(57)【要約】  本発明は、プロピオン酸菌との共培養において増殖できる真菌細胞、例えば酵母細胞を提供する。また、そのような細胞を生産する方法、および本発明の真菌細胞とプロピオン酸菌とを共培養で用いる発酵プロセスを提供する。そのような共培養によって、廃棄発酵ブロスの化学的酸素要求量負荷が著しく低減される。
2017514526.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロピオン酸菌培養の定常期上清中で少なくとも０．０２ｈ−１の最大増殖速度μｍａｘで増殖できる真菌細胞であって、前記定常期上清が、水中の６０ｇ／Ｌの甘性ホエーパウダー、５ｇ／Ｌの酵母抽出物および４０ｍｇ／ＬのＤ−パントテン酸カルシウムからなる液体培地中で、無曝気で３５℃で培養されたＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉの定常的培養物から得られる、真菌細胞。
【請求項２】
該真菌細胞が酵母細胞である、請求項１に記載の真菌細胞。
【請求項３】
２０１４年１月１４日にドイツのＢｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇのＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＤＳＭＺ）に寄託され、受託番号ＤＳＭ２８２７１のもとに入手可能である、酵母細胞。
【請求項４】
生物工学的生成物を生産するプロセスであって、プロピオン酸菌と真菌細胞との共培養を含み、前記真菌細胞が、培養培地中で、プロピオン酸菌培養の定常期上清中で増殖できる、プロセス。
【請求項５】
前記真菌細胞が酵母細胞である、請求項４に記載のプロセス。
【請求項６】
前記真菌細胞が、請求項１〜３のいずれか１項に記載の真菌細胞である、請求項４に記載のプロセス。
【請求項７】
前記生物工学的生成物が前記プロピオン酸菌によって産生される、請求項４〜６のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項８】
前記生物工学的生成物がビタミンＢ１２である、請求項４〜７のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項９】
前記プロセスが、無曝気時期、およびそれに続く好気的時期を含む、請求項４〜８のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１０】
該無曝気時期の間に該プロピオン酸菌の増殖の［乾燥重量グラム％表示で］少なくとも９０％が起こる、請求項４〜９のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１１】
該好気的時期の間に該真菌細胞の増殖の［乾燥重量グラム％表示で］少なくとも９０％が起こる、請求項４〜１０のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１２】
該培地の化学的酸素要求量（ＣＯＤ）が、該培養培地の初期ＣＯＤの２５％以下、好ましくは１０％以下のレベルに低減される、請求項４〜１１のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１３】
前記培養培地が乳清を含む、請求項４〜１２のいずれか１項に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオプロセス技術の分野、特に、酵母とプロピオン酸菌（すなわちＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）との共培養物を用いるバイオプロセスの分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
有機の化学的酸素要求量（ＣＯＤ）が高い廃液は、適宜対処しなければならない環境上の負荷である。これらの廃液は、様々な産業、例えば、乳製品、青果物または砂糖の処理産業の副産物であり得る。その一例は、チーズ製造から生じる副産物として乳業で生産される乳清である。このプロセスは、乳清（甘性ホエーまたはサワーホエー）を大量に生じる。乳清は、高いＣＯＤを有する一方で、有用な乾燥固形分、例えば乳タンパク質や乳糖の含有量が比較的低いために容易に／経済的に他へ利用することができない。
【０００３】
チーズ製造のプロセスによっては、余剰乳清のＣＯＤ値は３５，０００〜１００，０００ｍｇＯ２／Ｌの範囲であり得る。この高い有機負荷の主因は乳糖であり、乳糖は最高でＣＯＤ値の９０％に相当し得る。サワーホエーの場合、乳酸の存在はこの問題をさらに増大させる。また、乳糖は乳清乾燥物の約７５％に相当し、それ自体、微生物を利用するプロセスによって使用され得る。バイオエタノールおよびバイオガスの生産、乳糖またはタンパク質の抽出、有機酸またはバイオマスの生産など、乳清を利用するいくつかの解決策が研究されてきたが、乳清を利用する経済的なやり方がなおも必要とされている。
【０００４】
ＷＯ２０１１／１４０６４９には、食用バイオマスを生産するために乳酸細菌と酵母との混合培養によって乳清を利用することが記載されている。このプロセスは乳清のＣＯＤ負荷をうまく低減できるが、最終生成物には商業的価値がほとんどない。
【０００５】
乳清は、放線菌目に属するＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．属由来の細菌の培養に用いることができる（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（第１版、１９８６））。Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．は、有機酸（プロピオン酸および酢酸）、ビタミンＢ１２ならびに乳酸菌増殖促進性化合物などの価値の高い生成物を産生することが知られている。Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．は、乳清でうまく培養できるが、発酵済（使用済）乳清中に蓄積して最終的なＣＯＤ負荷に著しく寄与する有機酸を産生するため、ＣＯＤ負荷を十分に下げることができない。以下において、用語「Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．」と「プロピオン酸菌」とを互換的に用いる。
【０００６】
Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．とその他の細菌との共培養物は使用済培地のＣＯＤ負荷を低減できることが知られている（Ｍｉｙａｎｏら、２０００）が、そのようなプロセスは、食品用に適さないために食品加工工場内での使用が除外されるという欠点を有する。
【０００７】
Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．によって産生される代謝物は、他の微生物、特に真菌の増殖を阻害することが知られており、食品腐敗防止におけるそれらの使用はよく知られている。ＵＳ５，２６０，０６１には、酵母の増殖を阻害するためにＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．代謝物を食品用途に適用することが記載されている。国際公開第２００８／０３００８９号には、チーズ製造プロセスにおいて良好な風味／香気特性を得る目的でＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．と酵母とを共培養することが記載されている。この場合には、適用された酵母細胞がＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．由来の増殖阻害物質に対して耐性でなかったことから、混合培養における酵母の増殖はＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．を用いて制御され、最終的に阻害された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００８／０３００８９号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（第１版、１９８６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記の先行技術に鑑みて、本発明は、甘性ホエーまたはサワーホエーから価値の高い生物工学的生成物を生産するための新規バイオプロセスであって、最終的な使用済発酵培地が比較的低いＣＯＤを呈するバイオプロセスを提供することを目的とする。本発明の別の目的は、本発明のプロセスに有用な真菌細胞を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、プロピオン酸菌との共培養において増殖できる新規な真菌細胞、好ましくは酵母細胞を提供することによって、上記の目的を達成する。そのような真菌細胞または細胞は、プロピオン酸菌培養後に生じる定常期上清（使用済培地）においてそれらが増殖する能力によって特徴付けられ／定義され得る。また、本発明は、プロピオン酸菌との共培養において上記培地の存在下で増殖できるそのような真菌細胞を用いる生物工学プロセスに関する。
【００１２】
したがって、本発明の第１の態様は、プロピオン酸菌培養の定常期上清中で増殖できる真菌細胞に関する。
【００１３】
そのような真菌細胞は、本特許出願に記載される突然変異誘発／選択手順によって再現性よく得ることができる。ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ培養の定常期上清中で増殖する能力を有する真菌細胞、特に酵母細胞は、本発明に従って発酵プロセスからの廃棄物のＣＯＤ負荷を低減するのに役立つ。そのような真菌細胞（特にそのような酵母細胞）は、これまで当業者にとって利用可能ではなかった。
【００１４】
本発明の真菌細胞は、本明細書において以下に開示する手順によって容易に他の真菌細胞との識別および区別がなされ得る。具体的には、本発明によれば、真菌細胞の「プロピオン酸菌培養の定常期上清中で増殖する」能力を試験するための十分に定義された培養培地、および該培養培地中でのプロピオン酸菌の十分に定義された培養条件が開示される。
【００１５】
したがって、好ましい実施形態において、（真菌細胞が本発明によるものであるか否かを試験するために用いられる）定常期上清は、嫌気的条件下、３５℃およびｐＨ６．５で、６０ｇ／Ｌの甘性ホエーパウダー、５ｇ／Ｌの酵母抽出物および４０ｍｇ／ＬのＤ−パントテン酸カルシウムからなる培地中で培養されたＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉの定常的培養物から得られる。好ましくは、該甘性ホエーパウダーは、食品用に適した品質を有し、好ましくは、少なくとも６３ｗｔ％の乳糖、少なくとも１０ｗｔ％のタンパク質、および最大５ｗｔ％の水を含有する。
【００１６】
真菌（酵母）培養物の培養について、プロピオン酸菌培養の定常期上清中で増殖する能力は、真菌細胞がプロピオン酸菌培養の定常期上清中で増殖する場合に達成される最大増殖速度に関して定義することができる。したがって、別の好ましい実施形態において、プロピオン酸菌培養の定常期上清中での上記真菌細胞の上記の増殖する能力は、上記定常期上清において上記真菌細胞が少なくとも０．０２ｈ−１の最大増殖速度（μｍａｘ）で増殖する能力であると定義される。培養物中の微生物の増殖速度を決定する方法は、当該技術分野においてよく知られている。
【００１７】
プロピオン酸菌培養物の定常的培養状態は、該培養物が曝気に曝されていない場合の培養培地中での酢酸およびプロピオン酸の経時的に一定な濃度によって示され得る。別の実施形態では、プロピオン酸菌培養物の定常状態は、プロピオン酸菌の経時的に一定な細胞密度（ｇ（ＤＷ）／Ｌ表示）によって示される。
【００１８】
好ましい実施形態において、真菌細胞がプロピオン酸菌培養の定常期上清中で増殖する能力は、本明細書における以下の実施例２に記載する試験方法で試験される。
【００１９】
好ましい真菌細胞は、酵母細胞である。
一実施形態において、酵母細胞は、２０１４年１月１４日に受託番号ＤＳＭ２８２７１のもとにＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＤＳＭＺ）に寄託された酵母細胞である。
【００２０】
本発明の第２の態様は、生物工学的生成物を生産するプロセスであって、培養培地中でのプロピオン酸菌と真菌細胞との共培養を含むプロセスに関する。該真菌細胞は、プロピオン酸菌培養の定常期上清中で増殖できることが好ましい。
【００２１】
上記真菌細胞は、好ましくは酵母細胞、例えば本明細書の上記および下記に記載される本発明による真菌細胞である。
【００２２】
上記生物工学的生成物は、好ましくは、プロピオン酸菌によって産生されるものである。
【００２３】
好ましい生物工学的生成物は、ビタミンＢ１２である。
好ましい実施形態において、上記プロセスは、無曝気での第１時期、およびそれに続く曝気の起こる第２時期を含む。好ましくは、いずれの時期も少なくとも２４時間、または４８時間、または７２時間の長さである。
【００２４】
好ましい実施形態では、無曝気の上記第１時期の間にプロピオン酸菌の増殖の［乾燥重量グラム％表示で］少なくとも９０％が起こる。
【００２５】
別の好ましい実施形態では、曝気の起こる上記第２時期の間に真菌細胞の増殖の［乾燥重量グラム％表示で］少なくとも９０％が起こる。
【００２６】
別の好ましい実施形態において、上記培養培地の化学的酸素要求量（ＣＯＤ）は、上記培養培地の初期ＣＯＤの２５％以下、好ましくは１０％以下、または１％以下のレベルに低減される。
【００２７】
別の好ましい実施形態において、上記培養培地は乳清である（または、乳清を含む）。培養培地は、例えば、甘性ホエーもしくはサワーホエーである、または甘性ホエーもしくはサワーホエーを含む。
【００２８】
本発明のプロセスにおいて、上記真菌細胞は、好ましくは、培養物中で上記プロピオン酸菌がその最大細胞密度［ｇ（ＤＷ）／Ｌ］の少なくとも９０％に達した時点またはその後に添加される。本発明のプロセスの他の実施形態では、真菌細胞は、プロピオン酸菌がその定常的増殖期に達したとき、またはその後に添加される。
【００２９】
さらに本発明は、プロピオン酸菌耐性真菌株、例えばプロピオン酸菌耐性酵母株を作製する方法に関する。該方法は、以下を含む。
１．出発真菌株を得ること。
２．出発真菌株を突然変異誘発剤および／または突然変異誘発条件に暴露させること。
３．暴露されたステップ２の真菌株を第１濃度の酢酸および／または（好ましくは「および」）プロピオン酸の存在下で培養すること。
４．場合によって、上記の培養されたステップ３の真菌株を突然変異誘発剤および／または突然変異誘発条件に暴露させ、上記の場合によって暴露された真菌株を第２濃度の酢酸および／または（好ましくは「および」）プロピオン酸の存在下で培養すること（好ましくは、それぞれについて上記第２濃度は上記第１濃度よりも高い）。
５．培養されたステップ３または４の真菌株を突然変異誘発剤および／または突然変異誘発条件に暴露させること。
６．暴露されたステップ６の真菌株を、プロピオン酸菌培養の定常期上清を含む培地中で培養すること。
７．場合によって、プロピオン酸菌培養の定常期上清を漸増濃度で用いてステップ７を繰り返すこと。
８．それにより、プロピオン酸菌培養の定常期上清中で増殖できる真菌細胞を得ること。
【００３０】
本発明による好ましい突然変異誘発剤は、メタンスルホン酸エチルである。しかしながら、突然変異発生の頻度を高めるその他のいかなる突然変異誘発剤、すなわち化学的または物理的な突然変異誘発剤も、用いることができる。上記方法において用いることのできる既知の突然変異誘発剤としては、例えば、活性酸素種（ＲＯＳ）、例えば超酸化物、ヒドロキシルラジカルおよび過酸化水素；脱アミノ化剤、例えば亜硝酸；多環式芳香族炭化水素（ＰＡＨ）；アルキル化剤、例えばエチルニトロソ尿素やメタンスルホン酸メチル；グアニン；ニトロソアミン；ニトロソグアニジン；マスタードガス；塩化ビニル；芳香族アミン；アミド；２−アセチルアミノフルオレン；植物由来のアルカロイド；例えばビンカ属由来のものなど；臭素；化学構造中に臭素を含有する化合物；アジ化ナトリウム；ベンゼンが挙げられる。好適な突然変異誘発条件または物理的変異原は、例えば、ＵＶ照射、Ｘ線への暴露、および／または放射能への暴露である。
【００３１】
当業者であれば、例えばステップ１の出発菌株が酢酸および／またはプロピオン酸に対して既に十分に耐性である場合、またそうでなければ、プロピオン酸菌培養の定常期上清の含まれた培地中で増殖できる場合に、上記ステップ２〜４を省略できる、ということを理解するであろう。この場合には、ステップ１からの出発菌株を直接ステップ５において突然変異誘発剤および／または突然変異誘発条件に暴露させる。
【００３２】
本発明のさらなる態様は、上記方法によって得られる真菌株に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．による乳糖の利用、および乳清に対する２段階プロセスにおける酢酸とプロピオン酸とビタミンＢ１２の生産を示す。このように、ＣＯＤ値を８５０００ｍｇＯ２／Ｌから３６０００ｍｇＯ２／Ｌへと低減できる。７５時間までは無曝気で発酵を行い、７５時間後に曝気を導入した。
【図２】図２は、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．による乳糖の利用、および乳清に対する２段階プロセスにおける酢酸とプロピオン酸とビタミンＢ１２の生産を示し、この場合、酸素を導入した段階で耐性ＤＳＭ２８２７１酵母培養物を添加した。このように、ＣＯＤ値を８５０００ｍｇＯ２／Ｌから１３０００ｍｇＯ２／Ｌへと低減できる。７５時間までは無曝気で発酵を行い、７５時間後に酵母および曝気を導入した。
【図３】図３は、本発明に従ってＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．と耐性酵母とを共培養するためのバイオプロセスの模式図を示す。
【図４】図４は、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．による乳糖の利用、および乳清に対する２段階プロセスにおける酢酸とプロピオン酸とビタミンＢ１２の生産を示し、この場合、酸素を導入した段階で耐性Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＡＢＬＭＫＬ６酵母培養物を添加した。このように、ＣＯＤ値を８００００ｍｇＯ２／Ｌから１４５００ｍｇＯ２／Ｌへと低減できる。１１２時間まで無曝気で発酵を行い、１１２時間後に酵母および曝気を導入した。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
発明の詳細な説明
本発明との関連において、「上清」または「培養上清」の表現は、発酵ブロスを濾過または遠心分離し、それによって細胞およびその他の不溶物質を除去するときに得られる液体を意味する。上清は、微生物によって（未だ）消費されていない培養培地のあらゆる栄養素およびその他の成分、または分解生成物、ならびに発酵中に微生物によって産生されたあらゆる生成物を含有する。
【００３５】
「培養培地」は、微生物の増殖できる栄養素含有培地であると理解されるべきである。液体培養培地が好ましい。
【００３６】
「ブロス」または「発酵ブロス」は、微生物が増殖する、または増殖した培養培地を指すと理解されるべきである。ブロスは、未使用栄養素および／または微生物によって産生された生成物を含み得る。
【００３７】
「定常期上清」または「使用済培地」は、本発明によれば、定常期発酵ブロス由来の上清であると理解されるべきである。
【００３８】
定常期は、微生物が実質的に増殖を停止した、例えば培養中に微生物がその最大細胞密度に達した培養の時期であると理解されるべきである。また、培養の定常期は、発酵生成物の濃度をモニタリングすることによって検出することもできる。一実施形態において、プロピオン酸菌培養の定常期は、酢酸および／またはプロピオン酸の濃度がその最大値に達したか、あるいはその最大値の９０％に達した時点から始まる時期であると定義される。
【００３９】
「乳清」は、乳業における副産物であり、レンネットまたは酸性物質を添加するかまたは系中で形成させたときに凝乳形成後に乳から分離するものである。「甘性ホエー」は、レンネットタイプのハードチーズ、例えばチェダーまたはスイスチーズの作製中に製造される。「酸性ホエー」、すなわち「サワーホエー」は、酸タイプの乳製品、例えばカッテージチーズや水切りヨーグルトなどの作製中に生成する副産物である。
【００４０】
「化学的酸素要求量」、すなわち「ＣＯＤ」は、ＩＳＯ６０６０：１９８９規格の方法によって決定される化学的酸素要求量であると理解されるべきである。この方法によれば、決定すべきＣＯＤが許容最大ＣＯＤの７００ｍｇ／Ｌを上回る場合には試料を水で希釈せねばならないかもしれない、ということが理解される。次いでＣＯＤは、測定ＣＯＤに希釈係数を乗じることによって計算される。
【００４１】
本発明は、プロピオン酸菌との共培養に耐性である真菌細胞を提供する。また本発明は、プロピオン酸菌と、プロピオン酸菌によって産生される阻害性化合物に耐性である真菌細胞とを共培養するプロセスを提供する。
【００４２】
本発明は、プロピオン酸菌およびそれらの阻害性代謝物の存在下で増殖できる真菌細胞を提供する。これらの細胞は、プロピオン酸菌が先に培養された増殖基質において、一般に入手可能な真菌細胞の自然発生ランダム変異体を選択する手順によって得られる。好ましくは、そのような耐性真菌細胞の選択は、少なくとも２つのステップで行われる。最初のステップでは、高濃度の有機酸、例えば酢酸およびプロピオン酸に耐えることのできる真菌細胞のランダム変異体を選択する。次のステップでは、プロピオン酸菌が先に培養されて増殖定常期に達した使用済増殖培地において、これらの酸耐性細胞のランダム変異体の選択をもう一回行う。好ましくは、本発明によって提供される真菌細胞は酵母細胞である。
【００４３】
プロピオン酸菌との共培養に耐性の、例えばプロピオン酸菌培養の定常期上清中で増殖できる本発明の真菌細胞は、場合によってはランダム変異誘発、遺伝子工学、または天然の分離株のスクリーニングによって支援されている、古典的な選択方法によって得ることができる。
【００４４】
プロピオン酸菌との共培養のプロセスにおいて耐性酵母細胞を用いる本発明の生物工学プロセスは、下記のステップを含み得る。
１．培養培地の調製
２．プロピオン酸菌の接種
３．無曝気での発酵
４．好気的条件への切り替え
５．耐性酵母細胞の接種
６．プロピオン酸菌と酵母との共培養としての発酵の継続
７．場合による、下流処理および生成物回収
発酵培地
発酵培地は、プロピオン酸菌と真菌細胞との両方が増殖できるいかなる適切な発酵培地でもあり得る。例えば発酵培地は、糖蜜または乳清を含んでいてもよい。発酵培地は、様々な産業からの廃液（乳清など）からなっていてもよく、これらの廃液には、増殖速度や所望生成物の形成を増大させるために、特定の添加物（無機物、ビタミン、窒素源および追加炭素源、前駆体など）を添加してもよい。培地は、プロピオン酸菌に適した様々な炭素源、例えばブドウ糖、乳糖、果糖、乳酸、ならびに窒素源、例えば硫酸アンモニウム、アミノ酸、ペプチドおよびタンパク質を含有し得る。発酵培地のｐＨ値は、プロピオン酸菌の良好な増殖および／または生成物形成を可能にするために、プロセスの開始時に調節してもよく、または発酵プロセス中に維持され得る。
【００４５】
培地は通常、プロピオン酸菌の接種前に、発酵培地中に最初から存在するであろう微生物を十分な割合で不活性化させるプロセスによって処理される。これらのプロセスは、滅菌／殺菌、例えばオートクレーブ滅菌、濾過、照射殺菌および／または化学処理であり得る。
【００４６】
培養容器または発酵槽は、最初から存在する微生物を十分な割合で除去することが可能な方法によって準備された後に、発酵培地で充填されるべきである。本発明のプロセスにおいて用いることのできる培養容器は、所望の温度を維持でき、かつ大きなｐＨ勾配または栄養素勾配を防止するために十分な撹拌を維持できる限り、非常に単純なものであり得る。該培養容器は、わずかな過圧力に耐え得るものであることが理想的である。
【００４７】
プロピオン酸菌の接種
プロピオン酸菌の接種は、最終的な種培養物量および用いるプロセスに応じて１つまたはいくつかの段階からなり得る。種菌は、プロピオン酸菌の増殖を補助する培地中で作ってもよい。種菌を好ましい温度で所望の時間培養した後、該種菌を用いて発酵培地に接種することができる。接種の次の段階または発酵段階のための接種量は、１〜２０％の範囲であり得る。
【００４８】
無曝気での発酵
発酵ブロスは、最適な増殖または生成物形成のために、まずは無曝気で所望の温度に維持される。温度は２５〜４０℃の範囲であり得、好ましくは３５℃であり得る。発酵培地中に糖類が存在する場合にはｐＨ値を所望のレベルに維持するべきであり、該ｐＨ値は５．５〜８．０の範囲、好ましくは６．５であり得る。ｐＨは、いくつかの異なる酸／塩基、例えばＨ２ＳＯ４、ＨＣｌ、ＮａＯＨ、ＮＨ４ＯＨなどによって維持することができる。バイオプロセスは、無曝気で実施され得、またはＣＯ２および／もしくはＮ２の注入および／もしくは過圧力のもとで維持され得る。ＣＯ２過圧力下での培養が好ましい。
【００４９】
発酵培地の撹拌は、大きなｐＨ勾配を防止するのに十分でなくてはならず、限定はしないが、ラシュトンタービン、船舶用プロペラ、または内部および／もしくは外部の再循環ポンプによって行うことができる。
【００５０】
好気的条件への切り替え
プロピオン酸菌によって消費可能な栄養素が使い果たされた後、培養物を好気的条件へと切り替え得る。空気は、培養容器内へ導入され得、以下に記載する酵母の増殖のために十分でなくてはならない。曝気速度もまた、プロピオン酸菌の産生する有機酸を酵母が代謝する速度に影響を与える。
【００５１】
ブロスの特性に影響を与えるもの（すなわち消泡剤）、プロピオン酸菌によって産生される生成物の形成に影響を与えるもの（すなわち５，６−ジメチルベンズイミダゾール）、または酵母の増殖もしくは生成物形成に影響を与えるもの（窒素源、前駆体など）のうちのいずれかである追加補給物を、この時に導入してもよい。
【００５２】
培養物を好気的条件へと切り替えた後、ｐＨを再び所望のレベルに維持しなければならない。酵母の良好な増殖を可能にするために、ｐＨ値は５．５〜８の範囲、好ましくは６．５であり得る。
【００５３】
プロピオン酸菌耐性酵母細胞の接種
耐性酵母細胞の接種は、種培養物の最終的な量に応じて１つまたはいくつかの段階からなり得る。酵母種菌は、酵母の増殖を補助する培地中で作られる。その種菌を好ましい温度で所望の時間培養する。その後、酵母種菌を用いて、好気的条件に切り替わった後の培養プロピオン酸菌を含む発酵培地に接種することができる。接種のその後の段階または最終段階のための接種量は、限定はしないが、１〜２０％の範囲であり得る。好ましくは、酵母種菌は、最終容量の５％に相当する。
【００５４】
結果として生じる微生物共培養物による発酵の継続
発酵ブロスを所望の温度で維持し、適切な酸または塩基の添加によってｐＨ値を所望のレベルで一定に維持する。有機酸の完全利用を確実なものとするために、撹拌および曝気を要求されるレベルで維持しなければならない。曝気および／またはかき混ぜの量は酵母による有機酸の代謝に影響を与える。
【００５５】
また、ブロスの特性に影響を与えるもの（すなわち消泡剤）、プロピオン酸菌によって産生される生成物の形成に影響を与えるもの、または酵母の増殖もしくは生成物形成に影響を与えるもののうちのいずれかである追加補給物を、この時に導入することができる。ブロスの所望の特性を達成するために、発酵ブロスの上清のＣＯＤ値、およびプロピオン酸菌または酵母細胞によって産生される価値の高い生成物の生産量をモニタリングする。そのような共培養手順を用いると、ブロスの上清のＣＯＤ値を２００００ｍｇＯ２／Ｌ未満、好ましくは１５０００ｍｇＯ２／Ｌ未満、より好ましくは１００００ｍｇＯ２／Ｌ、よりいっそう好ましくは５０００ｍｇＯ２／Ｌ未満に低減することができる。選択した高価値生成物がビタミンＢ１２である場合、ビタミンＢ１２の生産量は、５ｍｇ／Ｌ超、好ましくは１０ｍｇ／Ｌ超、より好ましくは２０ｍｇ／Ｌ超、よりいっそう好ましくは１００ｍｇ／Ｌ超となり得る。
【００５６】
発酵ブロスの下流処理
有機酸が消費され、上清のＣＯＤが満足のいくレベルに達した後に、バイオプロセスを停止する。プロピオン酸菌／酵母バイオマス混合物は、ブロスの不溶成分と一緒に遠心分離、濾過またはその他のあらゆる適切な方法によって上清から分離することができる。上清は低いＣＯＤを有し、水処理施設へ廃棄された場合に示す負荷が小さく、理想的な場合には、ＣＯＤは、上清を環境中へ直接廃棄できる程に低い。バイオマスが価値の高い物質、例えばビタミンおよびタンパク質、特にビタミンＢ１２で強化される場合、これらの物質を動物用飼料の添加物として用いることができる。あるいはバイオマスを、価値の高い物質、例えばあらゆる形態のビタミンＢ１２（例えばシアノコバラミンやメチルコバラミン）を単離するための出発材料として用いることができる。ビタミンＢ１２は、純度の等級に応じて、動物用飼料のための添加物として、またはヒトが消費するための医薬品もしくは栄養補助食品として用いることができる。
【００５７】
本発明による酵母は、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属のもの（例えばＫ．ｌａｃｔｉｓ；Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、好ましくはＫ．ｌａｃｔｉｓ、および／またはＹａｒｒｏｗｉａ属のもの、好ましくはＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａであり得る。しかしまた、菌株は、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ属（例えばＤｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉｉ）、Ｃａｎｄｉｄａ属（例えばＣａｎｄｉｄａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ）、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属（例えばＴｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｂｅｉｇｅｌｉｉ）、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ属、Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ属（例えばＩｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、またはＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属のものであってもよい。そのような細胞は、当該技術分野において入手可能であり、寄託機関から得ることができるか、または食品から単離できるかのいずれかである。
【実施例】
【００５８】
実施例１−プロピオン酸菌耐性酵母細胞の作製
酵母Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ  ＮＲＲＬ  Ｙ−７５８６を、酵母抽出物（２０ｇ／Ｌ）、ペプトン（２０ｇ／Ｌ）およびデキストロース（１０ｇ／Ｌ）からなるＹＥＰＤ培地中で７２時間、３５℃で培養し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）で２回洗浄し、十分な用量の突然変異誘発剤（メタンスルホン酸エチル）に暴露させて９９．９％の殺菌率を達成した。他のいかなる適切な真菌細胞または酵母細胞も用いられ得る。生存細胞を、酵母抽出物（１０ｇ／Ｌ）ならびに最低阻害濃度の酢酸およびプロピオン酸を含有する培地中で培養した。３５℃で３日間培養した後に、このブロスからの一定量をＹＥＰＤ培地へ移し、７２時間そのまま増殖させ、もう一回突然変異誘発に暴露させた。その後、生存細胞を、酵母抽出物（１０ｇ／Ｌ）ならびに（前の回に比べて）より高い濃度の酢酸およびプロピオン酸を含有する培地中で培養する。この手順を、酵母が高濃度の酢酸およびプロピオン酸に耐えることができる（すなわち、酵母が増殖でき、かつ濃度１５ｇ／Ｌの濃度で酢酸およびプロピオン酸を消費できる）まで反復して繰り返した。このようにして、菌株Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ  ＡＢＬＭＣＵ１が得られた。
【００５９】
結果として生じる、高濃度の酢酸およびプロピオン酸に耐性のＣ．ｕｔｉｌｉｓ株（ＡＢＬＭＣＵ１）を用いて、今度はプロピオン酸菌の発酵からの希釈された定常期上清を阻害剤として用いる同様の突然変異誘発／選択スキームを用いた。より詳しく述べると、有機酸に耐性であるように予め選択されたＣ．ｕｔｉｌｉｓ細胞をＹＥＰＤ培地中で増殖させ、メタンスルホン酸エチルに暴露させ、続いて、乳清中でのＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ株ＡＢＬＭ１７００の発酵から得られた定常期上清（乳清、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、２０ｍｇ／ＬのＣｏＣｌ２、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉを３５℃で９６時間培養、上清を以下において培地「Ａｓ」と呼ぶ）と、有機酸に耐性の酵母細胞の発現に用いた培地（すなわち、酢酸（１５ｇ／Ｌ）、プロピオン酸（１５ｇ／Ｌ）および酵母抽出物（１０ｇ／Ｌ）（本明細書において培地「Ｂｓ」と呼ぶ））との混合物である培地で培養した。これらの培地を、ＡＢＬＭＣＵ１酵母細胞の増殖できるレベルを上回るＡｓ：Ｂｓ＝３：７の比率で混合した。７２時間後、結果として生じるＣ．ｕｔｉｌｉｓ培養物の一定量をＹＥＰＤへ移して増殖させ、再びメタンスルホン酸エチルに暴露させた後、より高い比率のＡｓ：Ｂｓ、つまり４：６である培地ＡｓとＢｓとの混合物へ移した。この手順を、プロピオン酸菌の発酵の未希釈の定常期上清（１００％Ａｓ）に耐性である酵母コロニーが得られるまで繰り返した。結果として生じる酵母株は、２０１４年１月１４日にＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＤＳＭＺ）に寄託され、受託番号ＤＳＭ２８２７１のもとに入手可能である。
【００６０】
上記の手順によってプロピオン酸菌耐性Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ株が生じた。しかしながら、同様の手順をうまく用いてその他のプロピオン酸菌耐性株が作られた、つまり異なる酵母株から出発して作られたことに留意すべきである。例えば、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ  Ｙ−１７５９７株を同様の手順で処理して、本発明によるプロピオン酸菌耐性真菌株（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＡＢＬＭＫＬ６）が生じた。よって、当該手順が再現可能であり他の酵母株に適用可能であることが示された。
【００６１】
実施例２−「プロピオン酸菌培養の定常期上清中で増殖する能力」を実証するための試験
以下の方法は、真菌株、例えば酵母株が請求項１に従って「プロピオン酸菌培養の定常期上清中で増殖できる」か否かを決定するのに有用である。
【００６２】
ステップ１：プロピオン酸菌培養の定常期上清の獲得
第１段階のプロピオン酸菌種培養物を培地Ｐ１（下表１）中で下記のように作製する。微生物株保存機関から得たプロピオン酸菌保存培養株（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ＡＴＣＣ６２０７）１００μＬを、５０ｍＬの培地Ｐ１へ移し、３５℃で４日間、無曝気および無振盪でインキュベートする。
【００６３】
その後、この第１段階種培養物１５ｍＬを、１３５ｍＬの培地Ｐ２（下表２）を充填した１５０ｍＬのガラス瓶へ移し、３５℃で４日間、無曝気および無振盪で培養して第２段階種培養物を得る。
【００６４】
そのようにして得られた第２段階種培養物１００ｍＬをその後に用いて、９００ｍＬの培地Ｐ３（下表３）を充填した１Ｌの作業容量の撹拌タンクバイオリアクターに接種する。培養パラメータは、温度：３５±０．５℃、ｐＨ：６．５±０．１（１５％のＮａＯＨまたはＨ２ＳＯ４で制御）、撹拌：１００±１０ＲＰＭ、ＣＯ２の注入：０．１±０．０５ｖｖｍ、ＮＨ４＋濃度：４００±１００ｍｇ／Ｌ（１２時間毎にｐＨ６．５の１５％（ＮＨ４）２ＳＯ４を用いて調節）である。発酵は、乳糖の濃度が１ｇ／Ｌ未満になるまで行う。発酵終了時にブロス中の酢酸とプロピオン酸との合計濃度は２０ｇ／Ｌ以上であることが好ましい。
【００６５】
そのようにして得られた発酵ブロス５０ｍＬを１００００ｇで遠心分離し、上清を三角フラスコへ移し、１２１℃で２０分間オートクレーブ滅菌する。そのオートクレーブ滅菌された培地は「プロピオン酸菌培養の定常期上清」である。
【００６６】
ステップ２：プロピオン酸菌の定常期上清中で増殖する能力の試験
試験すべき真菌細胞の種菌は、１００μＬの保存培養株を１０ｍＬのＹ１培地（表４）に添加することによって作製する。種菌培養物を回転振盪器上で３５℃、２００ＲＰＭで７２時間インキュベートする。結果として生じる培養物を後のステップで「真菌種菌」として用いる。
【００６７】
オートクレーブ滅菌された、上記ステップ１で得られた定常期上清の入った三角フラスコに、２．５ｍＬの真菌種菌を接種し、回転振盪器上で３５℃、２００ＲＰＭでインキュベートする。初期ｐＨ値はｐＨ６．５に設定する。これを「試験培養」と考える。
【００６８】
２４時間の培養後に培養物のｐＨ変化を測定することによって真菌の増殖を評価する。一実施形態において、試験培養におけるブロスのｐＨ値が出発ｐＨ（ｐＨ６．５）から２４時間の培養時間後に８．０以上のｐＨ値に上昇する場合、試験された真菌細胞は添付の請求項１の趣意の範囲内において「プロピオン酸菌の定常期上清中で増殖できる」と見なされる。
【００６９】
したがって、試験培養におけるブロスのｐＨ値が２４時間の培養時間後に８．０未満にとどまる場合には、試験された真菌細胞はプロピオン酸菌培養の定常期上清中で増殖できないと見なしてもよい。
【００７０】
特許請求の範囲に記載の、プロピオン酸菌培養の定常期上清中で増殖できる真菌細胞は、上記試験で良好な結果を示すものであることが好ましい。
【００７１】
実施例２ｂ）−代替的試験
あるいは、２４時間の培養後の培養物のＯＤ変化を測定することによって真菌の増殖を評価することができる。
【００７２】
接種後２４時間以内にブロスの光学濃度差（６２０ｎｍで測定）が少なくとも０．５増加する場合には、試験された真菌細胞を、添付の請求項１の趣意の範囲内においてプロピオン酸菌培養の定常期上清中で増殖できるものと見なしてもよい。あるいは、試験培養において真菌細胞の最大増殖速度（μｍａｘ）が０．０２ｈ−１以上である場合に、試験された真菌細胞を、添付の請求項１の趣意の範囲内においてプロピオン酸菌培養の定常期上清中で増殖できるものと見なす。
【００７３】
したがって、接種後２４時間以内のブロスの光学濃度差（６２０ｎｍで測定）の増加が０．５未満である場合、試験された真菌細胞は添付の請求項１の趣意の範囲内においてプロピオン酸菌培養の定常期上清中で増殖できないと見なされる。あるいは、試験培養において真菌細胞の最大増殖速度（μｍａｘ）が０．０２ｈ−１未満である場合、試験された真菌細胞は添付の請求項１の趣意の範囲内においてプロピオン酸菌培養の定常期上清中で増殖できないと見なされる。
【００７４】
したがって、プロピオン酸菌培養の定常期上清中で増殖できる特許請求の範囲に記載の真菌細胞は、上記の代替的試験で良好な結果を示すものである。
【００７５】
【表１】
2017514526.tif 000003
【００７６】
【表２】
2017514526.tif 000004
【００７７】
【表３】
2017514526.tif 000005
【００７８】
【表４】
2017514526.tif 000006
【００７９】
実施例３−プロピオン酸菌と酵母との効果的な共培養
ｉ）プロピオン酸菌種菌の作製
プロピオン酸菌の種菌は２段階で作製した。Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ＡＢＬＭ２４７５（他のいかなるビタミンＢ１２産生株、例えばＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ＡＴＣＣ６２０７を用いることもできた）の保存株懸濁液０．５ｍＬを、５０ｍＬの第１成長培地（酵母抽出物２０ｇ／ＬおよびＤＬ−乳酸塩２０ｇ／Ｌ）に接種し、３５℃で４日間インキュベートした。その後、第１成長段階を４００ｍＬの第２段階成長培地（ブドウ糖４０ｇ／Ｌ、酵母抽出物４０ｇ／Ｌ、ＤＬ−乳酸塩４０ｇ／Ｌ、炭酸カルシウム１０ｇ／Ｌ、塩化コバルト２０ｍｇ／Ｌ、パントテン酸塩１０ｍｇ／Ｌ）へ移し、ｐＨ値を継続的に水酸化ナトリウムで中性にしながら４日間培養した。その後、第２段階の全部を最終バイオリアクターへ移した。
【００８０】
ｉｉ）耐性酵母種菌の作製
耐性酵母の種菌も２段階で作製した。酵母ＤＳＭ２８２７１の保存株懸濁液０．５ｍＬを２５０ｍＬ三角フラスコ内の５０ｍＬの第１成長培地（酵母抽出物４０ｇ／Ｌ、ペプトン４０ｇ／Ｌおよびブドウ糖１０ｇ／Ｌ）に接種し、３５℃で２日間、回転振盪器上で２２０ＲＰＭでインキュベートした。その後、第１成長段階を１０００ｍＬ三角フラスコ内の２００ｍＬの同じ培地中へ移し、３５℃で２日間、回転振盪器上で２２０ＲＰＭで培養した。
【００８１】
ｉｉｉ）発酵
７Ｌの作業容量のバイオリアクターに、酵母抽出物（５ｇ／Ｌ）と塩化コバルト（２０ｍｇ／Ｌ）とが補給された４Ｌのサワーホエー（ＣＯＤは８０．０００ｍｇＯ２／Ｌであった）を充填し、１２１℃で１時間滅菌した。３５℃に冷却した後、パントテン酸塩（１０ｍｇ／Ｌ）を添加し、バイオリアクターにプロピオン酸菌の種培養物を接種した。培養温度は３５℃であり、撹拌速度は１００ＲＰＭであった。バイオリアクターの内容物にＣＯ２ガスを注入（１０ｍＬ／分）し、ｐＨを（ＮａＯＨで）６．５に維持した。９０時間後に乳酸塩および乳糖が使い果たされ、おおよそ８ｇ／Ｌおよび１５ｇ／Ｌの酢酸およびプロピオン酸が生成した。この時点で２０ｍｇ／Ｌの５，６−ジメチルベンズイミダゾールを添加し、撹拌速度を５００ＲＰＭに上げ、１ｖｖｍで曝気を導入し、バイオリアクターに５％の耐性酵母を接種した。ｐＨ値を（Ｈ２ＳＯ４で）６．５に維持した。４８時間後に全ての有機酸が酵母によって消費され、発酵が停止した。このプロセスは１５ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２を生じた。プロピオン酸菌と酵母からなるバイオマスを遠心分離で除去したところ、結果として生じる上清のＣＯＤ値は１２．０００ｍｇＯ２／Ｌとなり、８５％低減された。
【００８２】
代表的なプロセスの模式的な流れ図を図３に示す。
実施例４−プロピオン酸菌と酵母（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＡＢＬＭＫＬ６）との効果的な共培養
ｉ）プロピオン酸菌種菌の作製
プロピオン酸菌の種菌は２段階で作製した。Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ＡＢＬＭ２４７５（他のいかなるビタミンＢ１２産生株、例えばＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ＡＴＣＣ６２０７を用いることもできた）の保存株懸濁液０．５ｍＬを、５０ｍＬの第１成長培地（酵母抽出物２０ｇ／ＬおよびＤＬ−乳酸塩２０ｇ／Ｌ）に接種し、３５℃で４日間インキュベートした。その後、第１成長段階を４００ｍＬの第２段階成長培地（ブドウ糖４０ｇ／Ｌ、酵母抽出物４０ｇ／Ｌ、ＤＬ−乳酸塩４０ｇ／Ｌ、炭酸カルシウム１０ｇ／Ｌ、塩化コバルト２０ｍｇ／Ｌ、パントテン酸塩１０ｍｇ／Ｌ）へ移し、ｐＨ値を継続的に水酸化ナトリウムで中性にしながら４日間培養した。その後、第２段階の全部を最終バイオリアクターへ移した。
【００８３】
ｉｉ）耐性酵母種菌の作製
耐性酵母の種菌も２段階で作製した。耐性酵母Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＡＢＬＭＫＬ６の保存株懸濁液０．５ｍＬを２５０ｍＬ三角フラスコ内の５０ｍＬの第１成長培地（酵母抽出物４０ｇ／Ｌ、ペプトン４０ｇ／Ｌおよびブドウ糖１０ｇ／Ｌ）に接種し、３５℃で２日間、回転振盪器上で２２０ＲＰＭでインキュベートした。その後、第１成長段階を１０００ｍＬ三角フラスコ内の２００ｍＬの同じ培地中へ移し、３５℃で２日間、回転振盪器上で２２０ＲＰＭで培養した。
【００８４】
ｉｉｉ）発酵
７Ｌの作業容量のバイオリアクターに、酵母抽出物（５ｇ／Ｌ）と塩化コバルト（２０ｍｇ／Ｌ）とが補給された４Ｌのサワーホエー（ＣＯＤは８０．０００ｍｇＯ２／Ｌであった）を充填し、１２１℃で１時間滅菌した。３５℃に冷却した後、パントテン酸塩（１０ｍｇ／Ｌ）を添加し、バイオリアクターにプロピオン酸菌の種培養物を接種した。培養温度は３５℃であり、撹拌速度は１００ＲＰＭであった。バイオリアクターの内容物にＣＯ２ガスを注入（１０ｍＬ／分）し、ｐＨを（ＮａＯＨで）６．５に維持した。１１２時間後に乳酸塩および乳糖が使い果たされ、おおよそ４ｇ／Ｌおよび１４ｇ／Ｌの酢酸およびプロピオン酸が生成した。この時点で２０ｍｇ／Ｌの５，６−ジメチルベンズイミダゾールを添加し、撹拌速度を５００ＲＰＭに上げ、１ｖｖｍで曝気を導入し、バイオリアクターに５％の耐性酵母を接種した。ｐＨ値を（Ｈ２ＳＯ４で）６．５に維持した。７２時間後に全ての有機酸が酵母によって消費され、発酵が停止した。このプロセスは１６ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２を生じた。プロピオン酸菌と酵母からなるバイオマスを遠心分離で除去したところ、結果として生じる上清のＣＯＤ値は１４．５００ｍｇＯ２／Ｌとなり、８１％低減された。
【図１】
2017514526.tif 000007
【図２】
2017514526.tif 000008
【図３】
2017514526.tif 000009
【図４】
2017514526.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】平成28年2月22日(2016.2.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロピオン酸菌培養の定常期上清中で少なくとも０．０２ｈ−１の最大増殖速度μｍａｘで増殖できる真菌細胞であって、前記定常期上清が、水中の６０ｇ／Ｌの甘性ホエーパウダー、５ｇ／Ｌの酵母抽出物および４０ｍｇ／ＬのＤ−パントテン酸カルシウムからなる液体培地中で、無曝気で３５℃で培養されたＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉの定常的培養物から得られる、真菌細胞。
【請求項２】
該真菌細胞が酵母細胞である、請求項１に記載の真菌細胞。
【請求項３】
２０１４年１月１４日にドイツのＢｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇのＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＤＳＭＺ）に寄託され、受託番号ＤＳＭ２８２７１のもとに入手可能である、酵母細胞。
【請求項４】
生物工学的生成物を生産するプロセスであって、プロピオン酸菌と請求項１〜３のいずれか１項に記載の真菌細胞との培養培地中での共培養を含む、プロセス。
【請求項５】
前記生物工学的生成物が前記プロピオン酸菌によって産生される、請求項４に記載のプロセス。
【請求項６】
前記生物工学的生成物がビタミンＢ１２である、請求項４または５に記載のプロセス。
【請求項７】
前記プロセスが、無曝気時期、およびそれに続く好気的時期を含む、請求項４〜６のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項８】
該無曝気時期の間に該プロピオン酸菌の増殖の［乾燥重量グラム％表示で］少なくとも９０％が起こる、請求項４〜７のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項９】
該好気的時期の間に該真菌細胞の増殖の［乾燥重量グラム％表示で］少なくとも９０％が起こる、請求項４〜８のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１０】
該培地の化学的酸素要求量（ＣＯＤ）が、該培養培地の初期ＣＯＤの２５％以下、好ましくは１０％以下のレベルに低減される、請求項４〜９のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記培養培地が乳清を含む、請求項４〜１０のいずれか１項に記載のプロセス。
【国際調査報告】
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2017514526.tif 000012
2017514526.tif 000013