(57)【要約】  本発明は、ＣＲＩＳＰＲ系における使用のための修飾された組成物、及びそれらの使用方法に関する。具体的に、長さ修飾及び化学修飾された形態のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡが、ＣＲＩＰＳＲ系のＣａｓ９との相互作用のための再構成ガイドＲＮＡとしての使用に関して説明されている。結果として得られる長さ修飾及び化学修飾された形態のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、経済的に製造され、ＣＲＩＰＳＲ  Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ系の状況において、それらの生化学活性及び生物活性に関連する固有の特性を有するように調整され得る。
2017538427.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
長さ修飾された形態の配列番号１８を含む単離されたｔｒａｃｒＲＮＡであって、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼ系において活性を示す、単離されたｔｒａｃｒＲＮＡ。
【請求項２】
前記長さ修飾された形態の配列番号１８が、短縮形態の配列番号１８からなる、請求項１に記載の単離されたｔｒａｃｒＲＮＡ。
【請求項３】
前記短縮形態の配列番号１８が、
５′末端で１〜２０個のヌクレオチドを欠いている配列番号１８、
３′末端で１〜１０個のヌクレオチドを欠いている配列番号１８、ならびに
５′末端で１〜２０個のヌクレオチド、及び３′末端で１〜１０個のヌクレオチドを欠いている配列番号１８
からなる群から選択されるメンバーからなる、請求項２に記載の単離されたｔｒａｃｒＲＮＡ。
【請求項４】
前記短縮形態の配列番号１８が、配列番号２、３０〜３３、及び３６〜３９からなる群から選択されるメンバーからなる、請求項２に記載の単離されたｔｒａｃｒＲＮＡ。
【請求項５】
前記短縮形態の配列番号１８が、配列番号２または３８からなる、請求項２に記載の単離されたｔｒａｃｒＲＮＡ。
【請求項６】
少なくとも１個の化学修飾されたヌクレオチドを更に含む、請求項１に記載の単離されたｔｒａｃｒＲＮＡ。
【請求項７】
長さ修飾された形態の式（Ｉ）を有する、単離されたｃｒＲＮＡであって、
【数１】
2017538427.tif 000072
式中、Ｘが、約２０個のユニバーサルヌクレオチドを含む標的特異的プロトスペーサードメインを含む配列を表し、Ｚが、約２０個のヌクレオチドを含むｔｒａｃｒＲＮＡ結合ドメインを含む配列を表し、
前記単離されたｃｒＲＮＡが、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼ系において活性を示す、単離されたｃｒＲＮＡ。
【請求項８】
前記長さ修飾された形態の式（Ｉ）が、短縮形態の式（Ｉ）からなる、請求項７に記載の単離されたｃｒＲＮＡ。
【請求項９】
前記短縮形態の式（Ｉ）が、
前記Ｚドメインの３′末端で１〜８ヌクレオチドを欠いている式（Ｉ）、及び
１７、１８、１９、または２０個のヌクレオチドを有する標的特異的プロトスペーサードメインに対応するために前記Ｘドメインの５′末端でヌクレオチドを欠いている式（Ｉ）
からなる群から選択されるメンバーからなる、請求項８に記載の単離されたｃｒＲＮＡ。
【請求項１０】
少なくとも１個の化学修飾されたヌクレオチドを更に含む、請求項７に記載の単離されたｃｒＲＮＡ。
【請求項１１】
前記長さ修飾された形態の式（Ｉ）が、配列番号４２９〜４３９からなる、請求項１０に記載の単離されたｃｒＲＮＡ。
【請求項１２】
化学修飾された形態の配列番号２、１８、３０〜３３、及び３６〜３９のうちの１つを含む、単離されたｔｒａｃｒＲＮＡであって、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼ系において活性を示す、単離されたｔｒａｃｒＲＮＡ。
【請求項１３】
前記化学修飾された形態の配列番号２、１８、３０〜３３、及び３６〜３９のうちの１つが、リボース修飾、末端修飾基、及びヌクレオチド間修飾結合からなる群から選択される修飾を有する、化学修飾されたヌクレオチドを含む、請求項１２に記載の単離されたｔｒａｃｒＲＮＡ。
【請求項１４】
修飾を有する前記化学修飾されたヌクレオチドが、２′ＯＭｅ、２′Ｆ、二環式核酸、及びロックされた核酸（ＬＮＡ）からなる群から選択されるリボース修飾からなる、請求項１３に記載の単離されたｔｒａｃｒＲＮＡ。
【請求項１５】
修飾を有する前記化学修飾されたヌクレオチドが、プロパンジオール（Ｃ３）スペーサー、Ｎ，Ｎ−ジエチル−４−（４−ニトロナフタレン−１−イルアゾ）−フェニルアミン（「ＺＥＮ」）、及び反転ｄＴ残基からなる群から選択される末端修飾基からなる、請求項１３に記載の単離されたｔｒａｃｒＲＮＡ。
【請求項１６】
修飾を有する前記化学修飾されたヌクレオチドが、ホスホロチオエート修飾からなるヌクレオチド間修飾結合からなる、請求項１３に記載の単離されたｔｒａｃｒＲＮＡ。
【請求項１７】
前記単離されたｔｒａｃｒＲＮＡが、配列番号１００、１２９、１３０、１３１、１３２、１３４、１３６、４４９、及び５５１からなる群から選択される、請求項１３に記載の単離されたｔｒａｃｒＲＮＡ。
【請求項１８】
化学修飾された形態の式（Ｉ）を含む、単離されたｃｒＲＮＡであって、
【数２】
2017538427.tif 000073
式中、Ｘが、約１７個のヌクレオチド〜約２０個のヌクレオチドを含む標的特異的プロトスペーサードメインを含む配列を表し、Ｚが、約１２個のヌクレオチド〜約１９個のヌクレオチドを含むｔｒａｃｒＲＮＡ結合ドメインを含む配列を表し、
前記単離されたｃｒＲＮＡが、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼ系において活性を示す、単離されたｃｒＲＮＡ。
【請求項１９】
前記化学修飾された形態の式（Ｉ）が、リボース修飾、末端修飾基、及びヌクレオチド間修飾結合からなる群から選択される修飾を有する、化学修飾されたヌクレオチドを含む、請求項１８に記載の単離されたｃｒＲＮＡ。
【請求項２０】
修飾を有する前記化学修飾されたヌクレオチドが、２′ＯＭｅ、２′Ｆ、二環式核酸、及びロックされた核酸（ＬＮＡ）からなる群から選択されるリボース修飾からなる、請求項１９に記載の単離されたｃｒＲＮＡ。
【請求項２１】
修飾を有する前記化学修飾されたヌクレオチドが、プロパンジオール（Ｃ３）スペーサー、Ｎ，Ｎ−ジエチル−４−（４−ニトロナフタレン−１−イルアゾ）−フェニルアミン（「ＺＥＮ」）、及び反転ｄＴ残基からなる群から選択される末端修飾基からなる、請求項１９に記載の単離されたｃｒＲＮＡ。
【請求項２２】
修飾を有する化学修飾された前記ヌクレオチドが、ホスホロチオエート修飾からなるヌクレオチド間修飾結合からなる、請求項１９に記載の単離されたｔｒａｃｒＲＮＡ。
【請求項２３】
前記化学修飾された形態の式（Ｉ）が、配列番号４２９〜４３９から選択される、請求項１９に記載の単離されたｔｒａｃｒＲＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条の下、２０１４年１２月１８日及び２０１５年１０月９日出願の「ＣＲＩＳＰＲ−ＢＡＳＥＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＵＳＥ」と題する、通し番号６２／０９３，５８８及び６２／２３９，５４６を持つ米国仮特許出願への優先権の利益を主張し、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットで提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０１５年１２月１８日作成のこのＡＳＣＩＩコピーは、ＩＤＴ０１−００８−ＵＳ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名称であり、１７７，１６３バイトサイズである。
【０００３】
本発明は、ＣＲＩＳＰＲ系における使用のための修飾された組成物、及びそれらの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
部位特異的ＤＮＡ切断のための、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）及び関連Ｃａｓタンパク質（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系）の使用は、多くの生物学的用途に対する優れた可能性を示してきた。ＣＲＩＳＰＲは、ゲノム編集、内在性遺伝子に対する転写抑制因子（ＣＲＩＳＰＲｉ）及び活性因子（ＣＲＩＳＰＲａ）のゲノムスケール特異的標的、及びＣａｓ酵素によるＲＮＡ指向型ＤＮＡ標的の他の用途に使用されている。
【０００５】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、細菌及び古細菌に天然であり、ウイルス及びプラスミドに対する適応免疫を提供する。試験及び治療試薬に潜在的に適応され得るＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の３つのクラスが存在するが、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系は、標的ＤＮＡの二本鎖切断を媒介するために、単一ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ヌクレアーゼ（具体的に、Ｃａｓ９）を、適切なガイドＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ活性化ＲＮＡ：トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ）対を含む細菌内の天然複合体と同様の２部ＲＮＡ系、または人工キメラ単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）のいずれかとの複合体中で用いることにおける望ましい特徴を有する。哺乳類系において、これらのＲＮＡは、ＲＮＡ転写を駆動するＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター（Ｕ６またはＨ１等）、ウイルスベクター、及びインビトロ転写に続く一本鎖ＲＮＡを含有するＤＮＡカセットの形質移入によって導入されてきた（Ｘｕ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０１４．８０（５）：ｐ．１５４４−５２を参照されたい）。
【０００６】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系において、例えば、化膿性連鎖球菌に存在する系を例として使用すると（Ｓ．ｐｙ．またはＳｐｙ）、天然ｃｒＲＮＡは、約４２ｂｐ長であり、標的配列に相補的な約２０塩基の５′領域（プロトスペーサー配列とも称される）、及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列の相補性領域に対応する典型的に約２２塩基長の３′領域を含む。天然ｔｒａｃｒＲＮＡは、約８５〜９０塩基長であり、ｃｒＲＮＡに相補的な領域を含む５′領域、ならびに５′上流の約１０塩基領域を有する。ｔｒａｃｒＲＮＡの残りの３′領域は、二次構造（本明細書では「ｔｒａｃｒＲＮＡ  ３′テール」と称される）を含む。
【０００７】
Ｊｉｎｅｋらは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系の正常機能に必要なｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの部分を多角的に調査した（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１２．３３７（６０９６）：ｐ．８１６−２１）。彼らは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９において依然として機能し得る切断されたｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ断片を考案し、ｃｒＲＮＡは、野生型４２個のヌクレオチドであり、ｔｒａｃｒＲＮＡは、７５個のヌクレオチドに切断されていた。彼らはまた、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡが、リンカーループで連結され、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を形成する実施形態を開発し、異なる実施形態では、９９〜１２３個のヌクレオチドの間で異なる。天然２部ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体の構成を図１に示し、人工ｓｇＲＮＡ単一ガイドの９９個のヌクレオチド実施形態を図２に示す。
【０００８】
少なくとも２つのグループが、化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９（ＳｐｙＣａｓ９）の結晶構造を解明してきた。Ｊｉｎｅｋ，Ｍらにおいて、この構造は、ガイドＲＮＡまたは標的ＤＮＡのいずれかとの複合体中でヌクレアーゼを示さなかった。彼らは、分子モデリング実験を実行してＲＮＡ及びＤＮＡとの複合体中のタンパク質間の予測的相互作用を明らかにした（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１４．３４３，ｐ．１２１５，ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ／１２４７９９７）。
【０００９】
Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ，Ｈらにおいて、ＳｐｙＣａｓ９の結晶構造は、ｓｇＲＮＡ及びその標的ＤＮＡとの複合体において２．５Å解像度で示される（Ｃｅｌｌ，２０１４．１５６（５）：ｐ．９３５−４９、その全体が本明細書に組み込まれる）。この結晶構造は、Ｃａｓ９酵素に対する２つのローブ、認識ローブ（ＲＥＣ）、及びヌクレアーゼローブ（ＮＵＣ）を特定した。ｓｇＲＮＡ：標的ＤＮＡヘテロ二重鎖（負の電荷を持つ）は、２つのローブ間の正の電荷を持つ溝内にある。既知のタンパク質との構造的類似性を示さず、したがってＣａｓ９特異的機能ドメインのようなＲＥＣローブは、互いに相補的なｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの部分と相互作用する。
【００１０】
別のグループ、Ｂｒｉｎｅｒら（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ，２０１４．５６（２）：ｐ．３３３−９、その全体が本明細書に組み込まれる）は、天然ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖及びｓｇＲＮＡ内の６つの保存モジュールを特定し、特徴付けを行った。
【００１１】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系は、ゲノム工学において以下の通り用いられる。ｃｒＲＮＡの一部分は、標的配列にハイブリダイズする。ｔｒａｃｒＲＮＡの一部分は、ｃｒＲＮＡの一部分にハイブリダイズする。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、構築体全体に結合し、切断を指向する。このＣａｓ９は、エンドヌクレアーゼＨＮＨ及びＲｕｖＣに相同的な２つのドメインを含み、ＨＮＨドメインは、ｃｒＲＮＡに相補的なＤＮＡ鎖を切断し、ＲｕｖＣ様ドメインは、非相補鎖を切断する。これは、ゲノムＤＮＡにおいて二本鎖破断をもたらす。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって修復された場合、この切断は、典型的に１つ以上の塩基だけシフトし、天然ＤＮＡ配列の崩壊につながり、多くの場合、この事象がタンパク質をコードする遺伝子のコード化エキソン内で起こる場合、フレームシフト突然変異につながる。この破断はまた、相同性依存的組み換え（ＨＤＲ）によって修復され、新たな遺伝子材料の、実験操作を介した、Ｃａｓ９切断によって創出された切断部位への挿入を許す。
【００１２】
哺乳類細胞へのガイドＲＮＡ送達のための現在の方法のうちの一部には、内在性転写のためのＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターを含有する二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の形質移入、ウイルス送達、インビトロ転写（ＩＶＴ）産物としてのＲＮＡの形質移入、またはＩＶＴ産物の微量注入が含まれる。これらの方法には各々短所がある。哺乳類細胞に導入された非修飾外因性ＲＮＡは、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、ＲＩＧ−Ｉ、ＯＡＳＩ、及び病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を認識する他の受容体による認識を介して自然免疫応答を開始することが知られている。しかしながら、大部分の公表された試験において、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによってインビトロ転写された（ＩＶＴ）ＲＮＡが、細胞に送達される。このタイプのＲＮＡペイロードは、自然免疫応答のトリガーであることが示されてきた。上記の代替送達方法の各々は、それら独自の短所も同様に有する。例えば、ｄｓＤＮＡカセットは、統合につながり得、ＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩプロモーターによって内因的に駆動されるガイドＲＮＡ転写は、構成的に持続し得、転写されるＲＮＡの量は制御不可能である。
【００１３】
ＲＮＡは、血清中及び細胞中に存在するヌクレアーゼによって速やかに分解される。ＩＶＴ方法または化学合成によって作製された非修飾ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡトリガー（ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及びｓｇＲＮＡ）は、哺乳類細胞への送達中または送達後に速やかに分解される。ＲＮＡが、ヌクレアーゼ耐性を得るように化学修飾された場合、より優れた活性が認識される。血清中及び細胞中に存在する最も強力な分解活性は、３′エキソヌクレアーゼである（Ｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １：１４１−１５１，１９９１）。故に、合成オリゴヌクレオチドを「末端ブロッキングすること」は、多くの場合、ヌクレアーゼ安定性を改善する。一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）及び二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の化学修飾は、十分に研究されてきており、現在では良好なアプローチが実施されている（レビューについては、Ｋｕｒｒｅｃｋ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７０：１６２８−１６４４，２００３、Ｂｅｈｌｋｅ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１８：３０５−３２０，２００８、Ｌｅｎｎｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１８：１１１１−１１２０，２０１１を参照されたい）。したがって、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓのＲＮＡ構成要素と共に使用するための化学修飾戦略を考案することが望ましい。入手可能な化学修飾の基本的ツールボックスは、当業者には周知であるが、ＲＮＡ種及びエフェクタータンパク質の相互作用に対して部位特異的修飾が有する効果は容易に予測されず、有効な修飾パターンは、通常は経験的に決定されなければならない。場合によって、ＲＮＡの配列は、修飾パターンの有効性に影響を及ぼし得、異なる配列構成に用いられる修飾パターンの調整を必要とし、かかる方法の実地応用をより困難にする。
【００１４】
したがって、細胞へのその毒性を低減し、哺乳細胞内での寿命及び機能性を拡張する一方で、依然としてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系におけるそれらの意図された目的を果たすようにガイドＲＮＡを修飾する必要性が存在する。本明細書に記載される本発明の方法及び組成物は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系における使用のためのＲＮＡ及び修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドを提供する。本発明のこれら及び他の利点、ならびに追加の発明の特徴は、本明細書に提供される本発明の説明から明らかとなるであろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｘｕ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０１４．８０（５）：ｐ．１５４４−５２
【非特許文献２】Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１２．３３７（６０９６）：ｐ．８１６−２１
【非特許文献３】Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１４．３４３，ｐ．１２１５，ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ／１２４７９９７
【非特許文献４】Ｃｅｌｌ，２０１４．１５６（５）：ｐ．９３５−４９
【非特許文献５】Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ，２０１４．５６（２）：ｐ．３３３−９
【非特許文献６】Ｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １：１４１−１５１，１９９１
【非特許文献７】Ｋｕｒｒｅｃｋ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７０：１６２８−１６４４，２００３
【非特許文献８】Ｂｅｈｌｋｅ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１８：３０５−３２０，２００８
【非特許文献９】Ｌｅｎｎｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１８：１１１１−１１２０，２０１１
【発明の概要】
【００１６】
本発明は、ＣＲＩＳＰＲ系における使用のための修飾された組成物、及びそれらの使用方法に関する。これらの組成物は、修飾されたヌクレオチド間結合、ならびにＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のガイド鎖（ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ）として機能する２′−Ｏ−アルキル及び２′−Ｏ−フルオロ修飾されたＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。組成物はまた、エキソヌクレアーゼ攻撃を妨げる反転ｄＴ塩基または他の非ヌクレオチド修飾因子（例えば、プロパンジオール基（Ｃ３スペーサー）、ナフチル−アゾ修飾因子、または他の当該技術分野において周知であるようなもの）等の末端修飾を含む。
【００１７】
第１の態様において、長さ修飾された形態の配列番号１８を含む単離されたｔｒａｃｒＲＮＡが提供される。単離されたｔｒａｃｒＲＮＡは、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼ系において活性を示す。
【００１８】
第２の態様において、長さ修飾された形態の式（Ｉ）を含む単離されたｃｒＲＮＡが提供され、
【００１９】
【数１】
2017538427.tif 000003
式中、Ｘが、約２０個の標的特異的ヌクレオチドを含む標的特異的プロトスペーサードメインを含む配列を表し、Ｚが、約２０個のヌクレオチドを含むユニバーサルｔｒａｃｒＲＮＡ結合ドメインを含む配列を表す。単離されたｃｒＲＮＡは、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼ系において活性を示す。
【００２０】
第３の態様において、化学修飾された形態の配列番号２、１８、３０〜３３、及び３６〜３９のうちの１つを含む単離されたｔｒａｃｒＲＮＡが提供される。単離されたｔｒａｃｒＲＮＡは、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼ系において活性を示す。
【００２１】
第４の態様において、化学修飾された形態の式（Ｉ）を含む単離されたｃｒＲＮＡが提供され、
【００２２】
【数２】
2017538427.tif 000004
式中、Ｘが、約１７個のヌクレオチド〜約２０個のヌクレオチドを含む標的特異的プロトスペーサードメインを含む配列を表し、Ｚが、約１２個のヌクレオチド〜約１９個のヌクレオチドを含むユニバーサルｔｒａｃｒＲＮＡ結合ドメインを含む配列を表す。単離されたｃｒＲＮＡは、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼ系において活性を示す。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】４２塩基非修飾ｃｒＲＮＡ（配列番号４６）及び８９塩基非修飾ｔｒａｃｒＲＮＡ（配列番号１８）との野生型（ＷＴ）天然２部ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体の図である。小文字は、ＲＮＡを表す。
【図２】ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ要素を、新たなヘアピンループの付加を通じて単一配列に融合する、９９塩基人工単一ガイドＲＮＡ（配列番号４２８）（ｓｇＲＮＡ）の図である。小文字は、ＲＮＡを表す。
【図３】実施例２において試験された全長及び切断されたｔｒａｃｒＲＮＡ種のアラインメントを示す。配列は、ＲＮＡであり、５′〜３′が示される。アラインメントは、一番上の８９塩基ＷＴ  ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（配列番号１８）に基づいている。内部間隙は、内部切断／欠失の部位を表す。大文字は、ＲＮＡを表す。
【図４】実施例３において試験された全長及び切断されたｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ種のアラインメントを示す。アラインメントは、それらそれぞれのグループ分けの一番上の４２塩基ＷＴ  ｃｒＲＮＡ（配列番号４６）及び８９塩基ＷＴ  ｔｒａｃｒＲＮＡ（配列番号１８）配列に基づいている。ｃｒＲＮＡの２０塩基の５′ドメインは、配列特異的であり、ヒトＨＰＲＴ１を標的とする。下線が引かれた３′ドメインは、ｔｒａｃｒＲＮＡの５′末端に向かう領域に結合する。ｃｒＲＮＡの３′末端に結合する、ｔｒａｃｒＲＮＡの５′ドメインに下線が引かれている。大文字は、ＲＮＡを表す。
【図５】３６塩基ｃｒＲＮＡ（配列番号４８）及び６７塩基ｔｒａｃｒＲＮＡ（配列番号２）との切断された２部ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体の図である。小文字は、ＲＮＡを表す。
【図６】最適化された切断及び化学修飾ｔｒａｃｒＲＮＡ（配列番号１３４）の一実施形態の構造を示す概略である。長さは、６７塩基である。ＲＮＡは小文字であり、２′ＯＭｅ  ＲＮＡは大文字である。ホスホロチオエート（ＰＳ）ヌクレオチド間結合は、「＊」によって示される。ＲＮＡから２′ＯＭｅ  ＲＮＡに変換された場合に大幅な機能喪失につながる残基は、大きな矢印によって特定され、ＲＮＡから２′ＯＭｅ  ＲＮＡに変換された場合に中度の機能喪失につながる残基は、小さな矢印によって特定される。
【図７】最適化された切断及び化学修飾ｃｒＲＮＡ（配列番号２３９）の一実施形態の構造を示す概略である。長さは、３６塩基である。ＲＮＡは小文字であり、２′ＯＭｅ  ＲＮＡは大文字である。ホスホロチオエート（ＰＳ）ヌクレオチド間結合は、「＊」によって示される。ＲＮＡから２′ＯＭｅ  ＲＮＡに変換された場合に大幅な機能喪失につながる残基は、大きな矢印によって特定され、ＲＮＡから２′ＯＭｅ  ＲＮＡに変換された場合に中度の機能喪失につながる残基は、小さな矢印によって特定される。５′末端２０塩基プロトスペーサー標的特異的ガイドドメインが示され、これはこの場合、ヒトＨＰＲＴ１遺伝子に特異的な配列である。３′末端１６塩基ｔｒａｃｒＲＮＡ結合ドメインが示される。
【図８】実施例８において用いられる、最適化された切断／修飾ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体の一実施形態の構造を示す概略である。ｃｒＲＮＡは、５′プロトスペーサードメイン２０塩基に下線が引かれて一番上に位置付けられ、これはこの場合、標的ヒトＨＰＲＴ１部位３８２８５に特異的であり、３′末端は、１６塩基ｔｒａｃｒＲＮＡ結合ドメインである。ｔｒａｃｒＲＮＡは、下に整列される。ＲＮＡは小文字であり、２′ＯＭｅ  ＲＮＡは大文字であり、「＊」は、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾を示す。この図は、ｃｒＲＮＡ配列番号１７８及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列番号１００によって形成された複合体を示す。
【図９】高度に修飾された、最適化された切断／修飾ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体の一実施形態の構造を示す概略である。ｃｒＲＮＡは、５′プロトスペーサードメイン２０塩基に下線が引かれて一番上に位置付けられ、これはこの場合、標的ヒトＨＰＲＴ１部位３８２８５に特異的であり、３′末端は、１６塩基ｔｒａｃｒＲＮＡ結合ドメインである。ｔｒａｃｒＲＮＡは、下に整列される。ＲＮＡは小文字であり、２′ＯＭｅ  ＲＮＡは大文字であり、「＊」は、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾を示す。この図は、ｃｒＲＮＡ配列番号４４６及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列番号１３４によって形成された複合体を示す。
【図１０】実施例１０において用いられる、ｃｒＲＮＡ修飾パターンを示す概略である。オリゴヌクレオチド配列（それぞれ配列番号４２９〜４３９、出現順）の５′〜３′が示される。小文字＝ＲＮＡ、下線＝２′−Ｏ−メチルＲＮＡ、Ｃ３＝Ｃ３スペーサー（プロパンジオール修飾因子）、＊＝ホスホロチオエートヌクレオチド間結合、ＺＥＮ＝ナフチル−アゾ修飾因子。５′標的特異的プロトスペーサードメインが示される。各標的部位の配列が異なるため、塩基は、このドメイン内で「Ｎ」によって示されるが、用いられる修飾パターンは一定のままである。３′ユニバーサルｔｒａｃｒＲＮＡ結合ドメインが示される。修飾パターンは、表１０と図１０との間で参照のために番号付けされている。
【図１１】ヒトＨＰＲＴ１遺伝子内の１２の異なる部位で試験された１１の異なる修飾パターンで作製されたｃｒＲＮＡを使用し、哺乳類細胞内でＴ７Ｅ１アッセイを使用して観察された機能的遺伝子編集を示す、表１０のデータのプロットである。全てのｃｒＲＮＡ変異型は、最適化された修飾ｔｒａｃｒＲＮＡ（配列番号１００）と対合された。
【図１２】ユニバーサルであり、任意の配列構成において適用され得る、ｃｒＲＮＡ修飾パターン６を使用して高度に修飾された、最適化された切断／修飾ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体の一実施形態の構造を示す概略である。ｃｒＲＮＡ（配列番号４４０）は、５′プロトスペーサードメイン２０塩基に下線が引かれて（Ｎ塩基）一番上に位置付けられ、３′末端は、１６塩基ｔｒａｃｒＲＮＡ結合ドメインである。ｔｒａｃｒＲＮＡは、下に整列される（配列番号１３４）。ＲＮＡは小文字であり、２′ＯＭｅ  ＲＮＡは大文字であり、「＊」は、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾を示す。
【図１３】インターフェロンシグナル伝達経路に関与する２つの遺伝子、ＩＦＩＴ１及びＩＦＩＴＭ１の相対発現レベルを示す、異なるＣＲＩＳＰＲ  ｇＲＮＡで形質移入されたＨＥＫ−Ｃａｓ９細胞からのＲＴ−ｑＰＣＲデータのプロットを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明の態様は、ＣＲＩＳＰＲ系における使用のための修飾された組成物、及びそれらの使用方法に関する。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有する）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含有する）、及びプリンまたはピリミジン塩基のＮグリコシドである任意の他のタイプのポリヌクレオチドを指す（単一ヌクレオチドは、「塩基」または「残基」とも称される）。「核酸」、「オリゴヌクレオチド」、及び「ポリヌクレオチド」という用語間で意図される長さの区別はなく、これらの用語は、交換可能に使用され得る。これらの用語は、分子の一次構造のみを指す。故に、これらの用語には、二本鎖及び一本鎖ＤＮＡ、ならびに二本鎖及び一本鎖ＲＮＡが含まれる。本発明における使用のために、オリゴヌクレオチドは、塩基、糖、またはリン酸塩骨格が修飾されるヌクレオチド類似体、ならびに非プリン若しくは非ピリミジンヌクレオチド類似体を含むこともできる。オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド（例えば、２′修飾を持つヌクレオチド、合成塩基類似体等）、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。
【００２６】
本発明の組成物は、自然免疫系の活性化を潜在的に低減する任意の修飾を含む。修飾は、従来のホスホジエステル結合において、リボース糖において、またはＲＮＡの核酸塩基において配置または置換され得る。かかる組成物は、例えば、２′−Ｏ−メチル修飾されたＲＮＡ等の修飾されたヌクレオチドを含み得る。
【００２７】
より広義には、「修飾されたヌクレオチド」という用語は、ヌクレオシド、核酸塩基、ペントース環、またはリン酸基に対する１つ以上の修飾を有するヌクレオチドを指す。例えば、修飾されたヌクレオチドは、アデノシン一リン酸塩、グアノシン一リン酸塩、ウリジン一リン酸塩、及びシチジン一リン酸塩を含有するリボヌクレオチド、ならびにデオキシアデノシン一リン酸塩、デオキシグアノシン一リン酸塩、デオキシチミジン一リン酸塩、及びデオキシシチジン一リン酸塩を含有するデオキシリボヌクレオチドを除外する。修飾には、メチルトランスフェラーゼ等のヌクレオチドを修飾する酵素による修飾から生じる、天然に存在するものが含まれる。修飾されたヌクレオチドは、合成または非天然に存在するヌクレオチドも含む。修飾は、塩基類似体及びユニバーサル塩基も含む。ヌクレオチドにおける合成または非天然に存在する修飾には、２′修飾を有するもの、例えば、２′−Ｏ−アルキル（２′−Ｏ−メチルを含む）、２′−フルオロ、２′−メトキシエトキシ、２′−アリル、２′−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、４′−チオ、二環式核酸、４′−ＣＨ２−Ｏ−２′−架橋、４′−（ＣＨ２）２−Ｏ−２′−架橋、２′−ＬＮＡ、及び２′−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバメート）、または塩基類似体を含むものが挙げられる。かかる修飾基は、例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎらの米国特許第５，６７２，６９５号、及びＭａｔｕｌｉｃ−Ａｄａｍｉｃらの米国特許第６，２４８，８７８号に記載されている。
【００２８】
２′−Ｏ−メチルの使用は、ｓｉＲＮＡ文献（Ｂｅｈｌｋｅ，Ｍ．Ａ．，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，２００８．１８（４）：ｐ．３０５−１９を参照されたい）ならびにｍＲＮＡ送達（Ｓａｈｉｎ，Ｕ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ，２０１４．１３（１０）：ｐ．７５９−８０を参照されたい）に記録されている。Ｓａｈｉｎらは、２′−ＯＭｅ修飾及び「非免疫原性」ｍＲＮＡを超えて拡張するｍＲＮＡ治療薬の修飾を説明している。
【００２９】
「リボヌクレオチド」という用語は、天然及び合成、非修飾及び修飾リボヌクレオチドを包含する。修飾には、糖部分、塩基部分、及び／またはオリゴヌクレオチド内のリボヌクレオチド間の結合への変化が含まれる。
【００３０】
「Ｃａｓ９タンパク質」という用語は、好適なガイドＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡまたは二重ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ組成物）と複合されて活性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系を形成する場合に生化学活性及び生物活性を有する野生型及び突然変異型のＣａｓ９を包含する。これには、本発明における実施例として用いられる化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９からの異なるアミノ酸配列を有するオルソログ及びＣａｓ９変異型が含まれる。
【００３１】
「長さ修飾された」という用語は、その用語がＲＮＡを修飾する場合、短縮または切断された形態のヌクレオチド配列を欠いている基準ＲＮＡ、または追加のヌクレオチド配列を含む細長い形態の基準ＲＮＡを指す。
【００３２】
「化学修飾された」という用語は、その用語がＲＮＡを修飾する場合、化学修飾されたヌクレオチドを含有する基準ＲＮＡの形態、またはそのＲＮＡに共有結合された非ヌクレオチド化学基を指す。本明細書に記載される、化学修飾されたＲＮＡは、概して、オリゴヌクレオチド合成手順を使用して調製された合成ＲＮＡを指し、修飾されたヌクレオチドは、ＲＮＡオリゴヌクレオチドの合成中に組み込まれる。しかしながら、化学修飾されたＲＮＡはまた、合成後に好適な修飾剤で修飾された合成ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。
【００３３】
出願人は、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼ系において頑強な活性を示す、新規のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡオリゴヌクレオチド組成物を発見した。このオリゴヌクレオチド組成物には、長さ修飾された形態のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ、ならびに化学修飾された形態のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡが含まれる。長さ修飾された形態のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、費用効果があり、効率的なオリゴヌクレオチド合成プロトコルが日常的に入手可能である、これらのＲＮＡの活性形態を調製するのを可能にする。化学修飾された形態のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、細胞状況及びインビボ状況において、改善された安定性等のある特定の特性で調整可能な活性剤を提供する。長さ修飾された形態のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系状況において活性を有する広範囲の組成物にアクセスするのを可能にする修飾も含み得る。これらのオリゴヌクレオチド組成物及びＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系におけるそれらの特性が後述される。
【００３４】
長さ修飾された形態のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ
【００３５】
図１は、野生型化膿性連鎖球菌ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体の表示を示し、例示的な単離されたｃｒＲＮＡ（配列番号４６）は、単離されたｔｒａｃｒＲＮＡ（配列番号１８）と対合される。第１の態様において、長さ修飾された形態の配列番号１８を含む単離されたｔｒａｃｒＲＮＡが提供される。単離されたｔｒａｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系において活性を示す。一態様において、単離されたｔｒａｃｒＲＮＡは、欠失された配列情報を有する長さ修飾された形態の配列番号１８ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、長さ修飾された形態の配列番号１８には、短縮または切断された形態の配列番号１８が含まれ、配列番号１８は、５′末端で１〜２０個のヌクレオチド、及び３′末端で１〜１０個のヌクレオチドだけ短縮され得る。かかる短縮または切断された形態の配列番号１８は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系において機能的に競合するｃｒＲＮＡと対合される場合に活性を保持する。ｔｒａｃｒＲＮＡの５′末端の短縮が行われ、ｃｒＲＮＡの３′末端と対合する配列へと延びる場合、これらのドメインにおいて結合親和性を増強する化学修飾を使用して、改善された活性が得られ得る。ｃｒＲＮＡの３′末端の短縮が行われ、ｔｒａｃｒＲＮＡの５′末端と対合する配列へと延びる場合、これらのドメインにおいて結合親和性を強化する化学修飾を使用して、改善された活性が得られ得る。短縮または切断された形態を有する長さ修飾された形態の配列番号１８の好ましい実施例には、配列番号２、３０〜３３、及び３６〜３９が含まれる。短縮または切断された形態を有する長さ修飾された形態の配列番号１８の非常に好ましい実施例には、配列番号２が含まれる。各々の短縮または切断された形態を有する前述の例示的な長さ修飾された形態の配列番号１８の場合、配列番号２、３０〜３３、及び３６〜６９は、化学的に非修飾のヌクレオチドからなる。
【００３６】
第２の態様において、長さ修飾された形態の式（Ｉ）を含む単離されたｃｒＲＮＡが提供され、
【００３７】
【数３】
2017538427.tif 000005
式中、Ｘが、標的特異的プロトスペーサードメインを含む配列を表し、Ｚが、ｔｒａｃｒＲＮＡ結合ドメインを含む配列を表す。
【００３８】
標的特異的プロトスペーサードメイン（式（Ｉ）のＸドメイン）は、典型的に、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系によって標的されたＤＮＡの領域に対して相補性を有する約２０個のヌクレオチドを含む。ｔｒａｃｒＲＮＡ結合ドメイン（式（Ｉ）のＺドメイン）は、典型的に、大部分のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ系において約２０個のヌクレオチドを含む（天然Ｓ．ｐｙ．バージョンにおいて、このドメインは、２２個のヌクレオチドである）。単離されたｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系において活性を示す。
【００３９】
一態様において、単離されたｃｒＲＮＡは、欠失された配列情報を有する長さ修飾された形態の式（Ｉ）を含む。一部の実施形態において、長さ修飾された形態の式（Ｉ）には、短縮または切断された形態の式（Ｉ）が含まれ、式（Ｉ）は、Ｚドメインの３′末端で１〜８個のヌクレオチドだけ短縮され得る。長さ修飾された形態の式（Ｉ）は、１７、１８、１９、または２０個のヌクレオチドを有する標的特異的プロトスペーサードメインに対応するためにＸドメインの５′末端で短縮され得る。かかる長さ修飾された形態の式（Ｉ）の非常に好ましい実施例には、１９または２０個のヌクレオチドを有する標的特異的プロトスペーサードメインが含まれる。１７〜２０個のヌクレオチドの長さであり、かつ／またはＺドメインの３′末端で１〜８個のヌクレオチドを欠いている、標的特異的プロトスペーサー（Ｘドメイン）を持つ短縮または切断された形態を有する例示的な長さ修飾された形態の式（Ｉ）は、化学的に非修飾のヌクレオチドからなり得る。
【００４０】
かかる短縮または切断された形態の式（Ｉ）は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系において競合するｔｒａｃｒＲＮＡと対合される場合に活性を保持する。長さ修飾された形態の式（Ｉ）を有する式（Ｉ）の単離されたｃｒＲＮＡの好ましい実施形態には、化学的に非修飾のヌクレオチド及び化学修飾されたヌクレオチドが含まれ得る。
【００４１】
化学修飾された形態のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ
【００４２】
第３の態様において、化学修飾されたヌクレオチドまたは非ヌクレオチド化学修飾因子を含む単離されたｔｒａｃｒＲＮＡが提供される。単離されたｔｒａｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系において活性を示す。一態様において、単離されたｔｒａｃｒＲＮＡは、リボース修飾、末端修飾基、及びヌクレオチド間修飾結合からなる群から選択される修飾を有する、化学修飾されたヌクレオチドを含む。例示的なリボース修飾には、２′Ｏ−アルキル（例えば、２′ＯＭｅ）、２′Ｆ、二環式核酸、及びロックされた核酸（ＬＮＡ）が含まれる。例示的な末端修飾基には、プロパンジオール（Ｃ３）スペーサー及びナフチル−アゾ修飾因子（Ｎ，Ｎ−ジエチル−４−（４−ニトロナフタレン−１−イルアゾ）−フェニルアミン、または「ＺＥＮ」）、ならびに反転ｄＴ残基が含まれる。例示的なヌクレオチド間修飾結合には、ホスホロチオエート修飾が含まれる。一態様において、化学修飾された形態を有する単離されたｔｒａｃｒＲＮＡには、配列番号４６及びその長さ修飾された形態、例えば、短縮または切断された形態の配列番号４６が含まれる。化学修飾されたヌクレオチドを有する好ましい短縮または切断された形態の配列番号４６には、化学修飾されたヌクレオチドを有する配列番号２、３０〜３３、及び３６〜３９が含まれる。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系において頑強な活性を持つ化学修飾されたヌクレオチドを有する単離されたｔｒａｃｒＲＮＡの更に他の例を、実施例において提示する。
【００４３】
第４の態様において、化学修飾されたヌクレオチドを含む単離されたｃｒＲＮＡが提供される。単離されたｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系において活性を示す。一態様において、単離されたｃｒＲＮＡは、リボース修飾、末端修飾基、及びヌクレオチド間修飾結合からなる群から選択される修飾を有する、化学修飾されたヌクレオチドを含む。例示的なリボース修飾には、２′Ｏ−アルキル（例えば、２′ＯＭｅ）、２′Ｆ、二環式核酸、及びロックされた核酸（ＬＮＡ）が含まれる。例示的な末端修飾基には、プロパンジオール（Ｃ３）スペーサー及びナフチル−アゾ修飾因子（Ｎ，Ｎ−ジエチル−４−（４−ニトロナフタレン−１−イルアゾ）−フェニルアミン、または「ＺＥＮ」）、ならびに反転ｄＴ残基が含まれる。例示的なヌクレオチド間修飾結合には、ホスホロチオエート修飾が含まれる。一態様において、化学修飾された形態を有する単離されたｃｒＲＮＡには、式（Ｉ）のｃｒＲＮＡ及びその長さ修飾された形態が含まれる。好ましい短縮または切断された形態の、化学修飾されたヌクレオチドを有する式（Ｉ）のｃｒＲＮＡは、配列番号４２９〜４３９を含む。化学修飾されたヌクレオチドを有する単離されたｃｒＲＮＡの非常に好ましい実施例には、配列番号４３４及び４３５が含まれる。これらの特定の単離されたｃｒＲＮＡ種は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系においてコンピテントｔｒａｃｒＲＮＡと複合された場合に高い活性を示す化学修飾されたヌクレオチドを有する「ユニバーサル」ｃｒＲＮＡを表す。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系において頑強な活性を持つ化学修飾されたヌクレオチドを有する単離されたｃｒＲＮＡの更に他の例を、実施例において提示する。
【００４４】
前述の単離された、長さ修飾された、及び化学修飾されたｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、好ましくは２′−ＯＨ基（例えば、特に２′ＯＭｅ、２′Ｆ、二環式核酸、ロックされた核酸）での化学修飾、及び末端ブロッキング修飾（例えば、ＺＥＮ、Ｃ３スペーサー、反転ｄＴ）を含む。両方のタイプの一般修飾の使用は、単離された、長さ修飾された、及び化学修飾されたｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡに、生物学的状況における単離された、長さ修飾された、及び化学修飾されたｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの生化学的安定性及び免疫寛容を提供する。
【００４５】
前述の単離された、長さ修飾された、及び化学修飾されたｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、異なる組み合わせで混合されて、活性ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡをＣａｓ９のガイドＲＮＡとして形成することができる。例えば、単離され、長さ修飾されたｔｒａｃｒＲＮＡは、単離され、化学修飾されたｃｒＲＮＡと組み合わせて、活性ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡをＣａｓ９のガイドＲＮＡとして形成することができる。実施例は、活性ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡをＣａｓ９のガイドＲＮＡとしてもたらす、単離された、長さ修飾された、及び化学修飾されたｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの異なる組み合わせの例証を提供する。
【００４６】
単離された、長さ修飾された、及び化学修飾されたｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの一方（または両方）に含まれる特定の化学修飾されたヌクレオチドを必要とする程度は、結果として生じる活性ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡが、Ｃａｓ９のガイドＲＮＡとして機能する用途に依存する。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系のある特定の生化学アッセイにおいて、特にヌクレアーゼが最小または不在であり得る場合、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系のＣａｓ９の結果として得られるガイドＲＮＡの頑強な活性を生じるために、広範囲に化学修飾されたｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを必要としない場合がある。これは、ヌクレアーゼへの耐性を付与する化学修飾されたヌクレオチドが、ヌクレアーゼが最小または不在である場合に必須でないという事実に寄与する。ある特定の生物学的（インビボ）状況において、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む混合物は、リポソームナノ粒子等の担体ビヒクル内の細胞に送達され、単離された、長さ修飾された、及び化学修飾されたｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、血流に直接送達されるか、または単離された「裸の」ＲＮＡ混合物として臓器系に注入されるｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの混合物より広範囲でない化学修飾されたヌクレオチドを必要とし得る。化学修飾されたｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡに存在する化学修飾の程度は、インビボでの（すなわち、関連生物学的状況における、例えば、血流中または細胞内の）関連ＲＮＡ分子の半減期を既定し得る。したがって、化学修飾されたｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの修飾プロファイルを使用して、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系におけるＣａｓ９のガイドＲＮＡとして結果として得られるｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖の生化学活性及び生物活性を微調整することができる。
【００４７】
先行技術は、Ｃａｓ９がｓｇＲＮＡと相互作用するため、Ｃａｓ９の構造に焦点を当てているが、本明細書に記載の開示される設計パターンは、前述のｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重ＲＮＡ系を企図する。一本鎖ガイドＲＮＡは、治療設計の簡素性等のいくつかの利得を提供する。しかしながら、標準固相ホスホルアミダイトＲＮＡ合成は、長さが増加するにつれてオリゴヌクレオチドの収率の低下を示し、この問題は、長さが６０〜７０塩基を超えるとより明らかになる。これは、特に一部の商用または治療用途に必要とされる、より大きな規模での、一部のｔｒａｃｒＲＮＡならびにキメラｓｇＲＮＡの頑強な費用効果のある合成を妨げる。この理由から、本発明は、ｓｇＲＮＡだけでなく、代替二重ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡの、Ｃａｓ９のガイドＲＮＡとしての実施形態を企図する。しかしながら、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系においてＣａｓ９と複合された場合に頑強な活性を有する単離されたガイドＲＮＡは、本明細書に提供される単離された、長さ修飾された、及び化学修飾された形態のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡに基づいて、適切なｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの、人工単分子ｓｇＲＮＡとしての結合または合成によって操作され得る。このタイプの長い単一ガイドは、より短い鎖の直接合成によるか、または合成後化学共役によって得ることができる。
【００４８】
長さ修飾された、及び化学修飾されたｔｒａｃｒＲＮＡ組成物の設計は、長さが８０個超のヌクレオチドであるｔｒａｃｒＲＮＡオリゴヌクレオチドと関連付けられた潜在的合成問題に取り組んでいる。２′−ＯＭｅ修飾されたＲＮＡモノマーのカップリング効率（２′−ＯＨ上に保護基を有効に含有する）は、ＲＮＡモノマーのカップリングより優れている。２′−ＯＭｅ修飾されたＲＮＡを組み込むことは、いくつかの利点を提供する。第１に、より長いオリゴヌクレオチドが、完全２′−ＯＭｅまたはＲＮＡ／２′−ＯＭｅ混合オリゴヌクレオチドのいずれかとして合成されるのを可能にする。第２に、本発明の方法及び組成物は、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡの合成及び形質移入につながり、免疫系による検出を回避し得る。外来性の非修飾ＲＮＡが、哺乳類細胞ならびに全動物において自然免疫応答を誘起することも周知である。２′ＯＭｅ修飾されたオリゴヌクレオチドを使用することは、ヌクレアーゼに対するＲＮＡ安定性（第３の利点）を付与するとともに、免疫原性トリガーと関連付けられる細胞死及び毒性を低減することができる。異なる化学部分を有する他の開示される修飾ヌクレオチド（例えば、２′Ｆ、他の２′Ｏ−アルキル、ＬＮＡ、及び他の二環式ヌクレオチド）が、ヌクレアーゼへの耐性を付与することに関して同様の利得及び利点をもたらし得るため、これらの利点は、２′−ＯＭｅ修飾自体に固有ではない。
【００４９】
別の実施形態において、ｃｒＲＮＡに相補的なｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを含有し、更なる実施形態において、ｃｒＲＮＡに相補的なｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、１０％超の修飾された残基で構成され、更なる実施形態において、ｃｒＲＮＡに相補的でないｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、５０％超の修飾された残基で構成され、更なる実施形態、ｃｒＲＮＡに相補的でないｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、９０％超の修飾された残基で構成される。
【００５０】
別の実施形態において、ｃｒＲＮＡ部分は、非修飾であり、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドで構成される。更なる実施形態において、ｃｒＲＮＡ部分は、非修飾であり、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、１０％超の修飾された塩基で構成される。
【００５１】
別の実施形態において、式（Ｉ）の単離されたｃｒＲＮＡは、経験的に決定される修飾を用いて設計される。図７及び１０に描かれる通り、Ｚドメイン（ｔｒａｃｒＲＮＡ結合ドメイン）の３′末端における１２個のヌクレオチド及びＸドメイン（プロトスペーサードメイン内）の５′末端における１０〜１２個のヌクレオチドは、化学修飾されたヌクレオチドでの置換を受けやすいユニバーサルヌクレオチドを表し、結果として得られるＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系において頑強な活性を保持する。Ｚドメイン（ｔｒａｃｒＲＮＡ結合ドメイン）の５′末端内の更に他のヌクレオチドは、化学修飾されたヌクレオチドでの置換に不寛容である（図７）。しかし、式（Ｉ）の単離されたｃｒＲＮＡ内の他の部位が、化学修飾されたヌクレオチドを許容し、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系における活性を保持する能力は、主に経験的に決定される。ｃｒＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ結合ドメイン（Ｚドメイン）は、定常であり（すなわち、標的部位が異なっても配列が変化しない）、そのため本明細書に記載される修飾パターンは、標的部位に関係なく全てのｃｒＲＮＡに対してユニバーサルであり、広く適用され得る。ｃｒＲＮＡのプロトスペーサー（Ｘドメイン）は、標的により異なり、このドメイン内の塩基位置のうちのいくつかの、化学修飾への寛容は、配列構成により異なり、部位の最大化学修飾が望まれる場合、経験的最適化から利得を享受し得る。しかしながら、標的特異的プロトスペーサー（Ｘ）ドメイン内の残基の一部は、配列構成への考慮なく修飾され得る。このドメインの５′末端における１０〜１２個の残基は、修飾されたｃｒＲＮＡの完全活性が維持されるという予想とともに、２′修飾された残基で置換され得る。プロトスペーサー（Ｘ）ドメインの３′末端に向かう残りの８〜１０個の塩基は、配列構成に応じて、修飾に寛容である場合とそうでない場合がある。完全活性を維持しながら、プロトスペーサー（Ｘ）ドメインの２０個の塩基のうちの１７個が修飾され得る１つの配列構成を図７に示す。部位が修飾により低下された活性であったことを示す。
【００５２】
Ｃａｓ９系ツールの用途は多く、異なる。それらには、植物遺伝子編集、酵母遺伝子編集、ノックアウト／ノックイン動物系の急速生成、疾患状態の動物モデルの生成、疾患状態の補正、レポーター遺伝子の挿入、及び全ゲノム機能性スクリーニングが含まれるが、これらに限定されない。
【００５３】
本発明の実用性は、Ｃａｓ９のＤ１０Ａ及びＨ８４０ａ二重突然変異体等のＣａｓ酵素の突然変異体バージョンを、転写活性因子（ＣＲＩＳＰＲａ）及び抑制因子（ＣＲＩＳＰＲｉ）との融合タンパク質として含めることによって更に拡大される（Ｘｕ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０１４．８０（５）：ｐ．１５４４−５２を参照されたい）。Ｃａｓ９−ｓｇＲＮＡ複合体を使用して、一本鎖ｍＲＮＡを同様に標的とすることもできる（Ｏ′Ｃｏｎｎｅｌｌ，Ｍ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５１６：２６３，２０１４を参照されたい）。ｄｓＤＮＡを標的とするのと同じ方法で、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡをＰＡＭｍｅｒ  ＤＮＡオリゴヌクレオチドと共に使用して、Ｃａｓ９切断を標的ｍＲＮＡに指向するか、またはそれをＯ′Ｃｏｎｎｅｌｌにより説明されるｍＲＮＡ捕捉アッセイにおいて使用することができる。
【００５４】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９用途に合成ＲＮＡオリゴヌクレオチドを送達するアプローチを用いることにより、１）質量分光法を使用して別個のＲＮＡ配列を確認すること、２）２′−ＯＭｅ修飾されたＲＮＡを十分に寛容される位置に選択的に挿入して、安定性を付与し、免疫原性を回避する一方で機能有効性を付与すること、３）制御された過渡効果のために細胞に導入されるＲＮＡの量を特異的に制御すること、及び４）ＲＮＡに内在的に転写されるが、相同性指向型修復経路、または統合事象をもたらす非相同性末端接合のいずれかにおいて基質にもなり得るｄｓＤＮＡを導入することに関する懸念を排除することを可能にする。これらの統合事象は、ｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ要素の長期の望まれない発現につながり得る。更に、統合は、他の遺伝子をランダムかつ予測不能な様式で崩壊し得、細胞の遺伝子材料を、望まれない、潜在的に有害な方法で変更する。したがって、本発明は、一過性であり、ｃｒＲＮＡガイドにより指向されると意図されるあらゆる改変以外のゲノムの永続する証拠または変化を残さないように、細胞内のＣＲＩＳＰＲ経路の要素の一過性発現を導入する手段として望ましい。
【００５５】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系
【００５６】
コンピテントＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系は、単離されたＣａｓ９タンパク質、ならびに二重ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡの組み合わせ及びキメラｓｇＲＮＡのうちの１つから選択される単離されたガイドＲＮＡで形成されたリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体を含む。一部の実施形態において、単離された、長さ修飾された、及び／または化学修飾された形態のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、精製されたＣａｓ９タンパク質（例えば、配列番号４０７〜４１０）、Ｃａｓ９タンパク質をコードする単離されたｍＲＮＡ（例えば、配列番号４１３）、またはＣａｓ９タンパク質をコードする遺伝子（例えば、配列番号４１１及び４１２）と発現ベクター内で複合される。ある特定のアッセイにおいて、単離された、長さ修飾された、及び／または化学修飾された形態のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９遺伝子をコードする内在性発現カセットからＣａｓ９タンパク質を安定して発現する細胞株に導入され得る。他のアッセイにおいて、長さ修飾された及び／または化学修飾された形態のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの混合物は、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡまたはＣａｓ９タンパク質のいずれかとの組み合わせで細胞に導入され得る。
【実施例】
【００５７】
実施例１
本実施例は、化学修飾及び切断されたガイドＲＮＡの、インビトロＣａｓ９  ＤＮＡ切断アッセイにおける機能性を説明する。
【００５８】
示されるようにＷＴ配列に対して様々な化学修飾及び切断を有するＣｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡオリゴヌクレオチドを合成した（表１）。
【００５９】
【表１】
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オリゴヌクレオチド配列の５′〜３′を示す。小文字＝ＲＮＡ、下線＝２′−Ｏ−メチルＲＮＡ、斜体＝２′−フルオロＲＮＡ。ＲＮＡオリゴヌクレオチドの長さを示す（塩基）。アガロースゲル電気泳動により可視化されるｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ対の各々を持つ組み換えＣａｓ９によるＤＮＡ標的の切断の相対効率は、完全切断を示す「＋＋＋」、中間レベルの切断を示す「＋＋」及び「＋」、ならびに切断なしを示す「−」で示される。
【００６０】
ｃｒＲＮＡは、好適な「ＮＧＧ」ＰＡＭ部位に隣接したヒトＨＰＲＴ１遺伝子内の部位にマッチする１９塩基プロトスペーサーガイド配列を含有していた。ヒトＨＰＲＴ１遺伝子からの９３８塩基対領域を、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にクローン化した。Ｃａｓ９切断アッセイにおいて使用する前に、制限エンドヌクレアーゼＸｍａＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）での消化によりプラスミドを系統化した。ＨＰＲＴ１標的断片の配列を以下に示す。標的ＰＡＭ部位は、太字で示され、プロトスペーサーガイド配列結合部位は下線が引かれている。
【００６１】
【化１】
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【００６２】
ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ対を、組み換えＳｐｙ  Ｃａｓ９（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）によるヒトＨＰＲＴ１遺伝子のクローン化断片を含有する系統化されたプラスミドＤＮＡの分解を指向する能力について試験した。ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡを、Ｄｕｐｌｅｘ  Ｂｕｆｆｅｒ（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１００ｍＭ酢酸カリウム）中、１５０ｎＭ濃度でアニールした。Ｓｐｙ  Ｃａｓ９（１５ｎＭ）を、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡで１０分間、３７℃で１：１モル比でプレインキュベートした。後次に、３ｎＭの系統化された標的プラスミドを添加し、３７℃で１時間インキュベートした。反応産物を、１％アガロースゲル上で１２５Ｖで１時間分離した。製造元のプロトコルに従い、ＧｅｌＲｅｄ（Ｂｉｏｔｉｕｍ）後染色によりバンドを可視化した。ゲルをＵＶトランスイルミネーター上で撮像し、結果を上の表１に要約する。
【００６３】
天然の野生型（ＷＴ）ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡは、５′末端に１９〜２０塩基プロトスペーサードメイン（標的核酸に結合するガイド）、及び３′末端にｔｒａｃｒＲＮＡに結合する２２塩基ドメインを有する。故に、ＷＴ  ｃｒＲＮＡは、４１〜４２塩基長である。ＷＴ  ｔｒａｃｒＲＮＡは、８９塩基長である。ＷＴ型ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ対が、標的ＤＮＡの完全切断を支持していたことを観察した（ｃｒ／ｔｒａｃｒＲＮＡ対２Ｄ）。追加として、６７塩基ｔｒａｃｒＲＮＡと対合された３５塩基ｃｒＲＮＡ（１９塩基プロトスペーサー及び１６塩基ｔｒａｃｒＲＮＡ結合ドメイン）を持つ切断されたバージョンの試薬が、標的ＲＮＡの完全切断を支持していたことを観察した（ｃｒ／ｔｒａｃｒＲＮＡ対１Ａ）。ｃｒＲＮＡ  ｔｒａｃｒＲＮＡ結合領域は、３′末端の切断された６塩基であった（配列番号１）。ｔｒａｃｒＲＮＡを、両末端で切断した（配列番号２）。短いｃｒＲＮＡと長いｔｒａｃｒＲＮＡとの対合組は、長いｃｒＲＮＡと短いｔｒａｃｒＲＮＡとの対合組と同様の切断を示した（対２Ａ）。これらの発見は、Ｃａｓ９標的認識及び切断を指向するための短いＲＮＡ構成要素の使用を許すため重要である。より短いＲＮＡオリゴヌクレオチドは、より安価で化学合成があまり困難でなく、精製の必要が少なく、長いＲＮＡオリゴヌクレオチドより高い収率を付与する。
【００６４】
天然のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ（図１）の一部の要素を欠失させて機能的ｓｇＲＮＡ（図２）を作製した。しかしながら、ｓｇＲＮＡ内でｃｒＲＮＡをｔｒａｃｒＲＮＡに結合する二重鎖核酸の量は、１１塩基対に限定され、これは典型的に、生物学的塩条件における二重鎖形成には短すぎる。複合体は、単分子ヘアピン構造に起因してｓｇＲＮＡフォーマットで安定しているが、２つのＲＮＡに分裂した同じ配列は不安定となる。したがって、どの長さの二重鎖ドメインが、最小だが機能的な２分子（２部）ＣＲＩＳＰＲ複合体を作製する必要があるかどうか、またはこの複合体がＣａｓ９による標的切断を指向するように機能するかどうかは不明であった。本実施例は、わずか１５塩基を塩基対合させることが、ｃｒＲＮＡプロトスペーサードメイン（配列番号１及び２）に相補的な標的に対してＣａｓ９ヌクレアーゼ活性を指向する、２部ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体の機能を可能にすることを実証する。
【００６５】
２′ＯＭｅ  ＲＮＡによるｃｒＲＮＡの完全化学修飾は寛容でなかった（対３Ａ及び対５Ａ）。更に、ｃｒＲＮＡの２２塩基ｔｒａｃｒＲＮＡ結合ドメインの完全２′ＯＭｅ修飾は、標的切断を支持せず（対４Ａ、対６Ａ）、プロトスペーサーガイドドメインの完全２′ＯＭｅ修飾は、切断を支持しなかった（対７Ａ）。２′ＯＭｅ  ＲＮＡでのｔｒａｃｒＲＮＡの完全化学修飾も寛容でなかった（対１Ｂ、１Ｃ、及び対２Ｂ、２Ｃ）。
【００６６】
重要なことに、両方のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ種の一部の高度に２′ＯＭｅ修飾されたバージョンは、切断を支持した。対１Ｋは、３′末端に２９個の２′ＯＭｅ残基を有するｔｒａｃｒＲＮＡによる高度な切断活性を示す（配列番号１１）。対１Ｌは、５′末端の９個の２′ＯＭｅ残基、及び３′末端の２９個の２′ＯＭｅ残基による高度な切断活性を示す（配列番号１３）。故に、短いバージョンのｔｒａｃｒＲＮＡにおける６７個のＲＮＡ残基のうちの３８個は、インビトロ切断アッセイにおいて、活性の喪失なく２′ＯＭｅ  ＲＮＡに変換され得る（５７％）。
【００６７】
対１４Ａは、ｃｒＲＮＡの３′末端における１１塩基（２２塩基ｔｒａｃｒＲＮＡ結合ドメインの５０％）が、２′ＯＭｅ  ＲＮＡで修飾され、標的切断を支持できることを実証する（配列番号１４）。修飾されたｃｒＲＮＡは、修飾されたｔｒａｃｒＲＮＡと対合される場合に完全な活性を保持する（対１４Ｌ、配列番号１３及び１４）。ｃｒＲＮＡの５′末端に向かう１１塩基の修飾（ガイド、プロトスペーサードメイン、塩基２〜１２個における）は、標的切断を支持し（対１５Ａ）、この修飾は、修飾されたｔｒａｃｒＲＮＡと対合される場合にも機能的である（対１５Ｌ、配列番号１３及び１５）。ｃｒＲＮＡの５′末端及び３′末端に向かう２′ＯＭｅ修飾は、修飾されたｔｒａｃｒＲＮＡと対合される場合でも（対１６Ｌ、配列番号１３及び１６）、３５個の残基のうちの２２個が修飾され（６３％）、依然として切断を支持するように（対１６Ａ）複合され得る（配列番号１６）。
【００６８】
上述されるｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ対は全て、２′ＯＭｅ  ＲＮＡを修飾因子として用いた。追加の試験は、２′Ｆ修飾がまた、Ｃａｓ９により寛容であり、標的ＤＮＡの切断を可能にしたことを示した。対９Ａは、全てのピミジン塩基に２′Ｆ修飾を持つｃｒＲＮＡ（配列番号２３）を用い、この設計は、完全標的切断を支持した。同様に、ｃｒＲＮＡの完全２′Ｆ修飾は、完全標的切断を支持した（対１０Ａ、配列番号２４）。２′ＯＭｅ及び２′Ｆ修飾の併用は、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの両方の完全修飾を可能にし得る。本実施例における試験は、インビトロ生化学解析で用いられる。性能は、配列が細胞核環境で機能する必要がある哺乳類遺伝子編集の状況において異なり得る。
【００６９】
実施例２
この実施例は、哺乳類細胞内でＳｐｙ  Ｃａｓ９ヌクレアーゼによるゲノム編集を指向する、切断されたｔｒａｃｒＲＮＡの機能を実証する。
【００７０】
機能的Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及びＲＮＡトリガーの両方（単一ｓｇＲＮＡまたは二重ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ対）は、ＣＲＩＳＰＲゲノム編集が起こるように哺乳類細胞の核内に存在しなければならない。Ｃａｓ９を発現する大きなプラスミドベクターの形質移入は不十分であり、実験的結果に変化性を加える。ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの長さ及び化学組成物の変化が、他の変数の不在下で哺乳類細胞内で及ぼす影響を正確に評価するために、Ｓｐｙ  Ｃａｓ９を安定して発現する細胞株が構築された。
【００７１】
Ｇ４１８下で安定したベクター統合及び選択を持つＳｐｙＣａｓ９（ヒトコドン最適化された）の構成的発現を有するＨＥＫ２９３細胞株を、下記の通り発達させた。ヒト最適化されたＳｐｙ  Ｃａｓ９は、ｐｃＤＮＡ３．１発現ベクターに結紮され（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、リポフェクタミン２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＨＥＫ２９３に形質移入された。形質移入された細胞を、ネオマイシンを使用して選択的圧力下に置かれる前に２日間成長させた。７日後、限界希釈技法を使用して、細胞を単一コロニーに播種した。モノクローナルコロニーを、Ｃａｓ９活性についてスクリーニングし、最高レベルの発現を有するクローンをその後の試験に使用した。Ｃａｓ９の単一コピー統合事象は、液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を使用して決定した。抗Ｃａｓ９抗体を使用するウェスタンブロットは、低いが一定のＣａｓ９タンパク質の発現を示した。この細胞株は、以降「ＨＥＫ−Ｃａｓ９」と称される。
【００７２】
このＨＥＫ−Ｃａｓ９細胞株を後次試験に用いた。逆形質移入フォーマットにおいて、抗ＨＰＲＴ１  ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を、リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と混合し、ＨＥＫ−Ｃａｓ９細胞に形質移入した。９６ウェルプレートフォーマットにおいて１ウェル当たり４０，０００個の細胞を用いて形質移入を行った。０．７５μＬの脂質試薬中３０ｎＭの最終濃度でＲＮＡを導入した。細胞を３７℃で４８時間インキュベートした。ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を使用して、ゲノムＤＮＡを単離した。ゲノムＤＮＡは、ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）及び関心対象のＨＰＲＴ領域を標的とするプライマー（ＨＰＲＴ順方向プライマー：ＡＡＧＡＡＴＧＴＴＧＴＧＡＴＡＡＡＡＧＧＴＧＡＴＧＣＴ（配列番号２８）、ＨＰＲＴ逆方向プライマー：ＡＣＡＣＡＴＣＣＡＴＧＧＧＡＣＴＴＣＴＧＣＣＴＣ（配列番号２９））で増幅させた。ＰＣＲ産物を溶解し、ＮＥＢ緩衝液２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）中で再アニールして、ヘテロ二重鎖形成を可能にし、続いて２単位のＴ７エンドヌクレアーゼ１（Ｔ７ＥＩ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）で１時間、３７℃で消化した。消化された産物を、断片アナライザー（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃｓ）上で可視化した。標的されたＤＮＡの切断パーセントは、切断産物の平均モル濃度／（切断産物の平均モル濃度＋未切断バンドのモル濃度）×１００として計算した。
【００７３】
５′末端、３′末端、内部、またはそれらの組み合わせに欠失を有するｔｒａｃｒＲＮＡ（表２）を合成した。ｔｒａｃｒＲＮＡを、５′末端にＨＰＲＴ１を標的とする１９塩基プロトスペーサードメイン、及び３′末端に１６塩基ｔｒａｃｒＲＮＡ結合ドメインを有する、非修飾切断抗ＨＰＲＴ１  ｃｒＲＮＡ配列番号１（表１）と複合した。対合されたｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ  ＲＮＡオリゴヌクレオチドを、ＨＥＫ−Ｃａｓ９細胞に形質移入し、上記の通り処理した。断片アナライザーを使用して行われる産物の定量的測定と共に、Ｔ７ＥＩミスマッチエンドヌクレアーゼ切断アッセイを使用して、ＨＰＲＴ１遺伝子内の切断率を比較することにより、相対遺伝子編集活性を評価した。野生型化膿性連鎖球菌ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体の表示を図１に示す（ｃｒＲＮＡ配列番号４６をｔｒａｃｒＲＮＡ配列番号１８と対合させる）。本実施例において試験されたｔｒａｃｒＲＮＡ内の欠失の相対位置を、配列アラインメントフォーマットで図３に示す。
【００７４】
【表２】
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オリゴヌクレオチド配列の５′〜３′を示す。小文字＝ＲＮＡ。ＲＮＡオリゴヌクレオチドの長さを示す（塩基）。切断試験において除去された５′末端、３′末端、及び内部（ｉｎｔ）におけるＲＮＡ残基の数を示す。各種の相対機能的活性は、Ｔ７ＥＩヘテロ二重鎖アッセイにおいて切断％により示される。
【００７５】
この実施例は、哺乳類細胞における遺伝子編集の目的のために、ｔｒａｃｒＲＮＡが、５′末端及び３′末端の両方からの著しい欠失を寛容し、完全な機能性を保持し得ることを実証する。５′末端からの１８塩基の欠失は、十分に寛容された。５′末端からの２０塩基の欠失は、恐らくｃｒＲＮＡの結合の低い親和性に起因して、低減した活性につながった。この低減した長さまたは更に短い長さは、Ｔｍ強化修飾を用いて短い二重鎖形成領域を安定させる場合に機能的である可能性がある。３′末端から最大１０個の塩基の欠失は、十分に寛容された。追加の欠失は、活性の喪失をもたらした。ヘアピン要素またはヘアピン要素間の間隔を中断した内部欠失は、機能的でなかった。
【００７６】
要するに、この実施例は、野生型（ＷＴ、配列番号１８）の８９塩基長から６７塩基長（配列番号２）、または６２塩基長（配列番号３８）、または６１塩基長（配列番号３９）へのｔｒａｃｒＲＮＡの切断は、高い機能的活性を保持したことを実証する。この種の短縮されたｔｒａｃｒＲＮＡの使用は、より安価かつＷＴ８９塩基ＲＮＡよりも容易に化学的方法により製造される。切断された種（配列番号２、配列番号３８、及び配列番号３９）の一部は、８９塩基ＷＴ  ｔｒａｃｒＲＮＡにわたって増加した機能的活性を示した。したがって、より安価かつ容易に化学的方法により製造されることに加えて、本発明の短縮されたｔｒａｃｒＲＮＡは、改善された活性を示した。
【００７７】
実施例３
実施例１及び２は、それぞれ４２塩基及び８９塩基のＷＴ長より短いｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体が、哺乳類遺伝子編集においてより高い機能的活性を示し得ることを実証した。本実施例は、これらのＲＮＡ種の長さの更なる最適化を示す。
【００７８】
示される通り異なる長さを有する、一連のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ（表３）を合成した。ｃｒＲＮＡの３′末端、ｔｒａｃｒＲＮＡの５′末端、及び／またはｔｒａｃｒＲＮＡの３′末端において切断を行った。ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを、表３に示される通り対合した。ｃｒＲＮＡは全て、５′末端及び可変長３′末端でＨＰＲＴ１を標的とする２０塩基プロトスペーサードメイン（ｔｒａｃｒＲＮＡ結合ドメイン）を用いた。本実施例において試験されたｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列のアラインメントを図４に示し、各機能的ドメインに対する切断の位置を明らかにする。
【００７９】
対合されたｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ  ＲＮＡオリゴヌクレオチドを、ＨＥＫ−Ｃａｓ９細胞に形質移入し、実施例２に記載される通り処理した。断片アナライザーを使用して行われる産物の定量的測定と共に、Ｔ７ＥＩミスマッチエンドヌクレアーゼ切断アッセイを使用して、ＨＰＲＴ１遺伝子内の切断率を比較することにより、相対遺伝子編集活性を評価した。結果を表３に示す。欠失の相対位置を、配列アラインメントフォーマットで図４に示す。
【００８０】
【表３】
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オリゴヌクレオチド配列の５′〜３′を示す。小文字＝ＲＮＡ。ＲＮＡオリゴヌクレオチドの長さを示す（塩基）。各ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ対の相対機能的活性は、Ｔ７ＥＩヘテロ二重鎖アッセイにおいて切断％により示される。
【００８１】
試験された化合物の全てが、ＨＥＫ−Ｃａｓ９細胞内のＨＰＲＴ１遺伝子座におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ編集を指向した。効率は、６％〜５７％まで広く異なっていた。最も有効なｃｒＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡの組み合わせは、３６塩基ｃｒＲＮＡ（配列番号４８）と６７ｍｅｒ  ｔｒａｃｒＲＮＡ（配列番号２）であった。切断され、最適化されたｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体の概略表示を図５に示す。この場合、ｃｒＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ結合ドメインは、ＷＴ２２塩基配列から１６塩基に切断された（３′末端）。これは、ｔｒａｃｒＲＮＡの５′末端においてｃｒＲＮＡ結合ドメインにハイブリダイズする。ｔｒａｃｒＲＮＡは、５′末端で１８塩基、及び３′末端で４塩基が切断されて活性６７塩基産物を生成した。この対の場合、ｔｒａｃｒＲＮＡの５′末端によるｃｒＲＮＡの３′末端のハイブリダイゼーション時に丸い末端が形成される。７０塩基ｔｒａｃｒＲＮＡ（配列番号５１）と対合された４２塩基（ＷＴ）ｃｒＲＮＡ（配列番号４６）を含む他のバージョンもまた、高い活性を示した。
【００８２】
試験された最短ｃｒＲＮＡは、３４塩基長（配列番号４９）であり、一般に長い変異型よりも低い活性を示した。この変異型とｔｒａｃｒＲＮＡとの間で形成されたより短い二重鎖ドメインは、３６塩基ｃｒＲＮＡ変異型と比較して低減された結合親和性（Ｔｍ）を有し、３４塩基複合体は、３７℃で不安定であった。２′ＯＭｅ  ＲＮＡ、２′Ｆ  ＲＮＡ、またはＬＮＡ残基等の結合親和性（Ｔｍ）を増加させる化学修飾の使用は、この短い二重鎖ドメインの安定性を増加させ、改善された活性につながり、この設計の非常に短いｃｒＲＮＡの使用を可能にする。Ｔｍ強化修飾の広範囲の使用は、ｃｒＲＮＡにおいて、用いられる修飾残基の種類及び数に応じて、例えば、１３塩基、または１２塩基、または１１塩基、または１０塩基、または９塩基、または８塩基、またはそれより短い、更に短いｔｒａｃｒＲＮＡ結合ドメインの使用を可能にする。
【００８３】
実施例４
実施例１、２、及び３は、それぞれ４２塩基及び８９塩基のＷＴ長より短いｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体が、哺乳類遺伝子編集においてより高い機能的活性を示し得ることを実証した。そのような実施例において、全ての切断は、ＲＮＡのユニバーサルドメインにおいて行われた。本実施例は、切断が、ガイドｃｒＲＮＡの標的特異的プロトスペーサードメインに対して有する効果を試験する。
【００８４】
示される通り、２０、１９、１８、または１７塩基のプロトスペーサードメイン長を有する一連のｃｒＲＮＡ（表４）を合成した。１６ｍｅｒユニバーサルｔｒａｃｒＲＮＡ結合配列を３′末端で使用し、ｃｒＲＮＡの５′末端で切断を行った。ｃｒＲＮＡを、非修飾６７ｍｅｒ  ｔｒａｃｒＲＮＡ（配列番号２）と対合させた。ｃｒＲＮＡは、ヒトＨＰＲＴ１遺伝子の同じエキソン内で４つの異なる部位を標的とした。
【００８５】
対合されたｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ  ＲＮＡオリゴヌクレオチドを、ＨＥＫ−Ｃａｓ９細胞に形質移入し、実施例２に記載される通り処理した。断片アナライザーを使用して行われる産物の定量的測定と共に、Ｔ７ＥＩミスマッチエンドヌクレアーゼ切断アッセイを使用して、ＨＰＲＴ１遺伝子内の切断率を比較することにより、相対遺伝子編集活性を評価した。結果を表４に示す。
【００８６】
【表４】
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オリゴヌクレオチド配列の５′〜３′を示す。小文字＝ＲＮＡ。標的特異的プロトスペーサードメインに下線が引かれ、長さを示す（塩基）。各種の相対機能的活性は、Ｔ７ＥＩヘテロ二重鎖アッセイにおいて切断％により示される。
【００８７】
試験された４つの部位のうち、１つ（部位３８０８７）は、４つのｃｒＲＮＡ全てに関して高い活性を示し、プロトスペーサードメインが短縮されても変化がなかった。部位３８２８５は、２０及び１９塩基プロトスペーサーｃｒＲＮＡ（配列番号４８及び１）に関して同様の有効性、１８塩基バージョン（配列番号５４）に関してわずかな減少、及び１７塩基バージョン（配列番号５５）に関して大幅な減少。部位３８０９４は、２０及び１９塩基プロトスペーサーｃｒＲＮＡ（配列番号６４及び６５）に関して同様の有効性、１８塩基バージョン（配列番号６６）に関して中度の減少を示し、１７塩基バージョン（配列番号６７）に関して活性を示さなかった。部位３８３５８は、２０塩基バージョン（配列番号６０）に関して良好な活性、１９塩基バージョン（配列番号６１）に関して低い活性、１８塩基バージョン（配列番号６２）に関して更に低い活性を示し、１７塩基バージョン（配列番号６３）に関して活性を示さなかった。
【００８８】
短縮された１７塩基プロトスペーサーガイドドメインの使用は、野生型２０塩基ドメインと比較して、望まれないオフターゲット事象の発生を低下させることができる（Ｆｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３２：２７９，２０１４）。オンターゲット有効性が、配列構成特異的に異なること、及び２０塩基及び１９塩基プロトスペーサーガイドドメインが一般に有効であるが、１８塩基プロトスペーサードメインが使用される場合に活性が減少し始め、１７塩基プロトスペーサードメインが使用される場合に活性が著しく減少することを観察する。したがって、望ましいオンターゲット効率を維持するために、２０及び１９塩基標的特異的プロトスペーサーガイドドメインの使用が本明細書で用いられる。プロトスペーサーガイドドメインの著しい切断は、多くの場合、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼによるＤＮＡ標的のオンターゲット切断を低下させる。Ｔｍを強化する（標的ＤＮＡ配列に対するｃｒＲＮＡのプロトスペーサー標的特異的ドメインの結合親和性を増加させる）化学修飾の使用は、より短い配列の使用を可能にし得、それにより、１７塩基プロトスペーサーガイドは、非修飾２０塩基プロトスペーサーガイドドメインと同様のオンターゲット有効性を示し得る。
【００８９】
実施例５
本実施例は、切断されたｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体が、複数部位において改善された遺伝子編集活性を示すことを実証する。先の実施例は、ヒトＨＲＰＴ１遺伝子内の単一部位での哺乳類細胞におけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集のトリガーとしての、切断されたＲＮＡの有効性を試験した。部位／配列特異的効果が存在し得る。本実施例は、ヒトＨＰＲＴ１遺伝子のエキソン内の１２部位において、本発明の切断された種の改善された性能を実証する。
【００９０】
３′末端に１６ｍｅｒユニバーサルｔｒａｃｒＲＮＡ結合配列を持つヒトＨＰＲＴ１遺伝子内の１２部位に特異的な２０塩基のプロトスペーサードメイン長を有する、一連のｃｒＲＮＡ（表５）を合成した。ｃｒＲＮＡを、非修飾６７ｍｅｒ  ｔｒａｃｒＲＮＡ（配列番号２）と対合させた。ＷＴ長さｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を使用して、同じ１２部位を試験し、ｃｒＲＮＡは、ＷＴ８９ｍｅｒ  ｔｒａｃｒＲＮＡ（配列番号１８）と複合された３′末端に２２ｍｅｒユニバーサルｔｒａｃｒＲＮＡ結合配列を持つ２０塩基プロトスペーサーガイドを含んでいた。
【００９１】
対合されたｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ  ＲＮＡオリゴヌクレオチドを、ＨＥＫ−Ｃａｓ９細胞に形質移入し、実施例２に記載される通り処理した。断片アナライザーを使用して行われる産物の定量的測定と共に、Ｔ７ＥＩミスマッチエンドヌクレアーゼ切断アッセイを使用して、ＨＰＲＴ１遺伝子内の切断率を比較することにより、相対遺伝子編集活性を評価した。結果を表５に示す。
【００９２】
【表５】
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オリゴヌクレオチド配列の５′〜３′を示す。小文字＝ＲＮＡ。ＲＮＡオリゴヌクレオチドの長さを示す（塩基）。各ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ対の相対機能的活性は、Ｔ７ＥＩヘテロ二重鎖アッセイにおいて切断％により示される。
【００９３】
ＨＥＫ−Ｃａｓ９細胞におけるＣＲＩＳＰＲ媒介型遺伝子編集の相対効率は、配列構成により異なっていた。しかしながら、全ての場合において、より短い最適化されたＲＮＡガイド（３６ｍｅｒ  ｃｒＲＮＡ及び６７ｍｅｒ  ｔｒａｃｒＲＮＡ）は、ＷＴ  ＲＮＡ（４２ｍｅｒ  ｃｒＲＮＡ及び８９ｍｅｒ  ｔｒａｃｒＲＮＡ）より高い効率を示した。本発明の短縮された、最適化されたガイドＲＮＡの使用は、ＷＴ  ＲＮＡに対して標的されたＤＮＡのＣａｓ９切断を改善し、遺伝子編集率を改善する。
【００９４】
実施例６
実施例１は、インビトロ生化学標的ＤＮＡ切断アッセイにおいて、Ｃａｓ９で機能化された化学修飾パターンについて説明した。この実施例は、哺乳類細胞内でＳｐｙ  Ｃａｓ９ヌクレアーゼによるゲノム編集を指向する、化学修飾されたｔｒａｃｒＲＮＡの機能を実証する。最適な修飾パターンは、インビトロ用途とインビボ用途との間で異なる。
【００９５】
リボース修飾２′ＯＭｅ  ＲＮＡ及びＬＮＡ；末端修飾基プロパンジオールスペーサー及びナフチル−アゾ修飾因子（Ｎ，Ｎ−ジエチル−４−（４−ニトロナフタレン−１−イルアゾ）−フェニルアミン、または「ＺＥＮ」）；及びホスホロチオエート修飾を持つ選択ヌクレオチド間結合を含む、様々な化学修飾を有する一連のｔｒａｃｒＲＮＡ（表６）を合成した。ナフチル−アゾ修飾された構造、及びエキソヌクレアーゼ攻撃を遮断するための末端基として使用するためのナフチル−アゾ修飾因子及びプロパンジオール修飾因子の使用については、Ｌｅｎｎｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ２：ｅ１１７  ２０１３を参照されたい。表６に列挙されるｔｒａｃｒＲＮＡを、５′末端にＨＰＲＴ１を標的とする１９塩基プロトスペーサードメイン、及び３′末端に１６塩基ｔｒａｃｒＲＮＡ結合ドメインを有する、非修飾切断抗ＨＰＲＴ１  ｃｒＲＮＡ配列番号１（表１）と複合した。対合されたｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ  ＲＮＡオリゴヌクレオチドを、ＨＥＫ−Ｃａｓ９細胞に形質移入し、上記の通り処理した。断片アナライザーを使用して行われる産物の定量的測定と共に、Ｔ７ＥＩミスマッチエンドヌクレアーゼ切断アッセイを使用して、ＨＰＲＴ１遺伝子内の切断率を比較することにより、相対遺伝子編集活性を評価した。
【００９６】
【表６】
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オリゴヌクレオチド配列の５′〜３′を示す。大文字＝ＤＮＡ、小文字＝ＲＮＡ；下線＝２′−Ｏ−メチルＲＮＡ；斜体＝２′−フルオロＲＮＡ；＋ａ、＋ｃ、＋ｔ、＋ｇ＝ＬＮＡ；Ｃ３＝Ｃ３スペーサー（プロパンジオール修飾因子）；＊＝ホスホロチオエートヌクレオチド間結合；ＺＥＮ−ナフチル−アゾ修飾因子；Ｉｎｖ−ｄＴ＝反転ｄＴ。各種の相対機能的活性は、Ｔ７ＥＩヘテロ二重鎖アッセイにおいて切断％により示される。
【００９７】
修飾は、通常、非修飾オリゴヌクレオチドを分解するエキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼの存在に起因して、合成核酸が細胞内環境で良好に機能するために必須である。オリゴヌクレオチドへのヌクレアーゼ耐性を付与する、広範囲の修飾が説明されてきた。所与の適用に功を奏する修飾の正確な組み合わせ及び用いる順序は、配列構成及び生物学的機能に必要なタンパク質相互作用の性質により異なり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＲＮａｓｅ  Ｈ１と相互作用する）及びｓｉＲＮＡ（ＤＩＣＥＲ、ＡＧＯ２、及び他のタンパク質と相互作用する）の化学修飾に関する広範囲の先行研究が行われてきた。化学修飾は、ＣＲＩＳＰＲ  ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体の機能を改善することが予想される。しかしながら、修飾の種類及び／または修飾のパターンがＣａｓ９との合成ＲＮＡの機能的複合と適応するかを予測することは不可能である。本発明は、哺乳類細胞においてＣａｓ９媒介型遺伝子編集を指向する高レベルの機能を保持する、ｔｒａｃｒＲＮＡの最小、中度、及び広範囲の化学修飾パターンを定義する。
【００９８】
表６の結果は、広範囲の修飾が、ｔｒａｃｒＲＮＡの５′及び３′末端ドメイン全体で寛容されることを実証する。ｔｒａｃｒＲＮＡの内部ドメインの修飾は、恐らく折り畳まれたＲＮＡの変化した構造及び／または２′ＯＭｅ修飾による重要なＲＮＡ残基の２′−ＯＨとのタンパク質接点の遮断に起因して、低減された活性を示した。例えば、化合物配列番号１００は、３９／６７残基を２′ＯＭｅ  ＲＮＡで修飾させ（５８％）、非修飾配列と比較して完全な活性を保持する。配列番号１３４は、４６／６７残基を２′ＯＭｅ  ＲＮＡで修飾させ（６９％）、非修飾配列と比較してほぼ完全な活性を保持する（図６）。配列番号１３４は、ｔｒａｃｒＲＮＡの切断された６７ｍｅｒ変異型である。配列番号１３４をモデルとして使用し、２′ＯＭｅ  ＲＮＡによる５′ドメイン内の１１個の連続残基の修飾は、活性の喪失なく寛容された。２′ＯＭｅ  ＲＮＡによる３′ドメイン内の３５個の連続残基の修飾は、活性の喪失なく寛容された。３′ドメインに存在する２つのヘアピン構造は、これらの特徴のいずれかの欠失が活性の喪失をもたらすため、機能に必須であるが（実施例２、図３）、これらのドメインの両方が、機能を低下させることなく２′ＯＭｅ  ＲＮＡにより完全に修飾され得ることは記録に値する。配列番号１３４及び１００の両方が、５′末端及び３′末端にホスホロチオエート（ＰＳ）修飾されたヌクレオチド間結合も有し、これがエキソヌクレアーゼ攻撃に対して追加の保護を提供することに留意されたい。
【００９９】
修飾された場合に活性の大幅な低減または完全な喪失につながる特定の残基が特定された。６７塩基ｔｒａｃｒＲＮＡ（例えば、配列番号１３４）を基準として使用し、残基Ｕ１２、Ａ１５、Ｇ２６、Ｕ２７、Ｇ３０、Ｕ３１、及びＵ３２における天然ＲＮＡの２′ＯＭｅ  ＲＮＡの配列置換の５′末端から開始することは、活性の実質的な喪失につながった（図６）。修飾された場合に、小さいが著しい活性の低減につながる特定の残基も特定された。６７塩基ｔｒａｃｒＲＮＡ（例えば、配列番号１３４）を基準として使用し、残基Ｕ１３、Ｕ１８、Ｃ２３、Ｕ２４、及びＣ２８における天然ＲＮＡの２′ＯＭｅ  ＲＮＡの配列置換の５′末端から開始することは、活性の低減につながった（図６）。この試験は、２′ＯＭｅ  ＲＮＡを使用して行った。これらの位置における２′Ｆ、ＬＮＡ、ＤＮＡ等の他の修飾の使用は、より良好に寛容され得る。配列番号１３４における非修飾ＲＮＡの中央２１残基ドメインを、２′−Ｆ  ＲＮＡで完全に（配列番号１４１）または部分的に（配列番号１４２及び１４３）修飾した。これらの変異型は機能的でなかった。配列番号１３４における非修飾ＲＮＡの中央２１残基ドメインを、ＤＮＡで完全に（配列番号１３８）または部分的に（配列番号１３９及び１４０）修飾した。これらの変異型は機能的でなかった。このドメイン内の単離された残基の修飾は機能し得るが、このドメイン内の修飾の大きな連続ブロックが、ｔｒａｃｒＲＮＡの活性を低減する。
【０１００】
ｔｒａｃｒＲＮＡの中央ドメイン内で２′ＯＭｅ  ＲＮＡを使用して、どの個々の残基が修飾され得るかを更に調査するために、単一塩基修飾２′ＯＭｅ  ＲＮＡ「ウォーク」を行った（配列番号１４４〜１６２）。このシリーズ内で、残基Ａ１４、Ａ１９、Ａ２０、Ｇ２１、Ｇ２２、Ａ２５、及びＣ２９としての修飾は、活性の喪失を示さず、修飾の候補である。
【０１０１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、多くの場合、完全なＰＳ修飾を使用して作製され、全てのヌクレオチド結合がホスホロチオエート修飾される。タンパク質エフェクター分子ＲＮａｓｅ  Ｈ１（ＡＳＯ指向型ｍＲＮＡ分解を媒介する）が、機能的基質／酵素複合体を形成する場合に、ＡＳＯ内のＰＳ修飾を寛容するため、この広範なレベルの修飾が可能である。一方で、ｓｉＲＮＡは、完全ＰＳ修飾を寛容せず、広範なＰＳ修飾は、エフェクタータンパク質ＡＧＯ２（ｓｉＲＮＡ指向型ｍＲＮＡ分解を媒介する）との生産的相互作用を妨げる。内部ＲＮＡループ内のｔｒａｃｒＲＮＡの広範囲のＰＳ修飾は、Ｃａｓ９との機能的相互作用を妨げる（配列番号１３３、２９ＰＳ修飾）。限定されたＰＳ末端修飾は、活性の喪失なく行われ得る（配列番号９８及び１０１、各末端の２〜３ＰＰ結合）。広範囲でないＰＳ修飾は、中央ドメイン内で寛容され得る。特に、ＲＮａｓｅ切断マッピング（一連の血清または細胞抽出希釈におけるｔｒａｃｒＲＮＡのインキュベーションを使用して、ＲＮａｓｅ攻撃に最も感受性のある部位を見出す）を使用して、１つのみまたはいくつかの結合のＰＳ修飾が機能を妨げることなくＲＮＡを安定させ得る重要な部位を特定することができる。
【０１０２】
ＰＳ修飾が化学毒性に寄与する適用が存在する。この場合、エキソヌクレアーゼ攻撃を遮断する他の方法の使用が望ましい。選択肢には、反転ｄＴ等の末端修飾因子、またはｄスペーサー、Ｃ３スペーサー（プロパンジオール）、ＺＥＮ（ナフチル−アゾ修飾因子）等の塩基脱落基が含まれる。かかる末端修飾基の配置は、末端ＰＳヌクレオチド間結合の必要性を排除し得る。
【０１０３】
実施例７
実施例１は、インビトロ生化学標的ＤＮＡ切断アッセイにおいて、Ｃａｓ９で機能化された化学修飾パターンについて説明した。この実施例は、哺乳類細胞内でＳｐｙ  Ｃａｓ９ヌクレアーゼによるゲノム編集を指向する、化学修飾されたｃｒＲＮＡの機能を実証する。最適な修飾パターンは、インビトロ用途とインビボ用途との間で異なる。
【０１０４】
リボース修飾２′ＯＭｅ  ＲＮＡ、２′Ｆ、及びＬＮＡ；末端修飾基プロパンジオールスペーサー及びナフチル−アゾ修飾因子（Ｎ，Ｎ−ジエチル−４−（４−ニトロナフタレン−１−イルアゾ）−フェニルアミン、または「ＺＥＮ」）、及び反転ｄＴ残基；ならびにホスホロチオエート修飾を持つ選択ヌクレオチド間結合を含む、様々な化学修飾を有する一連のｃｒＲＮＡ（表７）を合成した。ナフチル−アゾ修飾された構造、及びエキソヌクレアーゼ攻撃を遮断するための末端基として使用するためのナフチル−アゾ修飾因子及びプロパンジオール修飾因子の使用については、Ｌｅｎｎｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ２：ｅ１１７  ２０１３を参照されたい。ｃｒＲＮＡは、５′末端でＨＰＲＴ１を標的とする１９塩基プロトスペーサードメイン（配列番号１、９、１０、１４〜１６、２２〜２４、１６３〜１７３）または３′末端に１６塩基ｔｒａｃｒＲＮＡ結合ドメインを持つ同じ部位を標的とする２０塩基プロトスペーサードメイン（配列番号４８、１７４〜２３７）のいずれかを有していた。表７に列挙されるｃｒＲＮＡを、非修飾切断（６７塩基）ｔｒａｃｒＲＮＡ配列番号２（表１）または化学修飾された切断（６７塩基）ｔｒａｃｒＲＮＡ配列番号１００（表６）と複合した。２つのｔｒａｃｒＲＮＡの使用は、修飾されたｔｒａｃｒＲＮＡと対合された場合、化学修飾されたｃｒＲＮＡの機能が異なるかどうかの決定を可能にする。対合されたｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ  ＲＮＡオリゴヌクレオチドを、ＨＥＫ−Ｃａｓ９細胞に形質移入し、前述の通り処理した。断片アナライザーを使用して行われる産物の定量的測定と共に、Ｔ７ＥＩミスマッチエンドヌクレアーゼ切断アッセイを使用して、ＨＰＲＴ１遺伝子内の切断率を比較することにより、相対遺伝子編集活性を評価した。
【０１０５】
【表７】
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オリゴヌクレオチド配列の５′〜３′を示す。大文字＝ＤＮＡ、小文字＝ＲＮＡ；下線＝２′−Ｏ−メチルＲＮＡ；斜体＝２′−フルオロＲＮＡ；＋ａ、＋ｃ、＋ｔ、＋ｇ＝ＬＮＡ；Ｃ３＝Ｃ３スペーサー（プロパンジオール修飾因子）；＊＝ホスホロチオエートヌクレオチド間結合；ＺＥＮ−ナフチル−アゾ修飾因子；ＩｎｖＴ＝反転ｄＴ。各種の相対機能的活性は、示されたｃｒＲＮＡが示されたｔｒａｃｒＲＮＡと対合される場合、Ｔ７ＥＩヘテロ二重鎖アッセイにおける切断％によって示される。ＮＤ＝決定されない。
【０１０６】
一部の種類の化学修飾は、通常、非修飾オリゴヌクレオチドを分解するエキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼの存在に起因して、合成核酸が細胞内環境で良好に機能するために必須である。オリゴヌクレオチドへのヌクレアーゼ耐性を付与する、広範囲の修飾が説明されてきた。所与の適用に功を奏する修飾の正確な組み合わせ及び用いる順序は、配列構成、及び生物学的機能に必要なタンパク質相互作用の性質により異なり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＲＮａｓｅ  Ｈ１と相互作用する）及びｓｉＲＮＡ（ＤＩＣＥＲ、ＡＧＯ２、及び他のタンパク質と相互作用する）の化学修飾に関する広範囲の先行研究が行われてきた。化学修飾は、ＣＲＩＳＰＲ  ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体の機能を改善することが予想される。しかしながら、修飾の種類及び／または修飾のパターンが、ＲＮＡの、Ｃａｓ９との機能的関連付けと適応するかを予測することは不可能である。本発明は、哺乳類細胞においてＣａｓ９媒介型遺伝子編集を指向する高レベルの機能を保持する、ｃｒＲＮＡの最小、中度、及び広範囲の化学修飾パターンを定義する。実施例７における調査は、ヒトＨＰＲＴ１遺伝子内の単一部位を標的として行った。良好に機能するｃｒＲＮＡの２０塩基５′末端プロトスペーサーガイドドメインの修飾パターンが、配列構成により異なり得ることに留意されたい。しかしながら、本明細書で定義される、良好に機能する３′末端ｔｒａｃｒＲＮＡ結合ドメインの修飾パターンは、異なる部位が標的とされる場合に隣接したプロトスペーサードメインの配列が変化すると影響を受けるため、ここで示される３′ドメイン修飾は、「ユニバーサル」となる可能性がある。
【０１０７】
表７の結果は、広範囲の修飾が、ｃｒＲＮＡの５′及び３′末端全体で寛容されることを実証する。ｃｒＲＮＡの内部ドメイン内のある特定の選択位置の修飾は、恐らく折り畳まれたＲＮＡの変化した構造及び／または２′ＯＭｅ修飾による重要なＲＮＡ残基の２′−ＯＨとのタンパク質接点の遮断に起因して、低減された活性または活性の全体遮断につながる。例えば、化合物配列番号２０４は、２１／３６残基を２′ＯＭｅ  ＲＮＡで修飾させ（５８％）、非修飾配列と比較して完全な活性を保持する。化合物配列番号２３９は、２′ＯＭｅ  ＲＮＡで修飾された３０／３６残基を有し（８３％）、非修飾配列と比較して完全な活性を保持する。これらの化合物の両方は、５′末端及び３′末端に３つのホスホロチオエート（ＰＳ）修飾されたヌクレオチド間結合も有し、これがエキソヌクレアーゼ攻撃に対して追加の保護を提供する。対照的に、配列番号１６５は、４／３６残基（１１％）のみを２′ＯＭｅ  ＲＮＡで修飾させるが、活性の全喪失を有する。
【０１０８】
配列の大きなブロックは、ｃｒＲＮＡの５′末端及び３′末端において２′ＯＭｅ修飾に寛容であったが、分子の中央部分におけるある特定の残基の修飾は、不活化につながった。ｃｒＲＮＡの中央ドメイン内で２′ＯＭｅ  ＲＮＡを使用して、どの個々の残基が修飾され得るかを更に調査するために、単一塩基修飾２′ＯＭｅ  ＲＮＡ「ウォーク」を行った（配列番号２７２〜２８６）。活性の大幅な低減または完全な喪失につながる特定の残基（ｃｒＲＮＡ内の位置）が特定された。３６塩基ｃｒＲＮＡ配列番号２３９をモデルとして使用し、配列の５′末端から番号を付けて、残基Ｕ１５及びＵ１６の天然ＲＮＡの２′ＯＭｅ  ＲＮＡの置換は、活性の実質的な喪失につながり、残基Ｕ１９は、中度の活性の喪失につながった（図７）。これら３つの部位は、標的特異的プロトスペーサーガイドドメイン内にあるため、配列は標的により異なる（残基１５、１６、及び１９、図７）。ある特定の配列構成において、これらの部位は、修飾に寛容となることが可能である。ユニバーサルｔｒａｃｒＲＮＡ結合ドメイン（残基２１〜３６）内で、残基Ｕ２２、Ｕ２３、及びＵ２４の天然ＲＮＡに対する２′ＯＭｅ  ＲＮＡの置換は、実質的な活性の喪失につながった。このドメインが配列構成により変化しないとすると、これらの部位は、標的配列が変化するにつれて修飾寛容が異ならない可能性がある。２０塩基標的特異的プロトスペーサーガイドドメイン内の修飾の配列特異的効果は、実施例１０において更に詳細に試験される。
【０１０９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、多くの場合、完全なＰＳ修飾を用いて作製され、全てのヌクレオチド結合がホスホロチオエート修飾される。タンパク質エフェクター分子ＲＮａｓｅ  Ｈ１が、機能的基質／酵素複合体を形成する場合に、ＡＳＯ内のＰＳ修飾を寛容するため、この広範囲のレベルの修飾が可能である。一方で、ｓｉＲＮＡは、完全ＰＳ修飾を寛容せず、広範囲のＰＳ修飾は、エフェクタータンパク質ＡＧＯ２との生産的相互作用を妨げる。ｃｒＲＮＡの限定されたＰＳ末端修飾は、活性の喪失なく行われ得る（配列番号１７７、１７８、２３９等は、各末端で３ＰＳ結合を有する）。末端修飾は、これがエキソヌクレアーゼ攻撃からの追加の保護を加えるため望ましい。選択内部部位のＰＳ修飾が寛容されてもよく、エンドヌクレアーゼ攻撃からの追加の保護を提供し得る。配列番号２６４を塩基修飾パターンとして使用し、内部結合を、ｔｒａｃｒＲＮＡ結合ドメイン（配列番号２６５）内、プロトスペーサーガイドドメインの３′末端内（種領域）（配列番号２６６）、または両方の領域（配列番号２６７）でＰＳ修飾した。増加レベルのＰＳ修飾は、低減された機能的活性につながり、配列番号２６７は、修飾の少ない配列番号２６４変異型の活性の約５０％を有する。配列番号２６７は、修飾された３５個のヌクレオチド間結合のうちの２１個を有し、ヌクレアーゼ曝露に対して安定となる。高ヌクレアーゼ環境への曝露が必要とされる場合（研究または治療適用のための直接ＩＶ投与等）、この高度に修飾された変異型は、実際に修飾の少ない変異型よりも高い活性を示し、より速やかに分解される。
【０１１０】
ＰＳ修飾が化学毒性に寄与する実験的設定が存在する。この場合、エキソヌクレアーゼ攻撃を遮断する他の方法の使用が望ましい。ｃｒＲＮＡは、エキソヌクレアーゼ攻撃を遮断するように５′末端及び３′末端のいずれかまたは両方に配置されたＣ３スペーサー（プロパンジオール修飾因子）またはＺＥＮ（ナフチル−アゾ修飾因子）を有し、ＰＳ修飾の必要性を省く。この戦略は、ＰＳ末端ブロック修飾を排除するために用いられ得る（配列番号１７９〜１８６を参照されたい）。この戦略を使用して、より高度に修飾されたｃｒＲＮＡ変異型のＰＳ含有量を低減することができる。配列番号２７１は、配列番号２６７と同じパターンでＰＳ修飾された内部プロトスペーサードメイン及びｔｒａｃｒＲＮＡ結合ドメインを有するが、（２１個ではなく）１５個のＰＳヌクレオチド間結合のみを用い、改善された活性を示す。したがって、内部ＰＳ修飾を持つ非塩基末端ブロックの組み合わせを使用して、高い活性を維持しながらヌクレアーゼを増加させることができる。
【０１１１】
実施例８
以下の実施例は、本発明の修飾されたＣＲＩＳＰＲ  ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの改善された能力を実証する。実施例２〜７は、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体の、３０ｎＭ濃度でのヒトＨＥＫ−Ｃａｓ９細胞への形質移入を用いた。実験的試験は、この用量が、用量応答曲線の上肩部を表し、それにより、高用量のＲＮＡを使用することが、遺伝子編集効率を改善しなかったが、低用量の使用が低い遺伝子編集効率をもたらしたことを以前に示していた。それらの測定は、非修飾ＲＮＡを使用して行った。本実施例は、非修飾ＲＮＡと比較して、本発明の新たな最適化された化学修飾ＲＮＡの用量応答を再審査し、化学修飾（すなわち、ヌクレアーゼ安定化）が、低用量で使用され得る、より強力な化合物をもたらすことを実証する。
【０１１２】
実施例５は、本発明の切断されたガイドＲＮＡが、ヒトＨＰＲＴ１遺伝子内の１２部位においてＷＴ  ＲＮＡよりも優れて機能したことを実証した。これらの部位のうちの４つ（３８０８７、３８２３１、３８１３３、及び３８２８５）を、本実施例において、非修飾と修飾ＲＮＡとの比較のために選択した。非修飾ｃｒＲＮＡを、非修飾ｔｒａｃｒＲＮＡ（配列番号２）と１：１モル比で対合させた。非修飾ｃｒＲＮＡを、修飾されたｔｒａｃｒＲＮＡ（配列番号１００）と１：１モル比で対合させた。修飾されたｃｒＲＮＡを、修飾されたｔｒａｃｒＲＮＡ（配列番号１００）と１：１モル比で対合させた。配列を表８に示す。ＲＮＡを、前述のとおり、３０ｎＭ、１０ｎＭ、及び３ｎＭ濃度でＨＥＫ−Ｃａｓ９細胞に形質移入した。細胞を３７℃で４８時間インキュベートし、次いで、ＤＮＡに関して処理し、Ｔ７ＥＩミスマッチエンドヌクレアーゼ活性におけるＨＰＲＴ１遺伝子座での切断率を比較することにより、遺伝子編集活性の証拠について試験し、産物の定量的測定は、前述の通り、断片アナライザーを使用して行った。結果を表８に示す。
【０１１３】
【表８】
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2017538427.tif 000043
オリゴヌクレオチド配列の５′〜３′を示す。小文字＝ＲＮＡ、下線＝２′−Ｏ−メチルＲＮＡ、＊＝ホスホロチオエートヌクレオチド間結合。非修飾ｃｒＲＮＡ＝Ｕｎ−ｃｒ。非修飾ｔｒａｃｒＲＮＡ＝Ｕｎ−ｔｒ。修飾されたｃｒＲＮＡ＝Ｍｏｄ−ｃｒ。修飾されたｔｒａｃｒＲＮＡ＝Ｍｏｄ−ｔｒ。各種の相対機能的活性は、試験された各用量に関して、Ｔ７ＥＩヘテロ二重鎖アッセイにおいて切断％により示される。
【０１１４】
一般に、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの修飾は、ＲＮＡが過剰に存在する場合、ＲＮＡが高用量で形質移入されると遺伝子編集効率にわずかな影響を及ぼした。より低い用量で、修飾された試薬は、改善された能力を示し、場合によっては顕著に能力を改善した。改善の程度は、部位により異なっていた。非常に有能な部位３８０８７は、試験された全てのｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ変異型により３０ｎＭ及び１０ｎＭ用量で非常に効率的な遺伝子編集を示し、３ｎＭの修飾されたｔｒａｃｒＲＮＡの使用（ｃｒＲＮＡのいずれかと共に）、改善された活性を示した。３８２３１等の低能力部位は、修飾されたＲＮＡを使用して試験された最高用量（３０ｎＭ）においても改善された遺伝子編集効率を示した。ｔｒａｃｒＲＮＡ単独の修飾は、単独で利得を示したが、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの両方が修飾された場合に最も優れた利得が認識された。図８は、ＨＰＲＴ１部位３８２８５に特異的な修飾ｔｒａｃｒＲＮＡ（配列番号１００）と対合された１つの有効な修飾ｃｒＲＮＡ（配列番号１７８）の概略を示す。図９もまた、ＨＰＲＴ１部位３８２８５に特異的な修飾ｔｒａｃｒＲＮＡ（配列番号１３４）と対合された高度に機能的なｃｒＲＮＡ（配列番号２３９）である、より高度に修飾された対の概略を示す。
【０１１５】
本実施例は、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体の、ＨＥＫ−Ｃａｓ９細胞への形質移入を用い、Ｃａｓ９タンパク質が構成的に発現される。したがって、形質移入されたＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質に即時結合することができ、ヌクレアーゼによる細胞質中の分解の危険性を最小限に抑える。ｃｒＲＮＡ及び／またはｔｒａｃｒＲＮＡの化学修飾の利得は、Ｃａｓ９タンパク質が作製されている間、形質移入されたＲＮＡが細胞ヌクレアーゼへの曝露から生き残らなければならない場合により優れていることが期待される。Ｃａｓ９  ｍＲＮＡまたはＣａｓ９発現ベクターが標的ＲＮＡと共形質移入されるプロトコルを使用する場合に起こり、それによりＣａｓ９は、既に細胞内で発現しないようにすることが期待される。ＲＮＡは、血清（ＩＶ投与後）及び細胞性細胞質ヌクレアーゼに存在する両方のヌクレアーゼに曝露され得る場合、高度に修飾されたＲＮＡを使用する利得は、インビボ適用（医学的治療等）に関して最大となるであろう。
【０１１６】
実施例９
実施例２〜８は、Ｃａｓ９を構成的に発現する哺乳類細胞内でＣａｓ９媒介ゲノム編集を誘起する、切断及び／または化学修飾されたＣＲＩＳＰＲ  ｃｒＲＮＡ及び／またはｔｒａｃｒＲＮＡの活性を実証する。本実施例は、本発明の切断された修飾ＲＮＡ組成物は、Ｃａｓ９タンパク質に結合することができ、この複合体は、ヒト細胞に形質移入され得ること、更にリボヌクレアタンパク質（ＲＮＡ）複合体の形質移入が、非常に効率的なゲノム編集を誘起するのに十分であることを実証する。
【０１１７】
ヒトＨＰＲＴ１部位３８２８５に特異的な試薬を、本実施例に用いられた。非修飾ｃｒＲＮＡを、非修飾ｔｒａｃｒＲＮＡと１：１モル比で対合させた。修飾ｃｒＲＮＡを、修飾ｔｒａｃｒＲＮＡと１：１モル比で対合させた。修飾ｃｒＲＮＡを、修飾ｔｒａｃｒＲＮＡと１：１モル比で対合させた。配列を表９に示す。増加量のＲＮＡｉＭＡＸ脂質形質移入試薬を使用して（１．２μＬ、ＨＥＫ−Ｃａｓ９細胞内の３０ｎＭ  ＲＮＡ単独形質移入の場合、９６ウェルフォーマットで１００μＬ形質移入当たりに使用される０．７５μＬ量にわたって増加した）、Ｃａｓ９タンパク質（Ｃａｒｉｂｏｕ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡとの１：１複合体を１０ｎＭ濃度で用いたことを除いて上記の通り、ＲＮＡを非修飾ＨＥＫ２９３細胞に形質移入した。細胞を３７℃で４８時間インキュベートし、次いで、ＤＮＡに関して処理し、Ｔ７ＥＩミスマッチエンドヌクレアーゼ活性におけるＨＰＲＴ１遺伝子座での切断率を比較することにより、遺伝子編集活性の証拠について試験し、産物の定量的測定は、前述の通り、断片アナライザーを使用して行った。結果を表９に示す。
【０１１８】
【表９】
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オリゴヌクレオチド配列の５′〜３′を示す。小文字＝ＲＮＡ、下線＝２′−Ｏ−メチルＲＮＡ、＊＝ホスホロチオエートヌクレオチド間結合。非修飾ｃｒＲＮＡ＝Ｕｎ−ｃｒ。非修飾ｔｒａｃｒＲＮＡ＝Ｕｎ−ｔｒ。修飾されたｃｒＲＮＡ＝Ｍｏｄ−ｃｒ。修飾されたｔｒａｃｒＲＮＡ＝Ｍｏｄ−ｔｒ。各複合体の相対機能的活性は、試験された各用量に関して、Ｔ７ＥＩヘテロ二重鎖アッセイにおいて切断％により示される。
【０１１９】
３つのＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ複合体の全ては、哺乳類ゲノム編集のためのＲＮＰ形質移入プロトコルにおいて良好に機能した。非修飾ｃｒＲＮＡ＋非修飾ｔｒａｃｒＲＮＡ対（配列番号４８及び２）ならびに非修飾ｃｒＲＮＡ＋修飾ｔｒａｃｒＲＮＡ対（配列番号４８及び１００）は、ＨＥＫ−Ｃａｓ９プロトコルよりもＲＮＰプロトコルにおいて、１０ｎＭ用量で２．５倍良好に機能し、細胞質または核内のＣａｓ９タンパク質との形質移入と結果として起こる複合との間で悪化を起こす修飾ＲＮＡが少ないことと一致する。故に、非修飾ＲＮＡには高用量が必要とされ、一部の設定において、非修飾ＲＮＡがいかなるゲノム編集活性も指向できない可能性がある。一方、修飾ｃｒＲＮＡ＋修飾ｔｒａｃｒＲＮＡ（配列番号１７８及び１００）は、両方のプロトコルにおいて高い効率で機能した。
【０１２０】
本発明の修飾された切断ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡは、直接Ｃａｓ９  ＲＮＰ形質移入方法により良好に機能する。
【０１２１】
実施例１０
実施例６及び７において行われた化学修飾最適化試験は、様々な修飾パターンを有するｔｒａｃｒＲＮＡと対合された様々な修飾パターンを有するｃｒＲＮＡの活性を試験した。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ユニバーサルであり、同じ配列を全ての標的部位で用いる。ｔｒａｃｒＲＮＡの様々な修飾パターンの性能は、異なる標的部位間で同様であることが予想される。しかしながら、ｃｒＲＮＡは、異なる標的部位間で配列が異なる。実施例７及び８で試験された最適化バージョンにおいて、ｃｒＲＮＡの５′−２０塩基は、標的特異的であり（すなわち、「プロトスペーサードメイン」）、３′−１６塩基はユニバーサルである（すなわち、「ｔｒａｃｒＲＮＡ結合ドメイン」）。ｔｒａｃｒＲＮＡのように、ｃｒＲＮＡのユニバーサル１６塩基３′ドメイン内の様々な修飾パターンの性能は、全ての標的部位において同様であると予想される。しかしながら、異なる修飾パターンの性能は、５′−２０塩基標的特異的ドメイン内に存在する配列構成によって影響され得る可能性がある。
【０１２２】
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に有効な修飾パターンは、配列環境によって影響されることは十分に確立されている（Ｂｅｈｌｋｅ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １８：３０５−３２０，２００８）。ｓｉＲＮＡの場合、ある特定の「限定修飾」パターンは、全ての部位に適用され得るが、「重い修飾」の場合、どのパターンが所与の配列に対して機能的であり、経験的試験が必須であるかを予測することは不可能である。本実施例は、配列構成がｃｒＲＮＡに及ぼす効果を試験し、５′−２０塩基標的特異的ドメイン内の異なる修飾パターンを異なる部位で試験する。
【０１２３】
実施例６及び７における修飾試験は、ヒトＨＰＲＴ１遺伝子において単一ｃｒＲＮＡ  ＰＡＭを用いた。本試験は、異なる修飾パターンの機能的性能を比較して、以前に調べた部位を含む、ヒトＨＰＲＴ１遺伝子内の１２部位を調べ、全ての部位において良好な結果で用いられ得る単一修飾パターンを確立する。これら１２部位に関する他の試験については、実施例５を参照されたい。
【０１２４】
３′末端に１６ｍｅｒユニバーサルｔｒａｃｒＲＮＡ結合配列を持つヒトＨＰＲＴ１遺伝子内の１２部位に特異的な２０塩基のプロトスペーサードメイン長を有する、一連のｃｒＲＮＡ（表１０）を合成した。ｃｒＲＮＡは、リボース修飾２′ＯＭｅ  ＲＮＡ、末端修飾基プロパンジオールスペーサー及びナフチル−アゾ修飾因子（Ｎ，Ｎ−ジエチル−４−（４−ニトロナフタレン−１−イルアゾ）−フェニルアミン、または「ＺＥＮ」）、反転ｄＴ残基；及びホスホロチオエート修飾を持つ選択ヌクレオチド間結合を含む、様々な化学修飾を使用して作製した。用いられた異なる修飾の概略表示を図１０に示す。
【０１２５】
ｃｒＲＮＡを、高度に修飾された６７ｍｅｒ  ｔｒａｃｒＲＮＡ（配列番号１００）と対合された。対合されたｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ  ＲＮＡオリゴヌクレオチドを、ＨＥＫ−Ｃａｓ９細胞に形質移入し、実施例２に記載される通り処理した。断片アナライザーを使用して行われる産物の定量的測定と共に、Ｔ７ＥＩミスマッチエンドヌクレアーゼ切断アッセイを使用して、ＨＰＲＴ１遺伝子内の切断率を比較することにより、相対遺伝子編集活性を評価した。結果を表１０及び図１１に示す。
【０１２６】
【表１０】
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オリゴヌクレオチド配列の５′〜３′を示す。小文字＝ＲＮＡ、下線＝２′−Ｏ−メチルＲＮＡ、Ｃ３＝Ｃ３スペーサー（プロパンジオール修飾因子）、＊＝ホスホロチオエートヌクレオチド間結合、ＺＥＮ＝ナフチル−アゾ修飾因子。各種の相対機能的活性は、示されたｃｒＲＮＡが、ヒトＨＲＰＴ１内の１２部位の各々において示されたｔｒａｃｒＲＮＡと対合される場合、Ｔ７ＥＩヘテロ二重鎖アッセイにおける切断％によって示される。
【０１２７】
修飾されたｃｒＲＮＡは、ユニバーサルであり、ｔｒａｃｒＲＮＡに結合する１６塩基３′末端ドメイン内で固定された修飾パターンを用いた。異なる修飾パターンを、標的特異的である（すなわち、配列が標的部位により異なる）５′末端ドメイン内で試験／比較した。試験設定は、５′末端で開始して３′末端に向かって進む０、３、４、６、８、１０、１２、１３、または１４個の連続２′ＯＭｅ  ＲＮＡ残基を有する変異型を含んでいた。これらの修飾パターンは、ｃｒＲＮＡの機能的性能を低減することが以前に実証された位置を回避した（実施例７）。非塩基修飾因子末端基（Ｃ３スペーサー、またはＺＥＮ）の使用も（追加の修飾なしに）試験した。この調査において、機能的活性を１２部位全てにわたって比較した場合、試験された全ての部位は、５′末端における０〜１０個のＲＮＡ残基が２′ＯＭｅ  ＲＮＡ残基で置換された場合に完全な活性を示した。１／１２部位のみが、修飾された１２残基により活性のわずかな低減を示したが、１３残基が修飾された場合に３／１２部位が活性の低減を示し、１４残基が修飾された場合に４／１２部位が活性の低減を示した。末端修飾因子（Ｃ３、ＺＥＮ）は、全ての部位において完全な活性を示した。
【０１２８】
試験された全ての部位で完全な活性を示した最高レベルのｃｒＲＮＡ修飾は、修飾パターン６及び７を含んでいた（図１０）。これは、それぞれ２′ＯＭｅ  ＲＮＡで修飾されたｃｒＲＮＡ内の塩基の６１％及び６７％を表す。
【０１２９】
【化２】
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【０１３０】
本実施例におけるデータはまた、個々の部位が最高レベルで修飾され、能力を保持し得ることを実証する。例えば、試験された１２部位のうちの８部位は、修飾された残基の７２％を有する修飾パターン８を使用して、完全な活性を示した。更に、実施例７は、ＨＰＲＴ１のｃｒＲＮＡ標的部位３８２８５（配列番号２３９）が、完全な活性を有し、修飾された３０／３６残基を有する（８３％、６個の非修飾ＲＮＡ残基のみが残る）。修飾パターン６または修飾パターン７等の塩基修飾パターンを、試験の開始点として使用し、活性が喪失する前に特定の配列が修飾され得る程度を経験的に確認することができる。図１２は、修飾パターン６  ｃｒＲＮＡが高度に修飾されたｔｒａｃｒＲＮＡ配列番号１３４と対合される概略を示す。
【０１３１】
実施例１１
本明細書における実施例は、化膿性連鎖球菌由来のＣａｓ９エンドヌクレアーゼを用いる。Ｓ．ｐｙ．Ｃａｓ９（ＳｐｙＣａｓ９）の天然アミノ酸配列を以下に示す（配列番号４０７）。
【０１３２】
天然Ｃａｓ９  ＤＮＡ配列を、大腸菌内の発現のためにコドン最適化され、哺乳類核局在化（ヌクレアーゼ局在化シグナル）、及びタンパク質精製補助（Ｈｉｓタグ）のために添加された要素を有していた。組み換えタンパク質の最終アミノ酸配列を示す（配列番号４０８）。大腸菌内で組み換えタンパク質を発現させるために用いられるＤＮＡ配列を示す（配列番号４０９）。
【０１３３】
天然Ｃａｓ９  ＤＮＡ配列を、ヒト細胞内の発現のためにコドン最適化し、追加される抗体認識（Ｖ５エピトープ）及び哺乳類核局在化（ヌクレアーゼ局在化シグナル、ＮＬＳ）のために要素を追加させた。最終アミノ酸配列（配列番号４１０）、続いてＤＮＡ配列（配列番号４１１）を示す。
【０１３４】
天然Ｓ．ｐｙ  Ｃａｓ９  ＤＮＡ配列コドンを、ヒト細胞内の発現のために最適化し、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ発現カセット（配列番号４１２）として組み立てた。この配列は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、Ｖ５エピトープタグ、核局在化シグナル、コドン最適化されたＣａｓ９配列、第２の核局在化シグナル、及びポリアデニル化シグナルを持つＢＧＨ（ウシ成長ホルモン）遺伝子３′ＵＴＲ要素を含む。この発現カセットから作製されたｍＲＮＡの配列を示す（配列番号４１３）。
【０１３５】
Ｓ．ｐｙ．Ｃａｓ９アミノ酸配列（配列番号４０７）。
【０１３６】
【化３】
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３  ＮＬＳ配列及び精製Ｈｉｓタグを含む大腸菌内の発現のためにコドン最適化されたＤＮＡから発現されるＳ．ｐｙ  Ｃａｓ９アミノ酸配列（配列番号４０８）。
【０１３７】
【化４】
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３  ＮＬＳ配列及び精製Ｈｉｓタグを含む大腸菌内の発現のためにコドン最適化されたＳ．ｐｙ  Ｃａｓ９  ＤＮＡ配列（配列番号４０９）。
【０１３８】
【化５】
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Ｖ５エピトープタグ及び２  ＮＬＳ配列を含むヒト細胞内の発現のためにコドン最適化されたＤＮＡから発現されるＳ．ｐｙ  Ｃａｓ９アミノ酸配列（配列番号４１０）。
【０１３９】
【化６】
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Ｖ５エピトープタグ及び２  ＮＬＳ配列を含むヒト細胞内の発現のためにコドン最適化されたＳ．ｐｙ  Ｃａｓ９  ＤＮＡ配列（配列番号４１１）。
【０１４０】
【化７】
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Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ発現カセットとしてヒト細胞内の発現のためにコドン最適化されたＳ．ｐｙ  Ｃａｓ９  ＤＮＡ配列（配列番号４１２）。この配列は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、Ｖ５エピトープタグ、核局在化シグナル、コドン最適化されたＣａｓ９配列、第２の核局在化シグナル、及びポリアデニル化シグナルを持つＢＧＨ（ウシ成長ホルモン）遺伝子３′ＵＴＲ要素を含む。
【０１４１】
【化８】
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発現カセット（配列番号４１２）から作製されたＳ．ｐｙ  Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ（配列番号４１３）。この配列は、Ｖ５エピトープタグ、核局在化シグナル、コドン最適化されたＣａｓ９配列、第２の核局在化シグナル、及びＢＧＨ（ウシ成長ホルモン）遺伝子３′ＵＴＲ要素及びポリ−Ａテールを含む。
【０１４２】
【化９】
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【０１４３】
実施例１２
以下の実施例は、非修飾ＩＶＴ  ｓｇＲＮＡと比較した場合に、本発明の切断され、化学修飾されたｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体により哺乳類細胞内の自然免疫系の低減された刺激を実証する。
【０１４４】
哺乳類細胞は、抗ウイルス免疫の一部として外来ＲＮＡを特定し、応答することが意図される種々の受容体を有する。これには、ＴＬＲ−３、ＴＬＲ−７、ＴＬＲ８、ＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ５、ＯＡＳ、ＰＫＲ等の受容体が含まれる。広義には、短いかまたは哺乳類細胞に存在する化学修飾を含有するＲＮＡ（２′ＯＭｅ  ＲＮＡ等）は、検出を回避するか、または長い非修飾ＲＮＡより低い刺激性である。本実施例は、商用ＩＶＴ  ｓｇＲＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて、哺乳類ＨＥＫ２９３細胞が、本発明の切断された非修飾または切断された修飾ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体で形質移入される場合の、２つの免疫応答関連遺伝子（ＩＦＩＴ１及びＩＦＩＴＭ１）の刺激のレベルを比較する。
【０１４５】
ヒトＨＰＲＴ１部位３８２８５に特異的なＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡを用いた。配列を以下の表１１に示す。非修飾ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体（配列番号４８及び２）、修飾されたｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体（配列番号１７８及び１００）、ならびにｓｇＲＮＡ（配列番号４１４）を、上記実施例２に概説される通り、ＨＥＫ−Ｃａｓ９細胞に３０ｎＭ濃度で形質移入した。ＳＶ９６全ＲＮＡ単離キット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、形質移入の２４時間後にＲＮＡを調製した。ランダム六量体及びオリゴ−ｄＴプライミングの両方を使用し、製造元の指示に従って、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）−ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）と共に１５０ｎｇの全ＲＮＡを使用することによりｃＤＮＡを合成した。形質移入実験は、全て最低３回行った。
【０１４６】
Ｉｍｍｏｌａｓｅ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ，Ｒａｎｄｏｌｐｈ，ＭＡ）、２００ｎＭプライマー、及び２００ｎＭプローブを用い、１０μＬ反応当たり１０ｎｇのｃＤＮＡを使用して、定量的リアルタイムＰＣＲを行った。用いられたサイクル条件は、以下の通りであった。９５℃で１０分間、続いて９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間の２ステップｐＣＲを４０サイクル。ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（商標）７９００配列検出器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して、ＰＣＲ及び蛍光測定を行った。全ての反応は、２色多重化を使用して３回行った。発現データを、２つの内在性コントロール遺伝子の平均に対して正規化した。コピー数標準を線形化し、全てのアッセイに関して増幅産物をクローン化した。不明なものは、標準に対して外挿法によって推定し、絶対定量測定を確立した。ハウスキーピング内在性コントロール正規化アッセイは、ＨＰＲＴ１（プライマー及びプローブ配列番号４１５〜４１７）及びＳＦＲＳ９（プライマー及びプローブ配列番号４１８〜４２０）であった。免疫活性化経路アッセイは、ＩＦＩＴＭ１（プライマー及びプローブ配列番号４２１〜４２３）、ＩＦＩＴ１（プライマー及びプローブ配列番号４２４〜４２６）であった。ベースラインとして非形質移入細胞を使用して、これらの結果を正規化し、図１３に示す。
【０１４７】
【表１１】
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１化合物Ｉは、配列番号４１７−（ＺＥＮ）−配列番号４４１という式を有するオリゴヌクレオチドである。
２化合物ＩＩは、配列番号４２０−（ＺＥＮ）−配列番号４４２という式を有するオリゴヌクレオチドである。
３化合物ＩＩＩは、配列番号４２３−（ＺＥＮ）−配列番号４４３という式を有するオリゴヌクレオチドである。
４化合物ＩＶは、配列番号４２６−（ＺＥＮ）−配列番号４４４という式を有するオリゴヌクレオチドである。
オリゴヌクレオチド配列の５′〜３′を示す。大文字＝ＤＮＡ；小文字＝ＲＮＡ；下線＝２′−Ｏ−メチルＲＮＡ；＊＝ホスホロチオエートヌクレオチド間結合；ｐｐｐ＝三リン酸塩；ＺＥＮ＝ナフチル−アゾ修飾因子、暗色失活剤；ＦＡＭ＝６−カルボキシフルオレセイン；ＨＥＸ＝ヘキサクロロフルオレセイン。
【０１４８】
非修飾または化学修飾され、切断されたｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体による処置は、ベースラインを超えるＩＦＩＴ１またはＩＦＩＴＭ１発現の検出可能な増加につながらなかった。対照的に、より長いＩＶＴ  ｓｇＲＮＡによる処置は、４５倍のＩＦＩＴＭ１の誘導及び２２０倍のＩＦＩＴ１の誘導につながった。故に、ｓｇＲＮＡを使用して、自然免疫系の著しい刺激が起こり、これは、本発明の短いｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を使用すると不在であった。
【０１４９】
実施例１３
以下の実施例は、哺乳類ＣＲＩＳＰＲゲノム編集適用において高い効率で実行する、新たな高度に修飾されたｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ組成物を実証するために特に有効であると実施例６及び７で特定された修飾パターンを組み合わせる。
【０１５０】
示される通り、化学修飾を有する一連のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ（表１２）を合成した。ｃｒＲＮＡは、３′末端の１６塩基ｔｒａｃｒＲＮＡ結合ドメインと共に、５′末端でヒトＨＰＲＴ１遺伝子（３８２８５）内の同じ部位を標的とする２０塩基プロトスペーサードメインを用いた。６７個のヌクレオチドまたは６２個のヌクレオチドが切断されたバージョンのｔｒａｃｒＲＮＡ配列を使用して、示される通り、化学修飾を有するｔｒａｃｒＲＮＡを合成した。表１２に列挙されたｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを、示される通り対合させて、３０ｎＭの濃度でＨＥＫ−Ｃａｓ９細胞に形質移入し、前述の実施例に記載される通り処理した。断片アナライザーを使用して行われる産物の定量的測定と共に、Ｔ７ＥＩミスマッチエンドヌクレアーゼ切断アッセイを使用して、ＨＰＲＴ１遺伝子内の切断率を比較することにより、相対遺伝子編集活性を評価した。
【０１５１】
【表１２】
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【０１５２】
オリゴヌクレオチド配列の５′〜３′を示す。小文字＝ＲＮＡ、下線＝２′−Ｏ−メチルＲＮＡ、小文字斜体＝２′Ｆ  ＲＮＡ；＊＝ホスホロチオエートヌクレオチド間結合。各複合体の相対機能的活性は、試験された各用量に関して、Ｔ７ＥＩヘテロ二重鎖アッセイにおいて切断％により示される。
【０１５３】
ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ対＃１及び＃２は、高度に２′Ｆ  ＲＮＡ修飾されたｃｒＲＮＡ（配列番号４４８、２２／３６残基が修飾された、若しくは６１％）は、非修飾ｔｒａｃｒＲＮＡ（配列番号２）、または高度に２′ＯＭｅ修飾されたｔｒａｃｒＲＮＡ（配列番号１００）のいずれかと対合された場合、高度に機能的であることを示す。ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ対＃３及び＃４は、中レベル（配列番号４５０、１９／６７残基が修飾された、若しくは２８％）、または高レベル（配列番号４４９、４６／６７残基が修飾された、若しくは６９％）の２′Ｆ  ＲＮＡ修飾は、高度に機能的であることを示す。実施例６（特に、２′ＯＭｅ「ウォーク」、配列番号１４４〜１６２）から得られた情報を使用して、ｔｒａｃｒＲＮＡの内部ドメイン内で修飾され得る特定の残基を特定した（図６を参照されたい）。ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ対＃５は、この場合、切断された６２ヌクレオチド設計（配列番号４５１、５１／６２残基が２′ＯＭｅ  ＲＮＡで修飾された、若しくは８２％）であった極めて高度に修飾されたｔｒａｃｒＲＮＡが、哺乳類細胞内でＣＲＩＳＰＲゲノム編集を誘起することにおいて高い能力を有することを実証する。したがって、元の８９ＲＮＡヌクレオチド野生型ｔｒａｃｒＲＮＡが、本明細書において、わずか１１個のＲＮＡ残基が残る（１１／６２）形態に最適化され、それにより、哺乳類自然免疫系のＲＮＡ系活性化の危険性を著しく低減し、ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレアーゼ感受性ＲＮＡ含有量を最低レベルに低減する。
【０１５４】
本明細書において引用される刊行物、特許出願、及び特許を含む全ての参考文献は、各参考文献が、個々にかつ具体的に参照により組み込まれることが示され、その全体が本明細書に記載されているのと同じ程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５５】
本発明を説明する文脈における（特に以下の特許請求の範囲の文脈における）「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という用語、ならびに同様の指示語の使用は、本明細書において別途指示しない限りまたは、文脈により明らかに矛盾しない限り、単数及び複数の両方を含むものと解釈される。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び「含有する」という用語は、別途記載されない限り、変更可能な用語として解釈される（すなわち、「含むが、これに限定されない」を意味する）。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書において別途指示されない限り、その範囲内に含まれる各別個の値を個々に言及することの簡易方法として役立つことが意図されるにすぎず、各別個の値は、それが本明細書において個々に列挙されるように、本明細書に組み込まれる。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書において別途指示されない限り、または文脈により明らかに矛盾しない限り、いずれかの適切な順序で行われ得る。本明細書において提供されるいずれの及び全ての実施例、または例示的な言語（例えば、「等」）の使用は、本発明をより良く解明することが意図されているにすぎず、別途要求されない限り、本発明の範囲に限定を与えるものではない。本明細書におけるいかなる文言も、請求されていないいずれの要素が本発明の実施に必須であるとして示すものと解釈されるべきではない。
【０１５６】
本発明を実行するために発明者らに既知の最良の形態を含む、本発明の好ましい実施形態が本明細書に記載される。そのような好ましい実施形態の変型は、前述の説明を読むことで当業者には明らかとなり得る。発明者らは、当業者がこのような変型を適切に用いることを期待し、発明者らは、本発明が本明細書に具体的に記載方法とは異なる方法で実施されることを意図する。したがって、本発明は、準拠法により許可される通り、本明細書に添付される特許請求の範囲内に列挙される主題の全ての修正及び同等物を含む。更に、上記要素の、それらの全ての可能な変型におけるいずれの組み合わせは、本明細書において別途指示されない限り、または文脈により明らかに矛盾しない限り、本発明に包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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