(57)【要約】式（Ｉ）の新たな両親媒性ポリマーが記載される。それらの調製の方法および医薬品用担体としてのそれらの使用も記載される。【化１】2017538796.tif 000012【選択図】図１
2017538796.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）を有するポリマーであって、
【化１】
2017538796.tif 000010
前記式中、
Ｘ−は、Ｈ、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ａ−ＯＨ、または−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ａ−Ｏ−ＣＨ３であり、ここでａは９〜４５０であり、
Ｙ−は、１〜４０ｋＤａの分子量を有する乳酸−グリコール酸エステル共重合体（ＰＬＧＡ）からなり、
ｎおよびｍは、それぞれ、前記ポリマーのアルファおよびベータ繰り返し単位の総数の０．１〜５０％であり、前記総数は６３〜３８０であり、
ｗ＝前記ポリマーのアルファおよびベータ繰り返し単位の総数−ｎであり、ｚ＝前記ポリマーのアルファおよびベータ繰り返し単位の総数−ｍである、ポリマー。
【請求項２】
前記式中、Ｘ−はウレタン結合によって前記ポリマーに直接コンジュゲートされており、Ｙ−はエステル結合によってポリマーに直接コンジュゲートされている、請求項１に記載の式（Ｉ）のポリマー。
【請求項３】
式（Ｉ）のポリマーであって、前記式中、Ｘ−はＨまたは−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ａ−Ｏ−ＣＨ３であり、ここでａは１７４であり、Ｙ−は１０〜１８ｋＤａの分子量を有する乳酸−グリコール酸エステル共重合体（ＰＬＧＡ）である、ポリマー。
【請求項４】
医薬活性薬物用の担体として請求項１乃至３のいずれか１項に記載のポリマーを含有する医薬組成物。
【請求項５】
前記医薬活性薬物は以下の薬物分類：ステロイドおよび非ステロイド性抗炎症剤、アミノグリコシド、マクロライド、セファロスポリン、テトラサイクリン、キノロン、ペニシリン、ベータラクタムのような抗生物質、プロスタグランジン、プロスタマイド、アルファおよびベータ遮断薬のような抗緑内障薬、炭酸脱水酵素の阻害剤、カンナビノイド、抗ウイルス薬、診断用薬、抗血管新生薬、抗酸化剤に属する薬物分子の中から選択される、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記共重合体は、有効成分を担持したミセルまたはナノ粒子を形成する、請求項４または請求項５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
局所投与または全身投与に適した形態である、請求項４乃至６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
ナノスケール薬物送達が適している疾患の治療に使用するための、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記疾患は、血管新生および炎症性要素を有する後眼部を伴う眼疾患である、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記疾患は脳の障害である、請求項８に記載の医薬組成物
【請求項１１】
式（Ｉ）のポリマーの調製方法であって、式（ＩＩ）のポリマー：
【化２】
2017538796.tif 000011
（前記式中、
αおよびβは、それぞれ、該ポリマーのアルファおよびベータ繰り返し単位の数であり、かつ６３〜３８０である）が、
以下の反応工程、
ａ）カルボニル化剤によってポリマー（ＩＩ）のヒドロキシル基を活性化する工程；
ｂ）そのように活性化された化合物を、式ＮＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ａ−ＯＨまたはＮＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ａ−Ｏ−ＣＨ３（前記式中、ｂは９〜４５０である）の末端アミン基を有するＰＥＧ分子と反応させる工程；
ｃ）カルボン酸活性化剤によって、１〜４０ｋＤａの分子量を有するＰＬＧＡのカルボン酸基を活性化する工程；
ｄ）工程（ｃ）の活性化された化合物をポリマー（ＩＩ）と反応させて、式（Ｉ）の化合物（前記式中、Ｘ＝ＨかつＹ＝ＰＬＧＡである）を得る工程、
または、
ｄ’）工程（ｃ）の活性化された化合物を工程（ｂ）において得られた化合物と反応させて、化学式（Ｉ）の化合物〔前記式中、Ｘは、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ａ−ＯＨまたは−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ａ−Ｏ−ＣＨ３であり、ここでａは９〜４５０であり、かつＹは１〜４０ｋＤａの分子量を有する乳酸−グリコール酸エステル共重合体（ＰＬＧＡ）である〕を得る工程を受ける、方法。
【請求項１２】
工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）は非プロトン性極性溶媒中において行なわれる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記カルボニル化剤は、フェニル−ビス−カルボナート、またはスクシミジル−ビス−カルボナートである、請求項１１または請求項１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｃ）は、カルボン酸基活性化剤として、カルボニル−ジ−イミダゾール（ＣＤＩ）、または１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、またはヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）、またはＮ−ヒドロキシ−スクシンイミド（ＮＨＳ）の存在下で行われる、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なポリマー、並びにそれらの調製および医薬化合物を送達するための担体としての使用に言及する。
【背景技術】
【０００２】
異なる物理的、化学的、および薬理学的性質を有する薬物を送達する可能な方法の１つは、ナノ粒子、リポソーム、デンドリマーまたはポリマーミセルのようなナノスケール薬物送達系（ｎａｎｏ−ｓｃａｌｅｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ：ＮＳＤＤＳ）を用いることである。
【０００３】
ＮＳＤＤＳの中でも、自己集合ナノ粒子系（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ）は、該系が薬物濃度を治療上望ましい範囲に維持し、かつ薬物の溶解度、安定性、透過性および半減期を増大することができるために、薬物送達およびターゲティングのために有望な担体として最近浮上している。
【０００４】
これらの系は、高分子ミセルおよび高分子ナノ粒子を含有し、水溶液中において親水性部分および疎水性部分が安定したコア−シェル構造を形成する両親媒性共重合体の自己集合（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ）によって得ることができ、前記系は、その臨床的用途が水溶液中におけるそれらの低い溶解度によって制限される疎水性薬物を含む様々な薬物を送達することができる。前記系はまた、送達効率を改善し、標的を定めた送達により副作用を低減する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、物理的に封入された薬物分子を送達するための有効な担体として使用可能なミセルまたはナノ粒子に自己集合することができる生体適合性の両親媒性共重合体の開発および合成は依然として行われている最中であり、医薬品工業の必要性を満たすために、より多くのこれらの製品が絶えず必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、以下に記載する式（Ｉ）の新規な両親媒性ポリマー、並びにそれらの調製およびそれらの使用の方法に言及する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】異なる濃度を用いることにより、インキュベーションの４時間後（ａ）および２４時間後（ｂ）の１６ＨＢＥ細胞に対する空ミセルの細胞適合性プロファイルを報告する図である。
【図２Ａ】ＮＰ懸濁液に２４時間曝露したＮＩＨ／３Ｔ３マウス繊維芽細胞（Ａ）におけるアポトーシス細胞死の活性化を示す図である。カスパーゼ活性化は、プロ−カスパーゼ−３（３２ｋＤａ）およびその活性型カスパーゼ−３（１７ｋＤａ）に対する特異抗体を有する総細胞抽出液のウエスタンブロット解析によって測定した。未曝露の培養物を対照として用い、カンプトテシン処理したジャーカット溶解物をアポトーシス（ａｐｏｔｏｓｉｓ）に対する正の対照として用いた。（ＰＰ：ＰＨＥＡ−Ｐｌｇａ  ＮＰｓ；ＰＰＰ：ＰＨＥＡ−Ｐｌｇａ−Ｐｅｇ）。
【図２Ｂ】ＮＰ懸濁液に２４時間曝露したＨＵＶＥＣ（Ｂ）におけるアポトーシス細胞死の活性化を示す図である。カスパーゼ活性化は、プロ−カスパーゼ−３（３２ｋＤａ）およびその活性型カスパーゼ−３（１７ｋＤａ）に対する特異抗体を有する総細胞抽出液のウエスタンブロット解析によって測定した。未曝露の培養物を対照として用い、カンプトテシン処理したジャーカット溶解物をアポトーシス（ａｐｏｔｏｓｉｓ）に対する正の対照として用いた。（ＰＰ：ＰＨＥＡ−Ｐｌｇａ  ＮＰｓ；ＰＰＰ：ＰＨＥＡ−Ｐｌｇａ−Ｐｅｇ）。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明は上記の前記問題を克服することを可能にし、式（Ｉ）を有するポリアスパルトアミド構造を備えたポリマーを利用可能にする。
【化１】
2017538796.tif 000003
前記式中、
Ｘ−は、Ｈ、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ａ−ＯＨまたは−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ａ−Ｏ−ＣＨ３からなる群から選択され、ここでａは９〜４５０であり、
Ｙ−は、１〜４０ｋＤａの分子量を有する乳酸−グリコール酸エステル共重合体（ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ）  ｅｓｔｅｒ：ＰＬＧＡ）からなり、
前記式中、
ｎおよびｍは、それぞれ、前記ポリマーのアルファおよびベータ繰り返し単位の総数の０．１〜５０％であり得、前記総数は６３〜３８０であり、
ｗ＝前記ポリマーのアルファおよびベータ繰り返し単位の総数−ｎであり、ｚ＝前記ポリマーのアルファおよびベータ繰り返し単位の総数−ｍであり、
式（Ｉ）中のＸ−基は、例えば、エステル結合、ウレタン結合または炭酸結合（ｃａｒｂｏｎｉｃ  ｌｉｎｋａｇｅｓ）によって、ポリマーＰＨＥＡに結合され、
同様に、Ｙ−が、例えばポリラクチド−グリコール酸鎖（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｄｅ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ  ｃｈａｉｎ）である場合、それはＰＬＧＡのカルボン酸基がエステル結合によって前記ポリマーに結合されることを意味する。
【０００９】
前記式から分かり得るように、本発明に従った本ポリマーは、生体適合性のα，β−ポリ（Ｎ−２−ヒドロキシ−エチル）−ｄ，ｌ−アスパルトアミド（ＰＨＥＡ）骨格と、乳酸−グリコール酸共重合体（ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）（ＰＬＧＡ）鎖からなる側鎖における疎水性部分とを示す。
【００１０】
ＰＨＥＡは、合成の水溶性、生体適合性、無毒、かつ非抗原性のポリマーであり、該ポリマーは、ナノ粒子、ミセルのようなコロイド薬物送達系（ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  ｄｒｕｇ−ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を調製するため、および遺伝子送達用の高分子電解質複合体を調製するために用いられてきた。
【００１１】
また、より生体適合性にするために、ＰＨＥＡをその側鎖において、疎水性分子と組み合わせて、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような親水性鎖によって、修飾することも知られている。
【００１２】
通常、高分子ミセルの親水性外殻を形成するためには、２０００〜５０００Ｄａの分子量を有するＰＥＧ鎖が用いられ、これは立体保護に有効である前記ミセルが細網内皮系（ＲＥＳ）による認識を妨げ、かつ血流循環を延長することを含む重要な利点を提供するためである。
【００１３】
好ましい式（Ｉ）のポリマーは、前記式中、Ｘ−はウレタン結合によって該ポリマーに直接コンジュゲートされており、Ｙ−はエステル結合によって該ポリマーに直接コンジュゲートされているポリマーである。
【００１４】
より好ましいのは、式（Ｉ）のポリマーであって、前記式中、Ｘ−はＨまたは−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｂ−Ｏ−ＣＨ３であり、ここでａは１７４であり、Ｙは１０〜１８ｋＤａの分子量を有する乳酸−グリコール酸エステル共重合体（ＰＬＧＡ）からなる、ポリマーである。
【００１５】
本発明に従ったポリマー材料は、高い生体適合性と、高い収率、再現性および低いコストを有する容易な製造方法と、薬物含量および薬物タイプ、活性および投与経路の観点からの多用途性とを有するナノスケール薬物送達系、すなわち両親媒性ポリアスパルトアミドグラフト共重合体を含有する医薬組成物の調製に用いることができる。
【００１６】
実際、本発明に従った共重合体は、水中において、以下の薬物分類：ステロイドおよび非ステロイド性抗炎症剤、アミノグリコシド、マクロライド、セファロスポリン、テトラサイクリン、キノロン、ペニシリン、ベータラクタムのような抗生物質、プロスタグランジン、プロスタマイド（ｐｒｏｓｔａｍｉｄｅ）、アルファおよびベータ−遮断薬のような抗緑内障薬、炭酸脱水酵素の阻害剤、カンナビノイド、抗ウイルス薬、診断用薬、抗血管新生薬、抗酸化剤（その中でも、例えば、シリビン、ソラフェニブ（ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）、デソニド、クルクミン）に属する薬物分子を担持する（物理的にそれらを封入する）ことができるミセル型またはナノ粒子型構造に自己集合することができ、さらに、上記の前記ミセルまたはナノ粒子は、封入した薬物を長期間かつ制御された時間で放出することができる。
【００１７】
従って、本発明はまた、本発明の目的の前記共重合体が用いられる医薬製剤にも言及し、前記ミセルは水分散法または透析分散法（ｄｉａｌｙｓｉｓ  ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）によって調製することができる。ナノ粒子は均質化−溶媒蒸発法（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ−ｓｏｌｖｅｎｔ  ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）、水分散法、高圧均質化法（ｈｉｇｈ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）によって調製することができる。
【００１８】
本記載に従った医薬製剤は、上記に述べたすべての薬物分類が応用される各種疾患の治療のための局所投与または全身投与のいずれにも用いることができる。
【００１９】
一例として、ＡＭＤ（加齢黄斑変性）、糖尿病性網膜症、黄斑浮腫、ＣＮＶ（脈絡膜血管新生（Ｃｈｏｒｏｉｄｅａｌ  Ｎｅｏ−Ｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ））のような血管新生および炎症性要素を有する後眼部を伴うすべての眼疾患の治療および予防のためである。または常に例として、古典的な治療処置が有効でない神経膠腫、パーキンソン病、アルツハイマーのような脳疾患の治療のためである。従って、典型的には、これらの医薬製剤は、ナノスケール薬物送達系（ＮＳＤＤＳ）が治療上の利点を提供し得るすべてのそれらの疾患の治療に応用され得る。
【００２０】
さらに、本発明は、式（ＩＩ）：
【化２】
2017538796.tif 000004
のポリマーから出発する式（Ｉ）のポリマーの調製方法にも言及し、
前記式中、
αおよびβは、それぞれ前記ポリマーのアルファおよびベータ繰り返し単位の数であり、かつ６３〜３８０である。
【００２１】
本発明によれば、式（ＩＩ）のポリマーの調製方法は、下記工程、すなわち、
ａ）カルボニル化剤（ｃａｒｂｏｎｙｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）によってポリマー（ＩＩ）のヒドロキシル基を活性化する工程；
ｂ）そのように活性化された化合物を式ＮＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ａ−ＯＨまたはＮＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ａ−Ｏ−ＣＨ３（前記式中ｂは９〜４５０である）の末端アミン基を有するＰＥＧ分子と反応させる工程；
ｃ）カルボン酸活性化剤によって、１〜４０ｋＤａの分子量を有するＰＬＧＡのカルボン酸基を活性化する工程；
ｄ）工程（ｃ）の活性化された化合物をポリマー（ＩＩ）と反応させて、化学式（Ｉ）の化合物（前記式中（ｉｎ  ｃｕｉ）、Ｘ＝ＨかつＹ＝ＰＬＧＡである）を得る工程、
または、
ｄ’）工程（ｃ）の活性化された化合物を工程（ｂ）において得られた化合物と反応させて、化学式（Ｉ）の化合物〔前記式中、Ｘは、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ａ−ＯＨ、または−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ａ−Ｏ−ＣＨ３であり、ここでａは９〜４５０であり、かつＹ＝１〜４０ｋＤａの分子量を有する乳酸−グリコール酸エステル共重合体（ＰＬＧＡ）である〕を得る工程を含む。
【００２２】
反応（ａ），（ｂ），（ｃ），（ｃ’）は、好ましくは非プロトン性極性溶媒、例えばジメチルホルムアミド（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｆｏｒｍａｍｉｄｅ：ＤＭＦ）中において行なわれる。
【００２３】
カルボニル化剤は、好ましくは、例えば炭酸ビス（４−ニトロフェニル）（ｂｉｓ（４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｃａｒｂｏｎａｔｅ）（ＰＮＦＣ）のようなフェニル−ビス−カルボナート（ｐｈｅｎｙｌ−ｂｉｓ−ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、または例えば炭酸ジスクシンイミジル（ｄｉ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−ｃａｒｂｏｎａｔｅ：ＤＣＳ）のようなスクシミジル−ビス−カルボナート（ｓｕｃｃｉｍｉｄｙｌ−ｂｉｓ−ｃａｒｂｏｎａｔｅ）である。
【００２４】
反応（ｃ）は、好ましくは適当なカルボン酸基活性化剤（例えば、カルボニル−ジ−イミダゾール（ｃａｒｂｏｎｙｌ−ｄｉ−ｉｍｉｄａｚｏｌｅ：ＣＤＩ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（１−ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ：ＥＤＣ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ：ＨＯＢＴ）、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ：ＮＨＳ））の存在下で行われる。
【００２５】
反応（ａ）について、ポリマー活性化度は、例えばＰＮＦＣのような式フェニル−ビス−カルボナート、または例えばＤＣＳのような式スクシミジル−ビス−カルボナート（ｓｕｃｃｉｍｉｄｙｌ−ｂｉｓ−ｃａｒｂｏｎａｔｅ）のヒドロキシル基活性化剤の濃度を調整することにより変更することができる。反応（ａ）について、前記ポリマーのヒドロキシル基の活性化度は、出発ポリマーの繰り返し単位（Ｒ．Ｕ．）間のモル比および活性化剤のモル比（０．０１〜１）、反応時間（１〜２４時間）並びに反応温度（−１０〜＋６０℃）に依存する。よって、これらのパラメータを調整して、０．１〜２０ｍｏｌ％の間で変化する活性化度を得ることが可能である。
【００２６】
本発明は、以下の実験の実施例を鑑みると、よりよく理解されるであろう。
【実施例】
【００２７】
実験部
式（Ｉ）のポリマーの合成
式（Ｉ）（ＰＨＥＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡ）のポリマーを、１０〜７０ｋＤａ（好ましくは４５ｋＤａ）の平均分子量（Ｍｖ）を有する水溶性ポリマーのポリ（Ｎ−２−ヒドロキシ−エチル）−ＤＬ−アスパルトアミド（ＰＨＥＡ）から出発して、２つの合成段階によって合成した。
【００２８】
ＰＨＥＡ側鎖内に存在するヒドロキシル基を、４０℃のＤＭＦ溶液中でジスクシンイミジル−ビス−カルボナート（ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−ｂｉｓ−ｃａｒｂｏｎａｔｅ）（ＤＳＣ）と反応させることによって活性化した。活性化反応の後、ＰＥＧ−ＮＨ２を添加し、混合物を２５℃で１８時間にわたって維持した。ＰＨＥＡ繰り返し単位（ＲＵ）と活性化剤のモルとのモル比、反応時間、並びにＰＥＧ−ＮＨ２のモルは、ポリマーの誘導体化度（ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ  ｄｅｇｒｅｅ）を決定する。例えば、０．１５のＲＵ／ＤＳＣモル比、０．１５のＲＵ／ＰＥＧ−ＮＨ２モル比、および４時間の活性化時間を用いることによって、１０ｍｏｌ％に相当するＰＨＥＡのＰＥＧ中における誘導体化度を得た。反応生成物を徹底的な透析（ｅｘｈａｕｓｔｉｖｅ  ｄｉａｌｙｓｉｓ）によって精製し、凍結乾燥した。出発ＰＨＥＡに対して８５％の収率でＰＨＥＡ−ＰＥＧを得た。
【００２９】
ＰＥＧのＰＨＥＡへのコンジュゲーションの程度（Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｄｅｇｒｅｅ）は１Ｈ−ＮＭＲ分光法によって測定した。
【００３０】
ＰＬＧＡ鎖中に存在する末端カルボン酸基を、３５℃のＤＭＦ溶液中でカルボニルジイミダゾール（ｃａｒｂｏｎｙｌｄｉｉｍｉｄａｚｏｌｅ：ＣＤＩ）と反応させることによって活性化した。活性化反応の後、活性化されたＰＬＧＡをＰＨＥＡ−ＰＥＧのＤＭＦ溶液に添加し、混合物を３５℃で１８時間にわたって維持した。ＰＨＥＡ繰り返し単位（ＲＵ）とＰＬＧＡのモルとのモル比、反応時間、並びに活性化剤のモルは、ポリマーの誘導体化度を決定する。例えば、０．０１のＲＵ／ＰＬＧＡモル比、１．２のＰＬＧＡ／ＣＤＩモル比、および４時間の活性化時間を用いることによって、１ｍｏｌ％に相当するＰＨＥＡ−ＰＥＧのＰＬＧＡ中における誘導体化度を得た。反応生成物を徹底的な透析によって精製し、凍結乾燥した。出発ＰＨＥＡ−ＰＥＧに対して５５％の収率でＰＨＥＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡを得た。
【００３１】
コンジュゲーション反応の順序および上述の反応の試薬比率は、最終的な共重合体の溶解度の関数で調整され得る。例えば、活性化されたＰＬＧＡをＰＨＥＡのＤＭＦ溶液中に添加し、次にＰＨＥＡ側鎖中に存在するヒドロキシル基を、ジスクシンイミジル−ビス−カルボナート（ＤＳＣ）と反応させることによって活性化して、ＰＥＧ−ＮＨ２と反応させることができる。最終的な共重合体は、この場合、ＰＨＥＡ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧと名付けられる。
【００３２】
ＰＨＥＡ−ＰＥＧに対するＰＬＧＡのコンジュゲーションの程度は１Ｈ−ＮＭＲ分光法によって測定した。
【００３３】
ＰＨＥＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡの平均分子量（Ｍｖ）は、有機（ＤＭＦ）ＳＥＣによって測定され、１０００〜１４５０００Ｄａに及ぶＰＥＧ分子量標準を用いることにより得られた検量線との比較によって計算されて４５，０００〜５００，０００Ｄａ（好ましくは９５，０００Ｄａ）であり得る。
【００３４】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＦｄ７）：δ８．４９−８．０５（ｂｒ、２Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−）、５．４９（ｍ、１Ｈ、−ＣＨ−Ｏ−）、５．２５（ｍ、２Ｈ、−ＣＨ２−Ｏ−）４．７０（ｍ、Ｈ、−ＮＨ−ＣＨ−）、４．２−４．０（ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−）、３．６３（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）、３．５０（ｍ、２Ｈ、−ＮＨ−ＣＨ２−）、３．３１（ｍ、２Ｈ、−ＣＨ２−ＯＨ）、２．７９（ｍ、２Ｈ、−ＣＨ２−ＣＯ−）、１．５７（ｍ、３Ｈ、−ＣＨ３−）。
【００３５】
【化３】
2017538796.tif 000005
スキーム１：ＰＨＥＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡ、すなわち式Ｉのポリマーとして本文中に示されるポリマーの構造；ｑはグリコール酸モノマー（ｇｌｙｃｏｌｉｃ  ｍｏｎｏｍｅｒ）の繰り返し単位の数であり、ｐはラクチドモノマー（ｌａｃｔｉｄｅ  ｍｏｎｏｍｅｒ）の繰り返し単位の数であり、ａはオキシエチレンモノマーの繰り返し単位の数である。
【００３６】
（実施例１）
ＰＨＥＡ−ＰＥＧの合成：ＤＭＦ（５ｍＬ）中４００ｍｇのＰＨＥＡに、９７．２１ｍｇのＤＳＣを添加し、混合物を４０℃で４時間にわたって撹拌した。４時間の反応後、この溶液にアミノ−ＰＥＧ２０００（７４０ｍｇ）を添加した。２５℃で１８時間後、ＰＨＥＡ．ＰＥＧをジエチルエーテル（５０ｍＬ）中で沈殿させ、公称分画分子量３５００の膜を介して水に対して透析した。収量７２７．５ｍｇ。１Ｈ  ＮＭＲによって計算されたＰＥＧ部分の誘導体化度（ＤＤＰＥＧ％）は、繰り返し単位の総量に対して９．６％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＦｄ７）：８．４９−８．０５（ｂｒ、２Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−）、４．７０（ｍ、Ｈ、−ＮＨ−ＣＨ−）、４．２（ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−）、３．６３（−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）、３．５０（ｍ、２Ｈ、−ＮＨ−ＣＨ２−）、３．３１（ｍ、２Ｈ、−ＣＨ２−ＯＨ）、２．７９（ｍ、２Ｈ、−ＣＨ２−ＣＯ−）。
【００３７】
（実施例２）
ＰＨＥＡ−ＰＥＧの合成：得られたＰＨＥＡ−ＰＥＧ（４００ｍｇ、１．１４ｍｍｏｌの繰り返し単位）をＤＭＦ（８ｍＬ）中に分散させた。これとは別に、ＰＬＧＡ（ポリラクチド−ｃｏ−グリコール酸（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｄｅ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）  ５０：５０）（１２５ｍｇ、０．０１１４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（８ｍＬ）中で可溶化させ、次にＣＤＩ（１．８５ｍｇ、０．０１１４ｍｍｏｌ）を一度に添加した。その反応を撹拌しながら３５℃で４時間にわたって維持した。次に、活性化されたＰＬＧＡを前記ＰＨＥＡ−ＰＥＧ溶液に滴下して添加した。その反応混合物を３５℃で１８時間にわたって反応させるために放置した。その後、ジエチルエーテル（１５０ｍＬ）中でＰＨＥＡ−ＰＲＧ−ＰＬＧＡを沈殿させ、その固形物を２：１のジエチルエーテル／ジクロロメタン混合物で洗浄した（４０ｍＬ×３回）。よって、水溶性画分を再蒸留水（２０ｍＬ）で抽出し、凍結乾燥後に固体生成物を回収した。収率：５１％。１Ｈ  ＮＭＲによって算出したＰＬＧＡ部分の誘導体化度は、繰り返し単位の総量に対して１％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＦｄ７）：８．４９−８．０５（ｂｒ、２Ｈ、−ＣＯ−ＮＨ−）、５．４９（ｍ、１Ｈ、−ＣＨ−Ｏ−）、５．２５（ｍ、２Ｈ、−ＣＨ２−Ｏ−）、４．７０（ｍ、Ｈ、−ＮＨ−ＣＨ−）、４．２−４．０（−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−）、３．６３（−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）、３．５０（ｍ、２Ｈ、−ＮＨ−ＣＨ２−）、３．３１（ｍ、２Ｈ、−ＣＨ２−ＯＨ）、２．７９（ｍ、２Ｈ、−ＣＨ２−ＣＯ−）、１．５７（ｍ、３Ｈ、−ＣＨ３）。
【００３８】
ＰＨＥＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡの平均分子量（Ｍｖ）は、有機（ＤＭＦ）ＳＥＣによって測定され、１０００〜１４５０００Ｄａに及ぶＰＥＧ分子量標準を用いることにより得られた検量線と比較して計算された９５，０００Ｄａという結果を得た。
【００３９】
（実施例３）
前記ポリマーの臨界凝集濃度（ＣＡＣ）の測定：一例として用いられるＰＨＥＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡのＣＡＣは、プローブとしてピレンを用いた蛍光分析によって測定した。ピレンのストック溶液（アセトン中、６．０×１０−５Ｍ）を調製し、次に、２０μＬのアリコートをバイアルに入れ、３７℃のオービタルシェイカーにおいて、アセトンを除去するために蒸発させた。続いて、１×１０−５〜５ｍｇ／ｍＬに及ぶ濃度の共重合体水溶液２ｍＬをピレン残留物に添加した。ピレンの最終濃度は各試料において６．０×１０−７Ｍであった。それらの溶液を連続して撹拌しながら３７℃で２４時間にわたって維持し、ピレンをミセルと平衡させた。ピレン励起および発光スペクトルを、３７３ｎｍの発光波長および３３３ｎｍの励起波長を用いて、３７℃で記録した。結果を表１に報告する。
【００４０】
【表１】
2017538796.tif 000006
【００４１】
（実施例４）
ＰＨＥＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡからのソラフェニブ担持ミセルの調製：典型的には、ＤＭＦ（２ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ）中の前記ポリマーにソラフェニブ（１０ｍｇ）を添加した。次に、そのポリマー／薬物溶液を真空（０．９ミリバール）下で乾燥させ、必然的に超音波処理／強力な混合のサイクル（１０分間×３回）によって、ｐＨ７．４のＰＢＳ中に分散させた。その後、その分散液を２５℃で１８時間にわたってオービタルシェイカー内に配置し、その後、公称分画分子量１０００を有する膜を介して水に対して透析した。結果として生じた分散液を次に凍結乾燥させ、黄色粉末として生成物を得た。収率を表２に報告する。
【００４２】
（実施例５）
ＰＨＥＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡ系ナノ担体の薬物ペイロードの測定：３ｍｇの薬物担持ナノ担体を、１０分間超音波処理することにより、９０：１０のメタノール／水（５ｍＬ）中に分散させ、その分散液を４時間にわたって強力に撹拌した。この後、前記分散液を０．２μｍのシリンジフィルタによって濾過し、メタノール／水溶液を分析用フラスコ（１０ｍＬ）中に回収した。最後に前記シリンジフィルタを、前記溶液が１０ｍＬに正確に希釈されるまで、メタノール／水で洗浄した。５０μＬのこの溶液をＨＰＬＣ分析によって分析した：１ｍＬ／分の流量で溶離液としてメタノール／水（９０：１０）、およびＣ６−フェニルカラム。結果を表２に報告する。
【００４３】
（実施例６）
ＰＨＥＡ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧからのソラフェニブ担持ナノ粒子の調製：ＰＨＥＡ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧからのナノ粒子の調製：ＰＨＥＡ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧ（１００ｍｇ）を５０：５０のＴＨＦ／ＤＭＳＯ（８ｍＬ）中で可溶化させ、次に、ポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｉｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）（ＰＶＰ、８０ｍｇ）およびソラフェニブ（ｓｏｒａｎｅｆｉｂ）（４０ｍｇ）を一度に添加した。その混合物を、公称分画分子量１２〜１４ｋを有する透析試験管内に配置し、それによりｐＨ７．５の０．０５Ｍのトリス（ＴＲＩＳ）緩衝液に対して４時間にわたって透析した。最後に、ナノ粒子を公称分画分子量１００ｋを有する透析管に入れ、水に対して２日間維持した。
【００４４】
分散液を５μｍの細孔サイズのシリンジフィルタに通して濾過し、凍結乾燥させて、固体ナノ粒子を得た。収率：１００％
【００４５】
（実施例７）
ＰＨＥＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡ系ナノ担体のサイズおよびゼータ電位の測定：前記ミセルのサイズ分布は、１７３°の固定散乱角で５３２ｎｍのレーザが取り付けられたマルバーン  ゼータサイザー  ナノＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ＮａｎｏＺＳ）装置において２５℃で実施した動的光散乱分析によって得た。ミセルの水溶液（２ｍｇ／ｍＬ）を５μｍのセルロースメンブレンフィルターに通して濾過した後に分析した。強度−平均流体力学的径および多分散性指数（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ  ｉｎｄｅｘ：ＰＤＩ）は、相関関数の累積率分析によって得た。ゼータ電位（ｍＶ）は、スモルコフスキーの関係（Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｙ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ）を用いて、Ｋａ＞＞１であると仮定して（Ｋおよびａは、それぞれデバイ−ヒュッケルパラメータおよび粒子半径である）、電気泳動移動度から計算した。結果を表２に報告する。見られるように、すべての共重合体は疎水性薬物シリビンを担持する能力を示した。
【００４６】
【表２】
2017538796.tif 000007
【００４７】
（実施例８）
インビトロの細胞適合性評価。得られたミセルの生体適合性を、市販のキット（Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  ９６（登録商標）  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を用いることにより、ヒト気管支上皮（１６ＨＢＥ）細胞系統に対するＭＴＳアッセイによって評価した。細胞を２×１０４細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種し、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中、３７℃で、１０％のＦＢＳ（ウシ胎児血清）および１％のペニシリン／ストレプトマイシン（１００００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび１０ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン）を含むダルベッコ最少必須培地（ＤＭＥＭ）中において増殖させた。細胞増殖の２４時間後、前記培地を、０．０２５、０．０５、０．１、０．２５、０．５および１ｍｇ／ｍＬに相当するウェル当たりの濃度で未担持のＰＨＥＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡミセルを含有する２００μＬの新鮮な培地と交換した。インキュベーション時間の４時間後および２４時間後、ＤＭＥＭを１００μＬの新鮮な培地と交換し、２０μＬのＭＴＳ溶液を各ウェルに添加した。プレートを３７℃でさらに２時間インキュベートした。培地とともにインキュベートした細胞を負の対照として用いた。結果を対照細胞の減少率として表わした（図１を参照）。培養実験はすべて３回繰り返して実施した。
【００４８】
細胞適合性調査の結果は、空のミセルとして試験された高分子ミセルはすべて、高度に生体適合性であり、インビトロで正常ヒト上皮細胞に対して有毒ではなく、したがって薬物をインビボで送達するための有望な効果的手段を構成するということを明示した。
【００４９】
（実施例９）
ＰＨＥＡ−ＰＬＧＡおよびＰＨＥＡ−Ｐｌｇａ−Ｐｅｇナノ粒子の細胞毒性の評価
細胞培養および処理  ２つの細胞タイプ、すなわち、ＮＩＨ−３Ｔ３マウス繊維芽細胞およびヒト臍帯静脈内皮細胞（Ｈｕｍａｎ  Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  Ｖｅｉｎ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ：ＨＵＶＥＣ）を用いた。
【００５０】
ＮＩＨ／３Ｔ３マウス繊維芽細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５８）を、湿度９５％の５％ＣＯ２中、３７℃で、１０％のウシ胎児血清および１００Ｕ／ｍＬのペニシリン−ストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地中で維持した。前記細胞を、ウェル当たり６．５×１０４細胞の濃度で２４−ウェル滅菌プレート（ヌンク（Ｎｕｎｃ））に蒔いて、５００μＬの培地中でインキュベートした。２４時間後、培地を更新して、前記細胞を実験に使用した。
【００５１】
ＨＵＶＥＣは、新たに得られたヒト臍帯から、別記されているように（ジャッフェ、１９７３年ら）、臍静脈の内部のコラゲナーゼ消化によって分離し、ゼラチンで前処理したフラスコ内において、２０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％のＬ−グルタミン、２０ｍＭのヘペス（ｈｅｐｅｓ）、ペニシリン／ストレプトマイシン、５０ｍｇ／ｍＬの内皮細胞成長因子および１０μｇ／ｍＬのヘパリンを補充した培地１９９中で培養した。細胞を５％のＣＯ２を含む加湿雰囲気を有するインキュベーター内において３７℃で維持した。
【００５２】
検定されるべきナノ粒子（ＮＰ）を超音波処理によって培地中に懸濁させ、５．５ｍｇ／ｍＬ〜０．０７５ｍｇ／ｍＬに及ぶ濃度で２４時間にわたって培養物に添加し、その後、細胞生存率（スルホロダミンＢアッセイによる）およびアポトーシス（カスパーゼ−３活性化測定による）を評価するために細胞を用いた。
【００５３】
スルホロダミンＢ（ＳＲＢ）アッセイ  細胞培養上澄み液を除去せずに、１２５μＬの冷５０％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を各ウェルに添加し（最終的なＴＣＡ  １０％）、それらのプレートを４℃で１時間にわたってインキュベートした。前記プレートを水で２回洗浄し、次いで、室温で風乾させた。１％（ｖ／ｖ）酢酸中の４％（ｗ／ｖ）ＳＲＢ溶液３００μＬを各ウェルに添加した。プレートを室温で３０分間放置し、次に、未結合の色素を除去するために、１％（ｖ／ｖ）の酢酸で４回濯いだ。前記プレートを室温で風乾させた。結合した色素を前記細胞から塩基性溶液（トリス塩基  １０ｍＭ）によって抽出し、ＳＲＢの吸収を５６５ｎｍで測定した。シグナルの強度は、生細胞の数、従ってそれらの増殖の尺度に比例する。
【００５４】
細胞の５０％を死滅させる生成物の濃度として定義されるＬＣ５０、および９５％の信頼限界をリッチフィールド・ウィルコクソン法（Ｌｉｔｃｈｉｆｉｅｌｄ  ａｎｄ  Ｗｉｌｃｏｘｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）（１９４９年）に従って計算した。
【００５５】
カスパーゼ−３評価のためのウエスタンブロット  適当な処理に従って、細胞溶解物を非変性緩衝液（１０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）  Ｘ−１００、５ｍＭのＥＤＴＡ−Ｎａ２、１ｍＭのジチオトレイトール（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ：ＤＴＴ）、１ｇ／ｍＬのロイペプチン、１ｍＭのベンズアミジン、２μｇ／ｍＬのアプロチニン）中において調製した。イムノブロット分析について、１試料当たり４０μｇのタンパク質溶解物を４×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液［トリス−ＨＣｌ  ２６０ｍＭ、ｐＨ８．０、４０％（ｖ／ｖ）のグリセリン、９．２％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ、０．０４％のブロモフェノールブルー（ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅｍ）、および還元剤として２−メルカプトエタノール］中で変性させ、１０％のアクリルアミド（ａｃｒｉｌａｍｉｄｅ）／ビスアクリルアミド（ｂｉｓａｃｒｉｌａｍｉｄｅ）ゲル上におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。分離したタンパク質をニトロセルロース膜（ＨｙｂｏｎｄＰ  ＰＶＤＦ、アマシャム  バイオサイエンス）に転写した。膜上の残留結合部位を、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むトリス緩衝食塩水（１０ｍＭのトリス、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ２０）および５％（ｗ／ｖ）の脱脂粉乳中において４℃で一晩インキュベートすることによってブロックした。次に、膜を特定の一次抗体のウサギ抗カスパーゼ−３ポリクローナル抗体（セル  シグナリング  テクノロジー（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））でプローブし、その後、ペルオキシダーゼをコンジュゲートした二次抗体（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）Ｉｇ（ビーディ  ファーミジェン（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ））（１：５０００）でプローブし、ＥＣＬプラス検出系（アマシャム  バイオサイエンス）によって視覚化した。各ウェル内のタンパク質の等価負荷（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ  ｌｏａｄｉｎｇ）を、ポンソー染色（Ｐｏｎｃｅａｕ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）およびアクチンまたはラミンＢ対照によって確認した。
【００５６】
結果：表１に示すように、ＰＨＥＡ−ＰＬＧＡ系ナノ担体は、２つの細胞系統（繊維芽細胞および細胞内皮細胞）に対して良好な生体適合性を有し、ＨＵＶＥＣは繊維芽細胞よりも耐性を有する。実際、すべての場合において、ＬＣ５０値は＞５．０ｍｇ／ｍＬであり、よってこれらのナノ担体が薬理反応を引き起こすのに十分な量の薬物を担持するために有用であり得ると考えるに至った。興味深いことには、良好な生体適合性は、生理学的条件下で一般により安定しているペグ化された（ＰＥＧｙｌａｔｅｄ）ナノ担体についても、明らかである。
【００５７】
さらに、ＮＩＨ／３Ｔ３株細胞（図２Ａ）およびＨＵＶＥＣ（図２Ｂ）の双方に対して、ＳＲＢアッセイにおいて軽度の細胞毒性（ａ  ｌｉｇｈｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ）のみを誘発することができる濃度（１ｍｇ／ｍＬ）（細胞約２０％を死滅させる）まで、これらのナノ担体（ペグ化されているか、またはされていない）は細胞のアポトーシス機構を活性化せず、よってそれらの良好な生体適合性を確認する。
【００５８】
表１：ＮＩＨ／３Ｔ３およびＨＵＶＥＣに対するＳＲＢアッセイにおいて評価されたＮＰ細胞毒性。ＬＣ５０は計算され、９５％信頼区間は推定された。示したデータは、４回繰り返し行なったうちの最低３回の独立した実験である。
【表３】
2017538796.tif 000008
【００５９】
（実施例１０）
インビトロのトランズウェル（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）アッセイによる、ＰＨＥＡ−ＰＬＧＡおよびＰＨＥＡ−Ｐｌｇａ−Ｐｅｇナノ粒子の細胞バリア（ｃｅｌｌ  ｂａｒｒｉｅｒｓ）を通過する能力の評価。
【００６０】
細胞培養
上皮バリア輸送（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）のために、Ｃａｃｏ−２細胞を用いた。実験はすべて２５〜３０継代（ｐａｓｓａｇｅｓ  ２５−３０）から実施した。前記細胞を、二室型チャンバに取り付けられたポリエチレンテレフタレート膜インサート（０．４μｍ）（Ｆａｌｃｏｎ（商標）  セルカルチャーインサート（Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｉｎｓｅｒｔｓ）、１０．５ｍｍ  ＩＤ、コーニング  ライフ  サイエンス  ＤＬ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＤＬ）、ニューヨーク州コーニング）上に４．５×１０４細胞／ｃｍ２で播種した。細胞間結合の密着性（ｔｉｇｈｔｎｅｓｓ）を反映するために、経上皮電気抵抗（ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ：ＴＥＥＲ）をミリセル（Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ）  ＥＲＳメータ（フィッシャー  サイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉ．）、ペンシルベニア州ピッツバーグ）によって試験し、ＴＥＥＲ≧２５０Ωｃｍ２を有する細胞のみを透過性の検討に用いた。トランズウェル上に播種後１８〜２０日（９０〜１００％コンフルエント（９０−１００％  ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ））に、それらの細胞を実験に使用した。
【００６１】
内皮透過性測定のために、ＨＵＶＥＣをゼラチン被覆ポリエチレンテレフタレート膜インサート（０．４μｍ）（Ｆａｌｃｏｎ（商標）セルカルチャーインサート、１０．５ｍｍ  ＩＤ、コーニング  ライフ  サイエンス  ＤＬ、ニューヨーク州コーニング）上に播種した。前記インサートを１２ウェル培養プレートに配置して、膜によって分離された二室コンパートメント系を得た。０．５ｍＬの完全培地中の約１０５のＨＵＶＥＣ／ｃｍ２を前記膜の上側に播種し、一方、１．５ｍＬの完全培地を下側のコンパートメントに添加した。これらの体積は前記膜を横切る静水学的流体圧力を防止した。双方のコンパートメントを記載したような完全培地で頻繁に補充した。培養物を６日間増殖させると、コンフルエントな単層の形成をもたらし、それを位相差光学顕微鏡（ｐｈａｓｅ  ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｌｉｇｈｔ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）によって確認した。
【００６２】
フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識したＮＰの輸送。完全培地中に溶解した非細胞毒性濃度（５００μｇ／ｍＬ）のＦＩＴＣ標識ＮＰをアピカルチャンバ（ａｐｉｃａｌ  ｃｈａｍｂｅｒ）に添加し、次いで、バソラテラル溶液を６時間後および２４時間後に収集した。２４時間後、アピカル溶液を収集し、トランズウェルインサート上の膜を１．５ｍＬの氷冷水酸化ナトリウム（０．５Ｍ）中に入れて、プローブ型ソニック  ディスメンブレーターで超音波処理した。ＦＩＴＣ定量化のために、アピカル溶液およびバソラテラル溶液を分光光度法で読み取った（励起  ４８５ｎｍ、発光  ５３８ｎｍ）。ＮＰ−ＦＩＴＣの漏出は、下部コンパートメントにおける蛍光によって規定し、全蛍光（上側および下側コンパートメントの合計測定値）のパーセンテージとして表わした。
【００６３】
内皮層の機能的完全性の評価。経内皮アルブミン透過性を内皮層の完全性の機能的マーカーとして評価した。ＨＵＶＥＣをトランズウェル（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）  インサート上で培養し、非細胞毒性濃度のＮＰ（５００μｇ／ｍＬを上側コンパートメントに添加）に２４時間曝露した。次に、前記細胞を無血清培地によって１時間インキュベートした。ウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ：ＢＳＡ）（２００μΜ）をアピカルチャンバに添加した。試料（５０μＬ）をバソラテラルチャンバから１時間後および２時間後に採取した。前記試料のアルブミン含有量をブロモクレゾールグリーン比色分析キット（シグマ−オールドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（ミラノ））によって、検量線を用いて測定した。過酸化水素を正の対照に用いた。結果：腸上皮細胞を介したＮＰ輸送に対する調査研究において、Ｃａｃｏ−２細胞系統は、腸上皮細胞とのその相同性および同様のモルホロジーのために、古典的な細胞モデルとして一般に認められている。本発明者らの実験において、ＦＩＴＣ標識ＰＨＥＡ−Ｐｌｇａ  ＮＰおよびＰＨＥＡ−Ｐｌｇａ−Ｐｅｇ  ＮＰ（表２）の定量的測定は、この選択的に透過性の腸細胞単層の非常に高い性能に従って、２４時間後に全ＮＰの約５％が細胞単層を通ってトランズウェルプレートの下部コンパートメントに移行したことを示した。内皮単層（表２）を介したＮＰの輸送を調査するためにＨＵＶＥＣを用いた場合、その結果は、双方のＮＰについてより高い輸送、すなわち、ＰＨＥＡ−ＰｌｇａおよびＰＨＥＡ−Ｐｌｇａ−Ｐｅｇについて総量のそれぞれ最高２６％および３３％を示した。
【００６４】
表２：Ｃａｃｏ−２およびＨＵＶＥＣ単層におけるＮＰ輸送の割合（各フィルタのアピカル側に適用された濃度の％として表現）。３組のインサート（Ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ  ｉｎｓｅｒｔｓ）を各実験反復において用いた。データは平均±標準偏差として表わす。
【表４】
2017538796.tif 000009
【００６５】
内皮層の機能的完全性を評価するために、０．４μｍ−細孔トランズウェルフィルタ上で（上部から底部チャンバまで）増殖したＨＵＶＥＣのコンフルエントな単層を介したＢＳＡの輸送を評価した。試験したＰＨＥＡ−ＰｌｇａＮＰまたはＰＨＥＡ−Ｐｌｇａ−Ｐｅｇ  ＮＰの双方は、負の対照試料と比較した場合に、ＨＵＶＥＣ単層を介したアルブミンの輸送を増大せず、従って、２４時間のＰＨＥＡ−Ｐｌｇａ  ＮＰまたはＰＨＥＡ−Ｐｌｇａ−Ｐｅｇ  ＮＰとのインキュベーション後でさえ、前記内皮細胞単層は依然として機能的に完全であることを示した。
【図１】
2017538796.tif 000013
【図２Ａ】
2017538796.tif 000014
【図２Ｂ】
2017538796.tif 000015
【国際調査報告】
2017538796.tif 000016
2017538796.tif 000017
2017538796.tif 000018