(57)【要約】  化合物１が全３種の型のＴＲＫ、すなわちＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２、およびＮＴＲＫ３を含むＴＲＫキナーゼを予想外かつ強力に阻害することが示される。さらに、化合物１が融合タンパク質を含むＴＲＫキナーゼの発癌変異型を強力に阻害することが示される。例えば、化合物１は細胞アッセイにおいてＮＴＲＫ１発癌融合タンパク質ＴＰＭ３／ＮＴＲＫ１を強力に阻害する。化合物１はＴＰＭ３／ＮＴＲＫ１異種移植モデルにおいてインビボでＴＲＫキナーゼ媒介性の腫瘍増殖を阻害する。
2017532344.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−（４−（２−（シクロプロパンカルボキサミド）ピリジン−４−イルオキシ）−２，５−ジフルオロフェニル）−Ｎ’−（４−フルオロフェニル）シクロプロパン−１，１−ジカルボキサミドまたはその医薬的に許容される塩の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、ＴＲＫキナーゼ媒介性の腫瘍の増殖、生存、または疾患進行を阻害する方法。
【請求項２】
腫瘍の増殖、生存、または進行がＴＲＫキナーゼの過剰発現、ＴＲＫキナーゼの変異、またはＴＲＫキナーゼ融合タンパク質によって引き起こされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
腫瘍の増殖、生存、または進行がＮＴＲＫ１融合タンパク質によって引き起こされる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＮＴＲＫ１融合タンパク質がＭＰＲＩＰ−ＮＴＲＫ１、ＣＤ７４−ＮＴＲＫ１、ＲＦＷＤ２−ＮＴＲＫ１、ＳＱＳＴＭ１−ＮＴＲＫ１、ＴＰＭ３−ＮＴＲＫ１、ＴＦＧ−ＮＴＲＫ１、ＴＰＲ−ＮＴＲＫ１、ＲＡＢＧＡＰ１Ｌ−ＮＴＲＫ１  ＬＭＮＡ−ＮＴＲＫ１、ＴＰ５３−ＮＴＲＫ１、ＮＦＡＳＣ−ＮＴＲＫ１、およびＰＥＡＲ１−ＮＴＫＲ１から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
腫瘍の増殖、生存、または進行がＮＴＲＫ２融合タンパク質によって引き起こされる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＮＴＲＫ２融合タンパク質がＰＡＮ３−ＮＴＲＫ２、ＡＦＡＰ１−ＮＴＲＫ２、ＴＲＩＭ２４−ＮＴＲＫ２、ＱＫ１−ＮＴＲＫ２、ＮＡＣＣ２−ＮＴＲＫ２、ＶＣＬ−ＮＴＲＫ２、およびＡＧＢＬ４−ＮＴＲＫ２から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
腫瘍の増殖、生存、または進行がＮＴＲＫ３融合タンパク質によって引き起こされる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＮＴＲＫ３融合タンパク質がＥＴＶ６−ＮＴＲＫ３およびＢＴＢＤ１−ＮＴＲＫ３から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
腫瘍の増殖、生存、または進行がＴＲＫキナーゼの変異によって引き起こされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ＴＲＫキナーゼの変異が急性骨髄性白血病のＮＴＲＫ１欠失変異である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
腫瘍の増殖、生存、または進行が野生型ＴＲＫキナーゼの過剰発現によって引き起こされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ＮＴＲＫ１が膵臓癌または神経芽細胞腫で過剰発現している、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
腫瘍が肺腺癌、胆管癌、結腸直腸癌、結腸腺癌、甲状腺乳頭癌、スピッツ様腫瘍、膠芽腫、肉腫、先天性線維肉腫、星状細胞腫、頭頸部癌、低悪性度神経膠腫、分泌性乳癌、急性骨髄性白血病、先天性中胚葉性腎腫、急性リンパ芽球性白血病、甲状腺癌、皮膚黒色腫、小児神経膠腫、神経芽細胞腫、または膵臓癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
Ｎ−（４−（２−（シクロプロパンカルボキサミド）ピリジン−４−イルオキシ）−２，５−ジフルオロフェニル）−Ｎ’−（４−フルオロフェニル）シクロプロパン−１，１−ジカルボキサミドまたはその医薬的に許容される塩が単剤として、または他の癌標的治療剤、癌標的生物製剤、もしくは化学療法剤と組み合わせて投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
それを必要とする対象の癌を治療する方法であって、Ｎ−（４−（２−（シクロプロパンカルボキサミド）ピリジン−４−イルオキシ）−２，５−ジフルオロフェニル）−Ｎ’−（４−フルオロフェニル）シクロプロパン−１，１−ジカルボキサミドまたはその医薬的に許容される塩の有効量を該対象に投与することを含む方法であり、該癌がＴＲＫキナーゼの過剰発現、ＴＲＫキナーゼの変異、および／またはＴＲＫキナーゼ融合タンパク質と関連する、方法。
【請求項１６】
癌がＮＴＲＫ１融合タンパク質によって引き起こされる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＮＴＲＫ１融合タンパク質がＭＰＲＩＰ−ＮＴＲＫ１、ＣＤ７４−ＮＴＲＫ１、ＲＦＷＤ２−ＮＴＲＫ１、ＳＱＳＴＭ１−ＮＴＲＫ１、ＴＰＭ３−ＮＴＲＫ１、ＴＦＧ−ＮＴＲＫ１、ＴＰＲ−ＮＴＲＫ１、ＲＡＢＧＡＰ１Ｌ−ＮＴＲＫ１  ＬＭＮＡ−ＮＴＲＫ１、ＴＰ５３−ＮＴＲＫ１、ＮＦＡＳＣ−ＮＴＲＫ１、およびＰＥＡＲ１−ＮＴＫＲ１から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
癌がＮＴＲＫ２融合タンパク質によって引き起こされる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
ＮＴＲＫ２融合タンパク質がＰＡＮ３−ＮＴＲＫ２、ＡＦＡＰ１−ＮＴＲＫ２、ＴＲＩＭ２４−ＮＴＲＫ２、ＱＫ１−ＮＴＲＫ２、ＮＡＣＣ２−ＮＴＲＫ２、ＶＣＬ−ＮＴＲＫ２、およびＡＧＢＬ４−ＮＴＲＫ２から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
癌がＮＴＲＫ３融合タンパク質によって引き起こされる、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
ＮＴＲＫ３融合タンパク質がＥＴＶ６−ＮＴＲＫ３およびＢＴＢＤ１−ＮＴＲＫ３から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
癌がＴＲＫキナーゼの変異によって引き起こされる、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
変異が急性骨髄性白血病のＮＴＲＫ１欠失変異である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
癌が野生型ＴＲＫキナーゼの過剰発現によって引き起こされる、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
ＮＴＲＫ１が膵臓癌または神経芽細胞腫で過剰発現している、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
癌が肺腺癌、胆管癌、結腸直腸癌、結腸腺癌、甲状腺乳頭癌、スピッツ様腫瘍、膠芽腫、肉腫、先天性線維肉腫、星状細胞腫、頭頸部癌、低悪性度神経膠腫、分泌性乳癌、急性骨髄性白血病、先天性中胚葉性腎腫、急性リンパ芽球性白血病、甲状腺癌、皮膚黒色腫、小児神経膠腫、神経芽細胞腫、または膵臓癌である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２７】
Ｎ−（４−（２−（シクロプロパンカルボキサミド）ピリジン−４−イルオキシ）−２，５−ジフルオロフェニル）−Ｎ’−（４−フルオロフェニル）シクロプロパン−１，１−ジカルボキサミドまたはその医薬的に許容される塩が単剤として、または他の癌標的治療剤、癌標的生物製剤、もしくは化学療法剤と組み合わせて投与される、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願へのクロスリファレンス
本出願は、２０１４年１０月１４日に出願された米国仮出願第６２／０６３，６６０号に対する優先権を主張するものであって、その内容はそれらの全体において参照することによって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
電子的に提出されたテキストファイルの記載
添付の電子的に提出されたテキストファイルの内容は、その全体において参照することによって本明細書に組み込まれる：コンピューターが読めるフォーマットの配列表のコピー（ファイル名：ＤＥＣＰ＿０６７＿０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ；記録日２０１５年１０月１３日：ファイルサイズ１０ＫＢ）。
【背景技術】
【０００３】
キナーゼ融合タンパク質は様々な癌の原因となることが知られている（Ｖａｉｓｈｎａｖｉ  ２０１５；Ｓｔｒａｎｓｋｙ  ２０１４）。最も頻繁に報告されている癌のドライバー変異であるキナーゼ融合は受容体チロシンキナーゼ融合であり、染色体転座が常時活性変異キナーゼをもたらし、触媒キナーゼドメイン（受容体チロシンキナーゼのＣ末端領域）が別の遺伝子に由来するＮ末端領域と融合する。典型的に、通常は該Ｎ末端領域が融合タンパク質二量体化を促進することによって、該キナーゼドメインの構成的活性化を促進する（Ｓｔｒａｎｋｓｙ  ２０１４）。
【０００４】
融合タンパク質は、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２、またはＮＴＲＫ３のキナーゼドメインと様々なＮ末端融合パートナーの染色体転座の結果であると報告されている。ＮＴＲＫ１遺伝子融合は、肺腺癌、胆管癌、結腸直腸癌、甲状腺乳頭癌、スピッツ様腫瘍、および膠芽腫のドライバー変異であることが立証されている。ＮＴＲＫ２遺伝子融合は、肉腫、星状細胞腫、肺腺癌、および頭頸部癌のドライバー変異であることが立証されている。ＮＴＲＫ３遺伝子融合は、低悪性度神経膠腫、分泌性乳癌、甲状腺乳頭癌、急性骨髄性白血病、先天性中胚葉性腎腫、先天性線維肉腫、急性リンパ芽球性白血病、結腸腺癌、甲状腺癌、皮膚黒色腫、頭頸部癌、および小児神経膠腫のドライバー変異であることが立証されている（Ｖａｉｓｈｎａｖｉ  ２０１５）。
【０００５】
報告されている具体的なＴＲＫ融合タンパク質は、肺腺癌におけるＭＰＲＩＰ−ＮＴＲＫ１、ＣＤ７４−ＮＴＲＫ１、ＲＦＷＤ２−ＮＴＲＫ１、およびＳＱＳＴＭ１−ＮＴＲＫ１融合（Ｖａｉｓｈｎａｖｉ  ２０１３、Ｃｕｅｓｔａ  ２０１４、Ｐａｔｅｌ  ２０１５）；結腸直腸癌および甲状腺癌におけるＴＰＭ３−ＮＴＲＫ１、ＴＦＧ−ＮＴＲＫ１、およびＴＰＲ−ＮＴＲＫ１（Ａｌｂｅｒｔｉ  ２００３；Ｇｒｅｃｏ  ２０１０、Ｍａｒｔｉｎ−Ｚａｎｃａ  １９８６）；肉腫におけるＴＰＭ３−ＮＴＲＫ１（Ｓｔｒａｎｋｓｙ  ２０１４）；胆管癌におけるＲＡＢＧＡＰ１Ｌ−ＮＴＲＫ１（Ｒｏｓｓ  ２０１４）；スピッツ様腫瘍におけるＬＭＮＡ−ＮＴＲＫ１およびＴＰ５３−ＮＴＲＫ１（Ｗｉｅｓｎｅｒ  ２０１４）；膠芽腫におけるＮＦＡＳＣ−ＮＴＲＫ１（Ｋｉｍ  ２０１４）；頭頸部癌におけるＰＡＮ３−ＮＴＲＫ２融合（Ｓｔｒａｎｓｋｙ  ２０１４）；低悪性度神経膠腫におけるＡＦＡＰ１−ＮＴＲＫ２融合（Ｓｔｒａｎｓｋｙ  ２０１４）；肺腺癌におけるＴＲＩＭ２４−ＮＴＲＫ２（Ｓｔｒａｎｓｋｙ  ２０１４）；ならびに先天性線維肉腫および分泌性乳癌におけるＥＴＶ６−ＮＴＲＫ３（Ｋｎｅｚｅｖｉｃｈ  １９９８；Ｒｉｃａｒｔｅ−Ｆｉｌｈｏ  ２０１３、Ｔｏｇｎｏｎ  ２００２）を含む。
【０００６】
ＴＲＫキナーゼ融合タンパク質に加えて、他の型のＴＲＫキナーゼが癌を引き起こすことが立証されている。ＮＴＲＫ１の欠失変異は急性骨髄性白血病の原因となることが示されている（Ｒｅｕｔｈｅｒ  ２０００）。ＮＴＲＫ１の不活性化は膵臓腫瘍をゲムシタビンに感作させることが示されている（Ｌｉｕ  ２００７）。ＮＧＦ／ＮＴＲＫ１の発現増加はヒト膵臓癌における神経周囲の浸潤および疼痛症候群において役割を果たすことが示されている（Ｚｈｕ  １９９９）。ＴＲＫキナーゼシグナル伝達の増加は神経芽細胞腫においても立証されている（Ｂｒｏｄｅｕｒ  ２００９）。
【０００７】
当該技術分野で、１つ以上のＴＲＫキナーゼ変異、ＴＲＫキナーゼ過剰発現、および／または１つ以上のＴＲＫキナーゼ融合タンパク質と関連する癌の治療を改善しようとする要求がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
１つの態様では、本開示はＴＲＫキナーゼの過剰発現、ＴＲＫキナーゼの１つ以上の変異、および／または１つ以上のＴＲＫキナーゼ融合タンパク質と関連する癌を治療するための組成物および方法を提供する。別の態様では、化合物１またはその医薬的に許容される塩は、癌の腫瘍の増殖、生存、または進行がＴＲＫキナーゼの過剰発現、ＴＲＫキナーゼの変異、またはＴＲＫキナーゼ融合タンパク質によって引き起こされる癌を有するか有している疑いがある対象に投与される。
【０００９】
１つの実施態様では、化合物１またはその医薬的に許容される塩は、腫瘍の増殖、生存、または進行がＮＴＲＫ１融合タンパク質によって引き起こされる癌を有するか有している疑いがある対象に投与される。さらなる実施態様では、ＮＴＲＫ１融合タンパク質は、限定されるものではないが、ＭＰＲＩＰ−ＮＴＲＫ１、ＣＤ７４−ＮＴＲＫ１、ＲＦＷＤ２−ＮＴＲＫ１、ＳＱＳＴＭ１−ＮＴＲＫ１、ＴＰＭ３−ＮＴＲＫ１、ＴＦＧ−ＮＴＲＫ１、ＴＰＲ−ＮＴＲＫ１、ＲＡＢＧＡＰ１Ｌ−ＮＴＲＫ１  ＬＭＮＡ−ＮＴＲＫ１、ＴＰ５３−ＮＴＲＫ１、ＮＦＡＳＣ−ＮＴＲＫ１、およびＰＥＡＲ１−ＮＴＫＲ１から選択される。
【００１０】
別の実施態様では、化合物１またはその医薬的に許容される塩は、腫瘍の増殖、生存、または進行がＮＴＲＫ２融合タンパク質によって引き起こされる癌を有するか有している疑いがある対象に投与される。さらなる実施態様では、ＮＴＲＫ２融合タンパク質は、限定されるものではないが、ＰＡＮ３−ＮＴＲＫ２、ＡＦＡＰ１−ＮＴＲＫ２、ＴＲＩＭ２４−ＮＴＲＫ２、ＱＫ１−ＮＴＲＫ２、ＮＡＣＣ２−ＮＴＲＫ２、ＶＣＬ−ＮＴＲＫ２、およびＡＧＢＬ４−ＮＴＲＫ２から選択される。
【００１１】
別の実施態様では、化合物１またはその医薬的に許容される塩は、腫瘍の増殖、生存、または進行がＮＴＲＫ３融合タンパク質によって引き起こされる癌を有するか有している疑いがある対象に投与される。さらなる実施態様では、ＮＴＲＫ３融合タンパク質は、限定されるものではないが、ＥＴＶ６−ＮＴＲＫ３およびＢＴＢＤ１−ＮＴＲＫ３から選択される。
【００１２】
別の実施態様では、化合物１またはその医薬的に許容される塩は、腫瘍の増殖、生存、または進行がＴＲＫキナーゼの変異によって引き起こされる癌を有するか有している疑いがある対象に投与される。さらなる実施態様では、該変異は急性骨髄性白血病のＮＴＲＫ１欠失変異を含んでよい。
【００１３】
別の実施態様では、化合物１またはその医薬的に許容される塩は、腫瘍の増殖、生存、または進行が野生型ＴＲＫキナーゼの過剰発現によって引き起こされる癌を有するか有している疑いがある対象に投与される。さらなる実施態様では、ＴＲＫキナーゼは膵臓癌または神経芽細胞腫で過剰発現している。
【００１４】
別の実施態様では、化合物１またはその医薬的に許容される塩は、腫瘍の増殖、生存、または進行がＴＲＫ融合タンパク質によって引き起こされ、かつ癌が肺腺癌、胆管癌、結腸直腸癌、結腸腺癌、甲状腺乳頭癌、スピッツ様腫瘍、膠芽腫、肉腫、先天性線維肉腫、星状細胞腫、頭頸部癌、低悪性度神経膠腫、分泌性乳癌、急性骨髄性白血病、先天性中胚葉性腎腫、急性リンパ芽球性白血病、甲状腺癌、皮膚黒色腫、小児神経膠腫、神経芽細胞腫、または膵臓癌である癌を有するか有している疑いがある対象に投与される。
【００１５】
別の実施態様では、化合物１またはその医薬的に許容される塩は、単剤として、または他の癌標的治療剤、癌標的生物製剤、もしくは化学療法剤と組み合わせて、癌を有するか有している疑いがある対象に投与される。
【００１６】
いくつかの実施態様では、Ｎ−（４−（２−（シクロプロパンカルボキサミド）ピリジン−４−イルオキシ）−２，５−ジフルオロフェニル）−Ｎ’−（４−フルオロフェニル）シクロプロパン−１，１−ジカルボキサミドまたはその医薬的に許容される塩の有効量が対象に経口投与される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１Ａは、ＫＭ−１２  ＴＰＭ３−ＮＴＲＫ１異種移植モデルにおいて、化合物１による治療が腫瘍増殖の遅延をもたらすことを示す折れ線グラフである。１５ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、および３．７５ｍｇ／ｋｇ用量の化合物１（経口、１日２回）をビヒクルコントロールと比較して試験した。腫瘍増殖の遅延は１５ｍｇ／ｋｇおよび７．５ｍｇ／ｋｇの用量で統計的に有意であった。
【００１８】
図１Ｂは、１５ｍｇ／ｋｇまたは７．５ｍｇ／ｋｇでの化合物１の単回経口用量投与後のＮＴＲＫ１リン酸化活性化のパーセント阻害を示す棒グラフである。
【００１９】
【図２】図２Ａは、ＮＩＨ−３Ｔ３  ＥＴＶ６−ＮＴＲＫ３異種移植モデルにおいて、１５ｍｇ／ｋｇ（経口、１日２回）の化合物１による治療が腫瘍増殖の遅延をもたらすことを示す折れ線グラフである。
【００２０】
図２Ｂは、１５ｍｇ／ｋｇでの化合物１の単回経口用量投与後のＥＴＶ６−ＮＴＲＫ３リン酸化活性化のパーセント阻害を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
詳細な記載
Ｎ−（４−（２−（シクロプロパンカルボキサミド）ピリジン−４−イルオキシ）−２，５−ジフルオロフェニル）−Ｎ’−（４−フルオロフェニル）シクロプロパン−１，１−ジカルボキサミドが、予想外にもＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２、およびＮＴＲＫ３キナーゼの野生型および発癌融合タンパク質型を阻害することが見出された。本開示は、Ｎ−（４−（２−（シクロプロパンカルボキサミド）ピリジン−４−イルオキシ）−２，５−ジフルオロフェニル）−Ｎ’−（４−フルオロフェニル）シクロプロパン−１，１−ジカルボキサミドまたはその医薬的に許容される塩の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、ＴＲＫキナーゼ媒介性の腫瘍の増殖および疾患進行を阻害することによって癌を治療するための組成物および方法を提供する。
【００２２】
それゆえ、１つの態様では、本開示はＴＲＫキナーゼの過剰発現、ＴＲＫキナーゼの１つ以上の変異、および／または１つ以上のＴＲＫキナーゼ融合タンパク質と関連する癌を治療するための方法および組成物を提供する。本明細書で提供される組成物および方法は、腫瘍の増殖、生存、および／または進行を阻害または予防する。
【００２３】
本明細書で用いられている化合物１は、化合物Ｎ−（４−（２−（シクロプロパンカルボキサミド）ピリジン−４−イルオキシ）−２，５−ジフルオロフェニル）−Ｎ’−（４−フルオロフェニル）シクロプロパン−１，１−ジカルボキサミドまたはその医薬的に許容される塩を示し、その構造は以下の通りである。
【化１】
2017532344.tif 000003
化合物１
【００２４】
化合物１を製造する方法は、米国特許第８，６３７，６７２号に開示されており、その内容は参照することによって本明細書に組み込まれる。本発明の詳細は、以下に記載されている。本明細書に記載されている方法および物質と類似または均等の方法および物質を本発明の実施または試験に用いることができるが、例示的方法および物質がここに記載されている。本発明の他の特徴、目的、および利点は本明細書および特許請求の範囲から明らかであろう。文脈において明確に反対の記載がない限り、本明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形は複数対象も含む。特に定義していない限り、本明細書で用いられている全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同一の意味を有する。
【００２５】
いくつかの実施態様では、癌は肺腺癌、胆管癌、結腸直腸癌、結腸腺癌、甲状腺乳頭癌、スピッツ様腫瘍、膠芽腫、肉腫、先天性線維肉腫、星状細胞腫、頭頸部癌、低悪性度神経膠腫、分泌性乳癌、急性骨髄性白血病、先天性中胚葉性腎腫、急性リンパ芽球性白血病、甲状腺癌、皮膚黒色腫、小児神経膠腫、神経芽細胞腫、膵臓癌、消化管間質腫瘍、卵巣癌、腎臓癌、肝癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌、中皮腫、結腸癌、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、乳癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、精巣腫瘍、肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、網膜芽細胞腫、および神経内分泌腫瘍から選択される。
【００２６】
いくつかの実施態様では、本開示の融合タンパク質は、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２、またはＮＴＲＫ３のキナーゼドメインと様々なＮ末端融合パートナーとの染色体転座の結果である。ＴＲＫ融合タンパク質は、限定されるものではないが、ＭＰＲＩＰ−ＮＴＲＫ１、ＣＤ７４−ＮＴＲＫ１、ＲＦＷＤ２−ＮＴＲＫ１、ＳＱＳＴＭ１−ＮＴＲＫ１、ＴＰＭ３−ＮＴＲＫ１、ＴＦＧ−ＮＴＲＫ１、ＴＰＲ−ＮＴＲＫ１、ＴＰＭ３−ＮＴＲＫ１、ＲＡＢＧＡＰ１Ｌ−ＮＴＲＫ１、ＬＭＮＡ−ＮＴＲＫ１、ＴＰ５３−ＮＴＲＫ１、ＮＦＡＳＣ−ＮＴＲＫ１、ＰＡＮ３−ＮＴＲＫ２、ＡＦＡＰ１−ＮＴＲＫ２、ＴＲＩＭ２４−ＮＴＲＫ２、およびＥＴＶ６−ＮＴＲＫ３を含む。融合タンパク質に加えて、他の型のＴＲＫキナーゼが癌の原因となることが立証されている。例えば、ＴＲＫキナーゼの過剰発現および／またはＴＲＫキナーゼの１つ以上の変異が癌の原因となることが立証されている。変異はＴＲＫの置換、挿入、および／または欠失変異体を含んでよい。
【００２７】
用語「患者」および「対象」は本明細書で互換的に用いられている。１つの実施態様では、対象は哺乳類、例えばげっ歯類、ネコ、イヌ、および霊長類であってよい。好ましくは、対象はヒトである。１つの実施態様では、本明細書で提供される化合物および付加的治療剤は、経口、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹腔内（ｉｎｔｒａａｂｄｏｍｉｎａｌ）、嚢内、軟骨内、腔内（ｉｎｔｒａｃａｖｉｔａｒｙ）、腔内（ｉｎｔｒａｃｅｌｉａｌ）、小脳内、脳室内、結腸内、頸部内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ）、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑膜内、胸腔内、鼓室内、子宮内、膀胱内、硝子体内、ボーラス、結膜下、膣内、直腸、頬側、舌下、鼻腔内、腫瘍内、および経皮から独立して選択されるいずれかの適切な経路によって投与されてよい。さらなる実施態様では、Ｎ−（４−（２−（シクロプロパンカルボキサミド）ピリジン−４−イルオキシ）−２，５−ジフルオロフェニル）−Ｎ’−（４−フルオロフェニル）シクロプロパン−１，１−ジカルボキサミドまたはその医薬的に許容される塩の有効量は、対象に経口投与される。
【００２８】
用語「医薬的に許容される塩」は、遊離塩基の塩を形成する一般的に用いられている塩を包含する。医薬的に許容される限り、塩の性質は重要ではない。用語「医薬的に許容される」は、健全な医学的判断の範囲内で、ヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに適切であり、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症がなく、合理的なベネフィット／リスク比に釣り合った、化合物、物質、組成物、および／または剤形を示す用語として本開示で利用されている。適切な医薬的に許容される酸付加塩は、無機酸または有機酸から製造されてよい。そのような無機酸の例として、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、炭酸、硫酸、およびリン酸を挙げることができる。適切な有機酸は、カルボン酸およびスルホン酸を含有する脂肪族、脂環族、芳香族、アリール脂肪族、およびヘテロシクリルから選択されてよい、その例として、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、グルクロン酸、マレイン酸、フマル酸、ピルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、アントラニル酸、メシル酸、ステアリン酸、サリチル酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、マンデル酸、エンボン酸（パモ酸）、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パントテン酸、トルエンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、スルファニル酸、シクロヘキシルアミノスルホン酸、アルギン酸（ａｌｇｅｎｉｃ）、３−ヒドロキシ酪酸、ガラクタル酸、およびガラクツロン酸を挙げることができる。
【００２９】
対象に関する用語「治療すること」は、対象の障害の少なくとも１つの症状を改善することを示す。治療することは、障害を予防すること、治療すること、改善すること、または少なくとも部分的に回復させることであってよい。
【００３０】
用語「有効量」および「治療的有効量」は本開示で互換的に用いられており、対象に投与された場合に、対象における障害の症状を減少させることができる化合物の量を示す。「有効量」または「治療的有効量」を含む実際の量は、多数の条件、例えば限定されるものではないが、治療される特定の障害、障害の重症度、患者の大きさおよび健康、ならびに投与経路に依存して変動するであろう。熟練の医師であれば、医学分野で知られている方法を用いて容易に適量を決定することができるであろう。
【００３１】
いくつかの実施態様では、Ｎ−（４−（２−（シクロプロパンカルボキサミド）ピリジン−４−イルオキシ）−２，５−ジフルオロフェニル）−Ｎ’−（４−フルオロフェニル）シクロプロパン−１，１−ジカルボキサミドまたはその医薬的に許容される塩は、単剤として対象に投与される。他の実施態様では、Ｎ−（４−（２−（シクロプロパンカルボキサミド）ピリジン−４−イルオキシ）−２，５−ジフルオロフェニル）−Ｎ’−（４−フルオロフェニル）シクロプロパン−１，１−ジカルボキサミドまたはその医薬的に許容される塩は、付加的な治療剤と組み合わせて対象に投与される。付加的な治療剤は、他の癌標的治療剤、癌標的生物製剤、免疫療法剤、および／または化学療法剤を含む。
【００３２】
いくつかの実施態様では、付加的な化学療法剤は抗チューブリン剤である。さらなる実施態様では、抗チューブリン剤は、パクリタキセル、ドセタキセル、アブラキサン、およびエリブリンから選択される。いくつかの実施態様では、免疫療法剤は抗ＣＴＬＡ−４剤、抗ＰＤ剤、抗ＰＤＬ剤、またはＩＤＯ阻害剤である。いくつかの実施態様では、免疫療法剤はイピリムマブ、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、ＭＥＤＩ４７３６、インドキシモド、ＩＮＣＢ０２４３６０、およびエパカドスタットから選択される。いくつかの実施態様では、癌標的生物製剤は、モノクローナル抗体、キナーゼ阻害剤ならびに増殖因子およびそれらの受容体の阻害剤、遺伝子治療剤、細胞治療、例えば幹細胞、またはそのいずれかの組み合わせを含んでよい。
【００３３】
本開示を通じて、様々な特許、特許出願、および出版物が参照されている。これらの特許、特許出願、および出版物の開示は、本開示の優先日時点で当業者に知られている技術水準をさらに十分に記載するために、それらの全体において、参照することによって本開示に組み込まれる。特許、特許出願、および出版物と、本開示の間に何らかの不一致がある場合、本開示が優先される。
【００３４】
便宜上、本明細書、実施例、および特許請求の範囲で利用されている特定の用語は、ここに集められる。特に定義しない限り、本開示で用いられている全ての技術的および科学的用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同一の意味を有する。特段の記載がない限り、本開示で提供されているあるグループまたは用語について提供されている最初の定義は、個別にまたは別のグループの一部として、本開示を通じてそのグループまたは用語に適用される。
【００３５】
本開示は以下の実施例によってさらに説明されるが、本開示の範囲または精神が本明細書に記載されている特定の手順に限定されると解釈されるべきではない。実施例は特定の実施態様を説明するために提供されているのであって、それによって本開示の範囲を限定することは意図していないと理解されたい。本開示の精神および／または添付の特許請求の範囲から逸脱することなくそれ自体当業者に示唆されてよい様々な他の実施態様、修正、およびその均等物に対する手段が実行されてよいこともさらに理解されたい。
【実施例】
【００３６】
実施例１．ＮＴＲＫ１（配列番号１）、ＮＴＲＫ２（配列番号２）、およびＮＴＲＫ３（配列番号３）組換えキナーゼの阻害剤としての化合物１の評価
ピルビン酸キナーゼ／乳酸脱水素酵素系とのカップリングを通じたキナーゼ反応からのＡＤＰの産生を追跡することによって、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２、およびＮＴＲＫ３キナーゼの活性を決定した［Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ  ２０００］。本アッセイにおいて、ＮＡＤＨの酸化（Ａ３４０ｎｍの減少）を分光光度法で連続的にモニターした。反応混合物（１００μＬ）は、キナーゼ［ＮＴＲＫ１（インビトロジェン社）（４．７ｎＭ）、ＮＴＲＫ２（インビトロジェン社）（４ｎＭ）、またはＮＴＲＫ３（インビトロジェン社）（１．８ｎＭ）］、ｐｏｌｙＥＹ（１ｍｇ／ｍＬ）、ＭｇＣｌ２（１８ｍＭ）、ＤＴＴ（０．５ｍＭ）、ピルビン酸キナーゼ（４ユニット）、乳酸脱水素酵素（７ユニット）、ホスホエノールピルビン酸（１ｍＭ）、ならびにＮＡＤＨ（０．２８ｍＭ）およびＡＴＰ（ＮＴＲＫ１およびＮＴＲＫ２については１ｍＭ；ＮＴＲＫ３については０．２５ｍＭ）を、０．２％オクチル−グルコシドおよび１％ＤＭＳＯを含有する９０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．５中に入れた。阻害反応は、段階希釈した試験化合物１と上記反応混合物を混合することによって開始した。プレートリーダー（バイオテック社）で、３４０ｎｍでの吸収を３０℃で４時間連続的にモニターした。２〜４時間のタイムフレームを用いて反応速度を計算した。反応速度をコントロール（すなわち試験化合物を含まない混合物）の反応速度と比較することによってパーセント阻害を得た。化合物１のＩＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアパッケージで実行されるソフトウェアルーチンを用いて、様々な阻害剤濃度で決定した一連のパーセント阻害値から計算した。
【００３７】
化合物１は組換えＮＴＲＫ１キナーゼ活性を０．７１ｎＭのＩＣ５０値で阻害し、ＮＴＲＫ２キナーゼを４．６ｎＭのＩＣ５０値で阻害し、ＮＴＲＫ３キナーゼを０．８３ｎＭのＩＣ５０値で阻害した（表１）。
【表１】
2017532344.tif 000004
【００３８】
スクリーニングに用いられるＮＴＲＫ１タンパク質配列（配列番号１）
ＭＫＣＧＲＲＮＫＦＧＩＮＲＰＡＶＬＡＰＥＤＧＬＡＭＳＬＨＦＭＴＬＧＧＳＳＬＳＰＴＥＧＫＧＳＧＬＱＧＨＩＩＥＮＰＱＹＦＳＤＡＣＶＨＨＩＫＲＲＤＩＶＬＫＷＥＬＧＥＧＡＦＧＫＶＦＬＡＥＣＨＮＬＬＰＥＱＤＫＭＬＶＡＶＫＡＬＫＥＡＳＥＳＡＲＱＤＦＱＲＥＡＥＬＬＴＭＬＱＨＱＨＩＶＲＦＦＧＶＣＴＥＧＲＰＬＬＭＶＦＥＹＭＲＨＧＤＬＮＲＦＬＲＳＨＧＰＤＡＫＬＬＡＧＧＥＤＶＡＰＧＰＬＧＬＧＱＬＬＡＶＡＳＱＶＡＡＧＭＶＹＬＡＧＬＨＦＶＨＲＤＬＡＴＲＮＣＬＶＧＱＧＬＶＶＫＩＧＤＦＧＭＳＲＤＩＹＳＴＤＹＹＲＶＧＧＲＴＭＬＰＩＲＷＭＰＰＥＳＩＬＹＲＫＦＴＴＥＳＤＶＷＳＦＧＶＶＬＷＥＩＦＴＹＧＫＱＰＷＹＱＬＳＮＴＥＡＩＤＣＩＴＱＧＲＥＬＥＲＰＲＡＣＰＰＥＶＹＡＩＭＲＧＣＷＱＲＥＰＱＱＲＨＳＩＫＤＶＨＡＲＬＱＡＬＡＱＡＰＰＶＹＬＤＶＬＧＫＧＶＥＡＣＱＬＧＴＤＤＹＤＩＰＴＴＨＨＨＨＨＨ
【００３９】
スクリーニングに用いられるＮＴＲＫ２タンパク質配列（配列番号２）
ＭＶＩＥＮＰＱＹＦＧＩＴＮＳＱＬＫＰＤＴＦＶＱＨＩＫＲＨＮＩＶＬＫＲＥＬＧＥＧＡＦＧＫＶＦＬＡＥＣＹＮＬＣＰＥＱＤＫＩＬＶＡＶＫＴＬＫＤＡＳＤＮＡＲＫＤＦＨＲＥＡＥＬＬＴＮＬＱＨＥＨＩＶＫＦＹＧＶＣＶＥＧＤＰＬＩＭＶＦＥＹＭＫＨＧＤＬＮＫＦＬＲＡＨＧＰＤＡＶＬＭＡＥＧＮＰＰＴＥＬＴＱＳＱＭＬＨＩＡＱＱＩＡＡＧＭＶＹＬＡＳＱＨＦＶＨＲＤＬＡＴＲＮＣＬＶＧＥＮＬＬＶＫＩＧＤＦＧＭＳＲＤＶＹＳＴＤＹＹＲＶＧＧＨＴＭＬＰＩＲＷＭＰＰＥＳＩＭＹＲＫＦＴＴＥＳＤＶＷＳＬＧＶＶＬＷＥＩＦＴＹＧＫＱＰＷＹＱＬＳＮＮＥＶＩＥＣＩＴＱＧＲＶＬＱＲＰＲＴＣＰＱＥＶＹＥＬＭＬＧＣＷＱＲＥＰＨＭＲＫＮＩＫＧＩＨＴＬＬＱＮＬＡＫＡＳＰＶＹＬＤＩＬＧＫＧＧＲＡＤＰＡＦＬＹＫＶＶＲＭＮＥＤＬＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴＲＴＧＨＨＨＨＨＨ
【００４０】
スクリーニングに用いられるＮＴＲＫ３タンパク質配列（配列番号３）
ＭＶＩＥＮＰＱＹＦＲＱＧＨＮＣＨＫＰＤＴＹＶＱＨＩＫＲＲＤＩＶＬＫＲＥＬＧＥＧＡＦＧＫＶＦＬＡＥＣＹＮＬＳＰＴＫＤＫＭＬＶＡＶＫＡＬＫＤＰＴＬＡＡＲＫＤＦＱＲＥＡＥＬＬＴＮＬＱＨＥＨＩＶＫＦＹＧＶＣＧＤＧＤＰＬＩＭＶＦＥＹＭＫＨＧＤＬＮＫＦＬＲＡＨＧＰＤＡＭＩＬＶＤＧＱＰＲＱＡＫＧＥＬＧＬＳＱＭＬＨＩＡＳＱＩＡＳＧＭＶＹＬＡＳＱＨＦＶＨＲＤＬＡＴＲＮＣＬＶＧＡＮＬＬＶＫＩＧＤＦＧＭＳＲＤＶＹＳＴＤＹＹＲＶＧＧＨＴＭＬＰＩＲＷＭＰＰＥＳＩＭＹＲＫＦＴＴＥＳＤＶＷＳＦＧＶＩＬＷＥＩＦＴＹＧＫＱＰＷＦＱＬＳＮＴＥＶＩＥＣＩＴＱＧＲＶＬＥＲＰＲＶＣＰＫＥＶＹＤＶＭＬＧＣＷＱＲＥＰＱＱＲＬＮＩＫＥＩＹＫＩＬＨＡＬＧＫＡＴＰＩＹＬＤＩＬＧＫＧＧＲＡＤＰＡＦＬＹＫＶＶＲＭＮＥＤＬＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴＲＴＧＨＨＨＨＨＨ
【００４１】
実施例２．ＴＰＭ３−ＮＴＲＫ１融合タンパク質を有するＫＭ−１２結腸直腸癌細胞株における細胞増殖の阻害剤としての化合物１の評価
ＫＭ−１２細胞培養
ＫＭ−１２細胞は、国立癌研究所のＤｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  Ｔｕｍｏｒ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ（フレデリック、メリーランド州）から入手した。手短に述べると、１０％キャラクタライズド（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ）ウシ胎児血清および１％ペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ−グルタミン溶液（インビトロジェン社、カールズバッド、カリフォルニア州）を補充したＲＰＭＩ  １６４０培地中、３７℃、５％ＣＯ２、および湿度９５％で細胞を増殖させた。７０〜９５％の培養密度に達するまで細胞を増殖させ、その時点で細胞を継代培養またはアッセイに用いるために収集した。
【００４２】
ＫＭ−１２細胞増殖アッセイ
段階希釈した試験化合物を３８４ウェルのブラッククリアーボトムプレート（コーニング社、コーニング、ニューヨーク州）に分注した。ウェル当たり５０μＬの完全増殖培地中の１，２５０個の細胞を加えた。３７℃、５％ＣＯ２、および湿度９５％で６７時間プレートをインキュベートした。インキュベーション期間の終わりに１０μＬの４４０μＭレサズリン（シグマ社、セントルイス、ミズーリ州）のＰＢＳ溶液を各ウェルに加え、３７℃、５％ＣＯ２、および湿度９５％でさらに５時間インキュベートした。励起５４０ｎＭおよび発光６００ｎＭを用いてプレートをＳｙｎｅｒｇｙ２リーダー（バイオテック社、ウィヌースキ、バーモント州）で読み取った。Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ、サンディエゴ、カリフォルニア州）を用いてデータを分析し、ＩＣ５０値を計算した。
【００４３】
化合物１は、ＴＰＭ３／ＮＴＲＫ１発癌融合タンパク質を発現しているＫＭ−１２結腸直腸癌細胞の増殖阻害について、３．８ｎＭのＩＣ５０値を示した（表１）。
【００４４】
実施例３．ＥＴＶ６−ＮＴＲＫ３融合キナーゼによってもたらされるトランスフェクトＮＩＨ３Ｔ３細胞増殖の阻害剤としての化合物１の評価
トランスフェクトＮＩＨ−３Ｔ３  ＥＴＶ６−ＮＴＲＫ３細胞培養
トランスフェクトＮＩＨ−３Ｔ３  ＥＴＶ６−ＮＴＲＫ３細胞はジェームズ・ファギン医学博士の研究室（メモリアル・スローン・ケタリング癌センター）から入手した。手短に述べると、１０％キャラクタライズド（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ）ウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ−グルタミン溶液（ライフテクノロジーズ社、カールズバッド、カリフォルニア州）、および１μｇ／ｍＬピューロマイシン（インビトロジェン社、カールズバッド、カリフォルニア州）を補充したＤＭＥＭ培地中、３７℃、５％ＣＯ２、および湿度９５％で細胞を増殖させた。およそ７５％の培養密度に達するまで細胞を増殖させ、その時点で細胞を継代培養またはアッセイに用いるために収集した。
【００４５】
トランスフェクトＮＩＨ−３Ｔ３  ＥＴＶ６−ＮＴＲＫ３細胞増殖アッセイ
段階希釈した試験化合物を９６ウェルブラッククリアーボトムプレート（コーニング社、コーニング、ニューヨーク州）に分注した。ウェル当たり２００μＬの培地（０．５％キャラクタライズド（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ）ウシ胎児血清（ライフテクノロジーズ社、カールズバッド、カリフォルニア州）を補充したＤＭＥＭ培地）中の１５，０００個の細胞を加えた。３７℃、５％ＣＯ２、および湿度９５％で６日間プレートをインキュベートした。インキュベーション期間の終わりに４０μＬの４４０μＭレサズリン（シグマ社、セントルイス、ミズーリ州）のＰＢＳ溶液を各ウェルに加え、３７℃、５％ＣＯ２、および湿度９５％でさらに５時間インキュベートした。励起５４０ｎＭおよび発光６００ｎＭを用いてプレートをＳｙｎｅｒｇｙ２リーダー（バイオテック社、ウィヌースキ、バーモント州）で読み取った。Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ、サンディエゴ、カリフォルニア州）を用いてデータを分析し、ＩＣ５０値を計算した。
【００４６】
化合物１はＥＴＶ６−ＮＴＲＫ３キナーゼ融合タンパク質によってもたらされるトランスフェクトＮＩＨ−３Ｔ３  ＥＴＶ６−ＮＴＲＫ３細胞増殖の阻害について、０．４４ｎＭのＩＣ５０を示した（表１）
【００４７】
実施例４．Ｋ５６２慢性骨髄性白血病細胞におけるＮＴＲＫ１キナーゼの細胞リン酸化活性化の阻害剤としての化合物１の評価
Ｋ５６２細胞培養
Ｋ５６２細胞（カタログ番号ＣＣＬ−２４３）はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ；マナッサス、バージニア州）から入手した。手短に述べると、１０％キャラクタライズド（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ）ウシ胎児血清および１％ペニシリン−ストレプトマイシン−Ｌ−グルタミン溶液（インビトロジェン社、カールズバッド、カリフォルニア州）を補充したＩＭＤＭ培地中の懸濁液中で、３７℃、５％ＣＯ２、および湿度９５％でＫ５６２細胞を増殖させた。１，０００，０００〜３，０００，０００細胞／ｍＬに達するまで細胞を増殖させ、その時点で細胞を継代培養またはアッセイに用いるために収集した。
【００４８】
Ｋ５６２ホスホＮＴＲＫ１ウエスタンブロット
２４ウェルの組織培養処理プレート内にウェル当たり１，０００，０００個の無血清ＩＭＤＭ培地中の細胞を加えた。段階希釈した試験化合物を細胞に加え、３７℃、５％ＣＯ２、および湿度９５％で４時間プレートをインキュベートした。次いで１００ｎｇ／ｍＬのＮＧＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ社、ミネアポリス、ミネソタ州）で細胞を１０分間刺激した。遠心分離によって細胞をペレット状にし、ＰＢＳで洗浄し、次いで溶解した。細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＰＶＤＦへ移した。セル・シグナリング・テクノロジー社（ベバリー、マサチューセッツ州）製の抗体、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥヘルスケア社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｓｔｏｒｍ  ８４０ホスフォイメージャーを蛍光モードで用いてホスホＮＴＲＫ１（Ｔｙｒ６７４／６７５）を検出した。ブロットを剥がし、サンタクルス・バイオテック社（サンタクルス、カリフォルニア州）製の抗体を用いて総ＮＴＲＫ１をプローブした。Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ、サンディエゴ、カリフォルニア州）を用いてＩＣ５０値を計算した。
【００４９】
化合物１は０．６９ｎＭのＩＣ５０値でＫ５６２細胞中のＮＴＲＫ１リン酸化を阻害した（表２）。
【表２】
2017532344.tif 000005
【００５０】
実施例５．ＳＫ−Ｎ−ＳＨ神経芽細胞腫細胞におけるＮＴＲＫ１キナーゼの細胞リン酸化活性化の阻害剤としての化合物１の評価
ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞培養
ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞（カタログ番号ＨＴＢ−１１）はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ；マナッサス、バージニア州）から入手した。手短に述べると、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を１０％キャラクタライズド（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ）ウシ胎児血清および１％ペニシリン−ストレプトマイシン−Ｌ−グルタミン溶液（インビトロジェン社、カールズバッド、カリフォルニア州）を補充したＭＥＭ培地中、３７℃、５％ＣＯ２、および湿度９５％で増殖させた。７０〜９５％の培養密度に達するまで細胞を増殖させ、その時点で細胞を継代培養またはアッセイに用いるために収集した。
【００５１】
ＳＫ−Ｎ−ＳＨホスホＮＴＲＫ１ウエスタンブロット
２４ウェルの組織培養処理プレート内にウェル当たり２５０，０００個の増殖培地中の細胞を加えた。３７℃、５％ＣＯ２、および湿度９５％で一晩プレートをインキュベートした。翌日、増殖培地を吸引し、細胞を無血清ＭＥＭ培地で洗浄し、ウェル当たり１ｍＬの無血清ＭＥＭ培地を加えた。段階希釈した試験化合物を細胞に加え、３７℃、５％ＣＯ２、および湿度９５％で４時間プレートをインキュベートした。次いで１００ｎｇ／ｍＬのＮＧＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ社、ミネアポリス、ミネソタ州）で細胞を１０分間刺激した。次いで培地を吸引し、細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで溶解した。細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＰＶＤＦへ移した。セル・シグナリング・テクノロジー社（ベバリー、マサチューセッツ州）製の抗体、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥヘルスケア社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｓｔｏｒｍ  ８４０ホスフォイメージャーを蛍光モードで用いてホスホＮＴＲＫ１（Ｔｙｒ６７４／６７５）を検出した。ブロットを剥がし、サンタクルス・バイオテック社（サンタクルス、カリフォルニア州）製の抗体を用いて総ＮＴＲＫ１をプローブした。Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ、サンディエゴ、カリフォルニア州）を用いてＩＣ５０値を計算した。
【００５２】
化合物１は１．０ｎＭのＩＣ５０値でＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞中のＮＴＲＫ１リン酸化を阻害した（表２）。
【００５３】
実施例６．ＫＭ−１２細胞におけるＴＰＭ３−ＮＴＲＫ１融合キナーゼの細胞リン酸化活性化の阻害剤としての化合物１の評価
ＫＭ−１２細胞培養
ＫＭ−１２細胞は国立癌研究所のＤｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  Ｔｕｍｏｒ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ（フレデリック、メリーランド州）から入手した。手短に述べると、細胞を１０％キャラクタライズド（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ）ウシ胎児血清および１％ペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ−グルタミン溶液（インビトロジェン社、カールズバッド、カリフォルニア州）を補充したＲＰＭＩ  １６４０培地中、３７℃、５％ＣＯ２、および湿度９５％で増殖させた。７０〜９５％の培養密度に達するまで細胞を増殖させた、その時点で細胞を継代培養またはアッセイに用いるために収集した。
【００５４】
ＫＭ−１２ホスホＮＴＲＫ１ウエスタンブロット
２４ウェルの組織培養処理プレート内にウェル当たり２５０，０００個の増殖培地中の細胞を加えた。３７℃、５％ＣＯ２、および湿度９５％で一晩プレートをインキュベートした。翌日、段階希釈した試験化合物を細胞に加え、３７℃、５％ＣＯ２、および湿度９５％で４時間プレートをインキュベートした。次いで培地を吸引し、細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで溶解した。細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＰＶＤＦへ移した。セル・シグナリング・テクノロジー社（ベバリー、マサチューセッツ州）製の抗体、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥヘルスケア社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｓｔｏｒｍ  ８４０ホスフォイメージャーを蛍光モードで用いてホスホＮＴＲＫ１（Ｔｙｒ６７４／６７５）を検出した。ブロットを剥がし、サンタクルス・バイオテック社（サンタクルス、カリフォルニア州）製の抗体を用いて総ＮＴＲＫ１をプローブした。Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ、サンディエゴ、カリフォルニア州）を用いてＩＣ５０値を計算した。
【００５５】
化合物１は１．４ｎＭのＩＣ５０値でＫＭ−１２細胞中のＴＰＭ３−ＮＴＲＫ１リン酸化を阻害した（表２）。
【００５６】
実施例７．トランスフェクトＮＩＨ−３Ｔ３細胞におけるＥＴＶ６−ＮＴＲＫ３融合キナーゼの細胞リン酸化活性化の阻害剤としての化合物１の評価
トランスフェクトＮＩＨ−３Ｔ３  ＥＴＶ６−ＮＴＲＫ３細胞培養
トランスフェクトＮＩＨ−３Ｔ３  ＥＴＶ６−ＮＴＲＫ３細胞はジェームズ・ファギン医学博士の研究室（メモリアル・スローン・ケタリング癌センター）から入手した。手短に述べると、１０％キャラクタライズド（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ）ウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ−グルタミン溶液（ライフテクノロジーズ社、カールズバッド、カリフォルニア州）、および１μｇ／ｍＬピューロマイシン（インビトロジェン社、カールズバッド、カリフォルニア州）を補充したＤＭＥＭ培地中、３７℃、５％ＣＯ２、および湿度９５％で細胞を増殖させた。およそ７５％の培養密度に達するまで細胞を増殖させ、その時点で細胞を継代培養またはアッセイに用いるために収集した。
【００５７】
トランスフェクトＮＩＨ−３Ｔ３  ＥＴＶ６−ＮＴＲＫ３ホスホＮＴＲＫ３ウエスタンブロット
１２ウェルの組織培養処理プレート内にウェル当たり８０，０００個の培地（０．５％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ−グルタミン溶液を補充したＤＭＥＭ培地）中の細胞を加えた。３７℃、５％ＣＯ２、および湿度９５％で３日間プレートをインキュベートした。次いで、培地を吸引し、２ｍＬの無血清ＤＭＥＭを加えた。段階希釈した試験化合物を細胞に加え、３７℃、５％ＣＯ２、および湿度９５％で４時間プレートをインキュベートした。次いで培地を吸引し、細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで溶解した。細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＰＶＤＦへ移した。セル・シグナリング・テクノロジー社（ベバリー、マサチューセッツ州）製の抗体、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥヘルスケア社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｓｔｏｒｍ  ８４０ホスフォイメージャーを蛍光モードで用いてホスホＮＴＲＫ３（Ｔｙｒ５１６）を検出した。Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ、サンディエゴ、カリフォルニア州）を用いてＩＣ５０値を計算した。
【００５８】
化合物１は０．４７ｎＭのＩＣ５０値でトランスフェクトＮＩＨ−３Ｔ３細胞内のＥＴＶ６−ＮＴＲＫ３リン酸化を阻害した（表２）。
【００５９】
実施例８．ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞におけるＮＴＲＫ２の細胞リン酸化活性化の阻害剤としての化合物１の評価
ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞培養
ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞（カタログ番号ＨＴＢ−１１）はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ；マナッサス、バージニア州）から入手した。手短に述べると、１０％キャラクタライズド（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ）ウシ胎児血清および１％ペニシリン−ストレプトマイシン−Ｌ−グルタミン溶液（インビトロジェン社、カールズバッド、カリフォルニア州）を補充したＭＥＭ培地中、３７℃、５％ＣＯ２、および湿度９５％でＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を増殖させた。７０〜９５％の培養密度に達するまで細胞を増殖させ、その時点で細胞を継代培養した。ＮＴＲＫ２の発現を誘導するために、アッセイ用に細胞を収集する前に、１０μＭのオールトランス型レチノイン酸を含有する増殖培地中で１０〜１４日間細胞を増殖させた。
【００６０】
ＳＫ−Ｎ−ＳＨホスホＮＴＲＫ１ウエスタンブロット
１２ウェルの組織培養処理プレート内に１０μＭのオールトランス型レチノイン酸で分化させたウェル当たり２５０，０００個の増殖培地中の細胞を加えた。３７℃、５％ＣＯ２、および湿度９５％で一晩プレートをインキュベートした。翌日、増殖培地を吸引し、細胞を無血清ＭＥＭ培地で洗浄し、ウェル当たり１ｍＬの無血清ＭＥＭ培地を加えた。段階希釈した試験化合物を細胞に加え、３７℃、５％ＣＯ２、および湿度９５％で４時間プレートをインキュベートした。次いで１００ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ社、ミネアポリス、ミネソタ州）で細胞を５分間刺激した。次いで培地を吸引し、細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで溶解した。細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＰＶＤＦへ移した。セル・シグナリング・テクノロジー社（ベバリー、マサチューセッツ州）製の抗体、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥヘルスケア社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｓｔｏｒｍ  ８４０ホスフォイメージャーを蛍光モードで用いてホスホＮＴＲＫ２（Ｔｙｒ７０６／７０７）を検出した。ブロットを剥がし、サンタクルス・バイオテック社（サンタクルス、カリフォルニア州）製の抗体を用いて総ＮＴＲＫ２をプローブした。Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ、サンディエゴ、カリフォルニア州）を用いてＩＣ５０値を計算した。
【００６１】
化合物１は０．２４ｎＭのＩＣ５０値でＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞内のＮＴＲＫ２リン酸化を阻害した（表２）。
【００６２】
実施例９．ＴＰＭ３−ＮＴＲＫ１形質転換ＫＭ−１２異種移植モデルにおける化合物１の評価
ＫＭ−１２  ＴＰＭ３−ＮＴＲＫ１異種移植モデルにおける単剤有効性について化合物１を評価した（図１Ａ）。マウスの皮下に移植し、Ｄａｙ５に治療を開始した。治療の３週間後、Ｄａｙ２５に治療を終了した。化合物１による治療（１５ｍｇ／ｋｇ、経口、１日２回）は統計的に有意な１７．８日（ｐ＜０．０５）の腫瘍増殖遅延、および１６％（ｐ＜０．０５）のＤａｙ１１％Ｔ／Ｃをもたらした。化合物１による治療（７．５ｍｇ／ｋｇ、経口、１日２回）は統計的に有意な１１．４日（ｐ＜０．０５）の腫瘍増殖遅延、および２２％（ｐ＜０．０５）のＤａｙ１１％Ｔ／Ｃをもたらした。化合物１による治療（３．７５ｍｇ／ｋｇ、経口、１日２回）は４．５日の腫瘍増殖遅延、および３９％のＤａｙ１１％Ｔ／Ｃをもたらしたが、この用量では統計的な有意性はなかった。
【００６３】
ＫＭ−１２  ＴＰＭ３−ＮＴＲＫ１異種移植モデルにおける単回投与後のＮＴＲＫ１リン酸化活性化の阻害について化合物１を評価した（図１Ｂ）。マウスの皮下に移植し、Ｄａｙ８に単回治療を与えた。単回経口投与後の時点で、腫瘍を切除し、凍結し、微粉砕し、次いで溶解した。溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、タンパク質をＰＶＤＦへ移した。セル・シグナリング・テクノロジー社（ベバリー、マサチューセッツ州）製の抗体、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥヘルスケア社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｓｔｏｒｍ  ８４０ホスフォイメージャーを蛍光モードで用いてホスホＮＴＲＫ１（Ｔｙｒ６７４／６７５）を検出した。ブロットを剥がし、サンタクルス・バイオテック社（サンタクルス、カリフォルニア州）製の抗体を用いて総ＮＴＲＫ１をプローブした。単回用量の化合物１（１５ｍｇ／ｋｇ；経口）の経口投与により、投与後１８時間の間、インビボでＮＴＲＫ１キナーゼリン酸化の〜９５％阻害をもたらした。化合物１は投与後２４時間でＮＴＲＫ１リン酸化の７９％阻害を示した。７．５ｍｇ／ｋｇの単回経口用量で、化合物１はＮＴＲＫ１リン酸化を＞９５％、８時間阻害した。投与後１２、１８、および２４時間で、化合物１はそれぞれＮＴＫＲ１リン酸化の６６％、７４％、および５９％阻害を示した。
【００６４】
実施例１０．ＥＴＶ６−ＮＴＲＫ３形質転換ＮＩＨ−３Ｔ３異種移植モデルにおける化合物１の評価（図２）
トランスフェクトＮＩＨ−３Ｔ３  ＥＴＶ６−ＮＴＲＫ３異種移植モデルにおける化合物１の単剤有効性を評価した（図２Ａ）。マウスの皮下に移植し、Ｄａｙ４に治療を開始した。治療の３週間後、Ｄａｙ２４に治療を終了した。化合物１による治療（１５ｍｇ／ｋｇ；経口；１日２回）は統計的に有意な２６．５日（ｐ＜０．０５）の腫瘍増殖遅延、および６％（ｐ＜０．０５）のＤａｙ８％Ｔ／Ｃをもたらした。
【００６５】
トランスフェクトＮＩＨ−３Ｔ３  ＥＴＶ６−ＮＴＲＫ３異種移植モデルにおける単回投与後のＮＴＲＫ３リン酸化活性化の阻害について化合物１を評価した（図２Ｂ）。マウスの皮下に移植し、Ｄａｙ６に単回治療を与えた。単回経口投与後の時点で、腫瘍を切除し、凍結し、微粉砕し、次いで溶解した。溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、タンパク質をＰＶＤＦへ移した。セル・シグナリング・テクノロジー社（ベバリー、マサチューセッツ州）製の抗体、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥヘルスケア社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｓｔｏｒｍ  ８４０ホスフォイメージャーを蛍光モードで用いてホスホＮＴＲＫ３（Ｔｙｒ５１６）を検出した。化合物１の単回用量の投与（１５ｍｇ／ｋｇ；経口）は、投与後１２時間の間、インビボでＮＴＲＫ３キナーゼリン酸化の＞９５％阻害をもたらした。化合物１は１８時間でＮＴＲＫ３リン酸化の６３％阻害を示し、投与後２４時間でＮＴＲＫ３リン酸化の２３％阻害を示した。
【００６６】
当業者であれば、単なるルーチン的な実験を用いて、本開示内に具体的に記載されている特定の実施態様の多数の均等物を認識または確認することができるであろう。そのような均等物は、添付の特許請求の範囲に包含されることが意図されている。
【００６７】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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