(57)【要約】  本明細書において提供される技術は、前赤内期、血液、および有性寄生生物の主な段階に由来するいくつかの異なる熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）抗原を含む種々の組換えタンパク質、特に、組換え融合タンパク質から構成される新規マラリアワクチンに関する。タンパク質は、ヒトにおいて防御免疫応答を誘発するために混合物ワクチン製剤中に使用され得る。前記組換えタンパク質をコードする核酸分子、核酸を含有するベクターおよび宿主細胞ならびにこのようなタンパク質を調製および生成する方法、ならびに前記マラリアワクチンの使用によって誘導または作製される抗体ならびに受動免疫療法のためのこのような抗体または組換え誘導体の使用も開示されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
寄生生物熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）に対するヒトワクチンとして適した組換えタンパク質の混合物であって、寄生生物生活環の前赤内期、血液および有性の主な段階の熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）表面タンパク質に由来する複数の抗原を含み、
ａ）ＰｆＣＳＰの前赤内期抗原ＴＳＲ−ドメインまたはその変異体もしくは断片、
ｂ）血液段階抗原頂端膜抗原（ＰｆＡＭＡ１）の１種または複数の変異体または断片およびメロゾイト表面タンパク質ＰｆＭｓｐ１−１９またはその変異体もしくは断片およびＰｆＲｈ５由来のペプチドまたはその変異体、
ｃ）有性段階、オーキネート抗原Ｐｆｓ２５またはその変異体もしくは断片
を含む、混合物。
【請求項２】
前記頂端膜抗原（ＰｆＡＭＡ１）の変異体または断片が、ＰｆＡＭＡ１、ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ１、ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ２、ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ３の任意の野生型変異体ならびにその変異体もしくは断片からなる群から選択される、請求項１に記載の混合物。
【請求項３】
前記頂端膜抗原の変異体または断片が、ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ１、ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ２およびＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ３を含む、請求項１から２のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項４】
前記抗原が、１種または複数の組換え融合タンパク質中に含まれる、請求項１から３のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項５】
３種の組換え融合タンパク質を含み、前記異なる組換え融合タンパク質が、以下の抗原：
ａ）融合タンパク質１：ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ１、Ｐｆｓ２５およびＰｆＣＳＰ＿ＴＳＲ
ｂ）融合タンパク質２：ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ２、Ｐｆｓ２５およびＰｆＭＳＰ１−１９
ｃ）融合タンパク質３：ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ３、Ｐｆｓ２５およびＰｆＲｈ５由来のペプチド
を含む、請求項４に記載の混合物。
【請求項６】
前記３種の組換え融合タンパク質が、
ａ）融合タンパク質１：配列番号９、
ｂ）融合タンパク質２：配列番号１０、
ｃ）融合タンパク質３：配列番号１１、
または１個もしくは複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加もしくは欠失による組換えもしくは合成法によって生成されるその相同ポリペプチド
のアミノ酸配列を有する、請求項５に記載の混合物。
【請求項７】
前記３種の組換え融合タンパク質が、
ａ）融合タンパク質１：配列番号９、
ｂ）融合タンパク質２：配列番号１０、
ｃ）融合タンパク質３：配列番号１２、
または１個もしくは複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加もしくは欠失による組換えもしくは合成法によって生成されるその相同ポリペプチド
のアミノ酸配列を有する、請求項５に記載の混合物。
【請求項８】
前記組換え融合タンパク質が、混合物中に等モル比で含まれる、請求項５から７のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項９】
ａ）配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２の配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子、
ｂ）好ましくは、１個もしくは複数のアミノ酸残基が保存的に置換されている、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２の配列を有する配列の修飾された形態をコードする核酸分子、
ｃ）ストリンジェントな条件下でａ）〜ｂ）の核酸分子のいずれかとハイブリダイズ可能である核酸分子、
ｄ）ストリンジェントな条件下でａ）〜ｃ）の核酸分子のいずれかの相補体とハイブリダイズ可能である核酸分子、
ｅ）ａ）〜ｄ）の核酸分子のいずれかと少なくとも８５％の配列同一性を有する核酸分子、
ｆ）またはａ）〜ｅ）の核酸分子のいずれかの相補体
からなる群から選択される単離された核酸分子。
【請求項１０】
請求項９に記載のヌクレオチド分子を含むベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載のベクターを含む宿主細胞であって、酵母細胞、特に、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）である、宿主細胞。
【請求項１２】
活性成分としての請求項１から８のいずれか一項に記載の混合物を含む、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）に対してヒト個体を免疫処理するのに適した、ワクチン組成物。
【請求項１３】
アジュバントをさらに含む、請求項１２に記載のワクチン組成物。
【請求項１４】
請求項１から８のいずれか一項に記載の組換えタンパク質の混合物を生成する方法であって、（ａ）前記組換えタンパク質を生成するのに適した条件下、適した培養培地中で請求項１１に記載の宿主細胞を培養するステップと、（ｂ）前記生成された組換えタンパク質を得るステップと、任意選択で、（ｃ）前記組換えタンパク質をプロセシングするステップとを含む、方法。
【請求項１５】
請求項１から８のいずれか一項に記載の混合物中の種々の組換えタンパク質と結合する、種々の単離された抗体またはその断片を含む抗体組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、前赤内期、血液および有性寄生生物の主な段階に由来するいくつかの異なる熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）抗原を含む種々の組換えタンパク質、特に、組換え融合タンパク質から構成される新規マラリアワクチンに関する。タンパク質は、ヒトにおいて防御免疫応答を誘発するために混合物ワクチン製剤中に使用され得る。前記組換えタンパク質をコードする核酸分子、核酸を含有するベクターおよび宿主細胞ならびにこのようなタンパク質を調製および生成する方法、ならびに前記マラリアワクチンの使用によって誘導または作製される抗体ならびに受動免疫療法のためのこのような抗体または組換え誘導体の使用も開示されている。
【背景技術】
【０００２】
マラリアは、アピコンプレクサ（Apicomplexa）門原生動物の寄生生物、すなわちプラスモジウム属（Plasmodium）の寄生生物による感染によって引き起こされる疾患であり、全世界で毎年２億人以上の新規感染、および７０万人以上の死亡を引き起こす。マラリアは、アフリカでは特に深刻な問題であり、５人に１人（２０％）の小児の死亡はこの疾患の影響によるものである。アフリカの小児は毎年、平均して１．６から５．４の間のマラリア発熱のエピソードを有する。
【０００３】
ヒトでは、マラリア疾患はプラスモジウム属（Plasmodium）寄生生物のうち５種：熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）、三日熱マラリア原虫（P. vivax）、卵形マラリア原虫（P. ovale）、四日熱マラリア原虫（P. malariae）および二日熱マラリア原虫（P. knowlesi）によって引き起こされ、中でも最も蔓延しているのは熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）および三日熱マラリア原虫（Plasmodium vivax）である。熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）によって引き起こされるマラリア（悪性マラリア、熱帯熱マラリアまたは熱帯性マラリアとも呼ばれる）は最も危険な形態のマラリアであり、最高割合の合併症および死亡率を有する。ほとんどすべてのマラリアによる死亡は熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）によって引き起こされる。
【０００４】
手短には、ヒトにおけるマラリア原虫の生活環（図１）は、ハマダラカ属（Anopheles）の蚊に刺されることによる２、３のスポロゾイトの播種で開始する。数分でスポロゾイトは肝細胞に侵入してその発達を開始し、シゾゴニーによって増殖する（肝臓段階または前赤内期段階）。マラリア原虫の種に応じて５〜１４日の期間の後、シゾントは何千ものメロゾイトに発達し、これが血流中に放出され、赤血球（ＲＢＣ）に侵入し、血液段階を開始する。ＲＢＣ内で各メロゾイトが、マラリア原虫の種に応じて、４２〜７２時間以内にトロホゾイトに発達し、これが成熟、分裂し、シゾントが生じ、これが十分に成熟した後、最大３２個のメロゾイトを生じさせる。血流中に放出されたメロゾイトは他のＲＢＣに侵入し、その生活環を維持する。いくつかのメロゾイトはＲＢＣに侵入した後、有性型−雄または雌ガメトサイトに発達し、これも成熟および赤血球破裂後に血流に入る。雌のハマダラカ属（Anopheles）の蚊が吸血し、ガメトサイトを摂取すると、感染することとなり、プラスモジウム属（Plasmodium）生活環の有性段階を開始する。蚊の腸では雄ガメトサイトが雌ガメトサイトと融合し、腸壁と結合し、それを通過するオーキネートを形成し、その外面と結合したままオーシストに変換する。オーシストはスポロゴニーによって分裂し、数千ものスポロゾイトが生じ、それらが蚊の体腔中に放出され、最終的にその唾液腺に移動し、ここでそれらは成熟し、吸血のために宿主を刺すときにヒトにおいて新規感染を開始できるようになる。
【０００５】
既存の抗マラリア薬クロロキンに対する熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）の耐性は１９６０年代に出現し、それから蔓延した。さらにマラリア原虫は、過去数十年かけてほとんどのその他の抗マラリア薬に対する耐性を発達させた。これは熱帯諸国における公衆衛生および旅行者を大きく脅かす。抗マラリア薬耐性の蔓延および程度は増大し続けると考える十分な根拠がある。殺虫剤耐性ベクターおよび薬剤耐性寄生生物の数の増大が、有効なマラリアワクチンの需要をさらに増大する。マラリアワクチンは単一の作用様式に限定されず、マラリアによる負担を劇的に軽減する可能性がある。
【０００６】
効率的なマラリアワクチンを開発する困難の一部は、寄生生物の多段階の生活環に起因する。寄生生物発達の各段階は、異なる種類の免疫応答を誘発する異なるセットの表面抗原を特徴とする。提示されるさまざまな表面抗原にもかかわらず、それらに対する免疫応答は有効でないことが多い。理由の１つはマラリア原虫抗原の大規模な配列多形であり、これが種々の分離株の免疫回避を促進する。
【０００７】
前赤内期のワクチンは、蚊によって注入される感染性形態（スポロゾイト）から保護し、それによって肝臓における寄生生物発達を阻害する。これまでに曝露されていない個体では、２、３の寄生生物が前赤内期のワクチンによって誘導された免疫防御を逃れた場合、それらは最終的に血液段階に入り、赤血球内で増殖し、最も悪化した疾患を確立する。
【０００８】
赤血球または血液段階ワクチンは、赤血球における寄生生物の侵襲および増殖を阻害し、したがって血液感染の間の重症疾患症状を防ぐ（または減少させる）。しかし、このアプローチによってプラスモジウム属（Plasmodium）生活環を完全に中断し、寄生生物の伝達を防ぐ可能性は低い。
【０００９】
有性段階ワクチンは、ワクチン接種されているヒトを保護しないが、代わりに、寄生生物が蚊によって取り込まれると、ワクチンに応じて生じた抗体とともに、寄生生物の発達を阻害することによって伝達のサイクルを妨げる。伝達阻止ワクチンは、寄生生物排出に対して、同時に抗前赤内期または赤血球治療に対する寄生生物耐性の防止に対して向けられた多角的戦略の一部として含まれ得る。
【００１０】
マラリア原虫の上記の複雑な多段階生活環は、相乗的ワクチンアプローチについて独特の課題を示す。マラリア原虫に対する免疫性は段階依存的であり、種依存的である。多数のマラリア研究者および教本の記述は、生活環の１段階のみに対応する単一抗原ワクチンは十分ではなく、有効な免疫性を誘導するには、寄生生物発達の異なる段階、すなわち少なくとも２段階、を標的とする複数抗原、多段階ワクチンが必要であると考え結論づけている（Mahajan，Berzofsky et al. 2010）。複数抗原ワクチンの構築（異なる寄生生物段階を変換することおよび可能性のある熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）エスケープ突然変異体を包囲しようという、ワクチンによって誘導される免疫応答の幅を増大することを目的とした）は、（フルサイズ）抗原を一緒に遺伝子連結することによって、組換えタンパク質の混合物によって、または異なる寄生生物タンパク質および段階に由来するいくつかのペプチドを含有する、合成ペプチドベースの（１５〜２５マー）化学合成ワクチンによってのいずれかで達成され得る。
【００１１】
いくつかの異なる抗原または単一抗原のいくつかの異なる対立遺伝子からなる単一融合タンパク質アプローチ（寄生生物に対して相乗的活性を有する抗体を誘導するための）は、抗原多様性および免疫回避のための熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）の能力によって妨げられる（Richards,Beeson, 2009）。可能性のあるワクチン候補として多数の抗原が評価されたが、ほとんどの臨床治験は臨床マラリアを防ぐことに対して有意な影響を示さなかったものの、それらのうち一部は寄生生物増殖を低減させるとわかった。得られた融合タンパク質／ワクチン候補の大きさは、２、３の選択された抗原の組合せのみを許可する、選択された抗原が自然免疫の標的でないこと、および／または相当な遺伝的多形性を示すことを排除しない別の制限因子である。複対立遺伝子を有する高度に可変性の抗原が、自然なチャレンジ下での免疫応答の明白な標的であり、ＰｆＡＭＡ１およびＰｆＭＳＰ２のワクチン研究は対立遺伝子特異的効果が達成され得ることを示唆する（Schwartz, 2012）。現在組合せワクチンのみ（ＰｆＣＳＰおよびＰｆＡＭＡ１からなる）が、熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）の前赤内期および無性血液段階を標的とする臨床治験を受けている（Schwartz, 2012）。プラスモジウム属（Plasmodium）の３種の生活環の主な段階のすべてを標的とする、融合物でも組合せアプローチでもない複数抗原ワクチン候補（ハマダラカ属（Anopheles）の蚊の有性段階を含み、したがって寄生生物伝達を妨げる）は、いまだ臨床治験で試験されていない。
【００１２】
したがって、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）に対する新規および改善された複数成分多段階ワクチンを利用できることは、高度に有利となる。
【発明の概要】
【００１３】
本開示は、好ましくは、必ずしもそうではないが、寄生生物の生活環の異なる段階の間に熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）寄生生物の表面に提示されるタンパク質に由来する複数の抗原または抗原ドメインを含む、マラリアに対するヒトワクチンとして適している、組換えポリペプチドの組合せ、特に、組換え融合タンパク質に関する。
【００１４】
第１の態様では、本開示は、寄生生物生活環の前赤内期、血液および有性の主な段階の熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）表面タンパク質に由来する複数の抗原を含む寄生生物熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）に対するヒトワクチンとして適している、組換えタンパク質の混合物に関連し、混合物は、
ａ）ＰｆＣＳＰの前赤内期（pre-erytrocytic）抗原ＴＳＲ−ドメイン、またはその変異体もしくは断片、
ｂ）血液段階抗原頂端膜抗原（ＰｆＡＭＡ１）の１種または複数の変異体または断片およびメロゾイト表面タンパク質ＰｆＭｓｐ１−１９またはその変異体もしくは断片、およびＰｆＲｈ５由来のペプチドまたはその変異体、
ｃ）有性段階、オーキネート抗原Ｐｆｓ２５またはその変異体もしくは断片
を含む。
【００１５】
さらなる態様では、本開示の実施形態は、本開示の混合物中の種々の組換えタンパク質と結合する種々の単離された抗体またはその断片を含む抗体組成物に関する。
【００１６】
別の態様では、本開示の実施形態は、本開示の組換えタンパク質および／または抗体の混合物を含む医薬組成物および／または診断用組成物に関する。
【００１７】
さらなる態様では、本開示の実施形態は、生理学的に許容される培地中に活性成分として本開示の組換えタンパク質の混合物と担体とを含む、マラリアに対して哺乳動物、特に、ヒトを免疫処置するためのワクチン組成物に関する。
【００１８】
さらに別の態様では、本開示の実施形態は、本開示の混合物中に含まれる前記組換え融合タンパク質をコードする核酸ならびにこのような核酸を含有するベクターおよび宿主細胞を提供する。
【００１９】
その他の態様では、本開示は、熱帯性マラリアの予防および／または治療における本開示の組換えタンパク質の混合物の使用に関する。
【００２０】
さらに、有効量の、本開示の混合物中に含まれる組換えタンパク質、本開示の組換え融合タンパク質の混合物を含む組成物または本開示のワクチン組成物を投与するステップを含む、プラスモジウム属感染に対して、特に熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）に対してヒトを免疫処置する方法が開示される。
【００２１】
本開示が詳細に記載される前に、本明細書において使用される技術用語は、単に特定の実施形態を説明する目的のものであり、限定とする意図がないということも理解されるべきである。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は文脈が明確に他のものを示さない限り、単数および／または複数の言及を含むということに留意されなければならない。数値によって範囲が定められるパラメータ範囲が与えられる場合には、範囲はこれらの限界値を含むと見なされるということがさらに理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）の生活環のスキームを示す図である。
【図２】図２は、抗原ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ１、Ｐｆｓ２５およびＰｆＣＳＰ＿ＴＳＲ（Ａ）を含む第１の組換え融合タンパク質と、抗原ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ２、Ｐｆｓ２５およびＰｆＭＳＰ１−１９（Ｂ）を含む第２の組換え融合タンパク質と、抗原ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ３、Ｐｆｓ２５およびＰｆＲｈ５＿Ｑ５Ａを含む第３の組換え融合タンパク質とを含有するワクチン混合物の一実施形態を示す図である。
【図３】図３は、Ａ）ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ１、Ｐｆｓ２５およびＰｆＣＳＰ＿ＴＳＲを有する融合タンパク質１と、Ｂ）ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ２、Ｐｆｓ２５およびＰｆＭＳＰ１−１９を有する融合タンパク質２と、Ｃ）ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ３、Ｐｆｓ２５およびＰｆＲｈ５＿Ｑ５Ａを有する融合タンパク質３とを含むワクチン混合物の一実施形態のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ）および（Ｂ）ウエスタンブロット解析を示す図である。
【図４】図４は、滑走運動性アッセイの結果を示す図である。
【図５】図５は、成長阻害アッセイの結果を示すグラフである。
【図６】図５は、標準膜飼育検定法（ＳＭＦＡ）の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
発明の詳細な説明
本開示は、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）に対するヒトワクチンとして適した、組換えタンパク質の組合せ、特に、組換え融合タンパク質に関する。有利な実施形態では、本開示の組換えタンパク質およびワクチン組成物は、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）表面タンパク質または寄生生物発達の種々の段階に由来するそのドメインを組み合わせる。
【００２４】
熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）の複雑な多段階生活環および遺伝的変動は、マラリアワクチン開発の成功にとって重大な課題に相当する。発達段階に応じて、寄生生物は、肝臓細胞の侵襲を低減または防止する（前赤内期の主な段階）、マラリアの臨床徴候を低減または防止する（血液の主な段階）、および蚊宿主によるマラリアの伝達を低減または防止することを目的として、防御免疫応答によって標的とされる必要がある表面タンパク質の異なるセットを提示する。さらに、多数の重要な表面タンパク質は、二形性またはさらには多形性である。したがって、効率的な多段階マラリアワクチン候補は、異なる段階に由来する複数の関連抗原を組み合わせ、多型を対象としなければならない。これに対処するための１つのアプローチは、いくつかの適したタンパク質および／またはタンパク質ドメインを含む融合タンパク質の設計である。さらに、単一ポリペプチドから構成されるこのようなワクチン候補の切望は、再現性があり、頑強な費用効率の高い生成に対する、実際の技術的で経済的な需要から主に起こっている。
【００２５】
しかし当業者には、組換え発現される融合タンパク質には大きさの制限があるということも明確である。タンパク質特有の相違も同様に考慮されなければならないが、ポリペプチドの長さが増大するにつれ、発現レベルおよび収率の大きな低下がある。複数の課題が大きさによって比例する以上に増大し、大きなタンパク質の全体的な特性は小さいタンパク質、ドメインまたは断片のものよりも大幅に最適化を受け入れにくい。これらの問題すべては今まで、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）に対する効率的なワクチンの開発の大きなボトルネックであり、その結果複数の線形エピトープ、１種または２種の生活環の主な段階に由来する１種または２種の抗原のみを含む最適以下の、圧倒的な数のワクチン候補が得られてきた。代替法として、化学的または遺伝的に弱毒化された、または不活性化された生ワクチンが提案されているが（例えば照射されたスポロゾイト）、このようなアプローチは、バッチ間一貫性、スケールアップ生成および最も重要な生成物の安全性に関する困難に取り組まなければならない。
【００２６】
他方、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）の段階および抗原多様性を対象とするように組換えタンパク質の混合物を使用することは、いくつかの利点を有する。組換え抗原および／または抗原融合タンパク質の混合物を使用は、マラリアの伝播および臨床症状と関連する寄生生物生活環ならびに免疫学的に関連する熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）表面タンパク質の対立遺伝子変動の両方を対象とするためのよい選択肢に相当する。対立遺伝子変異体またはさらには人工的な多様性を網羅するものを、異なる段階に由来する保存された抗原と、遺伝子融合によって、ならびに製剤中でそれらを混合することによって組み合わせることができる。このような複数成分ワクチンにおける適した融合タンパク質の設計において、ポリペプチドの大きさならびにそれぞれの生成システムにおける収率および安定性が考慮され得る。一方では、複数成分ワクチンという概念は、それ自体、簡単なサブユニットワクチンまたは単一融合タンパク質アプローチと比較して、規制問題ならびに製造において種々の上流および下流プロセスを確立する必要性の増大によって引き起こされる、幾分かの固有の不利点を有し、他方、より高度な努力は、病原体の地理的分布および進化に対応するためのより高い柔軟性、ならびに単一融合タンパク質との関連の中では容易に認識され得ないいくつかの免疫関連抗原（ならびにそのＢおよびＴ細胞エピトープ）を特徴とするこのような抗原カクテルを用いて誘発され得るより広い多段階特異的免疫応答によって相殺される。
【００２７】
本開示において記載される混合物中に含まれる組換えタンパク質、特に、融合タンパク質は、選択された生成宿主ピキア・パストリス（Pichia pastoris）における最適な収率および安定性のために設計され、最適化される。融合タンパク質は、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）生活環のそれぞれの段階に対応し、所望の免疫応答を誘発するのに必要な最も必須の抗原または抗原ドメインを特徴とするよう設計された。融合タンパク質中に抗原を組み合わせることは、ワクチン混合物中に使用されるタンパク質の数を低減し、生成の際の上流、下流および品質管理費用を低減するのに有用であり、段階特異的抗原を融合タンパク質に組み合わせることは、組成物において種々の割合の段階特異的機能性を実行することによって、多段階、複数成分ワクチン組成物の有効性および特異性を微調整するための好都合な概念である。
【００２８】
重要なことに、本開示の混合物中に含まれる融合タンパク質は、（ｉ）種々の熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）表面タンパク質に由来するドメインを含み、（ｉｉ）十分に発現し、免疫学的に関連していると実験的に同定され、確認されているビルディングブロック（ドメイン）を使用して設計された。
【００２９】
手短には、本開示の組換えタンパク質および融合タンパク質の記載された組合せは、十分に発現され、高い免疫学的関連を有し、改善された免疫原性を有し得る。有利な実施形態では、ワクチンとして使用される本開示の組換えタンパク質と融合タンパク質の組合せは、感染を阻止し、ならびに病状を防ぎ、寄生生物の伝達を妨げる感染防御免疫を誘発する立証された能力を有し、異なる寄生生物段階から得られたサブユニットから構成される組合せワクチンである可能性が高い。
【００３０】
全般的に、本明細書において使用される命名法および本発明において利用される実験室手順として、分子的、生化学的、微生物学的および組換えＤＮＡ技術が挙げられる。このような技術は、文献において十分に説明されている。例えば、“Molecular Cloning: A laboratory Manual”Sambrook et al., (1989); “Current Protocols in Molecular Biology” Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989); Perbal, “A Practical Guide to Molecular Cloning”, John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., “Recombinant DNA”, Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) “Genome Analysis: A Laboratory Manual Series”, Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); 米国特許第４，６６６，８２８号明細書；同４，６８３，２０２号明細書；同４，８０１，５３１号明細書；同５，１９２，６５９号明細書および同５，２７２，０５７号明細書に示される方法論; “Cell Biology: A Laboratory Handbook”, Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); “Culture of Animal Cells-A Manual of Basic Technique” by Freshney, Wiley-Liss, N.Y. (1994), Third Edition; “Current Protocols in Immunology” Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), “Basic and Clinical Immunology” (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, Conn. (1994); Mishell and Shiigi (eds), “Selected Methods in Cellular Immunology”, W.H. Freeman and Co., New York (1980)を参照のこと；利用可能なイムノアッセイは、特許および科学文献に広範に記載されている、例えば、米国特許第３，７９１，９３２号明細書；同３，８３９，１５３号明細書；同３，８５０，７５２号明細書；同３，８５０，５７８号明細書；同３，８５３，９８７号明細書；同３，８６７，５１７号明細書；同３，８７９，２６２号明細書；同３，９０１，６５４号明細書；同３，９３５，０７４号明細書；同３，９８４，５３３号明細書；同３，９９６，３４５号明細書；同４，０３４，０７４号明細書；同４，０９８，８７６号明細書；同４，８７９，２１９号明細書；同５，０１１，７７１号明細書および同５，２８１，５２１号明細書；“Oligonucleotide Synthesis” Gait, M. J., ed. (1984); “Nucleic Acid Hybridization” Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); “Transcription and Translation” Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1984); “Animal Cell Culture” Freshney, R. I., ed. (1986); “Immobilized Cells and Enzymes” IRL Press, (1986); “A Practical Guide to Molecular Cloning”Perbal, B., (1984) and “Methods in Enzymology” Vol. 1-317, Academic Press; “PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications”, Academic Press, San Diego, Calif. (1990); Marshak et al., “Strategies for Protein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual” CSHL Press (1996)を参照のこと；それらのすべては、本明細書において十分に記載されるかのように参照により組み込まれる。その他の一般的な参考文献は、本文書を通じて提供される。本明細書における手順は、当技術分野で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。本明細書に含有されるすべての情報は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００３１】
語句「組換えタンパク質」は、宿主細胞中にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現されたタンパク質などの、組換え手段によって、調製され、発現され、作製されるか、または単離されるタンパク質、特に、組換え融合タンパク質を含む。
【００３２】
用語「組換え融合タンパク質」は、特に、異なるタンパク質、異なるタンパク質ドメインまたは異なる生物などの異種供給源に由来するセグメント、すなわちアミノ酸配列を含む組換え技術によって生成されるタンパク質を指す。セグメントは、ペプチド結合によって互いに直接的または間接的のいずれかで接合される。間接的接合とは、ペプチドリンカーなどの介在するアミノ酸配列が、融合タンパク質を形成するセグメント間に並置されることを意味する。組換え融合タンパク質は、１種の遺伝子の異なる領域に由来するヌクレオチド配列を遺伝子的に接合することによって、および／または２種以上の別個の遺伝子に由来するヌクレオチド配列を接合することによって得られるヌクレオチド配列によってコードされる。これらのヌクレオチド配列は、熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）に由来し得るが、それらはまたその他の生物に、クローニング手順のために使用されるプラスミドに、またはその他のヌクレオチド配列に由来する場合もある。
【００３３】
さらに、コードするヌクレオチド配列は、例えばデジタル遺伝子配列からのオリゴヌクレオチド合成および得られた断片のその後のアニーリングによって最初の鋳型ＤＮＡサンプルを必要とせずに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成され得る。所望のタンパク質配列は、例えば適当なソフトウェアツールを使用して「逆翻訳」され得る。ユニバーサルな遺伝暗号の縮重のために、オープンリーディングフレーム（すなわち組換えタンパク質コーディング領域）内の同義のコドンは、例えばシス作用性不安定性エレメント（例えばＡＵＵＵＡ）を除去し、二次および三次ｍＲＮＡ構造（例えばシュードノット、ステム−ループ、…）を除去、導入または修飾するよう、転写後遺伝子サイレンシング（ＰＧＴＳ）を引き起こし得る自己相補性領域を避けるよう、全体的なＡＴ：ＧＣ含量を変更するよう、または発現宿主にコドン使用を調整するよう、種々の方法で交換されてもよい。このような変更は手作業で、または適当なソフトウェアツールを使用して、またはその組合せによって設計され得る。
【００３４】
プラスモジウム属（Plasmodium）表面タンパク質またはそのドメインを含む組換え融合タンパク質は、当技術分野で公知であるように、組換えＤＮＡ法および適した宿主細胞における発現を使用して調製された組換え生成物であり得る（例えばSambrook et al., (2001) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Yを参照のこと）。特定の単離されたタンパク質ドメインをコードするヌクレオチド配列は、例えば単離に必要なドメインの５’および３’領域に対応する適当なオリゴヌクレオチドプライマー、および鋳型としての単離されるタンパク質ドメイン配列の全長コーディングを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって好都合に調製され得る。全長コーディングタンパク質配列の供給源は、例えば寄生生物細胞またはクローニングされた全長遺伝子を含有するプラスミドベクターから抽出されたＤＮＡであり得る。あるいは、タンパク質コード配列はｉｎ  ｖｉｔｒｏで部分的に、もしくは完全に合成され得るか、種々のアプローチの組合せが使用され得る。本開示の融合タンパク質の特性の限定されない例は、熱安定性およびｐＨ安定性である。
【００３５】
有利な実施形態では、本開示のワクチン組成物または組換えタンパク質の混合物は、寄生生物生活環の前赤内期、血液および有性の主な段階の熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）表面タンパク質に由来する抗原を含み、ここで、
ａ）前赤内期抗原は、ＰｆＣＳＰのＴＳＲ−ドメインまたはその変異体もしくは断片を含み、
ｂ）血液段階抗原は、頂端膜抗原（ＰｆＡＭＡ１）の１種または複数の変異体または断片およびメロゾイト表面タンパク質ＰｆＭｓｐ１−１９またはその変異体もしくは断片およびＰｆＲｈ５由来のペプチドまたはその変異体を含み、
ｃ）有性段階抗原（単数または複数）は、オーキネート抗原Ｐｆｓ２５またはその変異体もしくは断片を含む。
【００３６】
さらなる有利な実施形態では、ワクチン組成物または本開示の組換えタンパク質の混合物は、寄生生物生活環の前赤内期、血液および有性の主な段階の熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）表面タンパク質に由来する抗原を含み、ここで、混合物は、
ｄ）ＰｆＣＳＰの前赤内期抗原ＴＳＲ−ドメインまたはその変異体もしくは断片、
ｅ）血液段階抗原頂端膜抗原（ＰｆＡＭＡ１）の１種または複数の変異体または断片およびメロゾイト表面タンパク質ＰｆＭｓｐ１−１９またはその変異体もしくは断片およびＰｆＲｈ５由来のペプチドまたはその変異体、
ｆ）有性段階、オーキネート抗原Ｐｆｓ２５またはその変異体もしくは断片
を含む。
【００３７】
本明細書において、用語「熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）表面タンパク質に由来する抗原」は、全長熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）表面タンパク質または特に、特定のドメインまたはその他の部分のような全長タンパク質の一部のみのアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００３８】
前赤内期抗原「ＰｆＣＳＰ＿ＴＳＲ」は、熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）のスポロゾイト周囲タンパク質（ＣＳＰ）のＴＳＲ−ドメインを指す。
【００３９】
「ＴＳＲドメイン」は、免疫性、細胞接着、細胞間相互作用および神経細胞発達に関与している、細胞外タンパク質中または膜貫通タンパク質の細胞外部分中に見られる、小さな約６０残基のドメインである（Tucker, 2004）。トロンボスポンジン−１（ＴＳＰ−１; Tan et al. 2002）およびＦ−スポンジン（ＰＤＢコード１ＳＺＬおよび１ＶＥＸ）由来のＴＳＲドメインの構造は解明されている。これらは、ＴＳＲドメインが逆平行３本鎖β−シートからなる長い構造を有することを示す。ドメインコアは保存されたトリプトファン、アルギニンおよびシステインの側鎖の積み重ねられたアレイによって形成される。いくつかのタンパク質のＴＳＲは、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）結合を媒介すると報告されている。例えばプラスモジウム属（plasmodium）表面タンパク質プラスモジウム属（plasmodium）ＣＳおよびＴＲＡＰは両方とも、接着性トロンボスポンジン１型ドメイン、ＴＳＲを含有する。
【００４０】
用語「断片」は本明細書において、全長熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）表面タンパク質またはそのドメインから分離されており、それとの関連にはない、突然変異を有する、または有さない、天然全長タンパク質またはドメインの連続部分を指す。それは全長または完全タンパク質の構造的／組織分布的または機能的サブユニットであり得る。
【００４１】
一実施形態では、ＰｆＣＳＰのＴＳＲ−ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を含む。
【００４２】
別の有利な実施形態では、本開示のタンパク質（ポリペプチド）混合物は、血液段階抗原頂端膜抗原（ＰｆＡＭＡ１）および少なくともさらなる熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）血液段階抗原の１種または複数の変異体を含む。
【００４３】
本明細書において、抗原「ＰｆＡＭＡ１」とは、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）頂端膜抗原（ＡＭＡ１）細胞外ドメイン１〜３を指す。熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）ＡＭＡ−１の全エクトドメイン（ドメインＩ〜ＩＩＩ）に好ましくは相当する組換えタンパク質は、天然寄生生物を認識する抗体を誘導し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで赤血球のメロゾイト侵襲を阻害し得る。ＰｆＡＭＡ１の制限された多形は、天然に存在する対立遺伝子の極めて高い網羅度を有する（平均で＞９７％）３種の人工ＰｆＡＭＡ１配列の合理的な設計を可能にした。この多様性を網羅するアプローチ（ＤｉＣｏ）は、天然に見られる多形を克服し、すべての天然に存在するＡＭＡ１対立遺伝子に対する広い応答を可能にすると予測される（Remarque et al. 2008）。
【００４４】
したがって、頂端膜抗原（ＰｆＡＭＡ１）の変異体は、ＰｆＡＭＡ１および／またはＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ１、ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ２および／またはＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ３の任意の野生型変異体、ならびにまたその変異体、特に、除去されたまたは追加の潜在的なＮ−グリコシル化部位を有する変異体であり得る。Ｎ結合型グリコシル化は、タンパク質中のアミノ酸残基中の窒素原子への糖分子の結合（グリコシル化として知られるプロセス）である（Drickamer et al. 2006）。
【００４５】
本開示のいくつかの実施形態では、ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ１は、配列番号１のアミノ酸配列を含む。本開示のさらなる実施形態では、ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ２は、配列番号２のアミノ酸配列を含む。本開示のさらなる実施形態では、ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ３は、配列番号３のアミノ酸配列を含む。有利な実施形態では、本開示の組換えタンパク質の混合物は、血液段階抗原、特に、配列番号１の配列を有するＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ１、特に、配列番号２の配列を有するＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ２および特に、配列番号３の配列を有するＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ３を含む。
【００４６】
本開示の組換えタンパク質の混合物は、メロゾイト表面タンパク質をさらに含む。いくつかのメロゾイト表面タンパク質（ＭＳＰ）が同定されているが、それらのほとんどについて、なおもその機能はさらに解明されなければならない。ＭＳＰ−１と名付けられた主なＭＳＰの場合には、ＲＢＣとのメロゾイト結合において、侵入と関連するその後の生化学的機序において役割が仮定されている。このタンパク質は、後期シゾント段階において１８５〜２１０ｋＤａの前駆体として合成され、分子量の変動するいくつかのポリペプチドを生成するようプロセシングされる。４２ｋＤａのポリペプチド（ＭＳＰ１−４２）はメロゾイト膜と結合されて維持され、１９ｋＤａのポリペプチド（ＭＳＰ１−１９）を生成するようさらにプロセシングされ、宿主細胞中に入る。いくつかの有利な実施形態では、さらなる熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）血液段階抗原は、特に、配列番号６のアミノ酸配列を含む、ＰｆＭｓｐ１−１９である。
【００４７】
別の実施形態では、本開示の組換えタンパク質の混合物は、さらなる熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）血液段階抗原、特に、血液段階抗原ＰｆＲｈ５、好ましくは、血液段階抗原ＰｆＲｈ５に由来するペプチドを含む（Douglas et al. 2014）。いくつかの有利な実施形態では、ＰｆＲｈ５由来のペプチドは、配列番号７および／または配列番号８のアミノ酸配列を含む。
【００４８】
本明細書において、用語「ＰｆＲｈ５由来のペプチド」は、ＰｆＲｈ５＿Ｑ５Ａのような全長ＰｆＲｈ５タンパク質の一部のみを含み、完全な全長ＰｆＲｈ５タンパク質ではないポリペプチドを含む。
【００４９】
有利な実施形態では、本開示の混合物は、少なくとも有性段階抗原、特に、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）由来のＰｆｓ２５またはその変異体を含む。Ｐｆｓ２５は、蚊の中腸において発達するので寄生生物接合子の表面に見られる有性段階タンパク質である。いくつかの有利な実施形態では、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）有性段階抗原は、配列番号４のアミノ酸配列を含むＰｆｓ２５である。
【００５０】
有利な実施形態では、本開示の混合物は、配列番号１〜７および／または配列番号１〜６および配列番号８のアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはその変異体、断片もしくは相同ポリペプチドを含む。
【００５１】
上記のように、いくつかの有利な実施形態では、ＰｆＣＳＰ＿ＴＳＲおよびＰｆｓ２５のような、またＰｆＭｓｐ１−１９のような混合物中の抗原の変異体は、除去されたまたは追加の潜在的なＮ−グリコシル化部位も含む。
【００５２】
有利な実施形態では、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）抗原のうちいくつかが、組換え融合タンパク質中に含まれ、例えば、抗原ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ１、Ｐｆｓ２５およびＰｆＣＳＰ＿ＴＳＲが１種の組換え融合タンパク質中に含まれ、抗原ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ２、Ｐｆｓ２５およびＰｆＭＳＰ１−１９が、１種の組換え融合タンパク質中に含まれ、ならびに／または抗原ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ３、Ｐｆｓ２５およびＰｆＲｈ５由来のペプチドが、組換え融合タンパク質中に含まれる。
【００５３】
さらなる有利な実施形態では、ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ１、Ｐｆｓ２５およびＰｆＣＳＰ＿ＴＳＲを有する組換え融合タンパク質は、配列番号９を含み、ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ２、Ｐｆｓ２５およびＰｆＭＳＰ１−１９を有する組換え融合タンパク質は、配列番号１０を含み、ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ３、Ｐｆｓ２５およびＰｆＲｈ５＿Ｑ５Ａを有する組換え融合タンパク質は、配列番号１１を含み、またはＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ３、Ｐｆｓ２５およびＰｆＲｈ５＿９ＡＤ４を有する組換え融合タンパク質は、配列番号１２もしくは１個もしくは複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加もしくは欠失による組換えもしくは合成法によって生成されるその相同ポリペプチドを含む。
【００５４】
有利な実施形態では、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）抗原は、１種または複数の組換え融合タンパク質中に、例えば、配列番号９（融合タンパク質１）、配列番号１０（融合タンパク質２）および配列番号１１（融合タンパク質３）、１個もしくは複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加もしくは欠失による組換えまたは合成法によって生成されるそれらの相同ポリペプチドを含む、３種の組換え融合タンパク質の混合物中に含まれる。
【００５５】
別の有利な実施形態では、本開示の混合物またはワクチン組成物の抗原は、
ｉ）ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ１、Ｐｆｓ２５およびＰｆＣＳＰ＿ＴＳＲ
ｉｉ）ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ２、Ｐｆｓ２５およびＰｆＭｓｐ１−１９
ｉｉｉ）ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ３、Ｐｓｆ２５およびＰｆＲｈ５＿Ｑ５Ａ
を含む。
【００５６】
一実施形態では、ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ１、Ｐｆｓ２５およびＰｆＣＳＰ＿ＴＳＲ抗原は、第１の組換え融合タンパク質中に含まれ、ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ２、Ｐｆｓ２５およびＰｆＭｓｐ１−１９抗原は、第２の組換え融合タンパク質中に含まれ、ならびにＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ３、Ｐｆｓ２５およびＰｆＲｈ５＿Ｑ５Ａ抗原は、第３の組換え融合タンパク質中に含まれる。
【００５７】
別の有利な実施形態では、本開示の混合物またはワクチン組成物の抗原は、
ｉ）ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ１、Ｐｆｓ２５およびＰｆＣＳＰ＿ＴＳＲ
ｉｉ）ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ２、Ｐｆｓ２５およびＰｆＭｓｐ１−１９
ｉｉｉ）ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ３、Ｐｓｆ２５およびＰｆＲｈ５＿９ＡＤ４
を含む。
【００５８】
一実施形態では、ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ１、Ｐｆｓ２５およびＰｆＣＳＰ＿ＴＳＲ抗原は、第１の組換え融合タンパク質中に含まれ、ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ２、Ｐｆｓ２５およびＰｆＭｓｐ１−１９抗原は、第２の組換え融合タンパク質中に含まれ、ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ３、Ｐｆｓ２５およびＰｆＲｈ５＿９ＡＤ４抗原は、第３の組換え融合タンパク質中に含まれる。
【００５９】
別の有利な実施形態では、本開示のワクチン混合物は、３種の組換え融合タンパク質を含み、ここで、異なる組換え融合タンパク質は、以下の抗原：
ａ）融合タンパク質１：ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ１、Ｐｆｓ２５およびＰｆＣＳＰ＿ＴＳＲ
ｂ）融合タンパク質２：ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ２、Ｐｆｓ２５およびＰｆＭＳＰ１−１９
ｃ）融合タンパク質３：ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ３、Ｐｆｓ２５およびＰｆＲｈ５＿Ｑ５Ａ
を含む。
【００６０】
別の有利な実施形態では、本開示のワクチン混合物は、３種の組換え融合タンパク質を含み、ここで、異なる組換え融合タンパク質は、以下の抗原：
ａ）融合タンパク質１：ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ１、Ｐｆｓ２５およびＰｆＣＳＰ＿ＴＳＲ
ｂ）融合タンパク質２：ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ２、Ｐｆｓ２５およびＰｆＭＳＰ１−１９
ｃ）融合タンパク質３：ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ３、Ｐｆｓ２５およびＰｆＲｈ５＿９ＡＤ４
を含む。
【００６１】
別の実施形態では、上記の第１の組換え融合タンパク質（融合タンパク質１）は、配列番号９または１個もしくは複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加もしくは欠失により組換えもしくは合成法によって生成されるその相同ポリペプチドを含む。
【００６２】
別の実施形態では、上記の第２の組換え融合タンパク質（融合タンパク質２）は、配列番号１０または１個もしくは複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加もしくは欠失により組換えもしくは合成法によって生成されるその相同ポリペプチドを含む。
【００６３】
別の実施形態では、上記の第３の組換え融合タンパク質（融合タンパク質３）は、配列番号１１または１個もしくは複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加もしくは欠失により組換えもしくは合成法によって生成されるその相同ポリペプチドを含む。
【００６４】
別の実施形態では、上記の第３の組換え融合タンパク質（融合タンパク質３）は、配列番号１２または１個もしくは複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加もしくは欠失により組換えまたは合成法によって生成されるその相同ポリペプチドを含む。
【００６５】
有利な実施形態では、本開示の混合物は、３種の組換え融合タンパク質を含み、ここで、異なる組換え融合タンパク質は、
ａ）融合タンパク質１：配列番号９
ｂ）融合タンパク質２：配列番号１０
ｃ）融合タンパク質３：配列番号１１
または１個もしくは複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加もしくは欠失による組換えもしくは合成法によって生成されるその相同ポリペプチドのアミノ酸配列
を有する。
【００６６】
別の有利な実施形態では、本開示の混合物は、３種の組換え融合タンパク質を含み、ここで、異なる組換え融合タンパク質は、
ａ）融合タンパク質１：配列番号９
ｂ）融合タンパク質２：配列番号１０
ｃ）融合タンパク質３：配列番号１２
または１個もしくは複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加もしくは欠失による組換えもしくは合成法によって生成されるその相同ポリペプチドのアミノ酸配列
を有する。
【００６７】
例えば、組換えポリペプチドおよび／または融合タンパク質は、等モルでまたは任意のその他の割合で混合物中に含まれる。有利な実施形態では、組換え融合タンパク質は、混合物中に等モル比で含まれる。
【００６８】
有利な組換えタンパク質、特に、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）に対するヒトワクチンとして適した、混合物中に含まれる組換え融合タンパク質（配列番号９〜１２）および本開示の混合物中に含まれる個々の抗原または抗原ドメイン（配列番号１〜８）が、以下の表１に列挙されている。
【００６９】
【表１−１】
2017527293.tif 000002
【００７０】
【表１−２】
2017527293.tif 000003
【００７１】
【表１−３】
2017527293.tif 000004
【００７２】
【表１−４】
2017527293.tif 000005
【００７３】
さらなる実施形態は、特に無作為法による、または部位指定カップリング法の使用による、組換えタンパク質をそれ自身またはその他の分子、タンパク質または担体とコンジュゲートするための方法に関する。特に部位指定カップリングは、組換えタンパク質内に特異的に保持される、または導入されるＮ−グリコシル化部位に収容され得る。
【００７４】
本開示は、本開示のポリヌクレオチドに由来するすべての分子、および遺伝的にコードされるアミノ酸配列と比較した、翻訳後プロセシングによる本願に記載されるそのすべての変異体を含むということも理解される。これらの翻訳後修飾は、天然宿主または任意の適した発現宿主による生成／発現の際に起こるとき、これらに限らないが、リーダーおよび／またはプロ配列などのＮ末端配列のタンパク質分解による切断、Ｃ末端伸長のタンパク質分解による除去、Ｎ−および／またはＯ−グリコシル化または脱グリコシル化、脂質化、アシル化、脱アミド化、ピログルタミン酸形成、リン酸化および／またはその他、またはそれらの任意の組合せを含む。これらの翻訳後修飾は、本明細書において調査されたようにタンパク質の特性に影響を有する場合も有さない場合もある。
【００７５】
用語「修飾」は本明細書において、例えばアミノ酸配列中の特定の位置でのアミノ酸残基の置換、挿入または欠失、ならびにポリペプチド状の特定の位置のリン酸化、パルミトイル化のようなアセチル化、メチル化、硫酸化、グリコシル化、イソプレニル化のような脂質化、ファルネシル化、脂肪酸部分の結合、グリピエーション（glypiation）および／もしくはユビキチン化、またはそれらの組合せを指す。
【００７６】
用語「修飾すること」は本明細書において、抗体またはその抗原結合部分中の１個または複数のアミノ酸を変更することを含む。変更は、１つまたは複数の位置でアミノ酸を付加、置換または欠失することによってもたらされ得る。変更は、ＰＣＲ突然変異誘発などの既知技術を使用してもたらされ得る。
【００７７】
用語「変異体」とは、元の非変異体ポリペプチドに対する相同ポリペプチドを含み、元の非変異体ポリペプチドと結合する少なくとも１種の抗体によって認識され得、ここで、変異体は、１つまたは複数の（いくつかの）位置で変更、すなわち、置換、挿入および／または欠失を含む。用語「変異体」はまた、修飾を有するポリペプチドも含むが、元のポリペプチドの同一または相同アミノ酸配列を含む。
【００７８】
用語「相同ポリペプチド」は、本開示によれば、本開示の混合物またはワクチン組成物中の組換えタンパク質に対して少なくとも７０％、または好ましくは少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％もしくは９９％の配列同一性を有する任意の組換えタンパク質を含む。特に、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１または配列番号１２の配列を含む混合物に対して。
【００７９】
相同性は、本開示の融合タンパク質の類似体または変異体として規定される。融合タンパク質は特定のアミノ酸を特徴とし、特定の核酸配列によってコードされる。このような配列は組換えまたは合成法によって生成される類似体および変異体を含み、このようなポリペプチド配列は組換えポリペプチド中の１個または複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加または欠失によって修飾されており、本明細書において記載される生物学的アッセイのいずれかにおいて依然として免疫原性であると理解される。置換は、好ましくは「保存的」である。置換は、好ましくはアミノ酸配列の何らかの変更につながらないが、タンパク質の発現を増強するよう導入され得るコドン使用におけるサイレント置換である。表４によれば、第２列の同一ブロック中の、好ましくは第４列の同一の並び中のアミノ酸は互いに置換され得る。第２および第４列中のアミノ酸は１文字コードで示されている。
【００８０】
別の態様では、本開示は、
ａ）配列番号９、配列番号１０、配列番号１１もしくは配列番号１２の配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子、
ｂ）好ましくは、１個もしくは複数のアミノ酸残基が保存的に置換されている配列番号９、配列番号１０、配列番号１１もしくは配列番号１２の配列を有する配列の修飾された形態をコードする核酸分子、
ｃ）ストリンジェントな条件下でａ）〜ｂ）の核酸分子のいずれかとハイブリダイズ可能である核酸分子、
ｄ）ストリンジェントな条件下でａ）〜ｃ）の核酸分子のいずれかの相補体とハイブリダイズ可能である核酸分子、
ｅ）ａ）〜ｄ）の核酸分子のいずれかと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸分子、
ｆ）またはａ）〜ｅ）の核酸分子のいずれかの相補体
をコードする単離された核酸分子または複数の核酸分子に関連する。
【００８１】
用語「核酸分子」または「核酸」は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡまたはＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはＬＮＡ起源の任意の一本鎖または二本鎖核酸分子を示すよう意図される。
【００８２】
用語「保存的突然変異」または「保存的置換」はそれぞれ、当業者が第１の突然変異に対して保存的と考えるアミノ酸突然変異を指す。この関連で「保存的」は、アミノ酸の特徴の点で同様のアミノ酸を意味する。例えば突然変異が、特定の位置で、非脂肪族アミノ酸残基（例えばＳｅｒ）の脂肪族アミノ酸残基（例えばＬｅｕ）との置換につながる場合、異なる脂肪族アミノ酸（例えばＩｌｅまたはＶａｌ）との同一位置における置換は保存的突然変異と呼ばれる。さらなるアミノ酸の特徴として、残基の大きさ、疎水性、極性、電荷、ｐＫ値およびその他の当技術分野で公知のアミノ酸の特徴が挙げられる。したがって保存的突然変異は、塩基性と塩基性の置換、酸性と酸性の置換、極性と極性の置換などの置換を含み得る。このように導かれたアミノ酸のセットは構造的理由のために保存される可能性が高い。
【００８３】
本開示はまた、本開示のヌクレオチド分子を含むベクターを対象とする。用語「ベクター」は、連結されている別の核酸を輸送できる核酸分子を含む。ある種のベクターは、さらなるＤＮＡセグメントがライゲーションされ得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す「プラスミド」である。別の種類のベクターは、さらなるＤＮＡセグメントがウイルスゲノム中にライゲーションされ得るウイルスベクターである。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞中で自己複製できる（例えば細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。その他のベクター（例えば非エピソーム哺乳動物ベクター）は宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ得、それによって宿主ゲノムとともに複製される。さらに特定のベクターは、作動可能に連結されている遺伝子の発現を指示できる。このようなベクターは本明細書において「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターはプラスミドの形態であることが多い。本明細書において「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドがベクターの最もよく使用される形態であるので同義的に使用され得る。しかし本開示は、同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）など発現ベクターの、このようなその他の形態を含むことを意図する。
【００８４】
有利な実施形態では、組換えタンパク質のヌクレイック（nucleic）配列は、例えば、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）中に形質転換され得る適した酵母発現ベクター中に挿入され得る。
【００８５】
本開示はまた、本開示の組換え融合タンパク質を含むベクターを有する宿主細胞を対象とする。語句「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）は、組換え発現ベクターが導入されている細胞を含む。このような用語は特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の後代も指すことを意図することは理解されなければならない。突然変異または環境の影響のいずれかによって、続いて起こる世代において特定の修飾が起こり得るので、このような後代は実際親細胞と同一でない場合もあるが、なおも本明細書における用語「宿主細胞」の範囲内に含まれる。
【００８６】
宿主細胞は単一の宿主細胞の後代を含み、後代は天然の、偶発的または計画的な突然変異および／または変更により、元の親細胞と必ずしも完全に同一でない場合もある（形態において、または全ＤＮＡ相補体において）。宿主細胞は本開示の組換えベクターまたはポリヌクレオチドを用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでトランスフェクトされた、または感染した細胞を含む。本発明の組換えベクターを含む宿主細胞は「組換え宿主細胞」とも呼ばれることもある。
【００８７】
用語「宿主細胞（単数または複数）」は、本開示に従って組換えタンパク質を精製するプロセスにおいて使用され得る細胞（単数または複数）を指す。このような宿主細胞は対象のタンパク質（ＰＯＩ）を保持する。宿主細胞はタンパク質発現細胞とも呼ばれ得る。本発明の宿主細胞は、これらに限らないが、原核細胞、真核細胞、古細菌、細菌細胞、昆虫細胞、酵母、哺乳動物細胞および／または植物細胞であり得る。宿主細胞として想定される細菌はグラム陰性またはグラム陽性のいずれか、例えば、大腸菌（Escherichia coli）、エルウィニア（Erwinia）種、クレブジエラ（Klebsellia）種、ラクトバチルス（Lactobacillus）種、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescence）種または枯草菌（Bacillus subtilis）であり得る。通常の酵母宿主細胞はサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）およびピキア・パストリス（Pichia pastoris）からなる群から選択される。
【００８８】
有利な実施形態では、宿主細胞は、酵母細胞、特に、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）酵母細胞である。
【００８９】
本開示の組換えタンパク質を発現するために、融合タンパク質またはその一部をコードするＤＮＡは、遺伝子が転写および翻訳制御配列と作動可能に連結されるよう発現ベクター中に挿入され得る。この関連で、用語「作動可能に連結された」は、ベクター内の転写および翻訳制御配列が、タンパク質遺伝子の転写および翻訳を調節するその意図される機能を果たすよう、タンパク質遺伝子がベクター中にライゲーションされることを意味する。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用される発現宿主細胞と適合するよう選択される。単離されたタンパク質ドメイン配列は通常、同一発現ベクター中に挿入される。タンパク質遺伝子は、標準法によって発現ベクター中に挿入される。さらに、組換え発現ベクターは、培養上清への標的タンパク質の分泌を促進するシグナルペプチドをコードし得る。
【００９０】
一般に当業者はベクターを十分に構築し、組換え遺伝子発現のためのプロトコールを設計できる。さらなる詳細については、例えば参照により本明細書において組み込まれるMolecular Cloning : a Laboratory Manual : 2nd edition, Sambrook et al, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press（またはこの研究の後の版）およびCurrent Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992を参照のこと。
【００９１】
有利な実施形態では、発現ベクターは既知技術に従って酵母細胞に送達され得る。
【００９２】
本開示のさらなる態様は、本明細書において記載される核酸分子から本明細書において記載されるように組換えタンパク質を宿主細胞において発現する方法、前記タンパク質を生成するための適当な培養条件において本明細書において記載される融合タンパク質を発現できる宿主細胞、適当な条件下でこのような宿主細胞を培養することを含む組換えタンパク質を生成する方法に関し、この方法は細胞培養から前記タンパク質を単離することをさらに含み得、単離された融合タンパク質を適したさらなる成分（例えば別のタンパク質または賦形剤または担体であり得る）と混合することをさらに含み得る。
【００９３】
上記で論じたように、本開示に従って、組換えタンパク質は任意の望ましい系において生成され得る。ベクター構築物および発現系は当技術分野で公知であり、本明細書において提供される組換え融合ポリペプチドの使用を組み込むよう適応され得る。
【００９４】
一般に、当技術分野で公知の標準法は、本開示に従って酵母を培養するために使用され得る。
【００９５】
特定の実施形態では、本明細書に従う組換えポリペプチド／タンパク質は任意の既知方法によって生成され得る。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は酵母細胞またはその一部において発現される。タンパク質は、当技術分野で公知の従来の条件および技術に従って単離および精製され得る。これらは抽出、沈殿、クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動などといった方法を含む。本発明は、当技術分野で公知であり、本明細書において提供されるさまざまな植物発現系のいずれかを使用する、組換えポリペプチド（単数または複数）の生成物の精製および手頃なスケールアップを含む。
【００９６】
したがって、いくつかの有利な実施形態は、本開示の組換えタンパク質、特に、組換え融合タンパク質を生成する方法に関連し、方法は、
ａ）組換え融合タンパク質をコードする核酸を含む核酸構築物を提供するステップと、
ｂ）核酸構築物を宿主細胞中に導入するステップと、
ｃ）融合タンパク質の発現を可能にする条件下で宿主細胞を維持するステップと
を含む。
【００９７】
さらに、本開示は、生理学的に許容される媒体中に、活性成分としての本開示の混合物および担体を含む、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）に対してヒト個体を免疫処置するためのワクチン組成物に関連する。
【００９８】
「ワクチン」は、例えば、対象に投与されると、免疫応答を誘導する物質分子の組成物である。ワクチンは、ポリヌクレオチド分子、ポリペプチド分子および炭水化物分子ならびに糖タンパク質、リポタンパク質、炭水化物−タンパク質コンジュゲート、２種以上のポリペプチドまたはポリヌクレオチド間の融合物などといった各々の誘導体および組合せを含み得る。ワクチンは、当業者によって容易に理解されるであろうが、希釈剤、アジュバント、担体またはそれらの組合せをさらに含み得る。一実施形態では、ワクチン組成物は、アジュバントをさらに含む。
【００９９】
上記のように、ワクチン組成物中の組換えタンパク質は、炭水化物または脂質部分、例えば、担体に連結され得る、またはその他の方法で修飾され、例えばアセチル化され得る。適した担体は、プラスチック、例えばポリスチレンなどのポリペプチド（単数または複数）が疎水性非共有結合相互作用によって結合されているポリマーまたは多糖またはポリペプチド、例えばウシ血清アルブミン、オボアルブミンまたはキーホールリンペットヘマトシアニンなどのポリペプチド（単数または複数）が共有結合によって結合されているポリマーからなる群から選択される。適した媒体は、希釈剤および懸濁剤からなる群から選択される。アジュバントは、好ましくはジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ）、Ｑｕｉｌ  Ａ、ポリＩ：Ｃ、水酸化アルミニウム、フロイントの不完全アジュバント、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコール酸（ＴＤＭ）、トレハロースジベヘナートおよびムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、イヌリンまたはグルコピラノシル脂質アジュバント安定エマルジョン（ＧＬＡ−ＳＥ）からなる群から選択される。
【０１００】
活性成分としてペプチド配列を含有するワクチンの調製は、参照によってすべて本明細書に組み込まれる、米国特許第４，６０８，２５１号明細書、同４，６０１，９０３号明細書、同４，５９９，２３１号明細書および同４，５９９，２３０号明細書によって例示されるように、一般に当技術分野で十分に理解されている。
【０１０１】
ワクチンのアジュバント効果を達成するその他の方法として、水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウム（ミョウバン）などの薬剤の使用、糖の合成ポリマー（Carbopol）、熱処理によるワクチン中のタンパク質の凝集、アルブミンに対するペプシン処理された（Ｆａｂ）抗体を用いる再活性化による凝集、Ｃ．パルバム（parvum）などの細菌細胞またはグラム陰性菌の内毒素もしくはリポ多糖類成分との混合物が挙げられ、モノオレイン酸マンニド（Ａｒａｃｅｌ  Ａ）などの生理学的に許容されるオイル媒体中のエマルジョンまたはブロック代用物として使用されるパーフルオロカーボン（Ｆｌｕｏｓｏｌ−ＤＡ）の２０％溶液を有するエマルジョンも使用され得る。その他の可能性は、上記のアジュバントと組み合わせたサイトカインまたはポリＩ：Ｃなどの合成ＩＦＮ−γ誘導因子などの免疫調節物質の使用を含む。
【０１０２】
アジュバント効果を達成するための別の可能性は、Gosselin et al, 1992に記載される技術を使用することである。手短には、本発明の抗原などの関連抗原は、単球／マクロファージ上のＦｃ受容体に対する抗体（または抗原結合抗体断片）とコンジュゲートされ得る。
【０１０３】
ワクチンは、投与製剤と適合する方法で、治療上有効であり免疫原性であるような量で投与される。投与されるべき量は、例えば免疫応答を開始する個体の免疫系の能力および所望の保護の程度を含み、治療されるべき対象に応じて変わる。適した投与量範囲は約０．１マイクロｇ〜１０００マイクロｇの好ましい範囲、例えば約１マイクロｇ〜３００マイクロｇの範囲の、特に約１０マイクロｇ〜５０マイクロｇの範囲の、ワクチン接種あたりほぼ数百マイクログラム程度の活性成分のものである。最初の投与およびブースターショットのための適したレジメンも可変性であるが、それは最初の投与と、それに続くその後の接種またはその他の投与によって典型的に表される。適用の方法は広く変わり得る。ワクチンの投与のための従来法のいずれかが適用可能である。これらは、固体の生理学的に許容される基剤での、または生理学的に許容される分散物中での経口投与、注射などによる非経口的投与を含むと考えられている。ワクチンの投与量は投与経路に応じて変わり、ワクチン接種されるべきヒトの年齢、より少ない程度であるがワクチン接種されるヒトの大きさに従って変わる。
【０１０４】
ワクチンは注射、例えば皮下注射または筋肉内注射のいずれかによって従来的に非経口的に投与される。その他の投与様式に適しているさらなる製剤として、坐剤が挙げられ、いくつかの場合には、経口製剤が挙げられる。坐剤については、従来の結合剤および担体として、例えばポリアルカレングリコールまたはトリグリセリドを挙げることができ、このような坐剤は０．５パーセント〜１０パーセント、好ましくは１〜２パーセントの範囲の活性成分を含有する混合物から形成され得る。経口製剤は、例えば医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなど通常使用される賦形剤を含む。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性製剤または散剤の形態をとり、有利には１０〜９５パーセントの活性成分、好ましくは２５〜７０％の活性成分を含有する。
【０１０５】
多数の例では、ワクチンの複数の投与を有することが必要であろう。特にワクチンはマラリアの感染を防ぐために、および／または確定的なマラリア感染を治療するために投与され得る。感染を防ぐために投与される場合には、ワクチンは感染の決定的な臨床徴候または感染症状が存在する前に予防的に与えられる。
【０１０６】
遺伝的変動のために、異なる個体は同一タンパク質に対して変動する強度の免疫応答を有して反応し得る。したがって、本開示のワクチンは免疫応答を増大するために、本開示のいくつかの異なる融合タンパク質を含み得る。ワクチンは２種以上の融合タンパク質または免疫原性部分を含み得、そこでタンパク質のすべては上記で定義されるとおりであり、またはペプチドのすべてではない一部は、熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）またはプラスモジウム属（Plasmodium）由来のその他の寄生生物に由来し得、後の実施例では、ポリペプチドについて上記で示される判定基準を必ずしも満たさないポリペプチドは、その自身の免疫原性ゆえ作用し得るか、または単にアジュバントとして作用し得る。ワクチンは、１〜２０種、例えば２〜２０種またはさらに３〜２０種の異なる組換えタンパク質または融合タンパク質、例えば３〜１０種の異なるタンパク質または融合タンパク質を含み得る。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は前記担体に吸着されるか、または共有結合によって結合される。別の実施形態では、担体は担体タンパク質である。
【０１０８】
本開示はまた、本開示の混合物中の種々の組換えタンパク質と結合する単離された抗体またはその断片を含む抗体組成物に関連する。本開示によれば、用語「抗体」は、これらに限らないが、組換え抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体、ミニボディー、ダイアボディー、ナノボディー、トリボディーならびにＦａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２および上述の単一ドメイン抗体などの本開示の抗体の抗原結合部分を含む抗体断片を含む。
【０１０９】
本開示のさらなる態様は、治療有効量の本開示の組換えタンパク質の混合物を投与するステップを含む、患者において熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）によって引き起こされるマラリアを治療および／または予防するための方法に関連する。
【０１１０】
対象に投与される本開示の混合物の実際の投与量は、体重、状態の重症度、治療されている疾患の種類、これまでのまたは同時発生的治療的介入、患者の特発性および投与経路などに関する物理的および生理学的因子によって決定され得る。投与に責任のある医師がいかなる事象においても、組成物中の活性成分（単数または複数）の濃度および個々の対象に適当な用量を決定する。
【０１１１】
以下の方法および実施例は例示目的で提供され、決して本開示の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【０１１２】
方法および実施例
以下の実施例では、本開示の材料および方法が提供される。これらの実施例は単に例示目的であって、決して本開示を限定すると解釈されてはならないということが理解されなければならない。本明細書において引用されたすべての刊行物、特許および特許出願は、すべての目的でその全文が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１３】
例として、ＶＡＭＡＸ  Ｉ（配列番号９）、ＶＡＭＡＸ  ＩＩ（配列番号１０）およびＶＡＭＡＸ  ＶＩ（配列番号１１）と名付けられた３種の異なる組換え融合タンパク質が、Ｐ．パストリス（P. pastoris）において発酵によって生成された。その後、タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットによって精製および分析された。
【０１１４】
１．発現構築物のクローニング
Ｐ．パストリス（P. pastoris）コドン使用頻度について最適化された合成遺伝子（ＧｅｎｅＡｒｔ）を、導入遺伝子発現を制御するためのメタノール誘導性ＡＯＸ１プロモーターおよびＡＯＸ１ターミネーターを含むＰ．パストリス（P. pastoris）発現ベクター中に挿入した。発現カセットはまた、天然Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）α因子分泌配列を特徴としていた。ｐＵＣ複製起点および選択のための、プロモーターとしてのＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）ＴＥＦ１および合成原核ＥＭ７およびターミネーターとしてのＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）ＣＹＣ１領域の制御下の、ゼオシン耐性タンパク質Ｓｈ  ｂｌｅ。最適化された配列を、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ断片としてＰ．パストリス（P. pastoris）発現ベクター中に挿入した。各プラスミドの１．５μｇのアリコートを、ＰｍｅＩ（ＮＥＢ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて線形化し、沈殿（７０％イソプロパノール、１０％  ４Ｍ  ＬｉＣｌ）によって精製し、１０μｌの滅菌再蒸留水に再溶解した。（Cregg et al. 2000）によって記載されたようにエレクトロポレーションのためにＰ．パストリス（P. pastoris）ＫＭ７１Ｈ細胞を調製し、−８０℃で保存した。２ｍｍキュベット、２５００Ｖの充電電圧および５ｍｓのパルス長を用いるＭｕｌｔｉｐｏｒａｔｏｒデバイス（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｗｅｓｓｅｌｉｎｇ−Ｂｅｒｚｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、４０μｌのコンピテント細胞中に５μｌのプラスミドＤＮＡを導入することによってエレクトロポレーションを実施した。細胞を直ちに、氷冷１Ｍソルビトールと混合し、２ｍｌのＹＳＤ培地（１％酵母抽出物、２％ダイズペプトン、２％デキストロース）中に移した。２８℃および１６０ｒｐｍ（ＶＫＳ−７５  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｓｈａｋｅｒ、Ｅｄｍｕｎｄ  Ｂｕｈｌｅｒ、Ｈｅｃｈｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で４５分間インキュベートした後、細胞を遠心分離（８００×ｇ）によってペレット化し、５０μｌの滅菌水に再懸濁し、選択培地（１００μｇ／Ｌのゼオシンを補給したＹＳＤ）上にプレーティングし、２８℃で、暗所に４８時間置いた。
【０１１５】
図２は、この実施例において使用されるＶＡＭＡＸ  Ｉ（配列番号９）、ＶＡＭＡＸ  ＩＩ（配列番号１０）およびＶＡＭＡＸ  ＶＩ（配列番号１１）と名付けられた組換え融合タンパク質の模式図を示す。
【０１１６】
２．スクリーニング
各形質転換事象の最大２４個のコロニーを、マイクロタイタープレート中の１００μｌのＹＳＤ選択培地中に選びとり、ＶＫＳ−７５  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｓｈａｋｅｒ（Ｅｄｍｕｎｄ  Ｂｕｈｌｅｒ、Ｈｅｃｈｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中、２８℃で２４時間インキュベートした。５０μｌの前培養物を使用して、深底ウェルプレート中の、７５０μｌの、ゼオシン（Zeocin）を補給したＹＳＧ培地（１％酵母抽出物、ダイズペプトン２％、グリセロール２％）に播種した。２８℃および９００ｒｐｍ（ＶＫＳ−７５  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｓｈａｋｅｒ、Ｅｄｍｕｎｄ  Ｂｕｈｌｅｒ、Ｈｅｃｈｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で２４時間インキュベートした後、２４時間間隔での１％メタノールの添加によって、発現を２回誘導した。遠心分離（２０００×ｇ、４℃、１０分）によって細胞を回収し、１／５０００の希釈で、対応する骨髄腫細胞株ＭＲＡ−３１５（LH MillerおよびA Saulによって寄託されたＭＲ４によって得られた）から生成されたＰｆｓ２５特異的マウスモノクローナル抗体ｍＡｂ  ４Ｂ７を使用するドットブロットによって、分泌された組換えタンパク質の存在について上清を試験し、続いて、標識されたヤギ抗マウスＨ＋Ｌアルカリホスファターゼを用いて検出した。ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（基質バッファー：１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．６中の１ｍｇ  ｍｌ−１）を用いてバンドを可視化した。インキュベーションステップの間に、メンブランを、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を補給したＰＢＳを用いて３回洗浄した。
【０１１７】
３．流加発酵
播種材料調製
１５０μＬの予め確立したリサーチセルバンクを、２００ｍｌのＹＳＧを含有する５００ｍｌのバッフル底振盪フラスコに移すことによって播種材料を調製した。培養物を２８℃および１６０ｒｐｍの振盪速度で一晩インキュベートした。
【０１１８】
発酵
培養を、３０Ｌの作業容量および３のＨ／Ｄ比を有するＢｉｏＰｉｌｏｔ４０バイオリアクター（Ａｐｐｌｉｋｏｎ、Ｓｃｈｉｅｄａｍ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）において実施した。リアクターは３つの６羽Ｒｕｓｈｔｏｎ羽根車、高いガス流速流速を確実にするための１つのＬ−スパージャ、ＢｌｕｅＩｎＯｎｅ  Ｆｅｒｍオフガス分析機器（ＢｌｕｅＳｅｎｓ、Ｈｅｒｔｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＡＣＴＯＭＡＴ  Ｎ  ＩＩコントロールシステム（Ｈｅｉｎｒｉｃｈ  Ｆｒｉｎｇｓ、Ｂｏｎｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）と組み合わせたＡＬＣＯＳＥＮＳプローブを備えていた。
【０１１９】
発泡を防ぐために、１５Ｌの減少した、２５ｍｌ／ＬのＨ３ＰＯ４（８５％、ｖ／ｖ）、２．３１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１８ｇ／ＬのＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．７２ｇ／ＬのＫＯＨ、２．８５ｇ／ＬのＫ２ＳＯ４、２０ｇ／Ｌのグリセロールおよび０．２５ｍｌ／ＬのＳｔｒｕｋｔｏｌ  Ｊ６７３（Ｓｃｈｉｌｌ＋Ｓｅｉｌａｃｈｅｒ  「Ｓｔｒｕｋｔｏｌ」ＧｍｂＨ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を含有する基礎塩類培地を用いて流加培養を開始した。
【０１２０】
滅菌および２５％（ｗ／ｗ）アンモニアを用いるｐＨ調整後、８ｍｌ／Ｌのピキア微量金属（ＰＴＭ）溶液を無菌的に添加した。ＰＴＭ溶液は、０．１０ｇ／Ｌのビオチン、０．０１ｇ／ＬのＨ３ＢＯ３、０．１０ｇ／ＬのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．３０ｇ／ＬのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、３２．５０ｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２．５０ｍｌ／ＬのＨ２ＳＯ４、１．５０ｇ／ＬのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．０４ｇ／ＬのＮａＩ、０．１０のｇ／ＬのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、１０ｇ／ＬのＺｎＣｌ２を含有していた。培養は、以下の条件下で制御された：成長温度２８℃、誘導温度２５℃、通気１ｖｖｍおよび１〜２．１バールの間で変動する絶対圧力。ｐＨは、２５％（ｗ／ｗ）アンモニアの添加によって６．０で維持した。誘導相を除いて、溶存酸素飽和（ＤＯ）は、３５０から６１０ｒｐｍに撹拌速度を増大することによって３０％を上回って維持した。１５０ｍｌの前培養物を用いて播種した後、すべての発酵は、２相戦略に従って実施した：第１相は、ＯＤ６００約６０±１０のＤＯ値の急上昇によって示されるバッチグリセロールの枯渇で終了した。その後、０．２５％（ｖ／ｖ）メタノールを添加することによって第２相（誘導相）を開始した。その結果、すべての添加された溶液および除去されたサンプル容量を考慮して発酵容量を算出した。得られた抵抗読み取り値を、ＡＣＥＴＯＭＡＴ  Ｎ  ＩＩの再較正のために使用した。再較正後、メタノール濃度を、閉ループ制御を使用して０．２５％（ｖ／ｖ）で一定に維持した。合計約２７００ｇのメタノールを添加した後に誘導を停止し、発酵培養液を２０℃未満の温度に冷却した。その後、全培養液を回収し、細胞を、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ａｖａｎｔｉ  Ｊ２０（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｂｒｅａ、ＣＡ、ＵＳＡ）ビーカー遠心分離機（４℃、９，０００×ｇで２０分間）における遠心分離によって上清から分離した。上清を回収し、８００／４５０ｍＬアリコートで−２０℃で保存した。
【０１２１】
４．タンパク質精製
ｐＨを７．０に調整した後、発酵培養液を回収し、４℃および９０００×ｇで２０分間遠心分離した（Ｂｅｃｋｍａｎｎ  Ａｖａｎｔｉ  Ｊ−２６  ＸＰ）。上清を、即時処理のため、または−２０℃での貯蔵のために回収した。
【０１２２】
その後の処理／精製のために、２種の直交型クロマトグラフィー法を使用した：捕獲ステップとしての固定化された金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）と、それに続く、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）。
【０１２３】
ＩＭＡＣ
ＩＭＡＣの間の生成物の効率的な結合を確実にするために、上清を室温に順化させ、必要な場合には、ｐＨを、５Ｍ  ＮａＯＨを用いて７．０に調整した。０．４５／０．２μｍフィルター（Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ  ２  １５０、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ、Ｇｏｅｔｔｌｉｎｇｅｎ）を使用して、粒子を除去し、したがって、クロマトグラフィーカラムが閉塞するのを防いだ。
【０１２４】
条件付けされた上清を、平衡化された（２００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．０）、銅担持キレーティングセファロースファストフロー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に、２００〜２５０ｃｍ／ｈの流速でローディングした。ローディング後、カラムを、７カラム容積（ＣＶ）の平衡バッファーを用いて洗浄し、続いて、生成物を溶出した（２００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、７５〜１２５ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）。溶出物をＳＤＳ−Ｐａｇｅ、クマシー染色およびウエスタンブロットによって分析した。最後に、適当な画分をプールした。
【０１２５】
バッファー交換
陰イオン交換クロマトグラフィーを流す前に、ＩＭＡＣ溶出液のバッファーを、ＨｉＰｒｅｐ  ２６／１０脱塩カラム（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して２０ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー、ｐＨ８．０と交換した。
【０１２６】
陰イオン交換クロマトグラフィー
先に脱塩したＩＭＡＣ溶出液を、平衡化された（バッファーＡ：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０）、５ｍＬのＱセファロースＨＰ（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を詰めたＭｅｄｉａＳｃｏｕｔ（登録商標）ＭｉｎｉＣｈｒｏｍカラム（ＡＴＯＬＬ、Ｗｅｉｎｇａｒｔｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）上にローディングした。その後、カラムをバッファーＡを用いて洗浄し、２０％バッファーＢ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）を使用する第２の洗浄ステップを続けた。最後に、ワクチン候補に応じて、生成物溶出のために以下の濃度のバッファーＢを使用した：
【０１２７】
【表２】
2017527293.tif 000006
【０１２８】
ＳＥＣ
ＩＭＡＣ溶出液／プールを、１０ｋＤａ  ＭＷＣＯメンブレン（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）を有するＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ遠心フィルターユニットを使用して１０〜３０倍濃縮した。最大２ｍｌの濃縮物を、平衡化した（２．７ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭのＮａＣｌ、８．１ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４）セファクリルＳ−１００  ＨＲ  １６／６０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にローディングした。生成物を、平衡バッファーを用いるイソクラティック溶出によって分離した。
【０１２９】
５．ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロット解析
タンパク質を、非還元条件下で市販の４〜１２％（ｗ／ｖ）勾配ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で分離し、フェアバンクス（Fairbanks）プロトコール（Wong et al. 2000）に従ってクマシーＲ−２５０で染色した。分離されたタンパク質をニトロセルロースメンブレン（Ｗｈａｔｍａｎ、Ｄａｓｓｅｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ）上にブロッティングし、ＰＢＳに溶解した５％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳を用いてブロッキングした。タンパク質を、１：５０００希釈のＰｆＡＭＡ１特異的ラットｍＡｂ４Ｇ２を用いてプロービングした。二次抗体は、アルカリホスファターゼ標識されたヤギ抗ラットＩｇＧとした。バンドをＮＢＴ／ＢＣＩＰ（基質バッファー：１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．６中、１ｍｇ・ｍｌ−１）を用いて可視化した。インキュベーションステップの間に、メンブランを０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を補給したＰＢＳを用いて３回洗浄した。
【０１３０】
図３は、Ｖ１：ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ１、Ｐｆｓ２５およびＰｆＣＳＰ＿ＴＳＲを有するＶＡＭＡＸ  Ｉ、Ｖ２：ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ２、Ｐｆｓ２５およびＰｆＭＳＰ１−１９を有するＶＡＭＡＸ  ＩＩならびにＶ３：ＰｆＡＭＡ１−ＤＩＣＯ３、Ｐｆｓ２５およびＰｆＲｈ５＿Ｑ５Ａを有するＶＡＭＡＸ  ＶＩ  のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ）およびウエスタンブロット解析（Ｂ）を示す。３種の融合タンパク質は、十分に発現され、単離後ワクチン接種のために使用され得る。図は、３種の融合タンパク質すべてが無傷であり、酵母において十分に発現されることを示す。
【０１３１】
図３中の略語は以下である：
Ｖ１：ＶＡＭＡＸ  Ｉ（配列番号９）
Ｖ２：ＶＡＭＡＸ  ＩＩ（配列番号１０）
Ｖ３：ＶＡＭＡＸ  ＶＩ（配列番号１１）
Ｍ：分子量マーカー
【０１３２】
６．ウサギの免疫処置
精製されたタンパク質（配列番号９〜１１）を、等モル比量で混合し（本明細書において以下、ＶＡＭＡＸ−Ｍｉｘと呼ばれる）、凍結乾燥した。製造業者の使用説明書に従ってＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（Ｂｒｅｎｎｔａｇ）を用いる５０μｇ用量の製剤化後に、１回の初回刺激および２回の連続追加免疫注射（２８および５６日目）を使用してウサギを免疫処置するために、組換えタンパク質混合物を、Ｂｉｏｇｅｎｅｓ（Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に送った。７０日目に血液サンプルを採取した。
【０１３３】
７．ウサギ血清から得られた抗体のプロテインＡ精製
免疫処置後、ウサギ抗血清から得られた抗体を、プロテインＡクロマトグラフィーによって精製した。手短には、血清サンプルをＰＢＳを用いて１：５希釈し、精製に先立って０．４５μｍフィルターを通して濾過した。抗体をプロテインＡ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に結合させ、結合していない不純物をＰＢＳを用いる洗浄ステップによって除去した。結合している抗体を１００ｍＭグリシンｐＨ３．０を用いて溶出し、１Ｍ  ＴＲＩＳ  ｐＨ８．０を用いて直接中和した。溶出画分を、２．５ｍｌに濃縮し、５ｍＭリン酸バッファーｐｈ７．５（ＰＤ１０）に対してバッファー交換し、凍結乾燥した。抗体を６００μｌのＰＢＳに溶解し、濾過滅菌した。濃度を、分析用ＳＥＣ（Ｓ２００  ５／１５０）で１／２０希釈で測定した。
【０１３４】
８．滑走運動性アッセイ
９６ウェルガラス底黒色プレートを、抗ＣＳＰ  ｍＡｂ  ３ＳＰ２を用いてコーティングして、ｓｈｅｄ  ＣＳＰタンパク質を捕獲した。１０．０００個の熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）スポロゾイトを、ウサギＩｇＧとともに３０分間プレインキュベートし、次いで、３ＳＰ２コーティングされたスライド上に移した。９０分インキュベートした後、スポロゾイトを洗浄除去した。滑走痕跡を固定化し、抗ＣＳＰビオチン、続いてストレプトアビジン−ＡＦ５９４を用いて染色した。１０００ｘの倍率で蛍光顕微鏡によって滑走痕跡を可視化し、イメージをＦＩＪＩイメージングソフトウェアを用いて分析した。
【０１３５】
図４は、滑走運動性アッセイから得た結果を示す。精製されたウサギ免疫ＩｇＧを、９、３および１ｍｇ／ｍｌで使用した。プロットは、正常なウサギ血清から精製された抗体に対する阻害パーセントを示す。阻害の明確な用量依存性が観察された。
【０１３６】
９．成長阻害アッセイ
プラスモジウム属（Plasmodium）寄生生物に対する成長阻害の可能性を、標準化されたプロトコールを使用して実施した。熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）寄生生物株３Ｄ７Ａ、ＨＢ３、Ｖ１−Ｓおよび７ＧＢ（ＭＲ４によって提供された）を、３７℃で５％ＣＯ２、５％Ｏ２および９０％Ｎ２で、１０％Ａｌｂｕｍａｘ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１２μｇ／ｍｌのゲンタマイシンおよび１００μΜのヒポキサンチンを補給したＲＰＭＩ培地中、４％のヘマトクリットで、５％未満の寄生虫症で培養物中に維持した。培養物を日常的なルーチンで維持し、ギムザ染色によって寄生中症を推定した。アッセイに使用される赤血球は１５人のマラリア無感作血液ドナーから混合し、それらは３週間以内のものだった。赤血球はＳＡＧ−マンニトール中、４℃で保存した。寄生生物を、侵襲後１〜１６時間の時間ウィンドウ内の１０％ソルビトール処理によって同調させた。アッセイには、侵襲後３６〜４０時間の高度に同調した培養物のみを使用した。
【０１３７】
寄生生物および新鮮なＲＢＣおよび抗体を、およそ、０．１％の最終寄生中症および２％の最終ヘマトクリットを有するよう９６ウェルプレート中で混合した。バックグラウンド対照のために、寄生生物を含まないＲＢＣのみを寄生生物と同一条件下で培養物中に維持した。添加を行わずに熱帯熱マラリア原虫（plasmodium falciparum）寄生生物を培養することによって、寄生生物成長をモニタリングするための成長制御を実施した。すべてのサンプルを３連で測定した。陰性対照として、マラリア無感作ウサギおよびヒト血漿を得、精製された抗体を試験した。完全侵襲阻害の陽性対照として、ＥＤＴＡ（４ｍＭ最終濃度）およびＢＧ９８ウサギ抗ＡＭＡ−１ポリクローナル抗体を使用した。プレートは３７℃、９５％湿度、５％ＣＯ２、５％Ｏ２および９０％Ｎ２で４０〜４４時間インキュベートした。回収時に、冷ＰＢＳを用いて１回ウェルを洗浄し、凍結した。寄生生物成長をＭａｌｓｔａｔ（商標）アッセイ３２によって推定した。吸光度を分光光度計を使用して６５５ｎｍの波長で３０分後に測定した。阻害能は以下の式によって推定した：
阻害％＝１００％−（（Ａ６５５  ＩｇＧサンプル−Ａ６５５  ＲＢＣ対照））／（（Ａ６５５シゾント対照−Ａ６５５  ＲＢＣ対照））＊１００％
【０１３８】
上記のように、成長阻害アッセイは抗体の阻害の可能性を評価するための標準のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイである。アッセイは無性段階／血液段階をシミュレートする。
【０１３９】
図５は、成長阻害アッセイから得た結果を示す。精製された免疫ＩｇＧを、１０、５、２．５、１．２５、０．６２５、０．３１３、０．１５６および０．０７８ｍｇ／ｍｌで使用した。４種の試験された株のすべて（各グラフの上に示される）について、１０ｍｇ／ｍｌで４５％〜６８％の寄生生物成長阻害が観察され、ＶＡＭＡＸ−Ｍｉｘによって誘導される交雑株有効性が確認された。
【０１４０】
１０．標準膜飼育検定法（ＳＭＦＡ）
精製したＩｇＧサンプルを、熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）株ＮＦ５４−ｈｓｐ７０−ｌｕｃ由来の段階Ｖガメトサイト、ヒト赤血球と組み合わせ、アノフェレス・ステフェンシ（Anopheles stephensi）蚊に与えた。実験は、活性相補体の存在下で実施した。８日後、個々の蚊におけるルシフェラーゼ発現を分析した。
【０１４１】
図６は、ＳＭＦＡから得た結果を示す。精製したウサギ免疫ＩｇＧを、１、０．３、０．１、０．０３および０．０１ｍｇ／ｍｌで使用した。プロットは、正常なウサギ血清から精製された抗体に対する阻害パーセントを示す。阻害の明確な用量依存性が観察された。
【０１４２】
（参考文献）
本明細書を通じて引用される文献参考文献、発行された特許および公開された特許出願を含むすべての引用された参考文献の内容は、参照により本明細書に明確に組み込まれる。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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