(57)【要約】  本発明は、ポリヌクレオチドの移動を制御するために使用でき、ポリヌクレオチドを配列決定するために特に有用である修飾Ｄｄａヘリカーゼに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ依存性ＡＴＰａｓｅ（Ｄｄａ）ヘリカーゼであって、
（ａ）１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）中の１つまたは複数のヌクレオチドと相互作用する少なくとも１つのアミノ酸が置換されており、
（ｂ）膜貫通ポアと相互作用するヘリカーゼの部分が１つまたは複数の修飾を含み、
ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有する、ヘリカーゼ。
【請求項２】
（ａ）１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）中の１つまたは複数のヌクレオチドの糖および／または塩基と相互作用する少なくとも１つのアミノ酸がより大きな側鎖（Ｒ基）を含むアミノ酸で置換されている、請求項１に記載のヘリカーゼ。
【請求項３】
（ａ）配列番号８の変種であって、ｓｓＤＮＡ中の１つまたは複数のヌクレオチドの前記糖および／または塩基と相互作用する前記少なくとも１つのアミノ酸がＨ８２、Ｎ８８、Ｐ８９、Ｆ９８、Ｄ１２１、Ｖ１５０、Ｐ１５２、Ｆ２４０、Ｆ２７６、Ｓ２８７、Ｈ３９６およびＹ４１５の少なくとも１つである、変種；または
（ｂ）配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３の変種であって、ｓｓＤＮＡ中の１つまたは複数のヌクレオチドの前記糖および／または塩基と相互作用する前記少なくとも１つのアミノ酸が配列番号８におけるＨ８２、Ｎ８８、Ｐ８９、Ｆ９８、Ｄ１２１、Ｖ１５０、Ｐ１５２、Ｆ２４０、Ｆ２７６、Ｓ２８７、Ｈ３９６およびＹ４１５に対応するアミノ酸の少なくとも１つである、変種
を含む、請求項２に記載のヘリカーゼ。
【請求項４】
ｓｓＤＮＡ中の１つまたは複数のヌクレオチドの前記糖および／または塩基と相互作用する前記少なくとも１つのアミノ酸がｓｓＤＮＡ中の前記ヌクレオチド間に介在する少なくとも１つのアミノ酸である、請求項２または３に記載のヘリカーゼ。
【請求項５】
（ａ）配列番号８の変種であって、ｓｓＤＮＡ中の前記ヌクレオチド間に介在する前記少なくとも１つのアミノ酸がＰ８９、Ｆ９８およびＶ１５０の少なくとも１つである、変種；または
（ｂ）配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２もしくは２３の変種であって、ｓｓＤＮＡ中の前記ヌクレオチド間に介在する前記少なくとも１つのアミノ酸が配列番号８中のＰ８９、Ｆ９８およびＶ１５０に対応するアミノ酸の少なくとも１つである、変種
を含む、請求項４に記載のヘリカーゼ。
【請求項６】
前記より大きな側鎖（Ｒ基）が、増加した数の炭素原子を含有し、増加した長さを有し、増加した分子体積を有し、および／または増加したファンデルワールス体積を有する、請求項２から５のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
【請求項７】
前記より大きな側鎖（Ｒ基）が前記少なくとも１つのアミノ酸とｓｓＤＮＡ中の前記１つまたは複数のヌクレオチドとの間の（ｉ）静電気的相互作用、（ｉｉ）水素結合および／または（ｉｉｉ）カチオンｐｉ（カチオンπ）相互作用を増加させる、請求項２から６のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
【請求項８】
より大きな側鎖（Ｒ基）を含むアミノ酸がアラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、グリシン（Ｇ）、セレノシステイン（Ｕ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）ではない、請求項２から７のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
【請求項９】
ヒスチジン（Ｈ）が（ｉ）アルギニン（Ｒ）もしくはリシン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）もしくはアスパラギン（Ｎ）または（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）もしくはトリプトファン（Ｗ）で置換されており；
アスパラギン（Ｎ）が（ｉ）アルギニン（Ｒ）もしくはリシン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）もしくはヒスチジン（Ｈ）または（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）もしくはトリプトファン（Ｗ）で置換されており；
プロリン（Ｐ）が（ｉ）アルギニン（Ｒ）もしくはリシン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）、スレオニン（Ｔ）もしくはヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉｉ）チロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）もしくはトリプトファン（Ｗ）または（ｉｖ）ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）もしくはイソロイシン（Ｉ）で置換されており；
フェニルアラニン（Ｆ）が（ｉ）アルギニン（Ｒ）もしくはリシン（Ｋ）、（ｉｉ）ヒスチジン（Ｈ）または（ｉｉｉ）チロシン（Ｙ）もしくはトリプトファン（Ｗ）で置換されており；
アスパラギン酸（Ｄ）が（ｉ）アルギニン（Ｒ）もしくはリシン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）もしくはヒスチジン（Ｈ）または（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）もしくはトリプトファン（Ｗ）で置換されており；
バリン（Ｖ）が（ｉ）アルギニン（Ｒ）もしくはリシン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）もしくはヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）もしくはトリプトファン（Ｗ）または（ｉｖ）イソロイシン（Ｉ）もしくはロイシン（Ｌ）で置換されており；
セリン（Ｓ）が（ｉ）アルギニン（Ｒ）もしくはリシン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）もしくはヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）もしくはトリプトファン（Ｗ）または（ｉｖ）イソロイシン（Ｉ）もしくはロイシン（Ｌ）で置換されており；および／あるいは
チロシン（Ｙ）が（ｉ）アルギニン（Ｒ）もしくはリシン（Ｋ）または（ｉｉｉ）トリプトファン（Ｗ）で置換されている、前記請求項のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
【請求項１０】
配列番号８の変種であり：
−Ｈ８２Ｎ；
−Ｈ８２Ｑ；
−Ｈ８２Ｗ；
−Ｎ８８Ｒ；
−Ｎ８８Ｈ；
−Ｎ８８Ｗ；
−Ｎ８８Ｙ；
−Ｐ８９Ｌ；
−Ｐ８９Ｖ；
−Ｐ８９Ｉ；
−Ｐ８９Ｅ；
−Ｐ８９Ｔ；
−Ｐ８９Ｆ；
−Ｄ１２１Ｈ；
−Ｄ１２１Ｙ；
−Ｄ１２１Ｋ；
−Ｖ１５０Ｉ；
−Ｖ１５０Ｌ；
−Ｖ１５０Ｎ；
−Ｖ１５０Ｗ；
−Ｖ１５０Ｈ；
−Ｐ１５２Ｗ；
−Ｐ１５２Ｆ；
−Ｐ１５２Ｙ；
−Ｐ１５２Ｈ；
−Ｐ１５２Ｉ；
−Ｐ１５２Ｌ；
−Ｐ１５２Ｖ；
−Ｆ２４０Ｗ；
−Ｆ２４０Ｙ；
−Ｆ２４０Ｈ；
−Ｆ２７６Ｗ；
−Ｆ２７６Ｒ；
−Ｆ２７６Ｋ；
−Ｆ２７６Ｈ；
−Ｓ２８７Ｋ；
−Ｓ２８７Ｒ；
−Ｓ２８７Ｗ；
−Ｓ２８７Ｆ；
−Ｈ３９６Ｙ；
−Ｈ３９６Ｆ；
−Ｈ３９６Ｑ；
−Ｈ３９６Ｋ；
−Ｙ４１５Ｗ；
−Ｙ４１５Ｒ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｈ８２Ｎ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｈ８２Ｑ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｈ８２Ｗ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｎ８８Ｒ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｎ８８Ｈ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｎ８８Ｗ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｎ８８Ｙ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｐ８９Ｌ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｐ８９Ｖ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｐ８９Ｉ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｐ８９Ｔ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｐ８９Ｆ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｄ１２１Ｈ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｄ１２１Ｙ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｄ１２１Ｋ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｖ１５０Ｉ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｖ１５０Ｌ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｖ１５０Ｎ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｖ１５０Ｗ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｖ１５０Ｈ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｐ１５２Ｗ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｐ１５２Ｆ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｐ１５２Ｙ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｐ１５２Ｈ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｐ１５２Ｉ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｐ１５２Ｌ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｐ１５２Ｖ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｆ２４０Ｗ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｆ２４０Ｙ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｆ２４０Ｈ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｆ２７６Ｗ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｆ２７６Ｒ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｆ２７６Ｋ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｆ２７６Ｈ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｓ２８７Ｋ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｓ２８７Ｒ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｓ２８７Ｗ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｓ２８７Ｆ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｈ３９６Ｙ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｈ３９６Ｆ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｈ３９６Ｑ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｙ４１５Ｗ；または
−Ｆ９８Ｗ／Ｙ４１５Ｒ
を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
【請求項１１】
前記より大きな側鎖（Ｒ基）を有するアミノ酸が非天然アミノ酸である、請求項２から７のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
【請求項１２】
（ａ）１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）中の１つまたは複数のヌクレオチド中の１つまたは複数のリン酸基と相互作用する少なくとも１つのアミノ酸が置換されている、前記請求項のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
【請求項１３】
前記置換が前記少なくとも１つのアミノ酸とｓｓＤＮＡ中の前記１つまたは複数のリン酸基との間の（ｉ）静電気的相互作用、（ｉｉ）水素結合および／または（ｉｉｉ）カチオンｐｉ（カチオンπ）相互作用を増加させる、請求項１２に記載のヘリカーゼ。
【請求項１４】
前記置換が前記位置の正味の正電荷を増加させる、請求項１３に記載のヘリカーゼ。
【請求項１５】
（ａ）配列番号８の変種であって、ｓｓＤＮＡ中の１つまたは複数のヌクレオチド中の１つまたは複数のリン酸と相互作用する前記少なくとも１つのアミノ酸がＨ６４、Ｔ８０、Ｓ８３、Ｎ２４２、Ｋ２４３、Ｎ２９３、Ｔ３９４およびＫ３９７の少なくとも１つである、変種；または
（ｂ）配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３の変種であって、ｓｓＤＮＡ中の１つまたは複数のヌクレオチド中の１つまたは複数のリン酸と相互作用する前記少なくとも１つのアミノ酸が配列番号８中のＨ６４、Ｔ８０、Ｓ８３、Ｎ２４２、Ｋ２４３、Ｎ２９３、Ｔ３９４およびＫ３９７に対応するアミノ酸の少なくとも１つである、変種
を含む、請求項１２から１４のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
【請求項１６】
ヒスチジン（Ｈ）が（ｉ）アルギニン（Ｒ）もしくはリシン（Ｋ）、（ｉｉ）アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）もしくはスレオニン（Ｔ）、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）もしくはチロシン（Ｙ）で置換されており；
スレオニン（Ｔ）が（ｉ）アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）もしくはリシン（Ｋ）、（ｉｉ）アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）もしくはヒスチジン（Ｈ）または（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）もしくはヒスチジン（Ｈ）で置換されており；
セリン（ｓ）が（ｉ）アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）もしくはリシン（Ｋ）、（ｉｉ）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、スレオニン（Ｔ）もしくはヒスチジン（Ｈ）または（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）もしくはヒスチジン（Ｈ）で置換されており；
アスパラギン（Ｎ）が（ｉ）アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）もしくはリシン（Ｋ）、（ｉｉ）セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）、スレオニン（Ｔ）もしくはヒスチジン（Ｈ）または（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）もしくはヒスチジン（Ｈ）で置換されており；および／あるいは
リシン（Ｋ）が（ｉ）アルギニン（Ｒ）もしくはヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉ）アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）、スレオニン（Ｔ）もしくはヒスチジン（Ｈ）または（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）もしくはヒスチジン（Ｈ）で置換されている、請求項１５に記載のヘリカーゼ。
【請求項１７】
前記アミノ酸が非天然アミノ酸で置換されている、請求項１２から１６のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
【請求項１８】
（ａ）Ｈ６４Ｎ、Ｈ６４Ｑ、Ｈ６４ＫまたはＨ６４Ｆ、（ｂ）Ｔ８０Ｋ、Ｔ８０ＱまたはＴ８０Ｎ、（ｃ）Ｓ８３Ｈ、Ｓ８３Ｎ、Ｓ８３Ｋ、Ｓ８３Ｔ、Ｓ８３ＲまたはＳ８３Ｑ、（ｄ）Ｎ２４２ＨまたはＮ２４２Ｑ、（ｅ）Ｋ２４３ＱまたはＫ２４３Ｈ、（ｆ）Ｎ２９３Ｑ、Ｎ２９３ＫまたはＮ２９３Ｈ、（ｇ）Ｔ３９４Ｋ、Ｔ３９４ＨまたはＴ３９４Ｎおよび（ｈ）Ｋ３９７Ｒ、Ｋ３９７ＨまたはＫ３９７Ｙの１つまたは複数を含む配列番号８の変種である、請求項１２から１７のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
【請求項１９】
−  Ｆ９８Ｗ／Ｈ６４Ｎ、Ｆ９８Ｗ／Ｈ６４Ｑ、Ｆ９８Ｗ／Ｈ６４ＫもしくはＦ９８Ｗ／Ｈ６４Ｆなどの、Ｆ９８／Ｈ６４における置換；
−  Ｆ９８Ｗ／Ｔ８０Ｋ、Ｆ９８Ｗ／Ｔ８０Ｑ、Ｆ９８Ｗ／Ｔ８０Ｎなどの、Ｆ９８／Ｔ８０における置換；
−  Ｆ９８Ｗ／Ｈ８２Ｎ、Ｆ９８Ｗ／Ｈ８２ＱもしくはＦ９８Ｗ／Ｈ８２Ｗなどの、Ｆ９８／Ｈ８２における置換；
−  Ｆ９８Ｗ／Ｓ８３Ｈ、Ｆ９８Ｗ／Ｓ８３Ｎ、Ｆ９８Ｗ／Ｓ８３Ｋ、Ｆ９８Ｗ／Ｓ８３Ｔ、Ｆ９８Ｗ／Ｓ８３ＲもしくはＦ９８Ｗ／Ｓ８３Ｑなどの、Ｆ９８／Ｓ８３における置換；
−  Ｆ９８Ｗ／Ｎ２４２Ｈ、Ｆ９８Ｗ／Ｎ２４２Ｑ、Ｆ９８Ｗ／Ｋ２４３ＱもしくはＦ９８Ｗ／Ｋ２４３Ｈなどの、Ｆ９８／Ｎ２４２における置換；
−  Ｆ９８Ｗ／Ｎ２９３Ｑ、Ｆ９８Ｗ／Ｎ２９３Ｋ、Ｆ９８Ｗ／Ｎ２９３Ｈ、Ｆ９８Ｗ／Ｔ３９４Ｋ、Ｆ９８Ｗ／Ｔ３９４Ｈ、Ｆ９８Ｗ／Ｔ３９４Ｎ、Ｆ９８Ｗ／Ｈ３９６Ｙ、Ｆ９８Ｗ／Ｈ３９６Ｆ、Ｆ９８Ｗ／Ｈ３９６ＱもしくはＦ９８Ｗ／Ｈ３９６Ｋなどの、Ｆ９８／Ｎ２９３における置換；または
−  Ｆ９８Ｗ／Ｋ３９７Ｒ、Ｆ９８Ｗ／Ｋ３９７ＨもしくはＦ９８Ｗ／Ｋ３９７Ｙなどの、Ｆ９８／Ｋ３９７における置換
を含む配列番号８の変種である、前記請求項のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
【請求項２０】
（ａ）前記ヘリカーゼが、配列番号８の変種を含み、膜貫通ポアと相互作用する前記ヘリカーゼの一部が、配列番号８中の位置１、２、３、４、５、６、５１、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８５、１８９、１９１、１９３、１９４、１９５、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１６、２１９、２２０、２２１、２２３、２２４、２２６、２２７、２２８、２２９、２４７、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２９８、３００、３０４、３０８、３１８、３１９、３２１、３３７、３４７、３５０、３５１、４０５、４１５、４２２、４３４、４３７、４３８を含むか；
（ｂ）前記ヘリカーゼが、配列番号８の変種を含み、膜貫通ポアと相互作用する前記ヘリカーゼの一部が、配列番号８中の位置１、２、４、５１、１７７、１７８、１７９、１８０、１８５、１９３、１９５、１９７、１９８、１９９、２００、２０２、２０３、２０４、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１６、２２１、２２３、２２４、２２６、２２７、２２８、２２９、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２６０、３０４、３１８、３２１、３４７、３５０、３５１、４０５、４１５、４２２、４３４、４３７および４３８を含むか；
（ｃ）前記ヘリカーゼが、配列番号８の変種を含み、膜貫通ポアと相互作用する前記ヘリカーゼの一部が、配列番号８中の位置１、２、１７８、１７９、１８０、１８５、１９５、１９７、１９８、１９９、２００、２０２、２０３、２０７、２０９、２１０、２１２、２１６、２２１、２２３、２２６、２２７、２５５、２５８、２６０、３０４、３５０および４３８を含むか；または
（ｄ）前記ヘリカーゼが、配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３の変種を含み、膜貫通ポアと相互作用する前記ヘリカーゼの一部が、（ａ）、（ｂ）もしくは（ｃ）において定義される配列番号８中の位置に対応する位置を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
【請求項２１】
（ａ）Ｋ１９４、（ｂ）Ｗ１９５、（ｃ）Ｄ１９８、（ｄ）Ｋ１９９および（ｅ）Ｅ２５８の１つまたは複数に修飾を含む配列番号８の変種を含む、請求項２０に記載のヘリカーゼ。
【請求項２２】
−  Ｆ９８Ｗ／Ｋ１９４Ｌ／Ｈ６４Ｎ、Ｆ９８Ｗ／Ｋ１９４Ｌ／Ｈ６４Ｑ、Ｆ９８Ｗ／Ｋ１９４Ｌ／Ｈ６４ＫもしくはＦ９８Ｗ／Ｋ１９４Ｌ／Ｈ６４Ｆなどの、Ｆ９８／Ｋ１９４／Ｈ６４における置換；
−  Ｆ９８Ｗ／Ｋ１９４Ｌ／Ｔ８０Ｋ、Ｆ９８Ｗ／Ｋ１９４Ｌ／Ｔ８０ＱもしくはＦ９８Ｗ／Ｋ１９４Ｌ／Ｔ８０Ｎなどの、Ｆ９８／Ｋ１９４／Ｔ８０における置換；
−  Ｆ９８Ｗ／Ｋ１９４Ｌ／Ｈ８２Ｎ、Ｆ９８Ｗ／Ｋ１９４Ｌ／Ｈ８２ＱもしくはＦ９８Ｗ／Ｋ１９４Ｌ／Ｈ８２Ｗなどの、Ｆ９８／Ｋ１９４／Ｈ８２における置換；
−  Ｆ９８Ｗ／Ｓ８３Ｈ／Ｋ１９４Ｌ、Ｆ９８Ｗ／Ｓ８３Ｔ／Ｋ１９４Ｌ、Ｆ９８Ｗ／Ｓ８３Ｒ／Ｋ１９４Ｌ、Ｆ９８Ｗ／Ｓ８３Ｑ／Ｋ１９４Ｌ、Ｆ９８Ｗ／Ｓ８３Ｎ／Ｋ１９４Ｌ、Ｆ９８Ｗ／Ｓ８３Ｋ／Ｋ１９４Ｌ、Ｆ９８Ｗ／Ｎ８８Ｒ／Ｋ１９４Ｌ、Ｆ９８Ｗ／Ｎ８８Ｈ／Ｋ１９４Ｌ、Ｆ９８Ｗ／Ｎ８８Ｗ／Ｋ１９４ＬもしくはＦ９８Ｗ／Ｎ８８Ｙ／Ｋ１９４Ｌなどの、Ｆ９８／Ｓ８３／Ｋ１９４における置換；
−  Ｆ９８Ｗ／Ｓ８３Ｈ／Ｋ１９４Ｌ／Ｆ２７６Ｋなどの、Ｆ９８／Ｓ８３／Ｋ１９４／Ｆ２７６における置換；
−  Ｆ９８Ｗ／Ｐ８９Ｌ／Ｋ１９４Ｌ、Ｆ９８Ｗ／Ｐ８９Ｖ／Ｋ１９４Ｌ、Ｆ９８Ｗ／Ｐ８９Ｉ／Ｋ１９４ＬもしくはＦ９８Ｗ／Ｐ８９Ｔ／Ｋ１９４Ｌなどの、Ｆ９８／Ｐ８９／Ｋ１９４における置換；
−  Ｆ９８Ｗ／Ｄ１２１Ｈ／Ｋ１９４Ｌ、Ｆ９８Ｗ／Ｄ１２１Ｙ／Ｋ１９４ＬもしくはＦ９８Ｗ／Ｄ１２１Ｋ／Ｋ１９４Ｌなどの、Ｆ９８／Ｄ１２１／Ｋ１９４における置換；
−  Ｆ９８Ｗ／Ｖ１５０Ｉ／Ｋ１９４Ｌ、Ｆ９８Ｗ／Ｖ１５０Ｌ／Ｋ１９４Ｌ、Ｆ９８Ｗ／Ｖ１５０Ｎ／Ｋ１９４Ｌ、Ｆ９８Ｗ／Ｖ１５０Ｗ／Ｋ１９４ＬもしくはＦ９８Ｗ／Ｖ１５０Ｈ／Ｋ１９４Ｌなどの、Ｆ９８／Ｖ１５０／Ｋ１９４における置換；
−  Ｆ９８Ｗ／Ｐ１５２Ｗ／Ｋ１９４Ｌ、Ｆ９８Ｗ／Ｐ１５２Ｆ／Ｋ１９４Ｌ、Ｆ９８Ｗ／Ｐ１５２Ｙ／Ｋ１９４Ｌ、Ｆ９８Ｗ／Ｐ１５２Ｈ／Ｋ１９４Ｌ、Ｆ９８Ｗ／Ｐ１５２Ｉ／Ｋ１９４Ｌ、Ｆ９８Ｗ／Ｐ１５２Ｌ／Ｋ１９４ＬもしくはＦ９８Ｗ／Ｐ１５２Ｖ／Ｋ１９４Ｌなどの、Ｆ９８／Ｐ１５２／Ｋ１９４における置換；
−  Ｆ９８Ｗ／Ｆ２４０Ｗ／Ｋ１９４Ｌ、Ｆ９８Ｗ／Ｆ２４０Ｙ／Ｋ１９４ＬもしくはＦ９８Ｗ／Ｆ２４０Ｈ／Ｋ１９４Ｌなどの、Ｆ９８／Ｆ２４０／Ｋ１９４における置換；
−  Ｆ９８Ｗ／Ｎ２４２Ｈ／Ｋ１９４ＬもしくはＦ９８Ｗ／Ｎ２４２Ｑ／Ｋ１９４Ｌなどの、Ｆ９８／Ｎ２４２／Ｋ１９４における置換；
−  Ｆ９８Ｗ／Ｋ１９４Ｌ／Ｆ２７６Ｋ、Ｆ９８Ｗ／Ｋ１９４Ｌ／Ｆ２７６Ｈ、Ｆ９８Ｗ／Ｋ１９４Ｌ／Ｆ２７６ＷもしくはＦ９８Ｗ／Ｋ１９４Ｌ／Ｆ２７６Ｒなどの、Ｆ９８／Ｋ１９４／Ｆ２７６における置換；
−  Ｆ９８Ｗ／Ｋ１９４Ｌ／Ｓ２８７Ｋ、Ｆ９８Ｗ／Ｋ１９４Ｌ／Ｓ２８７Ｒ、Ｆ９８Ｗ／Ｋ１９４Ｌ／Ｓ２８７ＷもしくはＦ９８Ｗ／Ｋ１９４Ｌ／Ｓ２８７Ｆなどの、Ｆ９８／Ｋ１９４／Ｓ２８７における置換；
−  Ｆ９８Ｗ／Ｎ２９３Ｑ／Ｋ１９４Ｌ、Ｆ９８Ｗ／Ｎ２９３Ｋ／Ｋ１９４ＬもしくはＦ９８Ｗ／Ｎ２９３Ｈ／Ｋ１９４Ｌなどの、Ｆ９８／Ｎ２９３／Ｋ１９４における置換；
−  Ｆ９８Ｗ／Ｔ３９４Ｋ／Ｋ１９４Ｌ、Ｆ９８Ｗ／Ｔ３９４Ｈ／Ｋ１９４ＬもしくはＦ９８Ｗ／Ｔ３９４Ｎ／Ｋ１９４Ｌなどの、Ｆ９８／Ｔ３９４／Ｋ１９４における置換；
−  Ｆ９８Ｗ／Ｈ３９６Ｙ／Ｋ１９４Ｌ、Ｆ９８Ｗ／Ｈ３９６Ｆ／Ｋ１９４Ｌ、Ｆ９８Ｗ／Ｈ３９６Ｑ／Ｋ１９４ＬもしくはＦ９８Ｗ／Ｈ３９６Ｋ／Ｋ１９４Ｌなどの、Ｆ９８／Ｈ３９６／Ｋ１９４における置換；
−  Ｆ９８Ｗ／Ｋ３９７Ｒ／Ｋ１９４Ｌ、Ｆ９８Ｗ／Ｋ３９７Ｈ／Ｋ１９４ＬもしくはＦ９８Ｗ／Ｋ３９７Ｙ／Ｋ１９４Ｌなどの、Ｆ９８／Ｋ３９７／Ｋ１９４における置換；または
−  Ｆ９８Ｗ／Ｙ４１５Ｗ／Ｋ１９４ＬもしくはＦ９８Ｗ／Ｙ４１５Ｒ／Ｋ１９４Ｌなどの、Ｆ９８／Ｙ４１５／Ｋ１９４における置換
を含む配列番号８の変種である、前記請求項のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
【請求項２３】
（ａ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメインおよび／もしくは（ｉｉ）ピンドメインおよび／もしくは（ｉｉｉ）１Ａ（ＲｅｃＡ様モーター）ドメインに導入されているか；
（ｂ）少なくとも１つのシステイン残基および／もしくは少なくとも１つの非天然アミノ酸がフックドメインおよび／もしくは２Ａ（ＲｅｃＡ様モーター）ドメインに導入されているか；または
（ｃ）その表面負電荷を低減するように修飾されている、前記請求項のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
【請求項２４】
配列番号８の変種であり、Ｅ９４Ｃ、Ｆ９８Ｗ、Ｃ１０９Ａ、Ｃ１３６Ａ、Ｋ１９４ＬおよびＡ３６０Ｃを含む、前記請求項のいずれか一項に記載のヘリカーゼ。
【請求項２５】
前記請求項のいずれか一項に記載のヘリカーゼおよび追加的ポリヌクレオチド結合成分を含む構築物であって、前記ヘリカーゼが前記ポリヌクレオチド結合成分に付着しており、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有する構築物。
【請求項２６】
請求項１から２４のいずれか一項に記載の２つ以上のヘリカーゼを含む、請求項２５に記載の構築物。
【請求項２７】
請求項１から２４のいずれか一項に記載のヘリカーゼ、または請求項２５もしくは２６に記載の構築物をコードする配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項２８】
プロモーターに作動可能に連結した請求項２７に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２９】
請求項２５に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３０】
請求項２７に記載のポリヌクレオチドを発現させるステップ、請求項２８に記載のベクターを細胞にトランスフェクトするステップまたは請求項２９に記載の宿主細胞を培養するステップを含む、請求項１から２４のいずれか一項に記載のヘリカーゼ、または請求項２５もしくは２６に記載の構築物を作製する方法。
【請求項３１】
ポリヌクレオチドの移動を制御する方法であって、前記ポリヌクレオチドを請求項１から２４のいずれか一項に記載のヘリカーゼまたは請求項２５もしくは２６に記載の構築物に接触させ、それにより前記ポリヌクレオチドの移動を制御することを含む、方法。
【請求項３２】
膜貫通ポアを通るポリヌクレオチドの移動を制御するためである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
標的ポリヌクレオチドを特性決定する方法であって、
（ａ）前記標的ポリヌクレオチドを膜貫通ポアおよび請求項１から２４のいずれか一項に記載のヘリカーゼまたは請求項２５もしくは２６に記載の構築物に、前記ヘリカーゼまたは構築物が前記ポアを通る前記標的ポリヌクレオチドの移動を制御するように接触させるステップ；ならびに
（ｂ）前記ポリヌクレオチドが前記ポアに対して移動する際に１つまたは複数の測定値を取るステップであって、前記測定値が前記標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性を示し、それにより前記標的ポリヌクレオチドを特性決定するステップ
を含む方法。
【請求項３４】
前記１つまたは複数の特性が、（ｉ）前記標的ポリヌクレオチドの長さ、（ｉｉ）前記標的ポリヌクレオチドの同一性、（ｉｉｉ）前記標的ポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）前記標的ポリヌクレオチドの二次構造および（ｖ）前記標的ポリヌクレオチドが修飾されているか否か、から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記標的ポリヌクレオチドがメチル化によって、酸化によって、損傷によって、１つまたは複数のタンパク質でまたは１つまたは複数の標識、タグもしくはスペーサーで修飾されている、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記標的ポリヌクレオチドの前記１つまたは複数の特性が電気的測定および／または光学的測定によって測定される、請求項３３から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記電気的測定が電流測定、インピーダンス測定、トンネル測定または電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）測定である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
（ａ）前記標的ポリヌクレオチドを膜貫通ポアおよび請求項１から２４のいずれか一項に記載のヘリカーゼまたは請求項２５もしくは２６に記載の構築物に接触させて、前記ヘリカーゼまたは前記構築物が前記ポアを通る前記標的ポリヌクレオチドの移動を制御するようにするステップ；および
（ｂ）前記ポリヌクレオチドが前記ポアに関して移動するときに前記ポアを通過する電流を測定するステップであって、前記電流が前記標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性を示し、それにより前記標的ポリヌクレオチドを特性決定するステップ
を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ポアに電圧を印加して、前記ポアと前記ヘリカーゼまたは構築物との複合体を形成するステップをさらに含む、請求項３３から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記ポリヌクレオチドの少なくとも一部が２本鎖である、請求項３３から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記ポアが、膜貫通タンパク質ポアまたはソリッドステートポアである、請求項３３から４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記膜貫通タンパク質ポアが、ヘモリジン（hemolysin）、ロイコシジン（leukocidin）、スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ポリン（porin）Ａ（ＭｓｐＡ）、ＭｓｐＢ、ＭｓｐＣ、ＭｓｐＤ、リセニン、外膜ポリン（porin）Ｆ（ＯｍｐＦ）、外膜ポリン（porin）Ｇ（ＯｍｐＧ）、外膜ホスホリパーゼＡ、ナイセリア（Neisseria）オートトランスポーターリポタンパク質（ＮａｌＰ）およびＷＺＡ由来である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記膜貫通タンパク質が、配列番号２に示す８個の同一のサブユニットから形成されている、または（ｂ）８個のサブユニットの１つもしくは複数が配列全体にわたるアミノ酸同一性に基づいて配列番号２に対して少なくとも５０％の相同性を有し、ポア活性を有しているその変種である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
（ａ）ポアと、（ｂ）請求項１から２４のいずれか一項に記載のヘリカーゼまたは請求項２５もしくは２６に記載の構築物との複合体を形成し、それにより標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサーを形成するステップを含む、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサーの形成方法。
【請求項４５】
前記複合体が、（ａ）前記標的ポリヌクレオチドの存在下で前記ポアと前記ヘリカーゼまたは構築物とを接触させるステップおよび（ａ）前記ポアに電位を印加するステップによって形成される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記電位が、電圧電位または化学電位である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記複合体が、前記ポアを前記ヘリカーゼまたは構築物に共有結合的に付着するステップによって形成される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのセンサーであって、（ａ）ポアと、（ｂ）請求項１から２４のいずれか一項に記載のヘリカーゼまたは請求項２５もしくは２６に記載の構築物との間の複合体を含む、センサー。
【請求項４９】
ポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御するための、請求項１から２４のいずれか一項に記載のヘリカーゼまたは請求項２５もしくは２６に記載の構築物の使用。
【請求項５０】
標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのキットであって、
（ａ）ポアおよび請求項１から２４のいずれか一項に記載のヘリカーゼまたは請求項２５もしくは２６に記載の構築物；または
（ｂ）請求項１から２４のいずれか一項に記載のヘリカーゼまたは請求項２５もしくは２６に記載の構築物および１つもしくは複数のローディング成分
を含む、キット。
【請求項５１】
試料中の標的ポリヌクレオチドを特徴付けるための装置であって、（ａ）複数のポアと、（ｂ）請求項１から２４のいずれか一項に記載の複数のヘリカーゼまたは請求項２５もしくは２６に記載の複数の構築物とを含む、装置。
【請求項５２】
請求項１から２４のいずれか一項に記載のヘリカーゼを産生する方法であって、
（ａ）ヘリカーゼを提供するステップ；ならびに
（ｂ）請求項１から２４のいずれか一項に記載のヘリカーゼを産生するようにヘリカーゼを修飾するステップ
を含む方法。
【請求項５３】
（ｃ）前記得られたヘリカーゼがポリヌクレオチドの移動を制御できるかどうかを決定するステップをさらに含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
請求項２５または２６に記載の構築物を産生する方法であって、請求項１から２４のいずれか一項に記載のヘリカーゼを追加的ポリヌクレオチド結合成分に付着させ、それにより前記構築物を産生するステップを含む方法。
【請求項５５】
前記得られた構築物がポリヌクレオチドの移動を制御できるかどうかを決定するステップをさらに含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
ポリヌクレオチドに付着している２つ以上のヘリカーゼのシリーズであって、前記２つ以上のヘリカーゼの少なくとも１つが請求項１から２４のいずれか一項に記載のヘリカーゼであるシリーズ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリヌクレオチドの移動を制御するために使用でき、ポリヌクレオチドを配列決定するために特に有用である修飾Ｄｄａヘリカーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
迅速で安価なポリヌクレオチド（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）配列決定および同定技術が、幅広い応用にわたって現在必要である。既存の技術は、主にそれらが、大量のポリヌクレオチドを生成するための増幅技術に依存し、シグナル検出のために多量の専門的な蛍光化学物質を必要とするために、遅く高価である。
【０００３】
膜貫通ポア（ナノポア）は、ポリマーおよび種々の小分子のための直接的、電気的バイオセンサーとして大きな将来性を有する。特に、将来性のあるＤＮＡ配列決定技術としてナノポアが近年注目されている。
【０００４】
電位がナノポア全体に印加される場合、ヌクレオチドなどの分析物が一定時間バレルに一過的に存在する場合に電流が変化する。ヌクレオチドのナノポア検出は、既知のサインおよび持続時間での電流変化をもたらす。「鎖配列決定」法では、１本のポリヌクレオチド鎖がポアを通り、ヌクレオチドのアイデンティティが得られる。鎖配列決定は、ポアを通るポリヌクレオチドの移動を制御するためのヘリカーゼなどのヌクレオチドハンドリングタンパク質の使用を含み得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、ポアを通るポリヌクレオチドの移動を制御する改善された能力を有する特異的Ｄｄａ変異体を驚くべきことに同定した。本発明の変異体はフォワードスリッピング（forward slipping）の低減を示す。これは、ポアと比較してＤＮＡの少なくとも４個の連続したヌクレオチド、典型的には１０を超える連続したヌクレオチド前方へ移動する現象である。前方へのスリッピングは、１００個またはそれ以上の連続したヌクレオチドの前方への移動を含んでよく、これは各ポリヌクレオチドについて１回より多く生じる場合がある。前方へのスリッピングは、ポリヌクレオチド配列決定のためには問題となる場合がある。本発明者らによって同定された変異体は、典型的には変異の組合せ、すなわち（１）１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）中のヌクレオチドと相互作用するアミノ酸の１つまたは複数の置換、および（２）膜貫通ポアと相互作用する変異体の部分での１つまたは複数の修飾を含む。
【０００６】
したがって本発明は、（ａ）１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）中の１つまたは複数のヌクレオチドと相互作用する少なくとも１つのアミノ酸が置換されており、（ｂ）膜貫通ポアと相互作用するヘリカーゼの部分が１つまたは複数の修飾を含むＤＮＡ依存性ＡＴＰａｓｅ（Ｄｄａ）ヘリカーゼであって、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有する、ＤＮＡ依存性ＡＴＰａｓｅ（Ｄｄａ）ヘリカーゼを提供する。
【０００７】
本発明は：
−  本発明のヘリカーゼおよび追加的ポリヌクレオチド結合成分を含む構築物であって、ヘリカーゼがポリヌクレオチド結合成分に付着しており、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有する構築物；
−  本発明のヘリカーゼ、または本発明の構築物をコードしている配列を含むポリヌクレオチド；
−  プロモーターに作動可能に連結した本発明のポリヌクレオチドを含むベクター；
−  本発明のベクターを含む宿主細胞；
−  本発明のポリヌクレオチドを発現するステップ、本発明のベクターを細胞にトランスフェクトするステップまたは本発明の宿主細胞を培養するステップを含む、本発明のヘリカーゼ、または本発明の構築物を作製する方法；
−  ポリヌクレオチドの移動を制御する方法であって、ポリヌクレオチドを本発明のヘリカーゼまたは本発明の構築物と接触させるステップおよびそれによりポリヌクレオチドの移動を制御するステップを含む方法；
−  標的ポリヌクレオチドを特性決定する方法であって、（ａ）標的ポリヌクレオチドを膜貫通ポアおよび本発明のヘリカーゼまたは本発明の構築物と、ヘリカーゼがポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御するように接触させるステップ、ならびに（ｂ）ポリヌクレオチドがポアに対して移動する際に１つまたは複数の測定値を取るステップであって、測定値が標的ポリヌクレオチドの特性の１つまたは複数を示し、それにより標的ポリヌクレオチドを特性決定するステップを含む方法；
−  標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサーを形成する方法であって、（ａ）ポアと（ｂ）本発明のヘリカーゼまたは本発明の構築物との間の複合体を形成するステップ、およびそれにより標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサーを形成するステップを含む方法；
−  （ａ）ポアと（ｂ）本発明のヘリカーゼまたは本発明の構築物との間の複合体を含む標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサー；
−  ポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御するための本発明のヘリカーゼまたは本発明の構築物の使用；
−  （ａ）ポアおよび（ｂ）本発明のヘリカーゼまたは本発明の構築物を含む、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのキット；
−  （ａ）複数のポアおよび（ｂ）複数の本発明のヘリカーゼまたは複数の本発明の構築物を含む試料中の標的ポリヌクレオチドを特性決定するための装置；ならびに
−  ポリヌクレオチドに付着している２つ以上のヘリカーゼのシリーズであって、少なくとも１つが本発明のヘリカーゼである２つ以上のヘリカーゼのシリーズ
も提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ＭｓｐＡ−（Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｄ９０Ｎ／Ｄ９１Ｎ／Ｄ１１８Ｒ／Ｑ１２６Ｒ／Ｄ１３４Ｒ／Ｅ１３９Ｋ）８（変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｄ９０Ｎ／Ｄ９１Ｎ／Ｄ１１８Ｒ／Ｑ１２６Ｒ／Ｄ１３４Ｒ／Ｅ１３９Ｋを有する配列番号２＝ＭｓｐＡ変異体１）またはＭｓｐＡ−（（Ｄｅｌ−Ｌ７４／Ｇ７５／Ｄ１１８／Ｌ１１９）Ｄ５６Ｎ／Ｅ５９Ｒ／Ｌ８８Ｎ／Ｄ９０Ｎ／Ｄ９１Ｎ／Ｑ１２６Ｒ／Ｄ１３４Ｒ／Ｅ１３９Ｋ）８（変異Ｄ５６Ｎ／Ｅ５９Ｒ／Ｌ８８Ｎ／Ｄ９０Ｎ／Ｄ９１Ｎ／Ｑ１２６Ｒ／Ｄ１３４Ｒ／Ｅ１３９Ｋおよびアミノ酸Ｌ７４／Ｇ７５／Ｄ１１８／Ｌ１１９の欠失を有する配列番号２＝ＭｓｐＡ変異体２）のいずれかに関するＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ（変異Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａを有する配列番号８）の３種の異なる初期シミュレーションの配向を示す図である。実行１と実行２との間の差は、ポアおよび酵素が同じ位置にあるにも関わらず、酵素およびポアの両方が異なる側鎖コンホメーションを有したことであった。実行３では酵素は、ナノポアに関してわずかに傾けられた。
【図２】酵素変異体１とのナノポアＭｓｐＡ変異体１との相互作用点のプロット（ｙ軸標識＝ポア／酵素接触の数、ｘ軸標識＝ポアアミノ酸残基数）を示す図である。プロットの各列は、異なる酵素／ナノポアの配向、例えば実行１〜３についての相互作用点を示している。
【図３】ＭｓｐＡ変異体１との酵素変異体１の相互作用点のプロット（ｙ軸標識＝ポア／酵素接触の数、ｘ軸標識＝ポアアミノ酸残基数）を示す図である。プロットの各列は、異なる酵素／ナノポアの配向、例えば実行１〜３についての相互作用点を示している。
【図４】酵素変異体１とのナノポアＭｓｐＡ変異体２の相互作用点のプロット（ｙ軸標識＝ポア／酵素接触の数、ｘ軸標識＝ポアアミノ酸残基数）を示す図である。プロットの各列は、異なる酵素／ナノポアの配向、例えば実行１〜３についての相互作用点を示している。
【図５】ＭｓｐＡ変異体２との酵素変異体１の相互作用点のプロット（ｙ軸標識＝ポア／酵素接触の数、ｘ軸標識＝ポアアミノ酸残基数）を示す図である。プロットの各列は、異なる酵素／ナノポアの配向、例えば実行１〜３についての相互作用点を示している。
【図６】（Ａ）ポア（ＭｓｐＡ変異体２）中のどのアミノ酸が酵素（酵素変異体１）中の具体的なアミノ酸と相互作用するかを実行１から示すプロット（ｙ軸標識＝ポアアミノ酸残基数／ｘ軸標識＝酵素アミノ酸残基数）の２領域を示す図である。（Ｂ）ポア（ＭｓｐＡ変異体２）中のどのアミノ酸が酵素（酵素変異体１）中の具体的なアミノ酸と相互作用するかを実行３から示すプロット（ｙ軸標識（ａ１）＝ポアアミノ酸残基数、ｙ軸標識（ａ２）＝ポア／酵素接触の数、ｘ軸標識＝酵素アミノ酸残基数）の領域を示す図である。プロットの灰色バンドは、アミノ酸間の相互作用を示す。灰色バンドの濃さは、濃い灰色＝多数の相互作用および薄い灰色＝少ない相互作用で酵素／ポア間の相互作用の数に対応する。各ボックス中の最初のアミノ酸は、ＭｓｐＡ変異体２中の相互作用するアミノ酸に対応し、２番目のアミノ酸は酵素変異体１中の相互作用するアミノ酸に対応する。
【図７】実施例３において使用されるＤＮＡ構築物Ｘを示す図である。セクションＡは３０個のｉＳｐＣ３スペーサーに対応した。セクションＢは配列番号６０に対応した。標識Ｃは、実験において使用される酵素変異体に対応した。セクションＤは、４個のｉＳｐ１８スペーサーに対応した。セクションＥは、配列番号６１に対応した。セクションＦは、４個のｉＳｐＣ３スペーサーに対応した。セクションＧは、配列番号６２に対応した。セクションＨは、配列番号６３に対応した。セクションＩは、配列番号６４に対応した。セクションＪは、３’コレステロールに対応した。
【図８】ヘリカーゼ（Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｋ１９４Ｌ／Ａ３６０Ｃ（変異Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｋ１９４Ｌ／Ａ３６０Ｃおよび次いで（ΔＭ１）Ｇ１を有する配列番号８））がＣｓｇＧ−Ｅｃｏナノポア（ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ）−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（変異Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑを有する配列番号６６、ＳｔｅｐＩＩ（Ｃ）は配列番号６７であり、Ｃ末端に付着されている）を通るＤＮＡ構築物Ｘの移行を制御した場合の電流トレース例（３種全てのトレースについてｙ軸標識＝電流（ｐＡ）、ｘ軸標識＝時間（ｓ））を示す図である。セクションＢおよびＣは、電流トレースＡの領域を拡大して示す。
【図９】ヘリカーゼ（Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｋ１９４Ｌ／Ａ３６０Ｃ（変異Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｋ１９４Ｌ／Ａ３６０Ｃおよび次いで（ΔＭ１）Ｇ１）を有する配列番号８）がＭｓｐＡナノポアを通るＤＮＡ／ＲＮＡ構築物Ｙの移行を制御した場合の電流トレース例（ｙ軸標識＝電流（ｐＡ）、ｘ軸標識＝時間（ｓ））を示す図である。１と標識した領域はＲＮＡ領域に対応し、２と標識した領域はＤＮＡ領域に対応する。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
配列表の記載
配列番号１は、野生型ＭｓｐＡ単量体をコードするコドン最適化ポリヌクレチド配列を示す。この変異体は、シグナル配列を欠失している。
【００１０】
配列番号２は、野生型ＭｓｐＡ単量体の成熟形態のアミノ酸配列を示す。この変異体は、シグナル配列を欠失している。
【００１１】
配列番号３は、α−ヘモリジン−Ｅ１１１Ｎ／Ｋ１４７Ｎ（α−ＨＬ−ＮＮ；Stoddart et al., PNAS, 2009;106(19):7702-7707）の１つの単量体をコードするポリヌクレオチド配列を示す。
【００１２】
配列番号４は、α−ＨＬ−ＮＮの１つの単量体のアミノ酸配列を示す。
【００１３】
配列番号５から７は、ＭｓｐＢ、ＣおよびＤのアミノ酸配列を示す。
【００１４】
配列番号８から２３は、表１および２に示すＤｄａヘリカーゼのアミノ酸配列を示す。
【００１５】
配列番号２４は好ましいＨｈＨドメインのアミノ酸配列を示す。
【００１６】
配列番号２５はｇｐ３２遺伝子によってコードされる、バクテリオファージＲＢ６９由来ｓｓｂのアミノ酸配列を示す。
【００１７】
配列番号２６はｇｐ２．５遺伝子によってコードされるバクテリオファージＴ７由来ｓｓｂのアミノ酸配列を示す。
【００１８】
配列番号２７はヘルペスウイルス１由来ＵＬ４２前進性因子のアミノ酸配列を示す。
【００１９】
配列番号２８はＰＣＮＡのサブユニット１のアミノ酸配列を示す。
【００２０】
配列番号２９はＰＣＮＡのサブユニット２のアミノ酸配列を示す。
【００２１】
配列番号３０はＰＣＮＡのサブユニット３のアミノ酸配列を示す。
【００２２】
配列番号３１はＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を示す。
【００２３】
配列番号３２はヘルペスウイルス１由来ＵＬ４２前進性因子のアミノ酸配列（１から３１９）を示す。
【００２４】
配列番号３３はバクテリオファージＲＢ６９由来ｓｓｂのアミノ酸配列、すなわちＣ末端が欠失している（ｇｐ３２ＲＢ６９ＣＤ）配列番号２５を示す。
【００２５】
配列番号３４はバクテリオファージＴ７（ｇｐ２．５Ｔ７−Ｒ２１１Ｄｅｌ）由来のｓｓｂのアミノ酸配列（１から２１０）を示す。全長タンパク質は配列番号９６において示されている。
【００２６】
配列番号３５はＨｅｌ３０８Ｈｌａの第５ドメインのアミノ酸配列を示す。
【００２７】
配列番号３６はＨｅｌ３０８Ｈｖｏの第５ドメインのアミノ酸配列を示す。
【００２８】
配列番号３７は（ＨｈＨ）２ドメインのアミノ酸配列を示す。
【００２９】
配列番号３８は（ＨｈＨ）２−（ＨｈＨ）２ドメインのアミノ酸配列を示す。
【００３０】
配列番号３９はヒトミトコンドリアＳＳＢ（ＨｓｍｔＳＳＢ）のアミノ酸配列を示す。
【００３１】
配列番号４０はＰｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ由来ｐ５タンパク質のアミノ酸配列を示す。
【００３２】
配列番号４１は大腸菌（E. coli）由来野生型ＳＳＢのアミノ酸配列を示す。
【００３３】
配列番号４２は、ｇｐ３２遺伝子によってコードされるバクテリオファージＴ４由来ｓｓｂのアミノ酸配列を示す。
【００３４】
配列番号４３はＥｃｏＳＳＢ−ＣｔｅｒＡｌａのアミノ酸配列を示す。
【００３５】
配列番号４４はＥｃｏＳＳＢ−ＣｔｅｒＮＧＧＮのアミノ酸配列を示す。
【００３６】
配列番号４５はＥｃｏＳＳＢ−Ｑ１５２ｄｅｌのアミノ酸配列を示す。
【００３７】
配列番号４６はＥｃｏＳＳＢ−Ｇ１１７ｄｅｌのアミノ酸配列を示す。
【００３８】
配列番号４７はトポイソメラーゼＶ  Ｍｋａ（メタノピュルス・カンドレリ（Methanopyrus Kandleri））のアミノ酸配列を示す。
【００３９】
配列番号４８はトポイソメラーゼＶ  Ｍｋａ（メタノピュルス・カンドレリ（Methanopyrus Kandleri））のドメインＨ−Ｌのアミノ酸配列を示す。
【００４０】
配列番号４９は変異体Ｓ（大腸菌（Escherichia coli））のアミノ酸配列を示す。
【００４１】
配列番号５０はＳｓｏ７ｄ（スルホロブス・ソルファタリカス（Sufolobus solfataricus））のアミノ酸配列を示す。
【００４２】
配列番号５１はＳｓｏ１０ｂ１（スルホロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）Ｐ２）のアミノ酸配列を示す。
【００４３】
配列番号５２はＳｓｏ１０ｂ２（スルホロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）Ｐ２）のアミノ酸配列を示す。
【００４４】
配列番号５３はトリプトファンリプレッサー（大腸菌（Escherichia coli））のアミノ酸配列を示す。
【００４５】
配列番号５４はラムダリプレッサー（腸内細菌（Enterobacteria）ファージラムダ）のアミノ酸配列を示す。
【００４６】
配列番号５５はＣｒｅｎ７（ヒストン・クレンアーキア（Histone crenarchaea）Ｃｒｅｎ７  Ｓｓｏ）のアミノ酸配列を示す。
【００４７】
配列番号５６はヒトヒストン（ヒト（Homo sapiens））のアミノ酸配列を示す。
【００４８】
配列番号５７はｄｓｂＡ（腸内細菌ファージＴ４）のアミノ酸配列を示す。
【００４９】
配列番号５８はＲａｄ５１（ヒト（Homo sapiens））のアミノ酸配列を示す。
【００５０】
配列番号５９はＰＣＮＡスライディングクランプ（sliding clamp）（シトロミクロビウム・バチオマリヌム（Citromicrobium bathyomarinum)ＪＬ３５４）のアミノ酸配列を示す。
【００５１】
配列番号６０から６４は、実施例３において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。
【００５２】
配列番号６５は、大腸菌（Escherchia coli）Ｋ−１２株ＭＣ４１００亜系由来野生型ＣｓｇＧ単量体をコードするコドン最適化ポリヌクレオチド配列を示す。この単量体はシグナル配列を欠失している。
【００５３】
配列番号６６は、大腸菌（Escherchia coli）Ｋ−１２株ＭＣ４１００亜系由来野生型ＣｓｇＧ単量体の成熟形態のアミノ酸配列を示す。この単量体は、シグナル配列を欠失している。これについて使用される略称ＣｓｇＧ＝ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ。
【００５４】
配列番号６７は、ＳｔｅｐＩＩ（Ｃ）のアミノ酸配列を示す。
【００５５】
配列番号６８から７３は、実施例５において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。
【００５６】
発明の詳細な記載
本開示の生成物および方法のさまざまな応用が当技術分野における具体的な必要性に適合され得ることは理解される。本明細書で用いられる用語は本発明の詳細な実施形態を記載する目的のためのみであり、限定されることを意図しないことも理解される。
【００５７】
付加的に、本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容が他を明確に記す場合を除いて複数の参照物を含む。したがって例えば、「ヘリカーゼ（a helicase）」を参照することは「ヘリカーゼ（helicases）」を含み、「修飾（a modification）」を参照することは２つ以上のそのような修飾を含み、「膜貫通タンパク質ポア（a transmembrane protein pore）」を参照することは２つ以上のそのようなポアを含む、など。
【００５８】
本明細書に引用する全ての刊行物、特許および特許出願は（上記または下記に関わらず）それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００５９】
修飾Ｄｄａヘリカーゼ
本発明は、修飾Ｄｄａヘリカーゼを提供する。１つまたは複数の特異的修飾は、下により詳細に考察される。本発明による修飾は、上に考察の１つまたは複数の置換を含む。
【００６０】
膜貫通ポアおよびヘリカーゼを使用する配列決定などの、ポリヌクレオチドの特徴付けは、典型的にはｋ個のヌクレオチドで作られたポリマー単位を分析することを含み、ｋは正の整数である（すなわち「ｋ量体」）。これは国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５２３４３号（国際公開第２０１３／０４１８７８号パンフレットとして公開）において考察されている。標的ポリヌクレオチドがポアに関してまたは通って移動するときに、ポリヌクレオチド内のさまざまなｋ量体が、典型的にはポアを通って流れる電流を測定することによって分析される。通るなどのポアに関するポリヌクレオチドの移動は１個のｋ量体から別へまたはｋ量体からｋ量体への移動として観察され得る。
【００６１】
本発明の修飾ヘリカーゼは、通るなどの膜貫通ポアに関する標的ポリヌクレオチドのさらに安定した移動を提供する。ヘリカーゼは、標的ポリヌクレオチドが通るなどポアに関して移動するときに１個のｋ量体から別へまたはｋ量体からｋ量体へのさらに安定した移動を好ましくは提供する。ヘリカーゼは、通るなどの膜貫通ポアに関して標的ポリヌクレオチドがさらに円滑に移動できるようにする。ヘリカーゼは、通るなどの膜貫通ポアに関する標的ポリヌクレオチドのさらに規則的なまたはより不規則でない移動を好ましくは提供する。
【００６２】
修飾（複数可）、具体的にはｓｓＤＮＡ中の１つまたは複数のヌクレオチドと相互作用する１つまたは複数のアミノ酸の置換）は、修飾ヘリカーゼがフォワードスリッピングの低減を示すようにする。これは、ポアと比較してＤＮＡの少なくとも４個の連続したヌクレオチド、典型的には１０個より多い連続したヌクレオチド前方へ移動する現象である。前方へのスリッピングは、１００個またはそれ以上の連続したヌクレオチドの前方への移動を含んでよく、これは各ポリヌクレオチドについて１回より多く生じる場合がある。前方へのスリッピングは、ポリヌクレオチド配列決定のために問題となる場合がある。
【００６３】
修飾（複数可）は、ヘリカーゼによって示されるフォワードスリッピングの頻度を、典型的には少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％低減する。修飾（複数可）は、典型的にはフォワードスリッピングを消滅させる、すなわちヘリカーゼによって示されるフォワードスリッピングの頻度を１００％低減する。修飾（複数可）は、ヘリカーゼによって示されるフォワードスリッピングの長さを、典型的には９ヌクレオチド以下、８ヌクレオチド以下、７ヌクレオチド以下、６ヌクレオチド以下、５ヌクレオチド以下、４ヌクレオチド以下、３ヌクレオチド以下、２ヌクレオチド以下または１ヌクレオチドなどの１０ヌクレオチド以下に低減する。修飾（複数可）は、ヘリカーゼによって示されるフォワードスリッピングの頻度および長さを好ましくは低減する。
【００６４】
フォワードスリッピングは、当技術分野において公知の任意の方法を使用して測定され得る。ポリヌクレオチドの移動およびフォワードスリッピングの発生を制御するヘリカーゼの能力は、下に記載するものなどのナノポア系において典型的にはアッセイされる。ポリヌクレオチドの移動およびフォワードスリッピングの発生を制御するヘリカーゼの能力は、実施例において記載の通り決定され得る。
【００６５】
修飾（複数可）、具体的には膜貫通ポアと相互作用するヘリカーゼの部分中の修飾（複数可）は、通るなどの膜貫通ポアに関する標的ポリヌクレオチドの移動に関連する雑音を典型的には低減する。ｋ量体としての任意の大きさの標的ポリヌクレオチドの望まれない移動も分析され、典型的にはｋ量体についての電流サインまたはレベルに雑音を生じる。本発明のヘリカーゼは、標的ポリヌクレオチド中の各ｋ量体などの１つまたは複数のｋ量体に関連する望まれない移動を低減することによってこの雑音を低減できる。ヘリカーゼは、標的ポリヌクレオチド中の各ｋ量体などの１つまたは複数のｋ量体についての電流レベルまたはサインに関連する雑音を低減できる。
【００６６】
好ましい実施形態では標的ポリヌクレオチドは２本鎖であり、ヘリカーゼは、相補鎖の移動に関連する雑音を鋳型鎖の移動に関連する雑音を低減するよりも大きな程度低減する、および／または相補鎖の移動の一貫性を鋳型鎖の移動の一貫性を増加させるよりも大きな程度増加させる。これは、２本鎖標的ポリヌクレオチドの鎖配列決定のために有利である。２本鎖ポリヌクレオチドの２本の鎖は、ヘアピンループまたはヘアピンループアダプターなどの架橋成分によって好ましくは連結される。これは下でより詳細に考察される。言い換えると本発明の修飾ヘリカーゼは、ポリヌクレオチドの移動を制御することに優れている。ヘリカーゼがポリヌクレオチドの移動を制御できる程度は、下により詳細に考察される修飾によって典型的には変化する。
【００６７】
本発明のヘリカーゼは、修飾される。修飾ヘリカーゼは、対応する野生型ヘリカーゼまたは天然ヘリカーゼと比較して典型的には修飾されている。本発明のヘリカーゼは、人工または非天然である。
【００６８】
本発明の修飾ヘリカーゼは、鎖配列決定法の際にポリヌクレオチドの移動を制御するための有用な手段である。ヘリカーゼは、少なくとも２つの活性様式の操作（ヘリカーゼが移動を促進するために必要な全ての構成成分、例えばＡＴＰおよびＭｇ２＋と共に提供される場合）で、および１つの不活性様式の操作（ヘリカーゼが移動を促進するために必要な構成成分と共に提供されない場合）でＤＮＡの移動を制御できる。移動を促進するために必要な全ての構成成分と共に提供される場合、ヘリカーゼは、ＤＮＡに沿って５’−３’方向で移動するが、ナノポア中のＤＮＡの方向は（ＤＮＡのどちらの末端が捕捉されたかに依存する）、酵素が印加された場とは反対にナノポアの外へＤＮＡを移動させるように、または印加された場でナノポア中にＤＮＡを移動させるようにのいずれかで使用され得る。ＤＮＡの３’末端が捕捉される場合、ヘリカーゼは電圧によって印加された場とは反対の方向に働き、通したＤＮＡをナノポアの外側、ｃｉｓチャンバー内に引く。しかし、ＤＮＡがナノポア中で５’が下で捕捉される場合、ヘリカーゼは電圧によって印加される場の方向に働き、通したＤＮＡをナノポア中、ｔｒａｎｓチャンバー中に押す。ヘリカーゼが移動を促進するために必要な構成成分と共には提供されない場合、それはＤＮＡに結合でき、印加された場によってポア内に引かれた場合に、ＤＮＡの移動を遅くするブレーキとして作用できる。不活性様式では、ＤＮＡが３’または５’のどちらが下で捕捉されるかは問題ではなく、ブレーキとして作用する酵素と共にＤＮＡをナノポア中、トランス側に向けて引くのは印加された場である。不活性様式では、ヘリカーゼによるＤＮＡの移動制御は、ラチェッティング、スライディングおよびブレーキングを含む多数の方法で記載され得る。
【００６９】
ポリヌクレオチド、特に、５００ヌクレオチド以上のものを配列決定することにおいて生じる問題は、ポリヌクレオチドの移行を制御する分子モーターがポリヌクレオチドから離される場合があることである。これは、ポリヌクレオチドが印加された場の方向に急速かつ制御されない様式でポアを通って引かれるようにする。本発明の修飾ヘリカーゼは、配列決定されているポリヌクレオチドから解離または離されにくい。修飾ヘリカーゼは、ナノポアを通るポリヌクレオチドの移動をそれらが制御することからポリヌクレオチドの読み取り長さの増大を提供できる。本発明の修飾ヘリカーゼの制御下でポリヌクレオチド全体をナノポアを通して移動させる能力は、その配列などのポリヌクレオチドの特性を改善された確度でおよび公知の方法を超える速度で推定できるようにする。鎖長が長くなるにつれてこれはより重要になり、分子モーターは前進性の改善を必要とする。発明の修飾ヘリカーゼは、５００ヌクレオチド以上、例えば１０００ヌクレオチド、５０００、１００００、２００００、５００００、１０００００またはそれ以上の標的ポリヌクレオチドの移動を制御することにおいて特に有効である。
【００７０】
本発明の修飾ヘリカーゼは、等温ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のための有用な手段でもある。そのような方法においては、２本鎖ＤＮＡの鎖は典型的には最初に本発明のヘリカーゼによって分離され、１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）−結合タンパク質によってコートされる。第二ステップでは、２個の配列特異的プライマーが、典型的にはＤＮＡ鋳型の各辺縁にハイブリダイズする。次いでＤＮＡポリメラーゼは鋳型にアニールしたプライマーを、２本鎖ＤＮＡを産生するように伸長するために使用でき、２個の新たに合成されたＤＮＡ産生物は、次いで本発明のヘリカーゼによって基質として使用され、次の回の反応に入ることができる。したがって鎖反応が同時に進行し、選択された標的配列の指数関数的増幅が生じる。
【００７１】
修飾ヘリカーゼは、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有する。ポリヌクレオチドの移動を制御するヘリカーゼの能力は、当技術分野において公知の任意の方法を使用してアッセイできる。例えばヘリカーゼは、ポリヌクレオチドに接触されてよく、ポリヌクレオチドの位置は、標準的方法を使用して決定され得る。ポリヌクレオチドの移動を制御する修飾ヘリカーゼの能力は、下に記載のものなどのナノポア系において、具体的には実施例において記載のとおり典型的にはアッセイされる。
【００７２】
本発明の修飾ヘリカーゼは、単離、実質的に単離、精製または実質的に精製されていてよい。ヘリカーゼは、それが脂質、ポリヌクレオチド、ポア単量体または他のタンパク質などの任意の他の構成成分を完全に含まない場合に単離または精製されている。ヘリカーゼは、その目的の使用を妨害しない担体または希釈剤と混合されている場合に実質的に単離されている。例えばヘリカーゼは、１０％未満、５％未満、２％未満または１％未満の脂質、ポリヌクレオチド、ポア単量体または他のタンパク質などの他の構成成分を含む形態で存在する場合に実質的に単離または実質的に精製されている。
【００７３】
任意のＤｄａヘリカーゼは、本発明により修飾されてよい。好ましいＤｄａヘリカーゼは下に考察される。
【００７４】
Ｄｄａヘリカーゼは、次の５個のドメイン：１Ａ（ＲｅｃＡ様モーター）ドメイン、２Ａ（ＲｅｃＡ様モーター）ドメイン、タワードメイン、ピンドメインおよびフックドメインを典型的には含む（Xiaoping He et al., 2012, Structure; 20: 1189-1200）。ドメインは、タンパク質モデリング、結晶状態でのタンパク質のＸ−線回折測定（Rupp B (2009)を使用して同定され得る。 Biomolecular Crystallography: Principles、Practice and Application to Structural Biology. New York: Garland Science.）、溶液におけるタンパク質の核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法（Mark Rance; Cavanagh、John; Wayne J. Fairbrother; Arthur W. Hunt III; Skelton、NNicholas J. (2007). Protein NMR spectroscopy: principles and practice (2nd ed.). Boston: Academic Press.）または凍結水和状態におけるタンパク質のクリオ電子顕微鏡（van Heel M, Gowen B, Matadeen R, Orlova EV, Finn R, Pape T, Cohen D, Stark H, Schmidt R, Schatz M, Patwardhan A (2000). ”Single-particle electron cryo-microscopy: towards atomic resolution.”. Q Rev Biophys. 33: 307-69）を使用して同定できる。上に述べた方法によって決定されたタンパク質の構造情報は、タンパク質バンク（ＰＤＢ）データベースから公開で入手可能である。
【００７５】
タンパク質モデリングは、相同体においてタンパク質構造がタンパク質配列よりも保存されているという事実を活用する。それにより、タンパク質の原子分解モデルを作成することは、クエリー配列の構造に類似していると考えられる１つまたは複数のタンパク質構造の同定に依存する。タンパク質モデルを構築するための「鋳型」として使用するための好適なタンパク質構造が存在するかどうかを評価するために、タンパク質データバンク（ＰＤＢ）データベースの検索を実施する。タンパク質構造は、クエリー配列と合理的なレベルの配列同一性を共有している場合に好適な鋳型であると考えられる。そのような鋳型が存在する場合、次いで鋳型配列はクエリー配列と「配列比較」される、すなわちクエリー配列中の残基が鋳型残基に位置付けられる。配列の配列比較および鋳型構造は、次いでクエリー配列の構造モデルを作成するために使用される。そのためタンパク質モデルの品質は、配列の配列比較および鋳型構造の品質に依存する。
【００７６】
シミュレーションは、どのアミノ酸が酵素結合部位内のｓｓＤＮＡ中のヌクレオチドと接触するかを評価するために実施されてよい。シミュレーションは、ＧＲＯＭＡＣＳパッケージバージョン４．０．５をＡＭＢＥＲ−９９ＳＢ力場およびＴＩＰ３Ｐ水モデルと共に使用して実施され得る。好ましい方法は実施例において開示される。
【００７７】
本発明の修飾
本発明のヘリカーゼは、１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）中の１つまたは複数のヌクレオチドと相互作用する少なくとも１つのアミノ酸が置換されているものである。任意の数のアミノ酸、１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上または６個以上のアミノ酸などが置換されてよい。ヘリカーゼがｓｓＤＮＡに沿って移動するとき、またはｓｓＤＮＡがヘリカーゼを通って移動するときに、アミノ酸は異なるヌクレオチドと逐次的に相互作用できる。置換される各アミノ酸は、任意の数のヌクレオチドと同時に、１個、２個、３個以上などのヌクレオチドと同時に相互作用できる。１本鎖ＤＮＡ中の１つまたは複数のヌクレオチドと相互作用するアミノ酸は、上に考察のタンパク質モデリングを使用して同定され得る。
【００７８】
塩基および／または糖相互作用
本発明のヘリカーゼは、好ましくは、１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）中の１つまたは複数のヌクレオチドの糖および／または塩基と相互作用する少なくとも１つのアミノ酸がより大きな側鎖（Ｒ基）を含むアミノ酸で置換されているものである。任意の数のアミノ酸、１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上または６個以上のアミノ酸などが置換されてよい。各アミノ酸は、塩基、糖または塩基および糖と相互作用してよい。１本鎖ＤＮＡ中の１つまたは複数のヌクレオチドの糖および／または塩基と相互作用するアミノ酸は、上に考察のタンパク質モデリングを使用して同定され得る。
【００７９】
下の表１は、本発明により修飾され得る好ましいＤｄａヘリカーゼを要約する。
【００８０】
【表１−１】
2017535256.tif 000002
【００８１】
【表１−２】
2017535256.tif 000003
【００８２】
【表１−３】
2017535256.tif 000004
【００８３】
本発明のヘリカーゼは、配列番号８の変種であって、ｓｓＤＮＡ中の１つまたは複数のヌクレオチドの糖および／または塩基と相互作用する少なくとも１つのアミノ酸がＨ８２、Ｎ８８、Ｐ８９、Ｆ９８、Ｄ１２１、Ｖ１５０、Ｐ１５２、Ｆ２４０、Ｆ２７６、Ｓ２８７、Ｈ３９６およびＹ４１５の少なくとも１つである、変種を好ましくは含む。これらの番号は、配列番号８中の関連する位置に対応し、配列番号８と比較して１つまたは複数のアミノ酸が挿入または欠失されている変種の場合では変更される必要がある場合がある。当業者は、上に考察した変種中の対応する位置を決定できる。本発明のヘリカーゼは、配列番号８の変種であって、ｓｓＤＮＡ中の１つまたは複数のヌクレオチドの糖および／または塩基と相互作用する少なくとも１つのアミノ酸がＦ９８／Ｈ８２、Ｆ９８／Ｎ８８、Ｆ９８／Ｐ８９、Ｆ９８／Ｄ１２１、Ｆ９８／Ｖ１５０、Ｆ９８／Ｐ１５２、Ｆ９８／Ｆ２４０、Ｆ９８／Ｆ２７６、Ｆ９８／Ｓ２８７またはＦ９８／Ｈ３９６などの、Ｆ９８ならびにＨ８２、Ｎ８８、Ｐ８９、Ｄ１２１、Ｖ１５０、Ｐ１５２、Ｆ２４０、Ｆ２７６、Ｓ２８７、Ｈ３９６およびＹ４１５の１つまたは複数である、変種を好ましくは含む。
【００８４】
本発明のヘリカーゼは、好ましくは配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３の変種であって、ｓｓＤＮＡ中の１つまたは複数のヌクレオチドの糖および／または塩基と相互作用する少なくとも１つのアミノ酸が配列番号８中のＨ８２、Ｎ８８、Ｐ８９、Ｆ９８、Ｄ１２１、Ｖ１５０、Ｐ１５２、Ｆ２４０、Ｆ２７６、Ｓ２８７、Ｈ３９６およびＹ４１５に対応するアミノ酸の少なくとも１つである、変種である。本発明のヘリカーゼは、配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３の変種であって、ｓｓＤＮＡ中の１つまたは複数のヌクレオチドの糖および／または塩基と相互作用する少なくとも１つのアミノ酸が、Ｆ９８／Ｈ８２、Ｆ９８／Ｎ８８、Ｆ９８／Ｐ８９、Ｆ９８／Ｄ１２１、Ｆ９８／Ｖ１５０、Ｆ９８／Ｐ１５２、Ｆ９８／Ｆ２４０、Ｆ９８／Ｆ２７６、Ｆ９８／Ｓ２８７またはＦ９８／Ｈ３９６に対応するアミノ酸などの配列番号８中のＦ９８に対応するアミノ酸、配列番号８中のＨ８２、Ｎ８８、Ｐ８９、Ｄ１２１、Ｖ１５０、Ｐ１５２、Ｆ２４０、Ｆ２７６、Ｓ２８７、Ｈ３９６およびＹ４１５に対応するアミノ酸の１つまたは複数である、変種を好ましくは含む。
【００８５】
表２は、配列番号８中のＨ８２、Ｎ８８、Ｐ８９、Ｆ９８、Ｄ１２１、Ｖ１５０、Ｐ１５２、Ｆ２４０、Ｆ２７６、Ｓ２８７、Ｈ３９６およびＹ４１５に対応する配列番号９から２３中のアミノ酸を示す。
【００８６】
【表２】
2017535256.tif 000005
【００８７】
ｓｓＤＮＡ中の１つまたは複数のヌクレオチドの糖および／または塩基と相互作用する少なくとも１つのアミノ酸は、好ましくはｓｓＤＮＡ中のヌクレオチド間に介在する少なくとも１つのアミノ酸である。ｓｓＤＮＡ中のヌクレオチド間に介在するアミノ酸は、上に考察した通りモデル化されてよい。ｓｓＤＮＡ中のヌクレオチド間に介在する少なくとも１つのアミノ酸は、好ましくはＰ８９、Ｆ９８、Ｖ１５０、Ｐ８９／Ｆ９８、Ｐ８９／Ｖ１５０、Ｆ９８／Ｖ１５０またはＰ８９／Ｆ９８／Ｖ１５０などの配列番号８中のＰ８９、Ｆ９８およびＶ１５０の少なくとも１つである。
【００８８】
配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３中のｓｓＤＮＡ中のヌクレオチド間に介在する少なくとも１つのアミノ酸は、Ｐ８９、Ｆ９８、Ｖ１５０、Ｐ８９／Ｆ９８、Ｐ８９／Ｖ１５０、Ｆ９８／Ｖ１５０またはＰ８９／Ｆ９８／Ｖ１５０などの好ましくは配列番号８中のＰ８９、Ｆ９８およびＶ１５０に対応する、アミノ酸の少なくとも１つである。対応するアミノ酸は上の表２に示される。
【００８９】
より大きなＲ基
より大きな側鎖（Ｒ基）は、好ましくは（ａ）増加した数の炭素原子を含有し、（ｂ）増加した長さを有し、（ｃ）増加した分子体積を有し、および／または（ｄ）増加したファンデルワールス体積を有する。より大きな側鎖（Ｒ基）は、好ましくは（ａ）；（ｂ）；（ｃ）；（ｄ）；（ａ）および（ｂ）；（ａ）および（ｃ）；（ａ）および（ｄ）；（ｂ）および（ｃ）；（ｂ）および（ｄ）；（ｃ）および（ｄ）；（ａ）、（ｂ）および（ｃ）；（ａ）、（ｂ）および（ｄ）；（ａ）、（ｃ）および（ｄ）；（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）；または（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）。（ａ）から（ｄ）のそれぞれは、当技術分野における標準的方法を使用して測定され得る。
【００９０】
より大きな側鎖（Ｒ基）は、好ましくは少なくとも１つのアミノ酸とｓｓＤＮＡ中の１つまたは複数のヌクレオチドとの間の（ｉ）静電気的相互作用、（ｉｉ）水素結合および／または（ｉｉｉ）カチオンｐｉ（カチオンπ）相互作用を増加させ、例えば、（ｉ）；（ｉｉ）；（ｉｉｉ）；（ｉ）および（ｉｉ）；（ｉ）および（ｉｉｉ）；（ｉｉ）および（ｉｉｉ）；ならびに（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を増加させる。当業者は、Ｒ基がこれらの相互作用のいずれを増加させるかを決定できる。例えば（ｉ）ではアルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）およびリシン（Ｋ）などの正に荷電したアミノ酸は、静電気的相互作用を増加させるＲ基を有する。例えば（ｉｉ）では、アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）、スレオニン（Ｔ）およびヒスチジン（Ｈ）などのアミノ酸は水素結合を増加させるＲ基を有する。例えば（ｉｉｉ）では、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）またはヒスチジン（Ｈ）などの芳香族アミノ酸は、カチオンｐｉ（カチオン−π）相互作用を増加させるＲ基を有する。下の具体的な置換は、これらの変化を反映する（ｉ）から（ｉｉｉ）と標識される。他の可能性がある置換は（ｉｖ）と標識される。これらの（ｉｖ）置換は、典型的には側鎖（Ｒ基）の長さを増加させる。
【００９１】
より大きな側鎖（Ｒ）を含むアミノ酸は、非天然アミノ酸であってよい。非天然アミノ酸は、下に考察のいずれであってもよい。
【００９２】
より大きな側鎖（Ｒ基）を含むアミノ酸は、好ましくはアラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、グリシン（Ｇ）、セレノシステイン（Ｕ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）ではない。
【００９３】
ヒスチジン（Ｈ）は、好ましくは（ｉ）アルギニン（Ｒ）もしくはリシン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）もしくはアスパラギン（Ｎ）または（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）もしくはトリプトファン（Ｗ）で置換されている。ヒスチジン（Ｈ）は、より好ましくは（ａ）Ｎ、ＱもしくはＷまたは（ｂ）Ｙ、Ｆ、ＱもしくはＫで置換されている。
【００９４】
アスパラギン（Ｎ）は、好ましくは（ｉ）アルギニン（Ｒ）もしくはリシン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）もしくはヒスチジン（Ｈ）または（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）もしくはトリプトファン（Ｗ）で置換されている。アスパラギン（Ｎ）は、より好ましくはＲ、Ｈ、ＷまたはＹで置換されている。
【００９５】
プロリン（Ｐ）は、好ましくは（ｉ）アルギニン（Ｒ）もしくはリシン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）、スレオニン（Ｔ）もしくはヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉｉ）チロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）もしくはトリプトファン（Ｗ）または（ｉｖ）ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）もしくはイソロイシン（Ｉ）で置換されている。プロリン（Ｐ）は、より好ましくは（ｉ）アルギニン（Ｒ）もしくはリシン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）、スレオニン（Ｔ）もしくはヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）もしくはトリプトファン（Ｗ）または（ｉｖ）ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）もしくはイソロイシン（Ｉ）で置換されている。プロリン（Ｐ）は、より好ましくは（ａ）Ｆ、（ｂ）Ｌ、Ｖ、Ｉ、ＴもしくはＦまたは（ｃ）Ｗ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｉ、ＬもしくはＶで置換されている。
【００９６】
バリン（Ｖ）は、好ましくは（ｉ）アルギニン（Ｒ）もしくはリシン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）もしくはヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）もしくはトリプトファン（Ｗ）または（ｉｖ）イソロイシン（Ｉ）もしくはロイシン（Ｌ）で置換されている。バリン（Ｖ）は、より好ましくは（ｉ）アルギニン（Ｒ）もしくはリシン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）もしくはヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉｉ）チロシン（Ｙ）もしくはトリプトファン（Ｗ）または（ｉｖ）イソロイシン（Ｉ）もしくはロイシン（Ｌ）で置換されている。バリン（Ｖ）は、より好ましくはＩもしくはＨまたはＩ、Ｌ、Ｎ、ＷもしくはＨで置換されている。
【００９７】
フェニルアラニン（Ｆ）は、好ましくは（ｉ）アルギニン（Ｒ）もしくはリシン（Ｋ）、（ｉｉ）ヒスチジン（Ｈ）または（ｉｉｉ）チロシン（Ｙ）もしくはトリプトファン（Ｗ）で置換されている。フェニルアラニン（Ｆ）は、より好ましくは（ａ）Ｗ、（ｂ）Ｗ、ＹもしくはＨ、（ｃ）Ｗ、ＲもしくはＫまたは（ｄ）Ｋ、Ｈ、ＷもしくはＲで置換されている。
【００９８】
グルタミン（Ｑ）は、好ましくは（ｉ）アルギニン（Ｒ）もしくはリシン（Ｋ）または（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）もしくはトリプトファン（Ｗ）で置換されている。
【００９９】
アラニン（Ａ）は、好ましくは（ｉ）アルギニン（Ｒ）もしくはリシン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）もしくはヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）もしくはトリプトファン（Ｗ）または（ｉｖ）イソロイシン（Ｉ）もしくはロイシン（Ｌ）で置換されている。
【０１００】
セリン（Ｓ）は、好ましくは（ｉ）アルギニン（Ｒ）もしくはリシン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）もしくはヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）もしくはトリプトファン（Ｗ）または（ｉｖ）イソロイシン（Ｉ）もしくはロイシン（Ｌ）で置換されている。セリン（Ｓ）は、好ましくはＫ、Ｒ、ＷまたはＦで置換されている。
【０１０１】
リシン（Ｋ）は、好ましくは（ｉ）アルギニン（Ｒ）または（ｉｉｉ）チロシン（Ｙ）もしくはトリプトファン（Ｗ）で置換されている。
【０１０２】
アルギニン（Ｒ）は、好ましくは（ｉｉｉ）チロシン（Ｙ）またはトリプトファン（Ｗ）で置換されている。
【０１０３】
メチオニン（Ｍ）は、好ましくは（ｉ）アルギニン（Ｒ）もしくはリシン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）もしくはヒスチジン（Ｈ）または（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）もしくはトリプトファン（Ｗ）で置換されている。
【０１０４】
ロイシン（Ｌ）は、好ましくは（ｉ）アルギニン（Ｒ）もしくはリシン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）もしくはアスパラギン（Ｎ）または（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）もしくはトリプトファン（Ｗ）で置換されている。
【０１０５】
アスパラギン酸（Ｄ）は、好ましくは（ｉ）アルギニン（Ｒ）もしくはリシン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）もしくはヒスチジン（Ｈ）または（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）もしくはトリプトファン（Ｗ）で置換されている。アスパラギン酸（Ｄ）は、より好ましくはＨ、ＹまたはＫで置換されている。
【０１０６】
グルタミン酸（Ｅ）は、好ましくは（ｉ）アルギニン（Ｒ）もしくはリシン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）もしくはヒスチジン（Ｈ）または（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）もしくはトリプトファン（Ｗ）で置換されている。
【０１０７】
イソロイシン（Ｉ）は、好ましくは（ｉ）アルギニン（Ｒ）もしくはリシン（Ｋ）、（ｉｉ）グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）もしくはヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）もしくはトリプトファン（Ｗ）または（ｉｖ）ロイシン（Ｌ）で置換されている。
【０１０８】
チロシン（Ｙ）は、好ましくは（ｉ）アルギニン（Ｒ）もしくはリシン（Ｋ）または（ｉｉｉ）トリプトファン（Ｗ）で置換されている。チロシン（Ｙ）は、より好ましくはＷまたはＲで置換されている。
【０１０９】
ヘリカーゼは、配列番号８の変種をより好ましくは含み、（ａ）Ｐ８９Ｆ、（ｂ）Ｆ９８Ｗ、（ｃ）Ｖ１５０Ｉ、（ｄ）Ｖ１５０Ｈ、（ｅ）Ｐ８９ＦおよびＦ９８Ｗ、（ｆ）Ｐ８９ＦおよびＶ１５０Ｉ、（ｇ）Ｐ８９ＦおよびＶ１５０Ｈ、（ｈ）Ｆ９８ＷおよびＶ１５０Ｉ、（ｉ）Ｆ９８ＷおよびＶ１５０Ｈ、（ｊ）Ｐ８９Ｆ、Ｆ９８ＷおよびＶ１５０Ｉ、または（ｋ）Ｐ８９Ｆ、Ｆ９８ＷおよびＶ１５０Ｈを含む。
【０１１０】
ヘリカーゼは：
−Ｈ８２Ｎ；
−Ｈ８２Ｑ；
−Ｈ８２Ｗ；
−Ｎ８８Ｒ；
−Ｎ８８Ｈ；
−Ｎ８８Ｗ；
−Ｎ８８Ｙ；
−Ｐ８９Ｌ；
−Ｐ８９Ｖ；
−Ｐ８９Ｉ；
−Ｐ８９Ｅ；
−Ｐ８９Ｔ；
−Ｐ８９Ｆ；
−Ｄ１２１Ｈ；
−Ｄ１２１Ｙ；
−Ｄ１２１Ｋ；
−Ｖ１５０Ｉ；
−Ｖ１５０Ｌ；
−Ｖ１５０Ｎ；
−Ｖ１５０Ｗ；
−Ｖ１５０Ｈ；
−Ｐ１５２Ｗ；
−Ｐ１５２Ｆ；
−Ｐ１５２Ｙ；
−Ｐ１５２Ｈ；
−Ｐ１５２Ｉ；
−Ｐ１５２Ｌ；
−Ｐ１５２Ｖ；
−Ｆ２４０Ｗ；
−Ｆ２４０Ｙ；
−Ｆ２４０Ｈ；
−Ｆ２７６Ｗ；
−Ｆ２７６Ｒ；
−Ｆ２７６Ｋ；
−Ｆ２７６Ｈ；
−Ｓ２８７Ｋ；
−Ｓ２８７Ｒ；
−Ｓ２８７Ｗ；
−Ｓ２８７Ｆ；
−Ｈ３９６Ｙ；
−Ｈ３９６Ｆ；
−Ｈ３９６Ｑ；
−Ｈ３９６Ｋ；
−Ｙ４１５Ｗ；
−Ｙ４１５Ｒ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｈ８２Ｎ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｈ８２Ｑ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｈ８２Ｗ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｎ８８Ｒ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｎ８８Ｈ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｎ８８Ｗ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｎ８８Ｙ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｐ８９Ｌ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｐ８９Ｖ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｐ８９Ｉ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｐ８９Ｔ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｐ８９Ｆ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｄ１２１Ｈ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｄ１２１Ｙ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｄ１２１Ｋ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｖ１５０Ｉ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｖ１５０Ｌ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｖ１５０Ｎ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｖ１５０Ｗ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｖ１５０Ｈ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｐ１５２Ｗ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｐ１５２Ｆ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｐ１５２Ｙ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｐ１５２Ｈ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｐ１５２Ｉ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｐ１５２Ｌ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｐ１５２Ｖ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｆ２４０Ｗ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｆ２４０Ｙ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｆ２４０Ｈ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｆ２７６Ｗ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｆ２７６Ｒ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｆ２７６Ｋ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｆ２７６Ｈ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｓ２８７Ｋ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｓ２８７Ｒ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｓ２８７Ｗ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｓ２８７Ｆ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｈ３９６Ｙ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｈ３９６Ｆ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｈ３９６Ｑ；
−Ｆ９８Ｗ／Ｙ４１５Ｗ；または
−Ｆ９８Ｗ／Ｙ４１５Ｒ
を含む配列番号８の変種をより好ましくは含む。
【０１１１】
リン酸相互作用
本発明のヘリカーゼは好ましくは、ｓｓＤＮＡ中の１つまたは複数のヌクレオチド中の１つまたは複数のリン酸基と相互作用する少なくとも１つのアミノ酸が置換されているものである。１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上または６個以上のアミノ酸などの任意の数のアミノ酸が置換されてよい。ｓｓＤＮＡ中のヌクレオチドは、それぞれ３個のリン酸基を含む。置換される各アミノは、１個、２個または３個のリン酸基と同時など任意の数のリン酸基と同時に相互作用できる。１つまたは複数のリン酸基と相互作用するアミノ酸は上に考察したタンパク質モデリングを使用して同定され得る。
【０１１２】
置換は、少なくとも１つのアミノ酸とｓｓＤＮＡ中の１つまたは複数のリン酸基との間の（ｉ）静電気的相互作用、（ｉｉ）水素結合および／または（ｉｉｉ）カチオンｐｉ（カチオンπ）相互作用を好ましくは増加させる。（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を増加させる好ましい置換は、標識（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を使用して下に考察される。
【０１１３】
置換は、位置の正味の正電荷を好ましくは増加させる。任意の位置の正味の電荷は、当技術分野において公知の方法を使用して測定され得る。例えば等電点は、アミノ酸の正味の電荷を明らかにするために使用され得る。正味の電荷は、典型的には約７．５で測定される。置換は、好ましくは負に荷電したアミノ酸の正に荷電した、無電荷、非極性または芳香族アミノ酸での置換である。負に荷電したアミノ酸は、正味の負電荷を有するアミノ酸である。負に荷電したアミノ酸は、これだけに限らないがアスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）を含む。正に荷電したアミノ酸は、正味の正電荷を有するアミノ酸である。正に荷電したアミノ酸は、天然に存在しても、または天然に存在していなくてもよい。正に荷電したアミノ酸は、合成または修飾されてよい。例えば正味の正電荷を有する修飾アミノ酸は、本発明における使用のために具体的に設計されてよい。アミノ酸への多数の異なる種類の修飾が当技術分野において周知である。好ましい天然に存在する正に荷電したアミノ酸は、これだけに限らないがヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ）を含む。
【０１１４】
無電荷アミノ酸、非極性アミノ酸または芳香族アミノ酸は、天然に存在しても、天然に存在していなくてもよい。それは合成または修飾されてよい。無電荷アミノ酸は正味の電荷を有さない。好適な無電荷アミノ酸は、これだけに限らないがシステイン（Ｃ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）を含む。非極性アミノ酸は非極性側鎖を有する。好適な非極性アミノ酸は、これだけに限らないがグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、プロリン（Ｐ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）およびバリン（Ｖ）を含む。芳香族アミノ酸は芳香族側鎖を有する。好適な芳香族アミノ酸は、これだけに限らないがヒスチジン（Ｈ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）およびチロシン（Ｙ）を含む。
【０１１５】
ヘリカーゼは、配列番号８の変種であって、ｓｓＤＮＡ中の１つまたは複数のヌクレオチド中の１つまたは複数のリン酸と相互作用する少なくとも１つのアミノ酸がＨ６４、Ｔ８０、Ｓ８３、Ｎ２４２、Ｋ２４３、Ｎ２９３、Ｔ３９４およびＫ３９７の少なくとも１つである、変種を好ましくは含む。これらの番号は、配列番号８中の関連する位置に対応し、１つまたは複数のアミノ酸が配列番号８と比較して挿入または欠失されている変種の場合では変更される必要がある場合がある。当業者は、上に考察した変種中の対応する位置を決定できる。
【０１１６】
ヘリカーゼは、配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３の変種であって、ｓｓＤＮＡ中の１つまたは複数のヌクレオチド中の１つまたは複数のリン酸と相互作用する少なくとも１つのアミノ酸が配列番号８中のＨ６４、Ｔ８０、Ｓ８３、Ｎ２４２、Ｋ２４３、Ｎ２９３、Ｔ３９４およびＫ３９７に対応するアミノ酸の少なくとも１つである、変種を好ましくは含む。
【０１１７】
表３は、配列番号８中のＨ６４、Ｔ８０、Ｓ８３、Ｎ２４２、Ｋ２４３、Ｎ２９３、Ｔ３９４およびＫ３９７に対応する配列番号９から２３中のアミノ酸を示す。
【０１１８】
【表３】
2017535256.tif 000006
【０１１９】
ヒスチジン（Ｈ）は、好ましくは（ｉ）アルギニン（Ｒ）もしくはリシン（Ｋ）、（ｉｉ）アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）もしくはスレオニン（Ｔ）、（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）もしくはチロシン（Ｙ）で置換されている。ヒスチジン（Ｈ）は、好ましくは（ａ）Ｎ、Ｑ、ＫもしくはＦまたは（ｂ）Ｎ、ＱもしくはＷで置換されている。
【０１２０】
スレオニン（Ｔ）は、好ましくは（ｉ）アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）もしくはリシン（Ｋ）、（ｉｉ）アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）もしくはヒスチジン（Ｈ）または（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）もしくはヒスチジン（Ｈ）で置換されている。スレオニン（Ｔ）は、より好ましくは（ａ）Ｋ、ＱもしくはＮまたは（ｂ）Ｋ、ＨもしくはＮで置換されている。
【０１２１】
セリン（ｓ）は、好ましくは（ｉ）アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）もしくはリシン（Ｋ）、（ｉｉ）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、スレオニン（Ｔ）もしくはヒスチジン（Ｈ）または（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）もしくはヒスチジン（Ｈ）で置換されている。セリン（Ｓ）は、より好ましくはＨ、Ｎ、Ｋ、Ｔ、ＲまたはＱで置換されている。
【０１２２】
アスパラギン（Ｎ）は、好ましくは（ｉ）アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）もしくはリシン（Ｋ）、（ｉｉ）セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）、スレオニン（Ｔ）もしくはヒスチジン（Ｈ）または（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）もしくはヒスチジン（Ｈ）で置換されている。アスパラギン（Ｎ）は、より好ましくは（ａ）ＨもしくはＱまたは（ｂ）Ｑ、ＫもしくはＨで置換されている。
【０１２３】
リシン（Ｋ）は、好ましくは（ｉ）アルギニン（Ｒ）もしくはヒスチジン（Ｈ）、（ｉｉ）アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）、スレオニン（Ｔ）もしくはヒスチジン（Ｈ）または（ｉｉｉ）フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）もしくはヒスチジン（Ｈ）で置換されている。リシン（Ｋ）は、より好ましくは（ａ）ＱもしくはＨまたは（ｂ）Ｒ、ＨもしくはＹで置換されている。
【０１２４】
ヘリカーゼは、より好ましくは配列番号８の変種を含み、（ａ）Ｈ６４Ｎ、Ｈ６４Ｑ、Ｈ６４ＫもしくはＨ６４Ｆ、（ｂ）Ｔ８０Ｋ、Ｔ８０ＱもしくはＴ８０Ｎ、（ｃ）Ｓ８３Ｈ、Ｓ８３Ｎ、Ｓ８３Ｋ、Ｓ８３Ｔ、Ｓ８３ＲもしくはＳ８３Ｑ（ｄ）Ｎ２４２ＨもしくはＮ２４２Ｑ、（ｅ）Ｋ２４３ＱもしくはＫ２４３Ｈ、（ｆ）Ｎ２９３Ｑ、Ｎ２９３ＫもしくはＮ２９３Ｈ、（ｇ）Ｔ３９４Ｋ、Ｔ３９４ＨもしくはＴ３９４Ｎまたは（ｈ）Ｋ３９７Ｒ、Ｋ３９７ＨもしくはＫ３９７Ｙの全てなどの１つまたは複数を含む。
【０１２５】
組合せ
ヘリカーゼは（ａ）ｓｓＤＮＡ中の１つまたは複数のヌクレオチドの糖および／または塩基と相互作用する少なくとも１つのアミノ酸がより大きな側鎖（Ｒ基）を含むアミノ酸で置換されており、（ｂ）ｓｓＤＮＡ中の１つまたは複数のヌクレオチド中の１つまたは複数のリン酸基と相互作用する少なくとも１つのアミノ酸が置換されているものであってよい。ヘリカーゼは：
（ａ）上に定義のＦ９８に置換ならびにＨ６４、Ｔ８０、Ｓ８３、Ｎ２４２、Ｋ２４３、Ｎ２９３、Ｔ３９４およびＫ３９７の１つもしくは複数に置換を含む配列番号８の変種；または
（ｂ）配列番号８中のＦ９８に対応するアミノ酸に置換ならびにＨ６４、Ｔ８０、Ｓ８３、Ｎ２４２、Ｋ２４３、Ｎ２９３、Ｔ３９４およびＫ３９７に対応するアミノ酸の１つまたは複数に置換を含む配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３の変種
を好ましくは含む。
【０１２６】
ヘリカーゼは、好ましくは：
−  Ｆ９８Ｗ／Ｈ６４Ｎ、Ｆ９８Ｗ／Ｈ６４Ｑ、Ｆ９８Ｗ／Ｈ６４ＫもしくはＦ９８Ｗ／Ｈ６４Ｆなどの、Ｆ９８／Ｈ６４における置換；
−  Ｆ９８Ｗ／Ｔ８０Ｋ、Ｆ９８Ｗ／Ｔ８０Ｑ、Ｆ９８Ｗ／Ｔ８０Ｎなどの、Ｆ９８／Ｔ８０における置換；
−  Ｆ９８Ｗ／Ｈ８２Ｎ、Ｆ９８Ｗ／Ｈ８２ＱもしくはＦ９８Ｗ／Ｈ８２Ｗなどの、Ｆ９８／Ｈ８２における置換；
−  Ｆ９８Ｗ／Ｓ８３Ｈ、Ｆ９８Ｗ／Ｓ８３Ｎ、Ｆ９８Ｗ／Ｓ８３Ｋ、Ｆ９８Ｗ／Ｓ８３Ｔ、Ｆ９８Ｗ／Ｓ８３ＲもしくはＦ９８Ｗ／Ｓ８３Ｑなどの、Ｆ９８／Ｓ８３における置換；
−  Ｆ９８Ｗ／Ｎ２４２Ｈ、Ｆ９８Ｗ／Ｎ２４２Ｑ、Ｆ９８Ｗ／Ｋ２４３ＱもしくはＦ９８Ｗ／Ｋ２４３Ｈなどの、Ｆ９８／Ｎ２４２における置換；
−  Ｆ９８Ｗ／Ｎ２９３Ｑ、Ｆ９８Ｗ／Ｎ２９３Ｋ、Ｆ９８Ｗ／Ｎ２９３Ｈ、Ｆ９８Ｗ／Ｔ３９４Ｋ、Ｆ９８Ｗ／Ｔ３９４Ｈ、Ｆ９８Ｗ／Ｔ３９４Ｎ、Ｆ９８Ｗ／Ｈ３９６Ｙ、Ｆ９８Ｗ／Ｈ３９６Ｆ、Ｆ９８Ｗ／Ｈ３９６ＱもしくはＦ９８Ｗ／Ｈ３９６Ｋなどの、Ｆ９８／Ｎ２９３における置換；または
−  Ｆ９８Ｗ／Ｋ３９７Ｒ、Ｆ９８Ｗ／Ｋ３９７ＨもしくはＦ９８Ｗ／Ｋ３９７Ｙなどの、Ｆ９８／Ｋ３９７における置換
を含む配列番号８の変種である。
【０１２７】
配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３における好ましい組合せは、上に列挙した配列番号８中の組合せに対応するアミノ酸の組合せを含む。
【０１２８】
ポア相互作用
さらに本発明のヘリカーゼは、膜貫通ポアと相互作用するヘリカーゼの部分が１つまたは複数の修飾、好ましくは１つまたは複数の置換を含むものである。膜貫通ポアと相互作用するヘリカーゼの部分は、典型的には、例えば下により詳細に考察される通りヘリカーゼがポアを通るポリヌクレオチドの移動を制御するために使用される場合に、膜貫通ポアと相互作用するヘリカーゼの部分である。部分は、典型的には、例えば下により詳細に考察される通りヘリカーゼがポアを通るポリヌクレオチドの移動を制御するために使用される場合、ポアと相互作用するまたは接触するアミノ酸を含む。部分は、典型的には、ヘリカーゼが印加された電位下でポアを通って移動するポリヌクレオチドに結合されるまたは付着される場合に、ポアと相互作用するまたは接触するアミノ酸を含む。
【０１２９】
配列番号８において、膜貫通ポアと相互作用する部分は、典型的には、位置１、２、３、４、５、６、５１、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８５、１８９、１９１、１９３、１９４、１９５、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１６、２１９、２２０、２２１、２２３、２２４、２２６、２２７、２２８、２２９、２４７、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２９８、３００、３０４、３０８、３１８、３１９、３２１、３３７、３４７、３５０、３５１、４０５、４１５、４２２、４３４、４３７、４３８のアミノ酸を含む。これらの番号は、配列番号８中の関連する位置に対応し、１つまたは複数のアミノ酸が配列番号８と比較して挿入または欠失されている変種の場合では変更される必要がある場合がある。当業者は、上に考察した変種中の対応する位置を決定できる。膜貫通ポアと相互作用する部分は
（ａ）配列番号８中の位置１、２、４、５１、１７７、１７８、１７９、１８０、１８５、１９３、１９５、１９７、１９８、１９９、２００、２０２、２０３、２０４、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１６、２２１、２２３、２２４、２２６、２２７、２２８、２２９、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２６０、３０４、３１８、３２１、３４７、３５０、３５１、４０５、４１５、４２２、４３４、４３７および４３８；または
（ｂ）配列番号８中の位置１、２、１７８、１７９、１８０、１８５、１９５、１９７、１９８、１９９、２００、２０２、２０３、２０７、２０９、２１０、２１２、２１６、２２１、２２３、２２６、２２７、２５５、２５８、２６０、３０４、３５０および４３８
のアミノ酸を好ましくは含む。
【０１３０】
膜貫通ポアと相互作用する部分は、好ましくは配列番号８中の位置Ｋ１９４、Ｗ１９５、Ｋ１９８、Ｋ１９９およびＥ２５８に２個、３個、４個または５個などの１つまたは複数のアミノ酸を含む。配列番号８の変種は、（ａ）、Ｋ１９４、（ｂ）Ｗ１９５、（ｃ）Ｄ１９８、（ｄ）Ｋ１９９および（ｄ）Ｅ２５８の１つまたは複数に修飾を好ましくは含む。配列番号８の変種は、（ａ）Ｋ１９４、Ｋ１９４Ｌなど（ｂ）Ｗ１９５、Ｗ１９５Ａなど（ｃ）Ｄ１９８、Ｄ１９８Ｖなど（ｄ）Ｋ１９９、Ｋ１９９Ｌなどおよび（ｄ）Ｅ２５８、Ｅ２５８Ｌなどの１つまたは複数に置換を好ましくは含む。変種は、｛ａ｝；｛ｂ｝；｛ｃ｝；｛ｄ｝；｛ｅ｝；｛ａ，ｂ｝；｛ａ，ｃ｝；｛ａ，ｄ｝；｛ａ，ｅ｝；｛ｂ，ｃ｝；｛ｂ，ｄ｝；｛ｂ，ｅ｝；｛ｃ，ｄ｝；｛ｃ，ｅ｝；｛ｄ，ｅ｝；｛ａ，ｂ，ｃ｝；｛ａ，ｂ，ｄ｝；｛ａ，ｂ，ｅ｝；｛ａ，ｃ，ｄ｝；｛ａ，ｃ，ｅ｝；｛ａ，ｄ，ｅ｝；｛ｂ，ｃ，ｄ｝；｛ｂ，ｃ，ｅ｝；｛ｂ，ｄ，ｅ｝；｛ｃ，ｄ，ｅ｝；｛ａ，ｂ，ｃ，ｄ｝；｛ａ，ｂ，ｃ，ｅ｝；｛ａ，ｂ，ｄ，ｅ｝；｛ａ，ｃ，ｄ，ｅ｝；｛ｂ，ｃ，ｄ，ｅ｝；または｛ａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅ｝を含んでよい。本段落に記載の修飾または置換は、修飾ポリヌクレオチド結合タンパク質がＭｓｐＡ由来のポア、詳細には下に考察の修飾ポアのいずれかと相互作用する場合に好ましい。
【０１３１】
膜貫通ポアと相互作用するポリヌクレオチド結合タンパク質の部分は、配列番号８の位置１９４または１９９のアミノ酸を好ましくは含む。変種は、Ｋ１９４Ａ、Ｋ１９４Ｖ、Ｋ１９４Ｆ、Ｋ１９４Ｄ、Ｋ１９４Ｓ、Ｋ１９４ＷもしくはＫ１９４Ｌおよび／またはＫ１９９Ａ、Ｋ１９９Ｖ、Ｋ１９９Ｆ、Ｋ１９９Ｄ、Ｋ１９９Ｓ、Ｋ１９９ＷもしくはＫ１９９Ｌを好ましくは含む。配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３では膜貫通ポアと相互作用する部分は、典型的には、上に列挙した配列番号８中のものに対応する位置のアミノ酸を含む。配列番号９中のこれらの位置に対応する配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２および２３中のアミノ酸は、下に示す配列比較を使用して同定され得る。
【０１３２】
【表Ａ】
2017535256.tif 000007
【０１３３】
好ましい組合せ
本発明のヘリカーゼは、Ｆ９８に、Ｆ９８Ｒ、Ｆ９８Ｋ、Ｆ９８Ｑ、Ｆ９８Ｎ、Ｆ９８Ｈ、Ｆ９８Ｙ、Ｆ９８ＦもしくはＦ９８Ｗなどの置換、ならびにＫ１９４に、Ｋ１９４Ａ、Ｋ１９４Ｖ、Ｋ１９４Ｆ、Ｋ１９４Ｄ、Ｋ１９４Ｓ、Ｋ１９４ＷもしくはＫ１９４Ｌなど、および／またはＫ１９９に、Ｋ１９９Ａ、Ｋ１９９Ｖ、Ｋ１９９Ｆ、Ｋ１９９Ｄ、Ｋ１９９Ｓ、Ｋ１９９ＷもしくはＫ１９９Ｌなどの置換を含む配列番号８の変種を好ましくは含む。本発明のヘリカーゼは、配列番号８中のＦ９８に対応する位置に置換ならびに配列番号８中のＫ１９４および／またはＫ１９９に対応する位置（複数可）に置換を含む配列番号  ９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２もしくは２３の変種を好ましくは含む。これらの対応する位置は、配列番号８中のＦ９８、Ｋ１９４およびＫ１１９について上に列挙したアミノ酸のいずれかで置き換えられてよい。
【０１３４】
ヘリカーゼは、好ましくは：
−  Ｆ９８Ｗ／Ｋ１９４Ｌ／Ｈ６４Ｎ、Ｆ９８Ｗ／Ｋ１９４Ｌ／Ｈ６４Ｑ、Ｆ９８Ｗ／Ｋ１９４Ｌ／Ｈ６４ＫもしくはＦ９８Ｗ／Ｋ１９４Ｌ／Ｈ６４Ｆなどの、Ｆ９８／Ｋ１９４／Ｈ６４における置換；
−  Ｆ９８Ｗ／Ｋ１９４Ｌ／Ｔ８０Ｋ、Ｆ９８Ｗ／Ｋ１９４Ｌ／Ｔ８０ＱもしくはＦ９８Ｗ／Ｋ１９４Ｌ／Ｔ８０Ｎなどの、Ｆ９８／Ｋ１９４／Ｔ８０における置換；
−  Ｆ９８Ｗ／Ｋ１９４Ｌ／Ｈ８２Ｎ、Ｆ９８Ｗ／Ｋ１９４Ｌ／Ｈ８２ＱもしくはＦ９８Ｗ／Ｋ１９４Ｌ／Ｈ８２Ｗなどの、Ｆ９８／Ｋ１９４／Ｈ８２における置換；
−  Ｆ９８Ｗ／Ｓ８３Ｈ／Ｋ１９４Ｌ、Ｆ９８Ｗ／Ｓ８３Ｔ／Ｋ１９４Ｌ、Ｆ９８Ｗ／Ｓ８３Ｒ／Ｋ１９４Ｌ、Ｆ９８Ｗ／Ｓ８３Ｑ／Ｋ１９４Ｌ、Ｆ９８Ｗ／Ｓ８３Ｎ／Ｋ１９４Ｌ、Ｆ９８Ｗ／Ｓ８３Ｋ／Ｋ１９４Ｌ、Ｆ９８Ｗ／Ｎ８８Ｒ／Ｋ１９４Ｌ、Ｆ９８Ｗ／Ｎ８８Ｈ／Ｋ１９４Ｌ、Ｆ９８Ｗ／Ｎ８８Ｗ／Ｋ１９４ＬもしくはＦ９８Ｗ／Ｎ８８Ｙ／Ｋ１９４Ｌなどの、Ｆ９８／Ｓ８３／Ｋ１９４における置換；
−  Ｆ９８Ｗ／Ｓ８３Ｈ／Ｋ１９４Ｌ／Ｆ２７６Ｋなどの、Ｆ９８／Ｓ８３／Ｋ１９４／Ｆ２７６における置換；
−  Ｆ９８Ｗ／Ｐ８９Ｌ／Ｋ１９４Ｌ、Ｆ９８Ｗ／Ｐ８９Ｖ／Ｋ１９４Ｌ、Ｆ９８Ｗ／Ｐ８９Ｉ／Ｋ１９４ＬもしくはＦ９８Ｗ／Ｐ８９Ｔ／Ｋ１９４Ｌなどの、Ｆ９８／Ｐ８９／Ｋ１９４における置換；
−  Ｆ９８Ｗ／Ｄ１２１Ｈ／Ｋ１９４Ｌ、Ｆ９８Ｗ／Ｄ１２１Ｙ／Ｋ１９４ＬもしくはＦ９８Ｗ／Ｄ１２１Ｋ／Ｋ１９４Ｌなどの、Ｆ９８／Ｄ１２１／Ｋ１９４における置換；
−  Ｆ９８Ｗ／Ｖ１５０Ｉ／Ｋ１９４Ｌ、Ｆ９８Ｗ／Ｖ１５０Ｌ／Ｋ１９４Ｌ、Ｆ９８Ｗ／Ｖ１５０Ｎ／Ｋ１９４Ｌ、Ｆ９８Ｗ／Ｖ１５０Ｗ／Ｋ１９４ＬもしくはＦ９８Ｗ／Ｖ１５０Ｈ／Ｋ１９４Ｌなどの、Ｆ９８／Ｖ１５０／Ｋ１９４における置換；
−  Ｆ９８Ｗ／Ｐ１５２Ｗ／Ｋ１９４Ｌ、Ｆ９８Ｗ／Ｐ１５２Ｆ／Ｋ１９４Ｌ、Ｆ９８Ｗ／Ｐ１５２Ｙ／Ｋ１９４Ｌ、Ｆ９８Ｗ／Ｐ１５２Ｈ／Ｋ１９４Ｌ、Ｆ９８Ｗ／Ｐ１５２Ｉ／Ｋ１９４Ｌ、Ｆ９８Ｗ／Ｐ１５２Ｌ／Ｋ１９４ＬもしくはＦ９８Ｗ／Ｐ１５２Ｖ／Ｋ１９４Ｌなどの、Ｆ９８／Ｐ１５２／Ｋ１９４における置換；
−  Ｆ９８Ｗ／Ｆ２４０Ｗ／Ｋ１９４Ｌ、Ｆ９８Ｗ／Ｆ２４０Ｙ／Ｋ１９４ＬもしくはＦ９８Ｗ／Ｆ２４０Ｈ／Ｋ１９４Ｌなどの、Ｆ９８／Ｆ２４０／Ｋ１９４における置換；
−  Ｆ９８Ｗ／Ｎ２４２Ｈ／Ｋ１９４ＬもしくはＦ９８Ｗ／Ｎ２４２Ｑ／Ｋ１９４Ｌなどの、Ｆ９８／Ｎ２４２／Ｋ１９４における置換；
−  Ｆ９８Ｗ／Ｋ１９４Ｌ／Ｆ２７６Ｋ、Ｆ９８Ｗ／Ｋ１９４Ｌ／Ｆ２７６Ｈ、Ｆ９８Ｗ／Ｋ１９４Ｌ／Ｆ２７６ＷもしくはＦ９８Ｗ／Ｋ１９４Ｌ／Ｆ２７６Ｒなどの、Ｆ９８／Ｋ１９４／Ｆ２７６における置換；
−  Ｆ９８Ｗ／Ｋ１９４Ｌ／Ｓ２８７Ｋ、Ｆ９８Ｗ／Ｋ１９４Ｌ／Ｓ２８７Ｒ、Ｆ９８Ｗ／Ｋ１９４Ｌ／Ｓ２８７ＷもしくはＦ９８Ｗ／Ｋ１９４Ｌ／Ｓ２８７Ｆなどの、Ｆ９８／Ｋ１９４／Ｓ２８７における置換；
−  Ｆ９８Ｗ／Ｎ２９３Ｑ／Ｋ１９４Ｌ、Ｆ９８Ｗ／Ｎ２９３Ｋ／Ｋ１９４ＬもしくはＦ９８Ｗ／Ｎ２９３Ｈ／Ｋ１９４Ｌなどの、Ｆ９８／Ｎ２９３／Ｋ１９４における置換；
−  Ｆ９８Ｗ／Ｔ３９４Ｋ／Ｋ１９４Ｌ、Ｆ９８Ｗ／Ｔ３９４Ｈ／Ｋ１９４ＬもしくはＦ９８Ｗ／Ｔ３９４Ｎ／Ｋ１９４Ｌなどの、Ｆ９８／Ｔ３９４／Ｋ１９４における置換；
−  Ｆ９８Ｗ／Ｈ３９６Ｙ／Ｋ１９４Ｌ、Ｆ９８Ｗ／Ｈ３９６Ｆ／Ｋ１９４Ｌ、Ｆ９８Ｗ／Ｈ３９６Ｑ／Ｋ１９４ＬもしくはＦ９８Ｗ／Ｈ３９６Ｋ／Ｋ１９４Ｌなどの、Ｆ９８／Ｈ３９６／Ｋ１９４における置換；
−  Ｆ９８Ｗ／Ｋ３９７Ｒ／Ｋ１９４Ｌ、Ｆ９８Ｗ／Ｋ３９７Ｈ／Ｋ１９４ＬもしくはＦ９８Ｗ／Ｋ３９７Ｙ／Ｋ１９４Ｌなどの、Ｆ９８／Ｋ３９７／Ｋ１９４における置換；または
−  Ｆ９８Ｗ／Ｙ４１５Ｗ／Ｋ１９４ＬもしくはＦ９８Ｗ／Ｙ４１５Ｒ／Ｋ１９４Ｌなどの、Ｆ９８／Ｙ４１５／Ｋ１９４における置換
を含む配列番号８の変種である。
【０１３５】
上記の組合せのいずれかにおいてＫ１９４は、Ｗ１９５、Ｄ１９８、Ｋ１９９およびＥ２５８のいずれかで置き換えられてよい。
【０１３６】
ヘリカーゼは、好ましくは上に列挙した配列番号８中の組合せに対応するアミノ酸に置換を含む配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３の変種である。
【０１３７】
タワードメインおよび／またはピンドメインおよび／または１Ａドメイン中の修飾
本発明のヘリカーゼは、好ましくは少なくとも１つのシステイン残基（すなわち１つまたは複数のシステイン残基）および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸（すなわち１つまたは複数の非天然アミノ酸）が（ｉ）タワードメインおよび／または（ｉｉ）ピンドメインおよび／または（ｉｉｉ）１Ａ（ＲｅｃＡ様モーター）ドメインに導入されているものであって、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有しているものである。これらの種類の修飾は、ＰＣＴ／ＧＢ２０１４／０５２７３６（国際公開第２０１５／０５５９８１号パンフレット）に開示されている。少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸は、タワードメイン、ピンドメイン、１Ａドメイン、タワードメインおよびピンドメイン、タワードメインおよび１Ａドメインまたはタワードメイン、ピンドメインおよび１Ａドメインに導入されてよい。
【０１３８】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメインならびに（ｉｉ）ピンドメインおよび／または１Ａ（ＲｅｃＡ様モーター）ドメインのそれぞれ、すなわちタワードメインおよびピンドメインに、タワードメインおよび１Ａドメインまたはタワードメイン、ピンドメインおよび１Ａドメインに導入されたもので好ましくはある。
【０１３９】
任意の数のシステイン残基および／または非天然アミノ酸が各ドメインに導入され得る。例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれ以上のシステイン残基が導入されてよく、および／または１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれ以上の非天然アミノ酸が導入されてよい。１つまたは複数のシステイン残基だけが導入されてよい。１つまたは複数の非天然アミノ酸だけが導入されてよい。１つまたは複数のシステイン残基と１つまたは複数の非天然アミノ酸との組合せは導入されてよい。
【０１４０】
少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸は（ａｒｅ／ｉｓ）、置換によって好ましくは導入される。これを行うための方法は、当技術分野において公知である。
【０１４１】
これらの修飾は、ポリヌクレオチドへの結合についてヘリカーゼを妨げない。これらの修飾は、ヘリカーゼから解離するまたは離されるポリヌクレオチドの能力を減少させる。換言すると１つまたは複数の修飾は、ポリヌクレオチド鎖からの離脱を妨げることによってヘリカーゼの前進性を増大させる。酵素の熱安定性も１つまたは複数の修飾によって典型的には増大され、鎖配列決定法において有益である改善された構造的安定性をもたらす。
【０１４２】
非天然アミノ酸は、ヘリカーゼ中に天然で見出されないアミノである。非天然アミノ酸は、好ましくはヒスチジン、アラニン、イソロイシン、アルギニン、ロイシン、アスパラギン、リシン、アスパラギン酸、メチオニン、システイン、フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニン、グルタミン、トリプトファン、グリシン、バリン、プロリン、セリンまたはチロシンではない。非天然アミノ酸は、より好ましくは前述の２０個のアミノ酸のいずれでも、セレノシステインでもない。
【０１４３】
本発明における使用のための好ましい非天然アミノ酸は、これだけに限らないが、４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆａｚ）、４−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、３−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、４−アセトアセチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−アリル−Ｌ−チロシン、３−（フェニルセラニル）−Ｌ−アラニン、Ｏ−２−プロピン−１−イル−Ｌ−チロシン、４−（ジヒドロキシボリル）−Ｌ−フェニルアラニン、４−［（エチルスルファニル）カルボニル］−Ｌ−フェニルアラニン、（２Ｓ）−２−アミノ−３−４−［（プロパン−２−イルスルファニル）カルボニル］フェニル；プロパン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−３−４−［（２−アミノ−３−スルファニルプロパノイル）アミノ］フェニル；プロパン酸、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、４−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、４−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、３−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、４−フルオロ−Ｌ−フェニルアラニン、４−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン、４−ブロモ−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−（トリフルオロメチル）チロシン、４−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン、３−ヒドロキシ−Ｌ−チロシン、３−アミノ−Ｌ−チロシン、３−ヨード−Ｌ−チロシン、４−イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、３−（２−ナフチル）−Ｌ−アラニン、４−フェニル−Ｌ−フェニルアラニン、（２Ｓ）−２−アミノ−３−（ナフタレン−２−イルアミノ）プロパン酸、６−（メチルスルファニル）ノルロイシン、６−オキソ−Ｌ−リシン、Ｄ−チロシン、（２Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパン酸、（２Ｒ）−２−アンモニオオクタノエート３−（２，２’−ビピリジン−５−イル）−Ｄ−アラニン、２−アミノ−３−（８−ヒドロキシ−３−キノリル）プロパン酸、４−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｓ−（２−ニトロベンジル）システイン、（２Ｒ）−２−アミノ−３−［（２−ニトロベンジル）スルファニル］プロパン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−３−［（２−ニトロベンジル）オキシ］プロパン酸、Ｏ−（４，５−ジメトキシ−２−ニトロベンジル）−Ｌ−セリン、（２Ｓ）−２−アミノ−６−（［（２−ニトロベンジル）オキシ］カルボニル；アミノ）ヘキサン酸、Ｏ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシン、２−ニトロフェニルアラニン、４−［（Ｅ）−フェニルジアゼニル］−Ｌ−フェニルアラニン、４−［３−（トリフルオロメチル）−３Ｈ−ジアジレン−３−イル］−Ｄ−フェニルアラニン、２−アミノ−３−［［５−（ジメチルアミノ）−１−ナフチル］スルホニルアミノ］プロパン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−４−（７−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）ブタン酸、（２Ｓ）−３−［（６−アセチルナフタレン−２−イル）アミノ］−２−アミノプロパン酸、４−（カルボキシメチル）フェニルアラニン、３−ニトロ−Ｌ−チロシン、Ｏ−スルホ−Ｌ−チロシン、（２Ｒ）−６−アセトアミド−２−アンモニオヘキサノエート、１−メチルヒスチジン、２−アミノノナン酸、２−アミノデカン酸、Ｌ−ホモシステイン、５−スルファニルノルバリン、６−スルファニル−Ｌ−ノルロイシン、５−（メチルスルファニル）−Ｌ−ノルバリン、Ｎ６−［（２Ｒ，３Ｒ）−３−メチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピロール−２−イル］カルボニル；−Ｌ−リシン、Ｎ６−［（ベンジルオキシ）カルボニル］リシン、（２Ｓ）−２−アミノ−６−［（シクロペンチルカルボニル）アミノ］ヘキサン酸、Ｎ６−［（シクロペンチルオキシ）カルボニル］−Ｌ−リシン、（２Ｓ）−２−アミノ−６−［（２Ｒ）−テトラヒドロフラン−２−イルカルボニル］アミノ；ヘキサン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−８−［（２Ｒ，３Ｓ）−３−エチニルテトラヒドロフラン−２−イル］−８−オキソオクタン酸、Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−リシン、（２Ｓ）−２−ヒドロキシ−６−（［（２−メチル−２−プロパニル）オキシ］カルボニル；アミノ）ヘキサン酸、Ｎ６−［（アリルオキシ）カルボニル］リシン、（２Ｓ）−２−アミノ−６−（［（２−アジドベンジル）オキシ］カルボニル；アミノ）ヘキサン酸、Ｎ６−Ｌ−プロリル−Ｌ−リシン、（２Ｓ）−２−アミノ−６−［（プロパ−２−イン−１−イルオキシ）カルボニル］アミノ；ヘキサン酸およびＮ６−［（２−アジドエトキシ）カルボニル］−Ｌ−リシンを含む。最も好ましい非天然アミノ酸は、４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆａｚ）である。
【０１４４】
下の表４（２つの部分に分かれている）は、各Ｄｄａ相同体（配列番号８から２３）において各ドメインを作っている残基を同定する。
【０１４５】
【表４】
2017535256.tif 000008
【０１４６】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ｄ２６０〜Ｐ２７４およびＮ２９２〜Ａ３８９）ならびに／または（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｋ８６〜Ｅ１０２）ならびに／または（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｌ８５およびＶ１０３〜Ｋ１７７）に導入されている配列番号８の変種を好ましくは含む。少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸は、タワードメインの残基Ｎ２９２〜Ａ３８９に好ましくは導入されている。
【０１４７】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ｇ２９５〜Ｎ３０９およびＦ３１６〜Ｙ４２１）ならびに／または（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｙ８５〜Ｌ１１２）ならびに／または（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｉ８４およびＲ１１３〜Ｙ２１１）に導入されている配列番号９の変種を好ましくは含む。少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸は、タワードメインの残基Ｆ３１６〜Ｙ４２１に好ましくは導入されている。
【０１４８】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ｖ３２８〜Ｐ３４２およびＮ３６０〜Ｙ４４８）ならびに／または（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｋ１４８〜Ｎ１６５）ならびに／または（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｌ１４７およびＳ１６６〜Ｖ２４０）に導入されている配列番号１０の変種を好ましくは含む。少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸は、タワードメインの残基Ｎ３６０〜Ｙ４４８に好ましくは導入されている。
【０１４９】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ａ２６１〜Ｔ２７５およびＴ２８５〜Ｙ３７０）ならびに／または（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｇ９１〜Ｅ１０７）ならびに／または（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｌ９０およびＥ１０８〜Ｈ１７３）に導入されている配列番号１１の変種を好ましくは含む。少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸は、タワードメインの残基Ｔ２８５〜Ｙ３７０に好ましくは導入されている。
【０１５０】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ｇ２９４〜Ｉ３０７およびＴ３１４〜Ｙ４０７）ならびに／または（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｇ１１６〜Ｔ１３５）ならびに／または（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｌ１１５およびＮ１３６〜Ｖ２０５）に導入されている配列番号１２の変種を好ましくは含む。少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸は、タワードメインの残基Ｔ３１４〜Ｙ４０７に好ましくは導入されている。
【０１５１】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ｖ２８８〜Ｅ３０１およびＮ３０７〜Ｎ３９３）ならびに／または（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｇ９７〜Ｐ１１３）ならびに／または（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｌ９６およびＦ１１４〜Ｖ１９４）に導入されている配列番号１３の変種を好ましくは含む。少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸は、タワードメインの残基Ｎ３０７〜Ｎ３９３に好ましくは導入されている。
【０１５２】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ｓ２５０〜Ｐ２６４およびＥ２７８〜Ｓ３７１）ならびに／または（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｋ７８〜Ｅ９５）ならびに／または（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｌ７７およびＶ９６〜Ｖ１６６）に導入されている配列番号１４の変種を好ましくは含む。少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸は、タワードメインの残基Ｅ２７８〜Ｓ３７１に好ましくは導入されている。
【０１５３】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ｋ２５５〜Ｐ２６９およびＴ２８４〜Ｓ３８０）ならびに／または（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｋ８２〜Ｋ９８）ならびに／または（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｍ８１およびＬ９９〜Ｍ１７１）に導入されている配列番号１５の変種を好ましくは含む。少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸は、タワードメインの残基Ｔ２８４〜Ｓ３８０に好ましくは導入されている。
【０１５４】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ｄ２４２〜Ｐ２５６およびＴ２７１〜Ｓ３６６）ならびに／または（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｋ６９〜Ｋ８５）ならびに／または（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｍ６８およびＭ８６〜Ｍ１５８）に導入されている配列番号１６の変種を好ましくは含む。少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸は、タワードメインの残基Ｔ２７１〜Ｓ３６６に好ましくは導入されている。
【０１５５】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ｔ２６３〜Ｐ２７７およびＮ２９５〜Ｐ３９２）ならびに／または（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｋ８８〜Ｋ１０７）ならびに／または（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｌ８７およびＡ１０８〜Ｍ１８１）に導入されている配列番号１７の変種を好ましくは含む。少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸は、タワードメインの残基Ｎ２９５〜Ｐ３９２に好ましくは導入されている。
【０１５６】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ｄ２６３〜Ｐ２７７およびＮ２９５〜Ａ３９１）ならびに／または（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｋ８８〜Ｋ１０７）ならびに／または（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｌ８７およびＡ１０８〜Ｍ１８１）に導入されている配列番号１８の変種を好ましくは含む。少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸は、タワードメインの残基Ｎ２９５〜Ａ３９１に好ましくは導入されている。
【０１５７】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ａ２５８〜Ｐ２７２およびＮ２９０〜Ｐ３８６）ならびに／または（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｋ８６〜Ｇ１０２）ならびに／または（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｌ８５およびＴ１０３〜Ｋ１７６）に導入されている配列番号１９の変種を好ましくは含む。少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸は、タワードメインの残基Ｎ２９０〜Ｐ３８６に好ましくは導入されている。
【０１５８】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ｌ２６６〜Ｐ２８０およびＮ２９８〜Ａ３９２）ならびに／または（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｋ９２〜Ｄ１０８）ならびに／または（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｌ９１およびＶ１０９〜Ｍ１８３）に導入されている配列番号２０の変種を好ましくは含む。少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸は、タワードメインの残基Ｎ２９８〜Ａ３９２に好ましくは導入されている。
【０１５９】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ｄ２６２〜Ｐ２７６およびＮ２９４〜Ａ３９２）ならびに／または（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｋ８８〜Ｅ１０４）ならびに／または（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｌ８７およびＭ１０５〜Ｍ１７９）に導入されている配列番号２１の変種を好ましくは含む。少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸は、タワードメインの残基Ｎ２９４〜Ａ３９２に好ましくは導入されている。
【０１６０】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ｄ２６１〜Ｐ２７５およびＮ２９３〜Ａ３８９）ならびに／または（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｋ８７〜Ｅ１０３）ならびに／または（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｌ８６およびＶ１０４〜Ｋ１７８）に導入されている配列番号２２の変種を好ましくは含む。少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸は、タワードメインの残基Ｎ２９３〜Ａ３８９に好ましくは導入されている。
【０１６１】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン（残基Ｅ２６１〜Ｐ２７５およびＴ２９３〜Ａ３９０）ならびに／または（ｉｉ）ピンドメイン（残基Ｋ８７〜Ｅ１０３）ならびに／または（ｉｉｉ）１Ａドメイン（残基Ｍ１〜Ｌ８６およびＶ１０４〜Ｍ１７８）に導入されている配列番号２３の変種を好ましくは含む。少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸は、タワードメインの残基Ｔ２９３〜Ａ３９０に好ましくは導入されている。
【０１６２】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメインおよび（ｉｉ）ピンドメインおよび／または１Ａドメインのそれぞれに導入されている配列番号８から２３のいずれか１つの変種を好ましくは含む。本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸が（ｉ）タワードメイン、（ｉｉ）ピンドメインおよび（ｉｉｉ）１Ａドメインのそれぞれに導入されている配列番号８から２３のいずれか１つの変種をより好ましくは含む。任意の数および組合せのシステイン残基および非天然アミノ酸が上に考察したとおり導入され得る。
【０１６３】
本発明のヘリカーゼは、（ｉ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＡ３６０Ｃ；（ｉｉ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＫ３５８Ｃ；（ｉｉｉ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＡ３６０Ｃ；（ｉｖ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＥ３６１Ｃ；（ｖ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＫ３６４Ｃ；（ｖｉ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＬ３５４Ｃ；（ｖｉｉ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＫ３５８Ｃ；（ｖｉｉｉ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＬ３５４Ｃ；（ｉｘ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＥ３６１Ｃ；（ｘ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＫ３６４Ｃ；（ｘｉ）Ｌ９７Ｃおよび／またはＬ３５４Ｃ；（ｘｉｉ）Ｌ９７Ｃおよび／またはＫ３５８Ｃ；（ｘｉｉｉ）Ｌ９７Ｃおよび／またはＡ３６０Ｃ；（ｘｉｖ）Ｌ９７Ｃおよび／またはＥ３６１Ｃ；（ｘｖ）Ｌ９７Ｃおよび／またはＫ３６４Ｃ；（ｘｖｉ）Ｋ１２３Ｃおよび／またはＬ３５４Ｃ；（ｘｖｉｉ）Ｋ１２３Ｃおよび／またはＫ３５８Ｃ；（ｘｖｉｉｉ）Ｋ１２３Ｃおよび／またはＡ３６０Ｃ；（ｘｉｘ）Ｋ１２３Ｃおよび／またはＥ３６１Ｃ；（ｘｘ）Ｋ１２３Ｃおよび／またはＫ３６４Ｃ；（ｘｘｉ）Ｎ１５５Ｃおよび／またはＬ３５４Ｃ；（ｘｘｉｉ）Ｎ１５５Ｃおよび／またはＫ３５８Ｃ；（ｘｘｉｉｉ）Ｎ１５５Ｃおよび／またはＡ３６０Ｃ；（ｘｘｉｖ）Ｎ１５５Ｃおよび／またはＥ３６１Ｃ；（ｘｘｖ）Ｎ１５５Ｃおよび／またはＫ３６４Ｃ；（ｘｘｖｉ）（ｉ）から（ｘｘｖ）のいずれかおよびＧ３５７Ｃ；（ｘｘｖｉｉ）（ｉ）から（ｘｘｖ）のいずれかおよびＱ１００Ｃ；（ｘｘｖｉｉｉ）（ｉ）から（ｘｘｖ）のいずれかおよびＩ１２７Ｃ；（ｘｘｉｘ）（ｉ）から（ｘｘｖ）のいずれかおよびＱ１００ＣおよびＩ１２７Ｃ；（ｘｘｘ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＦ３７７Ｃ；（ｘｘｘｉ）Ｎ９５Ｃ；（ｘｘｘｉｉ）Ｔ９１Ｃ；（ｘｘｘｉｉｉ）Ｙ９２Ｌ、Ｅ９４Ｙ、Ｙ３５０Ｎ、Ａ３６０ＣおよびＹ３６３Ｎ；（ｘｘｘｉｖ）Ｅ９４ＹおよびＡ３６０Ｃ；（ｘｘｘｖ）Ａ３６０Ｃ；（ｘｘｘｖｉ）Ｙ９２Ｌ、Ｅ９４Ｃ、Ｙ３５０Ｎ、Ａ３６０ＹおよびＹ３６３Ｎ；（ｘｘｘｖｉｉ）Ｙ９２Ｌ、Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｙ；（ｘｘｘｖｉｉｉ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＡ３６０ＣおよびＦ２７６Ａ；（ｘｘｘｉｘ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＬ３５６Ｃ；（ｘｌ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＥ３５６Ｃ；（ｘｌｉ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＧ３５７Ｃ；（ｘｌｉｉ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＡ３６０Ｃ；（ｘｌｉｉｉ）Ｎ９５Ｃおよび／またはＷ３７８Ｃ；（ｘｌｉｖ）Ｔ９１Ｃおよび／またはＳ３８２Ｃ；（ｘｌｖ）Ｔ９１Ｃおよび／またはＷ３７８Ｃ；（ｘｌｖｉ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＮ３５３Ｃ；（ｘｌｖｉｉ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＳ３８２Ｃ；（ｘｌｖｉｉｉ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＫ３８１Ｃ；（ｘｌｉｘ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＤ３７９Ｃ；（ｌ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＳ３７５Ｃ；（ｌｉ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＷ３７８Ｃ；（ｌｉｉ）Ｅ９３Ｃおよび／またはＷ３７４Ｃ；（ｌｉｉｉ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＮ３５３Ｃ；（ｌｉｖ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＳ３８２Ｃ；（ｌｖ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＫ３８１Ｃ；（ｌｖｉ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＤ３７９Ｃ；（ｌｖｉｉ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＳ３７５Ｃ；（ｌｖｉｉｉ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＷ３７８Ｃ；（ｌｉｘ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＷ３７４Ｃ；（ｌｘ）Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｙ；（ｌｘｉ）Ｅ９４Ｃ、Ｇ３５７ＣおよびＡ３６０Ｃまたは（ｌｘｉｉ）Ｔ２Ｃ、Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃを含んでいる配列番号８の変種を好ましくは含む。（ｉ）から（ｌｘｉｉ）のいずれか１つにおいて、および／または、好ましくはおよびである。
【０１６４】
本発明のヘリカーゼは、（ｉ）から（ｌｘｉｉ）のいずれかに定義の配列番号８中のものに対応する位置にシステイン残基を含む配列番号９から２３のいずれか１つの変種を好ましくは含む。配列番号８中のものに対応する配列番号９から２３のいずれか１つの位置は、下の配列番号８から２３の配列比較を使用して同定され得る。本発明のヘリカーゼは、（ａ）Ｄ９９Ｃおよび／またはＬ３４１Ｃ、（ｂ）Ｑ９８Ｃおよび／もしくはＬ３４１Ｃまたは（ｄ）Ｑ９８Ｃおよび／またはＡ３４０Ｃを含む配列番号１１の変種を好ましくは含む。本発明のヘリカーゼは、Ｄ９０Ｃおよび／またはＡ３４９Ｃを含む配列番号１５の変種を好ましくは含む。本発明のヘリカーゼは、Ｄ９６Ｃおよび／またはＡ３６２Ｃを含む配列番号２１の変種を好ましくは含む。
【０１６５】
本発明のヘリカーゼは、Ｆａｚがシステインの代わりに特異的位置の１つまたは複数に導入されている（ｉ）から（ｌｘｉｉ）のいずれか１つに定義の配列番号８から２３のいずれか１つの変種を好ましくは含む。Ｆａｚは、システインの代わりに各特異的位置に導入されてよい。本発明のヘリカーゼは、（ｉ）Ｅ９４Ｆａｚおよび／またはＡ３６０Ｃ；（ｉｉ）Ｅ９４Ｃおよび／またはＡ３６０Ｆａｚ；（ｉｉｉ）Ｅ９４Ｆａｚおよび／またはＡ３６０Ｆａｚ；（ｉｖ）Ｙ９２Ｌ、Ｅ９４Ｙ、Ｙ３５０Ｎ、Ａ３６０ＦａｚおよびＹ３６３Ｎ；（ｖ）Ａ３６０Ｆａｚ；（ｖｉ）Ｅ９４ＹおよびＡ３６０Ｆａｚ；（ｖｉｉ）Ｙ９２Ｌ、Ｅ９４Ｆａｚ、Ｙ３５０Ｎ、Ａ３６０ＹおよびＹ３６３Ｎ；（ｖｉｉｉ）Ｙ９２Ｌ、Ｅ９４ＦａｚおよびＡ３６０Ｙ；（ｉｘ）Ｅ９４ＦａｚおよびＡ３６０Ｙ；および（ｘ）Ｅ９４Ｃ、Ｇ３５７ＦａｚおよびＡ３６０Ｃを含む配列番号８の変種を好ましくは含む。
【０１６６】
本発明のヘリカーゼは、ピンドメインからの１つまたは複数の単一アミノ酸欠失を好ましくはさらに含む。１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれ以上などの任意の数の単一アミノ酸欠失が作られてよい。ヘリカーゼは、Ｅ９３の欠失、Ｅ９５の欠失またはＥ９３およびＥ９５の欠失を含む配列番号８の変種をより好ましくは含む。ヘリカーゼは（ａ）Ｅ９４Ｃ、Ｎ９５の欠失およびＡ３６０Ｃ；（ｂ）Ｅ９３の欠失、Ｅ９４の欠失、Ｎ９５の欠失およびＡ３６０Ｃ；（ｃ）Ｅ９３の欠失、Ｅ９４Ｃ、Ｎ９５の欠失およびＡ３６０Ｃまたは（ｄ）Ｅ９３Ｃ、Ｎ９５の欠失およびＡ３６０Ｃを含む配列番号８の変種をより好ましくは含む。本発明のヘリカーゼは、配列番号８中のＥ９３に対応する位置の欠失、配列番号８中のＥ９５に対応する位置の欠失、配列番号８中のＥ９３およびＥ９５に対応する位置の欠失を含む配列番号９から２３のいずれか１つの変種を好ましくは含む。
【０１６７】
本発明のヘリカーゼは、フックドメインからの１つまたは複数の単一アミノ酸欠失を好ましくはさらに含む。１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれ以上などの任意の数の単一アミノ酸欠失が作られてよい。ヘリカーゼは、位置Ｔ２７８からＳ２８７の任意の数の欠失を含む配列番号８の変種をより好ましくは含む。ヘリカーゼは、（ａ）Ｅ９４Ｃ、Ｙ２７９からＫ２８４の欠失およびＡ３６０Ｃ、（ｂ）Ｅ９４Ｃ、Ｔ２７８、Ｙ２７９、Ｖ２８６およびＳ２８７の欠失ならびにＡ３６０Ｃ、（ｃ）Ｅ９４Ｃ、Ｉ２８１およびＫ２８４の欠失ならびに単一のＧでの置き換え、ならびにＡ３６０Ｃ、（ｄ）Ｅ９４Ｃ、Ｋ２８０およびＰ２８４５の欠失、Ｅ９４Ｃならびに単一のＧでの置き換えならびにＡ３６０Ｃ、または（ｅ）Ｙ２７９からＫ２８４の欠失、Ｅ９４Ｃ、Ｆ２７６ＡおよびＡ２３０Ｃを含む配列番号８の変種をより好ましくは含む。本発明のヘリカーゼは、配列番号８中の位置２７８から２８７に対応する任意の数の欠失を含む配列番号９から２３のいずれか１つの変種を好ましくは含む。
【０１６８】
本発明のヘリカーゼは、ピンドメインからの１つまたは複数の単一アミノ酸欠失およびフックドメインからの１つまたは複数の単一アミノ酸欠失を好ましくはさらに含む。
【０１６９】
本発明のヘリカーゼは、好ましくは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸がフックドメインならびに／または２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメインにさらに導入されているものである。任意の数および組合せのシステイン残基および非天然アミノ酸が上に考察したとおり、タワー、ピンおよび１Ａドメインに導入されてよい。
【０１７０】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸がフックドメイン（残基Ｌ２７５〜Ｆ２９１）ならびに／または２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ１７８〜Ｔ２５９およびＬ３９０〜Ｖ４３９）にさらに導入されている配列番号８の変種を好ましくは含む。
【０１７１】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸がフックドメイン（残基Ａ３１０〜Ｌ３１５）ならびに／または２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ２１２〜Ｅ２９４およびＧ４２２〜Ｓ６７８）にさらに導入されている配列番号９の変種を好ましくは含む。
【０１７２】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸がフックドメイン（残基Ｖ３４３〜Ｌ３５９）ならびに／または２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ２４１〜Ｎ３２７およびＡ４４９〜Ｇ４９６）にさらに導入されている配列番号１０の変種を好ましくは含む。
【０１７３】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸がフックドメイン（残基Ｗ２７６〜Ｌ２８４）ならびに／または２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ１７４〜Ｄ２６０およびＡ３７１〜Ｖ４２１）にさらに導入されている配列番号１１の変種を好ましくは含む。
【０１７４】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸がフックドメイン（残基Ｒ３０８〜Ｙ３１３）ならびに／または２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ２０６〜Ｋ２９３およびＩ４０８〜Ｌ５００）にさらに導入されている配列番号１２の変種を好ましくは含む。
【０１７５】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸がフックドメイン（残基Ｍ３０２〜Ｗ３０６）ならびに／または２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ１９５〜Ｄ２８７およびＶ３９４〜Ｑ４５０）にさらに導入されている配列番号１３の変種を好ましくは含む。
【０１７６】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸がフックドメイン（残基Ｖ２６５〜Ｉ２７７）ならびに／または２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ１６７〜Ｔ２４９およびＬ３７２〜Ｎ４２１）にさらに導入されている配列番号１４の変種を好ましくは含む。
【０１７７】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸がフックドメイン（残基Ｖ２７０〜Ｆ２８３）ならびに／または２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ１７２〜Ｔ２５４およびＬ３８１〜Ｋ４３４）にさらに導入されている配列番号１５の変種を好ましくは含む。
【０１７８】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸がフックドメイン（残基Ｖ２５７〜Ｆ２７０）ならびに／または２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ１５９〜Ｔ２４１およびＬ３６７〜Ｋ４２０）にさらに導入されている配列番号１６の変種を好ましくは含む。
【０１７９】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸がフックドメイン（残基Ｌ２７８〜Ｙ２９４）ならびに／または２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ１８２〜Ｔ２６２およびＬ３９３〜Ｖ４４３）にさらに導入されている配列番号１７の変種を好ましくは含む。
【０１８０】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸がフックドメイン（残基Ｌ２７８〜Ｙ２９４）ならびに／または２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ１８２〜Ｔ２６２およびＬ３９２〜Ｖ４４２）にさらに導入されている配列番号１８の変種を好ましくは含む。
【０１８１】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸がフックドメイン（残基Ｌ２７３〜Ｆ２８９）ならびに／または２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ１７７〜Ｎ２５７およびＬ３８７〜Ｖ４３８）にさらに導入されている配列番号１９の変種を好ましくは含む。
【０１８２】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸がフックドメイン（残基Ｌ２８１〜Ｆ２９７）ならびに／または２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ１８４〜Ｔ２６５およびＬ３９３〜Ｉ４４２）にさらに導入されている配列番号２０の変種を好ましくは含む。
【０１８３】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸がフックドメイン（残基Ｈ２７７〜Ｆ２９３）ならびに／または２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ１８０〜Ｔ２６１およびＬ３９３〜Ｖ４４２）にさらに導入されている配列番号２１の変種を好ましくは含む。
【０１８４】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸がフックドメイン（残基Ｌ２７６〜Ｆ２９２）ならびに／または２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ１７９〜Ｔ２６０およびＬ３９０〜Ｉ４３９）にさらに導入されている配列番号２２の変種を好ましくは含む。
【０１８５】
本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸がフックドメイン（残基Ｌ２７６〜Ｆ２９２）ならびに／または２Ａ（ＲｅｃＡ様）ドメイン（残基Ｒ１７９〜Ｔ２６０およびＬ３９１〜Ｖ４４１）にさらに導入されている配列番号２３の変種を好ましくは含む。
【０１８６】
本発明のヘリカーゼは、（ｉ）Ｉ１８１Ｃ；（ｉｉ）Ｙ２７９Ｃ；（ｉｉｉ）Ｉ２８１Ｃ；および（ｉｖ）Ｅ２８８Ｃの１つまたは複数を含む配列番号８の変種を好ましくは含む。ヘリカーゼは、（ｉ）；（ｉｉ）；（ｉｉｉ）；（ｉｖ）；（ｉ）および（ｉｉ）；（ｉ）および（ｉｉｉ）；（ｉ）および（ｉｖ）；（ｉｉ）および（ｉｉｉ）；（ｉｉ）および（ｉｖ）；（ｉｉｉ）および（ｉｖ）；または（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）などの（ｉ）から（ｉｖ）の任意の組合せを含み得る。ヘリカーゼは、（ａ）Ｅ９４Ｃ、Ｉ２８１ＣおよびＡ３６０Ｃまたは（ｂ）Ｅ９４Ｃ、Ｉ２８１Ｃ、Ｇ３５７ＣおよびＡ３６０Ｃを含む配列番号８の変種をより好ましくは含む。本発明のヘリカーゼは、（ｉ）から（ｉｖ）、（ａ）および（ｂ）に定義の配列番号８のものに対応する１つまたは複数の位置（複数可）にシステイン残基を含む配列番号９から２３のいずれか１つの変種を好ましくは含む。ヘリカーゼは、Ｆａｚが１つまたは複数の特異的位置（または各特異的位置）にシステインの代わりに導入されているこれらの変種のいずれかを含み得る。
【０１８７】
本発明のヘリカーゼは、その表面負電荷を低減するためにさらに修飾される。表面残基は、上に開示のＤｄａドメインと同じ方法で同定され得る。表面負電荷は、典型的には、アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）などの表面の負に荷電したアミノ酸である。
【０１８８】
ヘリカーゼは、１つまたは複数の負に荷電したアミノ酸を１つもしくは複数の正に荷電したアミノ酸、無電荷アミノ酸、非極性アミノ酸および／もしくは芳香族アミノ酸で置換することによって、または１つもしくは複数の正に荷電したアミノ酸を、好ましくは１つもしくは複数の負に荷電したアミノ酸に隣接して導入することによって１つまたは複数の表面負電荷を中和するように好ましくは修飾される。好適な正に荷電したアミノ酸は、これだけに限らないが、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ）を含む。無電荷アミノ酸は、正味電荷を有さない。好適な無電荷アミノ酸は、これだけに限らないが、システイン（Ｃ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）を含む。非極性アミノ酸は、非極性側鎖を有する。好適な非極性アミノ酸は、これだけに限らないが、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、プロリン（Ｐ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）およびバリン（Ｖ）を含む。芳香族アミノ酸は、芳香族側鎖を有する。好適な芳香族アミノ酸は、これだけに限らないが、ヒスチジン（Ｈ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）およびチロシン（Ｙ）を含む。
【０１８９】
好ましい置換は、これだけに限らないが、ＥのＲでの置換、ＥのＫでの置換、ＥのＮでの置換、ＤのＫでの置換およびＤのＲでの置換を含む。
【０１９０】
本発明のヘリカーゼは、配列番号８の変種を好ましくは含み、１つまたは複数の負に荷電したアミノ酸は、Ｄ５、Ｅ８、Ｅ２３、Ｅ４７、Ｄ１６７、Ｅ１７２、Ｄ２０２、Ｄ２１２およびＥ２７３の１つまたは複数である。それらの１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個または８個などの任意の数のこれらのアミノ酸は、中和されてよい。任意の組合せが中和され得る。本発明のヘリカーゼは、配列番号９から２３のいずれか１つの変種、および配列番号８中のＤ５、Ｅ８、Ｅ２３、Ｅ４７、Ｄ１６７、Ｅ１７２、Ｄ２０２、Ｄ２１２およびＥ２７３の１つまたは複数に対応する１つまたは複数の負に荷電したアミノ酸を好ましくは含む。配列番号８中のＤ５、Ｅ８、Ｅ２３、Ｅ４７、Ｄ１６７、Ｅ１７２、Ｄ２０２、Ｄ２１２およびＥ２７３に対応する配列番号９から２３中のアミノ酸は、下の配列比較を使用して決定され得る。本発明のヘリカーゼは、（ａ）Ｅ９４Ｃ、Ｅ２７３ＧおよびＡ３６０Ｃまたは（ｂ）Ｅ９４Ｃ、Ｅ２７３Ｇ、Ｎ２９２ＧおよびＡ３６０Ｃを含む配列番号８の変種を好ましくは含む。
【０１９１】
本発明のヘリカーゼは、１つまたは複数の天然システイン残基の除去によって好ましくはさらに修飾される。任意の数の天然システイン残基は、除去され得る。配列番号９から２３のそれぞれにおけるシステイン残基の数は、表１（＃Ｃとして）において示されている。１つまたは複数のシステイン残基は、好ましくは置換によって除去される。１つまたは複数のシステイン残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）またはバリン（Ｖ）で好ましくは置換される。本発明のヘリカーゼは、配列番号８の変種を好ましくは含み、１つまたは複数の天然システイン残基はＣ１０９、Ｃ１１４、Ｃ１３６、Ｃ１７１およびＣ４１２の１つまたは複数である。これらのシステイン残基の任意の数および組合せは、除去され得る。例えば配列番号８の変種はＣ１０９；Ｃ１１４；Ｃ１３６；Ｃ１７１；Ｃ４１２；Ｃ１０９およびＣ１１４；Ｃ１０９およびＣ１３６；Ｃ１０９およびＣ１７１；Ｃ１０９およびＣ４１２；Ｃ１１４およびＣ１３６；Ｃ１１４およびＣ１７１；Ｃ１１４およびＣ４１２；Ｃ１３６およびＣ１７１；Ｃ１３６およびＣ４１２；Ｃ１７１およびＣ４１２；Ｃ１０９、Ｃ１１４およびＣ１３６；Ｃ１０９、Ｃ１１４およびＣ１７１；Ｃ１０９、Ｃ１１４およびＣ４１２；Ｃ１０９、Ｃ１３６およびＣ１７１；Ｃ１０９、Ｃ１３６およびＣ４１２；Ｃ１０９、Ｃ１７１およびＣ４１２；Ｃ１１４、Ｃ１３６およびＣ１７１；Ｃ１１４、Ｃ１３６およびＣ４１２；Ｃ１１４、Ｃ１７１およびＣ４１２；Ｃ１３６、Ｃ１７１およびＣ４１２；Ｃ１０９、Ｃ１１４、Ｃ１３６およびＣ１７１；Ｃ１０９、Ｃ１１４、Ｃ１３６およびＣ４１２；Ｃ１０９、Ｃ１１４、Ｃ１７１およびＣ４１２；Ｃ１０９、Ｃ１３６、Ｃ１７１およびＣ４１２；Ｃ１１４、Ｃ１３６、Ｃ１７１およびＣ４１２；またはＣ１０９、Ｃ１１４、Ｃ１３６、Ｃ１７１およびＣ４１２を含み得る。
【０１９２】
本発明のヘリカーゼは、好ましくは、少なくとも１つのシステイン残基（すなわち１つまたは複数のシステイン残基）および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸（すなわち１つまたは複数の非天然アミノ酸）がタワードメインだけに導入されたものである。好適な修飾は上に考察されている。
【０１９３】
本発明のヘリカーゼは、次の変異：
−  Ｅ９３ＣおよびＫ３６４Ｃ；
−  Ｅ９４ＣおよびＫ３６４Ｃ；
−  Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｌ９７ＣおよびＥ３６１Ｃ；
−  Ｌ９７ＣおよびＥ３６１ＣおよびＣ４１２Ａ；
−  Ｋ１２３ＣおよびＥ３６１Ｃ；
−  Ｋ１２３Ｃ、Ｅ３６１ＣおよびＣ４１２Ａ；
−  Ｎ１５５ＣおよびＫ３５８Ｃ；
−  Ｎ１５５Ｃ、Ｋ３５８ＣおよびＣ４１２Ａ；
−  Ｎ１５５ＣおよびＬ３５４Ｃ；
−  Ｎ１５５Ｃ、Ｌ３５４ＣおよびＣ４１２Ａ；
−  ｄｅｌｔａＥ９３、Ｅ９４Ｃ、ｄｅｌｔａＮ９５およびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、ｄｅｌｔａＮ９５およびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｑ１００Ｃ、Ｉ１２７ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｌ３５４Ｃ；
−  Ｇ３５７Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｇ３５７ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｙ２７９ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｉ２８１ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｙ２７９ＦａｚおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｙ２７９ＣおよびＧ３５７Ｃ；
−  Ｉ２８１ＣおよびＧ３５７Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｙ２７９Ｃ、Ｇ３５７ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｉ２８１Ｃ、Ｇ３５７ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ８Ｒ、Ｅ４７Ｋ、Ｅ９４Ｃ、Ｄ２０２ＫおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｄ５Ｋ、Ｅ２３Ｎ、Ｅ９４Ｃ、Ｄ１６７Ｋ、Ｅ１７２Ｒ、Ｄ２１２ＲおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｄ５Ｋ、Ｅ８Ｒ、Ｅ２３Ｎ、Ｅ４７Ｋ、Ｅ９４Ｃ、Ｄ１６７Ｋ、Ｅ１７２Ｒ、Ｄ２０２Ｋ、Ｄ２１２ＲおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｃ１１４Ａ、Ｃ１７１Ａ、Ａ３６０ＣおよびＣ４１２Ｄ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｃ１１４Ａ、Ｃ１７１Ａ、Ａ３６０ＣおよびＣ４１２Ｓ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｃ１０９Ａ、Ｃ１３６ＡおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｃ１０９Ａ、Ｃ１１４Ａ、Ｃ１３６Ａ、Ｃ１７１Ａ、Ａ３６０ＣおよびＣ４１２Ｓ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｃ１０９Ｖ、Ｃ１１４Ｖ、Ｃ１７１Ａ、Ａ３６０ＣおよびＣ４１２Ｓ；
−  Ｃ１０９Ａ、Ｃ１１４Ａ、Ｃ１３６Ａ、Ｇ１５３Ｃ、Ｃ１７１Ａ、Ｅ３６１ＣおよびＣ４１２Ａ；
−  Ｃ１０９Ａ、Ｃ１１４Ａ、Ｃ１３６Ａ、Ｇ１５３Ｃ、Ｃ１７１Ａ、Ｅ３６１ＣおよびＣ４１２Ｄ；
−  Ｃ１０９Ａ、Ｃ１１４Ａ、Ｃ１３６Ａ、Ｇ１５３Ｃ、Ｃ１７１Ａ、Ｅ３６１ＣおよびＣ４１２Ｓ；
−  Ｃ１０９Ａ、Ｃ１１４Ａ、Ｃ１３６Ａ、Ｇ１５３Ｃ、Ｃ１７１Ａ、Ｋ３５８ＣおよびＣ４１２Ａ；
−  Ｃ１０９Ａ、Ｃ１１４Ａ、Ｃ１３６Ａ、Ｇ１５３Ｃ、Ｃ１７１Ａ、Ｋ３５８ＣおよびＣ４１２Ｄ
−  Ｃ１０９Ａ、Ｃ１１４Ａ、Ｃ１３６Ａ、Ｇ１５３Ｃ、Ｃ１７１Ａ、Ｋ３５８ＣおよびＣ４１２Ｓ；
−  Ｃ１０９Ａ、Ｃ１１４Ａ、Ｃ１３６Ａ、Ｎ１５５Ｃ、Ｃ１７１Ａ、Ｋ３５８ＣおよびＣ４１２Ａ；
−  Ｃ１０９Ａ、Ｃ１１４Ａ、Ｃ１３６Ａ、Ｎ１５５Ｃ、Ｃ１７１Ａ、Ｋ３５８ＣおよびＣ４１２Ｄ；
−  Ｃ１０９Ａ、Ｃ１１４Ａ、Ｃ１３６Ａ、Ｎ１５５Ｃ、Ｃ１７１Ａ、Ｋ３５８ＣおよびＣ４１２Ｓ；
−  Ｃ１０９Ａ、Ｃ１１４Ａ、Ｃ１３６Ａ、Ｎ１５５Ｃ、Ｃ１７１Ａ、Ｌ３５４ＣおよびＣ４１２Ａ；
−  Ｃ１０９Ａ、Ｃ１１４Ａ、Ｃ１３６Ａ、Ｎ１５５Ｃ、Ｃ１７１Ａ、Ｌ３５４ＣおよびＣ４１２Ｄ；
−  Ｃ１０９Ａ、Ｃ１１４Ａ、Ｃ１３６Ａ、Ｎ１５５Ｃ、Ｃ１７１Ａ、Ｌ３５４ＣおよびＣ４１２Ｓ；
−  Ｃ１０９Ａ、Ｃ１１４Ａ、Ｋ１２３Ｃ、Ｃ１３６Ａ、Ｃ１７１Ａ、Ｅ３６１ＣおよびＣ４１２Ａ；
−  Ｃ１０９Ａ、Ｃ１１４Ａ、Ｋ１２３Ｃ、Ｃ１３６Ａ、Ｃ１７１Ａ、Ｅ３６１ＣおよびＣ４１２Ｄ；
−  Ｃ１０９Ａ、Ｃ１１４Ａ、Ｋ１２３Ｃ、Ｃ１３６Ａ、Ｃ１７１Ａ、Ｅ３６１ＣおよびＣ４１２Ｓ；
−  Ｃ１０９Ａ、Ｃ１１４Ａ、Ｋ１２３Ｃ、Ｃ１３６Ａ、Ｃ１７１Ａ、Ｋ３５８ＣおよびＣ４１２Ａ；
−  Ｃ１０９Ａ、Ｃ１１４Ａ、Ｋ１２３Ｃ、Ｃ１３６Ａ、Ｃ１７１Ａ、Ｋ３５８ＣおよびＣ４１２Ｄ；
−  Ｃ１０９Ａ、Ｃ１１４Ａ、Ｋ１２３Ｃ、Ｃ１３６Ａ、Ｃ１７１Ａ、Ｋ３５８ＣおよびＣ４１２Ｓ；
−  Ｃ１０９Ａ、Ｃ１１４Ａ、Ｃ１３６Ａ、Ｇ１５３Ｃ、Ｃ１７１Ａ、Ｅ３６１ＣおよびＣ４１２Ａ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｃ１０９Ａ、Ｃ１１４Ａ、Ｃ１３６Ａ、Ｃ１７１Ａ、Ａ３６０ＣおよびＣ４１２Ｄ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｃ１０９Ａ、Ｃ１１４Ｖ、Ｃ１３６Ａ、Ｃ１７１Ａ、Ａ３６０ＣおよびＣ４１２Ｄ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｃ１０９Ｖ、Ｃ１１４Ａ、Ｃ１３６Ａ、Ｃ１７１Ａ、Ａ３６０ＣおよびＣ４１２Ｄ；
−  Ｌ９７Ｃ、Ｃ１０９Ａ、Ｃ１１４Ａ、Ｃ１３６Ａ、Ｃ１７１Ａ、Ｅ３６１ＣおよびＣ４１２Ａ；
−  Ｌ９７Ｃ、Ｃ１０９Ａ、Ｃ１１４Ａ、Ｃ１３６Ａ、Ｃ１７１Ａ、Ｅ３６１ＣおよびＣ４１２Ｄ；または
−  Ｌ９７Ｃ、Ｃ１０９Ａ、Ｃ１１４Ａ、Ｃ１３６Ａ、Ｃ１７１Ａ、Ｅ３６１ＣおよびＣ４１２Ｓ
を含んでいる配列番号８の変種を好ましくは含む。
【０１９４】
フックドメインおよび／または２Ａドメイン中の修飾
一実施形態では本発明のヘリカーゼは、少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸がフックドメインおよび／または２Ａ（ＲｅｃＡ様モーター）ドメインに導入されているものであって、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有しているものである。少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸は、フックドメインおよび２Ａ（ＲｅｃＡ様モーター）ドメインに好ましくは導入されている。
【０１９５】
任意の数のシステイン残基および／または非天然アミノ酸が各ドメインに導入され得る。例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれ以上のシステイン残基が導入されてよく、および／または１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれ以上の非天然アミノ酸が導入されてよい。１つまたは複数のシステイン残基だけが導入されてよい。１つまたは複数の非天然アミノ酸だけが導入されてよい。１つまたは複数のシステイン残基と１つまたは複数の非天然アミノ酸との組合せが導入されてよい。
【０１９６】
少なくとも１つのシステイン残基および／または少なくとも１つの非天然アミノ酸は、置換によって好ましくは導入される。これを行うための方法は、当技術分野において公知である。フックドメインおよび／または２Ａ（ＲｅｃＡ様モーター）ドメインの好適な修飾は、上に考察されている。
【０１９７】
本発明のヘリカーゼは、好ましくは（ａ）Ｙ２７９Ｃ、Ｉ１８１Ｃ、Ｅ２８８Ｃ、Ｙ２７９ＣおよびＩ１８１Ｃ、（ｂ）Ｙ２７９ＣおよびＥ２８８Ｃ、（ｃ）Ｉ１８１ＣおよびＥ２８８Ｃまたは（ｄ）Ｙ２７９Ｃ、Ｉ１８１ＣおよびＥ２８８Ｃを含む配列番号８の変種である。本発明のヘリカーゼは、（ａ）から（ｄ）に定義の配列番号８中のものに対応する１つまたは複数の位置（複数可）に変異を含む配列番号９から２３のいずれか１つの変種を好ましくは含む。
【０１９８】
表面修飾
一実施形態ではヘリカーゼは、その表面負電荷を低減するように修飾され、ヘリカーゼは、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有している。好適な修飾は、上に考察されている。任意の数の表面負電荷は、中和されてよい。
【０１９９】
本発明のヘリカーゼは、次の変異：
−  Ｅ２７３Ｇ；
−  Ｅ８Ｒ、Ｅ４７ＫおよびＤ２０２Ｋ；
−  Ｄ５Ｋ、Ｅ２３Ｎ、Ｄ１６７Ｋ、Ｅ１７２ＲおよびＤ２１２Ｒ；または
−  Ｄ５Ｋ、Ｅ８Ｒ、Ｅ２３Ｎ、Ｅ４７Ｋ、Ｄ１６７Ｋ、Ｅ１７２Ｒ、Ｄ２０２ＫおよびＤ２１２Ｒ
を含む配列番号８の変種を好ましくは含む。
【０２００】
他の修飾ヘリカーゼ
一実施形態では本発明のヘリカーゼは：
−  Ａ３６０Ｋ；
−  Ｙ９２Ｌおよび／またはＡ３６０Ｙ；
−  Ｙ９２Ｌ、Ｙ３５０ＮおよびＹ３６３Ｎ；
−  Ｙ９２Ｌおよび／またはＹ３６３Ｎ；または
−  Ｙ９２Ｌ
を含む配列番号８の変種を好ましくは含む。
【０２０１】
他の修飾
上に考察の特異的変異に加えて配列番号８の変種は、１つまたは複数の次の変異：
−  Ｋ３８Ａ；
−  Ｔ９１Ｆ；
−  Ｔ９１Ｎ；
−  Ｔ９１Ｑ；
−  Ｔ９１Ｗ；
−  Ｖ９６Ｅ；
−  Ｖ９６Ｆ；
−  Ｖ９６Ｌ
−  Ｖ９６Ｑ；
−  Ｖ９６Ｒ；
−  Ｖ９６Ｗ；
−  Ｖ９６Ｙ；
−  Ｐ２７４Ｇ；
−  Ｖ２８６Ｆ；
−  Ｖ２８６Ｗ；
−  Ｖ２８６Ｙ；
−  Ｆ２９１Ｇ；
−  Ｎ２９２Ｆ；
−  Ｎ２９２Ｇ；
−  Ｎ２９２Ｐ；
−  Ｎ２９２Ｙ；
−  Ｇ２９４Ｙ；
−  Ｇ２９４Ｆ；
−  Ｋ３６４Ａ；および
−  Ｗ３７８Ａ
を変種を含んでよい。
【０２０２】
上に開示の具体的な変異に加えて配列番号８の変種は、以下を含んでよい：
−  Ｋ３８Ａ、Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｈ６４Ｋ；Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｈ６４Ｎ；Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｈ６４Ｑ；Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｈ６４Ｓ；Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｈ６４Ｗ、Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｔ８０Ｋ、Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｔ８０Ｋ、Ｓ８３Ｋ、Ｅ９４Ｃ、Ｎ２４２Ｋ、Ｎ２９３ＫおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｔ８０Ｋ、Ｓ８３Ｋ、Ｅ９４Ｃ、Ｎ２４２Ｋ、Ｎ２９３Ｋ、Ａ３６０ＣおよびＴ３９４Ｋ；
−  Ｔ８０Ｋ、Ｓ８３Ｋ、Ｅ９４Ｃ、Ｎ２９３ＫおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｔ８０Ｋ、Ｓ８３Ｋ、Ｅ９４Ｃ、Ａ３６０ＣおよびＴ３９４Ｋ；
−  Ｔ８０Ｋ、Ｓ８３Ｋ、Ｅ９４Ｃ、Ａ３６０ＣおよびＴ３９４Ｎ；
−  Ｔ８０Ｋ、Ｅ９４Ｃ、Ｎ２４２ＫおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｔ８０Ｋ、Ｅ９４Ｃ、Ｎ２４２Ｋ、Ｎ２９３ＫおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｔ８０Ｋ、Ｅ９４Ｃ、Ｎ２９３ＫおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｔ８０Ｎ、Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｈ８２Ａ、Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｈ８２Ａ、Ｐ８９Ａ、Ｅ９４Ｃ、Ｆ９８ＡおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｈ８２Ｆ、Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｈ８２Ｑ、Ｅ９４Ｃ、Ａ３６０Ｃ；
−  Ｈ８２Ｒ、Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｈ８２Ｗ、Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｈ８２Ｗ、Ｐ８９Ｗ、Ｅ９４Ｃ、Ｆ９８ＷおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｈ８２Ｙ、Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｓ８３Ｋ、Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｓ８３Ｋ、Ｔ８０Ｋ、Ｅ９４Ｃ、Ａ３６０ＣおよびＴ３９４Ｋ；
−  Ｓ８３Ｎ、Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｓ８３Ｔ、Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｎ８８Ｈ、Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｎ８８Ｑ、Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｐ８９Ａ、Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｐ８９Ａ、Ｆ９８Ｗ、Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｐ８９Ａ、Ｅ９４Ｃ、Ｆ９８ＹおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｐ８９Ａ、Ｅ９４Ｃ、Ｆ９８ＡおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｐ８９Ｆ、Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｐ８９Ｓ、Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｐ８９Ｔ、Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｐ８９Ｗ、Ｅ９４Ｃ、Ｆ９８ＷおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｐ８９Ｙ、Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｔ９１Ｆ、Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｔ９１Ｎ、Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｔ９１Ｑ、Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｔ９１Ｗ、Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｖ９６ＥおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｖ９６ＦおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｖ９６ＬおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｖ９６ＱおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｖ９６ＲおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｖ９６ＷおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｖ９６ＹおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｆ９８ＡおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｆ９８ＬおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｆ９８ＶおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｆ９８ＹおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ；Ｆ９８ＷおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｖ１５０ＡおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｖ１５０ＦおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｖ１５０ＩおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｖ１５０ＫおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｖ１５０ＬおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｖ１５０ＳおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｖ１５０ＴおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｖ１５０ＷおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｖ１５０ＹおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｆ２４０ＹおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｆ２４０ＷおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｎ２４２ＫおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｎ２４２Ｋ、Ｎ２９３ＫおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｐ２７４ＧおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｌ２７５ＧおよびＡ３６０Ｃ
−  Ｅ９４Ｃ、Ｆ２７６ＡおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｆ２７６ＩおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｆ２７６ＭおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｆ２７６ＶおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｆ２７６ＷおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｆ２７６ＹおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｖ２８６ＦおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｖ２８６ＷおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｖ２８６ＹおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｓ２８７ＦおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｓ２８７ＷおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｓ２８７ＹおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｆ２９１ＧおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｎ２９２ＦおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｎ２９２ＧおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｎ２９２ＰおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｎ２９２ＹおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｎ２９３ＦおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｎ２９３ＫおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｎ２９３ＱおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｎ２９３ＹおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｇ２９４ＦおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ｇ２９４ＹおよびＡ３６０Ｃ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ａ３６ＣおよびＫ３６４Ａ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ａ３６０Ｃ、Ｗ３７８Ａ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ａ３６０ＣおよびＴ３９４Ｋ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ａ３６０ＣおよびＨ３９６Ｑ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ａ３６０ＣおよびＨ３９６Ｓ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ａ３６０ＣおよびＨ３９６Ｗ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ａ３６０ＣおよびＹ４１５Ｆ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ａ３６０ＣおよびＹ４１５Ｋ；
−  Ｅ９４Ｃ、Ａ３６０ＣおよびＹ４１５Ｍ；または
−  Ｅ９４Ｃ、Ａ３６０ＣおよびＹ４１５Ｗ。
【０２０３】
本発明のヘリカーゼは、（ａ）Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ／Ｗ３７８Ａ、または（ｂ）Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｗ３７８Ａまたは（ｄ）Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｗ３７８Ａおよびさらに（ΔＭ１）Ｇ１Ｇ２（すなわちＭ１の欠失ならびにさらにＧ１およびＧ２付加）を含む配列番号８の変種を好ましくは含む。
【０２０４】
配列番号８から２３のいずれか１つの好ましい変種は（本発明の修飾に加えて）１つのグリシン残基（Ｇ）で置き換えられたＮ末端メチオニン（Ｍ）を有する。実施例においてこれは、（ΔＭ１）Ｇ１として示される。これは、Ｍ１Ｇと称される場合もある。上に考察の変種のいずれかは、Ｍ１Ｇをさらに含んでよい。
【０２０５】
本発明の最も好ましいヘリカーゼは（ａ）Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ａ３６０Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｋ１９４Ｌ、（ｂ）Ｍ１Ｇ／Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ａ３６０Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｋ１９４Ｌ、（ｃ）Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ａ３６０Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｋ１９９Ｌまたは（ｄ）Ｍ１Ｇ／Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ａ３６０Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｋ１９９Ｌを含む配列番号８の変種を含む。
【０２０６】
変種
ヘリカーゼの変種は、野生型ヘリカーゼのものから変化しており、ポリヌクレオチド結合活性を有しているアミノ酸配列を有する酵素である。具体的には配列番号８から２３のいずれか１つの変種は、配列番号８から２３のいずれか１つのものから変化しており、ポリヌクレオチド結合活性を有しているアミノ酸配列を有する酵素である。ポリヌクレオチド結合活性は、当技術分野において公知の任意の方法を使用して決定できる。好適な方法は、これだけに限らないが、蛍光偏光測定、トリプトファン蛍光および電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を含む。例えば１本鎖ポリヌクレオチドに結合する変種の能力は、実施例に記載のとおり決定できる。
【０２０７】
変種はヘリカーゼ活性を有している。これは、種々の方法において測定できる。例えばポリヌクレオチドに沿って移行させる変種の能力は電気生理化学、蛍光アッセイまたはＡＴＰ加水分解を使用して測定され得る。
【０２０８】
変種は、ヘリカーゼをコードするポリヌクレオチドの操作を促進するならびに／または高塩濃度および／もしくは室温でのその活性を促進する修飾を含む場合がある。
【０２０９】
配列番号８から２３のいずれか１つのアミノ酸配列全長にわたって、変種は、アミノ酸類似性または同一性に基づいてその配列に好ましくは少なくとも２０％相同性である。より好ましくは変種ポリペプチドは、配列番号８から２３のいずれか１つのアミノ酸配列に配列全体にわたるアミノ酸同一性に基づいて少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同性である。１００個またはそれ以上、例えば１５０個、２００個、３００個、４００個または５００個またはそれ以上の近接アミノ酸のストレッチにわたって少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％、アミノ酸同一性がある（「高い相同性」）。相同性は、下に記載の通り決定される。変種は、配列番号２および４を参照して下に考察する任意の方法で野生型配列とは異なっていてよい。具体的には上に考察の特異的修飾に加えて配列番号８から２３のいずれか１つの変種は、下に考察の１つまたは複数の置換、１つまたは複数の欠失および／または１つまたは複数の付加を含んでよい。
【０２１０】
配列番号８から２３のいずれか１つの好ましい変種は、アミノ（Ｎ）末端におよび／またはカルボキシ（Ｃ）末端にＦａｚなどの非天然アミノ酸を有する。配列番号８から２３のいずれか１つの好ましい変種は、アミノ（Ｎ）末端および／またはカルボキシ（Ｃ）末端にシステイン残基を有する。配列番号８から２３のいずれか１つの好ましい変種は、システイン残基をアミノ（Ｎ）端に、およびＦａｚなどの非天然アミノ酸をカルボキシ（Ｃ）末端にまたは逆に有する。
【０２１１】
配列番号８の好ましい変種は、次の修飾Ｅ５４Ｇ、Ｄ１５１Ｅ、Ｉ１９６ＮおよびＧ３５７Ａの全てなどの１つまたは複数を含有する。
【０２１２】
非接続
好ましい一実施形態では、本発明の修飾ヘリカーゼ中の導入されたシステインおよび／または非天然アミノ酸は、いずれも互いに繋がれていない。
【０２１３】
２つ以上の導入されたシステインおよび／または非天然アミノ酸を繋ぐステップ
別の好ましい実施形態では、本発明の修飾ヘリカーゼ中の２つ以上の導入されたシステインおよび／または非天然アミノ酸は、互いに繋がれている。これは、典型的にはポリヌクレオチドから解離する本発明のヘリカーゼの能力を低減する。
【０２１４】
２つ以上の導入されたシステインおよび／または非天然アミノ酸の任意の数および組合せは、互いに繋がれていてよい。例えば３個、４個、５個、６個、７個、８個またはそれ以上のシステインおよび／または非天然アミノ酸は、互いに繋がれてよい。１つまたは複数のシステインは、１つまたは複数のシステインに繋がれてよい。１つまたは複数のシステインは、Ｆａｚなどの１つまたは複数の非天然アミノ酸に繋がれてよい。Ｆａｚなどの１つまたは複数の非天然アミノ酸は、Ｆａｚなどの１つまたは複数の非天然アミノ酸に繋がれてよい。
【０２１５】
２つ以上のシステインおよび／または非天然アミノ酸は、任意の方法で繋がれてよい。接続は、一過的、例えば非共有結合であってよい。一過的接続でさえヘリカーゼからのポリヌクレオチドの解離を低減する。
【０２１６】
２つ以上のシステインおよび／または非天然アミノ酸は、親和性分子によって好ましくは繋がれている。好適な親和性分子は、当技術分野において公知である。親和性分子は、好ましくは、（ａ）相補的ポリヌクレオチド（国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３２号（国際公開第２０１０／０８６６０２号パンフレットとして公開）、（ｂ）抗体またはその断片および相補的エピトープ（Biochemistry 6thEd, W.H. Freeman and co (2007) pp953-954）、（ｃ）ペプチドジッパー（OShea et al., Science 254 (5031): 539-544）、（ｄ）β−シート増強により相互作用できる（Remaut and Waksman Trends Biochem. Sci. (2006) 31 436-444）、（ｅ）水素結合、ｐｉ−スタッキングまたは塩橋形成できる、（ｆ）ロタキサン（Xiang Ma and He Tian Chem. Soc. Rev., 2010,39, 70-80）、（ｇ）アプタマーおよび相補的タンパク質（James, W. in Encyclopedia of Analytical Chemistry, R.A. Meyers (Ed.) pp. 4848-4871 John Wiley & Sons Ltd, Chichester、2000）または（ｈ）ハーフキレーター（half-chelator）（Hammerstein et al. J Biol Chem. 2011 April 22; 286(16): 14324-14334）である。（ｅ）に関して水素結合は電気陰性原子に結合したプロトンと別の電気陰性原子との間に生じる。ｐｉ−スタッキングは、環の平面が平行である場合に互いにスタックできる２つの芳香族環を必要とする。塩橋は、それらの電子をいくつかの原子に非局在化できる基の間、例えばアスパラギン酸とアルギニンとの間にある。
【０２１７】
２つ以上の部分は、ヘキサｈｉｓタグまたはＮｉ−ＮＴＡによって一過的に繋がれる場合がある。
【０２１８】
２つ以上のシステインおよび／または非天然アミノ酸は、好ましくは持続的に繋がれている。本発明の内容では、ヘリカーゼが使用されている間に破壊されないまたは−Ｓ−Ｓ−結合を開くための還元を使用するなどの、使用者の部分への介入なしには破壊されない場合に接続は永久的である。
【０２１９】
２つ以上のシステインおよび／または非天然アミノ酸は、好ましくは共有結合的に付着される。２つ以上のシステインおよび／または非天然アミノ酸は、当技術分野において公知の任意の方法を使用して共有結合的に付着されてよい。
【０２２０】
２つ以上のシステインおよび／または非天然アミノ酸は、システイン、スレオニン、セリン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸およびグルタミンなどのそれらの天然に存在するアミノ酸を介して共有結合的に付着されてよい。天然に存在するアミノ酸は、付着を促進するために修飾されてよい。例えば天然に存在するアミノ酸は、アシル化、リン酸化、グリコシル化またはファルネシル化によって修飾されてよい。他の好適な修飾は、当技術分野において公知である。天然に存在するアミノ酸への修飾は、翻訳後修飾であってよい。２つ以上のシステインおよび／または非天然アミノ酸は、それらの配列に導入されたアミノ酸を介して付着されてよい。そのようなアミノ酸は、好ましくは置換によって導入される。導入されるアミノ酸は、システインまたは付着を促進する非天然アミノ酸であってよい。好適な非天然アミノ酸は、これだけに限らないが、４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆａｚ）、Liu C. C. and Schultz P. G., Annu. Rev. Biochem., 2010, 79, 413-444の図１に含まれている１〜７１と番号付けられたアミノ酸のいずれか１つまたは下に列挙するアミノ酸のいずれか１つを含む。導入されるアミノ酸は、上に考察したとおり修飾されてよい。
【０２２１】
好ましい実施形態では、２つ以上のシステインおよび／または非天然アミノ酸は、リンカーを使用して繋がれている。リンカー分子は、下により詳細に考察される。接続の１つの好適な方法は、システイン連結である。これは下でより詳細に考察される。２つ以上のシステインおよび／または非天然アミノ酸は、１つまたは複数、２つまたは３つなどのリンカーを使用して好ましくは繋がれている。１つまたは複数のリンカーは、上に考察したとおり開口部のサイズを低減するまたは閉じるように設計されてよい。１つまたは複数のリンカーが上に考察したとおり開口部を閉じるために使用される場合、１つまたは複数のリンカーの少なくとも部分は、ヘリカーゼに結合した際にポリヌクレオチドと平行ではないように好ましくは方向付けられる。より好ましくは全てのリンカーは、この様式で方向付けられる。１つまたは複数のリンカーが上に考察したとおり開口部を閉じるために使用される場合、１つまたは複数のリンカーの少なくとも部分は、好ましくはヘリカーゼに結合した際にポリヌクレオチドと平行ではない方向で開口部に交差している。より好ましくは全てのリンカーがこの様式で開口部に交差している。これらの実施形態では１つまたは複数のリンカーの少なくとも部分は、ポリヌクレオチドに垂直であってよい。そのような方向は、ポリヌクレオチドが開口部を通ってヘリカーゼから解離できないように開口部を効果的に閉じる。
【０２２２】
各リンカーは、２個、３個または４個の機能末端などの２個以上の機能末端を有する場合がある。リンカーにおける末端の好適な立体配置は当技術分野において十分公知である。
【０２２３】
１つまたは複数のリンカーの１つまたは複数の末端は、好ましくはヘリカーゼに共有結合的に付着している。一方の末端が共有結合的に付着されている場合、１つまたは複数のリンカーは、上に考察したとおり２つ以上のシステインおよび／または非天然アミノ酸を一過的に繋いでよい。両方または全ての末端が共有結合的に付着されている場合、１つまたは複数のリンカーは、２つ以上のシステインおよび／または非天然アミノ酸を持続的に繋ぐ。
【０２２４】
１つまたは複数のリンカーは、好ましくはアミノ酸配列および／または化学的架橋剤である。
【０２２５】
ペプチドリンカーなどの好適なアミノ酸リンカーは、当技術分野において公知である。アミノ酸またはペプチドリンカーの長さ、可動性および親水性は、開口部のサイズを低減するが、ヘリカーゼの機能を妨害しないように典型的には設計される。好ましい可動性ペプチドリンカーは４、６、８、１０または１６などの２から２０のセリンおよび／またはグリシンアミノ酸のストレッチである。より好ましい可動性リンカーは（ＳＧ）１、（ＳＧ）２、（ＳＧ）３、（ＳＧ）４、（ＳＧ）５、（ＳＧ）８、（ＳＧ）１０、（ＳＧ）１５または（ＳＧ）２０を含み、式中Ｓはセリンであり、Ｇはグリシンである。好ましい硬いリンカーは、４、６、８、１６または２４などの２から３０のプロリンアミノ酸のストレッチである。より好ましい硬いリンカーは（Ｐ）１２を含み、式中Ｐはプロリンである。リンカーのアミノ酸配列は、好ましくはポリヌクレオチド結合成分を含む。そのような成分およびそれらの使用に関連する有利点は、下に考察される。
【０２２６】
好適な化学的架橋剤は、当技術分野において十分公知である。好適な化学的架橋剤は、これだけに限らないが、次の官能基: マレイミド、活性エステル、サクシニミド、アジド、アルキン（ジベンゾシクロオクチノール（ＤＩＢＯまたはＤＢＣＯ）、ジフルオロシクロアルカンおよび直鎖アルカンなど）、ホスフィン（無痕跡および無痕跡でないシュタウディンガーライゲーションにおいて使用されるものなど）、ハロアセチル（ヨードアセトアミドなど）、ホスゲン型試薬、スルホニルクロリド試薬、イソチオシアン酸、ハロゲン化アシル、ヒドラジン、ジスルフィド、ビニルスルホン、アジリジンおよび光反応性試薬（アリールアジド、ジアジリジンなど）を含むものを含む。
【０２２７】
システイン／マレイミドなど、アミノ酸と官能基との間の反応は自発的であってよく、またはアジドと直鎖状アルキンを連結するためのＣｕ（Ｉ）など、他の試薬を必要としてよい。
【０２２８】
リンカーは、必要な距離にわたって伸びる任意の分子を含んでよい。リンカーは、炭素１個（ホスゲン型リンカー）から多数のオングストロームに長さが変化できる。直鎖状分子の例に含まれるのは、これだけに限らないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリペプチド、多糖、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、飽和および不飽和炭化水素、ポリアミドである。これらのリンカーは不活性または反応性であってよく、具体的にはそれらは、規定の位置で化学的に切断可能であってよい、またはフルオロフォアもしくはリガンドでそれ自体が修飾されてよい。リンカーは、好ましくはジチオスレイトール（dithiothreitol）（ＤＴＴ）に抵抗性である。
【０２２９】
好ましい架橋剤は、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル３−（ピリジン−２−イルジスルファニル）プロパノエート、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル４−（ピリジン−２−イルジスルファニル）ブタノエートおよび２，５−ジオキソピロリジン−１−イル８−（ピリジン−２−イルジスルファニル）オクタノエート、ジ−マレイミドＰＥＧ  １ｋ、ジ−マレイミドＰＥＧ  ３．４ｋ、ジ−マレイミドＰＥＧ  ５ｋ、ジ−マレイミドＰＥＧ  １０ｋ、ビス（マレイミド）エタン（ＢＭＯＥ）、ビス−マレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、１，４−ビス−マレイミドブタン（ＢＭＢ）、１，４ビス−マレイミジル−２，３−ジヒドロキシブタン（ＢＭＤＢ）、ＢＭ［ＰＥＯ］２（１，８−ビス−マレイミドジエチレングリコール）、ＢＭ［ＰＥＯ］３（１，１１−ビス−マレイミドトリエチレングリコール）、トリス［２−マレイミドエチル］アミン（ＴＭＥＡ）、ＤＴＭＥジチオビスマレイミドエタン、ビスマレイミドＰＥＧ３、ビスマレイミドＰＥＧ１１、ＤＢＣＯ−マレイミド、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−マレイミド、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨ２、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨＳ、ＤＢＣＯ−ＮＨＳ、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ−ＤＢＣＯ  ２．８ｋＤａ、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ−ＤＢＣＯ  ４．０ｋＤａ、ＤＢＣＯ−１５原子−ＤＢＣＯ、ＤＢＣＯ−２６原子−ＤＢＣＯ、ＤＢＣＯ−３５原子−ＤＢＣＯ、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−Ｓ−Ｓ−ＰＥＧ３−ビオチン、ＤＢＣＯ−Ｓ−Ｓ−ＰＥＧ３−ビオチン、ＤＢＣＯ−Ｓ−Ｓ−ＰＥＧ１１−ビオチン、（サクシニジミル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸（ＳＰＤＰ）およびマレイミド−ＰＥＧ（２ｋＤａ）−マレイミド（アルファ、オメガ−ビス−マレイミドポリ（エチレングリコール））を含む。最も好ましい架橋剤は、マレイミド−プロピル−ＳＲＤＦＷＲＳ−（１，２−ジアミノエタン）−プロピル−マレイミドである。
【０２３０】
１つまたは複数のリンカーは、切断可能であってよい。これは下でより詳細に考察される。
【０２３１】
２つ以上のシステインおよび／または非天然アミノ酸は、互いに特異的である２つの異なるリンカーを使用して繋がれてよい。リンカーの１つは、一部に付着されており、他方は別の一部に付着されている。リンカーは、本発明の修飾ヘリカーゼを形成するように反応するはずである。２つ以上のシステインおよび／または非天然アミノ酸は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３２号（国際公開第２０１０／０８６６０２号パンフレットとして公開）に記載のハイブリダイゼーションリンカーを使用して繋がれてよい。具体的には２つ以上のシステインおよび／または非天然アミノ酸は、ハイブリダイズ可能な領域および共有結合を形成できる基をそれぞれ含む２つ以上のリンカーを使用して繋がれてよい。リンカー中のハイブリダイズ可能な領域は、２つ以上のシステインおよび／または非天然アミノ酸とハイブリダイズし、連結する。連結したシステインおよび／または非天然アミノ酸は、次いで基の間の共有結合の形成を介してカップルする。国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３２号（国際公開第２０１０／０８６６０２号パンフレットとして公開）に開示の任意の特異的リンカーは、本発明により使用できる。
【０２３２】
２つ以上のシステインおよび／または非天然アミノ酸は、修飾されてよく、次いで２つの修飾に特異的である化学的架橋剤を使用して付着され得る。上に考察の任意の架橋剤は使用され得る。
【０２３３】
リンカーは、標識されてよい。好適な標識は、これだけに限らないが、蛍光分子（Ｃｙ３またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５５５など）、放射性同位元素、例えば  １２５Ｉ、３５Ｓ、酵素、抗体、抗原、ポリヌクレオチドおよび、ビオチンなどのリガンドを含む。そのような標識は、リンカーの量を定量できるようにする。標識は、ビオチンなどの切断可能な精製タグ、またはタンパク質自体には存在しないがトリプシン消化によって遊離されるペプチドなどの同定方法において明らかになる特異的配列であってもよい。
【０２３４】
２つ以上のシステインを繋ぐ好ましい方法は、システイン連結を介する。これは、二機能性化学的架橋剤により、または末端に存在するシステイン残基を有するアミノ酸リンカーにより調節できる。
【０２３５】
任意の二機能性リンカーの長さ、反応性、特異性、硬さおよび溶解度は、開口部のサイズが十分に低減され、ヘリカーゼの機能が保持されることを確実にするように設計される場合がある。好適なリンカーは、１，４−ビス（マレイミド）ブタン（ＢＭＢ）またはビス（マレイミド）ヘキサンなどのビスマレイミド架橋剤を含む。特異的部位での付着が好ましい場合に、表面の利用可能なシステイン残基への二機能性リンカーの結合は制御することが困難である場合があり、基質結合または活性に影響を与える場合があることから、二機能性リンカーを引き戻すものは、さらなる表面の利用可能なシステイン残基を含まないヘリカーゼの必要性である。ヘリカーゼがいくつかの利用可能なシステイン残基を含有する場合は、修飾がヘリカーゼのフォールディングまたは活性に影響を与えないことを確実にしながら、それらを除去するためにヘリカーゼの修飾が必要である場合がある。これは、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（国際公開第２０１０／０８６６０３号パンフレットとして公開）において考察されている。システイン残基の反応性は隣接残基の、例えばペプチドリンカー上の修飾によって増強できる。例えば近接するアルギニン、ヒスチジンまたはリシン残基の塩基性基は、システインチオール基のｐＫａをさらに反応性のＳ−基のものに変化させる。システイン残基の反応性は、５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）（ｄＴＮＢ）などのチオール保護基によって保護できる。これらは、リンカーが付着する前にヘリカーゼの１つまたは複数のシステイン残基と反応できる。表面の利用可能なシステインの選択的脱保護は、ビーズに固定した還元試薬（例えば固定化トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン、ＴＣＥＰ）を使用して可能である。システイン連結は、下により詳細に考察される。
【０２３６】
Ｆａｚ連結を介する付着の別の好ましい方法。これは、二機能性化学的リンカーによって、または末端に存在するＦａｚ残基を有するポリペプチドリンカーによって調節されてよい。
【０２３７】
他の修飾
本発明のヘリカーゼは（ｉ）タワードメインと（ｉｉ）ピンドメインおよび／または１Ａドメインとの間の誘引を増加させるためにも修飾されてよい。任意の公知の化学的修飾は、本発明により作られ得る。これらの種類の修飾は、ＰＣＴ／ＧＢ２０１４／０５２７３６（国際公開第２０１５／０５５９８１号パンフレット）において開示されている。
【０２３８】
具体的には本発明は、少なくとも１つの荷電アミノ酸が（ｉ）タワードメインおよび／または（ｉｉ）ピンドメインおよび／または（ｉｉｉ）１Ａ（ＲｅｃＡ様モーター）ドメインに導入されている本発明のヘリカーゼであって、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有している本発明のヘリカーゼを提供する。ポリヌクレオチドの移動を制御するヘリカーゼの能力は、上に考察したとおり測定され得る。本発明は、少なくとも１つの荷電アミノ酸が（ｉ）タワードメインおよび（ｉｉ）ピンドメインおよび／または１Ａドメインに導入されている本発明のヘリカーゼを好ましくは提供する。
【０２３９】
少なくとも１つの荷電アミノ酸は、負に荷電または正に荷電していてよい。少なくとも１つの荷電アミノ酸は、ヘリカーゼ中で相互作用する任意のアミノ酸（複数可）とは好ましくは逆に荷電している。例えば、少なくとも１つの正に荷電したアミノ酸は、ピンドメイン中の負に荷電したアミノ酸と相互作用する位置でタワードメインに導入されてよい。少なくとも１つの荷電アミノ酸は、野生型（すなわち未修飾）ヘリカーゼ中で荷電していない位置で典型的には導入される。少なくとも１つの荷電アミノ酸は、ヘリカーゼ中の少なくとも１つの逆に荷電したアミノ酸を置き換えるために使用されてよい。例えば正に荷電したアミノ酸は、負に荷電したアミノ酸を置き換えるために使用されてよい。
【０２４０】
好適な荷電アミノ酸は、上に考察されている。少なくとも１つの荷電アミノ酸は、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｄ）などの中性であってよい。代替的に少なくとも１つの荷電アミノ酸は、人工または非天然であってよい。任意の数の荷電アミノ酸は、各ドメインに導入されてよい。例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれ以上の荷電アミノ酸は、各ドメインに導入されてよい。
【０２４１】
ヘリカーゼは、次の位置：（ｉ）９３；（ｉｉ）３５４；（ｉｉｉ）３６０；（ｉｖ）３６１；（ｖ）９４；（ｖｉ）９７；（ｖｉｉ）１５５；（ｖｉｉｉ）３５７；（ｉｘ）１００；および（ｘ）１２７の１つまたは複数に正に荷電したアミノ酸を含む配列番号８の変種を好ましくは含む。ヘリカーゼは、次の位置：（ｉ）３５４；（ｉｉ）３５８；（ｉｉｉ）３６０；（ｉｖ）３６４；（ｖ）９７；（ｖｉ）１２３；（ｖｉｉ）１５５；（ｖｉｉｉ）；３５７；（ｉｘ）１００；および（ｘ）１２７の１つまたは複数に負に荷電したアミノ酸を含む配列番号８の変種を好ましくは含む。ヘリカーゼは、配列番号８における（ｉ）から（ｘ）のいずれかに定義のものに対応する位置に正に荷電したアミノ酸または負に荷電したアミノ酸を含む配列番号９から２３のいずれか１つの変種を好ましくは含む。配列番号８におけるものに対応する配列番号９から２３のいずれか１つの位置は、下の配列番号８から２３の配列比較を使用して同定され得る。
【０２４２】
ヘリカーゼは、次の位置：（ｉ）９３および３５４；（ｉｉ）９３および３５８；（ｉｉｉ）９３および３６０；（ｉｖ）９３および３６１；（ｖ）９３および３６４；（ｖｉ）９４および３５４；（ｖｉｉ）９４および３５８；（ｖｉｉｉ）９４および３６０；（ｉｘ）９４および３６１；（ｘ）９４および３６４；（ｘｉ）９７および３５４；（ｘｉｉ）９７および３５８；（ｘｉｉｉ）９７および３６０；（ｘｉｖ）９７および３６１；（ｘｖ）９７および３６４；（ｘｖｉ）１２３および３５４；（ｘｖｉｉ）１２３および３５８；（ｘｖｉｉｉ）１２３および３６０；（ｘｉｘ）１２３および３６１；（ｘｘ）１２３および３６４；（ｘｘｉ）１５５および３５４；（ｘｘｉｉ）１５５および３５８；（ｘｘｉｉｉ）１５５および３６０；（ｘｘｉｖ）１５５および３６１；（ｘｘｖ）１５５および３６４に逆に荷電しているアミノ酸を含むように少なくとも１つの荷電アミノ酸の導入によって修飾されている配列番号８の変種を好ましくは含む。本発明のヘリカーゼは、（ｉ）から（ｘｘｖ）のいずれかに定義の配列番号８中のものに対応する位置に逆に荷電したアミノ酸を含む配列番号９から２３のいずれか１つの変種を好ましくは含む。
【０２４３】
本発明は（ｉ）少なくとも１つの荷電アミノ酸がタワードメインに導入されており、（ｉｉ）少なくとも１つの逆に荷電したアミノ酸がピンドメインおよび／または１Ａ（ＲｅｃＡ様モーター）ドメインに導入されているヘリカーゼであって、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有しているヘリカーゼも提供する。少なくとも１つの荷電アミノ酸は負に荷電していてよく、少なくとも１つの逆に荷電したアミノ酸は正に荷電していよく、逆も同様である。好適な荷電アミノ酸は、上に考察されている。任意の数の荷電アミノ酸および任意の数の逆に荷電したアミノ酸は、導入されてよい。例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個もしくはそれ以上の荷電アミノ酸は、導入されてよく、および／または１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個もしくはそれ以上の逆に荷電したアミノ酸は導入されてよい。
【０２４４】
荷電アミノ酸は、野生型ヘリカーゼでは荷電していない位置に典型的には導入される。一方または両方の荷電アミノ酸は、ヘリカーゼ中の荷電アミノ酸を置き換えるために使用され得る。例えば正に荷電したアミノ酸は、負に荷電したアミノ酸を置き換えるために使用され得る。荷電アミノ酸は、上に考察の（ｉ）タワードメインおよび（ｉｉ）ピンドメインおよび／または１Ａドメイン中の任意の位置に導入されてよい。逆に荷電したアミノ酸は、それらが生じたヘリカーゼと相互作用するように典型的には導入される。ヘリカーゼは、逆に荷電したアミノ酸が次の位置：（ｉ）９７および３５４；（ｉｉ）９７および３６０；（ｉｉｉ）１５５および３５４；または（ｉｖ）１５５および３６０に導入されている配列番号の変種８を好ましくは含む。本発明のヘリカーゼは、（ｉ）から（ｉｖ）のいずれかに定義の配列番号８のものに対応する位置に逆に荷電したアミノ酸を含む配列番号９から２３のいずれか１つの変種を好ましくは含む。
【０２４５】
構築物
本発明は、本発明の修飾ヘリカーゼおよび追加的ポリヌクレオチド結合成分を含む構築物であって、ヘリカーゼがポリヌクレオチド結合成分に付着されており、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有する構築物も提供する。構築物は、人工または非天然であってよい。
【０２４６】
本発明の構築物は、鎖配列決定法の際にポリヌクレオチドの移動を制御するための有用な手段である。本発明の構築物は、本発明の修飾ヘリカーゼよりも配列決定されているポリヌクレオチドから離されにくい。構築物は、それがナノポアを通るポリヌクレオチドの移行を制御することから、ポリヌクレオチドのさらに長い読み取り長を提供できる。
【０２４７】
特異的ポリヌクレオチド配列に結合する標的化構築物も設計できる。下により詳細に考察されるとおりポリヌクレオチド結合成分は、特異的ポリヌクレオチド配列に結合でき、それにより構築物のヘリカーゼ部分を特異的配列に標的化できる。
【０２４８】
構築物は、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有する。これは、上に考察したとおり決定できる。
【０２４９】
本発明の構築物は、単離、実質的に単離、精製または実質的に精製されていてよい。構築物は、それが脂質、ポリヌクレオチドまたはポア単量体などの任意の他の構成成分を完全に含まない場合に単離または精製されている。構築物は、その目的の使用を妨害しない担体または希釈剤と混合されている場合に実質的に単離されている。例えば構築物は、１０％未満、５％未満、２％未満または１％未満の脂質、ポリヌクレオチドまたはポア単量体などの他の構成成分を含む形態で存在する場合に実質的に単離または実質的に精製されている。
【０２５０】
ヘリカーゼは、上に考察の本発明のヘリカーゼのいずれかであってよい。
【０２５１】
ヘリカーゼは、好ましくは共有結合的に追加的ポリヌクレオチド結合成分に付着している。ヘリカーゼは、２個または３個などの１個以上の点で成分に付着していてよい。
【０２５２】
ヘリカーゼは、当技術分野において公知の任意の方法を使用して成分に共有結合的に付着できる。好適な方法は、２つ以上の部分を繋ぐことを参照して上に考察されている。
【０２５３】
ヘリカーゼおよび成分は、別々に産生され、次いで一緒に付着されてよい。２つの構成成分は、任意の立体配置で付着されてよい。例えばそれらは、それらの末端（すなわちアミノまたはカルボキシ末端）アミノ酸を介して付着してよい。好適な立体配置は、これだけに限らないが、成分のアミノ末端がヘリカーゼのカルボキシ末端に付着しているおよびその逆を含む。代替的に２つの構成成分は、それらの配列内のアミノ酸を介して付着され得る。例えば成分は、ヘリカーゼのループ領域中の１つまたは複数のアミノ酸に付着する場合がある。好ましい実施形態では成分の末端アミノ酸は、ヘリカーゼのループ領域中の１つまたは複数のアミノ酸に付着する。
【０２５４】
好ましい実施形態ではヘリカーゼは、例えば上に考察した１つまたは複数のリンカー分子を介して、成分に化学的に付着する。別の好ましい実施形態ではヘリカーゼは、成分に遺伝子的に融合される。構築物全体が１本のポリヌクレオチド配列から発現される場合にヘリカーゼは、遺伝子的に成分に融合されている。ヘリカーゼおよび成分のコード配列は、構築物をコードしている１本のポリヌクレオチド配列を形成するために任意の方法で組み合わされてよい。核酸結合タンパク質へのポアの遺伝子的融合は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号（国際公開第２０１０／００４２６５号パンフレットとして公開）において考察されている。
【０２５５】
ヘリカーゼおよび成分は、任意の立体配置で遺伝的に融合され得る。ヘリカーゼおよび成分は、それらの末端アミノ酸を介して融合され得る。例えば成分のアミノ末端はヘリカーゼのカルボキシ末端に融合でき、逆も同様である。成分のアミノ酸配列は、ヘリカーゼのアミノ酸配列にインフレームで好ましくは付加される。換言すると成分は、ヘリカーゼの配列内に好ましくは挿入される。そのような実施形態ではヘリカーゼおよび成分は、２つの点で、すなわち成分のアミノおよびカルボキシ末端アミノ酸を介して典型的には付着される。成分がヘリカーゼの配列内に挿入される場合、成分のアミノおよびカルボキシ末端アミノ酸が近接近にあり、ヘリカーゼまたはその変種の配列内の隣接アミノ酸にそれぞれ付着していることは好ましい。好ましい実施形態では成分は、ヘリカーゼのループ領域に挿入される。
【０２５６】
ヘリカーゼは、成分に直接付着され得る。ヘリカーゼは、上に考察したとおり２つまたは３つなどの１つまたは複数のリンカーを使用して成分に好ましくは付着される。１つまたは複数のリンカーは、成分の移動性を限定するように設計され得る。ヘリカーゼおよび／または成分は、上に考察したとおり１つまたは複数のリンカーの付着を促進するように修飾され得る。
【０２５７】
切断可能なリンカーは、非付着構成成分からの構築物の分離への補助として使用でき、合成反応をさらに制御するために使用できる。例えばヘテロ二機能性リンカーは、ヘリカーゼと反応できるが、成分とはできない。ヘリカーゼタンパク質を表面に結合するためにリンカーの遊離末端が使用できる場合、最初の反応由来の未反応ヘリカーゼは混合物から除去され得る。続いてリンカーは、成分と反応する基を露出させるために切断され得る。付加的に、一連の連結反応に続いて、条件は最初にヘリカーゼへの反応のために、次いでリンカーの切断後の成分への反応のために最適化され得る。第二の反応は、リンカーが既に付着している領域に限定されることから、成分との正確な反応部位に向けてさらに方向付けられる。
【０２５８】
ヘリカーゼは、ヘリカーゼ／架橋剤複合体が成分に共有結合的に付着する前に、二機能性架橋剤に共有結合的に付着されてよい。代替的に成分は、二機能性架橋剤／成分複合体がヘリカーゼに付着する前に、二機能性架橋剤に共有結合的に付着してよい。ヘリカーゼおよび成分は、化学的架橋剤に同時に共有結合的に付着してよい。
【０２５９】
ヘリカーゼの成分への付着の好ましい方法は、上に記載のとおりシステイン連結およびＦａｚ連結である。好ましい実施形態では反応性システインは、成分に遺伝子的に付着しているペプチドリンカー上に存在する。これは、成分から他の利用可能なシステイン残基を除去するために追加的修飾が必ずしも必要ではないことを意味する。
【０２６０】
ヘリカーゼまたは成分のそれ自体への交差結合は、リンカーの濃度をヘリカーゼおよび／または成分の大過剰に維持することによって妨げることができる。代替的に「鍵と鍵穴」配置は、２つのリンカーが使用される場合に使用できる。各リンカーの一方の末端だけが長いリンカーを形成するために併せて反応でき、リンカーの他方の末端は構築物の異なる部分（すなわちヘリカーゼまたは成分）とそれぞれ反応する。これは下でより詳細に考察される。
【０２６１】
付着の部位は、構築物がポリヌクレオチドと接触する場合に、ヘリカーゼおよび成分の両方がポリヌクレオチドに結合でき、その移動を制御できるように選択される。
【０２６２】
付着は、ヘリカーゼおよび成分のポリヌクレオチド結合活性を使用して促進され得る。例えば相補的ポリヌクレオチドは、ヘリカーゼおよび成分を、それらがハイブリダイズすることから、併せて運ぶために使用できる。ヘリカーゼは一方のポリヌクレオチドに結合でき、成分は相補的ポリヌクレオチドに結合できる。次いで２つのポリヌクレオチドは、相互にハイブリダイズできるようになる。これは、ヘリカーゼを成分と密接に接触するようにして、連結反応をさらに効率的にする。これは、標的ポリヌクレオチドの移動を制御するための正確な方向で２つ以上のヘリカーゼを付着させるために特に有益である。使用できる相補的ポリヌクレオチドの一例は、下に示されている。
【０２６３】
【化１】
2017535256.tif 000009
【０２６４】
ヘリカーゼ−Ｐｈｉ２９構築物に関して、下のＤＮＡは使用され得る。
【０２６５】
【化２】
2017535256.tif 000010
【０２６６】
構築物の精製を容易にするためにタグが構築物に付加され得る。これらのタグは、次いでそれらの除去が必要である場合に、化学的にまたは酵素的に切断除去され得る。フルオロフォアまたはクロモフォアも含まれる場合があり、これらも切断可能であってよい。
【０２６７】
構築物を精製するための簡単な方法は、各タンパク質（すなわちヘリカーゼおよび成分）上に、ヘキサ−Ｈｉｓ−タグおよびＳｔｒｅｐ−タグ（登録商標）などの異なる精製タグを含むことである。２つのタンパク質が互いに異なる場合、この方法は特に有用である。２つのタグの使用は、両方のタグを含む分子種だけが容易に精製されるようにする。
【０２６８】
２つのタンパク質が２つの異なるタグを有さない場合、他の方法が使用できる。例えば遊離表面システインを有するタンパク質または構築物を形成するために反応していない付着リンカーを有するタンパク質は、例えばマレイミドリンカーに対するヨードアセトアミドレジンを使用して除去され得る。
【０２６９】
本発明の構築物は、未反応タンパク質から異なるＤＮＡ前進性特徴に基づいても精製され得る。具体的には本発明の構築物は、未反応タンパク質からポリヌクレオチドに対する親和性の増大、既に結合したポリヌクレオチドから離れる可能性の低減および／またはナノポアを通るポリヌクレオチドの移行を制御するときのポリヌクレオチドの読み取り長さの増大に基づいて精製され得る。
【０２７０】
特異的ポリヌクレオチド配列に結合する標的化構築物も設計され得る。下により詳細に考察されるとおりポリヌクレオチド結合成分は、特異的ポリヌクレオチド配列に結合でき、それにより構築物のヘリカーゼ部分を特異的配列に標的化する。
【０２７１】
ポリヌクレオチド結合成分
本発明の構築物は、ポリヌクレオチド結合成分を含む。ポリヌクレオチド結合成分は、ポリヌクレオチドに結合できるポリペプチドである。成分は、規定のポリヌクレオチド配列に好ましくは特異的結合できる。換言すると成分は、特異的ポリヌクレオチド配列に好ましくは結合するが、少なくとも１０分の１の結合を異なる配列に、またはより好ましくは少なくとも１００分の１の結合を異なる配列に、または最も好ましくは少なくとも１０００分の１の結合を異なる配列に示す。異なる配列は無作為配列であってよい。いくつかの実施形態では成分は、特異的ポリヌクレオチド配列に結合するが、異なる配列への結合は測定できない。特異的配列に結合する成分は、そのような配列に標的化される構築物を設計するために使用され得る。
【０２７２】
成分は、典型的にはポリヌクレオチドの少なくとも１つの特徴と相互作用および改変する。成分は、個々のヌクレオチドまたは、ジまたはトリヌクレオチドなどのヌクレオチドの短い鎖を形成するように切断することによってポリヌクレオチドを修飾できる。成分は、ポリヌクレオチドを特異的位置に方向付けるまたは移動させること、すなわちその移動を制御することによってそれを修飾できる。
【０２７３】
核酸などのポリヌクレオチドは、２個以上のヌクレオチドを含む巨大分子である。ポリヌクレオチドまたは核酸は、任意のヌクレオチドの任意の組合せを含み得る。ヌクレオチドは、天然に存在するものまたは人工的であってよい。標的ポリヌクレオチド中の１つまたは複数のヌクレオチドは、酸化またはメチル化され得る。標的ポリヌクレオチド中の１つまたは複数のヌクレオチドは、損傷をうけ得る。例えばポリヌクレオチドは、ピリミジン二量体を含む場合がある。そのような二量体は、紫外光による障害に典型的には関連し、皮膚メラノーマの主原因である。標的ポリヌクレオチド中の１つまたは複数のヌクレオチドは、例えば標識またはタグで、修飾され得る。好適な標識は、上に記載されている。標的ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のスペーサーを含み得る。
【０２７４】
ヌクレオチドは、典型的には、核酸塩基、糖および少なくとも１つのリン酸基を含有する。核酸塩基は典型的には複素環である。核酸塩基は、これだけに限らないがプリンおよびピリミジンならびにより具体的にはアデニン、グアニン、チミン、ウラシルおよびシトシンを含む。糖は典型的には五炭糖である。ヌクレオチド糖は、これだけに限らないがリボースおよびデオキシリボースを含む。ヌクレオチドは、典型的にはリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドである。ヌクレオチドは典型的には一リン酸、二リン酸または三リン酸を含有する。リン酸は、ヌクレオチドの５’または３’側に付着できる。
【０２７５】
ヌクレオチドは、これだけに限らないがアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、５−メチルシチジンモノホスフェート、５−メチルシチジンジホスフェート、５−メチルシチジントリホスフェート、５−ヒドロキシメチルシチジンモノホスフェート、５−ヒドロキシメチルシチジンジホスフェート、５−ヒドロキシメチルシチジントリホスフェート、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）およびデオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）を含む。ヌクレオチドは、好ましくはＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＣＭＰおよびｄＵＭＰから選択される。
【０２７６】
ヌクレオチドは、塩基を持たない場合がある（すなわち核酸塩基を欠失している）。ヌクレオチドは、核酸塩基および糖も欠失している場合がある（すなわちＣ３スペーサーである）。
【０２７７】
ポリヌクレオチド中のヌクレオチドは、任意の様式で相互に付着されてよい。ヌクレオチドは、核酸においてと同様にそれらの糖およびリン酸基により典型的には付着されている。ヌクレオチドは、ピリミジン二量体においてと同様にそれらの核酸塩基を介して繋がれてよい。
【０２７８】
ポリヌクレオチドは、１本鎖または２本鎖であってよい。ポリヌクレオチドの少なくとも一部は、好ましくは２本鎖である。
【０２７９】
ポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）などの核酸であってよい。標的ポリヌクレオチドは、ＤＮＡの１本鎖にハイブリダイズしたＲＮＡの１本鎖を含む場合がある。ポリヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）またはヌクレオチド側鎖を有する他の合成ポリマーなどの当技術分野において公知の任意の合成核酸であってよい。
【０２８０】
成分の三次構造が公知であることは好ましい。成分の三次元構造の知識は、本発明の構築物におけるその機能を促進するために成分に修飾を作製できるようにする。
【０２８１】
成分は、任意のサイズであってよく、任意の構造を有してよい。例えば成分は、二量体または三量体などのオリゴマーである場合がある。成分は、好ましくは１つの単量体から形成された小さな球状ポリペプチドである。そのような成分は操作が容易であり、ポリヌクレオチドの移動を制御するヘリカーゼの能力を、特にヘリカーゼの配列に融合または挿入された場合に、干渉しにくい。
【０２８２】
成分のアミノおよびカルボキシ末端は、好ましくは近接近にある。成分のアミノおよびカルボキシ末端は、成分の同じ面により好ましくは存在する。そのような実施形態は、ヘリカーゼの配列中への成分の挿入を促進する。例えば成分のアミノおよびカルボキシ末端が近接近にある場合、それぞれはヘリカーゼの配列中の隣接アミノ酸への遺伝子的融合によって付着され得る。
【０２８３】
成分の活性部位の位置および機能が公知であることも好ましい。これは、成分の活性を消滅させる活性部位に修飾が作製されることを防ぐ。これは成分がヘリカーゼに付着できるようにし、成分はポリヌクレオチドに結合し、その移動を制御する。成分がポリヌクレオチドに結合および方向付けられる方法の知識は、有効な構築物を設計できるようにする。
【０２８４】
本発明の構築物は鎖配列決定法において有用である。成分は、鎖配列決定法およびヌクレオチドの識別に適合性である緩衝液バックグラウンドにおいてポリヌクレオチドに好ましくは結合する。成分は、１００ｍＭから２Ｍなどの通常の生理学的レベルを大幅に上回る塩濃度において少なくとも残存活性を好ましくは有する。成分は、高塩濃度でのその活性を増大させるためにより好ましくは修飾される。成分は、その前進性、安定性および有効期間を改善するために修飾されてもよい。
【０２８５】
好適な修飾は、好塩性、中度好塩性細菌、好熱性および中等度好熱性生物などの好極限性細菌（extremphile）、ならびに中温性または好熱性エキソヌクレアーゼの耐塩性、安定性および温度依存性を変更するための定向進化手法由来のポリヌクレオチド結合成分の特性決定から決定され得る。
【０２８６】
ポリヌクレオチド結合成分は、ヘリックス−ヘアピン−ヘリックス（helix-hairpin-helix）（ＨｈＨ）ドメイン、真核生物１本鎖結合タンパク質（single-stranded binding protein）（ＳＳＢ）、細菌性ＳＳＢ、古細菌ＳＳＢ、ウイルス性ＳＳＢ、２本鎖結合タンパク質、スライディングクランプ、前進性因子（processivity factor）、ＤＮＡ結合ループ、複製開始タンパク質、テロメア結合タンパク質、リプレッサー、亜鉛フィンガーおよび増殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen）（ＰＣＮＡ）から独立に選択される１つまたは複数のドメインを好ましくは含む。
【０２８７】
ヘリックス−ヘアピン−ヘリックス（ＨｈＨ）ドメインは、ＤＮＡに配列非特異的様式で結合するポリペプチドモチーフである。それらは、ポリメラーゼに融合された場合に塩安定性および前進性を付与し、それらの熱安定性を増大させることが示されている。好適なドメインは、メタノピュルス・カンドレリ（Methanopyrus kandleri）由来のトポイソメラーゼＶ（配列番号４７）由来のドメインＨ（残基６９６〜７５１）およびドメインＨＩ（残基６９６〜８０２）を含む。下の考察のとおり、ポリヌクレオチド結合成分は、配列番号４８に示す配列番号４７のドメインＨ〜Ｌであってよい。メタノピュルス・カンドレリ（Methanopyrus kandleri）由来のトポイソメラーゼＶは、下に考察の２本鎖結合タンパク質の一例である。
【０２８８】
ＨｈＨドメインは、配列番号２４もしくは３７もしくは３８に示す配列またはその変種を好ましくは含む。このドメインは、本発明の構築物において使用された場合にヘリカーゼの前進性および耐塩性を増大させる。配列番号２４もしくは３７もしくは３８の変種は、配列番号２４または３７または３８のものから変化しているアミノ酸配列を有し、ポリヌクレオチド結合活性を有しているタンパク質である。これは、上に記載のとおり測定され得る。変種は、アミノ酸同一性に基づいてその配列全体にわたって、配列番号２４または３７または３８に少なくとも５０％相同性（またはヘリカーゼと関連して上に考察した任意の％相同性）を典型的には有し、ポリヌクレオチド結合活性を有している。変種はヘリカーゼと関連して上にまたはポアと関連して下に考察したいずれの方法においても配列番号２４または３７または３８と異なっていてよい。変種は、上に考察したとおりヘリカーゼへの付着を促進するために１つもしくは複数の置換システイン残基および／または１つもしくは複数の置換Ｆａｚ残基を好ましくは含む。
【０２８９】
ＳＳＢは、高親和性で配列非特異的様式で１本鎖ＤＮＡに結合する。それらは、全ての生き物に種々の形態で存在し、単量体または多量体としてＤＮＡに結合する。アミノ酸配列の配列比較およびアルゴリズム（Ｈｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖモデルなど）を使用して、ＳＳＢはそれらの配列相同に従って分類され得る。Ｐｆａｍファミリー、ＰＦ００４３６は、全てが公知のＳＳＢに配列類似性を示すタンパク質を含む。ＳＳＢのこの群は、次いでタンパク質の構造分類（Structural Classification of Proteins）（ＳＣＯＰ）に従ってさらに分類され得る。ＳＳＢは、次の系列に分けられる：クラス；全てのベータタンパク質、フォールド；ＯＢ−フォールド、スーパーファミリー：核酸結合タンパク質、ファミリー；１本鎖ＤＮＡ結合ドメイン、ＳＳＢ。このファミリー内でＳＳＢは、各サブファミリー内でしばしば特性決定されるいくつかの型の分子種を含むサブファミリーに分類され得る。
【０２９０】
ＳＳＢは、ヒト、マウス、ラット、真菌、原虫または植物など由来の真核生物由来、細菌および古細菌などの原核生物由来またはウイルス由来であってよい。
【０２９１】
真核性ＳＳＢは、複製タンパク質Ａ（ＲＰＡ）として公知である。多くの場合それらは、さまざまなサイズの単位から形成されたヘテ三量体である。大きな単位（例えばサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のＲＰＡ７０）のいくつかは安定であり、単量体形態でｓｓＤＮＡに結合する。
【０２９２】
細菌性ＳＳＢは安定なホモ四量体（例えば大腸菌（E.coli）、マイコバクテリウム・スメグマチス（Mycobacterium smegmatis）およびヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori））またはホモ二量体（例えばディノコッカス・ラディオデュランス（Deinococcus radiodurans）およびサーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima））としてＤＮＡに結合する。古細菌ゲノム由来のＳＳＢは、真核ＲＰＡと関連すると考えられている。クレン古細菌門スルホロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）によってコードされるＳＳＢなどのそのいくつかは、ホモ四量体である。他の大部分の種由来のＳＳＢは、真核生物由来の複製タンパク質に密接に関連しており、ＲＰＡと称される。これらの種のいくつかにおいて、それらは単量体であることが示されている（メタノコッカス・ジャンナスキイ（Methanococcus jannaschii）およびメタノサーモバクター・サーモオートトロフィクカム（Methanothermobacter thermoautotrophicum））。さらに、アーケオグロブス・フルギダス（Archaeoglobus fulgidus）およびメタノコッコイデス・ブルトニイ（Methanococcoides burtonii）を含む古細菌の他の種は、ＲＰＡに配列類似性を有する２つのオープンリーディングフレームをそれぞれ含有すると考えられている。タンパク質レベルでの証拠はなく、それらのＤＮＡ結合能力またはオリゴマー状態に関する公表されたデータもない。しかし、これらの各遺伝子中の２つのオリゴヌクレオチド／オリゴ糖（oligonucleotide/oligosaccharide）（ＯＢ）フォールドの存在（Ｍ．ブルトニイ（M.burtonii）ＯＲＦの１つの場合にはＯＢフォールド３個）はそれらも１本鎖ＤＮＡに結合することを示唆している。
【０２９３】
ウイルス性ＳＳＢは、単量体としてＤＮＡに結合する。このことおよびそれらの比較的小さなサイズは、それらを、例えば可動性ペプチドリンカーを介して他のタンパク質に遺伝子的に融合しやすくする。代替的にＳＳＢは、別々に発現され、化学的方法（例えばシステイン、非天然アミノ酸）によって他のタンパク質に付着される場合がある。これは下でより詳細に考察される。
【０２９４】
ＳＳＢは、好ましくは（ｉ）正味の負電荷を有さないカルボキシ末端（Ｃ末端）領域を含むＳＳＢ（ｉｉ）Ｃ末端領域の正味の負電荷を減少させる１つまたは複数の修飾をそのＣ末端領域に含む修飾ＳＳＢのいずれかである。そのようなＳＳＢは、膜貫通ポアを遮断せず、したがって標的ポリヌクレオチドの特性決定を可能にする。
【０２９５】
正味の負電荷を有さないＣ末端領域を含むＳＳＢの例は、これだけに限らないが、ヒトミトコンドリアＳＳＢ（ＨｓｍｔＳＳＢ；配列番号３９、ヒト複製タンパク質Ａ  ７０ｋＤａサブユニット、ヒト複製タンパク質Ａ  １４ｋＤａサブユニット、オキシトリカ・ノバ（Oxytricha nova）由来テロメア末端結合タンパク質アルファサブユニット、オキシトリカ・ノバ（Oxytricha nova）由来テロメア末端結合タンパク質ベータサブユニットのコアドメイン、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）由来のテロメアタンパク質１（Ｐｏｔ１）の保護、ヒトＰｏｔ１、マウスまたはラット由来ＢＲＣＡ２のＯＢ−フォールドドメイン、ｐｈｉ２９由来のｐ５タンパク質（配列番号４０）またはこれらのタンパク質のいずれかの変種を含む。変種は、野生型タンパク質から変化したアミノ酸配列を有し、１本鎖ポリヌクレオチド結合活性を有しているタンパク質である。ポリヌクレオチド結合活性は、当技術分野において公知の任意の方法を使用して決定できる（上に記載のとおり）。例えば、１本鎖ポリヌクレオチドに結合する変種の能力は、実施例に記載のとおり決定され得る。
【０２９６】
配列番号３９または４０の変種は、アミノ酸同一性に基づいてその配列全体にわたって、配列番号３９または４０に少なくとも５０％相同性（またはヘリカーゼと関連して上に考察した任意の％相同性）を典型的には有し、１本鎖ポリヌクレオチド結合活性を有している。変種はヘリカーゼと関連して上に考察したいずれの方法においても配列番号３９または４０と異なっていてよい。具体的には変種は、表７および８に示す１つまたは複数の保存的置換を有する場合がある。
【０２９７】
正味の負電荷を減少させる１つまたは複数の修飾をそれらのＣ末端領域に必要とするＳＳＢの例は、これだけに限らないが、大腸菌（E. coli）のＳＳＢ（ＥｃｏＳＳＢ；配列番号４１、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）のＳＳＢ、ディノコッカス・ラディオデュランス（Deinococcus radiodurans）のＳＳＢ、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophiles）のＳＳＢ、スルホロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）由来ＳＳＢ、ヒト複製タンパク質Ａ  ３２ｋＤａサブユニット（ＲＰＡ３２）断片、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来ＣＤＣ１３  ＳＳＢ、大腸菌（E. coli）由来プライモソーム複製タンパク質Ｎ（Primosomal replication protein N）（ＰｒｉＢ）、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）由来ＰｒｉＢ、仮説タンパク質Ａｔ４ｇ２８４４０、Ｔ４由来ＳＳＢ（ｇｐ３２；配列番号４２）、ＲＢ６９由来ＳＳＢ（ｇｐ３２；配列番号２５）、Ｔ７由来ＳＳＢ（ｇｐ２．５；配列番号２６）またはこれらの任意のタンパク質の変種を含む。したがって本発明の方法において使用されるＳＳＢは、これらのタンパク質のいずれかに由来してよい。
【０２９８】
Ｃ末端領域中の１つまたは複数の修飾に加えて、方法において使用されるＳＳＢはＣ末端領域の外側にあるまたはＣ末端領域の正味の負電荷を減少させない追加的修飾を含んでよい。換言すると本発明の方法において使用されるＳＳＢは、野生型タンパク質の変種に由来する。変種は、野生型タンパク質のものから変化しているアミノ酸配列を有し、１本鎖ポリヌクレオチド結合活性を有しているタンパク質である。ポリヌクレオチド結合活性は、上に考察したとおり決定され得る。
【０２９９】
本発明において使用されるＳＳＢは、配列番号２５、２６、４１または４２の変種に由来してよい。換言すると配列番号２５、２６、４１または４２の変種は、本発明において使用されるＳＳＢのための出発点として使用できるが、実際に使用されるＳＳＢは、Ｃ末端領域の正味の負電荷を減少させる１つまたは複数の修飾をそのＣ末端領域にさらに含む。配列番号２５、２６、４１または４２の変種は、配列番号２５、２６、４１または４２にアミノ酸同一性に基づいてその配列全体にわたって少なくとも５０％相同性（またはヘリカーゼと関連して上に考察した任意の％相同性）を典型的には有し、１本鎖ポリヌクレオチド結合活性を有している。変種はヘリカーゼと関連して上に考察したいずれの方法においても配列番号２５、２６、４１または４２と異なっていてよい。具体的には変種は、表７および８に示す１つまたは複数の保存的置換を有してよい。
【０３００】
通常のタンパク質ＮからＣへの命名法に従ってＳＳＢのＣ末端領域を同定することは容易である。ＳＳＢのＣ末端領域は、ＳＳＢのＣ末端の最後の３分の１などの好ましくはＳＳＢのＣ末端の最後の約３分の１である。ＳＳＢのＣ末端領域は、より好ましくはＳＳＢのＣ末端の最後の４分の１、５分の１または８分の１などのＳＳＢのＣ末端の最後の約４分の１、５分の１または８分の１である。ＳＳＢの最後の３分の１、４分の１、５分の１または８分の１は、アミノ酸の数を単位としてまたはＳＳＢタンパク質の一次構造の実際の長さを単位として測定されてよい。ＮからＣ方向での種々のアミノ酸の長さは、当技術分野において公知である。
【０３０１】
Ｃ末端領域は、好ましくはＳＳＢのＣ末端の最後の約１０から最後の約６０アミノ酸である。Ｃ末端領域は、より好ましくはＳＳＢのＣ末端の最後の約１５、最後の約２０、最後の約２５、最後の約３０、最後の約３５、最後の約４０、最後の約４５、最後の約５０または最後の約５５アミノ酸である。
【０３０２】
Ｃ末端領域は、グリシンおよび／またはプロリンのリッチ領域を典型的には含む。このプロリン／グリシンリッチ領域は、Ｃ末端領域に可動性を与え、Ｃ末端領域を同定するために使用され得る。
【０３０３】
正味の負電荷を減少させるために好適な修飾は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２４号（国際公開第２０１４／０１３２５９号パンフレットとして公開）に開示されている。ＳＳＢは、この国際出願において開示の任意のＳＳＢであってよい。
【０３０４】
修飾ＳＳＢは、配列番号３３、３４、４３から４６に示されるものから選択される配列を最も好ましくは含む。
【０３０５】
２本鎖結合タンパク質は高親和性で２本鎖ＤＮＡに結合する。好適な２本鎖結合タンパク質は、これだけに限らないがミューテーターＳ（ＭｕｔＳ；ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿４１７２１３．１；配列番号４９）、Ｓｓｏ７ｄ（スルホロブス・ソルファタリカス（Sufolobus solfataricus）Ｐ２；ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿３４３８８９．１；配列番号５０；Nucleic Acids Research, 2004, Vol 32, No. 3, 1197-1207）、Ｓｓｏ１０ｂ１（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿３４２４４６．１；配列番号５１）、Ｓｓｏ１０ｂ２（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿３４２４４８．１；配列番号５２）トリプトファンリプレッサー（Ｔｒｐリプレッサー；ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿２９１００６．１；配列番号５３）、ラムダリプレッサー（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０４０６２８．１；配列番号５４）、Ｃｒｅｎ７（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿３４２４５９．１；配列番号５５）、主なヒストンクラスＨ１／Ｈ５、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０６６４０３．２；配列番号５６）、ｄｓｂＡ（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０４９８５８．１；配列番号５７）、Ｒａｄ５１（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００２８６６．２；配列番号５８）、スライディングクランプおよびトポイソメラーゼＶ  Ｍｋａ（配列番号４７）またはこれらのタンパク質のいずれかの変種を含む。配列番号４７、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７または５８の変種は、アミノ酸同一性に基づいてその配列全体にわたって、配列番号４７、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７または５８に少なくとも５０％相同性（またはヘリカーゼと関連して上に考察した任意の％相同性）を典型的には有し、１本鎖ポリヌクレオチド結合活性を有している。変種は、ヘリカーゼと関連して上に考察したいずれの方法においても配列番号４７、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７または５８と異なっていてよい。具体的には変種は、表７および８に示す１つまたは複数の保存的置換を有する場合がある。大部分のポリメラーゼは、スライディングクランプと相互作用することにより前進性を達成している。一般にこれらは、ｄｓＤＮＡの周囲を囲む多量体タンパク質（ホモ二量体またはホモ三量体）である。これらのスライディングクランプは、ＡＴＰ依存性プロセスでそれらをＤＮＡヘリックスの周囲に会合させるためにアクセサリータンパク質（クランプローダー）を必要とする。それらもＤＮＡと直接接触せず、形態的テザーとして作用する。スライディングクランプがポリメラーゼドメインを介する特異的様式で同族ポリメラーゼと相互作用することから、この断片はヘリカーゼのスライディングクランプへの動員刺激のためにヘリカーゼに融合され得る。この相互作用は共有結合の作製によってさらに安定化され得る（システインまたは非天然アミノ酸の導入）。
【０３０６】
ＤＮＡスライディングクランプに関して前進性因子は、それらの同族ポリメラーゼをＤＮＡに固着させるウイルス性タンパク質であり、作製される断片の長さの劇的な増大を導く。それらは、単量体（単純ヘルペスウイルス（Herpes simplex virus）１由来ＵＬ４２についての場合）または多量体（サイトメガロウイルス（Cytomegalovirus）由来ＵＬ４４は二量体である）であってよく、それらはＤＮＡ鎖周囲に閉じた環を形成せず、それらはＤＮＡに直接接触する。ＵＬ４２は、その対応するポリメラーゼの速度を低減することなく前進性を増大させることが示されており、それがＳＳＢとは異なるモードでＤＮＡと相互作用することを示唆している。ＵＬ４２は、配列番号２７もしくは配列番号３２に示す配列またはその変種を好ましくは含む。配列番号２７または３２の変種は、配列番号２７または３２のものから変化しているアミノ酸配列を有し、ポリヌクレオチド結合活性を有しているタンパク質である。これは、上に記載のとおり測定され得る。変種は、アミノ酸同一性に基づいてその配列全体にわたって、配列番号２７または３２に少なくとも５０％相同性（またはヘリカーゼと関連して上に考察した任意の％相同性）を典型的には有し、ポリヌクレオチド結合活性を有している。変種はヘリカーゼと関連して上にまたはポアと関連して下に考察したいずれの方法においても配列番号２７または配列番号３２と異なっていてよい。変種は、上に考察したとおりヘリカーゼへの付着を促進するために１つもしくは複数の置換システイン残基および／または１つもしくは複数の置換Ｆａｚ残基を好ましくは含む。
【０３０７】
ＵＬ４２をヘリカーゼに付着させることは、遺伝子的融合または化学的付着（システイン、非天然アミノ酸）を介して行われ得る。ＵＬ４２に結合しているポリメラーゼポリペプチドが結晶構造において観察できることから、これらの３５アミノ酸（残基１２００〜１２３５）はヘリカーゼのＣ末端に融合でき、このポリペプチドと前進性因子との間の天然の親和性は複合体を形成するために使用される。相互作用は、共有結合相互作用（システインまたは非天然アミノ酸）を導入することによって安定化され得る。選択肢の１つは、ポリペプチド相互作用部位近くに位置付けられている天然ＵＬ４２システイン（Ｃ３００）を利用し、ポリメラーゼポリペプチドに点変異（例えばＬ１２３４Ｃ）を導入することである。
【０３０８】
ポリメラーゼ前進性を増大する報告された方法は、大腸菌（E.coli）チオレドキシン（Ｔｒｘ）とバクテリオファージＴ７ＤＮＡポリメラーゼのチオレドキシン結合ドメイン（ＴＢＤ）（残基２５８〜３３３）との間の相互作用を活用することである。ＴｒｘからＴＢＤへの結合は、ＤＮＡに結合するものへのコンホメーション変化をポリペプチドに生じさせる。ＴＢＤは、ＤＮＡ鎖上に固定され、ポリメラーゼオフ速度を限定し、それにより前進性を増大させると考えられている。キメラポリメラーゼは、ＴＢＤを非前進性ポリメラーゼに転移することによって作製され、重合された断片長の１０００倍増加を生じる。ＴＢＤを任意の他のクラスのタンパク質に付着させる試みはなかったが、ＴＢＤとＴｒｘとの間の共有結合は操作され、相互作用を安定化するために使用できる。
【０３０９】
いくつかのヘリカーゼは、前進性を達成するためにアクセサリータンパク質をｉｎ−ｖｉｖｏで使用する（例えば大腸菌（E.coli）Ｒｅｐヘリカーゼに関して、ファージΦｘ１７４由来ｃｉｓＡおよびファージＭ１３由来ｇｅｎｅ  ＩＩタンパク質）。これらのタンパク質のいくつかは、１つより多いヘリカーゼと相互作用することが示されている（例えばＭｕｔＬは同程度ではないがＵｖｒＤおよびＲｅｐの両方に作用する）。これらのタンパク質は内在性ＤＮＡ結合能力を有し、それらのいくつかは特異的ＤＮＡ配列を認識する。いくつかのこれらのアクセサリータンパク質のそれら自体を特異的ＤＮＡ配列に共有結合的に付着させる能力は、ヘリカーゼ活性についての一連の開始点を作出するためにも使用できる。
【０３１０】
染色体の末端を保護するタンパク質は、テロメアｓｓＤＮＡ配列に高特異性の様式で結合する。この能力は、そのまままたは配列特異性を消滅させる点変異を使用することによってのいずれかで活用され得る。
【０３１１】
小さなＤＮＡ結合モチーフ（ヘリックス−ターン−ヘリックスなど）は、特異的ＤＮＡ配列を認識する。バクテリオファージ４３４リプレッサーの場合、６２残基断片が操作され、ＤＮＡ結合能力および特異性を保持していることが示されている。
【０３１２】
真核生物タンパク質における豊富なモチーフ、亜鉛フィンガーは特異的様式でＤＮＡに結合するおよそ３０アミノ酸からなる。典型的には各亜鉛フィンガーは３個のＤＮＡ塩基だけを認識するが、マルチプルフィンガーはより長い配列を認識するために連結されてよい。
【０３１３】
増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）は、ｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡを引き上げるおよび下げる非常に堅固なクランプ（ドーナツ）を形成する。クレン古細菌門（crenarchaeota）由来ＰＣＮＡは、ヘテロ三量体になることが特有であり、それにより１つのサブユニットを機能化し、活性を保持することが可能である。そのサブユニットは、配列番号２８、２９および３０に示されている。ＰＣＮＡは、好ましくは配列番号２８、２９および３０に示す配列またはその変種を含む三量体である。ＰＣＮＡスライディングクランプ（ＮＣＢＩ参照配列：ＺＰ＿０６８６３０５０．１；配列番号５９）は二量体を形成する。ＰＣＮＡは、好ましくは配列番号５９またはその変種を含む二量体である。変種は、配列番号２８、２９、３０または５９から変化しているアミノ酸配列を有し、ポリヌクレオチド結合活性を有しているタンパク質である。これは、上に記載のとおり測定され得る。変種は、アミノ酸同一性に基づいてそれぞれその配列全体にわたって配列番号２８、２９および３０に少なくとも５０％相同性を有する配列を含む典型的には三量体または、配列番号５９に少なくとも５０％相同性（またはヘリカーゼと関連して上に考察した任意の％相同性）を有する配列を含む二量体であり、ポリヌクレオチド結合活性を有している。変種はヘリカーゼと関連して上にまたはポアと関連して下に考察したいずれの方法においても配列番号２８、２９、３０または５９と異なっている配列を含んでよい。変種は、上に考察したとおりヘリカーゼへの付着を促進するために１つもしくは複数の置換システイン残基および／または１つもしくは複数の置換Ｆａｚ残基を好ましくは含む。好ましい実施形態では、クレン古細菌門（crenarchaeota）由来ＰＣＮＡのサブユニット１および２（すなわち配列番号２８および２９またはその変種）は、遺伝子的に融合されるなど付着し、得られたタンパク質は本発明の構築物を形成するようにヘリカーゼに付着される。構築物の使用の際にサブユニット３（すなわち配列番号３０またはその変種）は、構築物がポリヌクレオチドに結合すると、ＰＣＮＡクランプ（またはドーナツ）を完了するために付加される場合がある。好ましい実施形態では、ＰＣＮＡスライディングクランプ（すなわち配列番号５９またはその変種）の１つの単量体は、遺伝子的に融合されているなど、本発明の構築物を形成するようにヘリカーゼに付着されている。構築物の使用の際に第二の単量体（すなわち配列番号５９またはその変種）は、構築物がポリヌクレオチドに結合すると、ＰＣＮＡクランプ（またはドーナツ）を完了するために付加される場合がある。
【０３１４】
ポリヌクレオチド結合モチーフは、下の表５に示すもののいずれかから選択されてよい。
【０３１５】
【表５−１】
2017535256.tif 000011
【０３１６】
【表５−２】
2017535256.tif 000012
【０３１７】
【表５−３】
2017535256.tif 000013
【０３１８】
【表５−４】
2017535256.tif 000014
【０３１９】
【表５−５】
2017535256.tif 000015
【０３２０】
ポリヌクレオチド結合成分は、ポリヌクレオチド結合酵素に好ましくは由来する。ポリヌクレオチド結合酵素は、ポリヌクレオチドに結合でき、ポリヌクレオチドの少なくとも１つの特徴と相互作用し、修飾するポリペプチドである。酵素は、個々のヌクレオチドまたは、ジまたはトリヌクレオチドなどのヌクレオチドの短い鎖を形成するように切断することによってポリヌクレオチドを修飾できる。酵素は、ポリヌクレオチドを特異的位置に方向付けるまたは移動させることによってそれを修飾できる。ポリヌクレオチド結合成分は、ポリヌクレオチドに結合でき、その移動を制御できる限り酵素活性を示す必要はない。例えば成分は、その酵素活性を除去するように修飾されている酵素由来であってよく、またはそれが酵素として作用することを妨げる条件下で使用されてよい。
【０３２１】
ポリヌクレオチド結合成分は、好ましくは核酸分解酵素由来である。酵素は、より好ましくは酵素分類（ＥＣ）群３．１．１１、３．１．１３、３．１．１４、３．１．１５、３．１．１６、３．１．２１、３．１．２２、３．１．２５、３．１．２６、３．１．２７、３．１．３０および３．１．３１のいずれかのメンバー由来である。酵素は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（国際公開第２０１０／０８６６０３号パンフレットとして公開）に開示のもののいずれかであってよい。
【０３２２】
好ましい酵素は、エキソヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、ヘリカーゼおよび、ジャイレースなどのトポイソメラーゼである。好適なエキソヌクレアーゼは、これだけに限らないが、大腸菌（E. coli）由来エキソヌクレアーゼＩ、大腸菌（E. coli）由来エキソヌクレアーゼＩＩＩ酵素、Ｔ．サーモフィラス（T. thermophilus）由来ＲｅｃＪおよびバクテリオファージラムダエキソヌクレアーゼ、ＴａｔＤエキソヌクレアーゼならびにそれらの変種を含む。
【０３２３】
ポリメラーゼは、好ましくは成分分類（ＥＣ）群２．７．７．６、２．７．７．７、２．７．７．１９、２．７．７．４８および２．７．７．４９のいずれかのメンバーである。ポリメラーゼは、好ましくはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである。ポリメラーゼは、ＰｙｒｏＰｈａｇｅ（登録商標）３１７３  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｕｃｉｇｅｎ（登録商標）Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから商業的に入手できる）、ＳＤポリメラーゼ（Ｂｉｏｒｏｎ（登録商標）から商業的に入手できる）またはその変種であってよい。ポリヌクレオチド結合成分は、好ましくはＰｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号３１）由来である。成分は、配列番号１０１に示される配列またはその変種を含んでよい。配列番号３１の変種は、配列番号３１のものから変化しているアミノ酸配列を有し、ポリヌクレオチド結合活性を有している酵素である。これは、上に記載のとおり測定され得る。変種は、ポリヌクレオチドの結合を促進するならびに／または高塩濃度および／もしくは室温での活性を促進する修飾を含む場合がある。
【０３２４】
配列番号３１のアミノ酸配列の全長にわたって変種は、アミノ酸同一性に基づいてその配列に好ましくは少なくとも５０％相同性である。より好ましくは変種ポリペプチドは、アミノ酸同一性に基づいて配列の全長にわたって配列番号３１のアミノ酸配列に少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同性であってよい。少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％または９５％のアミノ酸同一性が２００以上のストレッチ、例えば２３０、２５０、２７０または２８０以上の連続するアミノ酸にわたってあり得る（「高い相同性」）。相同性は下に記載のとおり決定される。変種は配列番号２および４を参照して下に考察したいずれの方法においても野生型配列と異なっていてよい。
【０３２５】
ヘリカーゼは、配列番号８から２３のいずれかを含む、上に考察のもののいずれかであってよい。ヘリカーゼ二量体および多量体は下に詳細に考察される。ポリヌクレオチド結合成分は、ヘリカーゼ由来のポリヌクレオチド結合ドメインであってよい。例えばポリヌクレオチド結合成分は、配列番号３５または３６に示す配列またはその変種を好ましくは含む。配列番号３５または３６の変種は、配列番号３５または３６のものから変化しているアミノ酸配列を有し、ポリヌクレオチド結合活性を有しているタンパク質である。これは、上に記載のとおり測定され得る。変種は、ポリヌクレオチドの結合を促進するならびに／または高塩濃度および／もしくは室温での活性を促進する修飾を含む場合がある。
【０３２６】
配列番号３５または３６のアミノ酸配列の全長にわたって変種は、アミノ酸同一性に基づいてその配列に好ましくは少なくとも５０％相同性である。より好ましくは変種ポリペプチドは、アミノ酸同一性に基づいて配列番号３５または３６のアミノ酸配列の配列の全長にわたって少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同性であってよい。少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％または９５％のアミノ酸同一性が４０以上のストレッチ、例えば５０、６０、７０または８０以上の連続するアミノ酸にわたってあり得る（「高い相同性」）。相同性は下に記載のとおり決定される。変種は配列番号２および４を参照して下に考察したいずれの方法においても野生型配列と異なっていてよい。
【０３２７】
トポイソメラーゼは、好ましくは成分分類（ＥＣ）群５．９９．１．２および５．９９．１．３のいずれかのメンバーである。
【０３２８】
ポリヌクレオチド結合成分は、上に考察したいずれの酵素であってもよい。
【０３２９】
成分は、明示用標識（revealing label）で標識されてよい。標識は、上に記載のもののいずれであってもよい。
【０３３０】
成分は、大腸菌（E. coli）、Ｔ．サーモフィルス（T. thermophilus）またはバクテリオファージ、などの任意の成分産生生物から単離され得る、または合成的もしくは組換え的手段によって作製できる。例えば成分は、下に記載のとおりｉｎ  ｖｉｔｒｏ 翻訳および転写によって合成できる。成分は、下に記載のとおり大規模に産生されてよく、精製が続く。
【０３３１】
ヘリカーゼオリゴマー
上の考察から明らかであるとおり、ポリヌクレオチド結合成分は、ヘリカーゼに好ましくは由来する。例えばそれは、ヘリカーゼ由来ポリヌクレオチドドメインであってよい。成分は、１つまたは複数のヘリカーゼをより好ましくは含む。ヘリカーゼは、本発明のヘリカーゼおよび本発明により修飾されていないヘリカーゼを含む、本発明の構築物を参照して上に考察の任意のものであってよい。そのような実施形態では、当然のことながら本発明の構築物は、共に付着した２つ以上のヘリカーゼを含む。少なくとも１つのヘリカーゼは、本発明により修飾される。構築物は、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上のヘリカーゼを含んで良い。換言すると本発明の構築物は、ヘリカーゼ二量体、ヘリカーゼ三量体、ヘリカーゼ四量体、ヘリカーゼ五量体などを含んでよい。
【０３３２】
２つ以上のヘリカーゼは、任意の方向で互いに付着していてよい。同一または類似のヘリカーゼは、各ヘリカーゼ中の同一のアミノ酸位置または空間的に近接しているアミノ酸位置を介して付着してよい。これは、「ヘッドトゥーヘッド」編成と呼ばれる。代替的に同一または類似のヘリカーゼは、各ヘリカーゼの反対または異なる側の位置を介して付着してよい。これは、「ヘッドトゥーテール」編成と呼ばれる。３つの同一のまたは類似のヘリカーゼを含むヘリカーゼ三量体は、ヘッドトゥーヘッドおよびヘッドトゥーテール編成の両方を含む場合がある。
【０３３３】
２つ以上のヘリカーゼは、互いに異なっていてよい（すなわち構築物はヘテロ二量体、三量体、四量体または五量体などである）。例えば本発明の構築物は（ａ）本発明の１つもしくは複数のヘリカーゼおよび本発明により修飾されていない１つもしくは複数のヘリカーゼ；または（ｂ）本発明の２つ以上の異なるヘリカーゼを含んでよい。構築物は、同じＤｄａヘリカーゼの２つの異なる変種を含んでよい。例えば構築物は、各変種において異なる位置に導入された１つまたは複数のシステイン残基またはＦａｚ残基を有する、上に考察したヘリカーゼの内の１つの２つの変種を含む場合がある。この場合ヘリカーゼは、ヘッドトゥーテール編成であってよい。
【０３３４】
ヘテロ二量体は、２つの可能な方法で形成されてもよい。第一は、上に考察したホモ二機能性リンカーの使用を含む。ヘリカーゼ変種の１つは、１つのリンカーがタンパク質の１分子に付着されるように大過剰量のリンカーで修飾されてよい。このリンカー修飾変種は、次いで未修飾タンパク質、潜在的ホモ二量体、および他のヘリカーゼ変種と反応する未反応リンカーから精製されてよい。得られた二量体は、次いで他の分子種から精製されてよい。
【０３３５】
第二は、ヘテロ二機能性リンカーの使用を含む。例えばヘリカーゼ変種の１つは、一方の末端にマレイミドまたはヨードアセトアミド官能基および他方の末端にシクロオクチン官能基（ＤＩＢＯ）を含有する第一のＰＥＧリンカーで修飾されてよい。この一例は下に示される：
【０３３６】
【化３】
2017535256.tif 000016
【０３３７】
第二のヘリカーゼ変種は、一方の末端にマレイミドまたはヨードアセトアミド官能基および他方の末端にアジド官能基を含有する第二のＰＥＧリンカーで修飾されてよい。一例を下に示す：
【０３３８】
【化４】
2017535256.tif 000017
【０３３９】
２つの異なるリンカーを有する２つのヘリカーゼ変種は、次いで精製され、二量体を作製するために合わせてクリック（銅フリークリックケミストリーを使用する）されてよい。銅フリークリックケミストリーは、その望ましい特徴によりこれらの応用において使用されている。例えばそれは、迅速、清潔およびタンパク質に無毒である。しかし他の好適な生体直交型化学は、これだけに限らないが、シュタウディンガー化学、ヒドラジンまたはヒドラジド／アルデヒドまたはケトン試薬（ＨｙＮｉｃ＋４ＦＢ化学、全てのＳｏｌｕｌｉｎｋ（商標）試薬を含む）、ディール・アルダー試薬対およびボロン酸／サリチルヒドロキサム酸試薬を含む。
【０３４０】
同じヘリカーゼの２つの異なる変種を連結するこれらの２つの方法は、２つの異なるヘリカーゼの二量体およびヘリカーゼポリメラーゼ二量体などのヘリカーゼと成分とが互いに異なっている上に考察した構築物のいずれについても有効である。
【０３４１】
類似の方法がさまざまなＦａｚ変種を連結するために使用され得る。１つのＦａｚ変種は、１つのリンカーがタンパク質の１つの分子に付着されるように大過剰量のリンカーで修飾されてよい。このリンカー修飾Ｆａｚ変種は、次いで未修飾タンパク質、潜在的ホモ二量体、および第二のＦａｚ変種と反応する未反応リンカーから精製されてよい。得られた二量体は、次いで他の分子種から精製されてよい。
【０３４２】
ヘテロ二量体は、同じヘリカーゼまたは異なるヘリカーゼのシステイン変種とＦａｚ変種とを連結することによっても作製できる。一方の末端にマレイミドまたはヨードアセトアミド官能性および他方の末端にＤＢＣＯ官能性を有するヘテロ二機能性ＰＥＧリンカーは、この変異体の組合せにおいて使用できる。そのようなリンカーの一例は、下に示されている（ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−マレイミド）：
【０３４３】
【化５】
2017535256.tif 000018
【０３４４】
リンカーの長さは、２つの官能基間のＰＥＧ単位の数を変えることによって変更できる。
【０３４５】
ヘリカーゼヘテロ三量体は、３種の異なる型のヘリカーゼを含んでよい。３個より多いヘリカーゼを含むオリゴマーについても同様である。構築物中の２つ以上のヘリカーゼは、配列番号８から２３のいずれか１つの異なる変種などの同じヘリカーゼの異なる変種であってよい。異なる変種は、異なる位置を介する付着を促進するために異なる位置で修飾されてよい。ヘテロ三量体は、したがってヘッドトゥーテールおよびヘッドトゥーヘッド編成である場合がある。
【０３４６】
本発明の構築物中の２つ以上のヘリカーゼは、互いに同じであってよい（すなわち構築物はホモ二量体、三量体、四量体または五量体などである）。そのような実施形態ではヘリカーゼは、各ヘリカーゼ中の同じ位置を使用して好ましくは付着している。ヘリカーゼは、したがってヘッドトゥーヘッドで付着している。ヘリカーゼは、同じ位置でヘリカーゼに置換されているシステイン残基またはＦａｚ残基を使用して連結されてよい。同一のヘリカーゼ変種中のシステイン残基は、マレイミドまたはヨードアセトアミドなどのチオール反応性基を含有するホモ二機能性リンカーを使用して連結されてよい。これらの官能基は、次の例のとおりポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖の末端にあってよい：
【０３４７】
【化６】
2017535256.tif 000019
【０３４８】
リンカーの長さは、必要とされる応用に合わせて変更できる。例えばｎは、２、３、４、８、１１、１２、１６またはそれ以上であってよい。ＰＥＧリンカーは、水溶性などの好都合な特徴を有することから好適である。他の非ＰＥＧリンカーもシステイン連結において使用できる。
【０３４９】
同様の手法を使用することによって同一のＦａｚ変種は、ホモ二量体に作製され得る。ＤＩＢＯ官能基を有するホモ二機能性リンカーは、Ｃｕ２＋フリークリック化学を使用してホモ二量体を作製するために、同じＦａｚ変種の２分子を連結するために使用できる。リンカーの一例は下に示されている：
【０３５０】
【化７】
2017535256.tif 000020
【０３５１】
ＰＥＧリンカーの長さは、２、４、８、１２、１６またはそれ以上のＰＥＧ単位を含んで変化してよい。そのようなリンカーは、定量を容易にするために蛍光タグを組み込んで作製されてもよい。そのような蛍光タグは、マレイミドリンカーにも組み込まれ得る。
【０３５２】
２つ以上のシステイン残基または非天然アミノ酸が本発明によるヘリカーゼに導入され、別々のヘリカーゼモノマー中の別々のシステインまたは非天然アミノ酸が合わせて付着されている場合に、ホモ二量体またはより長いホモオリゴマーは、ヘッドトゥーテール編成に調製されてもよい。例えばホモオリゴマーは、Ｙ２７９ＣおよびＧ３５７Ｃを含む配列番号８の変種から形成されてよく、１つのモノマー中の２７９のＣは、別のモノマー中の３５７のＣに付着されてよい。同様にホモオリゴマーは、Ｉ２８１ＣおよびＧ３５７Ｃを含む配列番号８の変種から形成されてよく、１つのモノマー中の２８１のＣは、別のモノマー中の３５７のＣに付着されてよい。同様のことが、ＦａｚがＣの代わりにこれらの位置に導入される場合に真である。そのようなＣおよびＦａｚ変異体は、シリーズのまたは一続きの（trains of）ヘリカーゼが作製されるようにする。
【０３５３】
ポリヌクレオチド配列
本発明は本発明のヘリカーゼまたは本発明の構築物をコードする配列を含むポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、そのような配列からなってよい。ポリヌクレオチドは、上に考察の任意のものであってよい。
【０３５４】
本明細書に記載の任意のタンパク質は、当技術分野において公知の方法を使用して発現され得る。ポリヌクレオチド配列は、当技術分野における標準的方法を使用して単離および複製され得る。染色体ＤＮＡは、メタノコッコイデス・ブルトニイ（Methanococcoides burtonii）などのヘリカーゼ産生生物からおよび／または大腸菌（E. coli）などのＳＳＢ産生生物から抽出され得る。目的の配列をコードしている遺伝子は、特異的プライマーを伴うＰＣＲを使用して増幅され得る。増幅された配列は、次いでクローニングベクターなどの組換え複製可能ベクターに組み込まれてよい。ベクターは、適合性の宿主細胞においてポリヌクレオチドを複製するために使用され得る。したがってポリヌクレオチド配列は、目的の配列をコードしているポリヌクレオチドを複製可能ベクターに導入し、ベクターを適合性の宿主細胞に導入し、ベクターの複製をもたらす条件下で宿主細胞を増殖させることによって作製され得る。ベクターは宿主細胞から回収され得る。ポリヌクレオチドのクローニングのために好適な宿主細胞は、当技術分野において公知であり、下により詳細に記載される。
【０３５５】
ポリヌクレオチド配列は、好適な発現ベクターにクローニングされてよい。発現ベクターではポリヌクレオチド配列は、典型的には、宿主細胞によるコード配列の発現をもたらすことができる制御配列に作動可能に連結される。そのような発現ベクターは構築物を発現するために使用され得る。
【０３５６】
用語「作動可能に連結する」は、記載される構成成分がそれらが意図する様式で機能する関係の近位にあることを指す。コード配列に「作動可能に連結される」制御配列は、コード配列の発現が制御配列と適合性である条件下で達成されるような方法でライゲーションされる。同じまたは異なるポリヌクレオチドの複数のコピーは、ベクターに導入されてよい。
【０３５７】
発現ベクターは、次いで好適な宿主細胞に導入されてよい。それにより構築物は、構築物をコードしているポリヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入し、ベクターを適合性の細菌宿主細胞に導入し、ポリヌクレオチド配列の発現をもたらす条件下で宿主細胞を増殖させることによって産生され得る。
【０３５８】
ベクターは、複製開始点、場合により前記ポリヌクレオチド配列の発現のためのプロモーターおよび場合によりプロモーターのレギュレーターと共に提供される例えば、プラスミド、ウイルスまたはファージベクターであってよい。ベクターは、１つまたは複数の選択可能マーカー遺伝子、例えばアンピリシン耐性遺伝子を含有してよい。プロモーターおよび他の発現調節シグナルは、発現ベクターが設計された宿主細胞に適合性であるように選択されてよい。Ｔ７、ｔｒｃ、ｌａｃ、ａｒａまたはλＬプロモーターは典型的には使用される。
【０３５９】
宿主細胞は、典型的には高いレベルで構築物を発現する。ポリヌクレオチド配列で形質転換される宿主細胞は、細胞を形質転換するために使用される発現ベクターに適合性であるように選ばれる。宿主細胞は、典型的には細菌性、好ましくは大腸菌（E. coli）である。λＤＥ３溶原菌を有する任意の細胞、例えばＲｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓ、Ｃ４１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＪＭ１０９（ＤＥ３）、Ｂ８３４（ＤＥ３）、ＴＵＮＥＲ、ＯｒｉｇａｍｉおよびＯｒｉｇａｍｉ  Ｂは、Ｔ７プロモーターを含むベクターを発現できる。
【０３６０】
シリーズ
本発明は、ポリヌクレオチドに付着した（または結合した）２つ以上のヘリカーゼのシリーズであって、２つ以上のヘリカーゼの少なくとも１つが本発明のヘリカーゼであるヘリカーゼのシリーズも提供する。シリーズは、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれ以上などのヘリカーゼなどの任意の数のヘリカーゼを含んでよい。任意の数のヘリカーゼは、本発明のヘリカーゼであってよい。２つ以上のヘリカーゼの全ては、好ましくは本発明のヘリカーゼである。本発明の１つまたは複数のヘリカーゼは、上に考察の任意のものであってよい。
【０３６１】
２つ以上のヘリカーゼは、同じヘリカーゼであってよく、または異なるヘリカーゼであってよい。例えばシリーズが２つ以上の本発明のヘリカーゼを含む場合、本発明のヘリカーゼは同じであってよくまたは異なっていてよい。
【０３６２】
シリーズは、任意の数および任意の組合せの本発明のヘリカーゼを含んでよい。２つ以上のヘリカーゼのシリーズは、少なくとも２つの本発明のヘリカーゼを好ましくは含む。シリーズは、（ａ）Ｐ８９Ｆ、（ｂ）Ｖ１５０Ｉ、（ｃ）Ｖ１５０Ｈ、（ｄ）Ｐ８９ＦおよびＦ９８Ｗ、（ｅ）Ｐ８９ＦおよびＶ１５０Ｉ、（ｆ）Ｐ８９ＦおよびＶ１５０Ｈ、（ｇ）Ｆ９８ＷおよびＶ１５０Ｉ、（ｈ）Ｆ９８ＷおよびＶ１５０Ｈ（ｉ）Ｐ８９Ｆ、Ｆ９８ＷおよびＶ１５０Ｉまたは（ｊ）Ｐ８９Ｆ、Ｆ９８ＷおよびＶ１５０Ｈを含む（またはだけを含む）配列番号８の変種をそれぞれ含む２つ以上のヘリカーゼを含んでよい。
【０３６３】
シリーズは、（ｉ）Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ、（ｉｉ）Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃおよび次いで（ΔＭ１）Ｇ１Ｇ２（すなわちＭ１の欠失ならびに次いでＧ１およびＧ２付加）、（ｉｉｉ）Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ、（ｉｖ）Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａおよび次いで（ΔＭ１）Ｇ１Ｇ２（すなわちＭ１の欠失ならびに次いでＧ１およびＧ２付加）、（ｖ）Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ／Ｗ３７８Ａ、（ｖｉ）Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ／Ｗ３７８Ａおよび次いで（ΔＭ１）Ｇ１Ｇ２（すなわちＭ１の欠失ならびに次いでＧ１およびＧ２付加）、（ｖｉｉ）Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｗ３７８Ａまたは（ｖｉｉｉ）Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｗ３７８Ａおよび次いで（ΔＭ１）Ｇ１Ｇ２（すなわちＭ１の欠失ならびに次いでＧ１およびＧ２付加）を含む配列番号８の変種をそれぞれ含む２つ以上のヘリカーゼを含んでよい。シリーズ中の１つの本発明のヘリカーゼは、（ｉ）から（ｉｖ）の１つを含む配列番号８の変種を好ましくは含み、シリーズ中の別の本発明のヘリカーゼは、好ましくは（ｖ）から（ｖｉｉｉ）の１つを含む配列番号８の変種を含む。
【０３６４】
本発明の１つまたは複数のヘリカーゼに加えて、シリーズは本発明の一部ではない１つまたは複数のヘリカーゼを含んでよい。１つまたは複数のヘリカーゼは、Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼ、ＴｒａＩヘリカーゼもしくはＴｒｗＣヘリカーゼなどのＲｅｃＤヘリカーゼ、ＸＰＤヘリカーゼまたはＤｄａヘリカーゼ（配列番号８から２３のいずれか一つなど）であってよい、または由来してよい。１つまたは複数のヘリカーゼは、ヘリカーゼ、修飾ヘリカーゼまたは国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５２５７９号（国際公開第２０１３／０５７４９５号パンフレットとして公開）；第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７４号（国際公開第２０１３／０９８５６２号パンフレットとして公開）；第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７３号（国際公開第２０１３／０９８５６１号パンフレットとして公開）；第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２５号（国際公開第２０１４／０１３２６０号パンフレットとして公開）；第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２４号（国際公開第２０１４／０１３２５９号パンフレットとして公開）および第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２８号（国際公開第２０１４／０１３２６２号パンフレットとして公開）；ならびにＰＣＴ／ＧＢ２０１４／０５２７３６（国際公開第２０１５／０５５９８１号パンフレット）において開示のヘリカーゼ構築物のいずれであってもよい。具体的には１つまたは複数のヘリカーゼは、少なくとも１つのコンホメーション状態でポリヌクレオチドがヘリカーゼから解離できる、ポリヌクレオチド結合ドメイン中の開口部のサイズを低減するように好ましくは修飾される。これは、国際公開第２０１４／０１３２６０号パンフレットに開示されている。
【０３６５】
シリーズ中の２つ以上のヘリカーゼは、互いに離れていてよい。シリーズ中の２つ以上のヘリカーゼは、ポアを通ってポリヌクレオチドが移動する際に、膜貫通ポアによって互いに引き寄せられ得る。シリーズ中の２つ以上のヘリカーゼは、互いに接触できる。
【０３６６】
２つ以上のヘリカーゼは、ポリヌクレオチドを介する場合を除いて好ましくは互いに付着されない。２つ以上のヘリカーゼは、好ましくは互いに共有結合的に付着されない。
【０３６７】
２つ以上のヘリカーゼは、互いに付着できる、または共有結合的に付着できる。ヘリカーゼは、任意の順序で、任意の方法を使用して付着され得る。付着されたヘリカーゼのシリーズは、一続き（train）と呼ばれる場合がある。
【０３６８】
本発明のシリーズが付着できる／結合できるポリヌクレオチドは、下により詳細に考察される。
【０３６９】
本発明の方法
本発明は、標的ポリヌクレオチドの移動を制御する方法を提供する。方法は、標的ポリヌクレオチドを本発明の修飾ヘリカーゼまたは本発明の構築物と接触させ、それによりポリヌクレオチドの移動を制御するステップを含む。方法は、好ましくはポアに電位が印加されて実行される。下により詳細に考察されるとおり、印加された電位は、ポアとヘリカーゼまたは構築物との複合体の形成を典型的には生じる。印加された電位は、電圧電位であってよい。代替的に印加された電位は、化学電位であってよい。この一例は、両親媒性層全体に塩勾配を用いている。塩勾配は、Holden et al., J Am Chem Soc. 2007 Jul 11;129(27):8650-5に開示されている。
【０３７０】
本発明は標的ポリヌクレオチドを特性決定する方法も提供する。方法は、
（ａ）標的ポリヌクレオチドを膜貫通ポアおよび本発明の修飾ヘリカーゼまたは本発明の構築物に接触させて、ヘリカーゼまたは構築物がポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御するステップを含む。方法は、（ｂ）ポリヌクレオチドがポアに関して移動するときに１つまたは複数の測定値を取るステップであって、測定値が標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性の指標であり、それにより標的ポリヌクレオチドを特性決定するステップも含む。
【０３７１】
本発明の全ての方法ではヘリカーゼまたは構築物は、上に考察の任意のものであってよい。
【０３７２】
任意の数の本発明のヘリカーゼがこれらの方法において使用され得る。例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれ以上のヘリカーゼが使用され得る。２つ以上の本発明のヘリカーゼが使用される場合、それらは同じまたは異なっていてよい。好適な数および組合せは、本発明のシリーズを参照して上に考察されている。これらは、本発明の方法に等しく適用される。
【０３７３】
２つ以上のヘリカーゼが使用される場合、それらは互いに付着されてよい。２つ以上のヘリカーゼは、互いに共有結合的に付着されてよい。ヘリカーゼは、任意の順序で任意の方法を使用して付着されてよい。本発明における使用のために好ましいヘリカーゼ構築物は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２５号（国際公開第２０１４／０１３２６０号パンフレットとして公開）；第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２４号（国際公開第２０１４／０１３２５９号パンフレットとして公開）および第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２８号（国際公開第２０１４／０１３２６２号パンフレットとして公開）；ならびにＰＣＴ／ＧＢ２０１４／０５２７３６（国際公開第２０１５／０５５９８１号パンフレット）に記載されている。
【０３７４】
２つ以上のヘリカーゼが使用される場合、それらはポリヌクレオチドを介する場合を除いて好ましくは互いに付着されない。２つ以上のヘリカーゼは、より好ましくは互いに共有結合的に付着されない。
【０３７５】
ステップ（ａ）および（ｂ）は、上に考察したとおり好ましくはポアに電位が印加されて実行される。いくつかの場合では、ポリヌクレオチドがポアに関して移動するときにポアを通る電流が標的ポリヌクレオチドの配列を決定するために使用される。これは、鎖配列決定法である。
【０３７６】
本発明の方法は、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためである。ポリヌクレオチドは上に定義されている。
【０３７７】
標的ポリヌクレオチドの全体または部分だけは、本方法を用いて特性付けられ得る。標的ポリヌクレオチドは、任意の長さであってよい。例えばポリヌクレオチドは、長さ少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも４００または少なくとも５００ヌクレオチド対であってよい。ポリヌクレオチドは、１０００ヌクレオチド対以上、長さ５０００ヌクレオチド対以上または長さ１０００００ヌクレオチド対以上であってよい。
【０３７８】
標的ポリヌクレオチドは、任意の好適な試料中に存在する。本発明は、標的ポリヌクレオチドを含有することが公知であるまたは含有すると考えられる試料について典型的には実行される。代替的に本発明は、１つまたは複数の標的ポリヌクレオチドの同一性を確認するために試料中でのその存在が公知であるまたは期待される試料について実行され得る。
【０３７９】
試料は生物学的試料であってよい。本発明は、任意の生物または微生物から得られたまたは抽出された試料についてｉｎ  ｖｉｔｒｏで実行されてよい。試料は、非生物学的試料であってよい。非生物学的試料は、好ましくは液体試料である。非生物学的試料の例は、手術用液（surgical fluids）、水（飲料水、海水または河川水など）および検査室検査のための試薬を含む。
【０３８０】
膜貫通ポアは、ある程度膜を超える構造である。それは印加された電位によって駆動された水和イオンが膜を超えてまたは膜内に流れるようにする。膜貫通ポアは、典型的には膜全体を超え、それにより水和イオンは膜の一方の側から膜の他方の側へ流れられる。しかし膜貫通ポアは、膜を超えている必要はない。それは、一方の端で閉じていてもよい。例えばポアは、水和イオンが膜に沿ってまたは膜内に流れ得る穴であってもよい。
【０３８１】
任意の膜貫通ポアが本発明において使用され得る。ポアは、生物学的または人工であってよい。好適なポアは、これだけに限らないが、タンパク質ポア、ポリヌクレオチドポアおよびソリッドステートポアを含む。
【０３８２】
任意の膜が本発明により用いられ得る。好適な膜は、当技術分野において周知である。膜は、好ましくは両親媒性層である。両親媒性層は、少なくとも１つの親水性の部分および少なくとも１つの親油性または疎水性の部分の両方を有するリン脂質などの両親媒性分子から形成される層である。両親媒性分子は合成または天然に存在するものでよい。天然に存在しない両親媒性物質、および単層を形成する両親媒性物質は当技術分野において公知であり、例えばブロックコポリマー（Gonzalez-Perez et al., Langmuir, 2009, 25, 10447-10450）を含む。ブロック共重合体は、２つ以上の単量体サブユニットが１本のポリマー鎖を作るように併せて重合されている重合体材料である。ブロック共重合体は、典型的には各単量体サブユニットによって寄与される特徴を有する。しかし、ブロック共重合体は、個々のサブユニットから形成されたポリマーが有さない特有の特徴を有する場合がある。ブロック共重合は、単量体サブユニットの１つが疎水性（すなわち親油性）である一方で他のサブユニット（複数可）が水性媒体中では親水性であるように操作されてよい。この場合ブロック共重合体は、両親媒性特徴を有する場合があり、生物学的膜を模倣する構造を形成できる。ブロック共重合体は、ジブロック（２個の単量体サブユニットからなる）であってよいが、両親媒性物質として振る舞うさらに複雑な配置を形成するために２個より多い単量体サブユニットから構築されてもよい。共重合体はトリブロック、テトラブトックまたはペンタブロック共重合体であってもよい。
【０３８３】
両親媒性層は、単層または二重層であってよい。両親媒性層は、典型的には平面状脂質二重層または支持された二重層である。
【０３８４】
両親媒性層は典型的には、脂質二重層である。脂質二重層は細胞膜のモデルであり、さまざまな実験研究のための優れたプラットフォームとして役立つ。例えば、脂質二重層は、単一チャネル記録による膜タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ調査のために用いられ得る。代替的に脂質二重層は、さまざまな物質の存在を検出するためのバイオセンサーとして用いられ得る。脂質二重層は、任意の脂質二重層であってよい。好適な脂質二重層は、これだけに限らないが平面状脂質二重層、支持された二重層またはリポソームを含む。脂質二重層は好ましくは平面状脂質二重層である。好適な脂質二重層は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／０００５６３号（国際公開第２００８／１０２１２１号パンフレットとして公開）、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７号（国際公開第２００９／０７７７３４号パンフレットとして公開）および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００１０５７号（国際公開第２００６／１００４８４号パンフレットとして公開）に開示されている。
【０３８５】
脂質二重層を形成するための方法は、当技術分野において公知である。好適な方法は実施例に開示する。脂質二重層は、脂質単層が水溶液／空気界面にその界面に垂直である開口部のいずれかの端を通って運ばれる、モンタルおよびミューラーの方法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 1972;69:3561-3566）によって一般的には形成される。
【０３８６】
モンタルおよびミューラーの方法は、タンパク質ポア挿入のために好適である良質な脂質二重層を形成する対費用効果が高くて比較的簡単な方法であることから一般的である。二重層形成の他の一般的方法は、チップディッピング、ペインティング二重層およびリポソーム二重層のパッチクランピングを含む。
【０３８７】
好ましい実施形態では、脂質二重層は国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７号（国際公開第２００９／０７７７３４号パンフレットとして公開）に記載のとおり形成される。
【０３８８】
別の好ましい実施形態では、膜は、ソリッドステート層である。ソリッドステート層は生物由来ではない。換言すると、ソリッドステート層は、生物または細胞などの生物学的環境由来でなく、またはそれから単離されず、生物学的に入手可能な構造の合成的に製造されたバージョンでもない。ソリッドステート層は、これだけに限らないがミクロ電子材料、Ｓｉ３Ｎ４、Ａ１２０３およびＳｉＯなどの絶縁材料、ポリアミドなどの有機および無機ポリマー、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）などのプラスチックまたは２要素添加硬化シリコンゴム（two-component addition-cure silicone rubber）などのエラストマーならびにガラスを含む有機材料ならびに無機材料の両方から形成され得る。ソリッドステート層は、グラフェン（graphene）などの一原子層からまたは数原子厚だけである層から形成され得る。好適なグラフェン（graphene）層は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１０６３７号（国際公開第２００９／０３５６４７号パンフレットとして公開）に開示されている。
【０３８９】
方法は、（ｉ）ポアを含む人工両親媒性層、（ｉｉ）ポアを含む単離された天然に存在する脂質二重層、または（ｉｉｉ）挿入されたポアを有する細胞を用いて典型的には実行される。方法は、人工脂質二重層などの人工両親媒性層を用いて典型的には実行される。両親媒性層は、ポアに加えて他の膜貫通タンパク質および／または膜内タンパク質ならびに他の分子を含んでもよい。好適な装置および条件は、下に考察される。本発明の方法は、典型的にはｉｎ  ｖｉｔｒｏで実行される。
【０３９０】
ポリヌクレオチドは、膜にカップリングされ得る。ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のアンカーを使用して好ましくは膜にカップリングされる。ポリヌクレオチドは、任意の公知の方法を使用して膜にカップリングされてよい。
【０３９１】
各アンカーは、ポリヌクレオチドにカップリング（または結合）する基および膜にカップリング（または結合）する基を含む。各アンカーは、ポリヌクレオチドおよび／または膜に共有結合的にカップリング（または結合）できる。
【０３９２】
各ポリヌクレオチドは、２、３、４個以上のアンカーなどの任意の数のアンカーを使用して膜にカップリングされてよい。例えば１個のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドおよび膜の両方に別々にカップリング（または結合）する２個のアンカーを使用して膜にカップリングされてよい。
【０３９３】
１つまたは複数のアンカーは、１つまたは複数のヘリカーゼおよび／または１つまたは複数の分子ブレーキを含んでよい。
【０３９４】
膜が共重合体膜または脂質二重層などの両親媒性層である場合、１つまたは複数のアンカーは膜に存在するポリペプチドアンカーおよび／または膜に存在する疎水性アンカーを好ましくは含む。疎水性アンカーは、好ましくは脂質、脂肪酸、ステロール、カーボンナノチューブ、ポリペプチド、タンパク質またはアミノ酸、例えばコレステロール、パルミテートまたはトコフェロールである。好ましい実施形態では１つまたは複数のアンカーは、ディテクター（detector）ではない。
【０３９５】
両親媒性分子、共重合体または脂質などの膜の構成成分は、１つまたは複数のアンカーを形成するように化学的に修飾または官能基化されてよい。好適な化学的修飾の例および膜の構成成分を官能基化する好適な方法は、下により詳細に考察される。膜構成成分の任意の割合、例えば少なくとも０．０１％、少なくとも０．１％、少なくとも１％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％または１００％が官能基化されてよい。
【０３９６】
ポリヌクレオチドは、膜に直接カップリングされてよい。ポリヌクレオチドを膜にカップリングするために使用される１つまたは複数のアンカーは、リンカーを好ましくは含む。１つまたは複数のアンカーは、２、３、４個以上などの１つまたは複数のリンカーを含んでよい。１つのリンカーは、２、３、４個以上などの１つより多いポリヌクレオチドを膜にカップリングするために使用され得る。
【０３９７】
好ましいリンカーは、これだけに限らないがポリヌクレオチド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、多糖およびポリペプチドなどのポリマーを含む。これらのリンカーは、直鎖状、分枝状または環状であってよい。例えばリンカーは、環状ポリヌクレオチドであってよい。ポリヌクレオチドは、環状ポリヌクレオチドリンカー上の相補性配列にハイブリダイズできる。
【０３９８】
１つもしくは複数のアンカーまたは１つもしくは複数のリンカーは破壊のために切断され得る構成成分、制限部位または感光基などを含んでよい。
【０３９９】
官能基化リンカーおよび、それらが分子をカップリングできる方法は、当技術分野において公知である。例えばマレイミド基で官能基化されたリンカーは、タンパク質中のシステイン残基と反応および付着する。本発明の内容ではタンパク質は、膜中に存在してよく、またはポリヌクレオチドにカップリング（もしくは結合）するために使用され得る。これは下でより詳細に考察される。
【０４００】
ポリヌクレオチドの交差反応は、「鍵と鍵穴」配置を使用して回避され得る。各リンカーの一方の末端だけが長いリンカーを形成するために併せて反応でき、リンカーの他方の末端はポリヌクレオチドまたは膜とそれぞれ反応する。そのようなリンカーは国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３２号（国際公開第２０１０／０８６６０２号パンフレットとして公開）に記載されている。
【０４０１】
リンカーの使用は、下で考察される配列決定実施形態において好ましい。ポリヌクレオチドが、ポアと相互作用したときにカップリングが切り離されないという意味で膜に直接永久的にカップリングされると、膜とディテクターとの間の距離のために配列決定実行がポリヌクレオチドの末端まで継続できないことからいくつかの配列データは失われる。リンカーが使用される場合、ポリヌクレオチドは完了まで処理され得る。
【０４０２】
カップリングは、永久的または安定であってよい。言い換えるとカップリングは、ポアと相互作用する場合にポリヌクレオチドが膜にカップリングされたままになるようなものであってよい。
【０４０３】
カップリングは一過的であってよい。言い換えるとカップリングは、ポアと相互作用する場合にポリヌクレオチドが膜から脱カップリングされ得るようなものであってよい。
【０４０４】
アプタマー検出などのある種の応用に関してカップリングの一過的な性質は好ましい。永久的または安定なリンカーがポリヌクレオチドの５’または３’末端のいずれかに直接付着されており、リンカーが膜と膜貫通ポアのチャネルとの間の距離より短い場合、ポリヌクレオチドの末端まで配列決定実行が継続できないことから、いくらかの配列データが失われる。カップリングが一過的である場合、カップリングされた端は無作為に膜から遊離し、ポリヌクレオチドは完了まで処理され得る。永久的／安定または一過的の連結を形成する化学基は、下により詳細に考察される。ポリヌクレオチドは、コレステロールまたは脂肪酸アシル鎖を用いて両親媒性層またはトリブロック共重合体膜に一過的にカップリングされ得る。ヘキサデカン酸などの長さ６個から３０個の炭素原子を有する任意の脂肪酸アシル鎖は用いられ得る。
【０４０５】
好ましい実施形態では核酸などのポリヌクレオチドは、トリブロック共重合体膜または脂質二重層などの両親媒性層にカップリングされる。合成脂質二重層への核酸のカップリングは、種々の異なるテザーリング戦略で既に実行されている。これらを下の表６に要約する。
【０４０６】
【表６】
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【０４０７】
合成ポリヌクレオチドおよび／またはリンカーは、合成反応において修飾ホスホラミダイトを用いて官能基化されることができ、コレステロール、トコフェロール、パルミテート、チオール、脂質およびビオチン基などの好適なアンカー基の直接付加に容易に適合される。これらのさまざまな付着化学物質は、ポリヌクレオチドに一連の付着選択肢をもたらす。さまざまな各修飾基は、わずかに異なる方法でポリヌクレオチドをカップリングし、カップリングは常に永久的ではなく、膜へのさまざまな残存時間をポリヌクレオチドにもたらす。一過的カップリングの有利点は、上に考察される。
【０４０８】
ポリヌクレオチドのリンカーまたは官能基化膜へのカップリングは、相補性反応基またはアンカー基がポリヌクレオチドに付加され得る限り多数の他の手段によっても達成され得る。ポリヌクレオチドのいずれかの端への反応基の付加は既に報告されている。チオール基はＴ４ポリヌクレオチドキナーゼおよびＡＴＰγＳを用いてｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡの５’に付加され得る（Grant,G.P.およびP.Z.Qin (2007) "A facile method for attaching nitroxide spin labels at the 5' terminus of nucleic acids." Nucleic Acids Res 35(10):e77）。アジド基は、ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡの５’−リン酸にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼおよびγ−［２−アジドエチル］−ＡＴＰまたはγ−［６−アジドヘキシル］−ＡＴＰを使用して付加され得る。チオールまたはクリック化学を使用して、チオール、ヨードアセトアミドＯＰＳＳまたはマレイミド基（チオールに反応性）またはＤＩＢＯ（ジベンゾシクロオキシチン（dibenzocyclooxtyne）またはアルキン基（アジドに反応性）を含有するテザーは、ポリヌクレオチドに共有結合的に付着されてよい。ビオチン、チオールおよびフルオロフォア（fluorophore）などの化学基のより多様な選択は、修飾オリゴヌクレオチドをｓｓＤＮＡの３’に組み込むためにターミナルトランスフェラーゼを用いて付加され得る(Kumar,A.,P.Tchen, et al. (1988)."Nonradioactive labeling of synthetic oligonucleotide probes with terminal deoxynucleotidyl transferase." Anal Biochem 169(2):376-82)。ストレプトアビジン／ビオチンおよび／またはストレプトアビジン／デスチオビオチンカップリングは、任意の他のポリヌクレオチドのために使用され得る。下の例は、ポリヌクレオチドがストレプトアビジン／ビオチンおよびストレプトアビジン／デスチオビオチンを使用してどのように膜にカップリングされ得るかを記載している。適切に修飾されたヌクレオチド（例えばコレステロールまたはパルミテート）と共にターミナルトランスフェラーゼを使用してアンカーが、ポリヌクレオチドに直接添加されることも可能である。
【０４０９】
１つまたは複数のアンカーは、ポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションを介して膜に好ましくはカップリングする。１つまたは複数のアンカーでのハイブリダイゼーションは、上に考察した一過的な様式でのカップリングを可能にする。ハイブリダイゼーションは、１つもしくは複数のアンカーとポリヌクレオチドの間、１つもしくは複数のアンカー内または１つもしくは複数のアンカーと膜との間などの１つまたは複数のアンカーの任意の部分に存在してよい。例えばリンカーは、合わせてハイブリダイズされる３個、４個または５個のポリヌクレオチドなどの２個以上のポリヌクレオチドを含んでよい。１つまたは複数のアンカーはポリヌクレオチドにハイブリダイズできる。１つまたは複数のアンカーは、ポリヌクレオチドに直接、またはポリヌクレオチドに付着されたＹアダプターおよび／もしくはリーダー配列に直接、またはポリヌクレオチドに付着された、ヘアピンループアダプターなどの架橋成分アダプターに直接ハイブリダイズされてよい（下に考察の通り）。代替的に１つまたは複数のアンカーは、ポリヌクレオチドに、ポリヌクレオチドに付着されたＹアダプターおよび／もしくはリーダー配列に、またはポリヌクレオチドに付着された架橋成分アダプターにハイブリダイズされる２個または３個などの１つまたは複数の中間体ポリヌクレオチド（または「スプリント」）にハイブリダイズされてよい（下に考察の通り）。
【０４１０】
１つまたは複数のアンカーは、１本鎖または２本鎖ポリヌクレオチドを含んでよい。アンカーの一部分は、１本鎖または２本鎖ポリヌクレオチドにライゲーションされてよい。ｓｓＤＮＡの短片のライゲーションは、Ｔ４ＲＮＡリガーゼＩを用いて報告されている（Troutt,A.B., M.G.McHeyzer-Williams, et al.(1992)."Ligation-anchored PCR: a simple amplification technique with single-sided specificity." Proc Natl Acad Sci U S A 89(20):9823-5）。代替的に１本鎖または２本鎖ポリヌクレオチドのいずれかは、２本鎖ポリヌクレオチドにライゲーションされることができ、次いで２本の鎖は熱的または化学的変性によって分離された。２本鎖ポリヌクレオチドについて、１本鎖ポリヌクレオチドの１片を二重鎖の１つもしくは両方の端に、または２本鎖ポリヌクレオチドを１つまたは両方の端へのいずれかで付加できる。１本鎖ポリヌクレオチドの２本鎖ポリヌクレオチドへの付加について、これは１本鎖ポリヌクレオチドの他の領域へのライゲーションと同様にＴ４  ＲＮＡリガーゼＩを使用して達成され得る。２本鎖ポリヌクレオチドの２本鎖ポリヌクレオチドへの付加について、次いでライゲーションは、ポリヌクレオチド上の相補性３’ｄＡ／ｄＴテールおよびそれぞれ付加されたポリヌクレオチドを有する（鎖状体または二量体形成を妨げるために多数の試料調製適用のために日常的に行われる通り）またはポリヌクレオチドの制限消化によって生成された「突出末端」および適合性アダプターのライゲーションを使用する「平滑末端」であってよい。次いで、二重鎖が融解される際に、１本鎖ポリヌクレオチドが５’末端、３’末端もしくは両端でのライゲーションもしくは修飾のために用いられた場合、または２本鎖ポリヌクレオチドがライゲーションのために用いられた場合、各１本鎖は５’または３’修飾のいずれかを有する。
【０４１１】
ポリヌクレオチドが合成鎖である場合、１つまたは複数のアンカーはポリヌクレオチドの化学合成の際に組み込まれ得る。例えばポリヌクレオチドは、付着された反応基を有するプライマーを用いて合成され得る。
【０４１２】
アデニル化ポリヌクレオチドは、アデノシン一リン酸がポリヌクレオチドの５’−リン酸に付着されるライゲーション反応における中間体である。ＮＥＢからの５’ＤＮＡアデニル化キットなどの種々のキットがこの中間体の生成のために利用可能である。修飾ヌクレオチド三リン酸についての反応においてＡＴＰを置換することによって、次に反応基（チオール、アミン、ビオチン、アジドなど）をポリヌクレオチドの５’に付加することが可能になる。アンカーが、５’ＤＮＡアデニル化キットを適切に修飾されたヌクレオチド（例えばコレステロールまたはパルミテート）と共に使用してポリヌクレオチドに直接添加されることも可能である。
【０４１３】
ゲノムＤＮＡのセクションの増幅のための一般的技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いている。本明細書では、２個の合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＤＮＡの同じセクションの多数の複製物が作製される場合があり、各複製物について二重鎖中の各鎖の５’は合成ポリヌクレオチドである。単一または複数のヌクレオチドは、ポリメラーゼを用いることによって１本鎖または２本鎖ＤＮＡの３’末端に付加され得る。使用され得るポリメラーゼの例は、これだけに限らないが、ターミナルトランスフェラーゼ、クレノウおよび大腸菌（E.coli）ポリ（Ａ）ポリメラーゼ）を含む。反応中のＡＴＰを修飾ヌクレオチド三リン酸に置換することによって、次いでコレステロール、チオール、アミン、アジド、ビオチンまたは脂質などのアンカーは、２本鎖ポリヌクレオチドに組み込まれ得る。したがって増幅ポリヌクレオチドの各複製物は、アンカーを含有する。
【０４１４】
理想的にはポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドを官能基化することなく膜にカップリングされる。これは、ポリヌクレオチド結合タンパク質または化学基などの１つまたは複数のアンカーを膜にカップリングし、１つまたは複数のアンカーがポリヌクレオチドと相互作用できるようにすることによって、または膜を官能基化することによって達成され得る。１つまたは複数のアンカーは、本明細書に記載の方法のいずれかによって膜にカップリングされてよい。具体的には１つまたは複数のアンカーは、マレイミド官能基化リンカーなどの１つまたは複数のリンカーを含んでよい。
【０４１５】
本実施形態ではポリヌクレオチドは、典型的にはＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、ＴＮＡまたはＬＮＡであり、２本鎖または１本鎖であってよい。本実施形態は、ゲノムＤＮＡポリヌクレオチドに特に適している。
【０４１６】
１つまたは複数のアンカーは、１本鎖もしくは２本鎖ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド内の特異的ヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド内の修飾ヌクレオチドのパターン、またはポリヌクレオチド上に存在する任意の他のリガンドにカップリング、結合または相互作用する任意の基を含み得る。
【０４１７】
アンカーにおける使用のために好適な結合タンパク質は、これだけに限らないが、下に列挙するものを含む大腸菌（E. coli）１本鎖結合タンパク質、Ｐ５  １本鎖結合タンパク質、Ｔ４  ｇｐ３２  １本鎖結合タンパク質、ＴＯＰＯ  Ｖ  ｄｓＤＮＡ結合領域、ヒトヒストンタンパク質、大腸菌（E. coli）ＨＵ  ＤＮＡ結合タンパク質および他の古細菌、原核または真核１本鎖もしくは２本鎖ポリヌクレオチド（または核酸）結合タンパク質を含む。
【０４１８】
特異的ヌクレオチド配列は、転写因子、リボソーム、エンドヌクレアーゼ、トポイソメラーゼまたは複製開始因子によって認識される配列であってよい。修飾ヌクレオチドのパターンは、メチル化または障害のパターンであってよい。
【０４１９】
１つまたは複数のアンカーは、ポリヌクレオチドにカップリング、結合、介在または相互作用する任意の基を含み得る。基は、静電気、水素結合またはファンデルワールス相互作用を介してポリヌクレオチドに介在または相互作用できる。そのような基は、リシン単量体、ポリリジン（ｓｓＤＮＡもしくはｄｓＤＮＡと相互作用する）、エチジウムブロマイド（ｄｓＤＮＡに介在する）、ユニバーサル塩基またはユニバーサルヌクレオチド（任意のポリヌクレオチドとハイブリダイズできる）およびオスミウム複合体（メチル化塩基と反応できる）を含む。ポリヌクレオチドは、したがって膜に付着された１つまたは複数のユニバーサルヌクレオチドを使用して膜にカップリングされ得る。各ユニバーサルヌクレオチドは、１つまたは複数のリンカーを使用して膜にカップリングされ得る。ユニバーサルヌクレオチドは、次の核酸塩基：ヒポキサンチン、４−ニトロインドール、５−ニトロインドール、６−ニトロインドール、ホルミルインドール、３−ニトロピロール、ニトロイミダゾール、４−ニトロピラゾール、４−ニトロベンズイミダゾール、５−ニトロインダゾール、４−アミノベンズイミダゾ−ルまたはフェニル（Ｃ６−芳香族環）の１つを好ましくは含む。ユニバーサルヌクレオチドは、次のヌクレオシド：２’−デオキシイノシン、イノシン、７−デアザ−２’−デオキシイノシン、７−デアザ−イノシン、２−アザ−デオキシイノシン、２−アザ−イノシン、２−Ｏ’−メチルイノシン、４−ニトロインドール２’−デオキシリボヌクレオシド、４−ニトロインドールリボヌクレオシド、５−ニトロインドール２’−デオキシリボヌクレオシド、５−ニトロインドールリボヌクレオシド、６−ニトロインドール２’−デオキシリボヌクレオシド、６−ニトロインドールリボヌクレオシド、３−ニトロピロール２’−デオキシリボヌクレオシド、３−ニトロピロールリボヌクレオシド、ヒポキサンチンの非環式糖類似物、ニトロイミダゾール２’−デオキシリボヌクレオシド、ニトロイミダゾールリボヌクレオシド、４−ニトロピラゾール２’−デオキシリボヌクレオシド、４−ニトロピラゾールリボヌクレオシド、４−ニトロベンズイミダゾール２’−デオキシリボヌクレオシド、４−ニトロベンズイミダゾールリボヌクレオシド、５−ニトロインダゾール２’−デオキシリボヌクレオシド、５−ニトロインダゾールリボヌクレオシド、４−アミノベンズイミダゾール２’−デオキシリボヌクレオシド、４−アミノベンズイミダゾールリボヌクレオシド、フェニルＣ−リボヌクレオシド、フェニルＣ−２’−デオキシリボシルヌクレオシド、２’−デオキシネブラリン、２’−デオキシイソグアノシン、Ｋ−２’−デオキシリボース、Ｐ−２’−デオキシリボースおよびピロリジンの１つをより好ましくは含む。ユニバーサルヌクレオチドは、２’−デオキシイノシンをより好ましくは含む。ユニバーサルヌクレオチドは、より好ましくはＩＭＰまたはｄＩＭＰである。ユニバーサルヌクレオチドは、最も好ましくはｄＰＭＰ（２’−デオキシ−Ｐ−ヌクレオシドモノホスフェート）またはｄＫＭＰ（Ｎ６−メトキシ−２、６−ジアミノプリンモノホスフェート）である。
【０４２０】
１つまたは複数のアンカーは、フーグスティーン水素結合（２個の核酸塩基が水素結合によって一緒に保持されている）または逆フーグスティーン水素結合（１個の核酸塩基が他の核酸塩基に対して１８０°回転されている）を介してポリヌクレオチドにカップリング（または結合）できる。例えば１つまたは複数のアンカーは、ポリヌクレオチドとフーグスティーン水素結合または逆フーグスティーン水素結合を形成する１つもしくは複数のヌクレオチド、１つもしくは複数のオリゴヌクレオチドまたは１つもしくは複数のポリヌクレオチドを含み得る。これらの水素結合の種類は、第３のポリヌクレオチド鎖が２本鎖ヘリックスに巻き付くようにし、三重鎖を形成できるようにする。１つまたは複数のアンカーは、２本鎖の二重鎖と三重鎖を形成することによって２本鎖ポリヌクレオチドにカップリング（または結合）できる。
【０４２１】
本実施形態では少なくとも１％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％または１００％の膜構成成分が官能基化されてよい。
【０４２２】
１つまたは複数のアンカーがタンパク質を含む場合、例えばそれが膜に適合性である外部疎水性領域を既に有する場合、それらはさらなる官能基化を伴わずに膜に直接アンカーされ得る。そのようなタンパク質の例は、これだけに限らないが、膜貫通タンパク質、膜内タンパク質および膜タンパク質を含む。代替的にタンパク質は、膜に適合性である遺伝子的に融合された疎水性領域と共に発現され得る。そのような疎水性タンパク質領域は、当技術分野において公知である。
【０４２３】
１つまたは複数のアンカーは、膜に接触される前に好ましくはポリヌクレオチドと混合されるが、１つまたは複数のアンカーは膜に接触され、次にポリヌクレオチドに接触されてよい。
【０４２４】
別の態様ではポリヌクレオチドは、上に記載の方法を使用して官能基化されてよく、それにより特異的な結合基によって認識され得る。具体的にはポリヌクレオチドは、ビオチン（ストレプトアビジンへの結合のため）、アミロース（マルトース結合タンパク質もしくは融合タンパク質への結合のため）、Ｎｉ−ＮＴＡ（ポリヒスチジンもしくはポリヒスチジンタグ化タンパク質への結合のため）またはペプチド（抗原など）などのリガンドで官能基化されてよい。
【０４２５】
好ましい実施形態により１つまたは複数のアンカーは、ポリヌクレオチドがポアを優先的に通すリーダー配列に付着されている場合、ポリヌクレオチドを膜にカップリングするために使用されてよい。リーダー配列は下により詳細に考察される。好ましくはポリヌクレオチドは、ポアを優先的に通すリーダー配列に付着（ライゲーションなど）される。そのようなリーダー配列は、ホモポリマー性ポリヌクレオチドまたは脱塩基領域を含んでよい。リーダー配列は、１つまたは複数のアンカーに直接または１つまたは複数の中間体ポリヌクレオチド（もしくはスプリント）を介してのいずれかでハイブリダイズするように典型的には設計される。そのような場合１つまたは複数のアンカーは、リーダー配列中の配列にまたは１つもしくは複数の中間体ポリヌクレオチド（またはスプリント）中の配列に相補性であるポリヌクレオチド配列を典型的には含む。そのような場合１つまたは複数のスプリントは、リーダー配列中の配列に相補性であるポリヌクレオチド配列を典型的には含む。
【０４２６】
化学的付着において使用される分子の例は、ＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩）である。反応基も商業的に入手できるキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｐｉｅｒｃｅ、Ｐａｒｔ  Ｎｏ．２２９８０）を使用してポリヌクレオチドの５’に付加され得る。好適な方法は、これだけに限らないが、ヒスチジン残基およびＮｉ−ＮＴＡを使用する一過的親和性付着、ならびに反応性システイン、リシンまたは非天然アミノ酸によるさらに強い共有結合的付着を含む。
【０４２７】
膜貫通ポアは、好ましくは膜貫通タンパク質ポアである。膜貫通タンパク質ポアは、分析物などの水和イオンが膜の一方の側から膜の他方の側へ流れるようにするポリペプチドまたはポリペプチドの集積物である。本発明では膜貫通タンパク質ポアは、水和イオンが印加された電位によって膜の一方の側から他方へ流れるように駆動されるようにするポアを形成できる。膜貫通タンパク質ポアは、ヌクレオチドなどの分析物が膜（脂質二重層など）の一方の側から他方へ流れるように好ましくはする。膜貫通タンパク質ポアは、ＤＮＡまたはＲＮＡなどのポリヌクレオチドがポアを通って移動されることを可能にする。
【０４２８】
膜貫通タンパク質ポアは、単量体またはオリゴマーであってよい。ポアは、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個または少なくとも９個のサブユニットなどの、いくつかの反復サブユニットから好ましくはできている。ポアは、６個、７個、８個または９個のサブユニットから好ましくはできている。ポアは、好ましくは六量体、七量体、八量体または九量体ポアである。ポアは、ホモオリゴマーまたはヘテロオリゴマーであってよい。
【０４２９】
膜貫通タンパク質ポアは、イオンが通って流れることができるバレルまたはチャネルを典型的には含む。ポアのサブユニットは、典型的には中央軸を取り囲み、膜貫通βバレルもしくはチャネルまたは膜貫通αヘリックス束もしくはチャネルに鎖を供する。
【０４３０】
膜貫通タンパク質ポアのバレルまたはチャネルは、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸などの分析物との相互作用を促進するアミノ酸を典型的には含む。これらのアミノ酸は、バレルまたはチャネルの狭窄部付近に好ましくは位置する。膜貫通タンパク質ポアは、アルギニン、リシンもしくはヒスチジンなどの１つもしくは複数の正に荷電したアミノ酸またはチロシンもしくはトリプトファンなどの芳香族アミノ酸を典型的には含む。これらのアミノ酸は、ポアとヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸との間の相互作用を典型的には促進する。
【０４３１】
本発明による使用のための膜貫通タンパク質ポアは、β−バレルポアまたはα−ヘリックス束ポアから生じ得る。β−バレルポアは、β−鎖から形成されるバレルまたはチャネルを含む。好適なβ−バレルポアは、これだけに限らないが、α−ヘモリジン（hemolysin）、炭疽毒素およびロイコシジン（leukocidin）などのβ−毒素、スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ポリン（porin）（Ｍｓｐ）、例えばＭｓｐＡ、ＭｓｐＢ、ＭｓｐＣまたはＭｓｐＤ、ＣｓｇＧ、外膜ポリン（porin）Ｆ（ＯｍｐＦ）、外膜ポリン（porin）Ｇ（ＯｍｐＧ）、外膜ホスホリパーゼＡおよびナイセリア（Neisseria）オートトランスポーターリポタンパク質（ＮａｌＰ）およびリセニンなどの他のポアなどの細菌の外膜タンパク質／ポリン（porin）を含む。α−ヘリックス束ポアは、α−ヘリックスから形成されたバレルまたはチャネルを含む。好適なα−ヘリックス束ポアは、これだけに限らないが内膜タンパク質ならびに、ＷＺＡおよびＣｌｙＡ毒などのα外膜タンパク質を含む。膜貫通ポアは、ライセニン由来であってよい。ライセニン由来の好適なポアは、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５０６６７号（国際公開第２０１３／１５３３５９号パンフレットとして公開）において開示されている。ＣｓｇＧ由来の好適なポアは、国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０６９９６５号において開示されている。膜貫通ポアは、Ｍｓｐ由来またはα−ヘモリジン（α−ＨＬ）由来である場合がある。
【０４３２】
膜貫通タンパク質ポアは、好ましくはＭｓｐに由来し、好ましくはＭｓｐＡに由来する。そのようなポアはオリゴマーであり、典型的にはＭｓｐ由来の７、８、９または１０個の単量体を含む。ポアは、同一の単量体を含むＭｓｐ由来のホモオリゴマーポアであってよい。代替的にポアは、少なくとも１個の他とは異なる単量体を含むＭｓｐ由来のヘテロオリゴマーポアであってもよい。好ましくはポアは、ＭｓｐＡまたはその相同体もしくはパラログ由来である。
【０４３３】
Ｍｓｐ由来の単量体は典型的には、配列番号２に示す配列またはその変種を含む。配列番号２は野生型ＭｓｐＡ単量体である。配列番号２の変種は、配列番号２のものから変化し、ポアを形成する能力を有しているアミノ酸配列を有するポリペプチドである。ポアを形成する変種の能力は、当技術分野において公知の任意の方法を用いてアッセイされ得る。例えば変種は、他の適切なサブユニットと共に両親媒性層に挿入されることができ、ポアを形成するためにオリゴマー化するその能力は測定され得る。サブユニットを両親媒性層などの膜に挿入するための方法は、当技術分野において公知である。例えばサブユニットは、脂質二重層に拡散し、脂質二重層に結合するステップおよび機能的状態に会合するステップによって挿入されるように脂質二重層を含有する溶液中に精製された形態で懸濁され得る。代替的にサブユニットは、M.A.Holden,H.Bayley.J.Am.Chem.Soc.2005, 127, 6502-6503および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００１０５７号（国際公開第２００６／１００４８４号パンフレットとして公開）に記載の「ピックアンドプレース」法を用いて膜に直接挿入され得る。
【０４３４】
配列番号２のアミノ酸配列の全長にわたって変種は、アミノ酸類似性または同一性に基づいてその配列に好ましくは少なくとも５０％相同である。より好ましくは変種は、配列全体にわたって配列番号２のアミノ酸配列にアミノ酸同一性に基づいて少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同である。少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％または９５％のアミノ酸同一性が１００以上（例えば１２５、１５０、１７５もしくは２００またはそれ以上）のストレッチの連続アミノ酸にわたってある場合がある（「高い相同性」）。
【０４３５】
相同性を決定するために当技術分野における標準的方法が用いられ得る。例えばＵＷＧＣＧパッケージは、相同性を算出するために用いられ得るＢＥＳＴＦＩＴプログラム（例えばその初期設定で用いられる）を提供する（Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395）。ＰＩＬＥＵＰ、ＢＬＡＳＴおよびＰＳＩＢＬＡＳＴアルゴリズムは、相同性を算出するためまたは配列を列挙するために（等価残基または対応する配列を同定するステップなど（典型的にはその初期設定で））用いられ得る、例えばAltschul S.F.(1993)J Mol Evol 36:290-300；Altschul,S.F, et al., (1990) J Mol Biol 215:403-10に記載のとおり。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウエアは、ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を通じて公開で入手可能である。
【０４３６】
変種は、次の変異：Ｄ９０Ｎ、Ｄ９１Ｎ、Ｄ９３Ｎ、Ｄ１１８Ｒ、Ｄ１３４ＲおよびＥ１３９Ｋを含んでよい。変種は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５０３０１号（国際公開第２０１２／１０７７７８号パンフレット）において開示の変種のいずれかであってよい。
変種は、好ましくは（ａ）位置９０にアスパラギン酸（Ｄ）を含まない；（ｂ）位置９１にアスパラギン酸（Ｄ）を含まない；（ｃ）位置９３にアスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）を含む；および（ｄ）単量体のキャップ形成領域および／またはバレル形成領域中の内側を向いているアミノ酸の正味の負電荷を減少させる１つまたは複数の修飾を含む。（ｄ）中の好ましい変異は、これだけに限らないがＤ１１８Ｒ、Ｑ１２６Ｒ、Ｄ１３４ＲおよびＥ１３９Ｋを含む。変種は、Ｄ９０Ｎ、Ｄ９１Ｎ、９３にＤまたはＥ、Ｄ１１８Ｒ、Ｄ１３４ＲおよびＥ１３９Ｋを好ましくは含む。変種は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１５／０５１２９０号に開示された変種のいずれかであってもよい。
【０４３７】
配列番号２は、ＭｓｐＡ単量体のＭＳ−（Ｂ１）８変異体である。変種は、ＭｓｐＡと比較してＭｓｐＢ、ＣまたはＤ単量体中の任意の変異を含み得る。ＭｓｐＢ、ＣおよびＤの成熟形態は配列番号５から７に示される。詳細には変種は、ＭｓｐＢに存在する次の置換：Ａ１３８Ｐを含む場合がある。変種は、ＭｓｐＣに存在する次の置換：Ａ９６Ｇ、Ｎ１０２ＥおよびＡ１３８Ｐの１つまたは複数を含む場合がある。変種はＭｓｐＤに存在する次の置換：Ｇ１の欠失、Ｌ２Ｖ、Ｅ５Ｑ、Ｌ８Ｖ、Ｄ１３Ｇ、Ｗ２１Ａ、Ｄ２２Ｅ、Ｋ４７Ｔ、Ｉ４９Ｈ、Ｉ６８Ｖ、Ｄ９１Ｇ、Ａ９６Ｑ、Ｎ１０２Ｄ、Ｓ１０３Ｔ、Ｖ１０４Ｉ、Ｓ１３６ＫおよびＧ１４１Ａの１つまたは複数を含む場合がある。変種は、ＭｓｐＢ、ＣおよびＤ由来の１つまたは複数の変異および置換の組合せを含み得る。変種は、好ましくは変異Ｌ８８Ｎを含む。配列番号２の変種は、ＭＳ−（Ｂ１）８の全変異に加えて変異Ｌ８８Ｎを有し、ＭＳ−（Ｂ２）８と称される。本発明において用いられるポアは、好ましくはＭＳ−（Ｂ２）８である。さらに好ましい変種は、変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを含む。配列番号２の変種は変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６ＲをＭＳ−（Ｂ１）８の全ての変異に加えて含み、ＭＳ−（Ｂ２Ｃ）８と称される。本発明において使用されるポアは、好ましくはＭＳ−（Ｂ２）８またはＭＳ−（Ｂ２Ｃ）８である。
【０４３８】
アミノ酸置換は、上に考察したものに加えて配列番号２のアミノ酸配列に作出され得る（例えば１、２、３、４、５、１０、２０または３０置換まで）。保存的置換は、アミノ酸を同様の化学構造、同様の化学的特性または同様の側鎖容積を有する他のアミノ酸で置き換える。導入されるアミノ酸は、それらが置き換えるアミノ酸と同様の極性、親水性、疎水性、塩基性度、酸性度、中性度または電荷を有してよい。代替的に保存的置換は、既存の芳香族または脂肪族アミノ酸の代わりに芳香族または脂肪族である別のアミノ酸を導入する場合がある。保存的アミノ酸変更は、当技術分野において周知であり、下の表７に定義のとおり２０種の主なアミノ酸の特性に従って選択され得る。アミノ酸が同様の極性を有する場合、これは表８におけるアミノ酸側鎖についてのハイドロパシースケールを参照することによっても決定され得る。
【０４３９】
【表７】
2017535256.tif 000022
【０４４０】
【表８】
2017535256.tif 000023
【０４４１】
配列番号２のアミノ酸配列の１つまたは複数のアミノ酸残基は、上に記載のポリペプチドから追加的に欠失され得る。１、２、３、４、５、１０、２０または３０残基までまたはそれ以上が欠失され得る。
【０４４２】
変種は、配列番号２の断片を含み得る。そのような断片は、ポア形成活性を保持する。断片は、長さ少なくとも５０、１００、１５０または２００アミノ酸であってよい。そのような断片は、ポアを生成するために用いられ得る。断片は、配列番号２のポア形成ドメインを好ましくは含む。断片は、配列番号２の残基８８、９０、９１、１０５、１１８および１３４の１つを含まなければならない。典型的には断片は、配列番号２の残基８８、９０、９１、１０５、１１８および１３４の全てを含む。
【０４４３】
１つまたは複数のアミノ酸は、上に記載のポリペプチドに代替的または追加的に付加され得る。伸長は、配列番号２のアミノ酸配列またはそのポリペプチド変種もしくは断片のアミノ末端またはカルボキシ末端に与えられ得る。伸長は極めて短い（例えば長さ１から１０アミノ酸）場合がある。代替的に伸長はより長くても（例えば５０または１００アミノ酸まで）よい。担体タンパク質は、本発明によるアミノ酸配列に融合され得る。他の融合タンパク質は、下により詳細に考察される。
【０４４４】
上に考察したとおり変種は、配列番号２から変更され、ポアを形成する能力を有しているアミノ酸配列を有するポリペプチドである。変種は、ポア形成に関与する配列番号２の領域を典型的には含有する。β−バレルを含有するＭｓｐのポア形成能力は、各サブユニットのβシートによって与えられる。配列番号２の変種は、β−シートを形成する配列番号２中の領域を典型的には含む。１つまたは複数の修飾が、得られる変種がポアを形成する能力を有する限り、β−シートを形成する配列番号２の領域に作出され得る。配列番号２の変種は、置換、付加または欠失などの１つまたは複数の修飾をα−ヘリックスおよび／またはループ領域内に好ましくは含む。
【０４４５】
Ｍｓｐ由来の単量体は、それらの同定または精製を支援するために、例えばヒスチジン残基（ｈｉｓｔタグ）、アスパラギン酸残基（ａｓｐタグ）、ストレプトアビジンタグもしくはフラッグタグの付加によって、または（細胞からのそれらの分泌を促進するためのシグナル配列の付加によってポリペプチドが天然でそのような配列を含有しない場合に）修飾され得る。遺伝子タグを導入するための別法は、ポア上の天然のまたは操作された位置にタグを化学的に反応させることである。この例は、ポアの外側に操作されたシステインにゲルシフト試薬を反応させることである。これは、ヘモリジンヘテロ−オリゴマーを分離するステップのための方法として実証されている(Chem Biol.1997 Jul;4(7):497-505)。
【０４４６】
Ｍｓｐ由来の単量体は、明示標識（revealing label）で標識され得る。明示標識は、ポアが検出されるようにする任意の好適な標識であってよい。好適な標識は、上に記載されている。
【０４４７】
Ｍｓｐ由来の単量体は、Ｄ−アミノ酸を用いても生成され得る。例えばＭｓｐ由来の単量体は、Ｌ−アミノ酸とＤ−アミノ酸との混合物を含み得る。これは、そのようなタンパク質またはペプチドを生成するための当技術分野における従来法である。
【０４４８】
Ｍｓｐ由来の単量体は、ヌクレオチド識別を促進するために１つまたは複数の特異的修飾を含有する。Ｍｓｐ由来の単量体は、他の非特異的な修飾をそれらがポア形成を干渉しない限り含有できる。多数の非特異的側鎖修飾が当技術分野において公知であり、Ｍｓｐ由来の単量体の側鎖に作出され得る。そのような修飾は、例えばアルデヒドとの反応に続くＮａＢＨ４での還元によるアミノ酸の還元的アルキル化、メチルアセトイミデート（methylacetimidate）でのアミジン化または無水酢酸でのアシル化を含む。
【０４４９】
Ｍｓｐ由来の単量体は、当技術分野において公知の標準的方法を用いて生成され得る。Ｍｓｐ由来の単量体は、合成的にまたは組換え手段によって作出され得る。例えばポアはｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳および転写（ＩＶＴＴ）によって合成され得る。ポアを生成するための好適な方法は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６９０号（国際公開第２０１０／００４２７３号パンフレットとして公開）、第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号（国際公開第２０１０／００４２６５号パンフレットとして公開）または第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（国際公開第２０１０／０８６６０３号パンフレットとして公開）に考察されている。ポアを膜に挿入するための方法は考察されている。
【０４５０】
膜貫通タンパク質ポアは、好ましくはα−ヘモリジン（α−ＨＬ）由来でもある。
【０４５１】
いくつかの実施形態では膜貫通タンパク質ポアは、化学的に修飾される。ポアは、任意の方法および任意の部位で化学的に修飾され得る。膜貫通タンパク質ポアは、１つもしくは複数のシステインへの分子の付着（システイン連結）、１つもしくは複数のリシンへの分子の付着、１つもしくは複数の非天然アミノ酸への分子の付着、エピトープの酵素修飾または末端の修飾によって好ましくは化学的に修飾される。そのような修飾を実行するための好適な方法は、当技術分野において周知である。膜貫通タンパク質ポアは、任意の分子の付着によって化学的に修飾され得る。例えばポアは、色素またはフルオロフォアの付着によって化学的に修飾され得る。
【０４５２】
ポア中の任意の数の単量体は、化学的に修飾され得る。１つまたは複数（２、３、４、５、６、７、８、９または１０個など）の単量体は、上に考察のとおり好ましくは化学的に修飾される。
【０４５３】
システイン残基の反応性は、隣接残基の修飾によって増強され得る。例えば近接アルギニン、ヒスチジンまたはリシン残基の塩基性基は、システインチオール基のｐＫａをより反応性のＳ−基のものに変化させる。システイン残基の反応性は、ｄＴＮＢなどのチオール保護基によって保護され得る。これらは、リンカーが付着する前にポアの１つまたは複数のシステイン残基と反応できる。
【０４５４】
（ポアが化学的に修飾される）分子は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６９０号（国際公開第２０１０／００４２７３号パンフレットとして公開）、第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号（国際公開第２０１０／００４２６５号パンフレットとして公開）または第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（国際公開第２０１０／０８６６０３号パンフレットとして公開）に開示のとおりポアに直接付着され得るか、またはリンカーを介して付着され得る。
【０４５５】
ヘリカーゼまたは構築物は、ポアに共有結合的に付着されていてもよい。ヘリカーゼまたは構築物は、好ましくはポアに共有結合的に付着されていない。ポアおよびヘリカーゼまたは構築物への電圧の印加は、典型的には標的ポリヌクレオチドを配列決定できるセンサーの形成を生じる。これは、下により詳細に考察される。
【０４５６】
本明細書に記載の任意のタンパク質、すなわちヘリカーゼ、膜貫通タンパク質ポアまたは構築物は、それらの同定または精製を支援するために、例えばヒスチジン残基（ｈｉｓタグ）、アスパラギン酸残基（ａｓｐタグ）、ストレプトアビジンタグ、フラッグタグ、ＳＵＭＯタグ、ＧＳＴタグもしくはＭＢＰタグの付加によって、または、それらの細胞からの分泌を促進するために（ポリペプチドが天然でそのような配列を含有していない場合に）シグナル配列の付加によって修飾され得る。遺伝子タグを導入するための別法は、ヘリカーゼ、ポアまたは構築物上の天然のまたは操作された位置にタグを化学的に反応させることである。この例は、ポアの外側の操作されたシステインにゲルシフト試薬を反応させることである。これは、ヘモリジンヘテロ−オリゴマーを分離するステップのための方法として実証されている（Chem Biol.1997 Jul;4(7):497-505）。
【０４５７】
ヘリカーゼ、ポアまたは構築物は明示標識（revealing label）で標識され得る。明示標識は、ポアが検出されるようにする任意の好適な標識であってよい。好適な標識は、これだけに限らないが蛍光分子、放射性同位元素（例えば125I、35S）、酵素、抗体、抗原、ポリヌクレオチドおよびリガンド（ビオチンなど）を含む。
【０４５８】
タンパク質は、合成的にまたは組換え手段によって作出され得る。例えばヘリカーゼ、ポアまたは構築物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳および転写（ＩＶＴＴ）によって合成され得る。ヘリカーゼ、ポアまたは構築物のアミノ酸配列は、天然に存在しないアミノ酸を含むようにまたはタンパク質の安定性を増大させるように修飾され得る。タンパク質が合成的手段によって生成される場合、そのようなアミノ酸は、生成の際に導入され得る。ヘリカーゼ、ポアまたは構築物は、合成的にまたは組換え生成のいずれかに続いて変更され得る。
【０４５９】
ヘリカーゼ、ポアまたは構築物は、Ｄ−アミノ酸を用いても生成し得る。例えばポアまたは構築物は、Ｌ−アミノ酸とＤ−アミノ酸との混合物を含み得る。これは、そのようなタンパク質またはペプチドを生成するための当技術分野における従来法である。
【０４６０】
ヘリカーゼ、ポアまたは構築物は、他の非特異的修飾もそれらがポア形成またはヘリカーゼまたは構築物機能を干渉しない限り含有できる。多数の非特異的側鎖修飾が当技術分野において公知であり、タンパク質（複数可）の側鎖に作出され得る。そのような修飾は、例えばアルデヒドとの反応に続くＮａＢＨ４での還元によるアミノ酸の還元的アルキル化、メチルアセトイミデート（methylacetimidate）でのアミジン化または無水酢酸でのアシル化を含む。
【０４６１】
ヘリカーゼ、ポアおよび構築物は、当技術分野において公知の標準的方法を用いて生成され得る。ヘリカーゼ、ポアまたは構築物をコードするポリヌクレオチド配列は、当技術分野における標準的方法を用いて得られ、複製され得る。ヘリカーゼ、ポアまたは構築物をコードするポリヌクレオチド配列は、当技術分野における標準的技術を用いて細菌宿主細胞において発現され得る。ヘリカーゼ、ポアおよび／または構築物は、組換え発現ベクターからのポリペプチドの原位置での発現によって細胞において生成され得る。場合により発現ベクターは、ポリペプチドの発現を制御するために誘導性プロモーターを保持する。これらの方法は、Sambrook,J.and Russell,D.(2001).Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 3rd Edition.Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYに記載されている。
【０４６２】
ヘリカーゼ、ポアおよび／または構築物は、大規模に生成されることができ、タンパク質生成生物または組換え発現からの任意のタンパク質液体クロマトグラフィー系による精製が続く。典型的なタンパク質液体クロマトグラフィー系は、ＦＰＬＣ、ＡＫＴＡ  ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｉｏ−Ｃａｄ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＢｉｏＬｏｇｉｃ  ｓｙｓｔｅｍおよびＧｉｌｓｏｎ  ＨＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍを含む。
【０４６３】
本発明の方法は、標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性を測定するステップを含む。方法は、標的ポリヌクレオチドの２つ、３つ、４つまたは５つ以上の特性を測定するステップを含み得る。１つまたは複数の特性は、好ましくは（ｉ）標的ポリヌクレオチドの長さ、（ｉｉ）標的ポリヌクレオチドの同一性、（ｉｉｉ）標的ポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）標的ポリヌクレオチドの二次構造および（ｖ）標的ポリヌクレオチドが修飾されているか否か、から選択される。（ｉ）から（ｖ）の任意の組合せは本発明により測定され得る。
【０４６４】
（ｉ）に関して、ポリヌクレオチドの長さは、例えば標的ポリヌクレオチドとポアとの間の相互作用の数または標的ポリヌクレオチドとポアとの間の相互作用の持続時間を測定することによって測定され得る。
【０４６５】
（ｉｉ）に関して、ポリヌクレオチドの同一性は、多数の方法において測定され得る。ポリヌクレオチドの同一性は、標的ポリヌクレオチドの配列の測定を伴ってまたは標的ポリヌクレオチドの配列の測定を伴わずに測定され得る。前者は、簡単であり、ポリヌクレオチドは配列決定され、それにより同定される。後者は、いくつかの方法で行われ得る。例えばポリヌクレオチド中の具体的なモチーフの存在は（ポリヌクレオチドの残りの配列を測定するステップを伴わずに）測定され得る。代替的に、方法における具体的な電気的および／または光学的シグナルの測定は、標的ポリヌクレオチドを具体的な供給源由来であるとして同定できる。
【０４６６】
（ｉｉｉ）に関して、ポリヌクレオチドの配列は、以前記載されたとおり決定され得る。好適な配列決定方法、詳細には電気的測定を用いるものは、Stoddart D et al., Proc Natl Acad Sci, 12;106(19):7702-7, Lieberman KR et al, J Am Chem Soc.2010;132(50):17961-72および国際公開第２０００／２８３１２号パンフレットに記載されている。
【０４６７】
（ｉｖ）に関して、二次構造は、種々の方法において測定され得る。例えば方法が電気的測定を含む場合、二次構造は残存時間における変化またはポアを通って流れる電流における変化を用いて測定され得る。これは、１本鎖と２本鎖のポリヌクレオチドの領域を区別できるようにする。
【０４６８】
（ｖ）に関して、任意の修飾の存在または非存在は、測定され得る。方法は、好ましくは標的ポリヌクレオチドが、メチル化によって、酸化によって、損傷によって、１つまたは複数のタンパク質でまたは１つまたは複数の標識、タグもしくはスペーサーで修飾されているかどうかを決定するステップを含む。具体的な修飾は、下に記載の方法を用いて測定され得るポアとの特異的な相互作用を生じる。例えばメチルシトシンは、各ヌクレオチドとのその相互作用の際にポアを通って流れる電流に基づいてシトシンから区別され得る。
【０４６９】
種々の異なる種類の測定が作出されてよい。これは、非限定的に:電気的測定および光学的測定を含む。可能性のある電気的測定は、電流測定：インピーダンス測定、トンネル測定（Ivanov AP et al., Nano Lett.2011 Jan 12;11(1):279-85）およびＦＥＴ測定（国際公開第２００５／１２４８８８号パンフレット）を含む。光学的測定は、電気的測定(Soni GV et al., Rev Sci Instrum. 2010 Jan;81(1):014301)と組み合わされ得る。測定は、ポアを通って流れるイオン電流の測定などの膜貫通電流測定であってよい。
【０４７０】
電気的測定は、Stoddart D et al., Proc Natl Acad Sci, 12;106(19):7702-7, Lieberman KR et al, J Am Chem Soc.2010;132(50):17961-72および国際出願第ＷＯ−２０００／２８３１２号に記載の標準的単一チャネル記録機器を用いて作出され得る。代替的に電気的測定は、例えば国際出願第ＷＯ−２００９／０７７７３４号および国際出願第ＷＯ−２０１１／０６７５５９号に記載のマルチチャネル系を用いても作出され得る。
【０４７１】
好ましい実施形態では、方法は、
（ａ）標的ポリヌクレオチドを膜貫通ポアおよび本発明のヘリカーゼまたは本発明の構築物と、標的ポリヌクレオチドがポアを通って移動し、ヘリカーゼまたは構築物がポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御するように接触させるステップ、ならびに
（ｂ）ポリヌクレオチドがポアに関して移動するときにポアを通る電流を測定するステップであって、電流が標的ポリヌクレオチドの特性の１つまたは複数を示し、それにより標的ポリヌクレオチドを特性決定するステップ
を含む。
【０４７２】
方法は、ポアが膜内に存在している膜／ポア系を調べるのに好適である任意の装置を用いて実行され得る。方法は、膜貫通ポアセンシングに好適である任意の装置を用いて実行され得る。例えば装置は、水性溶液および、チャンバーを２つのセクションに分離する障壁を含むチャンバーを含む。障壁は典型的にはポアを含有する膜が形成される開口部を有する。代替的に障壁は、ポアが存在する膜を形成する。
【０４７３】
方法は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／０００５６２号（国際公開第２００８／１０２１２０号パンフレット）に記載の装置を用いて実行され得る。
【０４７４】
方法は、ポリヌクレオチドがポアに関して移動するときにポアを通る電流を測定するステップを含んでよい。したがって装置は、電位を印加でき、膜およびポアを通る電気シグナルを測定できる電気回路も含む。方法は、パッチクランプまたは電圧クランプを用いても実行され得る。方法は、電圧クランプの使用を好ましくは含む。
【０４７５】
本発明の方法は、ポリヌクレオチドがポアに関して移動するときにポアを通過する電流の測定を含み得る。膜貫通タンパク質ポアを通るイオン電流を測定するための好適な条件は、当技術分野において公知であり、実施例で開示される。方法は、膜およびポア全体に印加される電圧と共に典型的には実行される。用いられる電圧は典型的には、＋２Ｖから−２Ｖまで、典型的には−４００ｍＶから＋４００ｍＶまでである。好ましくは用いられる電圧は、−４００ｍＶ、−３００ｍＶ、−２００ｍＶ、−１５０ｍＶ、−１００ｍＶ、−５０ｍＶ、−２０ｍＶおよび０ｍＶから選択される下限値および＋１０ｍＶ、＋２０ｍＶ、＋５０ｍＶ、＋１００ｍＶ、＋１５０ｍＶ、＋２００ｍＶ、＋３００ｍＶおよび＋４００ｍＶから独立に選択される上限値を含む範囲内である。用いられる電圧は、より好ましくは１００ｍＶから２４０ｍＶまでの範囲内、最も好ましくは１２０ｍＶから２２０ｍＶまでの範囲内である。印加される電位を増加させることによってポアによるさまざまなヌクレオチド間の識別を向上させることは可能である。
【０４７６】
方法は、金属塩（例えばアルカリ金属塩）、ハロゲン化塩（例えばアルカリ金属塩化物塩などの塩化物塩）などの任意の電荷担体の存在下で典型的には実行される。電荷担体は、イオン液体または有機塩、例えばテトラメチル塩化アンモニウム、トリメチルフェニル塩化アンモニウム、フェニルトリメチル塩化アンモニウムもしくは１−エチル−３メチルイミダゾリウムクロリド（1-ethyl-3-methyl imidazolium chloride）を含み得る。上に考察した例示的装置では、塩はチャンバー中の水性溶液中に存在する。塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）またはフェロシアン化カリウムとフェリシアン化カリウムとの混合物が典型的には使用される。ＫＣｌ、ＮａＣｌおよびフェロシアン化カリウムとフェリシアン化カリウムとの混合物は 好ましい。塩濃度は飽和であってよい。塩濃度は、３Ｍ以下があり得、典型的には０．１から２．５Ｍまで、０．３から１．９Ｍまで、０．５から１．８Ｍまで、０．７から１．７Ｍまで、０．９から１．６Ｍまでまたは１Ｍから１．４Ｍまでである。塩濃度は、好ましくは１５０ｍＭから１Ｍまでである。Ｈｅｌ３０８、ＸＰＤ、ＲｅｃＤおよびＴｒａＩヘリカーゼは、高塩濃度下で驚くべきことに作用する。方法は、少なくとも０．４Ｍ、少なくとも０．５Ｍ、少なくとも０．６Ｍ、少なくとも０．８Ｍ、少なくとも１．０Ｍ、少なくとも１．５Ｍ、少なくとも２．０Ｍ、少なくとも２．５Ｍまたは少なくとも３．０Ｍなどの少なくとも０．３Ｍの塩濃度を用いて好ましくは実行される。高塩濃度は、高い信号対雑音比を提供し、通常の電流変動のバックグラウンドに対してヌクレオチドの存在を示す電流が同定されることを可能にする。
【０４７７】
方法は、緩衝剤の存在下で典型的には実行される。上に考察した例示的装置では、緩衝剤はチャンバー中の水性溶液に存在する。任意の緩衝剤が本発明の方法において用いられ得る。典型的には緩衝液は、リン酸緩衝液である。他の好適な緩衝液は、これだけに限らないが、ＨＥＰＥＳおよびＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を含む。方法は、４．０から１２．０まで、４．５から１０．０まで、５．０から９．０まで、５．５から８．８まで、６．０から８．７までまたは７．０から８．８までまたは７．５から８．５までのｐＨで典型的には実行される。用いられるｐＨは好ましくは約７．５である。
【０４７８】
方法は、０ｏＣから１００ｏＣまで、１５ｏＣから９５ｏＣまで、１６ｏＣから９０ｏＣまで、１７ｏＣから８５ｏＣまで、１８ｏＣから８０ｏＣまで、１９ｏＣから７０ｏＣまでまたは２０ｏＣから６０ｏＣまでで実行され得る。方法は典型的には室温で実行される。方法は、約３７℃などの酵素機能を支持する温度で場合により実行される。
【０４７９】
方法は、遊離ヌクレオチドまたは遊離ヌクレオチド類似物および／またはヘリカーゼもしくは構築物の作用を促進する酵素補因子の存在下で実行されてもよい。方法は、遊離ヌクレオチドまたは遊離ヌクレオチド類似物の非存在下でおよび酵素補因子の非存在下で実行されてもよい。遊離ヌクレオチドは、上に考察した個々のヌクレオチドの任意の１つまたは複数であってよい。遊離ヌクレオチドは、これだけに限らないがアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、チミジン三リン酸（ＴＴＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシアデノシン二リン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシグアノシン二リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシチミジン二リン酸（ｄＴＤＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）、デオキシウリジン二リン酸（ｄＵＤＰ）、デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）、デオキシシチジン二リン酸（ｄＣＤＰ）およびデオキシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）を含む。遊離ヌクレオチドは、好ましくはＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰまたはｄＣＭＰから選択される。遊離ヌクレオチドは、好ましくはアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）である。酵素補因子は、ヘリカーゼまたは構築物を機能させる因子である。酵素補因子は、好ましくは二価金属カチオンである。二価金属カチオンは好ましくはＭｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋またはＣｏ２＋である。酵素補因子は、最も好ましくはＭｇ２＋である。
【０４８０】
標的ポリヌクレオチドは、ヘリカーゼまたは構築物およびポアと任意の順序で接触され得る。標的ポリヌクレオチドがヘリカーゼまたは構築物およびポアと接触される場合、標的ポリヌクレオチドは最初にヘリカーゼまたは構築物と複合体を形成することは好ましい。ポアに電圧が印加される場合、標的ポリヌクレオチド／ヘリカーゼまたは構築物複合体は次いでポアと複合体を形成し、ポアを通るポリヌクレオチドの移動を制御する。
【０４８１】
他の方法
本発明は、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサーの形成方法も提供する。方法は、ポアと本発明のヘリカーゼまたは本発明の構築物との間に複合体を形成するステップを含む。ヘリカーゼは、上に考察の任意のものであってよい。本発明のシリーズおよび方法を参照して上に考察の任意の数および組合せの本発明のヘリカーゼが使用されてよい。
【０４８２】
複合体は、ポアとヘリカーゼまたは構築物とを標的ポリヌクレオチドの存在下で接触させ、次いで、ポアに電位を印加するステップによって形成され得る。印加される電位は、上に記載のとおり化学電位または電圧電位であってよい。代替的に複合体は、ポアをヘリカーゼまたは構築物に共有結合的に付着するステップによっても形成され得る。共有結合付着のための方法は、当技術分野において公知であり、例えば国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号（国際公開第２０１０／００４２６５号パンフレットとして公開）および第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（国際公開第２０１０／０８６６０３号パンフレットとして公開）において開示されている。複合体は、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサーである。方法は、Ｍｓｐ由来のポアと本発明のヘリカーゼまたは本発明の構築物との複合体を形成するステップを好ましくは含む。本発明の方法を参照して上に考察した任意の実施形態は、この方法に等しく適用される。本発明は、本発明の方法を使用して産生されるセンサーも提供する。
【０４８３】
キット
本発明は、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのキットも提供する。
【０４８４】
一実施形態で、キットは、（ａ）ポアおよび（ｂ）本発明のヘリカーゼまたは本発明の構築物を含む。ポアは上に考察のもののいずれであってもよい。
【０４８５】
別の実施形態ではキットは（ａ）本発明のヘリカーゼまたは本発明の構築物および（ｂ）１つまたは複数のローディング成分（loading moiety）を含む。各ローディング成分は、標的ポリヌクレオチドに付着できる任意の成分であってよい。各ローディング成分は、ヘリカーゼまたは構築物が結合でき、標的ポリヌクレオチドに付着され得る限り、任意の長さであってよい。
【０４８６】
１つまたは複数のローディング成分は、好ましくは合成または人工である。１つまたは複数のローディング成分は、好ましくは非天然である。
【０４８７】
好適なローディング成分は、これだけに限らないがポリマー性リンカー、化学的リンカー、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む。１つまたは複数のローディング成分は、ポリヌクレオチドまたはローディングポリヌクレオチドを好ましくは含む。そのような実施形態ではヘリカーゼまたは構築物は、ポリヌクレオチドに好ましくは結合（または付着）される。上に考察のポリヌクレオチドのいずれかは使用され得る。好ましくは１つまたは複数のローディング成分は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾ＤＮＡ（脱塩基ＤＮＡなど）、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＢＮＡまたはＰＥＧを含む。１つまたは複数のローディング成分は１本鎖または２本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡをより好ましくは含む。
【０４８８】
１つまたは複数のローディング成分は、１つまたは複数のポリヌクレオチド結合タンパク質が結合（または付着）する１本鎖ポリヌクレオチドを好ましくは含む。
【０４８９】
１つまたは複数のローディング成分の少なくとも１つは、好ましくはＹアダプターである。Ｙアダプターは、（ａ）２本鎖領域および（ｂ）１本鎖領域または他方の末端では相補性でない領域を、典型的には含む。Ｙアダプターは、１本鎖領域を含む場合オーバーハングを有するとして記載され得る。Ｙアダプター中の非相補性領域の存在は、２本鎖部分とは異なり２本の鎖が典型的には互いにハイブリダイズしないことからアダプターをそのＹ形にする。Ｙアダプターは、Ｙアダプターを膜にカップリングできる１つまたは複数のアンカーを好ましくは含む。アンカーは、上により詳細に考察されている。好ましいアンカーはコレステロールである。
【０４９０】
Ｙアダプターは、ポアを優先的に通すリーダー配列を好ましくは含む。リーダー配列は、本発明の方法を促進する。リーダー配列は、ポアを優先的に通し、それによりポアを通るなどのポアに関する標的ポリヌクレオチドの移動を促進するように設計される。リーダー配列は上に考察の通り、ポリヌクレオチドを１つまたは複数のアンカーに連結するためにも使用され得る。
【０４９１】
リーダー配列は、ポリマーを典型的には含む。ポリマーは、好ましくは負に荷電している。ポリマーは、好ましくはＤＮＡもしくはＲＮＡなどのポリヌクレオチド、修飾ポリヌクレオチド（脱塩基ＤＮＡなど）、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＢＮＡ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリペプチドである。リーダーは、ポリヌクレオチドを好ましくは含み、１本鎖ポリヌクレオチドをより好ましくは含む。リーダー配列は、上に考察のポリヌクレオチドのいずれかを含んでよい。１本鎖リーダー配列は、ポリｄＴセクションなどのＤＮＡの１本鎖を最も好ましくは含む。リーダー配列は、下に考察のスペーサーを好ましくは含む。
【０４９２】
リーダー配列は、任意の長さであってよいが、典型的には長さ２０から１５０ヌクレオチドなどの長さ１０から１５０ヌクレオチドである。リーダーの長さは、典型的には方法において使用される膜貫通ポアに依存する。
【０４９３】
１つまたは複数のローディング成分の少なくとも１つは、好ましくは架橋成分である。架橋成分は、最も好ましくはヘアピンループまたはヘアピンループアダプターである。好適なヘアピンループアダプターは、当技術分野において公知の方法を使用して設計されてよい。ヘアピンループは、任意の長さであってよい。ローディング成分として使用される場合ヘアピンループは、典型的には長さ３５０ヌクレオチド以下、３００ヌクレオチド以下、２５０ヌクレオチド以下、２００ヌクレオチド以下、１５０ヌクレオチド以下、１００ヌクレオチド以下、９０ヌクレオチド以下、８０ヌクレオチド以下、７０ヌクレオチド以下、６０ヌクレオチド以下、５０ヌクレオチド以下、４０ヌクレオチド以下、３０ヌクレオチド以下、２０ヌクレオチド以下または１０ヌクレオチド以下などの４００ヌクレオチド以下である。ヘアピンループは、好ましくは長さ約１から４００、２から３００、５から２００、６から１００ヌクレオチドである。ポリヌクレオチドの２個の相補性部分が２本鎖配列（ステムと称される）を形成するようにハイブリダイズする場合にヘアピンループは形成される。ローディング成分として使用される場合、ヘアピンループのステムは、好ましくは長さ１５０ヌクレオチド対以下、１００ヌクレオチド対以下、９０ヌクレオチド対以下、８０ヌクレオチド対以下、７０ヌクレオチド対以下、６０ヌクレオチド対以下、５０ヌクレオチド対以下、４０ヌクレオチド対以下、３０ヌクレオチド対以下、２０ヌクレオチド対以下または１０ヌクレオチド対以下などの２００ヌクレオチド対以下である。１つまたは複数のポリヌクレオチド結合タンパク質は、典型的にはヘアピンのループ、すなわちステムではない、に結合する。
【０４９４】
標的ポリヌクレオチドが２本鎖である場合、１つまたは複数のローディング成分は、Ｙアダプターおよび任意選択でヘアピンループアダプターなどの架橋成分を好ましくは含む。少なくとも１つまたは複数のローディング成分がＹアダプターである場合、それは結合または付着したいかなるポリヌクレオチド結合タンパク質も有さない架橋アダプターとの組合せで使用されてよい。
【０４９５】
ヘリカーゼまたは構築物は、１つまたは複数のローディング成分上の１つまたは複数のスペーサーに止められてよい。スペーサーはＰＣＴ／ＧＢ２０１４／０５０１７５（国際公開第２０１４／１３５８３８号パンフレット）において明らかにされている。好ましいスペーサーは、これだけに限らないがニトロインドール、５−ニトロインドール、イノシン、アクリジン、２−アミノプリン、２−６−ジアミノプリン、５−ブロモデオキシウリジン、逆位チミジン（逆位ｄＴ）、逆位ジデオキシチミジン（ｄｄＴ）、ジデオキシシチジン（ｄｄＣ）、５−メチルシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ塩基、イソ−デオキシシチジン（イソ−ｄＣ）、イソ−デオキシグアノシン（イソ−ｄＧ）、ｉＳｐＣ３基（すなわち糖および塩基を欠失しているヌクレオチド）、光開裂可能な（ＰＣ）基、ヘキサンジオール基、スペーサー９（ｉＳｐ９）基、スペーサー１８（ｉＳｐ１８）基、ポリマーまたはチオール連結を含む。スペーサーは、これらの基の任意の組合せを含んでよい。これらの基の多くは、ＩＤＴ（登録商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標））から商業的に入手できる。
【０４９６】
任意の数の１つまたは複数のローディング成分が使用され得る。方法は、それに結合（付着）したヘリカーゼまたは構築物をそれぞれ有する２つ以上のローディング成分を付着することを含んでよい。例えばローディング成分は、標的ポリヌクレオチドの各末端に付着されてよい。そのような実施形態では、１つのローディング成分は好ましくはＹアダプターであり、他のローディング成分はヘアピンループアダプターなどの架橋成分であってよい。
【０４９７】
１つまたは複数のローディング成分は、任意の様式で標的ポリヌクレオチドに付着されてよい。１つまたは複数のローディング成分は、好ましくは標的ポリヌクレオチドに共有結合的に付着される。
【０４９８】
１つまたは複数のローディング成分は、最も好ましくは標的ポリヌクレオチドにライゲーションされる。１つまたは複数のローディング成分は、ポリヌクレオチドのいずれかの端、すなわち５’または３’末端にライゲーションされてよい。ローディング成分は、標的ポリヌクレオチドの両末端にライゲーションされてよい。１つまたは複数のローディング成分は当技術分野において公知の任意の方法を使用してポリヌクレオチドにライゲーションされてよい。１つまたは複数のローディング成分は、ＡＴＰの非存在でまたはＡＴＰの代わりにガンマ−Ｓ−ＡＴＰ（ＡＴＰγＳ）を使用してポリヌクレオチドにライゲーションされてよい。
【０４９９】
１つまたは複数のローディング成分は、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、大腸菌（E. coli）ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔｍａ  ＤＮＡリガーゼおよび９ｏＮ  ＤＮＡリガーゼなどのリガーゼを使用してライゲーションされ得る。リガーゼは、好ましくは実施例３に記載の条件下で使用される。
【０５００】
ローディング成分が標的ポリヌクレオチドに付着されると、ヘリカーゼまたは構築物は、好ましくはローディング成分に結合（付着）したままである。本発明により付着された後に、ヘリカーゼまたは構築物は１つまたは複数のローディング成分から解離する場合がある。
【０５０１】
本発明の方法に関連して上に考察された任意の実施形態は、キットに等しく適用する。ヘリカーゼは、上に考察の任意のものであってよい。キットは、本発明のシリーズおよび方法を参照して上に考察の任意の数および組合せの本発明のヘリカーゼを含んでよい。
【０５０２】
キットは、脂質二重層などの両親媒性層を形成するために必要なリン脂質などの膜の構成成分をさらに含んでよい。
【０５０３】
本発明のキットは、上に述べた任意の実施形態が実行されるようにする１つまたは複数の他の試薬または器具を追加的に含んでよい。そのような試薬または器具は、次の：好適な緩衝剤（複数可）（水性溶液）、対象から試料を得るための手段（容器もしくは、針を含む器具など）、ポリヌクレオチドを増幅および／もしくは発現するための手段、上に定義の膜または電圧もしくはパッチクランプ装置、の１つまたは複数を含む。試薬は、液体試料が試薬を再懸濁するように乾燥状態でキット中に存在する場合がある。キットは、キットが本発明の方法において用いられ得るようにする説明書、またはいずれの患者に方法が用いられ得るかに関する詳細も場合により含む場合がある。キットは、場合によりヌクレオチドを含み得る。
【０５０４】
装置
本発明は、標的ポリヌクレオチドを特性決定するための装置も提供する。装置は、複数のポアおよび複数の本発明のヘリカーゼまたは複数の本発明の構築物を含む。装置は、本発明の方法を実行するための説明書を好ましくはさらに含む。装置は、アレイまたはチップなどのポリヌクレオチド分析のための任意の従来装置であってよい。本発明の方法に関連して上に考察された任意の実施形態は、本発明の装置に等しく適用可能である。ヘリカーゼは、本発明のヘリカーゼおよび本発明により修飾されていないヘリカーゼを含む、本発明の構築物を参照して上に考察の任意のものであってよい。装置は、任意の数および組合せの本発明のヘリカーゼを含んでよい。
【０５０５】
装置は、本発明の方法を実行するために好ましくはセットアップされている。
【０５０６】
装置は、好ましくは：
複数のポアおよび膜を支持でき、ポアおよび膜を用いてポリヌクレオチド特性決定を実施するために作動可能であるセンサーデバイス；ならびに
特性決定を実施するための材料の送達のための少なくとも１つのポート；
を含む。
【０５０７】
代替的に装置は、好ましくは：
複数のポアおよび膜を支持でき、ポアおよび膜を用いてポリヌクレオチド特性決定を実施するために作動可能であるセンサーデバイス；ならびに
特性決定を実施するための材料を保持するための少なくとも１つのリザーバー；
を含む。
【０５０８】
装置は、
膜および複数のポアおよび膜を支持でき、ポアおよび膜を用いてポリヌクレオチド特性決定を実施するために作動可能であるセンサーデバイス；
特性決定を実施するための材料を保持するための少なくとも１つのリザーバー；
少なくとも１つのリザーバーからセンサーデバイスに材料を制御可能に供給するように構成された流体系；および
各試料を受けるための１つまたは複数の容器をより好ましくは含み、
流体系は、１つまたは複数の容器からセンサーデバイスに試料を選択的に供給するように構成されている。装置は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７号（国際公開第２００９／０７７７３４号パンフレットとして公開）、第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００７８９号（国際公開第２０１０／１２２２９３号パンフレットとして公開）、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ１０／００２２０６号（国際公開第２０１１／０６７５５９号パンフレットとして公開）または国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／２５６７９号（国際公開第００／２８３１２号パンフレットとして公開）において記載の任意のものであってよい。
【０５０９】
本発明のヘリカーゼを産生する方法
本発明は、本発明の修飾ヘリカーゼを産生する方法も提供する。方法は、Ｄｄａヘリカーゼを提供するステップおよび本発明の修飾ヘリカーゼを形成するようにヘリカーゼを修飾するステップを含む。
【０５１０】
方法は、ヘリカーゼがポリヌクレオチドの移動を制御できるかどうかを決定するステップを好ましくはさらに含む。これを行うためのアッセイは、上に記載されている。ポリヌクレオチドの移動が制御され得る場合、ヘリカーゼは正しく修飾されており、本発明のヘリカーゼが産生されている。ポリヌクレオチドの移動が制御され得ない場合、本発明のヘリカーゼは産生されていない。
【０５１１】
本発明の構築物を産生する方法
本発明は、本発明の構築物を産生する方法も提供する。方法は、本発明のヘリカーゼを追加的ポリヌクレオチド結合成分に付着、好ましくは共有結合的に付着させるステップを含む。上に考察した任意のヘリカーゼおよび成分が方法において使用できる。共有結合的付着の部位および方法は上に考察したとおり選択される。
【０５１２】
方法は、構築物がポリヌクレオチドの移動を制御できるかどうかを決定するステップを好ましくはさらに含む。これを行うためのアッセイは、上に記載されている。ポリヌクレオチドの移動が制御され得る場合、ヘリカーゼおよび成分は正しく付着され、本発明の構築物が産生されている。ポリヌクレオチドの移動が制御され得ない場合、本発明の構築物は産生されていない。
【０５１３】
次の実施例は、本発明を例示する。
実施例
【実施例１】
【０５１４】
本実施例は、ＭｓｐＡ−（Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｄ９０Ｎ／Ｄ９１Ｎ／Ｄ１１８Ｒ／Ｑ１２６Ｒ／Ｄ１３４Ｒ／Ｅ１３９Ｋ）８（変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｄ９０Ｎ／Ｄ９１Ｎ／Ｄ１１８Ｒ／Ｑ１２６Ｒ／Ｄ１３４Ｒ／Ｅ１３９Ｋを有する配列番号２＝ＭｓｐＡ変異体１）またはＭｓｐＡ−（（Ｄｅｌ−Ｌ７４／Ｇ７５／Ｄ１１８／Ｌ１１９）Ｄ５６Ｎ／Ｅ５９Ｒ／Ｌ８８Ｎ／Ｄ９０Ｎ／Ｄ９１Ｎ／Ｑ１２６Ｒ／Ｄ１３４Ｒ／Ｅ１３９Ｋ）８（変異Ｄ５６Ｎ／Ｅ５９Ｒ／Ｌ８８Ｎ／Ｄ９０Ｎ／Ｄ９１Ｎ／Ｑ１２６Ｒ／Ｄ１３４Ｒ／Ｅ１３９Ｋおよびアミノ酸Ｌ７４／Ｇ７５／Ｄ１１８／Ｌ１１９の欠失を有する配列番号２＝ＭｓｐＡ変異体２）とＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ（変異Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ／Ｃ１１４Ａ／Ｃ１７１Ａ／Ｃ４２１Ｄを有する配列番号８）＝酵素変異体１ａ）との間の相互作用を調査するために実行されたシミュレーションを記載する。
【０５１５】
シミュレーションは、ＧＲＯＭＡＣＳパッケージバージョン４．０．５をＧＲＯＭＯＳ  ５３ａ６力場およびＳＰＣ水モデルと共に使用して実施された。
【０５１６】
ＭｓｐＡ変異体１およびＭｓｐＡ変異体２モデルは、タンパク質データバンク受入コード１ＵＵＮに見出されるＭｓｐＡの結晶構造に基づいた。関連変異は、ＰｙＭＯＬを使用して作られ、ＭｓｐＡ変異体２の場合は残基Ｌ７４／Ｇ７５／Ｄ１１８／Ｌ１１９はバレルから除去された。生じたポアモデルは次いで最急降下アルゴリズムを使用してエネルギー最少化された。酵素変異体１ａモデルは、タンパク質データバンク受入コード３ＵＰＵに見出されるＤｄａ１９９３構造に基づいた。再度関連変異はＰｙＭＯＬを使用して作られ、モデルは最急降下アルゴリズムを使用してエネルギー最少化された。
【０５１７】
次いで酵素変異体１ａモデルは、ＭｓｐＡ変異体１およびＭｓｐＡ変異体２上に置かれた。３種のシミュレーションを酵素変異体１ａ／ＭｓｐＡ変異体１および酵素変異体１ａ／ＭｓｐＡ変異体２系について、酵素変異体１ａの配向が各シミュレーションで異なるようにして実施した（３種の異なるシミュレーションの配向のグラフィック表示（cartoon representation）については、図１を参照されたい）。ポアは、ＤＰＰＣ分子を含む脂質膜中に置き、シミュレーションボックスを溶媒和した。シミュレーションを通じて、ポアの骨格に制限をかけた。しかし酵素は制限をかけなかった。系は、３００ＫへのＢｅｒｅｎｄｓｅｎサーモスタットおよびＢｅｒｅｎｄｓｅｎバロスタットを使用してＮＰＴアンサンブルで４０ｎｓシミュレートされた。
【０５１８】
酵素とポアとの間の接触をＧＲＯＭＡＣＳ分析ソフトウェアおよび局所的に書かれたコードの両方を使用して分析した。図２から５は、ＭｓｐＡ変異体１（図２および３）ならびにＭｓｐＡ変異体２（図４および５）中の酵素変異体１ａと相互作用するアミノ酸残基を示す。下の表は、相互作用することが見出されたポアおよび酵素両方におけるアミノ酸位置を示す（表９は相互作用がＭｓｐＡ変異体１と酵素変異体１ａとの間に測定された場合に観察されたＭｓｐＡ変異体１アミノ酸接触点を示し、表１０は相互作用がＭｓｐＡ変異体１と酵素変異体１ａとの間に測定された場合に観察された酵素変異体１ａアミノ酸接触点を示し、表１１は相互作用がＭｓｐＡ変異体２と酵素変異体１ａとの間に測定された場合に観察されたＭｓｐＡ変異体２アミノ酸接触点を示し、表１２は相互作用がＭｓｐＡ変異体２と酵素変異体１ａとの間に測定された場合に観察された酵素変異体１ａアミノ酸接触点を示す）。図６は、ポア（ＭｓｐＡ変異体２）中のどのアミノ酸が酵素（酵素変異体１ａ）中の具体的なアミノ酸と相互作用するかを示している。シミュレーションデータは、通るなどの膜貫通ポアに関する標的ポリヌクレオチドのさらに安定した移動を提供するための酵素とナノポアとの間の相互作用を改善するために修飾され得る酵素変異体１ａの部分を同定するために使用され得る。
【０５１９】
【表９】
2017535256.tif 000024
【０５２０】
【表１０】
2017535256.tif 000025
【０５２１】
【表１１】
2017535256.tif 000026
【０５２２】
【表１２】
2017535256.tif 000027
【実施例２】
【０５２３】
本実施例は、２つの異なる酵素（野生型Ｄｄａ１９９３（配列番号８））およびＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ（変異Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃを有する配列番号８）＝酵素変異体１８）とポリヌクレオチドとの間の相互作用を調査するために実行されたシミュレーションを記載している。
【０５２４】
シミュレーションはどの残基が酵素結合部位内のＤＮＡと接触しているかを評価するために実施した。シミュレーションは、ＧＲＯＭＡＣＳパッケージバージョン４．０．５をＡＭＢＥＲ−９９ＳＢ力場およびＴＩＰ３Ｐ水モデルと共に使用して実施した。
【０５２５】
２つの酵素、野生型Ｄｄａ１９９３および酵素変異体１８をシミュレートした。酵素変異体１８をジスルフィド結合がＥ９４ＣとＡ３６０Ｃとの間に存在するような、その閉鎖複合体形態でシミュレートした。野生型Ｄｄａ１９９３の初期構造はタンパク質データバンク、受入コード３ＵＰＵで入手可能な構造に基づいた。このＰＤＢファイル中の構造はＤｄａ１９９３−Ｋ３８Ａである。それにより野生型Ｄｄａ１９９３シミュレーションでは、残基３８はＰｙＭＯＬを使用してリシンに戻し変異された。酵素変異体１８モデルもＰｙＭＯＬで作製された関連変異を含んで３ＵＰＵでの構造に基づいた。両酵素シミュレーションでシミュレートされたＤＮＡは、３ＵＰＵ（ＤＮＡ配列はポリ（ｄＴ）である）の結晶構造に存在するＤＮＡである。生じた酵素／ＤＮＡモデルは、次いで最急降下アルゴリズムを使用してエネルギー最少化した。シミュレーションボックスを溶媒和し、エネルギー最少化の別の回を実施した。シミュレーションを通じて酵素およびＤＮＡは非制限であった。系は、３００ＫへのＢｅｒｅｎｄｓｅｎサーモスタットおよびＢｅｒｅｎｄｓｅｎバロスタットを使用してＮＰＴアンサンブルで２０ｎｓシミュレートした。
【０５２６】
酵素とＤＮＡとの間の接触は、ＧＲＯＭＡＣＳ分析ソフトウェアおよび局所的に書かれたコードの両方を使用して分析した。下の表は、結晶構造３ＵＰＵ中に存在するＤＮＡと相互作用した２つの酵素中のアミノ酸を示す（表１３および１４は相互作用が野生型Ｄｄａ１９９３とＤＮＡとの間で測定された場合に観察された野生型Ｄｄａ  １９９３アミノ酸接触点を示し、表１５および１６は相互作用が酵素変異体１８とＤＮＡとの間で測定された場合に観察された酵素変異体１８アミノ酸接触点を示す）。シミュレーションデータは、通るなどの膜貫通ポアに関する標的ポリヌクレオチドのさらに安定した移動を提供するための酵素とＤＮＡとの間の相互作用を改善するために変異され得るＤｄａ１９９３酵素および酵素変異体１８中の位置を同定するために使用され得る。
【０５２７】
【表１３】
2017535256.tif 000028
【表１４】
2017535256.tif 000029
【０５２８】
【表１５】
2017535256.tif 000030
【表１６】
2017535256.tif 000031
【実施例３】
【０５２９】
本実施例は、多数の異なるヘリカーゼでのＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ（変異Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃおよび次いで（ΔＭ１）Ｇ１）を有する配列番号８）（酵素変異体１）を使用するナノポアを通るＤＮＡ構築物Ｘ（図７を参照されたい）の移動制御を比較する。検査した全てのヘリカーゼは、ナノポアを通るＤＮＡの移動を制御し、ＤＮＡがナノポアを通って移行される際の電流における変化が観察された。検査したヘリカーゼは、ａ）１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）中の１つもしくは複数のヌクレオチドと相互作用した少なくとも１つのアミノ酸置換、またはｂ）膜貫通ポアと相互作用するヘリカーゼの部分における１つもしくは複数の修飾のいずれかまたは両方を有し、ａ）およびｂ）を変化させる。本実施例は、３．６ｋｂあたりの相補スリップフォワードの数、ｋｂあたりの相補スリップフォワードの数、前方へのスリッピングのために失われた構築物Ｘ中の塩基の％、相補中のスリップフォワードの全長およびスリップフォワードの平均長を調査する。実施例で調査されたヘリカーゼは、ポリヌクレオチドに沿って５’から３’方向へ移動した。ポリヌクレオチドの５’末端（ヘリカーゼが移動するところから離れた末端）がポアによって捕捉された場合、ヘリカーゼは印加された電位から生じる場の方向に働き、通したポリヌクレオチドをポア中およびｔｒａｎｓチャンバー中に移動させる。本実施例では、前方へのスリッピングはポアと比較して前方への少なくとも４個の連続するヌクレオチドのＤＮＡ移動を含有する（すなわちその３’へおよびその５’末端から離れて）。
【０５３０】
材料および方法
実験を設定する前に、ＤＮＡ構築物Ｘ（最終濃度０．１ｎＭ）を室温、５分間、好適な酵素（下に提供する酵素の表を参照されたい（ナノポア系に加えられた最終濃度１０ｎＭ、緩衝液（２５３ｍＭ  ＫＣｌ、５０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ８．０、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に提供された）と共に予備インキュベートした。５分後、ＴＭＡＤ（ナノポア系に加えられた最終濃度１００μＭ）を予備混合物に加え、混合物をさらに５分間インキュベートした。最終的にＭｇＣｌ２（ナノポア系に加えられた最終濃度２ｍＭ）、ＡＴＰ（ナノポア系に加えられた最終濃度２ｍＭ）およびＫＣｌ（ナノポア系に加えられた最終濃度５００ｍＭ）を予備混合物に加えた。
【０５３１】
電気的測定は、緩衝液（２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液、１５０ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、１５０ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８．０）中のブロック共重合体に挿入された単一のＭｓｐＡナノポア（ＭｓｐＡ−（（Ｄｅｌ−Ｌ７４／Ｇ７５／Ｄ１１８／Ｌ１１９）Ｄ５６Ｆ／Ｅ５９Ｒ／Ｌ８８Ｎ／Ｄ９０Ｎ／Ｄ９１Ｎ／Ｑ１２６Ｒ／Ｄ１３４Ｒ／Ｅ１３９Ｋ）８（変異Ｄ５６Ｆ／Ｅ５９Ｒ／Ｌ８８Ｎ／Ｄ９０Ｎ／Ｄ９１Ｎ／Ｑ１２６Ｒ／Ｄ１３４Ｒ／Ｅ１３９Ｋおよびアミノ酸Ｌ７４／Ｇ７５／Ｄ１１８／Ｌ１１９の欠失を有する配列番号２）（ＭｓｐＡ変異体３））から取得した。ブロック共重合体に挿入された単一ポアが達成された後、次いで緩衝液（２ｍＬ、２５ｍＭリン酸Ｋ緩衝液、１５０ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、１５０ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８．０）をいかなる過剰のＭｓｐＡナノポアも除去するために系に流した。５００ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ８．０の１５０ｕＬを系を通して流した。１０分後、５００ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ８．０のさらなる１５０ｕＬを系に通して流し、次いで酵素（下の表を参照されたい、１０ｎＭ最終濃度）、ＤＮＡ構築物Ｘ（０．１ｎＭ最終濃度）、燃料（ＭｇＣｌ２最終濃度２ｍＭ、ＡＴＰ最終濃度２ｍＭ）予備混合物（合計１５０μＬ）を単一ナノポア実験系に流した。実験は−１４０ｍＶで実行し、ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動をモニターした。
【０５３２】
結果
ＤＮＡ構築物Ｘと相互作用すると考えられたヘリカーゼの領域への少なくとも１つもしくは複数の置換またはナノポアと相互作用すると考えられた１つもしくは複数の修飾の影響を判定するために、多数の異なるヘリカーゼを調査した。５個の異なるパラメーターをヘリカーゼ制御ＤＮＡ移行の改善を示すヘリカーゼを同定するために調査した、１）３．６ｋｂあたりの相補スリップフォワード数、２）ｋｂあたりの相補スリップフォワード数、３）前方へのスリッピングのために失われた構築物Ｘ中の塩基の％、４）相補中のスリップフォワードの全長、および５）スリップフォワードの平均長。
【０５３３】
キロベースあたりまたは３．６ｋｂあたりのスリップフォワードの測定を次の手順を使用して算出した、１）ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動をＨＭＭアルゴリズムを使用してモデルに位置付けた、２）次いでヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動をフィルタリングに供した、３）位置付けたヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動を正確な位置付けを確実にするためにチェックした、４）少なくとも４個の連続したヌクレオチドの前方へのスリッピング移動として分類された転移をキロベースあたりまたは３．６ｋｂあたりで決定した。前方へのスリッピングのために構築物Ｘにおいて失われた％塩基は、ＤＮＡ構築物Ｘに沿ったスリップフォワードの結果として失われた構築物Ｘ中の塩基数の測定であり、百分率で表される。相補スリップの全長は、鎖の相補セクションにおける全てのスリップの合計である。平均スリップ長は、鎖の相補セクションにおける全てのスリップの合計を相補中のスリップの合計数で割ったものである。
【０５３４】
下の表１７は、酵素変異体１と比較した検査されたさまざまな酵素を示す。検査された酵素の内、変異体２から１３および１５から１７は、酵素変異体１と比較した場合にパラメーター１から５の少なくとも１つにおいて改善を示した。
【０５３５】
変異体５から１３は、１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）中の１つまたは複数のヌクレオチドの糖および／または塩基と相互作用し、より大きな側鎖（Ｒ基）を含むアミノ酸で置換され、膜貫通ポアと相互作用するヘリカーゼの部分中に１つまたは複数の修飾を有さない少なくとも１つのアミノ酸を有する。変異体５から１３の全ては、より大きな側鎖（Ｒ基）を有し、１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）中の１つまたは複数のヌクレオチドの糖および／または塩基と相互作用するアミノ酸置換によるものである酵素変異体１と比較した場合にパラメーター１から５の少なくとも１つに改善を示した。明らかに、１本鎖（ｓｓＤＮＡ）中の１つまたは複数のヌクレオチドの糖およびまたは塩基と相互作用した位置により大きな側鎖基を有する少なくとも１つの置換を作ることは、移動制御の改善を生じた。
【０５３６】
変異体１４は、１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）中の１つまたは複数のヌクレオチドの糖および／または塩基と相互作用し、小さな側鎖（Ｒ基）を有するアミノ酸で置換され、膜貫通ポアと相互作用するヘリカーゼの部分に１つまたは複数の修飾を有さない少なくとも１つのアミノ酸を有する。変異体１４は、小さな側鎖（Ｒ基）を有し、１本鎖（ｓｓＤＮＡ）中の１つまたは複数のヌクレオチドの糖および／または塩基と相互作用するアミノ酸置換によるものである酵素変異体１と比較した場合にパラメーター１から５のいずれにおいても改善を示さなかった。明らかに、１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）中の１つまたは複数のヌクレオチドの糖およびまたは塩基と相互作用した位置に小さな側鎖基を有する少なくとも１つの置換を作ることにより、移動制御が不十分になる。
【０５３７】
変異体４は、１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）中の１つまたは複数のヌクレオチドの１つまたは複数のリン酸基と相互作用する少なくとも１つのアミノ酸置換、１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）中の１つまたは複数のヌクレオチドの糖および／または塩基と相互作用し、より大きな側鎖（Ｒ基）を有するアミノ酸で置換され、膜貫通ポアと相互作用するヘリカーゼの部分に１つまたは複数の修飾を有さない少なくとも１つのアミノ酸を有する。変異体４は、アミノ酸置換の組合せ、例えば１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）中の１つまたは複数のヌクレオチドの１つまたは複数のリン酸基と相互作用するもの、および１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）中の１つまたは複数のヌクレオチドの糖および／または塩基と相互作用する第２のものによるものである酵素変異体１と比較した場合にパラメーター１から５の少なくとも１つに改善を示した。さらに変異体４は、１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）中の１つまたは複数のヌクレオチド中の１つまたは複数のリン酸基と相互作用するアミノ酸置換によるものである酵素変異体９と比較した場合にパラメーター１から５の少なくとも１つに改善を示した。明らかに、１つまたは複数のヌクレオチドの糖および／または塩基と相互作用する位置により大きな側鎖基を有する置換を作ることならびに１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）中の１つまたは複数のヌクレオチド中の１つまたは複数のリン酸基と相互作用する置換を作ることは、移動制御の改善を生じた。
【０５３８】
変異体２は、１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）中の１つまたは複数のヌクレオチドの糖および／または塩基と相互作用し、より大きな側鎖（Ｒ基）を含むアミノ酸で置換され、膜貫通ポアと相互作用するヘリカーゼの部分に１つまたは複数の修飾を有する少なくとも１つのアミノ酸を有する。変異体２は、変化の組合せ、例えば１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）中の１つまたは複数のヌクレオチドの糖および／または塩基と相互作用する第１の少なくとも１つの置換、ならびに膜貫通ポアと相互作用するヘリカーゼの部分中の第２の１つまたは複数の修飾によるものである酵素変異体１と比較した場合にパラメーター１から５の少なくとも１つに改善を示した。変異体２は、膜貫通ポアと相互作用するヘリカーゼの部分中の第２の１つまたは複数の修飾によるものである酵素変異体９と比較した場合にパラメーター１から５の少なくとも１つにも改善を示した。さらに変異体２は、１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）中の１つまたは複数のヌクレオチドの糖および／または塩基と相互作用する第１の少なくとも１つの置換によるものである酵素変異体１６と比較した場合にパラメーター１から５の少なくとも１つに改善を示した。明らかに、変化の組合せを作ること（１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）中の１つまたは複数のヌクレオチドの糖および／または塩基と相互作用する第１の少なくとも１つの置換、および膜貫通ポアと相互作用するヘリカーゼの部分中の第２の１つまたは複数の修飾）は、移動制御の改善を示す酵素を生じた。
【０５３９】
変異体３は、１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）中の１つまたは複数のヌクレオチドの糖および／または塩基と相互作用し、より大きな側鎖（Ｒ基）を含むアミノ酸で置換され、膜貫通ポアと相互作用するヘリカーゼの部分に１つまたは複数の修飾を有する少なくとも１つのアミノ酸を有した。変異体３は、変化の組合せ、例えば１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）中の１つまたは複数のヌクレオチドの糖および／または塩基と相互作用する第１の少なくとも１つの置換、ならびに膜貫通ポアと相互作用するヘリカーゼの部分中の第２の１つまたは複数の修飾によるものである酵素変異体１と比較した場合にパラメーター１から５の少なくとも１つに改善を示した。変異体３は、膜貫通ポアと相互作用するヘリカーゼの部分中の第２の１つまたは複数の修飾によるものである酵素変異体９と比較した場合にパラメーター１から５の少なくとも１つにも改善を示した。さらに変異体３は、１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）中の１つまたは複数のヌクレオチドの糖および／または塩基と相互作用する第１の少なくとも１つの置換によるものである酵素変異体１７と比較した場合にパラメーター１から５の少なくとも１つに改善を示した。明らかに置換の組合せ（１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）中の１つまたは複数のヌクレオチドの糖および／または塩基と相互作用する第１の少なくとも１つの置換ならびに膜貫通ポアと相互作用するヘリカーゼの部分中の第２の１つまたは複数の修飾）を作ることは、移動制御の改善を示す酵素を生じた。
【０５４０】
酵素ＩＤ
酵素変異体１＝Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ（変異Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃおよび次いで（ΔＭ１）Ｇ１）を有する配列番号８）
酵素変異体２＝Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｋ１９９Ｌ／Ａ３６０Ｃ（変異Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｋ１９９Ｌ／Ａ３６０Ｃおよび次いで（ΔＭ１）Ｇ１）を有する配列番号８）
酵素変異体３＝Ｔ４  Ｄｄａ−Ｆ９８Ｗ／Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｋ１９４Ｌ／Ａ３６０Ｃ（変異Ｆ９８Ｗ／Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｋ１９４Ｌ／Ａ３６０Ｃおよび次いで（ΔＭ１）Ｇ１）を有する配列番号８）
酵素変異体４＝Ｔ４  Ｄｄａ−Ｓ８３Ｈ／Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ（変異Ｓ８３Ｈ／Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃおよび次いで（ΔＭ１）Ｇ１）を有する配列番号８）
酵素変異体５＝Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｆ２７６Ｋ／Ａ３６０Ｃ（変異Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｆ２７６Ｋ／Ａ３６０Ｃおよび次いで（ΔＭ１）Ｇ１）を有する配列番号８）
酵素変異体６＝Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｓ２８７Ｒ／Ａ３６０Ｃ（変異Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｓ２８７Ｒ／Ａ３６０Ｃおよび次いで（ΔＭ１）Ｇ１）を有する配列番号８）
酵素変異体７＝Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｓ２８７Ｗ／Ａ３６０Ｃ（変異Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｓ２８７Ｗ／Ａ３６０Ｃおよび次いで（ΔＭ１）Ｇ１）を有する配列番号８）
酵素変異体８＝Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｓ２８７Ｆ／Ａ３６０Ｃ（変異Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｓ２８７Ｆ／Ａ３６０Ｃおよび次いで（ΔＭ１）Ｇ１）を有する配列番号８）
酵素変異体９＝Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ（変異Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃおよび次いで（ΔＭ１）Ｇ１）を有する配列番号８）
酵素変異体１０＝Ｔ４  Ｄｄａ−Ｐ８９Ｆ／Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ（変異Ｐ８９Ｆ／Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃおよび次いで（ΔＭ１）Ｇ１）を有する配列番号８）
酵素変異体１１＝Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｖ１５０Ｈ／Ａ３６０Ｃ（変異／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｖ１５０Ｈ／Ａ３６０Ｃおよび次いで（ΔＭ１）Ｇ１）を有する配列番号８）
酵素変異体１２＝Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｖ１５０Ｉ／Ａ３６０Ｃ（変異Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｖ１５０Ｉ／Ａ３６０Ｃおよび次いで（ΔＭ１）Ｇ１）を有する配列番号８）
酵素変異体１３＝Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｐ１５２Ｆ／Ａ３６０Ｃ（変異Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｐ１５２Ｆ／Ａ３６０Ｃおよび次いで（ΔＭ１）Ｇ１）を有する配列番号８）
酵素変異体１４＝Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ａ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ（変異Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ａ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃおよび次いで（ΔＭ１）Ｇ１）を有する配列番号８）
酵素変異体１５＝Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｋ１９９Ｌ／Ａ３６０Ｃ（変異Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｋ１９９Ｌ／Ａ３６０Ｃおよび次いで（ΔＭ１）Ｇ１）を有する配列番号８）
酵素変異体１６＝Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｋ１９４Ｌ／Ａ３６０Ｃ（変異Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｋ１９４Ｌ／Ａ３６０Ｃおよび次いで（ΔＭ１）Ｇ１）を有する配列番号８）
酵素変異体１７＝Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｗ１９５Ａ／Ａ３６０Ｃ（変異Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｗ１９５Ａ／Ａ３６０Ｃおよび次いで（ΔＭ１）Ｇ１）を有する配列番号８）。
【０５４１】
【表１７】
2017535256.tif 000032
【実施例４】
【０５４２】
本実施例は、ヘリカーゼＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｋ１９４Ｌ／Ａ３６０Ｃ（変異Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｋ１９４Ｌ／Ａ３６０Ｃおよび次いで（ΔＭ１）Ｇ１）を有する配列番号８）がどのようにＣｓｇＧナノポア（ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ）−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（ＳｔｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号６７であり、Ｃ末端に付着されている変異Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑを有する配列番号６６）を通るＤＮＡ構築物Ｘ（図７を参照されたい）の移動を制御するかを示している。
【０５４３】
材料および方法
ＤＮＡ構築物Ｘヘリカーゼ（Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｋ１９４Ｌ／Ａ３６０Ｃ（変異Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｋ１９４Ｌ／Ａ３６０Ｃおよび次いで（ΔＭ１）Ｇ１を有する配列番号８））予備混合物を実施例３の材料および方法のセクションに記載の通り調製した。
【０５４４】
電気的測定は、ナノポアがＣｓｇＧであり、ＭｓｐＡではないことを除いて実施例３に記載のものの類似の方法でブロック共重合体に挿入された単一ＣｓｇＧナノポア（ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ）−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（ＳｔｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号６７であり、Ｃ末端で付着されている変異Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑを有する配列番号６６）から取得した。
【０５４５】
結果
ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動は、Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｋ１９４Ｌ／Ａ３６０Ｃ（変異Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｋ１９４Ｌ／Ａ３６０Ｃおよび次いで（ΔＭ１）Ｇ１）を有する配列番号８）がＣｓｇＧナノポア（ＣｓｇＧ−Ｅｃｏ−（Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑ）−ＳｔｒｅｐＩＩ（Ｃ））９（ＳｔｅｐＩＩ（Ｃ）が配列番号６７であり、Ｃ末端に付着されている変異Ｙ５１Ｔ／Ｆ５６Ｑを有する配列番号６６）を通るＤＮＡ構築物Ｘ（図７を参照されたい）の移動を制御した際に観察された。ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の電流トレース例は、図８Ａに示され、同じトレースの像の拡大を図８ＢおよびＣに示す。
【実施例５】
【０５４６】
本実施例は、どのようにヘアピンがＲＮＡ鎖の３’末端に付着し、ＲＮＡ鎖がＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを作るように逆転写されたかを示す。次に非ＲＮＡポリヌクレオチドを、ＤＮＡヘリカーゼ、Ｔ４  Ｄｄａ（Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｋ１９４Ｌ／Ａ３６０Ｃ（変異Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｋ１９４Ｌ／Ａ３６０Ｃおよび次いで（ΔＭ１）Ｇ１）を有する配列番号８）のローディングを促進するようにＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド中のＲＮＡ鎖の５’末端に付着させた。ナノポアを通るＲＮＡ／ＤＮＡ構築物のヘリカーゼ制御移動が観察された。
【０５４７】
材料および方法
１．ヘアピンライゲーション
下の表１８に列挙する試薬を混合し、下の表１９のプログラムに設定したサーモサイクラー上に置いた。次いで混合物をＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  Ａｍｐｕｒｅ  ＳＰＲＩビーズを試料１μＬあたりＳＰＲＩビーズ１．８μＬの比で使用して精製した。精製後、逆転写を表２０のＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｓｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ：試薬を使用して実施し、製造者のプロトコールに従って混合し、表２１のプログラムに設定したサーモサイクラーに置いた。次いで混合物をＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  Ａｍｐｕｒｅ  ＳＰＲＩビーズを試料１μＬあたりＳＰＲＩビーズ１．８μＬの比で使用して精製した。この試料は逆転写試料１として公知である。
【０５４８】
【表１８】
2017535256.tif 000033
【０５４９】
【表１９】
2017535256.tif 000034
【０５５０】
【表２０】
2017535256.tif 000035
【０５５１】
【表２１】
2017535256.tif 000036
【０５５２】
次に「非ＲＮＡポリヌクレオチド」（ＲＮＡ配列ＣＡＡＧＧＧに３’末端で付着した４個の５−ニトロインドールの５’末端に３’末端で付着した配列番号７０の５’末端に３’末端で付着した４個のｉＳｐ１８スペーサーの５’末端に３’末端で付着されている配列番号６９の５’末端に付着した３０ＳｐＣ３スペーサー）は、表２２に列挙した試薬と混合するおよび混合物を表２３のプログラムに設定したサーモサイクラーに置くことによってＲＮＡポリヌクレオチド（先のステップで逆転写された）にライゲーションした。次いで混合物をＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  Ａｍｐｕｒｅ  ＳＰＲＩビーズを試料１μＬあたりＳＰＲＩビーズ１．８μＬの比で使用して精製した。この試料はライゲーション試料１として公知である。
【０５５３】
【表２２】
2017535256.tif 000037
【０５５４】
【表２３】
2017535256.tif 000038
【０５５５】
下の表２４に列挙する試薬を混合し、６５°Ｃでインキュベートし、次いで１秒あたり０．１°Ｃの速度で４°Ｃに冷却した。この試料はＤＮＡ／ＲＮＡ構築物Ｙとして公知である。
【０５５６】
【表２４】
2017535256.tif 000039
【０５５７】
電気生理学
ＤＮＡ／ＲＮＡ構築物Ｙを１７．４μＭ  Ｔ４  Ｄｄａ（Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｋ１９４Ｌ／Ａ３６０Ｃ（変異Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｋ１９４Ｌ／Ａ３６０Ｃおよび次いで（ΔＭ１）Ｇ１）を有する配列番号８）の２μｌと２０分間インキュベートした。次いで８００μＭ  ＴＭＡＤ  ２．１μｌをインキュベート混合物に加え、室温、１０分間保持した。次いでこの試料を緩衝液（５００ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭリン酸カリウムｐＨ８．０の２７６μＬ）ＭｇＣｌ２（４μＬ、１５０ｍＭ）およびＡＴＰ（４μＬ、１５０ｍＭ）に合計容量３００μＬになるように希釈した。
【０５５８】
電気的測定は、緩衝液（２５ｍＭリン酸Ｋ緩衝液、１５０ｍＭフェロシアン化カリウム、１５０ｍＭフェリシアン化カリウム、約ｐＨ８．０）中のブロック共重合体に挿入された単一のＭｓｐＡナノポアから取得した。ブロック共重合体に挿入された単一ポアが達成された後、次いで緩衝液（２ｍＬ、２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液、１５０ｍＭフェロシアン化カリウム、１５０ｍＭフェリシアン化カリウム、ｐＨ８．０）をいかなる過剰のＭｓｐＡナノポアも除去するように系に流した。
【０５５９】
過剰の緩衝液（５００ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭリン酸カリウムｐＨ８．０）をＤＮＡ／ＲＮＡ構築物Ｙおよびヘリカーゼを加える前に系を通して流した。最終的にＤＮＡ／ＲＮＡ構築物Ｙに結合した（Ｔ４  Ｄｄａ（Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｋ１９４Ｌ／Ａ３６０Ｃ（変異Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｋ１９４Ｌ／Ａ３６０Ｃおよび次いで（ΔＭ１）Ｇ１）を有する配列番号８））を次いでナノポア系に加え、実験を−１４０ｍＶで実行し、ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動をモニターした。
【０５６０】
結果：
本実施例は、どのように非ＲＮＡポリヌクレオチドがＤＮＡヘリカーゼ、Ｔ４  Ｄｄａ（Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｋ１９４Ｌ／Ａ３６０Ｃ（変異Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｋ１９４Ｌ／Ａ３６０Ｃおよび次いで（ΔＭ１）Ｇ１）を有する配列番号８）のローディングを促進するようにＲＮＡ（転写された）に付着したかを示し、次に構築物のヘリカーゼ制御移動を観察した。Ｔ４  Ｄｄａ（Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｋ１９４Ｌ／Ａ３６０Ｃ（変異Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ｋ１９４Ｌ／Ａ３６０Ｃおよび次いで（ΔＭ１）Ｇ１）を有する配列番号８）ヘリカーゼ制御移動の例を図９に示す。
【０５６１】
本発明の好ましいＤｄａヘリカーゼの配列比較（配列番号８から２３）
【０５６２】
【化８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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