(57)【要約】本明細書は、トラスツズマブに応答性である乳癌（例えば、HER2陽性乳癌）を有する哺乳動物を同定することに関する方法および材料、ならびにトラスツズマブに応答性である乳癌（例えば、HER2陽性乳癌）を有する哺乳動物を処置することに関する方法および材料を提供する。例えば、トラスツズマブに応答性である可能性がより高いHER2陽性乳癌を有する哺乳動物を同定するために発現レベルプロフィールを使用するための方法および材料が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物に由来する癌細胞が表9に記載の核酸のうち少なくとも9個について上昇した発現レベルを含むかどうかを決定する段階を含む、哺乳動物を、トラスツズマブに応答性である可能性がより高い乳癌を有すると同定するための方法であって、
該上昇したレベルの存在が、該哺乳動物がトラスツズマブに応答性である可能性がより高い乳癌を有することを示す、方法。
【請求項２】
前記哺乳動物がヒトである、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記上昇したレベルが、cDNAを介したアニーリング、選択、伸長、およびライゲーション（DASL）アッセイを用いて決定される、請求項1記載の方法。
【請求項４】
前記乳癌がHER2陽性乳癌である、請求項1記載の方法。
【請求項５】
哺乳動物を、トラスツズマブに応答性である可能性がより高い乳癌を有すると同定するための方法であって、
（a）哺乳動物に由来する乳癌細胞が表9に記載の核酸のうち少なくとも9個について上昇した発現レベルを含むかどうかを決定する段階；および
（b）試料が該少なくとも9個の核酸の上昇したレベルを含む場合に、該哺乳動物を、トラスツズマブに応答性である可能性がより高い乳癌を有すると分類する段階
を含む、方法。
【請求項６】
前記哺乳動物がヒトである、請求項5記載の方法。
【請求項７】
前記上昇したレベルが、cDNAを介したアニーリング、選択、伸長、およびライゲーション（DASL）アッセイを用いて決定される、請求項5記載の方法。
【請求項８】
前記乳癌がHER2陽性乳癌である、請求項5記載の方法。
【請求項９】
哺乳動物を、トラスツズマブに応答性である可能性がより高い乳癌を有すると同定するための方法であって、
（a）哺乳動物に由来する乳癌細胞において表9に記載の核酸のうち少なくとも9個について上昇した発現レベルの存在を検出する段階；および
（b）該上昇したレベルの存在に少なくとも部分的に基づき、該哺乳動物を、トラスツズマブに応答性である可能性がより高い乳癌を有すると分類する段階
を含む、方法。
【請求項１０】
前記哺乳動物がヒトである、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
前記上昇したレベルが、cDNAを介したアニーリング、選択、伸長、およびライゲーション（DASL）アッセイを用いて決定される、請求項9記載の方法。
【請求項１２】
前記乳癌がHER2陽性乳癌である、請求項9記載の方法。
【請求項１３】
乳癌を処置するための方法であって、
（a）哺乳動物に由来する乳癌細胞において、表9に記載の核酸のうち少なくとも9個について上昇した発現レベルの存在を検出する段階；および
（b）該哺乳動物中の乳癌細胞数が減少する条件下で、該哺乳動物にタキサン化合物およびトラスツズマブを投与する段階
を含む、方法。
【請求項１４】
前記哺乳動物がヒトである、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
前記上昇したレベルが、cDNAを介したアニーリング、選択、伸長、およびライゲーション（DASL）アッセイを用いて決定される、請求項13記載の方法。
【請求項１６】
前記乳癌がHER2陽性乳癌である、請求項13記載の方法。
【請求項１７】
前記タキサン化合物がパクリタキセルである、請求項13記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、2014年4月21日に出願された米国仮出願第61/982,251号の恩典を主張する。先願の開示は、本願の開示の一部とみなされる（および、参照により本願の開示に組み入れられる）。
【０００２】
1. 技術分野
本明細書は、トラスツズマブに応答性である乳癌（例えば、HER2陽性乳癌）を有する哺乳動物を同定することに関する方法および材料、ならびに乳癌（例えば、HER2陽性乳癌）を有する哺乳動物を処置することに関する方法および材料に関する。例えば、本明細書は、哺乳動物をトラスツズマブに応答性である乳癌（例えば、HER2陽性乳癌）を有すると同定するために発現レベルプロフィールを使用するための方法および材料を提供する。
【背景技術】
【０００３】
2. 背景情報
臨床試験は、アジュバント設定におけるトラスツズマブの有効性を実証した。しかし、HER2陽性乳房腫瘍を有する患者の20〜25％は、HER2標的化治療にもかかわらず再発する。多くの潜在的なメカニズムが、EGFR、cMYCまたはERBB3の過剰発現、PI3Kの突然変異による活性化、およびPTENの突然変異による欠失を含む、HER2標的化治療に対する異なる応答の原因であると提案された（Arteaga et al., Nat. Rev. Clin. Oncol., 9(1):16-32 (2012)（非特許文献1））。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Arteaga et al., Nat. Rev. Clin. Oncol., 9(1):16-32 (2012)
【発明の概要】
【０００５】
概要
本明細書は、トラスツズマブに応答性である乳癌（例えば、HER2陽性乳癌）を有する哺乳動物を同定することに関する方法および材料、ならびにトラスツズマブに応答性である乳癌（例えば、HER2陽性乳癌）を有する哺乳動物を処置することに関する方法および材料を提供する。例えば、本明細書は、トラスツズマブに応答性である可能性がより高いHER2陽性乳癌を有する哺乳動物を同定するために発現レベルプロフィールを使用するための方法および材料を提供する。本明細書に記載のように、哺乳動物に由来するHER2陽性乳癌試料中の表9に記載の核酸のうち少なくとも9個の上昇した発現レベルの存在は、哺乳動物（例えば、ヒト）がトラスツズマブに応答性である可能性がより高いHER2陽性乳癌を有することを示し得る。また本明細書に記載のように、乳癌を有する哺乳動物は、哺乳動物に由来するHER2陽性乳癌試料中の表9に記載の核酸のうち少なくとも9個の上昇した発現レベルの存在を検出すること、およびその哺乳動物にトラスツズマブを投与することによって、処置され得る。
【０００６】
本明細書に記載のように、哺乳動物を、トラスツズマブに応答性である可能性がより高い乳癌（例えば、HER2陽性乳癌）を有すると同定する能力を有することにより、それらの乳癌患者を正確に同定し、有効かつ信頼できる様式で処置することが可能になる。例えば、本明細書に提供される乳癌処置は、トラスツズマブに応答性である可能性がより高い乳癌（例えば、HER2陽性乳癌）を有すると同定された乳癌患者を処置するために使用され得る。
【０００７】
概して、本明細書の一局面は、哺乳動物を、トラスツズマブに応答性である可能性がより高い乳癌を有すると同定するための方法を特徴とする。この方法は、哺乳動物に由来する癌細胞が、表9に記載の核酸のうち少なくとも9個について上昇した発現レベルを含むかどうかを決定する段階を含むか、または実質的にこの段階からなり、上昇したレベルの存在は、哺乳動物がトラスツズマブに応答性である可能性がより高い乳癌を有することを示す。哺乳動物はヒトであり得る。上昇したレベルは、cDNAを介したアニーリング、選択、伸長、およびライゲーション（DASL）アッセイを用いて決定され得る。乳癌はHER2陽性乳癌であり得る。
【０００８】
別の局面において、本明細書は、哺乳動物を、トラスツズマブに応答性である可能性がより高い乳癌を有すると同定するための方法を特徴とする。この方法は、（a）哺乳動物に由来する乳癌細胞が、表9に記載の核酸のうち少なくとも9個について上昇した発現レベルを含むかどうかを決定する段階、および（b）試料が少なくとも9個の核酸の上昇したレベルを含む場合に、哺乳動物を、トラスツズマブに応答性である可能性がより高い乳癌を有すると分類する段階を含むか、または実質的にこれらの段階からなる。哺乳動物はヒトであり得る。上昇したレベルは、cDNAを介したアニーリング、選択、伸長、およびライゲーション（DASL）アッセイを用いて決定され得る。乳癌はHER2陽性乳癌であり得る。
【０００９】
別の局面において、本明細書は、哺乳動物を、トラスツズマブに応答性である可能性がより高い乳癌を有すると同定するための方法を特徴とする。この方法は、（a）哺乳動物に由来する乳癌細胞において表9に記載の核酸のうち少なくとも9個について上昇した発現レベルの存在を検出する段階、および（b）少なくとも部分的に上昇したレベルの存在に基づき、哺乳動物を、トラスツズマブに応答性である可能性がより高い乳癌を有すると分類する段階を含むか、または実質的にこれらの段階からなる。哺乳動物はヒトであり得る。上昇したレベルは、cDNAを介したアニーリング、選択、伸長、およびライゲーション（DASL）アッセイを用いて決定され得る。乳癌はHER2陽性乳癌であり得る。
【００１０】
別の局面において、本明細書は、乳癌を処置するための方法を特徴とする。この方法は、（a）哺乳動物に由来する乳癌細胞において表9に記載の核酸のうち少なくとも9個について上昇した発現レベルの存在を検出する段階；および（b）哺乳動物に、哺乳動物中の乳癌細胞数が減少する条件下で、タキサン化合物およびトラスツズマブを投与する段階を含むか、または実質的にこれらの段階からなる。哺乳動物はヒトであり得る。上昇したレベルは、cDNAを介したアニーリング、選択、伸長、およびライゲーション（DASL）アッセイを用いて決定され得る。乳癌はHER2陽性乳癌であり得る。タキサン化合物はパクリタキセルであり得る。
【００１１】
別段の定義がない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野における当業者により通常理解されるものと同じ意味を有する。本発明を実施するために、本明細書に記載されているものと類似または同等の方法および材料を用いることができるが、適当な方法および材料が以下に記載される。本明細書で言及された全ての刊行物、特許出願、特許、および他の文献は、その全体が参照により組み入れられる。矛盾がある場合は、定義を含む本明細書が優先される。加えて、材料、方法、および実施例は、単なる例示であり、限定することを意図しない。
【００１２】
本発明の1つまたは複数の態様の詳細は、添付の図面および以下の説明に記載される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】N9831多部位（multi-site）第III相試験（NCT00005970）は、3つのアーム（arm）を有した。アームAにランダムに割り当てられた患者は、ドキソルビシンおよびシクロホスファミド（AC）を受容した後、12週間、毎週パクリタキセルを受容し（化学療法のみ）、アームBおよびCの患者は、化学療法に加えて12ヶ月間トラスツズマブを受容した。アームCにおいては、パクリタキセルが、トラスツズマブ処置の最初の1ヶ月間、同時に与えられ、アームBにおいては、トラスツズマブが、パクリタキセル治療の完了後に開始された点において、アームBおよびCは相違した。トラスツズマブアームBおよびCにランダムに割り当てられた女性は、対照（化学療法のみ）アームに分けられた女性と比較して、有意に増加したDFS（p＜0.001）および全生存期間（OS）（p＜0.001）を有した。
【図２】1282試料が下流の解析に対して選択されたプロセスを記載するコンソートダイヤグラム。N9831試験に登録された3505名の患者のうち1282名（アームA: 433、アームB: 477、アームC: 372）が、DASL遺伝子発現プロファイリングに対して評価可能であった。追跡期間の中央値は、6年11ヶ月であった。この図に含まれる全ての腫瘍は、中央実験室（Mayo Clinic, Rochester, MN）において、免疫組織化学（IHC）によるHER2タンパク質の過剰発現および／または蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（FISH）による遺伝子増幅について試験され、いくつかの腫瘍は、HER2状態の中央判定（central review）の後で排除された。排除の最大の理由は、不十分な組織であった。DASL解析後の品質管理（QC）の失敗は、少数の試料を排除した。
【図３】下流の解析に含まれる1282名の患者におけるRFSのカプラン-マイヤー解析。連続と同時のトラスツズマブ化学療法のN9831比較において、同時トラスツズマブ（アームC）によるDFSは、連続トラスツズマブ（アームB）と比較して増加した。同時アーム（アームC）からのアウトカムは、連続アーム（アームB）からのものより僅かに良好であったが、有意性は、これら2つのアームの中間解析（interim analysis）に対して、予め特定されたO'ブリエン-フレミング境界（pre-specified O'Brien-Fleming boundary）にクロスしなかった（p＝0.00116）（Perez et al., J. Clin. Oncol., 29(34):4491-7 (2011)）。この図に示されるデータは、遺伝子発現を解析するために使用された1282名の患者のアウトカムが、N9831に登録された患者の全てに対して他の部分に記載されたアウトカムを要約することを示す。
【図４】表面マッピングは、qおよびmの最適値を明らかにする。100回のイテレーション（iteration）を用いた5分割交差検証（five-fold cross-validation）（CV）は、qおよびmの最適値（q分位点（quantile）を超える少なくとも1つのプローブを有する遺伝子の数m）を同定するために使用された。500回のCVイテレーショントレーニングセットの各々に対して、mが4〜10である全ての値は、0.01ずつの0.25〜0.75のq値でペアにされた。得られた357ペアのq/m値は、濃縮腫瘍および非濃縮腫瘍を決定するために使用された。カプラン-マイヤー曲線およびログランク検定は、濃縮腫瘍に対するアーム間の差に対するハザード割合およびp値を決定するために使用された。パネルAは、HRの得られたコンター（contour）を示し、パネルBは、500回のCVイテレーションのうちの代表的なもののp値を示す。最適q/mペアは、最小p値を用いて選択された。両パネルの点線は、このCVイテレーションに対する最適q/m値に対するHRおよびp値を示す。
【図５】ネットワークモデルは、N9831におけるアウトカムに関連する遺伝子間の機能的関連性を明らかにする。サイトスケイプ ファンクショナル インタラクトーム（Cytoscape Functional Interactome）ツールは、タンパク質-タンパク質および遺伝子-遺伝子の相互作用データセットを含む、複数のバイオインフォマティクスツールによって定義された機能的関係を統合する。このツールは、アームA（パネルAおよびB）またはアームB/C（パネルCおよびD）における、減少したRFS（パネルAおよびC）または増加したRFS（パネルBおよびD）のいずれかに関連するネットワークを定義するために使用された。ネットワークは、表4および表5において同定された、有意なHR（p＜0.01）を有する遺伝子を用いて構築された。単一のリンカー遺伝子の挿入は、ネットワーク構築において許可された。
【図６】免疫機能遺伝子のコホートは、トラスツズマブ処置後のアウトカムに強く関連するが、化学療法のみの後のRFSに対する効果を有さない。アームAおよびアームB/Cの腫瘍は、濃縮（enrichment）がm9q41モデルによって定義された投票（voting）モデルを用いて、免疫濃縮（immune-enriched）（IRE）および非免疫濃縮（not immune-enriched）（NIRE）に「入れられた（binned）」。パネルAは、両アームからの腫瘍の濃縮および非濃縮サブセットに対する年単位の無再発生存期間（RFS）を示す。パネルBは、両アームからの腫瘍の濃縮サブセットに対する年単位の無再発生存期間（RFS）を示す。パネルCは、両アームからの腫瘍の非濃縮サブセットに対する年単位の無再発生存期間（RFS）を示す。
【図７】免疫機能スコアモデルの交差検証。データは、5つのコホートにランダムに分割され、最適q/m組み合わせが、4つのコホートに基づき選択された。その後、このq/m関係は、腫瘍が、残りのコホートにおいて免疫濃縮（IRE）または非免疫濃縮（NIRE）されたかどうかを決定するために使用された。各腫瘍は、100回（各交差検証に対して1回）分類される。曲線は、これら100回の異なる交差検証セットに基づき観測されたRFSの結果を示し、したがって、合計n＝128200の観測（アームA.IRE 18117、アームA.NIRE 25183、アームB/C.IRE 36877、およびアームB/C.NIRE 48023）である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
詳細な説明
本明細書は、トラスツズマブに応答性である乳癌（例えば、HER2陽性乳癌）を有する哺乳動物を同定することに関する方法および材料、ならびにトラスツズマブに応答性である乳癌（例えば、HER2陽性乳癌）を有する哺乳動物を処置することに関する方法および材料を提供する。例えば、本明細書は、哺乳動物に由来する乳癌試料が、表9に記載の核酸のうち少なくとも9個について上昇した発現レベルを有するかどうかを決定することによって、哺乳動物を、トラスツズマブに応答性である可能性がより高いHER2陽性乳癌を有すると同定するための方法および材料を提供する。本明細書に記載のように、哺乳動物が、表9に記載の核酸のうち少なくとも9個について上昇した発現レベルを有する乳癌細胞（例えば、HER2陽性乳癌細胞）含む場合に、哺乳動物は、トラスツズマブに応答性である可能性がより高いHER2陽性乳癌を有すると分類され得る。
【００１５】
本明細書に使用される「上昇したレベル」との用語は、試料の母集団におけるmRNA量と比較した、所与の試料における個々のmRNA量に関する。mRNA量が、特定のmRNAに対する試料の母集団に対する0.40分位点と同じまたはそれを超える場合に、レベルは「上昇」する。概して、表9に記載の核酸の発現の範囲は、全ての試験される試料に対して定義され、最も低い分位点が0であり最も高い分位点が1.0である0〜1.0の範囲として表される。その後、所与の試料中の各核酸の発現は、母集団内の発現の分布と呼ばれ、発現レベルが0.40〜1.0の範囲内にある場合、「上昇した」と定義される。
【００１６】
本明細書に記載のように、乳癌細胞において表9に記載の核酸のうち9個以上の核酸の発現レベルは、特定の哺乳動物が、トラスツズマブに応答性である可能性がより高い乳癌（例えば、HER2陽性乳癌）を有するかどうかを決定するために使用され得る。任意の適切な乳癌試料は、トラスツズマブに応答性である可能性がより高い乳癌（例えば、HER2陽性乳癌）を有する哺乳動物を同定するために、本明細書に記載のように使用され得る。例えば、乳癌組織試料、乳癌細胞試料、および乳癌針生検標本は、哺乳動物が、トラスツズマブに応答性である可能性がより高い乳癌（例えば、HER2陽性乳癌）を有するかどうかを決定するために使用され得る。加えて、任意の適切な方法が、乳癌細胞を得るために使用され得る。例えば、乳癌試料は、組織生検または以下の外科的切除によって得ることができる。試料が得られたら、試料は、発現レベルを測定する前に処理され得る。例えば、乳癌試料は、試料からRNAを抽出するために処理され得る。RNAが得られたら、RNAは、対象となるmRNAのレベルを決定するために評価され得る。いくつかの場合において、試料中に存在する核酸は、発現レベルを決定する（例えば、アレイ技術を使用する）前に、増幅（例えば、直線的増幅）され得る。他の例において、乳癌試料は凍結され得、凍結された組織試料の切片は、ガラススライド上で調製され得る。凍結された組織切片は、解析前に貯蔵（例えば、-80℃で）され得、またはすぐに解析（例えば、対象となる特定のポリペプチドに対して特異的な抗体による免疫組織化学）され得る。
【００１７】
乳癌細胞において表9に記載の核酸のうち1個または複数個の核酸の発現レベルを決定するために、任意の適切な方法を使用することができる。例えば、特定の試料が、特定の核酸の上昇したmRNA発現レベルを含むかどうか、または特定の核酸の上昇したmRNA発現レベルを欠いているかどうかを決定するために、定量的リアルタイムPCR、インサイチューハイブリダイゼーション、またはマイクロアレイ技術が使用され得る。いくつかの場合において、発現レベルは、免疫化学技術などのポリペプチド検出方法を用いて決定され得る。例えば、FYNポリペプチドに特異的な抗体が、試料におけるポリペプチドレベルを決定するために使用され得る。いくつかの場合において、特定の試料が、特定の核酸に対して上昇したポリペプチド発現レベルを含むかどうか、または特定の核酸に対して上昇したポリペプチド発現レベルを欠失するかどうかを決定するために、ELISAおよび免疫細胞化学技術などのポリペプチドベースの技術が使用され得る。
【００１８】
本明細書に記載のように、一旦、哺乳動物に由来する乳癌細胞において表9に記載の核酸のうち少なくとも9個に対する発現レベルが決定されると、このレベルは、参照レベルと比較することができ、哺乳動物を、トラスツズマブに応答性である可能性がより高い乳癌（例えば、HER2陽性乳癌）を有するか、または有しないと分類するために使用することができる。
【００１９】
本明細書はまた、乳癌（例えば、HER2陽性乳癌）を処置するための方法および材料を提供する。いくつかの場合において、タキサン化合物（例えば、パクリタキセル、アブラキサン（Abraxane）（登録商標）、タキソール（Taxol）（登録商標）、またはドセタキセル）、およびトラスツズマブは、乳癌細胞の数または乳癌の進行が減少する条件下で、トラスツズマブに応答性である可能性がより高い乳癌（例えば、HER2陽性乳癌）を有する哺乳動物（例えば、ヒト）に投与され得る。例えば、パクリタキセルは、乳癌を有するヒトに、1週間当たり80〜100 mg/m2の投与量で投与され得、一方、トラスツズマブは、同ヒトに、1週間に1回、2 mg/kg の投与量、または3週間に1回、6 mg/kgの投与量で（負荷投与量の後に）投与され得る。いくつかの場合において、非タキサン化合物（例えば、エリブリン、カルボプラチン、またはビノレルビン）、およびトラスツズマブは、乳癌細胞の数または乳癌の進行が減少する条件下で、トラスツズマブに応答性である可能性がより高い乳癌（例えば、HER2陽性乳癌）を有する哺乳動物（例えば、ヒト）に投与され得る。
【００２０】
いくつかの場合において、乳癌を有する哺乳動物（例えば、ヒト）は、哺乳動物に由来するHER2陽性乳癌試料中の表9に記載の核酸のうち少なくとも9個の核酸の上昇した発現レベルの存在を検出すること、およびトラスツズマブを単独で、またはタキサン化合物と組み合わせて哺乳動物に投与することによって処置され得る。
【００２１】
本発明は、以下の実施例においてさらに記載されるが、これが特許請求の範囲に記載される範囲を限定することはない。
【実施例】
【００２２】
実施例1 - 上昇した発現レベルの核酸パネルは、トラスツズマブに応答性である乳癌を有する患者を同定するために使用され得る。
患者
3505名の患者がN9831（NCT 00005970）に登録され、3アームにランダムに割り当てられた。全ての患者は、アントラサイクリンに加えて、シクロホスファミド（AC）を受容した。AC治療の完了後、アームA患者は、パクリタキセルのみを受容した；アームB患者は、パクリタキセルを受容した後、トラスツズマブを受容した；およびアームC患者は、パクリタキセルおよび同時のトラスツズマブを受容した（図1）。これらの患者から、1282試料（アームA-433、アームB-477、アームC-372）が、DASL遺伝子発現プロファイリングに対して評価可能であった（図2）。この解析に含まれた1282名の患者と除かれた2223名の患者の間の臨床病理学的特徴には、いくらかの差があった（表1）；しかし、1282名の含まれた患者の3つのアーム間のアウトカムの差（図3）は、全体としては試験に対して報告されたものと類似した（Perez et al., J. Clin. Oncol., 29(25):3366-73 (2011)）。この解析の関心は、トラスツズマブ応答の根底にある生物学的基礎であるため、トラスツズマブ（アームBおよびC、アームB/Cで示される）を受容した849名の患者がプールされた。
【００２３】
（表１）DASL解析に含まれた1282試料とN9831に登録された残りの患者における患者の人口統計学データ
2017514470.tif 000002
＊  マンテル-ヘンツェルカイ二乗検定
^  カイ二乗検定
±  統計的検定に含まれない、不明
【００２４】
表1に関して、1282名の患者の人口統計学データは、下流の解析に含まれた。本明細書において報告されるアームA、B、およびCに登録された1282名の患者の臨床病理学的特徴およびアウトカムは、解析から除かれたアームA、B、およびCの2223名の患者のものと類似していた。DASL解析に含まれたこれらの間には、ER陰性患者の提示において、小さいが有意な増加があった。
【００２５】
mRNA量のDASL解析
個々の腫瘍ブロックを顕微鏡的に試験し、組織パンチを、プランジャー（Fisher Scientific）による1 mmの生検パンチを用いて、境界を画定された領域の浸潤性腫瘍から得た。総RNAを少なくとも1つの1 mm組織パンチから抽出した。パンチを、室温で30分間、Citrisolv（Fisher Scientific）中で脱パラフィンした。Citrisolvを吸引し、組織を100％エタノールで洗浄し、ボルテックスし、2回遠心分離した。エタノールを除去し、組織を37℃で10分間、乾燥させた。その後、試料を、プロテイナーゼK消化（Proteinase K Digestion）（PKD）緩衝液およびプロテイナーゼK（1μg／μl）中、56℃で一晩（少なくとも8時間）インキュベートした。消化された組織を80℃で15分間、インキュベートし、室温で2分間、遠心分離（14000 rpm）した。上清を回収し、DNase I処理を含むRNA抽出を、製造業者（QIAGEN, Valencia, CA）の指示に従って、自動化されたQIAcubeプラットフォームでのRNeasy FFPEキットを用いて完了した。精製されたRNAの濃度を、NanoDrop ND-1000分光光度計（Nanodrop Technologies; Wilmington, DE）を用いて決定した。精製された総RNAを-80℃で保存した。BeadChip（HumanRef v4 Beadchip, Illumina）の標識化およびBeadChipへのハイブリダイゼーションを、別の箇所（Ton et al., Breast Cancer Research and Treatment, 125(3):879-83 (2011)、Bibikova et al., Am. J. Pathol., 165(5):1799-807 (2004)、Li et al., Cancer Res., 66(8):4079-88 (2006)、およびReinholz et al., BMC Med. Genomics, 3:60 (2010)）に記載されているものを少し改変して行った。試料（200 ng RNA）は、17プレート、その後、136チップにわたって、日付け、RNA抽出の順序、臨床病理学的特徴、試験の年、および処置アームに従って、ランダムに割り当てられた。BeadStudioからの非バックグラウンド補正発現値は、1）p＜0.05で検出されたプローブの割合、2）四分位範囲、および3）歪度の測定基準を用いて、品質管理評価を行った（Mahoney et al., BMC Res. Notes, 6(1):33 (2013)）。加えて、アレイを正規化するために必要とされる変換の量を定量化するストレス測定基準を適用した。最小ストレス値を有する反復した患者試料を、解析のために使用した。ストレス値＞log2(1.5)を有する試料は、品質が悪いと考えられ、除去された。残りのデータは、分位点正規化を用いて正規化された。これらの試料に適用された品質評価プロトコールの詳細な説明は、別の箇所（Mahoney et al., BMC Res. Notes, 6(1):33 (2013)）に記載される。
【００２６】
プレート内およびプレート間の技術的反復は、ランダムに選択されたN9831患者試料およびユニバーサルヒューマンリファレンスRNA（Universal Human Reference RNA）（UHRR）対照試料（Ambion Life Technologies）を用いて実施された。UHRR試料は、プレート毎に二つ組で、推奨されるCV値が正確なアッセイと考慮される15％未満であるFDAおよびNCIガイドライン内に十分にある、UHRRおよび患者試料の両方（それぞれ表2および表3）に対して相関係数＞0.9で解析された。
【００２７】
（表２）UHRRおよび患者試料を用いた反復解析は、DASLプラットフォームにおいて高度な解析精度を示す。
2017514470.tif 000003
【００２８】
（表３）
2017514470.tif 000004
【００２９】
表2および表3に関して、5分位点正規化のペアワイズスピアマンの順位相関係数、34個のUHRR試料からのlog2変換データ（UHR.1 vs UHR.2と呼ばれる異なるプレートにおいてアッセイされた二つ組によりUHR01-UHR17として同定された）が、解析された。表2は、全ての他の試料に対する全ての試料の相関係数を示す。同プレートにおける二つ組試料の相関係数は、平均すると0.994（S.D.＝0.006、95％C.I. 0.98-1.00、範囲0.97-1.0）であり、一方、別々のプレートにおいて行われた二つ組の相関係数は、平均すると0.989（S.D.＝0.006、95％C.I. 0.989-0.990. 範囲0.97-1.0）であった。同様に、23個の二つ組FFPE患者試料は、同プレートにおいて二つ組で、および2つの異なるプレートにおいて2回解析された（表3）。同プレートにおいて二つ組で行われた患者試料の相関係数（.1および.3により同定された)は、平均すると0.91（S.D.＝0.052、95％C.I. 0.74-0.97、範囲0.73-0.97）であり、一方、2つの異なるプレートにおいて行われた二つ組患者試料の相関は、平均すると0.903（S.D.＝0.05 95％C.I. 0.75-0.96、範囲0.75-0.96）であった。
【００３０】
（表４）アームAにおける有意な補正されたHRを有する遺伝子
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【００３１】
表4に関して、補正されたHR＞1（p＜0.01）を有する遺伝子が、上部に示され、HR＜1（p＜0.01）を有する遺伝子が、下部に示される。コックスPH解析（有意な臨床／病理学的変数に対して補正された）は、DASLアレイからの遺伝子発現データおよび連続変数としてRFSを用いて実施された。フィルタリングは、最低20％を超え且つ最高2％を下回った全てのアームにわたって中央値発現を有したプローブを同定するために実施された。
【００３２】
コックスハザード割合（HR）の統計解析
主要エンドポイントは、ランダム化から、最初の局所性、領域性もしくは遠位の再発、または新しい対側一次乳癌の発生までの時間として定義された、無再発生存期間（RFS）であった。多変数コックスモデル（節の状態、腫瘍サイズ、ホルモン受容体の状態、年齢、および腫瘍グレードに対して補正）は、RFSと全ての遺伝子に対するプローブ発現の間の関連性を評価するために使用された。関連性は、トラスツズマブへの応答性に関わる可能性のある生物学的プロセスを理解するために、各患者群内で別々に評価された。フィルタリング基準に合い、かつ補正されたモデルp＜0.01を有するプローブは、機能解析の目的に対してRFSに有意に関連することが考慮された。コックス比例モデルは、補正変数として先に記載された予後因子を含み、これは、トラスツズマブの応答性を潜在的に予測するプローブを同定するために、全ての患者セットおよび含まれたプローブ、処置群、およびプローブ処置群交互作用タームで評価された。
【００３３】
機能解析
コックスハザード割合は、本明細書に記載のように、連続変数としてイベント（RFS）までの時間を用いたDASL解析から、全ての遺伝子に対して決定された。サイトスケイプ ファンクショナル インタラクトームツール（Matthews et al., Nucleic Acids Res., 37(Database issue):D619-22 (2009)）は、補正されたモデルp＜0.01を有するコックスハザード割合を有する遺伝子間のネットワーク関連性を定義するために使用された。ネットワークコンポーネントに関連する機能プロセスは、サイトスケイプ ファンクショナル インタラクトームツール内のパスウェイ濃縮統計機能から推定された。
【００３４】
遺伝子オントロジー生物学的プロセスタームの濃縮
機能オントロジー濃縮は、フィッシャーの直接検定を用いた遺伝子オントロジー生物学的プロセス（Gene Ontology Biological Process）（GO:BP）タームの解析によって決定された。個々のGOタームは多数の遺伝子に適用され、個々の遺伝子は多数の関連したGOタームを有し得る。遺伝子と遺伝子オントロジー（GO）タームの間のこの1対多数の関係（one-to-many relationship）は、Ensembl（http://useast.ensembl.org/biomart/martview/）でBioMartポータルからダウンロードされた。Ensemblヒューマン ジーン アノーテーション バージョン70（v70）は、遺伝子を同定するために使用された。生成したスクリプトは、各遺伝子をそれが属する全ての可能なGOタームにアサインするために使用された。これは、有意なハザード割合（HR）を有する遺伝子、ならびにv70アノーテーションにおける全ての遺伝子の両方において行われた。GOタームの各々について、フィッシャーの直接検定が、以下の数を有する2×2分割表において実施された：（1）アームAからのGOタームに属する有意なHRを有する遺伝子の数；（2）アームB/CからのGOタームに属する有意なHRを有する遺伝子の数；（3）GOタームにアサインされた全てのv70遺伝子から（1）のものを除く遺伝子の数；ならびに（4）GOタームにアサインされた全てのv70遺伝子から（2）のものを除く遺伝子の数。
【００３５】
統計解析
全体のデータセット（アームAにおいて89個、アームB/Cにおいて115個を有する、204個の再発イベント）における制限された検出力のために、決定は、有意な生成のために、試料を、分離されたトレーニングおよび検証セットに分割しないように行われた。データがトレーニングおよび検証のための2つのコホートに分割される分割試料アプローチは、ノイズのあるシグネチャを生じるシグネチャ生成のために、試料の全ての情報を使用することに失敗する（Subramanian and Simon, Stat. Med., 30(6):642-53 (2011)）。シグネチャの予備的検証について、交差検証が、以下に記載されるように使用された。
【００３６】
解析は、ネットワークおよび機能オントロジー解析によって同定されたような、トラスツズマブの応答性に関する妥当な生物学的機能を有する遺伝子に着目した。投票スキームが、HR＜1.0、補正されたモデルp＜0.01、および交互作用p＜0.05を有する遺伝子のコホートからシグネチャを生成するために使用された。生物学的プロセス内の個々の遺伝子の寄与が、腫瘍毎に様々である可能性があったため、投票スキームが、シグネチャを生成するために使用された。機能群における遺伝子のm個以上が、分位点q閾値を超えて発現された1個または複数のプローブを有した場合、腫瘍は、生物学的機能に対して濃縮されていると指定された。mおよびq値の最良のペアを決定するために、0.01のインクリメントで0.25〜0.75の間の全ての分位点の値qからなる応答表面が、検索された。各q/mペアに対して、腫瘍は、全ての試料にわたってそのプローブに対してq分位点を超える発現値を有する少なくとも1つのプローブを有するm個以上の遺伝子を有した場合に、濃縮されたと分類された。最良として選択されたq/mペアは、トラスツズマブで処置されなかった濃縮された腫瘍を有する女性と比べたトラスツズマブで処置された濃縮された腫瘍を有する女性の間のRFSの比較（q/m値に基づく投票方式によって決定）に対して、最小のp値を有した。
【００３７】
シグネチャ生成の交差検証
交差検証法は、シグネチャの観測された予測性質が一般化できるかどうかを評価するために使用された。特徴選択は、アームAおよびB/Cの間で異なった、同定された生物学的プロセスに基づいたため、特徴選択から開始する全体のプロセスの完全な交差検証を行うことは可能ではなかった。しかし、シグネチャの生成は、選択されたプローブに基づき交差検証された。
【００３８】
5分割交差検証は、腫瘍を、濃縮されたものまたは濃縮されないものに分類するための投票スキームのパフォーマンスを決定するため、および得られたシグネチャがRFSを予測し得るかどうかを決定するために、100回反復された。各交差検証の反復の間に、全ての患者は、5つの異なるコホートにランダムにアソートされた。その後、コホートの4つは、q/mグリッドを検索するq/mペアの最良セットを定義するために使用された（図4）。この様式で決定されたq/mペアは、その後、腫瘍の「外された（left out）」1/5の免疫濃縮スコアを定義するために使用された。この手順は、毎回コホートの1つを外して、5回反復された。この解析の100回の反復は、各腫瘍を免疫濃縮または非濃縮として決定した。
【００３９】
最終投票スキームの値および解析
選択されたq/m値を用いて、患者を、濃縮群と非濃縮群に分類した。カプラン-マイヤー曲線は、各群に対してRFSを要約するために使用され、ログランク検定と比較された。予後因子に対して補正され（先に記載）、および処置群、濃縮状態（投票スキームによって決定）、および処置群-濃縮状態交互作用タームを有する多変数コックスモデルは、シグネチャが予測可能であったかどうかを決定するために使用された。
【００４０】
遺伝子発現およびアウトカムの関連性
多変数コックス回帰は、アームAおよびアームB/CにおけるRFSに有意に関連する遺伝子を同定するために使用された。アームAにおいて補正されたモデルp＜0.01でRFSに関連した473個の遺伝子が、同定された（表4）。アームB/Cにおいて補正されたモデルp＜0.01でRFSに有意に関連した510個の遺伝子を同定した（表5）。
【００４１】
（表５）N9831のアームB/C（化学療法およびトラスツズマブ）において有意な補正されたHRを有する遺伝子
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【００４２】
表5に関して、p＜0.01で減少したRFS（上部）および増加したRFS（下部）に関連する遺伝子に対して補正されたHRは、本明細書に記載のように決定された。
【００４３】
機能解析
サイトスケイプ ファンクショナル インタラクトームツールは、アウトカムに有意に関連する遺伝子を用いて、4個のインタラクトームモデルを構築するために使用された（図5）。各インタラクトームマップは、ネットワーク内の他のモジュールに接続された10〜12個の高度に相互接続されたモジュール（色分けされた）を含んだ。パスウェイ濃縮統計学は、これらの4個のネットワークモデルの生物学的有意性を評価するために使用された。各ネットワークのトップスコアパスウェイは、表6に提供される。アームAにおける減少したRFS（HR＞1.0）に関連する最も有意なパスウェイは、インテグリンシグナル伝達、アンドロゲン受容体活性の同時調節、および血管平滑筋収縮であった（表6、パネルA）。アームAにおける増加したRFS（HR＜1.0）に関連するパスウェイは、mRNA転写物の形成および成熟、リボソーム、向神経活性リガンド-受容体相互作用、相同組換え、ならびに自然免疫シグナル伝達を含んだ（表6、パネルB）。
【００４４】
（表６）サイトスケイプ ネットワークからのパスウェイ濃縮統計学。有意なパスウェイは、p＜0.001およびFDR＜0.1に対してフィルタリングされた。パスウェイは、個々のパスウェイにおけるネットワークからの遺伝子の数に対してランク付けされた。
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【００４５】
トラスツズマブ処置患者（アームB/C）において、インテグリンシグナル伝達、アルツハイマー病-プレセニリンパスウェイ、およびM/G1細胞周期移行パスウェイは、減少したRFS（HR＞1.0）に関連する最も有意なパスウェイであった（表6、パネルC）。アジュバントトラスツズマブの後で増加したRFS（HR＜1.0）に関連する最も有意なパスウェイは、サイトカイン-サイトカイン受容体相互作用、CD8+ T細胞におけるT細胞受容体シグナル伝達、INF-γパスウェイ、TNF受容体シグナル伝達パスウェイ、血管内皮での細胞表面相互作用、およびクラス1 PI3Kシグナル伝達イベントを含んだ（表6、パネルD）。4／6の有意なパスウェイが免疫学的機能と関係があるという観測は、HER2陽性乳房腫瘍を有するトラスツズマブで処置された患者における、免疫応答と増加したRFSの関連性を強く示唆する。
【００４６】
遺伝子オントロジー生物学的プロセスタームは、有意なHR（補正されたモデルp＜0.01）を有する各遺伝子に対して定義された。フィッシャーの直接検定は、p＜0.01でのアームAおよびB/Cにおける有意な相違分布を示した、13個のGO生物学的プロセス記述子を同定するために使用された（表7）；最も有意なものは、免疫応答であった（GO:0006955_BP）。13個の生物学的プロセスのうち10個は、T細胞およびB細胞応答、ケモカインシグナル伝達および走化性、ならびに炎症を含む、免疫機能に関係した。これらの結果は、主要な免疫学的コンポーネントが、初期段階のHER2陽性乳癌を有するトラスツズマブ処置患者の間のRFSを予測することを示唆する。
【００４７】
アームB/Cにおいて濃縮された10個の免疫機能GOタームによって定義され（表7）、補正されたモデルp＜0.01で増加したRFS（HR＜1.0）に関連する87個の免疫機能遺伝子が、同定された（表8）。これらのプローブが潜在的に予測することを見出すために、有意な交互作用ターム（p＜0.05）を有した87個の免疫機能遺伝子の間のプローブが、選択された。これは、14個の遺伝子のリストを生じた（表9）。
【００４８】
（表７）遺伝子オントロジー（GO）タームによって定義された生物学的プロセスの解析は、アームB/Cにおける免疫機能タームの濃縮を明らかにする。13個のGO生物学的プロセスタームは、アームAと比べ、アームB/Cにおいて濃縮された。これらのうち10個は「R」で標識され、様々な免疫機能に関係した。シグナル伝達または薬物に対する応答に関連するGOタームは、それぞれ「G」および「B」で標識された。
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【００４９】
（表８）87個の免疫機能遺伝子のコホートは、N9831におけるRFSに関連する。表7に記載されるように、様々な免疫機能に関連する10個のGOタームは、アームAとアームB/Cとの比較において、濃縮されたと同定された。いずれかのアームにおける有意なHR（p＜0.01）を有する全ての遺伝子は、その後、いずれかまたは両方のアームにおけるRFSに有意に関連する87個の免疫機能遺伝子のリストを作製するために使用された。
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【００５０】
（表９）交互作用p値。表は、補正変数としての予後変数（節状態、腫瘍サイズ、ホルモン受容体状態、および腫瘍グレード）をも含む多変数コックスモデルにおいて、プローブ発現効果に対するハザード割合（HR）（HR.exprs）、処置アーム効果に対するハザード割合（HR.rand.arm）、ならびにプローブおよび処置アームの交互作用に対するハザード割合（HR interaction exprs:arm）を示す。予後補正変数は、表中に示されない。それはまた、プローブ発現に対するp値、処置アームに対するp値、プローブ-処置アーム交互作用変数に対するp値：p.exprs, p.rand.arm、およびp interaction exprs:armをそれぞれ含む。
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【００５１】
投票スキームパラメータ
応答表面解析は、q/m値の2つのユニークセットにおいて生じた。第1セットq=40およびm=9（q40m9）は、235回（47％）生じ、アームAにおいて226名（52.2％）の濃縮された患者を同定し、アームB/Cにおいて441名（51.9％）の濃縮された患者を同定した。第2セットq=58およびm=8（q58m8）は、265回（53％）生じ、アームAにおいて139名（32.1％）の濃縮された患者を同定し、アームB/Cにおいて310名（36.5％）の濃縮された患者を同定した。両セットの最適q/m値は、ほぼ均一に生じたため、q/mペアq40m9は、最適として選択された。
【００５２】
最終シグネチャ解析
最適セットのq/m値に基づき、14個の免疫機能遺伝子のうち任意の9（m）個以上が、1個または複数個のプローブに対して0.40であるかまたはそれ以上の分位点（q）発現値で発現された場合、腫瘍は、免疫濃縮されたと指定される。このシグネチャは、アームAおよびアームB/Cの腫瘍を、免疫応答濃縮（IRE）群および非免疫応答濃縮（NIRE）群に「入れる（bin）」ために使用された。アームAのIRE腫瘍とNIRE腫瘍の間のRFSにおける差は、統計学的に有意でなかった（HR＝0.90、p＝0.64、黒および赤の標識された曲線、図6A）。IRE腫瘍を有する患者は、トラスツズマブを受容しなかったIRE患者（黒の標識された曲線）と比較して、アジュバントトラスツズマブ後に有意に増加したRFSを示した（緑の標識された曲線）（HR＝0.35、p＜0.0001）。さらに、腫瘍がNIREであったトラスツズマブ処置患者のRFS（青の標識された曲線）は、化学療法のみを受容したIRE患者のRFSと有意に相違しなかった（HR＝0.89、p＝0.53）。補正変数として予後因子、免疫濃縮状態、処置群、ならびに免疫濃縮状態および処置群相互作用群タームを含む、多変数コックスモデルが評価された。このモデルにおいて、相互作用ターム値は、有意であった（p＜0.0001）。図6Bおよび図6Cは、トラスツズマブ応答における相互作用の効果を示す。化学療法のみを受容したものと比較して、トラスツズマブで処置されたIRE腫瘍を有する患者に対するRFSにおいて差がある（図6B；HR＝0.36、p＜0.0001）。トラスツズマブで処置されたNIRE腫瘍を有する患者のRFSと化学療法のみを受容したものに、差はなかった（図6C；HR＝0.98；p＝0.91）。
【００５３】
交差検証結果
シグネチャを検証するために、5分割交差検証を行った。各イテレーションに対して「外された（left out）」群における腫瘍の免疫濃縮状態が組み合わされ、そのため、試験内の全ての試料が、濃縮されたまたは非濃縮されたとアサインされた。図7は、交差検証から得られた各濃縮状態および処置群組み合わせに対するRFS曲線を示す。NIRE腫瘍に対するアームAおよびアームB/Cの間のRFSにおける差はない（HR＝0.93）が、IRE腫瘍に対するアームAおよびアームB/Cの間のRFSにおける差はある（HR＝0.32）。濃縮状態-処置群相互作用に対するp値は、公知の予後因子に対して補正された多変数コックスモデルにおいて、0.0001未満であった。
【００５４】
これらの結果は、表9に記載の14個の免疫機能遺伝子のうちの9個以上が、特定の患者に対する母集団に対して0.40またはそれ以上の分位点である場合、その患者は、アジュバントトラスツズマブでの処置後に寛解フリーの生存の可能性がより高いことを実証する。
【００５５】
実施例2 - トラスツズマブによるHER2陽性乳癌の処置
HER2陽性乳癌を有する患者が、表9に記載の14個の遺伝子のうちの9個以上が増加した発現レベルを有すると同定され、タキサン剤（例えば、パクリタキセル）およびトラスツズマブを投与される。タキサン剤は、1週間当たり80〜100 mg/m2の投与量で投与される。トラスツズマブは、（負荷投与量の後に）毎週2 mg/kgの投与量、または3週間毎に6 mg/kgの投与量で投与される。
【００５６】
他の態様
本発明はその詳細な説明と共に記載されるが、上述の記載は説明すること意図しており、特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するものではないことが理解されるべきである。他の局面、利点、および改変は、特許請求の範囲内である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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