(57)【要約】本発明は、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）を含む抽出植物脂質または微生物脂質、及び該抽出脂質の製造方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エステル化された形態の脂肪酸を含み、前記脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸（ＬＡ）を含むω６脂肪酸、α−リノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３脂肪酸及びドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）を含み、場合により、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、及びエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）のうち１つ以上を含んでもよく、前記抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるＤＰＡのレベルが、７％から３５％の間である、抽出植物脂質または微生物脂質。
【請求項２】
以下の特徴：
ｉ）前記抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるパルミチン酸のレベルは、約２％から１５％の間、または約３％から１０％の間であること、
ｉｉ）前記抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるミリスチン酸（Ｃ１４：０）のレベルは、約０．１％であること、
ｉｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるオレイン酸のレベルは、約１％から約３０％の間、約３％から約３０％の間、約６％から約３０％の間、約１％から約２０％の間、約３０％から約６０％の間、約４５％〜約６０％、約３０％、または約１５％から約３０％の間であること、
ｉｖ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるリノール酸（ＬＡ）のレベルは、約４％から約３５％の間、約４％から約２０％の間、約４％から約１７％の間、または約５％から約１０％の間であること、
ｖ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるα−リノレン酸（ＡＬＡ）のレベルは、約４％から約４０％の間、約７％から約４０％の間、約１０％から約３５％の間、約２０％から約３５％の間、約４％から約１６％の間、または約２％から約１６％の間であること、
ｖｉ）前記抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるγ−リノレン酸（ＧＬＡ）のレベルは、４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．５％未満、０．０５％から７％の間、０．０５％から４％の間、０．０５％から約３％の間、または０．０５％から約２％の間であること、
ｖｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるステアリドン酸（ＳＤＡ）のレベルは、約１０％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約４％未満、約３％未満、約０．０５％から約７％の間、約０．０５％から約６％の間、約０．０５％から約４％の間、約０．０５％から約３％の間、約０．０５％から約１０％の間、または約０．０５％から約２％の間であること、
ｖｉｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）のレベルは、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約１％未満、約０．５％未満、０．０５％から約６％の間、０．０５％から約５％の間、０．０５％から約４％の間、０．０５％から約３％の間、または０．０５％から約２％の間であること、
ｉｘ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるエイコサトリエン酸（ＥＴｒＡ）のレベルは、４％未満、約２％未満、約１％未満、０．０５％から４％の間、０．０５％から３％の間、または０．０５％から約２％の間、または０．０５％から約１％の間であること、
ｘ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）のレベルは、４％から１５％の間、４％未満、約３％未満、約２％未満、０．０５％から１０％の間、０．０５％から５％の間、０．０５％から約３％の間、または０．０５％から約２％の間であること、
ｘｉ）もし、前記抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるＤＨＡのレベルが、２％未満、または０．０５％から約２％の間であること、
ｘｉｉ）該脂質は、その脂肪酸含有物中にω６−ドコサペンタエン酸（２２：５Δ４，７，１０，１３，１６）を含むこと、
ｘｉｉｉ）該脂質は、その脂肪酸含有物中に０．１％未満のω６−ドコサペンタエン酸（２２：５Δ４，７，１０，１３，１６）を含むこと、
ｘｉｖ）該脂質は、その脂肪酸含有物中に０．１％未満の１つ以上または全てのＳＤＡ、ＥＰＡ及びＥＴＡを含むこと、
ｘｖ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総飽和脂肪酸レベルは、約４％から約２５％の間、約４％から約２０％の間、約６％から約２０％の間、または約６％から約１２％の間であること、  
ｘｖｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総一価不飽和脂肪酸レベルは、約４％から約４０％の間、約４％から約３５％の間、約８％から約２５％の間、８％から約２２％の間、約１５％から約４０％の間または約１５％から約３５％の間であること、
ｘｖｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総多価不飽和脂肪酸レベルは、約２０％から約７５％の間、３０％から７５％の間、約５０％から約７５％の間、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、または約６０％から約７５％の間であること、
ｘｖｉｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総ω６脂肪酸レベルは、約３５％から約５０％の間、約２０％から約３５％の間、約６％から約２０％の間、２０％未満、約１６％未満、約１０％未満、約１％から約１６％の間、約２％から約１０％の間、または約４％から約１０％の間であること、
ｘｉｘ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量における新ω６脂肪酸レベルは、約１０％未満、約８％未満、約６％未満、４％未満、約１％から約２０％の間、約１％から約１０％の間、０．５％から約８％の間、または０．５％から４％の間であること、
ｘｘ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総ω３脂肪酸レベルは、３６％から約６５％の間、３６％から約７０％の間、４０％から約６０％の間、約３０％から約６０％の間、約３５％から約６０％の間、４０％から約６５％の間、約３０％から約６５％の間、約３５％から約６５％の間、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％または約７０％であること、
ｘｘｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量における新ω３脂肪酸レベルは、２１％から約４５％の間、２１％から約３５％の間、約２３％から約３５％の間、約２５％から約３５％の間、約２７％から約３５％の間、約２３％から約２５％の間、約２７％、約３０％、約３５％、約４０％または約４５％であること、  
ｘｘｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総ω６脂肪酸：総ω３脂肪酸の比は、約１．０から約３．０の間、約０．１から約１の間、約０．１から約０．５の間、約０．５０未満、約０．４０未満、約０．３０未満、約０．２０未満、約０．１５未満、約１．０未満、約０．１未満、約０．１０〜約０．４、または約０．２であること、
ｘｘｉｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量における新ω６脂肪酸：新ω３脂肪酸の比は、約１．０から約３．０の間、約０．０２から約０．１の間、約０．１から約１の間、約０．１から約０．５の間、約０．５０未満、約０．４０未満、約０．３０未満、約０．２０未満、約０．１５未満、約０．０２、約０．０５、約０．１、約０．２または約１．０であること、
ｘｘｉｖ）該脂質の脂肪酸組成は、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、約６０％から約９８％の間、約７０％から約９５％の間、または約７５％から約９０％の間のΔ１２−デサチュラーゼによるオレイン酸からＬＡへの転換効率に基づくこと、
ｘｘｖ）該脂質の脂肪酸組成は、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、約３０％から約７０％の間、約３５％から約６０％の間、または約５０％から約７０％の間のΔ６−デサチュラーゼによるＡＬＡからＳＤＡへの転換効率に基づくこと、
ｘｘｖｉ）該脂質の脂肪酸組成は、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、約６０％から約９５％の間、約７０％から約８８％の間、または約７５％から約８５％の間のΔ６−エロンガーゼによるＳＤＡからＥＴＡ酸への転換効率に基づくこと、
ｘｘｖｉｉ）該脂質の脂肪酸組成は、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、約６０％から約９９％の間、約７０％から約９９％の間、または約７５％から約９８％の間のΔ５−デサチュラーゼによるＥＴＡからＥＰＡへの転換効率に基づくこと、
ｘｘｖｉｉｉ）該脂質の脂肪酸組成は、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、約５０％から約９９％の間、約８５％から約９９％の間、約５０％から約９５％の間、または約８５％から約９５％の間のΔ５−エロンガーゼによるＥＰＡからＤＰＡへの転換効率に基づくこと、
ｘｘｉｘ）前記脂質の脂肪酸組成は、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、約２０％、約２５％、約３０％、約１０％から約５０％の間、約１０％から約３０％の間、約１０％から約２５％の間または約２０％から約３０％の間のオレイン酸からＤＰＡへの転換効率に基づくこと、
ｘｘｘ）前記脂質の脂肪酸組成は、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２２％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約１５％から約５０％の間、約２０％から約４０％の間、または約２０％から約３０％の間のＬＡからＤＰＡへの転換効率に基づくこと、
ｘｘｘｉ）前記脂質の脂肪酸組成は、少なくとも約１７％、少なくとも約２２％、少なくとも約２４％、少なくとも約３０％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約２２％から約７０％の間、約１７％から約５５％の間、約２２％から約４０％の間、または約２４％から約４０％の間のＡＬＡからＤＰＡへの転換効率に基づくこと、
ｘｘｘｉｉ）該抽出脂質中の総脂肪酸は、１．５％未満のＣ２０：１、１％未満のＣ２０：１または約１％のＣ２０：１を有すること、
ｘｘｘｉｉｉ）該脂質のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）含有率は、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、約７０％から約９９％の間、または約９０％から約９９％の間であること、
ｘｘｘｉｖ）該脂質は、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）を含み、ＤＡＧは好ましくはＤＰＡを含むこと、
ｘｘｘｖ）該脂質は、約１０％未満、約５％未満、約１％未満または約０．００１％から約５％の間の遊離（非エステル化）脂肪酸及び／またはリン脂質を含む、または本質的にそれを含まないこと、
ｘｘｘｖｉ）ＴＡＧの形態でエステル化されたＤＰＡの少なくとも７０％、少なくとも７２％または少なくとも８０％は、前記ＴＡＧのｓｎ−１位またはｓｎ−３位であること、
ｘｘｘｖｉｉ）前記脂質において最も豊富なＤＰＡ含有ＴＡＧ種は、ＤＰＡ／１８：３／１８：３（ＴＡＧ５６：１２）であること、  
ｘｘｘｖｉｉｉ）前記脂質は、トリＤＰＡ  ＴＡＧ（ＴＡＧ６６：１８）を含むこと、及び
ｘｘｘｉｘ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるＤＰＡのレベルが、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１２％、約１５％、約１８％、約２０％、約２２％、約２４％、約２６％、約２８％、約３１％、約７％から約３１％の間、約７％から約２８％の間、約１０％から約３５％の間、約１０％から約３０％の間、約１０％から約２５％の間、約１０％から約２２％の間、約１４％から約３５％の間、約１６％から約３５％の間、約１６％から約３０％の間、約１６％から約２５％の間、または約１６％から約２２％の間であり、場合により、ＤＨＡレベルは、該抽出脂質の総脂肪酸含有量の０．５％未満であること
の１つ以上を有する、請求項１に記載の脂質。
【請求項３】
前記脂質がオイル、好ましくは、油料種子から採れるオイルであり、より好ましくは、前記脂質が、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）オイルまたはカラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）オイルなどのアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｓｐ．）オイル、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）オイル、アマ（Ｌｉｎｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）オイル、ヘリアンタス属（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｓｐ．）オイル、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）オイル、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）オイル、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）オイル、ギニアアブラヤシ（Ｅｌａｅｓｉｓ  ｇｕｉｎｅｅｎｉｓ）オイル、ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）オイル、アオバナルーピン（Ｌｕｐｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓ）オイル、カメリナサティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ  ｓａｔｉｖａ）オイル、クランベアビシニカ（Ｃｒａｍｂｅ  ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ）オイル、ジャイアントミスカンサス（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ  ｘ  ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）オイル、またはススキ（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）オイルを含むまたはである、請求項１または２のいずれか１項に記載の脂質。
【請求項４】
ｉ）脂質を含む植物部分または微生物細胞を得る工程であって、前記脂質がエステル化された形態の脂肪酸を含み、前記脂肪酸がオレイン酸、パルミチン酸、リノール酸（ＬＡ）を含むω６脂肪酸、α−リノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３脂肪酸、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）を含み、場合により、１つ以上のエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）及びエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）を含んでもよく、前記植物部分中の抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるＤＰＡのレベルが７％から３５％の間である前記工程、及び
ｉｉ）前記植物部分または微生物細胞から脂質を抽出する工程
を含み、前記抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるＤＰＡのレベルが７％から３５％の間である抽出植物脂質または微生物脂質の産生方法。
【請求項５】
前記抽出脂質が請求項２または請求項３で定義された特徴の１つ以上を有する、請求項４記載の方法
【請求項６】
前記植物部分が種子、好ましくは、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）またはカラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）などのアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｓｐ．）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、アマ（Ｌｉｎｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）、ヘリアンタス属（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｓｐ．）、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、ギニアアブラヤシ（Ｅｌａｅｓｉｓ  ｇｕｉｎｅｅｎｉｓ）、ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）、アオバナルーピン（Ｌｕｐｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓ）、カメリナサティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ  ｓａｔｉｖａ）、またはクランベアビシニカ（Ｃｒａｍｂｅ  ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ）、好ましくは、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、カラシナ（Ｂ．  ｊｕｎｃｅａ）またはカメリナサティバ（Ｃ．  ｓａｔｉｖａ）の種子などの油料種子である、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記植物部分または微生物細胞が、酵素の以下のセット：
ｉ）ω３−デサチュラーゼ、Δ６−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ６−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ、
ｉｉ）Δ１５−デサチュラーゼ、Δ６−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ６−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ、
ｉｉｉ）Δ１２−デサチュラーゼ、Δ６−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ６−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ、
ｉｖ）Δ１２−デサチュラーゼ、ω３−デサチュラーゼ及び／またはΔ１５−デサチュラーゼ、Δ６−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ６−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ、
ｖ）ω３−デサチュラーゼ、Δ８−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ９−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ、
ｖｉ）Δ１５−デサチュラーゼ、Δ８−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ９−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ、
ｖｉｉ）Δ１２−デサチュラーゼ、Δ８−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ９−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ、
ｖｉｉｉ）Δ１２−デサチュラーゼ、ω３−デサチュラーゼ及び／またはΔ１５−デサチュラーゼ、Δ８−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ９−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ、
ｉｘ）ω３−デサチュラーゼまたはΔ１５−デサチュラーゼ、Δ６−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ６−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ、または
ｘ）ω３−デサチュラーゼまたはΔ１５−デサチュラーゼ、Δ８−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ９−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ
の１つをコードする外来性ポリヌクレオチドを含み、各ポリヌクレオチドは、前記植物部分または微生物細胞の細胞内の前記ポリヌクレオチドの発現を誘導可能である１つ以上のプロモーターと作動可能に結合している、請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記植物部分または微生物細胞が、以下の特徴：
ｉ）前記Δ１２‐デサチュラーゼが、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、約６０％から約９５％の間、約７０％から約９０％の間、または約７５％から約８５％の間の効率で、前記植物部分または微生物細胞の１つ以上の細胞内で、オレイン酸をリノール酸に転換すること、
ｉｉ）前記ω３‐デサチュラーゼが、少なくとも約６５％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、約６５％から約９５％の間、約７５％から約９１％の間、または約８０％から約９１％の間の効率で、前記植物部分または微生物細胞の１つ以上の細胞内で、ω６脂肪酸をω３脂肪酸に転換すること、
ｉｉｉ）前記Δ６‐デサチュラーゼが、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、約３０％から約７０％の間、約３５％から約６０％の間、または約５０％から約７０％の間の効率で、前記植物部分または微生物細胞の１つ以上の細胞内で、ＡＬＡをＳＤＡに転換すること、
ｉｖ）前記Δ６‐デサチュラーゼが、約５％未満、約２．５％未満、約１％未満、約０．１％から約５％の間、約０．５％から約２．５％の間、または約０．５％から約１％の間の効率で、前記植物部分または微生物細胞の１つ以上の細胞内で、リノール酸をγ‐リノレン酸に転換すること、
ｖ）前記Δ６‐エロンガーゼが、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、約６０％から約９５％の間、約７０％から約８０％の間、または約７５％から約８０％の間の効率で、前記植物部分または微生物細胞の１つ以上の細胞内で、ＳＤＡをＥＴＡに転換すること、
ｖｉ）前記Δ５‐デサチュラーゼが、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、約６０％から約９５％の間、約７０％から約９５％の間、または約７５％から約９５％の間の効率で、前記植物部分または微生物細胞の１つ以上の細胞内で、ＥＴＡをＥＰＡに転換すること、
ｖｉｉ）前記Δ５‐エロンガーゼが、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、約５０％から約９０％の間、または約８５％から約９５％の間の効率で、前記植物部分または微生物細胞の１つ以上の細胞内で、ＥＰＡをＤＰＡに転換すること、
ｖｉｉｉ）前記植物部分または微生物細胞の１つ以上の細胞内で、オレイン酸をＤＰＡに転換する効率が、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、約２０％、約２５％、約３０％、約１０％から約５０％の間、約１０％から約３０％の間、または約１０％から約２５％の間、または約２０％から約３０％の間であること、
ｉｘ）前記植物部分または微生物細胞の１つ以上の細胞内で、ＬＡをＤＰＡに転換する効率が、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２２％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、約２５％、約３０％、約３５％、約１５％から約５０％の間、約２０％から約４０％の間、または約２０％から約３０％の間であること、
ｘ）前記植物部分または微生物細胞の１つ以上の細胞内で、ＡＬＡをＤＰＡに転換する効率が、少なくとも約１７％、少なくとも約２２％、少なくとも約２４％、少なくとも約３０％、約３０％、約３５％、約４０％、約１７％から約５５％の間、約２２％から約３５％の間、または約２４％から約３５％の間であること、
ｘｉ）前記植物部分または微生物細胞の１つ以上の細胞は、前記外来性ポリヌクレオチドを含まない対応細胞より、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、約２５％から約４０％の間、または約２７．５％から約３７．５％の間で多いω３脂肪酸を含むこと、
ｘｉｉ）前記Δ６−デサチュラーゼは、リノール酸（ＬＡ）と比較してα−リノレン酸（ＡＬＡ）を優先的に不飽和化すること、
ｘｉｉｉ）前記Δ６−エロンガーゼは、Δ９−エロンガーゼ活性も有すること、
ｘｉｖ）前記Δ１２−デサチュラーゼは、Δ１５−デサチュラーゼ活性も有すること、
ｘｖ）前記Δ６−デサチュラーゼは、Δ８−デサチュラーゼ活性も有すること、
ｘｖｉ）前記Δ８−デサチュラーゼは、Δ６−デサチュラーゼ活性も有する、またはΔ６−デサチュラーゼ活性を有しないこと、
ｘｖｉｉ）前記Δ１５−デサチュラーゼは、ＧＬＡに対するω３−デサチュラーゼ活性も有すること、
ｘｖｉｉｉ）前記ω３−デサチュラーゼは、ＬＡに対するΔ１５−デサチュラーゼ活性も有すること、
ｘｉｘ）前記ω３−デサチュラーゼは、ＬＡ及び／またはＧＬＡの両方を不飽和化すること、
ｘｘ）前記ω３−デサチュラーゼは、ＬＡと比較してＧＬＡを優先的に不飽和化すること、
ｘｘｉ）１つ以上または全ての前記デサチュラーゼは、対応するアシル‐ＰＣ基質より、アシル−ＣｏＡ基質に対して高い活性を有すること、
ｘｘｉｉ）前記Δ６−デサチュラーゼは、脂肪酸基質として、ＬＡより、ＡＬＡに対して高いΔ６−デサチュラーゼ活性を有すること、
ｘｘｉｉｉ）前記Δ６−デサチュラーゼは、脂肪酸基質としてのＰＣのＳｎ−２位と結合したＡＬＡに対するより、脂肪酸基質としてのＡＬＡ−ＣｏＡに対して高いΔ６−デサチュラーゼ活性を有すること、
ｘｘｉｖ）前記Δ６−デサチュラーゼは、ＬＡと比較して、基質としてのＡＬＡに対して、少なくとも約２倍高いΔ６−デサチュラーゼ活性、少なくとも３倍高い活性、少なくとも４倍高い活性、または少なくとも５倍高い活性を有すること、
ｘｘｖ）前記Δ６−デサチュラーゼは、脂肪酸基質としてのＰＣのｓｎ−２位と結合したＡＬＡに対するより、脂肪酸基質としてのＡＬＡ−ＣｏＡに対して高い活性を有すること、
ｘｘｖｉ）前記Δ６−デサチュラーゼは、脂肪酸基質としてのＰＣのｓｎ−２位に結合したＡＬＡに対するより、脂肪酸基質としてのＡＬＡ−ＣｏＡに対して、少なくとも約５倍高いΔ６‐デサチュラーゼ活性または少なくとも１０倍高い活性を有すること、
ｘｘｖｉｉ）前記デサチュラーゼは、フロントエンドデサチュラーゼであること、及び
ｘｘｖｉｉｉ）前記Δ６‐デサチュラーゼは、ＥＴＡに対する検出可能なΔ５‐デサチュラーゼ活性を有しないこと
の１つ以上または全てを有する、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記植物部分または微生物細胞が、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）、モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＭＧＡＴ）、グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）、１−アシル−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）、好ましくは、ＤＰＡ−ＣｏＡなどのＣ２２多価不飽和脂肪アシル−ＣｏＡ基質を使用できるＬＰＡＡＴ、アシル−ＣｏＡ：リゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）、ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）、ＣＤＰ−コリンジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）、ホスファチジルコリンジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＰＤＡＴ）、ホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）、アシル−ＣｏＡシンターゼ（ＡＣＳ）、またはその２つ以上の組合せをコードする外来性ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項７または請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記外来性ポリヌクレオチドが、前記植物部分または微生物細胞の細胞のゲノムに組み込まれたＤＮＡ分子、好ましくは、Ｔ−ＤＮＡ分子内に共有結合しており、好ましくは、前記植物部分または微生物細胞の細胞のゲノムに組み込まれたかかるＤＮＡ分子数が、１以下、２もしくは３以下であり、または２もしくは３である、請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記外来性ポリヌクレオチドを含む前記植物部分または微生物細胞の総オイル含有率が、前記外来性ポリヌクレオチドを含まない対応する植物部分または微生物細胞の総オイル含有率の少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、約５０％から約８０％の間、または約８０％から約１００％の間である、請求項４〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記脂質を処理して、総脂肪酸含有率のパーセンテージとして、ＤＰＡのレベルを増加させることをさらに含み、前記処理が、１つ以上の分別蒸留、蒸留またはＤＰＡのメチルエステルまたはエチルエステルの生成などのエステル交換反応を含む、請求項４〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
その種子中に脂質を含む油料種子植物、もしくはその部分、または微生物細胞であって、
ａ）エステル化された形態の脂肪酸を含む脂質、及び
ｂ）酵素の以下のセット；
ｉ）Δ１２−デサチュラーゼ、ω３−デサチュラーゼ及び／またはΔ１５−デサチュラーゼ、Δ６−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ６−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ、
ｉｉ）Δ１２−デサチュラーゼ、ω３−デサチュラーゼ及び／またはΔ１５−デサチュラーゼ、Δ８−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ９−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ
ｉｉｉ）ω３−デサチュラーゼ及び／またはΔ１５−デサチュラーゼ、Δ６−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ６−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ、または
ｉｖ）ω３−デサチュラーゼ及び／またはΔ１５−デサチュラーゼ、Δ８−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ９−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ  
の１つをコードする外来性ポリヌクレオチド
を含み、
各ポリヌクレオチドが、前記植物の発育種子中の前記ポリヌクレオチドの発現を誘導可能である１つ以上の種子特異的プロモーター、または前記微生物細胞中の前記ポリヌクレオチドの発現を誘導可能である１つ以上のプロモーターと作動可能に結合されており、前記脂肪酸が、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸（ＬＡ）を含むω６脂肪酸、α−リノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３脂肪酸、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、及びドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）を含み、場合によっては、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）及び／またはエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）を含んでもよく、及び前記種子または微生物細胞の脂質の総脂肪酸含有量におけるＤＰＡのレベルが７％から３５％の間である、
前記油料種子植物、もしくはその部分、または微生物細胞。
【請求項１４】
ＤＰＡを含む種子を産生可能であるセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、カラシナ（Ｂ．  ｊｕｎｃｅａ）またはカメリナサティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ  ｓａｔｉｖａ）植物であって、前記植物の成熟した収穫された種子が、種子１グラム当たり少なくとも約２８ｍｇ、好ましくは、種子１グラム当たり少なくとも約３２ｍｇ、種子１グラム当たり少なくとも約３６ｍｇ、種子１グラム当たり少なくとも約４０ｍｇ、より好ましくは、種子１グラム当たり少なくとも約４４ｍｇまたは少なくとも４８ｍｇ、種子１グラム当たり少なくとも約８０ｍｇ、または種子１グラム当たり約３０ｍｇから約８０ｍｇの間のＤＰＡ含有量を有する、前記植物。
【請求項１５】
前記外来性ポリヌクレオチドを含む請求項１３記載の植物細胞。
【請求項１６】
以下の特徴：
ｉ）請求項１３または１４記載の植物由来であること、
ｉｉ）請求項１〜３のいずれか１項に記載の脂質を含むこと、
ｉｉｉ）請求項４〜１２のいずれか１項に記載の方法で使用できること
の１つ以上を有する植物部分、好ましくは種子、または微生物細胞。
【請求項１７】
ＤＰＡ及び約４重量％から約１５重量％の間、好ましくは、約６重量％から約８重量％の間または約４重量％から約８重量％の間の水分を含む成熟して収穫されたセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、カラシナ（Ｂ．  ｊｕｎｃｅａ）またはカメリナサティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ  ｓａｔｉｖａ）種子であって、前記種子のＤＰＡ含有量が種子１グラム当たり少なくとも約２８ｍｇ、好ましくは、種子１グラム当たり少なくとも約３２ｍｇ、種子１グラム当たり少なくとも約３６ｍｇ、種子１グラム当たり少なくとも約４０ｍｇ、より好ましくは、種子１グラム当たり少なくとも約４４ｍｇまたは種子１グラム当たり少なくとも約４８ｍｇ、種子１グラム当たり約８０ｍｇ、または種子１グラム当たり約３０ｍｇから約８０ｍｇの間である、前記種子。
【請求項１８】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の抽出植物脂質または抽出微生物脂質の製造に使用できる植物または微生物細胞の産生方法であって、前記方法が、
ａ）複数の植物または微生物細胞からの１つ以上の植物部分または微生物細胞により産生された脂質中のＤＰＡのレベルをアッセイすることであって、各植物または微生物細胞が、酵素の以下のセット；
ｉ）ω３−デサチュラーゼ、Δ６−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ６−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ、
ｉｉ）Δ１５−デサチュラーゼ、Δ６−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ６−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ、
ｉｉｉ）Δ１２−デサチュラーゼ、Δ６−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ６−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ、
ｉｖ）Δ１２−デサチュラーゼ、ω３−デサチュラーゼまたはΔ１５−デサチュラーゼ、Δ６−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ６−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ、
ｖ）ω３−デサチュラーゼ、Δ８−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ９−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ、
ｖｉ）Δ１５−デサチュラーゼ、Δ８−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ９−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ、
ｖｉｉ）Δ１２−デサチュラーゼ、Δ８−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ９−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ、
ｖｉｉｉ）Δ１２−デサチュラーゼ、ω３−デサチュラーゼまたはΔ１５−デサチュラーゼ、Δ８−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ９−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ、
ｉｘ）ω３−デサチュラーゼまたはΔ１５−デサチュラーゼ、Δ６−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ６−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ、または
ｘ）ω３−デサチュラーゼまたはΔ１５−デサチュラーゼ、Δ８−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ９−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ
の１つをコードする１つ以上の外来性ポリヌクレオチドを含み、
各ポリヌクレオチドが、植物部分または微生物細胞の細胞内の前記ポリヌクレオチドの発現を誘導可能である１つ以上のプロモーターと作動可能に結合する、前記アッセイすること、と
ｂ）１つ以上のその部分の請求項１〜３のいずれか１項に記載の抽出植物脂質または微生物脂質の産生に使用できる複数の植物または微生物細胞から植物または微生物細胞を同定すること、と
ｃ）場合によっては、前記同定植物または微生物細胞、またはそれ由来の種子から後代植物または微生物細胞を産生すること
とを含む前記方法。
【請求項１９】
種子の産生方法であって、前記方法が、
ａ）好ましくは、少なくとも１０００または２０００または３０００のかかる植物の集合部分としての耕地または標準栽植密度で植えられた少なくとも１ヘクタールまたは２ヘクタールまたは３ヘクタールの領域で、請求項１３または１４記載の植物、または請求項１６記載の植物部分を産生、もしくは請求項１７記載の種子を産生する植物を生育すること、
ｂ）前記１つまたは複数の植物から種子を収穫すること、及び
ｃ）場合によっては、前記種子から脂質を抽出して、好ましくは、少なくとも６０ｋｇまたは７０ｋｇまたは８０ｋｇのＤＰＡ／ヘクタールの総ＤＰＡ収率でオイルを産生すること
を含む、前記方法。
【請求項２０】
次の特徴：
ｉ）請求項２または請求項３に定義されるオイルを含むこと、及び
ｉｉ）前記植物部分または種子または微生物細胞が請求項４〜１２のいずれか１項に記載の方法で使用可能であること
の１つ以上を有する、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の植物、植物細胞、植物部分もしくは種子、または微生物細胞。
【請求項２１】
請求項４〜１２のいずれか１項に記載の方法を用いて、請求項１５記載の細胞、請求項１３記載の油料種子植物、請求項１３記載の微生物細胞、請求項１４記載のセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、カラシナ（Ｂ．  ｊｕｎｃｅａ）もしくはカメリナサティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ  ｓａｔｉｖａ）植物、請求項１６記載の植物部分、または請求項１７記載の種子により産生、またはから得られる脂質、またはオイル。
【請求項２２】
請求項１７記載の種子から得られる、または請求項１３または１４記載の植物から得られるシードミール。
【請求項２３】
１つ以上の請求項２１記載の脂質もしくはオイル、請求項１５記載の細胞、請求項２０記載の植物細胞または微生物細胞、請求項１７記載の種子、または請求項２２記載のシードミールを含む組成物。
【請求項２４】
１つ以上の請求項２１記載の脂質もしくはオイル、請求項１５記載の細胞、請求項１３記載の油料種子植物、請求項２０記載の植物細胞もしくは微生物細胞、請求項１４記載のセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、カラシナ（Ｂ．  ｊｕｎｃｅａ）もしくはカメリナサティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ  ｓａｔｉｖａ）植物、請求項２０記載の植物部分、請求項１７記載の種子、請求項２２記載のシードミール、または請求項２３記載の組成物を含む家畜飼料、化粧品または化学薬品。
【請求項２５】
家畜飼料の製造方法であって、前記方法が、少なくとも１つの他の食物成分と、１つ以上の請求項１〜３のいずれか１項に記載の脂質もしくはオイル、請求項１５記載の細胞、請求項１３記載の油料種子植物、請求項２０記載の植物細胞もしくは微生物細胞、請求項１４記載のセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、カラシナ（Ｂ．  ｊｕｎｃｅａ）もしくはカメリナサティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ  ｓａｔｉｖａ）植物、請求項２０記載の植物部分、請求項１７記載の種子、請求項２２記載のシードミール、または請求項２３記載の組成物を混合することを含む前記方法。
【請求項２６】
ＰＵＦＡから利益を受けることになる症状の治療または予防用医薬品製造のための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の１つ以上の脂質またはオイル、請求項１５記載の細胞、請求項２０記載の植物細胞もしくは微生物細胞、請求項２０記載の植物部分、請求項１７記載の種子、請求項２２記載のシードミール、または請求項２３記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物細胞または微生物細胞から得られたドコサペンタエン酸を含む脂質、及び該脂質の産生及び使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ω３長鎖多価不飽和脂肪酸（ＬＣ−ＰＵＦＡ）は、ヒト及び動物の健康のための重要な化合物として、今では広く認識されている。これらの脂肪酸を、食事供給源からまたは、その両方とも食餌の必須脂肪酸として見なされているリノール酸（ＬＡ、１８：２ω６）またはα−リノレン酸（ＡＬＡ、１８：３ω３）脂肪酸の転換により得ることができる。ヒト及び多くの他脊椎動物は、植物源から得られたＬＡまたはＡＬＡをＣ２２に転換できるが、この転換反応は、非常に遅い速度で起こる。さらに、現代社会のほとんどは、理想とされるω６：ω３脂肪酸について４：１以下の比の代わりに、少なくとも９０％の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）がω６脂肪酸であるというバランスのとれていない食事をとっている（Ｔｒａｕｔｗｅｉｎ、２００１）。ヒトのためのエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、２０：５ω３）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、及びドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、２２：６ω３）などのＬＣ−ＰＵＦＡの即時型食事供給源は、ほとんど、魚または魚油からである。従って、健康専門家はヒトの食事に、ＬＣ−ＰＵＦＡの有意なレベルを含む魚を規則的に含めることを推奨している。益々、魚由来ＬＣ−ＰＵＦＡオイルは、例えば、食品及び乳児用調製粉乳に配合されている。しかしながら、世界的及び国の水産業の衰退のせいで、これらの有益な健康増進オイルの代替源が必要とされている。
【０００３】
動物と対照的に、顕花植物類は、１８個の炭素より長い長鎖を有する多価不飽和脂肪酸を合成する能力を有しない。特に、他被子植物類と共に作物及び園芸植物は、ＡＬＡから誘導されるＥＰＡ、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ、２２：５ω３）及びＤＨＡなどのより長鎖ω３脂肪酸を合成するために必要な酵素を有しない。従って、植物バイオ技術の重要ゴールは、実質的量のＬＣ−ＰＵＦＡを産生し、それ故、これらの化合物の代替供給源を提供する作物のエンジニアリングである。
【発明の概要】
【０００４】
ＬＣ−ＰＵＦＡ生合成経路
微細藻類、セン類及び真菌類などの生物のＬＣ−ＰＵＦＡの生合成は、通常、一連の酸素依存性不飽和化及び伸長反応として起こる（図１）。これらの生物内でＥＰＡを産生する最も共通の経路としては、Δ６−不飽和化反応、Δ６−伸長反応及びΔ５−不飽和化反応（Δ６−不飽和化反応経路と呼ばれる）が挙げられ、一方で、余り共通でない経路は、Δ９−伸長反応、Δ８−不飽和化反応及びΔ５−不飽和化反応（Δ９−不飽和化反応経路と呼ばれる）を使用する。これらの連続した不飽和化及び伸長反応は、図１の上左部に模式的に示したω６脂肪酸基質ＬＡ（ω６）または図１の下右部に示したＥＰＡに完結するω３基質ＡＬＡ（ω３）のいずれかで開始し得る。もし、最初のΔ６−不飽和化反応が、ω６基質ＬＡ上で起こるならば、一連の３種の酵素のＬＣ−ＰＵＦＡ産生物は、ω６脂肪酸ＡＲＡであろう。ＬＣ−ＰＵＦＡ合成生物は、アラキドン酸（ＡＲＡ、２０：４ω６）のＥＰＡへの転換について図１中のΔ１７−デサチュラーゼ工程として示したω３−デサチュラーゼを用いて、ω６脂肪酸をω３脂肪酸に転換し得る。ω３−デサチュラーゼファミリーのいくつかのメンバーは、ＬＡからＡＲＡまでの範囲の様々な基質上で作用できる。植物ω３−デサチュラーゼは、しばしば、ＬＡからＡＬＡまでのΔ１５−不飽和化反応を特異的に触媒するが、一方、真菌類及び酵母のω３−デサチュラーゼは、ＡＲＡからＥＰＡまでのΔ１７−不飽和化反応に対して特異的であり得る（Ｐｅｒｅｉｒａら，２００４ａ；Ｚａｎｋら，２００５）。広範囲のω６基質をそれらの対応するω３産生物に転換できる非特異的ω３−デサチュラーゼが存在し得ることを、いくつかの報告が示唆している（Ｚｈａｎｇら，２００８）。
【０００５】
これらの生物内におけるＥＰＡのＤＨＡへの転換は、ＥＰＡのΔ５−伸長反応により起こり、ＤＰＡを産生し、次いで、Δ４−不飽和化反応によりＤＨＡを産生する（図１）。対照的に、哺乳類は、Δ４−デサチュラーゼと独立した３種の別反応によりＤＰＡをＤＨＡに転換する、いわゆる、「シュプレッヒャー」経路を使用する（Ｓｐｒｅｃｈｅｒら，１９９５）。
【０００６】
植物、セン類、微細藻類、及び線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）などの下等動物で概して見られるフロントエンドデサチュラーゼは、ホスファチジルコリン（ＰＣ）基質のｓｎ−２位とエステル化された脂肪酸基質を支配的にに受容する。従って、これらのデサチュラーゼは、アシル−ＰＣ、脂質結合、フロントエンドデサチュラーゼとして知られる（Ｄｏｍｅｒｇｕｅら，２００３）。対照的に、高等動物フロントエンドデサチュラーゼは、概して、脂肪酸基質がＰＣよりＣｏＡと結合しているアシル−ＣｏＡ基質を受容する（Ｄｏｍｅｒｇｕｅら，２００５）。いくつかの微細藻類デサチュラーゼ及び１つの植物デサチュラーゼは、ＣｏＡとエステル化された脂肪酸基質を使用することが知られている（表２）。
【０００７】
各ＰＵＦＡ伸長反応は、他成分タンパク質複合体により触媒される４工程から成る：先ず、縮合反応の結果、マロニル−ＣｏＡから脂肪酸に２Ｃ単位が付加され、β−ケトアシル中間体を生成する。それから、これが、ＮＡＤＰＨにより還元され、次いで、脱水反応によりエノイル中間体を得る。この中間体は、最終的に、２回還元されて、伸長脂肪酸を生成する。他工程はそうでないが、これらの４反応の縮合工程は基質特異的であると、概して、考えられる。実際に、天然植物伸長機構は、非天然ＰＵＦＡ基質の伸長において天然植物伸長機構の効率が低くあり得るが、ＰＵＦＡに特異的縮合酵素（通常、「エロンガーゼ」と呼ぶ）が導入されること提供するＰＵＦＡを伸長可能であることを、このことは意味している。２００７年に、酵母伸長サイクルデヒドラターゼの同定及び特徴付けが発表された（ＤｅｎｉｃとＷｅｉｓｓｍａｎ、２００７）。
【０００８】
伸長反応がアシル−ＣｏＡプールにおいて基質に対して起こる一方で、植物、セン類及び微細藻類のＰＵＦＡ不飽和化は、アシル−ＰＣプールにおいて優先的に脂肪酸基質に対して自然に起こる。ＰＣ担体へのアシル−ＣｏＡ脂肪酸の転移がリゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）により起こる一方で、アシル−ＰＣ分子からＣｏＡ担体への脂肪酸の転移は、ホスホリパーゼ（ＰＬＡ）により起こる（Ｓｉｎｇｈら、２００５）。
【０００９】
ＬＣ−ＰＵＦＡの工学的産生
ほとんどのＬＣ−ＰＵＦＡ代謝工学は、好気性Δ６−不飽和化／伸長経路を用いて行われている。タバコ中にγ−リノレン酸（ＧＬＡ、１８：３ω６）の生合成は、シアノバクテリア・シネコシスティス（ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）のΔ６−デサチュラーゼを用いて、１９９６年に初めて報告された（ＲｅｄｄｙとＴｈｏｍａｓ、１９９６）。より近年では、ＧＬＡは、ベニバナ（種子オイル中ＧＬＡ７３％、ＷＯ２００６／１２７７８９）及びダイズ（ＧＬＡ２８％；Ｓａｔｏら、２００４）などの作物で産生された。ＥＰＡ及びＤＨＡなどのＬＣ−ＰＵＦＡの産生は、関連する不飽和化及び伸長工程数が多いせいで、より複雑な工学操作を伴う。ＥＰＡ陸上植物のＥＰＡ産生は、Ｑｉらにより初めて報告され（２００４）、イソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ）のΔ９−エロンガーゼ、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）のΔ８−デサチュラーゼ及びモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）のΔ５−デサチュラーゼをコードする遺伝子を、ＥＰＡ３％までの収率で、アラビドプシス属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）に導入した。この研究後、Ａｂｂａｄｉら（２００４）が続き、ニセツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）のΔ６−デサチュラーゼ及びΔ６−エロンガーゼ及びフェオダクチラム・トリコルヌタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）のΔ５−デサチュラーゼをコードする遺伝子を用いて、亜麻仁でＥＰＡ０．８％までの産生を報告した。
【００１０】
ＤＨＡ産生の最初の報告は、ダイズ胚芽内におけるＤＨＡ３％の産生を記載しているＷＯ０４／０１７４６７であったが、種子ではなく、サプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ）Δ６−デサチュラーゼ、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）Δ６−デサチュラーゼ、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）Δ５−デサチュラーゼ、サプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ）Δ４−デサチュラーゼ、サプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ）Δ１７−デサチュラーゼ、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）Δ６−エロンガーゼ及びパブロバ・ルセリ（Ｐａｖｌｏｖａ  ｌｕｔｈｅｒｉ）Δ５−エロンガーゼをコードする遺伝子導入によるものであった。ＤＨＡも産生する胚芽内の最大ＥＰＡレベルは１９．６％であり、ＥＰＡからＤＨＡへの転換効率は小さいことを示した（ＷＯ２００４／０７１４６７）。この発見は、ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）Δ５／６−デサチュラーゼ、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）Δ６−エロンガーゼ、並びにパブロバ・サリナ（Ｐａｖｌｏｖａ  ｓａｌｉｎａ）Δ５−エロンガーゼ及びΔ４−デサチュラーゼを用いて、アラビドプシス属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）内におけるＥＰＡ３％及びＤＨＡ０．５％の産生についてＲｏｂｅｒｔら（２００５）により発表されたものと類似していた。また、２００５年に、Ｗｕらは、ピシリウム・イレグラーレ（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ）Δ６−エロンガーゼ、スラウストキトリッド（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）Δ５−デサチュラーゼ、ニセツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）Δ６−エロンガーゼ、キンセンカ（Ｃａｌｅｎｄｕｌａ  ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ）Δ１２−デサチュラーゼ、スラウストキトリッド（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）Δ５−エロンガーゼ、フィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）Δ１７−デサチュラーゼ、ニジマス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｕｓ  ｍｙｋｉｓｓ）ＬＣ−ＰＵＦＡエロンガーゼ、スラウストキトリッド（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）Δ４−デサチュラーゼ及びスラウストキトリッド（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）ＬＰＣＡＴを用いて、カラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）内において、ＡＲＡ２５％、ＥＰＡ１５％、及びＤＨＡ１．５％の産生を発表した（Ｗｕら、２００５）。ω３ＬＣ−ＰＵＦＡを合成する油料種子作物を産生する試みの総括が、Ｖｅｎｅｇａｓ−Ｃａｎｅｌｏｎら（２０１０）及びＲｕｉｚ−Ｌｏｐｅｚら（２０１２）により提供されている。  Ｒｕｉｚ−Ｌｏｐｅｚら（２０１２）により示されたように、トランスジェニック植物内のＤＨＡ産生について、今日までに得られた結果は魚油で見られるレベルにはほど遠いものであった。より近年、Ｐｅｔｒｉｅら（２０１２）は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）の種子内におけるＤＨＡ約１５％の産生を報告し、ＷＯ２０１３／１８５１８４は、７％から２０％の間のＤＨ���を有する特定の種子オイルの産生を報告した。しかしながら、２０％を超えるＤＨＡを有する植物油の産生の報告はない。
【００１１】
ＤＨＡの同時産生なしに有意なレベルまで、組換え細胞内のＤＰＡ産生の報告はない。実際、本発明者らは、ＤＨＡ産生なしで、組換え細胞内でＤＰＡを産生するいかなる公になった示唆も動機づけも知らない。
【００１２】
従って、組換え細胞内でのＬＣ−ＰＵＦＡ、特に、油料種子植物の種子内のＤＰＡのより効率的な産生の必要性が依然として存在する。
【００１３】
発明の概要
ほとんどの生物体が、１〜２％を超えてＤＰＡを有するオイルを産生することができず、そのため、天然源からラージスケールでＤＰＡを産生するという選択肢は、たとえあったとしても限定的である。本発明者らは、天然源よりも非常に高レベルのＤＰＡを有する脂質を産生するための方法及び植物を特定した。
【００１４】
第一の態様では、本発明は、エステル化された形態の脂肪酸、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸（ＬＡ）を含むω６脂肪酸、α−リノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３脂肪酸を含み、及び場合により、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）及びエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）の１つ以上を含んでもよく、該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるＤＰＡのレベルが、約７％から３５％の間である抽出脂質、好ましくは、抽出植物脂質または抽出微生物脂質を提供する。この態様の実施形態において、該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるＤＰＡのレベルは、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１２％、約１５％、約１８％、約２０％、約２２％、約２４％、約２６％、約２８％、約３０％、約７％から約２８％の間、約７％から約２５％の間、約１０％から３５％の間、約１０％から約３０％の間、約１０％から約２５％の間、約１０％から約２２％の間、約１４％から３５％の間、約１６％から３５％の間、約１６％から約３０％の間、約１６％から約２５％の間、または約１６％から約２２％の間である。
【００１５】
上記態様の実施形態では、ＤＨＡは、該抽出脂質の総脂肪酸含有量の２％未満または０．５％未満のレベルで存在し、より好ましくは、該脂質の総脂肪酸含有物中に存在しない。
【００１６】
別の態様では、本発明は、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）を含むエステル化された形態の脂肪酸を含む抽出脂質、好ましくは、抽出植物脂質または抽出微生物脂質を提供し、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の形態でエステル化された少なくとも３５％のＤＰＡが、該ＴＡＧのｓｎ−２位でエステル化されている。実施形態では、該抽出脂質は、（ｉ）オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸（ＬＡ）を含むω６脂肪酸、α−リノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３脂肪酸の１つ以上または全てを含み、場合により、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、及びエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）の１つ以上を含んでもよいこと、（ｉｉ）少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約４８％、３５％から約６０％の間、または３５％から約５０％の間のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の形態でエステル化されたＤＰＡが該ＴＡＧのｓｎ−２位でエステル化されていること、及び（ｉｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるＤＰＡのレベルが約１％から３５％の間、または約７％から３５％の間または約２０．１％から３５％の間であることの１つ以上または全てにより、さらに特徴付けられる。この態様の実施形態では、該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるＤＰＡのレベルが、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１２％、約１５％、約１８％、約２０％、約２２％、約２４％、約２６％、約２８％、約３０％、約７％から約２８％の間、約７％から約２５％の間、約１０％から３５％の間、約１０％から約３０％の間、約１０％から約２５％の間、約１０％から約２２％の間、約１４％から３５％の間、約１６％から３５％の間、約１６％から約３０％の間、約１６％から約２５％の間、または約１６％から約２２％の間である。好ましい実施形態では、該抽出脂質は、（ｉ）及び（ｉｉ）、（ｉ）及び（ｉｉｉ）または（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）、より好ましくは、（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の全てにより特徴付けられる。好ましくは、該抽出脂質は、約２％から１６％の間である該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるパルミチン酸レベル、及び、もし存在する場合、１％未満である該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるミリスチン酸（Ｃ１４：０）レベルにより、さらに特徴付けられる。
【００１７】
上記の態様の各々の実施形態を、以下、さらに詳細に説明する。当業者が理解するように、上記態様の対応する特徴より広範である、記載された実施形態のいかなる特徴もその態様に適用しない。
【００１８】
実施形態では、抽出脂質は、以下の特徴：
ｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるパルミチン酸のレベルは、約２％から１８％の間、約２％から１６％の間、約２％から１５％の間、または約３％から１０％の間であること、
ｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるミリスチン酸（Ｃ１４：０）のレベルは、６％未満、３％未満、２％未満、１％未満、または約０．１％であること、
ｉｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるオレイン酸のレベルは、約１％から約３０％の間、約３％から約３０％の間、約６％から約３０％の間、約１％から約２０％の間、約３０％から約６０％の間、約４５％〜約６０％、約３０％、または約１５％から約３０％の間であること、
ｉｖ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるリノール酸（ＬＡ）のレベルは、約４％から約３５％の間、約４％から約２０％の間、約４％から約１７％の間、または約５％から約１０％の間であること、
ｖ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるα−リノレン酸（ＡＬＡ）のレベルは、約４％から約４０％の間、約７％から約４０％の間、約１０％から約３５％の間、約２０％から約３５％の間、約４％から約１６％の間、または約２％から約１６％の間であること、
ｖｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるγ−リノレン酸（ＧＬＡ）のレベルは、４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．５％未満、０．０５％から約７％の間、０．０５％から４％の間、０．０５％から約３％の間、または０．０５％から約２％の間であること、
ｖｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるステアリドン酸（ＳＤＡ）のレベルは、約１０％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約４％未満、約３％未満、約０．０５％から約７％の間、約０．０５％から約６％の間、約０．０５％から約４％の間、約０．０５％から約３％の間、約０．０５％から約１０％の間、または約０．０５％から約２％の間であること、
ｖｉｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）のレベルは、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約１％未満、約０．５％未満、０．０５％から約６％の間、０．０５％から約５％の間、０．０５％から約４％の間、０．０５％から約３％の間、または０．０５％から約２％の間であること、
ｉｘ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるエイコサトリエン酸（ＥＴｒＡ）のレベルは、４％未満、約２％未満、約１％未満、０．０５％から４％の間、０．０５％から３％の間、または０．０５％から約２％の間、または０．０５％から約１％の間であること、
ｘ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）のレベルは、４％から１５％の間、４％未満、約３％未満、約２％未満、０．０５％から１０％の間、０．０５％から５％の間、０．０５％から約３％の間、または０．０５％から約２％の間であること、
ｘｉ）該脂質は、その脂肪酸含有物中にω６−ドコサペンタエン酸（２２：５Δ４，７，１０，１３，１６）を含むこと、
ｘｉｉ）該脂質は、その脂肪酸含有物中に０．１％未満のω６−ドコサペンタエン酸（２２：５Δ４，７，１０，１３，１６）を含むこと、
ｘｉｉｉ）該脂質は、その脂肪酸含有物中に０．１％未満の１つ以上または全てのＳＤＡ、ＥＰＡ及びＥＴＡを含むこと、
ｘｉｖ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総飽和脂肪酸レベルは、約４％から約２５％の間、約４％から約２０％の間、約６％から約２０％の間、または約６％から約１２％の間であること、  
ｘｖ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総一価不飽和脂肪酸レベルは、約４％から約４０％の間、約４％から約３５％の間、約８％から約２５％の間、８％から約２２％の間、約１５％から約４０％の間または約１５％から約３５％の間であること、
ｘｖｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総多価不飽和脂肪酸レベルは、約２０％から約７５％の間、３０％から７５％の間、約５０％から約７５％の間、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、または約６０％から約７５％の間であること、
ｘｖｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総ω６脂肪酸レベルは、約３５％から約５０％の間、約２０％から約３５％の間、約６％から約２０％の間、２０％未満、約１６％未満、約１０％未満、約１％から約１６％の間、約２％から約１０％の間、または約４％から約１０％の間であること、
ｘｖｉｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量における新ω６脂肪酸レベルは、約１０％未満、約８％未満、約６％未満、４％未満、約１％から約２０％の間、約１％から約１０％の間、０．５％から約８％の間、または０．５％から４％の間であること、
ｘｉｘ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総ω３脂肪酸レベルは、３６％から約６５％の間、３６％から約７０％の間、４０％から約６０％の間、約３０％から約６０％の間、約３５％から約６０％の間、４０％から約６５％の間、約３０％から約６５％の間、約３５％から約６５％の間、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％または約７０％であること、
ｘｘ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量における新ω３脂肪酸レベルは、２１％から約４５％の間、２１％から約３５％の間、約２３％から約３５％の間、約２５％から約３５％の間、約２７％から約３５％の間、約２３％から約２５％の間、約２７％、約３０％、約３５％、約４０％または約４５％であること、  
ｘｘｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総ω６脂肪酸：総ω３脂肪酸の比は、約１．０から約３．０の間、約０．１から約１の間、約０．１から約０．５の間、約０．５０未満、約０．４０未満、約０．３０未満、約０．２０未満、約０．１５未満、約１．０未満、約０．１未満、約０．１０〜約０．４、または約０．２であること、
ｘｘｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量における新ω６脂肪酸：新ω３脂肪酸の比は、約１．０から約３．０の間、約０．０２から約０．１の間、約０．１から約１の間、約０．１から約０．５の間、約０．５０未満、約０．４０未満、約０．３０未満、約０．２０未満、約０．１５未満、約０．０２、約０．０５、約０．１、約０．２または約１．０であること、
ｘｘｉｉｉ）該脂質の脂肪酸組成は、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、約６０％から約９８％の間、約７０％から約９５％の間、または約７５％から約９０％の間のΔ１２−デサチュラーゼによるオレイン酸からＬＡへの転換効率に基づくこと、
ｘｘｉｖ）該脂質の脂肪酸組成は、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、約３０％から約７０％の間、約３５％から約６０％の間、または約５０％から約７０％の間のΔ６−デサチュラーゼによるＡＬＡからＳＤＡへの転換効率に基づくこと、
ｘｘｖ）該脂質の脂肪酸組成は、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、約６０％から約９５％の間、約７０％から約８８％の間、または約７５％から約８５％の間のΔ６−エロンガーゼによるＳＤＡからＥＴＡ酸への転換効率に基づくこと、
ｘｘｖｉ）該脂質の脂肪酸組成は、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、約６０％から約９９％の間、約７０％から約９９％の間、または約７５％から約９８％の間のΔ５−デサチュラーゼによるＥＴＡからＥＰＡへの転換効率に基づくこと、
ｘｘｖｉｉ）該脂質の脂肪酸組成は、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、約５０％から約９９％の間、約８５％から約９９％の間、約５０％から約９５％の間、または約８５％から約９５％の間のΔ５−エロンガーゼによるＥＰＡからＤＰＡへの転換効率に基づくこと、
ｘｘｖｉｉｉ）該脂質の脂肪酸組成は、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、約２０％、約２５％、約３０％、約１０％から約５０％の間、約１０％から約３０％の間、約１０％から約２５％の間または約２０％から約３０％の間のオレイン酸からＤＰＡへの転換効率に基づくこと、
ｘｘｉｘ）該脂質の脂肪酸組成は、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２２％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約１５％から約５０％の間、約２０％から約４０％の間、または約２０％から約３０％の間のＬＡからＤＰＡへの転換効率に基づくこと、
ｘｘｘ）該脂質の脂肪酸組成は、少なくとも約１７％、少なくとも約２２％、少なくとも約２４％、少なくとも約３０％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約２２％から約７０％の間、約１７％から約５５％の間、約２２％から約４０％の間、または約２４％から約４０％の間のＡＬＡからＤＰＡへの転換効率に基づくこと、
ｘｘｘｉ）該抽出脂質中の総脂肪酸は、１．５％未満のＣ２０：１、１％未満のＣ２０：１または約１％のＣ２０：１を有すること、  
ｘｘｘｉｉ）該脂質のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）含有率は、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、約７０％から約９９％の間、または約９０％から約９９％の間であること、
ｘｘｘｉｉｉ）該脂質は、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）を含み、ＤＡＧは好ましくはＤＰＡを含むこと、
ｘｘｘｉｖ）該脂質は、約１０％未満、約５％未満、約１％未満または約０．００１％から約５％の間の遊離（非エステル化）脂肪酸及び／またはリン脂質を含む、または本質的にそれを含まないこと、
ｘｘｘｖ）ＴＡＧの形態でエステル化されたＤＰＡの少なくとも７０％、少なくとも７２％または少なくとも８０％は、該ＴＡＧのｓｎ−１位またはｓｎ−３位であり、
ｘｘｘｖｉ）該脂質中に最も豊富なＤＰＡを含むＴＡＧ化学種は、ＤＰＡ／１８：３／１８：３（ＴＡＧ５８：１２）であり、該脂質はトリＤＰＡ  ＴＡＧ（ＴＡＧ６６：１８）を含むこと、及び
ｘｘｘｖｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるＤＰＡのレベルが、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１２％、約１５％、約１８％、約２０％、約２２％、約２４％、約２６％、約２８％、約３１％、約７％から約３１％の間、約７％から約２８％の間、約１０％から約３５％の間、約１０％から約３０％の間、約１０％から約２５％の間、約１０％から約２２％の間、約１４％から約３５％の間、約１６％から約３５％の間、約１６％から約３０％の間、約１６％から約２５％の間、または約１６％から約２２％の間であり、場合により、ＤＨＡレベルは、該抽出脂質の総脂肪酸含有量の０．５％未満であること
の１つ以上を有する。
【００１９】
別の実施形態では、該抽出脂質は、以下の特徴：
ｉ）  該抽出植物脂質の総脂肪酸含有量におけるパルミチン酸のレベルは、２％から１５％の間であること、
ｉｉ）  該抽出植物脂質の総脂肪酸含有量におけるミリスチン酸（Ｃ１４：０）のレベルは、約０．１％であること、
ｉｉｉ）  該抽出植物脂質の総脂肪酸含有量におけるオレイン酸のレベルは、１％から３０％の間であること、
ｉｖ）  該抽出植物脂質の総脂肪酸含有量におけるリノール酸（ＬＡ）のレベルは、４％から２０％の間であること、
ｖ）  該抽出植物脂質の総脂肪酸含有量におけるα−リノレン酸（ＡＬＡ）のレベルは、４％から４０％の間であること、
ｖｉ）  該抽出植物脂質の総脂肪酸含有量におけるγ−リノレン酸（ＧＬＡ）のレベルは、０．０５％から７％の間であること、
ｖｉｉ）  該抽出植物脂質の総脂肪酸含有量におけるステアリドン酸（ＳＤＡ）のレベルは、０．０５％から１０％の間であること、
ｖｉｉｉ）  該抽出植物脂質の総脂肪酸含有量におけるエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）のレベルは、６％未満であること、
ｉｘ）  該抽出植物脂質の総脂肪酸含有量におけるエイコサトリエン酸（ＥＴｒＡ）のレベルは、４％未満であること、  
ｘ）  該抽出植物脂質は、その脂肪酸含有物中に０．１％未満のω６−ドコサペンタエン酸（２２：５Δ４，７，１０，１３，１６）を含むこと、
ｘｉ）  該抽出植物脂質の総脂肪酸含有量における新ω６脂肪酸のレベルは、１０％未満であること、  
ｘｉｉ）  該抽出植物脂質の脂肪酸含有物中の総ω６脂肪酸：総ω３脂肪酸の比は、１．０から３．０の間、または０．１から１の間であること、
ｘｉｉｉ）  該抽出植物脂質の脂肪酸含有物中の新ω６脂肪酸：新ω３脂肪酸の比は、１．０から３．０の間、または０．０２から０．１の間、または０．１から１の間であること、
ｘｉｖ）  該抽出植物脂質の脂肪酸組成は、少なくとも１０％のオレイン酸からＤＰＡへの転換効率に基づくこと、
ｘｖ）  該抽出植物脂質の脂肪酸組成は、少なくとも１５％のＬＡからＤＰＡへの転換効率に基づくこと、
ｘｖｉ）  該抽出植物脂質の脂肪酸組成は、少なくとも１７％のＡＬＡからＤＰＡへの転換効率に基づくこと、
ｘｖｉｉ）  該抽出植物脂質中の総脂肪酸は、１．５％未満のＣ２０：１であること、及び
ｘｖｉｉｉ）  該抽出植物脂質中のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）含有率は、少なくとも７０％であり、１つ以上の以下の特徴により特徴付けられ得ること、
ｘｉｘ）  該抽出植物脂質は、ＤＰＡを含むジアシルグリセロール（ＤＡＧ）を含むこと、
ｘｘ）  該抽出植物脂質は、１０％未満の遊離（非エステル化）脂肪酸及び／またはリン脂質を含む、または本質的にそれを含まないこと、
ｘｘｉ）  ＴＡＧの形態でエステル化されたＤＰＡの少なくとも７０％は、該ＴＡＧのｓｎ−１位またはｓｎ−３位であること、
ｘｘｉｉ）該抽出植物脂質中の最も豊富なＤＰＡ含有ＴＡＧ化学種は、ＤＰＡ／１８：３／１８：３（ＴＡＧ５８：１２）であること、及び
ｘｘｉｉｉ）該抽出植物脂質は、トリＤＰＡ  ＴＡＧ（ＴＡＧ６６：１８）を含むこと
の１つ以上を有する。
【００２０】
実施形態では、該抽出植物脂質の総脂肪酸含有量におけるエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）のレベルは、０．０５％から１０％の間である。。
【００２１】
さらなる実施形態では、該抽出植物脂質の総脂肪酸含有量におけるＤＨＡのレベルは、２％未満、好ましくは１％未満、または０．１％から２％の間、より好ましくは検出されないことである。好ましくは、植物、または種子などその一部、または微生物細胞は、Δ４−デサチュラーゼをコードするポリヌクレオチドを有していないか、またはΔ４−デサチュラーゼポリペプチドを有していない。別の実施形態では、該抽出脂質は、オイルの形態であり、少なくとも約９０重量％、少なくとも約９５重量％、少なくとも約９８重量％、または約９５重量％から約９８重量％の間であるオイルは脂質である。
【００２２】
好ましくは、該抽出脂質は、アブラナ属の種子オイルの脂質、またはカメリナサティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ  ｓａｔｉｖａ）の種子オイルの脂質である。
【００２３】
上記第１の態様の好ましい実施形態では、脂質またはオイル、好ましくは、種子オイル、より好ましくは、アブラナ属の種子オイルまたはカメリナサティバの種子オイルは、以下の特徴を有する：脂質またはオイルの総脂肪酸含有量において、ＤＰＡレベルは、約７％から３０％の間または約７％から３５％の間であり、パルミチン酸レベルは、約２％から約１６％の間であり、ミリスチン酸レベルは、１％未満であり、オレイン酸レベルは、約１％から約３０％の間であり、ＬＡレベルは、約４％から３５％の間であり、ＡＬＡは存在し、抽出脂質の総脂肪酸含有量における総飽和脂肪酸レベルは、約４％から約２５％の間であり、抽出脂質の脂肪酸含有量における総ω６脂肪酸：総ω３脂肪酸の比は、０．０５から約３．０の間であり、脂質のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）含有率は、少なくとも約７０％であり、場合により、脂質は、コレステロールを本質的に含まなくてもよく、及び／または脂質は、トリ−ＤＰＡ  ＴＡＧ（ＴＡＧ６６：１５）を含む。より好ましくは、脂質またはオイル、好ましくは、種子オイルは、以下の特徴の１つ以上または全てをさらに有する：少なくとも７０％のＤＰＡは、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）のｓｎ−１位またはｓｎ−３位でエステル化されており、ＡＬＡは、総脂肪酸含有物の４％から４０％の間のレベルで存在し、ＧＬＡは存在し、及び／またはＧＬＡレベルは、総脂肪酸含有物の４％未満であり、ＳＤＡレベルは、０．０５％から約１０％の間であり、ＥＴＡレベルは、約４％未満であり、ＥＰＡレベルは、０．０５％から約１０％の間であり、抽出脂質の総脂肪酸含有量における総一価不飽和脂肪酸レベルは、約４％から約３５％の間であり、抽出脂質の総脂肪酸含有量における総多価不飽和脂肪酸レベルは、約２０％から約７５％の間であり、抽出脂質の総脂肪酸含有量における新ω６脂肪酸：新ω３脂肪酸の比は、約０．０３から約３．０の間、好ましくは、約０．５０未満であり、脂質の脂肪酸組成は：少なくとも約６０％のΔ１２−デサチュラーゼによるオレイン酸からＬＡへの転換効率、少なくとも約６０％のΔ６−エロンガーゼによるＳＤＡからＥＴＡへの転換効率、約５０％から約９５％の間のΔ５−エロンガーゼによるオレイン酸からＤＰＡへの転換効率、少なくとも約１０％のオレイン酸からＤＰＡへの転換効率に基づく。最も好ましくは、少なくとも８１％のＤＰＡはトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）のｓｎ−１位またはｓｎ−３位でエステル化されている。
【００２４】
上記第２の態様の別の好ましい実施形態では脂質またはオイル、好ましくは、種子オイル、より好ましくは、ＤＰＡを含むアブラナ属の種子オイルまたはカメリナサティバの種子オイルは、以下の特徴を有する：脂質またはオイルの総脂肪酸含有量において、パルミチン酸レベルは、約２％から約１６％の間であり、ミリスチン酸レベルは、１％未満であり、オレイン酸レベルは、約１％から約３０％の間であり、ＬＡレベルは、約４％から３５％の間であり、ＡＬＡは存在し、抽出脂質の総脂肪酸含有量における総飽和脂肪酸レベルは、約４％から約２５％の間であり、抽出脂質の脂肪酸含有量における総ω６脂肪酸：総ω３脂肪酸の比は、０．０５から約３．０の間であり、脂質のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）含有率は、少なくとも約７０％であり、場合により、脂質は、トリ−ＤＰＡ  ＴＡＧ（ＴＡＧ６６：１５）を含んでもよく、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の形態でエステル化された少なくとも３５％のＤＰＡは、該ＴＡＧのｓｎ−２位でエステル化されている。より好ましくは、脂質またはオイル、好ましくは、種子オイルは、加えて、次の特徴の１つ以上または全てを有する：ＡＬＡは総脂肪酸含有物の４％から４０％の間のレベルで存在し、ＧＬＡは存在し、及び／またはＧＬＡのレベルは総脂肪酸含有物の４％未満であり、ＳＤＡレベルは、０．０５％から約１０％の間であり、ＥＴＡレベルは約４％未満であり、ＥＰＡレベルは０．０５％から約１０％の間であり、該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総一価不飽和脂肪酸のレベルは約４％から約３５％の間であり、該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総多価不飽和脂肪酸のレベルは約２０％から約７５％の間であり、該抽出脂質の脂肪酸含有物中の新ω６脂肪酸：新ω３脂肪酸の比は約０．０３から約３．０の間、好ましくは、約０．５０未満であり、該脂質の脂肪酸組成は：少なくとも約６０％のΔ１２−デサチュラーゼによるオレイン酸からＬＡへの転換効率、少なくとも約６０％のΔ６−エロンガーゼによるＳＤＡからＥＴＡへの転換効率、約５０％から約９５％の間のΔ５−エロンガーゼによるＥＰＡからＤＰＡへの転換効率、少なくとも約１０％のオレイン酸からＤＰＡへの転換効率に基づく。
【００２５】
本発明の抽出脂質またはオイルに関連して、ある実施形態では、該抽出脂質またはオイル中のＤＰＡのレベルは、抽出前の植物部分または微生物の脂質またはオイル中のＤＰＡのレベルから増加していない、または実質的に同じである。言い換えれば、他の抽出後の脂肪酸と比較して、脂質またはオイル中のＤＰＡのレベルを増加させる処理はない。明白であるようなとき、脂質またはオイルを、分取または他の方法により、その後に処理して、脂肪酸組成を変化させてもよい。
【００２６】
別の好ましい実施形態では、脂質またはオイル、好ましくは、種子オイル、より好ましくは、カラシ油またはキャノーラオイルまたはカメリナサティバの種子オイルなどのアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）種子オイルは、以下の特徴を有する：脂質またはオイルの総脂肪酸含有量におけるＤＰＡレベルは、約７％から３５％の間であり、パルミチン酸レベルは、約２％から約１６％の間であり、ミリスチン酸レベルは、約６％未満、好ましくは１％未満であり、オレイン酸レベルは、約１％から約３０％の間であり、ＬＡレベルは、約４％から約３５％の間であり、ＡＬＡは存在し、ＳＤＡレベルは、約０．０５％から約１０％の間であり、ＥＴＡレベルは、約６％未満であり、ＥＰＡレベルは、約０．０５％から約１０％の間である。ＤＨＡは、脂質またはオイル中で検出され、好ましくは、脂質またはオイル中で検出されない。好ましくは、ＤＨＡは、もし存在するならば、脂質またはオイルの総脂肪酸含有量の２％未満のレベル、または０．５％未満のレベルで存在し、より好ましくは、該脂質またはオイルの総脂肪酸含有物中に存在しない。場合により、脂質は、コレステロールを本質的に含まなくてもよく、及び／または脂質はトリ−ＤＰＡ  ＴＡＧ（ＴＡＧ６６：１５）を含んでもよい。より好ましくは、脂質またはオイル、好ましくは、種子オイルは、以下の特徴の１つ以上または全てをさらに有する：少なくとも７０％のＤＰＡは、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）のｓｎ−１位またはｓｎ−３位でエステル化されており、ＡＬＡは、総脂肪酸含有物の４％から４０％の間のレベルで存在し、ＧＬＡは存在し、及び／またはＧＬＡレベルは、総脂肪酸含有物の４％未満であり、ＳＤＡレベルは、０．０５％から約１０％の間であり、ＥＴＡレベルは、約４％未満であり、ＥＰＡレベルは、０．０５％から約１０％の間であり、抽出脂質の総脂肪酸含有量における総一価不飽和脂肪酸レベルは、約４％から約３５％の間であり、抽出脂質の総脂肪酸含有量における総多価不飽和脂肪酸レベルは、約２０％から約７５％の間であり、抽出脂質の総脂肪酸含有量における新ω６脂肪酸：新ω３脂肪酸の比は、約０．０３から約３．０の間、好ましくは、約０．５０未満であり、脂質の脂肪酸組成は：少なくとも約６０％のΔ１２−デサチュラーゼによるオレイン酸からＬＡへの転換効率、少なくとも約６０％のΔ６−エロンガーゼによるＳＤＡからＥＴＡへの転換効率、約５０％から約９５％の間のΔ５−エロンガーゼによるＥＰＡからＤＰＡへの転換効率、少なくとも約１０％のオレイン酸からＤＰＡへの転換効率に基づく。実施形態では、少なくとも８１％のＤＰＡはトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）のｓｎ−１位またはｓｎ−３位でエステル化されている。あるいは、ＴＡＧの形態でエステル化されたＤＰＡの少なくとも３５％は、該ＴＡＧのｓｎ−２位でエステル化されている。
【００２７】
さらなる実施形態では、本発明の抽出脂質は、１つ以上のステロール類、好ましくは、植物ステロール類をさらに含む。
【００２８】
別の実施形態では、抽出脂質はオイルの形態であり、オイル１ｇ当たり約１０ｍｇ未満のステロール類、オイル１ｇ当たり約７ｍｇ未満のステロール類、オイル１ｇ当たり約１．５ｍｇから約１０ｍｇの間のステロール類、またはオイル１ｇ当たり約１．５ｍｇから約７ｍｇの間のステロール類を含む。
【００２９】
抽出脂質中のあり得るステロール類の例としては、必ずしも限定されないが、１つ以上または全てのカンプエステロール／２４−メチルコレステロール、Δ５−スチグマステロール、エブリコール、β−シトステロール／２４−エチルコレステロール、Δ５−アベナステロール／イソフコステロール、Δ７−スチグマステロール／スチグマスト−７−エン−３β−オール、及びΔ７−アベナステロールが挙げられる。
【００３０】
実施形態では、植物種は、セイヨウアブラナなど、表１１にリストしたものであり、ステロール類のレベルは、その特定の植物種について、表１１にリストしたものとほぼ同じである。該植物種は、セイヨウアブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）、カラシナ（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）またはカンナビス・サティバ（Ｃ．ｓａｔｉｖａ）であってよく、それぞれ、野生型のカラシナセイヨウアブラナ、カラシナまたはカンナビス・サティバ抽出オイル中に見られる辺りのステロール類のレベルを含む。
【００３１】
実施形態では、抽出植物脂質は、１つ以上まては全てのカンペステロール／２４−メチルコレステロール、Δ５−スチグマステロール、エブリコール、β−シトステロール／２４−エチルコレステロール、Δ５−アベナステロール／イソフコステロール、Δ７−スチグマステロール／スチグマスト−７−エン−３β−オール、及びΔ７−アベナステロールを含む、または野生型キャノーラオイルと本質的に同じステロール含有率を有する。
【００３２】
実施形態では、抽出脂質は、野生型キャノーラオイル、カラシナオイルまたはカンナビス・サティバオイルと本質的に同じステロール含有率を有する。
【００３３】
実施形態では、抽出脂質は、オイル１ｇ当たり約０．５ｍｇ未満のコレステロール、オイル１ｇ当たり約０．２５ｍｇ未満のコレステロール、オイル１ｇ当たり約０ｍｇから約０．５ｍｇの間のコレステロール、またはオイル１ｇ当たり約０ｍｇから約０．２５ｍｇの間のコレステロールを含む、またはコレステロールを本質的に含まない。
【００３４】
さらなる実施形態では、脂質はオイル、好ましくは、  油料種子のオイルである。かかるオイルの例としては、これに限定されないが、例えば、キャノーラオイルもしくはカラシナオイルなどのアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｓｐ．）オイル、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）オイル、アマ（Ｌｉｎｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）オイル、ヘリアンタス属（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｓｐ．）オイル、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）オイル、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）オイル、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）オイル、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）オイル、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）オイル、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）オイル、エンバク（Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ）オイル、トリフォリウム属（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ  ｓｐ．）オイル、ギニアアブラヤシ（Ｅｌａｅｓｉｓ  ｇｕｉｎｅｅｎｉｓ）オイル、ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）オイル、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）オイル、アオバナルーピン（Ｌｕｐｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓ）オイル、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）オイル、アフリカイネ（Ｏｒｙｚａ  ｇｌａｂｅｒｒｉｍａ）オイル、カメリナサティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ  ｓａｔｉｖａ）オイル、クランベアビシニカ（Ｃｒａｍｂｅ  ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ）オイル、ジャイアントミスカンサス（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ  ｘ  ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）オイル、またはススキ（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）オイルが挙げられる。より好ましくは、オイルは、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｓｐ．）オイル、カメリナ・サティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ  ｓａｔｉｖａ）オイルまたはグリシンマックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）（ダイズ）オイルである。実施形態では、脂質は、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）オイルまたはカラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）オイルなどのアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｓｐ．）オイル、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）オイル、アマ（Ｌｉｎｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）オイル、ヘリアンタス属（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｓｐ．）オイル、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）オイル、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）オイル、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）オイル、ギニアアブラヤシ（Ｅｌａｅｓｉｓ  ｇｕｉｎｅｅｎｉｓ）オイル、ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）オイル、アオバナルーピン（Ｌｕｐｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓ）オイル、カメリナサティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ  ｓａｔｉｖａ）オイル、クランベアビシニカ（Ｃｒａｍｂｅ  ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ）オイル、ジャイアントミスカンサス（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ  ｘ  ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）オイル、またはススキ（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）オイルを含むまたはである。さらなる実施形態では、該オイルは、キャノーラオイル、カラシナ（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）オイル、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）オイル、カメリナサティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ  ｓａｔｉｖａ）オ���ルまたはシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）オイルである。別の実施形態では、該オイルは、シロイヌナズナ（Ａ．  ｔｈａｌｉａｎａ）オイル及び／またはカメリナサティバ（Ｃ．  ｓａｔｉｖａ）オイル以外の植物オイルである。実施形態では、植物オイルは、Ｇ．ｍａｘ（ダイズ）オイル以外のオイルである。実施形態では、該オイルを、例えば、実施例１に記載の標準条件下に生育した植物から、または標準条件下、畑または温室で生育した植物から得た。
【００３５】
さらなる態様では、本発明は、  
ｉ）脂質を含む植物部分、好ましくは脂質を含むアブラナ属の種子もしくはカメリナサティバの種子、または微生物細胞を得る工程であって、該脂質がエステル化された形態の脂肪酸を含み、該脂肪酸がオレイン酸、パルミチン酸、リノール酸（ＬＡ）を含むω６脂肪酸、α−リノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３脂肪酸、及びドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）を含み、場合により、１つ以上のステアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、及びエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）を含んでもよく、該植物部分または微生物部分の該脂質の総脂肪酸含有量におけるＤＰＡのレベルが約７％から３５％の間である工程、及び
ｉｉ）該植物部分または微生物細胞から脂質を抽出する工程であって、該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるＤＰＡのレベルが約７％から３５％の間である工程、
を含む、抽出植物脂質または微生物脂質の産生方法を提供する。ある実施形態では、該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるＤＰＡのレベルが、約７％から２０％の間または２０．１％から３５％の間である。ある実施形態では、ＤＰＡのレベルは、７％から２０％の間、または２０．１％から３０％の間、好ましくは、２０．１％から３５％の間、より好ましくは、３０％から３５％の間である。ある実施形態では、該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるＤＰＡのレベルが、８％から２０％の間、または１０％から２０％の間、より好ましくは１１％から２０％の間、または１２％から２０％の間である。
【００３６】
上記態様の実施形態では、本発明は、
ｉ）脂質を含む植物部分、好ましくはアブラナ属の種子もしくはカメリナサティバの種子、または微生物細胞を得る工程であって、該脂質がエステル化された形態の脂肪酸を含み、該脂質は、がオレイン酸、パルミチン酸、リノール酸（ＬＡ）を含むω６脂肪酸、α−リノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３脂肪酸及びドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、並びにステアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、及びエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）のうち１つ以上を含む脂肪酸組成を有し、（ｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるＤＰＡレベルが７％から３０％の間または７％から３５％の間、好ましくは３０％から３５％の間であり、（ｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるパルミチン酸レベルが２％から１６％の間であり、（ｉｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるミリスチン酸（Ｃ１４：０）レベルが６％未満、好ましくは１％未満であり、（ｉｖ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるオレイン酸レベルが１％から３０％の間であり、（ｖ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるリノール酸（ＬＡ）レベルが４％から３５％の間であり、（ｖｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるα−リノレン酸（ＡＬＡ）が４％から４０％の間であり、（ｖｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるエイコサトリエン酸（ＥＴｒＡ）レベルが４％未満であり、（ｖｉｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総飽和脂肪酸レベルが４％から２５％の間であり、（ｉｘ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総ω６脂肪酸：総ω３脂肪酸の比が０．０５から１の間であり、（ｘ）該脂質のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）含有率が少なくとも７０％であり、及（ｘｉ）びＴＡＧの形態でエステル化された少なくとも７０％のＤＰＡが該ＴＡＧのｓｎ−１位またはｓｎ−３位である、並びに
ｉｉ）該植物部分から脂質を抽出する工程
を含み、該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるＤＰＡのレベルが約７％から３０％の間または７％から３５％の間、好ましくは、３０％から３５％の間である、抽出植物脂質または微生物脂質の産生方法を提供する。好ましくは、ＴＡＧの形態でエステル化されたＤＰＡの少なくとも８１％または少なくとも９０％は、該ＴＡＧのｓｎ−１位またはｓｎ−３位である。
【００３７】
別の態様では、本発明は、
ｉ）脂質を含む細胞、好ましくは、脂質を含む細胞を含む植物部分または微生物細胞、より好ましくはアブラナ属の種子またはカメリナサティバの種子を得る工程であって、該脂質は、エステル化された形態の脂肪酸を含み、該脂肪酸は、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）を含み、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の形態でエステル化された少なくとも３５％のＤＰＡは、該ＴＡＧのｓｎ−２位でエステル化されており、及び
ｉｉ）該細胞から脂質を抽出する工程
を含み、該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の形態でエステル化された少なくとも３５％のＤＰＡは、該ＴＡＧのｓｎ−２位でエステル化されている、抽出脂質の産生方法を提供する。実施形態では、該方法により産生された抽出脂質は、（ｉ）オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸（ＬＡ）を含むω６脂肪酸、α−リノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３脂肪酸の１つ以上または全てを含み、場合により、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、及びエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）の１つ以上を含んでもよいこと、（ｉｉ）少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約４８％、３５％から約６０％の間、または３５％から約５０％の間のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の形態でエステル化されたＤＰＡが該ＴＡＧのｓｎ−２位でエステル化されていること、及び（ｉｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるＤＰＡのレベルが約１％から３５％の間、または約７％から３５％の間または約２０．１％から３５％の間であることの１つ以上または全てにより、さらに特徴付けられる。本態様の実施形態では、該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるＤＰＡのレベルは、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１２％、約１５％、約１８％、約２０％、約２２％、約２４％、約２６％、約２８％、約３０％、約７％から約２８％の間、約７％から約２５％の間、約１０％から約３５％の間、約１０％から約３０％の間、約１０％から約２５％の間、約１０％から約２２％の間、約１４％から約３５％の間、約１６％から約３５％の間、約１６％から約３０％の間、約１６％から約２５％の間、または約１６％から約２２％の間である。好ましい実施形態では、該抽出脂質は、（ｉ）及び（ｉｉ）、（ｉ）及び（ｉｉｉ）または（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）、より好ましくは、（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の全てにより特徴付けられる。好ましくは、該抽出脂質は、約２％から１６％の間である該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるパルミチン酸レベル、及び、もし存在する場合、１％未満である該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるミリスチン酸（Ｃ１４：０）レベルにより、さらに特徴付けられる。
【００３８】
上記態様の実施形態では、本発明は、
ｉ）脂質を含む細胞、好ましくは、脂質を含む、細胞を含む植物部分または微生物細胞、より好ましくは、アブラナ属の種子またはカメリナサティバの種子を得る工程であって、該脂質がエステル化された形態の脂肪酸を含み、該脂肪酸は、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）を含み、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸（ＬＡ）を含むω６脂肪酸、α−リノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３脂肪酸、並びにステアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、及びエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）のうち１つ以上をさらに含み、（ｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるパルミチン酸レベルが２％から１６％の間であり、（ｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるミリスチン酸（Ｃ１４：０）レベルが１％未満であり、（ｉｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるオレイン酸レベルが１％から３０％の間であり、（ｉｖ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるリノール酸（ＬＡ）レベルが４％から３５％の間であり、（ｖ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるα−リノレン酸（ＡＬＡ）が４％から４０％の間であり、（ｖｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるエイコサトリエン酸（ＥＴｒＡ）レベルが４％未満であり、（ｖｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総飽和脂肪酸レベルが４％から２５％の間であり、（ｖｉｉｉ）該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総ω６脂肪酸：総ω３脂肪酸の比が０．０５から１の間であり、（ｉｘ）該脂質のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）含有率が少なくとも７０％であり、及び（ｘ）トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の形態でエステル化された少なくとも３５％のＤＰＡが該ＴＡＧのｓｎ−２位でエステル化されている、並びに
ｉｉ）該植物部分から脂質を抽出する工程
を含み、該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の形態でエステル化された少なくとも３５％のＤＰＡは、該ＴＡＧのｓｎ−２位でエステル化されている、抽出脂質の産生方法を提供する。
【００３９】
植物部分または微生物細胞を得る工程は、該植物部分を産生する植物から植物部分、好ましくは種子を収穫すること、かかる細胞の培養液から微生物細胞を回収すること、または製造業者もしくは供給業者から購入、または輸入により該植物部分もしくは微生物細胞を得ることを含んでもよい。方法は、植物部分もしくは微生物細胞試料中の脂質、または抽出脂質の脂肪酸組成を決定する工程を含んでもよい。
【００４０】
好ましい実施形態では、本発明の方法により得られた抽出脂質は、該当する場合、本明細書で定義した通り、例えば、最初の２つの態様に関連した上記定義した通りの１つ以上の特徴を有する。
【００４１】
本発明の上記の態様の実施形態を、以下、さらに詳細に説明する。当業者が理解するように、上記態様の対応する特徴より広範である、いかなる記載される実施形態もその態様に適用しない。
【００４２】
実施形態では、植物部分は種子、好ましくは油料種子である。かかる種子の例としては、これに限定されないが、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｓｐ．）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、アマ（Ｌｉｎｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）、ヘリアンタス属（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｓｐ．）、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、エンバク（Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ）、トリフォリウム属（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ  ｓｐ．）、ギニアアブラヤシ（Ｅｌａｅｓｉｓ  ｇｕｉｎｅｅｎｉｓ）、ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、アオバナルーピン（Ｌｕｐｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓ）、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、アフリカイネ（Ｏｒｙｚａ  ｇｌａｂｅｒｒｉｍａ）、カメリナサティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ  ｓａｔｉｖａ）、またはクランベアビシニカ（Ｃｒａｍｂｅ  ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ）、好ましくは、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｓｐ．）の種子、カメリナサティバ（Ｃ．  ｓａｔｉｖａ）の種子またはＧ．ｍａｘ（ダイズ）の種子、より好ましくは、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、カラシナ（Ｂ．  ｊｕｎｃｅａ）またはカメリナサティバ（Ｃ．  ｓａｔｉｖａ）の種子が挙げられる。実施形態では、植物部分は、種子、好ましくは、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）またはカラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）などのアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｓｐ．）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、アマ（Ｌｉｎｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）、ヘリアンタス属（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｓｐ．）、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、ギニアアブラヤシ（Ｅｌａｅｓｉｓ  ｇｕｉｎｅｅｎｉｓ）、ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）、アオバナルーピン（Ｌｕｐｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓ）、カメリナサティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ  ｓａｔｉｖａ）、またはクランベアビシニカ（Ｃｒａｍｂｅ  ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ）、好ましくは、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、カラシナ（Ｂ    ｊｕｎｃｅａ）またはカメリナサティバ（Ｃ．  ｓａｔｉｖａ）の種子などの油料種子である。実施形態では、種子は、キャノーラ種子、カラシナ種子、ダイズ種子、カメリナサティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ  ｓａｔｉｖａ）種子またはシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）種子である。代替の実施形態では、該種子は、シロイヌナズナ（Ａ．  ｔｈａｌｉａｎａ）の種子及び／またはカメリナサティバ（Ｃ．  ｓａｔｉｖａ）の種子以外の種子である。実施形態では、種子は、ダイズの種子以外の種子である。実施形態では、植物部分は、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｓｐ．）種子である。植物部分は、好ましくは、アブラナ属の種子またはカメリナサティバの種子である。実施形態では、該種子を、例えば、実施例１に記載の標準条件下に生育した植物から、または標準条件下、畑または温室で生育した植物から得た。
【００４３】
別の実施形態では、種子は、種子１ｇ当たり、少なくとも約１８ｍｇ、少なくとも約２２ｍｇ、少なくとも約２６ｍｇ、約１８ｍｇから約１００ｍｇの間、約２２ｍｇから約７０ｍｇの間、約８０ｍｇ、約３０ｍｇから約８０ｍｇの間、または約２４ｍｇから約５０ｍｇの間のＤＰＡを含む。
【００４４】
さらなる実施形態では、種子などの植物部分は、酵素の以下のセット；
ｉ）ω３−デサチュラーゼ、Δ６−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ６−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ、
ｉｉ）Δ１５−デサチュラーゼ、Δ６−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ６−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ、
ｉｉｉ）Δ１２−デサチュラーゼ、Δ６−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ６−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ、
ｉｖ）Δ１２−デサチュラーゼ、ω３−デサチュラーゼ及び／またはΔ１５−デサチュラーゼ、Δ６−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ６−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ、
ｖ）ω３−デサチュラーゼ、Δ８−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ９−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ、
ｖｉ）Δ１５−デサチュラーゼ、Δ８−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ９−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ、
ｖｉｉ）Δ１２−デサチュラーゼ、Δ８−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ９−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ、
ｖｉｉｉ）Δ１２−デサチュラーゼ、ω３−デサチュラーゼ及び／またはΔ１５−デサチュラーゼ、Δ８−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ９−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ、
の１つをコードする外来性ポリヌクレオチドを含み、各ポリヌクレオチドは、該植物部分の細胞内の前記ポリヌクレオチドの発現を誘導可能である１つ以上のプロモーターと作動可能に結合している。
【００４５】
さらなる実施形態では、種子などの植物部分または微生物細胞などの組換え細胞は、酵素の以下のセット；
ｉ）ω３−デサチュラーゼ及び／またはΔ１５−デサチュラーゼ、Δ６−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ６−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ、
ｉｉ）Δ１２−デサチュラーゼ、Δ６−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ６−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ、
ｉｉｉ）Δ１２−デサチュラーゼ、ω３−デサチュラーゼ及び／またはΔ１５−デサチュラーゼ、Δ６−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ６−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ、
ｉｖ）ω３−デサチュラーゼ及び／またはΔ１５−デサチュラーゼ、Δ８−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ９−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ、
ｖ）Δ１２−デサチュラーゼ、Δ８−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ９−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ、
ｖｉ）Δ１２−デサチュラーゼ、ω３−デサチュラーゼ及び／またはΔ１５−デサチュラーゼ、Δ８−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ９−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ
の１つをコードする外来性ポリヌクレオチドを含み、各ポリヌクレオチドは、該植物部分または細胞の細胞内の前記ポリヌクレオチドの発現を誘導可能である１つ以上のプロモーターと作動可能に結合している。
【００４６】
実施形態では、もし、植物部分または細胞がエステル化された形態の脂肪酸を含む脂質を含み、該脂肪酸がドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）を含み、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の形態でエステル化された少なくとも３５％のＤＰＡ及び／またはＤＨＡ（もし存在する場合）が該ＴＡＧのｓｎ−２位でエステル化されているならば、種子などの植物部分または微生物細胞などの組換え細胞は、１−アシル−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）をコードする外来性ポリヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドは、該植物部分の細胞もしくは細胞中のポリヌクレオチドの発現を誘導可能である１つ以上のプロモーターと作動可能に結合している。さらなる実施形態では、該細胞は、酵素の以下のセット；
ｉ）１−アシル−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）、ω３−デサチュラーゼ、Δ６−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ６−エロンガーゼ、及びΔ５−エロンガーゼ、
ｉｉ）１−アシル−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）、Δ１５−デサチュラーゼ、Δ６−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ６−エロンガーゼ、及びΔ５−エロンガーゼ、
ｉｉｉ）１−アシル−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）、Δ１２−デサチュラーゼ、Δ６−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ６−エロンガーゼ、及びΔ５−エロンガーゼ、
ｉｖ）１−アシル−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）、Δ１２−デサチュラーゼ、ω３−デサチュラーゼ及び／またはΔ１５−デサチュラーゼ、Δ６−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ６−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ、
ｖ）１−アシル−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）、ω３−デサチュラーゼ、Δ８−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ９−エロンガーゼ、及びΔ５−エロンガーゼ、
ｖｉ）１−アシル−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）、Δ１５−デサチュラーゼ、Δ８−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ９−エロンガーゼ、及びΔ５−エロンガーゼ、
ｖｉｉ）１−アシル−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）、Δ１２−デサチュラーゼ、Δ８−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ９−エロンガーゼ、及びΔ５−エロンガーゼ、
ｖｉｉｉ）１−アシル−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）、Δ１２−デサチュラーゼ、ω３−デサチュラーゼ及び／またはΔ１５−デサチュラーゼ、Δ８−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ９−エロンガーゼ、及びΔ５−エロンガーゼ、
の１つをコードする外来性ポリヌクレオチドを含み、各ポリヌクレオチドは、該細胞内の前記ポリヌクレオチドの発現を誘導可能である１つ以上のプロモーターと作動可能に結合している。好ましくは、ＬＰＡＡＴは、ＤＰＡ−ＣｏＡなどのＣ２２多価不飽和脂肪アシル−ＣｏＡ基質を使用できる。
【００４７】
好ましくは、植物部分、もしくはたとえば種子などのその一部、または微生物細胞は、Δ４−デサチュラーゼをコードするポリヌクレオチドを有しておらず、またはΔ４−デサチュラーゼポリペプチドを有していない。
【００４８】
実施形態では、Δ１２‐デサチュラーゼは、ω３−デサチュラーゼ及び／またはΔ１５−デサチュラーゼ活性も有する、すなわち、該活性は、１つのポリペプチドにより与えられる。あるいは、Δ１２‐デサチュラーゼは、ω３−デサチュラーゼ活性を有さず、かつΔ１５−デサチュラーゼ活性を有さない、すなわち、Δ１２‐デサチュラーゼは、ω３−デサチュラーゼ活性及び／またはΔ１５−デサチュラーゼを有するポリペプチドと別のポリペプチドである。
【００４９】
さらなる実施形態では、種子などの植物部分または微生物細胞などの組換え細胞は、以下の特徴；
ｉ）Δ１２‐デサチュラーゼが、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、約６０％から約９５％の間、約７０％から約９０％の間、または約７５％から約８５％の間の効率で、１つ以上の該植物部分の細胞内または組換え細胞内において、オレイン酸をリノール酸に転換すること、
ｉｉ）ω３‐デサチュラーゼが、少なくとも約６５％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、約６５％から約９５％の間、約７５％から約９１％の間、または約８０％から約９１％の間の効率で、１つ以上の該植物部分の細胞内または組換え細胞内において、ω６脂肪酸をω３脂肪酸に転換すること、
ｉｉｉ）Δ６‐デサチュラーゼが、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、約３０％から約７０％の間、約３５％から約６０％の間、または約５０％から約７０％の間の効率で、１つ以上の該植物部分の細胞内または組換え細胞内において、ＡＬＡをＳＤＡに転換すること、
ｉｖ）Δ６‐デサチュラーゼが、約５％未満、約２．５％未満、約１％未満、約０．１％から約５％の間、約０．５％から約２．５％の間、または約０．５％から約１％の間の効率で、１つ以上の該植物部分の細胞内または組換え細胞内において、リノール酸をγ‐リノレン酸に転換すること、
ｖ）Δ６‐エロンガーゼが、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、約６０％から約９５％の間、約７０％から約８０％の間、または約７５％から約８０％の間の効率で、１つ以上の該植物部分の細胞内または組換え細胞内において、ＳＤＡをＥＴＡに転換すること、
ｖｉ）Δ５‐デサチュラーゼが、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、約６０％から約９５％の間、約７０％から約９５％の間、または約７５％から約９５％の間の効率で、１つ以上の該植物部分の細胞内または組換え細胞内において、ＥＴＡをＥＰＡに転換すること、
ｖｉｉ）Δ５‐エロンガーゼが、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、約５０％から約９０％の間、または約８５％から約９５％の間の効率で、１つ以上の該植物部分の細胞内または組換え細胞内において、ＥＰＡをＤＰＡに転換すること、
ｉｘ）１つ以上の該植物部分の細胞または組換え細胞内において、オレイン酸をＤＰＡに転換する効率が、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、約２０％、約２５％、約３０％、約１０％から約５０％の間、約１０％から約３０％の間、または約１０％から約２５％の間、または約２０％から約３０％の間であること、
ｘ）１つ以上の該植物部分の細胞内または組換え細胞内において、ＬＡをＤＰＡに転換する効率が、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２２％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、約２５％、約３０％、約３５％、約１５％から約５０％の間、約２０％から約４０％の間、または約２０％から約３０％の間であること、
ｘｉ）１つ以上の該植物部分の細胞内または組換え細胞内において、ＡＬＡをＤＰＡに転換する効率が、少なくとも約１７％、少なくとも約２２％、少なくとも約２４％、少なくとも約３０％、約３０％、約３５％、約４０％、約１７％から約５５％の間、約２２％から約３５％の間、または約２４％から約３５％の間であること、
ｘｉ）１つ以上の該植物部分の細胞または組換え細胞は、該外来性ポリヌクレオチドを含まない対応細胞より、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、約２５％から約４０％の間、または約２７．５％から約３７．５％の間で多いω３脂肪酸を含むこと、
ｘｉｉ）Δ６−デサチュラーゼは、リノール酸（ＬＡ）と比較してα−リノレン酸（ＡＬＡ）を優先的に不飽和化すること、
ｘｉｉｉ）Δ６−エロンガーゼは、Δ９−エロンガーゼ活性も有すること、
ｘｉｖ）Δ１２−デサチュラーゼは、Δ１５−デサチュラーゼ活性も有すること、
ｘｖ）Δ６−デサチュラーゼは、Δ８−デサチュラーゼ活性も有すること、
ｘｖｉ）Δ８−デサチュラーゼは、Δ６−デサチュラーゼ活性も有する、またはΔ６−デサチュラーゼ活性を有しないこと、
ｘｖｉｉ）Δ１５−デサチュラーゼは、ＧＬＡに対するω３−デサチュラーゼ活性も有すること、
ｘｖｉｉｉ）ω３−デサチュラーゼは、ＬＡに対するΔ１５−デサチュラーゼ活性も有すること、
ｘｉｘ）ω３−デサチュラーゼは、ＬＡ及び／またはＧＬＡの両方を不飽和化すること、
ｘｘ）ω３−デサチュラーゼは、ＬＡと比較してＧＬＡを優先的に不飽和化すること、
ｘｘｉ）１つ以上または全てのデサチュラーゼ、好ましくはΔ６−デサチュラーゼ及び／またはΔ５−デサチュラーゼは、対応するアシル‐ＰＣ基質より、アシル−ＣｏＡ基質に対して高い活性を有すること、
ｘｘｉｉ）Δ６−デサチュラーゼは、脂肪酸基質として、ＬＡより、ＡＬＡに対して高いΔ６−デサチュラーゼ活性を有すること、
ｘｘｉｉｉ）Δ６−デサチュラーゼは、脂肪酸基質としてのＰＣのＳｎ−２位と結合したＡＬＡに対するより、脂肪酸基質としてのＡＬＡ−ＣｏＡに対して高いΔ６−デサチュラーゼ活性を有すること、
ｘｘｉｖ）Δ６−デサチュラーゼは、ＬＡと比較して、基質としてのＡＬＡに対して、少なくとも約２倍高いΔ６−デサチュラーゼ活性、少なくとも３倍高い活性、少なくとも４倍高い活性、または少なくとも５倍高い活性を有すること、
ｘｘｖ）Δ６−デサチュラーゼは、脂肪酸基質としてのＰＣのｓｎ−２位と結合したＡＬＡに対するより、脂肪酸基質としてのＡＬＡ−ＣｏＡに対して高い活性を有すること、
ｘｘｖｉ）Δ６−デサチュラーゼは、脂肪酸基質としてのＰＣのｓｎ−２位に結合したＡＬＡに対するより、脂肪酸基質としてのＡＬＡ−ＣｏＡに対して、少なくとも約５倍高いΔ６‐デサチュラーゼ活性または少なくとも１０倍高い活性を有すること、
ｘｘｖｉｉ）デサチュラーゼは、フロントエンドデサチュラーゼであること、及び
ｘｘｖｉｉｉ）Δ６‐デサチュラーゼは、ＥＴＡに対する検出可能なΔ５‐デサチュラーゼ活性を有しないこと
の１つ以上または全てを有する。
【００５０】
さらなる実施形態では、種子、好ましくはアブラナ属の種子またはカメリナサティバの種子などの植物部分または微生物細胞などの組換え細胞は、以下の特徴の１つ以上または全てを有する。
ｉ）Δ１２−デサチュラーゼは、配列番号４で提供される配列を有するアミノ酸、その生物活性なフラグメント、または配列番号４と少なくとも５０％同一なアミノ酸配列を含むこと、
ｉｉ）ω３−デサチュラーゼは、配列番号６で提供される配列を有するアミノ酸、その生物活性なフラグメント、または配列番号６と少なくとも５０％同一なアミノ酸配列を含むこと、
ｉｉｉ）Δ６−デサチュラーゼは、配列番号９で提供される配列を有するアミノ酸、その生物活性なフラグメント、または配列番号９と少なくとも５０％同一なアミノ酸配列を含むこと、
ｉｖ）Δ６−エロンガーゼは、配列番号１６で提供される配列を有するアミノ酸、配列番号１７などのその生物活性なフラグメント、または配列番号１６及び／または配列番号１７と少なくとも５０％同一なアミノ酸配列を含むこと、
ｖ）Δ５−デサチュラーゼは、配列番号２０で提供される配列を有するアミノ酸、その生物活性なフラグメント、または配列番号２０と少なくとも５０％同一なアミノ酸配列を含むこと、及び、
ｖｉ）Δ５−エロンガーゼは、配列番号２５で提供される配列を有するアミノ酸、その生物活性なフラグメント、または配列番号２５と少なくとも５０％同一なアミノ酸配列を含むこと。
【００５１】
実施形態では、種子などの植物部分または微生物細胞などの組換え細胞は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）、モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＭＧＡＴ）、グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）、１−アシル−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）、好ましくは、ＤＰＡ−ＣｏＡなどのＣ２２多価不飽和脂肪アシル−ＣｏＡ基質を使用できるＬＰＡＡＴ、アシル−ＣｏＡ：リゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）、ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）、ＣＤＰ−コリンジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）、ホスファチジルコリンジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＰＤＡＴ）、ホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）、アシル−ＣｏＡシンターゼ（ＡＣＳ）、またはその２つ以上の組合せをコードする外来性ポリヌクレオチドをさらに含む。
【００５２】
別の実施形態では、種子などの植物部分または微生物細胞などの組換え細胞は、ＦＡＥ１、ＤＧＡＴ、ＭＧＡＴ、ＧＰＡＴ、ＬＰＡＡＴ、ＬＰＣＡＴ、ＰＬＡ２、ＰＬＣ、ＰＬＤ、ＣＰＴ、ＰＤＡＴ、ＦＡＴＢなどのチオエステラーゼ、もしくはΔ１２−デサチュラーゼ、またはその２つ以上の組合せから選択される植物部分細胞内の内在性酵素の産生及び／または活性をダウンレギュレートする導入変異体または外来性ポリヌクレオチドをさらに含む
【００５３】
さらなる実施形態では、少なくとも１つ、または好ましくは全てのプロモーターは、種子特異的プロモーターである。実施形態では、少なくとも１つ、または全てのプロモーターを、オイル生合成もしくはオレオシンをコードする遺伝子などの集積遺伝子、またはコンリニンをコードする遺伝子などの種子貯蔵タンパク質遺伝子から得た。
【００５４】
別の実施形態では、Δ５−エロンガーゼをコードする外来性ポリヌクレオチドの発現を誘導するプロモーターは、該プロモーターがΔ１２−デサチュラーゼ及びω３−デサチュラーゼをコードする外来性ポリヌクレオチドの発現を誘導する前の微生物細胞などの植物もしくは組換え細胞の発育種子内のポリヌクレオチドの発現を開始、または発現をピークにする。
【００５５】
さらなる実施形態では、外来性ポリヌクレオチドは、植物部分の細胞または微生物細胞などの組換え細胞のゲノムに組み込まれたＤＮＡ分子、好ましくは、Ｔ−ＤＮＡ分子内に共有結合しており、好ましくは、植物部分の細胞または組換え細胞のゲノムに組み込まれたかかるＤＮＡ分子数が、１以下、２もしくは３以下であり、または２もしくは３である場合である。
【００５６】
さらに別の実施形態では、植物部分は、同じまたは異なるアミノ酸配列を有するΔ６−デサチュラーゼを各々コードする少なくとも２つの異なる外来性ポリヌクレオチドを含む。
【００５７】
さらなる実施形態では、外来性ポリヌクレオチドを含む植物部分の総オイル含有率は、該外来性ポリヌクレオチドを含まない対応する植物部分の総オイル含有率の少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、約５０％から約８０％の間、または約８０％から約１００％の間である。さらなる実施形態では、外来性ポリヌクレオチドを含む種子は、該外来性ポリヌクレオチドを含まない対応する種子重量の少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、約５０％から約８０％の間、または約８０％から約１００％の間である。
【００５８】
別の実施形態では、脂質は、オイルの形態であり、好ましくは、油料種子の種子オイルであり、少なくとも約９０重量％、少なくとも約９５重量％、少なくとも約９８重量％、または約９５重量％から約９８重量％の間の脂質はトリアシルグリセロール類である。
【００５９】
さらなる実施形態では、方法は、総脂肪酸含有率パーセントとして、ＤＰＡのレベルを増加するように脂質を処理することを含む。例えば、該処理は、遊離脂肪酸を生成するためのエステル化脂肪酸の加水分解、またはエステル交換反応を含む。例えば、キャノーラオイルなどの脂質を、該オイル中の脂肪酸を、メチルまたはエチルエステルなどのアルキルエステルに転換してもよく、それから、ＤＰＡの脂質またはオイルが豊富になるように分取してもよい。実施形態では、かかる処理後の脂質の脂肪酸組成は、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％ＤＰＡを含む。ある実施形態では、処理後の総脂肪酸含有量におけるＤＨＡレベルは、２．０％未満または０．５％未満であり、好ましくは、該脂質中に検出されない。
【００６０】
脂質、またはたとえば遊離脂肪酸もしくはアルキルエステルなどの脂質を含むオイルも提供され、本発明の方法を用いて産生される。
【００６１】
別の態様では、本発明は、多価不飽和脂肪酸のメチルまたはエチルエステルを産生する方法を提供し、該方法は、抽出植物脂質中、または抽出過程中に、トリアシルグリセロール類を、それぞれ、メタノールまたはエタノールと反応させることを含み、該抽出植物脂質は、ＴＡＧの形態でエステル化された脂肪酸を含み、該脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸（ＬＡ）を含むω６脂肪酸、α−リノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３脂肪酸、及びドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）を含み、場合により、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、及びエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）のうち１つ以上を含んでもよく、該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるＤＰＡレベルは約７％から３５％の間、好ましくは２０．１％から３０％の間、または、２０．１％から３５％の間であり、それにより、多価不飽和脂肪酸のメチルまたはエチルエステルを産生する。
【００６２】
別の態様では、本発明は、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）のメチルまたはエチルエステルの産生方法を提供し、該方法は、それぞれ、メタノールまたはエタノールと抽出植物脂質中、または抽出処理中にトリアシルグリセロール類（ＴＡＧ）を反応させることを含み、該抽出植物脂質はエステル化された形態の脂肪酸を含み、該脂肪酸はドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）を含み、ＴＡＧの形態でエステル化された少なくとも３５％のＤＰＡは該ＴＡＧのｓｎ−２位でエステル化されており、それにより、多価不飽和脂肪酸のメチルまたはエチルエステルを産生する
【００６３】
好ましい実施形態では、上記２つの態様の方法で使用される脂質は、本発明の抽出脂質またはオイルに関連して、本明細書で定義された１つ以上の特徴を有する。
【００６４】
別の態様では、本発明は、  
ａ）エステル化された形態の脂肪酸を含む脂質、及び
ｂ）酵素の以下のセット；
ｉ）Δ１２−デサチュラーゼ、ω３−デサチュラーゼ及び／またはΔ１５−デサチュラーゼ、Δ６−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ６−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ、
ｉｉ）Δ１２−デサチュラーゼ、ω３−デサチュラーゼ及び／またはΔ１５−デサチュラーゼ、Δ８−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ９−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ
ｉｉｉ）ω３−デサチュラーゼ及び／またはΔ１５−デサチュラーゼ、Δ６−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ６−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ、または
ｉｖ）ω３−デサチュラーゼ及び／またはΔ１５−デサチュラーゼ、Δ８−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ９−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ  
の１つをコードする外来性ポリヌクレオチド
を含み、
各ポリヌクレオチドが、前記植物の発育種子中の前記ポリヌクレオチドの発現を誘導可能である１つ以上の種子特異的プロモーター、または前記微生物細胞中の前記ポリヌクレオチドの発現を誘導可能である１つ以上の種子特異的プロモーターと作動可能に結合されており、前記脂肪酸が、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸（ＬＡ）を含むω６脂肪酸、及び場合により、γ−リノレン酸（ＧＬＡ）、α−リノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３脂肪酸、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、及びドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）を含み、場合によっては、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）及び／またはエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）を含んでもよく、及び前記種子または微生物細胞の脂質の総脂肪酸含有量におけるＤＰＡのレベルが７％から３５％の間である、
油料種子植物、もしくは種子などのその部分、好ましくはその種子中に脂質を含むアブラナ属植物またはカメリナサティバ植物、または微生物細胞を提供する。本態様の好ましい実施形態では、ＤＨＡは、種子及び抽出脂質の脂質の総脂肪酸含有物の２％未満、または０．５％未満のレベルで存在し、より好ましくは、脂質の総脂肪酸含有物中に検出されない。
【００６５】
別の態様では、本発明は、
ａ）エステル化された形態の脂肪酸であって、該脂肪酸は、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）を含み、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の形態でエステル化された少なくとも３５％のＤＰＡは、該ＴＡＧのｓｎ−２位でエステル化されている該脂肪酸、及び
ｂ）酵素の以下のセットのうち１つをコードする外来性ポリヌクレオチド；
ｉ）１−アシル−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）、ω３−デサチュラーゼ、Δ６−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ６−エロンガーゼ、及びΔ５−エロンガーゼ、
ｉｉ）１−アシル−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）、Δ１５−デサチュラーゼ、Δ６−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ６−エロンガーゼ、及びΔ５−エロンガーゼ、
ｉｉｉ）１−アシル−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）、Δ１２−デサチュラーゼ、Δ６−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ６−エロンガーゼ、及びΔ５−エロンガーゼ、
ｉｖ）１−アシル−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）、Δ１２−デサチュラーゼ、ω３−デサチュラーゼ及び／またはΔ１５−デサチュラーゼ、Δ６−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ６−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ、
ｖ）１−アシル−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）、ω３−デサチュラーゼ、Δ８−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ９−エロンガーゼ、及びΔ５−エロンガーゼ、
ｖｉ）１−アシル−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）、Δ１５−デサチュラーゼ、Δ８−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ９−エロンガーゼ、及びΔ５−エロンガーゼ、
ｖｉｉ）１−アシル−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）、Δ１２−デサチュラーゼ、Δ８−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ９−エロンガーゼ、及びΔ５−エロンガーゼ、
ｖｉｉｉ）１−アシル−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）、Δ１２−デサチュラーゼ、ω３−デサチュラーゼ及び／またはΔ１５−デサチュラーゼ、Δ８−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ９−エロンガーゼ、及びΔ５−エロンガーゼ、
を含む細胞、好ましくは、油料種子植物などの植物中もしくはそれからの細胞または種子などのその部分、または好ましくはアブラナ属植物もしくはカメリナサティバ植物といった油料植物もしくはその部分、または微生物細胞を提供し、各ポリヌクレオチドが、該細胞内の前記ポリヌクレオチドの発現を誘導可能である１つ以上のプロモーターと作動可能に結合している。好ましくは、ＬＰＡＡＴは、ＤＰＡ−ＣｏＡなどのＣ２２多価不飽和脂肪アシル−ＣｏＡ基質を使用でき、抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるＤＰＡのレベルは、約１％から３５％の間、または、約７％から３５％の間、または約２０．１％から３５％の間である。実施形態では、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の形態でエステル化された、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約４８％、３５％から約６０％の間、または３５％から約５０％の間のＤＰＡは、ＴＡＧのｓｎ−２位でエステル化されている。
【００６６】
上記２つの態様の各々の好ましい実施形態では、Δ１５−デサチュラーゼは、真菌のΔ１５−デサチュラーゼであり、ω３−デサチュラーゼは、真菌のω３−デサチュラーゼである。
【００６７】
好ましい実施形態では、本発明の油料植物、微生物細胞または細胞は、該当する場合、本明細書で定義した、例えば、抽出植物脂質、抽出微生物脂質またはその産生方法に関連した上記定義した通りの１つ以上の特徴を有する。
【００６８】
油料種子植物の例としては、これに限定されないが、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｓｐ．）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、アマ（Ｌｉｎｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）、ヘリアンタス属（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｓｐ．）、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、エンバク（Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ）、トリフォリウム属（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ  ｓｐ．）、ギニアアブラヤシ（Ｅｌａｅｓｉｓ  ｇｕｉｎｅｅｎｉｓ）、ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、アオバナルーピン（Ｌｕｐｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓ）、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、アフリカイネ（Ｏｒｙｚａ  ｇｌａｂｅｒｒｉｍａ）、カメリナサティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ  ｓａｔｉｖａ）、またはクランベアビシニカ（Ｃｒａｍｂｅ  ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ）が挙げられる。実施形態では、該植物は、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｓｐ．）植物、カメリナサティバ（Ｃ．  ｓａｔｉｖａ）植物またはグリシンマックス（Ｇ．  ｍａｘ）（ダイズ）植物である。実施形態では、該油料種子植物は、セイヨウアブラナ、カラシナ（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、カメリナサティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ  ｓａｔｉｖａ）またはシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）植物である。代替の実施形態では、該油料種子植物は、シロイヌナズナ（Ａ．  ｔｈａｌｉａｎａ）及び／またはカメリナサティバ（Ｃ．  ｓａｔｉｖａ）以外である。実施形態では、該油料種子植物は、Ｇ．ｍａｘ（ダイズ）以外の植物である。該植物は、好ましくはアブラナ属またはカメリナサティバである。実施形態では、油料種子植物は、例えば、実施例１に記載したような標準条件で、畑にある、または畑で生育した、または温室で生育した。
【００６９】
実施形態では、本発明の方法で使用される、または本発明の細胞もしくは植物もしくはその植物部分に存在する１つ以上のデサチュラーゼは、アシル−ＣｏＡ基質を使用可能である。好ましい実施形態では、Δ６−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ及びΔ８−デサチュラーゼは、もし存在するならば、アシル−ＣｏＡ基質を使用可能であり、好ましくは、ｉ）Δ６−デサチュラーゼ、及びΔ５−デサチュラーゼまたはｉｉ）Δ５−デサチュラーゼ、及びΔ８−デサチュラーゼの各々は、アシル−ＣｏＡ基質を使用可能である。実施形態では、Δ１２−デサチュラーゼ及び／またはω３−デサチュラーゼは、アシル−ＣｏＡ基質を使用可能である。該アシル−ＣｏＡ基質は、好ましくは、Δ６−デサチュラーゼにはＡＬＡ−ＣｏＡ、Δ５−デサチュラーゼにはＥＴＡ−ＣｏＡ、そしてΔ８−デサチュラーゼにはＥＴｒＡ−ＣｏＡ、Δ１２−デサチュラーゼにはオレオイル−ＣｏＡ、またはω３−デサチュラーゼにはＬＡ−ＣｏＡ、ＧＬＡ−ＣｏＡ、及びＡＲＡ−ＣｏＡのうち１つ以上である。
【００７０】
実施形態では、植物の収穫された種子は、種子１グラム当たり少なくとも約２８ｍｇ、好ましくは、種子１グラム当たり少なくとも約３２ｍｇ、種子１グラム当たり少なくとも約３６ｍｇ、種子１グラム当たり少なくとも約４０ｍｇ、より好ましくは、種子１グラム当たり少なくとも約４４ｍｇまたは少なくとも４８ｍｇ、種子１グラム当たり少なくとも約８０ｍｇ、または種子１グラム当たり約３０ｍｇから約８０ｍｇの間のＤＰＡ含有量を有する。
【００７１】
さらなる態様では、本発明は、ＤＰＡを含む種子を産生可能であるセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、カラシナ（Ｂ．  ｊｕｎｃｅａ）またはカメリナサティバ（Ｃ．  ｓａｔｉｖａ）植物を提供し、該植物の成熟した収穫された種子が、種子１グラム当たり少なくとも約２８ｍｇ、好ましくは、種子１グラム当たり少なくとも約３２ｍｇ、種子１グラム当たり少なくとも約３６ｍｇ、種子１グラム当たり少なくとも約４０ｍｇ、より好ましくは、種子１グラム当たり少なくとも約４４ｍｇまたは少なくとも４８ｍｇ、種子１グラム当たり少なくとも約８０ｍｇ、または種子１グラム当たり約３０ｍｇから約８０ｍｇの間のＤＰＡ含有量を有する。
【００７２】
別の態様では、本発明は、本明細書で定義した外来性ポリヌクレオチドを含む本発明の植物の植物細胞を提供する。
【００７３】
以下の特徴：
ｉ）本発明の植物由来であること、
ｉｉ）本明細書で定義した脂質を含むこと、または
ｉｉｉ）本発明の方法で使用できること、のうちの１つ以上を有する植物部分、好ましくは種子、または微生物細胞などの組換え細胞も提供される。
【００７４】
さらに別の態様では、本発明は、ＤＰＡ及び約４重量％から約１５重量％の間、好ましくは、約６重量％から約８重量％の間または約４重量％から約８重量％の間、より好ましくは、約４重量％から約６重量％の水分を含む成熟して収穫されたセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、カラシナ（Ｂ．  ｊｕｎｃｅａ）またはカメリナサティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ  ｓａｔｉｖａ）種子を提供し、該種子のＤＰＡ含有量が種子１グラム当たり少なくとも約２８ｍｇ、好ましくは、種子１グラム当たり少なくとも約３２ｍｇ、種子１グラム当たり少なくとも約３６ｍｇ、種子１グラム当たり少なくとも約４０ｍｇ、より好ましくは、種子１グラム当たり少なくとも約４４ｍｇまたは種子１グラム当たり少なくとも約４８ｍｇ、種子１グラム当たり約８０ｍｇ、または種子１グラム当たり約３０ｍｇから約８０ｍｇの間である。
【００７５】
実施形態では、本発明の細胞、本発明の油料種子植物、本発明のセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、カラシナ（Ｂ．  ｊｕｎｃｅａ）またはカメリナサティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ  ｓａｔｉｖａ）植物、本発明の植物部分、または本発明の種子を、本明細書で定義した特徴の１つ以上または全てを含む抽出脂質を産生するために使用できる。
【００７６】
その上、さらなる態様では、本発明は、本発明の抽出脂質を産生するために使用できる植物または細胞の産生方法を提供し、該方法は、
ａ）複数の植物または微生物細胞などの組換え細胞からの種子などの１つ以上の植物部分または微生物細胞などの組換え細胞により産生された脂質中のＤＰＡのレベルをアッセイすることであって、各植物または微生物細胞などの組換え細胞が、酵素の以下のセット；
ｉ）ω３−デサチュラーゼ、Δ６−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ６−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ、
ｉｉ）Δ１５−デサチュラーゼ、Δ６−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ６−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ、
ｉｉｉ）Δ１２−デサチュラーゼ、Δ６−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ６−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ、
ｉｖ）Δ１２−デサチュラーゼ、ω３−デサチュラーゼまたはΔ１５−デサチュラーゼ、Δ６−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ６−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ、
ｖ）ω３−デサチュラーゼ、Δ８−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ９−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ、
ｖｉ）Δ１５−デサチュラーゼ、Δ８−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ９−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ、
ｖｉｉ）Δ１２−デサチュラーゼ、Δ８−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ９−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ、
ｖｉｉｉ）Δ１２−デサチュラーゼ、ω３−デサチュラーゼまたはΔ１５−デサチュラーゼ、Δ８−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ９−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ、
ｉｘ）ω３−デサチュラーゼ、Δ６−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ６−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ、
ｘ）Δ１５−デサチュラーゼ、Δ６−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ６−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ、または、
ｘｉ）Δ１２−デサチュラーゼ、Δ６−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ６−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ、
の１つをコードする１つ以上の外来性ポリヌクレオチドを含み、
各ポリヌクレオチドが、植物部分または組換え細胞の細胞内の該ポリヌクレオチドの発現を誘導可能である１つ以上のプロモーターと作動可能に結合する、該アッセイすること、と
ｂ）１つ以上のその部分の本発明の抽出植物脂質または組換え細胞脂質の産生に使用できる複数の植物または組換え細胞から植物または組換え細胞を同定すること、と
ｃ）場合によっては、前記同定植物または組換え細胞、またはそれ由来の種子から後代植物または組換え細胞を産生すること
とを含む。
【００７７】
実施形態では、植物または組換え細胞は、本明細書で定義したＬＰＡＡＴをコードする外来性ポリヌクレオチドをさらに含む。
【００７８】
好ましくは、後代植物は、同定された植物から取り出された少なくとも第二または第三世代であり、好ましくは、１つ以上のポリヌクレオチドにとってホモ接合である。より好ましくは、該１つ以上のポリヌクレオチドは、１つの挿入遺伝子座のみにおいて、後代植物中に存在する。すなわち、本発明は、複数の形質転換候補植物または種子から植物またはその種子を同定するためのスクリーニング方法として使用できるような方法を提供し、同定された植物またはその後代植物が好ましくはその種子内で、本発明の脂質を産生する。かかる植物または後代植物またはその種子は、特に特定のＤＰＡレベルを有する本発明の脂質を産生する場合に選択され、または本発明の脂質を産生しない場合選択されない。
【００７９】
実施形態では、本明細書で定義した微生物細胞、または植物もしくはその部分などの細胞内に存在する外来性ポリペプチドは、該細胞、植物または種子などの植物部分のゲノム中に安定に組み込まれる。好ましくは、外来性ポリヌクレオチドは、該ゲノム中の１つの遺伝子座において、該細胞、植物または種子などの植物部分のゲノム中に安定に組み込まれ、好ましくは、挿入にとってホモ接合である。より好ましくは、該植物、植物部分または種子は、１つ以上のＴ−ＤＮＡ分子以外の外来性ポリヌクレオチドを欠いているという点でさらに特徴付けられる。すなわち、外来性ベクター配列は、Ｔ−ＤＮＡ配列以外のゲノム中に組み込まれない。
【００８０】
実施形態では、工程ａ）の前に、該方法は、１つ以上の外来性ポリヌクレオチドを、植物の１つ以上の細胞に導入することを含む。
【００８１】
本発明の方法を用いて産生した植物、及びかかる植物の種子も提供する。
【００８２】
実施形態では、本発明の植物は、雌雄両方の生殖能力があり、好ましくは、対応する野生型植物と比較して少なくとも７０％である、または好ましくはほぼ同じである雌雄両方の生殖能力レベルを有する。実施形態では、本発明の植物または本発明の種子から産生された植物により産生された花粉は、生存性染色での染色により測定したとき、９０〜１００％の生存性である。例えば、花粉の生存性を、実施例１に記載のように評価してもよい。
【００８３】
別の態様では、本発明は、種子を産生する方法を提供し、該方法は、
ａ）好ましくは、少なくとも１０００または２０００または３０００のかかる植物の集合部分としての耕地または標準栽植密度で植えられた少なくとも１ヘクタールまたは２ヘクタールまたは３ヘクタールの領域、あるいは標準条件下温室内で、本発明の植物、または本発明の植物部分を産生、もしくは本発明の種子を産生する植物を生育すること、
ｂ）前記１つまたは複数の植物から種子を収穫すること、及び
ｃ）場合によっては、前記種子から脂質を抽出して、好ましくは、少なくとも６０ｋｇまたは７０ｋｇまたは８０ｋｇのＤＰＡ／ヘクタールの総ＤＰＡ収率でオイルを産生すること
を含む。
【００８４】
実施形態では、本発明の植物、植物細胞、植物部分もしくは種子、または組換え細胞は、次の特徴：
ｉ）  そのオイルは、本明細書で定義したものであること、または  
ｉｉ）  該植物部分または種子または組換え細胞が本発明の方法で使用可能であること  
の１つ以上を有する。
【００８５】
例えば、種子を、本発明の植物を産生するために使用できる。植物は、例えば、実施例１に記載したように、標準条件下で、畑または温室で生育してもよい。
【００８６】
さらなる態様では、本発明は、本発明の方法を用いて、本発明の細胞、本発明の油料種子、本発明のアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｓｐ．）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、カラシナ（Ｂ．  ｊｕｎｃｅａ）、ダイズ（Ｇ．  ｍａｘ）またはカメリナサティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ  ｓａｔｉｖａ）植物、本発明の植物部分、本発明の種子、または本発明の植物、植物細胞、植物部分もしくは種子により産生された、またはそれから得られた脂質、またはオイルを提供する。好ましくは、脂質またはオイルを精製して、核酸（ＤＮＡ及び／またはＲＮＡ）、タンパク質及び／または炭水化物、またはクロロフィルなどの顔料などの夾雑物を取り除く。脂質またはオイルを精製して、例えば、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）またはリン脂質の除去により、ＴＡＧの割合を濃縮する
【００８７】
実施形態では、脂質またはオイルを、油料種子からオイルを抽出することにより得る。油料種子のオイルの例としては、これに限定されないが、キャノーラオイル（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ，Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ  ｓｓｐ）、カラシナオイル（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）、他のブラシカオイル、ヒマワリオイル（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｓ）、アマニオイル（Ｌｉｎｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）、ダイズオイル（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、ベニバナオイル（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）、トウモロコシオイル（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、タバコオイル（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）、ピーナッツオイル（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａ）、パームオイル、綿実油（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、ココナッツオイル（Ｃｏｃｏｓ  ｎｕｃｉｆｅｒａ）、アボカドオイル（Ｐｅｒｓｅａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）、オリーブオイル（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ）、カシューオイル（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ）、マカダミアオイル（Ｍａｃａｄａｍｉａ  ｉｎｔｅｒｇｒｉｆｏｌｉａ）、アーモンドオイル（Ｐｒｕｎｕｓ  ａｍｙｇｄａｌｕｓ）、またはアラビドプシス種子オイル（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）が挙げられる。
【００８８】
実施形態では、本発明の、または本発明で使用される細胞（組換え細胞）は、発酵に適切な細胞などの微生物細胞、好ましくは、重量基準で少なくとも２５％のレベルまでトリアシルグリセロールを蓄積可能である油性微生物細胞である。好ましい発酵方法は、当技術分野で周知であるような嫌気性発酵方法である。適切な発酵細胞、通常、微生物は、発酵可能である、すなわち、グルコースまたはマルトースなどの糖類を、直接または間接的に所望の脂肪酸に転換できる。発酵する微生物の例としては、酵母などの真菌生物が挙げられる。本明細書で使用されるとき、「酵母」は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）、サッカロミセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．）、クルベロミセス属（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｓｐｐ．）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐｐ．）、リポミセス・スターキー（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｒｋｅｙ）、及び好ましくは、アルカン資化性酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）が挙げられる。
【００８９】
さらなる態様では、本発明は、本発明の方法を用いて、本発明の細胞、本発明の油料種子、本発明のアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｓｐ．）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、カラシナ（Ｂ．  ｊｕｎｃｅａ）、ダイズ（Ｇ．  ｍａｘ）またはカメリナサティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ  ｓａｔｉｖａ）植物、本発明の植物部分、本発明の種子、または本発明の植物、植物細胞、植物部分もしくは種子により産生された、またはそれから得られた脂肪酸を提供する。好ましくは、脂肪酸は、ＤＰＡである。脂肪酸は、本明細書に記載の脂肪酸組成を有する脂肪酸混合物であってよく、または脂肪酸、好ましくはＤＰＡが混合物中の脂肪酸含有物の少なくとも４０％または少なくとも９０％を含むように濃縮されてもよい。実施形態では、脂肪酸は、エステル化されていない。あるいは、脂肪酸は、例えば、メチル、エチル、プロピルまたはブチル基になど、エステル化されている。
【００９０】
本発明の種子から得られる、または本発明の植物から得られるシードミール（ｓｅｅｄｍｅａｌ）も提供される。好ましいシードミールとしては、これに限定されないが、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｓｐ．）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、カラシナ（Ｂ．  ｊｕｎｃｅａ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ．  ｍａｘ）シードミールが挙げられる。実施形態では、該シードミールは、本明細書で定義した外来性ポリヌクレオチド及び／または遺伝子構築物を含む。好ましい実施形態では、該シードミールは、シードミールが得られるが、ほとんどの脂質またはオイルの抽出後低レベル（例えば、２重量％未満）である種子内で産生された脂質またはオイルのいくらかを保持する。該シードミールを、動物用飼料または食料製品の成分として使用してもよい。
【００９１】
別の態様では、本発明は、１つ以上の本発明の脂質またはオイル、本発明の脂肪酸、本発明に記載の細胞、本発明の油料種子植物、本発明のアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｓｐ．）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、カラシナ（Ｂ．  ｊｕｎｃｅａ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ．  ｍａｘ）またはカメリナサティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ  ｓａｔｉｖａ）植物、本発明の植物部分、本発明の種子、または本発明のシードミールを含む組成物を提供する。実施形態では、該組成物は、医薬品、食物もしくは農業用途、種子処理化合物、肥料、別の食物もしくは飼料成分、または添加タンパク質もしくはビタミン類に適切な担体を含む。
【００９２】
１つ以上の本発明の脂質またはオイル、本発明の脂肪酸、本発明に記載の細胞、本発明の油料種子植物、本発明のアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｓｐ．）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、カラシナ（Ｂ．  ｊｕｎｃｅａ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ．  ｍａｘ）またはカメリナサティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ  ｓａｔｉｖａ）植物、本発明の植物部分、本発明の種子、または本発明のシードミール、または本発明の組成物を含む飼料、化粧品または化学薬品も提供する。好ましい飼料は、本発明の脂質またはオイルを含む乳児用調製粉乳である。
【００９３】
別の態様では、本発明は、飼料、好ましくは乳児用調製粉乳の製造方法を提供し、該方法は、１つ以上の本発明の脂質またはオイル、本発明の脂肪酸、本発明に記載の細胞、本発明の油料種子植物、本発明のアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｓｐ．）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、カラシナ（Ｂ．  ｊｕｎｃｅａ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ．  ｍａｘ）またはカメリナサティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ  ｓａｔｉｖａ）植物、本発明の植物部分、本発明の種子、または本発明のシードミール、または本発明の組成物を、少なくとも１つの他の食物成分と混合することを含む。該方法は、配合、料理、ベーキング、押出、乳化、さもなければ飼料の処方、または飼料の包装、または試料中の脂質もしくはオイルの量の分析の工程を含んでもよい。
【００９４】
別の態様では、本発明は、ＰＵＦＡ、好ましくはＤＰＡから効果を得るだろう病状の治療または予防方法を提供し、該方法は、対象に、１つ以上の本発明の脂質またはオイル、本発明の脂肪酸、本発明に記載の細胞、本発明の油料種子植物、本発明のアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｓｐ．）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、カラシナ（Ｂ．  ｊｕｎｃｅａ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ．  ｍａｘ）またはカメリナサティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ  ｓａｔｉｖａ）植物、本発明の植物部分、本発明の種子、または本発明のシードミール、本発明の組成物、または本発明の飼料を投与することを含む。好ましい実施形態では、ＰＵＦＡを、ＰＵＦＡのエチルエステルを含む医薬組成物の形態で投与する。対象は、ヒトまたはヒト以外の動物であり得る。
【００９５】
ＰＵＦＡから効果を得られるだろう病状の例としては、これに限定されないが、血清トリグリセリド値上昇、ＬＤＬコレステロール値上昇などの血清コレステロール値上昇、不整脈、血管形成、炎症、喘息、乾癬、骨粗鬆症、腎臓結石、ＡＩＤＳ、多発性硬化症、関節リウマチ，  クローン病、統合失調症、がん、胎児アルコール症候群、注意不足多動性障害、嚢胞性線維症、フェニルケトン尿症、単極性うつ病、攻撃的な敵意、アドレノロイコジストフィー、冠動脈心疾患、高血圧症、糖尿病、肥満症、アルツハイマー病、慢性閉塞性肺疾患、潰瘍性大腸炎、血管形成術後の再狭窄、湿疹、高血圧、血小板凝集、胃腸出血、子宮内膜症、月経前緊張症、筋痛性脳脊髄炎、ウイルス性感染後の慢性疲労または眼疾患が挙げられる。
【００９６】
１つ以上の本発明の脂質またはオイル、本発明の脂肪酸、本発明に記載の細胞、本発明の油料種子植物、本発明のアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｓｐ．）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、カラシナ（Ｂ．  ｊｕｎｃｅａ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ．  ｍａｘ）またはカメリナサティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ  ｓａｔｉｖａ）植物、本発明の植物部分、本発明の種子、または本発明のシードミール、本発明の組成物、または本発明の飼料を、ＰＵＦＡ、好ましくはＤＰＡから効果を得られるだろう病状を治療用または予防用医薬品製造のための使用も提供される。
【００９７】
該医薬品製造は、本明細書に記載の病状の治療のため、本発明のオイルを薬剤的に許容可能な担体と混合することを含んでもよい。該方法は、オイルを先ず精製し、及び／またはエステル交換し、及び／または該オイルの分取をしてＤＰＡのレベルを増加することを含んでもよい。特定の実施形態では、該方法は、キャノーラオイルなどの脂質またはオイルを処理して、オイル中の脂肪酸をメチルまたはエチルなどのアルキル  エステルに転換することを含む。分取または蒸留などのさらなる処理を、脂質またはオイルのＤＰＡを濃縮するために適用してもよい。好ましい実施形態では、該医薬品は、ＤＰＡのエチルエステルを含む。さらにより好ましい実施形態では、医薬品中のＤＰＡのエチルエステルのレベルは、３０％から５０％の間、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも約９５％である。該医薬品は、医薬品中総脂肪酸含有率の３０％から５０％の間、または少なくとも９０％などのＥＰＡのエチルエステルをさらに含む。かかる医薬品は、本明細書に記載の病状の治療のため、ヒトまたは動物対象に投与するのに適切である。
【００９８】
別の態様では、本発明は、本発明の種子を得ること、及び得られた種子を金銭利益のため取引きすることを含む種子の取引き方法を提供する。
【００９９】
実施形態では、種子を得ることは、本発明の植物を栽培すること、及び／または該植物から種子を収穫することを含む。
【０１００】
別の実施形態では、種子を得ることは、該種子を容器に入れること、及び／または該種子を貯蔵することをさらに含む
【０１０１】
さらなる実施形態では、種子を得ることは、該種子を異なる場所に輸送することをさらに含む。
【０１０２】
さらに別の実施形態では、該方法は、該種子を取り引き後、該種子を異なる場所に輸送することをさらに含む。
【０１０３】
さらなる実施形態では、該取り引きを、コンピューターなどの電子的手段を用いて実行する。
【０１０４】
その上、さらなる態様では、本発明は、
ａ）本発明の種子を含む植物の地上部を包む、引き抜く及び／または刈り取ること
ｂ）植物の部分を脱穀及び／または選穀して、植物部分の残部から種子を分離すること、及び
ｃ）工程ｂ）で分離した種子を篩い分け及び／または選別し、篩い分け及び／または選別した種子を貯蔵箱に充填し、それにより、種子の箱を製造すること、を含む種子の箱の製造方法を提供する。
【０１０５】
実施形態では、関連する場合、本発明の、または本発明に有用な脂質またはオイル、好ましくは、種子オイルは、実施例のセクション中の表中に提供したものについて脂肪レベルを有する。
【０１０６】
本明細書中のいかなる実施形態も、特に別段の明記がない限り、いずれもの他の実施形態に対して、変更すべきところは変更して適用されるべきである。
【０１０７】
本発明は、例証することのみを目的と意図された、本明細書に記載の特定の実施形態により、範囲を限定されない。機能的に均等な製品、組成物及び方法は、本明細書に記載のように、明白に、本発明の範囲内である。
【０１０８】
本明細書を通して、特に別段の明言がない、または文脈上別の意味を必要としない限り、１つの工程、物質の組成物、工程の群または物質の組成物の群の参照は、１つ及び複数（すなわち、１つ以上）のこれらの工程、物質の組成物、工程の群または物質の組成物の群を包含すると解釈すべきである。
【０１０９】
以下、本発明を、以下の非限定的実施例として、及び添付の図を参照して説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】好気的ＤＰＡ生合成経路。
【図２】ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７の左右境界領域間のＴ−ＤＮＡ挿入領域のマップ。ＲＢは右境界領域を示し；ＬＢは左境界領域を示し、ＴＥＲは転写ターミネーター／ポリアデニル化領域を示し、ＰＲＯはプロモーターを示し；コード領域は矢印上に示され、プロモーター及びターミネーターは矢印の下に示される。Ｍｉｃｐｕ−Δ６Ｄはミクロモナス・プシーラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎａｓ  ｐｕｓｉｌｌａ）Δ６−デサチュラーゼ；Ｐｙｒｃｏ−Δ６Ｅはピラミモナス・コルダタ（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ  ｃｏｒｄａｔａ）Δ６−エロンガーゼ；Ｐａｖｓａ−Δ５Ｄはパブロバ・サリナ（Ｐａｖｌｏｖａ  ｓａｌｉｎａ）Δ５−デサチュラーゼ；Ｐｉｃｐａ−ω３Ｄはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ω３−デサチュラーゼ；Ｐａｖｓａ−Δ４Ｄはパブロバ・サリナ（Ｐ．  ｓａｌｉｎａ）Δ４−デサチュラーゼ；Ｌａｃｋｌ−Δ１２Ｄはラカンセア・クルイベリ（Ｌａｃｈａｎｃｅａ  Ｋｌｕｙｖｅｒｉ）Δ１２−デサチュラーゼ、Ｐｙｒｃｏ−Δ５Ｅはピラミモナス・コルダタ（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ  ｃｏｒｄａｔａ）Δ５−エロンガーゼを示す。ＮＯＳはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ノバリン合成転写ターミネーター／ポリアデニル化領域を示し；ＦＰ１はセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）短縮化ナピンプロモーターを示し；ＦＡＥ１はシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ＦＡＥ１プロモーターを示し；Ｌｅｃｔｉｎはダイス（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）レクチン転写ターミネーター／ポリアデニル化領域；Ｃｎｌ１及びＣｎｌ２はアマ（Ｌｉｎｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）コンリニン１またはコンリニン２プロモーターまたはターミネーターを示す。ＭＡＲはタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）Ｒｂ７マトリックス結合領域を示す。
【図３】（Ａ）は、環番号及び側鎖番号を伴う、基本的な植物ステロールの構造である。（Ｂ）は、一部の植物ステロールの化学構造である。
【図４】ｐＪＰ３６６２の左境界と右境界の間のＴ−ＤＮＡ挿入領域の地図である。ＲＢは、右境界を示す。ＬＢは左境界を示す。ＴＥＲは、転写ターミネーター（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）／ポリアデニル化領域（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ  ｒｅｇｉｏｎ）。ＰＲＯは、プロモーター。コード領域は、矢印の上に示され、プロモーター及びターミネーターは、は矢印の下に示される。Ｍｉｃｐｕ−Δ６Ｄは、ミクロモナス・プシーラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎａｓ  ｐｕｓｉｌｌａ）のΔ６−デサチュラーゼ。Ｐｙｒｃｏ−Δ６Ｅは、ピラミモナス・コルダタ（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ  ｃｏｒｄａｔａ）のΔ６−エロンガーゼ。Ｐａｖｓａ−Δ５Ｄは、パブロバ・サリナ（Ｐａｖｌｏｖａ  ｓａｌｉｎａ）のΔ５−デサチュラーゼ。Ｐｉｃｐａ−ω３Ｄは、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）のω３−デサチュラーゼ。Ｌａｃｋｌ−Δ１２Ｄは、ラカンセア・クルイベリ（Ｌａｃｈａｎｃｅａ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）のΔ１２−デサチュラーゼ。Ｐｙｒｃｏ−Δ５Ｅは、ピラミモナス・コルダタ（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ  ｃｏｒｄａｔａ）のΔ５−エロンガーゼ。ＮＯＳは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のノパリン合成酵素転写ターミネーター／ポリアデニル化領域を示す。ＦＰ１は、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）短縮化ナピンプロモーターを示す。ＦＡＥ１は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ＦＡＥ１プロモーターを示す。Ｌｅｃｔｉｎは、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）レクチン転写ターミネーター／ポリアデニル化領域。Ｃｎｌ１は、アマ（Ｌｉｎｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）コンリニン１プロモーターまたはターミネーターを示す。ＭＡＲはタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）由来のＲｂ７マトリックス結合領域を示す。
【０１１１】
配列表のキー
配列番号１−ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７ヌクレオチド配列。
配列番号２−ｐＧＡ７−ｍｏｄ＿Ｂヌクレオチド配列。
配列番号３−植物のラカンセア・クルイベリ（Ｌａｃｈａｎｃｅａ  Ｋｌｕｙｖｅｒｉ）Δ１２デサチュラーゼの発現のコドン最適化オープンリーディングフレーム。
配列番号４−ラカンセア・クルイベリ（Ｌａｃｈａｎｃｅａ  Ｋｌｕｙｖｅｒｉ）Δ１２デサチュラーゼ。
配列番号５−植物のピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ω３デサチュラーゼの発現のコドン最適化オープンリーディングフレーム。
配列番号６−ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ω３デサチュラーゼ。
配列番号７−ミクロモナス・プシーラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎａｓ  ｐｕｓｉｌｌａ）Δ６−デサチュラーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号８−植物のミクロモナス・プシーラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎａｓ  ｐｕｓｉｌｌａ）Δ６−デサチュラーゼの発現のコドン最適化オープンリーディングフレーム。
配列番号９−ミクロモナス・プシーラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎａｓ  ｐｕｓｉｌｌａ）Δ６−デサチュラーゼ。
配列番号１０−オストレオコッカス・ルシマリヌス（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｃｉｍａｒｉｎｕｓ）Δ６−デサチュラーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号１１−植物のオストレオコッカス・ルシマリヌス（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｃｉｍａｒｉｎｕｓ）Δ６−デサチュラーゼの発現のコドン最適化オープンリーディングフレーム。
配列番号１２−オストレオコッカス・ルシマリヌス（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｃｉｍａｒｉｎｕｓ）Δ６−デサチュラーゼ。
配列番号１３−オストレオコッカス・タウリ（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ  ｔａｕｒｉ）Δ６−デサチュラーゼ。
配列番号１４−ピラミモナス・コルダタ（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ  ｃｏｒｄａｔａ）Δ６−エロンガーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号１５−植物のピラミモナス・コルダタ（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ  ｃｏｒｄａｔａ）Δ６−エロンガーゼの発現のコドン最適化オープンリーディングフレーム（３’末端で短縮化され、機能的エロンガーゼをコードする）。
配列番号１６−ピラミモナス・コルダタ（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ  ｃｏｒｄａｔａ）Δ６−デサチュラーゼ。
配列番号１７−短縮化ピラミモナス・コルダタ（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ  ｃｏｒｄａｔａ）Δ６−デサチュラーゼ。
配列番号１８−パブロバ・サリナ（Ｐａｖｌｏｖａ  ｓａｌｉｎａ）Δ５−デサチュラーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号１９−植物のパブロバ・サリナ（Ｐａｖｌｏｖａ  ｓａｌｉｎａ）Δ５−デサチュラーゼの発現のコドン最適化オープンリーディングフレーム。
配列番号２０−パブロバ・サリナ（Ｐａｖｌｏｖａ  ｓａｌｉｎａ）Δ５−デサチュラーゼ。
配列番号２１−ピラミモナス・コルダタ（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ  ｃｏｒｄａｔａ）Δ５−デサチュラーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号２２−ピラミモナス・コルダタ（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ  ｃｏｒｄａｔａ）Δ５−デサチュラーゼ。
配列番号２３−ピラミモナス・コルダタ（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ  ｃｏｒｄａｔａ）Δ５−エロンガーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号２４−植物のピラミモナス・コルダタ（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ  ｃｏｒｄａｔａ）Δ５−エロンガーゼの発現のコドン最適化オープンリーディングフレーム。
配列番号２５−ピラミモナス・コルダタ（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ  ｃｏｒｄａｔａ）Δ５−エロンガーゼ。
配列番号２６−パブロバ・サリナ（Ｐａｖｌｏｖａ  ｓａｌｉｎａ）Δ４−デサチュラーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号２７−植物のパブロバ・サリナ（Ｐａｖｌｏｖａ  ｓａｌｉｎａ）Δ４−デサチュラーゼの発現のコドン最適化オープンリーディングフレーム。
配列番号２８−パブロバ・サリナ（Ｐａｖｌｏｖａ  ｓａｌｉｎａ）Δ４−デサチュラーゼ。  
配列番号２９−イソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ）Δ９−エロンガーゼ。
配列番号３０−植物のエミリアニア・ハクスレイ（Ｅｍｉｌｉａｎｉａ  ｈｕｘｌｅｙｉ）Δ９−エロンガーゼの発現のコドン最適化オープンリーディングフレーム。
配列番号３１−エミリアニア・ハクスレイ（Ｅｍｉｌｉａｎｉａ  ｈｕｘｌｅｙｉ）ＣＣＭＰ１５１６Δ９−エロンガーゼ。
配列番号３２−パブロバ・サリナ（Ｐａｖｌｏｖａ  ｐｉｎｇｕｉｓ）Δ９−エロンガーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号３３−パブロバ・サリナ（Ｐａｖｌｏｖａ  ｐｉｎｇｕｉｓ）Δ９−エロンガーゼ。
配列番号３４−パブロバ・サリナ（Ｐａｖｌｏｖａ  ｓａｌｉｎａ）Δ９−エロンガーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号３５−パブロバ・サリナ（Ｐａｖｌｏｖａ  ｓａｌｉｎａ）Δ９−エロンガーゼ。
配列番号３６−パブロバ・サリナ（Ｐａｖｌｏｖａ  ｓａｌｉｎａ）Δ８−デサチュラーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号３７−パブロバ・サリナ（Ｐａｖｌｏｖａ  ｓａｌｉｎａ）Δ８−デサチュラーゼ。
配列番号３８−Ｖ２ウイルスサプレッサー。
配列番号３９−Ｖ２ウイルスサプレッサーをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号４０−シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ＬＰＡＡＴ２。
配列番号４１−リムナンテス・アルバ（Ｌｉｍｎａｎｔｈｅｓ  ａｌｂａ）ＬＰＡＡＴ。
配列番号４２−サッカロミセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＬＰＡＡＴ。
配列番号４３−ミクロモナス・プシーラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎａｓ  ｐｕｓｉｌｌａ）ＬＰＡＡＴ。
配列番号４４−モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）ＬＰＡＡＴ。
配列番号４５−セイヨウアブラナ（Ｂｒａｃｃｉｓａ  ｎａｐｕｓ）ＬＰＡＡＴ。
配列番号４６−セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）ＬＰＡＡＴ。
配列番号４７−フィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）ω３−デサチュラーゼ。
配列番号４８−タラシオシラ・シュードナナ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ）  ω３−デサチュラーゼ。
配列番号４９−ピシリウム・イレグラーレ（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ）ω３−デサチュラーゼ。
配列番号５０〜５８−オリゴヌクレオチドプライマー／プローブ。
【発明を実施するための形態】
【０１１２】
一般的方法及び定義
特に、別段の規定がない限り、本明細書で使用する全ての技術及び科学用語は、当業者（例えば、細胞培養、分子遺伝学、脂肪酸合成、トランスジェニック植物、組換え細胞、タンパク質化学、及び生化学）により共通に理解されるのと同じ意味を有すると解すべきである。
【０１１３】
別段の指示がない限り、本発明に利用するタンパク質、細胞培養、及び免疫技術は当業者に周知の標準的方法である。かかる技術を、Ｊ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  （１９８４），Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９），Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ（ｅｄｉｔｏｒ），Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １  ａｎｄ  ２，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９１），Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ  ａｎｄ  Ｂ．Ｄ．．Ｈａｍｅｓ  （ｅｄｉｔｏｒｓ），ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １−４，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９５  ａｎｄ  １９９６），Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｉｔｏｒｓ），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  （１９８８，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ａｌｌ  ｕｐｄａｔｅｓ  ｕｎｔｉｌ  ｐｒｅｓｅｎｔ），Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ  （ｅｄｉｔｏｒｓ），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８），ａｎｄ  Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｉｔｏｒｓ），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  （現在までの全最新版を含む）などの資料中の文献により記載し説明する。
【０１１４】
「及び／または」という語、例えば、「Ｘ及び／またはＹ」は、「Ｘ及びＹ」または「ＸまたはＹ」のいずれかを意味すると理解すべきであり、両方の意味またはどちらかの意味を明示的に支持すると解する。
【０１１５】
本明細書で使用するとき、「約」という語は、そうでないと言及されない限り、指示値の±１０％、より好ましくは、±５％、より好ましくは、±１％を表す
【０１１６】
本明細書を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、言及した要素、整数もしくは工程、または要素、整数もしくは工程の群を含むが、他の要素、整数もしくは工程、または要素、整数もしくは工程の群を除外しないことを意味すると理解されるだろう。
【０１１７】
選択された定義
本明細書で使用するとき、「抽出植物脂質」及び「単離植物脂質」という語は、例えば、植物または種子などのその部分から、例えば、圧搾により抽出された脂質組成物を表す。該抽出脂質は、例えば、植物種子の圧搾により得られた比較的粗製の組成物、または植物材料由来の水、核酸、タンパク質及び炭水化物の１つ以上または各々の、もし全部でなければ、ほとんどを取り除いたより純粋な組成物であり得る。精製方法の例を以下に記載する。実施形態では、抽出または単離植物脂質は、組成物の少なくとも約６０重量％、少なくとも約７０重量％、少なくとも約８０重量％、少なくとも約９０重量％、または少なくとも約９５重量％（ｗ／ｗ）の脂質を含む。脂質は、室温において、固体であっても液体であってもよく、液体の時、オイルであると見なされる。実施形態では、本発明の抽出脂質を、別原料（例えば、魚油のＤＰＡ）により産生されたＤＰＡなどの別の脂質と配合していない。実施形態では、抽出後、ＤＰＡに対するオレイン酸、ＤＰＡに対するパルミチン酸、ＤＰＡに対するリノレン酸、及び総ω６脂肪酸：総ω３脂肪酸の１つ以上または全ての比を、無処置の種子または細胞中の比と比較したとき、有意に変化しなかった（例えば、１０％または５％以下の変化）。別の実施形態では、抽出植物脂質を、無処置の種子または細胞中の比と比較したとき、ＤＰＡに対するオレイン酸、ＤＰＡに対するパルミチン酸、ＤＰＡに対するリノレン酸、及び総ω６脂肪酸：総ω３脂肪酸の１つ以上または全ての比を変化させ得る水素化または分取などの方法にさらさなかった。本発明の抽出植物脂質がオイル中に含まれるとき、該オイルは、ステロール類などの非脂肪酸分子をさらに含んでもよい。
【０１１８】
本明細書で使用するとき、「抽出植物オイル」及び「単離植物オイル」という語は、抽出植物脂質または単離植物脂質を含み、室温において液体である物質または組成物を表す。該オイルは、植物または種子などのその部分から得られる。該抽出または単離オイルは、例えば、植物種子の圧搾により得られた比較的粗製の組成物、または植物材料由来の水、核酸、タンパク質及び炭水化物の１つ以上または各々の、もし全部でなければ、ほとんどを取り除いたより純粋な組成物であり得る。該組成物は、脂質または非脂質であり得る他の成分を含んでもよい。実施形態では、該オイルは、少なくとも約６０重量％、少なくとも約７０重量％、少なくとも約８０重量％、少なくとも約９０重量％、または少なくとも約９５重量％（ｗ／ｗ）の抽出植物脂質を含む。実施形態では、本発明の抽出オイルを、別原料（例えば、魚油のＤＰＡ）により産生されたＤＰＡなどの別のオイルと配合していない。実施形態では、抽出後、ＤＰＡに対するオレイン酸、ＤＰＡに対するパルミチン酸、ＤＰＡに対するリノレン酸、及び総ω６脂肪酸：総ω３脂肪酸の１つ以上または全ての比を、無処置の種子または細胞中の比と比較したとき、有意に変化しなかった（例えば、１０％または５％以下の変化）。別の実施形態では、抽出植物オイルを、無処置の種子または細胞中の比と比較したとき、ＤＰＡに対するオレイン酸、ＤＰＡに対するパルミチン酸、ＤＰＡに対するリノレン酸、及び総ω６脂肪酸：総ω３脂肪酸の１つ以上または全ての比を変化させ得る水素化または分取などの方法にさらさなかった。本発明の抽出植物オイルは、ステロール類などの非脂肪酸分子を含んでもよい。
【０１１９】
本明細書で使用するとき、「抽出微生物脂質」または「抽出微生物オイル」などの語は、主に異なる点が脂質またはオイルの原料であることで、それぞれ、対応する語「抽出植物脂質」及び「抽出植物オイル」と類似の意味を有する。
【０１２０】
本明細書で使用するとき、「オイル」は、主に脂質を含み、室温において液体である組成物である。例えば、本発明のオイルは、好ましくは、少なくとも７５重量％、少なくとも８０重量％、少なくとも８５重量％または少なくとも９０重量％の脂質を含む。通常、精製オイルは、該オイル中脂質の少なくとも９０重量％のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）を含む。ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、リン脂質及びステロール類などのオイルの少量成分は、本明細書に記載のように存在し得る。
【０１２１】
本明細書で使用するとき、「脂肪酸」という語は、飽和あるいは不飽和の長鎖脂肪族末端をしばしば有するカルボン酸（または有機酸）を表す。通常、脂肪酸は、長さが少なくとも８個の炭素原子、より好ましくは、長さが少なくとも１２個の炭素の炭素−炭素結合鎖を有する。本発明の好ましい脂肪酸は、１８〜２２個の炭素原子（Ｃ１８、Ｃ２０、Ｃ２２脂肪酸）、より好ましくは、２０〜２２個の炭素原子（Ｃ２０、Ｃ２２）及び最も好ましくは、２２個の炭素原子（Ｃ２２）の炭素鎖を有する。ほとんどの天然脂肪酸は、その生合成が２個の炭素原子を有するアセテートを取り込むので、偶数の炭素原子を有する。脂肪酸は、遊離状態（非エステル化）またはトリグリセリド、ジアシルグリセリド、モノアシルグリセリド、アシル−ＣｏＡ（チオエステル）結合または他結合体の部分などのエステル化された形態であり得る。脂肪酸は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトールまたはジホスファチジルグリセロール体などのリン脂質としてエステル化され得る。実施形態では、脂肪酸は、例えば、Ｃ２０またはＣ２２ＰＵＦＡのメチルまたはエチルエステルなどのメチル基またはエチル基とエステル化される。好ましい脂肪酸は、ＥＰＡ、またはＤＰＡ、またはＥＰＡ、ＤＰＡ及びＤＨＡ、またはＥＰＡ及びＤＰＡのメチルまたはエチルエステルである。
【０１２２】
「飽和脂肪酸」は、鎖上に二重結合も他の官能基も含まない。「飽和」という語は、全ての炭素（カルボン酸［−ＣＯＯＨ］基は別として）が可能な限り多くの水素を含むという点において、水素を表す。言い換えれば、オメガ（ω）末端は、３個の水素（−ＣＨ３−）を含み、鎖内の各炭素は２個の水素（−ＣＨ２−）を含む。
【０１２３】
「不飽和脂肪酸」は、１つ以上のアルケン官能基が鎖上に存在し、各アルケンが鎖の一重結合「−ＣＨ２−ＣＨ２−」部分を二重結合「−ＣＨ＝ＣＨ−」部分（すなわち、別炭素と二重結合した炭素）により置換されていることを除いて、飽和脂肪酸と類似の形態である。二重結合のどちらかの側と結合している、鎖中の２つの隣接炭素原子は、ｃｉｓまたはｔｒａｎｓ配置、好ましくは、ｃｉｓ配置になることができる。実施形態では、脂質またはオイルまたは本発明は、１％未満のｔｒａｎｓ配置の炭素−炭素二重結合を有する脂肪酸（ｔｒａｎｓ脂肪酸）を含む脂肪酸組成物を有する。
【０１２４】
本明細書で使用するとき、「一価不飽和脂肪酸」という語は、その炭素鎖中少なくとも１２個の炭素原子及び鎖中１個のみのアルケン基（炭素−炭素二重結合）を含む脂肪酸を表す。本明細書で使用するとき、「多価不飽和脂肪酸」または「ＰＵＦＡ」という語は、その炭素鎖中少なくとも１２個の炭素原子及び鎖中少なくとも２個のアルケン基（炭素−炭素二重結合）を含む脂肪酸を表す。
【０１２５】
本明細書で使用するとき、「長鎖多価不飽和脂肪酸」または「ＬＣ−ＰＵＦＡ」という語は、その炭素鎖中少なくとも２０個の炭素原子及び鎖中少なくとも２個の炭素−炭素二重結合を含む脂肪酸を表し、それ故、ＶＬＣ−ＰＵＦＡを含む。本明細書で使用するとき、「超長鎖多価不飽和脂肪酸」または「ＶＬＣ−ＰＵＦＡ」という語は、その炭素鎖中少なくとも２２個の炭素原子及び鎖中少なくとも３個の炭素−炭素二重結合を含む脂肪酸を表す。通常、脂肪酸の炭素鎖中の炭素原子数は、分岐していない炭素鎖を表す。もし、炭素鎖が分岐しているならば、炭素原子数は、側鎖基のものを除外する。１つの実施形態では、長鎖多価不飽和脂肪酸は、ω３脂肪酸である、すなわち、該脂肪酸のメチル末端から３つ目の炭素−炭素結合において不飽和化（炭素−炭素二重結合）を有する。別の実施形態では、長鎖多価不飽和脂肪酸は、ω６脂肪酸である、すなわち、該脂肪酸のメチル末端から６つ目の炭素−炭素結合において不飽和化（炭素−炭素二重結合）を有する。さらなる実施形態では、長鎖多価不飽和脂肪酸は、アラキドン酸（ＡＲＡ、２０：４Δ５、８、１１、１４；ω６）、エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ、２０：４Δ８、１１、１４、１７；ω３）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、２０：５Δ５、８、１１、１４、１７；ω３）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ、２２：５Δ７、１０、１３、１６、１９；ω３）、またはドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、２２：６Δ４、７、１０、１３、１６、１９；ω３）から成る群から選択される。ＬＣ−ＰＵＦＡは、ジホモ−γ−リノール酸（ＤＧＬＡ）またはエイコサトリエン酸（ＥＴｒＡ、２０：３Δ１１、１４、１７；ω３）であってもよい。本発明に従って産生されるＬＣ−ＰＵＦＡは、上記のいずれかまたは全ての混合物であってよく、他のＬＣ−ＰＵＦＡまたはこれらのＬＣ−ＰＵＦＡのいずれかの誘導体を含んでもよいことは、容易に分かるだろう。好ましい実施形態では、ω３脂肪酸は、少なくともＤＰＡ、またはＤＰＡ及びＤＨＡ、またはＥＰＡ、ＤＰＡ及びＤＨＡ、またはＥＰＡ及びＤＰＡである。実施形態では、ＤＰＡは、総脂肪酸組成物の約７％から３０％または３５％の間のレベルで存在し、ＤＨＡは存在しないか、もし存在するならば、２．０％未満、好ましくは１．０％未満、より好ましくは０．５％未満のレベルで存在し、最も好ましくは、存在しないか検出不可である。これは、細胞内にΔ４−デサチュラーゼが存在しないことにより達成され得る。実施形態では、ＤＰＡレベルは、ＥＰＡレベルより多く、より好ましくは、ＥＰＡ及びＤＨＡの各々のレベルより多く、最も好ましくは、ＥＰＡ及びＤＨＡを合わせたレベルより多い。この実施形態では、ＤＨＡは、存在しなくてよく、もし存在するならば、総脂肪酸組成物の０．５％未満のレベルで存在する。
【０１２６】
さらに、本明細書で使用するとき、「長鎖多価不飽和脂肪酸」（ＬＣ−ＰＵＦＡ）及び「超長鎖多価不飽和脂肪酸」（ＶＬＣ−ＰＵＦＡ）は、遊離状態（非エステル化）またはトリグリセリド（トリアシルグリセロール）、ジアシルグリセリド、モノアシルグリセリド、アシル−ＣｏＡ結合または他結合体の部分などのエステル化された形態である脂肪酸を表す。トリグリセリドでは、ＤＰＡなどのＬＣ−ＰＵＦＡまたはＶＬＣ−ＰＵＦＡは、ｓｎ−１／３位またはｓｎ−２位においてエステル化されていてもよく、または該トリグリセリドは、ＬＣ−ＰＵＦＡ及びＶＬＣ−ＰＵＦＡアシル基から選択される２つまたは３つのアシル基を含んでもよい。例えば、トリグリセリドは、ｓｎ−１位及びｓｎ−３位の両方において、ＤＰＡを含んでもよい。脂肪酸は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトールまたはジホスファチジルグリセロール体などのリン脂質としてエステル化され得る。このように、ＬＣ−ＰＵＦＡは、細胞の脂質または細胞、組織または生物から抽出した精製オイルもしくは脂質の形態の混合物として存在し得る。好ましい実施形態では、本発明は、ＬＣ−ＰＵＦＡを含む少なくとも前記トリアシルグリセロールを含む、言及したものなどの脂質の他の形態として存在する残部と、少なくとも７５％または少なくとも８５％のトリアシルグリセロールを含むオイルを提供する。オイルは、引き続き、例えば、強塩基を用いて加水分解して遊離脂肪酸を遊離することにより、またはエステル交換、蒸留などにより、さらに精製または処理してもよい。
【０１２７】
本明細書で使用するとき、「総ω６脂肪酸」または「総ω６脂肪酸含有率」などは、状況に応じて、該総脂肪酸含有物のパーセントとして表され、抽出脂質、オイル、組換え細胞、植物部分または種子中のエステル化された、及びエステル化されていない全てのω６脂肪酸の総和を表す。これらのω６脂肪酸は、（もし存在するならば）ＬＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＤＡ及びω６−ＤＰＡを含み、ω３脂肪酸及び一価不飽和脂肪酸を含まない。本発明の植物、種子またはオイル中に存在するω６脂肪酸は、全て、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の分類に含まれる。
【０１２８】
本明細書で使用するとき、「新ω６脂肪酸」または「新ω６脂肪酸含有率」などは、状況に応じて、該総脂肪酸含有物のパーセントとして表され、抽出脂質、オイル、組換え細胞、植物部分または種子中のエステル化された、及びエステル化されていない、ＬＡを除いた全てのω６脂肪酸の総和を表す。これらの新ω６脂肪酸は、細胞中に導入された遺伝子構築物（外来性ポリヌクレオチド）の発現により、本発明の細胞、植物、植物部分及び種子内で産生された脂肪酸であり、（もし存在するならば）ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＤＡ及びω６−ＤＰＡを含むが、ＬＡ及びω３脂肪酸及び一価不飽和脂肪酸を含まない。実例となる総ω６脂肪酸含有率及び新ω６脂肪酸含有率を、実施例１に記載のように、試料中の脂肪酸をＦＡＭＥに転換して、ＧＣにより分析することによって決定する。
【０１２９】
本明細書で使用するとき、「総ω３脂肪酸」または「総ω３脂肪酸含有率」などは、状況に応じて、該総脂肪酸含有物のパーセントとして表され、抽出脂質、オイル、組換え細胞、植物部分または種子中のエステル化された、及びエステル化されていない全てのω３脂肪酸の総和を表す。これらのω３脂肪酸は、（もし存在するならば）ＡＬＡ、ＳＤＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ及びＤＨＡを含み、ω６脂肪酸及び一価不飽和脂肪酸を含まない。本発明の植物、種子またはオイル中に存在するω３脂肪酸は、全て、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の分類に含まれる。
【０１３０】
本明細書で使用するとき、「新ω３脂肪酸」または「新ω３脂肪酸含有率」などは、状況に応じて、該総脂肪酸含有物のパーセントとして表され、抽出脂質、オイル、組換え細胞、植物部分または種子中のエステル化された、及びエステル化されていない、ＡＬＡを除いた全てのω３脂肪酸の総和を表す。これらの新ω３脂肪酸は、細胞中に導入された遺伝子構築物（外来性ポリヌクレオチド）の発現により、本発明の細胞、植物、植物部分及び種子内で産生されたω３脂肪酸であり、（もし存在するならば）ＳＤＡ、ＥｔｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ及びＤＨＡを含むが、ＡＬＡ及びω６脂肪酸及び一価不飽和脂肪酸を含まない。実例となる総ω３脂肪酸含有率及び新ω３脂肪酸含有率を、実施例１に記載のように、試料中の脂肪酸をＦＡＭＥに転換して、ＧＣにより分析することによって決定する。
【０１３１】
当業者が認識する通り、本発明の方法の工程として「植物部分を得ること」は、該方法用途の１つ以上の植物部分を得ることを含み得る。植物部分を得ることは、機械的収穫機を用いて、または植物部分を購入、または供給者から植物部分を受け取るなどの植物からの植物部分を収穫することを含む。別の例では、植物部分を得ることは、植物部分を収穫した誰か他の者から植物を取得することであってよい。
【０１３２】
本発明で使用され得る、デサチュラーゼ、エロンガーゼ並びにアシルトランスフェラーゼタンパク質及びそれをコードする遺伝子は、当技術分野で公知のもの、またはそのホモログもしくは誘導体のいずれかである。かかる遺伝子及びコードされたタンパク質サイズの例を、表１にリストする。ＬＣ−ＰＵＦＡ生合成に関与することが分かっているデサチュラーゼ酵素は全て、いわゆる「フロントエンド」デサチュラーゼの群に属する。好ましいタンパク質、またはタンパク質の組合せは、  本明細書で提供された配列番号１及び２の遺伝子構築物によりコードされたものである。
【０１３３】
本明細書で使用するとき、「フロントエンドデサチュラーゼ」という語は、３つの高度に保存されたヒスチジンボックスを含む典型的な脂肪酸デサチュラーゼドメインと共に、Ｎ−末端チトクロームｂ５ドメインの存在により、構造的に特徴付けられる、脂質のアシル鎖のカルボン酸基と既存の不飽和部分との間に二重結合を導入する酵素分類のメンバーを表す（Ｎａｐｉｅｒら、１９９７）。
【０１３４】
本発明に使用するためのいずれかのエロンガーゼまたはデサチュラーゼの活性を、例えば、植物細胞などの細胞内、または好ましくは、体細胞胚もしくはトランスジェニック植物内で、該酵素をコードする遺伝子を発現し、該細胞、胚または植物が該酵素を発現しない同等の細胞、胚または植物と比較して、ＬＣ−ＰＵＦＡを産生する能力の増強を有するかどうかを決定することにより試験し得る。
【０１３５】
１つの実施形態では、本発明に使用するための１つ以上のデサチュラーゼ及び／またはエロンガーゼを、微細藻類から精製できる、すなわち、微細藻類から精製できるポリペプチドとアミノ酸配列が同一である。
【０１３６】
特定の酵素を本明細書で、「二元機能性」と具体的に説明している一方、そうような語がないからといって、必ずしも、特定の酵素が具体的に定義された以外の活性を有しないと意味するわけではない。
【表１】
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本明細書で使用するとき、「デサチュラーゼ」という語は、例えば、アシル−ＣｏＡエステルなどの通常エステル化された形態の脂肪酸基質のアシル基に炭素−炭素二重結合を導入可能な酵素を表す。アシル基を、ホスファチジルコリン（ＰＣ）などのリン脂質に、またはアシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）に、または好ましい実施形態では、ＣｏＡにエステル化してもよい。デサチュラーゼは、それによって、３つの群に通常分類され得る。１つの実施形態では、デサチュラーゼは、フロントエンドデサチュラーゼである。
【０１３７】
本明細書で使用するとき、「Δ４−デサチュラーゼ」は、脂肪酸基質のカルボン酸末端から４番目の炭素−炭素結合に炭素−炭素二重結合を導入するデサチュラーゼ反応を行うタンパク質を表す。「Δ４−デサチュラーゼ」は、少なくとも、ＤＰＡをＤＨＡに転換可能である。好ましくは、「Δ４−デサチュラーゼ」は、少なくとも、ＤＰＡ−ＣｏＡをＤＨＡ−ＣｏＡに転換可能である、すなわち、アシル−ＣｏＡデサチュラーゼである。実施形態では、「Δ４−デサチュラーゼ」は、ＰＣのｓｎ−２位においてエステル化されたＤＰＡを、ＤＨＡ−ＰＣに転換可能である。好ましくは、Δ４−デサチュラーゼは、ＤＰＡ−ＰＣに対してより、ＤＰＡ−ＣｏＡに対して大きな活性を有する。ＤＰＡからＤＨＡを産生する不飽和化工程は、哺乳類以外の生物内のΔ４−デサチュラーゼにより触媒され、この酵素をコードする遺伝子は、淡水原生生物種ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）及び海産種スラウストキトリウム属（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）から単離された（Ｑｉｕら、２００１；Ｍｅｙｅｒら、２００３）。１つの実施形態では、Δ４−デサチュラーゼは、配列番号２８の配列をを有するアミノ酸、またはスラウストキトリウム属（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）Δ４−デサチュラーゼ、その生物活性フラグメント、または配列番号２８と少なくとも８０％同一なアミノ酸配列を含む。実施形態では、総抽出可能脂肪酸含有物の５％〜３５％がＤＰＡであるような高レベルのＤＰＡを産生する、本発明の、または本発明で使用される植物、植物部分（種子など）または細胞は、機能的Δ４−デサチュラーゼをコードする遺伝子を含まない。
【０１３８】
本明細書で使用するとき、「Δ５−デサチュラーゼ」は、脂肪酸基質のカルボン酸末端から５番目の炭素−炭素結合に炭素−炭素二重結合を導入するデサチュラーゼ反応を行うタンパク質を表す。実施形態では、脂肪酸基質はＥＴＡであり、該酵素はＥＰＡを産生する。好ましくは、「Δ５−デサチュラーゼ」は、ＥＴＡ−ＣｏＡをＥＰＡ−ＣｏＡに転換可能である、すなわち、アシル−ＣｏＡデサチュラーゼである。実施形態では、「Δ５−デサチュラーゼ」は、ＰＣのｓｎ−２位においてエステル化されたＥＴＡを転換可能である。好ましくは、Δ５−デサチュラーゼは、ＥＴＡ−ＰＣに対してより、ＥＴＡ−ＣｏＡに対して大きな活性を有する。Δ５−デサチュラーゼの例は、Ｒｕｉｚ−Ｌｏｐｅｚら（２０１２）及びＰｅｔｒｉｅら（２０１０ａ）及び本明細書の表１にリストされている。１つの実施形態では、Δ５−デサチュラーゼは、配列番号２０の配列を有するアミノ酸、その生物活性フラグメント、または配列番号２０と少なくとも８０％同一なアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、Δ５−デサチュラーゼは、配列番号２２の配列を有するアミノ酸、その生物活性フラグメント、または配列番号２２と少なくとも５３％同一なアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、Δ５−デサチュラーゼは、スラウストキトリウム属（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）またはエミリアニア・ハクスレイ（Ｅｍｉｌｉａｎｉａ  ｈｕｘｌｅｙｉ）由来である。
【０１３９】
本明細書で使用するとき、「Δ６−デサチュラーゼ」は、脂肪酸基質のカルボン酸末端から６番目の炭素−炭素結合に炭素−炭素二重結合を導入するデサチュラーゼ反応を行うタンパク質を表す。実施形態では、脂肪酸基質はＡＬＡであり、該酵素はＳＤＡを産生する。好ましくは、「Δ６−デサチュラーゼ」は、ＡＬＡ−ＣｏＡをＳＤＡ−ＣｏＡに転換可能である、すなわち、アシル−ＣｏＡデサチュラーゼである。実施形態では、「Δ６−デサチュラーゼ」は、ＰＣのｓｎ−２位においてエステル化されたＡＬＡを転換可能である。好ましくは、Δ６−デサチュラーゼは、ＡＬＡ−ＰＣに対してより、ＡＬＡ−ＣｏＡに対して大きな活性を有する。Δ６−デサチュラーゼは、Δ５−デサチュラーゼとしての活性も有し得、ＥＴＡに対するΔ５−デサチュラーゼ活性より、大きなＡＬＡに対するΔ６−デサチュラーゼ活性を有する限り、Δ５／Δ６−二元機能性デサチュラーゼと呼ばれる。Δ６−デサチュラーゼの例は、Ｒｕｉｚ−Ｌｏｐｅｚら（２０１２）及びＰｅｔｒｉｅら（２０１０ａ）及び本明細書の表１にリストされている。好ましいΔ６−デサチュラーゼは、ミクロモナス・プシラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎａｓ  ｐｕｓｉｌｌａ）、ピシウム・イレグラレ（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ）またはオストレオコッカス・タウリ（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ  ｔａｕｒｉｉ）由来である。
【０１４０】
実施形態では、Δ６−デサチュラーゼは、以下：ｉ）脂肪酸基質として、リノール酸（ＬＡ、１８：２Δ９，１２，，ω６）よりα−リノレン酸（ＡＬＡ、１８：３Δ９，１２，１５，ω３）に対して大きなΔ６デサチュラーゼ活性；ｉｉ）脂肪酸基質としてＰＣのｓｎ−２位と結合したＡＬＡに対してより、脂肪酸基質としてＡＬＡ−ＣｏＡに対して大きなΔ６−デサチュラーゼ活性；及びｉｉｉ）ＥＴｒＡに対するΔ８−デサチュラーゼ活性のうち少なくとも２つ、好ましくは３つ全て、及び好ましくは植物細胞内で、有することによりさらに特徴付けられる。そのようなΔ６−デサチュラーゼを表２に示す。
【０１４１】
実施形態では、Δ６−デサチュラーゼは、対応するω６基質より、ω３基質に対して高い活性を有し、植物細胞などの組換え細胞内の外来性ポリヌクレオチドから発現されるとき、少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、もしくは最も好ましくは少なくとも５０％、または酵母細胞内で発現されるとき、少なくとも３５％の効率で、ＡＬＡに対して、オクタデカテトラエン酸（ステアリドン酸、ＳＤＡ、１８：４Δ６，９，１２，１５，ω３）を産生する活性をＡＬＡに対して有する。１つの実施形態では、Δ６−デサチュラーゼは、脂肪酸基質としてＬＡより、ＡＬＡに対して高い活性、例えば、少なくとも約２倍高いΔ６−デサチュラーゼ活性を有する。別の実施形態では、Δ６−デサチュラーゼは、脂肪酸基質としてＰＣのｓｎ−２位と結合したＡＬＡに対してより、脂肪酸基質としてＡＬＡ−ＣｏＡに対して高い活性、例えば、少なくとも約５倍高いΔ６−デサチュラーゼ活性または少なくとも約１０倍高い活性を有する。さらなる実施形態では、Δ６−デサチュラーゼは、ＰＣのｓｎ−２位と結合した脂肪酸基質ＡＬＡ−ＣｏＡ及びＡＬＡの両方に対して活性を有する。
【表２】
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【０１４２】
１つの実施形態では、Δ６−デサチュラーゼは、ＥＴＡに対して、検出可能なΔ５−デサチュラーゼ活性を有しない。別の実施形態では、Δ６−デサチュラーゼは、配列番号９、配列番号１２または配列番号１３の配列を有するアミノ酸、その生物活性フラグメント、または配列番号９、配列番号１２または配列番号１３と少なくとも７７％同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、Δ６−デサチュラーゼは、配列番号１２または配列番号１３の配列を有するアミノ酸、その生物活性フラグメント、または配列番号１２または配列番号１３の１つまたは両方と少なくとも６７％同一であるアミノ酸配列を含む。Δ６−デサチュラーゼは、Δ８−デサチュラーゼ活性も有し得る。
【０１４３】
本明細書で使用するとき、「Δ８−デサチュラーゼ」は、脂肪酸基質のカルボン酸末端から８番目の炭素−炭素結合に炭素−炭素二重結合を導入するデサチュラーゼ反応を行うタンパク質を表す。Δ８−デサチュラーゼは、少なくとも、ＥＴｒＡをＥＴＡに転換可能である。好ましくは、Δ８−デサチュラーゼは、ＥＴｒＡ−ＣｏＡをＥＴＡ−ＣｏＡに転換可能である、すなわち、アシル−ＣｏＡデサチュラーゼである。実施形態では、Δ８−デサチュラーゼは、ＰＣのｓｎ−２位においてエステル化されたＥＴｒＡを転換可能である。好ましくは、Δ８−デサチュラーゼは、ＥｔｒＡ−ＰＣに対してより、ＥＴｒＡ−ＣｏＡに対して大きな活性を有する。Δ８−デサチュラーゼは、Δ６−デサチュラーゼとしての活性も有し得、ＡＬＡに対するΔ６−デサチュラーゼ活性より、大きなＥＴｒＡに対するΔ８−デサチュラーゼ活性を有する限り、Δ６／Δ８二元機能性デサチュラーゼと呼ばれる。Δ８−デサチュラーゼの例を、表１にリストする。１つ実施形態では、Δ８−デサチュラーゼは、配列番号３７の配列を有するアミノ酸、その生物活性フラグメント、または配列番号３７と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１４４】
本明細書で使用するとき、「ω３−デサチュラーゼ」は、脂肪酸基質のメチル末端から３番目の炭素−炭素結合に炭素−炭素二重結合を導入するデサチュラーゼ反応を行うタンパク質を表す。従って、ω３−デサチュラーゼは、ＬＡをＡＬＡに、ＧＬＡをＳＤＡ（全てＣ１８脂肪酸）、またはＤＧＬＡをＥＴＡに、及び／またはＡＲＡをＥＰＡ（Ｃ２０脂肪酸）に転換し得る。いくつかのω３−デサチュラーゼ（グループＩ）は、植物及びシアノバクテリアω３−デサチュラーゼなどのＣ１８基質に対してのみ活性を有する。そのようなω３−デサチュラーゼは、Δ１５−デサチュラーゼでもある。他のω３−デサチュラーゼは、Ｃ１８基質に対して活性を有しない（グループＩＩ）または活性有して（グループＩＩＩ）、Ｃ２０基質に対する活性を有する。そのようなω３−デサチュラーゼは、Δ１７−デサチュラーゼでもある。好ましいω３−デサチュラーゼは、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ω３−デサチュラーゼ（配列番号６）など、ＬＡをＡＬＡに、ＧＬＡをＳＤＡに、ＤＧＬＡをＥＴＡに、及びＡＲＡをＥＰＡに転換するグループＩＩＩ型である。ω３−デサチュラーゼの例としては、Ｐｅｒｅｉｒａら（２００４ａ）（サプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ）ω３−デサチュラーゼ、グループＩＩ）、Ｈｏｒｉｇｕｃｈｉら（１９９８）、Ｂｅｒｂｅｒｉｃｈら（１９９８）及びＳｐｙｃｈａｌｌａら（１９９７）（カエノラブディティス・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）ω３−デサチュラーゼ、グループＩＩＩ）により記載されたものが挙げられる。好ましい実施形態では、ω３−デサチュラーゼは、真菌ω３−デサチュラーゼである。本明細書で使用するとき、「真菌ω３−デサチュラーゼ」は、卵菌起源、またはアミノ酸配列が少なくとも９５％同一であるその変異体を含む真菌起源由来のω３−デサチュラーゼを表す。多数のω３−デサチュラーゼをコードする遺伝子は、例えば、フィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）（受託番号ＣＡＪ３０８７０、ＷＯ２００５０８３０５３；配列番号４７）、サプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ）（受託番号ＡＡＲ２０４４４、Ｐｅｒｅｉｒａら、２００４ａ及びＵＳ７２１１６５６）、ピシウム・イレグラレ（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ）（ＷＯ２００８０２２９６３、グループＩＩ；配列番号４９）、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）（Ｓａｋｕｒａｄａｎｉら、２００５；受託番号ＢＡＤ９１４９５；ＷＯ２００６０１９１９２）、タラッシオシラ・シュードナナ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ）（Ａｒｍｂｒｕｓｔら、２００４；受託番号ＸＰ＿００２２９１０５７；ＷＯ２００５０１２３１６、配列番号４８）、ラカンセア・クルイベリ（Ｌａｃｈａｎｃｅａ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）（サッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）としても公知；Ｏｕｒａら、２００４；受託番号ＡＢ１１８６６３）など、真菌起源から単離された。Ｘｕｅら（２０１２）は、Ｃ２０基質を好んで、ω６脂肪酸基質を、対応するω３脂肪酸に効率的に転換できる卵菌ピシウム・アファニデルマータム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）、フィトフトラ・ソジャエ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅ）、及びフィトフトラ・ラモルム（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｒａｍｏｒｕｍ）由来のω３−デサチュラーゼを記載しており、すなわち、それらは、Δ１５−デサチュラーゼ活性より、強力なΔ１７−デサチュラーゼ活性を有した。これらの酵素は、Δ１２−デサチュラーゼ活性がないが、基質として、アシル−ＣｏＡ及びリン脂質画分の両方の脂肪酸を使用できる。
【０１４５】
より好ましい実施形態では、真菌ω３−デサチュラーゼは、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ω３−デサチュラーゼ／Δ１５−デサチュラーゼ（Ｚｈａｎｇら、２００８；受託番号ＥＦ１１６８８４；配列番号６）、または少なくとも９５％同一であるポリペプチドである。
【０１４６】
実施形態では、ω３−デサチュラーゼは、ＡＲＡからＥＰＡ、ＤＧＬＡからＥＴＡ、ＧＬＡからＳＤＡ、ＡＲＡからＥＰＡとＤＧＬＡからＥＴＡの両方、ＡＲＡからＥＰＡとＧＬＡからＳＤＡの両方、またはこれら３つ全てのうち１つの転換を少なくとも可能である。
【０１４７】
１つの実施形態では、ω３−デサチュラーゼは、少なくとも３つの炭素−炭素二重結合を有するＣ２０脂肪酸、好ましくはＡＲＡに対するΔ１７−デサチュラーゼ活性を有する。別の実施形態では、ω３−デサチュラーゼは、３つの炭素−炭素二重結合を有するＣ１８脂肪酸、好ましくはＧＬＡに対するΔ１５−デサチュラーゼ活性を有する。好ましくは、両方の活性が存在する。
【０１４８】
本明細書で使用するとき、「Δ１２−デサチュラーゼ」は、脂肪酸基質のカルボン酸末端から１２番目の炭素−炭素結合に炭素−炭素二重結合を導入するデサチュラーゼ反応を行うタンパク質を表す。Δ１２−デサチュラーゼは、通常、オレオイル−ホスファチジルコリンまたはオレオイル−ＣｏＡのいずれかを、それぞれ、リノレオイル−ホスファチジルコリン（１８：１−ＰＣ）またはリノレオイル−ＣｏＡ（１８：１−ＣｏＡ）に転換する。ＰＣ結合基質を使用するサブクラスは、リン脂質依存性Δ１２−デサチュラーゼと呼ばれ、後者のサブクラスは、アシル−ＣｏＡ依存性Δ１２−デサチュラーゼと呼ばれる。植物及び真菌Δ１２−デサチュラーゼは、概して、前者のサブクラスであり、一方、動物Δ１２−デサチュラーゼは、後者のサブクラスであり、例えば、Ｚｈｏｕら（２００８）による、昆虫からクローンした遺伝子によりコードされたΔ１２−デサチュラーゼがある。多くの他のΔ１２−デサチュラーゼ配列を、配列データベースの検索により容易に同定できる。
【０１４９】
本明細書で使用するとき、「Δ１５−デサチュラーゼ」は、脂肪酸基質のカルボン酸末端から１５番目の炭素−炭素結合に炭素−炭素二重結合を導入するデサチュラーゼ反応を行うタンパク質を表す。Δ１５−デサチュラーゼをコードする多数の遺伝子は、植物及び真菌種からクローンされた。例えば、ＵＳ５９５２５４４は、植物Δ１５−デサチュラーゼをコードする核酸について記載している（ＦＡＤ３）。これらの酵素は、植物Δ１５−デサチュラーゼの特徴であったアミノ酸モチーフを含む。ＷＯ２００１１４５３８は、ダイズＦＡＤ３をコードする遺伝子について記載している。多くの他のΔ１５−デサチュラーゼ配列を、配列データベースの検索により容易に同定できる。
【０１５０】
本明細書で使用するとき、「Δ１７−デサチュラーゼ」は、脂肪酸基質のカルボン酸末端から１７番目の炭素−炭素結合に炭素−炭素二重結合を導入するデサチュラーゼ反応を行うタンパク質を表す。Δ１７−デサチュラーゼは、もし、Ｃ２０基質に作用してω３結合に不飽和化を導入するならば、ω３−デサチュラーゼとも見なされる。
【０１５１】
好ましい実施形態では、Δ１２−デサチュラーゼ及び／またはΔ１５−デサチュラーゼは、真菌Δ１２−デサチュラーゼまたは真菌Δ１５−デサチュラーゼである。本明細書で使用するとき、「真菌Δ１２−デサチュラーゼ」または「真菌Δ１５−デサチュラーゼ」は、卵菌起源を含む真菌起源、またはそのアミノ酸配列が少なくとも９５％同一である変異体由来であるΔ１２−デサチュラーゼまたはΔ１５−デサチュラーゼを表す。多数のデサチュラーゼをコードする遺伝子は、真菌起源から単離された。ＵＳ７２１１６５６は、サプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ）のΔ１２−デサチュラーゼについて記載している。ＷＯ２００９０１６２０２は、Ｈｅｌｏｂｄｅｌｌａ  ｒｏｂｕｓｔａ、Ｌａｃｃａｒｉａ  ｂｉｃｏｌｏｒ、Ｌｏｔｔｉａ  ｇｉｇａｎｔｅａ、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ  ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ、Ｍｏｎｏｓｉｇａ  ｂｒｅｖｉｃｏｌｌｉｓ、Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ  ｆｉｊｉｅｎｓｉｓ、Ｍｙｃｏｓｐａｅｒｅｌｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ、Ｎａｅｇｌｅｒｉａ  ｇｒｕｂｅｎ、Ｎｅｃｔｒｉａ  ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃａ、Ｎｅｍａｔｏｓｔｅｌｌａ  ｖｅｃｔｅｎｓｉｓ、Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ  ｂｌａｋｅｓｌｅｅａｎｕｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｓｉｉ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ、Ｐｏｓｔｉａ  ｐｌａｃｅｎｔａ、Ｓｅｌａｇｉｎｅｌｌａ  ｍｏｅｌｌｅｎｄｏｒｆｆｉｉ及びＭｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ  ｎｉｖａｌｅの真菌デサチュラーゼについて記載している。ＷＯ２００５／０１２３１６は、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ及び他の真菌のΔ１２−デサチュラーゼについて記載している。ＷＯ２００３／０９９２１６は、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ及びＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａから単離された真菌Δ１２−デサチュラーゼ及びΔ１５−デサチュラーゼをコードする遺伝子について記載している。ＷＯ２００７１３３４２５は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ及びＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａから単離された真菌Δ１５−デサチュラーゼについて記載している。好ましいΔ１２−デサチュラーゼは、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅ由来のものである（Ｒｕｉｚ−Ｌｏｐｅｚら、２０１２）。
【０１５２】
真菌Δ１２−デサチュラーゼ、及び真菌Δ１５−デサチュラーゼの別のサブクラスは、二元機能性真菌Δ１２／Δ１５−デサチュラーゼである。これらをコードする遺伝子は、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｏｌｉｆｏｒｍｅ（受託番号ＤＱ２７２５１６、Ｄａｍｕｄｅら、２００６）、アカントアメーバ・カステラーニ（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ  ｃａｓｔｅｌｌａｎｉｉ）（受託番号ＥＦ０１７６５６、Ｓａｙａｎｏｖａら、２００６）、パーキンサス・マリヌス（Ｐｅｒｋｉｎｓｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ）（ＷＯ２００７０４２５１０）、クラビセプス・プルプレア（Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ  ｐｕｒｐｕｒｅａ）（受託番号ＥＦ５３６８９８、Ｍｅｅｓａｐｙｏｄｓｕｋら、２００７）及びコプリナス・シネレウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｃｉｎｅｒｅｕｓ）（受託番号ＡＦ２６９２６６、Ｚｈａｎｇら、２００７）からクローンされた。
【０１５３】
別の実施形態では、ω３−デサチュラーゼは、少なくともいくらかの活性を有し、好ましくは、対応するアシル−ＰＣ基質より、アシル−ＣｏＡ基質に対して大きな活性を有する。本明細書で使用するとき、「対応するアシル−ＰＣ基質」は、脂肪酸が該アシル−ＣｏＡ基質中と同じ脂肪酸であるホスファチジルコリン（ＰＣ）のｓｎ−２位においてエステル化された脂肪酸を表す。例えば、アシル−ＣｏＡ基質は、ＡＲＡ−ＣｏＡであってよく、対応するアシル−ＰＣ基質はｓｎ−２ＡＲＡ−ＰＣである。実施形態では、活性は、少なくとも２倍大きい。好ましくは、ω３−デサチュラーゼは、アシル−ＣｏＡ基質とその対応するアシル−ＰＣ基質との両方に対して少なくともいくらかの活性を有し、Ｃ１８とＣ２０基質の両方に対して活性を有する。そのようなω３−デサチュラーゼの例は、上記クローンされた真菌デサチュラーゼの中で公知である。
【０１５４】
さらなる実施形態では、ω３−デサチュラーゼは、配列番号６の配列を有するアミノ酸、その生物活性フラグメント、または配列番号６と少なくとも６０％同一である、好ましくは、配列番号６と少なくとも９０％または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１５５】
その上、さらになる実施形態では、本発明で使用するためのデサチュラーゼは、対応するアシル−ＰＣ基質より、アシル−ＣｏＡ基質に対して大きな活性を有する。別の実施形態では、本発明で使用するためのデサチュラーゼは、対応するアシル−ＣｏＡ基質より、アシル−ＰＣ基質に対して大きな活性を有するが、両方の基質に対していくらかの活性を有する。上記のように、「対応するアシル−ＰＣ基質」は、脂肪酸が該アシル−ＣｏＡ基質中と同じ脂肪酸であるホスファチジルコリン（ＰＣ）のｓｎ−２位においてエステル化された脂肪酸を表す。実施形態では、該より大きな活性は、少なくとも２倍の大きさである。実施形態では、デサチュラーゼは、Δ５もしくはΔ６−デサチュラーゼ、またはω３−デサチュラーゼであり、この例は、これに限定されないが、表２にリストしたものである。デサチュラーゼがどの基質に対して作用するか、例えば、アシル−ＣｏＡまたはアシル−ＰＣ基質についてテストするため、Ｄｏｍｅｒｇｕｅら（２００３及び２００５）に記載の酵母細胞内で、アッセイを実行できる。デサチュラーゼと一緒に発現される際、エロンガーゼが該デサチュラーゼの産生の伸長を触媒する場合に、該エロンガーゼが少なくとも約９０％の植物細胞内酵素転換効率を有するとき、該デサチュラーゼに対するアシル−ＣｏＡ基質の能力も推測できる。これの基づき、ＧＡ７構築物（実施例２、図２及び配列番号１を参照のこと）及びその変異体（実施例３）から発現されたΔ５−デサチュラーゼ及びΔ４−デサチュラーゼは、それらのそれぞれのアシル−ＣｏＡ基質、ＥＴＡ−ＣｏＡ及びＤＰＡ−ＣｏＡを不飽和化可能である。
【０１５６】
エロンガーゼ
脂肪酸伸長が４工程：縮合反応、還元反応、脱水反応及び第二還元反応から成ることは生化学的証拠が示唆している。本発明に関連して、「エロンガーゼ」は、適切な生理条件下、伸長複合体の他のメンバーの存在で、縮合工程を触媒するポリペプチドを表す。伸長タンパク質複合体の縮合成分（「エロンガーゼ」）のみの細胞内非相同発現または相同的発現は、それぞれのアシル鎖の伸長に必要であることが分かっている。このように、導入されたエロンガーゼは、トランスジェニック宿主から還元及び脱水活性を首尾良く補充でき、アシル伸長を上手く実行する。脂肪酸基質の鎖長及び不飽和度に対する伸長反応の特異性は、縮合成分に属すると考えられる。この成分は、伸長反応に律速であるとも考えられる。
【０１５７】
本明細書で使用するとき、「Δ５−エロンガーゼ」は、ＥＰＡをＤＰＡに少なくとも転換可能である。Δ５−エロンガーゼの例としては、ＷＯ２００５／１０３２５３に開示されたものが挙げられる。１つの実施形態では、Δ５−エロンガーゼは、ＥＰＡに対して、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも８０％または９０％の効率でＤＰＡを産生する活性を有する。さらなる実施形態では、Δ５−エロンガーゼは、配列番号２５のアミノ酸配列、その生物活性フラグメント、または配列番号２５と少なくとも４７％同一であるアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、Δ６−エロンガーゼは、オストレオコッカス・タウリ（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ  ｔａｕｒｉｉ）またはオストレオコッカス  ・ルシマリヌス（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｃｉｍａｒｉｎｕｓ）由来である（ＵＳ２０１０／０８８７７６）。
【０１５８】
本明細書で使用するとき、「Δ６−エロンガーゼ」は、ＳＤＡをＥＴＡに少なくとも転換可能である。Δ６−エロンガーゼの例としては、表１にリストしたものが挙げられる。１つの実施形態では、Δ６−エロンガーゼは、配列番号１６の配列を有するアミノ酸、その生物活性フラグメント（配列番号１７のフラグメントなど）、または配列番号１６または配列番号１７の１つまたは両方と少なくとも５５％同一であるアミノ酸配列を含む。実施形態では、Δ６−エロンガーゼは、フィスコミトレラ・パテンス（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）（Ｚａｎｋら、２００２；受託番号ＡＦ４２８２４３）またはＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ（Ｒｕｉｚ−Ｌｏｐｅｚら、２０１２）由来である。
【０１５９】
本明細書で使用するとき、「Δ９−エロンガーゼ」は、ＡＬＡをＥＴｒＡに少なくとも転換可能である。Δ９−エロンガーゼの例としては、表１にリストしたものが挙げられる。１つの実施形態では、Δ９−エロンガーゼは、配列番号２９の配列を有するアミノ酸、その生物活性フラグメント、または配列番号２９と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、Δ９−エロンガーゼは、配列番号３１の配列を有するアミノ酸、その生物活性フラグメント、または配列番号３１と少なくとも８１％同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、Δ９−エロンガーゼは、配列番号３３の配列を有するアミノ酸、その生物活性フラグメント、または配列番号３３と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、Δ９−エロンガーゼは、配列番号３５の配列を有するアミノ酸、その生物活性フラグメント、または配列番号３５と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、Δ９−エロンガーゼは、対応するω３基質より、ω６基質に対して大きな活性を有する、またはその逆である。
【０１６０】
本明細書で使用するとき、「対応するω３基質より、ω６基質に対して大きな活性を有する」という語は、ω３デサチュラーゼの作用と異なる基質に対する酵素の相対的作用を表す。好ましく、ω６基質はＬＡであり、ω３基質はＡＬＡである。
【０１６１】
Δ６−エロンガーゼ及びΔ９−エロンガーゼ活性を有するエロンガーゼは、少なくとも（ｉ）ＳＤＡをＥＴＡに転換、及び（ｉｉ）ＡＬＡをＥＴｒＡに転換可能であり、Δ９−エロンガーゼ活性より大きなΔ６−エロンガーゼ活性を有する。１つの実施形態では、エロンガーゼは、ＳＤＡに対して、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％であるＥＴＡを産生する転換効率、及び／またはＡＬＡに対して、少なくとも６％、より好ましくは少なくとも９％であるＥＴｒＡを産生する転換効率を有する。別の実施形態では、エロンガーゼは、Δ９−エロンガーゼ活性より、少なくとも約６．５倍大きなΔ６−エロンガーゼ活性を有する。さらなる実施形態では、エロンガーゼは、検出可能なΔ５−エロンガーゼ活性を有しない。
【０１６２】
他の酵素
微生物細胞などの組換え細胞、またはトランスジェニック植物もしくはその部分に導入された導入遺伝子は、ＬＰＡＡＴもコードし得る。本明細書で使用するとき、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼまたはアシル−ＣｏＡ−リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼとも呼ばれる「１−アシル−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ」（ＬＰＡＡＴ）という語は、ｓｎ−１−アシル−グリセロール−３−リン酸（ｓｎ−１Ｇ−３−Ｐ）を、ｓｎ−２位でアシル化してホスファチジン酸（ＰＡ）を生成するタンパク質を表す。従って、「１−アシル−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ活性」という語は、ｓｎ−２位において、ｓｎ−１  Ｇ−３−Ｐをアシル化してＰＡ（ＥＣ２．３．１．５１）を産生することを表す。好ましいＬＰＡＡＴは、基質として多価不飽和Ｃ２２アシル−ＣｏＡを使用して多価不飽和Ｃ２２アシル基をＬＰＡのｓｎ−２位に転移してＰＡを生成することができるものである。実施形態では、多価不飽和Ｃ２２アシル−ＣｏＡは、ＤＰＡ−ＣｏＡである。そのようなＬＰＡＡＴを実施例６に例示しており、そこに記載のように試験できる。実施形態では、本発明の有用なＬＰＡＡＴは、配列番号４０〜４６のいずれか１つの配列を有するアミノ酸、その生物活性フラグメント、またはいずれか１つ以上の配列番号４０〜４６と少なくとも４０％同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＬＰＡＡＴは、配列番号４４のいずれか１つの配列を有するアミノ酸を有しない。好ましい実施形態では、Ｃ２２多価不飽和脂肪アシル−ＣｏＡ基質、好ましくは、ＤＰＡ−ＣｏＡを使用できる、本発明に有用なＬＰＡＡＴは、配列番号４１、４２及び４４のいずれか１つの配列を有するアミノ酸、その生物活性フラグメント、またはいずれか１つ以上の配列番号４１、４２及び４４と少なくとも４０％同一であるアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、Ｃ２２多価不飽和脂肪アシル−ＣｏＡ基質、好ましくは、ＤＰＡ−ＣｏＡを使用できる、本発明に有用なＬＰＡＡＴは、配列番号４１または４２のいずれか１つの配列を有するアミノ酸、その生物活性フラグメント、またはいずれか１つ以上の配列番号４１または４２と少なくとも４０％同一であるアミノ酸配列を含む。実施形態では、ＬＰＡＡＴは、好ましくは、そのアミノ酸配列が配列番号４４で記載されるモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）ＬＰＡＡＴ、または基質としてＤＰＡ−ＣｏＡを使用して、ＤＰＡをＬＰＡに転移し、ｓｎ−２位においてＤＰＡを有するＰＡを生成できる別のＬＰＡＡＴである。
【０１６３】
組換え細胞、トランスジェニック細胞、トランスジェニック植物もしくはその部分に導入された導入遺伝子は、ＤＧＡＴもコードし得る。本明細書で使用するとき、「ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ」（ＥＣ  ２．３．１．２０；ＤＧＡＴ）という語は、脂肪アシル基を、アシル−ＣｏＡからジアシルグリセロール基質に転移してトリアシルグリセロールを産生するタンパク質を表す。従って、「ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性」という語は、アシル−ＣｏＡからジアシルグリセロールへ転移してトリアシルグリセロールを産生することを表す。それぞれ、ＤＧＡＴ１、ＤＧＡＴ２及びＤＧＡＴ３と呼ばれる３つの既知タイプのＤＧＡＴがある。ＤＧＡＴ１ポリペプチドは、通常、１０個の膜貫通型ドメインを有し、ＤＧＡＴ２は、通常、２個の膜貫通型ドメインを有し、一方、ＤＧＡＴ３は、通常、可溶性である。ＤＧＡＴ１ポリペプチドの例としては、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）（受託番号ＸＰ＿７５５１７２）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）（ＣＡＢ４４７７４）、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）（ＡＡＲ１１４７９）、シナアブラギリ（Ｖｅｒｎｉｃｉａ  ｆｏｒｄｉｉ）（ＡＢＣ９４４７２）、ベルノニア・ガラメンシス（Ｖｅｒｎｏｎｉａ  ｇａｌａｍｅｎｓｉｓ）（ＡＢＶ２１９４５、ＡＢＶ２１９４６）、ニシキギ（Ｅｕｏｎｙｍｕｓ  ａｌａｔｕｓ）（ＡＡＶ３１０８３）、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）（ＡＡＦ８２４１０）、ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）（ＮＰ＿４４５８８９）、ホモサピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）（ＮＰ＿０３６２１１）、並びにその変異体及び／または突然変異体のＤＧＡＴ１遺伝子によりコードされたポリペプチドが挙げられる。ＤＧＡＴ２ポリペプチドの例としては、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）（受託番号ＮＰ＿５６６９５２）、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）（ＡＡＹ１６３２４）、シナアブラギリ（Ｖｅｒｎｉｃｉａ  ｆｏｒｄｉｉ）（ＡＢＣ９４４７４）、モルティエレラ・ラマニアナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｒａｍａｎｎｉａｎａ）（ＡＡＫ８４１７９）、ホモサピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）（Ｑ９６ＰＤ７、Ｑ５８ＨＴ５）、ウシ（Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ）（Ｑ７０ＶＤ８）、ハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）（ＡＡＫ８４１７５）、ミクロモナス属  （Ｍｉｃｒｏｍｏｎａｓ）ＣＣＭＰ１５４５、並びにその変異体及び／または突然変異体のＤＧＡＴ２遺伝子によりコードされたポリペプチドが挙げられる。ＤＧＡＴ３ポリペプチドの例としては、ピーナッツ（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａ、Ｓａｈａら、２００６）並びにその変異体及び／または突然変異体のＤＧＡＴ３遺伝子によりコードされたポリペプチドが挙げられる。
【０１６４】
ポリペプチド／ペプチド
「ポリペプチド」及び「タンパク質」という語は、概して、互換的に使用される。
【０１６５】
ポリペプチドまたはポリペプチドの分類を、基準アミノ酸配列に対するそのアミノ酸配列の同一性の程度（同一性％）により、または１つの基準アミノ酸配列に対して、別のものに対するより大きな％の同一性を有することにより、規定し得る。基準アミノ酸配列に対するポリペプチドの同一性％は、通常、ギャップクリエーションペナルティ＝５、及びギャップエクステンションペナルティ＝０．３のパラメーターを用いて、ＧＡＰ解析（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、１９７０；ＧＣＧプログラム）により決定される。クエリシーケンスは、少なくとも１５アミノ酸長であり、ＧＡＰ解析は、少なくとも１５アミノ酸の領域に渡って２つの配列を配置する。より好ましくは、クエリシーケンスは、少なくとも５０アミノ酸長であり、ＧＡＰ解析は、少なくとも５０アミノ酸の領域に渡って２つの配列を配置する。より好ましくは、クエリシーケンスは、少なくとも１００アミノ酸長であり、ＧＡＰ解析は、少なくとも１００アミノ酸の領域に渡って２つの配列を配置する。さらにより好ましくは、クエリシーケンスは、少なくとも２５０アミノ酸長であり、ＧＡＰ解析は、少なくとも２５０アミノ酸の領域に渡って２つの配列を配置する。さらにより好ましくは、ＧＡＰ解析はその完全長に渡って２つの配列を配置する。ポリペプチドまたはポリペプチドの分類は、基準のポリペプチドと同じ酵素活性を有してもよく、異なる活性を有してもよく、または活性を有しなくてもよい。好ましくは、ポリペプチドは、基準のポリペプチドの少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％または少なくとも９０％の酵素活性を有する。
【０１６６】
本明細書で使用するとき、「生物活性」フラグメントは、例えば、デサチュラーゼ及び／またはエロンガーゼ活性または他の酵素活性を有する完全長基準ポリペプチドの定義された活性を維持する、本明細書で定義されたポリペプチドの部分である。本明細書で使用するとき、生物活性フラグメントは、完全長ポリペプチドを除外する。生物活性フラグメントは、それらが定義された活性を維持する限り、いかなるサイズの部分でもあり得る。好ましくは、生物活性フラグメントは、完全長タンパク質の少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％または少なくとも９０％の活性を維持する。
【０１６７】
定義されたポリペプチドまたは酵素に関して、本明細書で提供されたものより高い同一性％の数字は、好ましい実施形態を包含することは理解されるだろう。従って、適用可能な場合、最小の同一性％の数字に照らして、ポリペプチド／酵素が、関連する指定配列番号と、少なくとも６０％、より好ましくは６５％、より好ましくは７０％、より好ましくは７５％、より好ましくは７６％、より好ましくは８０％、より好ましくは８５％、より好ましくは９０％、より好ましくは９１％、より好ましくは９２％、より好ましくは９３％、より好ましくは９４％、より好ましくは９５％、より好ましくは９６％、より好ましくは９７％、より好ましくは９８％、より好ましくは９９％、より好ましくは９９．１％、より好ましくは９９．２％、より好ましくは９９．３％、より好ましくは９９．４％、より好ましくは９９．５％、より好ましくは９９．６％、より好ましくは９９．７％、より好ましくは９９．８％、さらにより好ましくは９９．９％同一であるアミノ酸配列を含むことは好ましい。
【０１６８】
本明細書で定義されたポリペプチドのアミノ酸配列変異体／突然変異体を、本明細書で定義された核酸に適切なヌクレオチド変化を導入することにより、または所望のポリペプチドのインビトロ合成により、準備できる。かかる変異体／突然変異体としては、例えば、アミノ酸配列内の残基の欠失、挿入または置換が挙げられる。欠失、挿入及び置換の組合せを行って、最終構築物に到達できるが、但し、最終ペプチド構築物は、所望の酵素活性を有する。
【０１６９】
突然変異（変化した）ペプチドを、当技術分野で公知のいずれかの技術を用いて、準備できる。例えば、本明細書で定義されたポリヌクレオチドに対して、インビトロ突然変異誘発またはＨａｒａｙａｍａ（１９９８）により広範に記載されているＤＮＡシャフリング技術を行うことができる。突然変異／変化したＤＮＡ由来の生成物を、本明細書に記載の技術を用いて容易にスクリーニングし、それらが、例えば、デサチュラーゼまたはエロンガーゼ活性を有しているかどうかを決定できる。
【０１７０】
アミノ酸配列突然変異体の設計では、突然変異部位の位置及び突然変異体の性質は、修飾される特徴に依存するだろう。突然変異の部位を、例えば、（１）先ず、保存的アミノ酸の選択により、次いで得られた結果に依ってより多くのラジカルの選択により置換し、（２）対象の残基を欠失し、または（３）その位置に隣接して他の残基を挿入することにより、個別にまたは連続して修飾できる。
【０１７１】
アミノ酸配列の欠失は、概して、約１〜１５残基、より好ましくは約１〜１０残基、典型的には約１〜５隣接残基の範囲である。
【０１７２】
置換突然変異体は、除去したポリペプチド分子中に少なくとも１つのアミノ酸残基及びその位置に挿入した異なる残基を有する。置換突然変異誘発の最も対象の部位としては、天然デサチュラーゼまたはエロンガーゼ中に保存されない部位が挙げられる。これらの部位は、好ましくは、酵素活性を維持するため、比較的保存的方法で置換される。このような保存的置換を、「実例となる置換」の表題の表３に示す。
【０１７３】
好ましい実施形態では、突然変異／変異ポリペプチドは、天然ポリペプチドと比較したとき、保存的アミノ酸変化のみ有する、または１つもしくは２つもしくは３つもしくは４つ以下の保存的アミノ酸変化を有する。保存的アミノ酸変化の詳細を表３に示す。当業者が認識するように、かかる少しの変化を、組換え細胞内で発現するとき、ポリペプチドの活性を変化させないで、合理的に予測できる。
【表３】
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【０１７４】
ポリヌクレオチド
本発明は、例えば、遺伝子、単離ポリヌクレオチド、Ｔ−ＤＮＡ分子などのキメラ遺伝子構築物、またはキメラＤＮＡであり得るポリヌクレオチドの使用も提供する。ポリヌクレオチドは、ゲノム起源もしくは合成起源、二本鎖もしくは一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡであってよく、本明細書で定義された特定の活性を行うために炭水化物、脂質、タンパク質または他の物質と結合していてもよい。「ポリヌクレオチド」という語は、本明細書中、「核酸分子」という語と互換的に使用される。
【０１７５】
実施形態では、ポリヌクレオチドは非天然である。非天然ポリヌクレオチドの例としては、これに限定されないが、突然変異したもの（本明細書に記載の方法を用いてなど）、及びタンパク質をコードするオープンリーディングフレームが自然の状態では関連しないプロモーター（本明細書に記載の構築物など）と作動可能に結合しているポリヌクレオチドが挙げられる。
【０１７６】
本明細書で使用するとき、「遺伝子」という語は、広義に考えるべきであり、転写された領域を含むデオキシリボヌクレオチド配列及び、もし翻訳されたならば、構造的遺伝子のタンパク質コード領域を含み、いずれかの末端の少なくとも約２ｋｂの距離に対して、５’と３’末端の双方上のコード領域と隣接する位置の配列を含み、該遺伝子の発現に関係する。この点では、遺伝子は、プロモーター、エンハンサー、停止などの制御シグナル及び／または所与の遺伝子と自然に関連するポリアデニル化シグナル、または該遺伝子が「キメラ遺伝子」と呼ばれる場合の非相同制御シグナルを含む。タンパク質コード領域の５’に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は、５’非翻訳配列と呼ばれる。タンパク質コード領域の３’または下流に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は、３’非翻訳配列と呼ばれる。「遺伝子」という語は、ｃＤＮＡ及び遺伝子のゲノム体の両方を包含する。遺伝子のゲノム体またはクローンは、「イントロン」または「介在領域」または「介在配列」と呼ばれる非コード配列により分断され得るコード領域を含む。イントロンは、核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）に転写される遺伝子のセグメントである。イントロンは、エンハンサーなどの調節エレメントを含み得る。イントロンを、核または一次転写産物から除去または「スプライシング」し；従って、イントロンはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写産物中に存在しない。ｍＲＮＡは、翻訳中、新生ポリペプチド中のアミノ酸の配列または順序を指定する働きをする。「遺伝子」という語は、本明細書に記載のタンパク質の全てまたは部分をコードする合成または融合分子及び上記のいずれか１つに対する相補ヌクレオチド配列を含む。
【０１７７】
本明細書で使用するとき、「キメラＤＮＡ」または「キメラ遺伝子構築物」または類似物は、その天然部位の天然ＤＮＡ分子でないＤＮＡ分子を表し、本明細書で、「ＤＮＡ構築物」と呼ぶ。通常、キメラＤＮＡまたはキメラ遺伝子は、天然で、作動可能に一緒に結合したものが見つからない、すなわち、互いに非相同である調節及び転写またはタンパク質コード配列を含む。従って、キメラＤＮＡまたはキメラ遺伝子は、異なる起源由来の調節配列及びコード配列、または同じ起源由来だが、天然で見られるものと異なるように配置されている調節配列及びコード配列を含んでもよい。
【０１７８】
「内在性遺伝子」は、生物のゲノム中のその天然の位置の天然遺伝子を表す。本明細書で使用するとき、「組換え核酸分子」、「組換えポリヌクレオチド」またはその変異体は、組換えＤＮＡ技術により構築または修飾された核酸分子を表す。「外来性（ｆｏｒｅｉｇｎ）ポリヌクレオチド」または「外来性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）ポリヌクレオチド」または「非相同ポリヌクレオチド」等は、実験操作により細胞のゲノム中に導入された核酸を表す。外来性（ｆｏｒｅｉｇｎ）または外来性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）遺伝子は、非天然生物中に挿入された遺伝子、天然宿主内の新しい位置に導入された天然遺伝子、またはキメラ遺伝子であってよい。「導入遺伝子」は、形質転換方法によりゲノム中に導入された遺伝子である。「遺伝子的修飾」、「トランスジェニック」という語及びその変化形は、形質転換または形質導入により細胞中に遺伝子を導入すること、細胞内の遺伝子を突然変異させること、及びこれらの作用が起こった細胞または生物またはその子孫内の遺伝子の調節を変更または調節することを含む。本明細書で使用するとき、「ゲノム領域」は、導入遺伝子、または導入遺伝子群（本明細書中、クラスターとも呼ばれる）が細胞、またはその祖先中に挿入されたゲノム内の位置を表す。そのような領域は、本明細書に記載の方法などにより人の介在によって組み込まれたヌクレオチドのみ含む。
【０１７９】
ポリヌクレオチドに関連した「外来性」という語は、その自然状態と比較して、変化した量で細胞内に存在するときのポリヌクレオチドを表す。１つの実施形態では、細胞は、自然に、ポリヌクレオチドを含まない細胞である。しかしながら、該細胞は、コードされたポリペプチドの変化した産生量で得られる非内在性ポリヌクレオチドを含む細胞であってよい。外来性ポリヌクレオチドは、トランスジェニック（組換え）細胞、または存在する場合、無細胞発現系の他成分から分離していないポリヌクレオチド、及びそのような細胞または少なくともいくつかの他成分から離して引き続き精製した無細胞系で産生されたポリヌクレオチドを含む。外来性ポリヌクレオチド（核酸）は、天然に存在するヌクレオチドの隣接伸長（ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ  ｓｔｒｅｔｃｈ）であり得、または結合して一本鎖ポリヌクレオチドを生成する異なる起源（天然及び／または合成）からのヌクレオチドの２つ以上の隣接伸長を含む。通常、このようなキメラポリヌクレオチドは、対象となる細胞内のオープンリーディングフレームの転写の駆動に適切なプロモーターと作動可能に結合したポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを少なくとも含む。
【０１８０】
定義されたポリヌクレオチドに関して、上記のものより高い同一性％の特徴は、好ましい実施形態を包含することは認識されるだろう。このように、適用可能な場合、最小の同一性％の数字に照らして、ポリヌクレオチドが、関連する指定配列番号と、少なくとも６０％、より好ましくは６５％、より好ましくは７０％、より好ましくは７５％、より好ましくは８０％、より好ましくは８５％、より好ましくは９０％、より好ましくは９１％、より好ましくは９２％、より好ましくは９３％、より好ましくは９４％、より好ましくは９５％、より好ましくは９６％、より好ましくは９７％、より好ましくは９８％、より好ましくは９９％、より好ましくは９９．１％、より好ましくは９９．２％、より好ましくは９９．３％、より好ましくは９９．４％、より好ましくは９９．５％、より好ましくは９９．６％、より好ましくは９９．７％、より好ましくは９９．８％、さらにより好ましくは９９．９％同一であるポリヌクレオチド配列を含むことは好ましい。
【０１８１】
ポリヌクレオチドは、天然分子と比較したとき、ヌクレオチド残基の欠失、挿入、または置換である１つ以上の突然変異を有してもよい。基準配列と比較して突然変異を有するポリヌクレオチドは、天然（すなわち、天然起源から単離）または合成（例えば、上記核酸に対して部位特異的突然変異誘発またはＤＮＡシャフリングを行うことにより）のいずれかであり得る。従って、ポリヌクレオチドが天然起源または組換えのいずれかからであり得ることは明白である。好ましいポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の、植物細胞内の翻訳にコドン最適化したコード領域を有するものである。
【０１８２】
組換えベクター
組換え発現を、本発明の組換え細胞、または植物もしくは植物部分の産生するため使用できる。組換えベクターは、非相同ポリヌクレオチド配列、すなわち、好ましくは、該ポリヌクレオチド分子が誘導された種以外の種由来の、本明細書で定義されたポリヌクレオチド分子と隣接して、天然に見られないポリヌクレオチド配列を含む。ベクターは、ＲＮＡあるいはＤＮＡのいずれかであり得、通常、プラスミドである。プラスミドベクターは、通常、原核細胞内の発現カセット、例えば、ｐＵＣ誘導ベクター、ｐＳＫ誘導ベクター、ｐＧＥＭ誘導ベクター、ｐＳＰ誘導ベクター、ｐＢＳ誘導ベクター、または好ましくは、１つ以上のＴ−ＤＮＡ領域を含むバイナリーベクターの容易な選択、増幅、及び形質転換を提供する付加的核酸配列を含む。付加的核酸配列は、ベクターの自律的複製を提供する複製開始点、好ましくは、抗菌剤または除草剤耐性をコードする選択可能なマーカー遺伝子、核酸配列または核酸構築物内でコードされた遺伝子を挿入する多重部位を提供する固有の多重クローニング部位、及び原核細胞及び真核細胞（特に植物）の形質転換を促進する配列を含む。組換えベクターは、好ましくは、本明細書で定義されたキメラ遺伝子構築物と組み合わせて、本明細書で定義された１つより多いポリヌクレオチド、例えば、３つ、４つ、５つまたは６つの本明細書で定義されたポリヌクレオチドを含んでもよく、各ポリヌクレオチドは、対象となる細胞内で作働可能な発現制御配列と作動可能に結合している。好ましくは、該発現制御配列は、非相同プロモーターを含む、または全てである、すなわち、それらが制御するコード領域に関して非相同である。本明細書で定義された１つより多いポリヌクレオチド、例えば、３つ、４つ、５つまたは６つのポリヌクレオチド、好ましくは、各々が異なるポリペプチドをコードする７つまたは８つのポリヌクレオチドを、好ましくは、１つのＴ−ＤＮＡ分子内の１つの組換えベクター中で好適に共有結合し、それから、細胞内に１つの分子として導入して本発明に記載の組換え細胞を生成し、好ましくは、組換え細胞のゲノム内に、例えば、トランスジェニック植物内に組み込んでもよい。ゲノム内への組込みは、核のゲノムまたはトランスジェニック植物のプラスチドゲノム内への組込みであってよい。それにより、そのように結合したポリヌクレオチドは、組換え細胞または植物の子孫の単一遺伝子座として一緒に遺伝するだろう。組換えベクターまたは植物は、２つ以上のそのような組換えベクターを含んでもよく、各々は、例えば、各々の組換えベクターが３つ、４つ、５つまたは６つのポリヌクレオチドを含む、複数のポリヌクレオチドを含む。
【０１８３】
本明細書で使用するとき、「作動可能に結合」は、２つ以上の核酸（例えば、ＤＮＡ）セグメント間の機能的関係性を表す。通常、転写された配列に対する転写調節エレメント（プロモーター）の機能的関係性を表す。例えば、プロモーターは、もし、適切な細胞内のコード配列の転写を刺激または調節するならば、本明細書で定義されたポリヌクレオチドなどのコード配列と作動可能に結合する。概して、転写配列と作動可能に結合しているプロモーター転写調節エレメントは、転写配列と物理的に隣接している、すなわち、それらはシス作用性である。しかしながら、エンハンサーなどのいくつかの転写調節エレメントは、それらがその転写を促進するコード配列と物理的に隣接または近接近して配置している必要がない。
【０１８４】
複数のプロモーターが存在するとき、各プロモーターは、独立して、同じであっても異なっていてもよい。好ましくは、６つの異なるプロモーター配列のうち少なくとも３つから最大値までを、組換えベクター内で使用して、外来性ポリヌクレオチドの発現を制御する。
【０１８５】
キメラＤＮＡまたは遺伝子構築物などの組換え分子は、（ａ）単一ペプチド配列をコードして、本明細書で定義された発現されたポリペプチドが該ポリペプチドを産生または該発現されたポリペプチドの局在化、例えば、細胞内の小胞体（ＥＲ）中のポリペプチドの保持を提供する１つ以上の分泌シグナル、及び／または（ｂ）融合タンパク質として核酸分子の発現をもたらす融合配列も含んでもよい。適切な単一セグメントの例としては、本明細書で定義されたポリペプチドの分泌または局在化を誘導可能ないずれかのシグナルセグメントが挙げられる。組換え分子は、本明細書で定義された核酸分子の核酸配列周囲及び／または内の介在及び／または非翻訳配列も含んでもよい。
【０１８６】
形質転換体の同定を容易にするため、核酸構築物は、外来性（ｆｏｒｅｉｇｎ）または外来性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）ポリヌクレオチドとして、またはそれに加えて、選択可能またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子を望ましく含む。「マーカー遺伝子」は、カーカー遺伝子を発現する細胞に別のフェノタイプを付与して、それ故、そのような形質転換された細胞を、マーカーを有しない細胞と区別することを可能とする遺伝子を意味する。選択可能なマーカー遺伝子は、選択剤（例えば、除草剤、抗菌剤、放射線、熱、または形質転換していない細胞にダメージを与える他の処理）に対する耐性に基づいて「選択」できる特色を与える。スクリーニング可能なマーカー遺伝子（またはリポーター遺伝子）は、観察または試験により、すなわち、「スクリーニング」（例えば、β−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、ＧＦＰまたは形質転換していない細胞内に存在しない他の酵素活性）により、同定できる特色を与える。マーカー遺伝子及び対象となるヌクレオチド配列は、結合している必要がない。マーカーの実際の選択は、植物細胞などの選択の細胞と組み合わせて機能的（すなわち、選択的）である限り、重大ではない。
【０１８７】
選択可能なマーカーの例は、アンピシリン、クロラムフェニコールまたはテトラサイクリン耐性、好ましくは、カナマイシン耐性などの抗菌耐性を与えるマーカーである。植物形質転換体の選択のための実例となる選択可能なマーカーとしては、これに限定されないが、ハイグロマイシンＢ耐性をコードするｈｙｇ遺伝子；カナマイシン、パロモマイシン、Ｇ４１８に対する耐性を与えるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子；例えば、ＥＰ２５６２２３に記載のグルタチオン誘導除草剤に対する耐性を与えるラット肝臓のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ；例えば、過剰発現時、ＷＯ８７／０５３２７に記載のホスフィノトリシンなどのグルタミンシンセターゼインヒビターに対する耐性、例えば、ＥＰ２７５９５７に記載の選択剤ホスフィノトリシンに対する耐性を与えるストレプトミセス・ビリドクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）のアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、例えば、Ｈｉｎｃｈｅｅら（１９８８）により記載されたＮ−ホスホノメチルグリシンに対する耐性を与える５−エノールシキメート−３−ホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）をコードする遺伝子、または好ましくは、例えば、ＷＯ９１／０２０７１に記載のビアラホスに対する耐性を与えるｂａｒ遺伝子が挙げられる。
【０１８８】
好ましくは、核酸構築物を、植物細胞などの細胞のゲノム内に安定に組み込む。従って、核酸は、分子がゲノム内に組み込まれることを可能とする適切なエレメントを含んでもよく、好ましくは、Ｔ−ＤＮＡ分子または構築物の左右境界配列を、細胞の染色体中に組み込むことができる適切なベクター内に配置する。
【０１８９】
発現
本明細書で使用するとき、発現ベクターは、宿主細胞を形質転換すること及び１つ以上の特異的ポリヌクレオチド分子の発現に影響することが可能であるＤＮＡベクターである。本発明の発現ベクターは、植物細胞内または微生物細胞などの組換え細胞内で遺伝子発現を誘導できる。本発明に有用な発現ベクターは、転写制御配列、翻訳制御配列、複製開始点、及び組換え細胞と互換性があり、本発明のポリヌクレオチド分子の発現を制御する他の調節配列などの調節配列を含む。特に、本発明に有用なポリヌクレオチドまたはベクターは、転写制御配列を含む。転写制御配列は、転写の開始、伸長、及び停止を制御する配列である。特に、重要な転写制御配列は、プロモーター及びエンハンサー配列などの転写開始を制御するものである。適切な転写制御配列は、本発明の少なくとも１つの組換え細胞内で機能できるいずれかの転写制御配列を含む。使用される調節配列の選択は、対象となる植物及び／または器官または組織などの対象生物体に依存する。かかる調節配列を、植物または植物ウイルスなどの真核生物から得てもよく、化学的に合成してもよい。様々なそのような転写制御配列は、当業者に公知である。特に、好ましい転写制御配列は、恒常的にあるいは植物もしくその部分の使用に依存して特異的な段階及び／または組織のいずれかに、植物内の転写を誘導する活性のあるプロモーターである。
【０１９０】
植物細胞の安定なトランスフェクトまたはトランスジェニック植物の確立に適切ないくつかのベクターは、例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら、Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、１９８５、ｓｕｐｐ．  １９８７；Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ及びＷｅｉｓｓｂａｃｈ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９；及びＧｅｌｖｉｎら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９０に記載されている。通常、植物発現ベクターとしては、例えば、５’及び３’調節配列及び優性選択可能マーカーの転写制御下の１つ以上のクローン植物遺伝子が挙げられる。かかる植物発現ベクターは、プロモーター調節領域（例えば、誘導的もしくは恒常的、環境的に調節もしくは発生的に調節、または細胞特異的もしくは組織特異的発現を制御する調節領域）、転写開始部位、リボソーム結合部位、ＲＮＡプロセシングシグナル、転写停止部位、及び／またはポリアデニル化シグナルも含み得る。
【０１９１】
植物細胞で活性ないくつかの構成的プロモーターを説明した。植物の構成的発現に適切なプロモーターとしては、これに限定されないが、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、ゴマノハグサモザイクウイルス（ＦＭＶ）３５Ｓ、及びリブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼの小サブユニットからの光誘導プロモーターが挙げられる。
【０１９２】
葉、種子、根または幹などの植物の源組織の発現の目的のため、本発明で利用されるプロモーターがこれらの特異的組織内で比較的高い発現を有することは好ましい。多くの例が当技術分野で周知である。環境、ホルモン、化学的、及び／または発生のシグナルに応答して調節される様々な植物遺伝子プロモーターを、植物細胞内で遺伝子発現のためにも使用でき、または器官特異的プロモーターを使用することも有利であり得る。
【０１９３】
本明細書で使用するとき、「種子特異的プロモーター」という語またはその変化形は、他の植物組織と比較したとき、優先的に、植物、好ましくは、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｓｐ．）、カメリナサティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ  ｓａｔｉｖａ）またはダイズ（Ｇ．  ｍａｘ）の植物の発育種子の遺伝子転写を誘導するプロモーターを表す。実施形態では、種子特異的プロモーターを、植物の葉及び／または幹と比較して、植物の発育種子中で、少なくとも５倍強力に発現し、他の植物組織と比較して、発育種子の胚中でより強力に好適に発現する。好ましくは、プロモーターのみが、発育種子中の対象となる遺伝子の発現を誘導し、及び／または葉などの植物の他の部分中の対象となる遺伝子の発現はノーザンブロット解析及び／またはＲＴ−ＰＣＲにより検出できない。通常、プロモーターは、種子の成長及び発育中、特に、種子内の貯蔵化合物の合成フェーズ及び蓄積中、遺伝子の発現を駆動する。かかるプロモーターは、植物貯蔵器官全体もしくは種皮、もしくは子葉などのその部分のみ、好ましくは、双子葉植物の種子中の胚、または単子葉植物の種子の胚乳もしくはアリューロン層中の遺伝子発現を駆動し得る。
【０１９４】
種子特異的発現のための好ましいプロモーターとしては、ｉ）脂肪酸デサチュラーゼ及びエロンガーゼなどの、種子内の脂肪酸生合成及び蓄積に関連する酵素をコードする遺伝子からのプロモーター、ｉｉ）種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子からのプロモーター、及びｉｉｉ）種子内の炭水化物生合成及び蓄積に関連する酵素をコードする遺伝子からのプロモーターが挙げられる。適切な種子特異的プロモーターは、アブラナナピン遺伝子プロモーター（ＵＳ５，６０８，１５２）、ソラマメＵＳＰプロモーター（Ｂａｕｍｌｅｉｎら、１９９１）、アラビドプシス・オレオシン（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｏｌｅｏｓｉｎ）プロモーター（ＷＯ９８／４５４６１）、ファセオラス・ブルガリス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）ファゼオリンプロモーター（ＵＳ５，５０４，２００）、ブラシカＢｃｅ４プロモーター（ＷＯ９１／１３９８０）またはソラマメからのレグミンＬｅＢ４プロモーター（Ｂａｕｍｌｅｉｎら、１９９２）及びトウモロコシ、オオムギ、コムギ、ライムギ、コメなどの単子葉植物中の種子特異的発現をもたらすプロモーターである。適切な注目すべきプロモーターは、オオムギｌｐｔ２またはｌｐｔ１遺伝子プロモーター（ＷＯ９５／１５３８９及びＷＯ９５／２３２３０）またはＷＯ９９／１６８９０に記載のプロモーター（オオムギホルデイン遺伝子、コメグルテリン遺伝子、コメオリジン遺伝子、コメプロラミン遺伝子、コムギグリアジン遺伝子、コムギグルテリン遺伝子、トウモロコシゼイン遺伝子、カラスムギグルテリン遺伝子、モロコシカシリン（ｋａｓｉｒｉｎ）遺伝子、ライムギセカリン遺伝子からのプロモーター）である。他のプロモーターとしては、Ｂｒｏｕｎら（１９９８）、Ｐｏｔｅｎｚａら（２００４）、ＵＳ２００７０１９２９０２及びＵＳ２００３０１５９１７３に記載されたものが挙げられる。実施形態では、種子特異的プロモーターを、優先的に、胚、子葉または胚乳などの画定された種子部分内で発現する。そのような特異的プロモーターの例としては、これに限定されないが、ＦＰ１プロモーター（Ｅｌｌｅｒｓｔｒｏｍら、１９９６）、エンドウマメレグミンプロモーター（Ｐｅｒｒｉｎら、２０００）、マメフィトヘマグルトニンプロモーター（Ｐｅｒｒｉｎら、２０００）、アマ２Ｓ貯蔵タンパク質をコードする遺伝子のコンリニン１及びコンリニン２プロモーター（Ｃｈｅｎｇら、２０１０）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）からのＦＡＥ１遺伝子のプロモーター、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）のグロブリン様タンパク質遺伝子のＢｎＧＬＰプロモーター、アマ（Ｌｉｎｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）からのペルオキシレドキシン遺伝子のＬＰＸＲプロモーターが挙げられる。
【０１９５】
５’非翻訳リーダー配列を、本発明のポリヌクレオチドの非相同遺伝子配列を発現するため選択されたプロモーターから誘導でき、または好ましくは、産生される酵素のコード領域に関して非相同であり、ｍＲＮＡの翻訳を増強するように、必要に応じて、特異的に修飾できる。導入遺伝子の最適発現をレビューするため、Ｋｏｚｉｅｌら（１９９６）参照。５’非翻訳領域を、植物ウイルスＲＮＡ（とりわけ、タバコモザイクウイルス、タバコエッチウイルス、トウモロコシドワーフモザイクウイルス、アルファルファモザイクウイルス）から、適切な真核遺伝子、植物遺伝子（コムギ及びトウモロコシクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質遺伝子リーダー）から、または合成遺伝子配列からも得ることができる。本発明は、非翻訳領域がプロモーター配列を付随する５’非翻訳配列から誘導される構築物に限定されない。リーダー配列を、関連しないプロモーターまたはコード配列からも誘導できる。本発明との関連で有用なリーダー配列は、トウモロコシＨｓｐ７０リーダー（ＵＳ５，３６２，８６５及びＵＳ５，８５９，３４７）、及びＴＭＶオメガエレメントを含む。
【０１９６】
転写停止を、キメラベクター中で対象となるポリヌクレオチドと作動可能に結合した３’非翻訳ＤＮＡ配列により実行する。組換えＤＮＡ分子の３’非翻訳領域は、植物内で、アデニル酸ヌクレオチドのＲＮＡの３’末端への付加を引き起こす機能をするポリアデニル化シグナルを含む。３’非翻訳領域を、植物細胞内で発現される様々な遺伝子から得ることができる。ノパリンシンターゼ３’非翻訳領域、エンドウマメ小サブユニットルビスコ遺伝子からの３’非翻訳領域は、ダイズ７Ｓ種子貯蔵タンパク質遺伝子またはアマコンリニン遺伝子からの３’非翻訳領域が、この目的で、共通に使用される。アグロバクテリウム腫瘍誘導（Ｔｉ）プラスミドのポリアデニル化シグナルを含む３’転写された非翻訳領域も適切である。
【０１９７】
組換えＤＮＡ技術を、例えば、宿主細胞内のポリヌクレオチド分子の複製数、これらのポリヌクレオチド分子が転写される効率、得られた転写産物が翻訳される効率、及び翻訳後修飾の効率の操作により、形質転換されたポリヌクレオチド分子の発現を改良するために使用できる。本明細書で定義されたポリヌクレオチド分子の発現の増加に有用な組換え技術としては、これに限定されないが、ポリヌクレオチド分子の１つ以上の宿主細胞染色体への組込み、ｍＲＮＡへの安定配列の付加、転写制御シグナルの置換または修飾（例えば、プロモーター、オペレーター、エンハンサー）、翻訳制御シグナルの置換または修飾（例えば、リボソーム結合部位、シャイン・ダルガノ配列）、宿主細胞のコドン使用頻度に対応するためのポリヌクレオチド分子の修飾、及び転写を不安定化する配列の欠失が挙げられる。
【０１９８】
トランスジェニック植物
本明細書で名詞として使用するとき、「植物」という語は、植物全体を表すが、形容詞として使用するとき、例えば、植物器官（例えば、葉、幹、根、花）、１つの細胞（例えば、花粉）、種子、植物細胞など、植物中に存在、植物から得られる、植物由来、または植物に関連する物質を表す。「植物部分」という語は、該植物部分が本発明に記載の脂質を合成する限り、例えば、葉もしくは幹、根、花器もしくは花の構造物、花粉、種子、胚などの種子部分、胚乳、胚盤もしくは種皮、例えば、維管束組織などの植物組織、その細胞と子孫などの植物性構造物を含む植物ＤＮＡを含む全ての植物部分を表す。
【０１９９】
概して、「トランスジェニック植物」、「遺伝子的に修飾された植物」またはその変化形は、同じ種、変種または栽培品種の野生型植物に見られない遺伝子構築物（「導入遺伝子」）を含む植物を表す。本発明に関連して定義されたトランスジェニック植物は、組換え技術を用いて遺伝子的に修飾して、所望の植物または植物器官内で本明細書中に定義された脂質または少なくとも１つのポリペプチドの産生を引き起こした植物またはその子孫を含む。トランスジェニック植物細胞及びトランスジェニック植物部分は、対応する意味を有する。本明細書で呼ぶ「導入遺伝子」は、バイオテクノロジーの技術分野における通常の意味を有し、組換えＤＮＡまたはＲＮＡ技術により産生または変更され、植物細胞内に導入された遺伝子配列を含む。導入遺伝子は、該導入遺伝子が植物細胞以外の細胞に導入された、または異なる種、変種もしくは栽培品種、または由来である植物細胞と同じ種、変種もしくは栽培品種であり得る植物細胞由来の遺伝子配列を含む。通常、導入遺伝子は、植物などの細胞内に、例えば、形質転換などのヒトの操作により導入されるが、いずれの方法も、当業者が認識する通りに使用できる。
【０２００】
「種子」及び「穀物」という語は、本明細書で互換的に使用される。「穀物」は、収穫された穀物またはまだ植物上にあるがいつでも収穫する状態になっている穀物などの成熟した穀物を表すが、文脈により吸水または発芽後の穀物も表し得る。成熟した穀物または種子は、通常、約１８〜２０％未満、好ましくは、１０％未満の含水率を有する。キャノーラ種子などのアブラナ属種子は、通常、成熟時、約４〜８％または６〜８％、好ましくは、約４％〜約６％の含水率を有する。本明細書で使用するとき、「発育種子」は、成熟前、通常、受精または開花後の植物の生殖構造物内で見られる種子を表すが、植物から単離された成熟前のそのような種子も表し得る。
【０２０１】
本明細書で使用するとき、「植物部分を得ること」または「種子を得ること」という語は、畑または温室もしくはグロースチャンバーなどのコンテインメントの植物から植物部分または種子を収穫することを含み、または該植物部分もしくは種子の供給者から購入もしくは受け取ることにより、それぞれ、植物部分または種子を得るいずれかの手段を表す。室温における標準的生育条件は、自然光の射す、２２〜２４℃の日中温度及び１６〜１８℃の夜間温度を含む。種子は、呈色に適切であり得る、すなわち、子孫植物を発芽または産生できる、あるいは、もはや発芽できないように処理した、例えば、食物もしくは飼料用途、または本発明の脂質の抽出に有用である、粉砕、研磨もしくは製粉した種子であり得る。
【０２０２】
本明細書で使用するとき、「植物貯蔵器官」という語は、例えば、タンパク質、炭水化物、脂肪酸及び／またはオイルの形態でエネルギーを貯蔵するために特殊化した植物の部分を表す。植物貯蔵器官の例としては、種子、果実、塊根、及び塊茎が挙げられる。好ましい植物貯蔵器官は種子である。
【０２０３】
本発明のまたは本発明で使用される植物または植物部分は、好ましくは、表現型的に正常である。本明細書で使用するとき、「表現型的に正常」という語は、遺伝的に修飾された植物または植物器官、特に、未修飾の植物または植物器官と比較したとき、生育及び繁殖する能力を著しく低下していない種子、塊茎または果実などの貯蔵器官を表す。実施形態では、表現型的に正常である遺伝的に修飾された植物または植物器官は、外来性ポリヌクレオチドを含まないアイソジェニックな植物または器官と本質的に同じである生育または繁殖する能力を有する。好ましくは、バイオマス、生育速度、発芽速度、貯蔵器官サイズ、花粉生存率、雌雄受精、種子サイズ及び／または産生された生存種子数は、同一条件下で生育したとき、前記外来性ポリヌクレオチドを含まない植物の９０％以上である。好ましくは、本発明の植物、または本発明の種子から産生した植物の花粉生存率は、対応する野生型植物の花粉生存率と比較して約１００％である。この語は、野生型植物と異なり得るが、例えば、子葉（ｓｅｅｄｌｉｎｇ  ｌｅａｖｅｓ）のバレリーナ表現型などの商業目的用植物の有用性に影響しない、植物の特徴を包含しない。
【０２０４】
本発明により提供される、または本発明の実践での使用を考慮した植物としては、単子葉植物及び双子葉植物の両方が挙げられる。好ましい実施形態では、本発明の植物は、作物（例えば、穀類及び豆類、トウモロコシ、コムギ、ジャガイモ、タピオカ、コメ、モロコシ、アワ、キャッサバ、オオムギ、またはエンドウマメ）、または他のマメ科植物である。植物を、食用根、塊茎、葉、幹、花または果実の産生のため生育してもよい。植物は、野菜植物または観賞植物であってよい。本発明の、または本発明に有用な植物は：トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ  ｓｓｐ．）、カラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）、アマ（Ｌｉｎｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）、コメ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒａｌｅ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｕｒ、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｓ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、ピーナッツ（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、サツマイモ（Ｌｏｐｍｏｅａ  ｂａｔａｔｕｓ）、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、コーヒー（Ｃｏｆｅａ  ｓｐｐ．）、ココナツ（Ｃｏｃｏｓ  ｎｕｃｉｆｅｒａ）、パイナップル（Ａｎａｎａ  ｃｏｍｏｓｕｓ）、柑橘系樹木（ｃｉｔｒｉｓ  ｔｒｅｅ）（Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｐｐ．）、ココア（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ）、茶（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｅｎｅｎｓｉｓ）、バナナ（Ｍｕｓａ  ｓｐｐ．）アボカド（Ｐｅｒｓｅａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）、イチジク（Ｆｉｃｕｓ  ｃａｓｉｃａ）、グアバ（Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａ）、マンゴ（Ｍａｎｇｉｆｅｒ  ｉｎｄｉｃａ）、オリーブ（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ）、パパイヤ（Ｃａｒｉｃａ  ｐａｐａｙａ）、カシュー（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ）、マカダミア（Ｍａｃａｄａｍｉａ  ｉｎｔｅｒｇｒｉｆｏｌｉａ）、アーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ  ａｍｙｇｄａｌｕｓ）、サトウダイコン（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、カラスムギ、またはオオムギであってよい。
【０２０５】
好ましい実施形態では、植物は被子植物である。
【０２０６】
実施形態では、植物は、油料種子植物、好ましくは、油料種子作物である。本明細書で使用するとき、「油料種子植物」という語は、該植物の種子からオイルの商業的産生のために使用される植物種である。油料種子植物は、油料種子用セイヨウアブラナ（ｒａｐｅ）（セイヨウアブラナ（ｃａｎｏｌａ）など）、トウモロコシ、ヒマワリ、ダイズ、モロコシ、アマ（亜麻仁）またはサトウダイコンであってよい。さらに、油料種子植物は、他のアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａｓ）、ワタ、ピーナッツ、ポピー、カラシナ、トウゴマ、ゴマ、ヒマワリ、ベニバナ、アマナズナ属（Ｃａｍｅｌｉｎａ）、クランベ属（Ｃｒａｍｂｅ）または木の実を産生する植物であってよい。植物は、オリーブ、油ヤシまたはココナッツなどのその果実中に高レベルのオイルを産生し得る。本発明を適用し得る園芸植物は、レタス、エンダイブ、またはキャベツ、ブロッコリー、またはカリフラワーを含む野菜のアブラナ属である。本発明を、タバコ、ウリ科植物、ニンジン、イチゴ、トマト、またはコショウに適用してもよい。
【０２０７】
さらに好ましい実施形態では、本発明のトランスジェニック植物を産生するために使用される非トランスジェニック植物は、特に種子中に、ｉ）２０％未満、１０％未満または５％未満の１８：２脂肪酸及び／またはｉｉ）１０％未満または５％未満の１８：３脂肪酸を有するオイルを産生する。
【０２０８】
好ましい実施形態では、トランスジェニック植物またはその部分は、その子孫が所望の表現型に対して分離しないように導入された（導入遺伝子）各々及び全ての遺伝子（外来性ポリヌクレオチド）について相同である。トランスジェニック植物は、導入された導入遺伝子について非相同であってもよく、好ましくは、例えば、ハイブリッド種子から生育したＦ１子孫など、導入遺伝子について一律に非相同であってよい。そのような植物は、当技術分野で周知の雑種強勢などの長所を備え得、または植物育種もしくは戻し交配で使用され得る。
【０２０９】
関連する場合、トランスジェニック植物またはその部分は、これに限定されないが、Δ６−デサチュラーゼ、Δ９−エロンガーゼ、Δ８−デサチュラーゼ、Δ６−エロンガーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、ω３−デサチュラーゼ、Δ５−エロンガーゼ、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、ＬＰＡＡＴ、Δ１７−デサチュラーゼ、Δ１５−デサチュラーゼ及び／またはΔ１２−デサチュラーゼなどＬＣ−ＰＵＦＡの産生に関連する酵素をコードする付加的導入遺伝子も含んでよい。１つ以上のこれらの活性を有するそのような酵素の例は、当技術分野で公知であり、本明細書に記載のものが挙げられる。具体例では、トランスジェニック植物は；
ａ）Δ５−デサチュラーゼ、Δ６−デサチュラーゼ、Δ５−エロンガーゼ、及びΔ６−エロンガーゼ、
ｂ）Δ５−デサチュラーゼ、Δ８−デサチュラーゼ、Δ５−エロンガーゼ、及びΔ９−エロンガーゼ、
ｃ）Δ５−デサチュラーゼ、Δ６−デサチュラーゼ、Δ５−エロンガーゼ、Δ６−エロンガーゼ、及びΔ１５−デサチュラーゼ、
ｄ）Δ５−デサチュラーゼ、Δ８−デサチュラーゼ、Δ５−エロンガーゼ、Δ９−エロンガーゼ、及びΔ１５−デサチュラーゼ、
ｅ）Δ５−デサチュラーゼ、Δ６−デサチュラーゼ、Δ５−エロンガーゼ、Δ６−エロンガーゼ、及びΔ１７−デサチュラーゼ、
ｆ）Δ５−デサチュラーゼ、Δ８−デサチュラーゼ、Δ５−エロンガーゼ、Δ９−エロンガーゼ、及びΔ１７−デサチュラーゼ、
ｇ）ω３−デサチュラーゼまたはΔ１５−デサチュラーゼ、Δ６−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ６−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ、
ｈ）ω３−デサチュラーゼまたはΔ１５−デサチュラーゼ、Δ８−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ９−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ、
ｉ）Δ１２−デサチュラーゼ、ω３−デサチュラーゼまたはΔ１５−デサチュラーゼ、Δ６−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ６−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ、
ｊ）Δ１２−デサチュラーゼ、ω３−デサチュラーゼまたはΔ１５−デサチュラーゼ、Δ８−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ９−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ、
ｋ）１−アシル−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）、ω３−デサチュラーゼ、Δ６−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ６−エロンガーゼ、及びΔ５−エロンガーゼ、
ｌ）１−アシル−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）、Δ１５−デサチュラーゼ、Δ６−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ６−エロンガーゼ、及びΔ５−エロンガーゼ、
ｍ）１−アシル−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）、Δ１２−デサチュラーゼ、Δ６−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ６−エロンガーゼ、及びΔ５−エロンガーゼ、
ｎ）１−アシル−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）、Δ１２−デサチュラーゼ、ω３−デサチュラーゼ及び／またはΔ１５−デサチュラーゼ、Δ６−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ６−エロンガーゼ及びΔ５−エロンガーゼ、
ｏ）１−アシル−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）、ω３−デサチュラーゼ、Δ８−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ９−エロンガーゼ、及びΔ５−エロンガーゼ、
ｐ）１−アシル−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）、Δ１５−デサチュラーゼ、Δ８−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ９−エロンガーゼ、及びΔ５−エロンガーゼ、
ｑ）１−アシル−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）、Δ１２−デサチュラーゼ、Δ８−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ９−エロンガーゼ、及びΔ５−エロンガーゼ、または
ｒ）１−アシル−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）、Δ１２−デサチュラーゼ、ω３−デサチュラーゼ及び／またはΔ１５−デサチュラーゼ、Δ８−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ９−エロンガーゼ、及びΔ５−エロンガーゼ、
をコードする外来性ポリヌクレオチドのセットを少なくとも含む。
【０２１０】
実施形態では、外来性ポリヌクレオチドは、ピシリウム・イレグラーレ（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ）Δ６−エロンガーゼ、スラウストキトリッド（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）Δ５−デサチュラーゼまたはエミリアナ  ・ハックスレイ（Ｅｍｉｌｉａｎａ  ｈｕｘｌｅｙｉ）Δ５−デサチュラーゼ、ニセツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）Δ６−エロンガーゼ、スラウストキトリッド（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）Δ５−エロンガーゼまたはオストレオコッカス・タウリ（Ｏｓｔｒｅｏｃｃｃｕｓ  ｔａｕｒｉｉ）Δ５−エロンガーゼ、及びフィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）ω３−デサチュラーゼまたはピシリウム・イレグラーレ（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ）ω３−デサチュラーゼであるポリペプチドのセットをコードする。
【０２１１】
実施形態では、本発明の、または本発明に使用される植物を、畑、好ましくは、本質的に同じ、または少なくとも１ヘクタールまたは２ヘクタールの面積である少なくとも１，０００、１，０００，０００または２，０００，０００の植物の集団として生育する。栽植密度は、植物種、植物品種、天候、土壌条件、肥料割合及び当技術分野で公知の他の因子に応じて異なる。例えば、セイヨウアブラナは、通常、ヘクタール当たり１．２〜１．５百万植物の栽植密度で生育される。当技術分野で公知のように、植物を収穫し、植物を刈取り（ｓｗａｔｈｉｎｇ）、引抜き及び／または刈取り（ｒｅａｐｉｎｇ）し、次いで、植物素材を脱穀及び／または風選して、しばしばもみ殻の形態である植物部分の残部から種子を分離することを含み得る。あるいは、種子を、１回の処理、例えば、コンバイン収穫機で、畑の植物から収穫してもよい。
【０２１２】
植物の形質転換
トランスジェニック植物を、Ａ．Ｓｌａｔｅｒら、Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−Ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００３）、及びＰ．Ｃｈｒｉｓｔｏｕ  ａｎｄ  Ｈ．Ｋｌｅｅ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（２００４）に全般的に記載されたものなど、当技術分野で公知の技術を用いて産生できる。
【０２１３】
本明細書で使用するとき、「安定に形質転換すること」、「安定に形質転換された」及びその変化形は、それらの存在について積極的に選択する必要なく、細胞分裂中の子孫細胞に転移されるように、該細胞のゲノム中に、外来性核酸分子を組み込むことを表す。安定な形質転換、またはその子孫を、染色体ＤＮＡに対するサザンブロットまたはゲノムＤＮＡのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどの当技術分野で公知のいずれかの方法により選択できる。好ましくは、植物形質転換を、本明細書の実施例で記載の通り実施する。
【０２１４】
アグロバクテリウム介在転移は、植物細胞ゲノム中のＤＮＡの一過性発現または安定な組込みのいずれかのため、全植物組織または植物器官または組織培養中の移植片中の細胞に、ＤＮＡを導入できるので、植物細胞中に遺伝子を導入するために広範に応用できるシステムである。ＤＮＡを植物細胞に導入するためのアグロバクテリウム介在植物組込みベクターの使用は、アグロバクテリウムまたはＤＮＡを植物細胞に導入できる他の細菌を用いたフローラルディップ法を含み、当技術分野で周知である（例えば、ＵＳ５１７７０１０、ＵＳ５１０４３１０、ＵＳ５００４８６３またはＵＳ５１５９１３５参照）。転移されるＤＮＡ領域は、境界配列により画定され、介在ＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）は、通常、植物ゲノムに挿入される。さらに、Ｔ−ＤＮＡの組込みは、ほとんど再転位のない比較的正確な処理である。アグロバクテリウム介在形質転換が効率的である場合のこれらの植物品種では、遺伝子導入の容易且つ定義された性質から、選択の方法となる。好ましいアグロバクテリウム形質転換ベクターは、記載のように便利な操作を可能とする、アグロバクテリウムだけでなく大腸菌内で複製可能である（Ｋｌｅｅら、Ｉｎ：Ｐｌａｎｔ  ＤＮＡ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ａｇｅｎｔｓ、Ｈｏｈｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｌｌ，ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１７９〜２０３（１９８５））。
【０２１５】
使用され得る加速法としては、例えば、微粒子銃などが挙げられる。形質転換する核酸分子を植物細胞に送達する方法の１つの例は、微粒子銃である。この方法は、Ｙａｎｇら．Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｏｘｆｏｒｄ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９４）に概説されている。非生物粒子（微粒子噴出体）を核酸で被覆し、推進力により細胞に送達し得る。例証となる粒子としては、タングステン、近、プラチナ等から成るものが挙げられる。単子葉植物を再現性よく形質転換する効率的手段であることに加えて、微粒子銃の特定の利点は、プロトプラストの単離もアグロバクテリウム感染の感受性も必要ないことである。
【０２１６】
別の代替の実施形態では、プラスチドを、安定に形質転換できる。高等植物のプラスチド形質転換について開示された方法としては、選択可能なマーカーを含み、ＤＮＡを相同組換えによるプラスチドゲノムに標的化するＤＮＡのパーティクルガン送達が挙げられる（ＵＳ５，４５１，５１３、ＵＳ５，５４５，８１８、ＵＳ５，８７７，４０２、ＵＳ５，９３２４７９、及びＷＯ９９／０５２６５）。
【０２１７】
細胞形質転換の他の方法も使用でき、これに限定されないが、花粉への直接ＤＮＡ転移により、植物の生殖器中へのＤＮＡの直接注入により、または未成熟胚の細胞中にＤＮＡを直接注入して、次いで、乾燥胚に水分補給して戻すことにより、ＤＮＡを植物に導入することが挙げられる。
【０２１８】
単一の植物プロトプラスト形質転換から、または様々な形質転換移植片からの植物の再生、発育、及び栽培は、当技術分野で周知である（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈら，Ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，（１９８８））。この再生及び生育過程としては、形質転換細胞の選択工程、定着小植物期を通して胚発育の通常期にわたるこれらの個別化細胞の培養工程を通常含む。トランスジェニック胚及び種子を同様に再生する。得られたトランスジェニック定着新芽を、その後に、土壌などの適切な植物生育培地で栽培する。
【０２１９】
外来性（ｆｏｒｅｉｇｎ）、外来性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）遺伝子を含む植物の発育または再生は、当技術分野で周知である。好ましくは、再生された植物を、相同トランスジェニック植物を得るため自家受粉する。さもなければ、再生植物から得られた花粉を、農学的に重要な系統の種子から生育する植物と交雑する。逆に、所望の外来性核酸を含む本発明のトランスジェニック植物を、当業者に周知の方法を用いて栽培する。所望の外来性核酸を含む本発明のトランスジェニック植物を、当業者に周知の方法を用いて培養する。
【０２２０】
トランスジェニック細胞及び植物内の導入遺伝子の存在を確認するため、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅法またはサザンブロット解析を、当業者に公知の方法を用いて実施できる。導入遺伝子の発現産生物を、該産生物の性質に依存して、様々な方法のいずれかで検出でき、ウェスタンブロット法及び酵素アッセイを含む。一旦、トランスジェニック植物を得たならば、それらを、所望の表現型を有する植物組織または部分を産生するように生育し得る。該植物組織または部分を収穫、及び／または種子を採取し得る。種子は、所望の特徴を有する組織または部分を含む追加の植物を成長源の役割をし得る。
【０２２１】
アグロバクテリウムまたは他の形質転換方法を用いて作成したトランスジェニック植物は、１つ染色体上に単一の遺伝子座を通常含む。かかるトランスジェニック植物を、付加遺伝子についてヘミ接合であると言うことができる。より好ましくは、付加遺伝子についてホモ接合であるトランスジェニック植物、すなわち、２つの付加遺伝子を含むトランスジェニック植物、染色体対の各染色体上の同じ坐位に１つの遺伝子である。ホモ接合トランスジェニック植物を、ヘミ接合トランスジェニック植物の自家受粉、産生種子のいくつかの発芽、及び対象となる遺伝子のため得られた植物の分析により得ることができる。
【０２２２】
２つの、独立して分離する外来性遺伝子または遺伝子座を含む２つの異なるトランスジェニック植物も、遺伝子または遺伝子座の両セットを含む子孫を産生するため交雑（交配）できる。適切なＦ１子孫の自家受粉は、外来性遺伝子または遺伝子座の両方についてホモ接合である植物を産生できる。親植物との戻し交配及び非トランスジェニック植物との外交配も、植物性繁殖であると考えられる。異なる特色及び作物のため通常使用される他の繁殖方法の説明を、Ｆｅｈｒ，Ｉｎ：Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｃｕｌｔｉｖａｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｗｉｌｃｏｘ  Ｊ．ｅｄ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｇｒｏｎｏｍｙ，Ｍａｄｉｓｏｎ  Ｗｉｓ．（１９８７）に見ることができる。
【０２２３】
外来性ＲＮＡレベルの増強及び安定化した発現
サイレンシングサプレッサー
実施形態では、植物細胞、植物または植物部分は、サイレンシングサプレッサータンパク質をコードする外来性ポリヌクレオチドを含む。
【０２２４】
転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）は、細胞及びウイルスｍＲＮＡを分解ＰＴＧＳの標的にし、外来性（非相同）または内在性ＤＮＡを安定にまたは一過性に形質転換された植物または真菌内で発生し、導入された核酸と配列類似性を有するＲＮＡ分子の蓄積減少をもたらすことができるヌクレオチド配列特異的生体防御機構である。
【０２２５】
対象となる導入遺伝子とサイレンシングサプレッサーの同時発現が、該導入遺伝子から転写される細胞内に存在するＲＮＡレベルを増加させるだろうと広く考えられてきた。このことがインビトロ細胞について真実であると証明した一方、著しい副作用が多くの全植物同時発現試験で観察された。より具体的には、Ｍａｌｌｏｒｙら（２００２）、Ｃｈａｐｍａｎら（２００４）、Ｃｈｅｎら（２００４）、Ｄｕｎｏｙｅｒら（２００４）、Ｚｈａｎｇら（２００６）、Ｌｅｗｓｅｙら（２００７）及びＭｅｎｇら（２００８）に記載のように、概して構造的プロモーター下、植物発現サイレンシングサプレッサーは、しばしば、それらが商業生産に有用でなくなる程度まで表現型的に異常である。
【０２２６】
近年、ＲＮＡ分子レベルを増加できる、及び／またはＲＮＡ分子レベルを、サイレンシングサプレッサーの発現を植物またはその部分の種子に限定することにより、何世代にもわたって安定化できることが分かった（ＷＯ２０１０／０５７２４６）。本明細書で使用するとき、「サイレンシングサプレッサータンパク質」またはＳＳＰは、特に、初めに形質転換された植物から反復世代にわたって、植物細胞内の異なる導入遺伝子からの発現産生物レベルを増強する植物細胞内で発現され得るポリペプチドである。実施形態では、ＳＳＰは、ウイルスサイレンシングサプレッサーまたはその突然変異体である。大多数のウイルスサイレンシングサプレッサーは、当技術分野で公知であり、これに限定されないが、Ｐ１９、Ｖ２、Ｐ３８、Ｐｅ−Ｐｏ及びＲＰＶ−Ｐ０が挙げられる。実施形態では、ウイルスサイレンシングサプレッサーは、配列番号３８の配列を有するアミノ酸、その生物活性フラグメント、または配列番号３８と少なくとも５０％同一でありサイレンシングサプレッサーとしての活性を有するアミノ酸配列を含む。
【０２２７】
本明細書で使用するとき、「安定発現」、「安定に発現された」、「安定化された発現」及びその変化形は、ＲＮＡ分子レベルが、サイレンシングサプレッサーをコードする外来性ポリヌクレオチドを含まないアイソジェニック植物と比較したとき、反復世代、例えば、少なくとも３世代、少なくとも５世代または少なくとも１０世代にわたって、子孫植物内で本質的に同じまたはより高いことを表す。しかしながら、この語は、反復世代にわたって、ＲＮＡ分子レベルのいくらかのロス、前の世代と比較したとき、例えば、世代当たり１０％以上のロスがある可能性を除外しない。
【０２２８】
該サプレッサーを、いずれかの起源、例えば、植物、ウイルス、哺乳類、その他から選択できる。該サプレッサーを得ることができるウイルス、及び各特定のウイルスからのサプレッサーのタンパク質（例えば、Ｂ２、Ｐ１４、その他）またはコード領域指定の一覧は、ＷＯ２０１０／０５７２４６参照。サプレッサーの多重コピーを使用してもよい。異なるサプレッサーを一緒に使用してもよい（例えば、直列に）。
【０２２９】
ＲＮＡ分子
本質的に、植物種子内で発現されるのが望ましいいずれかのＲＮＡを、サイレンシングサプレッサーと同時発現できる。コードされたポリペプチドは、オイル、デンプン、炭水化物、栄養素、その他の代謝と関連し得る、またはタンパク質、ペプチド類、脂肪酸類、脂質類、ワックス類、オイル類、デンプン類、糖類、炭水化物、香料、匂い、毒素類、カロテノイド類、ホルモン類、高分子類、フラボノイド類、貯蔵タンパク質、フェノール酸類、アルカロイド類、リグニン類、タンニン類、セルロース類、糖タンパク質、糖脂質、他、好ましくは、ＴＡＧの生合成または会合体の合成に関与し得る。
【０２３０】
特定の例では、産生された植物は、アブラナ属、例えば、セイヨウアブラナまたはヒマワリ、ベニバナ、アマ、ワタ、ダイズ、カメリナ（Ｃａｍｅｌｉｎａ）またはトウモロコシなどの植物内のオイル産生のための酵素レベルを増加させた。
【０２３１】
産生されたＬＣ−ＰＵＦＡレベル
組換え細胞または種子などの植物部分内で産生されたＬＣ−ＰＵＦＡまたは複数のＬＣ−ＰＵＦＡの組合せのレベルは重要である。特定のＬＣ−ＰＵＦＡまたは関連するＬＣ−ＰＵＦＡ群、例えば、ω３ＬＣ−ＰＵＦＡもしくはω６ＬＣ−ＰＵＦＡ、もしくはＶＬＣ−ＰＵＦＡ、もしくは当技術分野で公知の方法により決定され得るその他である総脂肪酸の組成（％）として、レベルを表してよい。例えば、組換え細胞を含む物質の乾燥重量におけるＬＣ−ＰＵＦＡのパーセント、例えば、ＬＣ−ＰＵＦＡである種子の重量のパーセントなど、ＬＣ−ＰＵＦＡ含有率として、レベルを表してもよい。油料種子内で産生されたＬＣ−ＰＵＦＡが、オイル産生物のために生育されない野菜または穀類におけるより、ＬＣ−ＰＵＦＡ含有率の点でかなり高く、さらにどちらも類似のＬＣ−ＰＵＦＡ組成を有し、どちらもヒトまたは動物の食用ＬＣ−ＰＵＦＡの供給源として使用してもよいことは認識されるだろう。
【０２３２】
ＬＣ−ＰＵＦＡレベルを、当技術分野で公知の方法のいずれかにより決定してもよい。好ましい方法では、総脂質を細胞、組織または生物体から抽出し、ガスクロマトグラフィ（ＧＣ）による分析前に、脂肪酸をメチルエステルに転換する。そのような技術を実施例１に記載している。クロマトグラフィーのピーク位置を使用して各特定の脂肪酸を同定し、各ピーク下の積算面積で量を決定し得る。本明細書で使用するとき、反対に明示されない限り、試料中の特定の脂肪酸のパーセントを、クロマトグラム中の脂肪酸の総面積パーセントとして、この脂肪酸のピーク下面積から決定する。これは本質的に重量パーセント（ｗ／ｗ）に対応する。脂肪酸の同定を、ＧＣ−ＭＳにより確認し得る。総脂質を、当技術分野で公知の技術により分離してＴＡＧフラクションなどのフラクションを精製し得る。例えば、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を、分析スケールで行って、ＴＡＧの脂肪酸組成特異的に決定するために、ＤＡＧ、アシル−ＣｏＡまたはリン脂質などの他の脂質フラクションからＴＡＧを分離し得る。
【０２３３】
１つの実施形態では、抽出脂質中の脂肪酸のＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ及びＤＨＡの合計は、細胞内の総脂肪酸の約２１％から約４０％の間である。さらなる実施形態では、細胞内の総脂肪酸は、１％未満のＣ２０：１を有する。好ましい実施形態では、細胞内の抽出可能なＴＡＧは、本明細書に示されたレベルで脂肪酸を含む。本明細書に記載の脂質を定義する特徴の各可能な組合せも包含する。
【０２３４】
組換え細胞、植物または種子などの植物部分内のＬＣ−ＰＵＦＡ産生レベルを、本明細書中、「転換効率」または「酵素効率」とも呼ぶ、１つ以上の産生脂肪酸に対する特異的基質脂肪酸の転換パーセントとしても表してもよい。このパラメーターは、細胞、植物、植物部分または種子から抽出された脂質の脂肪酸組成、すなわち、１つ以上の基質脂肪酸（それ由来の全ての他脂肪酸を含む）のパーセントとして生成されたＬＣ−ＰＵＦＡ（それ由来の全ての他ＬＣ−ＰＵＦＡを含む）の量に基づく。転換パーセントの一般式は：１００ｘ（産生ＬＣ−ＰＵＦＡ及びそれ由来の全産生物のパーセント総和）／（基質脂肪酸及びそれ由来の全産生物のパーセント総和）である。ＤＰＡに関して、例えば、基質脂肪酸（例えば、ＯＡ、ＬＡ、ＡＬＡ、ＳＤＡ、ＥＴＡまたはＥＰＡ）及び該基質由来のＤＰＡを含む全産生物のレベルに対するＤＰＡレベルの比として（脂質中の総脂肪酸含有率のパーセントとして）、これを表してよい。転換パーセントまたは転換効率を、経路内の単一酵素工程、または経路の部分もしくは全体について表すことができる。
【０２３５】
具体的転換効率を式に従って本明細書中算出する：
１．  ＯＡからＤＰＡ＝１００ｘ（ＤＨＡ％＋ＤＰＡ％）／（ＯＡ、ＬＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＤＡ、ＡＬＡ、ＳＤＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ及びＤＨＡの％総和）。
２．  ＬＡからＤＰＡ＝１００ｘ（ＤＨＡ％＋ＤＰＡ）／（ＬＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＤＡ、ＡＬＡ、ＳＤＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ及びＤＨＡの％総和）。
３．  ＡＬＡからＤＰＡ＝１００ｘ（ＤＨＡ％＋ＤＰＡ％）／（ＡＬＡ、ＳＤＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ及びＤＨＡの％総和）。
４．  ＥＰＡからＤＰＡ＝１００ｘ（ＤＨＡ％＋ＤＰＡ）／（ＥＰＡ、ＤＰＡ及びＤＨＡの％総和）。
５．  ＤＰＡからＤＨＡ（Δ４−デサチュラーゼ効率）＝１００Ｘ（ＤＨＡ％）／（ＤＰＡ及びＤＨＡの％総和）。
６．  Δ１２−デサチュラーゼ効率＝１００ｘ（ＬＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＤＡ、ＡＬＡ、ＳＤＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ及びＤＨＡの％総和）／（ＯＡ、ＬＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＤＡ、ＡＬＡ、ＳＤＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ及びＤＨＡの％総和）。
７．ω３−デサチュラーゼ効率＝１００ｘ（ＡＬＡ、ＳＤＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ及びＤＨＡの％総和）／（ＬＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＤＡ、ＡＬＡ、ＳＤＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ及びＤＨＡの％総和）。
８．  ＯＡからＡＬＡ＝１００ｘ（ＡＬＡ、ＳＤＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ及びＤＨＡの％総和）／（ＯＡ、ＬＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＤＡ、ＡＬＡ、ＳＤＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ及びＤＨＡの％総和）。
９．  Δ６−デサチュラーゼ効率（ω３基質ＡＬＡ）＝１００ｘ（ＳＤＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ及びＤＨＡの％総和）／（ＡＬＡ、ＳＤＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ及びＤＨＡの％）
１０．  Δ６−エロンガーゼ効率（ω３基質ＳＤＡ）＝１００ｘ（ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ及びＤＨＡの％総和）／（ＳＤＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ及びＤＨＡの％総和）。
１１．  Δ５−デサチュラーゼ効率（ω３基質ＥＴＡ）＝１００ｘ（ＥＰＡ、ＤＰＡ及びＤＨＡの％総和）／（ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ及びＤＨＡの％総和）。
１２．  Δ５−エロンガーゼ効率（ω３基質ＥＰＡ）＝１００ｘ（ＤＰＡ及びＤＨＡの％総和）／（ＥＰＡ、ＤＰＡ及びＤＨＡの％総和）。
【０２３６】
本発明の脂質、好ましくは、種子オイルの脂肪酸組成は、総ω６脂肪酸：総ω３脂肪酸または新ω６脂肪酸：新ω３脂肪酸のいずれかについて、総脂肪酸含有量におけるω６脂肪酸：ω３脂肪酸の比によっても特徴付けられる。総ω６脂肪酸、総ω３脂肪酸、新ω６脂肪酸及び新ω３脂肪酸という語は、本明細書で定義した意味を有する。本明細書で例証された方法で、細胞、植物、植物部分または種子から抽出された脂質の脂肪酸組成から、比を算出する。脂質中のω６脂肪酸より大きなω３レベルを有することが望ましく、従って、１．０未満のω６：ω３比は好ましい。０．０の比は、定義されたω６脂肪酸が全く存在しないことを示し；０．０３の比を得た。このような低い比を、ω３−デサチュラーゼ、特に、本明細書に例証のピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ω３−デサチュラーゼなどの真菌ω３−デサチュラーゼと一緒にω３基質選択性を有するΔ６−デサチュラーゼの併用により達成できる。
【０２３７】
種子の重量当たりのＬＣ−ＰＵＦＡの収量を、種子中の総オイル含有率及び該オイル中のＤＰＡ％に基づいて算出してもよい。例えば、もし、キャノーラ種子のオイル含有率が約４０％（ｗ／ｗ）及びオイル中の総脂肪酸含有量の約１２％がＤＰＡであるならば、種子のＤＰＡ含有率は、約４．８％または種子グラム当たり約４８ｍｇである。約２１％のＤＰＡ含有率において、キャノーラ種子またはカメリナサティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ  ｓａｔｉｖａ）種子は、種子グラム当たり約８４ｍｇのＤＰＡ含有量を有する。従って、本発明は、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、カラシナ（Ｂ．  ｊｕｎｃｅａ）及びカメリナサティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ  ｓａｔｉｖａ）植物、及び種子グラム当たり少なくとも約８０ｍｇまたは少なくとも約８４ｍｇのＤＰＡを含む、該植物から得られた該種子を提供する。種子は、乾燥後（４〜１５％の含水）の収穫された成熟種子について標準的に、水分を含有している。本発明は、種子を得ること及び該種子からオイルを抽出することを含むオイルを得る方法、及び該オイルの使用及び本発明に記載の植物から種子を収穫することを含む種子を得る方法も提供する。
【０２３８】
ヘクタール当たり産生されたＤＰＡの量も、もし、ヘクタール当たりの種子の収量が既知または推定できるならば算出できる。例えば、オーストラリアにおけるセイヨウアブラナは、通常、ヘクタール当たり約２．５トンの種子を産生し、４０％のオイル含有率において、約１０００ｋｇのオイルを産生する。総オイル中２０．１％のＤＰＡにおいて、これは、ヘクタール当たり約２００ｋｇのＤＰＡを得る。もし、オイル含有率が５０％低下すれば、これは、それでも、ヘクタール当たり約１００ｋｇのＤＰＡを得る。
【０２３９】
現在までの証拠は、酵母または植物内で非相同に発現された、いくつかのデサチュラーゼは、いくつかのエロンガーゼとの併用で比較的低活性であることを示唆している。これを、ＬＣ−ＰＵＦＡ合成における基質としての脂肪酸のアシル−ＣｏＡ形態を使用する能力を有するデサチュラーゼの提供により軽減してもよく、これは、組換え細胞、特に、植物細胞内で利点があると思われる。効率的ＤＰＡ合成のための特に有益な組合せは、例えば、ミクロモナス・プシーラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎａｓ  ｐｕｓｉｌｌａ）Δ６−デサチュラーゼ（配列番号９）などのω３アシル基質に対する優先性を有するΔ６−デサチュラーゼ、または少なくとも９５％のアミノ酸配列の同一性を有するその変異体と、例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ω３−デサチュラーゼ（配列番号６）などの真菌ω３−デサチュラーゼとである。
【０２４０】
本明細書で使用するとき、「本質的に含まない」という語は、組成物（例えば、液体またはオイル）が規定の成分をほとんど（例えば、約０．５％未満、約０．２５％未満、約０．１％未満、または約０．０１％未満）または全く含まないことを意味する。実施形態では、「本質的に含まない」は、ルーチンの分析技術、例えば、特定の脂肪酸（ω６−ドコサペンタエン酸など）を、実施例１で概要を述べたガスクロマトグラフィを用いて、成分を検出できないことを意味する。
【０２４１】
実施形態では、（本発明の、または本発明のプロセス／方法で用いられる）本発明の抽出脂質、抽出オイル、植物、もしくはたとえば種子など植物の一部、飼料、または本発明の組成物は、全シス−６，９，１２，１５，１８−ヘネイコサペンタエン酸（ｎ−３  ＨＰＡ）を含まない。
【０２４２】
オイルの製造
当技術分野においてルーチンに実施される技術を、本発明の細胞、植物、種子、その他により産生されたオイルを抽出、処理、及び分析するために使用できる。通常、植物種子を調理し、圧力をかけ、抽出して粗オイルを製造し、それから該オイルを脱ガムし、精製し、脱色し、脱臭する。概して、種子を粉砕する技術は、当技術分野において公知である。例えば、油料種子を、水との噴霧により適度な柔らかさにして、例えば、含水率を８．５％まで上げることができ、０．２３〜０．２７ｍｍのギャップ設定した平滑ローラーを用いてフレーク状にする。種子のタイプに応じて、粉砕前に水を添加しなくてもよい。加熱は酵素を不活性化させ、さらなる細胞破壊を促進し、油滴を凝集させ、タンパク質粒子を凝集させる。これらの全ては、抽出処理を促進する。
【０２４３】
実施形態では、種子オイルの大部分を、スクリュープレスを通過させることにより遊離する。それから、スクリュープレスから追い出されたケーキを、熱追跡カラム（ｈｅａｔ  ｔｒａｃｅｄ  ｃｏｌｕｍｎ）を用いて、例えば、ヘキサンで溶媒抽出する。あるいは、圧搾操作により製造された粗オイルを、溝付きワイヤー排液上蓋を有する沈降タンクを通過させて、圧搾操作中のオイルで発現された固形物を除去できる。澄ませたオイルを板枠式圧濾機を通過させて、残った微細な固形粒子を除去できる。必要に応じて、抽出処理から回収されたオイルを、澄ませたオイルと合わせて、配合粗オイルを製造できる。
【０２４４】
一旦、溶媒を粗オイルから取り除くと、圧搾及び抽出部分を合わせたものに対して、通常のオイル処理方法を行う。本明細書で使用するとき、本発明の脂質またはオイルと組み合わせて使用されるとき、「精製された」という語は、抽出脂質またはオイルに対して、脂質／オイル成分の純度を上げる１つ以上の処理工程を行うことを意味する。例えば、精製工程は、脱ガム、脱臭、脱色、乾燥及び／または抽出オイルの分取から成る群の１つ以上または全てを含み得る。しかしながら、本明細書で使用するとき、「精製された」という語は、総脂肪酸含有物のパーセントとしてＤＰＡ含有率を増加させるように、本発明の脂質またはオイルの脂肪酸組成を変更するエステル交換反応処理または他の処理を含まない。言い換えれば、精製された脂質またはオイルの脂肪酸組成は、未精製の脂質またはオイルと本質的に同じである。
【０２４５】
脱ガム
脱ガムはオイル精製の初期工程であり、その主な目的は、総抽出脂質の約１〜２％存在し得る、該オイルからリン脂質のほとんどを除去することである。７０〜８０℃において、リン酸を通常含む、約２％の水を粗オイルに添加すると、微量金属及び顔料と会合したリン脂質のほとんどが分離する。除去された不溶性物質は、主に、リン脂質及びトリアシルグリセロールの混合物であり、レクチンとしても公知である。濃縮リン酸を粗種子オイルに添加することにより、脱ガムを実行し、水和可能でないホスファチド類を水和可能な形態に転換して、存在する少量の金属をキレート化できる。ガムを遠心分離により種子オイルから分離する。
【０２４６】
アルカリ精製
アルカリ精製は、時折、中和とも呼ばれる、粗オイルの処理の精製方法の１つである。通常、脱ガム後、脱色前に行う。脱ガム後、十分量のアルカリ溶液の添加により、種子オイルを処理して、脂肪酸及びリン酸の全てを滴定し、こうして生成した石鹸を除去し得る。適切なアルカリ物質としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化リチウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム及び水酸化アンモニウムが挙げられる。この方法は、通常、室温において実行され、遊離脂肪酸部分を除去する。石鹸を遠心分離または石鹸を溶媒に抽出することにより除去し、中和オイルを水で洗浄する。必要であれば、オイル中の過剰アルカリを、塩酸または硫酸などの適切な酸で中和してもよい。
【０２４７】
脱色
脱色は、漂白土（０．２〜２．０％）の存在下、酸素の非存在下、窒素または蒸気でまたは真空中での操作により、９０〜１２０℃において、１０〜３０分間、オイルを加熱する精製方法である。オイル処理のこの工程は、望まれない顔料（カロテノイド、クロロフィル、ゴシポール、他）を除去するように設計されており、この方法は、酸化生成物、微量金属、イオウ化合物及び微量の石鹸も除去する。
【０２４８】
脱臭
脱臭は、高温（２００〜２６０℃）及び低圧（０．１〜１ｍｍＨｇ）におけるオイル及び脂肪の処理である。通常、約０．１ｍｌ／分／１００ｍｌの種子オイルの速度で種子オイル中に蒸気を導入することにより、これを実施する。約３０分のスパージ後、種子オイルを真空下冷却させる。種子オイルを、通常、ガラス容器に移動して、冷蔵貯蔵する前にアルゴンを流す。この処理により、種子オイルの色を改善し、揮発性物質または残っている遊離脂肪酸、モノアシルグリセロール及び酸化生成物を含む臭気化合物の大部分を除去する。
【０２４９】
脱ろう
脱ろうは、オイル及び脂肪を、周囲以下の温度における結晶化により固体（ステアリン）及び液体（オレイン）フラクションに分離するため、オイルの商業生産で時々使用される方法である。最初に、綿実油に応用され、固形分のない製品を製造した。オイルの飽和脂肪酸含有量を減少させるために、通常使用される。
【０２５０】
エステル交換反応
本明細書で使用するとき、「エステル交換反応」は、ＴＡＧ内及びＴＡＧ間で脂肪酸を交換または脂肪酸を別のアルコールに転移してエステルを生成する方法を意味する。これは、遊離脂肪酸としてＴＡＧから脂肪酸を遊離することを最初に含み得る、または直接、脂肪酸エステル、好ましくは、脂肪酸メチルエステルまたはエチルエステルを生成し得る。メタノールまたはエタノールなどのアルコールとＴＡＧとのエステル交換反応では、アルコールのアルキル基は、ＴＡＧのアシル基（ＤＰＡを含む）とのエステル結合を生成する。分取方法と合わせたとき、エステル交換反応を、脂質の脂肪酸組成の修飾のため使用できる（Ｍａｒａｎｇｏｎｉら、１９９５）。エステル交換反応は、化学的（例えば、強酸または塩基触媒）または酵素的手段のいずれかを使用でき、後者は、ＴＡＧの脂肪酸に対して位置特異的（ｓｎ−１／３またはｓｎ−２特異的）であり得る、または他よりいくつかの脂肪酸に対して選択性を有するリパーゼを使用する（Ｓｐｅｒａｎｚａら、２０１２）。オイル中のＬＣ−ＰＵＦＡ濃度を上昇させる脂肪酸分取を、例えば、凍結結晶化、尿素を用いた複合体形成、分子蒸留、超臨界流体抽出法、カウンターカレントクロマトグラフィー及び銀イオン錯体化などの、当技術分野で公知の方法のいずれかにより実施できる。尿素との複合体形成は、オイル中の飽和及び一価不飽和脂肪酸レベルを低下するのにその簡便さ及び効率のため、好ましい方法である（Ｇａｍｅｚら、２００３）。初めに、オイルのＴＡＧを、酸または塩基触媒反応条件下のいずれかで加水分解により、しばしば、脂肪酸エステルの形態で、その構成脂肪酸に分割し、それにより、生成したアルキルアステルと生成されたまたはリパーゼによるグリセロールとの分離が可能であるように過剰のアルコールを含む、少なくとも３モルのアルコール（例えば、エチルエステルにはエタノールまたはメチルエステルにはメタノール）と、ＴＡＧの１モルを反応する。それから、処理により脂肪酸組成が通常変更されない、これらの遊離脂肪酸または脂肪酸エステルを複合体生成のため、尿素のエタノール溶液と混合してもよい。飽和及び一価不飽和脂肪酸は、容易に尿素と複合体を形成し、冷却により晶出し、その後、濾過により除去してもよい。非尿素複合フラクションは、それにより、ＬＣ−ＰＵＦＡが豊富となる。
【０２５１】
飼料
本発明は、飼料として使用できる組成物を含む。本発明の目的のため、「飼料」は、体に取り込まれたとき、（ａ）栄養を与えるまたは組織を蓄積するまたはエネルギーを供給する役割をし；及び／または（ｂ）充分な栄養状態または代謝機能を維持、回復または支持するヒトまたは動物の食用の食物または製剤を含む。本発明の飼料としては、例えば、乳児用調整粉乳、及び本発明のシードミールなどの乳児及び／または幼児のための栄養組成物が挙げられる。
【０２５２】
本発明の飼料は、例えば、本発明の細胞、本発明の植物、本発明の植物部分、本発明の種子、本発明の抽出物、本発明の方法の産生物、本発明の発酵処理産生物、または適切な担体を伴う組成物を含む。「担体」という語は、栄養価値を有していても有していなくてもよいいずれかの成分を包含するという広義の意味で使用される。熟練者が認識するように、担体は、飼料を消費する生物に対して有害な影響を有しないように、該飼料中に使用に適切（または充分に低濃度で使用される）でなければならない。
【０２５３】
本発明の飼料は、本明細書に記載の方法の使用、細胞または植物により直接または間接的に産生されたオイル、脂肪酸エステル、または脂肪酸を含む。組成物は、固体または液体のいずれかであってよい。加えて、組成物は、特定の使用に望ましい量で、食用多量栄養素、タンパク質、炭水化物、ビタミン類、及び／またはミネラル類を含んでもよい。これらの成分量は、該組成物が、正常な個体が使用するのか、代謝障害等に患っている個体などの専門的ニーズを有する個体が使用するのか、どちらを意図するかに依って異なるだろう。
【０２５４】
栄養価値を有する適切な担体の例としては、これに限定されないが、食用脂肪などの多量栄養素、炭水化物及びタンパク質が挙げられる。かかる食用脂肪の例としては、これに限定されないが、ココナツオイル、ルリジサオイル、真菌オイル、黒潮オイル、ダイズオイル、及びモノ−及びジグリセリドが挙げられる。かかる炭水化物の例としては（これに限定されないが）：グルコース、食用ラクトース、及び加水分解デンプンが挙げられる。さらに、本発明の栄養組成物で利用され得るタンパク質の例としては、（これに限定されないが）ダイズタンパク質、電気透析ホエー、電気透析スキムミルク、ミルクホエー、またはこれらのタンパク質の加水分解産物が挙げられる。
【０２５５】
ビタミン類及びミネラル類に関して、本発明の飼料組成物に、以下のものを添加してもよい：カルシウム、リン、カリウム、ナトリウム、塩化物、マグネシウム、マンガン、鉄、銅、亜鉛、セレン、ヨウ素、及びビタミンＡ、Ｅ、Ｄ、Ｃ、及びビタミンＢ複合体が挙げられる。他のかかるビタミン類及びミネラル類も添加してよい。
【０２５６】
本発明の飼料組成物で利用される成分は、半精製または精製された原料であり得る。半精製または精製というのは、天然物質の精製またはデノボ合成により準備された物質を意味する。
【０２５７】
本発明の飼料組成物を、食事補給を必要としないときでさえ、食物に添加してもよい。例えば、該組成物を、（これに限定されないが）：マーガリン、モディファイドバター、チーズ、牛乳、ヨーグルト、チョコレート、キャンディー、スナック類、サラダオイル、料理用油、料理用油脂、肉類、魚及び野菜類を含む、いずれかのタイプの食物に添加してよい。
【０２５８】
加えて、本発明に従って産生された脂肪酸または対象遺伝子を含み発現するように形質転換された宿主細胞を、ヒトまたは動物の食用により望ましいものに、動物の蘇生器、卵または乳脂肪酸組成物を変えるための動物用栄養補助食品としても使用してよい。かかる動物の例としては、ヒツジ、ウシ、ウマ、ニワトリ等の家禽類が挙げられる。
【０２５９】
さらに、本発明の飼料を、例えば、ヒトまたは動物の食用エビなどの魚または甲殻類の脂肪酸レベルの増加させるように水産養殖で使用できる。好ましい魚はサケである。
【０２６０】
本発明の好ましい飼料は、ヒトまたは他の動物用食物または餌として直接使用され得る葉及び幹などの植物、種子及び他の植物部分である。例えば、動物は、畑で成育したそのような植物を直接食べてもよい、または制御された給餌でより計量された量を与えられてもよい。本発明は、ヒトまたは他の動物のＬＣ−ＰＵＦＡレベルを増加するために食料としてかかる植物及び植物部分の使用を含む。
【０２６１】
実施形態では、飼料は、本発明の脂質またはオイルを含む乳児用調製粉乳である。本明細書において用いられる場合、「乳児用調製粉乳」とは、乳児の栄養要求の少なくとも一部を満たす非天然組成物を意味する。「乳児」とは、出生時から、１歳を超えない範囲の年齢のヒト対象を意味し、０から１２か月の間の補正年齢の乳児を含む。「補正年齢」という文言は、乳児が未熟児であった期間を引いた乳児の実年齢を意味する。従って、補正年齢は、もしその乳児が正期産で生まれた場合の乳児の年齢である。本明細書において用いられる場合「非天然」とは、その生成物は自然界には存在しないが、ヒトの介入により生成されることを意味する。本明細書において用いられる場合、本発明の乳児用調製粉乳は、純粋なヒトの母乳（Ｋｏｌｅｔｚｋｏら、１９８８）及び非ヒト動物により産生された純粋な乳は含まないが、本発明の乳児用調製粉乳は、たとえばホエータンパク質もしくはラクトースなどの、乳のタンパク質または炭水化物などの、乳由来の成分は含みうる。本発明の乳児用調製粉乳は、たとえば牛肉、海獣肉、鯨肉または魚類などの天然の食肉は含まないが、本発明の乳児用調製粉乳は、たとえばこれらの源由来のタンパク質などの成分は含みうる。本発明の乳児用調製粉乳は、総脂肪酸含有量の好ましくは０．０５重量％から約０．５重量％の間のレベルで本発明のＤＰＡを含む脂質を常に含有する。該ＤＰＡは、ＴＡＧとして、リン脂質として、または非エステル化脂肪酸として、またはそれらの混合物として存在しうる。本発明の脂質またはオイルは、当分野に公知の方法を用いて乳児用調製粉乳に混合されてもよい。たとえば、当業者であれば、ＤＰＡが、下記文献中に記載されている１つ以上の多価不飽和脂肪酸に加えて添加されている、または代わりに添加されている、ＷＯ２００８／０２７９９１、ＵＳ２０１５０１５７０４８、ＵＳ２０１５０９４３８２及びＵＳ２０１５０１４８３１６に記載されている方法を一般的に用いて、本発明の乳児用調製粉乳を容易に製造することができる。
【０２６２】
１つの例において、乳児用調製粉乳は、ＤＰＡ（すなわち、本明細書に記載されるオメガ−３  ＤＰＡ）を、任意選択的にプレバイオティクス、特にポリデキストロース（ＰＤＸ）及びガラクト−オリゴ糖（ＧＯＳ）、非ヒト源由来のラクトフェリン、ならびに他の長鎖多価不飽和脂肪酸（ＬＣ−ＰＵＦＡ）と共に含む。一部の実施形態では、栄養組成物は、ＳＤＡ及び／またはガンマ−リノレン酸（ＧＬＡ）をさらに含む。ある実施形態では、乳児用調製粉乳は、約７ｇ／１００ｋｃａｌ以下の脂肪源または脂質源、より好ましくは約３ｇ／１００ｋｃａｌ〜約７ｇ／１００ｋｃａｌの脂肪源または脂質源を含み、この場合において、該脂肪源または脂質源は、少なくとも約０．５ｇ／１００ｋｃａｌ、より好ましくは約１．５ｇ／１００ｋｃａｌ〜約７ｇ／１００ｋｃａｌ；約７ｇ／１００ｋｃａｌ以下のタンパク質源またはタンパク質相当の源、より好ましくは約１ｇ／１００ｋｃａｌ〜約７ｇ／１００ｋｃａｌのタンパク質源またはタンパク質相当の源；及び少なくとも約５ｇ／１００ｋｃａｌの炭水化物、より好ましくは約５ｇ〜約２５ｇ／１００ｋｃａｌの炭水化物を含む。乳児用調製粉乳は、１）少なくとも約１０ｍｇ／１００ｋｃａｌのラクトフェリン、より好ましくは約１０ｍｇ／１００ｋｃａｌ〜約２００ｍｇ／１００ｋｃａｌのラクトフェリン；２）約０．１ｇ／１００ｋｃａｌ〜約１ｇ／１００ｋｃａｌのＰＤＸ及びＧＯＳを含有するプレバイオティクス組成物；及び３）ＤＨＡを含有する少なくとも約５ｍｇ／１００ｋｃａｌの追加のＬＣ−ＰＵＦＡ（すなわち、ＤＰＡ以外のＬＣ−ＰＵＦＡ）、より好ましくはＤＨＡを含有する５ｍｇ／１００ｋｃａｌ〜約７５  ｍｇ／１００ｋｃａｌの追加のＬＣ−ＰＵＦＡ、のうちの１つ以上、またはすべてをさらに含んでもよい。
【０２６３】
実施形態では、乳児用調製粉乳の総脂肪酸含有量におけるＤＰＡ：ＤＨＡの比率は、１：３と２：１の間である。ＥＰＡが存在してもよいが、存在しないほうが好ましい。もし存在する場合、総脂肪酸含有量におけるＥＰＡ：ＤＰＡの比率は、好ましくは１：２未満、より好ましくは１：５未満である。ＡＲＡが存在しなくてもよいが、存在するほうが好ましく、総脂肪酸含有量におけるＡＲＡ：ＤＰＡの比率は、好ましくは、１：３と２：１の間である。最も好ましくは、乳児用調製粉乳中の各ＬＣ−ＰＵＦＡのレベルは、任意のヒト母乳中に見られるレベルとほぼ同じであり、ヒト母乳は、自然状態で、母体の年齢、遺伝的素因、食事摂取量、及び栄養状態により変動を示す。たとえば、Ｋｏｌｅｔｚｋｏら、（１９８８）を参照のこと。好ましい実施形態では、乳児用調製粉乳は、検出可能レベルのヘネイコサペンタエン酸（ＨＰＡ、２１：５ω３）を含まない。
【０２６４】
たとえば、乳児用調製粉乳とは、液体、粉末、ゲル、ペースト、固形物、濃縮物、懸濁液、またはすぐに使用可能な形態の経腸調製物、経口調製物、乳児用の調製物を指し得る。
【０２６５】
本開示において有用なプレバイオティクスは、ポリデキストロース、ポリデキストロース粉末、ラクツロース、ラクトスクロース、ラフィノース、グルコ−オリゴ糖、イヌリン、フルクト−オリゴ糖、イソマルト−オリゴ糖、ダイズオリゴ糖、ラクトスクロース、キシロ−オリゴ糖、キト−オリゴ糖、マンノ−オリゴ糖、アリビノ−オリゴ糖、シアリル−オリゴ糖、フコ−オリゴ糖、ガラクト−オリゴ糖、及びゲンチオ−オリゴ糖を含んでもよい。
【０２６６】
また、本開示の栄養組成物にラクトフェリンが含まれてもよい。ラクトフェリンは種によって１〜４個のグリカンを含有する約８０ｋＤの単鎖ポリペプチドである。異種のラクトフェリンの３Ｄ構造は非常に似ているが、同じではない。各ラクトフェリンはＮローブ及びＣローブと呼ばれる２つの対応するローブを含有し、それぞれ該分子のＮ末端部分とＣ末端部分を指す。
【０２６７】
タンパク質源またはタンパク質相当の源は、たとえば無脂肪乳、ホエータンパク質、カゼイン、大豆タンパク質、タンパク質加水分解物、アミノ酸などの当分野で用いられている任意のものであってもよい。本開示の実施に有用なウシの乳タンパク質源としては、限定されないが、乳タンパク質粉末、乳タンパク質濃縮物、乳タンパク質単離物、無脂肪乳固形物、無脂肪乳、脱脂粉乳、ホエータンパク質、ホエータンパク質単離物、ホエータンパク質濃縮物、スイートホエー、酸ホエー、カゼイン、酸カゼイン、カゼイン塩（たとえばカゼインナトリウム、カゼインナトリウムカルシウム、カゼインカルシウムなど）、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【０２６８】
適切な炭水化物源は、たとえばラクトース、グルコース、フルクトース、コーンシロップ固形物、マルトデキストリン、スクロース、デンプン、ライスシロップ固形物などの当分野で用いられる任意のものであってもよい。栄養組成物中の炭水化物成分の量は、少なくとも約５ｇ／１００ｋｃａｌであり、一般的には約５ｇと約２５ｇ／１００ｋｃａｌの間で変化し得る。一部の実施形態では、該炭水化物の量は、約６ｇと約２２ｇ／１００ｋｃａｌの間である。他の実施形態では、該炭水化物の量は、約１２ｇと約１４ｇ／１００ｋｃａｌの間である。一部の実施形態では、コーンシロップ固形物が好ましい。さらに、加水分解された、部分的に加水分解された、及び／または十分に加水分解された炭水化物が、その消化の容易さを理由として、栄養組成物中での含有に望ましい場合がある。具体的には、加水分解された炭水化物は、アレルゲンとなるエピトープを含有する可能性が低い。本明細書における使用に適した炭水化物性物質の非限定的な例としては、トウモロコシ、タピオカ、コメ、またはジャガイモを源とする、加水分解されたまたは損なわれていない、天然または化学修飾された、ワックス形態または非ワックス形態のデンプンが挙げられる。適切な炭水化物の非限定的な例としては、加水分解されたコーンスターチ、マルトデキストリン、マルトース、コーンシロップ、デキストロース、コーンシロップ固形物、グルコース、及び様々な他のグルコースポリマー、ならびにそれらの組み合わせとして特徴づけられる様々な加水分解されたデンプンが挙げられる。他の適切な炭水化物の非限定的な例としては、スクロース、ラクトース、フルクトース、高フルクトースコーンシロップとしばしば呼称されるもの、たとえばフルクトオリゴ糖などの消化しにくいオリゴ糖、及びそれらの組み合わせ、が挙げられる。
【０２６９】
好ましくは、対象の１日栄養所要量を供給するのに十分な量の１つ以上のビタミン及び／またはミネラルが乳児用調製粉乳に加えられていてもよい。当分野の当業者であれば、該ビタミン及びミネラル要求量は、たとえば小児の年齢に基づき変化することが理解されるであろう。栄養組成物は、任意選択的に、限定されないが、以下のビタミンまたはその誘導体を１つ以上含みうる：ビタミンＢ１（チアミン、チアミンピロリン酸、ＴＰＰ、チアミン三リン酸、ＴＴＰ、チアミン塩酸塩、チアミン硝酸塩）、ビタミンＢ２（リボフラビン、フラビンモノヌクレオチド、ＦＭＮ、フラビンアデニンジヌクレオチド、ＦＡＤ、ラクトフラビン、オボフラビン）、ビタミンＢ３（ナイアシン、ニコチン酸、ニコチンアミド、ナイアシンアミド、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ＮＡＤ、ニコチン酸モノヌクレオチド、ＮｉｃＭＮ、ピリジン−３−カルボン酸）、ビタミンＢ３前駆体トリプトファン、ビタミンＢ６（ピリドキシン、ピリドキサール、ピリドキサミン、塩酸ピリドキシン）、パントテン酸（パントテン酸塩、パンテノール）、葉酸塩（葉酸、フォラシン、プテロイルグルタミン酸）、ビタミンＢ１２（コバラミン、メチルコバラミン、デオキシアデノシルコバラミン、シアノコバラミン、ヒドロキシコバラミン、アデノシルコバラミン）、ビオチン、ビタミンＣ（アスコルビン酸）、ビタミンＡ（レチノール、酢酸レチニル、パルミチン酸レチニル、他の長鎖脂肪酸を有するレチニルエステル、レチナール、レチノイン酸、レチノールエステル）、ビタミンＤ（カルシフェロール、コレカルシフェロール、ビタミン３、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ）、ビタミンＥ（α−トコフェロール、α−酢酸トコフェロール、α−コハク酸トコフェロール、α−ニコチン酸トコフェロール、α−トコフェロール）、ビタミンＫ（ビタミンＫ１、フィロキノン、ナフトキノン、ビタミンＫ２、メナキノン−７、ビタミンＫ３、メナキノン−４、メナジオン、メナキノン−８、メナキノン−８Ｈ、メナキノン−９、メナキノン−９Ｈ、メナキノン−１０、メナキノン−１１、メナキノン−１２、メナキノン−１３）、コリン、イノシトール、β−カロテン、及びそれらの任意の組み合わせ。さらに、栄養組成物は、任意選択的に、限定されないが、以下のミネラルまたはその誘導体を１つ以上含み得る：ホウ素、カルシウム、酢酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、塩化カルシウム、乳酸カルシウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、塩素、クロム、塩化クロム、クロミウムピコロネート、銅、硫酸銅、グルコン酸銅、硫酸銅、フッ素、鉄、カルボニル鉄、第二鉄、フマル酸第一鉄、リン酸第二鉄、鉄粉砕物（ｉｒｏｎ  ｔｒｉｔｕｒａｔｉｏｎ）、多糖鉄、ヨウ化物、ヨウ素、マグネシウム、炭酸マグネシウム、水酸化マグネシウム、酸化マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、マンガン、モリブデン、リン、カリウム、リン酸カリウム、ヨウ化カリウム、塩化カリウム、酢酸カリウム、セレニウム、硫黄、ナトリウム、ドキュセートナトリウム、塩化ナトリウム、セレン酸ナトリウム、モリブデン酸ナトリウム、亜鉛、酸化亜鉛、硫酸亜鉛、及びそれらの混合物。ミネラル化合物の非限定的な誘導���例としては、塩、アルカリ塩、エステル、及び任意のミネラル化合物のキレートが挙げられる。ミネラルは、たとえばリン酸カルシウム、グリセロールリン酸カルシウム、クエン酸ナトリウム、塩化カリウム、リン酸カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸亜鉛、硫酸銅、硫酸マンガン、及びセレン酸ナトリウムなどの塩の形態で栄養組成物に添加されてもよい。当分野内で公知の追加のビタミン及びミネラルが添加されてもよい。
【０２７０】
実施形態では、本発明の乳児用調製粉乳、または本発明を用いて作製される乳児用調製粉乳は、ＤＰＡを含有するヒトの乳もしくは動物の乳またはそれらの抽出物を含まない。
【０２７１】
他の実施形態では、乳児用調製粉乳の総脂肪酸含有量におけるオメガ−６ＤＰＡのレベルは２％未満であり、好ましくは１％未満であり、または０．１％〜２％の間であり、より好ましくは含まれていない。
【０２７２】
組成物
本発明は、組成物、特に、１つ以上の脂肪酸及び／または好ましくは、脂肪酸のエチルエステルの形態の、本発明の方法を用いて産生され得られたオイルを含む医薬組成物も包含する。
【０２７３】
医薬組成物は、標準的で周知の無毒性薬剤的に許容可能な担体、賦形剤またはリン酸緩衝食塩水、水、エタノール、ポリオール類、植物油類、湿潤剤または、水／油エマルジョンなどの、エマルジョンなどの媒体と組み合わせて、１つ以上の脂肪酸及び／またはオイルを含んでよい。組成物は、液体または固体のいずれかであってよい。例えば、組成物は、錠剤、カプセル剤、接種可能な液体もしくは散剤、注射剤、または局所軟膏剤もしくはクリーム剤の形態であってよい。適切な流動性を、例えば、分散剤の場合では必要な粒径の維持及び界面活性剤の使用により維持できる。等張剤、例えば、糖類、塩化ナトリウム等を含むことも望ましい場合がある。そのような不活性希釈剤に加えて、組成物は、湿潤剤、乳化及び懸濁剤、甘味料、香味料及び芳香剤などのアジュバントも含むことができる。
【０２７４】
活性化合物に加えて、懸濁剤は、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンエステル、結晶セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天、及びトラガカントまたはこれらの物質の混合物を含んでよい。
【０２７５】
錠剤及びカプセル剤などの固体剤形を、当技術分野で周知の技術を用いて製剤できる。例えば、本発明に従って産生された脂肪酸を、アカシア、コーンスターチまたはゼラチンなどの結合剤、ジャガイモデンプンまたはアルギン酸などの崩壊剤、及びステアリン酸またはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤と組み合わせて、ラクトース、ショ糖、及びコーンスターチなどの従来の錠剤用基材で打錠できる。カプセル剤を、酸化防止剤及び関連する脂肪酸と共に、ゼラチンカプセル中にこれらの賦形剤を組み込むことにより製剤できる。
【０２７６】
静脈内投与のため、本発明に従って産生した脂肪酸またはその誘導体を、市販製剤中に組み入れてもよい。
【０２７７】
特定の脂肪酸の典型的投与量は、１日１〜５回の服用で、０．１ｍｇ〜２０ｇ（１日１００ｇまで）であり、好ましくは、１日約１０ｍｇ〜約１、２、５、または１０ｇの範囲（１回または複数回投与で服用）である。当技術分野で公知のように、最小約３００ｍｇ／日の脂肪酸、特にＬＣ−ＰＵＦＡが望ましい。しかしながら、いずれの量の脂肪酸も対象に有益であろうと考えられる。
【０２７８】
本発明の医薬組成物の可能な投与経路としては、例えば、経腸（例えば、経口及び直腸）及び非経口が挙げられる。例えば、液体製剤を、経口または直腸投与してよい。加えて、均一混合物を無菌条件下で、生理学的に許容可能な希釈剤、防腐剤、緩衝剤またはスプレー剤もしくは吸入剤を作成するための噴霧剤と混合した水中に完全に分散できる。
【０２７９】
患者に投与される組成物の投与量を、当業者が決定してよく、患者の体重、患者の年齢、患者の健康全般、患者の病歴、患者の免疫状態、他に依存する。
【０２８０】
加えて、本発明の組成物を、化粧品目的用に利用してもよい。混合物を生成または対象となる発明に従って産生した脂肪酸を化粧品組成物中の単独「活性」成分として使用してもよいように、既に存在する化粧品組成物に添加してよい。
【実施例】
【０２８１】
実施例１．物質及び方法
一過性発現系の植物細胞内の遺伝子の発現
外来性遺伝子構築物を、Ｖｏｉｎｎｅｔら（２００３）及びＷｏｏｄら（２００９）により記載されたように、本質的に一過性発現系の植物細胞内で発現した。
【０２８２】
脂肪酸のガスクロマトグラフィ（ＧＣ）分析
３０ｍ  ＳＧＥ−ＢＰＸ７０カラム（７０％シアノプロピルポリシルフェニレン−シロキサン、内径０．２５ｍｍ、膜厚０．２５ｍｍ）、ＦＩＤ、スプリット／スプリットレスインジェクター及びＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ７６９３シリーズオートサンプラー及びインジェクターを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ７８９０Ａ  ＧＣ（米国カリフォルニア州パロアルト）を用いてガスクロマトグラフィにより、ＦＡＭＥを分析した。キャリアガスとしてヘリウムを使用した。１５０℃のオーブン温度において、スプリットモード（比５０：１）で試料を注入した。注入後、オーブン温度を１分間１５０℃で保持し、その後、３℃／分で２１０℃まで上昇させ、再度、５０℃／分で２４０℃まで上昇させ、最終的に２４０℃で１．４分保持した。外部標準ＧＬＣ−４１１（Ｎｕｃｈｅｃｋ）及びＣ１７：０−ＭＥ内部標準の既知量の応答に基づいて、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェア（Ｒｅｖ  Ｂ．０４．０３（１６）、米国カリフォルニア州パロアルト）を用いて、ピークを定量化した。
【０２８３】
脂質の液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）
開花後１２日目（ｄａｆ）、凍結乾燥した発育種子及び内部定量標準としてトリ−Ｃ１７：０−ＴＡＧの既知量を添加後の成熟種子から総脂質を抽出した。乾燥物質５ｍｇ当たりブタノール：メタノール（１：１ｖ／ｖ）中の１０ｍＭブチル化ヒドロキシトルエン１ｍＬ中に抽出脂質を溶解し、Ａｇｉｌｅｎｔ１２００シリーズＬＣ及び６４１０ｂエレクトロスプレーイオン化トリプル四重極ＬＣ−ＭＳを用いて分析した。流速０．２ｍＬ／分でバイナリーグラジエントを用いて、Ａｓｃｅｎｔｉｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＲＰ−アミドカラム（５０ｍｍ  ｘ  ２．１ｍｍ、２．７μｍ、Ｓｕｐｅｌｃｏ）を用いて、液体をクロマトグラフィー法で分離した。移動相は：Ａ．１０ｍＭギ酸アンモニウム水溶液：メタノール：テトラヒドロフラン（５０：２０：３０ｖ／ｖ／ｖ）；Ｂ．１０ｍＭギ酸アンモニウム水溶液：メタノール：テトラヒドロフラン（５：２０：７５ｖ／ｖ／ｖ）。多重反応モニタリング（ＭＲＭ）リストは、コリジョンエネルギー３０Ｖ及びフラグメンタ６０Ｖを用いて、次の主要脂肪酸：１６：０、１８：０、１８：１、１８：２、１８：３、１８：４、２０：１、２０：２、２０：３、２０：４、２０：５、２２：４、２２：５、２２：６に基づいた。２２：６のニュートラルロスからアンモニアと化合したプリカーサ−イオンとプロダクトイオンに基づいて、個々のＭＲＭ  ＴＡＧを同定した。１０μＭトリステアリン外部標準を用いて、ＴＡＧを定量化した。
【０２８４】
ＬＣ−ＭＳを用いた脂質プロファイリング
Ａｇｉｌｅｎｔ６４１０Ｂエレクトロスプレーイオン化ＱＱＱ−ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ、米国カリフォルニア州パロアルト）と連結したＡｇｉｌｅｎｔ１２００シリーズＬＣを用いて、抽出した総脂質を分析した。流速０．２ｍＬ／分でバイナリーグラジエントを用いたＡｓｃｅｎｔｉｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＲＰ−アミド  ５０ｍｍ  ｘ  ２．１ｍｍ、２．７μｍ  ＨＰＬＣカラム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、オーストラリア、キャッスルヒル）を用いて、各総脂質抽出物５μＬを注入して、クロマトグラフィー法で分離した。移動相は：Ａ．１０ｍＭギ酸アンモニウム水溶液：メタノール：テトラヒドロフラン（５０：２０：３０ｖ／ｖ／ｖ）；Ｂ．１０ｍＭギ酸アンモニウム水溶液：メタノール：テトラヒドロフラン（５：２０：７５ｖ／ｖ／ｖ）。コリジョンエネルギー３０Ｖ及びフラグメンテーションエネルギー６０Ｖを用いて、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）により、選択した中性脂質（ＴＡＧ及びＤＡＧ）及びリン脂質（ＰＣ、ＰＥ、ＰＩ、ＰＳ、ＰＡ、ＰＧを含むＰＬ）を分析した。次の主要脂肪酸：１６：０（パルミチン酸）、１８：０（ステアリン酸）、１８：１ω９（オレイン酸、ＯＡ）、１８：２ω６（リノール酸、ＬＡ）、１８：３ω３（α−リノレン酸、ＡＬＡ）、１８：４ω３（ステアリドン酸、ＳＤＡ）、２０：１、２０：２、２０：３、２０：４ω３、２０：５ω３、２２：４ω３、２２：５ω３、２２：６ω３に、中性脂質を標的とし、一方、それぞれ、０−３、０−４、０−５、４−６の二重結合を有するＣ１６、Ｃ１８、Ｃ２０及びＣ２２化学種を含めてリン脂質をスキャンした。
【０２８５】
２０：１、ＳＤＡ、ＥＰＡ及びＤＨＡのニュートラルロスからアンモニアと化合したプリカーサ−イオンとプロダクトイオンに基づいて、個々のＭＲＭ  ＴＡＧを同定した。外部標準として５０μＭトリステアリン及びジステアリンを用いて、ＴＡＧ及びＤＡＧを定量化した。１０μＭのジ−１８：０−ＰＣ、ジ−１７：０−ＰＡ、ジ−１７：０−ＰＥ、１７：０−１７：１−ＰＧ、ジ−１８：１−ＰＩ及びジ−１７：０−ＰＳ外部標準（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ、米国アラバマ州アラバスター）を日いて、ＰＬを定量化した。選択したＴＡＧ、ＤＡＧ及びＰＬ化学種を、Ａｇｉｌｅｎｔ６５２０Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳ／ＭＳによりさらに確認した。
【０２８６】
種子脂肪酸プロファイル及びオイル含有率の決定
種子オイル含有率を決定する場合、種子を、２４時間デシケーター内で乾燥し、種子約４ｍｇを、テフロン加工スクリューキャップを含む２ｍｌガラスバイアル中に移動した。トルエン０．１ｍｌ中に溶解したトリヘプタデカノイン０．０５ｍｇを内部標準としてバイアルに添加した。
【０２８７】
種子ＦＡＭＥを、種子物質を含むバイアルに、１Ｎ  ＨＣｌメタノール溶液（Ｓｕｐｅｌｃｏ）０．７ｍｌを添加することにより調製し、短時間ボルテックスし、８０℃で２時間インキュベートした。室温まで冷却後、０．９％ＮａＣｌ（ｗ／ｖ）０．３ｍｌ及びヘキサン０．１ｍｌを該バイアルに添加し、Ｈｅｉｄｏｌｐｈ  Ｖｉｂｒａｍａｘ  １１０で、１０分間よく混合した。ＦＡＭＥを、０．３ｍｌガラスインサート中に集め、前述のように水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を備えたＧＣにより分析した。
【０２８８】
市販標準品ＧＬＣ−４１１（ＮＵ−ＣＨＥＫ  ＰＲＥＰ，ＩＮＣ．、米国）中に存在する同じＦＡＭＥの既知量のピーク面積応答に基づき、個々のＦＡＭＥのピーク面積を、先ず補正した。ＧＬＣ−４１１は、Ｃ８：０〜Ｃ２２：６の範囲の等量の３１種の脂肪酸（重量％）を含む。標準品中に存在しなかった脂肪酸の場合、本発明者らは、最も類似のＦＡＭＥのピーク面積応答を利用した。例えば、１６：１ｄ９のＦＡＭＥのピーク面積応答を１６：１ｄ７に使用し、Ｃ２２：６のＦＡＭＥ応答をＣ２２：５に使用した。内部標準質量との比較により、補正面積を使用して、試料中の各ＦＡＭＥの質量を算出した。オイルを、主に、ＴＡＧの形態で貯蔵し、その重量を、ＦＡＭＥの重量に基づいて算出した。各ＦＡＭＥのモル数を計算し、ＦＡＭＥの総モル数を３で割ることにより、グリセロールの総モル数を決定した。関係：オイルの重量％＝１００  ｘ  （（４１  ｘ  ＦＡＭＥ総モル数／３）＋（ＦＡＭＥ総ｇ数−（１５  ｘ  ＦＡＭＥ総モル数）））／種子ｇ数（式中、４１及び１５は、それぞれ、グリセロール部分とメチル基のモル重量である）を用いて、グリセロール及び脂肪アシル部分の総和として、ＴＡＧを算出した。
【０２８９】
オイル試料のステロール含有率の分析
内部標準としてＣ２４：０モノオールのアリコットを添加して一緒にオイル約１０ｍｇの試料を、８０％ＭｅＯＨ中５％ＫＯＨ４ｍＬを用いてけん化し、テフロン加工スクリューキャップしたガラスチューブ内で８０℃２時間加熱した。反応混合物を冷却後、ミリＱ水２ｍＬを添加し、ステロールを、振盪及びボルテックスすることにより、ヘキサン：ジクロロメタン（４：１ｖ／ｖ）２ｍＬ中に抽出した。混合物を遠心分離し、ステロール抽出物を除去し、ミリＱ水２ｍＬで洗浄した。それから、該ステロール抽出物を振盪及び遠心分離後に除去した。該抽出物を窒素ガス気流中で蒸発し、ＢＳＴＦＡ２００ｍＬを用いて、ステロールをシリル化し、８０℃で２時間加熱した。
【０２９０】
ステロールのＧＣ／ＧＣ−ＭＳ分析のため、ステロール−ＯＴＭＳｉ誘導体を４０℃においてヒートブロック上で窒素ガス気流下乾燥し、それから、ＧＣ／ＧＣ−ＭＳ分析直前に、クロロホルムまたはヘキサン中に再溶解した。Ｓｕｐｅｌｃｏ  Ｅｑｕｉｔｙ（商標）−１フューズドシリカキャピラリーカラム（１５ｍ  ｘ  ０．１ｍｍ（内径）、膜厚０．１μｍ）、ＦＩＤ、スプリット／スプリットレスインジェクター及びＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ７６８３Ｂシリーズオートサンプラー及びインジェクターを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ６８９０Ａ  ＧＣ（米国カリフォルニア州パロアルト）を用いたガスクロマトグラフィ（ＧＣ）により、ステロール−ＯＴＭＳ誘導体を分析した。キャリアーガスはヘリウムだった。オーブン温度１２０℃においてスプリットレスモードで試料を注入した。注入後、オーブン温度を、１０℃／分で２７０℃まで、最終的に、５℃／分で３００℃まで上昇させた。Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェア（米国カリフォルニア州パロアルト）を用いて、ピークを定量化した。ＧＣ結果には、個々の成分面積の±５％の誤差がある。
【０２９１】
ＧＣ−質量分光（ＧＣ−ＭＳ）分析を、Ｆｉｎｎｉｇａｎ  Ｔｈｅｒｍｏｑｕｅｓｔ  ＧＣＱ  ＧＣ＝ＭＳ及びＦｉｎｎｉｇａｎ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ＧＣ−ＭＳで行った；両システムは、オンカラムインジェクター及びＴｈｅｒｍｏｑｕｅｓｔ  Ｘｃａｌｉｂｕｒソフトウェア（米国テキサス州オースチン）を備えていた。各ＧＣは、上記のものと同様な極性のキャピラリーカラムを装着していた。質量分析データを用いて、且つ信頼ある基準及び実験室基準で得られたものと保持時間データを比較することにより、個々の成分を同定した。試料バッチと同時に、全工程のブランク分析を行った。
【０２９２】
ＲＴ−ＰＣＲ条件
順方向プライマー１０ｐｍｏｌ（ピコモル）及び逆方向プライマー３０ｐｍｏｌ、最終濃度２．５ｍＭまでのＭｇＳＯ４、緩衝剤を含むＲＮＡ合計４００ｎｇ（ナノグラム）及び製造者説明書に従ったヌクレオチド成分を用いた、体積２５μＬのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）増幅を通常に行った。典型的な温度状況は、４５℃、３０分間の１サイクルで逆転写を起こし、；それから、９４℃、２分の１サイクル、次いで、９４℃、３０秒の４０サイクル、５２℃、３０秒間、７０℃、１分間；それから、７２℃、２分間の１サイクル後、反応混合物を５℃まで冷却した。
【０２９３】
デジタルＰＣＲによる導入遺伝子のコピー数の決定
トランスジェニック植物内の導入遺伝子のコピー数を決定するため、次のように、デジタルＰＣＲ法を使用した。この方法を、植物が、本明細書に記載の遺伝子構築物のトランスジェニックであるかどうかを決定するためにも使用できるはずである。約１平方センチメートルの葉組織を、各個々の植物から収穫し、コレクションマイクロチューブ（Ｑｉａｇｅｎ）に入れた。それから、試料を２４〜４８時間凍結乾燥した。ＤＮＡ抽出物の試料を解氷のため、ステンレススチールボールベアリングを各乾燥試料に添加し、Ｑｉａｇｅｎ  Ｔｉｓｓｕｅｌｙｓｅｒでチューブを振盪した。抽出緩衝液３７５μＬ（０．１Ｍ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ８、０．０５Ｍ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８及び１．２５％ＳＤＳ）を各チューブに添加し、混合物を６５℃で１時間インキュベートし、それから、冷却後、６Ｍ酢酸アンモニウム（４℃）１８７μＬを徹底的に混合しながら各チューブに添加した。それから、試料を３０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。各チューブの上澄みを、室温で５分間ＤＮＡ沈降のためイソプロパノール２２０μＬを各々含む新しいマイクロチューブ中に取り出した。ＤＮＡを、３０００ｒｐｍで３０分間チューブを遠心分離することにより集め、ＤＮＡペレットを、７０％エタノール３２０μＬで洗浄し、乾燥後、水２２５μＬ中にＤＮＡを再懸濁した。不溶解性物質を３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離することによりペレット化し、各上澄み１５０μＬを長期貯蔵用９６ウェルプレートに移動した。
【０２９４】
効率的且つ定量的デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）のため、ＤＮＡを導入遺伝子または複数挿入の複数のコピーが物理的に分離していることを保証するため、増幅反応前に制限酵素で消化した。従って、ＤＮＡ製剤のアリコットを１０ｘＥｃｏＲＩ緩衝剤、ＤＮＡ５μＬ及び試料当たり各酵素４単位を用いて、２０μＬ体積において、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩと一緒に、３７℃で一夜インキュベートして消化した。
【０２９５】
これらのＰＣＲ反応で使用したプライマーを、参照及び標的遺伝子用プライマーが相互作用すると予測されない、またはかかる相互作用が使用条件下問題とならないと確認するため、Ｐｒｉｍｅｒ３ソフトウェアを用いて設計した。アッセイに使用する参照遺伝子は、セイヨウアブラナゲノム当たり１つの遺伝子に存在するアブラナＨｍｇ（高移動度群）遺伝子であった（Ｗｅｎｇら、２００４）。セイヨウアブラナは異質四倍体であるので、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）において、Ｈｍｇ遺伝子の４コピー、すなわち、２つの遺伝子の各々の２つのアレルがあると分かった。参照遺伝子反応は、プライマー対及び以下の二重標識プローブを使用した：センスプライマー、Ｃａｎ１１  ＧＣＧＡＡＧＣＡＣＡＴＣＧＡＧＴＣＡ（配列番号５０）；アンチセンスプライマー、Ｃａｎ１２  ＧＧＴＴＧＡＧＧＴＧＧＴＡＧＣＴＧＡＧＧ（配列番号５１）；プローブ、Ｈｍｇ−Ｐ３  ５’−Ｈｅｘ／ＴＣＴＣＴＡＣ／ｚｅｎ／ＣＣＧＴＣＴＣＡＣＡＴＧＡＣＧＣ／３ＩＡＢｋＦＱ／−３’（配列番号５２）。増幅産生物サイズは７３ｂｐであった。
【０２９６】
全てのトランスジェニック植物をスクリーニングするため、ＰＰＴ選択マーカー遺伝子領域を検出した１つの標的遺伝子増幅反応では、センスプライマーは、Ｃａｎ１７、ＡＴＡＣＡＡＧＣＡＣＧＧＴＧＧＡＴＧＧ（配列番号：５３）；アンチセンスプライマーは、Ｃａｎ１８  ＴＧＧＴＣＴＡＡＣＡＧＧＴＣＴＡＧＧＡＧＧＡ（配列番号：５４）；プローブは、ＰＰＴ−Ｐ３  ５’−／ＦＡＭ／ＴＧＧＣＡＡＡＧＡ／ｚｅｎ／ＧＡＴＴＴＣＧＡＧＣＴＴＣＣＴＧＣ／３ＩＡＢｋＦＱ／−３’（配列番号：５５）であった。この標的遺伝子増幅産生物は８２ｂｐであった。時として、第二標的遺伝子アッセイを、Ｔ−ＤＮＡの部分的挿入を検出するため平行して行った。この第二アッセイはセンスプライマー、Ｃａｎ２３  ＣＡＡＧＣＡＣＣＧＴＡＧＴＡＡＧＡＧＡＧＣＡ（配列番号：５６）、アンチセンスプライマー、Ｃａｎ２４  ＣＡＧＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＴＴＡＧＣＡ（配列番号：５７）；プローブ、Ｄ６ｄｅｓ−Ｐ３  ５’−／ＦＡＭ／ＴＣＣＣＣＡＣＴＴ／ｚｅｎ／ＣＴＴＡＧＣＧＡＡＡＧＧＡＡＣＧＡ／３ＩＡＢｋＦＱ／−３’（配列番号：５８）を用いて、Δ６−デサチュラーゼ遺伝子領域を検出した。この標的遺伝子増幅産生物のサイズは８９ｂｐであった。反応は、ルーチンに消化ＤＮＡ製剤２μＬを使用した。試料当たりの反応組成；総体積２５μＬ中、参照センスプライマー（１０ｐＭ）、１μＬ；参照アンチセンスプライマー（１０ｐＭ）、１μＬ；参照遺伝子プローブ（１０ｐＭ）、０．５μＬ；標的遺伝子センスプライマー（１０ｐＭ）、１μＬ；標的遺伝子アンチセンスプライマー（１０ｐＭ）、１μＬ；標的遺伝子プローブ（１０ｐＭ）、０．５μＬ；ｄｄＰＣＲ試薬混合物、１２．５μＬ；水５．５μＬ。
【０２９７】
それから、各試料を２００００ナノリットルサイズ液滴に分割するＱＸ１００ドロプレットジェネレーター中に入れた。全ての試料を処理して９６ウェルＰＣＲプレートに移動するまで、８ウェルカートリッジ中でこれを行った。それから、このプレートを、プレートシーラー機を用いて、突き刺し可能な箔（ｐｉｅｒｃｅａｂｌｅ  ｆｏｉｌ）で熱シールした。それから、試料を以下の反応条件下で処理した：９５℃、１０分間、２．５℃／秒でランピング；その後、２．５℃／秒でランピングしながら９４℃、３０秒間を３９サイクル；２．５℃／秒でランピングしながら６１℃、１分間；９８℃、１０分間、次いで、１２℃に冷却。液滴中のＤＮＡの増幅反応後、プレートを、二色検出システムを用いて個々に各液滴を分析するＱＸ１００ドロプレットリーダーに入れた（ＦＡＭまたはＨｅｘ検出に設定）。液滴デジタルＰＣＲデータを、蛍光強度グラフ上にプロットした試料の各液滴の１−Ｄプロット、または蛍光（ＦＡＭ）を各液滴の蛍光（Ｈｅｘ）に対してプロットする２−Ｄプロットのいずれかとして見る。ソフトウェアは、各試料の各フルオロフォア（ＦＡＭまたはＨｅｘ）について、正及び負の液滴の数を測定した。それから、ソフトウェアは、入力された、コピー／μＬの単位で標的ＤＮＡ分子濃度を決定するため、正の液滴に分画をポワソンアルゴリズムにフィットさせた。コピー数の変動を、式：ＣＮＶ＝（Ａ／Ｂ）＊Ｎｂ（式中、Ａ＝標的遺伝子濃度、Ｂ＝参照遺伝子濃度、及びＮｂ＝４、ゲノム中の参照遺伝子のコピー数）を用いて算出した。
【０２９８】
花粉生存率の評価
フルオレセイン二酢酸エステル（ＦＤＡ）を、アセトン中に２ｍｇ／ｍｌで溶解して原液を得た。持続的白濁の外観により示される飽和に達するまで、ショ糖溶液（０．５Ｍ）２ｍｌにＦＤＡ原液を滴下することにより使用直前に、ＦＤＡ希釈液を調製した。
【０２９９】
ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を滅菌蒸留水中１ｍｇ／ｍｌで溶解して原液を得た。使用直前に、原液１００μｌを、滅菌蒸留水１０ｍｌに添加して、使用液を作製した。生存花粉と非生存花粉の比をチェックするため、ＰＩ及びＦＤＡ原液を２：３の比で混合した。
【０３００】
１日１６時間の光周期で、２２±２℃の温室内の標準条件下、トランスジェニック及び野生型セイヨウアブラナ及びカラシナ植物を生育した。翌日開花する状態の成熟した花蕾を標識し、翌朝９〜１０時ａｍに集めた。開花した花の花粉をＦＤＡ／ＰＩ混合物で染色し、Ｌｅｉｃａ  ＭＺＦＬＩＩＩ蛍光顕微鏡を用いて可視化した。ＧＦＰ−２、４８０／４０ｎｍ励起フィルターを備えた５１０ｎｍロングパス発光フィルター（赤と緑の光を透過する）を使用して、生存及び非生存花粉を検出した。ＰＩ染色した非生存花粉は、蛍光顕微鏡下、赤く見えたが、生存花粉は、ＰＩ及びＦＤＡで染色したとき、鮮緑色に見えた。
【０３０１】
実施例２．カメリナサティバ（Ｃａｍｅｌｉｎａ  ｓａｔｉｖａ）種子内のトランスジェニックＤＨＡ経路の安定発現
【０３０２】
バイナリーベクターｐＪＰ３４１６−ＧＡ７（図２及び配列番号１を参照のこと）を、アグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＡＧＬ１及び形質転換のためのフローラルディップ法を用いたカメリナサティバ顕花植物の処理に使用した形質転換アグロバクテリウムの培養液からの細胞中に導入した（Ｌｕ及びＫａｎｇ、２００８）。植物の生育及び成熟後、処理した植物のＴ１種子を収穫し、土壌に播種し、得られた植物を、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７のＴ−ＤＮＡに存在するｂａｒ選択マーカー遺伝子のトランスジェニックであり、これを発現する植物について選択するため、除草剤ＢＡＳＴＡをスプレー処理した。除草剤に耐性のある生存Ｔ１植物を、自家受粉させて後、成熟するまで生育し、得られたＴ２種子を収穫した。５種のトランスジェニック植物を得て、これらの３種は全部そろったＴ−ＤＮＡを含んでいた。
【０３０３】
脂質を、全部そろったＴ−ＤＮＡを含む各３種の植物からの約２０個の種子プールから抽出した。プール試料の２種は非常に低く、かろうじて検出できるレベルのＤＨＡを含有していたが、３番目のプールは、約４．７％のＤＨＡを含有していた。従って、この植物からの１０個の個々のＴ２種子から、脂質を抽出し、脂肪酸組成をＧＣにより分析した。この形質転換系統について個々の種子の脂肪酸組成データも表４に示す。総種子脂質プロファイル（表４）から集めたデータを表５に示す。
【０３０４】
ＤＨＡは、１０個の個々の種子のうち６個中に存在した。４個の他の種子は、ＤＨＡを含まず、親植物のＴ−ＤＮＡインサーションのヘミ接合に基づいて、Ｔ−ＤＮＡを有しないヌルな分離個体であると推定された。最高レベルのＤＨＡを含む単一種子から抽出した脂質は９．０％のＤＨＡを含み、一方、ＥＰＡ、ＤＰＡ及びＤＨＡのパーセント合計は１１．４％であった。
【表４】
2017532949.tif 000013
2017532949.tif 000014
【表５】
2017532949.tif 000015
【０３０５】
この系統からのホモ接合種子を、Ｔ４世代で得た。全部のＴ４世代にわたって観察された平均７．３％のＤＨＡであったイベントＦＤ５−４６−１８−１１０で、１０．３％までのＤＨＡが産生された。その後の世代（Ｔ５）を、何世代かにわたって、ＰＵＦＡ産生、特に、ＤＨＡの安定性についてさらなる試験をするため確立した。プール種子ＤＨＡ含有率が、複数トランスジェニック遺伝子座の存在のため、Ｔ４世代まで安定化されなかったにもかかわらず、観察された最大ＤＨＡレベルは、５世代目で安定であると分かった。Ｔ５種子バッチも、発芽効率または速度で明らかな差が観察されない親カメリナサティバ種子と並べて、インビトロＭＳ培地上で発芽させた。トランスジェニック系統のさらなる世代（Ｔ６、Ｔ７世代、他）は、種子ＤＨＡレベルの低下を示さなかった。トランスジェニック植物は、完全に雌雄生殖能力があり、花粉は、野生型植物同様、約１００％生存率を示した。異なるレベルのＤＨＡを含む種子のオイル含有率の分析では、シロイヌナズナで見られた相関と対照的に、ＤＨＡレベルとオイル含有率との間の相関は確認されなかった。
【０３０６】
いくつかのさらなるトランスジェニック系統では、独立イベントからの単一種子のＤＨＡ含有率は１２％を超えた。これらの系統のトランスジェニック：ヌル比は、おおよそ、３：１から１５：１の間であると分かった。各構築物からのトップＤＨＡ試料の代表的脂肪酸プロファイルの分析で、他の新ω６ＰＵＦＡは検出されず、１．２〜１．４％のみのＧＬＡであると分かった。対照的に、新ω３ＰＵＦＡ（ＳＤＡ）、ω３ＬＣ−ＰＵＦＡ（ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、ＤＨＡ）は、総脂肪酸含有物の９．６％のＤＨＡレベルで１８．５％まで蓄積することが分かった。Δ６−不飽和化は３２％であり、ＥＰＡは総脂肪酸含有物の０．８％であった。Δ５−エロンゲーション効率は９３％であり、Δ６−エロンゲーション効率は６０％であった。ＧＡ７系統の極性種子脂質フラクション中でＤＨＡを検出した。
【０３０７】
なお、観察された分離比（約３：１〜約１５：１）は、１つまたは、高々、２つのトランスジェニック遺伝子座がカメリナサティバの魚オイルの様なＤＨＡレベルを産生するのに必要であることを示した。このことは、トランスジェニックの体質を導入遺伝子の安定性だけでなく繁殖できる容易さについて重要な意味を有する。
【０３０８】
ホモ接合種子を、合計６００以上の個々の植物を生成するため、いくつかの温室にわたって植え付けた。ソックスレー、アセトン及びヘキサン抽出を含む様々な方法を用いて、種子からオイルを抽出した。
【０３０９】
ＴＡＧのω３ＬＣ−ＰＵＦＡの位置分布を決定するため、トランスジェニックカメリナサティバ種子オイルに対して、１３Ｃ  ＮＭＲ位置特異性分析を行った。おおよそ等しいＥＰＡ及びＤＨＡでのイベントを、これらの脂肪酸に対する応答を最大にするため選択し、ｓｎ−２に対するｓｎ−１，３の比が、ＥＰＡについて０．７５：０．２５であり、ＤＨＡについて０．８６：０．１４であり、偏りがない分布は０．６６：０．３３であろうと分かった。すなわち、ＥＰＡ７５％及びＤＨＡ８６％が、ＴＡＧのｓｎ−１，３位に位置していた。このことは、ＥＰＡの優先度は、ＤＨＡより弱いが、両方の脂肪酸は、カメリナサティバＴＡＧのｓｎ−１，３位に優先的に位置することを示した。ＤＨＡがｓｎ−１，３位に優先的に見られたという発見は、シロイヌナズナの種子で以前に報告された結果と類似していた（Ｐｅｔｒｉｅら、２０１２）。
【０３１０】
少数の独立トランスジェニック系統が上記形質転換実験で得られたので、さらなるカメリナサティバ形質転換を、ＧＡ７−ｍｏｄＢ構築物を用いて行った（実施例３）。より多くの形質転換体を得て、２０．１％を超えるＤＨＡを産生するホモ接合系統を確認した。
【０３１１】
実施例３．植物種子内のＤＨＡをコードするＴ−ＤＮＡの修飾経路
ＷＯ２０１３／１８５１８４に記載のレベルを超えるアブラナのＤＨＡ産生レベルを改善するため、バイナリーベクターｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＡ、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＢ、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＣ、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＤ、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＥ及びｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＦを、ＷＯ２０１３／１８５１８４に記載の通り構築し、トランスジェニック植物で試験した。これらのバイナリーベクターは、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７構築物の変異体であり、特に、Δ６−デサチュラーゼ及びΔ６−エロンガーゼ機能の改良により、植物種子内のＤＨＡ合成をさらに増加するように設計した。ＳＤＡは、Δ５−エロンガーゼと比較して、比較的低いΔ６−エロンガーゼ効率のによってＧＡ７構築物で形質転換されたいくつかの種子内に蓄積されるので、他の修飾の中で、２つのエロンガーゼ遺伝子位置をＴ−ＤＮＡ中にスイッチすることが観察された。
【０３１２】
ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７中で配列をコードする２つのエロンガーゼを、Ｔ−ＤＮＡのそれらの位置でスイッチし、ピラミモナス・コルダタΔ５−エロンガーゼカセットを置換するためにｐＪＰ３４１６−ＧＡ７のＳｂｆ１部位間の新ピラミモナス・コルダタΔ６−エロンガーゼカセットを先ずクローニングすることにより、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＡを得た。この構築物を、コンリニンＣｎｌ２プロモーター（ｐＬｕＣｎｌ２）でミクロモナス・プシーラΔ６−デサチュラーゼを駆動づるＦＰ１プロモーターを交換して、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＢを得ることによりさらに修飾した。Δ６−デサチュラーゼ発現、それにより、酵素効率を増加する試みで、この修飾を行った。Ｃｎｌ２プロモーターは、短縮化ナピンプロモーターより、セイヨウアブラナの導入遺伝子のより高い発現を得る可能性があるはずである。
【０３１３】
８つのトランスジェニックｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＢシロイヌナズナイベント及び１５のトランスジェニックｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＧシロイヌナズナイベントを作成した。プールされたｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＢ種子内の３．４％から７．２％の間のＤＨＡを観察し、プールされたＴ２  ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＧ種子内の０．６から４．１％の間のＤＨＡを観察した。最も高いｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＢイベントのいくつかを、選択培地上に播種し、生存苗を次世代まで生育した。種子をＤＨＡ含有率について分析する。プールされたＴ１種子は、導入遺伝子について分離している集団を表し、いずれかのヌル分離個体を含んでいたので、子孫植物のホモ接合種子が、種子オイル中の総脂肪酸含有物の３０％まで、ＤＨＡレベルを増加したはずだと期待される。他の修飾された構築物を、シロイヌナズナを使用して形質転換した。少数のみの形質転換系統を得たにもかかわらず、ｍｏｄＢ構築物より高いレベルのＤＨＡを得るものはなかった。
【０３１４】
ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＢ構築物も、品種オスカー及びＮＸ００２、ＮＸ００３、ＮＸ００５、ＮＸ０５０、ＮＸ０５２及びＮＸ０５４と命名された一連の育成系統の形質転換セイヨウアブラナ植物を使用して作成した。オスカー形質転換のための７７独立形質転換植物（Ｔ０）、及びＦＡＤ２遺伝子中の突然変異の効果によってその種子オイル中の高オレイン酸含有率を有する系統であるＮＸ００５のための１８９を含む育成系統のための１４８０独立植物を含む１５５８形質転換植物全体を得た。他の育成系統はより高いレベルのＬＡ及びＡＬＡを有した。デジタルＰＣＲ法により決定するとき、Ｔ−ＤＮＡの４つより多いコピーを示すトランスジェニック植物（実施例１）を引抜き；Ｔ０植物の約２５％をこの判断基準により処分した。Ｔ０トランスジェニック植物の約５３％は、デジタルＰＣＲ法により決定するとき、Ｔ−ＤＮＡの１つまたは２つのコピーを有し、１２％は約３つのコピー、２４％は、４つ以上のコピーを有した。種子（Ｔ１種子）を、自家受粉後、約４５０のトランスジェニック系統から収穫し、異系交配を避けるために、開花中植物に袋掛けすることにより行った。Ｔ１種子を、成熟したとき、トランスジェニック植物の残りから収穫した。約１〜２％の植物系統は、雄または雌繁殖不能のいずれかであり、生存可能な種子を産生せず、Ｔ０植物を処分した。
【０３１５】
種子のプール（各ポールで２０のＴ１種子）を、プールされた種子オイル中のＤＨＡレベルについて試験し、最も高いレベルを示す系統を選択した。特に、プールされたＴ１種子内の総脂肪酸含有物の少なくとも２％のＤＨＡ含有率を有する系統を選択した。約１５％のトランスジェニック系統をこの方法で選択し；その他の８５％を処分した。これらのいくつかを系統ＣＴ１３２−５（品種オスカー）、ＣＴ１３３−１５、−２４、−６３、−７７、−１０３、−１２９及び−１３０（ＮＸ００５）と命名した。ＮＸ０５０の選択系統は、ＣＴ１３６−４、−８、−１２、−１７、−１９、−２５、−２７、−４９及び−５１を含んだ。ＣＴ１３２．５を含む選択系統の２０種子及びＣＴ１３３．１５の１１種子を浸し、２日後、各個々の種子からの半分の子葉からオイルを抽出した。胚軸を含む他の半分の子葉を残し、特異子孫系統を維持するために培地で培養した。オイル中の脂肪酸組成を決定した；データをＣＴ１３２．５について表６に示す。分析した２０種子のうち１０のＤＨＡレベルは、ＧＣ分析により測定して、総脂肪酸含有物の７〜２０％の範囲であった。他の種子は、７％未満のＤＨＡを含み、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＢからのＴ−ＤＮＡの部分（不完全）コピーを含んでいた可能性がある。トランスジェニック系統は、遺伝的に結合していない複数の導入遺伝子インサーションを含むように思われた。トランスジェニック系統ＣＴ１３３．１５の種子は、０〜５％の範囲のＤＨＡレベルを示した。ＤＨＡを含まない種子は、ヌル分離個体であるようであった。これらのデータは、ｍｏｄＢ構築物がキャノーラ種子内のＤＨＡ産生に対して十分に性能を発揮することを確認した。
【０３１６】
選択された形質転換系統から自家受粉後に各複数のＴ１植物から得られた２０または４０の個々の種子（Ｔ２種子）を、脂肪酸組成について個別に試験した。２０％より大きいレベルでＤＨＡを含む種子を同定した（表７）。２つの代表的試料、ＣＴ１３６−２７−１８−２及びＣＴ１３６−２７−１８−１９は、それぞれ、２１．２％及び２２．７％のＤＨＡを含んでいた。これらの種子内の総ω３脂肪酸含有率は、総脂肪酸含有物中のパーセントで約６０％であり、ω６含有率は１０％未満であった。さらに、各Ｔ１植物の２０または４０のＴ２種子のセットを、脂肪酸組成について試験した。３４．３％までのＤＨＡを含む種子を、例えば、種子ＣＴ１３６−２７−４７−２５で確認した（表９）。ＣＴ１３６−２７−４７−２５から得られた種子オイルの脂肪酸組成を表９に示す。脂肪酸組成は、ＤＰＡ約１．５％、ＥＰＡ０．６％及びＥＴＡ０．５％と一緒にＤＨＡ３４．３％を含んでいた。ＳＤＡレベルは約７．５％であり、ＡＬＡは約２１．９％、ＬＡは約６．９％であった。新ω６ＰＵＦＡはＧＬＡ１．１％を示したが、ω６−Ｃ２０も−Ｃ２２  ＬＣ−ＰＵＦＡも検出されなかった。総飽和脂肪酸：９．６％；一価不飽和脂肪酸、１２．５％；総ＰＵＦＡ、７５．２％；総ω６−ＰＵＦＡ（ＬＡを含む）、７．２％；総ω３−ＰＵＦＡ、６６．９％；総ω６：ω３脂肪酸の比、９．３：１；新ω６：新ω３脂肪酸、３７：１。オレイン酸からＤＨＡへの各酵素工程の効率は以下であった：Δ１２−デサチュラーゼ、９０％；Δ１５／ω３−デサチュラーゼ、８９％；Δ６−デサチュラーゼ、６７％；Δ６−エロンガーゼ、８３％；Δ５−デサチュラーゼ、９９％；Δ５−エロンガーゼ、９８％；Δ４−デサチュラーゼ、９６％。オレイン酸からＤＨＡへの転換の全体効率は約５０％であった。従って、種子オイルの総脂肪酸含有物の２０．１〜３５％の範囲でＤＨＡを産生する種子が、総脂肪酸含有物中の２０．１％から３０％の間のＤＨＡまたは３０％から３５％の間のＤＨＡを含む種子を含み確認され、選択されるとは明白であった。
【０３１７】
いくつかの種子内のオイル含有率は、野生型種子の約４４％から、ＤＨＡ産生種子のいくつかの約３１〜３９％まで低下するが、他のＤＨＡ産生種子の野生型レベルと同様であった。
【０３１８】
Ｔ２種子の少なくとも１０％のレベルでＤＨＡを産生する様々な形質転換植物系統を交配し、複数のＴ−ＤＮＡインサーションに対してホモ接合であるＦ２子孫を産生するため、Ｆ１子孫を自家受粉させた。ホモ接合種子からの種子オイルを分析し、種子オイル中の３０％までまたは３５％の総脂肪酸含有物はＤＨＡである。
【０３１９】
ＣＴ１３６−２７−１８−２及びＣＴ１３６−２７−１８−１９から得られたオイル中のＴＡＧを、ＴＡＧ分子のグリセロール骨格上のＤＨＡの位置分布について、１３Ｃ  ＮＭＲ位置特異性アッセイにより分析した。ＤＨＡは、ｓｎ−１，３位において優先的に結合していた。ＤＨＡの７０％より多く、実際、９０％より多くが、ｓｎ−１，３位であった。
【０３２０】
いくつかのさらなるトランスジェニック系統では、独立イベントからの単一種子のＤＨＡ含有率は１２％を超えた。これらの系統のトランスジェニック：ヌル比は、１つのトランスジェニック遺伝子座に対応して約３：１であり、２つのトランスジェニック遺伝子座に対応して１５：１であることが分かった。最も高いレベルのＤＨＡを有する各構築物からの試料の代表的脂肪酸プロファイルの分析では、新ω６ＰＵＦＡを含まず、１．２〜１．４％のみのＧＬＡが検出された。対照的に、新ω３ＰＵＦＡ（ＳＤＡ）及びω３ＬＣ−ＰＵＦＡ（ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、ＤＨＡ）は、ＧＡ７−形質転換種子について１８．５％と比較して、ｍｏｄＦ構築物について２５．８％及びｍｏｄＧ構築物について２１．９％の合計を蓄積した。これらの種子のオイル中のＤＨＡレベルは、それぞれ、９．６％、１２．４％及び１１．５％であった。Δ６−不飽和化は、ｍｏｄＦ−及びｍｏｄＧ−形質転換種子よりＧＡ７−形質転換種子で低く（３２％対４７％及び４３％）、これにより、ＧＡ７と比較して、ｍｏｄＦ及びｍｏｄＧ内のＡＬＡの低下をもたらすことが分かった。別の注目すべき差は、ｍｏｄＦ種子内のＥＰＡの蓄積であり（他の２つのトランスジェニック種子内で３．３％対０．８％）、これは、ＧＡ７及びｍｏｄＧ種子（９３％及び９４％）と比較して、ｍｏｄＦ（８０％）種子内で観察されたΔ５−エロンゲーションの低下に反映された。わずかにより活性なΔ６−不飽和化によって、ＳＤＡ量が実際に増加したが、これらの種子内のΔ６−エロンゲーションのわずかな増加（６６％対６０％及び６１％）があった。ＤＨＡを、ＧＡ７系統の極性種子脂質フラクションで検出した。
【０３２１】
ｍｏｄＢ構築物のＴ−ＤＮＡで形質転換されたセイヨウアブラナ育成系統ＮＸ５４の７０の独立トランスジェニック植物のＴ１種子内の脂質の脂肪酸組成物を分析した。これらのトランスジェニック植物の１つが、種子オイル中にＤＰＡを含むが、ＤＨＡを含まない種子を産生することが観察された。この系統（ＣＴ−１３７−２）のＴ１種子は、Ｔ１プール種子内に検出可能なＤＨＡを含まないで、ＤＰＡ約４％を産生した。本発明者らは、このことが、自然な突然変異により、その特定の挿入Ｔ−ＤＮＡ中のΔ４−デサチュラーゼ遺伝子の不活性化が原因であるか否かを検証した。ＰＣＲ分析及びＤＮＡ配列解析により欠失の存在が示され、ＧＡ７−ｍｏｄＢのＴ−ＤＮＡのヌクレオチド１２９８８−１５３１７の欠失が明らかにされた（配列番号２）。該欠失ヌクレオチドは、Δ４−デサチュラーゼコード領域の発現を駆動させるＬｉｎｕｓ  Ｃｎｌ２プロモーター部分ならびにΔ４−デサチュラーゼコード領域それ自体に相当し、これにより、該欠失を含むＴ−ＤＮＡで形質転換された種子がＤＨＡを産生しなかった理由が説明される。
【０３２２】
このトランスジェニック系統からの約５０のＴ１種子を発芽させ、各々からの１つの発生した子葉を、残りのオイル中の脂肪酸組成について分析した。それから、５％より多いＤＰＡを示す選択された苗を成熟するまで生育し、Ｔ２種子を収穫した。プール種子脂肪酸組成を、表８に示し、７％より多いＤＰＡを、これらの系統で観察した。Ｔ４種子はセイヨウアブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）ＤＰＡ系統ＣＴ−１３７−２から作製され、脂肪酸プロファイルについて分析された。最大で１３％のＤＰＡが、集められた成熟種子試料において観察された。
【０３２３】
約１０％のＤＰＡを有する種子からのオイルを、弱アルカリで処置し、脂肪酸を加水分解した。
【０３２４】
Ｂ０００３−５１４と指定される別のトランスジェニック系統は、Ｔ２種子において約１０〜１６％のＤＰＡを示した。１５．８％のＤＰＡ、０．２〜０．９％のＤＨＡ、及び０．１〜２．５％のＥＰＡを含有する種子が選択された。Ｔ２種子群は、高ＤＰＡ：中ＤＰＡ：無ＤＰＡに関し、１：２：１の分離割り当てを示し、このことから、該トランスジェニック系統において、ＤＰＡ産生に関し、単一遺伝子座の存在が示唆される。
【０３２５】
オイルは、ＬＣ−ＰＵＦＡを産生する種子試料からねじプレスにより抽出され、それによりシードミールを作製した。
【０３２６】
構築物の設計
この実験の焦点が油料種子作物種内のＤＨＡ及びＤＰＡの産生の実証であった一方、上記の結果は、構築物設計展望からも興味があった。最初、ｍｏｄＦ構築物中のΔ６−及びΔ５−エロンガーゼコード領域位置のスイッチは、より低いΔ５−エロンゲーションのために蓄積されたより多いＥＰＡを含む意図されたプロファイル変化をもたらした。Δ６−エロンゲーションの同時増加が観察されたが、これは、より低いＳＤＡレベルをもたらさなかった。これは、より高活性なアマコンリニン２プロモーターによる短縮化ナピンプロモーター（ＦＰ１）の置換だけでなく、余分にミクロモナス・プシーラΔ６−デサチュラーゼ発現カセットの付加により引き起こされた、ｍｏｄＦ形質転換種子内のΔ６−不飽和化の増加に起因した。ｍｏｄＧ構築物で観察されたΔ６−不飽和化のいくらか低い増加は、ＧＡ７中の高発現Δ５−エロンガーゼカセットの利用に起因した。Δ６−デサチュラーゼ及びΔ５−エロンガーゼコード領域の位置のスイッチは、より大きなΔ６−不飽和化をもたらした。Ｃｎｌ２プロモーターによるＦＰ１プロモーターの置換によって、この場合では、Δ５−エロンガーゼ活性は減少しなかった。
【０３２７】
これらのデータは、ｍｏｄＢ、ｍｏｄＦ及びｍｏｄＧ構築物が、アラビドプシス属及びセイヨウアブラナのように、カメリナ種子内のＤＨＡ産生に対して良い結果を出した。
【０３２８】
本発明者らは、概して、ＤＨＡ経路の律速酵素活性の効率が、単一コピーＴ−ＤＮＡ形質転換体と比較して、多コピーＴ−ＤＮＡ形質転換体でより大きくあり得る、または経路内で限定され得る酵素をコードするＴ−ＤＮＡ同義遺伝子中への挿入により増加し得ると考えた。多コピー形質転換体の可能性ある重要性に対する証拠は、ＧＡ７構築物で形質転換されたアラビドプシス属種子内で見られ、最高収率のＤＨＡイベントは、宿主ゲノム中に挿入された３種のＴ−ＤＮＡを有した。同義遺伝子は同じであり得る、または、好適に、同じポリペプチドをコードする異なる変異体である、または重複する発現パターンを有する異なるプロモーターの制御下にある。例えば、同じタンパク質が産生される場合でも、多重Δ６−デサチュラーゼコード領域の発現により、増加した発現を達成できるはずである。ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＦ及びｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＣでは、例えば、ミクロモナス・プシーラΔ６−デサチュラーゼの２つの変化形が存在し、異なるプロモーターにより発現された。コード配列は、異なるコドン使用頻度、従って、異なるヌクレオチド配列を有し、可能性のあるサイレンシングまたは同時抑制効果を減少させたが、同じタンパク質の産生をもたらした。
【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【０３２９】
実施例４．ＤＨＡを産生するトランスジェニックシロイヌナズナ種子のＴＡＧの分析
形質転換シロイヌナズナ種子のＴＡＧ上のＤＨＡの位置分布を、ＮＭＲにより測定した。総脂質を、ヘキサン１０ｍＬを含むガラスチューブに粉砕種子を移動する前に、ヘキサン下に、種子を先ず粉砕することにより約２００ｍｇの種子から抽出した。チューブを水浴で約５５℃に温めて、それから、ボルテックスして遠心分離した。ヘキサン溶液を取り出し、さらに４ｘ１０ｍＬでこの手順を繰り返した。抽出物を合わせて、ロータリーエバポレーターで濃縮し、抽出脂質中のＴＡＧを、２０ｍＬのヘキサン中７％ジエチルエーテルを用いて、短いシリカカラムを通過させることにより極性脂質から分離して精製した。精製ＴＡＧ上のアシル基位置分布を前述のように定量的に測定した（Ｐｅｔｒｉｅら、２０１０ａ及びｂ）。
【０３３０】
分析は、総種子オイル中のＤＨＡの大部分がＴＡＧのｓｎ−１／３位に位置しており、ｓｎ−２位においてはほとんど見られなかったことを示した。このことは、ＡＲＡ（２０：４Δ５、８、１１、１４）の５０％がトランスジェニックキャノーラオイルのｓｎ−２位に位置する一方、３３％のみランダムな分布で期待されることを示したＡＲＡ産生種子からのＴＡＧと対照的であった（Ｐｅｔｒｉｅら、２０１２）。
【０３３１】
トランスジェニックシロイヌナズナ種子の総脂質を、主要なＤＨＡ含有トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）化学種を測定するため、トリプル四重極ＬＣ−ＭＳによっても分析した。最も豊富なＤＨＡ含有ＴＡＧ化学種は、ＤＨＡ−１８：３−１８：３（ＴＡＧ５８：１２；位置分布を表現できない命名法）であり、２番目に最も豊富なのはＤＨＡ−１８：３−１８：２（ＴＡｇ５８：１１）であることが分かった。トリＤＨＡ  ＴＡＧ（ＴＡＧ６６：１８）を、たとえ低くても、検出可能レベルで、総種子オイル中に観察された。他の主要ＤＨＡ含有ＴＡＧ種は、ＤＨＡ−３４：３（ＴＡＧ５６：９）、ＤＨＡ−３６：３（ＴＡＧ５８：９）、ＤＨＡ−３６：４（ＴＡＧ５８：１０）、ＤＨＡ−３６：７（ＴＡＧ５８：１３）及びＤＨＡ−３８：４（ＴＡＧ６０：１０）を含んでいた。２つの主要ＤＨＡ含有ＴＡＧ種を、Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳ／ＭＳによりさらに確認した。
【０３３２】
実施例５．オイルのステロール含有量及び組成のアッセイ
オーストラリアの商業的給源から購入した１２種の植物オイルからのフィトステロールは、実施例１に記載のＯ−トリメチルシリルエーテル（ＯＴＭＳｉ−エーテル）誘導体としてＧＣ及びＧＣ−ＭＳにより特徴付けられた。ステロールを、保持データ、質量スペクトル解析及び文献と実験標準質量スペクトルデータとの比較により同定した。ステロールを５β（Ｈ）−コラン−２４−オール内部標準の使用により定量化した。同定されたステロールのフィトステロール基本構造及び化学構造を、図３及び表１０に示す。
【０３３３】
分析された植物オイルは：ゴマ（Ｓｅｓａｍｕｍ  ｉｎｄｉｃｕｍ）、オリーブ（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｓ）、ヒマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）、ピーナッツ（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａ）、アマ（Ｌｉｎｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）及びダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）からであった。オイル試料全部にわたって、相対的存在比の減少では、主要フィトステロールは：β−シトステロール（総ステロール含有物中２８〜５５％の範囲）、Δ５−アベナステロール（イソフコステロール）（３〜２４％）、カンペステロール（２〜３３％）、Δ５−スチグマステロール（０．７〜１８％）、Δ７−スチグマステロール（１〜１８％）及びΔ７−アベナステロール（０．１〜５％）であった。いくつかの他の少量ステロールを同定し、これらは：コレステロール、ブラシカステロール、カリナステロール、カンペスタノール及びエブリコールであった。４種のＣ２９：２及び２種のＣ３０：２ステロールも検出されたが、これらの少量成分の同定を完了するには、さらなる調査が必要である。加えて、いくつかの他の同定されたステロールは、オイルのいくつか中に存在したが、その非常に低存在量のために、質量スペクトルは、その構造を同定するには十分な強度でなかった。
【表１０】
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【０３３４】
減少量のオイルｍｇ／ｇとして表現したステロール含有量は：キャノーラオイル（６．８ｍｇ／ｇ）、ゴマオイル（５．８ｍｇ／ｇ）、アマオイル（４．８〜５．２ｍｇ／ｇ）、ヒマワリオイル（３．７〜４．１ｍｇ／ｇ）、ピーナッツオイル（３．２ｍｇ／ｇ）、ベニバナオイル（３．０ｍｇ／ｇ）、ダイズオイル（３．０ｍｇ／ｇ）、オリーブオイル（２．４ｍｇ／ｇ）、ヒマシオイル（１．９ｍｇ／ｇ）であった。ステロール組成％及び総ステロール含有率を表１１に示す。
【０３３５】
全ての種子オイル試料の中で、主要フィトステロールは、概して、β−シトステロールであった（総ステロール含有物の３０〜５７％の範囲）。他の腫瘍ステロール：カンペステロール（２〜１７％）、Δ５−スチグマステロール（０．７〜１８％）、Δ５−アベナステロール（４〜２３％）、Δ７−スチグマステロール（１〜１８％）の割合のオイルの中で広範囲であった。異なる種のオイルは、全く異なるプロファイルを有するいくつかを含む異なるステロールプロファイルを有した。キャノーラオイルの場合、カンペステロールの最も高い比率（３３．６％）を有したが、他種の試料は、概して、ピーナッツオイル中、例えば、１７％までの低レベルを有した。ベニバナオイルは、比較的高い割合のΔ７−スチグマステロール（１８％）を有したが、このステロールは、ヒマワリオイル中９％まで、他種オイル中、通常低かった。それらは、各種について特徴的であったので、従って、ステロールプロファイルを特異的植物（ｖｅｇｅｔａｂｌｅ）または植物（ｐｌａｎｔ）オイルの同定の助け及びその真実性または他のオイルによる不純物混和のチェックのため使用できる。
【０３３６】
種子の冷間圧縮により製造され精製されていない各場合において、２つの試料の各ヒマワリとベニバナを比較したが、一方、その他は冷間圧縮をせず精製した。いくつかの異なる点が観察されたが、オイルの２つの源は、類似のステロール組成及び総ステロール含有率を有し、処理及び精製がこれらの２つのパラメーターに対してほとんど影響がないことを示唆した。試料中のステロール含有量は、３倍変わり、１．９ｍｇ／ｇ〜６．８ｍｇ／ｇの範囲であった。キャノーラオイルは、最も高く、ヒマシオイルは最も低いステロール含有率であった。
【０３３７】
実施例６．ＴＡＧのｓｎ−２位におけるＤＨＡ及びＤＰＡの蓄積増加
本発明は、ＴＡＧのｓｎ−２位におけるＤＨＡ及び／またはＤＰＡ蓄積を、１−アシル−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）をＧＡ７構築物またはその変異体により与えられるなど、ＤＨＡまたはＤＰＡ生合成経路と一緒に同時発現することにより増加できた。好ましいＬＰＡＡＴは、内在性ＬＰＡＡＴと比較して、ＬＰＡのｓｎ−２位における多価不飽和Ｃ２２鎖の挿入増加をもたらし、ＰＡを生成する、基質として多価不飽和Ｃ２２脂肪アシル−ＣｏＡ、好ましくはＤＨＡ−ＣｏＡ及び／またはＤＰＡ−ＣｏＡに対して作用できるもの、特に基質としてＤＨＡ−ＣｏＡ及びＤＰＡ−ＣｏＡの両方を用いることができるものである。細胞質内ＬＰＡＡＴ酵素は、特に、該種が合成及びＴＡＧ中の異常な脂肪酸を蓄積する場合、しばしば、多様な基質選択性を示す。リムナンテス・ダグラシー（Ｌｉｍｎａｎｔｈｅｓ  ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）からのＬＰＡＡＴ２を、Ｃ２２基質を利用できない同じ種からのＬＰＡＡＴ１との対照で、ＰＡ合成の基質として、エルコイルＣｏＡ（Ｃ２２：１−ＣｏＡ）を使用することが分かった（Ｂｒｏｗｎら、２００２）。
【表１１】
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【０３３８】
既知ＬＰＡＡＴを考慮し、コントロールとして、ｓｎ−２位におけるＤＨＡの組み込みを増加すると期待されないいくつかを含み、試験のため数を選択した。既知のＬＰＡＡＴは：シロイヌナズナＬＰＡＡｔ２：（配列番号４０、受託番号ＡＢＧ４８３９２、Ｋｉｍら、２００５）、リムナンテス・アルバＬＰＡＡＴ（配列番号４１、受託番号ＡＡＣ４９１８５、Ｌａｓｓｎｅｒら、１９９５）、サッカロミセス・セレビシアＳｌｃ１ｐ（配列番号４２、受託番号ＮＰ＿０１０２３１、Ｚｏｕら、１９９７）、モルティエレラ・アルピナＬＰＡＡＴ１（配列番号４４、受託番号ＡＥＤ３３３０５；ＵＳ７８７９５９１）及びセイヨウアブラナＬＰＡＡＴ（配列番号４５及び配列番号４６、それぞれ、受託番号ＡＤＣ９７４７９及びＡＤＣ９７４７８）を含んでいた。
【０３３９】
アラビドプシス属ＬＰＡＡＴ２（ＬＰＡＴ２とも命名）は、Ｃ１６及びＣ１８基質に対する活性を有することが分かっている小胞体局在酵素であるが、しかしながら、Ｃ２０またはＣ２２基質に対する活性は試験されなかった（Ｋｉｍら、２００５）。リムナンテス・アルバＬＰＡＡＴ２は、基質としてＤＨＡまたはＤＰＡを使用する能力は試験されなかったが、ＰＡのｓｎ−２位中にＣ２２：１アシル鎖を挿入することが示された（Ｌａｓｓｎｅｒら、１９９５）。選択されたサッカロミセス・セレビシアＬＰＡＡＴ  Ｓｌｃ１ｐは、鎖長に関する広い基質特異性を示す、基質として１８：１−ＣｏＡに加えて、２２：１−ＣｏＡを用いた活性を有することが分かった（Ｚｏｕら、１９９７）。また、ＤＨＡ−ＣｏＡ、ＤＰＡ−ＣｏＡ及び他のＬＣ−ＰＵＦＡは、基質として試験されなかった。モルティエレラ属ＬＰＡＡＴは、アルカン資化性酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中でＥＰＡ及びＤＨＡ脂肪酸基質に対する活性を有することが以前に分かっている（ＵＳ７８７９５９１）が、植物細胞のその活性は未知であった。
【０３４０】
さらなるＬＰＡＡＴは、本発明者らにより同定された。ミクロモナス・プシーラは、この種のＴＡＧ上のＤＨＡの位置分布を確認しなかったが、そのオイル中のＤＨＡを産生し蓄積する微細藻類である。ミクロモナス・プシーラＬＰＡＡＴ（配列番号４３、受託番号ＸＰ＿００２５０１９９７）を、ＢＬＡＳＴクエリー配列として、アラビドプシスＬＰＡＡＴ２を用いた、ミクロモナス・プシーラゲノム配列の調査により同定した。いくつかの候補配列が明らかになり、配列ＸＰ＿００２５０１９９７を、Ｃ２２  ＬＣ−ＰＵＦＡについての試験のため合成した。トウゴマＬＰＡＡＴを、ヒマシゲノム配列中の推定ＬＰＡＡＴとしてアノテートした（Ｃｈａｎら、２０１０）。ヒマシゲノムからの候補４つのＬＰＡＡＴを合成し、湿潤されたベンサミアナタバコ葉組織の粗葉ライセートで試験した。本明細書に記載の候補配列は、ＬＰＡＡＴ活性を示した。
【０３４１】
いくつかの候補ＬＰＡＡＴを、系統樹上の既知ＬＰＡＡＴで配置した。なお、推定ミクロモナスＬＰＡＡＴは、推定Ｃ２２  ＬＰＡＡＴとクラスター形成しなかったが、分岐（ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ）配列であった。
【０３４２】
基質としてＤＨＡ−ＣｏＡ及び／またはＤＰＡ−ＣｏＡを使用するその能力について様々なＬＰＡＡＴの最初の試験として、キメラ遺伝子構築物を、ベンサミアナタバコ葉内の外来性ＬＰＡＡＴの構成的発現のため作成し、３５Ｓプロモーターの制御下、各々は次のものであった：３５Ｓ：Ａｒａｔｈ−ＬＰＡＡＴ２（シロイヌナズナＥＲ  ＬＰＡＡｔ）；３５Ｓ：Ｌｉｍａｌ−ＬＰＡＡＴ（リムナンテス・アルバＬＰＡＡＴ）；３５Ｓ：Ｓａｃｃｅ−Ｓｌｃ１ｐ（サッカロミセス・セレビシアＬＰＡＡＴ）；３５Ｓ：Ｍｉｃｐｕ−ＬＰＡＡＴ（ミクロモナス・プシーラＬＰＡＡＴ）；３５Ｓ：Ｍｏｒａｌ−ＬＰＡＡＴ１（モルティエレラ・アルピナＬＰＡＡＴ）；３５Ｓ：Ｂｒａｎａ−ＬＰＡＡＴ１．１３（セイヨウアブラナＬＰＡＡＴ１．１３）；３５Ｓ：Ｂｒａｎａ−ＬＰＡＡＴ１．５（セイヨウアブラナＬＰＡＡＴ１．５）。外来性ＬＰＡＡＴを含まない３５Ｓ：ｐ１９構築物を、実験のコントロールとして使用した；該構築物は、各ベンサミアナタバコ（Ｎ．  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）接種物に含まれた。これらの構築物の各々を、実施例１に記載のように、アグロバクテリウムによりベンサミアナタバコ葉中に導入し、浸潤後５日目、処理した葉のゾーンを切り取り粉砕して葉ライセートを作成した。各ライセートは、ＬＰＡを合成する内在性酵素だけでなく、外来性ＬＰＡＡＴを含有した。該ライセートに、１４Ｃ標識−ＯＡ及び−ＤＨＡを別々に添加することにより、インビトロ反応を行った。反応物を２５℃でインキュベートし、１４Ｃ標識脂肪酸をＰＡに組み込んだレベルをＴＬＣにより決定した。ＡＲＡ及びＣ１８脂肪酸と比較した各ＬＰＡＡＴがＤＨＡを使用する能力を評価した。メドウフォーム（リムナンテス・アルバ）、モルティエレラ及びサッカロミセスＬＰＡＡＴは、これらは見えるが、他のＬＰＡＡＴは見えない放射標識ＰＡを用いて、ＤＨＡ基質に対する活性を有することが分かった。全てのＬＰＡＡＴを、オレイン酸コントロールフィードにより確認した。
【０３４３】
種子中のＬＰＡＡＴ活性を試験するため、いくつかのタンパク質コード配列またはＬＰＡＡＴを、コンリニン（ｐＬｕＣｎｌ２）プロモーターの制御下、バイナリーベクター中に挿入した。それから、それぞれ、キメラ遺伝子、Ｃｎｌ２：Ａｒａｔｈ−ＬＰＡＡＴ（ネガティブコントロール）、Ｃｎｌ２：Ｌｉｍａｌ−ＬＰＡＡＴ、Ｃｎ２：Ｓａｃｃｅ−Ｓｌｃ１ｐ、及びＣｎｌ２：Ｍｏｒａｌ−ＬＰＡＡＴを含む得られた遺伝子構築物を、それらの種子内でＤＨＡを産生するシロイヌナズナ植物を使用し形質転換使用し、ＬＰＡＡＴ及びＴＡＧのｓｎ−２位へのＤＨＡの組み込みが増加するかどうかを試験するため、種子特異的方法のトランスジェニックＤＨＡ経路を発現する安定な形質転換体を生成する。ＧＡ７構築物及びその変異体（実施例２及び３）を既に含むセイヨウアブラナ及びカメリナサティバ植物を使用し形質転換し、親及びＬＰＡＡＴ遺伝子構築物の両方を保有する子孫を生成する。ＴＡＧのｓｎ−２位へのＤＨＡ及び／またはＤＰＡの組み込みの増加を、導入遺伝子をコードするＬＰＡＡＴを含まない植物での組み込みと比較して試験した。オイル含有率も種子内で改善され、特に、より高いレベルのＤＨＡを産生する種子に対して改善される。
【０３４４】
種子特異的ｐＣｎｌ２：Ｍｏｒａｌ−ＬＰＡＡＴ１構築物を使用して、ＧＡ７構築物からのＴ−ＤＮＡに対してホモ接合であり、その種子が種子脂質中にＤＨＡ約１５％をは含有する既にトランスジェニックなシロイヌナズナ系統を形質転換した（Ｐｅｔｒｉｅら、２０１２）。これのため、トランスジェニック系統中に既に存在するｂａｒ選択マーカー遺伝子と異なるｐＣｎｌ２：Ｍｏｒａｌ−ＬＰＡＡＴ１構築物中のカナマイシン選択マーカー遺伝子を使用した。カナマイシンに耐性があり、温室内で成熟するまで生育したトランスジェニック苗を選択した。Ｔ２種子を収穫し、その総種子脂質の脂肪酸組成をＧＣにより分析した（表１２）。３３種の独立した形質転換された系統の中から、３種の表現型を観察した。第一の群（６／３３系統）では、ＤＰＡは、総種子脂質の約１０．６％まで、ＤＨＡレベルより実質的に大きいレベルで増加した。これは、この系統群の中で、強く減少するＤＨＡの犠牲によって生じた。この第一の群の２つの系統では、ＤＰＡ＋ＤＨＡの合計は減少したが、他の４系統では減少しなかった。第二の群（５／３３）では、ＤＰＡとＤＨＡのレベルはほぼ等しく、ＤＰＡ＋ＤＨＡの合計は親種子とほぼ同じであった。第三の群では、ＤＰＡとＤＨＡのレベルは親種子のものと類似していた。第一及び第二群でＤＰＡレベルの増加についての１つの可能な説明は、ＬＰＡＡＴがＤＰＡ−ＣｏＡ基質に対するΔ４−デサチュラーゼとの競合に勝って、Δ４−デサチュラーゼと比較して、優先的に、ＤＰＡをＰＡ中に、それから、ＴＡＧ中に組み込むというものである。２番目の可能な説明は、Δ４−不飽和化が部分的に阻害されているものである。
【０３４５】
ｐＣｎｌ２：：Ｍｏｒａｌ−ＬＰＡＡＴベクターでさらに形質転換されたＧＡ７構築物のＴ−ＤＮＡで形質転換されたアラビドプシス植物の種子を収穫し、オイルを種子から抽出した。それから、ＴＡＧフラクションをＴＬＣ法により、抽出オイルから単離し、ＴＬＣプレートから回収した。これらのＴＡＧ試料及び分取前の種子オイルの試料を、リゾープス属リパーゼで消化することにより分析し、ＤＨＡの位置分布を決定した。該リパーゼは、ＴＡＧのｓｎ−１位またはｓｎ−３位においてエステル化されたアシル基に対して特異的である。５ｍＭのＣａＣｌ２を含む０．１ＭのトリスＨＣｌ  ｐＨ７．７中のリゾープス属リパーゼ溶液を添加して、超音波を用いて、５％アラビアゴム中の各脂質試料を乳化し、混合物を振盪し続けながら、３０℃でインキュベートすることによりこれを行った。各反応を、クロロホルム：メタノール（２／１、ｖ／ｖ）及び１体積の０．１ＭのＫＣｌを各混合物に添加することにより停止した。脂質をクロロホルムフラクション中に抽出し、ヘキサン／ジエチルエーテル／酢酸（５０／５０／１、ｖ／ｖ）を用いて２．３％ホウ酸含浸ＴＬＣでの分離により得られた脂質のｓｎ−２  ＭＡＧ、ｓｎ−１／３  ＦＦＡ、ＤＡＧ及びＴＡＧ成分の相対量を決定した。脂質バンドを、ＴＬＣプレート上にアセトン／水（８０／２０、ｖ／ｖ）中の０．０１％プリムリンの噴霧により可視化し、ＵＶ光下で可視化した。個々の脂質バンドを、同じＴＬＣプレート上に溶解された脂質の標準スポットに基づいて同定した。ＴＬＣ脂質バンドをガラスバイアル中に集め、それらの脂肪酸メチルエステルを、１Ｎメタノール性ＨＣｌ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）を用いて合成し、８０℃で２時間インキュベートした。個々の脂質の脂肪酸組成をＧＣにより分析した。
【０３４６】
このアッセイは、ＧＡ７（系統２２−２−１−１及び２２−２−３８−７）で形質転換された親種子内のＤＨＡは、ＴＡＧのｓｎ−１位またはｓｎ−３位において優先的にエステル化したことを示した。対照的に、ＧＡ７構築物及びＬＰＡＡＴをコードする導入遺伝子の両方で形質転換されたＮＹ１１及びＮＹ１５種子内のＤＨＡは、該系統の１つのＤＨＡの３５％及びＴＡＧのｓｎ−２位においてエステル化される他系統のＤＨＡの４８％で、ｓｎ−２位で、ＤＨＡは濃縮されていた、すなわち、リパーゼ消化後、ＤＨＡは、ｓｎ−２−ＭＡＧとして存在していた（表１３）。ＧＡ７−ｍｏｄＢ構築物からのＴ−ＤＮＡ及びＬＰＡＡＴコード遺伝子の両方で形質転換し、ＤＨＡを産生するセイヨウアブラナ及びカラシナ種子について、類似の結果を得、ＤＰＡを産生するセイヨウアブラナ及びカラシナの種子も同様である。
【０３４７】
モルティエレラＬＰＡＡＴまたは別のＬＰＡＡＴがＤＰＡ−ＣｏＡまたはＤＨＡ−ＣｏＡのいずれかに対して優先的であるか否かを決定するため、上記構成的プロモーターの制御下候補ＬＰＡＡＴを一過性に発現するベンサミアナタバコ葉のライセートに１４Ｃ標識ＤＰＡ−ＣｏＡまたは−ＤＨＡ−ＣｏＡを別々に添加することによりインビトロ反応を行った。反応物を２５℃でインキュベートし、ＰＡへの１４Ｃ標識脂肪酸の組み込みレベルを脂質のＴＬＣ分析により決定した。ＤＰＡ−ＣｏＡと比較して、各ＬＰＡＡＴのＤＨＡ−ＣｏＡを使用する能力を評価する。有効なＤＨＡを有し、ＬＰＡＡＴ活性を組み込んでいることが確認されているＬＰＡＡＴをコードする遺伝子を使用し、形質転換ＤＨＡ産生セイヨウアブラナ植物及び種子を産生する。
【０３４８】
ＤＰＡ−ＣｏＡを用いて強い活性を有するＬＰＡＡＴをコードする遺伝子を使用し、ＤＰＡ産生植物及び種子を形質転換し、ＴＡＧのｓｎ−２位においてエステル化されたＤＰＡの量を増加させる。
【表１２】
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【表１３】
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【０３４９】
実施例７．トランスジェニックカメリナサティバ種子のさらなる分析
総脂質含有率
ＧＡ７構築物のＴ−ＤＮＡに対してホモ接合である及び総脂肪酸含有物中にＤＨＡを含むカメリナサティバ種子を、以下の総脂質含有率及び組成について分析した。２つの連続した溶媒抽出工程を、初め、ヘキサンを用いて、次に、クロロホルム／メタノールを用いて、種子に対して行った。抽出または分析中、酸化防止剤は添加しなかった。脂質／溶媒混合物の長時間加熱及び還流により種子脂質を抽出ために通常に使用されるソックスレー抽出法は、ＤＨＡなどのω３ＰＵＦＡの分解または酸化の可能性があるので、使用しない。
【０３５０】
油料種子に対して業界標準であるので、最初の抽出で、溶媒としてヘキサンを使用した。また、ヘキサンは、その溶媒特性及び、特に室温において、極性脂質のその比較的貧溶解性おかげでＴＡＧ含有オイルを優先的に抽出する。形質転換及びコントロールカメリナ種子（それぞれ、１３０ｇ及び３０ｇ）をヘキサンで濡らし、電気めのう乳鉢と乳棒を用いて粉砕した（Ｒｅｔｓｃｈ  Ｍｕｈｌｅ、ドイツ）。混合物を、分液ロートに移動し、総量８００ｍＬのヘキサンを用いて４回抽出し、３番目の抽出では、一夜静置して抽出した。各抽出では、微粉を取り除くため、真空下ＧＦＣガラス繊維フィルターを通して、抽出物を濾過し、それから、真空下４０℃においてロータリーエバポレーターで蒸発させた。抽出物はプールされ、ＴＡＧリッチなヘキサン抽出物であった。
【０３５１】
ヘキサンでの抽出後、残ったシードミールを、ヘキサン抽出と同様な方法で、クロロホルム−メタノール（ＣＭ、１：１ｖ／ｖ）を用いてさらに抽出した。それから、ミールを濾過により取り除き、合わせた抽出物をロータリーエバポレーターで蒸発させた。それから、プールされたＣＭ総粗脂質抽出物を一相メタノール−クロロホルム−水混合物（２：１：０．８ｖ／ｖ／ｖ）を用いて溶解した。クロロホルム−水の添加により相を分離した（最終溶媒比、１：１：０．９ｖ／ｖ／ｖメタノール−クロロホルム−水）。各抽出物の精製脂質を下層のクロロホルム相中に分配し、ロータリーエバポレーターで濃縮して、極性脂質リッチＣＭ抽出物とした。これら各抽出物中の脂質含有物を重量測定法で決定した。
【０３５２】
脂肪酸組成分析では、ヘキサンとＣＭの抽出物のアプリコットを、Ｃｈｒｉｓｔｉｅら（１９８２）の方法に従って、トランスメチル化し、メタノール−クロロホルム−濃塩酸（３ｍＬ、１０：１：１、８０℃、２時間）を用いて脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）を生成した。ＦＡＭＥを、ヘキサン−クロロホルム（４：１、３ｘ１．８ｍＬ）中に抽出した。ヘキサンとＣＭの抽出後の残ったシードミール試料（１〜２ｇ）もトランスメチル化して、重量測定法によりＦＡＭＥとして残渣の脂質を測定した。種子の総脂質含有率を、ヘキサン及びＣＭ抽出物の脂質含有率及び溶媒抽出後のトランスメチル化したミールのＦＡＭＥ含有率を足すことにより算出した。
【０３５３】
トランスジェニック種子は、種子重量中４０．９％である野生型カメリナサティバ種子と比較して、種子重量中３６．２％であり、わずかに少ない総脂質を含有していた。油料種子を含む種子では、ヘキサン、それから、クロロホルム−メタノールを用いた連続抽出により得られた溶媒抽出可能な脂質、及び本明細書に例証の溶媒抽出後の抽出ミールのメチル基転移により放出された残渣の脂質の合計として、総脂質を決定した。この総脂質は、主に、トリアシルグリセロールなどの脂肪酸含有脂質及び極性脂質及び少量の非脂肪酸脂質、例えば、フィトステロール及び遊離した非エステル化形態で存在または脂肪酸とのエステル化された脂肪アルコールから成った。加えて、いずれかのステロールエステル類またはワックスエステル類及びカロテノイド、例えば、β−カロテンなどの炭化水素も、存在するならば、溶媒抽出可能な脂質中に含まれていた。これらは、全体的に重量測定に含まれ、ＴＬＣ−ＦＩＤ分析に含まれていた（表１４）。
【０３５４】
総脂質の種子重量当たりの脂質の３１〜３８％を、ヘキサンにより抽出し、トランスジェニック及びコントロール種子について、それぞれ、種子の総脂質の８６％及び９２％の割合であった。ＣＭ抽出は、トランスジェニック及びコントロール種子から、それぞれ、さらに４．８％及び２．４％（種子重量の）の主に極性な脂質リッチ抽出物を回収した。残りの溶媒抽出された油料シードミールのメチル基転移反応により遊離された残渣の脂質は、それぞれ、種子重量の０．３％及び０．４％であった。すなわち、第一及び第二の溶媒抽出は一緒に、種子の総脂質含有物の９９％を抽出した（すなわち、トリグリセリドなどの脂質及び糖脂質及びリン脂質から成る極性脂質を含む大部分脂肪酸であった、種子重量の３６．２％または４０％（次セクション−脂質分類分析参照））。
【０３５５】
脂質分類分析
ヘキサン及びＣＭ抽出物の脂質分類を、石英ロッド上のＣｈｒｏｍａｒｏｄ  Ｓ−ＩＩＩシリカと組み合わせて、展開溶媒系としてヘキサン／ジエチルエーテル／氷酢酸（７０：１０：０．１、ｖ／ｖ／ｖ）を用いて、水素炎イオン化検出器を備えた薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ−ＦＩＤ；Ｉａｔｒｏｓｃａｎ  Ｍａｒｋ  Ｖ．Ｉａｔｒｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、日本、東京）により分析した。適切な補正曲線を、Ｎｕ−Ｃｈｅｋ  Ｐｒｅｐ．Ｉｎｃ．（米国ミネソタ州エリジアン）から得た代表的基準を用いて作成した。ＳＩＣ−４８０ＩＩソフトウェア（ＳＩＳＣバージョン：７．０−Ｅ）を用いて、データを処理した。リン脂質化学種をシリカカラムクロマトグラフィーから得られた精製リン脂質フラクションの適用及びＦＩＤ検出前のクロロホルム／メタノール／氷酢酸／水（８５：１７：５：２、ｖ／ｖ／ｖ）中、ロッドの展開により分離した。
【０３５６】
ＣＭ抽出物からＴＡＧ、糖脂質及びリン脂質フラクションを分離するため、短いガラスカラム中のシリカゲル６０（１００〜２００メッシュ）（０．３〜１ｇ）またはグラスウールを詰めたパスツールピペットを使用して、１０ｍｇの精製ＣＭ脂質抽出物を精製した。ＣＭ抽出物の残渣のＴＡＧフラクションを、ヘキサン中１０％ジエチルエーテル２０ｍＬで溶離し、糖脂質を、アセトン２０ｍＬで溶離し、リン脂質を、最初メタノール１０ｍＬ、次いでメタノール−クロロホルム−水（５：３：２）１０ｍＬの２工程で溶離した。この第二の溶離はリン脂質の回収を増加させた。各フラクションの収量を重量測定法により決定し、純度をＴＬＣ−ＦＩＤにより確認した。全抽出物及びフラクションを、さらにＧＣ及びＧＣ−ＭＳ分析するまで、−２０℃においてジクロロメタン中で保管した。
【０３５７】
各トランスジェニック及びコントロール種子からのＴＡＧリッチヘキサン抽出物は、約９６％のＴＡｇを含有していた。ＣＭ抽出物は、トランスジェニック及び野生型種子について、それぞれ、該ＣＭ抽出物の４４重量％及び１３重量％になる残渣ＴＡＧを含有していた。ヘキサン抽出物と対照的に、ＣＭ抽出物は、トランスジェニック及びコントロール種子について、それぞれ、該ＣＭ抽出物の５０重量％及び７６重量％になる極性脂質、即ち、リン脂質及び糖脂質に富んでいた（表１４）。主なリン脂質は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）であり、総リン脂質の７０％〜７９％を占め、次いで、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ、７％〜１３％）、比較的低レベルのホスファチジン酸（ＰＡ、２％〜５％）及びホスファチジルセリン（ＰＳ、＜２％）であった。
【０３５８】
脂肪酸組成
概して、ＤＨＡ及び／またはＤＰＡを産生する種子では、本発明者らは、種子中の全脂質の直接的メチル基転移反応により決定したとき、種子中の総脂質の脂肪酸組成が、ＴＡＧフラクショと類似していることを観察した。このことは、種子中に存在する総脂質の９０％より多くが、ＴＡＧの形態で起こることに起因した。
【０３５９】
ヘキサン及びＣＭ抽出物の異なる脂質分類の脂肪酸組成を、Ｓｕｐｅｌｃｏ  Ｅｑｕｉｔｙ（商標）−１フューズドシリカキャピラリーカラム（１５ｍ  ｘ  内径０．１ｍｍ、膜厚０．１μｍ、米国ペンシルベニア州ベルフォント）、ＦＩＤ、スプリット／スプリットレスインジェクター及びＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ７６８３Ｂシリーズオートサンプラー及びインジェクターを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ６８９０Ａ  ＧＣ装置（米国カリフォルニア州パロアルト）を用いて、ガスクロマトグラフィ（ＧＣ）及びＧＣ−ＭＳ分析により決定した。キャリアーガスはヘリウムであった。試料を１２０℃のオーブン温度において、スプリットレスモードで注入した。注入後、オーブン温度を、１０℃／分で２７０℃まで上昇させ、最終的に５℃／分で３００℃まで上昇させた。溶離した化合物を、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェア（米国カリフォルニア州パロアルト）で定量化した。ＧＣ結果には、個々の成分面積の±５％以下の誤差があった。
【表１４】
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【０３６０】
ＧＣ質量分光測定（ＧＣ−ＭＳ）分析を、Ｆｉｎｎｉｇａｎ  Ｔｒａｃｅ  ｕｌｔｒａ  Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ  ＧＣ−ＭＳ（モデル：ＴｈｅｒｍｏＱｕｅｓｔ  Ｔｒａｃｅ  ＤＳＱ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で行った。ＴｈｅｒｍｏＱｕｅｓｔ  Ｘｃａｌｉｂｕｒソフトウェア（米国テキサス州オースチン）でデータを処理した。ＧＣにオンカラムインジェクター及び上記と類似極性のキャピラリーＨＰ−５  Ｕｌｔｒａ  Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｊ＆  Ｗカラム（５０ｍ  ｘ  内径０．３２ｍｍ、膜厚０．１７μｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国カリフォルニア州サンタクララ）を装着した。個々の成分を、質量分析データを用いて、及び信頼できる標準及び実験室基準として得たものを用いた保持時間データとの比較により同定した。試料バッチと同時に、全過程のブランク分析を行った。
【０３６１】
抽出物中の異なる脂質分類の脂肪酸組成データを表１５に示す。ＤＨＡ産生カメリナ種子では、ＤＨＡは、ＤＨＡ及びＡＬＡの比率と逆相関で、１．６％から６．８％の間の範囲の比率で主要脂質フラクション（ＴＡＧ、リン脂質及び糖脂質）中に分布していた。トランスジェニック種子からのＴＡＧリッチヘキサン抽出物は、６．８％のＤＨＡ及び４１％のＡＬＡを含有していた（表１５）。極性脂質リッチＣＭ抽出物は、４．２％のＤＨＡ及び５０％のＡＬＡ、すなわち、比較的より少ないＤＨＡ及びより多いＡＬＡを含有していた。極性脂質リッチＣＭ抽出物からの残渣ＴＡＧは、６％のＤＨＡ及び４０％のＡＬＡを含有していた。ＣＭ抽出物から単離された糖脂質フラクションは、３％のＤＨＡ及び３９％のＡＬＡを含有し、リン脂質フラクションは、最低レベルのＤＨＡ（１．６％）及び最高レベルのＡＬＡ（５４％）を含有していた。トランスジェニックカメリナ種子は、主要脂質分類（ＴＡｇ、糖脂質及びリン脂質）のコントロール種子と比較して、より高いレベルのＡＬＡ及びより低いレベルのＬＡ（リノール酸、１８：２ω６）を含有していた。ＡＬＡ及びＬＡの比率は：トランスジェニック種子についてＡＬＡ３９〜５４％及びＬＡ４％〜９％、並びに、コントロール種子についてＡＬＡ１２％〜３２％及びＬＡ２０％〜２９％であった。エルカ酸（２２：１ω９）の相対レベルは、コントロール種子より、トランスジェニック種子内の全フラクションで低く、例えば、ヘキサン抽出物では、１．３％対２．７％であった（表１５）。
【０３６２】
種子内のステロール組成
抽出脂質中のステロール含有率及び組成を決定するため、ＴＡＧリッチヘキサン抽出物及び極性脂質リッチＣＭ抽出物からの約１０ｍｇの総脂質試料を、８０％ＭｅＯＨ中５％ＫＯＨ４ｍＬを用いてけん化し、テフロン加工スクリューキャップしたガラス試験チューブ内で８０℃２時間加熱した。反応混合物を冷却後、ミリＱ水２ｍＬを添加し、ステロール及びアルコールを、振盪及びボルテックスすることにより、ヘキサン：ジクロロメタン（４：１ｖ／ｖ）２ｍＬ中に抽出した。混合物を遠心分離し、有機相の各抽出物を、振盪及び遠心分離によりミリＱ水２ｍＬで洗浄した。上層のステロール含有有機層を抜き出した後、溶媒を、窒素気流を用いて蒸発させ、ステロール及びアルコールを、ビス（トリメチルシリル）−トリフルオロアセトアミド（ＢＳＴＦＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）２００μＬを用いて、密封ＧＣバイアル内で８０℃２時間加熱によりシリル化した。この方法により、遊離ヒドロキシル基をトリメチルシリルエーテルに転換した。ステロール−及びアルコール−ＯＴＭＳｉ誘導体を、窒素気流下、加熱ブロック（４０℃）で乾燥し、上記ＧＣ／ＧＣ−ＭＳ分析直前に、ジクロロメタン（ＤＣＭ）に再溶解した。
【表１５】
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【０３６３】
トランスジェニック及びコントロール種子両方の主要ステロールは、２４−エチルコレステロール（シトステロール、総ステロールの４３％〜５４％）、２４−メチルコレステロール（カンペステロール、２０％〜２６％）であり、より低レベルのコレステロール（５％〜８％）では、ブラシカステロール（２％〜７％）、イソフコステロール（Δ５−アベナステロール、４％〜６％）、スチグマステロール（０．５％〜３％）、コレスタ−７−エン−３β−オール（０．２％〜０．５％）、２４−メチルコレスタノール（カンペスタノール、０．４％〜１％）及び２４−デヒドロコレステロール（０．５％〜２％）であった（表１６）。これらの９つのステロールは、総ステロールの８６％〜９５％を占め、残りの成分は、炭素及び二重結合数について部分的のみ同定されたステロールであった。全ステロールプロファイルは、ヘキサン及びＣＭ抽出物両方について、トランスジェニック及びコントロール種子間で類似していた。
【０３６４】
脂肪アルコール分析
種子中の脂肪アルコールを誘導体化し、ステロールと同様に分析した。イソ分岐脂肪アルコールを伴ったＣ１６〜Ｃ２２の一連の脂肪アルコールを、ヘキサン及びＣＭ抽出物両方で同定した。トランスジェニック及びコントロール種子について、観察された個々の成分の比率のいくらかの差異を含む類似のプロファイルが観察された。クロロフィル由来のフィトールは主要脂肪族アルコールであり、それぞれ、トランスジェニック及びコントロール種子中のヘキサンフラクションの総脂肪アルコールの４７％及び３７％を占める。奇数鎖アルコールは、ヘキサン抽出物中（１６％〜２３％）より、ＣＭ抽出物中で高いレベルで存在する（総脂肪アルコール含有物の３７％〜３８％）。イソ−１７：０（１６％〜３８％）は、１７：０（０．３％〜５．７％）に対して優勢であった。存在する別の奇数鎖アルコールは、１９：０であった（４．５％〜６．５％）。検出された他のアルコールは、イソ−１６：０、１６：０、イソ−１８：０、１８：１、１８：０を含み、少量レベルのイソ−２０：０、２０：１、２０：０、イソ−２２：０、２２：１及び２２：０も存在した。
【０３６５】
考察
結果は、室温においてヘキサンで複数回抽出と電動式乳鉢及び乳棒を用いた粉砕は、トランスジェニック種子からＴＡＧ含有オイルの大部分を回収するのに効果的であることを示した。中程度レベルのＤＨＡを含むトランスジェニック種子からのオイルに加えて、トランスジェニック種子は、コントロール種子と比較して、大部分の脂質分類（トリアシルグリセロール、糖脂質及びリン脂質）中に著しく高いレベルのＡＬＡも含んでいた。このことは、Δ１５−デサチュラーゼ活性が、種子発育中に、トランスジェニック種子内で著しく増強されることを示した。興味深いことに、様々な抽出物及びフラクション中の脂肪酸組成及びＤＨＡの比率においていくらかのわずかな差があり、ＤＨＡレベルは、ＴＡＧリッチヘキサン抽出物及びＣＭ抽出からのＴＡＧ中でより高く（６％〜６．８％）、極性脂質フラクション中でより低かった（糖脂質中３％及びリン脂質中１．６％）。１６：０のレベルは、ＴＡＧリッチヘキサン抽出物及びＣＭ抽出からのＴＡＧ（６％〜７％）と比較して、ＣＭ抽出物中の糖脂質及びリン脂質の極性脂質フラクション中でより高かった（１９％〜２１％）。
【表１６】
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【０３６６】
トランスジェニック種子及びコントロール種子のステロール組成は、同じ大部分のステロールが存在する精製カメリナオイル（Ｓｈｕｋｌａら、２００２）中で見られたものと同様であり、付加遺伝子が種子内のステロール合成に影響を及ぼさないことを示した。カメリナオイル中のコレステロールレベルは、大部分の植物オイルで生じるより高かった。カメリナサティバを含むアブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）ファミリー内で見られる特徴的ステロールであるブラシカステロールが存在していた。
【０３６７】
実施例８．カラシナ種子内のＬＣ−ＰＵＦＡの産生
トランスジェニックセイヨウアブラナ植物を、以下のように、ＤＨＡの産生のため、ＧＡ７−ｍｏｄＢ構築物（実施例３）を用いて産生した。長日反応性変種のカラシナ種子を、Ｋｅｒｅｓｚｔら（２００７）に記載のように塩素ガスを用いて滅菌した。滅菌種子を、ｐＨ５．８に調節した、０．８％寒天で固形化した１／２強化ＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ及びＳｋｏｏｇ、１９６２）で発芽させ、６〜７日間、１６／８時間（明／暗）光周期で、蛍光灯下（５０μＥ／ｍ２ｓ）、２４℃において生育した。２〜４ｍｍ柄の子葉柄を、これらの苗から無菌的に単離し、移植片として使用した。アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）株ＡＧＬ１を、バイナリーベクターＧＡ７で形質転換した。アグロバクテリウム培養を開始し、Ｂｅｌｉｄｅら（２０１３）に記載のように感染処理した。全形質転換のため、約５０の新たに単離した子葉柄を、６分間、アグロバクテリウム・ツメファシエンス１０ｍｌで感染させた。感染葉柄を、滅菌フィルターペーパー上で吸い取り、過剰なアグロバクテリウム・ツメファシエンスを除去して、共培養培地（１，５ｍｇ／ＬのＢＡ、０．０１ｍｇ／ＬのＮＡＡ及び１００μＭアセトシリンゴンを含み、Ｌ−システイン（５０ｍｇ／Ｌ）、アスコルビン酸（１５ｍｇ／Ｌ）及びＭＥＳ（２５０ｍｇ／Ｌ）を添加したＭＳ）に移動した。全プレートをマイクロポアテープで密封し、共培養４８時間２４℃において、暗所でインキュベートした。それから、移植片を、事前選択培地（１．５ｍｇ／ＬのＢＡ、０．０１ｍｇ／ＬのＮＡＡ、３ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ３、２５０ｍｇ／Ｌのセフォタキシム及び５０ｍｇ／Ｌのチメンチンを含むＭＳ−寒天）に移動し、１６／８時間光周期で、２４℃において４〜５日間培養した後、移植片を、事前選択培地（１．５ｍｇ／ＬのＢＡ、０．０１ｍｇ／ＬのＮＡＡ、３ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ３、２５０ｍｇ／Ｌのセフォタキシム、５０ｍｇ／Ｌのチメンチン及び５ｍｇ／ＬのＰＰＴを含むＭＳ−寒天）に移動し、１６／８時間光周期で、２４℃において４週間培養した。緑色のカルスを有する移植片を、シュート形成培地（２．０ｍｇ／ＬのＢＡ、３ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ３、２５０ｍｇ／Ｌのセフォタキシム、５０ｍｇ／Ｌのチメンチン及び５ｍｇ／ＬのＰＰＴを含むＭＳ−寒天）に移動し、さらに２週間培養した。小さな再分化シュート芽を、ホルモンフリーＭＳ培地（３ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ３、２５０ｍｇ／Ｌのセフォタキシム、５０ｍｇ／Ｌのチメンチン及び５ｍｇ／ＬのＰＰＴを含むＭＳ−寒天）に移動し、さらに２〜３週間培養した。
【０３６８】
少なくとも１．５ｃｍのサイズの可能性のあるトランスジェニックシュートを単離し、発根誘導培地（０．５ｍｇ／ＬのＮＡＡ、３ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ３、２５０ｍｇ／Ｌのセフォタキシム及び５０ｍｇ／Ｌのチメンチンを含むＭＳ−寒天）に移動し、２〜３週間培養した。ＰＣＲにより確認し、繁茂した根を有するトランスジェニックシュートを、温室内の土壌に移植し、２２℃において１６／８時間（明／暗）光周期下生育した。３つの確認されたトランスジェニック植物を得た。形質転換植物を温室で生育し、自家受粉させて、Ｔ１種子を収穫した。各Ｔ０形質転換植物からのＴ１種子のプールの脂質の脂肪酸組成を分析し、ＪＴ１−４と命名された１つの系統で、２．８％のＤＰＡ及び７．２％のＤＨＡの存在を示したが、ＪＴ１−６と命名された別の系統は２．６％のＤＰＡを示した。
【０３６９】
個々のＴ１種子の種子オイルを、脂肪酸組成について分析した；データのいくつかを表１７に示す。ＪＴ１−４−Ａ−１３、ＪＴ１−４−Ａ−５及びＪＴ１−４−Ｂ−１３を含むいくつかのＴ１種子は、総脂肪酸含有物の１０％〜約２１％のレベルでＤＨＡを産生した。驚くべきことに且つ予想外に、Ｔ１種子のいくつかは、総脂肪酸含有物の１０％〜約１８％のレベルでＤＰＡを含み、検出可能なＤＨＡを含んでいなかった（＜０．１％）。発明者らは、これらの植物中に挿入されたＴ−ＤＮＡのΔ４−デサチュラーゼ遺伝子が、実施例２に記載されるものと類似した自然な突然変異により不活性であったと結論づけた。Ｔ１種子を発芽し、各々からの１つの発生子葉を残りのオイル中の脂肪酸組成について分析した。各苗の残りを維持し、成熟するまで生育しＴ２種子を得た。
【０３７０】
１つのＴ−ＤＮＡインサーションに対してホモ接合であるトランスジェニック植物を同定し選択した。ＪＴ１−４−１７と命名された１つの選択系統の植物は、１つのＴ−ＤＮＡインサーションを有し、ＤＨＡを産生し、同時に低レベルのみのＤＰＡを産生するが、ＪＴ１−４−３４と命名された第二選択系統も１つのＴ−ＤＮＡインサーションを有するが、ＤＰＡを産生し、ＤＨＡを産生しなかった。本発明者らは、最初の形質転換体は２つの別々のＴ−ＤＮＡを含んでいたが、１つはＤＨＡ産生を与えられ、他方はＤＨＡでなくＤＰＡの産生を与えられたと結論した。その種子内でＤＨＡを産生するカラシナ植物を、その種子内でＤＰＡを産生する植物と交配した。Ｆ１子孫は、双方のＴ−ＤＮＡインサーションに対してヘテロ接合である植物を含んでいた。これらの子孫植物からの種子を観察し、２６％の総ＤＨＡ＋ＤＰＡ含有率に対して、約２０％のＤＨＡ及び約６％のＤＰＡを産生した。Ｆ１植物を自家受粉し、双方のＴ−ＤＮＡインサーションに対してホモ接合である子孫は、３５％までのＤＨＡ及びＤＰＡを産生すると期待される。
【０３７１】
約１８％のＤＰＡを、ＪＴ１−４−３４−１１と命名されたＴ３子孫のプール種子の脂質で観察した。同様に、約１７．５％のＤＨＡを、Ｔ３  ＪＴ１−４−１７−２０の子孫のプール種子の脂質で観察した。ＪＴ１−４  Ｔ１プール種子、Ｔ１単一種子、Ｔ２プール種子、Ｔ２単一種子、及びＴ３プール種子、Ｔ３単一種子の脂肪酸組成を、表１８〜２１に示す。ＪＴ１−４  Ｔ３分離個体ＪＴ−１−４−３４−１１は、１８％のプールＴ３種子ＤＰＡ含有率を有し、この特定の分離個体からの単一種子は、各々、総脂肪酸含有物のパーセントとして、約２６％のＤＰＡ含有率を有した。
【０３７２】
１７．９％のＤＰＡを有する種子のオイルについて、次のパラメーターを算出した：総飽和脂肪酸、６．８％；総一価不飽和脂肪酸、３６．７％；総多価不飽和脂肪酸、５６．６％、総ω６脂肪酸、７．１％；新ω６脂肪酸、０．４％、その全てはＧＬＡであった；総ω３脂肪酸、４６．５％；新ω３脂肪酸、２４．０％；総ω６：総ω３脂肪酸の比、６．５；新ω６：新ω３脂肪酸の比、６０；Δ１２−デサチュラーゼによるオレイン酸からＬＡへの転換効率、６１％；Δ６−デサチュラーゼによるＡＬＡからＳＤＡへの転換効率、５１％；Δ６−エロンガーゼによるＳＤＡからＥＴＡへの転換効率、９０％；Δ５−デサチュラーゼによるＥＴＡからＥＰＡへの転換効率、８７％；Δ５−エロンガーゼによるＥＰＡからＤＰＡへの転換効率、９８％。
【０３７３】
ｍｏｄＢ構築物で、カラシナのより多くのトランスジェニック植物を産生するため、形質転換を５回繰り返し、１６の推定トランスジェニックシュート／苗を再生した。Ｔ１種子分析を実行し、ＤＰＡ及びＤＨＡ含有率を決定する。
【０３７４】
ＤＰＡを含み、ＤＨＡを含まないさらなる種子を産生するため、以下のように、Δ４−デサチュラーゼ遺伝子を欠く、ｍｏｄＢ構築物の変異体である遺伝子構築物を作製した。２つのＤＮＡ断片、ＥＰＡ−ＤＰＡ断片１とＥＰＡ−ＤＰＡ断片２を、適切な制限酵素部位を用いて合成した（Ｇｅｎｅａｒｔ、ドイツ）。中間クローニングベクター、ｐＪＰ３６６０は、ＥＰＡ−ＤＰＡ断片１のＡａｔＩＩ−ＭｌｕＩ断片を、Δ６デサチュラーゼカセットを含むＧＡ７−ｍｏｄＢの構築において初期に使用したベクターである、１１ＡＢＨＺＨＣ＿ＧＡ７−ｆｒａｇ＿ｄ６Ｄ＿ｐＭＳと指定されるベクター中のＡｓｃＩ−ＡａｔＩＩ部位へとクローニングすることにより作製された。次いで、ｐＪＰ３６６１は、ｐＪＰ３６６０のＰｍｅＩ−ＰｓｐＯＭＩ断片を、ｍｏｄＢのＰｍｅＩ−ＰｓｐＯＭＩ部位へとクローニングすることにより作製した。次いで、ＤＰＡベクターであるｐＪＰ３６６２（図４）を、ＥＰＡ−ＤＰＡ断片２のＢｓｉＷＩ−ＰｓｐＯＭＩ断片を、ｐＪＰ３６６１のＢｓｉＷＩ−ＰｓｐＯＭＩ部位へとクローニングすることによりアセンブリした。このベクターは、オレイン酸をＤＰＡω３及び対応するω６脂肪酸へと転換する酵素をコードする脂肪酸生合成遺伝子を含有した。得られた構築物を使用し、カラシナ及びセイヨウアブラナを形質転換した。種子脂質の総脂肪酸含有物中３５％までのＤＰＡを含む子孫種子を産生する。
【０３７５】
ＤＨＡを産生する植物の種子から抽出されたオイルをＮＭＲにより検査し、少なくとも９５％のＤＨＡは、ＴＡＧ分子のｓｎ−１，３位に存在していることが観察された。
【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【表２１】
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【０３７６】
実施例９．形質転換植物のさらなる分析及び実地試験
サザンブロットハイブリダイゼーション解析を、ＧＡ７−ｍｏｄＢ構築物からのＴ−ＤＮＡで形質転換された選択Ｔ２セイヨウアブラナ植物に対して実行した。植物組織試料から抽出されたＤＮＡを、サザンブロットハイブリダイゼーション解析のためいくつかの制限酵素で消化した。Ｔ−ＤＮＡ部分に対応する放射活性プローブを、該ブロットにハイブリダイズし、ストリンジェントな条件下洗浄し、ブロットを膜に暴露してハイブリダイズするバンドを検出した。試料のいくつかは、植物の１つのＴ−ＤＮＡインサーションに対応する各制限酵素の単一ハイブリダイズバンドを示したが、他は、２本のバンドを示し、また、他は、４つ〜６つのインサーションに対応する複数のＴ−ＤＮＡバンドを示した。サザンブロット解析により観察されたハイブリダイズバンド数は、デジタルＰＣＲ法により決定されるとき、約３または４のコピー数まで、トランスジェニック植物のＴ−ＤＮＡコピー数とよく相関した。約５より大きいコピー数においては、デジタルＰＣＲ法はあまり信頼性ができなかった。
【０３７７】
選択系統のいくつかを、異なる遺伝子背景の一連の約３０種の異なるセイヨウアブラナ変種との交配において花粉ドナーとして使用した。さらに、戻し交配を実行し、複数のＴ−ＤＮＡインサーションが遺伝的に連鎖しているかどうかを示し、遺伝的に連鎖していないトランスジェニック遺伝子座の分離個体を可能とする。それにより、単一トランスジェニック遺伝子座を含む系統を選択する。
【０３７８】
単一プライマーＰＣＲ反応を、Ｔ−ＤＮＡの左右境界と隣接するプライマーを用いて、トランスジェニック系統に対して実行し、Ｔ−ＤＮＡの逆方向反復の存在を示すいずれもの系統を処分する。
【０３７９】
トランスジェニック系統のいくつかは、遅い開花を示し、一方、他は結実を減少し、従って、温室での生育後の植物当たりの種子収率が低下し、雌または雄生殖能力の低下と一致していた。花の形態をこれらの植物で調査し、いくつかの場合、葯から花粉の裂開及び放出が遅いので、裂開が起こる前に花柱が伸びて、それ故、柱頭から葯まで距離が遠ざかった。完全な受精率は人為的受粉により回復できる。さらに、裂開におけるは分生存率を、生体染色ＦＤＡ及びＰＩでの染色（実施例１）により決定し、系統のいくつかで減少しているが、トランスジェニック系統の大部分では、花粉生存率は、野生型コントロールのほぼ１００％であることが分かった。いくつかの植物での種子収率低下の可能性のある原因についてさらなる試験として、いくつかのＴ３及びＴ４の葯及び柱頭／花柱を含む花芽の脂肪酸含有率及び組成を試験した。抽出脂質中でＤＨＡは検出されず、遺伝子構築物の遺伝子が植物の生育中に花芽内で発現されなかったことを示し、種子収率低下の原因として、これを除外した。
【０３８０】
オイル含有率をＮＭＲにより測定し、総脂肪酸含有物中のＤＨＡレベルを、Ｔ２種子について決定した。６％未満のＤＨＡを含むトランスジェニック系統を処分した。Ｔ１、Ｔ２及びＴ３世代の植物からの葉試料のＴ−ＤＮＡコピー数を、デジタルＰＣＲ法（実施例１）により決定した。
【０３８１】
選択Ｔ３及びＴ４種子ロットを、オーストラリア、ビクトリアの２カ所の場所において、各々、約１０種子／ｍの播種密度で、１０ｍ作条で、畑に播種した。選択種子ロットは、約８〜１１％のプール種子ＤＨＡレベル、約１９％までの個々のＴ２種子ＤＨＡレベルを示し、Ｔ０植物Ｔ−ＤＮＡコピー数が３であるＢ００３−５−１４由来系統を含んでいた。選択種子ロットは、２０％を超えるＴ２種子ＤＨＡレベル、及び１または２のＴ２植物Ｔ−ＤＮＡコピー数を示したＢ００５０−２７由来系統も含んでいた。畑に播種された種子は発芽し、小植物は、野生型種子と同じ速度で発生した。大部分だが、全てではない播種された種子ロットから生育した植物は、表現的に正常であり、例えば、形態、生育速度、草高、雌雄生殖能力、花粉生存率（１００％）、結実、長角果サイズ及び同条件下生育した野生型コントロール植物と本質的に同じである形態を有した。植物当たりの種子収率は、同条件下生育した野生型コントロールと同様であった。他の種子試料を、より大きな面積で播種し、選択トランスジェニック系統を大きくした。収穫した種子中の総ＤＨＡ含有量は、少なくとも３０ｍｇ／種子ｇであった。
【０３８２】
広範に記載された本発明の精神または範囲から逸脱することなく、具体的実施形態で示したように、本発明に多数の変化形及び／または修飾が成され得ることを、当業者は認識するであろう。従って、本実施形態は、あらゆる点で、例証であって、制限されるものではないと見なすべきである。
【０３８３】
本明細書中に含まれた文書、行為、物質、装置、物品などのいかなる考察も、本発明のための状況を提供する目的のためだけのものである。本願の各請求範囲の優先日前に存在したので、いずれかまたは全てのこれらの物質が先行技術の基礎の部分を形成するまたは本発明に関連する分野で共通する一般知識であったとの承認であると解釈するべきでない。
【０３８４】
参考文献
Ａｂｂａｄｉら（２００４）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １６：２７３４〜２７４８。
Ａｂｂｏｔｔら（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：２０１２〜２０１８。
Ａｇａｂａら（２００４）Ｍａｒｉｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（ＮＹ）６：２５１〜２６１。
Ａｌｖａｒｅｚら（２０００）Ｔｈｅｏｒ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ  １００：３１９〜３２７。
Ａｒｍｂｒｕｓｔら（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０６：７９〜８６。
Ｂａｕｍｌｅｉｎら（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２５：４５９〜４６７。
Ｂａｕｍｌｅｉｎら（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２：２３３〜２３９。
Ｂｅａｕｄｏｉｎら（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７：６４２１〜６４２６。
Ｂｅｌｉｄｅら（２０１３）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔ．１１３：５４３〜５５３。
Ｂｅｒｂｅｒｉｃｈら（１９９８）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６：２９７〜３０６。
Ｂｒｏｕｎら（１９９８）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１３：２０１〜２１０。
Ｂｒｏｗｎら（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３６４：７９５〜８０５。
Ｃｈａｎら（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２８：９５１〜９５６。
Ｃｈａｐｍａｎら（２００４）Ｇｅｎ．Ｄｅｖ．１８：１１７９〜１１８６。
Ｃｈｅｎら（２００４）Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １６：１３０２〜１３１３。
Ｃｈｅｎｇら（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．１５：６５３〜６５７。
Ｃｈｅｎｇら（２０１０）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ  １９：２２１〜２２９。
Ｃｈｏら（１９９９ａ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：４７１〜４７７。
Ｃｈｏら（１９９９ｂ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３７３３５〜３７３３９。
Ｃｈｒｉｓｔｉｅ（１９８２）Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．２３：１０７２〜１０７５。
Ｄａｍｕｄｅら（２００６）．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０３：９４４６〜９４５１。
Ｄｅｎｉｃ及びＷｅｉｓｓｍａｎ（２００７）Ｃｅｌｌ  １３０：６６３〜６７７。
Ｄｏｍｅｒｇｕｅら（２００２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６９：４１０５〜４１１３。
Ｄｏｍｅｒｇｕｅら（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３５１１５〜３５１２６。
Ｄｏｍｅｒｇｕｅら（２００５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．ｌ  ３８９：４８３〜４９０。
Ｄｕｎｏｙｅｒら（２００４）Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １６：１２３５〜１２５０。
Ｅｌｌｅｒｓｔｒｏｍら（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２：１０１９〜１０２７。
Ｇａｍｅｚら（２００３）Ｆｏｏｄ  Ｒｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ３６：７２１〜７２７。
Ｇａｒｃｉａ−Ｍａｒｏｔｏら（２００２）Ｌｉｐｉｄｓ  ３７：４１７〜４２６。
Ｇｉｒｋｅら（１９９８）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１５：３９〜４８。
Ｈａｒａｙａｍａ（１９９８）．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：７６〜８２。
Ｈａｓｔｉｎｇｓら（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８：１４３０４〜１４３０９。
Ｈｉｎｃｈｅｅら（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：９１５〜９２２。
Ｈｏｆｆｍａｎｎら（２００８）Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３：２２３５２〜２２３６２。
Ｈｏｎｇら（２００２ａ）Ｌｉｐｉｄｓ  ３７：８６３〜８６８。
Ｈｏｒｉｇｕｃｈｉら（１９９８）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３９：５４０〜５４４。
Ｈｕａｎｇら（１９９９）Ｌｉｐｉｄｓ  ３４：６４９〜６５９。
Ｉｎａｇａｋｉら（２００２）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６６：６１３〜６２１。
Ｋａｊｉｋａｗａら（２００４）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５４：３３５〜５２。
Ｋａｊｉｋａｗａら（２００６）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５８０：１４９〜１５４。
Ｋｅｒｅｓｚｔら（２００７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃ  ２：９４８〜９５２。
Ｋｉｍら（２００５）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ．２００５  １０７３〜８９。
Ｋｎｕｔｚｏｎら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７３：２９３６０〜６。
Ｋｏｌｅｔｚｋｏら（１９８８）Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．４７：９５４−９５９。
Ｋｏｚｉｅｌら（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２：３９〜４０５。
Ｌａｓｓｎｅｒ（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０９：１３８９〜９４。
Ｌｅｏｎａｒｄら（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３４７：７１９〜７２４。
Ｌｅｏｎａｒｄら（２０００ｂ）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３５０：７６５〜７７０。
Ｌｅｏｎａｒｄら（２００２）Ｌｉｐｉｄｓ  ３７：７３３〜７４０。
Ｌｅｗｓｅｙら（２００７）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．５０：２４０〜２５２。
Ｌｏら（２００３）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１３：４５５〜４６６。
Ｌｕ及びＫａｎｇ（２００８）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．２７：２７３〜８。
Ｍａｌｌｏｒｙら（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：６２２〜６２５。
Ｍａｒａｎｇｏｎｉら（１９９５）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．６：３２９〜３３５。
Ｍｅｅｓａｐｙｏｄｓｕｋら（２００７）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８２：２０１９１〜２０１９９。
Ｍｅｎｇら（２００８）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８９：２３４９〜２３５８。
Ｍｅｙｅｒら（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．４２：９７７９〜９７８８。
Ｍｅｙｅｒら（２００４）Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ  ４５：１８９９〜１９０９。
Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎら（１９９８ａ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１９０５５〜１９０５９。
Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎら（１９９８ｂ）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４３９：２１５〜２１８。
Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ及びＳｋｏｏｇ（１９６２）Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ  Ｐｌａｎｔａｒｕｍ  １５：４７３〜４９７。
Ｎａｐｉｅｒら（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３０：６１１〜６１４．
Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３〜４５３。
Ｐａｒｋｅｒ−Ｂａｒｎｅｓら（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：８２８４〜８２８９。
Ｐｅｒｅｉｒａら（２００４ａ）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３７８：６６５〜６７１。
Ｐｅｒｅｉｒａら（２００４ｂ）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３８４：３５７〜３６６。
Ｐｅｒｒｉｎら（２０００）Ｍｏｌ  Ｂｒｅｅｄ  ６：３４５〜３５２。
Ｐｅｔｒｉｅら（２０１０ａ）Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．１２：２３３〜２４０。
Ｐｅｔｒｉｅら（２０１０ｂ）Ｐｌａｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １１：６：８。
Ｐｅｔｒｉｅら（２０１２）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．２１：１３９〜１４７。
Ｐｏｔｅｎｚａら（２００４）Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ−Ｐｌａｎｔ  ４０：１〜２２。
Ｑｉら（２００２）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５１０：１５９〜１６５。
Ｑｉら（２００４）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：７３９〜７４５。
Ｑｉｕら（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：３１５６１〜３１５６６。
Ｒｅｄｄｙ及びＴｈｏｍａｓ（１９９６）  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：６３９〜６４２。
Ｒｅｄｄｙら（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２：２９３〜３００。
Ｒｏｂｅｒｔら（２００５）Ｆｕｎｃ．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．３２：４７３〜−４７９。
Ｒｏｂｅｒｔら（２００９）Ｍａｒｉｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １１：４１０〜−４１８。
Ｒｕｉｚ−Ｌｏｐｅｚら（２０１２）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．２１：１３９〜１４７。
Ｓａｈａら（２００６）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１４１：１５３３〜１５４３。
Ｓａｉｔｏら（２０００）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７：１８１３〜１８１８。
Ｓａｋｕｒａｄａｎｉら（１９９９）Ｇｅｎｅ  ２３８：４４５〜４５３。
Ｓａｔｏら（２００４）Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉ．４４：６４６〜６５２。
Ｓａｋｕｒａｄａｎｉら（２００５）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６６：６４８〜６５４。
Ｓａｙａｎｏｖａら（２００６）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１：３６５３３〜３６５４１。
Ｓａｙａｎｏｖａら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：４２１１〜４２１６。
Ｓａｙａｎｏｖａら（２００３）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５４２：１００〜１０４。
Ｓａｙａｎｏｖａら（２００６）Ｐｌａｎｔａ  ２２４：１２６９〜１２７７。
Ｓａｙａｎｏｖａら（２００７）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １４４：４５５〜４６７。
Ｓｈｕｋｌａら（２００２）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．７９：９６５〜９６９。
Ｓｉｎｇｈら（２００５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．８：１９７〜２０３。
Ｓｐｅｒａｎｚａら（２０１２）Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （印刷中）。
Ｓｐｅｒｌｉｎｇら（２０００）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７：３８０１〜３８１１。
Ｓｐｅｒｌｉｎｇら（２００１）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３８８：２９３〜８。
Ｓｐｒｅｃｈｅｒら（１９９５）Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．３６：２４７１〜２４７７。
Ｓｐｙｃｈａｌｌａら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：１１４２〜１１４７。
Ｔｏｎｏｎら（２００３）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５５３：４４０〜４４４。
Ｔｒａｕｔｗｅｉｎ（２００１）Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｓｃｉ．ａｎｄ  Ｔｅｃｈ．１０３：４５〜５５．
Ｔｖｒｄｉｋ（２０００）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４９：７０７〜７１８。
Ｖｅｎｅｇａｓ−Ｃａｌｅｒｏｎら（２０１０）Ｐｒｏｇ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．４９：１０８〜１１９。
Ｖｏｉｎｎｅｔら（２００３）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．３３：９４９〜９５６。
Ｗａｌｌｉｓ及びＢｒｏｗｓｅ（１９９９）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３６５：３０７〜３１６。
Ｗａｔｔｓ及びＢｒｏｗｓｅ（１９９９ｂ）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３６２：１７５〜１８２。
Ｗｅｉｓｓら（２００３）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９３：９５：１０６。
Ｗｅｎｇら（２００４）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ２２：２８９〜３００。
Ｗｈｉｔｎｅｙら（２００３）Ｐｌａｎｔａ  ２１７：９８３〜９９２。
Ｗｏｏｄ（２００９）Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｊ．７：９１４〜２４。
Ｗｕら（２００５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１０１３〜１０１７。
Ｙａｎｇら（２００３）Ｐｌａｎｔａ  ２１６：５９７〜６０３。
Ｚａｎｋら（２００２）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．３１：２５５〜２６８。
Ｚａｎｋら（２００５）ＷＯ  ２００５／０１２３１６。
Ｚｈａｎｇら（２００４）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５５６：８１〜８５。
Ｚｈａｎｇら（２００６）２０：３２５５〜３２６８。
Ｚｈａｎｇら（２００７）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５８１：３１５〜３１９。
Ｚｈａｎｇら（２００８）Ｙｅａｓｔ  ２５：２１〜２７。
Ｚｈｏｕら（２００７）Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ．６８：７８５〜７９６。
Ｚｈｏｕら（２００８）Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １７：６６７〜６７６。
Ｚｏｕら（１９９７）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ．９：９０９〜２３。
【図１】
2017532949.tif 000033
【図２】
2017532949.tif 000034
【図３】
2017532949.tif 000035
【図４】
2017532949.tif 000036
【配列表】
2017532949000001.app
【国際調査報告】
2017532949.tif 000037
2017532949.tif 000038
2017532949.tif 000039
2017532949.tif 000040
2017532949.tif 000041
2017532949.tif 000042
2017532949.tif 000043
2017532949.tif 000044