(57)【要約】本発明は組換え核酸発現カセットおよびヘルパー依存型アデノウイルスを提供し、ここで、発現カセットは、ヘルパー依存型アデノウイルス用ウイルス産生細胞におけるヌクレアーゼの発現を制御するためのｍｉＲＮＡを利用したシステムを利用し、従って、産生を可能にするとともにＣＤ３４＋細胞におけるインビボでの遺伝子編集のための使用を可能にする。【選択図】なし
2017514476.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ＣＤ３４＋細胞ゲノム上の目的の標的内にＤＮＡ切断を生じさせることが可能なヌクレアーゼをコードする第１のコード領域；および
（ｉｉ）前記第１のコード領域の３’非翻訳領域内に位置し且つ前記第１のコード領域の翻訳終止コドンの少なくとも６０ヌクレオチド下流に位置する１つ以上のｍｉＲＮＡ標的部位をコードする第２のコード領域であって、前記１つ以上のコードされるｍｉＲＮＡ標的部位に結合するｍｉＲＮＡがウイルス産生細胞では高発現するがＣＤ３４＋細胞では発現しないか、または低レベルで発現する、第２のコード領域、
を含む少なくとも１つの第１の核酸モジュールを含む、組換え核酸発現カセットであって、
前記第１の核酸モジュールが、ＣＤ３４＋細胞において活性を有するプロモーターに機能可能に連結されている、組換え核酸発現カセット。
【請求項２】
ＣＤ４６結合性アデノウイルスファイバーポリペプチドをコードする第２の核酸モジュールをさらに含む、請求項１の組換え核酸発現カセット。
【請求項３】
組換え核酸ベクターの各末端に逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）をさらに含み、前記ＩＴＲはＣＤ４６結合性アデノウイルス血清型に由来する、請求項１または２の組換え核酸発現カセット。
【請求項４】
ＣＤ４６結合性アデノウイルス血清型由来のパッケージングシグナルをさらに含む、請求項１〜３の組換え核酸発現カセット。
【請求項５】
前記１つ以上のｍｉＲＮＡ標的部位は、（ａ）ＣＡＣＵＧＧＵＡＧＡ（配列番号１）（ｈａｓ−ｍｉＲ１８３−５ｐのコア）、（ｂ）ＵＧＵＧＣＵＵＧＡＵＣＵＡＡ（配列番号２）（ｈａｓ−ｍｉＲ２１８−５ｐのコア）、および（ｃ）ＣＡＣＵＡＧＣＡＣＡ（配列番号３）（ｍｉＲ９６−５ｐのコア）からなる群より選択される１種、２種、または３種全てのｍｉＲＮＡの逆相補配列を含む、請求項４のいずれかの組換え核酸発現カセット。
【請求項６】
前記１つ以上のｍｉＲＮＡ標的部位は、配列番号１〜９０からなる群より選択されるｍｉＲＮＡの逆相補配列を含む、請求項１〜５のいずれか１項の組換え核酸発現カセット。
【請求項７】
前記第２のコード領域は、少なくとも４つのｍｉＲＮＡ標的部位をコードする、請求項１〜６のいずれか１項の組換え核酸発現カセット。
【請求項８】
コードされるｍｉＲＮＡ標的部位の各々の間に１〜１０ヌクレオチドのスペーサー配列が存在する、請求項１〜７のいずれか１項の組換え核酸発現カセット。
【請求項９】
前記ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、およびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼからなる群より選択される、請求項１〜８のいずれか１項の組換え核酸発現カセット。
【請求項１０】
前記ヌクレアーゼは、配列番号９１〜９３および１０３からなる群より選択されるポリペプチドのアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項の組換え核酸発現カセット。
【請求項１１】
前記ヌクレアーゼは、ケモカインレセプター５（Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔｙｐｅ  ５）（ＣＣＲ５）、β−グロビン、補体レセプター２（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２）（ＣＲ２）（Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）受容体）、ニーマンピック病Ｃ１型レセプター（Ｎｉｅｍａｎｎ−Ｐｉｃｋ  ｄｉｓｅａｓｅ，  ｔｙｐｅ  Ｃ１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（ＮＰＣ１）（エボラ受容体）、アンジオテンシン変換酵素２型レセプター（ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（ＡＣＥ２）（ＳＡＲＳ受容体）をコードする遺伝子、およびミスフォールドした場合にリソソーム蓄積症を導く可能性のあるタンパク質をコードする遺伝子からなる群より選択されるＣＤ３４＋細胞ゲノム上の標的内にＤＮＡ切断を生じさせることができる、請求項１〜１０のいずれか１項の組換え核酸発現カセット。
【請求項１２】
前記プロモーターは、ＥＦ１αプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ）（ＰＧＫ）  １プロモーター、およびユビキチン遺伝子プロモーターからなる群より選択される、請求項１〜１１のいずれか１項の組換え核酸発現カセット。
【請求項１３】
前記第２の核酸モジュールは、ＣＤ４６に結合する１つ以上のヒトアデノウイルスノブドメインまたはその同等物を含むアデノウイルスファイバーポリペプチドをコードする、請求項２〜１２のいずれか１項の組換え核酸発現カセット。
【請求項１４】
前記ノブドメインは、Ａｄ１１ノブドメイン、Ａｄ１６ノブドメイン、Ａｄ２１ノブドメイン、Ａｄ３５ノブドメイン、Ａｄ５０ノブドメイン、およびそれらの機能的同等物からなる群より選択される、請求項１３の組換え核酸発現カセット。
【請求項１５】
前記ノブドメインは、配列番号９４〜１０１からなる群より選択される、請求項１３または１４の組換え核酸発現カセット。
【請求項１６】
前記第２の核酸モジュールは、１つ以上のヒトアデノウイルスシャフトドメインまたはその機能的同等物を含むアデノウイルスファイバーポリペプチドをコードする、請求項２〜１５のいずれか１項の組換え核酸発現カセット。
【請求項１７】
前記１つ以上のヒトアデノウイルスシャフトドメインは、１つ以上のＡｄ５シャフトドメイン、１つ以上のＡｄ１１シャフトドメイン、１つ以上のＡｄ１６シャフトドメイン、１つ以上のＡｄ２１シャフトドメイン、１つ以上のＡｄ３５シャフトドメイン、１つ以上のＡｄ５０シャフトドメイン、それらの組み合わせ、およびそれらの機能的同等物からなる群より選択される、請求項１６の組換え核酸発現カセット。
【請求項１８】
前記１つ以上のヒトアデノウイルスシャフトドメインは、配列番号１０５、１１８〜１３０、および１５２〜１５６からなる群より選択される、請求項１６または１７の組換え核酸発現カセット。
【請求項１９】
前記第２の核酸モジュールは、ヒトアデノウイルステイルドメインまたはその同等物を含むアデノウイルスファイバーポリペプチドをコードする、請求項２〜１８のいずれか１項の組換え核酸発現カセット。
【請求項２０】
前記ヒトアデノウイルステイルドメインは、Ａｄ１１テイルドメイン、Ａｄ１６テイルドメイン、Ａｄ２１テイルドメイン、Ａｄ３５テイルドメイン、Ａｄ５０テイルドメイン、およびそれらの機能的同等物からなる群より選択される、請求項１９の組換え核酸発現カセット。
【請求項２１】
前記ヒトアデノウイルステイルドメインは、配列番号１３１〜１３２からなる群より選択される、請求項２０の組換え核酸発現カセット。
【請求項２２】
前記ＩＴＲは、Ａｄ１１、Ａｄ１６、Ａｄ２１、Ａｄ３５、またはＡｄ５０に由来する、請求項３〜２１のいずれか１項の組換え核酸発現カセット。
【請求項２３】
前記ＩＴＲは、配列番号１３３〜１３７からなる群より選択されるポリヌクレオチドを含む、請求項３〜２２のいずれか１項の組換え核酸発現カセット。
【請求項２４】
前記パッケージングシグナルは、Ａｄ１１、Ａｄ１６、Ａｄ２１、Ａｄ３５、またはＡｄ５０のパッケージングシグナルを含む、請求項４〜２３のいずれか１項の組換え核酸発現カセット。
【請求項２５】
前記パッケージングシグナルは、配列番号１３８〜１４１からなる群より選択されるポリヌクレオチドを含む、請求項４〜２４のいずれか１項の組換え核酸発現カセット。
【請求項２６】
前記パッケージングシグナルが核酸切除シグナルに挟まれている、請求項４〜２５のいずれか１項の組換え核酸発現カセット。
【請求項２７】
前記カセットは、他のアデノウイルスタンパク質をコードしない、請求項１〜２６のいずれか１項の組換え核酸発現カセット。
【請求項２８】
ＣＤ３４＋細胞において活性を有する第２のプロモーターに機能可能に連結された導入遺伝子をさらに含む、請求項１〜２７のいずれか１項の組換え核酸発現カセット。
【請求項２９】
前記導入遺伝子に隣接する少なくとも第１の組換え部位および第２の組換え部位をさらに含み、前記第１の組換え部位および第２の組換え部位は、前記導入遺伝子のための所望の挿入部位に隣接するＣＤ３４＋細胞ゲノムＤＮＡ中の部位を標的とする、請求項２８の組換え核酸発現カセット。
【請求項３０】
前記導入遺伝子は、ＣＣＲ５、β−グロビン、補体レセプター２（ＣＲ２）（Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）受容体）、ニーマンピック病Ｃ１型レセプター（ＮＰＣ１）（エボラ受容体）、アンジオテンシン変換酵素２型レセプター（ＡＣＥ２）（ＳＡＲＳ受容体）、およびミスフォールドした場合にリソソーム蓄積症を導く可能性のあるタンパク質をコードする遺伝子からなる群より選択される、請求項２８または２９の組換え核酸発現カセット。
【請求項３１】
請求項１〜３０のいずれか１項の組換え核酸発現カセットを含む、組換え核酸ベクター。
【請求項３２】
前記カセットが少なくとも２８ｋｂの長さである、請求項１〜３０のいずれか１項の組換え核酸発現カセットまたは請求項３２の組換え核酸ベクター。
【請求項３３】
請求項１〜３２のいずれか１項の発現カセットまたは組換え核酸ベクターを含む、組換え宿主細胞。
【請求項３４】
前記宿主細胞は、前記カセットがコードする前記ｍｉＲＮＡ標的部位が結合する前記ｍｉＲＮＡを産生する、請求項３３の組換え宿主細胞。
【請求項３５】
ヘルパーアデノウイルスおよび／またはヘルパーアデノウイルスベクターをさらに含む、請求項３３〜３４のいずれか１項の組換え宿主細胞。
【請求項３６】
前記宿主細胞は、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞、ＨＥＫ２９３−Ｃｒｅ細胞、ＰｅｒＣ６細胞、およびＨＣＴ１１６細胞からなる群より選択される、請求項３３〜３５のいずれか１項の組換え宿主細胞。
【請求項３７】
請求項１〜３２のいずれか１項の発現カセットまたは組換え核酸ベクターを含む、組換えヘルパー依存型アデノウイルス。
【請求項３８】
請求項３７の組換えヘルパー依存型アデノウイルスを作製するための方法であって、前記ヘルパー依存型アデノウイルスの構築に十分な程度に前記発現カセット上および前記ヘルパーアデノウイルス上の遺伝子の発現を促進するのに好適な条件下で請求項３３〜３６のいずれか１項の組換え宿主細胞を培養することを含む、方法。
【請求項３９】
請求項３７の組換えヘルパー依存型Ａｄウイルスを用いた、造血細胞の遺伝子治療を必要とする対象の末梢血中に動員された造血細胞のインビボでの形質導入、を含む造血細胞の遺伝子治療のための方法であって、前記ヌクレアーゼは、破壊されるべき造血細胞ゲノム上の遺伝子を標的とし、前記造血細胞ゲノム上の遺伝子の破壊は前記対象に治療上の利点をもたらす、方法。
【請求項４０】
請求項３７の組換えヘルパー依存型Ａｄウイルスを用いた、造血細胞の遺伝子治療を必要とする対象の末梢血中に動員された造血細胞のインビボでの形質導入、を含む造血細胞の遺伝子治療のための方法であって、前記組換え核酸発現カセットは、ＣＤ３４＋細胞において活性を有するプロモーターに機能可能に連結された導入遺伝子を含み、前記導入遺伝子は少なくとも第１の組換え部位および第２の組換え部位に挟まれており、前記第１の組換え部位および第２の組換え部位は、前記導入遺伝子のための所望の挿入部位に隣接する造血細胞ゲノムＤＮＡ中の部位を標的とし、前記所望の挿入部位への前記導入遺伝子の挿入は前記対象に治療上の利点をもたらす、方法。
【請求項４１】
顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、プレリキサホル（ＡＭＤ３１００；ＣＸＣＲ阻害剤）、ＰＯＬ５５５１（ＣＸＣＲ４アンタゴニスト）、ＢＩＯ５１９２（ＶＬＡ−４の小分子阻害剤）、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される動員剤の組み合わせを前記対象に投与することによって造血細胞が末梢血中に動員される、請求項３９または４０の方法。
【請求項４２】
前記対象はヒトである、請求項３９〜４１のいずれか１項の方法。
【請求項４３】
前記対象は、β−サラセミア、ヒト免疫不全ウイルス感染症および／または後天性免疫不全症候群、エボラウイルス感染症、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス感染症、ならびに重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルス感染症からなる群より選択される疾患に罹患しているか、その発症のリスクがある、請求項３９〜４２のいずれか１項の方法。
【請求項４４】
前記組換えヘルパー依存型Ａｄウイルスは静脈内注射によって投与される、請求項３９〜４３のいずれか１項の方法。
【請求項４５】
配列番号１〜９０からなる群より選択される核酸配列の逆相補配列を含むｍｉＲＮＡ標的部位を２コピー以上含む、組換え核酸。
【請求項４６】
少なくとも４コピーの前記ｍｉＲＮＡ標的部位を含む、請求項４５の組換え核酸。
【請求項４７】
前記ｍｉＲＮＡ標的部位（複数）は全体として、少なくとも２種の異なるｍｉＲＮＡのための標的部位を含む、請求項４５または４６の組換え核酸。
【請求項４８】
コードされるｍｉＲＮＡ標的部位の各々の間に１〜１０ヌクレオチドのスペーサー配列が存在する、請求項４５〜４７のいずれか１項の組換え核酸。
【請求項４９】
前記２コピー以上のｍｉＲＮＡ標的部位の上流に位置する目的のタンパク質のコード領域をさらに含み、
前記２コピー以上のｍｉＲＮＡ標的部位は、前記コード領域の３’非翻訳領域内に位置し且つ前記コード領域の翻訳終止コドンの少なくとも６０ヌクレオチド下流に位置する、
請求項４５〜４８のいずれか１項の組換え核酸。
【請求項５０】
プロモーター配列に機能可能に連結された請求項４５〜４９のいずれか１項の組換え核酸を含む、核酸発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる２０１４年５月１日に出願された米国仮特許出願第６１／９８７，３４０号に対する優先権を主張する。
【０００２】
政府の権利に関する陳述
本発明は、米国国立衛生研究所（ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）が提供する助成金第Ｒ０１  ＨＬＡ０７８８３６号および第Ｒ２１  ＣＡ１９３０７７号の下で政府による支援を受けてなされたものである。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
造血幹細胞（ＨＳＣ）は、遺伝子治療の重要な標的である。現在のプロトコルは、ドナー／患者からのＨＳＣの採取、インビトロ培養、レトロウイルスベクターを用いた形質導入、および骨髄前処置がなされた患者への再移植を伴う。その技術的な複雑さに加えて、この手法の欠点としては、ＨＳＣの多能性およびそれらの生着の可能性に影響し得る複数のサイトカインの存在下での培養を必要とすることが挙げられる。さらに、非悪性疾患を有する患者における骨髄破壊的レジメンの必要性は、さらなるリスクをもたらす。
【０００４】
ＨＳＣの遺伝子治療における主要なタスクは、予め選択されたゲノム上の部位にＤＮＡ切断を標的化する人工的な部位特異的エンドヌクレアーゼ（ＥＮ）を用いたＨＳＣゲノムの部位特異的改変である。ＥＮは、遺伝子をノックアウトするため、フレームシフト変異を修正するため、または野生型のｃＤＮＡを本来の部位または本来とは異なる部位にノックインするために利用される。しかし、ゲノム中に部位特異的ＤＮＡ切断を生じさせるための現在のＥＮ遺伝子送達プラットフォームはいずれも、動員されたＨＳＣのインビボでの遺伝子操作には適切でない。
【発明の概要】
【０００５】
第一の態様では、本発明は、
（ｉ）ＣＤ３４＋細胞ゲノム上の目的の標的内にＤＮＡ切断を生じさせることが可能なヌクレアーゼをコードする第１のコード領域；および
（ｉｉ）第１のコード領域の３’非翻訳領域内に位置し且つ第１のコード領域の翻訳終止コドンの少なくとも６０ヌクレオチド下流に位置する１つ以上のｍｉＲＮＡ標的部位をコードする第２のコード領域であって、１つ以上のコードされるｍｉＲＮＡ標的部位に結合するｍｉＲＮＡがウイルス産生細胞では高発現するがＣＤ３４＋細胞では発現しないか、または低レベルで発現する、第２のコード領域、
を含む少なくとも１つの第１の核酸モジュールを含む、組換え核酸発現カセットであって、
第１の核酸モジュールが、ＣＤ３４＋細胞において活性を有するプロモーターに機能可能に連結されている、組換え核酸発現カセットを提供する。
【０００６】
一実施形態において、カセットは、ＣＤ４６結合性アデノウイルスファイバーポリペプチドをコードする第２の核酸モジュールをさらに含む。別の実施形態において、発現カセットは、組換え核酸ベクターの各末端に逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）をさらに含み、ここでＩＴＲはＣＤ４６結合性アデノウイルス血清型に由来する。さらなる実施形態において、発現カセットは、ＣＤ４６結合性アデノウイルス血清型由来のパッケージングシグナルをさらに含む。
【０００７】
一実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的部位は、（ａ）ＣＡＣＵＧＧＵＡＧＡ（配列番号１）（ｈａｓ−ｍｉＲ１８３−５ｐのコア）、（ｂ）ＵＧＵＧＣＵＵＧＡＵＣＵＡＡ（配列番号２）（ｈａｓ−ｍｉＲ２１８−５ｐのコア）、および（ｃ）ＣＡＣＵＡＧＣＡＣＡ（配列番号３）（ｍｉＲ９６−５ｐのコア）からなる群より選択される１種、２種、または３種全てのｍｉＲＮＡの逆相補配列を含む。別の実施形態において、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的部位は、配列番号１〜９０からなる群より選択されるｍｉＲＮＡの逆相補配列を含む。さらなる実施形態において、第２のコード領域は、少なくとも４つのｍｉＲＮＡ標的部位をコードする。別の実施形態において、コードされるｍｉＲＮＡ標的部位の各々の間に１〜１０ヌクレオチドのスペーサー配列が存在する。さらに別の実施形態において、ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、およびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼからなる群より選択され、これらには、限定されるものではないが配列番号９１〜９３からなる群より選択されるポリペプチドのアミノ酸配列を含むヌクレアーゼが包含される。別の実施形態において、ヌクレアーゼは、ケモカインレセプター５（Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔｙｐｅ  ５）（ＣＣＲ５）、β−グロビン、補体レセプター２（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２）（ＣＲ２）（Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）受容体）、ニーマンピック病Ｃ１型レセプター（Ｎｉｅｍａｎｎ−Ｐｉｃｋ  ｄｉｓｅａｓｅ，  ｔｙｐｅ  Ｃ１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（ＮＰＣ１）（エボラ受容体）、アンジオテンシン変換酵素２型レセプター（ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（ＡＣＥ２）（ＳＡＲＳ受容体）をコードする遺伝子、およびミスフォールドした場合にリソソーム蓄積症を導く可能性のあるタンパク質をコードする遺伝子からなる群より選択されるＣＤ３４＋細胞ゲノム上の標的内にＤＮＡ切断を生じさせることができる。一実施形態において、プロモーターは、ＥＦ１αプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ）（ＰＧＫ）  １プロモーター、およびユビキチン遺伝子プロモーターからなる群より選択される。
【０００８】
別の実施形態において、第２の核酸モジュールは、ＣＤ４６に結合する１つ以上のヒトアデノウイルスノブドメイン（ｈｕｍａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｋｎｏｂ  ｄｏｍａｉｎ）またはその同等物を含むアデノウイルスファイバーポリペプチドをコードする。さらなる実施形態において、ノブドメインは、Ａｄ１１ノブドメイン、Ａｄ１６ノブドメイン、Ａｄ２１ノブドメイン、Ａｄ３５ノブドメイン、Ａｄ５０ノブドメイン、およびそれらの機能的同等物からなる群より選択される。別の実施形態において、ノブドメインは、配列番号９４〜１０１からなる群より選択される。さらなる実施形態において、第２の核酸モジュールは、１つ以上のヒトアデノウイルスシャフトドメイン（ｈｕｍａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｓｈａｆｔ  ｄｏｍａｉｎ）またはその機能的同等物を含むアデノウイルスファイバーポリペプチドをコードする。一実施形態において、１つ以上のヒトアデノウイルスシャフトドメインは、１つ以上のＡｄ５シャフトドメイン、１つ以上のＡｄ１１シャフトドメイン、１つ以上のＡｄ１６シャフトドメイン、１つ以上のＡｄ２１シャフトドメイン、１つ以上のＡｄ３５シャフトドメイン、１つ以上のＡｄ５０シャフトドメイン、それらの組み合わせ、およびそれらの機能的同等物からなる群より選択される。別の実施形態において、１つ以上のヒトアデノウイルスシャフトドメインは、配列番号１１８〜１３０および１５２〜１５６からなる群より選択される。
【０００９】
さらなる実施形態において、第２の核酸モジュールは、ヒトアデノウイルステイルドメイン（ｈｕｍａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｔａｉｌ  ｄｏｍａｉｎ）またはその同等物を含むアデノウイルスファイバーポリペプチドをコードする。一実施形態において、ヒトアデノウイルステイルドメインは、Ａｄ１１テイルドメイン、Ａｄ１６テイルドメイン、Ａｄ２１テイルドメイン、Ａｄ３５テイルドメイン、Ａｄ５０テイルドメイン、およびそれらの機能的同等物からなる群より選択される。別の実施形態において、ヒトアデノウイルステイルドメインは、配列番号１３１〜１３２からなる群より選択される。さらなる実施形態において、ＩＴＲは、Ａｄ１１、Ａｄ１６、Ａｄ２１、Ａｄ３５、またはＡｄ５０に由来するものであり、これらには、限定されるものではないが配列番号１３３〜１３７からなる群より選択されるポリヌクレオチドが包含される。別の実施形態において、パッケージングシグナルは、Ａｄ１１、Ａｄ１６、Ａｄ２１、Ａｄ３５、またはＡｄ５０のパッケージングシグナルを含み、これらには、限定されるものではないが配列番号１３８〜１４１からなる群より選択されるポリヌクレオチドが包含される。さらなる一実施形態において、パッケージングシグナルは、核酸切除シグナル（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌｓ）に挟まれている。さらに別の実施形態において、カセットは、他のアデノウイルスタンパク質をコードしない。
【００１０】
別の実施形態において、発現カセットは、ＣＤ３４＋細胞において活性を有する第２のプロモーターに機能可能に連結された導入遺伝子をさらに含む。一実施形態において、カセットは、導入遺伝子に隣接する少なくとも第１の組換え部位および第２の組換え部位をさらに含み、ここで、第１の組換え部位および第２の組換え部位は、導入遺伝子のための所望の挿入部位に隣接するＣＤ３４＋細胞ゲノムＤＮＡ中の部位を標的とする。様々な非限定的実施形態において、導入遺伝子は、ＣＣＲ５、β−グロビン、補体レセプター２（ＣＲ２）（Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）受容体）、ニーマンピック病Ｃ１型レセプター（ＮＰＣ１）（エボラ受容体）、アンジオテンシン変換酵素２型レセプター（ＡＣＥ２）（ＳＡＲＳ受容体）、およびミスフォールドした場合にリソソーム蓄積症を導く可能性のあるタンパク質をコードする遺伝子からなる群より選択され得る。
【００１１】
別の態様では、本発明は、本発明の任意の実施形態または実施形態の組み合わせの組換え核酸発現カセットを含む組換え核酸ベクターを提供する。一実施形態において、発現カセットおよび／または組換え核酸ベクターは少なくとも２８ｋｂの長さである。
【００１２】
別の態様では、本発明は、本発明の任意の実施形態または実施形態の組み合わせの発現カセットまたは組換え核酸ベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。一実施形態において、宿主細胞は、カセットがコードするｍｉＲＮＡ標的部位が結合するｍｉＲＮＡを産生する。別の実施形態において、宿主細胞は、ヘルパーアデノウイルスおよび／またはヘルパーアデノウイルスベクターをさらに含む。様々な実施形態において、宿主細胞は、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞、ＨＥＫ２９３−Ｃｒｅ細胞、ＰｅｒＣ６細胞、およびＨＣＴ１１６細胞からなる群より選択される。
【００１３】
別の態様では、本発明は、本発明の任意の実施形態または実施形態の組み合わせの発現カセットまたは組換え核酸ベクターを含む組換えヘルパー依存型アデノウイルス、ならびに当該組換えヘルパー依存型アデノウイルスを作製するための方法を提供する。
【００１４】
さらなる態様では、本発明は、本発明の任意の実施形態または実施形態の組み合わせの組換えヘルパー依存型Ａｄウイルスを用いた、造血細胞の遺伝子治療を必要とする対象の末梢血中に動員された造血細胞のインビボでの形質導入、を含む造血細胞の遺伝子治療のための方法を提供し、ここで、ヌクレアーゼは、破壊されるべき造血細胞ゲノム上の遺伝子を標的とし、造血細胞ゲノム上の遺伝子の破壊は対象に治療上の利点をもたらす。
【００１５】
別の態様では、本発明は、本発明の任意の実施形態または実施形態の組み合わせの組換えヘルパー依存型Ａｄウイルスを用いた、造血細胞の遺伝子治療を必要とする対象の末梢血中に動員された造血細胞のインビボでの形質導入、を含む造血細胞の遺伝子治療のための方法を提供し、ここで、組換え核酸発現カセットは、ＣＤ３４＋細胞において活性を有するプロモーターに機能可能に連結された導入遺伝子を含み、導入遺伝子は少なくとも第１の組換え部位および第２の組換え部位に挟まれており、第１の組換え部位および第２の組換え部位は、導入遺伝子のための所望の挿入部位に隣接する造血細胞ゲノムＤＮＡ中の部位を標的とし、所望の挿入部位への導入遺伝子の挿入は対象に治療上の利点をもたらす。
【００１６】
本発明の治療法の一実施形態において、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、プレリキサホル（ＡＭＤ３１００；ＣＸＣＲ阻害剤）、ＰＯＬ５５５１（ＣＸＣＲ４（Ｃ−Ｘ−Ｃ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｐｅ  ４）アンタゴニスト）、ＢＩＯ５１９２（ＶＬＡ−４の小分子阻害剤）、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される動員剤（ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｇｅｎｔ）の組み合わせを対象に投与することによって、造血細胞が末梢血中に動員される。別の実施形態において、対象はヒトである。さらなる実施形態において、対象は、β−サラセミア、ヒト免疫不全ウイルス感染症および／または後天性免疫不全症候群、エボラウイルス感染症、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス感染症、ならびに重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルス感染症からなる群より選択される疾患に罹患しているか、その発症のリスクがある。さらに別の実施形態において、組換えヘルパー依存型Ａｄウイルスは、静脈内注射によって投与される。
【００１７】
さらなる態様では、本発明は、配列番号１〜９０からなる群より選択される核酸配列の逆相補配列を含むｍｉＲＮＡ標的部位を２コピー以上含む組換え核酸を提供する。一実施形態において、組換え核酸は、少なくとも４コピーのｍｉＲＮＡ標的部位を含む。別の実施形態において、ｍｉＲＮＡ標的部位は全体として、少なくとも２種の異なるｍｉＲＮＡのための標的部位を含む。さらなる実施形態において、コードされるｍｉＲＮＡ標的部位の各々の間に１〜１０ヌクレオチドのスペーサー配列が存在する。別の実施形態において、組換え核酸は、２コピー以上のｍｉＲＮＡ標的部位の上流に位置する、目的のタンパク質のコード領域をさらに含み、ここで、２コピー以上のｍｉＲＮＡ標的部位は、当該コード領域の３’非翻訳領域内に位置し且つ当該コード領域の翻訳終止コドンの少なくとも６０ヌクレオチド下流に位置する。さらに別の実施形態において、本発明は、プロモーター配列に機能可能に連結された本発明のこの態様の組換え核酸を含む核酸発現ベクターを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１ａ】２９３−Ｃｒｅ細胞対ＣＤ３４＋細胞におけるｍｉＲＮＡ発現プロファイリング。（ａ）ＣＤ３４＋細胞（Ｙ軸）および２９３−Ｃｒｅ細胞（Ｘ軸）のマイクロＲＮＡのｌｏｇ２強度の散布図。我々の選択基準（２９３−Ｃｒｅ細胞では発現レベルが高く、且つ、ＣＤ３４＋細胞では発現しない／低発現）を満たすｍｉＲＮＡがラベル付けされている。実施例に記載される通りに、Ａｄベクターを用いて２９３−Ｃｒｅ細胞およびＣＤ３４＋細胞（４人の異なるドナーからプールされたもの）を感染させた。感染から２４時間後に全ＲＮＡを単離して、２，０００超のｍｉＲＮＡプローブを含むアレイチップにハイブリダイズさせた。
【図１ｂ】２９３−Ｃｒｅ細胞対ＣＤ３４＋細胞におけるｍｉＲＮＡ発現プロファイリング。（ｂ）アレイによる調査に使用したものと同一のＲＮＡサンプルを用いた、選択されたｍｉＲＮＡについてのリアルタイムＰＣＲ解析によるアレイ結果の確認（上から下に：配列番号２、１４、７３、１５７、１５８、１５９）。Ｃｔ値を、四連の実験からの平均および標準偏差として示した。ポジティブコントロールとしてｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ａ−３ｐを選択した。これは、ｍｉＲＮＡアレイおよびｑＲＴ−ＰＣＲアッセイに基づけば、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ａ−３ｐが２９３細胞サンプルおよびＣＤ３４＋細胞サンプルの全てにおいて高レベルで発現していたためである。Ｃｔ値はＲＮＡ濃度と逆相関する。ｎ．ｄ．：不検出。
【図２−１】ｍｉＲＮＡにより制御される導入遺伝子の発現の解析。（ａ）ｍｉＲＮＡにより制御される発現を試験するために使用されたＡｄ５／３５ベクターの模式図。説明は本文中に記載される。グロビン遺伝子の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）にＧＦＰ遺伝子の３’末端が連結されている。ｍｉＲＮＡ標的部位を当該３’ＵＴＲ内に挿入した。従って、ＥＦ１ａプロモーターから転写されたＧＦＰのｍＲＮＡはｍｉＲＮＡ標的部位を含む。対照的に、ｍＣｈｅｒｒｙ（商標）の発現は、選択されたｍｉＲＮＡによって制御されない。
【図２−２】ｍｉＲＮＡにより制御される導入遺伝子の発現の解析。（ｂ）２９３−Ｃｒｅ細胞における導入遺伝子の発現。示されたＭＯＩにて細胞を、ｍｉＲＮＡ標的部位を有さないＡｄ５／３５ベクター（ｍｉＲなし）およびｍｉＲＮＡ標的部位を含むベクターを用いて感染させた。感染から４８時間後にフローサイトメトリーによって測定したｍＣｈｅｒｒｙ（商標）の蛍光強度で割ったＧＦＰの蛍光強度を示す。Ｎ＝３。不等分散を用いた対応のないｔ検定を使用してＰ値を算出した（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５  ｓｏｆｔｗａｒｅ）。「ｍｉＲなし」対「ｍｉＲ２１８−１８３」についてのｐ値は、２、５、１０、および２０ｐｆｕ／細胞のＭＯＩについて、それぞれ０．１２、０．００１２、０．０２、および０．００１６である。２種のプロモーター（ＰＧＫおよびＥＦ１ａ）は別々に制御され、異なる転写因子を必要とすることに留意されたい。ｍｉＲ標的部位を有さないベクターでは、ＭＯＩ（すなわち導入遺伝子のコピー数）が増加するにつれてＧＦＰレベルが、ｍＣｈｅｒｒｙ（商標）レベルよりも遥かに高い程度にまで増加する。（ｃ）感染から４８時間後の、形質導入されたＣＤ３４＋細胞のフローサイトメトリー。ＧＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙ（商標）のＭＦＩ比を示す。Ｎ＝３。第１世代ベクターを用いて、２９３細胞およびＣＤ３４＋細胞における形質導入の調査をおこなった。力価はプラーク形成単位（Ｐｆｕ）で示される。１ｐｆｕは、２０個のウイルス粒子（ｖｐ）に相当する。
【図３−１】ＨＤ−Ａｄ５／３５．ＺＦＮｍｉＲを用いた形質導入の調査。（ａ）ベクターのゲノム構造。自己切断ウイルス２Ａペプチドを介して２つのＺＦＮサブユニットが連結されている。ＺＦＮをコードする配列は、ｍｉＲ−１８３／２１８標的部位および３’ＵＴＲの上流にある。ＺＦＮサブユニットは両方とも、ＥＦ１ａプロモーターから転写される。ＣＤ３４＋細胞では、ｍＲＮＡは分解されず、ポリタンパク質が発現し、その後に、２Ａペプチドにおいて切断されて２つのＺＦＮサブユニットとなるであろう。
【図３−２】ＨＤ−Ａｄ５／３５．ＺＦＮｍｉＲを用いた形質導入の調査。（ｂおよびｄ）示されたＭＯＩでＨＤ−Ａｄ５／３５．ＺＦＮｍｉＲベクター（ＨＤ−ＺＦＮ）を用いた形質導入の後のＭＯ７ｅ細胞（ｂ）またはＣＤ３４＋細胞（ｄ）におけるＺＦＮタンパク質の発現。４８時間後に細胞を回収し、Ｆｏｋ１ドメインに対する抗体を用いたウェスタンブロットによって細胞溶解物を解析した。ローディングコントロールとしてアクチンＢを使用する。（ｃおよびｅ）Ｔ７Ｅ１ヌクレアーゼアッセイ。形質導入されたＭＯ７ｅ細胞（ｃ）またはＣＤ３４＋細胞（ｅ）に由来するゲノムＤＮＡを、変異を検出するＴ７Ｅ１ヌクレアーゼに基づいたＰＣＲアッセイに供した［１１］。ＰＣＲ産物をＰＡＧＥ電気泳動により分離した。破壊されたｃｃｒ５アレルに対応するバンドを矢印で示す。切断産物の予想サイズは１４１ｂｐおよび１２４ｂｐである。レーンの下の数字は、破壊されたｃｃｒ５アレルの％を示す。ドナーＡ由来のＣＤ３４＋細胞を用いて調査を実施した。
【図３−３】ＨＤ−Ａｄ５／３５．ＺＦＮｍｉＲを用いた形質導入の調査。（ｂおよびｄ）示されたＭＯＩでＨＤ−Ａｄ５／３５．ＺＦＮｍｉＲベクター（ＨＤ−ＺＦＮ）を用いた形質導入の後のＭＯ７ｅ細胞（ｂ）またはＣＤ３４＋細胞（ｄ）におけるＺＦＮタンパク質の発現。４８時間後に細胞を回収し、Ｆｏｋ１ドメインに対する抗体を用いたウェスタンブロットによって細胞溶解物を解析した。ローディングコントロールとしてアクチンＢを使用する。（ｃおよびｅ）Ｔ７Ｅ１ヌクレアーゼアッセイ。形質導入されたＭＯ７ｅ細胞（ｃ）またはＣＤ３４＋細胞（ｅ）に由来するゲノムＤＮＡを、変異を検出するＴ７Ｅ１ヌクレアーゼに基づいたＰＣＲアッセイに供した［１１］。ＰＣＲ産物をＰＡＧＥ電気泳動により分離した。破壊されたｃｃｒ５アレルに対応するバンドを矢印で示す。切断産物の予想サイズは１４１ｂｐおよび１２４ｂｐである。レーンの下の数字は、破壊されたｃｃｒ５アレルの％を示す。ドナーＡ由来のＣＤ３４＋細胞を用いて調査を実施した。
【図４ａ】ＨＤ−ＺＦＮによる形質導入に付随するＣＤ３４＋細胞毒性の解析。ドナーＡ由来のＣＤ３４＋細胞（ａ）およびドナーＢ由来のＣＤ３４＋細胞（ｂ）を用いて調査を実施した。示されたＭＯＩでｂ−グロビンＬＣＲを含むＨＤ−Ａｄ５／３５コントロールベクター（ＨＤ−ｂＧｌｏｂ）またはＨＤ−ＺＦＮベクターを用いた形質導入後４日目におけるアネキシンＶ陽性細胞の割合を示す。アネキシンＶおよび７ＡＡＤの発現をフローサイトメトリーによって解析した。Ｎ＝３。
【図４ｂ】ＨＤ−ＺＦＮによる形質導入に付随するＣＤ３４＋細胞毒性の解析。ドナーＡ由来のＣＤ３４＋細胞（ａ）およびドナーＢ由来のＣＤ３４＋細胞（ｂ）を用いて調査を実施した。示されたＭＯＩでｂ−グロビンＬＣＲを含むＨＤ−Ａｄ５／３５コントロールベクター（ＨＤ−ｂＧｌｏｂ）またはＨＤ−ＺＦＮベクターを用いた形質導入後４日目におけるアネキシンＶ陽性細胞の割合を示す。アネキシンＶおよび７ＡＡＤの発現をフローサイトメトリーによって解析した。Ｎ＝３。
【図４ｃ】ＨＤ−ＺＦＮによる形質導入に付随するＣＤ３４＋細胞毒性の解析。（ｃ）ＣＣＲ５  ＺＦＮを発現する、第１世代（ＦＧ−ＺＦＮ）Ａｄ５／３５ベクターおよびヘルパー依存型（ＨＤ−ＺＦＮ）Ａｄ５／３５ベクターを用いたＣＤ３４＋細胞の感染の後の細胞毒性。ドナーＢ由来のＣＤ３４＋細胞を使用した。Ｎ＝３。ＨＤ−ＺＦＮ対ＦＧ−ＺＦＮ（ＭＯＩ  １０００）：ｐ＝１．５１×１０−６、ＨＤ−ＺＦＮ対ＦＧ−ＺＦＮ（ＭＯＩ  １０，０００）：ｐ＝２．８３×１０−８。
【図５ａ】ＬＴＣ−ＩＣの解析。示されたＭＯＩにてＨＤ−ｂＧｌｏｂおよびＨＤ−ＺＦＮを用いてＣＤ３４＋細胞を形質導入した。３日後、細胞をＬＴＣ−ＩＣ培地に移し、５週間培養した。次に、合計で３，０００個のＬＴＣ−ＩＣ細胞を、増殖因子およびサイトカインを添加したメチルセルロースに播種した。２週間後にコロニーを計数した。プレートごとに全コロニー由来の細胞を混ぜ合わせ、ゲノムＤＮＡを単離してＴ７Ｅ１ヌクレアーゼアッセイに供した。（ａおよびｂ）ドナーＡおよびドナーＢそれぞれについてのプレートごとのコロニー数。異なる群においてＢＦＵ−ＥおよびＣＦＵ−ＧＭのコロニーの比に差はなかった。Ｎ＝３プレート。ｎ．ｓ．：非有意（ｐ＞０．０５）、＊＊：ｐ＜０．０５。
【図５ｂ】ＬＴＣ−ＩＣの解析。示されたＭＯＩにてＨＤ−ｂＧｌｏｂおよびＨＤ−ＺＦＮを用いてＣＤ３４＋細胞を形質導入した。３日後、細胞をＬＴＣ−ＩＣ培地に移し、５週間培養した。次に、合計で３，０００個のＬＴＣ−ＩＣ細胞を、増殖因子およびサイトカインを添加したメチルセルロースに播種した。２週間後にコロニーを計数した。プレートごとに全コロニー由来の細胞を混ぜ合わせ、ゲノムＤＮＡを単離してＴ７Ｅ１ヌクレアーゼアッセイに供した。（ａおよびｂ）ドナーＡおよびドナーＢそれぞれについてのプレートごとのコロニー数。異なる群においてＢＦＵ−ＥおよびＣＦＵ−ＧＭのコロニーの比に差はなかった。Ｎ＝３プレート。ｎ．ｓ．：非有意（ｐ＞０．０５）、＊＊：ｐ＜０．０５。
【図５ｃ】ＬＴＣ−ＩＣの解析。示されたＭＯＩにてＨＤ−ｂＧｌｏｂおよびＨＤ−ＺＦＮを用いてＣＤ３４＋細胞を形質導入した。３日後、細胞をＬＴＣ−ＩＣ培地に移し、５週間培養した。次に、合計で３，０００個のＬＴＣ−ＩＣ細胞を、増殖因子およびサイトカインを添加したメチルセルロースに播種した。２週間後にコロニーを計数した。プレートごとに全コロニー由来の細胞を混ぜ合わせ、ゲノムＤＮＡを単離してＴ７Ｅ１ヌクレアーゼアッセイに供した。（ｃ）ＦＧ−ＺＦＮおよびＨＤ−ＺＦＮを用いて形質導入されたドナーＢの細胞に由来するＣＦＵの数。
【図５ｄ】ＬＴＣ−ＩＣの解析。示されたＭＯＩにてＨＤ−ｂＧｌｏｂおよびＨＤ−ＺＦＮを用いてＣＤ３４＋細胞を形質導入した。３日後、細胞をＬＴＣ−ＩＣ培地に移し、５週間培養した。次に、合計で３，０００個のＬＴＣ−ＩＣ細胞を、増殖因子およびサイトカインを添加したメチルセルロースに播種した。２週間後にコロニーを計数した。プレートごとに全コロニー由来の細胞を混ぜ合わせ、ゲノムＤＮＡを単離してＴ７Ｅ１ヌクレアーゼアッセイに供した。（ｄ）Ｔ７Ｅ１ヌクレアーゼアッセイ。ドナーＡ由来のＣＤ３４＋細胞を、５０００ｖｐ／細胞のＭＯＩでＨＤ−ｂＧｌｏｂおよびＨＤ−ＺＦＮを用いた形質導入に使用した。コロニーからゲノムＤＮＡを単離してＴ７Ｅ１アッセイに供した。ＣＦＵ／ＬＴＣ−ＩＣサンプルの代表的なＴ７Ｅ１ヌクレアーゼアッセイを示す。
【図６ａ】ＮＯＤ／ＳＣＩＤ再増殖細胞におけるｃｃｒ５遺伝子のノックアウト。（ａ）調査の設計。低温保存されたドナーＡ由来のＣＤ３４＋細胞を、低サイトカイン濃度条件下で一晩培養し、５，０００ｖｐ／細胞のＭＯＩにて２４時間、ＨＤ−ｂＧｌｏｂまたはＨＤ−ＺＦＮを用いて形質導入した。次に、細胞を洗浄し、亜致死線量を照射したＮＯＧマウスに移植した。６週間後、動物を安楽死させ、骨髄細胞、脾細胞およびＰＢＭＣを回収した。回収した細胞におけるヒト細胞の割合を、汎白血球（ｐａｎ−ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）マーカーであるＣＤ４５についてのフローサイトメトリーによって測定した。抗ヒトＣＤ４５抗体と結合させたビーズを使用した磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）によりヒトドナー細胞を精製した。ＣＤ４５＋細胞をＴ７Ｅ１ヌクレアーゼアッセイに使用した。
【図６ｂ】ＮＯＤ／ＳＣＩＤ再増殖細胞におけるｃｃｒ５遺伝子のノックアウト。（ｂ）骨髄、脾臓、およびＰＢＭＣに由来する全細胞におけるヒトＣＤ４５＋細胞の割合に基づいた生着率。Ｎ＝３。
【図６ｃ】ＮＯＤ／ＳＣＩＤ再増殖細胞におけるｃｃｒ５遺伝子のノックアウト。（ｃ）ＭＡＣＳで単離した、移植を受けたマウスの骨髄中のヒトＣＤ３４＋細胞に由来するコロニーの数。Ｎ＝３。「Ａｄなし」と「ＨＤ−ＺＦＮ」との間の差は有意ではない（ｐ＝０．０６１）。
【図６ｄ】ＮＯＤ／ＳＣＩＤ再増殖細胞におけるｃｃｒ５遺伝子のノックアウト。（ｄ）移植を受けたマウスの骨髄に由来するヒトＣＤ４５＋細胞におけるｃｃｒ５遺伝子の破壊の解析。
【図７ａ】グロビンＬＣＲ特異的ＴＡＬＥＮを発現するＨＤ−Ａｄ５／３５ベクターの構造および機能解析。（ａ）ＴＡＬＥＮの標的部位。ＤＮアーゼ過感受性部位ＨＳ１〜ＨＳ５を有するグロビンＬＣＲの構造を示す。下のパネルは、水平方向の矢印でラベル付けされたＨＳ２標的部位の５’配列を示す（配列番号１６０および１６１）。配列の上および下の線はそれぞれ、２つのＴＡＬＥＮサブユニットの結合部位を示す。垂直方向の太線矢印は、ＴＡＬＥＮの切断部位を示す。
【図７ｂ】グロビンＬＣＲ特異的ＴＡＬＥＮを発現するＨＤ−Ａｄ５／３５ベクターの構造および機能解析。（ｂ）ＨＤ−Ａｄ５／３５．ＴＡＬＥＮｍｉＲ（ＨＤ−ＴＡＬＥＮ）のゲノムの構造。ＺＦＮベクターと同様に、ｍｉＲ１８３／２１８標的配列を含む３’ＵＴＲに３’末端で２Ａペプチドを介して２つのＴＡＬＥＮサブユニットを連結した。ＴＡＬＥＮ（１）のＮ末端は、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグを含んだ。
【図７ｃ】グロビンＬＣＲ特異的ＴＡＬＥＮを発現するＨＤ−Ａｄ５／３５ベクターの構造および機能解析。（ｃ）ＭＯ７ｅ細胞におけるＴＡＬＥＮの発現。１０００ｖｐ／細胞のＭＯＩにて細胞を感染させ、ＨＡタグに特異的な抗体を用いたウェスタンブロットによって細胞溶解物を解析した。
【図７ｄ】グロビンＬＣＲ特異的ＴＡＬＥＮを発現するＨＤ−Ａｄ５／３５ベクターの構造および機能解析。（ｄ）Ｔ７Ｅ１ヌクレアーゼアッセイ解析。１０３、２×１０３ｖｐ／細胞のＭＯＩでの感染から４８時間後にＭＯ７ｅ細胞からゲノムＤＮＡを単離し、グロビンＬＣＲ  Ｈ２に特異的なプライマーを用いたＰＣＲに供した。ＰＣＲ産物の予想される長さは、６０８、４３４、１７４ｂｐである。
【図８】非限定的および例示的な造血幹細胞動員および処置のスケジュールのフローチャート。
【図９Ａ】長いファイバーシャフトまたは短いファイバーシャフトを含むＡｄ５／３５ベクターを用いたインビトロでの形質導入の調査。Ａｄ５／３５ＳおよびＡｄ５／３５Ｌは、ＣＭＶ−ルシフェラーゼカセットを含む。（Ａ）ＨＳＰＧを発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞（左側のパネル）またはＨＳＰＧ発現を欠くＣＨＯ−Ｅ６０６細胞（９９）（右側のパネル）を形質導入するために第Ｘ因子を使用する能力。第Ｘ因子による形質導入の亢進には、長いファイバーシャフトおよびＨＳＰＧが必要である。使用されたＭＯＩは５０ｐｆｕ／細胞であった。ＦＸ濃度は７．５μｇ／ｍｌであった。Ｎ＝３。
【図９Ｂ】長いファイバーシャフトまたは短いファイバーシャフトを含むＡｄ５／３５ベクターを用いたインビトロでの形質導入の調査。Ａｄ５／３５ＳおよびＡｄ５／３５Ｌは、ＣＭＶ−ルシフェラーゼカセットを含む。（Ｂ）種々のＭＯＩにおけるヒトＣＤ３４＋細胞の形質導入。Ｎ＝３。
【図１０Ａ】動員後のＨＳＣのＡｄ５／３５＋＋によるインビボでの形質導入。（Ａ）ヒト組換えＧ−ＣＳＦを皮下注射（５μｇ／マウス／日、４日間）した後、最後のＧ−ＣＳＦ注射から１８時間後にＡＭＤ３１００を皮下注射（５ｍｇ／ｋｇ）することによって、ｈｕＣＤ４６ｔｇマウスにおいてＨＳＣを動員した。合計で２×１０９ｐｆｕのＡｄ５／３５＋＋ＧＦＰを、ＡＭＤ−３１００から１時間後に静脈内注射した。
【図１０Ｂ】動員後のＨＳＣのＡｄ５／３５＋＋によるインビボでの形質導入。（Ｂ）Ａｄの注射から６時間後および７２時間後にＰＢＭＣを回収し、それらを２日間培養して導入遺伝子を発現させることによって、形質導入を解析した。末梢血におけるＧＦＰ陽性ＬＳＫ細胞の割合を示す。Ｎ＝５。
【図１０Ｃ】動員後のＨＳＣのＡｄ５／３５＋＋によるインビボでの形質導入。（Ｃ）Ａｄの注射後３日目、７日目および１４日目に骨髄および脾臓を回収することによって、動員された動物および動員されていない動物において形質導入を解析した。骨髄および脾臓におけるＧＦＰ陽性ＬＳＫ細胞の割合を示す。Ｎ＝５。ＬＳＫ細胞のインビボでの形質導入は、動員が無い場合には非効率的であった。注目すべきことに、Ａｄ５／３５ベクターの静脈内注射は、マウスおよびヒト以外の霊長類において肝毒性を引き起こさない。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
引用される参照文献は全て、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本出願においては、特に明記されない限り、利用される技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８５，Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ編集，１９９１．  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｍ．Ｐ．Ｄｅｕｔｓｈｃｅｒ，ｅｄ．，（１９９０）  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）中の「Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ，ｅｔ  ａｌ．１９９０．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ．１９８７．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（ｐｐ．１０９−１２８，ｅｄ．Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ、Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、およびｔｈｅ  Ａｍｂｉｏｎ  １９９８  Ｃａｔａｌｏｇ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）などのいくつかの周知の参照文献のいずれかに見出される可能性がある。
【００２０】
本明細書において使用される場合、文脈上、特に断りのない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、複数の指示対象を包含する。本明細書において使用される場合、「および」は、別段の記載がない限り、「または」と交換可能に使用される。
【００２１】
本明細書において使用される場合、アミノ酸残基は以下のように省略される：アラニン（Ａｌａ；Ａ）、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）、グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）、グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ；Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）、およびバリン（Ｖａｌ；Ｖ）。
【００２２】
本発明の任意の態様の実施形態は全て、文脈上、特に断りのない限り、組み合わせて使用できる。
【００２３】
文脈上、そうではないことが特に必要とされない限り、明細書および特許請求の範囲の全体にわたって、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等の単語は、排他的または網羅的な意味ではなく包括的な意味で、すなわち「限定されるものではないが、・・・を包含する」という意味で、解釈されるべきである。また、単数または複数を用いた単語も、それぞれ複数および単数を包含する。さらに、「本明細書に」、「上記」、および「以下」なる単語ならびに類似の意味の単語は、本出願において使用される場合、本出願全体を指すものとし、本出願のいかなる特定の部分も指すことはない。
【００２４】
本開示の実施形態の説明は、網羅的であること、または開示される形態と正確に一致する形態に本開示を限定することを意図しない。本開示の特定の実施形態および例は、説明を目的として本明細書に記載されるが、当業者であれば理解するように、本開示の範囲内において様々な同等の改変が可能である。
【００２５】
第一の態様では、本発明は、
（ｉ）ＣＤ３４＋細胞ゲノム上の目的の標的内にＤＮＡ切断を生じさせることが可能なヌクレアーゼをコードする第１のコード領域；および
（ｉｉ）第１のコード領域の３’非翻訳領域内に位置し且つ第１のコード領域の翻訳終止コドンの少なくとも６０ヌクレオチド下流に位置する１つ以上のｍｉＲＮＡ標的部位をコードする第２のコード領域であって、１つ以上のコードされるｍｉＲＮＡ標的部位に結合するｍｉＲＮＡがウイルス産生細胞では高発現するがＣＤ３４＋細胞では発現しないか、または低レベルで発現する、第２のコード領域、
を含む（ａ）少なくとも１つの第１の核酸モジュールを含む、組換え核酸発現カセットであって、
第１の核酸モジュールが、ＣＤ３４＋細胞において活性を有するプロモーターに機能可能に連結されている、組換え核酸発現カセットを提供する。
【００２６】
以下の実施例に示されるように、本発明の発現カセットを、本発明のヘルパー依存型アデノウイルスのゲノムを作製するために使用でき、次にそれを、大幅に改善された、造血細胞などのＣＤ３４＋細胞におけるインビボでの遺伝子操作の方法に使用できる。例えば、ヘルパー依存型Ａｄウイルスの産生に必要な他の構成要素を含むベクター（プラスミドなど）へのクローニングにカセットを使用できる。
【００２７】
一実施形態において、カセットまたはそれに由来するベクターは、ＣＤ４６結合性アデノウイルスファイバーポリペプチドをコードする第２の核酸モジュールをさらに含む。さらなる実施形態において、カセットまたはそれに由来するベクターは、組換え核酸ベクターの各末端に逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）をさらに含み、ここでＩＴＲはＣＤ４６結合性アデノウイルス血清型に由来する。さらなる実施形態において、カセットまたはそれに由来するベクターは、ＣＤ４６結合性アデノウイルス血清型由来のパッケージングシグナルをさらに含む。
【００２８】
本発明のアデノウイルス（Ａｄ）のゲノムは、いくつかのヌクレアーゼ発現カセットおよび相同性ドナーテンプレート（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｄｏｎｏｒ  ｔｅｍｐｌａｔｅ）を含め、大きなペイロードを収容できる大きな収容能力（約３０ｋｂ）を有し、ＣＤ３４＋細胞のインビボでの形質導入に使用できる。産生細胞におけるＡｄの増幅中に、抑制されなければ大量のヌクレアーゼが産生されるであろう。Ａｄ産生細胞においては、高レベルのヌクレアーゼの発現はあまり許容されず、これは、ベクターのレスキューを妨げるか、または組換わったベクターゲノムおよびＥＮ発現カセットの欠失を選抜してしまう。
【００２９】
ヘルパー依存型アデノウイルスの産生は、ＨＤ−アデノウイルス産生細胞においてヌクレアーゼの発現を抑制することによって大幅に亢進され、これは、本発明においては、産生細胞対ＣＤ３４＋細胞のｍｉＲＮＡ発現プロファイリングに基づいた遺伝子発現の制御のためのｍｉＲＮＡを利用したシステムによって達成される。具体的には、ウイルス産生細胞では高発現するがＣＤ３４＋細胞では発現しないか、または低レベルで発現するｍｉＲＮＡのための標的部位が、ヌクレアーゼのｍＲＮＡに連結された融合物としてカセットから転写される。ＨＤ−産生細胞において発現すると、当該ｍｉＲＮＡがｍＲＮＡの標的部位に結合してヌクレアーゼのｍＲＮＡと標的部位の混成物の分解を導き、従って、産生細胞におけるヌクレアーゼの発現を低下させるか、排除し、ベクターのゲノム再編成を伴うことなく本発明の組換えＨＤ−アデノウイルスの産生を（ヘルパーＡｄウイルスと共同して）大幅に促進する。ＣＤ３４＋細胞は、ｍｉＲＮＡ標的部位への結合が可能なｍｉＲＮＡを全く、または遥かに少ない量しか有さないため、ヌクレアーゼタンパク質の発現が起こり、効果的な遺伝子編集が可能となる。
【００３０】
本明細書において使用される場合、「産生細胞」は、高力価のアデノウイルスの産生に使用できる任意の細胞型である。適切な産生細胞の決定は、当技術分野の通常の知識レベルの範囲内である。一実施形態において、産生細胞は、ヘルパー依存型アデノウイルスの産生に好適である。本発明における使用のための産生細胞の非限定的な例としては、限定されるものではないが、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞、ＨＥＫ２９３−Ｃｒｅ細胞、ＰｅｒＣ６細胞、ＨＣＴ１１６細胞等が挙げられる。一実施形態において、産生細胞は、ＨＥＫ２９３細胞またはＨＥＫ２９３−Ｃｒｅ細胞である。
【００３１】
本明細書において使用される場合、ＣＤ３４＋細胞は、細胞表面タンパク質としてＣＤ３４タンパク質を発現する細胞である。例示的なＣＤ３４＋細胞は、造血前駆細胞（造血幹細胞（ＨＳＣ）など）および他系統の前駆／成体幹細胞（すなわち、間葉系幹細胞、内皮前駆細胞、マスト細胞、樹状細胞等）である。一実施形態において、ＣＤ３４＋細胞は、ＨＳＣなどの造血前駆細胞である。
【００３２】
本明細書において使用される場合、リアルタイムｑＲＴ−ＰＣＴのＣｔ値が３５未満であれば、ｍｉＲＮＡは産生細胞において「高発現」する。リアルタイムｑＲＴ−ＰＣＴのＣｔ値が３９超であれば、ｍｉＲＮＡは低レベルで発現する。当業者には理解されるように、リアルタイムＰＣＲアッセイにおいては、陽性の反応は、蛍光シグナルの蓄積によって検出される。Ｃｔ（サイクル閾値）は、蛍光シグナルが閾値を越える（すなわち、バックグラウンドレベルを上回る）のに必要なサイクル数と定義される。Ｃｔレベルは、サンプル中の標的核酸の量に反比例する（すなわち、Ｃｔレベルが低いほど、サンプル中の標的核酸の量は多くなる）。３９以上のＣｔは、感染状態または周囲からの混入を表す可能性がある最小量の標的核酸を意味する弱い反応である。
【００３３】
目的の産生細胞において高発現し、目的のＣＤ３４＋細胞において発現しないか、低レベルで発現するｍｉＲＮＡを同定するために、限定されるものではないが以下の実施例に記載される方法を含め、任意の好適な手法を用いることができる。
【００３４】
ＨＥＫ２９３細胞およびＨＥＫ２９３−Ｃｒｅ細胞において高発現し、ＣＤ３４＋造血細胞において発現しない例示的なｍｉＲＮＡとしては、限定されるものではないが、
（ａ）ＣＡＣＵＧＧＵＡＧＡ（配列番号１）（ｈａｓ−ｍｉＲ１８３−５ｐのコア）、
（ｂ）ＵＧＵＧＣＵＵＧＡＵＣＵＡＡ（配列番号２）（ｈａｓ−ｍｉＲ２１８−５ｐのコア）、および
（ｃ）ＣＡＣＵＡＧＣＡＣＡ（配列番号３）（ｍｉＲ９６−５ｐのコア）、
を含むＲＮＡ配列が挙げられる。
【００３５】
以下の実施例に示されるように、これらのｍｉＲＮＡのうちの１種以上を含むｍｉＲＮＡのための標的部位をコードする発現カセットは、産生細胞におけるヌクレアーゼの発現の抑制に有効である。当業者には理解されるように、このような標的部位は、標的化されるｍｉＲＮＡの逆相補配列を含む。非限定的な例では：
・標的化されるｍｉＲＮＡは５’ＣＡＣＵＧＧＵＡＧＡ  ３’（配列番号１）（ｈａｓ−ｍｉＲ−１８３−５ｐのコア）であり、逆相補配列の標的部位は５’ＵＣＵＡＣＣＡＧＵＧ  ３’（配列番号４）を含む／からなる；
・標的化されるｍｉＲＮＡは５’ＣＡＣＵＡＧＣＡＣＡ  ３’（配列番号３）（ｍｉＲ−９６−５ｐのコア）であり、逆相補配列の標的部位は５’ＵＧＵＧＣＵＡＧＵＧ  ３’（配列番号５）を含む／からなる；
・標的化されるｍｉＲＮＡは５’ＵＧＵＧＣＵＵＧＡＵＣＵＡＡ  ３’（配列番号２）（ｈａｓ−ｍｉＲ−２１８−５ｐのコア）であり、逆相補配列の標的部位は５’ＵＵＡＧＡＵＣＡＡＧＣＡＣＡ  ３’（配列番号６）を含む／からなる；
・標的化されるｍｉＲＮＡは５’ＵＡＵＧＧＣＡＣＵＧＧＵＡＧＡＡＵＵＣＡＣＵ  ３’（配列番号１４）（ｈａｓ−ｍｉＲ−１８３−５ｐ）であり、逆相補配列の標的部位は５’ＡＧＵＧＡＡＵＵＣＵＡＣＣＡＧＵＧＣＣＡＵＡ  ３’（配列番号７）を含む／からなる；
・標的化されるｍｉＲＮＡは５’ＵＵＵＧＧＣＡＣＵＡＧＣＡＣＡＵＵＵＵＵＧＣＵ  ３’（配列番号７３）（ｍｉＲ−９６−５ｐ）であり、逆相補配列の標的部位は５’ＡＧＣＡＡＡＡＡＵＧＵＧＣＵＡＧＵＧＣＣＡＡＡ  ３’（配列番号８）を含む／からなる；
・標的化されるｍｉＲＮＡは５’ＵＵＧＵＧＣＵＵＧＡＵＣＵＡＡＣＣＡＵＧＵ  ３’（配列番号４８）（ｈａｓ−ｍｉＲ−２１８−５ｐ）であり、逆相補配列の標的部位は５’ＡＧＡＵＧＧＵＵＡＧＡＵＣＡＡＧＣＡＣＡＡ  ３’（配列番号９）を含む／からなる。
【００３６】
当業者には理解されるように、ｍｉＲＮＡは産生細胞において、それぞれが上記のコア配列を含む様々なプロセシングバージョンで存在する可能性がある。従って、さらなる様々な実施形態において、標的部位は、以下（全て５’から３’の方向である）のうちの１種以上の逆相補配列、またはそれらの組み合わせ、を含むか、からなる：
ｍｉＲ−ｈｓａ−１８３−５ｐのプロセシング：
ＵＧＵＡＵＧＧＣＡＣＵＧＧＵＡＧＡＡＵＵ（配列番号１０）
ＵＧＵＡＵＧＧＣＡＣＵＧＧＵＡＧＡＡＵＵＣＡ（配列番号１１）
ＵＧＵＡＵＧＧＣＡＣＵＧＧＵＡＧＡＡＵＵＣＡＣＵ（配列番号１２）
ＧＵＡＵＧＧＣＡＣＵＧＧＵＡＧＡＡＵＵＣＡＣＵ（配列番号１３）
ＵＡＵＧＧＣＡＣＵＧＧＵＡＧＡＡＵＵＣＡＣＵ（配列番号１４）
ＵＡＵＧＧＣＡＣＵＧＧＵＡＧＡＡＵＵＣＡＣＵＧ（配列番号１５）
ＵＡＵＧＧＣＡＣＵＧＧＵＡＧＡＡＵＵＣＡ（配列番号１６）
ＵＡＵＧＧＣＡＣＵＧＧＵＡＧＡＡＵＵＣＡＣ（配列番号１７）
ＵＡＵＧＧＣＡＣＵＧＧＵＡＧＡＡＵＵＣ（配列番号１８）
ＵＡＵＧＧＣＡＣＵＧＧＵＡＧＡＡＵＵＣＡＣＵＧＵ（配列番号１９）
ＵＡＵＧＧＣＡＣＵＧＧＵＡＧＡＡＵＵ（配列番号２０）
ＵＡＵＧＧＣＡＣＵＧＧＵＡＧＡＡＵ（配列番号２１）
ＵＡＵＧＧＣＡＣＵＧＧＵＡＧＡＡ（配列番号２２）
ＵＡＵＧＧＣＡＣＵＧＧＵＡＧＡ（配列番号２３）
ＡＵＧＧＣＡＣＵＧＧＵＡＧＡＡＵＵＣＡＣＵ（配列番号２４）
ＡＵＧＧＣＡＣＵＧＧＵＡＧＡＡＵＵＣＡＣＵＧ（配列番号２５）
ＡＵＧＧＣＡＣＵＧＧＵＡＧＡＡＵＵＣＡ（配列番号２６）
ＡＵＧＧＣＡＣＵＧＧＵＡＧＡＡＵＵＣＡＣＵＧＵ（配列番号２７）
ＡＵＧＧＣＡＣＵＧＧＵＡＧＡＡＵＵＣＡＣ（配列番号２８）
ＡＵＧＧＣＡＣＵＧＧＵＡＧＡＡ（配列番号２９）
ＡＵＧＧＣＡＣＵＧＧＵＡＧＡＡＵＵ（配列番号３０）
ＡＵＧＧＣＡＣＵＧＧＵＡＧＡＡＵＵＣ（配列番号３１）
ＡＵＧＧＣＡＣＵＧＧＵＡＧＡＡＵ（配列番号３２）
ＵＧＧＣＡＣＵＧＧＵＡＧＡＡＵＵＣＡＣＵＧ（配列番号３３）
ＵＧＧＣＡＣＵＧＧＵＡＧＡＡＵＵＣＡＣ（配列番号３４）
ＣＡＣＵＧＧＵＡＧＡＡＵＵＣＡＣＵＧ（配列番号３５）
ＣＡＣＵＧＧＵＡＧＡＡＵＵＣＡ（配列番号３６）
ＣＡＣＵＧＧＵＡＧＡＡＵＵＣＡＣ（配列番号３７）
ＣＡＣＵＧＧＵＡＧＡＡＵＵＣＡＣＵ（配列番号３８）
ＡＣＵＧＧＵＡＧＡＡＵＵＣＡＣＵ（配列番号３９）
ｍｉＲ−ｈｓａ−２１８−５ｐのプロセシング：
ＧＵＵＧＵＧＣＵＵＧＡＵＣＵＡＡＣＣＡＵＧＵ（配列番号４０）
ＧＵＵＧＵＧＣＵＵＧＡＵＣＵＡＡＣＣＡＵ（配列番号４１）
ＵＵＧＵＧＣＵＵＧＡＵＣＵＡＡＣＣＡＵＧ（配列番号４２）
ＵＵＧＵＧＣＵＵＧＡＵＣＵＡＡＣＣＡＵ（配列番号４３）
ＵＵＧＵＧＣＵＵＧＡＵＣＵＡＡＣＣＡＵＧＵＧＧＵ（配列番号４４）
ＵＵＧＵＧＣＵＵＧＡＵＣＵＡＡＣＣＡ（配列番号４５）
ＵＵＧＵＧＣＵＵＧＡＵＣＵＡＡＣＣＡＵＧＵＧＧ（配列番号４６）
ＵＵＧＵＧＣＵＵＧＡＵＣＵＡＡＣ（配列番号４７）
ＵＵＧＵＧＣＵＵＧＡＵＣＵＡＡＣＣＡＵＧＵ（配列番号４８）
ＵＵＧＵＧＣＵＵＧＡＵＣＵＡＡＣＣ（配列番号４９）
ＵＵＧＵＧＣＵＵＧＡＵＣＵＡＡＣＣＡＵＧＵＧ（配列番号５０）
ＵＵＧＵＧＣＵＵＧＡＵＣＵＡＡ（配列番号５１）
ＵＧＵＧＣＵＵＧＡＵＣＵＡＡＣＣＡＵＧＵ（配列番号５２）
ＵＧＵＧＣＵＵＧＡＵＣＵＡＡＣＣＡＵＧＵＧ（配列番号５３）
ＵＧＵＧＣＵＵＧＡＵＣＵＡＡＣＣＡＵＧＵＧＧＵ（配列番号５４）
ＧＵＧＣＵＵＧＡＵＣＵＡＡＣＣＡＵＧＵ（配列番号５５）
ＧＵＧＣＵＵＧＡＵＣＵＡＡＣＣＡＵＧＵＧ（配列番号５６）
ＵＧＣＵＵＧＡＵＣＵＡＡＣＣＡＵＧＵＧ（配列番号５７）
ＵＧＣＵＵＧＡＵＣＵＡＡＣＣＡＵＧＵ（配列番号５８）
ＧＣＵＵＧＡＵＣＵＡＡＣＣＡＵＧＵ（配列番号５９）
ＧＣＵＵＧＡＵＣＵＡＡＣＣＡＵＧ（配列番号６０）
ＧＣＵＵＧＡＵＣＵＡＡＣＣＡＵ（配列番号６１）
ＧＣＵＵＧＡＵＣＵＡＡＣＣＡＵＧＵＧＧＵ（配列番号６２）
ＧＣＵＵＧＡＵＣＵＡＡＣＣＡＵＧＵＧ（配列番号６３）
ＣＵＵＧＡＵＣＵＡＡＣＣＡＵＧＵ（配列番号６４）
ＣＵＵＧＡＵＣＵＡＡＣＣＡＵＧＵＧ（配列番号６５）
ＣＵＵＧＡＵＣＵＡＡＣＣＡＵＧ（配列番号６６）
ＵＵＧＡＵＣＵＡＡＣＣＡＵＧＵ（配列番号６７）
ＵＵＧＡＵＣＵＡＡＣＣＡＵＧＵＧ（配列番号６８）
ＵＵＧＡＵＣＵＡＡＣＣＡＵＧＵＧＧＵ（配列番号６９）
ＵＵＧＡＵＣＵＡＡＣＣＡＵＧＵＧＧＵＵ（配列番号７０）
ＵＵＧＡＵＣＵＡＡＣＣＡＵＧＵＧＧ（配列番号７１）
ｍｉＲ−９６−５ｐのプロセシング：
ＵＵＵＵＧＧＣＡＣＵＡＧＣＡＣＡＵＵＵＵＵＧＣＵ（配列番号７２）
ＵＵＵＧＧＣＡＣＵＡＧＣＡＣＡＵＵＵＵＵＧＣＵ（配列番号７３）
ＵＵＵＧＧＣＡＣＵＡＧＣＡＣＡＵＵＵＵＵＧ（配列番号７４）
ＵＵＵＧＧＣＡＣＵＡＧＣＡＣＡＵＵＵＵＵ（配列番号７５）
ＵＵＵＧＧＣＡＣＵＡＧＣＡＣＡＵＵＵＵＵＧＣ（配列番号７６）
ＵＵＵＧＧＣＡＣＵＡＧＣＡＣＡＵＵＵＵ（配列番号７７）
ＵＵＵＧＧＣＡＣＵＡＧＣＡＣＡＵＵＵ（配列番号７８）
ＵＵＵＧＧＣＡＣＵＡＧＣＡＣＡ（配列番号７９）
ＵＵＵＧＧＣＡＣＵＡＧＣＡＣＡＵＵ（配列番号８０）
ＵＵＵＧＧＣＡＣＵＡＧＣＡＣＡＵＵＵＵＵＧＣＵＵ（配列番号８１）
ＵＵＵＧＧＣＡＣＵＡＧＣＡＣＡＵ（配列番号８２）
ＵＵＧＧＣＡＣＵＡＧＣＡＣＡＵＵＵＵＵＧＣ（配列番号８３）
ＵＵＧＧＣＡＣＵＡＧＣＡＣＡＵＵＵＵＵＧＣＵ（配列番号８４）
ＧＧＣＡＣＵＡＧＣＡＣＡＵＵＵＵＵＧＣＵ（配列番号８５）
ＣＡＣＵＡＧＣＡＣＡＵＵＵＵＵＧＣＵ（配列番号８６）
ＣＡＣＵＡＧＣＡＣＡＵＵＵＵＵＧＣ（配列番号８７）
ＡＣＵＡＧＣＡＣＡＵＵＵＵＵＧ（配列番号８８）
ＣＵＡＧＣＡＣＡＵＵＵＵＵＧＣＵ（配列番号８９）
ＣＵＡＧＣＡＣＡＵＵＵＵＵＧＣ（配列番号９０）。
【００３７】
第２のコード領域は、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的部位をコードしてよい。従って、様々な実施形態において、第２のコード領域は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または７つ以上のｍｉＲＮＡ標的部位（すなわち、目的のｍｉＲＮＡの逆相補配列）をコードする。コードされる標的部位はそれぞれ、同一であってよく、または異なってよい。例えば、全ての標的部位が、同一のｍｉＲＮＡまたは同一のｍｉＲＮＡの種々のプロセシングされた形態の逆相補配列であってよい。別の非限定的な例では、第２のコード領域は、異なったｍｉＲＮＡのための標的部位（例えば、ｍｉＲ−ｈｓａ−１８３  ｍｉＲＮＡのコアを含むｍｉＲＮＡのための１つ以上の標的部位とｍｉＲ−ｈｓａ−２１８−５ｐのコアを含むｍｉＲＮＡのための１つ以上の標的部位）を含んでよい。異なったｍｉＲＮＡの標的部位の存在は、細胞内にそのｍｉＲＮＡが適切なコピー数で存在する限り、ｍｉＲＮＡの阻害活性を最大化し得る。２つ以上の標的部位が第２のコード領域にコードされる場合、それらの標的部位は、直接隣接してよいか、または様々な数のヌクレオチドからなるスペーサーによって隔てられてよい。様々な非限定的例において、スペーサーは、１〜１０、２〜９、３〜８、４〜７、または５〜６ヌクレオチドの長さであってよい。このようなスペーサー領域は、有用なＤＮＡの柔軟性をもたらす可能性がある。本明細書の開示に基づいて、コードされる標的部位間のスペーサー残基の適切な数を決定することは、当技術分野の通常の知識レベルの範囲内である。さらなる様々な非限定的実施形態において、第２のコード配列は、配列番号１４２（ｍｉＲ−１８３標的部位）、配列番号１４３（ｍｉＲ−２１８標的部位）、および配列番号１４４（ｍｉＲ−１８３／２１８標的部位）からなる群より選択される配列を含むか、からなる。
【００３８】
全ての実施形態において、融合された第１のコード領域と第２のコード領域の転写後にｍｉＲＮＡが標的部位に結合した際のｍＲＮＡの分解の効力を最大化するために、第２のコード領域は第１のコード領域の３’非翻訳領域内に位置し、第１のコード領域の翻訳終止コドンの少なくとも６０ヌクレオチド下流に位置する。第２のコード領域は、二次構造を形成しにくい３’ＵＴＲの領域（すなわち、ＡＴリッチ領域）に配置されてよい。
【００３９】
第１のコード領域は、ＣＤ３４＋細胞ゲノム上の目的の標的内にＤＮＡ切断を生じさせることが可能なヌクレアーゼをコードする。このようなＤＮＡ切断は一本鎖切断または二本鎖切断であってよい。ゲノム中に部位特異的ＤＮＡ切断を生じさせるための、種々の部位特異的エンドヌクレアーゼＥＮのプラットフォームがいくつか存在する。ＥＮのうちの１グループは、ＤＮＡ結合タンパク質ドメインを含む。このグループには、ＤＮＡ結合特性およびヌクレアーゼ特性を有するメガヌクレアーゼ、ならびに、ＤＮＡ結合ドメインが細菌のエンドヌクレアーゼＦｏｋＩと融合されているジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）が包含される。ＦｏｋＩによるＤＮＡ切断には、各ＤＮＡ鎖に結合した２分子のＦｏｋＩが必要となるため、ＦｏｋＩを含むＥＮの２つのサブユニットが発現される必要がある。この実施形態において、上記の２つのヌクレアーゼサブユニットは、切断可能なペプチドを介して連結されてよい。第２のグループのＥＮは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ認識に基づいており、クラスター化した規則的に間隔を有する短い回文配列の反復（ｔｈｅ  ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ）（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９なる細菌のシステムを利用する。従って、ＣＤ３４＋細胞ゲノム上の目的の標的内にＤＮＡ切断を生じさせることが可能な部位特異的ＥＮを設計することは、当技術分野の通常の知識レベルの範囲内である。非限定的な例が、以下の実施例において提供される。
【００４０】
非限定的な一実施形態において、第１のコード領域は、ヒトのケモカインレセプター５（ＣＣＲ５）遺伝子を標的とするＺＦＮをコードし、ここで、第１のコード配列は以下の配列を含むか、からなる：
ｈＣＣＲ５−ＺＦＮ
ＭＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫＭＡＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡＭＡＥＲＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＤＲＳＮＬＳＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＩＳＳＮＬＮＳＨＴＫＩＨＴＧＳＱＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＳＤＮＬＡＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＴＳＧＮＬＴＲＨＴＫＩＨＬＲＧＳＱＬＶＫＳＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫＬＫＹＶＰＨＥＹＩＥＬＩＥＩＡＲＮＳＴＱＤＲＩＬＥＭＫＶＭＥＦＦＭＫＶＹＧＹＲＧＫＨＬＧＧＳＲＫＰＤＧＡＩＹＴＶＧＳＰＩＤＹＧＶＩＶＤＴＫＡＹＳＧＧＹＮＬＰＩＧＱＡＤＥＭＥＲＹＶＥＥＮＱＴＲＮＫＨＬＮＰＮＥＷＷＫＶＹＰＳＳＶＴＥＦＫＦＬＦＶＳＧＨＦＫＧＮＹＫＡＱＬＴＲＬＮＨＩＴＮＣＮＧＡＶＬＳＶＥＥＬＬＩＧＧＥＭＩＫＡＧＴＬＴＬＥＥＶＲＲＫＦＮＮＧＥＩＮＦＲＳＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰＲＭＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫＭＡＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡＭＡＥＲＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＳＤＮＬＳＶＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＱＫＩＮＬＱＶＨＴＫＩＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＳＤＶＬＳＥＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＱＲＮＨＲＴＴＨＴＫＩＨＬＲＧＳＱＬＶＫＳＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫＬＫＹＶＰＨＥＹＩＥＬＩＥＩＡＲＮＳＴＱＤＲＩＬＥＭＫＶＭＥＦＦＭＫＶＹＧＹＲＧＫＨＬＧＧＳＲＫＰＤＧＡＩＹＴＶＧＳＰＩＤＹＧＶＩＶＤＴＫＡＹＳＧＧＹＮＬＰＩＧＱＡＤＥＭＱＲＹＶＫＥＮＱＴＲＮＫＨＩＮＰＮＥＷＷＫＶＹＰＳＳＶＴＥＦＫＦＬＦＶＳＧＨＦＫＧＮＹＫＡＱＬＴＲＬＮＨＫＴＮＣＮＧＡＶＬＳＶＥＥＬＬＩＧＧＥＭＩＫＡＧＴＬＴＬＥＥＶＲＲＫＦＮＮＧＥＩＮＦ（配列番号９１）。
【００４１】
別の非限定的な実施形態において、第１のコード領域は、ヒトのβ−グロビン遺伝子を標的とするＺＦＮをコードし、ここで、第１のコード配列は以下の配列を含むか、からなる：
ＴＡＬＥＮ  グロビン
ＭＶＹＰＹＤＶＰＤＹＡＥＬＰＰＫＫＫＲＫＶＧＩＲＩＱＤＬＲＴＬＧＹＳＱＱＱＱＥＫＩＫＰＫＶＲＳＴＶＡＱＨＨＥＡＬＶＧＨＧＦＴＨＡＨＩＶＡＬＳＱＨＰＡＡＬＧＴＶＡＶＫＹＱＤＭＩＡＡＬＰＥＡＴＨＥＡＩＶＧＶＧＫＱＷＳＧＡＲＡＬＥＡＬＬＴＶＡＧＥＬＲＧＰＰＬＱＬＤＴＧＱＬＬＫＩＡＫＲＧＧＶＴＡＶＥＡＶＨＡＷＲＮＡＬＴＧＡＰＬＴＰＡＱＶＶＡＩＡＳＮＩＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤＨＧＬＴＰＤＱＶＶＡＩＡＳＮＩＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤＨＧＬＴＰＤＱＶＶＡＩＡＳＮＮＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＡＱＶＶＡＩＡＳＮＩＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤＨＧＬＴＰＡＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤＨＧＬＴＰＤＱＶＶＡＩＡＳＮＩＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤＨＧＬＴＰＡＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤＨＧＬＴＰＤＱＶＶＡＩＡＳＮＩＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤＨＧＬＴＰＡＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＡＱＶＶＡＩＡＳＮＮＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＡＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＤＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤＨＧＬＴＰＤＱＶＶＡＩＡＳＮＩＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤＨＧＬＴＰＤＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＤＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＳＩＶＡＱＬＳＲＰＤＰＡＬＡＡＬＬＶＫＳＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫＬＫＹＶＰＨＥＹＩＥＬＩＥＩＡＲＮＰＴＱＤＲＩＬＥＭＫＶＭＥＦＦＭＫＶＹＧＹＲＧＥＨＬＧＧＳＲＫＰＤＧＡＩＹＴＶＧＳＰＩＤＹＧＶＩＶＤＴＫＡＹＳＧＧＹＮＬＰＩＧＱＡＤＡＭＱＳＹＶＥＥＮＱＴＲＮＫＨＩＮＰＮＥＷＷＫＶＹＰＳＳＶＴＥＦＫＦＬＦＶＳＧＨＦＫＧＮＹＫＡＱＬＴＲＬＮＨＩＴＮＣＮＧＡＶＬＳＶＥＥＬＬＩＧＧＥＭＩＫＡＧＴＬＴＬＥＥＶＲＲＫＦＮＮＧＥＩＮＦＬＤＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰＶＹＰＹＤＶＰＤＹＡＥＬＰＰＫＫＫＲＫＶＧＩＲＩＱＤＬＲＴＬＧＹＳＱＱＱＱＥＫＩＫＰＫＶＲＳＴＶＡＱＨＨＥＡＬＶＧＨＧＦＴＨＡＨＩＶＡＬＳＱＨＰＡＡＬＧＴＶＡＶＫＹＱＤＭＩＡＡＬＰＥＡＴＨＥＡＩＶＧＶＧＫＱＷＳＧＡＲＡＬＥＡＬＬＴＶＡＧＥＬＲＧＰＰＬＱＬＤＴＧＱＬＬＫＩＡＫＲＧＧＶＴＡＶＥＡＶＨＡＷＲＮＡＬＴＧＡＰＬＴＰＤＱＶＶＡＩＡＳＮＩＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＡＱＶＶＡＩＡＳＮＩＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤＨＧＬＴＰＡＱＶＶＡＩＡＳＮＩＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＤＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＤＱＶＶＡＩＡＳＮＩＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＡＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＤＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＤＱＶＶＡＩＡＳＮＩＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤＨＧＬＴＰＤＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＤＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＡＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＡＱＶＶＡＩＡＳＮＩＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＡＱＶＶＡＩＡＳＮＮＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤＨＧＬＴＰＡＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＤＱＶＶＡＩＡＳＮＮＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＡＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＮＧＧＧＫＱＡＬＥＳＩＶＡＱＬＳＲＰＤＰＡＬＡＡＬＬＶＫＳＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫＬＫＹＶＰＨＥＹＩＥＬＩＥＩＡＲＮＰＴＱＤＲＩＬＥＭＫＶＭＥＦＦＭＫＶＹＧＹＲＧＥＨＬＧＧＳＲＫＰＤＧＡＩＹＴＶＧＳＰＩＤＹＧＶＩＶＤＴＫＡＹＳＧＧＹＮＬＰＩＧＱＡＲＥＭＱＲＹＶＥＥＮＱＴＲＮＫＨＩＮＰＮＥＷＷＫＶＹＰＳＳＶＴＥＦＫＦＬＦＶＳＧＨＦＫＧＮＹＫＡＱＬＴＲＬＮＨＩＴＮＣＮＧＡＶＬＳＶＥＥＬＬＩＧＧＥＭＩＫＡＧＴＬＴＬＥＥＶＲＲＫＦＮＮＧＥＩＮＦＬＤ（配列番号９２）。
【００４２】
さらなる非限定的な実施形態において、第１のコード領域は、サルのケモカインレセプター５（ＣＣＲ５）遺伝子を標的とするＺＦＮをコードし、ここで、第１のコード配列は以下の配列を含むか、からなる：
サルＺＦＮ−ＣＣＲ５
ＭＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫＭＡＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡＭＡＥＲＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＳＤＮＬＳＶＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＡＮＨＨＲＩＮＨＴＫＩＨＴＧＳＱＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＤＲＳＤＬＳＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＲＳＤＨＬＳＲＨＴＫＩＨＴＧＳＱＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＱＳＧＮＬＡＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＱＲＮＤＲＫＳＨＴＫＩＨＬＲＧＳＱＬＶＫＳＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫＬＫＹＶＰＨＥＹＩＥＬＩＥＩＡＲＮＳＴＱＤＲＩＬＥＭＫＶＭＥＦＦＭＫＶＹＧＹＲＧＫＨＬＧＧＳＲＫＰＤＧＡＩＹＴＶＧＳＰＩＤＹＧＶＩＶＤＴＫＡＹＳＧＧＹＮＬＰＩＧＱＡＤＥＭＥＲＹＶＥＥＮＱＴＲＤＫＨＬＮＰＮＥＷＷＫＶＹＰＳＳＶＴＥＦＫＦＬＦＶＳＧＨＦＫＧＮＹＫＡＱＬＴＲＬＮＨＩＴＮＣＮＧＡＶＬＳＶＥＥＬＬＩＧＧＥＭＩＫＡＧＴＬＴＬＥＥＶＲＲＫＦＮＮＧＥＩＮＦＲＳＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰＲＭＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫＭＡＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡＭＡＥＲＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＳＤＨＬＳＱＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＴＳＡＮＲＴＴＨＴＫＩＨＴＧＳＱＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＥＲＧＴＬＡＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＱＳＳＤＬＲＲＨＴＫＩＨＴＧＳＱＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＱＳＳＤＬＳＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＣＲＳＮＬＫＫＨＴＫＩＨＬＲＧＳＱＬＶＫＳＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫＬＫＹＶＰＨＥＹＩＥＬＩＥＩＡＲＮＳＴＱＤＲＩＬＥＭＫＶＭＥＦＦＭＫＶＹＧＹＲＧＫＨＬＧＧＳＲＫＰＤＧＡＩＹＴＶＧＳＰＩＤＹＧＶＩＶＤＴＫＡＹＳＧＧＹＮＬＰＩＧＱＡＤＥＭＱＲＹＶＫＥＮＱＴＲＮＫＨＩＮＰＮＥＷＷＫＶＹＰＳＳＶＴＥＦＫＦＬＦＶＳＧＨＦＫＧＮＹＫＡＱＬＴＲＬＮＲＫＴＮＣＮＧＡＶＬＳＶＥＥＬＬＩＧＧＥＭＩＫＡＧＴＬＴＬＥＥＶＲＲＫＦＮＮＧＥＩＮＦ（配列番号９３）。
【００４３】
当業者には理解されるように、設計された部位特異的ＥＮは、任意のＣＤ３４＋ゲノム上の目的の標的を標的としてよい。様々な非限定的実施形態において、ヌクレアーゼは、ＣＣＲ５、β−グロビン、補体レセプター２（ＣＲ２）（Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）受容体）、ニーマンピック病Ｃ１型レセプター（ＮＰＣ１）（エボラ受容体）、アンジオテンシン変換酵素２型レセプター（ＡＣＥ２）（ＳＡＲＳ受容体）をコードする遺伝子、およびミスフォールドした場合にリソソーム蓄積症を導く可能性のあるタンパク質をコードする遺伝子からなる群より選択されるＣＤ３４＋細胞ゲノム上の標的内にＤＮＡ切断を生じさせることができる。
【００４４】
別の実施形態において、第１のコード領域は、インビボにおいて短時間発現を可能にするように改変されているヌクレアーゼをコードしてよい。一実施形態において、第１のコード領域は、ヌクレアーゼとＰＥＳＴペプチド（すなわち、プロリン、グルタミン酸、セリン、およびトレオニンに富んだペプチド配列）の融合物をコードし、ＰＥＳＴペプチドは、タンパク質の分解のためのシグナルペプチドとして機能する。一実施形態において、オルニチンデカルボキシラーゼ（ｍＯＤＣ）のＰＥＳＴアミノ酸配列（残基４２２〜４６１）をコードする配列を、本明細書に開示されるヌクレアーゼの任意の実施形態のＮ末端などにおいて使用できる（ＦＰＰＥＶＥＥＱＤＤＧＴＬＰＭＳＣＡＱＥＧＭＤＲ（配列番号１０２））。
【００４５】
さらなる実施形態において、第１のコード領域は、ヌクレアーゼとＦＲＢ＊ドメイン（配列番号１０６）の融合物をコードする（本明細書に開示されるヌクレアーゼの任意の実施形態のＮ末端に融合など）。
【００４６】
ラパマイシンはＦＫＢＰ１２に結合して、ＦＫＢＰ１２−ラパマイシン結合タンパク質（ＦＫＢＰ１２−ｒａｐａｍｙｃｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＦＲＡＰ）を阻害する複合体を形成する。ＦＫＢＰ１２−ラパマイシンとの結合に十分なＦＲＡＰ内の最小領域は、ＦＲＢ（ＦＫＢＰ−ｒａｐａｍｙｃｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ）と呼称される８９アミノ酸のドメインである。Ｔ２０９８Ｌ置換を有するＦＲＢの変異型（ＦＲＢ＊）は、融合タンパク質の分解を引き起こす。ラパマイシンを用いてＦＫＢＰ１２をリクルートすると、融合タンパク質が熱力学的に安定化し、標的タンパク質の活性は回復する。従って、ヌクレアーゼの発現の期間を制御できる。
【００４７】
別の実施形態において、ＴＡＬＥＮのＤＮＡ認識配列をＴＡＬＥＮのＯＲＦのＮ末端にインフレームで融合できる。ＣＤ３４＋細胞においてヌクレアーゼが発現すると、ヌクレアーゼは、ベクター内の自身の遺伝子を切断し、それによりヌクレアーゼを不活性することになる。これは、２９３細胞においてはｍｉＲＮＡによる制御を介してＴＡＬＥＮの発現が抑制されるため、ＨＤ−Ａｄの産生中には起こらないであろう。このような配列を以下に示す：
ＭＧＨＰＨＰＤＫＬＱＫＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫＭＡＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡＭＡＥＲＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＤＲＳＮＬＳＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＩＳＳＮＬＮＳＨＴＫＩＨＴＧＳＱＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＳＤＮＬＡＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＴＳＧＮＬＴＲＨＴＫＩＨＬＲＧＳＱＬＶＫＳＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫＬＫＹＶＰＨＥＹＩＥＬＩＥＩＡＲＮＳＴＱＤＲＩＬＥＭＫＶＭＥＦＦＭＫＶＹＧＹＲＧＫＨＬＧＧＳＲＫＰＤＧＡＩＹＴＶＧＳＰＩＤＹＧＶＩＶＤＴＫＡＹＳＧＧＹＮＬＰＩＧＱＡＤＥＭＥＲＹＶＥＥＮＱＴＲＮＫＨＬＮＰＮＥＷＷＫＶＹＰＳＳＶＴＥＦＫＦＬＦＶＳＧＨＦＫＧＮＹＫＡＱＬＴＲＬＮＨＩＴＮＣＮＧＡＶＬＳＶＥＥＬＬＩＧＧＥＭＩＫＡＧＴＬＴＬＥＥＶＲＲＫＦＮＮＧＥＩＮＦＲＳＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰＲＭＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫＭＡＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡＭＡＥＲＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＳＤＮＬＳＶＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＱＫＩＮＬＱＶＨＴＫＩＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＳＤＶＬＳＥＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＱＲＮＨＲＴＴＨＴＫＩＨＬＲＧＳＱＬＶＫＳＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫＬＫＹＶＰＨＥＹＩＥＬＩＥＩＡＲＮＳＴＱＤＲＩＬＥＭＫＶＭＥＦＦＭＫＶＹＧＹＲＧＫＨＬＧＧＳＲＫＰＤＧＡＩＹＴＶＧＳＰＩＤＹＧＶＩＶＤＴＫＡＹＳＧＧＹＮＬＰＩＧＱＡＤＥＭＱＲＹＶＫＥＮＱＴＲＮＫＨＩＮＰＮＥＷＷＫＶＹＰＳＳＶＴＥＦＫＦＬＦＶＳＧＨＦＫＧＮＹＫＡＱＬＴＲＬＮＨＫＴＮＣＮＧＡＶＬＳＶＥＥＬＬＩＧＧＥＭＩＫＡＧＴＬＴＬＥＥＶＲＲＫＦＮＮＧＥＩＮＦ（配列番号１０３）。
【００４８】
第１のコード領域および第２のコード領域の転写は、単一のプロモーターによって制御され、融合ＲＮＡ発現産物をもたらす。従って、第１のコード領域および第２のコード領域は、それらの間に任意の好適な長さの核酸リンカー配列を、そのリンカー配列が転写終結ポリアデニル化シグナルを含まない限り、有してよい。
【００４９】
当業者には理解されるように、ＨＤ−Ａｄベクターの挿入収容能力は、複数の第１の核酸モジュール（従って、複数の第１および第２のコード領域）の収容を可能にする３０ｋｂであり、例えば、遺伝子治療目的のための、または複遺伝子性のヒト疾患用の適切なモデルを確立するための、ＣＤ３４＋細胞における複数の標的遺伝子の同時編集が可能なＨＤ−Ａｄを作製するために用いることができる。
【００５０】
第１のコード領域および第２のコード領域はそれぞれ、ＣＤ３４＋細胞において活性を有するプロモーターに機能可能に連結される。本明細書において使用される場合、「機能可能に連結」なる用語は、発現カセット上におけるプロモーターとコード領域との間の距離にかかわらず、第１のコード領域および第２のコード領域の発現を可能にするようにプロモーターが機能する要素配置を指す。ＣＤ３４＋細胞において活性を有する任意のプロモーターを使用できる。様々な非限定的実施形態において、プロモーターは、ＥＦ１αプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）  １プロモーター、およびユビキチン遺伝子プロモーターからなる群より選択される。一実施形態において、プロモーターは産生細胞においても活性を有する。
【００５１】
さらなる様々な実施形態において、第１の核酸モジュールの発現を駆動するためのプロモーターは、以下に示される配列からなる群より選択される核酸配列を含むか、からなる：
ＰＧＫ：
ＣＡＣＧＧＧＧＴＴＧＧＧＧＴＴＧＣＧＣＣＴＴＴＴＣＣＡＡＧＧＣＡＧＣＣＣＴＧＧＧＴＴＴＧＣＧＣＡＧＧＧＡＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＧＣＧＴＧＧＴＴＣＣＧＧＧＡＡＡＣＧＣＡＧＣＧＧＣＧＣＣＧＡＣＣＣＴＧＧＧＴＣＴＣＧＣＡＣＡＴＴＣＴＴＣＡＣＧＴＣＣＧＴＴＣＧＣＡＧＣＧＴＣＡＣＣＣＧＧＡＴＣＴＴＣＧＣＣＧＣＴＡＣＣＣＴＴＧＴＧＧＧＣＣＣＣＣＣＧＧＣＧＡＣＧＣＴＴＣＣＴＧＣＴＣＣＧＣＣＣＣＴＡＡＧＴＣＧＧＧＡＡＧＧＴＴＣＣＴＴＧＣＧＧＴＴＣＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＧＧＡＣＧＴＧＡＣＡＡＡＣＧＧＡＡＧＣＣＧＣＡＣＧＴＣＴＣＡＣＴＡＧＴＡＣＣＣＴＣＧＣＡＧＡＣＧＧＡＣＡＧＣＧＣＣＡＧＧＧＡＧＣＡＡＴＧＧＣＡＧＣＧＣＧＣＣＧＡＣＣＧＣＧＡＴＧＧＧＣＴＧＴＧＧＣＣＡＡＴＡＧＣＧＧＣＴＧＣＴＣＡＧＣＧＧＧＧＣＧＣＧＣＣＧＡＧＡＧＣＡＧＣＧＧＣＣＧＧＧＡＡＧＧＧＧＣＧＧＴＧＣＧＧＧＡＧＧＣＧＧＧＧＴＧＴＧＧＧＧＣＧＧＴＡＧＴＧＴＧＧＧＣＣＣＴＧＴＴＣＣＴＧＣＣＣＧＣＧＣＧＧＴＧＴＴＣＣＧＣＡＴＴＣＴＧＣＡＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＧＣＧＣＡＣＧＴＣＧＧＣＡＧＴＣＧＧＣＴＣＣＣＴＣＧＴＴＧＡＣＣＧＡＡＴＣＡＣＣＧＡＣＣＴＣＴＣＴＣＣＣＣＡ（配列番号１４５）
ＥＦ１Ａ：
ＧＡＧＴＡＡＴＴＣＡＴＡＣＡＡＡＡＧＧＡＣＴＣＧＣＣＣＣＴＧＣＣＴＴＧＧＧＧＡＡＴＣＣＣＡＧＧＧＡＣＣＧＴＣＧＴＴＡＡＡＣＴＣＣＣＡＣＴＡＡＣＧＴＡＧＡＡＣＣＣＡＧＡＧＡＴＣＧＣＴＧＣＧＴＴＣＣＣＧＣＣＣＣＣＴＣＡＣＣＣＧＣＣＣＧＣＴＣＴＣＧＴＣＡＴＣＡＣＴＧＡＧＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＧＣＡＴＧＣＧＴＧＡＧＧＣＴＣＣＧＧＴＧＣＣＣＧＴＣＡＧＴＧＧＧＣＡＧＡＧＣＧＣＡＣＡＴＣＧＣＣＣＡＣＡＧＴＣＣＣＣＧＡＧＡＡＧＴＴＧＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＧＡＡＣＣＧＧＴＧＣＣＴＡＧＡＧＡＡＧＧＴＧＧＣＧＣＧＧＧＧＴＡＡＡＣＴＧＧＧＡＡＡＧＴＧＡＴＧＴＣＧＴＧＴＡＣＴＧＧＣＴＣＣＧＣＣＴＴＴＴＴＣＣＣＧＡＧＧＧＴＧＧＧＧＧＡＧＡＡＣＣＧＴＡＴＡＴＡＡＧＴＧＣＡＧＴＡＧＴＣＧＣＣＧＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＴＴＴＣＧＣＡＡＣＧＧＧＴＴＴＧＣＣＧＣＣＡＧＡＡＣＡＣＡＧＧＴＡＡＧＴＧＣＣＧＴＧＴＧＴＧＧＴＴＣＣＣＧＣＧＧＧＣＣＴＧＧＣＣＴＣＴＴＴＡＣＧＧＧＴＴＡＴＧＧＣＣＣＴＴＧＣＧＴＧＣＣＴＴＧＡＡＴＴＡＣＴＴＣＣＡＣＧＣＣＣＣＴＧＧＣＴＧＣＡＧＴＡＣＧＴＧＡＴＴＣＴＴＧＡＴＣＣＣＧＡＧＣＴＴＣＧＧＧＴＴＧＧＡＡＧＴＧＧＧＴＧＧＧＡＧＡＧＴＴＣＧＡＧＧＣＣＴＴＧＣＧＣＴＴＡＡＧＧＡＧＣＣＣＣＴＴＣＧＣＣＴＣＧＴＧＣＴＴＧＡＧＴＴＧＡＧＧＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＧＣＧＣＴＧＧＧＧＣＣＧＣＣＧＣＧＴＧＣＧＡＡＴＣＴＧＧＴＧＧＣＡＣＣＴＴＣＧＣＧＣＣＴＧＴＣＴＣＧＣＴＧＣＴＴＴＣＧＡＴＡＡＧＴＣＴＣＴＡＧＣＣＡＴＴＴＡＡＡＡＴＴＴＴＴＧＡＴＧＡＣＣＴＧＣＴＧＣＧＡＣＧＣＴＴＴＴＴＴＴＣＴＧＧＣＡＡＧＡＴＡＧＴＣＴＴＧＴＡＡＡＴＧＣＧＧＧＣＣＡＡＧＡＴＣＴＧＣＡＣＡＣＴＧＧＴＡＴＴＴＣＧＧＴＴＴＴＴＧＧＧＧＣＣＧＣＧＧＧＣＧＧＣＧＡＣＧＧＧＧＣＣＣＧＴＧＣＧＴＣＣＣＡＧＣＧＣＡＣＡＴＧＴＴＣＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＧＧＣＣＴＧＣＧＡＧＣＧＣＧＧＣＣＡＣＣＧＡＧＡＡＴＣＧＧＡＣＧＧＧＧＧＴＡＧＴＣＴＣＡＡＧＣＴＣＧＣＣＧＧＣＣＴＧＣＴＣＴＧＧＴＧＣＣＴＧＧＣＣＴＣＧＣＧＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＴＣＧＣＣＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＧＧＣＡＡＧＧＣＴＧＧＣＣＣＧＧＴＣＧＧＣＡＣＣＡＧＴＴＧＣＧＴＧＡＧＣＧＧＡＡＡＧＡＴＧＧＣＣＧＣＴＴＣＣＣＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＧＡＧＣＴＣＡＡＡＡＴＧＧＡＧＧＡＣＧＣＧＧＣＧＣＴＣＧＧＧＡＧＡＧＣＧＧＧＣＧＧＧＴＧＡＧＴＣＡＣＣＣＡＣＡＣＡＡＡＧＧＡＡＡＡＧＧＧＣＣＴＴＴＣＣＧＴＣＣＴＣＡＧＣＣＧＴＣＧＣＴＴＣＡＴＧＴＧＡＣＴＣＣＡＣＧＧＡＧＴＡＣＣＧＧＧＣＧＣＣＧＴＣＣＡＧＧＣＡＣＣＴＣＧＡＴＴＡＧＴＴＣＴＣＧＡＧＣＴＴＴＴＧＧＡＧＴＡＣＧＴＣＧＴＣＴＴＴＡＧＧＴＴＧＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＴＴＴＴＡＴＧＣＧＡＴＧＧＡＧＴＴＴＣＣＣＣＡＣＡＣＴＧＡＧＴＧＧＧＴＧＧＡＧＡＣＴＧＡＡＧＴＴＡＧＧＣＣＡＧＣＴＴＧＧＣＡＣＴＴＧＡＴＧＴＡＡＴＴＣＴＣＣＴＴＧＧＡＡＴＴＴＧＣＣＣＴＴＴＴＴＧＡＧＴＴＴＧＧＡＴＣＴＴＧＧＴＴＣＡＴＴＣＴＣＡＡＧＣＣＴＣＡＧＡＣＡＧＴＧＧＴＴＣＡＡＡＧＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＣＣＡＴＴＴＣＡＧＧＴＧＴＣＧＴＧＡ（配列番号１４６）
ユビキチン遺伝子プロモーター：
ＡＡＧＴＴＴＣＣＡＧＡＧＣＴＴＴＣＧＡＧＧＡＡＧＧＴＴＴＣＴＴＣＡＡＣＴＣＡＡＡＴＴＣＡＴＣＣＧＣＣＴＧＡＴＡＡＴＴＴＴＣＴＴＡＴＡＴＴＴＴＣＣＴＡＡＡＧＡＡＧＧＡＡＧＡＧＡＡＧＣＧＣＡＴＡＧＡＧＧＡＧＡＡＧＧＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＴＴＡＧＧＡＧＣＣＴＴＴＣＴＴＡＣＧＧＣＴＡＴＧＡＧＧＡＡＴＴＴＧＧＧＧＣＴＣＡＧＴＴＧＡＡＡＡＧＣＣＴＡＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＣＧＧＧＡＧＧＴＴＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＡＡＣＴＡＣＴＴＴＣＡＧＣＧＧＣＧＣＡＣＧＧＡＧＡＣＧＧＣＧＴＣＴＡＣＧＴＧＡＧＧＧＧＴＧＡＴＡＡＧＴＧＡＣＧＣＡＡＣＡＣＴＣＧＴＴＧＣＡＴＡＡＡＴＴＴＧＣｇＣＴＣＣＧＣＣＡＧＣＣＣＧＧＡＧＣＡＴＴＴＡＧＧＧＧＣＧＧＴＴＧＧＣＴＴＴＧＴＴＧＧＧＴＧＡＧＣＴＴＧＴＴＴＧＴＧＴＣＣＣＴＧＴＧＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＧＴＴＧＧＴＧＡＴＴＧＧＣＡＧＧＡＴＣＣＴＧＧＴＡＴＣＣＧＣＴＡＣＡＧ（配列番号１０４）。
【００５２】
２つ以上の第１の核酸モジュールが存在する実施形態において、モジュールはそれぞれ、異なるプロモーターに機能可能に連結されてよいが、これは、そのプロモーターが産生細胞およびＣＤ３４＋細胞において活性を有する限りにおいてである。
【００５３】
カセットまたはそれに由来するベクターは、ＣＤ４６結合性アデノウイルスファイバーポリペプチドをコードする第２の核酸モジュールを含んでよい。第２の核酸モジュールの発現を駆動するためには、カセット上にプロモーターは必要ない。その代わり、ヘルパー細胞においてＨＤ−Ａｄが産生される場合にはヘルパーウイルス内のアデノウイルス主要後期プロモーターによって発現が駆動される。
【００５４】
本明細書において使用される場合、「ファイバーポリペプチド」なる用語は、
（ａ）カプシドのペントンベースタンパク質と相互作用し、細胞核への当該タンパク質の輸送に必要なシグナルを含む、Ｎ末端テイルドメインまたはその同等物；
（ｂ）１つ以上のシャフトドメインまたはその同等物；および
（ｃ）受容体との結合を決定する要素を含むＣ末端ノブドメインまたはその同等物、
を含むポリペプチドを意味する。
【００５５】
ファイバーポリペプチドは、自発的に集合してホモ三量体（「ファイバー」と呼称される）を構築し、これは、カプシドの１２個の頂点の各々の基部においてアデノウイルスビリオンの外側に位置する。本明細書において使用される場合、「ファイバー」なる用語は、３つの個別のファイバーポリペプチドから構成されるホモ三量体のタンパク質構造を指す。アデノウイルスのファイバーは、標的宿主細胞との接触、および標的宿主細胞内への内部移行を媒介する。
【００５６】
本明細書において使用される場合、「ファイバーノブ」なる用語は、ＣＤ４６に結合するホモ三量体を形成することができるファイバーポリペプチドのＣ末端のドメインを指す。ファイバータンパク質のＣ末端部分は三量体化し、ＣＤ４６に結合するファイバー構造を形成できる。ＣＤ４６への標的化には、ファイバーノブのみが必要である。従って、第２の核酸モジュールは、ＣＤ４６に結合する１つ以上のヒトアデノウイルスノブドメインまたはその同等物を含むアデノウイルスファイバーをコードする。複数のノブドメインがコードされる場合、それらのノブドメインは、それらがそれぞれＣＤ４６に結合する限り、同一であってよく、または異なってよい。本明細書において使用される場合、ノブドメインの「機能的同等物」は、１つ以上のアミノ酸の欠失、置換、または付加を有するノブドメインであって、ＣＤ３４＋細胞の表面上のＣＤ４６への結合を維持するノブドメインである。ホモ三量体の形成は、当業者に周知の方法に従って判定できる。例えば、ファイバーノブタンパク質の三量体化は、ショ糖密度勾配中での沈降、トリプシンによるタンパク質分解に対する耐性、およびポリアクリルアミドゲル中での電気泳動移動度を含む判断基準によって評価できる（Ｈｏｎｇ  ａｎｄ  Ｅｎｇｌｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７０：７０７１−７０７８（１９９６））。電気泳動移動度に関しては、ファイバーノブドメインホモ三量体は非常に安定した複合体であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの前にサンプルを煮沸しない場合には、三量体の分子量と一致する分子量にて移動するであろう。しかし、煮沸すると三量体構造は破壊され、その後、タンパク質は、タンパク質単量体と一致するサイズにて移動する。また、ファイバーノブタンパク質の三量体化は、Ｗａｎｇ，  Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８１：１２７８５−１２７９２（２００７）に記載されるようにウサギポリクローナル抗Ｈｉｓ６−ＨＲＰ抗体を用いて判定することもできる。
【００５７】
様々な実施形態において、ノブドメインは、Ａｄ１１ノブドメイン、Ａｄ１６ノブドメイン、Ａｄ２１ノブドメイン、Ａｄ３５ノブドメイン、Ａｄ５０ノブドメイン、およびそれらの機能的同等物からなる群より選択される。
【００５８】
さらなる様々な実施形態において、ノブドメインは、以下のうちの１つ以上のアミノ酸配列またはその機能的同等物を含むか、からなる：
Ａｄ１１：
ＷＴＧＶＮＰＴＥＡＮＣＱＩＭＮＳＳＥＳＮＤＣＫＬＩＬＴＬＶＫＴＧＡＬＶＴＡＦＶＹＶＩＧＶＳＮＮＦＮＭＬＴＴＨＲＮＩＮＦＴＡＥＬＦＦＤＳＴＧＮＬＬＴＲＬＳＳＬＫＴＰＬＮＨＫＳＧＱＮＭＡＴＧＡＩＴＮＡＫＧＦＭＰＳＴＴＡＹＰＦＮＤＮＳＲＥＫＥＮＹＩＹＧＴＣＹＹＴＡＳＤＲＴＡＦＰＩＤＩＳＶＭＬＮＲＲＡＩＮＤＥＴＳＹＣＩＲＩＴＷＳＷＮＴＧＤＡＰＥＶＱＴＳＡＴＴＬＶＴＳＰＦＴＦＹＹＩＲＥＤＤ（配列番号９４）；
Ａｄ１６：
ＷＴＧＡＫＰＳＡＮＣＶＩＫＥＧＥＤＳＰＤＣＫＬＴＬＶＬＶＫＮＧＧＬＩＮＧＹＩＴＬＭＧＡＳＥＹＴＮＴＬＦＫＮＮＱＶＴＩＤＶＮＬＡＦＤＮＴＧＱＩＩＴＹＬＳＳＬＫＳＮＬＮＦＫＤＮＱＮＭＡＴＧＴＩＴＳＡＫＧＦＭＰＳＴＴＡＹＰＦＩＴＹＡＴＥＴＬＮＥＤＹＩＹＧＥＣＹＹＫＳＴＮＧＴＬＦＰＬＫＶＴＶＴＬＮＲＲＭＬＡＳＧＭＡＹＡＭＮＦＳＷＳＬＮＡＥＥＡＰＥＴＴＥＶＴＬＩＴＳＰＦＦＦＳＹＩＲＥＤＤ（配列番号９５）；
Ａｄ２１：
ＷＴＧＩＫＰＰＰＮＣＱＩＶＥＮＴＤＴＮＤＧＫＬＴＬＶＬＶＫＮＧＧＬＶＮＧＹＶＳＬＶＧＶＳＤＴＶＮＱＭＦＴＱＫＳＡＴＩＱＬＲＬＹＦＤＳＳＧＮＬＬＴＤＥＳＮＬＫＩＰＬＫＮＫＳＳＴＡＴＳＥＡＡＴＳＳＫＡＦＭＰＳＴＴＡＹＰＦＮＴＴＴＲＤＳＥＮＹＩＨＧＩＣＹＹＭＴＳＹＤＲＳＬＶＰＬＮＩＳＩＭＬＮＳＲＴＩＳＳＮＶＡＹＡＩＱＦＥＷＮＬＮＡＫＥＳＰＥＳＮＩＡＴＬＴＴＳＰＦＦＦＳＹＩＲＥＤＤＮ（配列番号９６）；
Ａｄ３５：
ＷＴＧＩＮＰＰＰＮＣＱＩＶＥＮＴＮＴＮＤＧＫＬＴＬＶＬＶＫＮＧＧＬＶＮＧＹＶＳＬＶＧＶＳＤＴＶＮＱＭＦＴＱＫＴＡＮＩＱＬＲＬＹＦＤＳＳＧＮＬＬＴＤＥＳＤＬＫＩＰＬＫＮＫＳＳＴＡＴＳＥＴＶＡＳＳＫＡＦＭＰＳＴＴＡＹＰＦＮＴＴＴＲＤＳＥＮＹＩＨＧＩＣＹＹＭＴＳＹＤＲＳＬＦＰＬＮＩＳＩＭＬＮＳＲＭＩＳＳＮＶＡＹＡＩＱＦＥＷＮＬＮＡＳＥＳＰＥＳＮＩＡＴＬＴＴＳＰＦＦＦＳＹＩＴＥＤＤＮ（配列番号９７）；および
Ａｄ５０：
ＷＴＧＩＫＰＰＰＮＣＱＩＶＥＮＴＤＴＮＤＧＫＬＴＬＶＬＶＫＮＧＧＬＶＮＧＹＶＳＬＶＧＶＳＤＴＶＮＱＭＦＴＱＫＳＡＴＩＱＬＲＬＹＦＤＳＳＧＮＬＬＴＤＥＳＮＬＫＩＰＬＫＮＫＳＳＴＡＴＳＥＡＡＴＳＳＫＡＦＭＰＳＴＴＡＹＰＦＮＴＴＴＲＤＳＥＮＹＩＨＧＩＣＹＹＭＴＳＹＤＲＳＬＶＰＬＮＩＳＩＭＬＮＳＲＴＩＳＳＮＶＡＹＡＩＱＦＥＷＮＬＮＡＫＥＳＰＥＳＮＩＡＴＬＴＴＳＰＦＦＦＳＹＩＲＥＤＤＮ（配列番号９８）。
【００５９】
別の実施形態において、アデノウイルスノブドメインは、改善されたＣＤ４６結合能を有することが示されている配列番号１００のアミノ酸配列を含む（米国特許第８，７５３，６３９号を参照のこと）。
【化１】
2017514476.tif 000003
【００６０】
別の実施形態において、第２の核酸モジュールは、１つ以上のヒトアデノウイルスシャフトドメインまたはその機能的同等物を含むアデノウイルスファイバーポリペプチドをコードする。シャフトドメインはＣＤ４６への結合には重要ではないため、シャフトドメインは任意のアデノウイルス血清型に由来し得る。従って、１つ以上のシャフトドメインは、ヒトアデノウイルス血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、それらの組み合わせ、またはそれらの機能的同等物に由来する１つ以上のシャフトドメインを含んでよいか、からなってよい。本明細書において使用される場合、シャフトドメインの「機能的同等物」は、ファイバーノブの三量体化を可能にする、シャフトドメインの任意の部分またはその変異型である。
【００６１】
一実施形態において、各シャフトドメインまたはシャフトドメインモチーフは、Ａｄ５シャフトドメイン、Ａｄ１１シャフトドメイン、Ａｄ１６シャフトドメイン、Ａｄ２１シャフトドメイン、Ａｄ３５シャフトドメイン、Ａｄ５０シャフトドメイン、およびそれらの機能的同等物、それらの組み合わせ、ならびにそれらの機能的同等物からなる群より選択される。シャフトドメインは、ＣＤ４６への結合に必要なファイバーノブの三量体化に必要である。このような同等物は、当業者が容易に判定できる。例えば、固定化された組換えＣＤ４６を含むセンサーを使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）調査を、ＣＤ４６競合調査と組み合わせて、評価される組換えポリペプチドがＣＤ４６に結合するかどうかを判定するために用いることができる。
【００６２】
シャフトドメインは、任意の好適な数（例えば１〜２２個）のシャフトドメインまたはその同等物を含んでよい。従って、様々な実施形態において、シャフトドメインは、１〜２２、１〜２１、１〜２０、１〜１９、１〜１８、１〜１７、１〜１６、１〜１５、１〜１４、１〜１３、１〜１２、１〜１１、１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、２〜２２、２〜２１、２〜２０、２〜１９、２〜１８、２〜１７、２〜１６、２〜１５、２〜１４、２〜１３、２〜１２、２〜１１、２〜１０、２〜９、２〜８、２〜７、２〜６、２〜５、２〜４、２〜３、３〜２２、３〜２１、３〜２０、３〜１９、３〜１８、３〜１７、３〜１６、３〜１５、３〜１４、３〜１３、３〜１２、３〜１１、３〜１０、３〜９、３〜８、３〜７、３〜６、３〜５、３〜４、４〜２２、４〜２１、４〜２０、４〜１９、４〜１８、４〜１７、４〜１６、４〜１５、４〜１４、４〜１３、４〜１２、４〜１１、４〜１０、４〜９、４〜８、４〜７、４〜６、４〜５、５〜２２、５〜２１、５〜２０、５〜１９、５〜１８、５〜１７、５〜１６、５〜１５、５〜１４、５〜１３、５〜１２、５〜１１、５〜１０、５〜９、５〜８、５〜７、５〜６、６〜２２、６〜２１、６〜２０、６〜１９、６〜１８、６〜１７、６〜１６、６〜１５、６〜１４、６〜１３、６〜１２、６〜１１、６〜１０、６〜９、６〜８、６〜７、７〜２２、７〜２１、７〜２０、７〜１９、７〜１８、７〜１７、７〜１６、７〜１５、７〜１４、７〜１３、７〜１２、７〜１１、７〜１０、７〜９、７〜８、８〜２２、８〜２１、８〜２０、８〜１９、８〜１８、８〜１７、８〜１６、８〜１５、８〜１４、８〜１３、８〜１２、８〜１１、８〜１０、８〜９、９〜２２、９〜２１、９〜２０、９〜１９、９〜１８、９〜１７、９〜１６、９〜１５、９〜１４、９〜１３、９〜１２、９〜１１、９〜１０、１０〜２２、１０〜２１、１０〜２０、１０〜１９、１０〜１８、１０〜１７、１０〜１６、１０〜１５、１０〜１４、１０〜１３、１０〜１２、１０〜１１、１１〜２２、１１〜２１、１１〜２０、１１〜１９、１１〜１８、１１〜１７、１１〜１６、１１〜１５、１１〜１４、１１〜１３、１１〜１２、１２〜２２、１２〜２１、１２〜２０、１２〜１９、１２〜１８、１２〜１７、１２〜１６、１２〜１５、１２〜１４、１２〜１３、１３〜２２、１３〜２１、１３〜２０、１３〜１９、１３〜１８、１３〜１７、１３〜１６、１３〜１５、１３〜１４、１４〜２２、１４〜２１、１４〜２０、１４〜１９、１４〜１８、１４〜１７、１４〜１６、１４〜１５、１５〜２２、１５〜２１、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１５〜１７、１５〜１６、１６〜２２、１６〜２１、１６〜２０、１６〜１９、１６〜１８、１６〜１７、１７〜２２、１７〜２１、１７〜２０、１７〜１９、１７〜１８、１８〜２２、１８〜２１、１８〜２０、１８〜１９、１９〜２２、１９〜２１、１９〜２０、２０〜２２、２０〜２１、２１〜２２、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２個のシャフトドメインまたはその同等物を含む。２つ以上のシャフトドメインまたは同等物が存在する場合、各シャフトドメインまたは同等物は同一であってよいか、または、シャフトドメインまたは同等物の１コピー以上が、単一の組換えポリペプチドにおいて異なってよい。一実施形態において、カセットは、単一のシャフトドメインまたは同等物をコードする。
【００６３】
別の実施形態において、１つ以上のシャフトドメインは、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列、それらの組み合わせ、またはそれらの同等物を含む：
Ａｄ１１Ｐファイバー：
ＮＧＶＬＴＬＫＣＬＴＰＬＴＴＴＧＧＳＬＱＬＫＶＧＧＧＬＴＶＤＤＴＮＧＦＬＫＥＮＩＳＡＴＴＰＬＶＫＴＧＨＳＩＧＬＰＬＧＡＧＬＧＴＮＥＮＫＬＣＩＫＬＧＱＧＬＴＦＮＳＮＮＩＣＩＤＤＮＩＮＴＬ（配列番号１１８）；
ＡＤ１６：
ＤＧＶＬＴＬＫＣＶＮＰＬＴＴＡＳＧＰＬＱＬＫＶＧＳＳＬＴＶＤＴＩＤＧＳＬＥＥＮＩＴＡＡＡＰＬＴＫＴＮＨＳＩＧＬＬＩＧＳＧＬＱＴＫＤＤＫＬＣＬＳＬＧＤＧＬＶＴＫＤＤＫＬＣＬＳＬＧＤＧＬＩＴＫＮＤＶＬＣＡＫＬＧＨＧＬＶＦＤＳＳＮＡＩＴＩＥＮＮＴＬ（配列番号１１９）；
ＡＤ２１：
ＤＧＶＬＴＬＮＣＬＴＰＬＴＴＴＧＧＰＬＱＬＫＶＧＧＧＬＩＶＤＤＴＤＧＴＬＱＥＮＩＲＡＴＡＰＩＴＫＮＮＨＳＶＥＬＳＩＧＮＧＬＥＴＱＮＮＫＬＣＡＫＬＧＮＧＬＫＦＮＮＧＤＩＣＩＫＤＳＩＮＴＬ（配列番号１２０）；
ＡＤ３５：
ＤＧＶＬＴＬＫＣＬＴＰＬＴＴＴＧＧＳＬＱＬＫＶＧＧＧＬＴＶＤＤＴＤＧＴＬＱＥＮＩＲＡＴＡＰＩＴＫＮＮＨＳＶＥＬＳＩＧＮＧＬＥＴＱＮＮＫＬＣＡＫＬＧＮＧＬＫＦＮＮＧＤＩＣＩＫＤＳＩＮＴＬ（配列番号１２１）；
ＡＤ５０：
ＤＧＶＬＴＬＮＣＬＴＰＬＴＴＴＧＧＰＬＱＬＫＶＧＧＧＬＩＶＤＤＴＤＧＴＬＱＥＮＩＲＶＴＡＰＩＴＫＮＮＨＳＶＥＬＳＩＧＮＧＬＥＴＱＮＮＫＬＣＡＫＬＧＮＧＬＫＦＮＮＧＤＩＣＩＫＤＳＩＮＴＬ（配列番号１２２）；および
ＡＤ５：
ＰＧＶＬＳＬＲＬＳＥＰＬＶＴＳＮＧＭＬＡＬＫＭＧＮＧＬＳＬＤＥＡＧＮＬＴＳＱＮＶＴＴＶＳＰＰＬＫＫＴＫＳＮＩＮＬＥＩＳＡＰＬＴＶＴＳＥＡＬＴＶＡＡＡＡＰＬＭＶＡＧＮＴＬＴＭＱＳＱＡＰＬＴＶＨＤＳＫＬＳＩＡＴＱＧＰＬＴＶＳＥＧＫＬＡＬＱＴＳＧＰＬＴＴＴＤＳＳＴＬＴＩＴＡＳＰＰＬＴＴＡＴＧＳＬＧＩＤＬＫＥＰＩＹＴＱＮＧＫＬＧＬＫＹＧＡＰＬＨＶＴＤＤＬＮＴＬＴＶＡＴＧＰＧＶＴＩＮＮＴＳＬＱＴＫＶＴＧＡＬＧＦＤＳＱＧＮＭＱＬＮＶＡＧＧＬＲＩＤＳＱＮＲＲＬＩＬＤＶＳＹＰＦＤＡＱＮＱＬＮＬＲＬＧＱＧＰＬＦＩＮＳＡＨＮＬＤＩＮＹＮＫＧＬＹＬＦＴＡＳＮＮＳＫＫＬＥＶＮＬＳＴＡＫＧＬＭＦＤＡＴＡＩＡＩＮＡＧＤＧＬＥＦＧＳＰＮＡＰＮＴＮＰＬＫＴＫＩＧＨＧＬＥＦＤＳＮＫＡＭＶＰＫＬＧＴＧＬＳＦＤＳＴＧＡＩＴＶＧＮＫＮＮＤＫＬＴＬ（配列番号１０５）。
【００６４】
別の実施形態において、１つ以上（または全て）のシャフトドメインまたは同等物は、
配列番号１２３：
ＧＶＬ（Ｔ／Ｓ）ＬＫＣ（Ｌ／Ｖ）（Ｔ／Ｎ）ＰＬＴＴ（Ｔ／Ａ）（Ｇ／Ｓ）ＧＳＬＱＬＫＶＧ（Ｇ／Ｓ）ＧＬＴＶＤ（Ｄ／Ｔ）Ｔ（Ｄ／Ｎ）Ｇ（Ｔ／Ｆ／Ｓ）Ｌ（Ｑ／Ｋ／Ｅ）ＥＮＩ（Ｇ／Ｓ／Ｋ）（Ａ／Ｖ）（Ｔ／Ｎ）ＴＰＬ（Ｖ／Ｔ）Ｋ（Ｔ／Ｓ）（Ｇ／Ｎ）ＨＳＩ（Ｇ／Ｎ）Ｌ（Ｓ／Ｐ）（Ｌ／Ｉ）Ｇ（Ａ／Ｐ／Ｎ）ＧＬ（Ｇ／Ｑ）（Ｔ／Ｉ）（Ｄ／Ｅ）（Ｅ／Ｑ）ＮＫＬＣ（Ｔ／Ｓ／Ａ）ＫＬＧ（Ｅ／Ｑ／Ｎ）ＧＬＴＦ（Ｎ／Ｄ）Ｓ（Ｎ／Ｓ）Ｎ（Ｉ／Ｓ）（Ｃ／Ｉ）（Ｉ／Ａ）（Ｄ／Ｎ／Ｌ）（Ｄ／Ｋ）Ｎ（Ｉ／−−）ＮＴＬ；
または配列番号１２４〜１２９：
Ａｄ３シャフトドメインモチーフ：ＮＳＩＡＬＫＮＮＴＬ  配列番号１２４
Ａｄ７シャフトドメインモチーフ：ＮＳＮＮＩＣＩＮＤＮＩＮＴＬ  配列番号１２５
Ａｄ５シャフトドメインモチーフ：ＧＡＩＴＶＧＮＫＮＮＤＫＬＴＬ  配列番号１２６
Ａｄ１１シャフトドメインモチーフ：ＮＳＮＮＩＣＩＤＤＮＩＮＴＬ  配列番号１２７
Ａｄ１４シャフトドメインモチーフ：ＮＳＮＮＩＣＩＤＤＮＩＮＴＬ  配列番号１２８
Ａｄ３５シャフトドメインモチーフ：ＧＤＩＣＩＫＤＳＩＮＴＬ  配列番号１２９
に記載のアミノ酸配列を含むか、からなる。
【００６５】
上記配列および本明細書に示される他の可変配列において、可変残基は括弧内に記載され、「−」は、その残基が存在しなくてよいことを示す。
【００６６】
別の実施形態において、１つ以上（または全て）のシャフトドメインまたは同等物は、
配列番号１３０：
ＧＶＬＴＬＫＣＬＴＰＬＴＴＴＧＧＳＬＱＬＫＶＧＧＧＬＴ（Ｖ／Ｉ）ＤＤＴＤＧ（Ｔ／Ｆ）Ｌ（Ｑ／Ｋ）ＥＮＩ（Ｇ／Ｓ）ＡＴＴＰＬＶＫＴＧＨＳＩＧＬ（Ｓ／Ｐ）ＬＧ（Ａ／Ｐ）ＧＬＧＴ（Ｄ／Ｎ）ＥＮＫＬＣ（Ｔ／Ａ）ＫＬＧ（Ｅ／Ｑ）ＧＬＴＦＮＳＮＮＩＣＩ（Ｄ／Ｎ）ＤＮＩＮＴＬ；または
配列番号１２４〜１２９
に記載のアミノ酸配列を含むか、からなる。
【００６７】
さらに別の実施形態において、組換えポリペプチド中の１つ以上（または全て）のシャフトドメインまたはシャフトドメインモチーフは、配列番号１５２（Ａｄ３）、配列番号１５３（Ａｄ７）、配列番号１５４（Ａｄ１１）、配列番号１５５（Ａｄ１４）、配列番号１５６（Ａｄ１４ａ）、および配列番号１２４〜１２９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、からなる。
【００６８】
さらなる実施形態において、第２の核酸モジュールは、ヒトアデノウイルステイルドメインまたはその同等物を含むアデノウイルスファイバーポリペプチドをコードする。本明細書において使用される場合、アデノウイルステイルドメインの機能的同等物は、（ヘルパーＡｄウイルス上の）カプシドのペントンベースタンパク質と相互作用する能力を維持する変異型であって、当該タンパク質の細胞核への輸送に必要なシグナルを含む変異型である。使用されるテイルドメインは、ＨＤ−Ａｄの産生のために使用されるヘルパーＡｄウイルスのカプシドのペントンベースタンパク質と相互作用するであろうテイルドメインである。従って、Ａｄ５ヘルパーウイルスが使用されるのであれば、テイルドメインはＡｄ５に由来することになる；Ａｄ３５ヘルパーウイルスが使用されるのであれば、テイルドメインはＡｄ３５に由来することになる、等である。
【００６９】
一実施形態において、テイルドメインは、Ａｄ１１テイルドメイン、Ａｄ１６テイルドメイン、Ａｄ２１テイルドメイン、Ａｄ３５テイルドメイン、Ａｄ５０テイルドメイン、およびそれらの機能的同等物からなる群より選択される。別の実施形態において、テイルドメインは、以下のタンパク質のうちの１つのアミノ酸配列を含む：
Ａｄ１１Ｐ：
ＭＴＫＲＶＲＬＳＤＳＦＮＰＶＹＰＹＥＤＥＳＴＳＱＨＰＦＩＮＰＧＦＩＳＰＮＧＦＴＱＳＰ（配列番号１３１）；
ＡＤ１６：
ＭＡＫＲＡＲＬＳＳＳＦＮＰＶＹＰＹＥＤＥＳＳＳＱＨＰＦＩＮＰＧＦＩＳＳＮＧＦＡＱＳＰ（配列番号１３２）；
ＡＤ２１：
ＭＴＫＲＶＲＬＳＤＳＦＮＰＶＹＰＹＥＤＥＳＴＳＱＨＰＦＩＮＰＧＦＩＳＰＮＧＦＴＱＳＰ（配列番号１３１）；
ＡＤ３５：
ＭＴＫＲＶＲＬＳＤＳＦＮＰＶＹＰＹＥＤＥＳＴＳＱＨＰＦＩＮＰＧＦＩＳＰＮＧＦＴＱＳＰ（配列番号１３１）；
ＡＤ５０：
ＭＴＫＲＶＲＬＳＤＳＦＮＰＶＹＰＹＥＤＥＳＴＳＱＨＰＦＩＮＰＧＦＩＳＰＮＧＦＴＱＳＰ（配列番号１３１）。
【００７０】
カセットまたはそれに由来するベクターは、組換え核酸ベクターの各末端に逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を含んでよく、ここで、ＩＴＲはＣＤ４６結合性アデノウイルス血清型に由来し、一本鎖のＨＤ−ＡｄウイルスＤＮＡが宿主細胞のＤＮＡポリメラーゼ複合体によって二本鎖ＤＮＡに変換された後に核内でのコンカテマーの形成を促進する。ＩＴＲは通常、約１００〜１５０ヌクレオチドの長さである。従って、一実施形態において、ＩＴＲは、Ａｄ１１、Ａｄ１６、Ａｄ２１、Ａｄ３５、またはＡｄ５０に由来する。別の実施形態において、ＩＴＲは、以下のうちの１つの配列を含むか、からなる：
Ａｄ１１ｐ（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：ＮＣ＿０１１２０２）
５’ＩＴＲ：ＣＡＴＣＡＴＣＡＡＴＡＡＴＡＴＡＣＣＴＴＡＴＡＧＡＴＧＧＡＡＴＧＧＴＧＣＣＡＡＴＡＴＧＴＡＡＡＴＧＡＧＧＴＧＡＴＴＴＴＡＡＡＡＡＧＴＧＴＧＧＡＴＣＧＴＧＴＧＧＴＧＡＴＴＧＧＣＴＧＴＧＧＧＧＴＴＡＡＣＧＧＣＴＡＡＡＡＧＧＧＧＣＧＧＴＧＣＧＡＣＣＧＴＧＧＧＡＡＡＡＴＧＡＣＧＴＴ（配列番号１３３）；
ＡＤ１６（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＮＵＭＢＥＲ：ＡＹ６０１６３６）
５’ＩＴＲ：ＣＡＴＴＡＴＣＴＡＴＡＡＴＡＴＡＣＣＴＴＡＴＡＧＡＴＧＧＡＡＴＧＧＴＧＣＣＡＡＣＡＴＧＴＡＡＡＴＧＡＧＧＴＡＡＴＴＴＡＡＡＡＡＡＧＴＧＣＧＣＧＣＴＧＴＧＴＧＧＴＧＡＴＴＧＧＣＴＧＣＧＧＧＧＴＧＡＡＣＧＧＣＴＡＡＡＡＧＧＧＧＣＧＧ（配列番号１３４）；
ＡＤ２１（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：ＫＦ５２８６８８）
５’ＩＴＲ：ＴＡＴＴＡＴＡＴＡＡＴＡＴＡＣＣＴＴＡＴＡＧＡＴＧＧＡＡＴＧＧＴＧＣＣＡＡＴＡＴＧＣＡＡＡＴＧＡＧＧＴＡＡＴＴＴＡＡＡＡＡＡＧＴＧＣＧＣＧＣＴＧＴＧＴＧＧＴＧＡＴＴＧＧＣＴＧＣＧＧＧＧＴＧＡＡＣＧＧＣＴＡＡＡＡＧＧＧＧＣＧＧ（配列番号１３５）；
ＡＤ３５（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：ＡＣ＿００００１９）
５’ＩＴＲ：ＣＡＴＣＡＴＣＡＡＴＡＡＴＡＴＡＣＣＴＴＡＴＡＧＡＴＧＧＡＡＴＧＧＴＧＣＣＡＡＴＡＴＧＴＡＡＡＴＧＡＧＧＴＧＡＴＴＴＴＡＡＡＡＡＧＴＧＴＧＧＧＣＣＧＴＧＴＧＧＴＧＡＴＴＧＧＣＴＧＴＧＧＧＧＴＴＡＡＣＧＧＴＴＡＡＡＡＧＧＧＧＣＧＧＣＧＣＧＧＣＣＧＴＧＧＧＡＡＡＡＴＧＡＣＧＴＴ（配列番号１３６）；および
ＡＤ５０（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：ＡＹ７３７７９８）
５’ＩＴＲ：ＣＡＡＴＣＡＡＴＡＴＡＡＴＡＴＡＣＣＴＴＡＴＡＧＡＴＧＧＡＡＴＧＧＴＧＣＣＡＡＴＡＴＧＴＡＡＡＴＧＡＧＧＴＡＡＴＴＴＡＡＡＡＡＡＧＴＧＣＧＣＧＣＴＧＴＧＴＧＧＴＧＡＴＴＧＧＣＴＧＣＧＧＧＧＴＧＡＡＣＧＧＣＴＡＡＡＡＧＧＧＧＣＧＧ（配列番号１３７）。
【００７１】
カセットまたはそれに由来するベクターは、ＣＤ４６結合性アデノウイルス血清型由来のパッケージングシグナルを含んでよい。従って、一実施形態において、パッケージングシグナルは、Ａｄ１１、Ａｄ１６、Ａｄ２１、Ａｄ３５、またはＡｄ５０に由来する。別の実施形態において、パッケージングシグナルは以下（配列番号１３９〜１４１）のうちの１つの配列を含むか、これからなり、ここで、配列番号１３９はＡｄ５パッケージングシグナルであり、配列番号１４０はＡｄ３５パッケージングシグナルであり、配列番号１４１はＡｄ５／３５パッケージングシグナルのコンセンサス配列である。
【００７２】
別の実施形態において、パッケージングシグナルは核酸切除シグナルに挟まれており、核酸切除シグナルとしては、限定されるものではないが、（Ｃｒｅリコンビナーゼと共に使用するための）ｌｏｘＰ部位または（Ｆｌｐリコンビナーゼと共に使用するための）ｆｔｒ部位が挙げられる。この実施形態は、例えば、共感染の間にＣｒｅリコンビナーゼまたはＦｌｐリコンビナーゼによって媒介されるｌｏｘＰ部位に挟まれたパッケージングシグナルの切除に基づいて、ＨＤベクター調製物からのヘルパーウイルスの除去を容易にする。
【００７３】
本発明のカセットおよびそれに由来する産生ベクターは、遺伝子治療のために使用できるヘルパー依存型アデノウイルス（ＨＤ−Ａｄ）の産生に特に有用である。一実施形態において、遺伝子治療患者への投与後のＨｄ  Ａｄの増殖ならびに任意の他の潜在的な毒性の問題を避けるために、カセットは他のアデノウイルスタンパク質を含まず、これは遺伝子治療用途に最適である。
【００７４】
別の実施形態において、カセットまたはそれに由来するベクターは、ＣＤ３４＋細胞において活性を有するプロモーターに機能可能に連結された導入遺伝子をさらに含んでよい。本明細書に記載されるものなど、任意の好適なプロモーターを使用してよい。この実施形態は、カセットまたはそれに由来するベクターを遺伝子治療の媒体（ｖｅｈｉｃｌｅｓ）として使用することを可能にする。ＨＤ−Ａｄベクターの挿入収容能力は、いくつかのＥＮおよび相同性ドナーテンプレートの収容を可能にする３０ｋｂである。これは、遺伝子治療目的のための、または複遺伝子性のヒト疾患用の適切なモデルを確立するための、ＨＳＣにおける複数の遺伝子の同時編集には重要である。この実施形態において、ヌクレアーゼは、ＣＤ３４＋細胞ゲノム上の目的の標的内にＤＮＡ切断を生じさせて、ゲノムへの導入遺伝子の組込みを可能にする。
【００７５】
一実施形態において、第１の組換え部位および第２の組換え部位が導入遺伝子に隣接し、ここで、第１の組換え部位および第２の組換え部位は、導入遺伝子のための所望の挿入部位に隣接するＣＤ３４＋細胞ゲノムＤＮＡ中の部位を標的とする。従って、ゲノムへの目的の導入遺伝子の組込みのために、標準的な相同組換え技術を使用できる。ゲノム上の目的の標的部位に基づいて、カセットにおいて使用するための適切な組換え部位を決定することは、当業者の通常のレベルの範囲内である。
【００７６】
カセットまたはそれに由来するベクターは、好ましくは少なくとも２８ｋｂの長さであり、２８〜３５ｋｂの長さであってよい。当業者には公知のように、任意の好適な核酸配列を「スタッファー」配列として使用できる。非限定的な一実施形態において、スタッファーＤＮＡは、スクランブルされた（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）ヒトＸ染色体ＤＮＡを含んでよい。
【００７７】
核酸カセットは、任意のＤＮＡまたはＲＮＡであってよく、本明細書の教示に基づいて、標準的な分子生物学的手法を用いて調製および単離できる。核酸は、カセットの発現および／または精製の促進に有用な追加のドメインを含んでよい。
【００７８】
さらなる態様では、本発明は、本発明の核酸カセットを含む組換え核酸ベクターを提供する。限定されるものではないがプラスミドベクターを含め、任意の好適なベクターを使用できる。一部の実施形態において、ベクターは、所望のＨＤ−Ａｄゲノムの一部（すなわち、少なくとも第１の核酸モジュール、および必要に応じてさらに第２の核酸モジュールおよび導入遺伝子（複数可））を含むシャトルベクター（シャトルプラスミドなど）である。このようなシャトルベクターを使用して核酸ベクターを大量に作製することができ、その後、当該核酸ベクターを使用して発現カセットの所望の領域を産生ベクターにサブクローニングできる。一実施形態において、シャトルベクターは第１の核酸モジュールを含み、この第１の核酸モジュールを、その後、第２の核酸モジュール、ＩＴＲ、スタッファー配列、パッケージングシグナル、および／または導入遺伝子（複数可）を含む産生ベクターにクローニングできる。別の実施形態において、シャトルベクターは第１の核酸モジュールおよび第２の核酸モジュールを含み、これらの第１の核酸モジュールおよび第２の核酸モジュールを、その後、ＩＴＲ、スタッファー配列、パッケージングシグナル、および／または導入遺伝子（複数可）を含む産生ベクターにクローニングできる。さらに別の実施形態において、シャトルベクターは第１の核酸モジュールおよび第２の核酸モジュールおよび導入遺伝子（複数可）を含み、これらの第１の核酸モジュールおよび第２の核酸モジュールおよび導入遺伝子（複数可）を、その後、ＩＴＲ、スタッファー配列、およびパッケージングシグナルを含む産生ベクターにクローニングできる。好適なシャトルベクターおよび産生ベクター（プラスミドベクターなど）の選択は、本明細書の教示に基づいた当業者の通常のレベルの範囲内である。
【００７９】
別の態様では、本発明は、本発明の任意の実施形態または実施形態の組み合わせの発現カセットを含む組換え宿主細胞を提供する。組換え宿主細胞は、カセットを発現できる任意の好適な宿主細胞であってよく、好ましくは本明細書に記載されるような産生細胞であり、これには、限定されるものではないが、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞、ＨＥＫ２９３−Ｃｒｅ細胞、ＰｅｒＣ６細胞、ＨＣＴ１１６細胞等が包含される。一実施形態において、産生細胞はＨＥＫ２９３細胞またはＨＥＫ２９３−Ｃｒｅ細胞である。組換え宿主細胞は、カセットにコードされたｍｉＲＮＡ標的部位が結合するｍｉＲＮＡを産生してよい。
【００８０】
さらなる実施形態において、宿主細胞はヘルパーアデノウイルスをさらに含む。本発明のＨＤ−Ａｄベクターの増殖は、ヘルパーＡｄベクターを用いた産生細胞の共感染に依存し、当該ヘルパーＡｄベクターは、全ての必要なＡｄタンパク質（すなわち、Ｅ１領域およびＥ３領域にコードされるタンパク質以外の全てのウイルスタンパク質）をトランスで供給し、さらに、カセット上のＡｄファイバーポリペプチド遺伝子の発現に必要なアデノウイルスのプロモーター配列（すなわち、Ａｄ主要後期プロモーター）を供給する。ヘルパー依存型アデノウイルスの産生のためのヘルパーアデノウイルスの使用は、当技術分野において深く理解されている（例えば、Ｋｏｃｈａｎｅｋ，Ｓ．，Ｇ．Ｓｃｈｉｅｄｎｅｒ，ａｎｄ  Ｃ．Ｖｏｌｐｅｒｓ．２００１．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ３：４５４−４６３を参照のこと）。一実施形態では、導入遺伝子を含む発現カセットをＨＤ−Ａｄ産生プラスミドにクローニングした後、そのコンストラクトを直線化してＨＤ−Ａｄ産生細胞の細胞にトランスフェクトし、その後、この細胞をヘルパーウイルスに感染させる。好適な数（３など）の連続的なプレ増幅工程（ｐｒｅ−ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｔｅｐｓ）の後、大スケールのＨＤ−Ａｄ産生を懸濁培養液中で実施する。精製については、超遠心分離を用いて塩化セシウム密度勾配によりウイルスを単離する。
【００８１】
従って、別の態様では、本発明は、本発明のＨＤ−Ａｄウイルスを作製するための方法であって、ヘルパーアデノウイルスを用いて形質導入された本発明の組換え宿主細胞を、ヘルパー依存型アデノウイルスの構築に十分な程度に発現カセット上およびヘルパーアデノウイルス上の遺伝子の発現を促進するのに好適な条件下で培養することを含む方法を提供する。ヘルパー依存型アデノウイルスの構築に十分な程度に発現カセット上およびヘルパーアデノウイルス上の遺伝子の発現を促進するために本発明の組換え宿主細胞を培養するための適切な条件を決定することは、本明細書の開示に基づいた当業者の通常のレベルの範囲内である。任意の好適な手法を用いて、ＨＤベクター調製物からのヘルパーウイルスの除去を実施してよい。非限定的な例示的条件は、以下の実施例において提供される。一実施形態において、パッケージング部位に隣接するｌｏｘＰ切除シグナルをカセットが含む場合、単離は、共感染の間にＣｒｅリコンビナーゼによって媒介される、ｌｏｘＰ部位に挟まれたパッケージングシグナルの切除の使用を含んでよい。この実施形態では、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現する細胞（２９３−Ｃｒｅなど）中においてＨＤ−Ａｄの増幅がなされてよい。
【００８２】
別の態様では、本発明は、本発明の任意の実施形態または実施形態の組み合わせの発現カセットをゲノムとして含む組換えヘルパー依存型アデノウイルスを提供する。本明細書に開示されるものを含め、任意の好適な方法を用いて組換えヘルパー依存型アデノウイルスを作製できる。
【００８３】
別の態様では、本発明は、本発明の任意の実施形態または実施形態の組み合わせの組換えヘルパー依存型Ａｄウイルスを用いた、造血細胞の遺伝子治療を必要とする対象の末梢血中に骨髄から動員された造血細胞のインビボでの形質導入、を含む造血細胞の遺伝子治療のための方法を提供し、ここで、ヌクレアーゼは、破壊されるべき造血細胞ゲノム上の遺伝子を標的とし、造血細胞ゲノム上の遺伝子の破壊は対象に治療上の利点をもたらす。
【００８４】
発明者らは、骨髄から末梢血流中へのＣＤ３４＋造血細胞（造血幹細胞（ＨＳＣ）など）の動員および本発明の任意の実施形態または実施形態の組み合わせのヘルパー依存型アデノウイルスベクターの（静脈内注射などによる）投与に基づいた、ＨＳＣの遺伝子編集／治療のための新規のインビボの手法を開発した。本発明のＨｄ−Ａｄベクターに対する細胞側の受容体は、ヒトＨＳＣ上において一様に高レベルで発現しているタンパク質であるＣＤ４６である。この方法は、動員されたＣＤ３４＋細胞のＨｄ−Ａｄによる形質導入、形質導入されたＣＤ３４＋細胞の骨髄への帰還（ｒｅｈｏｍｉｎｇ）、および形質導入された細胞（血液細胞の全系統の供給源としてのＨＳＣなど）の長期残存をもたらす。
【００８５】
ＨＳＣへのＥＮ遺伝子の送達のための本発明のＨＤ−Ａｄベクタープラットフォームは、他の送達システムを上回る大きな利点を有する。（ｉ）本発明のＨＤ−Ａｄベクタープラットフォームは、細胞毒性の少ない、原始ＨＳＣ（ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ＨＳＣ）の効率的な標的化を可能にする。（ｉｉ）ＨＤ−Ａｄベクターの挿入収容能力は、いくつかのＥＮおよび相同性ドナーテンプレートの収容を可能にする３０ｋｂである。これは、遺伝子治療目的のための、または複遺伝子性のヒト疾患用の適切なモデルを確立するための、ＨＳＣにおける複数の遺伝子の同時編集に有用である。また、ＨＤ−ＡＤベクターの使用は、ＥＮ発現カセットおよび幅のある相同領域を有するドナー導入遺伝子の両方を１つのベクターにまとめることを可能にする。この場合においては、相同組換えの効率は相同領域の長さと直接相関することに留意すべきである。（ｉｉｉ）本発明のＨＤ−Ａｄベクターは、インビボにおける標的細胞の形質導入を可能にする。ヒトＣＤ３４＋／ＮＯＧマウスおよびヒトＣＤ４６−トランスジェニックマウスにおける我々の予備的研究は、本発明のＨＤ−Ａｄベクターが、静脈内注射の後に、動員されたＨＳＣを形質導入できるということを示す。
【００８６】
形質導入率は、標的細胞への到達のしやすさ（ｔａｒｇｅｔ  ｃｅｌｌ  ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）を含め、いくつかの因子に影響される。ＨＳＣの動員がない場合、（静脈内注射などによる）本発明のＨＤ−Ａｄの投与は、ＣＤ３４＋細胞の形質導入をもたらさないであろう。
【００８７】
以下の実施例において、我々は、インビボで形質導入されたＨＳＣが骨髄に帰還し、そこで機能的なＨＳＣのまま存在するということをヒトＣＤ４６トランスジェニック（ｈＣＤ４６ｔｇ）マウスおよび生着したヒトＨＳＣを有するＮＯＧマウス（ＮＯＧ／ｈＣＤ３４＋）において示している。インビボでの形質導入後３日目において、骨髄に局在するＨＳＣのうち最高で１５％が導入遺伝子を発現した。
【００８８】
末梢血中へのＣＤ３４＋造血細胞（ＨＳＣなど）の動員のための任意の好適な方法を使用できる。様々な非限定的実施形態において、対象は、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、プレリキサホル（ＡＭＤ３１００；ＣＸＣＲ阻害剤）、ＰＯＬ５５５１（ＣＸＣＲ４アンタゴニスト）（Ｋａｒｐｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ（２０１３）２７，２３２２−２３３１）、ＢＩＯ５１９２（ＶＬＡ−４の小分子阻害剤）（Ｒａｍｉｒｅｚ，ｅｔ  ａｌ．，２００９．Ｂｌｏｏｄ  １１４：１３４０−１３４３）、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される動員剤を投与される。特定の実施形態において、動員剤は以下のように組み合わされてよい：
（ａ）顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）＋プレリキサホル（ＡＭＤ３１００；ＣＸＣＲ阻害剤）；
（ｂ）ＧＣＳＦ＋ＰＯＬ５５５１（ＣＸＣＲ４アンタゴニスト）；および
（ｃ）ＧＣＳＦ＋ＢＩＯ５１９２（ＶＬＡ−４の小分子阻害剤）。
【００８９】
担当の医療関係者によって決定される通りに全ての状況下において最も適切と認められる動員剤を用いて動員が達成されてよい。当業者には理解されるように、動員剤は、１回以上（すなわち、１、２、３、４、５、６回、または７回以上）投与されてよい。このような投与は、１日に複数回であるか、複数の日にわたって分散してよい。動員剤の投与量の範囲は、全ての状況に基づいて担当の医療関係者によって決定されてよい。同様に、ＨＤ−Ａｄは、１回以上（すなわち、１、２、３、４、５、６回、または７回以上）投与されてよい。このような投与は、１日に複数回であるか、複数の日にわたって分散してよい。ＨＤ−Ａｄの投与量の範囲は、全ての状況に基づいて担当の医療関係者によって決定されてよい。さらに当業者には理解されるように、処置は、１回または複数回の動員／ＨＤ−Ａｄ投与を含んでよい。様々な非限定的実施形態において、ＡＭＤ３１００を利用した動員から約１時間後に、またはＰＯＬ５５５１を利用した動員から約２時間後に、ＨＤ−Ａｄを投与できる。さらなる非限定的かつ例示的な処置のスケジュールを図８に示す。
【００９０】
対象は、造血細胞の遺伝子治療を必要とする任意の哺乳動物対象であってよく、これには、限定されるものではないが、霊長類、げっ歯類、イヌ、ネコ、ウマ等が包含される。一実施形態において、対象は、ヒトなどの哺乳動物である。対象は、造血細胞疾患に罹患していてよいか（治療的な遺伝子治療）、または、このような疾患のリスクがある状態であってよい（予防的な遺伝子治療）。このような造血細胞疾患の例としては、限定されるものではないが、β−サラセミア、ヒト免疫不全ウイルス感染症および／または後天性免疫不全症候群、エボラウイルス感染症、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス感染症、ならびに重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルス感染症が挙げられる。それぞれの場合において、対象は、既に疾患を有していてよいか、または疾患のリスクがある状態であってよい。
【００９１】
例えば、ＨＩＶ感染のためのＣＤ４の共受容体は２種類（ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４）存在する。感染後早いうちに感染個体から単離されたＨＩＶは、主にＣＣＲ５向性であり、これは、感染の初期段階の間のこれらのウイルスの選択的優位性を示す（５４，６１）。コーカサス人種の約１％に見出される、ｃｃｒ５遺伝子におけるホモ接合型Δ３２欠失は、ＨＩＶ−１に対する自然抵抗性を付与する（４，６３）。この変異を保持する個体は、おそらくはケモカインシステムの重複的性質に起因して、健康である。最近の研究では、急性骨髄性白血病およびＨＩＶ−１感染症を有する患者における、ｃｃｒ５  Δ３２についてホモ接合型であるドナー由来の造血幹／前駆細胞（ＨＳＣ）の移植がＨＩＶの長期的抑制をもたらすことが示された（４９）。従って、本発明の方法を、ＨＳＣ（ＣＤ３４＋細胞）においてＣＣＲ５を排除するために使用できる。ＨＳＣは、血液細胞の全系統の供給源であるため、ｃｃｒ５のノックアウトは、形質導入されたＨＳＣから派生するＣＤ４＋細胞を保護するだけでなく、ＨＩＶ感染の標的となる可能性がある残り全てのリンパ系および骨髄系の細胞型をも保護するであろう。インビボでの寿命が比較的限られているＣＤ４＋細胞の移植とは対照的に、単一のＨＳＣの移植は、長期的な保護またはＨＩＶ／ＡＩＤＳの抑制を可能にするであろう。この実施形態において、ＨＤ−Ａｄのヌクレアーゼは、ＣＣＲ５をコードする遺伝子内にＤＮＡ切断を生じさせることができる。非限定的な一実施形態において、ヌクレアーゼは、配列番号９１〜９３のヌクレアーゼを含むか、これからなり、方法は、ＨＩＶに感染している対象またはＨＩＶを発症するリスクのある対象（限定されるものではないが、商業的セックスワーカー、注射薬物の使用者、感染不一致の関係にある人々、および、コンドームを使用しないことを選択するハイリスクなグループのメンバーが包含される）においてＡＩＤＳの発症を処置または制限するために使用される可能性がある。
【００９２】
当業者には理解されるように、同様の手法が、エボラ（ニーマンピック病Ｃ１型レセプター（ＮＰＣ１）を標的とするヌクレアーゼ）およびＳＡＲＳ（アンジオテンシン変換酵素２型レセプター（ＡＣＥ２）を標的とするヌクレアーゼ）、ならびにＨＳＣにおいて遺伝子の発現を阻害／排除することによって処置または制限できる任意の他の疾患の発症を処置または制限するために使用される可能性がある。
【００９３】
本明細書において使用される場合、「処置する」、「処置」、または「処置すること」なる用語は、処置されている疾患の症状または状態の進行または重症度を逆戻りさせる、緩和する、寛解させる、抑制する、遅らせる、または停止させることを意味する。「処置すること」なる用語は、状態の少なくとも１つの有害作用または症状を低減または緩和することを包含する。処置は一般に、１つ以上の症状が低減すれば「有効」である。あるいは、処置は、状態の進行が低減または停止すれば「有効」である。すなわち、「処置」は、症状の改善だけでなく、処置がない場合に予想される症状の進行または悪化を停止させるか遅らせることも包含してよい。有益な臨床結果または所望の臨床結果としては、限定されるものではないが、１つ以上の症状の緩和、欠陥の程度の減少、疾患の状態の安定化（すなわち悪化しないこと）、疾患を遅滞させるか遅らせること、および処置がない場合に予想される寿命と比べて寿命を増加させることが挙げられる。
【００９４】
本明細書において使用される場合、「投与すること」なる用語は、適切と認められる方法または経路によって対象内に組換えヘルパー依存型Ａｄウイルスを配置することを指す。ＨＤ−Ａｄは、好適な医薬製剤の一部として投与されてよい。限定されるものではないが生理食塩水またはリン酸緩衝食塩水を含め、任意の医薬的に許容される製剤を使用できる。静脈内投与を含め、有効な処置を対象にもたらす任意の適切な経路によって治療が投与され得る。投与計画は、最適な所望の応答（例えば、治療的または予防的な応答）をもたらすように調整され得る。好適な投与量の範囲は、例えば、２×１０ｅ１０ｖｐ／ｋｇであってよい。組換えヘルパー依存型Ａｄウイルスは、単回ボーラスで送達され得るか、または、主治医によって決定される通りに２回以上（すなわち、２、３、４、５回、または６回以上）投与されてよい。
【００９５】
別の態様では、本発明は、本発明の任意の実施形態または実施形態の組み合わせの組換えヘルパー依存型Ａｄウイルスを用いた、造血細胞の遺伝子治療を必要とする対象の末梢血中に動員された造血細胞のインビボでの形質導入、を含む造血細胞の遺伝子治療のための方法を提供し、ここで、組換え核酸発現カセットは、ＣＤ３４＋細胞において活性を有するプロモーターに機能可能に連結された導入遺伝子を含み、導入遺伝子は少なくとも第１の組換え部位および第２の組換え部位に挟まれており、第１の組換え部位および第２の組換え部位は、導入遺伝子のための所望の挿入部位に隣接する造血細胞ゲノムＤＮＡ中の部位を標的とし、所望の挿入部位への導入遺伝子の挿入は対象に治療上の利点をもたらす。
【００９６】
この態様は上述の方法に類似するが、造血遺伝子治療（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ）による処置に影響されやすい疾患の発症を処置または制限するために（上述の標的化された遺伝子破壊に代えて、またはそれと組み合わせて）ＣＤ３４＋ゲノム中への標的化された導入遺伝子の挿入を含む。
【００９７】
例えば、β−サラセミアは、成人ヘモグロビンのβ−グロビン鎖の産生を減少または消失させる変異によって引き起こされる先天性溶血性貧血である。この欠陥は、無効な赤血球生成および溶血性貧血を引き起こす。適合するドナーがいない患者については、グロビンの遺伝子治療が治癒をもたらす。従って、本発明の方法は、導入遺伝子がβ−グロビン遺伝子、ガンマ−グロビン遺伝子、グロビンＬＣＲ、抗体遺伝子、Ｔ細胞受容体遺伝子、キメラ抗原受容体遺伝子であるＨＤ−Ａｄベクターの使用を含んでよい。
【００９８】
本発明の方法のいずれかの一実施形態において、組換えヘルパー依存型Ａｄウイルスは、静脈内注射によって投与される。別の実施形態において、１コピー以上のｍｉＲＮＡは、配列番号１〜９０からなる群より選択される。さらなる実施形態において、ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、およびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼからなる群より選択される。別の実施形態において、ヌクレアーゼは、ＣＣＲ５、β−グロビン、ＣＲ２（ＥＢＶ受容体）、ＮＰＣ１（エボラ受容体）、ＡＣＥ２（ＳＡＲＳ受容体）をコードする遺伝子、およびミスフォールドした場合にリソソーム蓄積症を導く可能性のあるタンパク質をコードする遺伝子からなる群より選択されるＣＤ３４＋細胞ゲノム上の標的内にＤＮＡ切断を生じさせることができる。さらなる実施形態において、ヌクレアーゼは、配列番号９１〜９３のアミノ酸配列を含む。
【００９９】
別の態様では、本発明は、配列番号１〜９０からなる群より選択される核酸配列の逆相補配列を含むか、からなるｍｉＲＮＡ標的部位を２コピー以上含む組換え核酸を提供する。それらのｍｉＲＮＡ標的部位は、全て同一であってよいか、または異なってよい。様々な実施形態において、組換え核酸は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０コピー、または１１コピー以上のｍｉＲＮＡ標的を含む。一実施形態において、ｍｉＲＮＡ標的部位は全体として、少なくとも２種の異なるｍｉＲＮＡのための標的部位を含む。
【０１００】
例えば、ｍｉＲＮＡ標的部位に結合するｍｉＲＮＡを発現する細胞において発現すると生じた融合ＲＮＡが分解されることになるように、目的の任意のコード領域に融合するためのモジュールとして、本発明のこの態様の組換え核酸を使用できる。このような細胞としては、限定されるものではないが、ＨＥＫ２９３細胞およびＨＥＫ２９３−Ｃｒｅ細胞などのウイルス産生細胞が挙げられる。この態様の組換え核酸は、本発明のカセットおよびＨＤ−Ａｄベクターにおいて使用でき、また、例えば、ＨＥＫ２９３細胞およびＨＥＫ２９３−Ｃｒｅ細胞において産生される任意の他のウイルスベクター（レンチウイルスベクターおよびｒＡＡＶベクターなど）の産生において使用してもよい。
【０１０１】
一実施形態において、組換え核酸は、ＣＡＣＵＧＧＵＡＧＡ（配列番号１）（ｈａｓ−ｍｉＲ１８３−５ｐのコア）を含むｍｉＲＮＡ（限定されるものではないが配列番号１０〜３９が包含される）に結合する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位と、ＵＧＵＧＣＵＵＧＡＵＣＵＡＡ（配列番号２）（ｈａｓ−ｍｉＲ２１８−５ｐのコア）を含むｍｉＲＮＡ（限定されるものではないが配列番号４０〜７１が包含される）に結合する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位と、を含む。別の実施形態において、組換え核酸は、ＣＡＣＵＧＧＵＡＧＡ（配列番号１）（ｈａｓ−ｍｉＲ１８３−５ｐのコア）を含むｍｉＲＮＡ（限定されるものではないが配列番号１０〜３９が包含される）に結合する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位と、ＣＡＣＵＡＧＣＡＣＡ（配列番号３）（ｍｉＲ９６−５ｐのコア）を含むｍｉＲＮＡ（限定されるものではないが配列番号７２〜９０が包含される）に結合する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位と、を含む。さらなる実施形態において、組換え核酸は、ＵＧＵＧＣＵＵＧＡＵＣＵＡＡ（配列番号２）（ｈａｓ−ｍｉＲ２１８−５ｐのコア）を含むｍｉＲＮＡ（限定されるものではないが配列番号４０〜７１が包含される）に結合する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位と、ＣＡＣＵＡＧＣＡＣＡ（配列番号３）（ｍｉＲ９６−５ｐのコア）を含むｍｉＲＮＡ（限定されるものではないが配列番号７２〜９０が包含される）に結合する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位と、を含む。さらなる実施形態において、組換え核酸は、ＣＡＣＵＧＧＵＡＧＡ（配列番号１）（ｈａｓ−ｍｉＲ１８３−５ｐのコア）を含むｍｉＲＮＡ（限定されるものではないが配列番号１０〜３９が包含される）に結合する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位と、ＵＧＵＧＣＵＵＧＡＵＣＵＡＡ（配列番号２）（ｈａｓ−ｍｉＲ２１８−５ｐのコア）を含むｍｉＲＮＡ（限定されるものではないが配列番号４０〜７１が包含される）に結合する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位と、ＣＡＣＵＡＧＣＡＣＡ（配列番号３）（ｍｉＲ９６−５ｐのコア）を含むｍｉＲＮＡ（限定されるものではないが配列番号７２〜９０が包含される）に結合する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位と、を含む。
【０１０２】
上記の実施形態のいずれかの一実施形態において、ｍｉＲＮＡ標的部位の各コピーは、天然に存在する核酸分子においてはｍｉＲＮＡ標的部位と一緒に存在することのないスペーサーによって隔てられている。様々な非限定的例において、スペーサーは、１〜１０、２〜９、３〜８、４〜７、または５〜６ヌクレオチドの長さであってよい。
【０１０３】
さらなる実施形態において、本発明は、プロモーター配列に機能可能に連結された本発明のこの態様の組換え核酸を含む核酸発現ベクターを提供する。
【０１０４】
実施例１
要約：
部位特異的エンドヌクレアーゼを用いたゲノム編集は、基礎的な生物医学研究ならびに遺伝子治療に対して意義を有する。我々は、動員された成人ドナー由来のヒトＣＤ３４＋造血幹細胞（ＨＳＣ）におけるジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）媒介性または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）媒介性のゲノム編集のためのヘルパー依存型カプシド修飾アデノウイルス（ＨＤ−Ａｄ５／３５；Ａｄ５シャフト（２２個のシャフトドメイン）、Ａｄ５テイルおよびＡｄ３５変異型ノブドメイン（配列番号１００））ベクターを作製した。これらのベクターの産生には、ＨＤ−Ａｄ５／３５産生２９３−Ｃｒｅ細胞におけるＺＦＮおよびＴＡＬＥＮの発現を抑制することが必要であった。これを行うために、我々は、２９３−Ｃｒｅ細胞およびＣＤ３４＋細胞のｍｉＲＮＡ発現プロファイリングに基づいて、遺伝子発現の制御のための、ｍｉＲＮＡを利用したシステムを開発した。ｍｉＲ−１８３−５ｐおよびｍｉＲ−２１８−５ｐを利用した、導入遺伝子の遺伝子発現の制御を用いて、我々は最初に、ＨＩＶ共受容体遺伝子ｃｃｒ５に特異的なＺＦＮを発現するＨＤ−Ａｄ５／３５ベクターを作製した。我々は、ＨＤ−Ａｄ５／３５．ＺＦＮｍｉＲベクターが原始ＨＳＣ（すなわち長期培養開始細胞およびＮＯＤ／ＳＣＩＤ再増殖細胞）においてｃｃｒ５のノックアウトをもたらすことを示した。移植を受けたマウスの骨髄に見出される生着したＨＳＣにおいて達成されたｃｃｒ５遺伝子の破壊頻度は、これらの細胞が、ＨＩＶの標的およびリザーバーとなる全系統を含む複数の系統を生じさせ得ることを考慮すると、ＨＩＶの治療に関して臨床的に適切なものであった。我々は、グロビンＬＣＲ内のＤＮアーゼ過感受性領域２（ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｒｅｇｉｏｎ  ２）（ＨＳ２）を標的とするＴＡＬＥＮを発現する第２のＨＤ−Ａｄ５／３５ベクターを作製した。このベクターは、異常ヘモグロビン症において、標的を定めて遺伝子を修正できる可能性がある。部位特異的エンドヌクレアーゼの発現のための、ｍｉＲＮＡにより制御されるＨＤ−Ａｄ５／３５ベクタープラットフォームは、治療を目的としたＨＳＣのゲノム操作のためのツールとして現在使用されているベクターを上回る利点を数多く有する。
【０１０５】
序論
造血幹細胞（ＨＳＣ）は、遺伝子治療の重要な標的である。ＨＳＣの遺伝子治療における主要な課題は、予め選択されたゲノム上の部位にＤＮＡ切断を標的化する人工的な部位特異的エンドヌクレアーゼ（ＥＮ）を用いたＨＳＣゲノムの部位特異的改変である。ＥＮは、遺伝子をノックアウトするため、フレームシフト変異を修正するため、または野生型のｃＤＮＡを本来の部位または本来とは異なる部位にノックインするために利用される。現在、ゲノム中に部位特異的なＤＮＡ切断を生じさせるための、いくつかの異なるＥＮプラットフォームが存在する［１］。ＥＮのうちの１グループは、ＤＮＡ結合タンパク質ドメインを含む。このグループには、ＤＮＡ結合特性およびヌクレアーゼ特性を有するメガヌクレアーゼ、ならびに、ＤＮＡ結合ドメインが細菌のエンドヌクレアーゼＦｏｋＩと融合されているＺＦＮおよびＴＡＬＥＮが包含される。ＦｏｋＩによるＤＮＡ切断には、各ＤＮＡ鎖に結合した２分子のＦｏｋＩが必要となるため、ＦｏｋＩを含むＥＮの２つのサブユニットが発現される必要がある。第２のグループのＥＮは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ認識に基づいており、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９なる細菌のシステムを利用する。いくつかの手法が、ＥＮ発現カセットをＨＳＣに送達するために使用されてきた。標的となるゲノム上の配列の永久的な改変を達成するためにはＥＮが短時間しか発現しないことが必要であると考えられるため、ＥＮカセット送達システムの大半は、ＥＮ遺伝子を宿主ゲノム中に組み込むことなくＥＮの一過性発現のみを可能にする。
【０１０６】
ＣＣＲ５  ＺＦＮを発現するＨＤ−Ａｄベクターを作製するという我々の試みの中で、Ｔｅｔ誘導性の導入遺伝子の発現を可能にしたベクターは、Ｋｒｕｐｐｅｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｂｏｘ（ＫＲＡＢ）ドメインとテトラサイクリンリプレッサーの融合物を使用していた。我々は、ＧＦＰを発現するＨＤ−Ａｄ５／３５ベクターを作製し、Ｔｅｔで誘導した場合の２９３細胞におけるバックグラウンド発現が抑制されることを示した。しかし、そのＧＦＰ遺伝子をＣＣＲ５  ＺＦＮ遺伝子に置き換えると、生じたＨＤ−Ａｄゲノム（精製した粒子から単離したもの）は、ゲノム再編成、およびＺＦＮカセットの一部の欠失を示した（データは示さない）。
【０１０７】
ＣＤ３４＋細胞においてＥＮを発現するＨＤ−Ａｄ５／３５ベクターを作製するために、ペイロードの発現を２９３細胞では抑制するがＣＤ３４＋細胞では可能にするための、ｍｉＲＮＡにより制御されるシステムを我々は開発した。これにより、我々は、産生の間のベクターのゲノム再編成を伴うことなく高力価で、機能的に活性を有するＺＦＮまたはＴＡＬＥＮのいずれかを発現するＨＤ−Ａｄ５／３５ベクターを作製できるようになった。ＣＣＲ５  ＺＦＮを発現するＨＤ−Ａｄ５／３５ベクターが原始ヒトＨＳＣにおいて、これらの細胞の生存率および分化能に影響することなく、期待されるような効率的なノックアウトをもたらすことを我々は示した。
【０１０８】
結果
ヒト造血ＣＤ３４＋幹細胞においてＺＦＮ導入遺伝子またはＴＡＬＥＮ導入遺伝子を発現するＨＤ−Ａｄ５／３５ベクターを作製するために、我々は、ｍｉＲＮＡにより制御される遺伝子発現システムを使用した。所与の細胞型において高レベルで発現するｍｉＲＮＡのための標的部位を導入遺伝子のｍＲＮＡが含む場合、この細胞型では当該ｍＲＮＡが分解され、導入遺伝子の発現が抑制されることになる。ＨＤ−Ａｄ産生細胞（すなわち２９３−Ｃｒｅ細胞）では導入遺伝子の発現を抑制するが、我々の標的である細胞（すなわちヒトＣＤ３４＋ＨＳＣ）では当該発現をもたらすであろう、ｍｉＲＮＡにより制御される発現システムを確立することを、両方の細胞型におけるｍｉＲＮＡ発現プロファイルを確立することによって我々は目指した。Ａｄの感染がｍｉＲＮＡ発現プロファイルに干渉する可能性があったため、我々は、ＨＤ−Ａｄベクターの増幅に使用されるＭＯＩである２０ｐｆｕ／細胞のＭＯＩにてＡｄ５／３５ヘルパーウイルスを用いて２９３−Ｃｒｅ細胞を感染させた［２８］。４人の異なる成人ドナー（ＧＣＳＦで動員）由来のＣＤ３４＋細胞をプールし、ＣＤ３４＋細胞の効率的な形質導入をもたらすＭＯＩである２０００ｖｐ／細胞のＭＯＩにて、ＧＦＰを発現するＨＤ−Ａｄ５／３５ベクターを用いて感染させた［１８］。Ａｄの感染から２４時間後に全ＲＮＡを精製し、２０００超の種々のヒトｍｉＲＮＡプローブを含むｍｉＲＮＡアレイチップ上にハイブリダイズさせた（図１ａ）。２９３−Ｃｒｅ細胞では高レベルで発現するがＣＤ３４＋細胞では存在しないか低発現である候補ｍｉＲＮＡが合計で８つ存在した（図１ａ）。候補ｍｉＲＮＡの発現レベルをリアルタイムＰＣＲによって測定した（図１ｂ）。Ｈｓａ−ｍｉＲ−７−５ｐおよびｈｓａ−ｍｉＲ−１８ａ−５ｐを候補リストから除外した。これは、これらがＣＤ３４＋細胞においても比較的高レベルで発現していたためである。ｍｉＲ−９６−５ｐは、ｍｉＲＮＡの５’末端において他のｍｉＲＮＡと同一のシード配列（すなわちｍｉＲＮＡの標的特異性を厳密に決定する配列［２９］）を有していた。そのため、我々はｍｉＲ−９６−５ｐを我々の選択に含めなかった。次に我々は、２種のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−１８３−５ｐおよびｈｓａ−ｍｉＲ−２１８−５ｐ）を選択した。これらは、２９３−Ｃｒｅ細胞においては最も高い発現レベルを有し、ＣＤ３４＋細胞では検出不能であったか（ｈｓａ−ｍｉＲ−１８３−５ｐ）、あるいは検出可能な最低レベルで発現していた（ｈｓａ−ｍｉＲ−２１８−５ｐ）。ｍｉＲＮＡにより制御されるシステムを確立するために、我々は、選択された２種のｍｉＲＮＡに対して１００％の相同性を有する４つの標的部位を単独で、および組み合わせて、グロビン遺伝子の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）内に挿入した。当該ＵＴＲを、ＣＤ３４＋細胞において高い活性を有するプロモーターであるＥＦ１αプロモーターの制御下にあるＧＦＰ遺伝子の３’末端に連結した（図２ａ）。これらのＧＦＰ発現カセットを第１世代Ａｄ５／３５ベクターに挿入した。また、これらのベクターは、選択されたｍｉＲＮＡによって制御されないＰＧＫプロモーター駆動性ｍＣｈｅｒｒｙ（商標）発現���セットも含んだ。ｍｉＲＮＡにより制御されるＧＦＰの発現をｍＣｈｅｒｒｙ（商標）の発現に対して標準化することで、異なるベクターおよび細胞型の間における形質導入効率の差を補正することが可能となる。我々は、これらのベクターを用いてＣＤ３４＋細胞および２９３−Ｃｒｅ細胞を形質導入し、４８時間後にフローサイトメトリーによってＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙ（商標）の発現を解析した（図２ｂおよびｃ）。２９３−Ｃｒｅ細胞において、ｍＣｈｅｒｒｙ（商標）の発現レベルは４つのベクター全てについて同等であったが、ＧＦＰの発現は、ｍｉＲＮＡ標的部位を含むベクターによって抑制された。ＧＦＰ対ｍＣｈｅｒｒｙ（商標）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）比に基づけば、ｍｉＲ１８３およびｍｉＲ２１８の標的配列を両方含むベクターを用いた場合に最も強い抑制が達成された（図２ｂ）。ｍｉＲ２１８標的部位のみを含むベクターとｍｉＲ２１８標的部位およびｍｉＲ１８３標的部位の両方の組み合わせを含むベクターとの間における標準化されたＧＦＰレベルの差は有意であり、ｐ値は、ＭＯＩが増加するにつれて低下する（ＭＯＩ５：ｐ＝０．０４７、ＭＯＩ１０：ｐ＝０．０３３、ＭＯＩ２０：ｐ＝０．００６）。これは、ｍｉＲ１８３標的部位がＧＦＰの発現の抑制に寄与することを示唆する。
【０１０９】
第１世代Ａｄベクターが２９３−Ｃｒｅ細胞において複製し、従って導入遺伝子産物を強く発現することを考慮すると、ｍｉＲ−１８３／２１８を利用したシステムが２９３−Ｃｒｅ細胞においてＧＦＰの発現を制御できることは注目に値する。これは、標準化されたＧＦＰレベルが２９３−Ｃｒｅ細胞においてＭＯＩ依存的には増加しないという知見によってさらに実証される。対照的に、ＣＤ３４＋細胞では、全てのベクターについて、ＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙ（商標）の両方の発現が比較的高かった（図２ｃ）。
【０１１０】
ｍｉＲＮＡ−１８３／２１８により制御される遺伝子発現システムを用いて、我々は、ＥＦ１αプロモーターの制御下でＺＦＮを発現するＨＤ−Ａｄ５／３５ベクターを作製した（図３ａ）。当該ＺＦＮは、ＨＩＶ共受容体ＣＣＲ５の遺伝子を対象とした［１１］。自己切断ピコルナウイルス２Ａペプチドを介して２つのＺＦＮサブユニットを連結し、ポリタンパク質として発現させる。これは次に切断される。ウイルスのＩＴＲおよびパッケージングシグナル以外には、ウイルスのタンパク質をコードするいかなる配列も有さないプラスミドに、ｍｉＲＮＡにより制御されるＺＦＮ発現カセットを挿入した［３０］。対応するＨＤ−Ａｄ５／３５．ＺＦＮｍｉＲベクター（ＨＤ−ＺＦＮ）は、２９３−Ｃｒｅ細胞において高力価（１．８８×１０１２ｖｐ／ｍｌ）で産生された。ＣｓＣｌ密度勾配により精製されたＨＤ−ＺＦＮの粒子から単離されたウイルスＤＮＡの制限分析では、ゲノム再編成は示されなかった（データは示さない）。ＨＤ−ＺＦＮベクターを機能的に試験するために、我々はまず、ＨＳＣの遺伝子治療の研究のためのモデルとして使用されることの多いＣＤ３４＋増殖因子依存性赤白血病細胞株であるＭＯ７ｅ細胞において形質導入の調査をおこなった［３１］。形質導入後２日目に、半数の細胞を使用して、ＦｏｋＩドメインに対する抗体を用いたウェスタンブロットによりＺＦＮの発現を解析した（図３ｂ）。残りの半数の細胞からゲノムＤＮＡを単離し、ＣＣＲ５−ＺＦＮ標的部位に特異的なＴ７Ｅ１ヌクレアーゼアッセイによって、ＺＦＮによる切断について解析した（図３ｃ）。この解析により、ＨＤ−ＺＦＮはＭＯ７ｅ細胞において、４０％超のｃｃｒ５アレル内に部位特異的ＤＮＡ切断をもたらすことが示された。次に、類似の調査を、２人の異なるドナー（ドナーＡおよびドナーＢ）に由来するヒトＣＤ３４＋細胞を用いておこなった。ドナーＡ由来の細胞を用いた調査を図３ｄおよびｅに示す。感染から４８時間後に回収した細胞のウェスタンブロット解析では、５×１０３ｖｐ／細胞以上のＭＯＩにて細胞を感染させた場合に、検出可能なＦｏｋＩのシグナルが現れた（図３ｄ）。ｃｃｒ５の改変についてのゲノムＤＮＡの解析では、１０３、５×１０３、および１０４ｖｐ／細胞のＭＯＩについて、それぞれ、１３％、８．９％、および８．１％という破壊頻度が示された。注目すべきことに、ｃｃｒ５の破壊頻度は、ＭＯＩと共には増加せず、おそらくはベクターまたはＺＦＮに関連する毒性に起因して、むしろ減少した。さらに、１０３ｖｐ／細胞のＭＯＩ（すなわちＺＦＮの発現がウェスタンブロットの検出レベル未満であったＭＯＩ）にて感染させた細胞において、遺伝子破壊が認められた。２つ目の調査を、ドナーＢ由来のＣＤ３４＋細胞を用いておこなった。このドナーに由来するＣＤ３４＋細胞は、癌患者における同種ＨＳＣ移植に使用されるＣＤ３４＋細胞バッチからのアリコートであった。Ａｄ５／３５ベクターおよびＨＤ−Ａｄ５／３５ベクターを用いた場合の形質導入効率は、ドナーＡ由来のＣＤ３４＋細胞のものと同等であった。従って、これらの細胞を使用して、ベクターの形質導入の潜在的な細胞毒性を評価できる。しかし、ドナーＢの細胞のゲノムは、ｃ���ｒ５遺伝子内においてＺＦＮの切断部位の近くに小ヌクレオチド多型（ｓｍａｌｌ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）を含んでいた（データは示さない）。Ｔ７Ｅ１ヌクレアーゼアッセイでは、ＳＮＰとＺＦＮ媒介性再編成とを見分けることができず、従って、形質導入されていない細胞を含め、全てのサンプルにおいてｃｃｒ５の破壊が示される（データは示さない）。
【０１１１】
ＨＤ−Ａｄ５／３５ベクターからのＺＦＮの発現が、我々の使用した用量にてＣＤ３４＋細胞において細胞毒性を引き起こすかどうかを評価するために、我々は、アポトーシスマーカーであるアネキシンＶについてのフローサイトメトリーを形質導入後４日目に実施した。この調査に使用したＣＤ３４＋細胞はドナーＡおよびドナーＢに由来するものであった（図４ａおよびｂ）。調査結果は２人のドナー間で僅かに異なっていたが、ＨＤ−ＺＦＮの形質導入は、形質導入されていない細胞およびコントロール（ＨＤ−ｂＧｌｏｂ）ベクターを形質導入した細胞と比較した場合、細胞の生存率に有意に影響しなかった。対照的に、ＣＣＲ５−ＺＦＮを発現する第１世代Ａｄ５／３５ベクター［１１］を用いたＣＤ３４＋細胞の形質導入は、この実験設定では、アネキシンＶ陽性細胞の割合を用量依存的に増加させた（図４ｃ）。
【０１１２】
次の課題は、ＨＤ−ＺＦＮが原始ＨＳＣにおいてＣＣＲ５の破壊を媒介すること、ならびに形質導入およびＺＦＮの発現がこれらの細胞の増殖能および分化能に影響しないことを示すことであった。後者を評価するために、我々は、ＨＤ−ＺＦＮにより形質導入されたＣＤ３４＋細胞を長期培養開始細胞（ＬＴＣ−ＩＣ）アッセイに供した。このアッセイでは、それらが骨髄系の後代を少なくとも５週間産生する能力に基づいて原始ＨＳＣを測定する。形質導入されたＣＤ３４＋細胞集団中に最初に存在する、方向付けされた前駆細胞（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ）は迅速に成熟し、それらの増殖能が限られているために培養の最初の３週間の間に消失するであろう。より原始的な細胞は、培養期間を通じて維持され、方向付けされた前駆細胞（例えば、コロニー形成細胞）の新規コホートを生み出し、後にこれは、アッセイ終了時に、半固形培地における前駆細胞コロニーアッセイを用いて検出およびカウントできる。コントロールのＨＤ−ｂＧｌｏｂベクターおよびＨＤ−ＺＦＮベクターの両方について、ドナーＡ由来のＣＤ３４＋細胞の形質導入は、形質導入されていないコントロールと比較してコロニー数を減少させたが、ここで、ＭＯＩ５０００ｖｐ／細胞の場合にのみ、差は有意であった（図５ａ）。コントロールベクターを用いたドナーＢ由来のＣＤ３４＋細胞の形質導入はコロニー形成に有意には影響しなかったが、１０００ｖｐ／細胞にてＨＤ−ＺＦＮを用いた形質導入はコロニー形成を有意に減少させた（図５ｂ）。ＦＧ−ＺＦＮベクターを用いた形質導入はコロニー形成を阻害した（図５ｃ）。
【０１１３】
ＬＴＣ−ＩＣにおいてＣＣＲ５の破壊のレベルを評価するために、プレート中の全コロニーに由来する細胞を混ぜ合わせ、ゲノムＤＮＡを単離して、Ｔ７Ｅ１ヌクレアーゼアッセイに供した。アッセイ終了時のＣＦＵにおけるＨＤ−ＺＦＮにより媒介されるｃｃｒ５遺伝子の破壊の頻度は２３．７％であった（図５ｄ）。これにより、ベクターが原始ＣＤ３４＋細胞を標的としたこと、および遺伝子の改変がＨＳＣの後代において存続することが示唆された。これをさらに裏付けるために、我々は、ＨＤ−ＺＦＮベクターがＮＯＤ／ＳＣＩＤ再増殖細胞においてＣＣＲ５の破壊を媒介できるかどうか調査した（図６ａ）。この機能的ＨＳＣアッセイは、ヒトでの試験において前処置されたレシピエントを再増殖させる能力を予測する可能性があると考えられている［３２］。このアッセイのために、我々は、ＣＤ３４＋細胞の分化を阻止するための低サイトカイン条件下で５，０００ｖｐ／細胞のＭＯＩにてコントロールのＨＤ−ｂＧｌｏｂベクターまたはＨＤ−ＺＦＮベクターを用いて２４時間、ドナーＡ由来のＣＤ３４＋細胞を形質導入した。形質導入された細胞を、亜致死線量を照射したＮＯＧマウスに移植した。移植から６週間後に、骨髄、脾臓およびＰＢＭＣ中のヒトＣＤ４５＋細胞についてのフローサイトメトリーによってヒト細胞の生着を解析した（注目すべきことに、成人ドナー由来のＣＤ３４＋細胞の場合の骨髄生着率は通常、臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞の場合に達成される生着率よりも低い）。我々は、形質導入されていないＣＤ３４＋細胞を移植されたマウスにおいて約６％の骨髄細胞がヒトＣＤ４５＋陽性であることを見出した（図６ｂ）。ＨＤ−ＺＦＮにより形質導入された細胞の平均骨髄生着率は２．１２％であった。これは、形質導入されていない細胞の平均骨髄生着率よりも約３倍低い。興味深いことに、ＨＤ−ｂＧｌｏｂベクターを用いた形質導入は生着率を増加させた。脾臓およびＰＢＭＣ中のヒトＣＤ４５＋細胞の解析は、同様の生着率を示した。ただし、これらの組織ではＨＤ−ｂＧｌｏｂによる形質導入の効果は、それほど顕著ではなかった。さらなる解析のため、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）を用いてヒトＣＤ４５＋細胞を精製した。ヒトＣＤ４５＋細胞を前駆細胞／コロニーアッセイに供して、ＨＳＣの存在を評価した（図６ｃ）。形質導入されていないＣＤ３４＋細胞またはＨＤ−ＺＦＮにより形質導入されたＣＤ３４＋細胞を受容したマウスに由来する生着したＣＤ４５＋細胞において同様の数のコロニーが見出された。コロニー数はＨＤ−ｂＧｌｏｂ群の方が多かったが、これは、このベクターがＨＳＣの生存を向上させることを示唆する。この理由は、現時点では不明のままである。ＣＣＲ５の改変の頻度を調べるために、ヒトＣＤ４５＋細胞をＴ７Ｅ１ヌクレアーゼアッセイにより解析した。我々は、移植を受けた２匹のマウスにおいてｃｃｒ５遺伝子の破壊のレベルがそれぞれ８．４％および１２％であることを見出した（図６ｃ）。これらのデータは、ＨＤ−ＺＦＮによる形質導入および／またはＺＦＮの発現がＣＤ３４＋細胞の生着率を低下させる可能性があるものの、移植を受けたマウスにおいて解析期間中は存続するＨＳＣにおいてｃｃｒ５遺伝子の破壊が達成されたということを示唆する。
【０１１４】
導入遺伝子の発現を制御するための我々のｍｉＲＮＡを利用した手法の万能性を示すために、我々は、グロビン遺伝子座調節領域（ＬＣＲ）内のＤＮアーゼ過感受性領域２（ＨＳ２）を標的とするＴＡＬＥＮを発現する第２のベクターを作製した（図７ａ）。標的ＤＮＡ配列は、活性クロマチンまたはＤＮアーゼＨＳ領域内に局在している場合に、よりＥＮに近づきやすいと考えられるため、この部位を選択した［３３，３４］。我々や他の者が、赤血球細胞株および造血幹細胞株において、ＨＳ２領域はオープンクロマチンのマークによって占有されるということを示していた［３５〜３８］。また、我々は以前に、β−グロビン遺伝子座調節領域の２３ｋｂの断片を保持するＨＤ−Ａｄ５／３５ベクターがクロマチンのＨＳ２領域への結合を介して染色体上のβ−グロビンＬＣＲに優先的に組み込まれるということを示していた［１８，３５］。後者の研究はＭＯ７ｅ細胞において行われた。ＺＦＮを発現するＨＤ−Ａｄ５／３５ベクターと同様に、（２９３細胞においてｍＲＮＡにより媒介される抑制を用いることなく）ＨＤ−Ａｄ５／３５−ＴＡＬＥＮウイルスベクターを回収するという我々の以前の試みは成功しなかった。
【０１１５】
ＨＤ−Ａｄ５／３５．ＴＡＬＥＮｍｉＲ（ＨＤ−ＴＡＬＥＮ）ベクターを作製するために、ＴＡＬＥＮのｍＲＮＡの３’末端を、ｍｉＲ−１８３／２１８結合部位を含むように改変した（図７ｂ）。ＨＤ−ＴＡＬＥＮベクターは、検出可能なゲノム再編成を伴うことなく高力価（２．５×１０１２ＶＰ／ｍｌ）で産生された（図２ｂ）。１０００ｖｐ／細胞のＭＯＩにてＨＤ−ＴＡＬＥＮを用いてＭＯ７ｅ細胞を感染させた後、抗ＨＡタグ抗体を用いたウェスタンブロットによってＴＡＬＥＮの発現を検出した（図７ｃ）。Ｔ７Ｅ１ヌクレアーゼアッセイにより、感染後２日目にＭＯ７ｅ細胞において約５０％のＨＳ２標的部位が改変されていることが明らかとなった。我々のグロビンＬＣＲを含むＨＤ−Ａｄ５／３５との組み合わせでＨＳ２特異的ＤＮＡ切断をもたらす能力は、標的化された導入遺伝子の挿入に適切である。
【０１１６】
まとめると、我々の研究は、ｍｉＲＮＡシステムが、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮを発現するＨＤ−Ａｄ５／３５ベクターの産生のための強力なプラットフォームであることを示す。
【０１１７】
考察
ＺＦＮは開発された最初のＥＮであったため、部位特異的活性およびオフターゲット活性に関するかなりの量のデータが、これらのタイプのＥＮについて蓄積されている。ＨＩＶのＣＣＲ５共受容体遺伝子を標的とするＺＦＮが、臨床試験において試験された最初のものであった［１２］。この試験は、ＣＣＲ５−ＺＦＮを発現するＡｄ５／３５ベクターを用いた患者のＣＤ４＋Ｔ細胞の生体外での形質導入を伴った。より最近の試みでは、ＨＳＣにおけるｃｃｒ５遺伝子のノックアウトに焦点が置かれている。ＣＤ４＋Ｔ細胞と比較して、ＨＳＣを標的とすることはいくつかの利点を有する。（ｉ）ＨＳＣは、血液細胞の全系統の供給源であるため、ＣＣＲ５のノックアウトは、ＣＤ４細胞を保護するだけでなく、ＨＩＶ感染の標的となる可能性のある残り全てのリンパ系および骨髄系の細胞型をも保護するであろう。（ｉｉ）ＣＤ４＋細胞の移植とは対照的に、単一のＨＳＣの移植は、おそらく、生涯を通じたＨＩＶ抵抗性細胞の供給源をもたらして、長期的な保護またはＨＩＶ／ＡＩＤＳの抑制を可能にするであろう。２０１０年にＨｏｌｔ  ｅｔ  ａｌによって、ＨＳＣにおいてＺＦＮにより媒介されるｃｃｒ５遺伝子配列の破壊を達成するという試みの最初の成功が報告された。この研究は、ＣＣＲ５向性ＨＩＶ−１感染に対する抵抗性をもたらす、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２ｒγｎｕｌｌ（ＮＳＧ）マウスにおける改変されたＨＳＣの生着を実証した［３］。奨励しつつも、データは、この実験系における、エレクトロポレーションによりＺＦＮ発現プラスミドをトランスフェクトした細胞の生存率の低さを含め、いくつかの潜在的な問題も示した。
【０１１８】
我々のシステムにおいて、２９３−Ｃｒｅ細胞における高レベルのＺＦＮの発現の潜在的な細胞毒性を防ぐために、我々は、ＺＦＮ導入遺伝子を抑制するための、ｍｉＲＮＡを利用した遺伝子制御システムを確立した。このシステムは、異なるドナーからプールされた２９３−Ｃｒｅ細胞およびヒトＣＤ３４＋細胞におけるｍｉＲＮＡの発現のプロファイリングに基づいている。レポーター遺伝子を用いた調査では、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８３−５ｐおよびｈｓａ−ｍｉＲ−２１８−５ｐにより制御される導入遺伝子の効率的な抑制が示された。ｍｉＲＮＡにより制御されるＧＦＰレポーター遺伝子のバックグラウンド発現が存在したが、これは用量依存的に、またはウイルスの複製の際に、増加しなかった。後者は、２９３−Ｃｒｅ細胞における高レベルのｍｉＲ−１８３およびｍｉＲ−２１８ならびに対応する標的部位の完全な飽和に起因する可能性がある。重要なことに、ｍｉＲ１８３／２１８による制御システムは、ＣＣＲ５  ＺＦＮまたはグロビンＬＣＲ  ＴＡＬＥＮを発現するＨＤ−Ａｄ５／３５ベクターの作製に成功した。おそらくは、ｍｉＲＮＡにより制御される我々の手法は、やはり２９３細胞を産生細胞として使用するレンチウイルスベクターまたはｒＡＡＶベクターの産生にも適切である。
【０１１９】
形質導入の調査において、我々は、ＨＤ−Ａｄ５／３５．ＺＦＮｍｉＲ（ＨＤ−ＺＦＮ）に焦点を置いた。感染後２日目に解析されたＺＦＮの発現は、ＣＤ３４＋細胞ではＭＯ７ｅ細胞よりも低かった。これは、ＣＤ３４＋細胞の形質導入がＣＤ３４＋細胞の約６０％におけるＧＦＰの発現ならびにＭＯ７ｅ細胞におけるよりも約１０倍低い平均ＧＦＰ蛍光強度をもたらすということを我々が示した、ＨＤ−Ａｄ５／３５．ＧＦＰベクターを用いた我々の以前の研究と一致する。ＨＤ−ＺＦＮによる形質導入後２日目におけるｃｃｒ５遺伝子の破壊の解析は、この時点においてはＺＦＮの発現レベルとの相関を示さなかった。形質導入後、さらに後の時点での解析はおそらく、より高いレベルの破壊を示すであろう。細胞因子（具体的には非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復に関与するタンパク質）が破壊効率、再編成効率を制限する可能性がある。あるいは、ＣＤ３４＋細胞が高度に不均一な細胞集団であることを考慮すると、ＨＤ−Ａｄ５／３５による形質導入、ＺＦＮによる切断、および／またはＮＨＥＪが、ごく一部のＣＤ３４＋細胞においてのみ起こる可能性がある。重要なことに、我々のその後のＬＴＣ−ＩＣおよびＮＯＧマウス再増殖の調査では、標的となったＣＤ３４＋細胞には原始幹細胞が含まれるということが示唆された。
【０１２０】
我々は、我々のシステムにおいてＨＤ−ＺＦＮによる形質導入がＮＯＧマウスにおけるＣＤ３４＋細胞の生着率、生存、および／または増殖を減少させることを見出した。これは、ＨＤ−ｂＧｌｏｂにより形質導入されたＣＤ３４＋細胞を用いた場合の生着率が、形質導入されていない細胞を用いた場合よりも実際に高かったため、必ずしもＨＤ−Ａｄ５／３５による形質導入ならびにベクターに関連する毒性それ自体に起因するものではなかった。従って、我々は、これが長期間にわたるＺＦＮの発現に関連していると推測する。組み込まれないＨＤ−Ａｄベクターのゲノムは、数回の細胞分裂の後に消失する。しかし、肝細胞などの非分裂細胞では、より長く存続する［４３］。ＨＳＣは低増殖性であるため、ＨＤ−Ａｄ５／３５のゲノムが、より長い時間維持され、従って、ＺＦＮを発現する可能性がある。遺伝子操作目的では、ＺＦＮは短時間のみ発現すれば十分である。
【０１２１】
我々が、ＣＣＲ５  ＺＦＮを用いた以前の研究において使用された胎児肝臓または臍帯血に由来するＣＤ３４＋細胞よりも容易に利用可能な供給源である、Ｇ−ＣＳＦで動員された成人ドナーに由来するＣＤ３４＋細胞を我々の研究において使用したことは注目に値する［２，３］。移植を受けたＮＯＧマウスの骨髄に見出される生着したＨＳＣにおける１２％というｃｃｒ５遺伝子の破壊頻度は、これらの細胞が、ＨＩＶの標的およびリザーバーとなる系統を含む複数の系統を生じさせ得ることを考慮すると、ＨＩＶの治療に関して臨床的に適切である。
【０１２２】
我々が追及する別の手段は、グロビンＬＣＲ特異的なＴＡＬＥＮを使用して、相同組換えを介したドナーＨＤ−Ａｄ５／３５ベクターの部位特異的組込みを増加させることである［１８］。
【０１２３】
ＨＳＣへのＥＮ遺伝子の送達のための本発明のＨＤ−Ａｄ５／３５ベクタープラットフォームは、他の送達システムを上回る大きな利点を有する。（ｉ）最も重要なことに、本発明のＨＤ−Ａｄ５／３５ベクタープラットフォームは、細胞毒性の少ない、原始ＨＳＣの効率的な標的化を可能にする。（ｉｉ）ＨＤ−Ａｄベクターの挿入収容能力は、いくつかのＥＮおよび相同性ドナーテンプレートの収容を可能にする３０ｋｂである。これは、遺伝子治療目的のための、または複遺伝子性のヒト疾患用の適切なモデルを確立するための、ＨＳＣにおける複数の遺伝子の同時編集に重要である。また、ＨＤ−ＡＤ５／３５ベクターの使用は、ＥＮ発現カセットおよび幅のある相同領域を有するドナーＤＮＡ配列の両方を１つのベクターにまとめることを可能にする。この場合においては、相同組換えの効率は相同領域の長さと直接相関することに留意すべきである［１６］。（ｉｉｉ）ＨＤ−Ａｄベクターは、インビボにおける標的細胞の形質導入を可能にする。ＨＤ−Ａｄ５ベクターは、静脈内注射の後に、マウスおよびヒト以外の霊長類において肝細胞を効率的に形質導入する［４４，４５］。ヒトＣＤ３４＋／ＮＯＧマウスおよびヒトＣＤ４６−トランスジェニックマウスにおける我々の予備的研究は、親和性を向上させたＡｄ５／３５ベクターおよびＨＤ−Ａｄ５／３５ベクターが、静脈内注射の後に、ＧＣＳＦ／ＡＭＤ３１００で動員されたＨＳＣを形質導入できるということを示す［２２］。インビトロ培養／形質導入ならびに骨髄前処置がなされた患者への再移植を伴うＨＳＣの遺伝子編集の手法は、技術的に複雑であり、且つ、高価である。複数のサイトカインの存在下でのＨＳＣのインビトロ培養は、ＨＳＣの生存率、多能性および生着能力に影響する。さらに、骨髄破壊的レジメンの必要性は、さらなるリスクを患者にもたらす。最後に、この方法は高価であり、専門機関でしか実施することができない。従って、インビボでのＨＳＣのゲノム編集を可能にするベクターシステムは適切である。
【０１２４】
まとめると、我々は、原始ＨＳＣにおける設計されたエンドヌクレアーゼの発現のための、ｍｉＲＮＡにより制御されるＨＤ−Ａｄ５／３５ベクタープラットフォームを開発した。このベクターシステムは、治療を目的としたＨＳＣのゲノム操作のための新しい重要なツールである。
【０１２５】
材料と方法
細胞：
１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（ＨｙＣｌｏｎｅ（商標））、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（ペニシリン−ストレプトマイシン）を加えたダルベッコ改変イーグル培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で２９３細胞、２９３−Ｃ７−ＣＲＥ細胞［４６］を培養した。１０％ＦＣＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（０．１ｎｇ／ｍｌ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ（商標））を含むＲＰＭＩ１６４０培地中でＭｏ７ｅ細胞［３１］を維持した。Ｇ−ＣＳＦで動員された正常ドナーに由来する初代のヒトＣＤ３４＋に富む細胞（Ｐｒｉｍａｒｙ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ３４＋−ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｃｅｌｌｓ）は、Ｆｒｅｄ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙから入手した。我々は、２人の異なるドナー（「ドナーＡ」および「ドナーＢ）とする）に由来するＣＤ３４＋細胞を使用した。ＣＤ３４＋細胞を凍結ストックから回収し、２０％ＦＣＳ、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、幹細胞因子（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＤＮアーゼＩ（１００μｇ／ｍｌ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ、５０ｎｇ／ｍｌ）、インターロイキン（ＩＬ）−３（１０Ｕ／ｍｌ）、およびトロンボポエチン（１０ｎｇ／ｍｌ）を加えたイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）中で一晩インキュベートした。サイトカインおよび増殖因子は、Ｐｅｐｔｏｔｅｃｈのものであった。
【０１２６】
ｍｉｃｒｏＲＮＡアレイ：
２００６種の異なるヒトｍｉＲＮＡプローブを含む、ＡｇｉｌｅｎｔのヒトｍｉＲＮＡ（８×６０Ｋ）  Ｖ１８．０を用いてアレイ調査を実施した。Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮＡｐｒｏｔｅｃｔ（商標）  ｃｅｌｌ  ｒｅａｇｅｎｔで安定化された細胞からのｍｉＲＮＡおよびＲＮＡの抽出は、Ｑｉａｇｅｎ  ｍｉＲＮｅａｓｙ（商標）ｋｉｔのプロトコルに従って実施した。ＲＮＡサンプルは、−８０℃で凍結させた。製造業者の指示に従って５５℃、２０ｒｐｍにてハイブリダイゼーションオーブン中で２０時間、ｍｉＲＮＡ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｈｙｂ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、各スライドを１００ｎｇのＣｙ３標識化ＲＮＡとハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションの後、スライドをＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ）で洗浄した。Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ＳｃａｎｎｅｒおよびＦｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  １０．７（初期設定）によってスライドをスキャンした。Ｑｕａｎｔｉｌｅアルゴリズム（Ｇｅｎｅ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  １１．０）によって生データを標準化した。
【０１２７】
選択されたｍｉＲＮＡについてのｑＲＴ−ＰＣＲ：
ＳｃａｎＤｒｏｐ（商標）（Ａｎａｌｙｔｉｋ  Ｊｅｎａ、ドイツ）を用いてＲＮＡプレップの濃度を測定した。ｍｉＲＮＡ特異的プライマーと共にＴａｑＭａｎ（商標）  ｍｉＲＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（全てＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入）を用いて逆転写を実施した（５ｎｇのテンプレートを使用；４℃６分、１６℃３０分、４２℃３０分、および８５℃５分）。７９００ＨＴマシン（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）においてＡｍｐＥｒａｓｅ（商標）  ＵＮＧなしでＴａｑＭａｎ  ２ｘＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを用いてリアルタイムＰＣＲを四連で実施した（１０μｌの反応体積において０．２７ｎｇのテンプレートを使用；９５℃で１０分、９５℃で１５秒を４０サイクル、６０℃で６０秒）。閾値を０．３、マニュアルベースラインのスタートサイクルを３、エンドサイクルを１３としてＣｔ値を算出した。「Ｒ  ｓｏｆｔｗａｒｅ」および「ｍｉｃｒｏＲＮＡ」ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｐａｃｋａｇｅ［２９］を用いて、５’シード配列におけるｍｉＲＮＡの相同性を解析した。
【０１２８】
アデノウイルスベクター：
【０１２９】
ｍｉＲＮＡ標的部位を含むＡｄ５／３５−ＲＧ：
ｐＲＧ０［４７］由来のＧＦＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ（商標）カセットをアデノウイルスシャトルプラスミドｐＤｅｌｔａＥ１／Ｓｐ１（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ）に移した。以下のｍｉＲＮＡ標的部位を合成して、シャトルベクターのＡｖｒＩＩ／ＳｍａＩ部位に挿入した：
ｍｉＲ−１８３標的部位：
５’ＣＴＡＧＧＡＴＴＡＴＧＧＣＡＣＴＧＧＴＡＧＡＡＴＴＣＡＣＴＡＣＴＴＡＴＧＧＣＡＣＴＧＧＴＡＧＡＡＴＴＣＡＣＴ  ＡＣＴＴＡＴＧＧＣＡＣＴＧＧＴＡＧＡＡＴＴＣＡＣＴＡＣＴＴＡＴＧＧＣＡＣＴＧＧＴＡＧＡＡＴＴＣＡＣＴＡＴＣＧＣＣＣＧＧＧ（配列番号１４７）
ｍｉＲ−２１８標的部位：
５’ＣＣＴＡＧＧＡＡＴＴＴＧＴＧＣＴＴＧＡＴＣＴＡＡＣＣＡＴＧＴＴＴＣＡＴＴＧＴＧＣＴＴＧＡＴＣＴＡＡＣＣＡＴＧＴ  ＴＴＣＡＴＴＧＴＧＣＴＴＧＡＴＣＴＡＡＣＣＡＴＧＴＴＴＣＡＴＴＧＴＧＣＴＴＧＡＴＣＴＡＡＣＣＡＴＧＴＡＴＣＧＣＣＣＧＧＧ（配列番号１４８）
ｍｉＲ−１８３／２１８標的部位：
５’ＣＣＴＡＧＧＡＴ  ＴＡＴＧＧＣＡＣＴＧＧＴＡＧＡＡＴＴＣＡＣＴ  ＡＣＴ  ＴＡＴＧＧＣＡＣＴＧＧＴＡＧＡＡＴＴＣＡＣＴ  ＡＣＴ  ＴＡＴＧＧＣＡＣＴＧＧＴＡＧＡＡＴＴＣＡＣＴ  ＡＣＴ  ＴＡＴＧＧＣＡＣＴＧＧＴＡＧＡＡＴＴＣＡＣＴ  ＡＴＣＧ  ＴＴＧＴＧＣＴＴＧＡＴＣＴＡＡＣＣＡＴＧＴ  ＴＴＣＡＴ  ＴＧＴＧＣＴＴＧＡＴＣＴＡＡＣＣＡＴＧＴ  ＴＴＣＡＴ  ＴＧＴＧＣＴＴＧＡＴＣＴＡＡＣＣＡＴＧＴ  ＴＴＣＡＴＴＧＴＧＣＴＴＧＡＴＣＴＡＡＣＣＡＴＧＴ  ＡＴＣＧＣＣＣＧＧＧ（配列番号１４９）。
【０１３０】
他［６］で説明された通りに第１世代Ａｄ５／３５ウイルスベクターを作製および試験した。
【０１３１】
ＥＦ１ａプロモーターの制御下にある、ｍｉＲ−１８２／２１９により制御されるＣＣＲ５  ＺＦＮを含むＨＤ−Ａｄ５／３５−ＺＦＮ：
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（商標）（ｐＢＳ）プラスミドを用いて、ＨＤバックボーンベクターにおける組換えのためのシャトルベクターを作製した。簡潔に説明すると、スタッファーＤＮＡを含むｐＨＣＡプラスミド［３０］から組換えアームを増幅し、ｐＢＳ中にクローニングしてｐＢＳ−Ｚ（ＺＦＮ−ＣＣＲ５コンストラクト用）およびｐＢＳ−Ｔ（Ｔａｌｅｎ−ＬＣＲコンストラクト用）を作製した。Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔにより３’ＵＴＲおよびｐＡ配列を合成し、ＡｇｅＩおよびＸｈｏＩにより両方のシャトルベクターにクローニングしてｐＢＳ−Ｚ−３’ＵＴＲ−ｐＡおよびｐＢＳ−Ｔ−３’ＵＴＲ−ｐＡを作製した。ＢａｍＨＩおよびＮｈｅＩを用いて、ＥＦ１ａプロモーターの１３３５ｂｐの断片を含むＰＪ２０４−ＥＦ１ａ−ｐＡからＥｆ１ａプロモーターを抜き出した後、両方のシャトルプラスミド中のそれぞれの部位に挿入してｐＢＳ−Ｚ−Ｅｆ１ａおよびｐＢＳ−Ｔ−ＥＦ１ａを作製した。ｐＢＳ−ＣＣＲ５［１１］由来のＺＦＮ−ＣＣＲ５断片をＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化し、シャトルベクターにクローニングしてｐＢＳ−Ｅｆ１ａ−ＺＦＮ−ＣＣＲ５を作製した。最後に、ＮｏｔＩが隣接する合成されたｍｉＲ−１８３／２１８タンデムリピートをｐＢＳ−Ｅｆ１ａ−ＺＦＮ−ＣＣＲ５中のそれらそれぞれの部位にクローニングしてｐＢＳ−Ｅｆ１ａ−ＺＦＮ−ＣＣＲ５−ｍｉＲを作製した。シャトルベクタープラスミドをＢｓｔＢＩで直線化して、Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＢＪ５１８３細胞中でｐＨＣＡバックボーンベクターと組換えさせた。次に、組換わったｐＨＣＡ−Ｅｆ１ａ−ＺＦＮ−ＣＣＲ５−ｍｉＲおよびｐＨＣＡ−ＥＦ１ａ−Ｔａｌｅｎ−ＬＣＲ−ｍｉＲをＰｍｅＩで直線化して、２９３−Ｃｒｅ細胞においてヘルパーウイルス（ＨＶ−Ａｄ５／３５）を用いてレスキューし、ＨＤ−Ａｄ５／３５−ＥＦ１ａ−ＺＦＮ−ＣＣＲ５−ｍｉＲウイルス（ＨＤ−Ａｄ５／３５．ＺＦＮｍｉＲ）およびＨＤ−Ａｄ５／３５−ＥＦ１ａ−Ｔａｌｅｎ−ＬＣＲ−ｍｉＲウイルス（ＨＤ−Ａｄ５／３５Ｔａｌｅｎ．ｍｉＲ）を作製した。
【０１３２】
ＥＦ１ａプロモーターの制御下にある、ｍｉＲ−１８２／２１９により制御されるＨＳ２−ＬＣＲ  ＴＡＬＥＮを含むＨＤ−Ａｄ５／３５−ＴＡＬＥＮ：
以前［４８］に説明された通りにＴｏｏｌＧｅｎ（商標）（ソウル、韓国）によりＨＳ２−ＬＣＲ特異的ＴＡＬＥＮを設計した。ＴＡＬＥＮの認識配列を図７ａに示す。ＤＮＡ結合ドメインはＦｏｋＩと融合されている。ＤＮＡ結合ドメインのＮ末端は、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグをタグ付けされており、核移行シグナルを含む。ＴＡＬＥＮカセットは、ＥＦ１ａプロモーターの制御下にあり、３’ＵＴＲの上流にｍｉＲ部位を含んだ。２つのＴＡＬＥＮをｐＢＳ−Ｔ−ＥＦ１ａ中にクローニングし、２Ａペプチドを介して連結させた。ＺＦＮ−ＣＣＲ５コンストラクトと同様に、ｍｉＲ１８３／２１８タンデムリピートを合成し、ｐＢＳ−ＥＦ１ａ−Ｔａｌｅｎ−ＬＣＲのＮｏｔＩ部位にクローニングしてｐＢＳ−ＥＦ１ａ−Ｔａｌｅｎ−ＬＣＲ−ｍｉＲを作製した。ウイルスレスキューのために、最終的なプラスミドをＰｍｅＩで直線化した。
【０１３３】
ＨＤ−Ａｄ５／３５．ｂＧｌｏｂ（ＨＤ−ｂＧｌｏｂ）：
このベクターは以前に説明されている［１８］。これは、約２６ｋｂのグロビンＬＣＲを含む。β−グロビンプロモーターがＧＦＰ遺伝子の発現を制御する。ＨＤ−Ａｄ５／３５ベクターを、他［２８］で詳細に説明される通りにヘルパーウイルスＡｄ５／３５−ヘルパー［４２］を用いて２９３−Ｃｒｅ細胞［２８］において産生させた。他で説明される通りにヘルパーウイルスの混入レベルを決定し、０．０５％未満であることを見出した。ＨＤＡｄのゲノム構造のＤＮＡ解析を、他［２８］で説明される通りに確認した。
【０１３４】
フローサイトメトリー解析：
細胞毒性の解析のために、Ａｄで形質導入されたＣＤ３４＋細胞をＡｎｎｅｘｉｎＶ／７ＡＡＤ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｋｉｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した。生着の解析のために、ＰＢＭＣ、骨髄および脾臓に由来する細胞を抗ｈＣＤ４５−ＰＥ（ＢＤ）で染色した。その後、データをＦｌｏｗＪｏ（商標）  ｓｏｆｔｗａｒｅで解析した。
【０１３５】
磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）：
抗ヒトＣＤ４５を結合させたマイクロビーズは、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈのものであった。製造業者のプロトコルに従って細胞の精製を実施した。
【０１３６】
ＬＴＣ−ＩＣ（長期培養開始細胞）アッセイ：
形質導入されたＣＤ３４＋細胞を、サイトカインを含むＩＭＤＭ中で４８時間インキュベートした後、長期開始培養条件（ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）に移した。簡潔に説明すると、ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより説明される通りに、接着性マウス骨Ｍ２−１０Ｂ４線維芽細胞フィーダー細胞の層を構築した。形質導入されたＣＤ３４＋細胞をフィーダー層に添加し、１０−６Ｍのヒドロコルチゾン（ＨＬＴＭ）（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むヒト長期開始培養培地中で５週間インキュベートした（培地の半分を毎週交換）。５週間後に細胞を回収し、コロニー形成ユニットアッセイに供した。
【０１３７】
コロニー形成ユニットアッセイ：
コロニー形成ユニットアッセイのために、２×１０４個の細胞をＬＴＣ−ＩＣからＭｅｔｈｏＣｕｌｔ（商標）  ＧＦ  Ｈ４４３４培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（３７℃で５％ＣＯ２の加湿雰囲気中、以下のサイトカインの存在下：ＩＬ−３  ５０Ｕ／ｍｌ、ＳＣＦ  ５０ｎｇ／ｍｌ、Ｅｐｏ  ２Ｕ／ｍｌ、Ｇ−ＣＳＦ  ６．３６ｎｇ）に移した。
【０１３８】
ウェスタンブロット：
プロテアーゼ阻害剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ、Ｒｏｃｈｅ）を含む氷冷ＰＢＳ中の細胞ペレットを超音波処理し、タンパク質を含む上清を−８０℃で保存した。合計２０μｇの総タンパク質をウェスタンブロット解析に使用した。４〜１５％の濃度勾配ゲル（ＢｉｏＲａｄ）を用いたポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によってタンパク質を分離した後、供給業者のプロトコル（Ｍｉｎｉ  ＰｒｏｔｅａｎＩＩＩ、ＢｉｏＲａｄ）に従ってニトロセルロースメンブレン上にトランスファーした。５％脱脂粉乳（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）中でメンブレンをブロッキングし、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴｒｉｓ食塩水（ＴＢＳ−Ｔ）中で洗浄した。メンブレンを抗ＦｏｋＩ抗体（Ｓａｎｇａｍｏ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ＨＡタグ（Ｒｏｃｈｅ）、または抗ベータアクチン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）とインキュベートした。ＥＣＬ  ｐｌｕｓ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてメンブレンを現像した。
【０１３９】
ミスマッチ感受性（ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）ヌクレアーゼアッセイＴ７Ｅ１アッセイ：
以前［４９］に説明された通りにゲノムＤＮＡを単離した。ＣＣＲ５またはＬＣＲ領域を増幅した。ＣＣＲ５の破壊の検出用のプライマーは以前に説明されている［５０］。ＨＳ−ＬＣＲ部位の解析用のプライマーは、５’ＡＡＡＴＣＴＴＧＡＣＣＡＴＴＣＴＣＣＡＣＴＣＴＣ（配列番号１５０）および５’ＧＧＡＧＡＣＡＣＡＣＡＧＡＡＡＴＧＴＡＡＣＡＧＧ（配列番号１５１）であった。ＰＣＲ産物をハイブリダイズさせ、２．５ユニットのＴ７Ｅ１（ＮＥＢ）で処理した。消化されたＰＣＲ産物を１０％のＴＢＥ  ＰＡＧＥ（ＢｉｏＲａｄ）によって分離し、臭化エチジウムで染色した。ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（商標）  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いてバンド強度を解析した。
【０１４０】
動物実験：
動物を伴う実験は全て、ワシントン大学（ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）の定める機関ガイドラインに従って行われた。マウスは特定の病原体を含まない設備内で飼育された。免疫不全ＮＯＧマウス（系統名：ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ／ＩＬ−２Ｒγｎｕｌｌ）は、ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。
【０１４１】
ＣＤ３４＋細胞の移植：
低温保存されたＣＤ３４＋細胞を、１％熱不活性化ＦＣＳを加えたＰＢＳ中で解凍した。解凍されたばかりの細胞を、１０％熱不活性化ＦＣＳ、１０％ＢＳＡ、４ｍＭグルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシン、ならびにヒトのサイトカイン（ＴＰＯ（５ｎｇ／ｍＬ）、ＳＣＦ（２５ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−３（２０ｎｇ／ｍＬ）、Ｆｌｔ３Ｌ（５０ｎｇ／ｍＬ））を含むＩＭＤＭ中で一晩培養した。翌日、５０００ｖｐ／細胞のＭＯＩにてＨＤ−ｂＧｌｏｂまたはＨＤ−ＺＦＮを用いて細胞を感染させ、２４時間インキュベートした。非感染細胞をコントロールとして使用した。翌日、ＮＯＧレシピエントマウスに３００Ｒａｄ／３Ｇｙの全身照射をおこなった。感染から２４時間後、形質導入されたＣＤ３４＋細胞３×１０５個を、照射されていないＮＯＧマウスから回収されたばかりの骨髄細胞２．５×１０５個と混合し、照射から４時間後にレシピエントマウスに静脈内注射した。骨髄移植から６週間後に生着率を以下のようにアッセイした：血液サンプルを採取し、赤血球を溶解させ、ＰＥを結合させた抗ヒトＣＤ４５抗体で残りの細胞を染色し、フローサイトメトリーによって解析した。移植から６週間後に骨髄細胞を、抗ｈＣＤ４５（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）ビーズを用いた二重選別（ｄｏｕｂｌｅ  ｓｏｒｔｉｎｇ）に供し、メチルセルロース上に播種した。２週間後、コロニーを計数し、Ｔ７Ｅ１ヌクレアーゼアッセイに供した。
【０１４２】
参照文献
１．  Ｋｉｍ  Ｈ，  Ｋｉｍ  ＪＳ  （２０１４）．  Ａ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  １５：  ３２１−３３４．
２．  Ｇｅｎｏｖｅｓｅ  Ｐ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）．  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ  ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ５１０：  ２３５−２４０．
３．  Ｈｏｌｔ  Ｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）．  Ｈｕｍａｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ／ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｂｙ  ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｏ  ＣＣＲ５  ｃｏｎｔｒｏｌ  ＨＩＶ−１  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２８：  ８３９−８４７．
４．  Ｐｅｌａｓｃｉｎｉ  ＬＰ，  Ｇｏｎｃａｌｖｅｓ  ＭＡ  （２０１４）．  Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍｏｄｅｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｌｏｃｕｓ  ＨＰＲＴ１．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １１１４：  １８１−１９９．
５．  Ｐｅｌａｓｃｉｎｉ  ＬＰ，  Ｍａｇｇｉｏ  Ｉ，  Ｌｉｕ  Ｊ，  Ｈｏｌｋｅｒｓ  Ｍ，  Ｃａｔｈｏｍｅｎ  Ｔ，  Ｇｏｎｃａｌｖｅｓ  ＭＡ  （２０１３）．  Ｈｉｓｔｏｎｅ  ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｒｅｓｃｕｅｓ  ｇｅｎｅ  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｌｅｖｅｌｓ  ａｃｈｉｅｖｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉｎｔｅｇｒａｓｅ−ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：  ３９９−４１１．
６．  Ｓｈａｙａｋｈｍｅｔｏｖ  ＤＭ，  Ｐａｐａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｕ  Ｔ，  Ｓｔａｍａｔｏｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ  Ｇ，  Ｌｉｅｂｅｒ  Ａ  （２０００）．  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ３４（＋）  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ａ  ｒｅｔａｒｇｅｔｅｄ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７４：  ２５６７−２５８３．
７．  Ｌｉ  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）．  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨＩＶ−１  ｃｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＣＣＲ５  ｉｎ  ａｄｕｌｔ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２１：  １２５９−１２６９．
８．  Ｙｏｔｎｄａ  Ｐ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）．  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ８：  ９３０−９３７．
９．  Ｌｕ  ＺＺ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）．  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ａ  ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ  ｗｉｔｈ  ａ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｆｉｂｅｒ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ５  ａｎｄ  １１ｐ．  Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ３４：  １１７１−１１８２．
１０．  Ｎｉｌｓｓｏｎ  Ｍ，  Ｋａｒｌｓｓｏｎ  Ｓ，  Ｆａｎ  Ｘ  （２００４）．  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ  ＣＤ３４＋  ｃｅｌｌｓ  ａｒｅ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ５  ｏｒ  ３５  ｔｒｏｐｉｓｍ．  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ９：  ３７７−３８８．
１１．  Ｐｅｒｅｚ  ＥＥ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）．  Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ＨＩＶ−１  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２６：  ８０８−８１６．
１２．  Ｔｅｂａｓ  Ｐ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）．  Ｇｅｎｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｏｆ  ＣＣＲ５  ｉｎ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ＣＤ４  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｐｅｒｓｏｎｓ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ＨＩＶ．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３７０：  ９０１−９１０．
１３．  Ｌｉｅｂｅｒ  Ａ，  Ｈｅ  ＣＹ，  Ｋｉｒｉｌｌｏｖａ  Ｉ，  Ｋａｙ  ＭＡ  （１９９６）．  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ｌａｒｇｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｂｙ  Ｃｒｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ  ｅｘｈｉｂｉｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｗｉｔｈ  ｆｉｒｓｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７０：  ８９４４−８９６０．
１４．  Ｓｈｉｍｉｚｕ  Ｋ，  Ｓａｋｕｒａｉ  Ｆ，  Ｍａｃｈｉｔａｎｉ  Ｍ，  Ｋａｔａｙａｍａ  Ｋ，  Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ  Ｈ  （２０１１）．  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｅａｋｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌｓ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｉｎｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ．  Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ  ８：  １４３０−１４３５．
１５．  Ｍｏｒｒａｌ  Ｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）．  Ｈｉｇｈ  ｄｏｓｅｓ  ｏｆ  ａ  ｈｅｌｐｅｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｙｉｅｌｄ  ｓｕｐｒａｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ａｌｐｈａ１−ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ  ｗｉｔｈ  ｎｅｇｌｉｇｉｂｌｅ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ．  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ９：  ２７０９−２７１６．
１６．  Ｂａｌａｍｏｔｉｓ  ＭＡ，  Ｈｕａｎｇ  Ｋ，  Ｍｉｔａｎｉ  Ｋ  （２００４）．  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｓｔａｂｌｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ３５  ｆｉｂｅｒ  ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ  ｈｅｌｐｅｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３２４：  ２２９−２３７．
１７．  Ｗａｎｇ  Ｈ，  Ｃａｏ  Ｈ，  Ｗｏｈｌｆａｈｒｔ  Ｍ，  Ｋｉｅｍ  ＨＰ，  Ｌｉｅｂｅｒ  Ａ  （２００８）．  Ｔｉｇｈｔｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｆｔｅｒ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｈｅｌｐｅｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ａｄ５／３５  ｖｅｃｔｏｒｓ．  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ．
１８．  Ｗａｎｇ  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）．  Ａ  ｃａｐｓｉｄ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｈｅｌｐｅｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ  ｌｏｃｕｓ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｒｅｇｉｏｎ  ｄｉｓｐｌａｙｓ  ａ  ｎｏｎｒａｎｄｏｍ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎ  ａｎｄ  ａｌｌｏｗｓ  ｓｔａｂｌｅ，  ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７９：  １０９９９−１１０１３．
１９．  Ｋｏｃｈａｎｅｋ  Ｓ，  Ｓｃｈｉｅｄｎｅｒ  Ｇ，  Ｖｏｌｐｅｒｓ  Ｃ  （２００１）．  Ｈｉｇｈ−ｃａｐａｃｉｔｙ  ‘ｇｕｔｌｅｓｓ’  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ．  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ３：  ４５４−４６３．
２０．  Ｗａｎｇ  Ｈ，  Ｃａｏ  Ｈ，  Ｗｏｈｌｆａｈｒｔ  Ｍ，  Ｋｉｅｍ  ＨＰ，  Ｌｉｅｂｅｒ  Ａ  （２００８）．  Ｔｉｇｈｔｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｆｔｅｒ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｈｅｌｐｅｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ａｄ５／３５  ｖｅｃｔｏｒｓ．  Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ３６：  ８２３−８３１．
２１．  Ｗａｎｇ  Ｈ，  Ｌｉｅｂｅｒ  Ａ  （２００６）．  Ａ  ｈｅｌｐｅｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃａｐｓｉｄ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｐ７８  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ２７−ｋｉｌｏｂａｓｅ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｃａｓｓｅｔｔｅ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８０：  １１６９９−１１７０９．
２２．  Ｒｉｃｈｔｅｒ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）．  Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ａｆｆｉｎｉｔｙ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ａｄ５／３５  ｖｅｃｔｏｒ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２２．
２３．  Ｈｏｌｋｅｒｓ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）．  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  ｏｆ  ＴＡＬＥ  ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｇｅｎｅｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ａｎｄ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ４１：  ｅ６３．
２４．  ｖａｎ  Ｒｅｎｓｂｕｒｇ  Ｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）．  Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｉｔｅｓ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２０：  ２０１−２１４．
２５．  Ｂｒｏｗｎ  ＢＤ，  Ｖｅｎｎｅｒｉ  ＭＡ，  Ｚｉｎｇａｌｅ  Ａ，  Ｓｅｒｇｉ  Ｓｅｒｇｉ  Ｌ，  Ｎａｌｄｉｎｉ  Ｌ  （２００６）．  Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｌｉｎｅａｇｅｓ  ａｎｄ  ｅｎａｂｌｅｓ  ｓｔａｂｌｅ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ．  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １２：  ５８５−５９１．
２６．  Ｍｕｌｌｏｋａｎｄｏｖ  Ｇ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）．  Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｓｅｎｓｏｒ  ａｎｄ  ｄｅｃｏｙ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９：  ８４０−８４６．
２７．  Ｂｒｏｗｎ  ＢＤ，  Ｎａｌｄｉｎｉ  Ｌ  （２００９）．  Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ  ａｎｄ  ａｎｔａｇｏｎｉｚｉｎｇ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｄ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  １０：  ５７８−５８５．
２８．  Ｐａｌｍｅｒ  ＤＪ，  Ｎｇ  Ｐ  （２００５）．  Ｈｅｌｐｅｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １６：  １−１６．
２９．  Ｗａｎｇ  Ｘ  （２０１４）．  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｓ  ａ  ｍａｊｏｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｐａｔｔｅｒｎｓ．  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ３０：  １３７７−１３８３．
３０．  Ｓａｎｄｉｇ  Ｖ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）．  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅｌｐｅｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９７：  １００２−１００７．
３１．  Ａｖａｎｚｉ  ＧＣ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）．  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ＩＬ−３  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋａｅｍｉｃ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｗｉｔｈ  ｍｅｇａｋａｒｙｏｂｌａｓｔｉｃ  ｆｅａｔｕｒｅｓ．  Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  ６９：  ３５９−３６６．
３２．  Ｄｉｃｋ  ＪＥ，  Ｂｈａｔｉａ  Ｍ，  Ｇａｎ  Ｏ，  Ｋａｐｐ  Ｕ，  Ｗａｎｇ  ＪＣ  （１９９７）．  Ａｓｓａｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＮＯＤ／ＳＣＩＤ  ｍｉｃｅ．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  １５  Ｓｕｐｐｌ  １：  １９９−２０３；  ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  ２０４−１９７．
３３．  Ｋｕｓｃｕ  Ｃ，  Ａｒｓｌａｎ  Ｓ，  Ｓｉｎｇｈ  Ｒ，  Ｔｈｏｒｐｅ  Ｊ，  Ａｄｌｉ  Ｍ  （２０１４）．  Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ｓｉｔｅｓ  ｂｏｕｎｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｃａｓ９  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．
３４．  Ｗｕ  Ｘ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）．  Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｃａｓ９  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．
３５．  Ｓｏｖａ  Ｐ，  Ｗａｎｇ  Ｈ，  Ｂｏｍｓｚｔｙｋ  Ｋ，  Ｓｔａｍａｔｏｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ  Ｇ，  Ｌｉｅｂｅｒ  Ａ  （２００８）．  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｉｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｌｐｅｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ  ｌｏｃｕｓ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｒｅｇｉｏｎ．  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １９：  １５３−１６６．
３６．  Ｆａｎｇ  Ｘ，  Ｙｉｎ  Ｗ，  Ｘｉａｎｇ  Ｐ，  Ｈａｎ  Ｈ，  Ｓｔａｍａｔｏｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ  Ｇ，  Ｌｉ  Ｑ  （２００９）．  Ｔｈｅ  ｈｉｇｈｅｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＬＣＲ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ  ｌｏｃｕｓ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３９４：  １９７−２０８．
３７．  Ｋｉｍ  Ａ，  Ｋｉｅｆｅｒ  ＣＭ，  Ｄｅａｎ  Ａ  （２００７）．  Ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｖｅ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｈｉｓｔｏｎｅ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ  ｃｏｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２７：  １２７１−１２７９．
３８．  Ｋｏｏｒｅｎ  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）．  ｂｅｔａ  −ｇｌｏｂｉｎ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｈｕｂ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ  ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｉｎ  ｐ４５  ＮＦ−Ｅ２  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｍｉｃｅ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．
３９．  Ｋｏｈｎ  ＤＢ，  Ｐａｉ  ＳＹ，  Ｓａｄｅｌａｉｎ  Ｍ  （２０１３）．  Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｂｉｏｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  １９：  Ｓ６４−６９．
４０．  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｌｉｅｔ  （１９９５）．  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ＤＮＡ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．  Ｉｎ：  Ｗ．  Ｄｏｅｒｆｌｅｒ  ａＰＢ  （ｅｄ）．  Ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ，  ｖｏｌ．  ２．  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ：  Ｂｅｒｌｉｎ．  ｐｐ  １−３１．
４１．  Ｓｔｅｉｎｗａｅｒｄｅｒ  ＤＳ，  Ｃａｒｌｓｏｎ  ＣＡ，  Ｌｉｅｂｅｒ  Ａ  （１９９９）．  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｄｅｖｏｉｄ  ｏｆ  ａｌｌ  ｖｉｒａｌ  ｇｅｎｅｓ  ｂｙ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅｐｅａｔｓ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７３：  ９３０３−９３１３．
４２．  Ｓｈａｙａｋｈｍｅｔｏｖ  ＤＭ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）．  Ｇｅｎｏｍｅ  ｓｉｚｅ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｐｏｓｔｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｔｅｐｓ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｃａｐｓｉｄ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ａ  ｃｅｌｌ−ｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍａｎｎｅｒ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７８：  １０００９−１００２２．
４３．  Ｅｈｒｈａｒｄｔ  Ａ，  Ｘｕ  Ｈ，  Ｋａｙ  ＭＡ  （２００３）．  Ｅｐｉｓｏｍａｌ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７７：  ７６８９−７６９５．
４４．  Ｂｒｕｎｅｔｔｉ−Ｐｉｅｒｒｉ  Ｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）．  Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｕｐ  ｔｏ  ７  ｙｅａｒｓ  ｉｎ  ｎｏｎｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｈｅｌｐｅｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ．  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２４：  ７６１−７６５．
４５．  Ｋｕｂｏ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）．  Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｓｔａｂｌｅ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ｌｉｖｅｒ  ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｍｉｃｅ  ｖｉａ  ｈｉｇｈ−ｃａｐａｃｉｔｙ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ  ｈｙｂｒｉｄ  ｖｅｃｔｏｒ．  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２１：  ４０−５０．
４６．  Ｐａｌｍｅｒ  Ｄ，  Ｎｇ  Ｐ  （２００３）．  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｈｅｌｐｅｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ８：  ８４６−８５２．
４７．  Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕ  ＥＰ，  Ｋｏｖａｌｏｖｓｋｙ  Ｄ，  Ｂｅｌｏｅｉｌ  Ｌ，  Ｓａｎｔ’ａｎｇｅｌｏ  Ｄ，  Ｓａｄｅｌａｉｎ  Ｍ  （２００９）．  Ｈａｒｎｅｓｓｉｎｇ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｍｉＲ−１８１ａ  ｔｏ  ｓｅｇｒｅｇａｔｅ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｖｅｒｓｕｓ  ｐｏｓｔ−ｔｈｙｍｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｈｉｍｅｒａｓ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１９：  １５７−１６８．
４８．  Ｋｉｍ  Ｙ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）．  Ａ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  ＴＡＬ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｓｐａｎｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１：  ２５１−２５８．
４９．  Ｍｉｌｌｅｒ  ＪＣ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）．  Ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈｌｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２５：  ７７８−７８５．
５０．  Ｐｅｒｅｚ  ＬＥ，  Ｒｉｎｄｅｒ  ＨＭ，  Ｗａｎｇ  Ｃ，  Ｔｒａｃｅｙ  ＪＢ，  Ｍａｕｎ  Ｎ，  Ｋｒａｕｓｅ  ＤＳ  （２００１）．  Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｂｌｏｏｄ  ＣＤ３４＋  ｃｅｌｌｓ  ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ａｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｏｐｏｉｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．  Ｂｌｏｏｄ  ９７：  １６３５−１６４３．
【０１４３】
実施例２
ＣＣＲ５を対象とするＡＩＤＳ治療：
ＨＩＶ感染のためのＣＤ４の共受容体は２種類（ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４）存在する。感染後早いうちに感染個体から単離されたＨＩＶは、主にＣＣＲ５向性であり、これは、ＨＩＶの初期感染におけるＣＣＲ５の重要な役割を示す。これは、ｃｃｒ５遺伝子のホモ接合型欠失を有する個体がＨＩＶから保護されるという事実により裏付けられる。
【０１４４】
１．Ａｄ５／３５ベクター：
Ａｄ５／３５ベクターは、ヒト血清型Ａｄ３５に由来するファイバーを含む。Ａｄ５／３５およびＡｄ３５は、１００％のＣＤ３４＋細胞で高発現している受容体であるＣＤ４６を介して細胞に感染する。Ａｄ５／３５ベクターによる形質導入が肝臓で起こらないことは重要である。Ａｄ５ベクターの静脈内注射は、肝細胞の形質導入およびその後の肝毒性をもたらす。Ａｄ５の肝細胞への侵入は、Ａｄ５のヘキソンとビタミンＫ依存性血液凝固因子（具体的には第Ｘ因子（ＦＸ））との相互作用により媒介される。我々は、ＦＸがＡｄ５／３５によるＣＤ４６陰性細胞の形質導入を増加させないことを示した（図９Ａ）。この調査で使用されたＡｄ５／３５は、Ａｄ３５ファイバーシャフト（６つのシャフトモチーフを有する）およびＡｄ３５ファイバーノブを含む（Ａｄ５／３５Ｓ）。より長いＡｄ５シャフト（２２個のシャフトモチーフ）でＡｄ３５シャフトを置き換えると（Ａｄ５／３５Ｌ）、ＦＸはインビトロにおいてＨＳＰＧ依存的にＣＤ４６陰性細胞の形質導入を増加させる（図９Ａ）。これは、より短く、より柔軟性の低いＡｄ３５シャフトが、ＦＸとヘキソンの相互作用ならびにその後の肝細胞の形質導入を妨げることを示す。しかし、Ａｄ５／３５Ｓベクターを用いた場合、低いＭＯＩでのＣＤ４６依存的な形質導入は、対応するシャフトの長いＡｄ５／３５Ｌベクターを用いた場合よりも効率が悪いということをインビトロでの調査は示唆する（図９Ｂ）。これはおそらく、短いファイバーを含むＡｄベクターについては細胞核への細胞内輸送が比較的非効率であるという事実に起因する。
【０１４５】
２．親和性を向上させたＡｄ５／３５ベクター：
我々は、ＣＤ４６に対する親和性が大きく向上した組換えＡｄ３５ファイバーノブ（配列番号１００）の使用に基づいて、親和性を向上させたＡｄ３５ファイバーを含むＡｄ（Ａｄ５／３５＋＋）を構築した。ヒトにおいてＣＤ４６は全ての有核細胞で発現するが、対応するマウスのオルソログは精巣においてのみ発現する。そのため、我々は、Ａｄ５／３５ベクターの静脈内注射を伴うインビボでの形質導入に関する我々の研究用のモデルとして、完全なヒトＣＤ４６遺伝子座を含み、従ってヒトと同様のパターンおよびレベルでｈｕＣＤ４６を発現するトランスジェニックマウス（ｈｕＣＤ４６ｔｇマウス）を使用した。インビボにおいて、ＣＤ４６ｈｉｇｈ肝転移を予め生じさせたｈｕＣＤ４６ｔｇマウスでは、Ａｄ５／３５＋＋の静脈内注射は、親ベクターであるＡｄ５／３５ベクターと比較して５倍超効率の良い腫瘍細胞の形質導入をもたらした。
【０１４６】
３．動員されたＨＳＣのインビボでのＡｄ５／３５Ｋ＋＋による形質導入：
静脈内注射されたＡｄベクターは、たとえそのベクターが骨髄細胞上に存在する受容体を標的とする場合でも、骨髄に局在する細胞を形質導入できない。これはおそらく、骨髄においてＨＳＣへの到達のしやすさが制限されるためである。我々は、ｈｕＣＤ４６ｔｇマウスにおいて顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）およびＣＸＣＲ４アンタゴニストであるＡＭＤ３１００（Ｍｏｚｏｂｉｌ（商標）、Ｐｌｅｒｉｘａ（商標））を用いて動員を試験した。マウス内のＨＳＣは、系統陰性（ｌｉｎｅａｇｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ）（Ｌｉｎ−）、ｃＫｉｔ＋およびＳｃａ１＋（ＬＳＫ）の細胞のサブセット内に存在する。ｈｕＣＤ４６ｔｇマウスにおいてＨＳＣを動員するために、我々は、Ｇ−ＣＳＦとＡＭＤ３１００の組み合わせを使用した（図１０Ａ）。Ｇ−ＣＳＦ／ＡＭＤ３１００による動員は、ＡＭＤ３１００の注射から１時間後に、末梢血中のＬＳＫ細胞を約１００倍増加させた。この時点で、我々は、親和性を向上させたＧＦＰ発現Ａｄ５／３５＋＋ベクター（１２２）を注射し、６時間後および７２時間後にＰＢＭＣにおけるＧＦＰの発現を解析した（図１０ＡおよびＢ）。この調査は、動員されたＬＳＫ細胞のうちの２０％超が末梢血において形質導入され得るということ、およびＧＦＰ陽性ＬＳＫ細胞の割合が時間の経過とともに減少するということを示す。後者は、骨髄および脾臓（すなわち第２の造血器官）への再局在化に部分的に起因する。Ａｄの注射後３日目において、骨髄および脾臓においてそれぞれ約９％および１３％のＬＳＫ細胞がＧＦＰを発現した。これは、骨髄細胞のうちの０．０１％が、形質導入されたＬＳＫ細胞であったことを意味する。完全な血液系を再構築するには１つのＨＳＣで十分であると考えれば、これらの数字は治療的に適切である。さらに、我々は、形質導入されたＨＳＣが多能性であり、コロニーを形成する能力を保持するということをコロニー形成ユニット（ＣＦＵ）アッセイにより実証した。この調査で使用されたＡｄ５／３５＋＋ベクターはＨＳＣのゲノムには組み込まれないため、ＧＦＰを発現するＬＳＫ細胞の数は１４日目までに減少した（図１０Ｃ）。これはおそらく、細胞分裂、ならびに第１世代Ａｄ５／３５ベクターに付随する細胞毒性が原因である。
【０１４７】
次に我々は、Ａｄ５／３５＋＋によるヒトＨＳＣのインビボでの形質導入を調査した。亜致死線量を照射したＮＯＧ（ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ／ＩＬ−２Ｒγｎｕｌｌ）マウスにヒトＣＤ３４＋細胞を移植した（ＮＯＧ／ＣＤ３４＋マウス）。６週間後にＰＢＭＣ中のヒトＣＤ４５＋細胞に基づいて生着を解析した。ＣＤ４５＋の割合は２１〜３５％であった。次に、図２Ａで説明される通りにＮＯＧ／ＣＤ３４＋マウスを動員してＡｄ５／３５＋＋−ＧＦＰを注射した。Ａｄの注射から４８時間後、骨髄細胞およびＰＢＭＣにおいてそれぞれ１２％および３９％のヒトＣＤ３４＋細胞がＧＦＰ陽性であった。注目すべきことに、このモデルではｈｕＣＤ４６陽性細胞のみが、移植されたヒト細胞であり、これは、ｈｕＣＤ４６ｔｇマウスモデルと比較して形質導入率が高いということを説明する可能性がある。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図７ｄ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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