(57)【要約】  本発明は、癌、特に乳癌の診断及び処置のための方法に関する。特に、本発明は、対象者における癌を診断する方法であって、ｉ）対象者から得られた試料における１１βＨＳＤ１及び／又は１１βＨＳＤ２の発現レベルを決定する工程、ｉｉ）工程ｉ）で決定された発現レベルをその所定の基準値と比較する工程、並びにｉｉ）１１βＨＳＤ１の発現レベルがその所定の基準値よりも低い場合又は１１βＨＳＤ２の発現レベルがその所定の基準値よりも高い場合に対象者が癌を患っていると結論付ける工程を含む方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象者における癌を診断する方法であって、ｉ）対象者から得られた試料における１１βＨＳＤ１及び／又は１１βＨＳＤ２の発現レベルを決定する工程、ｉｉ）工程ｉ）で決定された発現レベルをその所定の基準値と比較する工程、並びにｉｉ）１１βＨＳＤ１の発現レベルがその所定の基準値よりも低い場合又は１１βＨＳＤ２の発現レベルがその所定の基準値よりも高い場合に対象者が癌を患っていると結論付ける工程を含む方法。
【請求項２】
癌を患っている対象者の生存期間を決定するための方法であって、ｉ）対象者から得られた腫瘍試料における１１βＨＳＤ１及び／又は１１βＨＳＤ２の発現レベルを決定する工程、ｉｉ）工程ｉ）で決定された発現レベルをその所定の基準値と比較する工程、並びにｉｉ）１１βＨＳＤ１の発現レベルがその所定の基準値よりも高い場合に対象者が長い生存期間を有するだろうと結論付ける又は１１βＨＳＤ２の発現レベルがその所定の基準値よりも低い場合に対象者が短い生存期間を有するだろうと結論付ける工程を含む方法。
【請求項３】
癌を患っている対象者がタモキシフェン又はデンドロゲニンＡによる応答を得るか否かを決定するための方法であって、ｉ）対象者から得られた腫瘍試料における１１βＨＳＤ１及び／又は１１βＨＳＤ２の発現レベルを決定すること、ｉｉ）工程ｉ）で決定された発現レベルをその所定の基準値と比較すること、並びにｉｉ）１１βＨＳＤ１の発現レベルがその所定の基準値よりも高い場合又は１１βＨＳＤ２の発現レベルがその所定の基準値よりも低い場合に対象者がタモキシフェン又はデンドロゲニンＡによる応答を得るだろうと結論付ける方法。
【請求項４】
癌が、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳及び中枢神経系癌、乳癌、キャッスルマン病、子宮頸癌、大腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胆嚢癌、消化管カルチノイド腫瘍、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭及び下咽頭癌、肝臓癌、肺癌、中皮腫、形質細胞腫、鼻腔及び副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔及び口腔咽頭癌、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、下垂体癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、皮膚癌、胃癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、膣癌、外陰癌、並びに子宮癌からなる群より選択される、請求項１、２又は３に記載の方法。
【請求項５】
癌が乳癌である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
対象者がタモキシフェン又はデンドロゲニンＡによる応答を得るだろうと決定された場合に、対象者に前記の薬物が投与される、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
対象者が癌を患っていると決定された場合に、対象者に１１β−ＨＳＤ２阻害剤、１１β−ＨＳＤ２発現の阻害剤又は１１β−ＨＳＤ１をコードする核酸が投与される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、癌、特に乳癌の診断及び処置のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
乳癌（ＢＣ）は、最も一般的な女性の癌である。それは、全世界で１００万人を超える女性が罹患しており、そして、約４０００００人の対象者が毎年この疾患のために死亡している。タモキシフェン（Ｔａｍ）は、乳癌の治療及び予防のために世界中で使用されている主要な薬物の１つである。臨床試験では、エストロゲン及びプロゲステロン受容体（ＥＲ、ＰＲ）のレベルがＴａｍ応答の唯一使用されている予測因子である。しかしながら、ＥＲ＋／ＰＲ＋腫瘍の２５％、ＥＲ＋／ＰＲ−腫瘍の６６％及びＥＲ−／ＰＲ＋腫瘍の５５％がＴａｍ処置に失敗する１，２。これらの処置の失敗の原因となる機序は、依然として不明確なままであり、このことは、ＢＣの表現型検査及び処置有効性を改善すること並びに新規の抗癌化合物及びバイオマーカーを開発することに役立つであろう、ＢＣの病因及び耐性に関与する分子主体を特徴付けることが必要であることを示している。
【０００３】
主要な知見は、最近、ステロール代謝が癌の進行及び耐性についての新規ターゲットを産生し得ることを強調している２〜６。これらの結果と一致して、本発明者等は、細胞の分化及び成長の制御に関与するコレステロール代謝中の新規経路を特徴付け、そして、これが乳癌においてコレステロールエポキシドヒドロラーゼ（ＣｈＥＨ）代謝のレベルでデレギュレートされることを示した６〜８。ＣｈＥＨは、コレステロール５，６−エポキシドα及びβ（α−ＥＣ及びβ−ＥＣ）から５α−コレスタン−３β，５，６β−トリオール（ＣＴ）への加水分解を選択的に触媒し３，９，１０、そして、それは、Ｔａｍ及びデンドロゲニンＡなどの抗癌化合物のターゲットである３，７，１０〜１２。興味深いことに、多数の癌において異常に過剰発現される糖タンパク質のムチン１は、乳癌組織において、Ｔａｍ処置に対する耐性を予測する及び対象者の死亡リスクの増加と関連する、脂質及びステロール代謝転写シグネチャーを誘導する２。中でも、過剰発現される遺伝子は、ＣｈＥＨのサブユニットの１つである７−デヒドロコレステロールレダクターゼ（ＤＨＣＲ７）をコードする遺伝子であり１０、このことは、ＣｈＥＨ代謝のレベルでのデレギュレーションがＢＣの進行及びＴａｍ処置に対する耐性を導き得ることを示唆している。これらの結果と一致して、本発明者等は、腫瘍細胞におけるＣｈＥＨの活性が、癌細胞においてＣＴから予期せぬ代謝産物を生成したことを立証した８。本発明者等は、この未知の代謝産物の構造がＣＴの酸化産物である６−オキソ−コレスタン−３β，５α−ジオール（ＯＣＤＯ）であると同定し、かつ、ＯＣＤＯがインビトロ及びインビボで腫瘍の増殖及び浸潤を促進することを特徴付けた８。しかしながら、ＯＣＤＯの産生の原因となる酵素は同定されなかった。
【０００４】
発明の概要
本発明は、癌、特に乳癌の診断及び処置のための方法に関する。特に、本発明は、特許請求の範囲によって定義される。
【０００５】
発明の詳細な説明
本発明者等の目的は、ＣＴからのＯＣＤＯの産生に関与する酵素を同定すること、癌の促進／浸潤におけるそれらの役割を決定すること、及びＢＣ対象者試料対一致した正常組織におけるＯＣＤＯ産生を調節する酵素の発現を研究することであった。したがって、本発明者等は、ＣＴ／ＯＣＤＯの相互変換が、１型及び２型の１１β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（１１βＨＳＤ２及び１１βＨＳＤ１）酵素によって媒介されることをここに実証する。これらの酵素は、コルチゾール／コルチゾンの相互変換を調節することが知られている１３，１４。重要なことに、１１βＨＳＤ２がＯＣＤＯ産生を通じて腫瘍細胞の増殖及び浸潤に関与すること、そして、１１βＨＳＤ１がＯＣＤＯからＣＴへの転換を通じてこれらのイベントの反転に関与することが示された。さらに、本発明者等は、ＯＣＤＯ産生に関与する酵素の発現が正常組織試料と比較してヒト乳房腫瘍において増加すること、及び組織学的研究全体によって１１βＨＳＤ２と１１βＨＳＤ１との間の酵素の平衡が腫瘍ではＯＣＤＯの産生へシフトすることが明らかになることを見いだした。同時に、この研究は、癌の進行における及び癌の新規マーカーとしての１１βＨＳＤ１及び１１−βＨＳＤ２酵素についての新規機能に光を当てる。
【０００６】
本発明の診断法：
したがって、本発明の目的は、対象者における癌を診断する方法であって、ｉ）対象者から得られた試料における１１βＨＳＤ１及び／又は１１βＨＳＤ２の発現レベルを決定する工程、ｉｉ）工程ｉ）で決定された発現レベルをその所定の基準値と比較する工程、並びにｉｉ）１１βＨＳＤ１の発現レベルがその所定の基準値よりも低い場合又は１１βＨＳＤ２の発現レベルがその所定の基準値よりも高い場合に対象者が癌を患っていると結論付ける工程を含む方法に関する。
【０００７】
典型的には、癌は、胆管癌（例えば、末梢癌（periphilar cancer）、遠位胆管癌、肝内胆管癌）、膀胱癌、骨癌（例えば、骨芽細胞腫、骨軟骨腫（osteochrondroma）、血管腫、軟骨粘液様線維腫、骨肉腫、軟骨肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、骨の巨細胞腫、脊索腫、リンパ腫、多発性骨髄腫）、脳及び中枢神経系癌（例えば、髄膜腫、星状細胞腫（astocytoma）、乏突起神経膠腫、上衣腫、神経膠腫、髄芽腫、神経節膠腫、神経鞘腫、胚細胞腫、頭蓋咽頭腫）、乳癌（例えば、非浸潤性乳管癌、浸潤性乳管癌、浸潤性小葉癌、非浸潤性小葉癌、女性化乳房）、キャッスルマン病（例えば、巨大リンパ節過形成、血管胞状リンパ節過形成）、子宮頸癌、大腸癌、子宮内膜癌（例えば、子宮内膜腺癌、腺棘細胞腫（adenocanthoma）、乳頭状漿液性腺癌（papillary serous adnocarcinroma）、明細胞）、食道癌、胆嚢癌（膠様腺癌、小細胞癌）、消化管カルチノイド腫瘍（例えば、絨毛癌、破壊性絨毛腺腫）、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、腎臓癌（例えば、腎細胞癌）、喉頭及び下咽頭癌、肝臓癌（例えば、血管腫、肝腺腫、限局性結節性過形成、肝細胞癌）、肺癌（例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌）、中皮腫、形質細胞腫、鼻腔及び副鼻腔癌（例えば、鼻腔神経芽細胞腫、正中線肉芽腫）、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔及び口腔咽頭癌、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、下垂体癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫（例えば、胎児性横紋筋肉腫、胞巣状横紋筋肉腫、多形性横紋筋肉腫）、唾液腺癌、皮膚癌（例えば、黒色腫、非黒色腫の皮膚癌）、胃癌、精巣癌（例えば、精上皮腫、非精上皮腫の生殖細胞癌）、胸腺癌、甲状腺癌（例えば、濾胞状腺癌、退形成性癌、低分化癌、甲状腺髄様癌、甲状腺リンパ腫）、膣癌、外陰癌、並びに子宮癌（例えば、子宮平滑筋肉腫）からなる群より選択され得る。いくつかの実施態様において、癌は、乳癌である。
【０００８】
用語「試料」は、対象者に由来する任意の組織試料を意味する。前記の組織試料は、インビトロ評価のために得られる。試料は、新鮮であっても、凍結されていても、固定（例えば、ホルマリン固定）されていても、又は包埋（例えば、パラフィン包埋）されていてもよい。いくつかの実施態様において、試料は、腫瘍試料である。いくつかの実施態様において、腫瘍試料は、対象者から切除された腫瘍から生じ得る。いくつかの実施態様において、腫瘍試料は、対象者の原発腫瘍で実施された又は対象者の原発腫瘍から遠く離れた転移試料で実施された生検から生じ得る。例えば、内視鏡生検は、大腸癌に罹患した対象者の腸で実施される。
【０００９】
本明細書において使用されるように、用語「１１βＨＳＤ１」及び「１１βＨＳＤ２」は、当技術分野におけるそれらの一般的な意味を有し、そして、それぞれ１型及び２型の１１β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを指す。１１βＨＳＤ１及び１１βＨＳＤ２についての例示的なアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：１及び配列番号：２である。１１βＨＳＤ１及び１１βＨＳＤ２についての例示的な核酸配列は、それぞれ配列番号：３及び配列番号：４である。より特定すると、本明細書において使用されるような用語「１１β−ＨＳＤ１」は、１１−ベータ−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ１型酵素、その変異体又はアイソフォームを指す。１１β−ＨＳＤ１変異体は、天然の１１β−ＨＳＤ１に実質的に相同なタンパク質、すなわち、１以上の天然に存在する又は天然に存在しないアミノ酸の欠失、挿入又は置換を有するタンパク質（例えば、１１β−ＨＳＤ１誘導体、相同体及び断片）を含む。１１β−ＨＳＤ１変異体のアミノ酸配列は、天然の１１β−ＨＳＤ１に少なくとも約８０％同一、又は少なくとも約９０％同一、又は少なくとも約９５％同一（配列番号：１と）であり得る。１１β−ＨＳＤ２変異体は、天然の１１β−ＨＳＤ２に実質的に相同なタンパク質、すなわち、１以上の天然に存在する又は天然に存在しないアミノ酸の欠失、挿入又は置換を有するタンパク質（例えば、１１β−ＨＳＤ２誘導体、相同体及び断片）を含む。１１β−ＨＳＤ２変異体のアミノ酸配列は、天然の１１β−ＨＳＤ２に少なくとも約８０％同一、又は少なくとも約９０％同一、又は少なくとも約９５％同一（配列番号：２と）であり得る。
【００１０】
配列番号：１：１１βＨＳＤ１＿ホモサピエンス
【化１】
2017527290.tif 000002
【００１１】
配列番号：２：１１βＨＳＤ２＿ホモサピエンス
【化２】
2017527290.tif 000003
【００１２】
配列番号：３：１１βＨＳＤ１＿ホモサピエンス
【化３】
2017527290.tif 000004
【００１３】
配列番号：４：１１βＨＳＤ２＿ホモサピエンス
【化４】
2017527290.tif 000005
【００１４】
本発明のさらなる目的は、癌を患っている対象者の生存期間を決定するための方法であって、ｉ）対象者から得られた腫瘍試料における１１βＨＳＤ１及び／又は１１βＨＳＤ２の発現レベルを決定する工程、ｉｉ）工程ｉ）で決定された発現レベルをその所定の基準値と比較する工程、並びにｉｉ）１１βＨＳＤ１の発現レベルがその所定の基準値よりも高い場合に対象者が長い生存期間を有するだろうと結論付ける又は１１βＨＳＤ２の発現レベルがその所定の基準値よりも低い場合に対象者が短い生存期間を有するだろうと結論付ける工程を含む方法に関する。
【００１５】
本方法は、癌対象者の全生存（ＯＳ）、無増悪生存（ＰＦＳ）及び／又は無病生存（ＤＦＳ）の期間を予測するのに特に好適である。当業者であれば、ＯＳ生存期間が、一般に、ある種類の癌から特定の時間生き延びた人の割合に基づきかつ表されることを認識するであろう。癌統計は、しばしば全５年生存率を使用する。一般に、ＯＳ率は、癌克服者が依然として５年処置を受けているか否か又は彼らが無癌状態になった（寛解に達した）かを特定することはできない。ＤＳＦは、より具体的な情報を与え、そして、これは、特定の癌を有する人のうち寛解に達した人の数である。また、無増悪生存（ＰＦＳ）率（依然として癌を有するがその疾患は進行していない人の数）は、処置で一応の成果を挙げたかもしれないがその癌が完全に消失していない人を含む。本明細書において使用されるように、表現「短い生存期間」は、対象者が、前記の癌を患っている対象者の一般集団において観察される中央値（又は平均値）よりも小さい生存期間を有することを示す。対象者が短い生存期間を有する場合、対象者が「予後不良」を有することを意味する。反対に、表現「長い生存期間」は、対象者が、前記の癌を患っている対象者の一般集団において観察される中央値（又は平均値）よりも大きい生存期間を有することを示す。対象者が長い生存期間を有する場合、対象者が「予後良好」を有することを意味する。
【００１６】
本発明のさらなる目的は、癌を患っている対象者がタモキシフェン又はデンドロゲニンＡによる応答を得るか否かを決定するための方法であって、ｉ）対象者から得られた腫瘍試料における１１βＨＳＤ１及び／又は１１βＨＳＤ２の発現レベルを決定する、ｉｉ）工程ｉ）で決定された発現レベルをその所定の基準値と比較する、並びにｉｉ）１１βＨＳＤ１の発現レベルがその所定の基準値よりも高い場合又は１１βＨＳＤ２の発現レベルがその所定の基準値よりも低い場合に対象者がタモキシフェン又はデンドロゲニンＡによる応答を得るだろうと結論付ける方法に関する。
【００１７】
本明細書において使用されるように、用語「タモキシフェン」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、そして、その活性代謝産物であるヒドロキシタモキシフェンを介する、乳房組織におけるエストロゲン受容体のアンタゴニストを指す。より特定すると、用語「タモキシフェン」は、（Ｚ）−２−［４−（１，２−ジフェニルブタ−１−エニル）フェノキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタンアミン又はその塩を指す。
【００１８】
本明細書において使用されるように、用語「デンドロゲニンＡ」は、薬学的に活性な化合物５−ヒドロキシ−６−［２−（ｌＨ−イミダゾール−４−イル）エチルアミノ］コレスタン−３−オールを指す。デンドロゲニンＡは、ＷＯ０３／８９４４９及びde Medina et al (J. Med. Chem., 2009）に遊離塩基として開示されている。その構造式は、以下である：
【化５】
2017527290.tif 000006
【００１９】
遺伝子（すなわち、１１βＨＳＤ１及び／又は１１βＨＳＤ２）の発現レベルを測定することは、当技術分野において周知の様々な技術によって実施され得る。
【００２０】
いくつかの実施態様において、発現レベルは、核酸レベルで決定される。典型的には、遺伝子の発現レベルは、ｍＲＮＡの量を決定することによって決定され得る。ｍＲＮＡの量を決定するための方法は、当技術分野において周知である。例えば、試料（例えば、対象者から調製された細胞又は組織）中に含有される核酸を、最初に、標準的な方法に従って、例えば溶解酵素若しくは化学溶液を使用して抽出するか、又は製造業者の説明書に従って核酸結合樹脂によって抽出する。次に、抽出されたｍＲＮＡを、ハイブリダイゼーション（例えば、ノーザンブロット分析、インサイチューハイブリダイゼーション）及び／又は増幅（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）によって検出する。増幅の他の方法は、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）及び核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）を含む。
【００２１】
少なくとも１０ヌクレオチドを有しかつ本明細書における関心対象のｍＲＮＡに配列相補性又は相同性を示す核酸を、ハイブリダイゼーションプローブ又は増幅プライマーとして利用することができる。そのような核酸は、同一である必要はないが、典型的には同等なサイズの相同領域に少なくとも約８０％同一、より好ましくは８５％同一、さらにより好ましくは９０〜９５％同一であることが理解される。特定の実施態様において、核酸を、検出可能な標識などのハイブリダイゼーションを検出するための適切な手段と組み合わせて使用することが有利であろう。
【００２２】
典型的には、核酸プローブは、例えば開示するプローブを使用したターゲット核酸分子の検出を可能にするために、１以上の標識を含む。インサイチューハイブリダイゼーション手順などの種々の用途において、核酸プローブは、標識（例えば、検出可能な標識）を含む。「検出可能な標識」は、試料中のプローブ（特定すると、結合した又はハイブリダイズしたプローブ）の存在又は濃度を示す検出可能なシグナルを生成するために使用され得る、分子又は材料である。したがって、標識された核酸分子は、試料中のターゲット酸配列（例えば、ゲノムターゲット核酸配列）（標識された独自に特異的な核酸分子が結合した又はハイブリダイズした）の存在又は濃度の指標を提供する。１以上の核酸分子（開示する方法によって生成されるプローブなど）と会合した標識は、直接的又は間接的のいずれかで検出され得る。標識は、光子（無線周波数、マイクロ波周波数、赤外周波数、可視周波数及び紫外線周波数の光子を含む）の吸収、発光及び／又は散乱を含む、任意の公知の又はまだ発見されていない機序によって検出され得る。検出可能な標識は、着色、蛍光性、リン光性及び発光性の分子及び材料、１つの物質を別の物質へ変換して検出可能な差を提供する触媒（酵素など）（例えば、無色の物質を着色物質へ変換すること若しくはその逆によって、又は沈殿物を産生すること若しくは試料の濁度を増加させることによって）、抗体結合相互作用によって検出され得るハプテン、並びに常磁性及び磁性の分子又は材料を含む。
【００２３】
検出可能な標識の特定の例は、蛍光分子（又は蛍光色素）を含む。多数の蛍光色素が当業者に公知であり、そして、例えば Life Technologies（以前は、Invitrogen）から選択され得る（例えば、The Handbook-A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies を参照のこと）。核酸分子（独自に特異的な結合領域など）に接着（例えば、化学的にコンジュゲート）され得る特定のフルオロフォアの例、例えば、４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’ジスルホン酸、アクリジン及び誘導体、例えばアクリジン及びアクリジンイソチオシアナート、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、４−アミノ−Ｎ−［３  ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５  ジスルホナート（Lucifer Yellow VS）、Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド、アントラニルアミド（antl1ranilamide）、ブリリアントイエロー、クマリン及び誘導体、例えばクマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクルアリン（trifluoromethylcouluarin）（クマリン１５１）；シアノシン；４’，６−ジアルニニジノ（diarninidino）−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）；５’，５”ジブロモピロガロール−スルホンフタレイン（ブロモピロガロールレッド）；７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン；ジエチレントリアミンペンタアセタート；４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸；４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸（disulfor1ic acid）；５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−スルホニルクロリド（ＤＮＳ、ダンシルクロリド）；４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）；４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアナート（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシン及び誘導体、例えばエオシン及びエオシンイソチオシアナート；エリスロシン及び誘導体、例えばエリスロシンＢ及びエリスロシンイソチオシアナート；エチジウム；フルオレセイン及び誘導体、例えば５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６ ジクロロトリアジン−２−イル−アミノフルオレセイン（5-(4,6 dicl1lorotriazin-2-yDarninofluorescein）（ＤＴＡＦ）、２’７’ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、及びＱＦＩＴＣ  Ｑ（ＲＩＴＣ）；２’，７’−ジフルオロフルオレセイン（ＯＲＥＧＯＮ  ＧＲＥＥＮ（登録商標））；フルオレスカミン；ＩＲ１４４；ＩＲ１４４６；マラカイトグリーンイソチオシアナート；４−メチルウンベリフェロン；オルトクレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラローズアニリン；フェノールレッド；Ｂ−フィコエリスリン；ｏ−フタルジアルデヒド；ピレン及び誘導体、例えばピレン、ピレンブチラート及びスクシンイミジル  １−ピレンブチラート；リアクティブレッド４（シバクロンブリリアントレッド３Ｂ−Ａ）；ローダミン及び誘導体、例えば６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、ローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアナート、ローダミングリーン、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１及びスルホローダミン１０１のスルホニルクロリド誘導体（テキサスレッド）；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）；テトラメチルローダミン；テトラメチルローダミンイソチオシアナート（ＴＲＩＴＣ）；リボフラビン；ロゾール酸及びテルビウムキレート誘導体は、Nazarenko等の米国特許第５，８６６，３６６号に提供される。他の好適なフルオロフォアは、およそ６１７mnで発光するチオール反応性ユウロピウムキレート（Heyduk and Heyduk, Analyt. Biochem. 248:216-27, 1997; J. Biol. Chem. 274:3315-22, 1999）、並びに、ＧＦＰ、リサミンＴＭ、ジエチルアミノクマリン、フルオレセインクロロトリアジニル、ナフトフルオレセイン、４，７−ジクロロローダミン及びキサンテン（Lee等の米国特許第５，８００，９９６号に記載されているような）並びにその誘導体を含む。当業者に公知の他のフルオロフォア、例えば、Life Technologies（Invitrogen; Molecular Probes (Eugene, Oreg.)）から入手可能なフルオロフォア、並びにＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）シリーズの色素（例えば、米国特許第５，６９６，１５７号、第６，１３０，１０１号及び第６，７１６，９７９号に記載されているような）、ＢＯＤＩＰＹシリーズの色素（ジピロメテンボロンジフルオリド色素、例えば米国特許第４，７７４，３３９号、第５，１８７，２８８号、第５，２４８，７８２号、第５，２７４，１１３号、第５，３３８，８５４号、第５，４５１，６６３号及び第５，４３３，８９６号に記載されているような）、カスケードブルー（米国特許第５，１３２，４３２号に記載されているスルホン化ピレンのアミン反応性誘導体）及びマリーナブルー（米国特許第５，８３０，９１２号）を含むフルオロフォアもまた使用され得る。
【００２４】
上述した蛍光色素に加えて、蛍光標識は、半導体ナノ結晶、例えば、ＱＵＡＮＴＵＭ  ＤＯＴＴＭ（例えば、Life Technologies（QuantumDot Corp, Invitrogen Nanocrystal Technologies, Eugene, Oreg.）から得られる；また、米国特許第６，８１５，０６４号；第６，６８２，５９６号；及び第６，６４９，１３８号を参照のこと）などの蛍光ナノ粒子であり得る。半導体ナノ結晶は、サイズ依存的な光学的及び／又は電気的特性を有する微小粒子である。半導体ナノ結晶が一次エネルギー源で照射された場合、半導体ナノ結晶において使用される半導体材料のハンドギャップに対応する周波数のエネルギーの二次発光が起こる。この発光は、特定の波長又は蛍光の色光として検出され得る。異なるスペクトル特性を有する半導体ナノ結晶は、例えば、米国特許第６，６０２，６７１号に記載されている。例えば、Bruchez et al., Science 281 :20132016, 1998；Chan et al., Science 281:2016-2018, 1998；及び米国特許第６，２７４，３２３号に記載されている技術によって様々な生体分子（ｄＮＴＰ及び／又核酸を含む）又は物質にカップリングされ得る半導体ナノ結晶。種々の組成の半導体ナノ結晶の形成は、例えば、米国特許第６，９２７，０６９号；第６，９１４，２５６号；第６，８５５，２０２号；第６，７０９，９２９号；第６，６８９，３３８号；第６，５００，６２２号；第６，３０６，７３６号；第６，２２５，１９８号；第６，２０７，３９２号；第６，１１４，０３８号；第６，０４８，６１６号；第５，９９０，４７９号；第５，６９０，８０７号；第５，５７１，０１８号；第５，５０５，９２８号；第５，２６２，３５７号及び米国特許公報第２００３／０１６５９５１号、並びにＰＣＴ公報第９９／２６２９９号（May 27, 1999 に公開されている）に開示されている。それらの異なるスペクトル特性に基づいて識別可能である半導体ナノ結晶の別個の集団が生産され得る。例えば、それらの組成、サイズ又はサイズ及び組成に基づいて異なる色の光を発光する半導体ナノ結晶が生産され得る。例えば、本明細書において開示するプローブにおいて蛍光標識として好適である、サイズ（５６５mn、６５５mn、７０５mn又は８００mnの発光波長）に基づいて異なる波長で光を発光する量子ドットは、Life Technologies（Carlshad, Calif.）から入手可能である。
【００２５】
追加の標識は、例えば、放射性同位体（３Ｈなど）、Ｇｄ３＋のような放射性又は常磁性金属イオンのＤＯＴＡ及びＤＰＴＡキレートなどの金属キレート、並びにリポソームを含む。
【００２６】
核酸分子と共に使用され得る検出可能な標識はまた、酵素、例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ又はベータ−ラクタマーゼを含む。
【００２７】
代替的に、酵素は、金属組織検出スキームにおいて使用され得る。例えば、銀インサイチューハイブリダイゼーション（hyhridization）（ＳＩＳＨ）手順は、ハイブリダイズしたゲノムターゲット核酸配列の同定及び局在確認のための金属組織検出スキームを伴う。金属組織検出法は、アルカリホスファターゼなどの酵素を、水溶性金属イオン及び酵素の酸化還元に不活性な基質と組み合わせて使用することを含む。当該基質は、酵素によって酸化還元に活性な薬剤へと変換され、そして、酸化還元に活性な薬剤は、金属イオンを還元し、検出可能な沈殿物を形成する（例えば、米国特許出願公報第２００５／０１００９７６号、ＰＣＴ公報第２００５／００３７７７号及び米国特許出願公報第２００４／０２６５９２２号を参照のこと）。金属組織検出法はまた、オキシドレダクターゼ酵素（セイヨウワサビペルオキシダーゼなど）を、水溶性金属イオン、酸化剤及び還元剤と共に使用して、同じく検出可能な沈殿物を形成することを含む（例えば、米国特許第６，６７０，１１３号を参照のこと）。
【００２８】
開示する方法を使用して製造されるプローブは、ＩＳＨ手順（例えば、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、発色性インサイチューハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）及び銀インサイチューハイブリダイゼーション（ＳＩＳＨ））又は比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）などの核酸検出のために使用され得る。
【００２９】
インサイチューハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）は、中期又は間期の染色体調製物（スライド上にマウントされた細胞又は組織試料など）という状況下のターゲット核酸配列（例えば、ゲノムターゲット核酸配列）含有試料を、ターゲット核酸配列（例えば、ゲノムターゲット核酸配列）に特異的にハイブリダイズ可能な又は前記配列に特異的な標識プローブと接触させることを伴う。このスライドを、場合により、例えば、均一なハイブリダイゼーションを妨害し得るパラフィン又は他の材料を除去するために前処理する。試料及びプローブを共に、例えば加熱することによって処理して、二本鎖核酸を変性させる。プローブ（好適なハイブリダイゼーション緩衝液中に調合される）と試料を、ハイブリダイゼーションを起こす（典型的には、平衡に達する）ことを可能にする条件下で十分な時間混合する。染色体調製物を洗浄して過剰なプローブを除去し、そして、標準的な技術を使用して染色体ターゲットの特異的標識の検出を実施する。
【００３０】
例えば、ビオチニル化プローブは、フルオレセイン標識されたアビジン又はアビジン−アルカリホスファターゼを使用して検出され得る。蛍光色素検出のために、蛍光色素を直接検出しても、又は、試料を、例えばフルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）コンジュゲートアビジンとインキュベートしてもよい。ＦＩＴＣシグナルの増幅は、必要に応じて、ビオチンコンジュゲートヤギ抗アビジン抗体とのインキュベーション、洗浄及びＦＩＴＣコンジュゲートアビジンとの２回目のインキュベーションによって行われ得る。酵素活性による検出のために、試料を、例えばストレプトアビジンとインキュベートし、洗浄し、ビオチンコンジュゲートアルカリホスファターゼとインキュベートし、再度洗浄し、そして、予め平衡化（例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）緩衝液中）することができる。インサイチューハイブリダイゼーション手順の一般的な記載については、例えば、米国特許第４，８８８，２７８号を参照のこと。
【００３１】
ＦＩＳＨ、ＣＩＳＨ及びＳＩＳＨのための多数の手順が当技術分野において公知である。例えば、ＦＩＳＨを実施するための手順は、米国特許第５，４４７，８４１号；第５，４７２，８４２号；及び第５，４２７，９３２号；並びに、例えば、Pir1kel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 83:2934-2938, 1986; Pinkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85:9138-9142, 1988; and Lichter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85:9664-9668, 1988 に記載されている。ＣＩＳＨは、例えば、Tanner et al., Am. .1. Pathol. 157:1467-1472, 2000、及び米国特許第６，９４２，９７０号に記載されている。追加の検出法は、米国特許第６，２８０，９２９号に提供される。
【００３２】
多数の試薬及び検出スキームを、ＦＩＳＨ、ＣＩＳＨ及びＳＩＳＨ手順と併せて用いて、感度、解像度又は他の所望の特性を改善することができる。上に考察したように、フルオロフォア（蛍光色素及びＱＵＡＮＴＵＭ  ＤＯＴＳ（登録商標）を含む）で標識されたプローブは、ＦＩＳＨを実施すれば直接光学的に検出され得る。代替的に、プローブは、非蛍光分子、例えばハプテン（例えば、以下の非限定的な例：ビオチン、ジゴキシゲニン、ＤＮＰ、及び種々のオキサゾール、ピラゾール、チアゾール、ニトロアリール、ベンゾフラザン、トリテルペン、尿素、チオ尿素、ロテノン、クマリン、クマリン系化合物、ポドフィロトキシン、ポドフィロトキシン系化合物、及びそれらの組み合わせ）、リガンド又は他の間接的に検出可能な部分で標識され得る。次に、そのような非蛍光分子で標識されたプローブ（及びこれらが結合したターゲット核酸配列）は、試料（例えば、プローブが結合した細胞又は組織試料）を、選択されたハプテン又はリガンドに特異的な標識検出試薬、例えば抗体（又は受容体、又は他の特異的な結合パートナー）と接触させることによって検出され得る。検出試薬は、フルオロフォア（例えば、ＱＵＡＮＴＵＭ  ＤＯＴ（登録商標））で又は別の間接的に検出可能な部分で標識され得るか、あるいは、フルオロフォアで標識され得る１以上の追加の特異的結合剤（例えば、二次抗体又は特異的抗体）と接触され得る。
【００３３】
他の例において、プローブ、又は特異的結合剤（例えば、抗体、例えば一次抗体、受容体又は他の結合剤）は、蛍光発生組成物又は発色性組成物を検出可能な蛍光、着色又は別様に検出可能なシグナル（例えば、ＳＩＳＨにおける検出可能な金属粒子の沈着におけるような）へと変換することのできる酵素で標識される。上に示したように、酵素は、直接的に又はリンカーを介して間接的に、関連するプローブ又は検出試薬に接着され得る。好適な試薬（例えば、結合試薬）及び化学物質（例えば、リンカー及び接着化学物質）の例は、米国特許出願公報第２００６／０２４６５２４号；第２００６／０２４６５２３号及び第２００７／０１１７１５３号に記載されている。
【００３４】
標識プローブ−特異的結合剤の対を適切に選択することによって、マルチプレックス検出スキームを作製して、単回アッセイで（例えば、単一細胞若しくは組織試料上で又は２以上の細胞若しくは組織試料上で）複数のターゲット核酸配列（例えば、ゲノムターゲット核酸配列）の検出を容易にできることが当業者によって理解されるだろう。例えば、第一のターゲット配列に対応する第一のプローブを第一のハプテン（ビオチンなど）で標識することができ、一方で、第二のターゲット配列に対応する第二のプローブを第二のハプテン（ＤＮＰなど）で標識することができる。試料をプローブへ曝露した後に、試料を、第一の特異的結合剤｛この場合、第一のフルオロフォア、例えば、第一のスペクトル的に別個のＱＵＡＮＴＵＭ  ＤＯＴ（登録商標）（例えば、５８５mnで発光する）で標識されたアビジン｝及び第二の特異的結合剤｛この場合、第二のフルオロフォア、例えば、第二のスペクトル的に別個のＱＵＡＮＴＵＭ  ＤＯＴ（登録商標）（例えば、７０５mnで発光する）で標識された抗ＤＮＰ抗体、又は抗体断片｝と接触させることによって、結合したプローブを検出することができる。追加のプローブ／結合剤の対を、他のスペクトル的に別個のフルオロフォアを使用してマルチプレックス検出スキームに加えることができる。直接的な及び間接的な多数の変法（１工程、２工程以上）も想定することができ、その全てが開示するプローブ及びアッセイの状況下で好適である。
【００３５】
プローブは、典型的には、１０〜１０００の間、例えば１０〜８００の間、より好ましくは１５〜７００の間、典型的には２０〜５００の間のヌクレオチド長の一本鎖核酸を含む。プライマーは、典型的には、増幅しようとする関心対象の核酸と完全に又はほぼ完全に一致するように設計された、１０〜２５の間のヌクレオチド長のより短い一本鎖核酸である。プローブ及びプライマーは、これらがハイブリダイズする核酸に「特異的」であり、すなわち、これらは、好ましくは、高ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件下（最も高い融解温度Ｔｍ、例えば、５０％ホルムアミド、５×又は６×ＳＣＣに相当する。ＳＣＣは、０．１５M ＮａＣｌ、０．０１５M クエン酸Ｎａである）でハイブリダイズする。
【００３６】
上の増幅及び検出法において使用される核酸プライマー又はプローブは、キットとして組み立てられ得る。そのようなキットは、コンセンサスプライマー及び分子プローブを含む。好ましいキットはまた、増幅が起こったかを決定するのに必要な成分も含む。キットはまた、例えば、ＰＣＲ緩衝液及び酵素；陽性対照配列、反応対照プライマー；並びに特定の配列を増幅及び検出するための説明書も含み得る。
【００３７】
いくつかの実施態様において、本発明の方法は、卵丘細胞から抽出されたトータルＲＮＡを提供する工程と、そのＲＮＡを、より特定すると定量又は半定量ＲＴ−ＰＣＲを用いた、増幅及び特異的なプローブへのハイブリダイゼーションに供する工程とを含む。
【００３８】
いくつかの実施態様において、発現レベルは、ＤＮＡチップ分析によって決定される。そのようなＤＮＡチップ又は核酸マイクロアレイは、基剤（マイクロチップ、スライドガラス又はマイクロスフィアのサイズのビーズであり得る）に化学的に接着された異なる核酸プローブからなる。マイクロチップは、ポリマー、プラスチック、樹脂、多糖、シリカ若しくはシリカ系材料、炭素、金属、無機ガラス、又はニトロセルロースから構成され得る。プローブは、約１０〜約６０塩基対であり得る、ｃＤＮＡ又はオリゴヌクレオチドなどの核酸を含む。発現レベルを決定するために、試験対象者由来の試料（場合により、最初に逆転写に供された）を標識し、そして、ハイブリダイゼーション条件でマイクロアレイと接触させることで、マイクロアレイ表面に接着されたプローブ配列に相補的であるターゲット核酸間で複合体を形成する。次に、標識されたハイブリダイズした複合体を検出し、定量化又は半定量化することができる。標識化は、種々の方法によって、例えば、放射性又は蛍光標識化を使用することによって達成され得る。当業者であれば、マイクロアレイハイブリダイゼーション技術の多くの変法が利用可能である（例えば、Hoheisel, Nature Reviews, Genetics, 2006, 7:200-210 による概説を参照のこと）。
【００３９】
いくつかの実施態様において、nCounter（登録商標）Analysis システムを使用して、固有の遺伝子発現を検出する。nCounter（登録商標）Analysis システムの原理は、アッセイしようとする各核酸ターゲットに独自のコードを割り当てることである（国際特許出願公報第ＷＯ０８／１２４８４７号、米国特許第８，４１５，１０２号及びGeiss et al. Nature Biotechnology. 2008. 26(3): 317-325；その内容は各々、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる）。コードは、一連の連続した着色蛍光スポットから構成され、これがアッセイしようとする各ターゲットについて独自のバーコードを生み出す。一対のプローブが、各ＤＮＡ又はＲＮＡターゲット、ビオチニル化捕捉プローブ及び蛍光バーコードを担持するレポータープローブについて設計される。このシステムはまた、本明細書において、ナノレポーターコードシステムとも呼ばれる。特異的なレポータープローブ及び捕捉プローブが各ターゲットについて合成される。レポータープローブは、第一のシグナルを構成する光を発光する１以上の標識モノマーが接着される、少なくとも１つの第一の標識接着領域；第二のシグナルを構成する光を発光する１以上の標識モノマーが接着される、第一の標識接着領域と重複しない少なくとも１つの第二の標識接着領域；及び第一のターゲット特異的配列を含むことができる。好ましくは、各配列特異的レポータープローブは、１つのみの遺伝子にハイブリダイズすることができるターゲット特異的配列を含み、そして、場合により、少なくとも３つ又は少なくとも４つの標識接着領域を含み、前記の接着領域は、少なくとも第三のシグナル又は少なくとも第四のシグナルをそれぞれ構成する光を発光する１以上の標識モノマーを含む。捕捉プローブは、第二のターゲット特異的配列；及び第一のアフィニティータグを含むことができる。いくつかの実施態様において、捕捉プローブはまた、１以上の標識接着領域を含むことができる。好ましくは、レポータープローブの第一のターゲット特異的配列及び捕捉プローブの第二のターゲット特異的配列は、検出しようとする同じ遺伝子の異なる領域にハイブリダイズする。レポータープローブ及び捕捉プローブは全て、単一のハイブリダイゼーション混合物「プローブライブラリー」へとプールされる。各ターゲットの相対存在度は、単一のマルチプレックスハイブリダイゼーション反応で測定される。本方法は、試料をプローブライブラリーと接触させることを含み、それによって試料中にターゲットが存在するとプローブ対−ターゲット複合体が生じる。次に、その複合体を精製する。より具体的には、試料をプローブライブラリーと混合し、そして、ハイブリダイゼーションが溶液中で起こる。ハイブリダイゼーション後、三部分のハイブリダイズした複合体（プローブ対及びターゲット）を、捕捉プローブ及びレポータープローブ上に存在するユニバーサル配列に相補的なオリゴヌクレオチドに連結された磁性粒子を使用して２工程手順で精製する。この二重の精製プロセスは、駆動しようとするハイブリダイゼーション反応が大過剰のターゲット特異的プローブを用いて完了することを可能にするが、これらのプローブは最終的に除去されるので、したがって、試料の結合及びイメージング���妨害しない。全てのハイブリダイゼーション後の工程は、カスタム化されたリキッドハンドリングロボット（Prep Station, NanoString Technologies）でロボット制御により操作される。精製された反応物は、典型的には、Prep Stationによって試料カートリッジの個々のフローセル中に沈着させ、捕捉プローブを介してストレプトアビジンコート表面に結合させ、電気泳動することでレポータープローブを伸長し、そして固定化する。処理後、試料カートリッジを、完全自動化されたイメージング及びデータ集積デバイス（Digital Analyzer, NanoString Technologies）に移送する。ターゲットの発現レベルは、各試料をイメージングし、そして、そのターゲットのコードが検出された回数を計数することによって測定される。各試料について、典型的には、６００視野角（ＦＯＶ）をイメージングし（１３７６×１０２４画素）、およそ１０mm2の結合表面を表示する。典型的なイメージング密度は、マルチプレックス度、入力試料の量及びターゲット全体の存在度に応じて、１視野角当たりの１００〜１２００の計数レポーターである。データは、１試料当たりの計数／ターゲットを列挙する単純なスプレッドシート形式で出力される。このシステムは、ナノレポーターと共に使用され得る。ナノレポーターに関する追加の開示は、国際公報第ＷＯ０７／０７６１２９号及び第ＷＯ０７／０７６１３２号、並びに米国特許公報第２０１０／００１５６０７号及び第２０１０／０２６１０２６号に見いだすことができ、その内容はその全体が本明細書に組み入れられる。さらに、核酸プローブ及びナノレポーターという用語は、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる国際公報第ＷＯ２０１０／０１９８２６号及び米国特許公報第２０１０／００４７９２４号に記載されている、合理的に設計されたもの（例えば、合成配列）を含むことができる。
【００４０】
遺伝子の発現レベルは、絶対発現レベル又は正規化された発現レベルとして表され得る。典型的には、発現レベルは、その発現を、対象者の癌ステージを決定する際に関係しない遺伝子、例えば構成的に発現されているハウスキーピング遺伝子の発現と比較することによって、その遺伝子の絶対発現レベルを補正することによって正規化される。正規化に好適な遺伝子は、アクチン遺伝子ＡＣＴＢ、リボソーム１８Ｓ遺伝子、ＧＵＳＢ、ＰＧＫ１及びＴＦＲＣなどのハウスキーピング遺伝子を含む。この正規化は、１つの試料（例えば、対象者試料）中の、別の試料との、又は異なる起源由来の試料間の発現レベルの比較を可能にする。
【００４１】
いくつかの実施態様において、１１βＨＳＤ１及び／又は１１βＨＳＤ２の発現レベルは、当技術分野において周知の任意の方法によってタンパク質レベルで決定される。典型的には、そのような方法は、組織試料を、１１βＨＳＤ１及び／又は１１βＨＳＤ２と選択的に相互作用することができる少なくとも１つの選択的結合剤と接触させることを含む。選択的結合剤は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体、抗体断片、合成抗体又は核酸若しくはペプチドアプタマーなどの他のタンパク質特異的薬剤であり得る。いくつかの抗体が先行技術に記載されており、そして、また実施例に記載されているような多くの抗体が市販されている。１１βＨＳＤ１及び／又は１１βＨＳＤ２の存在が顕微鏡検査又は自動分析システムによって検出可能となる抗体の検出のために、抗体は、酵素、クロモゲン又は蛍光プローブなどの検出可能な標識で直接タグ化され得るか、あるいは、検出可能な標識とコンジュゲートされた二次抗体で間接的に検出され得る。本発明に係る好ましい方法は、免疫組織化学である。免疫組織化学は、典型的には、以下の工程を含む：
−前記試料をホルマリンで固定する工程、
−前記試料をパラフィン中に包埋する工程、
−前記試料を染色用に切断する工程、
−前記切片を特異的な結合パートナーとインキュベートする工程、
−前記切片をすすぐ工程、
−前記切片をビオチニル化二次抗体とインキュベートする工程、
−抗原−抗体複合体をアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体を用いて明らかにする工程。
【００４２】
したがって、組織試料を、最初に結合パートナーとインキュベートする。洗浄後、関心対象のマーカーに結合している標識抗体を、標識抗体が担持する標識の種類、例えば、放射性、蛍光又は酵素標識に応じた適切な技術によって明らかにする。複数の標識化を同時に実施することができる。代替的に、本発明の方法は、増幅システム（染色シグナルを増強するため）及び酵素分子にカップリングされた二次抗体を使用してもよい。そのようなカップリングされた二次抗体は、例えば、Dakoから市販されている（EnVision system）。対比染色、例えば、Ｈ＆Ｅ、ＤＡＰＩ、ヘキスト（Hoechst）を使用してもよい。他の染色法は、自動、半自動又は手動システムを含む当業者に明らかであろう任意の好適な方法又はシステムを使用して達成され得る。
【００４３】
典型的には、所定の基準値は、閾値又はカットオフ値である。典型的には、「閾値」又は「カットオフ値」は、実験的に、経験的に又は理論的に決定され得る。閾値はまた、当業者に認識されるであろう既存の実験及び／又は臨床条件に基づいて任意に選択され得る。例えば、適切に保存された歴史的対象者試料における１１βＨＳＤ１及び／又は１１βＨＳＤ２の発現レベルのレトロスペクティブ測定が、所定の基準値を確立する際に使用され得る。閾値は、試験の機能及びベネフィット／リスクバランス（偽陽性及び偽陰性の臨床的帰結）に応じた最適な感度及び特異度を得るために決定されなければならない。典型的には、最適な感度及び特異度（及びよって閾値）は、実験データに基づいた受信者オペレーティング（動作）特性（Receiver Operating Characteristic）（ＲＯＣ）曲線を使用して決定され得る。例えば、参照群におけるサイトカインのレベルを決定した後、試験しようとする試料中のサイトカインの測定濃度の統計的処理のためにアルゴリズム的分析を使用することができ、したがって試料分類のための有意性を有する分類基準を得ることができる。ＲＯＣ曲線のフルネームは、受信者オペレーター特性（receiver operator characteristic）曲線であり、受信者オペレーション特性（receiver operation characteristic）曲線としても公知である。それは主に、臨床生化学診断検査に使用される。ＲＯＣ曲線は、真陽性率（感度）及び偽陽性率（１−特異度）の連続変数を反映する包括的な指標である。それは、画像合成法を用いて感度と特異度の間の関係を明らかにする。一連の異なるカットオフ値（閾値又は臨界値、診断検査の正常な結果と異常な結果の間の境界値）は、一連の感度及び特異度値を算出するための連続変数として設定される。次に、感度を垂直座標として使用し、そして、特異度を水平座標として使用して曲線を描く。曲線下面積（ＡＵＣ）が高いほど、診断の正確さが高くなる。ＲＯＣ曲線上で、座標図の左上端に最も近い点は、高い感度値と高い特異度値の両方を有する臨界点である。ＲＯＣ曲線のＡＵＣ値は、１．０〜０．５の間である。ＡＵＣ＞０．５である場合、ＡＵＣが１に近づくにつれて診断結果はどんどん良くなる。ＡＵＣが０．５〜０．７の間である場合、正確さは低い。ＡＵＣが０．７〜０．９の間である場合、正確さは中程度である。ＡＵＣが０．９よりも高い場合、正確さはかなり高い。このアルゴリズム的方法は、好ましくは、コンピューターを用いて行われる。当技術分野における既存のソフトウェア又はシステム、例えば：MedCalc 9.2.0.1医療統計ソフトウェア、SPSS 9.0、ROCPOWER.SAS、DESIGNROC.FOR、MULTIREADER POWER.SAS、CREATE-ROC.SAS、GB STAT VI0.0（Dynamic Microsystems, Inc. Silver Spring, Md., USA）などがＲＯＣ曲線の描写に使用され得る。
【００４４】
所定の基準値は、同じ又は類似の年齢範囲の対象者、同じ又は類似の人種の対象者及び同じ癌重症度を有する対象者を非限定的に含む人口調査から導出された数又は値に相対的であり得る。そのような所定の基準値は、数学アルゴリズム及び算出指数から得られた集団の統計分析及び／又はリスク予測データから導出され得る。いくつかの実施態様において、所定の基準値は、癌を患っていない１以上の対象者に由来する対照試料中の１１βＨＳＤ１及び／又は１１βＨＳＤ２の発現レベルから導出される。さらに、適切に保存された歴史的対象者試料中の選択バイオマーカーのレベルのレトロスペクティブ測定が、これらの所定の基準値を確立する際に使用され得る。
【００４５】
いくつかの実施態様において、所定の基準値は、生存期間（例えば、無病生存（ＤＦＳ）及び／又は全生存（ＯＳ））と相関している。したがって、所定の基準値は、典型的には、以下の工程を含む方法を実施することによって決定され得る：
ａ）同じ癌を患っている対象者由来の腫瘍試料の収集物を提供する工程；
ｂ）工程ａ）で提供された各腫瘍試料について、対応する対象者についての実際の臨床転帰に関する情報（すなわち、無病生存（ＤＦＳ）及び／又は全生存（ＯＳ）の期間）を提供する工程；
ｃ）一連の任意の定量値を提供する工程；
ｄ）工程ａ）で提供された収集物中に含有される各腫瘍試料について、選択バイオマーカー（例えば、１１βＨＳＤ１又は１１βＨＳＤ２）のレベルを決定する工程；
ｅ）工程ｃ）で提供された１つの具体的な任意の定量値について、前記の腫瘍試料を２つの群にそれぞれ分類する工程：
（ｉ）第一群は、前記の一連の定量値中に含有される前記の任意の定量値よりも低いレベルについての定量値を示す腫瘍試料を含み；
（ｉｉ）第二群は、前記の一連の定量値中に含有される前記の任意の定量値よりも高い前記レベルについての定量値を示す腫瘍試料を含み；
それによって前記の具体的な定量値について腫瘍試料の２つの群が得られ、ここで、各群の腫瘍試料は別々に列挙される；
ｆ）（ｉ）工程ｅ）で得られた定量値と（ｉｉ）工程ｆ）で定義された第一群及び第二群中に含有される腫瘍試料が由来する対象者の実際の臨床転帰との間の統計学的有意性を算出する工程；
ｇ）工程ｄ）で提供された全ての任意の定量値が試験されるまで、工程ｆ）及びｇ）を繰り返す工程；
ｈ）前記の所定の基準値を、最も高い統計学的有意性（最も有意）が工程ｇ）で算出された任意の定量値からなるとして設定する工程。
【００４６】
例えば、選択バイオマーカー（例えば、１１βＨＳＤ１又は１１βＨＳＤ２）の発現レベルが１００の対象者の１００の腫瘍試料について評価されている。１００の試料は、選択バイオマーカー（例えば、１１βＨＳＤ１又は１１βＨＳＤ２）の発現レベルに従ってランク付けされる。試料１は最も高いレベルを有し、そして、試料１００は最も低いレベルを有する。第一のグループ分けは、２つのサブセット：一方が試料Ｎｒ１で他方が９９の他の試料を提供する。次のグループ分けは、一方が試料１及び２で他方が９８の残りの試料を提供する（最後のグループ分け：一方が試料１〜９９で他方が試料Ｎｒ１００まで）。対応する癌対象者についての実際の臨床転帰に関する情報に従って、２つのサブセットの９９の群の各々についてカプラン・マイヤー曲線を作成する。また、９９の群の各々について、両サブセット間のｐ値を算出した。次に、最小ｐ値の基準に基づく識別が最も強くなるように所定の基準値を選択する。言い換えると、ｐ値が最小である両サブセット間の境界値に対応する選択バイオマーカー（例えば、１１βＨＳＤ１又は１１βＨＳＤ２）の発現レベルが、所定の基準値として考慮される。所定の基準値が必ずしも選択バイオマーカー（例えば、１１βＨＳＤ１又は１１βＨＳＤ２）のレベルの中央値というわけではないことに留意すべきである。
【００４７】
したがって、いくつかの実施態様において、所定の基準値は、したがって、対象者のＤＦＳ及びＯＳに関して予後不良と予後良好との間の識別を可能にする。実際には、高い統計的に有意な値（例えば、低いＰ値）は、一般に、単一の任意の定量値についてだけではなく、ある範囲の連続した任意の定量値について得られる。したがって、本発明の１つの代替的な実施態様において、確定した所定の基準値を使用する代わりに、ある範囲の値が提供される。それゆえ、最小の統計的に有意な値（有意性の最小閾値、例えば、最大閾値Ｐ値）が任意に設定され、そして、工程ｇ）で算出された統計的に有意な値がより高い（より有意である、例えば、より低いＰ値）ある範囲の複数の任意の定量値が保持され、それによってある範囲の定量値が提供される。この定量値の範囲は、上述したような「カットオフ」値を含む。
【００４８】
例えば、「カットオフ」値のこの特定の実施態様によれば、転帰は、選択バイオマーカー（例えば、１１βＨＳＤ１又は１１βＨＳＤ２）の発現レベルと同定された範囲の値とを比較することによって決定され得る。特定の実施態様において、カットオフ値は、したがって、ある範囲の定量値、例えば、最も高い統計的に有意な値が見いだされる定量値（例えば、一般に、見いだされる最小ｐ値）を中心とする定量値からなる。例えば、１〜１０の仮定のスケールで、理想のカットオフ値（最も高い統計的に有意な値）が５であるならば、好適な（例示的な）範囲は４〜６であり得る。例えば、対象者は、１１βＨＳＤ２の発現レベルを測定することによって得られた値を比較することによって評価され得、５より大きい値は予後不を表し、そして、５未満の値は予後良好を表す。別の実施態様において、対象者は、１１βＨＳＤ２の発現レベルを測定することによって得られた値を比較し、その値をあるスケールで比較することによって評価され得、ここで、４〜６の範囲を超える値は予後不良を示し、そして、４〜６の範囲より小さい値は予後良好を示し、４〜６の範囲内の値は、中間の出現度（occurrence）（又は予後）を示す。
【００４９】
本発明の治療法：
対象者が癌を患っていると診断されると、医師は、対象者に最も正確な処置を施すことを選択することができる。典型的には、処置は、化学療法、放射線療法及び免疫療法を含む。
【００５０】
いくつかの実施態様において、本発明の方法によって癌を患っていると診断された対象者には、化学療法剤が投与される。用語「化学療法剤」は、腫瘍の成長を阻害するのに効果的な化合物を指す。化学療法剤の例は、アルキル化剤、例えば、チオテパ及びシクロホスファミド；アルキルスルホナート、例えば、ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファン；アジリジン、例えば、ベンゾドーパ、カルボクオン、メツレドーパ及びウレドーパ；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド（triethylenethiophosphaorarnide）及びトリメチロメラミンを含むエチレンイミン及びメチラメラミン；アセトゲニン（特に、ブラタシン及びブラタシノン）；カンプトセシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼルシン及びビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特定するとクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンギスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニマスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソウレア、例えば、カルマスティン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン；抗生物質、例えば、エンジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特に、カリケアマイシン（１１及びカリケアマイシン２１１、例えば、Agnew Chem Intl. Ed. Engl. 33:183-186 (1994) を参照のこと；ジネマイシンＡを含むジネマイシン；エスペラミシン；並びにネオカルジノスタチン発色団及び関連する色素タンパク質であるエンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗物質、例えば、メトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸類似体、例えば、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート；プリン類似体、例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロキシウリジン、５−ＦＵ；アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎物質、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補充薬、例えば、フロリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビスアントレン；エダトレキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エルフォルニチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシノイド、例えば、メイタンシン及びアンサマイトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン（trichlorotriethylarnine）；トリコテセン（特に、Ｔ−２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡ及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.].）及びドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）；クロランブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金類似体、例えば、シスプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１  １；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；カペシタビン；及び上記のいずれかの薬学的に許容し得る塩、酸又は誘導体を含む。また、この定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えば、抗エストロゲン薬（例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン及びトレミフェン（Fareston）を含む）；並びに抗アンドロゲン薬、例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド及びゴセレリン；並びに上記のいずれかの薬学的に許容し得る塩、酸又は誘導体も含まれる。
【００５１】
いくつかの実施態様において、癌を患っていると診断された対象者には、ターゲット化癌療法が施される。ターゲット化癌療法は、癌の成長、進行及び転移に関与する特定の分子（「分子ターゲット」）と干渉することによって癌の成長及び転移を遮断する薬物又は他の物質である。ターゲット化癌療法は、しばしば、「分子ターゲット化薬物」、「分子ターゲット化療法」、「高精度医療」又は類似の名称で呼ばれる。いくつかの実施態様において、ターゲット化療法は、対象者にチロシンキナーゼ阻害剤を投与することからなる。用語「チロシンキナーゼ阻害剤」は、受容体及び／又は非受容体チロシンキナーゼの選択的又は非選択的阻害剤として作用する様々な治療剤又は薬物のいずれかを指す。チロシンキナーゼ阻害剤及び関連化合物は、当技術分野において周知であり、そして、米国特許公報第２００７／０２５４２９５号（参照によってその全体が本明細書に組み入れられる）に記載されている。チロシンキナーゼ阻害剤に関連する化合物が、チロシンキナーゼ阻害剤の効果を反復するだろうこと、例えば、関連化合物が、チロシンキナーゼシグナル伝達経路の異なるメンバーに作用して、そのチロシンキナーゼのチロシンキナーゼ阻害剤と同じ効果を生むだろうことが当業者に理解されるだろう。本発明の実施態様の方法における使用に好適なチロシンキナーゼ阻害剤及び関連化合物の例は、限定されないが、ダサチニブ（ＢＭＳ−３５４８２５）、ＰＰ２、ＢＥＺ２３５、サラカチニブ、ゲフィチニブ（Iressa）、スニチニブ（Sutent；ＳＵ１１２４８）、エルロチニブ（Tarceva；ＯＳＩ−１７７４）、ラパチニブ（ＧＷ５７２０１６；ＧＷ２０１６）、カネルチニブ（ＣＩ  １０３３）、セマキシニブ（ＳＵ５４１６）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４）、ソラフェニブ（ＢＡＹ  ４３−９００６）、イマチニブ（Gleevec；ＳＴＩ５７１）、レフルノミド（ＳＵ１０１）、バンデタニブ（Zactima；ＺＤ６４７４）、ＭＫ−２２０６（８−［４−アミノシクロブチル）フェニル］−９−フェニル−１，２，４−トリアゾロ［３，４−ｆ］［１，６］ナフチリジン−３（２Ｈ）−オン塩酸塩）、その誘導体、その類似体及びその組み合わせを含む。本発明における使用に好適な追加のチロシンキナーゼ阻害剤及び関連化合物は、例えば、米国特許公報第２００７／０２５４２９５号、米国特許第５，６１８，８２９号、第５，６３９，７５７号、第５，７２８，８６８号、第５，８０４，３９６号、第６，１００，２５４号、第６，１２７，３７４号、第６，２４５，７５９号、第６，３０６，８７４号、第６，３１３，１３８号、第６，３１６，４４４号、第６，３２９，３８０号、第６，３４４，４５９号、第６，４２０，３８２号、第６，４７９，５１２号、第６，４９８，１６５号、第６，５４４，９８８号、第６，５６２，８１８号、第６，５８６，４２３号、第６，５８６，４２４号、第６，７４０，６６５号、第６，７９４，３９３号、第６，８７５，７６７号、第６，９２７，２９３号及び第６，９５８，３４０号に記載されており、その全ては参照によってその全体が本明細書に組み入れられる。特定の実施態様において、チロシンキナーゼ阻害剤は、経口投与されており、かつ、少なくとも��つの第Ｉ相臨床試験、より好ましくは少なくとも１つの第ＩＩ相臨床試験、さらにより好ましくは少なくとも１つの第ＩＩＩ相臨床試験、最も好ましくはＦＤＡによって少なくとも１つの血液学的又は腫瘍学的適応に承認されている対象である低分子キナーゼ阻害剤である。そのような阻害剤の例は、限定されないが、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、カネルチニブ、ＢＭＳ−５９９６２６（ＡＣ−４８０）、ネラチニブ、ＫＲＮ−６３３、ＣＥＰ−１１９８１、イマチニブ、ニロチニブ、ダサチニブ、ＡＺＭ−４７５２７１、ＣＰ−７２４７１４、ＴＡＫ−１６５、スニチニブ、バタラニブ、ＣＰ−５４７６３２、バンデタニブ、ボスチニブ、レスタウルチニブ、タンズチニブ、ミドスタウリン、エンザスタウリン、ＡＥＥ−７８８、パゾパニブ、アキシチニブ、モテサニブ（Motasenib）、ＯＳＩ−９３０、セジラニブ、ＫＲＮ−９５１、ドビチニブ、セリシクリブ、ＳＮＳ−０３２、ＰＤ−０３３２９９１、ＭＫＣ−Ｉ（Ｒｏ−３１７４５３；Ｒ−４４０）、ソラフェニブ、ＡＢＴ−８６９、ブリバニブ（ＢＭＳ−５８２６６４）、ＳＵ−１４８１３、テラチニブ、ＳＵ−６６６８、（ＴＳＵ−６８）、Ｌ−２１６４９、ＭＬＮ−８０５４、ＡＥＷ−５４１及びＰＤ−０３２５９０１を含む。
【００５２】
いくつかの実施態様において、癌を患っていると診断された対象者には、免疫療法剤が投与される。本明細書において使用されるような用語「免疫療法剤」は、癌細胞に対する身体の免疫応答を間接的に又は直接的に増強する、刺激する又は増加させる、及び／又は他の抗癌療法の副作用を減少させる化合物、組成物又は処置を指す。したがって、免疫療法は、癌細胞に対する免疫系の応答を直接的又は間接的に刺激又は増強する、及び／又は他の抗癌剤によって引き起こされ得る副作用を低下させる治療である。免疫療法はまた、当技術分野において、免疫学的療法、生物学的療法、生物学的応答修飾物質療法及びバイオセラピーと称される。当技術分野において公知の一般的な免疫療法剤の例は、限定されないが、サイトカイン、癌ワクチン、モノクローナル抗体及び非サイトカイン補助剤を含む。代替的に、免疫療法的処置は、対象者にある量の免疫細胞（Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、Ｂ細胞…）を投与することからなり得る。
【００５３】
免疫療法剤は、非特異的であっても、すなわち、一般にヒトの身体が癌細胞の成長及び／又は転移に対抗するのにより効果的になるように免疫系を高めても、又は、これらは特異的であっても、すなわち、癌細胞それ自体にターゲット化されてもよく、免疫療法レジメンは、非特異的免疫療法剤と特異的免疫療法剤の使用を組み合わせてもよい。
【００５４】
非特異的免疫療法剤は、免疫系を刺激するか又は間接的に改善する物質である。非特異的免疫療法剤は、癌の処置のために主治療として単独で、並びに、非特異的免疫療法剤が他の治療（例えば、癌ワクチン）の有効性を増強する補助剤として機能する場合には主治療に加えて使用されている。非特異的免疫療法剤はまた、この後者の状況において、他の治療の副作用、例えばある種の化学療法剤によって誘発される骨髄抑制を低下させるように機能することができる。非特異的免疫療法剤は、重要な免疫系細胞に対して作用し、かつサイトカイン及び免疫グロブリンの増加した産生などの二次応答を引き起こすことができる。代替的に、当該薬剤は、それ自体サイトカインを含むことができる。非特異的免疫療法剤は、一般に、サイトカイン補助剤又は非サイトカイン補助剤として分類される。
【００５５】
多数のサイトカインが、免疫系を高めるように設計された一般的な非特異的免疫療法、又は他の治療と共に提供される補助剤のいずれかとして癌の処置に適用されている。好適なサイトカインは、限定されないが、インターフェロン、インターロイキン及びコロニー刺激因子を含む。
【００５６】
本発明によって検討されるインターフェロン（ＩＦＮ）は、一般的な種類のＩＦＮ、ＩＦＮ−アルファ（ＩＦＮ−α）、ＩＦＮ−ベータ（ＩＦＮ−β）及びＩＦＮ−ガンマ（ＩＦＮ−γ）を含む。ＩＦＮは、例えば、癌細胞の成長を遅延させること、より正常な挙動を示す細胞への発達を促進すること、及び／又は癌細胞の抗原の産生を増加させる（したがって、免疫系が癌細胞を認識及び破壊するのを容易にする）ことによって癌細胞に直接作用することができる。ＩＦＮはまた、例えば、血管新生を遅らせること、免疫系を高めること、並びに／又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔ細胞及びマクロファージを刺激することによって、癌細胞に間接的に作用することができる。組み換えＩＦＮ−アルファは、ロフェロン（Roche Pharmaceuticalｓ）及びイントロンＡ（Schering Corporation）として市販されている。
【００５７】
本発明によって検討されるインターロイキンは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１１及びＩＬ−１２を含む。市販の組み換えインターロイキンの例は、プロロイキン（Proleukin）（登録商標）（IL-2;Chiron Corporation）及びニューメガ（Neumega）（登録商標）（IL-12; Wyeth Pharmaceuticals）を含む。Zymogenetics, Inc. (Seattle、Wash.）は、現在、組み換え型のＩＬ−２１を試験しており、これもまた本発明の組み合わせにおける使用に検討される。
【００５８】
本発明によって検討されるコロニー刺激因子（ＣＳＦ）は、顆粒コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ又はフィルグラスチム）、顆粒マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ又はサルグラモスチム）及びエリスロポエチン（エポエチンアルファ、ダルベポエチン）を含む。１以上の成長因子での処置は、従来の化学療法を受けている対象者中の新規血液細胞の生成を刺激するのを助けることができる。したがって、ＣＳＦでの処置は、化学療法と関連する副作用を減少させる上で役に立つことができ、かつ使用しようとする化学療法剤のより高い投与量を可能にすることができる。種々の組み換えコロニー刺激因子、例えば、ニューポジェン（Neupogen）（登録商標）（Ｇ−ＣＳＦ；Amgen）、ニューラスタ（Neulasta）（ペグフィルグラスチム（pelfilgrastim）；Amgen）、リューカイン（Leukine）（ＧＭ−ＣＳＦ；Berlex）、プロクリット（Procrit）（エリスロポエチン；Ortho Biotech）、エポジェン（Epogen）（エリスロポエチン；Amgen）、アラネスプ（Arnesp）（エリスロポエチン（erytropoietin））が市販されている。
【００５９】
特異的又は非特異的ターゲットを有する他に、免疫療法剤は、活性であっても、すなわち、身体自体の免疫応答を刺激しても、又は、これらは不活性であっても、すなわち、身体の外に生成された免疫系成分を含んでもよい。
【００６０】
不活性な特異的免疫療法は、典型的には、癌細胞の表面に見いだされる特定の抗原に特異的である又は特定の細胞成長因子に特異的である１以上のモノクローナル抗体の使用を伴う。モノクローナル抗体は、複数の方法で、例えば、特定の種類の癌に対する対象者の免疫応答を増強するために、特定の細胞成長因子（血管新生に関与する細胞成長因子など）をターゲットとすることによって、あるいは化学療法剤、放射性粒子又は毒素などの薬剤に連結又はコンジュゲートされた場合には他の抗癌剤の癌細胞への送達を増強することによって癌細胞の成長を妨害するために、癌の処置において使用され得る。
【００６１】
本発明の組み合わせへの包含に好適な癌免疫療法剤として現在使用されているモノクローナル抗体は、限定されないが、リツキシマブ（Rituxan（登録商標））、トラスツズマブ（Herceptin（登録商標））、イブリツモマブチウキセタン（Zevalin（登録商標））、トシツモマブ（Bexxar（登録商標））、セツキシマブ（Ｃ−２２５、Erbitux（登録商標））、ベバシズマブ（Avastin（登録商標））、ゲムツズマブオゾガマイシン（Mylotarg（登録商標））、アレムツズマブ（Campath（登録商標））及びＢＬ２２を含む。他の例は、抗ＣＴＬＡ４抗体（例えば、Ipilimumab）、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤＬ１抗体、抗ＴＩＭＰ３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗Ｂ７Ｈ３抗体、抗Ｂ７Ｈ４抗体又は抗Ｂ７Ｈ６抗体を含む。いくつかの実施態様において、抗体は、Ｂ細胞枯渇抗体を含む。典型的なＢ細胞枯渇抗体は、限定されないが、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体［例えば、リツキシマブ（Roche）、イブリツモマブチウキセタン（Bayer Schering）、トシツモマブ（GlaxoSmithKline）、ＡＭＥ−１３３ｖ（Applied Molecular Evolution）、オクレリズマブ（Roche）、オファツムマブ（ＨｕＭａｘ−ＣＤ２０、Gemnab）、ＴＲＵ−０１５（Trubion）及びＩＭＭＵ−１０６（Immunomedics）］、抗ＣＤ２２抗体［例えば、エプラツズマブ、Leonard et al., Clinical Cancer Research (Z004) 10: 53Z7-5334］、抗ＣＤ７９ａ抗体、抗ＣＤ２７抗体、又は抗ＣＤ１９抗体（例えば、米国特許第７，１０９，３０４号）、抗ＢＡＦＦ−Ｒ抗体（例えば、ベリムマブ、GlaxoSmithKline）、抗ＡＰＲＩＬ抗体（例えば、抗ヒトＡＰＲＩＬ抗体、ProSci inc.）、及び抗ＩＬ−６抗体［例えば、De Benedetti et al., J Immunol (2001) 166: 4334-4340 及び Suzuki et al., Europ J of Immunol (1992) 22 (8) 1989-1993 に以前に記載されている、参照によって本明細書に完全に組み入れられる］を含む。
【００６２】
免疫療法的処置は、同種移植すること、特に、造血幹細胞ＨＳＣを用いた同種移植からなり得る。免疫療法的処置はまた、Nicholas P. Restifo, Mark E. Dudley and Steven A. Rosenberg “Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response, Nature Reviews Immunology, Volume 12, April 2012) によって記載されているような養子免疫療法からなり得る。養子免疫療法では、対象者の循環リンパ球、ＮＫ細胞が、インビトロで単離、増幅され、そして、対象者に再投与される。活性化リンパ球又はＮＫ細胞は、最も好ましくは、血液又は腫瘍試料から事前に単離されインビトロで活性化された（又は「増大された」）対象者自身の細胞である。
【００６３】
いくつかの実施態様において、癌を患っていると診断された対象者には、放射線療法剤が投与される。本明細書において使用されるような用語「放射線療法剤」は、非限定的に、癌を処置又は改善するのに効果的である当業者に公知の任意の放射線療法剤を指すことを意図する。例えば、放射線療法剤は、小線源治療又は放射性核種治療において投与されるような薬剤であり得る。そのような方法は、場合により、限定されないが化学療法などの１以上の追加の癌治療及び／又は別の放射線療法の投与をさらに含むことができる。
【００６４】
いくつかの実施態様において、対象者がタモキシフェン又はデンドロゲニンＡによる応答を得るだろうことが決定された場合、対象者には前記の薬物が投与される。
【００６５】
いくつかの実施態様において、癌を患っていると診断された対象者には、１１β−ＨＳＤ２阻害剤が投与される。
【００６６】
用語「１１β−ＨＳＤ２阻害剤」は、１１β−ＨＳＤ２の活性又は発現を阻害又は減少させる任意の薬剤を含む。
【００６７】
いくつかの実施態様において、１１β−ＨＳＤ２阻害剤は、ステロイド又はその誘導体などの低分子である。いくつかの実施態様において、ステロイドは、３α，５α−還元型である。１１β−ＨＳＤ２阻害剤の例は、限定されないが、３α，５α−還元型−１１β−ＯＨ−プロゲステロン、３α，５α−還元型−１１β−ＯＨ−テストステロン、３α，５α−還元型−１１β−ＯＨ−アンドロステンジオン、３α，５α−還元型−１１−ケト−プロゲステロン、３α，５α−還元型−１１−デヒドロ−コルチコステロン、３α，５α−還元型−コルチコステロン、３α，５α−還元型−１１β−ＯＨ−プレグネノロン、３α，５α−還元型−１１β−ＯＨ−デヒドロ−エピアンドロステンジオン、３α，５α−還元型−プレグネノロン、３α，５α−還元型−デヒドロ−エピアンドロステンジオン、３α，５α−還元型アルドステロン、及び３α，５α−還元型デオキシコルチコステロンを含む。１１β−ＨＳＤ２阻害剤の他の例は、１１β−ＯＨ−プロゲステロン、１１β−ＯＨ−プレグネノロン、１１β−ＯＨ−デヒドロ−エピアンドロステンジオン、１１β−ＯＨ−テストステロン、１１−ケト−プロゲステロン、５α−ジヒドロ−コルチコステロン、３α，５α−還元型デオキシ−コルチコステロン、グリチルレチン酸又はカルベノキソロンを含む。
【００６８】
１１β−ＨＳＤ２阻害剤の他の例は、ＵＳ７６５９２８７に開示されている化合物、特に、以下の式を有する化合物を含む：
【化６】
2017527290.tif 000007
2017527290.tif 000008
2017527290.tif 000009
2017527290.tif 000010
2017527290.tif 000011
2017527290.tif 000012
2017527290.tif 000013
【００６９】
１１β−ＨＳＤ２阻害剤の他の例は、ＵＳ７４９５０１２に開示されている化合物、特に、以下の式を有する化合物を含む：
ｓｙｎ−２，６−ジメチル−１−（４−（２，２，２−トリフルオロ−１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）フェニル−スルホニル）−ピペリジン、
２−（Ｒ）−２−メチル−１−（４−（２，２，２−トリフルオロ−１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）フェニル−スルホニル）−ピペリジン、
２−（Ｓ）−２−メチル−１−（４−（２，２，２−トリフルオロ−１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）フェニル−スルホニル）−ピペリジン、
２−エチル−１−（４−（２，２，２−トリフルオロ−１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）フェニルスルホニル）−ピペリジン、
１−（４−（２，２，２−トリフルオロ−１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）フェニルスルホニル）−ピペリジン、
２−（４−（２，２，２−トリフルオロ−１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）フェニルスルホニル）−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン、
２−（Ｓ）−２−（ピリジン−３−イル）−１−（４−（２，２，２−トリフルオロ−１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）−フェニルスルホニル）−ピペリジン、
１−（４−（２，２，２−トリフルオロ−１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）フェニルスルホニル）−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン、
３−フルオロ−１−（４−（２，２，２−トリフルオロ−１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）フェニルスルホニル）−ピペリジン、
１−（４−（２，２，２−トリフルオロ−１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）フェニルスルホニル）−２−（２−イミダゾール−１−イル−エチル）ピペリジン、
２−（２−ピラゾール−１−イル−エチル）−１−（４−（２，２，２−トリフルオロ−１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）−フェニルスルホニル）−ピペリジン、及び
２−（２−ヒドロキシエチル）−１−（４−（２，２，２−トリフルオロ−１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）−フェニルスルホニル）−ピペリジン。
【００７０】
１１β−ＨＳＤ２阻害剤の他の例は、ＵＳ８１３８１９０に開示されている化合物、特に、以下の式を有する化合物を含む：
【化７】
2017527290.tif 000014
2017527290.tif 000015
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【００７１】
いくつかの実施態様において、１１β−ＨＳＤ２阻害剤は、１１β−ＨＳＤ２発現の阻害剤である。
【００７２】
「発現の阻害剤」は、遺伝子の発現を阻害する生物学的効果を有する天然又は合成化合物を指す。
【００７３】
いくつかの実施態様において、前記の遺伝子発現の阻害剤は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はリボザイムである。
【００７４】
本発明における使用のための遺伝子発現の阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド構築物をベースとし得る。アンチ−センスＲＮＡ分子及びアンチ−センスＤＮＡ分子を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ターゲットとするｍＲＮＡに結合することによってその翻訳を直接遮断するように作用し、ひいてはタンパク質翻訳を防止又はｍＲＮＡ分解を増大し、したがってターゲットとするタンパク質（すなわち、１１β−ＨＳＤ２）の細胞内レベル、ひいては活性を減少させるだろう。例えば、ターゲットタンパク質をコードするｍＲＮＡ転写配列の固有の領域に相補的な少なくとも約１５塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、例えば、慣用のホスホジエステル技術によって合成し、例えば、静脈注射又は注入によって投与することができる。配列が公知である遺伝子の遺伝子発現を特異的に阻害するためのアンチセンス技術を使用するための方法は、当技術分野において周知である（例えば、米国特許第６，５６６，１３５号；第６，５６６，１３１号；第６，３６５，３５４号；第６，４１０，３２３号；第６，１０７，０９１号；第６，０４６，３２１号；及び第５，９８１，７３２号を参照のこと）。
【００７５】
また、低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）も本発明における使用のための遺伝子発現の阻害剤として機能することができる。遺伝子発現は、腫瘍、対象者又は細胞を、低分子二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）と又は低分子二本鎖ＲＮＡの産生を引き起すベクター若しくは構築物と接触させることによって低下させることができ、それによって遺伝子発現が特異的に阻害される（すなわち、ＲＮＡ干渉又はＲＮＡｉ）。配列が公知である遺伝子について適切なｄｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡをコードするベクターを選択するための方法は、当技術分野において周知である（例えば、Tuschi, T. et al. (1999); Elbashir, S. M. et al. (2001); Hannon, GJ. (2002); McManus, MT. et al. (2002); Brummelkamp, TR. et al. (2002)；米国特許第６，５７３，０９９号及び第６，５０６，５５９号；並びに国際公開公報第ＷＯ０１／３６６４６号、第ＷＯ９９／３２６１９号及び第ＷＯ０１／６８８３６号を参照のこと）。
【００７６】
また、リボザイムも本発明における使用のための遺伝子発現の阻害剤として機能することができる。リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒することが可能な酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムの作用機序は、相補的ターゲットＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーションと、それに続く、エンドヌクレアーゼ的切断を伴う。そのため、ターゲットとするｍＲＮＡ配列のエンドヌクレアーゼ的切断を特異的かつ効果的に触媒する改変ヘパリン又はハンマーヘッドモチーフリボザイム分子は、本発明の範囲内において有用である。任意の潜在的ＲＮＡターゲット内の特異的リボザイム切断部位は、最初に、以下の配列：ＧＵＡ、ＧＵＵ及びＧＵＣを典型的に含むターゲット分子のリボザイム切断部位を走査することによって同定される。同定した後、その切断部位を含有するターゲット遺伝子の領域に対応する約１５〜２０リボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列を、オリゴヌクレオチド配列を不適合にし得る予測の構造的特徴（二次構造など）について評価することができる。また、例えば、リボヌクレアーゼ保護アッセイを使用して、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションへのアクセシビリティを試験することによって、候補ターゲットの適合性を評価することもできる。
【００７７】
遺伝子発現の阻害剤として有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドとリボザイムは共に、公知の方法によって調製され得る。これらは、例えば、固相ホスホアミダイト（phosphoramadite）化学合成によるなどの化学合成技術を含む。代替的に、アンチ−センスＲＮＡ分子を、ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のインビトロ又はインビボ転写によって生成することができる。そのようなＤＮＡ配列を、Ｔ７又はＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなどの好適なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを組み込んだ多種多様なベクターに組み込むことができる。細胞内安定性及び半減期を増大させる手段として、本発明のオリゴヌクレオチドに対して種々の修飾を導入することができる。可能な修飾は、限定されないが、分子の５’及び／若しくは３’末端へのリボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチドのフランキング配列の付加、又はオリゴヌクレオチド骨格内へのホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオアート若しくは２’−Ｏ−メチルの使用を含む。
【００７８】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ及びリボザイムは、単独で又はベクターと組み合わせてインビボ送達され得る。その最も広い意味で、「ベクター」は、細胞へのアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ又はリボザイム核酸の移送を容易にすることが可能な任意のビヒクルである。好ましくは、ベクターは、ベクターの非存在下で生じるであろう分解度よりも少ない分解で細胞に核酸を輸送する。一般に、本発明において有用なベクターは、限定されないが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ又はリボザイム核酸配列の挿入又は組み込みによって操作された、プラスミド、ファージミド、ウイルス、ウイルス又は細菌源に由来する他のビヒクルを含む。ウイルスベクターが好ましいタイプのベクターであり、そして、限定されないが、以下のウイルス由来の核酸配列を含む：モロニーマウス白血病ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウイルス、マウス乳腺腫瘍ウイルス及びラウス肉腫ウイルスなどのレトロウイルス；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス；ＳＶ４０型ウイルス；ポリオーマウイルス；エプスタイン−バーウイルス；パピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；並びにレトロウイルスなどのＲＮＡウイルス。命名されていないが当技術分野において公知である他のベクターを容易に採用することができる。
【００７９】
好ましいウイルスベクターは、必須でない遺伝子が関心対象の遺伝子に置換された非細胞変性真核生物ウイルスをベースとする。非細胞変性ウイルスは、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス）を含み、その生活サイクルは、ゲノムウイルスＲＮＡのＤＮＡへの逆転写とそれに続く宿主細胞ＤＮＡへのプロウイルスの組み込みを伴う。レトロウイルスは、ヒト遺伝子治療の治験に承認されている。最も有用なものは、複製欠損（すなわち、所望のタンパク質の合成を指示することが可能であるが、感染性粒子を製造することができない）レトロウイルスである。そのような遺伝的に改変されたレトロウイルス発現ベクターは、インビボでの遺伝子の高効率トランスダクションに対して一般的な有用性を有する。複製欠損レトロウイルスを産生するための標準的なプロトコール（プラスミドへの外因性遺伝物質の組み込み、プラスミドを用いたパッケージング細胞株のトランスフェクション、パッケージング細胞株による組み換えレトロウイルスの産生、組織培養培地からのウイルス粒子の回収、及びウイルス粒子のターゲット細胞への感染の工程を含む）は、KRIEGLER (A Laboratory Manual,” W.H. Freeman C.O., New York, 1990) 及び MURRY (”Methods in Molecular Biology,” vol.7, Humana Press, Inc., Cliffton, N.J., 1991）に提供されている。
【００８０】
特定の用途のための好ましいウイルスは、すでに遺伝子治療においてヒトへの使用が認められている二本鎖ＤＮＡウイルスである、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスである。アデノ随伴ウイルスは、複製欠損であるように遺伝子操作され得、広範な細胞タイプ及び種に感染することが可能である。それは、さらに、熱及び脂質溶媒安定性；造血細胞を含む多様な系列の細胞における高いトランスダクション頻度；並びに重感染阻害の欠如（したがって、複数系列のトランスダクションが可能）などの利点を有する。報告によると、アデノ随伴ウイルスをヒトの細胞ＤＮＡ中に部位特異的に組み込むことによって、レトロウイルス感染に特徴的な挿入突然変異誘発の可能性及び挿入された遺伝子発現の変動を最小限に抑えることができる。加えて、野生型アデノ随伴ウイルス感染は、選択圧の非存在下で、１００回を超える継代にわたって組織培養が追跡されており、このことは、アデノ随伴ウイルスのゲノム組み込みが比較的安定な事象であることを暗示している。アデノ随伴ウイルスはまた、染色体外においても機能することができる。
【００８１】
他のベクターは、プラスミドベクターを含む。プラスミドベクターは、当技術分野において広く記載されており、当業者に周知である。例えば、SANBROOK et al., ”Molecular Cloning: A Laboratory Manual,” Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 を参照のこと。ここ数年間、プラスミドベクターが、抗原をコードする遺伝子を細胞にインビボ送達するためのＤＮＡワクチンとして使用されている。これらは、ウイルスベクターの多くが持つものと同じ安全上の懸念を有していないため、ＤＮＡワクチンに特に有利である。しかしながら、宿主細胞と適合可能なプロモーターを有するこれらのプラスミドは、プラスミド内で作動的にコードされた遺伝子からペプチドを発現することができる。いくつかの一般的に使用されているプラスミドは、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣｌ９、ｐＲＣ／ＣＭＶ、ＳＶ４０及びｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔを含む。他のプラスミドは、当業者に周知である。加えて、プラスミドは、ＤＮＡの特定の断片を除去及び付加する制限酵素及びライゲーション反応を使用してカスタム設計され得る。プラスミドは、種々の非経口、粘膜及び局所経路によって送達され得る。例えば、ＤＮＡプラスミドは、筋肉内、皮内、皮下又は他の経路によって注射され得る。それはまた、鼻腔内スプレー又は液滴、直腸坐剤によって及び経口的に投与され得る。それはまた、遺伝子銃を使用して、表皮又は粘膜表面に投与され得る。プラスミドは、水溶液中に与えられるか、金粒子上に乾燥されるか、又は別のＤＮＡ送達系（限定されないが、リポソーム、デンドリマー、コクリエート（cochleate）及びマイクロカルセル化を含む）と組み合わせられ得る。
【００８２】
いくつかの実施態様において、癌を患っていると診断された対象者には、１１β−ＨＳＤ１をコードする核酸が投与される。典型的には、１１β−ＨＳＤ１をコードする核酸は、上述したようなベクターで送達される。
【００８３】
典型的には、上述したような有効成分（例えば、タモキシフェン、デンドロゲニンＡ、１１β−ＨＳＤ２の阻害剤、１１β−ＨＳＤ１をコードする核酸…）は、治療有効量で対象者に投与される。
【００８４】
上述したような活性成分の「治療有効量」とは、十分な化合物の量を意味する。しかしながら、本発明の化合物及び組成物の総一日使用量は、妥当な医学的判断の範囲内で担当医によって決定されることが理解されるだろう。任意の特定の対象者に対する具体的な治療有効用量レベルは、処置される障害及び障害の重症度；用いられる具体的な化合物の活性；用いられる具体的な組成物、対象者の年齢、体重、総合的な健康状態、性別及び食事；投与の期間、投与の経路及び用いられる具体的な化合物の排泄速度；処置の持続期間；用いられる具体的なポリペプチドと組み合わせて又は同時に使用される薬物；並びに医学分野において周知の類似の要因を含む種々の要因に依存するだろう。例えば、所望の治療効果を達成するのに必要とされるよりも低いレベルで化合物の用量を開始すること、そして所望の効果が達成されるまで用量を徐々に増加させることは、十分に当技術分野の技能の範囲内である。しかしながら、製品の一日用量は、成人一人当たり０．０１〜１，０００mg/日の広い範囲にわたって変化し得る。典型的には、組成物は、処置しようとする対象者への用量の対症調整のために、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０及び５００mgの有効成分を含有する。医薬は、典型的には、約０．０１mg〜約５００mgの有効成分、好ましくは１mg〜約１００mgの有効成分を含有する。薬物の有効量は、通常、一日当たり０．０００２mg/kg〜約２０mg/kg体重、とりわけ一日当たり約０．００１mg/kg〜７mg/kg体重の用量レベルで供給される。
【００８５】
本発明によれば、有効成分は、医薬組成物の形態で対象者に投与される。典型的には、有効成分は、薬学的に許容し得る賦形剤及び場合により徐放性マトリックス（生分解性ポリマーなど）と組み合わせられて、治療組成物を形成し得る。「薬学的に」又は「薬学的に許容し得る」は、必要に応じて、哺乳動物、とりわけヒトへ投与されたときに、有害な、アレルギー性の又は他の不都合な反応を生じることのない分子実体及び組成物を指す。薬学的に許容し得る担体又は賦形剤は、任意の種類の、無毒の固体、半固体又は液体の充填剤、希釈剤、封入材料又は製剤助剤を指す。
【００８６】
経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、局所又は直腸投与のための本発明の医薬組成物では、有効成分（単独又は別の有効成分との組み合わせ）は、単位投与剤形で、慣用の薬学的支持体との混合物として、動物及びヒトへ投与され得る。好適な単位投与剤形は、経口経路剤形（錠剤、ゲルカプセル剤、粉剤、顆粒剤及び経口の懸濁剤又は液剤など）、舌下及びバッカル投与剤形、エアロゾル、インプラント、皮下、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、皮下、経皮、髄腔内及び鼻腔内投与剤形並びに直腸投与剤形を含む。
【００８７】
典型的には、医薬組成物は、注射可能な製剤に対して薬学的に許容し得るビヒクルを含有する。これらは、特に、等張の無菌の食塩水（リン酸一ナトリウム若しくは二ナトリウム、塩化ナトリウム、カリウム、カルシウム若しくはマグネシウムなど、又はそのような塩の混合物）であるか、又は乾燥とりわけ凍結乾燥組成物（場合によって滅菌水又は生理食塩水を添加して、注射液剤の構成を可能にする）であり得る。注射使用に好適な薬学的剤形は、無菌の水性液剤又は分散剤；ゴマ油、落花生油又は水性プロピレングリコールを含む製剤；及び無菌の注射液剤又は分散剤の即時調製物用の無菌の粉剤を含む。全ての場合に、その剤形は、無菌でなければならず、かつ容易な注射性能が存在する程度に流動性でなければならない。それは、製造及び貯蔵条件下で安定でなければならず、かつ細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。本発明の化合物を遊離塩基又は薬理学的に許容し得る塩として含む液剤は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と好適に混合された水中に調製され得る。また、分散剤を、グリセロール、液体ポリエチレングリコール及びそれらの混合物中に並びに油中に調製することができる。通常の貯蔵及び使用条件下では、これらの調製物は、微生物の成長を抑制する防腐剤を含有する。有効成分は、中性又は塩形態で組成物中に製剤化され得る。薬学的に許容し得る塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と形成される）を含み、これは無機酸（例えば、塩酸又はリン酸など）又はそのような有機酸（酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのような）と形成される。遊離カルボキシル基と形成される塩もまた、無機塩基（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム又は水酸化鉄など）及びそのような有機塩基（イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどのような）から誘導することができる。担体はまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物及び植物油を含有する、溶媒又は分散媒体であることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散剤の場合には必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の抑制は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましいだろう。注射組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中に使用することによって達成することができる。無菌の注射液剤は、上に挙げたいくつかの他の成分と共に適切な溶媒中に必要量の活性化合物を組み込み、必要に応じて、続いて濾過滅菌することによって調製される。一般に、分散剤は、様々な滅菌有効成分を、基礎となる分散媒体と上に挙げたものからの必要な他の成分を含有する無菌のビヒクルに組み込むことによって調製される。無菌の注射液剤の調製用の無菌の粉剤の場合、典型的な調製方法は、有効成分と任意の追加の所望の成分の粉末を予め滅菌濾過されたその溶液から得る、真空乾燥及び凍結乾燥技術である。直接注射のためのより又は高度に濃縮された溶液の調製物もまた検討され、この場合には、極めて迅速な浸透をもたらすために溶媒としてＤＭＳＯの使用が想定され、高濃度の活性剤が小さな腫瘍領域に送達される。製剤化後に、液剤は、投薬製剤と適合する手法でかつ治療的に有効であるような量で投与されるだろう。製剤は、上述した種類の注射液剤などの様々な投薬剤形で容易に投与されるが、薬物放出カプセル剤なども採用することができる。水性液剤での非経口投与のために、例えば、溶液を必要であれば好適に緩衝化すべきであり、そして、液体希釈剤を最初に十分な食塩水又はグルコースで等張にすべきである。これらの特定の水性液剤は、とりわけ、静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内投与に好適である。これに関して、採用することができる無菌の水性媒体は、本開示に照らして、当業者に公知であろう。処置される対象者の状態に応じて、用量のいくらかの変動が必ず起こるだろう。いずれの場合においても、投与責任者が個々の対象者のための適切な用量を決定するだろう。
【００８８】
本発明は、以下の図面及び実施例によってさらに説明される。しかしながら、これらの実施例及び図面は、決して本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１Ａ】ＯＣＤＯは、ＥＣ又はＣＴとインキュベートされたＭＣＦ７腫瘍細胞から産生及び分泌される。１４Ｃ−αＥＣ（Ａ、Ｂ）又は１４Ｃ−βＥＣ（Ｃ、Ｄ）又は１４Ｃ−ＣＴ（Ｅ，Ｆ）で処理したＭＣＦ７細胞におけるＯＣＤＯの時間依存的産生を示す代表的なＴＬＣオートラジオグラフィー、及び３つの別々の実験からの各条件において産生された代謝産物の定量分析（±s.e.m）。細胞（左パネル）から又は培地（右パネル）から抽出された代謝産物をＴＬＣ分析によって分析し、そして、関心対象の放射性代謝産物に対応する領域を回収し、β−カウンターを使用して計数した。
【図１Ｂ】ＯＣＤＯは、ＥＣ又はＣＴとインキュベートされたＭＣＦ７腫瘍細胞から産生及び分泌される。１４Ｃ−αＥＣ（Ａ、Ｂ）又は１４Ｃ−βＥＣ（Ｃ、Ｄ）又は１４Ｃ−ＣＴ（Ｅ，Ｆ）で処理したＭＣＦ７細胞におけるＯＣＤＯの時間依存的産生を示す代表的なＴＬＣオートラジオグラフィー、及び３つの別々の実験からの各条件において産生された代謝産物の定量分析（±s.e.m）。細胞（左パネル）から又は培地（右パネル）から抽出された代謝産物をＴＬＣ分析によって分析し、そして、関心対象の放射性代謝産物に対応する領域を回収し、β−カウンターを使用して計数した。
【図１Ｃ】ＯＣＤＯは、ＥＣ又はＣＴとインキュベートされたＭＣＦ７腫瘍細胞から産生及び分泌される。１４Ｃ−αＥＣ（Ａ、Ｂ）又は１４Ｃ−βＥＣ（Ｃ、Ｄ）又は１４Ｃ−ＣＴ（Ｅ，Ｆ）で処理したＭＣＦ７細胞におけるＯＣＤＯの時間依存的産生を示す代表的なＴＬＣオートラジオグラフィー、及び３つの別々の実験からの各条件において産生された代謝産物の定量分析（±s.e.m）。細胞（左パネル）から又は培地（右パネル）から抽出された代謝産物をＴＬＣ分析によって分析し、そして、関心対象の放射性代謝産物に対応する領域を回収し、β−カウンターを使用して計数した。
【図１Ｄ】ＯＣＤＯは、ＥＣ又はＣＴとインキュベートされたＭＣＦ７腫瘍細胞から産生及び分泌される。１４Ｃ−αＥＣ（Ａ、Ｂ）又は１４Ｃ−βＥＣ（Ｃ、Ｄ）又は１４Ｃ−ＣＴ（Ｅ，Ｆ）で処理したＭＣＦ７細胞におけるＯＣＤＯの時間依存的産生を示す代表的なＴＬＣオートラジオグラフィー、及び３つの別々の実験からの各条件において産生された代謝産物の定量分析（±s.e.m）。細胞（左パネル）から又は培地（右パネル）から抽出された代謝産物をＴＬＣ分析によって分析し、そして、関心対象の放射性代謝産物に対応する領域を回収し、β−カウンターを使用して計数した。
【図１Ｅ】ＯＣＤＯは、ＥＣ又はＣＴとインキュベートされたＭＣＦ７腫瘍細胞から産生及び分泌される。１４Ｃ−αＥＣ（Ａ、Ｂ）又は１４Ｃ−βＥＣ（Ｃ、Ｄ）又は１４Ｃ−ＣＴ（Ｅ，Ｆ）で処理したＭＣＦ７細胞におけるＯＣＤＯの時間依存的産生を示す代表的なＴＬＣオートラジオグラフィー、及び３つの別々の実験からの各条件において産生された代謝産物の定量分析（±s.e.m）。細胞（左パネル）から又は培地（右パネル）から抽出された代謝産物をＴＬＣ分析によって分析し、そして、関心対象の放射性代謝産物に対応する領域を回収し、β−カウンターを使用して計数した。
【図１Ｆ】ＯＣＤＯは、ＥＣ又はＣＴとインキュベートされたＭＣＦ７腫瘍細胞から産生及び分泌される。１４Ｃ−αＥＣ（Ａ、Ｂ）又は１４Ｃ−βＥＣ（Ｃ、Ｄ）又は１４Ｃ−ＣＴ（Ｅ，Ｆ）で処理したＭＣＦ７細胞におけるＯＣＤＯの時間依存的産生を示す代表的なＴＬＣオートラジオグラフィー、及び３つの別々の実験からの各条件において産生された代謝産物の定量分析（±s.e.m）。細胞（左パネル）から又は培地（右パネル）から抽出された代謝産物をＴＬＣ分析によって分析し、そして、関心対象の放射性代謝産物に対応する領域を回収し、β−カウンターを使用して計数した。
【図２Ａ】ＯＣＤＯは、インビトロ及びインビボ腫瘍プロモーターであり、そして、その阻害は、Ｔａｍ及びＤＤＡの抗腫瘍効果に寄与する。（Ａ、Ｂ）ＤＮＡ中のＢｒＤＵ取り込みを測定する比色イムノアッセイを使用した、処理の２４時間後のＭＣＦ７（Ａ）及びＴＳ／Ａ（Ｂ）細胞の増殖に及ぼすＯＣＤＯ又は１７β−エストロゲン（Ｅ２）の効果を表すヒストグラム、（Ｃ、Ｄ）ＭＣＦ７（Ｃ）及びＴＳ／Ａ（Ｄ）細胞の浸潤に及ぼすＯＣＤＯの効果を表すヒストグラム。データは、３つの別々の実験の平均である（±s.e.m）、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ−検定）。（Ｅ、Ｆ）マウスにＭＣＦ７（Ｅ）又はＴＳ／Ａ（Ｆ）細胞を皮下（s.c.）移植し、そして、動物（１群当たり８匹）を、溶媒ビヒクル又はＯＣＤＯ（ＭＣＦ７について１６μg/kg又はＴＳ／Ａについて５０μg/kg）のいずれかで、移植当日から始めて毎日皮下（s.c.）処理した。腫瘍の成長について動物を週２回モニタリングした。データは、３つの独立した実験の代表である。平均腫瘍体積±s.e.mを示す、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（分散分析（ＡＮＯＶＡ）、ダネットの事後検定）。（Ｇ）（Ｅ）からのＭＣＦ７腫瘍切片のＩＨＣ染色から決定されたＫｉ６７陽性細胞数の平均（±s.e.m）、ｎ＝８、＊Ｐ＜０．０５（スチューデントのｔ−検定）  HistoQuant, Pannoramic Viewer（3DHistech）を使用。（Ｈ）対照で処理した腫瘍と比較してＯＣＤＯで処理した腫瘍において増加した染色を示す、（Ｆ）からのＴＳ／Ａ腫瘍切片の代表的なＫｉ６７染色。（Ｉ、Ｊ、Ｋ）マウスＥ０７７１（Ｉ）、又はヒトＭＤＡ−ＭＢ２３１（Ｊ）又はＭＤＡ−ＭＢ４６８（Ｋ）細胞をマウス（１群当たり８匹）へ皮下（s.c.）移植し、そして、動物を、溶媒ビヒクル又はＯＣＤＯ（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８について１６μg/kg又はＥ０７７１について５０μg/kg）のいずれかで皮下（s.c.）処理した。データは、２つの独立した実験の代表である。統計的分析をＥ及びＦと同様に実施した。（Ｌ）マウスにＴＳ／Ａ細胞を皮下（s.c.）移植し、そして、動物（１群当たり８匹）を、溶媒ビヒクル、ＯＣＤＯ（５０μg/kg）、Ｔａｍ（５６mg/kg）、ＤＤＡ（２０mg/kg）、又はＴａｍ（５６mg/kg）＋ＯＣＤＯ（５０μg/kg）の組み合わせ、又はＤＤＡ（２０mg/kg）＋ＯＣＤＯ（５０μg/kg）の組み合わせのいずれかで毎日皮下（s.c.）処理した。データは、３つの独立した実験の代表である。統計的分析をＥ及びＦと同様に実施した。
【図２Ｂ】ＯＣＤＯは、インビトロ及びインビボ腫瘍プロモーターであり、そして、その阻害は、Ｔａｍ及びＤＤＡの抗腫瘍効果に寄与する。（Ａ、Ｂ）ＤＮＡ中のＢｒＤＵ取り込みを測定する比色イムノアッセイを使用した、処理の２４時間後のＭＣＦ７（Ａ）及びＴＳ／Ａ（Ｂ）細胞の増殖に及ぼすＯＣＤＯ又は１７β−エストロゲン（Ｅ２）の効果を表すヒストグラム、（Ｃ、Ｄ）ＭＣＦ７（Ｃ）及びＴＳ／Ａ（Ｄ）細胞の浸潤に及ぼすＯＣＤＯの効果を表すヒストグラム。データは、３つの別々の実験の平均である（±s.e.m）、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ−検定）。（Ｅ、Ｆ）マウスにＭＣＦ７（Ｅ）又はＴＳ／Ａ（Ｆ）細胞を皮下（s.c.）移植し、そして、動物（１群当たり８匹）を、溶媒ビヒクル又はＯＣＤＯ（ＭＣＦ７について１６μg/kg又はＴＳ／Ａについて５０μg/kg）のいずれかで、移植当日から始めて毎日皮下（s.c.）処理した。腫瘍の成長について動物を週２回モニタリングした。データは、３つの独立した実験の代表である。平均腫瘍体積±s.e.mを示す、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（分散分析（ＡＮＯＶＡ）、ダネットの事後検定）。（Ｇ）（Ｅ）からのＭＣＦ７腫瘍切片のＩＨＣ染色から決定されたＫｉ６７陽性細胞数の平均（±s.e.m）、ｎ＝８、＊Ｐ＜０．０５（スチューデントのｔ−検定）  HistoQuant, Pannoramic Viewer（3DHistech）を使用。（Ｈ）対照で処理した腫瘍と比較してＯＣＤＯで処理した腫瘍において増加した染色を示す、（Ｆ）からのＴＳ／Ａ腫瘍切片の代表的なＫｉ６７染色。（Ｉ、Ｊ、Ｋ）マウスＥ０７７１（Ｉ）、又はヒトＭＤＡ−ＭＢ２３１（Ｊ）又はＭＤＡ−ＭＢ４６８（Ｋ）細胞をマウス（１群当たり８匹）へ皮下（s.c.）移植し、そして、動物を、溶媒ビヒクル又はＯＣＤＯ（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８について１６μg/kg又はＥ０７７１について５０μg/kg）のいずれかで皮下（s.c.）処理した。データは、２つの独立した実験の代表である。統計的分析をＥ及びＦと同様に実施した。（Ｌ）マウスにＴＳ／Ａ細胞を皮下（s.c.）移植し、そして、動物（１群当たり８匹）を、溶媒ビヒクル、ＯＣＤＯ（５０μg/kg）、Ｔａｍ（５６mg/kg）、ＤＤＡ（２０mg/kg）、又はＴａｍ（５６mg/kg）＋ＯＣＤＯ（５０μg/kg）の組み合わせ、又はＤＤＡ（２０mg/kg）＋ＯＣＤＯ（５０μg/kg）の組み合わせのいずれかで毎日皮下（s.c.）処理した。データは、３つの独立した実験の代表である。統計的分析をＥ及びＦと同様に実施した。
【図２Ｃ】ＯＣＤＯは、インビトロ及びインビボ腫瘍プロモーターであり、そして、その阻害は、Ｔａｍ及びＤＤＡの抗腫瘍効果に寄与する。（Ａ、Ｂ）ＤＮＡ中のＢｒＤＵ取り込みを測定する比色イムノアッセイを使用した、処理の２４時間後のＭＣＦ７（Ａ）及びＴＳ／Ａ（Ｂ）細胞の増殖に及ぼすＯＣＤＯ又は１７β−エストロゲン（Ｅ２）の効果を表すヒストグラム、（Ｃ、Ｄ）ＭＣＦ７（Ｃ）及びＴＳ／Ａ（Ｄ）細胞の浸潤に及ぼすＯＣＤＯの効果を表すヒストグラム。データは、３つの別々の実験の平均である（±s.e.m）、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ−検定）。（Ｅ、Ｆ）マウスにＭＣＦ７（Ｅ）又はＴＳ／Ａ（Ｆ）細胞を皮下（s.c.）移植し、そして、動物（１群当たり８匹）を、溶媒ビヒクル又はＯＣＤＯ（ＭＣＦ７について１６μg/kg又はＴＳ／Ａについて５０μg/kg）のいずれかで、移植当日から始めて毎日皮下（s.c.）処理した。腫瘍の成長について動物を週２回モニタリングした。データは、３つの独立した実験の代表である。平均腫瘍体積±s.e.mを示す、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（分散分析（ＡＮＯＶＡ）、ダネットの事後検定）。（Ｇ）（Ｅ）からのＭＣＦ７腫瘍切片のＩＨＣ染色から決定されたＫｉ６７陽性細胞数の平均（±s.e.m）、ｎ＝８、＊Ｐ＜０．０５（スチューデントのｔ−検定）  HistoQuant, Pannoramic Viewer（3DHistech）を使用。（Ｈ）対照で処理した腫瘍と比較してＯＣＤＯで処理した腫瘍において増加した染色を示す、（Ｆ）からのＴＳ／Ａ腫瘍切片の代表的なＫｉ６７染色。（Ｉ、Ｊ、Ｋ）マウスＥ０７７１（Ｉ）、又はヒトＭＤＡ−ＭＢ２３１（Ｊ）又はＭＤＡ−ＭＢ４６８（Ｋ）細胞をマウス（１群当たり８匹）へ皮下（s.c.）移植し、そして、動物を、溶媒ビヒクル又はＯＣＤＯ（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８について１６μg/kg又はＥ０７７１について５０μg/kg）のいずれかで皮下（s.c.）処理した。データは、２つの独立した実験の代表である。統計的分析をＥ及びＦと同様に実施した。（Ｌ）マウスにＴＳ／Ａ細胞を皮下（s.c.）移植し、そして、動物（１群当たり８匹）を、溶媒ビヒクル、ＯＣＤＯ（５０μg/kg）、Ｔａｍ（５６mg/kg）、ＤＤＡ（２０mg/kg）、又はＴａｍ（５６mg/kg）＋ＯＣＤＯ（５０μg/kg）の組み合わせ、又はＤＤＡ（２０mg/kg）＋ＯＣＤＯ（５０μg/kg）の組み合わせのいずれかで毎日皮下（s.c.）処理した。データは、３つの独立した実験の代表である。統計的分析をＥ及びＦと同様に実施した。
【図２Ｄ】ＯＣＤＯは、インビトロ及びインビボ腫瘍プロモーターであり、そして、その阻害は、Ｔａｍ及びＤＤＡの抗腫瘍効果に寄与する。（Ａ、Ｂ）ＤＮＡ中のＢｒＤＵ取り込みを測定する比色イムノアッセイを使用した、処理の２４時間後のＭＣＦ７（Ａ）及びＴＳ／Ａ（Ｂ）細胞の増殖に及ぼすＯＣＤＯ又は１７β−エストロゲン（Ｅ２）の効果を表すヒストグラム、（Ｃ、Ｄ）ＭＣＦ７（Ｃ）及びＴＳ／Ａ（Ｄ）細胞の浸潤に及ぼすＯＣＤＯの効果を表すヒストグラム。データは、３つの別々の実験の平均である（±s.e.m）、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ−検定）。（Ｅ、Ｆ）マウスにＭＣＦ７（Ｅ）又はＴＳ／Ａ（Ｆ）細胞を皮下（s.c.）移植し、そして、動物（１群当たり８匹）を、溶媒ビヒクル又はＯＣＤＯ（ＭＣＦ７について１６μg/kg又はＴＳ／Ａについて５０μg/kg）のいずれかで、移植当日から始めて毎日皮下（s.c.）処理した。腫瘍の成長について動物を週２回モニタリングした。データは、３つの独立した実験の代表である。平均腫瘍体積±s.e.mを示す、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（分散分析（ＡＮＯＶＡ）、ダネットの事後検定）。（Ｇ）（Ｅ）からのＭＣＦ７腫瘍切片のＩＨＣ染色から決定されたＫｉ６７陽性細胞数の平均（±s.e.m）、ｎ＝８、＊Ｐ＜０．０５（スチューデントのｔ−検定）  HistoQuant, Pannoramic Viewer（3DHistech）を使用。（Ｈ）対照で処理した腫瘍と比較してＯＣＤＯで処理した腫瘍において増加した染色を示す、（Ｆ）からのＴＳ／Ａ腫瘍切片の代表的なＫｉ６７染色。（Ｉ、Ｊ、Ｋ）マウスＥ０７７１（Ｉ）、又はヒトＭＤＡ−ＭＢ２３１（Ｊ）又はＭＤＡ−ＭＢ４６８（Ｋ）細胞をマウス（１群当たり８匹）へ皮下（s.c.）移植し、そして、動物を、溶媒ビヒクル又はＯＣＤＯ（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８について１６μg/kg又はＥ０７７１について５０μg/kg）のいずれかで皮下（s.c.）処理した。データは、２つの独立した実験の代表である。統計的分析をＥ及びＦと同様に実施した。（Ｌ）マウスにＴＳ／Ａ細胞を皮下（s.c.）移植し、そして、動物（１群当たり８匹）を、溶媒ビヒクル、ＯＣＤＯ（５０μg/kg）、Ｔａｍ（５６mg/kg）、ＤＤＡ（２０mg/kg）、又はＴａｍ（５６mg/kg）＋ＯＣＤＯ（５０μg/kg）の組み合わせ、又はＤＤＡ（２０mg/kg）＋ＯＣＤＯ（５０μg/kg）の組み合わせのいずれかで毎日皮下（s.c.）処理した。データは、３つの独立した実験の代表である。統計的分析をＥ及びＦと同様に実施した。
【図２Ｅ】ＯＣＤＯは、インビトロ及びインビボ腫瘍プロモーターであり、そして、その阻害は、Ｔａｍ及びＤＤＡの抗腫瘍効果に寄与する。（Ａ、Ｂ）ＤＮＡ中のＢｒＤＵ取り込みを測定する比色イムノアッセイを使用した、処理の２４時間後のＭＣＦ７（Ａ）及びＴＳ／Ａ（Ｂ）細胞の増殖に及ぼすＯＣＤＯ又は１７β−エストロゲン（Ｅ２）の効果を表すヒストグラム、（Ｃ、Ｄ）ＭＣＦ７（Ｃ）及びＴＳ／Ａ（Ｄ）細胞の浸潤に及ぼすＯＣＤＯの効果を表すヒストグラム。データは、３つの別々の実験の平均である（±s.e.m）、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ−検定）。（Ｅ、Ｆ）マウスにＭＣＦ７（Ｅ）又はＴＳ／Ａ（Ｆ）細胞を皮下（s.c.）移植し、そして、動物（１群当たり８匹）を、溶媒ビヒクル又はＯＣＤＯ（ＭＣＦ７について１６μg/kg又はＴＳ／Ａについて５０μg/kg）のいずれかで、移植当日から始めて毎日皮下（s.c.）処理した。腫瘍の成長について動物を週２回モニタリングした。データは、３つの独立した実験の代表である。平均腫瘍体積±s.e.mを示す、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（分散分析（ＡＮＯＶＡ）、ダネットの事後検定）。（Ｇ）（Ｅ）からのＭＣＦ７腫瘍切片のＩＨＣ染色から決定されたＫｉ６７陽性細胞数の平均（±s.e.m）、ｎ＝８、＊Ｐ＜０．０５（スチューデントのｔ−検定）  HistoQuant, Pannoramic Viewer（3DHistech）を使用。（Ｈ）対照で処理した腫瘍と比較してＯＣＤＯで処理した腫瘍において増加した染色を示す、（Ｆ）からのＴＳ／Ａ腫瘍切片の代表的なＫｉ６７染色。（Ｉ、Ｊ、Ｋ）マウスＥ０７７１（Ｉ）、又はヒトＭＤＡ−ＭＢ２３１（Ｊ）又はＭＤＡ−ＭＢ４６８（Ｋ）細胞をマウス（１群当たり８匹）へ皮下（s.c.）移植し、そして、動物を、溶媒ビヒクル又はＯＣＤＯ（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８について１６μg/kg又はＥ０７７１について５０μg/kg）のいずれかで皮下（s.c.）処理した。データは、２つの独立した実験の代表である。統計的分析をＥ及びＦと同様に実施した。（Ｌ）マウスにＴＳ／Ａ細胞を皮下（s.c.）移植し、そして、動物（１群当たり８匹）を、溶媒ビヒクル、ＯＣＤＯ（５０μg/kg）、Ｔａｍ（５６mg/kg）、ＤＤＡ（２０mg/kg）、又はＴａｍ（５６mg/kg）＋ＯＣＤＯ（５０μg/kg）の組み合わせ、又はＤＤＡ（２０mg/kg）＋ＯＣＤＯ（５０μg/kg）の組み合わせのいずれかで毎日皮下（s.c.）処理した。データは、３つの独立した実験の代表である。統計的分析をＥ及びＦと同様に実施した。
【図２Ｆ】ＯＣＤＯは、インビトロ及びインビボ腫瘍プロモーターであり、そして、その阻害は、Ｔａｍ及びＤＤＡの抗腫瘍効果に寄与する。（Ａ、Ｂ）ＤＮＡ中のＢｒＤＵ取り込みを測定する比色イムノアッセイを使用した、処理の２４時間後のＭＣＦ７（Ａ）及びＴＳ／Ａ（Ｂ）細胞の増殖に及ぼすＯＣＤＯ又は１７β−エストロゲン（Ｅ２）の効果を表すヒストグラム、（Ｃ、Ｄ）ＭＣＦ７（Ｃ）及びＴＳ／Ａ（Ｄ）細胞の浸潤に及ぼすＯＣＤＯの効果を表すヒストグラム。データは、３つの別々の実験の平均である（±s.e.m）、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ−検定）。（Ｅ、Ｆ）マウスにＭＣＦ７（Ｅ）又はＴＳ／Ａ（Ｆ）細胞を皮下（s.c.）移植し、そして、動物（１群当たり８匹）を、溶媒ビヒクル又はＯＣＤＯ（ＭＣＦ７について１６μg/kg又はＴＳ／Ａについて５０μg/kg）のいずれかで、移植当日から始めて毎日皮下（s.c.）処理した。腫瘍の成長について動物を週２回モニタリングした。データは、３つの独立した実験の代表である。平均腫瘍体積±s.e.mを示す、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（分散分析（ＡＮＯＶＡ）、ダネットの事後検定）。（Ｇ）（Ｅ）からのＭＣＦ７腫瘍切片のＩＨＣ染色から決定されたＫｉ６７陽性細胞数の平均（±s.e.m）、ｎ＝８、＊Ｐ＜０．０５（スチューデントのｔ−検定）  HistoQuant, Pannoramic Viewer（3DHistech）を使用。（Ｈ）対照で処理した腫瘍と比較してＯＣＤＯで処理した腫瘍において増加した染色を示す、（Ｆ）からのＴＳ／Ａ腫瘍切片の代表的なＫｉ６７染色。（Ｉ、Ｊ、Ｋ）マウスＥ０７７１（Ｉ）、又はヒトＭＤＡ−ＭＢ２３１（Ｊ）又はＭＤＡ−ＭＢ４６８（Ｋ）細胞をマウス（１群当たり８匹）へ皮下（s.c.）移植し、そして、動物を、溶媒ビヒクル又はＯＣＤＯ（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８について１６μg/kg又はＥ０７７１について５０μg/kg）のいずれかで皮下（s.c.）処理した。データは、２つの独立した実験の代表である。統計的分析をＥ及びＦと同様に実施した。（Ｌ）マウスにＴＳ／Ａ細胞を皮下（s.c.）移植し、そして、動物（１群当たり８匹）を、溶媒ビヒクル、ＯＣＤＯ（５０μg/kg）、Ｔａｍ（５６mg/kg）、ＤＤＡ（２０mg/kg）、又はＴａｍ（５６mg/kg）＋ＯＣＤＯ（５０μg/kg）の組み合わせ、又はＤＤＡ（２０mg/kg）＋ＯＣＤＯ（５０μg/kg）の組み合わせのいずれかで毎日皮下（s.c.）処理した。データは、３つの独立した実験の代表である。統計的分析をＥ及びＦと同様に実施した。
【図２Ｇ】ＯＣＤＯは、インビトロ及びインビボ腫瘍プロモーターであり、そして、その阻害は、Ｔａｍ及びＤＤＡの抗腫瘍効果に寄与する。（Ａ、Ｂ）ＤＮＡ中のＢｒＤＵ取り込みを測定する比色イムノアッセイを使用した、処理の２４時間後のＭＣＦ７（Ａ）及びＴＳ／Ａ（Ｂ）細胞の増殖に及ぼすＯＣＤＯ又は１７β−エストロゲン（Ｅ２）の効果を表すヒストグラム、（Ｃ、Ｄ）ＭＣＦ７（Ｃ）及びＴＳ／Ａ（Ｄ）細胞の浸潤に及ぼすＯＣＤＯの効果を表すヒストグラム。データは、３つの別々の実験の平均である（±s.e.m）、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ−検定）。（Ｅ、Ｆ）マウスにＭＣＦ７（Ｅ）又はＴＳ／Ａ（Ｆ）細胞を皮下（s.c.）移植し、そして、動物（１群当たり８匹）を、溶媒ビヒクル又はＯＣＤＯ（ＭＣＦ７について１６μg/kg又はＴＳ／Ａについて５０μg/kg）のいずれかで、移植当日から始めて毎日皮下（s.c.）処理した。腫瘍の成長について動物を週２回モニタリングした。データは、３つの独立した実験の代表である。平均腫瘍体積±s.e.mを示す、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（分散分析（ＡＮＯＶＡ）、ダネットの事後検定）。（Ｇ）（Ｅ）からのＭＣＦ７腫瘍切片のＩＨＣ染色から決定されたＫｉ６７陽性細胞数の平均（±s.e.m）、ｎ＝８、＊Ｐ＜０．０５（スチューデントのｔ−検定）  HistoQuant, Pannoramic Viewer（3DHistech）を使用。（Ｈ）対照で処理した腫瘍と比較してＯＣＤＯで処理した腫瘍において増加した染色を示す、（Ｆ）からのＴＳ／Ａ腫瘍切片の代表的なＫｉ６７染色。（Ｉ、Ｊ、Ｋ）マウスＥ０７７１（Ｉ）、又はヒトＭＤＡ−ＭＢ２３１（Ｊ）又はＭＤＡ−ＭＢ４６８（Ｋ）細胞をマウス（１群当たり８匹）へ皮下（s.c.）移植し、そして、動物を、溶媒ビヒクル又はＯＣＤＯ（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８について１６μg/kg又はＥ０７７１について５０μg/kg）のいずれかで皮下（s.c.）処理した。データは、２つの独立した実験の代表である。統計的分析をＥ及びＦと同様に実施した。（Ｌ）マウスにＴＳ／Ａ細胞を皮下（s.c.）移植し、そして、動物（１群当たり８匹）を、溶媒ビヒクル、ＯＣＤＯ（５０μg/kg）、Ｔａｍ（５６mg/kg）、ＤＤＡ（２０mg/kg）、又はＴａｍ（５６mg/kg）＋ＯＣＤＯ（５０μg/kg）の組み合わせ、又はＤＤＡ（２０mg/kg）＋ＯＣＤＯ（５０μg/kg）の組み合わせのいずれかで毎日皮下（s.c.）処理した。データは、３つの独立した実験の代表である。統計的分析をＥ及びＦと同様に実施した。
【図２Ｈ】ＯＣＤＯは、インビトロ及びインビボ腫瘍プロモーターであり、そして、その阻害は、Ｔａｍ及びＤＤＡの抗腫瘍効果に寄与する。（Ａ、Ｂ）ＤＮＡ中のＢｒＤＵ取り込みを測定する比色イムノアッセイを使用した、処理の２４時間後のＭＣＦ７（Ａ）及びＴＳ／Ａ（Ｂ）細胞の増殖に及ぼすＯＣＤＯ又は１７β−エストロゲン（Ｅ２）の効果を表すヒストグラム、（Ｃ、Ｄ）ＭＣＦ７（Ｃ）及びＴＳ／Ａ（Ｄ）細胞の浸潤に及ぼすＯＣＤＯの効果を表すヒストグラム。データは、３つの別々の実験の平均である（±s.e.m）、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ−検定）。（Ｅ、Ｆ）マウスにＭＣＦ７（Ｅ）又はＴＳ／Ａ（Ｆ）細胞を皮下（s.c.）移植し、そして、動物（１群当たり８匹）を、溶媒ビヒクル又はＯＣＤＯ（ＭＣＦ７について１６μg/kg又はＴＳ／Ａについて５０μg/kg）のいずれかで、移植当日から始めて毎日皮下（s.c.）処理した。腫瘍の成長について動物を週２回モニタリングした。データは、３つの独立した実験の代表である。平均腫瘍体積±s.e.mを示す、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（分散分析（ＡＮＯＶＡ）、ダネットの事後検定）。（Ｇ）（Ｅ）からのＭＣＦ７腫瘍切片のＩＨＣ染色から決定されたＫｉ６７陽性細胞数の平均（±s.e.m）、ｎ＝８、＊Ｐ＜０．０５（スチューデントのｔ−検定）  HistoQuant, Pannoramic Viewer（3DHistech）を使用。（Ｈ）対照で処理した腫瘍と比較してＯＣＤＯで処理した腫瘍において増加した染色を示す、（Ｆ）からのＴＳ／Ａ腫瘍切片の代表的なＫｉ６７染色。（Ｉ、Ｊ、Ｋ）マウスＥ０７７１（Ｉ）、又はヒトＭＤＡ−ＭＢ２３１（Ｊ）又はＭＤＡ−ＭＢ４６８（Ｋ）細胞をマウス（１群当たり８匹）へ皮下（s.c.）移植し、そして、動物を、溶媒ビヒクル又はＯＣＤＯ（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８について１６μg/kg又はＥ０７７１について５０μg/kg）のいずれかで皮下（s.c.）処理した。データは、２つの独立した実験の代表である。統計的分析をＥ及びＦと同様に実施した。（Ｌ）マウスにＴＳ／Ａ細胞を皮下（s.c.）移植し、そして、動物（１群当たり８匹）を、溶媒ビヒクル、ＯＣＤＯ（５０μg/kg）、Ｔａｍ（５６mg/kg）、ＤＤＡ（２０mg/kg）、又はＴａｍ（５６mg/kg）＋ＯＣＤＯ（５０μg/kg）の組み合わせ、又はＤＤＡ（２０mg/kg）＋ＯＣＤＯ（５０μg/kg）の組み合わせのいずれかで毎日皮下（s.c.）処理した。データは、３つの独立した実験の代表である。統計的分析をＥ及びＦと同様に実施した。
【図２Ｉ】ＯＣＤＯは、インビトロ及びインビボ腫瘍プロモーターであり、そして、その阻害は、Ｔａｍ及びＤＤＡの抗腫瘍効果に寄与する。（Ａ、Ｂ）ＤＮＡ中のＢｒＤＵ取り込みを測定する比色イムノアッセイを使用した、処理の２４時間後のＭＣＦ７（Ａ）及びＴＳ／Ａ（Ｂ）細胞の増殖に及ぼすＯＣＤＯ又は１７β−エストロゲン（Ｅ２）の効果を表すヒストグラム、（Ｃ、Ｄ）ＭＣＦ７（Ｃ）及びＴＳ／Ａ（Ｄ）細胞の浸潤に及ぼすＯＣＤＯの効果を表すヒストグラム。データは、３つの別々の実験の平均である（±s.e.m）、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ−検定）。（Ｅ、Ｆ）マウスにＭＣＦ７（Ｅ）又はＴＳ／Ａ（Ｆ）細胞を皮下（s.c.）移植し、そして、動物（１群当たり８匹）を、溶媒ビヒクル又はＯＣＤＯ（ＭＣＦ７について１６μg/kg又はＴＳ／Ａについて５０μg/kg）のいずれかで、移植当日から始めて毎日皮下（s.c.）処理した。腫瘍の成長について動物を週２回モニタリングした。データは、３つの独立した実験の代表である。平均腫瘍体積±s.e.mを示す、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（分散分析（ＡＮＯＶＡ）、ダネットの事後検定）。（Ｇ）（Ｅ）からのＭＣＦ７腫瘍切片のＩＨＣ染色から決定されたＫｉ６７陽性細胞数の平均（±s.e.m）、ｎ＝８、＊Ｐ＜０．０５（スチューデントのｔ−検定）  HistoQuant, Pannoramic Viewer（3DHistech）を使用。（Ｈ）対照で処理した腫瘍と比較してＯＣＤＯで処理した腫瘍において増加した染色を示す、（Ｆ）からのＴＳ／Ａ腫瘍切片の代表的なＫｉ６７染色。（Ｉ、Ｊ、Ｋ）マウスＥ０７７１（Ｉ）、又はヒトＭＤＡ−ＭＢ２３１（Ｊ）又はＭＤＡ−ＭＢ４６８（Ｋ）細胞をマウス（１群当たり８匹）へ皮下（s.c.）移植し、そして、動物を、溶媒ビヒクル又はＯＣＤＯ（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８について１６μg/kg又はＥ０７７１について５０μg/kg）のいずれかで皮下（s.c.）処理した。データは、２つの独立した実験の代表である。統計的分析をＥ及びＦと同様に実施した。（Ｌ）マウスにＴＳ／Ａ細胞を皮下（s.c.）移植し、そして、動物（１群当たり８匹）を、溶媒ビヒクル、ＯＣＤＯ（５０μg/kg）、Ｔａｍ（５６mg/kg）、ＤＤＡ（２０mg/kg）、又はＴａｍ（５６mg/kg）＋ＯＣＤＯ（５０μg/kg）の組み合わせ、又はＤＤＡ（２０mg/kg）＋ＯＣＤＯ（５０μg/kg）の組み合わせのいずれかで毎日皮下（s.c.）処理した。データは、３つの独立した実験の代表である。統計的分析をＥ及びＦと同様に実施した。
【図２Ｊ】ＯＣＤＯは、インビトロ及びインビボ腫瘍プロモーターであり、そして、その阻害は、Ｔａｍ及びＤＤＡの抗腫瘍効果に寄与する。（Ａ、Ｂ）ＤＮＡ中のＢｒＤＵ取り込みを測定する比色イムノアッセイを使用した、処理の２４時間後のＭＣＦ７（Ａ）及びＴＳ／Ａ（Ｂ）細胞の増殖に及ぼすＯＣＤＯ又は１７β−エストロゲン（Ｅ２）の効果を表すヒストグラム、（Ｃ、Ｄ）ＭＣＦ７（Ｃ）及びＴＳ／Ａ（Ｄ）細胞の浸潤に及ぼすＯＣＤＯの効果を表すヒストグラム。データは、３つの別々の実験の平均である（±s.e.m）、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ−検定）。（Ｅ、Ｆ）マウスにＭＣＦ７（Ｅ）又はＴＳ／Ａ（Ｆ）細胞を皮下（s.c.）移植し、そして、動物（１群当たり８匹）を、溶媒ビヒクル又はＯＣＤＯ（ＭＣＦ７について１６μg/kg又はＴＳ／Ａについて５０μg/kg）のいずれかで、移植当日から始めて毎日皮下（s.c.）処理した。腫瘍の成長について動物を週２回モニタリングした。データは、３つの独立した実験の代表である。平均腫瘍体積±s.e.mを示す、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（分散分析（ＡＮＯＶＡ）、ダネットの事後検定）。（Ｇ）（Ｅ）からのＭＣＦ７腫瘍切片のＩＨＣ染色から決定されたＫｉ６７陽性細胞数の平均（±s.e.m）、ｎ＝８、＊Ｐ＜０．０５（スチューデントのｔ−検定）  HistoQuant, Pannoramic Viewer（3DHistech）を使用。（Ｈ）対照で処理した腫瘍と比較してＯＣＤＯで処理した腫瘍において増加した染色を示す、（Ｆ）からのＴＳ／Ａ腫瘍切片の代表的なＫｉ６７染色。（Ｉ、Ｊ、Ｋ）マウスＥ０７７１（Ｉ）、又はヒトＭＤＡ−ＭＢ２３１（Ｊ）又はＭＤＡ−ＭＢ４６８（Ｋ）細胞をマウス（１群当たり８匹）へ皮下（s.c.）移植し、そして、動物を、溶媒ビヒクル又はＯＣＤＯ（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８について１６μg/kg又はＥ０７７１について５０μg/kg）のいずれかで皮下（s.c.）処理した。データは、２つの独立した実験の代表である。統計的分析をＥ及びＦと同様に実施した。（Ｌ）マウスにＴＳ／Ａ細胞を皮下（s.c.）移植し、そして、動物（１群当たり８匹）を、溶媒ビヒクル、ＯＣＤＯ（５０μg/kg）、Ｔａｍ（５６mg/kg）、ＤＤＡ（２０mg/kg）、又はＴａｍ（５６mg/kg）＋ＯＣＤＯ（５０μg/kg）の組み合わせ、又はＤＤＡ（２０mg/kg）＋ＯＣＤＯ（５０μg/kg）の組み合わせのいずれかで毎日皮下（s.c.）処理した。データは、３つの独立した実験の代表である。統計的分析をＥ及びＦと同様に実施した。
【図２Ｋ】ＯＣＤＯは、インビトロ及びインビボ腫瘍プロモーターであり、そして、その阻害は、Ｔａｍ及びＤＤＡの抗腫瘍効果に寄与する。（Ａ、Ｂ）ＤＮＡ中のＢｒＤＵ取り込みを測定する比色イムノアッセイを使用した、処理の２４時間後のＭＣＦ７（Ａ）及びＴＳ／Ａ（Ｂ）細胞の増殖に及ぼすＯＣＤＯ又は１７β−エストロゲン（Ｅ２）の効果を表すヒストグラム、（Ｃ、Ｄ）ＭＣＦ７（Ｃ）及びＴＳ／Ａ（Ｄ）細胞の浸潤に及ぼすＯＣＤＯの効果を表すヒストグラム。データは、３つの別々の実験の平均である（±s.e.m）、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ−検定）。（Ｅ、Ｆ）マウスにＭＣＦ７（Ｅ）又はＴＳ／Ａ（Ｆ）細胞を皮下（s.c.）移植し、そして、動物（１群当たり８匹）を、溶媒ビヒクル又はＯＣＤＯ（ＭＣＦ７について１６μg/kg又はＴＳ／Ａについて５０μg/kg）のいずれかで、移植当日から始めて毎日皮下（s.c.）処理した。腫瘍の成長について動物を週２回モニタリングした。データは、３つの独立した実験の代表である。平均腫瘍体積±s.e.mを示す、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（分散分析（ＡＮＯＶＡ）、ダネットの事後検定）。（Ｇ）（Ｅ）からのＭＣＦ７腫瘍切片のＩＨＣ染色から決定されたＫｉ６７陽性細胞数の平均（±s.e.m）、ｎ＝８、＊Ｐ＜０．０５（スチューデントのｔ−検定）  HistoQuant, Pannoramic Viewer（3DHistech）を使用。（Ｈ）対照で処理した腫瘍と比較してＯＣＤＯで処理した腫瘍において増加した染色を示す、（Ｆ）からのＴＳ／Ａ腫瘍切片の代表的なＫｉ６７染色。（Ｉ、Ｊ、Ｋ）マウスＥ０７７１（Ｉ）、又はヒトＭＤＡ−ＭＢ２３１（Ｊ）又はＭＤＡ−ＭＢ４６８（Ｋ）細胞をマウス（１群当たり８匹）へ皮下（s.c.）移植し、そして、動物を、溶媒ビヒクル又はＯＣＤＯ（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８について１６μg/kg又はＥ０７７１について５０μg/kg）のいずれかで皮下（s.c.）処理した。データは、２つの独立した実験の代表である。統計的分析をＥ及びＦと同様に実施した。（Ｌ）マウスにＴＳ／Ａ細胞を皮下（s.c.）移植し、そして、動物（１群当たり８匹）を、溶媒ビヒクル、ＯＣＤＯ（５０μg/kg）、Ｔａｍ（５６mg/kg）、ＤＤＡ（２０mg/kg）、又はＴａｍ（５６mg/kg）＋ＯＣＤＯ（５０μg/kg）の組み合わせ、又はＤＤＡ（２０mg/kg）＋ＯＣＤＯ（５０μg/kg）の組み合わせのいずれかで毎日皮下（s.c.）処理した。データは、３つの独立した実験の代表である。統計的分析をＥ及びＦと同様に実施した。
【図２Ｌ】ＯＣＤＯは、インビトロ及びインビボ腫瘍プロモーターであり、そして、その阻害は、Ｔａｍ及びＤＤＡの抗腫瘍効果に寄与する。（Ａ、Ｂ）ＤＮＡ中のＢｒＤＵ取り込みを測定する比色イムノアッセイを使用した、処理の２４時間後のＭＣＦ７（Ａ）及びＴＳ／Ａ（Ｂ）細胞の増殖に及ぼすＯＣＤＯ又は１７β−エストロゲン（Ｅ２）の効果を表すヒストグラム、（Ｃ、Ｄ）ＭＣＦ７（Ｃ）及びＴＳ／Ａ（Ｄ）細胞の浸潤に及ぼすＯＣＤＯの効果を表すヒストグラム。データは、３つの別々の実験の平均である（±s.e.m）、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ−検定）。（Ｅ、Ｆ）マウスにＭＣＦ７（Ｅ）又はＴＳ／Ａ（Ｆ）細胞を皮下（s.c.）移植し、そして、動物（１群当たり８匹）を、溶媒ビヒクル又はＯＣＤＯ（ＭＣＦ７について１６μg/kg又はＴＳ／Ａについて５０μg/kg）のいずれかで、移植当日から始めて毎日皮下（s.c.）処理した。腫瘍の成長について動物を週２回モニタリングした。データは、３つの独立した実験の代表である。平均腫瘍体積±s.e.mを示す、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（分散分析（ＡＮＯＶＡ）、ダネットの事後検定）。（Ｇ）（Ｅ）からのＭＣＦ７腫瘍切片のＩＨＣ染色から決定されたＫｉ６７陽性細胞数の平均（±s.e.m）、ｎ＝８、＊Ｐ＜０．０５（スチューデントのｔ−検定）  HistoQuant, Pannoramic Viewer（3DHistech）を使用。（Ｈ）対照で処理した腫瘍と比較してＯＣＤＯで処理した腫瘍において増加した染色を示す、（Ｆ）からのＴＳ／Ａ腫瘍切片の代表的なＫｉ６７染色。（Ｉ、Ｊ、Ｋ）マウスＥ０７７１（Ｉ）、又はヒトＭＤＡ−ＭＢ２３１（Ｊ）又はＭＤＡ−ＭＢ４６８（Ｋ）細胞をマウス（１群当たり８匹）へ皮下（s.c.）移植し、そして、動物を、溶媒ビヒクル又はＯＣＤＯ（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８について１６μg/kg又はＥ０７７１について５０μg/kg）のいずれかで皮下（s.c.）処理した。データは、２つの独立した実験の代表である。統計的分析をＥ及びＦと同様に実施した。（Ｌ）マウスにＴＳ／Ａ細胞を皮下（s.c.）移植し、そして、動物（１群当たり８匹）を、溶媒ビヒクル、ＯＣＤＯ（５０μg/kg）、Ｔａｍ（５６mg/kg）、ＤＤＡ（２０mg/kg）、又はＴａｍ（５６mg/kg）＋ＯＣＤＯ（５０μg/kg）の組み合わせ、又はＤＤＡ（２０mg/kg）＋ＯＣＤＯ（５０μg/kg）の組み合わせのいずれかで毎日皮下（s.c.）処理した。データは、３つの独立した実験の代表である。統計的分析をＥ及びＦと同様に実施した。
【図３】本発明者等は、コルチゾールからコルチゾンへの脱水素化を触媒する１１β−ＨＳＤ２型（１１ＨＳＤ２）がＣＴからＯＣＤＯを産生する酵素であり、そして、コルチゾンからコルチゾールへの水素化を触媒する１１β−ＨＳＤ１型（１１ＨＳＤ１）が逆反応（ＯＣＤＯからのＣＴ産生）を実現する酵素であると仮説を立てた。本発明者等はまた、１１βＨＳＤ１レダクターゼ活性及びコルチゾールの産生に必要な補因子ＮＡＤＰＨを産生するＨ６ＰＤＨもまたＣＴの産生に必要であると仮説を立てた。
【図４Ａ】１１βＨＳＤ２及び１１βＨＳＤ１は、それぞれＯＣＤＯ及びＣＴを産生する酵素である。ＨＥＫ−２７３細胞（５×１０６個の細胞）に、酵素１１βＨＳＤ２（ＨＳＤ２）、１１βＨＳＤ１（ＨＳＤ１）、Ｈ６ＰＤＨ、対照空ベクター（偽）のいずれかをコードするプラスミドをエレクトロポレーションによってトランスフェクトするか又は１１βＨＳＤ１又はＨ６ＰＤＨをコードするプラスミドを同時トランスフェクトし、そして、以下のように分析した：（Ａ）１１βＨＳＤ２の発現を、１１βＨＳＤ２に対する特異的抗体を使用したイムノブロッティングによって確認し、アクチンで正規化した；（Ｂ、Ｃ）コルチゾン（Ｂ）又はＯＣＤＯ（Ｃ）の産生を、偽又はＨＳＤ２をトランスフェクトした細胞と３Ｈ−コルチゾール又は１４Ｃ−ＣＴをそれぞれ３７℃で８時間インキュベートすることによって決定した。細胞及び培地から抽出した脂質をＴＬＣ分析によって分析し、そして、関心対象の放射性代謝産物に対応する領域を回収し、β−カウンターを使用して計数した；（Ｄ）１１βＨＳＤ１及びＨ６ＰＤＨの発現を、１１βＨＳＤ１又はＨ６ＰＤＨに対する特異的抗体を使用したイムノブロッティングによって確認し、アクチンで正規化した；（Ｅ、Ｆ）１１βＨＳＤ１、Ｈ６ＰＤＨ、両方の酵素又は対照空ベクター（偽）を発現するＨＥＫ−２７３細胞を、３Ｈ−コルチゾン（Ｅ）又は１４Ｃ−ＯＣＤＯ（Ｆ）のいずれかと７２時間インキュベートし、そして、関心対象の放射性代謝産物をＢ及びＣと同様に分析した。Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆの結果は、３つの実験の平均（±s.e.m）である、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ−検定）。
【図４Ｂ】１１βＨＳＤ２及び１１βＨＳＤ１は、それぞれＯＣＤＯ及びＣＴを産生する酵素である。ＨＥＫ−２７３細胞（５×１０６個の細胞）に、酵素１１βＨＳＤ２（ＨＳＤ２）、１１βＨＳＤ１（ＨＳＤ１）、Ｈ６ＰＤＨ、対照空ベクター（偽）のいずれかをコードするプラスミドをエレクトロポレーションによってトランスフェクトするか又は１１βＨＳＤ１又はＨ６ＰＤＨをコードするプラスミドを同時トランスフェクトし、そして、以下のように分析した：（Ａ）１１βＨＳＤ２の発現を、１１βＨＳＤ２に対する特異的抗体を使用したイムノブロッティングによって確認し、アクチンで正規化した；（Ｂ、Ｃ）コルチゾン（Ｂ）又はＯＣＤＯ（Ｃ）の産生を、偽又はＨＳＤ２をトランスフェクトした細胞と３Ｈ−コルチゾール又は１４Ｃ−ＣＴをそれぞれ３７℃で８時間インキュベートすることによって決定した。細胞及び培地から抽出した脂質をＴＬＣ分析によって分析し、そして、関心対象の放射性代謝産物に対応する領域を回収し、β−カウンターを使用して計数した；（Ｄ）１１βＨＳＤ１及びＨ６ＰＤＨの発現を、１１βＨＳＤ１又はＨ６ＰＤＨに対する特異的抗体を使用したイムノブロッティングによって確認し、アクチンで正規化した；（Ｅ、Ｆ）１１βＨＳＤ１、Ｈ６ＰＤＨ、両方の酵素又は対照空ベクター（偽）を発現するＨＥＫ−２７３細胞を、３Ｈ−コルチゾン（Ｅ）又は１４Ｃ−ＯＣＤＯ（Ｆ）のいずれかと７２時間インキュベートし、そして、関心対象の放射性代謝産物をＢ及びＣと同様に分析した。Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆの結果は、３つの実験の平均（±s.e.m）である、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ−検定）。
【図４Ｃ】１１βＨＳＤ２及び１１βＨＳＤ１は、それぞれＯＣＤＯ及びＣＴを産生する酵素である。ＨＥＫ−２７３細胞（５×１０６個の細胞）に、酵素１１βＨＳＤ２（ＨＳＤ２）、１１βＨＳＤ１（ＨＳＤ１）、Ｈ６ＰＤＨ、対照空ベクター（偽）のいずれかをコードするプラスミドをエレクトロポレーションによってトランスフェクトするか又は１１βＨＳＤ１又はＨ６ＰＤＨをコードするプラスミドを同時トランスフェクトし、そして、以下のように分析した：（Ａ）１１βＨＳＤ２の発現を、１１βＨＳＤ２に対する特異的抗体を使用したイムノブロッティングによって確認し、アクチンで正規化した；（Ｂ、Ｃ）コルチゾン（Ｂ）又はＯＣＤＯ（Ｃ）の産生を、偽又はＨＳＤ２をトランスフェクトした細胞と３Ｈ−コルチゾール又は１４Ｃ−ＣＴをそれぞれ３７℃で８時間インキュベートすることによって決定した。細胞及び培地から抽出した脂質をＴＬＣ分析によって分析し、そして、関心対象の放射性代謝産物に対応する領域を回収し、β−カウンターを使用して計数した；（Ｄ）１１βＨＳＤ１及びＨ６ＰＤＨの発現を、１１βＨＳＤ１又はＨ６ＰＤＨに対する特異的抗体を使用したイムノブロッティングによって確認し、アクチンで正規化した；（Ｅ、Ｆ）１１βＨＳＤ１、Ｈ６ＰＤＨ、両方の酵素又は対照空ベクター（偽）を発現するＨＥＫ−２７３細胞を、３Ｈ−コルチゾン（Ｅ）又は１４Ｃ−ＯＣＤＯ（Ｆ）のいずれかと７２時間インキュベートし、そして、関心対象の放射性代謝産物をＢ及びＣと同様に分析した。Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆの結果は、３つの実験の平均（±s.e.m）である、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ−検定）。
【図４Ｄ】１１βＨＳＤ２及び１１βＨＳＤ１は、それぞれＯＣＤＯ及びＣＴを産生する酵素である。ＨＥＫ−２７３細胞（５×１０６個の細胞）に、酵素１１βＨＳＤ２（ＨＳＤ２）、１１βＨＳＤ１（ＨＳＤ１）、Ｈ６ＰＤＨ、対照空ベクター（偽）のいずれかをコードするプラスミドをエレクトロポレーションによってトランスフェクトするか又は１１βＨＳＤ１又はＨ６ＰＤＨをコードするプラスミドを同時トランスフェクトし、そして、以下のように分析した：（Ａ）１１βＨＳＤ２の発現を、１１βＨＳＤ２に対する特異的抗体を使用したイムノブロッティングによって確認し、アクチンで正規化した；（Ｂ、Ｃ）コルチゾン（Ｂ）又はＯＣＤＯ（Ｃ）の産生を、偽又はＨＳＤ２をトランスフェクトした細胞と３Ｈ−コルチゾール又は１４Ｃ−ＣＴをそれぞれ３７℃で８時間インキュベートすることによって決定した。細胞及び培地から抽出した脂質をＴＬＣ分析によって分析し、そして、関心対象の放射性代謝産物に対応する領域を回収し、β−カウンターを使用して計数した；（Ｄ）１１βＨＳＤ１及びＨ６ＰＤＨの発現を、１１βＨＳＤ１又はＨ６ＰＤＨに対する特異的抗体を使用したイムノブロッティングによって確認し、アクチンで正規化した；（Ｅ、Ｆ）１１βＨＳＤ１、Ｈ６ＰＤＨ、両方の酵素又は対照空ベクター（偽）を発現するＨＥＫ−２７３細胞を、３Ｈ−コルチゾン（Ｅ）又は１４Ｃ−ＯＣＤＯ（Ｆ）のいずれかと７２時間インキュベートし、そして、関心対象の放射性代謝産物をＢ及びＣと同様に分析した。Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆの結果は、３つの実験の平均（±s.e.m）である、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ−検定）。
【図４Ｅ】１１βＨＳＤ２及び１１βＨＳＤ１は、それぞれＯＣＤＯ及びＣＴを産生する酵素である。ＨＥＫ−２７３細胞（５×１０６個の細胞）に、酵素１１βＨＳＤ２（ＨＳＤ２）、１１βＨＳＤ１（ＨＳＤ１）、Ｈ６ＰＤＨ、対照空ベクター（偽）のいずれかをコードするプラスミドをエレクトロポレーションによってトランスフェクトするか又は１１βＨＳＤ１又はＨ６ＰＤＨをコードするプラスミドを同時トランスフェクトし、そして、以下のように分析した：（Ａ）１１βＨＳＤ２の発現を、１１βＨＳＤ２に対する特異的抗体を使用したイムノブロッティングによって確認し、アクチンで正規化した；（Ｂ、Ｃ）コルチゾン（Ｂ）又はＯＣＤＯ（Ｃ）の産生を、偽又はＨＳＤ２をトランスフェクトした細胞と３Ｈ−コルチゾール又は１４Ｃ−ＣＴをそれぞれ３７℃で８時間インキュベートすることによって決定した。細胞及び培地から抽出した脂質をＴＬＣ分析によって分析し、そして、関心対象の放射性代謝産物に対応する領域を回収し、β−カウンターを使用して計数した；（Ｄ）１１βＨＳＤ１及びＨ６ＰＤＨの発現を、１１βＨＳＤ１又はＨ６ＰＤＨに対する特異的抗体を使用したイムノブロッティングによって確認し、アクチンで正規化した；（Ｅ、Ｆ）１１βＨＳＤ１、Ｈ６ＰＤＨ、両方の酵素又は対照空ベクター（偽）を発現するＨＥＫ−２７３細胞を、３Ｈ−コルチゾン（Ｅ）又は１４Ｃ−ＯＣＤＯ（Ｆ）のいずれかと７２時間インキュベートし、そして、関心対象の放射性代謝産物をＢ及びＣと同様に分析した。Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆの結果は、３つの実験の平均（±s.e.m）である、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ−検定）。
【図４Ｆ】１１βＨＳＤ２及び１１βＨＳＤ１は、それぞれＯＣＤＯ及びＣＴを産生する酵素である。ＨＥＫ−２７３細胞（５×１０６個の細胞）に、酵素１１βＨＳＤ２（ＨＳＤ２）、１１βＨＳＤ１（ＨＳＤ１）、Ｈ６ＰＤＨ、対照空ベクター（偽）のいずれかをコードするプラスミドをエレクトロポレーションによってトランスフェクトするか又は１１βＨＳＤ１又はＨ６ＰＤＨをコードするプラスミドを同時トランスフェクトし、そして、以下のように分析した：（Ａ）１１βＨＳＤ２の発現を、１１βＨＳＤ２に対する特異的抗体を使用したイムノブロッティングによって確認し、アクチンで正規化した；（Ｂ、Ｃ）コルチゾン（Ｂ）又はＯＣＤＯ（Ｃ）の産生を、偽又はＨＳＤ２をトランスフェクトした細胞と３Ｈ−コルチゾール又は１４Ｃ−ＣＴをそれぞれ３７℃で８時間インキュベートすることによって決定した。細胞及び培地から抽出した脂質をＴＬＣ分析によって分析し、そして、関心対象の放射性代謝産物に対応する領域を回収し、β−カウンターを使用して計数した；（Ｄ）１１βＨＳＤ１及びＨ６ＰＤＨの発現を、１１βＨＳＤ１又はＨ６ＰＤＨに対する特異的抗体を使用したイムノブロッティングによって確認し、アクチンで正規化した；（Ｅ、Ｆ）１１βＨＳＤ１、Ｈ６ＰＤＨ、両方の酵素又は対照空ベクター（偽）を発現するＨＥＫ−２７３細胞を、３Ｈ−コルチゾン（Ｅ）又は１４Ｃ−ＯＣＤＯ（Ｆ）のいずれかと７２時間インキュベートし、そして、関心対象の放射性代謝産物をＢ及びＣと同様に分析した。Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆの結果は、３つの実験の平均（±s.e.m）である、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ−検定）。
【図５Ａ】ＭＣＦ７における１１βＨＳＤ１の異所性発現は細胞増殖を阻害し、そして、ＯＣＤＯはこの効果を反転させる。ＭＣＦ７細胞に、酵素１１βＨＳＤ１（ＨＳＤ１）又は対照空ベクター（偽）のいずれかをコードするプラスミドをエレクトロポレーションによってトランスフェクトし、そして、以下のように分析した：（Ａ）１１βＨＳＤ１の発現を、１１βＨＳＤ１に対する特異的抗体を使用したイムノブロッティングによって確認し、アクチンで正規化した；（Ｂ）ＣＴの産生を、偽又はＨＳＤ１をトランスフェクトした細胞と１４Ｃ−ＯＣＤＯを３７℃で７２時間インキュベートすることによって決定した。関心対象の放射性代謝産物を図４Ｂの凡例と同様に分析した。（Ｃ）５μM ＯＣＤＯで２４時間処理した又は処理していない偽又はＨＳＤ１をトランスフェクトしたＭＣＦ７細胞の増殖を図２Ａと同様に分析した。Ｂ及びＣの結果は、３〜５つの実験の平均（±s.e.m）である、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ−検定）、ｎｓ：非特異的。
【図５Ｂ】ＭＣＦ７における１１βＨＳＤ１の異所性発現は細胞増殖を阻害し、そして、ＯＣＤＯはこの効果を反転させる。ＭＣＦ７細胞に、酵素１１βＨＳＤ１（ＨＳＤ１）又は対照空ベクター（偽）のいずれかをコードするプラスミドをエレクトロポレーションによってトランスフェクトし、そして、以下のように分析した：（Ａ）１１βＨＳＤ１の発現を、１１βＨＳＤ１に対する特異的抗体を使用したイムノブロッティングによって確認し、アクチンで正規化した；（Ｂ）ＣＴの産生を、偽又はＨＳＤ１をトランスフェクトした細胞と１４Ｃ−ＯＣＤＯを３７℃で７２時間インキュベートすることによって決定した。関心対象の放射性代謝産物を図４Ｂの凡例と同様に分析した。（Ｃ）５μM ＯＣＤＯで２４時間処理した又は処理していない偽又はＨＳＤ１をトランスフェクトしたＭＣＦ７細胞の増殖を図２Ａと同様に分析した。Ｂ及びＣの結果は、３〜５つの実験の平均（±s.e.m）である、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ−検定）、ｎｓ：非特異的。
【図５Ｃ】ＭＣＦ７における１１βＨＳＤ１の異所性発現は細胞増殖を阻害し、そして、ＯＣＤＯはこの効果を反転させる。ＭＣＦ７細胞に、酵素１１βＨＳＤ１（ＨＳＤ１）又は対照空ベクター（偽）のいずれかをコードするプラスミドをエレクトロポレーションによってトランスフェクトし、そして、以下のように分析した：（Ａ）１１βＨＳＤ１の発現を、１１βＨＳＤ１に対する特異的抗体を使用したイムノブロッティングによって確認し、アクチンで正規化した；（Ｂ）ＣＴの産生を、偽又はＨＳＤ１をトランスフェクトした細胞と１４Ｃ−ＯＣＤＯを３７℃で７２時間インキュベートすることによって決定した。関心対象の放射性代謝産物を図４Ｂの凡例と同様に分析した。（Ｃ）５μM ＯＣＤＯで２４時間処理した又は処理していない偽又はＨＳＤ１をトランスフェクトしたＭＣＦ７細胞の増殖を図２Ａと同様に分析した。Ｂ及びＣの結果は、３〜５つの実験の平均（±s.e.m）である、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ−検定）、ｎｓ：非特異的。
【図６Ａ】１１βＨＳＤ２のノックダウンは、ＭＣＦ７細胞におけるＯＣＤＯ産生、細胞増殖、浸潤及び生存を減少させる。ＭＣＦ７細胞（５×１０６個の細胞）に、１１βＨＳＤ２に対するショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）又は対照ｓｈＲＮＡを発現するプラスミドをエレクトロポレーションによってトランスフェクトし、２つのクローン（Ａ及びＢ）を選択し、そして、以下のように分析した：（Ａ）ＭＣＦ７における１１βＨＳＤ２発現のノックダウンを、図４に記載したようにイムノブロッティングによって又はｑＰＣＲによって確認した；（Ｂ、Ｃ）ｓｈ対照（ｓｈＣＡ及びＢ）又はｓｈＨＳＤ２をトランスフェクトした細胞（ｓｈＨＳＤ２  Ａ及びＢ）によって生産されたコルチゾン（Ｂ）又はＯＣＤＯ（Ｃ）の定量化を図４に記載したように測定した。（Ｄ、Ｅ）ｓｈ−Ｃ又はｓｈＨＳＤ２の増殖を、図２Ａに記載したようにＤＮＡのＢｒＤＵ取り込みの定量化（Ｄ）を使用して又は細胞計数（Ｅ）によって測定した。（Ｆ）ｓｈ−Ｃ又はｓｈＨＳＤ２ＭＣＦ７細胞によるコロニーの形成を、細胞固定及びクリスタルバイオレット染色後に定量化した。結果は、３〜５つの実験の平均（±s.e.m）である、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１（スチューデントのｔ−検定）。
【図６Ｂ】１１βＨＳＤ２のノックダウンは、ＭＣＦ７細胞におけるＯＣＤＯ産生、細胞増殖、浸潤及び生存を減少させる。ＭＣＦ７細胞（５×１０６個の細胞）に、１１βＨＳＤ２に対するショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）又は対照ｓｈＲＮＡを発現するプラスミドをエレクトロポレーションによってトランスフェクトし、２つのクローン（Ａ及びＢ）を選択し、そして、以下のように分析した：（Ａ）ＭＣＦ７における１１βＨＳＤ２発現のノックダウンを、図４に記載したようにイムノブロッティングによって又はｑＰＣＲによって確認した；（Ｂ、Ｃ）ｓｈ対照（ｓｈＣＡ及びＢ）又はｓｈＨＳＤ２をトランスフェクトした細胞（ｓｈＨＳＤ２  Ａ及びＢ）によって生産されたコルチゾン（Ｂ）又はＯＣＤＯ（Ｃ）の定量化を図４に記載したように測定した。（Ｄ、Ｅ）ｓｈ−Ｃ又はｓｈＨＳＤ２の増殖を、図２Ａに記載したようにＤＮＡのＢｒＤＵ取り込みの定量化（Ｄ）を使用して又は細胞計数（Ｅ）によって測定した。（Ｆ）ｓｈ−Ｃ又はｓｈＨＳＤ２ＭＣＦ７細胞によるコロニーの形成を、細胞固定及びクリスタルバイオレット染色後に定量化した。結果は、３〜５つの実験の平均（±s.e.m）である、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１（スチューデントのｔ−検定）。
【図６Ｃ】１１βＨＳＤ２のノックダウンは、ＭＣＦ７細胞におけるＯＣＤＯ産生、細胞増殖、浸潤及び生存を減少させる。ＭＣＦ７細胞（５×１０６個の細胞）に、１１βＨＳＤ２に対するショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）又は対照ｓｈＲＮＡを発現するプラスミドをエレクトロポレーションによってトランスフェクトし、２つのクローン（Ａ及びＢ）を選択し、そして、以下のように分析した：（Ａ）ＭＣＦ７における１１βＨＳＤ２発現のノックダウンを、図４に記載したようにイムノブロッティングによって又はｑＰＣＲによって確認した；（Ｂ、Ｃ）ｓｈ対照（ｓｈＣＡ及びＢ）又はｓｈＨＳＤ２をトランスフェクトした細胞（ｓｈＨＳＤ２  Ａ及びＢ）によって生産されたコルチゾン（Ｂ）又はＯＣＤＯ（Ｃ）の定量化を図４に記載したように測定した。（Ｄ、Ｅ）ｓｈ−Ｃ又はｓｈＨＳＤ２の増殖を、図２Ａに記載したようにＤＮＡのＢｒＤＵ取り込みの定量化（Ｄ）を使用して又は細胞計数（Ｅ）によって測定した。（Ｆ）ｓｈ−Ｃ又はｓｈＨＳＤ２ＭＣＦ７細胞によるコロニーの形成を、細胞固定及びクリスタルバイオレット染色後に定量化した。結果は、３〜５つの実験の平均（±s.e.m）である、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１（スチューデントのｔ−検定）。
【図６Ｄ】１１βＨＳＤ２のノックダウンは、ＭＣＦ７細胞におけるＯＣＤＯ産生、細胞増殖、浸潤及び生存を減少させる。ＭＣＦ７細胞（５×１０６個の細胞）に、１１βＨＳＤ２に対するショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）又は対照ｓｈＲＮＡを発現するプラスミドをエレクトロポレーションによってトランスフェクトし、２つのクローン（Ａ及びＢ）を選択し、そして、以下のように分析した：（Ａ）ＭＣＦ７における１１βＨＳＤ２発現のノックダウンを、図４に記載したようにイムノブロッティングによって又はｑＰＣＲによって確認した；（Ｂ、Ｃ）ｓｈ対照（ｓｈＣＡ及びＢ）又はｓｈＨＳＤ２をトランスフェクトした細胞（ｓｈＨＳＤ２  Ａ及びＢ）によって生産されたコルチゾン（Ｂ）又はＯＣＤＯ（Ｃ）の定量化を図４に記載したように測定した。（Ｄ、Ｅ）ｓｈ−Ｃ又はｓｈＨＳＤ２の増殖を、図２Ａに記載したようにＤＮＡのＢｒＤＵ取り込みの定量化（Ｄ）を使用して又は細胞計数（Ｅ）によって測定した。（Ｆ）ｓｈ−Ｃ又はｓｈＨＳＤ２ＭＣＦ７細胞によるコロニーの形成を、細胞固定及びクリスタルバイオレット染色後に定量化した。結果は、３〜５つの実験の平均（±s.e.m）である、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１（スチューデントのｔ−検定）。
【図６Ｅ】１１βＨＳＤ２のノックダウンは、ＭＣＦ７細胞におけるＯＣＤＯ産生、細胞増殖、浸潤及び生存を減少させる。ＭＣＦ７細胞（５×１０６個の細胞）に、１１βＨＳＤ２に対するショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）又は対照ｓｈＲＮＡを発現するプラスミドをエレクトロポレーションによってトランスフェクトし、２つのクローン（Ａ及びＢ）を選択し、そして、以下のように分析した：（Ａ）ＭＣＦ７における１１βＨＳＤ２発現のノックダウンを、図４に記載したようにイムノブロッティングによって又はｑＰＣＲによって確認した；（Ｂ、Ｃ）ｓｈ対照（ｓｈＣＡ及びＢ）又はｓｈＨＳＤ２をトランスフェクトした細胞（ｓｈＨＳＤ２  Ａ及びＢ）によって生産されたコルチゾン（Ｂ）又はＯＣＤＯ（Ｃ）の定量化を図４に記載したように測定した。（Ｄ、Ｅ）ｓｈ−Ｃ又はｓｈＨＳＤ２の増殖を、図２Ａに記載したようにＤＮＡのＢｒＤＵ取り込みの定量化（Ｄ）を使用して又は細胞計数（Ｅ）によって測定した。（Ｆ）ｓｈ−Ｃ又はｓｈＨＳＤ２ＭＣＦ７細胞によるコロニーの形成を、細胞固定及びクリスタルバイオレット染色後に定量化した。結果は、３〜５つの実験の平均（±s.e.m）である、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１（スチューデントのｔ−検定）。
【図６Ｆ】１１βＨＳＤ２のノックダウンは、ＭＣＦ７細胞におけるＯＣＤＯ産生、細胞増殖、浸潤及び生存を減少させる。ＭＣＦ７細胞（５×１０６個の細胞）に、１１βＨＳＤ２に対するショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）又は対照ｓｈＲＮＡを発現するプラスミドをエレクトロポレーションによってトランスフェクトし、２つのクローン（Ａ及びＢ）を選択し、そして、以下のように分析した：（Ａ）ＭＣＦ７における１１βＨＳＤ２発現のノックダウンを、図４に記載したようにイムノブロッティングによって又はｑＰＣＲによって確認した；（Ｂ、Ｃ）ｓｈ対照（ｓｈＣＡ及びＢ）又はｓｈＨＳＤ２をトランスフェクトした細胞（ｓｈＨＳＤ２  Ａ及びＢ）によって生産されたコルチゾン（Ｂ）又はＯＣＤＯ（Ｃ）の定量化を図４に記載したように測定した。（Ｄ、Ｅ）ｓｈ−Ｃ又はｓｈＨＳＤ２の増殖を、図２Ａに記載したようにＤＮＡのＢｒＤＵ取り込みの定量化（Ｄ）を使用して又は細胞計数（Ｅ）によって測定した。（Ｆ）ｓｈ−Ｃ又はｓｈＨＳＤ２ＭＣＦ７細胞によるコロニーの形成を、細胞固定及びクリスタルバイオレット染色後に定量化した。結果は、３〜５つの実験の平均（±s.e.m）である、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１（スチューデントのｔ−検定）。
【図７Ａ】１１βＨＳＤ２のノックダウンは、ＭＣＦ７細胞における細胞増殖、浸潤及び生存並びに腫瘍成長を減少させ、そして、ＯＣＤＯはこれらの効果を反転させる。ｓｈＣ又はｓｈＨＳＤ２ＭＣＦ７細胞を以下のように分析した：（Ａ）５μM ＯＣＤＯで２４時間処理した又は処理していないｓｈ−Ｃ又はｓｈＨＳＤ２細胞の増殖を、図２Ａに記載したようにＤＮＡのＢｒＤＵ取り込みの定量化を使用して測定した。（Ｂ）漸増濃度のコルチゾンで２４時間処理した又は処理していないｓｈ−Ｃ又はｓｈＨＳＤ２細胞の増殖を（Ａ）と同様に測定した。（Ｃ）５μM ＯＣＤＯで７２時間処理した又は処理していないｓｈ−Ｃ又はｓｈＨＳＤ２細胞の浸潤度を、マトリゲルコートフィルターを使用してアッセイした。（Ｄ）１μM ＯＣＤＯで処理した又は処理していないｓｈ−Ｃ又はｓｈＨＳＤ２細胞によるコロニーの形成を、図６Ｆに記載したように定量化した。（Ｅ）マウスにｓｈＣ又はｓｈＨＳＤ２ＭＣＦ７細胞（５×１０６個の細胞）を皮下（s.c.）移植し、そして、動物（１群当たり８匹）を、溶媒ビヒクル又はＯＣＤＯ（１６μg/kg）のいずれかで、移植当日から始めて毎日皮下（s.c.）処理した。腫瘍の成長について動物を週２回モニタリングした。データは、３つの独立した実験の代表である。平均腫瘍体積±s.e.mを示す、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（分散分析（ＡＮＯＶＡ）、ダネットの事後検定）。（Ｆ）（Ｅ）からのｓｈＣ又はｓｈＨＳＤ２ＭＣＦ７腫瘍切片のＩＨＣ染色から決定されたＫｉ６７陽性細胞数の平均（±s.e.m）、ｎ＝８、＊Ｐ＜０．０５（スチューデントのｔ−検定）  HistoQuant, Pannoramic Viewer（3DHistech）を使用。
【図７Ｂ】１１βＨＳＤ２のノックダウンは、ＭＣＦ７細胞における細胞増殖、浸潤及び生存並びに腫瘍成長を減少させ、そして、ＯＣＤＯはこれらの効果を反転させる。ｓｈＣ又はｓｈＨＳＤ２ＭＣＦ７細胞を以下のように分析した：（Ａ）５μM ＯＣＤＯで２４時間処理した又は処理していないｓｈ−Ｃ又はｓｈＨＳＤ２細胞の増殖を、図２Ａに記載したようにＤＮＡのＢｒＤＵ取り込みの定量化を使用して測定した。（Ｂ）漸増濃度のコルチゾンで２４時間処理した又は処理していないｓｈ−Ｃ又はｓｈＨＳＤ２細胞の増殖を（Ａ）と同様に測定した。（Ｃ）５μM ＯＣＤＯで７２時間処理した又は処理していないｓｈ−Ｃ又はｓｈＨＳＤ２細胞の浸潤度を、マトリゲルコートフィルターを使用してアッセイした。（Ｄ）１μM ＯＣＤＯで処理した又は処理していないｓｈ−Ｃ又はｓｈＨＳＤ２細胞によるコロニーの形成を、図６Ｆに記載したように定量化した。（Ｅ）マウスにｓｈＣ又はｓｈＨＳＤ２ＭＣＦ７細胞（５×１０６個の細胞）を皮下（s.c.）移植し、そして、動物（１群当たり８匹）を、溶媒ビヒクル又はＯＣＤＯ（１６μg/kg）のいずれかで、移植当日から始めて毎日皮下（s.c.）処理した。腫瘍の成長について動物を週２回モニタリングした。データは、３つの独立した実験の代表である。平均腫瘍体積±s.e.mを示す、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（分散分析（ＡＮＯＶＡ）、ダネットの事後検定）。（Ｆ）（Ｅ）からのｓｈＣ又はｓｈＨＳＤ２ＭＣＦ７腫瘍切片のＩＨＣ染色から決定されたＫｉ６７陽性細胞数の平均（±s.e.m）、ｎ＝８、＊Ｐ＜０．０５（スチューデントのｔ−検定）  HistoQuant, Pannoramic Viewer（3DHistech）を使用。
【図７Ｃ】１１βＨＳＤ２のノックダウンは、ＭＣＦ７細胞における細胞増殖、浸潤及び生存並びに腫瘍成長を減少させ、そして、ＯＣＤＯはこれらの効果を反転させる。ｓｈＣ又はｓｈＨＳＤ２ＭＣＦ７細胞を以下のように分析した：（Ａ）５μM ＯＣＤＯで２４時間処理した又は処理していないｓｈ−Ｃ又はｓｈＨＳＤ２細胞の増殖を、図２Ａに記載したようにＤＮＡのＢｒＤＵ取り込みの定量化を使用して測定した。（Ｂ）漸増濃度のコルチゾンで２４時間処理した又は処理していないｓｈ−Ｃ又はｓｈＨＳＤ２細胞の増殖を（Ａ）と同様に測定した。（Ｃ）５μM ＯＣＤＯで７２時間処理した又は処理していないｓｈ−Ｃ又はｓｈＨＳＤ２細胞の浸潤度を、マトリゲルコートフィルターを使用してアッセイした。（Ｄ）１μM ＯＣＤＯで処理した又は処理していないｓｈ−Ｃ又はｓｈＨＳＤ２細胞によるコロニーの形成を、図６Ｆに記載したように定量化した。（Ｅ）マウスにｓｈＣ又はｓｈＨＳＤ２ＭＣＦ７細胞（５×１０６個の細胞）を皮下（s.c.）移植し、そして、動物（１群当たり８匹）を、溶媒ビヒクル又はＯＣＤＯ（１６μg/kg）のいずれかで、移植当日から始めて毎日皮下（s.c.）処理した。腫瘍の成長について動物を週２回モニタリングした。データは、３つの独立した実験の代表である。平均腫瘍体積±s.e.mを示す、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（分散分析（ＡＮＯＶＡ）、ダネットの事後検定）。（Ｆ）（Ｅ）からのｓｈＣ又はｓｈＨＳＤ２ＭＣＦ７腫瘍切片のＩＨＣ染色から決定されたＫｉ６７陽性細胞数の平均（±s.e.m）、ｎ＝８、＊Ｐ＜０．０５（スチューデントのｔ−検定）  HistoQuant, Pannoramic Viewer（3DHistech）を使用。
【図７Ｄ】１１βＨＳＤ２のノックダウンは、ＭＣＦ７細胞における細胞増殖、浸潤及び生存並びに腫瘍成長を減少させ、そして、ＯＣＤＯはこれらの効果を反転させる。ｓｈＣ又はｓｈＨＳＤ２ＭＣＦ７細胞を以下のように分析した：（Ａ）５μM ＯＣＤＯで２４時間処理した又は処理していないｓｈ−Ｃ又はｓｈＨＳＤ２細胞の増殖を、図２Ａに記載したようにＤＮＡのＢｒＤＵ取り込みの定量化を使用して測定した。（Ｂ）漸増濃度のコルチゾンで２４時間処理した又は処理していないｓｈ−Ｃ又はｓｈＨＳＤ２細胞の増殖を（Ａ）と同様に測定した。（Ｃ）５μM ＯＣＤＯで７２時間処理した又は処理していないｓｈ−Ｃ又はｓｈＨＳＤ２細胞の浸潤度を、マトリゲルコートフィルターを使用してアッセイした。（Ｄ）１μM ＯＣＤＯで処理した又は処理していないｓｈ−Ｃ又はｓｈＨＳＤ２細胞によるコロニーの形成を、図６Ｆに記載したように定量化した。（Ｅ）マウスにｓｈＣ又はｓｈＨＳＤ２ＭＣＦ７細胞（５×１０６個の細胞）を皮下（s.c.）移植し、そして、動物（１群当たり８匹）を、溶媒ビヒクル又はＯＣＤＯ（１６μg/kg）のいずれかで、移植当日から始めて毎日皮下（s.c.）処理した。腫瘍の成長について動物を週２回モニタリングした。データは、３つの独立した実験の代表である。平均腫瘍体積±s.e.mを示す、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（分散分析（ＡＮＯＶＡ）、ダネットの事後検定）。（Ｆ）（Ｅ）からのｓｈＣ又はｓｈＨＳＤ２ＭＣＦ７腫瘍切片のＩＨＣ染色から決定されたＫｉ６７陽性細胞数の平均（±s.e.m）、ｎ＝８、＊Ｐ＜０．０５（スチューデントのｔ−検定）  HistoQuant, Pannoramic Viewer（3DHistech）を使用。
【図７Ｅ】１１βＨＳＤ２のノックダウンは、ＭＣＦ７細胞における細胞増殖、浸潤及び生存並びに腫瘍成長を減少させ、そして、ＯＣＤＯはこれらの効果を反転させる。ｓｈＣ又はｓｈＨＳＤ２ＭＣＦ７細胞を以下のように分析した：（Ａ）５μM ＯＣＤＯで２４時間処理した又は処理していないｓｈ−Ｃ又はｓｈＨＳＤ２細胞の増殖を、図２Ａに記載したようにＤＮＡのＢｒＤＵ取り込みの定量化を使用して測定した。（Ｂ）漸増濃度のコルチゾンで２４時間処理した又は処理していないｓｈ−Ｃ又はｓｈＨＳＤ２細胞の増殖を（Ａ）と同様に測定した。（Ｃ）５μM ＯＣＤＯで７２時間処理した又は処理していないｓｈ−Ｃ又はｓｈＨＳＤ２細胞の浸潤度を、マトリゲルコートフィルターを使用してアッセイした。（Ｄ）１μM ＯＣＤＯで処理した又は処理していないｓｈ−Ｃ又はｓｈＨＳＤ２細胞によるコロニーの形成を、図６Ｆに記載したように定量化した。（Ｅ）マウスにｓｈＣ又はｓｈＨＳＤ２ＭＣＦ７細胞（５×１０６個の細胞）を皮下（s.c.）移植し、そして、動物（１群当たり８匹）を、溶媒ビヒクル又はＯＣＤＯ（１６μg/kg）のいずれかで、移植当日から始めて毎日皮下（s.c.）処理した。腫瘍の成長について動物を週２回モニタリングした。データは、３つの独立した実験の代表である。平均腫瘍体積±s.e.mを示す、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（分散分析（ＡＮＯＶＡ）、ダネットの事後検定）。（Ｆ）（Ｅ）からのｓｈＣ又はｓｈＨＳＤ２ＭＣＦ７腫瘍切片のＩＨＣ染色から決定されたＫｉ６７陽性細胞数の平均（±s.e.m）、ｎ＝８、＊Ｐ＜０．０５（スチューデントのｔ−検定）  HistoQuant, Pannoramic Viewer（3DHistech）を使用。
【図７Ｆ】１１βＨＳＤ２のノックダウンは、ＭＣＦ７細胞における細胞増殖、浸潤及び生存並びに腫瘍成長を減少させ、そして、ＯＣＤＯはこれらの効果を反転させる。ｓｈＣ又はｓｈＨＳＤ２ＭＣＦ７細胞を以下のように分析した：（Ａ）５μM ＯＣＤＯで２４時間処理した又は処理していないｓｈ−Ｃ又はｓｈＨＳＤ２細胞の増殖を、図２Ａに記載したようにＤＮＡのＢｒＤＵ取り込みの定量化を使用して測定した。（Ｂ）漸増濃度のコルチゾンで２４時間処理した又は処理していないｓｈ−Ｃ又はｓｈＨＳＤ２細胞の増殖を（Ａ）と同様に測定した。（Ｃ）５μM ＯＣＤＯで７２時間処理した又は処理していないｓｈ−Ｃ又はｓｈＨＳＤ２細胞の浸潤度を、マトリゲルコートフィルターを使用してアッセイした。（Ｄ）１μM ＯＣＤＯで処理した又は処理していないｓｈ−Ｃ又はｓｈＨＳＤ２細胞によるコロニーの形成を、図６Ｆに記載したように定量化した。（Ｅ）マウスにｓｈＣ又はｓｈＨＳＤ２ＭＣＦ７細胞（５×１０６個の細胞）を皮下（s.c.）移植し、そして、動物（１群当たり８匹）を、溶媒ビヒクル又はＯＣＤＯ（１６μg/kg）のいずれかで、移植当日から始めて毎日皮下（s.c.）処理した。腫瘍の成長について動物を週２回モニタリングした。データは、３つの独立した実験の代表である。平均腫瘍体積±s.e.mを示す、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（分散分析（ＡＮＯＶＡ）、ダネットの事後検定）。（Ｆ）（Ｅ）からのｓｈＣ又はｓｈＨＳＤ２ＭＣＦ７腫瘍切片のＩＨＣ染色から決定されたＫｉ６７陽性細胞数の平均（±s.e.m）、ｎ＝８、＊Ｐ＜０．０５（スチューデントのｔ−検定）  HistoQuant, Pannoramic Viewer（3DHistech）を使用。
【実施例】
【００９０】
材料＆方法
材料
化学物質［３Ｈ］コルチゾール、［３Ｈ］コルチゾン及び［１４Ｃ］コレステロールをPerkin Elmerから購入した。当該化合物の放射化学的純度を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって検証し、９８％超であった。GE Healthcare又はKodakの蛍光スクリーンを用いてオートラジオグラフィー実験を行った。インビボで使用したフルベストラント（ICI 182780）は、Institute Claudius Regaud（France）からの寛大な贈り物であった。NEON TransfectionシステムはInvitrogenからであり、ＢｒｄＵ細胞増殖エライザ（elisa）はRoche Diagnosicからであり、全てのプラスミドはOrigene（HSD1 sc109325、HSD2 sc122552、H6PDH sc117481、DHCR7 sc110871、EBP又はD8D7I sc116006）からであった。他の化合物及び化学物質は、Sigma-Aldrich（St. Louis, MO）からであり、溶媒はＶＷからであった。抗体は、以下の会社からであった：１１βＨＳＤ２（Santa cruz, H-145）、１１βＨＳＤ１（Abcam, EPR9407(2)）、Ｈ６ＰＤＨ（Santa Cruz, C-10）、ＥＢＰ（Abgent, RB23728）及びＤＨＣＲ７（Abcam, ab170388）。
【００９１】
動物
雌のＣ５７ＢＬ／６ Charles River Laboratories（France），Ｂａｌｂ／ｃ及びＮＭＲＩヌードマウス（６週齢）Janvier（France）を特定病原体フリー条件で維持し、２週間隔離した後に初めてプロトコールに含めた。実験動物の管理及び使用のための動物手順の全ては、当機関の倫理指針に従って実施し、動物実験を管理する一般規則に従った。
【００９２】
細胞培養
ＭＣＦ−７、ＳＫＢＲ３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＨＥＫ２９３Ｔ及びＥ０７７１細胞は、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）からであり、これを３０継代まで培養した。ＴＳ／Ａ細胞は、Dr P.L. Lollini（Bologna, Italy）によって提供され、ＭＥＬＮ細胞は、Dr. G. Freiss（Montpellier, France）の寛大な贈り物であった。ＭＣＦ−７細胞を５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Dutcher）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Lonza）中で、ＳＫＢＲ３細胞をマッコイ（Mc Coy’s）培地（Invitrogen）１０％ＳＶＦ中で、ＴＳＡ及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞をＲＰＭＩ１０％中で、Ｅ０７７１をＲＰＭＩ １０％ＳＶＦ １０mM ＨＥＰＥＳ中で、そして、ＨＥＫ２９３Ｔ及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１をＤＭＥＭ（Lonza）１０％ＳＶＦ中で成長させた。細胞株の全てを、３７℃、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中、１％ペニシリン及びストレプトマイシン（５０U/ml）（Invitrogen）中で培養した。
【００９３】
細胞のトランスフェクション
ＭＣＦ７又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞（５×１０６個の細胞）に、NEON Transfection Systemを使用しかつ製造業者の助言に従って、表示のプラスミド５μgをトランスフェクトした。ＭＣＦ７細胞に１１βＨＳＤ２をターゲットとする４つの異なるｓｈＲＮＡプラスミド（１１βＨＳＤ２  ｓｈＲＮＡ）又は対照ｓｈＲＮＡ（１１βＨＳＤ２  ＳｕｒｅＳｉｌｅｎｃｉｎｇ  ＳｈＲＮＡプラスミド、Qiagen）を別々にトランスフェクトした後に、安定なクローンを確立した。次に、細胞を、０．５mg/ml ピューロマイシン（Life Technologies）の存在下で３週間培養した。いくつかのクローンを、イムノブロット分析及びリアルタイムＲＴ−ｑＰＣＲによって、関心対象のタンパク質の発現のノックダウンについて分析した。
【００９４】
腫瘍の分析
指数関数的に成長しているＭＣＦ７、ＳｈＭＣＦ７、Ｅ０７７１、ＭＤＡ−ＭＢ２３１、ＭＤＡ−ＭＢ４６８及びＴＳ／Ａ細胞を収集し、ＰＢＳ中で２回洗浄して、そして、ＰＢＳ中に再懸濁した。それぞれＰＢＳ１００μl中の３５×１０３個の細胞又は３×１０５個の細胞をＢＡＬＢ／ｃ又はＣ５７Ｂｌ６マウスの脇腹へ皮下移植することによって、ＴＳ／Ａ及びＥ９７７１腫瘍を作製した。他の腫瘍については、ＰＢＳ／マトリゲル（１／１）２００μL中の５〜１０×１０６個の細胞を、ＮＭＲＩヌードマウスの脇腹へ注射した。動物を、凡例に示したように処理した。動物を毎日調べ、体重を週２回測定した。全ての実験で、キャリパーを用いた直接測定によって腫瘍体積を決定し、式（幅２×長さ）／２を使用して計算した。腫瘍を、液体窒素中で凍結するか又は１０％中性緩衝化ホルマリン中で固定し、免疫組織化学分析用にパラフィン中に包埋した。パラフィン切片を組織形態学分析用にヘマトキシリン及びエオシンで染色した。免疫組織化学染色を、特異的Ｋｉ６７抗体（Dako）を使用してパラフィン包埋組織切片で行った。
【００９５】
化学合成
５，６α−ＥＣ、５，６β−ＥＣを報告のとおり合成した１０，２０。ＣＴ及びＯＣＤＯを報告のとおり合成した２１。
【００９６】
無傷細胞での代謝活性アッセイ
細胞を、６ウェルプレート上にて、適切な完全培地中にプレーティングした（１×１０５個の細胞／ウェル）。播種の翌日、細胞を、１４Ｃ−ＣＴ（１μM、１０μCi/μmol−１μl／ディッシュ）又は１４Ｃ−ＯＣＤＯ（１μM、１０μCi/μmol−１μL／ディッシュ）又は３Ｈ−コルチゾール（２００nM、８９Ci/mmol−１μL／ディッシュ）又は３Ｈ−コルチゾン（２００nM、８９Ci/mmol−１μL／ディッシュ）又は１４Ｃ−αＥＣ又は１４Ｃ−bＥＣ（６００nM、２０μCi/μmol−１μl／ディッシュ）のいずれかで表示の時間処理した。インキュベーション後、細胞を洗浄し、破砕し、そして、１１に記載のとおりに中性脂質をクロロホルム−メタノールで抽出し、次に、１４Ｃ−ＣＴ及び１４Ｃ−ＯＣＤＯについては酢酸エチルを又は３Ｈ−コルチゾール若しくは３Ｈ−コルチゾンについてはクロロホルム−メタノール（８７：１３、v/v）を溶離液として使用したＴＬＣによって分離した２２。放射性脂質をオートラジオグラフィー（KODAK, BioMax MS Film）によって検出した。精製１４Ｃ又は３Ｈ標準を使用して関心対象の代謝産物の位置を決定し、そして、ＣＴ、ＯＣＤＯ、コルチゾール又はコルチゾンの対応する領域を破砕し、ベータカウンターを使用して定量化した。
【００９７】
細胞増殖アッセイ
ＭＣＦ７（４×１０３）、ＭＣＦ７−ｓｈ１１ｂＨＳＤ２（４×１０３）、ＳＫＢＲ３（２．５×１０３）、ＴＳＡ（２．５×１０３）、ＭＤＡ−ＭＢ２３１（５×１０３）及びＭＤＡ−ＭＢ４６８（５×１０３）細胞を９６ウェルプレート中に播種し、完全培地中で２４時間培養した。次に、細胞を、表示の濃度のＯＣＤＯ、コルチゾール若しくはコルチゾン又は１μM ＲＵ４８６若しくはＩＣＩ１８２７８０（他の処理の３０分前に添加）のいずれかで２４時間処理した。この時間の最後に、細胞をＢｒＤＵとさらに８時間インキュベートし、次に、ＥＬＩＳＡキット（Roche Diagnostic）を使用し製造業者の指示のとおりにして増殖について評価した。
【００９８】
細胞浸潤アッセイ
浸潤アッセイを、マトリゲルが予めコートされた８μmフィルターを備えたBio-Coat遊走チャンバー（BD Falcon）を使用して行った。ＭＣＦ７−ｓｈ１１βＨＳＤ２又はＭＣＦ７−ｓｈＣ細胞（１×１０３）を、上部チャンバー中、ＳＶＦフリー培地にプレーティングし、そして、化学誘引物質（１０％ＦＢＳ）を下部チャンバー中に加えた。細胞を、ＯＣＤＯ（５μM）の非存在下又は存在下で、５％ＣＯ２インキュベーター内３７℃で７２時間インキュベートした後、フィルターを通って遊走した細胞を固定し（３．７％ＰＦＡ）、染色した（０．０５％水性クリスタルバイオレット）。膜全体をスライドガラス上にマウントし、顕微鏡下で計数した。全ての実験を二連で実施した。
【００９９】
クローン形成アッセイ
ＭＣＦ７−ｓｈ１１ｂＨＳＤ２（５×１０３）、ＭＣＦ７−ｓｈＣ（５×１０３）又はＴＳＡ（３×１０３）細胞を３５cm2径のディッシュ中に二連で播種した。２４時間後、細胞を１μM ＯＣＤＯ又は溶媒ビヒクルのいずれかで処理し、そして、この処理を３日毎に繰り返した。１０日目に、クローンを３．７％ＰＦＡで固定し、クリスタルバイオレット水溶液（０．０５％）で染色し、そしてクローンの数を計数した。
【０１００】
ルシフェラーゼアッセイ
エストロゲン依存的にルシフェラーゼを発現するＭＥＬＮ細胞２３又はヒトグルココルチコイド受容体ｈＧＲをコードするプラスミド及びプラスミドＧＲＥｌｕｃを上述したように同時トランスフェクトしたＭＣＦ７を、それぞれ５％ＦＢＳ（Dutcher）を補充したＤＭＥＭ又はＲＰＭＩ１６４０中でルーチンに成長させた。実験を先に記載したように行った２３。簡潔に述べると、１ウェル当たり５０×１０３個の細胞を１２ウェルプレート中に播種し、５％のデキストランコート木炭処理済みＦＣＳを含有するフェノールレッドフリー培地中で４日間成長させた。次に、細胞を表示の化合物で１６時間処理した。処理の最後に、細胞をＰＢＳで洗浄し、溶解緩衝液（Promega）２５０μL中に溶解した。ルシフェラーゼ活性を、ルシフェラーゼアッセイ試薬（Promega）を使用し製造業者の説明書に従って測定した。Bradford技術を使用してタンパク質濃度を測定し、ルシフェラーゼ活性データを正規化した。各条件について、３つの独立したウェルのデータから平均ルシフェラーゼ活性を算出した。
【０１０１】
イムノブロッティング
示したとおり処理した又は処理していない細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄し、粉砕し、そして、４℃にて１２００rpmで５分間遠心分離した。ペレットを、１％プロテアーゼ阻害剤カクテル（Sigma Aldrich）を含有する抽出緩衝液（５０mM Tris pH７．４；５mM ＮａＣｌ；１％トリトンＸ１００；１０％グリセロール）１００μL中に再懸濁し、ボルテックスし、そして、４℃にて１０，０００×ｇで１０分間遠心分離した。全細胞抽出物をＳＤＳ  ＰＡＧＥによって分画し、転写装置を使用し製造業者（Life Technologies）のプロトコールに従って二フッ化ポリビニリデン膜に転写した。ＴＢＳＴ（１０mM Tris、pH８．０、１５０mM ＮａＣｌ、１％Tween 20）中で５％脱脂乳と６０分間インキュベーションした後、膜を１１βＨＳＤ２（１：１０００）、１１βＨＳＤ１（１：５００）、Ｈ６ＰＤＨ（１：５００）、ＥＢＰ（１：５００）及びＤＨＣＲ７（１：２００）又はアクチン（１：１００００、Merck Millipore, C4）に対する抗体と４℃で一晩インキュベートした。膜を１０分間かけて３回洗浄し、セイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗マウス又は抗ウサギ抗体の１：１００００希釈物と１時間インキュベートした。ブロットをＴＢＳＴで３回洗浄し、製造業者のプロトコールに従ってＥＣＬシステム（Amersham Biosciences）で展開した。
【０１０２】
ＲＮＡ単離及びｑＰＣＲ分析
培養細胞からのトータルＲＮＡを、TRIzol Reagent（登録商標）（Invitrogen）を使用して単離した。ＲＮＡを、ナノドロップ（thermofisher）を使用して定量化した。トータルＲＮＡ（１μg）を、iScript ｃＤＮＡ合成キット（Bio-Rad）を使用し製造業者の説明書に従って逆転写した。ｑＲＴ−ＰＣＲを、iCycler iQreal-time PCR 検出システム（Bio-Rad）を用いて、iQ SYBR Green Supermix（Bio-Rad）及び表示のプライマーを使用して実施した。関心対象の遺伝子の闘値サイクル（Ｃｔ）値を、シクロフィリンＡ１のＣｔ値で正規化した。
【０１０３】
【表１】
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【０１０４】
免疫組織化学。全ての試料を、Claudius Regaud Institute の治験審査委員会（Institutional Review Board）の承認を得て収集した。この研究への受け入れの前に書面によるインフォームドコンセントを得た。患者の臨床的特徴及び腫瘍の病理学的特徴を診査報告書から得て、当施設内の標準的な手順に従った。免疫組織化学を、以下の抗体を用いて、初期腫瘍生検のホルマリン固定したパラフィン包埋切片で実施した：ＤＨＣＲ７  １：５０、Ｈ６ＰＤＨ  １：１００、ＥＢＰ  １：５００、１１β−ＨＳＤ１  １：５０及び１１β−ＨＳＤ２  １：５０。免疫染色を病理学者（ＭＬＴ）によって盲検的に分析した。
【０１０５】
統計分析。ダネットの多重比較検定を用いた分散分析によって、動物の腫瘍成長曲線を有意性について分析した。他の実験では、対照群と処理群の間の定量データ中の有意差を、対応のない変数についてスチューデントのｔ−検定を使用して分析した。図面において、＊、＊＊及び＊＊＊は、他に特に規定のない限り、それぞれ対照（ビヒクル）と比較したＰ＜０．０５、Ｐ＜０．０１及びＰ＜０．００１を指す。全ての分析についてPrismソフトウェアを使用した。
【０１０６】
結果
ＯＣＤＯは、ＣＴの代謝産物である。
本発明者等は、ＭＣＦ７腫瘍細胞を［１４Ｃ］α−ＥＣ、［１４Ｃ］β−ＥＣ又は［１４Ｃ］−ＣＴのいずれかと漸増時間の間インキュベートすることによって、乳房腫瘍におけるＯＣＤＯの産生を研究した。表示の時間で、細胞及び培地を収集し、別々に分析した。図１ａ及び１ｃのＴＬＣオートラジオグラフィーに示すように、α−ＥＣ及びβ−ＥＣはＣｈＥＨ活性の結果としてＣＴに変換されたが、インキュベーション時間の延長と共に、ＯＣＤＯ産生が観察された。α−ＥＣ又はβ−ＥＣが７２時間でＣＴに完全に代謝された場合にＯＣＤＯの形成が持続し（図１ａ及び１ｃ）、このことは、ＯＣＤＯがＣＴから形成されることを示している。［１４Ｃ］−ＣＴを用いて実施された類似の実験は、ＯＣＤＯがＣＴの代謝産物であることを確認した（図１ｅ）。
【０１０７】
ＯＣＤＯは、腫瘍細胞の増殖及び浸潤を刺激する。
本発明者等は、乳房腫瘍細胞の増殖及び浸潤に及ぼすＯＣＤＯの効果を研究した。図２Ａ及び２Ｂに示すように、ＯＣＤＯで２４時間処理したヒトＭＣＦ７及びマウスＴＳ／Ａ細胞の成長速度は濃度依存的に増加し、それぞれ対照の１．３倍及び１．７倍に達した。この増殖の増加は、１nM エストラジオール（Ｅ２）の場合と同じ範囲内にあった。ＯＣＤＯで処理したＭＣＦ７及びＴＳ／Ａ細胞の浸潤度もまた、濃度依存的に増加し、それぞれ対照と比較して、それぞれ６倍及び２．３倍に達した（図２Ｃ及び２Ｄ）。
【０１０８】
ＯＣＤＯは、マウスに移植した乳房腫瘍の増殖を刺激する。次に、本発明者等は、ＯＣＤＯがマウスに移植した乳房腫瘍の成長を刺激するか否かをアッセイした。ＯＣＤＯ処理は、対照群と比較して、それぞれ免疫不全又は免疫応答性マウスに移植されたヒトＭＣＦ７（図２Ｅ）及びマウスＴＳ／Ａ腫瘍の成長を有意に増加させた（図２Ｅ及び２Ｆ）。ＭＣＦ７又はＴＳ／Ａ腫瘍の組織学的分析は、増殖マーカーＫｉ６７が、両腫瘍モデルにおいて、対照で処理した腫瘍と比較してＯＣＤＯで処理した腫瘍で増加したことを示した（図２Ｇ及び２Ｈ）。加えて、ＯＣＤＯは、マウスＥ０７７１及びヒトＭＤＡ−ＭＢ２３１及びＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞（それぞれ図２Ｉ、２Ｊ及び２Ｋ）などのエストロゲン受容体を発現する又は発現しない他の腫瘍モデルの成長を刺激する。
【０１０９】
ＯＣＤＯは、マウスにおけるＣｈＥＨ阻害剤の腫瘍成長阻害効果を反転させる。次に、本発明者等は、ＯＣＤＯの非存在下又は存在下におけるＴＳ／Ａ腫瘍に対するＴａｍ又はＤＤＡの抗成長効果をアッセイした。上記のように、免疫応答性マウスに移植したＴＳ／Ａ腫瘍を、溶媒ビヒクル（対照）、ＯＣＤＯ（５０μg/kg）、Ｔａｍ（５６mg/kg）、ＤＤＡ（２０mg/kg）、又はＴａｍ（５６mg/kg）＋ＯＣＤＯ（５０μg/kg）の組み合わせ、又はＤＤＡ（２０mg/kg）＋ＯＣＤＯ（５０μg/kg）の組み合わせのいずれかで毎日皮下（s.c.）処理した。図２Ｌに示すように、処理の１３日後、ＯＣＤＯは、対照群の場合と比較してＴＳ／Ａ腫瘍成長を１４０％増強させた（ｐ＜０．０１）。Ｔａｍ又はＤＤＡ単独での処理は、腫瘍の成長を対照群と比較してそれぞれ３１％（ｐ＜０．０５）及び３３％（ｐ＜０．０１）有意に阻害した。動物を、ＯＣＤＯ及びＴａｍで、又はＤＤＡと共にＯＣＤＯで処理した場合、腫瘍の成長は対照群の場合と統計的に異なることはなく、このことは、Ｔａｍ又はＤＤＡの成長阻害作用がＯＣＤＯによって反転されたことを示している。これらのデータは、ＯＣＤＯ産生の阻害が、Ｔａｍ及びＤＤＡの両方の抗腫瘍効果に寄与することを示す。
【０１１０】
ＣＴからのＯＣＤＯの産生を調節する酵素の同定。
本発明者等が得たデータは、ＣＴをＯＣＤＯへ代謝するＣｈＥＨとは異なる酵素の存在について根拠を示したので、本発明者等は、ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（ＨＳＤ）がＣＴの６位のアルコール官能基からＯＣＤＯのケトンへの脱水素化（又は酸化）を触媒するだろうと仮説を立てた。ＨＳＤの３つの主なクラスが記載されている（３β−、１７β−及び１１β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ）。ステロイド骨格上の対称軸は、１１β位と７α位を等価にしており１５、このことは、本発明者等に１１βＨＳＤがこの反応の良好な候補となり得ることを示唆している。１１β−ＨＳＤは、２つの酵素、すなわちコルチゾールからコルチゾンへの脱水素化を触媒する１１β−ＨＳＤ２型（１１ＨＳＤ２）及び逆反応を実現しかつコルチゾンからコルチゾールへの水素化を触媒する１１β−ＨＳＤ１型（１１ＨＳＤ１）として存在する１３，１４，１６（図３Ａ）。興味深いことに、１１βＨＳＤ１はまた、７−ヒドロキシコレステロールへと転換される７−ケトコレステロールも基質として受け入れられている１６。重要なことに、１１βＨＳＤ２は、ＭＣＦ７において発現されるが、１１βＨＳＤ１は検出されず１７、このことは、腫瘍細胞における１１βＨＳＤ１と１１βＨＳＤ２の発現間の平衡の潜在的なデレギュレーションを示唆しており、これはＯＣＤＯ産生を優先するだろう。この仮説によれば、本発明者等は、異なるＢＣサブタイプを反映する種々のヒトＢＣ細胞株においてｍＲＮＡ及びタンパク質レベルで１１βＨＳＤ２の顕著なレベルを特徴付けたが、一方で、１１βＨＳＤ１発現は、ｍＲＮＡ又はタンパク質レベルのいずれにおいても検出されず、そして、試験した全ての細胞株はＯＣＤＯを産生した（表１）。
【０１１１】
ＣＴからのＯＣＤＯの産生における１１βＨＳＤ２の関わりを確認するために、本発明者等は、ＨＥＫ−２７３細胞（コルチゾール／コルチゾン代謝を研究するために過去に使用された細胞モデルである１８）に、１１βＨＳＤ２（ＨＳＤ２）又は空のベクター（偽）のいずれかをコードするプラスミドをトランスフェクトした。偽をトランスフェクトしたＨＥＫ−２７３細胞のイムノブロット分析は、内因性１１βＨＳＤ２を検出しなかった（図４Ａ）。対照的に、１１βＨＳＤ２をトランスフェクトしたＨＥＫ−２７３細胞では、遊走した１１βＨＳＤ２が十分に検出された（図４Ａ）。本発明者等は、最初に、３Ｈ−コルチゾールと８時間インキュベートした場合の、１１βＨＳＤ２をトランスフェクトしたＨＥＫ−２７３細胞のコルチゾン産生能を測定した。図４Ｂに観察されるように、１１βＨＳＤ２をトランスフェクトしたＨＥＫ−２７３細胞は、偽をトランスフェクトした細胞（１．１pmol／１０６個の細胞／時間）よりも３倍高いコルチゾンを産生し（３．３pmol／１０６個の細胞／時間）、このことは、コードされた酵素が機能的であったことを示している。次に、本発明者等は、トランスフェクトしたＨＥＫ−２７３細胞を［１４Ｃ］α−ＣＴと８時間インキュベートした後のＯＣＤＯの産生を測定した。図４Ｃに示すように、１１βＨＳＤ２をトランスフェクトしたＨＥＫ−２７３細胞は、偽をトランスフェクトしたＨＥＫ−２７３細胞（２９pmol／１０６個の細胞／時間）と比較して７倍増加したＯＣＤＯ産生を誘導した（１９５pmol／１０６個の細胞／時間）。同時に、これらのデータは、１１βＨＳＤ２がコルチゾンに加えて顕著なレベルのＯＣＤＯを産生することができることを示す。
【０１１２】
ＯＣＤＯからＣＴへの転換における１１βＨＳＤ１の関わりを研究するために、ＨＥＫ２９３細胞に、１１βＨＳＤ１（ＨＳＤ１）又は空のベクター（偽）をコードするプラスミドを、Ｈ６ＰＤＨ（１８に報告されるような１１βＨＳＤ１レダクターゼ活性に必要な補因子ＮＡＤＰＨを産生する酵素）をコードするプラスミドと共に又はこれなしでトランスフェクトした（図３Ａ）。空のベクター（偽）をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞では、ウェスタンブロット分析によって、１１βＨＳＤ１又はＨ６ＰＤＨの内因性発現は検出されなかった（図４Ｄ）。対照的に、１１βＨＳＤ１及びＨ６ＰＤＨをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞では、タンパク質が十分に検出された（図４Ｄ）。次に、本発明者等は、３Ｈ−コルチゾンとインキュベートした後のＨＥＫ２９３トランスフェクト細胞のコルチゾール産生能を測定した。図４Ｅに示すように、偽をトランスフェクトした細胞又はＨ６ＰＤＨをトランスフェクトした細胞において低いコルチゾール産生が測定された（約０．２０pmol／１０６個の細胞／時間）。対照的に、１１βＨＳＤ１をトランスフェクトした細胞は、偽をトランスフェクトした細胞よりも５倍高いコルチゾールを産生し（１．１pmol／１０６個の細胞／時間）、そして、この産生は、１１ＨβＳＤ１及びＨ６ＰＤＨを同時トランスフェクトすることによって２倍に増加した（２pmol／１０６個の細胞／時間）。同時に、このデータは、トランスフェクトした１１βＨＳＤ１及びＨ６ＰＤＨ酵素が機能的であることを示した。次に、本発明者等は、トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を［１４Ｃ］−ＯＣＤＯと２４時間インキュベートした後のＣＴの産生を測定した。図４Ｆに示すように、ＣＴの産生は、空のプラスミド又はＨ６ＰＤＨをトランスフェクトした細胞では約１pmol／１０６個の細胞／時間であったが、一方で、１１βＨＳＤ１をコードするプラスミドのトランスフェクションは、３倍増加したＣＴ産生を誘導し、そして、Ｈ６ＰＤＨ及び１１βＨＳＤ１の同時トランスフェクションは、ＣＴ産生をさらに増加させ、偽をトランスフェクトした細胞のレベルの８倍に達した（８．５pmol／１０６個の細胞／時間）。これらのデータは、１１βＨＳＤ１がコルチゾールに加えて顕著なレベルのＣＴを産生することができることを示す。
【０１１３】
ＭＣＦ−７細胞における１１βＨＳＤ１の異所性発現は、ＣＴ産生を誘導しかつ細胞増殖を減少させ、そして、ＯＣＤＯ処理はこの効果を反転させる。
ＭＣＦ７細胞は１１βＨＳＤ１を発現しないので、本発明者等は、これらの細胞にこの酵素を発現するプラスミドをトランスフェクションし（図５Ａ）、ＣＴ産生及び細胞増殖に及ぼすその発現の影響を評価した。図５Ｂに示すように、ＭＣＦ７細胞における１１βＨＳＤ１の発現は、対照と比較してＯＣＤＯからＣＴへの変換を有意に刺激した（８．５±２．５pmol／１０６個の細胞／時間に対して７３±１２pmol／１０６個の細胞／時間）。加えて、ＭＣＦ７細胞における１１βＨＳＤ１の発現は、細胞増殖を４５％有意に減少させ、そして、ＯＣＤＯ処理はこの効果を反転させ（図５Ｃ）、このことは、１１βＨＳＤ１が、ＯＣＤＯからＣＴへの転換を通じて、細胞増殖を阻害することを示している。
【０１１４】
１１βＨＳＤ２のノックダウンは、ＭＣＦ７細胞における細胞増殖、浸潤及び生存並びに腫瘍成長を減少させ、そして、ＯＣＤＯはこれらの効果を反転させる。
細胞増殖及び生存における１１βＨＳＤ２の関わりを研究するために、本発明者等は、この酵素に対するｓｈＲＮＡ又は対照ｓｈＲＮＡを使用することによってＭＣＦ７細胞における１１βＨＳＤ２の発現をノックダウンした。１１βＨＳＤ２の発現がタンパク質及びｍＲＮＡレベルの両方で有意に減少した２つの安定なクローン（ｓｈ１１ＨＳＤ２Ａ及びｓｈ１１ＨＳＤ２Ｂ）を選択し、ｓｈＲＮＡ対照クローン（ｓｈＣＡ及びｓｈＣＢ）と比較した（図６Ａ）。コルチゾン及びＯＣＤＯ産生の有意な減少を、ｓｈＣＡ及びＢ対照クローンと比較してｓｈ１１ＨＳＤ２Ａ及びＢクローンにおいて測定した（それぞれ図６Ｂ及び６Ｃ）。２つのｓｈ１１ＨＳＤ２クローンの基底細胞増殖は有意に減少し（図６Ｄ）、そして、それらの倍加時間は対照クローンと比較して１４２％及び１５０％増加した（図６Ｅ）。さらに、１１βＨＳＤ２発現のノックダウンはまた、クローン形成アッセイにおいて細胞生存を有意に減少させた（図６Ｆ）。重要なことに、本発明者等は、ｓｈ１１ＨＳＤ２における１１βＨＳＤ２の発現を減少させることによって誘導された細胞増殖の阻害を、ＯＣＤＯは反転させることができたが（図７Ａ）、一方で、コルチゾンは高濃度であってもそのようにできなかったことを決定した（図７Ｂ）。同様に、ＯＣＤＯは、１１βＨＳＤ２のノックダウンによって媒介された細胞浸潤（図７Ｃ）及び細胞生存（図７Ｄ）の阻害を反転させた。同時に、これらの結果は、１１βＨＳＤ２がＯＣＤＯ産生を通じて細胞増殖、生存及び細胞浸潤を制御することを示す。次に、本発明者等は、免疫不全マウスに異種移植されたＳｈＣ又はｓｈ１１ＨＳＤ２細胞に及ぼすインビボの１１βＨＳＤ２ノックダウンの影響を試験した。図７Ｅに示すように、ｓｈ１１ＨＳＤ２腫瘍の基底成長は、ｓｈＣ腫瘍の場合と比較して有意に減少した（２９％）。重要なことに、ＯＣＤＯ（１５μg/kg、５日／週）での皮下処理は、ｓｈ１１ＨＳＤ２腫瘍の成長阻害をｓｈＣ腫瘍の成長と同様のレベルまで反転させた。腫瘍のＫＩ６７染色は、細胞増殖がＳｈＣ腫瘍ではＯＣＤＯ処理を通じて増加し、ｓｈ１１ＨＳＤ２腫瘍では減少したこと、そして、ＯＣＤＯがｓｈ１１ＨＳＤ２腫瘍の成長阻害を反転させたことを示した。同時に、これらのデータは、１１βＨＳＤ２がＯＣＤＯ産生を通じて腫瘍成長を制御することを示す。
【０１１５】
乳癌試料及び一致した正常組織におけるＯＣＤＯ産生を調節する酵素の発現。
次に、本発明者等は、乳房患者試料及び正常な隣接組織におけるＯＣＤＯを調節する酵素の発現を調査した。表２に示すように、免疫組織学的分析は、１１βＨＳＤ２が主に乳房腫瘍において発現しており（４９の試料の９３％）、正常な隣接組織においては弱く発現したか又は全く発現しなかった（４６の試料の８％）ことを示した。１１βＨＳＤ２はまた、乳房腫瘍試料の４３％において血管中に観察された。１１βＨＳＤ１は、腫瘍試料（４８の試料の２５％）及び正常組織（４２の試料の３８％）のいずれにおいてもほとんど存在せず、Ｈ６ＰＤＨは同じ傾向を示したが（３２の腫瘍試料の３４％及び４２の正常試料の５７％）、両方の酵素の発現は正常組織に比べて腫瘍において低下した。ＤＨＣＲ７及びＤ８Ｄ７Ｉは、腫瘍組織及び正常組織に両方で発現していることが見いだされた。しかしながら、ＤＨＣＲ７については、正常組織と比較して４９の腫瘍試料の５４％において強い発現が観察され、興味深いことに、この酵素の発現は、離れた脂肪細胞と比較して腫瘍周囲の脂肪細胞において増加した（試料の７８％）。Ｄ８Ｄ７Ｉについて、強い染色がまた、正常組織と比較して５０の腫瘍試料の６３％において観察された。同時に、これらの結果は、ＯＣＤＯを産生する酵素の発現が正常組織と比較して腫瘍において増加するか又は高いことを示す。
【０１１６】
考察
本研究は、ＯＣＤＯとＣＴの相互変換に関与する酵素としての１１−βＨＳＤ２及び１１−βＨＳＤ１の新規機能を同定する。上に述べたように、いくつかの酵素がＯＣＤの産生及びその調節に関わっている。以前に、本発明者等は、Ｄ８Ｄ７Ｉ及びＤＨＣＲ７によって行われるＣｈＥＨが、腫瘍においてＯＣＤＯの産生を導く５，６−ＥＣからＣＴへの転換を媒介することを示した８，１０。Ｔａｍ又はＤＤＡなどの分子によるＣｈＥＨの阻害は、癌細胞及び腫瘍においてＯＣＤＯの産生及びその増殖効果を遮断するが、一方で、ＯＣＤＯの添加はこれらの効果８，１０及び本研究を反転させる。ここで、本発明者等は、ヒトにおいてグルココルチコイド、コルチゾール及びコルチゾンの代謝を調節することが知られている１１−βＨＳＤ２及び１１−βＨＳＤ１が、それぞれＣＴからＯＣＤＯを産生する又はＯＣＤＯからＣＴを産生する次の工程に関与することを示す。重要なことに、１１−βＨＳＤ２は、１１−βＨＳＤ２発現が弱化されている加減実験において、ＯＣＤＯ産生を通じてインビトロ及びインビボの両方で腫瘍細胞増殖を制御する。反対に、この酵素を欠く腫瘍細胞における１１−βＨＳＤ１の再発現は、ＯＣＤＯからＣＴへの転換を通じて細胞増殖を制御し、そして、ＯＣＤＯ添加はこの効果を反転させる。したがって、１１−βＨＳＤ２の活性化は、炎症を促進しかつコルチゾールからコルチゾンへの不活性化によって誘導される細胞増殖の阻害を減少させるだけでなく、癌増殖及び浸潤に積極的に関与する癌代謝産物ＯＣＤＯも産生する。重要なことに、ＯＣＤＯは、エストロゲン陽性又はエストロゲン陰性乳房腫瘍の増殖を高め、このことは、エストロゲンの非存在下であってもＯＣＤＯが腫瘍進行を刺激することに寄与し得ることを示している。１１−βＨＳＤ２酵素は、排他的に酸化的であり、活性コルチゾールを不活性コルチゾンへ変換し、かつ補因子としてＮＡＤを必要とする。１１−βＨＳＤ１は、補因子ＮＡＤＰを産生するＨ６ＰＤＨの存在のデスヒドロゲナーゼ（deshydrogenase）活性に依存して、二重のレダクターゼ及びデヒドロゲナーゼ活性を示す１８。Ｈ６ＰＤＨ発現の非存在下で、１１−βＨＳＤ１は、ヒト大網脂肪前駆細胞において報告されているようにデヒドロゲナーゼとして働くだろう１９。本発明者等の結果によれば、１１−βＨＳＤ２を発現する組織における１１−βＨＳＤ１のレベルの非存在又は減少は、コルチゾールからコルチゾンへの変換に加えてＯＣＤＯの産生を優先するだろう。同様に、Ｈ６ＰＤＨの減少又は非存在は、１１−βＨＳＤ１のデヒドロゲナーゼ活性を、ひいてはＯＣＤＯの産生及びコルチゾンを優先し得る。本研究では、免疫組織学的分析は、ＯＣＤＯ、１１βＨＳＤ２、Ｄ８Ｄ７Ｉ及びＤＨＣＲ７を産生する酵素の発現が正常組織と比較して腫瘍において増加するか又は高いこと、並びに、１１βＨＳＤ２と１１βＨＳＤ１／Ｈ６ＰＤＨとの間の酵素の平衡が腫瘍においてＯＣＤＯの産生へシフトすることを示す。これらの結果は、本発明者等が本研究において報告するＯＣＤＯの腫瘍促進及び浸潤促進活性と一致し、そして、腫瘍細胞によるその分泌が腫瘍の増殖及び悪性度に寄与するはずである。１１βＨＳＤ２はまた、腫瘍試料の４３％において血管���の細胞に存在し、このことは、ＯＣＤＯが、血液流体中に分泌されて自己分泌作用に加えて腫瘍から離れて作用し得ること、並びに、腫瘍浸潤に積極的に関与し得ることを示している。血管の増殖に及ぼすＯＣＤＯの効果もまた考慮され得る。
【０１１７】
したがって、ＯＣＤＯ及びその腫瘍促進効果の発見並びにその産生を調節する酵素の発見は、腫瘍生物学及び治療において主要な意義を有するはずである重要な知見である。それゆえ、ＯＣＤＯ産生の活性化並びにＯＣＤＯを産生又は調節する酵素の発現は、癌のマーカー並びにＴａｍ又はＤＤＡなどの抗癌化合物の有効性のマーカーとなり得る。
【０１１８】
【表２】
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【０１１９】
表１．ＢＣ腫瘍細胞における１１βＨＳＤ１及び１１βＨＳＤ２の発現及び活性。乳癌細胞の異なるサブタイプを、ｑＰＣＲ又はイムノブロティングのいずれかによって１１βＨＳＤ１及び１１βＨＳＤ２の発現について、そして、図１に記載したように腫瘍細胞を１４Ｃ−αＥＣと２４時間インキュベートすることによってＯＣＤＯ産生について分析した。１時間当たりに形成されたＯＣＤＯの量を細胞数に正規化した。結果は、２〜３の実験の平均（±s.e.m）である。
【０１２０】
【表３】
2017527290.tif 000028
【０１２１】
表２．乳房腫瘍患者試料及び一致した正常組織におけるＯＣＤＯ産生を調節する酵素の発現。ＯＣＤＯ産生を調節する酵素に対する特異的抗体を使用した免疫組織学的分析は、「材料及び方法」の項に記載のとおりに採点した。
【０１２２】
参考文献
本出願を通して、種々の参考文献が、本発明が属する分野の最先端技術を記載している。これらの参考文献の開示は、参照によって本開示に組み入れられる。
【表４】
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2017527290.tif 000030
【図１Ａ】
2017527290.tif 000031
【図１Ｂ】
2017527290.tif 000032
【図１Ｃ】
2017527290.tif 000033
【図１Ｄ】
2017527290.tif 000034
【図１Ｅ】
2017527290.tif 000035
【図１Ｆ】
2017527290.tif 000036
【図２Ａ】
2017527290.tif 000037
【図２Ｂ】
2017527290.tif 000038
【図２Ｃ】
2017527290.tif 000039
【図２Ｄ】
2017527290.tif 000040
【図２Ｅ】
2017527290.tif 000041
【図２Ｆ】
2017527290.tif 000042
【図２Ｇ】
2017527290.tif 000043
【図２Ｈ】
2017527290.tif 000044
【図２Ｉ】
2017527290.tif 000045
【図２Ｊ】
2017527290.tif 000046
【図２Ｋ】
2017527290.tif 000047
【図２Ｌ】
2017527290.tif 000048
【図３】
2017527290.tif 000049
【図４Ａ】
2017527290.tif 000050
【図４Ｂ】
2017527290.tif 000051
【図４Ｃ】
2017527290.tif 000052
【図４Ｄ】
2017527290.tif 000053
【図４Ｅ】
2017527290.tif 000054
【図４Ｆ】
2017527290.tif 000055
【図５Ａ】
2017527290.tif 000056
【図５Ｂ】
2017527290.tif 000057
【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７Ａ】
2017527290.tif 000065
【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【配列表】
2017527290000001.app
【国際調査報告】
2017527290.tif 000071
2017527290.tif 000072
2017527290.tif 000073
2017527290.tif 000074