(57)【要約】ＡＤＣＣ応答を増強もしくは可能にする、新規な合成生物学ベースのＡＤＣＣ技術が提供される。上記新規なＡＤＣＣ技術は、がん、感染性、炎症性もしくは自己免疫性の疾患、および罹病細胞の除去が望ましい他の疾患を防止もしくは処置するために使用され得る。ヒトＣＤ１６の抗体Ｆｃ結合親和性よりも高い抗体Ｆｃ結合親和性を有するエクトドメイン、膜貫通ドメイン、ならびにＡＤＣＣ活性化および増幅を媒介するためのエンドドメインを含む膜貫通キメラレセプターをコードする遺伝子構築物。
2017503510.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＣＤ１６の抗体Ｆｃ結合親和性よりも高い抗体Ｆｃ結合親和性を有するエクトドメイン、膜貫通ドメイン、ならびにＡＤＣＣ活性化および増幅を媒介するためのエンドドメインを含む膜貫通キメラレセプターをコードする遺伝子構築物。
【請求項２】
ＤＮＡ分子を含む、請求項１に記載の遺伝子構築物。
【請求項３】
ＲＮＡ分子を含む、請求項１に記載の遺伝子構築物。
【請求項４】
ＣＤ６４の実質的にＥＣ３エキソンを含む、請求項１に記載の遺伝子構築物。
【請求項５】
ＣＤ６４の実質的にＥＣ１エキソンおよびＥＣ２エキソンをさらに含む、請求項４に記載の遺伝子構築物。
【請求項６】
前記エクトドメインは、ＣＤ６４中のエキソンもしくはドメインの境界に基づいて選択される、請求項１に記載の遺伝子構築物。
【請求項７】
ＣＤ６４の実質的にエクトドメインを含むエクトドメインへと翻訳されるＲＮＡを含む、請求項１に記載の遺伝子構築物。
【請求項８】
前記エクトドメインは、ヒトＣＤ１６のＶ１５８改変体のＦｃ親和性よりも高いＦｃ親和性を有する、請求項１に記載の遺伝子構築物。
【請求項９】
前記エクトドメインは、ヒトＣＤ１６のＦ１５８改変体のＦｃ親和性よりも高いＦｃ親和性を有する、請求項１に記載の遺伝子構築物。
【請求項１０】
前記エンドドメインは、ＣＤ３ζの、ＣＤ２８の、ＣＤ１３４の、ＣＤ１３７の、ＣＤ２７の、ＣＤ７９ａの、ＣＤ７９ｂの、ＣＤ４０の、およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの、細胞内ドメインの一部もしくは全てからなる群より選択される、請求項１に記載の遺伝子構築物。
【請求項１１】
配列番号１、３、５、７、および９からなる群より選択されるＤＮＡ配列を含む、請求項１に記載の遺伝子構築物。
【請求項１２】
ヒトＣＤ１６の抗体Ｆｃ結合親和性よりも高い抗体Ｆｃ結合親和性を有するエクトドメイン、膜貫通ドメイン、ならびにＡＤＣＣ活性化および増幅を媒介するためのエンドドメインを含む、膜貫通キメラレセプター。
【請求項１３】
配列番号２、４、６、８、および１０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の膜貫通キメラレセプター。
【請求項１４】
前記エクトドメインは、ヒトＣＤ１６のＶ１５８改変体の抗体Ｆｃ結合親和性よりも高い抗体Ｆｃ結合親和性を有する、請求項１２に記載の膜貫通キメラレセプター。
【請求項１５】
前記エクトドメインは、ＣＤ６４のエクトドメインにおいて、ＣＤ１６には存在しない実質的に免疫グロブリン様折りたたみを含む、請求項１２に記載の膜貫通キメラレセプター。
【請求項１６】
前記エクトドメインは、ＣＤ６４の実質的にエクトドメインを含む、請求項１２に記載の膜貫通キメラレセプター。
【請求項１７】
前記膜貫通ドメインは、ＣＤ１６の実質的に膜貫通ドメインを含む、請求項１２に記載の膜貫通キメラレセプター。
【請求項１８】
宿主免疫エフェクター細胞の生存および増幅を増強するＡＤＣＣ増幅モジュールをさらに含む、請求項１２に記載の膜貫通キメラレセプター。
【請求項１９】
前記増幅モジュールは、ＣＤ３ζの、ＣＤ２８の、ＣＤ１３４の、ＣＤ１３７の、ＣＤ２７の、ＣＤ７９ａの、ＣＤ７９ｂの、ＣＤ４０のおよびＧＭ−ＣＳＦレセプターの、細胞内ドメインの一部もしくは全てからなる群より選択される、請求項１９に記載の膜貫通キメラレセプター。
【請求項２０】
請求項１〜１１に記載の遺伝子構築物もしくは請求項１２〜２０のタンパク質で、エキソビボで、感染させたかもしくはトランスフェクトされた、免疫エフェクター細胞。
【請求項２１】
細胞傷害性Ｔリンパ球を含む、請求項２１に記載の免疫エフェクター細胞。
【請求項２２】
ナチュラルキラー細胞を含む、請求項２１に記載の免疫エフェクター細胞。
【請求項２３】
好酸球、マクロファージ、好中球、好塩基球、単球、Ｂ細胞、および細胞傷害性因子を発現するかもしくは発現するように操作されている他の細胞からなる群より選択される、請求項２１に記載の免疫エフェクター細胞。
【請求項２４】
請求項１〜１１に記載の遺伝子構築物または請求項１２〜２０に記載のレセプター、および薬学的に受容可能な賦形剤を含む、薬学的組成物。
【請求項２５】
請求項２２〜２４に記載の免疫エフェクター細胞および薬学的に受容可能な賦形剤を含む、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本願は、２０１４年１月８日に出願された同じ発明の名称の同時係属中の米国仮特許出願第６１／９２５，２１７号に対する優先権およびその利益を主張する。この出願は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、免疫エフェクター細胞が抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介する能力または細胞にＡＤＣＣを媒介させ得る能力を増強するために使用され得る合成生物学的生成物およびプロセス、ならびにがん、感染性疾患、炎症性および自己免疫疾患ならびに他の疾患の処置および防止においてそれらを使用するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
哺乳動物、特に高等脊椎動物（ヒトを含む）は、複数の機構およびエフェクターを使用して、外来病原体ならびに罹病したかもしくはストレスを受けた自己由来細胞を検出、破壊もしくは少なくとも封じ込める、非常に複雑な免疫系を発達させた。これらの罹病細胞は、ウイルスもしくは細菌によって感染した可能性があるか、またはがんになった可能性がある。
【０００４】
免疫系が罹病宿主細胞および侵入している細胞内微生物（例えば、ウイルス、細菌もしくは寄生生物）を認識および排除する機構のうちの１つは、細胞媒介性細胞傷害性を通してであり、これは、多くの白血球およびタンパク質によって行われ得る。これら潜在的に細胞傷害性のエフェクターとしては、以下が挙げられる：リンパ球系統からはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）；ならびに骨髄系統からはマクロファージ、好中球および好酸球。
【０００５】
免疫系が細胞媒介性細胞傷害性を発揮させる（unleash）ための重要な方法は、抗体に依拠する。過去１０年間にわたって、腫瘍特異的細胞表面タンパク質を標的とするモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、がんに対する普及した治療アプローチになった。いくつかのｍＡｂは、リツキシマブ（リツキサン、マブセラ）、トラスツズマブ（ハーセプチン）およびセツキシマブ（アービタックス）を含め、慣用的な臨床実践に入った。ｍＡｂの人気は、それらの二機能性の性質の結果である。抗体の一方の末端（Ｆａｂ）は、腫瘍細胞を死滅させる種々のエフェクター細胞およびタンパク質を動員する他方の末端（Ｆｃ）を変化させることなく、特定の腫瘍タンパク質に精巧に特異的にされ得る。
【０００６】
具体的には、まず、標的細胞の表面にある抗原を認識および結合した後、抗体は、アダプターとして作用し、免疫エフェクター細胞上のある種のレセプターとの第２の結合を通じて免疫エフェクター細胞の細胞傷害性能力の活性化にすすむ。これは、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）といわれる。例えば、がんに対する先天的免疫の状況において、ＡＤＣＣは主に、標的の罹病細胞（例えば、腫瘍細胞）上に多価抗原を覆っている抗体のＦｃ（定常）部分を結合した際にのみ活性化される、相対的に低親和性のＦｃレセプター（ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａとしても公知））を発現するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（およびより低い程度には、好中球、単球およびマクロファージ）によって媒介される。この結合は、パーフォリンおよびグランザイム（ならびにＩＦＮ−γを含む多くのサイトカイン）のような細胞傷害性顆粒の放出の引き金となり、標的細胞の溶解をもたらす。上記ＡＤＣＣ応答の重要性は、インビトロで、および動物研究での両方において示されてきた。さらに、いくつかの臨床研究は、より低い親和性のＣＤ１６改変体（Ｆ１５８）を有する患者がより悪い臨床転帰を有することを示した。
【０００７】
しかし、ＡＤＣＣ効力は、内因性ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞によって主に媒介されるので、以下に説明されるとおりの多くの生理学的および病理学的な理由に起因して、身体では制限されている（内因性細胞傷害性Ｔリンパ球は、腫瘍クリアランスに少しでも参加し、それらの効力もまた、非常に限られており、欠けていると見出された程度に）。
【０００８】
第１に、ＡＤＣＣ応答に関与する大部分の細胞（例えば、マクロファージおよび好中球）は、それらが活性化されるときに増殖する傾向にない。ＮＫ細胞はまた、活性化に応じた増殖能力が制限されており、それらはまた、急速に死に絶えてしまう。従って、身体における天然のＡＤＣＣ応答は、ＡＤＣＣエフェクターが罹病細胞を覆う抗体を認識するとしても、疾患進行（例えば、ウイルス感染、がん）によって圧倒されるリスクがある。
【０００９】
第２に、ＡＤＣＣエフェクター細胞の多くはまた、それらの免疫応答性を低下させる阻害性レセプターを発現し、それによってバランスおよびチェックのシステムを設けている。これらレセプターとしては、ＣＤ５６ｌｏｗ  ＮＫ細胞に対する阻害性ＫＩＲ（キラー免疫グロブリン様レセプター）、単球およびＢ細胞上のＦｃγＲＩＩｂ、ならびにＴ細胞に対するＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）およびＰＤ−１（プログラム死−１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ−Ｄｅａｔｈ−１）、ＣＤ２７９）が挙げられる。がん細胞およびウイルスは、このような阻害経路を異常に増幅することによって身体のＡＤＣＣベースの防御システムに逆らう。
【００１０】
第３に、ＡＤＣＣエフェクター細胞上の主要ＦｃレセプターであるＦｃγＲＩＩＩａは、抗体に対して比較的低い親和性（Ｋｄ  約１０−６Ｍ）を有する−−さらに、上記レセプターのＶ１５８改変体は、上記レセプターの無効なＦ１５８形態と比較して、２倍高いに過ぎない親和性を有する。これは、細胞表面標的の密度がいったんあるレベル未満に落ちた後、がん細胞が、一部の治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）に抵抗性になる１つの機構である。
【００１１】
増殖および親和性におけるその天然の限界、ならびに疾患（例えば、がんもしくは他の疾患）の設定において阻害性Ｆｃレセプターによるさらなる低下に鑑みれば、身体のＡＤＣＣ機能は、決して十分には理解されていない大きな潜在能力を有する。従って合成生物学は、ヒト疾患の防止および処置においてＡＤＣＣ活性の十分な潜在能力を発揮させる、新規かつ非常に望ましいアプローチを表す。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の簡単な要旨）
本発明により新たなアプローチがもたらされ、がん、感染および他の疾患に対する免疫系の防御が改善される。合成生物学および組換え技術のツールを使用して、本発明は、がんを含む多くの種類の疾患に対するＡＤＣＣ応答の有効性を大いに改善するＡＤＣＣエンハンサーもしくは増強システムを設計および構築することを目的とする。一局面において、本発明は、特異性を損なうことなしに、ＡＤＣＣ防御システムの「センサー」部分におけるその結合親和性を増強することによって、ＡＤＣＣ防御システムの検出感度および効率を改善する。別の局面において、本発明は、細胞傷害性エフェクター細胞の増殖能力を増強することによって、上記システムの「エフェクター」部分を改善する。好ましい実施形態において、上記局面のうちの１つより多くが組み合わされる。しかし、本発明の他の実施形態は、前述の本発明の局面のうちの１つを反映するに過ぎなくてもよい。
【００１３】
本発明のＡＤＣＣエンハンサーは、治療目的で投与される、天然に存在する抗体もしくは人工抗体によって認識もしくは結合される罹病細胞を標的とするために、抗体療法と組み合わせて、もしくはそれ自体でのいずれかで使用され得る。
【００１４】
ＡＤＣＣ増強システムの「センサー」部分に焦点を当てる第１の局面において、本発明は、野生型ヒトＣＤ１６（例えば、ヒトＣＤ１６の最も一般的な形態、Ｆ１５８改変体）の抗体親和性よりも高い抗体親和性を有するエクトドメイン（すなわち、細胞外ドメイン）を構築することを呈示する。これは、高親和性膜貫通Ｆｃレセプターを生じ、その細胞外部分は、既存のＦｃレセプターのエクトドメインに基づき得る。「キメラ」もしくは「融合」レセプターは、一部もしくは全体が、免疫系における別の高分子から取り入れられてもよいし、新たに作られてもよい。高親和性Ｆｃレセプターを有することにより、免疫エフェクター細胞が種々の抗体に共通する同じＦｃフラグメントを効率的に結合することができ、これは次いで、広く種々の細胞表面抗原を、ならびに、それによって広く種々の疾患および適応症を標的とすることを可能にする。これは、抗原依存性免疫療法（ここでは、各々の特異的抗原に対して毎回異なる抗体を構築する必要があり、時間および他の資源において高くつくプロセスである）と比較して、大いに有利である。
【００１５】
焦点がＡＤＣＣシステムの「エフェクター」部分へと移る第２の局面において、本発明は、いったん発現されるとＡＤＣＣエフェクター細胞の増幅を促進し得るモジュールを組み込む。
【００１６】
よって、一実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ１６のＦ１５８改変体の抗体Ｆｃ結合親和性よりも高い抗体Ｆｃ結合親和性を有するエクトドメイン、膜貫通ドメイン、ならびにＡＤＣＣ活性化および増幅を媒介するためのエンドドメインを含む膜貫通キメラレセプターをコードする遺伝子構築物を提供する。
【００１７】
本発明の遺伝子構築物は、ＤＮＡ分子もしくはＲＮＡ分子を含み得る。上記構築物は、（例えば、ヒトの）ＣＤ６４の実質的にＥＣ３エキソン、もしくはさらに（ヒト）ＣＤ６４の実質的にＥＣ１およびＥＣ２エキソンを含み得る。あるいは、本発明の遺伝子構築物は、実質的にＣＤ６４のエクトドメインを含むエクトドメインへと翻訳されるＲＮＡを含む。ある特徴において、上記エクトドメインは、ＣＤ６４中のエキソンもしくはドメインの境界に基づいて選択される。好ましくは、上記エクトドメインは、ヒトＣＤ１６のＶ１５８改変体よりも高いＦｃ親和性を有する。別の特徴において、上記膜貫通キメラレセプターは、融合タンパク質として発現される。また、上記エンドドメインは、ＣＤ３ζの、ＣＤ２８の、ＣＤ１３４の、ＣＤ１３７の、ＣＤ２７の、ＣＤ７９ａの、ＣＤ７９ｂの、ＣＤ４０の、およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの細胞内ドメインの一部もしくはすべてからなる群より選択され得る増幅モジュールを含み得る。
【００１８】
さらなる実施形態において、本発明は、上記の遺伝子構築物から翻訳される膜貫通キメラレセプターを提供する。１つの特徴において、本発明のレセプターのエクトドメインは、ＣＤ１６には存在しないＣＤ６４のエクトドメインにおける実質的に免疫グロブリン様折りたたみ、またはＣＤ６４の実質的にエクトドメインを含む。１つの特徴として、上記膜貫通ドメインは、ＣＤ１６の実質的に膜貫通ドメインを含む。上記レセプターは、宿主免疫エフェクター細胞の生存および増殖を増強するＡＤＣＣ増幅モジュールをさらに含み得る。上記増幅モジュールは、ＣＤ３ζの、ＣＤ２８の、ＣＤ１３４の、ＣＤ１３７の、ＣＤ２７の、ＣＤ７９ａの、ＣＤ７９ｂの、ＣＤ４０のおよびＧＭ−ＣＳＦレセプターの細胞内ドメインの一部もしくは全てからなる群より選択され得る。
【００１９】
別の実施形態において、本発明は、本発明の遺伝子構築物もしくはタンパク質をエキソビボで感染させたかもしくはトランスフェクトした免疫エフェクター細胞を提供する。上記免疫エフェクター細胞は、例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球、ナチュラルキラー細胞、好酸球、マクロファージ、好中球、好塩基球、単球、Ｂ細胞、および細胞傷害性因子を発現するかもしくは発現するように操作されている他の細胞であり得る。
【００２０】
さらに別の実施形態において、本発明は、本発明の遺伝子構築物、タンパク質、もしくは免疫エフェクター細胞、および薬学的に受容可能な賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。
【００２１】
さらなる実施形態において、本発明は、処置の必要性のある被験体を、ある状態について治療的にもしくは予防的に処置する方法を提供し、ここでこの方法は、上記被験体に、治療上もしくは予防上有効な量の本発明の薬学的組成物を投与する工程を包含する。1つの特徴において、上記方法は、上記状態を示す少なくとも１種の細胞表面抗原に対する治療用抗体を投与する工程をさらに包含する。上記免疫エフェクター細胞は、上記被験体に対して自己由来であり得、上記状態は、がん、炎症性疾患、自己免疫疾患、移植片拒絶および感染からなる群より選択され得る。１つの特徴において、本発明の薬学的組成物は、上記状態に対するワクチンとして投与される。
【００２２】
さらに別の実施形態において、本発明は、処置の必要性のある被験体を、ある状態について治療的もしくは予防的に処置する方法を提供し、ここでこの方法は、（ａ）上記被験体から単離された樹状細胞を抗原の供給源でプライミングする（ｐｒｉｍｉｎｇ）工程；（ｂ）上記プライミングされた樹状細胞を上記被験体に注入し戻す工程；（ｃ）上記被験体に、治療上もしくは予防上有効な量の本発明の薬学的組成物を投与する工程による。抗原供給源は、自己由来であってもよいし外来のものであってもよく、上記状態は、がん、炎症性疾患、自己免疫疾患、移植片拒絶および感染からなる群より選択され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、本発明に従うキメラ抗体レセプターの実施形態を模式的に示す。上記キメラレセプターは、抗体のＦｃ部分に対して比較的高い親和性を有する細胞外ドメインおよび比較的高い増殖刺激活性を有する細胞内シグナル伝達ドメインを有する。
【００２４】
【図２】図２は、ＣＤ１６およびＣＤ６４のタンパク質ドメイン構造を模式的に比較し、ここでＣＤ１６およびＣＤ６４の細胞外ドメインは、それぞれ２つおよび３つの免疫グロブリン折りたたみからなる。類似の濃淡は、相同な折りたたみを表す。
【００２５】
【図３】図３は、ＣＤ１６およびＣＤ６４のゲノムエキソンマップを模式的に比較する：分泌シグナル配列は、白であり、細胞外領域は、平行線の陰影を付けてあり、膜貫通および細胞内の領域は、黒である。イントロン領域もエキソン領域も、縮尺を合わせて描かれていない。
【００２６】
【図４】図４は、一実施形態に従う本発明のキメラレセプターを生成するためのクローニングストラテジーを模式的に図示する。脇にある文字は、クローニングの間に使用される制限酵素部位を示す：Ｈ−ＨｉｎｄＩＩＩ（「Ｈ」）、Ｂ−ＢａｍＨＩ（「Ｂ」）、およびＢｇ−ＢｇｌＩＩ（「Ｂｇ」）。
【００２７】
【図５】図５は、本発明の一実施形態に従うレセプターをクローニングするために使用される市販のレンチウイルスベクターのマップである。
【００２８】
【図６】図６は、本発明に従うレセプターをクローニングするために使用され得る代替のベクター構築物のマップである。
【００２９】
【図７】図７は、発現されたベクターが発したＧＦＰシグナルによって測定した場合の、（ａ）陰性コントロール、（ｂ）空のベクター、（ｃ）ＣＤ１６Ｖを発現するベクター、および（ｄ）ＣＤ６４−１６（エキソン）構築物を発現するベクターでトランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３細胞のフローサイトメトリー結果を示す。
【００３０】
【図８】図８は、蛍光タグ化抗ＣＤ１６（ＳＭＰＵＷおよびＣＤ１６Ｖ）もしくは抗ＣＤ６４（エキソン−融合物に基づくＣＤ６４−１６）が発した蛍光によって測定した場合の（ａ）陰性コントロール、（ｂ）空のベクター、（ｃ）ＣＤ１６Ｖを発現するベクター、および（ｄ）ＣＤ６４−１６（エキソン）構築物を発現するベクターでトランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３細胞のフローサイトメトリー結果を示す。
【００３１】
【図９】図９は、Ｅｘｐｉ２９３細胞を、（ａ）陰性コントロール、（ｂ）空のベクター、（ｃ）ＣＤ１６Ｖを発現するベクター、および（ｄ）ＣＤ６４−１６（エキソン）構築物を発現するベクターでトランスフェクトした後に、蛍光タグ化抗ヒトＩｇＧが発した蛍光によって測定した場合の、リツキシマブ（治療用抗体）で染色したＥｘｐｉ２９３細胞のフローサイトメトリー結果を示す。
【００３２】
【図１０】図１０は、ヒトＣＤ６４の細胞外領域が、ドメインベースのストラテジーを使用してヒトＣＤ１６の領域に融合されている（融合点はダッシュによって印を付けられている）、本発明の実施形態に従うキメラレセプターへと翻訳されるＤＮＡ配列（配列番号１）（上）を収載する。その対応するタンパク質配列（配列番号２）は、下に収載する。
【００３３】
【図１１】図１１は、ヒトＣＤ６４の細胞外領域が、エキソンベースのストラテジーを使用してヒトＣＤ１６の領域に融合されている（融合点はダッシュによって印を付けられている）、本発明の実施形態に従うキメラレセプターへと翻訳されるＤＮＡ配列（配列番号３）（上）を収載する。その対応するタンパク質配列（配列番号４）は、下に収載する。
【００３４】
【図１２】図１２は、その細胞内領域がヒトＣＤ２８、ヒトＣＤ１３４、ヒトＣＤ１３７およびヒトＣＤ３ζに由来する増幅モジュールからなる、本発明の一実施形態に従うキメラレセプターの細胞内領域のＤＮＡ配列（配列番号５）を収載する。その対応するタンパク質配列（配列番号６）は、下に収載する。スペーサー配列は、小文字で書かれる。
【００３５】
【図１３】図１３は、ヒトＣＤ６４の細胞外領域が、ドメインベースのストラテジーを使用してヒトＣＤ１６の領域へと融合され、図１３に示される増幅モジュールへとさらに融合される、本発明の実施形態に従うキメラレセプターに翻訳されるＤＮＡ配列（配列番号７）（上）を収載する。その対応するタンパク質配列（配列番号８）は、下に収載する。スペーサー配列は、小文字で書かれる。
【００３６】
【図１４】図１４は、ヒトＣＤ６４の細胞外領域が、エキソンベースのストラテジーを使用してヒトＣＤ１６の領域へと融合され、図１３に示される増幅モジュールへとさらに融合される、本発明の実施形態に従うキメラレセプターへと翻訳されるＤＮＡ配列（配列番号９）（上）を収載する。その対応するタンパク質配列（配列番号１０）は、下に収載する。スペーサー配列および変異配列は、小文字で書かれる。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．定義）
別段示されなければ、技術用語は、従来の使用法に従って使用される。分子生物学における一般用語の定義は、例えば、Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ，  Ｇｅｎｅｓ  ＶＩＩ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓにより出版，２０００  （ＩＳＢＮ  ０１９８７９２７６Ｘ）；  Ｋｅｎｄｒｅｗ  ｅｔ  ａｌ．（編）；  Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓにより出版，１９９４  （ＩＳＢＮ  ０６３２０２１８２９）；およびＲｏｂｅｒｔ  Ａ．  Ｍｅｙｅｒｓ（編），  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，Ｗｉｌｅｙ，  Ｊｏｈｎ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．により出版，  １９９５（ＩＳＢＮ  ０４７１１８６３４１）；ならびに他の類似の技術的参考文献に見出され得る。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「ａ（１つの、ある）」もしくは「ａｎ（１つの、ある）」とは、１またはそれより多くを意味し得る。用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む、包含する、含有する）」とともに使用される場合、本明細書で使用されるとおり、用語「ａ（１つの、ある）」もしくは「ａｎ（１つの、ある）」とは、１もしくは１より多くを意味し得る。本明細書で使用される場合、「ａｎｏｔｈｅｒ（別の、もう１つの）」とは、少なくとも第２のもしくはより多くを意味し得る。さらに、文脈から別段必要とされなければ、単数形の用語は、複数形を包含し、複数形の用語は単数形を包含する。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「約」とは、明示されていようが明示されていまいが、例えば、整数、分数、およびパーセンテージを含めた数値をいう。用語「約」は一般に、当業者がその記載される値と均等である（例えば、同じ機能もしくは結果を有する）とみなすある数値範囲（例えば、記載される値の±５〜１０％）をいう。いくつかの場合には、用語「約」とは、最も近い有効数字へと四捨五入される数値を含み得る。
【００４０】
ＣＤ１６は、２つの異なる形態（ＣＤ１６ａおよびＣＤ１６ｂ）として発現され、これらは、２つの異なるが非常に相同性の高い遺伝子の生成物である。ＣＤ１６ａは、ポリペプチドアンカーがある膜貫通タンパク質である一方で、ＣＤ１６ｂは、グリコシルホスファチジルイノシトールアンカーがあるタンパク質である。本明細書で使用される場合、ＣＤ１６は、当業者に明らかであるように、不適切でなければ、上記タンパク質の両方をいう。
【００４１】
本発明のＡＤＣＣエンハンサーは、細胞傷害性能力を有する任意の免疫エフェクター（細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）およびヘルパーＴ細胞を含めたＴ細胞、ＮＫ細胞（大顆粒リンパ球）、好酸球、マクロファージ、好中球、好塩基球、単球、およびＢ細胞が挙げられるが、これらに限定されない）の中に組み込まれ得る。本発明のエフェクター細胞は、自己由来であっても、同系（syngeneic）であっても、同種異系（allogeneic）であってもよく、選択は、処置される予定の疾患および利用可能な手段に依存する。
【００４２】
（ＩＩ．組成物）
本発明は、以下の顕著な特徴のうちの１つまたはそれより多くを有するＡＤＣＣ増強システムを開発する：（ａ）標的細胞の表面に結合した抗体のＦｃフラグメントに対して改善された親和性を有するキメラレセプターをコードする遺伝物質；（ｂ）天然に存在するかもしくは治療用の抗体によってタグ化される標的とした罹病細胞と結合するとＡＤＣＣエフェクター細胞の増殖および生存を増強するタンパク質および／もしくはＲＮＡモジュールをコードする遺伝物質；（ｃ）ＡＤＣＣ応答の効率を増幅するタンパク質および／もしくはＲＮＡモジュールをコードする遺伝物質。この目的に向けて、このような成分をコードする遺伝子構築物は、ＡＤＣＣ増強システムとして、インビボもしくはエキソビボのいずれかで、宿主（例えば、患者被験体）の細胞の中へと導入される：
【００４３】
ＡＤＣＣを活性化し、エフェクター増殖をもたらす膜貫通および細胞内ドメインに融合された高親和性のＦｃ結合エクトドメインを含むキメラレセプター（図１）。
【００４４】
（１）キメラレセプター
上記エフェクターに依存して、上記キメラレセプターは、上記エフェクターの天然の構成要素の部分、例えば、天然のレセプターのエクトドメイン、膜貫通ドメインおよび／もしくは細胞内ドメインの一部もしくは全てを含み得る。本発明によって企図される宿主は、高等脊椎動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトである。本発明のキメラレセプターは、細胞外ドメイン（エクトドメイン）、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメイン（細胞質ドメインもしくはエンドドメイン）を含む。
【００４５】
（１）（ａ）エクトドメイン
図１を参照すると、一実施形態（左側）において、本発明のキメラレセプターは、ＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）のエクトドメインの一部もしくは全てを組み込む。ＣＤ６４およびＣＤ１６の両方が、抗体のＦｃ領域に結合する一方で、前者は、約１００〜１０００倍高い親和性を有する。高親和性ＦｃレセプターであるＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）（ＫｄはＩｇＧ１およびＩｇＧ３に関して約１０−９Ｍ）は、単核ファゴサイト系統（例えば、マクロファージおよび好中球）の全ての細胞に存在し、抗体媒介性ファゴサイトーシスおよびメディエーター放出を担う。図２に示されるように、ＦｃγＲＩは、細胞外ドメインが抗体への結合を担う３つの免疫グロブリンドメインから構成される糖タンパク質α鎖を含み、３つ全ての存在が抗体との高親和性相互作用に重要であることが示された。対照的に、ＣＤ１６のエクトドメインは、２個の免疫グロブリン様ドメインを有するのみである。ＣＤ６４における余分の免疫グロブリン様折りたたみの存在は、その高いＦｃ親和性の強力な決定因子であり得る。その程度まで、本発明はまた、抗体に対する高親和性レセプターを構築するために、ＣＤ６４におけるこの余分の免疫グロブリン様折りたたみもしくはその変異バージョンのみを、ＣＤ１６のエクトドメインの中に挿入することを企図する。
【００４６】
本発明の実施形態によれば、ＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）のエクトドメインは、ＡＤＣＣを媒介する高親和性Ｆｃレセプターを生成するために、任意の適切な膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインへと融合される。好ましい実施形態において、ヒトＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）のエクトドメインは、ヒトＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）の一部、例えば、ＣＤ１６の、好ましくは、ＣＤ１６ａ（ＦｃγＲＩＩＩａ）の、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインの両方に融合される。有利なことには、上記エクトドメインが身体に対して天然である場合、この実施形態におけるキメラレセプターは、同系のものであり、それゆえ、非免疫原性である。
【００４７】
図１に示されるように、本発明のキメラレセプターの細胞内ドメイン中には、さらなるモジュールがあり得る。これは、増殖および増幅（expansion）シグナルを増幅し得る１もしくはそれより多くのモジュール（例えば、ＣＤ２８）、上記エフェクター細胞の生存を促進しかつ活性化誘導性アポトーシスを防止する１もしくはそれより多くのモジュール（例えば、ＣＤ１３４およびＣＤ１３７）、増殖および細胞傷害性に関するシグナル伝達を活性化もしくはブーストする１もしくはそれより多くのモジュール（例えば、ＣＤ３ζ）を含み得る。これら増幅モジュールおよび刺激モジュールの詳細は、以下の節にさらに記載される。
【００４８】
（１）（ｂ）膜貫通ドメイン
本発明のキメラレセプターの膜貫通ドメインは、（好ましくは安定した様式で）細胞膜にまたがり得る任意の適切な疎水性領域であり得る。好ましい実施形態において、上記膜貫通ドメインは、上記細胞内ドメインのその隣接する成分に対して天然である。例えば、図１に示されるように、膜に最も近い細胞内ドメインの成分もしくは領域がＣＤ１６に由来する実施形態において、上記膜貫通ドメインは、好ましくは、ＣＤ１６の膜貫通ドメインである。
【００４９】
（１）（ｃ）エンドドメイン
（１）（ｃ）（ｉ）ＡＤＣＣのシグナル伝達
再び図１を参照すると、本発明の種々の実施形態において、上記キメラレセプターは、ＡＤＣＣに関する１もしくはそれより多くのシグナル伝達モジュールを含む。ＣＤ１６は、我々の身体においてＡＤＣＣ活性の大部分を担うエフェクター細胞（特にＮＫ細胞）を活性化する天然の抗体レセプターである。よって、種々の実施形態において、本発明のキメラレセプターのエンドドメインは、ＣＤ１６（好ましくは、ＣＤ１６ａ）の細胞内ドメインの一部もしくは全体を含む。ＣＤ１６ａと類似のＩＴＡＭドメインを共有する、ＣＤ３ζのような他のモジュールもまた、ＡＤＣＣシグナル伝達に寄与するように含まれ得る。いくつかの実施形態において、ＣＤ３ζは、上記ＣＤ１６ａ細胞内ドメインが、他の共刺激分子もしくはエレメントとタンデムに発現される限りにおいて、ＡＤＣＣシグナル伝達に必要とされなくてもよい。逆に言えば、ＣＤ３ζのようなモジュールは、ＣＤ１６の細胞内ドメインの機能を置換し得、それを不要にし得る。
【００５０】
（１）（ｃ）（ｉｉ）増幅モジュール
図１に示されるように、本発明のキメラレセプターは、ＡＤＣＣ応答を増幅するためのエレメントを含み得る。エフェクター細胞に依存して、１もしくはそれより多くの増幅モジュールが上記キメラレセプターの中に含められ得、種々の機能を提供する。以下のモジュールは、非限定的な例としてかつ例証目的で記載される。
【００５１】
一実施形態において、本発明のキメラレセプターのエンドドメインは、ＣＤ３ζの細胞内ドメインの一部もしくは全体を含む。Ｔ細胞表面に対して天然のマーカーであるＣＤ３ζは、リンパ球（例えば、Ｔ細胞）活性化および増殖に対する刺激効果を有し、大いに増幅された細胞傷害性Ｔ細胞応答をもたらすことが示された。
【００５２】
種々の実施形態において、１もしくはそれより多くのさらなる共刺激モジュールは、活性化効果が有意により長い時間にわたって持続し、それによって、増殖および増幅の潜在能力を増大するように、本発明のキメラレセプターに付加される。一例は、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメインであり、これは、抗原依存性レセプターにおいてＴＣＲζドメインとともに発現される場合に、Ｔリンパ球の生存および増殖を増強することが示されている（Ｋｒａｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １８８：６１９−２６，  １９９８）。本発明のキメラレセプターへと組みこまれ得る他の選択肢モジュールとしては、活性化誘導性アポトーシスを防止することによってエフェクター細胞の生存をブーストすることに関する腫瘍壊死因子レセプターファミリーのメンバー（例えば、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７）の細胞内ドメイン（例えば、Ｆｉｎｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２００４，  １７２：１０４−１３を参照のこと）が挙げられる。いくつかのもしくは複数の細胞タイプにおいて増殖を補助し得る他の細胞内ドメインは、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ４０、およびＧＭ−ＣＳＦレセプターに見出される。
【００５３】
（２）細胞発現
標準的組み換え技術を使用して、上記キメラレセプターの発現カセットのうちの１もしくはそれより多く以上が構築され、ベクター、例えば、プラスミド、アデノウイルス由来ベクター、レトロウイルス、もしくはレンチウイルスのベクターへとクローニングされる。上記ベクターは、免疫エフェクター細胞の任意のタイプへとトランスフェクトされる（またはウイルス媒介性遺伝子組み込みの場合には形質導入される）。レトロウイルス形質導入は、公知の技術（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｂｌｏｏｄ  １１４，  ５３５−４６，  ２００９）のもの）を使用して行われ得る。上記キメラレセプターの成功したトランスフェクションおよび表面呈示は、従来の手段を使用して、例えば、フローサイトメトリーによって確認される。
【００５４】
一実施形態において、免疫エフェクター細胞は、ヒト患者由来の全血から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）として抽出され、これは、リンパ球（ＣＤ４＋  Ｔ細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞）、単球、マクロファージなどを含む。必要に応じて、エフェクター細胞は、本発明を実施するために、ＰＢＭＣの選択された部分セットを富化することによってさらに調製される。特定の実施形態において、Ｂ細胞は、細胞混合物から取り出される。
【００５５】
形質導入した細胞が抗体を結合する能力は、フローサイトメトリーを使用して明らかにされる。細胞が抗体被覆細胞を結合し、サイトカインを放出し、ＡＤＣＣを果たし、そして増殖する能力は、当業者に周知の標準的なアッセイおよびモデル（例えば、マウス異種移植片モデル）を使用して、エキソビボおよびインビボで試験および確認される。
【００５６】
（ＩＩＩ．治療剤およびワクチン）
がんに関するＡＤＣＣエンハンサーの臨床的関係は、治療用抗体とともにヒトがん細胞を使用して明らかにされ得る。例えば、Ｄａｕｄｉ細胞は、（１）リンパ腫、自己免疫疾患および移植片拒絶に関わるＣＤ２０を標的とし、エフェクター細胞活性化、脱顆粒および増殖を生じるリツキシマブ（商用名リツキサン（登録商標））、ならびに（２）ＡＤＣＣエンハンサーで形質導入された免疫エフェクター細胞で処理される。標的細胞殺傷もまた、観察される。インビボ試験は、非常に少ないＴ細胞およびＢ細胞を有しかつＮＫ細胞を有さない市販のＮＯＤ．ｓｃｉｄ．ＩＬ２Ｒγ−／−マウスを使用して行われる。あるいは、非常に低いＴ細胞およびＢ細胞を有し、低下したＮＫ細胞を有するＮＯＤ．Ｓｃｉｄマウスが、使用される。これらマウスは、標識されたＤａｕｄｉ細胞が移植され、任意の適切な画像化技術を使用して腫瘍増殖が観察および測定される。リツキシマブおよびＡＤＣＣエンハンサーで形質導入された免疫エフェクター細胞を受容するマウスにおいて、継続した期間の腫瘍寛解、退縮、もしくは長期にわたって進行しないことが観察される。
【００５７】
別の例では、ＳＫ−ＢＲ−３細胞もしくはＭＣＦ−７細胞は、（１）ＡＤＣＣエンハンサーで形質導入された免疫エフェクター細胞、ならびに（２）乳がんに関わるＨＥＲ２／ｎｅｕを標的とし、エフェクター細胞活性化、脱顆粒および増殖を生じるトラスツズマブ（商用名ハーセプチン（登録商標））で処理される。標的細胞殺傷もまた、観察される。上記ＡＤＣＣエンハンサーのインビボ抗腫瘍有効性は、直ぐ上に記載される例に類似のマウスモデルで観察される。
【００５８】
自己免疫における上記ＡＤＣＣエンハンサーの臨床上の使用は、この種の疾患に関して十分確立されたマウスモデルのうちの１つを使用して明らかにされ得る。例えば、抗体媒介性Ｂ細胞枯渇は、ＮＯＤマウスにおいて１型糖尿病を防止およびさらには逆転させることが示された。しかし、この効果は、Ｆｃレセプターの低親和性によって制限される（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  ２００７，  １１７（１２）：３８５７−６７；  Ｘｉｕ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００８，  １８０（５）：２８６３−７５）。コントロールマウスは、抗ＣＤ１９抗体もしくは抗ＣＤ２０抗体のいずれかのみ、または本発明のＡＤＣＣエンハンサーで形質導入されたかもしくは別の方法でこれを発現するマウス免疫エフェクター細胞と組み合わせて受容するマウスと比較される。上記ＡＤＣＣエンハンサーを受容するマウスは、疾患の発現の遅延または症状の継続した逆転を示す。
【００５９】
類似の実験は、抗体媒介性枯渇が、多発性硬化症もしくは実験的自己免疫性脳脊髄炎（Ｂａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．  ２０１２，  ２０９（５）：  １００１−１０））、関節炎（Ｙａｎａｂａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００７，  １７９（２）：  １３６９−８０）などのような疾患に影響を及ぼすことが示された他のマウスモデルにおいて行われ得る。
【００６０】
ウイルス感染（例えば、ＨＩＶ感染）における上記ＡＤＣＣエンハンサーの臨床上の使用は、抗体の組み合わせでの処置がＨＩＶ複製をコントロールすることが示された（Ｎａｔｕｒｅ，  ２０１２，  ４９２（７４２７）：  １１８−２２）十分に確立されたヒト化マウスモデルを使用して明らかにされ得る。ヒト化マウスは、ＮＯＤ．ＲＡＧ１−／−．ＩＬ２Ｒγ−／−マウスをヒト胎児肝臓由来ＣＤ３４＋造血幹細胞で再構成することによってまず生成される。これらマウスは、完全にヒトの免疫系を有し、ＨＩＶによって感染され得、ヒト抗体に対して負に（ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ）反応しない。感染したコントロールマウスは、中和抗体カクテル単独もしくは本発明のＡＤＣＣエンハンサーで形質導入されたヒト免疫エフェクター細胞との組み合わせのいずれかを受容するマウスと比較される。上記ＡＤＣＣエンハンサーを受容するマウスは、ウイルス血症の継続した低減およびＴ細胞数の回復を示す。
【００６１】
上記ＡＤＣＣエンハンサーの臨床効力を試験するための代替のモデルシステムは、中和抗体が疾患の急激な発症を防止することが示されたサル−ヒト免疫不全ウイルス（ＳＨＩＶ）感染アカゲザル幼獣モデルである（Ｊａｗｏｒｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ２０１３，  ８７（１９）：  １０４４７−５９）。感染したコントロールアカゲザルは、中和抗体カクテル単独もしくは本発明のＡＤＣＣエンハンサーで形質導入された免疫エフェクター細胞との組み合わせのいずれかを受容するアカゲザルと比較される。上記ＡＤＣＣエンハンサーを受容するアカゲザルは同様に、ウイルス血症の継続した低減およびＴ細胞数の回復を示す。
【００６２】
本発明のＡＤＣＣ増強システムをコードするＤＮＡ構築物およびＲＮＡ構築物は、当業者に公知の技術を使用して被験体への投与のために製剤化され得る。上記ＡＤＣＣ増強システムをコードするＤＮＡ構築物およびＲＮＡ構築物を含む製剤は、薬学的に受容可能な賦形剤を含み得る。上記製剤に含まれる賦形剤は、例えば、使用される遺伝子構築物もしくはエフェクター細胞の種類、および投与様式に依存して種々の目的を有する。一般に使用される賦形剤の例としては、食塩水、緩衝化食塩水、デキストロース、注射用水、グリセロール、エタノール、およびこれらの組み合わせ、安定化剤、可溶化剤および界面活性剤、バッファーおよび保存剤、等張化剤（tonicity  agent）、増量剤、ならびに滑沢剤が挙げられるが、これらに限定されない。上記ＡＤＣＣエンハンサーを発現する免疫エフェクター細胞の集団は、代表的には、エキソビボで調製され培養される。
【００６３】
本発明の一方法の実施形態において、被験体由来の全血から抽出される免疫エフェクター細胞は、まず、エキソビボで本発明のＡＤＣＣエンハンサーをコードする組換えレンチウイルス（もしくは任意の他の遺伝子治療ベクター、例えば、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶなど）に感染させられる。上記感染したＰＢＭＣ細胞は、次いで、トランスフェクションが成功したことを確認した後に、その同じ患者被験体に注入し戻される。上記患者被験体へと輸注された免疫エフェクター細胞は、次いで、抗体で被覆された腫瘍細胞を含めた罹病細胞を見つけ出して破壊するようになる。この方法の実施形態を実施するために、本発明は、医師によって使用される予定の、本発明の製剤化された遺伝子構築物、および必要に応じて、ＰＢＭＣ細胞を調製するための薬剤、ならびに説明書を含むキットを提供する。この方法の改変された実施形態は、ＰＢＭＣに由来する細胞の部分セットを感染させるかもしくはトランスフェクトする工程を包含する。これは、上記ＰＢＭＣを、特定の細胞タイプの増殖を優先的に支援する条件下で培養することによって、あるいは蛍光活性化セルソーティングもしくは磁性活性化セルソーティング、または両方の組み合わせのような陽性選択技術もしくは陰性選択技術を通じて細胞を選択することによって、達成され得る。本発明の代替の方法の実施形態は、標準的なトランスフェクション技術を使用する、ＰＢＭＣもしくは精製された細胞サブセットへと上記レセプターに関するＤＮＡ構築物もしくはＲＮＡのトランスフェクションである。
【００６４】
本発明の別の実施形態において、上記製剤は、リポソームもしくはナノ粒子ベースの技術によって送達される、上記ＡＤＣＣエンハンサーをコードする遺伝子構築物を含み、そして当業者に公知の様式および技術を使用して、被験体に投与され得る。例示的な様式としては、静脈内注射が挙げられるが、これらに限定されない。他の様式としては、腫瘍内、皮内、皮下（ｓ．ｃ．、ｓ．ｑ．、ｓｕｂ−Ｑ、Ｈｙｐｏ）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、動脈内、髄内（ｉｎｔｒａｍｅｄｕｌｌａｒｙ）、心内、関節内（関節）、滑液嚢内（関節液領域）、頭蓋内、脊髄内（ｉｎｔｒａｓｐｉｎａｌ）、および髄腔内（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）（脳脊髄液）が挙げられるが、これらに限定されない。上記製剤の非経口注射もしくは注入のために有用な任意の公知のデバイスは、このような投与をもたらすために使用され得る。
【００６５】
被験体に投与される上記ＡＤＣＣエンハンサーをコードする遺伝子構築物を含む製剤は、特定の適応症もしくは疾患の処置および／もしくは予防に有効である多くの遺伝子構築物もしくはエフェクター細胞を含む。従って、上記ＡＤＣＣエンハンサーをコードする治療上有効な遺伝子構築物は、本発明の方法が実施される場合に被験体に投与される。一般に、約１×１０４〜約１×１０１０の間のエフェクター細胞を含む細胞ベースの製剤が投与される。大部分の場合、上記製剤は、約１×１０５〜約１×１０９の間のエフェクター細胞を含む。しかし、被験体に投与されるエフェクター細胞の数は、がんもしくは疾患の位置、源、正体、程度および重篤度、処置される予定である個体の年齢および状態などに依存して、広い範囲の間で変動する。医師は、使用される予定の適切な投与量を最終的に決定する。
【００６６】
本明細書で使用される場合、用語「ｔｒｅａｔ（処置する、処理する）」、「ｔｒｅａｔｉｎｇ（処置する、処理する）」、および「ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（処置、処理）」は、それらの通常のおよび慣習的な意味を有し、以下のうちの１以上を含む：被験体における疾患（例えば、がん）の症状を、重篤度および／もしくは頻度において、ブロック、改善もしくは低下させること、ならびに／あるいは被験体におけるがん細胞の成長、分裂、拡散もしくは増殖、またはがんの進行（例えば、新たな腫瘍の出現）を阻害すること。処置とは、本発明の方法が実施されなかった被験体と比較して約１％〜約１００％、ブロック、改善、低減もしくは阻害することを意味する。好ましくは、ブロック、改善、低減もしくは阻害は、本発明の方法が実施されなかった被験体と比較して約１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％もしくは１％である。
【００６７】
本発明のＡＤＣＣエンハンサーを発現する免疫エフェクター細胞の治療剤および予防剤の両方としての臨床有効性は、樹状細胞（ＤＣ）の使用を通じて、必要に応じて増強され得る。リンパ系器官において、ＤＣは、Ｔヘルパー細胞に抗原を提示し、これは次に、ＣＴＬ、Ｂ細胞、マクロファージ、好酸球およびＮＫ細胞を含む免疫エフェクターを調節する。ＨＩＶ抗原を発現するように操作されたかまたは外来のＨＩＶタンパク質をパルス添加された自己由来ＤＣが、ＨＩＶに対してインビトロでＣＴＬをプライミングし得ることが報告された（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １９９９，  １６２：３０７０−７８）。従って、本発明の一実施形態において、ＤＣは、被験体患者からまず単離され、次いで、標的抗原（例えば、ある種の腫瘍関連抗原または被験体患者もしくは外来の供給源に由来し得る疾患の他の表面マーカー）の供給源とともにインキュベートすることを通じてエキソビボでプライミングされる。これらＤＣは、自己由来ＣＴＬおよび／もしくは本発明のＡＤＣＣ増強システムでトランスフェクトされた他のエフェクター細胞によるか、または上記ＡＤＣＣ増強システムをコードするＤＮＡ構築物およびＲＮＡ構築物を含む製剤による処置の前に、上記患者へと最終的には注入し戻される。これは、ＤＣの助けを借りて、上記ＡＤＣＣエンハンサーを使用する増強された処置およびワクチンのモデルを提供する。
【００６８】
本発明はまた、薬学的に受容可能な賦形剤とともにある量の本発明のＡＤＣＣエンハンサーをコードする遺伝子構築物で満たされた１もしくはそれより多くの容器を含むキットを提供する。上記キットはまた、使用説明書を含み得る。医薬品もしくは生物学的製品の製造、使用もしくは販売を規制する政府機関によって指定された形態の注意書きがさらに、上記キットと関連づけられ得、この注意書きは、ヒトへの投与のための製造、使用もしくは販売についての上記機関による承認を反映する。
【実施例】
【００６９】
ＩＶ．実施例
（１）キメラレセプター
【００７０】
本発明の実施形態に従って、上記キメラＡＤＣＣ増強レセプターのエクトドメインを、２つの方法で生成した：
【００７１】
（ａ）ドメイン融合：  ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）のエクトドメインと膜貫通領域との間の推定されるアミノ酸境界に基づいて、ヒトＦｃγＲＩの推定されるエクトドメインを、ヒトＦｃγＲＩＩＩの膜貫通領域および細胞内領域に融合した。融合レセプターにおける得られた領域のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号１および２）を、図１０に示す。明らかに、配列番号１以外のＤＮＡ配列もまた、配列番号２のタンパク質へと翻訳し得、それらＤＮＡ配列はまた、本願全体を通じて、この場合および類似の場合に本発明によって企図される。
【００７２】
（ｂ）エキソンベースの融合体：  ＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩＩにおけるエキソン境界に基づいて、ヒトＦｃγＲＩの推定されるエクトドメインを、ヒトＦｃγＲＩＩＩの膜貫通領域および細胞内領域に融合した。図３に示されるように、両方のタンパク質は、分泌ペプチドをコードする２個のエキソン（Ｓ１およびＳ２）、続いて、細胞外領域をコードする３個のエキソン（ＣＤ６４）もしくは２個のエキソン（ＣＤ１６）を有する。具体的には、ＣＤ６４のＳ１からＥＣ３までのエキソンを、ＣＤ１６におけるＴＭ／Ｃエキソンと融合した。融合レセプターにおいて得られた領域のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号３および４）を、図１１に示す。
【００７３】
上記キメラレセプターを作製するために、ヒトＣＤ６４およびＣＤ１６のｃＤＮＡクローンを、Ｏｒｉｇｅｎｅから得た（種々の他の業者からも入手可能）。隣接プライマーを設計および合成して、上記ｃＤＮＡの選択された部分を増幅し、ＰＣＲを使用して組換えにより結合させて１つのベクターにした。プライマーは、上記融合構築物を生成するためのクローニングおよび種々の市販のベクターへのサブクローニングを容易にする制限部位を含んだ。標準的な制限消化およびライゲーションの手順を、全体を通じて使用した。
【００７４】
ここで図４を参照すると、ヒトＣＤ６４のエクトドメインを、ヒトＣＤ１６の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインへといったん融合した後、それらをさらに、種々のヒトタンパク質において見出される種々の増幅モジュール（具体的には、ＣＤ２８（ａ．ａ．  １６２〜２０２）、ＣＤ１３４（ａ．ａ．  ２１３〜２４９）、ＣＤ１３７（ａ．ａ．  １８７〜２３２）およびＣＤ３ζ（ａ．ａ．  ３１〜１４２）（全てのアミノ酸位置は、成熟タンパク質配列に基づく））に融合した。変異を、以下のとおりアスタリスクによって印を付けたとおりに配列の中に導入した：市販のＣＤ１６  ｃＤＮＡは、復帰した多型を有する。さらに、表面発現を下方調節することが公知のＣＤ２８中のジロイシンモチーフを変異させた。各モジュールを、２個のスペーサーアミノ酸を導入した−ＧＧＡＴＣＴ−配列によって分離した。上記融合レセプターにおいて得られた領域のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号５および６）を、図１２に示す。ＣＤ６４、ＣＤ１６および上記の４個の増幅モジュール（配列番号７〜１０）に由来する領域を伴う融合体／キメラレセプター全体のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、それぞれ、図１３（ドメイン融合体）および図１４（エキソンベースの融合体）に示す。ヒトＣＤ１６の「高親和性」変異体（Ｖ１５８）を、コントロールとして使用した。
【００７５】
次いで、上記キメラレセプターを、代理マーカーあり（例えば、図５に示されるｐＳＭＰＵＷ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ）もしくは代理マーカーなし（例えば、図６に示されるｐＳＭＰＵＷ−ｐｕｒｏ）のいずれかで、市販のレンチウイルスベクターへとクローニングした。
【００７６】
ｐＳＭＰＵＷ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（図５）では、ＧＦＰ発現を、キメラレセプターへと内部リボソーム進入部位を通じて連結した。ｐＳＭＰＵＷ−ｐｕｒｏベクター中のピューロマイシンカセットを使用して、安定しかつ成功したクローンを選択できた。しかし、本発明によって企図された治療的使用に関しては、図６に×印で示されているとおり、ＧＦＰおよびＰｕｒｏカセットの両方を除去して、ベクターのサイズを最小限にした。レセプター発現は、上記キメラレセプターがエキソンベースの融合を使用して生成された場合にのみＧＦＰ発現と相関し、従って、上記キメラレセプターのそのバージョンを、本明細書において好ましくかつデフォルトの実施形態となった。
【００７７】
（２）細胞発現
【００７８】
レンチウイルスベクター（ｐＳＭＰＵＷ）を、２９３Ｔ細胞もしくはＥｘｐｉ２９３細胞においてトランスフェクトして、フローサイトメトリーによって上記のキメラレセプターの発現を試験した。トランスフェクションを上記の手順に類似の標準的手順で行った。ｐＳＭＰＵＷ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰの場合には、トランスフェクションの２〜３日後に、ＧＦＰ発現を通じて、トランスフェクションをまず確認した（図７）。次に、本発明のキメラレセプターの発現を、市販の蛍光タグ化抗ＣＤ１６抗体もしくは抗ＣＤ６４抗体で上記細胞を染色し、得られた蛍光を測定することによって確認した（図８）。
【００７９】
上記レセプターの発現は、ＩＲＥＳエレメントとともにＧＦＰ発現に連鎖しているので、レセプター発現を、ＧＦＰ発現に相関させた。抗体での染色を、代表的には、１０６細胞を採取し、５％  ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むかもしくは含まないリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）で洗浄することによって達成した。細胞を、３０分間４℃でＰＢＳ−ＦＢＳ中、適切な量の抗体の存在下でインキュベートした。細胞を、ＰＢＳ中で再度洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。
【００８０】
ドメイン融合ストラテジーを使用して作製した上記ＣＤ６４−ＣＤ１６キメラレセプターは、上記エキソンベースの融合を使用して作製したものより遙かに弱い発現（データは示さず）を示した。
【００８１】
上記ｐＳＭＰＵＷベクターを、市販のヘルパープラスミドで共トランスフェクトして、レンチウイルス粒子を作製した。トランスフェクションの成功を、ＧＦＰおよび／もしくはレセプター発現を分析することによって確認した。
【００８２】
（３）治療剤親和性
【００８３】
ヒト抗体の結合に関して上記キメラレセプターの能力を試験するために、細胞を、市販のリツキシマブ（リツキサン）抗体で上記のようにまず「染色」（ｓｔａｉｎ）した。簡潔には、１０６細胞を採取し、ＰＢＳで洗浄し、３０分間４℃において０．１μｇ／ｍｌのリツキシマブとともにインキュベートした。細胞を、ＰＢＳ中で再度洗浄し、蛍光タグ化ヤギ抗ヒトＩｇＧ（リツキシマブもしくは任意の他のヒトＩｇＧに結合する抗体）で染色した。
【００８４】
本発明者らの試験条件下では、エキソンベースの融合ストラテジーで作製した上記ＣＤ６４−ＣＤ１６キメラレセプターは、ＣＤ１６の基準Ｖ１５８バージョンより有意に良好なリツキシマブへの結合を示した（図９）。類似の実験を、他の治療用抗体でも行う。
【００８５】
機能性のさらなるレベルは、抗体被覆標的細胞を結合する能力である。試験するために、標的細胞、例えば、Ｄａｕｄｉ（バーキットリンパ腫系統）細胞を、細胞追跡試薬、例えば、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｆａｒ  Ｒｅｄ  ＤＤＡＯ−ＳＥでまず蛍光標識する。これは、５×１０６細胞を採取し、これらをＰＢＳで洗浄し、次いで、５分間適切な量の試薬とともにインキュベートすることによって、代表的には行われる。その反応を、過剰量のＰＢＳ−ＦＢＳを添加することによって停止させ、次いで、上記細胞を、ＰＢＳで２回洗浄する。次いで、その標識された細胞を、上記のようにリツキシマブで被覆する。リツキシマブは、Ｄａｕｄｉ細胞で発現された細胞表面ＣＤ２０分子に結合する。上記リツキシマブ被覆細胞を、次いで、種々のキメラレセプターを発現する細胞とともに６０分間３７℃においてインキュベートして、フローサイトメトリーによって測定されるとおりの、それらが異種凝集物（ＧＦＰ＋，  ＣｅｌｌＴｒａｃｅ＋）を形成する能力を試験する。ＧＦＰのような代理マーカーなしのレンチウイルスベクターを使用する場合、上記キメラレセプターを発現する細胞はまた、適合性の色素（例えば、ＣＦＳＥ）で染色される必要がある。
【００８６】
類似の実験は、他の細胞株と適切な標的化抗体とを用いて、例えば、Ｒａｊｉ細胞もしくはＲａｍｏｓ細胞とリツキシマブとを用いて、ＳＫ−ＢＲ−３（乳がん）細胞とトラスツズマブとを用いて（など）行われ得る。
【００８７】
（４）免疫エフェクター細胞
【００８８】
レンチウイルス粒子を２９３Ｔ細胞において作製した後、それらを、Ｔ細胞におけるレセプターの機能性を試験するために使用し得る。例えば、Ｊｕｒｋａｔ（急性Ｔ細胞白血病）細胞は、初代Ｔ細胞についての一般に使用される代理である。上記レセプターの機能性は、２９３Ｔ細胞において上記で記載されるのとほぼ同じ方法で明らかにされる。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、標準的なスピノキュレーション（ｓｐｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）法を使用して感染させる。代表的には、１００μｌ中の２×１０５細胞を、９６ウェルプレートにプレートする。適切な量のウイルス上清を、ポリブレン（４μｇ／ｍｌ）とともに添加し、２時間にわたって３０℃で、３５０×ｇにおいて遠心分離する。細胞を、感染の２日後またはそれより後に分析する。ｐｕｒｏＲ含有レンチウイルスベクターの場合には、ピューロマイシンで上記細胞を選択することによって安定な系統が生成され得る。
【００８９】
類似の方法を使用して、抗ＣＤ３／ＣＤ２８での活性化後にナイーブ初代Ｔ細胞を感染させる。Ｊｕｒｋａｔ細胞もしくは２９３細胞に類似の分析の他に、本発明のレセプターの能力は、活性化、増殖および細胞傷害性の誘導について明らかにされ得る。代表的には、増殖を測定するために、１０６の形質導入した細胞を、５０  ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で増殖させる。リツキシマブ被覆Ｄａｕｄｉ細胞を、１：１の比で異なる日に、この培養物に添加する。上記のように、他の抗体被覆細胞をまた、これら実験において使用し得る。理想的には、上記標的細胞（例えば、Ｄａｕｄｉ）を、マイトマイシンＣで予備処理して、増殖を停止させる。Ｔ細胞増殖を、フローサイトメトリーもしくは他の旧来からの方法（例えば、チミジン組み込み、ＣＦＳＥ希釈など）によって測定する。
【００９０】
リソソーム結合膜タンパク質−１（ＬＡＭＰ−１もしくはＣＤ１０７ａ）は、刺激後の溶解顆粒（ｌｙｔｉｃ  ｇｒａｎｕｌｅ）のＣＤ８＋  Ｔ細胞およびＮＫ細胞脱顆粒のマーカーとして記載されてきた。上記の共存培養実験では、ＣＤ１０７ａ＋  Ｔ細胞のレベルを、脱顆粒の尺度としてフローサイトメトリーによって分析し得る。
【００９１】
細胞傷害性を評価するために、Ｔ細胞を、適切な治療用抗体の存在下で、ＣｅｌｌＴｒａｃｅタグ化標的細胞とともに数時間にわたって共存培養する。生きている標的細胞のレセプター形質導入依存性で抗体依存性の枯渇が観察される。これは、ヨウ化プロピジウムもしくは７−ＡＡＤを使用するフローサイトメトリーによって測定され得る。
【００９２】
（５）インビボでの抗腫瘍活性
【００９３】
抗腫瘍活性は、ジャクソン研究所のＮＳＧマウスを使用して標準的異種移植片腫瘍モデルによって明らかにされる（Ｓｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００７  Ｆｅｂ；７（２）：１１８−３０を参照のこと）。ＮＳＧマウスは、機能的なＴ細胞、Ｂ細胞またはＮＫ細胞を欠いており、重症の免疫不全であり、初代ヒト細胞の生着（ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ）に理想的である。他の類似のマウス系統、例えば、ＮＯＧマウスもまた使用され得る。
【００９４】
例えば、ルシフェラーゼ発現標的腫瘍細胞を、腹腔内に（ｉ．ｐ．  ０．３×１０６細胞／マウス）注射する。マウスを、リツキシマブ（１５０μｇ）およびレセプター形質導入Ｔ細胞（１０７細胞）で、数日後に１０００〜２０００ＩＵのＩＬ−２でｉ．ｐ．で処理した。コントロールとして、リツキシマブ、上記レセプターもしくはＴ細胞のいずれかを、マウスの部分セットの中で排除する。腫瘍の生着および増殖を、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳシステムを使用して測定する。
【００９５】
代替の腫瘍モデルは、１０７  Ｄａｕｄｉ細胞をｓ．ｃ．注射することおよびこの処置をｉ．ｖ．で与えることを含む。腫瘍増殖を、カリパスで直接測定するか、または生存によって判断する。
【００９６】
類似の実験を、他の細胞株と抗体との組み合わせ（Ｒａｊｉ細胞のｉ．ｐ．注射、ｓ．ｃ．注射もしくはｉ．ｖ．注射を包含する）で行う。後者では、腫瘍増殖を、生存によって測定する。
【００９７】
治療目的に関しては、ピューロマイシンもしくはＧＦＰマーカーを除去して、無関係の遺伝子の発現を最小限にする。
【００９８】
別の代替の例は、ｍＲＮＡを直接エレクトロポレートするかもしくはトランスフェクトすることである。これは、レンチウイルスより安全である。
【００９９】
種々の改変およびバリエーションが、本発明の範囲もしくは趣旨から逸脱することなく本発明において行われ得ることは、当業者に明らかである。本発明の他の実施形態は、本明細書を考慮することから、および本明細書で開示される発明の実施から、当業者に明らかである。本明細書および実施例は、例示と見做されるに過ぎず、本発明の真の範囲および趣旨は、以下の特許請求の範囲によって示されることが意図される。
【０１００】
本願全体を通じて、種々の刊行物、特許、および／もしくは特許出願が、本発明が属する分野の技術水準をより十分に記載するために参照される。これら刊行物、特許、および／もしくは特許出願の開示は、各個々の刊行物、特許、および／もしくは特許出願が、具体的かつ個々に参考として援用されることが示されるのと同程度に、それらの全体において本明細書に参考として援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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