(57)【要約】  予期せぬことに、コリネバクテリウム属の好アルカリ菌は、Ｌ−アミノ酸の製造に適していることが判明した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号７２で表される配列に対して少なくとも８５％の配列相同性を有することを特徴とするアラニンデヒドロゲナーゼ。
【請求項２】
以下のポリヌクレオチドからなる群から選択される、アラニンデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチド。
ａ）請求項３に記載のアラニンデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチド；
ｂ）配列番号７１で表される配列の位置３０１〜１３６５の配列に対して少なくとも７５％の配列相同性を有する配列を有するポリヌクレオチド；
ｃ）（ａ）又は（ｂ）に記載のポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチド。
【請求項３】
以下の酵素から選択される、ｈｕｔ群の酵素。
ａ）配列番号１９２で表される配列に対して、少なくとも８５又は９０％、好ましくは少なくとも９２、９４、９６又は９８％、特に好ましくは１００％の配列相同性を有することを特徴とするウロカニン酸ヒドラターゼ（ｈｕｔＵ）；
ｂ）配列番号１９４で表される配列に対して、少なくとも８５又は９０％、好ましくは少なくとも９２、９４、９６又は９８％、特に好ましくは１００％の配列相同性を有することを特徴とするイミダゾロンプロピオナーゼ（ｈｕｔＩ）；
ｃ）配列番号１９６で表される配列に対して、少なくとも８５又は９０％、好ましくは少なくとも９２、９４、９６又は９８％、特に好ましくは１００％の配列相同性を有することを特徴とするヒスチジンアンモニアリアーゼ（ｈｕｔＨ）；
ｄ）配列番号１９８で表される配列に対して、少なくとも８５又は９０％、好ましくは少なくとも９２、９４、９６又は９８％、特に好ましくは１００％の配列相同性を有することを特徴とするホルミミドイルグルタマーゼ。
【請求項４】
以下のポリヌクレオチドから選択される、ｈｕｔ群の酵素をコードするポリヌクレオチド。
ａ）請求項５の（ａ）に記載のウロカニン酸ヒドラターゼ（ｈｕｔＵ）をコードし、配列番号１９１で表される配列の位置３０１〜１９８３の配列に対して、少なくとも７０又は７５％、好ましくは少なくとも８０又は８５％、より好ましくは少なくとも９０又は９５％、特に好ましくは１００％の配列相同性を有するポリヌクレオチド；
ｂ）請求項５の（ｂ）に記載のイミダゾロンプロピオナーゼ（ｈｕｔＩ）をコードし、配列番号１９３で表される配列の位置３０１〜１５０９の配列に対して、少なくとも７０又は７５％、好ましくは少なくとも８０又は８５％、より好ましくは少なくとも９０又は９５％、特に好ましくは１００％の配列相同性を有するポリヌクレオチド；
ｃ）請求項５の（ｃ）に記載のヒスチジンアンニモアリアーゼ（ｈｕｔＨ）をコードし、配列番号１９５で表される配列の位置３０１〜１８５１の配列に対して、少なくとも７０又は７５％、好ましくは少なくとも８０又は８５％、より好ましくは少なくとも９０又は９５％、特に好ましくは１００％の配列相同性を有するポリヌクレオチド；
ｄ）請求項５の（ｄ）に記載のホルミミドイルグルタマーゼ（ｈｕｔＧ）をコードし、配列番号１９７で表される配列の位置３０１〜１２０９の配列に対して、少なくとも７０又は７５％、好ましくは少なくとも８０又は８５％、より好ましくは少なくとも９０又は９５％、特に好ましくは１００％の配列相同性を有するポリヌクレオチド；
ｅ）（ａ）〜（ｄ）に記載のポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１に記載のアラニンデヒドロゲナーゼの少なくとも１種及び／又は請求項２に記載のポリヌクレオチドの少なくとも１種を含むことを特徴とする組み換え微生物。
【請求項６】
請求項１に記載のアラニンデヒドロゲナーゼ及び／又は請求項２に記載のポリヌクレオチドが過剰発現された状態で存在することを特徴とする、請求項５に記載の組み換え微生物。
【請求項７】
請求項３に記載のｈｕｔ群の酵素の少なくとも１種、好ましくは全て及び／又は請求項４に記載のポリヌクレオチドの少なくとも１種、好ましくはｈｕｔ群の全ての酵素をコードするポリヌクレオチドを含むことを特徴とする組み換え微生物。
【請求項８】
請求項３に記載のｈｕｔ群の酵素の少なくとも１種、好ましくは全て及び／又は請求項４に記載のポリヌクレオチドの少なくとも１種、好ましくはｈｕｔ群の全ての酵素をコードするポリヌクレオチドが過剰発現された状態で存在することを特徴とする、請求項７に記載の組み換え微生物。
【請求項９】
コリネバクテリウム属菌、好ましくはＣ．ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓ又はＣ．グルタミカムであることを特徴とする、請求項５〜９のいずれか１項に記載の組み換え微生物。
【請求項１０】
微生物内でＬ−アミノ酸を過剰産生させる方法であって、請求項１又は３に記載のポリペプチド及び／又は請求項２又は４に記載のポリヌクレオチド及び／又は請求項５〜９のいずれか１項に記載の組み換え微生物を使用することを特徴とする方法。
【請求項１１】
Ｌ−アミノ酸を過剰産生させる方法であって、好アルカリ菌を使用することを特徴とする方法。
【請求項１２】
前記好アルカリ菌が、好アルカリコリネ型細菌、特に好アルカリコリネバクテリウム属菌、好ましくはＣ．ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓであることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
過剰産生させる前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、グルタミン酸系のＬ−アミノ酸、特に、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−プロリン及びＬ−アルギニン、アスパラギン酸系のＬ−アミノ酸、特に、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−リシン、Ｌ−イソロイシン及びＬ−トレオニンから選択されることを特徴とする、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
過剰産生させる前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−グルタミン酸及びＬ−リシンから選択されることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
以下の酵素からなる群から選択される酵素。
ａ）配列番号１０６で表される配列及び配列番号１０６で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するトレオニンデヒドラターゼ（ＩｌｖＡ、ＥＣ  ４．３．１．１９）、
ｂ）配列番号９８で表される配列及び配列番号９８で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するアセト乳酸合成酵素のサブユニット（ＩｌｖＢ）、
ｃ）配列番号１００で表される配列及び配列番号１００で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するイソメロレダクターゼ（ＩｌｖＣ、ＥＣ  １．１．１．８６）、
ｄ）配列番号１０２で表される配列及び配列番号１０２で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＩｌｖＤ、ＥＣ  ４．２．１．９）、
ｅ）配列番号１０４で表される配列及び配列番号１０４で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するトランスアミナーゼ（ＩｌｖＥ、ＥＣ  ２．６．１．４２）、
ｆ）配列番号１２２で表される配列及び配列番号１２２で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するアセト乳酸合成酵素（ＩｌｖＨ、ＥＣ  ２．２．１．６）、
ｇ）配列番号１０８で表される配列及び配列番号１０８で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するトレオニンシンターゼ（ＴｈｒＣ、ＥＣ  ４．２．３．１）、
ｈ）配列番号１１０で表される配列及び配列番号１１０で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有する任意にフィードバック阻害耐性を有するイソプロピルリンゴ酸シンターゼ（ＬｅｕＡ、ＥＣ  ２．３．３．１３）、
ｉ）配列番号１１２で表される配列及び配列番号１１２で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するイソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＬｅｕＢ、ＥＣ  １．１．１．８５）、
ｊ）配列番号１１４又は１１６で表される配列及び配列番号１１４又は１１６で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼのサブユニット（ＬｅｕＣＤ、ＥＣ  ４．２．１．３３）、
ｋ）配列番号１１８で表される配列及び配列番号１１８で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有する３−メチル−２−オキソブタン酸ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＰａｎＢ、ＥＣ  ２．１．２．１１）、
ｌ）配列番号１２０で表される配列及び配列番号１２０で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するパントテン酸合成酵素（ＰａｎＣ、ＥＣ  ６．３．２．１）、
ｍ）配列番号１２４で表される配列及び配列番号１２４で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｄｈ）、
ｎ）配列番号１２６で表される配列及び配列番号１２６で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するグルタミンシンテターゼ（グルタミンシンテターゼ１）、
ｏ）配列番号１２８で表される配列及び配列番号１２８で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するグルタミンシンテターゼ（グルタミンシンテターゼ２）、
ｐ）配列番号１３０で表される配列及び配列番号１３０で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するグルタミン酸シンターゼ、
ｑ）配列番号１３２で表される配列及び配列番号１３２で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するイソクエン酸デヒドロゲナーゼ、
ｒ）配列番号１３４で表される配列及び配列番号１３４で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するアコニット酸ヒドラーゼ、
ｓ）配列番号１３６で表される配列及び配列番号１３６で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するクエン酸シンターゼ、  
ｔ）配列番号１３８で表される配列及び配列番号１３８で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するアミノペプチダーゼＣ（ＰｅｐＣ）、
ｕ）配列番号１４０で表される配列及び配列番号１４０で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するピルビン酸デヒドロゲナーゼ、
ｖ）配列番号１４２で表される配列及び配列番号１４２で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するピルビン酸キナーゼ（ピルビン酸キナーゼ１）、
ｗ）配列番号１４４で表される配列及び配列番号１４４で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するピルビン酸キナーゼ（ピルビン酸キナーゼ２）、
ｘ）配列番号１４６で表される配列及び配列番号１４６で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するエノラーゼ、
ｙ）配列番号１４８で表される配列及び配列番号１４８で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有する２，３−ビスホスホグリセリン酸依存性ホスホグリセリン酸ムターゼ（ＧｐｍＡ）、
ｚ）配列番号１５０で表される配列及び配列番号１５０で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｐｇｋ）、
ａａ）配列番号１５２で表される配列及び配列番号１５２で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ１）、
ｂｂ）配列番号１５４で表される配列及び配列番号１５４で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ２）、
ｃｃ）配列番号１５６で表される配列及び配列番号１５６で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するトリオースホスフェートイソメラーゼ（ＴｐｉＡ）、
ｄｄ）配列番号１５８で表される配列及び配列番号１５８で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するフルクトース二リン酸アルドラーゼ、
ｅｅ）配列番号１６０で表される配列及び配列番号１６０で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有する１−ホスホフルクトキナーゼ、
ｆｆ）配列番号１６２で表される配列及び配列番号１６２で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有する６−ホスホフルクトキナーゼ、
ｇｇ）スクシニル−ＣｏＡリガーゼのサブユニット（ＳｕｃＣＤ、ＥＣ  ６．２．１．５）をコードする減衰ポリヌクレオチド（ｓｕｃＣＤ）、
ｈｈ）配列番号２で表される配列及び配列番号２で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するＨＴＨ  ｔｅｔＲのＤＮＡ結合ドメイン（ＭｃｂＲ）、
ｉｉ）配列番号４で表される配列及び配列番号４で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するホモセリンキナーゼ（ＴｈｒＢ、ＥＣ  ２．７．１．３９）、
ｊｊ）配列番号６で表される配列及び配列番号６で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するグルコース−６−リン酸イソメラーゼ（Ｐｇｉ、ＥＣ  ５．３．１．９）、
ｋｋ）配列番号８で表される配列及び配列番号８で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（Ｐｃｋ、ＥＣ  ４．１．１．３２）、
ｌｌ）配列番号１０で表される配列及び配列番号１０で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するＤ−メチオニン結合リポタンパク質（ＭｅｔＱ）、
ｍｍ）配列番号１２で表される配列及び配列番号１２で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するメチオニントランスポーター（ＭｅｔＰ）、
ｎｎ）配列番号１４で表される配列及び配列番号１４で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するＡＴＰ依存性メチオニントランスポーター（ＭｅｔＮ）、
ｏｏ）配列番号１６で表される配列及び配列番号１６で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するＳ−アデノシルメチオニンシンターゼ（ＭｅｔＫ）、
ｐｐ）配列番号１８で表される配列及び配列番号１８で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するメチオニン輸送系透過酵素（ＭｅｔＩ）、
ｑｑ）配列番号２０で表される配列及び配列番号２０で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有する４−ヒドロキシテトラヒドロジピコリン酸シンターゼ（ＤａｐＡ、ＥＣ  ４．３．３．７）、
ｒｒ）配列番号２２で表される配列及び配列番号２２で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するシステインシンターゼ（ＣＢＳ、ＣｙｓＫ）、
ｓｓ）配列番号２４で表される配列及び配列番号２４で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するカルボン酸−アミンリガーゼ、
ｔｔ）配列番号２６で表される配列及び配列番号２６で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するシスタチオニンβ−リアーゼ（ＡｅｃＤ）、
ｕｕ）配列番号２８で表される配列及び配列番号２８で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（Ａｓｄ、ＥＣ  １．２．１．１１）、
ｖｖ）５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステインメチルトランスフェラーゼ（ＭｅｔＨ、ＥＣ  ２．１．１．１３）をコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｍｅｔＨ）、
ｗｗ）配列番号３０で表される配列及び配列番号３０で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有する分枝鎖アミノ酸のトランスポーターの小サブユニット（ＢｒｎＥ）、
ｘｘ）配列番号３２で表される配列及び配列番号３２で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有する分枝鎖アミノ酸のトランスポーターの大サブユニット（ＢｒｎＦ）、
ｙｙ）配列番号３４で表される配列及び配列番号３４で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するセリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｙｓＥ）、
ｚｚ）配列番号３６で表される配列及び配列番号３６で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するシステインシンターゼ（ＣｙｓＫ）、
ａａａ）配列番号３８で表される配列及び配列番号３８で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するグリシン開裂系のＨ−タンパク質（ＧｃｖＨ）、
ｂｂｂ）配列番号４０で表される配列及び配列番号４０で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するグリシン開裂系のＰ−タンパク質（ＧｃｖＰ）、
ｃｃｃ）配列番号４２で表される配列及び配列番号４２で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するグリシン開裂系のＴ−タンパク質（ＧｃｖＴ）、
ｄｄｄ）配列番号４４で表される配列及び配列番号４４で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＧｌｙＡ）、
ｅｅｅ）配列番号４６で表される配列及び配列番号４６で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有する任意にフィードバック阻害耐性を有するホモセリンデヒドロゲナーゼ（Ｈｏｍ、ＥＣ  １．２．１．１１）、
ｆｆｆ）配列番号４８で表される配列及び配列番号４８で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するリポイルシンターゼ（ＬｉｐＡ）、
ｇｇｇ）配列番号５０で表される配列及び配列番号５０で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するリポイルシンターゼ（ＬｉｐＢ）、
ｈｈｈ）配列番号５２で表される配列及び配列番号５２で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ（Ｌｐｄ）、
ｉｉｉ）配列番号９４で表される配列及び配列番号９４で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するリポ酸−タンパク質リガーゼ（ＬｐｌＡ）、
ｊｊｊ）配列番号９６で表される配列及び配列番号９６で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ（ＧｃｖＬ）、
ｋｋｋ）配列番号５４で表される配列及び配列番号５４で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するフィードバック阻害耐性を有するアスパラギン酸キナーゼ（ＬｙｓＣ、ＥＣ  ２．７．２．４）、
ｌｌｌ）配列番号５６で表される配列及び配列番号５６で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するシスタチオニンγ−シンターゼ（ＭｅｔＢ）、
ｍｍｍ）配列番号５８で表される配列及び配列番号５８で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有する５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ（ＭｅｔＦ）、
ｎｎｎ）配列番号６０で表される配列及び配列番号６０で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ（ＭｅｔＸ）、
ｏｏｏ）配列番号６２で表される配列及び配列番号６２で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するＯ−アセチルホモセリンリアーゼ（ＭｅｔＹ）、
ｐｐｐ）配列番号６４で表される配列及び配列番号６４で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するフィードバック阻害耐性を有するピルビン酸カルボキシラーゼ（Ｐｙｃ、ＥＣ  ６．４．１．１）、
ｑｑｑ）配列番号６６で表される配列及び配列番号６６で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有する任意にフィードバック阻害耐性を有するＤ−３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（ＳｅｒＡ）、
ｒｒｒ）配列番号６８で表される配列及び配列番号６８で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するホスホセリンホスファターゼ（ＳｅｒＢ）、
ｓｓｓ）配列番号７０で表される配列及び配列番号７０で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するホスホセリンアミノトランスフェラーゼ（ＳｅｒＣ）、
ｔｔｔ）配列番号７４で表される配列及び配列番号７４で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有する硫酸アデニリルトランスフェラーゼのサブユニット（ＣｙｓＤ）、
ｕｕｕ）配列番号７６で表される配列及び配列番号７６で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するアデノシンホスホ硫酸レダクターゼ（ＣｙｓＨ）、
ｖｖｖ）配列番号７８で表される配列及び配列番号７８で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有する亜硫酸レダクターゼ（ＣｙｓＩ）、
ｗｗｗ）配列番号８０で表される配列及び配列番号８０で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するＮＡＤＰＨ依存性グルタミン酸シンターゼβ鎖（ＣｙｓＪ）、
ｘｘｘ）配列番号８２で表される配列及び配列番号８２で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有する硫酸アデニリルトランスフェラーゼのサブユニット（ＣｙｓＮ）、
ｙｙｙ）配列番号８４で表される配列及び配列番号８４で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するシスタチオニンβ−シンターゼ（ＣｙｓＹ）、
ｚｚｚ）配列番号８６で表される配列及び配列番号８６で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有する硫酸トランスポーター（ＣｙｓＺ）、
ａａａａ）配列番号８８で表される配列及び配列番号８８で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有する５−メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸−ホモシステインメチルトランスフェラーゼ（ＭｅｔＥ）、
ｂｂｂｂ）配列番号９０で表される配列及び配列番号９０で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するペプチジル−ｔＲＮＡヒドロラーゼ１（ＰｔＨ１）、
ｃｃｃｃ）配列番号９２で表される配列及び配列番号９２で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するペプチジル−ｔＲＮＡヒドロラーゼ２（ＰｔＨ２）、
ｄｄｄｄ）ジアミノピメリン酸ｄｅｈｒｏｇｅｎａｓｅ（Ｄｄｈ、ＥＣ  １．４．１．１６）をコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｄｄｈ）、
ｅｅｅｅ）配列番号１６４で表される配列及び配列番号１６４で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ（ＬｙｓＡ、ＥＣ  ４．１．１．２０）、
ｆｆｆｆ）配列番号１６６で表される配列及び配列番号１６６で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡａＴ、ＥＣ  ２．６．１．１）、
ｇｇｇｇ）配列番号１６８で表される配列及び配列番号１６８で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するＬ−リシンエクスポーター（ＬｙｓＥ、リシン透過酵素（ｌｙｓｉｎｅ  ｅｆｆｌｕｘ  ｐｅｒｍｅａｓｅ）、
ｈｈｈｈ）ジアミノピメリン酸エピメラーゼ（ＤａｐＦ、ＥＣ  ５．１．１．７）をコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｄａｐＦ）、
ｉｉｉｉ）配列番号１７０で表される配列及び配列番号１７０で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するジヒドロピコリン酸レダクターゼ（ＤａｐＢ、ＥＣ  １．３．１．２６）、
ｊｊｊｊ）配列番号１７２で表される配列及び配列番号１７２で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．４９）、
ｋｋｋｋ）配列番号１８６で表される配列及び配列番号１８６で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼのＺｗｆサブユニット（Ｚｗｆ、ＥＣ  １．１．１．４９）、
ｌｌｌｌ）配列番号１８８で表される配列及び配列番号１８８で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼのＯｐｃＡサブユニット（ＯｐｃＡ、ＥＣ  １．１．１．４９）、
ｍｍｍｍ）配列番号１７４で表される配列及び配列番号１７４で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｎｄ、ＥＣ  １．１．１．４４）、
ｎｎｎｎ）配列番号１７６で表される配列及び配列番号１７６で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するリンゴ酸：キノンオキシドレダクターゼ（Ｍｑｏ、ＥＣ  １．１．９９．１６）、
ｏｏｏｏ）配列番号１７８で表される配列及び配列番号１７８で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体のＥ１ｐサブユニット（ＡｃｅＥ、ＥＣ  １．２．４．１）、
ｐｐｐｐ）配列番号１８０で表される配列及び配列番号１８０で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するクエン酸シンターゼ（ＧｌｔＡ、ＥＣ  ４．１．３．７）、
ｑｑｑｑ）配列番号１８２で表される配列及び配列番号１８２で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（Ｍｄｈ、ＥＣ  １．１．１．３７）、
ｒｒｒｒ）配列番号１８４で表される配列及び配列番号１８４で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラモイルアラニル−Ｄ−グルタミン酸−２，６−ジアミノピメリン酸リガーゼ（ＭｕｒＥ、ＥＣ  ６．３．２．１３）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ−アミノ酸の製造方法であって、好アルカリ菌、特にＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓ株を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コリネバクテリウム属に属する細菌（コリネバクテリウム属菌）を使用するＬ−アミノ酸の製造方法が知られている。
【０００３】
多くのコリネバクテリウム属菌が知られているが、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）（Ｃ．グルタミカム）はＬ−アミノ酸を製造するために特に有利であることが判明しており、上記方法において一般的に使用されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、少なくとも１種のＬ−アミノ酸を有意に過剰産生させ、Ｃ．グルタミカムの代替株としてＬ−アミノ酸の製造に直接的に有用であるか、少なくとも新規なＬ−アミノ酸産生株を開発するための有望な開始株であると考えられる新規な菌株を提供することにある。
【０００５】
新規なＬ−アミノ酸産生株を開発するための開始株としては、Ｌ−アミノ酸の過剰産生が比較的わずかであっても十分である。すなわち、そのような開始株からの、関連アミノ酸の産生に対する有益又は有害な作用を有することが知られている遺伝子又は酵素の過剰発現又は減衰並びに任意の非特異的な突然変異生成（ｕｎｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）により、Ｌ−アミノ酸の収率を増加させることができる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
予期せぬことに、好アルカリ菌であるＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓ（Ｃ．ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓ）は、Ｌ−アミノ酸であるＬ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸及びＬ−バリンを大量に過剰産生していることが判明した。
【０００７】
また、ＡＥＣ並びに必要に応じてトレオニンを含む培地で培養することにより、大量のＬ−リシンを産生するＣ．ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓ株を得ることができた。
【０００８】
従って、Ｃ．ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓは、さらなるＬ−アミノ酸産生株を製造するための適当な開始点でもある。すなわち、細菌代謝の対応する転換により、上述したＬ−アミノ酸の過剰産生をその他の所望のＬ−アミノ酸の過剰産生に変化することができる。
【０００９】
Ｌ−アラニンの天然の過剰産生は、Ｃ．ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓにおいて見出された特に効率的なアラニンデヒドロゲナーゼによるものであると思われる。アラニンデヒドロゲナーゼに関しては、その他の数種類のコリネバクテリウム属菌についてのみこれまで報告されており、野生型細胞内においてＬ−アラニンを蓄積させる活性アラニンデヒドロゲナーゼについては報告されていない。
【００１０】
Ｌ−グルタミン酸の天然の過剰産生は、特に効率的なヒスチジン利用遺伝子（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｇｅｎｅ（ｈｕｔ遺伝子））によるものであると思われる。ｈｕｔ群（ｈｕｔ遺伝子群）は、ウロカニン酸ヒドラターゼ（ｈｕｔＵ）、イミダゾロンプロピオナーゼ（ｈｕｔＩ）、ヒスチジンアンニモアリアーゼ（ｈｕｔＨ）及びホルミミドイルグルタマーゼ（ｆｏｒｍｉｍｉｄｏｙｌｇｌｕｔａｍａｓｅ）（ｈｕｔＧ）からなる。ｈｕｔ遺伝子に関しては、その他の数種類のコリネバクテリウム属菌についてのみこれまで報告されており、野生型細胞内においてＬ−グルタミン酸を蓄積させる活性ｈｕｔ遺伝子については報告されていない。
【００１１】
従って、本発明は、Ｌ−アミノ酸を過剰産生させる方法であって、好アルカリ菌、好ましくは好アルカリコリネ型細菌、特に好アルカリコリネバクテリウム、特に好ましくはＣ．  ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓを使用することを特徴とする方法に関する。
【００１２】
本発明に係る好アルカリ菌は、好ましくは耐塩及び／又はフミン酸還元細菌である。
【００１３】
本発明に関連して使用する「好アルカリ菌」という用語は、８．５〜１１のｐＨにおいて成長することができる細菌を意味する。好ましくは、本発明に関連して使用する「好アルカリ菌」という用語は、９〜１０．５のｐＨにおいて成長することができる細菌を意味する。
【００１４】
本発明に関連して使用する「耐塩菌」という用語は、０．６〜０．９８の水分活性において成長することができる細菌を意味する。好ましくは、本発明に関連して使用する「耐塩菌」という用語は、０．７５〜０．９の水分活性において成長することができる細菌を意味する。
【００１５】
本発明に関連して使用する「Ｌ−アミノ酸」という用語は、特にタンパク質を構成するＬ−アミノ酸を意味する。
【００１６】
この場合、Ｌ−アミノ酸は、好ましくは、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、グルタミン酸系のＬ−アミノ酸、特に、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−プロリン及びＬ−アルギニン、アスパラギン酸系のＬ−アミノ酸、特に、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−リシン、Ｌ−イソロイシン及びＬ−トレオニンから選択される。Ｌ−アミノ酸は、特に好ましくは、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−メチオニン、Ｌ−リシン及びＬ−トレオニン、特にＬ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−グルタミン酸及びＬ−リシンから選択される。
【００１７】
Ｃ．ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓ株は、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２０１１），６１，８８２−８８７）によって初めて報告された。Ｃ．ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓ株は、受託番号ＤＳＭ４５３９２としてＤＳＭＺに寄託されており、その１６Ｓ  ｒＲＮＡは、登録番号ＧＱ４２１２８１としてＥＭＢＬに寄託されている。開始株は、耐塩性かつ好アルカリ性のフミン酸還元細菌である。
【００１８】
Ｃ．ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓに関するさらなる情報は、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｉｃｒｏｂ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１３），６（２），１４１−１４９）及びＬｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１３），１３６，３０２−３０８）に記載されている。
【００１９】
また、本発明は、配列番号７２で表される配列に対して、少なくとも８５又は９０％、好ましくは少なくとも９２、９４、９６又は９８％、特に好ましくは１００％の配列相同性を有することを特徴とするアラニンデヒドロゲナーゼ（Ａｌｄ）に関する。
【００２０】
また、本発明は、本発明に係るアラニンデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドに関する。配列番号７１で表される配列の位置３０１〜１３６５の配列に対して、少なくとも７０又は７５％、好ましくは少なくとも８０又は８５％、より好ましくは少なくとも９０又は９５％、特に好ましくは１００％の配列相同性を有する配列を有するポリヌクレオチド及び／又は配列番号７１で表される配列の位置３０１〜１３６５の配列に対して相補的な配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドが好ましい。
【００２１】
また、本発明は、以下の酵素から選択されるｈｕｔ群の酵素に関する。
ａ）配列番号１９０で表される配列に対して、少なくとも８５又は９０％、好ましくは少なくとも９２、９４、９６又は９８％、特に好ましくは１００％の配列相同性を有することを特徴とするウロカニン酸ヒドラターゼ（ｈｕｔＵ）；
ｂ）配列番号１９２で表される配列に対して、少なくとも８５又は９０％、好ましくは少なくとも９２、９４、９６又は９８％、特に好ましくは１００％の配列相同性を有することを特徴とするイミダゾロンプロピオナーゼ（ｈｕｔＩ）；
ｃ）配列番号１９４で表される配列に対して、少なくとも８５又は９０％、好ましくは少なくとも９２、９４、９６又は９８％、特に好ましくは１００％の配列相同性を有することを特徴とするヒスチジンアンモニアリアーゼ（ｈｕｔＨ）；
ｄ）配列番号１９６で表される配列に対して、少なくとも８５又は９０％、好ましくは少なくとも９２、９４、９６又は９８％、特に好ましくは１００％の配列相同性を有することを特徴とするホルミミドイルグルタマーゼ。
【００２２】
また、本発明は、本発明に係るｈｕｔ群の遺伝子をコードするポリヌクレオチドに関する。この場合、以下のポリヌクレオチドが好ましい。
ａ）ウロカニン酸ヒドラターゼ（ｈｕｔＵ）をコードし、配列番号１８９で表される配列の位置３０１〜１９８３の配列に対して、少なくとも７０又は７５％、好ましくは少なくとも８０又は８５％、より好ましくは少なくとも９０又は９５％、特に好ましくは１００％の配列相同性を有する配列を有する、及び／又は配列番号１８９で表される配列の位置３０１〜１９８３の配列に対して相補的な配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；
ｂ）イミダゾロンプロピオナーゼ（ｈｕｔＩ）をコードし、配列番号１９１で表される配列の位置３０１〜１５０９の配列に対して、少なくとも７０又は７５％、好ましくは少なくとも８０又は８５％、より好ましくは少なくとも９０又は９５％、特に好ましくは１００％の配列相同性を有する配列を有する、及び／又は配列番号１９１で表される配列の位置３０１〜１５０９の配列に対して相補的な配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；
ｃ）ヒスチジンアンニモアリアーゼ（ｈｕｔＨ）をコードし、配列番号１９３で表される配列の位置３０１〜１８５１の配列に対して、少なくとも７０又は７５％、好ましくは少なくとも８０又は８５％、より好ましくは少なくとも９０又は９５％、特に好ましくは１００％の配列相同性を有する配列を有する、及び／又は配列番号１９３で表される配列の位置３０１〜１８５１の配列に対して相補的な配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；
ｄ）ホルミミドイルグルタマーゼ（ｈｕｔＧ）をコードし、配列番号１９５で表される配列の位置３０１〜１２０９の配列に対して、少なくとも７０又は７５％、好ましくは少なくとも８０又は８５％、より好ましくは少なくとも９０又は９５％、特に好ましくは１００％の配列相同性を有する配列を有する、及び／又は配列番号１９５で表される配列の位置３０１〜１２０９の配列に対して相補的な配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【００２３】
本発明に関連して使用する「ストリンジェントな条件」という用語は、１×ＳＳＣの塩濃度の０．１重量％  ＳＤＳで８０℃で洗浄する条件を意味する。
【００２４】
また、本発明は、本発明に係るコーディングポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチドに関する。
【００２５】
また、本発明は、本発明に係るポリヌクレオチドを含むベクター、特にクローニング及び発現ベクターに関する。これらのベクターは、微生物、特にコリネ型細菌、特にコリネバクテリウム属又は腸内細菌科、特にエスケリキア属に適宜導入することができる。
【００２６】
また、コードされた遺伝子の発現のために、本発明に係るポリヌクレオチドを、微生物のゲノム、特にコリネ型細菌のゲノム、特にコリネバクテリウム属菌のゲノム又は腸内細菌科菌のゲノム、特にエスケリキア属菌のゲノムに導入することもできる。
【００２７】
また、本発明は、対応する組み換え微生物、好ましくは細菌、特にコリネ型細菌、特にコリネバクテリウム属菌、特に好ましくはＣ．ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓ又はＣ．グルタミカム並びに腸内細菌、特にエスケリキア属菌であって、本発明に係るアラニンデヒドロゲナーゼ及び／又は本発明に係るｈｕｔ群の酵素の１種以上（好ましくは全て）及び／又は本発明に係るポリヌクレオチドの１種以上及び／又は本発明に係るベクターを含む組み換え微生物に関する。
【００２８】
本発明に係るアラニンデヒドロゲナーゼ及び／又は本発明に係るアラニンデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチド及び／又は前記ポリヌクレオチドを含む少なくとも１種のベクターを含む、組み換えコリネバクテリウム属菌、特にＣ．ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓ及びＣ．グルタミカムが好ましい。
【００２９】
また、ｈｕｔ群の酵素の少なくとも１種（好ましくは全て）及び／又は前記酵素をコードするポリヌクレオチド及び／又は前記ポリヌクレオチドを含む少なくとも１種のベクターを含む、組み換えコリネバクテリウム属菌、特にＣ．ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓ及びＣ．グルタミカムも好ましい。
【００３０】
また、本発明は、組み換え微生物、好ましくは細菌、特にコリネ型細菌、特にＣ．ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓを除くコリネバクテリウム属菌、特にＣ．グルタミカムであって、本発明に係るアラニンデヒドロゲナーゼ及び／又は本発明に係るｈｕｔ群の酵素の１種以上（好ましくは全て）及び／又は本発明に係るポリヌクレオチドの１種以上及び／又は本発明に係るベクターを含む組み換え微生物に関する。
【００３１】
本発明に関連して使用する「組み換え微生物」又は「組み換え細菌」という用語は、少なくとも１種の遺伝子操作が行われた微生物又は細菌を意味する。遺伝子操作は、標的又はランダム突然変異、外来遺伝子の導入及び／又は宿主遺伝子又は外来遺伝子の過剰発現又は減衰であってもよい。本発明に係る組み換え微生物又は本発明に係る組み換え細菌は、好ましくは少なくとも１種の遺伝子の過剰発現又は減衰によって特徴付けられる。特に好適な実施形態では、本発明に係る微生物又は本発明に係る細菌は、本発明に係るアラニンデヒドロゲナーゼ又は本発明に係るアラニンデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドの過剰発現によって特徴付けられる。別の特に好適な実施形態では、本発明に係る微生物又は本発明に係る細菌は、本発明に係るｈｕｔ群の酵素の少なくとも１種、特に本発明に係るｈｕｔ群の酵素の全て又はこれらの酵素をコードする対応するポリヌクレオチドの過剰発現によって特徴付けられる。
【００３２】
本発明においては、コリネバクテリウム属菌としては、基準株ＤＳＭ４４５４９等のコリネバクテリウム・エフィシェンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）、基準株ＡＴＣＣ１３０３２又は株Ｒ等のコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  グルタミカム）、基準株ＡＴＣＣ６８７１等のコリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、株ＤＳＭ  ４５３９２等のＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、株ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．５３６１等のＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｋｉｎｅｓｅが好ましい。
【００３３】
これらのうち、コリネバクテリウム・グルタミカム及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓが特に好ましい。本願明細書においてＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓに言及する場合には、好ましくは株ＤＳＭ  ４５３９２又は株ＤＳＭ  ４５３９２に由来する株を意味する。
【００３４】
コリネバクテリウム・グルタミカムは別の名称でも知られている。それらの例としては、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）（ＡＴＣＣ１３８７０）、コリネバクテリウム・リリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｌｉｕｍ）（ＤＳＭ２０１３７）、コリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）（ＡＴＣＣ１７９６５）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）（ＡＴＣＣ１４０６７）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）（ＡＴＣＣ１３８６９）及びブレビバクテリウム・ディバリカタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）（ＡＴＣＣ１４０２０）が挙げられる。また、コリネバクテリウム・グルタミカムはミクロコッカス・グルタミカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｓ）とも呼ばれている。コリネバクテリウム・エフィシェンスは、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１５３９等）としても知られている。
【００３５】
コリネ型細菌株の分類に関する情報は、Ｓｅｉｌｅｒ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １２９，ｐｐ．１４３３−１４７７（１９８３））、Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ（１９８５，Ｇｌｕｔａｍｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｂａｃｔｅｒｉａ，ｐｐ．１１５−１４２：Ｄｅｍａｉｎ  ａｎｄ  Ｓｏｌｏｍｏｎ（ｅｄ），Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ．Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ），Ｋaｍｐｆｅｒ  ａｎｄ  Ｋｒｏｐｐｅｎｓｔｅｄｔ（Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ４２，ｐｐ．９８９−１００５（１９９６））、Ｌｉｅｂｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  ４１，ｐｐ．２５５−２６０（１９９１））、Ｆｕｄｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５２，１１２７−１１３１（２００２））及び米国特許第５，２５０，４３４号に記載されている。
【００３６】
「ＡＴＣＣ」と記載されている株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（米国バージニア州マナサス）から入手することができる。「ＤＳＭ」と記載されている株は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｎ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（Ｇｅｒｍａｎ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＤＳＭＺ）（ドイツ・ブラウンシュヴァイク）から入手することができる。「ＮＲＲＬ」と記載されている株は、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＲＳ）（米国イリノイ州ピオリア）から入手することができる。「ＦＥＲＭ」と記載されている株は、国立研究開発法人産業技術総合研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＡＩＳＴ））（茨城県つくば市東１−１−１中央第６）から入手することができる。「ＣＧＭＣＣ」と記載されている株は、Ｃｈｉｎａ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＧＭＣＣ）（中華人民共和国・北京市）から入手することができる。
【００３７】
また、本発明は、Ｌ−アミノ酸を過剰産生させる方法であって、本発明に係るアラニンデヒドロゲナーゼ及び／又は本発明に係るｈｕｔ群の酵素の少なくとも１種、好ましくは本発明に係るｈｕｔ群の酵素全て及び／又は本発明に係るポリヌクレオチドの少なくとも１種及び／又は本発明に係る組み換え微生物、好ましくは本発明に係る組み換え細菌、特に本発明に係る組み換えコリネ型細菌、特に好ましくは本発明に係る組み換えコリネバクテリウム属菌、特にＣ．ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓ又はＣ．グルタミカムであるコリネバクテリウム属菌を使用することを特徴とする方法に関する。本発明の好適な実施形態では、本発明に係るポリヌクレオチドの少なくとも１種又は前記ポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドを過剰発現された状態で使用する。
【００３８】
この場合、本発明は、好ましくは、Ｌ−アミノ酸を過剰産生させる方法であって、本発明に係るアラニンデヒドロゲナーゼ及び／又は前記酵素をコードする少なくとも１種のポリヌクレオチド及び／又は前記ポリヌクレオチドを含む少なくとも１種のベクター及び／又は本発明に係るアラニンデヒドロゲナーゼを含む組み換えコリネバクテリウム属菌、好ましくはＣ．ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓ又はＣ．グルタミカム及び／又は前記酵素をコードする少なくとも１種のポリヌクレオチド及び／又は前記ポリヌクレオチドを含む少なくとも１種のベクターを使用することを特徴とする方法に関する。
【００３９】
従って、本発明は、Ｌ−アミノ酸を過剰産生させる方法であって、本発明に係るｈｕｔ群の酵素の少なくとも１種、好ましくは本発明に係るｈｕｔ群の酵素の全て及び／又は前記酵素をコードする少なくとも１種のポリヌクレオチド、好ましくは本発明に係るｈｕｔ群の酵素の全てをコードするポリヌクレオチド及び／又は前記ポリヌクレオチドを含む少なくとも１種のベクター及び／又は本発明に係るｈｕｔ群の酵素の少なくとも１種、好ましくは本発明に係るｈｕｔ群の酵素の全てを含む組み換えコリネバクテリウム属菌、好ましくはＣ．ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓ又はＣ．グルタミカム及び／又は前記酵素をコードする少なくとも１種のポリヌクレオチド、好ましくは本発明に係るｈｕｔ群の酵素の全てをコードするポリヌクレオチド及び／又は前記ポリヌクレオチドを含む少なくとも１種のベクターを使用することを特徴とする方法に関する。
【００４０】
この場合、本発明を使用して製造するＬ−アミノ酸は、好ましくは、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、グルタミン酸系のＬ−アミノ酸、特に、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−プロリン及びＬ−アルギニン、アスパラギン酸系のＬ−アミノ酸、特に、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−リシン、Ｌ−イソロイシン及びＬ−トレオニン、特に好ましくは、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−メチオニン、Ｌ−リシン及びＬ−トレオニン、特に、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−グルタミン酸及びＬ−リシンから選択される。
【００４１】
本発明に係る製造方法に使用されるコリネバクテリウム属菌は、好ましくは、Ｃ．ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓ及びＣ．グルタミカムから選択される。
【００４２】
本発明に関連してＬ−アミノ酸について使用する「過剰産生」という用語は、微生物が必要に応じてＬ−アミノ酸を産生し、細胞内におけるＬ−アミノ酸の濃度が上昇するか、Ｌ−アミノ酸が培養液に分泌され、蓄積されることを意味する。この場合、微生物は、Ｌ−アミノ酸が、細胞内又は培養液内において、１２０時間以内、９６時間以内、４８時間以内、３６時間以内、２４時間以内又は１２時間以内に、少なくとも０．２５ｇ／ｌ、少なくとも０．５ｇ／ｌ、少なくとも１．０ｇ／ｌ、少なくとも１．５ｇ／ｌ、少なくとも２．０ｇ／ｌ、少なくとも４ｇ／ｌ又は、少なくとも１０ｇ／ｌの濃度となるような濃度上昇又は蓄積能力を有することが好ましい。
【００４３】
好適な実施形態では、本発明に係るポリヌクレオチド及び／又は本発明に係る本発明に係るベクターを導入する本発明に係る組み換え微生物は、本発明に係るポリヌクレオチド及び／又は本発明に係る本発明に係るベクターの導入前に、Ｌ−アミノ酸を過剰産生させる能力を有する。開始株は、突然変異生成及び選別、遺伝子組み換え技術又はこれらの組み合わせによって生成された株であることが好ましい。
【００４４】
なお、本発明に係る組み換え微生物は、言うまでもなく、本発明に係るポリヌクレオチド及び／又は本発明に係る本発明に係るベクターが存在するか、導入された野生型株において製造することができ、その後の遺伝子操作により、Ｌ−アミノ酸を産生させるか、Ｌ−アミノ酸の産生量を増加させることができる。
【００４５】
また、本発明は、Ｃ．ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓに由来するその他のポリヌクレオチド及び前記ポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドに関する。関連するポリヌクレオチド又はポリペプチドの過剰発現により、ある種のＬ−アミノ酸のアミノ酸生産に良い影響を与えることができる。
【００４６】
また、本発明は、以下の酵素等に関する。
ａ）配列番号１０６で表される配列及び配列番号１０６で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するトレオニンデヒドラターゼ（ＩｌｖＡ、ＥＣ  ４．３．１．１９）、
ｂ）配列番号９８で表される配列及び配列番号９８で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するアセト乳酸合成酵素のサブユニット（ＩｌｖＢ）、
ｃ）配列番号１００で表される配列及び配列番号１００で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するイソメロレダクターゼ（ｉｓｏｍｅｒ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）（ＩｌｖＣ、ＥＣ  １．１．１．８６）、
ｄ）配列番号１０２で表される配列及び配列番号１０２で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＩｌｖＤ、ＥＣ  ４．２．１．９）、
ｅ）配列番号１０４で表される配列及び配列番号１０４で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するトランスアミナーゼ（ＩｌｖＥ、ＥＣ  ２．６．１．４２）、
ｆ）配列番号１２２で表される配列及び配列番号１２２で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するアセト乳酸合成酵素（ＩｌｖＨ、ＥＣ  ２．２．１．６）、
ｇ）配列番号１１８で表される配列及び配列番号１１８で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有する３−メチル−２−オキソブタン酸ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＰａｎＢ、ＥＣ  ２．１．２．１１）、
ｈ）配列番号１２０で表される配列及び配列番号１２０で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するパントテン酸合成酵素（ＰａｎＣ、ＥＣ  ６．３．２．１）、
ｉ）配列番号１２４で表される配列及び配列番号１２４で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｄｈ）、
ｊ）配列番号１２６で表される配列及び配列番号１２６で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するグルタミンシンテターゼ（グルタミンシンテターゼ１）、
ｋ）配列番号１２８で表される配列及び配列番号１２８で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するグルタミンシンテターゼ（グルタミンシンテターゼ２）、
ｌ）配列番号１３０で表される配列及び配列番号１３０で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するグルタミン酸シンターゼ、
ｍ）配列番号１３２で表される配列及び配列番号１３２で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するイソクエン酸デヒドロゲナーゼ、
ｎ）配列番号１３４で表される配列及び配列番号１３４で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するアコニット酸ヒドラーゼ、
ｏ）配列番号１３６で表される配列及び配列番号１３６で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するクエン酸シンターゼ、  
ｐ）配列番号１３８で表される配列及び配列番号１３８で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するアミノペプチダーゼＣ（ＰｅｐＣ）、
ｑ）配列番号１４０で表される配列及び配列番号１４０で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するピルビン酸デヒドロゲナーゼ、
ｒ）配列番号１４２で表される配列及び配列番号１４２で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するピルビン酸キナーゼ（ピルビン酸キナーゼ１）、
ｓ）配列番号１４４で表される配列及び配列番号１４４で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するピルビン酸キナーゼ（ピルビン酸キナーゼ２）、
ｔ）配列番号１４６で表される配列及び配列番号１４６で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するエノラーゼ、
ｕ）配列番号１４８で表される配列及び配列番号１４８で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有する２，３−ビスホスホグリセリン酸依存性ホスホグリセリン酸ムターゼ（ＧｐｍＡ）、
ｖ）配列番号１５０で表される配列及び配列番号１５０で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｐｇｋ）、
ｗ）配列番号１５２で表される配列及び配列番号１５２で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ１）、
ｘ）配列番号１５４で表される配列及び配列番号１５４で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ２）、
ｙ）配列番号１５６で表される配列及び配列番号１５６で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するトリオースホスフェートイソメラーゼ（ＴｐｉＡ）、
ｚ）配列番号１５８で表される配列及び配列番号１５８で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するフルクトース二リン酸アルドラーゼ、
ａａ）配列番号１６０で表される配列及び配列番号１６０で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有する１−ホスホフルクトキナーゼ、
ｂｂ）配列番号１６２で表される配列及び配列番号１６２で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有する６−ホスホフルクトキナーゼ、
ｃｃ）配列番号４で表される配列及び配列番号４で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するホモセリンキナーゼ（ＴｈｒＢ、ＥＣ  ２．７．１．３９）、
ｄｄ）配列番号２２で表される配列及び配列番号２２で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するシステインシンターゼ（ＣＢＳ、ＣｙｓＫ）、
ｅｅ）配列番号２６で表される配列及び配列番号２６で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するシスタチオニンβ−リアーゼ（ＡｅｃＤ）、
ｆｆ）配列番号２８で表される配列及び配列番号２８で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（Ａｓｄ、ＥＣ  １．２．１．１１）、
ｇｇ）配列番号３０で表される配列及び配列番号３０で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有する分枝鎖アミノ酸のトランスポーターの小サブユニット（ＢｒｎＥ）、
ｈｈ）配列番号３２で表される配列及び配列番号３２で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有する分枝鎖アミノ酸のトランスポーターの大サブユニット（ＢｒｎＦ）、
ｉｉ）配列番号３４で表される配列及び配列番号３４で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するセリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｙｓＥ）、
ｊｊ）配列番号３６で表される配列及び配列番号３６で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するシステインシンターゼ（ＣｙｓＫ）、
ｋｋ）配列番号３８で表される配列及び配列番号３８で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するグリシン開裂系のＨ−タンパク質（ＧｃｖＨ）、
ｌｌ）配列番号４０で表される配列及び配列番号４０で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するグリシン開裂系のＰ−タンパク質（ＧｃｖＰ）、
ｍｍ）配列番号４２で表される配列及び配列番号４２で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するグリシン開裂系のＴ−タンパク質（ＧｃｖＴ）、
ｎｎ）配列番号４４で表される配列及び配列番号４４で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＧｌｙＡ）、
ｏｏ）配列番号４６で表される配列及び配列番号４６で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有する任意にフィードバック阻害耐性を有するホモセリンデヒドロゲナーゼ（Ｈｏｍ、ＥＣ  １．２．１．１１）、
ｐｐ）配列番号４８で表される配列及び配列番号４８で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するリポイルシンターゼ（ＬｉｐＡ）、
ｑｑ）配列番号５０で表される配列及び配列番号５０で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するリポイルシンターゼ（ＬｉｐＢ）、
ｒｒ）配列番号５２で表される配列及び配列番号５２で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ（Ｌｐｄ）、
ｓｓ）配列番号９４で表される配列及び配列番号９４で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するリポ酸−タンパク質リガーゼ（ＬｐｌＡ）、
ｔｔ）配列番号９６で表される配列及び配列番号９６で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ（ＧｃｖＬ）、
ｕｕ）配列番号５４で表される配列及び配列番号５４で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有する好ましくはフィードバック阻害耐性を有するアスパラギン酸キナーゼ（ＬｙｓＣ、ＥＣ  ２．７．２．４）、
ｖｖ）配列番号５６で表される配列及び配列番号５６で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するシスタチオニンγ−シンターゼ（ＭｅｔＢ）、
ｗｗ）配列番号５８で表される配列及び配列番号５８で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有する５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ（ＭｅｔＦ）、
ｘｘ）配列番号６０で表される配列及び配列番号６０で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ（ＭｅｔＸ）、
ｙｙ）配列番号６２で表される配列及び配列番号６２で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するＯ−アセチルホモセリンリアーゼ（ＭｅｔＹ）、
ｚｚ）配列番号６４で表される配列及び配列番号６４で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有する好ましくはフィードバック阻害耐性を有するピルビン酸カルボキシラーゼ（Ｐｙｃ、ＥＣ  ６．４．１．１）、
ａａａ）配列番号６６で表される配列及び配列番号６６で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有する任意にフィードバック阻害耐性を有するＤ−３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（ＳｅｒＡ）、
ｂｂｂ）配列番号６８で表される配列及び配列番号６８で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するホスホセリンホスファターゼ（ＳｅｒＢ）、
ｃｃｃ）配列番号７０で表される配列及び配列番号７０で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するホスホセリンアミノトランスフェラーゼ（ＳｅｒＣ）、
ｄｄｄ）配列番号７４で表される配列及び配列番号７４で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有する硫酸アデニリルトランスフェラーゼのサブユニット（ＣｙｓＤ）、
ｅｅｅ）配列番号７６で表される配列及び配列番号７６で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するアデノシンホスホ硫酸レダクターゼ（ＣｙｓＨ）、
ｆｆｆ）配列番号７８で表される配列及び配列番号７８で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有する亜硫酸レダクターゼ（ＣｙｓＩ）、
ｇｇｇ）配列番号８０で表される配列及び配列番号８０で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するＮＡＤＰＨ依存性グルタミン酸シンテターゼβ鎖（ＣｙｓＪ）、
ｈｈｈ）配列番号８２で表される配列及び配列番号８２で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有する硫酸アデニリルトランスフェラーゼの大サブユニット（ＣｙｓＮ）、
ｉｉｉ）配列番号８４で表される配列及び配列番号８４で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するシスタチオニンβ−シンターゼ（ＣｙｓＹ）、
ｊｊｊ）配列番号８６で表される配列及び配列番号８６で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有する硫酸トランスポーター（ＣｙｓＺ）、
ｋｋｋ）配列番号８８で表される配列及び配列番号８８で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有する５−メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸−ホモシステインメチルトランスフェラーゼ（ＭｅｔＥ）、
ｌｌｌ）配列番号９０で表される配列及び配列番号９０で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するペプチジル−ｔＲＮＡヒドロラーゼ１（ＰｔＨ１）、
ｍｍｍ）配列番号９２で表される配列及び配列番号９２で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するペプチジル−ｔＲＮＡヒドロラーゼ２（ＰｔＨ２）、
ｎｎｎ）配列番号２０２で表される配列及び配列番号２０２で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（Ｄｄｈ、ＥＣ  １．４．１．１６）、
ｏｏｏ）配列番号１６４で表される配列及び配列番号１６４で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ（ＬｙｓＡ、ＥＣ  ４．１．１．２０）、
ｐｐｐ）配列番号１６６で表される配列及び配列番号１６６で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡａＴ、ＥＣ  ２．６．１．１）、
ｑｑｑ）配列番号１６８で表される配列及び配列番号１６８で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するＬ−リシンエクスポーター（ＬｙｓＥ、リシン透過酵素（ｌｙｓｉｎｅ  ｅｆｆｌｕｘ  ｐｅｒｍｅａｓｅ）、
ｒｒｒ）配列番号１７０で表される配列及び配列番号１７０で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するジヒドロピコリン酸レダクターゼ（ＤａｐＢ、ＥＣ  １．３．１．２６）、
ｓｓｓ）配列番号１７２で表される配列及び配列番号１７２で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．４９）、
ｔｔｔ）配列番号１８６で表される配列及び配列番号１８６で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼのＺｗｆサブユニット（Ｚｗｆ、ＥＣ  １．１．１．４９）、
ｕｕｕ）配列番号１８８で表される配列及び配列番号１８８で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼのＯｐｃＡサブユニット（ＯｐｃＡ、ＥＣ  １．１．１．４９）、
ｖｖｖ）配列番号１７４で表される配列及び配列番号１７４で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｎｄ、ＥＣ  １．１．１．４４）。
【００４７】
また、本発明は、上述したポリヌクレオチドを含むベクター及び上述した酵素及び／又はポリヌクレオチド及び／又はベクターを含む組み換え微生物に関する。好適な実施形態では、関連するポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドが過剰発現された状態で微生物中に存在する。組み換え微生物は、好ましくは、コリネ型細菌、特にコリネバクテリウム属菌、特にＣ．ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓ又はＣ．グルタミカムである。
【００４８】
本発明は、上述したポリヌクレオチドの少なくとも１種、好ましくは２種、３種又は４種が過剰発現された状態で存在する、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、グルタミン酸系のＬ−アミノ酸、特に、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−プロリン及びＬ−アルギニン、アスパラギン酸系のＬ−アミノ酸、特に、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−リシン、Ｌ−イソロイシン及びＬ−トレオニン、特に好ましくは、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−メチオニン、Ｌ−リシン及びＬ−トレオニン、特にＬ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−グルタミン酸及びＬ−リシンから選択されるＬ−アミノ酸を過剰産生させる方法であって、好ましくは、コリネバクテリウム属菌、特にＣ．ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓ又はＣ．グルタミカムに対して実施される方法に関する。
【００４９】
また、本発明は、Ｃ．ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓに由来するその他のポリヌクレオチド及び前記ポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドに関する。関連するポリヌクレオチド又はポリペプチドの失活又は減衰により、ある種のＬ−アミノ酸のアミノ酸生産に良い影響を与えることができる。
【００５０】
また、本発明は、以下の酵素等に関する。
ａ）配列番号１０８で表される配列及び配列番号１０８で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するトレオニンシンターゼ（ＴｈｒＣ、ＥＣ  ４．２．３．１）、
ｂ）配列番号１１０で表される配列及び配列番号１１０で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するイソプロピルリンゴ酸シンターゼ（ＬｅｕＡ、ＥＣ  ２．３．３．１３）、
ｃ）配列番号１１２で表される配列及び配列番号１１２で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するイソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＬｅｕＢ、ＥＣ  １．１．１．８５）、
ｄ）配列番号１１４又は１１６で表される配列及び配列番号１１４又は１１６で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼのサブユニット（ＬｅｕＣＤ、ＥＣ  ４．２．１．３３）、
ｅ）配列番号１９８又は２００で表される配列及び配列番号１９８又は２００で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するスクシニル−ＣｏＡリガーゼのサブユニット（ＳｕｃＣＤ、ＥＣ  ６．２．１．５）、
ｆ）配列番号２で表される配列及び配列番号２で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するＨＴＨ  ｔｅｔＲのＤＮＡ結合ドメイン（ＭｃｂＲ）、
ｇ）配列番号４で表される配列及び配列番号４で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するホモセリンキナーゼ（ＴｈｒＢ、ＥＣ  ２．７．１．３９）、
ｈ）配列番号６で表される配列及び配列番号６で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するグルコース−６−リン酸イソメラーゼ（Ｐｇｉ、ＥＣ  ５．３．１．９）、
ｉ）配列番号８で表される配列及び配列番号８で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（Ｐｃｋ、ＥＣ  ４．１．１．３２）、
ｊ）配列番号１０で表される配列及び配列番号１０で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するＤ−メチオニン結合リポタンパク質（ＭｅｔＱ）、
ｋ）配列番号１２で表される配列及び配列番号１２で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するメチオニントランスポーター（ＭｅｔＰ）、
ｌ）配列番号１４で表される配列及び配列番号１４で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するＡＴＰ依存性メチオニントランスポーター（ＭｅｔＮ）、
ｍ）配列番号１６で表される配列及び配列番号１６で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するＳ−アデノシルメチオニンシンターゼ（ＭｅｔＫ）、
ｎ）配列番号１８で表される配列及び配列番号１８で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するメチオニン輸送系透過酵素（ＭｅｔＩ）、
ｏ）配列番号２０で表される配列及び配列番号２０で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有する４−ヒドロキシテトラヒドロジピコリン酸シンターゼ（ＤａｐＡ、ＥＣ  ４．３．３．７）、
ｐ）配列番号２４で表される配列及び配列番号２４で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するカルボン酸−アミンリガーゼ、
ｑ）配列番号１７６で表される配列及び配列番号１７６で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するリンゴ酸：キノンオキシドレダクターゼ（Ｍｑｏ、ＥＣ  １．１．９９．１６）、
ｒ）配列番号１７８で表される配列及び配列番号１７８で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体のＥ１ｐサブユニット（ＡｃｅＥ、ＥＣ  １．２．４．１）、
ｓ）配列番号１８０で表される配列及び配列番号１８０で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するクエン酸シンターゼ（ＧｌｔＡ、ＥＣ  ４．１．３．７）、
ｔ）配列番号１８２で表される配列及び配列番号１８２で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（Ｍｄｈ、ＥＣ  １．１．１．３７）、
ｕ）配列番号１８４で表される配列及び配列番号１８４で表される配列をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラモイルアラニル−Ｄ−グルタミン酸−２，６−ジアミノピメリン酸リガーゼ（ＭｕｒＥ、ＥＣ  ６．３．２．１３）。
【００５１】
また、本発明は、上述したポリヌクレオチドを含むベクター及び上述した酵素及び／又はポリヌクレオチド及び／又はベクターを含む組み換え微生物に関する。好適な実施形態では、関連するポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドが失活又は減衰された状態で微生物中に存在する。組み換え微生物は、好ましくは、コリネ型細菌、特にコリネバクテリウム属菌、特にＣ．ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓ又はＣ．グルタミカム、特にＣ．ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓである。
【００５２】
本発明は、上述したポリヌクレオチドの少なくとも１種、好ましくは２種、３種又は４種が失活又は減衰された状態で存在する、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、グルタミン酸系のＬ−アミノ酸、特に、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−プロリン及びＬ−アルギニン、アスパラギン酸系のＬ−アミノ酸、特に、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−リシン、Ｌ−イソロイシン及びＬ−トレオニン、特に好ましくは、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−メチオニン、Ｌ−リシン及びＬ−トレオニン、特にＬ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−グルタミン酸及びＬ−リシンから選択されるＬ−アミノ酸を過剰産生させる方法であって、好ましくは、コリネバクテリウム属菌、特にＣ．ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓ又はＣ．グルタミカムに対して実施される方法に関する。好適な実施形態では、上述したポリヌクレオチドの少なくとも１種、好ましくは少なくとも２種、３種又は４種が過剰発現された状態で同時に存在する。
【００５３】
好適な実施形態では、本発明に係る微生物又は細菌、特に、本発明に係るコリネバクテリウム属菌、特に、Ｃ．ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓ又はＣ．グルタミカムである本発明に係るコリネバクテリウム属菌、特に、本発明に係るＬ−バリン過剰産生株は、以下の特徴の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ又は３つ、特に好ましくは少なくとも４つ又は５つを有する。
ａ）トレオニンデヒドラターゼ（ＩｌｖＡ、ＥＣ  ４．３．１．１９）、好ましくは、配列番号１０６で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するトレオニンヒドラターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｉｌｖＡ遺伝子）、
ｂ）アセト乳酸合成酵素のサブユニット（ＩｌｖＢ）、好ましくは、配列番号９８で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するアセト乳酸合成酵素のサブユニットをコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｉｌｖＢ遺伝子）、
ｃ）アセト乳酸合成酵素の好ましくはフィードバック阻害耐性を有するサブユニット（ＩｌｖＮ、ＥＣ４．１．３．１８）をコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｉｌｖＮ遺伝子）、
ｄ）イソメロレダクターゼ（ＩＩｖＣ、ＥＣ  １．１．１．８６）、好ましくは、配列番号１００で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するイソメロレダクターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｉｌｖＣ遺伝子）、
ｅ）ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＩＩｖＤ、ＥＣ  ４．２．１．９）、好ましくは、配列番号１０２で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｉｌｖＤ遺伝子）、
ｆ）トランスアミナーゼ（ＩＩｖＥ、ＥＣ  ２．６．１．４２）、好ましくは、配列番号１０４で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するトランスアミナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｉｌｖＥ遺伝子）、
ｇ）アセト乳酸合成酵素（ＩＩｖＨ、ＥＣ  ２．２．１．６）、好ましくは、配列番号１２２で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するアセト乳酸合成酵素をコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｉｌｖＨ遺伝子）、
ｈ）ホモセリンキナーゼ（ＴｈｒＢ、ＥＣ  ２．７．１．３９）、好ましくは、配列番号４で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するホモセリンキナーゼをコードする減衰ポリヌクレオチド（ｔｈｒＢ遺伝子）、
ｉ）トレオニンシンターゼ（ＴｈｒＣ、ＥＣ  ４．２．３．１）、好ましくは、配列番号１０８で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するトレオニンシンターゼをコードする減衰ポリヌクレオチド（ｔｈｒＣ遺伝子）、
ｊ）任意にフィードバック阻害耐性を有するホモセリンデヒドロゲナーゼ（Ｈｏｍ、ＥＣ  １．２．１．１１）、好ましくは、配列番号４６で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｈｏｍ遺伝子）、
ｋ）任意にフィードバック阻害耐性を有するイソプロピルリンゴ酸シンターゼ（ＬｅｕＡ、ＥＣ  ２．３．３．１３）、好ましくは、配列番号１１０で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するイソプロピルリンゴ酸シンターゼをコードする減衰ポリヌクレオチド（ｌｅｕＡ遺伝子）、
ｌ）イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＬｅｕＢ、ＥＣ  １．１．１．８５）、好ましくは、配列番号１１２で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するイソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする減衰ポリヌクレオチド（ｌｅｕＢ遺伝子）、
ｍ）イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼのサブユニット（ＬｅｕＣＤ、ＥＣ  ４．２．１．３３）、好ましくは、配列番号１１４又は１１６で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼのサブユニットをコードする減衰ポリヌクレオチド（ｌｅｕＣＤ遺伝子）、
ｎ）３−メチル−２−オキソブタン酸ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＰａｎＢ、ＥＣ  ２．１．２．１１）、好ましくは、配列番号１１８で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有する３−メチル−２−オキソブタン酸ヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｐａｎＢ遺伝子）、
ｏ）パントテン酸シンターゼ（ＰａｎＣ、ＥＣ  ６．３．２．１）、好ましくは、配列番号１２０で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するパントテン酸シンターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｐａｎＣ遺伝子）。
【００５４】
また、本発明は、Ｌ−アミノ酸、特にＬ−バリンを過剰産生させる方法であって、上述した微生物又は細菌を使用することを特徴とする方法を提供する。
【００５５】
本発明の好適な実施形態では、本発明に係る微生物又は細菌、特に、本発明に係るコリネバクテリウム属菌、特に、Ｃ．ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓ又はＣ．グルタミカムである本発明に係るコリネバクテリウム属菌、特に、本発明に係るＬ−グルタミン酸過剰産生株は、特に好ましくは本発明に係るｈｕｔ遺伝子の少なくとも１種の過剰発現、特に本発明に係るｈｕｔ遺伝子の全ての過剰発現と共に、以下の特徴の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ又は３つ、特に好ましくは少なくとも４つ又は５つを有する。
ａ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｄｈ）、好ましくは、配列番号１２４で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するグルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｇｄｈ）、
ｂ）グルタミンシンテターゼ（グルタミンシンテターゼ１）、好ましくは、配列番号１２６で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するグルタミンシンテターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド、
ｃ）グルタミンシンテターゼ（グルタミンシンテターゼ２）、好ましくは、配列番号１２８で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するグルタミンシンテターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド、
ｄ）グルタミン酸シンターゼ、好ましくは、配列番号１３０で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するグルタミン酸シンターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド、
ｅ）イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、好ましくは、配列番号１３２で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するイソクエン酸デヒドロゲナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド、
ｆ）アコニット酸ヒドラーゼ、好ましくは、配列番号１３４で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するアコニット酸ヒドラーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド、
ｇ）クエン酸シンターゼ、好ましくは、配列番号１３６で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するクエン酸シンターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド、  
ｈ）アミノペプチダーゼＣ（ＰｅｐＣ）、好ましくは、配列番号１３８で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するアミノペプチダーゼＣをコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｐｅｐＣ）、
ｉ）ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、好ましくは、配列番号１４０で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するピルビン酸デヒドロゲナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド、
ｊ）ピルビン酸キナーゼ（ピルビン酸キナーゼ１）、好ましくは、配列番号１４２で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するピルビン酸キナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド、
ｋ）ピルビン酸キナーゼ（ピルビン酸キナーゼ２）、好ましくは、配列番号１４４で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するピルビン酸キナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド、
ｌ）エノラーゼ、好ましくは、配列番号１４６で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するエノラーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド、
ｍ）２，３−ビスホスホグリセリン酸依存性ホスホグリセリン酸ムターゼ（ＧｐｍＡ）、好ましくは、配列番号１４８で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するホスホグリセリン酸ムターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｇｐｍＡ）、
ｎ）ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｐｇｋ）、好ましくは、配列番号１５０で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するホスホグリセリン酸キナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｐｇｋ）、
ｏ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ１）、好ましくは、配列番号１５２で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド、
ｐ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ２）、好ましくは、配列番号１５４で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド、
ｑ）トリオースホスフェートイソメラーゼ（ＴｐｉＡ）、好ましくは、配列番号１５６で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するトリオースホスフェートイソメラーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｔｐｉＡ）、
ｒ）フルクトース二リン酸アルドラーゼ、好ましくは、配列番号１５８で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するフルクトース二リン酸アルドラーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド、
ｓ）１−ホスホフルクトキナーゼ、好ましくは、配列番号１６０で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有する１−ホスホフルクトキナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド、
ｔ）６−ホスホフルクトキナーゼ、好ましくは、配列番号１６２で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有する６−ホスホフルクトキナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド、
ｕ）グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、好ましくは、配列番号６で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するグルコース−６−リン酸イソメラーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｐｇｉ）、
ｖ）スクシニル−ＣｏＡリガーゼのサブユニット（ＳｕｃＣＤ、ＥＣ  ６．２．１．５）、好ましくは、配列番号１９８又は２００で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するスクシニル−ＣｏＡリガーゼのサブユニットをコードする減衰ポリヌクレオチド（ｓｕｃＣＤ）。
【００５６】
また、本発明は、Ｌ−アミノ酸、特にＬ−グルタミン酸を過剰産生させる方法であって、上述した微生物又は細菌を使用することを特徴とする方法を提供する。
【００５７】
本発明の好適な実施形態では、本発明に係る微生物又は細菌、特に、本発明に係るコリネバクテリウム属菌、特に、Ｃ．ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓ又はＣ．グルタミカムである本発明に係るコリネバクテリウム属菌、特に、本発明に係るＬ−アラニン過剰産生株は、特に好ましくは本発明に係るａｌｄ遺伝子の過剰発現と共に、以下の特徴の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ又は３つ、特に好ましくは少なくとも４つ又は５つを有する。
ａ）アラニンデヒドロゲナーゼ（ＡｌａＤ）、好ましくはコリネバクテリウム属菌に由来するアラニンデヒドロゲナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ａｌａＤ）、
ｂ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧａｐＡ）、好ましくはコリネバクテリウム属菌に由来するグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｇａｐＡ）、
ｃ）Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬｄｈＡ）、好ましくはコリネバクテリウム属菌に由来するＬ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする失活又は減衰ポリヌクレオチド（ＩｄｈＡ）、
ｄ）ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（Ｐｐｃ）、好ましくはコリネバクテリウム属菌に由来するホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする失活又は減衰ポリヌクレオチド（ｐｐｃ）、
ｅ）アラニンラセマーゼ（Ａｌｒ）、好ましくはコリネバクテリウム属菌に由来するアラニンラセマーゼをコードする失活又は減衰ポリヌクレオチド（ａｌｒ）。
【００５８】
また、本発明は、Ｌ−アミノ酸、特にＬ−アラニンを過剰産生させる方法であって、上述した微生物又は細菌を使用することを特徴とする方法を提供する。
【００５９】
本発明の好適な実施形態では、本発明に係る微生物又は細菌、特に、本発明に係るコリネバクテリウム属菌、特に、Ｃ．ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓ又はＣ．グルタミカムである本発明に係るコリネバクテリウム属菌、特に、Ｌ−メチオニン過剰産生株は、以下の特徴の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ又は３つ、特に好ましくは少なくとも４つ又は５つを有する。
ａ）ＨＴＨ  ｔｅｔＲのＤＮＡ結合ドメイン（ＭｃｂＲ）、好ましくは、配列番号２で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するＤＮＡ結合ドメインをコードする減衰ポリヌクレオチド（ｍｃｂＲ）、
ｂ）ホモセリンキナーゼ（ＴｈｒＢ、ＥＣ  ２．７．１．３９）、好ましくは、配列番号４で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するホモセリンキナーゼをコードする減衰ポリヌクレオチド（ｔｈｒＢ遺伝子）、
ｃ）グルコース−６−リン酸イソメラーゼ（Ｐｇｉ、ＥＣ  ５．３．１．９）、好ましくは、配列番号６で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するグルコース−６−リン酸イソメラーゼをコードする減衰ポリヌクレオチド（ｐｇｉ）、
ｄ）ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（Ｐｃｋ、ＥＣ  ４．１．１．３２）、好ましくは、配列番号８で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼをコードする減衰ポリヌクレオチド（ｐｃｋ）、
ｅ）Ｄ−メチオニン結合リポタンパク質（ＭｅｔＱ）、好ましくは、配列番号１０で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するＤ−メチオニン結合リポタンパク質をコードする減衰ポリヌクレオチド（ｍｅｔＱ）、
ｆ）メチオニントランスポーター（ＭｅｔＰ）、好ましくは、配列番号１２で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するメチオニントランスポーターをコードする減衰ポリヌクレオチド（ｍｅｔＰ）、
ｇ）ＡＴＰ依存性メチオニントランスポーター（ＭｅｔＮ）、好ましくは、配列番号１４で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するＡＴＰ依存性メチオニントランスポーターをコードする減衰ポリヌクレオチド（ｍｅｔＮ）、
ｈ）Ｓ−アデノシルメチオニンシンターゼ（ＭｅｔＫ）、好ましくは、配列番号１６で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するＳ−アデノシルメチオニンシンターゼをコードする減衰ポリヌクレオチド（ｍｅｔＫ）、
ｉ）メチオニン輸送系透過酵素（ＭｅｔＩ）、好ましくは、配列番号１８で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するメチオニン輸送系透過酵素をコードする減衰ポリヌクレオチド（ｍｅｔＩ）、
ｊ）４−ヒドロキシテトラヒドロジピコリン酸シンターゼ（ＤａｐＡ）、好ましくは、配列番号２０で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有する４−ヒドロキシテトラヒドロジピコリン酸シンターゼをコードする減衰ポリヌクレオチド（ｄａｐＡ）、
ｋ）システインシンターゼ（ＣＢＳ、ＣｙｓＫ）、好ましくは、配列番号２２で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するシステインシンターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ＣＢＳ、ｃｙｓＫ）、
ｌ）カルボン酸−アミンリガーゼ、好ましくは、配列番号２４で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するカルボン酸−アミンリガーゼをコードする減衰ポリヌクレオチド、
ｍ）シスタチオニンβ−リアーゼ（ＡｅｃＤ）、好ましくは、配列番号２６で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するシスタチオニンβ−リアーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ａｅｃＤ）、
ｎ）アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（Ａｓｄ）、好ましくは、配列番号２８で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ａｓｄ）、
ｏ）５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステインメチルトランスフェラーゼ（ＭｅｔＨ、ＥＣ  ２．１．１．１３）をコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｍｅｔＨ）、
ｐ）分枝鎖アミノ酸のトランスポーターの小サブユニット（ＢｒｎＥ）、好ましくは、配列番号３０で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するサブユニットをコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｂｒｎＥ）、
ｑ）分枝鎖アミノ酸のトランスポーターの大サブユニット（ＢｒｎＦ）、好ましくは、配列番号３２で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するサブユニットをコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｂｒｎＦ）、
ｒ）セリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｙｓＥ）、好ましくは、配列番号３４で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するセリンアセチルトランスフェラーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｃｙｓＥ）、
ｓ）システインシンターゼ（ＣｙｓＫ）、好ましくは、配列番号３６で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するシステインシンターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｃｙｓＫ）、
ｔ）グリシン開裂系のＨ−タンパク質（ＧｃｖＨ）、好ましくは、配列番号３８で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するＨ−タンパク質をコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｇｃｖＨ）、
ｕ）グリシン開裂系のＰ−タンパク質（ＧｃｖＰ）、好ましくは、配列番号４０で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するＰ−タンパク質をコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｇｃｖＰ）、
ｖ）グリシン開裂系のＴ−タンパク質（ＧｃｖＴ）、好ましくは、配列番号４２で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するＴ−タンパク質をコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｇｃｖＴ）、
ｗ）セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＧｌｙＡ）、好ましくは、配列番号４４で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｇｌｙＡ）、
ｘ）任意にフィードバック阻害耐性を有するホモセリンデヒドロゲナーゼ（Ｈｏｍ）、好ましくは、配列番号４６で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｈｏｍ）、
ｙ）リポイルシンターゼ（ＬｉｐＡ）、好ましくは、配列番号４８で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するリポイルシンターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｌｉｐＡ）、
ｚ）リポイルトランスフェラーゼ（ＬｉｐＢ）、好ましくは、配列番号５０で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するリポイルトランスフェラーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｌｉｐＢ）、
ａａ）ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ（Ｌｐｄ）、好ましくは、配列番号５２で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｌｐｄ）、
ｂｂ）リポ酸−タンパク質リガーゼ（ＬｐｌＡ）、好ましくは、配列番号９４で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するリポ酸−タンパク質リガーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｌｐｌＡ）、
ｃｃ）ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ（ＧｃｖＬ）、好ましくは、配列番号９６で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｇｃｖＬ）、
ｄｄ）好ましくはフィードバック阻害耐性を有するアスパラギン酸キナーゼ（ＬｙｓＣ）、好ましくは、配列番号５４で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するアスパラギン酸キナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｌｙｓＣ）、
ｅｅ）シスタチオニンγ−シンターゼ（ＭｅｔＢ）、好ましくは、配列番号５６で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するシスタチオニンγ−シンターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｍｅｔＢ）、
ｆｆ）５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ（ＭｅｔＦ）、好ましくは、配列番号５８で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有する５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｍｅｔＦ）、
ｇｇ）ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ（ＭｅｔＸ）、好ましくは、配列番号６０で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｍｅｔＸ）、
ｈｈ）Ｏ−アセチルホモセリンリアーゼ（ＭｅｔＹ）、好ましくは、配列番号６２で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するＯ−アセチルホモセリンリアーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｍｅｔＹ）、
ｉｉ）ピルビン酸カルボキシラーゼ（Ｐｙｃ）、好ましくは、配列番号６４で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するピルビン酸カルボキシラーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｐｙｃ）、
ｊｊ）任意にフィードバック阻害耐性を有するＤ−３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（ＳｅｒＡ）、好ましくは、配列番号６６で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するＤ−３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｓｅｒＡ）、
ｋｋ）ホスホセリンホスファターゼ（ＳｅｒＢ）、好ましくは、配列番号６８で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するホスホセリンホスファターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｓｅｒＢ）、
ｌｌ）ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ（ＳｅｒＣ）、好ましくは、配列番号７０で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するホスホセリンアミノトランスフェラーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｓｅｒＣ）、
ｍｍ）硫酸アデニリルトランスフェラーゼのサブユニット（ＣｙｓＤ）、好ましくは、配列番号７４で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するサブユニットをコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｃｙｓＤ）、
ｎｎ）アデノシンホスホ硫酸レダクターゼ（ＣｙｓＨ）、好ましくは、配列番号７６で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するアデノシンホスホ硫酸レダクターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｃｙｓＨ）、
ｏｏ）亜硫酸レダクターゼ（ＣｙｓＩ）、好ましくは、配列番号７８で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有する亜硫酸レダクターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｃｙｓＩ）、
ｐｐ）（ＣｙｓＪ）、好ましくは、配列番号８０で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有する（ＣｙｓＪ）をコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｃｙｓＪ）、
ｑｑ）硫酸アデニリルトランスフェラーゼのサブユニット（ＣｙｓＤ）、好ましくは、配列番号８２で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するサブユニットをコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｃｙｓＮ）、
ｒｒ）シスタチオニンβ−シンターゼ（ＣｙｓＹ）、好ましくは、配列番号８４で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するシスタチオニンβ−シンターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｃｙｓＹ）、
ｓｓ）推定上の硫酸トランスポーター（ＣｙｓＺ）、好ましくは、配列番号８６で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有する硫酸トランスポーターをコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｃｙｓＺ）、
ｔｔ）５−メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸−ホモシステインメチルトランスフェラーゼ（ＭｅｔＥ）、好ましくは、配列番号８８で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するタンパク質をコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｍｅｔＥ）、
ｕｕ）ペプチジル−ｔＲＮＡヒドロラーゼ１（ＰｔＨ１）、好ましくは、配列番号９０で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するペプチジル−ｔＲＮＡヒドロラーゼ１をコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｐｔＨ１）、
ｖｖ）ペプチジル−ｔＲＮＡヒドロラーゼ２（ＰｔＨ２）、好ましくは、配列番号９２で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するペプチジル−ｔＲＮＡヒドロラーゼ２をコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｐｔＨ２）。
【００６０】
また、本発明は、Ｌ−アミノ酸、特にＬ−メチオニンを過剰産生させる方法であって、上述した微生物又は細菌を使用することを特徴とする方法を提供する。
【００６１】
別の好適な実施形態では、本発明に係る微生物又は細菌、特に、本発明に係るコリネバクテリウム属菌、特に、Ｃ．ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓ又はＣ．グルタミカムである本発明に係るコリネバクテリウム属菌、特に、本発明に係るＬ−リシン過剰産生株は、以下の特徴の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ又は３つ、特に好ましくは少なくとも４つ又は５つを有する。
ａ）ジヒドロジピコリン酸シンターゼ（ＤａｐＡ、ＥＣ  ４．２．１．５２）、好ましくは、配列番号２０で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するジヒドロジピコリン酸シンターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｄａｐＡ）、
ｂ）好ましくはフィードバック阻害耐性を有するアスパラギン酸キナーゼ（ＬｙｓＣ、ＥＣ  ２．７．２．４）、好ましくは、配列番号５４で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するアスパラギン酸キナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｌｙｓＣ）、
ｃ）ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（Ｄｄｈ、ＥＣ  １．４．１．１６）、好ましくは、配列番号２０２で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｄｄｈ）、
ｄ）アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（Ａｓｄ、ＥＣ  １．２．１．１１）、好ましくは、配列番号２８で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ａｓｄ）、
ｅ）ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ（ＬｙｓＡ、ＥＣ  ４．１．１．２０）、好ましくは、配列番号１６４で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｌｙｓＡ）、
ｆ）アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡａＴ、ＥＣ  ２．６．１．１）、好ましくは、配列番号１６６で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ａａｔ）、
ｇ）Ｌ−リシンエクスポーター（ＬｙｓＥ、リシン透過酵素）、好ましくは、配列番号１６８で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するＬ−リシンエクスポーターをコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｌｙｓＥ）、
ｈ）ピルビン酸カルボキシラーゼ（Ｐｙｃ、ＥＣ  ６．４．１．１）、好ましくは、配列番号６４で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するピルビン酸カルボキシラーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｐｙｃ）、
ｉ）ジアミノピメリン酸エピメラーゼ（ＤａｐＦ、ＥＣ  ５．１．１．７）をコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｄａｐＦ）、
ｊ）ジヒドロピコリン酸レダクターゼ（ＤａｐＢ、ＥＣ  １．３．１．２６）、好ましくは、配列番号１７０で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するジヒドロピコリン酸レダクターゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｄａｐＢ）、
ｋ）グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．４９）、好ましくは、配列番号１７２で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド、
ｌ）グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼのＺｗｆサブユニット（Ｚｗｆ、ＥＣ  １．１．１．４９）、好ましくは、配列番号１８６で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するＺｗｆサブユニットをコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｚｗｆ）、
ｍ）グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼのＯｐｃＡサブユニット（ＯｐｃＡ、ＥＣ  １．１．１．４９）、好ましくは、配列番号１８８で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するＯｐｃＡサブユニットをコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｏｐｃＡ）、
ｎ）ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｎｄ、ＥＣ  １．１．１．４４）、好ましくは、配列番号１７４で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼをコードする過剰発現ポリヌクレオチド（ｇｎｄ）、
ｏ）リンゴ酸：キノンオキシドレダクターゼ（Ｍｑｏ、ＥＣ  １．１．９９．１６）、好ましくは、配列番号１７６で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するリンゴ酸：キノンオキシドレダクターゼをコードする失活又は減衰ポリヌクレオチド（ｍｑｏ）、
ｐ）ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体のＥ１ｐサブユニット（ＡｃｅＥ、ＥＣ  １．２．４．１）、好ましくは、配列番号１７８で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するＥ１ｐサブユニットをコードする失活又は減衰ポリヌクレオチド、
ｑ）クエン酸シンターゼ（ＧｌｔＡ、ＥＣ  ４．１．３．７）、好ましくは、配列番号１８０で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するクエン酸シンターゼをコードする失活又は減衰ポリヌクレオチド（ｇｌｔＡ）、
ｒ）リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（Ｍｄｈ、ＥＣ  １．１．１．３７）、好ましくは、配列番号１８２で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有するリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする失活又は減衰ポリヌクレオチド（ｍｄｈ）、
ｓ）ＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラモイルアラニル−Ｄ−グルタミン酸−２，６−ジアミノピメリン酸リガーゼ（ＭｕｒＥ、ＥＣ  ６．３．２．１３）、好ましくは、配列番号１８４で表される配列に対して、少なくとも９０、９５又は９８％、好ましくは１００％の配列相同性を有する酵素をコードする失活又は減衰ポリヌクレオチド（ｍｕｒＥ）。
【００６２】
また、本発明は、Ｌ−アミノ酸、特にＬ−リシンを過剰産生させる方法であって、上述した微生物又は細菌を使用することを特徴とする方法を提供する。
【００６３】
上述した本発明に係る方法に使用するポリヌクレオチド及びポリペプチドは、コリネバクテリウム属菌、特にＣ．ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓ又はＣ．グルタミカム、特に好ましくはＣ．ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓに由来することが好ましい。
【００６４】
本発明に関連して使用する「過剰発現」という用語は、開始株（親株）又は野生型株と比較した場合の、微生物内において対応するＤＮＡによってコードされたリボ核酸、タンパク質（ポリペプチド）又は酵素の細胞内濃度又は活性の上昇を通常は意味する。開始株（親株）とは、過剰発現を生じさせる手段が実施された株を意味する。
【００６５】
濃度又は活性の上昇は、例えば、少なくとも１回の複製により、対応するコーディングポリヌクレオチドの複製数を染色体的又は染色体外的に増加させることによって達成することができる。
【００６６】
複製数を増加させる方法としては、対応するコーディングポリヌクレオチドをベクター、好ましくはプラスミドに導入し、微生物、特にコリネ型細菌から複製する方法が広く使用されている。ベクターとしては、トランスポゾン、挿入因子（ＩＳ  ｅｌｅｍｅｎｔ）又はファージを使用することができる。多くの適当なベクターが先行技術に記載されている。
【００６７】
染色体遺伝子を増幅する方法も過剰発現を実施する方法として広く使用されている。このような方法では、対象となるポリヌクレオチドの少なくとも１つの複製をコリネ型細菌の染色体に挿入する。そのような増幅方法は、例えば、国際公開第０３／０１４３３０号又は国際公開第０３／０４０３７３号に記載されている。
【００６８】
また、過剰発現は、機能的な方法（作動的な連結）により、対応する遺伝子又は対立遺伝子をプロモーター又は発現カセットに連結することによって行うことができる。コリネバクテリウム・グルタミカムのための適当なプロモーターは、例えば、Ｐａｔｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０４（１−３），３１１−３２３（２００３））（図１）、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ」（Ｅｄｓ．：Ｌｏｔｈａｒ  Ｅｇｇｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｂｏｔｔ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＵＳ（２００５））、「Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｅｄ．：Ａｎｄｒｅａｓ  Ｂｕｒｋｏｖｓｋｉ，Ｃａｉｓｔｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｏｒｆｏｌｋ，ＵＫ（２００８））に記載されている。また、例えば、Ｖａｓｉｃｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １８１，６１８８−６１９１（１９９９））に記載されているｄａｐＡプロモーターの変異体（プロモーターＡ２５）も使用することができる。さらに、コリネバクテリウム・グルタミカムのギャッププロモーター（ＥＰ  ０６００７３７３）を使用することができる。また、Ａｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｅｎｅ  ６９（２），３０１−３１５（１９８８））及びＡｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｂｒｏｓｉｕｓ（Ｇｅｎｅ  ４０（２−３），１８３−１９０（１９８５））に記載されている周知のプロモーターＴ３、Ｔ７、ＳＰ６、ｌａｃ、ｔａｃ及びｔｒｃも使用することができる。そのようなプロモーターは、例えば、関連する遺伝子の上流（通常は開始コドンから約１〜５００核酸塩基の距離）に挿入することができる。
【００６９】
過剰発現手段により、対応するポリペプチドの活性又は濃度が、過剰発現手段を実施する前の株におけるポリペプチドの活性又は濃度と比較して、少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％又は５００％（好ましくは１０００％又は２０００％以下）上昇することが好ましい。
【００７０】
タンパク質の濃度は、一次元及び二次元タンパク質ゲル分画を実施した後、適切な評価ソフトウェアによってゲル中におけるタンパク質濃度を光学的に同定することによって測定することができる。通常行われているコリネ型細菌のタンパク質ゲルの調製方法及びタンパク質の同定方法は、Ｈｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２２：１７１２−２３（２００１））に記載されている。また、タンパク質の濃度は、検出対象のタンパク質に特異的な抗体を使用するウエスタンブロットハイブリダイゼーション（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）を実施した後、対応する濃度測定用ソフトウェアを使用する光学的評価（Ｌｏｈａｕｓ  ａｎｄ  Ｍｅｙｅｒ（１９９８）Ｂｉｏｓｐｅｋｔｒｕｍ  ５：３２−３９；Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  ３８：２６３０−２６４７（１９９９））を実施することによって測定することもできる。活性は、適当な酵素アッセイによって測定することができる。
【００７１】
本発明に関連して使用する「減衰」という用語は、開始株（親株）又は野生型株と比較した場合の、微生物内において対応するＤＮＡによってコードされたリボ核酸、タンパク質（ポリペプチド）又は酵素の細胞内濃度又は活性の低下を意味する。開始株（親株）とは、減衰を生じさせる手段が実施された株を意味する。
【００７２】
減衰は、例えば、弱いプロモーター又は活性が低下したポリペプチドをコードする対立遺伝子を使用して、ポリペプチドの発現を減少させることによって実施することができる。なお、上記手法は組み合わせて使用することもできる。また、減衰は、例えば、コード遺伝子を失活させることにより、ポリペプチドの発現を完全に防止することによって実施することもできる。
【００７３】
減衰手段により、対応するポリペプチドの活性又は濃度が、減衰手段を実施する前の株におけるポリペプチドの活性又は濃度と比較して、少なくとも１０％、２５％、５０％又は７５％（好ましくは１００％以下）低下することが好ましい。好適な実施形態では、関連するポリペプチドの発現を完全に失活させることによって減衰を実施する。
【００７４】
アミノ酸の産生に関連するフィードバック阻害耐性を有する酵素とは、野生型と比較して、産生されるＬ−アミノ酸及び／又はその類似体による阻害に対して低い感度を有する酵素を通常は意味する。
【００７５】
特に、フィードバック阻害耐性を有するアスパラギン酸キナーゼ（ＬｙｓＣＦＢＲ）とは、野生型と比較して、リシンとスレオニンの混合物又はアミノエチルシステイン（ＡＥＣ）とトレオニンの混合物又はリシン単独又はＡＥＣ単独による阻害に対して低い感度を有するアスパラギン酸キナーゼを意味する。リシンの産生では、そのようなフィードバック阻害耐性を有するか、感度を低下させたアスパラギン酸キナーゼを含む対応する株を使用することが好ましい。
【００７６】
例えば、Ａ２７９Ｔ、Ａ２７９Ｖ、Ｓ３０１Ｆ、Ｓ３０１Ｙ、Ｔ３０８Ｉ、Ｔ３１１Ｉ、Ｒ３２０Ｇ、Ｇ３４５Ｄ及びＳ３８１Ｆが、Ｃ．グルタミカムに由来するフィードバック阻害耐性を有するアスパラギン酸キナーゼとして知られている。Ｃ．グルタミカムに由来するフィードバック阻害耐性を有するアスパラギン酸キナーゼに関しては、特開１９９３−１８４３６６号、特開１９９４−０６２８６６号、特開１９９４−２６１７６６号、特開１９９７−０７０２９１号、特開１９９７−３２２７７４号、特開１９９８−１６５１８０号、特開１９９８−２１５８８３号、米国特許第５，６８８，６７１号、欧州特許第０３８７５２７号、国際公開第００／６３３８８号、米国特許第３，７３２，１４４号、日本国特許第６２６１７６６号及びＪｅｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４３：７６−８２）も参照されたい。Ｃ．グルタミカムに由来するフィードバック阻害耐性を有するアスパラギン酸キナーゼは、登録番号０５１０８Ｅ、０６８２５Ｅ、０６８２６Ｅ、０６８２７Ｅ、０８１７７Ｅ、０８１７８Ｅ、０８１７９Ｅ、０８１８０Ｅ、０８１８１Ｅ、０８１８２Ｅ、１２７７０Ｅ、１４５１４Ｅ、１６３５２Ｅ、１６７４５Ｅ、１６７４６Ｅ、Ｉ７４５８８、Ｉ７４５８９、Ｉ７４５９０、Ｉ７４５９１、Ｉ７４５９２、Ｉ７４５９３、Ｉ７４５９４、Ｉ７４５９５、Ｉ７４５９６、Ｉ７４５９７、Ｘ５７２２６、Ｌ１６８４８及びＬ２７１２５としてＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋに寄託されている。
【００７７】
本発明では、Ｄ２７４Ｙ、Ａ２７９Ｅ、Ｓ３０１Ｙ、Ｔ３０８Ｉ、Ｔ３１１Ｉ及びＧ３５９Ｄを、Ｃ．ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓに由来するフィードバック阻害耐性を有するアスパラギン酸キナーゼとして使用することが好ましい。
【００７８】
トレオニンの産生では、対応するフィードバック阻害耐性を有するホモセリンデヒドロゲナーゼ（ＨｏｍＦＢＲ）を含む株を使用することが好ましい。
【００７９】
イソロイシンの産生では、対応するフィードバック阻害耐性を有するアセト乳酸合成酵素を含む株を使用することが好ましい。
【００８０】
ロイシンの産生では、対応するフィードバック阻害耐性を有するイソプロピルリンゴ酸シンターゼ（ＬｅｕＡＦＢＲ）を含む株を使用することが好ましい。
【００８１】
プロリンの産生では、対応するフィードバック阻害耐性を有するグルタミン酸−５−キナーゼ（ＰｒｏＢＦＢＲ）を含む株を使用することが好ましい。
【００８２】
アルギニンの産生では、対応するフィードバック阻害耐性を有するオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＦＦＢＲ）を含む株を使用することが好ましい。
【００８３】
セリンの産生では、対応するフィードバック阻害耐性を有するＤ−３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（ＳｅｒＡＦＢＲ）を含む株を使用することが好ましい。
【００８４】
メチオニンの産生では、対応するフィードバック阻害耐性を有するＤ−３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（ＳｅｒＡＦＢＲ）及び／又はフィードバック阻害耐性を有するピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰｙｃＦＢＲ）を含む株を使用することが好ましい。
【００８５】
トリプトファンの産生では、対応するフィードバック阻害耐性を有するホスホ−２−デヒドロ−３−デオキシヘプトネートアルドラーゼ（ＡｒｏＧＦＢＲ又はＡｒｏＨＦＢＲ）を含む株を使用することが好ましい。
【００８６】
本発明に関連して使用する、Ｌ−アミノ酸過剰産生Ｃ．ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓ株のその他の好ましい特性については、上述したＷｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）及びその他の刊行物を参照されたい。
【００８７】
本発明に係る微生物、特にコリネバクテリウム属菌は、Ｌ−アミノ酸を製造するために、例えば国際公開第０５／０２１７７２号に開示されているように連続的に培養するか、回分処理（回分培養又は回分法）又は流加培養又は反復流加培養処理によって非連続的に培養することができる。公知の培養方法の概要は、Ｃｈｍｉｅｌ（Ｂｉｏｐｒｏｚｅｓｓｔｅｃｈｎｉｋ  １，Ｅｉｎｆuｈｒｕｎｇ  ｉｎ  ｄｉｅ  Ｂｉｏｖｅｒｆａｈｒｅｎｓｔｅｃｈｎｉｋ  ［Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ］（Ｇｕｓｔａｖ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，１９９１））又はＳｔｏｒｈａｓ（Ｂｉｏｒｅａｋｔｏｒｅｎ  ａｎｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒｅ  Ｅｉｎｒｉｃｈｔｕｎｇｅｎ［Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｄｅｖｉｃｅｓ］（Ｖｉｅｗｅｇ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ／Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ，１９９４））に記載されている。
【００８８】
使用する培地又は発酵培地は、特定の株に関する要件を適切に満たしていなければならない。様々な微生物に使用する培地については、「Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡ，１９８１）に記載されている。なお、「培地」及び「発酵培地」という用語は、互いに置き替え可能である。
【００８９】
使用する炭素源としては、糖及び糖質、例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、砂糖大根又はサトウキビの製造によって得られるスクロース含有溶液、でんぷん、でんぷん加水分解物、セルロース、油脂、例えば、大豆油、ひまわり油、落花生油及びココナツ油（ｃｏｃｏｎｕｔ  ｆａｔ）、脂肪酸、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸、アルコール、例えば、グリセリン、メタノール及びエタノール、有機酸、例えば、酢酸及び乳酸が挙げられる。
【００９０】
使用する窒素源としては、ペプトン等の有機含窒素化合物、酵母抽出物、肉抽出物、麦芽抽出物、コーンスティープリカー、大豆粉、尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウム等の無機化合物が挙げられる。これらの窒素源は、単独又は混合物として使用することができる。
【００９１】
使用するリン源としては、リン酸、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム及び対応するナトリウム含有塩が挙げられる。
【００９２】
培地は、増殖に必要な、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、鉄等の金属の塩化物又は硫酸塩等の塩、例えば、硫酸マグネシウム又は硫酸鉄をさらに含む。上述した物質に加えて、増殖に必須の物質、例えば、アミノ酸、例えば、ホモセリン及びビタミン、例えば、チアミン、ビオチン又はパントテン酸を使用することができる。
【００９３】
上述した物質は、単一の混合物として培地に添加するか、培養時に適当な方法で添加することができる。
【００９４】
培養物のｐＨは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア又はアンモニア水等の塩基性化合物又はリン酸又は硫酸等の酸性化合物を使用して制御することができる。ｐＨは、通常は６．０〜９．０、好ましくは６．５〜８に調節する。発泡の発生を制御するために、脂肪酸ポリグリコールエステル等の消泡剤を使用することができる。プラスミドの安定性を維持するために、抗生物質等の適当な選択的作用物質を培地に添加することができる。好気性条件を維持するために、酸素又は含酸素気体混合物（空気等）を培養物に導入する。過酸化水素を含む液体を使用することもできる。必要に応じて、例えば、０．０３〜０．２ＭＰａ等の加圧下で発酵を実施する。培養物の温度は、通常は２０〜４５℃、好ましくは２５〜４０℃である。回分処理を実施する場合には、所望のＬ−アミノ酸の産生が最大となるまで培養を継続する。この場合、培養時間は通常は１０〜１６０時間である。連続処理では、培養時間をさらに長くしてもよい。細菌の活性により、発酵培地及び／又は細菌細胞中のＬ−アミノ酸の濃度（蓄積）が上昇する。
【００９５】
適当な発酵培地の例は、米国特許第５，７７０，４０９号、米国特許第５，８４０，５５１号、米国特許第５，９９０，３５０号及び米国特許第５，２７５，９４０号に開示されている。
【００９６】
発酵時における一回以上の濃度決定のためのＬ−アミノ酸の分析は、イオン交換クロマトグラフィー、好ましくはカチオン交換クロマトグラフィーと、ニンヒドリンを使用するポストカラム誘導体化によるＬ−アミノ酸の分離によって実施することができる（Ｓｐａｃｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：１１９０−１２０６（１９５８））を参照）。ニンヒドリンの代わりに、オルトフタルジアルデヒドをポストカラム誘導体化に使用することもできる。イオン交換クロマトグラフィーについては、Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇ（ＬＣ・ＧＣ（Ｍａｇａｚｉｎｅ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）  ７（６），４８４−４８７（１９８９））を参照されたい。
【００９７】
また、例えば、オルトフタルアルデヒド又はフェニルイソチオシアネートを使用してプレカラム誘導体化を実施し、逆相クロマトグラフィー（ＲＰ）（好ましくは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ））によって得られたアミノ酸誘導体を分離することもできる。そのような方法は、例えば、Ｌｉｎｄｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５１：１１６７−１１７４（１９７９））に記載されている。
【００９８】
検出は光分析（吸収率、蛍光）によって行う。
【００９９】
アミノ酸分析に関するレビューは、「Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｋ」，Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ  ａｎｄ  Ｚｏｒｂａｓ（Ｓｐｅｋｔｒｕｍ  Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ  １９９８）に記載されている。
【０１００】
また、本発明は、Ｌ−アミノ酸の製造方法であって、（ａ）本発明に係る微生物、特にコリネ型細菌、好ましくはコリネバクテリウム属菌、特に好ましくはＣ．ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓ又はＣ．グルタミカムを適当な培養液中で発酵させる工程と、（ｂ）前記培養液及び／又は前記細菌の細胞内において前記Ｌ−アミノ酸を蓄積させる工程と、を実施することを特徴とする方法に関する。
【０１０１】
次に、液体又は固体としてＬ−アミノ酸を含む生成物を製造又は回収する。
【０１０２】
発酵により、関連するＬ−アミノ酸を含む発酵液が得られる。
【０１０３】
発酵液とは、微生物を所定の時間にわたって所定の温度で培養した発酵培地又は培養液を意味する。発酵時に使用する発酵培地又は培地は、微生物の増殖及び所望のＬ−アミノ酸の生成を可能とするあらゆる物質又は成分を含む。
【０１０４】
発酵によって得られる発酵液は、以下の成分を含む。
ａ）微生物の細胞の増殖によって生成された微生物の細胞集団。
ｂ）発酵時に生成されたＬ−アミノ酸。
ｃ）発酵時に生成された有機副生成物。
ｄ）発酵によって消費されなかったビオチン等のビタミン又は硫酸マグネシウム等の塩等の、発酵培地の成分又は出発材料。
【０１０５】
有機副生成物は、所望のＬ−アミノ酸と共に、発酵に使用した微生物によって生成され、任意に分泌された物質を含む。例えば、トレハロース等の糖が有機副生成物に含まれる。
【０１０６】
発酵液を培養容器又は発酵容器から取り出し、必要に応じて回収し、液体又は固体のＬ−アミノ酸含有製品を調製するために使用する。この場合にも、「Ｌ−アミノ酸含有製品を回収する」という表現を使用する。最も単純な場合には、回収される製品は、Ｌ−アミノ酸含有発酵液そのものである。
【０１０７】
以下の群から選択される１以上の手段により、発酵液からＬ−アミノ酸を濃縮又は精製することができる。
ａ）水の部分的（＞０％〜＜８０％）、完全（１００％）又はほぼ完全（≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％又は≧９９％）な除去。
ｂ）（必要に応じて非活性化させた）細胞集団の部分的（＞０％〜＜８０％）、完全（１００％）又はほぼ完全（≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％又は≧９９％）な除去。
ｃ）発酵時に生成した有機副生成物の部分的（＞０％〜＜８０％）、完全（１００％）又はほぼ完全（≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％、≧９９．３％又は≧９９．７％）な除去。
ｄ）発酵時に消費されなかった発酵培地の成分又は原料の部分的（＞０％〜＜８０％）、完全（１００％）又はほぼ完全（≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％、≧９９．３％又は≧９９．７％）な除去。
これにより、所望のＬ−アミノ酸含有量を有する製品を単離することができる。
【０１０８】
水の部分的（＞０％〜＜８０％）、完全（１００％）又はほぼ完全（≧８０％〜＜１００％）な除去（手段ａ））は、「乾燥」ということができる。
【０１０９】
水、細胞集団、有機副生成物及び消費されなかった発酵培地の成分を完全又はほぼ完全に除去することにより、純粋（≧８０重量％又は≧９０重量％）又は非常に純粋（≧９５％重量、≧９７重量％又は≧９９重量％）なＬ−アミノ酸を得ることができる。手段ａ）、ｂ）、ｃ）及びｄ）に関しては、多くの技術的な説明が存在する。
【実施例】
【０１１０】
実施例１：Ｌ−アラニン及びＬ−バリンに関するアッセイ
Ｌ−アラニン及びＬ−バリンに関するアッセイでは、基準株Ｃ．ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓ（ＤＳＭ  ４５３９２）を振盪フラスコ内で培養した。具体的には、１０ｍｌのＢＨＩ（Ｂｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ）液体媒体（Ｍｅｒｃｋ社製）（Ｈ２Ｏ：３７ｇ／ｌ）内において、Ｃ．ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓ株を予備培養した（３７℃、２００ｒｐｍ、２４時間）。振盪フラスコ内の培地（１０ｍｌ）を０．２のＯＤ６６０で播種し、培養した（３７℃、２００ｒｐｍ、４８時間）。培地は、２０ｇの硫酸アンモニウム、０．４ｇのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、０．６ｇのＫＨ２ＰＯ４及び１０ｇの酵母抽出物を７５０ｍｌのＨ２Ｏに溶解させて調製した。２０％ＮＨ４ＯＨを使用して溶液のｐＨを７．８に調節した後、溶液に対してオートクレーブ処理を行った。次に、前記溶液を、０．２５ｇ／ｌのビタミンＢ１，５０ｍｇ／ｌのシアノコバラミン、２５ｍｇ／ｌのビオチン及び１．２５ｇ／ｌのピリドキシンを含む、４ｍｌのビタミン溶液（ｐＨ７（ＮＨ４ＯＨを使用））を添加した。また、１４０ｍｌの無菌濾過５０％グルコース溶液及び５０ｇの乾燥オートクレーブ処理ＣａＣＯ３を添加した後、培地を１ｌとした。
【０１１１】
培養後、並行して培養した４種類の培養物の上清をＨＰＬＣによって分析し、アラニン及びバリンの含有量を測定した（検出限界：≧０．０１ｇ／ｌ）。
【０１１２】
基準株Ｃ．ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓを振盪フラスコ内で培養（３７℃、２００ｒｐｍ、４８時間）することにより、約０．８１ｇ／ｌのアラニン（正味収率：０．０１１ｇａｌａｎｉｎｅ／ｇｇｌｕｃｏｓｅ）及び約１．６ｇ／ｌのバリン（正味収率：０．０２２ｇｖａｌｉｎｅ／ｇｇｌｕｃｏｓｅ）が得られた（表１）。
【０１１３】
【表１】
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【０１１４】
実施例２：グルタミン酸に関するアッセイ
グルタミン酸に関するアッセイでは、基準株Ｃ．ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓ（ＤＳＭ  ４５３９２）を振盪フラスコ内で培養した。具体的には、１０ｍｌのＢＨＩ（Ｂｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ）液体媒体（Ｍｅｒｃｋ社製）（Ｈ２Ｏ：３７ｇ／ｌ）内において、Ｃ．ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓ株を予備培養した（３７℃、２００ｒｐｍ、２４時間）。振盪フラスコ内の培地（１０ｍｌ）を０．２のＯＤ６６０で播種し、培養した（３７℃、２００ｒｐｍ、４８時間）。培地は、２０ｇの硫酸アンモニウム、０．４ｇのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、０．６ｇのＫＨ２ＰＯ４及び１０ｇの酵母抽出物を７５０ｍｌのＨ２Ｏに溶解させて調製した。２０％ＮＨ４ＯＨを使用して溶液のｐＨを７．８に調節した後、溶液に対してオートクレーブ処理を行った。次に、前記溶液を、０．２５ｇ／ｌのビタミンＢ１，５０ｍｇ／ｌのシアノコバラミン、２５ｍｇ／ｌのビオチン及び１．２５ｇ／ｌのピリドキシンを含む、４ｍｌのビタミン溶液（ｐＨ７（ＮＨ４ＯＨを使用））を添加した。また、１４０ｍｌの無菌濾過５０％グルコース溶液及び５０ｇの乾燥オートクレーブ処理ＣａＣＯ３を添加した。次に、５ｍｌの４００ｍＭ無菌濾過トレオニン原液を添加し、培地を１ｌとした。
【０１１５】
培養後、並行して培養した４種類の培養物の上清をＨＰＬＣによって分析し、グルタミン酸の含有量を測定した（検出限界：≧０．０１ｇ／ｌ）。
【０１１６】
基準株Ｃ．ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓを振盪フラスコ内で培養（３７℃、２００ｒｐｍ、４８時間）することにより、１．８（±０．６）ｇ／ｌのＬ−グルタミン酸が得られた。培地中のＬ−グルタミン酸の初期濃度は０．７８（±０．１）ｇ／ｌだった。
【０１１７】
実施例４：ＡＥＣスクリーニング
振盪フラスコを使用し、１０ｍｌのＢＨＩ（Ｂｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ）液体媒体（Ｍｅｒｃｋ社製）（Ｈ２Ｏ：３７ｇ／ｌ）内において、野生型株Ｃ．ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓ（ＤＳＭ  ４５３９２）を一晩培養した（３７℃、２００ｒｐｍ）。次に、１００μｌの培養物を、２５ｍＭ  Ｓ−２−アミノエチル−Ｌ−システイン（ＡＥＣ）（ＭＷ＝１６４ｇ／ｍｏｌ）を含む最少寒天培地に入れ、３７℃で３日間培養した。培地は、５ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｇのＫＨ２ＰＯ４、２ｇのＫ２ＨＰＯ４及び１０ｇのＭＯＰＳを７５０ｍｌのＨ２Ｏに溶解させて調製した。１Ｍ  ＫＯＨを使用して培地のｐＨを７．６に調節し、混合物に対してオートクレーブ処理を行った。残った成分を別々に滅菌濾過した。具体的には、２０ｍｌの５０％（ｗ／ｖ）グルコース、１ｍｌの１％（ｗ／ｖ）ＣａＣｌ２、１ｍｌの１Ｍ  ＭｇＳＯ４、１ｍｌの０．０２％ビオチン及び１ｍｌの微量元素溶液（１ｇのＦｅＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、１ｇのＭｎＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、０．１ｇのＺｎＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、０．０２１ｇのＣｕＳＯ４×５Ｈ２Ｏ、０．００２ｇのＮｉＣｌ２×６Ｈ２Ｏ（Ｈ２Ｏ  １００ｍｌに対しての量）を培地に添加し、無菌Ｈ２Ｏを使用して１０００ｍｌとした。１５ｇ／ｌ寒天（Ｍｅｒｃｋ社製）を培地に添加して固形培地プレート上で培養を行った。
【０１１８】
目視可能な各コロニーを、２５ｍＭ  ＡＥＣ及び１２．５ｍＭトレオニンを含む最少寒天培地に分画標本として入れ、３７℃で３日間培養した。次に、振盪フラスコを使用し、１０ｍｌのＢＨＩ（Ｂｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ）液体媒体（Ｍｅｒｃｋ社製）（Ｈ２Ｏ：３７ｇ／ｌ）内に単一クローンを播種し、一晩培養（３７℃、２００ｒｐｍ）した後、１０％グリセリンで処理し、参考サンプルとして−８０℃で保管した。
【０１１９】
ｌｙｓＣ配列領域の配列分析
単離した各クローンのｌｙｓＣ配列領域を分析するために、プライマー（ｌｙｓＣ＿ｆｏｒ：５  ｆＡＧＡＣＧＡＡＡＧＧＣＧＧＣＣＴＡＣＡＣ３  ｆ、ｌｙｓＣ＿ｒｅｖ：５  ｆＴＣＣＡＧＧＡＴＣＧＡＧＣＧＣＡＴＣＡＣ３  ｆ）及びＰＣＲ法を使用してｌｙｓＣの関連遺伝子領域を増幅した。ソフトウェア「Ｃｌｏｎｅ  Ｍａｎａｇｅｒ」を使用して、得られたＤＮＡ配列を分析した。単離したＡＥＣ＋トレオニン耐性Ｃ．ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓクローンのｌｙｓＣ配列を分析することにより、以下に示す点突然変異を特定した。
【０１２０】
【表２】
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【０１２１】
実施例５：Ｌ−リシンに関するアッセイ
基準株Ｃ．ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓ及びＡＥＣ＋トレオニンスクリーニングによって単離した各クローンを振盪フラスコ内で培養し、リシン合成に関するアッセイを実施した。具体的には、１０ｍｌのＢＨＩ（Ｂｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ）液体媒体（Ｍｅｒｃｋ社製）（Ｈ２Ｏ：３７ｇ／ｌ）内において、Ｃ．ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓ株及び単離した各ＡＥＣ＋トレオニン耐性Ｃ．ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓクローンを予備培養した（３７℃、２００ｒｐｍ、２４時間）。振盪フラスコ内の培地（１０ｍｌ）を０．２のＯＤ６６０で播種し、培養した（３７℃、２００ｒｐｍ、４８時間）。培地は、７．５ｇのコーンスティープリカー（５０％）、２０ｇのモルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２５ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１ｇのＫＨ２ＰＯ４、１ｇのＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、０．０１ｇのＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ、０．０１ｇのＦｅＳＯ４×７Ｈ２Ｏ及び０．００５ｇのＭｎＳＯ４×Ｈ２Ｏを７５０ｍｌのＨ２Ｏに溶解させて調製した。アンモニア水を使用して培地のｐＨを７．０に調節し、混合物に対してオートクレーブ処理を行った。次に、２５ｇの乾燥オートクレーブ処理したＣａＣＯ３を添加した。残った成分を別々に滅菌濾過した。９０ｍｌの５０％（ｗ／ｖ）グルコース及び１０ｍｌの３０ｍｇ／ｌビタミンＢ１及び２０ｍｇ／ｌビオチン溶液を培地に添加し、無菌Ｈ２Ｏを使用して１０００ｍｌとした。
【０１２２】
培養後、並行して培養した２種類の培養物の上清をＨＰＬＣによって分析し、Ｌ−リシンの含有量を測定した（検出限界：≧０．０１ｇ／ｌ）。リシン力価及び培養物の収率を表３に示す。
【０１２３】
【表３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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