(57)【要約】  弱い免疫原性および／または低く発現された抗原に対するＴ細胞の応答を強化し、ＭＤＳＣにより媒介される抑制に対する耐性をＴ細胞に付与する新規な共刺激融合タンパク質およびＤＮＡ配列が開示される。該融合タンパク質は、ＣＤ４、ＣＤ８αまたはＭｙＤ８８の特定の領域と連結したＴ細胞受容体または他のシグナル伝達分子の部分を含む。これらの融合タンパク質およびそれらの配列変異体は、Ｔ細胞の活性化および応答性を改善する。細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む免疫細胞の応答を強化し共刺激する手段としての宿主細胞中におけるこれらの分子の使用、ならびに癌、感染性病原体および他の疾患を治療するためのこれらの細胞の使用も開示される。
2017538443.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＩＲドメインを欠くＭｙＤ８８の領域と連結したＣＤ８αの細胞外および膜貫通領域を含む融合タンパク質。
【請求項２】
ＣＤ８αの細胞外および膜貫通領域は、マウスＣＤ８αのアミノ酸１〜２１７（配列番号１６）に対応し、ＴＩＲドメインを欠くＭｙＤ８８の領域は、ヒトＭｙＤ８８のアミノ酸１〜１５５（配列番号２４）に対応する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
ＣＤ８αの細胞外および膜貫通領域は、ヒトＣＤ８αのアミノ酸１〜２０３（配列番号１２）に対応し、ＴＩＲドメインを欠くＭｙＤ８８の領域は、ヒトＭｙＤ８８のアミノ酸１〜１５５（配列番号２４）に対応する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
配列番号１７で表されるｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８または配列番号１４で表されるｈＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
ＴＩＲドメインを欠くＭｙＤ８８の領域と連結したＣＤ８αの膜貫通領域を含む融合タンパク質。
【請求項６】
ＣＤ８αの膜貫通領域は、配列番号１８のアミノ酸１〜８３に対応し、ＴＩＲドメインを欠くＭｙＤ８８の領域は、ヒトＭｙＤ８８のアミノ酸１〜１５５（配列番号２４）に対応する、請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
配列番号１８で表されるｈＣＤ８αＴＭ−ｈＭｙＤ８８を含む、請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、およびＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインと連結したＣＤ８αの細胞外および膜貫通領域を含む融合タンパク質。
【請求項９】
ＣＤ８αの細胞外および膜貫通領域は、マウスＣＤ８αのアミノ酸１〜２１７（配列番号１６）に対応し、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、およびＣＤ３ζドメインは、配列番号１９のアミノ酸２１８〜４１７に対応する、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
ＣＤ８αの細胞外および膜貫通領域は、ヒトＣＤ８αのアミノ酸１〜２０３（配列番号１２）に対応し、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、およびＣＤ３ζドメインは、配列番号１９のアミノ酸２１８〜４１７に対応する、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
配列番号１９で表されるｍＣＤ８α−２８−１３７−３を含む、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
ＴＩＲドメインを欠くＭｙＤ８８の領域と連結したＣＤ４の細胞外および膜貫通領域を含む融合タンパク質。
【請求項１３】
ＣＤ４の細胞外および膜貫通領域は、マウスＣＤ４のアミノ酸１〜４１７（配列番号２１のアミノ酸１〜４１７）に対応し、ＴＩＲドメインを欠くＭｙＤ８８の領域は、ヒトＭｙＤ８８のアミノ酸１〜１５５（配列番号２４）に対応する、請求項１２に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
ＣＤ４の細胞外および膜貫通領域は、ヒトＣＤ４のアミノ酸１〜４１８（配列番号２０のアミノ酸１〜４１８）に対応し、ＴＩＲドメインを欠くＭｙＤ８８の領域は、ヒトＭｙＤ８８のアミノ酸１〜１５５（配列番号２４）に対応する、請求項１２に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
配列番号２１で表されるｍＣＤ４−ｈＭｙＤ８８または配列番号２０で表されるｈＣＤ４−ｈＭｙＤ８８を含む、請求項１２に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
ＴＩＲドメインを欠くＭｙＤ８８の領域と連結したＴ細胞受容体を含む融合タンパク質。
【請求項１７】
ＴＣＲは、配列番号２２の残基１〜６０３のアミノ酸配列を有するＤＭＦ５  ＴＣＲであり、ＴＩＲドメインを欠くＭｙＤ８８の領域は、ヒトＭｙＤ８８のアミノ酸１〜１５５（配列番号２４）に対応する、請求項１６に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
配列番号２２で表されるｈＴＣＲ−ｈＭｙＤ８８を含む、請求項１６に記載の融合タンパク質。
【請求項１９】
融合タンパク質を含む少なくとも１つのペプチド領域またはドメインの長さは、アミノ末端、カルボキシ末端、または両端で、該ペプチド領域またはドメインがそこから得られるポリペプチドの元の配列に基づき１０個までのアミノ酸だけ個々に変化する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の融合タンパク質の配列変異体。
【請求項２０】
融合タンパク質の全長にわたって融合タンパク質と少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の融合タンパク質の配列変異体。
【請求項２１】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載の少なくとも１種の融合タンパク質を発現している細胞の単離された集団。
【請求項２２】
ｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８（配列番号１７）、ｈＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８（配列番号１４）、ｈＣＤ８αＴＭ−ｈＭｙＤ８８（配列番号１８）、ｍＣＤ８α−２８−１３７−３（配列番号１９）、ｍＣＤ４−ｈＭｙＤ８８（配列番号２１）、ｈＣＤ４−ｈＭｙＤ８８（配列番号２０）およびｈＴＣＲ−ｈＭｙＤ８８（配列番号２２）からなる群から選択される少なくとも１種の融合タンパク質を発現している、請求項２１に記載の細胞の単離された集団。
【請求項２３】
ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、好中球、マクロファージ、樹状細胞、肥満細胞、好塩基球、Ｂ細胞、および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からなる群から選択される、請求項２１に記載の細胞の単離された集団。
【請求項２４】
請求項１９に記載の少なくとも１種の配列変異体を発現している細胞の単離された集団。
【請求項２５】
ｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８（配列番号１７）、ｈＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８（配列番号１４）、ｈＣＤ８αＴＭ−ｈＭｙＤ８８（配列番号１８）、ｍＣＤ８α−２８−１３７−３（配列番号１９）、ｍＣＤ４−ｈＭｙＤ８８（配列番号２１）、ｈＣＤ４−ｈＭｙＤ８８（配列番号２０）およびｈＴＣＲ−ｈＭｙＤ８８（配列番号２２）からなる群から選択される少なくとも１種の融合タンパク質を発現している、請求項２４に記載の細胞の単離された集団。
【請求項２６】
請求項２０に記載の少なくとも１種の配列変異体を発現している細胞の単離された集団。
【請求項２７】
ｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８（配列番号１７）、ｈＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８（配列番号１４）、ｈＣＤ８αＴＭ−ｈＭｙＤ８８（配列番号１８）、ｍＣＤ８α−２８−１３７−３（配列番号１９）、ｍＣＤ４−ｈＭｙＤ８８（配列番号２１）、ｈＣＤ４−ｈＭｙＤ８８（配列番号２０）およびｈＴＣＲ−ｈＭｙＤ８８（配列番号２２）からなる群から選択される少なくとも１種の融合タンパク質を発現している、請求項２６に記載の細胞の単離された集団。
【請求項２８】
癌を有する対象を治療する方法であって、癌を有する対象に、請求項２１で定義された細胞の少なくとも１つの集団の治療的有効量を投与することを含む前記方法。
【請求項２９】
癌を有する対象を治療する方法であって、癌を有する対象に、請求項２２で定義された細胞の少なくとも１つの集団の治療的有効量を投与することを含む前記方法。
【請求項３０】
癌を有する対象を治療する方法であって、癌を有する対象に、請求項２４で定義された細胞の少なくとも１つの集団の治療的有効量を投与することを含む前記方法。
【請求項３１】
癌を有する対象を治療する方法であって、癌を有する対象に、請求項２６で定義された細胞の少なくとも１つの集団の治療的有効量を投与することを含む前記方法。
【請求項３２】
感染性疾患を有する対象を治療する方法であって、感染性疾患を有する対象に、請求項２１で定義された細胞の少なくとも１つの集団の治療的有効量を投与することを含む前記方法。
【請求項３３】
感染性疾患を有する対象を治療する方法であって、感染性疾患を有する対象に、請求項２２で定義された細胞の少なくとも１つの集団の治療的有効量を投与することを含む前記方法。
【請求項３４】
感染性疾患を有する対象を治療する方法であって、感染性疾患を有する対象に、請求項２４で定義された細胞の少なくとも１つの集団の治療的有効量を投与することを含む前記方法。
【請求項３５】
感染性疾患を有する対象を治療する方法であって、感染性疾患を有する対象に、請求項２６で定義された細胞の少なくとも１つの集団の治療的有効量を投与することを含む前記方法。
【請求項３６】
感染性疾患は、細菌、ウイルスまたは真菌により引き起こされる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
感染性疾患は、細菌、ウイルスまたは真菌により引き起こされる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
感染性疾患は、細菌、ウイルスまたは真菌により引き起こされる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
感染性疾患は、細菌、ウイルスまたは真菌により引き起こされる、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
自己免疫障害を有する対象を治療する方法であって、自己免疫障害を有する対象に、請求項２１で定義された細胞の少なくとも１つの集団の治療的有効量を投与することを含む前記方法。
【請求項４１】
自己免疫障害を有する対象を治療する方法であって、自己免疫障害を有する対象に、請求項２２で定義された細胞の少なくとも１つの集団の治療的有効量を投与することを含む前記方法。
【請求項４２】
自己免疫障害を有する対象を治療する方法であって、自己免疫障害を有する対象に、請求項２４で定義された細胞の少なくとも１つの集団の治療的有効量を投与することを含む前記方法。
【請求項４３】
自己免疫障害を有する対象を治療する方法であって、自己免疫障害を有する対象に、請求項２６で定義された細胞の少なくとも１つの集団の治療的有効量を投与することを含む前記方法。
【請求項４４】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載の少なくとも１種の融合タンパク質を、Ｔ細胞で発現させることを含む、骨髄腫由来のサプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）により媒介される抑制に対する耐性をＴ細胞に付与する方法。
【請求項４５】
融合タンパク質が、ｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８（配列番号１７）、ｈＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８（配列番号１４）、ｈＣＤ８αＴＭ−ｈＭｙＤ８８（配列番号１８）、ｍＣＤ８α−２８−１３７−３（配列番号１９）、ｍＣＤ４−ｈＭｙＤ８８（配列番号２１）、ｈＣＤ４−ｈＭｙＤ８８（配列番号２０）およびｈＴＣＲ−ｈＭｙＤ８８（配列番号２２）からなる群から選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
請求項１９に記載の少なくとも１種の配列変異体をＴ細胞で発現させることを含む、ＭＤＳＣにより媒介される抑制に対する耐性をＴ細胞に付与する方法。
【請求項４７】
請求項２０に記載の少なくとも１種の配列変異体をＴ細胞で発現させることを含む、ＭＤＳＣにより媒介される抑制に対する耐性をＴ細胞に付与する方法。
【請求項４８】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載の少なくとも１種の融合タンパク質を、免疫細胞に発現させることを含む、免疫細胞の抗原認識を強化する方法。
【請求項４９】
融合タンパク質は、ｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８（配列番号１７）、ｈＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８（配列番号１４）、ｈＣＤ８αＴＭ−ｈＭｙＤ８８（配列番号１８）、ｍＣＤ８α−２８−１３７−３（配列番号１９）、ｍＣＤ４−ｈＭｙＤ８８（配列番号２１）、ｈＣＤ４−ｈＭｙＤ８８（配列番号２０）およびｈＴＣＲ−ｈＭｙＤ８８（配列番号２２）からなる群から選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
免疫細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、好中球、マクロファージ、樹状細胞、肥満細胞、好塩基球、Ｂ細胞、および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からなる群から選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
抗原は、インビトロまたはインビボで、低濃度で存在する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
抗原は抗原性の弱い抗原である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】
請求項１９に記載の少なくとも１種の配列変異体を、免疫細胞で発現させることを含む、免疫細胞の抗原認識を強化する方法。
【請求項５４】
免疫細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、好中球、マクロファージ、樹状細胞、肥満細胞、好塩基球、Ｂ細胞、および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からなる群から選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
抗原は、インビトロまたはインビボで、低濃度で存在する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
抗原は抗原性の弱い抗原である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
請求項２０に記載の少なくとも１種の配列変異体を、免疫細胞で発現させることを含む、免疫細胞の抗原認識を強化する方法。
【請求項５８】
免疫細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、好中球、マクロファージ、樹状細胞、肥満細胞、好塩基球、Ｂ細胞、および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からなる群から選択される、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
抗原は、インビトロまたはインビボで、低濃度で存在する、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
抗原は抗原性の弱い抗原である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
配列番号６（ｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８）、配列番号３（ｈＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８）、配列番号７（ｈＣＤ８αＴＭ−ｈＭｙＤ８８）、配列番号８（ｍＣＤ８α−２８−１３７−３）、配列番号１０（ｍＣＤ４−ｈＭｙＤ８８）、配列番号９（ｈＣＤ４−ｈＭｙＤ８８）および配列番号１１（ｈＴＣＲ−ｈＭｙＤ８８）で表されるポリヌクレオチド配列およびそれらの配列変異体からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦に支援を受けた研究および開発の表明
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈにより授与された交付番号ＣＡ１４０９１７の下に政府の支援で行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
最近の研究で、対象におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の応答を変化させると多くの利益があり得ることが示されている。例えば、癌を破壊する腫瘍に反応性のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように操作された腫瘍浸潤性リンパ球またはＴ細胞の輸注（infusion）を使用する進行中の臨床試験は、将来性を示している。しかしながら、これらの検討は、このＴ細胞療法が有効でない患者のサブセットがいることも明らかにした。増強されたＣＤ８＋Ｔ細胞の応答についてのさらなる応用は、多くの高齢者および小児の患者がインフルエンザワクチンなどのワクチンに対して弱い応答を示すかまたは応答せず、インフルエンザウイルスにより米国において５０，０００名の死者が生ずるという観察により例証される。さらに、ＣＤ８＋Ｔ細胞の応答の上方調節は、ワクチンの効能（efficacy）およびＴ細胞に基づいた免疫療法の効能を強化することができる。
【０００３】
任意の所与の抗原に対するＣＤ８＋Ｔ細胞の応答のタイプおよび強度は、Ｔ細胞と抗原提示細胞との間に生ずる種々の分子の相互作用により支配される。そのような応答は、主として、Ｔ細胞上のＴＣＲと抗原提示細胞上の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子との接触の結果である。ＴＣＲによるシグナル伝達は、ＭＨＣ  Ｉ上に提示された抗原性ペプチドに対するＴＣＲの親和性ならびにＴＣＲとＭＨＣ−抗原（ＭＨＣ／Ａｇ）の間の相互作用の持続時間によって調節される。したがって、高親和性ペプチドを明確にするかまたは高親和性ＴＣＲを開発する試みに、多くの関心が集中した。
【０００４】
ＣＤ８α分子は、ＴＣＲ共受容体としてはたらき、ＭＨＣ  Ｉ分子のα３およびα２ドメインおよびＨＬＡβ２ミクログロブリンと相互作用する。ＣＤ８αは、ＴＣＲ：ＭＨＣ／Ａｇの安定性を維持し、ＴＣＲが抗原に特異的な活性化中に標的細胞に密接に結合するように保つことに役立つ。ＣＤ８αはＣＤ８βと相互作用するが、ＣＤ８αだけがＭＨＣ  Ｉと相互作用する。ＣＤ８αとＭＨＣ  Ｉとの相互作用は、ＴＣＲの離れる速度を低下させ且つＴＣＲのクラスター形成を促進することにより、細胞の結合力に部分的に寄与する。ＣＤ８αの細胞質ドメインは、ＴＣＲシグナルの伝達のために重要なｐ５６ｌｃｋ結合ドメインを含有する。
【０００５】
種々のグループによる研究は、Ｔ細胞上のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）を刺激すると、種々のＴ細胞の応答が強化されることを示した。例えば、ＴＬＲ２の関与は、ＴＣＲ活性化閾値を下げて、Ａｇの最適未満のレベルに対するＴ細胞の応答を増強することが示された。ＴＬＲに刺激されたＴ細胞は、増大したＩＬ−２産生、強化された増殖および生存、増大した細胞崩壊活性、および強化された抗腫瘍活性もマウスで示す。しかしながら、Ｔ細胞上のＴＬＲを刺激することの一つの限界は、共刺激分子の効果はＴＣＲの同時活性化を必要とすることであり、また抗腫瘍効能は、Ｔ細胞上における低くて一過性のＴＬＲの発現およびＴ細胞を共刺激するために十分なＴＬＲリガンドを腫瘍部位に局在化することができないことを含む幾つかの要因により部分的に限定されることが見出された。それに加えて、メラノーマを含む癌細胞は、ＴＬＲを発現することができ、癌細胞上におけるＴＬＲの関与は、種々の腫瘍の成長因子の発現を誘発することができる。
【０００６】
効果的なおよび恒久性のＴ細胞の応答を達成するためのさらに別の限界は、骨髄腫由来のサプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の存在を含む。ＭＤＳＣは、骨髄腫細胞の前駆細胞ならびに単球のおよび顆粒球の骨髄腫細胞の前駆体を含む細胞の不均一な集団を表す。ＭＤＳＣはＴ細胞の応答を：アルギナーゼ−１、誘導性の硝酸オキシドシンターゼ（ｉＮＯＳ）活性、活性酸素種（ＲＯＳ）の増大した発生、およびＴＧＦ−βの産生によるＬ−アルギニンの消耗により抑制する。最近の報告は、ＭＤＳＣの阻害活性における細胞のストレスセンサーＣ／ＥＢＰと相同性のタンパク質（Ｃｈｏｐ）の決定的に重要な役割を強調している。進行したメラノーマを有する患者においては、循環するＭＤＳＣが、低い患者生存率と直接相関し、機能的ＴＡｇに特異的なＴ細胞と逆相関する。鈍いＴ細胞活性に加えて、ＭＤＳＣは、メラノーマで制御性Ｔ細胞を誘発して維持することにおいて決定的に重要な役割を演ずる。さらに、ＭＤＳＣによって産生される因子（すなわち、ＩＬ−６、ＴＮＦおよびＩＬ−１β）は、腫瘍の成長を促進し、それ故、それらの多元的な腫瘍支持機能を封鎖する戦略の開発は、抗腫瘍Ｔ細胞の活性を増大させる可能性を有する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
下で詳細に説明するように、本出願の発明者らは、ＣＤ８＋Ｔ細胞内におけるＭｙＤ８８のシグナル伝達は、免疫原性の弱い抗原に対するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）活性化の閾値を直接下げて、抗原提示の最適のレベル未満に対する応答も増強することを見出した。ＴＣＲおよびＭｙＤ８８シグナル伝達の相伴う活性化は、Ｔ細胞の増殖を強化し、細胞崩壊活性を増大させて、ＭＤＳＣにより媒介されるＴ細胞抑制に対する耐性を付与し、腫瘍の成長速度を低下させて腫瘍担持マウスの生存期間を延長する。
【０００８】
これらの発見に基づいて、本発明者らは、Ｔ細胞活性化に関与する分子を含む融合タンパク質を製造した。特に、ＭｙＤ８８または他のシグナル伝達分子の領域と連結したＣＤ４、ＣＤ８αまたはＴ細胞受容体の部分を含む融合タンパク質を製造した。これらの融合タンパク質、およびそれらの配列変異体（本明細書では、これらの融合タンパク質および配列変異体を、総称的に本発明の「変異体」と称する）は、Ｔ細胞活性化および応答性を改善する。これらの変異体の発現は、Ｔ細胞の活性化および応答性に対して極めて大きい効果を有し、強化された抗腫瘍活性を生ずることが示される。
【０００９】
ＣＤ８α−ＭｙＤ８８
第１の実施形態では、本発明は、ＴＩＲドメインを欠くＭｙＤ８８の領域と連結したＣＤ８αの細胞外および膜貫通領域を含むＣＤ８α融合タンパク質およびそれをコードするポリヌクレオチドを対象とする。この実施形態の一態様では、これらの領域は：ＣＤ８αのＮ−細胞外領域−ＣＤ８αの膜貫通領域−ＴＩＲドメイン−Ｃを欠くＭｙＤ８８の領域として連結されている。これらの融合タンパク質のＣＤ８α部分は、マウスおよびヒトを含む任意の哺乳動物のＣＤ８α由来であってもよい。これらの融合タンパク質のＭｙＤ８８部分も、マウスおよびヒトを含む任意の哺乳動物供給源由来であってもよい。
【００１０】
この実施形態の一態様では、マウスＣＤ８αの細胞外および膜貫通領域は、マウスＣＤ８αのアミノ酸１〜２１７（配列番号１６）に対応する。この実施形態の一態様では、ヒトＣＤ８αの細胞外および膜貫通領域は、ヒトＣＤ８αのアミノ酸１〜２０３（配列番号１２）に対応する。この実施形態の一態様では、ＴＩＲドメインを欠くヒトＭｙＤ８８の領域は、ヒトＭｙＤ８８のアミノ酸１〜１５５（配列番号２４）に対応する。この実施形態の特定の態様では、本発明は、配列番号１７で表されるＣＤ８α融合タンパク質ｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８、および配列番号１４で表されるｈＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８を含む。この実施形態の他の特定の態様では、本発明は、配列番号６で表されるｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８、および配列番号３で表されるｈＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８をコードするポリヌクレオチドを含む。
【００１１】
ＣＤ８αＴＭ−ＭｙＤ８８
第２の実施形態では、本発明は、ＴＩＲドメインを欠くＭｙＤ８８の領域と連結したＣＤ８αの膜貫通領域を含むＣＤ８α融合タンパク質、およびそれをコードするポリヌクレオチドを対象とする。この実施形態の一態様では、これらの領域は：ＣＤ８αのＮ−膜貫通領域−ＴＩＲドメイン−Ｃを欠くＭｙＤ８８の領域として連結されている。これらの融合タンパク質のＣＤ８α部分は、マウスおよびヒトを含む任意の哺乳動物のＣＤ８α由来であってもよい。これらの融合タンパク質のＭｙＤ８８部分も、マウスおよびヒトを含む任意の哺乳動物供給源由来であってもよい。
【００１２】
この実施形態の一態様では、ヒトＣＤ８αの膜貫通領域は、ヒトＣＤ８αのアミノ酸１２８〜２１０（配列番号１８のアミノ酸１〜８３）に対応する。この実施形態の一態様では、ＴＩＲドメインを欠くヒトＭｙＤ８８の領域は、ヒトＭｙＤ８８のアミノ酸１〜１５５（配列番号２４）に対応する。この実施形態の特定の態様では、本発明は、配列番号１８で表されるＣＤ８α融合タンパク質ｈＣＤ８αＴＭ−ｈＭｙＤ８８を含む。この実施形態の他の特定の態様では、本発明は、配列番号７で表されるｈＣＤ８αＴＭ−ｈＭｙＤ８８をコードするポリヌクレオチドを含む。
【００１３】
ＣＤ８α−２８−１３７−３
第３の実施形態では、本発明は、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、およびＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインと連結したＣＤ８αの細胞外および膜貫通領域を含むＣＤ８α融合タンパク質およびそれをコードするポリヌクレオチドを対象とする。これらの融合タンパク質のＣＤ８α部分は、マウスおよびヒトを含む任意の哺乳動物のＣＤ８α由来であってもよい。ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）およびＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインは、マウスおよびヒトを含む任意の哺乳動物供給源由来であってもよい。
【００１４】
この実施形態の一態様では、マウスＣＤ８αの細胞外および膜貫通領域は、マウスＣＤ８αのアミノ酸１〜２１７（配列番号１６）に対応する。この実施形態の一態様では、ヒトＣＤ８αの細胞外および膜貫通領域は、ヒトＣＤ８αのアミノ酸１〜２０３（配列番号１２）に対応する。この実施形態の一態様では、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）およびＣＤ３ζドメインは、配列番号１９のアミノ酸２１８〜４１７に対応し、ここで、ＣＤ２８はアミノ酸２１８〜２５６に対応し；ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）はアミノ酸２５９〜３０５に対応し；ＣＤ３ζはアミノ酸３０８〜４１７に対応する。この実施形態の特定の態様では、本発明は、配列番号１９で表されるＣＤ８α融合タンパク質ｍＣＤ８α−２８−１３７−３を含む。この実施形態の他の特定の態様では、本発明は、配列番号８で表されるｍＣＤ８α−２８−１３７−３をコードするポリヌクレオチドを含む。
【００１５】
ＣＤ４−ＭｙＤ８８
第４の実施形態では、本発明は、ＴＩＲドメインを欠くＭｙＤ８８の領域と連結したＣＤ４の細胞外および膜貫通領域を含むＣＤ８α融合タンパク質、およびそれをコードするポリヌクレオチドを対象とする。この実施形態の一態様では、これらの領域は：ＣＤ４のＮ−細胞外領域−ＣＤ４の膜貫通領域−ＴＩＲドメインＣを欠くＭｙＤ８８として連結されている。これらの融合タンパク質のＣＤ４部分は、マウスおよびヒトを含む任意の哺乳動物のＣＤ４由来であってもよい。これらの融合タンパク質のＭｙＤ８８部分も、マウスおよびヒトを含む任意の哺乳動物供給源由来であってもよい。
【００１６】
この実施形態の一態様では、マウスＣＤ４の細胞外および膜貫通領域は、マウスＣＤ４のアミノ酸１〜４１７（配列番号２１のアミノ酸１〜４１７）に対応する。この実施形態の一態様では、ヒトＣＤ４の細胞外および膜貫通領域は、ヒトＣＤ４のアミノ酸１〜４１８（配列番号２０のアミノ酸１〜４１８）に対応する。この実施形態の一態様では、ＴＩＲドメインを欠くヒトＭｙＤ８８の領域は、ヒトＭｙＤ８８のアミノ酸１〜１５５（配列番号２４）に対応する。この実施形態の特定の態様では、本発明は、配列番号２１で表されるＣＤ４融合タンパク質ｍＣＤ４−ｈＭｙＤ８８、および、配列番号２０で表されるｈＣＤ４−ｈＭｙＤ８８を含む。この実施形態の他の特定の態様では、本発明は、配列番号１０で表されるｍＣＤ４−ｈＭｙＤ８８、および配列番号９で表されるｈＣＤ４−ｈＭｙＤ８８をコードするポリヌクレオチドを含む。
【００１７】
ＴＣＲ−ＭｙＤ８８
第５の実施形態では、本発明は、ＴＩＲドメインを欠くＭｙＤ８８の領域と連結したＴＣＲを含むＴＣＲ融合タンパク質、およびそれをコードするポリヌクレオチドを対象とする。この実施形態の一態様では、これらの構成要素は：Ｎ−ＴＣＲ−ＴＩＲドメイン−Ｃを欠くＭｙＤ８８として連結されている。これらの融合タンパク質のＴＣＲ部分は、マウスおよびヒトを含む任意の哺乳動物のＴＣＲ由来であってもよい。これらの融合タンパク質のＭｙＤ８８部分は、マウスおよびヒトを含む任意の哺乳動物供給源由来であってもよい。
【００１８】
この実施形態の一態様では、ＴＣＲは、配列番号２２の残基１〜６０３のアミノ酸配列を有するＤＭＦ５ＴＣＲである。この実施形態の一態様では、ＴＩＲドメインを欠くヒトＭｙＤ８８の領域は、ヒトＭｙＤ８８のアミノ酸１〜１５５（配列番号２４）に対応する。この実施形態の特定の態様では、本発明は、配列番号２２で表されるＴＣＲ融合タンパク質ｈＴＣＲ−ｈＭｙＤ８８を含む。この実施形態の他の特定の態様では、本発明は、配列番号１１で表されるｈＴＣＲ−ｈＭｙＤ８８をコードするポリヌクレオチドを含む。
【００１９】
配列変異体
本発明の実施形態および態様の各々は、融合タンパク質および該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの配列変異体を含み、ここで、融合タンパク質を含む各ペプチド領域またはドメインの長さは、アミノ末端、カルボキシ末端、または両端で、該ペプチド領域またはドメインがそこから得られたポリペプチドの元の配列に基づき１０個までのアミノ酸だけ個々に変化する。ある態様では、配列変異体は、それらの基礎となる特定の融合タンパク質の少なくとも７５％の活性を有する。
【００２０】
この実施形態の一態様では、配列変異体は、該融合タンパク質を含む少なくとも１つのペプチド領域またはドメインの長さが、アミノ末端、カルボキシ末端、または両端で、該ペプチド領域またはドメインがそこから得られたポリペプチドの元の配列に基づき１０個までのアミノ酸だけ個々に変化する配列変異体である。
【００２１】
本発明の実施形態および態様の各々は、本明細書で定義された特定の融合タンパク質と、その特定の融合タンパク質の全長にわたって少なくとも８０％の配列同一性を有する融合タンパク質、およびそれをコードするポリヌクレオチドの配列変異体も含む。ある態様では、これらの配列変異体は、それらの基礎となる特定の融合タンパク質の少なくとも７５％の活性を有するであろう。
【００２２】
細胞
第６の実施形態では、本発明は、本発明の少なくとも１種の変異体を発現している細胞の単離された集団を対象とする。この実施形態の一態様では、少なくとも１種の変異体は、ｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８（配列番号１７）、ｈＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８（配列番号１４）、ｈＣＤ８αＴＭ−ｈＭｙＤ８８（配列番号１８）、ｍＣＤ８α−２８−１３７−３（配列番号１９）、ｍＣＤ４−ｈＭｙＤ８８（配列番号２１）、ｈＣＤ４−ｈＭｙＤ８８（配列番号２０）およびｈＴＣＲ−ｈＭｙＤ８８（配列番号２２）、およびそれらの配列変異体からなる群から選択される。この実施形態の別の態様では、少なくとも１種の変異体は、配列番号６（ｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８）、配列番号３（ｈＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８）、配列番号７（ｈＣＤ８αＴＭ−ｈＭｙＤ８８）、配列番号８（ｍＣＤ８α−２８−１３７−３）、配列番号１０（ｍＣＤ４−ｈＭｙＤ８８）、配列番号９（ｈＣＤ４−ｈＭｙＤ８８）および配列番号１１（ｈＴＣＲ−ｈＭｙＤ８８）で表されるポリヌクレオチド配列、およびそれらの配列変異体からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列によりコードされる。
【００２３】
この実施形態の一態様では、配列変異体は、該融合タンパク質を含む少なくとも１つのペプチド領域またはドメインの長さが、アミノ末端、カルボキシ末端、または両端で、該ペプチド領域またはドメインがそこから得られるポリペプチドの元の配列に基づき１０個までのアミノ酸だけ個々に変化する配列変異体である。
【００２４】
この実施形態の一態様では、配列変異体は、本明細書で定義された特定の融合タンパク質と、その特定の融合タンパク質の全長にわたって少なくとも８０％の配列同一性を有する。
【００２５】
この実施形態の一態様では、細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、好中球、マクロファージ、樹状細胞、肥満細胞、好塩基球、Ｂ細胞および他の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）または他の初代またはいわゆる万能供与体細胞を含む確立された細胞株からなる群から選択される。
【００２６】
この実施形態の一態様では、細胞は、ウイルスにより媒介される遺伝子挿入により融合タンパク質および配列変異体を発現するように操作されている。しかしながら、ヌクレオフェクション（nucleofection）またはＤＮＡ、ＲＮＡもしくはタンパク質の一過性発現などの遺伝子挿入またはタンパク質発現の他の手段もまた適当である。
【００２７】
治療方法
第７の実施形態では、本発明は、癌を有する対象を治療する方法であって、癌を有する対象に、本発明の少なくとも１種の変異体を発現している細胞の集団の治療的有効量を投与することを含む方法を対象とする。
【００２８】
この実施形態の一態様では、少なくとも１種の変異体は、ｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８（配列番号１７）、ｈＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８（配列番号１４）、ｈＣＤ８αＴＭ−ｈＭｙＤ８８（配列番号１８）、ｍＣＤ８α−２８−１３７−３（配列番号１９）、ｍＣＤ４−ｈＭｙＤ８８（配列番号２１）、ｈＣＤ４−ｈＭｙＤ８８（配列番号２０）およびｈＴＣＲ−ｈＭｙＤ８８（配列番号２２）、およびそれらの配列変異体からなる群から選択される。この実施形態の別の態様では、少なくとも１種の変異体は、配列番号６（ｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８）、配列番号３（ｈＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８）、配列番号７（ｈＣＤ８αＴＭ−ｈＭｙＤ８８）、配列番号８（ｍＣＤ８α−２８−１３７−３）、配列番号１０（ｍＣＤ４−ｈＭｙＤ８８）、配列番号９（ｈＣＤ４−ｈＭｙＤ８８）および配列番号１１（ｈＴＣＲ−ｈＭｙＤ８８）で表されるポリヌクレオチド配列およびそれらの配列変異体からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列によりコードされている。
【００２９】
この実施形態の一態様では、配列変異体は、該融合タンパク質を含む少なくとも１つのペプチド領域またはドメインの長さが、アミノ末端、カルボキシ末端、または両端で、該ペプチド領域またはドメインがそこから得られたポリペプチドの元の配列に基づき１０個までのアミノ酸だけ個々に変化する配列変異体である。
【００３０】
この実施形態の一態様では、配列変異体は、本明細書で定義された特定の融合タンパク質と、その特定の融合タンパク質の全長にわたって少なくとも８０％の配列同一性を有する。
【００３１】
この実施形態の一態様では、細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、好中球、マクロファージ、樹状細胞、肥満細胞、好塩基球、Ｂ細胞および他の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、腫瘍浸潤リンパ球または他の初代またはいわゆる万能供与体細胞を含む確立された細胞株からなる群から選択される。
【００３２】
第８の実施形態では、本発明は、感染性疾患を有する対象を治療する方法であって、感染性疾患を有する対象に、本発明の少なくとも１種の変異体を発現している細胞の集団の治療的有効量を投与することを含む方法を対象とする。
【００３３】
この実施形態の一態様では、少なくとも１種の変異体は、ｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８（配列番号１７）、ｈＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８（配列番号１４）、ｈＣＤ８αＴＭ−ｈＭｙＤ８８（配列番号１８）、ｍＣＤ８α−２８−１３７−３（配列番号１９）、ｍＣＤ４−ｈＭｙＤ８８（配列番号２１）、ｈＣＤ４−ｈＭｙＤ８８（配列番号２０）およびｈＴＣＲ−ｈＭｙＤ８８（配列番号２２）、およびそれらの配列変異体からなる群から選択される。この実施形態のさらに態様では、少なくとも１種の変異体は、配列番号６（ｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８）、配列番号３（ｈＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８）、配列番号７（ｈＣＤ８αＴＭ−ｈＭｙＤ８８）、配列番号８（ｍＣＤ８α−２８−１３７−３）、配列番号１０（ｍＣＤ４−ｈＭｙＤ８８）、配列番号９（ｈＣＤ４−ｈＭｙＤ８８）および配列番号１１（ｈＴＣＲ−ｈＭｙＤ８８）で表されるポリヌクレオチド配列、およびそれらの配列変異体からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列によりコードされている。
【００３４】
この実施形態の一態様では、配列変異体は、該融合タンパク質を含む少なくとも１つのペプチド領域またはドメインの長さが、アミノ末端、カルボキシ末端、または両端で、該ペプチド領域またはドメインがそこから得られたポリペプチドの元の配列に基づき１０個までのアミノ酸だけ個々に変化する配列変異体である。
【００３５】
この実施形態の一態様では、配列変異体は、本明細書で定義された特定の融合タンパク質と、その特定の融合タンパク質の全長にわたって少なくとも８０％の配列同一性を有する。
【００３６】
この実施形態の一態様では、細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、好中球、マクロファージ、樹状細胞、肥満細胞、好塩基球、Ｂ細胞および他の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、腫瘍浸潤リンパ球または他の初代またはいわゆる万能供与体細胞を含む確立された細胞株からなる群から選択される。
【００３７】
この実施形態の一態様では、感染性疾患は、細菌、ウイルスまたは真菌により引き起こされる。
【００３８】
第９の実施形態では、本発明は、自己免疫障害を有する対象を治療する方法であって、自己免疫障害を有する対象に、本発明の少なくとも１種の変異体を発現している細胞の集団の治療的有効量を投与することを含む方法を対象とする。
【００３９】
この実施形態の一態様では、少なくとも１種の変異体は、ｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８（配列番号１７）、ｈＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８（配列番号１４）、ｈＣＤ８αＴＭ−ｈＭｙＤ８８（配列番号１８）、ｍＣＤ８α−２８−１３７−３（配列番号１９）、ｍＣＤ４−ｈＭｙＤ８８（配列番号２１）、ｈＣＤ４−ｈＭｙＤ８８（配列番号２０）およびｈＴＣＲ−ｈＭｙＤ８８（配列番号２２）、およびそれらの配列変異体からなる群から選択される。この実施形態の別の態様では、少なくとも１種の変異体は、配列番号６（ｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８）、配列番号３（ｈＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８）、配列番号７（ｈＣＤ８αＴＭ−ｈＭｙＤ８８）、配列番号８（ｍＣＤ８α−２８−１３７−３）、配列番号１０（ｍＣＤ４−ｈＭｙＤ８８）、配列番号９（ｈＣＤ４−ｈＭｙＤ８８）および配列番号１１（ｈＴＣＲ−ｈＭｙＤ８８）で表されるポリヌクレオチド配列、およびそれらの配列変異体からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列によりコードされている。
【００４０】
この実施形態の一態様では、配列変異体は、該融合タンパク質を含む少なくとも１つのペプチド領域またはドメインの長さが、アミノ末端、カルボキシ末端、または両端で、該ペプチド領域またはドメインがそこから得られたポリペプチドの元の配列に基づき１０個までのアミノ酸だけ個々に変化する配列変異体である。
【００４１】
この実施形態の一態様では、配列変異体は、本明細書で定義された特定の融合タンパク質と、その特定の融合タンパク質の全長にわたって少なくとも８０％の配列同一性を有する。
【００４２】
この実施形態の一態様では、細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、好中球、マクロファージ、樹状細胞、肥満細胞、好塩基球、Ｂ細胞および他の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、腫瘍浸潤リンパ球または他の初代またはいわゆる万能供与体細胞を含む確立された細胞株からなる群から選択される。
【００４３】
この実施形態の一態様では、自己免疫障害は、狼瘡、関節炎、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、円形脱毛症、およびセリアック病からなる群から選択される。
【００４４】
抗原認識を強化する方法
第１０の実施形態では、本発明は、ＭＤＳＣにより媒介される抑制に対する耐性をＴ細胞に付与する方法を対象とする。これらの方法は、本発明の少なくとも１種の変異体をＴ細胞で発現することを含む。
【００４５】
この実施形態の一態様では、少なくとも１種の変異体は、ｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８（配列番号１７）、ｈＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８（配列番号１４）、ｈＣＤ８αＴＭ−ｈＭｙＤ８８（配列番号１８）、ｍＣＤ８α−２８−１３７−３（配列番号１９）、ｍＣＤ４−ｈＭｙＤ８８（配列番号２１）、ｈＣＤ４−ｈＭｙＤ８８（配列番号２０）およびｈＴＣＲ−ｈＭｙＤ８８（配列番号２２）、およびそれらの配列変異体からなる群から選択される。この実施形態の別の態様では、少なくとも１種の変異体は、配列番号６（ｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８）、配列番号３（ｈＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８）、配列番号７（ｈＣＤ８αＴＭ−ｈＭｙＤ８８）、配列番号８（ｍＣＤ８α−２８−１３７−３）、配列番号１０（ｍＣＤ４−ｈＭｙＤ８８）、配列番号９（ｈＣＤ４−ｈＭｙＤ８８）および配列番号１１（ｈＴＣＲ−ｈＭｙＤ８８）で表されるポリヌクレオチド配列、およびそれらの配列変異体からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列によりコードされている。
【００４６】
この実施形態の一態様では、配列変異体は、該融合タンパク質を含む少なくとも１つのペプチド領域またはドメインの長さが、アミノ末端、カルボキシ末端、または両端で、該ペプチド領域またはドメインがそこから得られたポリペプチドの元の配列に基づき１０個までのアミノ酸だけ個々に変化する配列変異体である。
【００４７】
この実施形態の一態様では、配列変異体は、本明細書で定義された特定の融合タンパク質と、その特定の融合タンパク質の全長にわたって少なくとも８０％の配列同一性を有する。
【００４８】
第１１の実施形態では、本発明は、免疫細胞の抗原認識を強化する方法を対象とする。これらの方法は、本発明の少なくとも１種の変異体を免疫細胞で発現させることを含む。
【００４９】
この実施形態の一態様では、少なくとも１種の変異体は、ｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８（配列番号１７）、ｈＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８（配列番号１４）、ｈＣＤ８αＴＭ−ｈＭｙＤ８８（配列番号１８）、ｍＣＤ８α−２８−１３７−３（配列番号１９）、ｍＣＤ４−ｈＭｙＤ８８（配列番号２１）、ｈＣＤ４−ｈＭｙＤ８８（配列番号２０）およびｈＴＣＲ−ｈＭｙＤ８８（配列番号２２）、およびそれらの配列変異体からなる群から選択される。この実施形態の別の態様では、少なくとも１種の変異体は、配列番号６（ｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８）、配列番号３（ｈＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８）、配列番号７（ｈＣＤ８αＴＭ−ｈＭｙＤ８８）、配列番号８（ｍＣＤ８α−２８−１３７−３）、配列番号１０（ｍＣＤ４−ｈＭｙＤ８８）、配列番号９（ｈＣＤ４−ｈＭｙＤ８８）および配列番号１１（ｈＴＣＲ−ｈＭｙＤ８８）で表されるポリヌクレオチド配列、およびそれらの配列変異体からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列によりコードされている。
【００５０】
この実施形態の一態様では、配列変異体は、該融合タンパク質を含む少なくとも１つのペプチド領域またはドメインの長さが、アミノ末端、カルボキシ末端、または両端で、該ペプチド領域またはドメインがそこから得られたポリペプチドの元の配列に基づき１０個までのアミノ酸だけ個々に変化する配列変異体である。
【００５１】
この実施形態の一態様では、配列変異体は、本明細書で定義された特定の融合タンパク質と、その特定の融合タンパク質の全長にわたって少なくとも８０％の配列同一性を有する。
【００５２】
この実施形態の一態様では、免疫細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、好中球、マクロファージ、樹状細胞、肥満細胞、好塩基球、Ｂ細胞および他の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、腫瘍浸潤リンパ球または他の初代またはいわゆる万能供与体細胞を含む確立された細胞株からなる群から選択される。
【００５３】
この実施形態のある態様では、抗原は、インビトロまたはインビボで、低濃度で存在するか、または抗原は抗原性の弱い抗原であるか、またはその両方である。
【００５４】
前述で、以下の本発明の詳細な説明がより良く理解されるために、本発明の特質および技術的利点をやや広く概説した。本発明の特許請求の範囲の主題を形成する本発明の追加の特質および利点を、ここで説明する。本明細書で開示された如何なる概念および特定の実施形態も、改変するかまたは他の製剤を設計するための根拠として、本発明と同じ目的を実行するために容易に利用することができることが、当業者により認識されるべきである。そのような等価の製剤は、添付の特許請求の範囲で述べられた本発明の精神および範囲から逸脱しないことも当業者により了解されるべきである。本発明の特徴であると考えられる新規な特質は、その構成および実施方法の両方に関して、添付の図を合わせて考えれば、以下の説明から、さらなる目的および利点と一緒に、さらに良く理解されるであろう。しかしながら、如何なる記載、図、例その他も、例示および説明の目的にのみ提供され、本発明の限界を規定することは決して意図されないことが、特に理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】Ｔ細胞受容体とＭＨＣ分子との間の物理的相互作用の例示である。
【図２】異なるＣＤ８α変異体またはＧＦＰベクター対照をレトロウイルスで形質導入されたＴ細胞とメラノーマ腫瘍細胞とを２４時間共培養した後の、Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ産生を示すグラフである。
【図３】本発明のＣＤ８αの変異体の模式図である。ＣＤ８αのＥＣ、細胞外ドメイン；ＣＤ８αのＴＭ、膜貫通型ドメイン；ＭｙＤ８８のＤＤ、デスドメイン；ＭｙＤ８８のＩＤ、中間ドメイン；ＣＤ２８、ＣＤ２８の細胞内ドメイン；ＣＤ１３７、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）の細胞内ドメイン；ＣＤ３、ＣＤ３ζの細胞内ドメイン。
【図４】ＨＥＫおよびＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣＤ８αの発現および形質導入の有効度。図４Ａ：トランスフェクトされていないままであるかまたはｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８でトランスフェクトされたＨＥＫ細胞を示す。図４Ｂ：マウスＣＤ８＋ｐｍｅｌ  Ｔ細胞にｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８を形質導入して、ＧＦＰ＋Ｔ細胞の％に基づくトランスフェクション有効度を、形質導入後４８時間に決定した。
【図５】ＭｙＤ８８シグナル伝達がＮＦ−κＢを活性化する。ＨＥＫ−Ｂｌｕｅレポーター細胞に、構築物を一過性にトランスフェクトした。ＳＥＡＰ活性は、６２０ｎｍにおける吸光度の変化により測定される４８時間におけるＮＦ−κＢ活性化についての読出しとして決定した。ＬＰＳは、陽性対照として役立ち、ｐＭＩＧは空のベクター対照である。
【図６】マウスのＣＤ８Ｔ細胞中におけるｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８の発現は、腫瘍抗原の変化する濃度と共に刺激に応答してＴ細胞増殖およびＩＦＮ−γ産生を増強する。増殖は、３Ｈ−チミジン組み込みにより、およびＩＦＮ−γ産生はＥＬＩＳＡにより決定した。ペプチドを適用した脾臓細胞で４８時間刺激した後に、３連ウェルの平均（１分当たりの計数）（＋ＳＤ）を示す。＊ｍＣＤ８α−２８−１３７−３に対してＰ＜０．０５；ＡＮＯＶＡ。
【図７】ＣＤ８＋Ｔ細胞中のｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８発現は、活性化に応答して腫瘍細胞の滴定数と共にＴ細胞増殖を増強する。７２時間刺激後に、３連ウェルの平均ＣＰＭ（１分当たりの計数）（＋ＳＤ）を、Ｂ１６細胞の表示された数と共に示す。＊＊ｍＣＤ８α−１３７−２８−３に対してＰ＜０．０１；ＡＮＯＶＡ。
【図８】Ｔ細胞中におけるＭｙＤ８８シグナル伝達は、腫瘍細胞上の腫瘍抗原に応答してサイトカイン分泌を変化させる。形質導入されたｐｍｅｌ  Ｔ細胞を、放射線照射されたＢ１６−Ｆ１腫瘍細胞と共培養した。上清を２４時間で回収して、種々の因子のレベルを、Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘサイトカインアレイを使用して評価した。
【図９】Ｔ細胞中におけるＭｙＤ８８シグナル伝達は、腫瘍細胞上の腫瘍抗原に応答してサイトカイン分泌を増大させる。形質導入されたｐｍｅｌ  Ｔ細胞を、放射線照射されたＢ１６−Ｆ１腫瘍細胞と共培養した。上清を２４時間で回収して、１００倍に希釈した後ＥＬＩＳＡを実施した。＊ｍＣＤ８α−２８−１３７−３に対してＰ＜０．０５；ＡＮＯＶＡ。
【図１０】ＣＤ８−ＭｙＤ８８シグナルの伝達。ＣＤ８＋ｐｍｅｌ  Ｔ細胞にＣＤ８α−ＭｙＤ８８、ＣＤ８αΔＩＣまたはｐＭＩＧ対照ベクターを形質導入した。Ｔ細胞を１対１の比でＢ１６腫瘍細胞により１０分および３０分間刺激して、次に４％ＰＦＡで固定した。０時点は、Ｂ１６が加えられていない時を指示する。細胞を透過性にして染色し、ＴＣＲシグナル伝達に応答して活性化されてリン酸化されたタンパク質、ｐ−ｐ３８、ｐ−ＪＮＫ、ｐ−ＥＲＫ１／２を指示した。
【図１１】ｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８を形質導入されたＴ細胞は、Ｂ１６メラノーマに対して強化された細胞傷害性をインビトロで示す。細胞傷害性は、４時間経過して指示されたエフェクター（Ｔ細胞）の標的（Ｂ１６メラノーマ）に対する比で評価した。＊ｍＣＤ８α−２８−１３７−３に対してＰ＜０．０５；ＡＮＯＶＡ。
【図１２】ｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８を発現しているＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＭＤＳＣにより媒介される抑制に抵抗して増大した増殖を示す。ｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８を発現するように操作されたＣＤ８＋Ｔ細胞または対照ＧＦＰを、ＭＤＳＣと指示された比で共培養した。７２時間後の３連ウェルの平均ＣＰＭ（１分当たりの計数）（＋ＳＤ）を示す。＊Ｐ＜０．０５；Ｔ検定。
【図１３Ａ】ｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８Ｔ細胞で治療された腫瘍担持マウスは、増強された抗腫瘍応答および生存期間の延長を示す。
【図１３Ｂ】ｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８Ｔ細胞で治療された腫瘍担持マウスは、増強された抗腫瘍応答および生存期間の延長を示す。
【図１４】腫瘍反応性Ｔ細胞中におけるｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８の発現は、どのような支持療法がなくても抗腫瘍応答を増強してマウスの生存期間を延長する。ｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８Ｔ細胞で処理されたマウスは、未処理マウスまたは対照のｐＭＩＧ  ｐｍｅｌ  Ｔ細胞で処理されたマウスと比較して２３日目に始まる有意に増強された抗腫瘍応答（図１４Ａ）（一元配置ＡＮＯＶＡ；ｐ＜０．０１）および全体的に見た生存期間の延長（図１４Ｂ；Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定、ｐ＜０．０５）を示した。
【図１５】腫瘍に反応性のＴＣＲと連結したＭｙＤ８８を発現しているＴ細胞は、強化されたＴ細胞増殖を示した。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
Ｉ．定義
特に断らない限り、技術用語は従来の用法に従って使用する。分子生物学において一般的な用語の定義は、例えば、Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ、Ｇｅｎｅｓ  ＶＩＩ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ出版、２０００年（ＩＳＢＮ  ０１９８７９２７６Ｘ）；Ｋｅｎｄｒｅｗら（編）、Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ出版、１９９４年（ＩＳＢＮ  ０６３２０２１８２９）；およびＲｏｂｅｒｔ  Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．出版、１９９５年（ＩＳＢＮ  ０４７１１８６３４１）；および他の同様な技術的参考文献に見出される。
【００５７】
本明細書において使用する、「１つ（ａ）」または「１つ（ａｎ）」は、１つまたはそれ以上を意味し得る。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語と共に使用される場合、本明細書において使用する「１つ（ａ）」または「１つ（ａｎ）」という語は、１つまたは１つを超えるを意味し得る。本明細書において使用する「別の（ａｎｏｔｈｅｒ）」は、少なくとも第２のまたはそれ以上を意味し得る。さらに、文脈によって他に要求されない限り、単数の用語は、複数を含み、複数の用語は単数を含む。
【００５８】
本明細書において使用する「約」は、明示的に示されていてもいなくても、例えば、整数、分数、およびパーセンテージを含む数値を指す。用語「約」は、当業者が、挙げられた値と等価（例えば、同じ機能または結果を有する）と考える範囲の数値（例えば、挙げられた値の＋／−５〜１０％）を一般的に指す。場合によっては、用語「約」は、最も近い有効数字に丸められた数値を含むこともできる。
【００５９】
ＩＩ．本発明
任意の所与の抗原に対するＣＤ８＋Ｔ細胞の応答の強度は、Ｔ細胞と抗原提示細胞の間に生ずる種々の分子の相互作用により支配される。そのような相互作用は、図１に示すように、Ｔ細胞により発現されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と抗原提示細胞により発現されたＭＨＣ分子との間の相互作用を含む。
【００６０】
ＴＣＲにより発生されたシグナル伝達は、ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ８共受容体と抗原提示細胞上のＭＨＣタンパク質との間の相互作用により大きく調節される。図１で見ることができるように、ＣＤ８共受容体は、２つのサブユニット：ＣＤ８αおよびＣＤ８βで構成されており、ＣＤ８αサブユニットのみがＭＨＣ  Ｉと、該タンパク質のα３ドメインを通して直接相互作用する。
【００６１】
本明細書で提供されるデータおよび発行された報告は、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞内におけるＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）−ＭｙＤ８８のシグナル伝達を直接刺激することは、免疫原性の弱い抗原に対するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の活性化閾値を低下させて、最適未満のレベルの免疫優性の抗原提示に対する応答も増強することを示している。ＴＣＲおよびＴＬＲのシグナル伝達の相伴う活性化は、Ｔ細胞増殖を強化し、細胞崩壊活性を増大させて、腫瘍担持マウスにおけるエフェクターＴ細胞の生存期間を延長する。興味深いことに、高齢者の個体からの免疫細胞は、ＴＬＲの低下した発現レベルを示し、一般的にＴＬＲ刺激に対する応答性が劣る。
【００６２】
本発明者により実施された徹底的な研究と一緒に、これらの観察が、本明細書に記載されるＣＤ４、ＣＤ８およびＴＣＲ変異体、Ｔ細胞活性化に関与するポリペプチドの開発に導き、それらがＴ細胞の活性化および応答性を改善した。
【００６３】
特に、ＣＤ８αサブユニットおよびＴ細胞受容体のアミノ酸配列をヒトＭｙＤ８８タンパク質の特殊化された領域を含むように変化させると、Ｔ細胞活性化および応答性に対して非常に大きい効果があることが見出された。これは、ＣＤ８αまたはＴＣＲの細胞外および膜貫通領域をＭｙＤ８８の特定の領域と融合した合成遺伝子を創出することにより達成した。次にＣＤ８＋Ｔ細胞をこれらの遺伝子を発現するように操作して、ＣＤ８α−ＭｙＤ８８融合タンパク質は、ＩＦＮ−γ産生、Ｔ細胞の増殖および強化された細胞傷害性により測定して、他のＣＤ８αベクターに優る大きく改善された応答を示すことが見出された。したがって、ＣＤ８αサブユニットのアミノ酸配列に対する変化は、ＣＤ８のＭＨＣ  Ｉに対する親和性と、順送りで、選択された抗原に対するＣＤ８＋Ｔ細胞の応答の性質を調節することが見出された。これらの同じ結果の幾つかは、ＴＣＲ−ＭｙＤ８８融合タンパク質が製造されて試験されたときに見出された。この驚くべき発見は、本出願で報告されて特許請求される新規なポリペプチド、細胞株、および方法のための根拠として役立つ。
【００６４】
本発明の幾つかの新規な特質および有用な応用は以下のことを含む：
・本発明のＣＤ８α変異体は、可溶性のＴＣＲ（ｓＴＣＲ）または膜に結合したＴＣＲと一緒に連結してペプチドＭＨＣに対するＴＣＲ親和性を強化することができる。
・本発明のＣＤ８α変異体は、Ｔ細胞上に発現されて任意の所与の抗原に対する内因性ＴＣＲシグナルを強化することができる。
・本発明のＣＤ８α変異体は、トランスジェニック腫瘍に反応性のＴＣＲ（またはウイルスのもしくは他の細胞内の病原性抗原のような他の抗原に対して特異的なＴＣＲ）と共発現される。Ｔ細胞活性を増強することに加えて、ＣＤ８α変異体は、ＰＤ１およびＣＴＬＡ４により媒介される免疫抑制を、これらの負のシグナルに優先することにより低下させるために使用することができた（ＭｙＤ８８のＴＣＲシグナル伝達を強化する能力によって）。
・ＭＨＣ  Ｉに対する親和性を変化させるＣＤ８αまたはＣＤ８βサブユニットにおける変異は、患者のＴ細胞のワクチンに対する応答または遺伝子を改変されたＴ細胞による応答を予測するためのバイオマーカーとして役立つことができる。変異はＣＤ８親和性を低下させるかまたは強化することができるので、特異的な変異は、強いおよび弱い両方の応答を予測することができた。例えば、Ｋ２７３Ａおよび５３Ｎ変異を有する患者は、より強い応答を示すと予期される。
【００６５】
Ｔ細胞の応答を強化する最新の戦略は：
・Ｔ細胞が失活することを防止するかまたはそれらの死を防止するための抗体に基づく手法；
・高親和性のＴＣＲを発現するために操作されたＴ細胞；および
・腫瘍細胞表面に発現した腫瘍抗原を認識する能力をＴ細胞に与えるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作されたＴ細胞
を含む。
最後の２つの手法は、費用がかかり、時間および労力集約的な方法である。高親和性のＴＣＲの使用は癌でない組織を殺す結果となるが、ＣＡＲのＴ細胞は１種の抗原だけを標的とすることができる。したがって、Ｔ細胞の応答を強化するための新しい戦略の必要性がある。本明細書に記載する手法は、高親和性のＴＣＲを同定する必要性を回避する。その上、本発明のＣＤ８α変異体は、ＴＣＲシグナルを増幅するＣＤ８αの能力を活用することにより、低親和性のＴＣＲを有するＴ細胞の応答を強化する可能性を提供する。ＣＡＲ  Ｔ細胞は１種の抗原だけを標的とすることができるが、本発明のＣＤ８α変異体は、任意の抗原に対するＴＣＲまたはＣＡＲ応答を強化するための単一の基盤として使用することができる。
・例えば、樹状細胞、改変された腫瘍細胞、腫瘍溶解物、ペプチドまたはタンパク質系ワクチン、腫瘍抗原を発現するように改変された細菌のまたはウイルスのワクチンおよびＴ細胞の応答を引き出すことを意図された他の形態のワクチンなどのワクチンに基づく手法。
・免疫療法のための腫瘍浸潤リンパ球。
最後の２つの手法は、本明細書に記載した本発明を用いるＭｙＤ８８を用いてＴ細胞の応答を強化することから全ての利益を得ることができる。
【００６６】
したがって、Ｔ細胞に導入されたときに、抗原刺激に対するＴ細胞の応答を増強するＴＣＲ共受容体として役立ち得るＣＤ８α−ＭｙＤ８８融合タンパク質およびそれらの配列変異体を含むが、これらに限定されないＣＤ８α変異体が、本明細書で提供される。ＴＣＲ−ＭｙＤ８８融合タンパク質およびそれらの配列変異体を含むが、これらに限定されないＴＣＲ変異体も本明細書で提供される。これらのＴＣＲ変異体は、Ｔ細胞中に導入して免疫原性の弱い抗原に対するＴ細胞の応答を増強するおよび／または抗原刺激に対するＴ細胞の応答をさらに強化することができる。
【００６７】
本発明は、変異体を発現している細胞株ならびに該変異体および細胞株をインビトロおよびインビボで使用する方法も対象とする。
【００６８】
融合タンパク質
初期の研究で、ＣＤ８αを全長ＭｙＤ８８タンパク質と融合させる（またはＣＤ８αなしでＭｙＤ８８を過発現させる）とＴ細胞の死がもたらされることが見出された。理論により束縛されることは望まないが、この致死は慢性のおよび強化されたＭｙＤ８８シグナル伝達に対する応答で起こったと推測される。ＭｙＤ８８タンパク質は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）およびＩＬ−１受容体（ＩＬ−１Ｒ）と相互作用するＴＩＲドメイン（Ｔｏｌｌ／ＩＬ−１受容体ドメイン）と呼ばれる領域を含有するので、ＭｙＤ８８由来のＴＩＲドメインを除去すると、ＴＬＲおよびＩＬ−１Ｒへのクラスター形成を防止することができて、その結果ＴＣＲシグナル伝達においてのみＭｙＤ８８活性化が起こる（またはＭＨＣ抗原と遭遇する）と推測した。
【００６９】
ＣＤ８とＭＨＣ  Ｉとの間の物理的相互作用は、ＣＤ８の細胞外ドメインを通して起こるという事実に基づいて、分子の細胞内部分の重要性は低く、ＴＩＲドメインを欠くＭｙＤ８８により置き換えることができる可能性があるとさらに考えた。
【００７０】
下で報告するように、ＴＩＲドメインを欠くＭｙＤ８８と連結したＣＤ８αの細胞外および膜貫通領域を含む融合タンパク質は、Ｔ細胞の増殖、Ｔ細胞のサイトカインおよびケモカイン産生、およびＴ細胞の細胞傷害活性を、それらが発現されるＴ細胞で増大させることに関して優れた特性を示した。本発明は、一部、これらの分子を対象とする。
【００７１】
ＣＤ８α−ＭｙＤ８８
したがって、本発明は、マウスおよびヒトＣＤ８α変異体を含む。第１の態様では、ＣＤ８α変異体は、ＴＩＲドメインを欠くＭｙＤ８８の領域と連結したＣＤ８αの細胞外および膜貫通領域を含むＣＤ８α−ＭｙＤ８８融合タンパク質を含む。好ましい実施形態では、これらの領域は：ＣＤ８αのＮ−細胞外領域−ＣＤ８αの膜貫通領域−ＴＩＲドメイン−Ｃを欠くＭｙＤ８８として連結されている。これらの融合タンパク質のＣＤ８α部分は、マウスおよびヒトを含む任意の哺乳動物ＣＤ８α由来であってもよい。これらの融合タンパク質のＭｙＤ８８部分は、マウスおよびヒトを含む任意の哺乳動物供給源由来であってもよい。マウスＣＤ８αの細胞外および膜貫通領域は、一般的にマウスＣＤ８αのアミノ酸１〜２１７（配列番号１６；ｍＣＤ８αΔＩＣ）に対応する。ヒトＣＤ８αの細胞外および膜貫通領域は、一般的にヒトＣＤ８αのアミノ酸１〜２０３（配列番号１２；ｈＣＤ８αΔＩＣ）に対応する。ＴＩＲドメインを欠くヒトＭｙＤ８８の領域は、一般的にヒトＭｙＤ８８のアミノ酸１〜１５５（配列番号２４）に対応する。これらのＣＤ８α変異体の例は、ｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８（配列番号１７）およびｈＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８（配列番号１４）を含むが、これらに限定されない。
【００７２】
本発明は、ＴＩＲドメインを欠くＭｙＤ８８の領域と連結した元の全長ＣＤ８αを含むＣＤ８α変異体も含む。好ましい実施形態では、これらの領域は：ＴＩＲドメイン−Ｃを欠くＮ−ＣＤ８α−ＭｙＤ８８として連結されている。これらの融合タンパク質のＣＤ８α部分は、マウス（配列番号１５）およびヒト（配列番号１２）を含む任意の哺乳動物のＣＤ８αであってもよい。これらの融合タンパク質のＭｙＤ８８部分は、マウスおよびヒトを含む任意の哺乳動物供給源由来であってもよい。ＴＩＲドメインを欠くヒトＭｙＤ８８の領域は、一般的にヒトＭｙＤ８８のアミノ酸１〜１５５（配列番号２４）に対応する。
【００７３】
これらのＣＤ８α変異体の各々は、タンデムに連結されているＴＩＲドメインを欠く２つ以上のＭｙＤ８８領域を含むこともできて、これらのＭｙＤ８８領域は、融合タンパク質のＣＤ８α部分のＮ末端、Ｃ末端、または、Ｎ末端およびＣ末端の両方に現れることができる。
【００７４】
ＣＤ８αＴＭ−ＭｙＤ８８
第２の態様では、ＣＤ８α変異体は、ＴＩＲドメインを欠くＭｙＤ８８の領域と連結したＣＤ８αの膜貫通領域のみを含むＣＤ８α−ＭｙＤ８８融合タンパク質を含む。好ましい実施形態では、これらの領域は：ＣＤ８αのＮ−膜貫通領域−ＴＩＲドメイン−Ｃを欠くＭｙＤ８８として連結されている。これらの融合タンパク質のＣＤ８α部分は、マウスおよびヒトを含む任意の哺乳動物のＣＤ８α由来であってもよい。これらの融合タンパク質のＭｙＤ８８部分は、マウスおよびヒトを含む任意の哺乳動物供給源由来であってもよい。ヒトＣＤ８αの膜貫通領域は、一般的にヒトＣＤ８αのアミノ酸１２８〜２１０（配列番号１８のアミノ酸１〜８３）に対応する。ＴＩＲドメインを欠くヒトＭｙＤ８８の領域は、一般的にヒトＭｙＤ８８のアミノ酸１〜１５５（配列番号２４）に対応する。このＣＤ８α変異体の例は、ｈＣＤ８αＴＭ−ｈＭｙＤ８８（配列番号１８）を含むが、これらに限定されない。
【００７５】
これらのＣＤ８α変異体の各々は、タンデムに連結されているＴＩＲドメインを欠く２つ以上のＭｙＤ８８領域を含むこともできて、これらのＭｙＤ８８領域は、融合タンパク質のＣＤ８α部分のＮ末端、Ｃ末端、または、Ｎ末端およびＣ末端の両方に現れることができる。
【００７６】
ＣＤ８α−２８−１３７−３
第３の態様では、ＣＤ８α変異体は、伝統的な第３世代のＣＡＲ：ヒトＣＤ２８、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインと連結したＣＤ８αの細胞外および膜貫通領域を含むＣＤ８α融合タンパク質を含む。好ましい実施形態では、これらの構成要素は：ＣＤ８αのＮ−細胞外領域−ＣＤ８αの膜貫通型領域−ＣＤ２８−ＣＤ１３７−ＣＤ３ζ−Ｃとして連結されている。これらの融合タンパク質のＣＤ８α部分は、マウスおよびヒトを含む任意の哺乳動物のＣＤ８α由来であってもよい。ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、およびＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインは、マウスおよびヒトを含む任意の哺乳動物供給源由来であってもよい。マウスＣＤ８αの細胞外および膜貫通領域は、一般的にマウスＣＤ８αのアミノ酸１〜２１７（配列番号１６；ｍＣＤ８αΔＩＣ）に対応する。ヒトのＣＤ８αの細胞外および膜貫通領域は、一般的にヒトＣＤ８αのアミノ酸１〜２０３（配列番号１２；ｈＣＤ８αΔＩＣ）に対応する。ヒトＣＤ２８、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、およびＣＤ３ζは、一般的に配列番号１９のアミノ酸２１８〜４１７に対応し、その中でＣＤ２８は一般的にアミノ酸２１８〜２５６に対応し；ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）は一般的にアミノ酸２５９〜３０５に対応し；ＣＤ３ζは一般的にアミノ酸３０８〜４１７に対応する。このＣＤ８αの変異体の例は、本明細書ではｍＣＤ８α−１３７−２８−３と称されることもあるｍＣＤ８α−２８−１３７−３（配列番号１９）を含むが、これらに限定されない。
【００７７】
これらのＣＤ８α変異体の各々は、タンデムに連結されている２つ以上のＣＤ２８、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、およびＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインも含むこともできて、これらの細胞内シグナル伝達ドメインは、融合タンパク質のＣＤ８α部分のＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端−およびＣ末端の両方に現れることができる。
【００７８】
ＣＤ４−ＭｙＤ８８
本発明は、マウスおよびヒトのＣＤ４変異体も含む。ＣＤ４変異体は、ＴＩＲドメインを欠くＭｙＤ８８の領域と連結したＣＤ４の細胞外および膜貫通領域を含むＣＤ４−ＭｙＤ８８融合タンパク質を含む。好ましい実施形態では、これらの領域は：ＣＤ４のＮ−細胞外領域−ＣＤ４の膜貫通型領域−ＴＩＲドメイン−Ｃを欠くＭｙＤ８８として連結されている。これらの融合タンパク質のＣＤ４部分は、マウスおよびヒトを含む任意の哺乳動物のＣＤ４由来であってもよい。これらの融合タンパク質のＭｙＤ８８部分は、マウスおよびヒトを含む任意の哺乳動物供給源由来であってもよい。マウスＣＤ４の細胞外および膜貫通領域は、一般的にマウスＣＤ４のアミノ酸１〜４１７（配列番号２１のアミノ酸１〜４１７）に対応する。ヒトＣＤ４の細胞外および膜貫通領域は、一般的にヒトＣＤ４のアミノ酸１〜４１８（配列番号２０のアミノ酸１〜４１８）に対応する。ＴＩＲドメインを欠くヒトＭｙＤ８８の領域は、一般的にヒトＭｙＤ８８のアミノ酸１〜１５５（配列番号２４）に対応する。これらのＣＤ４の変異体の例は、ｍＣＤ４−ｈＭｙＤ８８（配列番号２１）およびｈＣＤ４−ｈＭｙＤ８８（配列番号２０）を含むが、これらに限定されない。
【００７９】
本発明は、ＴＩＲドメインを欠くＭｙＤ８８の領域と連結した元の全長ＣＤ４を含むＣＤ４変異体も含む。好ましい実施形態では、これらの領域は：Ｎ−ＣＤ４−ＴＩＲドメイン−Ｃを欠くＭｙＤ８８として連結されている。これらの融合タンパク質のＣＤ４部分は、マウスおよびヒトを含む任意の哺乳動物のＣＤ４であってもよい。これらの融合タンパク質のＭｙＤ８８部分は、マウスおよびヒトを含む任意の哺乳動物供給源由来であってもよい。ＴＩＲドメインを欠くヒトＭｙＤ８８の領域は、一般的にヒトＭｙＤ８８のアミノ酸１〜１５５（配列番号２４）に対応する。
【００８０】
これらのＣＤ４変異体の各々は、タンデムに連結されているＴＩＲドメインを欠く２つ以上のＭｙＤ８８領域も含むこともできて、これらのＭｙＤ８８領域は、融合タンパク質のＣＤ４部分のＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端の両方に現れることができる。
【００８１】
ＴＣＲ−ＭｙＤ８８
本発明は、マウスおよびヒトのＴＣＲ変異体も含む。ＴＣＲ変異体は、ＴＩＲドメインを欠くＭｙＤ８８の領域と連結したＴＣＲを含むＴＣＲ−ＭｙＤ８８融合タンパク質を含む。好ましい実施形態では、これらの構成要素は：Ｎ−ＴＣＲ−ＴＩＲドメイン−Ｃを欠くＭｙＤ８８として連結されている。これらの融合タンパク質のＴＣＲ部分は、マウスおよびヒトを含む任意の哺乳動物のＴＣＲ由来であってもよい。これらの融合タンパク質のＭｙＤ８８部分は、マウスおよびヒトを含む任意の哺乳動物供給源由来であってもよい。１例では、ＴＣＲはＤＭＦ５  ＴＣＲである。それは、配列番号２２のアミノ酸１〜６０３を含む。ＴＩＲドメインを欠くヒトＭｙＤ８８の領域は、一般的にヒトＭｙＤ８８のアミノ酸１〜１５５（配列番号２４）に対応する。これらのＴＣＲ変異体の例は、ｈＴＣＲ−ｈＭｙＤ８８（配列番号２２）を含むが、これに限定されない。
【００８２】
リンカーおよびスペーサー
本明細書で示したように、本発明の変異体は、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＭｙＤ８８、ＴＣＲ  ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、およびＣＤ３ζなどの分子からのペプチドドメインおよび領域で構成される融合タンパク質を含む。これらのドメインおよび領域が融合タンパク質との関係で連結されている場合、短いリンカーまたはスペーサーが、適当な３次元構造または形状の形成を強化するために望ましい。したがって、本発明の変異体は、機能的ペプチドドメインと融合タンパク質の領域との間に位置する５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５個までまたはそれを超えるアミノ酸の短いペプチドリンカーまたはスペーサーを有することができる。
【００８３】
配列変異体
長さにおける変動
本発明の変異体を含む異なるペプチドドメインおよび領域は、変異体の活性に悪影響のない若干のアミノ酸の変動性を有することができることは明らかであろう。例えば、ペプチドドメインおよび領域は、それらの長さが若干変化することができる。したがって、マウスのＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８融合タンパク質は、マウスＣＤ８αのアミノ酸１〜２１７（配列番号１５）を含むと言われるが、融合タンパク質のこの部分の長さは、多くのアミノ酸により、少数の例にすぎないが例えば、配列番号１５のアミノ酸１〜２１０、または配列番号１５のアミノ酸１〜２１０、または配列番号１５のアミノ酸１０〜２１５、または配列番号１５のアミノ酸８〜２２２であるように、伸張されるかまたは短縮されることもある。
【００８４】
したがって、本発明は、本発明の融合タンパク質の各々について、融合タンパク質で使用されるペプチドドメインおよび領域の長さが、アミノ末端、カルボキシ末端、または両端で、該ドメインまたは領域は、それらが得られた元のポリペプチドの配列に基づき６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１または０個までのアミノ酸だけ個々に増加または減少していてもよい配列変異体を含む。ペプチドドメインおよび領域が、本明細書で定義された特定の変異体と長さが異なるこれらの配列変異体は、それらの基礎となる特定の変異体の活性の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％以上を有するであろう。細胞質ドメインは、使用されることになるドメインおよび特定のドメインの数に依存して、一般的に２０〜１０００個のアミノ酸を有する。膜貫通型ドメインは、一般的に２０〜６０個のアミノ酸を有する。細胞外ドメインは、使用されることになるドメインおよび特定のドメインの数に依存して、一般的に５０〜５０００個のアミノ酸を有する。
【００８５】
配列における変動
本発明の変異体は、変異体の活性に悪影響なしに、それらのアミノ酸組成における変動性を有することができることも明らかであろう。例えば、変異体は、アミノ酸の装入（保存的および／または非保存的）、欠失および／または置換、および任意のそれらの組合せを有することができる。したがって、本発明は、本明細書で定義された特定の変異体と、その特定の変異体の全長にわたって、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する配列変異体も含む。これらの配列変異体は、それらの基礎となる特定の変異体の活性の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％以上を有するであろう。
【００８６】
下の実施例１に示すように、本明細書に記載された変異体のアミノ酸組成における変動は、該変異体を発現している免疫細胞の、抗原提示細胞と接触したときのそれらの応答を含む種々の属性および特徴を変更または変化させると予期することができる。例えば、マウスＣＤ８αにおけるＫ７３Ａの変異は、該タンパク質の元の形式より高い親和性を有するＣＤ８α分子を生ずる。そのような「高い親和性」のＣＤ８α（すなわち、Ｋ７３Ａ変異を有するＣＤ８α）を発現しているＴ細胞は、他のＣＤ８α変異体を発現しているＴ細胞より高いレベルの活性化を示した。
【００８７】
ポリヌクレオチド配列
本発明は、本発明の融合タンパク質および配列変異体の各々をコードするポリヌクレオチド配列も包含する。本発明の範囲内に包含される特定のポリヌクレオチド配列は、配列番号６（ｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８）、配列番号３（ｈＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８）、配列番号７（ｈＣＤ８αＴＭ−ｈＭｙＤ８８）、配列番号８（ｍＣＤ８α−２８−１３７−３）、配列番号１０（ｍＣＤ４−ｈＭｙＤ８８）、配列番号９（ｈＣＤ４−ｈＭｙＤ８８）および配列番号１１（ｈＴＣＲ−ｈＭｙＤ８８）で表されるポリヌクレオチド配列を含む。当業者は、遺伝コードの重複のために、単一のポリペプチドをコードする多数の異なるポリヌクレオチド配列があることを理解するであろう。本発明は、本発明の融合タンパク質または配列変異体をコードする各ポリヌクレオチド配列を含む。したがって、本発明は、ｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８（配列番号１７）、ｈＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８（配列番号１４）、ｈＣＤ８αＴＭ−ｈＭｙＤ８８（配列番号１８）、ｍＣＤ８α−２８−１３７−３（配列番号１９）、ｍＣＤ４−ｈＭｙＤ８８（配列番号２１）、ｈＣＤ４−ｈＭｙＤ８８（配列番号２０）およびｈＴＣＲ−ｈＭｙＤ８８（配列番号２２）をコードするポリヌクレオチド配列を含み、それらの配列変異体の各々は本発明の範囲内に包含される。
【００８８】
細胞
本発明は、本発明の変異体（すなわち、融合タンパク質および配列変異体）を産生するように操作された細胞も包含する。そのような細胞が如何なる細胞かについては、それがその変異体を産生する能力によってしか限定されない。好ましい態様では、細胞は、変異体を産生して、それを細胞の表面に発現させることの両方を行うことができる。細胞は、ヒトまたはマウスの細胞などの哺乳動物細胞、昆虫細胞、および原核細胞、例えば細菌の細胞などを含む。
【００８９】
変異体は、融合タンパク質、ｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８（配列番号１７）、ｈＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８（配列番号１４）、ｈＣＤ８αＴＭ−ｈＭｙＤ８８（配列番号１８）、ｍＣＤ８α−２８−１３７−３（配列番号１９）、ｍＣＤ４−ｈＭｙＤ８８（配列番号２１）、ｈＣＤ４−ｈＭｙＤ８８（配列番号２０）およびｈＴＣＲ−ｈＭｙＤ８８（配列番号２２）、およびそれらの配列変異体を含む。別の態様では、変異体は、配列番号６（ｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８）、配列番号３（ｈＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８）、配列番号７（ｈＣＤ８αＴＭ−ｈＭｙＤ８８）、配列番号８（ｍＣＤ８α−２８−１３７−３）、配列番号１０（ｍＣＤ４−ｈＭｙＤ８８）、配列番号９（ｈＣＤ４−ｈＭｙＤ８８）および配列番号１１（ｈＴＣＲ−ｈＭｙＤ８８）で表されるポリヌクレオチド配列、およびそれらの配列変異体から選択されるポリヌクレオチド配列によりコードされる。
【００９０】
本発明の特定の態様では、これらの変異体を発現している細胞は、本明細書で論ずるような医療処置の方法で使用することができる。そのような方法で使用される変異体を発現している細胞は、治療される個体の自己の、同系のまたは同種の細胞から、治療されるべき疾患およびそうするために利用できる手段に応じて、選択して誘導することができる。本方法で使用することができる細胞の適当な集団は、細胞崩壊活性を有するＴ細胞などの任意の免疫細胞を含む。Ｔ細胞の典型的亜集団は、ＣＤ４＋Ｔ細胞などのＣＤ４を発現しているもの、ＣＤ８＋Ｔ細胞などのＣＤ８を発現しているもの、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、好中球、マクロファージ、樹状細胞、肥満細胞、好塩基球、Ｂ細胞および他の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）または他の初代またはいわゆる万能供与体細胞を含む確立された細胞株を含むが、これらに限定されない。細胞は、対象の血液、リンパ節または脾臓を含む任意の供給源から、または対象の腫瘍外植片または対象の腫瘍内部のＴ細胞から単離することもできる。
【００９１】
細胞は、本発明の１種またはそれ以上の変異体を発現するように操作することもできる。したがって、本発明は、少なくとも１種、２種、または３種以上の本発明の変異体を発現している細胞の集団、ならびに１種またはそれ以上の本発明の変異体を発現している細胞の集団を包含する。
【００９２】
細胞は、当業者に容易に知られる手段により本発明の変異体を発現するように操作することができる。一般的に、融合タンパク質または配列変異体をコードするポリヌクレオチドベクターが構築され、該ベクターがＴ細胞などの細胞の集団にトランスフェクトされる。次に細胞は、該細胞による融合タンパク質または配列変異体の発現を促進する条件下で成長させられる。成功したトランスフェクション（またはウイルスにより媒介される遺伝子挿入を指す形質導入）およびポリペプチドの細胞表面表示は、その幾つかは本明細書における実施例で開示されている従来の手段により実施される。
【００９３】
一態様では、Ｔ細胞は、選択された融合タンパク質または配列変異体をコードするレトロウイルスベクターを最初に構築することにより変異体を産生するように操作することもできる。典型的レトロウイルスベクターは、ｐＭＳＧＶ（マウスの幹細胞のウイルスに基づくスプライス−ｇａｇベクター）から誘導されるベクター骨格ｐＭＳＧＶ１−ＣＤ８−２８ＢＢＺを含むが、これらに限定されない。しかしながら、遺伝子挿入またはタンパク質の発現、例えば、ヌクレオフェクションもしくはＤＮＡ、ＲＮＡもしくはタンパク質の一過性発現など他の手段も適当である。ＤＮＡの配列決定は、Ｔ細胞のトランスフェクション前にベクターの適当な構築物を確認するために使用することができる。レトロウイルスの形質導入は、Ｊｏｈｎｓｏｎらの方法（Ｂｌｏｏｄ  第１１４巻、５３５〜５４６頁（２００９年））などの知られている技法を使用して実施することもできる。形質導入されたＴ細胞における融合タンパク質および配列変異体の表面における発現は、例えば、標識された抗体で細胞を染色した後フローサイトメトリーによって決定することもできる。
【００９４】
本発明の変異体を発現している免疫細胞は、該変異体を発現しない元の免疫細胞と比較して属性が改善されている。例えば、Ｔ細胞における変異体の発現は、ＭＤＳＣにより媒介される抑制に対する耐性をＴ細胞に付与する。さらに、ある免疫細胞で変異体を発現させると、これらの細胞は、低濃度の抗原および／または免疫原性の弱い抗原を認識する能力が強化される。それ故、本発明は、本発明の少なくとも１種の変異体をＴ細胞またはＴ細胞の集団で発現させることを含む、Ｔ細胞におけるＭＤＳＣにより媒介される抑制に対する耐性を付与する方法を含む。
【００９５】
本発明は、本発明の少なくとも１種の変異体を免疫細胞または免疫細胞の集団で発現させることを含む、低濃度の選択された抗原を認識する免疫細胞の能力を強化する方法も含む。本発明は、本発明の少なくとも１種の変異体を免疫細胞または免疫細胞の集団で発現させることを含む、免疫原性の弱い抗原を認識する免疫細胞の能力を強化する方法をさらに含む。免疫細胞は、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞）、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、好中球、マクロファージ、樹状細胞、肥満細胞、好塩基球、Ｂ細胞および他の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）もしくは他の初代またはいわゆる万能供与体細胞を含む確立された細胞株を含むが、これらに限定されない。
【００９６】
細胞の投与
変異体を発現している細胞の集団は、当業者に知られている技法を使用して、対象に投与するために製剤化することができる。変異体を発現している細胞を含む製剤は、薬学的に許容される賦形剤（単数または複数）を含むこともできる。剤形製剤に含まれる賦形剤は、例えば、発現される変異体（例えば、ＣＤ８α−ＭｙＤ８８またはＴＣＲ−ＭｙＤ８８）の性質、使用されるＴ細胞の亜集団、および投与様式に依存して、異なる目的を有する。一般的に使用される賦形剤の例は：生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロ−ス、感染のための水（water-for-infection）、グリセロール、エタノール、およびそれらの組合せ、安定剤、可溶化剤および界面活性剤、緩衝剤および防腐剤、等張剤、増量剤、および潤滑剤を含むが、これらに限定されない。変異体を発現しているＴ細胞の集団を含む製剤は、動物血清（例えば、ウシ血清アルブミン）などの如何なる非ヒト成分の非存在下で製造されて培養されてきた。
【００９７】
製剤は、変異体を発現している細胞の集団の１つまたそれを超える、例えば、２、３、４、５、６またはそれ以上の異なる変異体を発現している細胞の集団を含むこともできる。異なる変異体を発現している細胞の集団は、如何なる変異体なのか、如何なるＴ細胞の亜集団なのか、またはそれらの組合せに基づいて変化することができる。
【００９８】
変異体を発現している細胞の集団（単数または複数）を含む製剤は、当業者に知られている様式および技法を使用して、対象に投与することができる。典型的様式は、静脈内注射を含むが、これに限定されない。他の様式は、腫瘍内部、皮内、皮下（ｓ．ｃ．、ｓ．ｑ．、ｓｕｂ−Ｑ、Ｈｙｐｏ）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、動脈内、髄内、心臓内、関節内（関節）、滑液嚢内（関節液野）、脳内、脊髄内、および髄腔内（脊髄液）を含むが、これらに限定されない。製剤の非経口的注射または輸注のために有用な任意の知られているデバイスを、そのような投与を実行するために使用することができる。
【００９９】
対象に投与される変異体を発現している細胞の集団（単数または複数）を含む製剤は、特定の適応症または疾患の治療に効果的な多くの変異体を発現している細胞を含む。したがって、本発明の方法が実行されるべき場合、変異体を発現している細胞の集団（単数または複数）を含む製剤の治療的有効量が対象に投与される。一般的に、変異体を発現している約１×１０３〜約１×１０１０個の間の細胞を含む製剤が投与される。大部分の場合、製剤は、約１×１０３と約１×１０８個の間の変異体を発現している細胞、約５×１０５〜約５×１０８個の変異体を発現している細胞、または約１×１０６〜約１×１０７個の変異体を発現している細胞を含む。しかしながら、対象に投与される変異体を発現している細胞の数は、疾患の位置、供給源、同一性、範囲および重症度、治療されるべき個体の年齢および状態、その他に依存して、広い範囲の間で変化するであろう。医師は、使用されるべき適当な投薬量を最終的に決定するであろう。
【０１００】
方法
癌の治療および予防
ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＭＨＣ  Ｉ分子に提示されたペプチドを認識する。癌細胞を含む全ての有核細胞はＭＨＣ  Ｉを発現しているので、実質的には如何なるタイプの癌も検知して細胞傷害性Ｔ細胞によって破壊することができる。いくつかの場合、腫瘍細胞が、ＭＨＣ  Ｉ発現を低下させてＴ細胞認識を逃れることができる。しかしながら、Ｔ細胞でＣＤ８α−ＭｙＤ８８を発現することは、低い抗原レベルまたは免疫原性の弱い抗原であってもＴ細胞の応答を強化するという利点を提供する。
【０１０１】
一方、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＭＨＣ  ＩＩ分子において提示されるペプチドを認識する。ＣＤ８にように、ＣＤ４は、ＴＣＲ共受容体として役立つ。それ故、ＣＤ８α−ＭｙＤ８８またはＣＤ４−ＭｙＤ８８のいずれかを（それぞれＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４−Ｔ細胞のいずれかに）発現することで、それらの応答を増強することが可能である。ＣＤ４−ＭｙＤ８８変異体の例は、本明細書で提供される。ＴＣＲおよびＴＣＲシグナル伝達分子が局在化して標的細胞上のＭＨＣと相互作用する場の免疫シナプスに、ＣＤ８は局在化するので、任意の手段により免疫シナプスにもたらされたＭｙＤ８８が、ＴＣＲシグナルも強化することができることも可能である。例えば、ＣＤ８（またはＣＤ４または任意の他のＴＣＲのシグナル伝達に関係する分子）の膜貫通型ドメインをＭｙＤ８８と融合させることは、ＭｙＤ８８の局在化を通してＴ細胞の応答を増強するために使用することができる。
【０１０２】
したがって、本発明は、癌を有する対象を治療する方法であって、癌を有する対象に、本発明の少なくとも１種の変異体を発現している細胞の集団の治療的有効量を投与することを含む方法を包含する。本発明は、癌を有する対象を治療する方法であって、癌を有する対象に、本発明の少なくとも１種の変異体を発現している細胞の少なくとも１つ集団および賦形剤を含む製剤の治療的有効量を投与することを含む方法も包含する。
【０１０３】
本発明は、対象における癌を予防する方法であって、癌を発症するリスクのある対象に、本発明の少なくとも１種の変異体を発現している細胞の集団の治療的有効量を投与することを含む方法も包含する。本発明は、対象における癌を予防する方法であって、癌を発症するリスクのある対象に、本発明の少なくとも１種の変異体を発現している細胞の少なくとも１つの集団および賦形剤を含む製剤の治療的有効量を投与することを含む方法をさらに包含する。
【０１０４】
用語「癌」は、広く解釈されることが意図されており、それは、異常な細胞成長および／または細胞分裂の全ての態様を包含する。例として：腺癌、扁平上皮細胞癌、腺扁平上皮癌、未分化癌、大細胞癌、小細胞癌、および皮膚、乳房、前立腺、膀胱、膣、子宮頸部、子宮、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、肺、気管、気管支、大腸、小腸、胃、食道、胆嚢の癌を含むが、これらに限定されない癌；軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性の血管内皮腫、悪性の神経鞘腫、骨肉腫、軟組織肉腫を含むが、これらに限定されない肉腫、および骨、軟骨、脂肪、筋肉、脈管、および造血性組織の癌；成熟Ｂ細胞新生物、例えば、慢性リンパ球性白血病／小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病など、リンパ腫、およびプラズマ細胞新生物、成熟Ｔ細胞および天然キラー（ＮＫ）細胞新生物、例えば、Ｔ細胞前リンパ球性白血病、Ｔ細胞大顆粒状リンパ球性白血病、侵攻性ＮＫ細胞白血病、および成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫など、ホジキンリンパ腫、および免疫不全関連リンパ組織増殖性の障害を含むが、これらに限定されないリンパ腫および白血病；精巣および卵巣の癌を含むが、これらに限定されない胚芽細胞腫瘍；肝芽腫、髄芽腫、腎芽細胞腫、神経芽細胞腫、膵芽細胞腫、胸膜肺芽細胞腫および網膜芽細胞腫を含むが、これらに限定されない芽細胞腫が含まれる。該用語は良性腫瘍も包含する。
【０１０５】
感染性疾患の治療および予防
ウイルスおよびある種の細菌および真菌などの感染性病原体は、宿主細胞またはプロフェッショナル抗原提示細胞と言われる免疫細胞により内在化される。該細胞は、感染性病原体の一部を加工処理して、それらをＭＨＣ  Ｉにおいて細胞表面に提示し、それは次にＴ細胞によって認識される。ＣＤ８α−ＭｙＤ８８のＴ細胞における発現は、抗原の供給源に関わらず、ＭＨＣ分子に提示された任意の抗原に対するＴ細胞の応答を強化するという利点を提供する。この戦略は：高齢者個体、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染した患者、Ｔ細胞の応答を抑制する療法（すなわちステロイド療法、癌の化学療法、放射線療法）で治療されてきた患者を含むが、これらに限定されない、免疫を抑制された個体の免疫応答を増強するために使用することができる。
【０１０６】
したがって、本発明は、感染性疾患を有する対象を治療する方法であって、感染性疾患を有する対象に、本発明の少なくとも１種の変異体を発現している細胞の集団の治療的有効量を投与することを含む方法を包含する。本発明は、感染性疾患を有する対象を治療する方法であって、感染性疾患を有する対象に、少なくとも１種の本発明の変異体を発現している細胞の少なくとも１つの集団を含む製剤の治療的有効量および賦形剤を投与することを含む方法も包含する。
【０１０７】
それに加えて、本発明は、対象における感染性疾患を予防する方法であって、感染性疾患を発症するリスクのある対象に、本発明の少なくとも１種の変異体を発現している細胞の集団の治療的有効量を投与することを含む方法を包含する。本発明は、対象における感染性疾患を予防する方法であって、感染性疾患を発症するリスクのある対象に、少なくとも１種の本発明の変異体を発現している細胞の少なくとも１つの集団および賦形剤を含む製剤の治療的有効量を投与することを含む方法をさらに包含する。
【０１０８】
感染性疾患が如何なる感染性疾患かについては、抗原提示細胞が、感染性疾患の原因となる作用因子に由来する抗原を、ＭＨＣ  Ｉにおいて細胞表面に提示する能力を有する点についてのみ限定される。ウイルス、細菌および真菌により引き起こされる感染性疾患は、本発明の範囲内に包含される。
【０１０９】
自己免疫疾患の治療および予防
本発明は、自己破壊反応性の細胞を標的とすることにより、自己免疫障害を有する対象を治療する方法を包含する。したがって、自己免疫障害を有する対象を治療する方法であって、自己免疫障害を有する対象に、本発明の少なくとも１種の変異体を発現している細胞の集団の治療的有効量を投与することを含む方法は、本発明に含まれる。本発明は、自己免疫障害を有する対象を治療する方法であって、自己免疫障害を有する対象に、少なくとも１種の本発明の変異体を発現している細胞の少なくとも１つの集団および賦形剤を含む製剤の治療的有効量を投与することを含む方法も包含する。
【０１１０】
本発明は、自己破壊反応性の細胞を標的とすることにより、自己免疫障害を予防する方法も包含する。したがって、対象における自己免疫障害を予防する方法であって、自己免疫障害を発症するリスクのある対象に、本発明の少なくとも１種の変異体を発現している細胞の集団の治療的有効量を投与することを含む方法は、本発明に含まれる。本発明は、対象における自己免疫障害を予防する方法であって、自己免疫障害を発症するリスクのある対象に、少なくとも１種の本発明の変異体を発現している細胞の少なくとも１つの集団および賦形剤を含む製剤の治療的有効量を投与することを含む方法も包含する。
【０１１１】
自己免疫障害が如何なるものであるかについての限定はない。しかしながら、例として、狼瘡、関節炎、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、円形脱毛症、セリアック病が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１２】
抗原認識の強化
本発明は、１種またはそれ以上の本発明の変異体を発現する免疫細胞の操作を通してＴ細胞などの免疫細胞の活性を変化させる方法を包含する。例えば、免疫細胞における変異体の発現は、ＭＨＣ  Ｉによる提示における抗原の認識を含め、抗原（例えば、対象に低濃度で存在する抗原または抗原性の弱い抗原）を認識する；エフェクター細胞を活性化する；エフェクター細胞により活性化される；抗原提示細胞と会合したままとどまる；エフェクター細胞による抑制を回避する、免疫細胞の能力における改善を提供することができる。
【０１１３】
したがって、ＭＤＳＣにより媒介される抑制に対する耐性をＴ細胞に付与する方法は本発明に含まれる。これらの方法は、本発明の少なくとも１種の変異体をＴ細胞で発現させることを含む。特定の態様では、変異体は、ｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８（配列番号１７）、ｈＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８（配列番号１４）、ｈＣＤ８αＴＭ−ｈＭｙＤ８８（配列番号１８）、ｍＣＤ８α−２８−１３７−３（配列番号１９）、ｍＣＤ４−ｈＭｙＤ８８（配列番号２１）、ｈＣＤ４−ｈＭｙＤ８８（配列番号２０）およびｈＴＣＲ−ｈＭｙＤ８８（配列番号２２）およびそれらの配列変異体からなる群から選択される。
【０１１４】
関係する態様では、本発明は、免疫細胞の抗原の認識を強化する方法を含む。これらの方法は、本発明の少なくとも１種の変異体を免疫細胞で発現させることを含む。特定の態様では、変異体は、ｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８（配列番号１７）、ｈＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８（配列番号１４）、ｈＣＤ８αＴＭ−ｈＭｙＤ８８（配列番号１８）、ｍＣＤ８α−２８−１３７−３（配列番号１９）、ｍＣＤ４−ｈＭｙＤ８８（配列番号２１）、ｈＣＤ４−ｈＭｙＤ８８（配列番号２０）およびｈＴＣＲ−ｈＭｙＤ８８（配列番号２２）、およびそれらの配列変異体からなる群から選択される。この実施形態のある態様では、抗原は、インビトロもしくはインビボで、低濃度で存在するか、または該抗原は抗原性の弱い抗原であるか、またはそれらの両方である。
【０１１５】
免疫細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、好中球、マクロファージ、樹状細胞、肥満細胞、好塩基球、Ｂ細胞および他の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、腫瘍浸潤リンパ球または他の初代またはいわゆる万能供与体細胞を含む確立された細胞株を含むが、これらに限定されない。
【０１１６】
本明細書において使用する、用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、および「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、それらの通常のおよび常習的な意味を有し：対象における癌または感染の症状を、重症度および／または頻度において、ブロックし、緩和しまたは低下させること、および／または癌細胞、細菌細胞もしくはウイルスの成長、分裂、蔓延、もしくは増殖、または対象における癌（例えば、新しい腫瘍の出現）、細菌感染またはウイルス感染の進行を阻害することの１つまたはそれ以上を含む。治療は、本発明の方法が実施されたことのない対象に対して約１％〜約１００％抑制し、緩和しまたは低下させ、または阻害することを意味する。好ましくは、ブロックし、緩和しまたは低下させ、または阻害することは、本発明の方法が実施されたことのない対象に対して約１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％または１％である。
【０１１７】
本明細書において使用する、用語「防止する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「防止すること（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」および「防止（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」は、それらの通常のおよび常習的な意味を有し、対象における癌または感染の発症を停止させる、避ける、回避する、軽減するもしくはブロックすること、および／または癌細胞、細菌細胞またはウイルスの成長、分裂、蔓延、または増殖、または癌の進行（例えば、新しい腫瘍の出現）、細菌感染またはウイルス感染を停止させる、避ける、回避する、軽減するまたはブロックすることの１つまたはそれ以上を含む。予防は、予防が適用されたことがない対象に対して、少なくとも約９５％停止させることを意味する。好ましくは、停止は、約１００％、約９９％、約９８％、約９７％、約９６％または約９５％である。予防の結果は、永続性であることもあり、日（１、２、３、４、５、６または７日など）、週（１、２、３または４週間）または月（１、２、３、４、５、６カ月またはそれ以上など）単位の期間持続することもある。
【０１１８】
変異体を発現している細胞の集団を含む製剤の投与頻度は、治療される疾患または状態、変異体を発現している細胞が如何なるものであるか、および投与様式を含む要因に依存して変化するであろう。各製剤は、毎日４、３、２または１回、１日置き、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎に、１週間に１回、８日毎、９日毎、１０日毎に、２週間に１回、１カ月に１回および２カ月に１回、独立に投与することができる。
【０１１９】
治療の継続期間は、治療される疾患または状態に基づいて主治医によって決定されるのが最もよいであろう。しかしながら、治療は、多くの日、週、または月の間継続することが考慮される。
【０１２０】
本発明は、１種またはそれ以上の変異体を発現している細胞の集団で満たされた１つまたはそれ以上の容器を含むキットも提供する。キットは、使用説明書も含んでもよい。キットには、医薬品またはバイオ医薬製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規制された形式における注意書がさらに付随して、その注意書はヒトへの投与に関する製造、使用または販売の当局による承認を反映する。
【０１２１】
ＩＩＩ．実施例
〔実施例１〕
ＭＨＣに対するＣＤ８αの親和性を変化させることによってＴ細胞の応答を増大させることができる可能性を探索するために、マウスＣＤ８αの３種の変異体を製造した。第１の変異体は、Ｋ７３Ａ変異を有する（「高親和性ＣＤ８α」；配列番号２３）マウスＣＤ８α構築物であった。第２の変異体は、４−１ＢＢ−ＣＤ２８−ＣＤ３の細胞内活性化ドメイン（ｍＣＤ８α−２８−１３７−３；配列番号１９）と連結したマウスＣＤ８αの細胞外および膜貫通型部分を含むマウスＣＤ８α構築物であった。第３の変異体は、細胞内ドメインが欠失したマウスＣＤ８α構築物（ｍＣＤ８αΔＩＣ；配列番号１６）であった。メラノーマに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞をレトロウイルス形質導入により操作して、これらの３種のＣＤ８α変異体またはＧＦＰベクター対照を発現させた。約５０〜６０％のＣＤ８＋Ｔ細胞がＧＦＰ発現により指示されたようにベクターを発現した（データ掲載せず）。Ｔ細胞とメラノーマ腫瘍細胞とを２４時間共培養した後、ＩＦＮ−γ産生（Ｔ細胞活性化の目安）を検査した。刺激すると、高親和性ＣＤ８α（すなわち、Ｋ７３Ａ変異を有するＣＤ８α）を発現しているＴ細胞は、他のＣＤ８α変異体を発現しているＴ細胞より高いレベルの活性化を示した（図２）。
【０１２２】
ｍＣＤ８α（配列番号２３）：
【化１】
2017538443.tif 000003
【０１２３】
〔実施例２〕
材料および方法
マウスおよび細胞株。Ｃ５７ＢＬ６マウスをメリーランド大学（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）内にあるＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ、米国）、特定病原体除去動物施設から購入して、採用する免疫療法の受容者として使用した。実験は、メリーランド大学（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）の動物実験委員会（Institutional Animal Care and Use Committee）によって審査されて承認された。
【０１２４】
マウスメラノーマのＢ１６細胞株（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）は、１０％熱不活化ウシ胎児血清（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｗｅｓｔ  Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ、ＣＡ、米国）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（ＧＩＢＣＯブランド；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１％ペニシリン−ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯブランド；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で補完されたダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ＧＩＢＣＯブランド；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、米国）中で維持した。Ｐｈｏｅｎｉｘ  ＥｃｏｔｒｏｐｉｃまたはＡｍｐｈｔｒｏｐｉｃ梱包細胞株は、Ｏｒｂｉｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、米国）から購入して、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１％ピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含有するＤ１０培地中で維持した。
【０１２５】
ＣＤ８およびＴＣＲ変異体の構築。図３は、ベクター構築物の模式的表示、およびフレーム中の成分の５’末端から３’末端への配置の順を示す。ＣＤ８α−ＭｙＤ８８の変異体は、マウスまたはヒトＣＤ８α配列をヒトＭｙＤ８８のデスドメインおよび中間ドメインの配列と融合させることにより設計した。ＭｙＤ８８分子のＴｏｌｌ−インターロイキン受容体（ＴＩＲ）ドメインを、内因性の受容体に対する結合を排除するために除外した。ＣＤ８α−２８−１３７−３変異体を、伝統的第３世代ＣＡＲ：ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインと連結したマウスまたはヒトの細胞外ＣＤ８αで構成した。これは、ＭｙＤ８８シグナル伝達構築物によるＴ細胞活性化のレベルを比較するための対照としての役目を果たす。ＣＤ８ΔＩＣ変異体は、マウスまたはヒトＣＤ８αの細胞外およびヒンジドメインで構成され、如何なる細胞内シグナル伝達部分も含有しない。ＭｙＤ８８ＴＭ変異体は、マウスまたはヒトＣＤ８α分子の膜貫通型部分と融合したＭｙＤ８８のデスドメインおよび中間ドメインで構成され、膜におけるＭｙＤ８８の過剰発現を制御する。遺伝子を、ＩＲＥＳ配列の下流にあると報告されたＧＦＰを含有するｐＭＩＧ−ｗベクター中でクローン化した。該構築物をＨＥＫ２９３細胞中にトランスフェクトしてフローサイトメトリーによりＣＤ８α発現を分析した。
【０１２６】
ＴＩＲドメインを欠くヒトＭｙＤ８８と融合した、ＭＨＣ  Ｉにより提示されるＭＡＲＴ−１メラノーマ抗原からのＭＡＲＴ−１２６〜３５ペプチドに特異的なＤＭＦ５、ヒトＴＣＲを含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）変異体も生成した。
【０１２７】
レトロウイルスベクターの構築。レトロウイルスベクター骨格ｐＭＳＧＶ１−ＣＤ８−２８ＢＢＺ（Ｈｕｇｈｅｓ  Ｍ．Ｓ．ら、Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ａ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＣＲ）  ｇｅｎｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ａ  ｍａｒｋｅｄ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｃｏｎｖｅｙｓ  ｈｉｇｈｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２００５年４月；第１６巻（４）：４５７〜７２頁）は、Ｄｒ．Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｍｏｒｇａｎ（国立がん研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、米国））の好意によるギフトであり、ｐＭＳＧＶ（マウスの幹細胞ウイルスに基づくスプライス−ｇａｇベクター）から誘導されたものである。
【０１２８】
マウスＣＤ８α（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＮＭ＿００１０８１１１０．２）、ヒトＣＤ８α（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＮＭ＿００１７６８．６）およびヒトＭｙＤ８８（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＮＭ＿００１１７２５６７．１）を、ＣＤ８α変異体をコードするレトロウイルスベクターの産生に使用した。使用したＭｙＤ８８ヌクレオチド配列は、Ｔｏｌｌ／ＩＬ−１受容体（ＴＩＲ）ドメイン（ＮＭ＿００１１７２５６７．１、ヌクレオチド＃２２４〜６８８）を欠く領域を示す。ヒトのＣＤ８αの細胞外および膜貫通領域（ＮＭ＿００１７６８．６、ヌクレオチド＃８９０〜１４９８）またはマウスＣＤ８α（ＮＭ＿００１０８１１１０．２、ヌクレオチド＃２４７〜７７７）も使用した。
【０１２９】
ＣＤ４−ＭｙＤ８８変異体を構築するために、ＴＩＲドメインを欠くＭｙＤ８８と連結したヒト（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＮＭ＿０００６１６）またはマウス（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＮＭ＿０１３４８８）ＣＤ４をコードするレトロウイルスベクターを製造した。
【０１３０】
ＴＣＲ−ＭｙＤ８８変異体を構築するために、ヒトＭｙＤ８８（ＴＩＲドメインを欠く）を、レトロウイルスベクター中のヒトＤＭＦ５ＴＣＲαβ鎖（ＴＣＲα鎖−Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号（３ＱＥＵ＿Ｄ）およびＧＩ（ＧＩ：３３９７１７５８６）の下流でクローン化した（ＴＣＲベータ鎖  Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号（３ＱＥＵ＿Ｅ）およびＧＩ：３３９７１７５８７；Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２００６年；第１７７巻（９）：６５４８〜５９頁も参照されたい）。ＤＭＦ５ベクターは、Ｄｒ．Ｌａｕｒａ  Ｊｏｈｎｓｏｎにより提供された（ＮＣＩ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ；Ｊｏｈｎｓｏｎ、ＬＡら、Ｂｌｏｏｄ  ２００９年；１１４巻：５３５〜５４６頁；Ｊｏｈｎｓｏｎ、ＬＡら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６年；１７７巻：６５４８〜６５５９頁）。
【０１３１】
該構築物の配列は、ＤＮＡ配列決定により確認されて以下の通りである：
【０１３２】
ヒトＣＤ８αの全配列（ｈＣＤ８α）：ｇｉ：２２５００７５３４：ｒｅｆ：ＮＭ＿００１７６８．６（配列番号１）：
ＡＴＧＧＣＣＴＴＡＣＣＡＧＴＧＡＣＣＧＣＣＴＴＧＣＴＣＣＴＧＣＣＧＣＴＧＧＣＣＴＴＧＣＴＧＣＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＡＧＧＣＣＧＡＧＣＣＡＧＴＴＣＣＧＧＧＴＧＴＣＧＣＣＧＣＴＧＧＡＴＣＧＧＡＣＣＴＧＧＡＡＣＣＴＧＧＧＣＧＡＧＡＣＡＧＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＧＴＧＣＣＡＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＴＣＣＡＡＣＣＣＧＡＣＧＴＣＧＧＧＣＴＧＣＴＣＧＴＧＧＣＴＣＴＴＣＣＡＧＣＣＧＣＧＣＧＧＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＡＧＴＣＣＣＡＣＣＴＴＣＣＴＣＣＴＡＴＡＣＣＴＣＴＣＣＣＡＡＡＡＣＡＡＧＣＣＣＡＡＧＧＣＧＧＣＣＧＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＣＡＣＣＣＡＧＣＧＧＴＴＣＴＣＧＧＧＣＡＡＧＡＧＧＴＴＧＧＧＧＧＡＣＡＣＣＴＴＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＣＴＧＡＧＣＧＡＣＴＴＣＣＧＣＣＧＡＧＡＧＡＡＣＧＡＧＧＧＣＴＡＣＴＡＴＴＴＣＴＧＣＴＣＧＧＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＴＧＴＡＣＴＴＣＡＧＣＣＡＣＴＴＣＧＴＧＣＣＧＧＴＣＴＴＣＣＴＧＣＣＡＧＣＧＡＡＧＣＣＣＡＣＣＡＣＧＡＣＧＣＣＡＧＣＧＣＣＧＣＧＡＣＣＡＣＣＡＡＣＡＣＣＧＧＣＧＣＣＣＡＣＣＡＴＣＧＣＧＴＣＧＣＡＧＣＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＣＧＣＣＣＡＧＡＧＧＣＧＴＧＣＣＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＧＧＧＧＧＧＣＧＣＡＧＴＧＣＡＣＡＣＧＡＧＧＧＧＧＣＴＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＴＧＴＧＡＴＡＴＣＴＡＣＡＴＣＴＧＧＧＣＧＣＣＣＴＴＧＧＣＣＧＧＧＡＣＴＴＧＴＧＧＧＧＴＣＣＴＴＣＴＣＣＴＧＴＣＡＣＴＧＧＴＴＡＴＣＡＣＣＣＴＴＴＡＣＴＧＣＡＡＣＣＡＣＡＧＧＡＡＣＣＧＡＡＧＡＣＧＴＧＴＴＴＧＣＡＡＡＴＧＴＣＣＣＣＧＧＣＣＴＧＴＧＧＴＣＡＡＡＴＣＧＧＧＡＧＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＣＴＴＴＣＧＧＣＧＡＧＡＴＡＣＧＴＣ
【０１３３】
細胞内シグナル伝達ドメイン（ｈＣＤ８αΔＩＣ）のないヒトＣＤ８α（配列番号２）：ＡＴＧＧＣＣＴＴＡＣＣＡＧＴＧＡＣＣＧＣＣＴＴＧＣＴＣＣＴＧＣＣＧＣＴＧＧＣＣＴＴＧＣＴＧＣＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＡＧＧＣＣＧＡＧＣＣＡＧＴＴＣＣＧＧＧＴＧＴＣＧＣＣＧＣＴＧＧＡＴＣＧＧＡＣＣＴＧＧＡＡＣＣＴＧＧＧＣＧＡＧＡＣＡＧＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＧＴＧＣＣＡＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＴＣＣＡＡＣＣＣＧＡＣＧＴＣＧＧＧＣＴＧＣＴＣＧＴＧＧＣＴＣＴＴＣＣＡＧＣＣＧＣＧＣＧＧＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＡＧＴＣＣＣＡＣＣＴＴＣＣＴＣＣＴＡＴＡＣＣＴＣＴＣＣＣＡＡＡＡＣＡＡＧＣＣＣＡＡＧＧＣＧＧＣＣＧＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＣＡＣＣＣＡＧＣＧＧＴＴＣＴＣＧＧＧＣＡＡＧＡＧＧＴＴＧＧＧＧＧＡＣＡＣＣＴＴＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＣＴＧＡＧＣＧＡＣＴＴＣＣＧＣＣＧＡＧＡＧＡＡＣＧＡＧＧＧＣＴＡＣＴＡＴＴＴＣＴＧＣＴＣＧＧＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＴＧＴＡＣＴＴＣＡＧＣＣＡＣＴＴＣＧＴＧＣＣＧＧＴＣＴＴＣＣＴＧＣＣＡＧＣＧＡＡＧＣＣＣＡＣＣＡＣＧＡＣＧＣＣＡＧＣＧＣＣＧＣＧＡＣＣＡＣＣＡＡＣＡＣＣＧＧＣＧＣＣＣＡＣＣＡＴＣＧＣＧＴＣＧＣＡＧＣＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＣＧＣＣＣＡＧＡＧＧＣＧＴＧＣＣＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＧＧＧＧＧＧＣＧＣＡＧＴＧＣＡＣＡＣＧＡＧＧＧＧＧＣＴＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＴＧＴＧＡＴＡＴＣＴＡＣＡＴＣＴＧＧＧＣＧＣＣＣＴＴＧＧＣＣＧＧＧＡＣＴＴＧＴＧＧＧＧＴＣＣＴＴＣＴＣＣＴＧＴＣＡＣＴＧＧＴＴＡＴＣＡＣＣ
【０１３４】
ＭｙＤ８８がＴＩＲドメイン（ｈＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８）を欠くヒトＣＤ８α−ＭｙＤ８８ΔＴＩＲ（配列番号３）：
下線を引いた区間はＭｙＤ８８配列を表す。
ＡＴＧＧＣＣＴＴＡＣＣＡＧＴＧＡＣＣＧＣＣＴＴＧＣＴＣＣＴＧＣＣＧＣＴＧＧＣＣＴＴＧＣＴＧＣＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＡＧＧＣＣＧＡＧＣＣＡＧＴＴＣＣＧＧＧＴＧＴＣＧＣＣＧＣＴＧＧＡＴＣＧＧＡＣＣＴＧＧＡＡＣＣＴＧＧＧＣＧＡＧＡＣＡＧＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＧＴＧＣＣＡＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＴＣＣＡＡＣＣＣＧＡＣＧＴＣＧＧＧＣＴＧＣＴＣＧＴＧＧＣＴＣＴＴＣＣＡＧＣＣＧＣＧＣＧＧＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＡＧＴＣＣＣＡＣＣＴＴＣＣＴＣＣＴＡＴＡＣＣＴＣＴＣＣＣＡＡＡＡＣＡＡＧＣＣＣＡＡＧＧＣＧＧＣＣＧＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＣＡＣＣＣＡＧＣＧＧＴＴＣＴＣＧＧＧＣＡＡＧＡＧＧＴＴＧＧＧＧＧＡＣＡＣＣＴＴＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＣＴＧＡＧＣＧＡＣＴＴＣＣＧＣＣＧＡＧＡＧＡＡＣＧＡＧＧＧＣＴＡＣＴＡＴＴＴＣＴＧＣＴＣＧＧＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＴＧＴＡＣＴＴＣＡＧＣＣＡＣＴＴＣＧＴＧＣＣＧＧＴＣＴＴＣＣＴＧＣＣＡＧＣＧＡＡＧＣＣＣＡＣＣＡＣＧＡＣＧＣＣＡＧＣＧＣＣＧＣＧＡＣＣＡＣＣＡＡＣＡＣＣＧＧＣＧＣＣＣＡＣＣＡＴＣＧＣＧＴＣＧＣＡＧＣＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＣＧＣＣＣＡＧＡＧＧＣＧＴＧＣＣＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＧＧＧＧＧＧＣＧＣＡＧＴＧＣＡＣＡＣＧＡＧＧＧＧＧＣＴＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＴＧＴＧＡＴＡＴＣＴＡＣＡＴＣＴＧＧＧＣＧＣＣＣＴＴＧＧＣＣＧＧＧＡＣＴＴＧＴＧＧＧＧＴＣＣＴＴＣＴＣＣＴＧＴＣＡＣＴＧＧＴＴＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＧＴＣＣＣＧＧＣＧＣＧＧＧＧＴＣＴＧＣＧＧＣＣＣＣＧＧＴＣＴＣＣＴＣＣＡＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＴＣＣＣＣＴＧＧＣＴＧＣＴＣＴＣＡＡＣＡＴＧＣＧＡＧＴＧＣＧＧＣＧＣＣＧＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＴＴＣＴＴＧＡＡＣＧＴＧＣＧＧＡＣＡＣＡＧＧＴＧＧＣＧＧＣＣＧＡＣＴＧＧＡＣＣＧＣＧＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＧＡＣＴＴＴＧＡＧＴＡＣＴＴＧＧＡＧＡＴＣＣＧＧＣＡＡＣＴＧＧＡＧＡＣＡＣＡＡＧＣＧＧＡＣＣＣＣＡＣＴＧＧＣＡＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＧＣＣＴＧＧＣＡＧＧＧＡＣＧＣＣＣＴＧＧＣＧＣＣＴＣＴＧＴＡＧＧＣＣＧＡＣＴＧＣＴＣＧＡＧＣＴＧＣＴＴＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＧＣＣＧＣＧＡＣＧＡＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＧＡＣＣＣＡＧＣＡＴＴＧＡＧＧＡＧＧＡＴＴＧＣＣＡＡＡＡＧＴＡＴＡＴＣＴＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＧＡＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＧＣＣＴＴＴＡＣＡＧＧＴＧＧＣＣＧＣＴＧＴＡＧＡＣＡＧＣＡＧＴＧＴＣＣＣＡＣＧＧＡＣＡＧＣＡＧＡＧＣＴＧＧＣＧＧＧＣＡＴＣＡＣＣＡＣＡＣＴＴＧＡＴＧＡＣＣＣＣＣＴＧＧＧＧ
【０１３５】
マウスＣＤ８α全配列（ｍＣＤ８α）：ｇｉ：１２６７２２８３９：ｒｅｆ：００１０８１１１０．２（配列番号４）：
ＡＴＧＧＣＣＴＣＡＣＣＧＴＴＧＡＣＣＣＧＣＴＴＴＣＴＧＴＣＧＣＴＧＡＡＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＴＧＡＧＴＣＧＡＴＴＡＴＣＣＴＧＧＧＧＡＧＴＧＧＡＧＡＡＧＣＴＡＡＧＣＣＡＣＡＧＧＣＡＣＣＣＧＡＡＣＴＣＣＧＡＡＴＣＴＴＴＣＣＡＡＡＧＡＡＡＡＴＧＧＡＣＧＣＣＧＡＡＣＴＴＧＧＴＣＡＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＣＴＧＧＴＡＴＧＴＧＡＡＧＴＧＴＴＧＧＧＧＴＣＣＧＴＴＴＣＧＣＡＡＧＧＡＴＧＣＴＣＴＴＧＧＣＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＴＣＣＡＧＣＴＣＣＡＡＡＣＴＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＡＣＣＴＴＣＧＴＴＧＴＣＴＡＴＡＴＧＧＣＴＴＣＡＴＣＣＣＡＣＡＡＣＡＡＧＡＴＡＡＣＧＴＧＧＧＡＣＧＡＧＡＡＧＣＴＧＡＡＴＴＣＧＴＣＧＡＡＡＣＴＧＴＴＴＴＣＴＧＣＣＡＴＧＡＧＧＧＡＣＡＣＧＡＡＴＡＡＴＡＡＧＴＡＣＧＴＴＣＴＣＡＣＣＣＴＧＡＡＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣＡＡＧＧＡＡＡＡＣＧＡＡＧＧＣＴＡＣＴＡＴＴＴＣＴＧＣＴＣＡＧＴＣＡＴＣＡＧＣＡＡＣＴＣＧＧＴＧＡＴＧＴＡＣＴＴＣＡＧＴＴＣＴＧＴＣＧＴＧＣＣＡＧＴＣＣＴＴＣＡＧＡＡＡＧＴＧＡＡＣＴＣＴＡＣＴＡＣＴＡＣＣＡＡＧＣＣＡＧＴＧＣＴＧＣＧＡＡＣＴＣＣＣＴＣＡＣＣＴＧＴＧＣＡＣＣＣＴＡＣＣＧＧＧＡＣＡＴＣＴＣＡＧＣＣＣＣＡＧＡＧＡＣＣＡＧＡＡＧＡＴＴＧＴＣＧＧＣＣＣＣＧＴＧＧＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＧＧＡＣＣＧＧＡＴＴＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＴＧＴＧＡＴＡＴＴＴＡＣＡＴＣＴＧＧＧＣＡＣＣＣＴＴＧＧＣＣＧＧＡＡＴＣＴＧＣＧＴＧＧＣＣＣＴＴＣＴＧＣＴＧＴＣＣＴＴＧＡＴＣＡＴＣＡＣＴＣＴＣＡＴＣＴＧＣＴＡＣＣＡＣＡＧＧＡＧＣＣＧＡＡＡＧＣＧＴＧＴＴＴＧＣＡＡＡＴＧＴＣＣＣＡＧＧＣＣＧＣＴＡＧＴＣＡＧＡＣＡＧＧＡＡＧＧＣＡＡＧＣＣＣＡＧＡＣＣＴＴＣＡＧＡＧＡＡＡＡＴＴＧＴＧＴＡＡ
【０１３６】
細胞内シグナル伝達ドメイン（ｍＣＤ８αΔＩＣ）のないマウスＣＤ８α（配列番号５）：
ＡＴＧＧＣＣＴＣＡＣＣＧＴＴＧＡＣＣＣＧＣＴＴＴＣＴＧＴＣＧＣＴＧＡＡＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＴＧＡＧＴＣＧＡＴＴＡＴＣＣＴＧＧＧＧＡＧＴＧＧＡＧＡＡＧＣＴＡＡＧＣＣＡＣＡＧＧＣＡＣＣＣＧＡＡＣＴＣＣＧＡＡＴＣＴＴＴＣＣＡＡＡＧＡＡＡＡＴＧＧＡＣＧＣＣＧＡＡＣＴＴＧＧＴＣＡＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＣＴＧＧＴＡＴＧＴＧＡＡＧＴＧＴＴＧＧＧＧＴＣＣＧＴＴＴＣＧＣＡＡＧＧＡＴＧＣＴＣＴＴＧＧＣＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＴＣＣＡＧＣＴＣＣＡＡＡＣＴＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＡＣＣＴＴＣＧＴＴＧＴＣＴＡＴＡＴＧＧＣＴＴＣＡＴＣＣＣＡＣＡＡＣＡＡＧＡＴＡＡＣＧＴＧＧＧＡＣＧＡＧＡＡＧＣＴＧＡＡＴＴＣＧＴＣＧＡＡＡＣＴＧＴＴＴＴＣＴＧＣＣＡＴＧＡＧＧＧＡＣＡＣＧＡＡＴＡＡＴＡＡＧＴＡＣＧＴＴＣＴＣＡＣＣＣＴＧＡＡＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣＡＡＧＧＡＡＡＡＣＧＡＡＧＧＣＴＡＣＴＡＴＴＴＣＴＧＣＴＣＡＧＴＣＡＴＣＡＧＣＡＡＣＴＣＧＧＴＧＡＴＧＴＡＣＴＴＣＡＧＴＴＣＴＧＴＣＧＴＧＣＣＡＧＴＣＣＴＴＣＡＧＡＡＡＧＴＧＡＡＣＴＣＴＡＣＴＡＣＴＡＣＣＡＡＧＣＣＡＧＴＧＣＴＧＣＧＡＡＣＴＣＣＣＴＣＡＣＣＴＧＴＧＣＡＣＣＣＴＡＣＣＧＧＧＡＣＡＴＣＴＣＡＧＣＣＣＣＡＧＡＧＡＣＣＡＧＡＡＧＡＴＴＧＴＣＧＧＣＣＣＣＧＴＧＧＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＧＧＡＣＣＧＧＡＴＴＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＴＧＴＧＡＴＡＴＴＴＡＣＡＴＣＴＧＧＧＣＡＣＣＣＴＴＧＧＣＣＧＧＡＡＴＣＴＧＣＧＴＧＧＣＣＣＴＴＣＴＧＣＴＧＴＣＣＴＴＧＡＴＣＡＴＣＡＣＴＣＴＣＡＴＣ
【０１３７】
ＭｙＤ８８がＴＩＲドメイン（ｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８）を欠くマウスＣＤ８α−ヒトＭｙＤ８８ΔＴＩＲ（配列番号６）：
下線を引いた区間はＭｙＤ８８配列を表す。
ＡＴＧＧＣＣＴＣＡＣＣＧＴＴＧＡＣＣＣＧＣＴＴＴＣＴＧＴＣＧＣＴＧＡＡＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＴＧＡＧＴＣＧＡＴＴＡＴＣＣＴＧＧＧＧＡＧＴＧＧＡＧＡＡＧＣＴＡＡＧＣＣＡＣＡＧＧＣＡＣＣＣＧＡＡＣＴＣＣＧＡＡＴＣＴＴＴＣＣＡＡＡＧＡＡＡＡＴＧＧＡＣＧＣＣＧＡＡＣＴＴＧＧＴＣＡＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＣＴＧＧＴＡＴＧＴＧＡＡＧＴＧＴＴＧＧＧＧＴＣＣＧＴＴＴＣＧＣＡＡＧＧＡＴＧＣＴＣＴＴＧＧＣＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＴＣＣＡＧＣＴＣＣＡＡＡＣＴＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＡＣＣＴＴＣＧＴＴＧＴＣＴＡＴＡＴＧＧＣＴＴＣＡＴＣＣＣＡＣＡＡＣＡＡＧＡＴＡＡＣＧＴＧＧＧＡＣＧＡＧＡＡＧＣＴＧＡＡＴＴＣＧＴＣＧＡＡＡＣＴＧＴＴＴＴＣＴＧＣＣＡＴＧＡＧＧＧＡＣＡＣＧＡＡＴＡＡＴＡＡＧＴＡＣＧＴＴＣＴＣＡＣＣＣＴＧＡＡＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣＡＡＧＧＡＡＡＡＣＧＡＡＧＧＣＴＡＣＴＡＴＴＴＣＴＧＣＴＣＡＧＴＣＡＴＣＡＧＣＡＡＣＴＣＧＧＴＧＡＴＧＴＡＣＴＴＣＡＧＴＴＣＴＧＴＣＧＴＧＣＣＡＧＴＣＣＴＴＣＡＧＡＡＡＧＴＧＡＡＣＴＣＴＡＣＴＡＣＴＡＣＣＡＡＧＣＣＡＧＴＧＣＴＧＣＧＡＡＣＴＣＣＣＴＣＡＣＣＴＧＴＧＣＡＣＣＣＴＡＣＣＧＧＧＡＣＡＴＣＴＣＡＧＣＣＣＣＡＧＡＧＡＣＣＡＧＡＡＧＡＴＴＧＴＣＧＧＣＣＣＣＧＴＧＧＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＧＧＡＣＣＧＧＡＴＴＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＴＧＴＧＡＴＡＴＴＴＡＣＡＴＣＴＧＧＧＣＡＣＣＣＴＴＧＧＣＣＧＧＡＡＴＣＴＧＣＧＴＧＧＣＣＣＴＴＣＴＧＣＴＧＴＣＣＴＴＧＡＴＣＡＴＣＡＣＴＣＴＣＡＴＣＡＴＧＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＧＴＣＣＣＧＧＣＧＣＧＧＧＧＴＣＴＧＣＧＧＣＣＣＣＧＧＴＣＴＣＣＴＣＣＡＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＴＣＣＣＣＴＧＧＣＴＧＣＴＣＴＣＡＡＣＡＴＧＣＧＡＧＴＧＣＧＧＣＧＣＣＧＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＴＴＣＴＴＧＡＡＣＧＴＧＣＧＧＡＣＡＣＡＧＧＴＧＧＣＧＧＣＣＧＡＣＴＧＧＡＣＣＧＣＧＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＧＡＣＴＴＴＧＡＧＴＡＣＴＴＧＧＡＧＡＴＣＣＧＧＣＡＡＣＴＧＧＡＧＡＣＡＣＡＡＧＣＧＧＡＣＣＣＣＡＣＴＧＧＣＡＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＧＣＣＴＧＧＣＡＧＧＧＡＣＧＣＣＣＴＧＧＣＧＣＣＴＣＴＧＴＡＧＧＣＣＧＡＣＴＧＣＴＣＧＡＧＣＴＧＣＴＴＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＧＣＣＧＣＧＡＣＧＡＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＧＡＣＣＣＡＧＣＡＴＴＧＡＧＧＡＧＧＡＴＴＧＣＣＡＡＡＡＧＴＡＴＡＴＣＴＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＧＡＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＧＣＣＴＴＴＡＣＡＧＧＴＧＧＣＣＧＣＴＧＴＡＧＡＣＡＧＣＡＧＴＧＴＣＣＣＡＣＧＧＡＣＡＧＣＡＧＡＧＣＴＧＧＣＧＧＧＣＡＴＣＡＣＣＡＣＡＣＴＴＧＡＴＧＡＣＣＣＣＣＴＧＧＧＧ
【０１３８】
ヒトＣＤ８αＴＭ−ＭｙＤ８８（ｈＣＤ８αＴＭ−ｈＭｙＤ８８）（配列番号７）：このベクターは、ヒトＣＤ８αの細胞外部分を欠くが、ＣＤ８αの膜貫通型ヒンジドメインを含有し、ヒトＭｙＤ８８ΔＴＩＲの細胞内シグナル伝達配列が続く（下線を引いた）。
ＴＴＣＧＴＧＣＣＧＧＴＣＴＴＣＣＴＧＣＣＡＧＣＧＡＡＧＣＣＣＡＣＣＡＣＧＡＣＧＣＣＡＧＣＧＣＣＧＣＧＡＣＣＡＣＣＡＡＣＡＣＣＧＧＣＧＣＣＣＡＣＣＡＴＣＧＣＧＴＣＧＣＡＧＣＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＣＧＣＣＣＡＧＡＧＧＣＧＴＧＣＣＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＧＧＧＧＧＧＣＧＣＡＧＴＧＣＡＣＡＣＧＡＧＧＧＧＧＣＴＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＴＧＴＧＡＴＡＴＣＴＡＣＡＴＣＴＧＧＧＣＧＣＣＣＴＴＧＧＣＣＧＧＧＡＣＴＴＧＴＧＧＧＧＴＣＣＴＴＣＴＣＣＴＧＴＣＡＣＴＧＧＴＴＡＴＣＡＣＣＣＴＴＴＡＣＴＧＣＡＡＣＣＡＣＡＧＧＡＡＣＡＴＧＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＧＴＣＣＣＧＧＣＧＣＧＧＧＧＴＣＴＧＣＧＧＣＣＣＣＧＧＴＣＴＣＣＴＣＣＡＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＴＣＣＣＣＴＧＧＣＴＧＣＴＣＴＣＡＡＣＡＴＧＣＧＡＧＴＧＣＧＧＣＧＣＣＧＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＴＴＣＴＴＧＡＡＣＧＴＧＣＧＧＡＣＡＣＡＧＧＴＧＧＣＧＧＣＣＧＡＣＴＧＧＡＣＣＧＣＧＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＧＡＣＴＴＴＧＡＧＴＡＣＴＴＧＧＡＧＡＴＣＣＧＧＣＡＡＣＴＧＧＡＧＡＣＡＣＡＡＧＣＧＧＡＣＣＣＣＡＣＴＧＧＣＡＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＧＣＣＴＧＧＣＡＧＧＧＡＣＧＣＣＣＴＧＧＣＧＣＣＴＣＴＧＴＡＧＧＣＣＧＡＣＴＧＣＴＣＧＡＧＣＴＧＣＴＴＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＧＣＣＧＣＧＡＣＧＡＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＧＡＣＣＣＡＧＣＡＴＴＧＡＧＧＡＧＧＡＴＴＧＣＣＡＡＡＡＧＴＡＴＡＴＣＴＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＧＡＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＧＣＣＴＴＴＡＣＡＧＧＴＧＧＣＣＧＣＴＧＴＡＧＡＣＡＧＣＡＧＴＧＴＣＣＣＡＣＧＧＡＣＡＧＣＡＧＡＧＣＴＧＧＣＧＧＧＣＡＴＣＡＣＣＡＣＡＣＴＴＧＡＴＧＡＣＣＣＣＣＴＧＧＧＧ
【０１３９】
マウスＣＤ８α−ヒトＣＤ２８−ヒト４１ＢＢ−ヒトＣＤ３ゼータ（ｍＣＤ８α−２８−１３７−３；この同じ構築物がｍＣＤ８α−１３７−２８−３と称される場合もある）（配列番号８）：
このベクターは、細胞外マウスＣＤ８αおよび膜貫通型ヒンジドメインを含有し、それにＣＤ２８、ＣＤ１３７およびＣＤ３ゼータ鎖を活性化するヒト細胞内シグナル伝達配列が続く。ＣＤ２８は太字であり、４１ＢＢには二重下線が引かれ、ＣＤ３ゼータには点線の下線が引かれている。リンカーは波状下線で示されている。
【化２】
2017538443.tif 000004
【０１４０】
ＭｙＤ８８がＴＩＲドメイン（ｈＣＤ４−ｈＭｙＤ８８）を欠くヒトＣＤ４−ＭｙＤ８８ΔＴＩＲ（配列番号９）：
このベクターは、細胞外ヒトＣＤ４（二重下線）およびＴＩＲドメインを欠くヒトＭｙＤ８８（一重下線）が続く膜貫通型ヒンジドメイン（波状下線）を含有する。
【化３】
2017538443.tif 000005
【０１４１】
ＭｙＤ８８がＴＩＲドメイン（ｍＣＤ４−ｈＭｙＤ８８）を欠くマウスＣＤ４−ヒトＭｙＤ８８ΔＴＩＲ（配列番号１０）：
このベクターは、細胞外マウスＣＤ４（二重下線）およびＴＩＲドメインを欠くヒトＭｙＤ８８（一重下線）が続く膜貫通型ヒンジドメイン（波状下線）を含有する。
【化４】
2017538443.tif 000006
【０１４２】
ヒトＤＭＦ５ＴＣＲ−ＭｙＤ８８（ｈＴＣＲ−ｈＭｙＤ８８）（配列番号１１）：
ＭＨＣ  Ｉにより提示されるＭＡＲＴ−１メラノーマ抗原からの２７〜３５ノナマーおよび２６〜３５デカマーペプチドエピトープを認識するＤＭＦ５  Ｔ細胞受容体が、ＴＩＲドメインを欠くヒトＭｙＤ８８と融合されている。ＤＭＦ５は国立がん研究所（米国）のＤｒ．Ｌａｕｒａ  Ｊｏｈｎｓｏｎの好意により提供されたもので、ｗｗｗ．ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖでＮＣＩ−０７−Ｃ−０１７４およびＮＣＩ−０７−Ｃ−０１７５として登録された臨床試験で使用されたものと同じ配列である（Ｊｏｈｎｓｏｎ、ＬＡら、Ｂｌｏｏｄ  ２００９年；１１４巻：５３５〜５４６頁；Ｊｏｈｎｓｏｎ、ＬＡら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６年；１７７巻：６５４８〜６５５９頁）。ＴＣＲαβ配列（一重下線）は、ＭｙＤ８８配列（二重下線）と連結されている。
【化５】
2017538443.tif 000007
【０１４３】
アミノ酸配列：
ｈＣＤ８α（配列番号１２）：
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰＳＱＦＲＶＳＰＬＤＲＴＷＮＬＧＥＴＶＥＬＫＣＱＶＬＬＳＮＰＴＳＧＣＳＷＬＦＱＰＲＧＡＡＡＳＰＴＦＬＬＹＬＳＱＮＫＰＫＡＡＥＧＬＤＴＱＲＦＳＧＫＲＬＧＤＴＦＶＬＴＬＳＤＦＲＲＥＮＥＧＹＹＦＣＳＡＬＳＮＳＩＭＹＦＳＨＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＮＨＲＮＲＲＲＶＣＫＣＰＲＰＶＶＫＳＧＤＫＰＳＬＳＡＲＹＶ
【０１４４】
ｈＣＤ８αΔＩＣ（配列番号１３）：
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰＳＱＦＲＶＳＰＬＤＲＴＷＮＬＧＥＴＶＥＬＫＣＱＶＬＬＳＮＰＴＳＧＣＳＷＬＦＱＰＲＧＡＡＡＳＰＴＦＬＬＹＬＳＱＮＫＰＫＡＡＥＧＬＤＴＱＲＦＳＧＫＲＬＧＤＴＦＶＬＴＬＳＤＦＲＲＥＮＥＧＹＹＦＣＳＡＬＳＮＳＩＭＹＦＳＨＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴ
【０１４５】
ｈＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８；ＭｙＤ８８はＴＩＲドメインを欠く（配列番号１４）：
下線を引いた区間はＭｙＤ８８配列を表す。
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰＳＱＦＲＶＳＰＬＤＲＴＷＮＬＧＥＴＶＥＬＫＣＱＶＬＬＳＮＰＴＳＧＣＳＷＬＦＱＰＲＧＡＡＡＳＰＴＦＬＬＹＬＳＱＮＫＰＫＡＡＥＧＬＤＴＱＲＦＳＧＫＲＬＧＤＴＦＶＬＴＬＳＤＦＲＲＥＮＥＧＹＹＦＣＳＡＬＳＮＳＩＭＹＦＳＨＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＭＡＡＧＧＰＧＡＧＳＡＡＰＶＳＳＴＳＳＬＰＬＡＡＬＮＭＲＶＲＲＲＬＳＬＦＬＮＶＲＴＱＶＡＡＤＷＴＡＬＡＥＥＭＤＦＥＹＬＥＩＲＱＬＥＴＱＡＤＰＴＧＲＬＬＤＡＷＱＧＲＰＧＡＳＶＧＲＬＬＥＬＬＴＫＬＧＲＤＤＶＬＬＥＬＧＰＳＩＥＥＤＣＱＫＹＩＬＫＱＱＱＥＥＡＥＫＰＬＱＶＡＡＶＤＳＳＶＰＲＴＡＥＬＡＧＩＴＴＬＤＤＰＬＧ
【０１４６】
ｍＣＤ８α（配列番号１５）：
ＭＡＳＰＬＴＲＦＬＳＬＮＬＬＬＬＧＥＳＩＩＬＧＳＧＥＡＫＰＱＡＰＥＬＲＩＦＰＫＫＭＤＡＥＬＧＱＫＶＤＬＶＣＥＶＬＧＳＶＳＱＧＣＳＷＬＦＱＮＳＳＳＫＬＰＱＰＴＦＶＶＹＭＡＳＳＨＮＫＩＴＷＤＥＫＬＮＳＳＫＬＦＳＡＭＲＤＴＮＮＫＹＶＬＴＬＮＫＦＳＫＥＮＥＧＹＹＦＣＳＶＩＳＮＳＶＭＹＦＳＳＶＶＰＶＬＱＫＶＮＳＴＴＴＫＰＶＬＲＴＰＳＰＶＨＰＴＧＴＳＱＰＱＲＰＥＤＣＲＰＲＧＳＶＫＧＴＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＩＣＶＡＬＬＬＳＬＩＩＴＬＩＣＹＨＲＳＲＫＲＶＣＫＣＰＲＰＬＶＲＱＥＧＫＰＲＰＳＥＫＩＶ
【０１４７】
ｍＣＤ８αΔＩＣ（配列番号１６）：
ＭＡＳＰＬＴＲＦＬＳＬＮＬＬＬＬＧＥＳＩＩＬＧＳＧＥＡＫＰＱＡＰＥＬＲＩＦＰＫＫＭＤＡＥＬＧＱＫＶＤＬＶＣＥＶＬＧＳＶＳＱＧＣＳＷＬＦＱＮＳＳＳＫＬＰＱＰＴＦＶＶＹＭＡＳＳＨＮＫＩＴＷＤＥＫＬＮＳＳＫＬＦＳＡＭＲＤＴＮＮＫＹＶＬＴＬＮＫＦＳＫＥＮＥＧＹＹＦＣＳＶＩＳＮＳＶＭＹＦＳＳＶＶＰＶＬＱＫＶＮＳＴＴＴＫＰＶＬＲＴＰＳＰＶＨＰＴＧＴＳＱＰＱＲＰＥＤＣＲＰＲＧＳＶＫＧＴＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＩＣＶＡＬＬＬＳＬＩＩＴＬＩ
【０１４８】
ｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８；ＭｙＤ８８はＴＩＲドメインを欠く（配列番号１７）：
下線を引いた区間はＭｙＤ８８配列を表す。
ＭＡＳＰＬＴＲＦＬＳＬＮＬＬＬＬＧＥＳＩＩＬＧＳＧＥＡＫＰＱＡＰＥＬＲＩＦＰＫＫＭＤＡＥＬＧＱＫＶＤＬＶＣＥＶＬＧＳＶＳＱＧＣＳＷＬＦＱＮＳＳＳＫＬＰＱＰＴＦＶＶＹＭＡＳＳＨＮＫＩＴＷＤＥＫＬＮＳＳＫＬＦＳＡＭＲＤＴＮＮＫＹＶＬＴＬＮＫＦＳＫＥＮＥＧＹＹＦＣＳＶＩＳＮＳＶＭＹＦＳＳＶＶＰＶＬＱＫＶＮＳＴＴＴＫＰＶＬＲＴＰＳＰＶＨＰＴＧＴＳＱＰＱＲＰＥＤＣＲＰＲＧＳＶＫＧＴＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＩＣＶＡＬＬＬＳＬＩＩＴＬＩＭＡＡＧＧＰＧＡＧＳＡＡＰＶＳＳＴＳＳＬＰＬＡＡＬＮＭＲＶＲＲＲＬＳＬＦＬＮＶＲＴＱＶＡＡＤＷＴＡＬＡＥＥＭＤＦＥＹＬＥＩＲＱＬＥＴＱＡＤＰＴＧＲＬＬＤＡＷＱＧＲＰＧＡＳＶＧＲＬＬＥＬＬＴＫＬＧＲＤＤＶＬＬＥＬＧＰＳＩＥＥＤＣＱＫＹＩＬＫＱＱＱＥＥＡＥＫＰＬＱＶＡＡＶＤＳＳＶＰＲＴＡＥＬＡＧＩＴＴＬＤＤＰＬＧ
【０１４９】
ｈＣＤ８αＴＭ−ｈＭｙＤ８８（配列番号１８）：
ヒトＭｙＤ８８ΔＴＩＲ細胞内シグナル伝達配列（下線）が続くＣＤ８α膜貫通型ヒンジドメイン。
ＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＮＨＲＮＭＡＡＧＧＰＧＡＧＳＡＡＰＶＳＳＴＳＳＬＰＬＡＡＬＮＭＲＶＲＲＲＬＳＬＦＬＮＶＲＴＱＶＡＡＤＷＴＡＬＡＥＥＭＤＦＥＹＬＥＩＲＱＬＥＴＱＡＤＰＴＧＲＬＬＤＡＷＱＧＲＰＧＡＳＶＧＲＬＬＥＬＬＴＫＬＧＲＤＤＶＬＬＥＬＧＰＳＩＥＥＤＣＱＫＹＩＬＫＱＱＱＥＥＡＥＫＰＬＱＶＡＡＶＤＳＳＶＰＲＴＡＥＬＡＧＩＴＴＬＤＤＰＬＧ
【０１５０】
ｍＣＤ８α−２８−１３７−３（およびｍＣＤ８α−１３７−２８−３）（配列番号１９）：
細胞外マウスＣＤ８αおよびＣＤ２８（太字）、ＣＤ１３７（二重下線を引いた）およびＣＤ３ゼータ鎖（点線）を活性化するヒト細胞内シグナル伝達配列が続く膜貫通型ヒンジドメイン。リンカーは波状下線で示す。
【化６】
2017538443.tif 000008
【０１５１】
ｈＣＤ４−ｈＭｙＤ８８（配列番号２０）：
ヒトＣＤ４の細胞外（二重下線）および膜貫通型ヒンジドメイン（波状下線）およびそれに続くＴＩＲドメインを欠くヒトＭｙＤ８８（一重下線）。
【化７】
2017538443.tif 000009
【０１５２】
ｍＣＤ４−ｈＭｙＤ８８（配列番号２１）：
マウスＣＤ４の細胞外（二重下線）および膜貫通型ヒンジドメイン（波状下線）およびそれに続くＴＩＲドメインを欠くヒトＭｙＤ８８（一重下線）。
【化８】
2017538443.tif 000010
【０１５３】
ｈＴＣＲ−ｈＭｙＤ８８（２２）：
ＴＣＲαβ配列（一重下線）がＭｙＤ８８配列（二重下線）と連結している。
【化９】
2017538443.tif 000011
【０１５４】
ヒトＭｙＤ８８（配列番号２４）：
ＭＡＡＧＧＰＧＡＧＳＡＡＰＶＳＳＴＳＳＬＰＬＡＡＬＮＭＲＶＲＲＲＬＳＬＦＬＮＶＲＴＱＶＡＡＤＷＴＡＬＡＥＥＭＤＦＥＹＬＥＩＲＱＬＥＴＱＡＤＰＴＧＲＬＬＤＡＷＱＧＲＰＧＡＳＶＧＲＬＬＥＬＬＴＫＬＧＲＤＤＶＬＬＥＬＧＰＳＩＥＥＤＣＱＫＹＩＬＫＱＱＱＥＥＡＥＫＰＬＱＶＡＡＶＤＳＳＶＰＲＴＡＥＬＡＧＩＴＴＬＤＤＰＬＧＨＭＰＥＲＦＤＡＦＩＣＹＣＰＳＤＩＱＦＶＱＥＭＩＲＱＬＥＱＴＮＹＲＬＫＬＣＶＳＤＲＤＶＬＰＧＴＣＶＷＳＩＡＳＥＬＩＥＫＲＣＲＲＭＶＶＶＶＳＤＤＹＬＱＳＫＥＣＤＦＱＴＫＦＡＬＳＬＳＰＧＡＨＱＫＲＬＩＰＩＫＹＫＡＭＫＫＥＦＰＳＩＬＲＦＩＴＶＣＤＹＴＮＰＣＴＫＳＷＦＷＴＲＬＡＫＡＬＳＬＰ
【０１５５】
ＨＥＫ細胞のトランスフェクション。マウスＣＤ８α変異体は、細胞膜中に適当に発現できることがヒト内皮腎臓細胞（ＨＥＫ；ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を使用して確認された。ＨＥＫ細胞は、１０％熱不活化ウシ胎児血清（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｗｅｓｔ  Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ、ＣＡ、米国）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（ＧＩＢＣＯブランド；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１％ペニシリン−ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯブランド；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で補完されたダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ＧＩＢＣＯブランド；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、米国）中で維持した。トランスフェクションの前日に、細胞をトリプシン処理して計数した。０．５×１０５細胞／ｍｌを集密度５０％の細胞密度で入れた。細胞に、血清を添加せずに１００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ低血清培地および０．５μｌのリポフェクタミンＬＴＸ（ＬＩＦＥ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）中で、ｍＣＤ８αをコードするＤＮＡ２．５μｇをメーカーのプロトコルに従ってトランスフェクトした。３０分のインキュベーション後、１００μｌのＤＮＡ−リポフェクタミンＬＴＸ試薬複合体を、細胞を含有する各ウェルに直接添加してプレートを前後に揺すって穏やかに混合した。トランスフェクション後４８時間でＣＤ８αの発現がフローサイトメトリーにより決定された。
【０１５６】
Ｔ細胞へのレトロウイルスの形質導入。脾臓およびリンパ節由来のマウスｐｍｅｌ  Ｔ細胞（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を、プレートに結合した抗ＣＤ３（５μｇ／ｍｌ）および抗ＣＤ２８Ａｂ（２．５μｇ／ｍｌ）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、米国）を使用して２日間活性化し、その間にマウスｇｐ１００２５〜３３抗原に特異的なＴ細胞受容体の発現を、１μｇ／ｍｌのｇｐ１００２５〜３３ペプチドの添加により活性化した。２日後に、細胞をレトロウイルス形質の導入のために回収した。形質導入のために、２４ウェルの組織培養処理されていないプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、米国）を、１ウェル当たり０．５ｍｌの１０μｇ／ｍｌ組み替えヒトフィブロネクチンフラグメント（ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ；タカラ、大津市、滋賀県、日本）を用いて終夜４℃でコートした。インキュベーション後、ウェルを、２．５％ヒトＡＢ血清を添加した１ｍｌのハンクス平衡塩類溶液（ＧＩＢＣＯブランド；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて３０分間ＲＴで封鎖して、２．５％Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）添加ハンクス平衡塩類溶液（ＧＩＢＣＯブランド；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で洗浄した。
【０１５７】
形質導入は前に記載したようにして実施した（Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｂｌｏｏｄ  １１４巻、５３５〜５４６頁（２００９年））。簡単に述べると、約２．５ｍｌのレトロウイルス上清をコートされた各ウェルに加え、続いて２０００ｇで、２時間３２℃で遠心分離した。１．５ｍｌのウイルスの上清を除去して１×１０６（０．５ｍｌ）の活性化されたＴ細胞を各ウェルに１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で加えた。プレートを１０００ｇで１０分間遠心分離して、次に３７℃で終夜インキュベートした。形質導入後、細胞を洗浄してＩＬ−２の存在下で（１００Ｕ／ｍｌ）維持して、形質導入後５日に実験で使用した。使用したＭＧＳＶベクターがＧＦＰをコードする遺伝子を含有するので、形質導入の効率は、緑色蛍光性タンパク質（ＧＦＰ＋）に陽性のＴ細胞のパーセンテージを評価して決定した。プラスミドはｐＭＩＧと称され、Ａｄｄｇｅｎｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）から購入した。ｌＴ細胞の形質導入の成功は、ＣＤ８、ＣＤ４およびＴＣＲ構築物の下流に位置するＧＦＰの発現によって確認した。
【０１５８】
ヒトＴ細胞の形質導入のために、健常な供与体からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｃｏｒｐ（Ｃｏｌｍａｒ、ＰＡ、米国）から購入して、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｇｕｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、米国）の密度勾配遠心分離により単離した。単離されたＰＢＭＣを、２４ウェルの組織培養プレートの１ウェル当たり３×１０６細胞で、５％ヒトＡＢ血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸、１％ペニシリン−ストレプトマイシンおよび１００Ｕ／ｍｌ組み替えヒトＩＬ−２（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、米国）で補完されたＡＩＭ  Ｖ培地（ＧＩＢＣＯブランド；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養して、５０ｎｇ／ｍｌＯＫＴ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ、米国）で活性化した。２日後に、細胞をレトロウイルスの形質導入のために回収した。
【０１５９】
形質導入のために、２４ウェルの組織培養処理されていないプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、米国）を、１ウェル当たり０．５ｍｌの１０μｇ／ｍｌ組み替えヒトフィブロネクチンフラグメント（ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ；タカラ、大津市、滋賀県、日本）を用いて終夜４℃でコートした。インキュベーション後、ウェルを２．５％ヒトＡＢ血清が添加された１ｍｌのハンクス平衡塩類溶液（ＧＩＢＣＯブランド；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて３０分間ＲＴで封鎖して、２．５％Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）（ＧＩＢＣＯブランド；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したハンクス平衡塩類溶液で洗浄した。
【０１６０】
形質導入は、前に記載したようにして実施した（Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｂｌｏｏｄ  １１４巻、５３５〜５４６頁（２００９年））。簡単に述べると、約２．５ｍｌのレトロウイルス上清をコートされた各ウェルに加えて、次に２０００ｇで、２時間３２℃で遠心分離した。１．５ｍｌのウイルスの上清を除去して、１×１０６（０．５ｍｌ）の活性化されたＰＢＭＣを１００Ｕ／ｍｌＩＬ−２の存在下で各ウェルに加えた。プレートを１０００ｇで１０分間遠心分離して、次に終夜３７℃でインキュベートした。形質導入後、細胞を洗浄し、ＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）の存在下で維持して、形質導入後５日に実験で使用した。形質導入されたヒトＴ細胞におけるＤＭＦ５の表面における発現を、細胞を染色した後、フローサイトメトリーによりＣＤ８およびＭＡＲＴ−１  ＭＨＣテトラマーについて決定した。
【０１６１】
ＮＦ−κＢ活性化アッセイ。ＴＬＲ４を発現しているＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞をＤＭＥＭ１０％のＦＢＳ１％ＰｅｎＳｔｒｅｐ１×ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ溶液（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）中で培養した。細胞を６ウェルのプレート上１ウェル当たり１×１０６細胞で、プレートの抗生物質無添加培地中に入れて３７℃／５％ＣＯ２で終夜培養した。リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、細胞に４μｇのＤＮＡをトランスフェクトした。２４時間後に、細胞を回収して９６ウェルのプレートの１ウェル当たり５０，０００細胞を４連で分注した。５０μｇ／ｍｌのＬＰＳ（ＩｎｖｉｔｒｏＧｅｎ）を陽性対照として使用した。２４時間後に細胞上清を回収してＱＵ抗Ｂｌｕｅ試薬（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）と合わせた。３時間後に吸光度を６２０ｎｍで測定した。これらの細胞を、ＮＦ−ｋＢを活性化する異なるＣＤ８構築物の能力を評価するために使用して、またＣＤ８の機能のための代用薬として使用した。
【０１６２】
Ｔ細胞増殖のアッセイ、サイトカインおよびケモカイン産生のアッセイ。形質導入後３〜５日に、１×１０５個のＴ細胞を９６ウェルの丸底プレート中で、ｇｐ１００２５〜３３ペプチドを適用したＢ１６腫瘍細胞またはマウス脾臓細胞と共に培養した。１×１０５個のエフェクターＴ細胞と１×１０５個の腫瘍細胞を、２００μｌの培養体積で、９６ウェルの丸底プレート中で７２時間共培養した。収穫する１６時間前に、０．５μＣｉの３Ｈ−チミジンを各ウェルに添加した後、チミジン取り込みを１４５０ＬＳＣ  ＆  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｃｏｕｎｔｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、米国）を使用して測定した。サイトカインおよびケモカインの産生レベルは、刺激後４８時間に回収した培養上清から、サイトカイン／ケモカインキット（ミリポア、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、米国）をメーカーの指示に従って使用して測定した。腫瘍反応性のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と融合したときのＭｙＤ８８の共刺激分子効果の検査を検討するために、１×１０５個のエフェクターＴ細胞のＤＭＦ５またはＤＭＦ５−ＭｙＤ８８を形質導入されたヒトＴ細胞を、１×１０５個のヒトＭａｌｍ−３Ｍメラノーマ腫瘍細胞と９６ウェル丸底プレート中で、２００μｌの培養体積で７２時間共培養した。収穫の１６時間前に、０．５μＣｉの３Ｈ−チミジンを各ウェルに加えた後、チミジン取り込みを、１４５０ＬＳＣ  ＆  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｃｏｕｎｔｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、米国）を使用して測定した。
【０１６３】
細胞傷害性のアッセイ。標的の腫瘍細胞に対する細胞傷害活性を、標準的な５１Ｃｒリリースアッセイを使用して測定した。標的細胞を２００μＣｉの５１Ｃｒにより２時間３７℃で標識して、３回洗浄し、抗ヒト抗体を１時間３７℃で適用した。次に１×１０４個の標識された標的細胞を減少する数のエフェクターＴ細胞と、指示されたエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で、９６ウェルの丸底プレート中２００μｌの培養体積で共培養した。培地中単独でインキュベートされた標的細胞を自発的な５１Ｃｒリリースを決定するために使用し、最高のリリースは標識された標的細胞を１０％トリトンＸ−１００中でインキュベートすることにより決定した。３７℃で５時間の後、５０μｌの上清を回収して、５１Ｃｒの放射能を１４５０ＬＳＣ  ＆  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｃｏｕｎｔｅｒで測定した。特定の細胞溶解の平均パーセンテージを、以下の方程式：特定の細胞溶解（％）＝（試験リリース−自発的リリース）／（最高のリリース−自発的リリース）×１００に従って計算した。全ての試験は３連ウェルで実施して、結果は平均±ＳＤとして示す。他の実験では、非放射性細胞傷害性キットを使用した（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）。
【０１６４】
ＭＤＳＣ抑制のアッセイ。骨髄腫由来のサプレッサー細胞（ＭＤＳＣ；ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋の発現で特徴づけられる）を、確立されたＢ１６−ＧＭＣＳＦメラノーマ腫瘍を有するマウスの血液から回収した。ＭＤＳＣを放射線照射して（１０，０００ラド；ガンマ線源）、ＣＤ８α−ＭｙＤ８８または対照ベクター（ＧＦＰ）を発現するように操作されたＴ細胞と９６ウェルの丸底プレート中で共培養した。１×１０５Ｔ個の細胞を１×１０５または２．５×１０５個のＭＤＳＣと共に４８時間培養した。収穫する１６時間前に、０．５μＣｉの３Ｈ−チミジンを各ウェルに加えた後、チミジン取り込みを１４５０ＬＳＣ  ＆  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｃｏｕｎｔｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、米国）を使用して測定した。
【０１６５】
結果
実験２Ａ。ＣＤ８α発現は、ＣＤ８αでトランスフェクトされたＨＥＫ細胞（内因性ＣＤ８αを発現しない）で確認した。図４Ａに示すように、ＣＤ８αは、実質的には１００％のＨＥＫ細胞上で検出された。これから、発現の成功およびＣＤ８αの細胞表面への転座が示される。マウスのＣＤ８＋Ｔ細胞における形質導入の有効度もフローサイトメトリーによって確認された。図４Ｂ中のデータは、平均約５０％のＣＤ８＋Ｔ細胞の形質導入有効度（全てのＣＤ８＋Ｔ細胞の）を示す。
【０１６６】
実験２Ｂ。ＭｙＤ８８のシグナル伝達をＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞で誘発する能力を決定した。図５からわかるように、ｈＭｙＤ８８（ＴＩＲドメインを欠く）と融合したｍＣＤ８α（ＣＤ８−ＭｙＤ８８）を発現しているかまたはｍＣＤ８αの膜貫通型ヒンジドメインと連結したＭｙＤ８８（ＭｙＤ８８ＴＭ）を発現しているＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞は、ｍＣＤ８αの細胞外領域および膜貫通型ヒンジドメイン（ＣＤ８ΔＩＣ）または２８−１３７−３（ＣＤ８−２８−１３７−３）と連結したＣＤ８αの細胞外領域および膜貫通型ヒンジドメインのみを有するｍＣＤ８α変異体を発現している細胞と比較してより高いレベルのＮＫ−κＢ活性化を示す。ＣＤ８ΔＩＣまたはＣＤ８−２８−１３７−３によって活性化されたＮＫ−κＢのレベルは、対照ベクター（ｐＭＩＧ）で操作された細胞または形質導入されていない細胞（ＷＴ）と同様であった。
【０１６７】
実験２Ｂ。ＭｙＤ８８のＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞でシグナル伝達を誘発する能力を決定した。図５からわかるように、ｈＭｙＤ８８（ＴＩＲドメインを欠く）と融合したｍＣＤ８α（ＣＤ８−ＭｙＤ８８）を発現しているかまたはｍＣＤ８αの膜貫通型ヒンジドメインと連結したＭｙＤ８８を発現しているＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞は、ｍＣＤ８αの膜貫通型ヒンジドメインのみを有するｍＣＤ８α変異体（ＣＤ８ΔＩＣ）または２８−１３７−３と連結したＣＤ８α（ＣＤ８−２８−１３７−３）を発現している細胞と比較して、より高いレベルのＮＫ−κＢ活性化を示す。ＣＤ８ΔＩＣまたはＣＤ８−２８−１３７−３によるＮＫ−κＢ活性化のレベルは、対照ベクター（ｐＭＩＧ）または形質導入されていない細胞（ＷＴ）で操作された細胞と同様であった。
【０１６８】
実験２Ｃ。各ＣＤ８α構築物のＴＣＲにより媒介されるＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖およびサイトカイン産生を変化せせる能力を検査した。ｇｐ１００２５〜３３抗原に特異的なＴＣＲトランスジェニックマウスから取ったＣＤ８＋Ｔ細胞を、ｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８、ｍＣＤ８αΔＩＣ、ｍＣＤ８α−２８−１３７−３、またはＧＦＰ対照（ｐＭＩＧ）を発現するように操作した。形質導入の４８時間後に、濃度を変えてｇｐ１００２５〜３３ペプチドを適用した、メラノーマ腫瘍抗原を提示する脾臓細胞でＴ細胞を刺激した。ｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８を発現しているＴ細胞は、腫瘍抗原の極めて低い濃度で、対照細胞よりも大きい増殖（図６Ａ）およびＩＦＮ−γ産生（図６Ｂ）を示した。さらに、ｍＣＤ８
αΔＩＣを発現しているＴ細胞またはｍＣＤ８α−２８−１３７−３を発現しているＴ細胞は、より高い抗原濃度（２．５μｇ／ｍｌ）で、減少した増殖またはＩＦＮ−γ産生の横這い状態を示したが、それに対してｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８は高い増殖能力およびＩＦＮ−γ産生を維持したことは注目すべき重要なことである。ｍＣＤ８αΔＩＣ、ｍＣＤ８α−２８−１３７−３、およびＧＦＰを発現するように操作されたＴ細胞は、全て同様な増殖を示した。ｍＣＤ８α−ＭｙＤ８８Ｔ細胞は、抗原の非存在下では増殖せずまたはＩＦＮ−γを産生しないという事実は、それがＭｙＤ８８の共刺激分子効果はＴＣＲおよび腫瘍抗原に特異的な様式で起こることを示すので、非常に重要である。
【０１６９】
実験２Ｄ。異なるＣＤ８α構築物が、ＣＤ８＋Ｔ細胞の腫瘍細胞による刺激に応答して増殖する能力を如何に変化させるかを決定するために、ｐｍｅｌ  Ｔ細胞を、ｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８、ｍＣＤ８αΔＩＣ、ｍＣＤ８α−２８−１３７−３（ｍＣＤ８α−１３７−２８−３）、またはＧＦＰ対照（ｐＭＩＧ）を発現するように操作して、変化する数のマウスＢ１６メラノーマ細胞と共培養した。図７に示すように、ｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８をトランスフェクトされたｐｍｅｌ  Ｔ細胞は、全てのしかし最低数のＢ１６細胞と共培養されたときに、対照細胞よりも大きい増殖を示した。増殖は、Ｂ１６細胞数に依存する様式で起こった。これは、Ｔ細胞の応答が、事実として腫瘍抗原の存在に基づいていることを示す。ｍＣＤ８αΔＩＣ、ｍＣＤ８α−１３７−２８−３およびＧＦＰを発現するように操作されたＴ細胞は、全て同様な増殖性能力を示した。
【０１７０】
実験２Ｅ。図８に示したように、マウスＴ細胞にｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８、ｍＣＤ８αΔＩＣ、ｍＣＤ８α−１３７−２８−３（ＣＤ８−２８−１ＢＢ−３ζ）、またはＧＦＰ対照（ｐＭＩＧ）を形質導入した。Ｔ細胞を、Ｂ１６細胞と２４時間共培養した。図８に示した種々の因子のレベルを、Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘサイトカインアレイを使用して評価した。ｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８Ｔ細胞は、対照ベクター（ｐＭＩＧ）およびｍＣＤ８αΔＩＣ（細胞内シグナル伝達ドメインを欠く）を発現しているＴ細胞と比較してＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦαの増大した産生を示した。重要なこととして、ｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８Ｔ細胞は、ｍＣＤ８α−２８−１３７−３に優るこれらの同じサイトカインの増大したレベルを示した。対照的に、ｍＣＤ８α−２８−１３７−３は、ｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８と比較してＩＬ−３の増大したレベルを示した。これらのデータは、２８−１３７−３のシグナル伝達との比較でＭｙＤ８８のＴ細胞を活性化する能力における特別の卓越性を際立たせる。ｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８は、ＩＬ−１７、ＭＩＰ−１Ａ、ＩＰ−１０およびＭＩＰ−１Ｂの発現の誘発で、ｍＣＤ８αΔＩＣおよびｍＣＤ８α−２８−１３７−３と同様に効果的であったので、他の因子の上昇したレベルは非特定の様式では起こらなかったことが示唆される。ｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８だけがＩＬ−１αを誘発した。ＣＤ８αの過剰発現も対照Ｔ細胞（ｐＭＩＧを形質導入された）と比較して増大したサイトカイン分泌を生じたことは注目に値する。このことは、ＣＤ８α過剰発現をＴ細胞の応答をさらに強化する別の手法として使用する可能性を際立たせる；もっとも、活性化する細胞内シグナル伝達ドメインの非存在下では、ＣＤ８αの過剰発現は、単独ではｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８よりかなり弱い。そのｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８Ｔ細胞の増大したＩＦＮ−γ産生は別の実験でＥＬＩＳＡによって確認された、図９。
【０１７１】
実験２Ｆ。ＣＤ８−ＭｙＤ８８シグナル伝達。ＣＤ８＋ｐｍｅｌ  Ｔ細胞にＣＤ８α−ＭｙＤ８８、ＣＤ８αΔＩＣまたはｐＭＩＧ対照ベクターを形質導入した。Ｔ細胞を１対１の比でＢ１６腫瘍細胞により１０分および３０分間刺激して、次に４％ＰＦＡで固定した。０時点はＢ１６が加えられていないときを示す。細胞を透過性にして、ＴＣＲシグナル伝達に応答して活性化されリン酸化されたタンパク質ｐ−ｐ３８、ｐ−ＪＮＫ、ｐ−ＥＲＫ１／２を示すために染色した。図１０に示したように、これらの結果は、ＣＤ８α−ＭｙＤ８８が、一部にはこれらのタンパク質の発現レベルを増大させて対照細胞に優るシグナル伝達の全体的持続時間を維持することにより、および応答する細胞の数を増加させることによりシグナル伝達を強化することを示す。
【０１７２】
実験２Ｇ。ｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８のＴ細胞の細胞傷害性を増強する能力を検査した。ｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８の発現は、ｍＣＤ８αΔＩＣまたはｍＣＤ８α−２８−１３７−３を発現しているＴ細胞と比較して、マウスメラノーマ細胞の致死を、有意に強化した、図１１。
【０１７３】
実験２Ｈ。Ｔｏｌｌ様受容体５（ＴＬＲ５）を活性化するリガンドを分泌するように操作された腫瘍反応性Ｔ細胞は、マウス中のメラノーマ腫瘍を破壊するＴ細胞の能力を強化することが示されている（Ｇｅｎｇら、Ｃａｎ  Ｒｅｓ．２０１５年；第７５巻：１９５９〜１９７１頁）。増大した抗腫瘍活性は、腫瘍および脾臓における骨髄腫由来のサプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の減少した数と関連していた。ＴＬＲ５リガンドを分泌するＴ細胞で処理されたマウスに由来するＭＤＳＣも、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）ＩおよびＭＨＣ  ＩＩの増大したレベルならびに抗腫瘍Ｔ細胞の活性を強化し得る共刺激分子ＣＤ８６の増大した発現レベルを含む表現型の変化を示した。さらに、Ｔ細胞上でのＴＬＲの関与は、サイトカインおよびケモカインのプロファイルをインビトロおよびインビボで変化させ、これらの変化は骨髄腫由来のサプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の数の減少および表現型の変質と関連していた。ＭＤＳＣは、抗腫瘍ＣＤ８およびＣＤ４Ｔ細胞の応答の強い阻害因子である。ＴＬＲの刺激はＭｙＤ８８シグナル伝達を必要とする。それ故、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８発現の、ＭＤＳＣにより媒介される抑制に対する細胞の応答を変化させる能力を評価した。図１２に示したように、ＭＤＳＣはＭＤＳＣ数に依存する様式でＧＦＰ対照Ｔ細胞の増殖を抑制した。１個のＴ細胞に対して２．５個のＭＤＳＣの比で、Ｔ細胞は４０％近く抑制された。極めて対照的に、ＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８を発現しているＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＭＤＳＣにより媒介される抑制に抵抗性であるだけでなく、そのようなＴ細胞は、検査したＴ細胞のＭＤＳＣに対する比において、ＭＤＳＣの非存在下におけるｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８Ｔ細胞との比較で増殖の有意な増加を示した。それ故、弱い腫瘍抗原および低密度で発現した抗原に対する応答を増強することに加えて、ｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８発現は、ＭＤＳＣにより媒介される抑制に打ち克つことによりＴ細胞の応答をさらに強化するという利点を提供する。
【０１７４】
実験２Ｉ。ＧＦＰ（形質導入の対照として役立つ）、ＣＤ２８−ＣＤ１３７−ＣＤ３ゼータ、またはＭｙＤ８８を発現するように操作されたｐｍｅｌ  ＣＤ８＋Ｔ細胞の抗腫瘍活性を、確立されたＢ１６メラノーマ腫瘍を用いてマウスで試験した。腫瘍が約３０ｍｍ２のサイズに達した時、マウスの静脈内に約２．５×１０６個のＴ細胞を注射して、腫瘍成長を、数週間のコースを通して測定した。ｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８Ｔ細胞で処理されたマウスは、対照ＧＦＰまたはｍＣＤ８α−２８−１３７−３Ｔ細胞で処理されたマウスと比較して遅れた腫瘍成長動態（図１３Ａ）およびマウスの生存期間の延長（図１３Ｂ）を示した。ＧＦＰおよびｍＣＤ８α−２８−１３７−３Ｔ細胞で処理されたマウスの間で有意な差は検出されなかった。
【０１７５】
実験２Ｊ。さらなるインビボ実験により、腫瘍反応性Ｔ細胞におけるｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８発現は、如何なる支持療法もなしで抗腫瘍応答を強化して、マウスの生存期間を延長することが確認された。Ｃ５７ＢＬ６マウスのひ腹にＢ１６メラノーマ腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍細胞注射の８日後に、マウスの尾部にｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８または対照ｐＭＩＧベクターを発現するように操作された約１０６個のｐｍｅｌ  Ｔ細胞を静脈内注射するかまたはマウスを未処理のままにした。支持療法（すなわち、ＩＬ−２、免疫補助剤またはチェックポイント封鎖抗体）は提供されなかった。ｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８Ｔ細胞で処理されたマウスは、未処理マウスまたは対照ｐＭＩＧ  ｐｍｅｌ  Ｔ細胞で処理されたマウスと比較して、第２３日に始まった有意に強化された抗腫瘍応答（図１４Ａ）（一元配置分散分析；ｐ＜０．０１）、および全体的生存期間の延長（図１４Ｂ；Ｗｉｌｃｏｘｏｎ、ｐ＜０．０５）を示した。未処理マウスは、生存の中央値が２４日；ｐＭＩＧ  Ｔ細胞で処理されたマウス：２３．５日；ｍＣＤ８α−ｈＭｙＤ８８で処理されたマウス：３１日であった。誤差のバーは、８匹のマウスの平均からの標準偏差を表す。
【０１７６】
実験２Ｋ。ＴＣＲに直接連結された場合に、ＭｙＤ８８のシグナル伝達が、ＴＣＲにより誘発される増殖を強化する能力を検査した。ＭＨＣ  Ｉにより提示されるＭＡＲＴ−１メラノーマ抗原からのＭＡＲＴ−１２６〜３５ペプチドに特異的なＤＭＦ５というＴＣＲを、ＴＩＲドメインを欠くＭｙＤ８８と融合させた。ＤＭＦ５  ＴＣＲは国立がん研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、米国）のＤｒ．Ｌａｕｒａ  Ｊｏｈｎｓｏｎの好意により提供され、ｗｗｗ．ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖでＮＣＩ−０７−Ｃ−０１７４およびＮＣＩ−０７−Ｃ−０１７５として登録された臨床試験（Ｊｏｈｎｓｏｎ、ＬＡら、Ｂｌｏｏｄ、２００９年；第１１４巻：５３５〜５４６頁；Ｊｏｈｎｓｏｎ、ＬＡら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６年；第１７７巻：６５４８〜６５５９頁）で使用されたものと同じ配列である。形質導入効率は、ＤＭＦ５およびＤＭＦ５−ＭｙＤ８８の間で同様であった。図１５に示したように、ＭｙＤ８８をＴＣＲに連結するとＴ細胞増殖は強化され、ＣＤ８αまたはＴＣＲを含むが、これらに限定されない異なる手段によりＭｙＤ８８をＴＣＲシグナル伝達複合体に入れるとＴ細胞の応答を強化することができることを示唆する。
【０１７７】
本発明を、それらのある特定の実施形態を参照して説明したが、当業者は、本発明の精神および範囲を逸脱することなく種々の改変を為すことができることを認識するであろう。添付の請求項の範囲が、記載された特定の実施形態に限定されることはない。
【０１７８】
参考文献
本明細書で言及された全ての特許および刊行物は、本発明が関係する当業者の技術レベルを示す。各引用された特許および刊行物は、その全体を参照によって本明細書に組み入れる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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