(57)【要約】  本出願は、ＨＤＬを模倣する、またはＨＤＬ発現レベルを上昇させる治療剤に関するコンパニオン診断アッセイに関する。本出願はまた、家族性低アルファリポタンパク血症の処置方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象においてコレステロールを動員するために有効なＨＤＬ治療剤の用量を同定する方法に使用するためのＨＤＬ治療剤であって、前記方法が、
（ａ）対象に前記ＨＤＬ治療剤の第１の用量を投与するステップと、
（ｂ）前記第１の用量の投与後、前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルを測定して、前記発現レベルに及ぼす前記第１の用量の効果を評価するステップと、
（ｃ）（ｉ）前記対象の１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルが、カットオフ量より大きく低減される場合、前記第１の用量より低い、前記ＨＤＬ治療剤の第２の用量を投与するステップ；または
（ｉｉ）前記対象の１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルが、前記カットオフ量より大きく低減されない場合、前記対象を前記ＨＤＬ治療剤の前記第１の用量で処置するステップと
を含む、ＨＤＬ治療剤。
【請求項２】
対象においてＨＤＬ治療剤の効能をモニターする方法に使用するためのＨＤＬ治療剤であって、前記方法が、
（ａ）対象を第１の投与スケジュールに従って前記ＨＤＬ治療剤で処置するステップと、
（ｂ）前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルを測定して、前記発現レベルに及ぼす前記第１の投与スケジュールの効果を評価するステップと、
（ｃ）（ｉ）前記対象の１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルが、上限のカットオフ量より大きく低減される場合、前記対象を第２の投与スケジュールに従って前記ＨＤＬ治療剤で処置するステップであって、前記第２の投与スケジュールが、前記ＨＤＬ治療剤のより低い用量を投与すること、前記ＨＤＬ治療剤を前記対象により長い期間にわたって注入すること、および前記ＨＤＬ治療剤を前記対象により少ない回数で投与することのうちの１つまたは複数を含む、ステップ、
（ｉｉ）前記対象の１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルが、下限のカットオフ量より大きく低減されない場合、前記対象を第２の投与スケジュールに従って前記ＨＤＬ治療剤で処置するステップであって、前記第２の投与スケジュールが、前記ＨＤＬ治療剤のより高い用量を投与すること、前記ＨＤＬ治療剤を前記対象により短い期間にわたって注入すること、および前記ＨＤＬ治療剤を前記対象により多い回数で投与することのうちの１つまたは複数を含む、ステップ；または
（ｉｉｉ）前記対象の１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルが、上限と下限のカットオフ量の間の量低減される場合、前記対象を前記第１の投与スケジュールに従って処置し続けるステップと
を含む、ＨＤＬ治療剤。
【請求項３】
前記カットオフ量が、前記投与前の前記対象自身のベースラインに関連する、請求項１または請求項２に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項４】
前記カットオフ量が、対照量に関連する、請求項１または請求項２に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項５】
前記対照量が、集団の平均値である、請求項４に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項６】
前記集団の平均値が、健康な対象から得られる、請求項５に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項７】
前記集団の平均値が、前記対象と同じ疾患状態を有する集団から得られる、請求項５に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項８】
コレステロールを動員するために有効なＨＤＬ治療剤の用量を同定する方法に使用するためのＨＤＬ治療剤であって、前記方法が、
（ａ）対象の集団にＨＤＬ治療剤の第１の用量を投与するステップと、
（ｂ）前記第１の用量の投与後、前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルを測定して、前記発現レベルに及ぼす前記第１の用量の効果を評価するステップと、
（ｃ）前記第１の用量より高いまたは低い、前記ＨＤＬ治療剤の第２の用量を投与するステップと、
（ｄ）前記第２の用量の投与後、前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルを測定して、前記発現レベルに及ぼす前記第１および／または第２の用量の効果を評価するステップと、
（ｅ）任意選択で、前記ＨＤＬ治療剤の１つまたは複数の追加の用量によってステップ（ｃ）および（ｄ）を繰り返すステップと、
（ｆ）１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルをカットオフ量より大きく低減させない最高用量を同定し、それによってコレステロールを動員するために有効な前記ＨＤＬ治療剤の用量を同定するステップと
を含む、ＨＤＬ治療剤。
【請求項９】
前記方法が、前記第２の用量の投与後、前記対象の循環中の単球、マクロファージまたは単核細胞における１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルを測定して、前記発現レベルに及ぼす前記第２の用量の効果を評価するステップをさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項１０】
前記対象の１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルが、カットオフ量より大きく低減される場合、前記第２の用量より低い、前記ＨＤＬ治療剤の第３の用量を投与する、請求項９に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項１１】
ＨＤＬ治療剤を必要とする対象を処置する方法に使用するための、任意選択でリポタンパク質複合体であるＨＤＬ治療剤であって、前記方法が、前記対象に、
（ａ）前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現を、前記対象のベースライン量または対照量と比較して２０％より大きくまたは１０％より大きく低減させない用量の前記ＨＤＬ治療剤と、
（ｂ）任意選択で、胆汁酸レジン、ナイアシン、スタチン、フィブレート、ＰＣＳＫ９阻害剤、エゼチミブ、およびＣＥＴＰ阻害剤から選択されるコレステロール低下治療剤と
の組み合わせを投与するステップを含む、ＨＤＬ治療剤。
【請求項１２】
前記比較される量が、対照量であり、集団の平均値である、請求項１１に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項１３】
前記集団の平均値が、健康な対象から得られる、請求項１２に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項１４】
前記集団の平均値が、前記対象と同じ疾患状態を有する集団から得られる、請求項１２に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項１５】
前記対象がヒトである、または対象の集団がヒト対象の集団である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項１６】
前記対象が非ヒト動物である、または対象の集団が非ヒト動物の集団である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項１７】
前記非ヒト動物がマウスである、請求項１６に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項１８】
少なくとも１つのＨＤＬマーカーがＡＢＣＡ１である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項１９】
ＡＢＣＡ１  ｍＲＮＡ発現レベルが測定される、請求項１８に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項２０】
ＡＢＣＡ１タンパク質発現レベルが測定される、請求項１８に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項２１】
前記ＡＢＣＡ１カットオフ量が２０％〜８０％である、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項２２】
前記ＡＢＣＡ１カットオフ量が３０％〜７０％である、請求項２１に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項２３】
前記ＡＢＣＡ１カットオフ量が４０％〜６０％である、請求項２２に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項２４】
前記ＡＢＣＡ１カットオフ量が５０％である、請求項２３に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項２５】
ＡＢＣＡ１発現レベルが、前記第１の用量または前記第２の用量の投与の２〜１２時間、４〜１０時間、２〜８時間、２〜６時間、４〜６時間、または４〜８時間後に測定される、請求項１８〜２４のいずれか１項に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項２６】
少なくとも１つのＨＤＬマーカーがＡＢＣＧ１である、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項２７】
ＡＢＣＧ１  ｍＲＮＡ発現レベルが測定される、請求項２６に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項２８】
ＡＢＣＧ１タンパク質発現レベルが測定される、請求項２６に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項２９】
前記ＡＢＣＧ１カットオフ量が２０％〜８０％である、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項３０】
前記ＡＢＣＧ１カットオフ量が３０％〜７０％である、請求項２９に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項３１】
前記ＡＢＣＧ１カットオフ量が４０％〜６０％である、請求項３０に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項３２】
前記ＡＢＣＡ１カットオフ量が５０％である、請求項３１に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項３３】
ＡＢＣＧ１発現レベルが、投与の２〜１２時間、４〜１０時間、２〜８時間、２〜６時間、４〜６時間、または４〜８時間後に測定される、請求項２６〜３２のいずれか１項に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項３４】
少なくとも１つのＨＤＬマーカーがＳＲＥＢＰ−１である、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項３５】
ＳＲＥＢＰ−１  ｍＲＮＡ発現レベルが測定される、請求項３４に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項３６】
ＳＲＥＢＰ−１タンパク質発現レベルが測定される、請求項３４に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項３７】
前記ＳＲＥＢＰ−１カットオフ量が２０％〜８０％である、請求項３４〜３６のいずれか１項に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項３８】
前記ＳＲＥＢＰ−１カットオフ量が３０％〜７０％である、請求項３７に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項３９】
前記ＳＲＥＢＰ−１カットオフ量が４０％〜６０％である、請求項３８に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項４０】
前記ＳＲＥＢＰ−１カットオフ量が５０％である、請求項３９に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項４１】
ＳＲＥＢＰ−１発現レベルが、投与の２〜１２時間、４〜１０時間、２〜８時間、２〜６時間、４〜６時間、または４〜８時間後に測定される、請求項３４〜４０のいずれか１項に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項４２】
リポタンパク質複合体である、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項４３】
前記リポタンパク質複合体がアポリポタンパク質を含む、請求項４２に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項４４】
前記アポリポタンパク質が、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、ＡｐｏＥ、またはその組み合わせである、請求項４３に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項４５】
前記リポタンパク質複合体がアポリポタンパク質ペプチド模倣体を含む、請求項４２に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項４６】
前記ペプチド模倣体が、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、もしくはＡｐｏＥペプチド模倣体、またはその組み合わせである、請求項４５に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項４７】
前記リポタンパク質複合体が、ＣＥＲ−００１、ＣＳＬ−１１１、ＣＳＬ−１１２、またはＥＴＣ−２１６である、請求項４２に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項４８】
低分子である、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項４９】
前記低分子がＣＥＴＰ阻害剤である、請求項４８に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項５０】
前記低分子がパントテン酸誘導体である、請求項４８に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項５１】
カットオフ量を決定することをさらに含む、請求項１〜４２のいずれか１項に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項５２】
前記カットオフ量が、前記ＨＤＬ治療剤の用量反応曲線を作成することによって決定される、請求項５１に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項５３】
前記カットオフ量が、前記用量反応曲線の変曲点となる用量の２５％〜７５％である、請求項５２に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項５４】
前記カットオフ量が、前記用量反応曲線の変曲点となる用量の４０％〜６０％である、請求項５３に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項５５】
前記対象または対象の集団が、ＡＢＣＡ１欠損を有する、請求項１〜５４のいずれか１項に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項５６】
前記対象または対象の集団が、ＡＢＣＡ１変異に関してホモ接合である、請求項５５に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項５７】
前記対象または対象の集団が、ＡＢＣＡ１変異に関してヘテロ接合である、請求項５５に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項５８】
治療に好適なＨＤＬ治療剤の用量を同定する方法に使用するためのＨＤＬ治療剤であって、前記方法が、
（ａ）対象または対象の集団に前記ＨＤＬ治療剤の１つまたは複数の用量を投与するステップと、
（ｂ）各用量の投与後、前記対象のまたは集団の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルを測定するステップと、
（ｃ）１つまたは複数の前記ＨＤＬマーカーの発現レベルを０％より大きく、１０％より大きく、または２０％より大きく上昇させない最大用量を同定し、それによって治療に好適なＨＤＬ治療剤の用量を同定するステップと
を含む、ＨＤＬ治療剤。
【請求項５９】
治療に好適なＨＤＬ治療剤の用量を同定する方法に使用するためのＨＤＬ治療剤であって、前記方法が、
（ａ）対象または対象の集団に前記ＨＤＬ治療剤の１つまたは複数の用量を投与するステップと、
（ｂ）各用量の投与後、前記対象のまたは集団の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルを測定するステップと、
（ｃ）前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における１つまたは複数のＨＤＬマーカーのベースライン発現レベルを維持する、または発現レベルを上昇させる用量を同定し、それによって、治療に好適なＨＤＬ治療剤の用量を同定するステップと
を含む、ＨＤＬ治療剤。
【請求項６０】
治療に好適なＨＤＬ治療剤の用量を同定する方法に使用するためのＨＤＬ治療剤であって、前記方法が、
（ａ）対象または対象の集団にＨＤＬ治療剤の１つまたは複数の用量を投与するステップと、
（ｂ）前記対象または対象の集団の細胞におけるコレステロール流出を測定するステップと、
（ｃ）前記対象におけるコレステロール流出を０％より大きく、１０％より大きく、または２０％より大きく低減させない最大用量を同定し、それによって治療に好適なＨＤＬ治療剤の用量を同定するステップと、
を含む、ＨＤＬ治療剤。
【請求項６１】
治療に好適なＨＤＬ治療剤の投与間隔を同定する方法に使用するためのＨＤＬ治療剤であって、前記方法が、
（ａ）１回または複数回の投与回数に従って対象または対象の集団にＨＤＬ治療剤を投与するステップと
（ｂ）前記対象または対象の集団の細胞におけるコレステロール流出を測定するステップと、
（ｃ）前記対象におけるコレステロール流出を０％より大きく、１０％より大きく、または２０％より大きく低減させない最大投与回数を同定し、それによって治療に好適なＨＤＬ治療剤の用量を同定するステップと
によって前記ＨＤＬ治療剤の最も頻回な投与レジメンの最高用量を同定するステップを含む、ＨＤＬ治療剤。
【請求項６２】
前記１回または複数回の投与回数が、
（ａ）２日ごとに１〜４時間の注入としての投与、
（ｂ）３日ごとに１〜４時間の注入としての投与、
（ｃ）１週間ごとに２４時間の注入としての投与、および
（ｄ）２週間ごとに２４時間の注入としての投与
から選択される１回または複数回の投与回数を含む、請求項６１に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項６３】
コレステロール流出が、前記対象または対象の集団の単球、マクロファージ、または単核細胞において測定される、請求項５９〜６２のいずれか１項に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項６４】
対象にＨＤＬ治療剤の治療的有効量を投与することを含む、ＡＢＣＡ１欠損を有する対象を処置する方法に使用するためのＨＤＬ治療剤。
【請求項６５】
ＣＥＲ−００１である、請求項６４に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項６６】
前記対象が、ＡＢＣＡ１変異に関してヘテロ接合である、請求項６４または６５に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項６７】
前記対象が、ＡＢＣＡ１変異に関してホモ接合である、請求項６４または６５に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項６８】
家族性原発性低アルファリポタンパク血症を有する対象を処置する方法に使用するためのＨＤＬ治療剤であって、前記方法が、
（ａ）前記対象に導入レジメンに従って前記ＨＤＬ治療剤を投与するステップ、および次に
（ｂ）前記対象に維持レジメンに従って前記ＨＤＬ治療剤を投与するステップ
を含む、ＨＤＬ治療剤。
【請求項６９】
前記維持レジメンが、前記ＨＤＬ治療剤をより低い用量で、より少ない回数で、またはその両方で投与することを伴う、請求項６８に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項７０】
前記対象が、ＡＢＣＡ１変異に関してヘテロ接合である、請求項６８または請求項６９に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項７１】
前記対象が、ＡＢＣＡ１変異に関してホモ接合である、請求項６８または請求項６９に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項７２】
前記対象が、ＬＣＡＴ変異に関してホモ接合またはヘテロ接合である、請求項６８〜７１のいずれか１項に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項７３】
前記対象が、ＡｐｏＡ−Ｉ変異に関してホモ接合またはヘテロ接合である、請求項６８〜７２のいずれか１項に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項７４】
前記対象が、ＡＢＣＧ１変異に関してホモ接合またはヘテロ接合である、請求項６８〜７３のいずれか１項に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項７５】
前記対象が、脂質調節薬でも処置される、請求項６８〜７４のいずれか１項に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項７６】
前記脂質調節薬が、アトルバスタチン、エゼチミブ、ナイアシン、ロスバスタチン、シンバスタチン、アスピリン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、またはその組み合わせである、請求項７５に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項７７】
ＣＥＲ−００１である、請求項６８〜７６のいずれか１項に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項７８】
前記導入レジメンが４週間の期間である、請求項７７に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項７９】
前記導入レジメンが、ＣＥＲ−００１を週に３回投与することを含む、請求項７７または請求項７８に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項８０】
前記導入レジメンで投与される用量が、８〜１５ｍｇ／ｋｇ（タンパク質重量に基づく）である、請求項７７〜７９のいずれか１項に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項８１】
前記導入レジメンで投与される用量が、８ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、または１５ｍｇ／ｋｇである、請求項８０に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項８２】
前記維持レジメンが、ＣＥＲ−００１を少なくとも１か月間、少なくとも２か月間、少なくとも３か月間、少なくとも６か月間、少なくとも１年間、少なくとも１８か月間、少なくとも２年間、または無限に投与することを含む、請求項７７〜８１のいずれか１項に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項８３】
前記維持レジメンが、ＣＥＲ−００１を週に２回投与することを含む、請求項７７〜８２のいずれか１項に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項８４】
前記維持レジメンで投与される前記用量が、１〜６ｍｇ／ｋｇ（タンパク質の重量に基づいて）である、請求項７７〜８３のいずれか１項に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項８５】
前記維持レジメンで投与される前記用量が、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、または６ｍｇ／ｋｇである、請求項８４に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項８６】
（ａ）前記導入レジメンが、１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルを、前記対象のベースライン量および／または集団の平均値と比較して２０％〜８０％、または４０％〜６０％低減させる用量を利用する、および／または
（ｂ）前記維持レジメンが、１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルを、前記対象のベースライン量および／または集団の平均値と比較して２０％より大きく、または１０％より大きく低減させない用量を利用する、
請求項６８〜８５のいずれか１項に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【請求項８７】
前記維持レジメンが、１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルを低減させない用量を利用する、請求項８６に記載の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．関連出願の相互参照
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下で、その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、２０１４年５月２日に提出された米国特許仮出願第６１／９８８，０９５号明細書に対する優先権を主張する。
【０００２】
２．配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出されており、その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、配列表を含む。２０１５年４月２２日に作成された前記ＡＳＣＩＩのコピーは、名称がＣＲＮ−０１６ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズは５７，０６５バイトである。
【背景技術】
【０００３】
３．背景
３．１．概要
循環中のコレステロールは、血液中の脂質を輸送する、脂質とタンパク質を組成とする血漿中リポタンパク質複合体粒子によって運ばれる。４つの主要なクラスのリポタンパク質粒子、すなわちカイロミクロン、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、および高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）が、血漿中を循環し、脂質輸送系に関係している。カイロミクロンは、腸管脂質吸収能を有する短命の産物を構成する。ＶＬＤＬおよび、特にＬＤＬは、肝臓からのコレステロール（肝臓で合成されるか、または食事源から得られる）を、動脈壁を含む肝臓外組織に送達することを司る。これに対し、ＨＤＬは、コレステロール逆輸送（ＲＣＴ）、特に、肝臓外組織から、コレステロールが貯蔵され、異化され、排泄またはリサイクルされる肝臓へのコレステロール脂質の除去を媒介する。ＨＤＬはまた、炎症においても有益な役割を果たし、酸化した脂質およびインターロイキンを輸送し、これにより血管壁の炎症を低減させ得る。
【０００４】
リポタンパク質粒子は、コレステロール（通常、コレステリルエステルの形態）とトリグリセリドとで構成される疎水性のコアを有する。コアは、リン脂質、非エステル化コレステロール、およびアポリポタンパク質を含む表面外皮によって取り囲まれている。アポリポタンパク質は、脂質輸送を媒介し、一部は、脂質代謝に関係する酵素と相互作用し得る。ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、ＡｐｏＡ−Ｖ、ＡｐｏＢ、ＡｐｏＣ−Ｉ、ＡｐｏＣ−ＩＩ、ＡｐｏＣ−ＩＩＩ、ＡｐｏＤ、ＡｐｏＥ、ＡｐｏＪ、およびＡｐｏＨを含む、少なくとも１０種のアポリポタンパク質が同定されている。リポタンパク質に会合した、ＬＣＡＴ（レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ）、ＣＥＴＰ（コレステリルエステル転送タンパク質）、ＰＬＴＰ（リン脂質転送タンパク質）およびＰＯＮ（パラオキソナーゼ）などの他のタンパク質も見出されている。
【０００５】
冠動脈性心疾患、冠動脈疾患、およびアテローム性動脈硬化症などの心血管疾患は、血清中コレステロールレベルの上昇に強く関係している。例えば、アテローム性動脈硬化症は、動脈壁内のコレステロール（およびコレステロールエステル）の蓄積によって特徴付けられる進行の遅い疾患である。マクロファージにおけるコレステロールおよびコレステロールエステルの蓄積により、アテローム動脈硬化性プラークの顕著な特徴である泡沫細胞が形成される。アテローム動脈硬化性病変に沈着した脂質は血漿中のＬＤＬに主に由来する、という理論を支持する説得力のある証拠があり、これによりＬＤＬは、「悪玉」コレステロールとして一般的に知られるようになった。これに対し、血清中ＨＤＬレベルは、冠動脈性心疾患と反比例する。実際に、高い血清中ＨＤＬレベルは、負の危険因子であると考えられる。高い血漿中ＨＤＬレベルは、冠動脈疾患に対して保護的であるのみならず、実際にアテローム動脈硬化性プラークの退縮を誘導し得るという仮説が立てられている（例えば、Badimon et al., 1992, Circulation 86 (Suppl. III):86-94；Dansky and Fisher, 1999, Circulation 100:1762-63；Tangirala et al., 1999, Circulation 100(17):1816-22；Fan et al., 1999, Atherosclerosis 147(1):139-45；Deckert et al., 1999, Circulation 100(11):1230-35；Boisvert et al., 1999, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 19(3):525-30；Benoit et al., 1999, Circulation 99(1):105-10；Holvoet et al., 1998, J. Clin. Invest. 102(2):379-85；Duverger et al., 1996, Circulation 94(4):713-17；Miyazaki et al., 1995, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 15(11):1882-88；Mezdour et al., 1995, Atherosclerosis 113(2):237-46；Liu et al., 1994, J. Lipid Res. 35(12):2263-67；Plump et al., 1994, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91(20):9607-11；Paszty et al., 1994, J. Clin. Invest. 94(2):899-903；She et al, 1992, Chin. Med. J. (Engl). 105(5):369-73；Rubin et al., 1991, Nature 353(6341):265-67；She et al., 1990, Ann. NY Acad. Sci. 598:339-51；Ran, 1989, Chung Hua Ping Li Hsueh Tsa Chih (also translated as: Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi) 18(4):257-61；Quezado et al., 1995, J. Pharmacol. Exp. Ther. 272(2):604-11；Duverger et al., 1996, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 16(12):1424-29；Kopfler et al., 1994, Circulation; 90(3):1319-27；Miller et al., 1985, Nature 314(6006):109-11；Ha et al., 1992, Biochim. Biophys. Acta 1125(2):223-29；Beitz et al., 1992, Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids 47(2): 149-52を参照されたい）。その結果、ＨＤＬは、「善玉」コレステロールとして一般的に知られるようになった（例えば、Zhang, et al., 2003 Circulation 108:661-663を参照されたい）。
【０００６】
ＨＤＬの「保護的な」役割は、多数の研究において確認されている（例えば、Miller et al., 1977, Lancet 1(8019):965-68；Whayne et al., 1981, Atherosclerosis 39:411-19）。これらの研究において、ＬＤＬレベルの上昇は、心血管リスクの増加に関連するように思われるが、高いＨＤＬレベルは、心血管の保護を与えるように思われる。Ｉｎ  ｖｉｖｏでの試験により、ＨＤＬの保護的な役割はさらに証明されており、ＨＤＬをウサギに注入すると、コレステロール誘発性の動脈病変の発生を妨害し得ること（Badimon et al., 1989, Lab. Invest. 60:455-61）、および／またはその退縮を誘導し得ること（Badimon et al, 1990, J. Clin. Invest. 85:1234-41）が示されている。新規標的治療（Treating to New Target）（ＴＮＴ）研究の事後分析において、ＨＤＬ−コレステロールは、スタチンで処置した患者において、そのＬＤＬ−コレステロールが７０ｍｇ／ｄｌ未満である患者でさえも主要心血管事象の予測因子であった。
【０００７】
最近の臨床試験において、ナイアシンおよび２つのＣＥＴＰ阻害剤（トルセトラピブ（Pfizer）およびダルセトラピブ（Roche））は、これらの試験の一部が何らかの交絡因子を有し得るものの、長期間の処置で冠動脈事象の発生率を低減することができなかった（Boden et al, 2011, N Engl J Med 365:2255-2267；HPS2-THRIVE Collaborative Group, 2013, Eur. Heart J. 34:1279-1291；Barter et al, 2007, N Engl J Med 357:2109-2122；Schwartz et al, 2012, N. Engl. J. Med. 367:2089-2099）。２つのメンデル遺伝学的研究は、ＨＤＬ−コレステロールと心血管疾患のリスクとの関連に疑問を呈した（Voight et al, Lancet DOI:10.1016/S0140-6736(12)60312-2, published online May 17, 2012；Holmes et al, Eur Heart J doi:10.1093/eurheartj/eht571, published online January 27, 2014）。これらの研究は、ＨＤＬコレステロール（ＨＤＬ−ｃ）の上昇よりむしろ、機能的なＨＤＬ粒子の数と脂質逆輸送の増強が、心血管事象を予防するための重要な要因であるという考え方をさらに強調している（Barter et al, 2007, N Engl J Med 357:2109-22；Group et al, 2010, N Engl J Med 362:1563-74；Nissen et al, 2007, The New England journal of medicine 356:1304-16）。実際に、患者数が５，０００人を超えるＭＥＳＡ臨床試験において、ＣＨＤの発生および心血管事象に相関する最善の因子は、ＨＤＬ分画のコレステロール含有量（すなわち、ＨＤＬ−ｃ）よりむしろＨＤＬ粒子数であった（Mackey et al, 2012, Journal of the American College of Cardiology 60:508-16；van der Steeg et al, 2008, Journal of the American College of Cardiology 51:634-42）。強力なスタチン治療の状況において、ＨＤＬ粒子数は、化学的に測定されたＨＤＬ−コレステロールまたはＡｐｏＡ−Ｉより残留リスクのより良好なマーカーであり得る（Mora et al. 2013, Circulation DOI:10.1161/CIRCULATIONAHA.113.002671）。
【０００８】
３．２．脂質逆輸送、ＨＤＬ、およびアポリポタンパク質Ａ−Ｉ
ＨＤＬ粒子の保護機能は、コレステロール逆輸送（ＲＣＴ）経路としても知られる脂質逆輸送（ＲＬＴ）経路におけるその役割によって説明することができる。ＲＬＴ（Tall, 1998, Eur Heart J 19:A31-5）経路は、主に４つの基本的なステップで動脈からのコレステロールの除去および体から排泄するために肝臓へのその輸送の要因である。
【０００９】
第１のステップは、「コレステロール除去」と呼ばれるプロセスにおける新生ＨＤＬ粒子による動脈からのコレステロールの除去である。コレステロールは、小胞体輸送およびシグナル伝達の調節において重要である構造ドメインを維持する膜構成成分である。ほとんどの細胞において、コレステロールは異化されない。このため、細胞のステロール流出の調節は、細胞のステロール恒常性において極めて重要な役割を果たす。細胞ステロールは、非調節性の受動的な拡散機構、ならびにＡＢＣＡ１およびＡＢＣＧ１トランスポーターなどの受容体によって媒介される能動的な調節性のエネルギー依存的プロセスの両方によって、細胞外ステロールアクセプターへと流出することができる。
【００１０】
ＲＣＴにおける重要な酵素であるＬＣＡＴは、腸管および肝臓によって産生され、主にＨＤＬ分画と会合して血漿中を循環する。ＬＣＡＴは、細胞由来のコレステロールをコレステリルエステルに変換し、これは、除去の運命にあるＨＤＬにおいて隔離されている（Jonas 2000, Biochim. Biophys. Acta 1529(1-3):245-56を参照されたい）。コレステリルエステル転送タンパク質（ＣＥＴＰ）およびリン脂質輸送タンパク質（ＰＬＴＰ）は、循環中のＨＤＬ集団のさらなるリモデリングに寄与する。ＣＥＴＰは、ＬＣＡＴによって作製されたコレステリルエステルを他のリポタンパク質、特にＶＬＤＬおよびＬＤＬなどのＡｐｏＢを含むリポタンパク質に移動させる。ＰＬＴＰは、ＨＤＬにレシチンを供給する。ＨＤＬトリグリセリドは、細胞外肝トリグリセリドリパーゼによって異化され、リポタンパク質コレステロールは、いくつかの機構によって肝臓から除去される。
【００１１】
ＨＤＬ粒子の機能的特徴は、ＡｐｏＡ−Ｉ、およびＡｐｏＡ−ＩＩなどのその主要なアポリポタンパク質成分によって主に決定される。微量のＡｐｏＣ−Ｉ、ＡｐｏＣ−ＩＩ、ＡｐｏＣ−ＩＩＩ、ＡｐｏＤ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、ＡｐｏＥ、およびＡｐｏＪもまた、ＨＤＬに会合して観察されている。ＨＤＬは、代謝ＲＣＴカスケードまたは経路の際のリモデリングの状況に応じて、広く多様な異なるサイズおよび上記構成成分の異なる混合物で存在する。
【００１２】
各ＨＤＬ粒子は通常、ＡｐｏＡ−Ｉの少なくとも１つの分子、通常２〜４個の分子を含む。ＨＤＬ粒子はまた、Ｇｅｒｄ  Ａｓｓｍａｎｎ教授（例えば、von Eckardstein et al., 1994, Curr Opin Lipidol. 5(6):404-16を参照されたい）によって記述されているように、コレステロール流出の要因であることが知られているＡｐｏＥ（ガンマ−ＬｐＥ粒子）のみを含み得る。ＡｐｏＡ−Ｉは、肝臓および小腸によってプレプロアポリポタンパク質Ａ−Ｉとして合成され、プロアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（プロＡｐｏＡ−Ｉ）として分泌され、迅速に切断されて、アミノ酸２４３個の１つのポリペプチド鎖であるＡｐｏＡ−Ｉの血漿型を生成する（Brewer et al., 1978, Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:623-30）。実験的に血流に直接注射されたプレプロＡｐｏＡ−Ｉもまた、ＡｐｏＡ−Ｉの血漿型へと切断される（Klon et al., 2000, Biophys. J. 79(3):1679-85；Segrest et al., 2000, Curr. Opin. Lipidol. 11(2) :105-15；Segrest et al., 1999, J. Biol. Chem. 274(45):31755-58）。
【００１３】
ＡｐｏＡ−Ｉは、しばしばプロリンであるリンカー部分によって隔てられた、６〜８個の異なるアミノ酸２２個のアルファ−ヘリックスまたは機能的反復を含む。反復単位は、両親媒性のヘリックス状の立体配座で存在し（Segrest et al., 1974, FEBS Lett. 38:247-53）、ＡｐｏＡ−Ｉの主要な生物活性、すなわち脂質結合およびレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）活性化を与える。
【００１４】
ＡｐｏＡ−Ｉは、脂質と３つのタイプの安定な複合体、すなわちプレ−ベータ−１ＨＤＬと呼ばれる脂質の少ない小さい複合体、プレ−ベータ−２ＨＤＬと呼ばれる極性の脂質（リン脂質およびコレステロール）を含む平坦なディスク状の粒子、および球状または成熟ＨＤＬ（ＨＤＬ３およびＨＤＬ２）とも呼ばれる極性と無極性の脂質の両方を含む球状の粒子を形成する。循環中の集団におけるほとんどのＨＤＬは、ＡｐｏＡ−ＩとＡｐｏＡ−ＩＩの両方を含む（「ＡＩ／ＡＩＩ−ＨＤＬ分画」）。しかし、ＡｐｏＡ−Ｉのみを含むＨＤＬの分画（「ＡＩ−ＨＤＬ分画」）は、ＲＣＴにおいてより有効であるように思われる。ある疫学的研究は、ＡｐｏＡ−Ｉ−ＨＤＬ分画が抗アテローム形成性であるという仮説を支持する（Parra et al., 1992, Arterioscler. Thromb. 12:701-07；Decossin et al., 1997, Eur. J. Clin. Invest. 27:299-307）。
【００１５】
ＨＤＬ粒子は、異なる大きさ、脂質組成およびアポリポタンパク質組成を有する粒子のいくつかの集団で形成される。ＨＤＬ粒子は、その水和密度、アポリポタンパク質組成および電荷特徴を含む、その特性に従って分離することができる。例えば、プレ−ベータ−ＨＤＬ分画は、成熟アルファ−ＨＤＬより低い表面電荷によって特徴付けられる。この電荷の差のために、プレ−ベータ−ＨＤＬおよび成熟アルファ−ＨＤＬは、アガロースゲルにおいて異なる電気泳動移動度を有する（David et al., 1994, J. Biol. Chem. 269(12):8959-8965）。
【００１６】
プレ−ベータ−ＨＤＬと成熟アルファ−ＨＤＬの代謝もまた異なる。プレ−ベータ−ＨＤＬは、２つの代謝運命を有し、血漿から除去されて腎臓で異化されるか、または中等度の大きさのＨＤＬにリモデリングされて、肝臓によって選択的に分解される（Lee et al., 2004, J. Lipid Res. 45(4)716-728）。
【００１７】
細胞表面からのコレステロール移動（すなわち、コレステロール流出）の機構は不明であるが、脂質の少ない複合体であるプレ−ベータ−１ＨＤＬが、末梢組織から転送されたコレステロールのＲＣＴに関係する好ましいアクセプターであると考えられている（Davidson et al., 1994, J. Biol. Chem. 269:22975-82；Bielicki et al., 1992, J. Lipid Res. 33:1699-1709；Rothblat et al., 1992, J. Lipid Res. 33:1091-97；およびKawano et al., 1993, Biochemistry 32:5025-28；Kawano et al., 1997, Biochemistry 36:9816-25を参照されたい）。細胞表面からのコレステロール動員のこのプロセスの際に、プレ−ベータ−１ＨＤＬは、プレ−ベータ−２ＨＤＬへと急速に変換される。ＰＬＴＰは、プレ−ベータ−２ＨＤＬディスク形成率を増加させ得るが、データは、ＲＣＴにおけるＰＬＴＰの役割が欠如していることを示している。ＬＣＡＴは、ディスク状、小さい（プレ−ベータ）および球状の（すなわち成熟）ＨＤＬに選択的に反応して、レシチンまたは他のリン脂質の２−アシル基を、コレステロールの遊離のヒドロキシル残基に転移させ、コレステリルエステル（ＨＤＬにおいて保持される）およびリゾレシチンを生成する。ＬＣＡＴ反応は、活性化因子としてＡｐｏＡ−Ｉを必要とし、すなわち、ＡｐｏＡ−Ｉは、ＬＣＡＴの天然の補因子である。ＨＤＬにおいて隔離されたコレステロールがそのエステルに変換されることにより、細胞へのコレステロールの再流入が防止され、最終結果は、コレステロールが細胞の勾配により細胞から除去され、ＨＤＬが維持されることである。
【００１８】
ＡｐｏＡ−Ｉ  ＨＤＬ分画（すなわち、ＡｐｏＡ−Ｉを含みＡｐｏＡ−ＩＩを含まない）の成熟ＨＤＬ粒子におけるコレステリルエステルは、肝臓によって除去されて、ＡｐｏＡ−ＩとＡｐｏＡ−ＩＩの両方を含むＨＤＬ（ＡＩ／ＡＩＩ−ＨＤＬ分画）に由来するコレステリルエステルよりも有効に胆汁へと処理される。これは部分的に、肝細胞膜にＡｐｏＡ−Ｉ−ＨＤＬがより有効に結合することによるものであり得る。ＨＤＬ受容体の存在は仮説が立てられており、スキャベンジャー受容体、クラスＢ、Ｉ型（ＳＲ−ＢＩ）がＨＤＬ受容体として同定されている（Acton et al., 1996, Science 271:518-20；Xu et al., 1997, Lipid Res. 38:1289-98）。ＳＲ−ＢＩは、ステロイド産生組織（例えば、副腎）および肝臓において最も豊富に発現されている（Landschulz et al., 1996, J. Clin. Invest. 98:984-95；Rigotti et al., 1996, J. Biol. Chem. 271:33545-49）。ＨＤＬ受容体の総説に関しては、Broutin et al., 1988, Anal. Biol. Chem. 46:16-23を参照されたい。
【００１９】
ＡＴＰ結合カセットトランスポーターＡ１（ＡＢＣＡ１）による最初の脂質化は、血漿中のＨＤＬ形成およびプレ−ベータ−ＨＤＬ粒子がコレステロール流出をもたらす能力にとって極めて重要であるように思われる（Lee and Parks, 2005, Curr. Opin. Lipidol. 16(1):19-25）。これらの著者らによれば、この最初の脂質化によって、プレ−ベータ−ＨＤＬは、コレステロールアクセプターとしてより効率的に機能することができ、ＡｐｏＡ−Ｉが既存の血漿中ＨＤＬ粒子に急速に会合するのを防止して、それによってコレステロール流出のためにプレ−ベータ−ＨＤＬ粒子をより一層利用することができる。
【００２０】
ＡＢＣＡ１欠損症は、家族性原発性低アルファリポタンパク血症の基礎となる原因の１つである。家族性原発性低アルファリポタンパク血症は、ＡＢＣＡ１などのＨＤＬ合成／成熟の要因である遺伝子の１つの遺伝的欠損によって引き起こされ、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）粒子の非常に少ない数に関連し、同様にアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ＡｐｏＡ−Ｉ）の非常に低い血漿中濃度にも反映される。疾患はまた一般的に、低いＨＤＬ−コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）または若年性心血管疾患の家族歴陽性にも関連している。
【００２１】
ホモ接合型ＡＢＣＡ１欠損は、タンジール病とも呼ばれ、重度の血漿中ＨＤＬ、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ＡｐｏＡ−Ｉ）の欠損または非存在、および全身の組織におけるコレステリルエステルの蓄積によって特徴付けられる（Puntoni et al, 2012）。タンジール病を有する対象は、大きい黄色−オレンジ色の扁桃および／または神経障害を呈する。他の臨床特徴には、肝腫大、脾腫大、若年性心筋梗塞または卒中、血小板減少症、貧血、および角膜混濁が挙げられる。
【００２２】
最近、第２のＡＴＰ結合カセットトランスポーターＧ１（ＡＢＣＧ１）が、細胞内コレステロール恒常性を媒介しているとして記述された。ＡＢＣＧ１の発現は、主に球状でコレステロールを含有する中等度から非常に大きいＨＤＬ粒子、ならびに大きいディスク状ＨＤＬ粒子との相互作用を通してコレステロール流出を増強する。より大きい粒子は、ＡＢＣＧ１からのアクセプターとしてより小さいＨＤＬ粒子と同様に有効である。
【００２３】
ＡＴＰ結合カセットトランスポーターＡＢＣＡ１およびＡＢＣＧ１は、肝臓Ｘ受容体転写因子によって増加し（Costet et al., 2000, J Biol Chem 275:28240-5；Kennedy et al., 2001, J Biol Chem 276:39438-47）、この転写因子はＡＢＣＡ１およびＡＢＣＧ１トランスポーターの両方によるコレステロール流出の調節において肝要な役割を果たす。Ｉｎ  ｖｉｖｏで、肝臓Ｘ受容体は、コレステロール含有細胞における特異的オキシステロールによって活性化され、ＡＢＣＡ１およびＡＢＣＧ１は、マクロファージにおける肝臓Ｘ受容体の重要な標的遺伝子である（Janowski et al., 1996, Nature 383:728-31）。ＡＢＣＡ１は、コレステロール欠損およびリン脂質枯渇ＡｐｏＡ−ＩおよびａｐｏＥ複合体へのコレステロールの流出を促進するが、ＡＢＣＧ１は、ＨＤＬ粒子への流出を促進する（Duong et al., 2006, Journal of lipid research 47:832-43；Mulya et al., 2007, Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology 27:1828-36；Wang et al., 2004, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101:9774-9）。ＡＢＣＡ１およびＡＢＣＧ１トランスポーターの発現の増加は、細胞質膜の内葉から外葉へのコレステロールの再分布に関連しており、コレステロール含有泡沫細胞からＨＤＬ粒子へのコレステロール流出を促進する（Pagler et al., 2011, Circulation research 108:194-200）。マクロファージのコレステロール流出の媒介にＡＢＣＡ１およびＡＢＣＧ１が協調して関与することは、動物試験から証明されている。マウスにおけるＡＢＣＡ１単独の欠損によって、アテローム性動脈硬化症の中等度の増加が起こり、ＡＢＣＧ１の欠損は効果を有しない。しかし、共に欠損すると、病変の発生が顕著に加速された（Yvan-Charvet et al., 2007, The Journal of clinical investigation 117:3900-8）。二重ノックアウトマクロファージは、ＨＤＬおよびＡｐｏＡ−Ｉへのコレステロール流出の顕著な欠如を示し、リポ多糖類で処置した場合の炎症応答を増加させた（Yvan-Charvet et al., 2008, Circulation 118:1837-47）。
【００２４】
コレステロール恒常性はまた、最近、生理的プロセスに関係する遺伝子の転写後調節剤である小さい内因性の非タンパク質コードＲＮＡであるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）によっても調べられている（Rayner et al., 2010, Science (New York, N.Y.) 328:1570-3；Najafi-Shoushtari et al., 2010, Science (New York, N.Y.) 328:1566-9；Marquart et al., 2010, PNAS）。ＭｉＲ−３３は、ステロール調節エレメント結合因子−２をコードする遺伝子内に存在するイントロンｍｉＲＮＡであり、ＡＢＣＡ１およびＡＢＣＧ１の両方の肝臓での発現を阻害し、ＨＤＬ−Ｃ濃度（Yvan-Charvet et al., 2008, Circulation 118:1837-47；Marquart et al., 2010, PNAS）ならびにマクロファージにおけるＡＢＣＡ１発現を低減させ、このようにして、コレステロール流出を減少させる（Yvan-Charvet et al., 2008, Circulation 118:1837-47）。オリゴヌクレオチドによるＭｉＲ−３３の拮抗により、マウスモデルにおいてＨＤＬ−Ｃが上昇し、アテローム性動脈硬化症が低減した（Rayner et al., 2011, The Journal of Clinical Investigation 121:2921-31）。
【００２５】
ＡＢＣＡ１ならびにＡＢＣＧ１は、細胞のコレステロール含有量によって高度に調節される。細胞の脂質過剰負荷によって、オキシステロールが形成され、これが核の肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲ）を活性化して、ＡＢＣＡ１およびＡＢＣＧ１の転写を誘導し、したがってコレステロール流出を誘導する（Jakobsson et al., 2012, Trends in pharmacological sciences 33:394-404）。このように、コレステロール流出は、ＨＤＬ粒子の細胞外濃度および組成、ならびにＡＢＣトランスポーターの活性の両方によって決定される。
【００２６】
興味深いことに、ＡＢＣＡ１の発現は、予めロードされたＨＤＬ粒子が細胞培地に存在することによってダウンレギュレートされたように思われる（Langmann et al., 1999, Biochemical and biophysical research communications 257:29-33）。
【００２７】
細胞コレステロール恒常性の重要な調節因子としてのコレステロール流出は、造血幹細胞の増殖および動員などの多くの細胞機能に対して重要な調節ステップを発揮する（Tall et al., 2012, Arterioscler Thromb Vase Biol 32:2547-52）。
【００２８】
ＡＴＰ結合カセットトランスポーターＧ４（ＡＢＣＧ４）は、ＨＤＬへのコレステロール流出を媒介し、それによって巨核球の増殖が起こる（Murphy et al., 2013, Nature medicine 19:586-94）。
【００２９】
コレステロール流出は、単球およびマクロファージに対する炎症応答（Westerterp et al., 2013, Circulation research 112:1456-65）、リンパ球の増殖（Sorci-Thomas et al., 2012, Arterioscler Thromb Vase Biol 32:2561-5）、内皮酸化窒素シンターゼ（ｅＮＯＳ）による酸化窒素（ＮＯ）の産生（Terasaka et al, 2010, Arterioscler Thromb Vase Biol 30:2219-25）、および膵臓のβ細胞からのインスリン産生（Kruit et al, 2012, Diabetes 61:659-64）を調節する。
【００３０】
ＣＥＴＰもまた、ＲＣＴにおいて役割を果たし得る。ＣＥＴＰ活性またはそのアクセプターであるＶＬＤＬおよびＬＤＬの変化は、ＨＤＬ集団の「リモデリング」において役割を果たす。例えば、ＣＥＴＰの非存在下では、ＨＤＬは、除去されない肥大した粒子となる（ＲＣＴおよびＨＤＬの総説に関しては、Fielding and Fielding, 1995, J. Lipid Res. 36:211-28；Barrans et al, 1996, Biochem. Biophys. Acta 1300:73-85；Hirano et al, 1997, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 17(6):1053-59を参照されたい）。
【００３１】
ＨＤＬはまた、他の脂質および無極性分子の逆輸送、ならびに解毒において、すなわち細胞、臓器、および組織から異化および排泄のための肝臓への脂質の輸送において役割を果たす。そのような脂質には、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、酸化脂質、およびリゾホスファチジルコリンが挙げられる。例えば、Robins and Fasulo（1997, J. Clin. Invest. 99:380-84）は、ＨＤＬが、肝臓による植物ステロールの胆汁分泌への輸送を刺激することを示している。
【００３２】
ＨＤＬの主成分であるＡｐｏＡ−Ｉは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＳＭと会合することができる。ＡｐｏＡ−Ｉをｉｎ  ｖｉｔｒｏでウシ脳ＳＭ（ＢＢＳＭ）によって再構成すると、最大再構成速度は、ＢＢＳＭの相転移温度に近似する温度である２８℃で起こる（Swaney, 1983, J. Biol. Chem. 258(2), 1254-59）。ＢＢＳＭ：ＡｐｏＡ−Ｉの重量比７．５：１またはそれ未満では、粒子１個あたり３分子のＡｐｏＡ−Ｉを含み、ＢＢＳＭ：ＡｐｏＡ−Ｉのモル比３６０：１を有する１つの再構成された均一なＨＤＬ粒子が形成される。電子顕微鏡では、リン脂質／タンパク質の比率が上昇したホスファチジルコリンとＡｐｏＡ−Ｉとの組み換えによって得られたものと類似のディスク状の複合体のように見える。しかし、ＢＢＳＭ：ＡｐｏＡ−Ｉの重量比１５：１では、より高いリン脂質：タンパク質モル比（５３５：１）を有するより大きい直径のディスク状複合体が形成する。これらの複合体は、ホスファチジルコリンによって形成されたＡｐｏＡ−Ｉ複合体より、有意に大きく、より安定で、変性に対してより抵抗性である。
【００３３】
スフィンゴミエリン（ＳＭ）は、初期コレステロールアクセプター（プレ−ベータ−ＨＤＬおよびガンマ−遊走ＡｐｏＥを含むリポタンパク質）において上昇し、これらの粒子のコレステロール流出促進能をＳＭが増強し得ることを示唆している（Dass and Jessup, 2000, J. Pharm. Pharmacol. 52:731-61；Huang et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1834-38；Fielding and Fielding 1995, J. Lipid Res. 36:211-28）。
【００３４】
３．３．ＨＤＬおよびＡｐｏＡ−Ｉの保護機構
ＨＤＬの保護機構に関する研究は、ＨＤＬの主成分であるアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ＡｐｏＡ−Ｉ）に集中している。高い血漿中ＡｐｏＡ−Ｉレベルは、冠動脈病変の非存在または低減に関連する（Maciejko et al., 1983, N. Engl. J. Med. 309:385-89；Sedlis et al., 1986, Circulation 73:978-84）。
【００３５】
実験動物にＡｐｏＡ−ＩまたはＨＤＬを注入すると、有意な生化学変化を発揮すると共に、アテローム動脈硬化性病変の程度および重症度を低減させる。Maciejko and Mao（1982, Arteriosclerosis 2:407a）による最初の報告後、Badimonら（1989, Lab. Invest. 60:455-61；1989, J. Clin. Invest. 85:1234-41）は、ＨＤＬ（ｄ＝１．０６３〜１．３２５ｇ／ｍｌ）を注入することによってコレステロールを与えたウサギにおいて、アテローム動脈硬化性病変の程度（４５％の低減）、およびそのコレステロールエステル含有量（５８．５％の低減）を有意に低減させることができることを見出した。彼らはまた、ＨＤＬの注入によって、確立された病変の５０％に近い退縮が起こることも見出した。（Esper et al. 1987, Arteriosclerosis 7:523a）は、ＨＤＬの注入が、初期動脈病変を発症する遺伝性の高コレステロール血症を有するＷａｔａｎａｂｅウサギの血漿中リポタンパク質組成を顕著に変化させることができることを示している。これらのウサギにおいて、ＨＤＬ注入は、保護的ＨＤＬとアテローム形成性ＬＤＬとの間の比率を倍より大きくすることができる。最近、組換え型ヒトアポリポタンパク質Ａ−Ｉ改変プレ−βＨＤＬであるＣＥＲ−００１を数回注入すると、家族性高コレステロール血症の前臨床モデルであるＬＤＬ受容体ノックアウトマウスにおいて、血管の炎症を低減して、食事誘発性のアテローム性動脈硬化症の退縮を促進することができた（HDL Tardy et al., Atherosclerosis 232 (2014) 110-118）。
【００３６】
ＨＤＬが動物モデルにおいて動脈疾患を予防する可能性は、ＡｐｏＡ−Ｉがｉｎ  ｖｉｔｒｏで線維素溶解活性を発揮することができるという知見によってさらに強調されている（Saku et al., 1985, Thromb. Res. 39:1-8）。Ronneberger（1987, Xth Int. Congr. Pharmacol., Sydney, 990）は、ＡｐｏＡ−Ｉがビーグル犬およびカニクイザル（Cynomologous）において線維素溶解を増加させることができることを証明している。類似の活性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒト血漿に関して認めることができる。Ronnebergerは、ＡｐｏＡ−Ｉ処置動物において脂質沈着および動脈プラーク形成の低減を確認することができた。
【００３７】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験は、ＡｐｏＡ−Ｉとレシチンの複合体が、培養動脈平滑筋からの遊離のコレステロールの流出を促進できることを示している（Stein et al., 1975, Biochem. Biophys. Acta, 380:106-18）。この機構によって、ＨＤＬは、これらの細胞の増殖もまた低減させることができる（Yoshida et al., 1984, Exp. Mol Pathol. 41:258-66）。
【００３８】
ＡｐｏＡ−ＩまたはＡｐｏＡ−Ｉ模倣ペプチドを含むＨＤＬの注入治療はまた、ＡＢＣＡ１トランスポーターにより血漿中ＨＤＬレベルを調節し、心血管疾患の処置において効能が得られることが示されている（例えば、Brewer et al., 2004, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 24:1755-1760を参照されたい）。
【００３９】
アルギニン残基がシステインに置換されている、ＡｐｏＡ−Ｉの天然に存在する２つのヒト多型が単離されている。アポリポタンパク質Ａ−ＩＭｉｌａｎｏ（ＡｐｏＡ−ＩＭ）において、この置換は、１７３位の残基で起こるが、アポリポタンパク質Ａ−ＩＰａｒｉｓ（ＡｐｏＡ−ＩＰ）では、この置換は、１５１位の残基で起こる（Franceschini et al., 1980, J. Clin. Invest. 66:892-900；Weisgraber et al., 1983, J. Biol. Chem. 258:2508-13；Bruckert et al, 1997, Atherosclerosis 128:121-28；Daum et al., 1999, J. Mol. Med. 77:614-22；Klon et al., 2000, Biophys. J. 79(3):1679-85）。ロイシンが１４４位でアルギニンに置換されている、ＡｐｏＡ−Ｉのなおさらなる天然に存在するヒト多型が単離されている。この多型は、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ  Ｚａｒａｇｏｚａ（ＡｐｏＡ−ＩＺ）と呼ばれ、重度の低アルファリポタンパク血症に関連し、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）のコレステロール逆輸送に及ぼす効果の増強に関連する（Recalde et al, 2001, Atherosclerosis 154(3):613-623；Fiddyment et al, 2011, Protein Expr. Purif. 80(1):110-116）。
【００４０】
ＡｐｏＡ−ＩＭまたはＡｐｏＡ−ＩＰのいずれかのジスルフィド結合ホモ二量体を含む再構成されたＨＤＬ粒子は、そのジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）乳剤の除去能およびコレステロール流出の促進能に関して、野生型ＡｐｏＡ−Ｉを含む再構成されたＨＤＬ粒子と類似である（Calabresi et al, 1997b, Biochemistry 36:12428-33；Franceschini et al, 1999, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 19:1257-62；Daum et al, 1999, J. Mol. Med. 77:614-22）。いずれの変異においても、ヘテロ接合個体は、減少したＨＤＬレベルを有するが、逆説的に言うと、アテローム性動脈硬化症のリスクは低減している（Franceschini et al, 1980, J. Clin. Invest. 66:892-900；Weisgraber et al, 1983, J. Biol. Chem. 258:2508-13；Bruckert et al, 1997, Atherosclerosis 128:121-28）。いずれかの変種を含む再構成されたＨＤＬ粒子は、野生型ＡｐｏＡ−Ｉを含む再構成されたＨＤＬ粒子と比較した場合に効率は減少しているが、ＬＣＡＴ活性化を行うことができる（Calabresi et al, 1997, Biochem. Biophys. Res. Commun. 232:345-49；Daum et al, 1999, J. Mol. Med. 77:614-22）。
【００４１】
ＡｐｏＡ−ＩＭ変異は、常染色体優性形質として伝搬され、家族内の８世代の保因者が同定されている（Gualandri et al., 1984, Am. J. Hum. Genet. 37:1083-97）。ＡｐｏＡ−ＩＭ保因個体の状態は、ＨＤＬ−コレステロールレベルの顕著な低減によって特徴付けられる。これにもかかわらず、保因個体は、動脈疾患のいかなるリスクの増加も明白に示していない。実際に、家系図の記録を調べることによって、これらの対象は、アテローム性動脈硬化症から「保護され」得るように思われる（Sirtori et al., 2001, Circulation, 103: 1949-1954；Roma et al., 1993, J. Clin. Invest. 91(4):1445-520）。
【００４２】
変異の保因者におけるＡｐｏＡ−ＩＭの可能性がある保護効果の機構は、１つのアルファ−ヘリックスが失われて疎水性残基の露出が増加した変異体ＡｐｏＡ−ＩＭの構造の修飾に関連するように思われる（Franceschini et al., 1985, J. Biol. Chem. 260:1632-35）。多数のアルファ−ヘリックスの堅固な構造が失われることによって分子の可撓性が増加し、正常なＡｐｏＡ−Ｉと比較して、脂質とより容易に会合する。その上、リポタンパク質複合体は、変性に対してより感受性が高く、このように、変異体では、脂質の輸送もまた改善されることを示唆している。
【００４３】
Bielickiら（1997, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 17(9):1637-43）は、ＡｐｏＡ−ＩＭが野生型ＡｐｏＡ−Ｉと比較して、限定的な膜コレステロールの動員能を有することを証明している。加えて、ＡｐｏＡ−ＩＭと膜脂質との会合によって形成された新生ＨＤＬは、野生型ＡｐｏＡ−Ｉによって形成されたより大きい９および１１ｎｍの複合体ではなくて主に７．４ｎｍの粒子であった。これらの知見は、ＡｐｏＡ−Ｉ一次配列におけるＡｒｇ１７３→Ｃｙｓ１７３置換が、細胞のコレステロール動員および新生ＨＤＬアセンブリの正常なプロセスを妨害したことを示している。変異は、細胞からのコレステロールの除去効率の減少に明らかに関連する。それゆえ、その抗アテローム形成特性は、ＲＣＴとは無関係であり得る。同様に、その抗アテローム形成特性は、ＨＤＬの成熟を小さい粒子に限定するその能力に起因し得る。
【００４４】
Ａｒｇ１７３→Ｃｙｓ１７３置換による最も顕著な構造の変化は、ＡｐｏＡ−ＩＭの二量体形成である（Bielicki et al., 1997, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 17(9):1637-43）。ＡｐｏＡ−ＩＭは、自身とホモ二量体を、およびＡｐｏＡ−ＩＩとヘテロ二量体を形成することができる。アポリポタンパク質の混合物を含む血液分画の研究は、循環中の二量体および複合体の存在が、アポリポタンパク質の消失半減期の増加の要因であり得ることを示している。そのような消失半減期の増加は、変異の保因者の臨床試験において観察されている（Gregg et al., 1988, NATO ARW on Human Apolipoprotein Mutants: From Gene Structure to Phenotypic Expression, Limone S G）。他の研究は、ＡｐｏＡ−ＩＭ二量体（ＡｐｏＡ−ＩＭ／ＡｐｏＡ−ＩＭ）がｉｎ  ｖｉｔｒｏでＨＤＬ粒子の相互変換の阻害因子として作用することを示している（Franceschini et al., 1990, J. Biol. Chem. 265:12224-31）。
【００４５】
３．４．脂質異常症および関連障害の現行の処置
脂質異常障害は、血清中コレステロールおよびトリグリセリドレベルの上昇、ならびに血清ＨＤＬ：ＬＤＬ比の低下に関連する疾患であり、高脂血症、特に高コレステロール血症、冠動脈性心疾患、冠動脈疾患、血管および血管周囲疾患、ならびにアテローム性動脈硬化症などの心血管疾患が含まれる。動脈の不全によって引き起こされる、一過性の虚血発作または間欠性爬行などのアテローム性動脈硬化症に関連する症候群もまた含まれる。脂質異常障害に関連する上昇した血清中コレステロールおよびトリグリセリドを低下させるために、多数の処置が現在利用可能である。しかし、それぞれの処置は、効能、副作用、および適任である患者集団に関してそれぞれが欠点および制限を有する。いくつかの脂質異常障害は、タンジール病、ＡＢＣＡ１欠損、ＡｐｏＡ−Ｉ欠損、ＬＣＡＴ欠損、または魚眼病などの、しかしこれらに限定されるわけではないＨＤＬ合成、成熟、または消失の要因である遺伝子の変異によるＨＤＬ欠損に関連している。これらの障害は、家族性原発性低アルファリポタンパク血症（ＦＰＨＡ）の項に再度分類することができる。
【００４６】
胆汁酸結合レジンは、小腸から肝臓への胆汁酸のリサイクルを中断するクラスの薬剤であり、例えばコレスチラミン（Questran Light（登録商標）、Bristol-Myers Squibb）、コレスチポール塩酸塩（Colestid（登録商標）、The Upjohn Company）、およびコレセベラム塩酸塩（Welchol（登録商標）、Daiichi-Sankyo Company）である。経口で服用すると、これらの正荷電レジンは、腸管で負荷電胆汁酸に結合する。レジンは、腸管から吸収されることができないことから、レジンは自身が運ぶ胆汁酸と共に排泄される。しかし、そのようなレジンを使用しても、せいぜい血清中コレステロールレベルを約２０％低下させるに過ぎず、便秘および特定のビタミン欠乏を含む消化管副作用に関連する。その上、レジンは、他の薬物に結合することから、他の経口薬は、レジンの摂取前少なくとも１時間か、または摂取後４〜６時間に服用しなければならず、このため、心疾患の患者の薬物レジメンを複雑にする。
【００４７】
スタチンは、コレステロール生合成経路に関係する重要な酵素であるＨＭＧＣｏＡレダクターゼを阻害することによってコレステロール合成を遮断するコレステロール低下剤である。スタチン、例えばロバスタチン（Mevacor（登録商標））、シンバスタチン（Zocor（登録商標））、プラバスタチン（Pravachol（登録商標））、フルバスタチン（Lescol（登録商標））、ピタバスタチン（Livalo（登録商標））、およびアトルバスタチン（Lipitor（登録商標））は、時に、胆汁酸結合レジンと併用して使用される。スタチンは、血清中コレステロールおよび血清中ＬＤＬレベルを有意に低減させ、冠動脈アテローム性動脈硬化症の進行を遅らせる。しかし、血清中ＨＤＬコレステロールレベルの増加は中等度に過ぎない。ＬＤＬ低下効果の機構は、ＶＬＤＬ濃度の低減およびＬＤＬ受容体の細胞発現の誘導の両方を必要とし、それによってＬＤＬの産生の低減および／または異化の増加が起こり得る。肝臓および腎臓の機能障害を含む副作用は、これらの薬剤の使用に関連する（The Physicians Desk Reference, 56th Ed., 2002, Medical Economics）。
【００４８】
ナイアシン（ニコチン酸）は、栄養補助食品および抗高脂血症剤として使用される水溶性ビタミンＢ−複合体である。ナイアシンは、ＶＬＤＬの産生を減少させ、ＬＤＬを低下させるために有効である。いくつかの場合において、ナイアシンは、胆汁酸結合レジンと併用して使用される。ナイアシンは、適切な用量で使用すると、ＨＤＬを増加させることができるが、その有用性は、そのような高用量で使用する場合の重篤な副作用によって制限されている。Niaspan（登録商標）は、純粋なナイアシンより副作用が少ない徐放性ナイアシンの剤形である。ナイアシン／ロバスタチン（Nicostatin（登録商標））は、ナイアシンとロバスタチンの両方を含有する製剤であり、各薬剤の有益性を組み合わせている。ＡＲＢＩＴＥＲ６−ＨＡＬＴＳ（Arterial Biology for the Investigation of the Treatment Effects of Reducing Cholesterol 6 - HDL and LDL Treatment Strategies in Atherosclerosis）試験は、ナイアシンが脂質プロファイルを都合よく改変するのみならず、頸動脈および冠動脈におけるプラーク形成を低減させることも示した（Villines et al., 2010, J Am Coll Cardiol 55:2721-6）。残念なことに、米国国立衛生研究所の支援を受けた大規模アウトカム試験であるＡＩＭ−ＨＩＧＨ（Atherothrombosis Intervention in Metabolic Syndrome with Low HDL/High Triglycerides）は、３０００人を超える患者の募集後まもなく、無益であるとして中止された（Investigators et al., 2011, N Engl J Med 365:2255-67）。ＨＰＳ−ＴＨＲＩＶＥ（Heart Protection Study 2 - Treatment of HDL to Reduce the Incidence of Vascular Events）試験は、心血管リスクの高い患者２５６７３人においてシンバスタチンに加えてラロピプラント（顔面紅潮の発生率を低減させるためのプロスタグランジンＤ２受容体拮抗剤）と併用した徐放性ナイアシンの効果を調べたが、主要血管事象に及ぼすナイアシン−ラロピプラント併用の有意な有益性は示されなかった（Group, 2013, Eur Heart J 34:1279-91）。
【００４９】
新規クラスのＨＤＬ−コレステロール増加薬は、ＣＥＴＰ阻害剤である。ＨＤＬからＶＬＤＬまたはＬＤＬへのコレステロールエステルの転送を低減させることによって、ＣＥＴＰ阻害剤は、血漿中ＨＤＬ−コレステロールレベルの３０〜１４０％（参照値の）の顕著で一貫した増加を生じる。スタチンに関連して、ＬＤＬ−コレステロールは、不変のままであるか（ダルセトラピブ）または約４０％（トルセトラピブ、アナセトラピブ、またはエバセトラピブ）さらに減少させる。ＩＬＬＵＭＩＮＡＴＥ（Investigation of Lipid Level Management to Understand its Impact in Atherosclerotic Events）試験において、患者１５０６７人に、トルセトラピブをアトルバスタチン８０ｍｇに追加すると、アトルバスタチン単独（Barter et al., 2007, N Engl J Med 357:2109-22）と比較して、ＨＤＬ−コレステロールが８０％増加して、ＬＤＬ−コレステロールが２５％減少したにもかかわらず、死亡率および有病率の増加に関連した（Barter et al., 2007, N Engl J Med 357:2109-22）。他の２つの試験、Ｂモード頸動脈超音波を使用したＲＡＤＩＡＮＣＥ２（Rating Atherosclerotic Disease Change by Imaging with a New Cholesteryl-Ester-Transfer Protein Inhibitor）試験（Bots et al., 2007, Lancet 370:153-60）、ならびに冠動脈血管内超音波を使用したＩＬＬＵＳＴＲＡＴＥ（Investigation of Lipid Level Management Using Coronary Ultrasound to Assess Reduction of Atherosclerosis by CETP Inhibition and HDL Elevation）試験（Nissen et al., 2007, N Engl J Med 356:1304-16）では、トルセトラピブは、脂質プロファイルを有利に変化させたにもかかわらず、頸動脈内膜中膜複合体厚を低減させず、冠動脈プラーク体積を減少させなかった。これらの好ましくない転帰は、副腎からのアルドステロン分泌の増加におそらく関連する血圧の上昇などのオフターゲット作用のためである可能性がある（Hu et al., 2009, Endocrinology 150:2211-9；Forrest et al., 2008, British journal of pharmacology 154:1465-73）。トルセトラピブのオフターゲット作用を欠如するように思われる、アナセトラピブ、ダルセトラピブ、およびエバセトラピブなどの他のＣＥＴＰ阻害剤が開発されている。これらの化合物は、アルドステロン分泌に影響を及ぼさない。ＤＥＦＩＮＥ（Determining the Efficacy and Tolerability of CETP Inhibition with Anacetrapib）試験において、アナセトラピブは、アトルバスタチンと比較して、ＨＤＬ−コレステロールを約１４０％増加させ、ＬＤＬ−コレステロールを４０％低下させた（Cannon et al., 2010, The New England journal of medicine 363:2406-15）。ｄａｌ−ＯＵＴＣＯＭＥＳ試験の中間分析において、ＡＣＳ患者では、プラセボと比較してダルセトラピブの有益性は示されなかったが、ＨＤＬ−コレステロールは約３０％増加して、ＡｐｏＡ−Ｉは１８％増加して、ＬＤＬ−コレステロールは変化しなかった（Schwartz et al., 2012, The New England journal of medicine 121105113014000）。効能の欠如は、スタチンによるＡＢＣＡ１のダウンレギュレーションに関連すると仮定された（Niesor et al. poster 167 presented at the American College of Cardiology, 62nd annual scientific sessions March 9-11, 2013, San Francisco, CA, USA）。
【００５０】
フィブレートは、高コレステロール血症にも関連し得る様々な型の高脂血症（すなわち、上昇した血清中トリグリセリド）を処置するために使用される脂質低下薬のクラスである。フィブレートは、ＶＬＤＬ分画を低減させるように思われ、ＨＤＬを控えめに増加させるように思われるが、血清中コレステロールに及ぼすこれらの薬物の効果は多様である。米国において、クロフィブレート（Atromid-S（登録商標））、フェノフィブレート（Tricor（登録商標））、およびベザフィブレート（Bezalip（登録商標））などのフィブレートは、抗脂質異常薬としての使用が承認されているが、高コレステロール血症剤としての承認は受けていない。例えば、クロフィブレートは、ＶＬＤＬ分画を低減させることによって血清中トリグリセリドを低下させるように作用する（未知の機構によって）抗脂質異常剤である。血清中コレステロールは、ある患者亜集団において低減され得るものの、薬物に対する生化学応答は多様であり、患者が都合の良い結果を得ると必ずしも予測することはできない。Atromid-S（登録商標）は、冠動脈性心疾患の予防に関して有効であることが示されていない。化学的および薬理学的に近縁の薬剤であるゲムフィブロジル（Lopid（登録商標））は、血清中トリグリセリドおよびＶＬＤＬコレステロールを中等度に減少させ、ＨＤＬコレステロール、すなわちＨＤＬ２およびＨＤＬ３小分画、ならびにＡｐｏＡ−ＩおよびＡ−ＩＩの両方（すなわち、ＡＩ／ＡＭＴ−ＨＤＬ分画）を中等度に増加させる脂質調節剤である。しかし、特に、異なる患者集団では、脂質の応答は様々である。その上、冠動脈性心疾患の予防は、既存の冠動脈性心疾患の既往または症状を有しない４０〜５５歳の男性患者において観察されたが、これらの知見を他の患者集団（例えば、女性、高齢者、およびより若い男性）にどの程度外挿できるかは不明である。実際に、確立された冠動脈性心疾患を有する患者において効能は観察されなかった。悪性腫瘍（特に消化管がん）、胆嚢疾患、および非冠動脈死亡率の発生率の増加などの毒性を含む重篤な副作用が、フィブレートの使用に関連する。
【００５１】
閉経後の女性における中等度の高コレステロール血症では、経口エストロゲン補充療法が検討され得る。しかし、ＨＤＬの増加は、トリグリセリドの増加を伴い得る。エストロゲン処置は、当然、特異的患者集団（閉経後女性）に限定され、悪性新生物の誘導、胆嚢疾患、血栓塞栓症、肝細胞線腫、血圧上昇、耐糖能障害、および高カルシウム血症を含む重篤な副作用に関連する。
【００５２】
高脂血症の処置にとって有用な他の薬剤には、エゼチミブ（Zetia（登録商標）、Merck）が挙げられ、これはコレステロール吸収を遮断または阻害する。しかし、エゼチミブの阻害剤は、一定の毒性を示すことが示されている。
【００５３】
ＨＤＬならびにリン脂質と複合体を形成したＡｐｏＡ−Ｉの組換え型は、無極性または両親媒性分子、例えばコレステロールおよび誘導体（オキシステロール、酸化ステロール、植物ステロール等）、コレステロールエステル、リン脂質および誘導体（酸化したリン脂質）、トリグリセリド、酸化産物、およびリポ多糖類（ＬＰＳ）のシンク／スキャベンジャーとして作用することができる（例えば、Casas et al., 1995, J. Surg. Res. Nov 59(5):544-52を参照されたい）。ＨＤＬはまた、ＴＮＦ−アルファおよび他のリンフォカインのスキャベンジャーとしても作用することができる。ＨＤＬはまた、ヒト血清パラオキソナーゼ、例えばＰＯＮ−１、−２、−３の担体としても作用することができる。ＨＤＬに会合するエステラーゼであるパラオキソナーゼは、酸化に対して細胞成分を保護するために重要である。酸化ストレスの際に起こるＬＤＬの酸化は、アテローム性動脈硬化症の発症に直接関連するように思われる（Aviram, 2000, Free Radic. Res. 33 Suppl:S85-97）。パラオキソナーゼは、アテローム性動脈硬化症および心血管疾患に対する感受性において役割を果たすように思われる（Aviram, 1999, Mol. Med. Today 5(9):381-86）。ヒト血清パラオキソナーゼ（ＰＯＮ−１）は、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）に結合する。その活性は、アテローム性動脈硬化症と反比例する。ＰＯＮ−１は、有機リン酸エステルを加水分解して、ＨＤＬおよび低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の酸化を阻害することによってアテローム性動脈硬化症に対して保護し得る（Aviram, 1999, Mol. Med. Today 5(9):381-86）。実験的研究は、この保護が、酸化されたリポタンパク質中の特異的脂質過酸化物をＰＯＮ−１が加水分解する能力に関連することを示唆している。ＰＯＮ−１活性を保存または増強する介入は、アテローム性動脈硬化症および冠動脈性心疾患の発症を遅らせるために役立ち得る。
【００５４】
ＨＤＬは、抗血栓剤およびフィブリノーゲン低下剤として、および出血性ショックにおける薬剤としての役割をさらに有する（Cockerill et al.、国際公開第０１／１３９３９号パンフレット、２００１年３月１日公表）。ＨＤＬおよびＡｐｏＡ−Ｉは、特に敗血症によって産生されたリポ多糖類のＡｐｏＡ−Ｉを含む脂質粒子への交換を促進して、リポ多糖類を機能的に中和させることが示されている（Wright et al.、国際公開第９５３４２８９号パンフレット、１９９５年１２月２１日に公表；Wright et al.、米国特許第５，９２８，６２４号明細書、１９９９年７月２７日に公表；Wright et al.、米国特許第５，９３２，５３６号明細書、１９９９年８月３日に発行）。
【００５５】
最近、フィブレート、ナイアシン、またはＣＥＴＰ阻害剤などのＨＤＬ−コレステロールを増加させる薬剤によって、スタチン治療単独によって達成される効果を超えて冠動脈リスクを低減する難しさを異なる試験が記述している（上記を参照されたい）。ヒトＨＤＬ代謝のいくつかの先天性異常ならびにＨＤＬ代謝が変化した遺伝的マウスモデルにおいて、ＨＤＬ−Ｃの変化はそれぞれ、心血管リスクまたはアテローム動脈硬化性プラークの大きさの変化に関連しなかった（Besler et al., 2012, EMBO molecular medicine 4:251-68；Voight et al., 2012, Lancet 6736:1-9；Frikke-Schmidt et al., JAMA, June 4, 2008- Vol 299, No. 21；Holmes et al., Eur Heart J first published online January 27, 2014 doi:10.1093/eurheartj/eht571）。このため、ＨＤＬの発病に及ぼす役割および治療標的としての適切性は疑問である。これによって、今後の臨床試験では、単純なＨＤＬ−コレステロールレベル（バイオマーカーとして）よりむしろＨＤＬの機能性が、心血管疾患におけるＨＤＬの有益性を評価するために肝要であり得るという結論に至った。ＨＤＬの機能性を調べると、ＨＤＬの代謝は高度に調節されているように思われ、それゆえＨＤＬレベルの強い増加（例としてＣＥＴＰ阻害剤治療で達成される増加）などの極端な変化によりダウンレギュレーションが起こり得て、それによって心血管疾患に対する影響が控えめとなるという仮説を立てることができる。この仮説は、再構成された異なるＨＤＬを使用したが用量反応関係が観察されなかった２つの臨床試験の結果によって強調される。その上、いずれの臨床試験においても、最大用量では低用量よりプラークの退縮に対してより弱い効果を示す傾向があることが記述された（Nissen et al., 2003, JAMA 290:2292-300；Tardif et al., 2007, JAMA 297:1675-82）。最近の臨床試験においてＣＥＴＰ阻害剤であるダルセトラピブの有益な効果がなかったことをさらに分析すると、いくつかのスタチンが、マクロファージのＡＢＣＡ１発現に対して特異的ダウンレギュレーション効果を有し、このことがＡＣＳ患者のアテローム動脈硬化性プラークの退縮におけるＨＤＬの有益性を損ない得るという結論に達した。要するに、それらの知見により、ＨＤＬレベルの直接の増加またはＨＤＬの性質（プレ−ベータＨＤＬ対球状のＨＤＬ）またはＨＤＬの粒子数が、心血管疾患の治療が成功するために鍵となり得るという結論が得られる。
【００５６】
健康な対象のＨＤＬは、血管系、特に内皮細胞に対して何らかの保護的効果を発揮することができる（Besler et al., 2011, The Journal of clinical investigation 121:2693-708；Yuhanna et al., 2001, Nature medicine 7:853-7；Kuvin et al., 2002, American heart journal 144:165-72）。健康な対象のＨＤＬは、培養ヒト大動脈内皮細胞からのＮＯ放出を刺激して、ｅＮＯＳの発現を増加させる（Besler et al, 2011, The Journal of clinical investigation 121:2693-708；Yuhanna et al., 2001, Nature medicine 7:853-7；Kuvin et al., 2002, American heart journal 144:165-72）。ＨＤＬは、血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ１）などの接着分子の発現を抑制して、このように、単球の接着を阻害する（Nicholls et al, 2005, Circulation 111 :1543-50；Ansell et al., 2003, Circulation 108:2751-6）。ＨＤＬはまた、上記のように抗血栓効果も発揮する。マウス頸動脈モデルにおいて、ＨＤＬは、血管損傷後の内皮の修復を増強する（Besler et al, 2011, The Journal of clinical investigation 121:2693-708）。健康な対象から得られたＨＤＬは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、およびｉｎ  ｖｉｖｏのａｐｏ−Ｅ欠損マウスにおいて内皮細胞のアポトーシスを低減させた（Riwanto et al., 2013, Circulation 127:891-904）。そのような効果は、ＡＢＣＡ１に変異を有する患者においても観察される（Attie et al., 2001, J Lipid Res 42:1717-26）。再構成されたＨＤＬ粒子（モル比１：１５０のＡｐｏＡ−Ｉ／ホスファチジルコリン）の注入は、アセチルコリンを動脈内に注入して、上腕動脈のプレチスモグラフィーまたは高解像度超音波による前腕の血流の測定および血流依存性血管拡張の測定によりそれぞれ観察されるように、内皮機能の障害を改善する（Spieker et al., 2002, Circulation 105:1399-402）。二重盲検無作為化プラセボ対照臨床試験（ｄａｌ−ＶＥＳＳＥＬ）において冠動脈性心疾患（ＣＨＤ）を有するまたはそのリスクのある患者において、ＣＥＴＰ阻害剤（ダルセトラピブ）は、ＮＯ依存的内皮機能、血圧、または炎症および酸化ストレスのマーカーに影響を及ぼすことなく、ＣＥＴＰ活性を低減させて、ＨＤＬ−Ｃレベルを増加させた（Luscher et al., 2012, European heart journal 33:857-65）。１つの仮説は、健康な対象のＨＤＬとは異なり、糖尿病、ＣＡＤ、ＡＣＳ、または慢性腎機能障害を有する患者のＨＤＬは、それらがもはや培養内皮細胞からのＮＯ放出を刺激しないことから、血管作用において機能障害性であるということである（Besler et al., 2011, The Journal of clinical investigation 121:2693-708；Sorrentino et al., 2010, Circulation 121:110-22；Speer et al., 2013, Immunity 1-15）。
【００５７】
ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＭ、ＡｐｏＡ−ＩＰおよび他の変種、ならびに再構成されたＨＤＬの治療的使用は、組み換えによって発現されたタンパク質の総産生収量が低いことおよび培養時にタンパク質分解が起こることを考慮すると、治療的投与に必要なアポリポタンパク質が大量であることおよびタンパク質産生に費用がかかることによって現在制限されている（例えば、Mallory et al., 1987, J. Biol. Chem. 262(9):4241-4247；Schmidt et al., 1997, Protein Expression & Purification 10:226-236を参照されたい）。初期の臨床試験から、用量範囲は、心血管疾患の処置に関して１回の注入あたりタンパク質１．５〜４ｇの間であることが示唆されている。完全な処置に必要な注入回数は不明である（例えば、Eriksson et al., 1999, Circulation 100(6):594-98；Carlson, 1995, Nutr. Metab. Cardiovasc. Dis. 5:85-91；Nanjee et al, 2000, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 20(9):2148-55；Nanjee et al, 1999, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 19(4):979-89；Nanjee et al, 1996, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 16(9):1203-14を参照されたい）。
【００５８】
組換え型ヒトＡｐｏＡ−Ｉは、異種宿主において発現されているが、成熟タンパク質の収量は、特に精製法と組み合わせると、さらに収量を低減させて不純な産物が得られることから、大規模治療応用にとって不十分である。
【００５９】
Weinberg et al., 1988, J. Lipid Research 29:819-824は、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、Ａ−ＩＩ、およびＡ−ＩＶの分離、ならびに逆相高速液体クロマトグラフィーによってヒト血漿から精製されたそのアイソフォームを記述している。
【００６０】
国際公開第２００９／０２５７５４号パンフレットは、ヒト血漿からのアルファ−１−アンチトリプシンおよびＡｐｏＡ−Ｉのタンパク質の分離および精製を記述している。
【００６１】
Hunter et al., 2009, Biotechnol. Prog. 25(2):446-453は、大腸菌（E. coli）において組換え発現されるＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏ変種の大規模精製を記述している。
【００６２】
Caparon et al., 2009, Biotechnol. And Bioeng. 105(2):239-249は、精製アポリポタンパク質産物における２つの宿主細胞タンパク質のレベルを低減させるために、これらのタンパク質を欠失させるように遺伝子改変された大腸菌（E. coli）宿主からのＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏの発現および精製を記述している。
【００６３】
米国特許第６，０９０，９２１号明細書は、陰イオン交換クロマトグラフィーを使用したＡｐｏＡ−ＩおよびＡｐｏＥを含有するヒト血漿分画からのＡｐｏＡ−Ｉまたはアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）の精製を記述している。
【００６４】
Brewer et al., 1986, Meth. Enzymol. 128:223-246は、クロマトグラフィー技術を使用して、ヒト血液からのアポリポタンパク質の単離および特徴付けを記述している。
【００６５】
Weisweiler et al, 1987, Clinica Chimica Acta 169:249-254は、タンパク質の高速液体クロマトグラフィーを使用したヒトＨＤＬからのＡｐｏＡ−ＩおよびＡｐｏＡ−ＩＩの単離を記述している。
【００６６】
deSilva et al., 1990, J. Biol. Chem. 265(24):14292-14297は、イムノアフィニティクロマトグラフィーおよび逆相高速液体クロマトグラフィーによるアポリポタンパク質Ｊの精製を記述している。
【００６７】
リポタンパク質およびリポタンパク質複合体は、臨床での使用のために現在開発中であり、異なるリポタンパク質に基づく薬剤を使用する臨床試験がリポタンパク質治療の実現可能性を確立している（Tardif, 2010, Journal of Clinical Lipidology 4:399-404）。１つの試験は、自己脱脂ＨＤＬを評価した（Waksman et al., 2010, J Am. Coll. Cardiol. 55:2727-2735）。別の試験は、組換え型ＡｐｏＡ−ＩＭとパルミトイル−オレオイル−ＰＣ（ＰＯＰＣ）の複合体であるＥＴＣ−２１６を評価した（Nissen et al., 2003, JAMA 290:2292-2300）。ＣＳＬ−１１１は、ダイズのホスファチジルコリン（ＳＢＰＣ）と複合体を形成した、血漿から精製した再構成されたヒトＡｐｏＡ−Ｉである（Tardif et al., 2007, JAMA 297:1675-1682）。現在の探索中の薬物は、アテローム動脈硬化性プラークの低減において効能を示しているが、その効果は、トランスアミナーゼの増加またはＡｐｏＡ−Ｉ抗体の形成などの二次効果を伴った（Nanjee et al., 1999, Arterioscler. Vase. Throm. Biol. 19:979-89；Nissen et al., 2003, JAMA 290:2292-2300；Spieker et al., 2002, Circulation 105:1399-1402；Nieuwdorp et al., 2004, Diabetologia 51:1081-4；Drew et al., 2009, Circulation 119, 2103-11；Shaw et al., 2008, Circ. Res. 103:1084-91；Tardiff et al., 2007, JAMA 297:1675-1682；Waksman, 2008, Circulation 118:S 371；Cho、米国特許第７，２７３，８４９号明細書Ｂ２、２００７年９月２５日発行）。例えば、ＥＲＡＳＥ臨床試験（Tardiff et al., 2007, JAMA 297:1675-1682）は、ＣＳＬ−１１１の２つの用量、すなわち４０ｍｇ／ｋｇと８０ｍｇ／ｋｇのＡｐｏＡ−Ｉを利用した。８０ｍｇ／ｋｇ用量群は、肝毒性（重篤なトランスアミナーゼ上昇によって示される）のために中止しなければならなかった。４０ｍｇ／ｋｇ用量群においても、数人の患者はトランスアミナーゼの上昇を経験している。毒性はおそらく、再構成されたＨＤＬの製造のために使用される洗浄剤である残留コール酸塩の存在のためである（Wright et al.、米国特許出願公開第２０１３／０１９０２２６号明細書によって強調される）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００６８】
それゆえ、肝毒性およびトリグリセリド、ＬＤＬ−トリグリセリド、もしくはＶＬＤＬトリグリセリドの増加などの副作用を最小限にしながら、血清中コレステロールを低下させるために、血清中ＨＤＬレベルを増加させるために、脂質異常症ならびに／または脂質異常に関連する疾患、状態、および／もしくは障害を予防および／または処置するためにより有効であるコレステロール低下薬の投与レジメンが必要であり、ならびにそのような投与レジメンを同定して、そのような処置を受ける対象をモニターする方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００６９】
４．概要
オーダーメイド医療のこの時代に、薬物の科学とゲノミクスとを組み合わせる薬理ゲノミクスにより、処置の選択、開始、用量の最適化、または回避の情報をよりよく知らせるために、治療産物と共に使用することが意図される診断産物である、いわゆる「コンパニオン診断」の使用および問い合わせが促進されている。本開示は、部分的に、ＡＢＣＡ１およびＡＢＣＧ１トランスポーターならびに脂肪酸生合成を調節する転写因子であるＳＲＥＢＰ１などの、コレステロール流出および脂質逆輸送の成分をダウンレギュレートする作用機序による、ＨＤＬ治療剤（以下の６．１章に定義される）、特にＨＤＬ模倣剤、脱脂もしくは脂質の少ないＨＤＬ、または投与後にＨＤＬレベルを増加させる他の化合物での対象の処置に応答した逆Ｕ字型の用量反応曲線の発見に関連している。この作用機序の発見により、ＨＤＬ治療剤での処置をモニターするためにおよび／または特定の対象または対象の亜群もしくは他の群に関するＨＤＬ治療剤の有効量を同定するために有用なコンパニオン診断アッセイの設計が可能となる。このように、本開示は、とりわけ、ＨＤＬ治療剤での処置を受けている対象と共に使用することができるＨＤＬマーカーコンパニオン診断アッセイに関する。いくつかの実施形態において、本開示は、ＨＤＬ治療剤での処置を受けている対象が治療的有効量または最適な用量を受けているか否かを決定する方法に関する。いくつかの実施形態において、本開示は、ＨＤＬ治療剤での処置を受けている対象が、安全性を最適にしながら治療的有効量または最適な用量を受けているか否かを決定する方法に関する。
【００７０】
対象が、ある状態（以下の６．１章に定義される）に関してＨＤＬ治療剤で処置される、またはある状態を有する対象を処置するためにＨＤＬ治療剤の投与スケジュールを同定もしくは最適化する、本明細書において記述される方法を使用することができる。
【００７１】
同様に、ＨＤＬ治療剤での処置に対象が応答する可能性を予測する方法も、本明細書において提供される。
【００７２】
ある態様において、本開示は、ある状態を有する対象をＨＤＬ治療剤で処置する、ある状態を処置するためにＨＤＬ治療剤の好適な用量を同定する、ある状態を有する対象におけるコレステロールを動員する、または対象におけるＨＤＬ治療剤の効能をモニターする方法に関する。方法は典型的に、対象にＨＤＬ治療剤を投与する（例えば、投与レジメンに従って１回または複数回）ことと、個体の試験試料における少なくとも１つ、いくつかの実施形態において、２つまたは３つまたはそれよりも多くのＨＤＬマーカーの遺伝子発現の変化をモニターすることとを含む。対象自身のベースライン、対象の前回の測定、および／または個体集団における１つもしくは複数のＨＤＬマーカーの測定から得られた対照と比較して試験試料におけるＨＤＬマーカーのいかなる変化もあり得る。個体集団は、任意の適切な集団、例えば健康な個体、ある状態を有する個体、遺伝的にマッチさせた個体等であり得る。測定後、ＨＤＬ治療剤が、治療効能が減弱される程度までコレステロール流出経路の成分をダウンレギュレートすれば、用量、投与回数、またはその両方を調節することができる。いくつかの実施形態において、対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルを変化させないまたは増加させない用量が同定される。
【００７３】
いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）対象または対象の集団から第１の試験試料を得るステップと、（ｂ）試験試料における１つまたは複数のＨＤＬマーカー（以下の６．１章に定義される）の発現レベルを測定するステップと、（ｃ）対象または対象の集団にＨＤＬ治療剤のある用量（または一連の用量）を投与するステップと、（ｄ）対象または対象の集団から第２の試験試料を得るステップと、（ｅ）第２の試験試料における１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルを測定するステップとを含む。いくつかの実施形態において、第１の試料は、ＨＤＬ治療剤での処置の前に得られる。他の実施形態において、第１の試料は、対象または対象の集団をステップ（ｃ）の用量とは異なるＨＤＬ治療剤の用量で処置した後に得られる。
【００７４】
他の実施形態において、方法は、（ａ）対象または対象の集団にＨＤＬ治療剤のある用量を投与するステップと、（ｂ）対象または対象の集団から試験試料を得るステップ、と（ｃ）試験試料における１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルを測定して、発現レベルがカットオフ量より上または下であるかを決定するステップとを含む。任意選択で、好適な用量が同定されるまで、ＨＤＬ治療剤の１つまたは複数の追加の用量でステップ（ａ）〜（ｃ）を繰り返す。追加の用量は、ＨＤＬ治療剤のより高い／より低い用量、より多い／より少ない投与回数、またはより速い／より遅い注入時間を含み得る。
【００７５】
試験試料は、好ましくは、末梢血単核細胞、または循環中の単球もしくはマクロファージの試料である。同様に、リンパ単核細胞または循環中の単球もしくはマクロファージの試料でもあり得る。試料は、例えば、無処置の対象もしくは対象の集団から、またはＨＤＬ治療剤の投与後の、例えば、投与の２、４、６、８、１０、１２、１６、２０、もしくは２４時間後の対象もしくは対象の集団から得ることができる。様々な実施形態において、試料は、投与の２〜１０、２〜１２、４〜６、４〜８、４〜２４、４〜１６、６〜８、または６〜１０時間後に得られる。対象は、単剤治療として、または例えばアトルバスタチン、エゼチミブ、ナイアシン、ロスバスタチン、シンバスタチン、アスピリン、フルバスタチン、ロバスタチン、およびプラバスタチンなどの１つまたは複数の脂質調節薬との併用治療レジメンの一部としてＨＤＬ治療剤で処置することができる。いくつかの実施形態において、好適な用量の同定は、健康な個体において行われ、他の実施形態において、ある状態を有する個体の集団において行われる。様々な実施形態において、好適な用量は、１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルを、対象のベースライン量および／または集団の平均値と比較して２０〜８０％、３０％〜７０％、４０％〜６０％、または５０％低減させる用量である。他の実施形態において、好適な用量は、１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルをわずか５０％低減させる用量であり、いくつかの実施形態において、対象のベースライン量または集団の平均値と比較してわずか４０％、わずか３０％、わずか２０％、またはわずか１０％低減させる用量である。なお他の実施形態において、用量は、対象のベースライン量または集団の平均値と比較して１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルを全く低減させない用量である。
【００７６】
なおもう一つの実施形態において、本明細書において、本開示のコンパニオン診断アッセイにおける使用のためのキットが提供される。いくつかの実施形態において、キットは、（ａ）少なくとも１つのＨＤＬ治療剤と、（ｂ）ＨＤＬマーカーの発現を定量するために有用な少なくとも１つの診断試薬（例えば、核酸アッセイの場合にはＨＤＬマーカーの検出のためのプライマーおよび／またはプローブ、ならびにタンパク質アッセイの場合には少なくとも１つの抗ＨＤＬマーカー抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル））とを含む。別の実施形態において、ＨＤＬマーカーは、生物試料（例として、血液またはリンパ）から細胞を分離するために使用されるセルソーターまたはＦＡＣＳ機器の助けを借りて決定される。
【００７７】
同様に、家族性低アルファリポタンパク血症、例えばＡＢＣＡ１欠損症を有する対象をＨＤＬ治療剤で処置する方法も、本明細書において示される。好ましくは、治療は、２つの相で、すなわち初回のより強い「誘導」相とその後のより弱い「維持」相で行われる。任意選択で、治療は、本明細書において記述される方法を使用して同定された投与スケジュールに従って行われる。
【００７８】
同様に、任意選択で、本明細書において記述される方法を使用して同定された投与スケジュールを使用して、ＬＣＡＴ欠損症（ホモ接合またはヘテロ接合体）を有する対象をＨＤＬ治療剤で処置する方法も、本明細書において示される。
【００７９】
同様に、任意選択で、本明細書において記述される方法を使用して同定された投与スケジュールを使用してＡｐｏＡ−Ｉ欠損症（ホモ接合またはヘテロ接合体）を有する対象をＨＤＬ治療剤で処置する方法も、本明細書において示される。
【００８０】
同様に、任意選択で、本明細書において記述される方法を使用して同定された投与スケジュールを使用して、低ＨＤＬレベル（男性においてＨＤＬ−コレステロールが４０ｍｇ／ｄｌ未満、または女性においてＨＤＬ−コレステロールが５０ｍｇ／ｄｌ未満）を有する対象をＨＤＬ治療剤で処置する方法も、本明細書において示される。
【００８１】
ある実施形態において、本開示は、対象におけるコレステロールを動員するために有効なＨＤＬ治療剤の用量を同定する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）対象にＨＤＬ治療剤の第１の用量を投与するステップと、（ｂ）前記第１の用量の投与後、前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルを測定して、前記発現レベルに及ぼす前記第１の用量の効果を評価するステップと、（ｃ）（ｉ）対象の１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルが、カットオフ量より大きく低減する場合、第１の用量より低い、前記ＨＤＬ治療剤の第２の用量を投与するステップ、または（ｉｉ）対象の１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルが、カットオフ量より大きく低減されない場合、対象を前記ＨＤＬ治療剤の第１の用量で処置するステップとを含む。
【００８２】
ある実施形態において、本開示は、対象におけるＨＤＬ治療剤の効能をモニターする方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）対象を第１の投与スケジュールに従ってＨＤＬ治療剤で処置するステップと、（ｂ）前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルを測定して、前記発現レベルに及ぼす前記第１の投与スケジュールの効果を評価するステップと、（ｃ）（ｉ）対象の１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルが、上限のカットオフ量より大きく低減される場合、対象を第２の投与スケジュールに従ってＨＤＬ治療剤で処置するステップであって、第２の投与スケジュールが、ＨＤＬ治療剤のより低い用量を投与すること、ＨＤＬ治療剤を対象により長い期間にわたって注入すること、およびＨＤＬ治療剤を対象により少ない回数で投与することのうちの１つまたは複数を含む、ステップ、（ｉｉ）対象の１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルが、下限のカットオフ量より大きく低減されない場合、対象を第２の投与スケジュールに従ってＨＤＬ治療剤で処置するステップであって、第２の投与スケジュールが、ＨＤＬ治療剤のより高い用量を投与すること、ＨＤＬ治療剤を対象により短い期間にわたって注入すること、およびＨＤＬ治療剤を対象により多い回数で投与することのうちの１つまたは複数を含むステップ；または（ｉｉｉ）対象の１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルが、上限と下限のカットオフ量の間の量低減される場合、対象を第１の投与スケジュールに従って処置し続けるステップとを含む。
【００８３】
カットオフ量は、前記投与前の対象自身のベースラインに関連し得るか、またはカットオフ量は、例えば健康な対象もしくは対象と同じ疾患状態を有する集団、または１つもしくは複数の疾患リスク遺伝子を対象と共有する集団からの集団の平均値などの対照量（control amount）に関連し得る。
【００８４】
ある実施形態において、本開示は、コレステロールを動員するために有効なＨＤＬ治療剤の用量を同定する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）対象の集団にＨＤＬ治療剤の第１の用量を投与するステップと、（ｂ）前記第１の用量の投与後、前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルを測定して、前記発現レベルに及ぼす前記第１の用量の効果を評価するステップと、（ｃ）前記第１の用量より高いまたは低い、前記ＨＤＬ治療剤の第２の用量を投与するステップと、（ｄ）前記第２の用量の投与後、前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルを測定して、前記発現レベルに及ぼす前記第１の用量の効果を評価するステップと、（ｅ）任意選択で、前記ＨＤＬ治療剤の１つまたは複数の追加の用量によってステップ（ｃ）および（ｄ）を繰り返すステップと、（ｆ）１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルをカットオフ量より大きく低減させない最大用量を同定し、それによってコレステロールを動員するために有効な前記ＨＤＬ治療剤の用量を同定するステップとを含む。
【００８５】
ある実施形態において、前記第２の用量の投与後、前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルを測定して、前記発現レベルに及ぼす前記第２の用量の効果を評価する。対象の１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルが、カットオフ量より大きく低減される場合、第２の用量より低い、前記ＨＤＬ治療剤の第３の用量が投与され得る。
【００８６】
ある実施形態において、本開示は、ＨＤＬ治療剤を必要とする対象を処置する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、対象に、（ａ）前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現を、対象のベースライン量と比較して２０％より大きくまたは１０％より大きく低減させない用量のリポタンパク質複合体と、（ｂ）任意選択で、胆汁酸レジン、ナイアシン、スタチン、フィブレート、ＰＣＳＫ９阻害剤、エゼチミブ、およびＣＥＴＰ阻害剤から選択されるコレステロール低下治療剤との組み合わせを投与するステップを含む。
【００８７】
ある実施形態において、本開示は、ＨＤＬ治療剤を必要とする対象を処置する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、対象に、（ａ）前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現を、対照量と比較して２０％より大きく、または１０％より大きく低減させない用量のリポタンパク質複合体と、（ｂ）任意選択で、胆汁酸レジン、ナイアシン、スタチン、フィブレート、ＰＣＳＫ９阻害剤、エゼチミブ、およびＣＥＴＰ阻害剤から選択されるコレステロール低減治療との組み合わせを投与するステップを含む。
【００８８】
対照量（control amount）は、集団の平均値、例えば健康な対象の集団の平均値、または対象と同じ疾患状態を有する集団の平均値、または１つもしくは複数の疾患リスク遺伝子を対象と共有する集団の平均値であり得る。対象はヒトであり得るか、または対象の集団はヒト対象の集団である。対象は、非ヒト動物、例えばマウスであり得るか、または対象の集団は、非ヒト動物の集団であり得る。
【００８９】
本明細書において記述される方法のある実施形態において、少なくとも１つのＨＤＬマーカーはＡＢＣＡ１である。例えば、ＡＢＣＡ１ｍＲＮＡ発現レベルまたはＡＢＣＡ１タンパク質発現レベルが測定される。様々な実施形態において、ＡＢＣＡ１カットオフ量は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、もしくは８０％であるか、または前述のカットオフ量の任意の２つを境界とする任意の範囲、例えば２０％〜８０％、３０％〜７０％、４０％〜６０％、１０％〜５０％、１０％〜４０％、２０％〜５０％等から選択される。ＡＢＣＡ１発現レベルは、投与の２〜１２時間、４〜１０時間、２〜８時間、２〜６時間、４〜６時間、または４〜８時間後に測定され得る。
【００９０】
本明細書において記述される方法のある実施形態において、少なくとも１つのＨＤＬマーカーは、ＡＢＣＧ１である。例えば、ＡＢＣＧ１ｍＲＮＡ発現レベルまたはＡＢＣＧ１タンパク質発現レベルが測定される。様々な実施形態において、ＡＢＣＧ１カットオフ量は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、もしくは８０％であるか、または前述のカットオフ量の任意の２つを境界とする任意の範囲、例えば２０％〜８０％、３０％〜７０％、４０％〜６０％、１０％〜５０％、１０％〜４０％、２０％〜５０％等から選択される。ＡＢＣＧ１発現レベルは、投与の２〜１２時間、４〜１０時間、２〜８時間、２〜６時間、４〜６時間、または４〜８時間後に測定され得る。
【００９１】
本明細書において記述される方法のある実施形態において、少なくとも１つのＨＤＬマーカーは、ＳＲＥＢＰ−１である。例えば、ＳＲＥＢＰ−１ｍＲＮＡ発現レベルまたはＳＲＥＢＰ−１タンパク質発現レベルが測定される。様々な実施形態において、ＳＲＥＢＰ−１カットオフ量は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、もしくは８０％であるか、または前述のカットオフ量の任意の２つを境界とする任意の範囲、例えば２０％〜８０％、３０％〜７０％、４０％〜６０％、１０％〜５０％、１０％〜４０％、２０％〜５０％等から選択される。ＳＲＥＢＰ−１発現レベルは、投与の２〜１２時間、４〜１０時間、２〜８時間、２〜６時間、４〜６時間、または４〜８時間後に測定され得る。
【００９２】
ある実施形態において、ＨＤＬ治療剤は、リポタンパク質複合体である。リポタンパク質複合体は、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、ＡｐｏＥ、またはその組み合わせなどのアポリポタンパク質を含み得る。リポタンパク質複合体は、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、もしくはＡｐｏＥペプチド模倣体、またはその組み合わせなどのアポリポタンパク質ペプチド模倣体を含み得る。リポタンパク質複合体は、ＣＥＲ−００１、ＣＳＬ−１１１、ＣＳＬ−１１２、ＣＥＲ−５２２、またはＥＴＣ−２１６であり得る。
【００９３】
ある実施形態において、ＨＤＬ治療剤は、ＣＥＴＰ阻害剤またはパントテン酸誘導体などの低分子である。
【００９４】
ある実施形態において、本明細書において記述される方法は、カットオフ量を決定するステップをさらに含む。例えば、カットオフ量は、ＨＤＬ治療剤の用量反応曲線を作成することによって決定され得る。カットオフ量は、用量反応曲線における変曲点でのＨＤＬマーカーの発現レベルの２５％、４０％、５０％、６０％、または７５％であり得る。特定の実施形態において、カットオフは、前述のカットオフ値の任意の２つを境界とする範囲、例えば用量反応曲線における変曲点でのＨＤＬマーカーの発現レベルの３０％〜７０％、４０％〜６０％、２５％〜５０％、２５％〜７５％から選択される。
【００９５】
ある実施形態において、対象または対象の集団は、ＡＢＣＡ１欠損症を有する。対象または対象の手段は、ＡＢＣＡ１変異に関してホモ接合であり得る。対象または対象の集団は、ＡＢＣＡ１変異に関してヘテロ接合であり得る。
【００９６】
他の実施形態において、対象または対象の集団は、ＨＤＬ欠損、低アルファリポタンパク血症、または原発性家族性低アルファリポタンパク血症を有する。
【００９７】
他の実施形態において、対象または対象の集団は、ＬＣＡＴ欠損症、または魚眼病を有する。対象または対象の集団は、ＬＣＡＴ変異に関してホモ接合であり得る。対象または対象の集団は、ＬＣＡＴ変異に関してヘテロ接合であり得る。
【００９８】
他の実施形態において、対象または対象の集団は、ＡＢＣＧ１欠損症を有する。対象または対象の集団は、ＡＢＣＧ１変異に関してホモ接合であり得る。対象または対象の集団は、ＡＢＣＧ１変異に関してヘテロ接合であり得る。
【００９９】
他の実施形態において、対象または対象の集団は、ＡｐｏＡ−Ｉ欠損症を有する。対象または対象の集団は、ＡｐｏＡ−Ｉ変異に関してホモ接合であり得る。対象または対象の集団は、ＡｐｏＡ−Ｉ変異に関してヘテロ接合であり得る。
【０１００】
なお他の実施形態において、対象または対象の集団は、ＡＢＣＧ８欠損症を有する。対象または対象の集団は、ＡＢＣＧ８変異に関してホモ接合であり得る。対象または対象の集団は、ＡＢＣＧ８変異に関してヘテロ接合であり得る。
【０１０１】
なお他の実施形態において、対象または対象の集団は、ＰＬＴＰ欠損症を有する。対象または対象の集団は、ＰＬＴＰ変異に関してホモ接合であり得る。対象または対象の集団は、ＰＬＴＰ変異に関してヘテロ接合であり得る。
【０１０２】
患者は、前述の遺伝子の１つまたは複数に遺伝子欠損を有し得る、すなわち複合遺伝子欠損を有する。
【０１０３】
ある実施形態において、本開示は、治療に好適なＨＤＬ治療剤の用量を同定する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）対象にＨＤＬ治療剤の１つまたは複数の用量を投与するステップと、（ｂ）各投与後、前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルを測定するステップと、（ｃ）１つまたは複数の前記ＨＤＬマーカーの発現レベルを０％より大きく、１０％より大きく、または２０％より大きく低減させない最大用量を同定し、それによって治療に好適なＨＤＬ治療剤の用量を同定するステップとを含む。
【０１０４】
他の実施形態において、本開示は、治療に好適なＨＤＬ治療剤の用量を同定する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）対象にＨＤＬ治療剤の１つまたは複数の用量を投与するステップと、（ｂ）各投与後、前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルを測定するステップと、（ｃ）対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における１つまたは複数のＨＤＬマーカーのベースライン発現レベルを維持する、または発現レベルを上昇させる用量を同定し、それによって、治療に好適なＨＤＬ治療剤の用量を同定するステップとを含む。レベルは、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または前述の値の任意の２つを境界とする範囲増加させることができ、例えば、レベルは、１０％まで、２０％まで、５０％まで、１０％〜５０％、２０％〜６０％等増加させることができる。
【０１０５】
ある実施形態において、本開示は、治療に好適なＨＤＬ治療剤の用量を同定する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）対象の集団にＨＤＬ治療剤の１つまたは複数の用量を投与するステップと、（ｂ）各投与後、前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルを測定するステップと、（ｃ）前記対象における１つまたは複数の前記ＨＤＬマーカーの発現レベルを０％より大きく、１０％より大きく、または２０％より大きく増加させない最大用量を同定し、それによって治療に好適なＨＤＬ治療剤の用量を同定するステップとを含む。
【０１０６】
ある実施形態において、本開示は、治療に好適なＨＤＬ治療剤の用量を同定する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）対象の集団にＨＤＬ治療剤の１つまたは複数の用量を投与するステップと、（ｂ）各投与後、前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルを測定するステップと、（ｃ）前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における１つまたは複数のＨＤＬマーカーのベースライン発現レベルを維持する、または発現レベルを上昇させる用量を同定し、それによって治療に好適なＨＤＬ治療剤の用量を同定するステップとを含む。レベルは、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または前述の値の任意の２つを境界とする範囲増加させることができ、例えば、レベルは、１０％まで、２０％まで、５０％まで、１０％〜５０％、２０％〜６０％等増加させることができる。
【０１０７】
ある実施形態において、本開示は、治療に好適なＨＤＬ治療剤の用量を同定する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、細胞のコレステロール流出を０％より大きく、１０％より大きく、または２０％より大きく低減させないＨＤＬ治療剤の最大用量を同定するステップを含む。治療に好適なＨＤＬ治療剤の用量を同定する方法は、（ａ）対象または対象の集団にＨＤＬ治療剤の１つまたは複数の用量を投与するステップと、（ｂ）対象または対象の集団の細胞におけるコレステロール流出を測定するステップと、（ｃ）前記対象におけるコレステロール流出を０％より大きく、１０％より大きく、または２０％より大きく低減させない最大用量を同定し、それによって治療に好適なＨＤＬ治療剤の用量を同定するステップとを含み得る。
【０１０８】
ある実施形態において、本開示は、治療に好適なＨＤＬ治療剤の投与間隔を同定する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、細胞のコレステロール流出を０％より大きく、１０％より大きく、または２０％より大きく低減させないＨＤＬ治療剤の最も頻回投与レジメンの最大用量を同定するステップを含む。治療に好適なＨＤＬ治療剤の投与間隔を同定する方法は、（ａ）１回または複数回の投与回数に従って対象または対象の集団にＨＤＬ治療剤を投与するステップと、（ｂ）前記対象または対象の集団の細胞におけるコレステロール流出を測定するステップと、（ｃ）前記対象におけるコレステロール流出を５０％〜１００％より大きく低減させない最大投与回数を同定し、それによって、治療に好適なＨＤＬ治療剤の用量を同定するステップとを含む。
【０１０９】
ある実施形態において、１回または複数回の投与回数は、（ａ）２日ごとに１〜４時間の注入としての投与、（ｂ）３日ごとに１〜４時間の注入としての投与、（ｃ）１週間ごとに２４時間の注入としての投与、および（ｄ）２週間ごとに２４時間の注入としての投与、から選択される１回または複数回の投与回数を含む。
【０１１０】
コレステロール流出は、前記対象または対象の集団からの単球、マクロファージ、または単核細胞において測定され得る。
【０１１１】
ある実施形態において、本開示は、ＡＢＣＡ１欠損症を有する対象を処置する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、対象に、ＣＥＲ−００１などのＨＤＬ治療剤の治療的有効量を投与することを含む。対象は、ＡＢＣＡ１変異に関してヘテロ接合またはホモ接合であり得る。
【０１１２】
ある実施形態において、本開示は、家族性原発性低アルファリポタンパク血症を有する対象を処置する方法を含む。いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）対象に導入レジメンに従ってＨＤＬ治療剤を投与するステップ、および次に（ｂ）対象に、維持レジメンに従って対ＨＤＬ治療剤を投与するステップを含む。維持レジメンは、ＨＤＬ治療剤をより低い用量で、より少ない回数で、またはその両方で投与することを伴い得る。対象は、ＡＢＣＡ１変異に関してヘテロ接合またはホモ接合であり得る。対象は、ＬＣＡＴ変異に関してホモ接合またはヘテロ接合であり得る。対象は、ＡｐｏＡ−Ｉ変異に関してホモ接合またはヘテロ接合であり得る。対象は、ＡＢＣＧ１変異に関してホモ接合またはヘテロ接合であり得る。対象はまた、アトルバスタチン、エゼチミブ、ナイアシン、ロスバスタチン、シンバスタチン、アスピリン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、またはその組み合わせなどの脂質調節薬でも処置され得る。
【０１１３】
ＨＤＬ治療剤は、ＣＥＲ−００１であり得、および／または導入レジメンは、４週間の期間であり得る。導入レジメンは、ＨＤＬ治療剤を１週間に２回、３回、または４回投与することを含み得る。ＨＤＬ治療剤がＣＥＲ−００１などのリポタンパク質複合体である場合、導入レジメンにおいて投与される用量は、８〜１５ｍｇ／ｋｇ（タンパク質の重量に基づく）から選択することができる。特定の実施形態において、導入用量は、８ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、または１５ｍｇ／ｋｇである。維持レジメンは、ＨＤＬ治療剤を少なくとも１か月間、少なくとも２か月間、少なくとも３か月間、少なくとも６か月間、少なくとも１年間、少なくとも１８か月間、少なくとも２年間、または無限に投与するステップを含み得る。維持レジメンは、ＨＤＬ治療剤を１週間に１回または２回投与するステップを含み得る。ＨＤＬ治療剤がＣＥＲ−００１などのリポタンパク質複合体である場合、維持レジメンにおいて投与される用量は、１〜６ｍｇ／ｋｇ（タンパク質の重量に基づく）から選択することができる。特定の実施形態において、維持用量は、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、または６ｍｇ／ｋｇである。
【０１１４】
ある実施形態において、（ａ）導入レジメンは、１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルを、対象のベースライン量および／または集団の平均値と比較して２０％〜８０％、または４０％〜６０％低減させる用量を利用する、および／または（ｂ）維持レジメンは、１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルを、対象のベースライン量および／または集団の平均値と比較して２０％より大きく、または１０％より大きく低減させない用量を利用する。
【０１１５】
不定詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」および定冠詞「その」は、特許出願において一般的であるように、本出願において、本文がそれ以外であることを明らかに述べている場合を除き、１つまたは複数を意味するために使用されると留意すべきである。さらに、用語「または」は、特許出願において一般的であるように、本出願において、離接語「または」または接続語「および」を意味するために使用される。
【０１１６】
本開示の特徴および利点は、以下の本発明の実施形態の詳細な説明からさらに明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】カイ二乗試験のデザインを描いた図である。
【図２】図２Ａ〜図２Ｃは最初および６回目のＣＥＲ−００１注入を投与した後のＡｐｏＡ−１、リン脂質および総血漿濃度を描いた図である。
【図３】ＭＨＩＣＣとＳＡＨＭＲＩとの間のフレームの分散を描いた図である。
【図４】ｍＩＴＴ集団におけるＴＡＶおよびＰＡＶのＬＳの平均変化を描いた図である。
【図５】ｍＰＰ集団におけるＴＡＶおよびＰＡＶのＬＳの平均変化を描いた図である。
【図６】図６Ａ〜図６ＢはＣＥＲ−００１の逆Ｕ字型用量効果曲線を描いた図である。
【図７】Ｊ７７４マクロファージにおけるＡＢＣＡ１の発現に及ぼすＣＥＲ−００１、ＨＤＬ３またはＡｐｏＡ−Ｉの効果を描いた図である。
【図８】Ｊ７７４マクロファージにおけるＡＢＣＧ１の発現に及ぼすＣＥＲ−００１、ＨＤＬ３またはＡｐｏＡ−Ｉの効果を描いた図である。
【図９】Ｊ７７４マクロファージにおけるＳＲ−ＢＩの発現に及ぼすＣＥＲ−００１、ＨＤＬ３またはＡｐｏＡ−Ｉの効果を描いた図である。
【図１０】Ｊ７７４マクロファージにおけるＳＲＥＢＰ−１の発現に及ぼすＣＥＲ−００１、ＨＤＬ３またはＡｐｏＡ−Ｉの効果を描いた図である。
【図１１】Ｊ７７４マクロファージにおけるＳＲＥＢＰ−２の発現に及ぼすＣＥＲ−００１、ＨＤＬ３またはＡｐｏＡ−Ｉの効果を描いた図である。
【図１２】Ｊ７７４マクロファージにおけるＬＸＲの発現に及ぼすＣＥＲ−００１、ＨＤＬ３またはＡｐｏＡ−Ｉの効果を描いた図である。
【図１３】ＣＥＲ−００１、ＨＤＬ３またはＡｐｏＡ−Ｉの用量（μｇ／ｍＬ）で処置したＪ７７４マクロファージにおけるＡＢＣＡ１の発現を描いた図である。
【図１４】ＣＥＲ−００１、ＨＤＬ３またはＡｐｏＡ−Ｉの用量（μｇ／ｍＬ）で処置したＪ７７４マクロファージにおけるＡＢＣＧ１の発現を描いた図である。
【図１５】ＣＥＲ−００１、ＨＤＬ３またはＡｐｏＡ−Ｉの用量（μｇ／ｍＬ）で処置したＪ７７４マクロファージにおけるＳＲＥＢＰ−１の発現を描いた図である。
【図１６】ＣＥＲ−００１、ＨＤＬ３またはＡｐｏＡ−Ｉの用量（μｇ／ｍＬ）で処置したＪ７７４マクロファージにおけるＳＲ−ＢＩの発現を描いた図である。
【図１７】ＣＥＲ−００１、ＨＤＬ３またはＡｐｏＡ−Ｉを用いてＪ７７４マクロファージを処置した後の、時間の経過に伴うＡＢＣＡ１のｍＲＮＡレベルの低下を描いた図である。
【図１８】ｃＡＭＰの存在および不在下におけるＪ７７４マクロファージでのＡＢＣＡ１のｍＲＮＡレベルを描いた図である。
【図１９】ｃＡＭＰの存在および不在下におけるＪ７７４マクロファージでのＡＢＣＧ１のｍＲＮＡレベルを描いた図である。
【図２０】Ｊ７７４マクロファージでのＡＢＣＡ１タンパク質レベルに及ぼすＣＥＲ−００１およびＨＤＬ３の効果を描いた図である。
【図２１】Ｊ７７４マクロファージでのＡＢＣＡ１タンパク質レベルに及ぼすＣＥＲ−００１およびＨＤＬ３の効果を描いた図である。
【図２２】ＣＥＲ−００１の濃度増加の存在下におけるＪ７７４マクロファージでのＡＢＣＡ１のｍＲＮＡレベルの調節に及ぼすｃＡＭＰの効果を描いた図である。
【図２３】ＣＥＲ−００１の濃度増加の存在下におけるＪ７７４マクロファージでのＡＢＣＡ１のｍＲＮＡレベルの調節に及ぼす効果を、ｃＡＭＰを０に設定して描いた図である。
【図２４】ＣＥＲ−００１の濃度増加の存在下におけるＪ７７４マクロファージでのＡＢＣＧ１のｍＲＮＡレベルの調節に及ぼすｃＡＭＰの効果を描いた図である。
【図２５】ＣＥＲ−００１の濃度増加の存在下におけるＪ７７４マクロファージでのＡＢＣＧ１のｍＲＮＡレベルの調節に及ぼす効果を、ｃＡＭＰを０に設定して描いた図である。
【図２６】ＣＥＲ−００１の濃度増加の存在下におけるＪ７７４マクロファージでのＡＢＣＡ１のｍＲＮＡレベルの調節に及ぼすｃＡＭＰの効果を描いた図である。
【図２７】ＣＥＲ−００１、ＨＤＬ３、およびＡｐｏＡ−Ｉを用いて処置した後に、ベースライン量のＡＢＣＡ１へ戻るために要する時間を描いた図である。
【図２８】ＣＥＲ−００１、ＨＤＬ３、およびＡｐｏＡ−Ｉを用いて処置した後に、ベースライン量のＡＢＣＧ１へ戻るために要する時間を描いた図である。
【図２９】ＣＥＲ−００１、ＨＤＬ３、およびＡｐｏＡ−Ｉを用いて処置した後に、ベースライン量のＳＲ−ＢＩへ戻るために要する時間を描いた図である。
【図３０】ＨｅｐＧ２肝細胞におけるＡＢＣＡ１レベルに及ぼすＣＥＲ−００１、ＨＤＬ３、およびＡｐｏＡ−Ｉの効果を描いた図である。
【図３１】ＨｅｐＧ２肝細胞におけるＳＲ−ＢＩレベルに及ぼすＣＥＲ−００１、ＨＤＬ３、およびＡｐｏＡ−Ｉの効果を描いた図である。
【図３２】Ｈｅｐａ１．６肝細胞におけるＡＢＣＡ１レベルに及ぼすＣＥＲ−００１、ＨＤＬ３、およびＡｐｏＡ−Ｉの効果を描いた図である。
【図３３】Ｈｅｐａ１．６肝細胞におけるＳＲ−ＢＩレベルに及ぼすＣＥＲ−００１、ＨＤＬ３、およびＡｐｏＡ−Ｉの効果を描いた図である。
【図３４】ＣＥＲ−００１およびＨＤＬ３によるＡＢＣＡ１のダウンレギュレーション後のＡｐｏＡ−１添加の効果を描いた図である。
【図３５】ＣＥＲ−００１およびＨＤＬ３によるＡＢＣＧ１のダウンレギュレーション後のＡｐｏＡ−１添加の効果を描いた図である。
【図３６】ＣＥＲ−００１およびＨＤＬ３によるＳＲ−ＢＩのダウンレギュレーション後のＡｐｏＡ−１添加の効果を描いた図である。
【図３７】Ｊ７７４マクロファージにおけるＡＢＣＡ１のｍＲＮＡレベルに及ぼすＨＤＬ２の効果を描いた図である。
【図３８】Ｊ７７４マクロファージにおけるＡＢＣＧ１のｍＲＮＡレベルに及ぼすＨＤＬ２の効果を描いた図である。
【図３９】Ｊ７７４マクロファージにおけるＳＲ−ＢＩのｍＲＮＡレベルに及ぼすＨＤＬ２の効果を描いた図である。
【図４０】コレステロール流出に及ぼすβ−シクロデキストリンの効果を描いた図である。
【図４１】β−シクロデキストリンの存在下におけるＪ７７４マクロファージでのＡＢＣＡ１のｍＲＮＡレベルの用量依存的な低下を描いた図である。
【図４２】β−シクロデキストリンの存在下におけるＪ７７４マクロファージでのＡＢＣＧ１のｍＲＮＡレベルの用量依存的な低下を描いた図である。
【図４３】β−シクロデキストリンの存在下におけるＪ７７４マクロファージでのＳＲ−ＢＩのｍＲＮＡレベルの用量依存的な増加を描いた図である。
【図４４】Ｊ７７４マクロファージでのＬＸＲのｍＲＮＡレベルに及ぼすβ−シクロデキストリンの効果を描いた図である。
【図４５】Ｊ７７４マクロファージでのＳＲＥＢＰ１のｍＲＮＡレベルに及ぼすβ−シクロデキストリンの効果を描いた図である。
【図４６】Ｊ７７４マクロファージでのＳＲＥＢＰ２のｍＲＮＡレベルに及ぼすβ−シクロデキストリンの効果を描いた図である。
【図４７】ＣＥＲ−００１およびＨＤＬ３を用いて処置されたマウスについて、結紮された頸動脈中の非エステル化コレステロールの含有量を描いた図である。
【図４８】ＣＥＲ−００１およびＨＤＬ３を用いて処置されたマウスについて、結紮された頸動脈中の総コレステロールの含有量を描いた図である。
【図４９】ＣＥＲ−００１注入後の血漿中総コレステロールレベルを描いた図である。
【図５０】ＨＤＬ３注入後の血漿中総コレステロールレベルを描いた図である。
【図５１】ＣＥＲ−００１注入後の血漿中非エステル化コレステロールレベルを描いた図である。
【図５２】ＨＤＬ３注入後の血漿中非エステル化コレステロールレベルを描いた図である。
【図５３】ＣＥＲ−００１およびＨＤＬ３について、投与後の血漿中総コレステロールレベルを描いた図である。
【図５４】ＣＥＲ−００１およびＨＤＬ３について、投与後の血漿中非エステル化コレステロールレベルを描いた図である。
【図５５】ＣＥＲ−００１の投与後の血漿中ＡｐｏＡ−Ｉレベルを示す図である。
【図５６】ＨＤＬ３の投与後の血漿中ＡｐｏＡ−Ｉレベルを示す図である。
【図５７】結紮された頸動脈におけるＡＢＣＡ１発現のウェスタンブロットによる決定を描いた図である。
【図５８】最後のＣＥＲ−００１の注射から２４時間後の肝臓におけるＡＢＣＡ１レベルを描いた図である。
【図５９】最後のＣＥＲ−００１の注射から２４時間後の肝臓におけるＳＲ−ＢＩレベルを描いた図である。
【図６０】ＣＥＲ−００１およびＨＤＬ３を注射されたマウスの糞便中に測定されたコレステロール含有量を描いた図である。
【図６１】ＨＤＬ粒子の発達の概要を描いた図である。
【図６２】逆脂質輸送（ＲＬＴ）経路の概要を描いた図である。
【図６３】ＨＤＬの成熟段階の概要を描いた図である。
【図６４】ヒトＡｐｏＡ−Ｉのアミノ酸配列（配列番号１）を描いた図である。
【図６５−１】図６５Ａ１はヒトＡＢＣＡ１のヌクレオチド配列（配列番号２）を描いた図である。
【図６５−２】図６５Ａ２はヒトＡＢＣＡ１のヌクレオチド配列（配列番号２）を描いた図である。
【図６５−３】図６５Ａ３はヒトＡＢＣＡ１のヌクレオチド配列（配列番号２）を描いた図である。
【図６５−４】図６５ＢはヒトＡＢＣＡ１のヌクレオチド配列（配列番号３）を描いた図である。
【図６６−１】図６６Ａ１はヒトＡＢＣＧ１のヌクレオチド配列（配列番号４）を描いた図である。
【図６６−２】図６６Ａ２および図６６ＢはヒトＡＢＣＧ１のヌクレオチド配列（それぞれ配列番号４および配列番号５）を描いた図である。
【図６７−１】図６７Ａ１はヒトＳＲＥＢＰ１のヌクレオチド配列（配列番号６）を描いた図である。
【図６７−２】図６７Ａ２はヒトＳＲＥＢＰ１のヌクレオチド配列（配列番号６）を描いた図である。
【図６７−３】図６７ＢはヒトＳＲＥＢＰ１のヌクレオチド配列（配列番号７）を描いた図である。
【図６８−１】図６８Ａ〜図６８ＣはＳＡＭＢＡ臨床試験の対象内におけるコレステロールのエステル化の経時変化を描いた図である。
【図６８−２】図６８Ｄ〜図６８ＦはＳＡＭＢＡ臨床試験の対象内におけるコレステロールのエステル化の経時変化を描いた図である。
【図６８−３】図６８ＧはＳＡＭＢＡ臨床試験の対象内におけるコレステロールのエステル化の経時変化を描いた図である。
【図６９−１】図６９Ａ〜図６９ＣはＳＡＭＢＡ臨床試験の対象内におけるロードされたコレステロールのＬＣＡＴによるエステル化を描いた図である。
【図６９−２】図６９Ｄ〜図６９ＦはＳＡＭＢＡ臨床試験の対象内におけるロードされたコレステロールのＬＣＡＴによるエステル化を描いた図である。
【図６９−３】図６９ＧはＳＡＭＢＡ臨床試験の対象内におけるロードされたコレステロールのＬＣＡＴによるエステル化を描いた図である。
【図７０】ＳＡＭＢＡ臨床試験の個々の対象における１か月後の頸動脈の血管壁厚の変化を描いた図である。
【図７１】ＳＡＭＢＡ臨床試験の個々の対象における１か月後の大動脈の血管壁厚の変化を描いた図である。
【図７２】ＳＡＭＢＡの対象における１か月後および６か月後の平均血管壁厚の変化を描いた図である。
【発明を実施するための形態】
【０１１８】
６．１．定義
本明細書において使用されるように、以下の用語は、以下の意味を有すると意図される。
【０１１９】
状態または複数の状態は、脂質異常障害（高脂血症、高コレステロール血症、冠動脈性心疾患、冠動脈疾患、血管および血管周囲疾患、およびアテローム性動脈硬化症などの心血管疾患）、および脂質異常障害に関連する疾患（冠動脈性心疾患、冠動脈疾患、急性冠血管症候群、不安定狭心症、心筋梗塞、卒中、一過性虚血発作（ＴＩＡ）、内皮機能障害、アテローム血栓性血管疾患などの血栓症、血管内皮炎症などの炎症疾患、心血管疾患、高血圧症、低酸素症誘導血管新生、内皮細胞のアポトーシス、黄斑変性、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、虚血、再狭窄、血管または血管周囲疾患、異リポタンパク血症、低密度リポタンパクコレステロールの高レベル、超低密度リポタンパクコレステロールの高レベル、高密度リポタンパク質の低レベル、リポタンパク質Ｌｐ（ａ）コレステロールの高レベル、アポリポタンパク質Ｂの高レベル、動脈不全によって引き起こされる間欠性跛行などのアテローム性動脈硬化症、急速進行型アテローム性動脈硬化症、グラフトアテローム性動脈硬化症、家族性高コレステロール血症（ＦＨ）、家族性複合高脂血症（ＦＣＨ）、高トリグリセリド血症などのリポタンパクリパーゼ欠損症、低アルファリポタンパク血症、および高コレステロール血症リポタンパク質）のうちの１つ、または複数、または全てを意味する。いくつかの実施形態において、脂質異常障害は、タンジール病、ＡＢＣＡ１欠損症、ＡｐｏＡ−Ｉ欠損症、ＬＣＡＴ欠損症、または魚眼病などの家族性原発性低アルファリポタンパク血症（ＦＰＨＡ）に関連する。
【０１２０】
「ＩＵＳＤＥＣ」は、「逆Ｕ字型用量反応曲線」を意味する。ＩＵＳＤＥＣは、治療剤の用量と患者の応答との間の非線形の関係である。所定の治療剤の用量を増加させる効果は、最大（正の勾配を有する用量反応曲線の部分）まで増加して、その後（変曲点）効果は減少する（負の勾配を有する用量反応曲線の部分）ように思われる。
【０１２１】
「ＨＤＬ治療剤」は、高コレステロール血症または脂質異常症および関連疾患状態を処置するために有用な治療剤を意味する。ＨＤＬ治療剤の例には、ＨＤＬ模倣リポタンパク質複合体（例えば、ＣＥＲ−００１、ＣＳＬ−１１１、ＣＳＬ−１１２、ＣＥＲ−５２２、ＥＴＣ−２１６）および低分子（例えば、スタチン）が挙げられる。
【０１２２】
「ＨＤＬマーカー」は、その発現がＨＤＬ模倣体での処置に応答してＩＵＳＤＥＣと相関する分子マーカーを意味する。例示的なＨＤＬマーカーは、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ１、ＡＢＣＧ５、ＡＢＣＧ８、およびＳＲＥＢＰ１である。ＨＤＬマーカーは、例えば、６．２章に記述されるｍＲＮＡまたはタンパク質レベルでアッセイすることができる。
【０１２３】
６．２．コンパニオン診断法
コレステロール逆輸送（ＲＣＴ）は、蓄積されたコレステロールが、排泄のために血管壁から肝臓へと輸送される経路であり、このようにしてアテローム性動脈硬化症を予防する。ＲＣＴの主要な構成成分は、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）およびアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ＡｐｏＡ−Ｉ）などのアクセプター、ならびにレシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）、リン脂質輸送タンパク質（ＰＬＴＰ）、肝リパーゼ（ＨＬ）、およびコレステロールエステル転送タンパク質（ＣＥＴＰ）などの酵素を含む。ＲＣＴの肝要な部分はコレステロール流出であり、蓄積されたコレステロールが、例えば血管壁の内膜下のマクロファージからＡＴＰ結合膜カセットトランスポーターＡ１（ＡＢＣＡ１）およびＧ１（ＡＢＣＧ１）によって除去されるか、または受動拡散、スキャベンジャー受容体Ｂ１（ＳＲ−Ｂ１）、カベオリン、およびステロール２７−ヒドロキシラーゼを含む他の機構によって除去されて、ＨＤＬおよびＡｐｏＡ−Ｉによって回収される。ＨＤＬにおけるエステル化コレステロールは、排泄のために肝臓に送達される。ステロール調節エレメント結合因子１遺伝子（ＳＲＥＢＰ１）は、脂肪酸およびコレステロールの生合成を調節することによって、ＲＣＴに影響を及ぼす。
【０１２４】
本開示は、ＨＤＬ治療剤での処置に対するＩＵＳＤＥＣ型応答の発見に部分的に基づいている。本開示はさらに、ＨＤＬ治療剤のＩＵＳＤＥＣの基礎となる作用機序、すなわちコレステロール流出に関係するタンパク質（本明細書においてＨＤＬマーカーと呼ばれる）（例えば、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ１）発現のダウンレギュレーション、またはＨＤＬ治療剤での処置に応答したＲＣＴ経路の調節（例えば、ＳＲＥＢＰ１）の発見に部分的に基づいている。そのようなタンパク質のダウンレギュレーションは、ＨＤＬ治療剤での処置に応答してＩＵＳＤＥＣと相関することが発見されている。
【０１２５】
本開示は部分的に、用量反応曲線における変曲点付近の用量、すなわち用量反応関係が最大となる用量を利用するために、診断、予後判定、およびＨＤＬ治療剤の用量を最適化するためにこの現象を使用することに関する。
【０１２６】
本開示は部分的に、用量反応曲線における変曲点付近の用量、すなわち過剰量のＨＤＬ治療剤を使用することなく、用量反応関係が最大となる用量を利用するために、診断、予後判定、およびＨＤＬ治療剤の用量を最適化するためにこの現象を使用することに関する。
【０１２７】
他の態様において、本開示は、例えば単球、マクロファージ、または単核細胞からのコレステロール流出の媒介におけるＨＤＬマーカーの発現および／または機能に及ぼす影響を最小限にする治療用量および投与スケジュールの同定に関する。いくつかの態様において、１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現を既定のカットオフ点より、例えばＨＤＬマーカーの参照量の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、または８０％より大きく低減させない用量が選択される。ある実施形態において、カットオフは、前述のカットオフ量の任意の２つを境界とする参照値の任意の範囲、例えば２０％〜８０％、３０％〜７０％、４０％〜６０％、１０％〜５０％、１０％〜４０％、２０％〜５０％等から選択され、参照値の２０％〜８０％の範囲であり得る。参照値は、対象自身のベースラインまたはいくつかの集団の平均値であり得る。集団は、年齢、性別、および／または疾患の危険因子（例えば、遺伝的危険因子またはライフスタイルの危険因子）をマッチさせた集団であり得る。集団の平均値は、正常な集団、または対象と同じもしくは類似の疾患を有する集団の平均値であり得る。特定のＨＤＬマーカーおよびカットオフ点は、特定のＨＤＬ治療剤、対象の状態、および対象が受けている他の治療に依存する。
【０１２８】
いくつかの態様において、特に併用治療を伴う場合、１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現を２０％より大きく低減させない用量が選択され、いくつかの実施形態において、わずか１０％、およびなお他の実施形態において、１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現を全く低減させない用量が選択される。
【０１２９】
本明細書において記述されるＨＤＬマーカーの使用は、６．６章の処置方法のいずれかを最適にするために使用することができる。ある実施形態において、本開示は、対象におけるコレステロールを動員するために有効なＨＤＬ治療剤の用量を同定する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）対象にＨＤＬ治療剤の第１の用量を投与するステップと、（ｂ）前記第１の用量の投与後、対象の試験試料、好ましくは前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルを測定して、前記発現レベルに及ぼす前記第１の用量の効果を評価するステップと、（ｃ）（ｉ）対象の１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルがカットオフ量より大きく低減される場合、第１の用量より低い、前記ＨＤＬ治療剤の第２の用量を投与するステップ、または（ｉｉ）対象の１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルがカットオフ量より大きく低減されない場合、対象を前記ＨＤＬ治療剤の第１の用量で処置するステップとを含む。
【０１３０】
ある実施形態において、本開示は、対象におけるＨＤＬ治療剤の効能をモニターする方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）対象を第１の投与スケジュールに従ってＨＤＬ治療剤で処置するステップと、（ｂ）対象の試験試料、好ましくは前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルを測定して、前記発現レベルに及ぼす前記第１の投与スケジュールの効果を評価するステップと、（ｃ）（ｉ）対象の１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルが、上限のカットオフ量より大きく低減される場合、対象を第２の投与スケジュールに従ってＨＤＬ治療剤で処置するステップであって、第２の投与スケジュールが、ＨＤＬ治療剤のより低い用量を投与すること、ＨＤＬ治療剤を対象により長い期間にわたって注入すること、およびＨＤＬ治療剤を対象により少ない回数で投与することのうちの１つまたは複数を含むステップ、（ｉｉ）対象の１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルが、下限のカットオフ量より大きく低減されない場合、対象を第２の投与スケジュールに従ってＨＤＬ治療剤で処置するステップであって、第２の投与スケジュールが、ＨＤＬ治療剤のより高い用量を投与すること、対象にＨＤＬ治療剤をより短い期間にわたって注入すること、および対象にＨＤＬ治療剤をより多い回数で投与することのうちの１つまたは複数を含むステップ；または（ｉｉｉ）対象の１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルが、上限と下限のカットオフ量の間の量低減される場合、対象を第１の投与スケジュールに従って処置し続けるステップとを含む。
【０１３１】
カットオフ量は、前記投与前の対象自身のベースラインに関連するか、またはカットオフ量は、例えば健康な対象もしくは対象と同じ疾患状態を有する集団からの集団の平均値などの対照量に関連し得る。
【０１３２】
ある実施形態において、本開示は、コレステロールを動員するために有効なＨＤＬ治療剤の用量を同定する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）対象の集団にＨＤＬ治療剤の第１の用量を投与するステップと、（ｂ）前記第１の用量の投与後、対象の試験試料、好ましくは前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルを測定して、前記発現レベルに及ぼす前記第１の用量の効果を評価するステップと、（ｃ）第１の用量より高いまたは低い、前記ＨＤＬ治療剤の第２の用量を投与するステップと、（ｄ）前記第２の用量の投与後、対象の試験試料、好ましくは前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルを測定して、前記発現レベルに及ぼす前記第１および／または第２の用量の効果を評価するステップと、（ｅ）前記ＨＤＬ治療剤の１つまたは複数の追加の用量でステップ（ｃ）および（ｄ）を任意選択で繰り返すステップと、（ｆ）１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルをカットオフ量より大きく低減させない最大用量を同定し、それによってコレステロールを動員するために有効な前記ＨＤＬ治療剤の用量を同定するステップとを含む。
【０１３３】
ある実施形態において、前記第２の用量の投与後、前記試験試料（例えば、循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞）における１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルを測定して、前記発現レベルに及ぼす前記第２の用量の効果を評価する。対象の１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルがカットオフ量より大きく低減される場合、第２の用量より低い、前記ＨＤＬ治療剤の第３の用量が投与され得る。
【０１３４】
ある実施形態において、本開示は、ＨＤＬ治療剤を必要とする対象を処置する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、対象に、（ａ）前記対象の試験試料（例えば、前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞）における１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現を、対象のベースライン量と比較して２０％より大きく、または１０％より大きく低減させない用量のリポタンパク質複合体と、（ｂ）任意選択で、胆汁酸レジン、ナイアシン、スタチン、フィブレート、ＰＣＳＫ９阻害剤、エゼチミブ、およびＣＥＴＰ阻害剤から選択されるコレステロール低減治療、の組み合わせを投与することを含む。
【０１３５】
ある実施形態において、本開示は、ＨＤＬ治療剤を必要とする対象を処置する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、対象に、（ａ）前記対象の試験試料（例えば、前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞）における１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現を、対照量と比較して２０％より大きく、または１０％より大きく低減させない用量のリポタンパク質複合体と、（ｂ）任意選択で、胆汁酸レジン、ナイアシン、スタチン、フィブレート、ＰＣＳＫ９阻害剤、エゼチミブ、およびＣＥＴＰ阻害剤から選択されるコレステロール低減治療、の組み合わせを投与することを含む。
【０１３６】
対照量は、集団の平均値、例えば健康な対象の集団の平均値、または対象と同じ疾患状態を有する集団の平均値であり得る。対象はヒトであり得るか、または対象の集団はヒト対象の集団である。対象は、非ヒト動物、例えばマウスであり得るか、または対象の集団は、非ヒト動物の集団であり得る。
【０１３７】
本明細書において記述される方法のある実施形態において、少なくとも１つのＨＤＬマーカーはＡＢＣＡ１である。例えば、ＡＢＣＡ１ｍＲＮＡ発現レベルまたはＡＢＣＡ１タンパク質発現レベルが測定される。ＡＢＣＡ１カットオフ量は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、もしくは８０％であるか、または前述のカットオフ量の任意の２つを境界とする任意の範囲、例えば２０％〜８０％、３０％〜７０％、４０％〜６０％、１０％〜５０％、１０％〜４０％、２０％〜５０％等から選択される。ＡＢＣＡ１発現レベルは、投与の２〜１２時間、４〜１０時間、２〜８時間、２〜６時間、４〜６時間、または４〜８時間後に測定され得る。
【０１３８】
本明細書において記述される方法のある実施形態において、少なくとも１つのＨＤＬマーカーはＡＢＣＧ１である。例えば、ＡＢＣＧ１ｍＲＮＡ発現レベルまたはＡＢＣＧ１タンパク質発現レベルが測定される。ＡＢＣＧ１カットオフ量は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、もしくは８０％であるか、または前述のカットオフ量の任意の２つを境界とする任意の範囲、例えば２０％〜８０％、３０％〜７０％、４０％〜６０％、１０％〜５０％、１０％〜４０％、２０％〜５０％等から選択される。ＡＢＣＡ１発現レベルは、投与の２〜１２時間、４〜１０時間、２〜８時間、２〜６時間、４〜６時間、または４〜８時間後に測定され得る。
【０１３９】
本明細書において記述される方法のある実施形態において、少なくとも１つのＨＤＬマーカーはＳＲＥＢＰ−１である。例えば、ＳＲＥＢＰ−１ｍＲＮＡ発現レベルまたはＳＲＥＢＰ−１タンパク質発現レベルが測定される。ＳＲＥＢＰ−１カットオフ量は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、もしくは８０％であるか、または前述のカットオフ量の任意の２つを境界とする任意の範囲、例えば２０％〜８０％、３０％〜７０％、４０％〜６０％、１０％〜５０％、１０％〜４０％、２０％〜５０％等から選択される。ＳＲＥＢＰ−１発現レベルは、投与の２〜１２時間、４〜１０時間、２〜８時間、２〜６時間、４〜６時間、または４〜８時間後に測定され得る。
【０１４０】
いくつかの実施形態において、対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルを変化させない、または増加させる用量が同定される。レベルは、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または前述の値の任意の２つを境界とする範囲増加させることができ、例えば、レベルは、１０％まで、２０％まで、５０％まで、１０％〜５０％、２０％〜６０％等増加させることができる。
【０１４１】
ある実施形態において、ＨＤＬ治療剤は、リポタンパク質複合体である。リポタンパク質複合体は、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、ＡｐｏＥ、またはその組み合わせなどのアポリポタンパク質を含み得る。リポタンパク質複合体は、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、またはＡｐｏＥペプチド模倣体、またはその組み合わせなどのアポリポタンパク質ペプチド模倣体を含み得る。リポタンパク質複合体は、ＣＥＲ−００１、ＣＳＬ−１１１、ＣＳＬ−１１２、ＣＥＲ−５２２、またはＥＴＣ−２１６であり得る。他の実施形態において、ＨＤＬ治療剤は、脱脂または脂質の少ないリポタンパク質である。
【０１４２】
ある実施形態において、ＨＤＬ治療剤は、ＣＥＴＰ阻害剤またはパントテン酸誘導体などの低分子である。
【０１４３】
ある実施形態において、本明細書において記述される方法は、カットオフ量を決定することをさらに含む。例えば、カットオフ量は、ＨＤＬ治療剤の用量反応曲線を作成することによって決定され得る。カットオフ量は、用量反応曲線における変曲点でのＨＤＬマーカーの発現レベルの２５％、４０％、５０％、６０％、または７５％であり得る。特定の実施形態において、カットオフは、前述のカットオフ値の任意の２つを境界とする範囲、例えば用量反応曲線における変曲点でのＨＤＬマーカーの発現レベルの３０％〜７０％、４０％〜６０％、２５％〜５０％、２５％〜７５％から選択される。
【０１４４】
ある実施形態において、本開示は、治療に好適なＨＤＬ治療剤の用量を同定する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）対象にＨＤＬ治療剤の１つまたは複数の用量を投与するステップと、（ｂ）各投与後の前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルを測定するステップと、（ｃ）１つまたは複数の前記ＨＤＬマーカーの発現レベルを０％より大きく、１０％より大きく、または２０％より大きく上昇させない最大用量を同定し、それによって治療に好適なＨＤＬ治療剤の用量を同定するステップとを含む。
【０１４５】
ある実施形態において、本開示は、治療に好適なＨＤＬ治療剤の用量を同定する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）対象の集団にＨＤＬ治療剤の１つまたは複数の用量を投与するステップと、（ｂ）各投与後の前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルを測定するステップと、（ｃ）前記対象における１つまたは複数の前記ＨＤＬマーカーの発現レベルを０％より大きく、１０％より大きく、または２０％より大きく上昇させない最大用量を同定し、それによって治療に好適なＨＤＬ治療剤の用量を同定するステップとを含む。
【０１４６】
ある実施形態において、本開示は、治療に好適なＨＤＬ治療剤の用量を同定する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、細胞のコレステロール流出を０％より大きく、１０％より大きく、または２０％より大きく低減させないＨＤＬ治療剤の最大用量を同定するステップを含む。治療に好適なＨＤＬ治療剤の用量を同定する方法は、（ａ）対象または対象の集団にＨＤＬ治療剤の１つまたは複数の用量を投与するステップと、（ｂ）対象または対象の集団の細胞におけるコレステロール流出を測定するステップと、（ｃ）前記対象におけるコレステロール流出を０％より大きく、１０％より大きく、または２０％より大きく低減させない最大用量を同定し、それによって治療に好適なＨＤＬ治療剤の用量を同定するステップとを含み得る。
【０１４７】
ある実施形態において、本開示は、治療に好適なＨＤＬ治療剤の投与間隔を同定する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、細胞のコレステロール流出を０％より大きく、１０％より大きく、または２０％より大きく低減させないＨＤＬ治療剤の最も頻回の投与レジメンの最大用量を同定するステップを含む。治療に好適なＨＤＬ治療剤の投与間隔を同定する方法は、（ａ）１回または複数回の投与回数に従って対象または対象の集団にＨＤＬ治療剤を投与するステップと、（ｂ）前記対象または対象の集団の細胞におけるコレステロール流出を測定するステップと、（ｃ）前記対象におけるコレステロール流出を５０％〜１００％より大きく低減させない最大投与回数を同定し、それによって治療に好適なＨＤＬ治療剤の用量を同定するステップとを含み得る。
【０１４８】
６．３．ＨＤＬ治療剤
本開示のＨＤＬ治療剤は、リポタンパク質複合体、脱脂または脂質の少ないリポタンパク質、ペプチド、融合タンパク質、およびＨＤＬ模倣体を含む。「リポタンパク質」および「アポリポタンパク質」は本明細書において互換的に使用されることに留意されたい。
【０１４９】
リポタンパク質複合体は、タンパク質分画（例えば、アポリポタンパク質分画）および脂質分画（例えば、リン脂質分画）を含み得る。タンパク質分画は、リポタンパク質複合体に存在するコレステロールを動員することができる、アポリポタンパク質、ペプチド、またはアポリポタンパク質ペプチド類似体もしくは模倣体などの１つまたは複数の脂質結合タンパク質を含む。そのようなアポリポタンパク質およびアポリポタンパク質ペプチドの非制限的な例には、好ましくは成熟型のＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、ＡｐｏＡ−Ｖ、およびＡｐｏＥが挙げられる。脂質結合タンパク質にはまた、活性多形型、アイソフォーム、変種、および変異体、ならびに前述のアポリポタンパク質の切断型が挙げられ、その最も一般的なものは、アポリポタンパク質Ａ−ＩＭｉｌａｎｏ（ＡｐｏＡ−ＩＭ）、アポリポタンパク質Ａ−ＩＰａｒｉｓ（ＡｐｏＡ−ＩＰ）およびアポリポタンパク質Ａ−ＩＺａｒａｇｏｚａ（ＡｐｏＡ−ＩＺ）である。システイン残基を含有するアポリポタンパク質変異体も同様に公知であり、同様に使用することができる（例えば、米国特許出願公開第２００３／０１８１３７２号明細書を参照されたい）。アポリポタンパク質は、単量体、またはホモ二量体もしくはヘテロ二量体であり得る二量体の形態であり得る。例えば、ＡｐｏＡ−Ｉ（Duverger et al., 1996, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 16(12):1424-29）、ＡｐｏＡ−ＩＭ （Franceschini et al., 1985, J. Biol. Chem. 260:1632-35）、ＡｐｏＡ−ＩＰ（Daum et al., 1999, J. Mol. Med. 77:614-22）、ＡｐｏＡ−ＩＩ（Shelness et al., 1985, J. Biol. Chem. 260(14):8637-46；Shelness et al., 1984, J. Biol. Chem. 259(15):9929-35）、ＡｐｏＡ−ＩＶ（Duverger et al., 1991, Euro. J. Biochem. 201(2):373-83）、ＡｐｏＥ（McLean et al, 1983, J. Biol. Chem. 258(14):8993-9000）、ＡｐｏＪおよびＡｐｏＨのホモおよびヘテロ二量体（可能であれば）が使用され得る。
【０１５０】
アポリポタンパク質は、複合体に含まれるアポリポタンパク質がいくつかの生物活性を保持する限り、Ｈｉｓタグなどのその単離を容易にするエレメント、または他の目的のために設計された他のエレメントに対応する残基を含み得る。特定の実施形態において、アポリポタンパク質分画は本質的にＡｐｏＡ−Ｉからなり、最も好ましくは１つのアイソフォームからなる。リポタンパク質複合体におけるＡｐｏＡ−Ｉは、図６４のＡｐｏＡ−Ｉリポタンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の２５〜２６７位のアミノ酸に対応するタンパク質と少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を有し得る。任意選択で、ＡｐｏＡ−Ｉは、さらに、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の完全長のＡｐｏＡ−Ｉの２５位のアミノ酸に対応する位置（および成熟タンパク質の１位）でアスパラギン酸を含む。好ましくは、ＡｐｏＡ−Ｉの少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％が正確にプロセシングされ、成熟タンパク質（すなわち、シグナル配列およびプロペプチド配列を欠如する）は、酸化されず、脱アミノ化されず、および／または切断されない。
【０１５１】
アポリポタンパク質に対応するペプチドおよびペプチド類似体、ならびにＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、およびＡｐｏＥの活性を模倣するアゴニストを使用することができる。ペプチドおよびペプチド類似体の非制限的な例は、その開示の全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第６，００４，９２５号明細書、第６，０３７，３２３号明細書、および第６，０４６，１６６号明細書（Dasseux et al.に発行）、米国特許第５，８４０，６８８号明細書（Tsoに発行）、米国特許出願公開第２００４／０２６６６７１号明細書、第２００４／０２５４１２０号明細書、第２００３／０１７１２７７号明細書、および第２００３／００４５４６０号明細書（Fogelmanに発行）、米国特許出願公開第２００３／００８７８１９号明細書（Bielickiに発行）、およびＰＣＴ出願国際公開第２０１０／０９３９１８号パンフレット（Dasseux et al.に発行）に開示されている。これらのペプチドおよびペプチド類似体は、Ｌ−アミノ酸もしくはＤ−アミノ酸、またはＬ−アミノ酸とＤ−アミノ酸の混合物で構成され得る。それらはまた、１つまたは複数の周知のペプチド／アミド同配体などの１つまたは複数の非ペプチド結合またはアミド結合を含み得る。そのような「ペプチドおよび／またはペプチド模倣体」アポリポタンパク質は、例えば米国特許第６，００４，９２５号明細書、第６，０３７，３２３号明細書、および第６，０４６，１６６号明細書に記述される技術を含む、当技術分野において公知の任意のペプチド合成技術を使用して合成または製造することができる。
【０１５２】
リポタンパク質は、脱脂型でまたはタンパク質分画に加えて脂質分画を含有するリポタンパク質複合体で、ＨＤＬ治療剤として使用することができる。脂質分画は典型的に、中性、負荷電、正荷電、またはその組み合わせであり得る１つまたは複数のリン脂質を含む。リン脂質上の脂肪酸鎖は、好ましくは長さが炭素１２〜２６個、または炭素１６〜２６個であり、飽和から一不飽和まで飽和の程度が異なり得る。例示的なリン脂質には、低分子アルキル鎖リン脂質、卵ホスファチジルコリン、ダイズホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、１−ミリストイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン、１−パルミトイル−２−ミリストイルホスファチジルコリン、１−パルミトイル−２−ステアロイルホスファチジルコリン、１−ステアロイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジオレオホスファチジルエタノールアミン、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロール、例えばジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルグリセロールなど、ジミリストイルホスファチジン酸、ジパルミトイルホスファチジン酸、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、脳ホスファチジルセリン、脳スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン、ミルクスフィンゴミエリン、パルミトイルスフィンゴミエリン、フィトスフィンゴミエリン、ジパルミトイルスフィンゴミエリン、ジステアロイルスフィンゴミエリン、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール塩、ホスファチジン酸、ガラクトセレブロシド、ガングリオシド、セレブロシド、ジラウリルホスファチジルコリン、（１，３）−Ｄ−マンノシル−（１，３）ジグリセリド、アミノフェニルグリコシド、３−コレステリル−６’−（グリコシルチオ）ヘキシルエーテルグリコリピッド、ならびにコレステロールおよびその誘導体が挙げられる。ＳＭおよびパルミトイルスフィンゴミエリンを含むリン脂質分画は、任意選択で、リゾリン脂質、パルミトイルスフィンゴミエリン以外のスフィンゴミエリン、ガラクトセレブロシド、ガングリオシド、セレブロシド、グリセリド、トリグリセリド、ならびにコレステロールおよびその誘導体を含むがこれらに限定されるわけではない、少量の任意のタイプの脂質を含み得る。
【０１５３】
ある実施形態において、脂質分画は、少なくとも１つの中性リン脂質、任意選択で１つまたは複数の負荷電リン脂質を含有する。中性および負荷電リン脂質の両方を含むリポタンパク質複合体において、中性および負荷電リン脂質は、同じまたは異なる数の炭素および同じまたは異なる飽和度を有する脂肪酸鎖を有し得る。いくつかの例において、中性および負荷電リン脂質は、同じアシルテール、例えばＣ１６：０またはパルミトイルアシル鎖を有する。特異的実施形態において、特に、卵ＳＭを中性脂質として使用する実施形態において、アポリポタンパク質分画：脂質分画の重量比は、約１：２．７〜約１：３（例えば、１：２．７）の範囲である。
【０１５４】
生理的ｐＨで少なくとも部分的に負電荷を有する任意のリン脂質を、負荷電リン脂質として使用することができる。非制限的な例には、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、およびホスファチジン酸の負荷電型、例えば塩が挙げられる。特異的実施形態において、負荷電リン脂質は、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）］、またはＤＰＰＧ、ホスファチジルグリセロールである。好ましい塩には、カリウム塩およびナトリウム塩が挙げられる。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、ＨＤＬ治療剤は、その全内容物のそれぞれが参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第８，２０６，７５０号明細書または国際公開第２０１２／１０９１６２号パンフレット（およびその米国対応特許、米国特許出願公開第２０１２／０２３２００５号明細書）に記述されているリポタンパク質複合体である。特定の実施形態において、リポタンパク質複合体のタンパク質成分は、６．１章に記述され、好ましくは国際公開第２０１２／１０９１６２号パンフレット（および米国特許出願公開第２０１２／０２３２００５号明細書）の６．１．１章に記述されているとおりであり、脂質成分は、国際公開第２０１２／１０９１６２号パンフレット（および米国特許出願公開第２０１２／０２３２００５号明細書）の６．２章に記述されているとおりであり、これは任意選択で、国際公開第２０１２／１０９１６２号パンフレット（および米国特許出願公開第２０１２／０２３２００５号明細書）の６．３章に記述される量で共に複合体を形成することができる。これらの章のそれぞれの内容は、参照により本明細書に組み入れられる。ある態様において、リポタンパク質複合体は、その内容が参照により本明細書に組み入れられる、国際公開第２０１２／１０９１６２号パンフレット（および米国特許出願公開第２０１２／０２３２００５号明細書）の６．４章に記述されるように、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または少なくとも９９％均一である複合体の集団に存在する。
【０１５６】
特異的実施形態において、リポタンパク質複合体は、本質的に２〜４当量のＡｐｏＡ−Ｉ、２分子の荷電リン脂質、５０〜８０分子のレシチン、および２０〜５０分子のＳＭからなる。
【０１５７】
別の特異的実施形態において、リポタンパク質複合体は、本質的に２〜４当量のＡｐｏＡ−Ｉ、２分子の荷電リン脂質、５０分子のレシチン、および５０分子のＳＭからなる。
【０１５８】
なお別の特異的実施形態において、リポタンパク質複合体は、本質的に２〜４当量のＡｐｏＡ−Ｉ、２分子の荷電リン脂質、８０分子のレシチン、および２０分子のＳＭからなる。
【０１５９】
なお別の特異的実施形態において、リポタンパク質複合体は、本質的に２〜４当量のＡｐｏＡ−Ｉ、２分子の荷電リン脂質、７０分子のレシチン、および３０分子のＳＭからなる。
【０１６０】
なお別の特異的実施形態において、リポタンパク質複合体は、本質的に２〜４当量のＡｐｏＡ−Ｉ、２分子の荷電リン脂質、６０分子のレシチン、および４０分子のＳＭからなる。
【０１６１】
特異的実施形態において、リポタンパク質複合体は、脂質成分が本質的に、約９０〜９９．８重量％のＳＭ、および約０．２〜１０重量％の負荷電リン脂質、例えば約０．２〜１重量％、０．２〜２重量％、０．２〜３重量％、０．２〜４重量％、０．２〜５重量％、０．２〜６重量％、０．２〜７重量％、０．２〜８重量％、０．２〜９重量％、または０．２〜１０重量％の総負荷電リン脂質からなる３成分複合体である。別の特異的実施形態において、リポタンパク質複合体は、脂質分画が、本質的に約９０〜９９．８重量％のレシチン、および約０．２〜１０重量％の負荷電リン脂質、例えば約０．２〜１重量％、約０．２〜２重量％、０．２〜３重量％、０．２〜４重量％、０．２〜５重量％、０．２〜６重量％、０．２〜７重量％、０．２〜８重量％、０．２〜９重量％、または０．２〜１０重量％の総負荷電リン脂質からなる３成分複合体である。
【０１６２】
なお別の特異的実施形態において、リポタンパク質複合体は、約９．８〜９０重量％のＳＭ、約９．８〜９０重量％のレシチン、および約０．２〜１０重量％の負荷電リン脂質、例えば、約０．２〜１重量％、０．２〜２重量％、０．２〜３重量％、０．２〜４重量％、０．２〜５重量％、０．２〜６重量％、０．２〜７重量％、０．２〜８重量％、０．２〜９重量％、または０．２〜１０重量％の総負荷電リン脂質からなる４成分複合体である。
【０１６３】
別の特異的実施形態において、リポタンパク質複合体は、３３重量％プロＡｐｏＡ−Ｉ、６５重量％スフィンゴミエリン、および２重量％ホスファチジルグリセロールからなる。
【０１６４】
別の特異的実施形態において、リポタンパク質複合体は、ＡｐｏＡ−Ｉアポリポタンパク質と脂質分画とを含み、脂質分画は本質的にスフィンゴミエリンと約３重量％の負荷電リン脂質とからなり、脂質分画対ＡｐｏＡ−Ｉアポリポタンパク質とのモル比は約２：１〜２００：１であり、前記リポタンパク質複合体は、２〜４当量のＡｐｏＡ−Ｉを含有する小さいまたは大きいディスク状粒子である。
【０１６５】
複合体は、１つのタイプの脂質結合タンパク質、または同じもしくは異なる種に由来し得る２つ以上の異なる脂質結合タンパク質の混合物を含み得る。必要ではないが、リポタンパク質複合体は、好ましくは、治療に対する免疫応答の誘導を回避するために、処置される動物種に由来する、またはアミノ酸配列が対応する脂質結合タンパク質を含む。このため、ヒト患者の処置に関して、好ましくは本開示の複合体において、ヒト起源の脂質結合タンパク質が使用される。ペプチド模倣アポリポタンパク質の使用もまた、免疫応答を低減または回避し得る。
【０１６６】
好ましい実施形態において、脂質成分は、２つのタイプのリン脂質、すなわちスフィンゴミエリン（ＳＭ）と、負荷電リン脂質とを含む。ＳＭは、それが生理的ｐＨで約ゼロの正味の電荷を有するという点において、「中性」のリン脂質である。このため、本明細書において使用されるように、「ＳＭ」という表現は、天然起源に由来するまたは天然起源から得られたスフィンゴミエリン、ならびに天然に存在するＳＭと同様にＬＣＡＴによる加水分解に対して抵抗性である天然に存在するＳＭの類似体および誘導体が含まれる。
【０１６７】
ＳＭは、実質的に任意の起源から得られ得る。例えば、ＳＭは、ミルク、卵、または脳から得られ得る。ＳＭの類似体または誘導体も同様に使用され得る。有用なＳＭの類似体および誘導体の非制限的な例には、パルミトイルスフィンゴミエリン、Ｎ−パルミトイル−４−ヒドロキシスフィンガニン−１−ホスホコリン（フィトスフィンゴミエリンの１つの形態）、パルミトイルスフィンゴミエリン、ステアロイルスフィンゴミエリン、Ｄ−エリスロ−Ｎ−１６：０−スフィンゴミエリンおよびそのジヒドロ異性体であるＤ−エリスロ−Ｎ−１６：０−ジヒドロ−スフィンゴミエリンが挙げられるがこれらに限定されるわけではない。合成パルミトイルスフィンゴミエリンまたはＮ−パルミトイル−４−ヒドロキシスフィンガニン−１−ホスホコリン（フィトスフィンゴミエリン）などの合成ＳＭは、動物起源のスフィンゴ脂質より均一で、混入物および／または酸化物の少ない複合体を産生するために使用することができる。
【０１６８】
天然起源から単離されたスフィンゴミエリンを、１つの特定の飽和または不飽和アシル鎖に関して人工的に濃縮することができる。例えば、ミルクスフィンゴミエリン（Avanti Phospholipid, Alabaster, Ala.）は、長い飽和アシル鎖（すなわち、炭素原子２０個以上を有するアシル鎖）によって特徴付けられる。これに対し、卵スフィンゴミエリンは、短い飽和アシル鎖（すなわち、炭素原子が２０個より少ないアシル鎖）によって特徴付けられる。例えば、ミルクスフィンゴミエリンのわずか約２０％がＣ１６：０（炭素１６個、飽和）アシル鎖を含むのに対し、卵スフィンゴミエリンの約８０％が、Ｃ１６：０アシル鎖を含む。溶媒抽出を使用して、ミルクスフィンゴミエリンの組成を、卵スフィンゴミエリンと同等であるアシル鎖組成を有するように濃縮することができ、またはその逆も可能である。
【０１６９】
ＳＭは、特定のアシル鎖を有するように、半合成であり得る。例えば、ミルクスフィンゴミエリンを、最初にミルクから精製した後、１つの特定のアシル鎖、例えばＣ１６：０アシル鎖を切断して、別のアシル鎖に交換することができる。ＳＭはまた、例えば大規模合成によって全合成することができる。例えば、Dongらの米国特許第５，２２０，０４３号明細書、表題Synthesis of D-erythro-sphingomyelins, issued Jun. 15, 1993；Weis, 1999, Chem. Phys. Lipids 102 (1-2):3-12を参照されたい。
【０１７０】
半合成または合成ＳＭを含むアシル鎖の長さおよび飽和レベルを、選択的に変化させることができる。アシル鎖は、飽和または不飽和であり得、炭素原子約６個〜約２４個を含有し得る。それぞれの鎖は同数の炭素原子を含有し得るか、あるいはそれぞれの鎖は異なる数の炭素原子を含有し得る。いくつかの実施形態において、半合成または合成ＳＭは、１つの鎖が飽和で１つの鎖が不飽和である混合アシル鎖を含む。そのような混合アシル鎖ＳＭにおいて、鎖長は、同じであるかまたは異なり得る。他の実施形態において、半合成または合成ＳＭのアシル鎖は、両方とも飽和または両方とも不飽和のいずれかである。この場合も、鎖は、同じまたは異なる数の炭素原子を含有し得る。いくつかの実施形態において、半合成または合成ＳＭを含む両方のアシル鎖は同一である。特異的実施形態において、鎖は、例えばミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、またはアラキドン酸などの天然に存在する脂肪酸のアシル鎖に対応する。別の実施形態において、飽和または不飽和の官能化された鎖を有するＳＭが使用される。別の特異的実施形態において、アシル鎖は両方とも飽和され、炭素原子６〜２４個を含有する。
【０１７１】
好ましい実施形態において、ＳＭは、Ｃ１６：０アシル鎖を有する合成パルミトイルＳＭなどのパルミトイルＳＭであるか、または主成分としてパルミトイルＳＭを含む卵ＳＭである。
【０１７２】
特異的実施形態において、フィトスフィンゴミエリンなどの官能化ＳＭが使用される。
【０１７３】
脂質成分は、好ましくは、負荷電リン脂質、すなわち、生理的ｐＨで正味の負電荷を有するリン脂質を含む。負荷電リン脂質は、１つのタイプの負荷電リン脂質または２つ以上の異なる負荷電リン脂質の混合物を含み得る。いくつかの実施形態において、荷電リン脂質は、負荷電グリセロリン脂質である。好適な負荷電リン脂質の特異的な例には、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）］、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、およびホスファチジン酸が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。いくつかの実施形態において、負荷電リン脂質は、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、および／またはホスファチジン酸のうちの１つまたは複数を含む。特異的実施形態において、負荷電リン脂質は、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）］、またはＤＰＰＧからなる。
【０１７４】
ＳＭと同様に、負荷電リン脂質は、天然起源から得ることができ、または化学合成によって調製することができる。合成負荷電リン脂質を使用する実施形態において、ＳＭに関連して上記で考察したように、アシル鎖の同一性を選択的に変化させることができる。本明細書において記述される負荷電リポタンパク質複合体のいくつかの実施形態において、負荷電リン脂質上の両方のアシル鎖は同一である。いくつかの実施形態において、ＳＭ上のアシル鎖と、負荷電リン脂質上のアシル鎖は全く同一である。特異的実施形態において、負荷電リン脂質（複数）および／またはＳＭは全て、Ｃ１６：０またはＣ１６：１アシル鎖を有する。特異的実施形態において、ＳＭの脂肪酸部分は、主にＣ１６：１パルミトイルである。１つの特異的実施形態において、荷電リン脂質（複数）および／またはＳＭのアシル鎖は、パルミチン酸のアシル鎖に対応する。
【０１７５】
使用されるリン脂質は、好ましくは少なくとも９５％純粋であり、および／または低減されたレベルの酸化剤を有する。天然起源から得られた脂質は、好ましくは、より少ない多価不飽和脂肪酸部分および／または酸化に対して感受性でない脂肪酸部分を有する。試料における酸化レベルは、ヨウ素滴定法を使用して決定することができ、この方法は、試料１ｋｇあたりの単離されたヨウ素のミリ当量数で表記され、ｍｅｑＯ／ｋｇと省略される過酸化物の値を提供する。例えば、Gray, J. I., Measurement of Lipid Oxidation: A Review, Journal of the American Oil Chemists Society, Vol. 55, p. 539-545 (1978)；Heaton, F.W. and Uri N., Improved Iodometric Methods for the Determination of Lipid Peroxides, Journal of the Science of food and Agriculture, vol 9. P, 781-786 (1958)を参照されたい。好ましくは、酸化のレベル、または過酸化物のレベルは低く、例えば５ｍｅｑＯ／ｋｇ未満、４ｍｅｑＯ／ｋｇ未満、３ｍｅｑＯ／ｋｇ未満、または２ｍｅｑＯ／ｋｇ未満である。
【０１７６】
ＳＭおよびパルミトイルスフィンゴミエリンを含む脂質成分は、任意選択で少量の追加の脂質を含み得る。リゾリン脂質、ガラクトセレブロシド、ガングリオシド、セレブロシド、グリセリド、トリグリセリド、ならびにコレステロールおよびその誘導体を含むがこれらに限定されるわけではない、実質的に任意のタイプの脂質が使用され得る。
【０１７７】
そのような任意選択の脂質が含まれる場合、任意選択の脂質は、典型的に脂質分画の約１５重量％未満を占めるが、いくつかの例において、より多くの任意選択の脂質を含めることができる。いくつかの実施形態において、任意選択の脂質は、約１０重量％未満、約５重量％未満、または約２重量％未満を占める。いくつかの実施形態において、脂質分画は、任意選択の脂質を含まない。
【０１７８】
特異的実施形態において、リン脂質分画は、卵ＳＭまたはパルミトイルＳＭ、またはフィトスフィンゴミエリンおよびＤＰＰＧを、９０：１０〜９９：１の範囲の重量比（ＳＭ：負荷電リン脂質）で、より好ましくは９５：５〜９８：２の範囲の重量比で含有する。１つの実施形態において、重量比は９７：３である。
【０１７９】
リポタンパク質複合体はまた、多様な治療応用または診断応用のために疎水性、親油性、または無極性活性剤を送達するための担体として使用することができる。そのような応用に関して、脂質成分はさらに、脂肪酸、薬物、核酸、ビタミン、および／または栄養素を含むがこれらに限定されるわけではない、１つまたは複数の疎水性、親油性、または無極性活性剤を含むことができる。好適な疎水性、親油性、または無極性活性剤は、治療の範疇に限定されず、例えば、鎮痛剤、抗炎症剤、抗蟯虫剤、抗不整脈剤、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗凝固剤、抗うつ剤、抗糖尿病剤、抗てんかん剤、抗真菌剤、抗痛風剤、抗高血圧剤、抗マラリア剤、抗片頭痛剤、抗ムスカリン作動剤、抗新生物剤、勃起機能障害改善剤、免疫抑制剤、抗原虫剤、抗甲状腺剤、抗不安剤、鎮静剤、睡眠剤、神経遮断剤、β−遮断剤、強心剤、コルチコステロイド、利尿剤、抗パーキンソン病剤、胃腸薬、ヒスタミン受容体拮抗剤、角質溶解剤、脂質調節剤、抗狭心症剤、ｃｏｘ−２阻害剤、ロイコトリエン阻害剤、マクロライド、筋弛緩剤、栄養剤、核酸（例えば、低分子干渉ＲＮＡ）、オピオイド鎮痛剤、プロテアーゼ阻害剤、性ホルモン、刺激剤、筋弛緩剤、抗骨粗鬆症剤、抗肥満剤、認知増強剤、抗尿失禁剤、栄養オイル、抗良性前立腺肥大剤、必須脂肪酸、非必須脂肪酸、およびそれらの混合物であり得る。
【０１８０】
リポタンパク質複合体の脂質成分対タンパク質成分のモル比は、変化し得るが、中でもタンパク質成分を含むアポリポタンパク質の同一性（複数）、脂質成分を含む脂質の同一性および量、ならびにリポタンパク質複合体の所望のサイズに依存するであろう。ＡｐｏＡ−Ｉなどのアポリポタンパク質の生物活性は、アポリポタンパク質を含む両親媒性ヘリックスによって媒介されると考えられることから、脂質：アポリポタンパク質のアポリポタンパク質分画のモル比はＡｐｏＡ−Ｉタンパク質当量を使用して簡便に表記される。一般的に、ヘリックスを計算するために使用される方法に応じて、ＡｐｏＡ−Ｉが６〜１０個の両親媒性ヘリックスを含有することは受け入れられている。他のアポリポタンパク質は、それらが含有する両親媒性ヘリックスの数に基づいてＡｐｏＡ−Ｉ当量に関して表記することができる。例えば、典型的にジスルフィド架橋された二量体として存在するＡｐｏＡ−ＩＭは、ＡｐｏＡ−ＩＭのそれぞれの分子が、１分子のＡｐｏＡ−Ｉの２倍多くの両親媒性ヘリックスを含有することから、２当量のＡｐｏＡ−Ｉとして表記することができる。逆に、１つの両親媒性ヘリックスを含有するペプチドアポリポタンパク質は、各分子が、１分子のＡｐｏＡ−Ｉの１／１０〜１／６の両親媒性ヘリックスを含有することから、１／１０〜１／６当量のＡｐｏＡ−Ｉとして表記することができる。一般的に、リポタンパク質複合体（本明細書において「Ｒｉ」と定義する）の脂質：ＡｐｏＡ−Ｉ当量のモル比は、約１０５：１〜１１０：１の範囲である。いくつかの実施形態において、Ｒｉは、約１０８：１である。リン脂質に関しておよそ６５０〜８００のＭＷを使用して、重量比を得ることができる。
【０１８１】
いくつかの実施形態において、脂質：ＡｐｏＡ−Ｉ当量のモル比（「ＲＳＭ」）は、約８０：１〜約１１０：１の範囲、例えば、約８０：１〜約１００：１である。特異的実施例において、リポタンパク質複合体のＲＳＭは、約８２：１であり得る。
【０１８２】
好ましい実施形態において、リポタンパク質複合体は、好ましくは成熟した完全長のＡｐｏＡ−Ｉであるタンパク質分画と、中性リン脂質、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、および負荷電リン脂質を含む脂質分画とを含む負荷電リポタンパク質複合体である。
【０１８３】
特異的実施形態において、脂質成分は、卵ＳＭ、またはパルミトイルＳＭ、またはフィトＳＭおよびＤＰＰＧを、９０：１０〜９９：１の範囲、より好ましくは９５：５〜９８：２、例えば９７：３の重量比（ＳＭ：負荷電リン脂質）で含有する。
【０１８４】
特異的実施形態において、タンパク質成分対脂質成分の比率は、典型的に、約１：２．７〜約１：３の範囲であり、１：２．７が好ましい。これは、約１：９０〜１：１４０の範囲のＡｐｏＡ−Ｉタンパク質対脂質のモル比に対応する。いくつかの実施形態において、リポタンパク質複合体のタンパク質対脂質のモル比は、約１：９０〜約１：１２０、約１：１００〜約１：１４０、または約１：９５〜約１：１２５である。
【０１８５】
特定の実施形態において、複合体は、ＣＥＲ−００１、ＣＳＬ−１１１、ＣＳＬ−１１２、ＣＥＲ−５２２、またはＥＴＣ−２１６である。
【０１８６】
ＣＥＲ−００１は、ＡｐｏＡ−Ｉ、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、およびＤＰＰＧを、リポタンパク質重量：総リン脂質重量比１：２．７で、ＳＭ：ＤＰＰＧの重量比９７：３で含む。好ましくは、ＳＭは、卵ＳＭであるが、合成ＳＭまたは植物ＳＭを置換することができる。いくつかの実施形態において、複合体は、国際公開第２０１２／１０９１６２号パンフレットの実施例４に記述される方法に従って作製される。
【０１８７】
ＣＳＬ−１１１は、ダイズホスファチジルコリン（ＳＢＰＣ）と複合体を形成した血漿から精製した再構成されたヒトＡｐｏＡ−Ｉである（Tardif et al, 2007, JAMA 297:1675-1682）。
【０１８８】
ＣＳＬ−１１２は、血漿から精製され、静脈内注入に好適なＨＤＬを形成するように再構成されたＡｐｏＡ−Ｉの製剤である（Diditchenko et al., 2013, DOI 10.1161/ATVBAHA.113.301981）。
【０１８９】
ＥＴＣ−２１６（ＭＤＣＯ−２１６としても知られる）は、組換え型ＡｐｏＡ−ＩＭｉｌａｎｏを含有するＨＤＬの脱脂型である。Nicholls et al., 2011, Expert Opin Biol Ther. 11(3):387-94. doi: 10.1517/14712598.2011.557061を参照されたい。
【０１９０】
別の実施形態において、複合体は、３個のリン脂質とアミノ酸２２個のペプチド、ＣＴ８０５２２の組み合わせを含むリポタンパク質複合体であるＣＥＲ−５２２である。
【０１９１】
【化１】
2017515893.tif 000002
【０１９２】
ＣＥＲ−５２２のリン脂質成分は、卵スフィンゴミエリン、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ジパルミトイルホスファチジルコリン、ＤＰＰＣ）、および１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）］（ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ＤＰＰＧ）の４８．５：４８．５：３の重量比からなる。ＣＥＲ−５２２複合体におけるペプチド対総リン脂質の重量比は、１：２．５である。
【０１９３】
ＨＤＬ治療剤の追加の例には、その全ての全内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第８，６１７，６１５号明細書、同第８，２０６，７５０号明細書、同第８，３７８，０６８号明細書、同第７，９９４，１２０号明細書、同第７，５６６，６９５号明細書、同第７，３１２，１９０号明細書、同第７，３０７，０５８号明細書、同第７，２７３，８４８号明細書、同第７，２５０，４０７号明細書、同第７，２１１，５６５号明細書、同第７，１８９，６８９号明細書、同第７，１８９，４１１号明細書、同第７，１５７，４２５号明細書、同第６，９００，１７７号明細書、同第６，８４４，３２７号明細書、同第６，７５３，３１３号明細書、同第６，７３４，１６９号明細書、同第６，７１６，８１６号明細書、同第６，６３０，４５０号明細書、同第６，６０２，８５４号明細書、同第６，５７３，２３９号明細書、同第６，４５５，０８８号明細書、同第６，３７６，４６４号明細書、同第６，３２９，３４１号明細書、同第６，２８７，５９０号明細書、同第６，２６５，３７７号明細書、同第６，０４６，１６６号明細書、同第６，０３７，３２３号明細書、同第６，００４，９２５号明細書、同第６，７４３，７７８  ８，３８３，５９２号明細書、同第８，１０１，５６５号明細書、同第８，０４４，０２１号明細書、同第７，９８５，７２８号明細書、同第７，９８５，７２７号明細書、同第８，５６８，７６６号明細書、同第８，５５７，７６７号明細書、同第８，４０４，６３５号明細書、同第８，１４８，３２８号明細書、同第８，０４８，８５１号明細書、同第７，９９４，１３２号明細書、同第７，８２０，７８４号明細書、同第７，８０７，６４０号明細書、同第７，７２３，３０３号明細書、同第７，６３８，４９４号明細書、同第７，５３１，５１４号明細書、同第７，１９９，１０２号明細書、同第７，１６６，５７８号明細書、同第７，１４８，１９７号明細書、同第７，１４４，８６２号明細書、同第６，９３３，２７９号明細書、同第６，９３０，０８５号明細書、同第８，５４１，２３６号明細書、同第８，１４８，３２３号明細書、同第８，０７１，７４６号明細書、同第７，５７２，７７１号明細書、同第７，２２３，７２６号明細書、同第８，１６３，６９９号明細書、同第８，４１５，２９３号明細書、同第７，６９１，９６５号明細書、同第７，６０１，８０２号明細書、同第７，４３９，３２３号明細書、同第７，２１７，７８５号明細書、同第８，１５８，６０１号明細書、同第８，６５３，２４５号明細書、同第８，５５７，９６２号明細書、同第７，４９１，６９３号明細書、同第７，７４９，３１５号明細書、同第５，０５９，５２８号明細書、再発行特許第３８，５５６号明細書、米国特許第６，２５８，５９６号明細書、同第５，８６６，５５１号明細書、同第６，９５３，８４０号明細書、同第８，１１９，５９０号明細書、同第７，１９３，０５６号明細書、同第６，７６７，９９４号明細書、同第６，６１７，１３４号明細書、同第６，５５９，２８４号明細書、同第６，４５４，９５０号明細書、同第６，３０６，４３３号明細書、同第６，１０７，４６７号明細書、同第５，９９０，０８１号明細書、同第５，８７６，９６８���明細書、同第５，７２１，１１４号明細書、同第８，３４３，９３２号明細書、同第７，７８６，３５２号明細書、同第８，５３６，１１７号明細書、同第８，１４３，２２４号明細書、同第７，７８１，２１９号明細書、同第７，７７６，５６３号明細書、同第７，３９０，５０４号明細書、同第７，３７８，３９６号明細書、同第６，８９７，０３９号明細書、同第７，２７３，８４９号明細書、同第８，６３７，４６０号明細書、同第８，２６８，７８７号明細書、同第８，０４８，８５１号明細書、同第８，０４８，０１５号明細書、同第８，０３０，２８１号明細書、同第７，４０２，２４６号明細書、同第７，３９３，８２６号明細書、同第７，３７５，１９１号明細書、同第７，３６１，７３９号明細書、同第７，３６４，６５８号明細書、同第７，３６１，７３９号明細書、同第７，３６４，６５８号明細書、同第７，３６１，７３９号明細書、同第７，２９７，２６２号明細書、同第７，２９７，２６１号明細書、同第７，１９５，７１０号明細書、同第７，１６６，２２３号明細書、同第７，０３３，５００号明細書、同第６，８９７，０３９号明細書、同第８，２５２，７３９号明細書、同第７，８４７，０７９号明細書、同第７，５９２，０１０号明細書、同第７，５５０，４３２号明細書、同第７，５２１，４２４号明細書、同第７，５０７，４１４号明細書、同第７，５０７，４１３号明細書、同第７，４８２，０１３号明細書、同第７，２３８，６６７号明細書、同第７，０９４，５７７号明細書、同第７，０８１，３５４号明細書、同第７，０５６，７０１号明細書、同第７，０４５，３１８号明細書、同第７，０４１，４７８号明細書、同第６，９９４，８５７号明細書、同第６，９８９，３６５号明細書、同第６，９８７，００６号明細書、同第６，９７２，３２２号明細書、同第６，９４６，１３４号明細書、同第６，９２６，８９８号明細書、同第６，９０９，０１４号明細書、同第６，９０５，６８８号明細書、および米国特許出願公開第２００４０２６６６６２号明細書に記述される、リポタンパク質複合体、脱脂アポリポタンパク質、ペプチド、融合タンパク質、およびＨＤＬ模倣体が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。
【０１９４】
本開示のＨＤＬ治療剤は、その投与によってＨＤＬレベルの増加が起こる低分子を含む。例示的な低分子には、ＣＥＴＰ阻害剤、例えば、トルセトラピブ、アナセトラピブ、エバセトラピブ、ＤＥＺ−００１（以前のＴＡ−８９９５）、およびダルセトラピブ、ならびにその全ての全内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第８，０５３，４４０号明細書、同第５，７８３，６００号明細書、同第５，７５６，５４４号明細書、同第５，７５０，５６９号明細書、同第５，６４８，３８７号明細書、同第８，６４２，６５３号明細書、同第８，６２３，９１５号明細書、同第８，４９７，３０１号明細書、同第８，３０９，６０４号明細書、同第８，１５３，６９０号明細書、同第８，０８４，４９８号明細書、同第８，０６７，４６６号明細書、同第７，８３８，５５４号明細書、同第７，８１２，１９９号明細書、同第７，７０９，５１５号明細書、同第７，７０５，１７７号明細書、同第７，５７６，１３０号明細書、同第７，３３５，７９９号明細書、同第７，３３５，６８９号明細書、同第７，３０４，０９３号明細書、同第７，１９２，９４０号明細書、同第７，１１９，２２１号明細書、同第６，９０９，０１４号明細書、同第６，８３１，１０５号明細書、同第６，７９０，９５３号明細書、同第６，７１３，５０７号明細書、同第６，７０３，４２２号明細書、同第６，６９９，９１０号明細書、同第６，６７３，７８０号明細書、同第６，６４６，１７０号明細書、同第６，５０６，７９９号明細書、同第６，４５９，００３号明細書、および同第６，４１０，８０２号明細書に開示されるそれらの低分子が挙げられる。
【０１９５】
本開示の低分子ＨＤＬ治療剤には、またＣＥＲ−００２およびＣＥＲ−２０９が挙げられる。
【０１９６】
【化２】
2017515893.tif 000003
【０１９７】
ＨＤＬ治療剤は、薬学的組成物として処方され得る。本開示によって企図される薬学的組成物は、対象に投与および送達するために好適な薬学的に許容される担体中に活性成分としてＨＤＬ治療剤を含む。
【０１９８】
注射可能組成物には、滅菌懸濁剤、液剤、または水性もしくは油性ビヒクル中の活性成分の乳剤が挙げられる。組成物はまた、懸濁剤、安定剤、および／または分散剤などの賦形剤を含み得る。いくつかの実施形態において、ＨＤＬ治療剤がＨＤＬ模倣体である場合、模倣体はリン酸緩衝生理食塩水（１０ｍＭリン酸ナトリウム、８０ｍｇ／ｍｌスクロース、ｐＨ８．２）中でＨＤＬ治療剤を含む注射可能組成物として製剤化される。注射用組成物は、単位投与剤形で、例えばアンプル、または多用量容器で提示することができ、添加された保存剤を含み得る。注入のためには、組成物を、エチレン酢酸ビニルまたは当技術分野で公知である他の任意の適合性の材料などの、ＨＤＬ治療剤と適合性である材料で作製された注入バッグで供給することができる。
【０１９９】
リポタンパク質複合体または脱脂リポタンパク質であるＨＤＬ治療剤の適した投与剤形は、ＨＤＬ治療剤を、約１ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬリポタンパク質で、好ましくは約５ｍｇ／ｍＬ〜約１５ｍｇ／ｍＬリポタンパク質の最終濃度で含む。特異的実施形態において、投与剤形は、ＨＤＬ治療剤を、約８ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬアポリポタンパク質Ａ−Ｉで、好ましくは約８ｍｇ／ｍＬの最終濃度で含む。
【０２００】
６．４．ＨＤＬマーカー
本開示は部分的に、ＨＤＬ治療剤の投与を増加させる（回数を増加、用量を増加、または両方）ことによってダウンレギュレートされるＨＤＬマーカーの利用に関する。ＨＤＬマーカーは、単球、マクロファージ、および単核細胞からの、蓄積したコレステロールまたはコレステリルエステルの除去に直接または間接的に関係しており、ＨＤＬマーカーには、脂肪酸およびコレステロールの生合成ならびに脂質代謝において重要な役割を果たす、ＡＴＰ結合膜カセットトランスポーターＡ１（ＡＢＣＡ１）およびＧ１（ＡＢＣＧ１）ならびにステロール調節エレメント結合因子１遺伝子（ＳＲＥＢＰ１）が挙げられる。様々な実施形態において、本開示の方法は、単一のＨＤＬマーカーに関してアッセイする。様々な実施形態において、本開示の方法は、複数の（例えば、２つまたは３つの）ＨＤＬマーカーに関してアッセイする。本開示の方法においてアッセイすることができるＨＤＬマーカーの例示的な組み合わせには、ＡＢＣＡ１＋ＡＢＣＧ１、ＡＢＣＡ１＋ＳＲＥＢＰ１、ＡＢＣＧ１＋ＳＲＥＢＰ１、およびＡＢＣＡ１＋ＡＢＣＧ１＋ＳＲＥＢＰ１が、単独で、または追加のマーカーとの組み合わせで挙げられる。ＨＤＬマーカーをアッセイする方法は、当技術分野において公知であり、以下に例示する。
【０２０１】
６．４．１．ＡＢＣＡ１
様々な実施形態において、本開示の方法は、ＡＢＣＡ１発現レベルおよび発現レベルの変化（例えば、ＨＤＬ治療剤による処置に応答した変化）をアッセイすることを伴う。その発現レベルをアッセイすることができるＡＢＣＡ１ｍＲＮＡ配列には、受託番号ＡＢ０５５９８２．１が割付けされており、その発現レベルをアッセイすることができるＡＢＣＡ１タンパク質には、受託番号ＡＡＦ８６２７６が割付けされている。これらの配列を図６５Ａ１〜６５Ａ３および６５Ｂにそれぞれ示す。
【０２０２】
例えば、Vinals et al., 2005, Cardiovascular Research 66:141-149；Sporstol et al., 2007, BMC Mol Biol. 8:5；Genvigir et al., 2010, Pharmacogenomics 11(9):1235-46；Wang et al., 2007, Biochem Biophys Res Commun. 353(3):650-4；Holven et al, 2013, PLOS ONE 8(11):e78241；およびRubic & Lorenz, 2006, Cardiovascular Research 69:527-35に記述されるように、本発明の方法に従ってＡＢＣＡ１発現に関してアッセイするために使用することができるいくつかのＲＴ−ＰＣＲおよび抗体検出システムが開発されている。
【０２０３】
６．４．２．ＡＢＣＧ１
様々な実施形態において、本開示の方法は、ＡＢＣＧ１発現レベルおよび発現レベルの変化（例えば、ＨＤＬ治療剤による処置に応答した変化）をアッセイすることを伴う。その発現レベルをアッセイすることができるＡＢＣＧ１ｍＲＮＡ配列には、受託番号ＮＭ＿２０７６２９．１が割付けされており、その発現レベルをアッセイすることができるＡＢＣＧ１タンパク質には、受託番号Ｐ４５８４４が割付けされている。これらの配列を図６６Ａ１〜６６Ａ２および６６Ｂにそれぞれ示す。
【０２０４】
例えば、Sporstol et al., 2007, BMC Mol Biol. 8:5；Genvigir et al., 2010, Pharmacogenomics 11(9):1235-46；Wang et al., 2007, Biochem Biophys Res Commun. 353(3):650-4；Holven et al., 2013, PLOS ONE 8(11):e78241；およびRubic & Lorenz, 2006, Cardiovascular Research 69:527-35に記述されるように、本発明の方法に従って、ＡＢＣＡ１発現に関してアッセイするために使用することができるいくつかのＲＴ−ＰＣＲおよび抗体検出システムが開発されている。
【０２０５】
６．４．３．ＳＲＥＢＰ１
様々な実施形態において、本開示の方法は、ＳＲＥＢＰ１発現レベルおよび発現レベルの変化（例えば、ＨＤＬ治療剤による処置に応答した変化）をアッセイすることを伴う。その発現レベルをアッセイすることができるＳＲＥＢＰ１ｍＲＮＡ配列には、受託番号ＢＣ０６３２８１．１が割付けされており、その発現レベルをアッセイすることができるＳＲＥＢＰ１タンパク質には、受託番号Ｐ３６９５６が割付けされている。これらの配列を図６７Ａ１〜６７Ａ２および６７Ｂにそれぞれ示す。
【０２０６】
６．５．単球
単球は、骨髄で生成されて、血流に放出され、同様に脳脊髄液、またはリンパなどの他の生体液にも存在して、循環中を離れると、異なるタイプの組織マクロファージまたは樹状細胞を生じ得る。単球、その子孫および骨髄における直前の前駆細胞もまた、「単核食細胞系」（ＭＰＳ）と呼ばれている。それらは、骨髄において単球および顆粒球を生じる顆粒球／マクロファージコロニー形成単位（ＣＦＵ−ＧＭ）前駆細胞に由来する。
【０２０７】
新たに形成された単球は骨髄を離れ、末梢血へと遊走する。循環中の単球は、毛細血管の内皮細胞に接着することができ、様々な組織へと遊走することができ（van Furth et al., 1992, Production and Migration of Monocytes and Kinetics of Macrophages. In: van Furth R ed. Mononuclear Phagocytes. Dordrecht, The Netherlands: Kluwer Academic Publishers）、そこで、それらはマクロファージまたは樹状細胞へと分化することができる。単球、マクロファージ、および樹状細胞は、アテローム性動脈硬化症の開始および進行における鍵となる細胞である。通常の環境下では、流れている血液に接する内皮単層は、単球の堅固な接着に抵抗する。しかし、炎症促進因子に曝露されると、内皮細胞における様々な白血球接着分子の発現が次第に増加して、それによって単球は、内皮細胞膜に接着することができる（Libby, 2002, Nature 420:868-874）。単球が遊走すると、単球は組織常在マクロファージとなり、次に改変リポタンパク質に曝露されると、脂質含有泡沫細胞となる（Osterud and Bjorklid, 2003, Physiol. Rev. 83:1069-1112）。
【０２０８】
本開示の診断および用量最適化法は、典型的に、患者レベル、集団レベル、動物モデル、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養での最適な投与を同定するために、ＨＤＬ治療剤での処置の前、間、および／または後にＨＤＬマーカーの発現に関して単球およびマクロファージをアッセイすることを伴う。
【０２０９】
末梢血単球を単離する方法は、当技術分野でルーチンである。そのような方法には、密度勾配遠心分離（細胞の比重の差を単離に利用する）、アフェレーシス、ポリスチレンフラスコなどのプラスチック表面器具への単球の接着、および分子マーカーを利用する細胞ソーティング法が挙げられる。
【０２１０】
単核細胞は、密度勾配遠心分離法によって単離することができる。
【０２１１】
単球は、末梢血において見出される他の細胞、例えばリンパ球およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞より強くプラスチック（ポリスチレン）基質に固着する傾向が大きいことから、プラスチック基質へのその接着を通して単離することができる。混入している細胞は、基質の十分な洗浄によって除去することができる。
【０２１２】
単球はまた、勾配を有するチャンバーの中で、遠心分離とは反対方向に緩衝液を流すことによって特定の細胞層を形成する、細胞浮遊液を遠心分離する方法であるエルトリエーションを使用して単離することもできる。
【０２１３】
単球およびマクロファージは、好ましくは、ＣＤ１４およびＣＤ１６などの細胞表面マーカーを利用する細胞ソーティング法（例えば、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）、磁気活性化細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）、またはフローサイトメトリ）を使用して単離される。例示的な細胞ソーティング法およびマーカーは、Mittar et al., August 2011 BD Biosciences publication entitled "Flow Cytometry and High-Content Imaging to Identify Markers of Monocyte-Macrophase Differentiation."に開示されている。
【０２１４】
６．６．治療法
本開示は、ある状態を処置または予防する方法を開示する。いくつかの実施形態において、方法は、それを必要とする対象におけるＨＤＬ治療剤の有効量を投与することを含む。対象は好ましくは哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。処置方法は、本明細書において記述される方法によって同定されたＨＤＬ治療剤の用量（量および／または投与スケジュールおよび／または注入時間）を利用することができ、および／または処置の効能をモニターするために本明細書において記述されるＨＤＬマーカーを利用するコンパニオン診断アッセイを伴うことができる。
【０２１５】
ＡＢＣＡ１の欠損によって、対立遺伝子障害である家族性低アルファリポタンパク血症（ＦＨＡ）、または血漿中ＨＤＬ−Ｃコレステロールレベルの大きい低減、コレステロール流出障害、および細胞内コレステロールエステルの蓄積傾向によって特徴付けられる、より重度の障害であるタンジール病（ＴＤ）が起こる。本開示は、そのような障害を処置する方法を提供する。
【０２１６】
本明細書において記述されるＨＤＬ治療剤および組成物は、実質的にあらゆる目的のために使用することができ、ＨＤＬ模倣体は、ＡＢＣＡ１関連疾患または欠損の処置または予防、ＡＢＣＧ１関連疾患または欠損の処置または予防、およびＨＤＬ欠損、ＡｐｏＡ−Ｉ欠損、またはＬＣＡＴ欠損の処置または予防などのために有用であることが示されている。ＨＤＬ治療剤は、黄斑変性、卒中、アテローム性動脈硬化症、急性冠症候群、内皮機能障害、急速進行型アテローム性動脈硬化症、グラフトアテローム性動脈硬化症、虚血、および一過性虚血発作などの疾患を処置または予防するために使用され得る。
【０２１７】
本開示のＨＤＬ治療剤および組成物は、心血管疾患、障害、および／または関連障害を処置または予防するために特に有用である。対象における心血管疾患、障害、および／または関連障害を処置または予防する方法は、一般的に、対象に、特定の適応を処置または予防するために有効なレジメンに従って、本明細書において記述されるＨＤＬ治療剤または薬学的組成物の低用量（＜１５ｍｇ／ｋｇ）または量を投与することを含む。
【０２１８】
ＨＤＬ治療剤は、治療上の有益性を提供するために十分または有効な量で投与される。心血管疾患、障害、および／または関連状態を処置するという文脈において、治療上の有益性は、以下のうちの１つまたは複数が起こる場合に推論することができる：ベースラインと比較してコレステロール動員の増加、アテローム動脈硬化性プラーク体積の低減、アテローム体積率の増加（ＩＶＵＳによって得られた測定値）（Nicholls et al., 2010, J Am Coll Cardiol 55:2399-407）、超音波撮像技術またはＭＲＩ（Duivenvoorden et al., 2009, Circ Cardiovasc Imaging. 2:235-242.）によって測定した血管壁厚（内膜中膜厚）の減少、平均血漿中トリグリセリド濃度の増加を伴わない、または肝トランスアミナーゼ（またはアラニンアミノトランスフェラーゼ）レベルの正常範囲を超える増加を伴わない、ベースラインレベルと比較した遊離のコレステロールの高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）分画の増加。完全な治癒は、望ましいが、治療上の有益性が存在するために必要ではない。
【０２１９】
いくつかの実施形態において、ＨＤＬ治療剤は、注射あたり約１ｍｇ／ｋｇのＡｐｏＡ−Ｉ当量〜約１５ｍｇ／ｋｇのＡｐｏＡ−Ｉ当量の用量で投与されるリポタンパク質複合体である。いくつかの実施形態において、リポタンパク質複合体は、約１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、または３ｍｇ／ｋｇのＡｐｏＡ−Ｉ当量の用量で投与される。いくつかの実施形態において、リポタンパク質複合体は、約６ｍｇ／ｋｇのＡｐｏＡ−Ｉ当量の用量で投与される。いくつかの実施形態において、リポタンパク質複合体は、約８ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、または１５ｍｇ／ｋｇのＡｐｏＡ−Ｉ当量の用量で投与される。
【０２２０】
いくつかの実施形態において、本明細書において記述されるある状態を処置または予防する方法は、例えば本明細書において記述されるＨＤＬ治療剤の効能をモニターする方法に従って、ＨＤＬ治療剤の処置効能をモニターするステップを含む。ＨＤＬ治療剤の用量および／または投与スケジュールの効能は、２回以上の時点で、例えばＨＤＬ治療剤の用量の投与前と、ＨＤＬ治療剤の用量の投与後で１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルを比較することによって、モニターすることができる。いくつかの実施形態において、発現レベルは、ＨＤＬ治療剤の用量の投与の、２〜１２時間、４〜１０時間、２〜８時間、２〜６時間、４〜６時間、または４〜８時間後に測定される。別の実施形態において、１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルは、投与スケジュール、例えば、ＨＤＬ治療剤が２日ごと、３日ごと、１週間ごと、または２週間ごとに投与される投与スケジュールに従って、ＨＤＬ治療剤の投与前と投与後に測定される。
【０２２１】
発現レベルは、タンパク質発現レベルまたはｍＲＮＡ発現レベルであり得る。１つの実施形態において、発現レベルは、例えば６．４章に記述されるように、抗体検出系を使用して決定されるタンパク質発現レベルである。別の実施形態において、発現レベルは、ＲＴ−ＰＣＲを使用して決定されるｍＲＮＡ発現レベルである。１つの実施形態において、１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルは、６．５章に記述される方法のいずれかに従って単離された循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞において測定される。ＨＤＬ治療剤の用量および／または投与スケジュールは、発現レベルが、６．２章に記述される１つまたは複数のＨＤＬマーカーのカットオフ量より大きく低減されるか否かに応じて維持または変更することができる。
【０２２２】
処置される対象は、心血管疾患、障害、および／または関連状態を有する個体である。本明細書において記述されるＨＤＬ治療剤および組成物で処置または予防することができるそのような心血管疾患、障害、および／または関連状態の非制限的な例には、末梢血管疾患、再狭窄、アテローム性動脈硬化症、および例えば卒中、虚血性卒中、一過性虚血発作、心筋梗塞、急性冠症候群、狭心症、間欠性跛行、重度の脚虚血、弁狭窄、および大動脈弁硬化などのアテローム性動脈硬化症の無数の臨床症状発現が挙げられる。対象は、心筋梗塞（ＳＴ上昇を伴うまたは伴わない）または不安定狭心症などの急性冠症候群が以前に起こったことがある個体であり得る。処置される対象は、任意の動物、例えば哺乳動物、特にヒトであり得る。
【０２２３】
１つの実施形態において、方法は、心臓移植（例えば、移植心冠動脈病変（ＣＡＶ））、腎移植、または肝移植（Garcia-Garcia et al., 201 0, European Heart Journal 3:2456-2469 at 2465, under "Cardiac Allograph Disease"）などの臓器移植を受けた対象における心血管疾患、急速進行型アテローム性動脈硬化症を処置または予防する方法を包含する。いくつかの実施形態において、方法は、対象に、本明細書において記述されるＨＤＬ治療剤または組成物を投与することを含む。
【０２２４】
ある態様において、方法は、心血管疾患を処置または予防する方法を包含する。いくつかの実施形態において、方法は、対象に、（ａ）投与後に患者のベースラインＡｐｏＡ−Ｉを変化させない量、および／または（ｂ）投与前のベースライン（最初の）レベルより、投与後約２時間で約５ｍｇ／ｄｌ〜１００ｍｇ／ｄｌ高い、および／または投与後約２４時間で約５ｍｇ／ｄｌ〜２０ｍｇ／ｄｌ高い、遊離または複合体形成アポリポタンパク質の血清中レベルを達成するために有効である量で、本明細書において記述されるＨＤＬ治療剤または組成物を投与することを含む。
【０２２５】
別の態様において、方法は、心血管疾患を処置または予防する方法を包含する。いくつかの実施形態において、方法は、対象に、投与前の最初のＨＤＬ−コレステロール分画より少なくとも約１０％高いＨＤＬ−コレステロール分画の循環中の血漿中濃度を投与後少なくとも１日間達成するために有効な量で、本明細書に記述されるＨＤＬ治療剤または組成物を投与することを含む。
【０２２６】
別の態様において、方法は、心血管疾患を処置または予防する方法を包含する。いくつかの実施形態において、方法は、対象に、３０〜３００ｍｇ／ｄｌであるＨＤＬ−コレステロール分画の循環中の血漿中濃度を投与後５分〜１日の間達成するために有効な量で、本明細書に記述されるＨＤＬ治療剤または組成物を投与することを含む。
【０２２７】
別の態様において、方法は、心血管疾患を処置または予防する方法を包含する。いくつかの実施形態において、方法は、対象に、３０〜３００ｍｇ／ｄｌの間であるコレステリルエステルの循環中の血漿中濃度を投与後５分から１日の間達成するために有効な量で、本明細書に記述されるＨＤＬ治療剤または組成物を投与することを含む。
【０２２８】
なお別の態様において、方法は、心血管疾患を処置または予防する方法を包含する。いくつかの実施形態において、方法は、対象に、投与前のベースライン（最初の）レベルより少なくとも約１０％高い便中コレステロール排泄の増加を投与後少なくとも１日間達成するために有効な量で、本明細書に記述されるＨＤＬ治療剤または組成物を対象に投与することを含む。
【０２２９】
本明細書において記述されるＨＤＬ治療剤または組成物は、単独で、または前述の状態を処置もしくは予防するために使用される他の薬剤との併用治療において使用することができる。そのような治療には、関係する薬物の同時または連続的投与が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。例えば、脂質異常症、家族性高コレステロール血症（ホモ接合またはヘテロ接合）などの高コレステロール血症、またはアテローム性動脈硬化症の処置において、ＨＤＬ治療剤は、現在使用されているコレステロール低下治療剤、例えば胆汁酸レジン、ナイアシン、スタチン、コレステロール吸収阻害剤、および／またはフィブレートの任意の１つまたは複数と共に投与することができる。そのような併用レジメンは、それぞれの薬物がコレステロール合成および輸送における異なる標的に作用を及ぼすことから、すなわち胆汁酸レジンは、コレステロールのリサイクル、カイロミクロンおよびＬＤＬ集団に影響を及ぼし、ナイアシンは、ＶＬＤＬおよびＬＤＬ集団に主に影響を及ぼし、スタチンはコレステロール合成を阻害し、ＬＤＬ集団を減少させる（およびおそらくＬＤＬ受容体発現を増加させる）が、本明細書において記述されるＨＤＬ治療剤は、ＲＣＴに影響を及ぼし、ＨＤＬを増加させ、コレステロール流出を促進することから、特に有益な治療効果を生じ得る。
【０２３０】
別の実施形態において、本明細書において記述されるＨＤＬ治療剤または組成物は、冠動脈性心疾患、冠動脈疾患、心血管疾患、再狭窄、血管または血管周囲疾患、アテローム性動脈硬化症（アテローム性動脈硬化症の処置および予防を含む）を処置または予防するためにフィブレートと共に使用され得る。
【０２３１】
本明細書において記述されるＨＤＬ治療剤または組成物は、小さいＨＤＬ分画、例えばプレ−ベータ、プレ−ガンマ、およびプレ−ベータ様ＨＤＬ分画、アルファＨＤＬ分画、ＨＤＬ３および／またはＨＤＬ２分画を増加させる投与量で投与することができる。いくつかの実施形態において、投与量は、例えば磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）または血管内超音波（ＩＶＵＳ）などの撮像技術によって測定されるように、アテローム動脈硬化性プラークの低減を達成するために有効である。ＩＶＵＳが追跡するパラメータには、ベースラインからのアテローム体積率の変化、および総アテローム体積の変化が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。ＭＲＩが追跡するパラメータには、ＩＶＵＳのパラメータ、ならびにプラークの脂質組成および石灰化が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。
【０２３２】
プラークの退縮は、患者自身の対照として患者を使用して測定することができる（ゼロ時間対最後の注入後ｔ時間、または最後の注入後数週間以内、または３か月以内、６か月以内、または治療開始後１年以内）。
【０２３３】
投与は、静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）、皮内、皮下（ＳＣ）、および腹腔内（ＩＰ）注射を含む、非経口投与経路によって最善に達成され得る。ある実施形態において、投与は、点滴装置、インフィルトレーター、またはカテーテルによる投与である。いくつかの実施形態において、ＨＤＬ治療剤は、注射、皮下植え込み可能ポンプ、またはデポー調製物によって、非経口投与を通して得られたものと等しい循環血清中濃度を達成する量で投与される。ＨＤＬ治療剤はまた、例えばステントまたは他の装置に吸収させることもできる。
【０２３４】
投与は、多様な異なる処置レジメンを通して達成することができる。例えば、累積の総注射容積が１日の毒性用量に達しないように、１日の間に数回の静脈内注射を定期的に投与することができる。方法は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２日の間隔でＨＤＬ治療剤を投与することを含む。いくつかの実施形態において、ＨＤＬ治療剤は、１週間に１回、１週間に２回、１週間に３回またはそれより多い間隔で投与される。
【０２３５】
方法はさらに、ＨＤＬ治療剤を、上記の投与間隔のいずれかで４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２回またはそれより多く投与することを含み得る。家族性原発性低アルファリポタンパク血症を有する対象において、ＨＤＬ治療剤は、数か月、数年、または無限に投与することができる。
【０２３６】
例えば、１つの実施形態において、ＨＤＬ治療剤は、各投与の間が１週間間隔で６回投与される。いくつかの実施形態において、投与は、一連の注射として行われ、その後６か月から１年間中止して、その後別のシリーズを開始することができる。その後、維持シリーズの注射を、毎年、または３〜５年ごとに投与することができる。一連の注射は１日かけて（複合体の明記された血漿中レベルを維持するための潅流）、数日かけて（例えば、８日間の間に４回注射）、または数週間かけて（例えば、４週間の間に４回注射）行うことができ、その後６か月から１年後に再開することができる。慢性的な状態では、投与は、継続的に行うことができる。任意選択で、方法は、ＨＤＬ治療剤をより頻回投与する誘導相の後で行われ得る。
【０２３７】
別の実施形態において、ＨＤＬ治療剤による処置は、誘導投与レジメンに従って開始した後、用量および／または投与回数を低減する維持レジメンを行うことができる。例えば、誘導レジメンは、ＨＤＬ治療剤を週に２回、３回、または４回投与することを伴い得る。ＨＤＬ治療剤が、ＣＥＲ−００１などのリポタンパク質複合体である場合、誘導相の用量は、タンパク質に基づいて４〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１２、または１５ｍｇ／ｋｇ）の範囲であり得る。維持レジメンは、ＨＤＬ治療剤を１週間に１回、２回、または３回投与することを伴い得る。ＨＤＬ治療剤が、ＣＥＲ−００１などのリポタンパク質複合体である場合、維持用量は、タンパク質に基づいて０．５〜８ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．５、１、２、３、４、５、６、７、または８ｍｇ／ｋｇ）の範囲であり得る。誘導相の投与スケジュールは、家族性原発性低アルファリポタンパク血症を有する対象にとって特に好適である。例示的な投与スケジュールを実施例４に記述する。
【０２３８】
なお別の代替において、投与あたり１ｍｇ／ｋｇ〜８ｍｇ／ｋｇの用量で約１〜１２回の投与から開始して、その後に投与あたり４ｍｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇの反復投与を行う漸増用量を投与することができる。患者の必要に応じて、投与は、１時間より長い期間での遅い注入、１時間以内での急速注入、または１回ボーラス注射によって行うことができる。用量は、１週間に１回、２回、３回またはそれより多く投与することができる。
【０２３９】
様々なＨＤＬ治療剤の毒性および治療効能は、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死である用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効である用量）を決定するために、細胞培養または実験動物において標準的な薬学的技法を使用して決定することができる。毒性効果と治療効果の間の用量比が治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表記することができる。大きい治療指数を示すＨＤＬ治療剤が好ましい。追跡することができるパラメータの非制限的な例には、肝機能トランスアミナーゼ（正常なベースラインレベルのわずか２倍）が挙げられる。これはあまりにも多くのコレステロールが肝臓に運ばれて、そのような量を同化できないことの指標である。赤血球からのコレステロールの動員により赤血球が脆弱となり、その形態に影響を及ぼすことから、赤血球に及ぼす効果もまたモニターすることができる。ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ１、または本明細書において記述されるＨＤＬマーカーのダウンレギュレーションもまた、モニターすることができる。
【０２４０】
患者は、医療行為（例えば、予防的処置）の前、医療行為の間、または後に数日から数週間処置することができる。投与は、血管形成術、頸動脈アブレーション、ロータブレーター、または臓器移植（例えば、心臓、腎臓、肝臓等）などの別の侵襲性の治療と同時または同時期であり得る。
【０２４１】
ある実施形態において、そのコレステロール合成が、スタチンまたはコレステロール合成阻害剤（ＰＣＳＫ９阻害剤などの、しかしこれらに限定されない）によって制御される患者にＨＤＬ治療剤が投与される。他の実施形態において、ＨＤＡＬ治療剤は、胆汁塩およびコレステロールを捕捉するために、胆汁酸の排泄を増加させるために、ならびに血中コレステロール濃度を低下させるために、結合レジン、例えばコレスチラミンなどの半合成レジンでの処置、または繊維、例えば植物の繊維での処置を受けている患者に投与される。
【実施例】
【０２４２】
７．実施例１：ＣＥＲ−００１の用量応答性解析
７．１．カイ二乗臨床試験
ＣＥＲ−００１は、負電荷を有する遺伝子工学的に改変された組換えヒトアポリポタンパク質Ａ−Ｉ高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）であり、静脈内注射された際に、天然のＨＤＬの生物特性を模倣する。ＣＥＲ−００１は、参照により本明細書にその全体を組み入れられている国際公開第２０１２／１０９１６２号パンフレットの実施例３および４では「Ｆｏｒｍｕｌａ  Ｈ」として記載され、組換えヒトアポリポタンパク質Ａ−ｌと、スフィンゴミエリン（Ｓｐｈ）およびジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）を含有するリン脂質とから構成される。タンパク質とリン脂質との比率は、１：２．７であり、９７％のＳｐｈおよび３％のＤＰＰＧを含有する。
【０２４３】
国際公開第２０１２／１０９１６２号パンフレットの実施例８に記載されるように、健康なボランティアで０．２５、０．７５、２、５、１０、３０および４５ｍｇ／ｋｇの単回静脈内投与が行われたＣＥＲ−００１の第Ｉ相試験では、この複合体が、良好な耐容性を有し、用量の増加に伴ってコレステロールの動員を増加させたこと、および１５ｍｇ／ｋｇを超えるレベルでは、トリグリセリドの一過的な増加が観察されたことが示された。
【０２４４】
第Ｉ相試験に基づき、「ＨＤＬ注入がアテローム性動脈硬化の退縮を有意に早めることができるか」（「カイ二乗」）と題された第ＩＩ相試験が開始された。急性の胸痛または他の狭心症と同等の症状を呈し、かつＳＴセグメント上昇型心筋梗塞、非ＳＴ上昇型心筋梗塞または不安定な狭心症の診断を示した５０４人の対象を登録した。適格性を持たせるために、対象は、冠動脈疾患の血管造影によるエビデンスを有さねばならず、そのエビデンスは、血管造影の目測または経皮的冠動脈形成術（「ＰＣＩ」）の受療歴によって、３つの主要な生来の冠動脈のうち管腔径の＞２０％が縮小したいずれかにある少なくとも１つの病変により定義した。ＰＣＩの標的血管は、研究ＩＶＵＳの標的冠動脈とはならなかったため、以前にＰＣＩを行ったいずれの血管も、標的冠動脈として使用することができなかった。
【０２４５】
試験のデザインを図１に図示する。主要評価項目は、３次元ＩＶＵＳ（血管内超音波検査）によって評価される標的冠動脈の３０ｍｍのセグメント中の総プラーク体積の名目変化とした。重要な副次評価項目は、標的の３０ｍｍセグメント中のプラーク体積の％変化およびアテローム体積の％の変化、標的の３０ｍｍセグメント中の総血管体積の変化、ならびに病状の最も軽いまたは重い５ｍｍのセグメントにおけるベースラインからのプラーク体積、管腔体積、および総血管体積の変化とした。罹患率および死亡率は、探索的評価項目とした。
【０２４６】
７．２．結果
静脈内へのＣＥＲ−００１投与に続いて、アポリポタンパク質Ａ−ｌが、用量依存的な様式（注入１）で、かつ第Ｉ相からの予測に一致する大きさで増加する。この効果は、注入６で保持され、このことは、時間の経過にわたって効能の減衰がなかったことを示す。図２Ａを参照されたい。
【０２４７】
リン脂質もまた、用量依存的な様式（注入１）で、かつ第Ｉ相からの予測に一致する大きさで増加する。この効果は、注入６で保持され、このことは、時間の経過にわたって効能の減衰がなかったことを示す。図２Ｂを参照されたい。リン脂質およびＡｐｏＡ−Ｉの用量反応曲線の傾斜比は、２．８であり、これは、ＣＥＲ−００１におけるリン脂質対タンパク質の比率に一致する。
【０２４８】
血漿中総コレステロールは、用量依存的な様式（注入１）で、かつ第Ｉ相からの予測に一致する大きさで増加する。この効果は、注入６で保持され、このことは、時間の経過にわたって効能の減衰がなかったことを示す。図２Ｃを参照されたい。これらのデータは、ＣＥＲ−００１の３ｍｇ／ｋｇでの力価が、ＥＴＣ−２１６の１５ｍｇ／ｋｇに匹敵することを示す。
【０２４９】
ＣＥＲ−００１は、３、６、および１２ｍｇ／ｋｇの用量で、用量に関連した明瞭な毒性を検査パラメータで示すことなく、全般的に良好な耐容性を示した。
【０２５０】
７．２．１．ＩＶＵＳ−最初のアプローチ
ベースラインでの総アテローム体積の平均は、１５５．２４±６７．９９ｍｍ３であった。総アテローム体積の変化の調整平均は、−２．７１、−３．１３、−１．５０および−３．０５ｍｍ３であり、それぞれプラセボ群、ＣＥＲ−００１の３ｍｇ／ｋｇ群、ＣＥＲ−００１の６ｍｇ／ｋｇ群、およびＣＥＲ−００１の１２ｍｇ／ｋｇ群であった（事前に定めた１２ｍｇ／ｋｇ対プラセボの一次解析についてはｐ＝０．８１）。また、ＣＥＲ−００１の６ｍｇ／ｋｇ群（名目ｐ＝０．４５）および３ｍｇ／ｋｇ群（名目ｐ＝０．７７）については、プラセボと比較して差がなかった。アテローム体積率の変化は、全ての試験群の間で同様であった（プラセボ群、ＣＥＲ−００１の３ｍｇ／ｋｇ群（ｐ＝０．８６）、ＣＥＲ−００１の６ｍｇ／ｋｇ群（ｐ＝０．９５）およびＣＥＲ−００１の１２ｍｇ／ｋｇ群（ｐ＝０．５３）で０．０２、−０．０２、０．０１および０．１９％（名目ｐ値対プラセボ）。
【０２５１】
後述に議論する「沿って歩く」アプローチとは対照的に、最適な可読性を得るためにフレーム対を別個に選択した。フレームは、エコー輝度（カルシウム）および側枝がないことに基づき選択した。最大の３１フレームを３０ｍｍのセグメントにわたって選択し、３０ｍｍよりも長い障害物の寄与を除いた。＞３１フレームが利用可能であった場合に解析セットに含めるための３１フレームを選択するためには、予め定義された判定基準は使用しなかった。
【０２５２】
約６０％の対画像セットが、３１フレームにクラスタリングされ、約１６％の対画像セットが、１６フレームにクラスタリングされた。
【０２５３】
１６フレームの画像セットで「クラスタリングされたこと」は、解析用の画像セットを適格とするために、フレームが１ｍｍ未満の間隔で（すなわち０．３ｍｍまで下げて）選択されたことを示唆する。
【０２５４】
３１フレームの画像セットで「クラスタリングされたこと」は、画像対の数を３１に最大化するために、＜１ｍｍ間隔も使用された可能性があることを示唆する。
【０２５５】
解析のさらに別の詳細は、本明細書に参照によりその全体が組み込まれているTardif et al., 2014, Eur. Heart Journal, first published online April 29, 2014 doi:10.1093/eurheartj/ehu171）に記載されている。
【０２５６】
このアプローチの下では、１２６人の患者／治療群で、カイ二乗は、心臓血管の事象についての有意性を示すには及ばなかった（およそ５０００人の患者／群が必要であったと思われる）。
【０２５７】
７．２．２．ＩＶＵＳ解析−第２のアプローチ
ＩＶＵＳデータの事後解析は、南オーストラリア健康医療研究所（ＳＡＨＭＲＩ）によって実施された。
【０２５８】
この場合では、ベースラインとフォローアップ調査との間では同様のフレーム数であった。選択したフレーム数は、正規分散していた（図３）。
【０２５９】
解析は、ＨＤＬ模倣体以前と比較して、統計学的に有意かつ匹敵する程度のベースラインに対するＰＡＶおよびＴＡＶの減少を示した（図４）。本試験は、ｍＩＴＴ集団では主要評価項目に達しなかったものの、修正パープロトコール（ｍＰＰ）集団では、３ｍｇ／ｋｇ用量が、ＴＡＶおよびＰＡＶの両方で、プラセボに対し名目上の統計学的有意性を達成した（図５）。
【０２６０】
図６Ａ〜６Ｂに見られるように、ＳＡＨＭＲＩ解析の結果は、ヒトにおけるＣＥＲ−００１の逆Ｕ型用量−効果曲線に一致する。
【０２６１】
表１に示すように、ベースラインＰＡＶが３０以上であった患者では、全ての患者（ｍＩＴＴ）について、最低用量の３ｍｇ／ｋｇで、総アテローム体積（ＴＡＶ）の変化およびＰＡＶでの変化においてプラセボに対し統計学的な有意性を得た。
【０２６２】
【表１】
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【０２６３】
ベースラインでＰＡＶ≧３０の患者の部分集団における用量応答は、総集団と同じパターンを辿ったが、３ｍｇ／ｋｇ用量では、ＴＡＶおよびＰＡＶに、さらに大きな強調すべき変化があった。
【０２６４】
８．実施例２：ＣＥＲ−００１またはＨＤＬ３を用いた処置後の、逆脂質輸送に関与する遺伝子の調節
８．１．序論
試験Ａ〜Ｐの目的は、ＣＥＲ−００１、ＨＤＬ３およびＡｐｏＡ−Ｉを用いてマウスマクロファージ（Ｊ７７４）を処置した後の、逆脂質輸送（ＲＬＴ）に関与する遺伝子の調節を決定することであった。逆コレステロール輸送（ＲＣＴ）とは、末梢細胞が、蓄積されたコレステロールを、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）などの細胞外アクセプターに向けて遊離するための経路であり、次いでＨＤＬは、排出のために肝臓へのコレステロールの送達を媒介し、それゆえアテローム性動脈硬化を予防する。コレステロール流出を試験するための１つのアプローチは、［３Ｈ］−コレステロール−酸化ＬＤＬを用いてマクロファージを標識し、アクセプター分子の存在下でこれらの細胞からのコレステロールの遊離を測定することである。ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ１およびＳＲ−ＢＩは、コレステロール流出に関与する膜タンパク質である。
【０２６５】
８．２．材料
これらの試験に使用した材料は、ＣＥＲ−００１（タンパク質と総脂質との比率が１：２．７の荷電リポタンパク質複合体、９７％卵スフィンゴミエリン／３％ＤＰＰＧ）濃度１３．５ｍｇ／ｍＬのＡｐｏＡ−Ｉ）、精製ヒトＨＤＬ３、および精製ＡｐｏＡ−Ｉを含む。材料は約−２０℃で保存した。
【０２６６】
８．３．１節に記載されたプロセスに従って、ヒト血漿からＨＤＬ３リポタンパク質画分を調製した。簡単に述べれば、まずＫＢｒ勾配（ｄ＜１．０５５）および連続的な超遠心分離（１００，０００×ｇ、２４時間を３回）によって、ＶＬＤＬ、ＩＤＬおよびＬＤＬ画分を除去した。ＬＤＬ画分は、コレステロール流出実験でのちに使用するために取り置いた。次いで、４０時間のＫＢｒ勾配（ｄ＝１．１９）−１００，０００×ｇから、ＨＤＬ３画分を単離した。リポタンパク質画分を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対し広範囲で透析した後、実験で利用した。
【０２６７】
８．３．プロトコール
８．３．１．血漿リポタンパク質の分離
血漿の受け取り。新鮮な血漿（凍結されていない）の体積を測定する。以下の終濃度で添加剤を添加する：ＥＤＴＡ：０．１％（ｗ／ｖ）、ＮａＮ３：０．０１％（ｗ／ｖ）。血漿を２００００ｒｐｍ、４℃で２０分間、遠心分離する。細胞の細片およびカイロミクロンである可能性のあるものを除去して、清浄な血漿を提供する。
【０２６８】
リポタンパク質の単離。ＫＢｒ溶液中で逐次浮揚超遠心分離を行うことによって（ＶＬＤＬ、ｄ＝１．００６ｇ／ｍＬ；ＬＤＬ、１．００６＜ｄ＜１．０６３ｇ／ｍＬ）、リポタンパク質を得る。まず、ＨＤＬ２をｄ＝１．１２５ｇ／ｍＬで単離し（１１０，０００×ｇを４０時間）、続いて、ＨＤＬ３をｄ＝１．１９ｇ／ｍＬで単離した（１１０，０００×ｇを４０時間）。使用前に、リポタンパク質を、リン酸緩衝生理食塩水に対し広範囲で透析する。生理食塩水溶液の体積は、血清の体積−７％であり、これは水和タンパク質の体積に相当する。
【０２６９】
８．３．２．ＲＮＡ抽出
ステップ１−ホモジナイゼーション：組織試料（５０ｍｇ）または培養細胞（６ウェルプレートのうち１ウェル）を、１ｍＬのＴＲＩ試薬（登録商標）中でホモジナイズする。ＲＮａｓｅ不含の１．５ｍＬチューブ内で、ホモジネートを室温で５分間、インキュベートする。組織試料については、４℃、１２，０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を新しいチューブに移す。注記：培養細胞試料については不要である。
【０２７０】
ステップ２−ＲＮＡ抽出：１００μＬのブロモクロロプロパン（ＢＣＰ）を１ｍＬのホモジネートに添加し、よく混合する（ボルテックス１５秒間）。室温で５分間インキュベートする。４℃、１２，０００×ｇで１０分間遠心分離する。新しいＲＮａｓｅ不含の１．５ｍＬチューブに、４００μＬの上部の水相を移す。
【０２７１】
ステップ３−最後のＲＮＡ精製：２００μＬの１００％エタノールを添加し、直ちに混合する（ボルテックスで５秒間）。試料を、１２，０００×ｇでの３０秒間の遠心分離によって、フィルターカートリッジに通す。５００μＬの洗浄溶液を用いて、フィルターを２回洗浄する（１２，０００×ｇで３０秒間）。３０秒超、遠心分離して、残渣の洗浄溶液を除去する。フィルターカートリッジを新しい採集チューブに移す。５０〜１００μＬの溶出緩衝液をフィルターカラムに添加して、室温で２分間インキュベートし、１２，０００×ｇで３０秒間遠心分離して、フィルターからＲＮＡを溶出する。回収したＲＮＡを−８０℃で保存する。
【０２７２】
ステップ４−ＲＮＡ濃度を決定する：ＲＮＡ溶液の濃度は、１．５μＬの試料について、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光器にて２６０ｎｍで吸光度を測定することによって決定する。ＲＮＡの質を評価するために、８．３．３節に記載されるようにＡｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザーを用いた分析を行うことができる。
【０２７３】
８．３．３．Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザーを用いたＲＮＡの質の決定
使用前に、全ての試薬を室温に３０分間平衡化させる。室温に至らせるまでの間、色素濃縮液を光から保護する。
【０２７４】
ステップ１−ゲルを調製する：５５０μＬのＡｇｉｌｅｎｔ  ＲＮＡ６０００ナノゲルマトリックスをスピンフィルター内におく。１５００×ｇで１０分間、遠心分離する。キットに含まれるＲＮａｓｅ不含の０．５ｍＬマイクロチューブ内に、６５μＬの濾過ゲルを分取する。１か月以内に濾過ゲルを使用する。
【０２７５】
ステップ２−ゲル−染色液混合物を調製する：ＲＮＡ６０００ナノ色素濃縮液を１０秒間ボルテックスして、スピンダウンする。１μＬのＲＮＡ６０００ナノ色素濃縮物を、６５μＬアリコートの濾過ゲルに添加する。チューブの蓋を閉め、ボルテックスを徹底的に行い、ゲルと色素とが適正に混合されたことを目視で検査する。チューブを室温、１３，０００×ｇで１０分間スピンする。調製したゲル−色素混合物を１日以内に使用する。ゲル−色素混合物は、使用前の都度、常に１３，０００×ｇで１０分間、再スピンする。
【０２７６】
ステップ３−ゲル−色素混合物をロードする：ゲル−色素混合物をロードする前に、チッププライミングステーションの底板が位置（Ｃ）にあり、かつ調整チップが最上部の位置にセットされていることを確認する。チッププライミングステーションの上に、新しいＲＮＡ６０００ナノチップをおく。白抜きＧウェルの底に、９μＬのゲル−色素混合物をピペットで量り入れる。タイマーを３０秒にセットし、プランジャーが１ｍＬに位置していることを確認し、次いで、チッププライミングステーションを閉める。プライミングステーションが正しく閉まった時に、ラッチのロックをクリックすることになる。クリップで固定されるまで、シリンジのプランジャーを押し下げる。正確に３０秒待ち、次いで、クリップ解放機構を用いてプランジャーを解放する。５秒間待ち、次いで、プランジャーをゆっくりと１ｍＬの位置に引き戻す。チッププライミングステーションをゆっくりと開く。２つのＧウェルのそれぞれに９μＬのゲル−色素混合物をピペットで量り入れる。
【０２７７】
ステップ４−Ａｇｉｌｅｎｔ  ＲＮＡ  ６０００ナノマーカーをロードする：５μＬのＲＮＡ６０００ナノマーカーを、ラダー記号で標示されたウェルおよび１２個の各試料ウェルにピペットで量り入れる。
【０２７８】
ステップ５−ラダーおよび試料をロードする：使用前に、ラダーのアリコートおよびＲＮＡ試料を解凍し、氷上に保つ。二次構造を最小限にするために、チップ上にロードする前に試料を熱変性する（７０℃、２分）。ラダー記号で標示されたウェル内に、１μＬの調製ラダーをピペットで量り入れる。１２個の各試料ウェルの中に、１μＬの各試料をピペットで量り入れる。非使用の各試料ウェルに、１μＬのＲＮＡ６００Ｎａｎｏマーカーをピペットで量り入れる。ＩＫＡボルテックスミキサーのアダプターに、チップを水平に設置し、２４００ｒｐｍで１分間ボルテックスする。５分以内に、チップをＡｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザーにてランする。
【０２７９】
ステップ６−チップの解析を開始する：Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔコンテキストでは、Ａｓｓａｙメニューから適切なアッセイを選択し（例えば、Ａｓｓａｙ  ＲＮＡ  ｅｕｌｋａｒｙｏｔｅ）、ＣＯＭ  Ｐｏｒｔ  １を選択する。現段階のＦｉｌｅ  Ｐｒｅｆｉｘを承認するか、または修正する。この接頭辞を使用した名称を有するファイルに、データが自動的にセーブされることになる。この時に、ファイルの保存場所および解析予定の試料数をカスタマイズすることができる。ウィンドウの上部右のＳｔａｒｔボタンをクリックして、チップのランを開始する。試料名やコメントなどの試料情報を入れるために、青で強調表示されたＤａｔａ  Ｆｉｌｅリンクを選択するか、またはＡｓｓａｙコンテキストへ進んでＣｈｉｐ  Ｓｕｍｍａｒｙタブを選択する。試料名の表を記入する。チップのランが終了した後、直ちにチップをレセプタクルから除く。
【０２８０】
８．３．４．逆転写
反応チューブを調製する前に、ｈｉｇｈ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ＲＮＡ  ｔｏ  ｃＤＮＡ  ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４３８７４０６）を使用して、ＲＴ反応混合物を調製する。ＲＴ反応混合物を氷上で調製するために（２０μＬの反応物当たり）：（１）キットの構成物を氷上で解凍し、（２）表２に示すように、必要な数の反応物を調製するのに要する構成物の体積を計算する。
【０２８１】
【表２】
2017515893.tif 000005
【０２８２】
２０μＬのＲＴ反応混合物をチューブ内に分注する。チューブを密閉して、２３０×ｇで１分間、遠心分離する。ＲＴ反応を実施するために、サーマルサイクラーを以下のようにプログラムする：３７℃→６０分；９５℃→５分；１２℃→∞。
【０２８３】
８．３．５．定量的遺伝子発現アッセイ（リアルタイムＰＣＲ）
ステップ１−ｃＤＮＡ試料を調製する：Ｒｉｂｏｐｕｒｅ  Ａｍｂｉｏｎ（登録商標）ＲＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＡＭ１９２４）を使用して、総ＲＮＡを単離し、１．５μＬの試料を用いて、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光器によってＲＮＡ濃度を決定する（８．３．２節を参照のこと）。Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ＲＮＡ  ｔｏ  ｃＤＮＡ  Ｋｉｔ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＰＮ４３８７４０６）を使用して、逆転写（ＲＴ）を実施する（８．３．４節を参照のこと）。直ちにＰＣＲに進めない場合には、ｃＤＮＡ試料を−２０℃で保存する。
【０２８４】
ステップ２−ＰＣＲ反応混合物を調製する：全ての試料について同量のｃＤＮＡを使用する（０．５または１μｇのＲＮＡにつき２０μＬのＲＴ反応物のうち４μＬ）。各試料（３連でランすることになる）につき、以下をヌクレアーゼ不含の１．５−ｍＬマイクロチューブ内にサンプリングする（さらに２試料分の体積を添加して、ＰＣＲ反応混合物の終体積を算出する）：２×ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ：１０μＬ；２０×ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ：１μＬ；ヌクレアーゼ不含Ｈ２Ｏ：５μＬ。チューブの蓋を閉め、何回か転倒して反応構成物を混合する。チューブを少しの間遠心分離する。
【０２８５】
ステップ３−プレートを装填する：４μＬのｃＤＮＡを９６ウェル反応プレートの各ウェル内に入れ、ウェル当たり１６μＬのＰＣＲ反応混合液を移すが、この２つの堆積物についてプレートの方向を変えることによってそれらを行う（４μＬのＨ２Ｏを含む１ウェルを各遺伝子に用いるブランクとすることを見越す）。プレートを適切なカバーで密閉する。プレートを少しの間遠心分離する（２３０×ｇを１分）。プレートをＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステム内に装填する。
【０２８６】
ステップ４−プレートをランする：ランに用いる実験／プレートドキュメントを作成する。プレートをランする。プログラム：（ａ）９５℃→１０分、（ｂ）９５℃→１５秒、（ｃ）６０℃→１分で、（ｂ）および（ｃ）を４０サイクル。
【０２８７】
８．３．６．放射活性コレステロール流出試験
１日目−細胞培養：ＡＴＣＣ（Ｎ°ＴＩＢ−６７）から入手したＪ７７４マクロファージを、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００ユニット／ｍＬ  ペニシリンＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および１００ユニット／ｍＬ  ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補ったダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、３７℃、５％ＣＯ２で増殖させた。細胞を２４ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）に４０，０００個／ウェルで播種し、２ｍＬのＤＭＥＭ１０％ＦＢＳ中で３２時間増殖させた。ＬＤＬ酸化：Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（商標）Ｍｉｎｉ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｕｎｉｔｓ  ７０００ＭＷＣＯ（Ｐｉｅｒｃｅ）中で、１ｍＬのＬＤＬを、４ＬのＰＢＳに対して透析した（２回、各回１２時間）。
【０２８８】
２日目−ＬＤＬ酸化：［１］透析後、アルブミン（＃２３２０９、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を標品として使用し、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅプロテインアッセイ（＃１８５６２０９、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、タンパク質−ＬＤＬを定量する。吸光度は、Ｇｌｏｍａｘマルチディテクションシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、６００ｎｍで読み取る。ＰＢＳ−透析したＬＤＬ（２ｍｇ／ｍＬ）を、ＣｕＳＯ４（終濃度５μΜ）（Ｃ８０２７、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して３７℃で４時間、酸化した。反応は、ＥＤＴＡ（終濃度１００μΜ）（＃２０３０２．２３６、Ｐｒｏｌａｂｌｏ）を添加することによって停止した。酸化ＬＤＬを１ＬのＰＢＳに対し０．５時間で２回、透析した。透析後、［１］と同じ方法によって、タンパク質−ＬＤＬを定量する。細胞培養：酸化ＬＤＬ（５０μＬ、１２．５μｇ）を、ＤＭＥＭ２．５％ＦＢＳ中で［３Ｈ］コレステロール（１μＣｉ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）と１５分間混合する。放射標識ＬＤＬを、４５０μＬのＤＭＥＭ２．５％ＦＢＳ中で２４時間、Ｊ７４４細胞に添加する。
【０２８９】
３日目−細胞培養：放射活性培地を除去し、細胞を１ｍＬのＤＭＥＭ（ＦＢＳ不含）で３回洗浄し、アゴニストＬＸＲ（１μΜ）の共存下または不在下で、一晩インキュベートする。
【０２９０】
４日目−コレステロール流出アッセイ：流出は、２５０μＬのＦＢＳ不含のＤＭＥＭ中で種々のアクセプターを６時間（または１から２４時間の間の種々の時間）添加することによって誘導する。放射活性は、培地（０．２５ｍＬ）をＳｕｐｅｒＭｉｘ（０．７５ｍＬ）（１２００−４３９、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）に添加して、２４ウェルフレキシブルマイクロプレート（１４５０−４０２、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）内で混合することによって測定し、放射活性は、ＭｉｃｒｏＢｅｔａ（登録商標）Ｔｒｉｌｕｘを用いて測定した（２分の計測時間）。細胞内［３Ｈ］コレステロールは、０．２ｍＬのヘキサン−イソプロパノール（３：２）（０．５時間のインキュベーション）によって抽出し、液体シンチレーションカウンティングによって測定した。
【０２９１】
８．３．７．膜／サイトゾル分離
超遠心分離を用いない膜／サイトゾル分離：細胞ペレット（６ウェルプレートのうち２ウェル）は、２００μＬの溶解緩衝液に再懸濁し、また、組織試料（５０〜１００ｍｇ）は、１ｍＬの溶解緩衝液に再懸濁する。組織試料は、Ｔｕｒｒａｘ（登録商標）を用いてホモジナイズし、細胞ペレットは、Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ（登録商標）ＢＲＡＮＳＯＮを使用して、３０％の振幅かつ１０秒を２回、超音波処理することによってホモジナイズする。４℃、８００×ｇで５分間、遠心分離する。上清を新しいチューブに移し、４℃、１３，０００×ｇで３０分、遠心分離し、上清（サイトゾル画分）を取っておく。ペレットを１００〜２００μＬの溶解緩衝液（１．２％ＴｒｉｔｏｎＸ１００を補ったもの）に再懸濁する。強い振盪下に１５分間おく。１４，０００×ｇで５分間遠心分離し、上清（可溶化膜タンパク質画分）を取っておく。
【０２９２】
超遠心分離を用いた膜／サイトゾル分離：細胞ペレット（６ウェルプレートのうち２ウェル）または組織試料（５０〜１００ｍｇ）は、１ｍＬの溶解緩衝液に再懸濁する。組織試料は、Ｔｕｒｒａｘ（登録商標）を用いてホモジナイズし、細胞ペレットは、Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ（登録商標）ＢＲＡＮＳＯＮを使用して、３０％の振幅かつ１０秒で２回、超音波処理することによってホモジナイズする。４℃、８００×ｇで５分間、遠心分離する。上清を超遠心分離用チューブに移し、８℃、１００，０００×ｇ（３８，５００ｒｐｍ）（ローターＴｉ７０）で１時間、遠心分離し、上清（サイトゾル画分）を取っておく。ペレットを１００〜２００μＬの溶解緩衝液（表３）（１．２％ＴｒｉｔｏｎＸ１００を補ったもの）に再懸濁する。強い振盪下に１５分間おく。１４，０００×ｇで５分間遠心分離し、上清（可溶化膜タンパク質画分）を取っておく。
【０２９３】
【表３】
2017515893.tif 000006
【０２９４】
８．４．遺伝子調節試験Ａ〜Ｐの結果
８．４．１．試験Ａ：ＣＥＲ−００１、ＨＤＬ３およびＡｐｏＡ−ＩによるＪ７７４のＡＢＣＡ１遺伝子の調節−用量応答性（２５、２５０および１０００μｇ／ｍＬ）
この試験では、種々の濃度のＣＥＲ−００１、ＨＤＬ３およびＡｐｏＡ−Ｉについて、コレステロール流出の状態にあるマウスマクロファージ（Ｊ７７４）におけるＡＢＣＡ１遺伝子の発現を調べた。Ｊ７７４を、６×ウェルプレート（３００，０００個／ウェル）に播種し、３Ｈ−コレステロールを使用せずに酸化ＬＤＬをロードした。ＣＥＲ−００１、ＨＤＬ３（凍結ストック溶液由来）およびＡｐｏＡ−Ｉ（２５、２５０および１０００μｇ／ｍＬ）をマクロファージ上に６時間添加し、ＲｉｂｏＰｕｒｅ（商標）キットを用いて、製造業者のプロトコールに従ってＲＮＡを抽出した（条件当たり１ウェル）。遺伝子発現は、８．３．２節（ＲＮＡ抽出）、８．３．４節（逆転写）および８．３．５節（ｑＰＣＲ）に記載のプロトコールを使用してアッセイした。ＡＢＣＡ１遺伝子の発現は、ＴａｑｍａｎプローブＭｍ００４４２６４６．ｍ１を用いて、製造業者のプロトコールに従って決定した。使用した参照遺伝子は、ＨＰＲＴ１（Ｔａｑｍａｎプローブ：Ｍｍ００４４６９６８．ｍ１）である。
【０２９５】
６時間のインキュベーションの後、ＡｐｏＡ−Ｉは、実験で使用された用量について、ＡＢＣＡ１の発現を変化させなかった。ＣＥＲ−００１は、全ての用量でＡＢＣＡ１のｍＲＮＡを低下させた。そして、ＨＤＬ３は、２５μｇ／ｍＬの用量で、ＡＢＣＡ１のｍＲＮＡ濃度に影響を及ぼさなかった（図７）。
【０２９６】
８．４．２．試験Ｂ：ＣＥＲ−００１、ＨＤＬ３およびＡｐｏＡ−ＩによるＪ７７４のＡＢＣＧ１遺伝子の調節−用量応答性（２５、２５０および１０００μｇ／ｍＬ）
この試験では、種々の濃度のＣＥＲ−００１、ＨＤＬ３およびＡｐｏＡ−Ｉについて、コレステロール流出の状態にあるマウスマクロファージ（Ｊ７７４）におけるＡＢＣＧ１遺伝子の発現を調べた。Ｊ７７４を、６ウェルプレート（３００，０００個／ウェル）に播種し、３Ｈ−コレステロールを使用せずに酸化ＬＤＬをロードした。ＣＥＲ−００１、ＨＤＬ３（凍結ストック溶液由来）およびＡｐｏＡ−Ｉ（２５、２５０および１０００μｇ／ｍＬ）を、マクロファージ上に６時間添加し、ＲｉｂｏＰｕｒｅ（商標）キットを用いて、製造業者のプロトコールに従ってＲＮＡを抽出した（条件当たり１ウェル）。遺伝子発現は、８．３．２節（ＲＮＡ抽出）、８．３．４節（逆転写）および８．３．５節（ｑＰＣＲ）に記載のプロトコールを使用してアッセイした。ＡＢＣＧ１遺伝子の発現は、ＴａｑｍａｎプローブＭｍ００４３７３９０．ｍ１を用いて、製造業者のプロトコールに従って決定した。使用した参照遺伝子は、ＨＰＲＴ１（Ｔａｑｍａｎプローブ：Ｍｍ００４４６９６８．ｍ１）である。
【０２９７】
ＡｐｏＡ−Ｉは、実験で使用された用量について、ＡＢＣＧ１の発現を変化させなかった。ＣＥＲ−００１は、全ての用量でＡＢＣＧ１のｍＲＮＡを低下させた。そして、ＨＤＬ３は、２５μｇ／ｍＬの用量で、ＡＢＣＧ１のｍＲＮＡ濃度に影響を及ぼさなかった（図８）。
【０２９８】
８．４．３．試験Ｃ：ＣＥＲ−００１、ＨＤＬ３およびＡｐｏＡ−ＩによるＪ７７４のＳＲ−ＢＩ遺伝子の調節−用量応答性（２５、２５０および１０００μｇ／ｍＬ）
この試験では、種々の濃度のＣＥＲ−００１、ＨＤＬ３およびＡｐｏＡ−Ｉについて、コレステロール流出の状態にあるマウスマクロファージ（Ｊ７７４）におけるＳＲ−ＢＩ遺伝子の発現を調べた。Ｊ７７４を、６ウェルプレート（３００，０００個／ウェル）に播種し、３Ｈ−コレステロールを使用せずに酸化ＬＤＬをロードした。ＣＥＲ−００１、ＨＤＬ３（凍結ストック溶液由来）およびＡｐｏＡ−Ｉ（２５、２５０および１０００μｇ／ｍＬ）を、マクロファージ上に６時間添加し、ＲｉｂｏＰｕｒｅ（商標）キットを用いて、製造業者のプロトコールに従ってＲＮＡを抽出した（条件当たり１ウェル）。遺伝子発現は、８．３．２節（ＲＮＡ抽出）、８．３．４節（逆転写）および８．３．５節（ｑＰＣＲ）に記載のプロトコールを使用してアッセイした。ＳＲ−ＢＩ遺伝子の発現は、ＴａｑｍａｎプローブＭｍ００４５０２３４．ｍ１を用いて、製造業者のプロトコールに従って決定した。使用した参照遺伝子は、ＨＰＲＴ１（Ｔａｑｍａｎプローブ：Ｍｍ００４４６９６８．ｍ１）である。
【０２９９】
全ての用量で種々の処置について、ＳＲ−ＢＩ遺伝子の発現には有意な変化は観察されなかった（図９）。
【０３００】
８．４．４．試験Ｄ：ＣＥＲ−００１、ＨＤＬ３およびＡｐｏＡ−ＩによるＪ７７４の他の遺伝子の調節−用量応答性（２５、２５０および１０００μｇ／ｍＬ）
ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ１およびＳＲ−ＢＩを発現する遺伝子のｍＲＮＡの調節は、ＬＸＲ、ＳＲＥＢＰ１およびＳＲＥＢＰ２のような核タンパク質と連鎖する。この試験では、種々の濃度のＣＥＲ−００１、ＨＤＬ３およびＡｐｏＡ−Ｉについて、コレステロール流出の状態にあるマウスマクロファージ（Ｊ７７４）におけるＬＸＲ、ＳＲＥＢＰ１およびＳＲＥＢＰ２遺伝子のｍＲＮＡレベルを調べる。Ｊ７７４を、６ウェルプレート（３００，０００個／ウェル）に播種し、３Ｈ−コレステロールを使用せずに酸化ＬＤＬをロードした。ＣＥＲ−００１、ＨＤＬ３およびＡｐｏＡ−Ｉ（２５、２５０および１０００μｇ／ｍＬ）をマクロファージ上に６時間添加し、ＲｉｂｏＰｕｒｅ（商標）キットを用いて、製造業者のプロトコールに従ってＲＮＡを抽出した（条件当たり１ウェル）。遺伝子発現は、８．３．２節（ＲＮＡ抽出）、８．３．４節（逆転写）および８．３．５節（ｑＰＣＲ）に記載のプロトコールを使用してアッセイした。ＳＲＥＢＰ−１、ＳＲＥＢＰ−２およびＬＸＲ遺伝子の発現レベルは、Ｔａｑｍａｎプローブ（それぞれＭｍ０１１３８３４４．ｍ１、Ｍｍ０１３０６２９２．ｍ１、Ｍｍ００４４３４５１．ｍ１）を用いて、製造業者のプロトコールに従って決定した。使用した参照遺伝子は、ＨＰＲＴ１（Ｔａｑｍａｎプローブ：Ｍｍ００４４６９６８．ｍ１）である。
【０３０１】
ＡｐｏＡ−Ｉを用いた種々の処置について、ＳＲＥＢＰ−１、ＳＲＥＢＰ−２およびＬＸＲ遺伝子の発現には有意な変化が観察されなかった。ＣＥＲ−００１およびＨＤＬ３は、種々の用量について、ＳＲＥＢＰ−１のｍＲＮＡレベルにのみ影響を及ぼし（図１０）、一方で、ＳＲＥＢＰ−２およびＬＸＲは変化しなかった（それぞれ図１１および図１２）。
【０３０２】
８．４．５．試験Ｅ：マウスＪ７７４マクロファージにおけるＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ１およびＳＲ−ＢＩの発現を調節するためのＣＥＲ−００１およびＨＤＬ３のＥＣ５０の決定
この試験では、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ１およびＳＲ−ＢＩの遺伝子発現の調節に必要なＡｐｏＡ−Ｉ、ＣＥＲ−００１またはＨＤＬ３の最小有効濃度を調べた。Ｊ７７４を６ウェルプレート（３００，０００個／ウェル）に播種し、酸化ＬＤＬをロードした。ＣＥＲ−００１、ＨＤＬ３およびＡｐｏＡ−Ｉ（０．２５、２．５、７．５、２５および２５０μｇ／ｍＬ）をマクロファージ上に６時間添加し、ＲｉｂｏＰｕｒｅ（商標）キットを用いて、製造業者のプロトコールに従ってＲＮＡを抽出した。遺伝子発現は、８．３．２節（ＲＮＡ抽出）、８．３．４節（逆転写）および８．３．５節（ｑＰＣＲ）に記載のプロトコールを使用してアッセイした。ＳＲ−ＢＩ遺伝子（ＴａｑｍａｎプローブＭｍ００４５０２３４．ｍ１）、ＡＢＣＧ１（ＴａｑｍａｎプローブＭｍ００４３７３９０．ｍ１）、ＳＲＥＢＰ１（ＴａｑｍａｎプローブＭｍ０１１３８３４４．ｍ１）およびＡＢＣＡ１（ＴａｑｍａｎプローブＭｍ００４４２６４６．ｍ１）の発現は、製造業者のプロトコールに従って決定した。使用した参照遺伝子は、ＨＰＲＴ１（Ｔａｑｍａｎプローブ：Ｍｍ００４４６９６８．ｍ１）であった。
【０３０３】
ＡｐｏＡ−Ｉは、供試した遺伝子のｍＲＮＡレベルを変化させなかった（図１３）。ＡＢＣＡ１レベルの半分を減じるためのＣＥＲ−００１の用量は、おおよそ７．５μｇ／ｍＬであり、ＨＤＬ３については２５μｇ／ｍＬである（図１３）。ＡＢＣＧ１については、ｍＲＮＡレベルを半分に低下させるためにＣＥＲ−００１およびＨＤＬ３で７５ｇ／ｍＬを超える用量が必要である（図１４）。ＳＲＥＢＰ１については、ＣＥＲ−００１では２．５μｇ／ｍＬを超える濃度で、ＨＤＬ３では２５μｇ／ｍＬで、低下およびプラトーが観察された（図１５）。ＳＲ−ＢＩレベルは、種々の処置によって影響を及ぼされなかった（図１６）。
【０３０４】
８．４．６．試験Ｆ：ＣＥＲ−００１およびＨＤＬ３による、マウスＪ７７４マクロファージにおけるＡＢＣＡ１  ｍＲＮＡの調節に関する反応速度論
この試験では、Ｊ７７４マクロファージにおけるＡＢＣＡ１のｍＲＮＡレベルの低下に関する反応速度論を調べた。Ｊ７７４を６ウェルプレート（３００，０００個／ウェル）に播種し、酸化ＬＤＬをロードした。ＣＥＲ−００１、ＨＤＬ３およびＡｐｏＡ−Ｉ（２５および２５０μｇ／ｍＬ）を種々の時点でマクロファージ上に添加し、ＲｉｂｏＰｕｒｅ（商標）キットを用いて、製造業者のプロトコールに従ってＲＮＡを抽出した。遺伝子発現は、８．３．２節（ＲＮＡ抽出）、８．３．４節（逆転写）および８．３．５節（ｑＰＣＲ）に記載のプロトコールを使用してアッセイした。ＡＢＣＡ１（ＴａｑｍａｎプローブＭｍ００４４２６４６．ｍ１）の発現は、製造業者のプロトコールに従って決定した。使用した参照遺伝子は、ＨＰＲＴ１（Ｔａｑｍａｎプローブ：Ｍｍ００４４６９６８．ｍ１）であった。
【０３０５】
ＣＥＲ−００１（２５または２５０μｇ／ｍＬ）は、４時間で、ＡＢＣＡ１のｍＲＮＡレベルの半分を低下させることができた。ＨＤＬ３（２５０μｇ／ｍＬ）（何度か解凍／凍結された）の挙動は、ダウンレギュレーションが２５μｇ／ｍＬのＨＤＬ３で観察されなかったことを除いて、ＣＥＲ−００１と同様である。先に報告したように、ＡｐｏＡ−Ｉは、２５μｇ／ｍＬと２５０μｇ／ｍＬとのどちらの濃度でもｍＲＮＡのＡＢＣＡ１レベルを低下させなかった。ＡＢＣＡ１のｍＲＮＡの増加は、ＡｐｏＡ−Ｉ処置を用いて２時間および４時間に観察された（図１７）。
【０３０６】
８．４．７．試験Ｇ：ＣＥＲ−００１、ＨＤＬ３およびＡｐｏＡ−Ｉの存在下でＡＢＣＡ１およびＡＢＣＧ１のｍＲＮＡレベルの調節に及ぼすｃＡＭＰの効果
この試験では、ｃＡＭＰを用いた処置後のＪ７７４マクロファージにおける、ＡＢＣＡ１およびＡＢＣＧ１のｍＲＮＡレベルに及ぼすＣＥＲ−００１、ＨＤＬ３またはＡｐｏＡ−Ｉの効果を調べた。Ｊ７７４を６ウェルプレート（３００，０００個／ウェル）に播種し、酸化ＬＤＬをロードした。翌日、培地をＤＭＥＭ＋／−ｃＡＭＰ（３００μΜ）で置換した。ｃＡＭＰの存在／不在下で一晩インキュベーションした後、培地を除去し、ＣＥＲ−００１またはＨＤＬ３またはＡｐｏＡ−Ｉ（２５０μｇ／ｍＬ）と混合したＤＭＥＭを用いて６時間置換し、ＲｉｂｏＰｕｒｅ（商標）キットを用いて、製造業者のプロトコールに従ってＲＮＡを抽出した。遺伝子発現は、８．３．２節（ＲＮＡ抽出）、８．３．４節（逆転写）および８．３．５節（ｑＰＣＲ）に記載のプロトコールを使用してアッセイした。ＡＢＣＧ１（ＴａｑｍａｎプローブＭｍ００４３７３９０．ｍ１）およびＡＢＣＡ１（ＴａｑｍａｎプローブＭｍ００４４２６４６．ｍ１）の発現は、製造業者のプロトコールに従って決定した。使用した参照遺伝子は、ＨＰＲＴ１（Ｔａｑｍａｎプローブ：Ｍｍ００４４６９６８．ｍ１）である。
【０３０７】
ｃＡＭＰの存在下で、ＡＢＣＡ１のｍＲＮＡレベルの増加が観察された（図１８）。ＣＥＲ−００１またはＨＤＬ３（２５０μｇ／ｍＬ）の存在下では、ＡＢＣＡ１およびＡＢＣＧ１のｍＲＮＡレベルが低下し、一方で、ＡｐｏＡ−Ｉは変わらなかった。ｃＡＭＰの存在下では、ＡＢＣＡ１およびＡＢＣＧ１の濃度は、細胞をＣＥＲ−００１またはＨＤＬ３とインキュベートした時にＲＱ＝１に戻ったが、ＡＢＣＡ１の刺激（ＲＱ＝５〜６）には届かなかった（図１８および図１９）。ＡｐｏＡ−ＩおよびｃＡＭＰの存在下では、ＡＢＣＡ１のｍＲＮＡレベル（ＲＱ≒３）は、ＡｐｏＡ−Ｉ単独と比較して増加したが、ＤＭＥＭ＋ｃＡＭＰ（ＲＱ≒６）と同じレベルではなかった。
【０３０８】
８．４．８．試験Ｈ：ＣＥＲ−００１およびＨＤＬ３の存在下でのＪ７７４マクロファージにおけるＡＢＣＡ１タンパク質レベルの調節に及ぼす効果
この試験では、Ｊ７７４マクロファージにおけるＡＢＣＡ１のタンパク質レベルに及ぼすＣＥＲ−００１およびＨＤＬ３の効果を調べた。Ｊ７７４を６ウェルプレート（３００，０００個／ウェル）に播種し、酸化ＬＤＬをロードした。翌日、培地をＤＭＥＭで置換した。一晩平衡化した後、培地を除去し、ＣＥＲ−００１またはＨＤＬ３（２５０μｇ／ｍＬ）と混合したＤＭＥＭを用いて６時間置換し、細胞を溶解し、８．３．７節の方法に従って膜を分離した。サイトゾルおよび膜のタンパク質を１０％ＳＤＳ  ＰＡＧＥ上で分解し、ＡＢＣＡ１（ａｂ７３６０−希釈率１／１０００）に対しプローブ化した。ｉｍａｇｅＪ（登録商標）ソフトウェアを使用して、タンパク質レベルを定量した。
【０３０９】
ＣＥＲ−００１およびＨＤＬ３を用いて処置されたマクロファージについて、ＡＢＣＡ１タンパク質レベルの有意な低下が観察された（図２０および図２１）。ＡｐｏＡ−Ｉは、ＡＢＣＡ１のレベルに影響を及ぼさず、ｃＡＭＰの添加は、このレベルを大きく増加させた。ＣＥＲ−００１およびＨＤＬ３を２５０μｇ／ｍＬで６時間、Ｊ７７４マクロファージに添加することによって、ＡＢＣＡ１のｍＲＮＡおよびタンパク質レベルが減少した。
【０３１０】
８．４．９．試験Ｉ：ＣＥＲ−００１の濃度の増加の存在下でＡＢＣＡ１およびＡＢＣＧ１のｍＲＮＡレベルの調節に及ぼすｃＡＭＰの効果
この試験では、ｃＡＭＰを用いた処置後のＡＢＣＡ１およびＡＢＣＧ１のｍＲＮＡレベルに及ぼすＣＥＲ−００１の濃度の増加の効果を調べる。Ｊ７７４を６ウェルプレート（３００，０００個／ウェル）に播種し、酸化ＬＤＬをロードした。翌日、培地をＤＭＥＭ＋／−ｃＡＭＰ（３００μΜ）で置換した。ｃＡＭＰの存在／不在下で一晩インキュベーションした後、培地を除去し、種々の濃度（０、０．１、０．５、１、２、４、６、８、１０、１５および３０μｇ／ｍＬ）でＣＥＲ−００１と混合したＤＭＥＭを用いて６時間置換し、ＲｉｂｏＰｕｒｅ（商標）キットを用いて、製造業者のプロトコールに従ってＲＮＡを抽出した。遺伝子発現は、８．３．２節（ＲＮＡ抽出）、８．３．４節（逆転写）および８．３．５節（ｑＰＣＲ）に記載のプロトコールを使用してアッセイした。ＡＢＣＧ１（ＴａｑｍａｎプローブＭｍ００４３７３９０．ｍ１）およびＡＢＣＡ１（ＴａｑｍａｎプローブＭｍ００４４２６４６．ｍ１）の発現は、製造業者のプロトコールに従って決定した。使用した参照遺伝子は、ＨＰＲＴ１（Ｔａｑｍａｎプローブ：Ｍｍ００４４６９６８．ｍ１）である。
【０３１１】
ｃＡＭＰの存在下では、ＡＢＣＡ１およびＡＢＣＧ１のｍＲＮＡレベルについて増加が観察された（図２２、図２３、図２４、図２５および図２６）。ＡＢＣＡ１およびＡＢＣＧ１のｍＲＮＡレベルの低下は、４〜６μｇ／ｍＬの用量で観察され、最大でおおよそ１５μｇ／ｍＬであった。ｃＡＭＰの存在下でも不在下でもプロファイルが同様であったことから、ｃＡＭＰの活性化によって、ＡＢＣＡ１のレベルを低下させるのに充分なＣＥＲ−００１の用量は変化しなかった（図２６）。
【０３１２】
８．４．１０．試験Ｊ：ＣＥＲ−００１およびＨＤＬ３を用いた処置後のＡＢＣＡ１およびＡＢＣＧ１のｍＲＮＡの正常量への戻り
この試験では、ＣＥＲ−００１およびＨＤＬ３を用いた処置後に、ＡＢＣＡ１およびＡＢＣＧＩのｍＲＮＡの正常量に戻るために必要な時間を調べた。Ｊ７７４を、６ウェルプレート（６００，０００個／ウェル）でＤＭＥＭ１０％ＦＣＳに播種した。翌日、培地を血清不含のＤＭＥＭで置換し、ＣＥＲ−００１、ＨＤＬ３またはＡｐｏＡ−Ｉ（２５０μｇ／ｍＬ）を用いて２４時間処置した。培地を除去し、マクロファージをＤＭＥＭで洗浄した。ＣＥＲ−００１、ＨＤＬ３またはＡｐｏＡ−Ｉを除去した後の種々の時点（０、１、２、４、８および２４時間）で、ＲｉｂｏＰｕｒｅ（商標）キットを用いて、製造業者のプロトコールに従って細胞ＲＮＡを抽出した。遺伝子発現は、８．３．２節（ＲＮＡ抽出）、８．３．４節（逆転写）および８．３．５節（ｑＰＣＲ）に記載のプロトコールを使用してアッセイした。ＡＢＣＧ１（ＴａｑｍａｎプローブＭｍ００４３７３９０．ｍ１）、ＡＢＣＡ１（ＴａｑｍａｎプローブＭｍ００４４２６４６．ｍ１）およびＳＲ−ＢＩ（ＴａｑｍａｎプローブＭｍ００４５０２３４．ｍ１）の発現は、製造業者のプロトコールに従って決定した。使用した参照遺伝子は、ＨＰＲＴ１（Ｔａｑｍａｎプローブ：Ｍｍ００４４６９６８．ｍ１）である。
【０３１３】
ＣＥＲ−００１およびＨＤＬ３の処置後に、ＡＢＣＡ１およびＡＢＣＧ１のｍＲＮＡレベルの低下が観察された。ＡｐｏＡ−Ｉは、これらのｍＲＮＡのレベルに影響を及ぼさず、ＣＥＲ−００１およびＨＤＬ３は、ＳＲ−ＢＩのｍＲＮＡレベルを変化させなかった（図２７、図２８および図２９）。ＣＥＲ−００１処置後、ＡＢＣＡ１のｍＲＮＡレベルは、８時間超でベースラインに戻り、ＡＢＣＧ１では、ベースラインに８時間で届いたために戻りがさらに早かった。ＨＤＬ３処置後では、ＡＢＣＡ１のｍＲＮＡレベルは、およそ８時間でベースラインに戻り、ＡＢＣＧ１では、２時間から４時間が必要であった。ＣＥＲ−００１処置とＨＤＬ３処置との間に観察された違いは、恐らくＣＥＲ−００１の存在下ではｍＲＮＡがさらに低いレベルであることに起因する。ＡｐｏＡ−Ｉの除去によって、種々の時点（ＡＢＣＡ１については１時間、およびＡＢＣＧ１については４時間）で、ＡＢＣＡ１およびＡＢＣＧ１のｍＲＮＡレベルの増加が誘導された。ＣＴは、対照、すなわちＣＥＲ−００１、ＨＤＬ３またはＡｐｏＡ−Ｉを添加されることなく増殖したＪ７７４マクロファージを表す。
【０３１４】
８．４．１１．試験Ｋ：ＣＥＲ−００１およびＨＤＬ３によるＡＢＣＡ１およびＳＲ−ＢＩのｍＲＮＡの調節についてのマクロファージの特異性−肝細胞（マウスおよびヒト）への効果
この試験では、マウスおよびヒト肝細胞におけるＡＢＣＡ１およびＳＲ−ＢＩのｍＲＮＡレベルに及ぼすＣＥＲ−００１およびＨＤＬ３（２５ｇ／ｍＬでの）の効果を調べた。ＨｅｐＧ２（ヒト肝細胞）およびＨｅｐａ１−６（マウス肝細胞）を、６ウェルプレート（３００，０００個／ウェル）にＤＭＥＭ１０％ＦＣＳ中で播種した。３日後、ＣＥＲ−００１、ＨＤＬ３およびＡｐｏＡ−Ｉ（ＤＭＥＭ中０．２５、２５および２５０μｇ／ｍＬ）を肝細胞に６時間添加し、ＲｉｂｏＰｕｒｅ（商標）キットを用いて、製造業者のプロトコールに従ってＲＮＡを抽出した。遺伝子発現は、８．３．２節（ＲＮＡ抽出）、８．３．４節（逆転写）および８．３．５節（ｑＰＣＲ）に記載のプロトコールを使用してアッセイした。ＡＢＣＡ１（それぞれＨｅｐＧ２およびＨｅｐａ１−６に用いるためのＴａｑｍａｎプローブＨｓ０１０５９１１８．ｍ１およびＭｍ００４４２６４６．ｍ１）ならびにＳＲ−ＢＩ（それぞれＨｅｐＧ２およびＨｅｐａ１−６に用いるためのＴａｑｍａｎプローブＨｓ００９６９８２１．ｍ１およびＭｍ００４５０２３４．ｍ１）の発現は、製造業者のプロトコールに従って決定した。使用した参照遺伝子は、Ｈｅｐａ１−６にはＨＰＲＴ１（ＴａｑｍａｎプローブＭｍ００４４６９６８．ｍ１）であり、ＨｅｐＧ２細胞にはＧＡＰＤＨ（Ｔａｑｍａｎプローブ：Ｈｓ０３９２９０９７．ｇ１）である。
【０３１５】
ヒト肝細胞では、ＣＥＲ−００１、ＨＤＬ３およびＡｐｏＡ−Ｉの処置について、ＡＢＣＡ１およびＳＲ−ＢＩのｍＲＮＡレベルの有意な低下は観察されなかった（図３０および図３１）。マウス肝細胞では、２５０μｇ／ｍＬでのＣＥＲ−００１およびＨＤＬ３の処置について、ＡＢＣＡ１のｍＲＮＡレベルに２分の１への低下が観察された（図３２および図３３）。ＡｐｏＡ−Ｉを用いた２５０μｇ／ｍＬでの処置によって、マウス肝細胞で、ＡＢＣＡ１のｍＲＮＡレベルが２５％低下した。
【０３１６】
８．４．１２．試験Ｌ：ＣＥＲ−００１およびＨＤＬ３によるＡＢＣＡ１のダウンレギュレーション後のＡｐｏＡ−Ｉ添加の結果
この試験では、ＣＥＲ−００１およびＨＤＬ３によるＡＢＣＡ１およびＡＢＣＧ１のダウンレギュレーション後の遺伝子発現に及ぼすＡｐｏＡ−Ｉ添加の効果を調べた。Ｊ７７４を、６ウェルプレート（３００，０００個／ウェル）にＭＥＭ２．５％ＦＣＳ中で播種した。平衡化した後（ＤＭＥＭ）、ＣＥＲ−００１、ＨＤＬ３およびＡｐｏＡ−Ｉを２５０μｇ／ｍＬで一晩添加する。翌日、培地を、ＡｐｏＡ−Ｉ（２５または２５０μｇ／ｍＬ）を補うか補わない新鮮なＤＭＥＭに置換して、ＡｐｏＡ−Ｉコレステロール流出を２時間開始させた。実験を種々の時点で停止させた：１）Ｊ７７４をＡｐｏＡ−Ｉの添加前に停止、２）Ｊ７７４＋ＤＭＥＭ（２時間の受動流出）、３）Ｊ７７４＋ＡｐｏＡ−Ｉ（２５μｇ／ｍＬ）を２時間、および４）Ｊ７７４＋ＡｐｏＡ−Ｉ（２５０μｇ／ｍＬ）を２時間。ＲＮＡは、ＲｉｂｏＰｕｒｅ（商標）キットを用いて、製造業者のプロトコールに従って抽出した。遺伝子発現は、８．３．２節（ＲＮＡ抽出）、８．３．４節（逆転写）および８．３．５節（ｑＰＣＲ）に記載のプロトコールを使用してアッセイした。ＡＢＣＡ１（ＴａｑｍａｎプローブＭｍ００４４２６４６．ｍ１）、ＡＢＣＧ１（ＴａｑｍａｎプローブＭｍ００４３７３９０．ｍ１）、およびＳＲ−Ｂｌ（ＴａｑｍａｎプローブＭｍ００４５０２３４．ｍ１）の発現は、製造業者のプロトコールに従って決定した。使用した参照遺伝子は、ＨＰＲＴ１（Ｔａｑｍａｎプローブ：Ｍｍ００４４６９６８．ｍ１）である。
【０３１７】
２５０μｇ／ｍＬでＡｐｏＡ−Ｉを添加することによって、２時間後にＡＢＣＡ１のｍＲＮＡレベルが増加した（ＤＭＥＭ条件−４番目のバー）（図３４）。６時間でレベルがベースラインに戻ったことから、この増加は一過的であった（実験Ｆを参照）。ＣＥＲ−００１またはＨＤＬ３の添加によって、ＡＢＣＡ１のｍＲＮＡレベルは大きく低下した（黒いバー）。リポタンパク質の除去から２時間後、ＡＢＣＡ１のｍＲＮＡレベルは、以前の結果通りに増加しており（実験１を参照）、この増加は、ＡｐｏＡ−Ｉを２５０μｇ／ｍＬで添加することによって促進された。２５０μｇ／ｍＬのＡｐｏＡ−Ｉとのマクロファージのプレインキュベーションによって、ＡＢＣＡ１のｍＲＮＡレベルは変化しなかった。また、ＤＭＥＭ＋２５０μｇ／ｍＬ  ＡｐｏＡ−Ｉによる顕著な刺激が、２５０μｇ／ｍＬ  ＡｐｏＡ−Ｉとのプレインキュベーションを伴う条件でも観察された。種々の条件で、ＡＢＣＧ１のｍＲＮＡの調節について、同様のプロファイルが観察された（図３５）。ＳＲ−ＢＩのｍＲＮＡは、ＨＤＬ３の存在下で増加したが、他の条件では増加しなかった（図３６）。供試した種々の条件で、ＡｐｏＡ−Ｉの添加により、ＳＲ−ＢＩのｍＲＮＡレベルは変化しなかった。
【０３１８】
８．４．１３．試験Ｍ：ＨＤＬ２によるＪ７７４マクロファージにおけるＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ１およびＳＲ−ＢＩのｍＲＮＡの細胞レベルの調節
この試験では、マウスマクロファージにおけるＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ１およびＳＲ−ＢＩのｍＲＮＡレベルに及ぼすＨＤＬ２の効果を調べた。ＨＤＬ２は、ＨＤＬ３と比較してさらに大きく、かつさらに成熟したリポタンパク質であり、ＨＤＬ２は、ＡＢＣＧ１と相互作用し、ＨＤＬ３は、ＡＢＣＡ１と相互作用する。Ｊ７７４を６ウェルプレート（３００，０００個／ウェル）に播種し、酸化ＬＤＬをロードした。ＨＤＬ２（２．５から１０００μｇ／ｍＬまで）をマクロファージ上に６時間添加し、ＲｉｂｏＰｕｒｅ（商標）キットを用いて、製造業者のプロトコールに従ってＲＮＡを抽出した。遺伝子発現は、８．３．２節（ＲＮＡ抽出）、８．３．４節（逆転写）および８．３．５節（ｑＰＣＲ）に記載のプロトコールを使用してアッセイした。ＡＢＣＡ１（ＴａｑｍａｎプローブＭｍ００４４２６４６．ｍ１）、ＡＢＣＧ１（ＴａｑｍａｎプローブＭｍ００４３７３９０．ｍ１）、およびＳＲ−Ｂｌ（ＴａｑｍａｎプローブＭｍ００４５０２３４．ｍ１）の遺伝子発現は、製造業者のプロトコールに従って決定した。使用した参照遺伝子は、ＨＰＲＴ１（Ｔａｑｍａｎプローブ：Ｍｍ００４４６９６８．ｍ１）である。実験に使用したＨＤＬ２は、新たにＰＢＳ溶液に対し透析したものである。
【０３１９】
７５μｇ／ｍＬを超えるＨＤＬ２処置について、マウスマクロファージにおけるＡＢＣＡ１およびＡＢＣＧ１のｍＲＮＡレベルの有意な低下が観察された（図３７および図３８）。ＳＲ−ＢＩのｍＲＮＡレベルは、７５μｇ／ｍＬを超えるＨＤＬ２濃度について増加し始めた。（図３９）。
【０３２０】
８．４．１４．試験Ｎ：シクロデキストリンによるＪ７７４マクロファージにおけるＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ１およびＳＲ−ＢＩのｍＲＮＡの細胞レベルの調節−シクロデキストリン存在下におけるコレステロール流出の決定
この試験は、細胞内コレステロール濃度が、ＣＥＲ−００１およびＨＤＬ３を用いて観察されるマウスＪ７７４マクロファージにおけるＡＢＣＡ１およびＡＢＣＧ１のダウンレギュレーションに関与しうるか否かを、β−シクロデキストリンを使用して調べた。β−シクロデキストリンは、環状のオリゴ糖であり、ステロールに高特異的に水に溶解することができるため、細胞からコレステロールを流出させることが可能である。Ｊ７７４を２４ウェルプレート（６０，０００個／ウェル）に播種し、３Ｈ−コレステロール酸化ＬＤＬをＤＭＥＭ２．５％ＦＣＳにロードした。２４時間の平衡化の後（ＤＭＥＭ）、β−シクロデキストリン（０．０３、０．１、０．３、１、３、１０および３０ｍＭ）を６時間添加した。流出率は、８．３．６節のプロトコールを使用してアッセイし、以下のように決定した：培地ＤＰＭ／（培地ＤＰＭ＋細胞ＤＰＭ）＊１００。３０ｍＭの用量は、毒性を有し、細胞集団の半分を死滅させたため、最終的なグラフには表示されていない。
【０３２１】
β−シクロデキストリンによるコレステロール流出について用量依存的な増加が観察された（図４０）。
【０３２２】
８．４．１５．試験Ｏ：シクロデキストリンによるＪ７７４マクロファージにおけるＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ１およびＳＲ−ＢＩのｍＲＮＡの細胞レベルの調節−遺伝子発現の決定
この試験では、細胞内コレステロール濃度が、ＣＥＲ−００１およびＨＤＬ３を用いて観察されるマウスＪ７７４マクロファージにおけるＡＢＣＡ１およびＡＢＣＧ１のダウンレギュレーションに関与しうるか否かを、β−シクロデキストリンを使用して調べた。Ｊ７７４を６ウェルプレート（３００，０００個／ウェル）に播種し、β−シクロデキストリン（０．０３、０．１、０．３、１、３、１０および３０ｍＭ）をマクロファージ上に６時間添加し、ＲｉｂｏＰｕｒｅ（商標）キットを用いて、製造業者のプロトコールに従ってＲＮＡを抽出した。遺伝子発現は、８．３．２節（ＲＮＡ抽出）、８．３．４節（逆転写）、および８．３．５節（ｑＰＣＲ）に記載のプロトコールを使用してアッセイした。ＡＢＣＡ１（ＴａｑｍａｎプローブＭｍ００４４２６４６．ｍ１）、ＡＢＣＧ１（ＴａｑｍａｎプローブＭｍ００４３７３９０．ｍ１）、およびＳＲ−ＢＩ（ＴａｑｍａｎプローブＭｍ００４５０２３４．ｍ１）の遺伝子発現は、製造業者のプロトコールに従って決定した。使用した参照遺伝子は、ＨＰＲＴ１（Ｔａｑｍａｎプローブ：Ｍｍ００４４６９６８．ｍ１）である。
【０３２３】
β−シクロデキストリンの存在下において、ＡＢＣＡ１およびＡＢＣＧ１のｍＲＮＡレベルについてのＪ７７４における用量依存的な低下が観察された（図４１および図４２）。対照的に、ＳＲ−ＢＩは、β−シクロデキストリンにより用量依存的な増加を示した（図４４）。
【０３２４】
８．４．１６．試験Ｐ：シクロデキストリンによるＪ７７４マクロファージにおけるＳＲＥＢＰ１、ＳＲＥＢＰ２およびＬＸＲのｍＲＮＡの細胞レベルの調節−遺伝子発現の決定
この試験では、Ｊ７７４マクロファージでのＬＸＲ、ＳＲＥＢＰ１およびＳＲＥＢＰ２のｍＲＮＡ発現に及ぼすβ−シクロデキストリンの効果を、β−シクロデキストリンを使用して調べた。Ｊ７７４を６ウェルプレート（３００，０００個／ウェル）に播種し、β−シクロデキストリン（０．０３、０．１、０．３、１、３、１０および３０ｍＭ）をマクロファージ上に６時間添加し、ＲｉｂｏＰｕｒｅ（商標）キットを用いて、製造業者のプロトコールに従ってＲＮＡを抽出した。遺伝子発現は、８．３．２節（ＲＮＡ抽出）、８．３．４節（逆転写）、および８．３．５節（ｑＰＣＲ）に記載のプロトコールを使用してアッセイした。ＳＲＥＢＰ−１、ＳＲＥＢＰ−２およびＬＸＲの遺伝子発現は、Ｔａｑｍａｎプローブ（それぞれＭｍ０１１３８３４４．ｍ１、Ｍｍ０１３０６２９２．ｍ１、Ｍｍ００４４３４５１．ｍ１）を用いて、製造業者のプロトコールに従って決定した。使用した参照遺伝子は、ＨＰＲＴ１（Ｔａｑｍａｎプローブ：Ｍｍ００４４６９６８．ｍ１）である。
【０３２５】
ＬＸＲのｍＲＮＡについて、β−シクロデキストリンの濃度の増加に伴う有意な変化は観察されなかった（図４４）。ＳＲＥＢＰ−２のｍＲＮＡは、最も低い用量のβ−シクロデキストリンで増加し、プラトーに達した（図４６）。ＳＲＥＢＰ−１のｍＲＮＡについて（図４５）、ＣＥＲ−００１およびＨＤＬ３処置を用いて観察されたものと同様に、用量依存的な低下が観察された。
【０３２６】
９．実施例３：ＣＥＲ−００１を用いて処置されたＡｐｏ−／−マウス流動停止モデルにおけるプラーク退縮の測定
９．１．序論
試験Ａ〜Ｆの目的は、高脂肪食を摂食させたアポＥ−／−マウスの結紮された左頸動脈において種々のＣＥＲ−００１濃度がプラーク退縮に及ぼす効能を測定することであった。
【０３２７】
９．２．材料および方法
９．２．１．概論
これらの試験に使用した材料は、ＣＥＲ−００１（Ｖｉｖａｆｌｏｗ  ３０ＫＤａカセット膜によって濃縮した１１０９ＨＤＬ０３−２Ｘ２４０９１３バッチ）および精製ヒトＨＤＬ３を含んでいた。実験前に、ＣＥＲ−００１およびＨＤＬ３の製剤を、少なくとも８アリコート／リポタンパク質濃度（群の注射当たり使用する１アリコート）に分けた。注射前に、１アリコートの製剤を、約３７℃の水浴中で５分インキュベートすることによって解凍し、穏やかに旋回させて混合した。製剤は、起泡を防ぐため、攪拌したり勢いよく振盪させたりするべきではない。溶液が濁るか、または目視で粒子が観察された場合には、溶液を約３７℃でさらに３０分間、水浴中でインキュベートした。
【０３２８】
リン酸緩衝スクロース希釈液（１０ｍＭリン酸、４％スクロース、および２％マンニトール、ｐＨ＝７．４）を調製し、分注し、約−２０℃で保存した。プラセボ溶液を種々の濃度のＣＥＲ−００１およびＨＤＬ３調製のために使用した。
【０３２９】
９．２．２．動物
これらの試験に使用した動物は、Ｃ５７Ｂｌ／６−Ｂ６．１２９Ｐ２−Ａｐｏｅｔｍ１Ｕｎｃ／Ｊ系統のマウスであった。この系統は、Ｊａｃｋｓｏｎ研究所に由来し、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒによって分与されている。この種および系統は、コレステロール代謝の研究に用いられる特徴がよく調べられたモデルである。選定基準は以下を含む：体重：２１グラム（８週齢）、２３グラム（９週齢）および２５グラム（１２週齢）；年齢：食餌および生殖の開始時に８、９および１２週；および数：雄、ｎ＝１２５（群当たり１２頭のマウス）。
【０３３０】
動物を、Ｐｒｏｌｏｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈの動物施設で、最大１２頭／ケージの群ずつ収容した。Ｐｒｏｌｏｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈは、フランス獣医局から認証番号Ａ−３１−２５４−０１を取得済みである。各ケージでは、動物の幸福に２つのイグルーを追加した。試験を始める前に、動物を５日間順応させた（０９／１８から０９／２３まで）。動物は、水および高コレステロール食にアクセスさせた（０．２％コレステロール、３９．９％脂肪、１４．４％タンパク質、４５．７％糖）。全ての動物を、同様に管理し、Ｐｒｏｌｏｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈの動物施設で広く運用されていた実践に従って、動物の幸福に充分に配慮した。試験計画は、Ｐｒｏｌｏｇｕｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ倫理委員会によって受理された（Ｎ℃ＥＦ−２０１１−ＣＥＲ−０９）。
【０３３１】
動物室の条件を以下の通りとした：温度：２１±１℃、相対湿度：５０±１０％、および明期／暗期サイクル：１２時間／１２時間（０７Ｈ／１９Ｈ）。各月に、動物室の条件の報告を編集した。各動物を毎週秤量した。動物は、実験の始めに挿入した耳環によって同定した。
【０３３２】
９．２．３．処置
動物を、群当たり１２頭ずつ１０群に分け、表４に示されるように処置した。
【０３３３】
【表４】
2017515893.tif 000007
【０３３４】
イソフルランで麻酔したマウスの眼窩後方の静脈に、２日に１回で８回、製剤を注射した（５０μＬ／マウス）。投与した用量は、各ケージにおけるマウスの体重の平均に基づいた。化合物は、毎日午前１０時に注射した。血液をサンプリングするため、一晩絶食させたマウスから、以下に指示した用量で１回サンプリングした：（１）投与前（午前９時）に眼窩後方からの引き抜きによる：最初の注射の２４時間前／外科的処置の日；（２）投与後（午前９時）に眼窩後方からの引き抜きによる：最後の注射から２４時間後；および（３）ｔ＝０（午前９時）かつ５回目の注射後の指示された時点で尾からの引き抜きによる。血液試料の変化を避けるために、採集後直ちに、血液試料を約＋４℃に保った。血液検体を遠心分離し（８００×ｇ、１０分間、＋４℃）、将来的な分析のために血漿を取り置いた。
【０３３５】
９．２．４．外科的処置
器官を採集するため、最後の注射の２４時間後に、ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）の混合物を腹腔内に注射してマウスを麻酔し、動物は２〜３分後に眠りに落ちた。血液を毛管作用によって引き抜き（眼窩後方静脈−およそ２００μＬの血液）、ＥＤＴＡを入れたチューブに移した。次いで、腹と胸郭の切開を行った。心臓を右室にてＰＢＳで灌流して、最初の洗浄を行い、必要に応じて、左室でも行った。液体は、胸大動脈によって流すべきものとした。
【０３３６】
左右の頸動脈、肝臓、脾臓、および心臓につながる大動脈を取り出し、−８０℃で保存した。肝臓を、４つの異なるアリコートに採集した。器官を採集した後、残りの生物学的検体を廃棄した。糞便を採集するため、各群について最後に注射した日に、ケージを新しい敷き藁に交換し、糞便を２４時間採集した（屠殺日）。
【０３３７】
９．２．５．総血漿コレステロールの決定
実験手順：各チューブにコレステロール標品（２ｇ／Ｌ）：０／０．６２５／１．２５／１．８７５／２．５／３．７５／５μＬを添加する。血漿試料を１２，０００×ｇで１分間遠心分離する。種に応じて、表５に示すように、各チューブ内に試料を添加する。０．５ｍｌの再構成緩衝液を各チューブ（標品および試料）に添加し、ボルテックスし、３７℃で５分間インキュベートする。各チューブから１５０μＬを、９６ウェルプレートのうち２つの異なるウェルに移す。５００ｎＭでの吸光度を読み取る。
【０３３８】
【表５】
2017515893.tif 000008
【０３３９】
９．２．６．血漿中の非エステル化コレステロールの決定
実験手順：各チューブにコレステロール標品（２ｇ／Ｌ）：０／０．６２５／１．２５／１．８７５／２．５／３．７５／５μＬを添加する。血漿試料を１２，０００×ｇで１分間遠心分離する。種に応じて、表６に示すように、各チューブ内に試料を添加する。０．５ｍｌの再構成緩衝液を各チューブ（標品および試料）に添加し、ボルテックスし、３７℃で５分インキュベートする。各チューブから１５０μＬを、９６ウェルプレートのうち２つの異なるウェルに移す。５００ｎＭにおける吸光度を読み取る。
【０３４０】
【表６】
2017515893.tif 000009
【０３４１】
９．２．７．ＲＰ  Ｃ１８  ＨＰＬＣによるコレステロールの決定
装置：ＨＰＬＣ（ＷａｔｅｒｓバイナリＨＰＬＣポンプ１５２５、ＷａｔｅｒｓＵＶ／可視検出器２４８９、Ｗａｔｅｒｓサンプルマネージャ２７６７、Ｍａｓｓｌｙｎｘソフトウェア（４．１）、カラム：ＲＰ  Ｃ１８  Ｚｏｒｂａｘ  ４．６ｍｍ×２５ｃｍ、粒径１０μｍ（または同等）、アセトニトリルＨＰＬＣグレード、無水エタノール、水（ｍｉｌｌｉＱ）、無水エタノール中標品コレステロール０．１ｇ／Ｌ。
【０３４２】
クロマトグラフィーのパラメータ：溶離液Ａ：８６％アセトニトリル、１０％エタノール、４％水；溶離液Ｂ：８６％アセトニトリル、１４％エタノール。使用前に溶離液をソニケーター浴中で５分間超音波処理する。流速：１．５ｍＬ／分；圧力：１４００ＰＳＩ；検出：ＵＶ２１４ｎｍ；ラン時間：２０分；注射：２５から１００μＬ；表７に示す勾配プログラム。
【０３４３】
【表７】
2017515893.tif 000010
【０３４４】
試料：９．２．８節の方法に従って、試料を調製する。マイクロバイアル内に５０μＬのエタノール抽出物を添加し、４０μＬをＨＰＬＣ内に注入する。２１４ｎｍでのピーク面積を決定し、抽出物中の濃度を算出する：［コレステロール試料］（μｇ／μＬ）＝ピーク面積／傾き／注入体積
【０３４５】
９．２．８．肝臓からのコレステロールの抽出
ステップ１：約５０ｍｇの肝臓を秤量し、ガラスチューブに組織を入れる。３ｍＬのＭｅＯＨ中で組織をホモジナイズする（Ｔｕｒｒａｘ（登録商標））。
【０３４６】
ＥＤＴＡ  ５ｍＭ（２：１）。３ｍＬのクロロホルムおよび３ｍＬのＨ２Ｏを添加し、５分間ボルテックスする。１，５００×ｇで１０分間遠心分離し、下方の相を採集する。溶液を２つのガラスチューブ（小）に等体積（２ｘ１．３ｍＬ）で分割する。
【０３４７】
ステップ２：以下のように溶液を処置する。
非エステル化コレステロール：溶液を乾燥する。４００μＬのＥｔＯＨを添加し、試料を可溶化する。
総コレステロール：溶液を乾燥する。１ｍＬの０．５Ｍ  ＫＯＨメタノール溶液を添加する。６０℃で少なくとも１時間インキュベートする。１ｍＬのクロロホルムおよび１ｍＬのＨ２Ｏを試料に添加し、ボルテックスし、１，５００×ｇで１０分間遠心分離し、下方の相を採集することによって、ＢｌｉｇｈおよびＤｙｅｒの脂質抽出を実施する。有機相を乾燥する。４００μＬのＥｔＯＨを添加して、試料を可溶化する。
【０３４８】
９．２．９．頸動脈または大動脈からのコレステロールの抽出
ステップ１：外科用ストラップを取り外して（頸動脈用のみ）、ガラスチューブに組織を入れる。１．８ｍＬのＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（２：１）を頸動脈用に、３ｍＬを大動脈用に添加する。４℃で一晩混合する。
【０３４９】
ステップ２：頸動脈または大動脈を取り出し、乾燥し、秤量する。有機溶液（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ）を２つのガラスチューブ（小）に等体積に分ける。溶液を以下のように処置する。
非エステル化コレステロール：溶液を乾燥する。２００μＬのＥｔＯＨを添加し、試料を可溶化する。
総コレステロール：溶液を乾燥する。１ｍＬの０．１Ｍ  ＫＯＨエタノール溶液を添加する。６０℃で少なくとも１時間インキュベートする。１ｍＬのクロロホルムおよび１ｍＬのＨ２Ｏを試料に添加し、ボルテックスし、１，５００×ｇで１０分間遠心分離し、下方の相を採集することによって、ＢｌｉｇｈおよびＤｙｅｒの脂質抽出を実施する。有機相を乾燥する。２００μＬのＥｔＯＨを添加して、試料を可溶化する。
【０３５０】
９．３．Ｉｎ  ｖｉｖｏプラーク進行試験Ａ〜Ｆの結果
９．３．１．試験Ａ：結紮された左頸動脈におけるアテローム動脈硬化性プラークの決定
この試験では、高脂肪食を摂食させたａｐｏＥ−／−マウス由来の結紮された頸動脈における、プラークの進行に及ぼすＣＥＲ−００１投与の効果を調べた。マウスの各群について、脂質抽出およびＨＰＬＣ分析の後に、頸動脈のコレステロール含有量を試験した。屠殺した日に、結紮された頸動脈を採集し、−８０℃で保存した。有機溶液を用いて脂質を抽出し、ＨＰＬＣでコレステロール濃度を決定した。
【０３５１】
９．２．９節の方法に従って、結紮された頸動脈を脂質抽出に供した。頸動脈（新鮮重）から外科用ストラップを取り外して、組織をガラスチューブに入れた。これに、１．８ｍＬのＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（２：１）を添加し、４℃で一晩混合した。次いで、頸動脈を取り出し、乾燥し、秤量し、有機溶液（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ）を２つのガラスチューブに等体積で分けた。非エステル化コレステロール（ＵＣ）については、１００μＬのβ−シトステロール（内部標準）を添加し、溶液を乾燥した。これに、２００μＬのＥｔＯＨを添加して試料を可溶化し、試料をＨＰＬＣでＵＣについて分析した。総コレステロール（ＴＣ）については、１００μＬのβ−シトステロール（内部標準）を添加し、溶液を乾燥した。これに、１ｍＬの０．１Ｍ  ＫＯＨメタノール溶液を添加し、溶液を６０℃で少なくとも３０分間、インキュベートした。ＢｌｉｇｈおよびＤｙｅｒ手順を実施してコレステロールを抽出し、この手順では、１ｍＬのクロロホルムを添加した後、１ｍＬのＨ２Ｏを添加し、ボルテックスで混合した。相が分離した際に、下方の相を採集して乾燥した。これに、２００μＬのＥｔＯＨを添加して試料を可溶化し、ＨＰＬＣによってＴＣを分析した。コレステロール濃度は、９．２．７節の方法に従ってＨＰＬＣで決定した。簡単に述べれば、５０μＬをＣ１８  Ｚｏｒｂａｘ：ＳＢ−Ｃ１８  ４．６×２５０ｍｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ参照番号８８０９７５−９０２）カラムに注入した。流速は、６０％の溶離液Ａ（ＡＣＮ／ＥＴＯＨ／Ｈ２Ｏ  ８５／１０／５）および４０％の溶離液Ｂ（ＡＣＮ／ＥＴＯＨ  ８６／１４）で１．５ｍＬ／分とした。ラン時間は５５分とし、そのうちコレステロールの保持時間は２２．８５分であり、β−シトステロールの保持時間は３２．２分であった。システム：バイナリポンプＷａｔｅｒｓ１５２５−２１４ｎｍに設定されたＵＶ検出器−ソフトウェア：Ｍａｓｓｓｌｙｎｘ４．１。
【０３５２】
ＣＥＲ−００１またはＨＤＬ３で処置したマウスの結紮された頸動脈におけるコレステロール含有量について、同様のプロファイルが観察された（図４７および図４８）。２、５および１０ｍｇ／ｋｇの濃度について、非エステル化コレステロールに２５％の低下が観察され、結紮された頸動脈における総コレステロール含有量に５０％の低下が観察された。ＣＥＲ−００１およびＨＤＬ３を用いた処置について、２０および５０ｍｇ／ｋｇの用量に対するプラーク進行の阻害は、おおよそ１０％である。
【０３５３】
９．３．２．試験Ｂ：ＣＥＲ−００１注入後の血漿コレステロールの動員の決定
この試験では、高脂肪食を摂食させたａｐｏＥ−／−マウスにおけるリポタンパク質プロファイルに及ぼすＣＥＲ−００１投与の結果を調べた。５回目の注入後の種々の時点で血液を採集して解析した。投与前の血漿（最初の注射の前）および投与後の血漿（最後の注射の２４時間後）を比較した。総コレステロールおよび非エステル化コレステロールならびにヒトＡｐｏＡ−Ｉの含有量について血漿を分析した。
【０３５４】
総コレステロールおよび非エステル化コレステロール濃度を、それぞれ９．２．５節および９．２．６節のプロトコールに従って決定した。総コレステロールから非エステル化コレステロールを差し引いた後、コレステロールエステル濃度を決定した。５回目の投与の後、群当たり１２頭のマウスに関して、コレステロールの動員を決定した（注射１時間前；注射から１時間後、２時間後、４時間後、および２４時間後）。動物を一晩、絶食させた。
【０３５５】
ＣＥＲ−００１およびＨＤＬ３を注入した後、総血漿コレステロールの動員に有意な変化は観察されなかった（図４９および図５０）。ＣＥＲ−００１またはＨＤＬ３を注入した後、非エステル化コレステロールの動員に有意な変化は観察されなかった（図５１および図５２）。５０ｍｇ／ｋｇでのＣＥＲ−００１によって、注入の２時間後および４時間後に血漿中非エステル化コレステロール濃度が増加したようであった。
【０３５６】
総コレステロール濃度および非エステル化コレステロール濃度が、ＣＥＲ−００１処置された動物では、ＨＤＬ３処置されたマウスと比較して２倍高かったことを除けば、ＣＥＲ−００１およびＨＤＬ３についての投与後のプロファイルは同様であった（図５３および図５４）。ＣＥＲ−００１では、１０ｍｇ／ｋｇを超える用量によって、８回の注射後に、マウス血漿中のコレステロール濃度がプラセボと比較して増加した。ＨＤＬ３の注入によって、コレステロール濃度はプラセボより大きく増加しなかった。
【０３５７】
９．３．３．試験Ｃ：血漿ヒトＡｐｏＡ−Ｉの決定
この試験では、ＣＥＲ−００１を注入した後の血漿中のヒトＡｐｏＡ−Ｉの濃度を決定することによって、ＣＥＲ−００１注入の反応速度論を調べた。血漿中のＡｐｏＡ−Ｉ濃度を、製造業者の取扱説明書に従い、ＥＬＩＳＡ（アッセイＰｒｏＥＡ５２０１−１）によって決定した。ＡｐｏＡ−Ｉを決定する前に、マウスに注射されたＣＥＲ−００１およびＨＤＬ３の濃度に応じて、血漿を１／１００、１／５０または１／１０に希釈した。
【０３５８】
ＣＥＲ−００１によって、ヒトＡｐｏＡ−Ｉ血漿濃度の用量依存的な増加が観察された。供試した全ての濃度について、血漿中のＡｐｏＡ−Ｉの予想される用量が回復した（図５５）。ＨＤＬ３について、ヒトＡｐｏＡ−Ｉ血漿濃度に用量依存的な増加が観察された（図５６）。しかし、ヒト血漿ＡｐｏＡ−Ｉは、予想された用量よりも３分の１少ない濃度である。
【０３５９】
９．３．４．試験Ｄ：結紮された頸動脈におけるＡＢＣＡ１発現のウェスタンブロットの決定
この試験では、マウスの結紮された頸動脈におけるコレステロール含有量に、低下（５ｍｇ／ｋｇ  ＣＥＲ−００１）および効果のないこと（５０ｍｇ／ｋｇ  ＣＥＲ−００１）が観察された時に、ＡＢＣＡ１の発現が、コレステロール含有量の差に関連しうるか否かを調べた。クロロホルム：メタノールを用いて既に抽出した、結紮された頸動脈を、０．１Ｎ  ＮＡＯＨ（１００μＬ／頸動脈）に可溶化した。溶液を少しの間超音波処理し、１５，０００×ｇで１０分間遠心分離した。Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイを用いてタンパク質濃度を決定し、４０μｇの試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードした。ｉｍａｇｅＪ（登録商標）ソフトウェアを使用して、ＡＢＣＡ１発現（ａｂ７３６０−希釈率１／１０００）を定量した。
【０３６０】
５０ｍｇ／ｋｇ用量でのＣＥＲ−００１およびＨＤＬ３について、頸動脈のＡＢＣＡ１含有量に低下が観察された（図５７）。ＣＥＲ−００１およびＨＤＬ３の両方について、５ｍｇ／ｋｇ用量は、ＡＢＣＡ１の発現に影響を及ぼさなかった。結紮された頸動脈におけるＡＢＣＡ１の発現は、５０ｍｇ／ｋｇのＣＥＲ−００１およびＨＤＬ３用量についてダウンレギュレーションされた。それらのマクロファージのコレステロール流出は、弱まっていた可能性があり、このことは、５０ｍｇ／ｋｇの濃度にはプラークコレステロール含有量への効果がないことを説明しうるものであった。
【０３６１】
９．３．５．試験Ｅ：マウス肝臓におけるＳＲ−ＢＩおよびＡＢＣＡ１の決定
この試験では、ＣＥＲ−００１の最後の注射から２４時間後の肝臓におけるＳＲ−ＢＩおよびＡＢＣＡ１タンパク質の含有量を調べた。少しの間超音波処理することによって、肝臓片（５０ｍｇ）をＰＢＳ（５００μＬ）に溶解した。この試料を遠心分離し（８００×ｇを１０分間）、ペレットを廃棄した。上清を４℃、１６，０００×ｇで３０分間遠心分離し、ＰＢＳ  １％Ｔｒｉｔｏｎ×１００（２００μＬ）を用いて、ペレットを可溶化した。１０μｇの可溶化ペレットを１０％ＳＤＳ  ＰＡＧＥにロードし、ｉｍａｇｅＪ（登録商標）ソフトウェアを使用して、ＡＢＣＡ１発現（ａｂ７３６０−希釈率１／１０００）またはＳＲ−ＢＩ発現（ａｂ２４６０３−希釈率１／１０００）を定量した。
【０３６２】
ＡＢＣＡ１頸動脈の含有量とは対照的に、マウス肝臓では、ＣＥＲ−００１の濃度の増加に伴って、ＡＢＣＡ１タンパク質レベルの増加が観察された（図５８）。この解離は、以下によって説明される：ｉ）細胞集団が異なっていたこと、すなわち、頸動脈では、細胞集団がマクロファージおよび内皮細胞から構成され、肝臓では、細胞集団は大部分が肝細胞であること、ｉｉ）ＣＥＲ−００１の形態およびその機能が、両方の場合で異なっていること、すなわち、頸動脈では、ＣＥＲ−００１がコレステロール中であまり荷電しておらず、その機能は細胞からコレステロールを流出させるものであり、肝臓では、ＣＥＲ−００１はロードされたコレステロールであって、その機能は肝臓によって排除されることになること。ＡＢＣＡ１発現は、コレステロール含有量によって強固に調節されることから、コレステロールが乏しい環境（例えばコレステロール流出が高い）では、ＡＢＣＡ１発現は低下し、コレステロールが豊富な環境（コレステロール取り込み）では、ＡＢＣＡ１発現は増加するものと仮定された。ＳＲ−ＢＩについては、ＣＥＲ−００１の濃度の増加に伴ってタンパク質レベルに有意な変化は観察されなかった（図５９）。
【０３６３】
９．３．６．試験Ｆ：マウス糞便におけるコレステロール含有量の決定
この試験では、種々の濃度のＣＥＲ−００１およびＨＤＬ３について、マウス糞便におけるコレステロール含有量を分析した。糞便を脂質抽出に供し、そのコレステロール含有量をＨＰＬＣで分析した。糞便（２００ｍｇ）をメタノール：水（５０：５０）溶液に可溶化し、Ｔｕｒｒａｘ（登録商標）を用いて１分間混合した。溶液を凍結して、一晩凍結乾燥した。翌日、４ｍＬのクロロホルム／メタノール（２：１）を添加し、溶液を４℃で２４時間混合した。これに、水（１．３３ｍＬ）を添加し、次いで、溶液を混合して、３７００×ｇで３分間遠心分離した。有機相を取り置いて乾燥した。ペレットを無水エタノール（２ｍＬ）に可溶化して、カートリッジＡＣ  ０．２μｍにて濾過した。９．２．７節の方法に従って、試料中のコレステロール濃度を分析した。
【０３６４】
ＣＥＲ−００１およびＨＤＬ３を注射されたマウスについて、糞便のコレステロール含有量に用量依存的な増加が観察された（図６０）。１０ｍｇ／ｋｇの濃度で、最大のコレステロール排出が観察された。
【０３６５】
１０．実施例４：低アルファリポタンパク血症に罹った患者におけるＣＥＲ−００１の臨床試験
１０．１．背景
Ｃｅｒｅｎｉｓは、遺伝子欠損（タンジール病患者および２つのＡＢＣＡ１のヘテロ接合が挙げられる）に起因して低アルファリポタンパク血症に罹った対象で、初期の臨床試験の業務を複数完了している。
【０３６６】
ＲＬＴ経路が一生を通して欠損しているために全身を通じて血管壁に捕捉されたコレステロールの負担は、「導入相」の間は各反復投与に伴い徐々に低減されるはずであり、ＬＤＬレベルが適正に制御されている患者では、アテローム動脈硬化性プラークが退縮するはずである。適切なコレステロールのホメオスタシス、すなわち、内在性ＬＤＬ−Ｃによる組織への送達と、注入されたＣＥＲ−００１前駆体β様ＨＤＬ粒子による除去との平衡を維持するために、治療は、投与間隔を減らして（「維持相」）長期にわたって続けることになる。遺伝子作因によるＨＤＬ生成およびＲＬＴの遺伝性欠損は、不変であることから、ＣＥＲ−００１治療は、一生にわたるものとなりうる。
【０３６７】
下記の表８は、治験（ＳＡＭＢＡ試験と呼ぶ）に含めた患者のプロファイルを示す。
【０３６８】
【表８】
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【０３６９】
患者を、初めに集中的な「導入相」で処置し、この相では、８ｍｇ／ｋｇの用量で４週間超、９回のＣＥＲ−００１の投与を与えた。この導入相の後、リポタンパク質のプロファイルおよびＭＲＩスキャンを用いて、試験対象を再び評価した。その後、試験対象を、「維持相」で２週間に１回処置し続けて、総治療を６か月間とした。その時点で、リポタンパク質のプロファイルおよびＭＲＩスキャンを繰り返した。
【０３７０】
１０．２．結果
コレステロールの動員およびＬＣＡＴによるコレステロールのエステル化に及ぼす、ＣＥＲ−００１の効果を、図６８Ａ〜６８Ｇおよび図６９Ａ〜６９Ｇに対象毎ベースで示す。
【０３７１】
対象１は、ＡｐｏＡ−Ｉ遺伝子を欠失しており（ホモ接合、ＡｐｏＡ−Ｉ−／−）、ＣＥＲ−００１を８ｍｇ／ｋｇで１回投与した後に、コレステロールの動員、ＬＣＡＴの活性化、および糞便コレステロールの排除を示した。
【０３７２】
対象７は、ＡＢＣＡ１遺伝子を持たず（ホモ接合のＡＢＣＡ１−／−）、タンジール病に罹患しており、ＣＥＲ−００１を８ｍｇ／ｋｇで１回投与した後に、コレステロールの動員およびＬＣＡＴの活性化を示した。この患者では、糞便コレステロールの排除を試験しなかった。
【０３７３】
図７０および図７１は、患者毎ベースで、処置の１か月後の頸動脈および大動脈の血管壁厚の平均をそれぞれ示す。頸動脈の平均血管壁厚は、導入治療の１か月後に、平均で−６．４％低下し、大動脈の平均血管壁厚は、導入治療の１か月後に、平均で−４．６％低下した。ホモ接合性のＡｐｏＡ−Ｉ欠乏患者は、頸動脈の平均血管壁厚が−１７％の退縮となった。図７２は、６か月後の平均血管壁厚を示す。平均血管壁厚は、３ＴｅｓｌａＭＲＩによって決定した。
【０３７４】
この治験は、これらの対象におけるメカニズムの実証（proof of mechanism）（すなわち、ＣＥＲ−００１が、ＲＬＴ経路の全ての段階を実行すること）ならびに正の治療効果のエビデンスを示しており、具体的には、集中的な処置の１か月後に頸動脈の血管内膜−内側部壁厚が減少するが、最も重度の欠損（ホモ接合性のＡＢＣＡ１欠乏）を有する対象において、この減少は、スタチン未処置の高コレステロール血症の対象において処置の２年後に認められる減少に相当するものであった。重要なことに、この観察された減少は、ケアの標準（個人に合わせた集中的な脂質の管理）を凌いで認められた。重要なことに、さらに５か月の維持治療の後には、永続的かつ累積的な恩恵が認められ、このことは、家族性低アルファリポタンパク血症に罹った患者が、一生にわたり絶えずＡｐｏＡ−Ｉ置換治療を必要とするという治療原理を支援するものである。ＡＢＣＡ１欠乏において、ＡＢＣＡ１がないかまたはＡＢＣＡ１機能がない際に、コレステロールは依然としてＣＥＲ−００１に流出するが、おそらくは、以下に限定されないがＡＢＣＧ１など、他の受容体による流出経路の重複性があるためである。
【０３７５】
１１．具体的な実施形態
本願の開示の様々な態様が、以下の付番された段落に規定された実施形態に記載される。
【０３７６】
１．対象においてコレステロールを動員するために有効なＨＤＬ治療剤の用量を同定する方法であって、（ａ）対象に前記ＨＤＬ治療剤の第１の用量を投与するステップと、（ｂ）前記第１の用量の投与後、前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルを測定して、前記発現レベルに及ぼす前記第１の用量の効果を評価するステップと、（ｃ）（ｉ）前記対象の１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルが、カットオフ量より大きく低減される場合、前記第１の用量より低い、前記ＨＤＬ治療剤の第２の用量を投与するステップ、または（ｉｉ）前記対象の１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルが、前記カットオフ量より大きく低減されない場合、前記対象を前記ＨＤＬ治療剤の前記第１の用量で処置するステップとを含む方法。
【０３７７】
２．対象においてＨＤＬ治療剤の効能をモニターする方法であって、（ａ）対象を第１の投与スケジュールに従って前記ＨＤＬ治療剤で処置するステップと、（ｂ）前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルを測定して、前記発現レベルに及ぼす前記第１の投与スケジュールの効果を評価するステップと、（ｃ）（ｉ）前記対象の１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルが、上限のカットオフ量より大きく低減する場合、前記対象を第２の投与スケジュールに従って前記ＨＤＬ治療剤で処置するステップであって、前記第２の投与スケジュールが、前記ＨＤＬ治療剤のより低い用量を投与すること、前記ＨＤＬ治療剤を前記対象により長い期間にわたって注入すること、および前記ＨＤＬ治療剤を前記対象により少ない回数で投与することのうちの１つまたは複数を含む、ステップ、（ｉｉ）前記対象の１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルが、下限のカットオフ量より大きく低減されない場合、前記対象を第２の投与スケジュールに従って前記ＨＤＬ治療剤で処置するステップであって、前記第２の投与スケジュールが、前記ＨＤＬ治療剤のより高い用量を投与すること、前記ＨＤＬ治療剤を前記対象により短い期間にわたって注入すること、および前記ＨＤＬ治療剤を前記対象により多い回数で投与することのうちの１つまたは複数を含む、ステップ、または（ｉｉｉ）前記対象の１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルが、上限と下限のカットオフ量の間の量低減される場合、前記対象を前記第１の投与スケジュールに従って処置し続けるステップとを含む方法。
【０３７８】
３．前記カットオフ量が、前記投与前の前記対象自身のベースラインに関連する、実施形態１または実施形態２の方法。
【０３７９】
４．前記カットオフ量が、対照量に関連する、実施形態１または実施形態２の方法。
【０３８０】
５．前記対照量が、集団の平均値である、実施形態４の方法。
【０３８１】
６．前記集団の平均値が、健康な対象から得られる、実施形態５の方法。
【０３８２】
７．前記集団の平均値が、前記対象と同じ疾患状態を有する集団から得られる、実施形態５の方法。
【０３８３】
８．対象においてコレステロールを動員するために有効なＨＤＬ治療剤の用量を同定する方法であって、（ａ）対象の集団にＨＤＬ治療剤の第１の用量を投与するステップと、（ｂ）前記第１の用量の投与後、前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルを測定して、前記発現レベルに及ぼす前記第１の用量の効果を評価するステップと、（ｃ）前記第１の用量より高いまたは低い、前記ＨＤＬ治療剤の第２の用量を投与するステップと、（ｄ）前記第２の用量の投与後、前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルを測定して、前記発現レベルに及ぼす前記第１および／または第２の用量の効果を評価するステップと、（ｅ）任意選択で、前記ＨＤＬ治療剤の１つまたは複数の追加の用量によってステップ（ｃ）および（ｄ）を繰り返すステップと、（ｆ）１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルをカットオフ量より大きく低減させない最高用量を同定し、それによってコレステロールを動員するために有効な前記ＨＤＬ治療剤の用量を同定するステップとを含む方法。
【０３８４】
９．ステップ（ｄ）が、前記第２の用量の投与後、前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルを測定して、前記発現レベルに及ぼす前記第１の用量の効果を評価するステップを含む、実施形態８の方法。
【０３８５】
１０．前記第２の用量の投与後、前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルを測定して、前記発現レベルに及ぼす前記第２の用量の効果を評価するステップをさらに含む、実施形態１から９のいずれか１つの方法。
【０３８６】
１１．前記対象の１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルが、カットオフ量より大きく低減される場合、前記第２の用量より低い、前記ＨＤＬ治療剤の第３の用量を投与する、実施形態１０の方法。
【０３８７】
１２．ＨＤＬ治療剤を必要とする対象を処置する方法であって、対象に、（ａ）前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現を、前記対象のベースライン量と比較して２０％より大きく、または１０％より大きく低減させない用量の、任意選択でリポタンパク質複合体であるＨＤＬ治療剤と、（ｂ）任意選択で、胆汁酸レジン、ナイアシン、スタチン、フィブレート、ＰＣＳＫ９阻害剤、エゼチミブ、およびＣＥＴＰ阻害剤から選択されるコレステロール低下治療剤との組み合わせを投与するステップを含む方法。
【０３８８】
１３．前記ＨＤＬ治療剤が、リポタンパク質複合体である、実施形態１２の方法。
【０３８９】
１４．ＨＤＬ治療剤を必要とする対象を処置する方法であって、対象に、（ａ）前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現を、対照量と比較して２０％より大きく、または１０％より大きく低減させない用量の、任意選択でリポタンパク質複合体であるＨＤＬ治療剤と、（ｂ）任意選択で、胆汁酸レジン、ナイアシン、スタチン、フィブレート、ＰＣＳＫ９阻害剤、エゼチミブ、およびＣＥＴＰ阻害剤から選択されるコレステロール低下治療剤との組み合わせを投与するステップを含む方法。
【０３９０】
１５．前記ＨＤＬ治療剤が、リポタンパク質複合体である、実施形態１４の方法。
【０３９１】
１６．前記対照量が、集団の平均値である、実施形態１４または１５の方法。
【０３９２】
１７．前記集団の平均値が、健康な対象から得られる、実施形態１６の方法。
【０３９３】
１８．前記集団の平均値が、前記対象と同じ疾患状態を有する集団から得られる、実施形態１６の方法。
【０３９４】
１９．前記対象がヒトであるか、または前記対象の集団がヒト対象の集団である、実施形態１から１８のいずれか１つの方法。
【０３９５】
２０．前記対象が非ヒト動物である、または前記対象の集団が非ヒト動物の集団である、実施形態１から１８のいずれか１つの方法。
【０３９６】
２１．前記非ヒト動物がマウスである、実施形態２０の方法。
【０３９７】
２２．少なくとも１つのＨＤＬマーカーがＡＢＣＡ１である、実施形態１から２１のいずれか１つの方法。
【０３９８】
２３．ＡＢＣＡ１  ｍＲＮＡ発現レベルが測定される、実施形態２２の方法。
【０３９９】
２４．ＡＢＣＡ１タンパク質発現レベルが測定される、実施形態２２の方法。
【０４００】
２５．前記ＡＢＣＡ１カットオフ量が２０％〜８０％である、実施形態２２から２４のいずれか１つの方法。
【０４０１】
２６．前記ＡＢＣＡ１カットオフ量が３０％〜７０％である、実施形態２５の方法。
【０４０２】
２７．前記ＡＢＣＡ１カットオフ量が４０％〜６０％である、実施形態２６の方法。
【０４０３】
２８．前記ＡＢＣＡ１カットオフ量が５０％である、実施形態２７に記載の方法。
【０４０４】
２９．ＡＢＣＡ１発現レベルが、前記第１の用量または前記第２の用量の投与の２〜１２時間、４〜１０時間、２〜８時間、２〜６時間、４〜６時間または４〜８時間後に測定される、実施形態２２から２８のいずれか１つの方法。
【０４０５】
３０．少なくとも１つのＨＤＬマーカーがＡＢＣＧ１である、実施形態１から２９のいずれか１つの方法。
【０４０６】
３１．ＡＢＣＧ１  ｍＲＮＡ発現レベルが測定される、実施形態３０の方法。
【０４０７】
３２．ＡＢＣＧ１タンパク質発現レベルが測定される、実施形態３０の方法。
【０４０８】
３３．前記ＡＢＣＧ１カットオフ量が２０％〜８０％である、実施形態３０から３２のいずれか１つの方法。
【０４０９】
３４．前記ＡＢＣＧ１カットオフ量が３０％〜７０％である、実施形態３３の方法。
【０４１０】
３５．前記ＡＢＣＧ１カットオフ量が４０％〜６０％である、実施形態３４の方法。
【０４１１】
３６．前記ＡＢＣＡ１カットオフ量が５０％である、実施形態３５の方法。
【０４１２】
３７．ＡＢＣＧ１発現レベルが、投与の２〜１２時間、４〜１０時間、２〜８時間、２〜６時間、４〜６時間または４〜８時間後に測定される、実施形態３０から３６のいずれか１つの方法。
【０４１３】
３８．少なくとも１つのＨＤＬマーカーがＳＲＥＢＰ−１である、実施形態１から３７のいずれか１つの方法。
【０４１４】
３９．ＳＲＥＢＰ−１  ｍＲＮＡ発現レベルが測定される、実施形態３８の方法。
【０４１５】
４０．ＳＲＥＢＰ−１タンパク質発現レベルが測定される、実施形態３８の方法。
【０４１６】
４１．前記ＳＲＥＢＰ−１カットオフ量が２０％〜８０％である、実施形態３８から４０のいずれか１つの方法。
【０４１７】
４２．前記ＳＲＥＢＰ−１カットオフ量が３０％〜７０％である、実施形態４１の方法。
【０４１８】
４３．前記ＳＲＥＢＰ−１カットオフ量が４０％〜６０％である、実施形態４２の方法。
【０４１９】
４４．前記ＳＲＥＢＰ−１カットオフ量が５０％である、実施形態４３の方法。
【０４２０】
４５．ＳＲＥＢＰ−１の発現レベルが、投与の２〜１２時間、４〜１０時間、２〜８時間、２〜６時間、４〜６時間または４〜８時間後に測定される、実施形態３８から４４のいずれか１つの方法。
【０４２１】
４６．前記ＨＤＬ治療剤がリポタンパク質複合体である、実施形態１から４５のいずれか１つの方法。
【０４２２】
４７．前記リポタンパク質複合体がアポリポタンパク質を含む、実施形態４６の方法。
【０４２３】
４８．前記アポリポタンパク質が、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、ＡｐｏＥ、またはその組み合わせである、実施形態４７の方法。
【０４２４】
４９．前記リポタンパク質複合体が、アポリポタンパク質ペプチド模倣体を含む、実施形態４６の方法。
【０４２５】
５０．前記ペプチド模倣体が、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、もしくはＡｐｏＥのペプチド模倣体、またはその組み合わせである、実施形態４９の方法。
【０４２６】
５１．前記リポタンパク質複合体が、ＣＥＲ−００１、ＣＳＬ−１１１、ＣＳＬ−１１２、またはＥＴＣ−２１６である、実施形態４６の方法。
【０４２７】
５２．前記ＨＤＬ治療剤が低分子である、実施形態１から４５のいずれか１つの方法。
【０４２８】
５３．前記低分子がＣＥＴＰ阻害剤である、実施形態５２の方法。
【０４２９】
５４．前記低分子がパントテン酸誘導体である、実施形態５２の方法。
【０４３０】
５５．カットオフ量を決定することをさらに含む、実施形態１から４６のいずれか１つの方法。
【０４３１】
５６．前記カットオフ量が、前記ＨＤＬ治療剤の用量反応曲線を生成することによって決定される、実施形態５５の方法。
【０４３２】
５７．前記カットオフ量が、用量反応曲線中の変曲点となる用量の２５％〜７５％である、実施形態５６の方法。
【０４３３】
５８．前記カットオフ量が、用量反応曲線中の変曲点となる用量の４０％〜６０％である、実施形態５７の方法。
【０４３４】
５９．前記対象または前記対象の集団が、ＡＢＣＡ１欠損を有する、実施形態１から５８のいずれか１つの方法。
【０４３５】
６０．前記対象または前記対象の集団が、ＡＢＣＡ１変異に関してホモ接合である、実施形態５９の方法。
【０４３６】
６１．前記対象または前記対象の集団が、ＡＢＣＡ１変異に関してヘテロ接合である、実施形態５９の方法。
【０４３７】
６２．治療に好適なＨＤＬ治療剤の用量を同定する方法であって、（ａ）対象に前記ＨＤＬ治療剤の１つまたは複数の用量を投与するステップと、（ｂ）各用量の投与後、前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルを測定するステップと、（ｃ）１つまたは複数の前記ＨＤＬマーカーの発現レベルを、０％より大きく、１０％より大きく、または２０％より大きく上昇させない最大用量を同定し、それによって、治療に好適なＨＤＬ治療剤の用量を同定するステップとを含む方法。
【０４３８】
６３．治療に好適なＨＤＬ治療剤の用量を同定する方法であって、（ａ）対象の集団に前記ＨＤＬ治療剤の１つまたは複数の用量を投与するステップと、（ｂ）各用量の投与後、前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルを測定するステップと、（ｃ）１つまたは複数の前記ＨＤＬマーカーの発現レベルを０％より大きく、１０％より大きく、または２０％より大きく上昇させない最大用量を同定し、それによって治療に好適なＨＤＬ治療剤の用量を同定するステップとを含む方法。
【０４３９】
６４．治療に好適なＨＤＬ治療剤の用量を同定する方法であって、細胞のコレステロール流出を０％より大きく、１０％より大きく、または２０％より大きく低減させない、前記ＨＤＬ治療剤の最高用量を同定するステップを含む方法。
【０４４０】
６５．（ａ）対象または対象の集団にＨＤＬ治療剤の１つまたは複数の用量を投与するステップと、（ｂ）前記対象または対象の集団の細胞におけるコレステロール流出を測定するステップと、（ｃ）前記対象におけるコレステロール流出を０％より大きく、１０％より大きく、または２０％より大きく低減させない最大用量を同定し、それによって治療に好適なＨＤＬ治療剤の用量を同定するステップとを含む、実施形態６４の方法。
【０４４１】
６６．治療に好適なＨＤＬ治療剤の投与間隔を同定する方法であって、細胞のコレステロール流出を０％より大きく、１０％より大きく、または２０％より大きく低減させない、前記ＨＤＬ治療剤の最も頻回な投与レジメンの最高用量を同定するステップを含む方法。
【０４４２】
６７．（ａ）１回または複数回の投与回数に従って対象または対象の集団にＨＤＬ治療剤を投与するステップと、（ｂ）前記対象または対象の集団の細胞におけるコレステロール流出を測定するステップと、（ｃ）前記対象におけるコレステロール流出を０％より大きく、１０％より大きく、または２０％より大きく低減させない最大投与回数を同定し、それによって治療に好適なＨＤＬ治療剤の用量を同定するステップとを含む、実施形態６６の方法。
【０４４３】
６８．前記１回または複数回の投与回数が、（ａ）２日ごとに１〜４時間の注入としての投与、（ｂ）３日ごとに１〜４時間の注入としての投与、（ｃ）１週間ごとに２４時間の注入としての投与、および（ｄ）２週間ごとに２４時間の注入としての投与から選択される１回または複数回の投与回数を含む、実施形態６７の方法。
【０４４４】
６９．コレステロール流出が、前記対象または対象の集団の単球、マクロファージ、または単核細胞において測定される、実施形態６５から６８のいずれか１つの方法。
【０４４５】
７０．対象にＨＤＬ治療剤の治療有効量を投与することを含む、ＡＢＣＡ１欠損を有する対象を処置する方法。
【０４４６】
７１．前記ＨＤＬ治療剤がＣＥＲ−００１である、実施形態７０の方法。
【０４４７】
７２．前記対象が、ＡＢＣＡ１変異に関してヘテロ接合である、実施形態７０または７１の方法。
【０４４８】
７３．前記対象が、ＡＢＣＡ１変異に関してホモ接合である、実施形態７０または７１の方法。
【０４４９】
７４．家族性原発性低アルファリポタンパク血症を有する対象を処置する方法であって、（ａ）前記対象に導入レジメンに従って前記ＨＤＬ治療剤を投与するステップ、および次に（ｂ）前記対象に維持レジメンに従って前記ＨＤＬ治療剤を投与するステップを含む方法。
【０４５０】
７５．前記維持レジメンが、前記ＨＤＬ治療剤をより低い用量で、より少ない回数で、またはその両方で投与することを伴う、実施形態７４の方法。
【０４５１】
７６．前記対象が、ＡＢＣＡ１変異に関してヘテロ接合である、実施形態７４または実施形態７５の方法。
【０４５２】
７７．前記対象が、ＡＢＣＡ１変異に関してホモ接合である、実施形態７４または実施形態７５の方法。
【０４５３】
７８．前記対象が、ＬＣＡＴ変異に関してホモ接合またはヘテロ接合である、実施形態７４から７７のいずれか１つの方法。
【０４５４】
７９．前記対象が、ＡｐｏＡ−Ｉ変異に関してホモ接合またはヘテロ接合である、実施形態７４から７８のいずれか１つの方法。
【０４５５】
８０．前記対象が、ＡＢＣＧ１変異に関してホモ接合またはヘテロ接合である、実施形態７４から７９のいずれか１つの方法。
【０４５６】
８１．前記対象が、脂質調節薬でも処置される、実施形態７４から８０のいずれか１つの方法。
【０４５７】
８２．前記脂質調節薬が、アトルバスタチン、エゼチミブ、ナイアシン、ロスバスタチン、シンバスタチン、アスピリン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、またはその組み合わせである、実施形態８１の方法。
【０４５８】
８３．前記ＨＤＬ治療剤がＣＥＲ−００１である、実施形態７４から８２のいずれか１つの方法。
【０４５９】
８４．前記導入レジメンが４週間の期間である、実施形態８３の方法。
【０４６０】
８５．前記導入レジメンが、ＣＥＲ−００１を週に３回投与することを含む、実施形態８３または実施形態８４の方法。
【０４６１】
８６．前記導入レジメンで投与される前記用量が、８〜１５ｍｇ／ｋｇ（タンパク質重量に基づく）である、実施形態８３から８５のいずれか１つの方法。
【０４６２】
８７．前記導入レジメンで投与される前記用量が、８ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、または１５ｍｇ／ｋｇである、実施形態から８６の方法。
【０４６３】
８８．前記維持レジメンが、ＣＥＲ−００１を少なくとも１か月間、少なくとも２か月間、少なくとも３カ月間、少なくとも６カ月間、少なくとも１年間、少なくとも１８か月間、少なくとも２年間、または無限に投与するステップを含む、実施形態８３から８７のいずれか１つの方法。
【０４６４】
８９．前記維持レジメンが、ＣＥＲ−００１を週に２回投与することを含む、実施形態８３から８８のいずれか１つの方法。
【０４６５】
９０．前記維持レジメンで投与される前記用量が、１〜６ｍｇ／ｋｇ（タンパク質の重量に基づいて）である、実施形態８３から８９のいずれか１つの方法。
【０４６６】
９１．前記維持レジメンで投与される前記用量が、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、または６ｍｇ／ｋｇである、実施形態９０の方法。
【０４６７】
９２．（ａ）前記導入レジメンが、１つもしくは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルを、前記対象のベースライン量および／もしくは集団の平均値と比較して２０％〜８０％、または４０％〜６０％低減させる用量を利用する、ならびに／または（ｂ）前記維持レジメンが、１つもしくは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルを、前記対象のベースライン量および／もしくは集団の平均値と比較して２０％より大きく、もしくは１０％より大きく低減させない用量を利用する、実施形態７４から９１のいずれか１つの方法。
【０４６８】
９３．前記維持レジメンが、１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルを低減させない用量を利用する、実施形態９２の方法。
【０４６９】
９４．対象においてコレステロールを動員するために有効なＨＤＬ治療剤の用量を同定する方法に使用するためのＨＤＬ治療剤であって、前記方法が、（ａ）対象に前記ＨＤＬ治療剤の第１の用量を投与するステップと、（ｂ）前記第１の用量の投与後、前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルを測定して、前記発現レベルに及ぼす前記第１の用量の効果を評価するステップと、（ｃ）（ｉ）前記対象の１つもしくは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルが、カットオフ量より大きく低減される場合、前記第１の用量より低い、前記ＨＤＬ治療剤の第２の用量を投与するステップ、または（ｉｉ）前記対象の１つもしくは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルが、前記カットオフ量より大きく低減されない場合、前記対象を前記ＨＤＬ治療剤の前記第１の用量で処置するステップとを含む、ＨＤＬ治療剤。
【０４７０】
９５．対象におけるＨＤＬ治療剤の効能をモニターする方法に使用するためのＨＤＬ治療剤であって、前記方法が、（ａ）対象を第１の投与スケジュールに従って前記ＨＤＬ治療剤で処置するステップと、（ｂ）前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルを測定して、前記発現レベルに及ぼす前記第１の投与スケジュールの効果を評価するステップと、（ｃ）（ｉ）前記対象の１つもしくは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルが、上限のカットオフ量より大きく低減される場合、前記対象を第２の投与スケジュールに従って前記ＨＤＬ治療剤で処置するステップであって、前記第２の投与スケジュールが、前記ＨＤＬ治療剤のより低い用量を投与すること、前記ＨＤＬ治療剤を前記対象により長い期間にわたって注入すること、および前記ＨＤＬ治療剤を前記対象により少ない回数で投与することのうちの１つもしくは複数を含む、ステップ、（ｉｉ）前記対象の１つもしくは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルが、下限のカットオフ量より大きく低減されない場合、前記対象を第２の投与スケジュールに従って前記ＨＤＬ治療剤で処置するステップであって、前記第２の投与スケジュールが、前記ＨＤＬ治療剤のより高い用量を投与すること、前記ＨＤＬ治療剤を前記対象により短い期間にわたって注入すること、および前記ＨＤＬ治療剤を前記対象により多い回数で投与することのうちの１つもしくは複数を含む、ステップ、または（ｉｉｉ）前記対象の１つもしくは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルが、上限と下限のカットオフ量の間の量低減される場合、前記対象を前記第１の投与スケジュールに従って処置し続けるステップとを含む、ＨＤＬ治療剤。
【０４７１】
９６．前記カットオフ量が、前記投与前の前記対象の自身のベースラインに関連する、実施形態９４または実施形態９５の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０４７２】
９７．前記カットオフ量が、対照量に関連する、実施形態９４または実施形態９５の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０４７３】
９８．前記対照量が、集団の平均値である、実施形態９７の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０４７４】
９９．前記集団の平均値が、健康な対象から得られる、実施形態９８の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０４７５】
１００．前記集団の平均値が、前記対象と同じ疾患状態を有する集団から得られる、実施形態９８の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０４７６】
１０１．コレステロールを動員するために有効なＨＤＬ治療剤の用量を同定する方法に使用するためのＨＤＬ治療剤であって、前記方法が、（ａ）対象の集団にＨＤＬ治療剤の第１の用量を投与するステップと、（ｂ）前記第１の用量の投与後、前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルを測定して、前記発現レベルに及ぼす前記第１の用量の効果を評価するステップと、（ｃ）前記第１の用量より高いかまたは低い、前記ＨＤＬ治療剤の第２の用量を投与するステップと、（ｄ）前記第２の用量の投与後、前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルを測定して、前記発現レベルに及ぼす前記第１および／または第２の用量の効果を評価するステップと、（ｅ）任意選択で、前記ＨＤＬ治療剤の１つまたは複数の追加の用量によってステップ（ｃ）および（ｄ）を繰り返すステップと、（ｆ）１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルをカットオフ量より大きく低減させない最高用量を同定し、それによってコレステロールを動員するために有効な前記ＨＤＬ治療剤の量を同定するステップとを含む、ＨＤＬ治療剤。
【０４７７】
１０２．ステップ（ｄ）が、前記第２の用量の投与後、前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルを測定して、前記発現レベルに及ぼす前記第１の用量の効果を評価するステップを含む、実施形態１０１の方法。
【０４７８】
１０３．前記方法が、前記第２の用量の投与後、前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルを測定して、前記発現レベルに及ぼす前記第２の用量の効果を評価するステップをさらに含む、実施形態９４から１０１のいずれか１つの使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０４７９】
１０４．前記対象の１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルが、カットオフ量より大きく低減される場合、前記第２の用量よりも低い、前記ＨＤＬ治療剤の第３の用量を投与する、実施形態１０２の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０４８０】
１０５．ＨＤＬ治療剤を必要とする対象を処置する方法に使用するための、任意選択でリポタンパク質複合体であるＨＤＬ治療剤であって、前記方法が、前記対象に、（ａ）前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現を、前記対象のベースライン量または対照量と比較して２０％より大きくまたは１０％より大きく低減させない用量の前記ＨＤＬ治療剤と、（ｂ）任意選択で、胆汁酸レジン、ナイアシン、スタチン、フィブレート、ＰＣＳＫ９阻害剤、エゼチミブ、およびＣＥＴＰ阻害剤から選択されるコレステロール低下治療剤との組み合わせを投与するステップを含む、ＨＤＬ治療剤。
【０４８１】
１０６．リポタンパク質複合体である、実施形態１０５の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０４８２】
１０７．前記比較される量が、前記対象のベースライン量である、実施形態１０５または１０６の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０４８３】
１０８．前記比較される量が、対照量であり、集団の平均値である、実施形態１０５または１０６の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０４８４】
１０９．前記集団の平均値が、健康な対象から得られる、実施形態１０８の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０４８５】
１１０．前記集団の平均値が、前記対象と同じ疾患状態を有する集団から得られる、実施形態１０８の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０４８６】
１１１．前記対象がヒトである、または、前記対象の集団がヒト対象の集団である、実施形態９４から１１０のいずれか１つの使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０４８７】
１１２．前記対象が非ヒト動物である、または前記対象の集団が非ヒト動物の集団である、実施形態９４から１１０のいずれか１つの使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０４８８】
１１３．前記非ヒト動物がマウスである、実施形態１１２の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０４８９】
１１４．少なくとも１つのＨＤＬマーカーがＡＢＣＡ１である、実施形態９４から１１３のいずれか１つの使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０４９０】
１１５．ＡＢＣＡ１  ｍＲＮＡ発現レベルが測定される、実施形態１１４の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０４９１】
１１６．ＡＢＣＡ１タンパク質発現レベルが測定される、実施形態１１４の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０４９２】
１１７．前記ＡＢＣＡ１カットオフ量が２０％〜８０％である、実施形態１１４から１１６のいずれか１つの使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０４９３】
１１８．前記ＡＢＣＡ１カットオフ量が３０％〜７０％である、実施形態１１７の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０４９４】
１１９．前記ＡＢＣＡ１カットオフ量が４０％〜６０％である、実施形態１１８の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０４９５】
１２０．前記ＡＢＣＡ１カットオフ量が５０％である、実施形態１１９の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０４９６】
１２１．ＡＢＣＡ１発現レベルが、前記第１の用量または前記第２の用量の投与の２〜１２時間、４〜１０時間、２〜８時間、２〜６時間、４〜６時間または４〜８時間後に測定される、実施形態１１４から１２０のいずれか１つの使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０４９７】
１２２．少なくとも１つのＨＤＬマーカーがＡＢＣＧ１である、実施形態９４から１２１のいずれか１つの使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０４９８】
１２３．ＡＢＣＧ１  ｍＲＮＡ発現レベルが測定される、実施形態１２２の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０４９９】
１２４．ＡＢＣＧ１タンパク質発現レベルが測定される、実施形態１２２の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０５００】
１２５．前記ＡＢＣＧ１カットオフ量が２０％〜８０％である、実施形態１２２から１２４のいずれか１つの使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０５０１】
１２６．前記ＡＢＣＧ１カットオフ量が３０％〜７０％である、実施形態１２５の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０５０２】
１２７．前記ＡＢＣＧ１カットオフ量が４０％〜６０％である、実施形態１２６の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０５０３】
１２８．前記ＡＢＣＡ１カットオフ量が５０％である、実施形態１２７の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０５０４】
１２９．ＡＢＣＧ１発現レベルが、投与の２〜１２時間、４〜１０時間、２〜８時間、２〜６時間、４〜６時間または４〜８時間後に測定される、実施形態１２２から１２８のいずれか１つの使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０５０５】
１３０．少なくとも１つのＨＤＬマーカーがＳＲＥＢＰ−１である、実施形態９４から１２９のいずれか１つの使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０５０６】
１３１．ＳＲＥＢＰ−１  ｍＲＮＡ発現レベルが測定される、実施形態１３０の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０５０７】
１３２．ＳＲＥＢＰ−１タンパク質発現レベルが測定される、実施形態１３０の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０５０８】
１３３．前記ＳＲＥＢＰ−１カットオフ量が２０％〜８０％である、実施形態１３０から１３２のいずれか１つの使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０５０９】
１３４．前記ＳＲＥＢＰ−１カットオフ量が３０％〜７０％である、実施形態１３３の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０５１０】
１３５．前記ＳＲＥＢＰ−１カットオフ量が４０％〜６０％である、実施形態１３４の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０５１１】
１３６．前記ＳＲＥＢＰ−１カットオフ量が５０％である、実施形態１３５  使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０５１２】
１３７．ＳＲＥＢＰ−１発現レベルが、投与の２〜１２時間、４〜１０時間、２〜８時間、２〜６時間、４〜６時間または４〜８時間後に測定される、実施形態１３０から１３６のいずれか１つの使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０５１３】
１３８．リポタンパク質複合体である、実施形態９４から１３７のいずれか１つの使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０５１４】
１３９．前記リポタンパク質複合体が、アポリポタンパク質を含む、実施形態１３８の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０５１５】
１４０．前記アポリポタンパク質が、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、ＡｐｏＥ、またはその組み合わせである、実施形態１３９の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０５１６】
１４１．前記リポタンパク質複合体が、アポリポタンパク質ペプチド模倣体を含む、実施形態１３８の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０５１７】
１４２．前記ペプチド模倣体が、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、もしくはＡｐｏＥのペプチド模倣体、またはその組み合わせである、実施形態１４１の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０５１８】
１４３．前記リポタンパク質複合体が、ＣＥＲ−００１、ＣＳＬ−１１１、ＣＳＬ−１１２、またはＥＴＣ−２１６である、実施形態１３８の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０５１９】
１４４．低分子である、実施形態９４から１３７のいずれか１つの使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０５２０】
１４５．前記低分子がＣＥＴＰ阻害剤である、実施形態１４４の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０５２１】
１４６．前記低分子がパントテン酸誘導体である、実施形態１４４の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０５２２】
１４７．カットオフ量を決定することをさらに含む、実施形態９４から１３８のいずれか１つの使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０５２３】
１４８．前記カットオフ量が、前記ＨＤＬ治療剤の用量反応曲線を生成することによって決定される、実施形態１４７の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０５２４】
１４９．前記カットオフ量が、用量反応曲線中の変曲点となる用量の２５％〜７５％である、実施形態１４８の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０５２５】
１５０．前記カットオフ量が、用量反応曲線中の変曲点となる用量の４０％〜６０％である、実施形態１４９の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０５２６】
１５１．前記対象または対象の集団が、ＡＢＣＡ１欠損を有する、実施形態９４から１５０のいずれか１つの使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０５２７】
１５２．前記対象または対象の集団が、ＡＢＣＡ１変異に関してホモ接合である、実施形態１５１の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０５２８】
１５３．前記対象または対象の集団が、ＡＢＣＡ１変異に関してヘテロ接合である、実施形態１５１の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０５２９】
１５４．治療に好適なＨＤＬ治療剤の用量を同定する方法に使用するためのＨＤＬ治療剤であって、前記方法が、（ａ）対象に前記ＨＤＬ治療剤の１つまたは複数の用量を投与するステップと、（ｂ）各用量の投与後、前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルを測定するステップと、（ｃ）１つまたは複数の前記ＨＤＬマーカーの発現レベルを０％より大きく、１０％より大きく、または２０％より大きく上昇させない最大用量を同定し、それによって治療に好適なＨＤＬ治療剤の用量を同定するステップとを含む、ＨＤＬ治療剤。
【０５３０】
１５５．治療に好適なＨＤＬ治療剤の用量を同定する方法に使用するためのＨＤＬ治療剤であって、前記方法が、（ａ）対象の集団に前記ＨＤＬ治療剤の１つまたは複数の用量を投与するステップと、（ｂ）各用量の投与後、前記対象の循環中の単球、マクロファージ、または単核細胞における１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルを測定するステップと、（ｃ）前記対象において、前記１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルを０％より大きく、１０％より大きく、または２０％より大きく上昇させない最大用量を同定し、それによって治療に好適なＨＤＬ治療剤の用量を同定するステップとを含む、ＨＤＬ治療剤。
【０５３１】
１５６．治療に好適なＨＤＬ治療剤の用量を同定する方法に使用するためのＨＤＬ治療剤であって、細胞のコレステロール流出を０％より大きく、１０％より大きく、または２０％より大きく低減させない、前記ＨＤＬ治療剤の最高用量を同定するステップを含む、ＨＤＬ治療剤。
【０５３２】
１５７．（ａ）１回または複数回の投与回数に従って対象または対象の集団にＨＤＬ治療剤を投与するステップと、（ｂ）前記対象または対象の集団の細胞におけるコレステロール流出を測定するステップと、（ｃ）前記対象におけるコレステロール流出を５０％超から１００％低減させない最大投与回数を同定し、それによって治療に好適なＨＤＬ治療剤の用量を同定するステップとを含む、実施形態１５６の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０５３３】
１５８．治療に好適なＨＤＬ治療剤の投与間隔を同定する方法に使用するためのＨＤＬ治療剤であって、細胞のコレステロール流出を０％より大きく、１０％より大きく、または２０％より大きく低減させない、前記ＨＤＬ治療剤の最も頻回な投与レジメンの最高用量を同定するステップを含む、方法。
【０５３４】
１５９．（ａ）１回または複数回の投与回数に従って対象または対象の集団にＨＤＬ治療剤を投与するステップと、（ｂ）前記対象または対象の集団の細胞におけるコレステロール流出を測定するステップと、（ｃ）前記対象におけるコレステロール流出を５０％超から１００％低減させない最大投与回数を同定し、それによって治療に好適なＨＤＬ治療剤の用量を同定するステップとを含む、実施形態１５８の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０５３５】
１６０．治療に好適なＨＤＬ治療剤の用量を同定する方法に使用するためのＨＤＬ治療剤であって、前記方法が、（ａ）対象または対象の集団にＨＤＬ治療剤の１つまたは複数の用量を投与するステップと、（ｂ）前記対象または対象の集団の細胞におけるコレステロール流出を測定するステップと、（ｃ）前記対象におけるコレステロール流出を０％より大きく、１０％より大きく、または２０％より大きく低減させない最大用量を同定し、それによって、治療に好適なＨＤＬ治療剤の用量を同定するステップとを含む、ＨＤＬ治療剤。
【０５３６】
１６１．治療に好適なＨＤＬ治療剤の投与間隔を同定する方法に使用するためのＨＤＬ治療剤であって、前記方法が、（ａ）１回または複数回の投与回数に従って対象または対象の集団にＨＤＬ治療剤を投与するステップと、（ｂ）前記対象または対象の集団の細胞におけるコレステロール流出を測定するステップと、（ｃ）前記対象におけるコレステロール流出を０％より大きく、１０％より大きく、または２０％より大きく低減させない最大投与回数を同定し、それによって、治療に好適なＨＤＬ治療剤の用量を同定するステップとによって、前記ＨＤＬ治療剤の最も頻回な投与レジメンの最高用量を同定するステップを含む、ＨＤＬ治療剤。
【０５３７】
１６２．前記１回または複数回の投与回数が、（ａ）２日ごとに１〜４時間の注入としての投与、（ｂ）３日ごとに１〜４時間の注入としての投与、（ｃ）１週間ごとに２４時間の注入としての投与、および（ｄ）２週間ごとに２４時間の注入としての投与から選択される１回または複数回の投与回数を含む、実施形態６７の方法。
【０５３８】
１６３．コレステロール流出が、前記対象または対象の集団の単球、マクロファージ、または単核細胞において測定される、実施形態１５６から１６２のいずれか１つの使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０５３９】
１６４．対象にＨＤＬ治療剤の治療有効量を投与することを含む、ＡＢＣＡ１欠陥を有する対象を処置する方法に使用するためのＨＤＬ治療剤。
【０５４０】
１６５．ＣＥＲ−００１である、実施形態１６４の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０５４１】
１６６．前記対象が、ＡＢＣＡ１変異に関してヘテロ接合である、実施形態１６４または１６５の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０５４２】
１６７．前記対象が、ＡＢＣＡ１変異に関してホモ接合である、実施形態１６４または１６５の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０５４３】
１６８．家族性原発性低アルファリポタンパク血症を有する対象を処置する方法に使用するためのＨＤＬ治療剤であって、前記方法が、（ａ）前記対象に導入レジメンに従って前記ＨＤＬ治療剤を投与するステップ、および次に（ｂ）前記対象に維持レジメンに従って前記ＨＤＬ治療剤を投与するステップを含む、ＨＤＬ治療剤。
【０５４４】
１６９．前記維持レジメンが、前記ＨＤＬ治療剤をより低い用量で、より少ない回数で、またはその両方で投与することを伴う、実施形態１６８の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０５４５】
１７０．前記対象が、ＡＢＣＡ１変異に関してヘテロ接合である、実施形態１６８または実施形態１６９の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０５４６】
１７１．前記対象が、ＡＢＣＡ１変異に関してホモ接合である、実施形態１６８または実施形態１６９の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０５４７】
１７２．前記対象が、ＬＣＡＴ変異に関してホモ接合またはヘテロ接合である、実施形態１６８から１７１のいずれか１つの使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０５４８】
１７３．前記対象が、ＡｐｏＡ−Ｉ変異に関してホモ接合またはヘテロ接合である、実施形態１６８から１７２のいずれか１つの使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０５４９】
１７４．前記対象が、ＡＢＣＧ１変異に関してホモ接合またはヘテロ接合である、実施形態１６８から１７３のいずれか１つの使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０５５０】
１７５．前記対象が、脂質調節薬でも処置される、実施形態１６８から１７４のいずれか１つの使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０５５１】
１７６．前記脂質調節薬が、アトルバスタチン、エゼチミブ、ナイアシン、ロスバスタチン、シンバスタチン、アスピリン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、またはその組み合わせである、実施形態１７５の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０５５２】
１７７．ＣＥＲ−００１である、実施形態１６８から１７６のいずれか１つの使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０５５３】
１７８．前記導入レジメンが、４週間の期間である、実施形態１７７の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０５５４】
１７９．前記導入レジメンが、ＣＥＲ−００１を週に３回投与するステップを含む、実施形態１７７または実施形態１７８の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０５５５】
１８０．前記導入レジメンで投与される前記用量が、８〜１５ｍｇ／ｋｇ（タンパク質重量に基づく）である、実施形態１７７から１７９のいずれか１つの使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０５５６】
１８１．前記導入レジメンで投与される前記用量が、８ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、または１５ｍｇ／ｋｇである、実施形態から１８０の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０５５７】
１８２．前記維持レジメンが、ＣＥＲ−００１を少なくとも１か月間、少なくとも２か月間、少なくとも３カ月間、少なくとも６カ月間、少なくとも１年間、少なくとも１８か月間、少なくとも２年間、または無限に投与することを含む、実施形態１７７から１８１のいずれか１つの使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０５５８】
１８３．前記維持レジメンが、ＣＥＲ−００１を週に２回投与することを含む、実施形態１７７から１８２のいずれか１つの使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０５５９】
１８４．前記維持レジメンで投与される前記用量が、１〜６ｍｇ／ｋｇ（タンパク質の重量に基づいて）である、実施形態１７７から１８３のいずれか１つの使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０５６０】
１８５．前記維持レジメンで投与される前記用量が、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、または６ｍｇ／ｋｇである、実施形態１８４の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０５６１】
１８６．（ａ）前記導入レジメンが、１つもしくは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルを、前記対象のベースライン量および／もしくは集団の平均値と比較して２０％〜８０％、もしくは４０％〜６０％低減させる用量を利用する、ならびに／または（ｂ）前記維持レジメンが、１つもしくは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルを、前記対象のベースライン量および／もしくは集団の平均値と比較して２０％より大きく、もしくは１０％より大きく低減させる用量を利用する、実施形態１６８から１８５のいずれか１つの使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０５６２】
１８７．前記維持レジメンが、１つまたは複数のＨＤＬマーカーの発現レベルを低減させない用量を利用する、実施形態１８６の使用のためのＨＤＬ治療剤。
【０５６３】
様々な具体的な実施形態が例示され記載されている一方で、本開示（複数可）の趣旨および範囲を逸脱することなく、様々な変更が行われうることが理解されよう。
【０５６４】
１２．参照による組込み
本出願に引用されたあらゆる刊行物、特許、特許出願および他の文書は、ここに、あらゆる目的のために参照によりその全体を組み入れられ、それは、それぞれの別個の刊行物、特許、特許出願または他の文書が、あらゆる目的のために参照により組み入れられることを別個に示すのと同程度である。
【０５６５】
本明細書が含む文書、行為、材料、デバイス、物品などに関するいかなる議論も、本願の開示の文脈を提供することを目的とするにすぎない。これらのいかなるまたはあらゆる事項が、先行技術の基盤の一部を形成すること、または、本出願の優先日前にどこかに存在していたかのように、本願の開示に関連する技術分野の一般常識であることを、自認するものと解されるものではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５−１】
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【図６５−２】
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【図６５−３】
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【図６５−４】
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【図６６−１】
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【図６６−２】
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【図６７−１】
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【図６７−２】
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【図６７−３】
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【図６８−１】
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【図６８−２】
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【図６８−３】
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【図６９−１】
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【図６９−２】
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【図６９−３】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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