(57)【要約】  本発明は、変形性関節症の処置における、ｐ７５ＮＴＲニューロトロフィン結合タンパク質および関連分子の新規の治療的使用に関する。
2017527303.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
変形性関節症の処置での使用のための、
ｐ７５ＮＴＲニューロトロフィン結合タンパク質（ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ））。
【請求項２】
請求項１に記載の使用のためのｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）であって、
変形性関節症の処置は、変形性関節症の症状からの緩和を含む、
ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）。
【請求項３】
ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）であって、
変形性関節症の症状からの緩和は、疼痛、炎症、腫れ、圧痛、関節硬直の低減、または関節可動性の増大、またはこれらの任意の組み合わせを含む、
ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）。
【請求項４】
請求項１に記載の使用のためのｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）であって、
変形性関節症の処置は、疾患の進行の遅滞または阻止を含む、
ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）。
【請求項５】
請求項１に記載の使用のためのｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）であって、
変形性関節症の処置は、疾患進行の反転、軟骨の再成長および／または治癒的処置を含む、
ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）。
【請求項６】
請求項４または５に記載の使用のためのｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）であって、
疾患進行は、軟骨の喪失または再成長の割合により判定される、
ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）。
【請求項７】
請求項１に記載の使用のためのｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）であって、
変形性関節症の処置は、予防的処置を含む、
ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）。
【請求項８】
請求項１から７のいずれかに記載の使用のためのｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）であって、
前記ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）は、１つまたは複数の補助分子に連結されたｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）を含む、
ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）。
【請求項９】
請求項８に記載の使用のためのｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）であって、
前記の１つまたは複数の補助分子は、（ａ）トランスフェリンまたはその一部；（ｂ）アルブミンまたはその一部；（ｃ）免疫グロブリンＦｃまたはその一部；または（ｄ）ポリエチレングリコールポリマー鎖から選択される、
ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）。
【請求項１０】
請求項８または９のいずれかに記載の使用のためのｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）であって、
前記ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）は、１つまたは複数のリンカーを介して、前記の１つまたは複数の補助分子に連結される、
ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）。
【請求項１１】
請求項９または１０のいずれかに記載の使用のためのｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）であって、
前記ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）は、免疫グロブリンＦｃまたはその一部に連結されたｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）を含む、
ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれかに記載の使用のためのｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）であって、
前記ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）は、配列番号３のアミノ酸配列を有する、
ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれかに記載の使用のためのｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）であって、
前記ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）は、２０℃で表面プラズモン共鳴により測定したときに、約５ｐＭ〜約５ｎＭの結合親和力（Ｋｄ）で、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ３またはＮＴ４／５のいずれかに結合する、
ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれかに記載の使用のためのｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）であって、
前記ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）は、別々の、連続の、または、第二の薬理学的に活性の化合物と組み合わせた併用での同時の使用のためのものである、
ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）。
【請求項１５】
請求項１４に記載の使用のためのｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）であって、
前記併用の前記の第二の薬理学的に活性の化合物は、オピオイド鎮痛薬、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、バルビツレート鎮静剤、鎮静作用を有するベンゾジアゼピン、鎮静作用を有するＨ１拮抗薬、グルテチミド、メプロバメート、メタカロンまたはジクロラルフェナゾンのような、鎮静剤；骨格筋弛緩薬；ＮＭＤ受容体拮抗薬、α−アドレナリン作用薬、三環系抗うつ薬、抗痙攣薬、タキキニン（ＮＫ）拮抗薬、具体的には、ＮＫ−３、ＮＫ−２またはＮＫ−１拮抗薬、ムスカリン性拮抗薬、ＣＯＸ−２選択的阻害剤、コールタール鎮痛剤、具体的にはパラセタモール；神経遮断薬バニロイド受容体作動薬または拮抗薬；β−アドレナリン作用薬；局部麻酔薬；コルチコステロイド；５−ＨＴ受容体作動薬または拮抗薬；５−ＨＴ２Ａ受容体拮抗薬；コリン作動性（ニコチン性）鎮痛剤；Ｔｒａｍａｄｏｌ（登録商標）；ＰＤＥＶ阻害剤；カンナビノイド；代謝型グルタミン酸サブタイプ１受容体（ｍＧｌｕＲ１）拮抗薬；セロトニン再取り込み阻害剤；ノルアドレナリン（ノルエピネフリン）再取り込み阻害剤；デュアルのセロトニン−ノルアドレナリン再取り込み阻害剤；誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）阻害剤；アセチルコリンエステラーゼ阻害剤；プロスタグランジンＥ２サブタイプ４（ＥＰ４）拮抗薬；ロイコトリエンＢ４拮抗薬；５−リポキシゲナーゼ阻害剤；ナトリウムチャネルブロッカー；または５−ＨＴ３拮抗薬、およびそれらの薬学的に許容できる塩類および溶媒和物、から選択される、
ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）。
【請求項１６】
請求項１から１５のいずれかに記載の使用のためのｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）であって、
前記ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）は、経口、舌下、口腔、局所、直腸、吸入、経皮、皮下、静脈内、動脈内、筋肉内、心臓内、骨内、関節滑液嚢内、皮内、腹腔内、経粘膜、膣、硝子体内、関節内、関節周囲、局部または経皮の投与のために製剤化される、
ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）。
【請求項１７】
ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）をコードする核酸であって、
請求項１から１６のいずれかに定義される変形性関節症の処置での使用のための、
核酸。
【請求項１８】
細胞をトランスフェクトするための複製可能な発現ベクターであって、
ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）をコードする核酸を含み、請求項１から１６のいずれかに定義される変形性関節症の処置での使用のための、
複製可能な発現ベクター。
【請求項１９】
ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）を発現する宿主細胞であって、
請求項１から１６のいずれかに定義される変形性関節症の処置での使用のための、
宿主細胞。
【請求項２０】
医薬組成物であって、
請求項１から１６のいずれか一項に記載のｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）または請求項１７に記載の核酸分子、または請求項１８に記載の複製可能な発現ベクター、または請求項１９に記載の宿主細胞、および薬学的に許容できる担体および／または賦形剤を含む、
医薬組成物。
【請求項２１】
キットであって、
ａ．請求項１から１６のいずれか一項に記載のｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）または請求項１７に記載の核酸分子、または請求項１８に記載の複製可能な発現ベクター、または請求項１９に記載の宿主細胞、または請求項２０の医薬組成物；および
ｂ．変形性関節症および／または変形性関節症の症状の予防または処置のいずれか１つまたは複数のため、または、変形性関節症および／または変形性関節症の症状の発生率を改善、制御、低下させ、または、その発達または進行を遅滞または反転させるための、個体への有効量の前記のｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）、核酸分子、複製可能な発現ベクターまたは医薬組成物の投与に関する説明書、
を含む、
キット。
【請求項２２】
個体における変形性関節症および／または変形性関節症の症状を処置および／または予防する方法であって、
前記個体に、治療的に有効量の請求項１から１６のいずれか一項に記載のｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）または請求項１７に記載の核酸分子、または請求項１８に記載の複製可能な発現ベクター、または請求項１９に記載の宿主細胞、または請求項２０の医薬組成物（場合により、薬学的に許容できる担体をさらに含む）を投与するステップを含む、
方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法であって、
前記ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）は、免疫グロブリンＦｃまたはその一部に連結されたｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）を含む、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変形性関節症の処置における、ｐ７５ＮＴＲニューロトロフィン結合タンパク質および関連分子の新規の治療的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
変形性関節症は、関節が劣化して関節の疼痛、圧痛、硬直およびロッキングをもたらす状態のグループである。それは関節炎の最も一般的な形であり、世界中で何百万もの人々に影響を及ぼしている。
【０００３】
その状態は概して、不十分な自己修復による、関節内の軟骨に対する機械的損傷の結果であると認識される。炎症、疼痛および腫れをもたらすことに加えて、軟骨の損失は、症状を悪化させる骨増殖体（骨棘）の形成をもたらし得て、関節の狭窄および歪みをもたらし得る。軟骨の損傷および損失の正確なメカニズムは、正確には理解されておらず、要因の組み合わせの結果であり得る。
【０００４】
変形性関節症の処置は、利用可能な治癒的処置の選択肢がなく、状態の管理に制限される。また、この変性疾患の進行を停止する処置も報告されていない。管理の選択肢は、理学療法、鎮痛剤の投与および／または抗炎症薬の投与および、ある場合には、外科的処置を介した関節置換を含む。
【０００５】
ニューロトロフィンである神経栄養成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン３（ＮＴ−３）、およびニューロトロフィン４／５（ＮＴ−４／５）は、４つの受容体：低親和性ｐ７５ニューロトロフィン受容体（ｐ７５ＮＴＲ）および高親和性チロシンキナーゼ受容体；ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、およびＴｒｋＣを介して作用する。低親和性受容体ｐ７５ＮＴＲは、４つのニューロトロフィンの全てに結合して活性化され、他の受容体から独立して機能することが報告されている。しかしながら、Ｔｒｋ受容体はより選択的に活性化され、すなわちＮＧＦはＴｒｋＡに関する選択的なリガンドであり、ＢＤＮＦはＴｒｋＢに関するリガンドであり、そして、ＮＴ−３、ＮＴ−４／５はＴｒｋＣに関するリガンドである。加えて、ｐ７５ＮＴＲとＴｒｋタンパク質が共発現されると、それらは複合体を形成し、両方の受容体のシグナリングを変えることが報告されている（Ｈｕａｎｇ  ａｎｄ  Ｒｅｉｃｈａｒｄｔ，２００３）。実際に、ｐ７５ＮＴＲは、各ニューロトロフィンのそれぞれのＴｒｋ受容体に関する選択性を促進することが示唆されている。
【０００６】
ｐ７５ＮＴＲは、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲ−ＳＦ）のメンバーであり、このスーパーファミリーの完全に特徴付けられた最初のメンバーであった。スーパーファミリー（ヒトでは約３０の遺伝子によりコードされる）は、ｐ７５ＮＴＲにおいて初めて同定された、４０アミノ酸のシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）の１つまたは複数の（典型的に４つ）の繰り返しからなるリガンド結合ドメインにより定義づけられる（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９８６；Ｒａｄｅｋｅ  ｅｔ  ａｌ，１９８７）。対照的に、全てのＴＮＦＲ−ＳＦファミリーメンバーの細胞内ドメインで共通する配列モチーフはない。その結果として、ＴＮＦＲ−ＳＦタンパク質のシグナリングメカニズムは非常に多様性がある。
【０００７】
ｐ７５ＮＴＲの構造の独特な特徴は、膜貫通ドメイン内のシステイニル残基を介して形成された、ジスルフィド結合のｐ７５ＮＴＲ二量体の存在である。このジスルフィド結合は、ｐ７５ＮＴＲによる効果的なニューロトロフィン依存性シグナリングに必要であり、細胞内および細胞外ドメインの形成において重要な役割を果たす（Ｖｉｌａｒ  ｅｔ  ａｌ，２００９ｂ）。ニューロトロフィンは、生理学的に、非共有結合的に関連する二量体として（Ｂｏｔｈｗｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｏｏｔｅｒ，１９７７）、およそ５分の分布相半減期で（Ｔｒｉａ  ｅｔ  ａｌ，１９９４）、存在する。ニューロトロフィン依存性のｐ７５ＮＴＲの活性化は、ｐ７５ＮＴＲ二量体の２つの細胞外ドメインのＣＲＤ２〜４とニューロトロフィン二量体の関連性に関与する（Ｈｅ  ａｎｄ  Ｇａｒｃｉａ，２００４）。最近の研究は、ニューロトロフィン結合が、ｐ７５ＮＴＲ二量体の２つの細胞外ドメインを共により近くに動かし、ジスルフィド結合を中心としたスネイルトング様の動きの中で細胞内ドメインを広げて離れさせて、シグナリングアダプタータンパク質ＮＲＩＦおよびＴＲＡＦ６と細胞内ドメインとを関連させるモデルを支持する（Ｖｉｌａｒ  ｅｔ  ａｌ，２００９ａ，  ２００９ｂ）。ｐ７５ＮＴＲに存在するような内部膜貫通ドメインのジスルフィド結合は、他のＴＮＦＲ−ＳＦファミリーメンバーまたは任意の他の膜タンパク質では、これまで開示されていない。
【０００８】
ｐ７５ＮＴＲは、α−セクレターゼとγ−セクレターゼの活性およびマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）により連続的にタンパク質分解的に切断され、Ｎｏｔｃｈとβ−アミロイド前駆体タンパク質の切断依存的シグナリングパスウェイに似た様式で、その細胞内ドメイン（ＩＣＤ）を細胞質内に放出する（Ｊｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｋａｎｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２００３）。このパスウェイによるｐ７５ＮＴＲ  ＩＣＤの細胞質放出は、関連するＮＲＩＦによるシグナリングを促進する（Ｋｅｎｃｈａｐｐａ  ｅｔ  ａｌ，２００６）。α−セクレターゼとγ−セクレターゼの活性およびＭＭＰによるタンパク質分解的な切断の後の、ｐ７５ＮＴＲの細胞外ドメインの役割は、完全には理解されていない。
【０００９】
ＮＧＦおよび他のニューロトロフィン（ＢＤＮＦ、ＮＴ−３およびＮＴ−４／５）が、変形性関節症、膵炎、関節リウマチ、乾癬、掻痒症および多発性硬化症に起因する疼痛などの病変において、重大な役割を果たすことが示されている（Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｒａｙｃｈａｕｄｈｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｂａｒｔｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｔｒｕｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；ＭｃＤｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｙａｍａｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。ＮＧＦまたはＢＤＮＦのいずれか、ＮＴ−３、およびＮＴ−４／５の、任意のニューロトロフィンに対する選択的抗体が、著しく疼痛を軽減させることが示されている。さらに、ニューロトロフィン受容体ｐ７５ＮＴＲ  Ｔｒｋ  Ａ、Ｔｒｋ  ＢまたはＴｒｋ  Ｃに対する抗体もまた、疼痛モデルに有効であることが示されている（Ｏｒｉｔａ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｓｖｅｎｓｓｏｎ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｉｗａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｃｉｒｉｌｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｐｅｚｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｈａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｕｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｇｈｉｌａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｆｕｋｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。疼痛モデルにおいて、Ｆｕｋｕｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）（坐骨神経挫滅に続く機械的アロディニア）は、抗ｐ７５ＮＴＲ抗体での処置後の、疼痛に関連するエンドポイントに対する有意な効能を示した。この研究から、ｐ７５ＮＴＲ阻害抗体での処置は、ＣＧＲＰおよびｐ７５ＮＴＲ発現を減少させて、疼痛の有意な低減をもたらすことが結論付けられた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ｐ７５ＮＴＲの細胞外ドメインが、変形性関節症の処置に有用であることを示す。ｐ７５ＮＴＲの細胞外ドメインは、疾患の進行を停止させ、さらに反転させることが示された。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
したがって、第一の態様では、変形性関節症の処置での使用のための、ｐ７５ＮＴＲニューロトロフィン結合タンパク質（ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ））が提供される。
【００１２】
好ましい実施態様では、変形性関節症の処置は、変形性関節症の症状からの緩和を含む。好ましくは、変形性関節症の症状からの緩和は、限定されないが、疼痛、炎症、腫れ、圧痛、関節硬直の低減、または関節可動性の増大、またはこれらの任意の組み合わせを含む。
【００１３】
特に好ましい実施態様では、変形性関節症の処置は、疾患進行の遅滞または阻止、および／または、軟骨の損失の低減を含む。好ましくは、変形性関節症の処置は、疾患の進行の反転、軟骨の再成長および／または治癒的処置を含む。好ましくは、疾患の進行は、軟骨の喪失または再成長の割合により判定される。他の好ましい実施態様では、疾患の進行は、関節内に存在する軟骨細胞の数を決定することによりモニタリングされ得る。
【００１４】
他の好ましい実施態様では、変形性関節症の処置は、予防的処置を含む。
【００１５】
特定の好ましい実施態様では、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）はヒトｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）である。
【００１６】
他の好ましい実施態様では、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）は、１つまたは複数の補助分子に連結されたｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）を含む。好ましくは、１つまたは複数の補助分子は、（ａ）トランスフェリンまたはその一部；（ｂ）アルブミンまたはその一部；（ｃ）免疫グロブリンＦｃまたはその一部；または（ｄ）ポリエチレングリコールポリマー鎖から選択される。さらに他の好ましい実施態様では、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）は、１つまたは複数のリンカーを介して、１つまたは複数の補助分子に連結される。
【００１７】
特に好ましい実施態様では、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）は、配列番号３のアミノ酸配列を有する。
【００１８】
特に好ましい実施態様では、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）は、２０℃で表面プラズモン共鳴により測定したときに、約５ｐＭ〜約５ｎＭの結合親和力（Ｋｄ）で、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ３またはＮＴ４／５のいずれかに結合する。
【００１９】
好ましい実施態様では、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）は、別々の、連続の、または、第二の薬理学的に活性の化合物と組み合わせた併用での同時の使用のためのものである。好ましくは、併用の第二の薬理学的に活性の化合物は、オピオイド鎮痛薬、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、バルビツレート鎮静剤、鎮静作用を有するベンゾジアゼピン、鎮静作用を有するＨ１拮抗薬、グルテチミド、メプロバメート、メタカロンまたはジクロラルフェナゾンのような、鎮静剤；骨格筋弛緩薬；ＮＭＤ受容体拮抗薬、α−アドレナリン作用薬、三環系抗うつ薬、抗痙攣薬、タキキニン（ＮＫ）拮抗薬、具体的には、ＮＫ−３、ＮＫ−２またはＮＫ−１拮抗薬、ムスカリン性拮抗薬、ＣＯＸ−２選択的阻害剤、コールタール鎮痛剤、具体的にはパラセタモール；神経遮断薬バニロイド受容体作動薬または拮抗薬；β−アドレナリン作用薬；局部麻酔薬；コルチコステロイド；５−ＨＴ受容体作動薬または拮抗薬；５−ＨＴ２Ａ受容体拮抗薬；コリン作動性（ニコチン性）鎮痛剤；Ｔｒａｍａｄｏｌ（登録商標）；ＰＤＥＶ阻害剤；カンナビノイド；代謝型グルタミン酸サブタイプ１受容体（ｍＧｌｕＲ１）拮抗薬；セロトニン再取り込み阻害剤；ノルアドレナリン（ノルエピネフリン）再取り込み阻害剤；デュアルのセロトニン−ノルアドレナリン再取り込み阻害剤；誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）阻害剤；アセチルコリンエステラーゼ阻害剤；プロスタグランジンＥ２サブタイプ４（ＥＰ４）拮抗薬；ロイコトリエンＢ４拮抗薬；５−リポキシゲナーゼ阻害剤；ナトリウムチャネルブロッカー；または５−ＨＴ３拮抗薬、およびそれらの薬学的に許容できる塩類および溶媒和物から選択される。
【００２０】
好ましくは、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）は、経口、舌下、口腔、局所、直腸、吸入、経皮、皮下、静脈内、動脈内、筋肉内、心臓内、骨内、関節滑液嚢内、皮内、腹腔内、経粘膜、膣、硝子体内、関節内、関節周囲、局部または経皮の投与のために製剤化される。
【００２１】
本発明のさらなる態様では、上記に定義した変形性関節症の処置での使用のための、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）をコードする核酸が提供される。
【００２２】
本発明の別の態様では、上記に定義した変形性関節症の処置での使用のための、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）をコードする核酸を含む、細胞をトランスフェクトするための複製可能な発現ベクターが提供される。
【００２３】
本発明のさらに別の態様では、上記に定義した変形性関節症の処置での使用のための、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）を発現する宿主細胞が提供される。
【００２４】
また、本発明のさらなる態様では、上述のｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）、核酸分子、複製可能な発現ベクター、または宿主細胞、および薬学的に許容できる担体および／または賦形剤を含む、医薬組成物が提供される。
【００２５】
本発明の別の態様は、以下を含むキットに関する：
ａ．上述のｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）、核酸分子、複製可能な発現ベクター、宿主細胞、または医薬組成物；および
ｂ．変形性関節症および／または変形性関節症の症状の予防または処置のいずれか１つまたは複数のため、または、変形性関節症および／または変形性関節症の症状の発生率を改善、制御、低下させ、または、その発達または進行を遅滞または反転させるための、個体への有効量のｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）、核酸分子、複製可能な発現ベクターまたは医薬組成物の投与に関する説明書。
【００２６】
本発明の別の態様では、個体における変形性関節症および／または変形性関節症の症状を処置および／または予防する方法が提供され、前記個体に、治療的に有効量の上述のｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）、核酸分子、複製可能な発現ベクター、宿主細胞、または医薬組成物（場合により、薬学的に許容できる担体をさらに含む）を投与するステップを含む。
【００２７】
本発明は、添付図面の参照により、さらに理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】ＭＩＡまたはＥＴＦ−ＰＢＳの注入後の、軟骨領域の損失の進行。データポイントは、平均±ＳＥＭ、ｎ＝６である。
【図２】コントロール抗体（Ａ、Ｂ）またはｐ７５ＮＴＲ  ０．３ｍｇ／ｋｇ（Ｃ、Ｄ）、１ｍｇ／ｋｇ（Ｅ、Ｆ）、３ｍｇ／ｋｇ（Ｇ、Ｈ）で処置された動物由来の、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色されたラットの膝の内側面。実験的な変形性関節症を、ＭＩＡの関節内注入により、各動物の左膝において誘導した（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ）。右膝はＥＴＦ−ＰＢＳを注入した（コントロール；Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ）（×４拡大）。左および右膝の画像の各セットは、対側性コントロールを示すために個々の動物から撮られる。
【図３】コントロール抗体（Ａ、Ｂ）またはｐ７５ＮＴＲ  ３ｍｇ／ｋｇ（Ｃ、Ｄ）で処置された動物由来の、サフラニンＯで染色されたラットの膝の内側面。実験的な変形性関節症を、ＭＩＡの関節内注入により、各動物の左膝において誘導した（ＡおよびＣ）。右膝は、ＥＴＦ−ＰＢＳを注入した（コントロール；ＢおよびＤ）（×４拡大）。左および右膝の画像の各セットは、対側性コントロールを示すために個々の動物から撮られる。
【図４】２６日目の、膝関節後部における合計の軟骨領域（軟骨表面から下へ、石灰化した軟骨および軟骨下骨の間の境界まで）。コントロール抗体と比較した有意差を示す。＊Ｐ＜０．１および＊＊Ｐ＜０．０５。
【図５】２６日の処置後の、膝関節後部における、１３０ｎｍの閾値吸収波長でのサフラニンＯにより染色された軟骨領域。データは、平均±ＳＥＭ、ｎ＝６であり、コントロール抗体と比較した有意差を示す。＊＊Ｐ＜０．０５。
【図６】ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列。αおよびγセクレターゼ切断部位をボールド体で示す。ＩｇＧ１のＦｃ部分をイタリックで示す。
【図７】図９に示す核酸配列（配列番号４）の、スタートコドンからストップコドンまでの翻訳物（配列番号２）である。
【図８】好ましいｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列である（配列番号３）。ＩｇＧ１のＦｃ部分をイタリック体で示す。ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）部分とＦｃ部分との間のリンカー配列を下線で示す。
【図９】５’クローニングサイトから３’クローニングサイトまでの、産物遺伝子全体の核酸配列である（配列番号４）。
【図１０】ｐ７５−ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃ融合タンパク質の変異体：１：ｐ７５＿ＮＴＲ（ｐ７５−ＮＴＲ配列）（配列番号６）；２：市販のｐ７５−ＮＴＲ−Ｆｃ融合タンパク質（配列番号７）；３：ｐ７５＿Ｆｃ（Ｆｃ配列をＩｇＧ１ｚａのＬｏｎｚａ定常領域のものに改変した市販のｐ７５−ＮＴＲ−Ｆｃ融合タンパク質）（配列番号８）；４：ｐ７５＿Ｆｃ＿Ｃ２２２Ｓ（Ｆｃ配列をＩｇＧ１ｚａのＬｏｎｚａ定常領域のものに改変し、２２２位にシステインからセリンへの追加の変異を有する市販のｐ７５−ＮＴＲ−Ｆｃ融合タンパク質）（配列番号９）；５：ｐ７５＿Ｆｃ＿Ｇ４ｘ１−変異１（４残基グリシンリンカーを有するｐ７５−ＮＴＲ−Ｆｃ融合タンパク質案）（配列番号１０）；６：ｐ７５＿Ｆｃ＿Ｇ４Ｓｘ１−変異２（単一のテトラ−グリシンセリンリンカーを有するｐ７５−ＮＴＲ−Ｆｃ融合タンパク質案）（配列番号１１）；７：ｐ７５＿Ｆｃ＿Ｇ４Ｓｘ２−変異３（２つのテトラ−グリシンセリンリンカーを有するｐ７５−ＮＴＲ−Ｆｃ融合タンパク質案）（配列番号１２）；８：ＩｇＧ１ｚａのＬｏｎｚａ定常領域（配列番号１３）。  このアライメントでは、フォーマットスキームを用いて、推定受容体、Ｆｃ−融合タンパク質およびＦｃ定常領域の間の類似領域を強調する：囲み型（Ｂｏｘｅｄ  ｔｙｐｅ）を用いて、変異タンパク質とｐ７５−ＮＴＲとの間の同一配列領域を示す；一重下線を用いて、全てのＦｃ−融合タンパク質とＬｏｎｚａ  ＩｇＧ１ｚａ  Ｆｃとの間の同一配列領域を示す；イタリック体を用いて、ｐ７５−ＮＴＲとＦｃ定常領域との接合部でのリンカー領域を示す；二重下線およびボールド体を用いて、リンカー領域の外側の非同一配列の位置（親のｐ７５−ＮＴＲ  Ｆｃ−融合タンパク質における２２２に相当する位置）を示す。
【図１１】配列番号１４  ヒトｐ７５ＮＴＲ全アミノ酸配列
【図１２】配列番号１５  シグナル配列を含む、ヒトｐ７５ＮＴＲ細胞外ドメイン
【図１３】配列番号１６  シグナル配列がない、ヒトｐ７５ＮＴＲ細胞外ドメイン
【図１４】配列番号１７  ヒトｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）ニューロトロフィン結合ドメイン１
【図１５】配列番号１８  ヒトｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）ニューロトロフィン結合ドメイン２
【図１６】配列番号１９  ヒトｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）ニューロトロフィン結合ドメイン３
【図１７】配列番号２０  ヒトｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）ニューロトロフィン結合ドメイン４
【図１８】配列番号２１  ヒトｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）ニューロトロフィン結合ドメイン５
【図１９】配列番号２２  ヒトトランスフェリン
【図２０】配列番号２３  ヒトアルブミン
【図２１】配列番号２４  ヒトＦｃＩｇＧ１
【図２２】配列番号２５  ヒトＦｃＩｇＧ２
【図２３】配列番号２６  ヒトＦｃＩｇＧ３
【図２４】配列番号２７  ヒトＦｃＩｇＧ４
【図２５】配列番号２８  血清半減期の延長に関して改変された、ヒトＦｃフラグメント
【図２６】配列番号２９  エフェクター機能の欠損に関して改変された、ヒトＦｃフラグメント
【図２７】配列番号３０  ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃリンカー
【図２８】配列番号３１  ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃリンカー
【図２９】配列番号３２  ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）−Ｆｃリンカー
【図３０】０日目での平均体重。体重（ｇ）は、平均±標準偏差としてプロットされる。グループ１の動物は１ｍｇ／ｋｇのｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃで、グループ２は３ｍｇ／ｋｇのｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃで、グループ３は０．３ｍｇ／ｋｇのｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃで、グループ４は３ｍｇ／ｋｇのＰＧ−００７で、グループ５は３ｍｇ／ｋｇのコントロールＩｇＧ  Ｆｃで処置した。
【図３１】実施例３に記載の８週間の試験中のラットの平均体重。体重（ｇ）は、平均±標準偏差としてプロットされる。グループ１の動物は１ｍｇ／ｋｇのｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃで、グループ２は３ｍｇ／ｋｇのｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃで、グループ３は０．３ｍｇ／ｋｇのｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃで、グループ４は３ｍｇ／ｋｇのＰＧ−００７で、グループ５は３ｍｇ／ｋｇのコントロールＩｇＧ  Ｆｃで処置した。
【図３２】試験薬での処置後、経時的に判定した自発痛測定。データは、各タイムポイント（３５日目〜５６日目）における各動物について示される。グループ１の動物は１ｍｇ／ｋｇのｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃで、グループ２は３ｍｇ／ｋｇのｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃで、グループ３は０．３ｍｇ／ｋｇのｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃで、グループ４は３ｍｇ／ｋｇのＰＧ−００７で、グループ５は３ｍｇ／ｋｇのコントロールＩｇＧ  Ｆｃで、グループ６はＥＴＦ−ＰＢＳで処置し、グループ７は無処置であった。理論的平均０．５に対する１サンプルｔ検定に関して、＊ｐ＜０．０５および＊＊＜０．０１。
【図３３】試験薬での処置後、経時的に判定した自発痛測定。データは、各タイムポイント（３５日目〜５６日目）における各動物について示される。グループ１の動物は１ｍｇ／ｋｇのｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃで、グループ２は３ｍｇ／ｋｇのｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃで、グループ３は０．３ｍｇ／ｋｇのｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃで、グループ４は３ｍｇ／ｋｇのＰＧ−００７で、グループ５は３ｍｇ／ｋｇのコントロールＩｇＧ  Ｆｃで、グループ６はＥＴＦ−ＰＢＳで処置し、グループ７は無処置であった。理論的平均０．５に対する１サンプルｔ検定に関して、＊ｐ＜０．０５および＊＊＜０．０１。
【図３４】０日目に低ＭＩＡまたはＥＴＦ−ＰＢＳを膝に注入後、２８日目から５６日目まで、３ｍｇ／ｋｇのコントロールＩｇＧ−Ｆｃで処置された動物由来の、Ｓａｆｒａｎｉｎ  Ｏ  Ｆａｓｔ  Ｇｒｅｅｎで染色されたラットの膝の内側面（×４拡大）。代表的な画像は、３ｍｇ／ｋｇのコントロールＩｇＧ−Ｆｃで処置された動物から撮られる。左および右膝の画像の各セットは、対側性コントロールを示すために、１匹の個々の動物から撮られる。
【図３５】０日目に低ＭＩＡまたはＥＴＦ−ＰＢＳを膝に注入後、２８日目から５６日目まで、３ｍｇ／ｋｇのＰＧ−００７で処置された動物由来の、Ｓａｆｒａｎｉｎ  Ｏ  Ｆａｓｔ  Ｇｒｅｅｎで染色されたラットの膝の内側面（×４拡大）。代表的な画像は、３ｍｇ／ｋｇのＰＧ−００７で処置された動物から撮られる。左および右膝の画像の各セットは、対側性コントロールを示すために、１匹の個々の動物から撮られる。
【図３６】０日目に低ＭＩＡまたはＥＴＦ−ＰＢＳを膝に注入後、２８日目から５６日目まで、３ｍｇ／ｋｇのｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃで処置された動物由来の、Ｓａｆｒａｎｉｎ  Ｏ  Ｆａｓｔ  Ｇｒｅｅｎで染色されたラットの膝の内側面（×４拡大）。代表的な画像は、３ｍｇ／ｋｇのｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃで処置された動物から撮られる。左および右膝の画像の各セットは、対側性コントロールを示すために、１匹の個々の動物から撮られる。
【図３７】０日目に低ＭＩＡまたはＥＴＦ−ＰＢＳを膝に注入後、２８日目から５６日目まで、１ｍｇ／ｋｇのｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃで処置された動物由来の、Ｓａｆｒａｎｉｎ  Ｏ  Ｆａｓｔ  Ｇｒｅｅｎで染色されたラットの膝の内側面（×４拡大）。代表的な画像は、１ｍｇ／ｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃで処置された動物から撮られる。左および右膝の画像の各セットは、対側性コントロールを示すために、１匹の個々の動物から撮られる。
【図３８】０日目に低ＭＩＡまたはＥＴＦ−ＰＢＳを膝に注入後、２８日目から５６日目まで、０．３ｍｇ／ｋｇのｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃで処置された動物由来の、Ｓａｆｒａｎｉｎ  Ｏ  Ｆａｓｔ  Ｇｒｅｅｎで染色されたラットの膝の内側面（×４拡大）。代表的な画像は、０．３ｍｇ／ｋｇのｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃで処置された動物から撮られる。左および右膝の画像の各セットは、対側性コントロールを示すために、１匹の個々の動物から撮られる。
【図３９】軟骨病理グレード。ＰＧ００７の投与は、組織学的に有意な効能効果を示さなかった。Ｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃは、０．３および１．０ｍｇ／ｋｇにおいて、軟骨保護に対して顕著な効能を示した。３．０ｍｇ／ｋｇにおける効能プロファイルは、より変動的であり、グループの５０％がコントロール群と重なった。
【図４０】軟骨下骨グレード。ＰＧ００７の投与は、３．０ｍｇ／ｋｇのＰ７５ＮＴＲＦｃで観察されたプロファイルと同様に、コントロール群と比較して軟骨下骨の病理の組織学的に有意な増大と関連した。対照的に、０．３および１．０ｍｇ／ｋｇでのＰ７５ＮＴＲ−Ｆｃの投与は、軟骨下骨の組織学における顕著な改善と関連した。
【図４１】間質腔グレード。ＰＧ００７の投与は、いかなる組織学的に有意な効能効果とも関連しなかった。対照的に、Ｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃの投与は、０．３および１．０ｍｇ／ｋｇでの効果が最も顕著であったが−全ての用量において溶骨性の病理の低減および間質腔の拡張と関連し、両方のグループとも、ほぼ正常レベルまで病理を低減した。
【図４２】海綿骨グレード。ＰＧ００７の投与は、コントロールと同様に海綿骨の病理と関連し−２つのサンプルはコントロールの範囲を超えた。対照的に、Ｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃは、０．３および１．０ｍｇ／ｋｇの投与量レベルで、海綿骨の病理を著しく低減させた。３．０ｍｇ／ｋｇでのＰ７５ＮＴＦ−Ｆｃは、より変動的なプロファイルを示し、サンプルの大部分がコントロール群と重なった。
【図４３】骨髄細胞過多。ＰＧ００７の投与は、骨髄内の骨髄性細胞の拡張と関連し、４つのサンプルが最高であるか、またはコントロールの範囲を超えた。Ｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃは−骨髄性の拡張の低減が顕著な特徴であり−０．３および１．０ｍｇ／ｋｇの投与量において髄質細胞性を低減させた。３．０ｍｇ／ｋｇの投与量は、阻害に向かう傾向を示すが、コントロール群における低レベルのレスポンダーと重なった。
【図４４】多病巣性骨硬化症。Ｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃサンプルはコントロール範囲の上端に向けてクラスタリングを見せたが、試験群の間に組織学的に有意な差は無かった。
【図４５】造骨細胞過形成。０．３および１．０ｍｇ／ｋｇでのＰ７５ＮＴＲ−Ｆｃの投与は、組織学的に有意な造骨細胞増殖と関連し、柵状配置（ｐａｌｉｓａｄｉｎｇ）および造骨細胞板（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｉｃ  ｐｌａｔｅ）の形成は、軟骨下骨／軟骨ゾーンにおいて、骨端ゾーンで特に顕著であった。加えて、等級付けられはしないが、このゾーン内に、顕著な「線維芽細胞様」細胞が存在した。ＰＧ００７およびＰ７５ＮＴＲ−Ｆｃ（３．０ｍｇ／ｋｇ）は、組織学的にコントロールと同様であった（図４５）。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
変形性関節症の症状は、炎症、疼痛および腫れを含む。加えて、軟骨の損失は、症状を悪化させる骨増殖体（骨棘）の形成をもたらし得て、関節の狭窄および歪みをもたらし得る。処置の選択肢は現在のところ、理学療法、鎮痛剤の投与および／または抗炎症薬の投与、および、ある場合には、外科的処置を介した関節置換を含む、疾患管理の選択肢に制限されている。現在まで、変形性関節症のための治癒的処置の選択肢は報告がされていない。また、この変性疾患の進行を停止する処置も報告がされていない。したがって、本発明は、治癒的な変形性関節症の処置に関する必要性を対処すること、または、少なくとも変形性関節症における変性を停止することが可能な処置を提供することを求める。
【００３０】
驚くべきことに、本発明者らは、変形性関節症の容認された動物モデルにおけるｐ７５ＮＴＲニューロトロフィン結合タンパク質（ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ））の投与は、疾患の進行を停止するだけでなく、変形性関節症の進行に帰し得る損傷の有意な反転をもたらすことを発見した。
【００３１】
したがって、第一の態様では、変形性関節症の処置での使用のための、ｐ７５ＮＴＲニューロトロフィン結合タンパク質（ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ））が提供される。
【００３２】
好ましい実施態様では、変形性関節症の処置は、変形性関節症の症状からの緩和を含む。好ましくは、変形性関節症の症状からの緩和は、限定されないが、疼痛、炎症、腫れ、圧痛、関節硬直の低減、または関節可動性の増大、またはこれらの任意の組み合わせを含む。
【００３３】
特に好ましい実施態様では、変形性関節症の処置は、疾患進行の遅滞または阻止、および／または、軟骨の損失の低減を含む。好ましくは、変形性関節症の処置は、疾患の進行の反転、軟骨の再成長および／または治癒的処置を含む。好ましくは、疾患の進行は、軟骨の損失または再成長の割合により判定される。軟骨の損失の割合は、制限されないが、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）またはＸ線コンピューター断層撮影（ｘ線ＣＴ）を含む様々な方法によりモニタリングされ得る。他の好ましい実施態様では、疾患の進行は、関節内に存在する軟骨細胞の数を判定することによりモニタリングされ得る。
【００３４】
本明細書において用いられる用語「治癒的処置」は、患者を彼らの疾患以前の状態に回復させる処置を含むことが意図される。そのような処置は、疾患以前の状態を維持するために、活性化合物の連続的な投与を必要とし得る。あるいは、治癒的処置は、疾患以前の状態に到達した時点で停止され得る。
【００３５】
他の好ましい実施態様では、処置は、原発性または続発性変形性関節症のいずれかのものである。原発性変形性関節症の処置は、原発性の全身性結節性変形性関節症および糜爛性変形性関節症（ＥＯＡ、炎症性変形性関節症とも呼ばれる）の両方の処置を含む。
【００３６】
また、変形性関節症の処置は、ＷＯＭＡＣの等級付けまたはＯｕｔｅｒｂｒｉｄｇｅ分類システムの下で分類される疾患症状の改善を含むことも意図される。好ましい実施態様では、変形性関節症の処置は、疾患進行の反転をもたらし、疾患ステージ（ＷＯＭＡＣの等級付け）またはグレード（Ｏｕｔｅｒｂｒｉｄｇｅ分類）の変化へ導く。
【００３７】
他の好ましい実施態様では、変形性関節症の処置は、予防的処置を含む。
【００３８】
特定の好ましい実施態様では、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）はヒトｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）である。
【００３９】
他の好ましい実施態様では、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）は、１つまたは複数の補助分子に連結されたｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）を含む。好ましくは、前記の１つまたは複数の補助分子は、（ａ）トランスフェリンまたはその一部；（ｂ）アルブミンまたはその一部；（ｃ）免疫グロブリンＦｃまたはその一部；または（ｄ）ポリエチレングリコールポリマー鎖から選択される。さらに他の好ましい実施態様では、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）は、前記の１つまたは複数の補助分子に、１つまたは複数のリンカーを介して連結される。好ましくは、リンカーは、（ａ）共有結合；（ｂ）非共有結合；（ｃ）ペプチド結合；または（ｄ）１個のアミノ酸、または、ペプチドを含む複数のアミノ酸、から選択される。特に好ましい実施態様では、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）は、場合によりリンカーを介して免疫グロブリンＦｃまたはその一部に連結された、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）を含む。
【００４０】
ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）が、１よりも多い補助分子に連結される場合は、場合により、各補助分子は、同じまたは異なるもののいずれか、または、同じものと異なるものとの混合である。同様に、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）が、１つまたは複数のリンカーを介して１よりも多い補助分子に連結される場合は、場合により、各リンカーは、同一または異なるもののいずれか、または、同じものと異なるものの混合である。
【００４１】
特に好ましい実施態様では、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）は、配列番号３のアミノ酸配列を有する。
【００４２】
特に好ましい実施態様では、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）は、２０℃で表面プラズモン共鳴により測定したときに、約５ｐＭ〜約５ｎＭの結合親和力（Ｋｄ）で、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ３またはＮＴ４／５のいずれかに結合する。
【００４３】
好ましい実施態様では、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）は、別々の、連続の、または、第二の薬理学的に活性の化合物と組み合わせた併用での同時の使用のためのものである。好ましくは、併用の第二の薬理学的に活性の化合物は、オピオイド鎮痛薬、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、バルビツレート鎮静剤、鎮静作用を有するベンゾジアゼピン、鎮静作用を有するＨ１拮抗薬、グルテチミド、メプロバメート、メタカロンまたはジクロラルフェナゾンのような、鎮静剤；骨格筋弛緩薬；ＮＭＤ受容体拮抗薬、α−アドレナリン作用薬、三環系抗うつ薬、抗痙攣薬、タキキニン（ＮＫ）拮抗薬、具体的には、ＮＫ−３、ＮＫ−２またはＮＫ−１拮抗薬、ムスカリン性拮抗薬、ＣＯＸ−２選択的阻害剤、コールタール鎮痛剤、具体的にはパラセタモール；神経遮断薬バニロイド受容体作動薬または拮抗薬；β−アドレナリン作用薬；局部麻酔薬；コルチコステロイド；５−ＨＴ受容体作動薬または拮抗薬；５−ＨＴ２Ａ受容体拮抗薬；コリン作動性（ニコチン性）鎮痛剤；Ｔｒａｍａｄｏｌ（登録商標）；ＰＤＥＶ阻害剤；カンナビノイド；代謝型グルタミン酸サブタイプ１受容体（ｍＧｌｕＲ１）拮抗薬；セロトニン再取り込み阻害剤；ノルアドレナリン（ノルエピネフリン）再取り込み阻害剤；デュアルのセロトニン−ノルアドレナリン再取り込み阻害剤；誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）阻害剤；アセチルコリンエステラーゼ阻害剤；プロスタグランジンＥ２サブタイプ４（ＥＰ４）拮抗薬；ロイコトリエンＢ４拮抗薬；５−リポキシゲナーゼ阻害剤；ナトリウムチャネルブロッカー；または５−ＨＴ３拮抗薬、およびそれらの薬学的に許容できる塩類および溶媒和物から選択される。
【００４４】
好ましいオピオイド鎮痛薬は、限定されないが、モルヒネ、ヘロイン、ヒドロモルフォン、オキシモルフォン、レボルファノール、レバロルファン、メタドン、メペリジン、フェンタニル、コカイン、コデイン、ジヒドロコデイン、オキシコドン、ヒドロコドン、プロポキシフェン、ナルメフェン、ナロルフィン、ナロキソン、ナルトレキソン、ブプレノルフィン、ブトルファノール、ナルブフィンまたはペンタゾシンを含む。
【００４５】
好ましい非ステロイド性抗炎症性薬（ＮＳＡＩＤ）は、限定されないが、アスピリン、ジクロフェナク、ジフルシナル（ｄｉｆｌｕｓｉｎａｌ）、エトドラク、フェンブフェン、フェノプロフェン、フルフェニサル、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラック、メクロフェナム酸、メフェナム酸、メロキシカム、ナブメトン、ナプロキセン、ニメスリド、ニトロフルルビプロフェン、オルサラジン、オキサプロジン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スルファサラジン、スリンダク、トルメチンまたはゾメピラックを含む。
【００４６】
好ましいバルビツレート鎮静剤は、限定されないが、アモバルビタール、アプロバルビタール、ブタバルビタール、ブタルビタール（ｂｕｔａｂｉｔａｌ）、メホバルビタール、メタルビタール、メトヘキシタール、ペントバルビタール、フェノバルビタール（ｐｈｅｎｏｂａｒｔｉｔａｌ）、セコバルビタール、タルブタール、チアミラール（ｔｈｅａｍｙｌａｌ）またはチオペンタールを含む。
【００４７】
鎮静作用を有する好ましいベンゾジアゼピンは、限定されないが、クロルジアゼポキシド、クロラゼペート、ジアゼパム、フルラゼパム、ロラゼパム、オキサゼパム、テマゼパムまたはトリアゾラムを含む。
【００４８】
鎮静作用を有する好ましいＨ１拮抗薬は、限定されないが、ジフェンヒドラミン、ピリラミン、プロメタジン、クロルフェニラミンまたはクロルシクリジンを含む。
【００４９】
好ましい鎮静剤は、限定されないが、グルテチミド、メプロバメート、メタカロンまたはジクロラルフェナゾンを含む。
【００５０】
好ましい骨格筋弛緩薬は、限定されないが、バクロフェン、カリソプロドール、クロルゾキサゾン、シクロベンザプリン、メトカルバモールまたはオルフレナジンを含む。
【００５１】
好ましいＮＭＤＡ受容体拮抗薬は、限定されないが、デキストロメトルファン（（＋）−３−ヒドロキシ−Ｎ−メチルモルフィナン）またはその代謝物デキストロルファン（（＋）−３−ヒドロキシ−Ｎ−メチルモルフィナン）、ケタミン、メマンチン、ピロロキノリンキニン、シス−４−（ホスホノメチル）−２−ピペリジンカルボン酸、ブジピン、ＥＮ−３２３１（ＭｏｒｐｈｉＤｅｘ（登録商標）、モルヒネおよびデキストロメトルファンの組み合わせ製剤）、トピラマート、ネラメキサン、または、ＮＲ２Ｂ拮抗薬を含むペルジンホテル、例えばイフェンプロジル、トラキソプロジルまたは（−）−（Ｒ）−６−｛２−［４−（３−フルオロフェニル）−４−ヒドロキシ−１−ピペリジニル］−１−ヒドロキシエチル−３，４−ジヒドロ−２（１Ｈ）−キノリノンを含む。
【００５２】
好ましいα−アドレナリン作用薬は、限定されないが、ドキサゾシン、タムスロシン、クロニジン、グアンファシン、デキスメタトミジン（ｄｅｘｍｅｔａｔｏｍｉｄｉｎｅ）、モダフィニル、または４−アミノ−６，７−ジメトキシ−２−（５−メタン−スルホンアミド−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノール−２−イル）−５−（２−ピリジル）キナゾリンを含む。
【００５３】
好ましい三環系抗うつ薬は、限定されないが、デシプラミン、イミプラミン、アミトリプチリン、またはノルトリプチリンを含む。
【００５４】
好ましい抗痙攣薬は、限定されないが、カルバマゼピン、ラモトリジン、トピラマート（ｔｏｐｉｒａｔｍａｔｅ）、またはバルプロエートを含む。
【００５５】
好ましいタキキニン（ＮＫ）拮抗薬は、限定されないが、（αＲ，９Ｒ）−７−［３，５−ビス（トリフルオロメチル）ベンジル］−８，９，１０，１１−テトラヒドロ−９−メチル−５−（４−メチルフェニル）−７Ｈ−［１，４］ジアゾシノ［２，１−ｇ］［１，７］−ナフチリジン−６−１３−ジオン（ＴＡＫ−６３７）、５−［［（２Ｒ，３Ｓ）−２−［（１Ｒ）−１−［３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル］エトキシ−３−（４−フルオロフェニル）−４−モルホリニル］−メチル］−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−１，２，４−トリアゾル−３−オン（ＭＫ−８６９）、アプレピタント、ラネピタント、ダピタントまたは３−［［２−メトキシ−５−（トリフルオロメトキシ）フェニル］−メチルアミノ］−２−フェニルピペリジン（２Ｓ，３Ｓ）を含む。
【００５６】
好ましいムスカリン性拮抗薬は、限定されないが、オキシブチニン、トルテロジン、プロピベリン、塩化トロスピウム、ダリフェナシン、ソリフェナシン、テミベリンおよびイプラトロピウムを含む。
【００５７】
好ましいＣＯＸ−２選択的阻害剤は、限定されないが、セレコキシブ、ロフェコキシブ、パレコキシブ、バルデコキシブ、デラコキシブ、エトリコキシブ、またはルミラコキシブを含む。
【００５８】
好ましいコールタール鎮痛剤は、限定されないが、パラセタモールを含む。
【００５９】
好ましい神経遮断薬は、限定されないが、ドロペリドール、クロルプロマジン、ハロペリドール、ペルフェナジン、チオリダジン、メソリダジン、トリフルオペラジン、フルフェナジン、クロザピン、オランザピン、リスペリドン、ジプラシドン、クエチアピン、セルチンドール、アリピプラゾール、ソネピプラゾール、ブロナンセリン、イロペリドン、ペロスピロン、ラクロプリド、ゾテピン、ビフェプルノックス、アセナピン、ルラシドン、アミスルプリド、バラペリドン、パリンドール、エプリバンセリン、オサネタント、リモナバン、メクリネルタント、Ｍｉｒａｘｉｏｎ（登録商標）またはサリゾタンを含む。
【００６０】
好ましいバニロイド受容体作動薬は、限定されないが、レシニフェラトキシンを含む。好ましいバニロイド受容体拮抗薬は、限定されないが、カプサゼピンを含む。
【００６１】
好ましいβ−アドレナリン作用薬は、限定されないが、プロプラノロールを含む。好ましい局部麻酔薬は、限定されないが、メキシレチンを含む。好ましいコルチコステロイドは、限定されないが、デキサメタゾンを含む。
【００６２】
好ましい５−ＨＴ受容体作動薬または拮抗薬、具体的には５−ＨＴ１Ｂ／１Ｄ作動薬は、限定されないが、エレトリプタン、スマトリプタン、ナラトリプタン、ゾルミトリプタンまたはリザトリプタンを含み；好ましい５−ＨＴ２Ａ受容体拮抗薬は、限定されないが、Ｒ（＋）−α−（２，３−ジメトキシ−フェニル）−１−［２−（４−フルオロフェニルエチル）］−４−ピペリジンメタノール（ＭＤＬ−１００９０７）を含む。
【００６３】
好ましいコリン作動薬（ニコチン性）鎮痛剤は、限定されないが、イスプロニクリン（ＴＣ−１７３４）、（Ｅ）−Ｎ−メチル−４−（３−ピリジニル）−３−ブテン−１−アミン（ＲＪＲ−２４０３）、（Ｒ）−５−（２−アゼチジニルメトキシ）−２−クロロピリジン（ＡＢＴ−５９４）またはニコチンを含む。
【００６４】
好ましいＰＤＥＶ阻害剤は、限定されないが、５−［２−エトキシ−５−（４−メチル−１−ピペラジニル−スルホニル）フェニル］−１−メチル−３−ｎ−プロピル−１，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン（シルデナフィル）、（６Ｒ，１２ａＲ）−２，３，６，７，１２，１２ａ−ヘキサヒドロ−２−メチル−６−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−ピラジノ［２’，１’：６，１］−ピリド［３，４−ｂ］インドール−１，４−ジオン（ＩＣ−３５１またはタダラフィル）、２−［２−エトキシ−５−（４−エチル−ピペラジン−１−イル−１−スルホニル）−フェニル］−５−メチル−７−プロピル−３Ｈ−イミダゾ［５，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−４−オン（バルデナフィル）、５−（５−アセチル−２−ブトキシ−３−ピリジニル）−３−エチル−２−（１−エチル−３−アゼチジニル）−２，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン、５−（５−アセチル−２−プロポキシ−３−ピリジニル）−３−エチル−２−（１−イソプロピル−３−アゼチジニル）−２，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン、５−［２−エトキシ−５−（４−エチルピペラジン−１−イルスルホニル）ピリジン−３−イル］−３−エチル−２−［２−メトキシエチル］−２，６−ジヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−７−オン、４−［（３−クロロ−４−メトキシベンジル）アミノ］−２−［（２Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−１−イル］−Ｎ−（ピリミジン−２−イルメチル）ピリミジン−５−カルボキサミド、３−（１−メチル−７−オキソ−３−プロピル−６，７−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）−Ｎ−［２−（１−メチルピロリジン−２−イル）エチル］−４−プロポキシベンゼンスルホンアミドを含む。
【００６５】
好ましいカンナビノイドは、限定されないが、テトラヒドロカンナビノール、カンナビノール、カンナビジオール、カンナビゲロール、テトラヒドロカンナビバリン、カンナビジバリンおよびカンナビクロメンを含む。
【００６６】
好ましいセロトニン再取り込み阻害剤は、限定されないが、セルトラリン、セルトラリン代謝物デメチルセルトラリン、フルオキセチン、ノルフルオキセチン（フルオキセチンデスメチル代謝物）、フルボキサミン、パロキセチン、シタロプラム、シタロプラム代謝物デスメチルシタロプラム、エスシタロプラム、ｄ，ｌ−フェンフルラミン、フェモキセチン、イフォキセチン、シアノドチエピン、リトキセチン、ダポキセチン、ネファゾドン、セリクラミンおよびトラゾドンを含む。
【００６７】
好ましいノルアドレナリン（ノルエピネフリン）再取り込み阻害剤は、限定されないが、マプロチリン、ロフェプラミン、ミルタザピン（ｍｉｒｔａｚｅｐｉｎｅ）、オキサプロチリン、フェゾラミン、トモキセチン、ミアンセリン、ブプロプリオン、ブプロプリオン代謝物ヒドロキシブプロプリオン、ノミフェンシンおよびビロキサジン（Ｖｉｖａｌａｎ（登録商標））、特に選択的ノルアドレナリン再取り込み阻害剤、例えばレボキセチン、特に（Ｓ，Ｓ）−レボキセチンを含む。
【００６８】
好ましいデュアルのセロトニンーノルアドレナリン再取り込み阻害剤は、限定されないが、ベンラファキシン、ベンラファキシン代謝物Ｏ−デスメチルベンラファキシン、クロミプラミン、クロミプラミン代謝物デスメチルクロミプラミン、デュロキセチン、ミルナシプランおよびイミプラミンを含む。
【００６９】
好ましい誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）阻害剤は、限定されないが、Ｓ−［２−［（１−イミノエチル）アミノ］エチル］−Ｌ−ホモシステイン、Ｓ−［２−［（１−イミノエチル）−アミノ］エチル］−４，４−ジオキソ−Ｌ−システイン、Ｓ−［２−［（１−イミノエチル）アミノ］エチル］−２−メチル−Ｌ−システイン、（２Ｓ，５Ｚ）−２−アミノ−２−メチル−７−［（１−イミノエチル）アミノ］−５−ヘプテン酸、２−［［（１Ｒ，３Ｓ）−３−アミノ−４−ヒドロキシ−１−（５−チアゾリル）−ブチル］チオ］−５−クロロ−３−ピリジンカルボニトリル；２−［［（１Ｒ，３Ｓ）−３−アミノ−４−ヒドロキシ−１−（５−チアゾリル）ブチル］チオ］−４−クロロベンゾニトリル、（２Ｓ，４Ｒ）−２−アミノ−４−［［２−クロロ−５−（トリフルオロメチル）フェニル］チオ］−５−チアゾールブタノール、２−［［（１Ｒ，３Ｓ）−３−アミノ−４−ヒドロキシ−１−（５−チアゾリル）ブチル］チオ］−６−（トリフルオロメチル）−３ピリジンカルボニトリル、２−［［（１Ｒ，３Ｓ）−３−アミノ−４−ヒドロキシ−１−（５−チアゾリル）ブチル］チオ］−５−クロロベンゾニトリル、Ｎ−［４−［２−（３−クロロベンジルアミノ）エチル］フェニル］チオフェン−２−カルボキサミジン、またはグアニジノエチルジスルフィドを含む。
【００７０】
好ましいアセチルコリンエステラーゼ阻害剤は、限定されないが、ドネペジルを含む。
【００７１】
好ましいプロスタグランジンＥ２サブタイプ４（ＥＰ４）拮抗薬は、限定されないが、Ｎ−［（｛２−［４−（２−エチル−４，６−ジメチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−１−イル）フェニル］エチル｝アミノ）−カルボニル］−４−メチルベンゼンスルホンアミドまたは４−［（１Ｓ）−１−（｛［５−クロロ−２−（３−フルオロフェノキシ）ピリジン−３−イル］カルボニル｝アミノ）エチル］安息香酸を含む。
【００７２】
好ましいロイコトリエンＢ４拮抗薬は、限定されないが、１−（３−ビフェニル−４−イルメチル−４−ヒドロキシ−クロマン−７−イル）−シクロペンタンカルボン酸（ＣＰ−１０５６９６）、５−［２−（２−カルボキシエチル）−３−［６−（４−メトキシフェニル）−５Ｅ−ヘキセニル］オキシフェノキシ］−吉草酸（ＯＮＯ−４０５７）またはＤＰＣ−１１８７０を含む。
【００７３】
好ましい５−リポキシゲナーゼ阻害剤は、限定されないが、ジレウトン、６−［（３−フルオロ−５−［４−メトキシ−３，４，５，６−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル］）フェノキシ−メチル］−１−メチル−２−キノロン（ＺＤ−２１３８）、または２，３，５−トリメチル−６−（３−ピリジルメチル）、１，４−ベンゾキノン（ＣＶ−６５０４）を含む。
【００７４】
好ましいナトリウムチャネルブロッカーは、限定されないが、リドカインを含む。好ましい５−ＨＴ３拮抗薬は、限定されないが、オンダンセトロンを含む。
【００７５】
好ましくは、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）は、経口、舌下、口腔、局所、直腸、吸入、経皮、皮下、静脈内、動脈内、筋肉内、心臓内、骨内、関節滑液嚢内、皮内、腹腔内、経粘膜、膣、硝子体内、関節内、関節周囲、局部または経皮の投与のために製剤化される。
【００７６】
本発明のさらなる態様では、上記に定義した変形性関節症の処置での使用のための、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）をコードする核酸が提供される。
【００７７】
本発明の別の態様では、上記に定義した変形性関節症の処置での使用のための、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）をコードする核酸を含む、細胞をトランスフェクトするための複製可能な発現ベクターが提供される。
【００７８】
本発明のさらに別の態様では、上記に定義した変形性関節症の処置での使用のための、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）を発現する宿主細胞が提供される。
【００７９】
また、本発明のさらなる態様では、上述のｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）、核酸分子、複製可能な発現ベクター、または宿主細胞、および薬学的に許容できる担体および／または賦形剤を含む、医薬組成物が提供される。
【００８０】
好ましい薬学的に許容できる担体は、限定されないが、［・・・］を含む。
【００８１】
本発明の別の態様は、以下を含むキットに関する：
ａ．上述のｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）、核酸分子、複製可能な発現ベクター、宿主細胞、または医薬組成物；および
ｂ．変形性関節症および／または変形性関節症の症状の予防または処置のいずれか１つまたは複数のため、または、変形性関節症および／または変形性関節症の症状の発生率を改善、制御、低下させ、または、その発達または進行を遅滞または反転させるための、個体への有効量のｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）、核酸分子、複製可能な発現ベクターまたは医薬組成物の投与に関する説明書。
【００８２】
本発明の別の態様では、個体における変形性関節症および／または変形性関節症の症状を処置および／または予防する方法が提供され、前記個体に、治療的に有効量の上述のｐ７５ＮＴＲ（ＮＢＰ）、核酸分子、複製可能な発現ベクター、宿主細胞、または医薬組成物（場合により、薬学的に許容できる担体をさらに含む）を投与するステップを含む。
【実施例】
【００８３】
実施例１−ビアコアを用いた、ｐ７５ＮＴＲのアフィニティ測定
方法
ｐ７５ＮＴＲのカイネティクスおよびアフィニティは、ビアコアＴ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いた表面プラズモン共鳴技術により判定される。ビアコア法は、Ａｂｄｉｃｈｅ  ａｎｄ  ｃｏｌｌｅａｇｕｅｓ（Ａｂｄｉｃｈｅ，ｅｔ  ａｌ．，２００８）により推奨されるものに基づく。プロテインＡ（１０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー中、１０μｇ／ｍＬ）を、アミンカップリングキットに提供される１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド）（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシ−スクシンイミド（ＮＨＳ）およびエタノールアミンを用いて、アミンカップリング法により、ＣＭ５バイオセンサーチップの表面上に固定化する。
【００８４】
手短には、ビアコア装置のアミンカップリング固定化操作ガイドに関するステップは：
・ＥＤＣおよびＮＨＳを、１：１混合する。
・ＥＤＣ／ＮＨＳ混合物を、１０μＬ／分で４２０秒間、ＣＭ５チップの各フローセルの上に注入する。
・１０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．５）中のプロテインＡ［１０μｇ／ｍＬ］を、１０μＬ／分で４２０秒間、同一のフローセルの上に注入する。
・エタノールアミンを、１０μＬ／分で４２０秒間、同一のフローセル上に注入する。
【００８５】
およそ２２００〜２９００応答単位（ＲＵ）が固定化される。１つのフローセルを、ブランクコントロールとしてセットする。ｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃは、流速１０μＬ／分でのｐ７５ＮＴＲ（ＨＢＳ−ＥＰ［０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％  ｖ／ｖ界面活性剤Ｐ２０］中、１０μｇ／ｍＬ）の３０秒の注入を用いて、１５℃で、バイオセンサーチップの他のフローセル上に捕捉されて、所望のｐ７５ＮＴＲ  ＲＵレベルを達成する（〜４００ＲＵ；ｐ７５ＮＴＲ、関連のあるニューロトロフィンの分子量および化学量論比を用いて計算した）。リガンドではなくｐ７５ＮＴＲを固定化することは、ニューロトロフィンが、それらの本来の状態であることを確認することを助ける。
【００８６】
単一サイクルのカイネティクス試験は、ニューロトロフィン濃度あたり３０μＬ／分で１２０秒間、ＨＢＳ−ＥＰバッファー中の増加濃度のニューロトロフィンを、フローセルの上に注入することにより行なわれる。最後のニューロトロフィン注入に続いて、ＨＢＳ−ＥＰがチップの上に６００秒間流されて、解離速度を決定する。チップセンサー表面は、全ての新しい注入サイクルの前に、１０ｍＭグリシンＨＣｌ（ｐＨ２）を３０μＬ／分で６０秒間注入することにより、それらの元のプロテインＡ表面に再生される。
【００８７】
複数サイクルのカイネティクス試験は、最も低いニューロトロフィン濃度を、３０μＬ／分でフローセルの上に３００秒間注入して、その後にＨＢＳ−ＥＰバッファーを３０μＬ／分で３００秒間注入することにより行なわれる。それから、１０ｍＭグリシン、ＨＣｌ  ｐＨ２を２×６０秒注入することによりチップを再生し、そのサイクルを、増加するニューロトロフィン濃度のそれぞれについて繰り返す。
【００８８】
結果
ｐ７５ＮＴＲは、ニューロトロフィンＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３およびＮＴ−４に可逆的に結合する。ビアコアを用いて測定されるアフィニティを表１に提供する。
【００８９】
【表１】
2017527303.tif 000003
【００９０】
実施例２−モノヨード酢酸誘導性の変形性関節症の試験
ラットの膝後部におけるモノヨード酢酸（ＭＩＡ）の関節内注入により誘導される実験的な変形性関節症は、変形性関節症のよく認識されたモデルである。疾患の病理学的進行および疼痛の挙動が報告されている（Ｇｕｚｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，２００３）（Ｆｅｒｎｉｈｏｕｇｈ，ｅｔ  ａｌ．，２００４）。ＭＩＡは、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの阻害により解糖作用を破壊し、軟骨細胞の死をもたらす（Ｈａｒｖｅｙ＆Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ，２００９）。軟骨の構造的完全性は、軟骨細胞の正常機能に依存し、したがって、ＭＩＡにより誘導される軟骨細胞の損失は、軟骨変性および軟骨下骨の変化をもたらし、ＯＡの臨床組織病理学と一致する（Ｊａｎｕｓｚ，ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｎａｖｅｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。０．３ｍｇのＭＩＡの注入は、１０週の期間にわたって軟骨の損失を誘導する。軟骨の損失は３週目と６周目の間で最も大きい（図１）。
【００９１】
ペアで飼育された、−２日目に２００〜２５０ｇの体重の４４匹の雄Ｗｉｓｔａｒラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，ＵＫ）を、各処置群の平均体重が同様になるように、ペアごとに無作為に処置に割り当てる。０日目に、ラットは、表１に示される処置を受ける。調製されたばかりのヒトＩｇＧ（エンドトキシン不存在のリン酸緩衝生理食塩水［ＥＴＦ−ＰＢＳ］中、３．２５ｍｇ／ｍＬ）およびｐ７５ＮＴＲ（ＥＦ−ＰＢＳ中、３．２５ｍｇ／ｍＬ）を、皮下に投与する。検査技師は、動物試験全体を通じて動物の処置を見ていない。
【００９２】
【表２】
2017527303.tif 000004
【００９３】
３時間後、全ての動物をイソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｏｒａｎｅ）で麻酔する。麻酔した動物はそれぞれ、無作為化スケジュールに従って、左または左膝のいずれかに、０．３ｍｇのＭＩＡを含む５０μＬのＥＦ−ＰＢＳの関節内注入を受ける。麻酔した動物それぞれの対側膝に、５０μＬのＥＦ−ＰＢＳを注入する。さらに、それぞれの抗体またはｐ７５ＮＴＲ処置を、５日目および１５日目に投与する。
【００９４】
試験は、軟骨の損失が明らかで活性であるときの２６日目に終了する（図１）。イソフルランを用いて動物を麻酔し、末端血液サンプルを心臓穿刺により採取して血漿サンプルを調製する。後肢下側の皮膚を除去して筋束を骨から分離するが、膝は無傷のままにする。大腿骨、腓骨および脛骨を切断して、筋肉が付着した膝を１０％中性緩衝化ホルマリン中に置く。組織サンプルを、組織学的分析のための処理をする前に、緩衝化ホルマリン中に４８〜７２時間保持する。
【００９５】
組織サンプルは、ホルマリン固定により生じる損傷を最小限にするために、採取後できる限り迅速に、標準的な手順を用いて光学顕微鏡のために調製する。サンプルを１０日間、８％ギ酸中で脱石灰化して、Ｓｈａｎｄｏｎ  Ｃｉｔａｄｅｌ組織プロセッサを用いて処理して、溶解パラフィンワックス内に埋め込む。各ラットの膝組織ブロック由来の少なくとも４つの切片（１０μｍ）を、自動化リニア染色装置（Ｌｅｉｃａ  ＳＴ４０４０）を用いた標準的なＨａｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  ａｎｄ  Ｅｏｓｉｎ（Ｈ＆Ｅ）染色のために処理する。さらなる切片を、Ｓａｆｒａｎｉｎ  Ｏを用いて染色する。スライドを４倍または１０倍拡大のいずれかで観察して、画像解析を、コンピューター化システムを用いて行なう。軟骨表面から下へ石灰化した軟骨と軟骨下骨の間の境界までの軟骨領域全体を測定する。組織切片に付いた塗料の光吸収を、デジタルのデンシトメトリーを用いて単色光の下で定量する。Ｓａｆｒａｎｉｎ  Ｏによるグリコサミノグリカンの赤色染色の強度を、吸収閾値を１３０ｎｍに設定した場合に染色される軟骨領域の測定により定量化する。
【００９６】
血漿中の外因性ｐ７５ＮＴＲおよびコントロール抗体の濃度を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いてヒトＩｇＧを測定することにより推定する。
【００９７】
結果−ＭＩＡにより誘導したＯＡの後の、膝における組織学的変化に対する、ｐ７５ＮＴＲの効果
全ての処置群由来の動物で、ＥＴＦ−ＰＢＳが注入された膝には、ＯＡの特徴も組織変性も見られなかった（図２Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、図３Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ）。対照的に、コントロール抗体で処置した動物において、ＭＩＡを注入した膝は、軽度の軟骨細胞変性の領域を示し、頻繁に関節軟骨の全層に関与した（図２Ａ）。一部の領域において最近の炎症性応答の証拠が存在し、白血球蓄積が著しかった。ｐ７５ＮＴＲでの処置は、ＯＡの進行を加速しなかった（図２Ｃ、Ｅ、Ｇ）。コントロール抗体で処置された動物と比較して、ｐ７５ＮＴＲで処置された低ＭＩＡ処置の膝のアーキテクチャでは組織学的変化がより少なく、外傷からの保護または損傷の修復が示された。このことは、試験した全てのｐ７５ＮＴＲ濃度（０．３〜３．０ｍｇ／ｋｇ）において明らかであった。実際に、ｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃを最も高い投与量で処置した動物は、軟骨領域において有意な（Ｐ＜０．０５）増加を有した（ＯＡにおけるｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃで誘導された修復の証拠は、図４参照）。
【００９８】
ＭＩＡで誘導したＯＡに後の、膝におけるプロテオグリカン密度に対する、ｐ７５ＮＴＲの効果
ＭＩＡで処置した膝における軟骨領域全体は、ｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃで処置した動物において改善された：このことは、関節内注入後２６日目に、対応するコントロール動物と比較して、３．０ｍｇ／ｋｇのｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃで処置した動物に関して有意に異なった（Ｐ＜０．０５）（図４）。
【００９９】
画像解析により評価されるサフラニンＯ染色の強度は、軟骨のグリコサミノグリカン含有量に比例し、処置群の間で顕著な違いを示した（Ｐ＜０．０５）（図５参照）。１３０ｎｍの吸収閾値を用いると、コントロール抗体で処置した動物では、対側膝と比較して、ＭＩＡで処置した膝由来の軟骨の２０％のみが、１３０ｎｍ閾値よりも上で赤色染色され、グリコサミノグリカンの実質的な損失が示された。対照的に、ｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃを享受した動物のＭＩＡで処置した膝における軟骨のおよそ５０％が、１３０ｎｍ閾値よりも上だった（図５）。このことは、ｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃは、ＭＩＡ注入後の軟骨の構造的完全性の進行する損失、およびさらにはＯＡにおける疾患改変を防止していることを示す。
【０１００】
実施例３−ＰＧ−００７と比較した、ラットでの変形性関節症の回帰に対する、ｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃの効果
この試験の目的は、疾患が確立された時点で、ｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃの上昇する投与量がＯＡの回帰を引き起こすことができるかどうかを評価することである。加えて、ラットにおけるＭＩＡで誘導される関節炎と関連する疼痛の観点から処置の効能を評価し、タネズマブ様の抗−ニューロトロフィン成長因子（ＮＧＦ）抗体、ＰＧ−００７を用いた処置と比較する。
【０１０１】
【表３】
2017527303.tif 000005
【０１０２】
ＭＩＡの調製
ＭＩＡを、６ｍｇ／ｍｌ  ＭＩＡストック溶液と同等である０．３ｍｇ／５０μｌＥＴＦ−ＰＢＳの濃度で調製した（関節内注入それぞれに用いた容量）。６８ｍｇのＭＩＡを量り取り、１１．３ｍｌのＥＴＦ−ＰＢＳ中に溶解させた。ＭＩＡを、１日前もって調製して、必要になるまで暗所に４℃で保管した。全ての動物は、同一バッチから調製されたＭＩＡを受けた。
【０１０３】
【表４】
2017527303.tif 000006
【０１０４】
試験薬の調製
この試験で用いた試験薬を、動物が投薬される特定の日に新たに調製した（表４参照）。抗体を注入するインビボ科学者が、各バイアルにおいて何の処置であるか分からないように、可能な限り、調製された各抗体の容量は等量であった（表５参照）。
【０１０５】
【表５】
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【０１０６】
動物
体重１２０〜１５０ｇ（到着時）の３９匹の雄Ｗｉｓｔａｒラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，ＵＫ由来）を実施例３において用いた。到着次第、各動物を検査して外見上健康であることが分かった。それらを３個のケージに無作為に割り当てて、各ラットに、入れ墨によって尾に固有の識別番号を割り当てた。動物を、０日目の試験の開始前に、少なくとも１０日間、動物ユニットに慣れさせた。
【０１０７】
ラットがそれらの環境に慣れた時点で、それらを保管／手順室に移して、インビボ手順の全てを行なった。Ｈｏｍｅ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ａｎｉｍａｌｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）Ａｃｔ  １９８６で推奨される１２時間の明暗サイクル（オン７時オフ１９時）を与えるように設定された蛍光灯により、動物を照らし続けた。部屋は空調管理し、空気温度（２１℃＋／−２℃）および相対的湿度を日常的に測定した。
【０１０８】
ラットに、ラット用のＲ１０５−２５照射完全食（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｎｉｍａｌ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａｕｇｙ，Ｆｒａｎｃｅ）を与え、オートクレーブした水を適宜利用可能にした。食事の各バッチを検査して、組成物および汚染物質に関して日常的にスクリーニングした。巣およびケージをオートクレーブして、各ケージは個別に換気した（ＩＶＣシステム）。
【０１０９】
実験設計
片方の膝におけるＭＩＡの関節内注入による関節炎の誘導後に、ＥＴＦ−ＰＢＳで処置されたその対側コントロールの肢と比較してＭＩＡで処置された肢の荷重負荷（無能力（ｉｎｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ）測定）に有意差が見られた時点で、動物を、侵害受容挙動（ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｖｅ  ｂｅｈａｖｉｏｕｒ）が同等の５つの処置群（ｎ＝６動物／群）および１つのビヒクルコントロール群（ｎ＝３）に無作為化した。６匹の無処置の動物を、ネガティブコントロールとして含めた。
【０１１０】
【表６】
2017527303.tif 000008
【０１１１】
試験を通して体重を定期的に記録して、自発痛の評価を週間隔で測定した。
抗ＮＧＦ抗−ニューロトロフィンは、ラットが顔と首じゅうを引っ掻くのを引き起こすことが示されているので、動物を皮膚病変の兆候に関して定期的に観察して、具体的には６日目以降、任意の病変スコアを記録して、以前の試験で決定された人道的な臨床エンドポイントに我々が到達していないことを確認した（皮膚全体の病変の最大領域が１０ｃｍ２を超えた場合、または、いずれか１つの病変のサイズが２ｃｍ×３ｃｍよりも大きく、そしてより深く湿潤となり、２４時間内に治癒する兆候がない場合に、動物は殺される）。
【０１１２】
末日に、血液サンプルを心臓穿刺により採取して、血漿を調製した。膝を取り出し、１０％中性緩衝化ホルマール生理食塩水内に置き、組織学のために処理した。
【０１１３】
処置（単数または複数）の無作為化
ＭＩＡの注入
各ラットの左または右膝のいずれかにＭＩＡが注入されるように、無作為化を行なった（各ラット由来の対側膝はＥＴＦ−ＰＢＳを注入した）。各ラットについてＭＩＡまたは生理食塩水をどちらの膝が受けるかという割り当ては、ＭａｃのＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（Ｖｅｒｓｉｏｎ  １４．１．１）における乱数発生器を用いて作成した。動物と接触したことのない職員が、無作為化手順および割り当てを行なった（スケジュールについては別表１参照）。２個の７ｍｌポリプロピレンバイアルを各動物に関して標識して、左または右膝を示した（合計６６バイアル）。２人（１人は、スコア付け、およびマスター無作為化シートをチェックして、１人は、関節内注入のために溶液を等分化する）が、６６バイアルを調製した。等分化は、ＭＩＡバイアルが最初に充填された後に残りのバイアルがＥＴＦ−ＰＢＳで充填されるように順々に行なった（これは、各動物に関する対側膝のバイアルであった）。無処置の動物に関するバイアルは、空のままにした。
【０１１４】
試験薬の投与
ビヒクルコントロールで処置した膝と比較してＭＩＡで処置された膝の侵害受容挙動（ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｖｅ  ｂｅｈａｖｉｏｕｒ）が等差の処置群に動物を無作為化した。これは、ＯＡの誘導後２８日目に行なった。
【０１１５】
動物手順
膝の関節内注入
ラットを、Ｂｏｙｌｅｓ  Ａｐｐａｒａｔｕｓを用いたイソフルランの吸入により麻酔した。各動物の両膝の毛を刈って、膝をエタノールで拭いた。５０μｌの、ＥＴＦ−ＰＢＳ中の０．３ｍｇ  ＭＩＡまたはＥＴＦ−ＰＢＳのみのいずれかを、２７Ｇニードルが取り付けられた０．５ｍｌの滅菌Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｍｉｃｒｏ−Ｆｉｎｅインスリンシリンジを用いて、膝蓋下靭帯を通して各膝に注入した。６匹の無処置の動物を麻酔して、両膝の毛だけ刈った。試験全体を通じて、インビボ科学者は、全ての動物の処置状態が見えなかった。
【０１１６】
試験薬の投与
試験薬を、５ｍｌ／ｋｇの投与容量を用いて、首の首筋または横腹に皮下経路により投与した。
【０１１７】
自発痛の評価
自発痛を、各動物に関して、無能力試験器（Ｌｉｎｔｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｕ．Ｋ．）を用いて左および右の後肢の荷重負荷を測定することにより、週間隔で判定した。ラットを、それらの後足が別々のセンサー上に乗るように、無能力試験器上の適切なサイズのパースペックス動物ボックス中に置いた。選択されるボックスのサイズは、ラットの体重に基づき（４５０ｇまでのラットに関しては小さいラットホルダー、および、４５０ｇを超えるラットに関しては大きいラット／モルモットホルダー）、ラットが押し潰されずに快適に座ることを可能にしたが、同様に、ラットが方向転換することができるような十分すぎる空間を与えなかった。ラットが安定して落ち着いた時点で、各肢の荷重負荷を５秒にわたり記録し、両後肢によって発揮される力（グラム）の平均を記録した。後足の荷重配分を各時点で各ラットに関して５回判定して、５回の測定値の平均を計算した。右肢の荷重を両後肢に関する合計荷重で割ることにより、個々の荷重負荷データを荷重配分に変換した。
【０１１８】
末端血液サンプル
末端血液サンプルを、ＭｉｌｌｉＱ水中の１％ＥＤＴＡカリウムで洗い流されたＴｅｒｕｍｏの２ｍｌシリンジおよび２１Ｇニードルを用いて、イソフルラン麻酔薬の下で心臓穿刺により採取した。回収した血液を、２ｍｌポリプロピレンチューブに入れた。それから動物は頚椎脱臼により殺された。
【０１１９】
血漿調製
末端血液サンプルを、２７００×ｇで１０分間遠心分離して、血漿をポリプロピレンチューブ中に等分して（動物あたり４アリコート）、−８０℃で凍結した。
【０１２０】
ラットの膝の取り出し
足の下側の皮膚を除去して筋束を骨から分離したが、膝は無傷のままにした。大腿骨、腓骨および脛骨を切断して、筋肉が付着した膝を取り出して、１２５ｍｌのスクリューキャップ容器内の、およそ８０ｍｌの１０％中性緩衝化ホルマリン中に置いた。膝を、組織学的分析のために処理される前に、緩衝化ホルマリン中に４８〜７２時間保持した。
【０１２１】
組織学のための処理
組織サンプルを、標準的な手順を用いて光学顕微鏡のために調製して、ケンブリッジ大学獣医学校で外部的に行なった。手短には、膝関節を固定した後、組織をＰＢＳでリンスした後に、１０日間８％ギ酸中で脱石灰化した。脱石灰化の後に、一連の段階的なエタノール濃度（７５％〜１００％エタノールの範囲、４時間の６交換）を通して、組織を脱水するＳｈａｎｄｏｎ  Ｃｉｔａｄｅｌ組織プロセッサを用いて組織を処理して、１００％クロロホルムでリンスして（４時間の３交換）、最後に溶解パラフィンワックス中に埋め込んで組織ブロックを形成した（４時間の２交換）。Ｓｕｒｇｉｐａｔｈ  ＰＥＣ  ３００１装置を用いて、溶解パラフィンワックスで組織をカセット中に埋め込んだ。組織切片が免疫組織化学に潜在的に用いられ得るようにホルマリン固定により生じる損傷を最小限化するために、採取後できる限り迅速に組織を処理した。
【０１２２】
少なくとも４つの１０μｍ切片を、Ｌｅｉｃａ  ＲＭ２１３５ワックスミクロトームを用いて各ラットの膝の組織ブロックから切断した。２つの切片をガラススライド上に置いて、そのスライドを、標準的なＨａｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  ａｎｄ  Ｅｏｓｉｎ（Ｈ＆Ｅ）およびＳａｆｒａｎｉｎ  Ｏ  Ｆａｓｔ  Ｇｒｅｅｎ（Ｓａｆｒａｎｉｎ  Ｏ  Ｆ／Ｇ）染色のために、自動化リニア染色装置（Ｌｅｉｃａ  ＳＴ４０４０）を用いて処理した。手短には、リニア染色装置は、染色スライドのための配置で並べられた２３個の試薬ステーションおよび４個の水ステーションを備え、標準的なＨ＆ＥまたはＳａｆｒａｎｉｎ  Ｏ  Ｆ／Ｇプロトコルに従う。Ｈ＆Ｅスライドは、２７ステーション間で、それぞれで１分後に交換した。その後、キシレン、エタノール、水、ヘマトキシリン、水、酸アルコール、水、エオシン、水、エタノールおよびキシレンのシリーズを続ける（全ての溶媒はＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ由来であり、Ｈ＆ＥはＬｅｉｃａ由来である）。切片を空気乾燥させて、マウントして、そして、顕微鏡下で観察される用意がされたカバーガラスで覆った。
【０１２３】
画像解析
Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ画像解析ソフトウェア（ｓｕｉｔｅ  ｖ７．０，Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｕ．Ｋ．）を用いたＯｌｙｍｐｕｓ  ＡＸ７０顕微鏡を用いて、２倍、４倍または１０倍拡大のいずれかでスライドを観察した。各ラットの内側膝関節の全体的な肉眼的変化を示すために、ＯＡ様の特徴に関する、染色された組織切片の最初の非公式の分析を行なった。
【０１２４】
画像解析を、×２対物を用いてＳＯ／ＦＧスライド上で行ない、軟骨の領域全体（ｍｍ２）を、全てのラットの膝（ＭＩＡおよびＥＴＦ−ＰＢＳで処置された膝）に関して判定した。軟骨層の深さ（最低限６個の測定値を内側膝関節ごとに作成した）および、これを、同一の膝関節由来の軟骨下骨の深さと比較した。
【０１２５】
データ解析
画像解析（軟骨領域など）および疼痛評価データ（例えば、荷重配分の不均衡）を、古典統計学を用いて各動物について解析した。多数の測定値を収集して、ｐ７５−ＮＴＲ−Ｆｃ（異なる投与量）またはＰＧ−００７のいずれかで処置した動物から平均して、適切な古典統計的試験を用いて、値をコントロール動物と比較した。全ての解析に関して、ｐ＜０．０５は、統計的有意性を示すと理解した。
【０１２６】
結果
体重
異なる群内のラットの体重を、動物のサイズの違いについて試験するために比較した。０日目には、異なる処置群内の動物の体重間に、統計的に有意な差はなかった（ｐ＝０．７６  ｎ．ｓ．，ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ，図３０参照）。
【０１２７】
６個の処置群間の平均体重（コントロール抗体で処置されたラットと比較して、ｐ７５ＮＴＲ−ＦｃまたはＰＧ−００７で処置されたラット）は、試験の過程中、互いに統計的に有意ではなかった（ｐ＝ｎ．ｓ．，ｔｗｏ  ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ、図３１参照）。
【０１２８】
自発痛測定
ＯＡにより引き起される自発痛に対する、ｐ７５ＮＴＲ−ＦｃおよびＰＧ−００７の効果
後部肢を通した荷重の分配を測定するために、無能力試験器を用いて自発痛を評価した。評価をベースラインで行ない（グループ７、無処置の動物を除く）、再度、片膝へのＭＩＡの注入後、１５、２１および２８日目に行なった（対側膝はＥＴＦ−ＰＢＳを注入した）。データを図３２に示し、ＭＩＡで処置された後部肢により支えられている後部肢にわたる合計荷重の比として表す。無処置の動物については、左後部肢を通る荷重の比を示す。
【０１２９】
全ての動物に関して、処置された後部肢の荷重の比と理論予想の０．５との間に、統計的に有意な差はなかった（０日目のベースラインにおいて、両方の後部肢にわたる均等分配（ｐ＝０．３７９、クラスカル・ワリス検定；図３２参照）。２８日目には、５個の処置群全てが理論的平均の０．５とは有意に異なり、それらのＭＩＡが注入された膝の荷重を本質的に受けていた（図３２参照）。以前の試験に基づき、このことは、ＯＡ病理の程度が、ラットに投与するのを開始するのに十分に重大であることを示した。
【０１３０】
３０日目からずっと、５６日目の試験終了まで、それぞれの処置レジメンを用いてラットにおいて投与を開始した（皮下経路を介して５日ごとに処置）。試験の過程中、自発痛のさらなる評価を測定した（３５、４２、４９および５６日目に行なった、図４参照）。４９日目までの試験全体を通じて、コントロールＩｇＧ  Ｆｃで処置された動物は、処置された後部肢の荷重の比と理論予想の０．５との間は有意に異なったままであり、ＭＩＡで処置された膝が動物に疼痛を引き起こしていることを示した（図３３参照）。対照的に、抗−ＮＧＦ  ＰＧ−００７で処置された動物およびｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃで処置されたもの（０．３〜３ｍｇ／ｋｇ）では、時間が進むにつれて、ＭＩＡで処置された後部肢の荷重の比と理論予想の０．５との間は有意でなかった（すなわち、後部肢における荷重の均等分配）。
【０１３１】
Ｍｉａにより誘導されたＯａの後の、膝における組織学的変化
ＯＡの回帰に対する、ｐ７５ＮＴＲ−ＦｃおよびＰＧ００７の効果
コントロール抗体で処置された動物由来のＭＩＡを注入した膝は、軟骨細胞変性の領域を示し、一部の領域では、軟骨の完全な損失をもたらした（図３４）。このことは、軟骨におけるＳａｆｒａｎｉｎ  Ｏ  Ｆａｓｔ  Ｇｒｅｅｎ染色の関連する損失により強調される。加えて、最大の軟骨損傷の領域の下にある軟骨下骨において、有意な病理学的変化が存在した（図３４）。軟骨下骨には変化の分布（ｓｐｅｃｔｒｕｍ）が存在し、反応性変化（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｃｈａｎｇｅ）、および、再構築から硬化性変化まで動因される進行の両方を反映する（図３４）。
【０１３２】
有意な病理が確立された後に３ｍｇ／ｋｇのＰＧ−００７で２８日間処置された動物は（処置された後部肢の荷重の比と理論予想の０．５が有意に異なる場合、疼痛評価により特定した）、コントロール抗体で処置され、ラットの膝の全般的な完全性を損失して効能の組織学的証拠がない動物と比較して、有意な組織学的変化を示した（図３５）。この病理は、関連する軟骨および骨髄の損失および骨壊死の証拠と一致し、それは概して、コントロール抗体で処置された動物と比較して、ＯＡの、全般的に迅速な進行、および一部の動物では、悪化をもたらす（図３５）。対照的に、ｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃ（０．３〜３ｍｇ／ｋｇ）で処置された動物は、非常に異なる組織病理を示し、有意な軟骨保護、およびコントロール抗体で処置された動物と比較して軟骨下骨の病理における関連する有意な増大（ｉｎｃｒｅａｓｅ）の証拠が存在し、ＯＡおよび骨の病理の重症度の全般的な低減をもたらす（図３６〜３８）。このことは、骨髄における低減された骨髄性拡張により表現型として表されていて、炎症性が仲介する溶骨性の動因を縮小させる。
【０１３３】
より少ない投与量のｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃ（０．３および１ｍｇ／ｋｇ）で処置された動物は、組織病理において最も顕著な変化を示し（図３７および図３８参照）、両方の処置群において、病理はほぼ正常レベルであった。３ｍｇ／ｋｇのｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃでの組織学的結果を考慮すれば（図３６参照）、全般的なプロファイルは、ｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃが「釣鐘状」の用量応答曲線を示すことを示唆する。
【０１３４】
組織病理評価
組織病理を、脱石灰化された膝のＳａｆｒａｎｉｎ  Ｏ  Ｆａｓｔ  Ｇｒｅｅｎで染色された切片について行なった。概して組織の処理と染色の両方の質は優れていて、３つのスライドのみが質の理由で拒絶された。スライドを処置群に体系化したので、最初の病理評価は見えないものではなかった。しかしながら、等級付けの目的のために、全ての群（ビヒクルを除く）を、観察者の先入観および診断傾向を減らすために単純な乱数配列を用いて無作為化した。
【０１３５】
説明的な軟骨組織病理の表現型
コントロール群
対にしたスライドの間には明白な差異があった。最も顕著な軟骨病理を有するスライドは：４ＲＡ、５ＬＡ、６ＬＢ、１０ＲＡ、１１ＬＢ（スライド１１ＲＡに等級付けするには不十分な軟骨）および１２ＲＢである。軟骨変化の大部分は、明らかな末梢軟骨細胞壊死を有する全層浸食であった。
【０１３６】
グループ４−ＰＧ００７、３ｍｇ／ｋｇ
対にしたスライドの間には明白な差異があった。最も顕著な軟骨病理を有するスライドは：１ＲＡ、２ＲＢ、３ＬＢ、３４ＬＡ、３５ＬＡ、３６ＲＢである。概して、軟骨病理は、コントロール群と組織学的に同様であった。
【０１３７】
グループ３−Ｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃ、０．３ｍｇ／ｋｇ
対にしたスライドの間の差異は、コントロール群と比較してそれほど顕著でなかった。Ｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃの投与は、ＭＩＡで誘導された軟骨病理の顕著な阻害と関連し−実際に２つの場合において正常に近かった。３つのスライドは、質の理由でこのグループから拒絶された。
【０１３８】
グループ１−Ｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃ、１．０ｍｇ／ｋｇ
対にしたスライドの間の差異は、コントロール群と比較してそれほど顕著でなかった。最も顕著な軟骨病理を有するスライドは（コントロールの病変と比較して控えめであるが）：７ＬＡ、８ＬＡ、１３ＲＢ、１５ＲＡ、３１ＲＢ、３３ＬＢである。Ｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃの投与は、ＭＩＡで誘導された軟骨病理の顕著な阻害と関連した。
【０１３９】
グループ２−Ｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃ、３．０ｍｇ／ｋｇ
このグループは、軟骨病理に対する効能効果の観点から−コントロールタイプの病変からグループ１に似たものまでの効果の範囲で（５０％）、顕著な変動性を示した。最も顕著な軟骨病理を有するスライドは：１６ＬＢ、１７ＲＡ、１８ＲＢ、２２ＲＢ、２３ＬＡおよび２４ＬＡである。最高の投与量でのＰ７５ＮＴＲ−Ｆｃの投与は、０．３および１．０ｍｇ／ｋｇと関連する明確な効果は示さなかった。
【０１４０】
組織病理のグレード基準
グレードの割り当ては、それぞれの解剖学的ゾーン内で観察される最も頻繁な病変に基づく。最初の評価に基づいて、重要な組織学的特徴をコントロール群において特定し、それは１．０ｍｇ／ｋｇのＰ７５ＮＴＲ−Ｆｃ投与後に明白な変化を示した。グレード基準は、以前のＭＩＡ試験の病理評価（ＭＬＦ）において用いられたものであった。
【０１４１】
軟骨病理
多くの刊行物が、ヒト軟骨病理の等級付けに関するＭａｎｋｉｎ  Ｓｃｏｒｅの使用を詳述する。オリジナルのＭａｎｋｉｎ  Ｓｃｏｒｅ（またはＨＨＧＳスコア）は、０（正常）〜１４（重度の病理）の範囲であり、観察者間の著しい先入観の影響を受ける。加えて、このスコアシステムは、パンヌス病理の関与を過小評価し、早期の変化を正常な変動と融合することが多い。重要なことに、Ｍａｎｋｉｎ  Ｓｃｏｒｅは、中度から重度の病理に関するグレード範囲を拡張し、軽度から中度の変化を著しく融合する。したがって、直接適用されるＭａｎｋｉｎ  Ｓｃｏｒｅは、薬力学的範囲の説明がほとんどなく、齧歯類と人との間の細胞ターンオーバーの違いに鈍いので、前臨床試験での有用性が疑わしい。この試験において用いられる等級付けシステムは、Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒの説明スキームを用いたＯＡＲＳＩシステムの改変である：
【０１４２】
０−重大でない異常；１−最小限の表面細動；２−表面浸食；表面ゾーン軟骨細胞の損失；３−深いゾーンの浸食；４−全層浸食；軟骨下骨の多病巣性曝露、＜５０％領域；５−軟骨板の損失；関節窩における使い古した（ｄｅｔｒｉｔｉｃ）形態、＞５０％領域
【０１４３】
軟骨下骨
軟骨下骨板は、退行性の変化（本質的には骨溶解が介在する）を受ける前に、軟骨グレードの範囲にわたる軟骨の完全性の損失に反応する。０−重大でない異常；１−表面ゾーンの組織破壊（不規則な類骨ゾーン）；２−全層組織破壊；３−多病巣性骨溶解；４−多病巣性骨減少；５−融合性の骨減少（ｏｓｔｅｏｐａｅｎｉｃ）ゾーン
【０１４４】
間質腔
間質腔は、軟骨下板の中およびちょうど遠位（ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ  ｄｉｓｔａｌ）の髄質腔である。０−重大でない異常；１−最小限の骨溶解；２−中度の骨溶解；３−空洞の大部分において多数の溶解性ピットの証拠を有する顕著な骨溶解；４−溶骨後の空洞の融合；５−融合された空洞が軟骨下骨および／または骨膜を破壊（ｂｒｅａｃｈ）
【０１４５】
海綿骨
海綿骨システムは、関節の生物力学における変化に起因して、最小限の軟骨病理における反応性変化を受けて−炎症に続発して、より退行性の表現型に進行する。
【０１４６】
０−重大でない異常；１−表面骨吸収／骨溶解の多病巣性領域；２−顕著な骨溶解の多数の領域；３−正常な石灰化線（ｔｉｄｅ−ｍａｒｋ）の帯状分布が損失している骨溶解の多数の領域；４−明らかに骨細胞が損失した骨溶解の多病巣性ゾーン；５−骨融合を有する／有さない、海綿骨の切れ目（ｂｒｅａｃｈ）
【０１４７】
骨髄細胞過多
０−重大でない異常；１−髄質間質内の細胞の多数の病巣が凝縮した病巣；２−髄質間質および骨膜ピット内の細胞の多数の病巣が凝縮した病巣；３−びまん性髄質細胞過多−帯状；４−間質腔への骨髄の拡張；５−軟骨下板、または、パンヌスの混合を有する／有さない骨膜への、髄質区画の切れ目
【０１４８】
骨硬化症
骨硬化症は、間質腔からの線維形成性の拡張の領域として通常見られる。０−重大でない異常；１−時折の小さな病巣；２−多数の病巣；３−多数の融合性の病巣；４−関連する骨変性を有する多数の融合性の病巣；５−骨嚢腫を有する多数の融合性の病巣
【０１４９】
造骨細胞過形成
０−重大でない異常；１−多数の造骨細胞板；２−多数の肥大性造骨細胞板；３−明らかな造骨細胞柵状配置；４−肥大性造骨細胞板−帯状；５−肥大性造骨細胞板−多数の帯状。
【０１５０】
組織学グレードの結果（対にしたセット由来の最も重度の軟骨病理サンプルをプロットした）
軟骨病理
ＰＧ００７の投与は、組織学的に有意な効能効果を示さなかった。Ｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃは、０．３および１．０ｍｇ／ｋｇにおいて、軟骨保護に対して顕著な効能を示した。３．０ｍｇ／ｋｇにおける効能プロファイルは、より変動的であり−グループの５０％がコントロール群と重なった（図３９）。
【０１５１】
軟骨下骨
ＰＧ００７の投与は、３．０ｍｇ／ｋｇのＰ７５ＮＴＲＦｃで観察されたプロファイルと同様に、コントロール群と比較して軟骨下骨の病理の組織学的に有意な増大と関連した。対照的に、０．３および１．０ｍｇ／ｋｇでのＰ７５ＮＴＲ−Ｆｃの投与は、軟骨下骨の組織学における顕著な改善と関連した（図４０）。
【０１５２】
間質腔
ＰＧ００７の投与は、いかなる組織学的に有意な効能効果とも関連しなかった。対照的に、Ｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃの投与は、０．３および１．０ｍｇ／ｋｇでの効果が最も顕著であったが−両方のグループとも、ほぼ正常レベルまで病理を低減し、とにかく、溶骨性の病理の低減および間質腔の拡張と関連した（図４１）。
【０１５３】
海綿骨
ＰＧ００７の投与は、コントロールと同様に海綿骨の病理と関連し−２つのサンプルはコントロールの範囲を超えた。対照的に、Ｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃは、０．３および１．０ｍｇ／ｋｇの投与量レベルで、海綿骨の病理を著しく低減させた。３．０ｍｇ／ｋｇでのＰ７５ＮＴＦ−Ｆｃは、より変動的なプロファイルを示し、サンプルの大部分がコントロール群と重なった（図４２）。
【０１５４】
骨髄細胞過多
ＰＧ００７の投与は、骨髄内の骨髄性細胞の拡張と関連し、４つのサンプルが最高であるか、またはコントロールの範囲を超えた。Ｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃは−骨髄性の拡張の低減が顕著な特徴であり−０．３および１．０ｍｇ／ｋｇの投与量において髄質細胞性を低減させた。３．０ｍｇ／ｋｇの投与量は、阻害に向かう傾向を示すが、コントロール群における低レベルのレスポンダーと重なった（図４３）。
【０１５５】
骨硬化症
Ｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃサンプルはコントロール範囲の上端に向けてクラスタリングを見せたが、試験群の間に組織学的に有意な差は無かった（図４４）。
【０１５６】
造骨細胞過形成
０．３および１．０ｍｇ／ｋｇでのＰ７５ＮＴＲ−Ｆｃの投与は、組織学的に有意な造骨細胞増殖と関連し、柵状配置および造骨細胞板の形成は、軟骨下骨／軟骨ゾーンにおいて、骨端ゾーンで特に顕著であった。加えて、等級付けられはしないが、このゾーン内に、顕著な「線維芽細胞様」細胞が存在した。ＰＧ００７およびＰ７５ＮＴＲ−Ｆｃ（３．０ｍｇ／ｋｇ）は、組織学的にコントロールと同様であった（図４５）。
【０１５７】
副作用
３ｍｇ／ｋｇのＰＧ−００７で処置された２匹のラットは、皮膚病変が発症した。非常に少数の皮膚病変が、４５日目までに（処置後１５日）、一部のラットにおいて、顔、首および肩の領域の周りに現れ始めたが、１匹のラットでは、４９日目から（処置後１９日）ずっと、より明らかになった。これらの病変は、注入部位と関連しなかった。ラットを定期的に検査して、数、サイズおよび各病変の程度を定量化して、試験の人道的臨床エンドポイント内に我々が留まっていることを確認した。いかなる濃度のｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃで処置されたラットも、皮膚病変を発症しなかった。
【０１５８】
考察
組織病理学
ＰＧ００７は、効能の組織学的証拠と関連しなかった。対照的に、Ｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃは、０．３および１．０ｍｇ／ｋｇで、組織学的に有意な軟骨保護と関連し、骨の病理の重症度および骨溶解が仲介する骨浸食が低減した。骨髄細胞過多（とりわけ骨髄性の拡張）が低減するという知見は、この表現型を支持し、炎症が仲介する溶骨性の動因の制限が、効能の応答に関与することを示唆する。重要なことに、これらの投与量は、造骨細胞プールの拡張とも関連し−Ｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃの効能のメカニズムが二重のメカニズムであり、骨溶解を制限し（したがって、骨髄性細胞の活性化の制限）、一方で、造骨細胞プールを拡張する（したがって、間葉細胞プールを増大させる）ことを示唆した。３．０ｍｇ／ｋｇのＰ７５ＮＴＲ−Ｆｃ群の組織学的プロファイルは、Ｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃが、「釣鐘状」の用量応答曲線を示すことを示唆する。多くの点において３．０ｍｇ／ｋｇのＰ７５ＮＴＲ−ＦｃおよびＰＧ００７の組織学的プロファイルは似ているが、正確な表現型は、Ｐ７５ＮＴＲＦｃの溶骨性の動因が、用量等価基準でＰＧ００７のものよりも少ないことを示唆する。古典的に、ＭＩＡモデルの組織病理評価は、原発性の軟骨病理からの線形関係に基づき、反応性の骨変化をもたらす。骨髄変化は、必然的であり、軟骨の損失に起因する生物力学的変化から生じる反応性の滑膜炎に続発するものと見なされることが多い。骨免疫学により蓄積しているデータがあり、この線形関係は無処置（ｎａｉｖｅ）であること、および、骨区画が、軟骨応答の表現型および一時的な進行の両方の調整において重要な役割を発揮し得ることを示唆する。実際に、この研究は、最小限のグレードの軟骨病変においてさえ骨の再構築を示すヒト試験による画像データを支持する。したがって、軟骨および軟骨下骨は、統合された機能性ユニットとして見られるべきであり−後者は、軟骨細胞の増殖および生存を支持する調整を与えて、そのようにして、変形性関節症における構造的結果に影響を及ぼす可能性がある。この試験によるデータは、ＮＧＦパスウェイの操作が、骨溶解を低減する可能性を提供しながら、間葉細胞が仲介する骨保護を増大させることもできるという仮説に対する支持を提供し−したがって、表面軟骨壊死から深いゾーンの病変、それ故に、全層軟骨浸食および軟骨の損失までの動因を支持する。
【０１５９】
結論
この試験では、ｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃ（０．３〜３ｍｇ／ｋｇ）を用いた治療的投与レジメンの効果を試験して、ＭＩＡ注入後にＯＡ病理の回帰を見ることができるかどうかを判定した。ＯＡは、投与が開始される前に３０日間進行させられて、理論的平均の０．５から有意に異なる疼痛の測定値により特定した。
【０１６０】
より少ない投与量のｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃ（０．３および１ｍｇ／ｋｇ）で処置された動物は、どちらも鎮痛性および有効性であり、コントロール抗体で処置された動物と比較して有意により低いＯＡ病理を示した。対照的に、３ｍｇ／ｋｇのＰＧ−００７で処置されたラットは、無痛覚を示したにもかかわらず、効能の組織学的証拠およびＯＡ病理におけるいかなる改善とも関連しなかった。より高い投与量のｐ７５ＮＴＲ−Ｆｃ（３ｍｇ／ｋｇ）で処置された動物は、鎮痛性であったが；３ｍｇ／ｋｇのＰＧ−００７で処置された動物と、病理組織学的な類似性が一部存在した。
【０１６１】
本発明は、本明細書に記載される特定の実施態様により範囲が制限されることはない。実際に、本明細書に記載されるものに加えて、本発明の様々な改変が、前述の説明および付随する図面から、当業者に明らかになるであろう。そのような改変は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。さらに、本明細書に記載される全ての実施態様は、必要に応じて、任意および全ての他の首尾一貫した実施態様に幅広く適用可能であり、組み合わせ可能であると考えられる。
【０１６２】
様々な刊行物が本明細書に挙げられ、それらの開示は、それらの全体で参照により援用される。
【図１】
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【図２Ａ−Ｂ】
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【図２Ｃ−Ｄ】
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【図２Ｅ−Ｆ】
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【図２Ｇ−Ｈ】
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【図３Ａ−Ｂ】
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【図３Ｃ−Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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