(57)【要約】  本発明は抗Ｄ因子抗体変異体、それらの変異体の作製、及び過剰補体活性化または無制御補体活性化に関連する疾患及び障害の治療用の組成物及び医薬の調製におけるそれらの変異体の使用に関する。【選択図】図１Ｂ
2017515811.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基準抗Ｄ因子抗体の超可変領域（ＨＶＲ）内に少なくとも１個の標的アスパラギン酸（ＤまたはＡｓｐ）残基の置換を含む安定性改善型抗Ｄ因子抗体変異体であって、該標的Ａｓｐ残基が異性化しやすいものと特定されており、且つ、該置換がＡｓｐからグルタミン酸（ＥまたはＧｌｕ）への置換であり、該基準抗Ｄ因子抗体と比較するとＤ因子結合親和性をあまり失わずに改善された安定性を示す、抗Ｄ因子抗体変異体。
【請求項２】
ＸａａがＡｓｐ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、ＳｅｒまたはＴｈｒであるＡｓｐ−Ｘａａモチーフ内にＡｓｐ残基が存在する、請求項１に記載の抗体変異体。
【請求項３】
標的Ａｓｐ残基がＡｓｐ−Ａｓｐモチーフの１番目のＡｓｐである、請求項２に記載の抗体変異体。
【請求項４】
変異体が基準抗Ｄ因子抗体のＨＶＲ内にさらに少なくとも１個のＡｓｐ残基のセリン（ＳまたはＳｅｒ）による置換をさらに含み、その結果生じる変異体が該基準抗Ｄ因子抗体と比較するとより少ない負電荷を有し、且つ、改善された溶解性を示す、請求項１に記載の抗体変異体。
【請求項５】
変異体が基準抗Ｄ因子抗体のＨＶＲ内に脱アミド化易発性アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）残基の１か所以上のＳｅｒ置換をさらに含む、請求項１に記載の抗体変異体。
【請求項６】
基準抗Ｄ因子抗体が配列番号３の軽鎖可変ドメイン配列を含む、請求項１に記載の抗体変異体。
【請求項７】
配列番号４の重鎖可変ドメイン配列をさらに含む、請求項６に記載の抗体変異体。
【請求項８】
基準抗Ｄ因子抗体が配列番号１の軽鎖配列と配列番号２の重鎖配列を含む、請求項７に記載の抗体変異体。
【請求項９】
変異体が配列番号１１の軽鎖ＨＶＲ１（ＨＶＲ−Ｌ１）配列と配列番号１２の重鎖ＨＶＲ２（ＨＶＲ−Ｈ２）配列を含む、請求項８に記載の抗体変異体。
【請求項１０】
配列番号１３の軽鎖ＨＶＲ３（ＨＶＲ−Ｌ３）配列をさらに含む、請求項９に記載の抗体変異体。
【請求項１１】
変異体が配列番号１４の軽鎖ＨＶＲ１（ＨＶＲ−Ｌ１）配列と配列番号１２の重鎖ＨＶＲ２（ＨＶＲ−Ｈ２）配列を含む、請求項８に記載の抗体変異体。
【請求項１２】
配列番号１５の重鎖ＨＶＲ３（ＨＶＲ−Ｈ３）配列をさらに含む、請求項１１に記載の抗体変異体。
【請求項１３】
基準抗Ｄ因子抗体のＨＶＲ内に１か所以上の位置に置換を含む抗Ｄ因子抗体変異体であって、前記基準抗Ｄ因子抗体が配列ＩＴＳＴＤＩＤＤＤＭＮ（配列番号５）を含む軽鎖ＨＶＲ−１、配列ＧＧＮＴＬＲＰ（配列番号６）を含む軽鎖ＨＶＲ−２、配列ＬＱＳＤＳＬＰＹＴ（配列番号７）を含む軽鎖ＨＶＲ−３、配列ＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮ（配列番号８）を含む重鎖ＨＶＲ−１、配列ＷＩＮＴＹＴＧＥＴＴＹＡＤＤＦＫＧ（配列番号９）を含む重鎖ＨＶＲ−２、及び配列ＥＧＧＶＮＮ（配列番号１０）を含む重鎖ＨＶＲ−３を含み、且つ、前記置換が次のもの、すなわち、（ａ）配列番号５の位置５のアミノ酸がＳ（配列番号２２において開示されるａ、ｂ、及びｃ）、（ｂ）配列番号５の位置７のアミノ酸がＥ、（ｃ）配列番号５の位置８のアミノ酸がＳ、（ｄ）配列番号９の位置１３のアミノ酸がＥ（配列番号２３）、（ｅ）配列番号７の位置４のアミノ酸がＥ（配列番号２４）、または（ｆ）配列番号１０の位置５のアミノ酸がＳ（配列番号２５）のうちの１つ以上である、抗Ｄ因子抗体変異体。
【請求項１４】
抗体変異体がその中に前記置換（ｂ）〜（ｄ）を含む、請求項１３に記載の抗体変異体。
【請求項１５】
抗体変異体がその中に前記置換（ｂ）〜（ｅ）を含む、請求項１３に記載の抗体変異体。
【請求項１６】
抗体変異体がその中に前記置換（ａ）〜（ｄ）を含む、請求項１３に記載の抗体変異体。
【請求項１７】
抗体変異体がその中に前記置換（ａ）〜（ｄ）及び（ｆ）を含む、請求項１３に記載の抗体変異体。
【請求項１８】
配列番号１６、１８または１９の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む、抗Ｄ因子抗体。
【請求項１９】
配列番号１７または２０の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む、抗Ｄ因子抗体。
【請求項２０】
配列番号１７または２０の重鎖可変ドメインアミノ酸配列をさらに含む、請求項１８に記載の抗Ｄ因子抗体。
【請求項２１】
軽鎖可変ドメインアミノ酸配列が配列番号１９に記載のものであり、且つ、重鎖可変ドメインアミノ酸配列が配列番号１７に記載のものである、請求項２０に記載の抗Ｄ因子抗体。
【請求項２２】
軽鎖可変ドメインアミノ酸配列が配列番号１９に記載のものであり、且つ、重鎖可変ドメインアミノ酸配列が配列番号２０に記載のものである、請求項２０に記載の抗Ｄ因子抗体。
【請求項２３】
配列番号１１または１４の配列を有するＨＶＲ−Ｌ１、配列番号６の配列を有するＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号７または１３の配列を有するＨＶＲ−Ｌ３を含む可変軽鎖、及び配列番号８の配列を有するＨＶＲ−Ｈ１、配列番号９または１２の配列を有するＨＶＲ−Ｈ２、及び配列番号１０または１５の配列を有するＨＶＲ−Ｈ３を含む可変重鎖を有する、抗Ｄ因子抗体。
【請求項２４】
配列番号１４の配列を有するＨＶＲ−Ｌ１、配列番号６の配列を有するＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号７の配列を有するＨＶＲ−Ｌ３を含む可変軽鎖、及び配列番号８の配列を有するＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１２の配列を有するＨＶＲ−Ｈ２、及び配列番号１０の配列を有するＨＶＲ−Ｈ３を含む可変重鎖を有する、請求項２３に記載の抗Ｄ因子抗体。
【請求項２５】
配列番号１４の配列を有する配列番号ＨＶＲ−Ｌ１のＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号６の配列を有するＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号７の配列を有するＨＶＲ−Ｌ３を含む可変軽鎖、及び配列番号８の配列を有するＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１２の配列を有するＨＶＲ−Ｈ２、及び配列番号１５の配列を有するＨＶＲ−Ｈ３を含む可変重鎖を有する、請求項２３に記載の抗Ｄ因子抗体。
【請求項２６】
配列番号２６のアミノ酸配列を有する軽鎖と配列番号２７のアミノ酸配列を有する重鎖を有する、抗Ｄ因子抗体。
【請求項２７】
配列番号２８のアミノ酸配列を有する軽鎖と配列番号２９のアミノ酸配列を有する重鎖を有する、抗Ｄ因子抗体。
【請求項２８】
配列番号２６のアミノ酸配列を有する軽鎖と配列番号３０のアミノ酸配列を有する重鎖を有する、抗Ｄ因子抗体。
【請求項２９】
配列番号２６のアミノ酸配列を有する軽鎖と配列番号３１のアミノ酸配列を有する重鎖を有する、抗Ｄ因子抗体。
【請求項３０】
配列番号２８のアミノ酸配列を有する軽鎖と配列番号３２のアミノ酸配列を有する重鎖を有する、抗Ｄ因子抗体。
【請求項３１】
配列番号２８のアミノ酸配列を有する軽鎖と配列番号３３のアミノ酸配列を有する重鎖を有する、抗Ｄ因子抗体。
【請求項３２】
（ａ）基準抗Ｄ因子抗体のＨＶＲ内にあるＡｓｐ異性化しやすい１個以上のＡｓｐ残基の特定、（ｂ）ステップ（ａ）で特定された該Ａｓｐ残基のＧｌｕによる置換、（ｃ）その結果生じた候補変異体のＡｓｐ異性化についてのスクリーニング、及び（ｄ）検出可能なＡｓｐ異性化を有しない変異体の選択、を含む方法によって作製される、検出可能なＡｓｐ異性化を有しない抗Ｄ因子抗体変異体。
【請求項３３】
方法が、（ｅ）基準抗Ｄ因子抗体のＨＶＲ内における脱アミド化しやすい１個以上のＡｓｎ残基の特定、（ｆ）ステップ（ｅ）で特定されたＡｓｎ残基のＳｅｒによる置換、（ｇ）その結果生じた候補変異体の脱アミド化についてのスクリーニング、及び（ｈ）脱アミド化が減少した、または無くなった変異体の選択をさらに含む、請求項３２に記載の抗体変異体。
【請求項３４】
方法が、（ｅ）基準抗Ｄ因子抗体のＨＶＲ内にある１個以上の負に帯電したアミノ酸残基ＤまたはＥの選択、（ｆ）ステップ（ｅ）で選択された残基のＳｅｒによる置換、（ｇ）その結果生じた候補変異体の溶解性についてのスクリーニング、及び（ｈ）該基準抗Ｄ因子抗体と比較すると改善された溶解性を有する変異体の選択をさらに含む、請求項３２に記載の抗体変異体。
【請求項３５】
方法が、結合親和性を維持しつつ改善された安定性を有する変異体を生じさせる、基準抗体のＨＶＲ内での追加置換をさらに含む、請求項３２に記載の抗体変異体。
【請求項３６】
請求項１〜３５のいずれか１項に記載の抗体または抗体変異体を含む、医薬製剤。
【請求項３７】
抗体変異体が少なくとも１００ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項３６に記載の医薬製剤。
【請求項３８】
抗体変異体が少なくとも２００ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項３６に記載の医薬製剤。
【請求項３９】
抗体変異体が少なくとも３００ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項３６に記載の医薬製剤。
【請求項４０】
抗体変異体が少なくとも５００ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項３６に記載の医薬製剤。
【請求項４１】
請求項３６に記載の医薬製剤及び該製剤を患者に硝子体内送達するための手段を含み、それにより該製剤が長期間にわたってその場で有効であり続ける、眼球送達用の長期作用性送達装置。
【請求項４２】
補体関連疾患の治療用医薬の製造における請求項３６に記載の製剤または請求項４１に記載の装置の使用。
【請求項４３】
前記補体関連疾患が眼疾患である、請求項４２に記載の使用。
【請求項４４】
眼疾患が加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、ぶどう膜炎、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼ヒストプラズマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生、及び網膜血管新生からなる群より選択される、請求項４３に記載の使用。
【請求項４５】
眼疾患が中期乾燥型ＡＭＤまたは地図状萎縮（ＧＡ）である、請求項４４に記載の使用。
【請求項４６】
Ｄ因子アンタゴニストとＨＴＲＡ１アンタゴニストを含む、組成物。
【請求項４７】
Ｄ因子アンタゴニストが抗Ｄ因子抗体である、請求項４６に記載の組成物。
【請求項４８】
ＨＴＲＡ１アンタゴニストが抗ＨＴＲＡ１抗体である、請求項４６または４７に記載の組成物。
【請求項４９】
抗Ｄ因子抗体が請求項１〜３１のいずれか１項に記載の抗Ｄ因子抗体である、請求項４６〜４８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５０】
補体関連疾患の治療用のＤ因子アンタゴニストとＨＴＲＡ１アンタゴニストとを含む組成物の使用。
【請求項５１】
補体関連疾患が眼疾患である、請求項４４に記載の使用。
【請求項５２】
ヒト対象における補体関連疾患の治療方法であって、該対象に第１治療化合物の有効量と第２治療化合物の有効量を投与することを含む、方法。
【請求項５３】
第１及び第２治療化合物が同時に投与される、請求項４６に記載の方法。
【請求項５４】
第１及び第２治療化合物が単一の組成物として投与される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
第１及び第２治療化合物が別個の組成物として投与される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
第１及び第２治療化合物が順次投与される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５７】
第１治療化合物がＤ因子アンタゴニストである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５８】
第２治療化合物がＨＴＲＡ１アンタゴニストである、請求項５２または５７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願はそれぞれ全体の参照により援用される２０１４年５月１日に出願された米国仮特許出願番号第６１／９８７２９８号及び２０１４年１１月６日に出願された米国仮特許出願番号第６２／０７６３７２号の利益を主張する。
【０００２】
配列表
本願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されており、且つ、ここにその全体の参照により援用される配列表を含有する。２０１５年４月２７日に作製された当該ＡＳＣＩＩコピーはＰ０５８２６−ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、３１，８２５バイトのサイズである。
【背景技術】
【０００３】
治療抗体の開発はヒト医療の長い歴史の中の革命的な時代を表す。３０種類を超える抗体がヒト治療用に認可されており、癌、自己免疫、炎症、心血管疾患、感染症、及び眼疾患をはじめとする広範囲の主要な疾患に対して２５０種類を超える抗体が世界中で臨床開発中である。モノクローナル抗体製品市場は過去十年にわたってトラスツズマブ、ベバシズマブ、リツキシマブ、インフリキシマブ及びアダリムマブのようなブロックバスター薬の成功によって押し上げられて指数関数的に成長している。これらの第１世代抗体治療薬は多数の患者の役に立ってきたが、抗体技術の進歩と作用機序の理解の深化によってさらに効力が高く、且つ、副作用がより少ない改良型の抗体への道筋がつけられている。
【０００４】
抗体治療薬の開発成功と実行可能な使用により、小有機分子及び無機分子である伝統的な医薬と比較して多数のユニークな課題が突きつけられている。全てのタンパク質のように抗体の物理的特性はそれらの挙動の重要な決定因子であり、発現、精製、製剤、貯蔵、送達、薬物動態学、免疫原性及び投与計画に関して治療薬の開発に重大な影響を有する。それら多数の特性のうち、タンパク質安定性が候補抗体の特質と有望な治療薬としてのその好ましさを規定する主要な特性である。
【０００５】
タンパク質療法は所望の効力を達成するために高用量のそのタンパク質を患者に送達することを多くの場合に必要とする。一方である特定の投与経路は送達時間、体積、及び物理的な力などの前記高用量のタンパク質が高濃度製剤（例えば、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ）の状態であることを必要とする制約と関連している。しかしながら、高濃縮タンパク質製剤は安定性、溶解性、粘性及び他のタンパク質特性に関する特定の課題を突きつける。
【０００６】
タンパク質は不安定であり得、複数の物理的及び化学的分解経路を介して分解し得る。物理的不安定性は主に２つの経路、すなわち、変性と凝集を介して生じ、一方で化学的不安定性は脱アミド化、異性化、架橋、酸化、及び断片化などの多数の経路を介して生じ得る。抗体不安定性は活性型薬品量の減少とインビボ効力の低下、治療薬のバッチ間の変動性の上昇、及びおそらくは最も重要なことに患者における凝集物と分解物に対する免疫原性につながり得るので抗体不安定性は薬品開発にとって望ましくない。Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ  （２００７）  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．  ９６：１−２６、Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ  （１９８０）  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ＆  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ５１：  ６９１−６９７、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ  （２００６）  ＡＡＰＳＪ  ８：Ｅ５０１−７、Ｊｏｕｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ  （２０１１）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８６：  ２５１１８−２５１３３、Ｊｏｕｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ  （２０１２）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（２０１２）  ２８６：２５２６６−７９）。
【０００７】
抗体は大きなマルチドメインタンパク質であり、抗体の安定性及び凝集性向に寄与する因子は複合的であり、温度、ｐＨ、濃度、イオン強度及び物理的ストレスなどの多数の外因性条件を含む。そのタンパク質自体の一次配列が同様に重要である。本来Ｆｃ領域は特定のアイソタイプの抗体の間では大部分で同一であるが、Ｆａｂ領域は非常に異なる。したがって、大部分はＦａｂ配列の差異と抗体の特定の抗原特異性に起因して抗体間で安定性と凝集性向に重大な違いがある。Ｌｏｗｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ａｄｖ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ．  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ．  ８４：４１−６１。
【０００８】
補体系は免疫複合体除去ならびに感染性因子、外来性抗原、ウイルス感染細胞、及び腫瘍細胞に対する免疫応答において中心的な役割を果たす。しかしながら、補体は病的炎症及び自己免疫疾患にも関係する。したがって、補体カスケードの過剰活性化または無制御活性化の抑制によってそのような疾患及び症状を有する患者に臨床的利益を与える可能性がある。
【０００９】
補体系は古典的経路と副経路と呼ばれる２つの別個の活性化経路を包含する（Ｖ．Ｍ．  Ｈｏｌｅｒｓ、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ内、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｒ．Ｒ．  Ｒｉｃｈ編、Ｍｏｓｂｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９６、３６３−３９１）。古典的経路は通常は抗原抗体複合体の形成によって活性化されるカルシウム／マグネシウム依存的カスケードである。副経路はある特定の感受性表面上（例えば酵母及び細菌の細胞壁多糖類、及びある特定の生体高分子物質）でのＣ３の沈着と活性化によって活性化されるマグネシウム依存的カスケードである。補体経路の活性化によって補体タンパク質の生物活性断片、例えばＣ３ａ、Ｃ４ａ及びＣ５ａアナフィラトキシン及びＣ５ｂ−９膜侵襲複合体（ＭＡＣ）が作製され、それらは白血球走化性、マクロファージ、好中球、血小板、肥満細胞及び内皮細胞の活性化、血管透過性、細胞溶解、ならびに組織傷害を含む炎症活性を媒介する。
【００１０】
Ｄ因子は副補体経路の活性化に必須である非常に特異的なセリンプロテアーゼである。それはＣ３ｂに結合したＢ因子を切断し、副経路Ｃ３／Ｃ５コンバターゼの活性要素であるＣ３ｂ／Ｂｂ酵素を作製する。Ｄ因子は、ヒトにおけるその血漿濃度は非常に低い（１．８μｇ／ｍｌ）ので、適切な阻害標的であり得、それは副補体経路の活性化の限定化酵素であることが示されている（Ｐ．Ｈ．  Ｌｅｓａｖｒｅ  ａｎｄ  Ｈ．Ｊ．  Ｍuｌｌｅｒ−Ｅｂｅｒｈａｒｄ．  （１９７８）  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １４８：  １４９８−１５１０、Ｊ．Ｅ．  Ｖｏｌａｎａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３１２：  ３９５−４０１）。
【００１１】
補体活性化の下方制御が動物モデル及び生体外試験で幾つかの疾患適応症、例えば全身性エリテマトーデスと糸球体腎炎、リウマチ性関節炎、心肺バイパスと血液透析、臓器移植の超急性拒絶反応、心筋梗塞、再灌流損傷、及び成人呼吸促迫症候群の治療に有効であることが示されている。加えて、熱傷、重症喘息、アナフィラキシーショック、腸炎、じん麻疹、血管浮腫、脈管炎、多発性硬化症、重症筋無力症、膜性増殖性糸球体腎炎、及びシェーグレン症候群をはじめとする他の炎症性症状及び自己免疫／免疫複合体疾患も補体活性化と密接に関連する。
【００１２】
加齢黄斑変性（ＡＭＤ）は視力に対する重大な結果を有する中心網膜の進行性慢性疾患である。Ｌｉｍ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｌａｎｃｅｔ  ３７９：１７２８。後期型のその疾患は工業化諸国における視力喪失の主因である。４０歳以上の白人集団について、初期ＡＭＤの有病率は６．８％と推計され、進行期ＡＭＤは１．５％と推計される。ｄｅ  Ｊｏｎｇ  （２００６）  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３５５：  １４７４。後期ＡＭＤの有病率は８０歳以降では加齢と共に１１．８％まで劇的に上昇する。非滲出（乾燥）型ＡＭＤと滲出（湿潤）型ＡＭＤの２種類のＡＭＤが存在する。より一般的な乾燥型ＡＭＤは中心網膜の下にある網膜色素上皮（ＲＰＥ）における萎縮性及び肥大性の変化（黄斑）ならびにＲＰＥ上の沈着（ドルーゼン）を伴う。進行期乾燥型ＡＭＤは地図状萎縮（ＧＡ）をはじめとする重大な網膜損傷を引き起こすことがあり得、不可逆的な視力喪失を伴う。また、乾燥型ＡＭＤの患者は湿潤型に進行することがあり得、湿潤型では脈絡膜新生血管膜（ＣＮＶＭ）と呼ばれる異常血管が網膜の下に発生し、体液と血液を漏出し、且つ、究極的には失明を引き起こす円板上瘢痕組織を網膜の中及び下に生じさせる。
【００１３】
新血管形成（血管新生）を標的とする薬品が湿潤型ＡＭＤ治療の中核となっている。ラニビズマブは抗ＶＥＧＦＡ抗体断片であり、湿潤型ＡＭＤに悩む患者の視力改善に非常に有効であることが示されている。最近の研究によってＡＭＤと補体カスケードにおける重要なタンパク質との間に関係があるとされており、乾燥型ＡＭＤを治療するために特定の補体要素を標的とする多数の治療法が開発されているところである。Ｄ因子上の非活性部位への結合を介してＤ因子と副補体経路を強力に阻害するヒト化抗Ｄ因子Ｆａｂ断片（ａＦＤ、ランパリズマブ、ＦＣＦＤ４５１４Ｓ）が乾燥型ＡＭＤ関連性ＧＡの治療のために現在臨床開発されている。Ｋａｔｓｃｈｋｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８７：１２８８６。ランパリズマブの毎月の硝子体内注射が進行期乾燥型ＡＭＤの患者におけるＧＡ病変の進行を効果的に遅らせたことが最近の第ＩＩ相治験によって示されている。
【００１４】
眼は眼球薬品送達をより困難だがやりがいのあるものにする多数のユニークな生物物理的特徴及び解剖的特徴を有する。例えば、血液眼球関門は眼を感染から守るための防御機構であるが、それは同時に薬品が、特に後眼部の疾患向けの薬品が透過することを困難にする。その結果、効力を改善するために薬品のその場での生物学的利用能（例えば、眼球滞留時間）を達成及び維持する高用量投与が望ましいことが多い。一方、眼球後部の空間が限られていることが送達される薬品の体積を抑制し、そのことが今度は薬品が高濃度製剤で送達されることを要求する。
【００１５】
眼疾患を有する患者は治療薬の長期作用性／徐放性送達から利益を得ることもあり得る。低い投与頻度は改善された利便性を患者にもたらし、感染率の低下と臨床効力の増加という潜在的な利益を有することになる。高用量薬品の制御放出は薬品の副作用を最小限にする可能性もある。長期作用性送達向けの２つの有望な系はＰＬＧＡ系固体移植物と移植可能ポート送達系（ＰＤＳ）である。両方の系が長期間にわたってほぼゼロ次放出カイネティクスを提供する潜在力を有する。ＰＬＧＡ移植物について、タンパク質薬品が疎水性高分子マトリックスにカプセル化され、その高分子のゆっくりとした加水分解を介して薬品放出が達成される。その放出速度は薬品負荷量、高分子疎水性、または高分子分子量を変えることで制御され得る。ＰＤＳは硝子体への放出がチタンフリットを含む多孔性金属膜によって制御される再充填可能器具である。その貯蔵器は低容量であるので高タンパク質濃度がそのＰＤＳを用いる効果的な送達に必要である。
【００１６】
高濃度及び長期作用性送達に加えて、またはそれらの代わりに薬品の生物学的利用能（例えば、眼球滞留時間）の上昇が、そのタンパク質薬品が天然または合成高分子と共有結合で複合体化されるポリシアル酸化、ＨＥＳ化（ヒドロキシエチルデンプンとの複合体化）及びＰＥＧ化などの翻訳後修飾によって達成または促進され得る。Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ  （２０１１）  Ｅｘｐｅｒｔ．  Ｏｐｉｎ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  ８：１２２１−３６、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  （２００９）  ＢｉｏＤｒｕｇｓ  ２３：９３−１０９。ＰＥＧ化は高分子ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のタンパク質への共有結合であり、抗体断片治療薬の半減期の延長に特に有用な充分に確立された技術である。Ｊｅｖｓｅｖａｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｊ．  ５：１１３−１２８。
【００１７】
薬品が曝露される条件は使用される送達系に応じて変化する。固体ＰＬＧＡ移植物へ組み込むために凍結乾燥薬品またはスプレー乾燥薬品が使用される。薬品が９０℃に近づいている温度に曝露される時間がわずかであるように移植物はホットメルト射出成形を用いて作製される。その薬品は放出期間にわたって固体状態のままであるが、その薬品はＰＬＧＡの分解によって低ｐＨ環境に曝露され得る。対照的に、ＰＤＳで送達される薬品は液体状態で高濃度に維持され、生理学的イオン強度及びｐＨにおいて還元的環境として特徴づけられる硝子体に曝露される。
【００１８】
したがって、安定性が改善しており、好ましくは高濃度製剤及び／または長期作用性送達に適切である抗Ｄ因子抗体の大きな必要性が存在する。
【発明の概要】
【００１９】
本発明は、抗体中の特定されたホットスポットの標的アミノ酸置換によりその抗体の安定性と治療薬としての全体的な効力が効果的に改善され得るという発見に部分的に基づく。
【００２０】
１つの態様では本発明は安定性が改善された抗Ｄ因子抗体変異体に関する。本発明には基準抗Ｄ因子抗体の超可変領域（ＨＶＲ）内の少なくとも１個の標的アスパラギン酸（ＤまたはＡｓｐ）残基の置換を含む抗Ｄ因子抗体変異体であって、標的Ａｓｐ残基が異性化しやすいものと特定されており、且つ、置換がＡｓｐからグルタミン酸（ＥまたはＧｌｕ）への置換であり、基準抗Ｄ因子抗体と比較するとＤ因子結合親和性をあまり失わずに改善された安定性を示す抗Ｄ因子抗体変異体が含まれる。幾つかの態様では置換の対象である標的Ａｓｐ残基はＸａａがＡｓｐ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、ＳｅｒまたはＴｈｒであるＡｓｐ−Ｘａａモチーフ内に存在する。１つの態様では標的Ａｓｐ残基はＡｓｐ−Ａｓｐ（ＤＤ）モチーフの１番目のＡｓｐである。１つの態様では抗Ｄ因子抗体変異体は、抗体の全体的な電荷を減少させることでその抗体の溶解性を改善するためにＡｓｐからセリン（ＳまたはＳｅｒ）への置換である１か所以上の置換を基準抗Ｄ因子抗体のＨＶＲ内の追加Ａｓｐ部位に含む。１つの態様では抗Ｄ因子抗体変異体は、抗体の脱アミド化を減少させる、または無くすためにＡｓｎからＳｅｒへの置換である１か所以上の置換を脱アミド化しやすいと特定されたアスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）部位に含む。
【００２１】
１つの態様では本発明の抗体変異体を作製するために使用される基準抗Ｄ因子抗体は配列番号３の軽鎖可変ドメイン配列、配列番号４の重鎖可変ドメイン配列、またはそれらの両方を含む。その後、その結果生じる抗体変異体は配列番号１１の軽鎖ＨＶＲ１（ＨＶＲ−Ｌ１）配列と配列番号１２の重鎖ＨＶＲ２（ＨＶＲ−Ｈ２）配列を含み得るか、または配列番号１３の軽鎖ＨＶＲ３（ＨＶＲ−Ｌ３）配列を含み得るか、または配列番号１４の軽鎖ＨＶＲ１（ＨＶＲ−Ｌ１）配列と配列番号１２の重鎖ＨＶＲ２（ＨＶＲ−Ｈ２）配列を含み得るか、または配列番号１５の重鎖ＨＶＲ３（ＨＶＲ−Ｈ３）配列を含み得る。
【００２２】
１つの態様では本発明の抗Ｄ因子抗体変異体は配列番号１の軽鎖配列と配列番号２の重鎖配列を含む基準抗Ｄ因子抗体の変異体であって、基準抗Ｄ因子抗体に対して次の配列改変、すなわち、配列番号１１の軽鎖ＨＶＲ１（ＨＶＲ−Ｌ１）配列と配列番号１２の重鎖ＨＶＲ２（ＨＶＲ−Ｈ２）配列を含む変異体である。そのような変異体は本明細書において下の実施例で「ＴＭ」変異体（ＡＦＤ．ｖ６）と呼ばれる（例えば表１を参照されたい）。
【００２３】
１つの態様では本発明の抗Ｄ因子抗体変異体は配列番号１の軽鎖配列と配列番号２の重鎖配列を含む基準抗Ｄ因子抗体の変異体であって、基準抗Ｄ因子抗体に対して次の配列改変、すなわち、配列番号１１の軽鎖ＨＶＲ１（ＨＶＲ−Ｌ１）配列、配列番号１２の重鎖ＨＶＲ２（ＨＶＲ−Ｈ２）配列及び配列番号１３の軽鎖ＨＶＲ３（ＨＶＲ−Ｌ３）配列を含む変異体である。そのような変異体は本明細書において下の実施例で「ＴＭ．Ｄ９２Ｅ」変異体（ＡＦＤ．ｖ７）と呼ばれる（例えば表１を参照されたい）。
【００２４】
１つの態様では本発明の抗Ｄ因子抗体変異体は配列番号１の軽鎖配列と配列番号２の重鎖配列を含む基準抗Ｄ因子抗体の変異体であって、基準抗Ｄ因子抗体に対して次の配列改変、すなわち、配列番号１４の軽鎖ＨＶＲ１（ＨＶＲ−Ｌ１）配列と配列番号１２の重鎖ＨＶＲ２（ＨＶＲ−Ｈ２）配列を含む変異体である。そのような変異体は本明細書において下の実施例で「ＳＩＥＳＤ」変異体（ＡＦＤ．ｖ８）と呼ばれる（例えば表１を参照されたい）。１つの実施形態では「ＳＩＥＳＤ」変異体（ＡＦＤ．ｖ８）は配列番号２６の軽鎖配列と配列番号２７の重鎖配列を含む。１つの実施形態ではＣｙｓ修飾型の「ＳＩＥＳＤ」変異体は配列番号３０の重鎖配列を含む。１つの実施形態ではＣｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ修飾型の「ＳＩＥＳＤ」変異体は配列番号３１の重鎖配列を含む。
【００２５】
１つの態様では本発明の抗Ｄ因子抗体変異体は配列番号１の軽鎖配列と配列番号２の重鎖配列を含む基準抗Ｄ因子抗体の変異体であって、基準抗Ｄ因子抗体に対して次の配列改変、すなわち、配列番号１４の軽鎖ＨＶＲ１（ＨＶＲ−Ｌ１）配列、配列番号１２の重鎖ＨＶＲ２（ＨＶＲ−Ｈ２）配列及び配列番号１５の重鎖ＨＶＲ３（ＨＶＲ−Ｈ３）配列を含む変異体である。そのような変異体は本明細書において下の実施例で「ＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ」変異体（ＡＦＤ．ｖ１４）と呼ばれる（例えば表１を参照されたい）。１つの実施形態では「ＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ」変異体（ＡＦＤ．ｖ１４）は配列番号２８の軽鎖配列と配列番号２９の重鎖配列を含む。１つの実施形態ではＣｙｓ修飾型の「ＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ」変異体は配列番号３２の重鎖配列を含む。１つの実施形態ではＣｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ修飾型の「ＳＩＥＳＤ」変異体は配列番号３３の重鎖配列を含む。
【００２６】
１つの態様では本発明は基準抗Ｄ因子抗体のＨＶＲ内に１か所以上の置換を含む抗Ｄ因子抗体変異体に関する。１つの態様では基準抗Ｄ因子抗体は次のＨＶＲ配列を含む：
ＨＶＲ−Ｌ１：ＩＴＳＴＤＩＤＤＤＭＮ（配列番号５）、
ＨＶＲ−Ｌ２：ＧＧＮＴＬＲＰ（配列番号６）、
ＨＶＲ−Ｌ３：ＬＱＳＤＳＬＰＹＴ（配列番号７）、
ＨＶＲ−Ｈ１：ＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮ（配列番号８）、
ＨＶＲ−Ｈ２：ＷＩＮＴＹＴＧＥＴＴＹＡＤＤＦＫＧ（配列番号９）、及び
ＨＶＲ−Ｈ３：ＥＧＧＶＮＮ（配列番号１０）。
そしてそれらの対応する変異体は次の置換、すなわち、
（ａ）配列番号５におけるＤ５Ｓ、
（ｂ）配列番号５におけるＤ７Ｅ、
（ｃ）配列番号５におけるＤ８Ｓ（配列番号２２において開示されるａ、ｂ、及びｃ）、
（ｄ）配列番号９におけるＤ１３Ｅ（配列番号２３）、
（ｅ）配列番号７におけるＤ４Ｅ（配列番号２４）、または
（ｆ）配列番号１０におけるＮ５Ｓ（配列番号２５）
のうちの１つ以上を含む。
【００２７】
１つの態様では本発明の変異体は上記の置換（ｂ）〜（ｄ）を含む。別の態様では変異体は上記の置換（ｂ）〜（ｅ）を含む。別の態様では変異体は上記の置換（ａ）〜（ｄ）を含む。別の態様では変異体は上記の置換（ａ）〜（ｄ）及び（ｆ）を含む。
【００２８】
１つの態様では本発明は配列番号１６、１８または１９の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む抗Ｄ因子抗体に関する。別の態様では本発明は配列番号１７または２０の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む抗Ｄ因子抗体に関する。別の態様では抗Ｄ因子抗体は配列番号１６、１８または１９の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列と配列番号１７または２０の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む。例えば、抗Ｄ因子抗体は配列番号１６の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列と配列番号１７の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む「ＴＭ」変異体（ＡＦＤ．ｖ６）、配列番号１８の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列と配列番号１７の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む「ＴＭ．Ｄ９２Ｅ」変異体（ＡＦＤ．ｖ７）、配列番号１９の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列と配列番号１７の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む「ＳＩＥＳＤ」変異体（ＡＦＤ．ｖ８）、または配列番号１９の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列と配列番号２０の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む「ＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ」変異体（ＡＦＤ．ｖ１４）であり得る。
【００２９】
１つの態様では本発明は配列番号１１または１４の配列を有するＨＶＲ−Ｌ１、配列番号６の配列を有するＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号７または１３の配列を有するＨＶＲ−Ｌ３を含む可変軽鎖、及び配列番号８の配列を有するＨＶＲ−Ｈ１、配列番号９または１２の配列を有するＨＶＲ−Ｈ２、及び配列番号１０または１５の配列を有するＨＶＲ−Ｈ３を含む可変重鎖を有する抗Ｄ因子抗体に関する。例えば、抗Ｄ因子抗体は次の６つのＨＶＲ配列、すなわち、ＨＶＲ−Ｌ１（配列番号１４）、ＨＶＲ−Ｌ２（配列番号６）、ＨＶＲ−Ｌ３（配列番号７）、ＨＶＲ−Ｈ１（配列番号８）、ＨＶＲ−Ｈ２（配列番号１２）、及びＨＶＲ−Ｈ３（配列番号１０）を含む「ＳＩＥＳＤ」変異体（ＡＦＤ．ｖ８）、または次の６つのＨＶＲ配列、すなわち、ＨＶＲ−Ｌ１（配列番号１４）、ＨＶＲ−Ｌ２（配列番号６）、ＨＶＲ−Ｌ３（配列番号７）、ＨＶＲ−Ｈ１（配列番号８）、ＨＶＲ−Ｈ２（配列番号１２）、及びＨＶＲ−Ｈ３（配列番号１５）を含む「ＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ」変異体（ＡＦＤ．ｖ１４）であり得る。
【００３０】
１つの態様では本発明は、異性化を無くす、または減少させるための方法であって、（ａ）基準抗Ｄ因子抗体のＨＶＲ内にあるＡｓｐ異性化しやすい１個以上のＡｓｐ残基の特定、（ｂ）ステップ（ａ）で特定されたＡｓｐ残基のＧｌｕによる置換、（ｃ）その結果生じた候補変異体のＡｓｐ異性化についてのスクリーニング、及び（ｄ）検出可能なＡｓｐ異性化を有しない変異体の選択を含む方法によって作製される検出可能なＡｓｐ異性化を有しない抗Ｄ因子抗体変異体に関する。１つの態様では上記の方法は、脱アミド化を無くす、または減少させるための方法であって、（ａ）基準抗Ｄ因子抗体のＨＶＲ内にある脱アミド化しやすい１個以上のＡｓｎ残基の特定、（ｂ）ステップ（ａ）で特定されたＡｓｎ残基のＳｅｒによる置換、（ｃ）その結果生じた候補変異体の脱アミド化についてのスクリーニング、及び（ｄ）脱アミド化が減少した、または無くなった変異体の選択を含む方法と組み合わせられる。別の態様では異性化を無くす、または減少させるための方法は、（ａ）基準抗Ｄ因子抗体のＨＶＲ内にある１個以上の負に帯電したアミノ酸残基ＤまたはＥを選択し、（ｂ）ステップ（ａ）で選択された残基をＳｅｒによって置換し、（ｃ）その結果生じた候補変異体を溶解性についてスクリーニングし、且つ、（ｄ）基準抗Ｄ因子抗体と比較すると改善された溶解性を有する変異体を選択することによって抗体の全体的な電荷を減少させるための方法と組み合わせられる。
【００３１】
１つの態様では本発明の抗Ｄ因子抗体変異体は基準抗Ｄ因子抗体と比較するとＤ因子結合親和性を維持しつつ改善された安定性を有する。１つの態様では本発明の抗体は少なくとも約１０−９から１０−１２Ｍの結合親和性でＤ因子に結合する。１つの態様では本発明の抗体にはヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体が含まれる。
【００３２】
１つの態様では本発明の抗体は抗体断片（例えば抗原結合断片）である。本発明の抗体断片は、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｄＡｂ、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、直鎖状抗体、単鎖抗体分子、ミニボディ、ディアボディ、または抗体断片から形成される多重特異性抗体であり得る。
【００３３】
本発明の他の態様では本発明には本発明の抗体を含む組成物が含まれる。別の態様では本発明は本明細書に記載されるように担体と組み合わせて本発明の抗体を含む組成物に関する。担体は薬学的に許容可能な担体でもよい。
【００３４】
１つの態様では本発明には上記の抗体または抗体変異体を治療有効濃度で含む医薬製剤が含まれる。幾つかの態様では医薬製剤は抗体または抗体変異体を少なくとも１００ｍｇ／ｍｌの濃度、１００〜１５０ｍｇ／ｍｌの間の濃度、１００〜２００ｍｇ／ｍｌの間の濃度、１００〜３００ｍｇ／ｍｌの間の濃度、１００〜４００ｍｇ／ｍｌの間の濃度、１００〜５００ｍｇ／ｍｌの間の濃度、少なくとも２００ｍｇ／ｍｌの濃度、少なくとも３００ｍｇ／ｍｌの濃度、少なくとも４００ｍｇ／ｍｌの濃度、または少なくとも５００ｍｇ／ｍｌの濃度で含む。幾つかの態様では製剤中の抗体または抗体変異体の濃度は約２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０または５００ｍｇ／ｍｌである。１つの態様では製剤中の抗体または抗体変異体の濃度は４５０ｍｇ／ｍｌ未満である。
【００３５】
本発明の別の態様は過剰補体活性化または無制御補体活性化と関連する疾患の治療用に本発明の抗体を使用することである。それらの疾患には心肺バイパス手術時の補体活性化、急性心筋梗塞、動脈瘤、脳卒中、出血性ショック、挫傷、多臓器不全、血液量減少性（ｈｙｐｏｂｏｌｅｍｉｃ）ショック、腸管虚血または虚血の原因になる他の事象の後の虚血再灌流に起因する補体活性化が含まれる。補体活性化は重症の火傷、内毒素血症、敗血症性ショック、成人呼吸促迫症候群、血液透析などの炎症症状；アナフィラキシーショック、重症喘息、血管浮腫、クローン病、鎌状赤血球貧血、溶連菌感染後糸球体腎炎及び膵臓炎と関連することも示されている。疾患は有害薬物反応、薬品アレルギー、ＩＬ−２誘導性血管漏出症候群またはＸ線撮影造影剤アレルギーの結果であり得る。その疾患には全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、リウマチ性関節炎、アルツハイマー病及び多発性硬化症などの自己免疫疾患も含まれる。別の実施形態では補体活性化は移植拒絶反応とも関連する。別の実施形態では補体活性化は眼疾患（補体の古典的経路及び副経路を含む、補体が病理に関与する全ての眼症状及び眼疾患）、例えば、限定されないが、乾燥型及び湿潤型（非滲出型及び滲出型）を含む全てのステージの加齢黄斑変性（ＡＭＤ）などの黄斑変性症、糖尿病性網膜症及び他の虚血性網膜症、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、ぶどう膜炎、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼ヒストプラズマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生、及び網膜血管新生などとも関連する。一例では補体関連眼疾患には非滲出型ＡＭＤ（例えば中期乾燥型ＡＭＤまたは地図状萎縮（ＧＡ））及び滲出型ＡＭＤ（例えば湿潤型ＡＭＤ（脈絡膜血管新生（ＣＮＶ））を含む加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、眼内炎及びぶどう膜炎が含まれる。追加の例では非滲出型ＡＭＤは硬性ドルーゼン、軟性ドルーゼン、地図状萎縮及び／またはピグメント・クランピングの存在を含み得る。別の例では補体関連眼疾患には初期ＡＭＤ（例えば、複数の小さなサイズのドルーゼンから１つ以上の大きくない中程度のサイズのドルーゼンを含む）、中期ＡＭＤ（例えば、大きな中程度のドルーゼンから１つ以上の大きなドルーゼンを含む）及び進行期ＡＭＤ（例えば、地図状萎縮または進行湿潤型ＡＭＤ（ＣＮＶ）を含む）をはじめとする加齢黄斑変性（ＡＭＤ）が含まれる。追加の例では中期乾燥型ＡＭＤは大きな集密的ドルーゼンを含み得る。追加の例では地図状萎縮は光受容体及び／または網膜色素上皮（ＲＰＥ）の喪失を含み得る。追加の例では地図状萎縮領域は小さくても大きくてもよく、及び／または黄斑領域の中にあっても周辺部網膜の中にあってもよい。一例では補体関連眼疾患は中期乾燥型ＡＭＤである。一例では補体関連眼疾患は地図状萎縮である。一例では補体関連眼疾患は湿潤型ＡＭＤ（脈絡膜血管新生（ＣＮＶ））である。
【００３６】
別の態様では本発明は本発明の抗体を含むキットを提供する。１つの実施形態では本発明は本発明の抗体と取扱説明書を含むキットを提供する。１つの実施形態では本発明は補体関連疾患を治療するための本発明の抗体と抗体の投与指示書を含むキットに関する。１つの実施形態では本発明は本発明の１つ以上の１つ以上の抗体を含む組成物を含む第１容器と緩衝液を含む第２容器を含むキットを提供する。１つの実施形態では緩衝液は薬学的に許容可能である。１つの実施形態では本発明の抗体を含む組成物は担体をさらに含み、幾つかの実施形態ではその担体は薬学的に許容可能である。１つの実施形態ではキットは対象に組成物（例えば抗体またはその抗体断片（例えば抗原結合断片））を投与するための指示書をさらに含む。１つの実施形態ではキットはそのキットの取扱説明書をさらに含む。
【００３７】
１つの態様では本発明は補体関連疾患の治療、予防、及び／または診断に有用な物質を含有する製品に関する。１つの実施形態では本発明は、（ａ）容器、（ｂ）その容器上のラベル、及び（ｃ）容器に入っている本発明の抗体を含む組成物を備える製品であって、補体関連疾患の治療、予防、及び／または診断に組成物を使用することができると容器上のラベルが示している製品に関する。
【００３８】
１つの態様では本発明は補体関連眼疾患などの疾患の治療処置及び／または予防処置のための医薬の調製における本発明の抗Ｄ因子抗体の使用法を提供する。１つの実施形態では補体関連眼疾患は非滲出型ＡＭＤ（例えば中期乾燥型ＡＭＤまたは地図状萎縮（ＧＡ））及び滲出型ＡＭＤ（例えば湿潤型ＡＭＤ（脈絡膜血管新生（ＣＮＶ））を含む加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、眼内炎及びぶどう膜炎から選択される。一例では補体関連眼疾患は中期乾燥型ＡＭＤである。一例では補体関連眼疾患は地図状萎縮である。一例では補体関連眼疾患は湿潤型ＡＭＤ（脈絡膜血管新生（ＣＮＶ））である。
【００３９】
１つの態様では本発明は補体関連眼疾患などの疾患の治療処置及び／または予防処置のための医薬の調製における本発明の製品の使用法を提供する。１つの実施形態では補体関連眼疾患は非滲出型ＡＭＤ（例えば中期乾燥型ＡＭＤまたは地図状萎縮（ＧＡ））及び滲出型ＡＭＤ（例えば湿潤型ＡＭＤ（脈絡膜血管新生（ＣＮＶ））を含む加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、眼内炎及びぶどう膜炎から選択される。一例では補体関連眼疾患は中期乾燥型ＡＭＤである。一例では補体関連眼疾患は地図状萎縮である。一例では補体関連眼疾患は湿潤型ＡＭＤ（脈絡膜血管新生（ＣＮＶ））である。
【００４０】
１つの態様では本発明は補体関連眼疾患などの疾患の治療処置及び／または予防処置のための医薬の調製における本発明のキットの使用法を提供する。１つの実施形態では補体関連眼疾患は非滲出型ＡＭＤ（例えば中期乾燥型ＡＭＤまたは地図状萎縮（ＧＡ））及び滲出型ＡＭＤ（例えば湿潤型ＡＭＤ（脈絡膜血管新生（ＣＮＶ））を含む加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、眼内炎及びぶどう膜炎から選択される。一例では補体関連眼疾患は中期乾燥型ＡＭＤである。一例では補体関連眼疾患は地図状萎縮である。一例では補体関連眼疾患は湿潤型ＡＭＤ（脈絡膜血管新生（ＣＮＶ））である。
【００４１】
１つの態様では本発明はＤ因子アンタゴニストとＨＴＲＡ１アンタゴニストを提供する。１つの実施形態ではＤ因子アンタゴニストは抗Ｄ因子抗体である。追加の実施形態では抗Ｄ因子抗体は本明細書に記載される抗Ｄ因子抗体変異体である。１つの実施形態ではＨＴＲＡ１アンタゴニストは抗ＨＴＲＡ１抗体である。
【００４２】
１つの態様では過剰補体活性化または無制御補体活性化と関連する疾患を有するヒト対象における過剰補体活性化または無制御補体活性化と関連する疾患の治療はＤ因子アンタゴニストなどの治療化合物の有効量を対象に投与することを含み、ＨＴＲＡ１アンタゴニストなどの第２治療化合物の有効量を対象に投与することをさらに含む。１つの実施形態ではＤ因子アンタゴニストは抗Ｄ因子抗体である。１つの実施形態では抗Ｄ因子抗体は本明細書に記載される抗Ｄ因子抗体変異体である。１つの実施形態ではＨＴＲＡ１アンタゴニストは抗ＨＴＲＡ１抗体である。１つの実施形態ではＤ因子アンタゴニストは抗Ｄ因子抗体であり、ＨＴＲＡ１アンタゴニストは抗ＨＴＲＡ１抗体である。
【００４３】
１つの態様ではＤ因子アンタゴニストといずれかの第２治療化合物の投与は、例えば、単一の組成物として、または２つ以上の別個の組成物として同じ投与経路または異なる投与経路を用いて同時に行われ得る。あるいは、または加えて、投与は任意の順序で順次行われ得る。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１Ａ】基準抗Ｄ因子抗体ＷＴ（ａＦＤ  ＷＴ）及びその選択した変異体のアミノ酸配列（１Ａ：ＷＴの軽鎖配列と重鎖配列、１Ｂ：軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインのアラインメント、１Ｃ：ＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）の軽鎖配列と重鎖配列、１Ｄ：ＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）の軽鎖配列と重鎖配列）を示す図である。それらの可変ドメイン内のＨＶＲに下線が引かれている。それらの変異体における残基置換がボールド体で示されている。Ｃｙｓ修飾及びＣｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（配列番号２１）修飾が図１Ｃ及び１Ｄにおいてイタリック体で示されている。
【図１Ｂ】基準抗Ｄ因子抗体ＷＴ（ａＦＤ  ＷＴ）及びその選択した変異体のアミノ酸配列（１Ａ：ＷＴの軽鎖配列と重鎖配列、１Ｂ：軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインのアラインメント、１Ｃ：ＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）の軽鎖配列と重鎖配列、１Ｄ：ＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）の軽鎖配列と重鎖配列）を示す図である。それらの可変ドメイン内のＨＶＲに下線が引かれている。それらの変異体における残基置換がボールド体で示されている。Ｃｙｓ修飾及びＣｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（配列番号２１）修飾が図１Ｃ及び１Ｄにおいてイタリック体で示されている。
【図１Ｃ】基準抗Ｄ因子抗体ＷＴ（ａＦＤ  ＷＴ）及びその選択した変異体のアミノ酸配列（１Ａ：ＷＴの軽鎖配列と重鎖配列、１Ｂ：軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインのアラインメント、１Ｃ：ＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）の軽鎖配列と重鎖配列、１Ｄ：ＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）の軽鎖配列と重鎖配列）を示す図である。それらの可変ドメイン内のＨＶＲに下線が引かれている。それらの変異体における残基置換がボールド体で示されている。Ｃｙｓ修飾及びＣｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（配列番号２１）修飾が図１Ｃ及び１Ｄにおいてイタリック体で示されている。
【図１Ｄ】基準抗Ｄ因子抗体ＷＴ（ａＦＤ  ＷＴ）及びその選択した変異体のアミノ酸配列（１Ａ：ＷＴの軽鎖配列と重鎖配列、１Ｂ：軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインのアラインメント、１Ｃ：ＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）の軽鎖配列と重鎖配列、１Ｄ：ＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）の軽鎖配列と重鎖配列）を示す図である。それらの可変ドメイン内のＨＶＲに下線が引かれている。それらの変異体における残基置換がボールド体で示されている。Ｃｙｓ修飾及びＣｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（配列番号２１）修飾が図１Ｃ及び１Ｄにおいてイタリック体で示されている。
【図２Ａ】規定条件下（２Ａ：ｐＨ５．５の緩衝液中に１０ｍｇ／ｍＬのＦａｂタンパク質濃度、２Ｂ：ＰＢＳ中に１００ｍｇ／ｍｌのＦａｂタンパク質濃度、２Ｃ：ＰＢＳ中に１００ｍｇ／ｍｌのＦａｂタンパク質濃度）での長期間にわたる様々な抗体Ｆａｂ断片の抗原結合能を示す図である。
【図２Ｂ】規定条件下（２Ａ：ｐＨ５．５の緩衝液中に１０ｍｇ／ｍＬのＦａｂタンパク質濃度、２Ｂ：ＰＢＳ中に１００ｍｇ／ｍｌのＦａｂタンパク質濃度、２Ｃ：ＰＢＳ中に１００ｍｇ／ｍｌのＦａｂタンパク質濃度）での長期間にわたる様々な抗体Ｆａｂ断片の抗原結合能を示す図である。
【図２Ｃ】規定条件下（２Ａ：ｐＨ５．５の緩衝液中に１０ｍｇ／ｍＬのＦａｂタンパク質濃度、２Ｂ：ＰＢＳ中に１００ｍｇ／ｍｌのＦａｂタンパク質濃度、２Ｃ：ＰＢＳ中に１００ｍｇ／ｍｌのＦａｂタンパク質濃度）での長期間にわたる様々な抗体Ｆａｂ断片の抗原結合能を示す図である。
【図３Ａ】イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）によって主要ピークが決定される規定条件下（３Ａ：ｐＨ５．５の緩衝液中に１０ｍｇ／ｍＬのＦａｂタンパク質濃度、３Ｂ：ＰＢＳ中に１００ｍｇ／ｍｌのＦａｂタンパク質濃度）での長期間にわたる様々な抗体Ｆａｂ断片の分解を示す図である。
【図３Ｂ】イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）によって主要ピークが決定される規定条件下（３Ａ：ｐＨ５．５の緩衝液中に１０ｍｇ／ｍＬのＦａｂタンパク質濃度、３Ｂ：ＰＢＳ中に１００ｍｇ／ｍｌのＦａｂタンパク質濃度）での長期間にわたる様々な抗体Ｆａｂ断片の分解を示す図である。
【図４Ａ】規定条件下（４Ａ：ｐＨ５．５の緩衝液中に１０ｍｇ／ｍＬのＦａｂタンパク質濃度、４Ｂ：ＰＢＳ中に１００ｍｇ／ｍｌのＦａｂタンパク質濃度）での長期間にわたる様々な抗体Ｆａｂ断片の異性化及び脱アミド化を示す図である。
【図４Ｂ】規定条件下（４Ａ：ｐＨ５．５の緩衝液中に１０ｍｇ／ｍＬのＦａｂタンパク質濃度、４Ｂ：ＰＢＳ中に１００ｍｇ／ｍｌのＦａｂタンパク質濃度）での長期間にわたる様々な抗体Ｆａｂ断片の異性化及び脱アミド化を示す図である。
【図５】サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による単量体ピークの測定によって決定される規定条件下（ＰＢＳ中に１００ｍｇ／ｍｌのＦａｂタンパク質濃度）での長期間にわたる様々な抗体Ｆａｂ断片の凝集を示す図である。
【図６】ｐＨ６及び低イオン強度でのａＦＤ  ＷＴ、ＡＦＤ．ｖ２、ＡＦＤ．ｖ６及びＡＦＤ．ｖ８（ｐＨ６の２０ｍＭヒスチジン塩酸中に約１００ｍｇ／ｍｌ）の溶解性を示す図である。
【図７】ｐＨ６及び低イオン強度での抗体Ｆａｂ断片（ｐＨ６の２０ｍＭヒスチジン塩酸中に約１００ｍｇ／ｍｌ）の溶解性を示す図である。透析によって塩（ＮａＣｌ）含有緩衝液であるＰＢＳに交換することでａＦＤ  ＷＴの不溶性が逆転させられている。
【図８】ａＦＤ  ＷＴについては２２７ｍｇ／ｍｌ、ＡＦＤ．ｖ８については２６９ｍｇ／ｍｌ、及びＡＦＤ．ｖ１４については３４４ｍｇ／ｍｌでのＰＢＳ（ｐＨ７．３）中の抗体Ｆａｂ断片の溶解性を示す図である。
【図９】２〜８℃で３週間の培養の前のＰＢＳ中のＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により測定されたときの凝集のパーセンテージを示す図である。
【図１０】ウサギにおける硝子体内注射時の抗体Ｆａｂ断片の薬物動態を示す図である。
【図１１】ｐＨ５．５の緩衝液中の抗体Ｆａｂ断片の粘度についてのタンパク質濃度依存性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
定義
本願を通して使用される用語は当業者にとって一般的で普通の意味によって解釈されるものとする。しかしながら、出願人は以下の用語に下で定義される特定の定義が与えられることを望む。
【００４６】
「抗体」という用語は最も広い意味で使用され、抗原結合活性などの所望の生物活性を示す限り具体的には全長型モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二特異性抗体）及び抗体断片を範囲とする。抗体（Ａｂ）及び免疫グロブリン（Ｉｇ）は同じ構造的特徴を有する糖タンパク質である。抗体が特定の標的への結合特異性を示す一方で免疫グロブリンには抗体と標的特異性を失っている他の抗体様分子の両方が含まれる。天然の抗体及び免疫グロブリンは通常は２本の同一の軽（Ｌ）鎖と２本の同一の重（Ｈ）鎖から構成される約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。それぞれの重鎖は一端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、続いてある数の定常ドメインを有する。それぞれの軽鎖は一端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、その他方の末端に定常ドメインを有する。本明細書において使用される「抗体」という用語は抗原結合活性を保持する抗体断片を明示的に包含する。
【００４７】
「抗体断片」は完全抗体の一部を含む完全抗体以外の分子であって、その完全抗体が結合する抗原に結合するその分子を指す。抗体断片の例にはＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ディアボディ、直鎖状抗体、単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれるがこれらに限定されない。
【００４８】
本明細書において使用される場合、「抗Ｄ因子抗体」は補体活性化を抑制するように、または実質的に低下させるようにＤ因子に特異的に結合する抗体を意味する。
【００４９】
「Ｄ因子」という用語は天然配列及び変異体のＤ因子ポリペプチドを指すために本明細書において使用される。
【００５０】
「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は抗体の抗原への結合に関与するその抗体の重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は一般的に同様の構造を有しており、それぞれのドメインが４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの超可変領域（ＨＶＲ）を備える（例えば、Ｋｉｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第６版、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、９１頁（２００７）を参照されたい）。抗原結合特異性を付与するには単一のＶＨドメインまたはＶＬドメインで充分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、その抗原に結合する抗体のＶＨドメインまたはＶＬドメインを使用してそれぞれ相補的なＶＬドメインまたはＶＨドメインのライブラリーをスクリーニングして単離され得る。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５０：８８０−８８７  （１９９３）、  Ｃｌａｒｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８  （１９９１）を参照されたい。
【００５１】
「可変」という用語は可変ドメインのある特定の部分が配列に関して抗体間で非常に異なっており、且つ、それぞれ特定の抗体のその特定の抗原に対する結合及び特異性にそれらの部分が使用されるという事実を指す。しかしながら、その可変性は抗体可変ドメインを通して均一に分布されているのではない。その可変性は軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの両方の中にある超可変領域と呼ばれる３つの区域に集中している。可変ドメインの保存性がより高い部分はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ４つのＦＲを含み、それらのＦＲは大部分がβシート構成を採り、３つの超可変領域によって接続されており、それらの超可変領域はそのβシート構造を接続するループを形成し、幾つかの事例ではそのβシート構造の一部を形成する。それぞれの鎖の超可変領域はＦＲによって近接した状態で一緒に保持されており、他の鎖の超可変領域と共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、公衆衛生局、米国国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州（１９９１）を参照されたい）。定常ドメインは抗体の抗原への結合には直接的に関与していないが、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）への抗体の関与など、様々なエフェクター機能を示す。
【００５２】
抗体のパパイン消化によって「Ｆａｂ」断片と呼ばれるそれぞれ単一の抗原結合部位を有する２つの同一の抗原結合断片、及び容易に結晶化する能力を反映する名前を有する残りの「Ｆｃ」断片が作製される。ペプシン消化によって２つの抗原結合部位を有し、且つ、依然として抗原の架橋が可能であるＦ（ａｂ’）２が産生される。
【００５３】
Ｆａｂ断片は軽鎖の定常ドメインと重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）も含む。Ｆａｂ’断片は抗体ヒンジ領域に由来する１個以上のシステインを含む数個の残基を重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に付加していることでＦａｂ断片と異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは定常ドメインのシステイン残基が少なくとも１つの遊離チオール基を担持しているＦａｂ’に対しての本明細書における名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片はヒンジシステインを間に有しているＦａｂ’断片対としてもともと作製された。抗体断片の他の化学的連結体も知られている。
【００５４】
「Ｆｖ」は完全抗原認識抗原結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域はしっかりと非共有結合で結合した１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。この構成で各可変ドメインの３つの超可変領域が相互作用してそのＶＨ−ＶＬ二量体の表面上に抗原結合部位を規定する。まとめると、それら６つの超可変領域がその抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（抗原に特異的な３つの超可変領域だけを含む半分のＦｖ）であっても完全な結合部位よりも低い親和性ではあるが抗原を認識し、結合する能力を有する。
【００５５】
「超可変領域」または「ＨＶＲ」という用語は本明細書において使用される場合に配列において超可変的であり、且つ／または構造的に規定されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの領域の各々を指す。一般的に天然四本鎖抗体は６つのＨＶＲ、すなわち、ＶＨ中の３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）とＶＬ中の３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）を含む。ＨＶＲは一般的に超可変ループ及び／または「相補性決定領域」（ＣＤＲ）に由来するアミノ酸残基を含み、後者は最も高い配列可変性を有し、且つ／または抗原認識に関与する。ＨＶＲ−Ｈ３は抗体への精密な特異性の付与に固有の役割を果たすと考えられている。例えば、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １３：３７−４５、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２４８巻内のＪｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｗｕ  （２００３）、１−２５頁（Ｌｏ編、Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、トトワ、ニュージャージー州）を参照されたい。「フレームワーク領域」残基または「ＦＲ」残基は本明細書において定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。本明細書において使用されるＨＶＲ領域は位置２４〜３６（Ｌ１について）、位置４６〜５６（Ｌ２について）、位置８９〜９７（Ｌ３について）、位置２６〜３５Ｂ（Ｈ１について）、位置４７〜６５（Ｈ２について）、及び位置９３〜１０２（Ｈ３について）内に位置する任意の数の残基を含む。したがって、ＨＶＲはこれまでに述べた位置、すなわち、
Ａ）２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、９１〜９６（Ｌ３）、２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、及び９６〜１０１（Ｈ３）（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６：９０１−９１７  （１９８７）、
Ｂ）Ｌ１の２４〜３４、Ｌ２の５０〜５６、Ｌ３の８９〜９７、Ｈ１の３１〜３５Ｂ、Ｈ２の５０〜６５、及びＨ３の９５〜１０２（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、公衆衛生局、米国国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州（１９９１）、
Ｃ）３０〜３６（Ｌ１）、４６〜５５（Ｌ２）、８９〜９６（Ｌ３）、３０〜３５（Ｈ１）、４７〜５８（Ｈ２）、９３〜１００ａ〜ｊ（Ｈ３）（ＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２６２：７３２−７４５  （１９９６）
内の残基を含む。
【００５６】
超可変領域は次のもの、すなわち、ＶＬ内の２４〜３６または２４〜３４（Ｌ１）、４６〜５６または５０〜５６（Ｌ２）及び８９〜９７（Ｌ３）ならびにＶＨ内の２６〜３５Ｂ（Ｈ１）、５０〜６５、４７−６５または４９〜６５（Ｈ２）及び９３〜１０２、９４〜１０２または９５〜１０２（Ｈ３）のような「拡張超可変領域」を含み得る。それらの可変ドメイン残基にはこれらの定義の各々についての上掲のＫａｂａｔらの著作に従って番号が付けられている。
【００５７】
ＶＨ中のＣＤＲ１を例外としてＣＤＲは超可変ループを形成するアミノ酸残基を含むことが一般的である。ＣＤＲは抗原と接触する残基である「特異性決定残基」、すなわち「ＳＤＲ」も含む。ＳＤＲは短縮型ＣＤＲ、すなわちａ−ＣＤＲと呼ばれるＣＤＲ領域内に含まれる。例となるａ−ＣＤＲ（ａ−ＣＤＲ−Ｌ１、ａ−ＣＤＲ−Ｌ２、ａ−ＣＤＲ−Ｌ３、ａ−ＣＤＲ−Ｈ１、ａ−ＣＤＲ−Ｈ２、及びａ−ＣＤＲ−Ｈ３）はＬ１のアミノ酸残基３１〜３４、Ｌ２のアミノ酸残基５０〜５５、Ｌ３のアミノ酸残基８９〜９６、Ｈ１のアミノ酸残基３１〜３５Ｂ、Ｈ２のアミノ酸残基５０〜５８、及びＨ３のアミノ酸残基９５〜１０２に見出される（Ａｌｍａｇｒｏ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｓｓｏｎ，  Ｆｒｏｎｔ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  １３：１６１９−１６３３  （２００８）を参照されたい）。
【００５８】
基準抗体（「出発抗体」または「親抗体」とも呼ばれる）の「抗体変異体」または「改変抗体」はその基準／出発抗体のものとは異なるアミノ酸配列を含む抗体であって、基準抗体のアミノ酸残基のうちの１個以上が改変されているものである。抗体変異体は基準抗体と少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、及び最も好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有することが一般的である。パーセンテージ配列同一性は最大相同性を提供するように基準抗体配列と候補抗体変異体配列を整列させた後に、例えば、Ｆｉｔｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８０：  １３８２−１３８６  （１９８３）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ４８：  ４４３−４５３  （１９７０）によって記載される版のアルゴリズムによって決定される。同一性または類似性は、最大パーセント配列同一性を達成するように配列を整列させ、必要であればギャップを導入した後で親抗体残基と同一である（すなわち同じ残基である）または類似している（すなわち下で参照される共通の側鎖特性に基づく同じグループのアミノ酸残基である）候補変異体配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして本明細書において定義される。抗体のアミノ酸配列変異体はその抗体をコードするＤＮＡに適切なヌクレオチド変化を導入することにより、またはペプチド合成により調製され得る。そのような変異体は、例えば、目的の抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／またはそれらの残基への挿入、及び／またはそれらの残基の置換を含む。最終構成物が所望の特徴を有することを条件としてその最終構成物に到達するために欠失、挿入、及び置換の任意の組合せが行われる。それらのアミノ酸変化はグリコシル化部位の数または位置の変化のように抗体の翻訳後処理を変更し得る。抗体の抗体配列変異体の作製方法は、例えば、参照により本明細書に明白に援用される米国特許番号第５，５３４，６１５号明細書に記載されるポリペプチドのアミノ酸配列変異体の作製方法と同様である。
【００５９】
抗体をはじめとするタンパク質が未変化の高次構造及び生物活性を基本的に保持する場合にそのタンパク質は「安定である」と言われる。タンパク質安定性を測定するための様々な分析技術が当技術分野において利用可能であり、例えばＰｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、２４７〜３０１頁、Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｌｅｅ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ社、ニューヨーク、ニューヨーク州（１９９１）及びＪｏｎｅｓ  （１９９３）  Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．  １０：  ２９−９０において論評されている。「改善された安定性」を有する抗体変異体は出発基準抗体と比較してより安定的な抗体変異体を指す。改善された安定性を有する抗体変異体は物理的安定性及び／または化学的安定性及び／または生物活性の改善、及び／または天然抗体の免疫原性の低減を目的として特定のアミノ酸残基が変更されている天然（野生型）抗体の変異体であることが好ましい。Ｗａｌｓｈ  （２０００）  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １８：８３１−３。
【００６０】
「異性化」という用語は、化学化合物がその異性体型、すなわち、同じ化学的組成を有しているが異なる構造または構成を有しており、したがって一般的に異なる物理的及び化学的特性を有している型のうちのいずれかに変換される化学的過程を一般的に指す。ポリペプチドの１個以上のアスパラギン酸（ＤまたはＡｓｐ）残基がイソアスパラギン酸残基に変換されている過程であるアスパラギン酸異性化が本明細書において特に使用される。Ｇｅｉｇｅｒ  ａｎｄ  Ｃｌａｒｋｅ  （１９８７）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６２：７８５−９４。
【００６１】
「脱アミド化」という用語は有機化合物からアミド官能基が除去される化学反応を一般的に指す。ポリペプチドの１個以上のアスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）残基がアスパラギン酸（ＤまたはＡｓｐ）に転換されている過程、すなわち中性アミド側鎖が全体的に酸性の特性を有する残基に転換されている過程であるアスパラギン脱アミド化が本明細書において特に使用される。Ｘｉｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｏｗｅｎ  （１９９９）  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．  ８８：８−１３。
【００６２】
ある特定の特定された物理的または化学的過程（例えば、異性化または脱アミド化）を「起こす傾向がある」アミノ酸残基は、特定のタンパク質分子内の異性化または脱アミド化などのそれら特定の過程を経る性向を有すると特定されている残基を指す。それらの残基の傾向はそのタンパク質の一次構造及び／または高次構造内のそれらの残基の相対的位置によって決定されることが多い。例えば、Ａｓｐ−ＸＸＸモチーフ（ＸＸＸはＡｓｐ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、ＳｅｒまたはＴｈｒであり得る）内の１番目のＡｓｐはその隣接する残基の関与に起因してＡｓｐ異性化しやすいことが示されており、その場合に同じタンパク質内の他の幾つかのＡｓｐはそのような性向を有しないことがあり得る。特定のタンパク質分子内のある特定の過程に至る残基を特定するためのアッセイが当技術分野において知られている。例えば、Ｃａｃｉａ  ｅｔ  ａｌ  （１９９６）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３５：１８９７−１９０３を参照されたい。
【００６３】
本発明の抗Ｄ因子抗体の文脈での「活性の」または「活性」または「生物活性」はＤ因子の生物活性に拮抗する（部分的または完全に抑制する）能力である。Ｄ因子アンタゴニストの生物活性の一例はＤ因子関連疾患または症状、例えば、補体関連眼疾患などの状態、例えば病状のある程度の改善を達成する能力である。その活性は適切な動物モデルを使用する結合アッセイ、副経路溶血アッセイ（例えば副経路補体活性の阻害または活性化を測定するアッセイ）をはじめとするインビトロ検査またはインビボ検査、またはヒト治験において決定され得る。
【００６４】
「補体関連疾患」という用語は最も広い意味で使用され、過剰補体活性化または無制御補体活性化と関連する疾患を含む。それらの疾患には心肺バイパス手術時の補体活性化、急性心筋梗塞、動脈瘤、脳卒中、出血性ショック、挫傷、多臓器不全、血液量減少性（ｈｙｐｏｂｏｌｅｍｉｃ）ショック、腸管虚血または虚血の原因になる他の事象の後の虚血再灌流に起因する補体活性化が含まれる。補体活性化は重症の火傷、内毒素血症、敗血症性ショック、成人呼吸促迫症候群、血液透析などの炎症症状；アナフィラキシーショック、重症喘息、血管浮腫、クローン病、鎌状赤血球貧血、溶連菌感染後糸球体腎炎及び膵臓炎と関連することも示されている。当該疾患は有害薬物反応、薬品アレルギー、ＩＬ−２誘導性血管漏出症候群またはＸ線撮影造影剤アレルギーの結果であり得る。その疾患には全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、リウマチ性関節炎、アルツハイマー病及び多発性硬化症などの自己免疫疾患も含まれる。補体活性化は移植拒絶反応とも関連する。補体活性化は加齢黄斑変性、糖尿病性網膜症及び他の虚血性網膜症、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、ぶどう膜炎、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼ヒストプラズマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生、及び網膜血管新生などの眼疾患とも関連する。
【００６５】
「補体関連眼疾患」という用語は最も広い意味で使用され、補体の古典的経路及び副経路、特に補体の副経路を含む、補体が病理に関与する全ての眼症状を含む。補体関連眼疾患には、限定されないが、乾燥型及び湿潤型（非滲出型及び滲出型）を含む全てのステージの加齢黄斑変性（ＡＭＤ）などの黄斑変性症、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、ぶどう膜炎、糖尿病性及び他の虚血性網膜症、ならびに糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼ヒストプラズマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生、及び網膜血管新生などの他の眼内血管新生病が含まれる。一例では補体関連眼疾患には非滲出型ＡＭＤ（例えば中期乾燥型ＡＭＤまたは地図状萎縮（ＧＡ））及び滲出型ＡＭＤ（例えば湿潤型ＡＭＤ（脈絡膜血管新生（ＣＮＶ））を含む加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、眼内炎及びぶどう膜炎が含まれる。追加の例では非滲出型ＡＭＤは硬性ドルーゼン、軟性ドルーゼン、地図状萎縮及び／またはピグメント・クランピングの存在を含み得る。一例では補体関連眼疾患には初期ＡＭＤ（例えば、複数の小さなサイズのドルーゼンから１つ以上の大きくない中程度のサイズのドルーゼンを含む）、中期ＡＭＤ（例えば、大きな中程度のドルーゼンから１つ以上の大きなドルーゼンを含む）及び進行期ＡＭＤ（例えば、地図状萎縮または進行湿潤型ＡＭＤ（ＣＮＶ）を含む）をはじめとする加齢黄斑変性（ＡＭＤ）が含まれる。（Ｆｅｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ＡＲＥＤＳ  Ｒｅｐｏｒｔ  Ｎｏ．  １８、Ｓａｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．，  ３４（３）：  ２３８−４０  （２００９）、  Ｊａｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．，  ３５９（１）：  １７３５  （２００８））。追加の例では中期乾燥型ＡＭＤは大きな集密的ドルーゼンを含み得る。追加の例では地図状萎縮は光受容体及び／または網膜色素上皮（ＲＰＥ）の喪失を含み得る。追加の例では地図状萎縮領域は小さくても大きくてもよく、且つ／または黄斑領域の中にあっても周辺部網膜の中にあってもよい。一例では補体関連眼疾患は中期乾燥型ＡＭＤである。一例では補体関連眼疾患は地図状萎縮である。一例では補体関連眼疾患は湿潤型ＡＭＤ（脈絡膜血管新生（ＣＮＶ））である。
【００６６】
「治療」はある疾患の病状の発生の防止またはその病状の変化を意図して実行される介入である。したがって、「治療」は治療処置と予防または防止手段の両方を指す。治療を必要とする者には既に疾患を有する者、ならびに疾患が予防されるべき者が含まれる。免疫関連疾患の治療では治療薬は免疫応答要素の応答の程度を直接的に変更し、その疾患を他の治療薬、例えば、抗生物質、抗真菌薬、抗炎症薬、化学療法薬等による治療に対してより敏感にすることができる。
【００６７】
補体関連眼疾患などのある疾患の「病状」にはその患者の健康状態を損なう全ての現象が含まれる。この現象には、限定されないが、異常または無制御の細胞増殖（好中球、好酸球、単球、リンパ球）、抗体生産、自己抗体生産、補体生産、隣接する細胞の正常な機能の妨害、異常なレベルでのサイトカインまたは他の分泌性産物の放出、任意の炎症応答または免疫応答の抑制または悪化、炎症細胞（好中球、好酸球、単球、リンパ球）の細胞空間への浸潤等が含まれる。
【００６８】
本明細書において使用される「哺乳類動物」という用語は、限定されないが、ヒト、高等霊長類、家畜、ならびにウマ、ブタ、ウシ、イヌ、ネコ、及びフェレットのような動物園動物、スポーツ用動物または愛玩動物をはじめとする哺乳類動物として分類されるあらゆる動物を指す。本発明の１つの実施形態ではその哺乳類動物はヒトである。
【００６９】
１種類以上の追加治療薬との「併用」投与には同時（並行）投与及び任意の順序の順次投与が含まれる。
【００７０】
「治療有効量」は標的疾患または症状、例えば、補体関連眼疾患などの状態、例えば病状の測定できるの改善を達成するために必要とされる「Ｄ因子アンタゴニスト」の量である。
【００７１】
「アミノ酸置換」は所定のアミノ酸配列内の少なくとも１個の既存のアミノ酸残基の別の異なる「置換」アミノ酸残基による置換を指す。その置換残基またはそれらの置換残基は「天然アミノ酸残基」（すなわち、遺伝コードによってコードされるアミノ酸残基）であり得、アラニン（ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、システイン（Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リシン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、及びバリン（Ｖａｌ）からなる群より選択され得る。１つ以上の非天然アミノ酸残基による置換も本明細書におけるアミノ酸置換の定義に包含される。「非天然アミノ酸残基」は上記の天然アミノ酸残基以外の残基であって、ポリペプチド鎖中の隣接するアミノ酸残基と共有結合可能である残基を指す。非天然アミノ酸残基の例にはノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン及びＥｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍ，  ２０２：  ３０１−３３６  （１９９１）に記載されるアミノ酸残基類似体のような他のアミノ酸残基類似体が含まれる。そのような非天然アミノ酸残基を作製するため、Ｎｏｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４４：  １８２  （１９８９）及び上掲のＥｌｌｍａｎらの手法を使用することができる。簡単に説明すると、これらの手法は非天然アミノ酸残基とのサプレッサーｔＲＮＡの化学的活性化とそれに続くＲＮＡのインビトロ転写とインビトロ翻訳を含む。
【００７２】
「アミノ酸挿入」は少なくとも１個のアミノ酸の所定のアミノ酸配列への組込みを指す。その挿入は１個または２個のアミノ酸残基の挿入からなることが通常であるが、本願はより大きな「ペプチド挿入」、例えば、約３個から約５個、または最大で約１０個ものアミノ酸残基の挿入を企図する。挿入残基は上で開示されたような天然残基または非天然残基であり得る。
【００７３】
「アミノ酸欠失」は所定のアミノ酸配列からの少なくとも１個のアミノ酸残基の除去を指す。
【００７４】
「長期作用性送達」、「持続放出」及び「制御放出」という用語は治療薬品の長期または持続性の放出または生物学的利用能を達成するために製剤、剤形、装置または他の種類の技術を使用する送達機構を説明するために一般的に使用される。その用語は全身循環または対象に対して、または（限定されないが）細胞、組織、器官、関節、領域等を含む対象中の局所的作用部位に対して薬品の長期または持続性の放出または生物学的利用能を提供する技術を指す。さらに、これらの用語は製剤または剤形からの薬品の放出を長期化または延長するために使用される技術を指してよく、またはそれらの用語は対象に対する薬品の生物学的利用能または薬物動態または作用期間を延長または長期化するために使用される技術を指してよく、またはそれらの用語は製剤によって引き出される薬力学効果を延長または長期化するために使用される技術を指してよい。「長期作用性製剤」、「持続放出性製剤」、または「制御放出製剤」は長期作用性送達をもたらすために使用される医薬製剤、剤形、または他の技術である。１つの態様では制御放出は薬品の局所的生物学的利用能、眼球送達の文脈においては具体的に眼球滞留時間を改善するために用いられる。「眼球滞留時間の増加」は送達された眼内薬品が質の点（活性であり続ける）でも量の点（有効量）でも有効であり続ける送達後の期間を指す。高用量制御放出に加えて、またはその代わりにインビボ半減期の増加を達成するためにＰＥＧ化などを介して翻訳後に薬品を修飾することができる。
【００７５】
抗Ｄ因子抗体及びそれらの変異体
本明細書において本発明には抗Ｄ因子抗体及びそれらの変異体の作製及び使用が含まれる。１つの態様では本発明の変異体を作製するための基を形作る親基準抗Ｄ因子抗体はヒト化抗Ｄ因子抗体である。非ヒト抗体をヒト化するための方法が当技術分野においてよく知られている。ヒト化抗体はヒトではない起源に由来する抗体に導入された１個以上のアミノ酸残基を有することが一般的である。これらの非ヒトアミノ酸残基は「輸入」残基と呼ばれることが多く、それらの輸入残基は「輸入」可変ドメインから取られることが典型的である。ヒト化は基本的にはＷｉｎｔｅｒ及び共同研究者の方法（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８６）  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ    ２３９：１５３４−１５３６）に従い、げっ歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列によりヒト抗体の対応する配列を置換することによって実行され得る。したがって、そのような「ヒト化」抗体はキメラ抗体（米国特許番号第４，８１６，５６７号明細書）であり、実質的には完全ではないヒト可変ドメインが非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている。実際にはヒト化抗体は幾つかのＣＤＲ残基及び可能であれば幾つかのＦＲ残基がげっ歯類抗体中の類似部位の残基によって置換されているヒト抗体であることが典型的である。
【００７６】
抗体がヒト治療用途のために意図されているとき、幾つかの事例ではヒト化抗体の作製において使用される軽鎖と重鎖の両方のヒト可変ドメインの選択が抗原性及び／またはＨＡＭＡ（ヒト抗マウス抗体）反応を低下させるために重要であり得る。ＨＡＭＡ反応の低下または除去は適切な治療薬の臨床開発の重要な要素であることが一般的である。例えば、Ｋｈａｘｚａｅｌｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｊ．  Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  ８０：９３７、Ｊａｆｆｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８６）  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ４１：５７２、Ｓｈａｗｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３５：１５３０、Ｓｅａｒｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８４）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｍｏｄ．  ３：１３８、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８３）  Ｂｌｏｏｄ  ６２：９８８、Ｈａｋｉｍｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４７：１３５２、Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３、Ｊｕｎｇｈａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５０：１４９５を参照されたい。本明細書に記載されるように、本発明はＨＡＭＡ反応の低下または除去が起こるようにヒト化されている抗体を提供する。当技術分野において知られている日常的方法を用いてさらにこれらの抗体の変異体を得ることができ、それらの方法のうちの幾つかが下でさらに説明される。いわゆる「ベストフィット」法に従い、げっ歯類抗体の可変ドメイン配列が既知のヒト可変ドメイン配列の完全ライブラリーに対してスクリーニングされる。そのげっ歯類のＶドメイン配列に最も近いヒトＶドメイン配列が特定され、且つ、その配列内のヒトフレームワーク領域（ＦＲ）がヒト化抗体用に受容される（Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５１：２２９６、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．１９６：９０１）。別の方法は軽鎖または重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークを幾つかの異なるヒト化抗体に使用してよい（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：４２８５、Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５１：２６２３）。
【００７７】
例えば、本明細書に記載される抗体のアミノ酸配列がフレームワーク配列及び／または超可変配列の多様化のための出発（親）配列として働き得る。出発超可変配列が連結される選択されたフレームワーク配列は本明細書において受容側ヒトフレームワークと呼ばれる。受容側ヒトフレームワークはヒト免疫グロブリン（そのＶＬ領域及び／またはＶＨ領域）に由来してよい、またはヒト免疫グロブリンから得られてよいが、ヒトコンセンサスフレームワークはヒト患者において免疫原性が最小であるか、または無いことが示されているのでその受容側ヒトフレームワークはヒトコンセンサスフレームワーク配列に由来してよい、またはその配列から得られてよい。本明細書における目的に適した「受容側ヒトフレームワーク」はヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに由来するＶＬフレームワークまたはＶＨフレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに「由来」する受容側ヒトフレームワークはそれの同アミノ酸配列を含んでよく、または前から存在するアミノ酸配列変化を含んでよい。アミノ酸変化が前から存在する場合、好ましくは５か所を超えない、及び好ましくは４か所を超えないまたは３か所を超えないアミノ酸変化が前から存在する。１つの実施形態ではＶＨ受容側ヒトフレームワークは配列に関してＶＨヒト免疫グロブリンフレームワーク配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列と同一である。１つの実施形態ではＶＬ受容側ヒトフレームワークは配列に関してＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列と同一である。「ヒトコンセンサスフレームワーク」は選択されたヒト免疫グロブリンＶＬフレームワーク配列またはＶＨフレームワーク配列の中で最も共通して現れるアミノ酸残基に当たるフレームワークである。一般的に、その選択されたヒト免疫グロブリンＶＬ配列またはＶＨ配列は可変ドメイン配列のサブグループに由来する。一般的に、その配列サブグループはＫａｂａｔらの著作に見られるようなサブグループである。ＶＬについての１つの実施形態ではそのサブグループはＫａｂａｔらの著作に見られるようなサブグループ・カッパＩである。ＶＨについての１つの実施形態ではそのサブグループはＫａｂａｔらの著作に見られるようなサブグループＩＩＩである。
【００７８】
その受容側がヒト免疫グロブリンに由来する場合、ヒトフレームワーク配列のコレクションの中の様々なヒトフレームワーク配列と供給側フレームワーク配列を整列させることによってその供給側フレームワーク配列に対する相同性に基づいて選択されるヒトフレームワーク配列を選択してもよく、最も相同的なフレームワーク配列を受容側として選択してもよい。受容側ヒトフレームワークは公開データベースで入手可能であるヒト抗体生殖系列配列に由来してよい、またはその配列から得られてよい。
【００７９】
１つの実施形態では本明細書におけるヒトコンセンサスフレームワークはＶＨサブグループＶＩＩコンセンサスフレームワーク配列及び／またはＶＬカッパサブグループＩコンセンサスフレームワーク配列に由来する、またはそれらのコンセンサスフレームワーク配列から得られる。
【００８０】
１つの実施形態では抗Ｄ因子抗体の作製に使用されるヒトフレームワークテンプレートはＶＨ鎖用のＶＩ−４．１ｂ＋（ＶＨ７ファミリー）とＪＨ４ｄの組合せ及び／またはＶＬ鎖用のＤＰＫ４（ＶκＩファミリー）及びＪＫ２の組合せを含むテンプレートに由来するフレームワーク配列を含み得る。
【００８１】
受容側は配列に関してヒト免疫グロブリンに由来するものであれ、ヒトコンセンサスフレームワークに由来するものであれ選択されたヒトフレームワーク配列と同一であり得るが、本発明は受容側配列がそのヒト免疫グロブリン配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列と比較して前から存在するアミノ酸置換を含み得ることを企図する。これらの前から存在する置換は最小限であることが好ましく、通常はヒト免疫グロブリン配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列と比較してわずかに４か所、３か所、２か所、または１か所のアミノ酸差異である。
【００８２】
非ヒト抗体の超可変領域残基がＶＬ受容側ヒトフレームワーク及び／またはＶＨ受容側ヒトフレームワークに組み込まれる。例えば、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲ残基、Ｃｈｏｔｈｉａ超可変ループ残基、Ａｂｍ残基、及び／または接触残基に相当する残基を組み込むことができる。任意選択で次のような拡張超可変領域残基が組み込まれる：２４〜３６または２４〜３４（Ｌ１）、４６〜５６または５０〜５６（Ｌ２）及び８９〜９７（Ｌ３）、２６〜３５Ｂ（Ｈ１）、５０〜６５、４７−６５または４９〜６５（Ｈ２）及び９３〜１０２、９４〜１０２、または９５〜１０２（Ｈ３）。
【００８３】
１つの態様では本発明の抗Ｄ因子抗体または抗体変異体は軽鎖ドメイン及び重鎖可変ドメインを含む。１つの態様では本発明の基準抗Ｄ因子抗体は配列番号３の軽鎖可変ドメインを含む。１つの態様では本発明の基準抗Ｄ因子抗体は配列番号４の重鎖可変ドメインを含む。
【００８４】
さらに、抗Ｄ因子抗体はその抗体がＤ因子結合能を保持することを条件としてあらゆる適切な定常ドメイン配列を含み得る。例えば、幾つかの実施形態では本発明の抗Ｄ因子抗体は重鎖定常ドメインの少なくとも一部を含む。１つの実施形態では本発明の抗Ｄ因子抗体はα重鎖、δ重鎖、ε重鎖、γ重鎖、またはμ重鎖のうちの１つまたはそれらの組合せのどちらかの重鎖定常ドメインを含む。免疫グロブリンはそれらの重鎖の定常ドメイン（ＣＨ）のアミノ酸配列に応じて異なるクラスまたはアイソタイプに指定され得る。それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる重鎖を有する５クラスの免疫グロブリンＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭが存在する。γクラスとαクラスはＣＨ配列と機能の比較的にわずかな差異に基づいてさらにサブクラスに分割され、例えば、ヒトは次のサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２を発現する。１つの実施形態では本発明の抗Ｄ因子抗体はエフェクター機能（例えば、結合親和性）に対して所望の効果を生じるアミノ酸位置に置換を含む重鎖定常ドメインを含む。１つの実施形態では本発明の抗Ｄ因子抗体はエフェクター機能（例えば、結合親和性）に対して効果を生じないアミノ酸位置に置換を含む重鎖定常ドメインを含む。１つの実施形態では本発明の抗Ｄ因子抗体はＩｇＧタイプ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）の重鎖定常ドメインを含み、且つ、位置１１４（Ｋａｂａｔ番号付け；ＥＵ番号付けにおける１１８と同等）、位置１６８（Ｋａｂａｔ番号付け；ＥＵ番号付けにおける１７２と同等）、位置１７２（Ｋａｂａｔ番号付け；ＥＵ番号付けにおける１７６と同等）及び／または位置２２８（ＥＵ番号付け）に置換をさらに含む。１つの実施形態では本発明の抗Ｄ因子抗体はＩｇＧ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）タイプの重鎖定常ドメインを含み、位置１１４に置換をさらに含んで位置１１４がシステイン（Ｃ）またはアラニン（Ａ）であり、位置１６８がシステイン（Ｃ）またはアラニン（Ａ）であり、位置１７２がシステイン（Ｃ）またはアラニン（Ａ）であり、且つ／または位置２２８がプロリン（Ｐ）、アルギニン（Ｒ）またはセリン（Ｓ）である。
【００８５】
さらに、例えば幾つかの実施形態では本発明の抗Ｄ因子抗体は軽鎖定常ドメインの少なくとも一部を含む。１つの実施形態では、任意の脊椎動物種の軽鎖はそれらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいてカッパ及びラムダと呼ばれる２つの明確に異なるタイプのうちの一方に指定され得るので本発明の抗Ｄ因子抗体はカッパ軽鎖またはラムダ軽鎖の一方またはそれらの組合せのどちらかの軽鎖定常ドメインを含む。１つの実施形態では本発明の抗Ｄ因子抗体はエフェクター機能（例えば、結合親和性）に対して所望の効果を生じるアミノ酸位置に置換を含む軽鎖定常ドメインを含む。１つの実施形態では本発明の抗Ｄ因子抗体はエフェクター機能（例えば、結合親和性）に対して効果を生じないアミノ酸位置に置換を含む軽鎖定常ドメインを含む。１つの実施形態では本発明の抗Ｄ因子抗体はカッパタイプの軽鎖定常ドメインを含み、位置１１０、位置１４４、位置１４６及び／または位置１６８（Ｋａｂａｔ番号付け）に置換をさらに含む。１つの実施形態では本発明の抗Ｄ因子抗体はカッパタイプの軽鎖定常ドメインを含み、位置１１０に置換をさらに含んで位置１１０がシステイン（Ｃ）またはバリン（Ｖ）であり、位置１４４に置換をさらに含んで位置１４４がシステイン（Ｃ）またはアラニン（Ａ）であり、位置１４６に置換をさらに含んで位置１４６がイソロイシン（Ｉ）またはバリン（Ｖ）であり、及び／または位置１６８に置換をさらに含んで位置１６８がシステイン（Ｃ）またはセリン（Ｓ）である。
【００８６】
ヒト化抗Ｄ因子抗体をはじめとする親抗Ｄ因子抗体または基準抗Ｄ因子抗体が改変されて改変抗Ｄ因子抗体または抗Ｄ因子抗体変異体が作製され得る。１つの実施形態ではそれらの改変抗Ｄ因子抗体及びそれらの変異体は親抗体に対して改善された物理的特性、化学的特性、生物学的特性、または同質特性を有し得る。
【００８７】
１つの実施形態では本発明の抗体は１か所以上のアミノ酸変化（例えば、置換）を親抗体の超可変領域のうちの１つ以上の領域に含む。あるいは、または加えて、フレームワーク領域残基の１か所以上の変化（例えば、置換）が親抗体に導入され得る。改変されるフレームワーク領域残基の例には抗原に直接的に非共有結合する残基（Ａｍｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８６）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３３：  ７４７−７５３）、ＣＤＲの立体構造と相互作用する／その立体構造をもたらす残基（Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９６：  ９０１−９１７）、及び／またはＶＬ−ＶＨ接触面（欧州特許第２３９４００（Ｂ１）号明細書）に関わる残基が含まれる。ある特定の実施形態ではそのようなフレームワーク領域残基のうちの１つ以上の残基の改変によって抗体の抗原に対する結合親和性の増強が生じる。例えば、約１個から約５個までのフレームワーク残基が本発明のこの実施形態において変更され得る。改変されるフレームワーク領域残基またはＨＶＲ領域残基の例には改変によって脱アミド化変異体の形成が起こる部位（例えば、アスパラギン酸（ＤまたはＡｓｐ）に改変されるアスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）残基）、酸化変異体の形成が起こる部位（例えば、スルホンまたはスルフオキシドに改変されるメチオニン（ＭまたはＭｅｔ）残基及び／またはトリプトファン（ＷまたはＴｒｐ）残基）、またはピログルタミン酸変異体の形成が起こる部位（例えば、ピログルタミン酸に改変されるグルタミン（ＱまたはＧｌｎ）残基）が含まれる。改変されるフレームワーク領域残基またはＨＶＲ領域残基の例には可能性がある脱アミド化部位（すなわちアスパラギン（ＮまたはＡｓｎ））、酸化部位（すなわちメチオニン（ＭまたはＭｅｔ）またはトリプトファン（ＷまたはＴｒｐ））またはピログルタミン酸変換部位（すなわちグルタミン（ＱまたはＧｌｎ））が含まれ、そのような部位での改変はそれぞれ脱アミド化及び／または酸化及び／またはピログルタミン酸変換を防止する。
【００８８】
脱アミド化変異体の形成を防止するためにはアスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）をアラニン（ＡまたはＡｌａ）、グルタミン（ＱまたはＧｌｎ）またはセリン（ＳまたはＳｅｒ）に変異させてよい。酸化変異体の形成を防止するためにはメチオニン（Ｍｅｔ）またはトリプトファン（ＷまたはＴｒｐ）をロイシン（Ｌ）またはイソロイシン（Ｉ）に変異させてよい。ピログルタミン酸変異体の形成を防止するためにはグルタミン（ＱまたはＧｌｎ）をグルタミン酸（ＥまたはＧｌｕ）に変異させてよい。（Ａｍｐｈｌｅｔｔ，  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ９：１−１４０  （１９９６））。あるいは、または加えて、フレームワーク領域残基の１か所以上の変化（例えば、置換）が親抗体のＦｃ領域中に存在し得る。
【００８９】
そのような改変抗体の作製の１つの有用な方法は「アラニンスキャニング突然変異形成」と呼ばれる（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ  （１９８９）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５）。この方法では超可変領域残基のうちの１つ以上をアラニン残基またはポリアラニン残基によって置換してそれらのアミノ酸の抗原との相互作用に影響を与える。次にそれらの置換に対して機能感受性を示す超可変領域残基は、それらの置換部位に追加の突然変異または他の突然変異を導入することにより精選される。したがって、アミノ酸配列変化を導入するための部位が予め決められているが、その突然変異それ自体の性質は必ずしも予め決められていない。この方法で作製されたａｌａ突然変異体が本明細書に記載されるようなそれらの突然変異体の生物活性（すなわち、結合親和性または溶血アッセイ）についてスクリーニングされる。
【００９０】
抗体またはそれらの断片（例えば抗原結合断片）の生物学的特性のずっとより実質的な改変は、（ａ）置換領域の、例えば、シート状またはらせん状立体構造としてのポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位におけるその分子の電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖の大きさの維持に対する効果に関して著しくことなる置換を選択することで達成される。天然残基は共通の側鎖特性に基づいて次のグループに分類される：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、
（５）鎖の方向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、及び
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【００９１】
非保存的置換はこれらのクラスのうちの１つのクラスのメンバーを別のクラスのものに変更することを必要とする。
【００９２】
別の実施形態では改変に選ばれた部位が改変され、改善された結合親和性を有する改変体がファージディスプレイによって選択される。
【００９３】
アミノ酸配列突然変異体または改変アミノ酸配列をコードする核酸分子が当技術分野において知られている様々な方法によって調製される。これらの方法には以前に調製された親抗体の変異体版または非変異体版のオリゴヌクレオチド介在性（または部位特異的）突然変異形成、ＰＣＲ突然変異形成、及びカセット突然変異形成が含まれるがこれらに限定されない。突然変異体または変異体または改変アミノ酸配列を作製するための１つの方法は部位特異的突然変異形成である（例えば、Ｋｕｎｋｅｌ  （１９８５）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８２：４８８を参照されたい）。
【００９４】
ある特定の実施形態では改変抗体は単一の超可変領域残基が置換されているだけである。他の実施形態では親抗体の超可変領域残基のうちの２つ以上の残基が置換されており、例えば約２か所から約１０か所の超可変領域置換がある。通常、改変抗体は親抗体の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインのどちらかのアミノ酸配列と少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、及び最も好ましくは少なくとも９５％の（定義節において上で定義された）アミノ酸配列の同一性または類似性を有しているアミノ酸配列を有する。
【００９５】
改変抗体の作製に続いて親抗体と比較したその分子の生物活性が決定される。上に記したように、この生物活性の決定は抗体変異体またはその断片（例えば抗原結合断片）の結合親和性及び／または他の生物学的活性の決定を含み得る。本発明の１つの実施形態では一団の改変抗体が調製され、Ｄ因子またはその断片のような抗原に対する結合親和性についてスクリーニングされる。この最初のスクリーニングから選択された抗体突然変異体または改変抗体のうちの１つ以上は、その抗体変異体またはその断片（例えば抗原結合断片）が例えば前臨床研究に実に有用であることを確認するための１種類以上の追加生物活性アッセイの対象とされてもよい。
【００９６】
本明細書に記載される改変抗Ｄ因子抗体はしばしばその改変抗体の使用目的に応じて追加改変の対象とされ得る。そのような改変はアミノ酸配列の追加変更、異種性ポリペプチドへの融合、及び／または下で説明されるような共有結合性修飾を含み得る。アミノ酸配列変化に関しては例となる改変は上で説明されている。例えば、改変抗体の適正な立体構造の維持に関与していない任意のシステイン残基もその分子の酸化安定性を改善し、異常架橋を防止するために一般的にはセリンで置換され得る。逆に、抗体の安定性（特に抗体がＦｖ断片などの抗体断片である場合）を改善するためにシステイン結合がその抗体に加えられ得る。
【００９７】
別のタイプのアミノ酸突然変異体は変更されたグリコシル化パターンを有する。これは抗体に見出される１か所以上の炭水化物部分を欠失すること、及び／または抗体には存在しない１か所以上のグリコシル化部位を付加することによって達成され得る。抗体または抗体断片（例えば抗原結合断片）のグリコシル化はＮ結合型かＯ結合型のどちらかであることが典型的である。Ｎ結合はアスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。Ｘがプロリンを除く任意のアミノ酸であるトリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−トレオニンはアスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。したがって、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のうちのどちらかの存在が潜在的なグリコシル化部位を形成する。Ｏ結合グリコシル化はヒドロキシアミノ酸、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンも使用され得るが最も一般的にはセリンまたはトレオニンへの糖Ｎ−アセチルグルコサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの１つの結合を指す。抗体へのグリコシル化部位の付加はそのアミノ酸配列が上記の（Ｎ結合グリコシル化部位の）トリペプチド配列のうちの１つ以上を含むようにそのアミノ酸配列を変更することによって都合よく達成される。その変更は元の抗体の（Ｏ結合グリコシル化部位の）配列への１個以上のセリン残基またはトレオニン残基の付加、または１個以上のセリン残基またはトレオニン残基による置換によっても行われ得る。
【００９８】
本発明の抗体及び抗体変異体は様々な非タンパク質性高分子のうちの１つに抗体を結合させることによっても共有結合的に改変され得る。それらの抗体高分子複合体は高分子を用いて抗体を誘導体化する任意の適切な技術を用いて作製され得る。本発明は抗体または抗体断片と高分子との間のいかなる特定のタイプの結合を利用する複合体にも限定されないことが理解される。
【００９９】
１つの態様では本発明の複合体には親抗体上の特定の部位または複数の特定の部位に高分子が共有結合している種、すなわち、高分子結合が親抗体または抗体断片中の特定の領域または特定のアミノ酸残基または複数の特定の残基を標的としている種が含まれる。高分子の部位特異的結合は最も一般的には親抗体または抗体断片中のシステイン残基への結合によって達成される。そのような実施形態ではその結合化学は、例えば、親抗体においてジスルフィド架橋の中にないシステイン残基の遊離スルフヒドリル基を利用することができる。その高分子は親抗体上の遊離スルフヒドリル基または遊離チオール基と特異的に反応することが可能であるマレイミド官能基、スルフヒドリル官能基、チオール官能基、トリフラート官能基、テシラート官能基、アジリジン官能基、エキシラン官能基、及び５−ピリジル官能基などの任意の官能基に関して活性化され得る。高分子は、米国特許番号第４，１７９，３３７号明細書、第７，１２２，６３６号明細書、及びＪｅｖｓｅｖａｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｊ．  ５：１１３−１２８に記載されるプロトコル及び系のような選択された結合系の化学に適切なあらゆるプロトコルを用いて親抗体に結合され得る。
【０１００】
１つの実施形態では親抗体中にもともと存在する１個以上のシステイン残基が高分子複合体化用の結合部位として使用される。別の実施形態では高分子の特定の結合部位または複数の特定の結合部位を提供することを目的に１個以上のシステイン残基が親抗体中の選択部位または複数の選択部位に加えられる。
【０１０１】
１つの態様では本発明は抗体断片高分子複合体であって、その抗体断片がＦａｂであり、且つ、その高分子がそのＦａｂ断片の軽鎖または重鎖の中の通常であれば軽鎖と重鎖を連結する鎖間ジスルフィド架橋を形成する１個以上のシステイン残基に結合している抗体断片高分子複合体を包含する。
【０１０２】
別の態様では本発明は抗体断片高分子複合体であって、その抗体断片がＦａｂ’であり、その高分子がそのＦａｂ’断片のヒンジ領域に向けらてる抗体断片高分子複合体を包含する。１つの実施形態では抗体断片のヒンジ領域中にもともと存在する１個以上のシステイン残基がその高分子の結合のために使用される。別の実施形態では高分子の特定の結合部位または複数の特定の結合部位を提供することを目的に１個以上のシステイン残基がＦａｂ’断片のヒンジ領域に加えられる。１つの実施形態では本発明の抗Ｄ因子抗体変異体Ｆａｂ断片は高分子複合体化用の１つの結合部位を提供することを目的にＣ’末端に１個のシステインを付加することによって改変される。別の実施形態では本発明の抗Ｄ因子抗体変異体Ｆａｂ断片は高分子複合体化用の２つの結合部位を提供することを目的にＣ’末端に４個の追加の残基Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（配列番号２１）を付加することによって改変される。
【０１０３】
１つの一般的に用いられる抗体複合体化はＰＥＧ化であり、１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）高分子が抗体の定常領域に共有結合する。米国特許番号第４，１７９，３３７号明細書、第７，１２２，６３６号明細書を参照されたい。様々なサイズ（例えば、約５００Ｄから約３００，０００Ｄまで）及び形状（例えば、直鎖状または分岐状）のＰＥＧ高分子が知られており、当分野において広く使用されている。本発明に有用なそれらの高分子は（例えば、日本油脂、Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｃｒｅａｔｉｖｅ  ＰＥＧＷｏｒｋｓから）商業的に入手可能であり、または従来の化学的手法を用いて市販の出発物質から調製可能である。ＰＥＧ化は抗体薬品の物理的及び化学的特性を変え、改善された安定性、低下した免疫原性、延長した循環寿命、ならびに増加した滞留時間などの改善された薬物動態挙動を生じ得る。
【０１０４】
親和性及び生物活性
抗Ｄ因子抗体に関して望ましいと本明細書において特定される特徴を有する抗体はＤ因子結合親和性及びＤ因子阻害活性などの望ましい特性についてインビトロまたはインビボでスクリーニングされ得る。
【０１０５】
ａ．親和性
１つの態様では本発明は、抗Ｄ因子抗体変異体を作製する元である親抗Ｄ因子抗体と競合するそれら抗Ｄ因子抗体変異体を提供する。親抗Ｄ因子抗体と同じエピトープに結合する抗Ｄ因子抗体変異体も提供される。
【０１０６】
抗Ｄ因子抗体変異体が基準抗Ｄ因子抗体によって結合されるヒトＤ因子上の同じエピトープに結合するか決定するためにクロスブロッキングアッセイを行うことができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ  （１９８８））。あるいは、抗Ｄ因子抗体が目的のエピトープに結合するか決定するためにエピトープマッピングを行うことができる（Ｃｈａｍｐｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７０：  １３８８−１３９４）。抗体親和性、例えば、ヒトＤ因子に対する抗体親和性は実施例においてより詳しく説明される表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイをはじめとする標準的方法を用いて決定され得る。
【０１０７】
１つの態様では本発明の抗Ｄ因子抗体変異体のＤ因子結合親和性はその抗Ｄ因子抗体変異体が作製される元である親抗Ｄ因子抗体のＤ因子結合親和性と同等である。幾つかの態様では本発明の抗Ｄ因子抗体変異体のＤ因子結合親和性は親抗Ｄ因子抗体のＤ因子結合親和性の１０倍以内、７倍以内、５倍以内、２倍以内、または１倍以内である。
【０１０８】
１つの実施形態では本発明はＤ因子に対する一価型の抗Ｄ因子抗体の親和性（例えば、Ｄ因子に対するＦａｂ断片としての抗体の親和性）が２０ｎＭ（２０×１０−９Ｍ）であるか、またはそれより良好な抗体を提供する。別の実施形態では本発明はＤ因子に対する一価型の抗Ｄ因子抗体の親和性（例えば、Ｄ因子に対するＦａｂ断片としての抗体の親和性）が１０ｎＭ（１０×１０−９Ｍ）であるか、またはそれより良好な抗体を提供する。別の実施形態では本発明はＤ因子に対する一価型の抗Ｄ因子抗体の親和性（例えば、Ｄ因子に対するＦａｂ断片としての抗体の親和性）が１．０ｎＭ（１．０×１０−９Ｍ）であるか、またはそれより世良好な抗体を提供する。別の実施形態では本発明はＤ因子に対する一価型の抗Ｄ因子抗体の親和性（例えば、Ｄ因子に対するＦａｂ断片としての抗体の親和性）が０．５ｎＭ（０．５×１０−９Ｍ）であるか、またはそれより良好な抗体を提供する。別の実施形態では本発明はＤ因子に対する一価型の抗Ｄ因子抗体の親和性（例えば、Ｄ因子に対するＦａｂ断片としての抗体の親和性）が１．０ｐＭ（１．０×１０−１２Ｍ）であるか、またはそれより良好な抗体を提供する。別の実施形態では本発明はＤ因子に対する一価型の抗Ｄ因子抗体の親和性（例えば、Ｄ因子に対するＦａｂ断片としての抗体の親和性）が０．５ｐＭ（０．５×１０−１２Ｍ）であるか、またはそれより良好な抗体を提供する。
【０１０９】
別の実施形態では本発明はＤ因子に対する二価型の抗Ｄ因子抗体の親和性（例えば、Ｄ因子に対するＩｇＧとしての抗体の親和性）が１０．０ｎＭ（１０．０×１０−９Ｍ）であるか、またはそれより良好な抗体を提供する。別の実施形態では本発明はＤ因子に対する二価型の抗Ｄ因子抗体の親和性（例えば、Ｄ因子に対するＩｇＧとしての抗体の親和性）が５．０ｎＭ（５．０×１０−９Ｍ）であるか、またはそれより良好な抗体を提供する。別の実施形態では本発明はＤ因子に対する二価型の抗Ｄ因子抗体の親和性（例えば、Ｄ因子に対するＩｇＧとしての抗体の親和性）が１．０ｎＭ（１．０×１０−９Ｍ）であるか、またはそれより良好な抗体を提供する。別の実施形態では本発明はＤ因子に対する二価型の抗Ｄ因子抗体の親和性（例えば、Ｄ因子に対するＩｇＧとしての抗体の親和性）が０．５ｎＭ（０．５×１０−９Ｍ）であるか、またはそれより良好な抗体を提供する。別の実施形態では本発明はＤ因子に対する二価型の抗Ｄ因子抗体の親和性（例えば、Ｄ因子に対するＩｇＧとしての抗体の親和性）が５．０ｐＭ（５．０×１０−１２Ｍ）であるか、またはそれより良好な抗体を提供する。別の実施形態では本発明はＤ因子に対する二価型の抗Ｄ因子抗体の親和性（例えば、Ｄ因子に対するＩｇＧとしての抗体の親和性）が２．０ｐＭ（２．０×１０−１２Ｍ）であるか、またはそれより良好な抗体を提供する。別の実施形態では本発明はＤ因子に対する二価型の抗Ｄ因子抗体の親和性（例えば、Ｄ因子に対するＩｇＧとしての抗体の親和性）が１．０ｐＭ（１．０×１０−１２Ｍ）であるか、またはそれより良好な抗体を提供する。別の実施形態では本発明はＤ因子に対する二価型の抗Ｄ因子抗体の親和性（例えば、Ｄ因子に対するＩｇＧとしての抗体の親和性）が０．５ｐＭ（０．５×１０−１２Ｍ）であるか、またはそれより良好な抗体を提供する。
【０１１０】
別の実施形態では本発明はＤ因子に対する一価型の抗Ｄ因子抗体の親和性（例えば、Ｄ因子に対するＦａｂ断片としての抗体の親和性）が０．５ｍＭ（０．５×１０−６Ｍ）と０．５ｐＭ（０．５×１０−１２Ｍ）との間である抗体を提供する。別の実施形態では本発明はＤ因子に対する一価型の抗Ｄ因子抗体の親和性（例えば、Ｄ因子に対するＦａｂ断片としての抗体の親和性）が１５ｎＭ（１５×１０−９Ｍ）と０．１ｎＭ（０．１×１０−９Ｍ）との間である抗体を提供する。別の実施形態では本発明はＤ因子に対する一価型の抗Ｄ因子抗体の親和性（例えば、Ｄ因子に対するＦａｂ断片としての抗体の親和性）が５．５ｎＭ（５．５×１０−９Ｍ）と１ｎＭ（１×１０−９Ｍ）との間である抗体を提供する。別の実施形態では本発明はＤ因子に対する一価型の抗Ｄ因子抗体の親和性（例えば、Ｄ因子に対するＦａｂ断片としての抗体の親和性）が０．５ｐＭ（０．５×１０−１２Ｍ）と５０ｐＭ（５×１０−１１Ｍ）との間である抗体を提供する。
【０１１１】
別の実施形態では本発明はＤ因子に対する二価型の抗Ｄ因子抗体の親和性（例えば、Ｄ因子に対するＩｇＧとしての抗体の親和性）が０．５ｍＭ（０．５×１０−６Ｍ）と０．５ｐＭ（０．５×１０−１２Ｍ）との間である抗体を提供する。別の実施形態では本発明はＤ因子に対する二価型の抗Ｄ因子抗体またはその抗体変異体の親和性（例えば、Ｄ因子に対するＩｇＧとしての抗体の親和性）が１０ｎＭ（１０×１０−９Ｍ）と０．０５ｎＭ（０．０５×１０−９Ｍ）との間である抗体を提供する。別の実施形態では本発明はＤ因子に対する二価型の抗Ｄ因子抗体の親和性（例えば、Ｄ因子に対するＩｇＧとしての抗体の親和性）が５．５ｎＭ（５．５×１０−９Ｍ）と１ｎＭ（１×１０−９Ｍ）との間である抗体を提供する。別の実施形態では本発明はＤ因子に対する二価型の抗Ｄ因子抗体の親和性（例えば、Ｄ因子に対するＩｇＧとしての抗体の親和性）が０．５ｐＭ（０．５×１０−１２Ｍ）と５０ｐＭ（５×１０−１１Ｍ）との間である抗体を提供する。
【０１１２】
別の実施形態では本発明はＤ因子に対する一価型の抗Ｄ因子抗体の親和性（例えば、Ｄ因子に対するＦａｂ断片としての抗体の親和性）が約１．４ｐＭ（１．４×１０−１２Ｍ）である抗体を提供する。別の実施形態では本発明はＤ因子に対する二価型の抗Ｄ因子抗体の親和性（例えば、Ｄ因子に対するＩｇＧとしての抗体の親和性）が約１．１ｐＭ（１．１×１０−１２Ｍ）である抗体を提供する。別の実施形態では本発明はＤ因子に対する一価型の抗Ｄ因子抗体の親和性（例えば、Ｄ因子に対するＦａｂ断片としての抗体の親和性）が約０．１９ｎＭ（０．１９×１０−９Ｍ）である抗体を提供する。別の実施形態では本発明はＤ因子に対する二価型の抗Ｄ因子抗体の親和性（例えば、Ｄ因子に対するＩｇＧとしての抗体の親和性）が約０．０８ｎＭ（０．０８×１０−９Ｍ）である抗体を提供する。別の実施形態では本発明はＤ因子に対する一価型の抗Ｄ因子抗体の親和性（例えば、Ｄ因子に対するＦａｂ断片としての抗体の親和性）が約１２．３ｎＭ（１２．３×１０−９Ｍ）である抗体を提供する。別の実施形態では本発明はＤ因子に対する二価型の抗Ｄ因子抗体の親和性（例えば、Ｄ因子に対するＩｇＧとしての抗体の親和性）が約９．０ｎＭ（９．０×１０−９Ｍ）である抗体を提供する。
【０１１３】
別の実施形態では本発明はＤ因子に対する一価型の抗Ｄ因子抗体の親和性（例えば、Ｄ因子に対するＦａｂ断片としての抗体の親和性）が約１．４ｐＭ（１．４×１０−１２Ｍ）±０．５である抗体を提供する。別の実施形態では本発明はＤ因子に対する二価型の抗Ｄ因子抗体の親和性（例えば、Ｄ因子に対するＩｇＧとしての抗体の親和性）が約１．１ｐＭ（１．１×１０−１２Ｍ）±０．６抗体を提供する。別の実施形態では本発明はＤ因子に対する一価型の抗Ｄ因子抗体の親和性（例えば、Ｄ因子に対するＦａｂ断片としての抗体の親和性）が約０．１９ｎＭ（０．１９×１０−９Ｍ）±．０１である抗体を提供する。別の実施形態では本発明はＤ因子に対する二価型の抗Ｄ因子抗体の親和性（例えば、Ｄ因子に対するＩｇＧとしての抗体の親和性）が約０．０８ｎＭ（０．０８×１０−９Ｍ）±０．０１である抗体を提供する。別の実施形態では本発明はＤ因子に対する一価型の抗Ｄ因子抗体の親和性（例えば、Ｄ因子に対するＦａｂ断片としての抗体の親和性）が約１２．３ｎＭ（１２．３×１０−９Ｍ）±２である抗体を提供する。別の実施形態では本発明はＤ因子に対する二価型の抗Ｄ因子抗体の親和性（例えば、Ｄ因子に対するＩｇＧとしての抗体の親和性）が約９．０ｎＭ（９．０×１０−９Ｍ）±１である抗体を提供する。
【０１１４】
別の実施形態では抗Ｄ因子抗体はその一価型でＤ因子に対して約１．４ｐＭ（１．４×１０−１２Ｍ）±２の親和性（例えば、Ｄ因子に対するＦａｂ断片としての抗体の親和性）を有し得る。別の実施形態では抗Ｄ因子抗体はその二価型でＤ因子に対して約１．１ｐＭ（１．１×１０−１２Ｍ）±２の親和性（例えば、Ｄ因子に対するＩｇＧとしての抗体の親和性）を有し得る。別の実施形態では抗Ｄ因子抗体はその一価型でＤ因子に対して約０．１９ｎＭ（０．１９×１０−９Ｍ）±２である親和性（例えば、Ｄ因子に対するＦａｂ断片としての抗体の親和性）を有し得る。別の実施形態では抗Ｄ因子抗体またはその抗体変異体はその二価型でＤ因子に対して約０．０８ｎＭ（０．０８×１０−９Ｍ）±２である親和性（例えば、Ｄ因子に対するＩｇＧとしての抗体の親和性）を有し得る。別の実施形態では抗Ｄ因子抗体はその一価型でＤ因子に対して約１２．３ｎＭ（１２．３×１０−９Ｍ）±２である親和性（例えば、Ｄ因子に対するＦａｂ断片としての抗体の親和性）を有し得る。別の実施形態では抗Ｄ因子抗体はその二価型でＤ因子に対して約９．０ｎＭ（９．０×１０−９Ｍ）±２である親和性（例えば、Ｄ因子に対するＩｇＧとしての抗体の親和性）を有し得る。
【０１１５】
当技術分野においてよく確立されているように、リガンドの受容体に対するそのリガンドの結合親和性を様々なアッセイのうちのいずれかを用いて決定することができ、様々な定量値で表すことができる。したがって、１つの実施形態ではその結合親和性はＫＤ値として表され、（例えば、アビディティー効果の最小化による）固有の結合親和性を反映する。結合親和性は無細胞環境であれ、細胞結合型環境であれ、インビトロで測定されることが一般的であり、好ましい。本明細書においてさらに詳しく説明されるように、結合親和性の差異倍率は、同様のアッセイ条件下で決定される（例えば、Ｆａｂ型の）ヒト化抗体の一価結合親和性値と（例えば、Ｆａｂ型の）基準／対照抗体（例えば、供給側超可変領域配列を有するマウス抗体）の一価結合親和性値の比率として定量され得る。したがって、１つの実施形態では結合親和性の差異倍率はＦａｂ型のヒト化抗体と基準／対照Ｆａｂ抗体のＫＤ値の比率として決定される。例えば、１つの実施形態では本発明の抗体（Ａ）が基準抗体（Ｍ）の親和性よりも「３倍低い」親和性を有している場合、ＡのＫＤ値が３倍であればＭのＫＤ値が１倍であり、ＭのＫＤに対するＡのＫＤの比率は３：１である。逆に、１つの実施形態において本発明の抗体（Ｃ）が基準抗体（Ｒ）の親和性よりも「３倍高い」親和性を有する場合、ＣのＫＤ値が１倍である場合にＲのＫＤ値が３倍であり、ＲのＫＤに対するＣのＫＤの比率が１：３である。例えばＢｉａｃｏｒｅ、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）及びＥＬＩＳＡをはじめとする本明細書に記載されるアッセイを含む当技術分野において知られている多数のアッセイのうちのいずれかを用いて結合親和性測定結果を得ることができる。
【０１１６】
さらに、本発明の抗体のＫＤ値は用いられる特定のアッセイの条件に応じて変化し得る。例えば、１つの実施形態では結合親和性測定結果はＦａｂまたは抗体が固定化され、そしてリガンド、すなわち、Ｄ因子の結合が測定されるアッセイ、あるいはＦａｂまたは抗体のリガンド、すなわちＤ因子が固定化され、そしてＦａｂまたは抗体の結合が測定されるアッセイにおいて取得され得る。１つの実施形態では結合親和性測定結果は再生条件が（１）ｐＨ１．５の１０ｍＭのグリシンまたは４ＭのＭｇＣｌ２、及び（２）ｐＨ１．５、ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、及びｐＨ７．２を含むｐＨ１．０とｐＨ７．５の間のｐＨを含み得るアッセイにおいて取得され得る。１つの実施形態では結合親和性測定結果は結合条件が（１）ＰＢＳまたはＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水及び（２）ツイーン−２０、すなわち０．１％のツイーン−２０を含み得るアッセイにおいて取得され得る。１つの実施形態では結合親和性測定結果はリガンド、すなわちＤ因子の起源が市販の起源の物であり得るアッセイにおいて取得され得る。１つの実施形態では結合親和性測定結果は（１）Ｆａｂまたは抗体が固定化され、そしてリガンド、すなわちＤ因子の結合が測定され、（２）再生条件がｐＨ７．２で４ＭのＭｇＣｌ２を含み、且つ、（３）結合条件が０．１％のツイーン−２０を含有するｐＨ７．２のＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水を含むアッセイにおいて取得され得る。１つの実施形態では結合親和性測定結果は（１）リガンド、すなわちＤ因子が固定化され、そしてＦａｂまたは抗体の結合が測定され、（２）再生条件がｐＨ１．５で１０ｍＭのグリシンを含み、（３）結合条件がＰＢＳ緩衝液を含むアッセイにおいて取得され得る。
【０１１７】
ｂ．生物活性
抗Ｄ因子抗体またはその変異体もしくは断片（例えば抗原結合断片）がＤ因子に結合し、且つ、生物学的効果、例えば、副経路溶血の抑制を発揮することができるか決定するために実施例２に記載されるアッセイを含むウサギＲＢＣを使用する溶血抑制アッセイを用いることができる。そのような溶血抑制は標準的アッセイ（Ｋｏｓｔａｖａｓｉｌｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｊ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５８：１７６３−７２；  Ｗｉｅｓｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｎａｔｕｒｅ  ４４４：１５９−６０）を用いて決定され得る。そのようなアッセイでは血清または血漿を用いて補体活性化を開始することができる。血清または血漿中のＤ因子の適切な濃度（Ｐａｓｃｕａｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ３４：５２９−５３６；  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｆａｃｔｓ  Ｂｏｏｋ，  Ｂｅｒｎａｒｄ  Ｊ．  Ｍｏｒｌｅｙ  ａｎｄ  Ｍａｒｋ  Ｊ．  Ｗａｌｐｏｒｔ，  ｅｄｉｔｏｒｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  （２０００）、  Ｂａｒｎｕｍ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８４）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ６７：  ３０３−３０９）はＰａｓｃｕａｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ３４：５２９−５３６及びＢａｒｎｕｍ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８４）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６７：３０３−３０９などの参照文献に記載されている方法を含む当技術分野において知られている方法に従って日常的に決定され得る。本発明は概してＤ因子と関連する生物学的活性を阻害することができる抗体に関する。例えば、１８μｇ／ｍｌ（血中のヒトＤ因子のモル濃度の約１．５倍と等しくＤ因子に対する抗Ｄ因子抗体の比率が約１．５：１）の濃度で抗体による副経路補体活性の著しい阻害を観察することができる（例えば、米国特許番号第号明細書６，９５６，１０７を参照されたい）。
【０１１８】
１つの実施形態では本発明は抗体Ｆａｂ断片が３０ｎＭ未満のＩＣ５０値で副経路溶血を抑制するような抗Ｄ因子抗体を含む。１つの実施形態では本発明は抗体Ｆａｂ断片が１５ｎＭ未満のＩＣ５０値で副経路溶血を抑制するような抗Ｄ因子抗体を含む。１つの実施形態では本発明は抗体Ｆａｂ断片が１０ｎＭ未満のＩＣ５０値で副経路溶血を抑制するような抗Ｄ因子抗体を提供する。１つの実施形態では本発明は抗体Ｆａｂ断片が５ｎＭ未満のＩＣ５０値で副経路溶血を抑制するような抗Ｄ因子抗体を提供する。
【０１１９】
１つの実施形態では本発明は抗体Ｆａｂ断片が３０ｎＭと２ｎＭの間のＩＣ５０値で副経路溶血を抑制するような抗Ｄ因子抗体を提供する。１つの実施形態では本発明は抗体Ｆａｂ断片が２５ｎＭと７ｎＭの間のＩＣ５０値で副経路溶血を抑制するような抗Ｄ因子抗体を提供する。１つの実施形態では本発明は抗体Ｆａｂ断片が２０ｎＭと１２ｎＭの間のＩＣ５０値で副経路溶血を抑制するような抗Ｄ因子抗体を提供する。１つの実施形態では本発明は抗体Ｆａｂ断片が３０ｎＭと１５ｎＭの間のＩＣ５０値で副経路溶血を抑制するような抗Ｄ因子抗体を提供する。１つの実施形態では本発明は抗体Ｆａｂ断片が１２ｎＭと８ｎＭの間のＩＣ５０値で副経路溶血を抑制するような抗Ｄ因子抗体を提供する。１つの実施形態では本発明は抗体Ｆａｂ断片が７ｎＭと２ｎＭの間のＩＣ５０値で副経路溶血を抑制するような抗Ｄ因子抗体を提供する。１つの実施形態では本発明は抗体Ｆａｂ断片が６ｎＭと３ｎＭの間のＩＣ５０値で副経路溶血を抑制するような抗Ｄ因子抗体を提供する。１つの実施形態では本発明は抗体Ｆａｂ断片が８ｎＭと５ｎＭの間のＩＣ５０値で副経路溶血を抑制するような抗Ｄ因子抗体を提供する。１つの実施形態では本発明は抗体Ｆａｂ断片が５ｎＭと２ｎＭの間のＩＣ５０値で副経路溶血を抑制するような抗Ｄ因子抗体を提供する。１つの実施形態では本発明は抗体Ｆａｂ断片が１０ｎＭと５ｎＭの間のＩＣ５０値で副経路溶血を抑制するような抗Ｄ因子抗体を提供する。１つの実施形態では本発明は抗体Ｆａｂ断片が８ｎＭと２ｎＭの間のＩＣ５５０値で副経路溶血を抑制するような抗Ｄ因子抗体を提供する。１つの実施形態では本発明は抗体Ｆａｂ断片が７ｎＭと３ｎＭの間のＩＣ５０値で副経路溶血を抑制するような抗Ｄ因子抗体を提供する。１つの実施形態では本発明は抗体Ｆａｂ断片が６ｎＭと４ｎＭの間のＩＣ５０値で副経路溶血を抑制するような抗Ｄ因子抗体を提供する。別の実施形態では本発明は抗体Ｆａｂ断片が約４．７ｎＭ±０．６ｎＭのＩＣ５０値で副経路溶血を抑制するような抗Ｄ因子抗体を提供する。別の実施形態では本発明は抗体Ｆａｂ断片が約６．４ｎＭ±０．６ｎＭのＩＣ５０値で副経路溶血を抑制するような抗Ｄ因子抗体を提供する。別の実施形態では本発明は抗体Ｆａｂ断片が約３．５ｎＭ±０．５ｎＭのＩＣ５０値で副経路溶血を抑制するような抗Ｄ因子抗体を提供する。別の実施形態では本発明は抗体Ｆａｂ断片が約４．４ｎＭ±１．５ｎＭのＩＣ５０値で副経路溶血を抑制するような抗Ｄ因子抗体を提供する。別の実施形態では本発明は抗体Ｆａｂ断片が約１０．２ｎＭ±０．８ｎＭのＩＣ５０値で副経路溶血を抑制するような抗Ｄ因子抗体を提供する。別の実施形態では本発明は抗体Ｆａｂ断片が約２３．９ｎＭ±５．０ｎＭのＩＣ５０値で副経路溶血を抑制するような抗Ｄ因子抗体を提供する。
【０１２０】
１つの実施形態では本発明は抗体Ｆａｂ断片が８０ｎＭ未満のＩＣ９０値で副経路溶血を抑制するような抗Ｄ因子抗体を提供する。１つの実施形態では本発明は抗体Ｆａｂ断片が５０ｎＭ未満のＩＣ９０値で副経路溶血を抑制するような抗Ｄ因子抗体を提供する。１つの実施形態では本発明は抗体Ｆａｂ断片が４０ｎＭ未満のＩＣ９０値で副経路溶血を抑制するような抗Ｄ因子抗体を提供する。１つの実施形態では本発明は抗体Ｆａｂ断片が２０ｎＭ未満のＩＣ９０値で副経路溶血を抑制するような抗Ｄ因子抗体を提供する。１つの実施形態では本発明は抗体Ｆａｂ断片が１５ｎＭ未満のＩＣ５０値で副経路溶血を抑制するような抗Ｄ因子抗体を提供する。
【０１２１】
１つの実施形態では本発明は抗体Ｆａｂ断片が８０ｎＭと１０ｎＭの間のＩＣ９０値で副経路溶血を抑制するような抗Ｄ因子抗体を提供する。１つの実施形態では本発明は抗体Ｆａｂ断片が７５ｎＭと１５ｎＭの間のＩＣ９０値で副経路溶血を抑制するような抗Ｄ因子抗体を提供する。１つの実施形態では本発明は抗体Ｆａｂ断片が７０ｎＭと２０ｎＭの間のＩＣ９０値で副経路溶血を抑制するような抗Ｄ因子抗体を提供する。１つの実施形態では本発明は抗体Ｆａｂ断片が６５ｎＭと２５ｎＭの間のＩＣ９０値で副経路溶血を抑制するような抗Ｄ因子抗体を提供する。１つの実施形態では本発明は抗体Ｆａｂ断片が６０ｎＭと３０ｎＭの間のＩＣ９０値で副経路溶血を抑制するような抗Ｄ因子抗体を提供する。１つの実施形態では本発明は抗体Ｆａｂ断片が５５ｎＭと３５ｎＭの間のＩＣ９０値で副経路溶血を抑制するような抗Ｄ因子抗体を提供する。１つの実施形態では本発明は抗体Ｆａｂ断片が５０ｎＭと４０ｎＭの間のＩＣ９０値で副経路溶血を抑制するような抗Ｄ因子抗体を提供する。１つの実施形態では本発明は抗体Ｆａｂ断片が８０ｎＭと７０ｎＭの間のＩＣ９０値で副経路溶血を抑制するような抗Ｄ因子抗体を提供する。１つの実施形態では本発明は抗体Ｆａｂ断片が５５ｎＭと２５ｎＭの間のＩＣ９０値で副経路溶血を抑制するような抗Ｄ因子抗体を提供する。１つの実施形態では本発明は抗体Ｆａｂ断片が１６ｎＭと１２ｎＭの間のＩＣ９０値で副経路溶血を抑制するような抗Ｄ因子抗体を提供する。別の実施形態では本発明は抗体Ｆａｂ断片が約１４．０ｎＭ±１．０ｎＭのＩＣ９０値で副経路溶血を抑制するような抗Ｄ因子抗体を提供する。別の実施形態では本発明は抗体Ｆａｂ断片が約３８．０ｎＭ±１１．０ｎＭのＩＣ９０値で副経路溶血を抑制するような抗Ｄ因子抗体を提供する。別の実施形態では本発明は抗体Ｆａｂ断片が約７２．６ｎＭ±４．８ｎＭのＩＣ９０値で副経路溶血を抑制するような抗Ｄ因子抗体を提供する。
【０１２２】
１つの実施形態では本発明は抗体Ｆａｂ断片が約０．０５：１（０．０５）から約１０：１（１０）、または約０．０９：１（０．０９）から約８：１（８）、または約０．１：１（０．１）から約６：１（６）、または約０．１５：１（０．１５）から約５：１（５）、または約０．１９：１（０．１９）から約４：１（４）、または約０．２：１（０．２）から約３：１（３）、または約０．３：１（０．３）から約２：１（２）、または約０．４：１（０．４）から約１：１（１）、または約０．５：１（０．５）から約１：２（０．５）、または約０．６：１（０．６）から約１：３（０．３３）、または約０．７：１（０．７）から約１：４（０．２５）、または約０．８：１（０．８）から約１：５（０．２）または約０．９：１（０．９）から約１：６（０．１７）のＤ因子に対する抗体のモル比で副経路溶血を抑制するような抗Ｄ因子抗体に関する。
【０１２３】
１つの実施形態では本発明にはヒト化抗Ｄ因子抗体の断片（例えば抗原結合断片）が含まれる。本発明の抗体断片は、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｄＡｂ、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、直鎖状抗体、単鎖抗体分子、ミニボディ、ディアボディ、または抗体断片から形成される多重特異性抗体であり得る。追加の実施形態では本発明は網膜の実質的に全体に浸透することが可能であるヒト化抗Ｄ因子抗体断片（例えば抗原結合断片）を提供する。さらに追加の実施形態では本発明は網膜全層に浸透することが可能であるヒト化抗Ｄ因子抗体断片（例えば抗原結合断片）を提供する。
【０１２４】
１つの実施形態では本発明には抗体Ｆａｂ断片が単回硝子体内注射による哺乳類（例えばヒト）の眼への投与後に少なくとも３日、５日、７日、１０日、または１２日の半減期を有するような抗Ｄ因子抗体が含まれる。別の実施形態では本発明には抗体Ｆａｂ断片が単回硝子体内注射による哺乳類（例えばヒト）の眼への投与後に少なくとも４０日間、４５日間、５０日間、５５日間、６０日間、６５日間、７０日間、７５日間、８０日間、８５日間、９０日間、９５日間、１００日間、１０５日間、１１０日間、または１１５日間にわたって副経路（ＡＰ）補体活性化を阻害するようなヒト化抗Ｄ因子抗体が含まれる。別の実施形態では本発明には副経路（ＡＰ）補体活性化を阻害する抗体Ｆａｂ断片の濃度が単回硝子体内注射による哺乳類（例えばヒト）の眼への投与後に少なくとも４０日間、４５日間、５０日間、５５日間、６０日間、６５日間、７０日間、７５日間、８０日間、または８５日間にわたって網膜組織内で維持されるようなヒト化抗Ｄ因子抗体が含まれる。別の実施形態では本発明には副経路（ＡＰ）補体活性化を阻害する抗体Ｆａｂ断片の濃度が単回硝子体内注射による哺乳類（例えばヒト）の眼への投与後に少なくとも８０日間、８５日間、９０日間、９５日間、１００日間、１０５日間、１１０日間、または１１５日間にわたって硝子体液中で維持されるようなヒト化抗Ｄ因子抗体が含まれる。
【０１２５】
Ｄ因子アンタゴニストは単独で、または少なくとも第２治療化合物と併用して投与され得る。Ｄ因子アンタゴニストと任意の第２治療化合物の投与は、例えば、単一の組成物として、または２つ以上の別個の組成物として同じ投与経路または異なる投与経路を用いて同時に行われ得る。あるいは、または加えて、投与は任意の順序で順次行われ得る。ある特定の実施形態ではそれら２つ以上の組成物の投与間に数分から数日まで、数週間まで、数か月までの間隔が存在し得る。例えば、Ｄ因子アンタゴニストが最初に投与され、続いて第２治療化合物が投与されてよい。しかしながら、第２治療化合物の同時投与またはＤ因子アンタゴニストの前の投与も企図される。一例ではＤ因子アンタゴニストは抗Ｄ因子抗体である。追加の例では抗Ｄ因子抗体は本明細書に記載される抗Ｄ因子抗体変異体である。一例では第２治療化合物はＨＴＲＡ１アンタゴニストである。追加の例ではＨＴＲＡ１アンタゴニストは抗ＨＴＲＡ１抗体である。
【０１２６】
１つの実施形態では補体介在性疾患を有するヒト対象における補体介在性疾患の本発明の治療はＤ因子アンタゴニストなどの治療化合物の有効量をその対象に投与することを含み、第２治療化合物、すなわち、ＨＴＲＡ１アンタゴニストの有効量をその対象に投与することをさらに含む。一例ではＤ因子アンタゴニストは抗Ｄ因子抗体である。追加の例では抗Ｄ因子抗体は本明細書に記載される抗Ｄ因子抗体変異体である。一例ではＨＴＲＡアンタゴニストは抗ＨＴＲＡ１抗体である。一例では補体介在性疾患は補体関連眼疾患である。一例では眼疾患は非滲出型ＡＭＤ（例えば中期乾燥型ＡＭＤまたは地図状萎縮（ＧＡ））及び滲出型ＡＭＤ（例えば湿潤型ＡＭＤ（脈絡膜血管新生（ＣＮＶ））を含む加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、眼内炎及びぶどう膜炎である。一例では補体関連眼疾患は中期乾燥型ＡＭＤである。一例では補体関連眼疾患は地図状萎縮である。一例では補体関連眼疾患は湿潤型ＡＭＤ（脈絡膜血管新生（ＣＮＶ））である。
【０１２７】
本明細書における併用投与は別々の製剤または単一の医薬製剤を用いる共投与、及びどちらかの順序での順次投与を含み、両方の（または全ての）活性剤がそれらの生物学的活性を同時に働かせる間に一定期間があることが一般的である。
【０１２８】
医薬製剤
抗体またはその抗体変異体の治療製剤は所望の程度の純度を有するポリペプチドを当技術分野において通常使用される任意選択の「薬学的に許容可能な」担体、賦形剤または安定化剤（それらの全てが「賦形剤」と呼ばれる）と混合することにより凍結乾燥製剤または水溶液として調製され得る。例えば、緩衝剤、安定化剤、保存剤、等張剤、非イオン性洗剤、抗酸化剤及び他の種々雑多な添加物である。（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ａ．  Ｏｓｏｌ編（１９８０）を参照されたい）。そのような添加物は用いられる投与量及び濃度において受容者にとって無毒でなくてはならない。
【０１２９】
緩衝剤は生理的条件に近似する範囲にｐＨを維持するのに役立つ。それらは約２ｍＭから約５０ｍＭまでの範囲の濃度で存在することが好ましい。本発明に関する使用に適切な緩衝剤にはクエン酸緩衝剤（例えば、クエン酸一ナトリウム−クエン酸二ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸三ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸一ナトリウム混合物、等）、コハク酸緩衝剤（例えば、コハク酸−コハク酸一ナトリウム混合物、コハク酸−水酸化ナトリウム混合物、コハク酸−コハク酸二ナトリウム混合物、等）、酒石酸緩衝剤（例えば、酒石酸−酒石酸ナトリウム混合物、酒石酸−酒石酸カリウム混合物、酒石酸−水酸化ナトリウム混合物、等）、フマル酸緩衝剤（例えば、フマル酸−フマル酸一ナトリウム混合物、等）、フマル酸緩衝剤（例えば、フマル酸−フマル酸一ナトリウム混合物、フマル酸−フマル酸二ナトリウム混合物、フマル酸一ナトリウム−フマル酸二ナトリウム混合物、等）、グルコン酸緩衝剤（例えば、グルコン酸−グルコン酸ナトリウム混合物、グルコン酸−水酸化ナトリウム混合物、グルコン酸−グルコン酸カリウム混合物、等）、シュウ酸緩衝液（例えば、シュウ酸−シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸−水酸化ナトリウム混合物、シュウ酸−シュウ酸カリウム混合物、等）、乳酸緩衝剤（例えば、乳酸−乳酸ナトリウム混合物、乳酸−水酸化ナトリウム混合物、乳酸−乳酸カリウム混合物、等）及び酢酸緩衝剤（例えば、酢酸−酢酸ナトリウム混合物、酢酸−水酸化ナトリウム混合物、等）などの有機酸及び無機酸とそれらの塩の両方が含まれる。加えてリン酸緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤及びトリスなどのトリメチルアミン塩も挙げられる。
【０１３０】
保存剤は微生物の増殖を遅らせるために、０．２％から１％（重量／体積）までの範囲の量で添加され得る。本発明に関する使用に適切な保存剤にはフェノール、ベンジルアルコール、メタクレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ベンザルコニウムハライド（例えば、塩化物、臭化物、ヨウ化物）、塩化ヘキサメトニウム、メチルパラベンまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、及び３−ペンタノールが含まれる。
【０１３１】
時には「安定化剤」として知られる等張剤が本発明の液体組成物の等張性を確保するために添加されてよく、等張剤には多価糖アルコール、好ましくはグリセリン、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール及びマンニトールなどの３価以上の糖アルコールが含まれる。
【０１３２】
安定化剤は充填剤から治療薬を溶解する添加剤または変性もしくは容器壁への付着の防止に役立つ添加剤まで様々な機能を範囲とし得る広いカテゴリーの賦形剤を指す。典型的な安定化剤は（上で列挙された）多価糖アルコール；アルギニン、リシン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ−ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、トレオニン等のようなアミノ酸；ラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイノシトール、ガラクチトール、グリセロール等のような有機糖または糖アルコールであってイノシトールのようなシクリトールを含む有機糖または糖アルコール；ポリエチレングリコール、アミノ酸重合体；尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α−モノチオグリセロール及びチオ硫酸ナトリウムなどの含硫還元剤；低分子量ポリペプチド（すなわち１０残基未満）；ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性重合体；キシロース、マンノース、フルクトース、グルコースなどの単糖類；ラクトース、マルトース、ショ糖などの二糖類及びラフィノースなどの三糖類；デキストランなどの多糖類であり得る。安定化剤は活性タンパク質重量部当たり０．１重量部から１０，０００重量部までの範囲で存在し得る。
【０１３３】
非イオン性界面活性剤または洗剤（「湿潤剤」としても知られる）は治療薬の溶解を補助するためにも撹拌誘導性凝集から治療タンパク質を守るためにも添加されてよく、それによって製剤がタンパク質の変性を引き起こすことなく加えられたせん断面に曝されることも可能になる。適切な非イオン性洗剤にはポリソルベート（２０、８０等）、ポリオキサマー（１８４、１８８等）、プルロニック（登録商標）ポリオール、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（ツイーン（登録商標）−２０、ツイーン（登録商標）−８０等）が含まれる。非イオン性洗剤は約０．０５ｍｇ／ｍｌから約１．０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．０７ｍｇ／ｍｌから約０．２ｍｇ／ｍｌの範囲で存在し得る。
【０１３４】
その他の種々雑多な賦形剤には充填剤（例えばデンプン）、キレート剤（例えばＥＤＴＡ）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ）、及び共溶媒が含まれる。本明細書における製剤は、治療を受けている特定の適応症の必要に応じて１種類より多くの活性化合物、好ましくは相互に悪影響を与えない相補的活性を有する活性化合物を含んでもよい。例えば、免疫抑制剤をさらに加えることが望ましいことがあり得る。そのような分子は意図する目的にとって有効である量で組み合わさって適切に存在する。それらの有効成分は、例えばそれぞれコアセルベーション技法または界面重合によって調製されたミクロカプセル、例えば、ヒドロキシメチルセルロースミクロカプセルまたはゼラチンミクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）ミクロカプセルの中に、コロイド状薬品送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、ミクロエマルジョン、ナノパーティクル及びナノカプセル）の中に、またはマクロエマルジョンの中に封入されてもよい。そのような技法はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ａ．  Ｏｓａｌ編（１９８０）において開示されている。
【０１３５】
インビボ投与に使用される製剤は無菌性でなくてはならない。これは例えば無菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成される。持続放出性調製物を調製してよい。持続放出性調製物の適切な例には抗体またはその抗体変異体もしくは断片（例えば抗原結合断片）を含有する固形疎水性重合体の半透過性マトリックスが含まれ、それらのマトリックスは成形物品、例えばフィルムまたはミクロカプセルの形態である。持続放出性マトリックスの例にはポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許番号第３，７７３，９１９号明細書）、Ｌ−グルタミン酸とエチル−Ｌ−グルタミン酸の共重合体、非分解性エチレンビニルアセテート、リュープロン（ＬＵＰＲＯＮ）デポー（商標）（乳酸グリコール酸共重合体とロイプロリド酢酸から構成される注射可能ミクロスフィア）などの分解性乳酸グリコール酸共重合体、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。エチレンビニルアセテート及び乳酸グリコール酸のような重合体が１００日間を超える期間にわたる分子の放出を可能にする一方である特定のヒドロゲルはより短い期間にわたってタンパク質を放出する。カプセル封入された抗体が長期間にわたって体内に留まっているとき、それらの抗体は３７℃の水分への曝露の結果として変性または凝集し、結果として生物活性を失い、可能性がある免疫原性の変化を生じ得る。関わる機序に応じて合理的な戦略が安定化のために工夫され得る。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド相互交換を介した分子間Ｓ−Ｓ結合形成であることが分かった場合、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含量の制御、適切な添加剤の使用、及び特定の高分子マトリックス組成物の開発によって安定化が達成され得る。
【０１３６】
眼疾患または眼症状の予防または治療のための本発明の化合物は眼球注射、眼内注射、及び／または硝子体内注射、及び／または強膜近傍注射、及び／またはテノン嚢下注射、及び／または脈絡膜上注射ならびに／または点眼液及び／もしくは軟膏の形態での局所投与によって投与されることが典型的である。本発明のそのような化合物はＩｎｔｒａｏｃｕｌａｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、Ｊａｆｆｅ，  Ｊａｆｆｅ，  Ａｓｈｔｏｎ，及びＰｅａｒｓｏｎ編、Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ（２００６年３月）のような参照文献に記載される方法を含む様々な方法によって、例えば、硝子体内への化合物の徐放を可能にする装置及び／またはデポーとして硝子体内に送達され得る。一例では装置は長期間にわたって化合物を放出するｍｉｎポンプ及び／またはマトリックス及び／または受動拡散系及び／またはカプセル封入セルの形態であり得る（Ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、Ｊａｆｆｅ，  Ｊａｆｆｅ，  Ａｓｈｔｏｎ，及びＰｅａｒｓｏｎ編、Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ（２００６年３月））。他の投与方法を用いてもよく、それらの方法には局所投与、非経口投与、皮下投与、腹膜内投与、肺内投与、鼻腔内投与、及び病変内投与が含まれるがこれらに限定されない。非経口注入には筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹膜内投与、または皮下投与が含まれる。
【０１３７】
眼球投与、眼内投与、または硝子体内投与用の製剤は当技術分野において知られている方法により、当技術分野において知られている成分を使用して調製され得る。有効な治療の主な要件は眼への適切な浸透である。薬品を局所送達することができる眼の前部の疾患と異なり網膜疾患はより部位特異的なアプローチを必要とする。点眼液及び軟膏は眼球後部にほとんど浸透せず、血液眼球関門が全身投与された薬品の眼組織への透過を妨げる。したがって、ＡＭＤ及びＣＮＶなどの網膜疾患を治療するために選択される薬品送達方法は直接硝子体内注射であることが通常である。硝子体内注射は患者の症状及び送達される薬品の特性と半減期に応じる間隔で繰り返されることが通常である。眼内（例えば硝子体内）浸透にとってより小さいサイズの分子が好ましいことが通常である。
【０１３８】
ＡＭＤまたはＣＮＶなどの補体関連眼疾患の治療効力は眼内疾患の評価に一般的に用いられる様々なエンドポイントによって測定され得る。例えば、視力喪失が評価され得る。視力喪失は、限定されないが、例えば、所望の時点までの最高矯正視力（ＢＣＶＡ）のベースラインからの平均変化の測定（例えば、ＢＣＶＡが糖尿病性網膜症の早期治療研究（ＥＴＤＲＳ）視力表と４メートルの検査距離での評価に基づく場合）、所望の時点において視力で１５文字よりも少ない文字をはずした対象のベースラインと比較した割合の測定、所望の時点において視力で１５文字以上の文字を当てた対象のベースラインと比較した割合の測定、所望の時点において２０／２０００以下のスネレン等価視力を有する対象の割合の測定、ＮＥＩ視覚機能質問票の評価、例えばフルオロセイン血管造影法による所望の時点におけるＣＮＶのサイズ及びＣＮＶの漏出量の測定等によって評価され得る。例えば検眼の実施、眼内圧の測定、視力評価、細隙灯圧力の測定、眼内炎症の評価等を、例えば、含むがこれらに限定されない眼球評価を行うことができる。
【０１３９】
特定の疾患または症状の治療に有効である抗体またはその抗体変異体の量はその疾患または症状の性質に左右され、標準的臨床技術によって決定され得る。可能であれば用量応答曲線と本発明の医薬組成物を最初にインビトロで決定し、次にヒトで検査する前に有用な動物モデル系で決定することが望ましい。
【０１４０】
幾つかの実施形態では製剤中の抗体は約５０ｍｇ／ｍＬ超、約７５ｍｇ／ｍＬ超、約１００ｍｇ／ｍＬ超、約１２５ｍｇ／ｍＬ超、約１５０ｍｇ／ｍＬ超、約１７５ｍｇ／ｍＬ超、約２００ｍｇ／ｍＬ超、約２２５ｍｇ／ｍＬ超、約２５０ｍｇ／ｍＬ超、約２７５ｍｇ／ｍＬ超、約３００ｍｇ／ｍＬ超、約３２５ｍｇ／ｍＬ超、約３５０ｍｇ／ｍＬ超、約３７５ｍｇ／ｍＬ超、約４００ｍｇ／ｍＬ超、約４２５ｍｇ／ｍＬ超、約４５０ｍｇ／ｍＬ超、約４７５ｍｇ／ｍＬ超、及び約５００ｍｇ／ｍＬ超のうちのいずれかの量である。製剤中の抗体は約５０ｍｇ／ｍＬと約５００ｍｇ／ｍＬとの間、約５０ｍｇ／ｍＬと約３００ｍｇ／ｍＬとの間、約１００ｍｇ／ｍＬと約５００ｍｇ／ｍＬとの間、約１００ｍｇ／ｍＬと約３００ｍｇ／ｍＬとの間、約２００ｍｇ／ｍＬと約５００ｍｇ／ｍＬとの間、約２００ｍｇ／ｍＬと約４００ｍｇ／ｍＬとの間、または約２５０ｍｇ／ｍＬと約３７５ｍｇ／ｍＬとの間のいずれかの量であり得る。
【０１４１】
１つの実施形態では治療ポリペプチド、抗体、またはその抗体変異体、またはその断片（例えば抗原結合断片）の水溶液は皮下注射により投与される。別の実施形態では治療ポリペプチド、抗体、またはその抗体変異体、またはその断片（例えば抗原結合断片）の水溶液は硝子体内注射により投与される。それぞれの用量は体重キログラム当たり約０．５μｇから約５０μｇまで、またはより好ましくは体重キログラム当たり約３μｇから約３０μｇまでの範囲であり得る。
【０１４２】
皮下投与の投与スケジュールは疾患の種類、疾患の重症度、及び治療薬に対する対象の感受性をはじめとする多数の臨床因子に応じて月一回から毎日まで変わり得る。
【０１４３】
製品及びキット
本発明の別の実施形態は本発明の抗体またはそれらの変異体またはそれらの断片（例えば抗原結合断片）によって標的とされる症状の治療、予防、及び／または診断に有用な物を含む製品である。例えば、本発明は補体関連疾患の治療、予防、及び／または診断に有用な物質を含有する製品に関する。その製品は容器とその容器上の、またはその容器に添えられたラベルまたは添付文書を含む。適切な容器には、例えば、ボトル、バイアル瓶、注射器等が含まれる。それらの容器はガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。その容器は補体関連症状の治療、予防、及び／または診断に有効である組成物を保持し、その容器は無菌アクセスポートを有してよい（例えば、その容器は皮下注射針によって突き刺すことが可能であるストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアル瓶であり得る）。その組成物の中の少なくとも１種類の活性薬剤が本発明の抗Ｄ因子抗体である。そのラベルまたは添付文書はその組成物が特定の症状の治療、予防及び／または診断に有用であることを示す。
【０１４４】
添付文書は市販の治療用製品パッケージに習慣的に含まれている指示書であって、そのような治療用製品の使用に関する適応症、使用法、服用量、投与、禁忌及び／または注意についての情報を含むものを指す。１つの実施形態ではそのラベルまたは添付文書は、例えば、眼疾患、例えば加齢黄斑変性（ＡＭＤ）をはじめとするこれまでに記載されている症状のうちのいずれかなど、補体関連疾患の治療に組成物が使用されることを示す。そのラベルまたは添付文書は患者へ抗体組成物を投与するための指示をさらに含む。
【０１４５】
加えて、その製品は静菌性注射用水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル溶液及びブドウ糖溶液などの薬学的に許容可能な緩衝液を含む第２容器をさらに含んでよい。その製品は、他の緩衝液、希釈液、フィルター、針、及び注射器をはじめとする商業的立場及び使用者の立場から望ましい他の物をさらに含んでよい。
【０１４６】
別の実施形態では様々な目的に、例えば、補体関連疾患の治療、予防、及び／または診断に、補体関連溶血アッセイに、細胞からのＤ因子ポリペプチドの精製に、または細胞からのＤ因子ポリペプチドの免疫沈殿に有用なキットも提供される。Ｄ因子ポリペプチドの単離及び精製のためにそのキットはビーズ（例えば、セファロースビーズ）に結合した抗Ｄ因子抗体を含み得る。例えばＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットにおいてＤ因子ポリペプチドをインビトロで検出及び定量するために抗体を含むキットが提供され得る。製品と同様にキットは容器とその容器上の、またはその容器に添えられたラベルまたは添付文書を含む。その容器は少なくとも１つの本発明の抗因子抗体を含む組成物を保持する。例えば希釈剤及び緩衝液、対照抗体を含む追加の容器が含まれてよい。そのラベルまたは添付文書はその組成物の説明ならびに意図されているインビトロ用途または検出用途についての指示を提供してよい。そのラベルまたは添付文書は対象への投与（例えば抗体またはその抗体断片（例えば抗原結合断片）についての指示を提供してよい。
【０１４７】
治療用途
本発明の抗体は哺乳類動物を治療するために使用され得る。１つの実施形態では抗体は例えば前臨床データを得ることを目的に非ヒト哺乳類動物に投与される。治療される例となる非ヒト哺乳類動物には前臨床研究が実施される非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、げっ歯類、及び他の哺乳類動物が含まれる。そのような哺乳類動物は抗体で治療される疾患の確立された動物モデルであり得、または目的の抗体の毒性を研究するために使用され得る。これらの実施形態の各々において用量増加試験を哺乳類動物に対して実施してよい。
【０１４８】
抗体は非経口投与、皮下投与、腹膜内投与、肺内投与、及び鼻腔内投与、及び局所的免疫抑制治療に望ましい場合は病変内投与を含む任意の適切な手法によって投与される。非経口注入には筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹膜内投与、または皮下投与が含まれる。加えて、抗体はパルス注入、特に抗体またはその抗体変異体またはその断片（例えば抗原結合断片）の用量を減少させることを含むパルス注入によって適切に投与される。投与は注射によって行われることが好ましく、部分的にはその投与にかかる時間の長短に応じて静脈内注射または皮下注射によって行われることが最も好ましい。
【０１４９】
疾患の予防または治療のため、抗体の適切な投与量は治療される疾患の種類、その疾患の重症度と経過、抗体が予防目的で投与されるのか、または治療目的で投与されるのか、それまでの治療法、患者の臨床歴と抗体への反応、及び主治医の判断に左右される。
【０１５０】
疾患の種類及び重症度に応じて約０．１ｍｇ／ｋｇから１５０ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が、例えば１回以上の個別投与か連続注入による、患者に投与される最初の候補投与量である。典型的な一日投与量は前述の因子に応じて約１ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ以上までの範囲であってよい。数日間以上にわたる反復投与には疾患症状の所望の抑制が起こるまで症状に応じてその治療が持続される。しかしながら、他の投与計画も有用であり得る。この治療法の進捗は従来技術及びアッセイによって容易にモニターされる。例となる投与計画はＷＯ９４／０４１８８に開示されている。
【０１５１】
抗体組成物は良好な医療行為に合うように製剤され、投薬され、投与され得る。この状況で考慮する因子には治療されている特定の疾患、治療されている特定の哺乳類動物、個々の患者の臨床状態、疾患の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジューリング、及び医師に知られている他の因子が含まれる。投与される抗体またはその抗体変異体またはその断片（例えば抗原結合断片）の「治療有効量」はそのような考慮事項によって決定され、その治療有効量は疾患または障害を予防、改善、または治療するために必要な最少の量である。抗体またはその抗体変異体またはその断片（例えば抗原結合断片）は問題の疾患の予防または治療のために現在使用されている１種類以上の薬剤と共に製剤される必要は無いが、一緒に製剤されてもよい。そのような他の薬剤の有効量はその製剤中に存在する抗体またはその抗体変異体またはその断片（例えば抗原結合断片）の量、疾患または治療の種類、及び上で考察した他の因子によって左右される。これらは本明細書の上文で使用されたものと同じ投与量と投与経路で、またはこれまでに採用されていた投与量の約１〜９９％までの投与量で使用されることが一般的である。
【０１５２】
Ｄ因子を標的として認識する本発明の抗体は補体介在性疾患を治療するために使用され得る。これらの疾患は過剰補体活性化または無制御補体活性化と関係する。それらの補体活性化には心肺バイパス手術時の補体活性化、急性心筋梗塞、動脈瘤、脳卒中、出血性ショック、挫傷、多臓器不全、血液量減少性（ｈｙｐｏｂｏｌｅｍｉｃ）ショック及び腸管虚血の後の虚血再灌流に起因する補体活性化が含まれる。これらの疾患には重症の火傷、内毒素血症、敗血症性ショック、成人呼吸促迫症候群、血液透析などの炎症症状；アナフィラキシーショック、重症喘息、血管浮腫、クローン病、鎌状赤血球貧血、溶連菌感染後糸球体腎炎及び膵臓炎である疾患または症状も含まれ得る。疾患は有害薬物反応、薬品アレルギー、ＩＬ−２誘導性血管漏出症候群またはＸ線撮影造影剤アレルギーの結果であり得る。その疾患には全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、リウマチ性関節炎、アルツハイマー病及び多発性硬化症などの自己免疫疾患も含まれる。補体活性化は移植拒絶反応とも関連する。近年、補体活性化と加齢黄斑変性、糖尿病性網膜症及び他の虚血性網膜症、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、ぶどう膜炎、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼ヒストプラズマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生、及び網膜血管新生などの眼疾患との間に強い相関関係が示されている。
【実施例】
【０１５３】
次の実施例は例示のために提供するものであり、限定のために提供するものではない。実施例中で言及される市販の試薬は別段の指示が無い限り製造業者の指示に従って使用された。次の実施例において、及び本明細書を通してＡＴＣＣ受託番号によって示される細胞の起源は２０１１０−２２０９、バージニア州、マナサス、ユニバーシーティー・ブルバード１０８０１にある米国培養細胞系統保存機関である。
【０１５４】
実施例１：抗Ｄ因子抗体変異体の作製
Ｄ因子上の非活性部位への結合を介してＤ因子と副補体経路を強力に阻害するヒト化抗Ｄ因子Ｆａｂ断片であるランパリズマブは進行型の乾燥型ＡＭＤである地図状萎縮（ＧＡ）の治療のために現在臨床開発されている。ランパリズマブ（ＦＣＦＤ４５１５Ｓ；以下「ａＦＤ」）は２１４残基の軽鎖（配列番号１）と２２３残基の重鎖（配列番号２）から構成される抗体Ｆａｂ断片である。
【０１５５】
ＧＡにおける第ＩＩ相ヒト治験の結果からａＦＤの毎月の硝子体内注射によって治療効果が得られることが示されているが、さらに良好な効力を達成するためにより高い薬品用量を使用する動機が存在する。一方、低い投与頻度は改善された利便性を患者にもたらし、感染率の低下と臨床効力の増加という潜在的な利益を有することになり、低進行型の乾燥型ＡＭＤの患者の治療を促進する可能性がある。
【０１５６】
野生型ａＦＤ（ＷＴ）の物理的及び化学的安定性、特に低ｐＨ条件下での、及び／または中性ｐＨにおける高濃度での物理的及び化学的安定性をさらに改善する取り組みがなされた。軽鎖上のアスパラギン酸残基Ａｓｐ−３０と重鎖上のアスパラギン残基Ａｓｐ−６２（図１Ａ）が異性化しやすい残基と特定されている。Ａｓｐ異性化は通常８未満のｐＨで長期にわたって存在し、且つ、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）時に塩基性ピークとして検出される環状イミド中間産物（Ａｓｕ）を形成するための脱水反応を含む。その環状中間産物の形成は低いｐＨになるほど促進される。出発物質と同じ荷電状態を生じ、したがってＩＥＣによって検出されないＡｓｐまたはイソ−Ａｓｐを形成するその環状中間産物の加水分解は高いｐＨになるほど速い。Ａｓｐ−６２（Ｋａｂａｔ番号付けによるＡｓｐ−６１）はＦａｂ：ｆＤ複合体の結晶構造の中でＤ因子と接触していないのでＡｓｐ−６２の異性化は効力に影響しないようである。Ｋａｔｓｃｈｋｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８７：１２８８６。Ａｓｐ−３０は軽鎖残基Ａｓｐ−３２及びＡｓｐ−９２と共にＤ因子上の塩基性残基と静電的接触を行う。Ａｓｐ−３０の異性化は極めて速く、抗体の効力の観察された減少の主要因であると仮定される。Ａｓｐ残基３２及び９２の異性化もｆＤ結合に対して効果を有する可能性があるが、速度が非常に遅いことが知られている。位置３０におけるその環状イミドの形成、またはその後続のイソアスパラギン酸への加水分解は静電的相互作用の妨害を介して抗原結合に対して負の影響を与える可能性がある。単離された塩基性画分に対する抗原結合測定の結果が環状中間産物型は充分に活性であることを示唆しており、結合減少の原因としてのイソアスパラギン酸形成と合致する。
【０１５７】
重鎖上のＡｓｎ−１０３（Ｋａｂａｔ番号付けによるＡｓｎ−１０１）はやや酸性のｐＨ（６〜７）と比較して中性のｐＨにおいてより高速で進行する反応である脱アミド化を受けやすい。脱アミド化はＩＥＣ時に酸性ピークの出現として検出され得る。Ａｓｎ脱アミド化はＡｓｐ異性化と同様に環状Ａｓｕ中間産物を介して進行する。しかしながら、ＡｓｎからのＡｓｕの形成はＡｓｕが加水分解されてＡｓｐまたはイソ−Ａｓｐを形成する高めのｐＨでしか起こらないので通常は酸性ピークだけが検出される。Ａｓｎ−１０３の側鎖はＤ因子残基Ａｒｇ−１７２と水素結合を形成する。この部位における脱アミド化または環状イミド中間産物Ａｓｕ形成の抗原結合に対する効果は不明である。
【０１５８】
ａＦＤ  ＷＴは典型的なヒト化Ｆａｂ（ｐＩ８〜９）よりも低いｐＩ（７．１）を有する。ＣＤＲ−Ｌ１の組成（図１Ａ）によりＶＬドメイン上に負の電荷クラスターが生じる。これらの特徴は特に低ｐＨ及び低イオン強度においてその分子の溶解性に影響し得る。加えて、中性ｐＨ及び生理的イオン強度であってもａＦＤ  ＷＴの高濃度製剤は３７℃においてより速い速度で非共有結合性二量体を形成する傾向を有し得る。
【０１５９】
安定性を改善することを目的にａＦＤ  ＷＴの幾つかの変異体を作製した。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＩＩ（登録商標）（Ａｇｉｌｅｎｔ）突然変異形成キットをそのキットに添付されたプロトコルに従って使用して部位特異的突然変異形成により点突然変異を導入した。要求されるコドン変化を規定するオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。設計された変化を有するプラスミドを特定し、ＤＮＡシーケンシングにより確認した。小規模の発現及び精製のためにＤＮＡを大腸菌株６４Ｂ４に形質転換した。５０μｇ／ｍＬのカルベネシリン（培地調製コードＡ３２３２）を含有する５ｍＬのＬＢ培地（培地調製コードＡ２００８）の中にシングルコロニーを採取し、３７℃のＩｎｎｏｖａ恒温器において２００ＲＰＭで振盪しながら１４ｍＬの培養チューブ中で一晩にわたって培養した。これらの培養物を使用して１Ｌのバッフル付き振盪フラスコ中の２５０ｍＬの完全大豆クラップ培地（培地調製コードＡ４５６４）、５０μｇ／ｍＬカルベネシリンに接種した。培養物を２００ＲＰＭで振盪しながら３０℃で一晩にわたって培養し、その後で遠心分離により回収した。製造業者によって支給されたプロトコルに従ってＰｏｐＣｕｌｔｕｒｅメディア（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して細胞沈殿物を溶解し、ＧｒａｖｉｔｒａｐプロテインＧカラム（ＧＥヘルスケア）上でＦａｂを精製した。より大規模のＦａｂ生産のために形質転換細胞の１０Ｌの発酵に由来する細胞ペーストを抽出緩衝液中に懸濁し、マイクロフルイダイザーを使用してホモジナイズした。ＦａｂをプロテインＧ−セファロースまたはカッパ−セレクト上で免疫親和性クロマトグラフィーにより捕捉し、低ｐＨ緩衝液により溶出した。低ｐＨ溶離液をｐＨ５に調節し、Ｓ−セファロースカラム上で陽イオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製した。それらの精製タンパク質の正体を質量分析により確認し、貯蔵画分を約１０ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、透析濾過によりＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．３）（本明細書において「ＰＢＳ」とも呼ばれる；８ｍＭのリン酸水素ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）、２ｍＭのリン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、１４０ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ）中に入れ換えた。
【０１６０】
実施例２：抗Ｄ因子抗体変異体の生物活性
有望な単一突然変異体及び混合突然変異体をＤ因子（ｆＤ）結合親和性及びＤ因子活性阻害能力について検査した。
【０１６１】
ａ．表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定結果によるＤ因子結合親和性
固定化されたａＦＤ  ＷＴ及びその変異体に対するＤ因子結合の動態及び結合定数ＫＤをＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ２００機器上での表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定より決定した。抗ｈｕＦａｂ捕捉キット（ＧＥヘルスケアカタログ番号２８−９５８３−２５）を製造業者により記載されたプロトコルに従って使用して抗体Ｆａｂ断片をシリーズＳ  ＣＭ５センサーチップ上に固定化した。濃度が０．３９ｎＭから２５ｎＭまで２倍毎に漸増するヒトＤ因子溶液の６０μＬアリコットの注入について記録されたセンサーグラムから結合動態を計算した。流速は３０μＬ／分であり、ランニング緩衝液はＨＢＳ−Ｐ＋であり、分析温度は２５℃であり、リアルタイム基準セルサブトラクションを採用し、且つ、Ｄ因子注入後の解離を１０分間にわたって追跡した。ランニング緩衝液の注入について観察されたセンサーグラムのサブトラクション後にＢｉａＥｖａｌソフトウェア第４．１版（ＧＥヘルスケア）を使用して１：１モデルに従ってデータを分析して動態及び親和性定数を抽出した。
2017515811.tif 000003
【０１６２】
ａＦＤ  ＷＴの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ；配列番号３）と重鎖可変ドメイン（ＶＨ；配列番号４）の中の位置に基づいて突然変異体に名前と番号を付けた。野生型残基の一文字コードの後に配列位置が続き、その後に置換アミノ酸の一文字コードが続く。同じドメイン上の複数の変化はコロンによって分けられている。
【０１６３】
表１に示されているようにａＦＤ  ＷＴはＳＰＲ技術で決定され得る限度（約１０ｐＭ  ＫＤ）のｆＤに対する高い親和性を有する。ＣＤＲ−Ｌ１中のアスパラギン酸残基２８、３０、及び３１はｆＤへの親和性に対して明確な効果を与えずにそれぞれＳｅｒ、Ｇｌｕ、及びＳｅｒにより個々に置換され得た（表１）。対照的に、ＣＤＲ−Ｌ１のＡｓｐ３２のＳｅｒによる置換は個別（ＡＦＤ．ｖ４）に検査された場合でもＤ２８Ｓ突然変異体及びＤ３１Ｓ突然変異体（ＡＦＤ．ｖ５）と組み合わせて検査された場合でもｆＤ結合の著しい減少を引き起こした。野生型分子と同等のｆＤ親和性がＶＬ−Ｄ３０Ｅ、Ｄ３１Ｓ及びＶＨ−Ｄ６２Ｅを組み合わせている三重突然変異体（「ＴＭ」（ＡＦＤ．ｖ６））とＴＭ（ＡＦＤ．ｖ６）にＶＬ−Ｄ９２Ｅが付加されている四重突然変異体（ＴＭ．Ｄ９２Ｅ（ＡＦＤ．ｖ７））について決定された。ＶＨ−Ｄ６２ＥはｆＤ結合に対して明確な効果を与えずに異性化を受ける部位における置換であり、ＶＬ−Ａｓｐ９２は異性化速度が遅い抗原接触残基である。ＶＬ−Ｄ２８Ｓ、Ｄ３０Ｅ、Ｄ３１Ｓ及びＶＨ−Ｄ６２Ｅを組み合わせている四重突然変異体「ＳＩＥＳＤ」（ＡＦＤ．ｖ８）はｆＤへの親和性のわずかな（約２倍の）減少を示す。ＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）の背景ではＶＬ−Ｄ９２Ｅ置換によってｆＤへの親和性のさらなる減少が生じた（ＡＦＤ．ｖ１０（表１内のＳＩＥＳＤ．Ｄ９２Ｅ）を参照されたい）。
【０１６４】
潜在的な脱アミド化部位を他の残基との置換について検査した。ＶＬ−Ｎ３４とＶＨ−Ｎ５２の両方が共結晶構造中でｆＤと接触しているが、これらの部位のどちらも中性ｐＨ条件下では顕著な脱アミド化速度を示さない。これらの部位におけるＳｅｒ置換は親和性の減少を引き起こした（表１；ＡＦＤ．ｖ９及びＡＦＤ．ｖ１１）。ＶＨ残基Ａｓｎ−１０３はｆＤと接触せず、ＰＢＳ中で測定可能な脱アミド化速度を有しない。ＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）の背景におけるＡｓｎ−１０３のＡｓｐまたはＳｅｒによる置換はｆＤへの親和性のわずかで許容可能な減少を引き起こした（ＡＦＤ．ｖ１２（ＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｄ）及びＡＦＤ．ｖ１４（ＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ）を参照されたい）（表１）。Ａｓｎ−１０３のＧｌｎ置換は結合親和性のより大きな減少を引き起こした（ＡＦＤ．ｖ１３（ＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｑ）を参照されたい（表１））。ＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）と同様に五重突然変異体ＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）にＶＬ−Ｄ９２Ｅを付加したＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ．Ｄ９２Ｅ（ＡＦＤ．ｖ１５）はｆＤへの親和性のさらに４倍の減少を引き起こした。
【０１６５】
ｂ．Ｄ因子阻害アッセイ
副経路（ＡＰ）溶血アッセイを用いてＤ因子誘導性補体活性化を阻害する能力についてａＦＤ  ＷＴ及び変異体を検査した。ウサギ赤血球（Ｅｒ）を使用するＡＰ溶血アッセイがこれまでに記載されている。Ｐａｎｇｂｕｒｎ  （１９９８），  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １６２：６３９、Ｋａｔｓｃｈｋｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８４：１０４７３。Ｅｒ（コロラド・セラム）をベロナール緩衝液中の０．５％ウシ皮膚ゼラチン（ＧＶＢ）で３回洗浄し、再懸濁した。ａＦＤの希釈物を２倍濃度で調製し、９６ウェルポリプロピレンプレートに添加した。Ｅｒ懸濁液をＧＶＢ／０．１Ｍ  ＥＧＴＡ／０．１Ｍ  ＭｇＣｌ２と混合し、それらのプレートに添加した。古典的経路を介したあらゆる補体活性化を回避するためにＣ１ｑ除去ヒト血清（Ｃｏｍｐ  Ｔｅｃｈ；ＧＶＢ中に１：３希釈）の添加により補体活性化を開始した。室温で３０分間の培養後にＧＶＢ中の１０ｍＭ  ＥＤＴＡの添加によりその反応を停止した。それらのプレートを遠心分離し、上清を移した。その上清の吸光度を４１２ｎｍで読んだ。最大半抑制（ＩＣ５０）を引き起こすａＦＤ濃度を非線形回帰分析により決定した。
2017515811.tif 000004
【０１６６】
表２において示されているように変異体ＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）、ＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）、及びＴＭ．Ｄ９２Ｅ（ＡＦＤ．ｖ７）は±３０％というＩＣ５０測定の標準誤差を考慮するとａＦＤ  ＷＴと同等のｆＤ依存的補体活性化活性を抑制する効力を有する。
【０１６７】
ｃ．長期にわたる結合能
規定条件下での長期間にわたるｆＤへのａＦＤ変異体の総合的結合を測定するためにもＳＰＲを使用した。これらの測定結果における標準誤差は±１０％である。図２ＡはｐＨ５．５でａＦＤ  ＷＴとａＦＤ変異体Ｄ３０Ｅ（ＡＦＤ．ｖ２）及びＴＭ（ＡＦＤ．ｖ６）については結合の減少が１カ月に約４０％であり、一方でＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）及びＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）については結合の減少は長期間（７０日）にわたっても約１５％とより少なかったことを示している。比較として、抗ＶＥＧＦ抗体Ｆａｂ断片（ａＶＥＧＦ）は７０日間にわたって結合の減少を示さなかった。そのｐＨ７．４条件への塩の添加はａＦＤ  ＷＴ及びａＶＥＧＦの結合減少速度を上昇させるようであった（データを示さず）。図２Ｂにおいて示されるようにＰＢＳ（１００ｍｇ／ｍｌのＦａｂタンパク質濃度を含む）の存在下でＤ３０Ｅ（ＡＦＤ．ｖ２）及びＴＭ（ＡＦＤ．ｖ６）はａＦＤ  ＷＴについて観察された速度より遅い、同等の結合減少速度を有した。３７℃で１０週間後に結合減少はａＦＤ  ＷＴについては約３０％、及び抗Ｄ因子Ｄ３０Ｅ（ＡＦＤ．ｖ２）変異体とＴＭ（ＡＦＤ．ｖ６）変異体については２０％であった。３７℃で１０週間後の結合減少はＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓについてはわずかに１０％であり（ＡＦＤ．１４；図２Ｂ）、実験誤差よりも大きくなく、同じ条件下でａＶＥＧＦについて観察されたものと等しかった。７０日間にわたってデータを収集するために１００ｍｇ／ｍＬのＦａｂ濃度でのＰＢＳ中温度ストレス実験をＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）について繰り返した。図２Ｃに示されているように、７０日目における結合減少はＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）について１０％未満であった。
【０１６８】
実施例３．改善された安定性を有する抗Ｄ因子抗体変異体
上記の親和性アッセイに基づいて幾つかの単一抗Ｄ因子抗体変異体及び混合抗Ｄ因子抗体変異体を追加の安定性分析に選択した。
【０１６９】
ａ．溶解性
試料を低イオン強度及びｐＨ６における溶解性について最初に検査した。アミコン・セントリプレップＹＭ−１０遠心フィルターユニットを使用して最初に試料を２０ｍＭヒスチジン塩酸のｐＨ５緩衝液中に約１００ｍｇ／ｍＬの濃度に調製した。ｐＨ５及び低イオン強度のこれらの溶液は目視検査時には濁りを示さなかった。試料を１４，０００×ｇで１０分間にわたって遠心分離してあらゆる不溶性物質を沈殿させた。沈殿物は観察されず、その溶液のタンパク質濃度をＵＶ吸光度測定により決定した。試料（約１ｍＬ）を１０Ｋ  ＭＷＣＯのＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒカセット（Ｐｉｅｒｃｅ）中に入れ、１Ｌの２０ｍＭヒスチジン緩衝液ｐＨ６に対して４℃で一晩にわたって透析し、続いて濁りについて目視検査した。それらの溶液の写真が撮影され、図６において提供されている。ｐＨ６及び低イオン強度条件（ｐＨ６の２０ｍＭヒスチジン塩酸中に約１００ｍｇ／ｍｌ）でａＦＤ  ＷＴ溶液及びＤ３０Ｅ（ＡＦＤ．ｖ２）溶液は著しく濁っており、ＴＭ（ＡＦＤ．ｖ６）溶液は濁りが少なく、ＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）の溶液は透明であった（図６）。上記の遠心分離の後、それによって大きな沈殿物がａＦＤ  ＷＴ及びＡＦＤ．ｖ２について目に見えて観察され、より小さい沈殿物がＴＭ（ＡＦＤ．ｖ６）について観察され、ＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）については沈殿物が観察されず、それらの上清のタンパク質濃度をＵＶ吸光度測定により決定した（表３）。ａＦＤ  ＷＴ及びＤ３０Ｅ（ＡＦＤ．ｖ２）は５０ｍｇ／ｍｌ未満の溶解度を示し、ＴＭ（ＡＦＤ．ｖ６）は１００ｍｇ／ｍＬに近い溶解度を示し、ＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）はこれらの条件下で完全に溶けた。ｐＨ５での出発濃度と比較したｐＨ６透析後のＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）のタンパク質濃度のわずかな減少は遠心分離時に沈殿物が観察されなかったのでＡＦＤ．ｖ８の沈殿よりはむしろ透析時の希釈効果を反映している。
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【０１７０】
追加の変異体ＡＦＤ．ｖ３、ＡＦＤ．ｖ１２、ＡＦＤ．ｖ１３及びＡＦＤ．ｖ１４を無塩溶解性検査において検査した。４℃のｐＨ６緩衝液への透析と３７℃で一晩にわたる培養の後にａＦＤ  ＷＴを除くタンパク質溶液の全てが透明であった（図７）。３７℃の培養と遠心分離の後のタンパク質濃度の測定値（表４）は全ての変異体がａＦＤ  ＷＴよりも溶けやすいことを示している。ａＦＤ  ＷＴの濁った溶液（図７上段）は後で塩（ＮａＣｌ）含有緩衝液であるＰＢＳ（ｐＨ７．３）に対して透析されると透明になり、このことは塩の添加及び／またはｐＨの上昇によって沈殿が可逆的であったことを示唆している（図７下段）。ＡＦＤ．ｖ３についての溶解性データは１個の負に帯電した残基の除去である単一アミノ酸変化Ｄ３１Ｓによって溶解度の上昇が引き起こされ得ることを示している。ＡＦＤ．ｖ８、ＡＦＤ．ｖ１２、ＡＦＤ．ｖ１３及びＡＦＤ．ｖ１４における追加のアミノ酸変化も溶解度の上昇を引き起こす。
2017515811.tif 000006
【０１７１】
ａＦＤ  ＷＴ、ＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）及びＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）ついても生理的なｐＨ（ｐＨ７．３）の条件下での溶解性およびイオン強度を検査した。生理的なｐＨの下での溶解性検査とイオン強度についてＰＢＳに対して一晩にわたって試料を透析し、その後でアミコン・セントリプレップＹＭ−１０遠心フィルターユニットを使用して２２７〜３７２ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。４℃で一晩にわたる培養の後に濁りについて試料を目視検査し、一部を遠心分離して沈殿したタンパク質を除去し、タンパク質濃度をＵＶ吸光度測定により決定し、表５に報告した。遠心分離の前にａＦＤ  ＷＴ試料は濁っており、一方でＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）及びＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）の溶液は透明であった（図８に示されるａＦＤ  ＷＴ、ＡＦＤ．ｖ８及びＡＦＤ．ｖ１４）。ＡＦＤ．ｖ１４の濃度は写真の溶液については３４４ｍｇ／ｍＬであり（図８）、それはその後３７２ｍｇ／ｍＬまでさらに濃縮された。ＡＦＤ．ｖ８の濃度は図８の溶液について２６９ｍｇ／ｍｌであった。ａＦＤ  ＷＴの濃度は図８の溶液について２２７ｍｇ／ｍｌであった。遠心分離後に沈殿物がａＦＤ  ＷＴ溶液について観察されたが、ＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）及びＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）の溶液について観察された沈殿物は無かった。タンパク質濃度データ（表５）から、ａＦＤ  ＷＴは沈殿が観察される前にＰＢＳ中で２２７ｍｇ／ｍＬまでにしか濃縮され得ないが、一方でＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）（２６９ｍｇ／ｍＬ以上）及びＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）（３７２ｍｇ／ｍＬ以上）については溶解性限度がより高いことが示された。２６９ｍｇ／ｍＬのＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）について沈殿物は観察されず、その溶液をさらに濃縮する試みが行われなかったので、これはＰＢＳ中のこの変異体の溶解度の下限である。同様に、ＰＢＳ中のＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）の溶解度の下限は３７２ｍｇ／ｍＬである。ＰＢＳ中のＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）の２６９ｍｇ／ｍＬ溶液は２〜８℃で４週間の培養後に透明なままであった。同様に、２〜８℃で３週間の培養後のＰＢＳ中のＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）の３７２ｍｇ／ｍＬ溶液については濁度のどのような明確な上昇もなかった。この濃度ではサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて測定すると凝集体の割合（％）の非常にわずかな変化があり（図９）、２〜８℃で３週間の内に０．９％から２．１％まで増加した（３週間の培養前のＳＥＣデータ（０．９％の凝集体）が図９に示されている；３週間の培養後のＳＥＣデータは示されないデータである）。
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＊ｐＩ値は画像化毛管等電点電気泳動（ｉｃＩＥＦ）によって決定された。
【０１７２】
変異体ＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）及びＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）の溶解性も硝子体内注射を介して投与される薬品に使用される製剤を代表し得るｐＨ５．５（２０ｍＭ  ＨＣｌ  ｐＨ５．５）の緩衝液の中でＮａＣｌ濃度を変えて比較した。約１００ｍｇ／ｍＬタンパク質濃度の溶液を調製し、検査緩衝液に対して透析した。その後、アミコン・セントリプレップＹＭ−１０遠心フィルターユニットを使用してこれらの溶液を濃縮した。溶液が外界温度で目に見えて透明のままである、その濃縮によって得られた濃度が表６に報告されている。ＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）はｐＨ５．５及び低ＮａＣｌ濃度で３１４ｍｇ／ｍＬまでの高い溶解度を有する。高濃度のＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）も１００ｍＭのＮａＣｌの添加により２７８ｍｇ／ｍＬまで達成可能である。
2017515811.tif 000008
【０１７３】
ＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）はａＦＤ  ＷＴと比較して２個少ない負に帯電した残基を有するが、電荷のこれらの変化は画像化毛管等電点電気泳動（ｉＣＩＥＦ）によって測定されると顕著なｐＩ変化を引き起こさない（表５）（Ｓａｌａｓ−Ｓｏｌａｎｏ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｓｅｐ  Ｓｃｉ，  ３５（２２）：  ３１２４  （２０１２））。タンパク質はｐＩに近いｐＨ値で最小の溶解度を有すると予期される（Ｇｒｅｅｎ，  Ａ．Ａ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ９３：  ５１７−５４２  （１９３１））。ＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）についてＰＢＳ（ｐＨ７．３）中での上昇した溶解度はｐＩの変化と相関しない。むしろＬＣ−ＣＤＲ−Ｌ１におけるＡｓｐのＳｅｒへのアミノ酸変化（ＶＬ−Ｄ２８Ｓ及びＤ３１Ｓ）がその分子の表面上の電荷分布を変更するようである。
【０１７４】
ｂ．異性化及び脱アミド化
長期作用性送達系に見出され得る様々な条件への変異体の曝露をシミュレートするため、３７℃で数週間にわたって変化したｐＨ及び塩条件の下で抗体にストレスをかけた。具体的には次の５つの異なる製剤で抗体を評価した：
製剤１：１０ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ２．５の１０ｍＭリン酸緩衝液、
製剤２：１０ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ５．５の１０ｍＭヒスチジン塩酸、
製剤３：１０ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸緩衝液（「低塩」）、
製剤４：１０ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．４ＰＢＳ（「高塩」；１０ｍＭリン酸、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ）、
製剤５：１００ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．４のＰＢＳ。
【０１７５】
全ての溶液が０．０２％ＰＳ２０を有し、３７℃で培養され、２週間ごとに試料採取された。低塩条件（ｐＨ２．５、５．５、及び７．４）は液体製剤における化学的分解の効果を評価するためのものであった。ＰＢＳをヒト硝子体のｐＨ及びイオン強度の模倣物として使用した。加えて、１０ｍＭリン酸、ｐＨ７．４をＰＢＳ条件と比較することで化学的及び物理的安定性に対するイオン強度の効果が明らかになるはずである。ＰＢＳ試料は硝子体の交換をシミュレートするために培養時に定期的に緩衝液交換された。野生型ａＦＤ（「ＷＴ」または「ａＦＤ  ＷＴ」）及びａＶＥＧＦを５条件全てで評価した。４番を除く全ての製剤でＤ３０Ｅ（ＡＦＤ．ｖ２）変異体及びＴＭ（ＡＦＤ．ｖ６）変異体を検査した。ＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）及びＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）は製剤２及び５で検査された。
【０１７６】
定量されている化学的分解は、酸性ピークの形成を特徴とする脱アミド化、及び塩基性ピークとして検出される長期存在性スクシンイミド（Ａｓｕ）中間産物の形成を特徴とする異性化脱水ステップであった。陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｄｉｏｎｅｘ  ＰｒｏＰａｃ  ＳＡＸ−１０カラム）（ＩＥＣ）を使用して異なる製剤中の抗体試料内のＡｓｎ脱アミド化種及びＡｓｐ脱水種の出現を定量した。
【０１７７】
検査した全ての条件についてａＦＤ  ＷＴは検査した抗体の中で主要ピークの最大の減少速度と塩基性ピークの最大の増加を示す。これはａＶＥＧＦ、Ｄ３０Ｅ（ＡＦＤ．ｖ２）、ＴＭ（ＡＦＤ．ｖ６）、ＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）、及びＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）の全てがａＦＤ  ＷＴよりも著しく低い主要ピーク減少速度を示すｐＨ５．５において非常に顕著である。図３Ａを参照されたい。ＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）はｐＨ５．５においてａＶＥＧＦと同様であり（図３Ａ）、且つ、ＰＢＳ中のａＶＥＧＦよりもさらにゆっくりとした速度による最もゆっくりとした主要ピーク減少速度を示す（図３Ｂ）。図４Ｂ（ＰＢＳ（ｐＨ７．３）中に１００ｍｇ／ｍｌのＦａｂ、Ｄ３０Ｅ（ＡＦＤ．ｖ２））は、ａＦＤ  ＷＴの約半分の塩基性ピーク形成速度を示し、一方でＴＭ（ＡＦＤ．ｖ６）、ＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）、及びＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．１４）は無視できるほどの塩基性ピーク形成を示す。対照的に、図４Ｂ（ＰＢＳ（ｐＨ７．３）中に１００ｍｇ／ｍｌのＦａｂ）に示されるようにａＦＤ  ＷＴ及びＤ３０Ｅ（ＡＦＤ．ｖ２）の酸性ピーク形成速度はＰＢＳ条件について同等であり、ＴＭ（ＡＦＤ．ｖ６）及びＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）について決定されたものよりも約２倍遅い。ＰＢＳ中でのＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）の酸性ピーク形成は基本的に無視できるほどである。
【０１７８】
ｃ．凝集
検査抗体の凝集体及び単量体の形成を定量するためにサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を活用した。使用したカラムはＴＳＫ−ＧＥＬ  Ｓｕｐｅｒ  ＳＷ２０００（東ソーバイオサイエンス）であった。製造業者の指示（ｗｗｗ．ｔｓｋｇｅｌ．ｃｏｍ）に基づいて材料と条件を用いた。
【０１７９】
３７℃でＰＢＳ中に製剤されたＦａｂの１００ｍｇ／ｍｌでの検査抗体のＳＥＣデータに基づく経時的な単量体の割合（％）が図５に示されている。ＡＦＤ  ＷＴは単量体ピーク画分の月当たり３〜４％の減少を示している。ａＦＤ  ＷＴと比較して負の電荷に変化を有しないＡＦＤ．ｖ２（Ｄ３０Ｅ）は同様の単量体減少速度を示す。ＡＦＤ．ｖ６、ＡＦＤ．ｖ８及びＡＦＤ．ｖ１４は低下した単量体減少速度を示す。０日目における単量体含量の差異は精製調製物の均一性のわずかな変化を反映している。Ｄ３０Ｅ（ＡＦＤ．ｖ２）及びＴＭ（ＡＦＤ．ｖ６）の凝集速度は１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度においてｐＨ５．５及び７．４（無塩）で同等である。ｐＨ７．４での塩の添加はａＦＤ変異体の凝集速度に影響しないが、ａＶＥＧＦの凝集速度を二倍にする。ＰＢＳ中での１０ｍｇ／ｍＬから１００ｍｇ／ｍＬまでの濃度の増加が検査された全ての試料の凝集速度を上昇させるので凝集はタンパク質濃度依存的である（表７）。１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４及び無ＮａＣｌ中の１０ｍｇ／ｍＬの濃度、及びＰＢＳ中の１０ｍｇ／ｍＬの濃度における凝集が最小であった（表７）。ＰＢＳ中に１００ｍｇ／ｍＬの濃度において単量体の減少は３７℃のＰＢＳ中に１００ｍｇ／ｍＬのａＶＥＧＦ、ＴＭ（ＡＦＤ．ｖ６）、ＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）、及びＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）（４０日間でそれぞれ１．８％、１．５％、０．７％、及び１．５％）よりもａＦＤ  ＷＴ及びＤ３０Ｅ（ＡＦＤ．ｖ２）（４０日間でそれぞれ５．８％及び７．３％）についてずっと大きい。これらのデータはＡＦＤ．ｖ６、ＡＦＤ．ｖ８及びＡＦＤ．ｖ１４がａＦＤ  ＷＴ及びＡＦＤ．ｖ２よりも少ない凝集を有し、それらはインビボで免疫原性になりにくい場合があり得るので治療薬としてより適切であり得ることを示唆している。
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【０１８０】
ｐＨの関数として形成される断片化を検出するため、直径５０μｍの内径を有する非被覆溶融石英毛管（Ｐｏｌｙｍｉｃｒｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）とベックマンＰＡ８００システムを使用してドデシル硫酸ナトリウムキャピラリー電気泳動（ＣＥ−ＳＤＳ）を実施した。Ｑ１２６９５と同等の自動化を有するベックマン・コールターＮＸｐリキッド・ハンドリング・ロボットにより試料を調製した。５ｋＶの電圧で１５秒間にわたって毛管に試料を注入し、その後で１５ｋＶの電圧で３０分間にわたって泳動した。全ての試料を外界温度で泳動した。全ての検査抗体の電気泳動図はａＦＤ  ＷＴの電気泳動図と同様である。ｐＨ２．５でのみ著しい断片化が観察された。高分子量種が観察される条件は無く、形成されたあらゆる凝集体がＳＤＳ分離可能であり、共有結合で結合していないことを示している。
【０１８１】
上記安定性結果は三重（ＴＭ（ＡＦＤ．ｖ６））及び四重（ＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８））突然変異体抗Ｄ因子変異体がａＦＤ  ＷＴまたはＤ３０Ｅ（ＡＦＤ．ｖ２）に対して著しく改善されている化学的安定性を有することを示している。このシリーズではＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．１４）はａＶＥＧＦの安定性と同様にｐＨ５．５及びＰＢＳにおいて最も高い化学的安定性を有する。異性化部位と脱アミド化部位の両方が除去されており、ｆＤ結合親和性を維持しつつ中性ｐＨにおける溶解性が上昇している。上記発見に基づくと、本明細書に記載される選択された抗Ｄ因子変異体、特にＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）変異体及びＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）変異体は高濃度製剤と、例えば、ポート送達系（ＰＤＳ）装置を介した長期作用性送達の両方に適切である。例えば、ポート送達系のような恒久的再充填可能装置を使用する長期作用性送達は高濃度製剤と生理的条件のｐＨ（約７．３）及びイオン強度（約１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）下での低い凝集傾向を必要とし得る。
ＨＶＲ配列の表（変異体中の置換に下線を引いてある）
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【０１８２】
実施例４．高分子複合体化用にさらに改変された抗Ｄ因子抗体変異体
上記実施例において説明されたａＦＤ  ＷＴ及び変異体はＦａｂ断片である。それらの軽鎖及び重鎖の可変ドメイン（ＶＬ及びＶＨ）は図１Ｂに示されるように配列に関して変化しており、それらの定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は同じままである。特に、重鎖のＣＨ１ドメインは図１Ａ（配列番号２）、図１Ｃ（配列番号２７）及び図１Ｄ（配列番号２９）に示されているようにトレオニン残基で終わる。ＰＥＧ化などの高分子複合体化用にａＦＤ変異体を調製するため、付加されたシステインがＰＥＧ高分子の結合部位として働くようにＦａｂ’対応物のヒンジ領域の最初のシステイン残基を付加することによりそのＦａｂ断片の重鎖をさらに改変した（例えばＡＦＤ．ｖ８のＣｙｓ修飾ＨＣ（配列番号３０）及びＡＦＤ．ｖ１４のＣｙｓ修飾ＨＣ（配列番号３２））。したがって、それにより生じる断片は１つのＰＥＧ分子と複合体化され得る。Ｆａｂ断片の重鎖は２つの付加されたＣｙｓの両方がＰＥＧの結合部位として働き、２つのＰＥＧ分子に結合できる改変ａＦＤ  Ｆａｂ断片が生じるようにＦａｂ’対応物のヒンジ領域の最初の４残基、すなわち、Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（配列番号２１）を付加することによっても改変された（例えば、ＡＦＤ．ｖ８のＣｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ修飾ＨＣ（配列番号３１）及びＡＦＤ．ｖ１４のＣｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ修飾ＨＣ（配列番号３３））。
【０１８３】
実施例５：ＡＦＤ．ｖ８／ｖ１４についてのウサギｐＫ
ＡＦＤ．ｖ８及びＡＦＤ．ｖ１４についてのインビボｐＫ試験をウサギにおいて行った。ヒト化抗体は反復投与時に、または曝露が持続性送達製剤を介して増加するとウサギにおいて免疫原性となるので単回投与実験からｐＫパラメーターを決定した。
【０１８４】
動物の世話はジェネンテック社動物実験委員会のガイドラインに従った。未感作ニュージーランド白（ＮＺＷ）ウサギ（４１匹のオス動物；投与時に３．１ｋｇから４．１ｋｇ及び約４か月齢）を投与群に割り当て、チャールス・リバー・ラボラトリーズにおいてそれらのウサギに検査品目を投与した。
【０１８５】
ＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）、ＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）またはラニビズマブを単回両側硝子体内注射によりウサギに投与し、最大で２７日間にわたって観察した。１日目及び２日目に剖検に送られる動物を除いて両眼に局所用抗生物質（トブラマイシン眼軟膏）を治療前日、その注射直後に２回塗布し、及びその注射の翌日に２回塗布した。投与前に完全に瞳孔を拡張させるために散瞳目薬（１％トロピカミド）を両目にさした。処置前及び処置中にイソフルラン／酸素ガスを用いて動物を落ち着かせた。注射前にアルカイン（０．５％）も両目にさした。結膜を米国薬局方の滅菌水に１：１０，０００（体積／体積）で希釈した塩化ベンザルコニウム（ゼフィラン（商標））で洗った。
【０１８６】
投与直前に注射器を層流フードの下で充填した。全ての動物においてＦａｂを単回３０μＬ硝子体内注射（０．３ｍｇ用量）により両眼に投与した。３０ゲージ×１／２インチの針を着けた滅菌１００μＬハミルトン・ルアーロック注射器を使用して認定獣医眼科専門医によって用量が投与された。臨床投与を模倣するため、眼の耳下側、すなわち、（動物に対面したときの）左眼及び右眼のそれぞれ５時と７時の位置に投与した。治療直後にそれらの眼を細隙灯生体顕微鏡検査法及び／または間接検眼法により調査した。
【０１８７】
全ての動物がペントバルビタールナトリウムの静脈内注射による麻酔後に腋下動脈または大腿動脈の切開により失血させられた。眼房水、硝子体液及び網膜組織を採取し、液体窒素中で瞬間凍結し、−８０℃で貯蔵した。網膜中の抗体Ｆａｂを５０ｍＭトリス塩酸ｐＨ８．０、１Ｍ  ＮａＣｌ中でのホモジナイゼーションにより抽出した。検査物品の硝子体濃度及び網膜濃度の決定は下に記載されるＧＲＩＰ  ＥＬＩＳＡによった。薬物動態分析、またはグラフ目的もしくは要約目的にＬＬＯＱ未満の値を使用しなかった。薬物動態パラメーターは名目上の時間及び用量を用いるノンコンパートメント解析（Ｐｈｏｅｎｉｘ  ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ、Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ社、マウンテン・ビュー、カリフォルニア州）により決定された。
【０１８８】
次の例外を含む一般的免疫グロブリン薬物動態（ＧＲＩＰ）ＥＬＩＳＡにおいてＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）、ＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）及びラニビズマブの分析を行った。ヒツジ抗ヒトＩｇＧ（Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ；サンディエゴ、カリフォルニア州）を０．５Ｍ炭酸／重炭酸、ｐＨ９．６中に１０００ｎｇ／ｍＬまで希釈し、４℃で一晩の培養中に３８４ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ；ネプチューン、ニュージャージー州）上に被覆した。プレートをＰＢＳプラス０．０５％ツイーン−２０で洗浄し、１時間から２時間の培養中にＰＢＳプラス０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックした。この培養及び後続の全ての培養は穏やかに撹拌しながら室温で実施した。ＡＦＤ．ｖ８、ＡＦＤ．ｖ１４またはラニビズマブをアッセイ緩衝液（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、１５ｐｐｍプロクリン、０．０５％ツイーン２０、０．２５％ＣＨＡＰＳ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．３５Ｍ  ＮａＣｌ、（ｐＨ７．４））中に４０〜０．６２５ｎｇ／ｍＬまで段階希釈することで検量線を作成した。ウサギ硝子体ホモジネート試料または網膜ホモジネート試料をアッセイ緩衝液中にそれぞれ最低１：１００または１：５０に希釈した。その後、それらの希釈標準品、対照、及び試料を洗浄したプレート上で１〜２時間にわたって培養した。洗浄ステップ後にプレートに結合したＡＦＤ．ｖ８、ＡＦＤ．ｖ１４またはラニビズマブをアッセイ希釈液（ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋０．０５％ツイーン２０＋１０ｐｐｍプロクリン）中に８３．３ｎｇ／ｍＬまで希釈したＨＲＰ結合ヒツジ抗ヒトＩｇＧ  ｍＡｂ（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社；モントゴメリー、テキサス州）との１．５時間の培養中に検出した。最後の洗浄後にテトラメチルベンジジンペルオキシダーゼ基質（Ｍｏｓｓ社、パサデナ、メリーランド州）を添加し、１０〜１５分間にわたって発色させ、及び１Ｍリン酸により反応を停止した。マイクロプレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ  Ａｓｃｅｎｔ、サーモフィッシャー；ウォルサム、マサチューセッツ州）を使用してそれらのプレートを６２０ｎｍの参照と共に４５０ｎｍで読んだ。自作のＥｘｃｅｌベースのソフトウェアを使用して各検量線の４パラメーターフィットからＡＦＤ．ｖ８、ＡＦＤ．ｖ１４またはラニビズマブの濃度を計算した。硝子体ホモジネートまたは網膜ホモジネートにおける最小希釈度を考慮に入れるとウサギ硝子体ホモジネートまたは網膜ホモジネート中のＡＦＤ．ｖ８、ＡＦＤ．ｖ１４またはラニビズマブの最小定量可能濃度はそれぞれ６２．５ｎｇ／ｍＬまたは３１．２５ｎｇ／ｍＬであった。
【０１８９】
０．３ｍｇのＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）の硝子体内注射、ＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）の硝子体内注射、またはラニビズマブ（抗ＶＥＧＦ）の対照投与について観察された時間依存濃度曲線が図１０に示されている。
【０１９０】
ノンコンパートメントモデルを使用する硝子体データの分析からＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）とＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）の両方がラニビズマブと非常に類似するクリアランス特性を有することが示された。３種類全てのタンパク質がＡＵＣパラメーターに反映されているように硝子体液、眼房水、及び網膜の３種類の眼の区画において非常に類似する曝露を示した。ラニビズマブについて計算されたＰＫパラメーターはウサギにおける以前の研究（Ｇａｕｄｒｅａｌｔ  ｅｔ  ａｌ，  Ｒｅｔｉｎａ，  ２７：１２６０−６  （２００７））と一致した。ＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）とＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）の両方がこれらの分子を開発にふさわしいものにする標的独立的眼クリアランス特性を示している。
【０１９１】
実施例６：ＡＦＤ．ｖ８／ｖ１４の粘度
低い粘度が硝子体内投与に重要であるので、ｐＨ５．５の低塩緩衝液中の様々なタンパク質濃度でのＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）及びＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）の粘度を測定した。１０００ｓ−１のせん断速度を用いて粘度測定を２５℃にサーモスタット制御されたＴＡインスツルメントのコーンプレートレオメーター上で実施した。
【０１９２】
ａＦＤ  ＷＴ、ＳＩＥＳＤ（ＡＦＤ．ｖ８）及びＳＩＥＳＤ．Ｎ１０３Ｓ（ＡＦＤ．ｖ１４）は２００ｍｇ／ｍＬを超える濃度であっても硝子体内注射にとって許容可能な粘度（３０ｃＰ未満）を有する同様の粘度のタンパク質濃度依存性プロファイルを示した（図１１）。
【０１９３】
当業者は本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多数の同等の実施形態を理解し、または日常的実験にすぎない実験を用いてそれらの実施形態を確認することができる。そのような同等の実施形態は以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
【０１９４】
前述の発明は明瞭な理解を目的として例示と実例により幾分詳しく説明されているが、それらの説明及び実例は本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書において引用される全ての特許文献及び科学文献の開示は参照により全体が明示的にに援用される。
【０１９５】
上記の明細書は当業者による本発明の実施を可能にするのに充分であると考えられる。挿入された実施形態は本発明のある特定の態様の一つの例示を目的としており、また機能的に同等であるあらゆる構成体は本発明の範囲内であるので、本発明は挿入された構成体によって範囲を限定されるべきではない。実際、本明細書において示され、記載された改変に加えて様々な本発明の改変が前述の説明から当業者に明らかになり、添付されている特許請求の範囲の範囲内に入る。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2017515811.tif 000019
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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