲノムは、約１．８、１．９、２．０および２．１ｋｂのサイズなどの、１．８から２．１ｋｂのサイズであり得る。非限定的な例として、中程度の二本鎖ベクターゲノムは、２．０ｋｂのサイズであり得る。さらに、ベクターゲノムは、プロモーターおよびポリＡテールを含み得る。
【０１３５】
一実施形態では、本明細書に記載の調節性ポリヌクレオチドをコードする核酸配列を含むベクターゲノムは、大きな一本鎖ベクターゲノムであり得る。大きな一本鎖ベクターゲノムは、約４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９および６．０ｋｂのサイズなどの、４．４から６．０ｋｂのサイズであり得る。非限定的な例として、大きな一本鎖ベクターゲノムは、４．７ｋｂのサイズであり得る。別の非限定的な例として、大きな一本鎖ベクターゲノムは、４．８ｋｂのサイズであり得る。さらに別の非限定的な例として、大きな一本鎖ベクターゲノムは、サイズが６．０ｋｂであってもよい。さらに、ベクターゲノムは、プロモーターおよびポリＡテールを含み得る。
【０１３６】
一実施形態では、本明細書に記載の調節性ポリヌクレオチドをコードする核酸配列を含むベクターゲノムは、大きな二本鎖ベクターゲノムであり得る。大きな二本鎖ベクターゲノムは、約２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９および３．０ｋｂのサイズなどの、２．２から３．０ｋｂのサイズであり得る。非限定的な例として、大きな二本鎖ベクターゲノムは、２．４ｋｂのサイズであり得る。さらに、ベクターゲノムは、プロモーターおよびポリＡテールを含み得る。
【０１３７】
プロモーター
当業者は、標的細胞が、種特異的、誘導性、組織特異的または細胞周期特異的なプロモーターを含むがこれらに限定されるものではない特異的なプロモーターを必要とすることを認識するであろう（Ｐａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ．３：１１４５−９（１９９７）；この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１３８】
一実施形態では、プロモーターは、調節ポリヌクレオチドの発現を効率的に駆動すると考えられるプロモーターである。
一実施形態では、プロモーターは、標的とされる細胞の向性を有するプロモーターである。
【０１３９】
一実施形態では、プロモーターは、限定されるものではないが、神経系組織などの標的組織中の一定期間、ペイロード、例えば調節ポリヌクレオチド、例えばｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡの発現を提供する弱いプロモーターである。発現は、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１５時間後、１６時間後、１７時間後、１８時間後、１９時間後、２０時間後、２１時間後、２２時間後、２３時間後、１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、１０日、１１日、１２日、１３日、２週間、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、３週間、２２日、２３日、２４日、２７日、２８日、２９日、３０日、３１日、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１１ヶ月、１年、１３ヶ月、１４ヶ月、１５ヶ月、１６ヶ月、１７ヶ月、１８ヶ月、１９ヶ月、２０ヶ月、２１ヶ月、２２ヶ月、２３ヶ月、２年、３年、４年、６年、７年、８年、９年、１０年、または１０年以上の期間、持続する。発現は、１〜５時間、１〜１２時間、１〜２日、１〜５日、１〜２週間、１〜３週間、１〜４週間、１〜２ヶ月、１〜４ヶ月、１〜６ヶ月、３〜６ヶ月、３〜９ヶ月、４〜８ヶ月、６〜１２ヶ月、１〜２年、１〜５年、２〜５年、３〜６年、３〜８、４〜８年、または５〜１０年の期間、持続する。非限定的な一例として、プロモーターは、神経組織におけるペイロードの持続的発現のための弱いプロモ
ーターである。
【０１４０】
一実施形態では、プロモーターは、１ｋｂ未満のプロモーターであってよい。プロモーターは、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、あるいは８００以上の長さであってよい。プロモーターは、２００〜３００，２００〜４００，２００〜５００，２００〜６００，２００〜７００，２００〜８００，３００〜４００，３００〜５００，３００〜６００，３００〜７００，３００〜８００、４００〜５００，４００〜６００，４００〜７００，４００〜８００，５００〜６００，５００〜７００，６００〜８００，６００〜７００，６００〜８００，７００〜８００の長さであってよい。
【０１４１】
一実施形態では、プロモーターは、ＣＭＶおよびＣＢＡを含むがこれらに限定されない２つあるいはそれ以上の構成要素の組み合わせであってよい。各構成要素は、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００または８００以上の長さであってよい。各構成要素は、２００〜３００、２００〜４００、２００〜５００、２００〜６００、２００〜７００、２００〜８００、３００〜４００、３００〜５００、３００〜６００、３００〜７００、３００〜８００、４００〜５００、４００〜６００、４００〜７００、４００〜８００、５００〜６００、５００〜７００、５００〜８００、６００〜７００、６００〜８００、７００〜８００の長さを有することができる。非限定的な一例として、プロモーターは、３８２ヌクレオチドのＣＭＶエンハンサー配列と２６０ヌクレオチドのＣＢＡプロモーター配列との組み合わせである。
【０１４２】
一実施形態において、ベクターゲノムは、標的特異性および発現を増強するための少なくとも１つのエレメントを含む。（例えば、Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｖｉｒａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｔｏ  Ｅｎｈａｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１５を参照せよ；この内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。）参照導入遺伝子標的特異性および発現を増強するエレメントの非限定的な例には、プロモーター、内在性ｍｉＲＮＡ、転写後調節エレメント（ＰＲＥ）、ポリアデニル化（ＰｏｌｙＡ）シグナル配列および上流エンハンサー（ＵＳＥ）、ＣＭＶエンハンサーおよびイントロンがある。
【０１４３】
一実施形態において、ベクターゲノムは、プロモーターのような、標的特異性および発現を増強するための少なくとも１つのエレメントを含む。（例えば、Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ
ａｌ．Ｖｉｒａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｔｏ  Ｅｎｈａｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１５を参照せよ；この内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１４４】
ほとんどの組織において発現を促進するプロモーターは、ヒト伸長因子１α−サブユニット（ＥＦ１α）、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）およびその誘導体ＣＡＧ、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）、またはユビキチンＣ（ＵＢＣ）を含むがこれに限定されない。組織特異的発現要素を使用して、発現をある細胞型に制限することができ、たとえば、ニューロン、星状細胞、または希突起膠細胞に制限するために使用することができる神経系プロモーターを含むがこれに限定されない。ニューロンに対する組織特異的発現エレメントの非限定的な例には、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血小板由来成長因子Ｂ鎖（ＰＤＧＦ−β）、シナプシン（Ｓｙｎ）、メチル−ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）、ＣａＭＫＩＩ、ｍＧｌｕＲ２、ＮＦＬ、ＮＦＨ、ｎβ２、ＰＰＥ、ＥｎｋおよびＥＡＡＴ２プロモーターが挙げられる。星状細胞に対する組織特異的発現エレメントの非限定的な例には、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）およびＥＡＡＴ２プロモーターが挙げられる。希突起膠細胞に対する組織特異的発現エレメントの非限定的な例には、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモーターが挙げられる。
【０１４５】
一実施形態では、ベクターゲノムはユビキタスプロモーターを含む。ユビキタスプロモーターの非限定的な例には、ＣＭＶ、ＣＢＡ（誘導体ＣＡＧ、ＣＢｈなどを含む）、ＥＦ−１α、ＰＧＫ、ＵＢＣ、ＧＵＳＢ（ｈＧＢｐ）、およびＵＣＯＥ（ＨＮＲＰＡ２Ｂ１−ＣＢＸ３のプロモーター）が挙げられる。Ｙｕら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｉｎ  ２０１１，７：６３；この内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、レンチウイルスベクターを用いて、ラットＤＲＧ細胞および一次ＤＲＧ細胞におけるＣＡＧ、ＥＦＩα、ＰＧＫおよびＵＢＣプロモーター下でのｅＧＦＰの発現を評価し、ＵＢＣが他の３つのプロモーターよりも弱い発現しか示さず、すべてのプロモーターについて見られたグリア発現がわずか１０〜１２％であったことを見いだした。Ｓｏｄｅｒｂｌｏｍら（Ｅ．Ｎｅｕｒｏ  ２０１５；この内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、運動皮質に注入後のＡＡＶ８におけるＣＭＶおよびＵＢＣプロモーターによるｅＧＦＰの発現、およびＣＭＶプロモーターによるＡＡＶ２におけるｅＧＦＰの発現を評価した。ＵＢＣまたはＥＦＩαプロモーターを含むプラスミドの鼻腔内投与は、ＣＭＶプロモーターによる発現よりも長く持続した気道発現を示した（例えば、Ｇｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２００１，Ｖｏｌ．８，１５３９−１５４６を参照せよ；この内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）。Ｈｕｓａｉｎら（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２００９；この内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、ｈＧＵＳＢプロモーター、ＨＳＶ−１ＬＡＴプロモーター、およびＮＳＥプロモーターを用いてＨβＨ構築物を評価し、ＨβＨ構築物がマウスの脳におけるＮＳＥよりも弱い発現を示したことを見いだした。ＰａｓｓｉｎｉおよびＷｏｌｆｅ（Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．２００１，１２３８２−１２３９２；この内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、新生児マウスにおける脳室内注射後のＨβＨベクターの長期効果を評価し、持続的発現が少なくとも１年間あったことを見いだした。Ｘｕら（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２００１，８，１３２３−１３３２；この内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、ＣＭＶ−ｌａｃＺ、ＣＭＶ−ｌｕｃ、ＥＦ、ＧＦＡＰ、ｈＥＮＫ、ｎＡＣｈＲ、ＰＰＥ、ＰＰＥ  ＋  ｗｐｒｅ、ＮＳＥ（０．３ｋｂ）、ＮＳＥ（１．８ｋｂ）、およびＮＳＥ（１．８ｋｂ  ＋  ｗｐｒｅ）に比較して、ＮＦ−ＬおよびＮＦ−Ｈプロモーターを使用した場合に、すべての脳領域において発現が低いことを見いだした。Ｘｕらは、プロモーター活性の降順が、ＮＳＥ（１．８ｋｂ）、ＥＦ、ＮＳＥ（０．３ｋｂ）、ＧＦＡＰ、ＣＭＶ、ｈＥＮＫ、ＰＰＥ、ＮＦＬおよびＮＦＨであることを見出した。ＮＦＬは６５０ヌクレオチドのプロモーターであり、ＮＦＨは９２０ヌクレオチドのプロモーターであり、いずれも肝臓には存在しないが、ＮＦＨは感覚固有受容体ニューロン、脳および脊髄に豊富であり、ＮＦＨは心臓に存在する。Ｓｃｎ８ａは、ＤＲＧ、脊髄および脳全体を通して、海馬ニューロンおよび小脳プルキンエ細胞、皮質、視床および視床下部に見られる特に高い発���を有する４７０ヌクレオチドのプロモーターである（例え
ば、Ｄｒｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．２００７およびＲａｙｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．２００４を参照せよ；この内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）。
【０１４６】
一実施形態では、ベクターゲノムはＵＢＣプロモーターを含む。ＵＢＣプロモーターは、３００〜３５０ヌクレオチドのサイズを有し得る。非限定的な一例として、ＵＢＣプロモーターは３３２ヌクレオチドの長さである。
【０１４７】
一実施形態では、ベクターゲノムはＧＵＳＢプロモーターを含む。ＧＵＳＢプロモーターは、３５０〜４００ヌクレオチドのサイズを有し得る。非限定的な例として、ＧＵＳＢプロモーターは３７８ヌクレオチドの長さである。非限定的な一例として、構築物は、ＡＡＶ−プロモーター−ＣＭＶ／グロビンイントロンｈＦＸＮ−ＲＢＧであってよく、この構築物では、ＡＡＶが自己相補的であってよく、ＡＡＶがＤＪ血清型であってよい。
【０１４８】
一実施形態では、ベクターゲノムはＮＦＬプロモーターを含む。ＮＦＬプロモーターは、６００〜７００ヌクレオチドのサイズを有し得る。非限定的な一例として、ＮＦＬプロモーターは６５０ヌクレオチドの長さである。非限定的な一例として、構築物は、ＡＡＶ−プロモーター−ＣＭＶ／グロビンイントロンｈＦＸＮ−ＲＢＧであってよく、この構築物では、ＡＡＶが自己相補的であってよく、ＡＡＶがＤＪ血清型であってよい。
【０１４９】
一実施形態では、ベクターゲノムはＮＦＨプロモーターを含む。前記ＮＦＨプロモーターは、９００〜９５０ヌクレオチドのサイズを有し得る。非限定的な一例として、ＮＦＨプロモーターは９２０ヌクレオチドの長さである。非限定的な一例として、構築物は、ＡＡＶ−プロモーター−ＣＭＶ／グロビンイントロンｈＦＸＮ−ＲＢＧであってよく、この構築物では、ＡＡＶが自己相補的であってよく、ＡＡＶがＤＪ血清型であってよい。
【０１５０】
一実施形態では、ベクターゲノムはｓｃｎ８ａプロモーターを含む。ｓｃｎ８ａプロモーターは、４５０〜５００ヌクレオチドのサイズを有し得る。非限定的な一例として、ｓｃｎ８ａプロモーターは４７０ヌクレオチドの長さである。非限定的な一例として、構築物は、ＡＡＶ−プロモーター−ＣＭＶ／グロビンイントロンｈＦＸＮ−ＲＢＧであってよく、この構築物では、ＡＡＶが自己相補的であってよく、ＡＡＶがＤＪ血清型であってよい。
【０１５１】
一実施形態では、ベクターゲノムはＦＸＮプロモーターを含む。
一実施形態では、ベクターゲノムはＰＧＫプロモーターを含む。
一実施形態では、ベクターゲノムはＣＢＡプロモーターを含む。
【０１５２】
一実施形態では、ベクターゲノムはＣＭＶプロモーターを含む。
一実施形態では、ベクターゲノムは、肝臓または骨格筋プロモーターを含む。肝臓プロモーターの非限定的な例には、ｈＡＡＴおよびＴＢＧが挙げられる。骨格筋プロモーターの非限定的な例には、Ｄｅｓｍｉｎ、ＭＣＫおよびＣ５−１２が挙げられる。
【０１５３】
一実施形態では、ＡＡＶベクターは、エンハンサーエレメント、プロモーターおよび／または５’ＵＴＲイントロンを含む。エンハンサーはＣＭＶエンハンサーであってよいが、これに限定されず；プロモーターはＣＭＶ、ＣＢＡ、ＵＢＣ、ＧＵＳＢ、ＮＳＥ、サナプシン、ＭｅＣＰ２、およびＧＦＡＰプロモーターであってよいが、これに限定されず；また５’ＵＴＲ／イントロンは、ＳＶ４０およびＣＢＡ−ＭＶＭであってよいが、これらに限定されない。非限定的な例として、組み合わせて使用されるエンハンサー、プロモーターおよび／またはイントロンには以下が挙げられる：（１）ＣＭＶエンハンサー、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０  ５’ＵＴＲイントロン；（２）ＣＭＶエンハンサー、ＣＢＡプロモーター、ＳＶ４０  ５’ＵＴＲイントロン；（３）ＣＭＶエンハンサー、ＣＢＡプ
ロモーター、ＣＢＡ−ＭＶＭ  ５’ＵＴＲイントロン；（４）ＵＢＣプロモーター；（５）ＧＵＳＢプロモーター；（６）ＮＳＥプロモーター；（７）シノプシンプロモーター；（８）ＭｅＣＰ２プロモーターおよび（９）ＧＦＡＰプロモーター。
【０１５４】
一実施形態では、ＡＡＶベクターは、操作されたプロモーターを有する。
イントロン
一実施形態では、ベクターゲノムは、イントロンなどの、導入遺伝子標的特異性および発現を増強するための少なくとも１つのエレメントを含む（例えば、Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ
ａｌ．Ｖｉｒａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｔｏ  Ｅｎｈａｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１５を参照せよ；この内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。イントロンの非限定的な例には、ＭＶＭ（６７〜９７ｂｐｓ）、Ｆ．ＩＸ短縮イントロン１（３００ｂｐｓ）、βグロビンＳＤ／免疫グロブリン重鎖スプライスアクセプター（２５０ｂｐｓ）、アデノウイルススプライスドナー／免疫グロブリンスプライスアクセプター（５００ｂｐｓ）、ＳＶ４０晩期スプライスドナー／スプライスアクセプター（１９Ｓ／１６Ｓ）（１８０ｂｐｓ）、およびハイブリッドアデノウイルススプライスドナー／ＩｇＧスプライスアクセプター（２３０ｂｐｓ）が挙げられる。
【０１５５】
一実施形態では、イントロンは１００〜５００ヌクレオチドの長さを有し得る。イントロンは、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０または５００の長さを有し得る。プロモーターは、８０−１００、８０−１２０、８０−１４０、８０−１６０、８０−１８０、８０−２００、８０−２５０、８０−３００、８０−３５０、８０−４００、８０−４５０、８０−５００、２００−３００、２００−４００、２００−５００、３００−４００、３００−５００または４００−５００の長さを有し得る。
【０１５６】
一実施形態では、ＡＡＶベクターゲノムは、ＣＭＶまたはＵ６などのプロモーターを含み得るが、これに限定されない。非限定的な例として、本発明のｓｉＲＮＡ分子の核酸配列を含むＡＡＶのプロモーターは、ＣＭＶプロモーターである。別の非限定的な例として、本発明のｓｉＲＮＡ分子の核酸配列を含むＡＡＶのプロモーターは、Ｕ６プロモーターである。
【０１５７】
一実施形態では、ＡＡＶベクターはＣＭＶおよびＵ６プロモーターを含み得る。
一実施形態では、ＡＡＶベクターはＣＢＡプロモーターを含み得る。
細胞への導入−合成ｄｓＲＮＡ
ｓｉＲＮＡ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ二本鎖およびｄｓＲＮＡ）の化学的および生物学的安定性を確実にするために、ｓｉＲＮＡ分子を標的細胞の内部に送達することが重要である。いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物起源の細胞、ヒト起源の細胞、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞、神経幹細胞、および神経前駆細胞を含み得るが、これらに限定されない。
【０１５８】
ｓｉＲＮＡを含む核酸は、正常な生理学的条件下で糖−リン酸骨格上に正味の負電荷を有する。細胞に入るためには、ｓｉＲＮＡ分子は細胞膜の脂質二重層と接触しなければならないが、そのヘッドグループもまた負に帯電している。
【０１５９】
ｓｉＲＮＡ二本鎖は、ｓｉＲＮＡの細胞取り込みを促進するためにパッケージ粒子のように細胞膜を横切ることを可能にする担体と複合化することができる。パッケージ粒子は、リポソーム、ナノ粒子、カチオン性脂質、ポリエチレンイミン誘導体、デンドリマー、カーボンナノチューブ、およびカーボンナノ粒子とデンドリマーとの組み合わせを含み得るが、これらに限定されない。脂質は、カチオン性脂質および／または中性脂質であり得る。ｓｉＲＮＡ分子とカチオン性キャリアとの間に確立された親油性複合体に加えて、ｓｉＲＮＡ分子は、コレステロールなどの疎水性部分にコンジュゲートすることができる（例えば、米国特許公開第２０１１０１１０９３７号；その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。この送達方法は、ｓｉＲＮＡ分子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞取り込みおよびｉｎ  ｖｉｖｏ薬理学的特性を改善する可能性を秘めている。本発明のｓｉＲＮＡ分子は、ＭＰＧ、トランスポータンまたはペネトラチンのような特定のカチオン性細胞浸透性ペプチド（ＣＰＰ）と共有結合または非共有結合されていてもよい（例えば、米国特許公開第２０１１００８６４２５号；その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１６０】
細胞への導入−ＡＡＶベクター
本発明のｓｉＲＮＡ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ二本鎖）は、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）などを含むがこれに限定されない様々なアプローチのいずれかを用いて細胞に導入することができる。これらのウイルスベクターは、容易にトランスフェクションすることができない細胞へのｓｉＲＮＡ分子の進入を容易にするように操作され最適化される。また、いくつかの合成ウイルスベクターは、ｓｈＲＮＡを細胞ゲノムに組み込み、安定したｓｉＲＮＡ発現および標的遺伝子の長期ノックダウンをもたらす能力を有する。このようにして、ウイルスベクターは特異的投与のための媒体として設計され、そのようなウイルスベクターは野生型ウイルスに見られる有害な複製および／または組み込みの特徴を欠いている。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ分子は、親油性担体と、本発明のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含むベクター、例えばＡＶＶベクターとを含む組成物に細胞を接触させることによって、細胞に導入される。他の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、細胞内で転写されるとｓｉＲＮＡ分子を産生することができる核酸配列を含むベクター、例えばＡＡＶベクターで細胞をトランスフェクトするかまたは感染させることによって細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、細胞内で転写されるとｓｉＲＮＡ分子を産生することができる核酸配列を含むベクター、例えばＡＡＶベクターを細胞に注入することによって細胞に導入される。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、トランスフェクションの前に、本発明のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含むベクター、例えばＡＡＶベクターを細胞にトランスフェクトすることができる。
【０１６３】
他の実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含むベクター、例えばＡＡＶベクターは、エレクトロポレーションによって細胞に送達され得る（例えば、米国特許公開第２００５００１４２６４号；その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１６４】
本明細書に記載のｓｉＲＮＡ分子の核酸配列を含むベクター、例えばＡＡＶベクターを導入するための他の方法は、米国特許公開第２０１２０２６４８０７号に記載されているような光化学的インターナリゼーションを含むことができる；その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の製剤は、本明細書に記載のｓｉＲＮＡ分子
をコードする核酸配列を含む少なくとも１つのベクター、例えばＡＡＶベクターを含むことができる。一実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、１つの標的部位でＳＯＤ１遺伝子を標的とすることができる。別の実施形態では、製剤は、複数のベクター、例えばＡＡＶベクターを含み、各ベクターは異なる標的部位でＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む。ＳＯＤ１は、２、３、４、５または５以上の部位で標的とされ得る。
【０１６６】
一実施形態では、以下に限定されるものではないが、ヒト、イヌ、マウス、ラットまたはサルなどの任意の関連種に由来するベクター、例えばＡＡＶベクターを細胞に導入することができる。
【０１６７】
一実施形態において、ベクター、例えばＡＡＶベクターは、治療される疾患に関連する細胞に導入され得る。非限定的な例として、その疾患はＡＬＳであり、標的細胞は運動ニューロンおよび星状細胞である。
【０１６８】
一実施形態では、ベクター、例えばＡＡＶベクターは、標的配列の高レベルの内因性発現を有する細胞に導入することができる。
別の実施形態では、ベクター、例えばＡＡＶベクターは、標的配列の低レベルの内在性発現を有する細胞に導入することができる。
【０１６９】
一実施形態では、その細胞は、ＡＡＶ形質導入の高い効率を有するものであってよい。
医薬組成物および製剤
医薬組成物（ｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含むベクター、例えばＡＡＶベクター）に加えて、本明細書はヒトへの投与に適した医薬組成物を提供しており、そのような組成物が一般に他の動物、例えばヒト以外の動物、例えば非ヒト哺乳動物、への投与に適していることは、当業者には理解されよう。医薬組成物を種々の動物への投与に適したものにするために、ヒトへの投与に適した医薬組成物の改変はよく理解されており、通常の熟練した獣医学の薬理学者は、もし実験を行なうとすれば、単に通常の実験でこのような改変を設計および／または実施することができる。当該医薬組成物の投与が企図される対象には、ヒトおよび／または他の霊長類；ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウスおよび／またはラットのような商業的に関連する哺乳動物を含む哺乳類；および／または家禽、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、および／またはシチメンチョウのような商業的に関連する鳥類を含むが、それらに限定されない。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、組成物は、ヒト、ヒトの患者、または対象に投与される。本開示の目的のために、語句「活性成分」は、一般に、合成ｓｉＲＮＡ二本鎖、ｓｉＲＮＡ二本鎖をコードするベクター（例えばＡＡＶベクター）、または、本明細書に記載のベクターによって送達されるｓｉＲＮＡ分子のいずれかを指す。
【０１７１】
本明細書に記載された医薬組成物の製剤は、薬理学の分野において既知または今後開発される任意の方法によって調製することができる。一般に、そのような調製方法は、活性成分を賦形剤および／または１つまたはそれ以上の他の補助成分と会合させる工程を包含し、必要であればおよび／または望ましい場合には、産物を所望の単回投与単位または複数回投与単位に、分割し、成形し、および／または包装する工程をも包含する。
【０１７２】
本発明による医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容される賦形剤および／または任意の追加の成分の相対量は、処置される対象の同一性、サイズおよび／または状態に依存して変化し、さらに、組成物が投与されるルートに依存して変化する。
【０１７３】
本発明のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含むベクター、例えばＡＡＶベクター
は、以下を行うために、１種以上の賦形剤を用いて製剤化することができる：（１）安定性を高める；（２）細胞トランスフェクションまたは形質導入を増加させる；（３）持続放出または遅延放出を可能にする；または（４）生体内分布を変える（例えば、ウイルスベクターを特定の組織または脳および運動ニューロンなどの細胞型に標的化する）。
【０１７４】
本発明の製剤には、限定することなく、生理食塩水、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コア−シェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、ウイルスベクターでトランスフェクションした細胞（例えば、対象への移植のための細胞）、ナノ粒子模倣物、およびそれらの組み合わせを含めてよい。さらに、本発明のウイルスベクターは、自己組織化核酸ナノ粒子を用いて製剤化してよい。
【０１７５】
本明細書に記載された医薬組成物の製剤は、薬理学の分野において既知または今後開発される任意の方法によって調製することができる。一般に、そのような調製方法は、有効成分を賦形剤および／または１つまたはそれ以上の他の補助成分と会合させる工程を含む。
【０１７６】
本開示による医薬組成物は、バルクで、単一の単位用量として、および／または複数の単一単位用量として調製、包装および／または販売されてよい。本明細書では、「単位用量」という語は、所定量の活性成分からなる医薬組成物の個別の量を指す。活性成分の量は、一般的に、対象に投与されるであろう活性成分の用量および／またはこのような用量の特定のニーズを満たす一部分（例えば、そのような用量の半分または三分の一）に等しい。
【０１７７】
本開示による医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容される賦形剤および／または任意の追加の成分の相対量は、処置される対象の同一性、サイズおよび／または状態に依存して変化し、さらに組成物が投与されるルートに依存して変化する。例えば、組成物は、０．１％〜９９％（ｗ／ｗ）の有効成分からなっていてよい。一例として、組成物は、０．１％〜１００％（例えば、０．５〜５０％、１〜３０％、５〜８０％、少なくとも８０％（ｗ／ｗ））の活性成分からなっていてよい。
【０１７８】
いくつかの実施形態において、薬学的に許容される賦形剤は、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％純粋であってよい。いくつかの実施形態において、賦形剤は、ヒトおよび獣医学のための使用が承認されている。いくつかの実施形態において、賦形剤は、米国食品医薬品局によって承認されている。いくつかの実施形態において、賦形剤は、医薬グレードのものである。いくつかの実施形態において、賦形剤は、米国薬局方（ＵＳＰ）、欧州薬局方（ＥＰ）、英国薬局方および／または国際薬局方の基準を満たす。
【０１７９】
本明細書では、賦形剤は、所望の特定の剤形に適したものである限り、任意のおよび全ての溶媒、分散媒、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散または懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、防腐剤などを含むが、これらに限定されない。医薬組成物を調製するための様々な賦形剤および組成物を調製するための技術は、当該分野で公知である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，２００６を参照せよ；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。任意の従来の賦形剤媒体が、任意の望ましくない生物学的効果を生じさせることによって、あるいは医薬組成物の他の成分（群）と有害に相互作用することによって、ある物質またはその誘導体と不適合でない限りにおいては、従来の賦形剤媒体の使用は、本開示の範囲内で考えられてよい。
【０１８０】
希釈剤の例には、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウム乳糖、ショ糖、セルロース、微晶質セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、コーンスターチ、粉末糖等、および／またはそれらの組み合わせが含まれるが、それらに限定されない。
【０１８１】
いくつかの実施形態において、製剤は、少なくとも１つの不活性成分を含み得る。本明細書中では、「不活性成分」という語は、製剤に含まれる１つ以上の不活性薬剤を指す。いくつかの実施形態では、本発明の製剤において使用され得る不活性成分の全てまたは一部は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認されているか、あるいは承認されていない。
【０１８２】
本発明のｓｉＲＮＡ分子の核酸配列を含むベクターの製剤は、カチオンまたはアニオンを含むことができる。一実施形態では、製剤は、限定されないが、Ｚｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｕ２＋、Ｍｇ＋およびそれらの組み合わせなどの金属カチオンを含む。
【０１８３】
本明細書中で使用される場合、「薬学的に許容される塩」は、親化合物が既存の酸または塩基部分をその塩形態に変換することによって修飾される開示化合物の誘導体を指す（例えば、遊離塩基基を適切な有機酸と反応させる）。薬学的に許容される塩の例としては、アミンのような塩基性残基の無機または有機酸塩；カルボン酸などの酸性残基のアルカリまたは有機塩；等が含まれるが、それらに限定されるものではない。代表的な酸付加塩の例としては、酢酸塩、酢酸、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属塩の例には、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなど、ならびに非毒性のアンモニウム、第四級アンモニウム、およびアミンカチオンがあり、それらの例には、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどが挙げられるが、これらに限定されない。本開示の薬学的に許容される塩には、例えば非毒性無機または有機酸から形成される親化合物の従来の非毒性塩が含まれる。本開示の薬学的に許容される塩は、塩基性または酸性部分を含む親化合物から、従来の化学的方法によって合成することができる。一般に、このような塩は、これらの化合物の遊離酸または塩基形態を、適切な塩基または酸の化学量論量と、水中または有機溶媒中で、またはその２種の混合物中で反応させることによって調製することができる。一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノールまたはアセトニトリルのような非水性媒体が好ましい。適切な塩のリストは、次を参照のこと。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．１４１８，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｕｓｅ，Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ  ａｎｄ  Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００８，
ａｎｄ  Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，６６，１−１９（１９７７）；これらの各々の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１８４】
本明細書で使用する用語「薬学的に許容される溶媒和物」は、適切な溶媒の分子が結晶格子に組み込まれている本発明の化合物を意味する。適切な溶媒は、投与される投与量で生理学的に許容される。例えば、溶媒和物は、有機溶媒、水、またはそれらの混合物を含む溶液からの結晶化、再結晶化、または沈殿によって調製することができる。適切な溶媒の例は、エタノール、水（例えば、一水和物、二水和物および三水和物）、Ｎメチルピロリドン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン（ＤＭＥＵ）、１，３−ジメチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２−（１Ｈ）−ピリミジノン（ＤＭＰＵ）、アセトニトリル（ＡＣＮ）、プロピレングリコール、酢酸エチル、ベンジルアルコール、２−ピロリドン、安息香酸ベンジル等が挙げられる。水が溶媒である場合、溶媒和物は「水和物」と呼ばれる。
【０１８５】
本発明によれば、本発明のｓｉＲＮＡ分子の核酸配列を含むベクター、例えばＡＡＶベクターは、ＣＮＳ送達のために製剤化することができる。脳血液関門を通過する薬剤を使用することができる。例えば、脳血液関門内皮にｓｉＲＮＡ分子を標的とすることができるいくつかの細胞浸透性ペプチドを用いて、ＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二本鎖を製剤化することができる（例えば、Ｍａｔｈｕｐａｌａ，  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ
Ｔｈｅｒ  Ｐａｔ．，２００９，１９，１３７−１４０；その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１８６】
投与
本発明のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含むベクター、例えばＡＡＶベクターは、治療上有効な結果をもたらす任意の経路によって投与することができる。これらの経路には、腸内（腸内に）、胃腸内、硬膜外（硬膜内に）、経口（口を介して）、経皮、経皮、大脳内（大脳内）、脳室内（脳室に入る）、皮膚上への塗布（皮膚への塗布）、皮内（皮膚自体の中）、皮下（皮膚の下）、経鼻投与（鼻を通して）、静脈内（静脈内に）、静脈内ボーラス、静脈点滴（静脈内に）、動脈（動脈内）、筋肉内（筋肉内に）、心臓内（心臓内に）、骨髄内注入（骨髄内に）、くも膜下腔内（脊柱管内）、腹腔内、（腹腔への輸液または注射）、膀胱内注入、硝子体内、（眼を通して）、海綿内注入（病的腔に）、腔内（陰茎の基部に）、膣内投与、子宮内、追加の羊水投与、経皮（全身分布のために無傷の皮膚を通した拡散）、経粘膜（粘膜を通した拡散）、経膣、吹送（吸入）、舌下、唇下、浣腸、点眼（結膜上）、耳下腺内、耳介（耳の中または耳を介して）、口腔（頬に向かって）、結膜、皮膚、歯（１つの歯または複数）、電気浸透、子宮頸部、内皮内、気管内、体外、血液透析、浸潤、間質性、腹腔内、羊水内、関節内、胆道内、気管支内、気管内、軟骨内（軟骨内）、仙骨内（仙骨内）、大槽内（大槽内の小脳髄腔内）、角膜内（角膜内）、歯内膜内、冠状動脈（冠動脈内）、海綿体内（陰茎の海綿体の膨張可能な空間内）、椎間板内（椎間板内）、導管内（腺管内）、十二指腸内（十二指腸内）、硬膜内（硬膜内またはその下）、表皮内（表皮内に）、食道内（食道に）、胃内（胃の内部に）、歯内組織内（歯肉内）、腹腔内（小腸の遠位部分内）、病巣内（局所の病変内または直接の導入）、管腔内（管の内腔内）、胸腔内（リンパ内）、髄内（骨の骨髄腔内）、髄膜内（髄膜内）、眼内（眼内）、卵巣内（卵巣内）、心膜内（心膜内）、胸膜内（胸膜内）、前立腺内（前立腺内）、肺内（肺または気管支内）、内腔（鼻腔または眼窩洞内）、脊髄内（脊柱内）、滑膜内（関節の滑膜腔内）、肩甲骨内（腱内）、精巣内（睾丸内）、髄腔内（脳脊髄軸の任意のレベルの脳脊髄液内）、胸腔内（胸腔内）、管腔内（器官の細管内）、腫瘍内（腫瘍内）、中耳内（オーロス媒体内）、血管内（血管または血管内）、心室内（心室内）、イオントフォレシス（可溶性塩のイオンが身体の組織に移動する電流）、
灌漑（開いた創傷または体腔を浸したり洗い流す）、喉頭（喉頭に直接）、経鼻胃（鼻から胃の中に）、閉塞性包帯技術（局所経路投与後その領域を閉塞する包帯によって覆われる）、眼科（外眼に）、口腔咽頭（口および咽頭に直接）、非経口、経皮、関節周囲、硬膜外、回神経、歯周病、直腸、呼吸器（局所的または全身的効果のために経口または鼻吸入によって気道内に）、眼球後ろ（眼窩の後ろ、または眼球の後ろ）軟組織、くも膜下腔、結膜下、粘膜下層、局所、経胎盤（胎盤を通してまたは胎盤を横切って）、経気管（気管の壁を通して）、胸腔鏡（横隔膜腔を横切って、またはそれを通って）、尿管（尿管内）、尿道（尿道内）、膣、尾骨ブロック、診断、神経ブロック、胆道灌流、心臓灌流、フォトフェレーシスまたは脊髄が含まれるがこれらに限定されない。
【０１８７】
特定の実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含むベクター、例えばＡＡＶベクターなどのベクター組成物は、ベクターまたはｓｉＲＮＡ分子が中枢神経系に入り、運動ニューロンに浸透するように投与され得る。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含むベクター、例えばＡＡＶベクターは、筋肉注射によって投与することができる。Ｒｉｚｖａｎｏｖらは、変異型ヒトＳＯＤ１  ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子が、ＳＯＤ１Ｇ９３ＡトランスジェニックＡＬＳマウスにおいて、坐骨神経によって取り込まれ、逆行的に運動ニューロンの周辺核に輸送され、且つ変異型ＳＯＤ１  ｍＲＮＡを阻害することを初めて実証した（Ｒｉｚｖａｎｏｖ  ＡＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，２００９，１９５（１），１−４；その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。もう一つの研究はまた、変異体型ＳＯＤ１遺伝子に対する小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を発現するＡＡＶの筋肉伝達が、筋肉および神経支配する運動ニューロンにおいて、有意な変異型ＳＯＤ１ノックダウンの結果をもたらすことを実証した（Ｔｏｗｎｅ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．，２０１１；１９（２）：２７４−２８３；その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ二本鎖を発現するＡＡＶベクターは、末梢注射および／または鼻腔内投与によって対象に投与することができる。ｓｉＲＮＡ二本鎖のためのＡＡＶベクターの末梢投与が中枢神経系、例えば運動ニューロンに輸送され得ることが当該分野で開示された（例えば、米国特許出願公開第２０１００２４０７３９号；および第２０１００１３０５９４号；これらの各々の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１９０】
他の実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む少なくとも１つのベクター、例えばＡＡＶベクターを含む組成物は、頭蓋内投与によって対象に投与され得る（例えば、米国特許第８，１１９，６１１号参照；その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１９１】
本発明のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含むベクター、例えばＡＡＶベクターは、液体溶液または懸濁液として、溶液または溶液中に混濁に適した個体形態として、任意の適切な形態で投与することができる。ｓｉＲＮＡ二本鎖は、任意の適切な薬学的に許容される賦形剤と共に製剤化され得る。
【０１９２】
本発明のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含むベクター、例えばＡＡＶベクターは、「治療的に有効な」量、すなわち、関連する少なくとも１つの症状を緩和および／または予防するために、または疾患の状態の改善を提供するために十分な量で投与することができる。
【０１９３】
一実施形態では、ＡＬＳを有する対象の機能および／または生存を改善するために、ベ
クター、例えばＡＡＶベクターを治療有効量でＣＮＳに投与することができる。非限定的な例として、ベクターは、くも膜下腔内に投与され得る。
【０１９４】
一実施形態では、例えば、ＡＡＶベクターなどのベクターを、ｓｉＲＮＡ二本鎖またはｄｓＲＮＡが脊髄および／または脳幹内の運動ニューロンおよび星状細胞を標的とするために、治療上有効な量で、対象（例えば、髄腔内投与によって対象のＣＮＳ）に投与し得る。非限定的な例として、ｓｉＲＮＡ二本鎖またはｄｓＲＮＡは、ＳＯＤ１タンパク質またはｍＲＮＡの発現を減少させることができる。別の非限定的な例として、ｓｉＲＮＡ二本鎖またはｄｓＲＮＡは、ＳＯＤ１を抑制し、ＳＯＤ１媒介毒性を減少させることができる。ＳＯＤ１タンパク質および／またはｍＲＮＡならびにＳＯＤ１媒介性毒性の低下は、ほとんど炎症が増強されずに達成され得る。
【０１９５】
一実施形態では、ベクター、例えばＡＡＶベクターは、対象の機能低下を遅らせるために治療有効量で対象（例えば、対象のＣＮＳ）に投与され得る（例えば、ＡＬＳ機能評価尺度（ＡＬＳＦＲＳ）などの既知の評価方法を使用して決定される）および／または対象の人工呼吸器非依存生存期間を延長する（例えば、死亡率の減少または呼吸支援の必要性）。非限定的な例として、ベクターは、くも膜下腔内に投与され得る。
【０１９６】
一実施形態では、ベクター、例えばＡＡＶベクターは、脊髄運動ニューロンおよび／または星状細胞を形質導入するために、治療有効量を大槽に投与され得る。非限定的な例として、ベクターは、くも膜下腔内に投与され得る。
【０１９７】
一実施形態において、ベクター、例えばＡＡＶベクターは、脊髄運動ニューロンおよび／または星状細胞を形質導入するために、治療有効量を、髄腔内注入を用いて投与され得る。非限定的な例として、ベクターは、くも膜下腔内に投与され得る。
【０１９８】
一実施形態では、調節ポリヌクレオチドを含むベクター、例えばＡＡＶベクターを製剤化することができる。非限定的な例として、製剤の塩基性および／または浸透圧は、中枢神経系または中枢神経系の領域または成分における最適な薬物分布を確実にするように最適化され得る。
【０１９９】
一実施形態では、調節ポリヌクレオチドを含むベクター、例えばＡＡＶベクターは、単一の経路投与によって対象に投与され得る。
一実施形態では、調節ポリヌクレオチドを含むベクター、例えばＡＡＶベクターは、多部位投与経路を介して対象に投与され得る。対象は、２、３、４、５またはそれ以上の部位に調節ポリヌクレオチドを含むベクター、例えばＡＡＶベクターを投与され得る。
【０２００】
一実施形態では、対象に、ボーラス注入を用いて本発明に記載の調節ポリヌクレオチドを含むベクター、例えばＡＡＶベクターを投与することができる。
一実施形態では、対象は、数分、数時間または数日間にわたる持続的投与を用いて本発明に記載の調節ポリヌクレオチドを含むベクター、例えばＡＡＶベクターを投与され得る。注入速度は、対象、分布、製剤または別の送達パラメータに応じて変化され得る。
【０２０１】
一実施形態では、複数部位への投与のために、カテーテルを脊椎の２つ以上の部位に配置され得る。調節ポリヌクレオチドを含むベクター、例えばＡＡＶベクターは、連続および／またはボーラス注入で投与され得る。投与の各部位は異なる投薬レジメンであってもよく、または同じ投薬レジメンを投与部位ごとに使用してよい。非限定的な例として、投与部位は、頚部および腰部領域にあり得る。別の非限定的な例として、投与部位は子宮頸部領域にあり得る。別の非限定的な例として、投与部位は、腰部領域にあり得る。
【０２０２】
一実施形態では、対象は、本明細書に記載の調節ポリヌクレオチドを含むベクター、例えばＡＡＶベクターの投与前に、脊髄の解剖学的構造および病理について分析され得る。非限定的な例として、脊柱側弯症を有する対象は、脊柱側弯症を伴わない対象と比較して、異なる投薬レジメンおよび／またはカテーテルの位置を有し得る。
【０２０３】
一実施形態では、調節ポリヌクレオチドを含むベクター、例えばＡＡＶベクターの投与中の対象の脊椎の向きは、地面に対して垂直であり得る。
別の実施形態では、調節ポリヌクレオチドを含むベクター、例えばＡＡＶベクターの投与中の対象の脊椎の向きは、地面に対して水平であり得る。
【０２０４】
一実施形態では、対象の脊椎は、調節ポリヌクレオチドを含むベクター、例えばＡＡＶベクターの投与の間に地面と比較してある角度であり得る。地面と比較し、対象の脊椎の角度は少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０または１８０度であり得る。
【０２０５】
一実施形態において、投与方法および持続時間は、脊髄における広範な形質導入を提供するように選択される。非限定的な例として、髄腔内投与は、脊髄の吻側−尾側の長さに沿って広い形質導入を提供するために使用される。別の非限定的な例として、複数部位注入は、脊髄の吻側−尾側の長さに沿ってより均一な形質導入を提供する。さらに別の非限定的な例として、長期の注入により、脊髄の吻側−尾側の長さに沿ってより均一な形質導入を提供する。
【０２０６】
投薬（Ｄｏｓｉｎｇ）
本発明の医薬組成物は、ＳＯＤ１関連障害の低減、予防および／または治療に有効な任意の量を用いて対象に投与することができる（例えば、ＡＬＳ）。正確な必要量は、対象の動物種、年齢、および全体的な状態、疾患の重篤度、特定の組成物、その投与様式、その活性様式などに依存して、対象によって異なるであろう。
【０２０７】
本発明の組成物は、典型的には、投与の容易さおよび投与量の均一性のために、単位剤形で製剤化される。しかし、本発明の組成物の１日総使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決定され得ることが理解されるであろう。任意の特定の患者に対する特異的治療有効性は、治療される障害および障害の重症度を含む様々な要因に依存する；使用される特定の化合物の活性；使用される特定の組成物；患者の年齢、体重、全般的な健康状態、性別および食事；投与時間、投与経路、および使用されるｓｉＲＮＡ二本鎖の排泄速度；治療の持続時間；使用される特定の化合物と組み合わせてまたは同時に使用される薬物；および医学分野でよく知られている同様の要因を含む。
【０２０８】
一実施形態では、対象の年齢および性別を用いて、本発明の組成物の用量を決定することができる。非限定的な例として、高齢対象は、若年対象と比較して組成物のより多くの投与を受け得る（例えば、５−１０％、１０−２０％、１５−３０％、２０−５０％、２５−５０％または少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９０％以上）。別の非限定的な例として、若年対象は、高齢対象と比較して組成物のより多くの投与量を受け得る（例えば、５〜１０％、１０〜２０％、１５〜３０％、２０〜５０％、２５〜５０％または少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９０％以上）。さらに別の非限定的な例として、女性対象は、男性対象と比較してより多い用量の組成物を受け得る（例えば、５〜１０％、１０〜２０％、１５〜３０％、２０〜５０％、２５〜５０％または少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９０％以上）。さらに別の非限定的な例として、男性対象は、女性対象と
比較してより多い用量の組成物を受け得る（例えば、５〜１０％、１０〜２０％、１５〜３０％、２０〜５０％、２５〜５０％または少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９０％以上）。
【０２０９】
いくつかの特定の実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ二本鎖を投与するためのＡＡＶベクターの用量は、疾患状態、対象および治療戦略に応じて適合させることができる。
一実施形態では、本発明による組成物の細胞への投与は、ＶＧをウイルスゲノム、ＶＧ／ｍＬを組成物濃度、ｍＬ／時間を延長された投与の速度とするとき、［ＶＧ／時間＝ｍＬ／時間＊ＶＧ／ｍＬ］によって定義される送達速度から成る。
【０２１０】
一実施形態では、本発明による組成物の細胞への送達は、対象あたりの総濃度が約１ｘ１０６ＶＧから約１ｘ１０１６ＶＧの間であり得る。いくつかの実施形態では、送達は、約１ｘ１０６、２ｘ１０６、３ｘ１０６、４ｘ１０６、５ｘ１０６、６ｘ１０６、７ｘ１０６、８ｘ１０６、９ｘ１０６、１ｘ１０７、２ｘ１０７、３ｘ１０７、４ｘ１０７、５ｘ１０７、６ｘ１０７、７ｘ１０７、８ｘ１０７、９ｘ１０７、１ｘ１０８、２ｘ１０８、３ｘ１０８、４ｘ１０８、５ｘ１０８、６ｘ１０８、７ｘ１０８、８ｘ１０８、９ｘ１０８、１ｘ１０９、２ｘ１０９、３ｘ１０９、４ｘ１０９、５ｘ１０９、６ｘ１０９、７ｘ１０９、８ｘ１０９、９ｘ１０９、１ｘ１０１０、２ｘ１０１０、３ｘ１０１０、４ｘ１０１０、５ｘ１０１０、６ｘ１０１０、７ｘ１０１０、８ｘ１０１０、９ｘ１０１０、１ｘ１０１１、２ｘ１０１１、２．１ｘ１０１１、２．２ｘ１０１１、２．３ｘ１０１１、２．４ｘ１０１１、２．５ｘ１０１１、２．６ｘ１０１１、２．７ｘ１０１１、２．８ｘ１０１１、２．９ｘ１０１１、３ｘ１０１１、４ｘ１０１１、５ｘ１０１１、６ｘ１０１１、７ｘ１０１１、７．１ｘ１０１１、７．２ｘ１０１１、７．３ｘ１０１１、７．４ｘ１０１１、７．５ｘ１０１１、７．６ｘ１０１１、７．７ｘ１０１１、７．８ｘ１０１１、７．９ｘ１０１１、８ｘ１０１１、９ｘ１０１１、１ｘ１０１２、１．１ｘ１０１２、１．２ｘ１０１２、１．３ｘ１０１２、１．４ｘ１０１２、１．５ｘ１０１２、１．６ｘ１０１２、１．７ｘ１０１２、１．８ｘ１０１２、１．９ｘ１０１２、２ｘ１０１２、３ｘ１０１２、４ｘ１０１２、４．１ｘ１０１２、４．２ｘ１０１２、４．３ｘ１０１２、４．４ｘ１０１２、４．５ｘ１０１２、４．６ｘ１０１２、４．７ｘ１０１２、４．８ｘ１０１２、４．９ｘ１０１２、５ｘ１０１２、６ｘ１０１２、７ｘ１０１２、８ｘ１０１２、８．１ｘ１０１２、８．２ｘ１０１２、８．３ｘ１０１２、８．４ｘ１０１２、８．５ｘ１０１２、８．６ｘ１０１２、８．７ｘ１０１２、８．８  ｘ１０１２、８．９ｘ１０１２、９ｘ１０１２、１ｘ１０１３、２ｘ１０１３、３ｘ１０１３、４ｘ１０１３、５ｘ１０１３、６ｘ１０１３、６．７ｘ１０１３、７ｘ１０１３、８ｘ１０１３、９ｘ１０１３、１ｘ１０１４、２ｘ１０１４、３ｘ１０１４、４ｘ１０１４、５ｘ１０１４、６ｘ１０１４、７ｘ１０１４、８ｘ１０１４、９ｘ１０１４、１ｘ１０１５、２ｘ１０１５、３ｘ１０１５、４ｘ１０１５、５ｘ１０１５、６ｘ１０１５、７ｘ１０１５、８ｘ１０１５、９ｘ１０１５、または１ｘ１０１６ＶＧ／対象の組成物濃度であり得る。
【０２１１】
一実施形態では、本発明による組成物の細胞への送達は、対象あたりの総濃度が約１ｘ１０６ＶＧ／ｋｇから１ｘ１０１６ＶＧ／ｋｇの間である。いくつかの実施形態では、投与は、１ｘ１０６、２ｘ１０６、３ｘ１０６、４ｘ１０６、５ｘ１０６、６ｘ１０６、７ｘ１０６、８ｘ１０６、９ｘ１０６、１ｘ１０７、２ｘ１０７、３ｘ１０７、４ｘ１０７、５ｘ１０７、６ｘ１０７、７ｘ１０７、８ｘ１０７、９ｘ１０７、１ｘ１０８、２ｘ１０８、３ｘ１０８、４ｘ１０８、５ｘ１０８、６ｘ１０８、７ｘ１０８、８ｘ１０８、９ｘ１０８、１ｘ１０９、２ｘ１０９、３ｘ１０９、４ｘ１０９、５ｘ１０９、６ｘ１０９、７ｘ１０９、８ｘ１０９、９ｘ１０９、１ｘ１０１０、２ｘ１０１０、３ｘ１０１０、４ｘ１０１０、５ｘ１０１０、６ｘ１０１０、７ｘ１０１０、８ｘ１０１０、９ｘ１０１０、１ｘ１０１１、２ｘ１０１１、２．１ｘ１０１１、２．２ｘ１０１１、２．３ｘ１０
１１、２．４ｘ１０１１、２．５ｘ１０１１、２．６ｘ１０１１、２．７ｘ１０１１、２．８ｘ１０１１、２．９ｘ１０１１、３ｘ１０１１、４ｘ１０１１、５ｘ１０１１、６ｘ１０１１、７ｘ１０１１、７．１ｘ１０１１、７．２ｘ１０１１、７．３ｘ１０１１、７．４ｘ１０１１、７．５ｘ１０１１、７．６ｘ１０１１、７．７ｘ１０１１、７．８ｘ１０１１、７．９ｘ１０１１、８ｘ１０１１、９ｘ１０１１、１ｘ１０１２、１．１ｘ１０１２、１．２ｘ１０１２、１．３ｘ１０１２、１．４ｘ１０１２、１．５ｘ１０１２、１．６ｘ１０１２、１．７ｘ１０１２、１．８ｘ１０１２、１．９ｘ１０１２、２ｘ１０１２、３ｘ１０１２、４ｘ１０１２、４．１ｘ１０１２、４．２ｘ１０１２、４．３ｘ１０１２、４．４ｘ１０１２、４．５ｘ１０１２、４．６ｘ１０１２、４．７ｘ１０１２、４．８ｘ１０１２、４．９ｘ１０１２、５ｘ１０１２、６ｘ１０１２、７ｘ１０１２、８ｘ１０１２、８．１ｘ１０１２、８．２ｘ１０１２、８．３ｘ１０１２、８．４ｘ１０１２、８．５ｘ１０１２、８．６ｘ１０１２、８．７ｘ１０１２、８．８  ｘ１０１２、８．９ｘ１０１２、９ｘ１０１２、１ｘ１０１３、２ｘ１０１３、３ｘ１０１３、４ｘ１０１３、５ｘ１０１３、６ｘ１０１３、６．７ｘ１０１３、７ｘ１０１３、８ｘ１０１３、９ｘ１０１３、１ｘ１０１４、２ｘ１０１４、３ｘ１０１４、４ｘ１０１４、５ｘ１０１４、６ｘ１０１４、７ｘ１０１４、８ｘ１０１４、９ｘ１０１４、１ｘ１０１５、２ｘ１０１５、３ｘ１０１５、４ｘ１０１５、５ｘ１０１５、６ｘ１０１５、７ｘ１０１５、８ｘ１０１５、９ｘ１０１５または１ｘ１０１６ＶＧ／ｋｇの組成物濃度であり得る。
【０２１２】
一実施形態では、１用量あたり約１０５から１０６ウイルスゲノム（単位）を投与することができる。
一実施形態では、本発明による組成物の細胞への投与は、約１ｘ１０６ＶＧ／ｍＬから１ｘ１０１６ＶＧ／ｍＬである。いくつかの実施形態において、投与は、約１ｘ１０６、２ｘ１０６、３ｘ１０６、４ｘ１０６、５ｘ１０６、６ｘ１０６、７ｘ１０６、８ｘ１０６、９ｘ１０６、１ｘ１０７、２ｘ１０７、３ｘ１０７、４ｘ１０７、５ｘ１０７、６ｘ１０７、７ｘ１０７、８ｘ１０７、９ｘ１０７、１ｘ１０８、２ｘ１０８、３ｘ１０８、４ｘ１０８、５ｘ１０８、６ｘ１０８、７ｘ１０８、８ｘ１０８、９ｘ１０８、１ｘ１０９、２ｘ１０９、３ｘ１０９、４ｘ１０９、５ｘ１０９、６ｘ１０９、７ｘ１０９、８ｘ１０９、９ｘ１０９、１ｘ１０１０、２ｘ１０１０、３ｘ１０１０、４ｘ１０１０、５ｘ１０１０、６ｘ１０１０、７ｘ１０１０、８ｘ１０１０、９ｘ１０１０、１ｘ１０１１、２ｘ１０１１、３ｘ１０１１、４ｘ１０１１、５ｘ１０１１、６ｘ１０１１、７ｘ１０１１、８ｘ１０１１、９ｘ１０１１、１ｘ１０１２、１．１ｘ１０１２、１．２ｘ１０１２、１．３ｘ１０１２、１．４ｘ１０１２、１．５ｘ１０１２、１．６ｘ１０１２、１．７ｘ１０１２、１．８ｘ１０１２、１．９ｘ１０１２、２ｘ１０１２、２．１ｘ１０１２、２．２ｘ１０１２、２．３ｘ１０１２、２．４ｘ１０１２、２．５ｘ１０１２、２．６ｘ１０１２、２．７ｘ１０１２、２．８ｘ１０１２、２．９ｘ１０１２、３ｘ１０１２、３．１ｘ１０１２、３．２ｘ１０１２、３．３ｘ１０１２、３．４ｘ１０１２、３．５ｘ１０１２、３．６ｘ１０１２、３．７ｘ１０１２、３．８ｘ１０１２、３．９ｘ１０１２、４ｘ１０１２、４．１ｘ１０１２、４．２ｘ１０１２、４．３ｘ１０１２、４．４ｘ１０１２、４．５ｘ１０１２、４．６ｘ１０１２、４．７ｘ１０１２、４．８ｘ１０１２、４．９ｘ１０１２、５ｘ１０１２、６ｘ１０１２、７ｘ１０１２、８ｘ１０１２、９ｘ１０１２、１ｘ１０１３、２ｘ１０１３、３ｘ１０１３、４ｘ１０１３、５ｘ１０１３、６ｘ１０１３、６．７ｘ１０１３、７ｘ１０１３、８ｘ１０１３、９ｘ１０１３、１ｘ１０１４、２ｘ１０１４、３ｘ１０１４、４ｘ１０１４、５ｘ１０１４、６ｘ１０１４、７ｘ１０１４、８ｘ１０１４、９ｘ１０１４、１ｘ１０１５、２ｘ１０１５、３ｘ１０１５、４ｘ１０１５、５ｘ１０１５、６ｘ１０１５、７ｘ１０１５、８ｘ１０１５、９ｘ１０１５、または１ｘ１０１６ＶＧ／ｍＬの組成物濃度であり得る。
【０２１３】
特定の実施形態では、所望のｓｉＲＮＡ二本鎖用量は、複数の投与を用いて投与され得る（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４またはそ
れ以上の投与）。複数の投与を行なう場合、本明細書に記載されているような分割投与計画を使用することができる。本明細書で使用される「分割投与量」は、単回用量または一日総用量の２つ以上の用量への分割、例えば単回用量の２回以上の投与である。本明細書で使用される「単一単位用量」は、１回分用量／一回／１つの経路／１つの接触点で投与される任意の調節ポリヌクレオチド治療剤の用量、すなわち単回投与である。本明細書中で使用される場合、「１日の総投与量」は、２４時間に与えられる、または処方される量である。それは単一単位用量として投与することができる。一実施形態では、本発明の調節性ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、分割用量で対象に投与される。それらは、緩衝液中でのみ、または本明細書に記載の製剤中で製剤化することができる。
【０２１４】
ＡＬＳの治療方法
本発明に示されるのは、本発明のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含むベクター、例えばＡＡＶベクターを細胞に導入する方法であって、該方法は、標的ＳＯＤ１  ｍＲＮＡの分解が起こるのに十分な量の該ベクターのいずれかを前記細胞に導入し、それにより細胞内の標的特異的ＲＮＡｉを活性化することを含む。いくつかの態様において、細胞は、幹細胞、運動ニューロンなどのニューロン、筋細胞、および星状細胞などのグリア細胞であり得る。
【０２１５】
本発明には、治療を必要とする対象における異常なＳＯＤ１機能に関連するＡＬＳを治療するための方法が開示される。該方法は、必要に応じて、本発明のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む少なくともベクター、例えばＡＡＶベクターを含む組成物の治療有効量を対象に投与することを含む。非限定的な例として、ｓｉＲＮＡ分子は、ＡＬＳが治療的に処置されるように、ＳＯＤ１遺伝子発現をサイレンシングさせ、ＳＯＤ１タンパク質産生を阻害し、対象におけるＡＬＳの１つ以上の症状を減少させることができる。
【０２１６】
いくつかの実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含むベクター、例えばＡＡＶベクターを含む組成物は、対象の中枢神経系に投与される。他の実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含むベクター、例えばＡＡＶベクターを含む組成物は、対象の筋肉に投与される。
【０２１７】
特に、本発明のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含むベクター、例えばＡＡＶベクターは、運動ニューロン、星状膠細胞および小膠細胞を含むグリア細胞、および／またはＴ細胞のようなニューロンを囲む他の細胞を含む特定のタイプの標的細胞に投与され得る。ヒトのＡＬＳ患者および動物のＳＯＤ１  ＡＬＳモデルにおける研究は、グリア細胞が運動ニューロンの機能不全および死において初期の影響を与えることを暗示している。周囲の保護グリア細胞中の正常なＳＯＤ１は、変異ＳＯＤ１が運動ニューロンに存在するにもかかわらず、運動ニューロンが死ぬのを防ぐことができる（例えば、Ｐｈｉｌｉｐｓ
ａｎｄ  Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ，  Ｅｘｐ．  Ｎｅｕｒｏｌ．，  ２０１４，  Ｍａｙ  ２２．  ｐｉｉ：  Ｓ００１４−４８８６（１４）００１５７−５によるレビュー；その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０２１８】
いくつかの特定の実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含むベクター、例えばＡＡＶベクターは、ＡＬＳの治療法として使用することができる。
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、ＡＬＳの治療のための単独療法または併用療法として投与される。
【０２１９】
ＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二本鎖をコードするベクター、例えばＡＡＶベクターは、１つ以上の他の治療剤と組み合わせて使用することができる。「〜と組み合わせて」とは、薬剤を同時に投与しなければならないこと、および／または共に投与するように製剤化しなければならないことを暗示することを意図するものではない。尤も、これ
らの投与方法は本開示の範囲内である。組成物は、１つまたはそれ以上の他の所望の治療または医療処置と同時に、その前に、またはその後に投与することができる。一般に、各薬剤は、その薬剤について決定された用量および／または時間スケジュールで投与される。
【０２２０】
本発明のｓｉＲＮＡ分子の核酸配列をコードするベクター、例えばＡＡＶベクターと組み合わせて使用され得る治療剤は、抗酸化剤、抗炎症剤、抗アポトーシス剤、カルシウム調節剤、抗グルタミン酸作動薬、構造タンパク質阻害剤、および金属イオン調節に関与する化合物の、小分子化合物であり得る。
【０２２１】
本明細書に記載されるベクターと組み合わせて使用され得る、ＡＬＳを治療するために試験される化合物としては、限定されるものではないが、以下が含まれる。抗グルタミン酸作動薬：リルゾール、トピラメート、タラパネル、ラモトリギン、デキストロメトルファン、ガバペンチンおよびＡＭＰＡ拮抗薬；抗アポトーシス剤：ミノサイクリン、フェニル酪酸ナトリウムおよびアリモクロモール；抗炎症剤：ガングリオシド、セレコキシブ、シクロスポリン、アザチオプリン、シクロホスファミド、プラズマフォレシス、グラチラマー酢酸塩およびサリドマイド；セフトリアキソン（Ｂｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ，２０１３，８（４））；ベータラクタム抗生物質；プラミペキソール（ドーパミンアゴニスト）（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｌａｔｅｒａｌ  Ｓｃｌｅｒ．，２００８，９（１），５０−５８）；米国特許公開第２００６００７４９９１号のニメスリド；米国特許公開第２０１３０１４３８７３号に開示されているジアゾキシド）；米国特許出願公開第２００８０１６１３７８号で開示されたラゾロン誘導体；酸化ストレス誘発細胞死を阻害するフリーラジカルスカベンジャー、例えばブロモクリプチン（米国特許公開第２０１１０１０５５１７号）；ＰＣＴ特許公開第２０１３１００５７１号で議論されたフェニルカルバメート化合物；例えば、米国特許第６，９３３，３１０号および第８，３９９，５１４号ならびに米国特許公報第２０１１０２３７９０７号および第２０１４００３８９２７号で開示された神経保護化合物；および米国特許公開第２００７０１８５０１２号に教示される糖ペプチド；これらの各々の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２２２】
本発明のｓｉＲＮＡ分子の核酸配列をコードするベクター（例えば、ＡＡＶベクター）との併用療法で使用され得る治療剤は、神経細胞喪失を保護することができるホルモンまたは変異体であり得、例えば、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）またはその断片など（米国特許公開第２０１３０２５９８７５号）；エストロゲン（例えば、米国特許第６，３３４，９９８号および第６，５９２，８４５号）であり；これらの各々の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２２３】
神経栄養因子は、ＡＬＳを治療するための本発明のｓｉＲＮＡ分子の核酸配列をコードするベクター、例えばＡＡＶベクターとの併用療法において使用され得る。一般的に、神経栄養因子は、ニューロンの生存、成長、分化、増殖および／または成熟を促進する物質、またはニューロンの活性の増加を刺激する物質と定義される。いくつかの実施形態では、本方法は、治療を必要とする対象への１つ以上の栄養因子の送達をさらに含む。栄養因子としては、ＩＧＦ−Ｉ、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ＣＴＮＦ、ＶＥＧＦ、コリベリン、サリプロデン、チロトロピン放出ホルモンおよびＡＤＮＦ、ならびにそれらの変異体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２４】
ひとつの態様では、ＳＯＤ１遺伝子を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ二本鎖の核酸配列をコードするベクター、例えばＡＡＶベクターは、ＡＡＶ−ＩＧＦ−Ｉのような神経栄養因子を発現するＡＡＶベクターやＡＡＶ−ＧＤＮＦと同時投与することができる（Ｖｉｎｃｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，神経分子医学，２００４，６，７９−８５；その内容
は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）および（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２００２，２２，６９２０−６９２８；その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、ＡＬＳを治療するための本発明の組成物は、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、くも膜下腔内および／または脳室内で必要な対象に投与され、ｓｉＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子を含むベクターが、血液脳関門および血液脊髄障壁の一方または両方を通過することを可能にする。いくつかの態様では、この方法は、対象の中枢神経系（ＣＮＳ）に本発明のｓｉＲＮＡ分子の核酸配列をコードするベクター、例えばＡＡＶベクターを含む組成物を、治療上有効な量を直接（例えば、輸液ポンプおよび／または投与足場を使用して）投与する方法（例えば、脳室内投与および／または髄腔内投与）を含む。このベクターは、ＡＬＳが治療的に処置されるように、ＳＯＤ１遺伝子発現をサイレンシングするかまたは抑制し、および／または対象におけるＡＬＳの１つ以上の症状を減少させるために使用され得る。
【０２２６】
ある態様では、治療された対象において、運動ニューロン変性、筋力低下、筋萎縮、筋肉硬化、呼吸困難、発語の不明瞭化、線維束性攣縮の発症、前頭側頭型認知症および／または早発死を含むがこれらに限定されないＡＬＳの症状が改善される。他の態様において、本発明の組成物は、脳および脊髄の一方または両方に適用される。他の態様において、筋肉協調および筋肉機能の一方または両方が改善される。他の態様において、対象の生存が延長される。
【０２２７】
一実施形態では、ベクター、例えば本発明のｓｉＲＮＡをコードするＡＡＶベクターを対象に投与することにより、対象のＣＮＳ中の変異型ＳＯＤ１を減少させ得る。別の実施形態では、対象へのベクター、例えばＡＡＶベクターの投与は、対象のＣＮＳにおける野生型ＳＯＤ１を減少させ得る。さらに別の実施形態では、対象へのベクター、例えばＡＡＶベクターの投与は、対象のＣＮＳにおける変異型ＳＯＤ１および野生型ＳＯＤ１の両方を減少させ得る。突然変異体ＳＯＤ１および／または野生型ＳＯＤ１は、ＣＮＳ、ＣＮＳの領域、または対象のＣＮＳの特定の細胞において、約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％および１００％、または少なくとも２０〜３０％、２０〜４０％、２０〜５０％、２０〜６０％、２０〜７０％、２０〜８０％、２０〜９０％、２０〜９５％、２０〜１００％、３０〜４０％、３０〜５０％、３０〜６０％、３０〜７０％、３０〜８０％、３０〜９０％、３０〜９５％、３０〜１００％、４０〜５０％、４０〜６０％、４０〜７０％、４０〜８０％、４０〜９０％、４０〜９５％、４０〜１００％、５０〜６０％、５０〜７０％、５０〜８０％、５０〜９０％、５０〜９５％、５０〜１００％、６０〜７０％、６０〜８０％、６０〜９０％、６０〜９５％、６０〜１００％、７０〜８０％、７０〜９０％、７０〜９５％、７０〜１００％、８０〜９０％、８０〜９５％、８０〜１００％、９０〜９５％、９０〜１００％または９５〜１００％減少し得る。非限定的な例として、ベクター、例えばＡＡＶベクターは、運動ニューロン（例えば、腹側角運動ニューロン）および／または星状細胞において、野生型ＳＯＤ１の発現を少なくとも５０％低下させ得る。別の非限定的な例として、ベクター、例えばＡＡＶベクターは、運動ニューロン（例えば、腹側角運動ニューロン）および／または星状細胞において少なくとも５０％変異ＳＯＤ１の発現を低下させ得る。さらに別の非限定的な例として、ベクター、例えばＡＡＶベクターは、運動ニューロン（例えば、腹側角運動ニューロン）および／または星状細胞において、野生型ＳＯＤ１および変異型ＳＯＤ１の発現を少なくとも５０％低下させ得る。
【０２２８】
一実施形態では、対象へのベクター、例えばＡＡＶベクターの投与は、脊髄における突然変異体および／または野生型ＳＯＤ１の発現を低下させ、突然変異体および／または野生型ＳＯＤ１の発現の低下は、対象におけるＡＬＳの影響を低減させる。
【０２２９】
一実施形態では、ベクター、例えばＡＡＶベクターは、ＡＬＳの初期段階にある対象に投与することができる。初期段階の症状には、衰弱して軟弱なまたは硬く堅固で痙攣した筋肉、筋肉のけいれんおよび引きつり（線維束性収縮）、筋肉量の喪失（萎縮）、疲労、平衡感覚異常、不明瞭な発語、握力低下、および／または歩行時のつまずきなどが含まれるがこれに限定されない。症状は１つの身体領域に限定されるか、または軽度の症状が複数の領域に現れる場合がある。非限定的な例として、ベクター、例えばＡＡＶベクターの投与は、ＡＬＳの症状の重篤度および／または発生を低減し得る。
【０２３０】
一実施形態において、ベクター、例えばＡＡＶベクターは、ＡＬＳの中期段階にある対象に投与され得る。ＡＬＳの中期段階は、初期段階と比較してより広範な筋肉症状を含んでおり、ある筋肉には麻痺が出る一方、他の筋肉は衰弱しているか影響されず継続的な筋肉の引きつり（線維束性収縮）があり、使用されない筋肉が、関節が硬く痛みを伴って時には変形するような拘縮を引き起こし、嚥下筋肉の衰弱が、窒息を引き起こしたり、摂食や唾液の対処がより困難になったりし、呼吸筋の衰弱が、特に横になった時に呼吸不全を引き起こし、および／または、制御不能かつ不適切な笑いまたは泣き（情動調節障害）の発作を有し得るが、これらに限定されない。非限定的な例として、ベクター、例えばＡＡＶベクターの投与は、ＡＬＳの症状の重篤度および／または発生を低減し得る。
【０２３１】
一実施形態において、ベクター、例えばＡＡＶベクターは、ＡＬＳの後期段階にある対象に投与され得る。ＡＬＳの後期段階は、ほとんど麻痺した随意筋を含み、肺の内外への空気の移動を補助する筋肉が著しく損なわれる、可動性が非常に限られる、不十分な呼吸が、疲労、あいまいな思考、頭痛、および、感染症または疾患（例えば、肺炎）に対する易罹患性を引き起こし、発語が困難になり、口での飲食が不可能になり得るが、これらに限定されない。
【０２３２】
一実施形態では、ベクター、例えばＡＡＶベクターは、Ｃ９ｏｒｆ７２の突然変異を有するＡＬＳ患者を治療するために使用され得る。
一実施形態では、ベクター、例えばＡＡＶベクターは、ＴＤＰ−４３の突然変異を有するＡＬＳ患者を治療するために使用され得る。
【０２３３】
一実施形態では、ベクター、例えばＡＡＶベクターは、ＦＵＳ変異を有するＡＬＳ患者を治療するために使用され得る。
定義
他に記載がない限り、以下の用語およびフレーズは、以下に説明する意味を有する。この定義は本質的に限定することを意味するものではなく、本発明の特定の態様をより明確に理解するのに役立つ。
【０２３４】
本明細書で使用される「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）またはポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含む）のいずれか、または、プリンもしくはピリミジン塩基または修飾されたプリンもしくはピリミジン塩基のＮグリコシドである他のタイプのポリヌクレオチドからなる任意の核酸ポリマーを指す。「核酸」という語、「ポリヌクレオチド」という語、および「オリゴヌクレオチド」という語の間には、その長さに意図された区別はなく、これらの用語は互換的に使用される。これらの語は、分子の一次構造のみを指す。したがって、これらの語は、二本鎖および一本鎖ＤＮＡ、ならびに二本鎖および一本鎖ＲＮＡを含む。
【０２３５】
本明細書で使用される「ＲＮＡ」または「ＲＮＡ分子」または「リボ核酸分子」という用語は、リボヌクレオチドのポリマーを指す；用語「ＤＮＡ」または「ＤＮＡ分子」また
は「デオキシリボ核酸分子」は、デオキシリボヌクレオチドのポリマーを指す。ＤＮＡおよびＲＮＡは、例えば、ＤＮＡ複製およびＤＮＡの転写によって、それぞれ天然に合成することができ、また化学的に合成することもできる。ＤＮＡおよびＲＮＡは、一本鎖（すなわち、それぞれｓｓＲＮＡまたはｓｓＤＮＡ）または複数鎖（例えば、二本鎖、すなわちｄｓＲＮＡおよびｄｓＤＮＡ）であり得る。本明細書で使用されている「ｍＲＮＡ」または「メッセンジャーＲＮＡ」という語は、１つまたはそれ以上のポリペプチド鎖のアミノ酸配列をコードする一本鎖ＲＮＡを指す。
【０２３６】
本明細書で使用される「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡｉ」という用語は、対応するタンパク質コード遺伝子の発現の阻害または干渉または「サイレンシング」をもたらすＲＮＡ分子によって媒介される配列特異的調節機構を指す。ＲＮＡｉは、植物、動物および真菌を含む多くの種類の生物において観察されている。ＲＮＡｉは、外来ＲＮＡ（例えば、ウイルスＲＮＡ）を自然に除去するために細胞内で自然発生する。天然ＲＮＡｉは、他の類似のＲＮＡ配列に分解機構を移動させる遊離ｄｓＲＮＡから切断された断片を介して進行する。ＲＮＡｉは、ＲＮＡ誘発サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）によって制御され、細胞の細胞質内の短鎖／低分子ｄｓＲＮＡ分子によって開始され、触媒性ＲＩＳＣ成分であるアルゴン酸と相互作用する。ｄｓＲＮＡ分子は外因的に細胞に導入することができる。外因性ｄｓＲＮＡは、リボヌクレアーゼタンパク質Ｄｉｃｅｒを活性化することによってＲＮＡｉを開始させ、ｄｓＲＮＡを結合および切断して、各末端に少数の不対オーバーハング塩基を有する２１−２５塩基対の二本鎖断片を生成する。これらの短い二本鎖断片は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる。
【０２３７】
本明細書中で使用される場合、用語「短分子干渉ＲＮＡ」、「低分子干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」は、ＲＮＡｉを案内または仲介することができる約５〜６０ヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）を含むＲＮＡ分子（またはＲＮＡ類似体）を指す。好ましくは、ｓｉＲＮＡ分子は、約１５−３０ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体、約１６−２５ヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）、約１８−２３ヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）、約１９−２２ヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）（例えば、１９、２０、２１または２２ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体）、約１９−２５ヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）、および約１９−２５ヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）を含む。「短い」ｓｉＲＮＡという語は、５〜２３ヌクレオチド、好ましくは２１ヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）、例えば１９，２０，２１または２２ヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡを指す。「長い」ｓｉＲＮＡという語は、２４〜６０ヌクレオチド、好ましくは約２４〜２５ヌクレオチド、例えば２３，２４，２５、または２６ヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡを指す。短いｓｉＲＮＡは、場合によっては、より短いｓｉＲＮＡがＲＮＡｉを媒介する能力を保持するならば、１９ヌクレオチド未満（例えば、１６，１７または１８ヌクレオチド、または５ヌクレオチド未満）を含み得る。同様に、より長いｓｉＲＮＡが、ＲＮＡｉ媒介する能力を保持する限り、または短いｓｉＲＮＡへのさらなるプロセシング（例えば、酵素プロセシング）を欠く翻訳抑制を保持する限り、長いｓｉＲＮＡは、いくつかの例では、２６を超えるヌクレオチド（例えば、２７，２８，２９，３０，３５，４０，４５，５０，５５、またはさらには６０ヌクレオチド）を含み得る。ｓｉＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡ分子（ｓｓ−ｓｉＲＮＡ）または二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓ−ｓｉＲＮＡ）であり得、これらは、ｓｉＲＮＡ二本鎖と呼ばれる二本鎖構造を形成するようにハイブリダイズされたセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む。
【０２３８】
本明細書中で使用される場合、ｓｉＲＮＡ分子の「アンチセンス鎖」または「第１鎖」または「ガイド鎖」という用語は、サイレンシングのために標的とされる遺伝子のｍＲＮＡの約１０〜５０ヌクレオチドの部分、例えば、約１５−３０、１６−２５、１８−２３または１９−２２ヌクレオチド、に対して実質的に相補的な鎖を指す。アンチセンス鎖または第１の鎖は、標的特異的サイレンシングを導くために所望の標的ｍＲＮＡ配列に十分
相補的な配列を有し、例えば、ＲＮＡｉの機構またはプロセスによって所望の標的ｍＲＮＡの破壊を引き起こすのに十分な相補性を有する。
【０２３９】
本明細書中で使用される場合、ｓｉＲＮＡ分子の「センス鎖」または「第２鎖」または「パッセンジャー鎖」という用語は、アンチセンス鎖または第１鎖に相補的な鎖を指す。ｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、二本鎖構造を形成するようにハイブリダイズされる。本明細書中で使用される場合、「ｓｉＲＮＡ二本鎖」は、サイレンシングの標的となる遺伝子のｍＲＮＡの約１０〜５０ヌクレオチドの部分に十分な相補性を有するｓｉＲＮＡ鎖、およびこのｓｉＲＮＡ鎖と二本鎖を形成するのに十分な相補性を有するｓｉＲＮＡ鎖を含む。
【０２４０】
本明細書中で使用される場合、用語「相補的」は、互いに塩基対を形成するポリヌクレオチドの能力を指す。塩基対は、典型的には、逆平行ポリヌクレオチド鎖中のヌクレオチド単位間の水素結合によって形成される。相補的ポリヌクレオチド鎖は、ワトソン−クリック様式（例えば、Ｔに対するＡ、Ｕに対するＡ、Ｇに対するＣ）、または二本鎖の形成を可能にする他の任意の様式で塩基対を形成することができる。当業者が認識しているように、ＤＮＡでなくＲＮＡを用いる場合、チミンではなくウラシルがアデノシンに相補的であると考えられる塩基である。しかし、Ｕが本発明の文脈において示される場合、特に断らない限り、Ｔを置換する能力が示唆されている。完全な相補性または１００％相補性は、１つのポリヌクレオチド鎖の各ヌクレオチド単位が第２のポリヌクレオチド鎖のヌクレオチド単位と水素結合を形成し得る状況を指す。完全な相補性よりも低いというのは、２本の鎖のヌクレオチド単位の一部が、すべてではないが互いに水素結合を形成し得る状況を指す。例えば、２つの２０量体について、各鎖上の２つの塩基対のみが互いに水素結合を形成し得る場合、ポリヌクレオチド鎖は１０％の相補性を示す。同じ例において、各鎖上の１８個の塩基対が相互に水素結合を形成することができる場合、ポリヌクレオチド鎖は９０％の相補性を示す。
【０２４１】
本明細書で使用されている「実質的に相補的」という語は、ｓｉＲＮＡが、所望の標的ｍＲＮＡと結合し、標的ｍＲＮＡのＲＮＡサイレンシングを引き起こすのに十分な配列（例えば、アンチセンス鎖中に）を有することを意味する。
【０２４２】
本明細書中で使用されている「標的設定」という語は、標的核酸にハイブリダイズし所望の効果を誘導する核酸配列の設計および選択のプロセスを意味する。
「遺伝子発現」という用語は、核酸配列が首尾よく転写されるプロセスを指し、そしてほとんどの場合翻訳されてタンパク質またはペプチドを産生することを指す。分かりやすく言えば、「遺伝子発現」の測定を参照する場合、これは、測定値が転写の核酸産物（例えば、ＲＮＡまたはｍＲＮＡ）由来であるか、あるいは翻訳のアミノ酸産物（例えば、ポリペプチドまたはペプチド）由来であることを意味すると理解されるべきである。ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ポリペプチドおよびペプチドの量またはレベルを測定する方法は、当技術分野で周知である。
【０２４３】
本明細書で使用される場合、用語「突然変異」は、遺伝子の構造の任意の変化を指し、その結果、次世代に伝達され得る変異体（「突然変異体」とも呼ばれる）の形態をもたらすことを指す。遺伝子の突然変異は、ＤＮＡ中の単一塩基の変化、または遺伝子または染色体のより大きな部分の欠失、挿入、または再編成によって引き起こされ得る。
【０２４４】
本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」は、本発明のｓｉＲＮＡ分子のような異種分子を輸送、形質導入またはそうでなければその担体として作用する任意の分子または部分を意味する。「ウイルスベクター」は、目的の分子、例えば導入遺伝子をコードするかまたは含む１つまたは複数のポリヌクレオチド領域を含んでおり、１つのポリペプチ
ドまたは複数のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）のような調節核酸を含むベクターである。ウイルスベクターは、遺伝物質を細胞に投与するために一般に使用される。ウイルスベクターは、特定の用途のためにしばしば改変される。ウイルスベクターの種類には、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターが含まれる。
【０２４５】
本明細書で使用される「アデノ随伴ウイルス」または「ＡＡＶ」または「ＡＡＶベクター」という用語は、アデノ随伴ベクターの成分を含むかまたはそれから派生し、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞に感染するのに適した任意のベクターを指す。用語ＡＡＶベクターは、典型的には、ｓｉＲＮＡ二本鎖をコードする核酸分子を含むＡＡＶ型ウイルス粒子またはビリオンを示す。ＡＡＶベクターは、血清型の組み合わせ（すなわち、「偽型」ＡＡＶ）または種々のゲノム（例えば、一本鎖または自己相補性）を含む種々の血清型に由来し得る。さらに、ＡＡＶベクターは複製欠損および／または標的化されていてもよい。
【０２４６】
本明細書において、「遺伝子の発現を阻害する」という句は、遺伝子の発現産物の量を減少させることを意味する。発現産物は、遺伝子から転写されたＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）またはその遺伝子から転写されたｍＲＮＡから翻訳されたポリペプチドである。典型的には、ｍＲＮＡレベルの低下は、それから翻訳されるポリペプチドのレベルの低下をもたらす。発現レベルは、ｍＲＮＡまたはタンパク質を測定するための標準的な技術を用いて決定することができる。
【０２４７】
本明細書中で使用される場合、用語「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」は、例えば、生物の中ではなく試験管または反応容器中、細胞培養中、ペトリ皿中などの人工環境（例えば、動物、植物または微生物）において生じる事象を指す。
【０２４８】
本明細書で使用される「ｉｎ  ｖｉｖｏ」という用語は、生物内（例えば、動物、植物、または微生物、またはそれらの細胞もしくは組織）で起こる事象を指す。
本明細書で使用する「修飾（改変）された」という用語は、本発明の分子の変化した状態または構造を指す。分子は、化学的、構造的、および機能的に多くの態様で修飾することができる。
【０２４９】
本明細書で使用される場合、用語「合成」は、人間の手によって製造、調製、および／または製造されることを意味する。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドまたはその他の分子の合成は、化学的または酵素的であってもよい。
【０２５０】
本明細書中で使用される場合、用語「トランスフェクション」は、外因性核酸を細胞に導入する方法を指す。トランスフェクションの方法には、化学的方法、物理的処理およびカチオン性脂質または混合物が含まれるが、これらに限定されない。細胞にトランスフェクトすることができる薬剤のリストは大きく、ｓｉＲＮＡ、センスおよび／またはアンチセンス配列、１つまたは複数の遺伝子をコードして発現プラスミドに編成されたＤＮＡ、タンパク質、タンパク質断片、その他を含むが、これに限定されない。
【０２５１】
本明細書中で使用される場合、「オフターゲット」とは、任意の１つ以上の標的、遺伝子または細胞転写産物に対する任意の意図しない効果をいう。
本明細書で使用される「薬学的に許容される」という語句は、健全な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題または合併症を伴わずにヒトおよび動物の組織と接触して使用するのに適しているとともに合理的な利益／リスク比に見合った化合物、材料、組成物および／または投薬形態を指す。
【０２５２】
本明細書中で使用される場合、薬剤の「有効量」という用語は、有益なまたは所望の結果、例えば臨床結果をもたらすのに十分な量であり、したがって「有効量」は、それが適用される状況に依存する。例えば、ＡＬＳを治療する薬剤を投与する状況において、薬剤の有効量は、例えば、薬剤の投与なしで得られた応答と比較して、ＡＬＳの本明細書で定義されるような治療を達成するのに十分な量のことである。
【０２５３】
本明細書中で使用される場合、用語「治療有効量」は、疾患、障害および／または状態に罹患しているかまたは罹患しやすい対象に投与される場合に、感染症、疾患、障害および／または状態を治療し、その症状を改善し、診断し、予防し、および／または、その発症を遅らせるために十分な、投与される薬剤（例えば、核酸、薬物、治療薬、診断薬、予防薬など）の量を意味する。
【０２５４】
本明細書中で使用される場合、用語「対象」または「患者」は、本発明による組成物が投与され得る任意の生物を指すのであって、例えば、実験的、診断的、予防的および／または治療的目的のためのものである。典型的な対象には、動物および／または植物（例えば、マウス、ラット、ウサギなどの哺乳動物、チンパンジーのような非ヒト霊長類、およびその他の類人猿およびサル種、およびヒト）が含まれる。
【０２５５】
本明細書中で使用される場合、用語「予防する」または「予防」は、状態または疾患の発症、進行または悪化を、数週間、数ヶ月または数年を含む期間、遅延または防止することを指す。
【０２５６】
本明細書で使用する「治療」または「治療する」という用語は、疾患の治癒または改善に使用される１つまたは複数の特定の手順の適用を指す。特定の実施形態では、特定の手順は、１つ以上の医薬品の投与である。本発明の文脈において、特定の手順は、ＳＯＤ１遺伝子を標的とする１つ以上のｓｉＲＮＡ二本鎖またはコードされたｄｓＲＮＡの投与である。
【０２５７】
本明細書で使用される場合、用語「改善」または「改善する」は、状態または疾患の、少なくとも１つの指標の重篤度を軽減することを指す。例えば、神経変性障害の文脈において、改善には、ニューロン損失の減少が含まれる。
【０２５８】
本明細書中で使用される場合、用語「投与する」は、対象に医薬品または組成物を提供することを指す。
本明細書中で使用される場合、用語「神経変性」は、神経細胞死をもたらす病理学的状態を指す。多数の神経学的障害は、共通の病的状態として神経変性を共有する。例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）はすべて、慢性的な神経変性を引き起こすが、これは数年にわたる遅く進行性の神経細胞死を特徴とし、また急性神経変性は、卒中などの虚血または外傷性脳損傷などの外傷の結果、または脊髄損傷または多発性硬化症によって引き起こされる脱髄または外傷による軸索切断の結果による、神経細胞死の突然の発症を特徴とする。いくつかの神経障害では、主に１種類のニューロン細胞が退行性であり、例えばＡＬＳにおける運動ニューロン変性である。
【０２５９】
同等のものおよび適用範囲
当業者であれば、本明細書に記載された本発明による特定の実施形態について多くの同等のものを認識するか、またはルーチンの実験のみを用いて確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記の説明に限定されるように意図されているのではなく、添付の特許請求の範囲に記載されている。
【０２６０】
特許請求の範囲において、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」などの不定冠詞は、文脈からその逆であることあるいは明らかに示されていない限り、１つまたはそれ以上のものを意味する。ある群の１つまたはそれ以上の構成員の間に「ｏｒ」を含む請求項または説明は、文脈からその逆であることあるいは明らかに示されていない限り、群の構成員の１つ、１つ以上、またはすべてが所与の製品またはプロセスに存在しているか、使用されているか、または関連している場合に、満たされているとみなされる：本発明は、群の構成員の１つだけが所与の製品またはプロセスに存在しているか、使用されているか、または関連している実施形態を含む。本発明は、２つ以上の、またはグループメンバー全体が、所与の製品またはプロセスに存在し、採用され、または関連する実施形態を含む。
【０２６１】
「〜からなる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、開かれていることを意図しており、追加の要素またはステップを含めることを許可するが、追加の要素またはステップを含めることを必要とはしていないことにも留意されたい。「〜からなる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語が本明細書で使用される場合、「から構成されている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という語もこのように包含され、明示される。
【０２６２】
範囲が与えられている場合、エンドポイントが含まれる。さらに、別途示されない限り、あるいは文脈および当業者の理解から明白でない限り、範囲として表される値は、本発明の多様な実施形態において記載された範囲内の任意の特定の値または部分範囲、当該範囲の下限の単位の１０分の１までと想定される（文脈上明確に別途指示されている場合を除く）と理解されるべきである。
【０２６３】
さらに、先行技術に含まれる本発明の特定の実施形態はすべて、特許請求の範囲のいずれか１つまたはそれ以上から明白に除外され得ることが理解されるべきである。そのような実施形態は、当業者に知られているとみなされるので、除外が明示的に本明細書に記載されていなくても除外されてよい。本発明の組成物の任意の特定の実施形態（例えば、任意の抗生物質、治療または有効成分；任意の製造方法；任意の使用方法など）は、先行技術の存在に関係なく、何らかの理由で、任意の１つ以上の請求項から除外することができる。
【０２６４】
使用されている語は、限定ではなく説明のための言葉であり、その広い意味で本発明の真の範囲および精神から逸脱することなく、添付の特許請求の範囲内で変更が可能であることを理解されたい。
【０２６５】
本発明は、記載された幾つかの実施形態に関して、ある程度の長さで、ある程度の特殊性を以て説明されているが、本発明は、そのような特殊性、実施形態、または任意の特定の実施形態に限定されるように意図されておらず、本発明は、添付の特許請求の範囲を参照して解釈されるべきである。その理由は、先行技術を考慮してそのような請求の範囲を可能な限り広く解釈するためであり、また本発明の意図する範囲を効果的に包含するためである。
【０２６６】
実施例
実施例１：ＳＯＤ１  ｓｉＲＮＡの設計と合成
ＳＯＤ１  ｓｉＲＮＡの設計
ヒトＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを同定するためにｓｉＲＮＡ設計を行った。このデザインでは、表２に記載されるように、ヒト（（ＧｅｎｅｂａｎｋアクセスＮＯ．ＮＭ＿０００４５４．４（配列番号：１））について、ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｓｅｑコレクションから（リリース６３）（配列番号：２））からのカニクイザル（（Ｇｅｎｅｂａｎｋ  アクセスＮＯ．ＸＭ＿００５５４８８３３．１）について、および、Ｅｎｓｅｍｂｌプロジェクトからの（リリース７５））アカゲザル（ＳＯＤ１トランスクリプトＥＮＳＭ
ＭＵＴ０００００００２４１５（配列番号：３）についてのＳＯＤ１トランスクリプトを使用した。
【０２６７】
【表２】
2017535266.tif 000004
ｓｉＲＮＡ二本鎖は、アンチセンス鎖の２−１８位についてヒトＳＯＤ１転写物と１００％の同一性を有するように設計され、アンチセンス鎖の２−１８位について非ヒト霊長類ＳＯＤ１転写産物と部分的または１００％の同一性を有する。全てのｓｉＲＮＡ二本鎖において、アンチセンス鎖の１位はＵに操作され、センス鎖の位置１９はこの位置で二本鎖を不対合にするようにＣに操作された。
【０２６８】
ＳＯＤ１  ｓｉＲＮＡ配列選択
ヒト、カニクイザルおよびアカゲザルＳＯＤ１遺伝子に対する予測されたアンチセンス鎖の選択性、およびｍｉＲＢａｓｅ２０．０中のアンチセンス鎖の２−７位のシード配列とヒト配列との一致の欠如に基づき、全部で１６９個のアンチセンスおよび１６９個のセンスヒトＳＯＤ１由来のオリゴヌクレオチドが合成され、二本鎖に形成された（表３）。ｓｉＲＮＡ二本鎖は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ内因性ＳＯＤ１遺伝子発現に対する阻害活性について試験された（ＳＯＤ１  ｍＲＮＡレベル）。
【０２６９】
【表３−１】
2017535266.tif 000005
【０２７０】
【表３−２】
2017535266.tif 000006
【０２７１】
【表３−３】
2017535266.tif 000007
【０２７２】
【表３−４】
2017535266.tif 000008
【０２７３】
【表３−５】
2017535266.tif 000009
【０２７４】
【表３−６】
2017535266.tif 000010
ＳＯＤ１  ｓｉＲＮＡ合成
ホスホラミダイトオリゴマー化化学によって、ＡＢＩ３９００合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）でオリゴリボヌクレオチドを合成した。固体支持体は、２’−デオキシ−チミジン（米国バージニア州スターリングのＧｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社から購入）を充填したポリスチレンであり、合成スケールが０．２μｍｏｌであった。ＳＡＦＣ  Ｐｒｏｌｉｇｏ社（ハンブルグ、ドイツ）から補助合成試薬、ＤＮＡおよびＲＮ
Ａホスホラミダイトを得た。具体的には、５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ、Ｎジイソプロピル）ウリジン（Ｕ）のホスホラミダイトモノマー、チミジン（ｄＴ）、４−Ｎ−アセチルシチジン（ＣＡｃ）、６−Ｎ−ベンゾイルアデノシン（Ａｂｚ）および２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリルを有する２−Ｎ−イソブチリルグアノシン（ＧｉＢｕ）を用いてオリゴマー配列を構築した。全ホスホラミダイト（アセトニトリル中７０ｍＭ）のカップリング時間が、活性剤として５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾール（ＥＴＴ）（アセトニトリル中０．５Ｍ）を使用して３分であった。合成機で最終的なジメトキシトリチル保護基の除去を実施し、配列を合成した（「ＤＭＴオフ」合成）。固相合成の完了時に、オリゴリボヌクレオチドを固体支持体から切断し、水性メチルアミン（４０％）とエタノール中メチルアミン（３３％）の１：１（ｖ／ｖ）混合物を用いて脱保護した。その溶液を４５℃にし、９０分後にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で希釈し、トリエチルアミン三フッ化水素酸（ＴＥＡ．ＨＦ）を加えた。４５℃で２時間インキュベートした後、１Ｍ  ＮａＯＡｃおよびアセトンとエタノールとの４：１（ｖ／ｖ）の混合物でオリゴリボヌクレオチドを沈殿させた。ペレットを１Ｍ  ＮａＣｌ水溶液に溶解し、サイズ排除クロマトグラフィーにより脱塩した。これは、ＨｉＴｒａｐ  ５ｍＬカラム（ＧＥヘルスケア社）を備えたＡＫＴＡ精製装置ＨＰＬＣシステム（ＧＥヘルスケア社、フライブルク、ドイツ）を用いて実施した。ＭＡＬＤＩ質量分析法またはＥＳＩ質量分析法によって、オリゴリボヌクレオチドの同一性を確認した。ＲＮＡ一本鎖からｓｉＲＮＡを生成するために、等モル量の相補的センス鎖およびアンチセンス鎖を混合し、２０ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．８緩衝液中でアニールした。使用するまでｓｉＲＮＡを凍結保存した。
【０２７５】
実施例２：ヒトＳＯＤ１  ｍＲＮＡ抑制に対するＳＯＤ１  ｓｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニング
ｓｉＲＮＡを標的とするヒトＳＯＤ１（表３に記載）を、ＳＯＤ１  ｍＲＮＡを定量するためｂＤＮＡ（分岐ＤＮＡ）法を用いて、ＨｅＬａ細胞の内在性ＳＯＤ１発現の阻害について評価した。用量２種類のアッセイによる結果を用いて、４種の培養細胞での用量反応実験のためのＳＯＤ１  ｄｓＲＮＡ二本鎖のサブセットを選択し、ＩＣ５０を算出した。
【０２７６】
細胞培養およびトランスフェクション
ＡＴＣＣ（ドイツ、ヴェーゼルのＬＧＣ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ社と提携したＡＴＣＣ）からＨｅＬａ細胞を入手し、５％ＣＯ２加湿インキュベーター内、３７℃で、ウシ胎仔血清１０％（ＧＩＢＣＯ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＵｌｔｒａ−ｌｏｗ  ＩｇＧ）およびＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ１％（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＧｍｂＨ社、ベルリン、ドイツ）を含むよう補充したＨＡＭのＦ−１２培地（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＧｍｂＨ社、ベルリン、ドイツ）で培養した。
【０２７７】
ｓｉＲＮＡによるトランスフェクションのため、９６ウェルプレートにＨｅＬａ細胞を密度１９，０００〜２０，０００細胞／ウェルで播種した。製造者の指示に従って、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いてｓｉＲＮＡのトランスフェクションを行った。２通りの用量投与スクリーニングでは、ＳＯＤ１  ｓｉＲＮＡ濃度１ｎＭまたは０．１ｎＭを用いた。用量応答実験では、ＳＯＤ１  ｓｉＲＮＡ濃度１０、２．５、０．６、０．１６、０．０３９、０．００９８、０．００２４、０．０００６、０．０００１５および０．００００３８ｎＭを用いて実施した。対照ウェルに、ルシフェラーゼｓｉＲＮＡ、Ａｈａ−１  ｓｉＲＮＡ、ＰＬＧＦ  ｓｉＲＮＡまたは関係のないｓｉＲＮＡの対照混合物をトランスフェクションした。
【０２７８】
分枝ＤＮＡアッセイ−ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  ２．０
ｓｉＲＮＡとともに２４時間インキュベーションした後、培地を除去し、細胞を１５０
μｌ溶解混合液（溶解混合液１に対しヌクレアーゼフリー水２）で溶解し、その後５３℃で６０分間インキュベートした。８０μｌワーキングプローブセット（Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｐｒｏｂｅ  Ｓｅｔ）ＳＯＤ１（遺伝子標的）、９０μｌワーキングプローブセットＧＡＰＤＨ（内在性対照）および、２０μｌまたは１０μｌの細胞溶解物を捕捉用プレートに添加した。捕捉用プレートを、（ＳＯＤ１では）５５℃、（ＧＡＰＤＨでは）５３℃でインキュベートした（約１６〜２０時間）。翌日、その捕捉用プレートを、少なくとも３００μｌの１×洗浄バッファー（ヌクレアーゼフリー水、緩衝液成分１および洗浄バッファー成分２）を用いて３回洗浄した（最後の洗浄後、プレートを逆さまにし、清潔なペーパータオルで吸い取った）。ＳＯＤ１捕捉用プレートに１００μｌの増幅前ワーキング試薬（ｐｒｅ−Ａｍｐｌｉｆｉｅｒ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ）を加え、アルミニウムホイルでシールし、５５℃で１時間インキュベートした。１時間インキュベーションした後、洗浄工程を繰り返し、その後、ＳＯＤ１およびＧＡＰＤＨ捕捉用プレートいずれにも、１００μｌの増幅ワーキング試薬（Ａｍｐｌｉｆｉｅｒ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ）を加えた。５５℃（ＳＯＤ１）または５３℃（ＧＡＰＤＨ）で１時間インキュベートした後、洗浄および乾燥の工程を繰り返し、１００μｌの標識プローブ（Ｌａｂｅｌ
Ｐｒｏｂｅ）を加えた。捕捉用プレートを５０℃（ＳＯＤ１）または５３℃（ＧＡＰＤＨ）で１時間インキュベートした。その後、プレートを１×洗浄バッファーで洗浄し、乾燥させ、捕捉プレートに基質１００μｌを加えた。暗所で３０分間インキュベートした後、１４２０発光カウンター（ＷＡＬＬＡＣ  ＶＩＣＴＯＲ  Ｌｉｇｈｔ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社、ロートガウ−ユーゲスハイム、ドイツ）を用いて発光を読み取った。
【０２７９】
ｂＤＮＡデータ解析
各ＳＯＤ１  ｓｉＲＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡについて、４つのウェルを並行してトランスフェクションし、個々のデータポイントをそれぞれのウェルから収集した。それぞれのウェルについて、ＳＯＤ１  ｍＲＮＡレベルをＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡレベルに標準化した。所与のＳＯＤ１  ｓｉＲＮＡの活性は、対照ウェルの平均ＳＯＤ１  ｍＲＮＡ濃度（ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡに標準化）に比して、処理された細胞のＳＯＤ１  ｍＲＮＡ濃度のパーセント（ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡに標準化）で表された。
【０２８０】
表３に配列が示されているＳＯＤ１  ｓｉＲＮＡを１ｎＭまたは０．１ｎＭのいずれかで試験したｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＨｅＬａスクリーニングの結果を表４に示している。表４に、それぞれのＳＯＤ１  ｓｉＲＮＡについて、対照と比較して、処理した細胞中に残存するＳＯＤ１  ｍＲＮＡ（ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡに標準化）の平均パーセントおよび標準偏差を示す。１ｎＭでＳＯＤ１  ｓｉＲＮＡの多数が、ＨｅＬａ細胞のＳＯＤ１  ｍＲＮＡレベルを８０％以上低下させるのに有効であった。さらに、０．１ｎＭでＳＯＤ１  ｓｉＲＮＡの多数が、ＨｅＬａ細胞のＳＯＤ１  ｍＲＮＡレベルを８０％以上低下させるのに有効であった。
【０２８１】
【表４−１】
2017535266.tif 000011
【０２８２】
【表４−２】
2017535266.tif 000012
【０２８３】
【表４−３】
2017535266.tif 000013
【０２８４】
【表４−４】
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【０２８５】
【表４−５】
2017535266.tif 000015
ＨｅＬａ細胞を対象に０．１ｎＭで最も活性の高いＳＯＤ１  ｓｉＲＮＡのうち１２種類を用量応答実験で評価した。表５ではＨｅＬａ細胞を対象に、その選択された１２種類のＳＯＤ１  ｓｉＲＮＡについて対照と比較し、ＳＯＤ１  ｍＲＮＡ５０％の抑制をもたらすＩＣ５０濃度を示す。この実験的パラダイムでは、その１２種類のＳＯＤ１  ｓｉＲＮＡは特に強力なものであり、ＩＣ５０値１〜８ｐＭを示した。
【０２８６】
【表５】
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以下の表６に、ＳＯＤ１  ｓｉＲＮＡの１２種類のＩＣ５０を同定するために用いたＨｅＬａ細胞に関する用量応答データを詳細に示す。ＨｅＬａ細胞では、全１２種類のｓｉＲＮＡにｐＭ  ＩＣ５０があることを明らかにした。表５に示すＳＯＤ１  ｓｉＲＮＡのＩＣ５０に関するデータは、以下の表６にまとめたデータの要約である。
【０２８７】
【表６】
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実施例３：ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞、Ｕ８７細胞およびヒト初代星状細胞の内在性ＳＯＤ１
ｍＲＮＡ発現に対する選択されたＳＯＤ１  ｓｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニング
ＡＴＣＣ（ドイツ、ヴェーゼルのＬＧＣ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ社と提携したＡＴＣＣ）からＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を入手し、５％ＣＯ２加湿インキュベーター内、３７℃で、ＦＣＳ  １５％（ＧＩＢＣＯ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＵｌｔｒａ−ｌｏｗ
ＩｇＧ）、Ｌ−グルタミン１％（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＧｍｂＨ社、ベルリン、ドイツ）およびＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ１％（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＧｍｂＨ社、ベルリン、ドイツ）を含むように補充したＤｕｌｂｅｃｃｏのＭＥＭ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＧｍｂＨ社、ベルリン、ドイツ）で培養した。
【０２８８】
ＡＴＣＣ（ドイツ、ヴェーゼルのＬＧＣ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ社と提携したＡＴＣＣ）からＵ８７ＭＧ細胞を入手し、５％ＣＯ２加湿インキュベーター内、３７℃で、ＦＣＳ１０％（ＧＩＢＣＯ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＵｌｔｒａ−ｌｏｗ  ＩｇＧ）、およびＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ  １％（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＧｍｂＨ社、ベルリン、ドイツ）を含むように補充したＡＴＣＣ配合イーグル最小必須培地（ＡＴＣＣ−ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）（ドイツ、ヴェーゼルのＬＧＣ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ社と提携したＡＴＣＣ）で培養した。
【０２８９】
ＬＯＮＺＡ（Ｌｏｎｚａ  Ｓａｌｅｓ社、バーゼル、スイス）からヒト初代星状細胞を入手し、５％ＣＯ２加湿インキュベーター内、３７℃で、ＡＧＭ  ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔキット（Ｌｏｎｚａ  Ｓａｌｅｓ社Ｌｔｄ、バーゼル、スイス）を用いて補充したＡＢＭ基礎培地（ＡＢＭ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）（Ｌｏｎｚａ  Ｓａｌｅｓ社、バーゼル、スイス）で培養した。
【０２９０】
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞にリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、Ｕ８７細胞にＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）およびヒト初代星状細胞にリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）のトランスフェクション試薬を用いたことを除いて、ＨｅＬａ細胞について記載したのとほぼ同じ方法で１２種類のｓｉＲＮＡ（Ｄ−２７５７、Ｄ−２８０６、Ｄ−２８６０、Ｄ−２８６１、Ｄ−２８７５、Ｄ−２８７１、Ｄ−２７５８、Ｄ−２７５９、Ｄ−２８６６、Ｄ−２８７
０、Ｄ−２８２３、Ｄ−２８５８）を用いてＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞、Ｕ８７ＭＧ細胞およびヒト初代星状細胞のトランスフェクションのほか、ｂＤＮＡを用いたＳＯＤ１およびＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡレベルの定量を実施した。
【０２９１】
以下の表７、８、９にそれぞれ、ＳＯＤ１  ｓｉＲＮＡの１２種類（Ｄ−２７５７、Ｄ−２８０６、Ｄ−２８６０、Ｄ−２８６１、Ｄ−２８７５、Ｄ２８７１、Ｄ−２７５８、Ｄ−２７５９、Ｄ−２８６６、Ｄ−２８７０、Ｄ−２８２３、Ｄ−２８５８）のＩＣ５０を同定するために用いたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞、Ｕ８７ＭＧ細胞およびヒト初代星状細胞に関する用量反応データを詳細に示す。Ｕ８７細胞では、全１２種類のｓｉＲＮＡにｐＭ  ＩＣ５０があることを明らかにした。
【０２９２】
表１０にＩＣ５０値を示す。ヒト初代星状細胞の方が、総じてＳＨ−ＳＹ５ＹやＵ８７ＭＧ細胞よりもＩＣ５０値が高かった。
【０２９３】
【表７】
2017535266.tif 000018
【０２９４】
【表８】
2017535266.tif 000019
【０２９５】
【表９】
2017535266.tif 000020
表１０のＳＯＤ１  ｓｉＲＮＡのＩＣ５０データは、表７、８および９に示すデータの要約である。
【０２９６】
【表１０】
2017535266.tif 000021
実施例４：ＳＯＤ１を標的とするｓｉＲＮＡ
有効であることが確認されているＳＯＤ１  ｓｉＲＮＡのパッセンジャー−ガイド二本鎖を発現ベクター内に遺伝子操作し、中枢神経系または神経細胞系の細胞にトランスフェクションさせる。ｓｉＲＮＡノックダウン試験に利用されるオーバーハングはｓｉＲＮＡの標準的なｄＴｄＴであるが、構築物のオーバーハングは、あらゆるジヌクレオチドのオーバーハングを含み得る。
【０２９７】
使用される細胞は、初代細胞または多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）に由来するものであってもよい。
次に、ＳＯＤ１ノックダウンを測定し、ディープシーケンスを実施して、発現ベクターに投与したそれぞれの構築物からプロセシングされた正確なパッセンジャー鎖およびガイド鎖を決定する。
【０２９８】
ノックダウン、例えばＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）プロセッシングの有効性を明らかにするため、パッセンジャー鎖に対するガイド鎖比を算出する。
Ｎ末端を配列決定して分裂部位を決定し、標的の均質な分裂の割合を算出する。分裂率は９０％を上回ることが予想される。
【０２９９】
並行試験でＨｅＬａ細胞を同時にトランスフェクションし、ＳＯＤ１のｉｎ  ｖｉｔｒｏノックダウンを分析する。オフターゲット効果を明らかにするため対照としてルシフェラーゼ構築物を用いる。
【０３００】
ディープシーケンスを再度実施する。
実施例５：ＳＯＤ１を標的とするパッセンジャーおよびガイドの配列
本発明に照らして、ＳＯＤ１  ｓｉＲＮＡを設計した。表１１Ａおよび１１Ｂにこれを示す。これらの表にパッセンジャー鎖とガイド鎖を記載する。表１１Ａおよび１１Ｂでは、配列名称の「ｍｉＲ」構成要素は、必ずしもｍｉＲＮＡ遺伝子の配列番号付けに対応しているわけではない（例えば、ＶＯＹｍｉＲ−１０１は配列の名称であり、必ずしもｍｉ
Ｒ−１０１がその配列の一部であることを意味するものではない）。
【０３０１】
【表１１Ａ−１】
2017535266.tif 000022
【０３０２】
【表１１Ａ−２】
2017535266.tif 000023
【０３０３】
【表１１Ａ−３】
2017535266.tif 000024
【０３０４】
【表１１Ａ−４】
2017535266.tif 000025
【０３０５】
【表１１Ａ−５】
2017535266.tif 000026
【０３０６】
【表１１Ａ−６】
2017535266.tif 000027
【０３０７】
【表１１Ａ−７】
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【０３０８】
【表１１Ｂ】
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実施例６：ＡＡＶ−ｍｉＲＮＡベクター中のＳＯＤ１  ｓｉＲＮＡ構築物
表１１にまとめたＳＯＤ１  ｓｉＲＮＡのパッセンジャー−ガイド二本鎖をＡＡＶ−ｍｉＲＮＡ発現ベクター内に遺伝子操作する。ＩＴＲからＩＴＲへ、列挙される５’から３’への構築物は、突然変異体ＩＴＲ、プロモーター（ＣＭＶ、Ｕ６またはＣＢ６プロモーターのいずれかであり、ＣＭＶｉｅエンハンサー、ＣＢＡプロモーターおよびＳＶ４０イ
ントロンを含む）、表１１のパッセンジャー鎖およびガイド鎖（パッセンジャー鎖とガイド鎖との間のループ、パッセンジャー鎖の前の５’フランキング領域およびガイド鎖の後の３’フランキング領域を有する）、ウサギグロビンポリＡおよび野生型ＩＴＲを含む。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ試験を実施し、ＡＡＶ−ｍｉＲＮＡ発現ベクターの有効性を検証する。
【０３０９】
実施例７：ＨｅＬａ細胞における構築物の活性
実施例６に記載されているＳＯＤ１  ｓｉＲＮＡ構築物７種類（ＶＯＹｍｉＲ−１０３、ＶＯＹｍｉＲ−１０５、ＶＯＹｍｉＲ−１０８、ＶＯＹｍｉＲ−１１４、ＶＯＹｍｉＲ−１１９、ＶＯＹｍｉＲ−１２０およびＶＯＹｍｉＲ−１２７）および二本鎖ｍＣｈｅｒｒｙの対照を、その構築物の活性を検証するためにＨｅＬａにトランスフェクションした。
【０３１０】
Ａ．パッセンジャーおよびガイド鎖の活性
ＳＯＤ１  ｓｉＲＮＡ構築物７種類と二本鎖ｍＣｈｅｒｒｙの対照をＨｅＬａ細胞にトランスフェクションした。４８時間後、内在性ｍＲＮＡ発現を評価した。ＳＯＤ１  ｓｉＲＮＡ構築物全７種類では、７５〜８０％のノックダウンを伴うガイド鎖の高い活性と、パッセンジャー鎖の低い活性または活性不存在とが示された。ＳＯＤ１  ｓｉＲＮＡ候補ベクターのガイド鎖は、高い活性を示し、７５〜８０％のＳＯＤ１のノックダウンをもたらしたが、パッセンジャー鎖では活性がほとんどない、または全くないことが示された。
【０３１１】
Ｂ．ＳＯＤ１の構築物の活性
ＳＯＤ１  ｓｉＲＮＡ構築物７種類および二本鎖ｍＣｈｅｒｒｙ（ｄｓＣｈｅｒｒｙ）の対照を１ｅ４ｖｇ／細胞、１ｅ３ｖｇ／細胞または１ｅ２ｖｇ／細胞のＭＯＩでＨｅＬａ細胞にトランスフェクションした。７２時間後、内在性ｍＲＮＡ発現を評価した。ＳＯＤ１  ｓｉＲＮＡ構築物全７種類が、１ｅ３ｖｇ／細胞で効率的なノックダウンを示した。図１に示すように、ＳＯＤ１  ｓｉＲＮＡ構築物のほとんどで、活性が高い（ノックダウン７５〜８０％）ことが示された。
【０３１２】
実施例８：ＨＥＫ細胞における構築物の活性
実施例６に記載されたＳＯＤ１  ｓｉＲＮＡ構築物３０種類（ＶＯＹｍｉＲ−１０２．８６０、ＶＯＹｍｉＲ−１０２．８６１、ＶＯＹｍｉＲ−１０２．８６６、ＶＯＹｍｉＲ−１０２．８７０、ＶＯＹｍｉＲ−１０２．８２３、ＶＯＹｍｉＲ−１０４．８６０、ＶＯＹｍｉＲ−１０４．８６１、ＶＯＹｍｉＲ−１０４．８６６、ＶＯＹｍｉＲ−１０４．８７０、ＶＯＹｍｉＲ−１０４．８２３、ＶＯＹｍｉＲ−１０９．８６０、ＶＯＹｍｉＲ−１０９．８６１、ＶＯＹｍｉＲ−１０９．８６６、ＶＯＹｍｉＲ−１０９．８７０、ＶＯＹｍｉＲ−１０９．８２３、ＶＯＹｍｉＲ−１１４．８６０、ＶＯＹｍｉＲ−１１４．８６１、ＶＯＹｍｉＲ−１１４．８６６、ＶＯＹｍｉＲ−１１４．８７０、ＶＯＹｍｉＲ−１１４．８２３、ＶＯＹｍｉＲ−１１６．８６０、ＶＯＹｍｉＲ−１１６．８６１、ＶＯＹｍｉＲ−１１６．８６６、ＶＯＹｍｉＲ−１１６．８７０、ＶＯＹｍｉＲ−１１６．８２３、ＶＯＹｍｉＲ−１２７．８６０、ＶＯＹｍｉＲ−１２７．８６１、ＶＯＹｍｉＲ−１２７．８６６、ＶＯＹｍｉＲ−１２７．８７０、ＶＯＹｍｉＲ−１２７．８２３）、ＶＯＹｍｉＲ−１１４の対照および二本鎖ｍＣｈｅｒｒｙを細胞にトランスフェクションし、構築物の活性を検証した。
【０３１３】
Ａ．ＨＥＫ２９３のパッセンジャーおよびガイド鎖の活性
構築物３０種類および対照２つをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。２４時間後、内在性ｍＲＮＡ発現を評価した。構築物のほとんどでは、ガイド鎖の活性が高く（図２）、パッセンジャー鎖の活性が低いか、あるいは活性がみられない（図３）ことが示された。
【０３１４】
Ｂ．ＨｅＬａのパッセンジャーおよびガイド鎖の活性
ＨｅＬａ細胞に構築物３０種類および対照２つをトランスフェクションした。４８時間後、内在性ｍＲＮＡ発現を評価した。ほとんどの構築物では、ガイド鎖の活性が高く（図４）、パッセンジャー鎖の活性が低いか、あるいは活性がみられない（図５）ことが示された。
【０３１５】
Ｃ．ＨｅｌＡおよびＨＥＫ２９３の相関
構築物３０種類のノックダウンは、ＨｅＬａ細胞とＨＥＫ２９３細胞との間で類似していた。その構築物３０種類は、構築物のガイド鎖に対してノックダウンを示した（図２および４を参照せよ）。構築物のガイド鎖のほとんどが、ノックダウン７０〜９０％を示した。
【０３１６】
Ｄ．キャプシドの選択
ＨｅＬａとＨＥＫ２９３のトップの構築物をＡＡＶにパッケージングし、ＨｅＬａ感染を実施する。その構築物をパッケージングする最良のＡＡＶを割り出すため、ＡＡＶ２またはＡＡＶ−ＤＪ８のいずれかにパッケージングされたｍＣｈｅｒｒｙをＭＯＩ  １０ｖｇ／細胞、１ｅ２ｖｇ／細胞、１ｅ３ｖｇ／細胞、１ｅ４ｖｇ／細胞または１ｅ５ｖｇ／細胞でＨｅＬａ細胞に感染させ、４０時間後にその発現を評価した。トップの構築物をパッケージングするためキャプシドとしてＡＡＶ２を選択した。
【０３１７】
Ｅ．ＡＡＶ２産生
ＨｅＬａおよびＨＥＫ２９３のトップの構築物をＡＡＶ２（１．６ｋｂ）にパッケージングし、このほか、二本鎖ｍＣｈｅｒｒｙ（ｄｓｍＣｈｅｒｒｙ）の対照もパッケージングした。分析前にパッケージングした構築物にイオジキサノール精製を実施した。ＡＡＶ力価を表１２に示す。
【０３１８】
【表１２】
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ＨｅＬａ細胞におけるＳＯＤ１ノックダウンに対する形質導入の効果を図６に示す。さらに、ＨｅＬａ細胞において、より大きいＭＯＩ（１．０Ｅ＋０５と比較した１．０Ｅ＋０４）では、全ての構築物についてノックダウンの増加を示さなかった。
【０３１９】
Ｆ．ヒト運動ニューロン前駆細胞（ＨＭＮＰ）における構築物の活動
実施例８Ｅに記載されるような上位１８のｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ構築物およびｍＣｈｅｒｒｙの対照を、１０Ｅ５のＭＯＩでヒト運動ニューロン前駆細胞（ＨＭＮＰ）に感染させた。４８時間後、内在性ｍＲＮＡ発現を評価した。約半数の構築物がＨＭＮＰのＳＯＤ１を５０％以上サイレンシングさせ、その内の４つが７０％以上サイレンシングさせた（図７）。
【０３２０】
Ｇ．ｉｎ  ｖｉｖｏ研究用の構築物の選抜
標的配列に大きな影響を及ぼし、カセットにわずかな影響を及ぼした上位１２の構築物が選択される。ＡＡＶ−ｒｈ１０キャプシド内にパッケージングされた構築物を注射用に製剤し、構築物が及ぼすｉｎ  ｖｉｖｏへの影響を研究するため哺乳類に投与した。
【０３２１】
実施例９：構築物のＩｎ  Ｖｉｔｒｏ研究
ＡＡＶ２にパッケージングされた実施例８Ｄに記載の１８の構築物およびｍＣｈｅｒｒｙ対照をこの研究に使用した。この研究には、培地（５００ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ−１２  ＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）補充物（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ＃．１０５６５−０１８）、５０ｍｌのＦＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ＃１６０００−０４４、ｌｏｔ：１３４７５５６）、５ｍｌのＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（１００ｘ）（Ｃａｔ．＃１１１４０−０５０）、および５ｍｌのＨＥＰＥＳ（１Ｍ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ＃１５６３０−０８０））中のＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｔ．＃  ＨＣＬ４５１７）、培地（５００ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ−１２  ＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）補充物（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ＃．１５６３０−０８０）、５０ｍｌのＦＢＳ（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ＃１６０００−０４４、ｌｏｔ：１３４７５５６）、５ｍｌのＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（１００ｘ）（Ｃａｔ．＃  １１１４０−０５０）、および５ｍｌのＨＥＰＥＳ（１Ｍ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ＃１５６３０−０８０））中のＵ２５１ＭＧ細胞（Ｐ１８）（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ＃．  ０９０６３００１−１ＶＬ）、または、培地（ＡＧＭ  ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔ  Ｋｉｔ  Ｓｕｐｐｌ＆Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ、Ｃａｔ＃  ＣＣ−４１２３）を補充した５００ｍｌのＡＢＭ基礎培地（Ｌｏｎｚａ、Ｃａｔ＃  ＣＣ−３１８６））中の正常ヒト星状細胞（ＨＡ）（Ｌｏｎｚａ、Ｃａｔ＃  ＣＣ−２５６５）を用いて構築物を試験した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（９６ウェルプレートに５×１０Ｅ４細胞／ウェル）、Ｕ２５１ＭＧ細胞（９６ウェルプレートに２×１０Ｅ４細胞／ウェル）およびＨＡ細胞（９６ウェルプレートに２×１０Ｅ４細胞／ウェル）を播種し、細胞の感染に使用したＭＯＩは１．０  Ｅ＋０５であった。４８時間後に細胞を分析したが、その結果を表１３に表す。
【０３２２】
【表１３】
2017535266.tif 000031
ほとんどの構築物について、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において８０％以上のノックダウンが観察された。Ｕ２５１ＭＧ細胞およびＨＡ細胞において、構築物の半分以上が８０％を超えるノックダウンを示した。
【０３２３】
実施例１０：用量依存性のＳＯＤ１の減少
実施例８Ｅに記載されたトップ１８のｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ構築物４つとｍＣｈｅｒｒｙの対照を、１．０Ｅ＋０２、１．０Ｅ＋０３、１．０Ｅ＋０４、１．０Ｅ＋０５または１．０Ｅ＋０６のＭＯＩで、ヒト星状細胞株（Ｕ２５１ＭＧ）または初代ヒト星状細胞（ＨＡ）にトランスフェクトした。４８時間後に内因性ｍＲＮＡ発現を評価したが、その用量依存的サイレンシングを図８（Ｕ２５１ＭＧ）と図９（ＨＡ）に示す。すべての構築物について、用量の増加はまた、ノックダウンされたＳＯＤ１  ｍＲＮＡの量の増加と相関した。
【０３２４】
実施例１１：ＳＯＤ１ノックダウンの時間的経過
ＳＯＤ１  ｓｉＲＮＡの陰性対照および陽性対照である２つのｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ構築物（ＶＯＹｍｉＲ−１２０およびＶＯＹｍｉＲ−１２２）を、ヒト星状細胞株（Ｕ２５１ＭＧ）にトランスフェクトした。図１０に示すように、相対ＳＯＤ１  ｍＲＮＡを６０時間測定した。ｈＳＯＤ１のノックダウンのうち７０〜７５％は、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒトランスフェクション後の両方のｐｒｉ−ｍｉＲ構築物について見られたが、中でも１２〜２４時間の間に最大のノックダウンを示した。
【０３２５】
実施例１２：ＳＯＤ１ノックダウンと鎖のパーセント
ＶＯＹｍｉＲ−１０４を、５０ｐＭ、１００ｐＭおよび１５０ｐＭの濃度でＨｅＬａ細胞にトランスフェクトし、未処理（ＵＴ）細胞と比較した。相対的なＳＯＤ１  ｍＲＮＡ、ガイド鎖のパーセントおよびパッセンジャー鎖のパーセントを、図１１Ａ−１１Ｃに示すように、３６、７２、１０８および１４４時間で決定した。最も高い濃度（１５０ｐＭ
）は発現の最大低下を示したが、３つの用量すべてがＳＯＤ１の発現の有意な減少を示した。
【０３２６】
実施例１３：ＳＯＤ１を標的とする構築物
構築物をイヌＳＯＤ１のために設計した。その構築物を表１４に示す。イヌＳＯＤ１は、本発明で標的とする領域において、ヒトと１００％保存されている。パッセンジャー鎖およびガイド鎖の配列は、表に記載されている。表１４において、配列の名称の「ｍｉＲ」構成要素は、必ずしもｍｉＲＮＡ遺伝子の配列番号付けに対応するわけではない（例えば、ｄＶＯＹｍｉＲ−１０２は配列の名称であり、必ずしもｍｉＲ−１０２が配列の一部であることを意味するものではない）。
【０３２７】
【表１４】
2017535266.tif 000032
実施例１４：調節ポリヌクレオチドの位置が及ぼす影響
Ａ．ウイルス力価への影響
図１２に示すように、ｓｉＲＮＡ分子（ＶＯＹｍｉＲ−１１４またはＶＯＹｍｉＲ−１２６）を６つの異なる位置で発現ベクター（ゲノムサイズ２４００ヌクレオチド；ｓｃＡＡＶ）に組み込んだ。図１２では、「ＩＴＲ」は逆方向末端反復であり、「Ｉ」はイントロンを表し、「Ｐ」はポリＡであり、「ＭＰ」はｓｉＲＮＡ分子を含む調節ポリヌクレオチドを示す。ウイルス力価を、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲを用いて位置６および対照（調節ポリヌクレオチドなしの構築物；ｓｃＡＡＶ）について評価し、その結果を表１５に示す。
【０３２８】
【表１５】
2017535266.tif 000033
Ｂ．ゲノムの完全性への影響
ｓｉＲＮＡ分子（ＶＯＹｍｉＲ−１１４）を、図１２に示すように、６つの異なる位置の発現ベクター（ゲノムサイズ２４００ヌクレオチド；ｓｃＡＡＶ）および調節ポリヌクレオチドなしの対照（ｓｃＡＡＶ）に組み込んだ。図１２では、「ＩＴＲ」は逆方向末端反復であり、「Ｉ」はイントロンを表し、「Ｐ」はポリＡであり、「ＭＰ」はｓｉＲＮＡ分子を含む調節ポリヌクレオチドを示す。精製されたＡＡＶ調製物からウイルスゲノムを抽出し、中性アガロースゲル上に流した。短縮型ゲノムはすべての構築物で見られるが、その短縮型ゲノムのおよそのパーセント（合計のパーセント）を表１６に示す。
【０３２９】
【表１６】
2017535266.tif 000034
短縮型ゲノムは位置６が最大値であり位置４および５が最小値だった。
【０３３０】
Ｃ．ノックダウン効率への影響
図１２に示すように、６つの異なる位置でｓｉＲＮＡ分子（ＶＯＹｍｉＲ−１１４）を発現ベクター（ＡＡＶ２）（ゲノムサイズ２４００ヌクレオチド；ｓｃＡＡＶ）に組み込んだ。図１２では、「ＩＴＲ」は逆方向末端反復であり、「Ｉ」はイントロンを表し、「Ｐ」はポリＡであり、「ＭＰ」はｓｉＲＮＡ分子を含む調節ポリヌクレオチドを示す。１ｘ１０４ｖｇ／細胞，１ｘ１０３ｖｇ／細胞および１ｘ１０２ｖｇ／細胞でＨｅＬａ細胞の形質導入を実施した。ＳＯＤ１  ｍＲＮＡの発現（対照の％（ｅＧＦＰ）として）を感染の７２時間後に測定した結果を表１７に示す。
【０３３１】
【表１７】
2017535266.tif 000035
位置３は最も高いＳＯＤ１  ｍＲＮＡ発現を示し（対照の％として）、位置４は最も低いＳＯＤ１  ｍＲＮＡ発現を示した（対照の％として）。
【０３３２】
実施例１５：ゲノムサイズの影響
Ａ．ウイルス力価への影響
図１２に示すように、ｓｉＲＮＡ分子（ＶＯＹｍｉＲ−１１４）を位置１、２、５および６の発現ベクター（ゲノムサイズ２ｋｂ；ｓｃＡＡＶ）に組み込んだ。図１２では、「ＩＴＲ」は逆方向末端反復であり、「Ｉ」はイントロンを表し、「Ｐ」はポリＡであり、「ＭＰ」はｓｉＲＮＡ分子を含む調節ポリヌクレオチドを示す。ｓｉＲＮＡ分子を含まな
い二本鎖対照（ゲノムサイズ１．６ｋｂ；ｓｃＡＡＶ  ｃｔｒｌ）と、二本鎖発現ベクター（ｓｃＡＡＶ  ｍｉＲ１１４；ＩＴＲ（１０５ヌクレオチド）−プロモーター（〜９００ヌクレオチド）−ｓｉＲＮＡ分子（１５８ヌクレオチド）  −  ポリＡ配列（１２７ヌクレオチド）およびＩＴＲを含む調節ポリヌクレオチド、ならびにｓｉＲＮＡ分子を含まない対照（ｅＧＦＰ；ｓｃＡＡＶ）を比較した。ウイルス力価をＴａｑＭａｎ  ＰＣＲを用いて測定した結果を表１８に示す。
【０３３３】
【表１８】
2017535266.tif 000036
位置５の構築物で最も低いウイルス力価、位置２の構築物で最も高いウイルス力価が観察された。
【０３３４】
Ｂ．ゲノムの完全性への影響
図１２に示すように、ｓｉＲＮＡ分子（ＶＯＹｍｉＲ−１１４）を位置１、２、５および６の発現ベクター（ゲノムサイズ２ｋｂ；ｓｃＡＡＶ）に組み込んだ。図１２では、「ＩＴＲ」は逆方向末端反復であり、「Ｉ」はイントロンを表し、「Ｐ」はポリＡであり、「ＭＰ」はｓｉＲＮＡ分子を含む調節ポリヌクレオチドを示す。ｓｉＲＮＡ分子を含まない二本鎖対照（ゲノムサイズ１．６ｋｂ；ｓｃＡＡＶ  ｃｔｒｌ）と、二本鎖発現ベクター（ｓｃＡＡＶ  ｍｉＲ１１４；ＩＴＲ（１０５ヌクレオチド）−プロモーター（〜９００ヌクレオチド）−ｓｉＲＮＡ分子（１５８ヌクレオチド）−ポリＡ配列（１２７ヌクレオチド）およびＩＴＲを含む調節ポリヌクレオチド、ならびにｓｉＲＮＡ分子を含まない対照（ｅＧＦＰ；ｓｃＡＡＶ）を比較した。短縮型のゲノムはすべての構築物で見られ、その短縮型ゲノムのおよそのパーセント（全体中のパーセント）を表１９に示す。
【０３３５】
【表１９】
2017535266.tif 000037
全ての構築物はいくつかの短縮型ゲノムを有することが断定された。
【０３３６】
異なるｓｉＲＮＡ分子の効果を究明するためのさらなる研究を行った。図１２に示すように、ＶＯＹｍｉＲ−１１４およびＶＯＹｍｉＲ−１２６を、位置３で別個の発現ベクター（ゲノムサイズ１．６ｋｂ；ｓｃＡＡＶ）に挿入した。図１２では、「ＩＴＲ」は逆方
向末端反復であり、「Ｉ」はイントロンを表し、「Ｐ」はポリＡであり、「ＭＰ」はｓｉＲＮＡ分子を含む調節ポリヌクレオチドを示す。ＶＯＹｍｉＲ−１１４構築物の場合、ベクターゲノムの５’末端（１５２６ヌクレオチド）と調節ポリヌクレオチドの中心（可撓性ループの中央）の間の距離は１１１５ヌクレオチドである。ＶＯＹｍｉＲ−１２６構築物の場合、ベクターゲノムの５’末端（１６２６ヌクレオチド）と調節ポリヌクレオチドの中心（可撓性ループの中央）との間の距離は１１６４ヌクレオチドである。
【０３３７】
ＶＯＹｍｉＲ−１１４構築物について、ウイルス力価（１５ｃｍ培養皿当たりのＶＧ）は約１．１Ｅ＋１１であった。ＶＯＹｍｉＲ−１２６構築物について、イントロンプローブウイルス力価（１５ｃｍ培養皿当たりのＶＧ）は約１．２Ｅ＋１２であった。対照は約２．１Ｅ＋１１（１５ｃｍ培養皿当たりのＶＧ）であった。ＶＯＹｍｉｒ−１１４は約２０％の短縮型ゲノムを有し、ＶＯＹｍｉＲ−１２６は約１５％の短縮型ゲノムを有し、対照は約５％の短縮型ゲノムを有した。
【０３３８】
実施例１６：一本鎖構築物の影響
Ａ．ウイルス力価への影響
図１２に示すように、位置１、３および５の発現ベクター（ゲノムサイズ４．７ｋｂ；ｓｓＡＡＶ）にｓｉＲＮＡポリヌクレオチド（ＶＯＹｍｉＲ−１１４）を組み込んだ。またｓｉＲＮＡポリヌクレオチド（ゲノムサイズ２ｋｂ；ｓｓＡＡＶ）なしで試験した対照もあった。図１２では、「ＩＴＲ」は逆方向末端反復であり、「Ｉ」はイントロンを表し、「Ｐ」はポリＡであり、「ＭＰ」はｓｉＲＮＡ分子を含む調節ポリヌクレオチドを示す。ウイルス力価をＴａｑＭａｎ  ＰＣＲを用いて評価した結果を表２０に示す。
【０３３９】
【表２０】
2017535266.tif 000038
位置３が最も高いウイルス力価を示し、位置１そして位置５の順で続いた。
【０３４０】
Ｂ．ゲノムの完全性への影響
図１２に示すように、位置１、３および５の発現ベクター（ゲノムサイズ４．７ｋｂ；ｓｓＡＡＶ）にｓｉＲＮＡ分子（ＶＯＹｍｉＲ−１１４）を組み込んだ。また調節性ポリヌクレオチドなしで試験した対照もあった（ゲノムサイズ２ｋｂ；ｓｓＡＡＶ）。図１２では、「ＩＴＲ」は逆方向末端反復であり、「Ｉ」はイントロンを表し、「Ｐ」はポリＡであり、「ＭＰ」はｓｉＲＮＡ分子を含む調節ポリヌクレオチドを示す。精製されたＡＡＶ調製物からウイルスゲノムを抽出し、中性アガロースゲル上に流した。すべての構築物に短縮型ゲノムが観察され、短縮型ゲノムのおよそのパーセント（全体中のパーセント）を表２１に示す。
【０３４１】
【表２１】
2017535266.tif 000039
短縮型ゲノムは位置５が最大値であり位置３が最小値であった。
【０３４２】
Ｃ．ノックダウン効率への影響
図１２に示すように、位置１、３および５の発現ベクター（ゲノムサイズ４．７ｋｂ；ｓｓＡＡＶ）にｓｉＲＮＡ分子（ＶＯＹｍｉＲ−１１４）を組み込んだ。ｓｉＲＮＡ分子を含まない一本鎖対照（ゲノムサイズ２ｋｂ；ｓｓＡＡＶ  ｃｔｒｌ）、ｓｉＲＮＡ分子を含まない二本鎖対照（ゲノムサイズ１．６ｋｂ；ｓｃＡＡＶ  ｃｔｒｌ）、ｓｉＲＮＡ分子を含む二本鎖発現ベクター（ゲノムサイズ２．４ｋｂ；ｓｃＡＡＶ  ｍｉＲ１１４）が存在した。図１２では、「ＩＴＲ」は逆方向末端反復であり、「Ｉ」はイントロンを表し、「Ｐ」はポリＡであり、「ＭＰ」はｓｉＲＮＡ分子を含む調節ポリヌクレオチドを示す。１ｘ１０４ｖｇ／細胞，１ｘ１０３ｖｇ／細胞および１  ｘ  １０２  ｖｇ／細胞でＨｅＬａ細胞の形質導入を実施した。ＳＯＤ１  ｍＲＮＡ発現（対照（ｅＧＦＰ）の％として）を感染の７２時間後に測定し、その結果を表２２に示す。
【０３４３】
【表２２】
2017535266.tif 000040
位置３は最も高いＳＯＤ１  ｍＲＮＡ発現（対照の％として）を有し、次いで位置１であり、最も低いＳＯＤ１  ｍＲＮＡ発現を有する一本鎖構築物（対照の％として）は位置５であった。一本鎖構築物のいずれも、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドを用いた二本鎖対照ほど低いノックダウン効率を有さなかった。
【０３４４】
実施例１７：ｉｎ  ｖｉｖｏ  でのＳＯＤ１ノックダウン
ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの  ｉｎ  ｖｉｖｏ生物活性を測定するために、自己相補のｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ（ＶＯＹｍｉＲ−１１４．８０６、ＶＯＹｍｉＲ１２７．８０６、ＶＯＹｍｉＲ１０２．８６０、ＶＯＹｍｉＲ１０９．８６０、ＶＯＹｍｉＲ１１４．８６０、ＶＯＹｍｉＲ１１６．８６０、ＶＯＹｍｉＲ１２７．８６０、ＶＯＹｍｉＲ１０２．８６１、ＶＯＹｍｉＲ１０４．８６１、ＶＯＹｍｉＲ１０９．８６１、ＶＯＹｍｉＲ１１４．８６１、ＶＯＹｍｉＲ１０９．８６６、ＶＯＹｍｉＲ１１６．８６６、またはＶＯＹｍｉＲ１２７．８６６）がＣＢＡプロモーターを有するＡＡＶ−ＤＪにパッケージングされた。
【０３４５】
マウスにおいて、これらのパッケージされたｐｒｉ−ｍｉＲＮＡまたはビヒクルのみの対照（５％ソルビトールおよび０．００１％Ｆ−６８を含むリン酸緩衝化生理食塩水）を、１０分間の点鼻内注入によって投与した。ヒトＳＯＤ１を発現し、体重約２０〜３０ｇの雌または雄のＴｇ（ＳＯＤ１）３Ｃｊｅ／Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、バーハーバー、メイン州）に線条体を標的とする５μＬの被験物質の片側注入をする（ブレグマに対し、前後＋０．５ｍｍ、中外＋２ｍｍ。頭蓋骨表面に対し、背腹３．８ｍｍ）。被験物質を、３３ゲージ針を用いて、予め充填されポンプ制御されたハミルトンマイクロシリンジ（１７０１モデル、１０μｌ）を用いて、毎分０．５ｕＬで注射する（被験物質当たり５匹の動物）。注射後１、２、３、４または６週間で動物を屠殺し、脳を摘出し、１ｍｍの冠状スラブからの注入部位を包含する同側の線条ならびに隣接する１ｍｍの冠状スラブからの線条体組織を解剖し、瞬間凍結させる。マウス組織サンプルを溶解し、ヒトＳＯＤ１タンパク質レベル、ＳＯＤ１およびマウスＧＡＰＤＨ（ｍＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡレベルを定量する。ＳＯＤ１タンパク質レベルを、ＥＬＩＳＡ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、サンディエゴ、カリフォルニア州））により定量し、全タンパク質レベルをＢＣＡ分析（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、マサチューセッツ州）によって定量する。各組織サンプルについて、全タンパク質に対して標準化されたＳＯＤ１タンパク質のレベルは、２回の測定の平均値で計算される。これら標準化したＳＯＤ１タンパク質レベルをビヒクル群に対してさらに標準化し、次に平均して群（治療群）の平均を得る。ＳＯＤ１およびｍＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡレベルをｑＲＴ−ＰＣＲによって定量する。各組織サンプルについて、ＳＯＤ１／ｍＧＡＰＤＨ（標準化したＳＯＤ１  ｍＲＮＡレベル）の比率を、３回の測定の平均値で計算する。次いで、これらの比率を平均して群（治療群）の平均値を得る。これらの群の平均は、ビヒクル群に対してさらに標準化される。
【０３４６】
ヒト以外の霊長類においては、被験物質（ＣＢＡプロモーターを有するＡＡＶ−ＤＪにパッケージされたｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの１×１０１３−３ｘ１０１３ｖｇ）またはビヒクルは、髄腔内腰椎ボーラスにより投与される。約２．５〜８．５ｋｇの体重のメスのカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ、ＣＲ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｍｏｄｅｌ  Ｈｏｕｓｔｏｎ、ヒューストン、テキサス州）には、腰椎に位置するカテーテルの先端を有する移植された単一髄腔内カテーテルを受け入れる。被験物質を、約６０分間隔で、１ｍＬボーラス注射（毎分１ｍＬ）を３回投与する（被験物質当たり４匹の動物）。投与後４〜６週間で動物を屠殺し、選択した組織を採取して生物分析および組織学的評価を行う。ＳＯＤ１タンパク質およびｍＲＮＡレベルを、ビヒクル群に対して、ＣＢＡプロモーターを有するＡＡＶ−ＤＪにパッケージングされたｐｒｉ−ｍｉＲＮＡでの治療後における抑制について評価する。
【０３４７】
実施例１８：ＶＯＹｍｉＲ−１１４．８０６を用いたｉｎ  ｖｉｖｏでのＳＯＤ１ノックダウン
Ｔｇ（ＳＯＤ１）３Ｃｊｅ／Ｊマウスにおいて、実施例１７に記載のように、ＣＢＡプロモーターを有するＡＡＶＤＪ中にＶＯＹｍｉＲ−１１４．８０６をパッケージングした。マウスに、一方向性線条体投与によって投与した。投与量は３．７ｘ１０９ｖｇであった。１週間または２週間後、標準化したＳＯＤ１タンパク質レベルの有意な減少はなかった。ビヒクル対照群のＳＯＤ１タンパク質濃度は、１週間および２週間後にそれぞれ９８＋１１％（標準偏差）および９８＋１０％であった。第３週までに、ＶＯＹｍｉＲ−１１４．８０６は、標準化ＳＯＤ１タンパク質レベルをビヒクル対照群の８４±１％±２％９．０％に減少させたが、これは統計的に有意であった（ｐ  ＜０．０５、Ｄｕｎｎｅｔｔのポストホック分析による一元配置ＡＮＯＶＡ）。第４週および第６週までに、ＶＯＹｍｉＲ−１１４．８０６は、正常化ＳＯＤ１タンパク質レベルをそれぞれビヒクル対照グループの７３＋７．９％（ｐ＜０．０００１）および７５＋７．４％（ｐ＜０．０００１）
減少させた。これらの結果は、ＣＢＡプロモーターを有するＡＡＶ−ＤＪにパッケージングされたＶＯＹｍｉＲ−１１４．８０６が、ＳＯＤ１タンパク質レベルをダウンモジュレーションするのにｉｎ  ｖｉｖｏで有効であることを実証している。さらに、これらの結果は、ＣＢＡプロモーターを有するＡＡＶＤＪ中にパッケージングされたＶＯＹｍｉＲ−１１４．８０６の３．７  ｘ１０９ｖｇの総線条体用量がＳＯＤ１タンパク質レベルの有意なダウンモジュレーションをもたらしたことを実証する。
【０３４８】
本発明は、記載された幾つかの実施形態に関して、ある程度の長さで、ある程度の特殊性を以て説明されているが、本発明は、そのような特殊性、実施形態、または任意の特定の実施形態に限定されるように意図されておらず、本発明は、添付の特許請求の範囲を参照して解釈されるべきである。その理由は、先行技術を考慮してそのような請求の範囲を可能な限り広く解釈するためであり、また本発明の意図する範囲を効果的に包含するためである。
【０３４９】
本明細書で言及された全ての刊行物、特許出願、特許およびその他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が支配する。さらに、セクション見出し、材料、方法、および実施例は、例示的なものに過ぎず、限定することを意図するものではない。
【図１】
2017535266.tif 000041
【図２】
2017535266.tif 000042
【図３】
2017535266.tif 000043
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2017535266.tif 000047
【図８】
2017535266.tif 000048
【図９】
2017535266.tif 000049
【図１０】
2017535266.tif 000050
【図１１Ａ】
2017535266.tif 000051
【図１１Ｂ】
2017535266.tif 000052
【図１１Ｃ】
2017535266.tif 000053
【図１２】
2017535266.tif 000054
【配列表】
2017535266000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成28年6月17日(2016.6.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つの逆方向末端反復（ＩＴＲ）の間に位置する核酸配列を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、前記核酸配列は、それが発現した場合に、細胞中のＳＯＤ１の遺伝子発現を阻害または抑制し、前記核酸配列は、センス鎖配列およびアンチセンス鎖配列を含み、前記センス鎖配列は、表３、表１１または表１４に列挙された配列のヌクレオチド配列と３ヌクレオチド以下で異なる少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含み、前記アンチセンス鎖配列は、表３、表１１または表１４に列挙された配列のヌクレオチド配列と３ヌクレオチド以下で異なる少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含み、前記センス鎖配列およびアンチセンス鎖配列は、少なくとも４ヌクレオチド長の相補性領域を共有する、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター。
【請求項２】
前記核酸配列が、ｓｉＲＮＡ二本鎖のセンス鎖配列およびアンチセンス鎖配列を含む、請求項１に記載のＡＡＶベクター。
【請求項３】
前記ｓｉＲＮＡ二本鎖が、ｓｉＲＮＡ二本鎖ＩＤ番号Ｄ−２７４１〜ＩＤ番号Ｄ−２９８５からなる群から選択される、請求項２に記載のＡＡＶベクター。
【請求項４】
前記ｓｉＲＮＡ二本鎖が、ｓｉＲＮＡ  ＩＤ：Ｄ−２７５７、Ｄ−２８０６、Ｄ−２８６０、Ｄ−２８６１、Ｄ−２８７５、Ｄ−２８７１、Ｄ−２７５８、Ｄ−２７５９、Ｄ−２８６６、Ｄ−２８７０、Ｄ−２８２３、およびＤ−２８５８の核酸配列からなる群から選択される、請求項２に記載のＡＡＶベクター。
【請求項５】
前記相補性領域が少なくとも１７ヌクレオチドの長さである、請求項１に記載のＡＡＶベクター。
【請求項６】
前記相補性領域が１９から２１ヌクレオチドの長さである、請求項５に記載のＡＡＶベクター。
【請求項７】
前記相補性領域が１９ヌクレオチドの長さである、請求項６に記載のＡＡＶベクター。
【請求項８】
前記センス鎖配列およびアンチセンス鎖配列が、独立して、３０ヌクレオチド以下である、請求項１に記載のＡＡＶベクター。
【請求項９】
前記センス鎖配列およびアンチセンス鎖配列の少なくとも１つが、少なくとも１ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む、請求項１に記載のＡＡＶベクター。
【請求項１０】
前記センス鎖配列およびアンチセンス鎖配列の少なくとも１つが、少なくとも２ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む、請求項９に記載のＡＡＶベクター。
【請求項１１】
前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９（ｈｕ１４）、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ−ＤＪ８およびＡＡＶ−ＤＪおよびそれらの変異体からなる群から選択されるキャプシド血清型を含む、請求項１に記載のＡＡＶベクター。
【請求項１２】
細胞中のＳＯＤ１遺伝子の発現を阻害する方法であって、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターを含む組成物を前記細胞に投与することを含む方法。
【請求項１３】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記哺乳類細胞が運動ニューロンである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記哺乳類細胞が星状細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
治療を必要とする対象における筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の治療および改善の少なくとも一方を行う方法であって、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターを含む組成物の治療有効量を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項１７】
前記ＳＯＤ１の発現が阻害または抑制される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＳＯＤ１が野生型ＳＯＤ１、少なくとも１つの突然変異を有する突然変異ＳＯＤ１、または野生型ＳＯＤ１および少なくとも１つの突然変異を有する突然変異ＳＯＤ１である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＳＯＤ１の発現が、約２０％〜約１００％阻害または抑制される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＡＬＳが、同定されたＳＯＤ１遺伝子突然変異を有する家族性ＡＬＳである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＡＬＳが散発性ＡＬＳである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
ＳＯＤ１遺伝子が細胞内で機能効果をもたらす変異を含む細胞におけるＳＯＤ１遺伝子の発現を抑制する方法であって、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターを含む組成物を前記細胞に投与することを含む方法。
【請求項２３】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記哺乳動物細胞が運動ニューロンである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記哺乳類細胞が星状細胞である、請求項２３に記載の方法。
【国際調査報告】
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