(57)【要約】本発明は、癌に対する内因性免疫応答を増強するための組成物、方法、および装置を含む。装置および方法は、癌に対する、治療的免疫を対象にもたらす。2017514835.tif 000066
2017514835.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、装置：
(a)免疫抑制性タンパク質の阻害剤;
(b)足場組成物;
(c)細胞動員組成物;および
(d)該足場組成物の内部に組み込まれているかまたは該足場組成物の表面にコーティングされており、かつ該装置の内部にある細胞または該装置に動員された細胞の改変を引き起こす、生理活性組成物。
【請求項２】
免疫抑制性タンパク質が、細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4(CTLA4)、プログラム細胞死タンパク質1(PD1)、プログラム細胞死タンパク質1リガンド(PDL1)、リンパ球活性化遺伝子3(LAG3)、B7-H3、B7-H4、およびT細胞膜タンパク質3(TIM3)からなる群より選択される、請求項1記載の装置。
【請求項３】
免疫抑制性タンパク質がCTLA4である、請求項2記載の装置。
【請求項４】
免疫抑制性タンパク質がPD1である、請求項2記載の装置。
【請求項５】
CTLA4阻害剤およびPD1阻害剤を含む、請求項1記載の装置。
【請求項６】
阻害剤がタンパク質、ペプチド、または核酸を含む、請求項1記載の装置。
【請求項７】
阻害剤が抗体またはその断片を含む、請求項2記載の装置。
【請求項８】
抗体またはその断片がCTLA4に結合する、請求項7記載の装置。
【請求項９】
抗体またはその断片がイピリムマブ、トレメリムマブ、またはその断片である、請求項8記載の装置。
【請求項１０】
阻害剤がPD1に結合し、かつタンパク質である、請求項2記載の装置。
【請求項１１】
阻害剤がMDX-1106、MK3475、CT-011、AMP-224、またはその断片である、請求項10記載の装置。
【請求項１２】
阻害剤がPDL2-免疫グロブリン(Ig)融合タンパク質である、請求項10記載の装置。
【請求項１３】
阻害剤がタンパク質であり、かつPDL1に結合する、請求項2記載の装置。
【請求項１４】
阻害剤がMDX-1105である、請求項13記載の装置。
【請求項１５】
阻害剤がタンパク質であり、かつLAG3に結合する、請求項2記載の装置。
【請求項１６】
阻害剤がLAG3-Ig融合タンパク質である、請求項15記載の装置。
【請求項１７】
LAG3-Ig融合タンパク質がIMP321である、請求項16記載の装置。
【請求項１８】
阻害剤がタンパク質であり、かつB7-H3に結合する、請求項2記載の装置。
【請求項１９】
阻害剤がMGA271である、請求項18記載の装置。
【請求項２０】
細胞動員組成物が免疫細胞を動員する、請求項1記載の装置。
【請求項２１】
免疫細胞が抗原提示細胞を含む、請求項20記載の装置。
【請求項２２】
抗原提示細胞が樹状細胞を含む、請求項21記載の装置。
【請求項２３】
免疫細胞が、マクロファージ、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、または樹状細胞を含む、請求項20記載の装置。
【請求項２４】
足場が、開口し相互接続したマクロ孔を含む、請求項1記載の装置。
【請求項２５】
細胞の遊走を誘導または促進することができる展開シグナルをさらに含む、請求項1記載の装置。
【請求項２６】
展開シグナルがタンパク質、ペプチド、または核酸を含む、請求項25記載の装置。
【請求項２７】
展開シグナルが、
(i)細胞の遊走を誘導し、かつ勾配を有するかもしくは勾配を形成することができる、1種類もしくは複数種の因子;
(ii)装置から外に細胞が遊走するのを誘導するタンパク質をコードする核酸分子;または
(iii)細胞動員組成物の枯渇もしくは拡散
を含む、請求項25記載の装置。
【請求項２８】
細胞動員組成物がサイトカイン、ケモカイン、または増殖因子を含む、請求項1記載の装置。
【請求項２９】
細胞動員組成物がGM-CSF、Flt3L、またはCCL20を含む、請求項1記載の装置。
【請求項３０】
生理活性組成物が標的抗原組成物を含む、請求項1記載の装置。
【請求項３１】
細胞動員組成物が免疫細胞を装置に動員し、ここで該免疫細胞が標的抗原に遭遇し、かつここで、該装置の外側にあるリンパ節組織への該免疫細胞の退出を展開シグナルが誘導するまで該免疫細胞が存在する、請求項1記載の装置。
【請求項３２】
退出時の免疫細胞の免疫活性化レベルが、装置に入る前の該レベルを上回る、請求項31記載の装置。
【請求項３３】
退出時の免疫細胞が、装置に入る前の初回刺激レベルと比較して抗原で初回刺激される、請求項31記載の装置。
【請求項３４】
標的抗原組成物が癌抗原または癌由来抗原を含む、請求項30記載の装置。
【請求項３５】
癌細胞が、メラノーマ、中枢神経系(CNS)癌、CNS生殖細胞腫瘍、肺癌、白血病、多発性骨髄腫、腎臓癌、悪性神経膠腫、髄芽腫、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、線維肉腫、膵臓癌、胃癌、頭頚部癌、または結腸直腸癌に由来する、請求項1記載の装置。
【請求項３６】
癌由来抗原が、抗原のMAGEシリーズ、MART-1/メランA、チロシナーゼ、ガングリオシド、gp100、GD-2、O-アセチル化GD-3、GM-2、MUC-1、Sos1、プロテインキナーゼC結合タンパク質、逆転写酵素タンパク質、AKAPタンパク質、VRK1、KIAA1735、T7-1、T11-3、T11-9、ホモ・サピエンス(Homo Sapiens)テロメラーゼ酵素(hTRT)、サイトケラチン-19(CYFRA21-1)、扁平上皮癌抗原1(SCCA-1)、(タンパク質T4-A)、扁平上皮癌抗原2(SCCA-2)、卵巣癌抗原CA125(1A1-3B)(KIAA0049)、ムチン1(腫瘍関連ムチン)、(癌腫関連ムチン)、(多型上皮ムチン)、(PEM)、(PEMT)、(エピシアリン)、(腫瘍関連上皮膜抗原)、(EMA)、(H23AG)、(ピーナッツ反応性尿中ムチン(PEANUT-REACTIVE URINARY MUCIN))、(PUM)、(乳癌関連抗原DF3)、CTCL腫瘍抗原se1-1、CTCL腫瘍抗原se14-3、CTCL腫瘍抗原se20-4、CTCL腫瘍抗原se20-9、CTCL腫瘍抗原se33-1、CTCL腫瘍抗原se37-2、CTCL腫瘍抗原se57-1、CTCL腫瘍抗原se89-1、前立腺特異的膜抗原、5T4癌胎児性栄養膜糖タンパク質、Orf73カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、MAGE-C1(癌/精巣抗原CT7)、MAGE-B1抗原(MAGE-XP抗原)(DAM10)、MAGE-B2抗原(DAM6)、MAGE-2抗原、MAGE-4a抗原、MAGE-4b抗原、結腸癌抗原NY-CO-45、肺癌抗原NY-LU-12バリアントA、癌関連表面抗原、腺癌抗原ART1、Paraneoplastic associated brain-testis-cancer antigen(癌ニューロン抗原MA2; 腫瘍随伴性ニューロン抗原)、Neuro-oncological ventral antigen 2(NOVA2)、肝細胞癌抗原遺伝子520、腫瘍関連抗原CO-029、腫瘍関連抗原MAGE-X2、Synovial sarcoma, X breakpoint 2、Squamous cell carcinoma antigen recognized by T cell、Serologically defined colon cancer antigen 1、Serologically defined breast cancer antigen NY-BR-15、Serologically defined breast cancer antigen NY-BR-16、クロモグラニンA、副甲状腺分泌タンパク質1、DUPAN-2、CA 19-9、CA 72-4、CA 195、および癌胎児抗原(CEA)からなる群より選択される、請求項34記載の装置。
【請求項３７】
生理活性組成物が腫瘍溶解産物を含む、請求項1記載の装置。
【請求項３８】
生理活性組成物が、放射線照射された腫瘍細胞を含む、請求項1記載の装置。
【請求項３９】
生理活性組成物が癌細胞表面抗原を含む、請求項1記載の装置。
【請求項４０】
生理活性組成物がウイルス抗原または細菌抗原を含む、請求項1記載の装置。
【請求項４１】
アジュバントをさらに含む、請求項1記載の装置。
【請求項４２】
アジュバントがCpGリッチオリゴヌクレオチドを含む、請求項41記載の装置。
【請求項４３】
アジュバントが凝縮CpGオリゴヌクレオチドを含む、請求項42記載の装置。
【請求項４４】
アジュバントがPEI-CpGオリゴヌクレオチドを含む、請求項43記載の装置。
【請求項４５】
足場がRGD改変アルギン酸塩をさらに含む、請求項1記載の装置。
【請求項４６】
toll様受容体(TLR)アゴニストをさらに含む、請求項1記載の装置。
【請求項４７】
TLRアゴニストがTLR3に優先的に結合する、請求項46記載の装置。
【請求項４８】
TLRアゴニストがTLR3アゴニストを含む、請求項46記載の装置。
【請求項４９】
TLR3アゴニストがポリイノシン-ポリシチジル酸(ポリI:C)またはPEI-ポリ(I:C)を含む、請求項48記載の装置。
【請求項５０】
足場がヒドロゲルまたは多孔性ポリマーを含み、該足場が、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、PLGA、アルギン酸塩、ゼラチン、コラーゲン、アガロース、ポリ(リジン)、ポリヒドロキシ酪酸塩、ポリ-ε-カプロラクトン、ポリホスファジン、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(アルキレンオキシド)、ポリ(エチレンオキシド)、ポリ(アリルアミン)、ポリ(アクリル酸塩)、ポリ(4-アミノメチルスチレン)、プルロニックポリオール、ポリオキサマー、ポリ(ウロン酸)、ポリ(無水物)、またはポリ(ビニルピロリドン)のポリマーまたはコポリマーを含む、請求項1記載の装置。
【請求項５１】
多孔性ポリマーがガス発泡によって生じる、請求項50記載の装置。
【請求項５２】
ビーズ、ペレット、シート、またはディスクの形態である、請求項1記載の装置。
【請求項５３】
その必要がある対象において癌細胞を殺滅する方法であって、請求項1記載の装置を投与する工程を含む、方法。
【請求項５４】
その必要がある対象において癌細胞を殺滅する方法であって、
(a)免疫抑制性タンパク質の阻害剤と、
(b) (i)足場組成物、
(ii)細胞動員組成物、および
(iii)該足場組成物の内部に組み込まれているかまたは該足場組成物の表面にコーティングされており、かつ該装置の内部にある細胞または該装置に動員された細胞の改変を引き起こす、生理活性組成物
を含む、装置と
を投与する工程を含む、方法。
【請求項５５】
足場が、開口し相互接続したマクロ孔を含み、体内の別の部位への改変細胞の遊走が、該開口し相互接続したマクロ孔によっておよび展開シグナルによって促進される、請求項54記載の方法。
【請求項５６】
体内の他の部位が、近傍のまたは遠方の組織標的である、請求項55記載の方法。
【請求項５７】
阻害剤が装置の内部または表面に存在する、請求項54記載の方法。
【請求項５８】
阻害剤が足場組成物の内部または表面にコーティングされる、請求項57記載の方法。
【請求項５９】
阻害剤が装置の内部にも表面にも存在しない、請求項54記載の方法。
【請求項６０】
阻害剤が足場組成物の内部にも表面にもコーティングされない、請求項59記載の方法。
【請求項６１】
阻害剤および装置が一緒に製剤化される、請求項54記載の方法。
【請求項６２】
阻害剤および装置が別々に製剤化される、請求項54記載の方法。
【請求項６３】
阻害剤および装置が対象に同時に投与される、請求項62記載の方法。
【請求項６４】
阻害剤および装置が対象に連続して投与される、請求項62記載の方法。
【請求項６５】
装置が対象に皮下移植される、請求項53または54記載の方法。
【請求項６６】
阻害剤が静脈内投与されるか、腹腔内投与されるか、皮下投与されるか、経口投与されるか、皮内投与されるか、吸入により投与されるか、経粘膜投与されるか、または直腸投与される、請求項54記載の方法。
【請求項６７】
阻害剤が注射、注入、または吸入によって投与される、請求項54記載の方法。
【請求項６８】
阻害剤が0.01〜10mg/kg体重の投与量で投与される、請求項54記載の方法。
【請求項６９】
阻害剤が0.01〜30mg/用量の量で投与される、請求項54記載の方法。
【請求項７０】
対象が癌細胞を含み、癌細胞が低免疫原性である、請求項53または請求項54記載の方法。
【請求項７１】
癌細胞が、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)を介した溶解に抵抗性である、請求項70記載の方法。
【請求項７２】
癌細胞が、ナチュラルキラー(NK)細胞を介した殺滅に抵抗性である、請求項70記載の方法。
【請求項７３】
対象が自己抗体を含まない、請求項53または54記載の方法。
【請求項７４】
免疫抑制性タンパク質の阻害剤がCTLA4阻害剤およびPD1阻害剤を含む、請求項54記載の方法。
【請求項７５】
CTLA4阻害剤が抗CTLA-4抗体を含み、PD1阻害剤が抗PD1抗体を含む、請求項74記載の方法。
【請求項７６】
足場がヒドロゲルまたは多孔性ポリマーを含み、該足場が、ポリ(D,L-ラクチド-コ-グリコリド)(PLG)のポリマーまたはコポリマーを含む、請求項54記載の方法。
【請求項７７】
免疫抑制Treg細胞に比べて細胞傷害性T細胞が強化される、請求項54記載の方法。
【請求項７８】
装置が投与される前または投与された後に、免疫抑制性タンパク質の阻害剤が投与される、請求項54記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、35U.S.C.119条(e)の下で、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、2014年4月30日に出願された米国特許仮出願第61/986,600号に係る優先権を主張する。
【０００２】
政府支援
本発明は、米国立衛生研究所助成金番号R01 EB015498により付与された政府支援を受けてなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
多くの癌は宿主免疫系を勝手に使い、内因性抗腫瘍免疫応答から逃れるので処置に対して不応性である。癌細胞が免疫系から癌細胞が逃れる、このような機構の1つは免疫抑制性タンパク質をアップレギュレートすることによる機構である。従って、これらの免疫抑制性タンパク質を遮断する薬剤が、内因性抗腫瘍免疫応答を再び可能にする潜在的な療法として探索されてきた。しかしながら、これらの薬剤は単独で用いられた場合、低免疫原性の腫瘍の殺滅において効果がない。従って、内因性抗腫瘍免疫応答を、特に、低免疫原性の腫瘍において促進することによって癌を予防または処置する組成物および方法が必要とされている。本発明は、この必要に取り組む。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、T細胞活性と抗腫瘍免疫応答を高めるための、免疫チェックポイント抗体と組み合わせた材料ベースの癌ワクチン(例えば、癌ワクチン装置)を特徴とする。
【０００５】
本発明の装置は、免疫抑制性タンパク質の阻害剤;足場組成物;細胞動員組成物;および生理活性組成物を含み、生理活性組成物は足場組成物の内部に組み込まれているかまたは足場組成物の表面にコーティングされており、かつ装置の内部にある細胞または装置に動員された細胞の改変を引き起こす。
【０００６】
例えば、免疫抑制性タンパク質は、免疫細胞の活性を下げる、および/または阻害するタンパク質である。例えば、免疫抑制性タンパク質は、T細胞、B細胞、NK細胞、または樹状細胞の活性を下げる、および/または阻害する。例えば、T細胞、B細胞、NK細胞、もしくは樹状細胞の活性が下がるかまたは阻害されると、抗原(例えば、癌細胞抗原)に対する内因性免疫応答が低下する。例えば、免疫抑制性タンパク質はT細胞エフェクター活性および/またはNK細胞殺滅活性を下げる、および/または阻害する。場合によっては、免疫抑制性タンパク質は細胞傷害性Tリンパ球(CTL)の活性を低減するかまたは阻害する。例えば、免疫抑制性タンパク質はCTLを介した標的細胞の溶解を低減するかまたは阻害する。例えば、免疫抑制性タンパク質は免疫チェックポイントタンパク質(例えば、CTLA4またはPD1)である。例えば、免疫抑制性タンパク質(例えば、CTLA4)はCD80および/またはCD86との結合においてCD28と競合し、それによって、T細胞活性化を妨害する。例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Pardoll et al. Nat. Reviews Cancer.(2012)12:252-264を参照されたい。例えば、免疫抑制性タンパク質(例えば、PD1、PDL1、またはPDL2)は、T細胞活性化に関与するキナーゼまたはホスファターゼ(例えば、SHP2)を阻害する。例えば、免疫抑制性タンパク質は、T細胞と抗原提示細胞(APC)が接触する期間またはT細胞と標的細胞が接触する期間を調整する。例えば、免疫抑制性タンパク質(例えば、CTLA4またはPD1)はTreg細胞の免疫抑制機能を強化する。
【０００７】
一部の態様では、免疫抑制性タンパク質は、細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4(CTLA4)、プログラム細胞死タンパク質1(PD1)、プログラム細胞死タンパク質1リガンド(PDL1)、リンパ球活性化遺伝子3(LAG3)、B7-H3、B7-H4、またはT細胞膜タンパク質3(TIM3)である。例えば、免疫抑制性タンパク質はCTLA4である。他の例では、免疫抑制性タンパク質はPD1である。
【０００８】
場合によっては、装置はCTLA4阻害剤およびPD1阻害剤を含む。例えば、阻害剤は、タンパク質、ペプチド、または核酸、例えば、抗体またはその断片を含む。ある例では、抗体またはその断片はCTLA4に結合する。例示的な抗CTLA4抗体またはその断片には、イピリムマブ、トレメリムマブ(Tremelimumab)、またはその断片が含まれる。他の例では、阻害剤はPD1に結合し、阻害剤は、タンパク質、例えば、MDX-1106、MK3475、CT-011、AMP-224、またはその断片である。場合によっては、阻害剤はPDL2-免疫グロブリン(Ig)融合タンパク質である。
【０００９】
一部の態様では、阻害剤はタンパク質であり、阻害剤、例えば、MDX-1105はPDL1に結合する。
【００１０】
他の例示的な阻害剤は、LAG3に結合するタンパク質、例えば、LAG3-Ig融合タンパク質、例えば、IMP321;またはB7-H3に結合するタンパク質、例えば、MGA271である。
【００１１】
装置の細胞動員組成物は免疫細胞を動員する。免疫細胞は、抗原提示細胞、例えば、樹状細胞、マクロファージ、T細胞、B細胞、またはナチュラルキラー(NK)細胞を含む。
【００１２】
装置は、開口し相互接続したマクロ孔を含む足場を含有する。装置は、細胞の遊走を誘導または促進することができる展開シグナルをさらに含む。ある例では、展開シグナルは、タンパク質、ペプチド、または核酸を含む。例えば、展開シグナルは、(i)細胞の遊走を誘導し、かつ勾配を有するかもしくは勾配を形成することができる、1種類もしくは複数種の因子;(ii) 細胞が装置から出て遊走するのを誘導するタンパク質をコードする核酸分子;または(iii)細胞動員組成物の枯渇もしくは拡散を含む。
【００１３】
例示的な細胞動員組成物はサイトカイン、ケモカイン、または増殖因子を含む。例えば、細胞動員組成物はGM-CSF、Flt3L、またはCCL20を含む。
【００１４】
場合によっては、装置の生理活性組成物は標的抗原組成物を含む。
【００１５】
一部の態様では、細胞動員組成物は免疫細胞を装置に動員し、ここで免疫細胞が標的抗原に遭遇し、かつ、装置の外側にあるリンパ節組織への免疫細胞の退出が展開シグナルにより誘導されるまで免疫細胞が存在する。
【００１６】
ある例では、退出時の免疫細胞の免疫活性化レベルは、装置に入る前の該レベルを上回る。
【００１７】
例えば、退出時の免疫細胞は、装置に入る前の初回刺激レベルと比較して抗原で刺激されている。場合によっては、装置に動員された免疫細胞は、2時間〜4週間、例えば、2時間〜24時間、2〜6日間、または1〜4週間にわたって装置に存在し続ける。
【００１８】
場合によっては、装置の標的抗原組成物は癌抗原または癌由来抗原を含む。癌抗原、癌由来抗原、または癌細胞は、例えば、メラノーマ、中枢神経系(CNS)癌、CNS生殖細胞腫瘍、肺癌、白血病、多発性骨髄腫、腎臓癌、悪性神経膠腫、髄芽腫(medulloblatoma)、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、線維肉腫、膵臓癌、胃癌、頭頚部癌、または結腸直腸癌に由来する。例えば、癌細胞は固形癌または血液癌に由来する。血液癌は、例えば、白血病またはリンパ腫である。白血病は、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性リンパ性白血病(CLL)、小リンパ球性リンパ腫(SLL)、慢性骨髄性白血病(CML)、または急性単球性白血病(AMoL)である。リンパ腫は、濾胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫(例えば、結節硬化型サブタイプ、混合細胞型サブタイプ、リンパ球豊富型サブタイプ、もしくはリンパ球減少型サブタイプ)、または非ホジキンリンパ腫である。例示的な固形癌には、メラノーマ(例えば、切除不能な転移性メラノーマ)、腎臓癌(例えば、腎細胞癌)、前立腺癌(例えば、転移性去勢抵抗性前立腺癌)、卵巣癌(例えば、上皮卵巣癌、例えば、転移性上皮卵巣癌)、乳癌(例えば、トリプルネガティブ乳癌)、および肺癌(例えば、非小細胞肺癌)が含まれるが、これに限定されない。
【００１９】
装置は、その必要がある対象に投与される。例えば、対象は哺乳動物、例えば、ヒトである。対象は、本発明の装置/ワクチンおよび/または阻害剤を用いた投与前に、癌療法(例えば、NSCLC、転移性メラノーマ、またはRCCに対する癌療法)による処置を以前に受けた。例えば、対象は、本発明の阻害剤による処置を以前に受けた。例えば、対象は、本発明の1種類または複数種の阻害剤による処置を以前に受けた。例えば、対象は、癌ワクチン(例えば、本発明の癌ワクチン装置)と同時投与されることなく本発明の阻害剤による処置を以前に受けた。哺乳動物は、任意の哺乳動物、例えば、ヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、ならびに家畜または食料消費のために飼育される動物、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ、およびヤギである。好ましい態様において、哺乳動物はヒトである。
【００２０】
場合によっては、装置は癌由来抗原を含有する。例示的な癌由来抗原が本明細書において説明される。例えば、癌由来抗原/腫瘍抗原は、腫瘍細胞に特有の、および/または変異から生じた抗原、例えば、表1に示した抗原を含む。別の例では、癌由来抗原は、共通抗原、例えば、腫瘍特異的抗原、分化抗原、および/または過剰発現している抗原、例えば、表2〜4に示した腫瘍特異的抗原、分化抗原、および/または過剰発現している抗原を含む。ある例では、癌由来抗原は、SEQ ID NO: 35〜434からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチドを含む。
【００２１】
例えば、癌由来抗原は、抗原のMAGEシリーズ、MART-1/メランA、チロシナーゼ、ガングリオシド、gp100、GD-2、O-アセチル化GD-3、GM-2、MUC-1、Sos1、プロテインキナーゼC結合タンパク質、逆転写酵素タンパク質、AKAPタンパク質、VRK1、KIAA1735、T7-1、T11-3、T11-9、ホモ・サピエンス(Homo Sapiens)テロメラーゼ酵素(hTRT)、サイトケラチン-19(CYFRA21-1)、扁平上皮癌抗原1(SCCA-1)、(タンパク質T4-A)、扁平上皮癌抗原2(SCCA-2)、卵巣癌抗原CA125(1A1-3B)(KIAA0049)、ムチン1(腫瘍関連ムチン)、(癌腫関連ムチン)、(多型上皮ムチン)、(PEM)、(PEMT)、(エピシアリン)、(腫瘍関連上皮膜抗原)、(EMA)、(H23AG)、(ピーナッツ反応性尿中ムチン(PEANUT-REACTIVE URINARY MUCIN))、(PUM)、(乳癌関連抗原DF3)、CTCL腫瘍抗原se1-1、CTCL腫瘍抗原se14-3、CTCL腫瘍抗原se20-4、CTCL腫瘍抗原se20-9、CTCL腫瘍抗原se33-1、CTCL腫瘍抗原se37-2、CTCL腫瘍抗原se57-1、CTCL腫瘍抗原se89-1、前立腺特異的膜抗原、5T4癌胎児性栄養膜糖タンパク質、Orf73カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、MAGE-C1(癌/精巣抗原CT7)、MAGE-B1抗原(MAGE-XP抗原)(DAM10)、MAGE-B2抗原(DAM6)、MAGE-2抗原、MAGE-4a抗原、MAGE-4b抗原、結腸癌抗原NY-CO-45、肺癌抗原NY-LU-12バリアントA、癌関連表面抗原、腺癌抗原ART1、Paraneoplastic associated brain-testis-cancer antigen(癌ニューロン抗原MA2; 腫瘍随伴性ニューロン抗原)、Neuro-oncological ventral antigen 2(NOVA2)、肝細胞癌抗原遺伝子520、腫瘍関連抗原CO-029、腫瘍関連抗原MAGE-X2、Synovial sarcoma, X breakpoint 2、Squamous cell carcinoma antigen recognized by T cell、Serologically defined colon cancer antigen 1、Serologically defined breast cancer antigen NY-BR-15、Serologically defined breast cancer antigen NY-BR-16、クロモグラニンA、副甲状腺分泌タンパク質1、DUPAN-2、CA19-9、CA72-4、CA195、および癌胎児抗原(CEA)からなる群より選択される。
【００２２】
他の場合では、装置の生理活性組成物は、腫瘍溶解産物、例えば、メラノーマ腫瘍に由来する溶解産物を含む腫瘍溶解産物を含む。他の場合では、生理活性組成物は、放射線照射された腫瘍細胞、例えば、メラノーマ細胞(例えば、B16-F10細胞)を含む放射線照射された腫瘍細胞を含む。
【００２３】
生理活性組成物はまた癌細胞表面抗原またはウイルス抗原もしくは細菌抗原も含んでもよい。
【００２４】
一部の態様では、装置は、アジュバント、例えば、CpGリッチオリゴヌクレオチド、例えば、凝縮CpGオリゴヌクレオチドをさらに含む。例示的な凝縮CpGオリゴヌクレオチドにはPEI-CpGが含まれる。
【００２５】
ある例では、足場はRGD改変アルギン酸塩をさらに含む。他の場合では、装置は、toll様受容体(TLR)アゴニスト、例えば、TLR3に優先的に結合するTLRアゴニストをさらに含む。例えば、TLRアゴニストは、TLR3アゴニスト、例えば、ポリイノシン-ポリシチジル酸(ポリI:C)またはPEI-ポリ(I:C)を含む。
【００２６】
場合によっては、足場はヒドロゲルまたは多孔性ポリマーを含み、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、PLGA、アルギン酸塩、ゼラチン、コラーゲン、アガロース、ポリ(リジン)、ポリヒドロキシ酪酸塩、ポリ-ε-カプロラクトン、ポリホスファジン(polyphosphazine)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(アルキレンオキシド)、ポリ(エチレンオキシド)、ポリ(アリルアミン)、ポリ(アクリル酸塩)、ポリ(4-アミノメチルスチレン)、プルロニック(pluronic)ポリオール、ポリオキサマー(polyoxamer)、ポリ(ウロン酸)、ポリ(無水物)、またはポリ(ビニルピロリドン)のポリマーまたはコポリマーを含む。例えば、好ましいポリマーはPLGまたはアルギン酸塩である。
【００２７】
例えば、多孔性ポリマーはガス発泡によって生じる。
【００２８】
場合によっては、装置はビーズ、ペレット、シート、またはディスクの形態である。
【００２９】
本発明はまた、その必要がある対象において癌細胞を殺滅する方法であって、本明細書に記載の装置を投与する工程を含む方法も特徴とする。
【００３０】
さらに、本発明は、その必要がある対象において癌細胞を殺滅する方法であって、(a)免疫抑制性タンパク質の阻害剤と、(b) (i)足場組成物、(ii)細胞動員組成物、および(iii)足場組成物の内部に組み込まれているかまたは足場組成物の表面にコーティングされており、装置の内部にある細胞または装置に動員された細胞の改変を引き起こす生理活性組成物を含む装置とを投与する工程を含む、方法を提供する。
【００３１】
例えば、足場は、開口し相互接続したマクロ孔を含み、体内の別の部位への改変細胞の遊走は、開口し相互接続したマクロ孔によっておよび展開シグナルによって促進される。
【００３２】
場合によっては、体内の他の部位は、近傍または遠方の組織標的である。
【００３３】
例えば、阻害剤は装置の内部または表面に存在する。または、もしくはさらに、阻害剤は、足場組成物の内部または表面にコーティングされる。
【００３４】
場合によっては、阻害剤は装置の内部にも表面にも存在しない。例えば、阻害剤は足場組成物の内部にも表面にもコーティングされない。例えば、阻害剤および装置は別々に製剤化される。
【００３５】
他の場合では、阻害剤および装置は一緒に製剤化される。
【００３６】
ある例では、阻害剤および装置は対象に同時に投与される。または、阻害剤および装置は対象に連続して投与される。
【００３７】
一部の態様では、装置は対象に皮下移植される。例えば、阻害剤は静脈内投与されるか、腹腔内投与されるか、皮下投与されるか、経口投与されるか、皮内投与されるか、吸入により投与されるか、経粘膜投与されるか、または直腸投与される。例えば、阻害剤は注射、注入、または吸入によって投与される。
【００３８】
場合によっては、阻害剤は、0.01〜10mg/kg(例えば、0.01mg/kg、0.05mg/kg、0.1mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、5mg/kg、または10mg/kg)体重の投与量で投与される。例えば、阻害剤は、0.01〜30mg(例えば、0.01mg、0.05mg、0.1mg、0.5mg、1mg、5mg、10mg、20mg、または30mg)/用量の量で投与される。
【００３９】
本発明の一部の方法では、対象は癌細胞を含み、癌細胞は低免疫原性である。例えば、癌細胞は、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)を介した溶解に対して抵抗性である、および/またはナチュラルキラー(NK)細胞を介した殺滅に対して抵抗性である。他の例では、対象は自己抗体を含まない。例えば、自己抗体とは、例えば、個体が腫瘍溶解産物で免疫されたか特定の精製抗原で免疫されたかに関係なく、個体自身のタンパク質の1つまたは複数に対して作られた、免疫系によって産生された抗体である。例えば、自己抗体は癌細胞に対して作られる。場合によっては、対象は癌細胞に対する自己抗体を含まない。
【００４０】
場合によっては、本発明は、癌ワクチン装置と免疫抑制性タンパク質の阻害剤の組み合わせを利用する方法を提供する。例えば、免疫抑制性タンパク質の阻害剤はCTLA4阻害剤およびPD1阻害剤を含む。場合によっては、CTLA4阻害剤は抗CTLA-4抗体を含み、PD1阻害剤は抗PD1抗体を含む。好ましくは、ワクチンおよび抗体が投与された後に、免疫抑制Treg細胞と比べて腫瘍内細胞傷害性T細胞が強化される。すなわち、癌ワクチン装置と免疫抑制性タンパク質の阻害剤の組み合わせを利用すると、免疫抑制細胞、例えばTreg細胞と比較して、腫瘍内エフェクターT細胞(例えば、細胞傷害性T細胞)が優先的に作製および増殖される。例えば、本明細書に記載の方法は、ワクチン接種単独と比較して少なくとも2倍のCD8(+)エフェクターT細胞とTreg細胞の腫瘍内比をもたらす。他の例では、癌ワクチン装置および免疫抑制性タンパク質の阻害剤は、CD8(+)エフェクターT細胞とTreg細胞の腫瘍内比を少なくとも2倍増加させ、例えば、CD8(+)エフェクターT細胞とTreg細胞の腫瘍内比を少なくとも3倍増加させる;少なくとも4倍増加させる、少なくとも5倍増加させる、少なくとも6倍増加させる、少なくとも7倍増加させる、少なくとも8倍増加させる、少なくとも9倍増加させる、少なくとも10倍増加させる、少なくとも11倍増加させる、少なくとも12倍増加させる、少なくとも13倍増加させる、少なくとも14倍増加させる、少なくとも15倍増加させる、少なくとも16倍増加させる、少なくとも17倍増加させる、少なくとも18倍増加させる、少なくとも19倍増加させる、または少なくとも20倍増加させる。
【００４１】
場合によっては、効力および腫瘍阻害効果を維持するために、癌ワクチン装置が投与される前、投与されると同時に、および/または投与された後に、免疫抑制性タンパク質の阻害剤は投与される。好ましくは、癌ワクチン装置が投与された後、抗体処置は継続する。例えば、抗体処置は、癌ワクチン装置が投与された後、少なくとも1日、例えば、2日、3日、4日、5日、6日、7日、2週間、3週間、4週間、2ヶ月、6ヶ月、7ヶ月、8ヶ月、9ヶ月、10ヶ月、11ヶ月、12ヶ月、2年、3年、4年、もしくは5年にわたって、またはそれより長く継続する。
【００４２】
場合によっては、足場は、ヒドロゲルまたは多孔性ポリマー、例えば、ポリ(D,L-ラクチド-コ-グリコリド)(PLG)のポリマーまたはコポリマーを含む。
【００４３】
本発明のワクチンを作製する組成物および方法は、米国特許出願第13/741,271号、米国特許出願公開第2013-0202707号、および米国特許第8,067,237号に記載されている。これらの内容は、その全体が本明細書に組み入れられる。
【００４４】
本発明は、インサイチューで樹状細胞などの免疫細胞を刺激するための装置および方法を提供する。例えば、癌ワクチン接種のために装置の状況でToll様受容体(TLR)アゴニストの提示が用いられる。構造ポリマー装置に埋め込まれたTLRアゴニストの組み入れおよび提示によって、癌ワクチン接種に重要なDCサブセットである、CD8(+)樹状細胞(DC)(ヒトではCD141+DCに対応する)および形質細胞様DCが特異的に刺激される。
【００４５】
従って、本発明は、多孔性ポリマー構造組成物、腫瘍抗原、およびtoll様受容体(TLR)アゴニストを含む装置を提供する。例えば、装置は、ポリマー構造組成物、腫瘍抗原、およびtoll様受容体(TLR)アゴニストの組み合わせを含み、TLRアゴニストは、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12、およびTLR13からなる群より選択される。例えば、ポリマー構造はポリ(D,L-ラクチド-コ-グリコリド)(PLG)を含む。例示的なTLRアゴニストには、病原体関連分子パターン(PAMP)、例えば、感染を模倣する組成物、例えば、細菌由来免疫調節剤が含まれる。TLRアゴニストには核酸または脂質組成物(例えば、モノホスホリル脂質A(MPLA))が含まれる。
【００４６】
ある特定の核酸は、TLRアゴニスト、例えば、TLR1アゴニスト、TLR2アゴニスト、TLR3アゴニスト、TLR4アゴニスト、TLR5アゴニスト、TLR6アゴニスト、TLR7アゴニスト、TLR8アゴニスト、TLR9アゴニスト、TLR10アゴニスト、TLR11アゴニスト、TLR12アゴニスト、またはTLR13アゴニストとして機能する。一例では、TLRアゴニストは、TLR9アゴニスト、例えば、シトシン-グアノシンオリゴヌクレオチド(CpG-ODN)、ポリ(エチレンイミン)(PEI)凝縮オリゴヌクレオチド(ODN)、例えば、PEI-CpG-ODN、または二本鎖デオキシリボ核酸(DNA)を含む。TLR9アゴニストは形質細胞様DCを刺激するのに有用である。例えば、装置は、5μg、10μg、25μg、50μg、100μg、250μg、または500μgのCpG-ODNを含む。
【００４７】
別の例では、TLRアゴニストは、TLR3アゴニスト、例えば、ポリイノシン-ポリシチジル酸(ポリI:C)、PEI-ポリ(I:C)、ポリアデニル酸-ポリウリジル酸(ポリ(A:U))、PEI-ポリ(A:U)、または二本鎖リボ核酸(RNA)を含む。
【００４８】
TLR3アゴニストは、マウスではCD8+DC、ヒトではCD141+DCを刺激するのに有用である。複数種のTLRアゴニスト、例えば、TLR3アゴニスト、例えば、ポリI:C、およびTLR9アゴニスト、例えば、CpGが相乗作用して抗腫瘍免疫応答を活性化する。例えば、装置は、TLR3アゴニスト、例えば、ポリ(I:C)、およびTLR9アゴニスト(CpG-ODN)またはPEI-CpG-ODNを含む。好ましくは、TLRアゴニストは、TLR3アゴニスト、ポリ(I:C)、およびTLR9アゴニスト、CpG-ODNを含む。CpG-ODNまたはP(I:C)しか組み入れていないワクチンと比較して、ポリ(I:C)とCpG-ODNの組み合わせは相乗作用する。
【００４９】
場合によっては、TLRアゴニストは、リポ多糖(LPS)、モノホスホリル脂質A(MPLA)、熱ショックタンパク質、フィブリノゲン、ヘパリン硫酸またはその断片、ヒアルロン酸またはその断片、ニッケル、オピオイド、α1-酸性糖タンパク質(AGP)、RC-529、マウスβ-デフェンシン2、および完全フロイントアジュバント(CFA)からなる群より選択されるTLR4アゴニストを含む。他の場合では、TLRアゴニストはTLR5アゴニストを含み、TLR5アゴニストはフラジェリンである。他の適切なTLRアゴニストには、一本鎖RNA、グアノシンアナログ、イミダゾキノリン、およびロキソリビンからなる群より選択されるTRL7アゴニストが含まれる。
【００５０】
好ましくは、TLRアゴニストは、樹状細胞によるインターロイキン-12(IL-12)の局所産生を誘導するのに有効な濃度で存在する。
【００５１】
一部の態様では、装置は、免疫原性因子/感染を模倣する組成物、例えば、toll様受容体リガンド、CpG-ODN配列もしくはその誘導体、腫瘍抗原、増殖因子、熱ショックタンパク質、細胞死産物、またはサイトカインを含有する。
【００５２】
本発明はまた、多孔性ポリマー構造組成物、疾患関連抗原、およびtoll様受容体(TLR)アゴニストを含む装置であって、TLRアゴニストがTLR3に優先的に結合する装置も提供する。場合によっては、ポリマー構造組成物はポリ-ラクチド-コ-グリコリド(PLG)を含む。TLR3アゴニストは、CD8+樹状細胞またはCD141+樹状細胞を優先的に刺激する量で存在する。
【００５３】
好ましくは、TLRアゴニストはTLR3アゴニストを含む。場合によっては、TLR3アゴニストはポリイノシン-ポリシチジル酸(ポリI:C)またはPEI-ポリ(I:C)を含む。例えば、TLRアゴニストは核酸を含む。他の場合では、TLRアゴニストはTLR9アゴニストをさらに含む。例えば、TLR9アゴニストはシトシン-グアノシンオリゴヌクレオチド(CpG-ODN)またはaPEI-CpG-ODNを含む。任意で、装置はTLRアゴニストの組み合わせを含み、この組み合わせはTLR3アゴニストおよびTLR9アゴニストを含む。例えば、TLR3アゴニストはポリ(I:C)を含み、TLR9アゴニストはCpG-ODNを含む。
【００５４】
または、装置はTLRアゴニストの組み合わせを含み、この組み合わせはTLR3アゴニストおよびTLR4アゴニストを含む。例えば、TLR3アゴニストはポリ(I:C)を含み、TLR4アゴニストはMPLAを含む。
【００５５】
任意で、装置は動員組成物をさらに含む。例示的な動員組成物には、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、Flt3L、およびCCL20が含まれる。例えば、動員組成物は、カプセル化されたGM-CSFを含む。
【００５６】
場合によっては、疾患関連抗原は腫瘍抗原を含む。例えば、腫瘍抗原は、腫瘍溶解産物、精製されたタンパク質腫瘍抗原、または合成された腫瘍抗原を含む。
【００５７】
任意で、TLRアゴニストは病原体関連分子パターン(PAMP)をさらに含む。例えば、PAMPはモノホスホリル脂質A(MPLA)を含む。
【００５８】
ポリマー構造組成物、腫瘍抗原、ならびに、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12、およびTLR13からなる群より選択されるTLRアゴニストの組み合わせを含む装置も提供される。
【００５９】
抗腫瘍免疫応答を誘発するための方法が、ポリマー構造組成物、腫瘍抗原、および、TLR3に優先的に結合するTLRアゴニストを含む装置を対象と接触させるかまたは対象に移植することによって行われる。例えば、TLRアゴニストはTLR3アゴニストを含む。または、TLRアゴニストはTLR3アゴニストおよびTLR9アゴニストを含む。
【００６０】
好ましくは、抗腫瘍免疫応答はCD8+樹状細胞またはCD141+樹状細胞の活性化を含む。場合によっては、抗腫瘍免疫応答は形質細胞様樹状細胞またはCD141+樹状細胞の活性化を含む。または、抗腫瘍性免疫応答は腫瘍量の低減を含む。
【００６１】
好ましくは、TLRアゴニストは、樹状細胞によるインターロイキン-12(IL-12)の産生を誘導するのに有効な濃度で存在する。
【００６２】
任意で、装置は顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)をさらに含む。ある例では、GM-CSFはカプセル化される。別の任意の動員組成物はサイトカインである。例えば、装置は1μg、3μg、5μg、10μg、25μg、または50μgのGM-CSFを含む。
【００６３】
装置はまた、腫瘍抗原も、例えば、腫瘍溶解産物(培養細胞もしくは患者由来初代細胞)、または精製された腫瘍抗原、例えば、化学合成タンパク質/合成タンパク質、組換え(例えば、生化学的に精製された)タンパク質/抗原(例えば、腫瘍細胞から精製されたタンパク質/抗原)の形で含有する。場合によっては、組換えタンパク質/抗原は原核細胞内で作製される。他の場合では、組換えタンパク質/抗原は真核(例えば、哺乳動物)細胞内で作製される。
【００６４】
多孔性ポリマー構造組成物、腫瘍抗原、およびTLRアゴニストを含む装置を対象と接触させることによって、例えば、対象に移植することによって、抗腫瘍免疫応答を誘発するための方法も本発明に包含される。例えば、TLRアゴニストは、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12、およびTLR13からなる群より選択される。前記の装置は以前のワクチンを上回る利点と結び付けられる。最も大きな利点は、強力な抗腫瘍活性を媒介する重要なDCサブセットを刺激できることである。前記方法は、TLR3アゴニストおよび/またはTLR9アゴニストを含有する装置を対象に投与する工程を伴う。TLR3アゴニストおよび/またはTLR9アゴニストは、ワクチンが投与された対象において形質細胞様DCおよび/またはCD141+DCの活性化によって特徴付けられる抗腫瘍免疫応答を誘発する。このワクチンは予防ならびに療法に有用である。
【００６５】
装置は投与され、例えば、局所に適用または移植され、リンパ節または体内の疾患部位もしくは感染部位に向かうように細胞を絶えず動員しながら、訓練しながら、およびまき散らながら、または送りながら、ある期間にわたって存在する、例えば、体内にある。既存の装置と比べた改善には、装置に入った細胞の長期の継続した活性化と、それに付随する、免疫学的に活性化された、例えば、抗原で初回刺激された細胞の長期の継続した退出が含まれる。装置は、足場組成物、動員組成物、および展開組成物を含む。初回刺激された細胞の長期の、かつ持続的な退出を媒介する展開組成物は、細菌由来免疫調節剤などの感染を模倣する組成物である。好ましい態様において、細菌由来免疫調節剤はシトシン-グアノシンオリゴヌクレオチド(CpG-ODN)などの核酸である。
【００６６】
前記方法は、多種多様な疾患を処置し、多種多様な抗原に対するワクチンを開発するのに用いられる。好ましい態様において、本発明は癌ワクチンを開発するのに用いられる。本発明の別の好ましい態様は、宿主免疫系を活性化し、その後に免疫応答を誘導する手段をもつ、感染を模倣する微小環境を含む。合成シトシン-グアノシンオリゴデオキシヌクレオチド(CpG-ODN)配列と外因性顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)を用いると、樹状細胞遊走を制御し、抗原特異的な免疫応答を制御するための方法が得られる。この合成シトシン-グアノシン(gyanosine)オリゴヌクレオチド(CpG-ODN)配列、および/またはポリ(I:C)、例えば、凝縮オリゴヌクレオチド(例えば、PEI-CpG-ODNもしくはPEI-ポリ(I:C))を用いるアプローチは以前の免疫療法と比べて大幅な改善を示す。例えば、参照により本明細書に組み入れられる、US2012-0100182、例えば、14頁、[0106]-15頁、[0110];および24頁、[0176]を参照されたい。
【００６７】
装置は、3つの主な機能、例えば、細胞を装置に誘引する機能、免疫原性因子を提示する機能、および装置から出て行き、例えば流入リンパ節（drain lymph node）に向かうように（ここで、活性化した免疫細胞が抗腫瘍作用を発揮する）、細胞遊走を誘導する機能を果たす。これらの主な機能はそれぞれ足場および/または生物学的組成物によって実行される。足場または生物学的組成物の様々な組み合わせによって、例示的な装置において少なくとも1つの主な機能が実現する。例えば、足場組成物は、一部の装置では3つの主な機能をそれぞれ果たす。別の例では、足場組成物は1つの主な機能、例えば、細胞(好ましくは、樹状細胞)を装置に誘引する機能を果たすのに対して、生物学的組成物は、2つの主な機能、例えば、免疫原性因子を提示する機能と、細胞(好ましくは、樹状細胞)が装置から出て行くように誘導する機能を果たす。これに対して、装置の中には、例えば、逆の組み合わせのものもある。足場および/または生物学的組成物の例示的な二次機能には、特定の細胞または組織タイプに装置を標的化する機能、1つまたは複数の細胞または組織の表面に装置をくっつける機能/1つまたは複数の細胞または組織の表面から装置を放出する機能、および装置の安定性/分解を調整する機能が含まれるが、これに限定されない。
【００６８】
本発明は、足場組成物および生理活性組成物を含む装置を含み、生理活性組成物は、足場組成物の内部に組み込まれているかまたは足場組成物の表面にコンジュゲートされており、足場組成物は樹状細胞を誘引し、樹状細胞に免疫原性因子を導入し、それによって、樹状細胞を活性化し、樹状細胞が足場組成物から出て行くように誘導する。または、足場組成物の内部に組み込まれているかまたは足場組成物の表面にコーティングされている生理活性組成物は樹状細胞を誘引し、樹状細胞に免疫原性因子を導入し、それによって、樹状細胞を活性化し、樹状細胞が足場組成物から出て行くように誘導する。他の好ましい態様において、足場組成物または生理活性組成物は別々に装置に樹状細胞を誘引し、樹状細胞に免疫原性因子を導入し、樹状細胞が装置から出て行くように誘導する。
【００６９】
DCには、従来のDCならびに特定のDCサブセットが含まれる。TLRアゴニスト、例えば、TLR3アゴニストはヒトではCD141+DC(マウスではCD8+DC)を優先的に誘引し、刺激する。TLR9アゴニスト、例えば、CpGは形質細胞様DCを優先的に誘引し、刺激する。
【００７０】
好ましい態様において、動員組成物は、GM-CSF、例えば、カプセル化されたGM-CSFである。装置は局所GM-CSF濃度を時間的に制御し、それによって、リンパ節または装置の場所から離れた組織部位、例えば、感染部位もしくは腫瘍の場所への免疫細胞の動員、存在、その後の分散/展開を制御する。GM-CSF濃度によって、GM-CSFが動員要素または展開要素として機能するかが決まる。従って、足場組成物およびカプセル化された動員組成物を含む装置を対象に導入することによって、インサイチューで樹状細胞をプログラミングする方法が行われる。装置を導入して1〜7日以内に装置から動員組成物のパルスが放出され、残りの量の動員組成物が、装置の内部または表面にある。パルスの後に、残りの量が数週間にわたって、ゆっくりと放出される。動員組成物の局所濃度および放出の時間パターンが樹状細胞の動員、保持、およびその後の装置からの放出に影響を及ぼす。例えば、パルスは、装置に関連している動員組成物の量の少なくとも50％、60％、75％、90％、または95％を含む。例示的な時間放出プロファイルは、装置に関連している動員組成物の量の少なくとも60％を、装置を対象に導入した後、1〜5日で放出することによって特徴付けられるパルスを含む。パルスの後に、残りの量が、パルス期間後、長期間にわたって(例えば、1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、12日にわたって、または2週間、3週間、4週間、5週間、もしくはそれより長く)、ゆっくりと放出される。他の動員組成物にはFlt3Lおよび/またはCCL20が含まれる。動員化合物は個々に、または組み合わせて用いられる。
【００７１】
足場を作製する方法は、足場組成物を準備する工程、樹状細胞を誘引または追い払うための手段をもつポリペプチドを含む第1の生理活性組成物を足場組成物の内部に組み込むかまたは足場組成物の表面にコーティングする工程、および、足場組成物を第2の生理活性組成物と接触させる工程によって行われ、ここで、第2の生理活性組成物は足場組成物と共有結合的または非共有結合的に結合し、第2の生理活性組成物は免疫原性因子を含む。この方法の別の態様では、複数の層を生じるように、連結する工程および接触させる工程が繰り返され、第2の生理活性組成物は、樹状細胞を活性化する手段をもつ化合物の組み合わせを含む。
【００７２】
方法は、インサイチューでの持続的な樹状細胞プログラミングを含み、これは、足場組成物および生理活性組成物を含む装置を対象に投与する工程を含み、ここで該生理活性組成物は該足場組成物の内部に組み込まれているかまたは足場組成物の表面にコンジュゲートされており、ここで該足場組成物が、樹状細胞を誘引し、樹状細胞に免疫原性因子を導入することによって樹状細胞を活性化し、樹状細胞が該足場組成物から出て行くように誘導する。装置は樹状細胞の不均一な集団を動員および刺激する。各サブセットは専門化されており、免疫応答の発生に大きく寄与する。例えば、装置は、CpG-ODN提示と、抗腫瘍免疫の発生において特に重要な樹状細胞サブセットである形質細胞様DC(pDC)、すなわちCD141+DCの増殖を媒介する。
【００７３】
方法は、ワクチン効力の増大を含み、これは、足場組成物および生理活性組成物を含む装置を対象に投与する工程を含み、ここで該生理活性組成物は該足場組成物の内部に組み込まれているかまたは足場組成物の表面にコンジュゲートされており、ここで該足場組成物が、樹状細胞を誘引し、樹状細胞に免疫原性因子を導入することによって樹状細胞を活性化し、樹状細胞が該足場組成物から出て行くように誘導し、それによって、ワクチン接種処置の有効性を高める。
【００７４】
方法は、対象への癌に対するワクチン接種を含み、これは、足場組成物および生理活性組成物を含む装置を対象に投与する工程を含み、ここで該生理活性組成物は足場組成物の内部に組み込まれているかまたは足場組成物の表面にコンジュゲートされており、足場組成物が樹状細胞を誘引し、樹状細胞に免疫原性因子を導入することによって樹状細胞を活性化し、樹状細胞が該足場組成物から出て行くように誘導し、それによって対象に、抗腫瘍免疫、例えば、IL-12産生を付与し、腫瘍量を減少させる。局所腫瘍または固形腫瘍の場合、装置は、腫瘍部位または腫瘍が切除されたかもしくは外科的に取り出された部位に、またはその部位の近くに、投与されるかまたは移植される。例えば、装置は、腫瘍部位または切除部位から1mm、3mm、5mm、10mm、15mm、20mm、25mm、40mmの距離に移植される。例えば、PLGワクチン装置は腫瘍塊から16〜21mm離して投与される。
【００７５】
免疫原性因子にはTLRリガンドが含まれる。例えば、使用される免疫原性因子は、改変されたTLR-9リガンド配列、PEI-CpG-ODNである。好ましくは、TLRリガンドは、TLR3アゴニスト、例えば、ポリ(I:C)または凝縮PEI-ポリ(I:C)である。
【００７６】
足場組成物は非生分解性材料を含む。例示的な非生分解性材料には、金属、プラスチックポリマー、または絹ポリマーが含まれるが、これに限定されない。さらに、足場組成物は生体適合性材料で構成される。この生体適合性材料は無毒であるか、または非免疫原性である。
【００７７】
生理活性組成物は足場組成物に共有結合的または非共有結合的に連結する。生理活性組成物は、樹状細胞を誘引する手段をもつ、足場組成物の表面に共有結合的または非共有結合的に結合する要素を含む。または、もしくはさらに、生理活性組成物は、樹状細胞に免疫原性因子を導入する手段をもつ、足場組成物の表面に共有結合的または非共有結合的に結合する要素を含む。または、もしくはさらに加えて、生理活性組成物は、樹状細胞が足場組成物から出て行くように誘導する手段をもつ、足場組成物の表面に共有結合的または非共有結合的に結合する要素を含む。
【００７８】
樹状細胞を操作する手段をもつ、生理活性組成物の要素は、分泌型または膜結合型のアミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、ジヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ポリマー、低分子、または化合物である。好ましい態様において、この要素は顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)である。なぜなら、この要素は樹状細胞を足場組成物に誘引するからである。別の好ましい態様において、この要素はPEI-CpG-ODN配列である。なぜなら、この要素は、樹状細胞にCpG-ODN配列を導入し、それによって細胞を活性化する手段をもつからである。一部の態様では、この要素は、リンパ節に向かいかつ足場組成物から出て行く樹状細胞遊走を媒介するケモカイン受容体であるCCR7をコードするポリヌクレオチドまたはこのポリペプチドである。CCR7要素は、足場組成物から出て行く樹状細胞遊走を強化するために、PEI-CpG-ODN配列と同時にまたは連続して樹状細胞に導入される。
【００７９】
本発明の足場組成物は外面を含む。または、もしくはさらに、本発明の足場組成物は内面を含む。足場組成物の外面または内面は固体または多孔性である。孔径は約10nm未満、直径が約100nm〜20μmの範囲であるか、または約20μm超である、例えば、1000μmまで、かつ1000μmを含む。好ましい態様において、孔のサイズは、DCなどの細胞が遊走して装置の内部に入り、その後に装置から出て行くのを可能にする。例えば、孔はナノ多孔性、マイクロ多孔性、またはマクロ多孔性である。例えば、ナノ孔の直径は約10nm未満である。マイクロ孔は直径が約100μm〜20μmの範囲である。マクロ孔は約20μm超(好ましくは、約100μm超、さらにより好ましくは、約400μm超、例えば、600μm超または800μm超)である。一例では、足場はマクロ多孔性であり、直径が約100〜500μm、例えば、100〜200μm、200〜400μm、または400〜500μmの開口し相互接続した孔をもつ。孔のサイズおよび相互接続した構造によって、細胞は装置に入り、相互接続した孔を通って装置の容積の中を横断し、次いで、孔を通って装置から離れて、装置の外にある体内の場所に、例えば、腫瘍部位に行き、そこで、腫瘍細胞に対する免疫応答が展開される。活性化されたDCは装置から出て行き、別の場所で固形腫瘍に対する免疫応答を展開するか、または転移性腫瘍細胞もしくは白血病などの血液腫瘍の場合は体全体で免疫応答を展開する。
【００８０】
本発明の足場組成物は1つまたは複数の区画を含む。
【００８１】
本発明の装置は、経口的に、全身に、皮下(sub-cunataneously)もしくは経皮的(trans-cunataneously)に、動脈ステントとして、または外科的に投与または移植される。
【００８２】
本発明の装置および方法は、インサイチューで持続的に細胞をプログラミングするのためのプロトコールに関連する、いくつかの問題の解決策を提供する。細胞の免疫応答を刺激し、感染または罹患した身体組織に住みつくように外向きの遊走を誘導するインサイチュー細胞プログラミングシステムは、回復、例えば、罹患組織の特異的排除の成功率を高める。細胞の機能および/または挙動、例えば、移動運動を制御する、このような装置は足場組成物および1種類または複数種の生理活性組成物を含有する。生理活性組成物は足場組成物の内部に組み込まれているかまたは足場組成物の表面にコーティングされている。足場組成物および/または生理活性組成物は、樹状細胞の誘引、プログラミング、および遊走を時間的および空間的(方向的)に制御する。
【００８３】
装置はインビボで宿主細胞の活発な動員、改変、および材料からの放出を媒介し、それによって、足場と接触した細胞の機能が改善される。例えば、装置は、体内に既に存在している細胞を足場材料に誘引するかまたは動員し、存在している細胞を望ましい運命(例えば、免疫活性化)にプログラムまたはリプログラムする。
【００８４】
この装置は、生理活性組成物を組み込んでいるかまたは生理活性組成物でコーティングされた足場組成物を含む。装置は樹状細胞の誘引、活性化、および遊走を調節する。装置が設計される用途に応じて、装置は、足場そのものの物理的特徴または化学的特徴を介して樹状細胞の誘引、活性化、および/または遊走を調節する。例えば、足場組成物は異なる透過性をもつことができるので、細胞が足場のある特定の物理領域でしか遊走しないようにすることができる。足場組成物の透過性は、例えば、孔径、密度、ポリマー架橋結合、剛性、靭性、延性、または粘弾性が大きく、または小さくなるように材料を選択または操作することによって調節される。足場組成物は、細胞が容易に、装置または装置内の区画の目標の退出領域に向かって移動することができる物理的な流路または経路を含む。足場組成物は任意で区画または層に組織化され、それぞれの区画または層は異なる透過性をもち、その結果、細胞が装置を移動するのに必要な時間が正確かつ予測可能に制御される。遊走はまた、分解、脱水または再水和、酸素化、化学変化もしくはpH変化、または足場組成物の進行中の自己集合によっても調節される。
【００８５】
生理活性組成物によって誘引、活性化、および/または遊走が調節される。装置は、その構造を介して細胞の活性化および遊走を制御する、および方向付ける。特定の退出領域に細胞を向けるために化学親和性が用いられる。例えば、細胞の遊走を誘引するかまたは遅らせるためにサイトカインが用いられる。これらの生理活性物質の密度および混合物を変えることによって、装置は遊走のタイミングを制御する。これらの生理活性物質の密度および混合物は、物質の初回ドーピングレベルもしくは濃度勾配によって、既知の浸出速度で生理活性物質を足場材料に埋め込むことによって、足場材料が分解するにつれて放出させることによって、濃縮領域から拡散させることによって、ある領域に拡散する前駆化学物質を相互作用させることによって、または存在している支持細胞が組成物を産生/排出することによって制御される。足場の物理構造または化学構造も、装置を通る生理活性薬剤の拡散を調節する。
【００８６】
生理活性組成物は、細胞の機能および/または挙動を調節する1種類または複数種の化合物を含む。生理活性組成物は足場組成物に共有結合的に連結させるか、足場と非共有結合的に結合させる。
【００８７】
免疫メディエーターに応答すると、細胞遊走プロセスに関与するシグナル伝達事象が開始する。従って、装置は、任意で、GM-CSF、CpG-ODNもしくはポリ(I:C)配列、癌抗原、および/または免疫調節剤を含む第2の生理活性組成物を含有する。
【００８８】
場合によっては、第2の生理活性組成物を足場組成物に共有結合的に連結させ、この組成物は、足場組成物の内部にまたは足場組成物の表面にかなり固定化される。他の場合では、第2の生理活性組成物を足場に非共有結合的に結合させる。非共有結合は一般的に共有結合より1〜3桁弱く、このため、因子は足場から周囲組織の中に拡散することができる。非共有結合には、静電結合、水素結合、ファン・デル・ワールス結合、π芳香族結合、および疎水結合が含まれる。
【００８９】
足場組成物は生体適合性である。組成物は生分解性/腐食性であるか、または体内での分解に対して抵抗性である。比較的、耐久性のある(分解に対して抵抗性である)足場組成物には、金属および絹などのいくつかのポリマーが含まれる。好ましくは、足場組成物は、温度、pH、水和状態、および多孔度、架橋密度、タイプ、ならびに分解に対する主鎖結合の化学特性もしくは感受性からなる群より選択される物理的パラメータに基づいて予め決められた速度で分解するか、または化学ポリマーの比に基づいて予め決められた速度で分解する。例えば、ラクチドだけで構成される高分子量ポリマーは数年、例えば、1〜2年にわたって分解するのに対して、ラクチドおよびグリコリドの50:50混合物で構成される低分子量ポリマーは数週間、例えば、1週間、2週間、3週間、4週間、6週間、10週間で分解する。高分子量の高グルロン酸アルギン酸で構成されるカルシウム架橋ゲルはインビボで数ヶ月(1ヶ月、2ヶ月、4ヶ月、6ヶ月、8ヶ月、10ヶ月、12ヶ月)〜数年(1年、2年、5年)にわたって分解するのに対して、低分子量アルギン酸塩および/または部分的に酸化されたアルギン酸塩で構成されるゲルは数週間で分解する。
【００９０】
例示的な足場組成物には、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、PLGAポリマー、アルギン酸塩およびアルギン酸塩誘導体、ゼラチン、コラーゲン、フィブリン、ヒアルロン酸、ラミニンに富むゲル、アガロース、天然多糖および合成多糖、ポリアミノ酸、ポリペプチド、ポリエステル、ポリ無水物、ポリホスファジン、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(アルキレンオキシド)、ポリ(アリルアミン)(PAM)、ポリ(アクリル酸塩)、改変スチレンポリマー、プルロニックポリオール、ポリオキサマー、ポリ(ウロン酸)、ポリ(ビニルピロリドン)、および上記のいずれかのコポリマーまたはグラフトコポリマーが含まれる。1つの好ましい足場組成物はRGD改変アルギン酸塩を含む。他の例では、足場組成物には、架橋ポリマー、例えば、架橋アルギン酸塩、ゼラチン、またはその誘導体、例えば、メタクリレート化(methacrylated)誘導体が含まれる。
【００９１】
別の好ましい足場組成物はマクロ多孔性ポリ-ラクチド-コ-グリコリド(PLG)である。例えば、PLGマトリックスはGM-CSF、デンジャーシグナル、および標的抗原、例えば、癌抗原を含み、プログラムされているように、動員されたDCの存在地として働く。動員要素であるGM-CSFはPLG足場に入れられてカプセル化される。カプセル化されたGM-CSFを含むPLGマトリックスは、樹状細胞動員組成物のパルスを出し、次いで、徐々にゆるやかな速度で放出する。パルスは、生理活性組成物の初期量の少なくとも40％、50％、60％、75％、80％、またはそれより多くを含み、残りのパーセントは、処置される対象の内部または表面にある部位に投与された後に、翌日または翌週にわたって徐々に放出される。例えば、放出は、最初の5日以内には生理活性GM-CSF搭載量(load)の約60％であり、その後に、生理活性GM-CSFが次の10日間にわたって、ゆっくりと持続放出される。この放出プロファイルは、存在しているDCを効果的に動員する、周囲組織を通り抜ける因子の拡散速度に影響を及ぼす。
【００９２】
足場組成物の多孔度は、装置を通り抜ける細胞の遊走に影響を及ぼす。孔はナノ多孔性、マイクロ多孔性、またはマクロ多孔性である。例えば、ナノ孔の直径は約10nm未満である。マイクロ孔は直径が約100nm〜20μmの範囲である。マクロ孔は、約20μm超(好ましくは、約100μm超、さらにより好ましくは、約400μm超)である。他の例では、孔径は10nm未満〜約1000μmである。場合によっては、平均孔径は約250μm〜約500μmである。場合によっては、多孔性構造はランダムであるか、または整列されている。一例では、足場はマクロ多孔性であり、整列された孔は直径が約400〜500μmである。
【００９３】
足場を作製する方法は、足場組成物を準備し、足場組成物を第1の生理活性組成物と共有結合的に連結するか、または非共有結合的に結合することによって行われる。例示的な装置および装置を作製する方法は、US2012/0100182、PCT/US2010/057630、およびPCT/US2012/35505に記載されており、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み入れられる。第1の生理活性組成物は、好ましくは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を含有する。足場組成物はまた、第2の生理活性組成物、好ましくは、1種類または複数種のシトシン-グアノシンオリゴヌクレオチド(CpG-ODN)配列とも接触される。第2の生理活性組成物を足場組成物と結合させて、ドーピングされた足場、すなわち、1種類または複数種の生理活性物質を含む足場組成物が生じる。任意で、複数のドーピングされた足場を生じるように、接触させる工程が繰り返される。例えば、足場装置の内部に第2の生理活性組成物の勾配が生じるように、接触させる工程はそれぞれ、異なる量の第2の生理活性組成物によって特徴付けられる。後の接触させる工程は組成物の量を変えるのではなく、異なる生理活性組成物、すなわち、因子の構造または化学式によって、前のドーピング工程の前の組成物または混合物と区別される第3、第4、第5、第6....の組成物または組成物の混合物を伴う。前記方法は、任意で、細胞または生理活性組成物の移動運動をさらに制御/調節するために、個々のニッチ、層、または成分を互いに付ける工程、および/あるいは装置の1つもしくは複数の境界の中にまたは1つもしくは複数の境界に、半透過性、透過性の、もしくは不透過性の膜を挿入する工程を伴う。
【００９４】
装置の治療用途には免疫細胞の指示が含まれる。例えば、前記方法は、足場組成物と、その内部または表面に組み込まれている生理活性組成物、および足場に結合した哺乳動物細胞を含む装置を準備する工程と、例えば、哺乳動物組織の内部または表面に装置を移植するかまたは付けることによって、装置と哺乳動物組織を接触させる工程を含む。装置を投与または移植する時の各成分、動員組成物(例えば、GM-CSF、Flt3L、またはCCL20)、デンジャーシグナル(例えば、CpG-ODN)、および抗原(例えば、精製された腫瘍抗原または腫瘍細胞溶解産物)の例示的な相対量は以下の通りである:GM-CSF:0.5μg〜500μg;CpG-ODN:50μg〜3,000μg;および腫瘍抗原/溶解産物:100μg〜10,000μg。
【００９５】
細胞、例えば、宿主細胞の活性を調整する方法は、足場組成物と、その内部または表面に組み込まれた動員組成物を含有する装置を哺乳動物に投与し、次いで、細胞を展開シグナルと接触させることによって行われる。細胞は抗原(および他の因子)に遭遇した後に、従って、活性化された後に、免疫応答が展開される体内の腫瘍細胞を見つけるために装置から離れる。退出時の細胞の活性は装置に入る前の活性とは異なる。細胞は装置に動員され、ある期間にわたって、例えば、数分間;0.2時間、0.5時間、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、24時間;2日間、4日間、6日間;数週間(1〜4週間)、数ヶ月(2ヶ月、4ヶ月、6ヶ月、8ヶ月、10ヶ月、12ヶ月)、または数年、装置に存在し続ける。この間、細胞は、構造要素と、細胞の活性または活性レベルを変える生理活性組成物に曝露される。装置の内部で抗原および他の化合物に遭遇すると、変化した(再指導された、またはリプログラミングされた)細胞の退出が誘導され、細胞は、腫瘍細胞などの罹患した細胞を見つけ、これに対する免疫を媒介するために、装置から出て周囲組織または遠く離れた目標の場所に遊走する。
【００９６】
展開シグナルは、タンパク質、ペプチド、もしくは核酸などの組成物、または細胞の活性化状態である。例えば、抗原を摂取したらDCは活性化され、リンパ節、脾臓、および他の解剖学的な場所に遊走し、ここで、T細胞に遭遇して、抗原特異的免疫応答、例えば、抗癌応答をさらに拡大する。例えば、装置に遊走した細胞は、いったん装置に入ったら、展開シグナルにしか遭遇ししない。場合によっては、展開シグナルは、核酸分子、例えば、装置から周囲組織への細胞の遊走を誘導するタンパク質をコードする配列を含有するプラスミドである。展開シグナルは、細胞が装置の内部にあるプラスミドに遭遇した時に発生し、DNAは細胞の内部に取り入れられ(すなわち、細胞はトランスフェクトされ)、細胞は、そのDNAによってコードされる遺伝子産物を生産する。場合によっては、展開シグナルを発する分子は装置の要素であり、動員組成物への細胞の曝露と比べて(例えば、時間的または空間的に)遅れて装置から放出される。または、展開シグナルは動員組成物の低減または非存在である。例えば、動員組成物は装置への細胞の遊走を誘導し、動員組成物の濃度の低下、または装置からの枯渇、散逸、もしくは拡散は、装置からの細胞の退出をもたらす。このように、個体の免疫細胞、例えば、T細胞、B細胞、または樹状細胞(DC)は装置の内部に動員され、初回刺激および活性化されて、抗原特異的標的に対する免疫応答を展開する。任意で、免疫応答が望まれる標的に対応する抗原は足場構造の内部または表面に組み込まれる。顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)などのサイトカインも、免疫活性化を増幅する、および/または初回刺激された細胞のリンパ節への遊走を誘導する、装置の成分である。他の細胞特異的な動員組成物を以下で説明する。
【００９７】
装置はインビボで細胞を動員し、これらの細胞を改変し、次いで、これらの細胞が体内の別の部位に遊走するのを促進する。このアプローチは、樹状細胞および癌ワクチン開発と関連して本明細書において例証されるが、微生物病原体に対するワクチンなどの他のワクチンならびに細胞療法全般にとっても有用である。本明細書に記載の装置を用いて指導された細胞は、材料のすぐ隣にあるか、またはやや離れた部位にある組織または器官の再生を促進する。または、細胞は、(局所にあるか、または離れた部位にある)組織の破壊を促進するように指導される。前記方法はまた、疾患の予防、例えば、疾患進行または加齢性の組織変化を止めるかまたは遅らせるように組織構造および組織機能の細胞ベースの維持を促進するのにも有用である。装置内での細胞の指導である「プログラミング」および「リプログラミング」によって、再び多能性幹細胞になり、治療効果を発揮するように、体内のあらゆる細胞の機能または活性を改変することが可能になる。
【００９８】
従来のエクスビボDCベースのワクチン接種戦略では、癌患者において、不均一なDCネットワークによって媒介される免疫応答を連係して働かせ、維持することができなかったために、これらのアプローチの臨床有効性は限定されていた。以前のワクチンアプローチと比較して、pDCの優先的な動員および増殖が癌抗原に対する免疫応答を劇的に改善させ、腫瘍進行を遅らせるので、本明細書に記載の装置および方法には独特の利点がある。
【００９９】
Tエフェクター活性を強化し、Treg細胞と、一部のアジュバントによって誘導され得る他の免疫抑制機構をダウンレギュレートするために、他のワクチン製剤と比べて最適化されている、例えば、GM-CSFおよびアジュバントの提示を制御するように最適化されている材料ベースの(例えば、PLG)ワクチンが本明細書において説明される。この材料ベースのワクチンは、Treg細胞と比較してエフェクターT細胞の作製および増殖を優先的に強化することによって、免疫抑制性タンパク質、例えば、抗CTLA-4に応答する腫瘍およびワクチン微小環境を作り出すという点で以前のワクチンシステムよりかなり優れている。
【０１００】
ポリヌクレオチド、ポリペプチド、または他の薬剤が精製および/または単離される。具体的には、本明細書で使用する「単離された」または「精製された」核酸分子、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、組換え技法によって産生された時に他の細胞材料も培養培地も実質的に含まず、化学合成された時に化学前駆体も他の化学物質も実質的に含まない。精製された化合物は少なくとも60重量％(乾燥重量)の関心対象の化合物である。好ましくは、調製物は、少なくとも75重量％、より好ましくは少なくとも90重量％、最も好ましくは少なくとも99重量％の関心対象の化合物である。例えば、精製された化合物は、少なくとも90重量％、91重量％、92重量％、93重量％、94重量％、95重量％、98重量％、99重量％、または100重量％(w/w)の望ましい化合物である。純度は、任意の適切な標準方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、または高速液体クロマトグラフィー(HPLC)分析によって測定される。精製または単離されたポリヌクレオチド(リボ核酸(RNA)またはデオキシリボ核酸(DNA))は、天然の状態で隣接する遺伝子も配列も含まない。精製または単離されたポリペプチドは、天然の状態で隣接するアミノ酸も配列も含まない。精製されたとは、ヒト対象に投与するのに安全な無菌性の程度、例えば、感染性作用物質も毒性作用物質も無いことも定義する。
【０１０１】
同様に、「実質的に純粋な」とは、天然で付随する成分から分離されているヌクレオチドまたはポリペプチドを意味する。典型的に、ヌクレオチドおよびポリペプチドは、天然で関連するタンパク質および天然有機分子を含まず、少なくとも60重量％、70重量％、80重量％、90重量％、95重量％である時に、または99重量％の時でも実質的に純粋である。
【０１０２】
「単離された核酸」とは、核酸が得られた生物の天然ゲノム内で隣接する遺伝子を含まない核酸を意味する。この用語は、例えば、(a)天然ゲノムDNA分子の部分であるが、その部分が天然で生じる生物のゲノム内で、その分子部分に隣接する核酸配列のいずれにも隣接していないDNA;(b)結果として生じる分子がどの天然ベクターともゲノムDNAとも同一にならないように、ベクターの中に組み込まれたかまたは原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAの中に組み込まれた核酸;(c)別の分子、例えば、合成cDNA、ゲノム断片、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって生成された断片、または制限断片;および(d)ハイブリッド遺伝子、すなわち、融合タンパク質をコードする遺伝子の一部である組換えヌクレオチド配列を含む。本発明による単離された核酸分子は、合成により生成された分子、ならびに化学的に変えられている、および/または改変バックボーンを有する任意の核酸をさらに含む。例えば、単離された核酸は、精製されたcDNAまたはRNAポリヌクレオチドである。単離された核酸分子はメッセンジャーリボ核酸(mRNA)分子も含む。
【０１０３】
特定のポリヌクレオチド配列の「保存的に改変された変化」とは、同一の、もしくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチドがアミノ酸配列をコードしない場合は本質的に同一の配列を指す。遺伝暗号の縮重のために、多くの種類の機能的に同一な核酸が任意のタンパク質をコードする。例えば、コドンCGU、CGC、CGA、CGG、AGA、およびAGGは全てアミノ酸アルギニンをコードする。従って、あるコドンによってアルギニンが特定されている、あらゆる位置において、そのコドンは、コードされているポリペプチドを変えることなく、記載の対応する任意のコドンに変更することができる。このような核酸変化は、「保存的に改変された変化」の一種である「サイレント置換」または「サイレント変化」である。ポリペプチドをコードする本明細書に記載のあらゆるポリヌクレオチド配列が、特に指定した場合を除き、可能な限り全てのサイレント変化も表している。従って、サイレント置換は、アミノ酸をコードする、あらゆる核酸配列の言外に示される特徴である。当業者であれば、機能的に同一の分子を生じるように、(通常、メチオニンの唯一のコドンであるAUGを除く)核酸の各コドンを標準的な技術によって改変できることを理解するだろう。
【０１０４】
同様に、アミノ酸配列中の1個または数個のアミノ酸が、非常に似た特性を有する異なるアミノ酸で置換される「保存的アミノ酸置換」もまた、特定のアミノ酸配列またはアミノ酸をコードする特定の核酸配列と非常に似ていることが容易に分かる。任意の特定の配列の、このような保存的に置換された変化は本発明の特徴である。コードされている配列において1個のアミノ酸または低パーセント(典型的には5％未満、さらに典型的には1％未満)のアミノ酸を変化、付加、または欠失する個々の置換、欠失、または付加は「保存的に改変された変化」であり、これらの変化によって、あるアミノ酸が化学的に似たアミノ酸と置換される。機能が似ているアミノ酸を示した保存的置換の表は当技術分野において周知である。例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Creighton (1984) Proteins, W.H. Freeman and Companyを参照されたい。
【０１０５】
製剤または製剤成分の「有効量」および「治療的有効量」という用語は、製剤または成分が単独で、または組み合わされて望ましい効果を生じるのに十分な量を意味する。例えば、「有効量」とは、化合物が単独で、または組み合わされて哺乳動物において癌を小さくするかまたは予防するのに必要な量を意味する。最終的に、担当の医師または獣医師が適切な量および投与計画を決定する。
【０１０６】
本明細書で使用する「処置する」および「処置」という用語は、症状の重篤度および/もしくは頻度が小さくなるように、症状および/もしくはその根底にある原因が無くなるように、ならびに/または損傷の改善もしくは治癒を容易にするように、有害な状態、障害、または疾患に罹患している臨床症状のある個体に薬剤または製剤を投与することを指す。
【０１０７】
「予防する」および「予防」という用語は、特定の有害な状態、障害、または疾患にかかりやすいかまたはその素因をもつ臨床症状のない個体に薬剤または製剤を投与することを指し、従って、症状および/またはその根底にある原因の発生を阻止することに関する。
【０１０８】
移行用語「を含む(comprising)」は「を含む(including)」、「を含有する」、または「によって特徴付けられる」と同義であり、包括的(inclusive)またはオープンエンドであり、さらなる引用されなかった要素も方法工程も排除しない。対照的に、移行句「からなる」は、特許請求の範囲において特定されていない、あらゆる要素、工程、成分を排除する。移行句「から本質的になる」は、クレームの範囲を、特定された材料または工程と、クレームに記載された発明の「基本的なかつ新規の特徴に物質的に影響を及ぼさない材料または工程」に限定する。
【０１０９】
本発明の他の特徴および利点は、以下の本発明の好ましい態様の説明および特許請求の範囲から明らかであろう。特に定義のない限り、本明細書において用いられる技術用語および科学用語は全て、本発明が属する当業者に一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様のまたは等価な方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、適切な方法および材料を以下で説明する。本明細書において言及される刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は全て、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が優先される。さらに、材料、方法、および実施例は例示にしかすぎず、限定することが意図されない。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】図1Aは、抗PD1抗体または抗CTLA4抗体で処置して、または処置せずに数日経過した後のメラノーマ腫瘍をもつマウスにおける腫瘍サイズのグラフである。値は平均および標準偏差を表す(n=10)。図1Bは、抗PD1抗体または抗CTLA4抗体で処置した、または処置しなかったメラノーマ腫瘍をもつマウスの生存期間を示したカプラン・マイヤー(Kaplar Meier)生存曲線である。
【図２】図2Aは、ワクチンおよび/または抗PD1抗体もしくは抗CTLA4抗体を用いて、または用いずに数日経過した後のメラノーマ腫瘍をもつマウスにおける腫瘍面積のグラフである。値(n=10)は平均および標準偏差を表す。特に断りのない限り、他の全ての実験条件と比較して*P<0.05。図2Bは、ワクチンおよび/または抗PD1抗体もしくは抗CTLA4抗体を用いて、または用いずに処置した後のメラノーマ腫瘍をもつマウスの生存期間を示したカプラン・マイヤー生存曲線である。値(n=10)は平均および標準偏差を表す。
【図３】図3Aは、ワクチンおよび/または抗PD1抗体もしくは抗CTLA4抗体を用いて、または用いずに処置した後のメラノーマ腫瘍をもつマウスから抽出したB16腫瘍に存在するCD3+CD8+腫瘍浸潤性T細胞の数の棒グラフである。値(n=5)は平均および標準偏差を表す。特に断りのない限り、他の全ての実験条件と比較して*P<0.05**P<0.01。図3Bは、ワクチンおよび/または抗PD1抗体もしくは抗CTLA4抗体で処置した、または処置しなかったマウスのB16腫瘍から単離したCD3+CD8+Tエフェクター細胞とCD3+FoxP3+T調節性細胞との比の棒グラフである。値(n=5)は平均および標準偏差を表す。特に断りのない限り、他の全ての実験条件と比較して*P<0.05**P<0.01。
【図４】図4Aは、PLGワクチン単独で(VAX)または抗CTLA4抗体と組み合わせて(VAX+CTLA-4)、14日間処置したマウスから単離したCD3+T細胞浸潤物のフローサイトメトリーヒストグラムである。図4Bは、ブランクマトリックス(Con)、PLGワクチン単独(VAX)、またはワクチンと抗PD1抗体の組み合わせ(VAX+PD1)もしくはワクチンと抗CTLA4抗体の組み合わせ(VAX+CTLA)が14日間移植されたマウスから単離したCD3+CD8+エフェクターT細胞の総数を示した棒グラフである。値(n=5)は平均および標準偏差を表す。特に断りのない限り、他の全ての実験条件と比較して*P<0.05**P<0.01。
【図５】図5Aは、4つの処置群における、足場から単離したCD8陽性CD107a陽性細胞集団のパーセントを示した一組のフローサイトメトリー散布図である。図5Bは、4つの処置群における、CD107a陽性IFNγ陽性の活性化CD8+足場浸潤性T細胞の数の増加倍率を示した棒グラフである。値(n=5)は平均および標準偏差を表す。特に断りのない限り、他の全ての実験条件と比較して*P<0.05**P<0.01。
【図６Ａ】ワクチンのみ(VAX)、ワクチン+抗CTLA4抗体(VAX+CTLA4)、またはワクチン+抗PD1抗体(VAX+PD1)で処置したマウスにおいて、CD4、CD8、および/またはFoxP3を発現するPLGワクチン移植片から単離したT細胞浸潤物の比率を示した一組の蛍光標識細胞分取(FACS)散布図である。
【図６Ｂ】ワクチンのみ(VAX)、ワクチン+抗CTLA4抗体(VAX+CTLA4)、またはワクチン+抗PD1抗体(VAX+PD1)で処置したマウスのワクチン接種部位におけるCD3+CD8+エフェクターT細胞とCD4+FoxP3+T細胞との比を示した棒グラフである。値は平均および標準偏差を表す(n=5)。特に断りのない限り、他の全ての実験条件と比較して*P<0.05**P<0.01。
【図７】図7Aは、ワクチン単独で(VAX)、または抗CTLA4抗体と組み合わせて(Vax+CTLA4)もしくは抗PD1抗体と組み合わせて(VAX+PD1)処置したマウスのワクチン流入領域リンパ節（vaccine draining lymph node）にあるCD8+Tエフェクター細胞の数を示した一組のフローサイトメトリーヒストグラムである。図7Bは、ワクチン単独で(VAX)、または抗CTLA4抗体と組み合わせて(VAX+CTLA4)もしくは抗PD1抗体と組み合わせて(VAX+PD1)処置したマウスのワクチン流入領域リンパ節にあるFoxP3+Treg細胞の数を示した一組のフローサイトメトリーヒストグラムである。
【図８】図8Aは、ワクチン単独で(VAX)、または抗CTLA4抗体と組み合わせて(+CTLA-4)または抗PD1抗体と組み合わせて(+PD-1)処置したマウスに由来する流入領域リンパ節にある、CD8+またはFoxP3+のT細胞のパーセントを示した棒グラフである。値(n=5)は平均および標準偏差(n=5)を表す。特に断りのない限り、他の全ての実験条件と比較して*P<0.05**P<0.01。図8Bは、ワクチン単独で(VAX)、または抗CTLA4抗体と組み合わせて(VAX+CTLA4)もしくは抗PD1抗体と組み合わせて(VAX+PD1)処置したマウスのワクチン流入領域リンパ節にあるCD8+T細胞とFoxP3+T細胞との比を示した棒グラフである。値(n=5)は平均および標準偏差(n=5)を表す。特に断りのない限り、他の全ての実験条件と比較して*P<0.05**P<0.01。
【図９】図9A〜図9Dは、PLG癌ワクチンを用いた複数のチェックポイント遮断の組み合わせを図示した一連の棒グラフである。図9Aは、105個の腫瘍細胞を接種して35日後の、ワクチン単独で(V)、またはワクチンと抗PD-1を組み合わせて(+P)、抗CTLA4と組み合わせて(+C)、もしくは抗PD-1および抗CTLA4の両方と組み合わせて(+P+C)処置したマウスにおけるB16メラノーマ腫瘍のサイズを示した棒グラフである。図9Bは、105個の腫瘍細胞を接種して35日後の、ワクチン単独で(V)、またはワクチンを抗PD-1と組み合わせて(+P)、抗CTLA4と組み合わせて(+C)、もしくは抗PD-1および抗CTLA4の両方と組み合わせて(+P+C)処置したマウスにあるB16腫瘍から単離した、CD8(+)T細胞の数を示した棒グラフであり、図9Cは、FoxP3(+)Tregの数を示した棒グラフである。図9Dは、105個の腫瘍細胞を接種して35日後の、ワクチン単独で(V)、またはワクチンを抗PD-1と組み合わせて(+P)、抗CTLA4と組み合わせて(+C)、または抗PD-1および抗CTLA4の両方と組み合わせて(+P+C)処置したマウスのB16腫瘍にあるCD8(+)T細胞とFoxP3(+)Tregとの比を示した棒グラフである。B(n=8)、CおよびD(n=5)の値は平均および標準偏差を表す。言及したように他の実験条件と比較して*P<0.05**P<0.01。
【図１０】図10A〜図10Eは、PLGワクチンと遮断抗体との組み合わせによって腫瘍内Tエフェクター細胞活性が強化されたことを示す一連の棒グラフおよびドットプロットである。図10Aは、無処置マウス(対照)、ならびにPLGワクチン単独で処置したマウス(Vax)、または抗PD-1抗体と組み合わせて処置したマウス(+PD-1)および抗CTLA-4抗体と組み合わせて処置したマウス(+CTLA4)のB16腫瘍から単離したCD3(+)CD8(+)T細胞の総数を示した棒グラフである。図10Bは、無処置マウス(対照)、ならびにPLGワクチン単独で処置したマウス(Vax)、または抗PD-1抗体と組み合わせて処置したマウス(+PD-1)および抗CTLA-4抗体と組み合わせて処置したマウス(+CTLA4)のB16腫瘍から単離したCD3(+)FoxP3(+)T調節性細胞の総数を示した棒グラフである。図10Cは、無処置マウス(対照)、ならびにPLGワクチン単独で処置したマウス(Vax)、または抗PD-1抗体と組み合わせて処置したマウス(+PD-1)および抗CTLA-4抗体と組み合わせて処置したマウス(+CTLA-4)のB16腫瘍から単離した、CD3(+)CD8(+)T細胞とCD3(+)FoxP3(+)T調節性細胞との比を示した棒グラフである。図10Dは、無処置マウス(対照)、ならびにPLGワクチン単独で処置したマウス(Vax)、または抗PD-1抗体と組み合わせて処置したマウス(+PD-1)および抗CTLA-4抗体と組み合わせて処置したマウス(+CTLA4)の腫瘍における腫瘍浸潤性白血球を表した一連のFACSプロットである。18日目に腫瘍からシングル細胞懸濁液を調製し、活性化細胞傷害性T細胞マーカーであるCD8(+)およびCD107aの染色を行った。FACSプロットの中の数は、両マーカーが陽性の細胞集団のパーセントを示す。図10Eは、ブランクマトリックス(対照)、PLGワクチン単独、またはワクチンと抗PD-1および抗CTLA-4との組み合わせにおけるIFNγまたはCD107aが陽性のCD8(+)腫瘍浸潤性T細胞の数を示した棒グラフである。A、B、C、およびD(n=5)の値は平均および標準偏差を表す。特に断りのない限り、ワクチン単独と比較して(V対V+P;V対V+C)、*P<0.05**P<0.01。
【図１１】無処置マウス(対照)、ならびにPLGワクチン単独で処置したマウス(Vax)または抗PD-1抗体と組み合わせて処置したマウス(+PD-1)および抗CTLA-4抗体と組み合わせて処置したマウス(+CTLA-4)のB16腫瘍から単離した、CD3(+)CD8(+)T細胞とCD3(+)FoxP3(+)T調節性細胞との比を示した棒グラフである。値は平均および標準偏差を表す(n=5)。V+Cと他の実験条件を比較して計算した時に、**P<0.01。
【図１２】腫瘍成長に及ぼす、PLGワクチン接種後に抗体処置を止めた影響を示したドットプロットである。(5x105個のB16-F10細胞を接種した)確立したメラノーマ腫瘍をもち、ワクチン単独で処置したマウス(V)、またはワクチンを抗PD1抗体のi.p.注射と組み合わせて処置したマウス(V+P)または抗CTLA-4抗体のi.p.注射と組み合わせて処置したマウス(V+C)における腫瘍面積の比較。各データポイントは1匹の動物(n=8)を表し、ドットプロットの中の線は平均腫瘍面積を表す。
【発明を実施するための形態】
【０１１１】
発明の詳細な説明
本発明より前は、典型的に、癌ワクチンは実験室での煩雑かつ高価な細胞操作に左右され、その後に細胞が移植されてもリンパ節ホーミングは十分ではなく、効力は限られていた。癌処置の点では、癌は免疫チェックポイント経路を勝手に使って内因性免疫応答から逃れることができるので、多くの既存の療法は効果がなかった。癌細胞が免疫系から逃れる能力を阻止または最小化するのに薬剤が特定されており、使用されるが、これらの薬剤は低免疫原性の腫瘍において効力がない。本発明は、癌ワクチン接種のために、細菌感染の重要な側面を模倣して体内での免疫細胞の輸送および活性化を直接制御する材料を用いることで、これらの問題を解決する。さらに、本発明は、これらの癌ワクチンを免疫抑制性タンパク質(例えば、免疫チェックポイントタンパク質)の阻害剤と組み合わせ、それによって、腫瘍を無くすかまたは腫瘍の進行を最小化するのに十分に強力な内因性免疫応答を可能にする。さらに、この癌ワクチンは免疫抑制性タンパク質の阻害剤と相乗作用して、阻害剤が単剤として用いられた時に必要な投与量と比較して癌処置における効力に必要な阻害剤の投与量を少なくする。
【０１１２】
本明細書に記載の結果から、ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)(PLG)癌ワクチンは、メラノーマモデルにおいて、かなりの数の抗原特異的T細胞を生み出すことが証明された。かいつまんで言うと、ワクチンと抗体(例えば、抗CTLA4抗体および/または抗PD1抗体)処置を組み合わせた効果を試験するために、高悪性度の治療用B16メラノーマモデルを使用した。B16メラノーマ腫瘍をもつマウスにおいて抗CTLA4抗体および抗PD1抗体だけで処置しても、これらの動物の腫瘍サイズおよび生存アウトカムは影響を受けなかった(図1A〜B)。PLGワクチン接種は腫瘍進行を中程度に抑制したが、B16メラノーマ腫瘍をもつ、どのマウスでも長期生存率に影響を及ぼさなかった。驚いたことに、CTLA-4抗体およびPD-1抗体をPLGワクチンと組み合わせて投与すると、各薬剤だけで処置した時に死んでいたマウスにおいて、それぞれ75％および40％であった長期生存率を促進することができた。これらの処置は相乗作用して、腫瘍部位で、およびワクチンの中で局所的に、かなり大きなT細胞活性を促進する(図3A〜6B)。この応答は、抑制性調節性T細胞活性と比べて細胞傷害性T細胞活性の方にかなり偏っている。これらの応答は、抗CTLA4抗体をワクチン接種と組み合わせた時に長期間、維持することができる(図6B)。
【０１１３】
免疫チェックポイント経路および癌
健常対象において自己寛容を維持し、自己免疫を阻止するには(免疫抑制性経路とも知られる)免疫チェックポイント経路が重要である。しかしながら、癌細胞では免疫チェックポイント経路は調節不全になることが多く、このために、腫瘍は身体の内因性抗腫瘍免疫応答から逃れることができるようになる。癌は、通常は免疫抑制的な役割を果たしている免疫チェックポイントタンパク質の発現をアップレギュレートするなど多くのやり方で免疫チェックポイント経路を勝手に用いる。例えば、癌細胞では、T細胞エフェクター活性を調節する抑制性リガンドおよび抑制性受容体が過剰発現していることが多い。
【０１１４】
例示的な抑制性受容体は、T細胞活性化レベルを低減する細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4(CTLA4)であり、CD152とも呼ばれる。別の例示的な抑制性受容体は、Tエフェクター細胞活性を制限するプログラム細胞死タンパク質1(PD1)であり、CD279とも呼ばれる。例えば、癌細胞はPD1のリガンド(例えば、プログラム細胞死タンパク質リガンド1(PDL1))をアップレギュレートし、それによって、抗腫瘍免疫応答を遮断する。
【０１１５】
この癌細胞が抗腫瘍免疫応答から逃れる機構と闘うための有望なアプローチとして、癌免疫療法における免疫チェックポイントの遮断が浮上した。例えば、可能性のある抗癌治療剤として、免疫チェックポイントタンパク質などの免疫抑制性タンパク質に対して作られた抗体(本明細書では遮断抗体とも呼ばれる)が探索されている。例えば、Pardoll.Nat.Reviews Cancer.(2012)12:252-264を参照されたい。
【０１１６】
免疫抑制性タンパク質およびその阻害剤
免疫チェックポイントタンパク質にはB7/CD28受容体スーパーファミリーが含まれる。CTLA-4は受容体の免疫グロブリンスーパーファミリーに属する。受容体の免疫グロブリンスーパーファミリーには、プログラム細胞死タンパク質1(PD-1)、Bリンパ球Tリンパ球アテニュエーター(B and T lymphocyte attenuator)(BTLA)、T細胞免疫グロブリン・ムチンドメイン含有タンパク質3(T-cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein 3)(TIM-3)、ならびにT細胞活性化のVドメイン免疫グロブリンサプレッサー(V-domain immunoglobulin suppressor of T cell activation)(VISTA)も含まれる。他の免疫調節チェックポイントタンパク質には、TNFファミリーの中にあるタンパク質(例えば、OX40(CD134とも知られる)および4-1BBリガンド)が含まれる。
【０１１７】
GenBankアクセッション番号AEO22039.1によって定められるハツカネズミ(Mus musculus)VISTAのアミノ酸配列を以下に示した(SEQ ID NO:1)。
2017514835.tif 000003
【０１１８】
GenBankアクセッション番号JN602184.1によって定められるハツカネズミVISTAをコードするmRNA配列を以下に示し(SEQ ID NO:2)、開始コドンおよび停止コドンを太字で示した。
2017514835.tif 000004
【０１１９】
GenBankアクセッション番号NP_003318.1によって定められるヒトOX40リガンドのアミノ酸配列を以下に示し(SEQ ID NO:3)、シグナルペプチドを下線付きのフォントで示し、成熟ペプチドをイタリック体のフォントで示した。
2017514835.tif 000005
【０１２０】
GenBankアクセッション番号NM_003327.3によって定められるヒトOX40リガンドをコードするmRNA配列を以下に示し(SEQ ID NO:4)、開始コドンおよび停止コドンを太字で示した。
2017514835.tif 000006
【０１２１】
GenBankアクセッション番号NP_001552.2によって定められるヒト4-1BBのアミノ酸配列を以下に示し(SEQ ID NO:5)、シグナルペプチドを下線付きのフォントで示し、成熟ペプチドをイタリック体のフォントで示した。
2017514835.tif 000007
【０１２２】
GenBankアクセッション番号NM-001561.5によって定められるヒト4-lBBのmRNA配列を以下に示し(SEQ ID NO:6)、開始コドンおよび停止コドンを太字で示した。
2017514835.tif 000008
2017514835.tif 000009
【０１２３】
CTLA4はT細胞上でしか発現していない受容体であり、T細胞補助刺激受容体であるCD28の活性を妨害することによってT細胞活性化レベルを低減する。CTLA4は、(例えば、CTLA4に結合し、これを遮断する抗体による)癌免疫療法の標的である。イピリムマブ(Bristol-MyersSquibbにより製造される)は、メラノーマ(特に、切除不能または転移性のメラノーマ)処置のために米食品医薬品局(FDA)により認可されており、他の癌での使用について臨床試験が進められている完全ヒト化抗CTLA4抗体である。トレメリムマブ(Pfizerにより製造される; CAS番号745013-59-6)は、メラノーマ処置について臨床試験が進められている完全ヒト化IgG2モノクローナル抗CTLA4抗体である。
【０１２４】
GenBankアクセッション番号P16410.3によって定められるヒトCTLA4のアミノ酸配列を以下に示した(SEQ ID NO:7)。
2017514835.tif 000010
SEQ ID NO:7のアミノ酸残基36〜223はCTLA4の成熟配列に対応する。
GenBankアクセッション番号AF414120.1によって定められるヒトCTLA4のmRNA配列を以下に示した(SEQ ID NO:8)。
2017514835.tif 000011
atg開始コドンおよび停止コドンを太字にし、これに下線を引いた。
【０１２５】
CTLA4が遮断されることで、既にある内因性抗腫瘍免疫応答が腫瘍を破壊できるようになる。従って、対象に内因性抗腫瘍免疫応答が存在すれば、CTLA4が阻害されることで、免疫応答への抵抗性が解除され、身体の免疫細胞が癌細胞を破壊できるようになる。しかしながら、低免疫原性の腫瘍では、内因性免疫応答は存在しないか、または弱すぎて癌細胞を殺滅できず、CTLA4単独での阻害は最小限の効力しかない。
【０１２６】
PD1の役割は、感染に対する免疫応答の間に末梢組織におけるT細胞活性を制限することと、自己免疫を最小化することである。PD1は、活性化されたTエフェクター細胞、B細胞、およびナチュラルキラー(NK)細胞を含む活性化されたリンパ球において発現している。PD1のリガンドには、PD1リガンド1(PDL1。B7-H1およびCD274とも呼ばれる)ならびにPDL2(B7-DCおよびCD273とも呼ばれる)が含まれる。PD1は、そのリガンドに結合した時にリンパ球機能を阻害する。癌をもつ対象では、PD1は腫瘍浸潤リンパ球の多くの割合で発現していることが多い。さらに、PDL1はメラノーマ、卵巣癌、腎臓癌、および肺癌などの癌でも過剰発現している。PDL2は、B細胞リンパ腫(例えば、原発性縦隔B細胞リンパ腫、濾胞細胞B細胞リンパ腫、およびホジキン病)などのリンパ腫に由来する細胞において過剰発現している。従って、PD1およびそのリガンドは腫瘍微小環境での免疫阻害の主要プレーヤーであり、従って、癌免疫療法の標的である。
【０１２７】
GenBankアクセッション番号NM_005018.2によって定められるヒトPD1をコードするmRNA配列を以下に示した(SEQ ID NO:9)。
2017514835.tif 000012
開始コドンおよび停止コドンを太字にし、これに下線を引いた。
【０１２８】
GenBankアクセッション番号NP_005009.2によって定められるヒトPD1のアミノ酸配列を以下に示した(SEQ ID NO:10)。
2017514835.tif 000013
SEQ ID NO:10の残基1〜20はシグナルペプチド配列に対応し、SEQ ID NO:10の残基21〜288は成熟ペプチド配列に対応する。
【０１２９】
ヒトPDL1のアミノ酸配列は、参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号Q9NZQ7.1によって定められる。これを以下に示した(SEQ ID NO:11)。
2017514835.tif 000014
【０１３０】
ヒトPDL1をコードするmRNA配列は、参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号AY291313.1によって定められる。これを以下に示し(SEQ ID NO:12)、開始コドンおよび停止コドンを太字で示した。
2017514835.tif 000015
【０１３１】
ヒトPDL2のアミノ酸配列は、参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号Q9BQ51.2によって定められる。これを以下に示した(SEQ ID NO:13)。
2017514835.tif 000016
【０１３２】
ヒトPDL2をコードするmRNA配列は、参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号AF344424.1によって定められる。これを以下に示し(SEQ ID NO:14)、開始コドンおよび停止コドンを太字で示した。
2017514835.tif 000017
【０１３３】
MDX-1106(BMS-936558とも呼ばれる; Bristol Myers Squibbにより製造される)は、メラノーマ、腎臓癌、および肺癌における使用について臨床試験が進められている抗PD1ヒトモノクローナル抗体である。例えば、臨床試験識別番号NCT00730639を参照されたい。MK-3475(Merckにより製造される)はPD1に対するモノクローナルIgG4抗体であり、以前に処置を受けたことがある非小細胞肺癌(NSCLC)患者における使用について臨床試験が進められている。CT-011(ピディリズマブ(pidilizumab)とも呼ばれる。Cure Techにより生産される)はPD1に対するヒト化モノクローナル抗体であり、転移性結腸直腸癌、転移性メラノーマ、およびリンパ腫における使用について臨床試験が進められている。AMP-224(GlaxoSmithKlineおよびAmplimmuneにより開発された)はPD1リガンドを含有するFc融合タンパク質である。AMP-224はPD1とPDL2またはPDL1との相互作用を遮断する。AMP-224は癌における使用について臨床試験が進められている。例えば、臨床試験識別番号NCT01352884を参照されたい。MDX1105(Bristol-Myers Squibbにより生産される)は完全ヒトモノクローナルIgG4抗PDL1抗体であり、癌(例えば、再発性/難治性腎細胞癌、NSCLC、結腸直腸腺癌、悪性メラノーマ、進行性/転移性上皮卵巣癌、胃癌、膵臓癌、および乳癌)における使用について臨床試験が進められている。例えば、臨床試験識別番号NCT00729664を参照されたい。
【０１３４】
免疫チェックポイント受容体に加えて、B7ファミリー免疫抑制性リガンドも、癌免疫療法の候補標的である免疫抑制性タンパク質である。例えば、B7-H3(CD276とも呼ばれる)およびB7-H4(B7-S1、B7x、またはVCTN1とも呼ばれる)が免疫阻害に結びつけられている。さらに、B7-H3およびB7-H4は癌細胞上および腫瘍浸潤細胞上で過剰発現している。MGA271(Macrogenicsにより生産される)はB7-H3に対するヒト化IgG1/κモノクローナル抗体であり、現在、難治性B7-H3発現新生物(例えば、前立腺癌およびメラノーマ)における使用について臨床試験が進められている。例えば、臨床試験識別番号NCT01391143を参照されたい
【０１３５】
ヒトB7-H3のアミノ酸配列は、参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号Q5ZPR3.1によって定められる。ヒトB7-H3をコードするmRNA配列は、参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号AJ583695.1によって定められる。
【０１３６】
ヒトB7-H4のアミノ酸配列は、参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号Q7Z7D3.1によって定められる。ヒトB7-H4をコードするmRNA配列は、参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号DQ103757.1によって定められる。
【０１３７】
他の多数のタンパク質が免疫細胞活性の阻害と関連することが示されており、従って、これらも癌免疫療法の潜在的な標的である。これらのタンパク質には、リンパ球活性化遺伝子3(LAG3、すなわちCD223)、2B4(CD244)、Bリンパ球Tリンパ球アテニュエーター(BTLA、CD272)、T膜タンパク質3(TIM3、HAVcr2)、アデノシンA2a受容体(A2aR)、およびキラー細胞抑制受容体が含まれる。キラー細胞抑制受容体には、キラー細胞免疫グロブリン様受容体(KIR)およびC型レプチン受容体が含まれる。これらはいずれもNK細胞の殺滅活性を調節する。IMP321(Immutepにより生産される)は、LAG3を標的とする可溶性LAG3-Ig融合タンパク質であり、現在、進行性腎細胞腺癌および進行性膵臓腺癌における使用について試験されている。例えば、Brignone et al. Clin. Cancer Res.(2009)15:6225-6231およびWang-Gillam et al. Invest. New Drugs (2013)31:707-13を参照されたい。
【０１３８】
ヒトBTLAのアミノ酸配列は、参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号NP_861445.3によって定められる。これを以下に示し(SEQ ID NO:15)、シグナルペプチドを下線付きのフォントで示し、成熟ペプチドをイタリック体のフォントで示した。
2017514835.tif 000018
ヒトBTLAをコードするmRNA配列は、参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号NM_181780.3によって定められる。これを以下に示し(SEQ ID NO:16)、開始コドンおよび停止コドンを太字で示した。
2017514835.tif 000019
【０１３９】
ヒトTIM3のアミノ酸配列は、参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号Q8TDQ0.3によって定められる。これを以下に示した(SEQ ID NO:17)。
2017514835.tif 000020
ヒトTIM3をコードするmRNA配列は、参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号AF450242.1によって定められる。これを以下に示した(SEQ ID NO:18)。
2017514835.tif 000021
【０１４０】
阻害剤とワクチンとの組み合わせ
内因性抗腫瘍免疫応答が対象に存在すると、前記の免疫抑制性(例えば、免疫チェックポイント)タンパク質が阻害されることで、免疫応答に対する癌細胞の抵抗性が解除され、身体の免疫細胞は癌を破壊できるようになる。しかしながら、低免疫原性の腫瘍では、内因性免疫応答は存在しないか、または弱すぎて癌細胞を殺滅できず、免疫抑制性タンパク質の阻害は最小限の効力しかない。
【０１４１】
この問題に取り組むために、本発明は、癌ワクチン装置と免疫抑制性タンパク質の阻害剤の組み合わせを提供する。実施例において詳述するように、驚いたことに、この組み合わせは、阻害剤単独での投与と比較して大幅に腫瘍サイズを縮小させ、生存期間を延ばした。Tエフェクター活性を強化し、Treg細胞と、一部のアジュバントによって誘導され得る他の免疫抑制機構をダウンレギュレートするために、他のワクチン製剤と比べて最適化されている、例えば、GM-CSFとアジュバントの提示を制御するように最適化されている材料ベース(例えば、PLG)ワクチンが本明細書において説明される。この材料ベースワクチンは、Treg細胞と比べてエフェクターT細胞の作製および増殖を優先的に強化することによって、免疫抑制性タンパク質、例えば、抗CTLA-4に応答する腫瘍およびワクチン微小環境を作り出すという点で以前のワクチンシステムよりもかなり優れている。
【０１４２】
本発明は、免疫抑制性タンパク質に対する1種類または複数種の(例えば、1種類、2種類、3種類、4種類、5種類、6種類の、またはそれより多い)阻害剤を含む癌ワクチン装置を特徴とする。例えば、阻害剤は癌ワクチン装置の内部または表面に組み込まれ、例えば、装置内にある足場組成物の内部または表面に組み込まれる。阻害剤を含有する癌ワクチン装置を投与すると、阻害剤が局所送達される、例えば、ワクチンと同じ部位に局所送達される。
【０１４３】
装置を製作している間に、阻害剤をワクチン装置の内部に入れてカプセル化することができる。または、ワクチン装置が製作された後に、阻害剤はワクチン装置に加えられる。例えば、阻害剤は、ワクチンを製作するのに用いられるPLGマイクロスフェアの内部に入れてカプセル化されるか、発泡前に、PLGに加えられるCpGおよびスクロースと組み合わされるか、または製作後に、例えば、装置の表面に吸着させることによって、もしくは阻害剤を持続放出性製剤に入れ、その後に、持続放出製剤をワクチン装置と組み合わせることによってワクチン装置に加えられる。
【０１４４】
例えば、癌ワクチン装置は抗CTLA4抗体および/または抗PD1抗体を含む。
【０１４５】
本発明はまた、癌ワクチンを免疫抑制性タンパク質の阻害剤と組み合わせて投与することによって、癌細胞を殺滅する方法、癌進行を遅らせる方法、腫瘍サイズを小さくする方法、癌患者の生存期間を延ばす方法、および/または癌を処置する方法も提供する。
【０１４６】
例えば、ワクチンと阻害剤は別々に製剤化される。すなわち、阻害剤はワクチン装置内に含まれない。一部の態様では、ワクチンと1種類または複数種の(例えば、1種類、2種類、3種類、4種類、5種類、6種類の、またはそれより多い)阻害剤が同時に投与される。他の場合では、ワクチンと阻害剤は連続して投与される。例えば、阻害剤は、ワクチンが投与される少なくとも6時間前に(例えば、6時間前、12時間前、24時間前、2日前、3日前、4日前、5日前、6日前、7日前、1.5週間前、2週間前、3週間前、4週間前、またはそれより前に)投与される。他の場合では、ワクチンは、阻害剤が投与される少なくとも6時間前に(例えば、6時間前、12時間前、24時間前、2日前、3日前、4日前、5日前、6日前、7日前、1.5週間前、2週間前、3週間前、4週間前、またはそれより前に)投与される。他の態様において、ワクチンと阻害剤は一緒に製剤化される。例えば、阻害剤はワクチン装置内に含まれるかまたはワクチン装置の表面にコーティングされる。
【０１４７】
例えば、抗CTLA4抗体および/または抗PD1抗体はワクチン装置と組み合わせて投与される(例えば、同時にまたは連続して投与される)。
【０１４８】
阻害剤とワクチンの組み合わせには、ある利点がある。例えば、この組み合わせは、腫瘍に浸潤するTエフェクター細胞の活性を相乗的に誘導する。この組み合わせは、局所的なTエフェクター細胞活性(例えば、移植されたワクチン装置の近くにあるT細胞および/またはワクチン流入領域リンパ節の中にあるT細胞)も強化する。同じ装置の内部にある阻害剤とワクチンの組み合わせにも、阻害剤と併用される非装置ワクチンと比べて利点がある。特に、ワクチン装置の内部に阻害剤を含めると、局所的および/または特異的な免疫細胞(例えば、装置に特異的に動員された免疫細胞)を標的化することが可能になる。阻害剤の全身投与とは異なり、このように阻害剤を局所投与すると、場合によっては、毒性が低下し、効力に必要な投与量が少なくなる。
【０１４９】
場合によっては、阻害剤はワクチン装置の前に投与される。例えば、阻害剤(例えば、抗体)が投与された後、例えば、1週間以内に、免疫細胞は腫瘍部位に浸潤する。浸潤によって腫瘍サイズが一時的に大きくなることがある。ワクチン装置が投与(例えば、移植)された後に腫瘍サイズは退縮する。例えば、腫瘍サイズの退縮は、ワクチン装置が投与されて少なくとも1週間後に(例えば、1週間後、2週間後、3週間後、4週間後、5週間後、6週間後、7週間後、8週間後、9週間後、10週間後、11週間後、12週間後、13週間後、14週間後、15週間後、16週間後、17週間後、18週間後、19週間後、20週間後、30週間後、40週間後、50週間後、60週間後、またはそれより後に)起こる。場合によっては、阻害剤および/またはワクチン装置が投与される前の腫瘍サイズと比較して、阻害剤とワクチン装置の組み合わせによって腫瘍サイズが小さくなる(例えば、少なくとも10％、例えば、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、またはそれより小さくなる)。ある例では、阻害剤とワクチン装置の組み合わせによって腫瘍は完全に一掃される。
【０１５０】
腫瘍サイズは当技術分野における標準方法によって求められる。例えば、腫瘍サイズは腫瘍の重量または腫瘍の面積である。腫瘍サイズ(面積、mm2)は、例えば、腫瘍の2つの最長径の積である。腫瘍直径は標準方法(例えば、カリパス)を用いて測定することができる。他の例では、腫瘍の重量は腫瘍サイズの尺度である。
【０１５１】
癌ワクチン装置
癌ワクチンにおいて、癌ワクチン接種のためにtoll様受容体(TLR)アゴニストを提示すると免疫細胞の活性化が改善される。ワクチンおよび方法は、構造ポリマー装置の内部に埋め込まれたTLRアゴニストの組み込みと、提示を含む。CD8(+)樹状細胞(DC)および形質細胞様DC(ならびに従来のDC)は癌ワクチン接種において重要な役割を果たす。これらの細胞は、TLRアゴニストを含有する構造ポリマー装置を用いて優先的に動員および活性化される。この装置は、腫瘍特異的抗原とTLRアゴニストで満たされている、生物工学によって作製された、とても小さな多孔性ディスクとして製造される。ディスクは体内に移植され、例えば、皮下に挿入され、ここで免疫系を活性化して癌細胞を破壊する。このアプローチは、身体に既にある細胞をリプログラミングする。
【０１５２】
ある例では、装置は動員成分を含む。従って、装置は、任意で、サイトカインなどの動員分子を含む。これらの状況で、最初に、サイトカインを放出して宿主樹状細胞(DC)を動員および収納し、その後に、癌抗原およびデンジャーシグナルを提示して、存在しているDCを活性化し、存在しているDCのリンパ節へのホーミングを劇的に強化するようにポリマーを設計した。これらの材料を用いて、特異的かつ保護的な抗腫瘍免疫が生じた。例えば、他の方法では25日以内に癌で死んでいた動物において90％の生存率が達成された。これらの材料は、癌ワクチンおよび他のワクチンにおいて体内の様々な細胞タイプの輸送をプログラムおよび制御するのに有用である。
【０１５３】
材料(ポリ[ラクチド-コ-グリコリド])(PLG)と生理活性分子(例えば、GM-CSFおよびCpG-ODN)を用いて、薬物送達装置として働くだけでなく、DCが動員され、存在している間に活性化される物理的な抗原提示構造としても働くポリマーシステムを設計した。これらの生理活性分子は優れた安全性プロファイルを有する。この材料システムは、既存の細胞療法につきものの時間、費用、および規制上の負担を無くし、複数回の全身注射および多量の全薬物負荷投与量(total drug loading)の必要を少なくするかまたは無くす効果的な癌ワクチンとして働く。本明細書に記載の装置では、インサイチューでDCをプログラムするために感染模倣材料を用いる。
【０１５４】
本発明は、GM-CSFおよびCpG-オリゴヌクレオチド(CpG-ODN)アジュバントの提示を正確に制御することによって、インビボでDCの輸送および活性化を調節するマクロ多孔性ポリマーマトリックスを含む(Ali et al.,2009 Nat Mater, 2: 151-8; Ali et al.,2009 Sci Transl Med, 1:8-19)。これらのマトリックスは癌ワクチンとして適用された時に、CTLを介したメラノーマ腫瘍の一掃を誘導した(Ali et al.,2009 Sci Transl Med, 1:8-19)。
【０１５５】
マクロ多孔性ポリ-ラクチド-コ-グリコリド(PLG)マトリックスは、インビボで、GM-CSF、デンジャーシグナル、および癌抗原を、規定された時間空間的なやり方で提示し、DCがプログラムされているように、動員されたDCの存在地として働く。GM-CSFは、US2013-0202707に記載のように高圧CO2発泡プロセスを用いてPLG足場の内部に入れてカプセル化される。マトリックスからのGM-CSF放出プロファイルによって、周囲組織を通り抜けて因子を拡散させて、存在しているDCを効果的に動員することが可能になる。
【０１５６】
TLRアゴニストを用いて免疫系を治療のために操作するために、インサイチュー樹状細胞標的化システムが用いられる。US2013-0202707(参照により本明細書に組み入れられる)において詳述されるように、インビボで3つの異なる種類のTLRアゴニスト:CpG-ODN、モノホスホリル脂質A(MPLA)、およびポリイノシン酸:ポリシチジル酸(P(I:C))とGM-CSF、Flt3L、またはCCL20の組み合わせを送達して、DCの動員および活性化を増大させるようにマクロ多孔性ポリマー足場を設計した。インサイチューワクチン接種のために様々なDCサブセットが動員および利用される。これらのシステムが免疫を保護しかつ腫瘍を退縮させる能力はCD8(+)DCを必要とした。またこれは、TLRアゴニストのタイプまたは用量に関係なく形質細胞様DC(pDC)およびIL-12産生と強く相関する。
【０１５７】
炎症メディエーター
樹状細胞(DC)の増殖、遊走、および成熟は炎症メディエーターに対して感受性があり、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)が、免疫応答、具体的には、癌抗原に対する免疫応答の強力な刺激物質として特定されている。GM-CSFには、これらの抗原提示免疫細胞を動員およびプログラムする能力もある。さらに、細菌DNAの中に見られるシトシン-グアノシン(CpG)オリゴヌクレオチド(CpG-ODN)配列は、DC活性化を刺激して特異的T細胞応答を引き起こす強力な免疫調節剤である。外因性のGM-CSFおよびCpG-ODNを提示することによって、感染を模倣する微小環境を作り出すことは、DC遊走の数およびタイミングを正確に制御し、抗原特異的免疫応答を調整する手段となる。
【０１５８】
脊椎動物免疫系では病原体を認識するために様々な機構が用いられ、このために、抗原特異的な応答を発生させ、感染を無くすことに長けている。免疫は、抗原提示細胞(APC)、特に、抗原を捕捉し、刺激、侵入病原体のユニークな「デンジャーシグナル」、例えば、細菌DNAの中にあるCpGジヌクレオチド配列によって活性化される樹状細胞(DC)によって制御される(Banchereau J, and Steinman RM. Nature. 392, 245-252. (1998); Klinman DM. Nat. Rev. Immunol. 4, 249-58 (2004); それぞれが参照により本明細書に組み入れられる)。
【０１５９】
しかしながら、自己組織に由来する癌細胞は、DC成熟のシグナルを送るのに必要なデンジャーシグナルが無く、その代わりに、細胞が免疫から逃れるのを可能にする免疫抑制微小環境を促進する。感染の重要な要素は炎症性サイトカインとデンジャーシグナルである。ポリマー材料システムは、これらの因子を、必要とされる時間空間的なやり方で提示して、ワクチンとして有用な、感染を模倣する微小環境をインサイチューで提供するのに理想的である。これらの感染模倣によって宿主DCが持続的にプログラミングされ、インサイチューで効率的にDCが活性化および分散される。これらの感染を模倣する装置は、メラノーマ癌ワクチンを含む非常に多くのワクチン用途に用いられる。
【０１６０】
多くの感染において、炎症性サイトカインとデンジャーシグナルは、免疫の認識と病原体の排除を媒介する特異的DC応答を刺激する。例えば、細菌が侵入し、毒素が放出されると、線維芽細胞、ケラチノサイト、およびメラノサイトなどの皮膚細胞は傷つけられ、その結果、GM-CSFなどの炎症性サイトカインが放出される(Hamilton J. Trends in Immunol. 23, 403-408. (2002); Hamilton J., and Anderson G. Growth Factors. 22(4), 225-231. (2004); それぞれが参照により本明細書に組み入れられる)。炎症性サイトカインはランゲルハンスDC(皮膚)およびDC前駆体(単球; 血液)を動員するように働く(Hamilton J. Trends in Immunol. 23, 403-408. (2002); Hamilton J., and Anderson G. Growth Factors. 22(4), 225-231. (2004); Bowne W.B., et al. Cytokines Cell Mol Ther. 5(4), 217-25. (1999).; Dranoff, G. Nat. Rev. Cancer 4, 11-22 (2004); それぞれが参照により本明細書に組み入れられる)。DCが感染部位に到達すると、炎症に応答して分化し、食作用能力を増加し始める(参照により本明細書に組み入れられる、Mellman I., and Steinman R.M. Cell. 106, 255-258. (2001))。細菌またはその産物を摂取したDCは抗原を処理し始め、細菌DNAの中にあるCpGジヌクレオチド配列によって刺激されるエンドソームTLR9シグナル伝達を介してDC成熟は進行する(参照により本明細書に組み入れられる、Krieg A. M., Hartmann G., and Weiner G. J. CpG DNA: A potent signal for growth, activation, and maturation of human dendritic cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 16, 9305-9310 (1999))。次いで、成熟DCはリンパ節にホーミングし、ここで、感染を無くす抗原特異的T細胞応答を刺激する。
【０１６１】
CpG-ODNは、CCR7、CD80/86補助刺激分子、およびMHC-抗原複合体のDC発現をアップレギュレートする強力な「デンジャーシグナル」である。重要なことに、TLR9シグナル伝達は、サイトカイン産生(例えば、1型IFN)とMHCI分子上への抗原の交差提示によって、Th1様細胞傷害性T細胞応答を促進するようにDCを誘導する。腫瘍抗原と同時に、これらのシグナルが提示されると、癌細胞と効果的に闘う免疫応答を促進するのに必要なデンジャーシグナルが供給される。
【０１６２】
様々な種類のCPG-ODNが、ODNの特異的な構造および配列に応じて様々な免疫応答を促進する。本発明において用いられるODNであるCpG-ODN1826は、メラノーマを含む様々なマウスワクチン接種モデルにおいて首尾よく試験されている。CpG-ODN1826は、単独で、またはペプチドワクチンおよび全細胞ワクチンのアジュバントとして用いられた時に有益な効果を示している。さらに、ODN1826はDC成熟およびサイトカイン産生を直接促進することが示されている。この特定のCpG ODN配列はまたTh1細胞およびNK細胞も間接的に活性化し、従って、適応細胞免疫応答を強化する。
【０１６３】
DCへのCpGの内部移行を促進して、送達とTLR9へのCpGの局在を強化するベクターシステムが開発されている。DNAリン酸基との結合を介してプラスミドDNAを凝縮させ、その結果、細胞膜との結合および細胞へのDNAの取り込みを容易にする正に荷電した小さな凝縮物が生じるように、アミンが豊富なポリカチオンであるポリエチルイミン(polyethylimine)(PEI)が広く用いられている(Godbey W.T., Wu K.K., and Mikos, A.G. J. of Biomed Mater Res, 1999, 45, 268-275; Godbey W.T., Wu K.K., and Mikos, A.G. Proc Natl Acad Sci U S A. 96(9), 5177-81. (1999); それぞれが参照により本明細書に組み入れられる)。結果として、PEIは、遺伝子トランスフェクションを強化し、インサイチューで宿主細胞における長期遺伝子発現を促進するPEI-DNA装填PLGマトリックスを製作するための非ウイルスベクターとして用いられてきた(参照により本明細書に組み入れられる、Huang YC, Riddle F, Rice KG, and Mooney DJ. Hum Gene Ther. 5, 609-17. (2005))。従って、本発明においてCpG-ODNをPEI分子と共に凝縮させた。PEI凝縮によってDCへのCpG-ODNの内部移行が強化され、その後のDC内でのPEI-CpG-ODN脱凝縮によってDC活性化が促進される(参照により本明細書に組み入れられる、US2013-0202707、例えば、86頁、1〜7行;および図3)。
【０１６４】
インサイチューで感染を適切に模倣し、細胞をプログラムするために、炎症性サイトカイン(例えば、GM-CSF)を放出する薬物送達装置として働くだけでなく、DCが動員され、存在している間にデンジャーシグナル(例えば、CpG-ODN)によって活性化される物理的構造としても働くように本発明のPLGシステムを設計した。DC動員と、多孔性PLGマトリックス内でのDC存在を制御する能力はインサイチューでのGM-CSF送達の時間的制御を用いて成し遂げられ、その結果として、インサイチューでGM-CSFレベルが下がるように設計された時だけ、プログラムされたDCのバッチが分散される。例えば、このシステムは、癌ワクチンとして適用された時に、プログラムされたDCの少なくとも5％(例えば、約6％)をリンパ節に分散させ、マウスの少なくとも20％(例えば、約23％)において抗腫瘍性防御免疫を誘導する。細胞プログラミングと分散効率は、GM-CSF阻害からDCを絶えず解放し、高いGM-CSFレベルの存在下ではインサイチューでDCの成熟および分散を促進する最も重要な二次シグナル(CpG-ODN)を用いて改善される。例えば、合成CpG-ODNと外因性GM-CSFを局所的に提示して、インサイチューでGM-CSFによって動員されたDCがCpG-ODNによって刺激されるようにPLGマトリックスを製作した。
【０１６５】
樹状細胞
樹状細胞(DC)は哺乳動物免疫系の中にある免疫細胞であり、造血骨髄前駆細胞に由来する。さらに具体的には、樹状細胞は、リンパ球系(または形質細胞様)前駆細胞から生じたリンパ球系(または形質細胞様)樹状細胞(pDC)と、骨髄球系前駆細胞から生じた骨髄球系樹状細胞(mDC)の下位区分に分類することができる。前駆細胞からは、前駆細胞のタイプに関係なく、未熟な樹状細胞が生まれる。未熟な樹状細胞は、高いエンドサイトーシス活性と低いT細胞活性化能によって特徴付けられる。従って、未熟な樹状細胞は、病原体があるかどうか、すぐそばの周囲の環境を構成的にサンプリングしている。例示的な病原体にはウイルスまたは細菌が含まれるが、これに限定されない。サンプリングは、toll様受容体(TLR)などのパターン認識受容体(PRR)によって成し遂げられる。病原体がtoll様受容体などのパターン認識受容体によって認識されたら、樹状細胞は活性化し、成熟する。
【０１６６】
成熟樹状細胞は病原体を貪食し、破壊するだけでなく、そのタンパク質を分解し、抗原とも呼ばれる、これらのタンパク質の破片を、MHC(主要組織適合複合体)分子(クラスI、II、およびIII)を用いて細胞表面上で提示する。成熟樹状細胞はまた、T細胞活性化の補助受容体として働く細胞表面受容体もアップレギュレートする。例示的な補助受容体には、CD80、CD86、およびCD40が含まれるが、これに限定されない。同時に、成熟樹状細胞は、血流またはリンパ系を通って、それぞれ、脾臓またはリンパ節に遊走するのを可能にする走化性受容体、例えば、CCR7をアップレギュレートする。
【０１６７】
樹状細胞は、外部環境と接触している外部組織、例えば、皮膚(皮膚にある樹状細胞はランゲルハンス細胞とも呼ばれる)に存在する。または、樹状細胞は、外部環境と接触している内部組織、例えば、鼻、肺、胃、および腸の裏打ちに存在する。最終的に、未熟な樹状細胞は血中に存在する。樹状細胞は活性化されたら、これらの組織から離れてリンパ系組織に遊走し、ここで抗原を提示し、T細胞およびB細胞と相互作用して免疫応答を開始する。本発明にとって特に重要なシグナル伝達系の1つは、樹状細胞表面に発現しているケモカイン受容体CCR7と、遊走している成熟樹状細胞を高濃度の免疫細胞に誘引するためにリンパ節構造が分泌するケモカイン受容体リガンドCCL19が関与する。成熟樹状細胞と接触することによって活性化される例示的な免疫細胞には、ヘルパーT細胞、キラーT細胞、およびB細胞が含まれるが、これに限定されない。マクロファージおよびBリンパ球を含む、免疫系の中にある複数の細胞タイプが抗原を提示するが、樹状細胞は全抗原提示細胞の中で最も強力なアクチベーターである。
【０１６８】
樹状細胞は、細胞体から伸びている複数の樹状突起を含む特徴的な細胞形状から名前が付けられた。この細胞形状の機能上の利益は、細胞容積と比較して細胞表面と、周囲との接触面積がかなり大きくなることである。未熟な樹状細胞は特徴的な樹状突起形成が無い時もあり、ベール細胞と呼ばれる。ベール細胞には、樹状突起ではなく大きな細胞質ベールがある。
【０１６９】
形質細胞様樹状細胞(pDC)は、血中を循環し、末梢リンパ器官において見られる自然免疫細胞である。pDCは末梢血単核球(PBMC)の<0.4％を占めている。ヒトにおいて、これらの細胞は表面マーカーCD123、BDCA-2(CD303)、およびBDCA-4(CD304)を発現するが、pDCを従来の樹状細胞と区別する高レベルのCD11cも、pDCを従来の単球と区別するCD14も発現しない。マウスpDCはCD11c、B220、BST-2(mPDCA)、およびSiglec-Hを発現し、CD11b陰性である。自然免疫系の成分として、これらの細胞は、ssRNAモチーフを検出する細胞内Toll様受容体7と、CpG DNAモチーフを検出する細胞内Toll様受容体9を発現する。これらの細胞は刺激され、その後に活性化されると多量のI型インターフェロン(主に、IFN-α(アルファ)およびIFN-β(ベータ))を産生する。これらは、広範囲の作用を媒介する重要な多面的抗ウイルス化合物である。CD8-サブセットはクラスII経路を用いて抗原をCD4+ヘルパーT細胞に提示する。CD8+サブセットはクラスI経路を用いて抗原を提示する。ペプチド/MHCクラスI分子は、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)になるCD8+T細胞に提示される。マウスのCD8細胞表面タンパク質はヒトのCD141細胞表面タンパク質に対応する。CD8/CD141陽性細胞はTLR3を発現し、TLR3アゴニストによって優先的に活性化される。
【０１７０】
Toll様受容体(TLR)
TLRは、病原体関連分子パターン(PAMP)と呼ばれる、構造が保存されている分子を認識する1回膜貫通ドメイン非触媒受容体の一種である。PAMPは微生物上に存在し、宿主分子と区別することができる。TLRは全脊椎動物に存在する。13種類のTLR(連続してTLR1-13と呼ばれる)がヒトおよびマウスにおいて特定されている。ヒトはTLR1-10を含む。
【０１７１】
TLRおよびインターロイキン-1(IL-1)受容体は受容体スーパーファミリーを含み、受容体スーパーファミリーのメンバーは全てTIRドメイン(Toll-IL-1受容体)を共有する。TIRドメインは3つの異なる機能をもつ3つの種類が存在する。サブグループ1のTIRドメインは、マクロファージ、単球、および樹状細胞によって産生されたインターロイキンの受容体に存在する。サブグループ2のTIRドメインは、微生物由来の分子に直接的または間接的に結合する古典的TLRに存在する。サブグループ3のTIRドメインは、サブグループ1および2のTIRドメインを含むタンパク質間のシグナル伝達を媒介するサイトゾルアダプタータンパク質に存在する。
【０１７２】
TLRリガンドは、病原体または細胞ストレスなどの宿主生存に驚異となるものと絶えず関連し、これに高度に特異的な分子を含む。TLRリガンドは病原体に高度に特異的であり、宿主には特異的でない。例示的な病原性の分子には、リポ多糖(LPS)、リポタンパク質、リポアラビノマンナン、フラジェリン、二本鎖RNA、およびDNAの非メチル化CpGアイランドが含まれるが、これに限定されない。
【０１７３】
本発明の好ましい一態様において、Toll様受容体9(TLR9)は、細菌DNAの中にある特定の非メチル化CpG含有配列、または樹状細胞のエンドソーム区画に見られる合成オリゴヌクレオチド(ODN)によって活性化される。CpG部位のメチル化状態は、細菌DNAと哺乳動物DNAとの、ならびに正常組織と癌組織との極めて大きな違いである。1つまたは複数のCpGモチーフを含む非メチル化ODNは細菌DNAの作用を模倣する。または、もしくはさらに、1つまたは複数のCpGモチーフを含む非メチル化ODNは悪性腫瘍細胞内に存在する癌遺伝子内に生じる。
【０１７４】
TLR-9受容体の1つまたは複数の配列は本発明の1つまたは複数のCpG-ODN配列を認識する。本発明によって包含される。TLR-9受容体は以下の配列で説明される。
【０１７５】
ヒトTLR-9、アイソフォームAは、以下のmRNA配列(NCBIアクセッション番号NM_017442およびSEQ ID NO:19; 本明細書に示した全mRNA配列の開始コドンを太字の大文字で示した)によってコードされる。
2017514835.tif 000022
2017514835.tif 000023
【０１７６】
ヒトTLR-9、アイソフォームAは、以下のアミノ酸配列(NCBIアクセッション番号NP_059138およびSEQ ID NO:20)によってコードされる。
2017514835.tif 000024
【０１７７】
ヒトTLR3は、以下のmRNA配列(参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号NM_003265.2(GI:19718735); SEQ ID NO:21)によってコードされる。
2017514835.tif 000025
【０１７８】
ヒトTLR3は、以下のアミノ酸配列(参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号ABC86910.1(GI:86161330); SEQ ID NO:22)によってコードされる。
2017514835.tif 000026
【０１７９】
ヒトTLR1の核酸配列は、参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号NM_003263.3(GI:41350336)において定められる。ヒトTLR1のアミノ酸配列は、参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号NP_003254.2(GI:41350337)において定められる。
【０１８０】
ヒトTLR2の核酸配列は、参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号NM_003264.3(GI:68160956)において定められる。ヒトTLR2のアミノ酸配列は、参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号NP_003255.2(GI:19718734)において定められる。
【０１８１】
ヒトTLR4の核酸配列は、参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号NM_138554.4(GI:373432600)において定められる。ヒトTLR4のアミノ酸配列は、参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号NP_612564.1(GI:19924149)において定められる。
【０１８２】
ヒトTLR5の核酸配列は、参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号NM_003268.5(GI:281427130)において定められる。ヒトTLR5のアミノ酸配列は、参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号NP_003259.2(GI:16751843)において定められる。
【０１８３】
ヒトTLR6の核酸配列は、参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号NM_006068.4(GI:318067953)において定められる。ヒトTLR6のアミノ酸配列は、参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号NP_006059.2(GI:20143971)において定められる。
【０１８４】
ヒトTLR7の核酸配列は、参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号NM_016562.3(GI:67944638)において定められる。ヒトTLR7のアミノ酸配列は、参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号NP_057646.1(GI:7706093)において定められる。
【０１８５】
ヒトTLR8の核酸配列は、参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号NM_138636.4(GI:257196253)において定められる。ヒトTLR8のアミノ酸配列は、参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号NP_619542.1(GI:20302168)において定められる。
【０１８６】
ヒトTLR10の核酸配列は、参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号NM_030956.3(GI:306140488)において定められる。ヒトTLR10のアミノ酸配列は、参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号NP_112218.2(GI:62865618)において定められる。
【０１８７】
マウスTLR11の核酸配列は、参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号NM_205819.3(GI:408684412)において定められる。マウスTLR11のアミノ酸配列は、参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号NP_991388.2(GI:408684413)において定められる。
【０１８８】
マウスTLR12の核酸配列は、参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号NM_205823.2(GI:148539900)において定められる。マウスTLR12のアミノ酸配列は、参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号NP_991392.1(GI:45430001)において定められる。
【０１８９】
マウスTLR13の核酸配列は、参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号NM_205820.1(GI:45429998)において定められる。マウスTLR13のアミノ酸配列は、参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号NP_991389.1(GI:45429999)において定められる。
【０１９０】
TLRアゴニスト(合成リガンドおよび天然リガンド)とその対応する受容体の代表的なリストを以下の表に示した。
2017514835.tif 000027
＊TLR1およびTLR2によって認識されるリガンド
＊＊TLR2およびTLR6によって認識されるリガンド
参考文献
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S.Gnjatic, N.B.Sawhney, N.Bhardwaj Toll-like receptor agonists: are they good adjuvants? Cancer J., 16(4) (2010), pp.382-91.
【０１９１】
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)
顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)は、マクロファージ、T細胞、マスト細胞、内皮細胞、および線維芽細胞によって分泌されるタンパク質である。具体的には、GM-CSFは、白血球増殖因子として機能するサイトカインである。GM-CSFは、顆粒球および単球を産生するように幹細胞を刺激する。単球は血流から出て、組織に遊走し、その後に成熟してマクロファージになる。
【０１９２】
本明細書に記載の足場装置は、宿主DCを装置に誘引するためにGM-CSFポリペプチドを含み、放出する。意図されるGM-CSFポリペプチドは内因性供給源から単離されるか、またはインビボもしくはインビトロで合成される。内因性GM-CSFポリペプチドは健常ヒト組織から単離される。トランスフェクションまたは形質転換によってテンプレートDNAが宿主生物または宿主細胞、例えば、哺乳動物細胞株または培養ヒト細胞株に導入された後に、合成GM-CSFポリペプチドはインビボで合成される。または、合成GM-CSFポリペプチドは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって、または他の当技術分野において認められている方法(参照により本明細書に組み入れられる、Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, Vol.1, 2, 3(1989))によってインビトロで合成される。
【０１９３】
GM-CSFポリペプチドはインビボでのタンパク質安定性を高めるように改変される。または、GM-CSFポリペプチドは免疫原性が強くなるかまたは弱くなるように操作される。内因性成熟ヒトGM-CSFポリペプチドは、報告によれば、アミノ酸残基23(ロイシン)、27(アスパラギン)、および39(グルタミン酸)がグリコシル化される(米国特許第5,073,627号を参照されたい)。本発明のGM-CSFポリペプチドは、グリコシル化状態に関して、これらのアミノ酸残基の1つまたは複数において改変される。
【０１９４】
GM-CSFポリペプチドは組換えである。または、GM-CSFポリペプチドは哺乳動物GM-CSFポリペプチドのヒト化誘導体である。GM-CSFポリペプチドが得られる例示的な哺乳動物種には、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、フェレット、ネコ、イヌ、サル、または霊長類が含まれるが、これに限定されない。好ましい態様において、GM-CSFは組換えヒトタンパク質(PeproTech、カタログ番号300-03)である。または、GM-CSFは組換えマウスタンパク質(PeproTech、カタログ番号315-03)である。最後に、GM-CSFは組換えマウスタンパク質のヒト化誘導体である。
【０１９５】
ヒト組換えGM-CSF(PeproTech、カタログ番号300-03)は、以下のポリペプチド配列(SEQ ID NO:24)によってコードされる。
2017514835.tif 000028
【０１９６】
マウス組換えGM-CSF(PeproTech、カタログ番号315-03)は、以下のポリペプチド配列(SEQ ID NO:25)によってコードされる。
2017514835.tif 000029
【０１９７】
ヒト内因性GM-CSFは、以下のmRNA配列(NCBIアクセッション番号NM_000758およびSEQ ID NO:26)によってコードされる。
2017514835.tif 000030
【０１９８】
ヒト内因性GM-CSFは、以下のアミノ酸配列(NCBIアクセッション番号NP_000749.2およびSEQ ID NO:27)によってコードされる。
2017514835.tif 000031
【０１９９】
GM-CSFシグナル伝達は従来のDCの強力な走化性因子であり、T細胞免疫を初回刺激するのに用いられるMHC(II)およびCD86(+)の表面発現を大幅に強化した。対照的に、Flt3Lワクチンは多数の形質細胞様DC(pDC)をもたらし、これはT細胞応答を増幅する高レベルのT細胞初回刺激サイトカインと相関関係があった。従って、参照により本明細書に組み入れられるUS2013-0202707に記載のように、免疫療法のためにインビボで様々なDCサブセットを効果的に動員および活性化するために、炎症性サイトカインを提示するように改変された3Dポリマーマトリックスが用いられる。
【０２００】
ヒトFlt3の例示的なアミノ酸配列を以下に示した(参照により本明細書に組み入れられる、GenBankアクセッション番号:P49771.1(GI:1706818); SEQ ID NO:28)。
2017514835.tif 000032
【０２０１】
シトシングアノシン(CpG)オリゴヌクレオチド(CpG-ODN)配列
CpG部位は、塩基の直鎖配列において、その長さに沿ってシステインヌクレオチドがグアニンヌクレオチドの次に現れるデオキシリボ核酸(DNA)領域である(「p」は、システインヌクレオチドとグアニンヌクレオチドとの間にあるリン酸結合を表し、これらをシトシン-グアニン相補塩基対合と区別する)。CpG部位は、遺伝子発現を停止するのに細胞が用いる、いくつかの内因性機構の1つであるDNAメチル化において中心的な役割を果たす。プロモーターエレメント内にあるCpG部位をメチル化すると遺伝子サイレンシングを引き起こすことができる。癌の場合、腫瘍抑制遺伝子は発現停止することが多いのに対して、癌遺伝子、すなわち癌を誘発する遺伝子は発現していることが知られている。重要なことに、ある特定の癌では、(癌形成を抑制する)腫瘍抑制遺伝子のプロモーター領域内にあるCpG部位はメチル化されることが示されているに対して、癌遺伝子のプロモーター領域内にあるCpG部位は低メチル化または非メチル化されている。TLR-9受容体はDNAの非メチル化CpG部位に結合する。
【０２０２】
本発明はCpGジヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを含む。意図されるCpGオリゴヌクレオチドは内因性供給源から単離されるか、またはインビボもしくはインビトロで合成される。内因性CpGオリゴヌクレオチドの例示的な供給源には、微生物、細菌、菌類、原生動物、ウイルス、カビ、または寄生生物が含まれるが、これに限定されない。または、内因性CpGオリゴヌクレオチドは哺乳動物の良性のまたは悪性の新生物腫瘍(neoplastic tumor)から単離される。トランスフェクションまたは形質転換によってテンプレートDNAが宿主生物に導入された後に、合成CpGオリゴヌクレオチドがインビボで合成される。または、合成CpGオリゴヌクレオチドはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)または他の当技術分野において認められている方法によってインビトロで合成される(参照により本明細書に組み入れられる、Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, Vol. 1, 2, 3 (1989))。
【０２０３】
樹状細胞による細胞取り込みのためにCpGオリゴヌクレオチドが提示される。一態様において、裸のCpGオリゴヌクレオチドが用いられる。「裸の」という用語は、さらなる置換基を含まない、単離された内因性または合成のポリヌクレオチド(またはオリゴヌクレオチド)を説明するために用いられる。別の態様において、細胞取り込みの効率を高めるために、CpGオリゴヌクレオチドを1種類または複数種の化合物に結合させる。または、もしくはさらに、足場内および/または樹状細胞内でのオリゴヌクレオチド安定性を高めるために、CpGオリゴヌクレオチドを1種類または複数種の化合物に結合させる。
【０２０４】
細胞取り込み前にCpGオリゴヌクレオチドは凝縮される。好ましい一態様において、CpGオリゴヌクレオチドは、樹状細胞への細胞取り込みの効率を高めるカチオン性ポリマーであるポリエチルイミン(PEI)を用いて凝縮される。
【０２０５】
本発明のCpGオリゴヌクレオチドは複数の種類に分けることができる。例えば、本発明の組成物、方法、および装置によって包含される例示的なCpG-ODNは刺激性であるか、中性であるか、または抑制性である。本明細書において用いられる「刺激性」という用語は、TLR9を活性化するCpG-ODN配列の一種を説明することが意図される。本明細書において用いられる「中性の」という用語は、TLR9を活性化しないCpG-ODN配列の一種を説明することが意図される。本明細書において用いられる「抑制性」という用語は、TLR9を阻害するCpG-ODN配列の一種を説明することが意図される。「TLR9を活性化する」という用語は、TLR9が細胞内シグナル伝達を開始するプロセスを説明する。
【０２０６】
刺激性CpG-ODNは、免疫刺激活性の点で異なる3つの型A、B、およびCにさらに分けることができる。A型刺激性CpGODNは、ホスホジエステル中心CpG含有パリンドロームモチーフおよびホスホロチオエート3'ポリ-G配列を特徴とする。TLR9が活性化された後に、これらのCpG ODNは形質細胞様樹状細胞(pDC)から多量のIFN-α産生を誘導する。A型CpG ODNはTLR9依存的NF-κBシグナル伝達を弱く刺激する。
【０２０７】
B型刺激性CpG ODNは完全ホスホロチオエートバックボーンと1つまたは複数のCpGジヌクレオチドを含有する。TLR9が活性化された後に、これらのCpG-ODNはB細胞を強く活性化する。A型Cpg-ODNとは対照的に、B型CpG-ODNはIFN-α分泌を弱く刺激する。
【０２０８】
C型刺激性CpG ODNはA型とB型の特徴を含む。C型CpG-ODNは完全ホスホロチオエートバックボーンとCpG含有パリンドロームモチーフを含有する。A型CpG ODNと同様に、C型CpG ODNはpDCから強力なIFN-α産生を誘導する。B型CpG ODNと同様に、C型CpG ODNは強力なB細胞刺激を誘導する。
【０２０９】
例示的な刺激性CpG ODNは、ODN1585、ODN1668、ODN1826、ODN2006、ODN2006-G5、ODN2216、ODN2336、ODN2395、ODN M362(全てInvivoGen)を含むが、これに限定されない。本発明はまた、前述のCpG ODNの任意のヒト化バージョンも包含する。好ましい一態様において、本発明の組成物、方法、および装置は、ODN 1826(5'→3'の配列はtccatgacgttcctgacgttであり、CpGエレメントを太字で示した。SEQ ID NO:29)を含む。
【０２１０】
TLR9を刺激しない中性、すなわち対照のCpG ODNが本発明によって包含される。これらのODNは、刺激性対応物と同じ配列を含むが、CpGジヌクレオチドの代わりにGpCジヌクレオチドを含有する。
【０２１１】
本発明によって包含される例示的な中性、すなわち対照のCpG ODNは、ODN1585対照、ODN1668対照、ODN1826対照、ODN2006対照、ODN2216対照、ODN2336対照、ODN2395対照、ODN M362対照(全てInvivoGen)を含むが、これに限定されない。本発明はまた、前述のCpG ODNの任意のヒト化バージョンも包含する。
【０２１２】
TLR9を阻害する抑制性CpG ODNが本発明によって包含される。例示的な強力な抑制性配列は、哺乳動物テロメアにおいて見られる(TTAGGG)4(SEQ ID NO:30)(オリゴヌクレオチドTTAGGG, InvivoGen)、および3個の塩基を交換することによってマウス刺激性CpG ODNから得られたODN 2088(InvivoGen)である。抑制性ODNは、細胞の結合および取り込みに影響を及ぼすことなく、エンドソーム小胞内でのCpG ODNとTLR9との共局在を破壊する。本発明によって包含される抑制性CpG ODNは、刺激性CpG-ODNの作用を微調整するか、弱めるか、逆転させるか、またはこれに逆らうように用いられる。または、もしくはさらに、抑制性CpG ODNを含む本発明の組成物、方法、または装置は、自己免疫状態を処置するか、移植処置後の免疫応答を阻止するために用いられる。
【０２１３】
癌抗原
本発明の組成物、方法、および装置は、このような装置が投与された対象にワクチン接種する手段および/または防御免疫を提供する手段をもつ癌抗原を含む。癌抗原は、単独で、またはGM-CSF、CpG-ODN配列、もしくは免疫調節剤と組み合わせて用いられる。さらに、癌抗原は、GM-CSF、CpG-ODN配列、または免疫調節剤と同時に、または連続して用いられる。
【０２１４】
本発明の組成物、方法、および装置によって包含される例示的な癌抗原には、生検材料から抽出した(例えば、メラノーマ腫瘍生検材料から抽出した、またはB16-F10メラノーマ腫瘍細胞を投与したマウスから単離したB16-F10腫瘍から抽出した)腫瘍溶解産物、放射線照射された腫瘍細胞(例えば、放射線照射されたメラノーマ細胞)、肺癌に由来する抗原、乳癌に由来する抗原(例えば、Her2、例えば、精製されたHer2またはその断片)、神経膠腫癌に由来する抗原、前立腺(例えば、前立腺癌)抗原(例えば、前立腺酸性ホスファターゼ)、抗原のMAGEシリーズ(MAGE-1が一例である)、MART-1/メランA、チロシナーゼ、ガングリオシド、gp100、GD-2、O-アセチル化GD-3、GM-2、MUC-1、Sos1、プロテインキナーゼC結合タンパク質、逆転写酵素タンパク質、AKAPタンパク質、VRK1、KIAA1735、T7-1、T11-3、T11-9、ホモ・サピエンステロメラーゼ酵素(hTRT)、サイトケラチン-19(CYFRA21-1)、扁平上皮癌抗原1(SCCA-1)、(タンパク質T4-A)、扁平上皮癌抗原2(SCCA-2)、卵巣癌抗原CA125(1A1-3B)(KIAA0049)、ムチン1(腫瘍関連ムチン)、(癌腫関連ムチン)、(多型上皮ムチン)、(PEM)、(PEMT)、(エピシアリン)、(腫瘍関連上皮膜抗原)、(EMA)、(H23AG)、(ピーナッツ反応性尿中ムチン)、(PUM)、(乳癌関連抗原DF3)、CTCL腫瘍抗原se1-1、CTCL腫瘍抗原se14-3、CTCL腫瘍抗原se20-4、CTCL腫瘍抗原se20-9、CTCL腫瘍抗原se33-1、CTCL腫瘍抗原se37-2、CTCL腫瘍抗原se57-1、CTCL腫瘍抗原se89-1、前立腺特異的膜抗原、5T4癌胎児性栄養膜糖タンパク質、Orf73カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、MAGE-C1(癌/精巣抗原CT7)、MAGE-B1抗原(MAGE-XP抗原)(DAM10)、MAGE-B2抗原(DAM6)、MAGE-2抗原、MAGE-4a抗原、MAGE-4b抗原、結腸癌抗原NY-CO-45、肺癌抗原NY-LU-12バリアントA、癌関連表面抗原、腺癌抗原ART1、Paraneoplastic associated brain-testis-cancer antigen (癌ニューロン抗原MA2;腫瘍随伴性ニューロン抗原)、Neuro-oncological ventral antigen 2(NOVA2)、肝細胞癌抗原遺伝子520、腫瘍関連抗原CO-029、腫瘍関連抗原MAGE-X2、Synovial sarcoma, X breakpoint 2、Squamous cell carcinoma antigen recognized by T cell、Serologically defined colon cancer antigen 1、Serologically defined breast cancer antigen NY-BR-15、Serologically defined breast cancer antigen NY-BR-16、クロモグラニンA;副甲状腺分泌タンパク質1、DUPAN-2、CA19-9、CA72-4、CA195、癌胎児抗原(CEA)が含まれるが、これに限定されない。
【０２１５】
ヒト前立腺酸性ホスファターゼのアミノ酸配列は、GenBankアクセッション番号AAA60022.1によって定められる。これを以下に示し(SEQ ID NO:31)、シグナルペプチドを下線付きのフォントで示し、成熟ペプチドをイタリック体のフォントで示した。
2017514835.tif 000033
ヒト前立腺酸性ホスファターゼをコードするmRNA配列は、GenBankアクセッション番号M24902.1によって定められる。これを以下に示し(SEQ ID NO:32)、開始コドンおよび停止コドンを太字で示した。
2017514835.tif 000034
【０２１６】
ヒトHer2のアミノ酸配列は、GenBankアクセッション番号P04626.1によって定められる。これを以下に示した(SEQ ID NO:33)。
2017514835.tif 000035
ヒトHer2をコードするmRNA配列は、GenBankアクセッション番号NM_004448.3によって定められる。これを以下に示し(SEQ ID NO:34)、開始コドンおよび停止コドンを太字で示した。
2017514835.tif 000036
2017514835.tif 000037
【０２１７】
一部の態様では、腫瘍抗原は発現プロファイルに基づいて4つの主なグループに分類される。参照により本明細書に組み入れられる、van der Bruggen P, Stroobant V, Vigneron N, Van den Eynde B. Peptide database: T cell-defined tumor antigens. Cancer Immun 2013. URL: www.cancerimmunity.org/peptide/を参照されたい。例示的な腫瘍抗原およびその分類を以下の通りに下記にまとめた。
1)ユニークな抗原:腫瘍細胞に特有のもの(表1)。これらの抗原は、タンパク質抗原をコードする遺伝子の変異から生じる。一般的に、変異は遺伝子のコード配列に影響を及ぼす。ある例では、変異は個々の対象または少数の対象の腫瘍に特有のものである。これらのユニークな抗原は、一般的に、異なる対象に由来する腫瘍に共通してない。
2)共通抗原:腫瘍特異的抗原(表2)。共通抗原はユニークな抗原とは異なり、関係のない複数の腫瘍において発現している。腫瘍特異的抗原は複数の腫瘍において発現しているが、正常細胞では発現していない。例えば、これらの抗原は「癌生殖系列」遺伝子によってコードされる。
3)共通抗原:分化抗原(表3)。分化抗原は、腫瘍と、腫瘍が発生する正常組織において発現している。例えば、これらの抗原は発生段階中に特定の細胞系列において発現している。これらの抗原は腫瘍特異的でないので、癌免疫療法のために、これらの抗原を標的化すると、対応する正常組織が重要でないかどうか、また、抗原を発現する組織が癌処置の間に外科的に取り除かれるかどうかに応じて、対応する正常組織に対する自己免疫が引き起こされることがある。
4)共通抗原:過剰発現している抗原(表4)。これらの抗原は様々な正常組織において発現しており、腫瘍細胞では過剰発現している。
例えば、腫瘍ペプチド、例えば、親タンパク質を発現する腫瘍細胞も認識するTリンパ球による認識に基づいて腫瘍抗原だとみなされた腫瘍ペプチドの表。以下の各表は、タンパク質または遺伝子の名前、タンパク質/遺伝子についてのGeneCard情報、タンパク質からのペプチド配列(例えば、抗原特異性のための最小配列、例えば、T細胞によって認識される最小配列)、および完全長タンパク質配列中のペプチドの位置を含む。ある例では、以下の表に示したペプチドはヒト白血球抗原(HLA)提示分子である。例えば、このペプチドは、主要組織適合複合体(MHC)分子上に提示される。表1の中にある下線付きのアミノ酸は、非腫瘍細胞に見られるタンパク質バージョンの配列とは異なるアミノ酸である。すなわち、腫瘍細胞は、表1で下線を付けた変異をもつ変異型タンパク質を含有する。
【０２１８】
【表１】
2017514835.tif 000038
2017514835.tif 000039
2017514835.tif 000040
2017514835.tif 000041
2017514835.tif 000042
aこの変異はHLA遺伝子そのものに影響を及ぼす
bこの変異は、ペプチドコードする領域に位置していない
cフレームシフト産物
dこの変異によって、調節性T細胞(Treg)によって認識される抗原性ペプチドをコードする別のオープンリーディングフレーム(ORF)を開始する開始コドン(ATG)が作り出される。
【０２１９】
【表２】
2017514835.tif 000043
2017514835.tif 000044
2017514835.tif 000045
2017514835.tif 000046
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2017514835.tif 000048
2017514835.tif 000049
2017514835.tif 000050
2017514835.tif 000051
d中間プロテアソームβ5iでしか処理されない(Guillaume et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107.43(2010): 18599-604)
eMAGE-A3/A2(aa271-279)と同じペプチド
fメラノーマにしか見られないN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼV(GnTV)の異常転写物
gメラノーマにしか見られない不完全にスプライシングされた転写物
iこのペプチドの処理には免疫プロテアソーム(immunoproteasome)が必要とされる
jこのペプチドは、MAGE-4陽性腫瘍試料の1/3において発現している対立遺伝子MAGE-4aによってコードされる。他の対立遺伝子、すなわち、MAGE-4bはペプチドEVDPTSNTYをコードする。
kムチン低グリコシル化により腫瘍において明らかになった反復モチーフのCTLによるMHC非拘束性認識。ムチン低グリコシル化は授乳中に乳管上皮細胞でも起こるが、T細胞が到達できない細胞外頂端表面にしか起こらない。
l中間プロテアソームβ1iβ51でしか処理されない(Guillaume et al. 2010)
【０２２０】
【表３】
2017514835.tif 000052
2017514835.tif 000053
2017514835.tif 000054
2017514835.tif 000055
2017514835.tif 000056
dチロシナーゼをコードする様々な対立遺伝子が述べられている。白人の50％において、ノナペプチドSEIWRDIDFのセリン残基がチロシンに置換されている
eこのペプチドは、プロテアソームによってスプライシングされた2つの連続していない断片で構成される
fホスホペプチド
g腫瘍細胞では不完全に処理されるようである(Fauquembergue et al.J.Immunother. 33.4 (2010): 402-13)
【０２２１】
【表４】
2017514835.tif 000057
2017514835.tif 000058
2017514835.tif 000059
2017514835.tif 000060
2017514835.tif 000061
2017514835.tif 000062
cこの抗原は、ある特定のHLA-C分子を発現する細胞の溶解を阻止するNK抑制性受容体をもつCTLによって認識される
e不完全に処理されるかまたは処理されない(Parkhurst, 2004; Ayyoub, 2001)
fこのペプチドは、スプライシングされた2つの連続していない断片で構成される
g選択的転写物
hMMP-2は普遍的に発現しているが、メラノーマ細胞は、分泌型MMP-2に由来する抗原をαvβ3依存的に交差提示する
iエピトープは非翻訳領域に位置する
【０２２２】
免疫調節剤
本発明の組成物、方法、および装置は、樹状細胞活性化を刺激する手段をもつ、TLRリガンド、増殖因子、および死につつある細胞の産物(product of dying cell)、例えば、熱ショックタンパク質を含むが、これに限定されない免疫調節剤を含む。免疫調節剤は、単独で、またはGM-CSF、CpG-ODN配列、もしくは癌抗原と組み合わせて用いられる。免疫調節剤は、GM-CSF、CpG-ODN配列、または癌抗原と同時に、または連続して用いられる。
【０２２３】
細胞表面または内部細胞区画のいずれかで見出された公知のTLRリガンドが全て、本発明の組成物、方法、および装置によって包含される。例示的なTLRリガンドには、トリアシルリポタンパク質(TLR1);リポタンパク質、グラム陽性ペプチドグリカン、リポテイコ酸(lipteichoic acid)、菌類およびウイルスの糖タンパク質(TLR2);二本鎖RNA、ポリI:C(TLR3);リポ多糖(lipopolysaccaride)、ウイルス糖タンパク質(TLR4);フラジェリン(TLR5);ジアシルリポタンパク質(TLR6);小さな合成化合物、一本鎖RNA(TLR7およびTLR8);非メチル化CpG DNA(TLR9);プロフィリン(TLR11)が含まれるが、これに限定されない。TRLリガンドとして、フィブロネクチンおよび熱ショックタンパク質(HSP)のような宿主分子も含まれる。宿主TLRリガンドも本発明によって包含される。自然免疫におけるTLRの役割ならびにTLRを活性化および阻害するのに用いられるシグナル伝達分子が当技術分野において公知である(総説については、参照により本明細書に組み入れられる、Holger K. Frank B., Hessel E., and Coffman RL. Therapeutic targeting of innate immunity with Toll-like receptor agonists and antagonists. Nature Medicine 13, 552-559(2007)を参照されたい)。
【０２２４】
公知の増殖因子が全て、本発明の組成物、方法、および装置によって包含される。例示的な増殖因子には、トランスフォーミング増殖因子ベータ(TGF-β)、顆粒球-コロニー刺激因子(G-CSF)、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、神経成長因子(NGF)、ニューロトロフィン、血小板由来増殖因子(PDGF)、エリスロポエチン(EPO)、トロンボポエチン(TPO)、ミオスタチン(GDF-8)、増殖分化因子-9(GDF9)、酸性線維芽細胞増殖因子(aFGFまたはFGF-1)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGFまたはFGF-2)、上皮細胞増殖因子(EGF)、肝細胞増殖因子(HGF)が含まれるが、これに限定されない。本発明は、樹状細胞活性化を刺激するためにサイトカインならびに増殖因子を包含する。例示的なサイトカインには、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、TNF-α、IFN-γ、およびIFN-αが含まれるが、これに限定されない。
【０２２５】
細胞死の徴候と、死につつある細胞の産物は、樹状細胞活性化を刺激する。従って、死につつある細胞の産物が全て、本発明の組成物、方法、および装置によって包含される。例示的な細胞死産物には、細胞の任意の細胞内特徴、例えば、細胞小器官、小胞、細胞骨格要素、タンパク質、DNA、およびRNAが含まれるが、これに限定されない。細胞がストレス下にある時に発現し、細胞死の際に放出される熱ショックタンパク質は特に関心が高い。例示的な熱ショックタンパク質には、Hsp10、Hsp20、Hsp27、Hsp33、Hsp40、Hsp60、Hsp70、Hsp71、Hsp72、Grp78、Hsx70、Hsp84、Hsp90、Grp94、Hsp100、Hsp104、Hsp110が含まれるが、これに限定されない。
【０２２６】
微小環境およびワクチン効率
本明細書に記載の装置/足場は感染を模倣する微小環境に相当する。それぞれの装置は、特定の抗原に対する免疫応答を刺激/強化することができる活性化樹状細胞を誘引する/受け入れる、指導する/刺激する、および周囲の身体組織に送り出す工場を構成する。具体的には、足場装置は、感染性微小環境を模倣して、樹状細胞応答をさらに活性化するように病原性分子と共に移植されるかまたは病原性分子でコーティングされる。
【０２２７】
材料システムを用いた感染の側面の適切な模倣は、癌ワクチンとして適用された時に、絶えずDCを動員、活性化し、LNにホーミングすることによって腫瘍進行に劇的に影響を及ぼす。GM-CSFを単独で用いる最初のPLGワクチンは、宿主DCがGM-CSFによって腫瘍抗原提示部位に存在するように動員され、GM-CSFレベルが下がり、細胞が活性化および分散できるようになるまで宿主DCがトラップされるバッチプロセスにつながった(参照により本明細書に組み入れられる、US2008/0044900A1を参照されたい)。時間により局所GM-CSF濃度が変化することで、動員されるDCの数と、活性化および分散のタイミングの制御が可能になった。最良のGM-CSFベースワクチンは、試験した動物のほぼ1/4において防御免疫を付与することができたが、動員されたDCの約26％(約240,000個のDC)が活性化され、DCの約6％がLNに分散された。高レベルのGM-CSFによって多数のDCが動員されたが、DC活性化は限定され、潜在的に治療的なDCが足場の内部に封入されたままであった。これらの結果は、GM-CSFによるDC活性化および分散の阻害に対抗する、最も重要な「デンジャーシグナル」CpG-ODNを局所的に提示することによって細菌感染を模倣する改善したシステムを開発する動機となった。これらの本明細書に記載の装置は、DCの大量かつ持続的な退出を媒介することによって大きな進歩を示す。
【０２２８】
DCへのODNの取り込みとTLR-9受容体へのODNの局在化を促進するだけでなく、腫瘍抗原と同時に提示されるようにPLGマトリックスにODNを静電気的に固定化するために、CpG-ODN分子はPEIを用いて凝縮される。インビトロ結果から、PEI-CpG-ODN凝縮物はDCの内部で脱凝縮し、抑制レベルのGM-CSF(500ng/ml)の存在下で、DCの活性化とリンパ節由来ケモカインCCL19への分散を促進したTLRシグナル伝達を刺激できることが分かった(参照により本明細書に組み入れられる、US2013-0202707)。
【０２２９】
US2013-0202707において詳述されるように、本発明のワクチン装置は、有利なことに、インサイチューで細胞の挙動およびプログラミングを微調整することができる。
【０２３０】
足場組成物および構造
足場の成分は様々な幾何学的形状(例えば、ディスク、ビーズ、ペレット)、ニッチ、平らな層(例えば、薄いシート)に組織化される。例えば、直径が約0.1〜200ミリメートル、例えば、5、10、20、40、50ミリメートルのディスクが皮下移植される。このディスクの厚さは、0.1〜10ミリメートル、例えば、1、2、5ミリメートルでもよい。ディスクは患者に投与するために容易に圧縮または凍結乾燥される。皮下投与用の例示的なディスクは以下の寸法:直径8ミリメートルおよび厚さ1ミリメートルを有する。多成分足場は、任意で、同心円状の層をなして構築され、それぞれの層は異なる物理的な品質(％ポリマー、ポリマーの％架橋結合、足場の化学組成、孔径、多孔度、および孔構造、剛性、靭性、延性、粘弾性、ならびに/または生理活性物質、例えば、増殖因子、ホーミング/遊走因子、分化因子の組成)によって特徴付けられる。それぞれのニッチには、細胞集団に対して特定の効果、例えば、特定の細胞の機能、増殖、分化の促進または阻害、分泌型の因子もしくは酵素の生成、または遊走がある。足場内でインキュベートされた細胞は、足場から出て遊走して、標的組織、例えば、損傷した組織部位に直接影響を及ぼすように指導および誘導される。例えば、間質血管細胞および平滑筋細胞は、血管様構造、例えば、血管または体腔の層の修復に用いられるシート状構造において有用である。例えば、このような構造は腹壁破裂などの腹壁の損傷または欠陥を修復するのに用いられる。同様に、皮膚幹細胞および/またはケラチノサイトが播種されたシート状足場が、皮膚組織再生用の包帯または創傷被覆材において用いられる。装置は、標的組織の表面もしくは標的組織の隣に、体内の保護された場所に、血管の隣に、または外部創傷被覆材の場合は体外に配置または移植される。装置は、様々な公知の方法およびツール、例えば、スプーン、ピンセット、またはつかむためのもの、皮下針、内視鏡マニピュレーター、血管内カテーテルまたは経血管カテーテル、定位針(stereotaxic needle)、ヘビ型装置(snake device)、臓器表面をはうロボット(organ-surface-crawling robot)(米国特許出願20050154376; Ota et al.,2006, Innovations 1:227-231)、最小侵襲外科装置、外科移植ツール、および経皮パッチを用いて身体組織の中に、または身体組織の表面に導入される。装置はまた、例えば、マトリックス材料を連続して注入または挿入することによって、所定の位置で組み立てられてもよい。任意で、足場装置は、例えば、増殖因子または分化因子などの物質を連続して注入または噴霧することによって、細胞または生理活性化合物が再充填される。
【０２３１】
足場または足場装置は、表面または内部に細胞が結合または付着する物理的構造であり、足場組成物は、この構造を作る材料である。例えば、足場組成物には、生分解性の材料または耐久性のある材料、例えば、以下に列挙した材料が含まれる。足場の機械的特徴は、用途に応じて、または再生が求められる組織タイプに応じて異なる。足場は生分解性があるか(例えば、コラーゲン、アルギン酸塩、多糖、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリ(グリコリド)(PGA)、ポリ(L-ラクチド)(PLA)、もしくはポリ(ラクチド-コ-グリコリド)(PLGA)、ポリ乳酸-コグリコール酸)、または耐久性がある(例えば、絹)。生分解性構造の場合、組成物は、物理的作用または化学的作用、例えば、水和レベル、熱、もしくはイオン交換によって、または細胞の働き、例えば、近傍の細胞または存在している細胞による酵素、ペプチド、もしくは他の化合物の生成によって分解される。コンシステンシーは柔らかい/柔軟性がある(例えば、ゲル)からガラス状、ゴム状、脆い、硬い、弾力性がある、堅いまで異なる。構造は、ナノ多孔性であるか、マイクロ多孔性であるか、またはマクロ多孔性の孔を含み、孔のパターンは、任意で、均一であるか、不均一であるか、整列されているか、反復しているか、またはランダムである。
【０２３２】
アルギン酸塩は、分子量、分解速度、および足場形成方法を制御することによって特定の用途のために製剤化され得る多用途の多糖ベースポリマーである。カップリング反応を用いて、細胞接着配列RGDなどの生理活性エピトープをポリマーバックボーンに共有結合的に取り付けることができる。アルギン酸塩ポリマーは様々な足場タイプに形成される。注射用ヒドロゲルは、カルシウムイオンなどの架橋結合剤が添加されると低MWアルギン酸塩溶液から形成することができるのに対して、マクロ多孔性足場は高MWアルギン酸塩ディスクを凍結乾燥することによって形成される。足場製剤の違いによって足場分解の動態が制御される。アルギン酸塩足場からのモルフォゲンまたは他の生理活性物質の放出速度は、モルフォゲンを空間的および時間的に制御されるやり方で提示するように足場製剤によって制御される。この徐放は、全身副作用と複数回の注射の必要を無くすだけでなく、移植部位にある宿主細胞と、足場に播種された移植細胞を活性化する微小環境を作り出すのに用いることができる。
2017514835.tif 000063
【０２３３】
足場は、任意で全てが生分解する、または部分的に生分解する生体適合性ポリマーマトリックスを含む。ヒドロゲルは適切なポリマーマトリックス材料の一例である。ヒドロゲルを形成することができる材料の例には、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、PLGAポリマー、アルギン酸塩およびアルギン酸塩誘導体、ゼラチン、コラーゲン、アガロース、天然多糖および合成多糖、ポリアミノ酸、例えば、ポリペプチド、特に、ポリ(リジン)、ポリエステル、例えば、ポリヒドロキシ酪酸塩およびポリ-ε-カプロラクトン、ポリ無水物;ポリホスファジン、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(アルキレンオキシド)、特に、ポリ(エチレンオキシド)、ポリ(アリルアミン)(PAM)、ポリ(アクリル酸塩)、改変スチレンポリマー、例えば、ポリ(4-アミノメチルスチレン)、プルロニックポリオール、ポリオキサマー、ポリ(ウロン酸)、ポリ(ビニルピロリドン)、ならびにグラフトコポリマーを含む上記のコポリマーが含まれる。
【０２３４】
足場は、コラーゲン、フィブリン、ヒアルロン酸、アガロース、およびラミニンに富むゲルなどがあるが、これに限定されない様々な合成ポリマーおよび天然ポリマーから製作される。ヒドロゲルに好ましい材料の1つはアルギン酸塩または改変アルギン酸塩材料である。アルギン酸塩分子は、比率およびポリマー鎖に沿った連続分布の点で異なることがある、(1-4)結合したβ-D-マンヌロン酸(M単位)とαL-グルロン酸(G単位)単量体で構成される。アルギン酸塩多糖は、二価カチオン(例えば、Ca+2、Mg+2、Ba+2)に対して強力な親和性を有し、これらの分子に曝露されると安定したヒドロゲルを形成する高分子電解質系である。Martinsen A., et al., Biotech. & Bioeng., 33 (1989) 79-89.)を参照されたい。例えば、カルシウムで架橋結合したアルギン酸塩ヒドロゲルは、歯科用途、創傷被覆材、軟骨細胞移植のために、他の細胞タイプのマトリックスとして有用である。
【０２３５】
例示的な装置では、比較的低い分子量、好ましくは、溶解後にヒトによる腎臓クリアランス閾値にあるサイズのアルギン酸塩または他の多糖を用いる。例えば、アルギン酸塩または多糖は1000〜80,000ダルトンの分子量まで小さくなる。好ましくは、分子量は1000〜60,000ダルトンであり、特に好ましくは1000〜50,000ダルトンである。マンヌロン酸塩単位とは反対に、グルロン酸塩単位は、ポリマーをゲル化するための二価カチオンを介したイオン架橋結合部位を供給するので、高グルロン酸塩含有量のアルギン酸塩材料を使用することも有用である。参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,642,363号は、多糖、例えば、細胞移植および組織工学用途に特に有用なアルギン酸塩または改変アルギン酸塩を含有するポリマーを作製および使用するための方法を開示する。
【０２３６】
アルギン酸塩以外の有用な多糖には、アガロースおよび微生物多糖、例えば、以下の表に列挙したものが含まれる。
2017514835.tif 000064
aN-中性、A=陰イオン性、およびC=陽イオン性
【０２３７】
本発明の足場は多孔性または非多孔性である。例えば、足場は、直径が約10nm未満のナノ多孔性;孔の直径が好ましくは約100nm〜20μmの範囲であるマイクロ多孔性;または孔の直径が約20μm超、より好ましくは約100μm超、さらにより好ましくは約400μm超のマクロ多孔性である。一例では、足場は、整列された孔の直径が約400〜500μmのマクロ多孔性である。望ましい孔径および孔整列をもつポリマーマトリックスの調製は実施例において説明される。多孔性ヒドロゲル製品を調製する他の方法は当技術分野において公知である(参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6,511,650号)。
【０２３８】
生理活性組成物
装置は1つまたは複数の生理活性組成物を含む。生理活性組成物は、精製された、天然の、合成により生成された、または組換えの化合物、例えば、ポリペプチド、核酸、低分子、または他の薬剤である。例えば、前記組成物は、GM-CSF、CpG-ODN、および腫瘍抗原または他の抗原を含む。例えば、本明細書に記載の組成物は、免疫抑制性タンパク質の阻害剤(例えば、CTLA4、PD1、PDL1、B7-H3、B7-H4、LAG3、2B4、BTLA、TIM3、A2aR、またはキラー細胞抑制受容体の阻害剤)を含む。例えば、前記組成物は、免疫抑制性タンパク質(例えば、CTLA4、PD1、PDL1、B7-H3、B7-H4、LAG3、2B4、BTLA、TIM3、A2aR、またはキラー細胞抑制受容体)に結合する抗体もしくはその断片またはタンパク質を含む。好ましい態様において、前記組成物は、CTLA4、PD1、またはPDL1に結合する抗体またはその断片を含む。
【０２３９】
本明細書に記載の組成物は精製される。精製された化合物は少なくとも60重量％(乾燥重量)の関心対象の化合物である。好ましくは、調製物は、少なくとも75重量％、より好ましくは少なくとも90重量％、最も好ましくは少なくとも99重量％の関心対象の化合物である。純度は、任意の適切な標準方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはHPLC分析によって測定される。
【０２４０】
ポリペプチド、抗体、またはその断片とポリマーマトリックスとのカップリングは当業者に公知の合成方法を用いて成し遂げられる。ペプチドをポリマーにカップリングするアプローチは、Hirano and Mooney, Advanced Materials, p.17-25 (2004)において議論される。他の有用な結合化学には、Hermanson, Bioconjugate Techniques, p.152-185 (1996)ににおいて議論される結合化学、特に、カルボジイミドカプラー、DCCおよびDIC(ウッドワード試薬K)を用いる結合化学が含まれる。ポリペプチドは、このようなカルボジイミド結合のための末端アミン基を含有する。アミド結合形成は、好ましくは、ペプチド合成において一般的に用いられる水溶性酵素である1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)によって触媒される。
【０２４１】
生理活性組成物の放出動態の制御
GM-CSFなどの生理活性組成物の放出プロファイルは、多数の異なる技法、例えば、カプセル化、足場との付着/結合の性質、足場の多孔度、および生理活性組成物の粒径を用いて制御される。
【０２４２】
例えば、GM-CSFを足場に組み込む一手段としてGM-CSFがカプセル化される。最初に、GM-CSFをPLGマイクロスフェアに入れてカプセル化し、次いで、これらのGM-CSF装填マイクロスフェアをガス発泡プロセスに供して、マクロ多孔性PLG足場を開発した。GM-CSFをマイクロスフェアに組み込むことによって、GM-CSFはポリマーの内部にさらに深く埋め込まれるようになり、これにより、装置はGM-CSF送達の初期パルスを1〜5日目にわたって持続する。所望に応じて、GM-CSFパルスの持続期間を変えるかまたは微調整し、その結果としてDC動員の動態を変えるために、他の組み込み方法が任意で用いられる。例えば、凍結乾燥GM-CSFと混合したPLG粒子を発泡させると、ポリマー足場表面とさらに結合したGM-CSFが生じ、タンパク質はさらに素早く拡散する。
【０２４３】
放出動態を改変する代わりの足場製作方法は、例えば、Riddle et al., Role of poly(lactide-co-glycolide) particle size on gas-foamed scaffolds. J Biomater Sci Polym Ed. 2004;15(12):1561-70に記載のように、足場孔の物理的構造を改変し、それによって、異なる分解時間および放出動態を生じさせる(孔径、または容積に対するパーセントである全多孔度を変える)ことを含む。放出動態を変える別の手法は、足場が作られる組成物、すなわち、原材料を改変し、それによって、放出特性を変える手法である。例えば、様々なポリマー、例えば、アルギン酸塩、PLA、PGA、またはPLGAの使用が用いられる。グリコール酸および乳酸の比が異なるポリマーを用いると異なる放出プロファイルが得られる。例えば、組成(ラクチドとグリコリドとの比)および分子量の点で異なる様々なPLGが、公知の二重エマルジョン(水/油/水)プロセスを用いてマイクロスフェア(5〜50μm)を調製し、その後に、ガス発泡/粒子浸出(particulate leaching)法を使用し、粒状PLGおよびPLGマイクロスフェアを用いて足場を調製するのに用いられる(Ennett et al., Temporally regulated delivery of VEGF in vitro and in vivo. J Biomed Mater Res A. 2006 Oct;79(1)。別の技法は、タンパク質を異なる区画に組み込むことを伴う(例えば、タンパク質をPLGマイクロスフェアの中に入れてカプセル化するかまたは単に混合し、ポリマーと共に凍結乾燥させた後に発泡させる)。本明細書に記載の足場を作製する方法は、例えば、両方とも参照により本明細書に組み入れられる、Harris et al. J. Biomed. Materials Res. Part A. 42.3(1998)396-402およびSheridan et al. J. Control. Rel. 64(2000)91-102において詳述されるようにガス発泡を使用する工程を含む。他の態様では、ワイヤ(例えば、複数のワイヤを備えるテンプレート)がポロゲン(porogen)として、すなわち、足場に孔を作り出すために、例えば、整列された孔を作り出すために用いられる。
【０２４４】
装置への充填および/または再充填
GM-CSFなどの生理活性組成物は装置の異なる層/区画の中に組み込まれ、それによって、複数のGM-CSFパルスが送達される。パルスごとに、装置にDC流入物が充填(または再充填)される。足場は、複数のGM-CSF(または他の生理活性薬剤)パルスを作り出す様々な方法を用いて製作される。例えば、このような装置は、(例えば、Richardson et al., Polymeric system for dual growth factor delivery. Nat Biotechnol. 2001 Nov;19(11)に記載のように)タンパク質を異なる区画に組み込み(例えば、タンパク質をPLGマイクロスフェアの中に入れてカプセル化するかまたは単に混合し、ポリマーと共に凍結乾燥させた後に発泡させる)、それによって、2つ以上の別々のタンパク質放出プロファイル(すなわち、パルス)を作り出すことによって作られる。
【０２４５】
または、タンパク質は、急速に分解するPLGマイクロスフェア(例えば、低MW、50:50比)と、ゆっくりと分解するPLGマイクロスフェア(高MW、85:15比) の中にカプセル化される。次いで、これらのマイクロスフェアは、足場を製作するのに後で用いるために一緒に混合される。従って、タンパク質は、急速に分解するポリマーと、ゆっくりと分解するポリマーの両方の内部にカプセル化される。それによって、結果として、少なくとも2つの別々の放出動態と送達パルスが生じる。この方法は、レシオメトリック(ratiometric)特徴が異なる、3種類、4種類、5種類、またはそれより多い異なる種類のマイクロスフェアを作り出し、それによって、GM-CSFなどの生理活性組成物の3つ、4つ、5つ、またはそれより多い放出パルスを生じさせるために用いられる。
【０２４６】
複数のパルスを送達する装置を作製する別のアプローチは層状の足場を製作するアプローチである。層状の足場は、異なる足場製剤の上で別の足場製剤と一緒に圧縮成型することによって作製される。例えば、原材料(スクロース+PLG1+タンパク質)は型の中で圧縮され、わずかに異なる製剤(スクロース+PLG2+タンパク質)も型の中で圧縮される。次いで、例えば、Chen et al., Pharm Res. Spatio-temporal VEGF and PDGF delivery patterns blood vessel formation and maturation. 2007 Feb;24(2):258-64)に記載のように、これらの2つの層が一緒に圧縮され、次いで、発泡され、その結果として、タンパク質濃度が別々に空間制御された二層の足場が生じる。
【０２４７】
装置構築
足場構造は、多数の異なる硬質、半硬質、可撓性、ゲル状、自己集合性、液晶性、または液状の組成物、例えば、ペプチドポリマー、多糖、合成ポリマー、ヒドロゲル材料、セラミックス(例えば、リン酸カルシウムまたはヒドロキシアパタイト)、タンパク質、糖タンパク質、プロテオグリカン、金属、および金属合金から構築される。組成物は、当技術分野において公知の方法、例えば、射出成型、前もって形成された構造の凍結乾燥、印刷、自己集合、位相反転、溶液流延(solvent casting)、融体加工、ガス発泡、繊維形成/加工、粒子浸出、またはその組み合わせを用いて細胞足場構造に組み立てられる。次いで、組み立てられた装置は、処置しようとする個体の身体に移植または投与される。
【０２４８】
装置は、インビボで、いくつかのやり方で組み立てられる。足場はゲル化材料から作られる。ゲル化材料は、ゲル化していない形で体内に導入され、体内でインサイチューでゲル化する。装置成分を、組み立てが起こる部位に送達する例示的な方法は、針または他の押出し器具による注入、噴霧、塗装、または組織部位に沈着させる方法、例えば、カニューレに通して挿入された適用装置を用いた送達を含む。一例では、体内に導入される前に、または導入されている間に、ゲル化していない足場材料またはまだ形をなしていない足場材料が生理活性物質および細胞と混合される。結果として生じたインビボ/インサイチューで組み立てられた足場は、これらの物質と細胞の混合物を含有する。
【０２４９】
足場のインサイチュー組み立ては、ポリマーが自発的に結合した結果として、または相乗的もしくは化学的に触媒された重合から起こる。相乗的または化学的な触媒反応は、組み立て部位における、もしくは組み立て部位付近での多数の内因性因子もしくは条件、例えば、体温、体内のイオンもしくはpHによって、またはオペレーターが組み立て部位に供給する外因性因子もしくは条件、例えば、ゲル化していない材料が導入された後に、ゲル化していない材料に向けられる光子、熱、電気、音、もしくは他の放射線によって開始する。エネルギーは、放射線ビームによって、または熱もしくは光の導体、例えば、ワイヤもしくは光ファイバーケーブルもしくは超音波変換器を介して足場材料に向けられる。または、加えられた剪断力、例えば、針に通すことによって加えられた剪断力が小さくなった後に再架橋結合する、剪断減粘性材料、例えば、両親媒性物質(ampliphile)が用いられる。
【０２５０】
足場装置をインビボおよびエクスビボで組み立てるのに適したヒドロゲルは当技術分野において周知であり、例えば、Lee et al.,2001, Chem. Rev. 7: 1869-1879に記載されている。ペプチド両親媒性自己集合アプローチは、例えば、Hartgerink et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99:5133-5138に記載されている。剪断減粘の後に可逆的にゲル化(gellation)するための方法は、Lee et al.,2003, Adv. Mat. 15: 1828-1832において説明される。
【０２５１】
多区画装置は、同じように、または異なってドーピングされたゲルまたは他の足場材料の連続した層を標的部位に適用することによってインビボで組み立てられる。例えば、装置は、針を用いて、先に注入された材料の中心に次の内層を連続して注入して同心円状のスフェロイドを形成することによって形成される。非同心円状の区画は、先に注入された層の異なる場所に材料を注入することによって形成される。複数の頭部がある注射装置が並行して、および同時に区画を押し出す。層は、生理活性物質および様々な細胞タイプが異なってドーピングされた同様の、または異なる足場組成物で作られる。または、区画は親水性/疎水性の特徴または各区画内での二次相互作用に基づいて自己組織化する。
【０２５２】
区画化された装置
ある特定の状況において、別個の化学的性質および/または物理的性質をもつ区画を備える装置が有用である。各区画に異なる組成または濃度の組成物を用いて、区画化された装置が設計および製作される。
【０２５３】
または、区画は個々に製作され、次いで、互いに付けられる(例えば、内部区画が1つまたは全ての側面で第2の区画に取り囲まれている「サンドイッチ」)。この後者の構築アプローチは、他の層に対する各層の固有の接着性、各層におけるポリマー鎖の拡散および相互浸透、重合もしくは第2の層と第1の層との架橋結合、接着剤(例えば、フィブリン糊)の使用、または他の区画の中への、ある区画の物理的封入を用いて成し遂げられる。これらの区画は、適当な前駆体(例えば、温度感受性オリゴペプチド、イオン強度感受性オリゴペプチド、ブロックポリマー、クロスリンカーおよびポリマー鎖(またはその組み合わせ)、ならびに細胞により制御される組み立てを可能にする細胞接着分子を含有する前駆体)の存在に応じてインビトロまたはインビボで適切に自己集合および接続する。
【０２５４】
または、区画化された装置は印刷技術を用いて形成される。生理活性物質がドーピングされた足場前駆体の連続した層が支持体上に配置され、次いで、例えば、自己集合化学によって架橋結合される。架橋結合が化学触媒重合、光触媒重合、または熱触媒重合によって制御される場合、各層の厚さおよびパターンはマスクによって制御され、これにより、重合が終わるたびに、架橋結合しなかった前駆体材料を洗い流した時に複雑な三次元パターンを作ることができるようになる(WT Brinkman et al., Photo-cross-linking of type 1 collagen gels in the presence of smooth muscle cells: mechanical properties, cell viability, and function. Biomacromolecules, 2003 Jul-Aug; 4(4): 890-895.; W. Ryu et al., The construction of three-dimensional micro-fluidic scaffolds of biodegradable polymers by solvent vapor based bonding of micro-molded layers. Biomaterials, 2007 Feb; 28(6): 1174-1184; Wright, Paul K. (2001). 21st Century manufacturing. New Jersey: Prentice-Hall Inc.)。異なるドーピングされた足場前駆体を支持体の異なる領域に「塗装」するインクジェット装置を用いて複雑な多区画層も作られる。Julie Phillippi (Carnegie Mellon University) presentation at the annual meeting of the American Society for Cell Biology on December 10, 2006; Print me a heart and a set of arteries, Aldhouse P., New Scientist 13 April 2006 Issue 2547 p19.; Replacement organs, hot off the press, C. Choi, New Scientist, 25 Jan 2003, v2379。これらの層は複雑な三次元区画になるように作られる。装置はまた、以下の方法: ジェットフォトポリマー(Jetted Photopolymer)、選択的レーザー焼結(Selective Laser Sintering)、薄膜積層法(Laminated Object Manufacturing)、熱溶解積層法(Fused Deposition Modeling)、シングルジェットインクジェット(Single Jet Inkjet)、三次元プリンティング(Three Dimensional Printing)、または薄膜積層法のどれを用いても作られる。
【０２５５】
足場装置からの生理活性物質の放出プロファイルは、因子の拡散とポリマーの分解、システムに装填された因子の用量、およびポリマーの組成によって制御される。同様に、これらの変数によって、作用範囲(組織分布)および作用期間、または放出される因子の時間空間的勾配が調節される。関心対象の組織における因子の拡散および分解は、任意で、因子を化学的に改変することによって(例えば、PEG化された増殖因子によって)調節される。いずれの場合でも、放出の時間枠は、装置による有効な細胞送達が望まれる時間を決定する。
【０２５６】
生理活性物質は、表面吸収、物理的固定化を含む公知の方法を用いて、例えば、足場材料の内部に物質を閉じ込める相変化を用いて足場組成物に加えられる。例えば、水相または液体相にある時に増殖因子が足場組成物と混合され、環境条件(例えば、pH、温度、イオン濃度)が変化した後に、液体はゲル化または固化し、それによって、生理活性物質が閉じ込められる。または、規定されたコンホメーションで足場上に生理活性物質を安定して長期に提示するために、共有結合カップリング、例えば、アルキル化剤またはアシル化剤を用いた共有結合カップリングが用いられる。このような物質を共有結合カップリングするための例示的な試薬を以下の表に示した。
【０２５７】
ペプチド/タンパク質をポリマーに共有結合的にカップリングする方法
2017514835.tif 000065
[a]EDC:塩酸1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド;DCC:ジシクロヘキシルカルボジイミド
【０２５８】
本発明における使用に適した生理活性物質には、インターフェロン、インターロイキン、ケモカイン、サイトカイン、コロニー刺激因子、走化性因子、顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)が含まれるが、これに限定されない。樹状細胞を活性化するのに有利に用いられる可能性がある、前述したタンパク質のいずれかのスプライスバリアントおよびその低分子アゴニストまたはアンタゴニストも本明細書において意図される。
【０２５９】
本発明のワクチン装置の内部で、本発明のワクチン装置の表面で、または本発明のワクチン装置と組み合わせて使用するのに適した例示的な生理活性物質には免疫抑制性タンパク質の阻害剤が含まれる。例示的な免疫抑制性タンパク質には、免疫チェックポイントタンパク質(例えば、CTLA4、PD1、PDL1、およびPDL2)が含まれる。他の例示的な免疫抑制性タンパク質には、B7-H3、B7-H4、LAG3、2B4、BTLA、TIM3、A2aR、および/またはキラー細胞抑制受容体が含まれる。例示的な阻害剤には、低分子、タンパク質、ペプチド、抗体またはその断片、および核酸が含まれる。例えば、阻害剤は、CTLA4、PD1、PDL1、PDL2、B7-H3、B7-H4、LAG3、2B4、BTLA、TIM3、A2aR、および/またはキラー細胞抑制受容体に結合する、核酸、タンパク質、抗体、またはその断片である。例えば、阻害剤は、CTLA4、PD1、PDL1、PDL2、B7-H3、B7-H4、LAG3、2B4、BTLA、TIM3、A2aR、および/またはキラー細胞抑制受容体をコードするmRNAに結合する核酸である。一部の態様では、阻害剤のmRNAに結合する核酸はmRNAレベルおよび/またはタンパク質レベルで阻害剤の発現をダウンレギュレートする。
【０２６０】
低分子は、1000ダルトン未満、800ダルトン未満、または500ダルトン未満の低分子量化合物である。本明細書に記載の抗体およびその断片には、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、dAb(ドメイン抗体)、単鎖、Fab、Fab'およびF(ab')2断片、Fv、scFvが含まれるが、これに限定されない。抗体の断片は、その各抗体の免疫学的活性を有する。一部の態様では、抗体の断片は、1500個以下、1250個以下、1000個以下、900個以下、800個以下、700個以下、600個以下、500個以下、400個以下、300個以下、200個以下のアミノ酸を含有する。例えば、タンパク質阻害剤またはペプチド阻害剤は、1500個以下、1250個以下、1000個以下、900個以下、800個以下、700個以下、600個以下、500個以下、400個以下、300個以下、200個以下、100個以下、80個以下、70個以下、60個以下、50個以下、40個以下、30個以下、25個以下、20個以下、10個以下のアミノ酸を含有する。例えば、本発明の核酸阻害剤は、400個以下、300個以下、200個以下、150個以下、100個以下、90個以下、80個以下、70個以下、60個以下、50個以下、40個以下、35個以下、30個以下、28個以下、26個以下、24個以下、22個以下、20個以下、18個以下、16個以下、14個以下、12個以下、10個以下のヌクレオチドを含有する。
【０２６１】
場合によっては、本発明の化合物(例えば、低分子)または高分子(例えば、核酸、ポリペプチド、またはタンパク質)は精製および/または単離される。本明細書で使用する「単離された」または「精製された」低分子、核酸分子、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはタンパク質(例えば、抗体またはその断片)は、組換え技法によって産生された時に他の細胞材料も培養培地も実質的に含まず、化学合成された時に化学前駆体も他の化学物質も含まない。精製された化合物は、少なくとも60重量％(乾燥重量)の関心対象の化合物である。好ましくは、調製物は、少なくとも75重量％、より好ましくは少なくとも90重量％、最も好ましくは少なくとも99重量％の関心対象の化合物である。例えば、精製された化合物は、望ましい化合物が少なくとも90重量％、91重量％、92重量％、93重量％、94重量％、95重量％、98重量％、99重量％、または100重量％(w/w)である化合物である。純度は、任意の適切な標準方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、または高速液体クロマトグラフィー(HPLC)分析によって測定される。精製または単離されたポリヌクレオチド(リボ核酸(RNA)またはデオキシリボ核酸(DNA))は、天然の状態で隣接する遺伝子も配列も含まない。精製されたとは、ヒト対象に投与するのに安全な無菌性の程度、例えば、感染性作用物質も毒性作用物質も無いことも定義する。
【０２６２】
「実質的に純粋な」とは、天然で付随する成分から分離されているヌクレオチドまたはポリペプチドを意味する。典型的に、ヌクレオチドおよびポリペプチドは、天然で関連するタンパク質および天然有機分子を含まず、少なくとも60重量％、70重量％、80重量％、90重量％、95重量％である時に、または99重量％の時でも実質的に純粋である。
【０２６３】
例えば、核酸阻害剤は、低分子干渉RNA、ショートヘアピンRNA、アンチセンスRNA、アプタマー、ペプチド核酸(PNA)、マイクロRNA(miRNA)、またはロックド核酸(LNA)である。一部の態様では、核酸は修飾オリゴヌクレオチド(例えば、2'-o-メチルRNA)を含む。
【０２６４】
前述したサイトカインの例には、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、インターフェロン-γ(γ-IFN)、IFN-α、腫瘍壊死因子(TNF)、TGF-β、FLT-3リガンド、およびCD40リガンドが含まれるが、これに限定されない。
【０２６５】
本発明の足場は、任意で、望ましい時間枠で、望ましい因子を局所的に利用可能にする遺伝子を、移植された細胞または移植片の近くにある宿主細胞のいずれかが吸収し、発現するような少なくとも1つの非ウイルス遺伝子療法ベクターを含む。このような非ウイルスベクターには、カチオン性の脂質、ポリマー、標的化タンパク質、およびリン酸カルシウムが含まれるが、これに限定されない。
【０２６６】
足場製作
D,L-ラクチド・グリコリド(PLG)の85:15, 120kDコポリマー(Alkermes, Cambridge, MA)をガス発泡プロセスにおいて用いて、開口し相互接続した孔をもつ足場を形成した(参照により本明細書に組み入れられる、Cohen S., Yoshioka T., Lucarelli, M., Hwang L.  H, and Langer R. Pharm. Res. 8,713-720 (1991))。標準的な二重エマルジョンを用いて、GM-CSFカプセル化PLGマイクロスフェアを作製した(Harris, L.D., Kim, B.S., and Mooney, D.J. J. Biomed. Mater. Res. 42, 396-402 (1998); 参照により本明細書に組み入れられる)。次いで、16mgのPLGマイクロスフェアを150mgのポロゲン、NaClまたはスクロース(250μm〜425μmの粒径までふるいにかけた)と混合し、圧縮成型した。結果として生じたディスクを高圧CO2環境内で平衡化した。圧力を急速に下げるとポリマー粒子は拡大し、融合して、相互接続した構造になる。水に浸けることにより、足場からNaClが侵出して、90％多孔度の足場が得られた。腫瘍溶解産物をPLG足場に組み込むために、C57BL/6Jマウス(Jackson Laboratory, Bar Harbor Maine)の背中の皮下で成長させたB16-F10腫瘍の生検材料をコラゲナーゼ(250U/ml)(Worthington, Lakewood, NJ)で消化し、40μmセルストレーナーで濾過した後に107細胞/mlに等しい濃度で懸濁した。腫瘍細胞懸濁液を液体窒素に入れて4サイクルの急速凍結に供し、解凍し(37℃)、次いで、400rpmで10分間、遠心分離した。腫瘍溶解産物を含有する上清(1ml)を収集し、PLGマイクロスフェアと共に凍結乾燥し、結果として生じた混合物を用いて、PLG足場ベースの癌ワクチンを作製した。CpG-ODNをPLG足場に組み込むために、PEI-CpG-ODN凝縮物溶液を60μlの50％(wt/vol)スクロース溶液と共にボルテックスし、凍結乾燥し、乾燥スクロースと混合して、最終重量150mgにした。次いで、PLG癌ワクチンを作製するために、スクロースを含有するPEI-CpG-ODN凝縮物を、ブランク、GM-CSF、および/または腫瘍溶解産物が装填されたPLGマイクロスフェアと混合した。
【０２６７】
本発明の足場組成物は、GM-CSF、Flt3L、および/またはCCL20、ならびにCpG-ODN配列を含む。ある範囲の濃度の各要素が意図される。好ましい態様において、足場組成物はPLGを含む。GM-CSF、Flt3L、および/またはCCL20については、40mgのポリマー足場組成物あたり、0〜100μgのGM-CSF、Flt3L、および/またはCCL20ポリペプチドが足場組成物の内部に組み込まれるかまたは足場組成物の表面にコーティングされる。または、0〜50μg、0〜25μg、0〜10μg、0〜5μg、および0〜3μgのGM-CSF、Flt3L、および/またはCCL20を含む用量が足場組成物の内部に組み込まれる。好ましい態様において、0〜3μgのGM-CSF、Flt3L、および/またはCCL20が足場組成物の内部に組み込まれる。CpG-ODN配列またはPEI-CpG-ODN凝縮物については、40mgのポリマー足場組成物あたり、0〜1000μgのPEI-CpG-ODNが足場組成物の内部に組み込まれるかまたは足場組成物の表面にコーティングされる。または、0〜500μg、0〜250μg、0〜100μg(例えば、100μg)、0〜50μg、0〜25μg、0〜10μg、および0〜5μgのPEI-CpG-ODNを含む用量が足場組成物の内部に組み込まれる。好ましい態様において、0〜50μgのPEI-CpG-ODNが足場組成物の内部に組み込まれる。
【０２６８】
ワクチン装置
生体適合性足場は癌ワクチン用の送達ビヒクルとして有用である。癌ワクチンは癌細胞に対する内因性免疫応答を刺激する。現在生産されているワクチンは主に体液性免疫系(すなわち、抗体依存性免疫応答)を活性化する。現在開発されている他のワクチンは、腫瘍細胞を殺滅することができる細胞傷害性Tリンパ球を含む細胞性免疫系を活性化することに焦点が合わされている。癌ワクチンは、一般的に、抗原提示細胞(例えば、マクロファージおよび樹状細胞)ならびに/または他の免疫細胞、例えば、T細胞、B細胞、およびNK細胞への癌抗原の提示を強化する。癌ワクチンはいくつかの形態の1つをとってもよいが、これらの目的は、抗原提示細胞(APC)による、癌抗原および/または癌関連抗原の内因性処理と、MHCクラスI分子の状況では細胞表面での抗原提示の最終的な提示を容易にするために、このような抗原をAPCに送達することである。癌ワクチンの一形態は、対象から取り出された癌細胞の調製物であり、エクスビボで処理され、次いで、全細胞として対象に再導入される全細胞ワクチンである。これらの処理は、任意で、細胞を活性化するためのサイトカイン曝露、細胞からサイトカインを過剰発現させるための遺伝子操作、または腫瘍特異的抗原もしくは抗原カクテルを用いた初回刺激、および培養状態での増殖を伴う。樹状細胞ワクチンは抗原提示細胞を直接活性化し、抗原提示細胞の増殖、活性化、およびリンパ節への遊走は、抗原提示細胞が免疫応答を誘発する能力を強化する足場組成物によって調節される。処置しようとする癌のタイプには、中枢神経系(CNS)癌、CNS生殖細胞腫瘍、肺癌、白血病、多発性骨髄腫、腎臓癌、悪性神経膠腫、髄芽腫、およびメラノーマが含まれる。
【０２６９】
抗原特異的免疫応答を誘発する目的で、足場装置が哺乳動物に移植される。装置は、免疫細胞を活性化し、細胞を特定の抗原で初回刺激し、それによって、免疫防御と、望ましくない組織および標的微生物、例えば、細菌病原体またはウイルス病原体の破壊を強化するように合わせられる。装置は、GM-CSFなどのシグナル伝達物質を含有および/または放出することによって、マクロファージ、T細胞、B細胞、NK細胞、および樹状細胞などの適当な免疫細胞を誘引する。これらのシグナル伝達物質は、他の生理活性化合物を足場組成物の内部に導入するのに用いた同じ技法を用いて、シグナル伝達物質の放出を空間的および時間的に制御するようなやり方で足場組成物の内部に組み込まれる。
【０２７０】
免疫細胞が装置内に入ったら、装置は、望ましくない組織(例えば、癌、脂肪沈着物、またはウイルスに感染した細胞もしくはそれ以外の罹患している細胞)あるいは微生物を攻撃するように、あるいは免疫系の他の側面を引き起こして攻撃するように免疫細胞をプログラムする。免疫細胞の活性化は、存在している免疫細胞を標的特異的組成物、例えば、望ましくない組織または生物の表面に見られるリガンド、例えば、癌細胞表面マーカー、ウイルスタンパク質、オリゴヌクレオチド(oligonucleatide)、ペプチド配列、または他の特異的抗原の調製物に曝露することによって成し遂げられる。例えば、有用な癌細胞特異的抗原および他の組織または生物に特異的なタンパク質を以下の表に列挙する。
【０２７１】
装置は、任意で、多価ワクチンを作り出すために複数種のリガンドまたは抗原を含有する。装置を通り抜けて遊走している免疫細胞が、装置を横断している間に組成物に曝露されるように、組成物は足場組成物の1つもしくは複数の区画の中に埋め込まれるかまたは1つもしくは複数の区画の表面にコーティングされる。足場組成物が分解するにつれて、抗原または他の免疫刺激性分子は細胞に曝露されるかまたは曝露されるようになる。装置はまた、リガンドを認識するように免疫細胞をプログラムし、抗原提示を強化するワクチンアジュバントも含有してもよい。例示的なワクチンアジュバントには、標的細胞特異的な抗原またはリガンドと同時に曝露される、ケモカイン/サイトカイン、CpGリッチオリゴヌクレオチド、または抗体が含まれる。
【０２７２】
装置は、遊走して足場の内部に入るように免疫細胞を誘引し、足場の内部で免疫細胞は抗原特異的になるように指導され、活性化される。次いで、プログラムされた免疫細胞は、多くのやり方で、リンパ節に向かって退出するように誘導される。動員組成物および展開シグナル/組成物、例えば、リンパ節遊走を誘導する物質は1回もしくは複数回の破裂(burst)で放出されるか、足場材料からの組み込みおよび/もしくは放出の方法によってプログラムされるか、または誘引物質を含有する足場区画の連続分解によって制御される。破裂が消散すると、細胞は遊走して去っていく。反発物質を分解し、1回もしくは複数回の破裂で、またはある期間にわたって絶え間なく放出するように、反発物質を含有する区画が設計される。反発物質の相対濃度によって免疫細胞は装置から出て遊走する。または、装置の内部に置かれたかまたは装置の内部に遊走した細胞は、反発物質を放出するかまたはその挙動を変えるようにプログラムされる。例えば、局所的な遺伝子療法は、足場に取り付けられたプラスミドDNAに細胞を曝露することによって行われる。有用な反発物質にはケモカインおよびサイトカインが含まれる。または、装置は、これらを分解および放出することによって免疫細胞を退出させてもよい。
【０２７３】
標的疾患状態、ワクチン装置構築において有用な刺激性分子および抗原を以下に列挙する。
免疫応答を促進する生理活性因子
a.インターロイキン:IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、1L-17、1L-18など
b.TNF-α
c.IFN-γ
d.IFN-α
e.GM-CSF
f.G-CSF
g.Ftl-3リガンド
h.MIP-3β(CCL19)
i.CCL21
j.M-CSF
k.MIF
l.CD40L
m.CD3
n.ICAM
o.抗CTLA4タンパク質もしくは抗体またはその断片(例えば、イピリムマブまたはトレメリムマブ)
p.TGF-β
q.CPGリッチDNAまたはオリゴヌクレオチド
r.細菌に関連する糖部分:リポ多糖(LPS)が一例である
s.Fasリガンド
t.Trail
u.リンホタクチン
v.マンナン(M-FP)
w.熱ショックタンパク質(apg-2、Hsp70、およびHsp90が例である)
x.抗PD1タンパク質または抗体(例えば、MDX-1106、MK3475、CT-011、またはAMP-224)
y.抗PDL1または抗PDL2タンパク質または抗体(例えば、MDX-1105)
z.抗LAG3タンパク質もしくは抗体またはその断片
aa.抗B7-H3タンパク質もしくは抗体またはその断片
bb.抗B7-H4タンパク質もしくは抗体またはその断片
cc.抗TIM3タンパク質もしくは抗体またはその断片
dd.抗BTLAタンパク質もしくは抗体またはその断片
ee.抗A2aRタンパク質もしくは抗体またはその断片
ff.抗キラー細胞抑制受容体(KIR)(例えば、キラー細胞免疫グロブリン様受容体またはC型レクチン受容体)タンパク質もしくは抗体またはその断片
gg.抗TIM4タンパク質もしくは抗体またはその断片
hh.抗TIM2タンパク質もしくは抗体またはその断片
ii.抗OX40タンパク質もしくは抗体またはその断片
jj.抗4-lBBタンパク質もしくは抗体またはその断片
kk.抗ホスファチジルセリンタンパク質もしくは抗体またはその断片(例えば、ホスファチジルセリンに対するモノクローナル抗体)
疾患および抗原-ワクチン接種標的
a.癌:抗原およびその供給源
i.生検材料(例えば、メラノーマ腫瘍生検材料)から抽出した腫瘍溶解産物
ii.放射線照射された腫瘍細胞(例えば、放射線照射されたメラノーマ細胞)
iii.メラノーマ
1.抗原のMAGEシリーズ(MAGE-1が一例である)
2.MART-1/メランA
3.チロシナーゼ
4.ガングリオシド
5.gp100
6.GD-2
7.O-アセチル化GD-3
8.GM-2
9.B16-F10腫瘍溶解産物、例えば、B16-F10メラノーマ腫瘍細胞(ATCC, Manassas, NJ)を投与したマウスに由来するB16-F10腫瘍溶解産物
10.チロシナーゼ関連タンパク質(TRP)-2
11.肺癌細胞溶解産物または肺癌細胞抗原
12.神経膠腫癌細胞溶解産物または神経膠腫癌細胞抗原
13.前立腺癌細胞溶解産物または前立腺癌細胞抗原
iv.乳癌
1.MUC-1
2.Sos1
3.プロテインキナーゼC結合タンパク質
4.逆転写酵素タンパク質
5.AKAPタンパク質
6.VRK1
7.KIAA1735
8.T7-1、T11-3、T11-9
9.Her2(CD340とも知られる)
v.他の一般的な癌抗原および特異的な癌抗原
1.ホモ・サピエンステロメラーゼ酵素(hTRT)
2.サイトケラチン-19(CYFRA21-1)
3.扁平上皮癌抗原1(SCCA-1)、(タンパク質T4-A)
4.扁平上皮癌抗原2(SCCA-2)
5.卵巣癌抗原CA125(1A1-3B)(KIAA0049)
6.ムチン1(腫瘍関連ムチン)、(癌腫関連ムチン)、(多型上皮ムチン)、(PEM)、(PEMT)、(エピシアリン)、(腫瘍関連上皮膜抗原)、(EMA)、(H23AG)、(ピーナッツ反応性尿中ムチン)、(PUM)、(乳癌関連抗原DF3)
7.CTCL腫瘍抗原se1-1
8.CTCL腫瘍抗原se14-3
9.CTCL腫瘍抗原se20-4
10.CTCL腫瘍抗原se20-9
11.CTCL腫瘍抗原se33-1
12.CTCL腫瘍抗原se37-2
13.CTCL腫瘍抗原se57-1
14.CTCL腫瘍抗原se89-1
15.前立腺特異的膜抗原
16.5T4癌胎児性栄養膜糖タンパク質
17.Orf73カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス
18.MAGE-C1(癌/精巣抗原CT7)
19.MAGE-B1抗原(MAGE-XP抗原)(DAM10)
20.MAGE-B2抗原(DAM6)
21.MAGE-2抗原
22.MAGE-4a抗原
23.MAGE-4b抗原
24.結腸癌抗原NY-CO-45
25.肺癌抗原NY-LU-12バリアントA
26.癌関連表面抗原
27.腺癌抗原ART1
28.Paraneoplastic associated brain-testis-cancer antigen(癌ニューロン抗原MA2;腫瘍随伴性ニューロン抗原)
29.Neuro-oncological ventral antigen 2(NOVA2)
30.肝細胞癌抗原遺伝子520
31.腫瘍関連抗原CO-029
32.腫瘍関連抗原MAGE-X2
33.Synovial sarcoma, X breakpoint 2
34.Squamous cell carcinoma antigen recognized by T cell
35.Serologically defined colon cancer antigen 1
36.Serologically defined breast cancer antigen NY-BR-15
37.Serologically defined breast cancer antigen NY-BR-16
38.クロモグラニンA;副甲状腺分泌タンパク質1
39.DUPAN-2
40.CA19-9
41.CA72-4
42.CA195
43.癌胎児抗原(CEA)
b.AIDS(HIV関連抗原)
i.Gp120
ii.SIV229
iii.SIVE660
iv.SHIV89.6P
v.E92
vi.HC1
vii.OKM5
viii.FVIIIRAg
ix.HLA-DR(Ia)抗原
x.OKM1
xi.LFA-3
c.一般的な感染症および関連抗原
i.結核
1.結核菌(Mycobacterium tuberculosis)抗原5
2.結核菌抗原85
3.ESAT-6
4.CFP-10
5.Rv3871
6.GLU-S
ii.マラリア
1.CRA
2.RAP-2
3.MSP-2
4.AMA-1
iii.可能性のある変異インフルエンザ株および変異髄膜炎株
d.神経保護-神経学的疾患(例えば、アルツハイマー、パーキンソン、プリオン病)から保護する
1.自己CNS抗原のクラス
2.ヒトα-シヌクレイン(パーキンソン)
3.ベータアミロイド斑(アルツハイマー)
e.自己免疫疾患(多発性硬化症、慢性関節リウマチなど)
i.疾患関連MHC抗原
ii.様々なクラスの自己抗原
iii.インシュリン
iv.インシュリンペプチドB9-23
v.グルタミン酸
vi.デカルボキシラーゼ65(GAD65)
vii.HSP60
疾患関連T細胞受容体(TCR)
【０２７４】
進行性疾患には、腫瘍細胞を殺滅し、疾患を一掃するためにCD8+細胞傷害性Tリンパ球(CTL)の強力かつ持続的な活性化が必要であるので、以前のワクチンは、確立した癌をもつ患者に対してほとんど効果がなかった。樹状細胞(DC)のサブセットは、抗原の交差提示と、CTLと、エフェクターT細胞応答を停止するT調節性(Treg)細胞の両方を調節するサイトカインの産生を専門とする。マウスにおいてDCネットワークと、特に、形質細胞様DC(pDC)およびCD8+DCが協調して調節されると宿主免疫が強化される。インサイチューで宿主DC集団の活性化および局在を制御するために、炎症性サイトカイン、免疫デンジャーシグナル、および腫瘍溶解産物の様々な組み合わせを取り入れた機能化生体材料が、本明細書に記載のワクチンにおいて用いられる。
【０２７５】
サイトカイン、腫瘍抗原、およびデンジャーシグナルのインビボ提示を空間的および時間的に制御する移植可能な合成ポリマーマトリックス(抗原が装填した無細胞生体材料装置)が用いられる。DC前駆体およびDCを動員するために、これらのポリラクチド-コ-グリコリド(PLG)[FDAにより認可された生体材料]マトリックスから周囲組織にGM-CSFが放出される。CpGリッチオリゴヌクレオチドがデンジャーシグナルとしてマトリックス上に固定化され、DCの発達および成熟をプログラムするために、マトリックスに存在しているDCに抗原(腫瘍溶解産物)が放出される。これらのマトリックスはインサイチューでDCの活性化および輸送を量的に調節し、マウスB16-F10メラノーマ細胞の接種に対する予防免疫を誘導する(P. Schnorrer, G. M. Behrens, N. S. Wilson, J. L. Pooley, C. M. Smith, D. El-Sukkari, G. Davey, F. Kupresanin, M. Li, E. Maraskovsky, G. T. Belz, F. R. Carbone, K. Shortman, W. R. Heath, J. A. Villadangos, The dominant role of CD8+ dendritic cells in cross-presentation is not dictated by antigen capture. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 10729-10734 (2006))。本明細書に記載のように、このシステムは、複数のDCサブセットおよびT細胞サブセットの動員および活性化を制御するために、ある期間にわたって繰り返し投与され、確立した腫瘍に対する治療用ワクチンとして有効である。
【０２７６】
マトリックス製作
マトリックスを製作するための例示的なプロトコールが本明細書において説明される(例えば、参照により本明細書に組み入れられる、US2013-0202707を参照されたい)。D,L-ラクチドとグリコリド(PLG)の85:15, 120kDコポリマー(Alkermes)をガス発泡プロセスにおいて用いて、多孔性PLGマトリックスを形成した(L. D. Harris, B. S. Kim, D. J. Mooney, Open pore biodegradable matrices formed with gas foaming. J. Biomed. Mater. Res. 42, 396-402 (1998))。最初に、標準的な二重エマルジョンを用いて、GM-CSFカプセル化PLGマイクロスフェアを作製した(S. Cohen, T. Yoshioka, M. Lucarelli, L. H. Hwang, R. Langer, Controlled delivery systems for proteins based on poly(lactic/glycolic acid) microspheres. Pharm. Res. 8, 713-720 (1991))。次いで、PLGマイクロスフェアを150mgのポロゲン、スクロース(250〜425mmの粒径までふるいにかけた)と混合し、圧縮成型した。結果として生じたディスクを高圧CO2環境内で平衡化した。圧力を急速に下げるとポリマー粒子は拡大し、融合して、相互接続した構造になる。水に浸けることにより、足場からスクロースが侵出して、90％多孔度の足場が得られた。腫瘍溶解産物をPLG足場に組み込むために、C57BL/6Jマウス(Jackson Laboratory)の背中の皮下で成長させたB16-F10腫瘍の生検材料をコラゲナーゼ(250U/ml)(Worthington)で消化し、40μmセルストレーナーで濾過した後に107細胞/ミリリットルに等しい濃度で懸濁した。腫瘍細胞懸濁液を液体窒素に入れて4サイクルの急速凍結に供し、解凍し(37℃)、次いで、400rpmで10分間、遠心分離した。腫瘍溶解産物を含有する上清(1ml)を収集し、PLGマイクロスフェアと共にインキュベートし、凍結乾燥した、結果として生じた混合物を高圧CO2プロセスにおいて用いて、腫瘍溶解産物を組み込んだマクロ多孔性PLGマトリックスを発泡させた。
【０２７７】
CpG-ODNをPLG足場の内部に組み込むために、CpG-ODN1826、5'-tccatgacgttcctgacgtt-3'(Invivogen, San Diego, CA; SEQ ID NO:29)を、ポリ(エチレンイミン)(PEI)(Mn約60,000; Sigma Aldrich)分子を用いて、混合物をボルテックスしながらODN1826溶液をPEI溶液に滴下することによって凝縮させた(L. D. Harris, B. S. Kim, D. J.Mooney, Open pore biodegradable matrices formed with gas foaming. J. Biomed. Mater. Res. 42, 396-402 (1998); S. Cohen, T. Yoshioka, M. Lucarelli, L. H. Hwang, R. Langer, Controlled delivery systems for proteins based on poly(lactic/glycolic acid) microspheres. Pharm. Res. 8, 713-720 (1991); Y. C. Huang, M. Connell, Y. Park, D. J. Mooney, K. G. Rice, Fabrication and in vitro testing of polymeric delivery system for condensed DNA. J. Biomed. Mater. Res. A 67, 1384-1392(2003))。凝縮中に、PEIとCpG-ODN(NH3+:P04-)との電荷比を7と一定に保った。次いで、PEI-CpG-ODN凝縮物溶液を60μlの50％(w/v)スクロース溶液と共にボルテックスし、凍結乾燥し、乾燥スクロースと混合して最終重量150mgにした。次いで、PLG癌ワクチンを作製するために、スクロースを含有するPEI-CpG-ODN凝縮物を、ブランク、GM-CSF、および/または腫瘍溶解産物が装填されたPLGマイクロスフェアと混合した。
【０２７８】
制御されたGM-CSFおよびTLRアゴニストの提示を成し遂げるために、マクロ多孔性のポリ-ラクチド-コ-グリコリド(PLG)マトリックスはGM-CSFを素早く放出する(Ali et al.,2009 Nat Mater, 2: 151-8)。例えば、DCまたはその前駆体の動員を誘導するために、タンパク質の約60％が10日目までに放出された(参照により本明細書に組み入れられる、US2013-0202707)。GM-CSFが装填されたPLG足場を、デンジャーシグナルであるTLR活性化CpG-ODN、MPLA、およびP(I:C)分子も提示するように改変した。長期局所シグナルを供給してDCを活性化するようにTLRアゴニストの提示を設計した。重要なことに、足場を製作するのに選択した比較的高い分子量および組成の特定のPLGは足場をゆっくりと分解させ、これにより、ワクチン部位の長期分析と、足場のによるDC活性化およびT細胞免疫の調節が可能になる。
【０２７９】
本発明のワクチンシステムは低免疫原性のB16-F10メラノーマに対して予防免疫を生じることができる(参照により本明細書に組み入れられる、O. A. Ali, N. Huebsch, L. Cao, G. Dranoff, D. J. Mooney, Infection-mimicking materials to program dendritic cells in situ. Nat. Mater. 8, 151-158 (2009)およびUS 2013-0202707)。参照により本明細書に組み入れられる、US2013-0202707に記載のように、ワクチンシステムは、pDCおよびCD8+DCにより誘導されるナイーブT細胞の分化、1型IFNおよびIL-12の対応する産生、ならびに負のフィードバック機構の阻害を介してCTL応答を促進および拡大する。
【０２８０】
参照により本明細書に組み入れられるUS2013-0202707に記載のように、様々なTLRアゴニストを含有するワクチン製剤は、特定のDCサブセットの活性化と相関する、かなり大きな全身性の抗メラノーマCTLを生じさせ、腫瘍量を低減する。TLRアゴニストを含めると、一般的に、DCが活性化され、それによって、MHCIIおよび補助刺激分子CD86の表面発現が増加する。このことは、抗原を提示し、T細胞集団を活性化する能力が強化されたことを示している。特に、適当なTLRシグナル伝達によって、ワクチン部位におけるCD8(+)サブセットおよびpDCサブセットの生成が強化され、IFNと、強力なT細胞増殖因子であるIL-12の産生が刺激された。
【０２８１】
一部の態様では、ワクチンにおいてアジュバントとして働くように、3つの異なるタイプの病原体関連分子パターン(PAMP)(3つのタイプ;短いオリゴヌクレオチド(CpG-ODN); 合成RNA-(ポリ(I:C); P(I:C))、合成脂質(モノホスホリル脂質A; MPLA)がPLGディスク構造/足場などの構造ポリマー装置の内部または表面に組み込まれる。このようなワクチン製剤はインサイチューで樹状細胞を動員および活性化する。
【０２８２】
高悪性度メラノーマ癌モデルにおけるワクチン依存的生存は、ワクチンシステムに用いたアジュバントに関係なく、ワクチンが樹状細胞の2つのサブセット-CD8(+)DCおよび形質細胞様DC-を特異的に活性化する能力と強く相関する。PLGワクチンに4つの異なるワクチンアジュバントを用いて、この相関性が確認された。これらのワクチンは、メラノーマの治療モデルにおいて、ワクチン部位と腫瘍に検出された特異的T細胞応答を活性化することによって強力な腫瘍拒絶反応を誘導する。これらの所見から、自然免疫応答および適応免疫応答の様々な経路を刺激する様々なタイプのアゴニストを組み込む上でPLGワクチンシステムの汎用性が証明された。
【０２８３】
免疫応答における樹状細胞の役割
樹状細胞(DC)は、特異的な細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答を初回刺激し、広げることによって感染および腫瘍に対する免疫応答をうまくまとめる。末梢組織に存在している未熟なDCは、侵入病原体に特有の異物(すなわち、抗原)を検出し、病原体によって誘導される炎症応答の間に生じる刺激、例えば、病原体関連分子パターン(PAMP)または死につつある細胞の産物(すなわち、「デンジャーシグナル」)によって活性化される。成熟中のDCは両プロセスを完成させ、主要組織適合複合体(MHC)受容体上に抗原を提示し、補助刺激分子CD80およびCD86を発現する。CD80およびCD86は両方ともエフェクターT細胞刺激に必要とされる。「デンジャーシグナル伝達」によるDC成熟の別の重要な結果は、DCが、リンパ節にホーミングして、ナイーヴT細胞に結合し、これを活性化し、DCが提示している抗原をT細胞が認識できるようになる能力を獲得することである。
【０２８４】
特定のDCが免疫応答を開始および制御する能力は、DCの組織内局在と、動員のための専門化された能力の結果である。DCは骨髄にある多能性幹細胞から生じ、血流に入り、ほぼ全ての器官に局在する。一連の表面マーカーの相対発現に基づいて、末梢血中に、形質細胞様DC(pDC)および従来のDC(cDC)2を含むDCまたはDC前駆体の様々なサブセットを特定することができる。pDCは主要なI型インターフェロン(IFN)産生細胞であり、サイトカインシグナル伝達を介したウイルス曝露に対する適応免疫応答の活性化を専門とする。表皮DCなどのCD11c(+)cDCは抗原提示およびT細胞の補助刺激に特に長けている。
【０２８５】
微生物が侵入し、炎症が起こると、DCは、マクロファージなどの他のAPCよりもはるかに数で勝る速度で流入領域リンパ節と主な感染部位に迅速に遊走する。(pDC)を含む、ほとんどのDCサブセットの生成は、定常状態では、サイトカインFms関連チロシンキナーゼ3リガンドリガンド(FL)によって制御される。損傷した細胞または感染した細胞によって放出される他のサイトカイン、例えば、GM-CSFおよびCCL20はcDCを活発に炎症部位に動員し、局在させる。インビボおよびインビトロ両方で炎症モデルにおいて、これらの炎症性サイトカインはDCの遊走と増殖を強化することも示されており、DC活性化状態を調節する可能性がある。感染中に、または腫瘍内で活性化されたDCの量は、その後の免疫応答と疾患予後の強さと相関する。
【０２８６】
免疫療法に十分な数の樹状細胞(DC)を作製するために、多くの場合、炎症性サイトカイン、例えば、顆粒球マクロファージ-コロニー刺激因子(GM-CSF)およびFL(Flt3)を用いた実験室ベースのDC前駆体培養が用いられてきた。腫瘍抗原を提示するようにインビトロで改変されたDCはマウスモデルに移植されると抗腫瘍効果を誘発することができる。エクスビボDCベースワクチンの初期臨床試験から、癌患者のサブセットにおいて腫瘍退縮が誘導されることが明らかになったが、生存利益はほとんどなかった。DCのエクスビボ操作が伴うプロトコールには、作製することができるDCの量およびタイプと、生着効率およびLNホーミングが不十分なことと、インビボ環境で注射するとDC活性化が失われるという制約がある。
【０２８７】
これらの制約に対処するために、装置の感染模倣材料は、インビボでDCを動員および活性化するために、デンジャーシグナルと組み合わせて炎症性サイトカインを提示する。シトシン-グアノシン(CpG)リッチオリゴヌクレオチド(CpG-ODN)は細菌DNAにおいて発現され、マトリックスに存在しているDCの活性化を刺激することができる強力なデンジャーシグナルであるので、CpG-ODN配列を含有するナノ粒子も足場上に固定化した。
【０２８８】
CD141+DCおよび形質細胞様DCは癌ワクチン接種(予防用および治療用)の成功にとって重大な意味をもつ。形質細胞様DCは形質細胞のように見えるが、骨髄球系樹状細胞に似た、ある特定の特徴をもち、多量のインターフェロン-αを産生することができ、TLR7およびTLR9によって特徴付けられる。TLRアゴニストであるCpGはTLR9に結合する。マウスのCD8+DCはCD141+樹状細胞に相当する。CD141+DCはヒトリンパ節、骨髄、扁桃腺、および血液に見出される。CD141+DCは、これよりよく研究されているCD1c+DCサブセットと比較して多量のtoll様受容体3(TLR3)発現、IL-12p70およびIFN-βの産生、Tヘルパー1細胞応答を誘導する優れた能力によって特徴付けられる。
【０２８９】
ポリイノシン-ポリシチジル酸(ポリI:C)で活性化されたCD141+DCが抗原をCD8+細胞傷害性Tリンパ球に交差提示する能力は、ポリI:Cで活性化されたCD1c+DCより優れている。従って、CD141+DCサブセットは、マウスCD8α+DCサブセットと同様の特徴をもつ機能的に異なる重要なヒトDCサブタイプである。CD141+DCは細胞傷害性Tリンパ球応答の誘導において役割を果たし、癌、ウイルス、および他の病原体に対するワクチン接種にはCD141+DCが活性化されることが重要である。
【０２９０】
ワクチン装置の内部にあるp(I:C)はヒトではCD141+DC(マウスではCD8+DC)を刺激し、CpGは形質細胞様DCを刺激する。これらのTLRアゴニストの1つまたは両方を含む装置は、強力なDC活性化と、かなり大きな予防的抗腫瘍性免疫応答および治療的抗腫瘍免疫応答の発生をもたらす。装置の内部にある様々なTLRアゴニストの組み合わせ、例えば、p(I:C)とCpGの組み合わせは、腫瘍に対するDC免疫応答の活性化の点で相乗効果をもたらす。
【０２９１】
CpG-ODNおよびP(I:C)を組み込んだPLGワクチンは相乗作用して、かなり大きな腫瘍阻害を生じさせ、腫瘍量を減らし、抗腫瘍免疫応答を改善する。
【０２９２】
サイトカイン徐放およびインビボDC動員
GM-CSF、FL、およびCCL20を長期的かつ持続的に放出し、活性化のためにDCを収納するようにマクロ多孔性ポリ-ラクチド-コ-グリコリド(PLG)マトリックスを設計した。樹状細胞浸潤を容易にするために、これらのPLG足場の多孔度は80〜90％であり、平均孔径は125〜200umであった。このマトリックスは最初の5日間で1回の破裂でタンパク質を素早く放出し、その後に、次の数週間で持続的に放出したので、3種類のサイトカインのインビトロ放出動態はほぼ同じであった(参照により本明細書に組み入れられる、US2013-0202707)。
【０２９３】
インビボDC活性化
炎症性サイトカインとの送達と協調して、感染を模倣するデンジャーシグナルであるTLR活性化CpG-ODNを含有するナノ粒子を提示するようにPLG足場を改変した。これにより、サイトカインシグナル伝達がない対照条件と比べて、インサイチューでのDC活性化が劇的に強化された。
【０２９４】
エクスビボDCベースワクチンの開発、さらに一般的には、インビボで免疫系を活性化する材料システムの設計において、DCおよびDC前駆体の制御された動員および活性化は特に関心が高い。本明細書に記載のように、微生物感染の重要な側面を模倣するポリマーは癌ワクチン接種のためにDCを効果的に動員する。GM-CSF、FL、およびCCL20を放出するように操作されたPLG足場は、かなりの数の存在するDCをもたらし、デンジャーシグナルの同時提示はDC成熟をもたらした。全ワクチン製剤がB16-F10メラノーマの治療モデルにおいて腫瘍からの保護を誘導することができたが、GM-CSFワクチンおよびFLワクチンはCCL20と比較して多量の抗原特異的CTL、高レベルのTh1初回刺激サイトカイン、および高い生存率を生じさせた。
【０２９５】
pDCおよびそのcDC対応物は、これらの抗腫瘍T細胞応答を媒介する専門化した能力を利用するために標的化される。ナノ粒子標的化システムとは対照的に、本明細書に記載のポリマーシステムは、DCを動員および活性化する抗原送達装置として働くだけでなく、DCが一時的に存在している間に活性化される物理的構造としても働く。
【０２９６】
本明細書に記載のシステムは、かなり大きな抗腫瘍活性を示した。本明細書に記載のポリマー、例えば、PLGの他に、任意で、免疫応答およびDC動員を高めるために、炎症性がさらに高い他のポリマーからマトリックスが製作される。これらの細胞による後のT細胞初回刺激の別の重要な側面はLNホーミングである。抗原曝露後のDCの離脱または分散は、様々なアジュバントを材料中に組み込んで遊走機能を活性化することによって最適化される。または、DC輸送のさらなる制御を促進するために、分解動態および多孔度を含む他のマトリックス特性が変えられる。
【０２９７】
インサイチューで感染誘導性DC動員を模倣するために、FL、CCL20、およびGM-CSFが生体材料システムにおいて用いられる。US2013-0202707、例えば、111頁、17行〜113頁、17行(参照により本明細書に組み入れられる)に記載のように、感染を模倣する多孔性装置が治療用癌ワクチンとして有効である。
【０２９８】
抗体
本明細書で使用する「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン(Ig)分子の免疫学的に活性のある部分、すなわち、抗原に特異的に結合する(抗原と免疫反応する)抗原結合部位を含有する分子を指す。「特異的に結合する」または「と免疫反応する」とは、抗体が望ましい抗原の1つまたは複数の抗原決定基と反応し、他の抗原と有意に反応しないことを意味する。抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、dAb(ドメイン抗体)、単鎖、Fab、Fab'、およびF(ab')2断片、scFv、およびFab発現ライブラリーが含まれるが、これに限定されない。
【０２９９】
単鎖Fv(「scFv」)ポリペプチド分子は、ペプチドをコードするリンカーによって連結された、VHをコードする遺伝子とVLをコードする遺伝子を含む遺伝子融合から発現させることができる、共有結合的に連結されたVH::VLヘテロ二量体である(Huston et al.(1988) Proc Nat Acad Sci USA 85(16): 5879-5883を参照されたい)。抗体V領域に由来する、天然で凝集するが化学的に分離されたポリペプチド軽鎖および重鎖を、抗原結合部位の構造に実質的に似た三次元構造に折り畳まれるscFv分子に変換するための化学構造を見分ける多数の方法が述べられている。例えば、米国特許第5,091,513号;同第5,132,405号;および同第4,946,778号を参照されたい。
【０３００】
「抗原結合部位」または「結合部分」という用語は、抗原結合に関与する免疫グロブリン分子の部分を指す。抗原結合部位は、重(「H」)鎖および軽(「L」)鎖のN末端可変(「V」)領域のアミノ酸残基によって形成される。「超可変領域」と呼ばれる、重鎖および軽鎖のV領域内にある3つの大きく異なる領域が、「フレームワーク領域」または「FR」と知られる、「超可変領域」より保存されている隣接領域の間に置かれている。従って、「FR」という用語は、免疫グロブリンの超可変領域間に天然に見られ、それに隣接するアミノ酸配列を指す。抗体分子には、軽鎖の3つの超可変領域と重鎖の3つの超可変領域が三次元空間で互いに関連して配置されて抗原結合表面を形成している。抗原結合表面は、結合する抗原の三次元表面に相補的であり、重鎖および軽鎖それぞれの3つの超可変領域は「相補性決定領域」または「CDR」と呼ばれる。
【０３０１】
本明細書で使用する「エピトープ」という用語は、免疫グロブリン、scFv、またはT細胞受容体に特異的結合することができる任意のタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性のある表面グループからなり、特定の三次元構造特徴ならびに特定の電荷特徴を有する。例えば、抗体は、ポリペプチドのN末端ペプチドまたはC末端ペプチド、タンパク質の直鎖ペプチド配列または非直鎖ペプチド配列、ならびに第1の抗原のアミノ酸と第2の抗原のアミノ酸を含むエピトープに対して作られてもよい。
【０３０２】
本明細書で使用する「免疫学的結合」および「免疫学的結合特性」という用語は、免疫グロブリン分子と、免疫グロブリンに特異性を示す抗原との間で起こるタイプの非共有結合的相互作用を指す。免疫学的結合相互作用の強度、すなわち親和性は相互作用の解離定数(Kd)で表すことができる。Kdが小さいほど親和性が大きいことを示している。選択されたポリペプチドの免疫学的結合特性は、当技術分野において周知の方法を用いて定量することができる。このような方法の1つは、抗原結合部位/抗原複合体が形成および解離する速度を測定することを伴う。これらの速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性、および両方向の速度に等しく影響を及ぼす幾何学的パラメータに依存する。従って、濃度と、実際の結合速度および解離速度を計算することによって、「オンレート定数」(Kon)および「オフレート定数」(Koff)を両方とも求めることができる(Nature 361: 186-87 (1993))。Koff/Konの比は、親和性に関連しない全パラメータを取り消すことができ、解離定数Kdに等しい。Davies et al.(1990) Annual Rev Biochem 59:439-473)。本発明の抗体は、放射性リガンド結合アッセイまたは当業者に公知の類似のアッセイなどのアッセイによって測定された時に、平衡結合定数(Kd)が≦1μΜ、好ましくは≦100nM、より好ましくは≦10nM、より好ましくは≦1nM、最も好ましくは≦100pM〜約1pMである時に、本明細書に記載の抗原またはエピトープ(例えば、CTLA、PD1、PDL1、または他の免疫抑制性タンパク質および/もしくは腫瘍抗原)に特異的に結合すると言われる。
【０３０３】
投与経路
本発明の薬学的組成物(例えば、本明細書に記載の阻害剤)は、その意図される投与経路と適合するように製剤化される。投与経路の例には、非経口投与、例えば、静脈内投与、腹腔内投与、皮内投与、皮下投与、経口投与(例えば、吸入)、経皮投与(すなわち、局部投与)、経粘膜投与、および直腸投与が含まれる。非経口適用、皮内適用、または皮下適用に用いられる溶液または懸濁液は、以下の成分:滅菌希釈剤、例えば、注射用水、食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒;抗菌剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン;抗酸化物質、例えば、アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム;キレート剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸(EDTA);緩衝剤、例えば、酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩、および張性を調節するための薬剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロースを含んでもよい。pHは塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調節されてもよい。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチックで作られたアンプル、使い捨て注射器、またはマルチドーズバイアルに入れられてもよい。
【０３０４】
注射に用いるのに適した薬学的組成物には、滅菌水溶液(水溶性の場合)または分散液、および滅菌注射液または分散液を即時に調製するための滅菌散剤が含まれる。静脈内投与の場合、適切な担体には、生理食塩水、静菌水(bacteriostatic water)、Cremophor EL(商標)(BASF, Parsippany, NJ)、またはリン酸緩衝食塩水(PBS)が含まれる。全ての場合において、組成物は無菌でなければならず、簡単な注射器使用可能性が存在する程度まで流動性がなければならない。組成物は製造および保管の条件下で安定してなければならず、細菌および菌類などの微生物の汚染作用から守らなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど)を含有する溶媒または分散媒、ならびにその適切な混合物でもよい。例えば、レシチンなどのコーティングを用いることによって、分散液の場合には、必要とされる粒径を維持することによって、および界面活性剤を用いることによって、適切な流動性を維持することができる。微生物の作用は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって防止することができる。多くの場合、組成物に等張剤、例えば、糖、多価アルコール、例えば、マニトール(manitol)、ソルビトール、塩化ナトリウムを含めることが好ましい。吸収を遅延する薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に含めることによって、注射可能な組成物を長期間吸収させることができる。
【０３０５】
滅菌注射液は、必要とされる量の活性化合物を、必要に応じて、前記で列挙された成分の1つまたは組み合わせと共に適切な溶媒中に混合された後に、濾過滅菌することによって調製することができる。一般的に、分散液は、活性化合物を、基本分散媒と、前記で列挙されたものからの必要とされる他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に混合することによって調製される。滅菌注射液を調製するための滅菌散剤の場合、調製方法は、予め濾過滅菌した溶液から、活性成分と任意のさらなる望ましい成分の散剤を生じさせる真空乾燥および凍結乾燥である。
【０３０６】
経口組成物は一般的に不活性希釈剤または食用担体を含む。経口組成物はゼラチンカプセルの内部に入れられてもよく、圧縮されて錠剤にされてもよい。経口治療投与の目的で、活性化合物は賦形剤と共に混合され、錠剤、トローチ、またはカプセルの形で用いられてもよい。経口組成物はまた、口腔洗浄薬として用いるために流体担体を用いて調製されてもよく、流体担体に溶解した化合物が経口的に適用され、素早く動かされ、吐き出されるか、または飲み込まれる。薬学的に適合する結合剤、および/またはアジュバント材料が組成物の一部として含まれてもよい。錠剤、丸剤、カプセル、トローチなどは、以下の成分:結合剤、例えば、結晶セルロース、トラガカントゴム、もしくはゼラチン;賦形剤、例えば、デンプンもしくはラクトース、崩壊剤、例えば、アルギン酸、Primogel、もしくはトウモロコシデンプン;潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムもしくはSterotes;流動化剤、例えば、コロイド状二酸化ケイ素;甘味剤、例えば、スクロースもしくはサッカリン;または着香剤、例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ着香料のいずれでも、または同様の性質の化合物を含有してもよい。
【０３０７】
吸入による投与の場合、化合物は、適切な噴霧剤、例えば、二酸化炭素などの気体を含有する加圧された容器もしくはディスペンサーから、またはネブライザーからエアロゾルスプレーの形で送達される。
【０３０８】
全身投与はまた経粘膜手段または経皮手段によるものでもよい。経粘膜投与または経皮投与の場合、透過しようとする障壁に適した透過剤が製剤に用いられる。このような透過剤は当技術分野において一般に知られており、例えば、経粘膜投与の場合、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は点鼻薬または坐剤を用いて成し遂げることができる。経皮投与の場合、活性化合物は、当技術分野において一般に知られている軟膏、膏薬、ゲル、またはクリームに製剤化することができる。
【０３０９】
化合物はまた、直腸送達の場合、坐剤(例えば、従来の坐剤主剤、例えば、カカオ脂および他のグリセリド)または停留浣腸(retention enema)の形で調製されてもよい。
【０３１０】
一態様において、活性化合物は、身体からの急速な排出から化合物を保護する担体、例えば、移植片およびマイクロカプセル化送達系を含む持続的放出製剤/徐放製剤を用いて調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性生体適合性ポリマーを使用することができる。このような製剤を調製するための方法は当業者に明らかであろう。
【０３１１】
例えば、活性成分は、例えば、コアセルベーション技法によって調製されたマイクロカプセルまたは界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチン-マイクロカプセルおよびポリ-(メチルメタクリレート)マイクロカプセルの内部に、コロイド薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル)の内部に、またはマクロエマルジョンの内部に封入されてもよい。
【０３１２】
持続放出調製物が調製されてもよい。持続放出調製物の適切な例には、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれる。このマトリックスは、成型物品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形をしている。持続放出マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、またはポリ(ビニルアルコール))、ポリ乳酸(米国特許第3,773,919号)、L-グルタミン酸およびγエチル-L-グルタミン酸のコポリマー、非分解性のエチレン-酢酸ビニル、分解性の乳酸-グリコール酸コポリマー、例えば、LUPRON DEPOT(商標)(乳酸-グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドで構成される注射用マイクロスフェア)、およびポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸が含まれる。エチレン-酢酸ビニルおよび乳酸-グリコール酸などのポリマーを用いると、100日間にわたって分子を放出することができるが、ある特定のヒドロゲルを用いると、もっと短い期間にわたってタンパク質が放出される。
【０３１３】
前記の材料はまた、Alza Corporation および Nova Pharmaceuticals, Incのリポソーム懸濁液(ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いて感染細胞に標的化されたリポソームを含む)から商業的に入手することもでき、薬学的に許容される担体として使用することもできる。これらは、例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第4,522,811号に記載のように、当業者に公知の方法に従って調製することができる。
【０３１４】
投与を容易にし、投与量を均一にするために、経口組成物または非経口組成物を単位剤形で製剤化することは特に有利である。本明細書で使用する単位剤形とは、処置しようとする対象に対する単位投与量として適した物理的に別個の単位を指す。それぞれの単位は、必要とされる薬学的担体と共同して、望ましい治療効果を生じるように計算された予め決められた量の活性化合物を含有する。本発明の単位剤形の仕様は、活性化合物の独自の特徴および実現しようとする特定の治療効果、ならびに個体を処置するために、このような活性化合物を配合する技術分野においてつきものの制約によって規定され、これに直接左右される。
【０３１５】
薬学的組成物は、投与のための説明書と一緒に、容器、パック、またはディスペンサーの内部に入れられてもよい。
【０３１６】
投与量
本発明の方法は、1種類または複数種の本明細書に記載の免疫抑制性タンパク質の阻害剤を、0.01〜10mg/kg(例えば、0.1〜5mg/kg)体重の投与量で投与する工程を含む。例えば、阻害剤は、0.01mg/kg、0.02mg/kg、0.05mg/kg、0.1mg/kg、0.3mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kgの投与量で投与される。一部の態様では、阻害剤は、毎日、隔日で、2日ごとに、3日ごとに、4日ごとに、5日ごとに、または6日ごとに投与される。他の態様において、阻害剤は、1〜10週間ごとに(例えば、1週間ごとに、2週間ごとに、3週間ごとに、4週間ごとに、5週間ごとに、6週間ごとに、7週間ごとに、8週間ごとに、9週間ごとに、または10週間ごとに)投与される。例えば、阻害剤は、合計7日〜3年(例えば、7日、14日、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、8週間、9週間、10週間、11週間、12週間、24週間、36週間、1年、1.5年、2年、2.5年、または3年)にわたって投与される。例えば、阻害剤は無期限に(例えば、少なくとも3年)投与される。一部の態様では、阻害剤は、0.01〜50mg(例えば、0.05〜30mg)/用量の量で提供される。例えば、阻害剤は、1回の投与につき(例えば、1回の注射につき)0.01mg、0.02mg、0.05mg、0.1mg、0.2mg、0.4mg、0.8mg、2mg、5mg、10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、40mg、または50mg)の量で投与される。場合によっては、阻害剤は隔週で投与される。例えば、阻害剤は隔週で合計1〜20回(例えば、1回、2回、4回、6回、8回、10回、15回、または20回)投与される。
【０３１７】
ある例では、阻害剤(例えば、本明細書に記載の抗体)はワクチン装置の内部または表面に組み込まれる。このような場合、0〜100mg(例えば、5〜100mg、10〜100mg、20〜100mg、30〜100mg、40〜100mg、50〜100mg、60〜100mg、70〜100mg、80〜100mg、90〜100mg、1〜95mg、1〜90mg、5〜95mg、5〜90mg、5〜80mg、5〜70mg、5〜60mg、5〜50mg、5〜40mg、5〜30mg、または5〜20mg)の阻害剤(例えば、本明細書に記載の抗体)が装置に存在する。例えば、阻害剤(例えば、本明細書に記載の抗体)は少なくとも5％の(例えば、少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％の、またはこれより多い)重量/重量濃度で装置に存在する。
【０３１８】
例えば、阻害剤(例えば、抗CTLA4抗体または抗PD1抗体)は、体重が約87kgの対象の場合、0.5〜5mg/kg(例えば、3mg/kg)体重、例えば、43mg〜435mg/用量(例えば、平均して260mg/用量)の投与量で投与(例えば、全身投与)される。ある例では、阻害剤(例えば、抗CTLA4抗体または抗PD1抗体)は、例えば、0.5〜5mg/kg/用量(例えば、3mg/kg/用量)で4回投与されて投与(例えば、全身投与)され、4回投与された後の全用量は約1000mgである。他の例では、阻害剤(例えば、抗CTLA4抗体または抗PD1抗体)は、複数回投与(例えば、1回、2回、3回、4回、5回、6回、7回、8回、9回、10回、11回、12回、13回、14回、15回、16回、17回、18回、19回、20回、またはそれより多い投与)されて投与される。一部の態様では、投与間の時間間隔は、少なくとも1日(例えば、1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、またはそれより長い、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、8週間、9週間、10週間、11週間、もしくは12週間、またはそれより長い、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月、7ヶ月、8ヶ月、9ヶ月、10ヶ月、11ヶ月、もしくは12ヶ月、またはそれより長い、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年、13年、14年、15年、16年、17年、18年、19年、もしくは20年、またはそれより長い)である。
【０３１９】
一部の態様では、イピリムマブは、その必要がある対象に0.5〜5mg/kg(例えば、3mg/kg)体重の投与量で投与される。例えば、イピリムマブは、毎日、隔日で、2日ごとに、3日ごとに、4日ごとに、5日ごとに、または6日ごとに投与される。例えば、イピリムマブは1〜6週間ごとに1回(例えば、3週間ごとに1回)投与される。例えば、イピリムマブは合計12週間以上にわたって対象に投与される。イピリムマブは注射または注入などの経路によって投与される。イピリムマブは、その必要がある対象に、合計4回投与されて投与される。例えば、イピリムマブは合計4回、3週間ごとに90分間にわたって3mg/kg体重の投与量で静脈内投与される。一部の態様では、イピリムマブは、本明細書に記載のワクチン装置と組み合わせて(例えば、同時にまたは連続して)投与される。
【０３２０】
場合によっては、トレメリムマブは、その必要がある対象に1〜20mg/kg(例えば、15mg/kg)体重の投与量で投与される。例えば、トレメリムマブは毎日、隔日で、2日ごとに、3日ごとに、4日ごとに、5日ごとに、6日ごとに1回、または毎週1回投与される。例えば、トレメリムマブは10〜100日(例えば、90日)ごとに1回投与される。
【０３２１】
場合により、MDX-1106は、その必要がある対象に0.01〜10mg/kg(例えば、0.1〜10mg/kg)体重(例えば、0.01〜1mg/kg、0.5〜8mg/kg、1〜10mg/kg、または2〜8mg/kg)の投与量で投与される。例えば、MDX-1106は10mg/kgの投与量で投与される。MDX-1106は、例えば、静脈内に投与される。場合によっては、MDX-1106は、毎日、隔日で、2日ごとに、3日ごとに、4日ごとに、5日ごとに、6日ごとに1回、または毎週1回投与される。他の場合では、MDX-1106は2週間ごとに、3週間ごとに、または4週間ごとに投与される。例えば、MDX-1106は、少なくとも6ヶ月の(例えば、6ヶ月、1年、2年、3年、またはそれより長い)全期間にわたって投与される。
【０３２２】
本発明はまた、その必要がある対象に、0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、5mg/kg、または10mg/kg体重の投与量でMK3475を投与する工程も意図する。MK3475は、毎日、隔日で、2日ごとに、3日ごとに、4日ごとに、5日ごとに、6日ごとに1回、または毎週1回投与される。別の態様において、MK3475は隔週で、2週間ごとに、または3週間ごとに投与される。
【０３２３】
場合によっては、CT-011は、その必要がある対象に0.05〜6mg/kg(例えば、0.2〜6.0mg/kg)体重の投与量で投与される。
【０３２４】
一部の態様では、MDX-1105は、その必要がある対象に0.01〜10mg/kg(例えば、0.1〜10mg/kg)体重(例えば、0.01mg/kg、0.05mg/kg、0.1mg/kg、0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg、または10mg/kg)の投与量で投与される。例えば、MDX-1105は、毎日、隔日で、2日ごとに、3日ごとに、4日ごとに、5日ごとに、6日ごとに1回、または毎週1回投与される。他の場合では、MDX-1105は隔週で、2週間ごとに、または3週間ごとに投与される。好ましい態様において、MDX-1105は合計少なくとも42日にわたって14日ごとに投与される。
【０３２５】
本発明はまた、その必要がある対象に、1回の投与につき(例えば、1回の注射につき)0.01〜30mg(例えば、0.050〜30mg、または0.01mg、0.05mg、0.25mg、1.25mg、6.25mg、または30mg)の投与量でIMP321を投与することも提供する。例えば、IMP321は、(例えば、合計少なくとも6週間、または少なくとも12週間にわたって)隔週で投与される。他の場合では、IMP321は、毎日、隔日で、2日ごとに、3日ごとに、4日ごとに、5日ごとに、6日ごとに1回、または毎週1回投与される。場合によっては、IMP321は5mg/kgの投与量で投与される。場合によっては、IMP321は皮下注射などの経路によって投与される。
【０３２６】
一部の態様では、本明細書に記載の阻害剤は、本明細書に記載のワクチン装置と組み合わせて(例えば、同時にまたは連続して)投与される。例えば、阻害剤は全身に送達されるのに対して、ワクチンは局所に送達される。一部の態様では、阻害剤はワクチン装置の内部かワクチン装置の表面にある。例えば、阻害剤およびワクチンは局所送達される。
【０３２７】
他の例では、阻害剤は、ワクチン装置が投与される少なくとも6時間前に(例えば、少なくとも6時間前、少なくとも12時間前、少なくとも1日前、少なくとも2日前、少なくとも3日前、少なくとも4日前、少なくとも5日前、少なくとも6日前、少なくとも1週間前、少なくとも2週間前、少なくとも3週間前、少なくとも4週間前、少なくとも1ヶ月前、少なくとも2ヶ月前、少なくとも3ヶ月前、少なくとも4ヶ月前、少なくとも6ヶ月前、少なくとも8ヶ月前、少なくとも1年前、少なくとも2年前、少なくとも3年前、少なくとも4年前、少なくとも6年前、少なくとも8年前、またはそれより前に)投与される。他の態様において、ワクチン装置は、阻害剤が投与される少なくとも6時間前に(例えば、少なくとも6時間前、少なくとも12時間前、少なくとも1日前、少なくとも2日前、少なくとも3日前、少なくとも4日前、少なくとも5日前、少なくとも6日前、少なくとも1週間前、少なくとも2週間前、少なくとも3週間前、少なくとも4週間前、少なくとも1ヶ月前、少なくとも2ヶ月前、少なくとも3ヶ月前、少なくとも4ヶ月前、少なくとも6ヶ月前、少なくとも1年前、少なくとも2年前、少なくとも3年前、少なくとも4年前、少なくとも6年前、少なくとも8年前、またはそれより前に)投与される。
【０３２８】
例えば、阻害剤(例えば、本明細書に記載の抗体)は、ワクチン装置が投与される(例えば、移植される)前に全身投与される。場合によっては、阻害剤(例えば、抗体)は腫瘍の減量(すなわち、退縮)を引き起こす。例えば、腫瘍の減量は、ワクチン装置が投与される前、投与されている間、および/または投与された後に起こる。
【０３２９】
本明細書で使用する「約」という用語は、プラスまたはマイナス1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、12％、または15％である。
【０３３０】
本発明は以下の実施例においてさらに説明される。以下の実施例は、特許請求の範囲において説明された本発明の範囲を限定しない。
【実施例】
【０３３１】
実施例1:抗CTLA4抗体および抗PD1抗体による腫瘍をもつマウスの処置
メラノーマ腫瘍のマウスモデルを用いて、腫瘍成長および生存に対する遮断抗体(抗CTLA4抗体または抗PD1抗体)の効果を確かめた。メラノーマ腫瘍を確立するために、マウスに5x105個のB16-F10メラノーマ細胞を接種し、9日間発達させた。
【０３３２】
確立したメラノーマ腫瘍をもつマウスを抗CTLA4抗体または抗PD1抗体の腹腔内(i.p.)注射で処置した。抗体処置を3日ごとに投与し、腫瘍投与して3日目に開始した。
【０３３３】
マウスの腫瘍成長および生存期間を無処置マウスと抗体処置マウスとの間で比較した。抗CTLA4抗体または抗PD1抗体で処置したマウスは無処置マウスより腫瘍サイズが小さく(図1A)、生存期間が長かった(図1B)。
【０３３４】
抗CTLA4抗体(9D9、カタログ番号BE0086)および抗PD1抗体(RMP1-14、カタログ番号BE0146**)はBioxcellから購入した。
【０３３５】
実施例2:治療用PLGワクチン接種と遮断抗体との組み合わせによって誘導された腫瘍からの保護およびT細胞活性
メラノーマ腫瘍のマウスモデルを用いて、治療用PLGワクチン接種を抗PD1抗体または抗CTLA4抗体と組み合わせた効果を確かめた。メラノーマ腫瘍を確立するために、マウスに5x105個のB16-F10メラノーマ細胞を接種し、9日間、発達させた。
【０３３６】
メラノーマ腫瘍をもつマウスを処置しなかったか、PLGワクチン単独で処置したか、またはPLGワクチンを抗PD1抗体もしくは抗CTLA4抗体と組み合わせて処置した。(前記のようにB16-F10細胞を用いた)腫瘍投与後3日目に抗体処置を開始し、腫瘍投与後24日間にわたって3日ごとにi.p.注射した。腫瘍を投与して9日後にPLGワクチン接種を行った。各処置群の腫瘍サイズ(面積、mm2)と生存率を求めた。腫瘍面積は腫瘍の2つの最長径の積である。腫瘍直径を標準方法(例えば、カリパス)を用いて測定した。ワクチン単独で処置したマウスは無処置マウスより長く生存し、腫瘍面積が小さくなった(図2A〜B)。驚いたことに、ワクチンを抗PD1抗体または抗CTLA4抗体と組み合わせて処置したマウスは、ワクチン単独で処置したマウスより長く生存し、腫瘍面積が小さくなった(図2A〜B)。
【０３３７】
実施例3:操作されたワクチンと遮断抗体の組み合わせによって腫瘍内エフェクターT細胞活性が強化される
マウスから単離したB16(メラノーマ細胞の一種)腫瘍から、各処置群(すなわち、無処置、ワクチン単独、ワクチン+抗PD1抗体、またはワクチン+抗CTLA4抗体)のCD3+CD8+腫瘍浸潤性T細胞の総数を求めた。CD3はT細胞補助受容体とも呼ばれ、成熟T細胞全ての表面に発現し、T細胞の活性化に必要とされるのでT細胞のマーカーである。CD8は細胞傷害性Tリンパ球(CTL)のマーカーである。腫瘍に浸潤したCD3+CD8+T細胞の数が増加したことから、腫瘍に対する免疫応答が増加したことが分かった。
【０３３８】
各処置群において、マウスのB16腫瘍から単離したCD3+CD8+T細胞とCD3+FoxP3+T調節性(Treg)細胞の比も求めた。FoxP3は、免疫応答を調整する(例えば、抑制する)Treg細胞のマーカーである。従って、この比はCTL対Treg応答の強さの尺度となる。比が大きいほど、腫瘍に対する免疫応答が大きいことを示す。
【０３３９】
(5x105個のB16-F10細胞を用いた)腫瘍投与後3日目から抗体を3日ごとにi.p.投与し、腫瘍を投与して9日後にワクチン接種を開始した。20日目にB16腫瘍を取り出して、腫瘍に浸潤したT細胞のタイプを確かめた。ワクチンで処置したマウスの腫瘍浸潤性CD3+CD8+T細胞の数は無処置マウスより有意に多かった(図3A)。ワクチンで処置したマウスのCD3+CD8+T細胞とCD3+FoxP3+Treg細胞の比も無処置マウスより有意に多かった(図3B)。驚いたことに、ワクチン+抗体の組み合わせで処置したマウスの腫瘍浸潤性CD3+CD8+T細胞の数は、ワクチン単独で処置したマウスと比較して有意に多かった(図3A)。ワクチン+抗体の組み合わせで処置したマウスのCD3+CD8+T細胞とCD3+FoxP3+Treg細胞の比も、ワクチン単独で処置したマウスと比較して有意に大きかった(図3B)。
【０３４０】
まとめると、これらの結果から、PLGワクチンと抗PD1抗体または抗CTLA4抗体の組み合わせは腫瘍サイズを相乗的に小さくし、生存期間を延ばし、腫瘍から単離したT細胞集団においてTreg細胞活性と比べてTエフェクター細胞活性を強化することが分かる。
【０３４１】
さらに、マウスに移植して14日後に、処置群(すなわち、ブランクマトリックス、PLGワクチン単独、またはワクチンと抗PD1抗体もしくは抗CTLA4抗体の組み合わせ)の間で、足場浸潤性白血球、具体的には、CTLパーセントをフローサイトメトリーによって比較した。ワクチン接種後、0日目、3日目、6日目、9日目、および12日目に抗体処置を投与した。14日目に足場からシングル細胞懸濁液を調製し、活性化CTLマーカーであるCD8およびCD107aの染色を行った。併用療法における足場にある両マーカーが陽性であった細胞のパーセントはワクチン単独で処置したマウスより大きかった(図5A)。
【０３４２】
マウスに移植して14日後に、ブランクマトリックス、PLGワクチン単独、およびワクチンと抗PD1抗体もしくは抗CTLA4抗体の組み合わせにおける、IFNγとCD107aの両方が陽性であったCD8+足場浸潤性T細胞の(ブランク対照と比べた)増加倍率も比較した。ワクチン接種後、0日目、3日目、6日目、9日目、および12日目に抗体処置を投与した。腫瘍投与して7日後にワクチンを移植した。CD107aはCTLのマーカーであり、IFNγは、腫瘍ならびにウイルス感染および細菌感染に対する免疫応答に関与するサイトカインである。組み合わせワクチン+抗体で処置したマウスに由来する足場における、IFNγとCD107aが陽性であった活性化CD8+T細胞の増加倍率はワクチン単独より有意に多かった(図5B)。
【０３４３】
従って、ワクチンは遮断抗体と相乗作用して、局所的に、すなわち、移植されたワクチンの部位において、またはワクチン内部においてTエフェクター細胞活性を強化する。ワクチンと遮断抗体との組み合わせは相乗作用して、活性化CD8+T細胞(例えば、CTL)による腫瘍浸潤も強化し、腫瘍部位におけるT細胞活性も強化する。
【０３４４】
実施例4:操作されたPLGワクチンと遮断抗体の組み合わせによって局所Tエフェクター細胞活性が強化される
局所Tエフェクター細胞活性に対する(すなわち、ワクチン足場移植部位における)PLGワクチンと遮断抗体の組み合わせの効果を確かめた。マウスをPLGワクチン単独で14日間処置したか、またはPLGワクチンを抗CTLA4抗体と組み合わせて14日間処置した。ワクチン部位での効果を分析するために、腫瘍を投与していないマウスサブセットを抗体とワクチンで処置した。別のマウスサブセットに500,000個のB16腫瘍細胞を投与した。腫瘍投与して7日後にワクチンを投与した。ワクチン接種後、0日目、3日目、6日目、9日目、および12日目に抗体処置を投与した。
【０３４５】
腫瘍部位での効果、具体的には、細胞傷害性T細胞の数、インターフェロンγ発現、CD107a発現、およびTreg細胞の数を調べた。フローサイトメトリーを用いて、2つの処置群から単離した移植ワクチン足場へのCD3+T細胞浸潤物の数を求めた。組み合わせ(ワクチン+抗CTLA4抗体)で処置したマウスの足場にあるT細胞浸潤物はワクチン単独で処置したマウスより多かった(図4A)。
【０３４６】
ワクチン無しのブランクマトリックス、PLGワクチン単独、またはワクチンと抗PD1抗体または抗CTLA4抗体の組み合わせが14日間移植されたマウスにおいて、CD3+CD8+Tエフェクター細胞の総数も求めた。ワクチン接種後、0日目、3日目、6日目、9日目、および12日目に抗体処置を投与した。驚いたことに、組み合わせ処置によって、足場に浸潤したCD3+CD8+Tエフェクター細胞の数はワクチン単独より有意に増えた(図4B)。
【０３４７】
実施例5:操作されたPLGワクチンとCTLA-4の組み合わせによって局所T細胞活性が維持される
マウスに14日間移植されたPLGワクチンへのT細胞浸潤物の量を求めた。フローサイトメトリーを用いて、PLGワクチン単独で処置したマウス(Vax)、または抗CTLA4抗体と組み合わせて処置したマウス(Vax+CTLA4)もしくは抗PD1抗体と組み合わせて処置したマウス(Vax+PD1)におけるPLG移植片から単離したT細胞浸潤物の表現型(すなわち、CD4+CD8+対CD4+FoxP3+)を確かめた(図6A)。VAX+CTLA4およびVAX+PD1マウスにおけるCD8を発現するCD4+T細胞の割合はVAX単独マウスより多かった。VAX+CTLAマウスにおけるCD4+T細胞のほとんどのFoxP3発現レベルは低かった(図6A)。30日間にわたってPLGワクチン単独で処置したマウス(VAX)、または抗CTLA4抗体と組み合わせて処置したマウス(VAX+CTLA4)もしくは抗PD1抗体と組み合わせて処置したマウス(VAX+PD1)におけるPLG移植片から単離した細胞について、CD3+CD8+エフェクターT細胞とCD4+FoxP3+T細胞の比も求めた(図6B)。VAX+CTLA4マウスにおけるCD3+CD8+エフェクターT細胞とCD4+FoxP3+T細胞の比はVAXマウスまたはVAX+PD1マウスより有意に大きかった(図6B)。従って、PLGワクチンと抗CTLA4抗体の組み合わせによって局所T細胞活性が維持され、T細胞応答は抑制性Treg活性と比べて細胞傷害性T細胞活性の方に偏る。これらの活性および応答は長期間、例えば、少なくとも30日間維持される。
【０３４８】
実施例6:ワクチン流入領域リンパ節におけるエフェクターT細胞活性は調節性T細胞活性より大きい
マウスをワクチン単独で処置したか、抗CTLA4抗体または抗PD1抗体と組み合わせて処置した。ワクチン接種後、0日目、3日目、6日目、9日目、および12日目に抗体処置を投与した。次いで、14日目にワクチン流入領域リンパ節を取り出してT細胞浸潤の程度を測定した。フローサイトメトリーを用いて、ワクチン流入領域リンパ節にあるCD8+T細胞およびFoxP3+Treg細胞のパーセントを定量した。CD3+CD8+T細胞とCD3+FoxP3+Treg細胞の比も求めた。
【０３４９】
フローサイトメトリーによって、ワクチン+抗体の組み合わせで処置したマウスのリンパ節にあるCD8+Tエフェクター細胞のパーセントはワクチン単独で処置したマウスより大きかった(図7Aおよび図8A)。さらに、組み合わせワクチン+抗体で処置したマウスのリンパ節にあるFoxP3+Treg細胞のパーセントはワクチン単独で処置したマウスより小さかった(図7Bおよび図8A)。組み合わせワクチン+抗CTLA4抗体で処置したマウスのリンパ節にあるCD3+CD8+T細胞とCD3+FoxP3+Treg細胞の比は、ワクチン単独で処置したマウスまたは組み合わせワクチン+抗PD1抗体で処置したマウスより有意に大きかった(図8B)。
【０３５０】
従って、ワクチンは遮断抗体、特に、抗CTLA4抗体と相乗作用して、ワクチン流入領域リンパ節にあるTエフェクター細胞の割合を増やし、Treg細胞の割合を減らす。
【０３５１】
実施例7:抗PD1抗体および抗CTLA4抗体をPLGワクチン接種と組み合わせることによって、メラノーマモデルにおけるT細胞活性化および腫瘍阻害が強化される
構造ワクチンとチェックポイント抗体の組み合わせに関するデータが本明細書において説明される。チェックポイント遮断阻害剤であるα-PD-1およびα-CTLA4とPLGワクチン接種の組み合わせは、抗体単独で用いたワクチン接種と比較して腫瘍成長に有意な影響を及ぼした(図9A)。T細胞浸潤分析のために35日目に腫瘍を切除するまで、ワクチン接種実験について説明したように抗体処置をi.p.投与した。腫瘍を投与した9日後にワクチン接種を開始した。腫瘍投与後35日目に、PLGワクチン接種とα-PD-1またはα-CTLA4抗体単独の組み合わせで処置したマウスの腫瘍進行はワクチン接種単独と比べて約2.2〜2.6倍阻害された(図9A)。両抗体をワクチン接種と組み合わせることによって、35日目のB16腫瘍成長は約1/5減少した(図9A)。腫瘍成長の阻害は腫瘍へのT細胞浸潤の大きさと相関した。3種類全ての処置(α-PD-1、α-CTLA4、およびPLGワクチン接種)の組み合わせによって、他の処置と比べて腫瘍にあるC8(+)T細胞の数、FoxP3(+)Treg、およびCD8 T細胞/Treg比が増えた(図9B〜図9D)。これらのデータから、ワクチン接種を遮断処置と組み合わせることによって誘導された腫瘍阻害は、他の場所で報告されたTregにより媒介される免疫抑制の遮断ではなく、T細胞活性化および細胞傷害性の強化によるものである可能性が高いことが示唆される。
【０３５２】
実施例8:抗PD1抗体および抗CTLA4抗体をPLGワクチン接種と組み合わせることによって細胞傷害性T細胞応答が強化される
下記で詳述するように、遮断抗体をPLGワクチン接種と組み合わせることによって、腫瘍浸潤性白血球(TIL)応答は、抑制性Tregと比べて、活発な細胞傷害性T細胞の方に大きく偏った(図10A〜図10Eおよび図11)。腫瘍内の高いCD8/Treg比が有効なワクチン接種を示しているように、これは腫瘍退縮の所見と一致する(Curran et al., 2010 PNAS U.S.A., 107, 4275-4280)。図10A〜10Eについては、T細胞浸潤分析のために18日目に腫瘍を切除するまで、ワクチン接種実験について説明したように抗体処置をi.p.投与した。腫瘍を投与して9日後にワクチン接種を開始した。細胞染色は全て、腫瘍から抽出した全細胞懸濁液に対して行った。同様に、図11については、T細胞浸潤分析のために30日目に腫瘍を切除するまで(3日ごとに)、ワクチン接種実験について説明したように抗体処置をi.p.投与した。腫瘍を投与して9日後にワクチン接種を開始した。
【０３５３】
腫瘍投与後9日目のPLGワクチン接種によって、20日齢B16腫瘍に、腫瘍1mm2あたり約3,500個の細胞傷害性T細胞となる有意なレベルのCD3(+)CD8(+)T細胞浸潤が誘導された(図10A)。抗PD-1処置をワクチン接種に加えても、腫瘍浸潤性CD3(+)CD8(+)T細胞の総数に対して有意な効果は無かったが、抗CTLA-4療法を加えると、腫瘍1mm2あたり17,000個を超えるCD3(+)CD8(+)T細胞に達する細胞傷害性T細胞レベルが生じた(図11)。対照的に、これらの処置群は、腫瘍に存在しているCD4(+)FoxP3(+)Tregの数には効果が無かった(図10B)。PD-1抗体投与による18日目のCD8(+)エフェクターとTregの腫瘍内比はワクチン接種単独と比較してほぼ2倍になった(図10C)。興味を引くことに、抗CTLA-4とワクチン接種の組み合わせにより、18日目のTeff/Treg比はクチン接種単独と比較して9倍増加した(25.3対2.8; 図10C)。腫瘍投与後30日目に同じ分析を行った。抗CTLA-4と組み合わせた免疫化だけが、長期生存データと一致する有意なCD8/Treg比を生じることができた(約6倍の増加; 図11)。さらに、ワクチン接種をPD-1抗体療法またはCTLA-4抗体療法で補うと、腫瘍内の細胞傷害性T細胞活性化は、CD107aおよびIFN-γ同時発現により確かめられた時に3倍増加および8倍増加した(図10Dおよび図10E)。チェックポイント遮断を加えることによって、活性化されたCD8(+)TILの密度が増えただけでなく、活性化された全CD8(+)T細胞のパーセントも増えた(図10Dおよび図10E)。このことから、これらの処置は腫瘍内で局所的にT細胞の細胞傷害性を促進したことが分かる。
【０３５４】
ワクチン接種前に腫瘍を全て抗体遮断で前処置した。なぜなら、この順序は、これらの抗体が治療の標準になる時に、腫瘍を最初に処置するのに用いられる臨床現場を反映している可能性が高からである。しかしながら、ワクチン接種後に抗体投与が中止になれば、腫瘍阻害に対する効果は失われる(図12)。このことは、ワクチン接種によって誘導される、続いて起こるT細胞応答を、遮断処置が大幅に増大させることを示唆している。図12では、0日目、3日目、6日目、および9日目に4回の抗体処置を投与した。腫瘍投与後9日目にマウスにワクチン接種し、腫瘍投与後26日目に腫瘍サイズの測定値を記録した。
【０３５５】
他の態様
本発明は本発明の詳細な説明に関連して説明されたが、前述の説明は例示を目的とし、本発明の範囲を限定しないことが意図される。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によって定義される。他の局面、利点、および修正は以下の特許請求の範囲の範囲内にある。
【０３５６】
本明細書において言及された特許および科学文献は当業者に利用可能な知識を定める。本明細書において引用された米国特許および公開された米国特許出願または公開されていない米国特許出願は全て参照により組み入れられる。本明細書において引用された公開された外国の特許および特許出願は全て参照により組み入れられる。本明細書において引用されたアクセッション番号により示されるGenBank提出およびNCBI提出は参照により本明細書に組み入れられる。本明細書において引用された他の公開された参考文献、文書、原稿、および科学文献は全て参照により本明細書に組み入れられる。
【０３５７】
本発明は、特に、本発明の好ましい態様に関連して示され、説明されたが、添付の特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲から逸脱することなく、形態および細部の点で様々な変更が加えられ得ることが当業者に理解されるだろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年1月11日(2017.1.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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