(57)【要約】本発明は、患者の生物学的サンプルにおいてフィブリンクロットの、その安定性を反映する構造プロファイルを動的に測定するための方法であって：ａ）無希釈の生物学的サンプルを組織因子と、または組織因子および組織プラスミノーゲン活性化因子の混合物と混合するステップ；ｂ）ステップａ）で得られた混合物をインキュベートし、次いで、フィブリンクロットの形成を開始させるため、得られた混合物にカルシウムイオンを加えるステップ；ｃ）ステップｂ）で形成過程にあるクロットの濁度または光学密度を、４５０ｎｍ〜８５０ｎｍの間の少なくとも２つの波長で１〜３５分の時間測定するステップ；ｄ）式τ．λ５＝Ａ［Ｆｇ］．（λ２−Ｂ）によってプロトフィブリルの数、密度および半径で表された、解析されたクロットの構造プロファイルを決定するステップ；およびｅ）得られたプロファイルをコントロールと比較するステップを含む方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者由来の生物学的サンプルにおいてフィブリンクロットの、その安定性を反映する構造プロファイルを決定するための方法であって、
ａ）前記無希釈の生物学的サンプルを組織因子およびリン脂質と混合するステップ、
ｂ）ステップａ）で得られた前記混合物をインキュベートし、次いでクロットの形成を開始させるため、得られた前記混合物にカルシウムイオンを加えるステップ、
ｃ）ステップｂ）で形成されている前記クロットの濁度または光学密度を、４５０ｎｍ〜８５０ｎｍの間の少なくとも２つの波長で１〜３５分の時間測定するステップ、および、
ｄ）好ましくはプロトフィブリルの数、密度および半径で表され、かつ式τ．λ５＝Ａ［Ｆｇ］．（λ２−Ｂ）によって計算された、ｃ）で解析した前記クロットの構造プロファイルを決定するステップであって、
式中、τは特定の波長λでの前記クロットの濁度または濁度における光学密度の表現であり、［Ｆｇ］はフィブリノーゲンの初期重量濃度であり、ＡおよびＢはそれぞれ、前記クロットを構成する線維の密度および半径に比例する係数である、ステップ、
を含む方法。
【請求項２】
ステップａ）において、前記組織因子および前記リン脂質は、プラスミノーゲン活性化因子、好ましくは組織プラスミノーゲン活性化因子の溶液と前混合され、次いで前記全混合物は前記無希釈の生物学的サンプルに加えられることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップａ）の前記混合物の前記組織因子は、前記無希釈の生物学的サンプルとの前記混合物中のその最終濃度が０．０１〜２０ｐＭ、好ましくは０．１〜５ｐＭ、好ましくは１〜５ｐＭであるような量で存在することを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記組織因子の前記組織プラスミノーゲン活性化因子との前記混合は、それぞれの重量比［ｔ−ＰＡ／ＴＦ］８００〜１７００、または０．１〜５ｐＭのＴＦ、好ましくは１〜５ｐＭのＴＦに対して７５〜１５０ｎｇ／ｍｌのｔ−ＰＡの比で行われることを特徴とする、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
ステップａ）の前記混合物は、少なくとも１種の二価カチオン、好ましくはカルシウムイオンを含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記生物学的サンプルは、血液サンプル、血漿サンプル、多血小板血漿もしくは乏血小板血漿のサンプル、または血小板マイクロパーティクル、赤血球もしくは他の任意の細胞を含む血漿のサンプル、好ましくは乏血小板血漿のサンプルであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記生物学的サンプルは、５μｌ〜５００μｌ、好ましくは５０μｌ〜４００μｌ、好ましくは５０μｌ〜３００μｌ、好ましくは１００μｌ〜３００μｌ、好ましくは約２００μｌの量を有することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記プラスミノーゲン活性化因子はフィブリンに対して親和性を有することを特徴とする、請求項２〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ステップｂ）は、ステップａ）で得られた前記混合物を３０℃〜４０℃の温度で６０秒から４００秒、好ましくは２００秒から３５０秒の時間インキュベートするステップを含むことを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップｂ）はトロンビン生成およびクロットの形成を開始させることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップｃ）の濁度または光学密度の前記測定は、極値に最も近い少なくとも２つの波長、好ましくは５４０ｎｍおよび７６０ｎｍで、好ましくは同時に行われることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ステップｃ）の濁度または光学密度の前記測定は、組織因子のみを用いて１分から３５分、好ましくは約１５分の時間、組織因子と組織プラスミノーゲン活性化因子との混合物を用いて好ましくは約３０分の時間行われることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
少なくともステップｃ）およびｄ）は自動診断装置、好ましくは凝固アナライザーで行われることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
患者由来の生物学的サンプルを用いて出血（ｂｌｅｅｄｉｎｇ）、血栓症または再血栓症のリスクを予測するための方法であって、
ａ）前記無希釈の生物学的サンプルを組織因子およびリン脂質と混合するステップ、
ｂ）ステップａ）で得られた前記混合物をインキュベートし、次いでクロットの形成を開始させるため、得られた前記混合物にカルシウムイオンを加えるステップ、
ｃ）ステップｂ）で形成されている前記クロットの濁度または光学密度を、４５０ｎｍ〜８５０ｎｍの間の少なくとも２つの波長で１〜３５分の時間測定するステップ、および、
ｄ）式τ．λ５＝Ａ［Ｆｇ］．（λ２−Ｂ）によって、ｃ）で解析した前記クロットのプロファイルを決定するステップであって、
式中、τは特定の波長λにおける前記クロットの濁度であり、［Ｆｇ］はフィブリノーゲンの初期重量濃度であり、ＡおよびＢはそれぞれ、前記クロットを構成する線維の密度および半径に比例する係数である、ステップ、および、
ｅ）ｄ）で得られた前記プロファイルをコントロールと比較するステップ、
を含む方法。
【請求項１５】
請求項２〜１３のいずれか一項に記載の特徴を有することを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ステップｅ）の後に、前記患者の臨床状況に最も好適な抗凝固薬を選択するステップｆ）であって、前記臨床状況は心房細動または別の心機能障害、癌または別の悪性状態もしくは前癌状態、および静脈または動脈血栓のリスクから選択される、ステップｆ）を含むことを特徴とする、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
ステップｅ）のコントロールは、
−  １人または複数の健常人由来の生物学的サンプル、好ましくは標準血漿、
−  患者の状態を模倣するための１つまたは複数の品質管理サンプル由来の生物学的サンプル、
−  出血性患者由来の生物学的サンプル、
−  血栓症患者由来の生物学的サンプル、および、
−  再血栓症に罹患している患者由来の生物学的サンプル、
から選択されることを特徴とする、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的サンプルにおいてフィブリンクロットの、その安定性を反映する構造を動的に測定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液凝固は、特に：
−  トロンビンの生成を担う組織因子、および
−  トロンビンの活性化の下でフィブリンに変換されるフィブリノーゲン
を含むいくつかの因子が関わる複雑な現象である。
【０００３】
フィブリンは、その集積により、出血を止めるクロットの形成を引き起こす。
【０００４】
血液凝固は、プラスミン生成を担うプラスミノーゲンを含む様々な化合物により制御される。実際、フィブリンにより形成されたクロットは、プラスミンの作用下で溶解される。これが線維素溶解である。線維素溶解は、クロット形成後に始まる場合、クロット安定性および出血または血栓のリスクにおいて重要な役割を果たしている。トロンビン−フィブリン結合とプラスミン−フィブリン結合が同時に開始される場合、対象組織の内因性線溶能によってトロンビン−フィブリン結合とプラスミン−フィブリン結合との間に、したがってフィブリン形成と溶解との間に競合が存在する。
【０００５】
患者の出血または血栓のリスクを評価するために非常に多くの方法が、長年にわたって記載されてきた。これらの方法は、トロンビン生成（ＴＧ：ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）および／またはプラスミン生成（ＰＧ：ｐｌａｓｍｉｎ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、線維素溶解、クロットの粘弾性特性（トロンボエラストグラフィーまたはＴＥＧ）またはその光学的特性（比濁法）に基づく。利用可能な方法の中で、部分トロンボプラスチン（ＰＴＴまたはａＰＴＴ）など一部の方法は、電磁的方法で粘度を測定することを含み、出血または血栓のリスクに伴う臨床重症度を決定するには正確ではない（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）。凝固性低下表現型および凝固性亢進表現型を有する患者を調査するには、多用途の診断ツールとしてトロンビン生成アッセイ（ＴＧＡ：ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）が知られている。光学的方法によるトロンビン生成能の評価に関しては、サンプルからフィブリノーゲンおよび血小板を除去する必要がある。発色法または蛍光によるＴＧの測定には、長い測定時間（９０分）用の専用機器、およびシグナルを解析して解釈するための特定のソフトウェアの使用が必要とされる。したがって、発色法または蛍光によるＴＧの測定は、調査に使用されている。
【０００６】
ＴＧはトロンビンで停止する。このためＴＧは、フィブリンクロットの安定性も、溶解に対するその抵抗性も反映しない。ＴＧにフィブリンクロットの品質の測定を結び付けると、処置の有効性を評価するための追加情報が得られる（非特許文献６）。特に、クロットの構造は出血および血栓のリスクの重要な決定因子である（非特許文献７、非特許文献８）。周術期輸血または臨床判断には、電子測定（ＴＥＧ）または光学的測定（ＲＯＴＥＭ）を用いたトロンボエラストグラフィーによる凝固中のクロットの粘弾性特性の決定がリアルタイムで使用される。しかしながら、この方法にはそのよく知られた再現性の欠如という難点があり、複数のサンプルの日常的な管理には好適ではない。
【０００７】
他の方法に関しては、かさばった特定の設備を使用するものであり、試験を自動化することができず、大量のサンプルを必要とするので、その実施は、研究所に限られる。
【０００８】
特に、２つの蛍光基質を用いてトロンビン生成およびプラスミン生成を同時に測定するための試験（新規止血アッセイＮＨＡ：Ｎｏｖｅｌ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ  Ａｓｓａｙ）について記載されたことがあるが、ＴＧ専用の蛍光光度計でしか行うことができない（（非特許文献９）（特許文献１））。フィブリンクロットの品質を反映させるためｔ−ＰＡを添加して改変した、２つの試験ＴＧＡおよびＴＥＧの組み合わせでは、追加情報が得られる（非特許文献６）ものの、その実施は、２種の特定の機器でしか行うことができず、実用的でない。利用可能な構造解析法（電子顕微鏡、共焦点顕微鏡、電気泳動光散乱、Ｘ線小角散乱（ＳＡＸＳ：ｓｍａｌｌ−ａｎｇｌｅ  Ｘ−ｒａｙ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）または小角中性子散乱（ＳＡＮＳ：ｓｍａｌｌ−ａｎｇｌｅ  ｎｅｕｔｒｏｎ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ））を使用して、フィブリンクロットの構造が線維素溶解に対する感受性に与える作用をモニターできるけれども、これらの方法は自動化することができず、実行するには長時間かかり複雑である。
【０００９】
利用可能な比濁法および光散乱法は、フィブリノーゲンおよびトロンビン精製系に限られる。
【００１０】
近年、クロット形成中のフィブリンクロットのナノ構造（線維の半径、１線維あたりのプロトフィブリルの数、プロトフィブリル間の距離および線維の密度を含む）を定量的に決定するのに、多波長分光光度法という物理的方法が提案されているが、この方法は手作業であり、大量のサンプル量（６００μｌ）を必要とするうえ、測定時間の長さ（９０分）、および通常の機器のすべての波長が利用できるとは限らないことによって自動化に適さない（非特許文献１０、非特許文献１１）。
【００１１】
多くの研究から、精製系（トロンビン＋フィブリノーゲン）の試験とトロンビンがｉｎ  ｓｉｔｕで生成される状況との間では、細胞および他のタンパク質の存在によりＴＧおよびフィブリン形成が変化するため、フィブリンクロットの形成に根本的相違が存在することが示されている。
【００１２】
最後に、フィブリン形成の光学的プロファイルの解析（または「波形解析」）を行うことができるが、この解析は依然として定性的で面倒である。
【００１３】
以上のように、従来技術の方法は、出血（ｂｌｅｅｄｉｎｇ）、血栓症または再血栓症のリスクを予測することを目的として一般的なやり方でフィブリンクロット安定性を測定できない。これらの方法の大部分は、以下の理由から調査または患者のベッドサイドでの使用に備えられている。
−  これらの方法は、血漿フィブリノーゲンの妨害のため精製サンプルに、またはトロンビンの血漿への付加後のフィブリン形成段階に限定される、
−  これらの方法は、特殊な設備、大量の血漿、およびかなり多くの専門知識を必要とする、
−  これらの方法は、再現性および実用性に欠けており、時間がかかりすぎて行うことができない、および／または
−  これらの方法は、フィブリンクロットの安定性または溶解に対するその抵抗性を反映しない。
【００１４】
よって、患者由来のサンプルを用いてフィブリンクロットの、その安定性を反映する構造プロファイルを決定するための方法であって、前記患者の止血リスクを予測することができる方法が求められている。現在標準的な方法と考えられている共焦点顕微鏡による調査方法しかこれを可能にできないためである（非特許文献１２）。
【００１５】
こうした方法はさらに、サンプルにおける線維素溶解を定量的に測定することも可能にするはずであり、行うのに信頼性が高く、自動化され、再現性があり、簡便かつ迅速でなければならない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】国際公開第２０１１／０５７１４３号
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】ＪＪ．ｖａｎ  Ｖｅｅｎ，Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  ２００８
【非特許文献２】Ｍ．Ａｄａｍｓ，Ｓｅｍｉｎ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈｅｍｏｓｔ  ２００９
【非特許文献３】Ｍ．Ｓｍｉｄ，Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ２０１１
【非特許文献４】Ｅ．Ｃａｓｔｏｌｄｉ，Ｔｈｒｏｍｂ  Ｒｅｓ  ２０１１
【非特許文献５】Ｏ．Ｒ．Ｚｅｋａｖａｔ，Ｃｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ２０１３
【非特許文献６】Ｙ  Ｄａｒｇａｕｄ，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ  ２０１１
【非特許文献７】Ｗｏｌｂｅｒｇ，Ｂｌｏｏｄ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２００７
【非特許文献８】Ｗｏｌｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｆｕｓ  Ａｐｈｅｒ  Ｓｃｉ  ２００８
【非特許文献９】Ａ．ｖａｎ  Ｇｅｆｆｅｎ，Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ２０１１
【非特許文献１０】Ｃ．Ｙｅｒｏｍｏｎａｈｏｓ，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊ  ２０１０
【非特許文献１１】Ｔｈｅｓｉｓ  Ｏｃｔｏｂｅｒ  １２，２０１１，ａｎｄ  ＡＴＶＢ  ２０１２
【非特許文献１２】ＪＰ．Ｃｏｌｌｅｔ，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ．２０００
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、非精製サンプルにおいて止血リスクを予測でき、かつ線維素溶解を定量的に測定できる方法を開発した。この方法はさらに、フィブリンクロットの構造決定の自動化も可能にする。本方法は、行うのに信頼性が高く、簡便かつ迅速であるうえ、再現性がある。最後に、本発明は、フィブリンクロットの安定性と共にトロンビン生成により得られる情報を増加させる。
【００１９】
したがって本発明は、患者由来の生物学的サンプルにおいてフィブリンクロットの、その安定性を反映する構造プロファイルを決定するための方法であって、以下のステップ：
ａ）無希釈の生物学的サンプルをある組織因子およびリン脂質と混合するステップ。組織因子およびリン脂質は、任意にプラスミノーゲン活性化因子、好ましくは組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）との混合物中にあってもよい；
ｂ）ステップａ）で得られた混合物を特に３７℃でインキュベートし、次いでクロットの形成を開始させるため、得られた混合物にカルシウムイオンを加えるステップ；
ｃ）ステップｂ）で形成過程にあるクロットの濁度または光学密度を、４５０ｎｍ〜８５０ｎｍの間の少なくとも２つの波長で１〜３５分の時間測定するステップ；および
ｄ）好ましくは式τ．λ５＝Ａ［Ｆｇ］．（λ２−Ｂ）によってプロトフィブリルの数、密度および半径で表された、ｃ）で解析したクロットのプロファイルを決定するステップであって、
式中、τは特定の波長λでのクロットの濁度または濁度における光学密度の表現であり、［Ｆｇ］はフィブリノーゲンの初期重量濃度であり、ＡおよびＢはそれぞれ、クロットを構成する線維の密度および半径に比例する係数であるステップ
を含む方法に関する。
【００２０】
こうした方法は、対象患者の出血（ｂｌｅｅｄｉｎｇ）、血栓症または再血栓症のリスクを予測することを可能にし、これは、特に実施例６に記載されているように非常に短時間（すなわち１時間未満）である。実際、様々な正常血漿、凝固低下および亢進血漿、ならびに線溶低下および亢進血漿のプロトフィブリルの数により、これらの血漿を、トロンビン生成、フィブリン形成および溶解中のそれらの構造プロファイルに基づき３０分で区別することができる。
【００２１】
凝固亢進プロファイル、正常プロファイルおよび凝固低下プロファイル間の識別は、プロトフィブリルの数、プラトーに達する時間およびプラトーに達する速度に基づく。
【００２２】
クロットの安定性を反映するプロトフィブリルのプラトーは、組織因子およびｔ−ＰＡの存在下、凝固亢進プロファイル、正常プロファイルおよび凝固低下プロファイルでそれぞれ２０分超、１０〜２０分および１０分未満持続する。プロトフィブリルのプラトーは、凝固低下血漿中の抗ＦＸａ抗凝固薬（リバーロキサバン）の濃度に応じて比例的に短縮し、線溶低下血漿中のプラスミノーゲン活性化因子阻害剤（ＰＡＩ−１）の濃度に応じて比例的に長くなる。
【００２３】
プロトフィブリルのプラトーの下り勾配が大きいほど、溶解が速くなる；これは線溶亢進血漿（ＰＡＩ−１が欠乏またはリバーロキサバンを含む）に当てはまる。一方、クロットが溶解に対して抵抗性を示す場合、下り勾配はゼロになる；これは、凝固亢進血漿（プロテインＳまたは組織因子阻害剤ＴＦＰＩが欠乏）に当てはまる。
【００２４】
実施例に示すように、プロテインＳが欠乏している凝固亢進血漿の１つを除くすべてのサンプルで、完全溶解に相当するプロトフィブリルの消失に３３分で到達する。
【００２５】
「フィブリンクロットのプロファイル」という用語は、前記クロットの、その安定性を反映する構造を意味することを意図する。本発明による方法は、形成されるクロットの構造、特にクロットを構成するプロトフィブリルの数、その密度およびその半径を決定することを可能にする。
【００２６】
本発明による方法は、患者由来の単純な生物学的サンプルを使用する。本発明ではこの生物学的サンプルを無希釈で使用する。好ましくは、生物学的サンプルは、血液サンプル、血漿サンプル、多血小板血漿もしくは乏血小板血漿のサンプル、または血小板マイクロパーティクル、赤血球もしくは他の任意の細胞を含む血漿のサンプルである。好ましくは、生物学的サンプルは乏血小板血漿（ＰＰＰ：ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｐｏｏｒ  ｐｌａｓｍａ）のサンプルである。この場合には、サンプルは、特に、１８〜２２℃の温度自動調節付き遠心分離機にて２０００〜２５００ｇの速度で１５分間、患者の血液サンプルを含むクエン酸塩管を遠心分離することにより得られる。サンプルを保存しなければならない場合、以下のプロトコルを使用してもよい：
−  血漿を速やかにデカントして、白血球および血小板の細胞層の上方約０．５ｃｍの血漿を残す；
−  血漿を溶血管またはプラスチック管に回収する；
−  この管を再び、１８〜２２℃の温度自動調節付き遠心分離機にて２０００〜２５００ｇの速度で１５分間、遠心分離する；
−  ０．５〜１ｍｌの画分を、管の底部（細胞残屑）を採取することなくアリコートに分ける；次いで
−  アリコートを−７０℃、より好ましくは−８０℃で速やかに凍結させる。
【００２７】
本発明では無希釈の生物学的サンプルが少量で使用される。好ましくは、生物学的サンプルは、５μｌ〜５００μｌ、好ましくは５０μｌ〜４００μｌ、好ましくは５０μｌ〜３００μｌ、好ましくは１００μｌ〜３００μｌ、好ましくは約２００μｌの量を有する。こうした量は、通常の機器解析には実際に十分であるが、サンプル量と最終量の比が守られる（すなわち約２：３の比）ならば、減らしてもよい。患者のベッドサイドで使用されるマイクロシステムの場合、こうした量は、この量比の制約が守られるのであれば、さらに減らしてもよい。
【００２８】
ステップａ）は、無希釈の生物学的サンプルを組織因子およびリン脂質と混合するステップを含む。無希釈の生物学的サンプルは、血漿の場合、好ましくはそのまま使用される。生物学的サンプルは、好ましくは半精製されたまたは精製された、組織因子（ＴＦ：ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ）、好ましくはヒト組織因子およびリン脂質（ＰＬ：ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）と混合する。
【００２９】
前記組織因子およびＰＬは好ましくは、特にフィブリンに対して親和性を有するプラスミノーゲン活性化因子、好ましくは組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）の溶液と前混合され、次いで全混合物を無希釈の生物学的サンプルに加える。この場合には、ＴＦおよびリン脂質を最初に、ｔ−ＰＡの溶液と混合することにより溶液中に再溶解させ、次いで得られた混合物を無希釈の生物学的サンプルに加える。
【００３０】
好ましくは使用されるプラスミノーゲン活性化因子は、フィブリンに対して親和性を有する。好ましくは、使用されるプラスミノーゲン活性化因子はｔ−ＰＡ、特に、ベーリンガーインゲルハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）によりＡｃｔｉｌｙｓｅ（登録商標）という名称で販売されているアルテプラーゼである。フィブリン特異的ストレプトキナーゼ誘導体などフィブリンに対して親和性を有する任意の活性化因子を使用してもよい。
【００３１】
ステップａ）の混合物は、混合物中に２〜５μＭのリン脂質濃度、好ましくは約４μＭの濃度を含んでもよい。
【００３２】
好ましくは、ＴＦは、無希釈の生物学的サンプルとの混合物中のその最終濃度が０．０１〜２０ｐＭとなるような量で使用される。
【００３３】
好ましくは、ＴＦは、無希釈の生物学的サンプルとの混合物中のその最終濃度が０．１〜５ｐＭ、好ましくは１〜５ｐＭとなるような量で使用される。
【００３４】
ｔ−ＰＡが存在する場合、ｔ−ＰＡは、ＴＦおよび無希釈の生物学的サンプルとの混合物中のその最終濃度が０．１〜０．３μｇ／ｍｌ、好ましくは０．１〜０．２μｇ／ｍｌとなるような量で使用される。
【００３５】
好ましくは、ステップａ）の組織因子（ＴＦ）における組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）の混合は、それぞれの重量比［ｔ−ＰＡ／ＴＦ］８００〜１７００、好ましくは１０００〜１３００で行われる。様々なサンプルを区別するため、実施例６では組織因子およびｔ−ＰＡをそれぞれ２ｐＭおよび１５０ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用した。好ましくは、ｔ−ＰＡおよびＴＦは、０．１〜５ｐＭのＴＦ、好ましくは１〜５ｐＭのＴＦに対して７５〜１５０ｎｇ／ｍｌのｔ−ＰＡの比で使用される。
【００３６】
ステップａ）の混合物は、少なくとも１つの二価カチオン、好ましくはカルシウムイオンをさらに含んでもよい。カルシウムイオンは、１５〜２０ｍＭの最終濃度、好ましくは１７ｍＭの最終濃度で存在してもよい。
【００３７】
好ましくは、本発明による方法のステップａ）は、
ａ１）リン脂質と任意のカルシウムとの溶液にＴＦを導入するステップ、次いで
ａ２）ａ１）で得られた溶液を無希釈の生物学的サンプルと混合するステップ
を含む。
【００３８】
あるいは、好ましくは、本発明による方法のステップａ）は、
ａ１）ＴＦの溶液にｔ−ＰＡを導入するステップ、
ａ２）ａ１）で得られた溶液にリン脂質を加え、任意にカルシウムを加えるステップ、次いで
ａ３）ａ１）またはａ２）で得られた溶液を無希釈の生物学的サンプルと混合するステップ
を含む。
【００３９】
ステップａ）の終了時に、凝固中の構造プロファイルを決定するための、無希釈の生物学的サンプルと少なくともＴＦの混合物が得られ、クロットの安定性プロファイルおよび溶解中の構造プロファイルを決定するための、無希釈の生物学的サンプルと少なくともＴＦおよびｔ−ＰＡの混合物が得られる。
【００４０】
次いで、トロンビン生成およびクロットの形成を開始させるため、ステップａ）で得られた混合物をインキュベートし、次いで、得られた混合物に少なくとも１つの二価カチオン、好ましくはカルシウムイオンを加えるステップｂ）が続く。優先的には、ステップｂ）は、トロンビン生成およびクロットの形成を開始させる。
【００４１】
したがってステップｂ）は、ステップａ）で得られた混合物をインキュベートするステップを含む。このインキュベーションは典型的には、３０℃〜４０℃、好ましくは約３７℃の温度にて機器で６０秒から４００秒、好ましくは２００秒から３５０秒、好ましくは３００秒の時間行ってもよい。このインキュベーション時間は、特にマイクロシステムを使用した場合、量の減少に伴い短くしてもよい。次いで、インキュベートした混合物に二価カチオン、好ましくはカルシウムイオンを加える。これらのカルシウムイオンは、約０．１Ｍの濃度のＣａＣｌ２溶液の形態で加えてもよい。
【００４２】
トロンビン生成およびフィブリンクロットの形成は、ＴＦの存在下でカルシウムなどの二価カチオンの添加により開始させる。
【００４３】
次いで、フィブリンクロットの構造は、４５０ｎｍ〜８５０ｎｍの間の少なくとも２つの波長で１〜３５分の時間濁度を測定することにより、ステップｃ）中に動的に、言い換えれば２秒またはそれ未満ごとにモニターされる。好ましくは、濁度測定は、極値に最も近い少なくとも２つの波長、たとえば５４０ｎｍおよび７８０ｎｍ、またはより好ましくは５４０ｎｍおよび７６０ｎｍで行われる。好ましくは、濁度測定は、測定に最適である少なくとも２つの波長で同時に、たとえば５４０ｎｍおよび７８０ｎｍで同時に、またはより好ましくは５４０ｎｍおよび７６０ｎｍで同時に行われる。好ましくは、ステップｃ）の測定時間は、凝固プロファイルおよび溶解プロファイルのどちらも１分から３５分、好ましくは１０から３５分である。ステップｃ）の測定時間は好ましくは、凝固プロファイル（ＴＦ単独）で約１５分、および溶解プロファイル（ＴＦ＋ｔ−ＰＡ）で約３０分である。
【００４４】
こうして、この間にフィブリンクロットの構造は、特に変動し得るプロトフィブリルの形成、半径および密度を通して解析される。
【００４５】
フィブリンクロットの構造はさらに、４５０ｎｍ〜８５０ｎｍの間の少なくとも２つの波長で１〜３５分の時間光学密度を測定することにより、ステップｃ）中に動的にモニターしてもよい。好ましくは、光学密度測定は、極値に最も近い少なくとも２つの波長、たとえば５４０ｎｍおよび７８０ｎｍ、またはより好ましくは５４０ｎｍおよび７６０ｎｍで行われる。好ましくは、光学密度測定は、行われる測定に最適である少なくとも２つの波長で、たとえば５４０ｎｍおよび７８０ｎｍで同時に、またはより好ましくは５４０ｎｍおよび７６０ｎｍで同時に行われる。好ましくは、ステップｃ）の測定時間は、凝固プロファイルおよび溶解プロファイルのどちらも１分から３５分、好ましくは１０〜３５分である。ステップｃ）の測定時間は好ましくは、凝固プロファイル（ＴＦ単独）で約１５分、および溶解プロファイル（ＴＦ＋ｔ−ＰＡ）で約３０分である。
【００４６】
光学密度測定に適用可能な特定の波長λにおけるｔ時でのτの表現は、式τ（ｔ）＝［ＯＤ（ｔ）−ＯＤ（ｉｎｉ）］ｌｎ（１０）による対数で表され、ＯＤ（ｔ）およびＯＤ（ｉｎｉ）はそれぞれｔ時の光学密度および初期光学密度（ｔ＝０の）である。ｃ）で解析したクロットのプロファイルの決定は、クロットの構造をその光学的特性に関連付けるモデルを用いて、好ましくは式τ．λ５＝Ａ［Ｆｇ］．（λ２−Ｂ）により得られる。ここでτは、特定の波長λにおけるクロットの濁度であり、［Ｆｇ］はフィブリノーゲンの初期重量濃度であり、ＡおよびＢはそれぞれ、クロットを構成する線維の密度および半径に比例する係数である。
【００４７】
この濁度または光学密度の測定は、任意の既存の機器を用いて、特に濁度計または分光光度計を用いて行ってもよい。好ましくは、この測定は自動診断装置、好ましくは凝固アナライザーで動力学的に行われる。より優先的には、この測定は、スターゴグループ（Ｓｔａｇｏ  ｇｒｏｕｐ）製のＳＴＡ−Ｒ（登録商標）Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｓｅｒｉｅｓ自動装置で行われる。この自動装置はさらに、光学的マイクロシステムと共に使用してもよい。
【００４８】
最後に、ステップｃ）で調査されるクロットのプロファイルは、クロットの構造をその光学的特性に関連付けるモデルによって決定される。好ましくは、このモデルは、下記式によって濁度を構造に関連付けるものであり（非特許文献１０）：
τ．λ５＝Ａ［Ｆｇ］．（λ２−Ｂ）
式中：
τは特定の波長λにおけるクロットの濁度であり、
［Ｆｇ］はフィブリノーゲンの初期重量濃度であり、
ＡおよびＢはそれぞれ、クロットを構成する線維の密度および半径に比例する係数である。
【００４９】
こうしてステップｄ）中に、時間の関数として、フィブリンクロットの構造に関する、したがってその特性に関する情報が得られる。
【００５０】
この情報を用いて、凝固および線維素溶解中のクロットの構造の、その安定性を反映したモニタリングが得られる。こうして、生物学的サンプルが解析された患者の出血（ｂｌｅｅｄｉｎｇ）、血栓症または再血栓症のリスクを予測することが可能になり、公知の止血危険因子である患者の内因性フィブリノーゲン濃度が考慮に入れられているため、一層そうなる。
【００５１】
「再血栓症」という用語は、患者が既に血栓症に罹患しており、再発を回避するため特定の経過観察の対象である場合に使用される。
【００５２】
特に、本発明による方法の少なくともステップｃ）およびｄ）は、自動診断装置、好ましくは凝固アナライザーで行われる。
【００５３】
より優先的には、本発明による方法のすべてのステップは、こうした自動装置で行われる。より優先的には、本発明による方法は、スターゴグループ製のＳＴＡ−Ｒ（登録商標）Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｓｅｒｉｅｓ自動装置で行われる。こうした自動装置は、サンプルの充填、混合物の調製およびインキュベーションの実施を同時に行い、少なくとも２つの波長で光学密度を測定して、複数のサンプルから得られたクロットのプロファイルを同時に決定することを可能にする。全プロセスは、凝固について約１５分、および凝固に続く線維素溶解について約３０分で行われる。これにより、本発明による方法は、患者の出血または血栓のリスクを予測する迅速で信頼性が高く再現性のある方法になる。本方法は、通常の機器で使用することができ、フィブリンクロットの、その安定性の反映である構造と共にトロンビン生成により得られる情報を補う一方、この構造は、共焦点顕微鏡によってのみ利用可能であり、定性的である。
【００５４】
本発明の対象はさらに、患者由来の生物学的サンプルを用いて出血（ｂｌｅｅｄｉｎｇ）、血栓症または再血栓症のリスクを予測するための方法であって、以下のステップ：
ａ）無希釈の生物学的サンプルを組織因子およびリン脂質と混合するステップ；
ｂ）ステップａ）で得られた混合物をインキュベートし、次いでクロットの形成を開始させるため、得られた混合物にカルシウムイオンを加えるステップ；
ｃ）ステップｂ）で形成されているクロットの濁度または光学密度を、４５０ｎｍ〜８５０ｎｍの間の少なくとも２つの波長で１〜３５分の時間測定するステップ；および
ｄ）式τ．λ５＝Ａ［Ｆｇ］．（λ２−Ｂ）によってｃ）で解析したクロットのプロファイルを決定するステップであって、
式中、τは、特定の波長λでの式τ（ｔ）＝［ＯＤ（ｔ）−ＯＤ（ｉｎｉ）］ｌｎ（１０）に従って計算されたクロットの濁度または光学密度であり、［Ｆｇ］はフィブリノーゲンの初期重量濃度であり、ＡおよびＢはそれぞれ、クロットを構成する線維の光学密度および半径に比例する係数であるステップ、ならびに
ｅ）ｄ）で得られたプロファイルをコントロールと比較するステップ
を含む方法である。
【００５５】
ステップａ）〜ｄ）は上記の通りである。特に、ステップａ）は、上述の通りプラスミノーゲン活性化因子、好ましくは組織プラスミノーゲン活性化因子を加えるステップをさらに含んでもよい。
【００５６】
ステップｅ）は、対象の患者由来の生物学的サンプルで得られたプロファイルと、コントロールで得られたプロファイルとの間の比較に相当する。前記コントロールは、特に：
−  １人または複数の健常人由来の生物学的サンプル、好ましくは標準血漿、
−  患者の状態を模倣するような１つまたは複数の品質管理サンプル由来の生物学的サンプル。これは、未処理である、または実施例１と同様に患者の状態を模倣するため、凝固または線維素溶解の特定の因子が血漿に欠乏するように処理した正常血漿のプールから作られた１つまたは複数の品質管理サンプルであってもよい、
−  出血性患者由来の生物学的サンプル、
−  血栓症患者由来の生物学的サンプル、または
−  特に実施例６と同様に再血栓症に罹患している患者由来の生物学的サンプル、
であってもよい。
【００５７】
この簡便なステップｅ）により、対象の患者の血栓症または出血のリスクを直接かつ迅速に低下させることが可能になり、実施例６に示すようにクロットの安定性に影響を与える患者の内因性フィブリノーゲン濃度が考慮に入れられているため、一層そうなる。
【００５８】
好ましくは、こうした方法は、ステップｅ）の後に、前記患者の臨床状況に最も好適な抗凝固薬を選択するステップｆ）であって、前記臨床状況は心房細動または他の任意の心機能障害；癌または他の任意の悪性状態もしくは前癌状態；および静脈または動脈血栓のリスクであるステップｆ）を含む。好ましくは、前記患者の臨床状況は、心房細動；癌；および静脈または動脈血栓のリスクから選択される。
【００５９】
使用してもよい抗凝固薬の中で好ましくは、ヘパリン（未分画ヘパリンまたは低分子量ヘパリン）およびその誘導体（フォンダパリナックス、イドラパリナックス、エノキサパリン、チンザパリン、ナドロパリンなど）；ビタミンＫアンタゴニスト（ＶＫＡ：ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）、たとえばクマリン誘導体（アセノクマロール、ワルファリンまたはフルインジオンなど）；トロンビン阻害剤、たとえばヒルジン、ビバリルジン、キシメラガトラン、ダビガトランまたはオジパルシル；第Ｘａ因子阻害剤、たとえばリバーロキサバン、オタミキサバン、アピキサバン、ベトリキサバンまたはエドキサバンが選択される。
【００６０】
ＶＫＡは、非弁膜性心房細動に罹患している患者の脳卒中および全身性塞栓症の予防に使用される。直接経口抗凝固薬（トロンビン阻害剤または第Ｘａ因子阻害剤）は、モニタリングが限定され、かつ高い出血のリスクを有するＶＫＡの初期順応期を回避することを可能にする。直接経口抗凝固薬はさらに、低分子量ヘパリンの非経口注射の処方を回避することも可能にすることで、深部血栓症および肺塞栓症の外来処置を容易にする。直接経口抗凝固薬は、整形外科手術の静脈血栓塞栓性疾患の予防において、腎不全でも肝不全でもない若年被検者のヘパリン処置の代替手段である。本方法は、新しい分子の主な有害作用が出血イベント（特に消化領域、およびむしろ医学的適用における）、特にその後の手術の後遺症における血栓塞栓性イベントに関連しているため、前記患者の臨床状況に最も好適な抗凝固薬を選択することを可能にする。
【００６１】
癌に罹患している患者の血栓塞栓性イベントの処置は、連続的経口投与を用いずに、３〜６ヶ月投与される低分子量ヘパリンに基づく。低分子量ヘパリンは、出血を増加させることなく血栓塞栓の再発を５０％著しく低下させる。本方法は、前記患者に最も好適な低分子量ヘパリンおよび用量を選択することを可能にする。その理由は：
ｉ）処置中の血栓塞栓性イベント再発の発生率は依然として高く、処置の３または６ヶ月後に約７％である。発生率は癌の非存在下より存在下で高く、
ｉｉ）再発があった場合、低分子量ヘパリンの用量は、効果的で忍容性が良好であり得るため１０％増加させることができる
ためである。
【００６２】
以下の例は、本発明の種々の実施形態を説明するために示す。
【００６３】
図の説明文を以下に示す。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】正常血漿、凝固低下血漿（ヘパリン加コントロール血漿０．２ＩＵ／ｍｌ）および凝固亢進血漿（プロテインＳが欠乏したコントロール血漿）について、プロトフィブリルの数の測定を時間の関数として示す。
【図２】正常血漿（コントロール血漿ＣＣＮおよび正常プールＰＮ）、凝固低下血漿（ＦＶＩＩＩ：Ｃが先天的に欠乏した血漿ＤＥＦ  ＶＩＩＩ）および凝固亢進血漿（プロテインＳが欠乏した血漿ＤＰＳ）について、プロトフィブリルの数の測定を時間の関数として示す。
【図３】正常血漿（コントロール血漿ＣＣＮおよび正常プールＰＮ）、凝固低下血漿（ＦＶＩＩＩ：Ｃが先天的に欠乏した血漿ＤＥＦ  ＶＩＩＩ）および凝固亢進血漿（プロテインＳが欠乏した血漿ＤＰＳ）について、プロトフィブリルの数の測定を時間の関数として示す。Ａ：１００ｎｇ／ｍｌのｔ−ＰＡ；Ｂ：１５０ｎｇ／ｍｌのｔ−ＰＡ；Ｃ：１７５ｎｇ／ｍｌのｔ−ＰＡ。
【図４】１５０ｎｇ／ｍｌのｔ−ＰＡと共にそれぞれ２．５２ｇ／ｌ、２．３２ｇ／ｌ、３．３４ｇ／ｌおよび２．５０ｇ／ｌのフィブリノーゲンを含む４種の正常コントロール血漿について、プロトフィブリルの数の測定を時間の関数として示す。
【図５】１５０ｎｇ／ｍｌのｔ−ＰＡを含む、９種のコントロール血漿（Ｎ−ＣＣＮ  ５５８７〜Ｎ−ＣＣＮ  ５５９４の血漿）、正常コントロール血漿（Ｃ−ＣＣＮ）および凝固亢進コントロール血漿（Ｃ−ＤＰＳ）について、プロトフィブリルの数の測定を時間の関数として示す。
【図６ａ】正常血漿（Ｎｏｒｍａｌ）、凝固低下血漿（ヘパリン加コントロール血漿０．２ＩＵ／ｍｌ）および凝固亢進血漿（プロテインＳが欠乏した血漿）について、２波長、３波長、７波長または２０波長でのプロトフィブリルの数の測定を時間の関数として示す。
【図６ｂ】正常コントロール血漿について、５４０ｎｍの波長と、５４０ｎｍおよび７８０ｎｍの２つの光波長と、連続スペクトルとでのプロトフィブリルの数の測定を時間の関数として示す。
【図７】正常コントロール血漿（ＳＴＡ  ＣＯＡＧ  ＣＯＮＴＲＯＬ  Ｎ）、正常プール（ＮＯＲＭＡＬ  ＰＯＯＬ）、凝固低下コントロール血漿（ＳＴＡ  ＨＥＰＡＲＩＮ  ＣＯＮＴＲＯＬ  ２）および凝固亢進コントロール血漿（ＳＴＡ  ＤＥＦＩＣＩＥＮＴ  ＰＳ）について、停止時のプロトフィブリルの数の測定を、そのプロファイルの決定にわたり患者のフィブリノーゲン割合における変化の関数として示す。
【図８】正常コントロール血漿（ＳＴＡ  ＣＯＡＧ  ＣＯＮＴＲＯＬ  Ｎ）、正常プール（ＮＯＲＭＡＬ  ＰＯＯＬ）、凝固低下コントロール血漿（ＳＴＡ  ＨＥＰＡＲＩＮ  ＣＯＮＴＲＯＬ  ２）および凝固亢進コントロール血漿（ＳＴＡ  ＤＥＦＩＣＩＥＮＴ  ＰＳ）について、停止時のプロトフィブリルの密度の測定を、そのプロファイルの決定にわたり患者のフィブリノーゲンの割合における変化の関数として示す。
【図９】正常コントロール血漿（ＳＴＡ  ＣＯＡＧ  ＣＯＮＴＲＯＬ  Ｎ）、正常プール（ＮＯＲＭＡＬ  ＰＯＯＬ）、凝固低下コントロール血漿（ＳＴＡ  ＨＥＰＡＲＩＮ  ＣＯＮＴＲＯＬ  ２）および凝固亢進コントロール血漿（ＳＴＡ  ＤＥＦＩＣＩＥＮＴ  ＰＳ）について、停止時のプロトフィブリルの密度の測定を、そのプロファイルの決定にわたり患者のフィブリノーゲンのレベルの変化の関数として示す。
【図１０】正常コントロール血漿（ＳＴＡ  ＣＯＡＧ  ＣＯＮＴＲＯＬ  Ｎ）、正常プール（ＮＯＲＭＡＬ  ＰＯＯＬ）、凝固低下コントロール血漿（ＳＴＡ  ＨＥＰＡＲＩＮ  ＣＯＮＴＲＯＬ  ２）および凝固亢進コントロール血漿（ＳＴＡ  ＤＥＦＩＣＩＥＮＴ  ＰＳ）について、停止時のプロトフィブリルの密度の測定を、そのプロファイルの決定にわたり患者のフィブリノーゲンのレベルの変化の関数として示す。
【図１１】ｔ−ＰＡを含まない９種の正常血漿（Ｎ−ＣＣＮ  ５５８７〜Ｎ−ＣＣＮ  ５５９４の血漿）、正常コントロール血漿（Ｃ−ＣＣＮ）および凝固亢進コントロール血漿（Ｃ−ＤＰＳ）について、プロトフィブリルの数の測定を時間の関数として示す。
【図１２】ｔ−ＰＡを含まない０ＡＵ／ｍｌ、２０ＡＵ／ｍｌおよび４０ＡＵ／ｍｌのＰＡＩ−１の血漿（それぞれＰ−ＰＡＩ  ４Ａ、４Ｂおよび４Ｃ）、ＰＡＩ−１が欠乏した血漿（Ｐ−ＤＰＡＩ）、正常コントロール血漿（Ｃ−ＣＣＮ）および凝固亢進コントロール血漿（Ｃ−ＤＰＳ）について、プロトフィブリルの数の測定を時間の関数として示す。
【図１３】ｔ−ＰＡを含まない０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌおよび２００ｎｇ／ｍｌのリバーロキサバンの過負荷を有する血漿（それぞれＰ−Ｒ０、Ｐ−Ｒ１００およびＰ−Ｒ２００）、ＴＦＰＩが欠乏した血漿（Ｐ−ＤＴＦＰＩ）、正常コントロール血漿（Ｃ−ＣＣＮ）および凝固亢進コントロール血漿（Ｃ−ＤＰＳ）について、プロトフィブリルの数の測定を時間の関数として示す。
【図１４】１５０ｎｇ／ｍｌのｔ−ＰＡを含む９種の正常血漿（Ｎ−ＣＣＮ  ５５８７〜Ｎ−ＣＣＮ  ５５９４の血漿）、正常コントロール血漿（Ｃ−ＣＣＮ）および凝固亢進コントロール血漿（Ｃ−ＤＰＳ）について、プロトフィブリルの数の測定を時間の関数として示す。
【図１５】１５０ｎｇ／ｍｌのｔ−ＰＡを含む０ＡＵ／ｍｌ、２０ＡＵ／ｍｌおよび４０ＡＵ／ｍｌのＰＡＩ−１の血漿（それぞれＰ−ＰＡＩ  ４Ａ、４Ｂおよび４Ｃ）、ＰＡＩ−１が欠乏した血漿（Ｐ−ＤＰＡＩ）、正常コントロール血漿（Ｃ−ＣＣＮ）および凝固亢進コントロール血漿（Ｃ−ＤＰＳ）について、プロトフィブリルの数の測定を時間の関数として示す。
【図１６】１５０ｎｇ／ｍｌのｔ−ＰＡを含む０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌおよび２００ｎｇ／ｍｌのリバーロキサバンの過負荷を有する血漿（それぞれＰ−Ｒ０、Ｐ−Ｒ１００およびＰ−Ｒ２００）、ＴＦＰＩが欠乏した血漿（Ｐ−ＤＴＦＰＩ）、正常コントロール血漿（Ｃ−ＣＣＮ）および凝固亢進コントロール血漿（Ｃ−ＤＰＳ）について、プロトフィブリルの数の測定を時間の関数として示す。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００６５】
本発明による方法の実施
実験プロトコル
後述される例には、以下のプロトコルを使用する：
・プロトコルＡ（比較の、手作業による方法）：
以下を１ｍｌの分光光度計キュベットに手作業で加える：
−  ６６７μｌの純粋な血漿のサンプル、
−  １６７μｌの［ＴＦ  １〜５ｐＭの最終濃度＋ＰＬ  ４μＭの最終濃度］混合物。
【００６６】
次いでこれを手作業で撹拌する。
【００６７】
それを３７℃で６００秒間インキュベートする。
【００６８】
１６７μｌのＣａＣｌ２を１６．７ｍＭの最終濃度で手作業にて加える。
【００６９】
これを手作業で撹拌する。
【００７０】
最後に、プロトフィブリルの数を４５０ｎｍ〜８５０ｎｍの２０波長で９０分間の時間の関数として測定する。
【００７１】
・プロトコルＢ（ｔ−ＰＡを含まない、組織因子を用いたＳＴＡ−Ｒ（登録商標）による方法）：
ＳＴＡ−Ｒ（登録商標）Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｓｅｒｉｅｓ自動装置（スターゴ）の８つのキュベットに、この機器により同時に：
−  ２００μｌの純粋な血漿のサンプル、
−  ５０μｌの［ＴＦ  ２〜５ｐＭの最終濃度＋ＰＬ  ４μＭの最終濃度］混合物
を加える。
【００７２】
自動装置のアームによって撹拌し、３７℃で３００秒間インキュベーションを行う。
【００７３】
次いで自動装置により５０μｌのＣａＣｌ２を１６．７ｍＭの最終濃度で加え、開試薬の針によって撹拌する。
【００７４】
最後に、自動装置により５４０ｎｍおよび７８０ｎｍの２波長でプロトフィブリルの数を１５分間の時間の関数として測定する。
【００７５】
・プロトコルＣ（ｔ−ＰＡを含む、組織因子およびプラスミノーゲン活性化因子を用いたＳＴＡ−Ｒ（登録商標）による方法）：
ＳＴＡ−Ｒ（登録商標）Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｓｅｒｉｅｓ自動装置（スターゴ）の８つのキュベットに、この機器により同時に：
−  ２００μｌの純粋な血漿のサンプル、
−  ５０μｌの［ＴＦ  ２〜５ｐＭの最終濃度＋ＰＬ  ４μＭの最終濃度＋ｔＰＡ  ０．１〜０．２μｇ／ｍｌの最終濃度］混合物
を加える。
【００７６】
自動装置のアームにより撹拌し、３７℃で３００秒間インキュベーションを行う。
【００７７】
次いで自動装置により５０μｌのＣａＣｌ２を１６．７ｍＭの最終濃度で加え、開試薬の針によって撹拌する。
【００７８】
最後に、自動装置により５４０ｎｍおよび７８０ｎｍの２波長でプロトフィブリルの数を３０分間の時間の関数として測定する。
【００７９】
実施例１−  正常、凝固低下および凝固亢進の３種のコントロール血漿を用いたフィブリンの構造プロファイル：
１ａ）プロトコルＡ：手作業による方法
以下：
−  ６６７μｌの純粋な血漿：正常（凍結正常プール）、凝固低下（ヘパリン加コントロール血漿０．２ＩＵ／ｍｌ）または凝固亢進（プロテインＳ欠乏コントロール血漿）のサンプル、
−  １６７μｌの［ＴＦ  ２ｐＭの最終濃度＋ＰＬ  ４μＭの最終濃度］混合物
を１ｍｌの分光光度計キュベットに手作業で加え、
続いて手作業で撹拌する。
【００８０】
それを３７℃で６００秒間インキュベートする。
【００８１】
１６７μｌのＣａＣｌ２を１６．７ｍＭの最終濃度で手作業にて加え、混合物を手作業で撹拌する。
【００８２】
最後に、プロトフィブリルの数を４５０ｎｍ〜８５０ｎｍの２０波長で９０分間の時間の関数として測定する。
【００８３】
結果を図１に示す。
【００８４】
様々な正常血漿、凝固低下血漿および凝固亢進血漿について、時間の関数として測定したプロトフィブリルの数により、トロンビン生成およびクロット形成中にこれらの血漿を区別することが可能になる。
【００８５】
１ｂ）プロトコルＢ：組織因子ＴＦを用いたＳＴＡ−Ｒ（登録商標）による方法
ＳＴＡ−Ｒ（登録商標）Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｓｅｒｉｅｓ自動装置（スターゴ）の８つのキュベットに、この機器により同時に：
−  ２００μｌの純粋な血漿（ｐｕｒｅ）：正常（Ｃｏａｇ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｎコントロール血漿および凍結正常プール）、凝固低下（ヘパリン加コントロール血漿０．２ＩＵ／ｍｌ）および凝固亢進（プロテインＳ欠乏血漿およびＦＶＩＩＩ：Ｃが先天的に欠乏した血漿）のサンプル、
−  ５０μｌの［ＴＦ  ２ｐＭの最終濃度＋ＰＬ  ４μＭの最終濃度］混合物
を加える。
【００８６】
撹拌および３７℃で３００秒間のインキュベーション後、自動装置により５０μｌのＣａＣｌ２を１６．７ｍＭの最終濃度で加え、針によって撹拌する。
【００８７】
最後に、自動装置により５４０ｎｍおよび７８０ｎｍの２波長でプロトフィブリルの数を１５分間の時間の関数として測定する。
【００８８】
結果を図２に示す。
【００８９】
本例では、時間の関数としての、様々な正常血漿、凝固低下血漿および凝固亢進血漿のプロトフィブリルの数により、トロンビン生成およびクロット形成中に６分未満でこれらの血漿を区別することが可能になる。
【００９０】
この区別は、プロトフィブリルの数、プラトーに達する時間およびプラトーに達する速度に基づく。
【００９１】
１ｃ）プロトコルＣ：組織因子およびプラスミノーゲン活性化因子ＴＦ＋ｔ−ＰＡを用いたＳＴＡ−Ｒ（登録商標）による方法−ｔ−ＰＡ濃度の影響
ＳＴＡ−Ｒ（登録商標）Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｓｅｒｉｅｓ自動装置（スターゴ）の８つのキュベットに、この機器により同時に：
−  ２００μｌの純粋な血漿：正常（Ｃｏａｇ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｎコントロール血漿および凍結正常プール）、凝固低下（ヘパリン加コントロール血漿０．２ＩＵ／ｍｌ）および凝固亢進（プロテインＳ欠乏血漿およびＦＶＩＩＩ：Ｃが先天的に欠乏した血漿）のサンプル、
−  ５０μｌの［ＴＦ  ２ｐＭの最終濃度＋ＰＬ  ４μＭの最終濃度＋ｔ−ＰＡ  １００ｎｇ／ｍｌ、１５０ｎｇ／ｍｌおよび１７５ｎｇ／ｍｌの最終濃度］混合物
を加える。
【００９２】
撹拌および３７℃で３００秒間のインキュベーション後、機器により５０μｌのＣａＣｌ２を１６．７ｍＭの最終濃度で加え、針によって撹拌する。
【００９３】
最後に、自動装置により５４０ｎｍおよび７８０ｎｍの２波長でプロトフィブリルの数を３０分間の時間の関数として測定する。
【００９４】
ａ）［ｔ−ＰＡ］＝１００ｎｇ／ｍｌ
結果を図３Ａに示す。
【００９５】
ｂ）［ｔ−ＰＡ］＝１５０ｎｇ／ｍｌ
結果を図３Ｂに示す。
【００９６】
ｃ）［ｔ−ＰＡ］＝１７５ｎｇ／ｍｌ
結果を図３Ｃに示す。
【００９７】
様々な正常血漿、凝固低下血漿および凝固亢進血漿のプロトフィブリルの数により、組織因子に含まれるｔ−ＰＡ濃度に依存する時間で血漿を区別することが可能になる。この区別は、プロトフィブリルの数、プラトーに達する時間およびプラトーに達する速度、さらにプラトーの持続期間およびその勾配に基づく。
【００９８】
本例では、様々なプロファイルで１７５ｎｇ／ｍｌの濃度のｔ−ＰＡからのみ、クロットの安定性を反映するプロトフィブリルのプラトーの持続期間に３０分で到達する。
【００９９】
プロトフィブリルのプラトーの下り勾配は、溶解が速いほど大きくなり、クロットが溶解に対して抵抗性を示す場合、ゼロまたは小さい（それぞれ因子ＦＶＩＩＩ：Ｃが欠乏、およびプロテインＳ欠乏血漿）。
【０１００】
本例では、完全溶解に相当するプロトフィブリルの消失は、１７５ｎｇ／ｍｌのｔ−ＰＡで達する。
【０１０１】
実施例２−健康なドナー由来または正常止血（ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ）結果を有する患者由来の正常血漿を用いたフィブリンの構造プロファイル
２ａ）プロトコルＡ：手作業による方法
以下：
−  健康なドナー由来の４種の凍結正常血漿の純粋な血漿サンプル６６７μｌ、
−  １６７μｌの［ＴＦ  ２ｐＭの最終濃度＋ＰＬ  ４μＭの最終濃度＋ｔ−ＰＡ  １５０ｎｇ／ｍｌ］混合物
を１ｍｌの分光光度計キュベットに手作業で加え、続いて手作業で撹拌する。それを３７℃で６００秒間インキュベートする。
【０１０２】
１６７μｌのＣａＣｌ２を１６．７ｍＭの最終濃度で手作業にて加え、手作業で撹拌を行う。
【０１０３】
最後に、プロトフィブリルの数を２０波長で９０分間の時間の関数として測定する。
【０１０４】
結果を図４に示す。
【０１０５】
様々な正常血漿のプロトフィブリルの数、プラトーに達する時間およびプラトーに達する速度は、非常に接近している。一方、１５０ｎｇ／ｍｌのｔ−ＰＡ濃度のプラトーの持続期間およびその勾配は、血漿によってかなり異なる。すべての血漿でプロトフィブリルの消失に５０分で到達するとは限らない。
【０１０６】
２ｂ）プロトコルＣ：組織因子およびプラスミノーゲン活性化因子ＴＦ＋ｔ−ＰＡを用いたＳＴＡ−Ｒ（登録商標）による方法
ＳＴＡ−Ｒ（登録商標）Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｓｅｒｉｅｓ自動装置（スターゴ）の８つのキュベットに、この機器により同時に：
−  通常の止血（ｈｅｍｏｓｔａｔｉｓ）試験（クイックタイム、部分トロンボプラスチン時間、フィブリノーゲン）によって正常と見なされた患者由来の新鮮な純粋血漿のサンプル２００μｌ、
−  ５０μｌの［ＴＦ  ２ｐＭの最終濃度＋ＰＬ  ４μＭの最終濃度＋ｔ−ＰＡ  １５０ｎｇ／ｍｌの最終濃度］最適化混合物
を加える。
【０１０７】
撹拌および３７℃で３００秒間のインキュベーション後、機器により５０μｌのＣａＣｌ２を１６．７ｍＭの最終濃度で加え、針によって撹拌する。
【０１０８】
最後に、自動装置により５４０ｎｍおよび７８０ｎｍの２波長でプロトフィブリルの数を３０分間の時間の関数として測定する。
【０１０９】
・「通常の止血（ｈｅｍｏｓｔａｔｉｓ）試験によって正常と見なされた」患者由来の新鮮な血漿の止血（ｈｅｍｏｓｔａｔｉｓ）結果
【表１】
2017523413.tif 000002
結果は、図５にも示す。
【０１１０】
・プロトフィブリルの数
様々な新鮮な正常血漿のプロトフィブリルの数は、７０〜１２０に及び、プラトーに達する時間およびプラトーに達する速度は、健康なドナーの入院に関係する出血または血栓のリスクに関連して、健康なドナーより大きく変化する。
【０１１１】
プラトーの持続期間およびその勾配は、本例の最適化ｔ−ＰＡ濃度に関連して、健康なドナーより変化が少ない。
【０１１２】
すべての血漿に使用したｔ−ＰＡ濃度でプロトフィブリルの消失に３３分で到達する。これらの血漿はすべて、プロトフィブリルのプラトーに基づきプロテインＳ欠乏凝固亢進血漿と区別される。
【０１１３】
実施例３−３種の正常、凝固低下および凝固亢進コントロール血漿を用いたフィブリンの構造プロファイル：波長の影響
プロトコルＡを、以下の通り行った：
以下：
−  正常血漿（凍結正常プール）、凝固低下血漿（ヘパリン加コントロール血漿０．２ＩＵ／ｍｌ）および凝固亢進血漿（プロテインＳ欠乏血漿）の純粋な血漿サンプル６６７μｌ、
−  １６７μｌの［ＴＦ  ２ｐＭの最終濃度＋ＰＬ  ４μＭの最終濃度］混合物
を１ｍｌの分光光度計キュベットに手作業で加え、続いて手作業で撹拌する。
【０１１４】
それを３７℃で６００秒間インキュベートする。
【０１１５】
１６７μｌのＣａＣｌ２を１６．７ｍＭの最終濃度まで手作業で加え、撹拌を手作業で行う。
【０１１６】
最後に、プロトフィブリルの数を２、３、７または２０波長で９０分間の時間の関数として測定する。
【０１１７】
次いで様々な波長数で得られた結果を比較する。
【０１１８】
結果を図６に示す。
【０１１９】
曲線は、波長の数に関係なく各血漿ごとに重なり合う。したがって、通常の機器の自動方法には、少なくとも２つの波長数を選択した。
【０１２０】
実施例４−３種の正常コントロール血漿、凝固低下コントロール血漿および凝固亢進コントロール血漿を用いたフィブリンの構造プロファイル：ＳＴＡ−Ｒ（登録商標）による自動方法の反復性および再現性
組織因子ＴＦを用いたＳＴＡ−Ｒ（登録商標）によるプロトコルＢは、以下の通り使用した：
ＳＴＡ−Ｒ（登録商標）Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｓｅｒｉｅｓ自動装置（スターゴ）の８つのキュベットに、この機器により同時に：
−  ２００μｌの正常（凍結正常血漿）、凝固低下（ヘパリン加コントロール血漿０．２ＩＵ／ｍｌ、ＳＴＡ  ＨＥＰ  Ｃ２）および凝固亢進（プロテインＳ欠乏血漿、ＳＴＡ  ＤＥＦ  ＰＳ）純粋血漿サンプル、
−  ５０μｌの［ＴＦ  ２ｐＭの最終濃度＋ＰＬ  ４μＭの最終濃度］混合物
を加える。
【０１２１】
撹拌および３７℃で３００秒間のインキュベーション後、自動装置により５０μｌのＣａＣｌ２を１６．７ｍＭの最終濃度で加え、針によって撹拌する。
【０１２２】
最後に、自動装置により５４０ｎｍおよび７８０ｎｍの２波長でプロトフィブリルの数を１５分間の時間の関数として測定する。
【０１２３】
４ａ）本方法の反復性
３連続のアッセイシリーズで２４の試験を行った：
【０１２４】
結果を以下の表に示す。
【表２】
2017523413.tif 000003
【０１２５】
フィブリンの構造パラメーター：プロトフィブリルの数、半径および勾配について得られた変動係数（ＣＶ：ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｏｆ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）は、正常血漿で２．５％未満、病的血漿で５％と同等またはそれ以下であり、したがってトロンビン生成試験によって得られるものよりかなり低い。時間パラメーター（凝固時間、ゲル化時間および停止時間）、特に停止時間についてのＣＶは高くなるが、フィブリン形成または溶解時間を測定するのに使用される比濁法とは異なり、それらをクロットの構造の決定または解釈には使用しない。
【０１２６】
４ｂ）本方法の再現性
１０連続の２回の測定で２０測定を５日間連続で行った。
【０１２７】
【表３】
2017523413.tif 000004
フィブリンの構造パラメーター：プロトフィブリルの数、半径および勾配について得られた変動係数（ＣＶ）はすべて、血漿に関係なく５％未満である。時間パラメーター（凝固時間、ゲル化時間および停止時間）、特に停止時間についてのＣＶは高くなるが、フィブリン形成または溶解時間を測定するのに使用される比濁法とは異なり、それらをクロットの構造の決定または解釈には使用しない。
【０１２８】
実施例５−４種の正常血漿、凝固低下血漿および凝固亢進血漿を用いたフィブリンの構造プロファイル：患者のフィブリノーゲンの変化の、そのプロファイルの決定に対する影響
組織因子ＴＦを用いたＳＴＡ−Ｒ（登録商標）によるプロトコルＢを、以下の通り使用した：
ＳＴＡ−Ｒ（登録商標）Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｓｅｒｉｅｓ自動装置（スターゴ）の８つのキュベットに、この機器により同時に：
−  ２００μｌの正常（凍結正常血漿および凍結正常プール）、凝固低下（ヘパリン加コントロール血漿０．２ＩＵ／ｍｌ）および凝固亢進（プロテインＳ欠乏血漿）純粋血漿サンプル、
−  ５０μｌの［ＴＦ  ２ｐＭの最終濃度＋ＰＬ  ４μＭの最終濃度］混合物
を加える。
【０１２９】
撹拌および３７℃で３００秒間のインキュベーション後、自動装置により５０μｌのＣａＣｌ２を１６．７ｍＭの最終濃度で加え、針によって撹拌する。
【０１３０】
最後に、自動装置により５４０ｎｍおよび７８０ｎｍの２波長でプロトフィブリルの数を１５分間の時間の関数として測定する。
【０１３１】
計算は、フィブリノーゲンレベルのプラスマイナス２０％の変化の、各血漿のプロファイルの決定に対する影響を研究するため、これらの変化を有する各血漿ごとに行う。
【０１３２】
結果を図７〜１０に示す。
【０１３３】
フィブリンの光学密度、さらに構造もサンプルの内因性フィブリノーゲンレベルに依存する。光学密度、さらにプロトフィブリルの数および密度も、フィブリノーゲンが直線関係ｙ＝ａｘ−ｂに従って増加するにつれ一層増加する。
【０１３４】
実施例６−正常血漿、凝固低下血漿、凝固亢進血漿、線溶低下血漿および線溶亢進血漿を用いたフィブリンの構造プロファイル：正常サンプルと病的サンプルとの区別
６ａ）組織因子ＴＦを用いたＳＴＡ−Ｒ（ＳＴＡＲ）（登録商標）によるプロトコルＢ：
ＳＴＡ−Ｒ（登録商標）Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｓｅｒｉｅｓ自動装置（スターゴ）の８つのキュベットに、この機器により同時に：
−  正常な止血（ｈｅｍｏｓｔａｔｉｓ）結果を有する９例の患者由来の純粋な血漿と、ＰＡＩ−１が欠乏した凍結血漿と、０ＡＵ／ｍｌ、２０ＡＵ／ｍｌおよび４０ＡＵ／ｍｌのＰＡＩ−１の３種のコントロール血漿と、プロテインＳ欠乏血漿と、ＴＦＰＩ欠乏血漿と、０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌおよび２００ｎｇ／ｍｌのリバーロキサバンの過負荷を有する３種の血漿とのサンプル２００μｌ、
−  ５０μｌの［ＴＦ  ２〜５ｐＭの最終濃度＋ＰＬ  ４μＭの最終濃度］混合物
を加える。
【０１３５】
自動装置のアームにより撹拌し、３７℃で３００秒間インキュベーションを行う。
【０１３６】
次いで自動装置により５０μｌのＣａＣｌ２を１６．７ｍＭの最終濃度で加え、針によって撹拌する。
【０１３７】
最後に、自動装置により５４０ｎｍおよび７８０ｎｍの２波長でプロトフィブリルの数を１５分間の時間の関数として測定する。
【０１３８】
結果を図１１〜１３に示す。
【０１３９】
様々な正常血漿、凝固低下血漿および凝固亢進血漿のプロトフィブリルの数は、これらの血漿を区別することを１５分で可能にする一方、線溶低下血漿および線溶亢進血漿を他の血漿と区別することはできない。
【０１４０】
凝固亢進プロファイル、正常プロファイルおよび凝固低下プロファイルの区別は、プロトフィブリルの数、プラトーに達する時間およびプラトーに達する速度に基づく：
−  これらのパラメーターは、抗凝固薬の濃度と並行して増加することから、クロットの構造が緩くなることが立証される；
−  これらのパラメーターは、凝固亢進血漿ですべての正常血漿より低いことから、クロットがよりコンパクトな構造であることが立証される
；
−  これらのパラメーターは、ＰＡＩ−１の過負荷を有する線溶低下血漿で正常サンプルの範囲内に含まれる。トロンビン生成中に得られた情報は不十分であり、この種の血漿を区別することができない。
【０１４１】
６ｂ）組織因子およびプラスミノーゲン活性化因子ＴＦ＋ｔ−ＰＡを用いたＳＴＡ−Ｒ（登録商標）によるプロトコルＣ：
ＳＴＡ−Ｒ（登録商標）Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｓｅｒｉｅｓ自動装置（スターゴ）の８つのキュベットに、この機器により同時に：
−  正常止血（ｈｅｍｏｓｔａｔｉｓ）結果を有する９例の患者由来の純粋な血漿と、ＰＡＩ−１が欠乏した凍結血漿と、０ＡＵ／ｍｌ、２０ＡＵ／ｍｌおよび４０ＡＵ／ｍｌのＰＡＩ−１の３種のコントロール血漿と、プロテインＳ欠乏血漿と、ＴＦＰＩ欠乏血漿と、０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌおよび２００ｎｇ／ｍｌのリバーロキサバンの過負荷を有する３種の血漿のサンプル２００μｌ、
−  ５０μｌの［ＴＦ  ２〜５ｐＭの最終濃度＋ＰＬ  ４μＭの最終濃度＋ｔ−ＰＡ  １５０ｎｇ／ｍｌ］混合物
を加える。
【０１４２】
自動装置のアームにより撹拌し、３７℃で３００秒間インキュベーションを行う。
【０１４３】
次いで自動装置により５０μｌのＣａＣｌ２を１６．７ｍＭの最終濃度で加え、針によって撹拌する。
【０１４４】
最後に、自動装置により５４０ｎｍおよび７８０ｎｍの２波長でプロトフィブリルの数を３０分間の時間の関数として測定する。
【０１４５】
結果を図１４〜１６に示す。
【０１４６】
様々な正常血漿、凝固低下血漿、凝固亢進血漿、線溶低下血漿および線溶亢進血漿のプロトフィブリルの数は、トロンビン生成、フィブリン形成および溶解中のそれらの構造プロファイルに基づき、これらすべての血漿を３０分で区別することを可能にする。
【０１４７】
すべてのプロファイルの区別が、プロトフィブリルの数、プラトーに達する時間およびプラトーに達する速度、プラトーの持続期間およびその勾配に基づき得られる。
【０１４８】
クロットの安定性を反映するプロトフィブリルのプラトーは、凝固亢進プロファイル、正常プロファイルおよび凝固低下プロファイルでそれぞれ２０分超、１０〜２０分および１０分未満持続する：
−  プロトフィブリルのプラトーは、抗凝固薬による出血のリスクに関連して、凝固低下血漿の抗ＦＸａ抗凝固薬（リバーロキサバン）の濃度に応じて比例的に短縮する；
−  プロトフィブリルのプラトーは、線溶低下血漿のプラスミノーゲン活性化因子阻害剤（ＰＡＩ−１）の濃度に応じて比例的に、およびプロテインＳおよびＴＦＰＩの欠乏と共に、これらの止血（ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ）障害に伴う血栓のリスクに関連して延長する。
【０１４９】
プロトフィブリルのプラトーの下り勾配は、溶解が速いほど一層大きくなり、これは、線溶亢進血漿（ＰＡＩ−１が欠乏またはリバーロキサバンを含む）に当てはまる；クロットが溶解に対して抵抗性を示す場合、下り勾配はゼロになり、これは凝固亢進血漿（プロテインＳまたは組織因子阻害剤ＴＦＰＩが欠乏）に当てはまる。
【０１５０】
プロテインＳが欠乏している凝固亢進血漿の１つを除くすべてのサンプルで、完全溶解に相当するプロトフィブリルの消失に３３分で到達する。
【図１】
2017523413.tif 000005
【図２】
2017523413.tif 000006
【図３Ａ】
2017523413.tif 000007
【図３Ｂ】
2017523413.tif 000008
【図３Ｃ】
2017523413.tif 000009
【図４】
2017523413.tif 000010
【図５】
2017523413.tif 000011
【図６ａ】
2017523413.tif 000012
【図６ｂ】
2017523413.tif 000013
【図７】
2017523413.tif 000014
【図８】
2017523413.tif 000015
【図９】
2017523413.tif 000016
【図１０】
2017523413.tif 000017
【図１１】
2017523413.tif 000018
【図１２】
2017523413.tif 000019
【図１３】
2017523413.tif 000020
【図１４】
2017523413.tif 000021
【図１５】
2017523413.tif 000022
【図１６】
2017523413.tif 000023
【国際調査報告】
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2017523413.tif 000025
2017523413.tif 000026
2017523413.tif 000027
2017523413.tif 000028
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