(57)【要約】遺伝子配列データの解析で用いる方法、プロセス、ならびに特に、コンピューターによって実施されるプロセス及びコンピュータープログラム製品を提供する。本プロセス及び製品は、短い核酸配列データを、連結された長い、好ましくは連続的な遺伝子コンストラクト（より大きいコンティグ、染色体及び全ゲノムを含む）にアセンブルする際に用いる。
2017526046.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸配列リードをアセンブルするための配列決定方法であって、
１つ以上のプロセッサーと、前記１つ以上のプロセッサーによって実行される１つ以上のプログラムを格納しているメモリーとを有するコンピューターシステムにおいて、
より大きい連続的な核酸に由来する複数の配列リードを得ることであって、前記より大きい連続的な核酸の共通のフラグメントに由来する２つ以上の配列リードが、共通のバーコード配列を含むことと、
前記複数の配列リードのうちの第１の配列リードサブセットであって、オーバーラップ配列と、共通のバーコード配列との両方を含むサブセットを特定することと、
前記第１の配列リードサブセットをアラインメントして、連続的な直鎖状核酸配列をもたらすことと、
を含む配列決定方法。
【請求項２】
複数の異なる配列リードサブセットで、前記特定ステップと前記アラインメントステップを繰り返して、複数の連続的な直鎖状核酸配列をもたらすことを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記より大きい連続的な核酸内の配列コンテクストにおいて、前記複数の異なる連続的な直鎖状核酸配列の順序を定めることを更に含む、請求項２の方法に記載の方法。
【請求項４】
前記順序を定めることが、前記複数の異なる連続的な直鎖状核酸配列を参照配列に対してマッピングすることを含む、請求項３の方法に記載の方法。
【請求項５】
前記順序を定めることが、
第１の連続的な直鎖状核酸配列に共通するバーコード配列を含むが、第２の連続的な直鎖状核酸配列とのオーバーラップ配列を含む１つ以上の配列リードを特定することと、
前記第１及び第２の連続的な直鎖状核酸を、構造的に連結されるものとして特定することと、
を含む、請求項３の方法に記載の方法。
【請求項６】
核酸配列リードの、より大きい連続的な配列へのアセンブル方法であって、
１つ以上のプロセッサーと、前記１つ以上のプロセッサーによって実行される１つ以上のプログラムを格納しているメモリーとを有するコンピューターシステムにおいて、
より大きい連続的な核酸に由来する複数の配列リードを得ることと、
前記複数の配列リードにおけるオーバーラップ配列リードセットから、第１のサブ配列を特定することと、
１つ以上の隣接またはオーバーラップ配列に、前記第１のサブ配列と共通するバーコード配列が存在することに基づき、前記第１のサブ配列を前記隣接配列まで伸長することと、
前記第１のサブ配列と、前記１つ以上の隣接配列とを含む直鎖状核酸配列をもたらすことと、
を含む方法。
【請求項７】
１つ以上のプロセッサーと、前記１つ以上のプロセッサーによって実行される１つ以上のプログラムを格納しているメモリーとを有するコンピューターシステムにおいて、
（Ａ）複数の配列リードを得ることであって、
前記複数の配列リードが、複数の配列リードセットを構成し、
１つの配列リードセットにおける対応する各配列リードが、（ｉ）より大きい連続的な核酸のサブセットに対応する第１の部分と、（ｉｉ）前記より大きい連続的な核酸の配列から独立しているとともに、複数の分画のうち、前記対応する配列リードが形成された１つの分画を特定する識別子を形成する共通の第２の部分とを含み、
前記複数の配列リードセットにおける対応する各配列リードセットが、前記複数の分画のうちの１つの分画に形成されており、各分画が、前記より大きい連続的な核酸のフラグメントで、その分画において、対応する各配列リードに対するテンプレートとして用いられるフラグメントを１つ以上含むことと、
（Ｂ）前記複数の配列リードの各配列リードに対して、対応するｋ−ｍｅｒセットを作成することであって、
前記ｋ−ｍｅｒセットが、全体で、複数のｋ−ｍｅｒを含み、
前記複数のｋ−ｍｅｒの各ｋ−ｍｅｒに対して、前記配列リードの前記識別子が保持されており、
ｋが、前記複数の配列リードにおける前記配列リードの平均長未満であり、
対応する各ｋ−ｍｅｒセットが、対応する配列リードの前記第１の部分の長さｋの考え得るｋ−ｍｅｒの少なくとも８０パーセントを含むことと、
（Ｃ）前記複数のｋ−ｍｅｒのうちの対応する各ｋ−ｍｅｒに対して、前記複数の配列リードにおける配列リードのうち、前記対応するｋ−ｍｅｒと、前記配列リードを含む前記配列リードセットの前記識別子とを含む各配列リードの識別を追跡することと、
（Ｄ）複数の有向アークによって連結された複数のノードを含むグラフとして、前記複数のｋ−ｍｅｒをグラフ化することであって、
各ノードが、長さｋの前記複数のｋ−ｍｅｒにおける連続的なｋ−ｍｅｒセットであって、ｋ−１のオーバーラップを有するｋ−ｍｅｒセットを含み、
各アークが、前記複数のノードにおいて、始点ノードを宛先ノードに連結し、
始点ノードの最後のｋ−ｍｅｒが、宛先ノードの最初のｋ−ｍｅｒとｋ−１のオーバーラップを有し、
前記複数のノードにおいて、第１の始点ノードが、第１の宛先ノードと第２の宛先ノードとのの両方を有する第１の有向アークを有することと、
（Ｅ）前記より大きい連続的な核酸の一部を表している可能性がより高いコンティグ配列を抽出するために、前記始点ノードを前記第１の宛先ノードにマージするか、または第２の宛先ノードにマージするか決定することであって、前記コンティグ配列が、（ｉ）前記始点ノードと、（ｉｉ）前記第１の宛先ノード及び前記第２の宛先ノードのうちの１つとを含み、前記決定において、少なくとも、前記第１の始点ノード、前記第１の宛先ノード及び前記第２の宛先ノードにおけるｋ−ｍｅｒにおける、前記配列リードの前記識別子を用いることと、
を含む配列決定方法。
【請求項８】
前記第１の始点ノードと前記第１の宛先ノードが、前記始点ノードと前記第１の宛先ノードと以外の追加のノードを１つ以上含む、前記グラフ内の第１のパスの一部であり、
前記第１の始点ノードと前記第２の宛先ノードが、前記始点ノードと前記第２の宛先ノードとの以外の追加のノードを１つ以上含む、前記グラフ内の第２のパスの一部であり、
前記決定（Ｅ）が、前記第１のパスの第１の部分のノードのｋ−ｍｅｒと、前記第１のパスの第２の部分のノードのｋ−ｍｅｒとの間で共通している識別子の数と、前記第２のパスの第１の部分のノードのｋ−ｍｅｒと、前記第２のパスの第２の部分のノードのｋ−ｍｅｒの間で共通している識別子の数との比較を評価することによって、前記第１のパスの方が、前記第２のパスよりも、前記より大きい連続的な核酸を表している可能性がより高いかどうかを決定することを含む、
請求項７に記載の配列決定方法。
【請求項９】
前記第１の始点ノードと前記第１の宛先ノードが、前記始点ノードと前記第１の宛先ノードと以外の追加のノードを１つ以上含む、前記グラフの第１のパスの一部であり、
前記第１の始点ノードと前記第２の宛先ノードとが、前記始点ノードと前記第２の宛先ノードと以外の追加のノードを１つ以上含む、前記グラフ内の第２のパスの一部であり、
前記決定（Ｅ）におて、前記第１のパスの方が、前記第２のパスよりも平均カバレッジがより大きいときに、前記第２のパスよりも前記第１のパスを優先させる、
請求項７に記載の配列決定方法。
【請求項１０】
前記第１の始点ノードと前記第１の宛先ノードが、前記始点ノードと前記第１の宛先ノードと以外の追加のノードを１つ以上含む、前記グラフ内の第１のパスの一部であり、
前記第１の始点ノードと前記第２の宛先ノードが、前記始点ノードと前記第２の宛先ノードと以外の追加のノードを１つ以上含む、前記グラフ内の第２のパスの一部であり、
前記決定（Ｅ）において、前記第１のパスによって表される、前記より大きい連続的な核酸配列の連続的な部分の方が、前記第２のパスによって表される、前記より大きい連続的な核酸配列の連続的な部分よりも長いときに、前記第２のパスよりも、前記第１のパスを優先させる、
請求項７に記載の配列決定方法。
【請求項１１】
前記第１のノード内の第１のｋ−ｍｅｒが、前記複数の配列リードのうちの一部の複数の配列リードに存在し、前記第１のｋ−ｍｅｒに対して、前記一部の複数の配列リードの各配列リードの識別が保持されており、前記決定（Ｅ）において、この識別を用いて、前記第１のパスの方が、前記第２のパスよりも、前記より大きい連続的な核酸配列を表している可能性がより高いことを決定する、
請求項７〜１０のいずれか一項に記載の配列決定方法。
【請求項１２】
前記複数の分画のうちの１つの分画が、前記共通の第２の部分とともに、少なくとも１０００個の分子を含み、
前記少なくとも１０００個の分子の各分子が、前記より大きい連続的な核酸の少なくとも一部に対して相補的であるプライマー配列を更に含む、
請求項７〜１１のいずれか一項に記載の配列決定方法。
【請求項１３】
前記複数の分画のうちの１つの分画が、前記共有の第２の部分とともに、少なくとも１０００個の分子を含み、
前記少なくとも１０００個の分子の各分子が、プライマー部位と、前記より大きい連続的な核酸の一部に対して相補的であるセミランダムなＮ−ｍｅｒプライミング配列を更に含む、
請求項７〜１１のいずれか一項に記載の配列決定方法。
【請求項１４】
前記複数の分画のうちの１つの分画内の、前記より大きい連続的な核酸の前記１つ以上のフラグメントが、５０キロベース超の長さである、請求項７〜１３のいずれか一項に記載の配列決定方法。
【請求項１５】
前記複数の分画のうちの１つの分画内の、前記より大きい連続的な核酸の前記１つ以上のフラグメントが、２０キロベース〜２００キロベースの長さである、請求項７〜１３のいずれか一項に記載の配列決定方法。
【請求項１６】
前記複数の分画のうちの１つの分画内の、前記より大きい連続的な核酸の前記１つ以上のフラグメントが、前記より大きい連続的な核酸の１〜５００個の異なるフラグメントからなる、請求項７〜１５のいずれか一項に記載の配列決定方法。
【請求項１７】
前記複数の分画のうちの１つの分画内の、前記より大きい連続的な核酸の前記１つ以上のフラグメントが、前記より大きい連続的な核酸の５〜１００個のフラグメントからなる、請求項７〜１５のいずれか一項に記載の配列決定方法。
【請求項１８】
前記複数の配列リードを、５ナノグラム未満の核酸またはリボ核酸から得る、請求項７〜１７のいずれか一項に記載の配列決定方法。
【請求項１９】
前記配列リードセットのうちの対応する各配列リードの前記第２の部分における前記識別子が、｛１，…，１０２４｝という集合、｛１，…，４０９６｝という集合、｛１，…，１６３８４｝という集合、｛１，…，６５５３６｝という集合、｛１，…，２６２１４４｝という集合、｛１，…，１０４８５７６｝という集合、｛１，…，４１９４３０４｝という集合、｛１，…，１６７７７２１６｝という集合、｛１，…，６７１０８８６４｝という集合または｛１，…，１×１０１２｝という集合から選択した共通の値をエンコードする、請求項７〜１８のいずれか一項に記載の配列決定方法。
【請求項２０】
前記識別子がＮ−ｍｅｒであり、Ｎが、｛４，…，２０｝という集合から選択した整数である、請求項７〜１８のいずれか一項に記載の配列決定方法。
【請求項２１】
前記複数の配列リードの平均配列リード長が、４０塩基〜２００塩基である、請求項７〜２０のいずれか一項に記載の配列決定方法。
【請求項２２】
前記複数の配列リードの平均配列リード長が、６０塩基〜１４０塩基である、請求項７〜２０のいずれか一項に記載の配列決定方法。
【請求項２３】
前記複数の配列リードの、より大きい連続的な核酸に対するカバレッジが、合わせて、少なくとも１５倍であり、
前記複数のｋ−ｍｅｒのうちの１０パーセント超のｋ−ｍｅｒが、前記複数の配列リードのうちの１個超の配列リードに由来し、
１個超の配列リードによって表される各ｋ−ｍｅｒに対して、各配列リードの前記識別子が保持されている、
請求項７〜２２のいずれか一項に記載の配列決定方法。
【請求項２４】
前記複数の配列リードの、より大きい連続的な核酸に対するカバレッジが、合わせて、少なくとも２５倍であり、
前記複数のｋ−ｍｅｒの３０パーセント超が、前記複数の配列リードのうちの１個超の配列リードに由来し、
１個超のソース配列リードによって表される各ｋ−ｍｅｒに対して、各配列リードの前記識別子が保持されている、
請求項７〜２２のいずれか一項に記載の配列決定方法。
【請求項２５】
前記複数の配列リードの配列リードが、前記より大きい連続的な核酸の７５〜１２５塩基をコードし、前記ｋの値が、５〜７３の奇数の整数である、請求項７〜２４のいずれか一項に記載の配列決定方法。
【請求項２６】
前記複数の配列リードのうちの１つの配列リードセットが、１００個超の配列リードを含み、前記１００個超の配列リードの各配列リードが、同じ共通する第２の部分を含む、請求項７〜２５のいずれか一項に記載の配列決定方法。
【請求項２７】
前記より大きい連続的な核酸が染色体である、請求項７〜２６のいずれか一項に記載の配列決定方法。
【請求項２８】
前記より大きい連続的な核酸が、４０００万塩基対超の長さである、請求項７〜２７のいずれか一項に記載の配列決定方法。
【請求項２９】
前記対応するｋ−ｍｅｒセットを作成することが、所与のｋ−ｍｅｒ長に従って、前記複数の配列リードの各配列リードをハッシングし、それによって、前記複数の配列リードの各配列リードに対して、対応するｋ−ｍｅｒセットを作成することを含む、請求項７〜２８のいずれか一項に記載の配列決定方法。
【請求項３０】
１つ以上のプロセッサーと、
前記１つ以上のプロセッサーによって実行される１つ以上のプログラムを格納しているメモリーと、
を備える演算システムであって、
前記１つ以上のプログラムが、
（Ａ）複数の配列リードを得るための命令であって、
前記複数の配列リードが、複数の配列リードセットを構成し、
１つの配列リードセットのうちの対応する各配列リードが、（ｉ）より大きい連続的な核酸のサブセットに対応する固有の第１の部分と、（ｉｉ）前記より大きい連続的な核酸の配列から独立しているとともに、複数の分画のうち、前記対応する配列リードが形成された１つの分画を特定する識別子を形成する共通の第２の部分とを含み、
前記複数の配列リードセットのうちの対応する各配列リードセットが、前記複数の分画のうちの１つの分画内に形成されており、各分画が、前記より大きい連続的な核酸のフラグメントであって、前記分画において、対応する各配列リードに対するテンプレートとして用いられるフラグメントを１つ以上含む命令と、
（Ｂ）前記複数の配列リードの各配列リードに対して、対応するｋ−ｍｅｒセットを作成するための命令であって、
前記ｋ−ｍｅｒセットが、全体で、複数のｋ−ｍｅｒを含み、
前記複数のｋ−ｍｅｒのうちの各ｋ−ｍｅｒに対して、前記配列リードの前記識別子が保持されており、
ｋが、前記複数の配列リードの前記配列リードの平均長未満であり、
対応する各ｋ−ｍｅｒセットが、前記対応する配列リードの前記第１の部分の長さｋの考え得るｋ−ｍｅｒの少なくとも８０パーセントを含む命令と、
（Ｃ）前記複数のｋ−ｍｅｒのうちの対応する各ｋ−ｍｅｒに対して、前記対応するｋ−ｍｅｒと、前記配列リードを含む前記配列リードセットの前記識別子とを含む、前記複数の配列リードの各配列リードの識別を追跡するための命令と、
（Ｄ）複数の有向アークによって連結された複数のノードを含むグラフとして、前記複数のｋ−ｍｅｒをグラフ化するための命令であって、
各ノードが、長さｋの前記複数のｋ−ｍｅｒのうちの連続的なｋ−ｍｅｒセットであって、ｋ−１のオーバーラップを有するｋ−ｍｅｒセットを含み、
各アークが、前記複数のノードにおいて、始点ノードを宛先ノードに連結し、
始点ノードの最後のｋ−ｍｅｒが、宛先ノードの最初のｋ−ｍｅｒとｋ−１のオーバーラップを有し、
前記複数のノードにおいて、第１の始点ノードが、第１の宛先ノードと第２の宛先ノードとの両方を有する第１の有向アークを有する命令と、
（Ｅ）前記より大きい連続的な核酸の一部を表している可能性がより高いコンティグ配列を抽出するために、前記始点ノードを前記第１の宛先ノードとマージするか、または前記第２の宛先ノードとマージするかを決定するための命令であって、前記コンティグ配列が、（ｉ）前記始点ノードと、（ｉｉ）前記第１の宛先ノード及び前記第２の宛先ノードのうちの１つを含み、前記決定において、前記第１の始点ノード、前記第１の宛先ノード及び前記第２の宛先ノードにおけるｋ−ｍｅｒに対して、前記配列リードの前記識別子を少なくとも用いる命令と、
を含む、演算システム。
【請求項３１】
１つ以上のプロセッサーと、前記１つ以上のプロセッサーによって実行される１つ以上のプログラムを格納しているメモリーとを有するコンピューターシステムにおいて、
（Ａ）複数の配列リードを得ることであって、
前記複数の配列リードが、複数の配列リードセットを構成し、
１つの配列リードセットにおける対応する各配列リードが、（ｉ）より大きい連続的な核酸のサブセットに対応する固有の第１の部分と、（ｉｉ）前記より大きい連続的な核酸の配列から独立しているとともに、複数の分画のうち、前記対応する配列リードが形成された１つの分画を特定する識別子を形成する共通の第２の部分とを含み、
前記複数の配列リードセットのうちの対応する各配列リードセットが、前記複数の分画のうちの１つの分画に形成されており、各分画が、前記より大きい連続的な核酸のフラグメントであって、前記分画において、対応する各配列リードに対するテンプレートとして用いられるフラグメントを１つ以上含むことと、
（Ｂ）前記複数の配列リードの各配列リードに対して、対応するｋ−ｍｅｒセットを作成することであって、
前記ｋ−ｍｅｒセットが、全体で、複数のｋ−ｍｅｒを含み、
前記複数のｋ−ｍｅｒのうちの各ｋ−ｍｅｒに対して、前記配列リードの前記識別子が保持されており、
ｋが、前記複数の配列リードのうちの前記配列リードの平均長未満であり、
対応する各ｋ−ｍｅｒセットが、前記対応する配列リードの前記第１の部分の考え得るｋ−ｍｅｒの少なくとも８０パーセントを含むことと、
（Ｃ）前記複数のｋ−ｍｅｒのうちの対応する各ｋ−ｍｅｒに対して、前記複数の配列リードのうち、前記対応するｋ−ｍｅｒを含む各配列リードの識別を追跡することと、
（Ｄ）第１のパスを特定することであって、前記第１のパスが、前記複数のｋ−ｍｅｒのうち、ｋ−１のオーバーラップを有する第１のｋ−ｍｅｒセットを含み、
（Ｅ）第２のパスを特定することであって、前記第２のパスが、前記複数のｋ−ｍｅｒのうち、ｋ−１のオーバーラップを有する第２のｋ−ｍｅｒセットを含み、前記第１のパスが、前記第２のパスと交差し、それによって、前記第１のパスの左側部分と、前記第１のパスの右側部分と、前記第２のパスの左側部分と、前記第２のパスの右側部分とを含む分岐セグメントセットを形成することと、
（Ｆ）前記分岐セグメントの連結性を検証するために、前記分岐セグメントセットの前記ｋ−ｍｅｒに対応付けられた前記識別子を使用することと、
を含む配列決定方法。
【請求項３２】
前記使用すること（Ｆ）が、前記分岐セグメントセットのうちの考え得る各分岐セグメントペアの間で共通している識別子の数を評価することを含む、請求項３１に記載の配列決定方法。
【請求項３３】
前記複数の分画の１つの分画が、前記共通の第２の部分とともに、少なくとも１０００個の分子を含み、
前記少なくとも１０００個の分子の各分子が、前記より大きい連続的な核酸の少なくとも一部に対して相補的なプライマー配列を含む、
請求項３１または３２に記載の配列決定方法。
【請求項３４】
前記配列リードセットのうちの対応する各配列リードの前記第２の部分内の前記識別子が、｛１，…，１０２４｝という集合、｛１，…，４０９６｝という集合、｛１，…，１６３８４｝という集合、｛１，…，６５５３６｝という集合、｛１，…，２６２１４４｝という集合、｛１，…，１０４８５７６｝という集合、｛１，…，４１９４３０４｝という集合、｛１，…，１６７７７２１６｝という集合、｛１，…，６７１０８８６４｝という集合または｛１，…，１×１０１２｝という集合から選択した共通の値をエンコードする、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の配列決定方法。
【請求項３５】
前記識別子がＮ−ｍｅｒであり、Ｎが、｛４，…，２０｝という集合から選択した整数である、請求項３１〜３４のいずれか一項に記載の配列決定方法。
【請求項３６】
前記複数の配列リードの平均配列リード長が、４０塩基〜２００塩基である、請求項３１〜３５のいずれか一項に記載の配列決定方法。
【請求項３７】
前記複数の配列リードの平均配列リード長が、６０塩基〜１４０塩基である、請求項３１〜３５のいずれか一項に記載の配列決定方法。
【請求項３８】
前記複数の配列リードの、より大きい連続的な核酸に対するカバレッジが、合わせて、少なくとも１５倍であり、
前記複数のｋ−ｍｅｒのうちの１０パーセント超のｋ−ｍｅｒが、前記複数の配列リードのうちの１個超のソース配列リードに由来し、
１個超のソース配列リードによって表される各ｋ−ｍｅｒに対して、かかる各ソース配列リードの前記識別子が保持されている、
請求項３１〜３７のいずれか一項に記載の配列決定方法。
【請求項３９】
前記複数の配列リードの、より大きい連続的な核酸に対するカバレッジが、合わせて、少なくとも２５倍であり、
前記複数のｋ−ｍｅｒの３０パーセント超が、前記複数の配列リードのうちの１個超のソース配列リードに由来し、
１個超のソース配列リードによって表される各ｋ−ｍｅｒに対して、かかる各ソース配列リードの前記識別子が保持されている、
請求項３１〜３７のいずれか一項に記載の配列決定方法。
【請求項４０】
前記複数の配列リードのうちの前記配列リードが、前記より大きい連続的な核酸の７５〜１２５塩基をコードし、ｋが、５〜７３の奇数の整数である、請求項３１〜３９のいずれか一項に記載の配列決定方法。
【請求項４１】
前記複数の配列リードのうちの１つの配列リードセットが、それぞれ、同じ共通する第２の部分とともに、１００個超の配列リードを含む、請求項３１〜４０のいずれか一項に記載の配列決定方法。
【請求項４２】
前記より大きい連続的な核酸が染色体である、請求項３１〜４１のいずれか一項に記載の配列決定方法。
【請求項４３】
前記より大きい連続的な核酸が、４０００万塩基対超の長さである、請求項３１〜４２のいずれか一項に記載の配列決定方法。
【請求項４４】
１つ以上のプロセッサーと、
前記１つ以上のプロセッサーによって実行される１つ以上のプログラムを格納しているメモリーと、
を備える演算システムであって、
前記１つ以上のプログラムが、
（Ａ）複数の配列リードを得るための命令であって、
前記複数の配列リードが、複数の配列リードセットを構成し、
１つの配列リードセットにおける対応する各配列リードが、（ｉ）より大きい連続的な核酸のサブセットに対応する固有の第１の部分と、（ｉｉ）前記より大きい連続的な核酸の配列から独立しているとともに、複数の分画のうち、前記対応する配列リードが形成された１つの分画を特定する識別子を形成する共通の第２の部分とを含み、
前記複数の配列リードセットのうちの対応する各配列リードセットが、前記複数の分画のうちの１つの分画に形成されており、各分画が、前記より大きい連続的な核酸のフラグメントであって、前記分画において、対応する各配列リードに対するテンプレートとして用いられるフラグメントを１つ以上含む命令と、
（Ｂ）前記複数の配列リードのうちの各配列リードに対して、対応するｋ−ｍｅｒセットを作成するための命令であって、
前記ｋ−ｍｅｒセットが、全体で、複数のｋ−ｍｅｒを含み、
前記複数のｋ−ｍｅｒの各ｋ−ｍｅｒに対して、前記配列リードの前記識別子が保持されており、
ｋが、前記複数の配列リードのうちの前記配列リードの平均長未満であり、
対応する各ｋ−ｍｅｒセットが、前記対応する配列リードの前記第１の部分の考え得るｋ−ｍｅｒの少なくとも８０パーセントを含む命令と、
（Ｃ）前記複数のｋ−ｍｅｒのうちの対応する各ｋ−ｍｅｒに対して、前記対応するｋ−ｍｅｒを含む、前記複数の配列リードの各配列リードの識別を追跡する命令と、
（Ｄ）第１のパスを特定するための命令であって、前記第１のパスが、前記複数のｋ−ｍｅｒのうちの第１のｋ−ｍｅｒセットであって、ｋ−１のオーバーラップを有するｋ−ｍｅｒセットを含む命令と、
（Ｅ）第２のパスを特定するための命令であって、前記第２のパスが、前記複数のｋ−ｍｅｒのうちの第２のｋ−ｍｅｒセットであって、ｋ−１のオーバーラップを有する第２のｋ−ｍｅｒセットを含み、前記第１のパスが、前記第２のパスと交差し、それによって、前記第１のパスの左側部分と、前記第１のパスの右側部分と、前記第２のパスの左側部分と、前記第２のパスの右側部分とを含む分岐セグメントセットを形成する命令と、
（Ｆ）前記分岐セグメントの連結性を検証するために、前記分岐セグメントセットの前記ｋ−ｍｅｒに対応付けられた前記識別子を使用する命令と、
を含む演算システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１４年６月２６日に提出され、「Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ」という標題である米国特許出願第６２／０１７，５８９号に対する優先権を主張するものであり、上記の特許出願は、参照により、本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
高スループットの次世代配列決定技術に伴う大きな課題の１つは、比較的短い配列リードを、更に長い連続的な配列にアセンブルすることにある。ゲノム配列アセンブルプロセスは、ばらばらに分けられた長編小説を再度つなぎ合わせて、１つの完全な長編小説に戻さなければならない作業になぞらえることが多い。配列アセンブルでは、概して、この作業は、アセンブル対象の全配列のオーバーラップサブセグメントをつなぎ合わせることによって行う。理解されるように、フラグメントが大きいほど、またフラグメントの不明瞭さが小さいほど、アセンブルプロセスは容易になる。例えば、小説をつなぎ合わせるには、完全な段落、ページまたは章をつなぎ合わせる方が、個々の文、文の断片、または無作為の単語もしくは単語の一部をつなぎ合わせるよりも容易であろう。同様に、核酸配列決定でも、複数のリードを、更に長い連続的な配列にアセンブルするのは、個々の配列リードが短いほど困難になる。
【０００３】
次世代配列決定技術は、大量の配列データ、例えば、１回のランで１テラベースの配列データを生成できるが、長さの短い配列リードしか得られない問題がある。具体的には、これらの配列決定技術では、概して、１００個以下の連続塩基（またはペアエンド配列決定として配列決定を行うときには、最大で約２００塩基）のリードで、配列データが得られる。続いて、これらのリードを、更に長い連続的な配列にアセンブルしなければならない。ある特定の配列決定技術では、８００塩基長、１０００塩基長、５０００塩基長または更には２０，０００塩基長という、更に長い配列リードが得られるが、これは、システムスループットの犠牲によって成り立つ場合が多く、１回のランで数百メガベースの配列データしか得られない。
【０００４】
比較的短い配列リードを、更に長い連続的な配列にアセンブルする際には、多くのプロセス及びアルゴリズムが用いられてきている。概して、これらの短い配列リードは典型的に、いくつかの他の短い配列リードとオーバーラップしており、更に長い配列全体の様々な部分に対する冗長カバレッジ（「カバレッジ」または「カバレッジ倍数」という）を提供する。高レベルでは、多くのリードから得られたオーバーラップ配列を用いて、更に長い配列の情報をつなぎ合わせる。多くの場合、例えば同じ生物種に由来する既存の既知の参照配列が利用可能である。これらの参照配列は、短い配列リードを、より大きいゲノムまたはゲノムフラグメント上にマッピングする足場として用いてよい。続いて、複数倍のカバレッジの配列をその足場の上に重ねて、比較的確信度の高い配列をもたらす。
【０００５】
しかしながら、多くの場合、参照配列は入手不可能であり、配列決定を行うゲノムまたはゲノムフラグメントの新規アセンブルが必要となる。さらに、多くの場合、このような参照配列は役に立たない。配列決定の目的が、対象配列における変異を検出することであるからである。例えば、対象配列が、がんに由来する場合、がんのステージまたはがんのその他の何らかの特質を診断する方法として、対象配列に、どの変異、挿入及び欠失が存在するかを解明することが重要である。したがって、配列決定作業においては、参照配列の利用は常に有用であるわけではない。
【０００６】
したがって、本明細書では、配列リードを、より大きいゲノムまたはゲノムフラグメント配列にアセンブルする改良された方法、プロセス及びシステム、具体的には、配列情報を、より大きい配列コンテクスト（例えば、全染色体または更には全ゲノムコンテクストを含む）に新規アセンブルする改良された方法、プロセス及びシステムについて記載する。
【発明の概要】
【０００７】
本明細書に記載されているのは、例えばショートリード配列決定系及びロングリード配列決定系の両方を含む様々な配列決定系から配列リードをアセンブルするのに用いる改良された遺伝子配列アセンブルプロセスである。本明細書に記載されているプロセスは、新規アセンブルプロセス及び再配列決定アセンブルプロセスの両方、または既知の参照配列に対するアセンブルプロセスで用いてよい。
【０００８】
本明細書に記載されている方法、プロセス及びシステムでは、１つ以上の異なるアセンブルステップで、アセンブルプロセス全体を支援するために、対応付けられたバーコード配列を有する配列リードを用いる。
【０００９】
ある特定の態様では、核酸配列リードをより大きい連続的な配列にアセンブルする方法を提供する。この方法は、コンピューターによって実施されるシステムであって、より大きい連続的な核酸に由来する複数の配列リードを含む第１のデータ構造を含むシステムにおいて、オーバーラップ配列と、共通のバーコード配列との両方を含む配列リードの第１のサブセットを特定することを含む。そのより大きい連続的な核酸の共通するフラグメントに由来する配列リードは、共通のバーコード配列を含む。第１の配列リードサブセットをアラインメントして、連続的な直鎖状核酸配列をもたらす。
【００１０】
核酸配列リードをより大きい連続的な配列にアセンブルする方法も提供する。かかる方法は、コンピューターによって実施されるシステムであって、より大きい連続的な核酸に由来する複数の配列リードを含む第１のデータ構造を含むシステムにおいて、オーバーラップ配列リードセットから、第１のサブ配列を特定する。続いて、隣接配列上に、第１のサブ配列と共通するバーコード配列が存在することに基づき、第１のサブ配列を、１つ以上の隣接またはオーバーラップ配列にまで伸長する。そして、第１のサブ配列と１つ以上の隣接配列とを含む直鎖状核酸配列をもたらす。
【００１１】
本開示の一態様は、１つ以上のプロセッサーと、その１つ以上のプロセッサーによって実行される１つ以上のプログラムを格納しているメモリーとを有するコンピューターシステムで、複数の配列リードを得る方法を実行することを含む配列決定方法を提供する。その複数の配列リードは、複数の配列リードセットを構成する。１つの配列リードセットにおける対応する各配列リードは、（ｉ）より大きい連続的な核酸のサブセットに対応する第１の部分と、（ｉｉ）そのより大きい連続的な核酸の配列から独立しているとともに、複数の分画のうち、その対応する配列リードが形成された１つの分画を特定する識別子を形成する共通の第２の部分とを含む。複数の配列リードセットにおける対応する各配列リードセットは、複数の分画のうちの１つの分画に形成されており、各分画は、より大きい連続的な核酸のフラグメントであって、その分画において、対応する各配列リードに対するテンプレートとして用いるフラグメントを１つ以上（例えば、２つ以上、３つ以上、１０個以上）含む。
【００１２】
この方法では、複数の配列リードの各配列リードに対して、１つの対応するｋ−ｍｅｒセットを作成する。これらのｋ−ｍｅｒセットは、全体で、複数のｋ−ｍｅｒを含む。その複数のｋ−ｍｅｒの各ｋ−ｍｅｒに対して、配列リードの識別子が保持されている。多くの場合、このような配列決定リード識別子は、少なくともｋ−ｍｅｒのいくつかにおいて、多数存在する。ｋの値は、複数の配列リードにおける配列リードの平均長未満である。対応する各ｋ−ｍｅｒセットは、対応する配列リードの第１の部分の長さｋの考え得るｋ−ｍｅｒののうちのいくつか（例えば少なくとも８０パーセント）を含む。
【００１３】
この方法では、複数のｋ−ｍｅｒのうちの対応する各ｋ−ｍｅｒに対して、その対応するｋ−ｍｅｒと、その配列リードを含む配列リードセットの識別子とを含む、複数の配列リードの各配列リードの識別を追跡する。
【００１４】
この方法では、複数の有向アークによって連結された複数のノードを含むグラフとして、複数のｋ−ｍｅｒの全てまたは一部（例えば、少なくとも１パーセント、少なくとも５パーセント、少なくとも５０パーセント）をグラフ化する。各ノードは、長さｋの複数のｋ−ｍｅｒのうちの連続的なｋ−ｍｅｒセットであって、ｋ−１のオーバーラップを有するｋ−ｍｅｒセットを含む。各アークは、複数のノードにおいて、始点ノードを宛先ノードに連結する。始点ノードの最後のｋ−ｍｅｒは、宛先ノードの最初のｋ−ｍｅｒとｋ−１のオーバーラップを有する。第１の始点ノードは、複数のノードにおいて、第１の宛先ノードと第２の宛先ノードとの両方を有する第１の有向アークを有する。
【００１５】
この方法では、より大きい連続的な核酸の一部を表している可能性がより高いコンティグ配列を抽出するために、始点ノードを第１の宛先ノードにマージするか、または第２の宛先ノードにマージするかを決定する。このコンティグ配列は、（ｉ）始点ノードと、（ｉｉ）第１の宛先ノードと第２の宛先ノードのうちの１つとを含む。上記の決定では、少なくとも、第１の始点ノード、第１の宛先ノード及び第２の宛先ノード内のｋ−ｍｅｒに対して、配列リードの識別子を用いる。
【００１６】
別の態様は、１つ以上のプロセッサーと、その１つ以上のプロセッサーによって実行される１つ以上のプログラムを格納しているメモリーとを備える演算システムであって、その１つ以上のプログラムが、上記の方法を実行するための命令を含む演算システムを提供する。
【００１７】
本開示の別の態様は、１つ以上のプロセッサーと、その１つ以上のプロセッサーによって実行される１つ以上のプログラムを格納しているメモリーとを有するコンピューターシステムで、複数の配列リードを得ることを含む配列決定方法を提供する。その複数の配列リードは、複数の配列リードセットを構成する。１つの配列リードセットにおける対応する各配列リードは、（ｉ）より大きい連続的な核酸のサブセットに対応する固有の第１の部分と、（ｉｉ）そのより大きい連続的な核酸の配列から独立しているとともに、複数の分画のうち、その対応する配列リードが形成された１つの分画を特定する識別子を形成する共通の第２の部分とを含む。複数の配列リードセットにおける対応する各配列リードセットは、複数の分画のうちの１つの分画に形成される。そのような各分画は、より大きい連続的な核酸のフラグメントであって、その分画において、対応する各配列リードに対するテンプレートとして用いるフラグメントを１つ以上含む。
【００１８】
この方法では、複数の配列リードの各配列リードに対して、１つの対応するｋ−ｍｅｒセットを作成する。そのｋ−ｍｅｒセットは、全体で、複数のｋ−ｍｅｒを含む。複数のｋ−ｍｅｒの各ｋ−ｍｅｒに対して、配列リードの識別子が保持されている。ｋの値は、複数の配列リードにおける配列リードの平均長未満である。対応する各ｋ−ｍｅｒセットは、対応する配列リードの第１の部分の考え得るｋ−ｍｅｒの少なくともいくつか（例えば、少なくとも８０パーセント）を含む。
【００１９】
この方法では、複数のｋ−ｍｅｒのうちの対応する各ｋ−ｍｅｒに対して、その対応するｋ−ｍｅｒを含む複数の配列リードの各配列リードの識別を追跡する。第１のパスを特定する。第１のパスは、複数のｋ−ｍｅｒにおける第１のｋ−ｍｅｒセットであって、ｋ−１のオーバーラップを有するｋ−ｍｅｒセットを含む。第２のパスを特定する。第２のパスは、複数のｋ−ｍｅｒにおける第２のｋ−ｍｅｒセットであって、ｋ−１のオーバーラップを有する第２のｋ−ｍｅｒセットを含む。第１のパスは、（例えば図１５に示されているように、）第２のパスと交差し、それによって、第１のパスの左側部分と、第１のパスの右側部分と、第２のパスの左側部分と、第２のパスの右側部分とを含む分岐セグメントセットを形成する。分岐セグメントセットのｋ−ｍｅｒに対応付けられた識別子を用いて、分岐セグメントの連結性を検証する。いくつかの実施形態では、これは、分岐セグメントセットにおける考え得る各分岐セグメントペアの間で共通している識別子の数を評価することを含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、複数の分画のうちの１つの分画は、共通する第２の部分とともに、少なくとも１０００個の分子を含み、その少なくとも１０００個の分子の各分子は、より大きい連続的な核酸の少なくとも一部に対して相補的なプライマー配列を含む。
【００２１】
いくつかの実施形態では、配列リードセットにおける対応する各配列リードの第２の部分における識別子は、｛１，…，１０２４｝という集合、｛１，…，４０９６｝という集合、｛１，…，１６３８４｝という集合、｛１，…，６５５３６｝という集合、｛１，…，２６２１４４｝という集合、｛１，…，１０４８５７６｝という集合、｛１，…，４１９４３０４｝という集合、｛１，…，１６７７７２１６｝という集合、｛１，…，６７１０８８６４｝という集合または｛１，…，１×１０１２｝という集合から選択した共通の値をエンコードする。
【００２２】
いくつかの実施形態では、この識別子はＮ−ｍｅｒであり、そのＮは、｛４，…，２０｝という集合から選択した整数である。
【００２３】
いくつかの実施形態では、複数の配列リードの平均配列リード長は、４０塩基〜２００塩基または６０塩基〜１４０塩基である。
【００２４】
いくつかの実施形態では、複数の配列リードは、全体で、より大きい連続的な核酸に対するカバレッジが少なくとも１５倍であり、複数のｋ−ｍｅｒの１０パーセント超のｋ−ｍｅｒが、複数の配列リードのうちの１個超のソース配列リードに由来し、１個超のソース配列リードによって表される各ｋ−ｍｅｒに対して、そのような各ソース配列リードの識別子が保持されている。
【００２５】
いくつかの実施形態では、複数の配列リードは、全体で、より大きい連続的な核酸に対するカバレッジが少なくとも２５倍であり、複数のｋ−ｍｅｒの３０パーセント超が、複数の配列リードのうちの１個超のソース配列リードに由来し、１個超のソース配列リードによって表される各ｋ−ｍｅｒに対して、そのような各ソース配列リードの識別子が保持されている。
【００２６】
いくつかの実施形態では、複数の配列リードにおける配列リードは、より大きい連続的な核酸の７５〜１２５塩基をコードし、ｋは、５〜７３の奇数の整数である。
【００２７】
いくつかの実施形態では、複数の配列リードにおける配列リードセットは、それぞれ、同じ共通する第２の部分とともに、１００個超の配列リードを含む。
【００２８】
いくつかの実施形態では、より大きい連続的な核酸は、染色体であり、及び／または長さが、４０００万塩基対超である。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１Ａ】オーバーラップ配列リードのアラインメントの概略図を示している。
【図１Ｂ】配列リードに基づく最初のド・ブランアセンブリーグラフの一例であり、プライマリーパスの特定が示されている。
【図２】いくつかの実施形態に従って、アセンブルプロセス全体において、プライマリーパスを連結する高レベル連結マップを示している。
【図３】いくつかの実施形態による、バーコードを利用したアセンブルプロセスを概略的に示している。
【図４】いくつかの実施形態によるゲノムアセンブルプロセスを概略的に示している。
【図５】いくつかの実施形態によるアセンブルプロセスの態様を概略的に示している。
【図６Ａ】図６Ａは、本明細書に記載されているバーコード付加式配列決定方法を用いた、大腸菌配列データの新規アセンブルを示している。
【図６Ｂ】図６Ｂは、本明細書に記載されているバーコード付加式配列決定方法を用いた、大腸菌配列データの新規アセンブルを示している。
【図６Ｃ】図６Ｃは、本明細書に記載されているバーコード付加式配列決定方法を用いた、大腸菌配列データの新規アセンブルを示している。
【図６Ｄ】図６Ｄは、本明細書に記載されているバーコード付加式配列決定方法を用いた、大腸菌配列データの新規アセンブルを示している。
【図７】いくつかの実施形態による演算デバイスを示すブロック図の例である。
【図８】いくつかの実施形態による、より大きい連続的な核酸と、そのより大きい連続的な核酸の様々なフラグメントと、フラグメントの配列リードとの関係を示している。
【図９】いくつかの実施形態による、長さ３の考え得る６４個のｋ−ｍｅｒにおけるｈ（Ｗ）の考え得る値を示している。
【図１０】いくつかの実施形態に従って、ＧＡＴＣＣＡＴＣＴＴという配列から生成される、長さ３の考え得るｋ−ｍｅｒを示している。
【図１１Ａ】図１１Ａは、いくつかの実施形態による配列決定のプロセスフローを示している。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、いくつかの実施形態による配列決定のプロセスフローを示している。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、いくつかの実施形態による配列決定のプロセスフローを示している。
【図１１Ｄ】図１１Ｄは、いくつかの実施形態による配列決定のプロセスフローを示している。
【図１１Ｅ】図１１Ｅは、いくつかの実施形態による配列決定のプロセスフローを示している。
【図１２Ａ】図１２Ａは、いくつかの実施形態に従って、複数の配列リードを得る方法を示しており、その複数の配列リードが、複数の配列リードセットを構成し、１つの配列リードセット内の対応する各配列リードが、（ｉ）より大きい連続的な核酸のサブセットに対応する第１の部分と、（ｉｉ）より大きい連続的な核酸の配列から独立しているとともに、複数の分画のうち、その対応する配列リードが形成された１つの分画を特定する識別子を形成する共通の第２の部分とを含む。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、いくつかの実施形態に従って、複数の配列リードを得る方法を示しており、その複数の配列リードが、複数の配列リードセットを構成し、１つの配列リードセット内の対応する各配列リードが、（ｉ）より大きい連続的な核酸のサブセットに対応する第１の部分と、（ｉｉ）より大きい連続的な核酸の配列から独立しているとともに、複数の分画のうち、その対応する配列リードが形成された１つの分画を特定する識別子を形成する共通の第２の部分とを含む。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、いくつかの実施形態に従って、複数の配列リードを得る方法を示しており、その複数の配列リードが、複数の配列リードセットを構成し、１つの配列リードセット内の対応する各配列リードが、（ｉ）より大きい連続的な核酸のサブセットに対応する第１の部分と、（ｉｉ）より大きい連続的な核酸の配列から独立しているとともに、複数の分画のうち、その対応する配列リードが形成された１つの分画を特定する識別子を形成する共通の第２の部分とを含む。
【図１２Ｄ】図１２Ｄは、いくつかの実施形態に従って、複数の配列リードを得る方法を示しており、その複数の配列リードが、複数の配列リードセットを構成し、１つの配列リードセット内の対応する各配列リードが、（ｉ）より大きい連続的な核酸のサブセットに対応する第１の部分と、（ｉｉ）より大きい連続的な核酸の配列から独立しているとともに、複数の分画のうち、その対応する配列リードが形成された１つの分画を特定する識別子を形成する共通の第２の部分とを含む。
【図１２Ｅ】図１２Ｅは、いくつかの実施形態に従って、複数の配列リードを得る方法を示しており、その複数の配列リードが、複数の配列リードセットを構成し、１つの配列リードセット内の対応する各配列リードが、（ｉ）より大きい連続的な核酸のサブセットに対応する第１の部分と、（ｉｉ）より大きい連続的な核酸の配列から独立しているとともに、複数の分画のうち、その対応する配列リードが形成された１つの分画を特定する識別子を形成する共通の第２の部分とを含む。
【図１２Ｆ】図１２Ｆは全体で、いくつかの実施形態に従って、複数の配列リードを得る方法を示しており、その複数の配列リードが、複数の配列リードセットを構成し、１つの配列リードセット内の対応する各配列リードが、（ｉ）より大きい連続的な核酸のサブセットに対応する第１の部分と、（ｉｉ）より大きい連続的な核酸の配列から独立しているとともに、複数の分画のうち、その対応する配列リードが形成された１つの分画を特定する識別子を形成する共通の第２の部分とを含む。
【図１２Ｇ】図１２Ｇは、いくつかの実施形態に従って、複数の配列リードを得る方法を示しており、その複数の配列リードが、複数の配列リードセットを構成し、１つの配列リードセット内の対応する各配列リードが、（ｉ）より大きい連続的な核酸のサブセットに対応する第１の部分と、（ｉｉ）より大きい連続的な核酸の配列から独立しているとともに、複数の分画のうち、その対応する配列リードが形成された１つの分画を特定する識別子を形成する共通の第２の部分とを含む。
【図１２Ｈ】図１２Ｈは、いくつかの実施形態に従って、複数の配列リードを得る方法を示しており、その複数の配列リードが、複数の配列リードセットを構成し、１つの配列リードセット内の対応する各配列リードが、（ｉ）より大きい連続的な核酸のサブセットに対応する第１の部分と、（ｉｉ）より大きい連続的な核酸の配列から独立しているとともに、複数の分画のうち、その対応する配列リードが形成された１つの分画を特定する識別子を形成する共通の第２の部分とを含む。
【図１３】いくつかの実施形態に従って、複数の配列リードを得て、それらを併せてプールする方法を示している。
【図１４】いくつかの実施形態によるド・ブラングラフを示している
【図１５】いくつかの実施形態による別のド・ブラングラフを示している。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本開示の全体を通じて、同様の参照番号は、対応する部分を指す。
【００３１】
本開示は概して、遺伝子配列データの解析で用いる方法、プロセス、ならびに、特には、コンピューターによって実施されるプロセス及び非一時的なコンピュータープログラム製品を提供する。本明細書に記載されているこのプロセス及び製品は、より短い核酸配列データを、連結されたより長い、好ましくは連続的な遺伝子コンストラクト（より大きいコンティグ、染色体及び全ゲノムを含む）にアセンブルするのに特に有用である。
【００３２】
以下の図面と詳細な説明を参照すれば、本発明、ならびに様々な具体的な態様及び実施形態が分かるであろう。図面と下記の詳細な説明の一部においては、本発明について、コンピューターシステムのように、ロジック処理デバイス上で動作するシステムの重要な独立した実施形態の観点で説明されている。これは、本発明を限定するものと解釈すべきではなく、本発明は、本明細書に示されている教示を用いて、共働するいずれの数のロジックプロセッサー（実験機器もしくは診断機器に組み込まれているか、または実験機器もしくは診断機器と機能的に連通しているスタンドアロン型コンピューターシステム、計器システム、またはその他の情報有効化デバイスもしくはロジック構成部分に組み込まれているかは問わない）にも適用できる。明確にするために、本考察は、具体例の観点におけるデバイス、方法及び概念に対するものである。しかしながら、本発明及びその態様は、様々なタイプのデバイス及びシステムへ適用される場合がある。したがって、添付の請求項に示されている場合を除き、本発明は限定されないように意図されている。
【００３３】
さらに、本明細書に記載されているようなロジックシステム及び方法は、モジュラー様式で様々な構成部分及び機能を含むことができるのは、当該技術分野において周知である。本発明の様々な実施形態は、様々な組み合わせの要素と機能を含むことができるとともに、各種要素の部分として、各種機能をグループ化してもよい。明確にするために、本発明については、多くの異なる革新的な構成部分と、革新的な構成部分と既知の構成部分とを革新的に組み合わせたものを含むシステムの観点で説明されている。本発明が、本明細書におけるいずれの例示的な実施形態に列挙されている全ての革新的な構成部分を含む組み合わせにも限定されると推測すべきではない。本明細書の教示から分かるように、コンピューターまたはその他のロジック処理システムもしくは回路に実装される、本発明の機能的態様は、いずれの適切な実装環境、またはプログラミング言語（Ｃ、Ｃ＋＋、Ｃｏｂｏｌ、Ｐａｓｃａｌ、Ｊａｖａ、Ｊａｖａスクリプト、ＨＴＭＬ、ＸＭＬ、ｄＨＴＭＬ、アセンブリーもしくはマシンコードプログラミング、ＲＴＬ、Ｐｙｔｈｏｎなど）を用いて実装または達成してもよい。本明細書に引用されている全ての参照文献、文献、特許及び特許出願は、あらゆる目的のために、参照により、その全体が本明細書に援用される。
【００３４】
Ｉ．概要
概して、核酸配列情報を、更に長く伸びた連続的な配列にアセンブルすることには、典型的に、異なるリードにおけるオーバーラップ配列を特定することと、それらのオーバーラップ配列を用いて、それらの配列を互いに対してマッピングすることが伴う。ゲノム配列は非常に大きいので、オーバーラップ配列の特定によってのみ、２つの配列間の連結が推測可能になる。配列全体の所与領域におけるオーバーラップ配列の数が多いほど、例えばカバレッジがより大きいほど、この推測は実質的に強固になる。
【００３５】
いくつかの実施形態では、配列を参照配列に対してマッピングすると、この推測を更に強固にできる。具体的には、多くの生物では、参照配列、例えば、ある１つの個体のゲノムの完全配列もしくはほぼ完全な配列、または多数の個体から得た、その生物のゲノムのコンセンサスであって、その生物のゲノム配列の概ねの骨格をもたらすコンセンサスが解明されている。そこで、概して、特定された配列連結の確信度を上昇させるとともに、異なる配列セグメントを、より大きいゲノムコンテクストに入れるために、ＤＮＡを配列決定しているその所与の生物の参照配列に対して、オーバーラップ配列群をマッピングできる。しかしながら、本開示のいくつかの実施形態では、参照配列は用いない。
【００３６】
より大きい配列全体をアセンブルする際には、その配列内の区域のうち、情報が不十分である区域（例えば、カバレッジが不十分、参照配列に明らかにマッチしている部分が不足しているなど）により、推測された配列全体に、途切れた部分が生じることがある。これらの途切れた部分により、ばらばらの連続的な配列セグメント（すなわちコンティグ）がいくつか生じ、これらのセグメント（すなわちコンティグ）には、連結して最終的に１つの連続的な配列にする前に、かなりの追加の処理が必要になることがある。これらの課題は、参照配列が入手可能である場合の配列決定プロセスでも重大であるが、新規配列アセンブルでは、更に重大である。定義上は、新規アセンブルには、参照配列に由来する配列連結の二次レベルの確認という利点はない。その代わりに、これらの配列をボトムアップ、例えば新規でアセンブルしなければならない。
【００３７】
例となるプロセスでは、様々な配列決定プロセスのいずれかから、短い配列リード群を得る。それらの配列リードは任意に、更なる評価に備えて、適切なデータ構造で保存される。コンピューターアルゴリズムによって、それらの配列を解析して、異なる配列リードのサブセット間で、共通の配列セグメント（ｋ−ｍｅｒ）を特定する。ｋ−ｍｅｒ配列の特定は典型的には、所望の長さのｋ−ｍｅｒ配列の重複またはカバレッジのレベルに基づいており、この長さは概して、配列決定対象のゲノムの複雑性、配列決定カバレッジの深さ及び様々なタイプのエラーに対する許容度に左右され得る。多くの場合、ｋ−ｍｅｒ長は、約７〜約３１塩基長または約１５〜約２５塩基長のいずれかとなるように選択してよい。例えば、解析対象の配列の複雑性などに応じて、配列集合データベースにおいて、所与のｋ−ｍｅｒの出現が、３回、４回、５回、１０回、２０回、またはそれ以上の回数未満に過ぎない場合には、有意に使用するには、カバレッジが不十分とみなされ得る。
【００３８】
続いて、特定されたｋ−ｍｅｒ配列を含む配列フラグメントを、配列間のオーバーラップ配列に沿ってアラインメントする。続いて、それらのオーバーラップ配列において、追加のｋ−ｍｅｒ配列を１つ又は複数特定して、追加の配列セグメントの集合を取りまとめて、このｋ−ｍｅｒからオーバーラップｋ−ｍｅｒまで伸長して完全コンティグ配列を作成する追加のアセンブリーアルゴリズムを用いて、例えばド・ブラングラフアセンブラー（Ｖｅｌｖｅｔ、Ｅｕｌｅｒなど）を用いて、最初のアセンブリーグラフにおいて連続的な配列を伸長してよい。具体的には、第１のｋ−ｍｅｒ配列を有する第１のリードセットを、繰り返されるアラインメント作業用のアンカーとして用いてよく、このアラインメント作業では、第１のセットの１つ以上の要素と共通する第２のｋ−ｍｅｒ配列を用いて、推定配列を伸長する。すなわち、第１の短い配列セットと第２の短い配列セットとの連結を確立する。明らかに配列を伸長できる限りは、この作業を繰り返す。
【００３９】
しかしながら、ゲノム試料では、ｋ−ｍｅｒ配列は、配列全体の多数の異なる部分に共通している場合があり、その結果、次のｋ−ｍｅｒ配列の特定の際、２つ以上の異なる配列リードセットが、所与の配列の伸長部として関係付けられる可能性があり、これらの２つの配列は、実際には関連しておらず、例えば、それらの配列の１つ以上は、所与の配列の正確な伸長部ではない。この結果、配列間の推測される連結部に分岐が発生し、例えば、２つ以上の配列のうちの１つが、この分岐点で連続的な配列を構成し得る。推測される最大の非分岐配列は概して、「プライマリーパス」という。１つのショートリード配列データセットに対して、多数のプライマリーパスが特定される。続いて、他のプロセスを通じて、例えば、ペアエンド配列データ、オーバーレイロングリード配列データなどを用いて、異なるプライマリーパスを相互に連結してよい。
【００４０】
図１Ａ及び１Ｂは、上記の新規アセンブルプロセスの概略図を示している。図示されているように、含まれるｋ−ｍｅｒ配列であって、カバレッジが低い他のｋ−ｍｅｒ、例えば、アラインメント内のｋ−ｍｅｒ１２０及びｋ−ｍｅｒ１２２と比べて、カバレッジレベルが十分に高いｋ−ｍｅｒ配列、例えば、ｋ−ｍｅｒ１０４、１０６及び１０８に従って、配列フラグメント１０２をアラインメントする。例えば、いくつかの場合では、カバレッジが少なくとも３〜４倍であるｋ−ｍｅｒをアラインメントに用いることになる。８塩基長に過ぎないｋ−ｍｅｒとして図示されているが、これは、図示しやすくするためであり、実際のｋ−ｍｅｒ長は様々であってよく、より長くてもよく、例えば、１０ｍｅｒ以上、２０ｍｅｒ以上、３０ｍｅｒ以上、４０ｍｅｒ以上、５０ｍｅｒ以上、６０ｍｅｒ以上、７０ｍｅｒ以上、８０ｍｅｒ以上、９０ｍｅｒ以上、１００ｍｅｒ以上であってよい。
【００４１】
一連のオーバーラップｋ−ｍｅｒ配列、例えば、ｋ−ｍｅｒ１０４及び１０６を特定して、オーバーラップフラグメント群に沿って進めて、更に長い連続的な配列をアセンブルする。図１Ｂに示されているように、所与のステップによって、２つ以上のオーバーラップｋ−ｍｅｒ、例えば、ｋ−ｍｅｒ１１０及び１１２が導かれる場合、連続的な配列内に分岐点１１４が作られる。図１Ｂの要素１１６は、連続的な配列内の別の区切り点を示している。これらの２つの分岐点の間の未分岐配列伸長部は、プライマリーパス１１８として定義する。比較的短いプライマリーパスが図示されているが、当然ながら、概して、もっと長いプライマリーパス、例えば、長さが５００塩基、１ｋｂ、２ｋｂ、５ｋｂまたはそれ以上の長さのプライマリーパスが生成される。
【００４２】
続いて、シードプライマリーパスをデータから特定する。シードプライマリーパス（シードパスともいう）は、典型的には、ゲノムまたはその他のより大きい試料核酸内でコピー数が小さい（例えば、１に近い数である）可能性が高いプライマリーパスを表す。このコピー数は、プライマリーパス内の配列の長さ、もしくはプライマリーパスの総リードカバレッジ、またはこれらの両方から推測してよい。続いて、各シードパスから、そのシードパスと明らかにオーバーラップする部分を通じてか、または他の連結情報、例えば、長いリード配列決定データ、もしくは２つのプライマリーパスをブリッジできるペアエンド配列リード（例えば、一方の末端は、１つのプライマリーパス内に現れており、もう一方の末端は、別のプライマリーパス内に現れている）を用いることによるかのいずれかによって、隣接するかまたは連結されるプライマリーパスを特定する。２つのプライマリーパス間の連結は、例えば介在配列の配列決定を通じて、明白に決定してよく、または、推測された構造的連結であってもよく、この場合、例えばペアエンド配列リードから、２つのプライマリーパスの相対的な位置と連結部が推測される。
【００４３】
これは図２に示されており、図２は、いくつかの別々のプライマリーパス２０２〜２１０を概略的に示しており、図では、それらのプライマリーパス間で、構造的連結部（連結部２１２として示されている）が定められている。図示されているように、いくつかの場合では、連結部を定めることができない。
【００４４】
続いて、アセンブルした最長の連続的配列セグメントを取りまとめる（図２には、コンティグ２１６及び２１８として示されている）。典型的には、続いて、例えば、手間のかかるサンガー配列決定又はその他の長いリード配列決定プロセス、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＳＭＲＴ（登録商標）配列決定を用いる長いゲノムのフィニッシングプロセスを利用して、配列全体における残りのギャップ、例えば、コンティグ２０６及び２０８間のギャップを埋める。
【００４５】
上記の例から明らかなように、完成した合理的なゲノム、または所与のゲノムに対する合理的な数のコンティグを単にアセンブルすることには、複数の多様な配列決定プロセス、例えば、高スループットショートリードショットガン配列決定、ペアエンドロングフラグメント配列決定及び／または低スループットロングリードＤＮＡ配列決定プロセスが伴い得る。これらのプロセスはそれぞれ、多大な費用と時間を要し得る。
【００４６】
しかしながら、本明細書に記載されているように、改良された配列決定及びアセンブルプロセスによって、効率性が向上した、より少ない配列決定プロセス、または更には１つの配列決定プロセスから、大幅に更に完全度の高いアセンブリーを得られるようになる。具体的には、本明細書に記載されているプロセスによれば、構造的に関連付けられるオリゴヌクレオチドであって、例えばショートリード配列決定技法を用いて配列決定できるオリゴヌクレオチドに、アセンブルプロセスにおいて、異なる配列セグメント間及び／または異なるプライマリーパス間の連結部を推測するために、アセンブルプロセスにおいて使用できる共有固有識別子、例えばバーコードを付加する。
【００４７】
ＩＩ．関連付けられるリードの配列決定
構造的に関連付けられる短い配列及び得られた配列リードへのバーコード付加は、いくつかの方法によって行ってよい。例示的なプロセスは、例えば、２０１４年２月７日に提出された米国特許仮出願第６１／９４０，３１８号、２０１４年５月９日に提出された米国特許仮出願第６１／９９１，０１８号、２０１４年６月２６日に提出された米国特許出願第１４／３１６，３８３号及び２０１４年２月７日に提出された米国特許出願第１４／１７５，９３５号に詳細に記載されており、これらの特許の開示内容は全て、参照により、その全体が本明細書に援用される。
【００４８】
簡潔に述べると、１つ以上の大きい核酸配列、例えば、ゲノム、染色体またはそれらのフラグメントから、バーコード配列が組み込まれた配列決定ライブラリーを用意する。その大きい試料核酸（１つまたは複数）は、典型的には長さが約１〜約１００ｋｂ以上の程度となる第１のフラグメントに分割する。続いて、これらの長い第１のフラグメントを別個の反応容量に分割する。これらの反応容量は、多種多様の種類の反応容器のいずれか、例えば、チューブ、ウェル、マイクロウェル、ナノウェルなどであってよく、好ましい態様では、反応容量（分画ともいう）は、エマルジョン中の水滴、例えば、油中水型エマルジョン）で構成されている。
【００４９】
この分割は、いずれの分画にも、最大で、第１のフラグメントが１つだけ含まれるように行ってもよい。しかしながら、そのようなプロセスでは、スループットが低下し、コストが高くなる傾向がある。大半の分画が空のままである場合、分画の利用効率が悪くなるからである。したがって、好ましい態様では、個々の分画に第１のフラグメントが複数含まれるが、所与の分画内に第１のフラグメントが複数存在できる一方で、そのようなフラグメントが、構造的に固有となる、例えば、より大きい試料核酸の構造的に別個かつ異なる領域を表す可能性が高くなる条件で、分割を行う。典型的には、これは、試料核酸のサイズと、第１のフラグメントのサイズと、反応容量とに基づき、構造的に固有の第１のフラグメントが、それぞれ別々の反応容量に統計的に割り当てられる濃度で、第１のフラグメントを供給することによって実現される。具体的には、そのような分割では、分画の１０％未満が、構造的に関連付けられる別々の第１のフラグメント（オーバーラップし、オーバーラップしていないが、直接隣接しているか、または０．１〜５ｋｂ内で隣接している）を有し、１つの所与の分画内の第１のフラグメントの５％未満が構造的に関連付けられ、１つの所与の分画内の第１のフラグメントの１％が構造的に関連付けられ、かつ、いくつかの場合では、所与の分画内の第１のフラグメントの０．５％、０．２％、または更には０．１％未満が構造的に関連付けられる。
【００５０】
１つの所与の分画内には、第１のフラグメントと併せて、例えば、同じ水滴内で、共通のバーコード配列を含むオリゴヌクレオチド群を分割する。そのオリゴヌクレオチド群は、それぞれ異なる分画によって、含まれるバーコード配列が異なるように、様々なバーコード配列の膨大かつ多様なライブラリーから取得する。好ましい態様では、バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドは、ビーズまたはマイクロカプセルに解放可能に結合した状態で個々の分画に入れ、その際、所与のビーズに結合したオリゴヌクレオチドに含まれるバーコード配列はいずれも、実質的に同じである。さらに、各ビーズは典型的に、個々のオリゴヌクレオチド分子を１００，０００個超、１，０００，０００個超、１０，０００，０００個超、及び多くの場合、５０，０００，０００個超含むことになる。これらのオリゴヌクレオチドは、１０００個超、１０，０００個超、１００，０００個超、５００，０００個超、１００万個超または更には２００万個超の異なるバーコード配列を含むバーコードライブラリーから得てよい。
【００５１】
好ましい態様では、これらのオリゴヌクレオチドは、機能配列、例えば、増幅プライマー配列（特定の配列、ユニバーサルプライミング配列もしくはランダムプライミング配列を標的としてよい）、プライマーアニーリング部位、配列決定プライマー配列、またはプライマーアニーリング部位なども含む。好ましい場合では、上記のオリゴヌクレオチド内の機能配列の少なくとも１つとして、ユニバーサルまたはランダムプライマー配列が含まれている。上記及びその他の機能配列は、例えば、２０１４年２月７日に提出された米国特許仮出願第６１／９４０，３１８号、２０１４年５月９日に提出された米国特許仮出願第６１／９９１，０１８号、２０１４年６月２６日に提出された米国特許出願第１４／３１６，３８３号、及び２０１４年２月７日に提出された米国特許出願第１４／１７５，９３５号に記載されており、これらの開示内容全体は、参照により、その全体が本明細書に援用される。
【００５２】
続いて、第１のフラグメントのオーバーラップフラグメントを構成する配列決定可能な、より短い第２のフラグメント群を反応容量内で生成させ、この第２の短いフラグメントは、共通のバーコード配列セグメントを含む。例示的なプロセスの１つでは、この生成は、バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドをビーズから分画内に解放することによって行う。オリゴヌクレオチドの解放は、オリゴヌクレオチドをビーズから解放するための様々な機構、例えば、熱による切断、化学的な切断または光による切断を用いて行ってよいが、多くの場合、この解放は、オリゴヌクレオチドとビーズとの間の連結を切断するか、もしくはビーズを分解して、オリゴヌクレオチドが解放されるようにするか、またはこの両方を行う化学的切断剤を、併合分割ステップの最中に分画に導入することによって行うことになる。
【００５３】
また、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ酵素、ヌクレオシド三リン酸、２価の金属イオン、例えばＭｎ２＋またはＭｇ２＋を含め、第１のフラグメントの様々な部分の増幅を行うための試薬も、第１のフラグメント及びオリゴヌクレオチドと併せて分割する。続いて、例えばユニバーサルまたはランダムプライマー配列を複製用のプライマーとして含むオリゴヌクレオチドを用いて、所与の分画内の第１のフラグメントの一部を複製して、第１のフラグメントの様々な部分をプライム及び複製するようにする。いくつかの場合では、これらの第１の複製フラグメントをオリゴヌクレオチドによって更にプライムして、複製してよい。これらの複製の結果、所与の分画内の第１のフラグメントのオーバーラップフラグメント群を作成し、それらのフラグメントはそれぞれ、その分画で共通のバーコード配列を含む。
【００５４】
別の分画においては、同様の方法で、別の第１のフラグメントから、別の第２のフラグメントを生成し、これらの第２のフラグメントには、別のバーコード配列を付加する。続いて、異なる分画群をに渡って、大規模な配列決定ライブラリーを作成し、そこでは、そのライブラリーの要素のうち、同じ分画内で作成した要素、すなわち、同じ第１のフラグメントから抽出できる要素は、同じバーコード配列を含むことになる。
【００５５】
続いて、これらの異なる分画（配列決定ライブラリーを表す）をプールし、それらに含まれるフラグメントの配列決定を行って、付加されたバーコード配列とともに、短い第２のフラグメント配列を特定する。所与の第１のフラグメントから得た第２のフラグメントは、共通のバーコード配列を含むので、そのバーコード配列が所与のリードまたはリードセットに存在することにより、連結に関する更なる推測が得られ、この推測は、アセンブルプロセス全体で適用できる。
【００５６】
ＩＩＩ．アセンブルへの適用
Ａ．概要
上記のように、短い配列リードを、連結された更に長い連続的な配列にアセンブルする際には、いくつかのパラメーターを用いる。これらのパラメーターとしては、配列リードの間及び中に、オーバーラップ配列セグメントが存在すること（それらの配列リードが、より大きい配列コンテクストのオーバーラップセグメントを表しているという推測をもたらす）が挙げられる。短い配列を連結して更に長くする能力、所与の核酸に由来するより大きい配列フラグメント間の連結を推測する能力、例えば、より大きい分子のため、コンティグの数を減少させるか、またはさらには１つに統合された配列を得る能力は、ある程度は、対象の核酸全体に対する配列決定カバレッジのレベルと均一性に左右されることになり、配列決定カバレッジのレベルが低い領域により、コンティグ間にギャップが生じ得る。その結果、更にカバレッジが低い区域を有する配列決定プロセスでは、更に途切れた配列データ、例えば大量のコンティグが得られることが多い。カバレッジ不足の一部は、総当たりによって、例えば、ゲノムを更に深層まで配列決定することによって、解消することができるが、その解消法は、配列決定プロセスコストの点で、潜在的に多大なコストを伴う。しかしながら、多くの場合、カバレッジ不足は体系的なものであり、例えば、部分的には、配列そのものに起因する。
【００５７】
これに対して、本明細書に記載されているように、バーコードを付加した配列決定ライブラリーのアセンブルでは、短い配列リードレベルでも、更に高レベルのアセンブルでも、必然的にカバレッジを大きく向上させたり、または補助的な追加の配列決定プロセスを用いたりする必要なしに、優れた連結情報を得ることができる。
【００５８】
具体的には、短い配列リードの典型的なアセンブルプロセスにおいて、オーバーラップ配列セグメントを含む短い配列リードを互いにアラインメントして、より大きい連続的な配列コンテクスト、すなわちコンティグをもたらす。続いて、これらのコンティグは、他のコンティグと新規で、または参照配列に対してマッピングすることによって、更にアセンブルに供してよい。しかしながら、これらの配列リードは非常に短く（例えば１００〜２００塩基長）、数１００万〜数１０億塩基のゲノムを考えると、いずれかの所与のリードがゲノム内の１つの遺伝子座に一意的にマッピングされる可能性は比較的低く、これにより、アセンブルプロセスにおいて、かなりの曖昧さが生じ得る。この曖昧さは、多数のオーバーラップフラグメントを配列決定して、所与の遺伝子座において、配列決定カバレッジを向上させることによって小さくし得る。しかしながら、それでも、いずれのアセンブルプロセスでも、カバレッジの低いゲノム区域により問題が生じ、コンティグ間にギャップが残る場合が多い。カバレッジの低い区域は、本明細書の他の段落に記載されているような他の方法、例えばロングリード配列決定によってブリッジしてよいが、このような方法は、プロセスのコストと非効率度を増大させる。
【００５９】
しかしながら、本明細書に記載されている方法においては、それほどより大きい配列決定カバレッジを必要とすることなく、２つ以上の配列リード間の構造的関係の追加の推測をもたらすバーコード配列を短いリード配列に付加する。具体的には、他の配列とのオーバーラップ配列と、共通のバーコード配列が含まれていることとの両方に基づき、アラインメントした短いリード配列を、アラインメントしたコンティグに割り当てることができる。対応付けられた共通のバーコード配列の追加の構造的連結情報を用いることにより、更に長いコンティグが特定される。
【００６０】
同様に、２つのコンティグ間をブリッジする作業も、バーコード配列の存在によって更に支援することができる。例えば、隣接し合う特定済みコンティグが、オーバーラップバーコード配列を共有する配列リードを含むが、その他の部分では、オーバーラップしていないか、またはアラインメントするにはオーバーラップが不十分である場合、これらの２つのコンティグ間の構造的連結を推測してよい。簡潔に述べると、２つの配列リードに含まれていることにより、その２つのリードが、１つの分画内に作成されたフラグメントから生成されたものであるという十分に強固な推測が得られる。追加の連結情報、例えば、その配列リードの２つ以上のコンティグへのアラインメント、または、２つのバーコードが、同じ２つのコンティグをまたいでいることと組み合わさったときに、これらの２つのコンティグを連結する有意な指標となる。
【００６１】
コンピューターによって実施される例示的なプロセスという観点では、対応付けられたバーコード配列を含む短いリード配列群は、データ構造内に供給する。これらの配列内のオーバーラップ配列に基づき、更には、それらの配列が同じバーコード配列に対応付けられていることに基づき、配列サブセットを互いにアラインメントする。同じバーコード配列を含まないアラインメント可能な配列、または同じバーコード配列を含むが、アラインメント不能な配列は含めず、別の配列サブセットに対してアラインメントしてよい。共通のバーコードが付加されているアラインメント済み配列セットに基づき、直鎖状の連続的な配列、すなわちコンティグを生成する。複数の様々な配列サブセットでこれを繰り返して、複数の様々なコンティグをもたらす。理解されるように、低い配列決定カバレッジに基づいているにもかかわらず、それらのコンティグは、配列アラインメントのみに基づいて得られるものよりも長くなることができ、または、高いレベルの確信度を得ることができる。
【００６２】
続いて、全ゲノム（またはその他のゲノム成分）配列に対する足場を確立するために、生成されたコンティグを更に処理して、相互に対する相対的な向きとゲノムコンテクストをもたらす。いくつかの場合では、これは、別個のコンティグを参照配列に対してマッピングすることを通じて達成され得る。しかしながら、多くの場合、例えば、ゲノム内に複数の重複配列領域が存在することにより、または好適な参照配列が存在しないことにより、参照に対するマッピングは、曖昧となり得る。
【００６３】
そのような場合では、バーコードを付加された配列を更に用いて、コンティグ間の連結情報をもたらしてよい。例えば、上述のように、いくつかの場合では、第１の配列サブセットにアラインメントされるが、共通の第１のバーコード配列を共有していない（例えば、第２のバーコード配列を含む）配列は、第１のコンティグの生成には用いない。しかしながら、そのような配列は、第２のコンティグの生成においてアラインメントしてよい。同様に、第１のバーコードを含むが、第２のコンティグ配列にアラインメントされる配列は、第２のコンティグの生成には使用されなかった可能性がある。しかしながら、データ構造内にこのような配列が存在することにより、第１のコンティングと第２のコンティグ間の連結を確認できる。このプロセスにおいては、コンティグの連結は、異なるコンティグにアラインメントされる配列間に、閾値レベルの共有バーコードが存在することに基づき、及び／または第１のコンティグにアラインメントされるが、第２のコンティグに対応付けられたバーコードを含む閾値レベルの配列が存在することに基づき、特定してよい。本明細書で使用する場合、このような閾値レベルとしては、１つの配列、２つ以上の配列、３つ以上の配列、４つ以上の配列、５つ以上の配列、１０個以上の配列または２０個以上の配列を挙げてよい。
【００６４】
Ｂ．新規アセンブルプロセスへの適用
バーコードが付加された上記の配列決定ライブラリーには、特に新規アセンブルにおいて利点がある。具体的には、上述のように、２つの配列リードに、共通のバーコードが存在することにより、それらの２つの配列間の構造的連結を推測できる。それらの配列が同じ分画において、同じ第１のフラグメントから作られた可能性が高くなるからである。同じバーコード配列は、他の分画、及び構造的に無関係の第１のフラグメントのフラグメントにも存在し得るので、上記の推測は確定的ではないが、構造的関係に関する他の指標、例えばオーバーラップ配列を組み合わせると、構造的連結の推測が強固となる。例として、上記のアセンブルプロセスを参照して、図３には、バーコードを付加された配列がアセンブルプロセスに及ぼす潜在的な影響が概略的に示されている。
【００６５】
一態様では、配列の高レベルスキャフォールディング（例えば、確信度の高いプライマリーパス足場をもたらす作業）を実現するために、配列リードに含まれるバーコードを用いて、最初のアセンブリーにおけるパスの間及び中の構造的関係を得てよく、上記のスキャフォールディングでは、プライマリーパス、好ましくは確信度の高いプライマリーパスの相対的順序を特定し、マッピングし、それに対して、最終的なゲノムアセンブリーをマッピングしてよい。理解されるように、確信度の高いプライマリーパスとは概して、その長さと複雑性に基づき、ゲノム内で重複しているか、または多数重複している可能性が低いと予測されるプライマリーパスを指し、そのプライマリーパスに連結する配列またはプライマリーパスが実際に、重複配列を有するプライマリーパスに連結されるのではなく、ゲノムにおいて連結されている確信度レベルを高くできる。好ましい態様では、確信度の高いプライマリーパスは、該当ゲノムにおける予測コピー数が１に近い（例えば２未満または約１である）プライマリーパスである。
【００６６】
簡潔に述べると、確信度の高いプライマリーパス（本明細書においては、「コピー数が１」のパス、「低コピー数の」パスまたは「ＣＮ１」パスともいう）を含むプライマリーパスセットは、上記のような最初のアセンブリーグラフから特定する。所与のプライマリーパスに含まれる各配列リードは、上記のように、対応付けられたバーコード配列を含む。続いて、各プライマリーパスに対応付けられたバーコードのリストを、それぞれのプライマリーパスに関して生成する。対応付けられたバーコード配列を用いて、隣接し合うＣＮ１プライマリーパス間に、共通のバーコード配列を共有するそれらのプライマリーパス（両方ともＣＮ１パスまたはその他）を用いて、最初の配列パスをプロットしてよい。続いて、そのパスを、次の隣接するＣＮ１パスまで伸長し、ＣＮ１パスの、互いに対する順序を明らかにする。理解されるように、多くの場合、配列決定プロセス全体において、重複バーコード配列が存在するとともに、より大きい核酸、例えば染色体フラグメントまたはゲノムフラグメントの構造的に別個の部分に結合されることがある。しかしながら、アセンブルプロセスは、低コピー数のパスすなわちＣＮ１パスに焦点を当て、非常に多様なバーコードライブラリー（例えば、１０００個超、５０００個超、１０，０００個超、１００，０００個超または更には１００万個超の異なるバーコード配列）を使用し、非常により大きい遺伝的試料を扱っているので、同じバーコード配列が、ゲノムまたはゲノムフラグメントの構造的別個の、例えば、構造的に関連付けられない部分に由来する類似配列またはオーバーラップ配列に結合している可能性は、極めて低い（例えば、多くの場合、０．０００１％未満）と予想される。
【００６７】
ＣＮ１パスの全ての順序が確立されるまで、この連結プロセスをＣＮ１パスの間で繰り返す。続いて、パス間の配列のアセンブルを完了させるための足場として、これらのＣＮ１パスを用いてよい。この作業は概して、ＣＮ１パスに共通するバーコードを含む配列リードを用いることによって、同様の方式で行って、隣接し合うＣＮ１パス間のローカルな配列アセンブルグラフを作成する。
【００６８】
具体的には、最初のアセンブリーグラフをアセンブルするための上記の方式と同じ方式で、所与のプライマリーパスと同じバーコード配列を含む配列リードを用いて、足場内の２つの隣接し合うプライマリーパス間のローカルな配列アセンブルグラフをつなぎ合わせる。このアセンブリーマップによって、２つのプライマリーパス間のスペースに対する配列を得ることができ、配列ギャップが埋まる。ｋ−ｍｅｒ内のオーバーラップ配列データに加えて、ｋ−ｍｅｒが存在する各配列に対応付けられたバーコード情報を用いることによって、２つのプライマリーパス間に延びる配列を明白に特定することができる。これは、図３に概略的に示されている。図示されているように、一連のｋ−ｍｅｒ配列３０２〜３１６は、組み込まれたバーコード配列３１８、例えば、バーコード配列「１」、バーコード配列「２」またはバーコード配列「ｎ」と、各ｋ−ｍｅｒが連結していることを除いて、図１Ａのグローバルアセンブリーグラフにおいて概略的に示されているものと同様である。最初のアセンブリーグラフにおけるように、１つまたは複数の所与の位置に、枝分かれのｋ−ｍｅｒ配列が存在することにより、配列内に分岐点、例えば分岐点３２０及び３２２が発生し得る。しかしながら、各ｋ−ｍｅｒ配列に対応付けられたバーコード情報を部分的に利用することによって、分岐点を排除して、正確な配列パスを効果的に特定することができる。具体的には、分岐点３２２を参照すると、ｋ−ｍｅｒ３１４及び３１６の両方が、考え得る続きの配列ステップであるが、ｋ−ｍｅｒ３１４に対応付けられたパスのみが、共通のバーコード「１」を含むので、次に続く配列ステップとして、ｋ−ｍｅｒ３１４が特定される。
【００６９】
Ｃ．例示的な実施形態
図７は、いくつかの実施態様による配列決定システム１００を示すブロック図である。いくつかの実施態様におけるこのデバイス１００は、１つ以上の処理ユニットＣＰＵ７０２（プロセッサーともいう）と、１つ以上のネットワークインターフェース７０４と、ユーザーインターフェース７０６と、メモリー７１２と、これらの構成部分を相互接続する１つ以上のコミュニケーションバス７１４とを備える。このコミュニケーションバス７１４は任意に、システム構成部分間の通信を相互接続及び制御する回路（チップセットという場合もある）を備える。メモリー７１２は典型的には、高速ランダムアクセスメモリー（ＤＲＡＭ、ＳＲＡＭ、ＤＤＲ  ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、フラッシュメモリー、ＣＤ−ＲＯＭ、デジタルバーサタイルディスク（ＤＶＤ）もしくはその他の光ストレージなど）、磁気カセット、磁気テープ、磁気ディスクストレージもしくはその他の磁気ストレージデバイスデバイス、その他のランダムアクセス固体メモリーデバイス、または所望の情報を格納するのに使用できるいずれかの他の媒体を備えるとともに、任意に、不揮発性メモリー（１つ以上の磁気ディスクストレージデバイス、光ディスクストレージデバイス、フラッシュメモリーデバイスまたはその他の不揮発性固体ストレージデバイスなど）を備える。メモリー７１２は任意に、ＣＰＵ（１つまたは複数）７０２から離れて配置された１つ以上のストレージデバイスを備える。メモリー７１２、またはその代わりに、メモリー７１２内の不揮発性メモリーデバイス（１つもしくは複数）は、非一時的なコンピューター可読ストレージ媒体を含む。いくつかの実施態様では、メモリー７１２、またはその代わりに、非一時的なコンピューター可読ストレージ媒体は、下記のプログラム、モジュール及びデータ構造、またはそれらのサブセットを格納する。
・  様々な基本システムサービスを処理するとともに、ハードウェア依存タスクを実行する手順を含むオペレーティングシステム７１６
・  デバイス７００を他のデバイスまたは通信ネットワークと接続するネットワーク通信モジュール（または命令）７１８
・  配列リードを処理する配列リード処理モジュール７２０
・  生体試料から得たより大きい連続的な核酸の任意の表現７２６
・  複数の配列リード７２８（その複数の配列リードにおける対応する各配列リードは、少なくとも、より大きい連続的な核酸のサブセットに対応する第１の部分７３０と、より大きい連続的な核酸の配列から独立しているとともに、複数の分画のうち、その対応する配列リードが形成された１つの分画を特定する識別子を形成する共通の第２の部分７３２とを含む）
・  対応する各配列リード７２８について、関連する第２の部分７４４（バーコード）と、所与のｋ−ｍｅｒ長Ｌに従って、対応する配列リード７２８のハッシュによって得られるｋ−ｍｅｒとを含むハッシュテーブル７４０
【００７０】
いくつかの実施態様では、ユーザーインターフェース７０６は、ユーザーがシステム７００及びディスプレイ７０８とやりとりするための入力デバイス（例えば、キーボード、マウス、タッチパッド、トラックパッド及び／またはタッチスクリーン）７１０を含む。
【００７１】
いくつかの実施態様では、上で特定された要素の１つ以上は、上述のメモリーデバイスの１つ以上に格納されるとともに、上記の機能を実行するための命令セットに対応する。上で特定されたモジュールまたはプログラム（例えば命令セット）は、別々のソフトウェアプログラム、手順またはモジュールとして実装する必要はないので、様々な実施形態において、これらのモジュールの様々なサブセットを組み合わせても、または別段の形で再編成してもよい。いくつかの実施態様では、メモリー７１２は任意に、これらのモジュールのサブセットと、上で特定されたデータ構造とを格納する。さらに、いくつかの実施形態では、このメモリーは、上記されていない追加のモジュールとデータ構造とを格納する。
【００７２】
図７には、「配列システム７００」が示されているが、図７は、本明細書に記載されている実施態様の構造概略図としてよりも、コンピューターシステムに存在してよい様々な特徴の機能的説明として意図されている。実際には、また、当業者によって認識されるように、別々に示されている項目を組み合わせることもできるとともに、一部の項目を別々にすることもできる。
【００７３】
図８は、より大きい連続的な核酸８０２と、そのより大きい連続的な核酸の異なるフラグメント８０４と、フラグメントの配列リード７２８との関係を示している。典型的には、１〜２５０個のフラグメント８０４、５〜５００個のフラグメント８０４または１０〜１０００個のフラグメント８０４を、１つの別個の分画に分割する。いずれにしても、１つの分画内のフラグメント８０４が、いかなる顕著なオーバーラップ配列を有する可能性も低くなるように、十分に少ないフラグメント８０４を、同じ分画に分割する。各フラグメント８０４の配列リード７２８を作成する。典型的な実施形態では、自動シーケンサーで配列決定できるように、配列リード７２８の長さは短い（例えば１０００塩基未満）。１つの分画内の各配列リード７２８は、より大きい連続的な核酸８０２の配列から独立しているとともに、複数の分画のうち、その対応する配列リードが形成された分画を特定する識別子を形成する共通の第２の部分７３２を含む。
【００７４】
いくつかの実施形態では、その複数の配列リードの各配列リード７２８において、対応するｋ−ｍｅｒセットを構築する。このような実施形態では、その配列リードを含む配列リードセットの識別子（バーコード７３２）は、複数のｋ−ｍｅｒの各ｋ−ｍｅｒに対して保持されている。ｋ−ｍｅｒは、配列リードよりも短い。いくつかの実施形態では、配列リードは５０〜２５０塩基であり、ｋ−ｍｅｒのｋ値（ｋ−ｍｅｒの核酸長がｋであることを意味する）は、７〜５１である。対応する各ｋ−ｍｅｒセットは、対応する配列リードの考え得るｋ−ｍｅｒの少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセントを含む。
【００７５】
図１１は、いくつかの実施形態に従って、より大きい連続的な核酸（例えば、生体試料から得たもの）を配列決定する（１１０２）方法（１１００）を示すフローチャートである。この方法は、１つ以上のプロセッサーと、１つ以上のプロセッサーによって実行される１つ以上のプログラムを格納するメモリーとを有するコンピューターシステムで行う（１１０４）。
【００７６】
複数の配列リードの取得：開示されているシステムと方法に従って、複数の配列リード７２８を得る（１１０６）。その複数の配列リードは、複数の配列リードセットを構成する。１つの配列リードセットにおける対応する各配列リード７２８は、より大きい連続的な核酸のサブセットに対応する第１の部分（１３０）と、より大きい連続的な核酸の配列から独立しているとともに、複数の分画のうち、その対応する配列リードが形成された１つの分画を特定する識別子を形成する共通の第２の部分（７３２）とを含む。換言すると、この識別子は、より大きい連続的な核酸の配列決定データに由来しないか、またはより大きい連続的な核酸の配列決定データの関数でない。
【００７７】
いくつかの実施形態では、図８に示されているように、複数の配列リード７２８を得るには、より大きい連続的な核酸８０２をフラグメント化して、フラグメント８０４を形成し、これらのフラグメントを別個の分画またはコンパートメント（本明細書では、これらを分画として、同義に言及する）にコンパートメント化または分割する。いくつかの実施形態では、１０超、１００超、１０００個超、１０，０００個超、１００，０００個超、１×１０６個超または５×１０６個超の配列リードセットが得られ、これらは、１０個超、１００個超、１０００個超、１０，０００個超、１００，０００個超、１×１０６個超または５×１０６個超の分画に対応する。
【００７８】
各分画は、その分画の内容を、他の分画の内容から分離した状態に保つ。本明細書で使用する場合、分画とは、様々な形態を収容できる入れ物または容器、例えば、ウェル、チューブ、マイクロウェル、ナノウェル、貫通穴などを指す。しかしながら、好ましい態様では、分画は、流体流内で流動可能である。いくつかの実施形態では、これらの容器は、例えば、内側の流体中心もしくはコアを取り囲む外側バリアを有するか、またはそのマトリックス内に物質を取り込み、及び／もしくは保持することができる多孔性マトリックスを有するマイクロカプセルまたはマイクロベシクルで構成される。しかしながら、好ましい態様では、これらの分画は、非水性の連続相、例えば油相内に、水性流体の水滴を含む。様々な好適な容器が、例えば、２０１３年８月１３日に提出された米国特許出願第１３／９６６，１５０号に記載されており、この特許出願は、参照により、その全体が本明細書に援用される。同様に、非水性または油性の連続相内で、安定した水滴を作るためのエマルジョン系は、例えば、米国特許出願公開第２０１０−０１０５１１２号に詳細に記載されており、この特許出願公開は、参照により、その全体が本明細書に援用される。ある特定の実施形態では、マイクロ流体チャネルネットワークが、分画の生成に特に適している。そのようなマイクロ流体デバイスの例としては、２０１４年４月４日に提出された米国特許仮出願第６１／９７７，８０４号に詳細に記載されているものが挙げられ、その開示内容は全て、あらゆる目的のために、参照により、その全体が本明細書に援用される。個々の細胞の分割では、細胞の水性混合物を非水性流体まで通す多孔質膜を含め、代替的機構も用いてよい。そのような系は概して、例えばＮａｎｏｍｉ，Ｉｎｃ．から入手可能である。
【００７９】
エマルジョン内の水滴の場合、フラグメント８０２を別個の分画に分割することは概して、水性試料を含む流動を、分割流体、例えばフッ素系油の非水性の流動も流入する接合部内に流入させて、流れている流動分割流体内に、水性水滴が作られるようにすることによって行ってよく、この際、そのような水滴は、試料物質を含む。下記のように、分画、例えば水滴は典型的に、併せて分割されたバーコードオリゴヌクレオチドも含む。
【００８０】
いずれかの特定の分画内の試料物質の相対量は、例えば、水性の流動内のフラグメント８０４の濃度、水性の流動及び／または非水性の流動の流速などを含め、その系の様々なパラメーターを制御することによって調節してよい。本明細書に記載されている分画は、総容積が１０００ｐＬ未満、９００ｐＬ未満、８００ｐＬ未満、７００ｐＬ未満、６００ｐＬ未満、５００ｐＬ未満、４００ｐＬ未満、３００ｐＬ未満、２００ｐＬ未満、１００ｐＬ未満、５０ｐＬ未満、２０ｐＬ未満、１０ｐＬ未満または更には１ｐＬ未満であることによって特徴付けられることが多い。ビーズと併せて分割する場合には、分画内の試料流体の体積は、上記の体積の９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満または更には上記の体積の１０％未満であってよいことが理解される。いくつかの場合では、少量の出発試薬との反応を行うには、例えば、より大きい連続的な核酸フラグメントを入れるには、反応体積の小さい分画を使用するのが特に有益である。低投入量の核酸で試料を解析する方法及びシステムは、２０１４年６月２６日の米国特許仮出願第６２／０１７，５８０号に示されており、この仮出願の開示内容は全て、参照により、その全体が本明細書に援用される。
【００８１】
フラグメント８０４を、対応する分画に導入したら、分画内のフラグメント８０４に、概して、固有識別子を付加して、それらのフラグメント８０４の特徴付けを行う際に、対応する分画から得たものとして帰属させることができるようにする。いくつかの実施形態では、特定のコンパートメントに含まれる試料核酸、特には、その分画に最初に挿入できる連続的な試料核酸の比較的長い伸長体に、特徴、例えば核酸配列情報を後で帰属付けできるように、コンパートメント化または分割したフラグメント８０４を保持する分画に、上記のような固有識別子を事前に、後で、または同時に付与する。
【００８２】
したがって、フラグメント８０４は典型的には、固有識別子７３２（例えばバーコード配列）と併せて分割する。特に好ましい態様では、固有識別子７３２は、核酸バーコード配列７３２を含むオリゴヌクレオチドの形態で付加する。１つの所与の分画内のオリゴヌクレオチド間では、オリゴヌクレオチドに含まれる核酸バーコード配列７３２は同じであるが、異なる分画間では、オリゴヌクレオチドが、異なるバーコード配列を有することができるように、好ましくは有するように、オリゴヌクレオチド７３２を分割する。好ましい実施形態では、１つの所与の分画には、１つの核酸バーコード配列７３２のみが対応付けられているが、いくつかの実施形態では、１つの所与の分画に、２つ以上の異なるバーコード配列が存在する。
【００８３】
典型的には、分画内の、より大きい連続的な核酸８０２のフラグメント８０４が、連続的な核酸分子の長いフラグメントまたは伸長体となるように、より大きい連続的な核酸８０２をフラグメント化及び分割する。図８に示されているように、これらのフラグメント８０４は典型的には、解析対象であるより大きい連続的な核酸全体、例えば、染色体、エキソームまたはその他のより大きいゲノムフラグメントの全体の数多くのオーバーラップフラグメントを表す。
【００８４】
また、典型的には、１つの所与の分画が、始めのより大きい連続的な核酸８０２のオーバーラップフラグメント８０４を２つ含む可能性が非常に小さくなるレベルで、より大きい連続的な核酸８０２をフラグメント化及び分割する。これは典型的には、分割プロセス中に、より大きい連続的な核酸８０２を低い投入量及び／または濃度で供給することによって実現する。その結果、好ましい場合には、１つの所与の分画は、始めのより大きい連続的な核酸のフラグメント８０４であって、長いが、オーバーラップしていないフラグメント８０４をいくつか含む。続いて、異なる分画内の核酸フラグメントを固有識別子７３２に対応付け、その際、いずれの所与の分画においても、その分画に含まれるフラグメント８０４は、同じ固有識別子を有するが、分画によって、含まれる固有識別子は異なる。さらに、分割ステップでは、試料構成部分を、非常に小さい体積の分画または水滴に割り当てるので、上に示されているように、所望の割り当てを行うためには、例えば、チューブまたはマルチウェルプレートのウェル内で、もっと体積がより大きいプロセスで必要とされるほどは、試料を希釈する必要はないことが理解される。さらに、本明細書に記載されているシステムでは、上記のような高レベルのバーコード多様性が採用されているので、上記のように、より大きい数のゲノム等価物中で、多様なバーコードを割り当てることができる。いくつかの実施形態では、１０，０００種類、１００，０００種類、５００，０００種類などを超える多様なタイプのバーコードを用いて、約１：５０以下、１：１００以下、１：１０００以下、またはそれよりも小さい値のゲノム：（バーコードのタイプ）比を実現させながら、ゲノム充填数の増大（例えば、１回のアッセイ当たり約１００個超のゲノム、１回のアッセイ当たり５００個超のゲノム、１回のアッセイ当たり１０００個のゲノム、または更にはそれ以上）を可能にするとともに、ゲノム当たりのバーコード多様性を大きく向上もさせる。本明細書では、そのような各ゲノムは、より大きい連続的な核酸の例である。
【００８５】
図１２ＡのパネルＢを参照すると、上記の分割は、分割ステップの前に、解放可能にビーズに結合したオリゴヌクレオチドタグ１２０２（バーコード７３２を含む）のセットと、より大きい連続的な核酸８０２を含む試料とを組み合わせることによって行うことが多い。オリゴヌクレオチド１２０２は、少なくとも、プライマー領域１２１０と、バーコード７３２領域とを含んでよい。１つの所与の分画内のオリゴヌクレオチド１２０２間では、バーコード領域７３２は、実質的に同じバーコード配列であるが、異なる分画間では、バーコード領域７３２は、大半の場合、異なるバーコード配列である。いくつかの実施形態では、プライマー領域は、分画内のフラグメント８０４をプライムするのに用いられるＮ−ｍｅｒ１２１６（ランダムなＮ−ｍｅｒまたは特定の配列を標的とするように設計されたＮ−ｍｅｒのいずれか）を含む（または更に含む）。いくつかの場合では、Ｎ−ｍｅｒが、特定の核酸配列を標的とするように設計されている場合、プライマー領域１２１０は、特定の染色体（例えば、ヒト第１染色体、ヒト第２染色体、ヒト第３染色体、ヒト第４染色体、ヒト第５染色体、ヒト第６染色体、ヒト第７染色体、ヒト第８染色体、ヒト第９染色体、ヒト第１０染色体、ヒト第１１染色体、ヒト第１２染色体、ヒト第１３染色体、ヒト第１４染色体、ヒト第１５染色体、ヒト第１６染色体、ヒト第１７染色体、ヒト第１８染色体、ヒト第１９染色体、ヒト第２０染色体、ヒト第２１染色体、ヒト第２２染色体、ヒトＸ染色体もしくはヒトＹ染色体）、または染色体領域、例えば、エキソームもしくはその他の標的領域を標的とするように設計する。いくつかの場合では、Ｎ−ｍｅｒは、特定の遺伝子または遺伝領域（疾患または障害（例えば、がん）に関連付けられた遺伝子または領域など）を標的とするように設計する。いくつかの場合では、Ｎ−ｍｅｒは、特定の構造的変異を標的とするように設計する。分画内においては、異なる位置で、そのプライマー配列の長さに沿って、フラグメント８０４をプライムするプライマー配列１２１０／１２１６（例えばＮ−ｍｅｒ）を用いて、増幅反応が行われる。増幅の結果、各分画には、フラグメント８０４の増幅産物（配列リード７２８という）が含まれることになり、それらの増幅産物は、同じかまたはほぼ同じ（共通の）バーコード７３２を含み、各分画におけるフラグメント８０４の更に小さいオーバーラップフラグメントを表す。したがって、バーコード７３２は、配列リード７２８のセットが同じ分画に由来すること、すなわち、潜在的に同じフラグメント８０４に由来することを示すマーカーとしての役割を果たす。典型的には、いずれかの所与の分画には、フラグメント８０４が数個存在することが理解される。それにもかかわらず、典型的な実施形態では、同じ分画にあるフラグメント８０４は典型的には、有意なオーバーラップは有さないので、増幅した配列リード７２８を、いずれかの所与の分画における正確なフラグメント８０４に割り当てることができる。増幅後、配列決定アルゴリズムを用いて、配列リード７２８をプールし、配列決定し、アラインメントする。より短い配列リード７２８は、それらに対応付けられたバーコード配列７３２により、アラインメントして、より大きい連続的な核酸８０２の長いフラグメント８０４の１つに帰属させることができるので、その配列上で特定された変異の全てを、元の１つのフラグメント８０２及びそのより大きい連続的な核酸の元の１つの染色体に帰属させることができる。さらに、多数のフラグメント８０４にわたって、帰属先が同じである多数の変異をアラインメントすることによって、その染色体の関与を更に特徴付けることができる。したがって、特定の遺伝的変異のフェージングに関する結論を引き出すことができる。そのような情報は、ハプロタイプ（概して、同じ核酸鎖または異なる核酸鎖に存在する特定の遺伝的変異セットである）の特定に有用であることがある。さらに、これに加えて、またはこの代わりに、構造的変異を特定する。
【００８６】
いくつかの実施形態では、図１２Ａを参照すると、併せて分割したオリゴヌクレオチド１２０２は、バーコード配列７３２及びプライマー領域配列１２１０／１２１６に加えて、機能配列も含む。例えば、いくつかの実施形態では、例えば、対応付けられたバーコード配列、配列決定プライマー、ハイブリダイゼーションもしくはプロービング配列の存在の特定に備えて、バーコードを付加した核酸のプルダウンに備えて、または多くの他の潜在的な機能配列のいずれかのために、対応付けられたバーコード配列、配列決定プライマー、ハイブリダイゼーションもしくはプロービング配列を結合させる一方で、併せて分割したオリゴヌクレオチド１２０２は、分割した核酸の処理に有用なその他の機能配列（分画内でフラグメント８０４を増幅するための標的またはランダム／ユニバーサル増幅プライマー配列など）も含む。例えば、２０１４年２月７日に提出された米国特許出願第６１／９４０，３１８号、２０１４年５月９日に提出された同第６１／９９１，０１８号、２０１４年６月２６日に提出された米国特許出願第１４／３１６，３８３号、及び２０１４年２月７日に提出された米国特許出願第１４／１７５，９３５号に記載されているように（これらの特許出願の開示内容は全て、参照により、その全体が本明細書に援用される）、例えば、試料物質とともに、オリゴヌクレオチド及び対応付けられるバーコード、並びにその他の機能配列を併せて分割することに関する開示を参照されたい。
【００８７】
例示的なプロセスの１つでは、ビーズが用意され、それぞれ、それらのビーズに解放可能な状態で結合した上記のオリゴヌクレオチド１２０２を多数含み、この際、１つの特定のビーズに結合したオリゴヌクレオチドは全て、同じ核酸バーコード配列７３２を含むが、使用するビーズ群にわたり、多様なバーコード配列が多数、示される。典型的には、ビーズ群には、少なくとも１０００種類のバーコード配列、少なくとも１０，０００種類のバーコード配列、少なくとも１００，０００種類のバーコード配列またはいくつかの場合では、少なくとも１，０００，０００種類のバーコード配列を含む多様なバーコード配列ライブラリーが用意される。加えて、各ビーズには、典型的には、多数のオリゴヌクレオチド分子１２０２が結合されている。具体的には、１つの個別のビーズ上の、バーコード配列７３２を含むオリゴヌクレオチド１２０２の分子の数は、少なくとも約１０，０００個のオリゴヌクレオチド、少なくとも１００，０００個のオリゴヌクレオチド分子、少なくとも１，０００，０００個のオリゴヌクレオチド分子、少なくとも１００，０００，０００個のオリゴヌクレオチド分子、及びいくつかの場合では、少なくとも１０億個のオリゴヌクレオチド分子であってよい。
【００８８】
いくつかの実施形態では、これらのオリゴヌクレオチドは、ビーズに特定の刺激を加えると、ビーズから解放可能である。いくつかの場合では、この刺激は、光による刺激、例えば、光に不安定な連結の切断であって、これらのオリゴヌクレオチドを解放できる切断によるものである。いくつかの場合では、熱による刺激を使用し、この場合、ビーズ環境の温度の上昇により、連結が切断されるか、またはオリゴヌクレオチドがビーズから別段の形で解放される。いくつかの場合では、オリゴヌクレオチドのビーズへの連結を切断する化学的刺激を使用するか、または化学的刺激によって、オリゴヌクレオチドをビーズから別段の形で解放させる。
【００８９】
いくつかの実施形態では、１つのビーズと１つの試料が１つの個別の分画内に含まれるように、オリゴヌクレオチド１２０２が結合されたビーズを、個々の試料と併せて分割する。いくつかの場合では、ビーズが１つの分画が望ましい場合、充填されるそれらの分画に、主に、ビーズが１つ充填されるようにするために、流体の相対流速を制御して、平均して、１つの分画当たりに１個未満のビーズが分画に含まれるようにするのが望ましいことがある。同様に、いくつかの実施形態では、充填される分画の割合（％）がより高くなるように、例えば、充填されない分画の割合（％）をほんのわずかにできるように、流速を制御する。好ましい態様では、ビーズが１つ充填される分画が所望の数となり、充填されない分画が特定のレベル未満となり、かつ複数のビーズが充填される分画が特定のレベル未満となるように、流動とチャネルアーキテクチャーを制御する。
【００９０】
２０１４年１０月２９日に提出された、「Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」という標題の米国特許出願第６２／０７２，２１４号（参照により本明細書に援用される）の図３と、図３について説明している明細書部分には、本開示の一実施形態に従って、より大きい連続的な核酸（この参照文献では、「試料核酸」と称されている）にバーコードを付加してから配列決定を行う方法の１つの詳細な例が示されている。上述のように、１つのビーズが充填されるのが、最も望ましい状態であり得るが、複数のビーズが充填される分画、または充填されない分画も存在し得ることが多いことが理解される。２０１４年１０月２９日に提出された、「Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」という標題の米国特許出願第６２／０７２，２１４号（参照により本明細書に援用される）の図４と、図４について説明している明細書部分には、本開示の一実施形態に従って、試料と、バーコードを付加したオリゴヌクレオチドを含むビーズとを併せて分割するマイクロ流体チャネル構造の詳細な例が示されている。
【００９１】
併せて分割を行ったら、ビーズに付着させたオリゴヌクレオチド１２０２を用いて、分割した試料にバーコードを付加するとともに、試料を増幅する。バーコードを付加されたこれらのオリゴヌクレオチド１２０２を、試料の増幅とバーコード付加に用いるプロセスの１つが、２０１４年２月７日に提出された米国特許出願第６１／９４０，３１８号、２０１４年５月９日に提出された同第６１／９９１，０１８号及び２０１４年６月２６日に提出された同第１４／３１６，３８３号（代理人整理番号４３４８７−７０８．２０１）に詳細に記載されており、これらの特許出願の開示内容は全て、参照により、その全体が本明細書に援用される。簡潔に述べると、一態様では、試料と併せて分割されるビーズ上に存在するオリゴヌクレオチドは、それらのビーズから、試料を有する分画内に解放される。それらのオリゴヌクレオチドは典型的には、バーコード配列７３２とともに、その５’末端１２１６にプライマー配列を含む。いくつかの実施形態では、このプライマー配列は、試料の多くの異なる領域をランダムにプライムするように意図されているランダムオリゴヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態では、プライマー配列１２１６は、試料の特異的標的領域の上流にプライムするようにされた特異的プライマー配列である。
【００９２】
解放されると、オリゴヌクレオチド１２０２のプライマー部分１２１６が、分画内のフラグメント８０４の相補的領域にアニーリングする。フラグメント８０４とビーズと併せて分割される伸長反応試薬、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、補因子（例えばＭｇ２＋またはＭｎ２＋など）が、フラグメント８０４をテンプレートとして用いて、プライマー配列を伸長して、プライマーがアニーリングしたフラグメント８０４の鎖と相補的な配列を生成し、この相補的配列は、オリゴヌクレオチド１２０２と、その対応付けられたバーコード配列７３２とを含む。分画内のフラグメント８０４の異なる部分に複数のプライマーがアニーリングして伸長することにより、フラグメント８０４のオーバーラップ相補的部分の大規模なプールが得られ、それらの部分はそれぞれ、その部分が作られた分画を示す固有のバーコード配列７３２を有する。いくつかの場合では、これらの相補的部分自体を、分画に存在するオリゴヌクレオチド１２０２によってプライムされるテンプレートとして用いて、同様にバーコード配列７３２を含む相補鎖を生成させてもよい。いくつかの場合では、第１の相補鎖が複製するときに、その末端または末端の近くで、２つの相補的配列を生成させて、その分子が、更なる反復コピーを生成させる土台となる能力を低下させるヘアピン構造または部分的ヘアピン構造を形成できるように、上記の複製プロセスを構成させる。この一例の概略図が図１２に示されている。
【００９３】
図１２Ａが示すように、例えばエマルジョン中の水滴１２０４内で、バーコード配列７３２を含むオリゴヌクレオチド１２０２を、試料フラグメント３０６と併せて分割する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド３０２は、より大きい連続的な核酸フラグメント８０４と併せて分割されているビーズ１２０８の上に供給される。オリゴヌクレオチド１２０２は、図１２Ａ、パネル（Ａ）に示されているように、ビーズ１２０８から解放可能であるのが好ましい。図１２Ａ、パネル（Ｂ）に示されているように、オリゴヌクレオチド１２０２は、１つ以上の機能配列、例えば、配列１２１２、７３２、１２１０及び１２１６に加えて、バーコード配列７３２を含む。例えば、オリゴヌクレオチド１２０２は、所与の配列決定システムにおいて結合または固定化配列として機能できる配列１２１２、例えば、ＩＬＬＵＭＩＮＡ、ＨＩＳＥＱまたはＭＩＳＥＱのシステムのフローセルにおいて結合の際に用いるＰ５配列を更に含むように示されている。換言すると、結合配列１２１２を用いて、いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド１２０２をビーズ１２０８に可逆的に結合させる。図１２Ａ、パネルＢに示されているように、オリゴヌクレオチド１２０２は、プライマー配列１２１０も含み、この配列は、フラグメント８０４の一部の複製をプライムするランダムまたは標的Ｎ−ｍｅｒ１２１６（上で論じたもの）を含んでもよい（または更に含んでもよい）。また、図１２Ａ、パネルＢの例示的なオリゴヌクレオチド１２０２には、配列決定システムにおける合成反応による、ポリメラーゼを介したテンプレート指向性配列決定をプライムするのに用いられる「リード１」すなわちＲ１プライム領域などの配列決定プライム領域をもたらすことができる配列１２１０も含まれている。多くの場合、バーコード配列７３２と固定化配列１２１２は、１つの所与のビーズに結合させた全てのオリゴヌクレオチド１２０２に共通していてもよい。プライマー配列１２１０／１２１６は、ランダムＮ−ｍｅｒプライマーにおいては、様々であってもよく、または、特定の目的用途用に、１つの所与のビーズ上のオリゴヌクレオチドに共通していてもよい。
【００９４】
図１２Ｂを参照すると、オリゴヌクレオチド１２０２ａ及び１２０２ｂは、プライマー配列１２１６の存在により、フラグメント８０４をプライムでき、それにより、ビーズ１２０８及びフラグメント８０４と併せて導入されたポリメラーゼ酵素及びその他の伸長試薬を用いて、オリゴヌクレオチド１２０２ａ及び１２０２ｂを伸長可能になる。
【００９５】
図１２Ｃに示されているように、ランダムＮ−ｍｅｒプライマーにおいて、フラグメント８０４の様々な領域にアニーリングしたオリゴヌクレオチドの伸長を受けて、フラグメント８０４のオーバーラップ相補配列が複数、例えば、配列リード７２８−１及び７２８−２が作られる。したがって、図１２Ｃには、（Ａ）複数の配列リードを得ることが示されており、その複数の配列リードのうちの対応する各配列リード７２８は、より大きい連続的な核酸８０２のサブセットに対応する第１の部分７３０と、より大きい連続的な核酸の配列から独立しているとともに、複数の分画のうち、その対応する配列リード７２８が形成された１つの分画を特定する識別子７３２（例えばバーコード７３２）を形成する共通の第２の部分１２５０とを含む。
【００９６】
続いて、図１２Ｂの、バーコードが付加された配列リード７２８に対して、例えば配列解析によって特徴付けを行ってもよいし、または、図１２Ｄに示されているように、そのプロセスにおいて、配列リード７２８を更に増幅してもよい。例えば、追加のオリゴヌクレオチド、例えば、前記同様ビーズ１２０８から解放されたオリゴヌクレオチド１２０２ｃが、フラグメント１２０２ｂをプライムしてよい。具体的には、前記同様、オリゴヌクレオチド１２０２ｃにランダムＮ−ｍｅｒプライマー１２１６（多くの場合、１つの所与の分画内の他のランダムＮ−ｍｅｒとは異なる）が存在することにより、そのオリゴヌクレオチドは、フラグメント１２０２ｂとアニーリングし、伸長されて、フラグメント１２０２ｂの少なくとも一部に対する相補鎖７２８−３が作られ、この相補鎖は、より大きい連続的な核酸配列の一部の複製物を構成する。フラグメント１２０２ｂのオリゴヌクレオチド部分７３０全体が複製されるまで、オリゴヌクレオチド１２０２ｂの伸長は継続される。図１２Ｄに示されているように、これらのオリゴヌクレオチドは、所望の時点に、例えば、オリゴヌクレオチド１２０２ｂの配列１２１６及び１２１０まで複製されたら、ポリメラーゼによる複製をすぐに停止するように構成させてよい。本明細書に記載されているように、これは、例えば、使用するポリメラーゼ酵素が処理できない様々なヌクレオチド及び／またはヌクレオチド類似体の導入を含む様々な方法によって行ってよい。例えば、この方法としては、配列領域１２１０内に、ウラシルを含むヌクレオチドを含めて、ウラシル非対応型ポリメラーゼを阻害して、その領域の複製を停止することを含み得る。その結果、図１２Ｅを参照すると、バーコード配列７３２、結合配列１２１２、プライマー領域１２１０及びランダムＮ−ｍｅｒ配列１２１６を含む完全長オリゴヌクレオチド１２０２を一方の末端に含む配列リード７２８−３が作られる。この配列のもう一方の末端には、第１のオリゴヌクレオチド１２０２のランダムＮ−ｍｅｒに対する相補配列１２１６’と、プライマー配列の全体または一部に対する相補配列（配列１２１０’として示されている）とが含まれる。続いて、Ｒ１配列１２１０とその相補配列１２１０’をハイブリダイズして、部分的ヘアピン構造１２６０を形成できる。理解されるように、ランダムＮ−ｍｅｒは、オリゴヌクレオチドによって異なるので、これらの配列とその相補配列は、ヘアピン形成に関与しないことが予想され、例えば、ランダムＮ−ｍｅｒ１２１６に対する相補配列である配列１２１６’は、ランダムＮ−ｍｅｒ配列１２１６ｂに対して相補的ではないことが予想される。これは、他の適用、例えば、Ｎ−ｍｅｒが、１つの所与の分画内のオリゴヌクレオチド間で共通している標的プライマーには当てはまらないであろう。
【００９７】
これらの部分的ヘアピン構造を形成することによって、試料配列の第１のレベルの複製物を更なる複製から除去可能になり、例えば、コピーの反復コピーを防ぐ。部分的ヘアピン構造は、作られたフラグメント、例えばフラグメント７３０−３を後に処理する際に有用な構造ももたらす。
【００９８】
続いて、複数の分画から得た全ての配列リード７２８は、本明細書に記載されているような高スループットシーケンサーでの配列決定に備えてプールしてよい。各配列リード７２８は、その帰属先の分画に対してコードされているので、バーコード７３２の存在により、その配列リード７２８の配列をその帰属先に再度帰属させることができる。
【００９９】
これは、図１３に概略的に示されている。一例に示されているように、フラグメント８０４−１及びフラグメント８０４−２をそれぞれ、上記のように、固有のバーコードオリゴヌクレオチドセット１２０２とともに分割する。続いて、各分画内で、各フラグメント（８０４−１及び８０４−２）を別々に処理して、フラグメント８０４−１及び８０４−２のオーバーラップ配列リード７２８をもたらして、配列リードセット１３０２−１及び１３０２−２を形成させる。この処理によって、特定の第１のフラグメント８０４から得た配列リード７２８のそれぞれにおいて同じであるバーコード配列７３２を有する配列リード７２８が得られる。図示されているように、配列リードセット１３０２−１には、「１」が付されており、配列リードセット１３０２−２には、「２」が付されている。多様なバーコードライブラリーを用いて、多数の異なる配列リードセットに、異なるバーコードを付加してよい。しかしながら、１つの所与の分画内の配列リードごとに、異なるバーコード配列を付加する必要はない。実際、多くの場合、複数の異なるフラグメント８０４を同じ分画において同時に処理して、同じバーコード配列７３２を含めてよい。多様なバーコードライブラリーについては、本明細書の別の段落に詳細に記載されている。
【０１００】
続いて、例えば、ＩｌｌｕｍｉｎａまたはＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，ＩｎｃのＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎから入手可能なＳｅｑｕｅｎｃｅ  ｂｙ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ技術を用いる配列決定に備えて、配列リードセットをプールしてよい。配列決定を行ったら、配列リード７２８は、例えば、集合リード１３１４及び１３１６に示されているように、含まれるバーコードに少なくとも部分的に基づき、任意に、かつ好ましくは、フラグメント自体の配列に部分的に基づき、対応するフラグメント８０４セットに帰属させることができる。続いて、各フラグメントセットに対して帰属させた配列リードをアセンブルして、各試料フラグメントに関して、アセンブル済みの配列、例えば配列１３１８及び１３２０をもたらし、そして、その配列を更に、対応する元のフラグメント８０４に再度帰属させてよい。ゲノム配列をアセンブルする方法及びシステムは、例えば、２０１４年６月２６日に提出された米国特許仮出願第６２／０１７，５８９号（代理人整理番号４３４８７−７２９．１０１）に記載されており、この仮出願の開示内容は全て、参照により、その全体が本明細書に援用される。
【０１０１】
図１１Ａ（１１０８）を参照すると、いくつかの実施形態では、複数の分画のうちの１つの分画は、共通の第２の部分７３２とともに、少なくとも１０個の分子、少なくとも１００個の分子、少なくとも１０００個の分子、少なくとも１×１０４個の分子、少なくとも１×１０５個の分子、少なくとも１×１０６個の分子、少なくとも１×１０７個の分子または少なくとも１×１０８個の分子を含む。換言すると、その１つの分画は、少なくとも１０個の分子、少なくとも１００個の分子、少なくとも１０００個の分子、少なくとも１×１０４個の分子、少なくとも１×１０５個の分子、少なくとも１×１０６個の分子、少なくとも１×１０７個の分子または少なくとも１×１０８個の分子１２０２（図１２Ａ）を含み、その各分子１２０２は、より大きい連続的な核酸８０２の少なくとも一部に対して相補的なプライマー配列１２１０を更に含む。
【０１０２】
図１１Ａ（１１１０）を参照すると、いくつかの実施形態では、複数の分画のうちの１つの分画は、共通の第２の部分７３２とともに、少なくとも１０個の分子、少なくとも１００個の分子、少なくとも１０００個の分子、少なくとも１×１０４個の分子、少なくとも１×１０５個の分子、少なくとも１×１０６個の分子、少なくとも１×１０７個の分子または少なくとも１×１０８個の分子を含み、その各分子１２０２は、プライマー部位１２１０と、より大きい連続的な核酸の一部に対して相補的であるセミランダムＮ−ｍｅｒプライミング配列１２１６とを更に含む（１１１０）。
【０１０３】
図１１Ａ（１１１２）を参照すると、いくつかの実施形態では、複数の分画のうちの１つの分画内にある、より大きい連続的な核酸８０２の１つ以上のフラグメント８０４は、長さが１キロベース超、長さが５キロベース超、長さが５０キロベース超、長さが１００キロベース超、長さが２００キロベース超、長さが２５０キロベース超、長さが３００キロベース超、または長さが３５０キロベース超である。典型的には、分画に分割される、より大きい連続的な核酸８０２のフラグメント８０４は、１ｋｂよりも長く、５ｋｂよりも長く、１０ｋｂよりも長く、１５ｋｂよりも長く、２０ｋｂよりも長く、３０ｋｂよりも長く、４０ｋｂよりも長く、５０ｋｂよりも長く、６０ｋｂよりも長く、７０ｋｂよりも長く、８０ｋｂよりも長く、９０ｋｂよりも長く、または更には１００ｋｂよりも長い。いくつかの実施形態では、複数の分画のうちの１つの分画内にある１つ以上のフラグメントのＮ５０（示されているＮ５０値よりも長いフラグメント８０４の長さの合計は、全てのフラグメント８０４の長さの合計の５０％である）は、少なくとも約１０ｋｂ、少なくとも約２０ｋｂ、少なくとも約５０ｋｂ、少なくとも約１００ｋｂ、少なくとも約１５０ｋｂ、少なくとも約２００ｋｂ、少なくとも約２５０ｋｂ、少なくとも約３００ｋｂ、少なくとも約３５０ｋｂ、少なくとも約４００ｋｂ、少なくとも約５００ｋｂ、１Ｍｂ超、または更には２Ｍｂ超である。いくつかの実施形態では、複数の分画全体のうちの各分画内にある１つ以上のフラグメントの総Ｎ５０（示されているＮ５０値よりも長いフラグメント８０４の長さの合計は、全てのフラグメント８０４の長さの合計の５０％である）は、少なくとも約１０ｋｂ、少なくとも約２０ｋｂ、少なくとも約５０ｋｂ、少なくとも約１００ｋｂ、少なくとも約１５０ｋｂ、少なくとも約２００ｋｂ、少なくとも約２５０ｋｂ、少なくとも約３００ｋｂ、少なくとも約３５０ｋｂ、少なくとも約４００ｋｂ、少なくとも約５００ｋｂ、１Ｍｂ超、または更には２Ｍｂ超である。いくつかの実施形態では、複数の分画のうちの１つの分画内にある、より大きい連続的な核酸８０２の１つ以上のフラグメント８０４は、長さが２０キロベース〜２００キロベースである（１１１４）。いくつかの実施形態では、複数の分画のうちの１つの分画内にある、より大きい連続的な核酸の１つ以上のフラグメントは、長さが２０キロベース〜２００キロベースである（１１１６）。
【０１０４】
図１１Ｂ（１１１８）を参照すると、いくつかの実施形態では、複数の分画のうちの１つの分画内にある、より大きい連続的な核酸の１つ以上のフラグメント８０４は、より大きい連続的な核酸の１〜５００個の異なるフラグメント、１０〜１０００個の異なるフラグメント、１００〜１０００個の異なるフラグメント、２５〜１５０個の異なるフラグメント、５〜５００個の異なるフラグメント、２５〜４００個の異なるフラグメント、１００〜１０，０００個の異なるフラグメント、５０〜２５０個の異なるフラグメントまたは２〜１２５個の異なるフラグメントからなる（１１１８）。いくつかの実施形態では、複数の分画のうちの１つの分画内にある、より大きい連続的な核酸の１つ以上のフラグメント８０４は、より大きい連続的な核酸の２個超の異なるフラグメント８０４、１０個超の異なるフラグメント８０４、２０個超の異なるフラグメント８０４、５０個超の異なるフラグメント８０４、１００個超の異なるフラグメント８０４、２００個超の異なるフラグメント８０４、３００個超の異なるフラグメント８０４、４００個超の異なるフラグメント８０４または５００個超の異なるフラグメント８０４を含む（１１１８）。特定の実施形態では、複数の分画のうちの１つの分画内にある、より大きい連続的な核酸８０２の１つ以上のフラグメント８０４は、より大きい連続的な核酸８０２の５〜１００個のフラグメント８０４からなる（１１２０）。
【０１０５】
図１１Ｂ（１１２２）を参照すると、いくつかの実施形態では、複数の配列リードは、５ナノグラム未満の核酸またはリボ核酸から得る。すなわち、複数の分画に必要な核酸８０４の総量は、有益なことに、いくつかの実施形態では、５ナノグラム未満である。本開示による様々な実施形態では、複数の配列リードは、５００ナノグラム未満の核酸もしくはリボ核酸、２５０ナノグラム未満の核酸もしくはリボ核酸、５０ナノグラム未満の核酸もしくはリボ核酸、５ナノグラム未満の核酸もしくはリボ核酸、または２ナノグラム未満の核酸もしくはリボ核酸から得る。
【０１０６】
図１１Ｂ（１１２４）を参照すると、いくつかの実施形態では、配列リードセットにおける対応する各配列リード７２８の第２の部分７３２における識別子は、｛１，…，１０２４｝という集合、｛１，…，４０９６｝という集合、｛１，…，１６３８４｝という集合、｛１，…，６５５３６｝という集合、｛１，…，２６２１４４｝という集合、｛１，…，１０４８５７６｝という集合、｛１，…，４１９４３０４｝という集合、｛１，…，１６７７７２１６｝という集合、｛１，…，６７１０８８６４｝という集合または｛１，…，１×１０１２｝という集合から選択した共通の値をエンコードする。例えば、識別子が、５つのヌクレオチド位置の集合によって表される場合について考える。この場合では、各ヌクレオチド位置には、４つの考え得る候補（Ａ、Ｔ、ＣまたはＧ）があり、５つの位置の全てについて考えると、４×４×４×４×４＝１０２４通りが考えられる。したがって、５つのヌクレオチド位置から、｛１，…，１０２４｝という集合が導かれる。したがって、バーコード配列が５−ｍｅｒである場合、各配列決定リード７２８の第２の部分７３２は、｛１，…，１０２４｝という集合から選択した固有の所与値をエンコードする。同様に、バーコード配列が、６個のヌクレオチド位置によって表される場合、その６個のヌクレオチド位置には合わせて、４×４×４×４×４×４＝４０９６通りある。したがって、６個のヌクレオチド位置から、｛１，…，４０９６｝という集合が導かれる。換言すると、バーコード配列が６−ｍｅｒである場合、各配列決定リード１２８の第２の部分７３２は、｛１，…，４０９６｝という集合から選択した固有の所与値をエンコードする。いくつかの実施形態では、識別子はＮ−ｍｅｒであり、Ｎは、｛４，…，２０｝という集合から選択した整数である（１１２６）。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、複数の配列決定リードにおける１つの配列決定リード７２８の識別子７３２は、その配列決定リード内の連続的なオリゴヌクレオチドセットに局在化させる。このような例示的な一実施形態では、この連続的なオリゴヌクレオチドセットはＮ−ｍｅｒであり、このＮは、｛４，…，２０｝という集合から選択した整数である（２１４）。換言すると、いくつかの実施形態では、例えば図１２Ａ、パネルＢにおけるバーコード７３２は、オリゴヌクレオチドタグ１２０２内の連続的なヌクレオチド位置セット（例えば、４個の連続的なヌクレオチド、５個の連続的なヌクレオチド位置、６個の連続的なヌクレオチド位置、７個の連続的なヌクレオチド位置、８個の連続的なヌクレオチド位置、９個の連続的なヌクレオチド位置、１０個の連続的なヌクレオチド位置、１１個の連続的なヌクレオチド位置、１２個の連続的なヌクレオチド位置、１３個の連続的なヌクレオチド位置、１４個の連続的なヌクレオチド位置、１５個の連続的なヌクレオチド位置、１６個の連続的なヌクレオチド位置、１７個の連続的なヌクレオチド位置、１８個の連続的なヌクレオチド位置、１９個の連続的なヌクレオチド位置または２０個の連続的なヌクレオチド位置）であり、これは最終的には、より大きい連続的な核酸の転写時に、第２の部分７３２となる。
【０１０８】
それに対して、いくつかの実施形態では、複数の配列決定リードのうちの１つの配列決定リードの第２の部分における識別子は、その配列決定リード内の非連続的なヌクレオチドセットに局在化させる。このような例示的な一実施形態では、その所与の非連続的なヌクレオチドセットは、合わせてＮ個のヌクレオチドからなり、Ｎは、｛４，…，２０｝という集合内の整数である。一例として、いくつかの実施形態では、図１２Ａ、パネルＢを参照すると、バーコード配列７３２は、オリゴヌクレオチドタグ１２０２内の第１の位置にある第１の連続的なヌクレオチド位置セットと、オリゴヌクレオチドタグ１２０内の第２の位置にある第２の連続的なヌクレオチド位置セットを含み、第２の連続的なヌクレオチド位置セットは、スペーサーによって、第１の連続的なヌクレオチド位置セットから隔てられている。一つの特定例では、バーコード配列７３２は、（Ｘ１）ｎＹｚ（Ｘ２）ｍを含み、Ｘ１は、ｎ個の連続的なヌクレオチド位置であり、Ｙは、一定の所与のｚ個の連続的なヌクレオチド位置セットであり、Ｘ２は、ｍ個の連続的なヌクレオチド位置である。この例では、配列決定リード７２８の第２の部分における識別子であって、この例示的なバーコードを導き出すスキーマによって生成される識別子は、非連続的なヌクレオチドセット、すなわち（Ｘ１）ｎ及び（Ｘ２）ｍに局在化される。これは、本開示の範囲内のバーコード配列に関する非連続的な形態の多くの例の１つに過ぎない。
【０１０９】
核酸バーコード配列７３２は典型的には、オリゴヌクレオチドの配列内の６〜約２０個以上のヌクレオチドを含むことになる。いくつかの実施形態では、これらのヌクレオチドは、例えば、隣接し合うヌクレオチドからなる１つの伸長体において、完全に連続している。代替的実施形態では、上記のヌクレオチドは、１つ以上のヌクレオチドによって隔てられている２つ以上の別々のサブ配列に分かれている。典型的には、分かれているサブ配列は、約４〜約１６個の介在ヌクレオチドによって隔てられている。
【０１１０】
図１１Ｂ（１１２８及び１１３０）を参照すると、いくつかの実施形態では、複数の配列リードの平均配列リード長は、４０塩基〜２００塩基（１１２８）、４０塩基〜２００塩基、６０塩基〜１４０塩基または３０塩基〜１３０塩基である。いくつかの実施形態では、配列リードの配列長は、ＩＬＬＵＭＩＮＡ、ＨＩＳＥＱ、ＭＩＳＥＱまたは関連するシステムのフローセルに適合できる長さである。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、集合体における複数の配列リードのＮ５０（示されているＮ５０値よりも長い配列リードの長さの合計は、全ての配列リードの長さの合計の５０％である）は、少なくとも約１０ｋｂ、少なくとも約２０ｋｂまたは少なくとも約５０ｋｂである。いくつかの態様では、Ｎ５０が少なくとも約１００ｋｂ、少なくとも約１５０ｋｂ、少なくとも約２００ｋｂ、多くの場合には、少なくとも約２５０ｋｂ、少なくとも約３００ｋｂ、少なくとも約３５０ｋｂ、少なくとも約４００ｋｂであり、及びいくつかの場合では、少なくとも約５００ｋｂ以上である配列リード長が得られる。更に別のケースでは、本開示によれば、２００ｋｂ超、３００ｋｂ超、４００ｋｂ超、５００ｋｂ超、１Ｍｂ超、または更には２Ｍｂ超の最大配列リード長が得られる。
【０１１２】
図１１Ｃ（１１２８及び１１３０）を参照すると、いくつかの実施形態では、複数の配列リードのうちの１つの配列リードセットは、１００個超の配列リードを含み、１００個超の配列リードの各配列リード７２８は、同じ共通の第２の部分を含む（１１３２）。すなわち、複数の分画における１つの所与の分画から、１００個の配列リードが得られ、その各配列リード７２８は、同じ識別子７３２を有する。より一般的には、いくつかの実施形態では、複数の配列リードのうちの１つの配列リードセットは、１０個超の配列リード、２００個超の配列リード、５００個超の配列リード、１０００個超の配列リード、２５００個超の配列リードまたは５０００個超の配列リードを含み、その各配列リード７２８は、同じ共通の第２の部分（同じ識別子７３２）を含む。
【０１１３】
図１１Ｃ（１１３４、１１３６）を参照すると、いくつかの実施形態では、より大きい連続的な核酸８０２は、染色体である（１１３４）。いくつかの実施形態では、より大きい連続的な核酸８０２は、ヒトのように複数の染色体を持つ生物のゲノムである。いくつかの実施形態では、より大きい連続的な核酸８０２としては、全ゲノム、個々の染色体、エキソーム、アンプリコンまたは対象となる多種多様な核酸のいずれかが挙げられる。いくつかの実施形態では、より大きい連続的な核酸８０２は、長さが４０００万塩基対超である（１１３６）。いくつかの実施形態では、より大きい連続的な核酸８０２は、長さが１００，０００塩基対超、長さが１００万塩基対超、長さが５００万塩基対超、長さが１０００万塩基対超、長さが２０００万塩基対超、長さが３０００万塩基対超または長さが５０００万塩基対超である。
【０１１４】
ｋ−ｍｅｒセットの作成：図１１Ｃ（１１３８）を参照すると、複数の配列リードを得たら、複数の配列リードの各配列リード７２８において、対応するｋ−ｍｅｒセットを作成する。合わせると、それらのｋ−ｍｅｒセットは、全体で、複数のｋ−ｍｅｒを含む。すなわち、複数の配列リードに由来するｋ−ｍｅｒセットをプールして、複数のｋ−ｍｅｒを形成させる。重要なことに、複数のｋ−ｍｅｒの各ｋ−ｍｅｒ７４６に対しては、元の配列リード７２８の識別子７３２が保持されている。本開示のいくつかの実施形態では、例えば、観察されるそれぞれの対応するｋ−ｍｅｒ７４６に対しては、対応するｋ−ｍｅｒを含む配列リード７２８のバーコード（第２の部分）７３２をリストするデータ構造を用いる。概して、対応するｋ−ｍｅｒ７４６を含む配列リード７２８に対応付けられたバーコード７３２を追跡するいずれの技法またはデータ構造も、本開示の範囲内である。
【０１１５】
ｋの値は必然的に、複数の配列リードにおける配列リード７２８の平均長未満である。いくつかの実施形態では、ｋの値は、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１または４３である。いくつかの実施形態では、ｋは、６〜１００の偶数の整数である。いくつかの実施形態では、ｋは、５〜９９の奇数の整数である。いくつかの実施形態では、対応する各ｋ−ｍｅｒセットは、対応する配列リード７２８の長さｋの考え得るｋ−ｍｅｒの少なくとも８０パーセントを含む（１１３８）。例えば、図１０を参照すると、配列リードがＧＡＴＣＣＡＴＣＴＴという配列を有し、ｋが３に設定されている場合、対応するｋ−ｍｅｒセットは、８個の考え得るｋ−ｍｅｒの少なくとも８０パーセント、例えば、８個の考え得るｋ−ｍｅｒのうちの少なくとも６個を含む。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、対応する各ｋ−ｍｅｒセットは、対応する配列リード７２８の長さｋの考え得るｋ−ｍｅｒの少なくとも６０パーセント、少なくとも７０パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセントまたは全てを含む（１１３８）。いくつかの実施形態では、対応するｋ−ｍｅｒセットは、対応する配列リード７２８の第１の部分の長さｋの考え得るｋ−ｍｅｒの少なくとも６０パーセント、少なくとも７０パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセントまたは全てを含む（１１３８）。いくつかの実施形態では、２つ以上のｋ−ｍｅｒセットが、対応する配列リード７２８の長さｋの考え得るｋ−ｍｅｒの少なくとも６０パーセント、少なくとも７０パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセントまたは全てを含む（１１３８）。
【０１１７】
図１１Ｃ（１１４０）を参照すると、いくつかの実施形態では、複数の配列リードは、合わせて、より大きい連続的な核酸８０２に対するカバレッジが、少なくとも１５倍または少なくとも２５倍であり、複数のｋ−ｍｅｒにおける１０パーセント超または３０パーセント超のｋ−ｍｅｒ７４６が、複数の配列リードにおける１個超の配列リード７２８に由来し、１個超の配列リードによって表される各ｋ−ｍｅｒ７４６に対して、その各配列リード７２８の識別子７３２が保持されている。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、複数のｋ−ｍｅｒにおける１０パーセント超、２０パーセント超、３０パーセント超、４０パーセント超、５０パーセント超、６０パーセント超、７０パーセント超または８０パーセント超のｋ−ｍｅｒが、複数の配列リードにおける１個超の配列リード７２８に由来する。対応するｋ−ｍｅｒ７４６が、１個超の配列リード７２８で見られる場合には、各配列リード７２８のバーコード（第２の部分）７３２が、その対応するｋ−ｍｅｒ７４６に対応付けられている。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、複数の配列リードは、合わせて、より大きい連続的な核酸８０２に対するカバレッジが、少なくとも５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍または少なくとも３０倍である。
【０１２０】
図１１Ｃ（１１４０）を参照すると、いくつかの実施形態では、複数の配列リードにおける配列リード７２８は、より大きい連続的な核酸８０２の７５〜１２５個の塩基をコードし、ｋの値は、５〜７３の奇数の整数である（１１４２）。いくつかの実施形態では、複数の配列リードにおける配列リード７２８は、より大きい連続的な核酸８０２の８０〜１２０個の塩基をコードし、ｋの値は、１１〜５１の奇数の整数である。いくつかの実施形態では、複数の配列リードにおける配列リード７２８は、より大きい連続的な核酸８０２の９０〜１１０個の塩基をコードし、ｋの値は、１３〜４５の奇数の整数である。
【０１２１】
図１１Ｃ（１１４４）を参照すると、いくつかの実施形態では、既定のｋ−ｍｅｒ長ｋに従って、複数の配列リードの各配列リード７２８の第１の部分７３０をハッシングすることによって、対応するｋ−ｍｅｒセットを作成し、それによって、複数の配列リードの各配列リード７２８に対して、対応するｋ−ｍｅｒセットを作成する。配列リードからｋ−ｍｅｒを生成するこのような方法の１つは、配列リードの第１の部分７３０に対応するｋ−ｍｅｒセットを形成するために、配列リード７２８の第１の部分７３０の上に重ねたヌクレオチド長ｋのスライディングウィンドウの各位置において、ハッシュ関数を演算することを伴う。この方法では、ハッシュ関数と呼ばれる簡潔な関数を用いて、長さｋの考え得る各ｋ−ｍｅｒをハッシングする。核酸配列における考え得るハッシュ関数ｈ（Ｗ）の１つは、以下の式に従って、配列リード７２８の第１の部分７３０から、Ｗ＝ｗ１ｗ１…ｗｋという形のｋ−ｍｅｒをマッピングする。
【数１】
2017526046.tif 000003
式中、ｗｉ＝Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔに対して、f（ｗｉ）＝０，１，２，３である。他のハッシュ関数も可能である。概して、配列リードから、Ｗ＝ｗ１ｗ１…ｗｋという配列のｋ−ｍｅｒをｋ−ｍｅｒの実際の核酸配列を再構築するのに用いることができる固有の数に割り当てるいずれかの関数を用いることができる。図９には、長さが３の６４個の考え得るｋ−ｍｅｒに対するｈ（Ｗ）の考え得る値が示されている。したがって、いくつかの実施形態では、各ｋ−ｍｅｒ７４６に対するｈ（Ｗ）の値をハッシュテーブル７４０または何らかの他の形態のデータ構造に格納する。いくつかの実施形態では、図７に示されているように、各配列リード７２８に対しては、その配列リード７２８が帰属する分画の、対応付けられた第２の部分７３２（例えばバーコード）が保持されている。さらに、いくつかの実施形態では、ｋ−ｍｅｒ７４０に関するデータ構造は、対応する配列リード７２８における各ｋ−ｍｅｒ７４６の位置を更に含む。典型的な実施形態では、配列リード７２８の第１の部分７３０における考え得る各ｋ−ｍｅｒをｋ−ｍｅｒ７４６に変換する。例えば、ｋ−ｍｅｒ長が３であり、Ｗ＝ｗ１ｗ１…ｗｋ（例えば配列リード７２８の第２の部分７３２）がＧＡＴＣＣＡＴＣＴＴである例では、図１０のｋ−ｍｅｒが生成され、それらの各ｋ−ｍｅｒに対して、ハッシュ値、例えばｈ（Ｗ）の値が生成されることになる。
【０１２２】
ｋ−ｍｅｒの追跡：図１１Ｄ（１１４６）を参照すると、複数のｋ−ｍｅｒのうちの対応する各ｋ−ｍｅｒ７４６に対して、その対応するｋ−ｍｅｒ７４６と、当該配列リードを含む配列リードセットの識別子７３２とを含む、複数の配列リードの各配列リード７２８の識別を追跡する。例えば、図７を参照すると、これを行う方法の１つは、バーコード７３２とともに、配列リード７２８から生成した全てのｋ−ｍｅｒ７４６を追跡することである。代替的な方法も可能である。例えば、対応するｋ−ｍｅｒ７４６を含む全ての配列リード７２８を、それらの配列リード７２８のバーコード７３２とともに追跡するデータ構造またはデータ構造群を実施してよい。このデータ構造またはデータ構造群は、全ての他の対応するｋ−ｍｅｒ７４６を含む配列リード７２８を、それらの配列リード７２８のバーコード７３２とともに、更に追跡することになる。
【０１２３】
ｋ−ｍｅｒのグラフ化：図１１Ｄ（１１４８）を参照すると、複数の有向アークによって連結された複数のノードを含むグラフとして、複数のｋ−ｍｅｒをグラフ化する。各ノードは、長さｋの複数のｋ−ｍｅｒにおける連続的なｋ−ｍｅｒセットであって、ｋ−１のオーバーラップを有するｋ−ｍｅｒセットを含む。各アークは、複数のノードにおいて、始点ノードを宛先ノードに連結させる。始点ノードの最後のｋ−ｍｅｒは、宛先ノードの最初のｋ−ｍｅｒと、ｋ−１のオーバーラップを有する。第１の始点ノードは、複数のノードにおいて、第１の宛先ノードと第２の宛先ノードとの両方を有する第１の有向アークを有する（１１４８）。
【０１２４】
図１４には、このようなグラフの１つ１４００が示されており、このグラフは、当該技術分野においてド・ブラングラフとして知られている。Ｚｅｒｂｉｎｏ  ａｎｄ  Ｂｉｒｎｅｙ，“Ｖｅｌｖｅｔ：Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ  ｆｏｒ  ｄｅ  ｎｏｖｏ  ｓｈｏｒｔ  ｒｅａｄ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｕｓｉｎｇ  ｄｅ  Ｂｒｕｉｊｎ  ｇｒａｐｈｓ，”Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅａｃｈ  ２００８，１８：８２１−８２９（参照により、その全体が本明細書に援用される）を参照されたい。各ノード１４０２は、一連のオーバーラップｋ−ｍｅｒを示している。図１４のケースでは、ｋ＝５である。ノード１４０２における隣接し合うｋ−ｍｅｒは、ｋ−１のヌクレオチドでオーバーラップしている。ｋ−ｍｅｒに含まれる境界情報は、その最後（例えば最後の３’）のヌクレオチドである。これらの最後のヌクレオチドの配列は、ノード１４０２ｂの配列またはｓ（Ｎ）と呼ばれる。図１４、及び任意の実施形態では、各ノード１４０２は、ツインノード１４０２ｂに結合しており、ノード１４０２ｂは、逆続きの逆向き相補鎖ｋ−ｍｅｒを表す。これにより、逆鎖に由来するリード間のオーバーラップが考慮されるようになる。ノード及びそのツインに結合される配列は、互いの逆向き相補鎖である必要がないことに留意されたい。ノード１４０２とそのツイン１４０２ｂの結合体は、「ブロック」という。ノード１４０２は、有向「アーク」１４０４によって連結されている。その場合には、アークの始点ノードの最後のｋ−ｍｅｒは、その宛先ノードの第１のｋ−ｍｅｒとオーバーラップする。ブロックの対称性により、アークがノード１４０２−１からノード１４０２−２に延びる場合には、対称アークは、ノード１４０２ｂ−２から１４０２ｂ−１に延びる。これらのノード１４０２及びアーク１４０４において、グラフをトラバースする「パス」としてリードをマッピングする。パスからヌクレオチド配列を抽出する作業は、第１のノードの最初のｋ−ｍｅｒと、パス内の全てのノードの配列から行う。
【０１２５】
図１４には、第１の始点ノードが、複数のノードにおいて、第１の宛先ノードと第２の宛先ノードの両方を有する第１の有向アークを有する場合が示されている（１１４８）。具体的には、ノード１４０２−２は、ノード１４０２−３に対する第１の有向アーク１４０４−２と、ノード１４０２−４に対する第２の有向アーク１４０４−３とを有する始点ノードである。これは、ノード１４０２−２の最後のｋ−ｍｅｒ（ＧＡＴＴＧ）と、ノード１４０２−３の第１のｋ−ｍｅｒ（ＡＴＴＧＡ）との間に、ｋ−１のオーバーラップ、すなわち、ＡＴＴＧのオーバーラップがあるとともに、ノード１４０２−２の最後のｋ−ｍｅｒ（ＧＡＴＴＧ）と、ノード１４０２−４の第１のｋ−ｍｅｒ（ＡＴＴＧＣ）との間に、オーバーラップ、すなわち、ＡＴＴＧのオーバーラップがあるからである。したがって、グラフ１４００には、１４０２−１→１４０４−１→１４０２−２→１４０４−２→１４０２−３を含むパスと、１４０２−１→１４０４−１→１４０２−２→１４０４−３→１４０２−４を含むパスという２本のパスが存在する。開示されている方法は、より大きい核酸８０２の対応する配列を表す可能性がより高いパスを決定するのに有用である。
【０１２６】
マージするノードの決定：図１１Ｄ（１１５０）を参照すると、（ｉ）始点ノードと、（ｉｉ）第１の宛先ノード及び第２の宛先ノードのうちの１つを含むコンティグ配列を抽出するために、始点ノードを第１の宛先ノードと第２の宛先ノードのどちらとマージするか決定する。より大きい連続的な核酸８０２の対応する部分を表している可能性がより高い方のコンティグ配列を決定し、選択する。例えば、図１４を参照すると、ノード１４０２−２（始点ノード）と１４０２−３（第１の宛先ノード）とをマージするか、または１４０２−２（始点ノード）と１４０２−４（第２の宛先ノード）とをマージするかを決定する。この決定１１５０では、有利なことに、少なくとも、第１の始点ノード、第１の宛先ノード及び第２の宛先ノード内のｋ−ｍｅｒ７４０における、配列リード７２８の識別子７３２を使用して、より大きい連続的な核酸８０２の対応する部分を表している可能性がより高い方のコンティグを特定する。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、ステップ１１５０は、少なくとも部分的に、２本以上のパスにおける各ｋ−ｍｅｒに対応付けられたバーコード７３２を評価することによって行う。例えば、グラフ１４００では、パス１４０２−１→１４０４−１→１４０２−２→１４０４−２→１４０２−３におけるｋ−ｍｅｒのバーコード７３２と、パス１４０２−１→１４０４−１→１４０２−２→１４０４−３→１４０２−４におけるｋ−ｍｅｒのバーコード７３２を評価する。元の核酸８０２は典型的には、標的核酸を複数コピー（例えば、配列決定対象である同じ標的染色体または他の核酸を複数コピー）含むので、典型的には、ノード内の各ｋ−ｍｅｒに対して、複数のバーコード７３２が存在する。それにもかかわらず、より大きい連続的な核酸８０２でみられる真の配列を表していないパスよりも、より大きい連続的な核酸８０２でみられる真の配列を表す正確なパスの方が、共通するバーコードが多い。バーコードを用いて、正しいパスを特定する実際の方法は、いくつか変数に左右されるので、様々であり得る。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、可能性がより高いパス、すなわち、（ｉ）始点ノードと、（ｉｉ）第１の宛先ノード及び第２の宛先ノードのうちの１つを含むコンティグ配列のうち、優れた方のコンティグ配列は、カットオフを設定することによって、例えば、始点ノード内のいずれかのｋ−ｍｅｒ及び選択される宛先ノード内のいずれかのｋ−ｍｅｒを表すバーコードの少なくとも３０パーセントが、それらの２つのノード間で共通していることを要件とすることによって選択する。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、可能性がより高いパス、すなわち、（ｉ）始点ノードと、（ｉｉ）第１の宛先ノード及び第２の宛先ノードのうちの１つを含むコンティグ配列のうち、優れた方のコンティグ配列は、カットオフを設定することによって、例えば、始点ノード内のいずれかのｋ−ｍｅｒ及び選択される宛先ノード内のいずれかのｋ−ｍｅｒを表すバーコードの少なくとも１０パーセント、少なくとも２０パーセント、少なくとも３０パーセント、少なくとも４０パーセント、少なくとも５０パーセントまたは少なくとも６０パーセントが、それらの２つのノード間で共通していることを要件とすることによって選択する。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、可能性がより高いパス、すなわち、（ｉ）始点ノードと、（ｉｉ）第１の宛先ノード及び第２の宛先ノードのうちの１つを含むコンティグ配列のうち、優れた方のコンティグ配列は、共通するバーコードの割合が最も高いノードペアを特定することによって選択する。
【０１３１】
図１１Ｄ（１１５２）を参照すると、いくつかの実施形態では、第１の始点ノードと第１の宛先ノードは、その始点ノード及び第１の宛先ノード以外の追加のノードを１つ以上含む、グラフにおける第１のパスの一部である。第１の始点ノードと第２の宛先ノードは、その始点ノードと第２の宛先ノード以外の追加のノードを１つ以上含む、グラフにおける第２のパスの一部である。これは、図１４では、パス１４０２−１→１４０４−１→１４０２−２→１４０４−２→１４０２−３と、パス１４０２−１→１４０４−１→１４０２−２→１４０４−３→１４０２−４として示されており、いずれの場合も、ノード１４０２が追加のノードである。そのようないくつかの実施形態では、１１５０の決定作業は、第１のパスの第１の部分のノードのｋ−ｍｅｒと、第１のパスの第２の部分のノードのｋ−ｍｅｒとの間で共通している識別子７２８の数と、第２のパスの第１の部分のノードのｋ−ｍｅｒと、第２のパスの第２の部分のノードのｋ−ｍｅｒとの間で共通している識別子の数とを比較して評価することによって、第１のパスの方が、第２のパスよりも、より大きい連続的な核酸を表している可能性がより高いかどうかを決定することを含む（１１５２）。いくつかの実施形態では、この作業は、相対基準で行う。例えば、パス内のいずれかのｋ−ｍｅｒに対応付けられた識別子７４６の総数のうち、パスの第１の部分と、パスの第２の部分との間で共通しているのが何パーセントかである。例えば、図１５を参照して、パス１が、ノード１５０２、１５０４、１５０６、１５０８、１５１０を含み、パス２が、ノード１５１２、１５１４、１５０６、１５１６及び１５１８を含む場合を考える。パス１は、ノード１５０２、１５０４及び１５０６からなる第１の部分と、ノード１５０８及び１５１０からなる第２の部分に分けることができる。ノード１５０２、１５０４及び１５０６のｋ−ｍｅｒのいずれかに対応付けられた識別子７３２を割り出す。ノード１５０８及び１５１０のｋ−ｍｅｒのいずれかに対応付けられた識別子７３２を割り出す。これを第２のパスについても繰り返す。すなわち、パス２は、ノード１５１２、１５１４及び１５０６からなる第１の部分と、ノード１５１６及び１５１８からなる第２の部分に分けられる。ノード１５１２、１５１４及び１５０６のｋ−ｍｅｒのいずれかに対応付けられた識別子７３２を割り出す。ノード１５１６及び１５１８のｋ−ｍｅｒのいずれかに対応付けられた識別子７３２を割り出す。第１のパスの第１の部分の識別子７３２と、第２の部分の識別子７３２がオーバーラップする程度と、第２のパスの第１の部分の識別子７３２と、第２の部分の識別子７３２がオーバーラップする程度とを比較する。例えば、第１のパスの第１の部分または第２の部分のいずれでみられる識別子の総数の３０パーセントが、第１のパスの第１の部分と第２の部分の両方でみられる場合を考える。さらに、第２のパスの第１の部分または第２の部分のいずれでみられる識別子の総数の４５パーセントが、第２のパスの第１の部分と第２の部分の両方でみられる。この場合には、第２のパスの方が、より大きい連続的な核酸８０２の対応する部分を表している可能性がより高いものとみなす。ベイズ解析またはピアソンのカイ二乗検定など、パス内のｋ−ｍｅｒのバーコード７３２を比較する他の技法を用いてよい。本発明の発見は、パス内の曖昧な部分を解消するのに、バーコード７３２を用いることである。
【０１３２】
図１１Ｅ（１１５４）を参照すると、いくつかの実施形態では、第１の始点ノードと第１の宛先ノードは、その始点ノードと第１の宛先ノード以外の追加のノードを１つ以上含む、グラフにおける第１のパスの一部である。第１の始点ノードと第２の宛先ノードは、その始点ノードと第２の宛先ノード以外の追加のノードを１つ以上含む、グラフにおける第２のパスの一部である。第１のパスの平均カバレッジが、第２のパスよりもより大きいときには、第２のパスよりも第１のパスを優先させるように決定する（１１５４）。例示するために再び図１５を参照するとともに、パス１（１５０２、１５０４、１５０６、１５０８、１５１０）とパス２（ノード１５１２、１５１４、１５０６、１５１６及び１５１８）を再び考察すると、パス１のノードのｋ−ｍｅｒの方が、パス２のノードのｋ−ｍｅｒよりも、カバレッジが高い場合、図１１のプロセス１１５０または１１５２で、配列識別子のみによって、明らかな勝者を特定することができなかったときに、これをタイブレークとして使用してよい。
【０１３３】
図１１Ｅ（１１５６）を参照すると、いくつかの実施形態では、第１の始点ノードと第１の宛先ノードは、その始点ノードと第１の宛先ノード以外の追加のノードを１つ以上含む、グラフにおける第１のパスの一部である。第１の始点ノードと第２の宛先ノードは、その始点ノードと第２の宛先ノード以外の追加のノードを１つ以上含む、グラフにおける第２のパスの一部である。第１のパスによって表される、より大きい連続的な核酸配列の連続的な部分の方が、第２のパスによって表される、より大きい連続的な核酸配列の連続的な部分よりも長いときには、第２のパスよりも第１のパスの方を優先させるように決定する（１１５６）。いくつかの実施形態では、プロセス１１５６は、図１１のプロセス１１５０、１１５２または１１５４で、配列識別子のみによって、明らかな勝者を特定することができない場合に、タイブレークとして使用する。いくつかの実施形態では、プロセス１１５６を図１１のプロセス１１５０、１１５２及び／または１１５４と併用して、複数の情報源を用いて、勝者を特定する。
【０１３４】
図１１Ｅ（１１５８）を参照すると、いくつかの実施形態では、第１のノード内の第１のｋ−ｍｅｒ７４６が、複数の配列リード７２８のうちの一部の複数の配列リードに存在し、第１のｋ−ｍｅｒ７２８に対して、その一部の複数の配列リードの各配列リード７２８の同一性が保持されており、このことは、第１のパスの方が、第２のパスよりも、より大きい連続的な核酸配列を表している可能性が高いかどうかを決定する決定１１５０において用いられる（１１５８）。これは、フラグメント８０４に分割されるより大きい連続的な核酸８０２の試料が実際に、標的核酸の複数コピー（例えば、同じ対象染色体又は配列決定を行う他の核酸のコピー）を構成する多くのケースでみられる。これにより、１つのノード内の各ｋ−ｍｅｒ７４６に対するバーコード７３２が複数となる。したがって、プロセス１１５０、１１５２、１１５４、１１５６及び／または１１５８のいずれも、このことを考慮に入れることができる。
【０１３５】
本開示の別の態様は、配列決定方法であって、１つ以上のプロセッサーと、その１つ以上のプロセッサーによって実行される１つ以上のプログラムを格納するメモリーとを有するコンピューターシステムで、図１１Ａの１１０６に関して、上に開示されているように、複数の配列リードを得ることを含む方法を提供する。その複数の配列リードは、複数の配列リードセットを構成する。配列リードセット内の対応する各配列リードは、（ｉ）より大きい連続的な核酸のサブセットに対応する固有の第１の部分と、（ｉｉ）より大きい連続的な核酸の配列から独立しているとともに、複数の分画のうち、その対応する配列リードが形成された分画を特定する識別子を形成する共通の第２の部分とを含む。その複数の配列リードセットにおける対応する各配列リードセットは、複数の分画のうちの１つの分画に形成される。そのような各分画は、より大きい連続的な核酸のフラグメントであって、その分画において、対応する各配列リードに対するテンプレートとして用いるフラグメントを１つ以上含む。
【０１３６】
この方法では、図１１Ｃのエレメント１１３８に関して、上で論じたように、複数の配列リードの各配列リードに対して、対応するｋ−ｍｅｒセットを作成する。ｋ−ｍｅｒセットは、全体で、複数のｋ−ｍｅｒを含む。複数のｋ−ｍｅｒの各ｋ−ｍｅｒ７４６に対して、配列リード７２８の識別子７３２が保持されている。ｋの値は、複数の配列リードにおける配列リードの平均長未満である。対応する各ｋ−ｍｅｒセットは、対応する配列リードの第１の部分の考え得るｋ−ｍｅｒの少なくとも一部（例えば少なくとも８０パーセント）を含む。
【０１３７】
この方法では、複数のｋ−ｍｅｒのうちの対応する各ｋ−ｍｅｒに対して、その対応するｋ−ｍｅｒを含む、複数の配列リードの各配列リードの識別を追跡する。第１のパスを特定する。その第１のパスは、複数のｋ−ｍｅｒにおける第１のｋ−ｍｅｒセットであって、ｋ−１のオーバーラップを有する第１のｋ−ｍｅｒセットを含む（例えば、図１５のノード１５０２、１５０４、１５０６、１５０８及び１５１０）。第２のパスを特定する。第２のパスは、複数のｋ−ｍｅｒにおける第２のｋ−ｍｅｒセットであって、ｋ−１のオーバーラップを有する第２のｋ−ｍｅｒセットを含む（例えば、図１５のノード１５１２、１５１４、１５０６、１５１６及び１５１８）。第１のパスは、（例えば、図１５に示されているように）第２のパスと交差し、それによって、第１のパスの左側部分（ノード１５０２及び１５０４）と、第１のパスの右側部分（ノード１５０８及び１５１０）と、第２のパスの左側部分（ノード１５１２及び１５４）と、第２のパスの右側部分（１５１６及び１５１８）とを含む分岐セグメントセットを形成し、ここで、分岐ノード１５０６をどう処理するかの選択（例えば、使用しないか、それらのパスに入れるか、または各パスの一部に入れるかの選択）は、用途に依存する。分岐セグメントセットのｋ−ｍｅｒに対応付けられた識別子を用いて、分岐セグメントの連結性を検証する。いくつかの実施形態では、これは、分岐セグメントセットにおける考え得る各分岐セグメントペアの間で共通している識別子の数を評価することを含む。いくつかの場合では、この評価の結果、パスのルートが再設定されることがある。例えば、図１５のグラフを評価する際には、下記の表に示されているように、４つのパス候補が考えられる。表に示されているように、パス１５２０〜１５２２（ノード１５０２、１５０４、１５０６、１５０８及び１５１０）と、パス１５２４〜１５２６（１５１２、１５１４、１５０６、１５１６及び１５１８が、正確なパスとしてみなされる。これらのパスはそれぞれ、相対基準で、パス１５２０〜１５２６及び１５２４〜１５２２よりもオーバーラップバーコードが多いからである。
【表１】
2017526046.tif 000004
【０１３８】
いくつかの実施形態では、パス長及びパスカバレッジのような追加の情報を用いて、これらの連結を検証する。当然ながら、上記の表にあるような情報に、いずれかの形態の統計的解析を適用して、パスを検証してよい。
【０１３９】
ＩＩＩ．例示的なアセンブルプロセス
以下は、上記のような新規アセンブルプロセス全体の例であり、下で説明されているとともに、図４に示されているプロセスフローチャートに概略的に示されている。図示されているように、配列決定及びリードの生成の後に、ステップ４０２で、短いリード配列をデータ構造に集約し、プレアセンブル処理を行う。これらのリードでは、配列決定したフラグメントの機能的な成分、例えばアダプター配列、リードプライマー配列などに対応付けられた配列データを配列リードから除去する。重複リードは、センスリード及びパートナーすなわちアンチセンスリードの最初の２つのｋ−ｍｅｒの両方で重複している配列を特定することによって除去してよい。最初のｋ−ｍｅｒが、重複リード及びそれらの相補鎖間で共通している場合、例えばＦａｓｔＵｎｉｑアルゴリズムまたはその他の類似のアルゴリズムを用いて、１つを除いて全てを重複リードとして除去することができる。いくつかの場合では、重複リードに対して、プレアセンブルプロセスを行ってよく、その場合、これらの重複リードの１つ以上には、配列決定エラーが含まれる。これらの最初の数個のｋ−ｍｅｒは、エラーがより少ない配列決定処理開始時に生じるので、エラーの生じる可能性は低くなると予想される。重複リードに加えて、低複雑性リード、例えば、１つの塩基がそのリードの９０％以上を占めるリード、または完全または実質的に２、３もしくは４塩基の繰り返し単位で構成されているリード。
【０１４０】
続いて、ステップ４０４において、リードに対して、エラー補正アルゴリズムを実行する。配列リード中の未補正エラーにより、アセンブリーのフラグメント化が生じ、演算の複雑性が増大するからである。様々なエラー補正アルゴリズムが一般的に利用可能であり（例えば、Ｔａｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｓｈｏｒｔ  Ｒｅａｄ  Ｅｒｒｏｒ  Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ”，Ａｍ．Ｊ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｒｅｓ．２０１３；３（１）１−９（参照により、本明細書に援用される）を参照されたい）、例えば、ＱＵＡＫＥ及びスタンドアロンのＡＬＬＰＡＴＨＳ−ＬＧエラー補正アルゴリズムが挙げられる。
【０１４１】
プレアセンブル処理とエラー補正に続いて、ステップ４０６において、ｋ−ｍｅｒサイズ、例えば、ｋ＝２０またはｋ＝２４を用いて、全ての集合リードにわたって、ｋ−ｍｅｒの頻度分布を生成する。大きな偏りなく配列決定が行われる典型的なゲノムプロファイルと想定して、ｋ−ｍｅｒ頻度のガウス分布となると予測され、この分布では、ピークの中心は、ゲノムの平均ｋ−ｍｅｒカバレッジを示す。頻度分布の演算に用いるｋ−ｍｅｒのサイズは概して、解析するゲノムの複雑性、予測される配列決定カバレッジレベルなどによって様々であり得る。
【０１４２】
続いて、ステップ４０８で、エラー補正済みのリードから、図１Ｂを参照しながら説明したｋ−ｍｅｒアセンブルプロセスを用いて、最初のアセンブリーグラフを作成する。いくつかの場合では、長めのｋ−ｍｅｒ配列を用いてよく、例えば、１５０塩基の配列リードに対して、４０塩基以上、５０塩基以上または６０塩基以上のｋ−ｍｅｒを用いてよい。グラフから、非分岐パスを個々のプライマリーパスとする。
【０１４３】
概して、配列内には、比較的短い分岐、例えば１、２、または３ｋ−ｍｅｒの分岐を表すハング末端が多くみられ、これらの末端は、未補正リードを含む多くの原因により生じ得る。これらの短いパスは、認識するのが容易であり、プライマリーパスの特定前または後のいずれかに、アセンブリーグラフから除去してよい。いくつかの場合では、短い分岐が生じ得るが、エラー補正済みリード内の欠失配列に由来する場合があり、この欠失配列は、低カバレッジに起因し得る。
【０１４４】
続いて、ステップ４１０で、エラー補正済みリードと連結しているバーコード配列を、対応するプライマリーパスに対応付けて、各プライマリーパスに対応付けられたバーコードのリストを生成する。各プライマリーパスについて、ゲノムにおける、そのプライマリーパスのコピー数を推定する。上述のように、所与のプライマリーパスのコピー数は、概して、ゲノムの複雑性、ならびにプライマリーパスの長さ及び複雑性に左右されることになる。コピー数は概して、プライマリーパスに接するリードの数から、その数を、ステップ４０６で演算したｋ−ｍｅｒ分布から抽出した平均ｋ−ｍｅｒカバレッジと比較して、推定できる。短いプライマリーパスは概して無視してよい。それらのプライマリーパスに接するリードは、プライマリーパスと部分的にしかオーバーラップしていない割合の方がかなりより大きい場合があるので、それらのコピー数を割り出すのは困難であるからである。このことから、低コピー数のプライマリーパス、例えば、コピー数が１に近いプライマリーパス（ＣＮ１パスともいう）を、上述のように、ステップ４１２で特定してよい。
【０１４５】
続いて、対応付けられたバーコード配列の助けを借りて、ＣＮ１プライマリーパスを足場にアセンブルする。具体的には、ステップ４１４で、最も多くのバーコードに対応付けられているＣＮ１プライマリーパスをシードパスとして選択する。続いて、ステップ４１６で、共通のバーコード配列を含む他の全てのオーバーラッププライマリーパスまでシードパスを伸長し、その際、各プライマリーパスは１度だけ考慮に入れ、所望のレベル未満、例えば、シードパスにおけるバーコード頻度の半分未満のバーコード頻度を有するプライマリーパスを無視する。図５には、このプロセスが詳細に示されている。具体的には、ステップ５０２で、第１のシードパスを特定する。ステップ４１６について上記したように、続いて、その第１のシードパスを伸長する。具体的には、ステップ５０４において、所与の分岐の末端に達するまで、プライマリーパスと追加のＣＮ１パスを通じて、伸長を継続する。続いて、ステップ５０６で、パスがつながった最後のＣＮ１パスまで、パスをトリミングして、アセンブルされる配列が常に、１つのＣＮ１パスの末端を始点とするとともに、シードパスを中心につなげられるようにする。
【０１４６】
続いて、ステップ５０８において、ＣＮ１パスではないパスを全て除去することによって、ＣＮ１パスを通るパスを縮約してから、それらをマージして、第１のシードパスを中心に、ＣＮ１パスの順序を定める１つの足場を形成する。続いて、それらのＣＮ１パスを、使用済みとして指定する。
【０１４７】
続いて、ステップ５１２において、残りのＣＮ１パスのうち、残りのうちでバーコードの頻度が最も高いＣＮ１パスを次のシードパスとして用いて、上記のプロセスを繰り返し、残りのＣＮ１パスにおいて足場を形成する。全てのＣＮ１パスが、使用済みとして指定されるまで、このプロセスを続ける。続いて、ステップ５１４において、縮約したプライマリーパスセットを更にマージして、ゲノムにおける、全てのＣＮ１パスの相対的順序を示す最終的なパスまたは足場をもたらす。このパスまたは足場は、最終的なアセンブルの基礎となるアンカー足場を形成する。
【０１４８】
ＣＮ１パス足場をアセンブルしたら、ステップ４２０において、ローカルなアセンブルを行って、ＣＮ１パスの間の足場ギャップを埋める。足場内の各ギャップに関しては、隣接し合うプライマリーパスを選択して、それらに対応付けられたバーコードを特定する。続いて、グローバルなプライマリーパスグラフをアセンブルするのに用いる方法と同じ方法で、これらのバーコードを含むリード群を、隣接し合うＣＮ１パスと併せて用いて、ローカルなプライマリーパスアセンブリーグラフをアセンブルする。各ＣＮ１パスから、他のプライマリーパスに連結する全てのパスを特定する。多くの場合、１つのパスのみが特定され、そのパスは、ギャップを埋めるパスとして使用できる。２つの隣接し合うＣＮ１プライマリーパスの間で、１個超のパスが特定される場合、リードサポート性が最も高いパスを用いて、隣接し合うＣＮ１プライマリーパスを継ぎ合わせて、ギャップを埋める。リードサポート性によって、２つのパス間の選択を行うことができない場合には、両方のパスをグラフに含めてもよく、または、ギャップが存在するままにすることもできる。
【０１４９】
完全なアセンブリーから、ゲノム全体の直鎖状グラフを作成し、このグラフには、残ったギャップまたは二重のパスが含まれないのが理想的である。しかしながら、多くの場合、この直鎖状グラフには、パスが二重か、またはギャップが残っている箇所がいくつか含まれ得るが、配列の全体的な順序は明らかになっている。残ったギャップまたは二重のパスに対しては、未補正の配列データ、すなわち、破棄した配列データについて更に検討して、早い段階でプロセスから除去したそれらの配列によって、いずれかのギャップまたは二重のパスに関する情報を与えるか決定してよい。あるいは、コピー数情報を用いて、曖昧なアセンブリーに関する情報を与える技法、またはリードペア情報を用いて、曖昧なアセンブリーに対する多数の解の相対的可能性を評価する技法など、他の曖昧性除去法を用いてよい。
【０１５０】
ある特定の態様では、本明細書に示されている方法は、コンピューターによる方法であって、その方法の少なくとも１つ以上のステップをコンピュータープログラムによって実行する方法である。いくつかの実施形態では、本明細書に示されている方法は、標準的コンピューターのハードドライブなどのコンピューター可読媒体に格納されたコンピュータープログラムで実行する。例えば、重複配列リードから少なくとも１つのコンセンサス配列を決定するコンピュータープログラムとしては、配列リードを提供または受信するコード、配列リード間の配列オーバーラップ領域を特定するコード、配列リードをアラインメントして、レイアウト、コンティグまたは足場を生成するコード、コンセンサス配列決定コード、アセンブリーを変換するかまたはコンピューターモニターに表示するコード、本明細書に記載されている様々なアルゴリズムを適用するコード、及びこれらのコードを含むコンピューター可読ストレージ媒体のうちの１つ以上を挙げることができる。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、重複配列セットから少なくとも１つのアセンブリーを決定するシステム（例えばデータ処理システム）は、プロセッサーと、動作時にそのプロセッサーに接続されるコンピューター可読媒体であって、メモリーを格納するコンピューター可読媒体とを含み、そのメモリーは、プロセッサーによる実行の命令を有し、この命令としては、配列リードの入力を受け付ける命令、配列リード間のオーバーラップ検出の命令、配列リードをアラインメントして、レイアウト、コンティグまたは足場を生成する命令、コンセンサス配列アルゴリズムを適用して、少なくとも１つのコンセンサス配列（例えば、「最善の」コンセンサス配列及び任意に１つ以上の追加のコンセンサス配列）を生成する命令、本発明の方法の様々なステップに関連する情報を演算／格納する命令、ならびにその方法の結果を記録する命令のうちの１つ以上が挙げられる。
【０１５２】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されているプロセスの様々なステップにおいて、情報及び／またはプログラムを使用し、結果を生成し、その結果を、コンピューター可読媒体（例えば、ハードドライブ、補助メモリー、外部メモリー、サーバー、データベース、可搬型メモリーデバイスなど）に格納する。例えば、本発明の方法で用いる情報と、本発明の方法によって生成される結果のうち、非一時的なコンピューター可読媒体に格納できる情報及び結果としては、入力配列リード情報、ペアワイズオーバーラップセット、新たに生成されたコンセンサス配列、クオリティー情報、テクノロジー情報、及び相同または参照配列情報が挙げられるが、これらに限らない。
【０１５３】
いくつかの態様では、本発明は、少なくとも１つの配列アセンブリーを決定する製造品であって、実行時に、本明細書に記載されているような本発明のステップを実施する１つ以上のプログラムを含む機械可読媒体を備える製造品を含む。
【０１５４】
当業者であれば、本明細書に示されている教示から分かるように、本発明は、ハードウェア及び／またはソフトウェアで実施することができる。本発明のいくつかの実施形態では、本発明の様々な態様は、クライアント側ロジックまたはサーバー側ロジックのいずれでも実施できる。当該技術分野において理解されるように、本発明またはその構成部分は、適切に構成された演算デバイスにロードされたときに、そのデバイスが、本発明に従って実行されるようにするロジック命令及び／またはデータを含む固定媒体プログラム構成部分内で具現化してもよい。当該技術分野において理解されるように、ロジック命令を含む固定媒体は、ビューワーのコンピューターに物理的にロードするために、固定媒体上のビューワーに送ってもよく、または、ロジック命令を含む固定媒体は、本明細書に示されているプロセスに従って、プログラム構成部分をダウンロードするために、通信媒体を通じてビューワーがアクセスするリモートサーバー、または１カ所または複数の遠隔地において、上記のハードウェア及び／またはソフトウェアを用いて処理するデータをユーザーがアップロードするリモートサーバーに存在してもよい。
【０１５５】
概して、本明細書に記載されているプロセスとともに用いる情報装置（またはデジタルデバイス）には、個別のコンピューターまたはパーソナルコンピューターの両方、ネットワークコンピューター、コンピューターメインフレームなどを含む従来のコンピューターシステムのような従来のロジックシステムが含まれる。これらのプロセスとの連動は、そのような従来の演算システムに限定しなくてもよく、これらに加えて、または代わりに、リモートデータアプリケーションと連動するいずれの情報装置も含まれてよく、デジタルテレビ、携帯電話／スマートフォン、パーソナルデジタルアシスタント、タブレット、ウェアラブル電子デバイス、例えば、Ｇｏｏｇｌｅ  Ｇｌａｓｓ、スマートウォッチなどのようなデバイスを挙げることができる。上記の種類のデバイスのいずれにおいても、本明細書に記載されているプロセスを実行するプログラミングは、そのデバイス自体のメモリー（メインメモリーもしくは補助メモリーのいずれか）に存在してもよく、または、他の場所及びデバイス、例えばコンピューターから、例えば、そのデバイス上のＡＰＩ、及び適切な通信ネットワーク、例えば、ＬＡＮ、ＷＡＮ、Ｗｉ−Ｆｉ、携帯システム、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ、もしくはその他の通信システムを通じて、このプログラミングにアクセスしてもよい。
【０１５６】
大腸菌ゲノム（Ｋ１２＿ＤＨ１０Ｂ株）を用いて、本明細書に記載されている新規アセンブルプロセスをモデル化した。ゲノムの物理的コピー６０個を平均サイズ５０キロベース（標準偏差５キロベース）まで剪断し、５０００個の分画にランダムに分割し、各分画に、固有のバーコードを含めた。各分画内で、バーコード・配列決定ライブラリーの作成プロセスをシミュレーションした。その後、１５０ｂｐのペアエンドリードを用いて、平均深度３０倍で、このライブラリーの配列決定のシミュレーションを行った。配列決定プロセスのシミュレーションには、実際の配列決定データに由来する経験的なエラー率モデルを組み込んだ。図６には、上記のモデル化データにおける新規アセンブルプロットが示されている。図示されているように、例えばバーコードのない短いリード配列のみに基づくデータにおける、６０ｋｂのＮ５０コンティグに対して、上記のアセンブルにより、７５０ｋｂのＮ５０コンティグが得られた。
【０１５７】
明確にするために、かつ理解のために、上記の発明について、ある程度詳細に説明したが、当業者であれば、本開示を読めば、本発明の真の範囲から逸脱せずに、形態及び詳細を様々に変化させることができるのは、当業者には明らかであろう。例えば、上記の全ての技法及び装置は、様々な組み合わせで使用することができる。例えば、パーティクルデリバリーは、記載されているようなアレイウェルサイジング法で実施できる。本願で引用されている全ての文献、特許、特許出願及び／またはその他の文書は、その個々の文献、特許、特許出願及び／またはその他の文書がそれぞれ、個々に、かつ別々に、あらゆる目的において、参照により援用されることが示されている場合と同程度に、参照により、あらゆる目的のために、その全体が援用される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１２Ｇ】
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【図１２Ｈ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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