(57)【要約】本発明は、新規アシディチオバチルス・フェロオキシダンス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）株ならびに硫黄加硫ゴム粒子を細菌により脱硫するための方法およびその方法により得られる脱硫ゴム粒子に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
寄託番号ＤＳＭ  ３２０４６として寄託されたアシディチオバチルス・フェロオキシダンス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）株。
【請求項２】
１０〜２０００ミクロンのサイズを有する硫黄加硫ゴム粒子の好気性細菌による脱硫のための方法であって、
前記硫黄加硫ゴム粒子は、圧力下で水をゴム含有物品に噴霧し、得られた前記硫黄加硫ゴム粒子を０．０１〜２０重量％の初期水分含量まで乾燥させることによって得られ、前記方法は、
ａ）Ｎａ２ＳＯ３、ＦｅＳＯ４、ＦｅＣｌ３およびＮａ２Ｓ４Ｏ６またはそれらの混合物を含む群から選択される細菌による脱硫を促進するための無機塩およびエネルギー源を含有する水溶液を含む細菌増殖用の培地中に、種アシディチオバチルス・チオオキシダンス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｉｏｏｘｉｄａｎｓ）、アシディチオバチルス・フェロオキシダンス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）、チオバチルス・チオパルス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｉｏｐａｒｕｓ）、チオバチルス・チオフィラス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｉｏｐｈｉｌｕｓ）またはそれらの混合物からなる群から選択される好気性無機栄養細菌を提供する工程と、
ｂ）前記硫黄加硫ゴム粒子を、前記好気性無機栄養細菌を含有する前記細菌増殖用の培地を加えた脱硫用の処理培地に添加する工程であって、前記脱硫用の処理培地は、細菌による脱硫を促進するためのエネルギー源が枯渇している、工程と、
ｃ）前記硫黄加硫ゴム粒子を、２４時間から１５日の間を含む期間、前記脱硫用の処理培地中に維持する工程と、
ｄ）得られた脱硫ゴム粒子を回収し、乾燥させる工程と
を含む、好気性細菌による脱硫のための方法。
【請求項３】
前記ゴム含有物品が、タイヤまたはタイヤ部分、タイヤトレッド、靴底、コンベヤーベルトから選択される、請求項２に記載の好気性細菌による脱硫のための方法。
【請求項４】
前記脱硫用の処理培地に加えられる前記好気性無機栄養細菌を含有する前記細菌増殖用の培地の体積が１０〜８０％である、請求項２〜３のいずれか一項に記載の好気性細菌による脱硫のための方法。
【請求項５】
工程ｂ）の前記硫黄加硫ゴム粒子が１〜３５重量％の濃度で添加される、請求項２〜４のいずれか一項に記載の好気性細菌による脱硫のための方法。
【請求項６】
工程ａ）の前記好気性無機栄養細菌が、純粋な株として利用されるか、または群生で利用される、請求項２〜５のいずれか一項に記載の好気性細菌による脱硫のための方法。
【請求項７】
工程ａ）の前記細菌増殖用の培地および工程ｂ）の前記脱硫用の処理培地が撹拌される、請求項２〜６のいずれか一項に記載の好気性細菌による脱硫のための方法。
【請求項８】
工程ｂ）の前記脱硫用の処理培地が、ジエノフィルおよび有機酸をさらに含有する、請求項２〜７のいずれか一項に記載の好気性細菌による脱硫のための方法。
【請求項９】
前記有機酸が、マレイン酸、ピルビン酸、安息香酸、サリチル酸および／またはそれらの混合物からなる群から選択される、請求項８に記載の好気性細菌による脱硫のための方法。
【請求項１０】
前記ジエノフィルが、無水マレイン酸、２−オキソプロパナールまたはそれらの混合物からなる群から選択される、請求項８に記載の好気性細菌による脱硫のための方法。
【請求項１１】
前記細菌増殖用の培地が、ＭｎＳＯ４、ロイシン、サリチル酸またはそれらの混合物から選択される少なくとも１種の任意選択のさらなる構成成分をさらに含む、請求項２〜１０のいずれか一項に記載の好気性細菌による脱硫のための方法。
【請求項１２】
細菌増殖のためのエネルギー源の消費が、２２０〜２５０ｎｍ（Ｆｅ２＋）および／もしくは２８０〜３４０ｎｍ（Ｆｅ３＋）にて培地の吸光度を測定することによって、ならびに／または誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ）および／もしくは原子吸光分光学法（ＡＡＳ）での分析によってＦｅ２＋および／もしくはＦｅ３＋濃度を評価することによってモニターされ、Ｎａ２Ｓ２Ｏ３利用がメチレンブルー変色および／またはイオンクロマトグラフィーによって決定され、硫黄酸化が呼吸計によって酸素消費量を測定することによって決定される、請求項２〜１１のいずれか一項に記載の好気性細菌による脱硫のための方法。
【請求項１３】
工程ａ）の前記好気性無機栄養細菌が、純粋な株として利用されるか、または群生で利用される、寄託番号ＤＳＭ  ３２０４６として寄託されたアシディチオバチルス・フェロオキシダンス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）株である、請求項２〜１２のいずれか一項に記載の好気性細菌による脱硫のための方法。
【請求項１４】
請求項２〜１３のいずれか一項に記載の方法によって得られ、得られた脱硫ゴム粒子が、化学的に修飾され、前記脱硫ゴム粒子の表面上にスルホキシドおよび／または三酸化硫黄および／またはメチルにより補助されたコンジュゲートした二重結合および／またはヒドロキシル基および／またはカルボキシル基および／またはエポキシ基を含有することを特徴とする、脱硫ゴム粒子。
【請求項１５】
０．１重量％〜０．５重量％の濃度の遊離有機物の存在、
シクロヘキサノン、シクロプロパンおよびエタノールの８０％を超える濃度の減少、
７５％〜９５％の範囲の、水接触角の減少を測定することによって評価した湿潤性の増加、ならびに
７５％〜１５０％の範囲の水保持力の増加
を特徴とする、請求項１４に記載の脱硫ゴム粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規アシディチオバチルス・フェロオキシダンス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）株ならびに硫黄加硫ゴム粒子を細菌により脱硫するための方法およびその方法により得られる脱硫ゴム粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
粉末ゴムおよびゴム加硫を微生物により、および酵素的に活性化する方法が知られている。
【０００３】
特許文献１は、硫黄加硫ゴム粒子の表面活性化および／または脱硫のための方法を開示している。硫黄架橋を破壊し、硫黄を減少させるために、ゴム粒子は、中温嫌気性および／もしくは中温性で、任意に嫌気性および／もしくは中温微好気性細菌、ならびに／またはこのような細菌の１種以上の酵素系を有する培地中で生物工学的方法において処理される。
【０００４】
特許文献２は、生物工学的タイプのプロセスにおいて、元素硫黄および／または硫酸として硫黄が、残存している再可塑化再生ゴムから分離されるまで、空気を供給しながら無機栄養微生物の細菌懸濁液中に粉砕したくずゴムを保持することによって、脱硫後、粉砕したくずゴムから再生ゴムを産生する、くずゴムを再処理する方法を開示している。この生物工学的再処理は簡単な方法で再生ゴムおよび硫黄を得、その製品を再利用できる。
【０００５】
特許文献３は、多硫化物の硫黄架橋を破壊するため、および硫黄を酸化するための、ゴム粒子、水および生物学的に活性な材料の懸濁液中での生物工学的処理による硫黄架橋ゴム粒子の表面活性化および修飾のための方法を開示しており、それによって、処理は粒子表面に制限され、ヒドロキシル基、エポキシ基およびカルボキシル基の形態の反応基が時間とともに形成され、反応性官能基の濃度が最大に到達すると、生物工学的処理は終了する。
【０００６】
特許文献４は、一方で、好熱性で、任意に無機栄養のスルフォロブス・アシドカルダリウス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）が、硫黄酸化微生物として主に使用され、他方で、ゴム粒子の処理が単にこの微生物の酵素系により実施されることからなる方法を開示している。ゴム粒子自体は微生物と直接接触しない。
【０００７】
規定された反応時間／酸化継続時間による加硫ゴム粒子の生物工学的処理によって、ヒドロキシル基、エポキシ基およびカルボキシル基の形態の特定の反応性官能基が粒子表面上に生成される、別の方法が特許文献３に開示されている。結果として、異なるプラスチック、ビチューメンおよび他のポリマーで活性化された粉末ゴムおよびゴム顆粒を加硫することが可能になる。チオバチルス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属の細菌も微生物の酸化に使用される。
【０００８】
非特許文献１は、グランドタイヤゴム（ｇｒｏｕｎｄ  ｔｙｒｅ  ｒｕｂｂｅｒ（ＧＴＲ））脱硫のための４種の微生物のスクリーニングを開示している。試験した微生物は、チオバチルス・フェロオキシダンス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）、チオバチルス・チオオキシダンス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｉｏｏｘｉｄａｎｓ）、ロドコッカス・ロドクラウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）、スルフォロブス・アシドカルダリウス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）および未同定細菌ＡＴＣＣ＃３９３２７である。脱硫の評価は、イオンクロマトグラフィーおよび物質分析技術（１０３２ｃｍ−１の吸光度でのＦＴＩＲおよびＸＡＮＥＳ）によって溶液中の硫酸塩の濃度を測定することによって行った。著者らは処理の２〜３日後にＧＴＲの表面上に酸化硫黄種を見出し、生物脱硫プロセスが７日後に完了したと判断した。最後に、彼らは、「チオバチルス培養はＳ．アシドカルダリウス（Ｓ．ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）ほど効果的ではなかった」と結論付けた。全体的に、著者らは、脱硫のためにも使用される標準的な増殖培地である１つの培地のみを使用した。さらに、Ｒｏｍｉｎｅらは、使用する細菌種の注意深い選択、脱硫処理前の細菌増殖工程の重要性、ならびにチオ硫酸ナトリウムまたはテトラチオン酸ナトリウムのような硫黄源および鉄を含有する適応増殖培地を考慮しなかった。これは、数日かかり、工業的レベルで使用することができない低い生産性を示す脱硫プロセスをもたらす。
【０００９】
非特許文献２は、Ｔ．フェロオキシダンス（Ｔ．ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）を使用したグランドタイヤゴム（ＧＴＲ）脱硫のための手法を示している。特に、脱硫を証明するための物質分析技術（ＦＴＩＲおよびＸＰＳ）を使用している。しかしながら、ＧＴＲに最初に存在する高い化学毒性、それにより細菌培養物へのゴム添加後にバイオマスの減少をもたらすためにこの手法には大きな欠点がある。結果として、制限された量のＧＴＲのみしか処理できず、脱硫は処理の３０日後にしか起こらない。したがって、工業的レベルでのプロセスを改良するためにＧＴＲまたは硫黄加硫ゴム粒子の脱硫プロセスをスケールアップする必要性が存在する。さらに、加硫を遅らせることも目的であり得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】欧州特許第１６２０４９８号
【特許文献２】欧州特許第０４９３７３２号
【特許文献３】独国特許第１９７２８０３６Ａ号
【特許文献４】米国特許第５５９７８５１号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｒｏｍｉｎｅ  Ａ．Ｒｏｍｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．＜＜Ｒｕｂｂｅｒｃｙｃｌｅ：ａ  ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｗａｓｔｅ  ｔｙｒｅ  ｒｕｂｂｅｒ＞＞  Ｐｏｌｙｍｅｒ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ５９（１９９８）３５３−３５８
【非特許文献２】Ｙｕａｎｈｕ  Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．「Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｒｏｕｎｄ  ｔｉｒｅ  ｒｕｂｂｅｒ  ｂｙ  Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ」  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  Ｖｏｌ．９６，Ｎｏ．９，Ｐｇ１６６２−１６６８（２０１１）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の目的の１つは、寄託番号ＤＳＭ３２０４６として寄託されたアシディチオバチルス・フェロオキシダンス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）株を提供することである。
【００１３】
本発明の別の目的は、１０〜２０００ミクロンのサイズを有する硫黄加硫ゴム粒子の好気性細菌による脱硫のための方法であって、
前記硫黄加硫ゴム粒子は、圧力下で水をゴム含有物品に噴霧し、得られた前記硫黄加硫ゴム粒子を０．０１〜２０重量％の初期水分含量まで乾燥させることによって得られ、前記方法は、
ａ）Ｎａ２ＳＯ３、ＦｅＳＯ４、ＦｅＣｌ３およびＮａ２Ｓ４Ｏ６またはそれらの混合物を含む群から選択される細菌による脱硫を促進するための無機塩およびエネルギー源を含有する水溶液を含む細菌増殖用の培地中に、種アシディチオバチルス・チオオキシダンス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｉｏｏｘｉｄａｎｓ）、アシディチオバチルス・フェロオキシダンス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）、チオバチルス・チオパルス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｉｏｐａｒｕｓ）、チオバチルス・チオフィラス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｉｏｐｈｉｌｕｓ）またはそれらの混合物からなる群から選択される好気性無機栄養細菌を提供する工程と、
ｂ）前記硫黄加硫ゴム粒子を、前記好気性無機栄養細菌を含有する前記細菌増殖用の培地を加えた脱硫用の処理培地に添加する工程であって、前記脱硫用の処理培地は、細菌による脱硫を促進するためのエネルギー源が枯渇している、工程と、
ｃ）前記硫黄加硫ゴム粒子を、２４時間から１５日の間を含む期間、前記脱硫用の処理培地中に維持する工程と、
ｄ）得られた脱硫ゴム粒子を回収し、乾燥させる工程と
を含む、好気性細菌による脱硫のための方法を提供することである。
【００１４】
本発明のさらなる目的は、本発明の方法によって得られた脱硫ゴム粒子を提供し、得られた脱硫ゴム粒子が化学的に修飾され、前記脱硫ゴム粒子の表面上にスルホキシドおよび／または三酸化硫黄および／またはメチルにより補助された（ｍｅｔｈｙｌ−ａｓｓｉｓｔｅｄ）コンジュゲートした二重結合および／またはヒドロキシル基および／またはカルボキシル基および／またはエポキシ基を含有することを特徴付けることである。
【００１５】
本発明の他の目的および利点は、以下の例示的な図面を参照して進める以下の詳細な説明の概説、および添付の特許請求の範囲から当業者に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】高圧力下で水を車のタイヤに噴霧することによって得られたゴム粒子のＳＥＭ画像を示す。左：１５０倍の倍率、右：５００倍の倍率
【図２】Ａ．フェロオキシダンス（Ａ．ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）株ＤＳＭ  ３２０４６で処理したタイヤゴム粉末のＦＴＩＲ分析を示す。３３００ｃｍ−１におけるピーク：ヒドロキシル基。ＮＴ：未処理；４８ｈ：４８時間の処理、６ｄ：６日間の処理。
【図３】Ａ．フェロオキシダンス（Ａ．ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）株ＤＳＭ  ３２０４６で４８時間処理したＮＲのＥＤＸ分析を示す。未処理および処理の値をスチューデントｔ検定によって比較した。＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図４】Ａ．フェロオキシダンス（Ａ．ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）株ＤＳＭ  ３２０４６で処理したタイヤゴム粉末のＦＴＩＲ分析を示す。１５３６ｃｍ−１におけるピーク：メチルにより補助されたコンジュゲートした二重結合。
【図５】燃焼イオンクロマトグラフィーによるゴム粒子における硫黄含有量の分析を示す。ＮＴ：未処理（１００％）、ＴＴ：Ａ．チオオキシダンス（Ａ．ｔｈｉｏｏｘｉｄａｎｓ）、ＴＦ：Ａ．フェロオキシダンス（Ａ．ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）で処理。
【図６】Ａ．フェロオキシダンス（Ａ．ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）株ＤＳＭ  ３２０４６で処理したＥＰＤＭのＳＥＭ／ＥＤＸ分析による表面硫黄定量化。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書に記載されているものと類似または等価の方法および材料が、本発明を実施または試験するのに使用されてもよいが、適切な方法および材料が以下に記載される。本明細書に述べられている全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献はそれらの全体が参照により援用される。本明細書で議論されている刊行物および出願は、本出願の出願日前のそれらの開示のためだけに提供されている。本明細書において、本発明が先行の発明によってそのような刊行物に先行する権利がないことを認めると解釈されるべきではない。加えて、材料、方法および例は、例示のみであり、限定することを意図していない。
【００１８】
矛盾する場合、定義を含む本明細書が支配する。他に定義しない限り、本明細書に使用される全ての技術および科学用語は、本明細書の主題が属している当業者により一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に使用される場合、以下の定義は本発明の理解を促進するために与えられる。
【００１９】
ゴムはタイヤを製造するのに使用される主原料であり、天然および合成の両方のゴムが使用される。天然ゴムは、ゴムノキ、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  Ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）の樹皮において乳状液体として見つけられる。タイヤ製造に使用される原料ゴムを生成するために、ゴムを凝固させる液体ラテックスを酸と混合する。圧力をかけることにより、過剰な水を絞り出し、ゴムをシートに形成し、次いでシートを丈の高いスモークハウスで乾燥させ、巨大なベールに押圧し、世界中のタイヤ工場に輸送する。合成ゴムは原油中に見出されるポリマーから生成される。
【００２０】
タイヤゴムにおける他の主成分はカーボンブラックである。カーボンブラックは、原油または天然ガスが限られた量の酸素で燃焼したときに生じ、不完全燃焼を引き起こし、大量の微細なすすを生じる、微細な軟性粉末である。
【００２１】
硫黄および他の化学物質もまた、タイヤに使用される。特定の化学物質は、ゴムと混合され、次いで加熱された場合、レース用タイヤについての高い摩擦（しかし少ない走行距離）または乗用車用のタイヤについての多い走行距離（しかし低い摩擦）などの特定のタイヤの特性を生じる。いくつかの化学物質は、タイヤに成形される間、ゴムの柔軟性を維持し、一方、他の化学物質は太陽光の紫外線放射からゴムを保護する。
【００２２】
合計、２００を超える原材料がタイヤの組成に入っている。研究者はタイヤ組成を組み合わせるためにこの広範な配列を利用し、それらの各々は、製造されるタイヤの種類に応じて役割を有する。ゴム化合物は、エラストマー、補強材、可塑剤および他の化学物質から構成される。
【００２３】
「含む」という用語は、一般に、含む意味で使用される。すなわち、１つまたは複数の特徴または成分の存在を許容する。
【００２４】
明細書および請求項に使用される場合、単数形「一つの（ａ、ａｎ）」および「その」は、文脈が明確に他を示さない限り、複数の参照を含む。
【００２５】
ＡＴＲ−ＦＴＩＲは、減衰全反射モジュールに連結されたフーリエ変換赤外分光についての省略形である。
【００２６】
無機栄養細菌は、鉄、窒素、硫黄または水素の無機化合物の酸化からエネルギーを導き出すことができる細菌である。
【００２７】
好気性細菌は、含酸素環境中で生存し、増殖できる生物である。
【００２８】
脱硫は、細菌によるゴム粒子の界面化学の修飾であり、ゴムマトリクス上の硫黄含有量の減少およびヒドロキシル基などの化学基の付加を生じる。ゴム粒子が、細菌が加えられた脱硫培地に添加されたとき、脱硫が起こる。
【００２９】
脱硫ゴム粒子は、脱硫に供されたゴム粒子である。
【００３０】
ジエノフィルは、ディールス・アルダー反応においてジエンを求めるオレフィンまたはアセチレン成分である。
【００３１】
ＥＰＤＭは、エチレン−プロピレンジエンモノマーゴムを表す。
【００３２】
ＮＲは、天然ゴムの省略形である。ゴム小球を含有する乳液状のホワイトラテックスはゴムノキの樹皮に切り込みを入れることによって得られる。その栽培は特定の気候条件および降雨を必要とする。ゴムノキの農園は主に東南アジア（タイ（世界で最大の生産国）およびインドネシアを含む）、中南米およびアフリカにある。化合物の配合において、天然ゴムはタイヤの発熱を減らすが、高い機械抵抗を与える。それは、主にトラックおよび土木機械タイヤトレッドのために使用される、タイヤの多くの部分に使用される。
【００３３】
ＳＢＲは、スチレンブタジエンゴムの省略形である。タイヤ工業に使用されるゴムの６０％は合成ゴムであり、石油系炭化水素から生成されるが、残りの４０％について天然ゴムが依然として必要である。合成エラストマーは応力下で変形し、応力が取り除かれる（ヒステリシス）とそれらの元の形状に戻る。この特性はハイグリップタイヤを製造するのに非常に有益である。合成ゴムはまた、とりわけ寿命および転がり抵抗の分野において他の特定の特性を提供する。それは主に、良好なグリップ性能を与えるので、乗用車用およびオートバイ用のタイヤに使用される。
【００３４】
ＳＥＭ／ＥＤＸは、エネルギー分散Ｘ線分析システムに連結された走査型電子顕微鏡の省略形を表す。
【００３５】
本発明は、寄託番号ＤＳＭ  ３２０４６として寄託されたアシディチオバチルス・フェロオキシダンス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）株に関する。
【００３６】
本発明の別の目的は、１０〜２０００ミクロンのサイズを有する硫黄加硫ゴム粒子の好気性細菌による脱硫のための方法であって、
前記硫黄加硫ゴム粒子は、圧力下で水をゴム含有物品に噴霧し、得られた前記硫黄加硫ゴム粒子を０．０１〜２０重量％の初期水分含量まで乾燥させることによって得られ得るか、または得られ、前記方法は、
ａ）Ｎａ２ＳＯ３、ＦｅＳＯ４、ＦｅＣｌ３およびＮａ２Ｓ４Ｏ６またはそれらの混合物を含む群から選択される細菌による脱硫を促進するための無機塩およびエネルギー源を含有する水溶液を含む細菌増殖用の培地中に、種アシディチオバチルス・チオオキシダンス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｉｏｏｘｉｄａｎｓ）、アシディチオバチルス・フェロオキシダンス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）、チオバチルス・チオパルス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｉｏｐａｒｕｓ）、チオバチルス・チオフィラス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｉｏｐｈｉｌｕｓ）またはそれらの混合物からなる群から選択される好気性無機栄養細菌を提供する工程と、
ｂ）前記硫黄加硫ゴム粒子を、前記好気性無機栄養細菌を含有する前記細菌増殖用の培地を加えた脱硫用の処理培地に添加する工程であって、前記脱硫用の処理培地は、細菌による脱硫を促進するためのエネルギー源が枯渇している、工程と、
ｃ）前記硫黄加硫ゴム粒子を、２４時間から１５日の間を含む期間、前記脱硫用の処理培地中に維持する工程と、
ｄ）得られた脱硫ゴム粒子を回収し、乾燥させる工程と
を含む、好気性細菌による脱硫のための方法
を提供することである。
【００３７】
Ｙｕａｎｈｕ  Ｌｉらに記載されている手法と本発明との１つの重要な相違は、ＧＴＲを得るための微粉化／粉砕技術の選択である。タイヤを再利用する最も一般的な手法は機械的粉砕によるが、出願人は、廃タイヤを完全に分解するために高圧水を利用する技術を選択した。高圧または超高圧水ジェットミル技術は、ゴムおよび類似の弾性材料などのエラストマーを細かく粉砕するための新たな方向性とみなされ得る。従来のタイヤの破砕および機械的粉砕の代わりに、この技術は、微細なゴム粉末を得るためのゴム（弾性）部分の抽出および同時粉砕のために高圧水ジェット（すなわち、米国特許第５１１５９８３Ａ号；Ｄ＆Ｒ  Ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ，Ｉｎｃ．に記載されている）のみを適用する。
【００３８】
特に、本発明の微粉化技術は、ＧＴＲに存在する毒性化学物質の減少を可能とする最適な培養培地と組み合わせた高圧水または水ジェットに基づく。有益には、出願人は、高濃度のＧＲＴ（Ｌｉらによって提示されている５％の代わりに好ましくは２０％）で作業でき、細菌培養物にゴムを加えた後にバイオマスの減少が全く観察されない。さらに本発明は、鉄と、チオ硫酸塩およびテトラチオン酸塩などの化合物を含む硫黄結合との組み合わせを使用した細菌種および増殖培地の特定の選択に基づき、エネルギー源としてＧＴＲにおけるジスルフィド結合を使用する細菌の能力を増加させる。驚くべきことに、本発明の脱硫プロセスは、Ｌｉらに記載されている３０日の代わりに処理の４８時間後に既に起こっている。
【００３９】
好ましくは、ゴム含有物品は、タイヤまたはタイヤ部分、タイヤトレッド、靴底、コンベヤーベルトから選択される。ゴム含有物品としてはまた、限定されないが、空気タイヤ、ゴムブーツ、ゴム製衣類、ウェットスーツ、ドライスーツ、バンパー、ロードフェンダー、マリンフェンダー、ゴムダンパー、タンクトラック用のパッド、ゴムクレーラートラック、機械防振パッド、保護用レールカーライナー、防音パッド、床タイル、レールダンパー、ボートトレーラーパッド、遮風ワイパーブレード、押出プロファイル、射出成形コア、泥よけが挙げられる。
【００４０】
空気タイヤは、車、自転車、単車、トラック、重機および航空機を含む、多くの種類の乗り物に使用される。固形ゴム（または他のポリマー）タイヤは、一部のキャスター、カート、芝刈り機および一輪車などの様々な自動ではない用途に使用される。高耐久性タイヤはトラック／バス用タイヤとも称される。
【００４１】
脱硫される硫黄加硫ゴム粒子は、有益には、高圧下で水をタイヤまたはタイヤ部分などのゴム含有物品に噴霧し、得られた粒子を乾燥させることによって得られる。
【００４２】
本発明の一実施形態によれば、脱硫用の処理培地に加えられる前記好気性無機栄養細菌を含有する細菌増殖用の培地の体積は１０〜８０％である。
【００４３】
好ましい実施形態において、工程ｂ）の硫黄加硫ゴム粒子は１〜３５重量％の濃度で添加される。
【００４４】
本発明の方法によれば、工程ａ）の好気性無機栄養細菌は、純粋な株として利用されてもよく、または群生で利用されてもよい。
【００４５】
有益には、工程ａ）の細菌増殖用の培地および工程ｂ）の脱硫用の処理培地は撹拌される。好ましくは、撹拌は、毎分１０〜３００回転（ｒｐｍ）の範囲の垂直もしくは水平らせん状撹拌混合および／または１０〜５００ｒｐｍの範囲の軌道変化（ｏｒｂｉｔａｌｌｙ）振盪および／または０．０１〜２０Ｌ／分の範囲の通気を含む。
【００４６】
細菌培養および増殖用の培地は、Ｎａ２ＳＯ３、ＦｅＳＯ４、ＦｅＣｌ３およびＮａ２Ｓ４Ｏ６またはそれらの混合物を含有し、
ａ．  Ｎａ２ＳＯ３および／またはＦｅＳＯ４は０．０５〜４．０ｇ／Ｌの濃度で含まれ、
ｂ．  ＦｅＣｌ３および／またはＮａ２Ｓ４Ｏ６は０．０５〜１０．０ｇ／Ｌの濃度で含まれる。
【００４７】
別の好ましい実施形態において、工程ｂ）の脱硫用の処理培地は、ジエノフィルおよび有機酸をさらに含有する。好ましくは、有機酸は、マレイン酸、ピルビン酸、安息香酸、サリチル酸および／またはそれらの混合物の群から選択される。通常、ジエノフィルは、無水マレイン酸、２−オキソプロパナールまたはそれらの混合物からなる群から選択される。特に、細菌培養および増殖用の培地は、０、好ましくは０．０１〜０．５ｇ／Ｌの濃度のサリチル酸、および／または０、好ましくは０．０１〜０．５ｇ／Ｌの濃度の安息香酸および／または０、好ましくは０．０１〜０．５ｇ／Ｌの濃度のピルビン酸および／または０、好ましくは０．０１〜０．５ｇ／Ｌの濃度のマレイン酸を含んでもよい。
【００４８】
本発明の別の実施形態によれば、細菌増殖用の培地は、ＭｎＳＯ４；ロイシン；チモール；サリチル酸および／またはそれらの混合物から選択される少なくとも１種の任意選択のさらなる構成成分をさらに含む。
【００４９】
１Ｍ〜１０ＭのＨＣｌ、６０％〜９８％のＨ２ＳＯ４、１Ｍ〜１０ＭのＮａＯＨおよび１Ｍ〜２ＭのＫ２ＣＯ３を使用することによって細菌増殖用の培地のｐＨは、１．０〜７．０、好ましくは１．５〜６．５に調整され得る。
【００５０】
細菌増殖のためのエネルギー源の消費は、２２０〜２５０ｎｍ（Ｆｅ２＋）および／もしくは２８０〜３４０ｎｍ（Ｆｅ３＋）にて培地の吸光度を測定することによって、ならびに／または誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ）および／もしくは原子吸光分光学法（ＡＡＳ）での分析によってＦｅ２＋および／もしくはＦｅ３＋濃度を評価することによってモニターされ、Ｎａ２Ｓ２Ｏ３利用はメチレンブルー変色および／またはイオンクロマトグラフィーによって決定され、硫黄酸化は呼吸計によって酸素消費量を測定することによって決定される。
【００５１】
本発明の好ましい実施形態において、工程ａ）の好気性無機栄養細菌は、純粋な株として利用されるか、または群生で利用される寄託番号ＤＳＭ  ３２０４６として寄託されたアシディチオバチルス・フェロオキシダンス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）株である。
【００５２】
脱硫のための生微生物のストックとして別々に細菌を培養する必要性はプロセスの効率的な工業化にとって不可欠である。
【００５３】
ゴム粉末中の汚染物質の存在は効率的な脱硫にとって妨害となる。なぜなら、汚染源（真菌または他の細菌）は、選択した細菌の増殖を妨げる可能性があり、ゴム粒子を分解する可能性があり、脱硫に関わる化学的および酵素的反応を妨げる可能性があるからである。
【００５４】
任意に、ゴム粒子は、細菌および他の微生物による汚染を回避するために、γ−殺菌または蒸気殺菌またはエチレンオキシドもしくは二酸化窒素もしくはオゾンに基づく化学殺菌によって脱硫の前および／または後に滅菌される。
【００５５】
本発明は、例示のみとして与えられる好ましい実施形態の以下の説明からより明確に理解される。
【００５６】
好ましい実施形態において、本発明は、１０〜２０００ミクロン、好ましくは１０〜９００ミクロン、より好ましくは１５０〜６００ミクロンのサイズ、および０．０１〜２０重量％、好ましくは０．０１〜５重量％、より好ましくは０．１〜４重量％の初期水分含有量を有する硫黄加硫ゴム粒子を細菌により脱硫するための方法を提供する。処理される硫黄加硫ゴム粒子は多くの起源に由来し得る。例えば、硫黄加硫ゴム粒子は、高圧下で水をタイヤまたはタイヤ部分に噴霧し、得られた粒子を乾燥させることによって得られ得る。この場合、脱硫される硫黄加硫ゴム粒子は特定の初期水分含有量に到達させるために予備乾燥処理に供され得る。少し好ましい変形例において、硫黄加硫ゴム粒子は乾燥処理を必要としない粉砕プロセスに由来してもよい。
【００５７】
この好ましい実施形態において、細菌および他の微生物からの汚染を回避するために、ゴム粒子は脱硫前にγ−殺菌、蒸気殺菌によって滅菌される。
【００５８】
この好ましい実施形態において、細菌は好気性無機栄養細菌生物から選択される。第１の実施形態において、アシディチオバチルス・チオオキシダンス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｉｏｏｘｉｄａｎｓ）は群生の３０％を占め、アシディチオバチルス・フェロオキシダンス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）は群生の３０％を占め、チオバチルス・チオパルス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｉｏｐａｒｕｓ）は群生の３０％を占め、チオバチルス・チオフィラス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｉｏｐｈｉｌｕｓ）は群生の１０％を占める。
【００５９】
細菌の群生は、０．５〜７、好ましくは０．５〜４．５のｐＨ、および２０〜３５℃、好ましくは２０〜３０℃の温度にて無機塩を含有する水溶液を含む細菌増殖培地中で細菌を増殖させる培養プロセスに供され、前記培養培地はさらに、Ｎａ２ＳＯ３および／またはＦｅＳＯ４および／またはＦｅＣｌ３および／またはＮａ２Ｓ４Ｏ６および／またはそれらの混合物から選択される、細菌増殖を促進するためのエネルギー源を含む。細菌増殖用の培地のｐＨは、１Ｍ〜１０ＭのＨＣｌ、６０％〜９８％のＨ２ＳＯ４、１Ｍ〜１０ＭのＮａＯＨおよび／または１Ｍ〜２ＭのＫ２ＣＯ３を使用することによって調整され得る。
【００６０】
増殖培地は異なる手段によって撹拌され得る。撹拌は、毎分１０〜３００回転（ｒｐｍ）、好ましくは３０〜１００  １２０ｒｐｍの範囲の垂直もしくは水平らせん状撹拌混合、または１０〜５００ｒｐｍ、好ましくは５０〜２００ｒｐｍの範囲の軌道変化振盪、または０．０１〜２０Ｌ／ｍｎの範囲の通気であってもよい。
【００６１】
細菌増殖用のエネルギー源の消費は、２２０〜２５０ｎｍ（Ｆｅ２＋）および／もしくは２８０〜３４０ｎｍ（Ｆｅ３＋）にて培地の吸光度を測定することによって、またはＦｅ２＋からＦｅ３＋への酸化を比色分析で測定することによって、または２３０〜２６０ｎｍ（Ｎａ２Ｓ２Ｏ３）にてモニターされ、Ｎａ２Ｓ２Ｏ３利用はヨード滴定メチレンブルー脱色によって決定され、硫黄酸化は呼吸計によって酸素消費量を測定することによって決定される。
【００６２】
次いでゴム粒子は、細菌を含み、１重量％〜３５重量％の濃度のゴム粒子を含有する処理培地中で硫黄脱硫処理に供される。脱硫の間、培地は好ましくは０．５〜４．５のｐＨおよび２０〜３０℃の温度である。
【００６３】
この好ましい実施形態において、細菌を含み、１〜３５重量％の濃度のゴム粒子を含有する処理培地はさらに、０．０５〜４．０ｇ／Ｌ、好ましくは０．０５〜３．０ｇ／Ｌの濃度のＭｇＳＯ４および０．０５〜１０．０ｇ／Ｌ、好ましくは０．０５〜３．５ｇ／Ｌの濃度のＫ２ＨＰＯ４、および０．０５〜１０．０ｇ／Ｌ、好ましくは２．０〜８．０ｇ／Ｌの濃度の（ＮＨ４）２ＳＯ４を含有する。この培地は以下から選択される少なくとも１種の任意選択のさらなる構成成分を含んでもよい：
ａ．  ０．１〜２ｇ／Ｌの濃度のＫＣｌ、ならびに／または
ｂ．  ０．１〜０．５ｇ／Ｌの濃度のＣａ（ＮＯ３）２、ならびに／または
ｃ．  ０．０１〜０．５ｇ／Ｌの濃度のチモールおよび／もしくは０．０１〜０．５ｇ／Ｌの濃度のサリチル酸および／もしくは０．０１〜０．５ｇ／Ｌの濃度のピルビン酸および／もしくは０．０１〜０．５ｇ／Ｌの濃度のマレイン酸から選択される化学物質。
【００６４】
脱硫処理は２４時間〜１２日間続けてもよい。プロセスの終了後、得られた脱硫ゴム粒子は湿っているので、０．０１〜１５重量％の水分含有量まで乾燥させる。
【００６５】
さらなる工程において、ゴム粒子は、γ−殺菌、加熱または蒸気殺菌によって細菌および他の微生物による汚染を回避するために脱硫後に滅菌される。
【００６６】
本発明の別の目的は、上記で特定した方法によって得られる（または得られた）脱硫ゴム粒子を提供することであり、得られた脱硫ゴム粒子は化学的に修飾され、前記脱硫ゴム粒子の表面上にスルホキシドおよび／または三酸化硫黄および／またはメチルにより補助されたコンジュゲートした二重結合および／またはヒドロキシル基および／またはカルボキシル基および／またはエポキシ基を含有する。
【００６７】
さらに、本発明の脱硫ゴム粒子は、０．１重量％〜０．５重量％の濃度の遊離有機物の存在、ＮＲ／ＳＢＲ混合物（車のタイヤ）中のシクロヘキサノン、シクロプロパンおよびエタノールなどの揮発性化合物の８０％を超える濃度の減少、（車およびトラックのタイヤ中の）メチルイソブチルケトン（ＭＩＢＫ）の少なくとも５０％の濃度の減少、７５％〜９５％の範囲の、水接触角の減少を測定することによって評価した高い湿潤性ならびに７５％〜１５０％の範囲の水分保持力の増加によって規定される。
【００６８】
水分保持力は規定量のゴム粒子に保持される蒸留水の百分率を測定することによって評価した。水接触角はゴム化合物の表面上の水滴の水接触角を測定することによって評価した。水平写真を各水滴について撮り、接触角を写真で測定する。
【００６９】
さらに、ＳＢＲおよびＮＲ（車およびトラックのタイヤ）中の５０％〜８０％の範囲のメチルイソブチルケトン（ＭＩＢＫ）（タイヤにおける溶媒として使用される）の濃度の減少、ならびにＮＲ／ＳＢＲ混合物（車のタイヤ）中のシクロヘキサノン、シクロプロパンおよびエタノールなどの揮発性化合物の８０％を超える濃度の減少が観察された（実施例２を参照のこと）。特に、揮発性有機化合物を、Ｈｅａｄｓｐａｃｅガスクロマトグラフィー質量分析（ＨＳ−ＧＣ−ＭＳ）によって確認し、定量した。
【００７０】
当業者は、本明細書に記載されている発明が、具体的に記載されているもの以外の変更および修飾をされてもよいことを理解するであろう。本発明は、その精神または不可欠な特徴から逸脱せずに全てのこのような変更および修飾を含むことは理解されるべきである。本発明はまた、個々にまたはまとめて本明細書に参照または示されている工程、特徴、組成物および化合物、ならびに前記工程もしくは特徴の任意および全ての組み合わせまたはそれらの任意の２つもしくはそれ以上の全てを含む。したがって、本開示は全ての態様において例示であり、限定とみなされず、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によって示され、等価物の意味および範囲内の全ての変更は本明細書に包含されると意図される。
【００７１】
様々な参考文献が本明細書全体を通して引用されており、それらの各々はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００７２】
前述の説明は以下の実施例を参照してより十分に理解される。しかしながら、このような実施例は本発明を実施する方法の例であり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【００７３】
ゴム粒子は、８００〜３０００バールの範囲の高圧下の水を用いて、毎分１〜４メートルの速度で水をタイヤに噴霧し、次いで乾燥させることによって得られる。これらの粒子は高表面積および不規則な形状によって特徴付けられる（図１）。このように得られた粒子は２０００〜５０マイクロメートルを含む粒度分布を有する。
【００７４】
選択した細菌を用いてゴム粒子を処理するための一般的なプロトコルは以下に記載されている。一般に、細菌はそれらの増殖を促進するための無機塩およびエネルギー物質を含む培養物中に維持される。ゴム粉末の処理に関して、ゴムに存在する硫黄化化合物の標的化を促進するために水性培地にはエネルギー源が枯渇している。そのため、細菌はエネルギー源としてゴム粒子から硫黄化合物を直接使用し、これによりゴムの脱硫が導かれる。
【００７５】
実施例１：
アシディチオバチルス・フェロオキシダンス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）株ＤＳＭ  ３２０４６を、０．５ｇ／ＬのＦｅＳＯ４、０．４ｇ／ＬのＭｇＳＯ４、０．６ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．４ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、０．３ｇ／ＬのＫ２Ｓ４Ｏ６を含有する水性増殖培地中の培養物中に維持する。ｐＨはＨ２ＳＯ４により２．２０に調整する。細菌を５００Ｌのバイオリタクター内で増殖させる。
【００７６】
細菌数が１×１０６細菌／ｍＬに到達したとき、増殖培養物からの７５０Ｌの細菌培地を脱硫バイオリアクター内で１：６の比率にて脱硫培地で希釈して、３’０００Ｌの最終体積にする。脱硫培地は、０．６ｇ／ＬのＭｇＳＯ４、２ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４によって構成される。次いでＮＲによって構成されるゴム粒子を２０重量％／体積（３’０００Ｌに対して６００ｋｇ）の濃度で脱硫バイオリアクター内に加える。ゴム粒子と細菌の混合物を、４８時間または６日間３０℃の温度で１００ｒｐｍにて撹拌下に維持する。
【００７７】
処理後、ゴム粒子を、混合物を水切り（市販されている）に通すことによって水性培地から分離し、次いで工業的に市販されている設備内で１２０℃にて乾燥させて、１．０＋０．３％の水分を含むゴム粉末を得る。
【００７８】
処理したゴム粒子はＡＴＲ−ＦＴＩＲおよびＳＥＭ／ＥＤＸによって分析する。ＡＴＲ−ＦＴＩＲ分析はゴム粒子の表面上のヒドロキシル基の出現を示す（図２、３’３００ｃｍ−１におけるブロードピークを参照のこと）。ヒドロキシル基の量に起因するピークの強度は時間依存的であり、処理の６日後に増加する（図２）。処理の４８時間後のゴム粒子のＳＥＭ／ＥＤＸ分析は粒子の表面上の硫黄の減少および酸素の増加を示し、表面上のヒドロキシル基の存在を確認した（図３）。まとめると、これらの結果は、Ａ．フェロオキシダンス（Ａ．ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）の選択した株がゴム粒子の脱硫を実施するのに特に効果的であり、この効果は処理時間に依存的であることを示す。
【００７９】
さらに、処理前のゴム粉末は表面上にいくつかのメチルにより補助されたコンジュゲートした二重結合を示し、それはＡＴＲ−ＦＴＩＲ分析（１５３６ｃｍ−１におけるピーク、図４）によって可視化できる。これらの化学構造はゴムの機械的特性を減少させ、サリチル酸の存在下でのＡ．フェロオキシダンス（Ａ．ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）による処理はこれらの望ましくない構造の消失を可能にする（図４）。このことは、本発明による細菌処理が、ゴム粒子の表面化学の修飾を引き起こし、有益には、最終産物の機械的特性を増加させることを証明する。
【００８０】
実施例２：
チオバチルス（ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｉ）の２つの株、Ａ．フェロオキシダンス（Ａ．ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）株ＤＳＭ  ３２０４６および１つのアシディチオバチルス・チオオキシダンス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｉｏｏｘｉｄａｎｓ）株を１５Ｌのバイオリアクター内で別々に増殖させる。
【００８１】
Ａ．フェロオキシダンス（Ａ．ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）株についての増殖培地は、０．１ｇ／ＬのＦｅＳＯ４、０．５ｇ／ＬのＭｇＳＯ４、３ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．５ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、２ｇ／ＬのＮａ２Ｓ２Ｏ３および０．０５ｇ／Ｌのサリチル酸によって構成される。ｐＨはＨ２ＳＯ４により４．５に調整する。
【００８２】
Ａ．チオオキシダンス（Ａ．ｔｈｉｏｏｘｉｄａｎｓ）株についての増殖培地は、０．０５ｇ／ＬのＭｎＳＯ４、０．５ｇ／ＬのＭｇＳＯ４、３．０ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２．０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、２．０ｇ／ＬのＮａ２Ｓ２Ｏ３および０．０５ｇ／Ｌのサリチル酸によって構成される。ｐＨはＨ２ＳＯ４により４．５に調整する。
【００８３】
細菌数が１×１０６細菌／ｍＬに到達したとき、各ストック培養物からの１０Ｌの細菌培地を、２つの脱硫バイオリアクター（１つの株につき１つ）内で１：３の比率にて脱硫培地で別々に希釈して３０Ｌの最終体積にする。
【００８４】
Ａ．フェロオキシダンス（Ａ．ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）株についての脱硫培地は、０．５ｇ／ＬのＭｇＳＯ４、３．０ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．８ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１．０ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、０．０５ｇ／Ｌのサリチル酸および０．０１ｇ／Ｌのピルビン酸によって構成される。
【００８５】
Ａ．チオオキシダンス（Ａ．ｔｈｉｏｏｘｉｄａｎｓ）株についての脱硫培地は、０．５ｇ／ＬのＭｇＳＯ４、３．０ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２．０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１．０ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、０．０５ｇ／Ｌのサリチル酸および０．０１ｇ／Ｌのピルビン酸によって構成される。
【００８６】
次いでＳＢＲ／ＮＲによって構成されるゴム粒子が２０重量％／体積（３０Ｌに対して６ｋｇ）の濃度で脱硫バイオリアクター内に加えられる。ゴム粒子と細菌の混合物を４８時間３０℃の温度で１００ｒｐｍにて撹拌下に維持する。
【００８７】
処理後、ゴム粒子を、混合物を水切り（市販されている）に通すことによって水性培地から分離し、次いで工業的に市販されている設備において５５℃にて乾燥させて、１．５＋０．２％の水分を含むゴム粉末を得る。
【００８８】
処理した粒子の全硫黄含有量を燃焼イオンクロマトグラフィーによって分析する。処理した粒子中の全硫黄含有量の１６％および２９％の減少を、Ａ．チオオキシダンス（Ａ．ｔｈｉｏｏｘｉｄａｎｓ）およびＡ．フェロオキシダンス（Ａ．ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）のそれぞれによる処理後に観察する（図５）。これらの結果は、両方の種がゴム粒子における硫黄含有量を減少させることができ、したがって脱硫を十分に実施できることを実証する。
【００８９】
さらに、処理前のゴム粉末は表面上のいくつかのメチルで補助されたコンジュゲートした二重結合を示し、それはＡＴＲ−ＦＴＩＲ分析によって可視化できる（１５３６ｃｍ−１におけるピーク、図５）。これらの化学構造はゴムの機械的特性を減少させ、サリチル酸の存在下でのＡ．フェロオキシダンス（Ａ．ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）による処理はこれらの望ましくない構造の消失を可能にする（図５）。このことは、細菌処理がゴム粒子の表面化学の修飾を引き起こし、有益には、最終産物の機械的特性を増加させることを証明する。
【００９０】
最後に、Ａ．フェロオキシダンス（Ａ．ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）により処理した粒子および未処理のゴム粒子における揮発性化合物の放出をＨＳ−ＧＣ−ＭＳによって評価した。すなわち、揮発性有機化合物を、Ｈｅａｄｓｐａｃｅガスクロマトグラフィー質量分析（ＨＳ−ＧＣ−ＭＳ）によって識別し、定量した。全体的に、処理後に揮発性物質の濃度の減少を測定した。特に、メチルイソブチルケトン（ＭＩＢＫ）の濃度は７０％減少し、シクロヘキサノンの濃度は８２％減少し、シクロプロパンの濃度は８４％減少し、エタノールの濃度は８７％減少した。
【００９１】
実施例３：
Ａ．フェロオキシダンス（Ａ．ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）株ＤＳＭ  ３２０４６を実施例２に記載されるように増殖させる。細菌数が１×１０６細菌／ｍＬに到達したとき、ストック培養物からの１０Ｌの細菌培地を脱硫バイオリアクター内で１：３の比率にて脱硫培地（実施例２に記載される組成）で希釈して、３０Ｌの最終体積にする。
【００９２】
次いでＥＰＤＭによって構成されるゴム粒子を、１０重量％／体積（３０Ｌに対して３ｋｇ）の濃度で脱硫バイオリアクター内に加える。ゴム粒子と細菌の混合物を４８時間３０℃の温度で１００ｒｐｍにて撹拌下に維持する。処理の終わりに、得られた粒子を流出させ、約１．５％の水分を含むゴム粉末を得るために実施例２に記載されるように乾燥させる。処理した粒子および未処理の粒子をＭＥＢ／ＥＤＸによって分析し、それは処理後の粒子の表面上の硫黄含有量の減少を示し、Ａ．フェロオキシダンス（Ａ．ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）株ＤＳＭ  ３２０４６が数種類のゴムを脱硫できることを証明している。
【００９３】
実施例４：
チオバチルス（ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｉ）の２つの株、１つのチオバチルス・チオパルス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｉｏｐａｒｕｓ）および１つのチオバチルス・チオフィラス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｉｏｐｈｉｌｕｓ）を１５Ｌのバイオリアクター内で別々に増殖させる。
【００９４】
Ｔ．チオパルス（Ｔ．ｔｈｉｏｐａｒｕｓ）の増殖培地は、０．０１ｇ／ＬのＭｎＳＯ４、０．５ｇ／ＬのＭｇＳＯ４、０．１ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、４．０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、２．０ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、０．１５ｇ／ＬのＦｅＣｌ３および５．０ｇ／ＬのＮａ２Ｓ２Ｏ３によって構成される。ｐＨはＨ２ＳＯ４により６．５に調整する。
【００９５】
Ｔ．チオフィラス（Ｔ．ｔｈｉｏｐｈｉｌｕｓ）の増殖培地は、０．８ｇ／ＬのＮＨ４Ｃｌ、１．０ｇ／ＬのＭｇＳＯ４、０．１ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２．０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、０．２ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、０．８ｇ／ＬのＫＮＯ３および５．０ｇ／ＬのＮａ２Ｓ２Ｏ３によって構成される。ｐＨはＨ２ＳＯ４により６．５に調整する。
【００９６】
これらの株は実施例２に記載されるようにＮＲ脱硫のために利用する。Ｔ．チオパルス（Ｔ．ｔｈｉｏｐａｒｕｓ）の脱硫培地は、０．８ｇ／ＬのＭｇＳＯ４、０．２５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、４．０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４および０．０５ｇ／ＬのＦｅＣｌ３によって構成される。
【００９７】
Ｔ．チオフィラス（Ｔ．ｔｈｉｏｐｈｉｌｕｓ）の増殖培地は、０．８ｇ／ＬのＮＨ４Ｃｌ、１．０ｇ／ＬのＭｇＳＯ４、０．２５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２．０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４および１．０ｇ／ＬのＫＮＯ３によって構成される。
【００９８】
ＡＴＲ−ＦＴＩＲおよびＳＥＭ／ＥＤＸによって得られた予備結果は、これらの株が本発明による方法の下でゴム粒子を脱硫するのに十分に効果的であることを示した。
【図１】
2017527263.tif 000002
【図２】
2017527263.tif 000003
【図３】
2017527263.tif 000004
【図４】
2017527263.tif 000005
【図５】
2017527263.tif 000006
【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年7月26日(2016.7.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
寄託番号ＤＳＭ  ３２０４６として寄託されたアシディチオバチルス・フェロオキシダンス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）株。
【請求項２】
１０〜２０００ミクロンのサイズを有する硫黄加硫ゴム粒子の好気性細菌による脱硫のための方法であって、前記方法は、
ａ）圧力下で水をゴム含有物品に噴霧し、得られた前記硫黄加硫ゴム粒子を０．０１〜２０重量％の初期水分含量まで乾燥させる工程と、
ｂ）Ｎａ２ＳＯ３、ＦｅＳＯ４、ＦｅＣｌ３およびＮａ２Ｓ４Ｏ６またはそれらの混合物を含む群から選択される細菌による脱硫を促進するための無機塩およびエネルギー源を含有する水溶液を含む細菌増殖用の培地中に、種アシディチオバチルス・チオオキシダンス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｉｏｏｘｉｄａｎｓ）、寄託番号ＤＳＭ  ３２０４６として寄託されたアシディチオバチルス・フェロオキシダンス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）株を含むアシディチオバチルス・フェロオキシダンス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）、チオバチルス・チオパルス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｉｏｐａｒｕｓ）、チオバチルス・チオフィラス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｉｏｐｈｉｌｕｓ）またはそれらの混合物からなる群から選択される好気性無機栄養細菌を提供する工程と、
ｃ）前記硫黄加硫ゴム粒子を、前記好気性無機栄養細菌を含有する前記細菌増殖用の培地を加えた脱硫用の処理培地に添加する工程であって、前記脱硫用の処理培地は、細菌による脱硫を促進するためのエネルギー源が枯渇している、工程と、
ｄ）前記硫黄加硫ゴム粒子を、２４時間から１５日の間を含む期間、前記脱硫用の処理培地中に維持する工程と、
ｅ）得られた脱硫ゴム粒子を回収し、乾燥させる工程と
を含む、好気性細菌による脱硫のための方法。
【請求項３】
前記ゴム含有物品が、タイヤまたはタイヤ部分、タイヤトレッド、靴底、コンベヤーベルトから選択される、請求項２に記載の好気性細菌による脱硫のための方法。
【請求項４】
前記脱硫用の処理培地に加えられる前記好気性無機栄養細菌を含有する前記細菌増殖用の培地の体積が１０〜８０％である、請求項２〜３のいずれか一項に記載の好気性細菌による脱硫のための方法。
【請求項５】
工程ｃ）の前記硫黄加硫ゴム粒子が１〜３５重量％の濃度で添加される、請求項２〜４のいずれか一項に記載の好気性細菌による脱硫のための方法。
【請求項６】
工程ｂ）の前記好気性無機栄養細菌が、純粋な株として利用されるか、または群生で利用される、請求項２〜５のいずれか一項に記載の好気性細菌による脱硫のための方法。
【請求項７】
工程ｂ）の前記細菌増殖用の培地および工程ｃ）の前記脱硫用の処理培地が撹拌される、請求項２〜６のいずれか一項に記載の好気性細菌による脱硫のための方法。
【請求項８】
工程ｃ）の前記脱硫用の処理培地が、ジエノフィルおよび有機酸をさらに含有する、請求項２〜７のいずれか一項に記載の好気性細菌による脱硫のための方法。
【請求項９】
前記有機酸が、マレイン酸、ピルビン酸、安息香酸、サリチル酸および／またはそれらの混合物からなる群から選択される、請求項８に記載の好気性細菌による脱硫のための方法。
【請求項１０】
前記ジエノフィルが、無水マレイン酸、２−オキソプロパナールまたはそれらの混合物からなる群から選択される、請求項８に記載の好気性細菌による脱硫のための方法。
【請求項１１】
前記細菌増殖用の培地が、ＭｎＳＯ４、ロイシン、サリチル酸またはそれらの混合物から選択される少なくとも１種の任意選択のさらなる構成成分をさらに含む、請求項２〜１０のいずれか一項に記載の好気性細菌による脱硫のための方法。
【請求項１２】
細菌増殖のためのエネルギー源の消費が、２２０〜２５０ｎｍ（Ｆｅ２＋）および／もしくは２８０〜３４０ｎｍ（Ｆｅ３＋）にて培地の吸光度を測定することによって、ならびに／または誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ）および／もしくは原子吸光分光学法（ＡＡＳ）での分析によってＦｅ２＋および／もしくはＦｅ３＋濃度を評価することによってモニターされ、Ｎａ２Ｓ２Ｏ３利用がメチレンブルー変色および／またはイオンクロマトグラフィーによって決定され、硫黄酸化が呼吸計によって酸素消費量を測定することによって決定される、請求項２〜１１のいずれか一項に記載の好気性細菌による脱硫のための方法。
【請求項１３】
工程ｂ）の寄託番号ＤＳＭ  ３２０４６として寄託された前記アシディチオバチルス・フェロオキシダンス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）株が、純粋な株として利用されるか、または群生で利用される、請求項２〜１２のいずれか一項に記載の好気性細菌による脱硫のための方法。
【国際調査報告】
2017527263.tif 000008
2017527263.tif 000009
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