(57)【要約】ヒトのガン腫（具体的には頭頸部扁平上皮ガン、これに限定されない）を含めて、原発性および転移性の様々な新生物疾患の検出、防止および処置のための方法および組成物が提供される。具体的には、ＬＯＸＬ４を発現する腫瘍の診断、および、とりわけ、その処置において有用である、腫瘍細胞の細胞質および／または細胞表面におけるＬＯＸＬ４のエピトープに結合する抗体および抗原結合断片、ならびに、それらの変異体が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍細胞の細胞質および／または細胞表面における抗リシルオキシダーゼ様４（ＬＯＸＬ４）のエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片であって、ＬＯＸＬ４を発現する腫瘍の処置における使用のための抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
前記エピトープがアミノ酸配列ＫＶＷＤＬＫＭＲ（配列番号１）を含む、またはアミノ酸配列ＫＶＷＤＬＫＭＲ（配列番号１）からなる、請求項１に記載の使用のための抗体。
【請求項３】
モノクローナル抗体、好ましくは、Ｌｅｉｐｎｉｚ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＤＳＭＺ−Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒ．７Ｂ，３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に２０１４年３月１９日に寄託され、ＤＳＭ  ＡＣＣ３２３３のアクセション番号が割り当てられたハイブリドーマＬＯＸＬ４−Ｐによって産生されるモノクローナル抗体ＬＯＸＬ４−Ｐであり、あるいは、腫瘍細胞の細胞質および／または細胞表面におけるＬＯＸＬ４と結合することについてモノクローナル抗体ＬＯＸＬ４−Ｐと競合することができる抗体である、請求項１または２に記載の使用のための抗体。
【請求項４】
損傷細胞の細胞質ゾルから放出されるＬＤＨの測定に基づく細胞死および細胞溶解を引き起こすことができる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のための抗体または抗原結合断片。
【請求項５】
ヒト抗体、ヒト化抗体、異種抗体またはヒト−マウス  キメラ抗体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用のための抗体。
【請求項６】
単鎖Ｆｖ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ断片およびＦ（ａｂ’）２断片からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用のための抗原結合断片。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項において定義される抗体の抗原結合ドメインと、ＬＯＸＬ４を発現する腫瘍を処置するための少なくとも１つのさらなる機能的ドメインとを含む二機能性分子。
【請求項８】
二重特異性抗体であり、かつ／または、前記さらなる機能的ドメインが細胞傷害剤もしくは標識である、請求項７に記載の二機能性分子。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか一項において定義される抗体または抗原結合断片、あるいは、請求項７または８に記載される二機能性分子を含み、かつ、薬学的に許容され得る担体をさらに含む医薬組成物であって、ＬＯＸＬ４を発現する腫瘍の処置における使用のための医薬組成物。
【請求項１０】
免疫刺激剤をさらに含む、請求項９に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１１】
Ｌｅｉｐｎｉｚ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＤＳＭＺ−Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒ．７Ｂ，３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に２０１４年３月１９日に寄託され、ＤＳＭ  ＡＣＣ３２３３のアクセション番号が割り当てられたハイブリドーマＬＯＸＬ４−Ｐによって産生される抗ＬＯＸＬ４抗体、あるいは、ハイブリドーマＤＳＭ  ＡＣＣ３２３３によって産生される抗ＬＯＸＬ４−Ｐ抗体の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、かつ、腫瘍細胞の細胞質および／または細胞表面におけるＬＯＸＬ４のエピトープに結合することができ、前記エピトープがアミノ酸配列ＫＶＷＤＬＫＭＲ（配列番号１）を含む、またはアミノ酸配列ＫＶＷＤＬＫＭＲ（配列番号１）からなる抗体または抗体断片。
【請求項１２】
請求項１１に記載される抗体または抗原結合断片の１つの免疫グロブリン鎖の可変領域を少なくともコードするポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１２に記載されるポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１４】
請求項１２に記載されるポリヌクレオチドまたは請求項１３に記載されるベクターを含む宿主細胞、好ましくはハイブリドーマＤＳＭ  ＡＣＣ３２３３である宿主細胞。
【請求項１５】
前記腫瘍が、頭部、頸部、喉頭、食道、胃、肺、肝臓、結腸、直腸、膵臓、乳房、卵巣、子宮、子宮頸部、外陰部、陰茎、膀胱または腎臓の腫瘍、および転移性細胞一般からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用のための抗体または抗原結合断片、請求項７または８に記載の二機能性分子、請求項９または１０に記載の使用のための医薬組成物、あるいは、請求項１１に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトのガン腫（具体的には頭頸部扁平上皮ガン（ＨＮＳＣＣ））を含むがこれに限定されない、原発性および転移性の様々な新生物疾患の検出、防止および処置のための方法および組成物に関連する。本発明によれば、ガンの検出、防止および処置の実施が、罹患組織または罹患細胞における特定の腫瘍マーカーの存在および局在性によって媒介され、かつ／または示される。具体的には、本発明は、腫瘍細胞の細胞質および／または細胞表面に局在化するリシルオキシダーゼ様４（ＬＯＸＬ４）のエピトープに結合することができる抗体および抗原結合分子に関連する。さらに、本発明は、前記抗体を含む組成物、ならびに、腫瘍を診断する方法および処置する方法におけるその使用に関連する。本発明はさらに、ＬＯＸＬ４タンパク質またはそのドメインを認識することができる抗体の使用であって、腫瘍の検出および／または処置のための使用に関する。いくつかの文書が本明細書の本文を通して引用される。すべての引用された参考文献（本願明細書を通して引用されるような文献参照物、発行された特許、公開された特許出願、および、製造者の仕様書、説明書などを含む）の内容が、本明細書により明示的に、参照によって組み込まれる；しかしながら、どのような文書であれ、引用される文書は実際に本発明に関して先行技術であることを何ら認めるものではない。
【背景技術】
【０００２】
リシルオキシダーゼは、ペプチジルリシンをδ−アミノアジピン酸β−セミアルデヒド（エラスチンおよびコラーゲンの線維を安定化する共有結合架橋の形成時における中間前駆体）の酸化を触媒する、ＬＯＸ、ＬＯＸＬ、ＬＯＸＬ２、ＬＯＸＬ３およびＬＯＸＬ４を含む５つの銅依存性アミンオキシダーゼのファミリーであり、細胞外マトリックスの発達および維持に寄与している（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。
【０００３】
ＬＯＸは、黒色腫細胞、線維肉腫細胞および横紋筋肉腫細胞のようないくつかのヒト腫瘍細胞において、また、前立腺ガンおよび乳ガンにおいて発現される（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６）。ＬＯＸは細胞外および細胞内の両方の部位で見出されており（非特許文献７；非特許文献８）、また、ＬＯＸは間質性および上皮性の細胞および組織における多様な機能（例えば、線維化プロセスにおける様々な原線維マトリックスタンパク質の成熟化）を有し、メタロプロテイナーゼに対するそれらの安定性を決定している（非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１）。浸潤性乳ガン細胞におけるＬＯＸの役割を調べる研究により、ＬＯＸ活性が、乳ガン細胞の浸潤性表現型を増進させることにおいて不可欠であることが明らかにされ（非特許文献１２；非特許文献１３）、また、マウスにおける転移挙動のために不可欠であることが明らかにされた（非特許文献１４）。ＬＯＸにより触媒された反応の期間中に生じる過酸化水素が、ＦＡＫ／Ｓｃｒの活性化、フォーカルアドヒージョンの代謝回転を媒介し、細胞遊走を増大させることもまた明らかにされた（非特許文献１３）。近年の研究では、ＬＯＸＬ４がトランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦ−β１）によって誘導され、ＥＣＭ再構築において役割を果たすことが示された（非特許文献１５）。
【０００４】
ＬＯＸＬ４遺伝子の選択的なアップレギュレーションおよび増幅、ならびに、ＬＯＸＬ４タンパク質の過剰発現が、正常な上皮細胞と比較した場合、原発性および転移性の頭頸部扁平上皮ガン（ＨＮＳＣＣ）細胞系統において、ならびに、浸潤性ＨＮＳＣＣの患者において見出され、原発性腫瘍タイプに対する局所的なリンパ節転移との、また、程度がより進んだ腫瘍病期との相関関係を有した（非特許文献１６；非特許文献１７）。さらに、９３ｋＤのＬＯＸ４抗原に対して惹起される親和性精製されたポリクローナル抗体を使用して、悪性度および病期が異なるＨＮＳＣＣ組織におけるＬＯＸＬ４発現が明らかにされ、また、扁平上皮の構造的組織化におけるその関与が調べられた（非特許文献１８）。培養された原発性下咽頭ＨＴＢ−４３ガン細胞における研究では、ＬＯＸＬ４の核周囲発現および細胞表面発現が検出されたが、核局在性は検出されなかった（非特許文献１７）。ＬＯＸＬ４発現はＨＮＳＣＣ患者（ｎ＝２５７）の大規模コホートにおいてさらに評価され、それにより、ＬＯＸＬ４陽性の免疫染色が、原発性腫瘍およびリンパ節転移物から得られるほとんどすべての組織サンプルにおいて検出された（非特許文献１７）。舌および口腔粘膜の病理学的に確認された前ガン性白板症のサンプル（ｎ＝９）の中では、中程度〜大きな程度の異形成を有するサンプルのみが、ＬＯＸＬ４について陽性に染まった。新生物性でないすべての組織成分（ｎ＝９）では、また、間葉系組織、角質化途中の、非角質化性の扁平上皮および腺上皮を含有する、３０名の健康なコントロールに由来する組織成分では、ＬＯＸＬ４免疫反応性は検出されなかった（非特許文献１７）。
【０００５】
ＬＯＸＬ４遺伝子の構成およびプロモーター領域の分析では、ＴＡＴＡおよびＳＰ１転写因子が主として、ＨＮＳＣＣにおけるＬＯＸＬ４遺伝子発現のアップレギュレーションに関与することが示された（非特許文献１９）。そのうえ、ＬＯＸＬ４遺伝子が含まれる染色体バンド１０ｑ２４．２が、ＬＯＸＬ４過剰発現に関連する同腕染色体の過剰コピーでＨＮＳＣＣ細胞において存在する（非特許文献１６）。
【０００６】
ＨＮＳＣＣは、世界中で６番目に多い一般的なガンであり、ほぼ９５％の腫瘍が上部気道消化管の粘膜扁平上皮に起源を有する（非特許文献２０）。残念ながら、局所的または限局的な疾患が、進行した腫瘍病期を有する患者の３分の１において再発し、遠位転移が２５％において現れ、５年生存率が、積極的な二療法または三療法による標準的処置にもかかわらず、４０％前後である（非特許文献２１）。予後パラメーターまたは腫瘍抗原が利用できれば、標的療法としての補助的な処置計画のために患者を選択することが可能となるであろう。それにもかかわらず、過去数十年間にわたって、特有の標的または予後マーカーをＴＮＭ病期について特定することにおいて、また、腫瘍成長の挙動（例えば、浸潤深さおよびガン性リンパ管症など）をＨＮＳＣＣにおける患者の特性（例えば、年齢、共存症）と一緒に特定することにおいて、ほんの限定された成功のみが達成されているにすぎない。
【０００７】
今までのところ、ＨＮＳＣＣに対する記載された抗体のほとんど（非特許文献２２；非特許文献２３；非特許文献２４；非特許文献２５；非特許文献２６；非特許文献２７；非特許文献２８）が、正常な組織とのかなりの交差反応性を示したか、または、発生部位が異なったＳＣＣとの反応性を示しただけであった（非特許文献２９）。ＨＮＳＣＣについての最初の成功した放射免疫療法結果が、１９９０年代初期に、Ｅ４８  ｍＡｂを用いて示された（非特許文献３０）。この２０年間は、多大な努力が、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）を阻止することができるセツキシマブ（アービタックス）のようなｍＡｂを開発することに向けられている。この受容体は腫瘍細胞では過剰発現しており、セツキシマブがＨＮＳＣＣ処置のための化学療法との併用療法のために承認されている（非特許文献３１）。セツキシマブは、８個中５個（６３％）の異種移植片腫瘍の成長を阻害することが示された（非特許文献３２）。細胞表面抗原としてのＥＧＦＲが頭頸部ガンにおいて強く過剰発現していることを仮定すると、セツキシマブの奏功率はかなり低い。
【０００８】
ＬＯＸＬ４の腫瘍細胞における、特にＨＮＳＣＣ細胞における存在および局在性は、有益なマーカーを提供しており、その存在および局在性はまた、治療的介入のための標的として有用である場合がある。したがって、そのような細胞の細胞質および／または細胞表面におけるＬＯＸＬ４のエピトープを特異的に認識する抗体または他の結合性分子を有することは非常に望ましい。
【０００９】
したがって、ＬＯＸＬ４のエピトープを検出することができ、それにより、腫瘍細胞の特異的な検出およびおそらくは処置を可能にする抗ＬＯＸＬ４抗体の信頼できる供給源が求められている。この技術的課題に対する解決策が、請求項において特徴づけられ、また、下記においてさらに記載される実施形態を提供することによって達成される。
【００１０】
本明細書において著者によって参照される刊行物の書誌詳細が説明の最後にアルファベット順にまとめられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Kagan HM,Trackman PC.Properties and function of lysyl oxidase.Am J Respir Cell Mol Biol 1991;5:206-210
【非特許文献２】Kagan HM and Li W:Lysyl oxidase-properties,specificity,and biological roles inside and outside of the cell.J Cell Biochem 2003;88:660-672
【非特許文献３】Maki JM,Tikkanen H,Kivirikko KI.Cloning and characterization of a fifth human lysyl oxidase isoenzyme:the third member of the lysyl oxidase-related subfamilly with four scavenger receptor cysteine-rich domains.Matrix Biol.2001;20:493-496
【非特許文献４】Csiszar K,Entersz I,Trackman PC,Samid D,Boyd CD.Functional analysis of the promoter and first intron of the human lysyl oxidase gene.Mol Biol Rep 1996;23:97-108
【非特許文献５】Csiszar K.LOX,a novel multifunctional copper amine oxidase family.Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 2001;70:1-32
【非特許文献６】Csiszar K,Fong SF,Ujfalusi A,Krawetz SA,Salvati EP,Mackenzie JW,et al.Somatic mutations of the lysyl oxidase gene on chromosome 5q23.1 in colorectal tumors.Int J Cancer 2002;97:636-642
【非特許文献７】Li W,Nellaiappan K,Strassmaier T,Graham L,Thomas KM,Kagan HM.Localization and activity of lysyl oxidase within nuclei of fibrogenic cells.Proc Natl Acad Sci USA 1997;94:12817-12822
【非特許文献８】Mello ML,Contente S,Vidal BC,Planding W,Schenck U.Modulation of ras transformation affecting chromatin supraorganization as assessed by image analysis.Exp Cell Res 1995;220:374-382
【非特許文献９】Ren C,Yang G,Timme TL,Wheeler TM,Thompson TC.Reduced lysyl oxidase messenger RNA levels in experimental and human prostate cancer. Cancer Res 1998;58:1285-1290
【非特許文献１０】Peyrol S,Raccurt M,Gerard F,Gleyzal C,Grimaud JA,Sommer P.Lysyl oxidase gene expression in the stromal reaction to in situ and invasive ductal breast carcinoma.Am J Pathol 1997;150:497-507
【非特許文献１１】Peyrol S,Galateau-Salle F,Raccurt M,Gleyzal C,Sommer P.Selective expression of lysyl oxidase(LOX)in the stromal reactions of broncho-pulmonary carcinomas.Histol Histopathol 2000;15:1127-1135
【非特許文献１２】Kirschmann DA,Seftor EA,Fong SFT,Nieva DRC,Sullivan CM,Edwards EM,Sommer P,Csiszar K,Hendrix MJ.A molecular role for lysyl oxidase in breast cancer invasion.Cancer Res 2002;62:4478-1483
【非特許文献１３】Payne SL,Fogelgren B,Fong SFT,Hess AR,Seftor EA,Csiszar K,et al.Lysyl oxidase regulates breast cancer migration and adhesion:implications for FAK/Src signalling pathway.Cancer Res 2005;15:1429-11436
【非特許文献１４】Erler JT,Bennewith KL,Nicolau M,Dornhofer N,Kong C,Le OT,et al.Lysyl oxidase is essential for hypoxia induced metastasis.Nature 2006;440:1222-1226
【非特許文献１５】Busnadiego O,Gonzalez-Santamaria J,Lagares D,Guinea-Viniegra J,Pichol-Thievend C,Muller L Rodriguez-Pascual F.LOXL4 is induced by transforming growth factor β1 through Smad and JunB/Fra2 and contributes to vascular matrix remodeling Mol Cell Biol 2013;33:2388-401
【非特許文献１６】Gorogh T,Weise JB,Holtmeier C,Rudolph P,Hedderich J,Gottschlich S,Hoffmann M,Ambrosch P,Csiszar K.Selective upregulation and amplification of the lysyl oxidase-like 4(LOXL4)gene in head and neck squamous cell carcinoma.J Pathol 2007;212:74-82
【非特許文献１７】Weise JB,Rudolph P,Heiser A,Kruse ML,Hedderich J,Cordes C,Hoffmann M,Brant O,Ambrosch P,Csiszar K,Gorogh T.LOXL4 is a selectively expressed candidate diagnostic antigen in head and neck cancer.Eur J Cancer 2008a;44:1323-1331
【非特許文献１８】Weise JB,Csiszar K,Gottschlich S,Hoffmann M,Schmidt A,Weingartz U,Adamzik I,Heiser A,Kabelitz D,Ambrosch P,Gorogh T.Vaccination strategy to target lysyl oxidase-like 4 in dendritic cell based immunotherapy for head and neck cancer.Int J Oncol 2008b;32:317-322
【非特許文献１９】Gorogh T,Holtmeier C,Weise JB,Hoffmann M,Ambrosch P,Laudien M,Csiszar K.Functional analysis of the 5'flanking domain of the LOXL4 gene in head and neck squamous cell carcinoma cells.Int J Oncol 2008;33:1091-1098
【非特許文献２０】Parkin DM,Laara E,Muir CS.Estimates of the worldwide frequency of sixteen major cancers in 1980.Int J Cancer 1988;41:184-197
【非特許文献２１】Hoffman HT,Karnell LH,Funk GF,Robinson RA,Menck HR.The National Cancer Data Base report on cancer of the head and neck.Arch Otolaryngol Head Neck Surg 1998;124:951-62
【非特許文献２２】Kimmel,K.A.and Carey,T.E.Altered expression in squamous carcinoma cells of an orientation-restricted epithelial antigen detected by monoclonal antibody A9.Cancer Res 1986;46,3614-3623
【非特許文献２３】Fernsten PD,Pekny KW,Reisfel,RA and Walker LE.Antigens associated with human squamous cell lung carcinoma defined by murine monoclonal antibodies.Cancer 1986;46:2970-2977
【非特許文献２４】Koprowska I,Zipfel S,Ross AH and Herlyn M.Development of monoclonal antibodies that recognize antigens associated with human cervical carcinoma.Acta Cytol 1986;30:207-213
【非特許文献２５】Myoken Y,Moroyama T,Miyauchi S,Takada K,and Namba M.Monoclonal antibodies against oral squamous-cell carcinoma reacting with keratin proteins.Cancer 1987;60:2927-2937
【非特許文献２６】Ranken R.,White C.F.,Gottfried T.G.(1987).Reactivity of monoclonal antibody 17.13 with human squamous cell carcinoma and its application to tumor diagnosis.Cancer Res 1987;47:5684-5690
【非特許文献２７】Samuel J,Noujaim AA,Willans DJ,Brzezinska GS,Haines DH and Longenecker BM.A novel marker for basal(stem)cells of mammalian stratified squamous epithelia and squamous cell carcinomas.Cancer Res 1989;49:2465-2470
【非特許文献２８】Tatake RJ,Amin KM,Maniar HS,Jambhekar NA,Srikhande SS and Gangal SG.Monoclonal antibody against human squamous-cell-carcinoma-associated antigen.Int J Cancer 1989;44:840-845
【非特許文献２９】Gerretsen M,Quakl JJ,Suhl JS,van Walsuml M,Meijer CJLM,Snow GB,van Dongen GAMS,Superior localisation and imaging of radiolabelled monoclonal antibody E48 F(ab'),fragment in xenografts of human squamous cell carcinoma of the head and neck and of the vulva as compared to monoclonal antibody E48 IgG.Br J Cancer 1991;63:37-44
【非特許文献３０】Gerretsen M,Schrijvers AHGJ,van Walsum M,Braakhuis BJM,Quak JJ,Meier CJLM,Snow GB,van Dongen GAMS.Radioimmunotherapy of human head and neck squamous cell carcinoma xenografts with 131I-labelled monoclonal antibody E48 IgG.Br J Cancer 1992;66:496-502
【非特許文献３１】Bou-Assaly W,and Mukherji S.Cetuximab(Erbitux).AJNR Am J Neuroradiol 2010;31:626-627
【非特許文献３２】Krummbach R,Schuler J,Hofmann M,Giesemann T,Fiebeg HH,Beckers T.Primary resistance to cetuximab in a panel of patient-derived tumor xenograft models:Activation of MET as one mechanism for drug resistance.Europ J Cancer 2011;47:1231-1243
【発明の概要】
【００１２】
本発明は免疫学の技術分野に関連し、罹患組織または罹患細胞の細胞表面における特定の腫瘍マーカーの存在および局在性によって媒介され、かつ／または示される、疾患の処置に関連する。本発明は、腫瘍細胞の細胞質および／または細胞表面に局在化するＬＯＸＬ４のエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片であって、ＬＯＸＬ４を発現する腫瘍の治療的処置における使用のための抗体またはその抗原結合断片に関連する。
【００１３】
具体的には、本発明は、Ｌｅｉｐｎｉｚ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＤＳＭＺ−Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒ．７Ｂ，３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に２０１４年３月１９日に寄託され、ＤＳＭ  ＡＣＣ３２３３のアクセション番号が割り当てられたハイブリドーマＬＯＸＬ４−Ｐによって産生されるようなモノクローナル抗体ＬＯＸＬ４−Ｐの使用に関する。さらに、本発明は、マウスのモノクローナルな抗ＬＯＸＬ４−Ｐ抗体のＤＳＭ  ＡＣＣ３２３３に言及することによって例示され、また、記載されるが、本発明の抗体または抗体断片には、その合成誘導体および生物工学誘導体が含まれ、したがって、本発明の抗体または抗体断片は、化学的技術または組換え技術によって合成される任意の改変抗体または抗体様のＬＯＸＬ４結合性分子であれ、主題抗体の機能的性質の１つまたは複数を保持する、具体的にはＬＯＸＬ４発現細胞に対するその細胞傷害活性を保持する改変抗体または抗体様のＬＯＸＬ４結合性分子を意味することを理解しなければならない。したがって、本発明は、簡潔さのために、ＤＳＭ  ＡＣＣ３２３３抗体に言及することによって記載されることがあるかもしれないが、別途述べられる場合を除き、その合成誘導体および生物工学誘導体、ならびに、同等なＬＯＸＬ４結合性分子が同様に意味され、抗体という用語の意味に含まれる。
【００１４】
好ましい実施形態において、抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、異種抗体またはヒト−マウス  キメラ抗体である。抗体もしくはその活性な断片、またはアゴニストおよび同族分子、または代替ではこれらのアンタゴニストを含む治療用組成物、ならびに、これらの組成物を使用して腫瘍形成疾患を防止し、診断し、または処置することにおけるそのような組成物の使用方法もまた含まれ、ただし、この場合、効果的な量の組成物が、そのような処置を必要としている患者に投与される。しかしながら、診断使用および研究のためには一般に、マウス抗体が同様に好ましい。モノクローナル抗体の抗原結合断片は、単鎖Ｆｖ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ断片およびＦ（ａｂ’）２断片、または、どのような他の抗原結合断片も可能である。具体的な実施形態において、とりわけ、モノクローナル抗体またはその断片はマウスのＩｇＧアイソタイプ抗体またはＩｇＭアイソタイプ抗体である。
【００１５】
当然のことながら、本発明は、モノクローナル抗体ＬＯＸＬ４−Ｐを産生するハイブリドーマにまで及ぶ（当該ハイブリドーマは、本明細書中先に示されるようにＤＳＭＺに寄託されている）。
【００１６】
本願はまた、本発明の抗体の免疫グロブリン鎖の可変領域を少なくともコードするポリヌクレオチドを開示する。好ましくは、前記可変領域は、抗体ＬＯＸＬ４−Ｐの可変領域のＶＨおよび／またはＶＬの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【００１７】
したがって、本願はまた、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、および、それにより形質転換される宿主細胞、ならびに、インタクトな細胞（特に腫瘍細胞）におけるＬＯＸＬ４−Ｐの細胞外の局在化したエピトープと特異的に結合することができる抗体あるいはその機能的断片または免疫グロブリン鎖を産生させるためのそれらの使用を開示する。
【００１８】
ＬＯＸＬ４と結合する、本発明の抗体、免疫グロブリン鎖または結合性断片の結合ドメインと、少なくとも１つのさらなる機能的ドメインとを含む二機能性分子または多機能性分子を提供することもまた、本発明の目的である。
【００１９】
本発明の抗体、免疫グロブリン鎖、その結合性断片、および、前記抗体に結合するＬＯＸＬ４以外のリガンドは、免疫応答を調節するための、また、検出するための、あるいは、腫瘍の検出および／または処置のための医薬組成物および診断組成物において使用することができる。
【００２０】
加えて、腫瘍を明らかにするための方法であって、患者由来のサンプルにおける細胞を、本発明による抗体または二機能性分子もしくは多機能性分子を用いてアッセイすることを含み、ＬＯＸＬ４の存在または増大した量がその腫瘍の指標となる方法、および、腫瘍の処置をその必要性のある対象において行うための方法であって、治療効果的な量の前記抗体または二機能性分子もしくは多機能性分子を前記対象に投与することを含む方法が提供される。
【００２１】
前記組成物を医薬品の調製において使用することが好ましい。好ましい実施形態において、この医薬品は、腫瘍に関連づけられる状態の処置において有用である。
【００２２】
本発明のさらなる実施形態が下記の説明および実施例から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ＬＯＸＬ４−Ｐの特異性の分析。（Ａ）抗体の純度を表すＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（５０ｋＤの重鎖および２５ｋＤの軽鎖が示される）。（Ｂ）ＬＯＸＬ４−Ｐに関してＬＯＸＬ４ペプチド抗原を特定するためのウエスタンブロット分析。（Ｃ）ＨＮＳＣＣ細胞におけるＬＯＸＬ４反応性、および、（Ｄ）ＨＮＳＣＣ生検におけるＬＯＸＬ４反応性。（Ｅ）免疫陽性が咽頭の正常な粘膜では認められなかった。
【図２】ＬＯＸＬ４−Ｐによる処置の後における細胞のＬＤＨ放出。単層にまで成長させたＨＮＳＣＣ細胞および正常な上皮細胞を、１５μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌおよび４５μｇ／ｍｌのＬＯＸＬ４−Ｐ  ｍＡｂの存在下で４８時間インキュベーションした。細胞を含まない培養上清のＬＤＨ活性を記載されるように求めた（実施例３）。２つの星印は、Ｐ≦０．００１を表し、３つの星印は、Ｐ≦０．０００１を表す。
【図３】異種移植片腫瘍の巨視的外観および組織化学的外観。（Ａ）腫瘍細胞接種後１ヶ月におけるＬＯＸＬ４−Ｐ非処置の腫瘍。（ＢおよびＣ）扁平上皮ガンの典型的なパターンを示す密に詰まった腫瘍細胞凝集物。（Ｄ〜Ｆ）腫瘍保有マウスに、１週間間隔でのＬＯＸＬ４−Ｐによるｉ．ｖ．注入を、（Ｄ）０．５ｃｍ、（Ｅ）０．８ｃｍおよび（Ｆ）１．２ｃｍの腫瘍サイズでそれぞれ開始して与えた。腫瘍サイズにかかわらず、壊死する腫瘍が痂皮で完全に覆われる。（Ｇ）痂皮で密に覆われた腫瘍残渣を切除し、組織学的観察（ＨおよびＩ）のために調製した。細胞を含まない、痂皮で覆われた創傷層を示す、Ｇからの微視的断面。
【図４】時間の関数としてのＳＣＩＤマウスにおける腫瘍発達。（▲）１０６個のＨＮＳＣＣ細胞がマウス（ｎ＝１２）にｓ．ｃ．注入された後、腫瘍が３０日の期間にわたって急速に発達し、０．５ｃｍのサイズに達した。（●）マウス（ｎ＝１２）に対して、２００μｇのＬＯＸＬ４−Ｐによるｉ．ｖ．前処理を行った。その後すぐに、マウスには、１０６個のＨＮＳＣＣ細胞が脇腹にｓ．ｃ．注入された。ＬＯＸＬ４−Ｐによる動物の前処理は腫瘍発達をかなり遅らせた。
【発明の詳細な説明】
【００２４】
本発明は、ヒト個体における原発性および転移性の新生物疾患の診断、防止および処置のための方法および組成物に関する。具体的には、本発明は、ＬＯＸＬ４を発現する腫瘍の処置において使用されるための、腫瘍細胞上のＬＯＸＬ４のエピトープに結合する分子に関連する。より具体的には、本発明は、Ｌｅｉｐｎｉｚ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＤＳＭＺ−Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒ．７Ｂ，  ３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に２０１４年３月１９日に寄託され、ＤＳＭ  ＡＣＣ３２３３のアクセション番号が割り当てられたハイブリドーマＬＯＸＬ４−Ｐによって産生されるようなモノクローナル抗体ＬＯＸＬ４−Ｐの免疫学的結合特徴を明らかにする抗体およびその抗原結合断片の使用に関連する。存在する場合、抗原との抗体の用語「免疫学的結合特徴」または他の結合特徴はその文法的形態のすべてで、抗体の特異性、親和性、交差反応性および他の結合特徴を示す。
【００２５】
本発明は、ハイブリドーマ株およびこのハイブリドーマ株によって産生される抗体を提供する。驚くべきことに、精製された抗体は、細胞質および／または細胞表面におけるＬＯＸＬ４に結合することができることが見出された。腫瘍サンプルの隣接部位から得られる非新生物組織ではなく、原発性および転移性のＨＮＳＣＣ細胞のみがＬＯＸＬ４を発現するようであるので、本発明による抗体は、正常な細胞と腫瘍細胞とを識別することができる。したがって、本発明は、腫瘍細胞のＬＯＸＬ４のエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片を提供する（これにより、本明細書中に記載されるいくつかの実施形態がもたらされる）。ＬＯＸＬ４の発現はいくつかの異なるタイプのガンの顕著な特徴であるので、本発明の抗体の好ましい実施形態は腫瘍細胞に結合し、この場合、前記腫瘍は、頭部、頸部、喉頭、食道、胃、肺、肝臓、結腸、直腸、膵臓、乳房、卵巣、子宮、子宮頸部、外陰部、陰茎、膀胱または腎臓の腫瘍からなる群から選択されるヒト腫瘍である。
【００２６】
本発明の好ましい実施形態において、抗体は、アミノ酸配列ＫＶＷＤＬＫＭＲ（配列番号１）を含むエピトープまたはこのアミノ酸配列からなるエピトープを認識する。最も好ましくは、前記抗体はモノクローナル抗体である。具体的には、本発明の抗体またはその抗原結合断片は好ましくは、Ｌｅｉｐｎｉｚ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＤＳＭＺ−Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒ．７Ｂ，３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に３月１９日に寄託され、ＤＳＭ  ＡＣＣ３２３３のアクセション番号が割り当てられたハイブリドーマＬＯＸＬ４−Ｐによって産生されるようなモノクローナル抗体ＬＯＸＬ４−Ｐの免疫学的結合特徴を示す。モノクローナル抗体ＬＯＸＬ４−Ｐの免疫学的結合特徴は、Ｗｅｉｓｅ他（２００８ａ）によって記載されるポリクローナル抗体の免疫学的結合特徴と実質的に同じである。しかしながら、ポリクローナル抗体は様々な抗体の不均一な混合物であり、単一種類、すなわち、モノクローナル抗体が、ポリクローナル抗体について示される特性を示し得るであろうか、または示すであろうかは、事前には不明である。そのうえ、本発明者らによる本公報には、本発明の抗体の望まれる免疫学的特徴、とりわけ、抗体が、ＬＯＸＬ４を発現するＨＮＳＣＣ腫瘍細胞に結合することができることが記載されるので、本発明が初めて、そのような抗体および信頼できる供給源（具体的には、対応するハイブリドーマ細胞株）を無限に提供することを可能にする。したがって、モノクローナル抗体ＬＯＸＬ４−Ｐを産生するハイブリドーマが提供されることにより、当業者は、例えば、言及された抗体の抗原結合部位を適合化することによって、機能的に同等な抗体を設計し、製造することが可能となる。
【００２７】
具体的に提供される抗体は、その免疫学的活性および生物学的活性に関して比類のないものである。具体的に提供される抗体は、ＬＯＸＬ４のエピトープに対するその結合能によって、特に、インタクトな生存腫瘍細胞におけるＬＯＸＬ４のエピトープに対するその結合能によって、他の抗ＬＯＸＬ４抗体と区別されることがある。具体的に提供される抗体はまた、損傷細胞の細胞質ゾルから上清に放出されるＬＤＨの測定に基づく細胞死および細胞溶解に対する影響を示すことができる（図２および表２を参照のこと）。したがって、ＬＯＸＬ４−Ｐに由来するＬＯＸＬ４結合性分子は好ましくは、治療用途および診断用途（これらに限定されない）において使用される。
【００２８】
そのうえ、１つの実施形態において、本発明の抗体は好ましくは、１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは５０μｇ／ｍｌ未満、最も好ましくは約１５μｇ／ｍｌ〜４５μｇ／ｍｌの本発明の抗体が、損傷細胞の細胞質ゾルから上清に放出されるＬＤＨの測定に基づく細胞死および細胞溶解のために十分であることを特徴とする（図２および表２を参照のこと）。そのような実験では通常、１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは５μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌ、最も好ましくは約５０μｇ／ｍｌまたは５０μｇ／ｍｌ未満の所与の抗体が、図２および表２に記載されるのと同じ結果を得るために十分である。
【００２９】
代替において、本発明の抗体は、ＬＯＸＬ４のエピトープに対する結合について、本発明によって提供される抗体と競合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片である。そのような抗体は同様にマウス由来である場合があり、しかしながら、ヒト抗体、ヒト化抗体、異種抗体またはヒト−マウス  キメラ抗体が、特に治療用途のためには好ましい。抗体の抗原結合断片は、例えば、単鎖Ｆｖ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ断片およびＦ（ａｂ’）２断片であることが可能である。したがって、いくつかの適用のために、抗体の可変領域のみが要求され、抗体の可変領域は、ハイブリドーマから単離されるモノクローナル抗体を好適な試薬により処理し、Ｆａｂ’部分、Ｆａｂ部分またはＦ（ａｂ’）２部分を生じさせるようにすることによって得ることができる。そのような断片は、例えば、免疫グロブリンの免疫特異性部分を検出用試薬（例えば、放射性同位体など）に連結することを伴う免疫診断手順における使用のために十分である。
【００３０】
当然のことながら、本発明は同様に、本発明による抗体を産生するハイブリドーマにまで及ぶ。したがって、本発明は好都合には、本発明のモノクローナル抗体の無限に続く細胞供給源、すなわち、ハイブリドーマを提供する。特に好ましいものが、Ｌｅｉｐｎｉｚ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＤＳＭＺ−Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒ．７Ｂ，３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に２０１４年３月１９日に寄託され、ＤＳＭ  ＡＣＣ３２３３のアクセション番号が割り当てられたハイブリドーマＬＯＸＬ４−Ｐである。
【００３１】
免疫グロブリンをハイブリドーマの培養物から直接に得ることの代替として、不死化されたハイブリドーマ細胞を、その後の発現および／または遺伝子操作のための、再編成された重鎖遺伝子座および軽鎖遺伝子座の供給源として使用することができる。再編成された抗体遺伝子は、この技術分野で知られている様々な方法に従って、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌの現行版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（１９８９）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）において一般的に記載されるような様々な方法に従って、適切なｍＲＮＡから逆転写して、ｃＤＮＡを作製することができる。所望されるならば、重鎖定常領域を異なるアイソタイプの重鎖定常領域に交換することができ、または、完全に除くことができる。可変領域を、単鎖のＦｖ領域をコードするために連結することができる。多数のＦｖ領域を、２つ以上の標的に対する結合能を与えるために連結することができ、または、重鎖および軽鎖のキメラな組合せを用いることができる。遺伝物質が入手可能となると、所望の標的と結合するそれらの能力をともに保持する、上で記載されるようなアナログの設計は直截的である。抗体可変領域のクローニングおよび組換え抗体の作製のための様々な方法が当業者には知られている。
【００３２】
上記によれば、本願はまた、上で記載される抗体の免疫グロブリン鎖の可変領域を少なくともコードするポリヌクレオチドを開示する。典型的には、このポリヌクレオチドによってコードされる前記可変領域は、上記ハイブリドーマによって産生される抗体の可変領域のＶＨおよび／またはＶＬの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。当業者は、抗体のそれぞれの可変ドメイン（重鎖ＶＨおよび軽鎖ＶＬ）が３つの超可変領域（これらはときには、４つの比較的保存されたフレームワーク領域または「ＦＲ」が両側に配置される相補性決定領域または「ＣＤＲ」と呼ばれる）を含むことを理解している。
【００３３】
配置されたＣＤＲによって形成される抗原結合ドメインにより、免疫反応性抗原におけるエピトープに対して相補的な表面が規定される。この相補的な表面により、抗体がその同族エピトープに非共有結合的に結合することが促進させられる。ＣＤＲおよびフレームワーク領域をそれぞれ構成するアミノ酸は、それらは正確に定義されているので、どのような所与の重鎖可変領域または軽鎖可変領域についてであれ当業者によって容易に特定することができる：「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、Ｋａｂａｔ，Ｅ．他編、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９８３）、ならびに、ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６（１９８７）、９０１〜９１７を参照のこと（これらはそれらの全体において参照によって本明細書中に組み込まれる）。この技術分野において使用される、および／または受け入れられる用語の２つ以上の定義が存在する場合、本明細書中で使用されるような当該用語の定義は、反するようなことが明示的に述べられる場合を除き、すべてのそのような意味を包含することが意図される。具体的な一例が、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域の中に見出される不連続な抗原結合部位を記述するための用語「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）の使用である。この特定の領域が、Ｋａｂａｔ他、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）によって、また、ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６（１９８７）、９０１〜９１７によって記載されており（これらは参照によって本明細書中に組み込まれる）、この場合、それらの定義には、互いに比較されたときのアミノ酸残基の重なりまたはサブセットが含まれる。それにもかかわらず、抗体またはその変異体のＣＤＲを指すためにどちらかの定義を適用することは、本明細書中で定義され、かつ使用されるような当該用語の範囲内であることが意図される。上記で引用された参考文献のそれぞれによって定義されるようなＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基が、比較として下記において表１に示される。特定のＣＤＲを包含する正確な残基番号は、ＣＤＲの配列およびサイズに依存して変わるであろう。当業者は、抗体の可変領域アミノ酸配列が与えられると、どの残基が抗体のヒトＩｇＧサブタイプの特定の超可変領域またはＣＤＲを構成するかを常法により決定することができる。
【００３４】
表１：ＣＤＲの定義１
【表１】
2017526369.tif 000002
表１におけるすべてのＣＤＲ定義の番号表記は、Ｋａｂａｔ他によって示される番号表記慣例に従っている（下記を参照のこと）。
【００３５】
Ｋａｂａｔ他はまた、どのような抗体に対しても適用可能である可変ドメイン配列のための番号表記システムを定義した。当業者は、「Ｋａｂａｔ番号表記」のこのシステムを、配列そのものを超える実験的データに何ら頼ることなく、どのような可変ドメイン配列に対してでも一義的に割り当てることができる。本明細書中で使用される場合、「Ｋａｂａｔ番号表記」は、Ｋａｂａｔ他、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）によって示される番号表記システムを示す。別途指定される場合を除き、本発明の抗体あるいはその抗原結合断片、変異体または誘導体における具体的なアミノ酸残基位置の番号表記に対する参照は、Ｋａｂａｔ番号表記システムに従っており、しかしながら、Ｋａｂａｔ番号表記システムは理論的であり、本発明のどの抗体にも等しく適用されない場合がある。例えば、最初のＣＤＲの位置に依存して、その後のＣＤＲはどちらかの方向でずれるかもしれない。
【００３６】
したがって、本発明はまた、上で記載された可変ドメインの少なくとも１つのＣＤＲを含み、かつ、好都合には、本明細書中上で記載される抗体と実質的に同じ結合特性または類似する結合特性を有するポリペプチドおよび抗体を包含する。当業者は、本明細書中に記載される可変ドメインまたはＣＤＲを使用して、様々な抗体が、この技術分野で知られている様々な方法に従って構築され得ることを容易に理解するであろう。そのうえ、当業者は、結合親和性が、アミノ酸置換をＣＤＲの内部において、または、Ｋａｂａｔ（１９８３、１９８７、１９９０）によって定義されるようなＣＤＲと部分的に重なる超可変ループの内部において行うことによって強化され得ることを理解している。したがって、本発明はまた、述べられたＣＤＲの１つまたは複数が１つまたは複数、好ましくは２つ以下のアミノ酸置換を含む抗体に関連する。
【００３７】
上記の抗体をコードするポリヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、あるいは合成により製造されたＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいは、そのようなポリヌクレオチドのいずれかを単独または組合せのどちらでも含む組換えにより製造されたキメラな核酸分子である場合がある。好ましくは、前記ポリヌクレオチドはベクターの一部である。そのようなベクターは、さらなる遺伝子を含む場合がある（例えば、前記ベクターを好適な宿主細胞において、また、好適な条件のもとで選択することについて可能にするマーカー遺伝子など）。したがって、前記ポリヌクレオチドを、必要な場合には、前記抗体の他方の免疫グロブリン鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチドとの組合せで含むベクターが、本発明の好ましい実施形態である。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、原核生物細胞または真核生物細胞における発現を可能にする発現制御配列に機能的に連結される。前記ポリヌクレオチドの発現は、当該ポリヌクレオチドの翻訳可能なｍＲＮＡへの転写を含む。真核生物細胞（好ましくは哺乳動物細胞）における発現を保証する様々な調節エレメントが当業者にはよく知られている。それらは通常、転写の開始を確実にする調節配列、ならびに、必要な場合には、転写の終結および転写物の安定化を確実にするポリＡシグナルを含む。さらなる調節エレメントには、転写エンハンサー、ならびに、翻訳エンハンサー、および／または、生来的に関連するプロモーター領域または異種のプロモーター領域が含まれる場合がある。これに関連して、当業者は、軽鎖および／または重鎖の可変ドメインを少なくともコードするポリヌクレオチドが両方の免疫グロブリン鎖または一方のみの免疫グロブリン鎖の可変ドメインをコードし得ることを容易に理解するであろう。同様に、前記ポリヌクレオチドは発現のために同じプロモーターの制御下にある場合があり、または別個に制御される場合がある。転写の開始に関わるエレメントのほかに、そのような調節エレメントはまた、転写終結シグナルを含む場合がある。そのうえ、使用される発現系に依存して、ポリペプチドを細胞区画に向かわせることができるリーダー配列、または、ポリペプチドを培地中に分泌させることができるリーダー配列が、本発明のポリヌクレオチドのコード配列に加えられる場合があり、そのような様々なリーダー配列がこの技術分野ではよく知られている。リーダー配列は、翻訳配列、開始配列および終結配列とともに適切な段階で組み立てられ、好ましくは、翻訳されたタンパク質またはその一部を細胞膜周辺腔または細胞外培地に分泌することを導くことができるリーダー配列である。必要な場合には、異種配列は、所望される特徴（例えば、発現した組換え産物の安定化または簡略化された精製）を与えるＣ末端またはＮ末端での同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードすることができる。好ましくは、発現制御配列は、真核生物宿主細胞の形質転換またはトランスフェクションを行うことができるベクターにおける真核生物プロモーターシステムであろう。しかし、原核生物宿主のための制御配列もまた使用される場合がある。ベクターが、適切な宿主に取り込まれると、宿主は、ヌクレオチド配列の高レベル発現のために好適である条件のもとで維持され、そして、所望されるように、免疫グロブリンの軽鎖、重鎖、軽鎖／重鎖の二量体または完全な抗体、結合性断片または他の免疫グロブリン形態の回収および精製が続く場合がある。
【００３８】
適切な遺伝物質が得られ、かつ、所望されるならば、アナログをコードするために改変されると、コード配列（これは、最低でも重鎖および軽鎖の可変領域をコードする配列を含む）は適切な発現系（すなわち、トランスフェクションに供することができるベクター）に挿入され、抗体またはその断片が宿主細胞において組換え発現される場合がある。したがって、本発明によるポリヌクレオチドまたはベクターを含む宿主細胞は、好ましい実施形態である。ベクターは、遺伝子操作において従来から使用されるプラスミド、コスミド、ウイルスおよびバクテリオファージである場合がある。本発明の抗体の免疫グロブリン鎖の可変ドメインをコードするポリヌクレオチドとは別に、ベクターは必要に応じて、本発明の抗体の他方の免疫グロブリン鎖の可変ドメインをコードする本発明のポリヌクレオチドを含む場合がある。好ましくは、前記ベクターは発現ベクターおよび／または遺伝子移入ベクターもしくは遺伝子標的化ベクターである。ウイルスに由来する発現ベクターが、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを標的化された細胞集団に送達するために使用される場合がある。当業者によく知られている様々な方法を、組換えウイルスベクターを構築するために使用することができる。代替において、本発明のポリヌクレオチドおよびベクターは、標的細胞への送達のためにリポソーム内に再構成することができる。本発明のポリヌクレオチド（例えば、免疫グロブリン鎖の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードする配列ならびに発現制御配列）を含有するベクターは、よく知られている様々な方法によって宿主細胞にトランスフェクションすることができる（ただし、そのような方法は細胞宿主のタイプに依存して変化する）。
【００３９】
本願はさらに、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターにより形質転換される宿主細胞を開示する。前記宿主細胞は原核生物細胞または真核生物細胞である場合がある。宿主細胞に存在する本発明のポリヌクレオチドまたはベクターは当該宿主細胞のゲノムに組み込まれるか、または、染色体外に維持されるかのどちらであってもよい。宿主細胞は、どのような原核生物細胞または真核生物細胞でも可能である（例えば、細菌細胞、昆虫細胞、真菌細胞、植物細胞またはヒト細胞など）。用語「原核生物（の）」は、本発明の抗体またはその対応する免疫グロブリン鎖を発現させるためのＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子による形質転換またはトランスフェクションを行うことができるすべての細菌を包含することが意味される。用語「真核生物（の）」は、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および、好ましくは哺乳動物細胞を包含することが意味される。組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる抗体または免疫グロブリン鎖はグリコシル化される場合があり、またはグリコシル化されない場合がある。本発明の抗体またはその対応する免疫グロブリン鎖はまた、最初となるメチオニンのアミノ酸残基を含む場合がある。本発明のポリヌクレオチドは、当業者には一般に知られている技術のいずれかを使用して宿主を形質転換するために、またはトランスフェクションするために使用することができる；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）、Ｎ．Ｙ．）、および、Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｎ．Ｙ．（１９９４））に記載される技術を参照のこと。それらに記載される遺伝子構築物および方法を、本発明の抗体またはその対応する免疫グロブリン鎖を真核生物宿主または原核生物宿主において発現させるために利用することができる。一般には、挿入されたポリヌクレオチドの効率的な転写を容易にするプロモーター配列を含有する発現ベクターが、宿主との関係で使用される。発現ベクターは典型的には、複製起点、プロモーターおよびターミネーター、ならびに、形質転換された細胞の表現型選抜をもたらすことができる特異的な遺伝子を含有する。そのうえ、本発明の細胞を含む遺伝子組換え動物（好ましくは、遺伝子組換え哺乳動物）が、本発明の抗体の大規模産生のために使用される場合がある。
【００４０】
本発明はまた、腫瘍細胞の細胞質および／または細胞表面におけるＬＯＸＬ４のエピトープに結合する抗体あるいはその機能的断片または免疫グロブリン鎖を調製するための方法であって、（ａ）上で記載される細胞を培養すること、および、（ｂ）前記抗体あるいはその機能的断片または免疫グロブリン鎖を培養物から単離することを含む方法を提供する。発現系は好ましくは、シグナルペプチドを含み、その結果、生じた抗体が培地中に分泌されるように設計される；しかしながら、細胞内産生もまた可能である。形質転換された宿主は発酵槽において成長させられ、そして、最適な細胞成長を達成するためにこの技術分野において知られている技術に従って培養されることが可能である。発現させられると、本発明の完全な抗体、その二量体、個々の軽鎖および重鎖または他の免疫グロブリン形態を、当該技術の標準的な手順に従って精製することができる。その場合、本発明の抗体またはその対応する免疫グロブリン鎖を、成長培地、細胞溶解物または細胞膜画分から単離することができる。例えば、微生物により発現された本発明の抗体または免疫グロブリン鎖の単離および精製は、どのような手段であれ、従来の手段によって、例えば、調製的クロマトグラフィー分離および免疫学的分離（例えば、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の使用、例えば、本発明の抗体の定常領域に対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の使用を伴う分離など）によって行われる場合がある。本発明の抗体はさらに、他の部分、例えば、薬物標的化適用および画像化適用のための他の部分にカップリングされ得ることが、当業者には明らかであろう。そのようなカップリングが、抗体または抗原の発現の後、結合部位に対して化学的に行われる場合があり、あるいは、カップリング産物がＤＮＡレベルで本発明の抗体または抗原の中に操作される場合がある。ＤＮＡはその後、好適な宿主系において発現させられ、発現したタンパク質が回収され、そして、必要ならば、再生される。少なくとも約９０％〜９５％の均一性の実質的に純粋な免疫グロブリンが医薬的使用のためには好ましく、９８％〜９９％またはそれ以上の均一性のものが最も好ましい。所望に応じて部分的または均一にまで、精製されると、抗体はその後、（体外的を含めて）治療的に使用される場合があり、または、アッセイ手法の開発および実施において使用される場合がある。
【００４１】
本発明はまた、本発明の抗体またはその対応する免疫グロブリン鎖を発現することができる細胞を作製するための方法であって、細胞を本発明のポリヌクレオチドまたはベクターにより遺伝子操作することを含む方法を含む。本発明の方法によって得ることができる細胞は、例えば、本発明の抗体とその抗原との相互作用を試験するために使用することができる。
【００４２】
前述のように、免疫グロブリンまたはそのコードｃＤＮＡはさらに改変される場合がある。したがって、さらなる実施形態において、本発明の方法は、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、二重特異性抗体、融合抗体、標識化抗体、または、それらのいずれか１つのアナログを作製する工程のいずれか１つを含む。対応する様々な方法が当業者には知られている。本発明に従って利用されるための抗体のさらなる供給源が、いわゆる異種抗体である。上記で議論されたように、本発明の抗体は、例えば、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２を含めて、完全な抗体のほかに様々な形態で、ならびに、単鎖で存在する場合がある。
【００４３】
本発明の様々な抗体またはそれらの対応する免疫グロブリン鎖はさらに、この技術分野において知られている様々な従来の技術を使用して改変することができ、例えば、この技術分野において知られているアミノ酸欠失、アミノ酸挿入、アミノ酸置換、アミノ酸付加および／または組換えならびに／あるいはいずれかの他の改変を単独または組合せでのどちらでも使用することによって改変することができる。本発明の抗体の修飾には、アセチル化、ヒドロキシル化、メチル化、アミド化、および、炭水化物部分または脂質部分および補因子などの連結を含む側鎖修飾、骨格修飾、ならびに、Ｎ末端修飾およびＣ末端修飾を含めて、１つまたは複数の構成アミノ酸における化学的および／または酵素的な誘導体化が含まれる。同様に、本発明は、記載された抗体またはその何らかの断片を異種分子（例えば、カルボキシル末端での免疫刺激リガンドなど）に融合されてアミノ末端において含むキメラなタンパク質の製造を包含する。
【００４４】
加えて、本発明は、上で記載されるようなＬＯＸＬ４結合断片を含有するポリペプチド、例えば、述べられたモノクローナル抗体の可変領域のＣＤＲ３領域を含有するポリペプチドを含めて、様々な小さいポリペプチドを包含する。そのようなペプチドが、本発明に従って有用であるＬＯＸＬ４結合性剤を製造するために組換え手段によって容易に合成され、または製造される場合がある。様々なそのような方法が当業者にはよく知られている。ペプチドＬＯＸＬ４結合性剤を合成する際に使用されるためのＣＤＲ領域の配列が、この技術分野において知られている様々な方法によって決定される場合がある。重鎖可変領域は、長さが一般には１００アミノ酸から１５０アミノ酸にまで及ぶペプチドである。軽鎖可変領域は、長さが一般には８０アミノ酸から１３０アミノ酸にまで及ぶペプチドである。ほんのおよそ３個〜２５個のアミノ酸を含む重鎖可変領域内および軽鎖可変領域内のＣＤＲ配列が当業者によって容易に配列決定される場合がある。ペプチドがＬＯＸＬ４に結合するかどうかを明らかにするために、どのような結合アッセイであれ、知られている結合アッセイが用いられる場合がある。
【００４５】
ＬＯＸＬ４結合性剤のスクリーニングはまた、競合アッセイを利用して行うことができる。試験されているＬＯＸＬ４結合性剤により、本発明の抗ＬＯＸＬ４モノクローナル抗体との競合が、当該モノクローナル抗体の結合における低下によって示されるようにもたらされるならば、当該剤と、当該抗ＬＯＸＬ４モノクローナル抗体とは、同じエピトープまたは近縁関係のエピトープに結合する可能性がある。剤が、上記で記載される抗ＬＯＸＬ４モノクローナル抗体の特異性を有するかどうかを明らかにするためのさらに別の方法が、このモノクローナル抗体を、通常の場合には当該モノクローナル抗体が反応性を有する（すなわち、結合する）ＬＯＸＬ４とプレインキュベーションし、その後、試験されている剤を加えて、この試験されている剤がＬＯＸＬ４との結合能において阻害されるかどうかを明らかにすることである。試験されている剤が阻害されるならば、この剤はおそらく、抗ＬＯＸＬ４モノクローナル抗体と同じまたは機能的に等価なエピトープおよび特異性を有する。
【００４６】
上で記載されるポリペプチド（例えば、抗体）および他のＬＯＸＬ４結合性剤はまた、ヒトにおける障害のために免疫療法的に使用することができる。用語「免疫療法的に」または用語「免疫療法」は、ＬＯＸＬ４結合性剤と併せて本明細書中で使用される場合、予防的投与、ならびに、治療的投与の両方を示す。したがって、ペプチドを、疾患（例えば、悪性腫瘍など）の可能性および／または重篤度を小さくするために高リスクの対象に投与することができ、あるいは、そのような疾患に既に罹患している対象に投与することができる。
【００４７】
したがって、本発明は、モノクローナル抗体ＬＯＸＬ４−Ｐと実質的に同じ免疫学的結合特徴を好ましくは有する、すなわち、本明細書中に例示される本発明の抗体と同じエピトープをこれと実質的に同じ親和性により、または、当該親和性の少なくとも１／１０により認識するどのような抗体および類似する結合性分子にも関連する。そのような抗体および結合性分子は、それらの結合特異性および結合親和性について、例えば、本発明のハイブリドーマによって産生される抗体を用いる競合的アッセイを使用することによって試験することができる。本発明の抗体は典型的には、モノクローナル抗体に基づく治療に対する感受性を有する実質的にどのような疾患であっても処置することにおいて個々に使用されるであろう。
【００４８】
上で記載されるように、本発明のポリヌクレオチドは、本発明の（ポリ）ペプチドを細胞において発現させるために単独で、またはベクターの一部として使用することができる。原理的には、このことはまた、ＬＯＸＬ４の不適切な発現に関連づけられる疾患の遺伝子治療を可能にする。
【００４９】
膜のＬＯＸＬ４は他の細胞表面分子と相互作用する場合があり、したがって、これらの相互作用を調整する剤は、これらのタンパク質のどちらかが関与する疾患および状態の処置に対する有益な相加効果および好ましくは相乗効果を有するであろうと想定することは妥当なことである。そのうえ、そのような剤は、前記タンパク質のどちらかの存在または非存在が前記疾患または状態に関連する診断において有用であることが予想される。したがって、本発明はまた、ＬＯＸＬ４と結合する、本発明による抗体、その免疫グロブリン鎖またはその結合性断片の結合ドメインと、少なくとも１つのさらなる機能的ドメインとを含む新規な二機能性分子または多機能性分子を提供する；上記もまた参照のこと。好ましい実施形態において、前記二機能性分子または多機能性分子は二重特異性分子であり、特に好ましいものが二重特異性抗体である。
【００５０】
用語「二重特異性分子」には、物理的手段または化学的手段によって直接的または間接的に連結される２つの言及された結合ドメインを少なくとも有する分子が含まれる。しかしながら、本発明の二重特異性分子は、さらなる機能的ドメインを含む場合があり、例えば、さらなる結合ドメインおよび／または部分など、例えば、細胞傷害剤または標識などを含む場合がある。好ましい実施形態において、本発明の二重特異性分子は二重特異性抗体である。二重特異性抗体は、Ｆｃ定常領域を、例えば、結合ドメインを含むポリペプチド鎖の会合のために含む場合がある。ポリペプチド鎖の会合に備えることに加えて、Ｆｃ定常ドメインは他の免疫グロブリン機能に寄与する。そのような機能には、補体媒介細胞傷害の活性化、抗体依存性細胞媒介細胞傷害の活性化およびＦｃ受容体結合が含まれる。本発明の抗原結合タンパク質が処置目的または診断目的のために投与されるとき、Ｆｃ定常ドメインはまた、血清半減期に寄与することができる。Ｆｃ定常ドメインは、どのような哺乳動物種または鳥類種からであっても由来することができる。本発明の抗原結合タンパク質がヒトの処置のために使用されるとき、ヒト起源の定常ドメインが好ましいが、可変ドメインは非ヒトであることが可能である。ヒトの可変ドメインが好ましい場合、キメラなｓｃＦｖを使用することができる。
【００５１】
さらに、本発明は、本発明の抗体、二機能性分子または多機能性分子、ポリヌクレオチド、あるいは、上記のベクターまたは細胞を含む組成物に関連する。本発明の組成物はさらに、薬学的に許容され得る担体を含む場合がある。加えて、主剤分子の溶解性、半減期、吸収などを改善する様々な部分が添加される場合がある。代替において、これらの部分は主剤分子の望ましくない副作用を弱める場合があり、または、主剤分子の毒性を低下させる場合がある。好適な医薬用担体の様々な例がこの技術分野ではよく知られており、これらには、リン酸塩緩衝化生理的食塩水溶液、水、エマルション（例えば、油／水エマルションなど）、様々なタイプの湿潤化剤、無菌溶液などが含まれる。そのような担体を含む組成物を、よく知られている従来の方法によって配合することができる。これらの医薬組成物は好適な用量で対象に投与することができる。好適な組成物の投与が、種々の方法によって、例えば、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投与、局所的投与または皮内投与によって行われる場合がある。エアロゾル配合物、例えば、鼻腔噴霧配合物などは、活性な薬剤の精製された水性溶液または他の溶液を保存剤および等張剤とともに含む。そのような配合物は好ましくは、鼻腔粘膜と適合し得るｐＨおよび等張性状態に調節される。
【００５２】
投薬計画が主治医および様々な臨床上の要因によって決定されるであろう。医療技術分野ではよく知られているように、どのような患者であれ、一人の患者のための投薬量が、患者の大きさ、体表面積、年齢、投与されるべき具体的な化合物、性別、投与時間および投与経路、全身の健康状態、ならびに、同時に投与されている他の薬物を含めて、多くの要因に依存する。典型的な用量が、例えば、体重１キログラムあたり０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲で可能である；しかしながら、この例示的な範囲よりも少ない用量または大きい用量が、とりわけ上述の要因を考慮して想定される。投薬量は変化するであろうが、ＤＮＡの静脈内投与のための好ましい投薬量が、当該ＤＮＡ分子のおよそ１０６コピー〜１０１２コピーである。本発明の組成物は局所的または全身的に投与される場合がある。投与は一般には非経口であろう（例えば、静脈内）；ＤＮＡはまた、例えば、体内または体外の標的部位へのバイオリスティック送達によって、あるいは、動脈内における部位へのカテーテルによって標的部位に直接に投与される場合がある。非経口投与のための調製物には、無菌の水性または非水性の溶液、懸濁物およびエマルションが含まれる。非水性溶媒の例として、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油など）、および、注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチルなど）が挙げられる。水性の担体には、生理的食塩水および緩衝化媒体を含めて、水、アルコール性／水性の溶液、エマルションまたは懸濁物が含まれる。非経口用ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルブドウ糖、ブドウ糖および塩化ナトリウム、乳酸加リンゲルまたは固定油が含まれる。
【００５３】
静脈内ビヒクルには、補充液および栄養補充液、ならびに、電解質補充液（例えば、リンゲルブドウ糖に基づくものなど）などが含まれる。保存剤および他の添加剤もまた存在する場合がある（例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤および不活性ガスなど）。そのうえ、本発明の医薬組成物は、医薬組成物の意図された使用に依存して、さらなる薬剤を含む場合がある。そのうえ、医薬組成物はまた、例えば、本発明の医薬組成物が受動免疫化のために上記で記載される二重特異性を含むならば、ワクチンとして配合される場合がある。
【００５４】
本発明の治療用または診断用の組成物は、上述のような障害を処置するために、または診断するために十分である治療効果的な用量で個体に投与される。効果的な量は、様々な要因に従って、例えば、個体の状態、体重、性別および年齢などに従って変化する場合がある。他の要因には、投与様式が含まれる。医薬組成物が、様々な経路によって、例えば、冠動脈内経路、腹腔内経路、皮下経路、静脈内経路、経皮経路、滑液嚢内経路、筋肉内経路または経口経路などによって個体に与えられる場合がある。加えて、他の薬剤の共投与または逐次投与が望ましい場合がある。治療効果的な用量は、症状または状態を改善するために十分である本発明の活性な分子のそのような量を指す。そのような化合物の治療効力および毒性を細胞培養または実験動物における標準的な薬学手順によって求めることができ、例えば、ＥＤ５０（集団の５０％において治療効果的な用量）およびＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）によって求めることができる。治療効果と毒性影響との間における用量比が治療指数であり、これはＬＤ５０／ＥＤ５０の比率として表すことができる。
【００５５】
本発明の医薬組成物はさらに、免疫刺激剤を好ましい実施形態において含む。様々な免疫刺激剤が、免疫反応を高めるために、あるいは、液性または細胞傷害性の防御反応を正常な状態のもとでは誘発させないエピトープに対する免疫反応を誘導するために使用される。そのような薬剤がこの技術分野ではよく知られており、そのような薬剤を広範囲の様々な分子（例えば、共刺激性分子など）から、例えば、サイトカインおよび／またはアジュバントから選ぶことができる。「アジュバント」は、例えば、抗原の免疫刺激特性あるいは化合物または薬物の薬理学的効果（これらに限定されない）を含めて、免疫応答を高める物質を指す。アジュバントにより、免疫応答、例えば、抗原に対する免疫応答が非特異的に高められる場合がある。例えば、「フロイント完全アジュバント」は、免疫原、乳化用薬剤およびマイコバクテリアを含有する、オイルおよび水のエマルションである。アジュバントは、オイル、乳化剤、死滅細菌、水酸化アルミニウムまたはリン酸カルシウム（例えば、ゲル形態でのもの）、あるいはそれらの組合せを含む場合がある。アジュバントは、抗体を産生させために十分な量で対象に（例えば、注入により筋肉内または皮下に）投与される場合がある。
【００５６】
本願はまた、本発明による抗体、二機能性分子もしくは多機能性分子、ポリヌクレオチド、ベクターまたは細胞と、必要な場合には免疫または核酸に基づく診断方法において従来から使用される試薬とを含む診断用組成物を開示する。診断における使用のために、様々な技術が、生体分子を標識するために利用可能であり、多くの異なる標識、標識方法および検出方法が当業者にはよく知られている。加えて、上記化合物などは固相に結合させられる場合がある。本発明の二重特異性分子を固相に固定化する好適な方法には、イオン性相互作用、疎水性相互作用および共有結合相互作用などが含まれるが、これらに限定されない。
【００５７】
本願はまた、本発明の抗体または二重特異性分子を含むキットを開示する。そのようなキットは、上記の疾患および障害に一致する法医学的分析、診断適用および疫学研究（これらに限定されない）を含めて、様々な目的のために有用である。そのようなキットは典型的には、少なくとも１つの容器でしっかりと閉じ込めて保持するために好適である区画化された運搬手段を含むであろう。この運搬手段はさらに、検出用の試薬（例えば、標識された抗原または酵素基質など）を含むであろう。
【００５８】
当然のことながら、本発明はまた、腫瘍を診断する方法であって、患者から得られるサンプルにおける細胞を、本発明による抗体または二機能性分子もしくは多機能性分子を用いてアッセイし、ＬＯＸＬ４の存在または増大した量が当該腫瘍の指標となる方法を包含する。この方法は好ましくは、免疫学的工程を含む。抗体および／または二機能性分子もしくは多機能性分子を用いる一般に使用されている診断方法として、例えば、凍結またはパラフィン包埋された組織切片での免疫組織化学、ウエスタンブロット、免疫沈降などが挙げられる。必要な場合には、検出が容易なシグナルを生じさせる薬剤を、前記抗体または二機能性分子もしくは多機能性分子と併せて使用することができる。様々な検出可能シグナル生成薬剤が診断目的のためにインビボおよびインビトロにおいて有用である。シグナル生成薬剤は、外部の手段によって検出可能である測定可能なシグナルをもたらし、通常の場合には電磁放射線の測定によって検出可能である測定可能なシグナルをもたらす。大抵の場合、シグナル生成薬剤は酵素または発色団であり、あるいは、蛍光、りん光または化学発光によって光を放射する。
【００５９】
前記のように、本発明の組成物は、診断、予防、ワクチン接種または治療において有用である。したがって、本発明は、本発明の抗体、二機能性分子もしくは多機能性分子、核酸分子または細胞の使用であって、腫瘍を処置するための医薬組成物を調製するための使用に関連する。これらの実施形態のために、本発明の抗体または二機能性分子もしくは多機能性分子は化学的または生合成的に、抗腫瘍剤または検出可能シグナル生成薬剤に連結することができる。二重特異性分子（例えば、二重特異性抗体）に連結される抗腫瘍剤には、抗体が結合した腫瘍、または、抗体が結合した細胞の環境における腫瘍を破壊し、あるいは、そのような腫瘍に損傷を与えるどのような薬剤も含まれる。例えば、抗腫瘍剤は毒性薬剤であり、例えば、化学療法剤または放射性同位体などである。腫瘍をその必要性のある対象において処置する方法は通常、治療効果的な量の抗体または二機能性分子もしくは多機能性分子を当該対象に投与することを含む。上述のように、治療効果的な用量は、症状または状態を改善するために十分である本発明の活性な分子のそのような量を指す。そのような化合物の治療効率および毒性を細胞培養または実験動物における標準的な薬学手順によって求めることができる。本発明の目的のために、前記医薬組成物は好ましくは、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内に投与されるために、またはエアロゾルとして投与されるために設計される。
【００６０】
好ましくは、処置または診断されるべき腫瘍が、頭部、頸部、喉頭、食道、胃、肺、肝臓、結腸、直腸、膵臓、乳房、卵巣、子宮、子宮頸部、外陰部、陰茎、膀胱または腎臓のガン腫、および転移性細胞一般からなる群から選択される。
【００６１】
用語「処置」および用語「処置する」などは、所望される薬理学的および／または生理学的な効果を得ることを一般には意味するために本明細書中では使用される。効果は、疾患またはその症状を完全または部分的に防止するという点では予防的である場合があり、ならびに／あるいは、疾患および／または当該疾患に起因すると考えられる有害影響を部分的または完全に治すという点では治療的である場合がある。本明細書中で使用される場合、用語「処置」は哺乳動物（特に、ヒト）における疾患のどのような処置であっても包含し、これには、（ａ）当該疾患に対する素因を有するかもしれないが、当該疾患を有するとは未だ診断されていない対象において当該疾患が生じることを防止すること；（ｂ）当該疾患を抑制すること、すなわち、その発達を停止させること；または（ｃ）当該疾患を緩和すること、すなわち、当該疾患の退行を生じさせることが含まれる。
【００６２】
さらに、用語「対象」は、本明細書中で用いられる場合、新生物疾患または感染性疾患の緩和、処置および／または防止を必要としている動物に関する。最も好ましくは、前記対象はヒトである。
【００６３】
疾患に関連した細胞の表面におけるＬＯＸＬ４の発現のために、本発明は、正常な細胞を避けながら、これらの細胞に対する標的化された送達のための手段を提供する。このことは、毒性部分が治療分子に連結されるならば、特に好都合である。ＬＯＸＬ４のエピトープを細胞表面に発現する細胞に対して治療剤および／または診断剤を標的化するそのような方法は、治療効果的な量の本発明の二機能性分子または多機能性分子を対象に投与することを含む。ＬＯＸＬ４のエピトープを細胞表面に発現する細胞に対して治療剤および／または診断剤を標的化するための二機能性分子または多機能性分子の使用は、当然のことではあるが、本発明の好ましい実施形態である。前記標的化された細胞は好ましくは、腫瘍細胞であり得る。
【００６４】
前記から、本発明は、上記抗体の少なくとも１つのＣＤＲを含むリガンド結合分子のどのような使用であっても包含すること、具体的には、標的細胞（具体的には腫瘍細胞）の細胞質および／または細胞表面におけるＬＯＸ４の発現または機能不全に関連づけられる障害の診断および／または処置のためのそのどのような使用であっても包含することが明白である。好ましくは、前記リガンド結合分子は本発明の抗体またはその免疫グロブリン鎖である。
【００６５】
加えて、本発明は、本明細書中前に記載される述べられたモノクローナル抗体の様々な抗イディオタイプ抗体に関連する。これらは、抗原結合部位の近くにおいて抗体の可変領域に位置する特有の抗原性ペプチド配列に結合する抗体または他の結合性分子である。ガンの免疫療法のための１つの概念では、腫瘍細胞に対して応答するように免疫系を誘発するために抗原模倣抗体を誘導することが伴う。他の抗体（Ａｂ１）の抗原結合部位に向けられる抗イディオタイプ抗体（Ａｂ２）により、抗原が機能的に、かつ、構造的にさえ模倣され、抗イディオタイプ免疫応答が誘導される場合がある。好ましくは、抗イディオタイプ抗体はヒト化される。
【００６６】
本明細書において特定される様々な抗体の生物学的活性により、これらの抗体が、適切な表面構造を発現する細胞への薬物局在化のための潜在的な候補物となるための十分な親和性を有することが示唆される。細胞に対するこの標的化および結合は、（標的化のための薬物、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、脂質、タンパク質（例えば、ヒト成長因子）を含めて）治療的または診断的に活性な薬剤の送達、および遺伝子治療／遺伝子送達のために有用であり得るかもしれない。本発明の抗体を伴う分子／粒子は、ＬＯＸＬ４を発現する細胞／組織に対して特異的に結合すると考えられ、したがって、診断および治療において有用であり得るかもしれない。したがって、本発明の抗体または抗原は、インビトロでの「免疫化学」様アッセイを含めて、インビボまたはインビトロにおいて特異的標的を検出するために標識し（例えば、蛍光、放射性、酵素、核磁気）、使用することができる。インビボにおいて、本発明の抗体または抗原は、ＬＯＸＬ４を特に標的細胞の細胞表面に発現する組織、細胞または他の材料を検出するために、核医学画像化技術と類似する様式で使用され得るかもしれない。別の方法では、治療活性な薬剤を患者に送達することが伴う。この方法は、少なくとも１つの抗体または抗原結合断片と、治療活性な薬剤とを患者に投与することを含む。好ましくは、治療活性な薬剤が、薬物、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、タンパク質、脂質およびそれらの組合せから選択される。より好ましくは、治療活性な薬剤は、抗菌剤、抗炎症剤または抗新生物剤である。治療的または診断的に活性な薬剤は様々な手段によって本発明の抗体またはその抗原結合断片にカップリングすることができる。
【００６７】
従来の抗体を含む免疫毒素である様々なコンジュゲートがこの技術分野において幅広く記載されている。様々な毒素が従来からのカップリング技術によって抗体にカップリングされる場合があり、または、タンパク質毒素部分を含有する免疫毒素を融合タンパク質として作製することができる。本発明の抗体は、そのような免疫毒素を得るための対応する方法で使用することができる。
【００６８】
本発明ではさらに、本発明の分子を標的部分またはレポーター部分に連結することが意図される。標的部分は、結合対の第１の構成部分である。例えば、抗腫瘍剤がそのような対の第２の構成部分にコンジュゲート化され、それにより、抗原結合タンパク質が結合する部位に向けられる。
【００６９】
前述のようなさらなる実施形態によって、本発明のリガンド結合分子および抗体はまた、血液サンプル、リンパサンプルまたはどのような他の体液サンプルであってもよい体液サンプルを検査された個体から得ること、および、この体液サンプルを、抗体−抗原複合体の形成を可能にする条件のもとで本発明の抗体と接触させることによってＬＯＸＬ４関連疾患を個体において診断するための方法において使用される場合がある。同様に、腫瘍診断において一般的である生検試料または他の試料が採取される場合がある。そのような複合体のレベルがその後、この技術分野で知られている方法によって求められ、コントロールサンプルにおいて形成されるレベルよりも有意に大きいレベルにより、疾患が、検査された個体において示される。同じ様式で、本発明の抗体が結合する特異的抗原もまた使用される場合がある。したがって、本発明は、本発明の抗体または抗原を含むインビトロ免疫アッセイに関連する。
【００７０】
別途言及されない限り、本明細書中で使用されるような用語および実施形態には、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９７年、２０００年改訂および２００３年再版、ＩＳＢＮ  ０ １９ ８５０６７３ ２）において提供されるような定義が与えられる。これらの実施形態および他の実施形態が本発明の説明および実施例によって開示され、包含される。
【００７１】
上記開示では、本発明が一般的に記載される。より完全な理解を、下記の具体的な実施例を参照することによって得ることができる。
【実施例】
【００７２】
下記の実施例は、本発明を例示するために意図され、その範囲を限定することは意図されない。
【００７３】
実施例１：ＬＯＸＬ４に対して特異的なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の確立
Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｓｕｌｚｆｅｌｄ、ドイツ）から得られる３匹の７週齢のメスＢａｌｂ／ｃマウスを、２０μｇのキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）コンジュゲート化ＬＯＸＬ４特異的ペプチド抗原により免疫化した（このＬＯＸＬ４特異的ペプチド抗原はＬＯＸＬ４の４つのＮ末端側のスカベンジャー受容体システインリッチ（ＳＲＣＲ）ドメイン（Ｍａｋｉ、２００１）の２番目の内部に位置する）。マウスは、５μｇの抗原を用いたｓ．ｃ．注入による４回の追加免疫を１０日間隔で受けた。細胞融合に先立って、３μｇの抗原の３日連続した抗原刺激を腹腔内注入によって行った。ＬＯＸＬ４ペプチド特異的な免疫応答をＥＬＩＳＡによって免疫化手順の期間中にモニターした。ＬＯＸＬ４特異的なｍＡｂを産生するマウスの脾臓細胞を、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）によるプロトコルに従ってＡｇ８  ６５３細胞と融合した。融合後約３週間で、成長しているクローンの上清をＥＬＩＳＡによってＬＯＸＬ４抗原特異的な抗体応答について試験した。陽性クローンをＬＯＸＬ４発現のＨＮＳＣＣ細胞およびＨＮＳＣＣ組織に対して試験した。治療研究のために、ＬＯＸＬ４−Ｐを、ＢｉｏＬｏｇｉｃ  Ｄｕｏ  Ｆｌｏｗ  ＦＰＬクロマトグラフィーシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ドイツ）を使用して、固定化ＨｉＴｒａｐプロテインＧ  ＨＰカラムによってハイブリドーマ細胞培養物の上清から精製した。精製されたｍＡｂを凍結乾燥し、ＰＢＳに溶解し、タンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ、１９７６）によって求めた。
【００７４】
実施例２：ＬＯＸＬ４−Ｐに対するＨＮＳＣＣ細胞感受性
ヒト細胞株
インビトロ実験のために、局在性が異なるヒトＨＮＳＣＣに由来する細胞株を使用した：食道（ＵＫＨＮ−２）、舌（ＵＫＨＮ−３、ＵＫＨＮ−７、ＵＴＳＣＣ−２４およびＵＰＣＩ−ＳＣＣ−１５４）、扁桃（ＵＫＨＮ−６、ＵＫＨＮ−８、ＵＫＨＮ−９およびＵＭＳＣＣ−８１Ｂ）、口（ＵＴＳＣＣ−４５）、喉頭（ＵＭＳＣＣ−１０Ｂ、ＵＭＳＣＣ−２４、ＵＴＳＣＣ−９、ＵＴＳＣＣ−１９ＡおよびＵＴＳＣＣ−２３）、咽頭（ＨＴＢ−４３）および下咽頭（ＵＤ−２）。すべての細胞株の遺伝子型決定を単一縦列反復（ｓｉｎｇｌｅ  ｔａｎｄｅｍ  ｒｅｐｅａｔ）ＤＮＡ型決定によって行った。咽頭および喉頭の正常な粘膜に由来する５つの初代のヒト上皮細胞培養物および線維芽細胞培養物はコントロールとして役立った。分析に先立って、全ての細胞株がマイコプラズマについて陰性と分析された。正常な粘膜の生検物を、ヘルシンキ宣言（１９８３年改定）に従うシュレースビッヒ・ホルスタイン州大学病院（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｓｃｈｌｅｓｗｉｇ−Ｈｏｌｓｔｅｉｎ）（Ｃａｍｐｕｓ  Ｋｉｅｌ）の倫理委員会（番号ＡＺ  Ｄ４３８／１０）に従って、書面による患者の同意が得られた後で手術中に採取した。ガン腫細胞を、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、Ｂｅｒｌｉｎ、ドイツ）を伴う最少必須培地において、５％ＣＯ２の加湿雰囲気で３７℃において成長させた。正常な上皮細胞を、同じ条件のもと、ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｇｇｅｎｓｔｅｉｎ、ドイツ）において成長させた。
【００７５】
細胞傷害性アッセイ
細胞死および細胞溶解の定量化は、非放射性ＬＤＨ検出キット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ドイツ）を使用する、損傷細胞の細胞質ゾルから上清に放出されるＬＤＨの測定に基づいた。単層にまで成長させたＨＮＳＣＣ細胞、正常な上皮細胞および正常な線維芽細胞を、１５μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌおよび４５μｇ／ｍｌのＬＯＸＬ４−Ｐの存在下、または、ＬＯＸＬ４−Ｐの非存在下で４８時間インキュベーションした。２５０ｘｇでの１０分間の遠心分離の後、細胞を含まない培養上清をＬＯＸＬ４−Ｐ処理細胞およびコントロール細胞から集め、製造者の説明書に従ってインキュベーションした。パーセント細胞傷害性を計算するために、適切なコントロールを製造者の説明書に従ってそれぞれの実験において測定した。吸光度を、９６ウエルプレートＥＬＩＳＡリーダー（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  ＭＲ５０００、Ｄｅｎｋｅｎｄｏｒｆ、ドイツ）を使用して４９２ｎｍおよび６２０ｎｍで測定した。
【００７６】
クローン形成アッセイ
０日目に、ＨＮＳＣＣ細胞、正常な上皮細胞および正常な線維芽細胞を６ウエルプレートに二連で置床した。１週間後、細胞がコンフルエンシーに達した後、細胞を、４８時間、７２時間および９６時間、様々なＬＯＸＬ４Ｐ濃度（１５μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、４５μｇ／ｍｌ）でインキュベーションした。その後、細胞をＰＢＳにより洗浄し、エタノール中で固定処理し、クリスタルバイオレット（２０％エタノールにおける０．１％クリスタルバイオレット）により染色した。染色された細胞を、１０個の無作為に選ばれた中倍率（×２００）視野の顕微鏡計数による測定に供した。ＬＤ５０値を計算し、平均＋／−標準偏差（ＳＤ）として表した。
【００７７】
ＦＰＬＣ精製されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＬＯＸＬ４−ＰをＬＯＸＬ４抗原特異的な抗体応答について試験し、また、ＬＯＸＬ４発現のＨＮＳＣＣ細胞およびＨＮＳＣＣ組織に対して試験した（図１）。ＬＯＸＬ４−Ｐの細胞傷害効果を解明するために、解剖学部位が異なる頭頸部腫瘍に起源を有するいくつかのＨＮＳＣＣ細胞株を、正常な上皮細胞および線維芽細胞との比較で分析した（表２）。１７個の腫瘍標的細胞株のうち、１３個（７６％）がＬＯＸＬ４−Ｐに対して非常に感受性であった。メジアン致死量（ＬＤ５０）が４８時間の期間にわたって、１５μｇ／ｍｌの濃度で達成され（ＵＫＨＮ−３、ＵＫＨＮ−６、ＵＫＨＮ−９、ＵＭＳＣＣ−８１Ｂ、ＵＴＳＣＣ−１９Ａ）、３０μｇ／ｍｌの濃度で達成され（ＨＴＢ−４３、ＵＫＨＮ−２、ＵＫＨＮ−７、ＵＴＳＣＣ−９、ＵＴＳＣＣ−２４）、４５μｇ／ｍｌの濃度で達成された（ＵＤＳＣＣ−２、ＵＭＳＣＣ−２４、ＵＰＣＩ−ＳＣＣ−１５４）。残る４個のガン腫細胞株（ＵＨＫＮ−８、ＵＭＳＣＣ−１０Ｂ、ＵＴＳＣＣ−２３、ＵＴＳＣＣ−４５）は、同じ実験条件のもとでは、ＬＯＸＬ４−Ｐに対して感受性でないことが判明し、または、無視できるほど（２０％未満）の細胞傷害性を示した。このことは、ＬＯＸＬ４−Ｐに対する感受性に関するＨＮＳＣＣ細胞株間の違いを示している。これらのＬＤ５０値に基づいて、正常な上皮細胞および線維芽細胞は、ほとんどのＨＮＳＣＣ細胞よりもＬＯＸＬ−Ｐに対してより抵抗性であった。４５μｇ／ｍｌのＬＯＸＬ４−Ｐの濃度がＨＮＳＣＣ細胞株において最大細胞傷害性のために十分であり、これに対して、正常な上皮細胞および線維芽細胞はこのＬＯＸＬ４−Ｐ濃度に対する応答を何ら示さなかった。しかしながら、５０μｇ／ｍｌよりも大きい濃度は、正常な細胞株の増殖に対する阻害的な影響を有した（データは示されず）。興味深いことに、腫瘍細胞に対するＬＯＸＬ４−Ｐの損傷効果が、図２に例示的に示されるようにＬＤＨ酵素の放出と相関した。異なるＬＯＸＬ４−Ｐ濃度の存在下におけるガン腫細胞の形態学的特徴が用量依存的様式で変化した。細胞損傷の典型的な証拠が、細胞のサイズ、形状および外観における構造的変化であった。ガン腫細胞の完全な破壊が、細胞の崩壊および培養表面からの剥離によって示された。
【００７８】
表２．ＨＮＳＣＣ細胞および正常な細胞に対するＬＯＸＬ４−Ｐの影響
【表２】
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＊Ｐ（原発性）、Ｍ（転移性）。＊＊細胞傷害効果をＬＤ５０値（ｉ．ｖ．）として特定した。＊＊＊正常な上皮細胞および線維芽細胞はコントロールとして役立った。これらの細胞は喉頭および咽頭の正常な粘膜に由来した（実施例もまた参照のこと）。
【００７９】
実施例３：固形腫瘍異種移植片に対するＬＯＸＬ４−Ｐの影響
動物実験
８週齢〜１０週齢のメスの重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）ｂｇ／ｂｇマウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｓｕｌｚｆｅｌｄ、ドイツ）から得た。治療応答研究のために、マウスを３つの実験群および１つのコントロール群に分けた。第１の群（ｎ＝１２）において、それぞれのマウスには、個別のＬＯＸＬ４−Ｐ感受性ＨＮＳＣＣ細胞培養物から得られる１００万個の腫瘍細胞が脇腹にｓ．ｃ．注入された。腫瘍細胞接種後１ヶ月において、腫瘍がおよそ０．５ｃｍのサイズに達したならば、それぞれのマウスが、ｉ．ｖ．注射（１５０μｌのＰＢＳに溶解される２００μｇのＬＯＸＬ４−Ｐ、これは１０ｍｇ／ｋｇに等しく、ｉ．ｖ．投与されるヒトにおけるセツキシマブの臨床的維持量とほぼ等価である）を３ヶ月半までの期間にわたって毎週受けた。第２の群に由来する動物（ｎ＝１２）には、腫瘍細胞が、ＬＯＸＬ４−Ｐによる処置を除いて第１の群における動物と同一の様式で投与され、動物は１５０μｌのＰＢＳのｉ．ｖ．注入のみを受けた。第３の群（ｎ＝１２）において、マウスは、（１５０μｌのＰＢＳに溶解される）２００μｇのＬＯＸＬ４−Ｐによるｉ．ｖ．前処置を受けた。前処置の後すぐに、マウスには、個別のＬＯＸＬ４−Ｐ感受性ＨＮＳＣＣ細胞培養物から得られる１００万個の腫瘍細胞が脇腹にｓ．ｃ．注入された。腫瘍サイズを週に２回、カリパスにより測定した。治療応答研究の後、残存腫瘍、ならびに、肝臓、腎臓および脾臓を組織病理学的に調べた。
【００８０】
コントロール群（ｎ＝５）において、マウスにはそれぞれ、１００万個の正常な上皮細胞が脇腹にｓ．ｃ．注入された。この群を、腫瘍成長が何ら生じないことを保証するために３０日の期間にわたって観察した。ＳＣＩＤマウスにおける実験はシュレースビッヒ・ホルスタイン州（ドイツ）の環境・自然・農業省によって承認された。
【００８１】
組織化学
組織化学的分析のために、異種移植片腫瘍をＬＯＸＬ４−Ｐ非処置マウスおよびＬＯＸＬ４−Ｐ処置マウスから切除した。腫瘍をホルマリン中で固定処理し、パラフィンに包埋した。脱パラフィン切片（５μｍ）をヘマトキシリンおよびエオシンにより染色した。
【００８２】
統計学的分析
データの統計学的分析を一元配置ＡＮＯＶＡ（ＳＰＳＳ  ｖｓ  ２０）によって行った。データは、ｐ＜０．０５であるならば、統計学的に有意であると見なした。
【００８３】
治療応答研究では、３群のマウスが含まれた。第１の群（ｎ＝１２）において、マウスはそれぞれが、個別のＬＯＸＬ４−Ｐ感受性ＨＮＳＣＣ細胞培養物から得られる腫瘍細胞のｓ．ｃ．投与を受けた。異種移植された腫瘍細胞は急速に成長し、１ヶ月以内に０．５ｃｍの腫瘍サイズに達した。腫瘍の巨視的外観および組織学的外観に関する代表的な観測結果が図３に示される。ＬＯＸＬ４−Ｐで処置されなかった腫瘍は扁平上皮ガンの典型的なパターンを示した。腫瘍細胞は、明瞭な内境界膜によって細胞表面から隔てられる小さい管腔を腫瘍細胞が取り囲む密に詰まった凝集物として現れた（図３Ｂおよび図３Ｃ）。治療研究のために、マウスは毎週、（１５０μｌのＰＢＳに溶解される）２００μｇ（１０ｍｇ／ｋｇ）のＬＯＸＬ４−Ｐのｉ．ｖ．注入を受けた。腫瘍サイズに依存して、治療は７０日〜１００日の内に、ＬＯＸＬ４−Ｐ処置の結果としての広範囲にわたる腫瘍破壊をもたらした（図３Ｄ〜図３Ｇ）。腫瘍の退行が腫瘍組織の段階的な破壊として生じた。腫瘍破壊についての重要な指標が、生存組織領域から明確に識別できる暗い領域によって示される壊死性斑の発達であった。壊死がＬＯＸＬ４−Ｐの投与頻度とともに進んだ。治療終了時には、完全に治癒しなかった密に痂皮で覆われた創傷部のみが残った。実験期間中および治療後２週間において、マウスは、実験手順に何ら供されていない健康な動物との比較で、何ら望ましくない行動パターン（例えば、頭部揺動（ｈｅａｄ  ｗｅａｖｉｎｇ）、運動の抑制および低下した登上活動など）を確実に示さないことが認められた。続いて、残存する痂皮化創傷部を組織学的検査のために切除した（図３Ｈおよび図３Ｉ）。肝臓および腎臓の組織学的検査もまた行ったが、病理学的な変化は何ら見出されなかった。
【００８４】
第２の群（ｎ＝１２）において、マウスには、第１の群に由来する動物と同一の様式で腫瘍細胞が投与され、しかしながら、マウスは１５０μｌのＰＢＳのｉ．ｖ．注入をＬＯＸＬ４−Ｐの代わりに受けた。予想されるように、すべてのこれらの動物において、腫瘍発達が生じ、ＰＢＳ投与のみによって緩和され得なかった。
【００８５】
腫瘍発達に対するＬＯＸＬ４−Ｐ前処置の影響を詳しく調べるために、マウス（ｎ＝１２）に、（１５０μｌのＰＢＳに溶解される）２００μｇのＬＯＸＬ４−Ｐをｉ．ｖ．注入した。前処置の後すぐに、マウスには、個別のＬＯＸＬ４−Ｐ感受性ＨＮＳＣＣ細胞培養物から得られる１００万個の腫瘍細胞が脇腹にｓ．ｃ．注入された。図４に示されるように、ＬＯＸＬ４−Ｐによる動物の前処置は、ＬＯＸＬ４−Ｐによる前処置を受けない動物とは対照的に、腫瘍発達をかなり遅らせた。
【００８６】
本発明のＬＯＸＬ４−ｍＡｂ、すなわち、ＬＯＸＬ４−Ｐが開発され、ＨＮＳＣＣ細胞および異種移植片における腫瘍標的化剤としてのその可能性が分析された。データからは、ＬＯＸＬ４−Ｐは、使用される腫瘍細胞株を標的とし、その７６％を殺すことができ、これに対して、正常な上皮細胞および線維芽細胞は、明らかな害を伴うことなく、同じ実験条件のもとでの抗体処置に耐え得ることが示される。このｍＡｂは、すべてのガン腫細胞株の成長および拡大を同じ程度に阻止しなかったこともまた、細胞治療実験から明白である。細胞株に依存して、ＬＤ５０値が１５μｇ／ｍｌ〜４５μｇ／ｍｌのＬＯＸＬ４−Ｐ濃度で達成された。このことから、ＨＮＳＣＣ細胞株は細胞株毎に、それらの細胞表面におけるＬＯＸＬ４抗原の量が異なるかもしれないことが示唆される。上述の細胞株において認められる異なる耐性機構の原因はまた、これらの細胞株が、治療剤に対して抵抗性である細胞を含有する元の腫瘍の一部に由来したという事実によって説明されるかもしれない。これらの細胞は、治療剤の存在下ではクローン増殖を開始し、それにより、Ｄｉａｚ他（２０１２）によって示唆されるように当該治療剤に対する耐性を生じさせているかもしれない。
【００８７】
予備的研究において、本発明者は、様々な頭頸部腫瘍から確立された一連の細胞株に関して実験を行い、いくつかのＨＮＳＣＣ細胞株はＨＮＳＣＣ注入動物において腫瘍を生じさせることができなかったことを認めた（未発表データ）。同様に、悪性のＨＮＳＣＣ組織から確立された他の細胞株は、免疫抑制マウスに投与されたときには腫瘍を形成することができない変種を含有することがしばしば報告されている（Ｒｕｐｎｉａｋ他、１９８５）。このことはもしかしたら、ＨＮＳＣＣ細胞の腫瘍形成効率が非常に足場依存的であり、かつ、ｒａｓガン遺伝子産物ｐ２１の発現と関連するという事実（Ｓａｃｋｓ他、１９８８）によって説明されるかもしれない。しかしながら、今回の研究において使用された１７個のＨＮＳＣＣ細胞株は、ｓ．ｃ．注入されたとき、腫瘍をＳＣＩＤマウスにおいて実際に生じさせることが示されている。
【００８８】
本発明のＬＯＸＬ４−ｍＡｂは、治療効力における著しい強化をインビトロだけでなく、インビボでもまた呈することが示された。マウスの異種移植片治療実験において示されるように、この抗体は単剤として、腫瘍を破壊することができる。試験された１２個のマウス異種移植片のうち、すべて（１００％）が応答性であると評価され、これに対して、腫瘍の退行がコントロール動物では生じなかった。腫瘍サイズに依存して、治療は、３ヶ月半までの期間、２００μｇ（１０ｍｇ／ｋｇ）のＬＯＸＬ４−Ｐの毎週の用量で継続されなければならなかった。この期間中に、腫瘍は徐々に壊死し、密集する閉鎖された完全に痂皮化した創傷部に変わった。ＬＯＸＬ４−Ｐのこの顕著な大きい奏効率は、この抗体の反応性の基礎となる潜在的機構をより深く研究することを強く求めるものである。比較において、ＥＧＦＲを標的とし、頭頸部ガンの処置のために承認された抗がん剤セツキシマブ（Ｒｉｖｅｒａ他、２００８）は、８個中５個（６３％）の異種移植片腫瘍の成長を抑制することが示された（Ｋｒｕｍｂａｃｈ他、２０１１）。細胞表面抗原としてのＥＧＦＲが頭頸部ガンにおいて強く過剰発現していることを仮定すると、セツキシマブの奏功率はかなり低い。このことはもしかしたら、ｒａｓファミリーメンバーの頭頸部ガン細胞における過剰発現に伴うセツキシマブに対する獲得された細胞耐性の結果であるかもしれない（Ｓａｋｉ他、２０１３）。
【００８９】
ＬＯＸＬ４−Ｐの影響をさらに調べるために、ＳＣＩＤマウスを最初に抗体で処置し、その後すぐにＨＮＳＣＣ細胞を接種した。ＬＯＸＬ４−Ｐによる事前の免疫化を受けるこれらのマウスの免疫抵抗性が、ＬＯＸＬ４−Ｐの前処置を受けないマウスとの比較における著しく遅れた腫瘍発達によって示されてかなり高まった。このことは、インビトロおよび異種移植片での治療実験と同様に、ＬＯＸＬ４−Ｐの抗腫瘍効果の立証を補強している。まとめると、ＨＮＳＣＣ細胞および異種移植片の治療的標的化のためのＬＯＸＬ４−Ｐの可能性が記載される。本発明のこれらの知見により、細胞外マトリックスの発達および維持に関与するＬＯＸＬ４抗原がＨＮＳＣＣのｍＡｂ治療のための好適な標的であるという強い証拠がもたらされる。
【００９０】
当業者は、本明細書中に記載される発明が、具体的に記載されるものとは異なる様々な変化および改変を許容し得ることを理解するであろう。本発明はすべてのそのような変化および改変を包含することを理解しなければならない。本発明はまた、個々に、またはまとめてであっても本明細書中において参照される、または示される工程、特徴、組成物および化合物のすべて、ならびに、前記工程または特徴のいずれか２つ以上のありとあらゆる組合せを包含する。
【００９１】
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【図１】
2017526369.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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2017526369.tif 000009
2017526369.tif 000010