(57)【要約】   灌流バイオリアクター用の細胞保持のためのマイクロ流体システムが提供される。前記マイクロ流体システムは、処理されるべき生物反応混合物を受けるように構成される少なくとも１つの入口を備える。少なくとも１つの曲線マイクロチャネルは、前記少なくとも１つの入口と流体接続し、前記生物反応混合物中の細胞を前記少なくとも１つの曲線マイクロチャネルの断面の少なくとも一部に沿って細胞サイズに基づき分離するようになっている。少なくとも２つの出口は、前記少なくとも１つの曲線マイクロチャネルと流体接続する。前記少なくとも２つの出口のうちの少なくとも一方の出口は、分離された細胞をリサイクルされるように前記灌流バイオリアクターへ流すように構成される。【選択図】図４
2017527299.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
灌流バイオリアクター用の細胞保持のためのマイクロ流体システムにおいて、
処理されるべき生物反応混合物を受けるように構成される少なくとも１つの入口と、
前記少なくとも１つの入口と流体接続する少なくとも１つの曲線マイクロチャネルであって、前記少なくとも１つの曲線マイクロチャネルは、前記生物反応混合物中の細胞を前記少なくとも１つの曲線マイクロチャネルの断面の少なくとも一部に沿って細胞サイズに基づき分離するようになっている、少なくとも１つの曲線マイクロチャネルと、
前記少なくとも１つの曲線マイクロチャネルと流体接続する少なくとも２つの出口であって、前記少なくとも２つの出口のうちの少なくとも一方の出口は、分離された細胞をリサイクルされるように前記灌流バイオリアクターへ流すように構成される、少なくとも２つの出口と、
を備えるマイクロ流体システム。
【請求項２】
前記少なくとも１つの曲線マイクロチャネルが少なくとも１つの螺旋チャネルを備える請求項１に記載のマイクロ流体システム。
【請求項３】
前記少なくとも１つの曲線マイクロチャネルが複数の曲線マイクロチャネルを備え、
前記複数の曲線マイクロチャネルのそれぞれの曲線マイクロチャネルの前記少なくとも１つの入口は、前記マイクロ流体システムの共通の入口と流体接続し、
前記複数の曲線マイクロチャネルのそれぞれの曲線マイクロチャネルの前記少なくとも２つの出口は、前記マイクロ流体システムの少なくとも２つのそれぞれの共通の出口と流体接続する、
請求項１又は請求項２に記載のマイクロ流体システム。
【請求項４】
前記システムが互いに取り付けられる複数のチャネル層を備え、前記複数のチャネル層の各チャネル層は、前記複数の曲線マイクロチャネルの少なくとも幾つかの曲線マイクロチャネルを備え、
前記システムが前記複数のチャネル層に取り付けられるガイド層を更に備え、前記ガイド層は、前記複数の曲線マイクロチャネルのための前記共通の入口及び前記少なくとも２つの共通の出口を備える、
請求項３に記載のマイクロ流体システム。
【請求項５】
前記少なくとも２つの出口のうちの少なくとも１つの他方の出口は、前記灌流バイオリアクターからの廃棄物及び前記灌流バイオリアクターの生成物のうちの少なくとも一方を流すように構成される請求項１から４のいずれか一項に記載のマイクロ流体システム。
【請求項６】
前記少なくとも１つの入口で生物反応混合物の連続する流れを受け、
分離された培地の連続する流れを前記少なくとも２つの出口のうちの少なくとも１つの他方の出口へ供給し、
分離された細胞の連続する流れをリサイクルされるように前記灌流バイオリアクターへ供給する、
ように構成される請求項１から５のいずれか一項に記載のマイクロ流体システム。
【請求項７】
前記少なくとも１つの曲線マイクロチャネルは、前記マイクロ流体システム内で膜の使用を伴うことなく、前記少なくとも１つの曲線マイクロチャネル内の流体力学的な力のみに起因して細胞を分離するようになっている請求項１から６のいずれか一項に記載のマイクロ流体システム。
【請求項８】
前記少なくとも１つの曲線マイクロチャネルが長さを有し、その断面は、アスペクト比を規定する高さ及び幅を有し、それにより、前記曲線マイクロチャネルは、その長さ及び断面により、前記生物反応混合物中の細胞を前記チャネルの断面の一部に沿って細胞サイズに基づき分離するようになっている請求項１から７のいずれか一項に記載のマイクロ流体システム。
【請求項９】
前記少なくとも１つの曲線マイクロチャネルの断面は、径方向内側の辺、径方向外側の辺、下辺、及び、上辺により規定される台形断面であり、前記台形断面は、ａ）高さが等しくない前記径方向内側の辺及び前記径方向外側の辺、又は、ｂ）前記径方向外側の辺に高さが等しい前記径方向内側の辺を有し、前記上辺が少なくとも２つの連続する直線部分を有し、前記各直線部分は幅が前記下辺に等しくない請求項１から８のいずれか一項に記載のマイクロ流体システム。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの曲線マイクロチャネルが前記生物反応混合物を濾過するようになっている請求項１から９のいずれか一項に記載のマイクロ流体システム。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの曲線マイクロチャネルは、前記少なくとも１つの曲線マイクロチャネルの一方側付近で前記生物反応混合物中の懸濁粒子を分離することにより前記生物反応混合物を濾過するようになっており、前記懸濁粒子が細胞を備え、前記少なくとも１つの曲線マイクロチャネルは、前記少なくとも１つの曲線マイクロチャネルの他方側で清浄な濾液を収集するようになっている請求項１０に記載のマイクロ流体システム。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの曲線マイクロチャネルが前記生物反応混合物を分別するようになっている請求項１から９のいずれか一項に記載のマイクロ流体システム。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの曲線マイクロチャネルは、前記少なくとも１つの曲線マイクロチャネルの外壁付近で生物反応混合物中の少なくとも１つのタイプの小さい粒子を分離するとともに前記少なくとも１つの曲線マイクロチャネルの内壁付近で生物反応混合物中の少なくとも１つのタイプの大きい粒子を分離することによって生物反応混合物を分別するようになっている請求項１２に記載のマイクロ流体システム。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの曲線マイクロチャネルは、哺乳類細胞及び酵母細胞のうちの少なくとも一方を分離するようになっている請求項１から１３のいずれか一項に記載のマイクロ流体システム。
【請求項１５】
前記灌流バイオリアクターの生成物は、薬剤、タンパク質、及び、バイオ燃料のうちの少なくとも１つを備える請求項１から１４のいずれか一項に記載のマイクロ流体システム。
【請求項１６】
前記灌流バイオリアクターの生成物は、モノクローナル抗体、組み換えタンパク、及び、ウイルス性ワクチンのうちの少なくとも１つを備える請求項１から１５のいずれか一項に記載のマイクロ流体システム。
【請求項１７】
前記処理されるべき生物反応混合物は、水前処理のための水を備える請求項１から１６のいずれか一項に記載のマイクロ流体システム。
【請求項１８】
前記生物反応混合物が生体液を備える請求項１から１７のいずれか一項に記載のマイクロ流体システム。
【請求項１９】
前記生物反応混合物が血液を備える請求項１から１８のいずれか一項に記載のマイクロ流体システム。
【請求項２０】
前記細胞は、癌細胞、胎児細胞、及び、幹細胞のうちの少なくとも１つを備える請求項１から１９のいずれか一項に記載のマイクロ流体システム。
【請求項２１】
灌流バイオリアクター用の細胞保持のための方法において、
処理されるべき生物反応混合物を前記灌流バイオリアクターのマイクロ流体細胞保持システムの少なくとも１つの入口を通じて流すステップと、
前記少なくとも１つの入口と流体接続する前記細胞保持システムの少なくとも１つの曲線マイクロチャネルを通じて前記少なくとも１つの入口から前記生物反応混合物を流し、それにより、前記生物反応混合物中の細胞を前記少なくとも１つの曲線マイクロチャネルの断面の少なくとも一部に沿って細胞サイズに基づき分離するステップと、
前記少なくとも１つの曲線マイクロチャネルと流体接続する前記細胞保持システムの少なくとも２つの出口のうちの少なくとも１つの出口を通じて、前記分離された細胞をリサイクルされるように前記灌流バイオリアクターへ流すステップと、
を備える方法。
【請求項２２】
前記少なくとも１つの曲線マイクロチャネルが少なくとも１つの螺旋チャネルを備える請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記少なくとも１つの曲線マイクロチャネルが複数の曲線マイクロチャネルを備え、
前記複数の曲線マイクロチャネルのそれぞれの曲線マイクロチャネルの前記少なくとも１つの入口は、前記細胞保持システムの共通の入口と流体接続し、
前記複数の曲線マイクロチャネルのそれぞれの曲線マイクロチャネルの前記少なくとも２つの出口は、前記細胞保持システムの少なくとも２つのそれぞれの共通の出口と流体接続する、
請求項２１又は請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞保持システムが互いに取り付けられる複数のチャネル層を備え、前記複数のチャネル層の各チャネル層は、前記複数の曲線マイクロチャネルの少なくとも幾つかの曲線マイクロチャネルを備え、
前記細胞保持システムが前記複数のチャネル層に取り付けられるガイド層を更に備え、前記ガイド層は、前記複数の曲線マイクロチャネルのための前記共通の入口及び前記少なくとも２つの共通の出口を備える、
請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記少なくとも２つの出口のうちの少なくとも１つの他方の出口を通じて、前記灌流バイオリアクターからの廃棄物及び前記灌流バイオリアクターの生成物のうちの少なくとも一方を流すステップを備える請求項２１から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記少なくとも１つの入口を通じて生物反応混合物を連続的に流すステップと、
分離された培地の連続する流れを前記少なくとも２つの出口のうちの少なくとも１つの他方の出口へ供給するステップと、
前記分離された細胞の連続する流れをリサイクルされるように前記灌流バイオリアクターへ供給するステップと、
を備える請求項２１から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記マイクロ流体システム内で膜の使用を伴うことなく、前記少なくとも１つの曲線マイクロチャネル内の流体力学的な力のみに起因して前記少なくとも１つの曲線マイクロチャネル内で細胞を分離するステップを備える請求項２１から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記少なくとも１つの曲線マイクロチャネルが長さを有し、その断面は、アスペクト比を規定する高さ及び幅を有し、それにより、前記曲線マイクロチャネルは、その長さ及び断面により、前記生物反応混合物中の細胞を前記チャネルの断面の一部に沿って細胞サイズに基づき分離するようになっている請求項２１から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記少なくとも１つの曲線マイクロチャネルの断面は、径方向内側の辺、径方向外側の辺、下辺、及び、上辺により規定される台形断面であり、前記台形断面は、ａ）高さが等しくない前記径方向内側の辺及び前記径方向外側の辺、又は、ｂ）前記径方向外側の辺に高さが等しい前記径方向内側の辺を有し、前記上辺が少なくとも２つの連続する直線部分を有し、前記各直線部分は幅が前記下辺に等しくない請求項２１から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記少なくとも１つの曲線マイクロチャネルを使用して前記生物反応混合物を濾過するステップを備える請求項２１から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記少なくとも１つの曲線マイクロチャネルの一方側付近で前記生物反応混合物中の懸濁粒子を分離することにより前記生物反応混合物を濾過するステップを備え、前記懸濁粒子が細胞を備え、前記少なくとも１つの曲線マイクロチャネルの他方側で清浄な濾液を収集するステップを備える請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記少なくとも１つの曲線マイクロチャネルを使用して前記生物反応混合物を分別するステップを備える請求項２１から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記少なくとも１つの曲線マイクロチャネルの外壁付近で前記生物反応混合物中の少なくとも１つのタイプの小さい粒子を分離するとともに前記少なくとも１つの曲線マイクロチャネルの内壁付近で前記生物反応混合物中の少なくとも１つのタイプの大きい粒子を分離することによって前記少なくとも１つの曲線マイクロチャネルを使用して前記生物反応混合物を分別するステップを備える請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
哺乳類細胞及び酵母細胞のうちの少なくとも一方を分離するステップを備える請求項２１から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記灌流バイオリアクターの生成物は、薬剤、タンパク質、及び、バイオ燃料のうちの少なくとも１つを備える請求項２１から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記灌流バイオリアクターの生成物は、モノクローナル抗体、組み換えタンパク、及び、ウイルス性ワクチンのうちの少なくとも１つを備える請求項２１から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
水前処理のための水を処理するステップを備える請求項２１から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記生物反応混合物が生体液を備える請求項２１から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記生物反応混合物が血液を備える請求項２１から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記細胞は、癌細胞、胎児細胞、及び、幹細胞のうちの少なくとも１つを備える請求項２１から３９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２０１４年９月１７日に出願された米国仮出願第６２／０５１，４９７号の利益を主張し、この仮出願の全体の教示内容は参照により本願に組み入れられる。
【０００２】
政府支援
この発明は、「Ｓｃａｌａｂｌｅ，  Ｓｅｌｆ−Ｐｏｗｅｒｅｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  Ｂｒａｃｋｉｓｈ  ａｎｄ  Ｈｅａｖｙ−Ｍｅｔａｌ  Ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｄ  Ｗａｔｅｒ」と題されたＡＲＰＡ−ＥからのＤＥ−ＡＲ００００２９４下で米国政府支援によりなされた。米国政府は、本発明において特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
哺乳類の細胞培養は、バイオテクノロジー及び医学において薬物及びタンパク質などの大きい複雑な化学物質を製造する際に幅広く使用される［１］。これらの生成物に対する高まる需要は、‘上流側’（バイオリアクター動作）の改善のためのたゆまない奮闘をもたらした［２］。この目的のために灌流バイオリアクターが幅広く使用されてきた。これは、それらの灌流バイオリアクターが、栄養素の連続的な供給及び廃棄物の除去を伴って、並びに、ｐＨ及び他の条件のより良い制御を伴って、高い細胞数を維持できるからである。連続的な灌流バイオリアクターの設計及び動作における主な課題は、細胞保持デバイスのコスト及び信頼性である。細胞保持又はリサイクルのために様々な技術が使用されてきたが、これらのいずれも欠点を伴わないわけではない。
【０００４】
哺乳類細胞は、バイオテクノロジー及び医薬の目的のために薬物及びタンパク質などの大きい複雑な化学物質を合成するのに有用である。これは、人体が医薬として必要とする複雑な構造を哺乳類細胞が正確にもたらし得るからである［３］。過去１０年間にわたって、モノクローナル抗体［４，５］、組み換えタンパク［６］（例えば糖タンパク質）、並びに、小児麻痺［１］、Ｂ型肝炎、及び、麻疹に対抗するウイルス性ワクチンなどの様々な診断用生成物及び治療用生成物の大規模製造のために哺乳類細胞が用いられてきた。哺乳類細胞からの生成物の詳細な概要は他の場所で与えられる［７，８］。バイオ燃料及び他の有用な化学物質を生成するために細胞（酵母、藻類、及び、他の細胞）も使用され、このことは、米国及び他の国での国内エネルギー生産においてより大きな役割を更に一層担っている。従来、大規模な哺乳類細胞及び酵母細胞の培養（発酵のため）は、懸濁（例えば、回分、流加、又は、灌流）、ローラーボトル、並びに、マイクロキャリアなどの様々な手法を使用して行なわれ得る［１，２］。しかしながら、生物医薬品製造及びバイオ燃料産業では、懸濁培養が、その拡張可能性、細胞、栄養素、代謝産物、及び、生成物の均一な濃度に起因して、１９８０年代のその発端以来から広く使用されてきた［９］。
【０００５】
異なる態様、すなわち、回分、流加、及び、灌流を伴って動作する３つのタイプのバイオリアクターが存在する。これらの動作態様は、基本的に、栄養素供給及び代謝産物除去が達成される方法の点で異なり、生成物の品質、生産性、及び、最終的にはコストに直接に影響を及ぼし得る［１］。流加プロセスは依然として生物医薬品製造及びバイオ燃料のための発酵において圧倒的に最もポピュラーな選択であるが、最近の研究により、灌流バイオリアクターが近未来で優勢であろうことが分かる。灌流バイオリアクターは製造目的のために理想的である。これは、灌流バイオリアクターが栄養素の連続的な供給及び廃棄物／生成物の除去を伴って高い細胞数を維持できるからであり、また、細胞増殖を最大にして製品バッチ一貫性を確保するために温度やｐＨなどのパラメータを注意深く調整できるからである。加えて、灌流バイオリアクターは、サイズ制限された（拡張可能な）バイオリアクターから大量の生成物を長期間にわたって連続して生成でき［１０］、それにより、資本コストが低減される。これに対し、回分態様及び流加態様は、栄養素及び廃棄物の交換の欠如に起因して、あまり適合性がなく、そのため、生産性を大きく制限するとともに、大型の容器を必要とする。また、培養後の生成物分子から細胞を分離するために大規模な遠心分離システムが必要とされ、そのため、高い資本コストを被るとともに、無菌を維持するのが難しい［１１］。特に第二世代のバイオ燃料において、使用される有機体は、生成物及び廃棄物が制限された増殖に対してより影響され易く、また、最新のバイオ燃料の幾つか（例えばブタノール）は、細胞に対して毒性を持つ［１２］。したがって、これらのプロセスにおいては回分培養から灌流培養へ切り換える必要性が将来増大することが予期される。
【０００６】
良好な灌流のために重要なパラメータは、バイオリアクター内における細胞の大部分の保持である。これは、一貫性のある製品品質／安定性及び細胞の最適な使用を伴って比較的高い流量での動作を可能にする。製薬産業では、灌流培養中のバイオリアクター内の細胞の分離のために、幾つかの異なる細胞保持技術が使用されてきた。これらの細胞保持技術は、通常、遠心分離作用（遠心分離機、ハイドロサイクロン）、濾過（直交流フィルタ、中空フィルタ、渦流フィルタ）、重力／音響沈殿、超音波及び誘電泳動分離に基づく［１，１３］。良好な保持システムが有さなければならない重要な因子は以下の通りである［１］。
【０００７】
−高い分離効率（〜１００％）及び高いスループット（１００〜１０００Ｌ／日）
【０００８】
−デバイスは、高い細胞生存率を維持するために細胞に及ぼす損傷（剪断応力に起因する）が最小でなければならない
【０００９】
−デバイスは、安定し且つ信頼できなければならず、また、長期の動作（７〜２１日）にわたって使用され得る
【００１０】
−デバイスは、洗浄可能、滅菌可能、及び、再使用可能であるべきである
【００１１】
−費用節減（低い資本コスト及び試薬コスト）
【００１２】
保持デバイスの第１の重要なカテゴリーは物理的な濾過に基づく。このカテゴリーでは、直交流（又は接線）濾過、渦流フィルタ、スピンフィルタ、及び、中空ファイバフィルタなどの異なる種類の濾過手法が存在する。マイクロフィルタを使用する物理的な濾過は分離技術の大部分の背後で主力であったが、この保持態様では、細胞破壊、細胞凝集、膜目詰まり、及び、ファウリングなどの幾つかの主要な欠点が存在し、これらの欠点がそれらの広域的有用性を複雑にする［２］。
【００１３】
製薬産業において重要な役割を果たす別の重要なカテゴリーは遠心分離である。遠心分離は、遠心分離機を使用する混合物の沈殿のために遠心力の使用を伴うプロセスである。遠心分離装置は、それらの使用の単純さにもかかわらず、無菌を維持することが難しく、連続流製造のために適合され得ない［１４］。また、５００ｇの高い加速度が細胞増殖を最大で５０％妨げ得る［１］とともに抗体生成速度に悪影響を及ぼし得ることも報告されてきた［１５］。
【００１４】
別の類の分離装置はハイドロサイクロンである。最近、研究者は、アルコール発酵μからの酵母分離のためにこれまで使用されてきた技術であるハイドロサイクロンを哺乳類細胞の分離に適用した。最大で４〜６バールの典型的な圧力降下を伴って細胞懸濁液を接線方向で装置の円筒部分へ導入することによって遠心力が生み出され、この場合、細胞はシステム内で〜１０００ｇを受ける。流体の強力な渦動作に起因して、浄化された培地がオーバーフロー中に抜け出るにつれて、濃縮細胞懸濁液がアンダーフロー中に抜け出る。従来の遠心分離機と同じ分離原理を使用して（遠心力場内の沈殿）、ハイドロサイクロンは、単純さ、安全性、及び、可動部の不存在など、バイオテクノロジー産業で使用するために多くの利点を有する。研究者は、灌流能力に関するハイドロサイクロンの性能に関する興味をそそる結果を提示したが、剪断に影響され易い細胞とのこの技術の適合性が確立されなければならない［１，２］。加えて、より小さな細胞（〜１０μｍ未満の直径）の使用は一般に制限される。これは、現在のハイドロサイクロンシステムがそれらの小さい細胞を捕捉するのに有効でないからである［１６，１７］。
【００１５】
重力沈殿機は、おそらく、細胞を保持するために業界で使用されてきた最も簡単な装置である。濾過、遠心分離、及び、ハイドロサイクロンと比べて、重力沈殿は、フィルタの目詰まり及び高い剪断応力による細胞損傷を引き起こし難い［２７］。それにもかかわらず、重力沈殿により必要とされる長い処理時間が懸案事項である。加えて、沈殿機のスケールアップが特に連続処理において依然として問題である。
【００１６】
前述した技術以外に、灌流培養における細胞保持のために業界が探究している新たな方法も存在する。超音波細胞保持が明らかにされてきたが、この技術で必要とされる非常に大きい振動振幅が局所温度の上昇を引き起こし、そのため、この技術が熱の影響を受け易い哺乳類細胞及び熱不安定性の生成物と適合しなくなる。共振器の音響特性の不均一性をもたらす温度の不均一性もこの技術の生産性を低下させた［１］。
【００１７】
最近では、細胞保持のために誘電泳動方法も試されてきた。この技術は、生存細胞と死細胞との間の分離効率の不均衡を示す。それにもかかわらず、それぞれのタイプの細胞にとって最適な周波数及び流量が調整されなければならず、また、今のところ、灌流培養でこの技術を使用する工業的な規模は存在しない。
【００１８】
細胞保持のために使用され得る他の方法は、電荷及び表面特性を含む。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明の一実施形態によれば、灌流バイオリアクター用の細胞保持のためのマイクロ流体システムが提供される。システムは、処理されるべき生物反応混合物を受けるように構成される少なくとも１つの入口と、少なくとも１つの入口と流体接続する少なくとも１つの曲線マイクロチャネルであって、少なくとも１つの曲線マイクロチャネルが、生物反応混合物中の細胞を少なくとも１つの曲線マイクロチャネルの断面の少なくとも一部に沿って細胞サイズに基づき分離するようになっている、少なくとも１つの曲線マイクロチャネルと、少なくとも１つの曲線マイクロチャネルと流体接続する少なくとも２つの出口であって、少なくとも２つの出口のうちの少なくとも一方の出口が、分離された細胞をリサイクルされるように灌流バイオリアクターへ流すように構成される、少なくとも２つの出口とを備える。
【００２０】
更なる関連する実施形態において、少なくとも１つの曲線マイクロチャネルが少なくとも１つの螺旋チャネルを備えてもよい。少なくとも１つの曲線マイクロチャネルが複数の曲線マイクロチャネルを備えてもよく、複数の曲線マイクロチャネルのそれぞれの曲線マイクロチャネルの少なくとも１つの入口は、マイクロ流体システムの共通の入口と流体接続し、複数の曲線マイクロチャネルのそれぞれの曲線マイクロチャネルの少なくとも２つの出口は、マイクロ流体システムの少なくとも２つのそれぞれの共通の出口と流体接続する。システムが互いに取り付けられる複数のチャネル層を備えてもよく、複数のチャネル層の各チャネル層は、複数の曲線マイクロチャネルの少なくとも幾つかの曲線マイクロチャネルを備え、システムが複数のチャネル層に取り付けられるガイド層を更に備え、ガイド層は、複数の曲線マイクロチャネルのための共通の入口及び少なくとも２つの共通の出口を備える。少なくとも２つの出口のうちの少なくとも１つの他方の出口は、灌流バイオリアクターからの廃棄物及び灌流バイオリアクターの生成物のうちの少なくとも一方を流すように構成されてもよい。マイクロ流体システムは、少なくとも１つの入口で生物反応混合物の連続する流れを受け、分離された培地の連続する流れを少なくとも２つの出口のうちの少なくとも１つの他方の出口へ供給し、及び、分離された細胞の連続する流れをリサイクルされるように灌流バイオリアクターへ供給するように構成されてもよい。
【００２１】
更なる関連する実施形態において、少なくとも１つの曲線マイクロチャネルは、マイクロ流体システム内で膜の使用を伴うことなく、少なくとも１つの曲線マイクロチャネル内の流体力学的な力のみに起因して細胞を分離するようになっていてもよい。少なくとも１つの曲線マイクロチャネルが長さを有してもよく、その断面は、アスペクト比を規定する高さ及び幅を有してもよく、それにより、曲線マイクロチャネルは、その長さ及び断面により、生物反応混合物中の細胞をチャネルの断面の一部に沿って細胞サイズに基づき分離するようになっている。少なくとも１つの曲線マイクロチャネルの断面は、径方向内側の辺、径方向外側の辺、下辺、及び、上辺により規定される台形断面であってもよく、台形断面は、ａ）高さが等しくない径方向内側の辺及び径方向外側の辺、又は、ｂ）径方向外側の辺に高さが等しい径方向内側の辺を有し、上辺は、少なくとも２つの連続する直線部分を有し、各直線部分は幅が下辺に等しくない。
【００２２】
他の関連する実施形態において、少なくとも１つの曲線マイクロチャネルは、例えば、少なくとも１つの曲線マイクロチャネルの一方側付近で生物反応混合物中の懸濁粒子を分離することにより生物反応混合物を濾過するようになっていてもよく、懸濁粒子が細胞を備え、また、少なくとも１つの曲線マイクロチャネルは、少なくとも１つの曲線マイクロチャネルの他方側で清浄な濾液を収集するようになっていてもよい。少なくとも１つの曲線マイクロチャネルは、例えば、少なくとも１つの曲線マイクロチャネルの外壁付近で生物反応混合物中の少なくとも１つのタイプの小さい粒子を分離するとともに少なくとも１つの曲線マイクロチャネルの内壁付近で生物反応混合物中の少なくとも１つのタイプの大きい粒子を分離することによって生物反応混合物を分別するようになっていてもよい。少なくとも１つの曲線マイクロチャネルは、哺乳類細胞及び酵母細胞のうちの少なくとも一方を分離するようになっていてもよい。灌流バイオリアクターの生成物は、薬物、タンパク質、及び、バイオ燃料のうちの少なくとも１つを備えてもよい。灌流バイオリアクターの生成物は、モノクローナル抗体、組み換えタンパク、及び、ウイルス性ワクチンのうちの少なくとも１つを備えてもよい。処理されるべき生物反応混合物は、水の前処理のための水を備えてもよい。生物反応混合物が血液などの生体液を備えてもよい。細胞は、癌細胞、胎児細胞、及び、幹細胞のうちの少なくとも１つを備えてもよい。
【００２３】
更なる関連する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
以上は、添付図面に示される本発明の実施形態の例の以下の更に特定の説明から明らかであり、添付図面において、同様の参照符号は、異なる図の全体にわたって同じ部分を示す。図面は必ずしも原寸に比例しているとは限らず、代わりに、本発明の実施形態を例示することに重点が置かれている。
【００２５】
【図１】図１Ａ〜図１Ｈのそれぞれで見られるように、本発明の一実施形態に係る多層慣性濾過システムの製造プロセスのステップを示す。  図１Ａでは、鋳型構造がＳｏｌｉｄＷｏｒｋｓを使用して形成される。  図１Ｂにおいて、鋳型は、従来のマイクロフライス加工を使用してアルミニウム上に形成される。  図１Ｃでは、形成された鋳型を使用してＰＤＭＳの単一層に対するソフトリソグラフィー及びパターン転写が行なわれる。  図１Ｄでは、２つの個々の層の酸素プラズマボンディング（すなわち、パターンの手動アライメント）と精密穿孔機を使用する穴の穿孔とが行なわれる。  図１Ｅには、穴を穿孔した後に２つの層の２つの個々の組を互いにボンディングして４層デバイスを形成することが示される。  図１Ｆでは、４つの層の２つの個々の組をボンディングして８層デバイスを形成するために手順が繰り返される（すなわち、この手順は、最大で１００層を伴うデバイスを形成するべく継続され得る）。  図１Ｇでは、流体送出のために３Ｄプリントガイド層がデバイスの内側に位置される。  図１Ｈは、チューブを使用して蠕動ポンプに接続されるＰＤＭＳの１５個の層（全部で６０個の螺旋チャネル）と３Ｄプリントガイド層とから構成される高スループットデバイスを示す。
【００２６】
【図２】１つの入口と２つの出口とを有する哺乳類細胞の濾過及び／又は分別のための本発明の一実施形態に係る単一螺旋マイクロ流体チップの形態及び動作機構の概略図である。
【００２７】
【図３Ａ】大量のサンプルからの連続する細胞保持のためにエンボス加工されたマイクロチャネル（すなわち、１２０個の螺旋マイクロチャネル）が互いにボンディングされるＰＤＭＳシートの複数の層から成る本発明の一実施形態に係る高スループットシステムの光学的な像である。
【図３Ｂ】灌流バイオリアクターの状態を真似るスピナーフラスコからの本発明の一実施形態に係る高スループット濾過システムを使用する細胞濃縮のプロセスを示すサンプル処理ワークフローである。
【００２８】
【図４Ａ】ガイド層を伴う螺旋チャネルの積層体の複数の層のアセンブリを示す分解概略図である。
【図４Ｂ】本発明の一実施形態に係る積層体の単一層の概略図である。
【００２９】
【図５】本発明の一実施形態に係る灌流バイオリアクターからの細胞保持のための高スループット精密濾過システムの特徴を示す図である。  図５Ａは、異なる細胞株の回収効率を示す。  図５Ｂは、細胞濃度に応じた分離効率を示す。  図５Ｃは、動作時間にわたる生存率及び細胞密度を示す。  図５Ｄは、動作時間にわたるハイブリドーマ細胞によるＩｇＧ生成の比率を示す。
【００３０】
【図６】本発明の一実施形態にしたがった実験においてフローサイトメータ（Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６，  ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  ＵＳＡ）から得られるＦＡＣＳデータを示す図であり、灌流バイオリアクターの状態に良く似た、２つの異なる濃度における高スループット慣性濾過システムを使用するＣＨＯ細胞の分離の結果を示している。
【００３１】
【図７】本発明の一実施形態に係る慣性精密濾過システムによる対照（選別されない）ＣＨＯ細胞（ａ−ｃ）及び選別された細胞（ｄ−ｆ）の培養の位相差顕微鏡写真の図である。
【００３２】
【図８】本発明の一実施形態に係るシステムで用いるための曲線マイクロチャネルの別の断面の図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明の実施形態例の説明は以下の通りである。
【００３４】
本発明に係る一実施形態は、慣性マイクロ流体を使用する極めて高い収率を伴う超高スループット（リットル／分程度）細胞分離のための膜無しの目詰まりしない精密濾過プラットフォームを提供する。本発明の一実施形態に係る先進のシステムは、大量の生物学的なサンプルからの連続的なサイズベースの細胞選別のためにエンボス加工されたマイクロチャネル（すなわち、最大５００螺旋）が互いに結合されたＰＤＭＳシートの複数の層から成る高多重化マイクロ流体デバイスである。該技術は、細胞集束及び細胞選別のために曲線マイクロチャネルに存在する流体力学的な力を利用する。
【００３５】
本発明の一実施形態に係るシステムにおいて、細胞は、外的に駆動される流れによってもたらされる流体相互作用のみに起因して分離され、したがって、システムは、本質的に目詰まりせず、膜フィルタ交換又は外力場を必要とすることなく連続的に作動できる。灌流バイオリアクターの状態を真似つつ本発明の一実施形態に係るシステムを特徴付けるため、３つの異なる細胞株に関して加湿培養器の内側で２５０ｍＬの使い捨て可能なスピナーフラスコを使用して細胞クラスターが実行された。各実験後に新鮮な培地が濃縮細胞と共に各フラスコに加えられる間に無菌環境内で本発明の一実施形態に係る慣性濾過システムを使用して細胞から生成物を分離することによって精密濾過試験が日々行われた。細胞密度、生存率、グルコース、抗体力価、及び、ｐＨがそれぞれのサンプルにおいて別々に監視された。異なる細胞濃度を使用する精密濾過試験は、９５％を超える細胞分離効率を伴うバイオリアクターからの連続的な細胞分離におけるシステムの有用性を明らかにした。選別された細胞の生存率は、選別されない細胞（対照）のそれと同様であった。この場合、９０％を超える細胞が色素を排除し、このことは、分離に起因する物理的損傷が最小であることを示唆する。また、酵素分析を使用して分泌ＩｇＧタンパク質の活性を測定することによって細胞増殖率が評価された。その結果は、１０日の期間にわたる細胞の持続可能な増殖と抗体生成とを示唆し、このことは、培地からの動物細胞の分離のためのこの新規な技術の価値を示す。ここで提供される高スループット精密濾過システムは、従来のマイクロフライス加工及びＰＤＭＳ鋳造を使用して極めて低コストで製造され得る。膜フィルタとは対照的に、このシステムは、フィルタの漸進的なタンパク質及び細胞のファウリングを被らないとともに、フラックス低下を何ら伴うことなく長期間にわたってノンストップで動作され得る。このプラットフォームは、高スループット、低コスト、拡張可能性、及び、小さいフットプリントの望ましい組み合わせを有し、それにより、プラットフォームは、様々な精密濾過用途に本質的に適する。
【００３６】
マイクロ流体工学は、主に生物学、工学、及び、医学の分野で、多くの新生の用途及び規律にとって実現技術である。細胞のスケールに適合する適切な長さスケールを伴って、マイクロ流体が細胞生態に大きく寄与するようにうまく位置される［１８］。マイクロ流体プラットフォームを利用する細胞及び粒子の選別は、近年では全盛の開発分野になってきた［１９］。最近では、曲線マイクロチャネル内の粒子の慣性移動に基づく高スループットな受動的粒子選別が、報告されてきたとともに、効率的なマイクロ流体細胞分離方法として幅広く注目されてきた［２０，２１］。粒子分離のために流体力学的な力を利用する慣性マイクロ流体デバイスは、分離を達成するために専らマイクロチャネル寸法、流体力、及び、粒径に依存する。これらの慣性マイクロ流体デバイスは、癌細胞単離、粒子分離、及び、血液分別を含む様々な用途のために最近利用されてきた［２１，２２］。慣性マイクロ粒子システムは、使用されるロバスト性が高い耐障害性の物理的効果と高い稼働率とに起因して、製薬工業、環境浄化、及び、生理的流体処理における高スループット分離用途に重大な影響を与える態勢ができている［２３］。
【００３７】
本発明の一実施形態によれば、大規模な濾過用途におけるマイクロ流体工学の有用性が実証される。表１は、本発明の一実施形態に係るマイクロ流体技術（「螺旋システム」の項目の縦列を参照）と比べた、５つの重要な選択基準に基づく先の背景技術の節で論じられた細胞保持のための従前の方法の概要を利点及び不利点と共に与える。
【表１】
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バイオリアクターからの細胞保持のための既存の技術（引用文献［１］及び［２］から抜粋）
【００３８】
本発明の一実施形態に係る一体型マイクロ流体システムは、大量の臨床的／生物学的なサンプルからの連続的な標識／目詰まりが無い細胞分離のためにエンボス加工されたマイクロチャネル（すなわち、台形の断面を伴う最大５００個の螺旋状のマイクロチャネル）が互いに結合されたＰＤＭＳシートの複数の層から成る。作業を簡略化するために、このシステムにおける流体チャネルは内部で接続され、この場合、流体流れは、共有の入口により全ての螺旋チャネルを通じて分配され得るとともに、集合的な出口を通じてシステムから抜け出ることができる。図１は、図１Ａ〜図１Ｈのそれぞれで見られるように、本発明の一実施形態に係る多層慣性濾過システムの製造プロセスのステップを示す。図１Ａでは、鋳型構造１００がＳｏｌｉｄＷｏｒｋｓを使用して形成される。図１Ｂにおいて、鋳型は、アルミニウム鋳型１０１を製造するために、従来のマイクロフライス加工を使用してアルミニウム上に形成される。図１Ｃでは、形成された鋳型１０１を使用してポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）１０２の単一層に対するソフトリソグラフィー及びパターン転写が行なわれる。図１Ｄでは、２つの個々の層１０３，１０４の酸素プラズマボンディング（すなわち、パターンの手動アライメント）と精密穿孔機を使用する穴１０５ａ−ｆの穿孔とが行なわれる。図１Ｅには、穴を穿孔した後に２つの層の２つの個々の組を互いにボンディングして４層デバイスを形成することが示され、この場合、４つの層が１０６で示される。図１Ｆでは、４つの層の２つの個々の組をボンディングして８層デバイスを形成するために手順が繰り返され、この場合、８個の層が１０７で示される。この手順は、例えば最大で１００層を伴うデバイスを形成するべく継続され得る。図１Ｇでは、流体送出のために３Ｄプリントガイド層１０８がデバイスの内側に位置される。図１Ｈは、チューブを使用して蠕動ポンプに接続されるＰＤＭＳの１５個の層１０９（１５個の層のそれぞれに４つの螺旋チャネルを伴って、全部で６０個の螺旋チャネル）と３Ｄプリントガイド層１０８とから構成される高スループットデバイスを示す。
【００３９】
図２は、１つの入口２１１と２つの出口−内側出口２１２及び外側出口２１３−とを有する哺乳類細胞の濾過及び／又は分別のための本発明の一実施形態に係るマイクロ流体チップの単一の螺旋チャネル２１０の形態及び動作機構の概略図である。
【００４０】
図２に概略的に示されるように、本発明の実施形態によれば、システムは、例えば、２つの別個の用途のために設計され得る。１つの用途は、パネル２１４ａ，２１４ｂに示されるように、濾過目的のためである。ここでは、パネル２１４ａに示されるように、流体がチャネルの入口２１１付近で流れているときに最初にランダムに分配される流体中の懸濁粒子２１５の全てを、マイクロチャネル２１０の一方側付近で、すなわち、通常は、強力な渦が存在する外壁２１６付近で集束させることができ、また、清浄な濾液を内壁２１７などの他方側から収集することができる（パネル２１４ｂ参照）。そのような集束の結果として、粒子が外側出口２１３などの一方の出口へ方向付けられ、また、清浄な濾液が内側出口２１２などの他方の出口へ方向付けられる。チャネルを通じた流体の流量は、そのような濾過を達成するようになっていてもよい。例えば、パネル２１４ｂに示されるように、チャネルの外側出口２１３付近で粒子集束を達成するために６ｍＬ／分の流量が使用された。システムを設計し得るための別の目的は、パネル２１４ｃ，２１４ｄに示されるように、分別目的のためである。ここでは、パネル２１４ｃに示されるように、流体がチャネルの入口２１１付近で流れているときに懸濁粒子２１８がランダムに分配されるが、パネル２１４ｄに示されるように、螺旋チャネル２１０を通じた流れの結果として、より小さい粒子２１８ａは、ディーン渦の内側で捕捉されて、チャネルの外壁２１９付近にとどまり、一方、より大きい粒子２１８ｂは、チャネルの内壁２２０付近で集束され、それにより、内側出口２１２及び外側出口２１３で粒子分離を行なうことができる。チャネルを通じた流体の流量は、そのような分別を達成するようになっていてもよい。例えば、パネル２１４ｄに示されるように、内側出口２１２及び外側出口２１３の付近で粒子を集束させるために２ｍＬ／分の流量が使用された。図２は、流体が入口２１１から出口２１２，２１３へと流れるにつれて内側へ向けて螺旋状になるような螺旋チャネル２１０を示すが、チャネルが螺旋の中心にある入口２１１を有するとともにチャネルの外縁にある出口２１２，２１３を有し、それにより、流体が入口から出口へと流れるにつれて螺旋チャネル２１０が外側へ向けて螺旋状になることも想定し得る。加えて、図２では、径方向内側の辺２２０と、径方向外側の辺２１９と、下辺２２１と、上辺２２２とを有する台形の断面をチャネル２１０が有し得ることが分かり、この場合、径方向内側の辺２２０及び径方向外側の辺２１９は高さが等しくない。或いは、図８の実施形態に示されるように、チャネル８１０は、高さが等しい径方向内側の辺８２０及び径方向外側の辺８１９を有してもよく、一方、上辺は少なくとも２つの連続する直線部分８２１ａ，８２１ｂを有し、それぞれの部分は幅が下辺８２２に等しくない。
【００４１】
図３Ａは、本発明の一実施形態に係る灌流バイオリアクターのための３０枚のＰＤＭＳシートの複数の層３２３から成る高スループットシステムの光学的な像であり、この場合、大量のサンプルからの連続する高スループットの細胞保持のために、エンボス加工されたマイクロチャネル（すなわち、４つの螺旋チャネルがそれぞれのシート上にある１２０個の螺旋マイクロチャネル）が互いにボンディングされる。ガイド層３０８が層３２３の近傍に示され、この場合、入口ポート及び出口ポート３２４が複数の層３２３上の螺旋チャネルの共通の入口及び出口（以下の図４Ａ及び図４Ｂにおいて論じられる）のための穴３０５内へ挿入されるようにガイド層３０８の下辺から延出するのが分かる。このようにすると、ガイド層３０８の他方側に接続される入口チューブ及び出口チューブに対して共通の入口及び出口を接続できる。図３Ｂは、灌流バイオリアクターの状態を真似るスピナーフラスコからの本発明の一実施形態に係る高スループット濾過システムを使用する細胞濃縮のプロセスを示すサンプル処理ワークフローである。フレッシュフィード３２５がスピナーフラスコ３２６内へと向かい、該スピナーフラスコ３２６から、細胞懸濁液３２７が本発明の一実施形態に係る慣性濾過システム３２８へと圧送される。浄化された培地３２９がシステム３２８外へと方向付けられ、一方、濃縮細胞リサイクル３３０が元のスピナーフラスコ３２６へと方向付けられる。流体をフレッシュフィード３２５からスピナーフラスコ３２６へ及びスピナーフラスコ３２６から濾過システム３２８へ流すためにポンプ３３１，３３２が使用される。本発明の実施形態にしたがって別の流れ構成を分別などの他の作業のために使用できるのが分かる。
【００４２】
図４Ａは、ガイド層を伴う螺旋チャネルの積層体の複数の層のアセンブリを示す分解概略図であり、また、図４Ｂは、本発明の一実施形態に係る積層体の単一層の概略図である。図４Ｂでは、図２の螺旋チャネルと同様であってもよい複数の螺旋チャネル４３９が積層体の単一層４４０上に一緒に組み込まれるのが分かる。ここでは、４つのそのような螺旋チャネル４３９が層４４０上に組み込まれるが、層ごとに異なる数が使用されてもよい。図４Ｂに示される螺旋チャネル４３９はそれぞれ、螺旋チャネルの中心に入口４４１を有し、この場合、２つの出口チャネル４４２，４４３が各螺旋の外縁から現れる。或いは、螺旋チャネル４３９がそれぞれ螺旋の外側に入口を有し、この場合、（図２の実施形態に示されるように）２つの出口チャネルが螺旋の中心に現れる。層４４０内において、層上の螺旋チャネル４３９のそれぞれからの出口チャネル４４２，４４３は、層を貫通する穴として打ち抜き加工されてもよい各層４４０上の２つの共通の出口ポイント４４４，４４５に結合される。図４Ａの場合のように、複数の層４４０ａ，４４０ｂ，４４０ｃが互いに結合されて積層体を形成すると、各積層体上の共通の出口ポイント４４４，４４５（図４Ｂ参照）のそれぞれを貫通する穴は、積層体全体を垂直に貫いて延びてガイド層４０８に達する２つの共通の出口チャネル４４６，４４７を形成するように互いに結合されてもよい。ガイド層の底部で、２つの出口ピン４４８，４４９が、積層体の上端層４４０ａ中へ挿入されるようにガイド層４０８の底部から延びるとともに、ガイド層４０８を貫通して延びる出口チャネル４５０，４５１に連結され、出口チャネル４５０，４５１は、例えば図３Ｂの構成の場合のようにシステムをバイオリアクターの他の構成要素に接続するチューブ（図示せず）に対する接続を可能にするべくガイド層４０８の上端から延びる出口ポート４５２，４５３に接続する。同様に、積層体４４０ａ，４４０ｂ，４４０ｃが互いに結合されるときに互いに接続する入口４４１（図４Ｂ参照）が各層４４０を貫く穴として打ち抜き加工されてもよく、それにより、４つの（例えば）共通の入口チャネル４５４が積層体を貫いて延びる。入口ピン４５５が積層体の上端層４４０ａ中へ挿入されるようにガイド層４０８の底部から延びる。ガイド層４０８の内部入口チャネル４５６が、外部チューブ（図示せず）に接続するために使用され得る単一の入口ポート４５７内へ流体を流すように互いに結合し、入口ポート４５７を通じて細胞懸濁液を含む流体がシステム内へと流れる。このようにすると、共通の入口ポート４５７を使用して、システム内の複数の異なる層４４０ａ，４４０ｂ，４４０ｃ上の複数の螺旋チャネル４３９のそれぞれの各入口４４１へ入口流体を供給することができ、その間に、一方の共通の出口ポート４５２は、螺旋チャネルの内側出口２１２（図２参照）などの１つの出口から流体を受け、また、他方の共通の出口ポート４５３は、システム内の複数の螺旋チャネル４３９のそれぞれごとに、外側出口２１３（図２参照）などの他の出口から流体を受ける。図４Ａ及び図４Ｂの螺旋チャネルがそれらの入口を螺旋チャネルの中心に有するのに対し、図２の螺旋チャネルがそれらの入口を螺旋チャネルの外縁に有するが、いずれの形態が使用されてもよいことが分かる。
【００４３】
図４Ａ及び図４Ｂの実施形態において、入口４５７は、処理されるべき生物反応混合物を受けるように構成される。螺旋チャネル４３９又は他の曲線マイクロチャネルは、入口４５７と流体接続するとともに、生物反応混合物中の細胞をチャネル４３９の断面の少なくとも一部に沿って細胞サイズに基づき分離するようになっている。２つの出口４５２，４５３がチャネル４３９と流体接続し、この場合、出口４５２，４５３の少なくとも一方は、分離された細胞をリサイクルされるように灌流バイオリアクターへ流すように構成される。出口４５２，４５３の少なくとも他方は、灌流バイオリアクターからの廃棄物又は灌流バイオリアクターの生成物を流すように構成され得る。生物反応混合物の連続する流れを入口４５７に供給することができ、一方、分離された培地の連続する流れが出口４５２，４５３の一方へ流され、また、分離された細胞の連続する流れが灌流バイオリアクターへとリサイクルされる。チャネル４３９は、マイクロ流体システム内で膜の使用を伴うことなく、少なくとも１つの曲線マイクロチャネル内の流体力学的な力のみに起因して細胞を分離するようになっている。特に、チャネル４３９は長さを有し、また、その断面は、アスペクト比を規定する高さ及び幅を有し、それにより、チャネル４３９は、例えば図２に示されるように、その長さ及び断面により、生物反応混合物中の細胞をチャネル４３９の断面の一部に沿って細胞サイズに基づき分離するようになっている。
【００４４】
実験
【００４５】
本発明の一実施形態に係る細胞分離のためのシステムの性能を評価するために、抗体生成のための産業で幅広く使用される３つの異なる細胞株が用いられた。これらの細胞は、バイオリアクター状態を正確に真似るために懸濁態様内で培養された。培地は６．３ｇ／Ｌのグルコースを含み、また、培地には、８ｍＭのＬ−グルタミンと１００μｇ／ｍＬの抗生物質溶液が補給された。凍結細胞（ＣＨＯ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、及び、ハイブリドーマ）が、解凍されて、化学的に規定された培地と共にＴ−２５フラスコへ移送されるとともに、拡張できるようにされた。培養された細胞が９０％密集度に達したときに、それらの細胞は、無菌環境内で本発明の一実施形態に係る精密濾過システムを使用して濾過され、その後、長期培養のためにスピナーフラスコへ移送された（図３Ｂ参照）。この手順は、既存の灌流バイオリアクターと同様の最大で１×１０８の細胞密度を得るために１０日間にわたって続いた。
【００４６】
図５は、本発明の一実施形態に係る灌流バイオリアクターからの細胞保持のための高スループット精密濾過システムの特徴を示す図である。図５Ａは、異なる細胞株の回収効率を示す。図５Ｂは、細胞濃度に応じた分離効率を示す。図５Ｃは、動作時間にわたる生存率及び細胞密度を示す。図５Ｄは、動作時間にわたるハイブリドーマ細胞によるＩｇＧ生成の比率を示す。
【００４７】
図５Ａは、本発明の一実施形態にしたがった実験における様々な細胞株に関する分離効率を描く。システムを使用して細胞タイプに依存しない高レベル分離（＞９０％）を達成できることが分かる。また、１０７及び１０８細胞／ｍｌなどの１０６細胞／ｍｌ以上の高い細胞濃度を含む灌流バイオリアクターからの細胞濃度（図５Ｂ及び図６も参照）と同様な高レベルの細胞濃度でシステムが機能し得ることも実証されてきた。図５Ｃは、本発明の一実施形態にしたがった３つの独立した実験における細胞増殖及び生存率を示し、この場合、細胞密度（細胞／ｍｌ）が増大しているのが分かり、一方、生存率（％）は最小限に減少するように示される。濾過中の細胞に対する最小の損傷を確認しつつ連続的な細胞増殖を達成できるのが分かる。酵素分析を使用して分泌ＩｇＧタンパク質の活性を測定することによって細胞増殖率（図５Ｄ）も評価された。ＩｇＧタンパク質濃度（μｇ／ｍｌ）が１０日の期間にわたって絶えず増大しているのが分かる。結果は、１０日の期間にわたる細胞の持続可能な増殖及び抗体生成を示唆し、このことは、動物細胞を培地から分離するためのこの新規な技術の価値を示す。選別された細胞の生存率は、選別されない細胞（対照）のそれと同様であった。この場合、９０％を超える細胞が色素を排除し、このことは、分離に起因する物理的損傷が最小であることを示唆する（図７参照）。
【００４８】
図６は、本発明の一実施形態にしたがった実験においてフローサイトメータ（Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６，  ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ）から得られるＦＡＣＳデータを示す図であり、灌流バイオリアクターの状態に良く似た、２つの異なる濃度における高スループット慣性濾過システムを使用するＣＨＯ細胞の分離の結果を示している。パネル６３３では、１０６細胞／ｍｌの濃度が入口で見られ、この場合、システムは、内側出口で０．０１％の濃度、すなわち、ほぼ完全に浄化された細胞を生み出すことができる（パネル６３４参照）とともに、外側出口で９９．９％の濃度を生み出すことができる（パネル６３５参照）。同様に、パネル６３６では、１０７細胞／ｍｌの濃度が入口で見られ、この場合、内側出口で３．７％の低い濃度を伴う（パネル６３７）とともに、外側出口で９６．７％の高い濃度を伴う（パネル６３８）。
【００４９】
図７は、本発明の一実施形態に係る慣性精密濾過システムによる対照（選別されない）ＣＨＯ細胞（ａ−ｃ）及び選別された細胞（ｄ−ｆ）の培養の位相差顕微鏡写真の図である。画像は、高い生存率及び無菌性を示唆する細胞の増殖率と形態との間の非有意差を示す。
【００５０】
本発明の一実施形態に係る高スループット精密濾過システムは、従来のマイクロフライス加工及びＰＤＭＳ鋳造を使用して極めて低コストで製造され得る。膜フィルタとは対照的に、このシステムは、フィルタの漸進的なタンパク質及び細胞のファウリングを被らないとともに、フラックス低下を何ら伴うことなく長期間にわたってノンストップで動作され得る。このプラットフォームは、高スループット、低コスト、拡張可能性、及び、小さいフットプリントの望ましい組み合わせを有し、それにより、プラットフォームは、様々な精密濾過用途に本質的に適する。生物学的な検証実験において、このシステムの有用性は、バイオリアクターからの大規模哺乳類細胞保持（１０００ｍＬ／分）、酵母分離、及び、幹細胞分別に関して成功裏に示されてきた。その設計の単純さは、灌流バイオリアクター内の他の下流側プロセスとのインライン統合に関して又はスタンドアロン高スループット精密濾過／分別デバイスとしての機能を果たすことに関してこのデバイスを理想的にする。
【００５１】
本発明の一実施形態に係る新規な膜無し精密濾過システムは、高スループット粒子分離／分別のための低コストなプラットフォームであるとともに、醸造産業、製薬産業、及び、水道産業などの細胞分離又は粒子分離が必要とされる多くの産業で適用され得る。概念の裏付けとして、抗体生成のための灌流バイオリアクターからの動物細胞の分離が実証されてきた。このプラットフォームは、水前処理のために水道産業において使用され得る、或いは、発酵培養液の酵母除去のために醸造所又はワイン醸造所で用いられ得る。加えて、このシステムは、大量の生体液（例えば血液）からの稀な細胞（例えば、癌細胞、胎児細胞、幹細胞）の分離が必要とされる生物医学的用途で使用される可能性を有する。
【００５２】
本明細書中で使用される「曲線マイクロチャネル」は、マイクロチャネルの流れ方向に沿う縦軸が直線から逸脱するマイクロチャネルであり、例えば螺旋チャネル又は正弦曲線チャネルであってもよい。
【００５３】
当業者であれば分かるように、チャネルは、チャネルの寸法が生物反応混合物中の細胞を少なくとも１つの曲線マイクロチャネルの断面の少なくとも一部に沿って細胞サイズに基づき分離するようになっている場合には、様々な形状（例えば、湾曲、螺旋、マルチループ、ｓ形状、直線）を有することができる。
【００５４】
１つの態様では、チャネルが湾曲している。特定の態様では、チャネルが螺旋である。螺旋チャネルの高さは、約１０μｍ〜約２００μｍの範囲内、例えば、約１００μｍ〜約１４０μｍであってもよい。螺旋チャネルの幅は約１００μｍ〜約５００μｍの範囲内であってもよい。螺旋チャネルの長さは約１ｃｍ〜約１０ｃｍの範囲内であってもよい。
【００５５】
１つの態様では、螺旋チャネルがバイループ螺旋チャネルであってもよい。別の態様では、螺旋チャネルが２ループ螺旋チャネルであってもよい。更なる別の態様では、螺旋チャネルが３ループ螺旋チャネルであってもよい。更に別の態様では、螺旋チャネルが４ループ螺旋チャネルであってもよい。別の態様では、螺旋チャネルが５ループ螺旋チャネル等であってもよい。
【００５６】
螺旋チャネルの半径は、約５に等しいディーン数をもたらす約１ｃｍの半径など、約１〜約１０の範囲内のディーン数をもたらすようになっていてもよい。螺旋チャネルの長さは、約３ｃｍ以上、例えば約９ｃｍ、約１０ｃｍ、約１５ｃｍ、及び、約２０ｃｍに等しくてもよい。螺旋チャネルの幅は、約１００μｍ〜約１０００μｍの範囲内、例えば、約２００μｍ、約３００μｍ、約４００μｍ、約５００μｍ、約６００μｍ、約７００μｍ、約８００μｍ、及び、約９００μｍであってもよい。螺旋チャネルの高さは、約２０μｍ〜約２００μｍの範囲内、例えば、約３０μｍ、約４０μｍ、約５０μｍ、約６０μｍ、約７０μｍ、約８０μｍ、約９０μｍ、約１００μｍ、約１１０μｍ、約１２０μｍ、約１３０μｍ、約１４０μｍ、約１５０μｍ、約１６０μｍ、約１７０μｍ、約１８０μｍ、及び、約１９０μｍであってもよい。チャネルのアスペクト比は、約０．１〜約１の範囲内、例えば、約０．１２、約０．２、約０．３、約０．４、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、及び、約０．９であってもよい。
【００５７】
本明細書中で使用される「アスペクト比」は、チャネルの高さをチャネルの幅で割った比率であり、生物反応混合物中の細胞を少なくとも１つの曲線マイクロチャネルの断面の少なくとも一部に沿って細胞サイズに基づき分離するのに適したチャネルの断面を与える。
【００５８】
本発明の一実施形態によれば、Ｌｉｍ等の米国特許出願公開第２０１３／０１３０２２６号明細書に教示される螺旋マイクロチャネルを含むマイクロチャネルが使用されてもよく、この出願の全体の開示は、参照により本願に組み入れられる。例えば、とりわけ、流量、幅、高さ、アスペクト比、及び、長さ、並びに、細胞の流体力学的な分離に関連する他の条件の教示内容が使用されてもよい。
【００５９】
引用文献
【００６０】
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１３．Ｈｕ，Ｗ．−Ｓ．  ａｎｄ  Ｊ．Ｇ．Ａｕｎｉｎｓ，  Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １９９７．８（２）：  ｐ．１４８−１５３．
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１５．Ｔａｋａｍａｔｓｕ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｔｈａｔ  ｕｓｅｓ  ａ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ｗｉｔｈ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｔｔｌｉｎｇ  ｚｏｎｅｓ．Ａｐｐｌｉｅｄ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９６．４５（４）：  ｐ．４５４−４５７．
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１６．Ｈａｂｉｂｉａｎ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｃｙｃｌｏｎｅ  ｆｏｒ  ｒｅｍｏｖａｌ  ｏｆ  ｙｅａｓｔｓ  ｆｒｏｍ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ  ｂｒｏｔｈ．  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｊｏｕｒｎａｌ，２００８．１３８（１-３）：  ｐ．３０−３４．
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１８．Ｂｈａｇａｔ，Ａ．Ａ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ．  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＆  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ＆  ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ，２０１０．４８（１０）：  ｐ．９９９−１０１４．
【００７８】
１９．Ｋａｒｉｍｉ，  Ａ．，  Ｓ．  Ｙａｚｄｉ，  ａｎｄ  Ａ．  Ａｒｄｅｋａｎｉ，  Ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ａｎｄ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｔｒａｐｐｉｎｇ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ．  Ｂｉｏｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，２０１３．７（２）：  ｐ．０２１５０１．
【００７９】
２０．Ｈｏｕ，Ｈ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ｆｏｒｃｅｓ．  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，  ２０１３．３：１２５９．
【００８０】
２１．Ｍａｊｉｄ，Ｅ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｌａｎｔｅｄ  ｓｐｉｒａｌ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｕｌｔｒａ−ｆａｓｔ，  ｌａｂｅｌ−ｆｒｅｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ，２０１３．
【００８１】
２２．Ｂｈａｇａｔ，Ａ．Ａ．Ｓ．，  Ｓ．Ｓ．Ｋｕｎｔａｅｇｏｗｄａｎａｈａｌｌｉ，  ａｎｄ  Ｉ．Ｐａｐａｕｔｓｋｙ，  Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｐｉｒａｌ  ｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｄｅａｎ  ｆｌｏｗｓ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ．  Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐ，２００８．８（１１）：  ｐ．１９０６−１９１４．
【００８２】
２３．Ｄｉ  Ｃａｒｌｏ，Ｄ．，  Ｉｎｅｒｔｉａｌ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ．  Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐ，２００９．９（２１）：  ｐ．３０３８−３０４６．
【００８３】
本明細書中で挙げられる全ての特許、公開出願、及び、引用文献は、それらの全体が参照により組み入れられる。
【００８４】
この発明をその実施形態の例に関連して特に図示して説明してきたが、当業者であれば分かるように、添付の特許請求の範囲により包含される発明の範囲から逸脱することなく、形状及び細部の様々な変更がなされてもよい。
【図１】
2017527299.tif 000004
【図２】
2017527299.tif 000005
【図３】
2017527299.tif 000006
【図４】
2017527299.tif 000007
【図５】
2017527299.tif 000008
【図６】
2017527299.tif 000009
【図７】
2017527299.tif 000010
【図８】
2017527299.tif 000011
【国際調査報告】
2017527299.tif 000012
2017527299.tif 000013