(57)【要約】本発明は、組織中のＭＩＦ、特に酸化型ＭＩＦ、および抗酸化型ＭＩＦ抗体の特異的検出に関する。免疫組織化学法または免疫蛍光法を使用し、特異的抗酸化型ＭＩＦ抗体および特異的抗イディオタイプモノクローナルウサギ抗体を使用する検出方法を提供する。
2017503176.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の組織試料で抗体ＲＡＢ４、ＲＡＢ９および／またはＲＡＢ０に示差的に結合するＭＩＦである酸化型ＭＩＦのインビトロ検出のための免疫組織化学(ＩＨＣ)アッセイ法であって、インビトロで該試料の酸化型ＭＩＦへの化合物の結合を決定することを含む、以下の工程の１つ以上：
a)  任意の工程である、ブロッキング緩衝液によるブロッキング工程および
b)  事前に固定工程、特にホルムアルでヒトまたはアセトンによる固定工程を伴わない；工程ｂ）の後に、過剰の抗体を洗い流すために洗浄工程を行う、一次抗酸化型ＭＩＦ抗体を用いる結合工程;
c)  ホルムアルデヒド中で１０〜２５分間固定尾を行う、固定工程;
d)  抗酸化型ＭＩＦ抗体に対する抗イディオタイプウサギモノクローナル抗体である、二次抗体とのインキュベーション；および/または
e)  一次抗酸化型ＭＩＦ抗体と二次抗体の間の結合の検出
を行う、アッセイ法。
【請求項２】
試料を、好ましくは約３０分間風乾させる、請求項１記載のＩＨＣアッセイ。
【請求項３】
一次抗体が標識されていない、例えばビオチン化されていない、および/または好ましくは、一次希釈緩衝液に含まれている、および/または、一次抗体が、好ましくは４５〜９０分間、より好ましくは約６０分間、試料とともにインキュベーションされる、請求項１〜２のいずれか記載のＩＨＣアッセイ。
【請求項４】
全てのさらなる工程の後に、さらに洗浄工程を行う、請求項１〜３のいずれか記載のＩＨＣアッセイ。
【請求項５】
検出工程ｅ）が、染色工程を含むか、または該工程からなる、および/または、さらなる（対比）染色工程を、検出工程の後に行い、該工程が三次抗体の使用を含んでいてよい、請求項１〜４のいずれか記載のＩＨＣアッセイ。
【請求項６】
工程ｅ）の後に、ヘマトキシリンを用いた（対比）染色工程を行う、請求項１〜５のいずれか記載のＩＨＣアッセイ。
【請求項７】
一次抗体と二次抗体の間の結合が、蛍光、または直接蛍光標識した二次抗体（例えば標識抗ＲＡＭ９）により、好ましくは、該二次抗体に対するフルオロフォア標識三次抗体を用いて、検出される、請求項１〜６のいずれか記載のＩＨＣ。
【請求項８】
該二次抗体が、抗ＲＡＭ９抗体、抗ＲＡＭ０抗体および抗ＲＡＭ４抗体からなる群から選択され、最も好ましくは抗ＲＡＭ９抗体であり、さらに好ましくはウサギ抗ＲＡＭ９抗体である、請求項１〜７のいずれか記載のＩＨＣアッセイ。
【請求項９】
一次抗体が酸化型ＭＩＦに結合するが、還元型ＭＩＦに結合しない、請求項１〜８のいずれか記載のＩＨＣアッセイ。
【請求項１０】
示差的な結合が、１００ｎＭ未満、好ましくは５０ｎＭ未満、さらにより好ましくは１０ｎＭ未満のＫＤ値で起こる酸化型ＭＩＦへの結合および、４００ｎＭより大きいＫＤによって特徴付けられる還元型ＭＩＦへの非結合である、請求項９に記載のＩＨＣアッセイ。
【請求項１１】
該一次抗体が、酸化型ＭＩＦ結合体、例えば抗体ＲＡＢ４、ＲＡＢ９および／またはＲＡＢ０および／またはＲＡＭ４、ＲＡＭ９および／またはＲＡＭ０からなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれかに記載のＩＨＣアッセイ。
【請求項１２】
試料が、組織生検試料、好ましくは凍結組織生検試料、好ましくはＯＣＴ包埋切片、またはコア針生検試料である、請求項１〜１１のいずれかに記載のＩＨＣアッセイ。
【請求項１３】
抗酸化型ＭＩＦ抗体、好ましくは抗ＲＡＭ９に特異的に結合するイディオタイプ抗体。
【請求項１４】
該抗体が、固定したＭＩＦおよびＲＡＭ９を用いた中和ＥＬＩＳＡにおける、６０ ng/ml 以下のＩＣ５０により特徴付けられる、請求項１３記載のイディオタイプ抗体。
【請求項１５】
配列番号１５および/または１６、または配列番号１７および/または１８に特徴付けられる、請求項１〜１４のいずれか記載の方法またはキットに用いるための、請求項１３または１４記載のイディオタイプ抗体。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれかに記載の方法またはキットに使用するための抗イディオタイプ抗体であって、寄託番号ＤＳＭ２８１８０でＤＳＭＺに寄託されている重鎖および/または寄託番号ＤＳＭ２８１８１でＤＳＭＺに寄託されている軽鎖により特徴付けられるか; または、寄託番号ＤＳＭ２８１８２でＤＳＭＺに寄託されている重鎖および/または寄託番号ＤＳＭ２８１８３でＤＳＭＺに寄託されている軽鎖により特徴付けられる、抗イディオタイプ抗体。
【請求項１７】
抗酸化型ＭＩＦ抗体、好ましくはＲＡＭ９、ＲＡＭ０またはＲＡＭ４を、該抗酸化型抗体に対するイディオタイプモノクローナルウサギ抗体、好ましくは請求項１３〜１６のいずれかに記載の抗体を用いて、検出する方法。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれかに記載の方法を行うために適合させた、ＩＨＣアッセイキットであって：
−請求項１６記載の抗イディオタイプ抗体
−抗酸化型ＭＩＦ抗体
を含む、ＩＨＣアッセイキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織中のＭＩＦ、特に酸化型ＭＩＦの特異的な検出に関する。本発明の検出方法はまた、組織中の抗ＭＩＦ抗体、例えばＲＡＭ９の検出を可能にするものである。免疫組織化学的検査または免疫蛍光法を用いる、特異的な抗酸化型ＭＩＦ抗体およびモノクローナルウサギ抗−酸化型ＭＩＦ抗体−抗体を用いる検出方法を提供する。本発明はまた、有利な検出抗体および、該検出抗体を提供するための方法を提供する。本発明はさらに、標的の飽和を決定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マクロファージ遊走阻害因子 (ＭＩＦ) は、最初は、ツベルクリン過敏性モルモットの腹膜滲出細胞 (マクロファージを含む) のインビトロでのランダムな遊走を阻害する能力に基づいて単離されたサイトカインである (Bloom et al. Science 1966, 153, 80-2; David et al. PNAS 1966, 56, 72-7)。今日、ＭＩＦは、多面的な活性を示す自然免疫応答および後天性免疫応答の重大な上流調節因子として知られている。
【０００３】
ヒトＭＩＦ ｃＤＮＡは１９８９年にクローニングされ (Weiser et al., PNAS 1989, 86, 7522-6)、そのゲノム局在は染色体22に位置付けられた。ヒトＭＩＦ遺伝子産物は、１１４アミノ酸 (Ｎ末端メチオニン切断後) および約１２.５kDaの見かけの分子量を有する蛋白質である。ＭＩＦは、他の何れの蛋白質とも有意な配列相同性を有さない。この蛋白質は、同一のサブユニットの三量体として結晶化する。各単量体は、４本鎖βシートとまとまった２本の逆平行αヘリックスを含む。単量体は、隣接するサブユニットのβシートと相互作用して単量体間のインターフェースを形成する、さらに２本のβ鎖を有する。３つのサブユニットは、分子の３回軸に沿って蛋白質の中心を通過する、溶媒が接近可能なチャネルを含むバレルを形成するよう配置される (Sun et al. PNAS 1996, 93, 5191-5196)。
【０００４】
極低濃度のグルココルチコイドで、マクロファージからのＭＩＦ分泌が誘発されることが報告された (Calandra et al. Nature 1995, 377, 68-71)。しかし、ＭＩＦはまた、グルココルチコイドの作用を対抗制御し、腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αやインターロイキンＩＬ−１βなどの他のサイトカインの分泌を刺激する (Baugh et al., Crit Care Med 2002, 30, S27-35)。ＭＩＦはまた、例えば、血管新生促進性、増殖促進性および抗アポトーシス性を示し、それによって腫瘍細胞増殖を促進することが示されている (Mitchell, R.A., Cellular Signalling, 2004. 16(1): p. 13-19; Lue, H. et al., Oncogene 2007. 26(35): p. 5046-59)。また、ＭＩＦは、例えばリンパ腫、黒色腫および結腸がんの増殖に直接関連している (Nishihira et al. J Interferon Cytokine Res. 2000, 20:751-62)。
【０００５】
ＭＩＦは、多くの病状のメディエーターであり、それゆえに、とりわけ炎症性腸疾患 (ＩＢＤ)、関節リウマチ (ＲＡ)、急性呼吸窮迫症候群 (ＡＲＤＳ)、喘息、糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、心筋梗塞 (ＭＩ)、敗血症および癌を含むがこれらに限定されない多様な疾患に関連している。
【０００６】
ポリクローナルおよびモノクローナル抗ＭＩＦ抗体が、組み換えヒトＭＩＦに対して開発されている(Shimizu et al., FEBS Lett. 1996; 381, 199-202; Kawaguchi et al, Leukoc. Biol. 1986, 39, 223-232, および Weiser et al., Cell. Immunol. 1985, 90, 167-78)。
【０００７】
抗ＭＩＦ抗体は、治療的使用が示唆されている。Calandraら (J. Inflamm. (1995); 47, 39-51)は、グラム陰性およびグラム陽性敗血症ショックの実験的誘発から動物を保護するために抗ＭＩＦ抗体を使用したことを報告した。抗ＭＩＦ抗体は、敗血症ショックおよび他の炎症性疾病状態におけるサイトカイン産生を調節するための治療手段として提案された。
【０００８】
ＵＳ６,６４５,４９３は、ＭＩＦの生物学的活性を中和するハイブリドーマ細胞由来モノクローナル抗ＭＩＦ抗体を開示している。マウス由来抗ＭＩＦ抗体は、エンドトキシン誘発ショックの処置に有益な効果を有することが動物モデルで示された。
【０００９】
ＵＳ２００３１０２３５５８４は、ＭＩＦ遺伝子をホモ接合的にノックアウトした動物中で、ＭＩＦに対する高親和性抗体を作製する方法を開示する。
【００１０】
グリコシル化阻害因子 (ＧＩＦ) は、Galatら (Eur. J. Biochem, 1994, 224, 417-21) によって記載された蛋白質である。現在、ＭＩＦおよびＧＩＦは同一であると認識されている。Wataraiら (PNAS 2000, 97, 13251-6) は、Ｔｓ細胞中のＧＩＦの翻訳後修飾の生化学的性質を識別するための、異なるＧＩＦエピトープに結合するポリクローナル抗体を記載している。Wataraiら (上掲) は、ＧＩＦが、インビトロにおいて、異なる立体配座のアイソフォームを生じることを報告した。１つのタイプのアイソマーは、１個のシステイン残基の化学修飾によって生じる。化学修飾は、ＧＩＦ蛋白質内の立体配座変化を引き起こす。
【００１１】
様々な疾患の発症後に、とりわけ炎症性疾患またはがんの発症後に、ＭＩＦレベル、すなわち全体的なＭＩＦレベルの上昇が検出される。しかし、健常対象でもＭＩＦは循環しており、そのことが明確な区別を難しくしている。酸化型ＭＩＦは、対照的に、健常対象では存在しない。酸化型ＭＩＦは疾病状態で増加し、血液、血清および尿などの患者の試料で検出可能である。
【００１２】
ＭＩＦおよびそれに対する抗体の詳細な研究により、抗体ＲＡＢ９、ＲＡＢ４およびＲＡＢ０は、酸化型ＭＩＦに特異的に結合する(そして還元型ＭＩＦに結合できない)ことが判明した。
【００１３】
本発明者らによって行われた先の試験において、酸化的操作、例えばシスチン媒介酸化、ＧＳＳＧ (酸化型グルタチオン) 媒介酸化、または、ＭＩＦのProclin300または蛋白質クロスリンカー (例えばＢＭＯＥ) とのインキュベーションにより、ＭＩＦの上記抗体への結合が引き起こされることが示された。
【００１４】
本発明者らが到達した驚くべき結論は、次の通りである。
・  組み換えＭＩＦ (ヒト、マウス、ラット、ＣＨＯ、サル) の酸化還元調節 (システイン／ＧＳＳＧが媒介する穏やかな酸化)、または、組み換えＭＩＦのProclin300または蛋白質クロスリンカーでの処理が、Baxterの抗ＭＩＦ抗体 ＲＡＢ９、ＲＡＢ４およびＲＡＢ０の結合をも引き起こす。
・  酸化型ＭＩＦの還元が、Ａｂ結合喪失をもたらす。
・  酸化型アイソフォームに対する特異性は、インビボの生物学的Ａｂ有効性と相関する。
・  酸化型ＭＩＦレベルは病状と相関し得る。
【００１５】
この (酸化型) ＭＩＦに関するさらなる知見は、本発明者らのさらなる研究の基礎として貢献した。
【００１６】
ＭＩＦ蛋白質は種々のアイソフォームで存在することが示されている。ＭＩＦ関連疾病状態の強力かつ信頼できるマーカーと考えられている、天然に生じる酸化型ＭＩＦの、組織、例えばガラススライド上の組織切片における、免疫組織化学法(以降、ＩＨＣとも記載)または免疫蛍光法(ＩＦ)による特異的検出は、標準的なＩＨＣ法またはＩＦ法を適用する際に、酸化型ＭＩＦの構造が影響を受けるか、または、しばしば完全に失われるという事実によって妨げられている。いくつかのＩＨＣまたはＩＦの手法では、内在性のビオチンまたはアビジン結合蛋白質および内在性のペルオキシダーゼにより、組織内のバックグラウンドノイズが高くなることがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】ＵＳ６,６４５,４９３
【特許文献２】ＵＳ２００３１０２３５５８４
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Bloom et al. Science 1966, 153, 80-2
【非特許文献２】David et al. PNAS 1966, 56, 72-7
【非特許文献３】Weiser et al., PNAS 1989, 86, 7522-6
【非特許文献４】Sun et al. PNAS 1996, 93, 5191-5196
【非特許文献５】Calandra et al. Nature 1995, 377, 68-71
【非特許文献６】Baugh et al., Crit Care Med 2002, 30, S27-35
【非特許文献７】Mitchell, R.A., Cellular Signalling, 2004. 16(1): p. 13-19
【非特許文献８】Lue, H. et al., Oncogene 2007. 26(35): p. 5046-59
【非特許文献９】Nishihira et al. J Interferon Cytokine Res. 2000, 20:751-62
【非特許文献１０】Shimizu et al., FEBS Lett. 1996; 381, 199-202
【非特許文献１１】Kawaguchi et al, Leukoc. Biol. 1986, 39, 223-232
【非特許文献１２】Weiser et al., Cell. Immunol. 1985, 90, 167-78
【非特許文献１３】Calandra et al., J. Inflamm. (1995); 47, 39-51
【非特許文献１４】Galat et al., Eur. J. Biochem, 1994, 224, 417-21
【非特許文献１５】Watarai et al., PNAS 2000, 97, 13251-6
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
したがって、酸化型ＭＩＦアイソフォームのための信頼できる検出方法について、明確な必要性が存在する。この必要性は本発明者らによって対処され、この目的は、下記の通りに本発明によって達成された。特に、下記の本発明は、組織中の酸化型ＭＩＦならびに抗酸化型ＭＩＦ抗体を高い感度および特異性で、バックグラウンドのノイズが低い状態で検出することができるものである。また、既に抗酸化型ＭＩＦ抗体による処置を受けた患者の組織においても、この方法を実行することが可能である。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、酸化型ＭＩＦ (酸化型マクロファージ遊走阻害因子) の検出のための検出方法に関する。本発明はまた、抗酸化型ＭＩＦ抗体の検出方法にも関する。本検出方法は、免疫組織化学的検出の原理に基づく。本検出方法は、組織試料、特に組織切片で使用する。
【００２１】
好ましくは、これらの組織切片は、ガラスまたはプラスチック支持体、例えばガラスまたはプラスチックスライド上で提供される。
【００２２】
本方法は、特異的な酸化型ＭＩＦ結合抗体 (「酸化型ＭＩＦ結合体」、抗酸化型ＭＩＦ抗体または一次抗体; これらの表現は、本明細書中において互換可能に用いられる) および特異的なイディオタイプ抗-酸化型ＭＩＦ結合体-抗体 (「イディオタイプ抗体」または二次抗体; これらの表現は、本願を通して互換可能に用いられる)。
【００２３】
酸化型ＭＩＦ結合体として本発明に使用するのに好ましい抗体は、モノクローナル抗体である。特に好ましい態様において、モノクローナル抗酸化型ＭＩＦ抗体は、下にさらに詳細に記載する通り、ＲＡＢ９、ＲＡＢ０および／またはＲＡＢ４からなる群から選択されるか、または、ＲＡＭ９、ＲＡＭ０および／またはＲＡＭ４からなる群から選択される。
【００２４】
さらに、本発明の発明者が、酸化型ＭＩＦに結合している酸化型ＭＩＦ結合抗体を高い信頼性で特異的に検出することができる、上述の酸化型ＭＩＦ結合抗体に対するイディオタイプモノクローナル抗体の特定に成功しているため、本発明は特に有利である。したがって、本発明は、一の態様において、本明細書に記載の一次抗体に対してイディオタイプである抗体に関する。それらは、これらの一次抗体に特異的に結合する。好ましくは、該抗体は、一次抗体が酸化型ＭＩＦにも結合しているときに、これらに特異的に結合する。好ましい態様において、該イディオタイプ抗体は、ウサギイディオタイプ抗体である。
【００２５】
最も好ましい二次抗体は、ともに下記により詳細に記載する、５４-５および６８-１と命名した抗体である。
【００２６】
好ましい態様において、本発明は、該二次抗体を提供する方法であって、酸化型ＭＩＦ抗体のＦａｂ断片を用いて免疫化する手法を行い、次いで中和ＥＬＩＳＡスクリーニングを行う、方法を提供する。抗体は、中和ＥＬＩＳＡにおいて、ＩＣ５０≦６０ng/mlである場合に、二次抗体として適当であるとみなす。
【００２７】
本発明の方法の好都合な特異性は、アイソタイプ対照抗体(ＭＩＦ/酸化型ＭＩＦを検出できないため陰性対照として適している)、または、他の抗酸化型ＭＩＦモノクローナル抗体(酸化型ＭＩＦに結合できるが、例えば抗ＲＡＭ９イディオタイプ抗体により検出し得ない)による対照染色によって示されており(下記の実施例の部分を参照のこと)、さらに、酸化型ＭＩＦが、罹患組織、例えばがん組織でのみ検出されるという証拠を伴う本発明者らの発見によってさらに確認されている。
【００２８】
本検出方法は、好ましい態様において、染色工程を含む。本発明の検出／染色プロトコルはそれ自体が、組織切片中の未変性の酸化型ＭＩＦ構造を保つよう設計された。本発明の時点までに知られていた標準的な方法は、ＭＩＦの酸化型ＭＩＦへの変換を引き起こし、それにより、免疫組織化学法において偽陽性染色が引き起こされる。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明は、次の項目によって一部が記載される。
１. 対象の組織試料で抗体ＲＡＢ４、ＲＡＢ９および／またはＲＡＢ０に示差的に結合するＭＩＦである酸化型ＭＩＦのインビトロ検出のための免疫組織化学(ＩＨＣ)アッセイ法であって、インビトロで当該試料の酸化型ＭＩＦへの化合物の結合を決定することを含み、
以下の工程の１つ以上：
ａ) ブロッキング緩衝液を用いる任意のブロッキング工程；
ｂ) 有機または無機の固定剤、特に、ホルムアルデヒドまたはアセトンを用いた、事前の固定工程を伴わない、一次抗酸化型ＭＩＦ抗体との結合工程；
ｃ) 任意の固定工程；
ｄ) 二次抗体が抗酸化型ＭＩＦ抗体に対する、抗イディオタイプモノウサギモノクローナル抗体である、二次抗体とのインキュベーション工程；および／または
ｅ) 一次抗酸化型ＭＩＦ抗体と二次抗体の間の結合の検出
を行う、ＩＨＣアッセイ法。
２. 第１結合工程ｂ）の前に、無機または有機固定剤、特にホルムアルデヒドまたはアセトンを用いる固定化を行わない、項目１に記載のＩＨＣアッセイ法。
３. 試料を、好ましくは約３０分間風乾する、項目１または２に記載のＩＨＣアッセイ法。
４. 一次抗体が標識されていない、例えばビオチン化されていない、および／または、好ましくは一次希釈緩衝液に含まれ、および／または、一次抗体を、試料と、好ましくは４５〜９０分間、より好ましくは約６０分間インキュベーションする、項目１〜３の何れか１つ以上に記載のＩＨＣアッセイ法。あるいは、一次抗体と試料のインキュベーション時間は、３０〜９０分間、より好ましくは約３０分間であってよい。
５. 過剰の抗体を洗い流すために、洗浄工程を結合工程ｂ)の後に行い、任意のさらなる洗浄工程を、全てのさらなる工程の後に行う、項目１〜４のいずれかに記載のＩＨＣアッセイ法。
【００３０】
６. 検出工程ｅ）が、染色工程を含むか、または該工程からなる、および/または、さらなる（対比）染色工程を、検出工程の後に行い、該工程が三次抗体の使用を含んでいてよい、項目１〜５のいずれかに記載のＩＨＣアッセイ。
７. 工程ｅ）の後に、ヘマトキシリンを用いて（対比）染色工程を行う、項１〜６のいずれかに記載のＩＨＣアッセイ法。
８. 一次抗体と二次抗体の間の結合が、蛍光、好ましくは二次抗体に対する蛍光標識した三次抗体により検出される、上述の項目のいずれかに記載のＩＨＣアッセイ。
９. 該二次抗体が、抗ＲＡＭ９抗体、抗ＲＡＭ４抗体からなる群から選択され、最も好ましくは抗ＲＡＭ９抗体であり、さらに好ましくはウサギ抗ＲＡＭ９抗体である、項目１〜８のいずれか記載のＩＨＣアッセイ。
１０. 一次抗体が酸化型ＭＩＦに結合するが、還元型ＭＩＦに結合しない、項目１〜９のいずれか記載のＩＨＣアッセイ。
【００３１】
１１．示差結合が、１００ｎＭ未満、好ましくは５０ｎＭ未満、さらにより好ましくは１０ｎＭ未満のＫＤ値で起こる酸化型ＭＩＦへの結合および、４００ｎＭより大きいＫＤによって特徴付けられる、還元型ＭＩＦへの非結合である、項１０に記載のＩＨＣアッセイ法。
１２. 一次抗体が、酸化型ＭＩＦ結合体、例えば抗体ＲＡＢ４、ＲＡＢ９および／またはＲＡＢ０および／またはＲＡＭ４、ＲＡＭ９および／またはＲＡＭ０からなる群から選択される、項１〜１１のいずれかに記載のＩＨＣアッセイ法。
１３. 試料が、組織生検試料、好ましくは凍結組織生検試料、好ましくはＯＣＴ包埋切片、またはコア針生検試料である、上述の項目のいずれかに記載のＩＨＣアッセイ法。
１４. 抗酸化型ＭＩＦ抗体、好ましくは抗ＲＡＭ９抗体に特異的に結合するイディオタイプ抗体。
１５. 該抗体が、固定したＭＩＦおよびＲＡＭ９を用いた中和ＥＬＩＳＡにおいて、６０ng/ml以下のＩＣ５０により特徴付けられる、項目１４記載のイディオタイプ抗体。
【００３２】
１６. 例えば項目１〜１５のいずれかに記載の方法またはキットで用いるための、配列番号１５および/または１６、または配列番号１７および/または１８により特徴付けられる、好ましくは項目１４または１５に記載されている、イディオタイプ抗体。
１７. 例えば、上述の項目のいずれかに記載の方法またはキットに用いるための抗イディオタイプ抗体であって、寄託番号ＤＳＭ２８１８０でＤＳＭＺに寄託されている重鎖および/または寄託番号ＤＳＭ２８１８１でＤＳＭＺに寄託されている軽鎖により特徴付けられるか; または、寄託番号ＤＳＭ２８１８２でＤＳＭＺに寄託されている重鎖および/または寄託番号ＤＳＭ２８１８３でＤＳＭＺに寄託されている軽鎖により特徴付けられる、抗イディオタイプ抗体。
１８. 抗酸化型ＭＩＦ抗体、好ましくはＲＡＭ９、ＲＡＭ０またはＲＡＭ４の検出方法であって、該抗酸化型ＭＩＦ抗体に対する、好ましくは項目１４〜１７のいずれか記載の、イディオタイプモノクローナル抗体を用いる、方法。
１９. 好ましい態様において、項目１８の検出方法は、ＲＡＭ９を検出する。
２０. 上述の項目に記載のいずれかの方法を行うために適用させた、および/または上述の項目に記載の１つ以上の抗体を含む、ＩＨＣアッセイキット。
【００３３】
本発明はまた、さらなる特に好ましい態様において、次の方法を提供する:
２１.  標的組織の標的飽和の、(好ましくは、上記の項目１および１０〜１２に記載するように)抗ＭＩＦ抗体を用いた決定方法であって、該標的飽和が、上述の項目１〜１３のいずれかに記載の方法により決定される、方法。
【００３４】
この標的飽和決定方法は、抗ＭＩＦ抗体の投与後、該抗ＭＩＦ抗体が実際に標的組織に到達しているのかどうか、およびどの程度の量が到達しているのかを決定するのに適当である。
【００３５】
この方法はまた、特に好ましい態様において、例えば、間質と腫瘍細胞の間の、標的組織飽和の差異を決定するのに適当である。
【００３６】
該方法の１つの可能な例を、下記の実施例５および図６に続けて示す。
【００３７】
上記（一次）抗体（酸化型ＭＩＦ結合体）は、その配列ならびに、上記抗体ＲＡＢ０、ＲＡＢ４およびＲＡＢ９のそれぞれならびにＲＡＭ０、ＲＡＭ４およびＲＡＭ９それぞれの軽鎖または重鎖のいずれかを含む大腸菌 (E. coli) (ＴＧ１株) のプラスミドとしての寄託により特徴付けられ、かつ支持される。
【００３８】
プラスミドは、ブダペスト条約に基づき、German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (ＤＳＭＺ), Mascheroder Weg 1b, Braunschweig, Germanyに寄託して得られた公式番号であるＤＳＭ番号によって特徴付けられる。プラスミドは、それぞれ大腸菌株で寄託した。
【００３９】
ＤＳＭ２５１１０の番号を有するプラスミドは、抗ＭＩＦ抗体 ＲＡＢ４の軽鎖配列を含む。
【００４０】
ＤＳＭ２５１１２の番号を有するプラスミドは、抗ＭＩＦ抗体 ＲＡＢ４の重鎖(ＩｇＧ４)配列を含む。
【００４１】
適当なホスト細胞中でのプラスミドＤＳＭ２５１１０およびＤＳＭ２５１１２の共発現により、好ましい抗ＭＩＦ抗体ＲＡＢ４が産生される。
【００４２】
ＤＳＭ２５１１１の番号を有するプラスミドは、抗ＭＩＦ抗体 ＲＡＢ９の軽鎖配列を含む。
【００４３】
ＤＳＭ２５１１３の番号を有するプラスミドは、抗ＭＩＦ抗体 ＲＡＢ９の重鎖(ＩｇＧ４)配列を含む。
【００４４】
適当なホスト細胞中でのプラスミドＤＳＭ２５１１１およびＤＳＭ２５１１３の共発現により、好ましい抗ＭＩＦ抗体ＲＡＢ９が産生される。
【００４５】
ＤＳＭ２５１１４の番号を有するプラスミドは、抗ＭＩＦ抗体 ＲＡＢ０の軽鎖配列を含む。
【００４６】
ＤＳＭ２５１１５の番号を有するプラスミドは、抗ＭＩＦ抗体 ＲＡＢ０の重鎖(ＩｇＧ４)配列を含む。
【００４７】
適当なホスト細胞中でのプラスミドＤＳＭ２５１１４およびＤＳＭ２５１１５の共発現により、好ましい抗ＭＩＦ抗体ＲＡＢ０が作製される。
【００４８】
また、抗体ＲＡＭ０、ＲＡＭ９およびＲＡＭ４を全て、ブダペスト条約に基づき、２０１２年４月１２日に、ＤＳＭＺ (Braunschweig, Germany) に寄託し、下記のように名付けられた：
ＲＡＭ９ - 重鎖: 大腸菌 GA.６６２-０１.pＲＡＭ９ｈｃ -ＤＳＭ２５８６０.
ＲＡＭ４ - 軽鎖: 大腸菌 GA.９０６-０４.pＲＡＭ４ｌｃ -ＤＳＭ２５８６１.
ＲＡＭ９ - 軽鎖: 大腸菌 GA.６６１-０１.pＲＡＭ９ｌｃ -ＤＳＭ２５８５９.
ＲＡＭ４ - 重鎖: 大腸菌 GA.６５７-０２.pＲＡＭ４ｈｃ -ＤＳＭ２５８６２.
ＲＡＭ０ - 軽鎖: 大腸菌 GA.９０６-０１.pＲＡＭ０ｌｃ -ＤＳＭ２５８６３.
ＲＡＭ０ - 重鎖: 大腸菌 GA.７８４-０１.pＲＡＭ０ｈｃ -ＤＳＭ２５８６４.
【００４９】
また、抗体５４-５および６８-１も、ブダペスト条約に基づき、２０１３年１２月１９日に、ＤＳＭＺ (Braunschweig, Germany) に寄託し、下記のように名付けられた：
５４-５ - 重鎖: 大腸菌 ＴＧ１ 抗ＲＡＭ９抗体-ＤＳＭ２８１８０.
５４-５ - 軽鎖: 大腸菌 ＴＧ１ 抗ＲＡＭ９抗体-ＤＳＭ２８１８１.
６８-１ - 軽鎖: 大腸菌 ＴＧ１ 抗ＲＡＭ９抗体-ＤＳＭ２８１８３.
６８-１ - 重鎖: 大腸菌 ＴＧ１ 抗ＲＡＭ９抗体-ＤＳＭ２８１８２.
【００５０】
本明細書において、生物学的試料は、好ましい態様において、組織試料であり、好ましくは組織生検試料、組織生検試料の凍結切片 (新鮮凍結または例えばＯＣＴ包埋)、またはコア針生検試料である。しかし、上記の好ましい試料に加えて、全てのさらなる公知の組織または細胞試料を、当業者に知られている通りに、本発明の方法で使用してよい。ＯＣＴ包埋は、この内容において、凍結組織を包埋するための包埋媒体を指し、当技術分野で十分に用いられよく知られている方法である。ＯＣＴは、最適切削温度 (Optimal Cutting Temperature) の略記であり、包埋は、例えばこの媒体を使用することによって保証される。ＯＣＴ媒体は、凍結による異物の形成、例えば水による組織の破壊を防ぐ。ＯＣＴ媒体は、１０.２４％のポリビニルアルコール、４.２６％のポリエチレングリコールおよび８５.５０％の非反応性成分からなる。この媒体または一般に知られる同様の媒体は、例えばクリオスタットでの切断前に組織を包埋するために使用される。この媒体の僅かな変更は、本発明に影響しない。
【００５１】
患者由来の試料中の酸化型ＭＩＦの検出は、疾患または障害の信頼できる診断、特にＭＩＦ関連疾患、すなわち(酸化型)ＭＩＦの関与がある疾患に罹患している患者の診断に重要な工程である。
【００５２】
「予防的」または「治療的」処置という用語は、当技術分野で認識されているものであり、患者への薬物の投与を指す。望ましくない症状 (ホスト、例えばヒトまたは動物の疾患または他の望ましくない症状) の臨床的顕在化の前に、特定の化合物を投与する場合、かかる処置は予防的であり、すなわち、望ましくない症状の発症からホストを守る。一方、望ましくない状態の顕在化後の投与ならば、処置は、治療的である (すなわち、現存する望ましくない状態またはその副作用を軽減、改善または増悪させないことを意図する)。
【００５３】
本明細書において、抗（酸化型）ＭＩＦは、（酸化型）ＭＩＦの生物活性を減弱、阻害、妨害、相殺、または低下させる任意の剤を指す。抗（酸化型）化合物は、（酸化型）ＭＩＦ活性を阻害または中和する剤、例えば、抗体、特に好ましくは本明細書に記載する抗体、より好ましくは抗体ＲＡＢ９、ＲＡＢ４および/またはＲＡＢ０、もしくはＲＡＭ９、ＲＡＭ４および/またはＲＡＭ０である。
【００５４】
本発明は、以下に記載する図によって、さらに説明される。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１Ａ】膵臓の浸潤性腺管がんにおける、ＲＡＭ９一次抗体、および、二次抗体としてのウサギ抗ＲＡＭ９（イディオタイプ、６８−１）を用いた、免疫組織化学的検査による、酸化型ＭＩＦのインサイチュ 検出。
【図１Ｂ】図１Ａの陰性対照。
【図２Ａ】正常な肺におけるＩＨＣによる酸化型ＭＩＦのインサイチュ検出、一次抗体: ＲＡＭ９、二次抗体: ウサギ抗ＲＡＭ９ (イディオタイプ)
【図２Ｂ】扁平上皮細胞がんにおけるＩＨＣによる酸化型ＭＩＦのインサイチュ検出、一次抗体： ＲＡＭ９、二次抗体: ウサギ抗ＲＡＭ９ (イディオタイプ)
【図３】モノクローナルウサギ抗ＲＡＭ９抗体の一次スクリーニングＥＬＩＳＡ
【図４Ａ】モノクローナルウサギ抗ＲＡＭ９抗体の二次スクリーニングＥＬＩＳＡ。
【図４Ｂ】最終精製したモノクローナルウサギ抗ＲＡＭ９抗体６８-１および５４-５の二次スクリーニングＥＬＩＳＡ
【図５】膵臓の浸潤性腺管がんにおける、ＲＡＭ９一次抗体、および、二次抗体としてウサギ抗ＲＡＭ９（イディオタイプ）抗体、クローン５４-５ (左) およびクローン ６８-１ (右)を用いた免疫組織化学的検査による酸化型ＭＩＦのインサイチュ検出。
【図６Ａ】組織中の抗酸化型ＭＩＦ抗体ＲＡＭ９の検出；ＣＬＬリンパ節、ＲＡＭ９処置
【図６Ｂ】組織中の抗酸化型ＭＩＦ抗体ＲＡＭ９の検出；ＣＬＬリンパ節、ビヒクル処置
【図７】本発明の免疫組織化学的検査後の、標的飽和の算出の代表的な図および工程。
【図８】１番目の列は、ＣＬＬリンパ節 (実施例５も参照) 組織マイクロアレイのスライド全体のスキャンを示す。１群あたり１つのリンパ節および染色を選択し、詳細を示す(１番目の列の黒色の四角形、２番目の列に示す)。しかし、実施例５に記載の算出は全てのリンパ節について行った。２番目の列において、濃灰色の印は、組織領域を強調しており、これは、手動で行ったか (上から３番目および４番目の図)またはソフトウェアにより自動的に行った (上から１番目および２番目の図)。薄灰色の領域は、例えば、壊死、組織ひだにより、除いた。３番目の列は、２番目の図において印をつけた領域の、より高い倍率における、代表的な本来の像を示す。４番目の列には、ソフトウェアアルゴリズムにより、褐色の色素原を自動で付けた後の、同じ代表的な図（ＲＡＭ９または酸化型ＭＩＦ染色についてのマーカー領域；濃灰色〜黒色領域）を示す。最後の列には、全てのリンパ節のマーカー領域の平均を、ＲＡＭ９および酸化型ＭＩＦ染色の両方について、棒グラフで示す。
【図９】標的飽和の算出
【図１０】腫瘍、間質における標的飽和および全体的な標的飽和。データは、四分位数範囲の中間値を示す。
【００５６】
定義および一般的な技術
本明細書で別途定義しない限り、本発明に関して用いられる学術用語および技術用語は、当業者に一般的に理解される意味を有する。一般的に、本明細書で記載された細胞、組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学および蛋白質および核酸化学に関連して用いられる命名法および技術は、当技術分野で周知のものであって、一般的に用いられているものである。本発明の方法および技法は、特に断りのない限り、一般的に、当技術分野で周知の慣用の方法に従って、本明細書全体で引用され、かつ説明された様々な一般的および具体的引用文献に記載された通りに行われる。例えばSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) および Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), およびHarlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990)(これらは、引用により本明細書に包含される)を参照のこと。
【００５７】
「ＭＩＦ」または「マクロファージ遊走阻害因子」は、免疫および炎症応答に重要なメディエーターとして、およびグルココルチコイドの対抗制御因子として知られる蛋白質を指す。ＭＩＦは、哺乳動物ＭＩＦ、特にヒトＭＩＦ (Swiss-Prot primary accession number: P14174)を含み、単量体型は、１１５アミノ酸蛋白質としてコードされるが、最初のメチオニンの切断により、１１４アミノ酸として産生される。また、「ＭＩＦ」は、「ＧＩＦ」(グリコシル化阻害因子)および他の型のＭＩＦ、例えばＭＩＦの融合蛋白質を含む。ＭＩＦのアミノ酸の番号付けは、Ｎ末端メチオニン(アミノ酸１)から始まり、Ｃ末端アラニン (アミノ酸１１５) で終わる。
【００５８】
「酸化されたＭＩＦ」または酸化型ＭＩＦは、本発明の目的のために、ＭＩＦを穏やかな酸化剤、例えばシスチンで処理することによって生じるＭＩＦのアイソフォームとして定義される。本発明によって示される通り、この方法で処理された組み換え酸化型ＭＩＦは、(例えば)動物を細菌に暴露した後にインビボで生じる酸化型ＭＩＦと構造的再配列を共有するＭＩＦのアイソフォームを含む。
【００５９】
還元型ＭＩＦは、本発明の目的のために、還元されたＭＩＦと定義され、ＲＡＢ０、ＲＡＢ９および／またはＲＡＢ４に結合しないＭＩＦである。
【００６０】
本発明で記載された抗酸化型ＭＩＦ抗体は、それぞれ穏やかな酸化または還元によって生じる酸化型ＭＩＦと還元型ＭＩＦを区別することができ、特異的に酸化型ＭＩＦを検出するのに有用である。これらの配座異性体の区別は、ＥＬＩＳＡまたは表面プラズモン共鳴によって評価される。
【００６１】
Biacoreによる抗体の示差的結合の評価
酸化型ＭＩＦおよび還元型ＭＩＦの抗体ＲＡＢ９およびＲＡＢ０に対する結合動態を、Biacore 3000 Systemを用いた表面プラズモン共鳴分析によって調べる。抗体をCM5 (＝カルボキシメチル化デキストラン) チップにコートし、０.２％ Proclin 300とプレインキュベーションした組み換えＭＩＦ蛋白質を注入した (Proclin 300は、酸化イソチアゾロンからなり、これは酸化型ＭＩＦから還元型ＭＩＦへの変換を回避することによって酸化型ＭＩＦ構造を安定化する)。ProClin３００を添加しない未変性ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液 (＝Biacoreランニング緩衝液)中では、組み換えＭＩＦ蛋白質は、ＲＡＢ９、ＲＡＢ０または陰性 (バックグラウンド) 結合対照として用いられる参照抗体 (無関係なアイソタイプ対照抗体) に一切結合しなかった。
【００６２】
好ましい態様において、酸化型ＭＩＦは、抗体ＲＡＢ９、ＲＡＢ４および／またはＲＡＢ０、またはその抗原結合断片に示差的に結合するＭＩＦであり、すなわち、これらの抗体は酸化型ＭＩＦと結合するが、これらの抗体のいずれにも還元型ＭＩＦは結合しないことを意味する。
【００６３】
他の態様において、抗酸化型ＭＩＦ抗体（「酸化型ＭＩＦ結合体」）、例えば上記の抗体またはその抗原結合部分は、１００ｎＭ未満のＫＤで、好ましくは５０ｎＭ未満のＫＤで、さらにより好ましくは１０ｎＭ未満のＫＤで酸化型ＭＩＦに結合する。特に好ましくは、本発明の抗体は、５ｎＭ未満のＫＤで酸化型ＭＩＦに結合する。
【００６４】
抗体、例えばＲＡＢ９、ＲＡＢ４またはＲＡＢ０の(酸化型ＭＩＦまたは還元型ＭＩＦへの)(非)結合は、一般的に当業者に知られている通りに決定でき、その例は、下記の方法：組み換えＭＩＦを用いる示差的結合ＥＬＩＳＡ、または、上に記載した周知のBiacoreアッセイのような、還元状態または酸化状態の組み換えＭＩＦを用いた表面プラズモン共鳴のいずれか１つである。
【００６５】
好ましい結合決定方法は、例えば還元型(酸化型)ＭＩＦに対する、抗体の表面プラズモン共鳴であり、ここで、「結合」は、１００ｎＭ未満、好ましくは５０ｎＭ未満、さらにより好ましくは１０ｎＭ未満のＫＤを表すことを意味し、一方、還元型ＭＩＦへの非結合は、４００ｎＭより大きいＫＤによって特徴付けられる。「結合」および「特異的結合」は、本明細書で、このことを表すのに互換可能に用いられる。「示差的結合」は、本明細書において、化合物、特に本明細書に記載の抗体が、酸化型ＭＩＦに(例えば上記のＫＤ値で)結合する一方、(上で定義する非結合の通りに)還元型ＭＩＦには結合しないことを意味する。
【００６６】
「抗体」は、インタクトな抗体か、または、(特異的)結合についてインタクトな抗体と競合する抗原結合部分を指す。一般的には、Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)) (引用により本明細書に包含される)を参照のこと。抗体という用語は、ヒトの抗体、哺乳動物の抗体、単離した抗体および遺伝子改変形態、例えばキメラ、ラクダ化またはヒト化抗体を含み、これらに限定されない。
【００６７】
抗体の「抗原結合部分」という用語は、抗原 (例えば (酸化型) ＭＩＦ) に特異的に結合する能力を保持する１種以上の抗体断片を指す。抗原結合部分は、組み換えＤＮＡ法によって、または、インタクトな抗体の酵素切断または化学的切断によって製造し得る。抗原結合部分は、例えば、次のもの：Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２、Ｆｖ、および相補性決定領域 (ＣＤＲ) 断片、一本鎖抗体 (ｓｃＦｖ)、キメラ抗体、抗体および、ポリペプチド、すなわち酸化型または還元型ＭＩＦに対する特異的な抗原結合に十分な、抗体の少なくとも一部を含むポリペプチドを含むが、これらに限定されない。Ｎ末端からＣ末端までの成熟軽鎖および重鎖の可変ドメインは、領域ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991))、Chothia et al. J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)、または、Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989)の定義にしたがう。抗体またはその抗原結合部分は、誘導体化するか、または他の機能性分子(例えば他のペプチドまたは蛋白質)に結合していてよい。例えば、抗体またはその抗原結合部分を、１つ以上の他の分子部分、例えば他の抗体(例えば二重特異性抗体または二特異性抗体)、検出可能な物質、細胞傷害剤、薬物および／または結合分子と機能的に結合してよい。
【００６８】
「ＫＤ」という用語は、本明細書において、当業者の一般的な知識に従って、特定の抗体とそれぞれの抗原との平衡解離定数を指す。この平衡解離定数は、より大きい対象 (ここでは酸化型または還元型ＭＩＦ−抗体複合体) が、より小さい構成要素 (ここでは酸化型または還元型ＭＩＦと抗体) に、分離、すなわち解離する傾向を測るものである。
【００６９】
「ヒト抗体」という用語は、可変および定常ドメインがヒトの配列である任意の抗体を指す。本用語は、ヒトの遺伝子由来であるが、例えば可能性のある免疫原性を低下させる、親和性を増大させる、望ましくないフォールディングを起こすかもしれないシステインを除くなどの変更をした配列を有する抗体を包含する。本用語は、例えばヒト細胞に典型的でないグリコシル化をもたらす可能性のある、非ヒト細胞における組み換えにより作製した抗体を包含する。
【００７０】
「ヒト化抗体」という用語は、ヒト配列を含み、かつ非ヒト配列も含む抗体を指す。
【００７１】
「ラクダ化抗体」という用語は、抗体構造または配列が、ラクダ由来の抗体により類似するように変更された抗体をいい、ラクダ科抗体とも称する。ラクダ化抗体の設計および作製は、当業者に一般的な知識の一部である。
【００７２】
「キメラ抗体」という用語は、２種以上の異なる種由来の領域を含む抗体を指す。
【００７３】
「単離された抗体」または「その単離された抗原結合部分」という用語は、抗体ソース、例えばファージディスプレイライブラリーまたはＢ細胞レパートリーから同定され、選択された、抗体またはその抗原結合部分を指す。
【００７４】
本発明による抗(酸化型)ＭＩＦ抗体（「酸化型ＭＩＦ結合体」）の作製は、遺伝子操作によって、例えばＲＮＡの逆転写および／またはＤＮＡの増幅および発現ベクターへのクローニングによって、組み換えＤＮＡを作製する任意の方法を含む。いくつかの態様において、ベクターは、さらなるＤＮＡセグメントをウイルスのゲノムにライゲートし得るウイルスベクターである。いくつかの態様において、ベクターは、導入されるホスト細胞中で自己複製できる(例えば細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソームの哺乳動物ベクター)。他の態様において、ベクター(例えば非エピソーム哺乳動物ベクター)は、ホスト細胞への導入によりホスト細胞のゲノムに組み込まれ、それによって、ホストのゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、それらに作動可能に結合した遺伝子を発現させることができる。このようなベクターを、本明細書において、「組み換え発現ベクター」(または単に「発現ベクター」)と称する。
【００７５】
抗(酸化型)ＭＩＦ抗体（「酸化型ＭＩＦ結合体」）は、とりわけ、慣用の発現ベクター、例えば細菌ベクター(例えばｐＢＲ３２２およびその誘導体)、または、真核生物ベクターによって作製できる。抗体をコードするこれらの配列は、複製、発現および／またはホスト細胞からの分泌を制御する制御配列と共に提供され得る。これらの制御配列は、例えばプロモーター(例えばＣＭＶまたはＳＶ４０)およびシグナル配列を含む。また、発現ベクターは、選択マーカーおよび増幅マーカー、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子(ＤＨＦＲ)、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼおよびチミジンキナーゼも含んでいてよい。用いるベクターの構成要素、例えば選択マーカー、レプリコン、エンハンサーは、商業的に得られるか、または、慣用の方法によって作製できる。ベクターは、様々な細胞培養物、例えば哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、ＮＳＯ、線維芽細胞、昆虫細胞、酵母または細菌、例えば大腸菌における発現のために構築し得る。いくつかの例において、発現させる蛋白質の最適なグリコシル化を可能とする細胞を用いる。
【００７６】
抗(酸化型)ＭＩＦ抗体軽鎖遺伝子および抗(酸化型)ＭＩＦ抗体重鎖遺伝子は、別のベクターに挿入しても、または、これらの遺伝子を、同じ発現ベクターに挿入してもよい。抗体遺伝子は、標準的な方法、例えば抗体遺伝子フラグメントおよびベクター上の相補的制限部位のライゲーションによって、または、制限部位が存在しない場合は平滑末端ライゲーションによって発現ベクターに挿入される。
【００７７】
抗(酸化型)ＭＩＦ抗体（「酸化型ＭＩＦ結合体」）またはその抗原結合フラグメントの作製は、例えばエレクトロポレーションまたはマイクロインジェクションによるトランスフェクションによって組み換えＤＮＡを真核生物細胞に導入するための当技術分野で知られている任意の方法を含み得る。例えば、抗(酸化型)ＭＩＦ抗体の組み換え発現は、抗(酸化型)ＭＩＦ抗体をコードするＤＮＡ配列を含む発現プラスミドを、１種以上の制御配列、例えば強力なプロモーターの制御下で適切なトランスフェクション法によって適当なホスト細胞株に導入することによって達成でき、その結果、ゲノムに安定に組み込まれた導入配列を有する細胞が得られる。リポフェクション法は、本発明にしたがって用い得るトランスフェクション法の一例である。
【００７８】
また、抗(酸化型)ＭＩＦ抗体（「酸化型ＭＩＦ結合体」）の作製は、例えば連続的またはバッチ式方法での形質転換した細胞の培養、および、例えば構成的な、または誘導時の抗(酸化型)ＭＩＦ抗体の発現について当業者に知られている任意の方法を含む。抗(酸化型)ＭＩＦ抗体の作製についてのさらなる参考として、特に、ＷＯ２００９/０８６９２０を引用する。好ましい態様において、本発明によって作製した抗(酸化型)ＭＩＦ抗体は、酸化型ＭＩＦまたはそのエピトープに結合する。本発明による、特に好ましい抗体は、抗体 ＲＡＢ９、ＲＡＢ４および／またはＲＡＢ０、ならびにＲＡＭ９、ＲＡＭ４および／またはＲＡＭ０である。
【００７９】
これらの抗体の配列は、一部がＷＯ２００９/０８６９２０号にも開示されている。さらに、本出願の配列表および次に示すものを参照のこと。
配列番号１：ＲＡＢ９の軽鎖のアミノ酸配列：
【化１】
2017503176.tif 000003
【００８０】
配列番号２：ＲＡＢ４の軽鎖のアミノ酸配列：
【化２】
2017503176.tif 000004
【００８１】
配列番号３：ＲＡＢ０の軽鎖のアミノ酸配列：
【化３】
2017503176.tif 000005
【００８２】
配列番号４：ＲＡＢ２の軽鎖のアミノ酸配列：
【化４】
2017503176.tif 000006
【００８３】
配列番号５：ＲＡＢ９の重鎖のアミノ酸配列：
【化５】
2017503176.tif 000007
【００８４】
配列番号６：ＲＡＢ４の重鎖のアミノ酸配列：
【化６】
2017503176.tif 000008
【００８５】
配列番号７：ＲＡＢ０の重鎖のアミノ酸配列
【化７】
2017503176.tif 000009
【００８６】
配列番号８：ＲＡＢ２の重鎖のアミノ酸配列：
【化８】
2017503176.tif 000010
【００８７】
配列番号９：ＲＡＭ０ｈｃのアミノ酸配列：
【化９】
2017503176.tif 000011
【００８８】
配列番号１０：ＲＡＭ０ｌｃのアミノ酸配列
【化１０】
2017503176.tif 000012
【００８９】
配列番号１１：ＲＡＭ９ｈｃのアミノ酸配列
【化１１】
2017503176.tif 000013
【００９０】
配列番号１２：ＲＡＭ９ｌｃのアミノ酸配列
【化１２】
2017503176.tif 000014
【００９１】
配列番号１３：ＲＡＭ４ｈｃのアミノ酸配列
【化１３】
2017503176.tif 000015
【００９２】
配列番号１４：ＲＡＭ４ｌｃのアミノ酸配列
【化１４】
2017503176.tif 000016
【００９３】
配列番号１５： 抗ＲＡＭ９-６８-１ｈｃのアミノ酸配列
【化１５】
2017503176.tif 000017
【００９４】
配列番号１６：抗ＲＡＭ９-６８-１ｌｃのアミノ酸配列
【化１６】
2017503176.tif 000018
【００９５】
配列番号１７：抗ＲＡＭ９-５４-５ｈｃのアミノ酸配列
【化１７】
2017503176.tif 000019
【００９６】
配列番号１８：抗ＲＡＭ９-５４-５ｌｃのアミノ酸配列
【化１８】
2017503176.tif 000020
【００９７】
本発明の抗(酸化型)ＭＩＦ抗体は、好ましくは、単離されたモノクローナル抗体である。抗ＭＩＦ抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡまたはＩｇＤ分子であり得る。他の態様において、抗ＭＩＦ抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブクラスである。他の態様において、抗体は、サブクラスＩｇＧ１またはＩｇＧ４のいずれかである。他の態様において、抗体は、サブクラスＩｇＧ４である。いくつかの態様において、ＩｇＧ４抗体は、セリン (Kabatナンバリングスキームによるセリン２２８) をプロリンに変更した単一突然変異を有する。したがって、ＩｇＧ４のＦｃ領域におけるＣＰＳＣ部分配列は、ＩｇＧ１の部分配列であるＣＰＰＣとなる (Angal et al. Mol Immunol. 1993, 30, 105-108)。
【００９８】
さらに、抗(酸化型)ＭＩＦ抗体（「酸化型ＭＩＦ結合体」）の作製は、当技術分野に知られている任意の抗体精製方法、例えばアニオン交換クロマトグラフィーまたは親和性クロマトグラフィーによる精製方法を含み得る。一つの態様において、抗(酸化型)ＭＩＦ抗体は、サイズ排除クロマトグラフィーによって、細胞培養上清から精製できる。
【００９９】
ＭＩＦの「中心領域」および「Ｃ末端領域」という用語は、それぞれアミノ酸３５〜６８およびアミノ酸８６〜１１５を含むヒトＭＩＦの領域、好ましくは、それぞれアミノ酸５０〜６８およびアミノ酸８６〜１０２のヒトＭＩＦを指す。
【０１００】
本発明の特に好ましい抗体は（「酸化型ＭＩＦ結合体」として）、ヒトＭＩＦのアミノ酸５０〜６８領域またはアミノ酸８６〜１０２領域のいずれかに結合する。また、これは、次の通りに結合する好ましい抗体ＲＡＢ０、ＲＡＢ４、ＲＡＢ２およびＲＡＢ９、ならびにＲＡＭ４、ＲＡＭ９およびＲＡＭ０の結合に反映される：
ＲＡＢ４ および ＲＡＭ４：アミノ酸８６〜１０２
ＲＡＢ９ および ＲＡＭ９：アミノ酸５０〜６８
ＲＡＢ０ および ＲＡＭ０：アミノ酸８６〜１０２
ＲＡＢ２：アミノ酸８６〜１０２
【０１０１】
「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンまたは抗体断片に特異的に結合できる任意の蛋白質決定因子を含む。エピトープ決定因子は、通常、分子の化学的に活性な表面の基、例えば、露出したアミノ酸、アミノ糖または他の炭水化物側鎖からなり、通常、特異的な３次元構造特性および特異的な電荷特性を有する。
【０１０２】
「ベクター」という用語は、それが結合している他の核酸を輸送できる核酸分子を指す。いくつかの態様において、ベクターは、プラスミドであり、すなわち、さらなるＤＮＡセグメントをライゲートし得る環状の二本鎖ＤＮＡループである。
【０１０３】
「ホスト細胞」という用語は、発現ベクター導入後に組み換え蛋白質を産生できる細胞株を指す。「組み換え細胞株」という用語は、組み換え発現ベクターが導入されている細胞株を指す。「組み換え細胞株」は、特定の対象の細胞株のみならず、該細胞株の子孫も意味すると理解されるべきである。突然変異または環境的影響のいずれかのために後の世代に特定の修飾が生じ得ることから、このような後代は、実際は親細胞と同一ではない可能性があるが、それでも本明細書で用いる、「組み換え細胞株」という用語の範囲内に含まれる。
【０１０４】
本発明によるホスト細胞の種類は、例えばＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、または、例えばＨＥＫ２９３細胞、または当業者に知られている他の何れかのホスト細胞であり、そのため、例えば大腸菌細胞のような細菌の細胞が挙げられる。一の態様において、抗ＭＩＦ抗体は、Ｇ４１８を選択マーカーとして添加して、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞株、例えばＤＸＢ１１中で発現させる。抗体遺伝子をコードする組み換え発現ベクターを、ＣＨＯホスト細胞に導入するとき、ホスト細胞中で抗体が発現するのに、またはホスト細胞を増殖させた培養培地に抗体を分泌するのに十分な時間、ホスト細胞を培養することによって、抗体を作製する。
【０１０５】
抗(酸化型)ＭＩＦ抗体（「酸化型ＭＩＦ結合体」）は、標準的な蛋白質精製方法を用いて、培養培地から回収できる。
【０１０６】
非常に驚くべきことに、本発明者らは、結合前に最先端のホルムアルデヒド固定工程を避けることが、可能であり、かつ特に重要であることを示した。この固定は、(無機または有機)溶媒を用いて行ったとき、たとえ非常によく知られ通常有用な固定剤であるホルムアルデヒドまたはアセトン(組織切片のために当技術分野で最も一般的に用いられる固定剤である)を用いた場合であっても、試料中のＭＩＦの立体構造が変化する傾向があり、偽陽性の結果を生じ得る。これは、一つの見解に過ぎないが、この固定剤/溶媒が、ＭＩＦ蛋白質内の構造再配置を誘発し、酸化型ＭＩＦエピトープに類似した構造が引き起こされる結果である可能性がある。
【０１０７】
本発明者らは、驚くべきことに、一次抗酸化型ＭＩＦ抗体との結合工程前に固定化工程を使用しなかった場合に、良好で信頼できる結果が得られることを示す。これは、当技術分野で通常用いられる方法の実質的に全てで広く確認されるように、固定工程が適当な結果を得るために必須であるという当業者の予測に反するものである。
【０１０８】
さらに、特に好ましい態様において、二次検出抗体は、イディオタイプモノクローナル抗体、好ましくはイディオタイプウサギモノクローナル抗体である。これらの抗体は、酸化型ＭＩＦ結合抗体、例えばＲＡＭ９を、該酸化ＭＩＦ結合体を標識する必要なく、直接検出できるために、特に有利であることが示されている。標識は、場合によっては、例えば活性喪失を引き起こし得るため、不利である場合もある。本発明の二次抗体（イディオタイプ）はまた、該検出方法のためのシグナルの増幅およびバックグラウンドノイズの低下を可能にする。
【０１０９】
本発明者らが、酸化型ＭＩＦに結合しているこれらの酸化型ＭＩＦ結合抗体を高い信頼性と特異性で検出することのできる、上述の酸化型ＭＩＦ結合抗体に対するイディオタイプモノクローナル抗体の特定に成功しているため、本発明は特に有利である。したがって、本発明は、一の態様において、本明細書に記載の一次抗体に対してイディオタイプである抗体に関する。それらはまた、これらの一次抗体に特異的に結合する。好ましくは、それらは、これらの一次抗体が、酸化型ＭＩＦに結合しているときも、特異的に結合する。好ましい態様において、該イディオタイプ抗体はモノクローナル抗体である。さらに好ましい態様において、該イディオタイプ抗体は、モノクローナルウサギイディオタイプ抗体である。
【０１１０】
最も好ましい二次抗体は、ともに上記および下記に詳細に記載する、５４−５および６８−１と命名された抗体である。該５４−５および６８−１抗体は、抗ＲＡＭ９抗体である。
【０１１１】
好ましい態様において、本発明は、該二次抗体を提供する方法であって、酸化型ＭＩＦ抗体のＦａｂ断片を用いる免疫化プロトコールを行った後、中和ＥＬＩＳＡスクリーニングを行う方法を提供する。抗体は、中和ＥＬＩＳＡにおいて、ＩＣ５０≦６０ ng/mlである場合に、二次抗体として適当であるとみなす。
【０１１２】
非常に好ましい態様において、本発明のイディオタイプ抗体は、
-  イディオタイプ (ウサギ) モノクローナル抗-ＲＡＭ９抗体、
-  イディオタイプ (ウサギ) モノクローナル抗-ＲＡＭ０抗体、および
-  イディオタイプ (ウサギ) モノクローナル抗-ＲＡＭ４抗体
からなる群から選択される。
【０１１３】
最も好ましくは、該イディオタイプ抗体は、
-  イディオタイプ (ウサギ) モノクローナル抗-ＲＡＭ９抗体である。
【０１１４】
有利なことに、これらのイディオタイプモノクローナル抗体を用いて、以前の方法のバックグラウンドノイズを最小化すること、および、既に酸化型ＭＩＦ結合抗体、例えばＲＡＭ９で処置された患者の組織における酸化型ＭＩＦを高い信頼性で検出することができた。
【０１１５】
本発明のウサギイディオタイプモノクローナル抗体は、酸化型ＭＩＦの結合エピトープを模倣している。該抗体は、それ自体が酸化型ＭＩＦに結合せず、酸化型ＭＩＦ結合一次抗体に結合することにより、シグナル強度を改善する。Ｆａｂ断片を用いる免疫化プロトコールで、かかる特異的な抗体を提供できることは、非常に驚くべきことであった。「特異的結合」は、ＩＣ５０値を介して決定する。中和ＥＬＩＳＡにおいて、６０ ng/ml以上のIC５０を有する場合、抗体は、二次抗体として適当であるとみなす。中和ＥＬＩＳＡは、「二次」ＥＬＩＳＡとして、より詳細に以下に記載する。
【０１１６】
本発明はまた、該二次抗体を提供する方法を開示する。特に、抗酸化型ＭＩＦ抗体のＦａｂ断片を免疫化に用いる。好ましい態様において、ＲＡＭ９の該Ｆａｂ断片をウサギの免疫化に用いる。好ましくは、免疫化は、下記の実施例３に詳述するように行う。免疫化プロトコールは、当業者にはよく知られている。免疫化後、最も高い免疫応答を示す動物を選択する。免疫応答をモニターする好ましい方法は、示差的ＥＬＩＳＡ、特に、下記の一次スクリーニングＥＬＩＳＡである。このＥＬＩＳＡは、例えば、抗酸化型ＭＩＦ抗体と対照品を用いることにより行う。実施例３も参照のこと。標準的なプロトコールにより得たウサギリンパ球を、適当なパートナー細胞と融合させ、適当な、よく知られたクローニングおよびサブクローニング工程を行う (実施例３を参照のこと)。
【０１１７】
好ましくは、一次スクリーニングＥＬＩＳＡを行う。該一次スクリーニングは、抗ＭＩＦ抗体および(陰性対照として)非特異的ヒトアイソタイプおよび/または精製全ヒトＩｇＧを用いる。二次抗体の結合を決定する。一次スクリーニングにおいて、抗ＲＡＭ抗体に対するシグナルが、陰性対照の少なくとも５０倍高い場合、該抗体を適当であるとみなす。
【０１１８】
二次スクリーニングにおいて、一次スクリーニングで適当であるとみなした抗体を、さらに評価する。（ヒト）ＭＩＦを、ＥＬＩＳＡプレートにコーティングする。二次抗体の試料を添加する。次いで、抗酸化型ＭＩＦ抗体の段階希釈液を較正用に用いる。６０ng/ml以下のＩＣ５０を、適当であり、有利であるとみなす。
【０１１９】
本発明の好ましい態様において、組織試料の切片は、２〜１５μｍの厚さを有する
べきである。より好ましい態様において、これらの切片は５〜１０μｍの厚さを有する。好ましい厚さは１０μｍである。
【０１２０】
生検試料は、それ自体を、新鮮凍結または例えばＯＣＴ包埋のいずれかで、当業者に知られている最先端技術にしたがって調製し、上記の厚さを有する切片を調製した。その後の方法の工程および染色手順は、断りのない限り、好ましくは環境温度で行う。
【０１２１】
好ましい態様において、切片を実際の手順を開始する前に２０〜４５分間、好ましくは約３０分間、風乾する。
【０１２２】
本発明のＩＨＣアッセイ法の好ましい態様において、試料、特に組織試料は、固定、特にホルムアルデヒドまたはアセトンのような無機または有機の固定剤または溶媒で固定しない。しかし、任意の態様において、最初の結合前に試料を乾燥させることが可能である。乾燥工程が、試料および、特に、試料に含まれると推定される (酸化型) ＭＩＦの酸化を避けるように行うことができることが特に重要である。風乾は、この要件を満たすことが、本発明者らによって示された。乾燥工程は、例えばアルコール性成分のような酸化的性質を有する乾燥成分なしで行う必要がある。
【０１２３】
特に、本発明者らは、最初の結合工程の前に固定手順を使用しない(任意のブロッキング工程前にも固定しないことを意味する)ことによって、ＭＩＦの酸化を回避することができること；他の手順を使用することによって、ＭＩＦ構造が再配列し、その結果、その後の抗体の酸化型ＭＩＦへの結合において偽陽性をもたらす可能性があることを示すことができた。しかし、試料を、最初の結合工程の前に風乾してよい。
【０１２４】
本発明の結合化合物との特異的な結合のために、好ましくは、上記の一次抗酸化型ＭＩＦ抗体を使用する。これらの抗体は、ビオチン化または他の方法で標識されている必要はない。
【０１２５】
他の態様において、該抗体で処置した患者の組織における抗酸化型ＭＩＦ抗体を直接検出することが可能である。該検出は、当業者に公知のように、この直接的な検出に適用させた本発明の方法にしたがって行う。非限定的な例において、風乾から開始し、次いで固定（例えばホルムアルデヒド）、透過処理、内在性ペルオキシダーゼブロッキング、ブロッキングバッファーを用いたブロッキングおよび、イディオタイプ抗ＲＡＭ９抗体の添加を行う。この態様において、この特定のアッセイを行うために一次抗体を添加する必要がないことは言うまでもないことである。この方法の実施態様として、実施例４を示す。
【０１２６】
本発明の好ましい態様の特異的結合（すなわち、一次抗体と酸化型ＭＩＦの間の結合）の前に、好ましい態様において、非特異的結合をブロックするブロッキング緩衝液を使用してよい。この態様の好都合な選択肢において、ブロッキング緩衝液は、トリス緩衝食塩水(ＴＢＳ)中にヤギ血清、血清アルブミンおよび魚ゼラチンを含み、より好ましい態様において、ＴＢＳ中に２０％ 正常ヤギ血清、２％ 血清アルブミンおよび０.２％ 魚ゼラチンを含む。他の態様において、ブロッキング緩衝液は、ダルベッコリン酸緩衝食塩水(ＤＰＢＳ)中に２０％ 正常ヤギ血清、２％ ウシ血清アルブミンおよびゼラチンを含む。一次抗酸化型ＭＩＦ抗体の特異的な結合工程の前に、ブロッキング緩衝液での試料の処理を、好ましくは、１５〜４５分間行い、非常に好ましくは３０分間行う。ブロッキング緩衝液処理の実施が１５分未満である場合、シグナル／ノイズ比が低下する、すなわち特異的シグナルに対するバックグラウンドシグナルが高くなりすぎることが示されている。
【０１２７】
さらに、好ましい態様において、抗酸化型ＭＩＦ抗体の濃度範囲は、０.３〜２０μg/mlである。特に好都合な抗酸化型ＭＩＦ抗体の濃度範囲は、０.５〜１６μg/mlである。より好ましい抗酸化型ＭＩＦ抗体の濃度範囲は、希釈緩衝液１mlあたり１〜１０μg、より好ましくは１〜５μgである。好ましくは、切片を酸化型ＭＩＦ抗体溶液で完全に覆い、この目的のためには、ほとんどの場合、５００μlの溶液で十分である。
【０１２８】
一次抗酸化型ＭＩＦ抗体を、好ましくは、第１希釈緩衝液で希釈する。好ましい態様において、この第１希釈緩衝液は、ＴＢＳ中にウシ血清アルブミンおよび魚ゼラチンを含み、より好ましい態様において、ＴＢＳ中に２％ ウシ血清アルブミンおよび０.２％ 魚ゼラチンを含む。酸化型ＭＩＦ抗体とのインキュベーションは、好ましくは、３０〜９０分間、より好ましくは５０〜７０分間、非常に好ましくは約６０分間行う。
【０１２９】
結合工程後、過剰の抗体を洗い流すために、好ましい態様では、切片を新しいＴＢＳ(または例えばＤＰＢＳ；洗浄緩衝液)に短時間浸漬するべきである。他の態様において、ブロッキング緩衝液および希釈緩衝液に、ＴＢＳではなくＤＰＢＳを用いている場合、浸漬は、新しいＤＰＢＳで行うべきである。浸漬後、新鮮洗浄緩衝液での洗浄工程は、約５〜１５分間、より好ましい態様では１０分間行うべきである。
【０１３０】
任意であるが、好ましい工程として、ただし、第１結合工程の後にのみ行われるべきであるが、適当な固定溶液、例えばリン酸緩衝ホルムアルデヒド中で、１０〜２５分間、好ましくは１５〜２０分間、検体を固定することが可能である。このホルムアルデヒドによる固定工程は、好ましいものであるが、任意であり、組織構造を維持するのに有用である。この工程は(酸化型)ＭＩＦ構造に負の影響を及ぼさず、偽陽性結果をもたらさない。
【０１３１】
この任意の工程後、過剰のホルムアルデヒドを洗い流すために、再度ＴＢＳ(あるいはＤＰＢＳ)に短時間浸漬することが好ましい；浸漬時間は上に説明した通りであり；その後、それを、５〜１５分間、好ましくは１０分間、新しいＴＢＳ(またはＤＰＢＳ、それぞれ)中でインキュベーションしてよい。
【０１３２】
所望により、次いで、内在性ペルオキシダーゼをブロックする。これは、組織切片を、例えばメタノール中のＨ２Ｏ２、好ましくはメタノール中０.３％のＨ２Ｏ２中で、２０〜３０分間インキュベーションすることによって行い得る。次いで、好ましくは、ＴＢＳ中で５〜１０分間洗浄することによって、過剰のメタノールを除去する。ペルオキシダーゼブロッキング (ＰＢ)は、市販のペルオキシダーゼブロッカー、例えばＤＡＫＯのdual endogenous enzyme blockを用いて行ってよい (例えば実施例４参照)。これらの市販のＰＢを用いる場合、固定後に透過処理工程をさらに行ってよい。可能な実施態様は、ＴＢＳ＋０.２％ TritonX-100中での５分間のインキュベーションである。
【０１３３】
代替の方法は、当業者には公知である。
【０１３４】
検出工程は、イディオタイプ抗体を、反応液に添加することにより行う。該イディオタイプ抗体は、希釈緩衝液中で供給される。濃度は、約０.５μg/mlであるのが好ましい。希釈緩衝液は、一次抗体について上述したものと同じである。好ましいインキュベーション時間は、１５〜４５分間、より好ましくは２０〜４０分間である。他の手法において、直接蛍光標識した、または、例えばペルオキシダーゼ標識したイディオタイプ抗体を用いることも可能である。その後、直接、洗浄および発色（ペルオキシダーゼ標識）工程に進むか、または直接、洗浄およびマウンティング工程（蛍光標識）にすすむことが可能であることは、当業者が認識することである。
【０１３５】
これらの工程後、好ましい態様に従って、適当な染色試薬での染色を行うべきである。この染色は、SignalStain（登録商標） Boost IHC Detection Reagent, Rabbitのような、公知のウサギＩＨＣ検出試薬を用いて行ってよい。あるいは、当業者に知られている他の検出方法が適当である；例えばフルオロフォア標識抗体を（第三の）検出手段として、例えばAlexa Fluor標識抗ウサギ抗体として使用するか、または、二次抗体の蛍光標識により使用し得る。フルオロフォア標識部分での検出は、本発明の内容において、適当であることが本発明者らにより示されている (例えば、実施例２を参照のこと)。これは、実施例３に、変法として、詳細に、しかし一般的に応用可能に記載されている。
【０１３６】
好ましい染色試薬は、SignalStain Boost IHC Detection Reagent, Rabbitである。染色時間は、少なくとも２０分間、好ましくは少なくとも３０分間、非常に好ましい態様において、少なくとも４５分間続けるべきである。
【０１３７】
当業者には公知のことであるが、一次抗体と二次抗体の間の結合を検出するために、適当な三次抗体を用いることも可能である。
【０１３８】
好ましくは、過剰の二次試薬を洗い流すために、再度切片をＴＢＳ(あるいはＤＰＢＳ、上記参照)に短時間浸漬する。その後、好ましい態様において、さらに、５〜１５分間、好ましくは１０分間、新しいＴＢＳまたは新しいＤＰＢＳ中でインキュベーションを行う。
【０１３９】
得られたスライドを、好ましい態様において、基質、例えば発色に適した基質で、当業者によく知られている通り、例えばImmPACT DAB基質を用いて１〜１０分間、好ましくは５分間発色させる。
【０１４０】
その後、好ましい態様において、過剰の基質を洗い流すために、切片をＴＢＳ(またはＤＰＢＳ、上記参照)に浸漬し、次いで５〜１５分間、好ましくは１０分間、新しいＴＢＳまたはＤＰＢＳ中でインキュベーションする。
【０１４１】
上記工程後、好ましくは、核を染色する対比染色工程を行う。免疫組織化学的手順でよく知られている染色試薬は全て、ここで使用できる。好ましい態様において、ヘマトキシリンを用いる。染色を、０.５〜３分間、好ましくは１〜２分間行うべきである。
【０１４２】
その後、過剰の染色試薬を洗い流すために、切片を水道水で濯ぎ、(好ましくは水道水中で再度)短時間浸漬する。その後、任意の態様において、切片を１〜５分間、好ましくは１〜２分間インキュベーションする。インキュベーション時間は多様であり、ヘマトキシリンの場合は、紫色から青色への色の変化が起こる時間に依存する。
【０１４３】
顕微鏡法のために、好ましくは、組織切片を、当業者によく知られている通り、例えば７０％、続いて９０％、そして無水エタノールで、例えばそれぞれ２分間乾燥させ、その後、好ましくは、例えばキシレンで、例えば少なくとも３分間透徹する。他の態様において、乾燥工程を、９６％〜無水エタノールで、２×２０秒間行う。長期間保存のために、切片を、VECTASTAIN Permamountを用いてマウントし、カバーガラスで覆った。乾燥およびマウント工程は、当業者の一般的な知識の範囲である。
【０１４４】
本発明を、さらに、下記の実施例によって説明するが、これは、特許請求の範囲によって決定される本発明の範囲を、決して限定するものではない。
【実施例】
【０１４５】
実施例１：膵臓の浸潤性腺管がん患者由来免疫組織化学(ＩＨＣ)による酸化型ＭＩＦのインサイチュ検出（図１）
６４歳の浸潤性腺管がん由来の生検試料の凍結切片を、業者から入手した。酸化型ＭＩＦの検出を、ＲＡＭ９を用いて、または、ＲＡＭ９を用いずに、抗イディオタイプモノクローナルウサギＲＡＭ９抗体を用いて行った。
【０１４６】
材料および方法
スライドを、専門家に知られた最先端技術に従って、新鮮凍結またはＯＣＴ包埋の何れかで調製し、１０μｍの薄片を作製し、その後≦−８０℃で保存した。その後の工程を全て環境温度で行った。凍結切片を３０分間風乾し、非特異的結合を、ブロッキング緩衝液(ＢＢ：ＴＢＳ中２０％ 正常ヤギ血清／２％ ウシ血清アルブミン／０.２％ 魚ゼラチン)で１５分間ブロックした。次いで、切片を、一次抗体を用いずに、または、一次抗体希釈緩衝液(ＰＡＤＢ：ＴＢＳ中２％ ウシ血清アルブミン／０.２％ 魚ゼラチン)中の抗酸化型ＭＩＦ抗体ＲＡＭ９（濃度２μg/ml）とともに、６０分間インキュベーションした。ＴＢＳで洗浄した後、検体を４％ ＰＢＳ緩衝ホルムアルデヒドで２０分間固定した。ＴＢＳで１０分間洗うことによって、過剰のホルムアルデヒドを除いた。これらの組織切片を、メタノール中の０.３％ Ｈ２Ｏ２中で２０分間インキュベーションすることにより、内在性のペルオキシダーゼをブロックした。ＴＢＳ中で５〜１０分間洗浄することにより、過剰のメタノール/Ｈ２Ｏ２を除いた。ＰＡＤＢ中に１μg/mlに希釈した抗イディオタイプウサギモノクローナル抗体(６８−１)とともに該組織切片を３０分間インキュベーションすることにより、検出を行った。過剰の検出抗体を、ＴＢＳ中で５〜１０分間洗浄することにより除いた。染色を、SignalStain（登録商標）Boost IHC Detection Reagent (HRP conjugated Streptavidin)-Rabbitを用いて３０分間行った。次いで、切片をＴＢＳで再度１０分徹底的に洗浄した。ImmPACT DAB基質を５分間使用することによって、染色を褐色として可視化させた。スライドをＴＢＳで洗浄し、核をヘマトキシリンで１〜２分間対比染色した。スライドを水道水で洗浄することによって、対比染色の色が、紫色から青色に変化する。顕微鏡法のために、組織切片を、９６％、続いて無水エタノールでそれぞれ２ｘ２０秒間乾燥し、その後、キシレンで、少なくとも２分間透徹した。長期保存のために、切片を、VECTASTAIN Permamountを用いてマウントし、カバーガラスで覆った。
【０１４７】
結果
染色が観察されなかった正常な膵臓組織(データは示さない)に比べて、酸化型ＭＩＦは膵臓の浸潤性腺管癌の患者の膵臓で検出され、主にPanIN管構造が染色された(濃灰色染色；すなわち図１Ａの濃灰色)。切片で観察された濃色の構造(すなわち添付の図１Ａの点状)は、細胞の核(ヘマトキシリン染色)である。注目すべきことに、上記の一次検出抗体を用いずに、同じ条件を用いて染色を行ったとき、正常またはがん性膵臓組織の凍結切片で、染色は検出されなかった（図１Ｂ）。
【０１４８】
さらなる研究を行うことによって、本発明者らは、好ましい態様において、厚さ２〜１６μm、または５〜１０μｍの切片が、特に好都合であると決定した。さらに、一次抗酸化型ＭＩＦ抗体の０.５〜１６μg/ml、好ましくは０.５〜５μg/mlの濃度範囲が、特に好都合であることが示された。
【０１４９】
結論
患部臓器、例えば膵臓の浸潤性の腺管癌に罹患している患者の膵臓において、酸化型ＭＩＦは本発明のＩＨＣ法によってインサイチュで検出することができるが、健常な腎臓組織には存在しない。
【０１５０】
実施例２ (図２):
ヒト肺の組織生検試料において、免疫蛍光法により酸化型ＭＩＦのインサイチュ検出を行った。該試料は、６６歳の女性ドナーの正常な肺（図２Ａ）および、６１歳の女性患者の扁平上皮がんより得た（図２Ｂ）。
【０１５１】
手法:
スライドを、専門家に知られた最先端技術にしたがって、新鮮凍結またはＯＣＴ包埋のいずれかで調製し、１０μｍの薄片を作製し、その後≦−８０℃で保存した。以降の工程を全て環境温度で行った。凍結切片を３０分間風乾させ、非特異的結合を、ブロッキング緩衝液(ＢＢ：ＴＢＳ中２０％ 正常ヤギ血清／２％ ウシ血清アルブミン／０.２％ 魚ゼラチン)で２０分間ブロックした。次いで、切片を、一次抗体希釈緩衝液(ＰＡＤＢ：ＴＢＳ中２％ ウシ血清アルブミン／０.２％ 魚ゼラチン)中の、抗酸化型ＭＩＦ抗体ＲＡＭ９（濃度５μg/ml）と、６０分間インキュベーションした。ＴＢＳで洗浄した後、検体を４％ ＰＢＳ緩衝ホルムアルデヒドで２０分間固定した。ＴＢＳ中で５〜１０分間洗浄して、過剰のホルムアルデヒドを除いた。該組織切片を、メタノール中で５分間インキュベーションすることにより透過処理した (あるいは、５〜１０分間 ＰＡＤＢ＋０.２５％ TritonX-100でも可能である)。ＴＢＳ中で５〜１０分間洗浄することにより、過剰のメタノールを除いた (組織切片は乾燥させなかった)。組織切片をＰＡＤＢに１μg/mlに希釈した抗イディオタイプウサギモノクローナル抗ＲＡＭ９抗体とともに３０分間インキュベーションすることにより、ＲＡＭ９の検出を行った。ＴＢＳ中で５〜１０分間洗浄することにより、過剰な検出抗体を除いた。ＰＡＤＢに希釈したAlexa Fluor (登録商標) ５５５ 標識抗ウサギ抗体を２μg/mlで３０分間用いて、染色を行った。次いで、該切片をＰＢＳＴ (ＰＢＳ ＋ ０.１％ Tween20)中で１０分間徹底的に洗浄した。顕微鏡観察のために、該組織切片をProLong (登録商標) Gold Antifade Reagent with DAPI (核対比染色)中でマウントした。
【０１５２】
結果
本発明の方法により、がん組織中では、酸化型ＭＩＦのはっきりとした染色を観察することができた。正常な肺では染色は見られなかった。
【０１５３】
結論
患部臓器、例えば、肺の扁平上皮がんに罹患している患者由来の肺では、本発明のＩＦ技術を用いて、酸化型ＭＩＦをインサイチュ検出することができるが、健常な肺組織には存在しない。
【０１５４】
実施例３
モノクローナルウサギＲＡＭ９抗イディオタイプ抗体の作製
材料および方法
モノクローナルウサギ抗酸化型ＭＩＦ抗体についての免疫化手法
特定のモノクローナルウサギイディオタイプ抗体の作製のために、ウサギを、パパイン消化、次いでPoros Sイオン交換カラム上の精製により作製したＦａｂ断片で免疫化した。純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のクマシー染色により確認した。
【０１５５】
免疫化は、５回の注射を行う標準的な免疫化を用いて行った。
最初の免疫化のために、組換えＲＡＭ９−Ｆａｂ ０.４mgをＣＦＡ (完全フロイントアジュバント)のアリコートと混合した。該動物は、該混合物２００μl (４×５０μl) の皮下投与を受けた。追加免疫を、３週間の間隔で、ＩＦＡ (不完全フロイントアジュバント)を用いて、上記のように、１個体あたり０.２mgの用量を用いて行った。最初の免疫化の前、免疫化と免疫化の間、および最後の追加免疫の後に血清を採取し、一次スクリーニングＥＬＩＳＡにより試験した。最後の追加免疫の後、バルビツレートの静脈内注射によりウサギを人為的に安楽死させた。
【０１５６】
細胞融合
一次スクリーニングＥＬＩＳＡ(ＲＡＭ９ 対 ヒト対照抗体による事前コーティング、ヤギ抗ウサギＩｇＧ/ＨＲＰにより検出)によりモニターされる、最も高い免疫応答を示すウサギについて脾臓摘出を行った。該脾臓を、１％ ペニシリン/ストレプトマイシン/ファンギゾンを含むRPMI 1640を満たした新しいペトリディッシュ中に浸し、数回洗浄して、３mlシリンジの無菌プランジャーを用いて小片に粉砕した。粉砕した脾臓を、２つの１００μm 細胞ストレイナーに通して、リンパ球を細片から分離した。数回の洗浄の後、２x１０８個のウサギリンパ球を、１×１０８個の融合パートナー細胞と融合させ、１融合につき、２０枚の９６ウェルプレートに播種した。
【０１５７】
マルチクローンの作製およびサブクローニング
マルチクローンの上清を、一次スクリーニングＥＬＩＳＡにより、免疫原（ＲＡＭ９）に対して試験した。選択した陽性のマルチクローンを、限界細胞希釈法を用いてサブクローニングした。サブクローンの上清を、上述のように試験した。最適なクローンを、培地スケールの工程において、ウサギ抗ＲＡＭ９抗体の作製に用いた。
【０１５８】
モノクローナルウサギ抗ＲＡＭ９抗体の作製
凍結細胞バイアルから、各ハイブリドーマクローンを、１２５ml 振盪フラスコ中で、２-メルカプトエタノール、ペニシリン/ストレプトマイシンおよび５％ Ultra Low IgG FBSを含む細胞培養培地１５mlに播種し、１２０rpmで振盪することにより、３７℃、５％ ＣＯ２雰囲気でインキュベーションした。培養物を、より大きい体積に増やし、上清を定期的に採取した。
【０１５９】
発酵の最後に、該細胞培養上清を遠心分離して細胞および小片を除いた。０.２μmメンブレンに通して濾過した後、上清を＜−２０℃で保存するか、または、すぐに抗体精製に適用した。
【０１６０】
モノクローナルウサギ抗ＲＡＭ９抗体の精製
抗体を産生するウサギハイブリドーマの細胞培養上清をHiTrap MabSelect Sure column (GE Health care)にアプライした。１０カラム体積の２０mM Ｎａ２ＨＰＯ４バッファー（ｐＨ７.２）で洗浄することにより不純物を除いた。モノクローナル抗ＲＡＭ９抗体の溶出は、１００mM グリシンバッファー (ｐＨ２.８) を用いて低いｐＨ条件で行った。次いで、一工程で精製したモノクローナル抗体をＰＢＳ (ｐＨ７.２) 中で希釈することにより中和し、濃縮し、−２０℃でさらなる試験のために保存した。
【０１６１】
ＨＥＫ２９３細胞における、選択したモノクローナルウサギ抗ＲＡＭ９抗体のクローニングおよび作製
市販のTuboCapture Kit (Qiagen: カタログ72232)を用いて製造者にしたがって、ハイブリドーマ細胞由来のｍＲＮＡを単離した後、オリゴｄＴプライマーを用いてｃＤＮＡに逆転写した。重鎖(ＶＨ)の可変領域をＰＣＲにより増幅した。軽鎖（ＬＣ）全体をＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ断片のＶＨ領域を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎｌを用いて消化した。ＬＣ ＰＣＲ断片を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩを用いて消化した。全ての消化産物を、Qiagen PCR cleaning up kit (カタログ番号28016)を用いて精製した。精製後、ＶＨまたはＬＣ断片を、対応する重鎖もしくは軽鎖発現ベクターにライゲーションし、コンピテント細胞ＤＨ５α(MC Lab, カタログ番号DA-100)に入れて形質転換させた。形質転換したコロニーを採取し、対応する制限酵素を用いて、（予測サイズ：ＶＨについては約４４０bp、およびＬＣについては約７４０bpにより）インサートを確認した。予測サイズのインサートを有するプラスミドを配列決定した (配列番号１５〜１８)。軽鎖および重鎖を、６ウェルプレート中のＨＥＫ２９３細胞に共形質導入した。上清を形質導入４日後に採取し、一次スクリーニングＥＬＩＳＡにおいて、対応する抗原に対して試験した。さらに、ウサギＩｇＧの濃度を決定した。大きいスケールでの作製のために、最適な特異的な産生クローンを選択した。その後、上述のように細胞培養上清を精製した。
【０１６２】
さらに、軽鎖全体または重鎖断片を、対応する発現ベクターから、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩを用いて、対応する発現ベクターから切断し、次いで、Qiagen PCR cleaning up kit (カタログ番号２８０１６)を用いて精製した。該ｃＤＮＡインサートを、ｐｃＤＮＡ３.１プラスミドにクローニングした。
【０１６３】
一次スクリーニングＥＬＩＳＡ
ＲＡＭ９ (標的) および非特異的ヒトアイソタイプおよび/または精製ヒト全ＩｇＧ (陰性対照) を、ＰＢＳ中１μg/mlで、１００μl/ウェルを用いて、マイクロプレート上に固定した。マイクロプレートを、２０％ ＨＳＡ (ヒト血清アルブミン) /ＴＢＳＴ (０.１％ Tween２０を含むＴＢＳ) ２００μlでブロッキングした。全てのインキュベーションの間に洗浄工程を含める。ウサギハイブリドーマ細胞株の細胞培養上清を、これらのマイクロプレートに、３０％ ＨＳＡ/ＴＢＳＴ中で、選択した希釈率でアプライした。抗ＲＡＭ９抗体の結合を、ヤギ抗ウサギＩｇＧ (Ｈ＋Ｌ)−ＨＲＰ検出抗体を用いて検出した。ＴＭＢまたは他の染色小粒ペルオキシダーゼ基質を用いてシグナルを発色させた。特異的な抗体は、陰性対照と比較して、ＲＡＭ９に対して少なくとも５０倍高いシグナルを示した (図３参照)。
【０１６４】
二次スクリーニングＥＬＩＳＡ
マイクロプレートを、ヒトＭＩＦ (１０μg/ml ＰＢＳ、１００μl/ウェル) でコートし、ＰＢＳ中の１.５％ 魚ゼラチン２５０μlでブロッキングした。インキュベーションとインキュベーションの間に洗浄工程(ＰＢＳ ２５０μl/ウェル×４) を含めていた。該試料を、事前に、最終濃度の２倍に(１％ 魚ゼラチン/ＰＢＳ中に)段階希釈し、同等の体積のビオチン化ＲＡＭ９ (３０ng/ml) (１：２希釈に相当するため、ＲＡＭ９の最終濃度は１５ng/ml)と混合した。これらの混合物に、複合体を３０分間形成させた。１％ 魚ゼラチン/ＰＢＳ中のビオチン化ＲＡＭ９の段階希釈 (２５〜０.２ng/ml) を較正に用い、１５ng/ml ビオチン化ＲＡＭ９を陰性対照で用いた(同一の調製物中のビオチン化ＲＡＭ９の最終濃度に相当)。該試料(１００μl/ウェル) を、マイクロプレートに２時間アプライした。該プレート上で捕捉されたビオチン化ＲＡＭ９を、ＨＲＰ共役ストレプトアビジンおよびＴＭＢを、発色性基質を用いて検出した。各ウェルの吸収を、線形回帰により、標準曲線の吸収と関連付け、ng/mlで表す。該試料中のビオチン化ＲＡＭ９について算出した濃度を、陰性対照中のビオチン化ＲＡＭ９について算出した濃度と関連付ける：
(回収％ = (１００％/陰性対照中で測定したビオチン化ＲＡＭ９の濃度) x (試料中の、測定したＲＡＭ９濃度))。
図４に示すように、抗ＲＡＭ９抗体の半数阻害濃度（Half maximal binding inhibition；ＩＣ５０）を、ウサギ抗ＲＡＭ９の対数濃度を、回収％に対してプロットし、可変性の勾配を用いて非線形４−パラメーター曲線フィッティングにより、算出した。
【０１６５】
最終精製工程後、２つの特に見込みのある抗体 (６８−１および５４−５と命名) を上述の二次スクリーニングで再度試験し、ＩＣ５０は、それぞれ、６８−１については、２９.６５に達し、５４-５については５.９５８に達した。図４ｂ参照のこと。
【０１６６】
両方の抗体が、二次検出抗体として非常に適当である。例えば、図１および５に示す浸潤性腺管がんにおける酸化型ＭＩＦのインサイチュ検出を参照のこと。
【０１６７】
実施例４
組織中のＲＡＭ９の検出
１群をＲＡＭ９で処置し、１群を抗体ビヒクルで処置したリンパ性白血病マウスモデル由来のリンパ節を新鮮凍結およびＯＣＴ包埋した。該組織片を１０μmで凍結切片化し、切片作製後、≦-８０℃で保存した。以降の工程は全て環境温度で行った。凍結切片を、４％ ＰＢＳ緩衝ホルムアルデヒドで１５〜２０分間固定した後、３０分間風乾させた。同時に、組織切片を透過処理し、ＴＢＳ＋０.２％ TritonX-100中で５〜１０分間洗浄することにより過剰のホルムアルデヒドを除いた。組織切片をdual endogenous enzyme block (Dako)とともに１０分間インキュベーションすることにより、内在性のペルオキシダーゼをブロックした。過剰なdual endogenous enzyme blockを、ＴＢＳ中で５〜１０分間洗浄することにより除いた。ブロッキング緩衝液 (ＢＢ: ＴＢＳ中 ２０％ 正常ヤギ血清/２％ ウシ血清アルブミン/ ０.２％魚ゼラチン)を１５〜２０分間用いて、非特異的な結合をブロックした。該組織切片をＰＡＤＢに０.５μg/mlに希釈したモノクローナルウサギ抗ＲＡＭ９抗体 (６８−１) と３０分間インキュベーションすることにより、ＲＡＭ９の検出を行った。過剰の検出抗体を、ＴＢＳ中で５〜１０分間洗浄することにより除いた。染色は、PDABに１.６μg/mlに希釈したhighly cross adsorbed goat anti-Rabbit HRP conjugate(Thermo Scientific) を用いて３０分間行った。次いで、切片をＴＢＳで再度１０分間徹底的に洗浄した。DAB基質 (Dako)を５〜１０分間使用することによって、染色を可視化した。スライドをＴＢＳで洗浄し、核をヘマトキシリンで１０秒間〜１分間対比染色した。スライドを水道水で洗浄することによって、対比染色の色が、紫色から青色に変化する。顕微鏡法のために、組織切片を、９６％、続いて無水エタノールでそれぞれ２×２０秒間乾燥させ、その後、キシレンで、約３分間透徹した。長期保存のために、切片を、VECTASTAIN Permamountを用いてマウントし、カバーガラスで覆った。
【０１６８】
結果: 
慢性リンパ性白血病に罹患しているマウス由来のリンパ節のような、疾患状態の器官では、酸化型ＭＩＦに結合したＲＡＭ９ (黒色矢印) は、本発明のＩＨＣ技術を用いてインサイチュ検出し得る(図６Ａ)。ビヒクル処置したマウス由来のリンパ節ではバックグラウンド染色が全く観察されなかった(図６Ｂ)。
【０１６９】
実施例５:
この実施例の目的は、治療介入適用後の悪性組織において、浸透し、集積することのできるＲＡＭ９の量を半定量的に決定すること、および、腫瘍生検試料の２つの連続的なスライドの同じ組織領域における標的（＝酸化型ＭＩＦ）の量を半定量的に決定するために相関させることである。半定量的に決定したＲＡＭ９および酸化型ＭＩＦ（＝標的）の量が互いに等しい場合に、１００％の標的飽和が達成されたことになる。
【０１７０】
動物モデル:
一群をＲＡＭ９で処置し、一群を抗体ビヒクルで処置した慢性リンパ性白血病マウスモデル由来のリンパ節を切除し、急速凍結した。該凍結リンパ節を、ＯＣＴに包埋し、組織マイクロアレイの準備をした (１つの組織片の１群由来の全てのリンパ節)。該組織片は、１０μmの凍結切片とし、切片作製後、≦−８０℃で保存した。
【０１７１】
免疫組織化学的検査:
ＲＡＭ９についての染色を、上述の実施例４に記載の通りに行った。
この方法により、インビボで適用したＲＡＭ９が検出されるが、酸化型ＭＩＦに結合しているＲＡＭ９と、該組織中に集積している遊離のＲＡＭ９は区別されない。
【０１７２】
酸化型ＭＩＦ (標的)の染色:
この方法により、酸化型ＭＩＦに結合したＲＡＭ９および、インビボで適用したが、ＲＡＭ９が未だ結合していない酸化型ＭＩＦ（遊離の酸化型ＭＩＦ）が検出される。外来性のＲＡＭ９を固定していない組織に適用することにより、インビボで適用したＲＡＭ９が未だ結合していない酸化型ＭＩＦが飽和する。外来性ＲＡＭ９の適用後および、組織固定前にすすぐことにより、結合していないＲＡＭ９が検出されることが避けられ、このとき、この免疫組織化学的方法により、酸化型ＭＩＦのみが検出される。
【０１７３】
以降の工程は全て環境温度で行った。凍結切片を３０分間風乾させ、ブロッキング緩衝液 (ＢＢ: ＴＢＳ中２０％ 正常ヤギ血清/２％ ウシ血清アルブミン/０.２％魚ゼラチン) を用いて、非特異的な結合を１５〜２０分間ブロックした。ＰＡＤＢ (ＴＢＳ中、２％ ウシ血清アルブミン/ ０.２％ 魚ゼラチン)中に１μg/mlに希釈したＲＡＭ９とともに該切片を３０分間インキュベーションすることにより、酸化型ＭＩＦを検出した。ＴＢＳ中で５〜１０分間すすぐことにより、過剰なＲＡＭ９を除いた。４％ ＰＢＳ緩衝ホルムアルデヒド中の１５〜２０分間の固定後、組織切片を透過処理しＴＢＳ＋０.２％ TritonX-１００中で５〜１０分間洗浄することにより、過剰のホルムアルデヒドを除いた。該組織切片を、dual endogenous enzyme block (Dako)とともに１０分間インキュベーションすることにより、内在性のペルオキシダーゼをブロックした。過剰のdual endogenous enzyme blockを、ＴＢＳ中で５〜１０分間洗浄することにより除いた。該組織切片を、ＰＡＤＢ中に０.５μg/mlに希釈したモノクローナルウサギ抗ＲＡＭ９抗体とともに３０分間インキュベーションすることにより、ＲＡＭ９の検出を行った。過剰の検出抗体を、ＴＢＳ中で５〜１０分間洗浄することにより除いた。ＰＤＡＢに１.６μg/mlで希釈したhighly cross adsorbed goat anti-Rabbit HRP conjugate (Thermo Scientific) を用いて、３０分間染色を行った。次いで、切片をＴＢＳで再度１０分間、徹底的に洗浄した。DAB Substrate (Dako)を５〜１０分間使用することによって、染色を可視化した。スライドをＴＢＳで洗浄し、核をヘマトキシリンで１０秒間〜１分間対比染色した。スライドを水道水で洗浄することによって、対比染色の色が、紫色から青色に変化する。顕微鏡法のために、組織切片を、９６％、続いて無水エタノールでそれぞれ２×２０秒間乾燥し、その後、キシレンで、約３分間透徹した。長期保存のために、切片を、VECTASTAIN Permamountを用いてマウントし、カバーガラスで覆った。スライド全体を、Olympus slide scanning microscope (VS１２０)によって、２０倍の倍率でスキャンした。
【０１７４】
評価:
デジタルの、スライド像全体を、Definiens Tissue StudioＴＭ V3.6を用いて解析した。該組織領域の印（mark-up）は、手動またはソフトウェアを用いて自動的に付した。壊死および組織ひだの領域は、さらなる解析から除外した。該組織領域に一度印をつけると、該ソフトウェアは、褐色の免疫染色 (酸化型ＭＩＦまたはＲＡＭ９) と青色の対比染色 (ヘマトキシリン)を区別し、組織領域全体における免疫染色領域を算出することができた。ＲＡＭ９についての、算出した染色されている領域（％）を、酸化型ＭＩＦ（標的）染色による、算出された染色されている領域（％）で割ることにより、標的飽和の比率が得られる。
【０１７５】
結果を図８〜９に示す。該方法は、標的飽和を決定するのに非常に適当であり、そのため、該処置を適当なものにし、同時に、処置の成功についての予測を可能にするものである。
【０１７６】
実施例６:
上記実施例５に記載の方法を、進行性の転移性結腸直腸がんの患者より得た生検試料に適用した。該患者は、１０mg/kg ＲＡＭ９で、７ヶ月間毎週処置した。生検試料は、１回目のＲＡＭ９適用よりも前、および、ＲＡＭ９での処置の１ヶ月後、２ヶ月後および６ヶ月後に採取した。該生検試料をＮ２で急速凍結し、ＯＣＴに包埋し、１０μmの薄片を作製した。該凍結切片を、酸化型ＭＩＦおよびＲＡＭ９についての免疫組織化学的な解析に供した。実施例５に記載のように、標的飽和を評価した。上述の実施例に加えて、該生検試料のデジタルイメージ解析の間に、病理学者が腫瘍細胞に印を付けた。したがって、腫瘍細胞、間質（全組織領域−腫瘍細胞領域）および組織領域全体における標的飽和を算出することが可能であった。
【０１７７】
結果:
１０mg/kg ＲＡＭ９を用いた、１週間に１回の患者の処置により、該処置過程における、腫瘍細胞および間質組織におけるＲＡＭ９の集積が引き起こされた。データは、１つのタイムポイントあたりの１人の患者由来の２〜５個の生検試料の、範囲を示すエラーバーを有する平均として表す(図１０を参照のこと)。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
2017503176.tif 000031
【図７Ｂ】
2017503176.tif 000032
【図８】
2017503176.tif 000033
【図９】
2017503176.tif 000034
【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2017503176.tif 000037
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