(57)【要約】細胞を分離するための装置及び方法は、細胞が第一のチャンバから第二のチャンバへ通過することを可能にする膜を含んでいる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロ流体装置を備えた細胞を選別するための装置であって、
入口及び出口を備えた頂部層と、
入口及び出口を備えた底部層と、
前記頂部層と前記底部層との間の膜を具備し、
前記頂部層と前記膜の間には第一のチャンバがあり、
前記膜と前記底部層の間には第二のチャンバがあり、
前記膜は前記第一のチャンバと前記第二のチャンバを分離し、
前記膜は前記第一のチャンバから前記第二のチャンバへと細胞を通過させるフィルタを有する前記装置。
【請求項２】
請求項１に記載の装置であって、前記膜が抗体を含んでいる前記装置。
【請求項３】
請求項１に記載の装置であって、前記膜は、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリカーボネート、フルオロポリマー、ｔｏｐａｓ、シリコーン、ポリスチレン、またはこれらの組み合わせを含む前記装置。
【請求項４】
請求項１に記載の装置であって、前記頂部層及び前記底部層のうちの少なくとも一方は、ポリカーボネート、フルオロポリマー、ｔｏｐａｓ、シリコーン、ポリスチレン、またはこれらの組み合わせを含む前記装置。
【請求項５】
請求項１に記載の装置であって、前記フィルタは複数の矩形開口部を含む前記装置。
【請求項６】
請求項１に記載の装置であって、前記フィルタは複数の円形開口部を含む前記装置。
【請求項７】
請求項１に記載の装置であって、前記フィルタは複数の十字形開口部を含む前記装置。
【請求項８】
請求項１に記載の装置であって、前記膜は、２〜１００マイクロメートルの厚さを有する前記装置。
【請求項９】
請求項１に記載の装置であって、前記膜は、０．２〜２マイクロメートルの厚さを有する前記装置。
【請求項１０】
請求項１に記載の装置であって、前記細胞は腫瘍細胞、白血球、または赤血球の少なくとも一つを含む前記装置。
【請求項１１】
サンプル中の複数のカテゴリの細胞を分離する方法であって、
複数のカテゴリの細胞を含むサンプルをマイクロ流体装置の入り口に添加することと、
全部ではなく幾つかの細胞を、前記マイクロ流体装置の中の膜を通過させることと、
前記マイクロ流体装置の少なくとも二つの出口から二つの出力流を回収することを含み、各出力流が異なるカテゴリの細胞を含んでいる前記方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、前記細胞を添加することは、細胞を前記入口に注入し、またはポンプで圧入することを含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜優先権の主張＞
本願は、２０１４年５月１日に出願された米国仮出願番号６１／９８７，４５９の優先権を主張し、その全体を本明細書の一部として援用する。
＜技術分野＞
本発明は、細胞を分離するための装置及び方法を特徴とする。
【背景技術】
【０００２】
生物学的流体及び組織の成分を分離することは、多くの場合、臨床診断手順、科学研究、及び場合によっては患者の治療のために必要である。臨床診断の分野では、例えば、試験及び方法のために、特定の型の精製された血液細胞を迅速に分離することを可能にする装置及び方法が必要とされる。基礎研究もまた、血液から精製された細胞型を必要とする。分離及び精製は、種々の方法で達成され得る。
【発明の概要】
【０００３】
一つの態様において、マイクロ流体装置を備えた細胞を選別するための装置は、入口及び出口を備えた頂部層と、入口及び出口を備えた底部層と、前記頂部層と前記底部層との間の膜を具備し、前記頂部層と前記膜の間には第一のチャンバがあり、前記膜と前記底部層の間には第二のチャンバがあり、前記膜は前記第一のチャンバと前記第二のチャンバを分離し、前記膜は前記第一のチャンバから前記第二のチャンバへと細胞を通過させるフィルタを有している。
【０００４】
一定の実施形態において、前記膜は抗体を含むことができる。前記膜は、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリカーボネート、フルオロポリマー、ｔｏｐａｓ（環状オレフィン共重合体−ＣＯＣ）、シリコーン、ポリスチレン、またはこれらの組み合わせを含むことができる。
【０００５】
一定の実施形態において、前記頂部層及び前記底部層のうちの少なくとも一方は、ポリカーボネート、フルオロポリマー、ｔｏｐａｓ（環状オレフィン共重合体−ＣＯＣ）、シリコーン、ポリスチレン、またはこれらの組み合わせを含むことができる。
【０００６】
一定の実施形態において、前記フィルタは複数の矩形開口部を含むことができる。前記フィルタは複数の開口部を含むことができる。前記フィルタは複数の十字形開口部を含むことができる。
【０００７】
一定の実施形態において、前記膜は、２〜１００マイクロメートルの厚さを有することができる。前記装置は、０．２〜２ミリメートルの厚さを有することができる。
【０００８】
一定の実施形態において、前記細胞は腫瘍細胞、白血球、または赤血球の少なくとも一つを含むことができる。
【０００９】
別の態様において、サンプル中の複数のカテゴリの細胞を分離する方法は、複数のカテゴリの細胞を含むサンプルをマイクロ流体装置の入り口に添加することと、全部ではなく幾つかの細胞を前記マイクロ流体装置の中の膜を通過させることと、前記マイクロ流体装置の少なくとも二つの出口からの二つの出力流を回収することを含むことができ、各出力流は異なるカテゴリの細胞を含んでいる。細胞を添加することは、細胞を前記入口に注入し、またはポンプで圧入することを含むことができる。
【００１０】
他の態様、実施形態及び特徴は、以下の説明、図面及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】マイクロ流体装置の動作原理の概略図である。
【図２】図２Ａ及び図２Ｂは、二つの異なる構成のマイクロ流体装置の等角図を示している：頂部からの入口及び出口（Ａ）、側部からの入口及び出口（Ｂ）；図２Ｃは、マイクロ流体装置の二つの構成の分解図である。他の構成は、両側に入口及び出口を有することができる。
【図３】濾過膜の概略図を示している。
【図４】濾過膜のための異なるパターンを示している。
【図５】ＰＭＭＡ濾過膜の製造工程を示している。
【図６】矩形孔を有するＰＭＭＡを示している。
【図７】円形孔を備えた膜を示している。
【図８】図８Ａは、マイクロ流体装置の層を示している；図８Ｂは、濾過膜（５ｍｍ側部）を示している；図８Ｃは組み立てられたマイクロ流体デバイスの等角図である；図８Ｄは、組み立てられたマイクロ流体デバイスの頂面図である；図８Ｅは同じ側に入口及び出口を有し、ガスケットを組み込んだポリマーフレームによって外部管に接続されたマイクロ流体デバイスのレイアウト図である；図８Ｆは、側面からの入口及び出口を有する装置の別の構成を示している。
【図９】図９Ａ〜Ｂは、ＰＭＭＡをアミノ化するためのバイオ官能化プロトコルの概略図を示している。
【図１０】アミノ化されたＰＭＭＡの表面にビオチン価された抗体を共有結合するための官能化プロトコルの概略図である。
【図１１】生物学的サンプルを濾過するための自動化されたプロトコルの概略図を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
マイクロ流体装置は、バイオサンプルを超精製するために使用することができる。該サンプルは、複数のカテゴリの細胞を含むことができる。特に、マイクロ流体装置は、形態学及び／または生体親和性の違いによって細胞カテゴリを分類するために使用できる。幾つかの実施形態においては、一つのカテゴリの細胞が、マイクロ流体装置の頂部層からマイクロ流体装置の底部層へと通過する。幾つかの実施形態では、一つのカテゴリを除くすべてのカテゴリが頂部層から底部層へと通過する。サンプルの調製及び分離は、生物学的及び環境的サンプルの、多くの遺伝子的、生化学的及び生物学的分析のために必要な工程であり得る。例えば、ＵＳ特許出願１３／１２２，１６９；Ｔ．Ｘｕ，ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１０，７０（１６），６４２０−６；Ｗ．Ｃｈｅｎ，ら，Ａｄｖ．Ｈｅａｌｔｈｃ．Ｍａｔｅｒ．２０１３を参照されたい。これらの各々を全体として本明細書に援用する。
【００１３】
マイクロ流体装置は、ポリ（メタクリル酸メチル）（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート、テフロン、ｔｏｐａｓ（環状オレフィン共重合体−ＣＯＣ）、シリコーン、ポリスチレン、これらの組み合わせ、及び他のポリマーから製造できる。マイクロ流体装置は、マイクロミリング、フォトリソグラフィ、或いは熱エンボス加工または射出成形、及びＵＶ支援もしくは溶媒支援による接合により調製することができる。それは、加工された濾過膜により分離され、且つ入口及び出口に接続された上部チャンバ及び下部チャンバからなることができる。該膜は特定の形状（矩形、円形、十字形、三角形）の微小孔を組み込むことができる。異なるカテゴリの細胞を含んだ生物学的サンプルがチップに注入されると、幾つかの型の細胞のみが前記膜の微小孔を通過できるので、これらの細胞はその異なる寸法を利用して分類することができる。これら細胞は、重力によって、または特定のマイクロ流体プロトコルによって、前記膜の孔へと強制的に向けられる。前記サンプルの当該装置への注入及び取り扱いは、外部ピペット及び／または外部ポンプ及び弁によって行うことができる。
【００１４】
更に、特定のカテゴリの細胞（例えば腫瘍細胞）を生体親和性により分類するために、バイオ官能化プロトコルによって、前記膜表面に特定の抗体を結合させることが可能である。当該装置は、赤血球、腫瘍細胞、血漿、及び血液由来のデブリを分類するために使用することができる。図１は、該装置の動作原理の概略図である。
【実施例】
【００１５】
＜装置の製造＞
マイクロ流体チャンバ、チャネル、及び膜からなるマイクロ流体装置は、マイクロミリング、フォトリソグラフィ及び選択的ボンディング技術により、ＰＭＭＡの中で製造することができる。該装置の製造は次の段階を含むことができる：即ち、１）膜の製造、２）マイクロ流体装置を構成するＰＭＭＡ層の製造；３）異なる部品の組み立て及び選択的ボンディング；４）装置のバイオ官能化である。図２は、マイクロ流体装置の構成を示している。
【００１６】
＜膜の製造＞
膜は、形態学的変化により、細胞を濾過するための加工された孔を組み込むことができる。特に、該膜は矩形の孔を備えるように設計することができる。図３は、特定の寸法の孔を有する膜の設計を示している。この膜の孔は、図４に示したように異なる形状を有することができる。
【００１７】
マイクロ流体装置に組み込む場合、５ｍｍ×５ｍｍの膜寸法は、機械的安定性を保証することができる。孔を組み込む膜部分は、３ｍｍ×３ｍｍ以内である。孔の間の距離は、連続する列が垂直有方向に０〜０．０３ｍｍのオフセットを有する状態で、０．０１〜０．０４ｍｍの範囲であることができる。膜の厚さは０．０１ｍｍであり、これは孔の正確な製造を可能にする。この膜は、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）で製造される。該膜の厚さは２〜１００マイクロメータであることができ；該膜の厚さは１０〜５０マイクロメータであることができ；該膜の厚さは１０マイクロメータであることができる。
【００１８】
この膜は、光リソグラフィーにより製造できる。液体ＰＭＭＡをシリコン（Ｓｉ）ウエハ上に堆積し、これを熱プレート上で加熱する。その後、金（Ａｕ）層をＰＭＭＡ上にスパッタリングする。その上に、フォトレジスト（Ｓ１８１３）を堆積させる。フォトリソグラフィ技術により、またクロム−ガラス光マスクの使用により、孔パターンをフォトレジスト層に転写する。続いて、金及びＰＭＭＡを選択的にエッチングし、ＰＭＭＡ膜上に微細孔を実現する。
【００１９】
図５は製造工程を示している：工程１）Ｓｉウエハの洗浄；工程２）固体ＰＭＭＡ（３０重量％）をアニソールに溶解して液体ＰＭＭＡを調製する；工程３）シリコンウエハ上でＰＭＭＡを２０００ｒｍｐで６０秒間スピンコートして厚さ０．０１ｍｍのＰＭＭＡの層を得、１８０℃で２時間焼成する；工程４）ＰＭＭＡ上でＳ１８１３を４０００ｒｐｍで６０秒間スピンコートし、厚さ０．００１ｍｍのフォトレジスト層を得る；工程５）Ａｕを８分間スパッタリングして、厚さ０．０００５〜０．００１ｍｍの金の膜厚を得る；工程６）ＰＭＭＡ上でＳ１８１３を４０００ｒｐｍで６０秒間スピンコートして、厚さ０．００１ｍｍのフォトレジスト層を得る；工程７）サンプルを９５℃で５分間焼成し、光マスク下で１２秒間ＵＶ露光する；工程８）現像液ＭＦ３２２またはＭＦ３１９中で１分間Ｓ１８１３を現像し、ＤＩ水中で１分間濯ぐ；工程９）金をＫＩ：Ｉ２：Ｈ２Ｏ（１００ｇ：２５ｇ：５００ｇ）の中で１分間エッチングし、ＤＩ水中で１分間濯ぐ：工程１０）ディープ反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）器具（パラメータ：ガス：Ｏ２、流れ＝１５ｓｃｃｍ；Ａｒ，流れ＝３０ｓｃｃｍ、コイルへの電力＝２００Ｗ、プラテンへの電力＝５０Ｗ）により、ＰＭＭＡを選択エッチングする；工程１１）サンプルをＫＩ：Ｉ２：Ｈ２Ｏ（１００ｇ：２５ｇ：５００ｇ）の中に１分間置くことにより金を除去し、ＤＩ水中で１分間濯ぐ；工程１２）イソプロパノールの中に１時間浸漬することにより、ＰＭＭＡ膜をシリコンウエハから剥離する。
【００２０】
図６は、矩形（幅０．０５５ｍｍ）の孔を有するＰＭＭＡ膜を示している。図７において、膜は円形の孔を備えている。
【００２１】
＜ＰＭＭＡ層＞
当該装置は、３層のＰＭＭＡを含むことができ、その厚さは、各層について０．５〜１ｍｍの範囲である。これらをマイクロミリングにより加工して、３ｍｍ×３ｍｍの側部（この寸法は膜の寸法に拘束され、該膜がこのチャンバの寸法よりも大きく製造されれば、それに従ってこのチャンバの寸法も調節されなければならない）及び深さ０．１ｍｍで、外部に接続されるマイクロチャンネル（０．２５〜０．５ｍｍ幅、及び０．１〜０．２５ｍｍ深さ）に連結された入口及び出口を備えたマイクロチャンバを得ることができる。これら層における１〜３ｍｍの範囲の二つの孔もまた製造され、組み立ての際に整列孔として使用される。
【００２２】
０．２５、０．５及び１ｍｍの直径、並びに８０００及び１００００ｒｐｍの回転速度を有する器具を使用したマイクロミリングにより、異なる層が製造される。８０ｍｍ／分の供給速度、並びに０．１及び０．２５ｍｍの切断深さを使用することができる。
【００２３】
＜マイクロ流体チャンバアセンブリ＞
ＰＭＭＡ層及び膜を一緒に接合して、マイクロ流体チャンバを組み込んだ単一の部品を作製することができる。
【００２４】
接合プロセスは、ＵＶ支援または溶媒支援による接合であることができる。これら二つのプロセスは、ＰＭＭＡ層をＵＶ下に（７０〜１４０秒）、またはエタノール中（１５〜２０分）に置くことを含むことができる。この後、ＰＭＭＡ層及び膜は、一緒に組み立てられ、エタノールが用いられた場合には４５℃において、ＵＶが用いられた場合には８５℃において１〜２時間加圧（５〜１５ｋＮ）することができる。
図８は、異なる装置構成の実際の写真である。
【００２５】
＜マイクロ流体装置のバイオ官能化＞
生体親和性により特定の細胞型を単離するために、バイオ官能化によって特異的抗体を膜表面に結合することが可能である。例えば、腫瘍細胞は、抗ＥＰＣＡＭビオチン化抗体を結合することによって単離することができる。該バイオ官能化は、種々の試薬及びバイオ分子を上部マイクロ流体チャンバの中に注入することにより、組み立てられたマイクロ流体装置上で行うことができる。
【００２６】
バイオ官能化は、ＰＭＭＡ表面がアミノ化されるプロセスを含むことができる。その後、このマイクロ流体装置を、ビオチン化された抗体によってバイオ官能化することができる。二つの異なるプロトコルを使用してＰＭＭＡをアミノ化することができ、これは図９Ａ及び図９Ｂに概略的に提示されている。
【００２７】
図９Ａの第一の方法において、ＰＭＭＡは、先ずその内部に室温でイソプロパノール（９９％）を注入することにより洗浄され、次いでＤＩ水中で洗浄される。引き続き、１００ｍＭの「ホウ酸緩衝液」ｐＨ１１．５中の１０％「ヘキサメチレンジアミン」を当該装置の内部に注入し、２時間インキュベートし、続いてＤＩ水で１０分間の洗浄工程を行う。最後に、当該装置を３０℃で一晩放置して乾燥させる。
【００２８】
図９Ｂの第二の方法では、当該装置は、その内部にＮａＯＨ（１０％ｗ／ｖ）、続いてエタノール５０％（ｖ／ｖ）を注入することにより洗浄される。次いで、１ｇ／ｌのジポリビニルアルコールの溶液を１０分間、続いて１％ジＮａＩＯ４を１時間、室温で当該装置に注入する。引き続き、１００ｍＭの「ホウ酸緩衝液」ｐＨ１１．５の中の１０％「ヘキサメチレンジアミン」を注入し、２時間インキュベートする。最後に、ｐＨ１１．５及び８．２の「ホウ酸緩衝液」の溶液で、当該装置をそれぞれ１５分間洗浄する。
【００２９】
このアミノ化の後、当該装置をＤＩ水中のビオチン（２ｍｇ／ｍｌ）、ＥＤＣ（１０ｍｇ／ｍｌ）及びＮＨＳ（１５ｍｇ／ｍｌ）と共に４℃で２時間インキュベートする。その後、「リン酸緩衝溶液」（ＰＢＳ）中のストレプトアビジン（２ｍｇ／ｍｌ）を、上部チャンバ内において４℃で１時間インキュベーションすることにより、当該装置のビオチン化された表面上に固定化する。この操作のために、５００μｌのＰＢＳ中のストレプトアビジン１ｍｇ及び１．６３μｌのナトリウムアジドが用いられる。その後、ＰＢＳ溶液中において前記ビオチン化された抗体を調製し、０．１％アルブミンを含有する０．２ｍｇ／ｍｌのトリスｐＨ７．３と共に一晩インキュベートする。各官能化工程の後に、当該装置をＰＢＳで洗浄する。以下の図は、バイオ官能化工程の概略図を示している。
【００３０】
＜当該装置の作用原理＞
当該装置は、異なる種の細胞を含有する生物学的サンプルを取り扱うことができる。また、全血または希釈もしくは前処理された血液を使用して、白血球及び腫瘍細胞から赤血球を枯渇させることも可能である。クラスター形成を回避するために、血液中に抗凝固剤を用いることが示唆される。前記生物学的サンプルは、血液中で希釈されることができる。
【００３１】
当該装置は、ピペットを使用することにより、またはそれをシリンジポンプに接続することにより、生物学的サンプルを直接注入することによって使用することができる。第一の方法は、外部設備を必要としないが、小容量（最大で１０マイクロリットル）のサンプルを取り扱うことのみを可能にする。第二の方法は、当該装置を扱うために外部設備を必要とするが、１ｍｌまでのより大容量の取り扱いを可能にする。
より大きな容積を取り扱うために、幾つかの装置を並列で接続することが可能である。
【００３２】
第一のプロトコルは、ピペットを使用して、前記マイクロ流体装置に生物学的サンプルを充填することからなる。該ピペットに生物学的サンプルを充填し、これを当該装置の上部チャンバの入口に接続し、前記サンプルを該マイクロ流体装置の中に注入する。後続の工程は、小さい細胞及びデブリが重力で膜を通過することを可能にするために１０秒待つべきである。１０秒後に、再度、サンプルを交互に吸引および注入することが数回必要とされる。この工程は、サンプルを装置の中で振動させることを可能にする。次いで、細胞は重力により膜を通過させるために、再度１０秒間放置される。これらの操作は、望ましいサンプル純度に到達するまで反復されるべきである。次いで、この濾過されたサンプルは、これに接続されたシリンジを用いて高流量（１ｍｌ／分の範囲）で流し、下部チャンバの入口及び出口を詰まらせることにより、上部チャンバから回収することができる。
【００３３】
第二のプロトコルは、当該マイクロ流体装置が外部流体設備及びシリンジポンプに接続されるときに使用できる。該プロトコルは、以下の工程において説明することができる。
【００３４】
１）前記装置は、サンプル入口（図１１−１ａ：Ｏｕｃ及びＯｂｃにおける弁は閉じられ、サンプル入口の弁は開かれる）、上部チャンバ（図１１−１ｂ：Ｏｂｃ及びサンプルにおける弁は閉じられ、Ｏｕｃにおける弁が開かれる）及びに下部チャンバ（図１１−１ｃ：Ｏｕｃ及びサンプル入口における弁は閉じられ、Ｏｂｃにおける弁が開かれる）に１ｍｌ／分の流量で充填することにより、緩衝液でプライミングされる。
【００３５】
２）生物学的サンプルは、シリンジを使用すること、及びこれを徐々に押し出すことにより、サンプル入口ポートを通して注入される（図１１−２ａ：サンプル入口及びＯｂｃにおける弁は開かれ、Ｏｕｃにおける弁は閉じられる）。
【００３６】
３）容積１マイクロリットルの緩衝液が注入され、前記上部チャンバ〜前記下部チャンバへと前記生物学的サンプルを押し出して、該サンプルを１〜１０μｌ／分の流量で濾過する（図１１−２ｂ：Ｏｕｃ及びサンプル入口における弁が閉じられ、Ｏｂｃにおける弁が開かれる）。
【００３７】
４）１マイクロリットル容積の緩衝液を、１００〜１０００μｌ／分の流量で交互に５〜１０回注入及び吸引して、前記生物学的サンプルを振動させる（図１１−２ｃ：Ｏｕｃ及びサンプル入口における弁が閉じられ、Ｏｂｃにおける弁は開かれる）。
【００３８】
５）操作３及び操作４を、前記生物学的サンプルの全容積が濾過されるまで反復する。
【００３９】
６）１００〜１０００μｌ／分の流量で１ｍｌの緩衝液を流すことにより、上部チャンバ内の前記濾過されたサンプルを回収する（図１１−３ａ：Ｏｂｃ及びサンプル入口における弁が閉じられ、Ｏｕｃにおける弁が開かれる）。
【００４０】
７）１００〜１０００μｌ／分の流量で１ｍｌの緩衝液を流すことにより、下部チャンバ内の前記濾過されたサンプルを回収する（図１１−３ｃ：Ｏｕｃ及びサンプル入口における弁が閉じられ、Ｏｂｃにおける弁が開かれる）。
【００４１】
このようなプロトコルを使用すれば、手動プロトコルを使用することにより９５％の純度を、また自動化プロトコルを使用することにより９７％の純度を得ることが可能である。事実、０．５ｍｌのＰＢＳ中に希釈された１５０．０００赤血球細胞／μｌ及び２．５００腫瘍細胞／μｌで構成されたサンプルを使用することにより、上記パーセンテージの赤血球を腫瘍細胞から枯渇させることが可能であった。
【００４２】
他の実施形態も、以下の特許請求の範囲内に含まれる。
【図１】
2017515472.tif 000003
【図２】
2017515472.tif 000004
【図３】
2017515472.tif 000005
【図４】
2017515472.tif 000006
【図５】
2017515472.tif 000007
【図６】
2017515472.tif 000008
【図７】
2017515472.tif 000009
【図８】
2017515472.tif 000010
【図９】
2017515472.tif 000011
【図１０】
2017515472.tif 000012
【図１１】
2017515472.tif 000013
【国際調査報告】
2017515472.tif 000014
2017515472.tif 000015