(57)【要約】  本発明は、抗凝血性組成物に関する。特に、上記抗凝血性組成物は、魚の血液の凝固を効果的に防止することが可能である。上記抗凝血性組成物は、塩化カリウム、塩化ナトリウム、EDTA、クエン酸三ナトリウム無水物及びリン酸緩衝液を含む。【選択図】図1a
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩化カリウム、塩化ナトリウム、EDTA、クエン酸三ナトリウム無水物及びリン酸緩衝液を含む抗凝血性組成物。
【請求項２】
前記リン酸緩衝液は、二塩基性リン酸ナトリウム及び一塩基性リン酸カリウムである、請求項1に記載の抗凝血性組成物。
【請求項３】
前記塩化カリウムの量は、2.0mMから3.0mMの範囲である、請求項1に記載の抗凝血性組成物。
【請求項４】
前記塩化ナトリウムの量は、130mMから140mMの範囲である、請求項1に記載の抗凝血性組成物。
【請求項５】
前記EDTAの量は、1mMから2mMの範囲である、請求項1に記載の抗凝血性組成物。
【請求項６】
前記クエン酸三ナトリウム無水物の量は、0.10mMから0.12mMの範囲である、請求項1に記載の抗凝血性組成物。
【請求項７】
前記リン酸緩衝液の量は、0.008mMから0.012mMの範囲である、請求項1に記載の抗凝血性組成物。
【請求項８】
前記組成物のpHは、pH 7.2からpH 7.5の範囲である、請求項1に記載の抗凝血性組成物。
【請求項９】
前記組成物のオスモル濃度は、280mOsmから320mOsmの範囲である、請求項1に記載の抗凝血性組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、血液凝固を防止するための組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
温水硬骨魚種の免疫学を研究するための基本的な方法は限られている。冷水魚種と比較して、熱帯温水魚では利用可能な知識が少ない(Lin et al. 2005)。冷水魚と温水魚との相違の1つは、血液凝固の時間であり(Feeney et al. 1972; Kawatsu 1986)、より暖かい水温の魚のほうが迅速である(Huss 1993)。更に、温水海水魚は、温水淡水魚と比較して、より迅速に血液が凝固する。病原体の伝播は、温水系においてより激しくより急速であるため、温水魚は、かかる迅速な血液凝固機構を発展させて開放創による疾患感染を防止する必要がある。
【０００３】
従って、有効な抗凝血物質は、凝固、凝集及び最終的な分解から血液を防ぐために極めて必要である。血液細胞成分の形態及び機能は、保存することができるため、血液の抗凝血は非常に重要である。これは、多くの水産養殖研究(例えば性決定アッセイ、血清学的分析並びに健康分析、疾患同定、ワクチンの評価、細胞系マーカーの開発及び酵素又は内分泌学的試験)では重要な意味をもつ。
【０００４】
ヒトの血液に関しては、多くの抗凝血性試薬が、とりわけ、診断サンプルの保存を含む種々の用途のために確立されている。ヘパリン、クエン酸ナトリウム溶液及びエチレンジアミン四酢酸(EDTA)は、研究室設定において一般的に利用可能な抗凝血薬剤である。EDTAは、主に医療及び外科手術での測定に関連してオーダーされる診断的血液検査の目的でキレート化剤及び抗凝血物質として適用される。
【０００５】
抗凝血物質を報告する多くの刊行物が存在する。米国特許であるUS4090977は、広範囲の抗凝血性濃度にわたってヘマトクリット値が新鮮な血液又はヘパリン化された血液のものと同等になる比率での、ヘマトクリット値を上げる遊離酸型EDTAとヘマトクリット値を低下させる相当量の塩との混合物、好ましくはEDTAのアルカリ金属塩を含む、全血を保存するための浸透圧平衡抗凝血性混合物を開示している。
【０００６】
別の米国特許であるUS6277556は、除去療法の間、ドナーの感覚異常のリスクが著しく低く、良好な血小板収率及び細胞形態をもたらす、ドナーの全血のための新規なクエン酸塩に基づく抗凝血物質を開示している。主なクエン酸塩抗凝血性組成物は、合計クエン酸塩に対するクエン酸の比率が約30%より大きい。抗凝血物質と全血とを混合して、約5.0mM超のクエン酸濃度、約20mM未満の合計クエン酸塩濃度及び約6.75未満の初期血液pHを含む抗凝固血液混合物が得られる。この発明により収集された血液から作成されるPRP及びPCを含む血小板が豊富な製品は、保存においてより良好な血小板形態及びより良好な血小板収率を示す。しかしながら、いずれの刊行物においても、熱帯魚の血液凝固を防止することができる抗凝血性組成物については報告されていない。
【０００７】
それ故、魚の血液の凝固を防止するのに有効な抗凝血性組成物を提供する必要がある。
【発明の概要】
【０００８】
発明の開示
第一本発明の態様によって、塩化カリウム、塩化ナトリウム、EDTA、クエン酸三ナトリウム無水物及びリン酸緩衝液を含む抗凝血性組成物が提供される。
【０００９】
長所として、上記抗凝血性組成物は、魚の血液の凝固を効果的に防止することが可能である。
【００１０】
長所として、上記抗凝血性組成物は、魚の血液細胞生理学的に等張である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１ａ】図1aは、商用ヘパリン採血管及び抗凝血性組成物の血液抗凝血能力を図示する。
【００１２】
【図１ｂ】図1bは、ヘパリン及びEDTAを含むリン酸緩衝生理食塩溶液での10倍の希釈の血液に関する血液抗凝能力を図示する。
【００１３】
【図２】図2は、血液細胞のMGG染色を図示する。
【００１４】
【図３ａ】図3aは、白血球の生存可能な細胞の顕微鏡映像を図示する。
【００１５】
【図３ｂ】図3bは、LPS刺激を受けてのコロニー形成を図示する。
【００１６】
【図３ｃ】図3cは、PHA刺激を受けてのコロニー形成を図示する。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
好ましい実施態様の詳細な説明
本発明は、魚の血液の凝固を防止するための抗凝血性組成物に関する。上記抗凝血性組成物は、塩化カリウム、塩化ナトリウム、EDTA、クエン酸三ナトリウム無水物及びリン酸緩衝液を含む。
【００１８】
リン酸緩衝液は、二塩基性リン酸ナトリウム及び一塩基性リン酸カリウムの組み合わせから作成される。リン酸緩衝液の量は、0.008mMから0.012mMの範囲である。二塩基性リン酸ナトリウムの量は、9.0mMから10.5mMの範囲であり、一塩基性リン酸カリウムの量は、1.5mMから2.5mMの範囲である。
【００１９】
塩化カリウムは、2.0mMから3.0mMの範囲である。塩化ナトリウムは、130mMから140mMの範囲である。EDTAは、1mMから2mMの範囲である。クエン酸三ナトリウム無水物は、0.10mMから0.12mMの範囲である。
【００２０】
抗凝血性組成物のpHは、pH 7.2からpH 7.5の範囲である。上記組成物のオスモル濃度は、280mOsmから320mOsmの範囲である。
【００２１】
EDTA及びクエン酸三ナトリウム無水物は、キレート化剤として機能する。キレート化剤は、凝集沈降過程の主要因の1つであるカルシウムイオンを不活性化することで、血液の凝固を防止する。更に、上述した濃度のEDTA及びクエン酸三ナトリウム無水物は、ロマンスキー(Romansky)染色において人工産物を生成せず、血液細胞の凝集又は分解を最小限にすることができる。
【００２２】
長所として、上記抗凝血性組成物は、血液細胞生理学的に等張であり、血液細胞形態及び機能に対して干渉もしない。
【００２３】
長所として、上記抗凝血性組成物は、血液細胞の生存率に影響を及ぼさない。
【００２４】
長所として、上記抗凝血性組成物は、免疫血液細胞の回復を高める。
【００２５】
上記抗凝血性組成物は、ヒト、両生類又は爬虫類の血液の凝固を防止するために用いることもできる。
【００２６】
本発明は、血液凝固を防止するためのキットにも関する。上記キットは、抗凝血性組成物及び緩衝液を含む。上記抗凝血性組成物は、塩化カリウム、塩化ナトリウム、EDTA、クエン酸三ナトリウム無水物及びリン酸緩衝液を含む。
【００２７】
本発明は、更に、抗凝血性組成物を作成する方法にも関する。
【００２８】
上記方法は、第一に、塩化カリウム、塩化ナトリウム、EDTA、クエン酸三ナトリウム無水物、二塩基性リン酸ナトリウム及び一塩基性リン酸カリウムを脱イオン水に溶解して、混合物を形成するステップを有する。第二に、上記混合物のpHを所定のpHに調節するステップと、第三に、上記混合物を滅菌するステップと、を有する。あるいは、蒸留水を用いて塩化カリウム、塩化ナトリウム、EDTA、クエン酸三ナトリウム無水物、二塩基性リン酸ナトリウム及び一塩基性リン酸カリウムを溶解することができる。
【００２９】
本発明を、下記の実施例で更に詳細に説明する。本実施例は、本発明の好ましい実施形態を例示するためだけに示しており、本発明の範囲を限定する意図はない。
【実施例】
【００３０】
抗凝血性組成物の調製
EDTA、塩化カリウム、一塩基性リン酸カリウム、塩化ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム及びクエン酸三ナトリウム無水物を、800mLの脱イオン水に溶解した。pHは、HClを用いて7.4に合わせ、次に、脱イオン水を加えて総量を1Lにした。抗凝血性組成物は、液体サイクルにて103421パスカル(1.05kg/cm)で20分間、加圧滅菌によって滅菌した。
【００３１】
魚血液の収集
体重の範囲が750から1100gの8匹のブラウンマーブルグルーパー(grouper)(アカマダラハタ)及び2匹のジャイアントグルーパーハイブリッドを、ケタム島(マレーシア)近くの養殖場から取得した。この魚を、50mg/Lのトリカインメタンスルホネート(MS222, Aldrich, USA)を用いて麻酔した。魚の体表面を70%のエタノールで消毒した。過剰な粘液は拭き取った。魚の血液の収集前に、蝶翼状インフュージョンセットをリンス緩衝液で洗浄した。初めに、針を魚の尾静脈に刺した。圧力をつくるためにシリンジのプランジャーを穏やかに引いて血液を抜いた。抜かれた血液の各部を、直ちに、抗凝血性溶液で5倍希釈すべきである。希釈した血液を、遠心までの間、穏やかに攪拌した。
【００３２】
図1aに示されるように、血液の凝固は、この研究において開発される抗凝血性組成物によって希釈したグルーパーの血液(チューブ2)においては観察されなかった一方で、商用ヘパリン採血管におけるグルーパーの血液(チューブ1)は凝固した。グルーパーの血液は、図1bに示されるように、ヘパリン緩衝液(チューブ3)又はEDTA緩衝液(チューブ4)の10倍の希釈でも凝固し続けた。
【００３３】
メイグリュンワルドギムザ(MGG)染色及び生死判別試験を経た形態学的評価
メタノールを用いて血液塗抹標本を作成・固定し、次にメイグリュンワルド溶液中で5分間、10%のギムザ溶液中で10分間インキュベーションした。直立顕微鏡(BX51、オリンパス)下で、スライドを調べた。カラー電荷結合素子カメラ(U-CMAD-2;オリンパス)を使用して、ランダムな場所由来の少なくとも20個の画像を各スライドから取得した。トリパンブルー排除試験を実行して細胞数及び細胞生存率を決定した。
【００３４】
MGGでの染色は、図2に示されるように、赤血球、リンパ球、血小板、単球及び好中球を含む、グルーパーの末梢血液細胞中の様々な細胞タイプの同定を可能にした。人為的な細胞形態も異常な細胞形態も観察されなかった。赤血球は、弱染色又は未染色の細胞質で楕円形であった。小リンパ球及び大リンパ球は、サイズが大きい核及び乏しい細胞質によって特徴づけられたグルーパーの末梢血液で見つかった最も大量の白血球であった。単球は、その大きな核及び好塩基細胞質を有する他の白血球から区別できた。単球の核に対する細胞質の比率は、大リンパ球のものと比較して大きかった。血小板は、そのスピンドル形状及び縮合核に基づいて同定することができる。
【００３５】
好中球は、周辺でのその偏在性の核によって特徴づけられる他の大白血球であった。細胞生存率は、血液凝固を阻止された血液中で98%超であった。
【００３６】
一次細胞培養
血液凝固を阻止された個々の血液由来の白血球を、赤血球の等張溶解の1分後に取得した。白血球を、リーボビッツ-15培地(Sigma, USA)、50μΜの2-メルカプトエタノール(Sigma, USA)及び10%のウシ胎児血清(56℃30分での熱不活性化型；Paa、オーストリア)からなる細胞培地で培養した。500,000個の白血球を、90μLの培地及び10μLのマイトジェン溶液を含む各96マイクロプレートに加えた。培養物を湿潤チャンバー中で、室温で48時間培養した。マイトジェン溶液は、200μgml-1の大腸菌055:B5リポポリサッカライド(LPS; Sigma, USA)又は10μgml-1の植物性凝集素(PHA-M; Sigma, USA)のいずれかからなる。完全培地を、コントロールとしてマイトジェン溶液の代わりに用いた。生存可能な細胞の数は、トリパンブルー排除試験によって決定した。増殖細胞コロニーは、逆位相差顕微鏡(CK40、オリンパス)を使用して観察した。
【００３７】
血液凝固を阻止された個々の血液由来の白血球は、図3aに示されるように、インビトロ培養で正常に維持された。LPS又はPHA刺激を受けて、増殖した白血球及び細胞コロニーは、それぞれ図3b及び図3cに示されるように観察された。
【００３８】
このように記載されている本発明は、同じものを様々な方法でバリエーションをつけることができることは明白である。かかるバリエーションは、本発明の範囲内であると考える。そして、当業者にとって明らかである全てのかかる変更形態は、添付の特許請求の範囲内であることを意図する。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３ａ】
2017503023.tif 000006
【図３ｂ】
2017503023.tif 000007
【図３ｃ】
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【国際調査報告】
2017503023.tif 000009
2017503023.tif 000010