(57)【要約】メタボリックシンドローム状態を予防、軽減または改善するための、７−ヒドロキシマタイレシノール（ＨＭＲ）を含む組成物、またはその立体異性体、塩、錯体、付加物もしくは誘導体、またはそれらを含有する抽出物。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
メタボリックシンドローム状態の予防、軽減または治療における使用のための７−ヒドロキシマタイレシノール（ＨＭＲ）。
【請求項２】
メタボリックシンドロームに関連する医学的状態の併発の予防、軽減または治療における、請求項１に記載の使用のための７−ヒドロキシマタイレシノール（ＨＭＲ）。
【請求項３】
前記メタボリックシンドロームに関連する医学的状態が、内臓型肥満、脂肪症、炎症、脂質代謝異常、インスリン感受性および高血糖からなる群から選択される、請求項２に記載の使用のための７−ヒドロキシマタイレシノール（ＨＭＲ）。
【請求項４】
メタボリックシンドローム状態を予防、軽減または治療するための、１つ以上のさらなる成分および／または賦形剤とともに７−ヒドロキシマタイレシノール（ＨＭＲ）を含む組成物。
【請求項５】
１つ以上のさらなる薬学的に許容可能な成分および／または賦形剤を含む医薬組成物である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
１つ以上のさらなる食用成分および／または賦形剤を含む食品である、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
前記成分および／または賦形剤が抗酸化剤である、請求項４〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
メタボリックシンドローム状態の予防、軽減または治療を、それを必要とする人において行う方法であって、前記人に有効量の７−ヒドロキシマタイレシノール（ＨＭＲ）を投与することを含む、方法。
【請求項９】
前記有効量が１日成人１人当たり約１０〜約５００ｍｇの範囲である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記有効量が１日成人１人当たり約３０〜約３００ｍｇの範囲である、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メタボリックシンドローム状態を改善するための７−ヒドロキシマタイレシノールを含む組成物に関する。詳細には、本発明は、メタボリックシンドロームを予防、軽減または治療することが可能な医薬組成物および／または食品、例えば７−ヒドロキシマタイレシノールを含む組成物、またはその立体異性体、塩、錯体、付加物もしくは誘導体、またはそれらを含有する抽出物に関する。
【背景技術】
【０００２】
メタボリックシンドローム（ＭｅｔＳ）は、幾つかの医学的状態の併発である。高血圧、脂質代謝異常および高血糖が付随する内臓型肥満（即ち、腹部の過剰な脂肪蓄積）であるＭｅｔＳの高罹患率は、健康に関するクオリティオブライフの実質的な低下を伴う、人々の健康にとっての大きい脅威である。
【０００３】
ＷＨＯ（世界保健機関）、ＯＥＣＤ（経済協力開発機構）およびＷＨＦ（世界心臓連合）によれば、欧州地域の成人人口の３０〜８０％が過体重である（ボディマスインデックス（ＢＭＩ）が２５を超える）。欧州人口の平均ＢＭＩは約２６．５であり、肥満（３０を超えるＢＭＩ）はその成人人口の３分の１にまで及んでいる。これは、欧州における成人４億人のうちの約１億３千万人が過体重であるか、または肥満であることを意味する。さらに、小児肥満が深刻な健康危機となっている。小児の約２０％が過体重であり、その３分の１が肥満である。
【０００４】
ＭｅｔＳは、幾つかの相互に関係した代謝に起因するリスクからなる複合的な生活習慣病である。脂質代謝異常、高血圧および高血糖に加えて、この症候群は炎症誘発状態を有する。ＭｅｔＳの罹患者においては、心血管疾患（２倍）、２型糖尿病（５倍）、呼吸不全、胆嚢疾患、特定の種類の癌および心理社会的問題のリスクが高まる。
【０００５】
ＭｅｔＳは食事に関連する疾患であり、ＭｅｔＳは正しい生活習慣および食事をとることにより予防し得ると考えられる。
【０００６】
メタボリックシンドロームの第一選択となる臨床介入が生活習慣の変更であるという点では概して意見が一致しているが、これは多くの患者においてリスク要因を正常化するには不十分であり、したがって、残存リスクは薬物療法を妥当とするのに十分に高いものであり得る。
【０００７】
しかしながら、現在、長期にわたって代謝リスク要因の全てを確実に低下させることができる承認された薬物はなく、したがって、複数のリスク要因をより有効に標的化し、それによって長期にわたる薬物の複数の摂取に関連する問題を最小限に抑え得る治療ストラテジーへの関心が高まっている。
【０００８】
リグナン類は、穀類、油糧種子、ナッツ、野菜（アブラナ属（ｂｒａｓｓｉｃａ））および果実類（液果類）などの食物繊維の豊富な食品に見られる化合物の群であり、典型的には健康に良い食事の成分と見なされる。
【０００９】
リグナンは、結腸での発酵による変換後、エンテロラクトンおよびエンテロジオールを生じ、ＭｅｔＳに関連する代謝パラメータに好影響を及ぼすことで、ヒトにおいて有益な効果を有すると予想されている。リグナン類の摂取量が多い一部の集団は、大幅に低い疾患頻度を示す。
【００１０】
脂質代謝異常および２型糖尿病などの代謝疾患の管理においてリグナンが豊富な種子（油糧種子）を補給する食事に有益な効果があることを示した無作為化対照試験が数件ある。動物モデルにおいても試験が行われており、ここでは部分的に精製されたリグナン画分によって血中脂質が改善され、血糖コントロールが増進し、かつ１型および２型糖尿病が改善された。
【００１１】
リグナン類を抗酸化剤、フィトエストロゲンおよび核内受容体モジュレーターとして同定するインビトロ試験も数件実施されている。
【００１２】
最近の研究において（Ｂｉａｓｏｔｔｏ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｏｉｌｓｅｅｄｓ  ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ｉｎ  ｍａｌｅ  ｍｉｃｅ，ｗｈｉｌｅ  ｃｏｎｔａｉｎｅｄ  ｌｉｇｎａｎｓ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ３Ｔ３−Ｌ１  ａｄｉｐｏｃｙｔｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ"，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，２０１４）、約１重量％の総リグナンを含有する最もリグナンが豊富な食物源のうちの２つである全ゴマおよび亜麻仁の分量が多い（飼料の２０％ｗ／ｗ）餌を与えた雄マウスで代謝パラメータの改善が示された。ゴマ抽出物は主にセサミン（ＳＥＳ）およびピノレジノール（ＰＩＮ）リグナンを含み、一方、亜麻仁抽出物は主にセコイソラリシレシノール（ＳＥＣ）リグナンを含む。７−ヒドロキシマタイレシノール（ＨＭＲ）はゴマ抽出物中には微量のみ存在し、亜麻仁抽出物には全く存在しない。
【００１３】
ＨＭＲは、ヨーロッパトウヒ（ピケア・アビエス（Ｐｉｃｅａ  ａｂｉｅｓ））におけるリグナン類の主要な単一成分であり、総リグナンの約６０パーセントの濃度に達し、主に非共役型の遊離形態で存在する。
【００１４】
太い根のリグナン濃度は２〜３パーセントである。リグナン類は枝の心材（５〜１０パーセント）およびねじれた部分（ｔｗｉｓｔ）、特に節に豊富に存在し、ここではリグナン類の量は１０パーセントより高いこともある。これらの濃度は、リグナンが豊富な材料として知られる亜麻仁の挽き粉と比較して約１００倍である。
【００１５】
国際公開第００／５９９４６号パンフレットおよび米国特許第６，４５１，８４９号明細書は、癌、ある種の非癌性ホルモン依存性疾患および／または心血管疾患を予防するためのＨＭＲの使用を開示している。
【００１６】
国際公開第２００６／０７２６４７号パンフレットは、個体におけるエストロゲン欠乏に関連する症状、例えば、閉経期または閉経後症状、更年期症状、ホットフラッシュ、腟乾燥、膣萎縮、下部尿路萎縮、骨塩量の減少、閉経期血管運動症状、気分変動、不眠症、骨粗鬆症または任意の他の閉経関連状態を予防または軽減するためのＨＭＲの使用を開示している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本出願人は、メタボリックシンドロームに関連する医学的状態の併発を予防、軽減または治療することが可能な活性化合物を選択する問題に直面した。
【００１８】
詳細には、本出願人は、高血圧、脂質代謝異常（即ち、トリグリセリドの増加およびＨＤＬ−Ｃの減少）および高血糖の１つ以上に関連する内臓型肥満を予防、軽減または治療することが可能な活性化合物を選択する問題に直面した。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本出願人は、意外にも、ＨＭＲが肥満、脂質代謝異常、および糖血症を低減可能であることを見出した。
【００２０】
本出願人は、意外にも、ＨＭＲが脂肪細胞の数および範囲を低減可能であるとともに、精巣上（ｅｐｉｄｙｄｉｍａｌ）体脂肪組織および肝臓における炎症誘発性サイトカインの濃度を低減可能であることも見出した。
【００２１】
さらに、本出願人は、意外にも、ＨＭＲが肝臓（ＰＰＡＲｇ遺伝子およびＴＦＥＢ遺伝子など）および精巣上体脂肪組織（ＡＴＧＬ  ｍＲＮＡ、ＰＬＡ２ｇ７遺伝子、およびＬＰＬ遺伝子など）における脂質代謝遺伝子の調節に寄与可能であることを見出した。
【００２２】
最後に、本出願人は、予想外にも、ＨＭＲが細胞酸化ストレスを低減可能であること、およびメタボリックシンドロームに関しても、鉄代謝を調節可能であることを見出した。
【００２３】
したがって、本発明の第１の態様は、メタボリックシンドローム状態を予防、軽減または治療するための７−ヒドロキシマタイレシノール（ＨＭＲ）の使用に関する。
【００２４】
さらに詳細には、本発明は、内臓型肥満、脂肪症、炎症、脂質代謝異常（即ち、トリグリセリドの増加およびＨＤＬ−Ｃの減少）、インスリン感受性および高血糖などのメタボリックシンドロームに関連する医学的状態の併発を予防、軽減または治療するためのＨＭＲの使用に関する。
【００２５】
本発明の第２の態様は、メタボリックシンドローム状態を予防、軽減または治療するための、１つ以上のさらなる成分および／または賦形剤とともに７−ヒドロキシマタイレシノール（ＨＭＲ）を含む組成物、例えば医薬組成物または食品に関する。
【００２６】
本発明の第３の態様は、メタボリックシンドローム状態の予防、軽減または治療を、それを必要とする人において行う方法であって、前記人に有効量の７−ヒドロキシマタイレシノール（ＨＭＲ）を投与することを含む、方法に関する。
【００２７】
本記載および続く特許請求の範囲の目的上、用語「７−ヒドロキシマタイレシノール」には、その立体異性体、塩、錯体、付加物もしくは誘導体、またはそれらを含有する抽出物が含まれることが意図される。
【００２８】
本発明との関連において、用語「７−ヒドロキシマタイレシノールの誘導体」は、木に天然に存在する修飾または木材からの抽出中に生じる修飾を含む化合物を指す。７−ヒドロキシマタイレシノールの天然の修飾は、例えば７−ヒドロキシマタイレシノールのグリコシド類およびアグリコン類の形成である。木の抽出中に得られる７−ヒドロキシマタイレシノールの最も重要な誘導体は、ジメチルマタイレシノール、７−メトキシマタイレシノール、７−オキソマタイレシノール、ジデメチルマタイレシノール、イソヒドロキシマタイレシノール、エンテロラクトン、コニデンドリン、および７’，８’−デヒドロ−７−ヒドロキシマタイレシノールである。
【００２９】
本発明は、限定としてではなく例示として提供される、添付の図面とともに読まれるべき以下の例を読むことにより、より良く理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】試験１によって計測した各マウス群の平均全体重の増加を示す。
【図２】（ａ，ｂ及びｃ）試験１によって計測した各マウス群のそれぞれ平均全脂肪量、平均精巣上体脂肪組織量、および平均臀部脂肪組織量を示す。
【図３】試験３による各マウス群の肝組織切片の試料画像を示す。
【図４】試験４によって計測した各マウス群のグルコース濃度を示す。
【図５】試験５によって計測した各マウス群のＩＲ値を示す。
【図６】（ａ，ｂ及びｃ）試験７によって計測した各マウス群の精巣上体脂肪組織（ＩＬ−６  −  図６ａ  −、およびＴＮＦ−α  −  図６ｂ）および肝臓（ＩＬ−６  −  図６ｃ）における炎症性サイトカインｍＲＮＡの発現を示す。
【図７】（ａ，ｂ及びｃ）試験８によって計測した各マウス群の精巣上体脂肪組織におけるＡＴＧＬ、ＰＬＡ２ｇ７およびＬＰＬ  ｍＲＮＡの発現を示す。
【図８】（ａ及びｂ）試験９によって計測した各マウス群の肝臓におけるＰＰＡＲｇおよびＴＦＥＢ  ｍＲＮＡの発現を示す。
【図９】試験１０Ａによって計測した各マウス群のＧＳＴ  ｍＲＮＡの発現を示す。
【図１０】試験１０Ｂによって計測した各マウス群の８ＯＨｄＧおよびｄＧＵ  ｍＲＮＡの発現を示す。
【図１１】（ａ，ｂ及びｃ）試験１１によって計測した各マウス群のそれぞれフェリチン、フェロポーチン、およびヘプシジンのレベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明は、メタボリックシンドローム状態を予防、軽減または治療するための７−ヒドロキシマタイレシノール（ＨＭＲ）の使用に関する。
【００３２】
ＨＭＲの化学構造は以下の式（Ｉ）によって表される。
【化１】
2017515830.tif 000003
【００３３】
ＨＭＲは、リグナン、即ち、ジベンジルブタン骨格にモノリグノールとして知られる置換桂皮アルコール類が二量化することによってフェニルアラニンから誘導される、植物に見られる化学的化合物の群である。リグナン類は、エストロゲン様化学物質であり、かつ抗酸化剤としても作用するフィトエストロゲン類の主要なクラスの１つである。
【００３４】
亜麻仁およびゴマ種子は、他の多くの食品と比べて高レベルのリグナン類を含有する。多量のリグナン類は針葉樹にも見られる。リグナン類のタイプは種によって異なり、リグナン類の量は樹木の部分によって様々である。
【００３５】
ＨＭＲはトウヒ（ピケア・アビエス（Ｐｉｃｅａ  ａｂｉｅｓ））抽出物中におけるリグナン類の中で最も豊富な単一成分であり、総リグナンの約６０％ｗ／ｗの濃度に達する。
【００３６】
トウヒでは、太い根のリグナン濃度は２〜３パーセントである。リグナン類は枝の心材（５〜１０パーセント）およびねじれた部分、特に節に豊富に存在し、ここではリグナン類の量は１０パーセントより高いこともある。これらの濃度は、リグナンが豊富な材料として知られる亜麻仁の挽き粉と比較して約１００倍である。
【００３７】
本発明で使用されるＨＭＲの単離は、トウヒ（ピケア・アビエス（Ｐｉｃｅａ  ａｂｉｅｓ））の圧縮あて材の過度に粗い木片（枝、ねじれた部分および節を含む）から行うことができる。ピケア・アビエス（Ｐｉｃｅａ  ａｂｉｅｓ）全抽出物（ＴＥＰ、ＨＭＲおよび異性体を含有する）およびＨＭＲｌｉｇｎａｎ（商標）精製ＨＭＲ（主にＨＭＲを含有する）が、Ｌｉｎｎｅａ  ＳＡ、Ｒｉａｚｚｉｎｏ、スイスから市販されている。
【００３８】
用語「メタボリックシンドローム」（ＭｅｔＳ）は、過栄養、座りっぱなしで体を動かさない生活、および結果として起こる脂肪過多を反映する構成要素の群を指し、および内臓型肥満、脂肪症、炎症、脂質代謝異常（即ち、トリグリセリドの増加およびＨＤＬ−Ｃの減少）、インスリン感受性および高血糖などの医学的状態の併発に関連する。例えば、メタボリックシンドロームには、（ｉ）肥満、（ｉｉ）血圧、（ｉｉｉ）グルコース、（ｉｖ）トリグリセリド、および（ｖ）コレステロールなどの診断基準に基づく障害が含まれる。
【００３９】
詳細には、メタボリックシンドロームの最も新しい定義が、ＩＤＦ（国際糖尿病連合）による刊行物"Ｔｈｅ  ＩＤＦ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ"（２００６）、ならびにＰ．ＺｉｍｍｅｔおよびＧ．Ａｌｂｅｒｔｉによる論文、"Ｔｈｅ  ＩＤＦ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ：ｗｈｙ  ｗｅ  ｎｅｅｄ  ａ  ｇｌｏｂａｌ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ"，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｖｏｉｃｅ，Ｍａｙ  ２００６，Ｖｏｌｕｍｅ  ５１，Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｉｓｓｕｅ，Ｐａｇｅｓ  １１−１４に提供されている。
【００４０】
用語「メタボリックシンドローム」は、男性では９４ｃｍ以上および女性では８０ｃｍ以上の腹囲または３０ｋｇ／ｍ２より高いボディマスインデックスに該当することに加えて、以下の条件、即ち（ｉ）１３０ｍｍＨｇ以上の収縮期血圧、または８５ｍｍＨｇ以上の拡張期血圧；（ｉｉ）１００ｍｇ／ｄＬ以上のグルコース；（ｉｉｉ）１５０ｍｇ／ｄＬより高い血中トリグリセリド；および（ｉｖ）男性で４０ｍｇ／ｄＬ未満および女性で５０ｍｇ／ｄＬ未満のＨＤＬコレステロールのうちの少なくとも２つが該当することによって特徴付けられる、一般的な肥満の状態の発生を意味する。
【００４１】
加えて、上記の条件のいずれか１つに対応する症例は、潜在的なメタボリックシンドローム群に属するものとして定義され、および潜在的なメタボリックシンドローム群における状態もメタボリックシンドロームに含まれる。いずれにしろ、他の任意の診断基準に関する他の状態も除外されない。例えば、メタボリックシンドロームの定義および状態のレビューについては、Ｍ．Ａ．Ｃｏｒｎｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ"，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２００８，２９（７）：７７７−８２２を参照することができる。
【００４２】
メタボリックシンドロームを予防、軽減または治療するとは、メタボリックシンドローム患者の状態および潜在的なメタボリックシンドローム群と診断される任意の状態の予防、軽減または治療を指す。
【００４３】
例えば、白色脂肪組織、血糖値、血中インスリン濃度、血中コレステロール、血中ＬＤＬコレステロール、および血中トリグリセリド濃度の低下が含まれる。
【００４４】
加えて、メタボリックシンドロームの予防、軽減または治療には、脂肪肝の低減、耐糖能の改善、インスリン抵抗性の低減、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αなどの炎症性サイトカインの低減、ＡＴＧＬ  ｍＲＮＡ、ＰＬＡ２ｇ７、ＬＰＬ、ＰＰＡＲｇおよびＴＦＥＢなどの脂質代謝遺伝子の発現の調節、細胞酸化ストレスの低減が含まれる。
【００４５】
本発明は、メタボリックシンドローム状態を予防、軽減または治療するための、１つ以上のさらなる成分および／または賦形剤とともにＨＭＲを含む組成物、例えば医薬組成物または食品にも関する。有利には、さらなる成分および／または賦形剤は抗酸化剤である。
【００４６】
本発明に係る医薬組成物は、好ましくは経口製剤である。活性化合物（ＨＭＲ）の所要量は、予防しようとする詳細な状態によって異なり得る。ＨＭＲの典型的な用量は、１日成人１人当たり約１０〜約５００ｍｇ、好ましくは１日成人１人当たり約３０〜約３００ｍｇの範囲である。
【００４７】
本発明の組成物の形態は、例えば、溶液、懸濁液、シロップ、錠剤、顆粒、ペレット、カプセル、ロゼンジおよび丸薬など、経口投与に有用な形態によって表され得る。
【００４８】
本発明に係る食品は、ＨＭＲの特性に影響を及ぼすことなくＨＭＲと混合するのに好適な任意の食用の非毒性固体または液体生成物であり得る。この生成物の役割は、主に、ＨＭＲの正確な投薬量調節を容易にすることである。
【００４９】
本発明に係る食品は、特に、機能性食品、栄養補助剤、ニュートラシューティカルズ、健康食品、または任意の食品である。食品中のＨＭＲの濃度は、成人について１日約１０〜約５００ｍｇ、好ましくは成人１人当たり１日約３０〜約３００ｍｇのＨＭＲの補給を確実にするため、食品のタイプに応じて適切に計算されることになる。
【００５０】
本発明に係る機能性食品は、例えば、バター、マーガリン、ビスケット、パン、ケーキ、キャンディー、菓子類、ヨーグルトもしくは別の発酵乳製品、またはミューズリーなどのシリアルの形態であり得る。
【００５１】
本発明の医薬組成物のさらなる成分および／または賦形剤は、任意の薬学的に許容可能な成分および／または賦形剤であり得る。
【００５２】
薬学的に許容可能な賦形剤という用語は、いかなる特定の限定もなしに、生物に投与される医薬組成物の調製に好適な任意の材料を含むものと理解される。既に考察した通り、賦形剤は、その果たす役割に応じて、（ｉ）充填剤賦形剤、（ｉｉ）製造用賦形剤、（ｉｉｉ）保存剤賦形剤、および（ｉｖ）体裁用賦形剤に分類される。当技術分野において公知のこれらの材料は、例えば（ｉ）希釈剤、吸収剤、吸着剤、充填剤および保湿剤、（ｉｉ）滑沢剤、結合剤、滑剤、可塑剤および粘度調整剤、（ｉｉｉ）保存剤、抗菌薬、抗酸化剤およびキレート剤、および（ｉｖ）香味料、甘味料および着色剤である。
【００５３】
本発明の食品のさらなる成分および／または賦形剤は、任意の食用の成分および／または賦形剤であり得る。
【００５４】
有利には、本発明の食品は、炭水化物、タンパク質、アミノ酸および誘導体、脂質、リン脂質、ビタミンおよび無機塩類を含む群から選択される少なくとも１つの食用成分を含む。
【００５５】
本発明の食品は、完全食材、栄養補助食品、胃腸内投与用、例えば経鼻胃管および経鼻腸管によって投与される経腸栄養用の栄養溶液、非経口投与用の栄養溶液、または糖尿病患者用の食材もしくはサプリメントの形態であり得る。
【００５６】
完全食材は、物質およびエネルギーの摂取量の点で使用者の一日所要量を満たすのに必要なあらゆる栄養物質を含む。したがって、製剤は、３０重量％〜７０重量％の分量の炭水化物、１０重量％〜３０重量％の分量のタンパク質および２０重量％〜４０重量％の脂質を含有しなければならない。
【００５７】
これに加えて、製剤は１日２０００〜２９００ｋｃａｌを提供することが可能でなければならず、水または他の飲料中に溶解または分散させる固体の形態であってもよく、または即時使用可能な形態のもしくは濃縮物としての液体であってもよい。特定の状況では（食事療法用またはスポーツ用のレジメン）、より少ないまたはより多いエネルギー摂取量が提供されてもよい。
【００５８】
栄養補助食品は、タンパク質およびエネルギー摂取量の点で使用者の一日所要量を満たすために要求される栄養物質の一部のみを含有し得る。したがって、製剤は、１日１５００ｋｃａｌ未満、好ましくは１００〜１０００ｋｃａｌを提供することが可能であり得る。あるいは、栄養補助食品は栄養物質を含まなくてもよい。そのような場合、その食品製剤はエネルギー摂取を提供せず、医薬組成物に関して記載される通りの従来の賦形剤を含むのみである。この場合もまた、製剤は、普通の食事に加えるための、または普通の食事の一構成要素としての、上記に記載した通りの固体または液体形態であってよい。
【００５９】
本発明の食品は、その外観、美味しさおよび保存性を改善するためのさらなる従来の食品添加剤、例えば着色剤、保存剤、抗酸化剤、酸性度調整剤、増粘剤、安定剤、乳化剤、調味料、香味料、保湿剤および甘味料を含有し得る。
【実施例】
【００６０】
１４０匹のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）の群を４つのサブ群に分け、群１は２０匹のマウスを有し、および群２〜４は各々４０匹のマウスを有した。群１には低脂肪（ＬＦ）食（脂肪から１０％カロリーを提供する）を６０日間与えた。群２には高脂肪（ＨＦ）食（脂肪から５０％カロリーを提供する）を６０日間与えた。群３および群４には、それぞれ、高脂肪食と３ｍｇ／ｋｇ／日のＨＭＲｌｉｇｎａｎ（商標）精製ＨＭＲ（ＨＦ＋ＨＭＲ）または１０ｍｇ／ｋｇ／日のピケア・アビエス（Ｐｉｃｅａ  ａｂｉｅｓ）全抽出物（ＨＦ＋ＴＥＰ）を６０日間与えた。
【００６１】
ＬＦ食およびＨＦ食の組成は以下の表１に報告する。ＬＦ食およびＨＦ食は、Ｐｉｃｃｉｏｎｉ  Ｓｒｌ、Ｒｏｍｅ、イタリアから市販されるものであった。ＨＭＲｌｉｇｎａｎ（商標）精製ＨＭＲおよびＴＥＰは、Ｌｉｎｎｅａ  ＳＡ、Ｒｉａｚｚｉｎｏ、スイスから市販されるものであった。
【００６２】
【表１】
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【００６３】
マウスは、２３℃の温度に維持した動物キャビネットにおいて自然光明暗サイクルで飼育した。治療前、マウスに低脂肪食を５日間とらせた。マウスは６０日間にわたり毎日強制給餌し（群３および群４）、一方、対照群（１および２）には強制給餌によって担体（トウモロコシ油）のみを与えた。頸椎脱臼によって動物を犠牲にし、組織を解剖し、直ちにドライアイスで凍結するか、または組織学的評価のため固定した。
【００６４】
以下の試験を実施した。
【００６５】
試験１  −  体脂肪量および除脂肪量の定量化
エコー磁気共鳴イメージングシステム（ＥｃｈｏＭＲＩ）（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）によって体脂肪量および除脂肪量の計測を実施した。
【００６６】
ＥｃｈｏＭＲＩは、生きているマウスにおいて麻酔または鎮静を行う必要なしに１分未満で全身組成パラメータ（総体脂肪および除脂肪量）の最も正確な計測を提供する。改良食を摂取する結果としてのマウス全身組成の変化を評価した。本試験の全期間中にわたり定期的に体脂肪量および除脂肪量ならびに体重の計測を行った。
【００６７】
ＥｃｈｏＭＲＩ−１００（商標）ＱＮＭＲシステムは、疾患または汚染物質の侵入を最小限に抑えるために専用領域に設置した。各ＱＮＭＲランの前に、Ｅｃｈｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍによって提供される標準を使用してシステムを校正した。各マウスを適切なサイズのチューブ内に置き、計測のためにＱＮＭＲ機に置いた。４７秒ランの間、マウスを所定の一連の高周波エネルギーに供した。各マウスにつき３回連続で独立したスキャンを行い、データはデータベースに自動転送された。出力情報はグラム単位の除脂肪組織量および体脂肪量として表現された。
【００６８】
図１には、全観察期間に沿った各群の平均全体重の増加をプロットした。観察期間終了時の各群の平均全脂肪量、平均精巣上（ｅｐｉｄｙｍａｌ）体脂肪組織量、および平均臀部脂肪組織量をそれぞれ図２ａ、図２ｂおよび図２ｃに報告した。
【００６９】
試験２  −  組織学的検査
新鮮な精巣上体脂肪組織をホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋し、３μｍ切片に切り分けた。切片をヘマトキシリンで染色し、エオシンで対比染色し、次にＤＰＸ（ＢＤＨ、Ｐｏｏｌｅ、英国）を加えてカバーガラスをかけた。画像収集はデジタルカメラ（Ｎｉｋｏｎ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｃａｍｅｒａ  ＤＭＸ  １２００）によって達成した。
【００７０】
専用ソフトウェア（Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ；Ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ、Ｍｉｌａｎ）によって倍率２０倍で平均脂肪細胞面積を計算した。全ての試料において、３つの異なる組織切片の少なくとも４つの異なる視野を評価している。
【００７１】
以下の表２に結果を要約する。
【００７２】
【表２】
2017515830.tif 000005
【００７３】
細胞の形状およびサイズのばらつきが極めて大きく、かつ手作業による組織学的検査であったため、データは示唆的なものに過ぎない。群２対群１のデータおよび群３対群２のデータは統計的に違いがある。
【００７４】
試験３  −  脂肪肝
新鮮な肝組織をホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋し、３μｍ切片に切り分けた。切片をヘマトキシリンで染色し、エオシンで対比染色し、次にＤＰＸ（ＢＤＨ、Ｐｏｏｌｅ、英国）を加えてカバーガラスをかけた。画像収集はデジタルカメラ（Ｎｉｋｏｎ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｃａｍｅｒａ  ＤＭＸ  １２００）によって達成した。４群の試料画像は図３に示した。
【００７５】
群１マウスの肝臓は正常な肝臓構造を呈し、一方、群２マウスの肝臓には、小滴性および大滴性脂肪変性が見られた。群３および群４の肝臓は幾らかの空胞を示したが、群２と比べるとはるかに少なかった。
【００７６】
試験４  −  耐糖能試験
耐糖能試験のため、動物を一晩１２時間にわたり絶食させ、尾静脈から血液試料を得た。次に動物に２ｇ／Ｋｇ体重のグルコースを腹腔内注射し、図４に示す間隔で血液試料を採取した。グルコース濃度は標準方法によって評価した（Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｂ．Ｗｈｉｄｄｏｎ  ａｎｄ  Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｄ．Ｐａｌｍｉｔｅｒ．Ａｂｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｎｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  Ｍｅｌａｎｉｎ−Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｎｇ  Ｈｏｒｍｏｎｅ（ＭＣＨ）ｉｎ  Ａｄｕｌｔ  Ｍｉｃｅ  Ｉｍｐｒｏｖｅｓ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｆ  ＭＣＨ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１３  Ｊａｎｕａｒｙ  ３０；３３（５）：２００９−２０１６）。
【００７７】
結果は図４に示した。
【００７８】
試験５  −  インスリン抵抗性恒常性モデル評価の決定
ＨＯＭＡカルキュレーター（Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｔｒｉａｌｓ  Ｕｎｉｔ）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ：ｈｏｍａ．ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ＠ｄｔｕ．ｏｘ．ａｃ．ｕｋを用いることにより、給餌中止の６時間後に得られたグルコースおよびインスリン濃度を使用してインスリン抵抗性恒常性モデル評価（ＨＯＭＡ−ＩＲ）を計算した。血漿インスリンレベルはインスリンＥＬＩＳＡキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マウスインスリン９６ウェルプレートアッセイ；カタログ番号ＥＺＲＭＩ−１３Ｋ）で計測した。
【００７９】
以下の表３および図５に結果を要約する。
【００８０】
【表３】
2017515830.tif 000006
【００８１】
試験６  −  脂質プロファイル
ＩＬａｂ  ＡＲＩＥＳアナライザー（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ、米国）および専用試薬キットＩＬ  Ｔｅｓｔ（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ、米国）を使用することにより、コレステロール（総合）、コレステロールＨＤＬ（ＨＤＬ）、コレステロールＬＤＬ（ＬＤＬ）およびトリグリセリド（ＴＧ）の血中濃度を標準方法に従って決定した。
試薬：
ＩＬ  Ｔｅｓｔ  ＨＤＬコレステロール：コード００１８２５５７４０
ＩＬ  Ｔｅｓｔ  ＬＤＬコレステロール：コード００１８２５６０４０
ＩＬ  Ｔｅｓｔトリグリセリド：コード００１８２５５６４０
ＩＬ  Ｔｅｓｔコレステロール：コード００１８２５０５４０
【００８２】
以下の表４に結果を要約する。
【００８３】
【表４】
2017515830.tif 000007
【００８４】
試験７  −  炎症性サイトカイン
以下の通りの標準手順に従い、４群のマウスの精巣上体脂肪組織（ＩＬ−６およびＴＮＦ−α）および肝臓（ＩＬ−６）における炎症性サイトカインｍＲＮＡの発現を計測した。
【００８５】
ＲＮｅａｓｙ  Ｌｉｐｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、米国）を使用して、製造者の指示に従って１０〜３０ｍｇの組織から全ＲＮＡを抽出した。ハイキャパシティｃＤＮＡ  Ａｒｃｈｉｖｅキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して各試料のＲＮＡを逆転写した。ＴａｑＭａｎケミストリーに基づくＡｓｓａｙ  ｏｎ  Ｄｅｍａｎｄキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて定量的ＰＣＲを実施した。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７０００配列検出システム機器でＲＴ−ＰＣＲ反応を実施し、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７０００  ＳＤＳソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でデータ解析を行った。基準ハウスキーピング遺伝子として１８Ｓ  ＲＮＡを使用した。特異的オリゴヌクレオチドペアはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓサービスによって設計された。計算は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ配列検出システムのＵｓｅｒ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ２にＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｔｈｏｄについて記載される通りに行った。上記の方法の詳細な説明については、"Ｂｉａｓｏｔｔｏ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｏｉｌｓｅｅｄｓ  ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ｉｎ  ｍａｌｅ  ｍｉｃｅ，ｗｈｉｌｅ  ｃｏｎｔａｉｎｅｄ  ｌｉｇｎａｎｓ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ３Ｔ３−Ｌ１  ａｄｉｐｏｃｙｔｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ"，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，２０１４"を参照することができる。
【００８６】
結果は図６ａ、図６ｂおよび図６ｃに示した。
【００８７】
試験８  −  脂質代謝の遺伝子の調節（精巣上体脂肪組織）
肥満は、脂肪組織におけるトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）蓄積の増加およびインスリン抵抗性に関連する。インスリン抵抗性のヒト対象の脂肪組織ではＡＴＧＬ  ｍＲＮＡが減少する。体脂肪量および体脂肪分布自体の増加よりむしろ、肥満におけるＩＲおよび高インスリン血症の程度がＡＴＧＬ  ｍＲＮＡの減少に関連する。
【００８８】
ＰＬＡ２ｇ７は、肥満に関連した炎症において役割を果たしている可能性のある脂肪および循環酵素ＰＡＦ−ＡＨ（血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ）をコードする遺伝子である。ＰＡＦを分解することによって抗炎症活性を有することに加えて、ＰＡＦ−ＡＨは、リン脂質を大量に加水分解してリゾホスファチジルコリン（ｌｙｓ−ＰＣ）および遊離酸化脂肪酸（両方ともに酸化ＬＤＬのアテローム生成促進活性に関与する炎症誘発性メディエーター）を生成することによって炎症誘発活性も及ぼし得る。脂肪細胞におけるこれらの遺伝子の上方制御は、脂肪組織拡大に適応するための細胞外マトリックスの変化（組織リモデリング）ももたらし得る。
【００８９】
リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）は、膵リパーゼ、肝性リパーゼおよび内皮リパーゼを含むリパーゼ遺伝子ファミリーのメンバーである。ＬＰＬは、カイロミクロンおよび超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）に見られるものなどのリポタンパク質中のトリグリセリドを遊離脂肪酸および１つのモノアシルグリセロール分子に加水分解する。ＬＰＬは、カイロミクロンレムナント、コレステロールリッチリポタンパク質および遊離脂肪酸の細胞取込みの促進にも関与する。ＬＰＬは大部分が脂肪、心臓、および骨格筋組織ならびに乳腺に分布する。
【００９０】
以下の通りの標準手順に従い、４群のマウスの精巣上体脂肪組織におけるＡＴＧＬ、ＰＬＡ２ｇ７およびＬＰＬ  ｍＲＮＡの発現を計測した。
【００９１】
ＲＮｅａｓｙ  Ｌｉｐｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、米国）を使用して、製造者の指示に従って１０〜３０ｍｇの組織から全ＲＮＡを抽出した。ハイキャパシティｃＤＮＡ  Ａｒｃｈｉｖｅキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して各試料のＲＮＡを逆転写した。ＴａｑＭａｎケミストリーに基づくＡｓｓａｙ  ｏｎ  Ｄｅｍａｎｄキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて定量的ＰＣＲを実施した。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７０００配列検出システム機器でＲＴ−ＰＣＲ反応を実施し、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７０００  ＳＤＳソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でデータ解析を行った。基準ハウスキーピング遺伝子として１８Ｓ  ＲＮＡを使用した。特異的オリゴヌクレオチドペアはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓサービスによって設計された。計算は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ配列検出システムのＵｓｅｒ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ２にＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｔｈｏｄについて記載される通りに行った。上記の方法の詳細な説明については、"Ｐｅｎｚａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ  ａｆｆｅｃｔｓ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｄｏｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｄ  ｇｅｎｄｅｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍａｎｎｅｒ；Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ；２００６  Ｄｅｃ；１４７（１２）：５７４０−５１  ２００６"を参照することができる。
【００９２】
結果は図７ａ、図７ｂ、および図７ｃに示した。
【００９３】
試験９  −  脂質代謝の遺伝子の調節（肝臓）
核内受容体スーパーファミリーに属するＰＰＡＲｇは、脂肪生成に必須である。先行研究では、ＰＰＡＲｇが脂肪細胞肥大、肥満およびインスリン抵抗性において極めて重要な役割を有し得ることが示唆されている。ＰＰＡＲｇ遺伝子の転写の減少は、ボディマスインデックス（ＢＭＩ）の低下、インスリンレベルの減少、ＨＤＬの増加およびインスリン感受性の増加、２型糖尿病リスクの低下に関連する。
【００９４】
ＴＦＥＢは、飢餓に対する代謝反応の中心的存在である。ＴＦＥＢ活性は栄養素によって調節される。ＴＦＥＢが存在しない場合には脂質異化障害および肥満の動物において重度の代謝不均衡が起こり、一方、ＴＦＥＢが過剰発現すると逆の効果が生じ、肥満および関連するメタボリックシンドロームがレスキューされる。
【００９５】
以下の通りの標準手順に従い、４群のマウスの肝臓におけるＰＰＡＲｇおよびＴＦＥＢ  ｍＲＮＡの発現を計測した。
【００９６】
ＲＮｅａｓｙ  Ｌｉｐｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、米国）を使用して、製造者の指示に従って１０〜３０ｍｇの組織から全ＲＮＡを抽出した。ハイキャパシティｃＤＮＡ  Ａｒｃｈｉｖｅキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して各試料のＲＮＡを逆転写した。ＴａｑＭａｎケミストリーに基づくＡｓｓａｙ  ｏｎ  Ｄｅｍａｎｄキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて定量的ＰＣＲを実施した。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７０００配列検出システム機器でＲＴ−ＰＣＲ反応を実施し、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７０００  ＳＤＳソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でデータ解析を行った。基準ハウスキーピング遺伝子として１８Ｓ  ＲＮＡを使用した。特異的オリゴヌクレオチドペアはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓサービスによって設計された。計算は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ配列検出システムのＵｓｅｒ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ２にＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｔｈｏｄについて記載される通りに行った。上記の方法の詳細な説明については、"Ｐｅｎｚａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ  ａｆｆｅｃｔｓ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｄｏｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｄ  ｇｅｎｄｅｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍａｎｎｅｒ；Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ；２００６  Ｄｅｃ；１４７（１２）：５７４０−５１  ２００６"を参照することができる。
【００９７】
結果は図８ａ、および図８ｂに示した。
【００９８】
試験１０  −  酸化ストレス
Ａ．肝臓抗酸化酵素の発現
グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）は、解毒のために生体異物基質に対する還元型のグルタチオン（ＧＳＨ）の抱合を触媒するその能力で最もよく知られる真核生物および原核生物第ＩＩ相代謝酵素のファミリーを含む。ＧＳＴは一部の哺乳類器官における細胞質タンパク質の最大１０％を構成し得る。この活性は、過酸化脂質などの内因性化合物を解毒し、生体異物の分解を可能にする。ＧＳＴは、毒素に結合して輸送タンパク質としても機能し得る。
【００９９】
以下の通りの標準手順に従い、４群のマウスにおけるＧＳＴ  ｍＲＮＡの発現を計測した。
【０１００】
ＲＮｅａｓｙ  Ｌｉｐｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、米国）を使用して、製造者の指示に従って１０〜３０ｍｇの組織から全ＲＮＡを抽出した。ハイキャパシティｃＤＮＡ  Ａｒｃｈｉｖｅキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して各試料のＲＮＡを逆転写した。ＴａｑＭａｎケミストリーに基づくＡｓｓａｙ  ｏｎ  Ｄｅｍａｎｄキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて定量的ＰＣＲを実施した。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７０００配列検出システム機器でＲＴ−ＰＣＲ反応を実施し、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７０００  ＳＤＳソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でデータ解析を行った。基準ハウスキーピング遺伝子として１８Ｓ  ＲＮＡを使用した。特異的オリゴヌクレオチドペアはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓサービスによって設計された。計算は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ配列検出システムのＵｓｅｒ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ２にＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｔｈｏｄについて記載される通りに行った。上記の方法の詳細な説明については、"Ｐｅｎｚａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ  ａｆｆｅｃｔｓ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｄｏｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｄ  ｇｅｎｄｅｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍａｎｎｅｒ；Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ；２００６  Ｄｅｃ；１４７（１２）：５７４０−５１  ２００６"を参照することができる。
【０１０１】
結果は図９に示した。
【０１０２】
Ｂ．酸化ＤＮＡの定量化
８−ヒドロキシデオキシグアノシン（８ＯＨｄＧ）は、酸化ストレスによって誘導されるＤＮＡ損傷の広く用いられているマーカーである。８ＯＨｄＧ形成は局所的抗酸化能力およびＤＮＡ修復酵素活性によって調節される。したがって、ＤＮＡ修復産物８−ヒドロキシデオキシグアノシン（８ＯＨｄＧ）の血清レベル、詳細には８ＯＨｄＧとその非酸化型の対応する塩基２’−デオキシ−グアノシン（ｄＧＵ）との比から、酸化的ＤＮＡ損傷を評価することができる。
【０１０３】
以下の通りの標準手順に従い、４群のマウスにおける８ＯＨｄＧおよびｄＧＵ  ｍＲＮＡの発現を計測した。
【０１０４】
ＤＮＡ抽出および消化。市販のキットＰＵＲＥＧＥＮＥ（Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＭＮ、米国）を用いて製造者の指示に従ってゲノムＤＮＡを単離し、次にＮａｎｏｄｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＤＥ、米国）を使用して定量化した。ＤＮＡをその個々のヌクレオシド成分に分解するヌクレアーゼ混合物である市販の試薬ＤＮＡ  Ｄｅｇｒａｄａｓｅ  Ｐｌｕｓ（Ｚｙｍｏｒｅｓｅａｒｃｈ、ＣＡ、米国）によって各試料につき３μｇのＤＮＡを消化した。
【０１０５】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ試薬。８−オキソ−７，８−ジヒドロ−２’−デオキシグアノシン（８ＯＨｄＧ、≧９８％）、２’−デオキシ−グアノシン（ｄＧＵ、≧９８％）、２’−デオキシシチジン（ｄＣｙｔ、≧９９％）、コチニン−ｄ3（９８％）、アスコルビン酸、リン酸二水素カリウム、水酸化アンモニウム、ギ酸、過酸化水素、ＨＰＬＣグレード水およびメタノールはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌａｎ、イタリア）から購入した。５−メチル−２’−デオキシシチジン（５−ＭｅｄＣｙｔ、≧９８％）および５−メチル−２’−デオキシシチジン−ｄ3（５−ＭｅｄＣｙｔ−ｄ3）はＴＲＣ（Ｏｎｔａｒｉｏ、カナダ）からのものであった。［15Ｎ5］ｄＧＵ（Ｕ−15Ｎ5、９６〜９８％）はＣａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＩＮＣ．（Ａｎｄｏｖｅｒ、ＭＡ）から入手した。［15Ｎ5］８ＯＨｄＧは、Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．［Ｈｕ，Ｃ．Ｗ．；Ｗｕ，Ｍ．Ｔ．；Ｃｈａｏ，Ｍ．Ｒ．；Ｐａｎ，Ｃ．Ｈ．；Ｗａｎｇ，Ｃ．Ｊ．；Ｓｗｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ａ．；Ｗｕ，Ｋ．Ｙ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｏｆ  ｕｒｉｎａｒｙ  ８−ｈｙｄｒｏｘｙ−２’−ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅ  ｂｙ  ｉｓｏｔｏｐｅ−ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｗｉｔｈ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｔａｎｄｅｍ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  ｂｙ  ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ，Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１８：５０５−５１０；２００４］に基づき、［Ａｎｄｒｅｏｌｉ，Ｒ．；Ｍａｎｉｎｉ，Ｐ．；Ｄｅ  Ｐａｌｍａ，Ｇ．；Ａｌｉｎｏｖｉ，Ｒ．；Ｇｏｌｄｏｎｉ，Ｍ．；Ｎｉｅｓｓｅｎ，Ｗ．Ｍ．Ａ．；Ｍｕｔｔｉ，Ａ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｒｉｎａｒｙ  ８−ｏｘｏ−７，８−ｄｉｈｙｄｒｏ−２’−ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅ，８−ｏｘｏ−７，８−ｄｉｈｙｄｒｏｇｕａｎｉｎｅ，８−ｏｘｏ−７，８−ｄｉｈｙｄｒｏｇｕａｎｏ−ｓｉｎｅ，ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｎｏｎ−ｏｘｉｄｉｚｅｄ  ｆｏｒｍｓ：ｄａｉｌｙ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  １５：２２１−２３１；２０１０］に記載される通りに若干の変更を加えて、［15Ｎ5］ｄＧＵから合成したものであった。内部標準（ＩＳ）として安定同位体標識化合物を使用した。全ての標準はさらなる精製なしに使用した。
【０１０６】
試料採取および分析。消化後、試料を６倍希釈し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ０．５ｍｌ  ３Ｋによって１３ｒｐｍで１５分間限外ろ過した。Ａｎｄｒｅｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．［上記に引用］による方法に従い、同じクロマトグラフィーランで５ＭｅｄＣｙｔおよびｄＣｙｔを決定するため幾らかの修正を加え、空気圧補助エレクトロスプレー用のＴｕｒｂｏＩｏｎＳｐｒａｙ（商標）インタフェースを備えたＡＰＩ  ４０００トリプル四重極質量分析計（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ、ＭＡ、米国）を使用して、同位体希釈液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって核酸酸化およびメチル化のバイオマーカーならびにそれらの非修飾ヌクレオシド、８ＯＨｄＧ、５−ＭｅｄＣｙｔ、ｄＧＵおよびｄＣｙｔを実施した。簡潔に言えば、ろ過した試料（３０μＬ）を、５０ｎｍｏｌ／Ｌの［15Ｎ5］８ＯＨｄＧ、５μｍｏｌ／Ｌの［15Ｎ5］ｄＧＵおよび６００ｎｍｏｌ／Ｌの５−ＭｅｄＣｙｔ−ｄ3を含有する９０μＬのＩＳ水性混合物と加え合わせた。次に、クロマトグラフシステムに１０μＬの試料を注入した。Ａｔｌａｎｔｉｓ（登録商標）ｄＣ18カラム（１００×２．０ｍｍ内径、３μｍ；Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）で、種々の割合の１０ｍｍｏｌ／ｌ含水ギ酸（ｐＨ３．７５）およびメタノールを０．２ｍＬ／分の流量で使用して分析物の分離を実施した。分析物（およびＩＳ）を陽イオンモードで電離し、以下のＳＲＭ移行をモニタした：８ＯＨｄＧおよびそのＩＳ  ［15Ｎ5］８ＯＨｄＧについてｍ／ｚ２８４→１６８およびｍ／ｚ２８９→１７３；ｄＧＵおよびそのＩＳ  ［15Ｎ5］ｄＧＵについてｍ／ｚ２６８→１５２およびｍ／ｚ２７３→１５７；５−ＭｅｄＣｙｔおよびそのＩＳ  ５−ＭｅｄＣｙｔ−ｄ3についてｍ／ｚ２４２→１２６およびｍ／ｚ２４５→１２９；ｄＣｙｔについてｍ／ｚ２２８→１１２。定量分析のため、８ＯＨｄＧについて０〜８０ｎｍｏｌ／Ｌ、５−ＭｅｄＣｙｔについて０〜５００ｎｍｏｌ／Ｌ、およびｄＧＵおよびｄＣｙｔについて０〜１０μｍｏｌ／Ｌの濃度範囲の標準溶液でプール消化試料をスパイクすることにより動作キャリブレーションを達成した。各分析物について、注射した既知の濃度の分析物に対する分析物対ＩＳ面積比の線形回帰分析によって検量線を作成した（ｒ2＞０．９９８）。ｄＣｙｔについては、５−ＭｅｄＣｙｔ−ｄ3を内部標準として使用した。ＬＯＱは、それぞれ８ＯＨｄＧおよび５−ＭｅｄＣｙｔについて０．７５ｎｍｏｌ／Ｌ、ｄＧＵおよびｄＣｙｔについて１ｎｍｏｌ／Ｌであった。％ＣＶは、全ての分析物ならびに全ての日中および日間測定について２．０％〜６．３％の範囲であった。
【０１０７】
結果は図１０に示した。
【０１０８】
試験１１  −  鉄代謝
鉄代謝は、ヒトにおける鉄レベルを一定に維持する幾つもの生物学的反応を含む。鉄（潜在的に高濃度で毒性）の制御はヒトの健康の維持に必須である。鉄は、人体の鉄のほとんどが含まれる赤血球にとって必須である。鉄代謝障害には、ヘモクロマトーシスなどの鉄過剰、および鉄欠乏性貧血などの鉄欠乏が含まれる。
【０１０９】
ヘプシジンは肝臓によって産生され、鉄恒常性の主要な調節因子と見られる。ヘプシジンは腸粘膜を通じた鉄輸送を調節（阻害）し、それによって過剰な鉄吸収を防ぎ、体内の正常な鉄レベルを維持する。ヘプシジンは、鉄がマクロファージ（鉄の貯蔵および輸送部位）から運び出されるのも阻害する。したがって、高ヘプシジンレベルの状態（炎症状態を含む）では、鉄がマクロファージ内に捕捉されるため血清鉄レベルが降下し得る。ヘプシジンは、マウスモデルにおいて、レベル上昇を引き起こし得る炎症の鎮静化において負のフィードバックとして機能する抗炎症特性を有することも分かっている。
【０１１０】
フェリチンは、鉄の貯蔵およびその放出を制御された方法で行う遍在性の細胞内タンパク質である。フェリチンの貯蔵量は鉄の貯蔵量を反映する。このタンパク質は、藻類、細菌、高等植物、および動物を含めたほぼ全ての生物によって産生される。ヒトでは、フェリチンは鉄欠乏および鉄過剰に対する緩衝として機能する。
【０１１１】
フェロポーチンは、細胞の内部からその外部へと鉄を輸送する膜貫通タンパク質である。フェロポーチンは肝臓および十二指腸細胞で発現する。
【０１１２】
肥満の人ではヘプシジン、フェリチンおよびフェロポーチンのレベルが変化し、肥満は鉄欠乏に関連する。
【０１１３】
例えば、Ａｎ−Ｓｈｅｎｇ  Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．"Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｈｅｐｃｉｄｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ａｃｕｔｅ  ｉｒｏｎ  ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｏｆ  ｍａｔｒｉｐｔａｓｅ−２  ｐｒｏｔｅｉｎ"，Ｂｌｏｏｄ．Ｆｅｂ  ３，２０１１；１１７（５）：１６８７−１６９９）に記載される通りの標準手順に従い、４群のマウスにおけるヘプシジン、フェリチンおよびフェロポーチンのレベルを計測した。
【０１１４】
結果は図１１に示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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