(57)【要約】  環外アミノ基が共有結合で修飾された塩基を有する少なくとも１個のヌクレオチドを含むブロッキングオリゴヌクレオチドを使用する、対立遺伝子特異的増幅方法が提供される。ここで当該ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズされる時に野生型（ＷＴ）配列と完全に相補的であり、第一の融解温度（Ｔｍ）を有する第一の複合体を形成し、当該ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズされる時に、標的突然変異体（ＭＴ）配列と１個以上のヌクレオチドで部分的に非相補的であり、第二の融解温度（Ｔｍ）を有する第二の複合体を形成し、第一のＴｍは第二のＴｍよりも高く、当該ブロッキングオリゴヌクレオチドは、環外アミノ基が共有結合で修飾された塩基を有する少なくとも１個のヌクレオチドを含み、ここで当該ブロッキングオリゴヌクレオチドは、増幅ステップの間、標的ＭＴ配列とハイブリダイズしなくなるが、ＷＴ配列とハイブリダイズし続け、５’−３’ヌクレアーゼ活性を欠いているポリメラーゼを使用するＷＴ配列の増幅を阻害する。
2017538429.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中で数種の変異配列の形態で存在する標的配列を対立遺伝子特異的に増幅する方法であって、
環外アミノ基が共有結合で修飾された塩基を有する少なくとも１個のヌクレオチド、５’末端及び３’末端を含むブロッキングオリゴヌクレオチドを提供し、ここで前記ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズされる時に野生型（ＷＴ）配列と完全に相補的であり、第一の融解温度（Ｔｍ）を有する第一の複合体を形成し、前記ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズされる時に、標的突然変異体（ＭＴ）配列と１個以上のヌクレオチドで部分的に非相補的であり、第二の融解温度（Ｔｍ）を有する第二の複合体を形成し、第一のＴｍは第二のＴｍよりも高く、前記ブロッキングオリゴヌクレオチドは３’末端でブロックされて伸長を阻害し；そして
５’−３’ヌクレアーゼ活性を欠いているポリメラーゼを使用して、第二のＴｍよりも高く、かつ第一のＴｍよりも低い温度で増幅ステップを行い、ここで、ＷＴ配列及び／又は標的ＭＴ配列が前記試料中に存在する場合、前記増幅ステップは、前記試料を１セットのプライマーと接触させて増幅産物を産生することを含み、ここで前記ブロッキングオリゴヌクレオチドは、増幅ステップの間、標的ＭＴ配列とハイブリダイズしなくなるが、ＷＴ配列とハイブリダイズし続け、ＷＴ配列の増幅を阻害する、方法。
【請求項２】
環外アミノ基が共有結合で修飾された塩基を有する前記ヌクレオチドは、ブロッキングオリゴヌクレオチドの非相補的ヌクレオチドの部位に対して−５位、−４位、−３位、−２位、−１位又は０位に位置する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
環外アミノ基が共有結合的に修飾された前記塩基は、Ｎ6−ベンジル−アデニン、Ｎ6−パラ−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジルアデニン、Ｎ2−アルキル−グアニン及びＮ4−ベンジル−シトシンからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記増幅産物を検出するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリメラーゼは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのＳｔｏｆｆｅｌ断片、ΔＺ０５  ＤＮＡポリメラーゼ及びΔＺ０５−Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
環外アミノ基が共有結合で修飾された塩基を有する前記ヌクレオチドの構造は、
【化１】
2017538429.tif 000007
［式中、Ｓは糖残基を表し、Ｒは修飾基を表す。］
からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
環外アミノ基が共有結合的に修飾された前記塩基は、以下の式：
【化２】
2017538429.tif 000008
［式中、
Ｒ1及びＲ2は、独立して、水素、アルキル、アルコキシ、無置換又は置換アリール及びフェノキシからなる群より選択される］
の修飾基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記修飾基が、以下の式：
【化３】
2017538429.tif 000009
［式中、
Ｒ3は、Ｃ1−Ｃ6アルキル、アルコキシ及びニトロからなる群より選択される］
を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記修飾基が、
【化４】
2017538429.tif 000010
からなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
数種の変異配列の形態で存在する標的配列を対立遺伝子特異的に増幅するためのキットであって、
１セットのプライマー：及び
環外アミノ基が共有結合で修飾された塩基を有する少なくとも１個のヌクレオチド、５’末端及び３’末端を含むブロッキングオリゴヌクレオチドであって、ここで前記ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズされる時に野生型（ＷＴ）配列と完全に相補的であり、第一の融解温度（Ｔｍ）を有する第一の複合体を形成し、前記ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズされる時に、標的突然変異体（ＭＴ）配列と１個以上のヌクレオチドで部分的に非相補的であり、第二の融解温度（Ｔｍ）を有する第二の複合体を形成し、第一のＴｍは第二のＴｍよりも高い、前記ブロッキングオリゴヌクレオチド
を含む、キット。
【請求項１１】
５’−３’ヌクレアーゼ活性を欠いているポリメラーゼをさらに含む、請求項１４に記載のキット。
【請求項１２】
環外アミノ基が共有結合で修飾された塩基を有する前記ヌクレオチドは、ブロッキングオリゴヌクレオチドの非相補的ヌクレオチドの部位に対して−５位、−４位、−３位、−２位、−１位又は０位に位置する、請求項１４に記載のキット。
【請求項１３】
数種の変異配列の形態で存在する標的配列を対立遺伝子特異的に増幅するためのオリゴヌクレオチドであって、
配列、５’末端及び３’末端を含み、
３’末端でブロックされて伸長を阻害し、
前記配列は、ハイブリダイズされる時に野生型（ＷＴ）配列と完全に相補的であり、第一の融解温度（Ｔｍ）を有する第一の複合体を形成し、前記配列は、ハイブリダイズされる時に、標的突然変異体（ＭＴ）配列と１個以上のヌクレオチドで部分的に非相補的であり、第二の融解温度（Ｔｍ）を有する第二の複合体を形成し、第一のＴｍは第二のＴｍよりも高く；そして
環外アミノ基が共有結合で修飾された塩基を有する少なくとも１個のヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
環外アミノ基が共有結合で修飾された塩基を有する前記ヌクレオチドは、前記配列の非相補的ヌクレオチドの部位に対して−５位、−４位、−３位、−２位、−１位又は０位に位置する、請求項１６に記載のオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は核酸増幅の分野に関し、具体的には、対立遺伝子特異的増幅 (allele-specific amplification)の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸の対立遺伝子特異的増幅によって、標的配列の増幅と分析を同時に行うことができる。対立遺伝子特異的増幅は、標的核酸配列がその配列中に変異 (variation)（多型 (polymorphism)）を有する１種以上の亜集団を有するか、又は有することが疑われる場合に一般的に使用される。ＤＮＡ多型は、ＤＮＡプロファイル分析（法医学、父子鑑別、臓器移植のための組織適合試験）、遺伝子マッピング、微生物の病原株の識別、及び希少突然変異（例えば正常ＤＮＡを有する細胞のバックグラウンド中に存在する癌細胞において生じる突然変異）の検出において使用される。
【０００３】
成功した対立遺伝子特異的増幅においては、標的核酸の所望の変異体が増幅されるが、他の変異体は増幅されないか、少なくとも検出可能なレベルまで増幅されない。典型的な対立遺伝子特異的増幅アッセイは、プライマーが標的配列の所望の変異体とハイブリッドを形成する場合のみ、プライマー伸長が起こるよう設計された少なくとも１つの対立遺伝子特異的プライマーによるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む。プライマーが標的配列の所望しない変異体にハイブリダイズする場合、プライマー伸長は阻害される。
【０００４】
核酸標的の対立遺伝子特異的増幅のための特定の改善が提案されている。核酸標的の多くの臨床的に関連する核酸標的に対する対立遺伝子特異的増幅の有効性及び感受性のさらなる改善が所望され、そして本開示は関連する利点を提供する。
【発明の概要】
【０００５】
１つの実施形態によれば、試料中に数種の変異配列 (variant sequences)の形態で存在する標的配列の対立遺伝子特異的増幅のための方法であって、環外アミノ基が共有結合で修飾された塩基を有する少なくとも１個のヌクレオチド、５’末端及び３’末端を含むブロッキングオリゴヌクレオチドを提供し、ここで前記ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズされる時に野生型（ＷＴ）配列と完全に相補的であり、第一の融解温度（Ｔｍ）を有する第一の複合体を形成し、前記ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズされる時に、標的突然変異体 (mutant）（ＭＴ）配列と１個以上のヌクレオチドで部分的に非相補的であり、第二の融解温度（Ｔｍ）を有する第二の複合体を形成し、第一のＴｍは第二のＴｍよりも高く、前記ブロッキングオリゴヌクレオチドは３’末端でブロックされて伸長を阻害し；そして５’−３’ヌクレアーゼ活性を欠いているポリメラーゼを使用して、第二のＴｍよりも高く、かつ第一のＴｍよりも低い温度で増幅ステップを行い、ここで、ＷＴ配列及び／又は標的ＭＴ配列が前記試料中に存在する場合、前記増幅ステップは、前記試料を１セットのプライマーと接触させて増幅産物を産生することを含み、ここで前記ブロッキングオリゴヌクレオチドは、増幅ステップの間、標的ＭＴ配列とハイブリダイズしなくなるが、ＷＴ配列とハイブリダイズし続け、ＷＴ配列の増幅を阻害する、方法が提供される。環外アミノ基が共有結合で修飾された塩基を有する前記ヌクレオチドは、ブロッキングオリゴヌクレオチドの非相補的ヌクレオチドの部位に対して−５位、−４位、−３位、−２位、又は−１位に、又は非相補的ヌクレオチドの部位で存在する０位に位置する。
【０００６】
別の実施形態によれば、数種の変異配列の形態で存在する標的配列の対立遺伝子特異的増幅のためのキットであって、１セットのプライマー；及び環外アミノ基が共有結合で修飾された塩基を有する少なくとも１個のヌクレオチド、５’末端及び３’末端を含むブロッキングオリゴヌクレオチドであって、ここで前記ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズされる時に野生型（ＷＴ）配列と完全に相補的であり、第一の融解温度（Ｔｍ）を有する第一の複合体を形成し、前記ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズされる時に、標的突然変異体 (mutant)（ＭＴ）配列と１個以上のヌクレオチドで部分的に非相補的であり、第二の融解温度（Ｔｍ）を有する第二の複合体を形成し、第一のＴｍは第二のＴｍよりも高い、前記ブロッキングオリゴヌクレオチドを含む、キットが提供される。
【０００７】
別の実施形態によれば、数種の変異配列の形態で存在する標的配列を対立遺伝子特異的に増幅するためのオリゴヌクレオチドであって、配列、５’末端及び３’末端を含み、３’末端でブロックされて伸長を阻害し、前記配列は、ハイブリダイズされる時に野生型（ＷＴ）配列と完全に相補的であり、第一の融解温度（Ｔｍ）を有する第一の複合体を形成し、前記配列は、ハイブリダイズされる時に、標的突然変異体 (mutant) （ＭＴ）配列と１個以上のヌクレオチドで部分的に非相補的であり、第二の融解温度（Ｔｍ）を有する第二の複合体を形成し、第一のＴｍは第二のＴｍよりも高く；そして環外アミノ基が共有結合で修飾された塩基を有する少なくとも１個のヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドが提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１Ａ及び１Ｂは、対立遺伝子特異的増幅アッセイの実施形態の模式図を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
定義：
特にことわらない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本主題の説明及び請求においては、次の定義が使用されるであろう。
【００１０】
用語「核酸（nucleic acid）」は、ヌクレオチド（例えばリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、等）のポリマーを意味し、そして線状又は分枝状のいずれかで一緒に共有結合されるヌクレオチドを含む、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、アプタイマー、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＰＮＡ−ＤＮＡコンジュゲート、ＰＮＡ−ＲＮＡコンジュゲート、等を包含する。核酸は典型的には、一本鎖又は二本鎖であり、そして一般的に、ホスホジエステル結合を含み、但しいくつかの場合、例えばホスホラミド（Beaucage et al. (1993) Tetrahedron 49(10):1925）、ホスホロチオエート（Mag et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:1437; 及び米国特許第5,644,048号）、ホスホロジチオエート（Briu et al. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:2321）、Ｏ−メチルホスホロアミダイト結合（Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press (1992)を参照のこと）、及びペプチド核酸骨格及び結合（Egholm (1992) J. Am. Chem. Soc. 114:1895を参照のこと）を包含する、別の骨格を有することができる核酸類似体が含まれる。他の核酸類似体は、正に荷電された骨格（Denpcy et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6097）；非イオン性骨格（米国特許第5,386,023号、第5,637,684号、第 5,602,240号、第 5,216,141号 及び第 4,469,863号）、及び非リボース骨格を有するそれら、例えば米国特許第5,235,033号及び第5,034,506号に記載されるそれらを包含する。１又は２以上の炭素環式糖を含む核酸もまた、核酸（Jenkins et al. (1995) Chem. Soc. Rev. pp. 169-176を参照のこと）の定義内に包含され、そして類似体はまた、例えばRawls, C & E News Jun. 2, 1997 page 35にも記載されている。リボース−リン酸骨格のそれらの修飾は、付加的部分、例えば標識の付加を促進するか、又は生理学的環境下でそのような分子の安定性及び半減期を変えるために行われ得る。
【００１１】
核酸において典型的に見出せる、天然に存在する複素環式塩基（例えば、アデニン、グアニン、チミン、シトシン及びウラシル）の他に、ヌクレオチド類似体はまた、天然に存在しない複素環式塩基、例えばSeela et al. (1999) Helv. Chim. Acta 82:1640に記載されるそれらも含むことができる。ヌクレオチド類似体に使用される特定の塩基は、融解温度（Ｔｍ）修飾基として作用する。例えばそれらのいくつかは、７−デアザプリン（例えば、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、等）、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、プロピニル−ｄＮ（例えば、プロピニル-ｄＵ、プロピニル−ｄＣ、等）、及び同様のものを包含する。例えば、米国特許第5,990,303号を参照のこと。他の代表的な複素環式塩基は、例えばヒポキサンチン、イノシン、キサンチン; ２−アミノプリンの８−アザ誘導体、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、ヒポキサンチン、イノシン及びキサンチン; アデニンの７−デアザ−８−アザ誘導体、グアニン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、ヒポキサンチン、イノシン及びキサンチン; ６−アザシチジン; ５−フルオロシチジン; ５−クロロシチジン; ５−ヨードシチジン; ５−ブロモシチジン; ５−メチルシチジン; ５−プロピニルシチジン; ５−ブロモビニルウラシル; ５−フルオロウラシル; ５−クロロウラシル; ５−ヨードウラシル; ５−ブロモウラシル; ５−トリフルオロメチルウラシル; ５−メトキシメチルウラシル; ５−エチニルウラシル; ５−プロピニルウラシル、及び同様のものを包含する。
【００１２】
「ヌクレオシド（nucleoside）」は、糖部分（リボース糖又はデオキシリボース糖）、糖部分の誘導体、又は糖部分の機能的同等物（例えば炭素環式環）に共有結合される、塩基又は塩基性基（少なくとも１つの同素環、少なくとも１つの複素環式環、少なくとも１つのアリール基及び／又は同様のものを含む）を含む核酸成分を意味する。例えば、ヌクレオシドが糖部分を含む場合、塩基は典型的には、その糖部分の１’位に結合される。上述されたように、塩基は、天然に存在する塩基か、又は天然に存在しない塩基であり得る。例示的なヌクレオシドは、リボヌクレオシドデオキシリボヌクレオシド、ジデオキシリボヌクレオシド及び炭素環式ヌクレオシドを包含する。
【００１３】
「ヌクレオチド（nucleotide）」は、ヌクレオシドの糖部分の５’位に共有結合される、１，２，３又はそれ以上のリン酸基を有する、ヌクレオシドのエステル、例えばヌクレオシドのリン酸エステルを意味する。
【００１４】
「プリンヌクレオチド（purine nucleotide）」とは、プリン塩基を含むヌクレオチドを意味し、そして「ピリミジンヌクレオチド（pyrimidine nucleotide）」とは、ピリミジン塩基を含むヌクレオチドを意味する。
【００１５】
「オリゴヌクレオチド（oligonucleotide）」とは、少なくとも２個、但し典型的には５〜５０個のヌクレオチド、及びより典型的には、１５〜３０個のヌクレオチドを含む核酸ポリマーを意味する。オリゴヌクレオチドの正確なサイズは一般的に、種々の要因、例えばオリゴヌクレオチドの最終的な機能又は使用に依存する。オリゴヌクレオチドは、例えば適切な配列のクローニング及び制限消化、又は下記方法による直接的化学合成を包含する当業界において知られている何れか適切な方法により調製され得る：Narang et al. (1979) Meth. Enzymol. 68:90-99のホスホトリエステル法；Brown et al. (1979) Meth. Enzymol. 68:109-151のホスホジエステル法；Beaucage et al. (1981) Tetrahedron Lett. 22:1859-1862のジエチルホスホロアミダイト法；Matteucci et al. (1981) J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191のトリエステル法；自動合成法；米国特許第4,458,066号の固体支持法、又は当業界において知られている他の化学的方法。
【００１６】
「プライマー核酸（primer nucleic acid）」又は「プライマー（primer）」は、鋳型核酸にハイブリダイズし、そしてヌクレオチド組込み生体触媒、例えばポリメラーゼを用いて鎖伸長 (extension)又は延長 (elongation)を可能にできるオリゴヌクレオチドである。他のプライマーの長さがしばしば利用されるが、プライマーは典型的には、１５〜３５個のヌクレオチドの範囲である。短いプライマー核酸は一般的に、鋳型核酸と十分に安定したハイブリッド複合体を形成するためにより低温を利用する。鋳型核酸の副配列に対して少なくとも部分的に相補的であるプライマー核酸は、典型的には、伸長が生じるために鋳型核酸とハイブリダイズするのに十分である。しかしながら、伸長の成功は一般的に、プライマーの３’末端で、より高い相補性（すなわち、鋳型とのより少ないミスマッチ）を必要とする。プライマー核酸は、必要に応じて、放射性、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、又は化学技法により検出可能な標識を取込むことにより標識され得る。
【００１７】
「伸長されたプライマー（extended primer）」とは、１又は２以上の追加のヌクレオチドが付加されたプライマーを意味する。「プライマー伸長（primer extension）」とは、追加のヌクレオチドがプライマーに付加される酵素の作用である。
【００１８】
「鋳型核酸（template nucleic acid）」、「鋳型（template）」又は「標的（target）」とは、プライマー核酸がハイブリダイズし、そして適切な条件下で伸長され得る核酸を意味する。核酸増幅に関しては、「標的（target）」は好ましくは、少なくとも２つのプライマー配列に対して少なくとも部分的に相補的な配列及び介在配列 (intervening sequence)から成る二本鎖核酸の領域である。標的はまた、第一プライマーに対して少なくとも部分的に相補的な配列、及び第二プライマーに対して部分的に同一の配列から成る、一本鎖核酸でもあり得る。鋳型核酸は、単離された核酸フラグメントとして存在できるか、又はより大きな核酸フラグメントの一部であり得る。標的核酸は、本質的に任意の源、例えば培養された微生物、未培養微生物、複雑な生物学的混合物、組織、血清、古代の又は保存された組織又は試料、環境分離物及び同様のものから誘導されるか又は単離され得る。さらに、鋳型核酸は任意には、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、クローン化ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、酵素的に断片化されたＤＮＡ又はＲＮＡ、化学的に断片化されたＤＮＡ又はＲＮＡ、物理的に断片化されたＤＮＡ又はＲＮＡ、又は同様のものを含むか、又は誘導される。鋳型核酸はまた、当業界において知られている技法を用いて、化学的に合成もされ得る。
【００１９】
本明細書において使用される場合、「遺伝子（gene）」とは、生物学的機能に関連するＤＮＡの任意のセグメントを意味する。従って、遺伝子は、コード配列、及び任意には、コード配列の発現のために必要とされる調節配列を含む。
【００２０】
核酸は、追加のヌクレオチドが、例えば核酸の３’末端で、ヌクレオチドを組込む生体触媒により、核酸に組込まれる場合、「伸長されるか（extended）」又は「延長される（elongated）」。
【００２１】
「部分（moiety）」又は「基（group）」とは、分子などのいずれかが分割される部分の１つ（例えば、官能基、置換基又は同様のもの）を意味する。例えば、ヌクレオチドは典型的には、塩基性基（例えば、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、ウラシル又は類似体）、糖部分、及び１又は２以上のリン酸基を含む。
【００２２】
「アルキル基（alkyl group）」とは、直鎖、分枝又は環状の飽和炭化水素部分を意味し、すべての位置変異体、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、1−メチルプロピル、２−メチルプロピル、１，１−ジメチルエチル、ペンチル、１−メチルブチル、２−メチルブチル、３−メチルブチル、２，２−ジメチルプロピル、１−エチルプロピル、ヘキシル、１，１−ジメチルプロピル、１，２−ジメチルプロピル、１−メチルペンチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、１，１−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、１，３−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、２，３−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、１−エチルブチル、２−エチルブチル、１，１，２−トリメチルプロピル、１，２，２−トリメチルプロピル、１−エチル−１−メチルプロピル及び１−エチル−２−メチルプロピル、ｎ−ヘキシル、シクロヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、２−エチルヘキシル、ｎ−ノニル、ｎ−デシル、及び同様のものを含む。アルキル基は典型的には、約１〜２０個の炭素原子を含み、そしてより典型的には、約２〜１５個の炭素原子を含む。アルキル基は置換されていても、又は置換されていなくても良い。
【００２３】
「アルコキシ基（alkoxy group）」とは、酸素原子を含むアルキル基のことであり、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペントキシ、ヘプチルオキシ、オクチルオキシ及び同様のものを包含する。
【００２４】
「アリール基（aryl group）」とは、芳香族化合物から誘導される原子又は部分の置換基のことである。例示的アリール基は例えば、フェニル基又は同様のものを包含する。アリール基は任意には、複数の芳香族環（例えば、ジフェニル基、等）を含む。さらに、アリール基は、置換されても又は置換されなくても良い。
【００２５】
「アリールオキシ基（aryloxy group）」とは、酸素原子を含むアリール基のことであり、例えば、フェノキシ、クロロフェノキシ、メチルフェノキシ、メトキシフェノキシ、ブチルフェノキシ、ペンチルフェノキシ、ベンジルオキシ及び同様のものを包含する。
【００２６】
「アルキル−アリール基（alkyl-aryl group）」とは、アルキル及びアリール部分を含む基のことである。アルキル−アリール基の例は、ベンジル基、トリル基及びキシリル基を包含する。
【００２７】
増幅アッセイは、他の可能な生成物よりも１つの生成物の優勢（すなわち、大部分であるが、但し１００％未満）をもたらす場合、「選択的（selective）」又は「対立遺伝子選択的（allele-selective）」である。アッセイは、標的配列の所望しない（ミスマッチされた (mismatched)）変異体の増幅が検出できる限り、「対立遺伝子選択的」として記載される。用語、「特異的（specific）」又は「対立遺伝子特異的（allele-specific）」増幅アッセイは、可能性ある産物の１つが独占的に形成される場合、使用される。所望しない（ミスマッチされた）標的の増幅が検出できない場合、アッセイは、「対立遺伝子特異的」と呼ばれる。検出方法がより高感度になるにつれて、以前に、対立遺伝子特異的であることが知られているいくつかのアッセイは、対立遺伝子選択的であることが判明し、すなわち標的の所望しない変異体のいくつかの増幅が検出できるようになる。従って、用語、「対立遺伝子特異的」とは、厳密に対立遺伝子特異的増幅、及び対立遺伝子選択的増幅の両方を包含することを意味する。
【００２８】
「遺伝子型（genotype）」とは、細胞又は被験体、又は細胞又は被験体のグループの遺伝子構成のすべて又は一部を意味する。例えば、遺伝子型は、所定の遺伝子座に存在するか、又はゲノム中に分布される特定の突然変異及び／又は対立遺伝子（例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）又は同様のもの）を包含する。
【００２９】
「ヌクレオチド組み込み生体触媒（nucleotide incorporating biocatalyst）」又は「ヌクレオチド組込み酵素（nucleotide incorporating enzyme）」とは、核酸中へのヌクレオチド組み込みを触媒する触媒（又は酵素）を言及する。例示的なヌクレオチド組込み酵素は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ターミナルトランスフェラーゼ、逆転写酵素、テロメラーゼ及び同様のものを包含する。
【００３０】
「熱安定性酵素（thermostable enzyme）」とは、安定性であり（すなわち、分解又は変性に抵抗性である）、そして選択された時間、高温にされる場合、十分な触媒活性を保持する酵素のことである。例えば、熱安定性ポリメラーゼは、二本鎖核酸を変性するのに必要な時間、高温にされる場合、続くプライマー伸長反応をもたらすのに十分な活性を保持する。核酸変性のために必要な加熱条件は、当業界においては良く知られており、そして米国特許第4,683,202号及び第4,683,195号に例示されている。本明細書において使用される場合、熱安定性ポリメラーゼは典型的には、温度サイクル反応、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）への使用のために適切である。熱安定性を核酸ポリメラーゼの例は、サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、サーマスsp．（Thermus sp.）Ｚ０５ポリメラーゼ、サーマス・フラバス（Thermus flavus）ポリメラーゼ、サーモトガ・マリチマ（Thermotoga maritima ）ポリメラーゼ、例えばＴＭＡ−２５及びＴＭＡ−３０ポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、及び同様のものを包含する。
【００３１】
「修飾された（modified）」酵素とは、少なくとも１つのモノマーが参照配列とは異なるアミノ酸ポリマーを含む酵素、例えば天然又は野生型の酵素又は別の修飾された形の酵素のことである。例示的な修飾は、モノマー挿入、欠失及び置換を包含する。修飾された酵素はまた、複数の親から誘導された同定可能な成分配列（例えば、構造的又は機能的ドメイン、等）を有するキメラ酵素も包含する。参照配列の化学的修飾を含むそれらの酵素もまた、修飾された酵素の定義内に含まれる。修飾されたポリメラーゼの例は、G46E E678G CS5 DNA ポリメラーゼ、G46E L329A E678G CS5 DNAポリメラーゼ、G46E L329A D640G S671F CS5 DNA ポリメラーゼ、 G46E L329A D640G S671F E678G CS5 DNA ポリメラーゼ、G46E E678G CS6 DNA ポリメラーゼ、ΔZ05 ポリメラーゼ、ΔZ05-Gold ポリメラーゼ、ΔZ05R ポリメラーゼ、E615G Taq DNA ポリメラーゼ、 E678G TMA-25 ポリメラーゼ、E678G TMA-30 ポリメラーゼ、及び同様のものを包含する。
【００３２】
用語、「５’〜３’ヌクレアーゼ活性（５’to ３’nuclease activity）」又は「５’−３’ヌクレアーゼ活性（５’−３’nuclease activity）」とは、典型的には核酸鎖合成に関連する核酸ポリメラーゼの活性のことであり、それにより、ヌクレオチド核酸鎖の５’末端から除去され、例えばＥ．コリＤＮＡポリメラーゼＩはこの活性を有するが、クレノウ (Klenow)フラグメントは有さない。
【００３３】
「実質的に５’−３’ヌクレアーゼ活性を欠いている（substantially lacks ５’−３’nuclease activity）」ポリメラーゼは、Ｔａｇ  ＤＮＡポリメラーゼの５０％以下（例えば、＜２５％、＜２０％、＜１５％、＜１０％）の５’−３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを意味する。５’−３’ヌクレアーゼ活性の測定方法及び測定のための条件は、当業界において良く知られている。例えば、米国特許第5,466,591号を参照のこと。５’−３’ヌクレアーゼ活性を実質的に欠いているＤＮＡポリメラーゼの例は、Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント；Ｎ末端の２３５個のアミノ酸を欠いているサーマス・アクアチカス（thermus aquaticus） ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｇ）（例えば、米国特許第5,616,494号に記載され、そして「stoffel フラグメント」として当業界において一般的に呼ばれる）を包含する。他の例は、５’−３’ヌクレアーゼ活性を担当するドメインを排除するか、又は不活性化するために、十分な欠失（例えば、Ｎ末端欠失）、突然変異又は修飾を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを包含する。例えば、米国特許第5,795,762号を参照のこと。
【００３４】
「標識（label）」とは、分子に結合され（共有又は非共有的に）、そして分子についての情報を提供できる部分のことである。例示的標識は、蛍光標識、比色標識、化学発光標識、生物発光標識、放射性標識、質量修飾基、抗体、抗原、ビオチン、ハプテンおよび酵素（ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、等を含む）を包含する。
【００３５】
核酸増幅反応における「ホットスタート（hot start）」とは、１つのプロトコルを意味し、この場合、温度がプライマー（単数又は複数）の必要なハイブリダイゼーション特異性を提供するのに十分に上昇するまで、少なくとも１つの決定的試薬が反応混合物から保留される（又は、反応混合物に存在する場合、試薬は不活性のままである）。「ホットスタート酵素（hot start enzyme）」とは、ホットスタートプロトコルにおいて「保留（withheld）」又は不活性試薬として作用できる酵素、典型的には核酸ポリメラーゼを意味する。
【００３６】
「ワトソン・クリック塩基対合（Watson-Crick bose pairing）」又は単に「塩基対合（base pairing）」とは、二本鎖核酸分子内の「従来の」水素結合を意味する。ワトソン・クリック塩基対合は、アデニンとチミンとの間、グアニンとシトシンとの間、アデニンとラウシルとの間、及びそれらの塩基の類似体間の水素結合である。
【００３７】
用語「スコーピオン（scorpion）」又は「スコーピオン様（scorpion-like）」とは、Whitcombe et al., (1999), Detection of PCR products using self-probing amplicons and fluorescence, Nature Biotech. 17:804-807に記載されるような単分子プライマー−プローブの組み合わせを示す。本開示の意味内のスコーピオン又はスコーピオン様プライマーは、スコーピオンの典型的な要素、すなわちプローブ部分、ステムループ部分、及びプライマー部分を組込む。「スコーピオン」又は「スコーピオン様」単分子プライマー−プローブ形式の例。
【００３８】
上記で言及されたように、１つの実施形態によれば、本開示は、試料中で数種の変異配列の形態で存在する標的配列を対立遺伝子特異的に増幅する方法であって、環外アミノ基が共有結合で修飾された塩基を有する少なくとも１個のヌクレオチド、５’末端及び３’末端を含むブロッキングオリゴヌクレオチドを提供し、ここで前記ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズされる時に野生型（ＷＴ）配列と完全に相補的であり、第一の融解温度（Ｔｍ）を有する第一の複合体を形成し、前記ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズされる時に、標的突然変異体 (mutant）（ＭＴ）配列と１個以上のヌクレオチドで部分的に非相補的であり、第二の融解温度（Ｔｍ）を有する第二の複合体を形成し、第一のＴｍは第二のＴｍよりも高く、前記ブロッキングオリゴヌクレオチドは３’末端でブロックされて伸長を阻害し；そして５’−３’ヌクレアーゼ活性を欠いているポリメラーゼを使用して、第二のＴｍよりも高く、かつ第一のＴｍよりも低い温度で増幅ステップを行い、ここで、ＷＴ配列及び／又は標的ＭＴ配列が前記試料中に存在する場合、前記増幅ステップは、前記試料を１セットのプライマーと接触させて増幅産物を産生することを含み、ここで前記ブロッキングオリゴヌクレオチドは、増幅ステップの間、標的ＭＴ配列とハイブリダイズしなくなるが、ＷＴ配列とハイブリダイズし続け、ＷＴ配列の増幅を阻害する、方法を提供する。
【００３９】
ブロッキングオリゴヌクレオチドは、例えば１０〜５０個の、又は例えば１５〜３５個のヌクレオチドを含み、ＷＴ配列に対して完全に相補的であり、そして標的ＭＴ配列に対して、１又は２個以上のヌクレオチドで部分的に非相補的である。標的ＭＴ配列に対するブロッキングオリゴヌクレオチドの部分的非相補的領域は、例えば５’末端のヌクレオチドで、又は２つの末端の間の内部位置で、ブロッキングオリゴヌクレオチドの長さに沿った任意の位置に存在するし、２個又はそれ以上のヌクレオチドを含むことができる。本開示のブロッキングオリゴヌクレオチドは、環外アミノ基で共有結合的に修飾された塩基を有する１又は２個以上のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態によれば、修飾された塩基ヌクレオチドは、ブロッキングオリゴヌクレオチドの非相補的ヌクレオチドの部位の１〜５ヌクレオチド、例えば３ヌクレオチド上流に存在する（また、本明細書においては、−１位、−２位、−３位、−４位、−５位又はＮ−１位、Ｎ−２位、Ｎ−３位、Ｎ−４位、Ｎ−５位として示される）。他の実施形態によれば、修飾された塩基ヌクレオチドは、ブロッキングオリゴヌクレオチドの非相補的ヌクレオチドの部位である。いくつかの実施形態によれば、修飾された塩基ヌクレオチドは、ブロッキングオリゴヌクレオチドの非相補的ヌクレオチドの部位で、及びオリゴヌクレオチド内の他の部位で少なくとももう１つ生じる。
【００４０】
環外アミノ基の共有結合修飾を有するヌクレオチドは、米国特許第6,001,611号に記載されている。そのようなヌクレオチドの合成、及びそのようなヌクレオチドを組込むオリゴヌクレオチドはまた、その'611特許にも記載されている。
【００４１】
本開示によれば、環外アミノ基の適切な修飾は、以下の特性の存在に基づいて選択され得る：（１）修飾は、二本鎖核酸中の相補的塩基との修飾された塩基のワトソン・クリック塩基対合を干渉するが、しかし妨げない；及び（２）修飾は、ＷＴ配列に対する完全な相補性に比較して、標的ＭＴ配列に対するブロッキングオリゴヌクレオチドの非相補的ヌクレオチドの部位で又は部位近くで、修飾された塩基を含むブロッキングオリゴヌクレオチド融解温度を低下させる。例えば、３０塩基長のオリゴヌクレオチドの中間に近いデオキシアデノシンの環外アミン上へのｔｅｒｔブチルベンジル基の包含は、完全に一致した鋳型に対するハイブリッドのＴｍを、２〜４℃低下させるであろう。しかしながら、そのようなオリゴヌクレオチドのハイブリッドのＴｍは、修飾の部位に対して相補的なミスマッチを有する配列にハイブリダイズされる場合、６℃以上、低下させるであろう。複数の修飾基の包含は、野生型配列に対してＴｍのわずかな増分変化しかないが、しかし存在するミスマッチを伴うハイブリットをさらに不安定にするであろう。修飾された塩基の包含は、ＷＴ配列とのその完全な一致に対するプローブのＴｍにはほとんど影響を与えない；約２℃低いＴｍ。しかしながら、この修飾は、ＭＴ配列に対するプローブのさらなる不安定化を提供し、ここでミスマッチの不安定化及び例えばベンジル基の相乗効果は、ＭＴ配列に対するプローブのＴｍを、約５℃〜１０℃低下させる。追加の不安定化は、所望のＭＴ配列の効果的増幅をなお可能にしながら、ＷＴ配列の増幅を制御するプローブの能力において、はるかに大きな区別 (discrimination)を与える。記載されたＴｍの差における「約（about）」という用語は、厳密にＴｍの記載された温度差を含んでも良く、同様に、Ｔｍの記載された温度差プラス又はマイナス１℃、２℃又はその端数を有する温度差も含む。
【００４２】
本開示のブロッキングオリゴヌクレオチドは、伸長を禁じるために、すなわちプライマー伸長産物へのブロッキングオリゴヌクレオチドの組み込みを阻害するために、３’末端でブロックされ得る。そのブロッキングは、種々の手段で、例えば最後のヌクレオチドの３’ヒドロキシルに、化学的部分、例えば、リン酸基を付加することにより、又は最後のヌクレオチドの非ヌクレオシド類似体の包含により、達成され得る。
【００４３】
環外アミノ基の例は、アデノシンの６位、グアノシンの２位及びシチジンの４位でのアミノ基を包含する。相補的核酸鎖との塩基対合に関与する環外アミノ基はまた、ヌクレオチド中の種々の従来のものではない窒素塩基においても生じることができる。従来のものではない塩基を有するヌクレオチドの例は、３−メチルアデノシン、７−メチルグアノシン、３−メチルグアノシン、５−メチルシチジン及び５−ヒドロキシメチルシチジンを包含するが、但しそれらだけには制限されない。そのような従来のものではない塩基の環外アミノ基の適切な修飾もまた、本開示の経験的方法に従って選択され得る。
【００４４】
修飾されたアデニン、グアニン及びシトシン塩基をそれぞれ含む修飾されたヌクレオチド構造が下記に示される：
【化１】
2017538429.tif 000003
[式中、Ｓは糖残基を表し、そして又は修飾基を表す]。上記で概説された４つの特性を有する種々の修飾基が想定される。特定の実施形態によれば、修飾基は、以下の構造を有する：
【化２】
2017538429.tif 000004
［式中、Ｒ1及びＲ2は、独立して、水素、アルキル、アルコキシ、無置換又は置換アリール及びフェノキシからなる群より選択される］。
【００４５】
アルキル基は、分枝状又は非分枝状であり得る。
【００４６】
アルキル基は、Ｃ1−Ｃ20アルキル、例えばＣ1−Ｃ10アルキルであり得る。
【００４７】
アルコキシ基は、Ｃ1−Ｃ20アルコキシ、例えばＣ1−Ｃ10アルコキシであり得る。
【００４８】
アリールは、非置換又は置換されたフェニル又はナフチルであり得る。
【００４９】
１つの実施形態によれば；Ｒはベンジル基又は置換ベンジル基である。特定の実施形態によれば、置換ベンジル基は、以下の構造を有することができる：
【化３】
2017538429.tif 000005
[式中、Ｒ3は、Ｃ1−Ｃ6分枝又は非分枝アルキル基、より好ましくは、Ｃ1−Ｃ4分枝又は非分枝アルキル基、アルコキシ基、又はニトロ基である]。好ましくは、Ｒ3はパラ位で結合される。
【００５０】
いくつかの実施形態によれば、修飾基は、下記に示される構造により表される：
【化４】
2017538429.tif 000006
【００５１】
一般的に、本明細書に記載される化合物の種類からの特定の適切な修飾基の経験的選択は、上記に列挙された４種の特性の存在に基づいて、当業者により日常的に実施され得る。好ましくは、特定基の適合性は、対立遺伝子特異的増幅反応において修飾されたヌクレオチドを有するブロッキングオリゴヌクレオチドを用いることにより経験的に決定される。修飾の適合性は、修飾されていないブロッキングオリゴヌクレオチドとの同一の反応と比較した場合、塩基修飾を有するブロッキングオリゴヌクレオチドを利用する反応の高められた選択性により示される。
【００５２】
いくつかの実施形態によれば、増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応、すなわち鋳型変性、鋳型へのオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング（ハイブリダイゼーション）、及びヌクレオチドを組込む生体触媒によるプライマーの伸長の反復サイクルを包含する。いくつかの実施形態によれば、アニーリング及び伸長は、同じ温度工程で生じる。
【００５３】
いくつかの実施形態によれば、増幅反応は、ホットスタートプロトコルを包含する。多くのホットスタートプロトコルは、当業界において知られており、反応混合物の残りから重要な試薬を分離するワックスの使用（米国特許第5,411,876号）、抗体により可逆的に不活性化された核酸ポリメラーゼ（米国特許第5,338,671号）、その活性部位を特異的に結合するよう企画されたオリゴヌクレオチドにより可逆的に不活性化された核酸ポリメラーゼ（米国特許第5,840,867号）の使用、又は米国特許第5,677,152号及び第5,773、528号に記載されるように、可逆的化学修飾を伴っての核酸ポリメラーゼの使用を包含する。
【００５４】
いくつかの実施形態によれば、対立遺伝子特異的増幅アッセイは、リアルタイムＰＣＲアッセイである。リアルタイムＰＣＲアッセイにおいては、増幅の尺度は、「閾値に対するサイクル」又はＣｔ値である。より早いＣｔ値は、閾値レベルの急速な達成、及び従ってより効率的な増幅を反映する。遅いＣｔ値は、非効率的又は阻害された増幅を反映する。対立遺伝子特異的リアルタイムＰＣＲアッセイにおいては、一致した鋳型とミスマッチした鋳型との間のＣｔ値の差異は、対立遺伝子間の区別、又はアッセイの選択性の尺度である。
【００５５】
対立遺伝子特異的増幅アッセイは、米国特許第5,795,762号に記載されるように、５’−３’ヌクレアーゼ活性を実質的に又は完全に欠いている酵素を用いる。そのような酵素の１つの例は、ΔＺ０５ポリメラーゼである。対立遺伝子特異的増幅アッセイはまた、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのStoffelフラグメントなどのプルーフリーディング（３’−５’エキソヌクレオーゼ）活性を有さない酵素を使用することもできる。「ホットスタート」能力を有する酵素、例えば米国特許第5,677,152号及び第5,773,528号に記載される可逆的に修飾された酵素を有することが時々、所望される。ホットスタート酵素の１つの例は、ΔＺ０５−Ｇｏｌｄポリメラーゼである。
【００５６】
増幅産物の検出は、当業界において知られている任意の方法により達成され得る。これらの方法は、標識されたプライマー及びプローブ、及び種々の核酸結合色素の使用を包含する。検出の手段は、標的配列の１つの変異体に対して特異的であり得るか、又は標的配列のすべての変異体、又はすべての二本鎖ＤＮＡに対してさえ一般的であり得る。非特異的検出方法が使用され得、ここで標的の望ましくない変異体の増幅が最小であり、そして方法の検出限界を下回ると予測される。
【００５７】
増幅産物は、増幅が例えば標識されていない産物のゲル電気泳動、及び核酸結合色素によるゲルの染色により完結された後、検出され得る。他方では、増幅産物は、合成中の取込みにより、又は標識されたプライマーの伸長産物の何れかにより、放射性又は化学的標識を担持することができる。電気泳動の後、又はその間、標識された増幅産物は、当業界において知られている適切な放射線又は化学的ツールを用いて検出され得る。電気泳動の後、産物はまた、当業界において知られている方法の何れか１つにより標識された標的特異的プローブにより検出され得る。標識されたプローブはまた、電気泳動なしに、すなわち「ドットブロット」アッセイ又は同様のもので標的に適用され得る。
【００５８】
他の実施形態によれば、増幅産物の存在は、均質アッセイ、すなわち新生産物が増幅のサイクルの間、検出されるか、又は少なくとも未開封管内で検出され、そして増幅後処理が必要とされないアッセイにおいて検出され得る。均質増幅アッセイは、例えば米国特許第5,210,015号に記載されている。核酸インターカレート色素を用いる均質増幅アッセイは、例えば、米国特許第5,871,908号及び第6,569,627号に記載されている。均質アッセイはまた、２種の相互作用用蛍光団により標識された蛍光プローブ、例えば「分子ビーコン」プローブ（Tyagi et al. (1996) Nat. Biotechnol. 14:303-308）、又は蛍光標識されたヌクレアーゼプローブ（Livak et al. (1995) PCR Meth. Appl. 4:357-362）も用いることができる。それらの技術の特定の変形において、増幅産物はまた、その特有の融解温度によっても同定され得る；米国特許第5,871,908号及び第6,569,627号を参照のこと。増幅産物はまた、「スコーピオン（scorpion）」と呼ばれる単分子プライマー−プローブの組み合わせを用いて検出され得る（Whitcombe et al. (1999), Detection of PCR products using self-probing amplicons and fluorescence, Nature Biotech. 17:804-807）。
【００５９】
別の実施形態によれば、キットが、本開示に従って対立遺伝子特異的増幅を行うために提供される。キットは一般的に、アッセイ特異的成分、及びＤＮＡ増幅アッセイを行うために一般的に必要とされる成分を含む。アッセイ特異的成分として、本開示の対立遺伝子特異的増幅キットは、典型的には、５’末端、及び伸長を阻害するためにブロックされる３’末端を有し、前記配列は、ハイブリダイズされる時にＷＴ配列と完全に相補的であり、第一のＴｍを有する第一の複合体を形成し、前記配列は、ハイブリダイズされる時に、標的ＭＴ配列と１個以上のヌクレオチドで部分的に非相補的であり、第二のＴｍを有する第二の複合体を形成し、第一のＴｍは第二のＴｍよりも高く、そしてまた、環外アミノ基で共有結合修飾される塩基を有する１又は２個以上のヌクレオチドを有する配列、任意には、キットに封入されるオリゴヌクレオチドに対して少なくとも部分的の相補的な量の対照標的配列の少なくとも１つの変異体を含む対照核酸配列を含む少なくとも１つの対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態によれば、対照核酸配列の複数の変異体が封入され得る。核酸増幅のために一般的に必要とされる成分として、本開示のキットは典型的には、１又は２個以上のヌクレオチドを組込む生体触媒、核酸前駆体、例えばヌクレオシド三リン酸（デオキシリボヌクレオシド三リン酸又はリボヌクレオシド三リン酸）、任意には、核酸のピロリン酸分解を最小にするためのピロホスファターゼ、増幅反応のキャリーオーバー汚染に対する保護のためのウラシルＮ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）、増幅反応及び検出のために必要な前もって製造された試薬及び緩衝液、及び本開示の対立遺伝子特異的増幅を行うための一組の説明書を含む。
【００６０】
特定の理論に束縛されるものではないが、本発明者は、本開示の共有結合による塩基修飾、特に嵩高い (bulky)基が、プライマーと鋳型核酸との間のワトソン−クリック塩基対合において水素結合を不安定にするが、しかし完全には破壊しないと仮定している。修飾が、ブロッキングオリゴヌクレオチド内の同じ位置又は近くの位置で非相補的塩基（標的配列の変異体又は「ミスマッチ」変異体と同様に）と組み合わされる場合、組み合わされた水素結合の弱さが、５’−３’ヌクレアーゼ活性を欠いているポリメラーゼによるプライマーの伸長をブロックしない（ブロッキングオリゴヌクレオチドが標的ＭＴ配列から融解する (melt off)ため）程度に、ブロッキングオリゴヌクレオチド−標的核酸複合体を不安定化する。しかしながら、塩基の修飾が、非相補的塩基（標的配列の野生型又は「適合」変異体と同様に）を伴わないで、単独で存在する場合、５’−３’ヌクレアーゼ活性を欠いているポリメラーゼによるプライマーの伸長をブロックする（ブロッキングオリゴヌクレオチドが標的配列から融解せず、そしてハイブリダイズされたままであり、そしてプライマーの伸長をブロックするため）程度まで、水素結合の弱さが少なく、そしてブロッキングオリゴヌクレオチド−標的核酸複合体の不安定化が少ない。図１は、多型及びブロッキングオリゴヌクレオチド修飾の位置、並びにマッチしない (unmatched)標的変異配列の増幅を可能とするが、マッチした野生型配列の増幅を阻害するそれらの役割を示す図である。
【００６１】
以下の実施例及び図面は、本発明の理解を助けるために提供され、その真の範囲は、添付の特許請求の範囲に記載されている。
【実施例】
【００６２】
この実施例においては、試料中にいくつかの変異体配列の形態で存在する標的配列の対立遺伝子特異的増幅のための方法が記載されている。前記方法は、５’末端、３’末端、及び環外アミノ基で共有結合的に修飾された塩基を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含むブロッキングオリゴヌクレオチドの提供を包含する。前記ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズされる時に野生型（ＷＴ）配列と完全に相補的であるよう企画され、第一の融解温度（Ｔｍ）を有する第一の複合体を形成し、前記ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズされる時に、標的突然変異体 (mutant）（ＭＴ）配列と１個以上のヌクレオチドで部分的に非相補的であり、第二の融解温度（Ｔｍ）を有する第二の複合体を形成する。第一のＴｍは、第二のＴｍよりも高く、そしてブロッキングオリゴヌクレオチドは、３’末端でブロックされて、伸長を阻害する。
【００６３】
前記方法はまた、５’−３’ヌクレアーゼ活性を欠いているポリメラーゼを使用して、第二のＴｍよりも高く、かつ第一のＴｍよりも低い温度で増幅ステップを実施することを包含する。ＷＴ配列及び／又は標的ＭＴ配列が前記試料中に存在する場合、前記増幅ステップは、前記試料を１セットのプライマーと接触させて増幅産物を産生することを包含する。このように、前記ブロッキングオリゴヌクレオチドは、増幅ステップの間、標的ＭＴ配列とハイブリダイズしなくなるが、ＷＴ配列とハイブリダイズし続け、ＷＴ配列の増幅を阻害する。
【００６４】
環外アミノ基が共有結合で修飾された塩基を有する前記ヌクレオチドは、ブロッキングオリゴヌクレオチドの非相補的ヌクレオチドの部位に対して−５位、−４位、−３位、−２位、−１位又は０位に位置する。修飾されたヌクレオチドは、修飾されたグアニン（Ｇ*）であり得、それはまだ、ＷＴ配列における相補的Ｃ塩基とハイブリダイズすることができる。この修飾基の包含は、ＷＴ配列とのその完全な一致に対するプローブのＴｍに対してほとんど影響がなく；約２℃低いＴｍ。しかしながら、この修飾は、ＭＴ配列に対するプローブのさらなる不安定化を提供し、ミスマッチ及びベンジル基の不安定化の相乗効果は、ＭＴ配列に対するプローブのＴｍを５℃〜１０℃低める。さらなる不安定化は、所望するＭＴ配列の効率的増幅を依然として可能にしながら、ＷＴ配列の増幅を抑制するプローブの能力において、はるか大きな区別を付与する。
【００６５】
以下は、ブロッキングオリゴヌクレオチドの非相補的ヌクレオチドの部位に対して、−５位、−４位、−３位、−２位、−１位、又は０位に位置するそれぞれの修飾されたヌクレオチドについてのＴｍの変化の比較を提供する。修飾されたヌクレオチドが０位に位置する場合、Ｔｍの差は約４℃低く；修飾されたヌクレオチドが−１位に位置する場合、Ｔｍの差は約８℃低く；修飾されたヌクレオチドが−２位に位置する場合、Ｔｍの差は約６℃低く；修飾されたヌクレオチドが−３位に位置する場合、Ｔｍの差は約５℃低く；修飾されたヌクレオチドが−４位に位置する場合、Ｔｍの差は約４℃低く；修飾されたヌクレオチドが−５位に位置する場合、Ｔｍの差は約３℃低い。
【図１】
2017538429.tif 000011
【国際調査報告】
2017538429.tif 000012
2017538429.tif 000013