(57)【要約】  本開示は、腫瘍内微小環境に影響を与える、可溶性のβ−グルカンと免疫抑制緩和剤との組み合わせに関する。可溶性のβ−グルカンは、免疫刺激環境を促進して、抗血管新生薬、非腫瘍標的化抗体を含むチェックポイント阻害剤の効果の増強を可能にする。【選択図】図１Ａ
2017535543.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
可溶性のβ−グルカンと、
非腫瘍標的化免疫抑制緩和剤とを含む、
免疫療法で使用される組成物。
【請求項２】
非腫瘍標的化免疫抑制緩和剤は抗ＰＤ−１抗体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
腫瘍標的化抗体をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
免疫療法はＩＬ−２を含まない、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
チェックポイント阻害剤はニボルマブである、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
可溶性のβ−グルカンは酵母由来である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
可溶性のβ−グルカンはβ−１，３／１，６グルカンを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
可溶性のβ−グルカンはβ（１，６）−［ポリ−（１，３）−Ｄ−グルコピラノシル］−ポリ−β（１，３）−Ｄ−グルコピラノースを含む、請求項１−７のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
単一製剤で提供される、請求項１−８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
可溶性のβ−グルカン成分と抗体成分は別々の製剤で提供される、請求項１−９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
可溶性のβ−グルカンによる免疫療法での使用のための可溶性のβ−グルカンと抗ＰＤ−１抗体の使用。
【請求項１２】
抗ＰＤ−１抗体は非補体活性化の非腫瘍標的化抗体である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
可溶性のβ−グルカンによる免疫療法はＩＬ−２を含まない、請求項１１に記載の使用。
【請求項１４】
腫瘍標的化抗体をさらに含む、請求項１１−１３のいずれかに記載の使用。
【請求項１５】
可溶性のβ−グルカンは酵母由来である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１６】
可溶性のβ−グルカンはβ−１，３／１，６グルカンを含む、請求項１１に記載の使用。
【請求項１７】
可溶性のβ−グルカンはβ（１，６）−［ポリ−（１，３）−Ｄ−グルコピラノシル］−ポリ−β（１，３）−Ｄ−グルコピラノースを含む、請求項１１に記載の使用。
【請求項１８】
ＴＧＦ−β阻害剤を含まない可溶性のβ−グルカンによる免疫療法で使用するための可溶性のβ−グルカンと抗血管新生薬の使用。
【請求項１９】
抗血管新生薬は抗ＶＥＧＦ抗体または抗ＶＥＧＦＲ２抗体である、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
可溶性のβ−グルカンは酵母由来である、請求項１８に記載の使用。
【請求項２１】
可溶性のβ−グルカンはβ−１，３／１，６グルカンを含む、請求項１８に記載の使用。
【請求項２２】
可溶性のβ−グルカンはβ（１，６）−［ポリ−（１，３）−Ｄ−グルコピラノシル］−ポリ−β（１，３）−Ｄ−グルコピラノースを含む、請求項１８に記載の使用。
【請求項２３】
癌を処置する方法であって、
可溶性のβ−グルカンと非腫瘍標的化免疫抑制緩和剤とを含む組成物を併用投与する工程を含む、方法。
【請求項２４】
可溶性のβ−グルカンと非腫瘍標的化免疫抑制緩和剤は同時に併用投与される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
可溶性のβ−グルカンと非腫瘍標的化免疫抑制緩和剤は異なる時間に併用投与される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
非腫瘍標的化免疫抑制緩和剤は抗ＰＤ−１抗体である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
癌を処置する方法はＩＬ−２を投与する工程を含まない、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
癌を処置する方法であって、
可溶性のβ−グルカンと抗血管新生薬を含み、ＴＧＦ−β阻害剤を含まない組成物を併用投与する工程を含む、方法。
【請求項２９】
抗血管新生薬は抗ＶＥＧＦ抗体または抗ＶＥＧＦＲ２抗体である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
可溶性のβ−グルカンと抗血管新生薬は同時にまたは異なる時間に併用投与される、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１４年１１月６日に出願された米国仮特許出願第６２／０７６，０９４号と、２０１５年２月１３日に出願された第６２／１１５，８９５号と、２０１５年４月２０日に出願された第６２／１４９，８９２号と、２０１５年９月２９日に出願された第６２／２３４，２７６号と、２０１５年１０月８日に出願された第６２／２３９，００５号に対する優先権を主張し、当該文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
本開示は、可溶性のβ−グルカンと、免疫抑制緩和型の抗癌剤を含む腫瘍内微小環境に影響を与える抗癌剤との組み合わせに関する。β−グルカンは真菌のＰＡＭＰであり、好中球と単球を含む、先天性の免疫細胞上の３型補体受容体（ＣＲ３）であるパターン認識受容体と同様に、血清中のパターン認識分子Ｃ３によって認識される。酵母由来の多糖類β−グルカンである、β−グルカン（β−（１，６）−［ポリ−１，３）−Ｄ−グルコピラノシル］−ポリ−β（１，３）−Ｄ−グルコピラノース）は、複数の癌の処置のために抗腫瘍モノクローナル抗体と組み合わせた免疫療法薬として開発されている。β−グルカンにより、先天性の免疫エフェクター細胞は補体ＣＲ３依存型メカニズムによって補体でコーティングされた腫瘍細胞を殺すことができる。多くの動物腫瘍モデルは、補体を活性化する、腫瘍を標的とする抗体と組み合わせて可溶性のβ−グルカンを投与することにより、いずれか一方のみを投与した場合と比較して、腫瘍の増殖を有意に抑えるとともに、全体の生存を改善することを実証した。
【０００３】
しかしながら、癌は単なる悪性細胞の塊というわけではなく複雑な「器官」であり、他の多くの非形質転換細胞を補充したり使用したりする。悪性細胞と非形質転換細胞の間の相互作用により、腫瘍内微小環境（ＴＭＥ）が作られる。ＴＭＥの非悪性細胞は発癌の様々な工程で動的な機能、しばしば腫瘍促進機能を有する。サイトカイン、ケモカイン、成長因子、および炎症性酵素とマトリックスリモデリング酵素の複雑かつ動的なネットワークは、罹患組織内で細胞間通信を行わせる。したがって、効果的に癌を克服するためには、ＴＭＥの腫瘍を促進する性質を抑える治療を開発せねばならない。
【発明の概要】
【０００４】
本開示は、１つの態様において、腫瘍内微小環境に影響を与える抗癌剤と組み合わせた可溶性のβ−グルカンの使用と組成物について記載している。１つの実施形態では、抗癌剤はチェックポイント阻害剤であってもよい。別の実施形態では、抗癌剤は抗血管新生薬であってもよい。併用療法はさらに腫瘍を標的とする抗体を含んでもよい。
【０００５】
上記の要約は、本明細書に記載されるテクノロジーの開示された各実施形態またはすべての実施について記載することを意図したものではない。とりわけ、以下の記載は例示的な実施形態を例証している。本出願全体にわたって複数の場所では、ガイダンスは実施例の一覧によって与えられ、実施例は様々な組み合わせで使用可能である。それぞれの例では、詳述された一覧は代表的なグループとしての機能を果たすだけであり、排他的な一覧として解釈されてはならない。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１Ａ】インビトロで培養されたヒトのＭ１とＭ２のマクロファージの形態的および機能的な特徴付け。
【図１Ｂ】インビトロで培養されたヒトのＭ１とＭ２のマクロファージの形態的および機能的な特徴付け。
【図１Ｃ】インビトロで培養されたヒトのＭ１とＭ２のマクロファージの形態的および機能的な特徴付け。
【図１Ｄ】インビトロで培養されたヒトのＭ１とＭ２のマクロファージの形態的および機能的な特徴付け。
【図２Ａ】可溶性のβ−グルカンで処理されたＭ２マクロファージの形態的、表現型的、および機能的な特徴付け。
【図２Ｂ】可溶性のβ−グルカンで処理されたＭ２マクロファージの形態的、表現型的、および機能的な特徴付け。
【図２Ｃ】可溶性のβ−グルカンで処理されたＭ２マクロファージの形態的、表現型的、および機能的な特徴付け。
【図２Ｄ】可溶性のβ−グルカンで処理されたＭ２マクロファージの形態的、表現型的、および機能的な特徴付け。
【図３Ａ】高バインダーおよび低バインダーからのβ−グルカンにより処置されたＭ１とＭ２のマクロファージにおける、ＣＤ４Ｔ細胞の増殖と、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の産生の調節との評価。
【図３Ｂ】高バインダーおよび低バインダーからのβ−グルカンにより処置されたＭ１とＭ２のマクロファージにおける、ＣＤ４Ｔ細胞の増殖と、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の産生の調節との評価。
【図３Ｃ】高バインダーおよび低バインダーからのβ−グルカンにより処置されたＭ１とＭ２のマクロファージにおける、ＣＤ４Ｔ細胞の増殖と、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の産生の調節との評価。
【図３Ｄ】高バインダーおよび低バインダーからのβ−グルカンにより処置されたＭ１とＭ２のマクロファージにおける、ＣＤ４Ｔ細胞の増殖と、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の産生の調節との評価。
【図４】免疫抑制性条件下でβ−グルカンにより処置されたＭ２とＭ２ａマクロファージにおける、Ｔ細胞の増殖と、ＩＦＮ−γの調節との評価。
【図５Ａ】Ｔｒｅｇｓの存在下でのＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞の増殖と活性化に対するβ−グルカンの評価。
【図５Ｂ】Ｔｒｅｇｓの存在下でのＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞の増殖と活性化に対するβ−グルカンの評価。
【図５Ｃ】Ｔｒｅｇｓの存在下でのＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞の増殖と活性化に対するβ−グルカンの評価。
【図５Ｄ】Ｔｒｅｇｓの存在下でのＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞の増殖と活性化に対するβ−グルカンの評価。
【図５Ｅ】Ｔｒｅｇｓの存在下でのＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞の増殖と活性化に対するβ−グルカンの評価。
【図６Ａ】インビトロで培養されたヒト未熟単球由来の樹状細胞（ｉｍＭｏＤＣ）と成熟した単球由来の樹状細胞（ｍＭｏＤＣ）の特徴付け。
【図６Ｂ】インビトロで培養されたヒト未熟単球由来の樹状細胞（ｉｍＭｏＤＣ）と成熟した単球由来の樹状細胞（ｍＭｏＤＣ）の特徴付け。
【図７Ａ】ＭｏＤＣｓの成熟に対するβ−グルカンの効果の評価。
【図７Ｂ】ＭｏＤＣｓの成熟に対するβ−グルカンの効果の評価。
【図７Ｃ】ＭｏＤＣｓの成熟に対するβ−グルカンの効果の評価。
【図７Ｄ】ＭｏＤＣｓの成熟に対するβ−グルカンの効果の評価。
【図８Ａ】細胞間接触によるＭ２−β−グルカンにより増加したＣＤ４Ｔ細胞の増殖の結果。
【図８Ｂ】細胞間接触によるＭ２−β−グルカンにより増加したＣＤ４Ｔ細胞の増殖の結果。
【図８Ｃ】細胞間接触によるＭ２−β−グルカンにより増加したＣＤ４Ｔ細胞の増殖の結果。
【図９】可溶性の因子によるＭ２−β−グルカンにより増加したＣＤ４Ｔ細胞の増殖の結果。
【図１０】高バインダーＶＳ低バインダーでのβ−グルカンで処置されたＭ２マクロファージの分析。
【図１１Ａ】高バインダーからの血清の存在下で低バインダーの単球に由来するＭ２−β−グルカンの機能評価の結果。
【図１１Ｂ】高バインダーからの血清の存在下で低バインダーの単球に由来するＭ２−β−グルカンの機能評価の結果。
【図１２Ａ】免疫抑制サイトカイン（ＴＣＭ）の存在下で培養されたβ−グルカンにより処置されたＭ２マクロファージ上でのＰＤ−Ｌ１アップレギュレーション。
【図１２Ｂ】免疫抑制サイトカイン（ＴＣＭ）の存在下で培養されたβ−グルカンにより処置されたＭ２マクロファージ上でのＰＤ−Ｌ１アップレギュレーション。
【図１３】ＭｉａＰａＣａでのＰＤ−Ｌ１アップレギュレーション。
【図１４Ａ】骨髄由来のサプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）に対する可溶性のβ−グルカンの効果。
【図１４Ｂ】骨髄由来のサプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）に対する可溶性のβ−グルカンの効果。
【図１５】腫瘍細胞上でのβ−グルカンにより誘発されたＰＤ−Ｌ１発現の評価。
【図１６Ａ】ＤＣ１０１抗体と組み合わせたＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧを使用するマウス研究の結果。
【図１６Ｂ】ＤＣ１０１抗体と組み合わせたＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧを使用するマウス研究の結果。
【図１６Ｃ】ＤＣ１０１抗体と組み合わせたＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧを使用するマウス研究の結果。
【図１６Ｄ】ＤＣ１０１抗体と組み合わせたＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧを使用するマウス研究の結果。
【図１７Ａ】可溶性のβ−グルカンとベバシズマブの腫瘍内微小環境に対するインビボ効果。
【図１７Ｂ】可溶性のβ−グルカンとベバシズマブの腫瘍内微小環境に対するインビボ効果。
【図１７Ｃ】可溶性のβ−グルカンとベバシズマブの腫瘍内微小環境に対するインビボ効果。
【図１７Ｄ】可溶性のβ−グルカンとベバシズマブの腫瘍内微小環境に対するインビボ効果。
【図１７Ｅ】可溶性のβ−グルカンとベバシズマブの腫瘍内微小環境に対するインビボ効果。
【図１７Ｆ】可溶性のβ−グルカンとベバシズマブの腫瘍内微小環境に対するインビボ効果。
【図１７Ｇ】可溶性のβ−グルカンとベバシズマブの腫瘍内微小環境に対するインビボ効果。
【図１７Ｈ】可溶性のβ−グルカンとベバシズマブの腫瘍内微小環境に対するインビボ効果。
【図１７Ｉ】可溶性のβ−グルカンとベバシズマブの腫瘍内微小環境に対するインビボ効果。
【図１７Ｊ】可溶性のβ−グルカンとベバシズマブの腫瘍内微小環境に対するインビボ効果。
【図１７Ｋ】可溶性のβ−グルカンとベバシズマブの腫瘍内微小環境に対するインビボ効果。
【図１７Ｌ】可溶性のβ−グルカンとベバシズマブの腫瘍内微小環境に対するインビボ効果。
【図１７Ｍ】可溶性のβ−グルカンとベバシズマブの腫瘍内微小環境に対するインビボ効果。
【図１７Ｎ】可溶性のβ−グルカンとベバシズマブの腫瘍内微小環境に対するインビボ効果。
【図１８Ａ】可溶性のβ−グルカンと抗ＰＤ−１抗体の腫瘍内微小環境に対する効果。
【図１８Ｂ】可溶性のβ−グルカンと抗ＰＤ−１抗体の腫瘍内微小環境に対する効果。
【図１８Ｃ】可溶性のβ−グルカンと抗ＰＤ−１抗体の腫瘍内微小環境に対する効果。
【図１９Ａ】抗ＰＤ−１抗体と組み合わせたＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧを使用するマウス研究の結果。
【図１９Ｂ】抗ＰＤ−１抗体と組み合わせたＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧを使用するマウス研究の結果。
【図１９Ｃ】抗ＰＤ−１抗体と組み合わせたＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧを使用するマウス研究の結果。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
β−グルカンは、例えば、酵母、細菌、藻類、海草、マッシュルーム、カラスムギ、およびオオムギを含む、様々な微生物源や植物源に由来するグルコースのポリマーである。これらのなかで、酵母β−グルカンはその免疫調節特性について広範に評価されている。酵母β−グルカンは、例えば、無処置の酵母、チモサン、精製された全グルカン粒子、可溶化チモサン多糖類、または高度に精製された様々な分子量の可溶性のβ−グルカンなどの様々な形態で存在することができる。構造上、酵母β−グルカンは、β−（１，６）グリコシド結合によってその骨格に結合された周期的なβ−（１，３）グルコピラノースを含むβ−（１，３）結合グルコピラノース骨格として組織されたグルコース単量体からなる。酵母β−グルカンの様々な形態は、互いに異なるように機能することができる。酵母β−グルカンがその免疫調節効果を発揮するメカニズムは、例えば、β−グルカンの様々な形態間の構造的な違い、例えば、その微粒子特性または可溶性特性、三次立体構造、主鎖の長さ、側鎖の長さ、および側鎖の頻度などによって影響を受けることがある。酵母β−グルカンは免疫刺激機能は、様々な種の様々な細胞型に関与する受容体にも依存し、これもβ−グルカンの構造特性に依存することがある。
【０００８】
一般に、（β）−グルカン免疫療法は、β−グルカンの任意の適切な形態、またはβ−グルカンの２つ以上の形態の任意の組み合わせを被験体に投与することを含み得る。適切なβ−グルカンと、その自然源からの適切なβ−グルカンの調製は、例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２００８／０１０３１１２  Ａ１号に記載されている。場合によっては、（β）−グルカンは例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの酵母に由来することもある。特定の場合には、（β）−グルカンは、可溶性の酵母に由来するβ−グルカンの高度に精製され、かつ十分に特徴付けられた形態である、ＰＧＧ（ＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧ、Ｂｉｏｔｈｅｒａ、Ｅａｇａｎ、ＭＮ）とも呼ばれる、β（１，６）−［ポリ−（１，３）−Ｄ−グルコピラノシル］−ポリ−β（１，３）−Ｄ−グルコピラノースであることもあれば、またはこれに由来することもある。さらに、β−グルカンベースの免疫療法は、例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１２／３６７９５号に記載されるような修飾されたおよび／または誘導されたβ−グルカンの使用を含み得る。他の場合には、（β）−グルカン免疫療法は、例えば、微粒子可溶性のβ−グルカン、または微粒子可溶性のβ−グルカン調製物を投与することを含むことがあり、これらは各々、例えば米国特許第７，９８１，４４７号に記載されている。
【０００９】
抗癌性免疫療法薬は、複数のモダリティ：１）先天性の免疫細胞の直接的な活性化、２）適応的な免疫細胞の直接的な活性化、３）腫瘍細胞をより免疫原性にすることにより、または腫瘍により引き起こされる免疫抑制を妨害することにより、先天性かつ適応的な免疫細胞の間接的な活性化、によって癌細胞を殺す。
【００１０】
Ｍ２マクロファージ、Ｎ２好中球、および骨髄由来のサプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を含む腫瘍内微小環境（ＴＭＥ）の骨髄性細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞の機能的な消耗を直接引き起こすことにより、またはＴ−調節性細胞（Ｔｒｅｇｓ）の抑制力を間接的に高めることにより、免疫抑制を促すことができる。これにより、ＴＭＥにおける免疫賦活性と免疫抑制性のバランスにひずみが生じる。ＴＭＥの免疫賦活性環境は、細胞傷害性Ｔ細胞とＮＫ細胞、細胞溶解性および食作用誘発性のＭ１マクロファージ、細胞毒性のＮ１好中球、体液性応答誘発Ｂ細胞、および抗原提示免疫原性樹状細胞（ＤＣ）の存在によって大部分は形作られる。インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）などのような免疫賦活性のサイトカインとケモカインは、免疫賦活性活性のコーディネーターである。ＴＭＥの免疫抑制性の性質を偏らせる免疫細胞は、抗炎症性のＴｈ２細胞、Ｎ２好中球、Ｍ２マクロファージ、Ｔｒｅｇｓ、および免疫寛容原性のＤＣである。形質転換増殖因子−ベータ（ＴＧＦ  −β）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、インターロイキン４（ＩＬ−４）などのような免疫抑制性のサイトカインとケモカインは、免疫抑制性の活性を調和させる。
【００１１】
可溶性のβ−グルカンは、骨髄起原の細胞（すなわち、好中球と単球）上でＣＤ１１ｂに結合する病原体に関連する分子パターン（ＰＡＭＰ）であるため、Ｎ１好中球とＭ１マクロファージの免疫賦活性機能に結合してこれを増大させ、ＭＤＳＣ、Ｎ２好中球、およびＭ２マクロファージの免疫抑制機能を低下させる。この調節により、ＴＭＥ中で様々な先天性かつ適応性の細胞サブセット間のクロストークを誘発し、最終的にはバランスを免疫刺激の方へと傾ける。具体的には、いったん末梢血単核球と結合すると、可溶性のβ−グルカンは、Ｍ１／抗腫瘍形成性対Ｍ２／論腫瘍形成促進性の極性化条件で単球のマクロファージへの分化を調節し、その結果、Ｍ１極性化が増強され、これによりマクロファージ免疫賦活性機能が増大し、Ｍ２極性化が抑制され、それによりマクロファージ免疫抑制機能が低下する。可溶性のβ−グルカンは、Ｍ１表現型へのＭ２再分極化に直接影響を与え、Ｔｈ１分極化を駆動し、可溶性のβ−グルカンで刺激された先天性の免疫細胞は、Ｔｒｅｇｓの存在下であってもサイトカインを生成して間接的にＣＤ４とＣＤ８のＴ細胞増殖に影響を与え、最終的にはＴｈ１極性化を駆り立てる。したがって、可溶性のβ−グルカンは、先天性の免疫系の十分な機能性を得るために、抗原提示の増強によって適応的な免疫系とのクロストークを生成させ、腫瘍を標的とする抗体、抗血管新生治療、およびチェックポイント阻害剤の抗腫瘍有効性を増強するために、ＰＡＭＰとして機能する。
【００１２】
可溶性のβ−グルカンは、先天性および適応的な免疫反応、単球由来のマクロファージ、および樹状細胞を架橋することが知られている、２つの先天性の細胞サブセットを介して適応的な免疫反応を誘発し、単球由来のマクロファージと樹状細胞の両方でのＰＤ−Ｌ１の発現をアップレギュレートする。ＰＤ−Ｌ１アップレギュレーションにもかかわらず、可溶性のβ−グルカンにより処置された単球由来のマクロファージと樹状細胞はＴ細胞の活性化と増殖を増強し、可溶性のβ−グルカンによって誘発された協調的な免疫反応は、適応的な免疫耐性と同種の腫瘍反応を誘発する（つまり、ＰＤ−Ｌ１の表面発現のアップレギュレーション）。
【００１３】
可溶性のβ−グルカンは、非補体活性化の腫瘍標的化免疫抑制緩和型ＭＡｂｓと組み合わせることが可能である。例えば、可溶性のβ−グルカンは、黒色腫、腎細胞癌、肺癌などの複数の癌の処置において、抗−ＰＤ−Ｌ１免疫チェックポイント阻害剤（Ｆｃ操作されたＩｇＧ１  ＭＡｂ）と組み合わせ可能である。抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１抗体の有効性は腫瘍上でのＰＤ−Ｌ１の発現レベルに依存し得る。腫瘍でのＰＤ−Ｌ１発現のメカニズムの１つは適応的な免疫耐性と呼ばれ、ＰＤ−Ｌ１発現は、腫瘍内微小環境（例えば、活性化Ｔ細胞によるインターフェロンガンマ産生）内での免疫反応の結果として適応的に誘発される。可溶性のβ−グルカンは、直接的または間接的にＴｈ１極性化を引き起こす。この効果は、腫瘍細胞上のＰＤ−Ｌ１の発現をアップレギュレートし、それによって抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１抗体の抗腫瘍活性を増強する。こうしたチェックポイント阻害剤の例は、ニボルマブとペムブロリズマブである。
【００１４】
可溶性のβ−グルカンは、免疫の同時刺激を増強する非補体活性化、非腫瘍標的化ＭＡｂｓと組み合わせることが可能である。いくつかの例としては、ａ）抗ＣＤ４０  ＭＡｂ（ＩｇＧ２  ＭＡｂ）、標的化樹状細胞と、ｂ）抗ＯＸ４０、抗４１ＢＢ、いくつかの癌の処置におけるＴ細胞同時刺激の促進剤が挙げられる。これらは例えばニボルマブのような抗ＰＤ−１抗体をさらに含む。
【００１５】
可溶性のβ−グルカンは非補体活性化、非腫瘍標的化免疫抑制緩和型の小分子、および／または非補体活性化、腫瘍標的化免疫抑制緩和型の小分子と組み合わせることが可能である。これを癌ワクチン中でアジュバントとして使用することでＴｈ１極性化を駆り立てることができる。これを治療的に使用して、感染の完全な排除を促すために慢性疾患（つまりＴＢ）中の抑制メカニズムを低下させることができる。最後に、これを用いて、Ｔｈ２優性の自己免疫疾患（アレルギー、喘息、アトピー性疾患）におけるＴｈ２−Ｔｈ１の平衡を、Ｔｈ１極性化された環境に偏らせることができる。
【００１６】
非補体活性化の免疫抑制緩和剤が好まれることもあるが、とりわけ、非腫瘍標的化薬剤については、本発明は補体活性化免疫抑制緩和剤とともに実施されることもある。こうした薬剤の例としては、バビツキシマブ、イピリムマブ、およびトレメリムマブが挙げられる。
【００１７】
本発明は、別の医薬品とともにβ−グルカンを同時投与することを部分的に含み、該医薬品は、本明細書でしようされるように、抗体調製物、または小分子調製物、またはＴＭＥに影響を与えるために投与される任意の調製物であってもよい。本明細書で使用されるように、「同時投与された」とは、ある組み合わせの２つ以上の成分が、その組み合わせの治療的または予防的な効果がいずれかの成分が単独で投与されたときの治療的または予防的な効果より大きくなるように投与されることを指す。２つの成分は同時にまたは連続的に同時投与されてもよい。同時に同時投与された成分は、１つ以上の医薬組成物中で提供されてもよい。２つ以上の成分の連続的な同時投与は、両方の成分が投与された後にその両方の成分が同時に生体利用可能となるように成分が投与される場合を含む。成分が同時にまたは連続して同時投与されるかどうかにかかわらず、成分は１つの部位または様々な部位で同時投与されることがある。
【００１８】
別の態様では、該方法は、抗体、治療用抗体、抗腫瘍抗体、または抗体のＦｃ部分などの抗体フラグメントに共役したβ−グルカン部分を含む組成物を被験体に投与する工程を含む。β−グルカン部分のβ−グルカン接合体と抗体を含む、修飾されたおよび／または誘導体化した可溶性のβ−グルカンは、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１２／３６７９５号に記載されており、これは抗体フラグメントの接合体に適用されることがある。β−グルカン部分はβ−１，３／１，６グルカンであってもよく、またはβ−１，３／１，６グルカンに由来してもよい。本文脈における「由来の」とは、接合体がβ−グルカンの１つ以上の原子を置き換える共有結合を形成することにより必ず調製され得るということを認めるものである。本明細書で使用されるように、「β−１，３／１，６グルカンに由来の」とは、接合体の共有結合を形成するためにβ−グルカンの１つ以上の原子を交換した後に接合体の一部として残るβ−グルカンの一部を指す。
【００１９】
β−グルカン、抗体、または小分子調製物、および／または両方の成分の組み合わせが、「担体」とともに組成物中に処方されてもよい。本明細書で使用されるように、「担体」とは、任意の溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤、および／または抗真菌薬、等張剤、吸収遅延薬、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイドなどを含む。医薬品活性物質のためのこうした媒体および／または薬剤の使用は、当該技術分野では周知である。任意の従来の媒体または薬剤がβ−グルカンまたは抗体と互換性がない時を除いて、治療用組成物でのその使用が企図されている。補足の活性成分も組成物に組み入れることができる。
【００２０】
「薬学的に許容可能な」とは、生物学的にまたはそれ以外の方法で望ましくないわけではない材料を意味し、つまり、材料は、いかなる望ましくない生物学的効果を引き起こすともなく、またはそれが含まれている医薬組成物の他の成分のいずれとも有害なやり方で相互作用することなく、β−グルカンおよび／または医薬品と共に個体に投与されてもよい。
【００２１】
β−グルカン、医薬品、および／または、両方の成分の組み合わせは医薬組成物へとなるように処方されてもよい。いくつかの実施形態において、（β）−グルカンと医薬品は単一の製剤で提供されてもよい。他の実施形態において（β）−グルカンと医薬品は別々の製剤で提供されてもよい。医薬組成物は、１つ以上の好ましい投与経路に適した様々なおよび／または複数の形態で処方されてもよい。したがって、医薬組成物は、経口、非経口（例えば、皮内、経皮的、皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内など）、または局所的（例えば、鼻腔内、肺内、乳腺内、膣内、子宮内、皮内、経皮的、直腸など）を含む、１つ以上の既知のルートに従って経由可能である。医薬組成物またはその一部は、例えば鼻粘膜または呼吸粘膜への投与（例えばスプレーまたはエアロゾルによる）によるなどの粘膜表面に投与可能である。医薬組成物またはその一部は、持続放出または遅延放出によっても投与可能である。
【００２２】
製剤は、単位用量形態で都合よく提示されてもよく、薬学の技術で周知の方法によって調製されてもよい。薬学的に許容可能な担体を含む組成物を調製する方法は、β−グルカンおよび／または医薬品を、１つ以上の副成分を構成する担体と会合させる工程を含む。一般に、製剤は、活性化合物を液体担体、微粉固体担体、またはその両方と均一におよび／または密接に会合させること、および、その後、必要に応じて、生成物を所望の製剤に成形することによって調製されてもよい。
【００２３】
β−グルカン、医薬品、および／または、その両方の成分の組み合わせは、限定されないが、溶液、懸濁液、エマルジョン、スプレー、エアロゾル、または混合物の任意の形態を含む任意の適切な形態で提供されてもよい。組成物は、任意の薬学的に許容可能な賦形剤、担体、またはビヒクルを含む製剤で送達されてもよい。例えば、製剤は、例えばクリーム、軟膏、エアロゾル製剤、非エアロゾル噴霧剤、ゲル、ローションなどのような従来の局所的な剤形で送達されてもよい。製剤は、例えば、アジュバント、皮膚浸透促進剤、着色剤、香水、調味料、保湿剤、増粘剤などを含む１つ以上の添加剤をさらに含んでもよい。
【００２４】
いくつかの実施形態において、（β）−グルカンは例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの酵母に由来することがある。いくつかの実施形態において、（β）−グルカンはβ−１，３／１，６グルカン、例えば、β（１，６）−［ポリ−（１，３）−Ｄ−グルコピラノシル］−ポリ−β（１，３）−Ｄ−グルコピラノースを含み得る。
【００２５】
いくつかの実施形態では、方法は、例えば、約１００ｎｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇの投与量を被験体に提供するために十分なβ−グルカンを投与する工程を含み得るが、実施形態によっては、方法はこの範囲外の投与量のβ−グルカンを投与することにより行われることもある。いくつかの実施形態では、方法は、約１０μｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇまでの投与量、例えば約４ｍｇ／ｋｇの投与量を被験体に提供するために、十分なβ−グルカンを投与する工程を含む。代替的に、投与量は、処置コースの開始直前に得られる実際の体重を使用して計算されてもよい。このように計算された投与量について、体表面積（ｍ２）は、デュボア方法（Ｄｕｂｏｉｓ  ｍｅｔｈｏｄ）：ｍ２＝（体重ｋｇ０．４２５×身長ｃｍ０．７２５）ｘ０．００７１８４  を使用して処置コースの開始直前に計算される。いくつかの実施形態では、したがって、方法は、例えば、約０．０１ｍｇ／ｍ２から約１０ｍｇ／ｍ２までの投与量を提供するために、十分なβ−グルカンを投与する工程を含み得る。
【００２６】
いくつかの実施形態では、方法は、例えば、約１００ｎｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇの投与量を被験体に提供するためにβ−グルカンに特異的に結合する十分な抗体を投与する工程を含み得るが、実施形態によっては、該方法はこの範囲外の投与量の抗体を投与することにより行われてもよい。いくつかの実施形態では、方法は、約１０μｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇまでの投与量、例えば、約１００μｇ／ｋｇから約１ｍｇ／ｋｇまでの投与量を被験体に提供するために十分な抗体を投与する工程を含む。
【００２７】
代替的に、投与量は、処置コースの開始直前に得られる実際の体重を使用して計算されてもよい。このように計算された投与量について、体表面積（ｍ２）は、デュボア方法（Ｄｕｂｏｉｓ  ｍｅｔｈｏｄ）：ｍ２＝（体重ｋｇ０．４２５×身長ｃｍ０．７２５）ｘ０．００７１８４  を使用して処置コースの開始前に計算される。いくつかの実施形態では、したがって、方法は、例えば、約０．０１ｍｇ／ｍ２から約１０ｍｇ／ｍ２までの投与量を提供するために十分な抗体を投与する工程を含み得る。
【００２８】
いくつかの実施形態において、β−グルカンと医薬品は、例えば、毎週一回投与量から複数回投与量までで同時投与されてもよいが、実施形態によっては、該方法はβ−グルカンと医薬品をこの範囲外の頻度で同時投与することにより行われてもよい。ある実施形態では、β−グルカンと医薬品は、毎年約一度から毎週一度まで投与されてもよい。
【００２９】
用語「および／または」とは、列挙された要素の１つまたはすべて、あるいは列挙された要素のいずれか２つ以上の組み合わせを意味し、用語「含む」とその変化形態は、本記載と請求項に現われる場合には限定的な意味を有していない。別段の定めがない限り、「１つの（ａ）、（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」、および、「少なくとも１つ」は、交換可能に使用され、１つまたはそれ以上を意味し、ならびに、エンドポイントによる数値範囲の列挙は、その範囲内に入れられる数をすべて含む（例えば、１〜５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５などを含む）。
【００３０】
前の記載では、特定の実施形態は、明快さのために分離して記載されることがある。特定の実施形態の特徴が別の実施形態の特徴と矛盾するという別段の定めのない限り、特定の実施形態は、１つ以上の実施形態に関連して、本明細書に記載される矛盾のない特徴の組み合わせを含み得る。
【００３１】
別々の工程を含む本明細書で開示された任意の方法について、工程は任意の実行可能な順序に行われてもよい。そして、必要に応じて、２つ以上の工程のいかなる組み合わせも同時に行われてもよい。
【００３２】
本発明は以下の例によって例証される。特定の例、材料、量、および手順は、本明細書で説明される本発明の範囲と精神に合わせて広く解釈されるものであることが理解されよう。
【実施例】
【００３３】
＜実施例１＞
インビトロで培養されたヒトＭ１とＭ２のマクロファージの確立と特徴付け：ヒトの全血からのＣＤ１４＋単球を、フィコール密度勾配と磁気ビーズ分離を使用して濃縮した。その後、濃縮した単球（１ｍＬ当たり５×１０５細胞）をその後、Ｍ１極性化（５％の自己血清と１００ｎｇ／ｍＬの組み換えのヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ｒｈＧＭ−ＣＳＦ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を追加されたＸＶｉｖｏ  １０媒体（Ｌｏｎｚａ  Ｇｒｏｕｐ））、または、Ｍ２極性化（１０％の自己血清と５０ｎｇ／ｍＬの組み換えのヒトマクロファージコロニー刺激因子（ｒｈＭ−ＣＳＦ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を追加されたＸＶｉｖｏ  １０媒体）の条件下で６日間培養した。β−グルカンの効果を評価するために行われた実験では、全血はビヒクル（クエン酸ナトリウム緩衝剤）または２５μｇ／ｍＬの可溶性のグルカンを用いて３７°Ｃで２時間最初に培養され、その後、単球を単離して分化させた。表現型の分析のためにマクロファージを収穫する前に、形態をチェックした。６日目のマクロファージ培養物（ＭＣＭ）の培地を集め、遠心沈殿させて汚染された細胞ペレット剤を取り除き、ＥＬＩＳＡによるその後のサイトカイン分析のために凍結させるか、または表面マーカーあるいはＣＤ４  Ｔ細胞増殖を評価するべく、ＣＤ３とＣＤ２８で刺激されたＣＤ４  Ｔ細胞（ＭＣＭ−ＣＤ４  Ｔ）を含む共培養を設定するために用いた。表面マーカーの調節またはＣＤ４  Ｔ細胞増殖に対する効果のいずれかを評価するべく、マクロファージを用いて、ＣＤ３とＣＤ２８により、またはＣＤ３のみで刺激されたＣＤ４  Ｔ細胞（ＭａｃＣＤ４  Ｔ）を用いて共培養を６日目に設定した。Ｍａｃ−ＣＤ４  Ｔ細胞増殖研究について、Ｍ１またはＭ２のマクロファージを、ＣＤ３とＣＤ２８で、またはＣＤのみで刺激した、ＣＦＳＥで標識した自己由来のＣＤ４  Ｔ細胞を１：１０の比率で培養した。Ｔ細胞増殖はフローサイトメトリーによって実験の最後に（９日目−１１日目）測定され、結果をＣＦＳＥ希釈ピークとしてグラフで示す。ＣＤ３のみで刺激されたＴ細胞の評価は常に１１日目に行われた。定量的な結果は、培養条件の各々において３通りのウェルの各々について計算された分裂指数（Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  Ｉｎｄｅｘ）（母集団の経験した細胞分裂の平均回数）として報告された。ＭａｃＣＤ４  Ｔ細胞共培養の培養上清が、その後のサイトカイン分析のために集められた。
【００３４】
ＭａｃＣＤ４  Ｔ細胞表面マーカー調節の評価について、Ｍ２マクロファージは上に記載されているようにＴ細胞で共培養され、Ｍ２マクロファージとＴ細胞の両方で表面受容体染色を行うために、８日目、９日目、および１０日目に細胞を収穫した。
【００３５】
ＭＣＭ−ＣＤ４  Ｔ細胞増殖研究について、ＣＤ３とＣＤ２８により刺激され、ＣＦＳＥ標識されたＣＤ４  Ｔ細胞を５０％のＭＣＭで培養した。Ｔ細胞増殖を上に記載されているように１１日目に測定した。ＭＣＭ−ＣＤ４  Ｔ細胞共培養の培養上清を、その後のサイトカイン分析のために集めた。ＭＣＭ−ＣＤ４  Ｔ細胞表面マーカーの評価を上に記載されるように行った。
【００３６】
上に記載されたように、Ｍａｃ−ＣＤ４  Ｔ細胞増殖のＡ）形態、Ｂ）表現型、およびＣ）機能の評価と、Ｄ）共培養におけるサイトカイン分析のために、Ｍ１とＭ２のマクロファージを調製して特徴付けした。図１Ａ−１Ｃは、５つの様々な実験からの代表的結果を含んでいる。
【００３７】
１つの文献毎に、Ｍ１の形態は、より丸くなったように見え、Ｍ２はより細長い繊維芽細胞のようであった（図１Ａ）。Ｍ１／Ｍ２に特異的なマーカーの発現が、フローサイトメトリーによって評価された。アイソタイプ対照着色と表面抗原着色のために中央のＭＦＩが計算され、その結果が表１に示される。
【００３８】
【表１】
2017535543.tif 000003
【００３９】
表現型に関する文献と一致して、Ｍ１マクロファージは典型的にはより高次のＨＬＡ−ＤＲとＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）を発現したが、Ｍ２マクロファージはより高次のＣＤ１６３とＣＤ１４を発現した。さらに、インビトロで分化したＭ２マクロファージと比較して、Ｍ１マクロファージは、図１Ｂで示されるように、ＣＤ４  Ｔ細胞を有意に増殖させた。増殖の増強と同時に、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）の産生の増加は、Ｍ１とＣＤ４のＴ細胞共培養の上清中で観察された（図１Ｃ）。
【００４０】
Ｍ１とＭ２のマクロファージ（指定されたＭ１ａとＭ２ａのマクロファージ）の活性化を含む、ヒトのマクロファージのインビトロでの培養と特徴付けのための代替的な方法の工程が以下に概説される。この方法は実験の次のシリーズで用いられた。
【００４１】
【化１】
2017535543.tif 000004
上に記載されたように調製され特徴付けられた活性化Ｍ１ａとＭ２ｓのマクロファージは、形態と表現型について特徴付けられた。５つの様々な実験からの代表的な結果がここに示される。
【００４２】
図１Ｄは、Ｍ１ａとＭ２ａのマクロファージの形態を示す。Ｍ１ａ／Ｍ２ａに特異的なマーカーの発現がフローサイトメトリーによって評価された。中央のＭＦＩはアイソタイプ対照着色と表面抗原着色について計算され、その結果が表２に示される。
【００４３】
【表２】
2017535543.tif 000005
【００４４】
＜実施例２＞
Ｍ２からＭ１への再分極に対するβ−グルカンの効果：ビヒクルによりまたはβ−グルカンにより処置された全血からのＭ１とＭ２のマクロファージを、上に記載されたように調製した。Ｍ１／Ｍ２に特異的なマーカー（ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１６３、ＣＤ２０６、ＣＤ２０９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＰＤ−Ｌ１を含む）のパネルの発現は、フローサイトメトリーによって測定された。β−グルカンの前処置はＭ１マクロファージ表現型に影響を与えなかったが、Ｍ２マクロファージ表現型には影響を与えた。図２Ａで示されるように、ＣＤ１６３の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、β−グルカンにより処置されたＭ２マクロファージでダウンモジュレートされる。加えて、ＣＤ８６の表面発現は、ＰＤ−Ｌ１のタンパク質とｍＲＮＡの両方のレベルと同様に増強された（図２Ｂ）。
【００４５】
次に、ビヒクルによりまたはβ−グルカンにより処置されたＭ１またはＭ２マクロファージは、ＣＤ３とＣＤ２８により刺激されたカルボキシフルオセインジアセテートサクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識された自己ＣＤ４  Ｔ細胞を用いて培養され、実験の最後にフローサイトメトリーによってＴ細胞増殖を測定した。その結果を分裂指数（母集団が経験した細胞分裂の平均回数）として定量的に報告した。図２Ｃは、β−グルカンにより処置されたＭ２マクロファージでＴ細胞を共培養することにより行われた代表的なＣＦＳＥ希釈Ｔ細胞増殖アッセイであり、その結果は、ＣＤ４  Ｔ細胞増殖を増強するβ−グルカンにより処置されたＭ２マクロファージの能力を示している。
【００４６】
ＣＦＳＥ希釈Ｔ細胞増殖アッセイ（図２Ｂ）からの培養上清も、ＥＬＩＳＡによってＩＦＮγレベルについて測定した。図２Ｄは、ＩＦＮ−ガンマ産生の同時の増大を示す、ＩＦＮ−ガンマレベルの代表的なグラフである。したがって、β−グルカンはＭ２からＭ１への再分極に影響を与え、抗腫瘍形成性のＴｈ１極性化を駆り立てる。
【００４７】
＜実施例３＞
高結合性の被験体対低結合性の被験体からの細胞におけるＭ２からＭ１への再分極に対するβ−グルカンの効果：好中球と単球への可溶性のβ−グルカンの結合を評価する初期の研究は、被験体が様々な結合能力を備えていることを明らかにした。さらなる研究では、可溶性のβ−グルカンが高結合性の被験体の免疫細胞の少なくともいくつかに結合しており、高結合性の被験体は高次の天然の抗β−グルカン抗体を有していることが分かった。機能的な研究は、結合レベルと抗体レベルの一般的なカットオフを特定し、これを用いて被験体を高バインダー（β−グルカンに対して高応答性）と低バインダー（β−グルカンに対して低応答性）であることを特定した。
【００４８】
この目的のために、高バインダーと低バインダーからの可溶性のβ−グルカンにより処置された単球に由来するＭ１／Ｍ２マクロファージの評価が行われた。高バインダーと低バインダーからのＭ１とＭ２のマクロファージはその後、Ａ）表現型、Ｂ）ＣＤ４  Ｔ細胞増殖の増強、およびＣ）ＩＦＮ−γとＩＬ−４産生の調節について評価された。図３Ａ−３Ｃは、４つの様々な実験からの代表的結果である。
【００４９】
マーカーのパネルの発現は、ビヒクルにより処置されたまたはβ−グルカンにより処理された高バインダー由来のＭ１とＭ２のマクロファージについて、フローサイトメトリーによって評価された（ＣＤ１６３を２回評価した）。中央のＭＦＩはアイソタイプ対照着色と表面抗原着色について計算され、その結果が表３に示される。
【００５０】
【表３】
2017535543.tif 000006
ＣＤ１６３とＣＤ８６は、ビヒクルにより処置された、およびβ−グルカンにより処置された低バインダー由来のＭ１とＭ２のマクロファージについてフローサイトメトリーによって評価された。中央のＭＦＩはアイソタイプ対照着色と表面抗原着色について計算され、その結果が表４に示される。
【００５１】
【表４】
2017535543.tif 000007
重要な結果は、β−グルカンにより処置されたＭ２マクロファージが、重要なＭ２マーカーの１つであるＣＤ１６３を低く発現していたということである。興味深いことに、ＣＤ１６３の発現はビヒクルにより処理されたおよびβ−グルカンにより処置されたＭ２マクロファージ間で同じままであったため、この結果は高バインダーに特異的であった。
【００５２】
次に、高バインダーと低バインダーからの可溶性のβ−グルカンにより処置された単球に由来するＭ１／Ｍ２マクロファージの、ＣＤ３とＣＤ２８により刺激されたＣＤ４  Ｔ細胞増殖を増強する能力が評価された。図３Ａは、高バインダー中のＣＤ４  Ｔ細胞増殖アッセイの結果を示し、図３Ｂは低バインダー中の結果を示す。β−グルカンにより処置されたＭ２マクロファージは、高バインダー中のビヒクルにより処置されたＭ２マクロファージで観察されたものと比較して、ＣＤ３とＣＤ２８により刺激されたＣＤ４  Ｔ細胞増殖を増強する著しく高い能力を有していたが、低バインダーでは増殖の増強はなかった。加えて、高バインダーまたは低バインダーのいずれかでのビヒクルにより処置されたＭ２マクロファージと比較して、β−グルカンにより処置されたＭ１マクロファージは、この機能的な能力においていかなる差も示さなかった。
【００５３】
その後、ビヒクルにより、およびβ−グルカンにより処置されたＭ２マクロファージのＩＦＮ−γとＩＬ−４の産生の調節が評価された。増殖の増強と同時に、ＩＬ−４ではなくＩＦＮ−γの産生の著しい増加が、低バインダー（図３Ｄ）ではなく高バインダー（図３Ｃ）においてβ−グルカンにより処置されたＭ２マクロファージとＣＤ４  Ｔ細胞の共培養で観察された。したがって、β−グルカンにより処置された単球に由来するＭ２マクロファージは、高バインダー被験体におけるＭ１のようである。
【００５４】
＜実施例４＞
免疫抑制条件におけるＭ２からＭ１への再分極に対するβ−グルカンの効果：免疫抑制サイトカインの存在下で、β−グルカンで処置したＭ２ａ及びβ−グルカン処置したＭ２のマクロファージの表現型評価と機能評価を行った。Ｍ２又はＭ２ａのマクロファージを上述のように調製した。３日目に、腫瘍培養培地（ＴＣＭ）をＭ２マクロファージ培養物に加えることで培養物の体積の７０％を占め、次いで６日目にＣＤ１６３発現及び機能活性を評価した。ＢｘＰＣ３、即ち膵癌細胞株からのＴＣＭは、Ｍ−ＣＳＦ、ＴＧＦ−ベータ、ＩＬ−４などを含む様々な免疫抑制サイトカインを含むことが示された。Ｍ２ａマクロファージを上述のようにＩＬ−４において培養した。
【００５５】
ＩＬ−４において培養されるβ−グルカンで処置したＭ２ａマクロファージで、及びＴＣＭにおいて培養されるＭ２マクロファージを先ず、ＣＤ１６３及びＣＤ８６の発現について評価した。ＣＤ１６３及びＣＤ８６をフローサイトメトリーにより評価し、中間のＭＦＩをアイソタイプ対照染色及び表面抗原染色について計算し、その結果を表５に示す。
【００５６】
【表５】
2017535543.tif 000008
【００５７】
以前のＭ−ＣＳＦを使用したＭ２分化実験に見られるように、ＴＣＭにおいて培養されるβ−グルカンで処置した単球も、ＣＤ１６３の著しいダウンレギュレーションを示した。加えて、β−グルカンで処置したＭ２マクロファージは、より高いＨＬＡ−ＤＲ発現（示されていないデータ）を有していた。
【００５８】
その後、ＣＤ４  Ｔ細胞の増殖を調節する能力の機能評価を、ＣＤ４  Ｔ細胞の増殖アッセイ（各条件において３又は６回の繰返し）により行った。ＴＣＭにおいて培養されるβ−グルカンで処置したＭ２マクロファージ、及びＩＬ−４において培養されるＭ２ａのマクロファージは、ビヒクルで処置したＭ２及びＭ２ａのマクロファージに観察されるものに比べて、ＣＤ４  Ｔ細胞の増殖を増強する能力を維持した。増殖の増強に付随して、ＩＦＮ−γの産生の著しい増加を、マクロファージ及びＣＤ４  Ｔ細胞の共培養物において観察した（図４）。
【００５９】
上記実施例は、可溶性のβ−グルカンが、Ｍ２分極を阻害し、且つ、ＣＤ１６３の発現減少、ＣＤ８６の発現増加、及びＭ２がＣＤ４  Ｔ細胞の増殖を抑える能力の阻害により実証されるように、Ｍ１様の細胞を誘発する能力を有していることを実証している。免疫抑制条件下でさえ、Ｍ−ＣＳＦと組み合わせたＩＬ−４又は腫瘍培養培地（ＴＣＭ）の何れかの存在により刺激されると、可溶性のβ−グルカンは、Ｍ２分極を阻害し、且つＣＤ４のＴ細胞増殖を支援する能力を増強することができた。Ｍ２−可溶性のβ−グルカンによるＣＤ４  Ｔ細胞の増殖の増強を、炎症促進性のＴｈ１極性化サイトカイン、ＩＦＮ−γの増加により達成し、免疫抑制サイトカインＩＬ−４の産生に変化は無かった。
【００６０】
＜実施例５＞
Ｔｒｅｇｓの存在下でのＣＤ４／ＣＤ８  Ｔ細胞の増殖及び活性化に対するβ−グルカンの効果：血漿を得るために、２５μｇ／ｍＬのβ−グルカン又はビヒクルで全血を６時間処理し、沈降させ、血漿を取り除いた。５０，０００の自己ＣＦＳＥ標識化ＰＢＭＣを、ＣＤ３／２８ビーズを活性化する５０，０００のＴ細胞（Ｔ細胞の拡張及び活性化のためのＤＹＮＡＢＥＡＤＳヒトＴ−活性化因子ＣＤ３／ＣＤ２８）の存在下で３日間、処置した血漿中で培養した。培養の終わりに、ＰＢＭＣをＣＤ４及びＣＤ８で染色し、Ｔ細胞増殖をＣＦＳＥ希釈により測定した。図５Ａにおいて典型的なＣＦＳＥ希釈プロットにより示されるように、β−グルカンで処置した全血からの血漿は、ビヒクルで処置した対照と比較して、ＣＤ４とＣＤ８の両方の増殖を著しく増強させた。
【００６１】
次に、ＣＤ４及びＣＤ８の細胞活性化に対する可溶性のβ−グルカンの効果を示すために、上述のＴ細胞増殖アッセイを再び行なった。しかし３日目に、Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂの産生及びＣＤ２５のアップレギュレーションを含む活性化のマーカーのために、細胞を染色した。図５Ｂに示されるグラフは、β−グルカンで処置した血漿がＣＤ４及びＣＤ８の細胞活性化を増強することを実証している。
【００６２】
血漿分離前に６時間のインキュベーション期間にわたって全血を処理した時に、増殖の増強は最大であり、このことは、Ｔ細胞増殖に対するこの効果が、間接的機構の結果（即ち、先天性の免疫細胞によるサイトカイン放出）であることを示している。β−グルカンによるＴ細胞増殖の増強が直接的又は間接的であるかを判定するために、後に未処置の（ビヒクル）全血からの血漿を、自己ＰＢＭＣを加える前にβ−グルカン又はビヒクルで処置したことを除いて、上述のようにＴ細胞増殖アッセイを行った。ＦＬＯＷＪＯソフトウェアを用いたＤｉｖｉｓｉｏｎ  ＩｎｄｅｘによりＣＦＳＥ希釈を定量化し、ビヒクル対照に対する倍率変化としてプロットした。図５Ｃに示される結果は、β−グルカンの増強された効果が間接的機構によるものであることを示している。
【００６３】
このようなＰＢＭＣ培養物がＴｒｅｇを含有しているため、Ｔｒｅｇの抑制能力は、可溶性のβ−グルカンの存在下で変わるものと思われ、研究を行いβ−グルカンがＴｒｅｇの抑制に影響を及ぼしたかを判定した。（上述の）β−グルカンで処置又はビヒクルで処置した全血からの血漿を、２５，０００の分離されたＣＦＳＥ標識化自己ＣＤ４  Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５−）に加えて、それに伴い分離された自己Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋）の数が増加し、その結果ウェルの比率が増加した。次に、細胞を３日間、５０，０００のＴ細胞活性化ＣＤ３／２８ビーズで刺激した。その後、ＣＦＳＥ希釈により増殖を測定し、Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  Ｉｎｄｅｘにより定量化して、それを用いて共培養物におけるＴｒｅｇの％抑制を計算した。％抑制＝１００−（ＴｒｅｇウェルのＤｉｖｉｓｉｏｎ  Ｉｎｄｅｘ／１：０のウェルのＤｉｖｉｓｉｏｎ  Ｉｎｄｅｘ）／１００。結果を図５Ｄに示す。β−グルカンで処置した全血からの血漿は、ビヒクルで処置した全血からの血漿と比較して、Ｔｒｅｇの抑制能力の著しい減少を示した。
【００６４】
β−グルカンによるＴｒｅｇの抑制はまた、結果としてＩＦＮ−ガンマの産生の増強をもたらした。Ｔｒｅｇ抑制アッセイを上述のように行い、共培養の３日後、ＩＦＮ−ガンマの産生のために上清を分析した。図５Ｅは、８：１であるＴ細胞対Ｔｒｅｇの比率で培養されたウェルからのＩＦＮ−ガンマの産生の結果を示している。まとめると、これらの結果は、β−グルカンが、抗腫瘍の適応可能なエフェクター機能の増強を結果としてもたらすＴｒｅｇ機能と共に、ＣＤ４及びＣＤ８の増殖に影響することを示している。
【００６５】
＜実施例６＞
インビトロで培養されたヒト未成熟単球由来の樹状細胞（ｉｍＭｏＤＣ）及び成熟単球由来の樹状細胞（ｍＭｏＤＣ）の確立と特性付け：マクロファージ及び樹状細胞が、自然免疫と適応免疫を架橋する２つの重要な抗原提示細胞であると仮定して、ヒト単球由来の樹状細胞（ＭｏＤＣ）に対する、可溶性のβ−グルカンの表現型効果及び機能効果も評価した。可溶性のβ−グルカン又はビヒクルで処置した全血から濃縮された単球を、樹状細胞の分化のために、適切なサイトカイン、ＧＭ−ＣＳＦ、加えてＩＬ−４を含有する培地で培養した。インビトロでの培養、及びヒトＭｏＤＣの評価のための方法に含まれる工程を、以下に概説する。
【００６６】
【化２】
2017535543.tif 000009
【００６７】
上述のように調製したｉｍＭｏＤＣとｍＭｏＤＣを図６Ａに示す。ｍＭｏＤＣの形態は、長い突起又は樹状突起の存在を特徴とする。
【００６８】
フローサイトメトリーにより、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、及びＨＬＡ−ＤＲの発現のためにｍＭｏＤＣを評価し、中間のＭＦＩをアイソタイプ対照染色及び表面抗原染色のために計算して、その結果を表６に示す。
【００６９】
【表６】
2017535543.tif 000010
【００７０】
ｍＭｏＤＣは、成熟及び同時刺激のマーカーであるＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、同様にＨＬＡ−ＤＲの表面発現の増加を示した。更に、これらｍＭｏＤＣはまた、同種の混合リンパ球反応（各条件において４回の繰返し）において免疫原性を示し、ＣＤ４及びＣＤ８のＴ細胞拡張の増加を誘発した（図６Ｂ）。
【００７１】
＜実施例７＞
ＭｏＤＣの成熟に対するβ−グルカンの効果：高バインダーと低バインダーの、可溶性のβ−グルカンで処置した全血から調製したｍＭｏＤＣの表現型評価及び機能評価を行った。高バインダーと低バインダーのｍＭｏＤＣを上述のように調製した。フローサイトメトリーにより、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、及びＨＬＡ−ＤＲの発現のためにｍＭｏＤＣを評価し、中間のＭＦＩをアイソタイプ対照染色及び表面抗原染色のために計算して、その結果を表７に示す。
【００７２】
【表７】
2017535543.tif 000011
【００７３】
高バインダーに由来するβ−グルカンで処置したｍＭｏＤＣ上での、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３、及びＨＬＡ−ＤＲの発現の増加は、これらｍＭｏＤＣが低バインダー由来のものよりも成熟していることを示している。
【００７４】
高バインダー由来のβ−グルカンで処置したｍＭｏＤＣはまた、同種−ＭＬＲにおける免疫原生の増加（各条件において４回の繰返し）を示し、低バインダー由来の細胞（図７Ｂ）よりもＣＤ４及びＣＤ８のＴ細胞拡張（図７Ａ）の増加を再度誘発した。
【００７５】
加えて、高バインダー由来のβ−グルカンで処理したｍＭｏＤＣは、低バインダー由来の細胞及びビヒクルで処理したｍＭｏＤＣの上でのＩＦＮ−γの産生を調節することができた（図７Ｃ）。
【００７６】
β−グルカンで処置した単球由来のＭｏＤＣは、免疫抑制条件においてさえも更に成熟している。ＭｏＤＣを上述のように調製した。ＴＣＭを加えることで、０日目に培養物の体積の７０％を占め、それは培養期間中に存在していた。その後、ＴＣＭの存在下で培養されたｍＭｏＤＣを、表現型の変化について評価した。中間のＭＦＩをアイソタイプ対照染色及び表面抗原染色のために計算し、その結果を表８に示す。
【００７７】
【表８】
2017535543.tif 000012
【００７８】
＜実施例８＞
細胞間接触及び可溶性因子が、β−グルカンで処置したＭ２マクロファージによりＣＤ４  Ｔ細胞増殖を増加させる：読み取り情報としてＣＤ４  Ｔ細胞増殖を用いて、β−グルカンで処置したＭ２マクロファージにより増殖を始める際の細胞間接触又は可溶性因子の要件を調べた。マクロファージとＴ細胞との間の細胞間接触を調べるために、ＣＤ２８が存在しない状態でβ−グルカンで処置したＭ２マクロファージと共培養した時にＣＤ４  Ｔ細胞増殖を測定し、表面活性化マーカーの同時刺激及び調節を、共培養物におけるβ−グルカンで処置したＭ２マクロファージとＴ細胞の両方に対して調べた。
【００７９】
細胞間接触の評価を以下のように行った：ビヒクル及びβ−グルカンで処置したＭ２マクロファージ、及び、ＣＤ３＆ＣＤ２８で刺激したＣＤ４  Ｔ細胞対ＣＤ３のみで刺激したＣＤ４  Ｔ細胞の共培養物を、ＣＤ４  Ｔ細胞の増殖及びＩＦＮ−γ産生の測定のために利用した。
【００８０】
図８Ａに示されるように、外因性のＣＤ２８抗体が無い状態でＣＤ４  Ｔ細胞と共に培養された、β−グルカンで処置したＭ２マクロファージは、ＣＤ４  Ｔ細胞の増殖を増強する能力が著しく高いことを実証した。増殖の増強に付随して、ＩＦＮ−γの産生の著しい増加を、β−グルカンで処置したＭ２マクロファージとＣＤ４のＴ細胞の共培養物において観察した（図８Ｂ）。
【００８１】
マクロファージとＣＤ３＆ＣＤ２８で刺激したＴ細胞の両方の上での表面マーカー発現の変化も、測定した。共培養物からの、ビヒクル及びβ−グルカンで処置したＭ２マクロファージ及びＣＤ  Ｔ細胞を、同時刺激又は同時抑制分子の調節のためにフローサイトメトリーによって評価した。図８Ｃと表９は、２つの異なる実験の典型的な結果である。
【００８２】
【表９】
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【００８３】
試験した全ての表面マーカー全ての中で、ビヒクルで処置したＭ２マクロファージ上で観察されたものと比較して、ＣＤ８６（８日目）とＰＤ−Ｌ１（９日目）の表面発現の相対的な増加を、β−グルカンで処置したＭ２マクロファージの表面上で観察した。ＰＤ−１（９日目）の発現増加を、β−グルカンで処置したＭ２マクロファージと共培養したＴ細胞の表面上で観察した。
【００８４】
β−グルカンで処置したＭ２マクロファージから分泌される可溶性因子が必要か否かを判定するために、β−グルカンで処置したＭ２マクロファージＭＣＭ（５０％の体積）と共培養したＣＤ４  Ｔ細胞増殖の測定を行い、ＭＣＭでインキュベートしたＴ細胞上で表面活性化マーカーの調節を観察した。図９は、２つの異なる実験の典型である。ＣＤ４  Ｔ細胞の増殖アッセイにより評価した時、ＣＤ４  Ｔ細胞と共培養された、β−グルカンで処置したＭ２マクロファージＭＣＭは、β−グルカンで処置したＭ２マクロファージＭＣＭと比較してＣＤ４のＴ細胞の増殖を増強する能力が著しく高いことを実証した（図９）。加えて、ビヒクル及びβ−グルカンで処置したＭ２マクロファージＭＣＭにおいて培養されたＣＤ４  Ｔ細胞を、同時刺激又は同時抑制分子（ＣＤ８０、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、４−１ＢＢ、及びＰＤ−１）の調節のために評価した。驚くことに、どのＴ細胞マーカーにも変化は観察されなかった（データは示されず）。
【００８５】
＜実施例９＞
高バインダーｖｓ低バインダーにおける、β−グルカンで処置したＭ２マクロファージの分析：前述で議論したように、被験体における抗β−グルカン抗体（ＡＢＡ）の閾値は、β−グルカン免疫療法に重要であることが示された。それ故、β−グルカンがＭ１／Ｍ２の分極を調節する能力におけるＡＢＡ閾値の重要性を調べた。β−グルカンが高バインダー対低バインダーにおけるＭ１／Ｍ２の分極を調節する能力を、表現型評価及び機能評価の両方により判定した。
【００８６】
４つの高バインダー及び４つの低バインダーからのＭ２マクロファージを調製し、それらがＣＤ４  Ｔ細胞増殖を調節する能力について評価した。様々なＣＤ４  Ｔ細胞の増殖条件からの上清を、ＥＬＩＳＡによりＩＦＮ−γについて測定した。図１０に示す結果は、４つの異なる実験からの典型である。ビヒクルで処置したＭ２マクロファージとＣＤ４  Ｔ細胞の共培養物において生成されたＩＮＦ−γのレベルにわたる倍率変化を、４つのドナー各々についてプロットする。
【００８７】
低バインダーにおいて、β−グルカンは、Ｍ１／Ｍ２極性化条件において単球由来のマクロファージ上で何れの表現型マーカーも調節せず（データは示されず）、ＣＤ４  Ｔ細胞の増殖アッセイによる低バインダーの機能評価において、β−グルカンで処置したＭ２マクロファージは、ＣＤ４  Ｔ細胞増殖を増強せず、ＩＦＮ−γの産生を増加させなかった。
【００８８】
＜実施例１０＞
血清交差研究：β−グルカンが低バインダーにおいてＭ１／Ｍ２分極の調節を示さなかったので、より高レベルのＡＢＡを含有する血清の存在下で低バインダーの単球を用いたβ−グルカンによる調節（高バインダーからの血清交差）を、評価した。これを試験するために、Ｍ２マクロファージを、若干の改変と共に上述のように調製した。低バインダーの全血を沈降させて血漿を取り除き、次いで細胞を高バインダーから得た血清と共に再構築した。再構築された血液を、３７℃で２時間、ビヒクル又はβ−グルカン（２５μｇ／ｍＬ）で処置した。抗β−グルカン特異的モノクローナル抗体、及び後にフローサイトメトリーを使用することにより、結合について単球を評価した。その後、全血中のビヒクル又はβ−グルカンで処置した単球を分離し、Ｍ２マクロファージに分化し、Ｍ２細胞（データは示されず）又はＭＣＭの何れかを使用して、それらがＣＤ４  Ｔ細胞の増殖（各条件において６回の繰返し）を増強し、且つ上述の方法を用いてＩＦＮ−γ産生を増加させる能力について評価した。
【００８９】
低バインダーの全血中の単球は、β−グルカンに結合しなかったが、より高レベルのＡＢＡを含有する高バインダーの血清を低バインダーの全血に加えた場合に著しく高い結合を示した（図１１Ａ）。加えて、高バインダーの血清とクロスオーバーした（ｃｒｏｓｓｅｄ  ｏｖｅｒ）低バインダーのβ−グルカンで処置したＭ２マクロファージからのＭＣＭは、ビヒクルで処置したＭ２マクロファージと共に観察されるものと比較して、ＣＤ４  Ｔ細胞の増殖を増強する能力が著しく高い。増殖の増強に付随して、ＩＦＮ−γの産生の著しい増加を、β−グルカンで処置したＭ２マクロファージとＣＤ４のＴ細胞の共培養において観察した（図１１Ｂ）。
【００９０】
＜実施例１１＞
免疫抑制サイトカイン（ＴＣＭ）の存在下で培養された、β−グルカンで処置したＭ２マクロファージ上でのＰＤ−Ｌ１のアップレギュレーション：単球又はＭ２マクロファージを上述のように調製した。３日目に、ＴＣＭを加えて、培養物の体積の７０％を占めて、その後、ＣＤ４  Ｔ細胞と再び共培養された場合にＴＣＭによるＰＤ−Ｌ１の発現を評価した。
【００９１】
ＴＣＭにおいて培養される、β−グルカンで処置したＭ２マクロファージは、ＰＤ−Ｌ１のより高度の表面発現を有していた（図１２Ａ）。ＣＤ４  Ｔ細胞と共培養された時にも、発現は増加した（図１２Ｂ）。
【００９２】
上述のシステムを使用して、β−グルカンが、重要なＭ２マーカーであるＣＤ１６３の発現の減少により、及び、ＣＤ４のＴ細胞増殖を抑えるＭ２の能力を阻害することにより実証されるように、Ｍ２極性化を阻害する能力を有していることを実証した。免疫抑制環境下でさえ、Ｍ−ＣＳＦと組み合わせたＩＬ−４（データは示されず）又は腫瘍培養培地（ＴＣＭ）の何れかの存在により刺激されると、β−グルカンは、Ｍ２分極を阻害し、ＣＤ４  Ｔ細胞の増殖を支援する能力を増強することができた。Ｍ２−β−グルカンによるＣＤ４  Ｔ細胞増殖の増強を、炎症促進性のＴｈ１極性化サイトカイン、ＩＦＮ−γの増加により達成し、免疫抑制サイトカインのＩＬ−４の産生に変化は無かった。Ｔ細胞活性化及びＩＦＮ−γ産生の増加により予測されるように、β−グルカンで処置したＭ２マクロファージ上のＰＤ−Ｌ１及びＴ細胞上のＰＤ−１の表面発現の増加を、観察した。
細胞により分泌された可溶性因子と同様に、β−グルカンで処置したＭ２マクロファージ自体も、ＣＤ４  Ｔ細胞の増殖の増強に重要である。最後に、β−グルカンは、より高レベルのＡＢＡを有している健康なドナーからの細胞のみにおいてＭ２分極を阻害した。
【００９３】
＜実施例１２＞
ＭｉａＰａＣａにおけるＰＤ−Ｌ１のアップレギュレーション：β−グルカン及びビヒクルで処置したＭ２マクロファージ、並びにβ−グルカンで処置したＭ２マクロファージ＋ＡＢＡを、高バインダーの血清及び低バインダーの血清と共に培養し、腫瘍細胞上でのＰＤ−Ｌ１の発現を評価した。図１３は、β−グルカンで処置したＭ２マクロファージが、高バインダーにおいて腫瘍細胞上でＰＤ−Ｌ１の発現を増加させ、及びＡＢＡの付加により、β−グルカンで処置したＭ２マクロファージが低バインダーにおいて腫瘍細胞上でＰＤ−Ｌ１の発現も増加したことを示している。
【００９４】
＜実施例１３＞
骨髄性サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）に対する可溶性のβ−グルカンの効果：ＭＤＳＣは、血液、リンパ節、及び骨髄中に、並びに癌を患う大半の患者と実験動物中の腫瘍部位にて蓄積され、適応免疫及び自然免疫の両方を阻害する。ＭＤＳＣを、腫瘍により分泌され及び宿主により分泌された因子によって誘発し、その多くは炎症促進性分子である。炎症促進性メディエータによるＭＤＳＣの誘発は、免疫監視機構と抗腫瘍免疫をダウンレギュレートし、それにより腫瘍増殖を促進するＭＤＳＣの蓄積を、炎症が促進するという仮説を導いた。
【００９５】
ＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧによる処置を受けている症例研究の被験体から様々な時間において血液を採取し、それをＭＤＳＣの存在について分析した。サイクル８で１日目、注入前に第１の採血を行った。図１４Ａに示されるように、ＣＤ３３＋、ＭＤＳＣの大きな集合が末梢血に存在している。サイクル８で１日目、注入後に第２の採血を行った。図１４Ａの第２のパネルに示されるように、注入後数時間以内に、ＭＤＳＣは一時的に消滅する。サイクル８で１５日目、注入前に最後の血液サンプルを採取した。ＣＤ３３＋ＭＤＳＣは、末梢血中に再び存在する。
【００９６】
別の研究において、ヒト臍帯血をＣＤ３４＋細胞のために濃縮し、９日間培養して、ＣＤ３３＋ＣＤ１１ｂ＋細胞（ＭＤＳＣ）を産生した。その後、可溶性のβ−グルカン又はクエン酸緩衝液（対照）でＭＤＳＣを処置し、それらがＴ細胞増殖を抑える能力を評価した。処置した又は未処置のＭＤＳＣに対するＣＤ８  Ｔ細胞の比率を２：１として、Ｔ細胞増殖アッセイを行った。図１４Ｂに示されるように、β−グルカンで処置したＭＤＳＣは、Ｔ細胞増殖に対してあまり抑制的ではなかった。
【００９７】
これらの結果は、β−グルカンがＭＤＳＣ集団を調節することで、それらに末梢血循環を一時的に残し、且つＴ細胞増殖にあまり抑制的ではなくしてしまうことを示している。故に、１以上の癌の免疫療法薬又は化学療法薬を、特に一時的にＣＤ３３＋細胞集団が無い期間中に、可溶性のβ−グルカンと組み合わせて投与する場合、治療は腫瘍に対してより有効なものとなる。
【００９８】
＜実施例１４＞
β−グルカンで処置したＭ２マクロファージ／ＭｏＤＣとＴ細胞の共培養部からの上清は、腫瘍細胞上でＰＤ−Ｌ１発現を誘発する：Ｍ２マクロファージとＭｏＤＣを上述のように調製した。その後、マクロファージとＭｏＤＣを、前述のようなＴ細胞増殖アッセイに使用した。これら増殖アッセイからの上清を集め、ＮＳＣＬＣ、乳房、膵臓、結腸、及びＢ細胞リンパ腫を含む様々な腫瘍細胞株でインキュベートした。これら腫瘍細胞株上でのＰＤ−Ｌ１の発現を、フローサイトメトリーにより４８時間後に評価した。図１５には、３つの異なる実験の典型的な結果が示されている。
【００９９】
Ｔ細胞は、それらのエフェクター機構に３つのシグナルを必要とする。シグナル１は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＭＨＣ分子の文脈において提示された抗原であり、シグナル２は、ＡＰＣ上の膜共刺激分子により提供され、及びシグナル３は、エフェクター機能のための環境で産生されたサイトカインである。ＰＤ−Ｌ１などの共阻害分子は、Ｔ細胞のエフェクター機能を阻害することができる。
【０１００】
インビトロでのβ−グルカンで処置した単球由来のマクロファージと樹状細胞は、より高い発現レベルのＰＤ−Ｌ１を有しているが、この処置はまた、共刺激分子ＣＤ８６（シグナル２）、及びサイトカイン（シグナル３）の発現を増大させ、Ｔ細胞エフェクター機能の増強を可能にする。
【０１０１】
β−グルカンにより誘発された、より広範囲の自然免疫反応及び適応的な免疫反応も、腫瘍細胞株上でＰＤ−Ｌ１発現を増強する。これらの結果は、免疫細胞と腫瘍細胞の両方の上でβ−グルカンにより誘発されたＰＤ−Ｌ１発現のアップレギュレーションが、チェックポイント阻害剤での癌免疫療法によりβ−グルカンを有望な組み合わせのパートナーにすることを実証する。
【０１０２】
β−グルカンが、共刺激分子の発現及び免疫刺激サイトカインの産生の増加といった、代償機構によるＰＤ−Ｌ１のアップレギュレーションの阻害作用を相殺する能力も有していることに注目することも、等しく重要である。
【０１０３】
＜実施例１５＞
ＴＭＥに対する、抗血管形成剤と組み合わせた可溶性のβ−グルカンの効果：腫瘍血管新生は、ＴＭＥにおける免疫機能を変え、その結果として免疫抑制環境をもたらす。抗ＶＥＧＦＲ２抗体ＤＣ１０１（マウスラムシルマブ）などの抗血管形成剤は、癌治療に有用であると証明されてきた。可溶性のβ−グルカンは、より多くの抗腫瘍の環境に対してＴＭＥを歪めることができるので、ＤＣ１０１と組み合わせて用いることで、マウスにおけるＮＣＩ−Ｈ４４１非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の皮下の異種移植片を処置し、ＤＣ１０１抗体の効果を増大させる。
【０１０４】
６〜８週齢のメスの胸腺欠損ヌードマウスの側腹部に、０．２ｍｌの体積で５×１０６のＨ４４１腫瘍細胞を皮下注射した。以下の薬剤により平均腫瘍体積が約１５０ｍｍ３に到達した場合に、二週に一回マウスに投薬した：
・０．２ｍｌ／マウスのビヒクル
・１．２ｍｇ／マウスのＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧ（Ｂｉｏｔｈｅｒａ，  Ｉｎｃ．）
・１０ｍｇ／ｋｇ又は２０ｍｇ／ｋｇのＤＣ１０１（Ｃｌｏｎｅ：ＤＣ１０１  Ｃａｔａｌｏｇ＃：ＢＥ００６０）
１０日目と最後の投薬２時間後に血液サンプルを採取した。
【０１０５】
処置群は、ビヒクル（ＰＢＳ対照）、ＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧのみ、ＤＣ１０１のみ、及びＤＣ１０１＋ＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧを含んでいた。一旦大きさが１５０ｍｍ３の群平均に到達した場合に、腫瘍を処置群へと無作為化した。１０ｍｇ／ｋｇの処置群の腫瘍体積の結果を図１６Ａと図１６Ｂに示す。
【０１０６】
グラフから明らかなように、ＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧ＋ＤＣ１０１（補体活性化、非腫瘍標的抗体）は、腫瘍の増殖を最小限にするよう相乗的に作用した。図１６Ｂに明確に示されるように、ＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧ＋ＤＣ１０１で処置したマウスの７０％は、ＤＣ１０１のみで処置したマウスのほんの３０％と比較して、７５％より多くの腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）を有していた。故に、（補体活性化、非腫瘍標的抗体であるか、又はそうでない場合もある）抗血管形成剤と組み合わせた可溶性のβ−グルカンは、有効な癌治療薬である。
【０１０７】
免疫細胞がＴＭＥにおいて活性化することを示すために、追加の分析を行った。３７日目、注射後に、脾臓を採取して、単細胞浮遊液をＦＡＣＳにより採取した。図１６Ｃに示される細胞にゲート化した（ｇａｔｉｎｇ）後に、頻度又はＧＭＦＩをＦＬＯＷＪＯにおいて計算した。図１６Ｃの上のグラフに示されるように、ＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧ＋ＤＣ１０１で処置した動物は脾臓のＭＤＳＣが減少した一方で、下のグラフは、組み合わせで処置した動物における脾臓マクロファージの増加を示している。
【０１０８】
注射後、３７日目にマウスから除去した全腫瘍に対し、追加の実験を更に行った。Ｍｉｌｔｅｎｙ  Ｏｃｔｏｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒを利用するプロトコルに従い、Ｈ４４１腫瘍からの単細胞浮遊液を生成した。全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙのミニキット（ＱＩＡＧＥＮ，  Ｖｅｎｌｏ，  Ｌｉｍｂｕｒｇ）により腫瘍懸濁液から分離した。第１鎖のｃＤＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）により合成した。Ｓｔｅｐ  Ｏｎｅ  Ｐｌｕｓ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により、ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、及び、ＴＮＦα、ＣＤ２０６、ＴＧＦβ、及び１８ｓ  ｒＲＮＡを含有するＴａｑｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎアッセイミックス（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、実時間の定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を行った。相対的なΔ―ΔＣｔ方法を使用してデータの定量化を行った。平均１８ｓのｒＲＮＡレベルを使用して、各サンプル中のｍＲＮＡの量を標準化した。ＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧ＋ＤＣ１０１で処置した群におけるＴＮＦ−α、ＣＤ２０６、及びＴＧＦ−βの倍率変化を、ビヒクル対照及びＤＣ１０１のみで処置した群の倍率変化と比較した。図１６Ｄに示されるように、ＴＮＦ−αの発現が増大した一方で、ＣＤ２０６及びＴＧＦ−βの発現は、ＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧ＋ＤＣ１０１で処置した動物において減少しており、このことは、ＴＭＥ内でのＴｈ１様の表現型を持つ細胞の増加を示している。
【０１０９】
＜実施例１６＞
抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わせた可溶性のβ−グルカンは腫瘍の無い生存を増強する：別の動物研究において、マウスにＭＣ３８腫瘍細胞を注入し、処置群へと無作為化した。８〜１２週齢のメスのＣ５７ＢＬ／６マウスの側腹部に、０．１ｍｌの体積で１×１０６のＭＣ３８腫瘍細胞、即ち低レベルのＰＤ−Ｌ１を発現する結腸腺癌腫を皮下注射した。３日目に始めて二週に一回、マウスに以下の薬剤を投薬した：
・０．２ｍｌ／マウスのビヒクル
・１．２ｍｇ／マウスのＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧ（Ｂｉｏｔｈｅｒａ，  Ｉｎｃ．）
・１００μｇ／マウスの抗ＰＤＬ−１  Ｃｌｏｎｅ：１０Ｆ．９Ｇ２  ＢｉｏＸｃｅｌｌ  Ｃａｔａｌｏｇ＃：ＢＥ０１０１
血液サンプルを、投薬１の１時間前、投薬３の２時間後、エンドポイント、及び最後の投薬（２０日目）の２時間後に集めた。処置群は、ビヒクル（ＰＢＳ対照）、ＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧのみ、抗ＰＤ−Ｌ１抗体のみ、及び抗ＰＤ−Ｌ１＋ＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧを含んでいた。一旦大きさが１５０ｍｍ３の群平均に到達した場合に、腫瘍を処置群へと無作為化した。結果を表１０に示す。
【０１１０】
【表１０】
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【０１１１】
再び、抗ＰＤ−Ｌ１抗体＋可溶性のβ−グルカンの組み合わせは、腫瘍の無い生存を効果的に増強するよう相乗的に作用した。
【０１１２】
腫瘍上でのＰＤ−Ｌ１発現は、抗ＰＤ−１抗体の反応性のためのバイオマーカーであることも、注目されたい。それ故、可溶性のβ−グルカンが腫瘍上でのＰＤ−Ｌ１発現を誘発するので、可溶性のβ−グルカンは、抗ＰＤ−１抗体の効果も増強する。このことは、上述の可溶性のβ−グルカンでの処理により誘発されたＰＤ−１発現の増加により確認される。
【０１１３】
＜実施例１７＞
可溶性のβ−グルカンと抗血管形成剤のＴＭＥに対するインビボでの効果：Ｈ１２９９  ＮＳＣＬＣ腫瘍を持つマウスに、ベバシズマブ（抗血管形成抗体）（４週間にわたり週に２回、５ｍｇ／ｋｇをＩＰで）を単独で、又は、他のマウスの研究用の上述のようなＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧ（４週間にわたり週に２回、１．２ｍｇ／マウスをＩＶで）と組み合わせて投与した。図１７Ａに示されるように、ベバシズマブとＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧの組み合わせを投与された処置群は、ＰＤ−Ｌ１発現の増加を示し、図１７Ｂは、アルギナーゼ１の下方調節を示しており、図１７Ｃは、ベバシズマブのみを投与された群のものと比較して、ＴＭＥのＣ１１ｂ陽性の自然免疫浸潤細胞中の誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）の発現の増加を示す。ｉＮＯＳの増加とアルギナーゼ１の減少は、Ｍ１、即ち免疫賦活性環境を示すマーカーである。
【０１１４】
加えて、２０日目、腫瘍に注射後、脾臓を採取して、単細胞浮遊液をマウス抗体で染色し、ＦＡＣＳにより分析した。ＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋ＣＤ６８＋細胞上でゲート化した後、ＦｌｏｗｊｏにおいてＧＭＦＩ又は頻度を計算した（図１７Ｄ−図１７Ｆ）。図１７Ｄと図１７Ｅは、それぞれｉＮＯＳの増加とアルギナーゼ−１の減少を示している。脾臓細胞を更に、１００ｎｇ／ｍｌのリポポリサッカリド（ＬＰＳ）で一晩刺激し、ＴＮＦ−αの産生について分析した。図１７ＦはＴＮＦ−αの増加を示す。このデータは、ＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧ処置による、Ｍ１様の表現型への脾臓マクロファージにおける推移を示す。アルギナーゼ−１、ｉＮＯＳ、及びＣＤ８６をＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞において分析し、データを図１７Ｇ−図１７Ｉに示す。示されるように、アルギナーゼ−１は減少し、ｉＮＯＳとＣＤ８６は増加しており、このことは、ＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧ処置によるＭ１／Ｎ１マクロファージ／好中球への脾臓ＭＤＳＣの分化を示している。図１７Ｊは、腫瘍の顆粒球性ＭＤＳＣ（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙｇ６＋）上の同時刺激マーカーＣＤ８６の発現の増強を示し、更に脾臓のＭＤＳＣの分化を示している。
【０１１５】
図１７Ｋ−図１７Ｍに関して、２０日目に腫瘍を採取し、３７℃で１時間、Ｉ型コラゲナーゼで消化した。単細胞浮遊液をマウス抗体で染色し、ＦＡＣＳにより分析した。ＣＤ１１ｂ＋細胞上でゲート化した後、ＦｌｏｗｊｏにおいてＧＭＦＩ又は頻度を計算した。示されるように、ＰＤ−Ｌ１とｉＮＯＳは増加し、一方でアルギナーゼ−１は減少しており、このことは、Ｍ１型の表現型への腫瘍浸潤性の骨髄細胞における推移を示している。
このデータは、可溶性のβ−グルカンが抗血管形成剤の効果を増加させ且つインビボでＴＭＥを調節することを明確に示している。
【０１１６】
最後に、腫瘍細胞の単細胞浮遊液を一晩培養し、ＥＬＩＳＡによって上清をＴＧＦ−βのために測定した。結果を図１７Ｎに示す。５０％より上の腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）を示したマウスは、ＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧとベバシズマブの組み合わせにより処置した場合、ＴＧＦ−βの減少を明確に示した。
【０１１７】
前に議論されたように、可溶性のβ−グルカン処置に対してより良く反応する被験体の亜群が存在する。図１７Ｎの結果は、併用療法により良く反応するこのような被験体が更に、ＴＧＦ−β発現を付随的に減少させることを示している。現在、フレソリムマブ（ｆｒｅｓｏｌｉｍｕｍａｂ）などのＴＧＦ−β−阻害薬が、癌治療薬として研究されている。そのため、可溶性のβ−グルカンに反応する被験体の亜群は、ＴＧＦ−β阻害剤による付加的な処置を必要としない。加えて、可溶性のβ−グルカン免疫療法に反応しない被験体を、それに反応する被験体へと変える、様々な方法及び組成物が、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３１６２５に記載されている。可溶性のβ−グルカンとベバシズマブによる処置の組み合わせにおいてこのような方法を使用することにより、被験体は全てＴＧＦ−β発現を減少させ、これにより、ＴＧＦ−β阻害剤による付加的な処置の必要性が排除される。
【０１１８】
＜実施例１８＞
抗ＰＤ−１抗体と組み合わせた可溶性のβ−グルカンは、腫瘍及びＴＭＥに影響を及ぼす：初めにインビトロでの研究を行い、抗ヒトＰＤ−１Ｍａｂ、ニボルマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂ）（非補体活性化抗体、非腫瘍標的抗体）、及びＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧの間の相乗効果を研究した。最初の研究は、ＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧで処置した単球から分化されたＭｏＤＣを用いる同種の混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を利用した。健全なドナーからの全血を、３７℃で２時間、ＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧ又はビヒクルで処置した。５００Ｕ／ｍＬのインターロイキン４（ＩＬ−４）及び２５０Ｕ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）と共に、７日間インビトロで、単球精製キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により、ネガティブ選択を使用してＰＢＭＣから分離された単球を培養することにより、樹状細胞（ＤＣ）を生成した。ＣＦＳＥ標識化ＣＤ４＋Ｔ細胞（１×１０５）及び同種のＤＣ（１×１０４）を、ニボルマブ又はアッセイの開始時に加えられるアイソタイプ対照抗体ＩｇＧ４の用量滴定により、又は用量滴定無しで共培養した。５日後、Ｔ細胞の増殖をＣＦＳＥ希釈アッセイにより測定し、結果を図１８Ａに示す。図に示されるように、特により高用量のニボルマブでは、ＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧ及びニボルマブによる処置は、抗体のみによる処置よりもＴ細胞の増殖を著しく増加させた。
【０１１９】
第２のインビトロの研究は、超抗原ブドウ状球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）によりＰＢＭＣの刺激を調べた。３７℃で２時間、ＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧ又はビヒクルで全血を処置した。５００Ｕ／ｍＬのインターロイキン４（ＩＬ−４）及び２５０Ｕ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）と共に、７日間インビトロで、単球精製キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により、ネガティブ選択を使用してＰＢＭＣから分離された単球を培養することにより、ＤＣを生成した。５日目に２５ｎｇ／ｍｌのＴＮＦα及び５０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳを加えることにより、ＤＣを完全に成熟させた。異なるドナーからのＰＢＭＣは、ＳＥＢ（Ｔｏｘｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の連続希釈と共に、アッセイの開始時にニボルマブ又はアイソタイプ対照抗体ＩｇＧ４（２０ｕｇ／ｍＬ）により３日間、１０：１の比率でＤＣと共に培養した。培養物の上清におけるＩＬ−２（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とＩＦＮγ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）のレベルをＥＬＩＳＡ分析により測定し、結果を図１８Ｂと図１８Ｃに示す。示されるように、ニボルマブとＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧの組み合わせは、ＩＦＮγとＩＬ−２の産生を含むＴ細胞機能を増強させる。
【０１２０】
ＩＬ−２はＴ細胞上で作用し、黒色腫及び腎細胞癌などの癌の処置のために米国及び様々なヨーロッパ諸国で承認されている。しかし、ＩＬ−２の投与は重度の副作用を備えかねない。これらのデータは、付加的なＩＬ−２処置が排除され得るように、抗ＰＤ−１抗体と組み合わせた可溶性のβ−グルカンによる処置がＩＬ−２発現を増加させることを示している。
【０１２１】
ＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧ＋抗ＰＤ−１抗体を使用して、インビボでの研究を行った。ＲＭＰ１−１４、即ち抗ＰＤ−１抗体と組み合わせたＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧを、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを有するＣＴ２６結腸癌において試験した。３×１０５のマウスのＣＴ２６細胞を皮下投与した。腫瘍が４０−１００ｍｍ３の大きさに到達した後、マウスに、ＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧ（４週間にわたり週に２回、１．２ｍｇ／マウスをＩ．Ｖ．で）を単独で、又は抗ＰＤ−１抗体（３週間にわたり週に２回、２００μｇ／マウスをＩＰで）を単独で、或いはその両方の組み合わせを投与した。研究の結果を図１９Ａに要約する。
【０１２２】
結果は、ＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧと抗ＰＤ−１抗体の組み合わせがインビボでの腫瘍増殖を相乗的に抑えることを示している。このことは、図１９Ｂ（ＩＭＰＲＩＭＥ  ＰＧＧ＋抗ＰＤ−１抗体）及び図１９Ｃ（抗ＰＤ−１抗体のみ）に示される個々のマウスのデータから、より一層明白である。併用療法で処置されたマウスの７０％が、腫瘍が５００ｍｍ３未満のままであった一方で、抗ＰＤ−１抗体のみで処置されたマウスは僅か４０％しか、腫瘍が５００ｍｍ３未満のままであった。再度、上記で議論されたように、マウスの３０％が可溶性のβ−グルカン免疫療法に反応しなかったと思われ、このことは、図１９Ａに示される全体的な結果を歪めることとなった。しかし、被験体を可溶性のβ−グルカン免疫療法に反応するようにすることで、その結果、ほぼ全ての被験体が、併用療法により腫瘍抑制の増加を示し得る。
【０１２３】
故に、総合すると、このデータは、インビボでの可溶性のβ−グルカン処置が、腫瘍と脾臓の両方の中で骨髄細胞を活性化させ、それにより、腫瘍認識及び腫瘍抑制を促進するＴＭＥにおける充分な推移を編成することができることを、示している。本明細書に記載される併用療法の何れかも、腫瘍標的抗体の追加を含んでもよく、これはＴＭＥにおける推移により更に有効なものとなり得る。
【０１２４】
本明細書で引用される全ての特許、特許出願、及び刊行物、並びに電子的に利用可能な資料（例えば、ＧｅｎＢａｎｋとＲｅｆＳｅｑにおけるヌクレオチド配列登録、及び、例えばＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢにおけるアミノ酸配列登録、及び、ＧｅｎＢａｎｋとＲｅｆＳｅｑにおける注釈されたコーディング領域の翻訳を含む）が、それらの全体において参照により組み込まれる。本出願の開示と、及び参照により本明細書に組み込まれる任意の文献の開示との間に、何らかの矛盾が存在する場合には、本出願の開示が適用される（ｇｏｖｅｒｎ）。前述の詳細な説明と実施例は、明確な理解のためだけのために提供されるものである。そこからは不必要な制限が理解されるものではない。本発明は、請求項により定められる発明内に含まれる、当業者に明白な変更について示され且つ記載される、正確な詳細に制限されることはない。
【０１２５】
他に示されない限り、明細書と請求項において使用される、成分の量や分子量などを表わす数字は全て、用語「約」により全ての例において修飾されていると理解されたい。従って、他に反対に示されていない限り、本明細書及び請求項で述べられた数のパラメータは、獲得が求められる所望の特性に依存して変動し得る、およそのものである。最低でも、及び、均等論を請求項の範囲に制限されないように、各数的パラメータは少なくとも、報告された有効数字の数に照らして、及び通常の四捨五入の技術の適用により、解釈されねばならない。
【０１２６】
本明細書で説明される数値域とパラメータがおよそのものであるにもかかわらず、特定の実施例で説明される数値は、可能な限り正確に報告される。しかし、全ての数値は、それら各々の試験測定において見出される標準偏差から必ず結果として生じる範囲を、本質的に含有している。
【０１２７】
全ての見出しは読者の利便性のためのものであり、そのように特定されない限り、この見出しに従うテキストの意味を制限するために使用されるものではない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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【図１７Ｇ】
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【図１７Ｈ】
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【図１７Ｉ】
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【図１７Ｊ】
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【図１７Ｋ】
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【図１７Ｌ】
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【図１７Ｍ】
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【図１７Ｎ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【国際調査報告】
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