(57)【要約】  本発明は、Ｃｒｙ１Ｄａがコーンイヤーワーム（ＣＥＷ）、アメリカタバコガ（Helicoverpa zea(Boddie)）に対し活性であるという驚くべき発見に一部関する。深刻な作物損傷を防止するために、トランスジェニック植物においてＣｒｙ１Ｄａを使用する方法が記載される。全長、コア毒素領域またはキメラ型のＣｒｙ１Ｄａを発現するトランスジェニックトウモロコシを使用した、葉およびシルクのバイオアッセイにより、ＣＥＷ幼虫による損傷に対する良好な昆虫防御が示された。
2017516840.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物に対するコーンイヤーワームによる損傷を防除する方法であって、摂食させるために、前記コーンイヤーワームに対しＣｒｙ１Ｄａ殺虫性タンパク質または変異体を与えるステップを含む、方法。
【請求項２】
前記Ｃｒｙ１Ｄａ殺虫性タンパク質または変異体が、植物細胞によって産生され、植物細胞に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｃｒｙ１Ｄａ殺虫性タンパク質または変異体が、稔性の植物体全体によって産生され、稔性の植物体全体に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｃｒｙ１Ｄａ殺虫性タンパク質が、配列番号６と少なくとも９５％同一であるコア毒素領域を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｃｒｙ１Ｄａ殺虫性タンパク質が、配列番号６と少なくとも９９％同一であるコア毒素領域を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記植物が、コーン、ダイズおよびワタからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
非Ｂｔ緩衝区植物、およびＣｒｙ１Ｄａコア毒素を含む殺虫性タンパク質を発現する複数の植物を含む、圃場内の複数の植物であって、前記緩衝区植物が、前記圃場における全ての作物植物のうち４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満または５％未満を占める、複数の植物。
【請求項８】
前記植物が１０エーカー超を占有する、請求項７に記載の複数の植物。
【請求項９】
緩衝区植物が存在しない、請求項７に記載の複数の植物。
【請求項１０】
前記緩衝区植物がブロックまたはストリップ内にある、請求項７に記載の複数の植物。
【請求項１１】
非Ｂｔ緩衝区植物由来の緩衝区種子、およびＣｒｙ１Ｄａを発現することができる複数の種子を含む種子混合物であって、前記緩衝区種子が前記混合物における全ての種子のうち４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満または５％未満を占める、種子混合物。
【請求項１２】
コーンイヤーワーム昆虫に、請求項７から１０に記載の植物のいずれかを摂食させることにより、前記昆虫を防除する方法。
【請求項１３】
植物に対するコーンイヤーワームによる損傷を防除する方法であって、配列番号６を含むコード領域を発現するＤＮＡ配列により植物細胞を形質転換させるステップ、前記形質転換された植物細胞由来の稔性のトランスジェニック植物を再生させるステップ、前記形質転換された植物由来の前記ＤＮＡ配列を有する種子を収集するステップ、前記形質転換された植物の前記種子を生長させるステップ、および前記コーンイヤーワームに、前記ＤＮＡ配列により発現されたタンパク質を摂食させるステップを含む、方法。
【請求項１４】
前記ＤＮＡ配列が、配列番号６と少なくとも９９％同一である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
植物に対するコーンイヤーワームによる損傷を防除する方法であって、配列番号６を含むコード領域を発現する前記形質転換された植物により産生された種子を生長させるステップ、および前記コーンイヤーワームに、前記ＤＮＡ配列により発現されたタンパク質を摂食させるステップを含む、方法。
【請求項１６】
前記ＤＮＡ配列が、配列番号６と少なくとも９９％同一である、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１４年３月２１日出願の米国仮出願第６１／９６８，７０３号の利益を主張する。その開示は、完全に本明細書に明確に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
Ｃｒｙ１Ｄａは、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）の特定の種により産生される既知のデルタエンドトキシンであり、米国特許第５，６９１，３０８号明細書に最初に記載された。より最近には、２つの独立な査読済み論文：Karim et al. (2000)およびFrankenhuyzen (2009)により、コーンイヤーワーム（ＣＥＷ）に対して不活性であることが報告された。その結果として、以下の驚くべき予期しない観察結果は、公表されたこれらの結果に直接反論し、Ｃｒｙ１Ｄａが、この遺伝子が植物において発現している場合、ＣＥＷ幼虫に対し良好な殺虫活性を有することを明確に示す。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、Ｃｒｙ１Ｄａがコーンイヤーワームの幼虫（ＣＥＷ）、アメリカタバコガ（Helicoverpa zea(Boddie)）に対し活性であるという驚くべき発見に一部関する。全長、短縮型およびキメラ型のＣｒｙ１Ｄａを発現するトランスジェニックトウモロコシを使用した、葉およびシルクのバイオアッセイにより、ＣＥＷ幼虫による損傷に対する良好な昆虫防御が示された。さらに驚くべきことは、ＣＥＷ幼虫のトウモロコシシルクの摂食の防御が、Ｃｒｙ１Ｆａを産生する商用植物と比較して、短縮型Ｃｒｙ１Ｄａを発現するトランスジェニック植物でより優れていることが判明したことであった。
【０００４】
ＣＥＷは、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）（Ｂｔ）タンパク質による防除が困難な害虫であり、本発明が、Ｃｒｙ１Ｄａを発現するトランスジェニックトウモロコシが、この昆虫により引き起こされる食害からトウモロコシシルクを防御する生物活性を示すことを最初に記載した観察である。ＣＥＷの成虫のガは、典型的にはコーンシルクに産卵し、新たに発生した幼虫は、穂に侵入する前にコーンシルクを摂食する。したがって、トウモロコシシルクの組織中に昆虫防御剤活性を存在させることで、トウモロコシのこの重大かつ破壊的な有害生物により引き起こされる食害に対し、有意な防御効果がもたらされるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】ＣＥＷ幼虫に曝露された、非形質転換トウモロコシ（Ｂ−１０４）、ＹＦＰ発現トランスジェニックトウモロコシ（１０９８１２）、Ｈｅｒｃｕｌｅｘ１（商標）トウモロコシ（ＨＸ１）、または、全長Ｃｒｙ１Ｄａ（１０９８４０）もしくは短縮型Ｃｒｙ１Ｄａ（１０９８４１）のいずれかを発現するトランスジェニックＴ−１トウモロコシの葉損傷活性パーセントを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
配列の簡単な説明
配列番号１は、ＤＩＧ−９１１コード配列（ＣＤＳ）を有するＤＮＡ断片である。
【０００７】
配列番号２は、ＤＩＧ−９１１タンパク質（Ｃｒｙ１Ｄａのコア毒素セグメント（アミノ酸１〜５９４、ＧＥＮＢＡＮＫ受託番１７６４１５．１および米国特許第５，６９１，３０８号明細書で開示）、ならびにＣｒｙ１Ａｂ由来のプロトキシンセグメント（ＤＩＧ−９１１アミノ酸５９５〜１１３９）からなるＣｒｙ１Ｄａ２／Ｃｒｙ１Ａｂキメラ殺虫性毒素、基本的にＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＡＦＫ７９７９５．１で開示）のアミノ酸配列である。
【０００８】
配列番号３は、ＤＩＧ−１８０コード配列（ＣＤＳ）を有するＤＮＡ断片である。
【０００９】
配列番号４は、ＤＩＧ−１８０（Ｃｒｙ１Ｆａ２）タンパク質である。
【００１０】
配列番号５は、Ｃｒｙ１Ｄａ２コア毒素殺虫性タンパク質（配列番号６）をコードするトウモロコシ最適化コード配列（配列番号５）を含む、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）エントリーベクターｐＤＡＢ１０９８２５である。
【００１１】
配列番号６は、Ｃｒｙ１Ｄａ２コア毒素殺虫性タンパク質である。
【００１２】
配列番号７は、ＡＡＤ−１のプライマーである；表２を参照のこと。
【００１３】
配列番号８は、ＡＡＤ−１のプライマーである。
【００１４】
配列番号９は、ＡＡＤ−１のプローブである。
【００１５】
配列番号１０は、スペクチノマイシン抵抗性遺伝子のプライマーである。
【００１６】
配列番号１１は、スペクチノマイシン抵抗性遺伝子のプライマーである。
【００１７】
配列番号１２は、スペクチノマイシン抵抗性遺伝子のプローブである。
【００１８】
配列番号１３は、トウモロコシインベルターゼ遺伝子のプライマーである。
【００１９】
配列番号１４は、トウモロコシインベルターゼ遺伝子のプライマーである。
【００２０】
配列番号１５は、トウモロコシインベルターゼ遺伝子のプローブである。
【００２１】
詳細な説明
本発明は、Ｃｒｙ１Ｄａがコーンイヤーワーム幼虫（ＣＥＷ）、アメリカタバコガ（Helicoverpa zea(Boddie)）に対し活性であるという驚くべき発見に一部関する。インビトロでの餌バイオアッセイのバイオアッセイ結果から、Ｃｒｙ１Ｄａ／Ｃｒｙ１Ａｂプロトキシンキメラが、ＣＥＷ幼虫に対して有意な成長阻害および死亡率をもたらすことが示された。Ｃｒｙ１Ｄａ殺虫性タンパク質または毒素は、配列番号６に示すコア毒素またはその変異体を含む、任意の殺虫性タンパク質である。このような変異体は、配列番号６に対し少なくとも９５％の配列同一性、好ましくは配列番号６に対し９９％の配列同一性を有する。
【００２２】
短縮型Ｃｒｙ１Ｄａを発現するトランスジェニックトウモロコシを使用した、葉およびシルクのバイオアッセイにより、ＣＥＷ幼虫による損傷に対する良好な昆虫防御が示された。ＣＥＷによる摂食に対する同等の葉防御が、短縮型Ｃｒｙ１Ｄａを発現するトランスジェニックトウモロコシ植物、およびＣｒｙ１Ｆａを発現する市販のＨｅｒｃｕｌｅｘ（登録商標）Ｉ（ＨＸ１）産物の両方で観察された。
【００２３】
驚くべきことに、ＣＥＷ幼虫のトウモロコシシルクの摂食の防御は、ＨＸ１植物と比較して、短縮型Ｃｒｙ１Ｄａを発現するトランスジェニック植物でより優れていることが判明した。短縮型Ｃｒｙ１Ｄａを発現するトランスジェニックトウモロコシ由来のシルク組織を摂食した昆虫は、死亡率（約２５％）となり、これは、ＨＸ１植物由来のシルク組織を摂食した昆虫について観察されたもの（１０％未満）よりも数値的に良好であった。
【００２４】
ＣＥＷは、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）（Ｂｔ）タンパク質による防除が困難な害虫であり、本発明が、Ｃｒｙ１Ｄａを発現するトランスジェニックトウモロコシが、この昆虫により引き起こされる食害からトウモロコシシルクを防御する生物活性を示すことを最初に記載した観察である。ＣＥＷの成虫のガは、典型的にはコーンシルクに産卵し、新たに発生した幼虫は、穂に侵入する前にコーンシルクを摂食する。したがって、トウモロコシシルク組織中に昆虫防御剤活性を存在させることで、トウモロコシのこの重大かつ破壊的な有害生物により引き起こされる食害に対し、有意な防御効果がもたらされるであろう。本発明の配備の選択肢には、ＣＥＷが存在し問題となっている、ダイズおよびコーン生育領域を含む地理的領域において、Ｃｒｙ１Ｄａタンパク質を使用することが含まれる。
【００２５】
本明細書で提示するデータは、Ｈｅｒｃｕｌｅｘ１（登録商標）と比較して、Ｃｒｙ１Ｄａがシルク組織を介してＣＥＷを防除する優れたタンパク質であることを示している。本明細書では、「防除する」および「防除すること」という用語には成長阻害および／または死亡率が含まれる。
【００２６】
Ｃｒｙ１Ｄａ／Ｃｒｙ１Ａｂプロトキシンキメラが、餌昆虫バイオアッセイにおいて、アメリカタバコガ（H. zea）に対し殺虫活性を有することが本明細書で示される。Ｃｒｙ１Ｄａの短縮型をトランスジェニックトウモロコシで発現させると、これによりＣＥＷまたはツマジロクサヨトウ（ＦＡＷ）、Spodoptera frugiperdaのいずれかにより引き起こされる葉およびシルクの食害から植物が防御された。Ｃｒｙ１Ｄａは、ＣＥＷに対しては活性でなく（Karim, 2000）、ＦＡＷに対してのみ活性である（Van Frankenhuyzen, 2009）ことが以前に報告されていたため、これらの結果は驚くべきものである。Ｃｒｙ１Ｄａ殺虫性タンパク質は知られているが、本発明は、植物、特に作物植物に対する深刻なＣＥＷによる損傷を防止するための、新規かつ予期しないＣｒｙ１Ｄの使用である。
【００２７】
アメリカタバコガ（Helicoverpa zea）は幼虫期雑食性を有する。アメリカタバコガは、好ましくは窒素が豊富な生殖構造および生長中の組織、例えばトウモロコシシルク、穂、穂軸および雄穂、綿花および芽、ならびにダイズのさやなどを摂食する。アメリカタバコガは、作物の収量に直接影響を及ぼす植物損傷のため、非常に重大な昆虫（作物に対する有害生物）である。トウモロコシ以外には、Ｃｒｙ１Ｄａは高価値の作物、例えばワタおよびダイズ、ならびにトマトなどの野菜においてこの昆虫種を防除する有用性を有する。
【００２８】
昆虫抵抗性管理（ＩＲＭ）は、害虫が殺有害生物剤に対し抵抗性となる可能性を低下させるために使用される農業技術について記載している。昆虫の抵抗性はトランスジェニック作物におけるＣｒｙ毒素の使用に対し数多くの脅威を与えるため、ＩＲＭは主要な作物植物におけるＣｒｙ毒素の使用に関して非常に重要である。特定のＩＲＭ戦略、例えば高用量および構造的緩衝区（structured refuge）は、昆虫が特定のＣｒｙ毒素に対する抵抗性を発達させる可能性を弱める能力を有する。有効なＩＲＭ技術は、抵抗性発達リスクを低下させることができる。
【００２９】
アメリカ合衆国環境保護庁（ｅｐａ．ｇｏｖ／ｏｐｐｂｐｐｄ１／ｂｉｏｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ／ｐｉｐｓ／ｂｔ＿ｃｏｒｎ＿ｒｅｆｕｇｅ＿２００６．ｈｔｍ）は、そのウェブサイトにおいて、標的有害生物に対し活性である単一のＣｒｙ毒素を産生するトランスジェニック作物とともに使用するための、Ｃｒｙ毒素不含植物から構成される緩衝区を設けるための、以下の必要条件を公開している。
「コーン穿孔虫保護性Ｂｔ（Ｃｒｙ１ＡｂまたはＣｒｙ１Ｆ）コーン産物についての、特定の構造的必要条件は以下の通りである：
−  構造的緩衝区：
コーン地帯では非鱗翅目Ｂｔコーン緩衝区２０％；
ワタ地帯では非鱗翅目Ｂｔ緩衝区５０％
−  ブロック
内部（すなわちＢｔ圃場内）
外部（すなわち、任意交配を最大にするための、Ｂｔ圃場の１／２マイル（可能であれば１／４マイル）以内の独立した圃場）
−  圃場内ストリップ
ストリップは、幼虫の運動の効果を低下させるため、少なくとも４作条幅（好ましくは６作条）でなければならない」
【００３０】
さらに、全米コーン生産者協会も、そのウェブサイト：（ｎｃｇａ．ｃｏｍ／ｉｎｓｅｃｔ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ−ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ−ｆａｃｔ−ｓｈｅｅｔ−ｂｔ−ｃｏｒｎ）において、緩衝区の必要条件に関する同様のガイダンスを提供している。例えば：
「コーン穿孔虫ＩＲＭの必要条件：
−  緩衝区混在地（refuge hybrids）に対してコーン畑の少なくとも２０％に設けること
−  ワタ生産領域においては、緩衝区は５０％でなければならない
−  緩衝区混在地の１／２マイル以内で設けなければならない
−  緩衝区は、Ｂｔ圃場内にストリップとして設けることができる；緩衝区ストリップは少なくとも４作条幅でなければならない
−  緩衝区は、標的昆虫について経済的許容限界に達した場合のみ、従来の殺有害生物剤で処理してよい
−  Ｂｔベースの散布式殺虫剤を緩衝区のコーンに使用することはできない
−  適切な緩衝区を、Ｂｔコーンを有する農場ごとに設けなければならない」
【００３１】
Roush et al.（上掲）および米国特許第６，５５１，９６２号明細書によりさらに論じられる、圃場における各種幾何学的植え付けパターン（上記）およびインバッグ種子混合（in-bag seed mixtures）を含む、緩衝区のＩＲＭ効果をもたらす各種方法が存在する。
【００３２】
昆虫毒素および昆虫に活性な変異体
本明細書で論じられる、具体的に例示される遺伝子およびタンパク質に加え、殺虫活性変異体が含まれる。「変異体」という用語により、出願人らは、断片、特定の欠失および挿入突然変異体、ならびに特定の融合タンパク質を含むことを意図する。Ｃｒｙ１Ｄａタンパク質は、古典的な３ドメインＣｒｙ毒素である。本発明に含まれるＣｒｙ１Ｄａ昆虫毒素の変異体について記載する前置きとして、一般的な３ドメインＣｒｙ毒素およびＣｒｙ１Ｄａ昆虫毒素の構成を簡潔に見直すことが有用であろう。
【００３３】
バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）デルタエンドトキシン結晶タンパク質分子の大半は、２つの機能的セグメントから構成される。プロテアーゼ抵抗性コア毒素は第１のセグメントであり、タンパク質分子の約前半分に相当する。全長約１３０ｋＤａのプロトキシン分子が、昆虫の腸内でプロテアーゼにより抵抗性コアセグメントに急速にプロセシングされる。このプロセシングにより欠失するセグメントを、本明細書では「プロトキシンセグメント」と称する。プロトキシンセグメントは、毒素結晶の形成（Arvidson et al., (1989)）に寄与すると考えられている。したがって、プロトキシンセグメントは、毒素分子のプロテアーゼプロセシングを減少させる（Haider et al., (1986)）か、毒素の溶解性を減少させる（Aronson et al., (1991)）ことにより、コアが昆虫に到達することを制限することで、毒素における部分的昆虫特異性を伝えることができる。Ｂ．ｔ．毒素は、一定の分類内であっても、長さ、およびコア毒素部分からプロトキシン部分へ移行する正確な位置がある程度変化する。コア毒素部分からプロトキシン部分への移行は、典型的には全長毒素の約５０％〜約６０％の間で起こる。
【００３４】
Ｃｒｙ１Ａａ１、Ｃｒｙ２Ａａ１、Ｃｒｙ３Ａａ１、Ｃｒｙ３Ｂｂ１、Ｃｒｙ４Ａａ、Ｃｒｙ４ＢａおよびＣｒｙ８Ｅａ１について、３次元結晶構造が決定されている。コア毒素についてのこれらの構造は著しく類似しており、３つの別個のドメインから構成されている（de Maagd et al., 2003で概説される）。
【００３５】
限られた数のアミノ酸欠失、置換または付加を行うことにより作製される昆虫毒素変異体
例示されるアミノ酸配列に対するアミノ酸欠失、置換および付加を連続的に容易に行うことができ、殺虫活性に対するこのような変異の効果を、バイオアッセイにより試験することができる。変化の数が数において限られるという条件で、このような試験は不当な実験法を伴わない。本発明は、最大１０個、最大１５個または最大２０個のアミノ酸付加、欠失または置換が行われたコア毒素の殺虫活性変異体を含む。
【００３６】
本明細書では、例示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるコア毒素セグメントを有するものを含む、Ｃｒｙ１Ｄａ殺虫活性変異体が含まれる。また、例示される配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％または９４％の同一性を有する類似の活性タンパク質も含まれる。
【００３７】
正式な命名手順に従って、ＣｒｙおよびＢ．ｔ．の命名は、"Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins, " N. Crickmore, D.R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, and D.H. Dean. Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998) Vol 62: 807-813に準拠して、配列同一性約９５％（例えばＣｒｙ１Ｄａ）、７８％（Ｃｒｙ１Ｄ）および４５％（Ｃｒｙ１）の境界に基づいている。
【００３８】
変異体はランダム突然変異を行うことにより作製されてもよく、変異体は設計されてもよい。設計された突然変異体の場合、生物活性に寄与する、または最終的に生物活性に寄与する３次元立体構造の決定に関与する、毒素の不可欠な領域においてアミノ酸の同一性が維持されている場合、天然の毒素に類似の活性を有する変異体が発生する可能性が高い。高い可能性での活性維持は、置換が保存的である場合にも起こる。アミノ酸は、以下の分類に位置付けることができる：非極性、非電荷極性、塩基性および酸性。保存的置換により１つの分類のアミノ酸が同じ種類の別のアミノ酸で置き換えられ、これは変異体の生物活性を著しく変化させる可能性が最も低い。以下は、各分類に属するアミノ酸の例のリストである。
アミノ酸の分類    アミノ酸の例
非極性側鎖        Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ
非電荷極性側鎖    Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ
酸性側鎖          Ａｓｐ、Ｇｌｕ
塩基性側鎖        Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ
β分岐側鎖        Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ
芳香族側鎖        Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ
【００３９】
いくつかの例において、非保存的置換を行うこともできる。不可欠な因子は、これらの置換が毒素の生物活性を有意に損なってはならないことである。変異体は、突然変異誘発によりアミノ酸配列が異なるポリペプチドを含む。本発明に包含される変異体タンパク質は生物的に活性である、つまり天然のタンパク質の望ましい生物活性を引き続き有している、つまり殺有害生物活性を維持している。
【００４０】
配列レベルでは異なるが、同じまたは類似した全体の本質的な３次元構造、表面電荷分布などを維持している変異体タンパク質を設計することもできる。例えば、米国特許第７０５８５１５号明細書；Larson et al., (2002)；Stemmer (1994a, 1994b, 1995)；およびCrameri et al., (1996a, 1996b, 1997)を参照のこと。
【００４１】
核酸
Ｃｒｙ１Ｄａ昆虫毒素をコードする単離された核酸は、本発明の一態様である。これは、配列番号２、配列番号４および配列番号６、およびそれらの補体をコードする核酸、ならびに殺虫活性変異体をコードするその他の核酸の本新規使用を含む。「単離された」により、出願人らは、核酸分子がそれらの天然の環境から取り出され、人の手で異なる環境に置かれたことを意味する。遺伝暗号の冗長性により、様々な異なるＤＮＡ配列が、本明細書で開示されるアミノ酸配列をコードすることができる。同じまたは本質的に同じ毒素をコードするこれらの代替ＤＮＡ配列を作り出すことは、当業者の技術の十分に範囲内である。
【００４２】
本発明のコード配列を、非Ｂ．ｔ．プロモーターを含む異種プロモーターに作動可能に連結させることができる。このような配列は、例えば植物ゲノムにおいて再現性良く存在するようにそれらを含む、発現構築物、形質転換カセットおよび発現カセットに含めることができる。
【００４３】
遺伝子合成
本明細書で記載される改良Ｃｒｙタンパク質をコードする遺伝子を、当技術分野で周知の様々な方法により作製することができる。例えば、合成遺伝子セグメントおよび合成遺伝子を、亜リン酸トリエステルおよびホスホロアミダイト化学反応（Caruthers et al, 1987）により作製することができ、オンデマンドで遺伝子合成を行うために、民間の供給業者を利用することもできる。例えば、制限酵素断片のライゲーション、または重複オリゴヌクレオチドのポリメラーゼ連鎖反応アセンブリーを含む様々な方法で、全長遺伝子を構築することができる（Stewart and Burgin, 2005）。さらに、末端遺伝子の欠失を、部位特異的な末端オリゴヌクレオチドを使用して、ＰＣＲ増幅により作製することができる。
【００４４】
Ｃｒｙ１Ｄａ昆虫毒素をコードする核酸を、例えば、数社の民間の供給業者のいずれかが現在実施している方法による合成構築によって作製することができる（例えば、米国特許第７４８２１１９号明細書を参照のこと）。これらの遺伝子、またはその部分もしくは変異体を、例えば、遺伝子合成機の使用、および例えば米国特許第５３８０８３１号明細書などの設計方法により、合成的に構築することもできる。あるいは、合成のまたは天然に存在する遺伝子の変異を、点突然変異を作製する標準的な分子生物学的技術を使用して容易に構築することができる。これらの遺伝子の断片を、標準的な手順に従って、市販のエキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼを使用して作製することもできる。例えば、Ｂａｌ３１などの酵素または部位特異的突然変異誘発を、これらの遺伝子の末端からヌクレオチドを系統的に切断するために使用することができる。また、活性な毒素断片をコードする遺伝子断片を、様々な制限酵素を使用して得ることができる。
【００４５】
Ｃｒｙ１Ｄａ昆虫毒素のアミノ酸配列が与えられると、所期の宿主にとって好ましいコドンを使用してアミノ酸配列を逆翻訳し、次いで、ノンコーディングリーディングフレームにおける長いオープンコード配列を除去するため、代替のコドンを使用して配列を精製し、問題を引き起こす可能性のある配列を除去し、周期的な終止コドンをもたらすことにより、コード配列を設計することができる。
【００４６】
配列同一性の定量
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するため、配列を最適に比較するため整列させる。２つの配列間の同一性パーセントは、配列に共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、同一性パーセント＝同一な位置の数／位置の総数（例えば、重複している位置）×１００）。一実施形態において、２つの配列は同じ長さである。２つの配列間の同一性パーセントを、ギャップを入れてまたは入れることなく、下記の技術に類似の技術を使用して決定することができる。同一性パーセントの算出において、典型的には正確な一致を計数する。
【００４７】
２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して行うことができる。このようなアルゴリズムの非限定的な例は、Karlin and Altschul (1993)で改変され、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸプログラムに組み込まれる、Altschul et al. (1990)、およびKarlin and Altschul (1990)のアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ検索は、好都合には核またはタンパク質データベースにおいて、クエリー配列に対し相同な（類似の）配列を特定するために使用されてよい。本発明で主張される核酸分子に対し相同性を有するヌクレオチド配列を特定するために、ＢＬＡＳＴＮ検索を行うことができる（スコア＝１００、ワード長＝１２）。本発明で主張される殺虫性タンパク質分子に対し相同性を有するアミノ酸配列を特定するために、ＢＬＡＳＴＸ検索を行うことができる（スコア＝５０、ワード長＝３）。
【００４８】
Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  Altschul et al., (1997)を利用して、比較のためにギャップドアラインメントを得ることができる。あるいは、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを使用して、分子間の遠位の関連を検出する繰り返し検索を行うことができるAltschul et al., (1997)。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、各プログラムのデフォルトパラメータを使用することができる。ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照のこと。
【００４９】
配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの非限定的な例は、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（Thompson et al., (1994)である。ＣｌｕｓｔａｌＷは配列を比較し、アミノ酸またはＤＮＡ配列の全体を整列させ、それにより、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列全体の配列保存についてのデータをもたらすことができる。ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムは、いくつかの市販のＤＮＡ／アミノ酸分析ソフトウェアパッケージ、例えばＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ＳｕｉｔｅのＡＬＩＧＮＸモジュール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）において使用される。アミノ酸配列をＡＬＩＧＮＸを用いて整列させる場合、好都合には、ギャップオープンペナルティ１０、ギャップ伸長ペナルティ０．１およびｂｌｏｓｕｍ６３ｍｔ２比較マトリックスとともにデフォルト設定を使用して、アミノ酸類似性（コンセンサス）パーセントまたは２つの配列間の同一性を評価することができる。ＤＮＡ配列をＡＬＩＧＮＸを用いて整列させる場合、好都合には、ギャップオープンペナルティ１５、ギャップ伸長ペナルティ６．６およびｓｗｇａｐｄｎａｍｔ比較マトリックスとともにデフォルト設定を使用して、２つの配列間の同一性パーセントを評価することができる。
【００５０】
配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの別の非限定的な例は、Myers and Miller (1988)のものである。このようなアルゴリズムは、ｗＥＭＢＯＳＳ配列アラインメントソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／で入手可能）の一部である、ｗＳＴＲＥＴＣＨＥＲプログラムに組み込まれる。ｗＳＴＲＥＴＣＨＥＲは、線形空間を使用する古典的動的プログラミングアルゴリズムの改変を使用して、２つの配列の最適なグローバルアラインメントを算出する。アラインメントを算出するために使用される、置換マトリックス、ギャップ挿入ペナルティおよびギャップ伸長ペナルティが特定されてよい。ヌクレオチド配列を比較するためにｗＳＴＲＥＴＣＨＥＲプログラムを利用する場合、スコアリングマトリックスファイルＥＤＮＡＦＵＬＬとともに、ギャップオープンペナルティ１６およびギャップ伸長ペナルティ４を使用することができる。アミノ酸配列を比較するために使用する場合、ＥＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスファイルとともにギャップオープンペナルティ１２およびギャップ伸長ペナルティ２を使用することができる。
【００５１】
配列の比較に利用される数学的アルゴリズムのさらなる非限定的な例は、配列アラインメントソフトウェアパッケージＧＡＰ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０およびｗＮＥＥＤＬＥ（ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／）に組み込まれる、Needleman and Wunsch (1970)のものである。ＧＡＰ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０を使用し、以下のパラメータを使用して配列同一性または類似性を決定することができる：ヌクレオチド配列については、ＧＡＰウェイト５０およびレングスウェイト３、およびｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリックスを使用して同一性％および類似性％が判明する。アミノ酸配列比較については、ＧＡＰウェイト８およびレングスウェイト２、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングプログラムを使用して同一性％または類似性％が決定される。
【００５２】
ｗＮＥＥＤＬＥは、インプットされた２つの配列を読み取り、それらの全長に沿って最適なアラインメント（ギャップ含む）を検出し、それらの最適なグローバル配列アラインメントをファイルに書き込む。アルゴリズムは、可能性のある各残基またはヌクレオチドの一致の値を含む．ａスコアリングマトリックスを使用して、全ての可能性のあるアラインメントを探索し、最良のものを選択する。ｗＮＥＥＤＬＥは、アラインメントのスコアが、整列させた配列における開始および伸長ギャップから生じるペナルティを差し引いた、スコアリングマトリックスから取られた一致の合計に等しい、最大に可能性のあるスコアを有するアラインメントを検出する。置換マトリックスおよびギャップ開始および伸長ペナルティは、ユーザー指定である。アミノ酸配列を比較する場合、デフォルトのギャップオープンペナルティ１０、ギャップ伸長ペナルティ０．５およびＥＢＬＯＳＵＭ６２比較マトリックスを使用する。ｗＮＥＥＤＬＥを使用してＤＮＡ配列を比較する場合、ギャップオープンペナルティ１０、ギャップ伸長ペナルティ０．５およびＥＤＮＡＦＵＬＬ比較マトリックスを使用する。
【００５３】
同等のプログラムを使用してもよい。「同等のプログラム」により、ＡＬＩＧＮＸ、ｗＮＥＥＤＬＥまたはｗＳＴＲＥＴＣＨＥＲにより生じる対応するアラインメントと比較すると、問題の任意の２つの配列について、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の一致および同一の配列同一性パーセントを有するアラインメントを生じる、任意の配列比較プログラムが意図される。同一性％は、報告された整列した領域（鎖長における任意のギャップを含む）にわたる、２つの配列間の完全な一致のパーセンテージであり、類似性％は、報告された整列させた領域（鎖長における任意のギャップを含む）にわたる、２つの配列間の一致のパーセンテージである。
【００５４】
アラインメントを目視により手入力で行ってもよい。
【００５５】
組換え宿主
本発明の昆虫毒素コード遺伝子を、多様な微生物または植物宿主に導入することができる。昆虫毒素遺伝子を発現させることにより、直接的または間接的に、殺有害生物性タンパク質の細胞内産生および維持がもたらされる。適切な微生物宿主、例えばシュードモナス属（Pseudomonas）を用いて、微生物を、微生物が増殖し摂食される有害生物環境に対し施用することができる。結果は有害生物の防除である。あるいは、昆虫毒素遺伝子を保有する微生物を、毒素の活性を長引かせ、細胞を安定化させる条件下で処理することもできる。毒性活性を維持している処理された細胞を、次いで、標的有害生物の環境に対し施用することができる。本発明の植物由来の非再生／非全能性植物細胞（本発明のＣｒｙ毒素遺伝子の少なくとも１種を含む）が本発明に含まれる。
【００５６】
Ｂ．ｔ．毒素遺伝子を適切なベクターにより微生物宿主に導入し、前記宿主を生きた状態で環境に施用する場合、特定の宿主微生物を使用することが不可欠である。１つまたは複数の対象の作物の「植物圏」（phytosphere）（葉面、葉圏、根圏および／または根面）を占有することが知られている微生物宿主が選択される。これらの微生物は、特定の環境（作物およびその他の昆虫生息地）において野生型の常在性微生物と競合して勝つことができ、ポリペプチド殺有害生物剤を発現する遺伝子の安定な維持および発現をもたらし、望ましくは、環境による分解および不活性化からの殺有害生物剤の防御の改善をもたらすように選択される。
【００５７】
多数の微生物が、多様な重要な作物の葉面（植物の葉表面）および／または根圏（植物根を取り巻く土壌）に生息することが知られている。これらの微生物には、細菌、藻類および菌類が含まれる。特に興味深いのは、細菌、例えばシュードモナス属（Pseudomonas）、エルウィニア属（Erwinia）、セラチア属（Serratia）、クレブシエラ属（Klebsiella）、キサントモナス属（Xanthomonas）、ストレプトマイセス属（Streptomyces）、リゾビウム属（Rhizobium）、シノリゾビウム属（Sinorhizobium）、ロドシュードモナス属（Rhodopseudomonas）、メチロフィラス属（Methylophilius）、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）、アセトバクター属（Acetobacter）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、アルスロバクター属（Arthrobacter）、アゾトバクター属（Azotobacter）、ロイコノストック属（Leuconostoc）およびアルカリゲネス属（Alcaligenes）；菌類、特に酵母、例えばサッカロマイセス属（Saccharomyces）、クリプトコッカス属（Cryptococcus）、クリベロマイセス属（Kluyveromyces）、スポロボロマイセス属（Sporobolomyces）、ロドトルラ属（Rhodotorula）およびアウレオバシジウム属（Aureobasidium）などの微生物である。特に興味深いのは、植物圏の細菌種、例えばシュードモナス・シリンゲ（Pseudomonas syringae）、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）、セラチア・マルセセンス（Serratia marcescens）、アセトバクター・キシリナム（Acetobacter xylinum）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter）、ロドシュードモナス・スフェロイデス（Rhodopseudomonas spheroides）、キサントモナス・カンペストリス（Xanthomonas campestris）、シノリゾビウム・メリロティ（Sinorhizobium meliloti）（正式にはリゾビウム・メリロティ（Rhizobium meliloti））、アルカリゲネス・ユートロファス（Alcaligenes eutrophus）およびアゾトバクター・ビネランジー（Azotobacter vinelandii）；ならびに植物圏の酵母種、例えばロドトルラ・ルブラ（Rhodotorula rubra）、Ｒ．グルチニス（R. glutinis）、Ｒ．マリナ（R. marina）、Ｒ．アウランティアカ（R. aurantiaca）、クリプトコッカス・アルビダス（Cryptococcus albidus）、Ｃ．ジフルエンス（C. diffluens）、Ｃ．ラウレンティ（C. laurentii）、サッカロマイセス・ロゼイ（Saccharomyces rosei）、Ｓ．プレトリエンシス（S. pretoriensis）、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）、スポロボロマイセス・ロセウス（Sporobolomyces roseus）、Ｓ．オドルス（S. odorus）、クリベロマイセス・ベロナエ（Kluyveromyces veronae）およびアウレオバシジウム・プルランス（Aureobasidium pollulans）などである。特に興味深いのは、色素性微生物である。
【００５８】
害虫の防除方法
トランスジェニック植物での発現、製剤化したタンパク質組成物、散布可能なタンパク質組成物、ベイトマトリックスまたはその他の送達系を介して送達される有効量の毒素に昆虫が接触すると、結果として典型的には昆虫が死亡するか、毒素を昆虫に与える供給源を昆虫が摂食しない。
【００５９】
本発明のタンパク質毒素を、様々な方法で、標的昆虫と接触させるために「施用する」または与えることができる。例えば、トランスジェニック植物（タンパク質が植物により産生され、植物中に存在する）が使用可能であり、当技術分野で周知である。毒素遺伝子の発現は、植物の特定の組織、例えば根、葉などにおいて選択的に実現することも可能である。これは、例えば組織特異的なプロモーターの使用によって行うことができる。噴霧式施用は別の例であり、当技術分野で既知でもある。本発明のタンパク質を、望ましい最終用途のために適切に製剤化し、次いで、寄生が発見される前、標的昆虫が発見された後、前後両方などに、植物に対しおよび／または植物周辺に／防御されるべき植物付近に散布する（または別の方法で施用する）ことができる。例えばベイト粒剤も使用可能であり、当技術分野で既知である。
【００６０】
トランスジェニック植物
本発明のタンパク質を、害虫による損傷から任意の種類の植物を実際に防御するために使用することができる。このような植物の例には、数例を挙げれば、トウモロコシ、ヒマワリ、ダイズ、ワタ、キャノーラ、イネ、モロコシ、コムギ、オオムギ、野菜、観賞植物、コショウ（トウガラシ含む）、テンサイ、果実および芝生が含まれる。植物を形質転換させる方法は当技術分野で周知であり、例示的な形質転換方法を実施例に記載する。
【００６１】
本発明の好ましい一実施形態は、本発明の殺虫性タンパク質またはその変異体をコードする遺伝子による植物の形質転換である。形質転換された植物の細胞内に、防除量の本発明の殺虫性タンパク質またはその変異体が存在するおかげで、形質転換された植物は、昆虫標的有害生物による攻撃に対し抵抗性である。Ｂ．ｔ．殺虫性毒素の殺虫特性をコードする遺伝子材料を、特定の害虫に摂食される植物のゲノムに組み込むことにより、成虫または幼虫が食用植物を消費した後死亡する。単子葉類および双子葉類の数多くのメンバーが形質転換されてきた。トランスジェニック農作物ならびに果実および野菜が商業上興味深い。このような作物には、トウモロコシ、イネ、ダイズ、キャノーラ、ヒマワリ、アルファルファ、モロコシ、コムギ、ワタ、ピーナッツ、トマト、ジャガイモなどが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの技術が、外部の遺伝子材料を植物細胞に導入するために、かつ導入された遺伝子を安定に維持し発現する植物を得るために存在する。このような技術には、微粒子にコーティングされた遺伝子材料を、直接細胞へと加速させることが含まれる（米国特許第４９４５０５０号明細書および米国特許第５１４１１３１号明細書）。アグロバクテリウム（Agrobacterium）技術を使用して植物を形質転換してよい。米国特許第５１７７０１０号明細書、米国特許第５１０４３１０号明細書、欧州特許第０１３１６２４号明細書、欧州特許出願第１２０５１６号明細書、欧州特許第１５９４１８号明細書、欧州特許出願第１７６１１２号明細書、米国特許第５１４９６４５号明細書、米国特許第５４６９９７６号明細書、米国特許第５４６４７６３号明細書、米国特許第４９４０８３８号明細書、米国特許第４６９３９７６号明細書、欧州特許出願第１１６７１８号明細書、欧州特許出願第２９０７９９号明細書、欧州特許出願第３２０５００号明細書、欧州特許出願第６０４６６２号明細書、欧州特許出願第６２７７５２号明細書、欧州特許出願第０２６７１５９号明細書、欧州特許出願第０２９２４３５号明細書、米国特許第５２３１０１９号明細書、米国特許第５４６３１７４号明細書、米国特許第４７６２７８５号明細書、米国特許第５００４８６３号明細書および米国特許第５１５９１３５号明細書を参照のこと。その他の形質転換技術には、ＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）技術が含まれる。米国特許第５３０２５２３号明細書および米国特許第５４６４７６５号明細書を参照のこと。エレクトロポレーション技術も、植物を形質転換させるために使用されてきた。国際公開第８７／０６６１４号パンフレット、米国特許第５４７２８６９号明細書、米国特許第５３８４２５３号明細書、国際公開第９２０９６９６号パンフレットおよび国際公開第９３２１３３５号パンフレットを参照のこと。形質転換についてのこれらの特許および公報の全てが、参照により組み込まれる。植物を形質転換させるための数多くの技術に加えて、外部の遺伝子と接触する組織の種類も変化させることができる。このような組織は、胚形成組織、カルス組織タイプＩおよびＩＩ、胚軸、分裂組織などを含むが、これらに限定されない。ほぼ全ての植物組織を、当業者の技術の範囲内の適切な技術を使用して脱分化中に形質��換することができる。
【００６２】
Ｃｒｙ１Ｄａ殺虫性毒素をコードする遺伝子を、上記の、当技術分野で周知の様々な技術を使用して植物細胞に挿入することができる。例えば、形質転換された微生物細胞の選択を可能にするマーカー、および大腸菌（Escherichia coli）において機能する複製系を含む多数のクローニングベクターが、高等植物に挿入するための外部遺伝子を調製および改変するのに利用可能である。このような操作には、例えば、意図される使用にとって望ましい、突然変異の挿入、トランケーション、付加または置換が含まれていてよい。ベクターは、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ系、Ｍ１３ｍｐ系、ｐＡＣＹＣ１８４などを含む。したがって、Ｃｒｙタンパク質または変異体をコードする配列を、適切な制限部位でベクターに挿入することができる。生じたプラスミドを大腸菌（E. coli）の形質転換に使用し、その細胞を適切な栄養培地で培養し、次いで収集し、実用的な量のプラスミドが回収されるように溶解させる。配列分析、制限断片分析、電気泳動およびその他の生化学−分子生物的方法が、分析方法として一般的に実施される。各操作後、使用したＤＮＡ配列を切断し、次のＤＮＡ配列に連結させることができる。操作された各ＤＮＡ配列を、同じまたはその他のプラスミドにクローニングすることができる。
【００６３】
植物細胞の形質転換のためのＴ−ＤＮＡ含有ベクターの使用が、欧州特許出願第１２０５１６号明細書；Lee and Gelvin (2008)、Fraley et al., (1986)、およびAn et al., (1985)で集中的に研究され、十分に記載されており、圃場において十分に確立されている。
【００６４】
一旦、挿入されたＤＮＡが植物ゲノムに組み込まれると、ＤＮＡは次世代にわたって比較的安定である。植物細胞を形質転換させるために使用されるベクターは、通常、除草剤または抗生物質、例えばとりわけ、ビアラホス、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシンまたはハイグロマイシンなどに対する抵抗性を、形質転換された植物細胞に付与するタンパク質をコードする、選択可能なマーカー遺伝子を含む。したがって、個別に使用される選択可能なマーカー遺伝子は、形質転換された細胞の選択を可能にするべきであり、一方、挿入されたＤＮＡを含まない細胞の増殖は選択的化合物により抑制される。
【００６５】
ＤＮＡを宿主植物細胞に挿入するために、多数の技術が利用可能である。これらの技術には、形質転換剤としてのアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）により送達されるＴ−ＤＮＡによる形質転換が含まれる。さらに、植物プロトプラストと、送達されるべきＤＮＡを含むリポソームとの融合、ＤＮＡの直接注射、パーティクルガン形質転換（微粒子銃）またはエレクトロポレーション、およびその他の可能性のある方法が使用されてよい。
【００６６】
本発明の好ましい一実施形態において、植物は、タンパク質コード領域のコドン使用が植物に最適化された遺伝子により形質転換される。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５３８０８３１号明細書を参照のこと。また、有利には、短縮型毒素をコードする植物が使用される。短縮型毒素は、典型的には全長毒素の約５５％〜約８０％をコードする。植物において使用するための合成Ｂ．ｔ．遺伝子を作り出す方法は、当技術分野で既知である（Stewart 2007）。
【００６７】
形質転換技術に関わらず、遺伝子は好ましくは、ベクターに植物プロモーターを含めることにより植物細胞においてＢ．ｔ．殺虫性毒素遺伝子および変異体を発現するように適合させた、遺伝子導入ベクターに組み込まれる。植物プロモーターに加えて、様々な起源由来のプロモーターを、外部の遺伝子を発現させるために、植物細胞において効率的に使用することができる。例えば、細菌由来のプロモーター、例えばオクトピンシンターゼプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、マンノピンシンターゼプロモーター；ウイルス由来のプロモーター、例えばカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓおよび１９Ｓプロモーターなどが使用可能である。植物プロモーターには、リブロース−１，６−ビスリン酸（ＲＵＢＰ）カルボキシラーゼ小サブユニット（ｓｓｕ）、β−コングリシニンプロモーター、ファゼオリンプロモーター、ＡＤＨ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、熱ショックプロモーター、ＡＤＦ（アクチン脱重合因子）プロモーター、および組織特異的なプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。プロモーターは、転写効率を改善しうる特定のエンハンサー配列エレメントも含んでいてよい。典型的なエンハンサーは、ＡＤＨ１−イントロン１およびＡＤＨ１−イントロン６を含むが、これらに限定されない。構成的プロモーターが使用されてもよい。構成的プロモーターは、ほぼ全ての細胞の種類においてほぼ常に、持続的な遺伝子発現を誘導する（例えば、アクチン、ユビキチン、ＣａＭＶ３５Ｓ）。組織特異的なプロモーターは、特定の細胞または組織の種類、例えば葉または種子などにおける遺伝子発現に寄与し（例えば、ゼイン、オレオシン、ナピン、ＡＣＰ（アシル輸送タンパク質））、これらのプロモーターが使用されてもよい。特定の植物組織および器官において活性なだけでなく、植物の発育における特定の段階の間活性なプロモーターも使用可能である。このようなプロモーターの例には、根において特異的な、花粉において特異的な、胚において特異的な、コーンシルクにおいて特異的な、綿花において特異的な、種子胚乳において特異的な、師部において特異的なプロモーターなどを含むが、これらに限定されない。
【００６８】
特定の状況下では、誘導性プロモーターを使用することが望ましい場合がある。誘導性プロモーターは、特定のシグナル、例えば：物理的刺激（例えば熱ショック遺伝子）；光（例えばＲＵＢＰカルボキシラーゼ）；ホルモン（例えばグルココルチコイド）；抗生物質（例えばテトラサイクリン）；代謝物；およびストレス（例えば干ばつ）などに対し反応することで遺伝子の発現に寄与する。植物において機能するその他の望ましい転写および翻訳エレメント、例えば５’非翻訳リーダー配列、ＲＮＡ転写終結配列およびポリアデニル酸付加シグナル配列などを使用してもよい。数多くの植物特異的な遺伝子導入ベクターが当技術分野で既知である。
【００６９】
昆虫抵抗性（ＩＲ）形質を含むトランスジェニック作物は、北米中のコーンおよびワタ植物に普及しており、これらの形質の使用は全世界に広まっている。ＩＲおよび除草剤耐性（ＨＴ）形質を組み合わせた市販のトランスジェニック作物が、多数の種子会社により開発されている。これらは、Ｂ．ｔ．殺虫性タンパク質により付与されるＩＲ形質、ならびにＨＴ形質、例えば、スルホニル尿素、イミダゾリノン、トリアゾロピリミジン、スルホンアニリドなどのアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）阻害剤、ビアラホス、グルホシネートなどのグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）阻害剤、メソトリオン、イソキサフルトールなどの４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）阻害剤、グリホサートなどの５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）阻害剤、およびハロキシホップ、キザロホップ、ジクロホップなどのアセチル−補酵素Ａカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）阻害剤に対する耐性などの組み合わせを含む。遺伝子導入によりもたらされるタンパク質が、除草剤化学的分類、例えばフェノキシ酸除草剤およびピリジルオキシアセテートオーキシン除草剤（国際公開第２００７／０５３４８２号パンフレットを参照のこと）、またはフェノキシ酸除草剤およびアリールオキシフェノキシプロピオネート除草剤（国際公開第２００５１０７４３７パンフレットを参照のこと）に対する植物耐性を与える、その他の例が知られている。ＩＲ形質により多数の有害生物問題を防除する能力は、有益な市販製品コンセプトであり、昆虫防除形質および雑草防除形質を同じ植物において組み合わせた場合、この製品コンセプトの利便性が増強される。さらに、例えば本発明のＩＲ形質などの、Ｂ．ｔ．殺虫性タンパク質により付与されるＩＲ形質を、例えば上記のＨＴ形質などの１種または複数のさらなるＨＴ形質、さらに１種または複数のさらなるインプット形質（例えば、Ｂ．ｔ．由来のまたはその他の殺虫性タンパク質により付与されるその他の昆虫抵抗性、ＲＮＡｉなどの機構により付与される昆虫抵抗性、疾患抵抗性、ストレス耐性、窒素利用の改善など）、またはアウトプット形質（例えば高い油含量、健康的な油組成、栄養性の改善など）と単一の植物で組み合わせることにより、価値の改善が得られる可能性がある。このような組み合わせを、従来の育種（育種スタック）により、または一緒に、多数の遺伝子の同時導入を伴う新規の形質転換事象として（分子スタック）得ることができる。利益は、害虫を管理する能力、ならびに生産者および／または消費者に副次的利益をもたらす、作物植物における雑草防除の改善を含む。したがって、本発明は、数々の農学的問題を柔軟にかつコスト効率よく抑止する能力を有する、作物品質を改善した完全な農学的パッケージをもたらすため、その他の形質と組み合わせて使用することができる。
【００７０】
本明細書で言及されるまたは引用される全ての特許、特許出願、仮出願および公報が、本明細書で明確に教示されていることと矛盾しない範囲で、その全体にわたって参照により組み込まれる。
【００７１】
具体的に示されないまたは示唆されない限り、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」という語は、本明細書では「少なくとも１つの」を意味する。
【００７２】
以下は、本発明を実施する手順を例示する実施例である。これらの実施例は限定的なものとして解釈されるべきではない。別に指定されない限り、全てのパーセンテージは重量により、全ての溶媒混合比は体積による。全ての温度はセルシウス度である。
【実施例１】
【００７３】
ＤＩＧ−９１１およびＤＩＧ−１８０をコードするプラスミドの構築および細菌宿主における発現
ＤＩＧ−９１１タンパク質（Ｃｒｙ１Ｄａ２／Ｃｒｙ１Ａｂキメラ殺虫性毒素；配列番号２）は、Ｃｒｙ１Ｄａ（アミノ酸１〜５９４、ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号１７６４１５．１および米国特許第５，６９１，３０８号明細書で開示）のコア毒素セグメント、およびＣｒｙ１Ａｂ（ＤＩＧ−９１１アミノ酸５９５〜１１３９）、基本的にＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＡＦＫ７９７９５．１で開示）由来のプロトキシンセグメントからなる。その他のＣｒｙまたはＶｉｐ殺虫性毒素と組み合わせたＣｒｙ１Ｄａコア毒素セグメントの使用については、米国特許出願公開第２０１３０００７９２３、２０１２０３３１５９０、２０１２０３３１５８９および２０１２０３１７６８１号明細書で以前に開示されているが、コーンイヤーワーム（ＣＥＷ；Helicoverpa zea(Boddie)）を防除するためのＣｒｙ１Ｄａ殺虫性タンパク質の使用については考慮されていない。
【００７４】
別に示されない限り、この実施例および後続の実施例に記載される分子生物学的および生化学的操作は、例えば、Sambrook et al., eds. (1989 and updates, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.)、Ausubel et al., eds. (1995 and updates, Current Protocols in Molecular Biology. Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York)およびHarlow & Lane, eds. (1988, and updates, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY)で開示される標準的な方法論により行った。ＤＩＧ−９１１およびＤＩＧ−１８０（すなわちＣｒｙ１Ｆａ２；配列番号４）タンパク質を産生するように操作したシュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）（Ｐｆ）発現プラスミドの構築には、標準的なクローニング方法を使用した。プラスミド調製は、供給業者の低コピープラスミド単離説明書に従い、ＮＵＣＬＥＯＳＰＩＮ  ＰＬＡＳＭＩＤ  ＫＩＴ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ  Ｉｎｃ、Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ、ＰＡ）を使用して行った。
【００７５】
基本的なクローニング戦略は、それぞれ配列番号１および配列番号３で示されるＤＩＧ−９１１またはＤＩＧ−１８０コード配列（ＣＤＳ）を有するＤＮＡ断片を、ＳｐｅＩまたはＸｂａＩ、およびＸｈｏＩまたはＳａｌＩ制限部位でｐＤＯＷ１１６９にサブクローニングすることを伴い、それによりＤＩＧ−９１１およびＤＩＧ−１８０ＣＤＳが、プラスミドｐＫＫ２２３−３（ＰＬ  ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）由来のＰｔａｃプロモーターおよびｒｒｎＢＴ１Ｔ２ターミネーターの発現制御下に置かれた。ｐＤＯＷ１１６９は、ＲＳＦ１０１０複製起点およびｐｙｒＦ遺伝子を有する中型コピープラスミドである（米国特許第７，６１８，７９９号明細書）。タンパク質コード領域配列を含むＤＮＡ断片が、ｐＤＯＷ１１６９配列内に存在するリボソーム結合部位下流の制限部位でｐＤＯＷ１１６９ＤＮＡにクローニングされるか、あるいは、独立したリボソーム結合部位が、タンパク質コード領域上流のコード領域断片上に存在する配列として導入されてもよい。発現プラスミドｐＤＯＷ２８４８（ＤＩＧ−９１１）のＤＮＡを、エレクトロポレーションによりＤＣ４５４細胞（突然変異ΔｐｙｒＦおよびｌｓｃ：：ｌａｃＩＱＩを有するほぼ野生型のＰ．フルオレセンス（P. fluorescens）株）に形質転換し、ｐＤＡＢ１８１７ＤＮＡ（ＤＩＧ−１８０）をＭＢ２１４細胞に形質転換した）。形質転換した細胞を、ＳＯＣ−Ｓｏｙ加水分解物培地中で回復させ、次いで、選択培地（ウラシルを欠乏させたＭ９グルコース寒天または適切な濃度でテトラサイクリンを含むＬＢ培地；Sambrook et al.、上掲）にプレーティングした。Ｐ．フルオレセンス（P. fluorescens）についての微生物学的操作の詳細は、参照により本明細書に組み込まれるSquires et al. (2004)、米国特許第７，９８５，５６４号明細書、米国特許第７，６８１，７９９号明細書および米国特許出願第２００８００５８２６２号明細書で入手可能である。組換えコロニーを、ミニプレッププラスミドＤＮＡの制限消化により特定した。
【００７６】
振とうフラスコにおける増殖および発現分析
特性決定および昆虫バイオアッセイのためのＤＩＧ−９１１およびＤＩＧ−１８０タンパク質産生を、振とうフラスコで増殖させたＰ．フルオレセンス（P. fluorescens）株ＤＰｆ１５０（プラスミドｐＤＯＷ２８４８保有）または株Ｄｐｆ１２９（プラスミドｐＤＡＢ１８１７保有）により行った。１％グルコースおよび微量元素を添加したＭ９培地で増殖させた種培養物を、５％グリセロール含有合成最少培地（ＴＥＫＮＯＶＡ  Ｃａｔ．＃３Ｄ７４２６、Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ、ＣＡ）５０ｍＬに播種するために使用した。振とうしながら３０℃で２４時間、最初にインキュベートした後、Ｐｔａｃプロモーターを介したＤＩＧ−９１１またはＤＩＧ−１８０遺伝子の発現を、イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加により誘導した。誘導時、および誘導後各時間に培養物を採取した。細胞密度を、６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ６００）により測定した。例えば、Huang et al. (2007, Prot)に記載される、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）の増殖に適切なその他の培養培地を利用してもよい。
【００７７】
振とうフラスコ試料の細胞分画およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
各試料採取時に、２ｍＬ分量を５分間１４０００ｘｇで遠心分離し、細胞ペレットを−８０℃で保管した。タンパク質抽出については、ペレットを解凍し、ｐＨ７．２のリン酸緩衝液０．５ｍＬ中に懸濁させた。２０ユニットを一定に排出する直径１／８インチのマイクロチップを使用する、ＢＲＡＮＳＯＮ２５０  ＳＯＮＩＦＩＥＲ（ＢＲＡＮＳＯＮ  ＵＬＴＲＡＳＯＮＩＣＳ、Ｄａｎｂｕｒｙ  ＣＴ）を使用したソニケーションにより、細胞を溶解させた。４５秒のバーストを２回、バースト間に氷上で試料を数分間冷却しながら使用した。１４，０００ｒｐｍで５分間、微量遠心管中で遠心分離することによりライセートを分画した後、上清（可溶性画分）を除去し、ペレットをリン酸緩衝液０．５ｍｌ中で懸濁させた（不溶性画分）。
【００７８】
試料を、β−メルカプトエタノールを含む４Ｘ  Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液（Sambrook et al., supra）と１：３で混合し、ＮＯＶＥＸ（登録商標）４〜２０％トリスグリシンＳＤＳポリアクリルアミドゲル（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）にローディングする前に５分間煮沸した。トリスグリシンＮＯＶＥＸ（登録商標）泳動緩衝液（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）中で電気泳動を行った。製造業者の（ＢＩＯ−ＲＡＤ  Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）プロトコルに従い、ＢＩＯ−ＳＡＦＥクーマシーステインを用いてゲルを染色した。
【００７９】
封入体の調製
Ｃｒｙタンパク質封入体（ＩＢ）調製を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＭＡＬＤＩ−ＭＳ（マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析）により示される、不溶性Ｂ．ｔ．殺虫性タンパク質を産生する、Ｐ．フルオレセンス（P. fluorescens）発酵物由来の細胞において行った。Ｐ．フルオレセンス（P. fluorescens）発酵ペレットを、３７℃のウォーターバスで解凍した。溶解緩衝液（５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ二ナトリウム塩（エチレンジアミン四酢酸）、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および５ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）に２５％ｗ／ｖで細胞を再懸濁させ、使用の直前に細菌プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｐ８４６５  ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）５ｍＬ／Ｌを添加した。最低の設定で手持ち式ホモジナイザー（ＴＩＳＳＵＥ  ＴＥＡＲＯＲ（商標）、ＢＩＯＳＰＥＣ  ＰＲＯＤＵＣＴＳ，Ｉｎｃ．、Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ、ＯＫ）を使用して、完全な懸濁液を得た。リゾチーム（ＳＩＧＭＡ  Ｌ７６５１  ２５ｍｇ、ニワトリ卵白由来）を、金属スパチュラで混合することにより細胞懸濁液に添加し、懸濁液を室温で１時間インキュベートした。懸濁液を氷上で１５分間冷却し、次いで、ＢＲＡＮＳＯＮ２５０  ＳＯＮＩＦＩＥＲ（１分間のセッションが２回、５０％デューティサイクル、３０％排出）を使用してソニケーションした。顕微鏡で細胞が溶解したことを確認した。さらなるリゾチーム２５ｍｇを必要に応じて添加し、インキュベーションおよびソニケーションを繰り返した。顕微鏡で細胞溶解を確認して、ライセートを１１，５００ｘｇで２５分間（４℃）遠心分離してＩＢペレットを形成させ、上清を捨てた。ＩＢペレットを溶解緩衝液１００ｍＬで再懸濁させ、手持ち式のミキサーでホモジナイズし上記のように遠心分離した。上清が無色になり、ＩＢペレットが固くオフホワイト色になるまで、ＩＢペレットを再懸濁（溶解緩衝液５０ｍＬ中）、ホモジナイズ、ソニケーションおよび遠心分離により繰り返し洗浄した。最後の洗浄については、ＩＢペレットを２ｍＭ  ＥＤＴＡを含む無菌濾過した（０．２２μｍ）蒸留水中で再懸濁させ、遠心分離した。最終ペレットを無菌状態で再懸濁させた。
【００８０】
封入体の可溶化
Ｐｆ単離菌ＤＰｆ１５０またはＤｐｆ１２９（ＤＩＧ−９１１またはＤＩＧ−１８０タンパク質約３０ｍｇ／ｍＬを含む）由来の封入体懸濁液６ｍＬを、微量遠心管の最高の設定（約１４，０００ｘｇ）で遠心分離し、封入体をペレットにした。５０ｍＬコニカルチューブ中で、保存緩衝液の上清を除去し、ｐＨ１１の１００ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液２５ｍＬに交換した。ピペットを使用して封入体を再懸濁させ、ボルテックスして完全に混合した。チューブを、４℃で一晩、穏やかに振動しているプラットフォーム上に配置して標的タンパク質を抽出した。抽出物を４℃で３０分間、３０，０００ｘｇで遠心分離し、生じた上清をＡＭＩＣＯＮ  ＵＬＴＲＡ−１５再生セルロース遠心式フィルターデバイス（分子量カットオフ３０，０００；ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）を使用して５倍に濃縮した。次いで、使い捨てＰＤ−１０カラム（ＧＥ  ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用して、試料緩衝液を１０ｍＭ  ＣＡＰＳ（３−（シクロヘキサミノ）１−プロパンスルホン酸）ｐＨ１０に交換した。
【００８１】
ＩＢ調製におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析およびタンパク質の定量を、１ｍＬ分量のＩＢペレットを解凍し、無菌濾過した蒸留水で１：２０に希釈することにより行った。次いで、希釈した試料を４Ｘ還元試料緩衝液（２５０ｍＭトリス、ｐＨ６．８、４０％グリセロール（ｖ／ｖ）、０．４％ブロモフェノールブルー（ｗ／ｖ）、８％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）および８％β−メルカプトエタノール（ｖ／ｖ））とともに煮沸し、ＮＯＶＥＸ（登録商標）４〜２０％トリス−グリシン、１２＋２ウェルゲル（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）にローディングして１Ｘトリス／グリシン／ＳＤＳ緩衝液（ＢＩＯ−ＲＡＤ）により泳動した。ゲルを２００ボルトで約６０分間泳動し、次いでクーマシーブルー（４５％メタノール、１０％酢酸中５０％Ｇ−２５０／５０％Ｒ−２５０）で染色し、蒸留水中７％酢酸、５％メタノールで脱染した。標準曲線を作成するための、同じゲルで泳動したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）試料に対する、バンドの濃度測定値を比較することにより標的のバンドの定量を行った。濃縮した抽出物を、還元剤として５ｍＭジチオスレイトールを含むＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳ試料緩衝液（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）で１：５０に希釈することにより電気泳動用に調製し、９５℃で４分間加熱した。試料を、０．２〜２μｇ／レーンの範囲の５つのＢＳＡ標準液とともに（標準曲線を作成するため）、４〜１２％ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ゲルの二連のレーンにローディングした。追跡用色素がゲルの底に達するまで、ＭＯＰＳ  ＳＤＳ泳動緩衝液（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）を使用して、２００Ｖで電圧を印加した。ゲルを４５％メタノール、１０％酢酸中０．２％クーマシーブルーＧ−２５０で染色し、まず４５％メタノール、１０％酢酸で一時的に、次いで、バックグラウンドがきれいになるまで７％酢酸、５％メタノールで長時間脱染した。脱染後、ゲルをＢＩＯ−ＲＡＤ  ＦＬＵＯＲ−Ｓ  ＭＵＬＴＩＩＭＡＧＥＲでスキャンした。この装置のＱＵＡＮＴＩＴＹ  ＯＮＥ  ｖ．４．５．２ソフトウェアを使用して、染色したタンパク質のバンドの、バックグラウンドを差し引いた体積を得、ＢＳＡの標準曲線を作成し、これを使用して保存液中のＤＩＧ−９１１またはＤＩＧ−１８０タンパク質濃度を算出した。
【実施例２】
【００８２】
ＣＥＷ幼虫に対する、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）において産生されたＤＩＧ−９１１およびＤＩＧ−１８０殺虫性毒素の活性 
試料調製およびバイオアッセイ
ｐＨ１０の１０ｍＭ  ＣＡＰＳ中の封入体製剤を、用量３，０００、１，０００、３３３．３、１１１．１、３７．０、１２．３または４．１ｎｇ／ｃｍ２の標的Ｃｒｙ１Ｄａタンパク質を送達するように、同じ緩衝液中で希釈した。全てのバイオアッセイは、死亡率または成長阻害についてのバックグラウンドチェックとして機能する、ｐＨ１０の１０ｍＭ  ＣＡＰＳ緩衝液または水からなるコントロール処理剤を含んでいた。
【００８３】
バイオアッセイ緩衝液中のタンパク質濃度を、ゲル濃度測定についての標準曲線を作り出すためにＢＳＡを使用したゲル電気泳動により推定し、ＢＩＯＲＡＤイメージングシステム（ＦＬＵＯＲ−Ｓ  ＭＵＬＴＩＩＭＡＧＥＲ  ｗｉｔｈ  ＱＵＡＮＴＩＴＹ  ＯＮＥ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．５．２）を使用して測定した。ゲルマトリックス中のタンパク質をクーマシーブルーベースの色素で染色し、測定前に脱染した。
【００８４】
民間昆虫飼育会社（ＢＥＮＺＯＮ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＩＮＣ．、Ｃａｒｌｉｓｌｅ、ＰＡ）により維持されたコロニーから得られた卵より、ＣＥＷの幼虫を孵化させた。昆虫バイオアッセイ専用に設計された１２８ウェルプラスチックトレイ（Ｃ−Ｄ  ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ、Ｐｉｔｍａｎ、ＮＪ）でバイオアッセイを実施した。各ウェルは複数種の鱗翅目用餌（ＳＯＵＴＨＬＡＮＤ  ＰＲＯＤＵＣＴＳ、Ｌａｋｅ  Ｖｉｌｌａｇｅ、ＡＲ）１．５ｍＬを含んでいた。４０μＬ分量のタンパク質試料を、ピペットで各ウェルの餌表面１．５ｃｍ２（２６．７μＬ／ｃｍ２）に送達した。ウェルの表面積１平方センチメートル（ｃｍ２）あたりの殺虫性毒素タンパク質の量（ｎｇ）として餌濃度を算出した。処理を行ったトレイを、餌表面上の液体が蒸発するか餌に吸収されるまで、ドラフト内に維持した。
【００８５】
孵化から２４〜４８時間内に、各幼虫を湿らせたラクダ毛のブラシで持ち上げ、１ウェルあたり幼虫１匹として、処理を行った餌上に置いた。次いで、寄生させたウェルを、ガス交換を可能にするため排気口を設けた透明なプラスチック製粘着シート（Ｃ−Ｄ  ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ）で密封した。バイオアッセイトレイを５日間、制御された環境的条件（２８℃、相対湿度約６０％、１６：８（明：暗））下に維持し、その後、各タンパク質試料に曝露された昆虫の総数、生存および死亡昆虫の数、ならびに生き残った昆虫の重量を記録した。死亡率パーセントおよび成長阻害パーセントを各処理について算出した。成長阻害（ＧＩ）を以下のように算出した：
ＧＩ＝［１−（ＴＷＩＴ／ＴＮＩＴ）／（ＴＷＩＢＣ／ＴＮＩＢＣ）］
ここで、ＴＷＩＴは処理における昆虫の総重量であり、
ＴＮＩＴは処理における昆虫の総数であり、
ＴＷＩＢＣはバックグラウンドチェック（緩衝液コントロール）における昆虫の総重量であり、
ＴＮＩＢＣはバックグラウンドチェック（緩衝液コントロール）における昆虫の総数である。
【００８６】
死亡率および成長阻害データを、名義ロジスティック回帰（Ｐ０．０５未満）により分析した。ＧＩ５０を、ＧＩ値が５０％となる餌中の殺虫性毒素タンパク質濃度として決定し、ＬＣ５０（５０％致死濃度）を、試験昆虫の５０％が死亡する餌中の殺虫性毒素タンパク質濃度として記録した。ＪＭＰ（登録商標）Ｐｒｏソフトウェア（ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０．３；ＳＡＳ、Ｃａｒｙ、ＮＣ）を使用して統計分析（Ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）を行った。表１は、餌バイオアッセイで測定したＤＩＧ−９１１およびＤＩＧ−１８０タンパク質の活性を示す。
【００８７】
【表１】
2017516840.tif 000003
【００８８】
表１のデータは、Ｃｒｙ１Ｄａコア毒素セグメントを含むＤＩＧ−９１１タンパク質が、コーンイヤーワーム（ＣＥＷ）の幼虫に対する死亡率および増殖阻害活性の両方を示すという驚くべき発見を示している。この結果は、Ｃｒｙ１Ｄａタンパク質がコーンイヤーワームに対し不活性であるという、他者により報告された結果（Karim et al. (2000) Pesticide Biochemistry and Physiology 67(3):198-216；およびFrankenhuyzen (2009) Journal of Invertebrate Pathology. 101:1-16を参照のこと）とは対照的である。
【実施例３】
【００８９】
植物形質転換ベクターの構築
Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）エントリーベクターを、標準的な分子クローニング方法により構築した。エントリーベクターｐＤＡＢ１０９８２５は、Ｃｒｙ１Ｄａ２コア毒素殺虫性タンパク質（配列番号６）をコードする、トウモロコシ最適化コード配列（配列番号５）を含む。エントリーベクターｐＤＡＢ１０９８４０は、Ｃｒｙ１Ｄａ２全長殺虫性タンパク質をコードする、トウモロコシ最適化コード配列を含む。Ｃｒｙ１Ｄａ２コア毒素コード配列の植物における発現は、付随するイントロン１を有するトウモロコシユビキチン１プロモーター（米国特許第５，５１０，４７４号明細書）のコピーの制御下にある。トウモロコシペルオキシダーゼ５遺伝子由来の３’ＵＴＲ（ＺｍＰｅｒ５  ３’ＵＴＲ；米国特許第６，６９９，９８４号明細書）を含む断片を使用して、Ｃｒｙ１Ｄａ２  ｍＲＮＡの転写を終結させた。アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性のトウモロコシ胚形質転換のための形質転換／発現ベクター（ｐＤＡＢ１０９８４１）を、標準的なクローニング方法、ならびに典型的なデスティネーションバイナリーベクター（ｐＤＡＢ１０９８０５）および上記のエントリーベクターｐＤＡＢ１０９８２５を使用するＧａｔｅｗａｙ（登録商標）組換え反応の使用により構築した。バイナリーデスティネーションベクターｐＤＡＢ１０９８０５は、サトウキビ桿状ウイルスプロモーター（ＳＣＢＶ；基本的に米国特許第６，０９３，５６９号明細書に記載）のコピーの発現制御下にある、ＡＡＤ−１除草剤耐性タンパク質コード領域（米国特許第７，８３８，７３３号明細書、およびWright et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107:20240-20245）を含む。メイズストリークウイルス（ＭＳＶ）コートタンパク質遺伝子５’ＵＴＲ由来の配列、およびトウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼ１（ＡＤＨ１）遺伝子由来のイントロン６から構成される合成５’ＵＴＲ配列は、ＳＣＢＶプロモーターセグメントの３’末端とＡＡＤ−１コード領域の開始コドンとの間に位置している。トウモロコシリパーゼ遺伝子由来の３’ＵＴＲ（上記）を含む断片を使用して、ＡＡＤ−１  ｍＲＮＡの転写を終結させた。
【００９０】
ネガティブコントロールバイナリーベクター（ｐＤＡＢ１０１５５６）は、イントロン１を有するトウモロコシユビキチン１プロモーター（上記）のコピー、およびトウモロコシペルオキシダーゼ５遺伝子由来の３’ＵＴＲ（ＺｍＰｅｒ５  ３’ＵＴＲ；米国特許第６，６９９，９８４号明細書）を含む断片の発現制御下にある、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）マーカー遺伝子コード領域（Shagin et al. (2004) Molecular Biology and Evolution 21:841-850）を含んでいた。ｐＤＡＢ１０１５５６は、イントロン１を有するトウモロコシユビキチン１プロモーター（上記）の二次コピー、およびトウモロコシリパーゼ遺伝子由来の３’ＵＴＲ（上記）の発現制御下にある、ＡＡＤ−１除草剤耐性タンパク質コード領域（上記）をさらに含む。
【実施例４】
【００９１】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性のトウモロコシ形質転換
アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性の形質転換を使用して、Ｃｒｙ１Ｄａ２コア毒素コード領域を植物ゲノムに安定に組み込み、それにより、全長または短縮型Ｃｒｙ１Ｄａ２殺虫性タンパク質を産生するトランスジェニックトウモロコシ細胞、組織および植物を生成した。スーパーバイナリーまたはバイナリー形質転換ベクターを使用するトウモロコシ形質転換方法は、例えば、国際ＰＣＴ公開第２０１０／１２０４５２号パンフレットに記載されるように、当技術分野で既知である。形質転換された組織を、Ｒ−ハロキシホップ含有培地で生長する能力により選択した。
【００９２】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）培養開始
プロジェクトベクターのグリセロールストックを、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）宿主株ＤＡｔ１３１９２（国際公開第２０１２／０１６２２２号パンフレット）内に用意した。アグロバクテリウム（Agrobacterium）培養物をグリセロールストックから、適切な抗生物質を含むＡＢ最少培地（Watson, et al., (1975) J. Bacteriology 123:255-264）にストリークし、２０℃の暗所で３日間インキュベートした。次いで、培養物を、抗生物質を有するＹＥＰ培地（ｍｇ／Ｌ：酵母抽出物、１０；ペプトン、１０；ＮａＣｌ、５）のプレートにストリークし、２０℃の暗所で１〜３日間インキュベートした。
【００９３】
実験当日に、播種培地とアセトシリンゴン（Frame et al. (2011) Methods in Molecular Biology 710:327-341）との混合物を、実験における構築物の数に適切な体積で調製し、無菌の使い捨て２５０ｍＬフラスコにピペッティングした。播種培地は：２．２ｍｇ／Ｌ  ＭＳ塩；改変ＭＳビタミン（Frame et al.、同書）６８．４ｍｇ／Ｌ  スクロース；３６ｍｇ／Ｌ  グルコース；１１５ｍｇ／Ｌ  Ｌ−プロリン；および１００ｍｇ／Ｌ  ミオイノシトール；をｐＨ５．４で含む）。アセトシリンゴンを、１００％ジメチルスルホキシド中の１Ｍ保存液から最終濃度２００μＭになるまで、播種培地を含むフラスコに添加した。
【００９４】
各構築物について、ＹＥＰプレートからの播種用白金耳量１回分のアグロバクテリウム（Agrobacterium）を、無菌の使い捨て５０ｍＬ遠心管内の播種培地／アセトシリンゴン混合物１５ｍＬ中に懸濁させ、５５０ｎｍでの溶液の光学密度（ＯＤ５５０）を分光光度計で測定した。次いで、さらなる播種培地／アセトシリンゴン混合物を使用して、懸濁液をＯＤ５５０  ０．３〜０．４に希釈した。次いで、アグロバクテリウム（Agrobacterium）懸濁液のチューブを、室温で約７５ｒｐｍに設定したプラットフォームシェーカー上に水平に配置し、使用前に１〜４時間振とうした。
【００９５】
穂の滅菌および胚の単離
トウモロコシ（Zea mays）近交系Ｂ１０４（Hallauer, et al. (1997) Crop Science 37:1405-1406）由来の穂を温室で産生し、受粉後１０〜１２日で収穫した。収穫した穂の殻を剥き、市販の漂白剤（Ｕｌｔｒａ  Ｃｌｏｒｏｘ（登録商標）Ｇｅｒｍｉｃｉｄａｌ  Ｂｌｅａｃｈ、６．１５％次亜塩素酸ナトリウム；ＴＷＥＥＮ２０  ２滴含有）の２０％溶液中に２０分間浸漬することにより表面を滅菌し、その後、ラミナーフローフード内で無菌の脱イオン水で３度洗い流した。未熟な接合胚（１．８〜２．２ｍｍ長）を各穂から無菌的に切除し、アグロバクテリウム（Agrobacterium）懸濁液２．０ｍＬを含む１つまたは複数の微量遠心管に分配し、そこへ１０％ＢＲＥＡＫ−ＴＨＲＵ（登録商標）Ｓ２３３界面活性剤（ＥＶＯＮＩＫ  ＩＮＤＵＳＴＲＩＥＳ；Ｅｓｓｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）２μＬを添加した。
【００９６】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）共培養
単離後、胚をロッカープラットフォーム（rocker platform）上に５分間配置した。次いで、チューブの内容物を、４．３３ｍｇ／Ｌ  ＭＳ塩；改変ＭＳビタミン；３０ｍｇ／Ｌ  スクロース；７００ｍｇ／Ｌ  Ｌ−プロリン；ＫＯＨ中３．３ｍｇ／Ｌ  ジカンバ（３，６−ジクロロ−ｏ−アニス酸または３，６−ジクロロ−２−メトキシ安息香酸）；１００ｍｇ／Ｌ  ミオイノシトール；１００ｍｇ／Ｌ  カゼイン酵素加水分解物；１５ｍｇ／Ｌ  ＡｇＮＯ３；ＤＭＳＯ中２００μＭアセトシリンゴン；および３ｍｇ／Ｌ  寒天（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ、植物細胞培養試験済み）をｐＨ５．８で含む共培養培地のプレートに注いだ。液体アグロバクテリウム（Agrobacterium）懸濁液を無菌の使い捨てトランスファーピペットで除去し、胚を含む共培養プレートをラミナーフローフードの後方に、蓋が半開きの状態で３０分間配置し、その後、顕微鏡を用い、無菌の鉗子を使用して、胚盤が上向いた状態に胚を指向させた。プレートを、ラミナーフローフードの後方に蓋が半開きの状態でさらに１５分間戻した。次いで、プレートを閉じて３Ｍ（商標）Ｍｉｃｒｏｐｏｒｅ（商標）医療用テープで密封し、光を約６０μＥｍ−２ｓｅｃ−１の光強度で持続させた２５℃のインキュベーター内に配置した。
【００９７】
カルス選択およびトランスジェニック事象の再生
共培養期間後、４．３３ｍｇ／Ｌ  ＭＳ塩；改変ＭＳビタミン；３０ｍｇ／Ｌ  スクロース；７００ｍｇ／Ｌ  Ｌ−プロリン；ＫＯＨ中３．３ｍｇ／Ｌ  ジカンバ；１００ｍｇ／Ｌミオイノシトール；１００ｍｇ／Ｌ  カゼイン酵素加水分解物；１５ｍｇ／Ｌ  ＡｇＮＯ３；０．５ｍｇ／Ｌ  ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸一水和物；Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｌａｂｒ．；Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ）；２５０ｍｇ／Ｌ  セフォタキシム；および７．０ｍｇ／Ｌ  寒天；ｐＨ５．８から構成される休止培地（resting medium）に胚を移した。３６個以下の胚を各プレートに移動させた。プレートをＭｉｃｒｏｐｏｒｅ（商標）テープで包み、７〜１０日間、光を約５０μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１の光強度で持続させた状態で、２７℃でインキュベートした。次いで、カルスを有する胚（１８未満／プレート）を、寒天は６．５ｍｇ／Ｌのみで、１００ｎＭ  Ｒ−ハロキシホップ酸（０．０３６２ｍｇ／Ｌ）を有する休止培地（上記）から構成される選択培地Ｉに移した。プレートをＭｉｃｒｏｐｏｒｅ（商標）テープで包み、７日間、光を約５０μＥｍ−２ｓｅｃ−１光強度で持続させた状態で、２７℃でインキュベートした。次いで、増殖したカルス（１２未満／プレート）を、寒天は６．５ｍｇ／Ｌのみで、５００ｎＭ  Ｒ−ハロキシホップ酸（０．１８１ｍｇ／Ｌ）を有する休止培地（上記）から構成される選択培地ＩＩに移した。プレートを包み、１４日間、光を約５０μＥｍ−２ｓｅｃ−１の光強度で持続させた状態で、２７℃でインキュベートした。
【００９８】
この段階で、抵抗性のカルス（９未満／プレート）を再生前培地に移動させた。再生前培地は、４．３３ｍｇ／Ｌ  ＭＳ塩；改変ＭＳビタミン；４５ｍｇ／Ｌ  スクロース；３５０ｍｇ／Ｌ  Ｌ−プロリン；１００ｍｇ／Ｌ  ミオイノシトール；５０ｍｇ／Ｌ  カゼイン酵素加水分解物；１．０ｍｇ／Ｌ  ＡｇＮＯ３；０．５ｍｇ／Ｌ  ＭＥＳ；ＮａＯＨ中０．５ｍｇ／Ｌ  ナフタレン酢酸；エタノール中２．５ｍｇ／Ｌ  アブシジン酸；１ｍｇ／Ｌ  ６−ベンジルアミノプリン；２５０ｍｇ／Ｌ  セフォタキシム；５．５ｍｇ／Ｌ  寒天；および５００ｎＭ  Ｒ−ハロキシホップ酸（０．１８１ｍｇ／Ｌ）をｐＨ５．８で含む。プレートを包み、７日間、光を約５０μＥｍ−２ｓｅｃ−１の光強度で持続させた状態で、２７℃でインキュベートした。次いで、再生しているカルス（６未満／プレート）をＰｈｙｔａｔｒａｙｓ（商標）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中の再生培地に移し、１４日間または苗条が生長するまで、約１５０μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１の光強度で、１日あたり明期１６時間／暗期８時間で２８℃でインキュベートした。再生培地は、４．３３ｍｇ／Ｌ  ＭＳ塩；改変ＭＳビタミン；６０ｍｇ／Ｌ  スクロース；０．５０ｍｇ／Ｌ  ＭＥＳ；１２５ｍｇ／Ｌ  セフォタキシム；５．５ｍｇ／Ｌ  寒天；および５００ｎＭ  Ｒ−ハロキシホップ酸（０．１８１ｍｇ／Ｌ）をｐＨ５．８で含む。次いで、一次根を有する小さい苗条を単離し、さらに生長させるために選択性を有しない伸長培地（すなわち、Ｒ−ハロキシホップ酸を含まず、６０ｍｇ／Ｌ  スクロースの代わりに３０ｍｇ／Ｌ  スクロースを含む再生培地）に移した。約６ｃｍ以上の、根を張った小植物を土壌に移植し、寒さに慣らすため生育チャンバーに移動させた。
【００９９】
アッセイおよび種子産生のための、温室におけるＴ０植物の移行および樹立
ハロキシホップを含む培地で生長する能力により選択される、形質転換された植物組織を、Ｐｈｙｔａｔｒａｙｓ（商標）から、生長培地（ＰＲＯＭＩＸ  ＢＸ；Ｐｒｅｍｉｅｒ  Ｔｅｃｈ  Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ）で満たされ、ヒューミドーム（Ａｒｃｏ  Ｐｌａｓｔｉｃｓ  Ｌｔｄ．）で覆われた小型の植木鉢（Ｔ．Ｏ．Ｐｌａｓｔｉｃｓ、３．５”ＳＶＤ）に移植し、次いで、生育室（昼２８℃／夜２４℃、明期１６時間、ＲＨ５０〜７０％、２００μＥｍ−２ｓｅｃ−１光強度）内で寒さに慣らした。植物がＶ３〜Ｖ４段階に達すると、それらをＳｕｎｓｈｉｎｅ  Ｃｕｓｔｏｍ  Ｂｌｅｎｄ  １６０土壌混合物に移植し、温室（光曝露型：光または同化；高光量限度：１２００ＰＡＲ；日長１６時間；昼２７℃／夜２４℃）内で開花するまで生長させた。トランスジェニックと推定される小植物を、導入遺伝子の相対的コピー数を検出するように設計したプライマーを使用して、定量的リアルタイムＰＣＲアッセイにより導入遺伝子コピー数について分析し、組み込まれたＣｒｙ１Ｄａ２遺伝子のコピーを１つまたは２つのみ有する事象を５ガロンの植木鉢に移植した。何らかの異常な形質を追跡するため、定期的に観察を行った。Ｔ０植物から収集した花粉で、Ｔ０トランスジェニック植物のシルクに自家受粉し、生じた種子を植え付けすることにより、Ｔ１世代の植物を得た。事象１０９８４１［３］−１０６由来のＴ１種子を植え付けし、植物にキザロホップを噴霧し、繁殖段階まで生き残った植物を維持することにより選択し、コーンイヤーワームのバイオアッセイおよびウェスタンブロット分析用のシルクを得た。
【０１００】
トランスジェニックトウモロコシ植物を、黄色蛍光タンパク質遺伝子発現カセットを保有するバイナリーベクターｐＤＡＢ１０１５５６により形質転換した後、同様に産生した。
【実施例５】
【０１０１】
トランスジェニックトウモロコシ組織の分子的および生化学的分析
コピー数分析のための加水分解プローブｑＰＣＲ
分子的分析を使用して、低コピーの単一事象をスクリーニングした。土壌への移植前に、トランスジェニックと推定される、根を張った植物から葉組織を収集した。Ｂｉｏｓｐｒｉｎｔ９６、ＱＩＡＧＥＮ抽出ロボットおよび供給業者推奨のプロトコルを使用し、ＱＩＡＧＥＮ  ＭａｇＡｔｔｒａｃｔ（商標）ｋｉｔを用いてＤＮＡを抽出した。ＡＡＤ−１遺伝子に特異的な加水分解プローブアッセイを使用して、組み込まれた導入遺伝子のコピー数分析を行った。さらに、バイナリーベクターバックボーンが有するスペクチノマイシン（Ｓｐｅｃ）抵抗性遺伝子に特異的な加水分解プローブアッセイにより、バイナリーベクタープラスミドバックボーンの偶発的な組み込みによるコンタミネーションを検出した。内因性トウモロコシ遺伝子インベルターゼ；（ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号Ｕ１６１２３）についての加水分解プローブアッセイを、内部参照標準として開発した。表２は、加水分解プローブアッセイ成分（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡおよびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡにより合成）のオリゴヌクレオチド配列を示す。バイプレックス加水分解プローブＰＣＲ反応を、ＤＮＡ約１０ｎｇを用いて表３に従って設定し、アッセイ条件を表４に提示する。
【０１０２】
【表２】
2017516840.tif 000004
【０１０３】
【表３】
2017516840.tif 000005
【０１０４】
【表４】
2017516840.tif 000006
【０１０５】
増幅のため、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０プローブマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を、各プライマー０．４μＭ、各プローブ０．２μＭの、１０μＬ体積のマルチプレックス反応物中最終濃度１Ｘで調製した。ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセインアミダイト）蛍光部分を４６５ｎｍで励起させ、蛍光を５１０ｎｍで測定した；ＨＥＸ（ヘキサクロロフルオレセイン）蛍光部分についての対応する値は５３３ｎｍおよび５８０ｎｍであった。各反応における発生した蛍光レベルを、製造業者の推奨に従い、Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０リアルタイムＰＣＲ系を使用して分析した。既知のコピー数標準液の標的／基準遺伝子の値に対する、未知の試料の標的／基準遺伝子の値についてのＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０結果を比較することにより、導入遺伝子のコピー数を決定した（１コピーはヘミ接合性植物を表し、２コピーはホモ接合性植物を表す）。
【０１０６】
Ｃｐスコア、すなわち、フィットポイントアルゴリズム（Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）ソフトウェアリリース１．５）およびＲｅｌａｔｉｖｅ  Ｑｕａｎｔモジュールを使用すると蛍光シグナルがバックグラウンド閾値と交差する点を使用して、リアルタイムＰＣＲデータの分析を行った。
【０１０７】
Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）フィットポイントアルゴリズムソフトウェアにおいて、測定されたＣｐ値に対して、インプットＤＮＡ鋳型濃度の対数をプロットすることにより、データのグラフを作製する。曲線の傾斜が、望ましい比較パラメータである；したがって、最初の対数インプット数は曲線上の任意の開始点とすることができる。ただし、インプットＤＮＡ鋳型に使用される任意の濃度値は、使用される実際の段階希釈の代表である。例えば、１０倍段階希釈系においては、実際のインプット濃度は１０００、１００、１０などとしてよく、それらの点についてＬＣ４８０フィットポイントアルゴリズムソフトウェアはインプットの対数として３、２、１などと点を付ける。次いで、線形回帰を使用して、この線（インプット対数対Ｃｐ）において生じた最良の適合を使用して、ｙ＝ｍｘ＋ｂの形の方程式から傾斜（ｍ）を推測する。開始時の鋳型量とＣｐ値との間には反比例関係があり、したがって傾斜（ｍ）は常に負である。
【０１０８】
完全な（すなわち１００％効率の）ＰＣＲ反応では、サイクルごとに全ての鋳型が２倍になる。ＰＣＲ効率（Ｅｆｆ）は：Ｅｆｆ＝１０ｅ（−１／ｍ）として算出される。したがって、対数インプット対Ｃｐのグラフの傾斜（ｍ）は、完全に効率的な反応（その効率は２．００と定義される）において−３．３２１９となる。
【０１０９】
言い換えれば、１００％効率のＰＣＲ反応は：２．０＝１０ｅ（−１／−３．３２１９）により定義される。ＬＣ４８０フィットポイントアルゴリズムソフトウェアは、最初の式により効率値を報告する。そのため、９９％効率の反応は、Ｅｆｆ値０．９９ではなく１．９９となる。効率パーセントとしてこれを表現するには、この値から１を引き、１００をかける。すなわち、％Ｅｆｆ＝［（１０ｅ（−１／ｍ）−１）］×１００。
【０１１０】
植物により産生される短縮型Ｃｒｙ１Ｄａ２タンパク質の検出
ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ緩衝液）０．６ｍＬ中の穂のシルク（未受粉の穂より収集）２００〜２４０ｍｇからタンパク質を抽出した。２ｍｍのスチールビーズを添加し、チューブに蓋をし、ＧＥＮＯ／ＧＲＩＮＤＥＲ（ＣＥＲＴＩＰＲＥＰ；Ｍｅｔｕｃｈｅｎ、ＮＪ）で固定し、１５００ｒｐｍで５分間振とうした。チューブを４０００ｒｐｍで７分間、４℃で遠心分離し、可溶性タンパク質を含む上清を使用まで−８０℃で保管した。
【０１１１】
供給業者の説明書に従い、ＰＩＥＲＣＥ６６０ｎｍタンパク質アッセイキット（ＴＨＥＲＭＯ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して総タンパク質濃度を決定した。標準的な手順（例えば、Harlow, E., and Lane, D.P. (1988) Antibodies：A Laboratory Manual. Cold Springs Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NYおよびそれらの改定版を参照のこと）を使用し、ウサギにおいて発生させたポリクローナル抗体を使用して、タンパク質イムノブロット分析を実施した。試料を調製し、変性電気泳動について製造業者が勧めるプロトコルに従って（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）、ＭＥＳ泳動緩衝液中でＮＵＰＡＧＥ４〜１２％ビス−トリスゲルによる電気泳動によってタンパク質を分離した。ＮＵＰＡＧＥトランスファー緩衝液中で、タンパク質を３０Ｖで８０分間ニトロセルロース膜に移した。５％乳／ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ）中で、ブロットを室温で１時間ブロッキングし、次いで、ブロッキング溶液中で、室温でそれぞれ１時間、一次抗体（Ｃｒｙ１Ｄａコア毒素タンパク質に特異的）、次に二次抗体でプローブし、各抗体の間に１５分間、ＰＢＳＴで洗い流した。製造業者のプロトコル（ＴＨＥＲＭＯ  ＦＩＳＨＥＲ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）に従い、ＰＩＥＲＣＥのＥＣＬウェスタンブロッティング基質を使用してブロットの発色を行った。事象１０９８４１［３］−１０６（植物１０９８４１［３］−１０６．ＡＪ００１．００８、１０９８４１［３］−１０６．ＡＪ００１．０１３、１０９８４１［３］−１０６．ＡＪ００１．０２０、１０９８４１［３］−１０６．ＡＪ００１．０２７および１０９８４１［３］−１０６．ＡＪ００１．０２８）から発生したトウモロコシ植物のシルク組織の二連の試料由来の抽出物において、短縮型Ｃｒｙ１Ｄａタンパク質の存在が確認された。２つのバンドが典型的には検出され、１つは約６５ｋＤａに相当する移動度であり、これは構築物ｐＤＡＢ１０９８４１によりコードされるＣｒｙ１Ｄａ２タンパク質の分子サイズに相当し、第２のバンドは６５ｋＤａよりもある程度小さいタンパク質に相当する移動度を有する。より小さいこのタンパク質は、Ｃｒｙ１Ｄａコア毒素タンパク質のＮ−末端からアミノ酸１〜２８が切断された後に残る産物に相当する可能性がある。（Ｃｒｙ１タンパク質からの数個のＮ末端アミノ酸のプロセシングがしばしば検出される。）このようなバンドは、非トランスジェニックＢ１０４植物由来のシルク抽出物では見られなかった。
【０１１２】
【表５】
2017516840.tif 000007
【実施例６】
【０１１３】
トランスジェニックトウモロコシ組織のバイオアッセイ
Ｔ１トウモロコシ事象を用いたＶ５葉のバイオアッセイ
バイオアッセイトレイ（３２ウェル／トレイ；Ｃ−Ｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を、部分的に２％寒天溶液で満たし、寒天を凝固させた。葉の部分２つ（面積約１平方インチ）を各植物から採取し、それぞれを３２ウェルトレイの独立したウェルに配置した。新生アメリカタバコガ（Helicoverpa zea）（ＣＥＷ）幼虫（孵化後約２４〜４８時間）１０匹を各ウェルに配置した。試験中換気できるように穴を開けた粘着性の蓋でトレイを密封し、次いで、２８℃、ＲＨ４０％、明期１６時間：暗期８時間下に配置した。３日後、単一の葉面積損傷パーセントスコアを各葉の小片について採点した。各試験における損傷スコアを平均した。
【０１１４】
コーンイヤーワームシルクバイオアッセイ
未受粉の穂を収集し、それらの長さを測定し、バイオアッセイに使用するまで穂を４℃で保管した。シルクおよびコーンイヤーワーム幼虫に水分を供給するため、２％素寒天約１０ｍＬを、３２ウェルバイオアッセイトレイの各アッセイウェル（約１平方インチ）の底に配置した。シルク５本（約１０ｃｍ長）を各ウェルの新生ＣＥＷ２匹に摂食させた。各事象を、完全に無作為な様式で、４回反復して（ウェル）試験した。昆虫寄生後、試験中換気できるように穴を開けた粘着性の蓋でトレイを密封した。２８℃、ＲＨ６０％、明期１６時間：暗期８時間下にトレイを配置した。寄生３日後、シルク組織上の排泄物量を視覚的に評価することにより、シルク損傷パーセントを記録した。生存、死亡および行方不明の昆虫数を事象ごとに記録し、幼虫の死亡率パーセントを推定した。
【０１１５】
ＣＥＷ幼虫に対する、植物により産生されるＣｒｙ１Ｄａの活性
イムノブロット分析により、Ｔ１ｐＤＡＢ１０９８４１トランスジェニック植物の穂のシルク中のＣｒｙ１Ｄａコア毒素タンパク質を検出し、このシルクが、バイオアッセイにおいてシルク損傷を４．６％しか示さず（表６）、アメリカタバコガ（H. zea）幼虫による食害に対し優れた防御をもたらした。非殺虫性黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ；構築物ｐＤＡＢ１０１５５６）を産生するネガティブコントロールトランスジェニックトウモロコシ植物、または非トランスジェニックＢ１０４植物由来のシルクは、アメリカタバコガ（H. zea）幼虫による平均シルク損傷９０％〜９５％を受けた。さらに、Ｃｒｙ１Ｄａコア毒素タンパク質を産生する植物由来のシルクを摂食した幼虫の死亡率は２６．８％であったが、ネガティブコントロール植物試料においては幼虫の死亡率は観測されなかった。ｐＤＡＢ１０９８５１トランスジェニック植物では、アメリカタバコガ（H. zea）により引き起こされる葉損傷が１２％〜２５％であり（表６）、Ｃｒｙ１Ｄａ構築物はＶ５段階の試料に対し優れた葉防御をもたらしたが、ネガティブコントロール植物（Ｂ１０４およびＹＦＰ産生）はほぼ１００％の葉損傷を受けた。シルクおよび葉のバイオアッセイ両方の結果は、Ｃｒｙ１Ｄａコア毒素タンパク質が、アメリカタバコガ（H. zea）幼虫による損傷からトウモロコシ植物を防御するのに非常に有効であることを示した。
【０１１６】
【表６】
2017516840.tif 000008
【０１１７】
表７は、アメリカタバコガ（H. zea）の死亡率パーセント、葉損傷パーセントおよびシルク損傷パーセントを示す。組織上の視覚的昆虫糞粒量に従ってシルク損傷量を採点した。１平方インチの葉小片上の、幼虫が摂食した面積の視覚的評価に従って、葉損傷パーセンテージを採点した。トウモロコシ変種Ｂ１０４および構築物１０１５５６（または葉損傷については構築物１０９８１２）は、それぞれハイブリッド品種由来のネガティブコントロール、および黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）コントールであり、ＨＸ１はＣｒｙ１Ｆａタンパク質を発現する市販のハイブリッドＨｅｒｃｕｌｅｘ（登録商標）Ｉであった。構築物１０９８４１は、Ｃｒｙ１Ｄａの短縮型を発現するＴ１トウモロコシであった。ＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ平均分離検定によりデータを分析した。
【０１１８】
【表７】
2017516840.tif 000009
【実施例７】
【０１１９】
ＣＥＷに対するＣｒｙ１Ｄａコア毒素タンパク質の圃場での有効性
８つのＴ１ｐＤＡＢ１０９８４１トランスジェニックＢ１０４事象由来の種子を、ＤＯＷ  ＡＧＲＯＳＣＩＥＮＣＥＳ  Ｆｉｅｌｄ  Ｓｔａｔｉｏｎ、Ｆｏｗｌｅｒ、Ｉｎｄｉａｎａの圃場試験区画で試験した。上記の分子的技術によりこれらの事象を分析したところ、検出可能なバイナリーベクターバックボーン配列を有しない単一のコピー事象であることが判明した。事象の全てを、Ｃｒｙ１Ｄａ／ＡＡＤ１組み込み事象について１：１で分離している（ヘミ接合性：ヌル）Ｔ１植物として試験した。ネガティブコントロールは、非トランスジェニックＢ１０４（ヌル）植物であった。
【０１２０】
試験区画は、試験される各昆虫種につき２０フィートの作条１つを含んでいた。４回反復する完全乱塊法で処理物を植え付けた。実験植物をＶ２段階で、１ヘクタールあたり１８４ｍｇ酸当量（ａｅ／ｈａ）のＡＳＳＵＲＥ（登録商標）ＩＩ（ＤＵＰＯＮＴ（商標）ＣＲＯＰ  ＰＲＯＴＥＣＴＩＯＮ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）＋１％ＣＯＣにより処理し、ヌル植物を除去した。ＡＳＳＵＲＥ（登録商標）ＩＩは、活性成分（ａｉ）キザロホップＰ−エチルエチル（Ｒ）−２−４−［４−６−クロロキノキサリン−２−イルオキシ］−フェノキシ］プロピオネートを含む。市販品は１ガロンあたり０．８８ｌｂのａｉおよび１．０％（ｖ／ｖ）作物油濃縮物（ＣＯＣ）を含む。ＣＯＣはパラフィン系油約８５％および乳化剤約１５％を含む、乳化可能な精製パラフィン系油である。処理２週間後に群落の計数を行った。１区画あたり植物５つを昆虫損傷について評価した。
【０１２１】
コーンイヤーワームの卵（ＣＥＷ；Helicoverpa zea Boddie）は、ＢＥＮＺＯＮ  ＲＥＳＥＡＲＣＨにより供給された。ＣＥＷに対する有効性を評価するため、各植物に、開花（第１生長段階番号６）中の２０１２／０８／２１に、穂のシルク上に二齢ＣＥＷ幼虫５匹を与えた。２０１２／０９／０４に、表８に示す基準に従って決定される、生存幼虫および食害について穂を試験した。
【０１２２】
【表８】
2017516840.tif 000010
【０１２３】
標準的なプロトコルを使用する定量的酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して、各事象におけるＣｒｙ１Ｄａ葉タンパク質レベルを評価した。ＥＬＩＳＡは植物抽出物の多数の希釈液を使用して、かつＥＬＩＳＡキット供給業者により提供される試薬および説明書を基本的に使用して行った。上記のＣｒｙ１Ｄａ抗体を使用した。
【０１２４】
【表９】
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【０１２５】
６７ｎｇ／ｃｍ２から１３５ｎｇ／ｃｍ２まで、広範なＣｒｙ１Ｄａ蓄積レベルが存在した。試験したｐＤＡＢ１０９８４１事象の全てが、Ｃｒｙ１Ｄａ産生レベルに関わらず、穀粒消費および穂への寄生レベルの両方で、ＣＥＷに対し統計的に類似したレベルの防御をもたらした。
【０１２６】
参考文献
Frankenhuyzen, K. 2009. Minireview: Insecticidal activity of Bacillus thuringiensis crystal proteins. Journal of Invertebrate Pathology. 101:1-16. 
Karim S., Ridzuddin, S., Gould, F., Dean, D.H. 2000. Determination of Receptor Binding Properties of Bacillus thuringiensis δ-Endotoxins to Cotton Bollworm (Helicoverpa zea) and Pink Bollworm (Pectinophora gossypiella) Midgut Brush Border Membrane Vesicles. Pesticide Biochemistry and Physiology 67(3):198-216. 
Hofte, H., P. Soetaert, S. Jansens, and M. Peferoen. 1990. Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of a new Lepidoptera-specific crystal protein gene from Bacillus thuringiensis. Nucl. Acids Res. 18:5545.
Payne, J., and A. J. Sick. 1997. US Patent No. 5,691,308.
【図１】
2017516840.tif 000012
【配列表】
2017516840000001.app
【国際調査報告】
2017516840.tif 000013
2017516840.tif 000014