(57)【要約】本出願は、水和ポリペプチドのマトリクス内のポリオールと二酸の縮合反応生成物であるエステルの水分散性生物分解性組成物に関する。本組成物は、付加製造及び他の用途において移植可能な物品と共に用いるために有用である。幾つかの態様においては、組成物中のエステルはグリセロール−セバシン酸縮合反応の生成物である。【選択図】図１
2017526432.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水；
ポリオールと二酸のエステル；及び
ポリペプチド；
を含む組成物。
【請求項２】
前記エステルがグリセロール−セバシン酸エステル化合物を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記グリセロール−セバシン酸エステル化合物が、１０，０００より大きい分子量を有するポリマー化合物である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
１０，０００未満の分子量を有するグリセロール−セバシン酸エステル化合物を更に含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物が、
約３０〜約８５重量％の水；
約１０％〜約６０％の前記グリセロール−セバシン酸エステル化合物；及び
約０．１％〜約３０％のポリペプチド；
を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物が、
約４０〜約８５重量％の水；
約１０％〜約５０％の前記グリセロール−セバシン酸エステル化合物；及び
約５％〜約３０％のポリペプチド；
を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項７】
前記ポリペプチドが前記組成物全体に均一に分散されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記エステルが官能化されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
生物活性物質を更に含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記生物活性物質が、ビタミン、ミネラル、トコフェロール、アスコルビン酸塩、レチノイン酸、及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記生物活性物質が細胞を含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
前記生物活性物質が、ペプチド配列、成長因子、プロテオグリカン、糖タンパク質、グリコサミノグリカン、多糖、栄養素、サイトカイン、ホルモン、血管新生因子、免疫調節因子、薬物、及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１３】
脂肪酸を更に含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記脂肪酸が前記ポリオール−二酸エステルと共エステル化されている、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ポリペプチドがコラーゲンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ポリペプチドがゼラチンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記組成物が、８〜１２重量％のゼラチン、３５〜４０重量％のグリセロール−セバシン酸エステル化合物、及び残余量の水からなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
前記二酸がセバシン酸である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
固体のポリペプチドを水中で混合してポリペプチドヒドロゲルを形成する工程；及び
前記ポリペプチドヒドロゲルにグリセロール−セバシン酸エステル化合物を加える工程；
を含む、組成物の形成方法。
【請求項２０】
前記グリセロール−セバシン酸エステル化合物を加える前記工程を、前記グリセロール−セバシン酸エステル化合物が溶融形態にある際に行う、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記グリセロール−セバシン酸エステル化合物が、１０，０００より大きい分子量を有するポリマー化合物である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
１０，０００未満の分子量を有するグリセロール−セバシン酸エステル化合物を前記ポリペプチドヒドロゲル中に混合する工程を更に含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１に記載の組成物の第１の二次元層を基材上に押出す工程；及び
第三次元で前記第１の二次元層の上に請求項１に記載の組成物の第２の二次元層を形成する工程；
を含む、三次元物品を印刷する方法。
【請求項２４】
押出及び形成の前記工程の後に前記組成物を硬化させる工程を更に含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記硬化工程が、光硬化、マイクロ波硬化、赤外硬化、及びこれらの組合せを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１に記載の組成物の繊維を押出す工程；
を含む、物品の形成方法。
【請求項２７】
前記押出工程が、請求項１に記載の組成物を、ポリマー材料を含む第２の組成物と共押出する工程を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記組成物中の前記ポリペプチドがコラーゲンである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
付加製造において用いるためのプリントヘッドであって、
ノズル及び複数の貯留タンクを含み、それぞれの貯留タンクは生体適合性材料を含み、前記ノズルは供給ラインによってそれぞれの前記貯留タンクと流体連絡している先端部を含み、前記ノズルは供給ラインによってそれぞれの前記貯留タンクと流体連絡している先端部を含み、前記ノズルはピッチ付の内腔を有していて、これによって押出中に前記生体適合性材料の混合が達成される、前記プリントヘッド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]本出願は、２０１４年８月１４日出願の米国出願６２／０３７，４２５、及び２０１４年８月１５日出願の６２／０３７，６４０（両方ともそれらの全部を参照として本明細書中に包含する）の利益及びそれに対する優先権を主張する。
【０００２】
[0002]本出願は、付加製造のような移植可能な物品の製造において有用な材料科学及び材料の分野に関する。より具体的には、本発明は、水和ポリペプチドのマトリクス内のポリオール／二酸縮合反応から形成されるエステルの水分散性の生物分解性組成物を提供する。
【背景技術】
【０００３】
[0003]医療関連産業は数多くの火急の問題に直面している。２０１２年６月時点において、全米臓器分配ネットワーク（ＵＮＯＳ）には臓器移植が必要な者として１１４，６３６人の患者が登録されている。ＵＮＯＳによれば、２０１２年の１月から３月の間には僅か６，８３８件の移植しか実施されなかった。毎年、移植が実施される数よりも多い患者がＵＮＯＳのリストに加えられており、移植を待っている患者の数の純増加がもたらされている。
【０００４】
[0004]これは、直接コスト及び間接コストの両方において米国の医療経済に対して経済的な負担をかけている。臓器移植及び再生医療は、生体材料の品揃えが増加するにつれて置換及び再生の課題をゆくゆくは満足すると期待されている。過去５０年において、科学者は組織／臓器工学において有用な生体材料の選択が制限されていた。
【０００５】
[0005]１つの新しい生体材料であるポリ（グリセロールセバケート）が組織工学のために開発され、薬物送達、整形外科、心血管、神経血管、及び軟組織修復などの治療領域に展開されている。中でも線維膜の形成が少ないか又はないこと、抗菌活性、非免疫原性のような利益によって、この材料は移植用途及び局所用途のために望ましい。しかしながら、この生体材料の現時点での形態は、具体的な用途のために種々の形態に操作するその能力に若干の限界がある。
【０００６】
[0006]付加製造は、組織工学及び再生医療において重要な組織の足場材料の製造手段になってきた。ＭＲＩ及び超音波のような３Ｄ医療診断画像モダリティから取り込んでソフトウエアによってデザインすると、正確な患者に特異の３Ｄ組織足場材料が構築され、これは対象の組織から組織骨格（組織足場材料）を生体外及び生体内で再構成することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
[0007]付加製造によって足場材料構造体を支持する基礎組成物を構築する生体適合性及び再吸収性のポリマー技術の選択には重大な制限がある。歴史的に、ラクチド及びグリコリドポリマーが選択される再吸収性ポリマーであった。その基本的な化学物質は再吸収性であるが、生体適合性の課題に直面していた。創傷した場所においてラクチド及びグリコリドポリマーが分解すると高酸性の副生成物が放出され、これによって治癒期間が長くなり、免疫系に悪影響が及ぼされ、瘢痕組織が形成され、本来の機能の回復が妨げられる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
[0008]代表的な態様は、ポリオールと二酸の縮合反応生成物であり、水和ポリペプチドのマトリクス内のエステルの水分散性の生分解性組成物、及びそれから製造される物品、並びにこれらの組成物を用いる方法及び装置に関する。
【０００９】
[0009]代表的な態様によれば、本組成物は、水、ポリオールと二酸のエステル、及びポリペプチドを含む。幾つかの態様においては、エステルは、ポリマーグリセロール−セバシン酸エステル化合物のようなグリセロール−セバシン酸エステル化合物を含む。
【００１０】
[0010]他の態様によれば、組成物を形成する方法は、固体ポリペプチドを水中で混合してポリペプチドヒドロゲルを形成し、そしてポリペプチドヒドロゲルにグリセロール−セバシン酸エステル化合物を加えることを含む。
【００１１】
[0011]他の態様によれば、三次元物品を印刷する方法は、ここに記載する組成物の第１の二次元層を基材上に押出し、そして第１の層の上にその組成物の第２の二次元層を形成することを含む。
【００１２】
[0012]更に他の態様によれば、物品を形成する方法は、ここに記載する組成物の繊維を押出すことを含み、これは、幾つかの態様においては繊維の形成において１種類以上の他のポリマー組成物を共押出することを含む。
【００１３】
[0013]更に他の態様によれば、付加製造において用いるためのプリントヘッドはノズル及び複数の貯留タンクを含み、それぞれの貯留タンクは生体適合性材料を含み、ノズルは供給ラインによってそれぞれの貯留タンクと流体連絡している先端部を含み、ノズルはピッチ付きの内腔（pitched bore)を有していて、これによって押出中に生体適合性材料の混合が達成される。
【００１４】
[0014]代表的な態様の有利性は、中でも、瘢痕化を制限し、自然の組織により良好に近づけるコンプライアンス係数（compliance modulus）を与えるなどの、移植可能な物品において用いる従来の材料の制限の多くを克服することができる組成物が提供されることである。
【００１５】
[0015]他の有利性は、幹細胞、間葉細胞、栄養剤、又は他の生物製剤のような外生要因の不存在下で組織の再生をもたらすことができる、移植可能な材料の形成において用いるための組成物が提供されることである。
【００１６】
[0016]更に他の有利性は、付加製造、造形、被覆、成形技術、機械加工、及び押出などの種々のプロセスにおいて用いるのに好適な形態の、その構成成分に関係する生物学的利益を達成する組成物が提供されることである。
【００１７】
[0017]本発明の他の特徴及び有利性は、本発明の原理を例として示す代表的な態様の以下のより詳細な記載から明らかになるであろう。
[0018]代表的な態様の以下の詳細な記載は、添付の図面と組み合わせて読むとより良好に理解することができる。しかしながら、本発明は示されている精確な配列及び手段に限定されないことを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】[0019]図１は、代表的な態様による３Ｄプリンターアセンブリシステムである。
【図２】[0020]図２は、代表的な態様による３Ｄ印刷構造体の拡大断面図の凍結乾燥ＳＥＭである。
【図３】[0021]図３は、対照溶液を代表的な態様による組成物と比較した温度スイープ曲線である。
【図４】[0022]図４Ａは、本発明の代表的な態様によるノズルの上面図である。[0023]図４Ｂは、図４Ａに示されるノズルの背面立面図である。[0024]図４Ｃは、図４Ａに示されるノズルの斜視図である。[0025]図４Ｄは、図４Ａに示されるノズルの側面図である。[0026]図４Ｅは、他の態様によるノズルである。
【図５】[0027]図５Ａは、本発明の代表的な態様によるノズルの正面断面図である。[0028]図５Ｂは、図５Ａに示されるノズルの供給ラインアセンブリの正面断面図である。[0029]図５Ｃは、図５Ａに示されるノズルの側面図である。
【図６】[0030]図６Ａは、本発明の代表的な態様による加熱部材の側面立面図である。[0031]図６Ｂは、図６Ａに示される加熱部材の底部立面図である。[0032]図６Ｃは、図６Ａに示される加熱部材の正面立面図である。[0033]図６Ｄは、図６Ａに示される加熱部材の斜視図である。
【図７】[0034]図７Ａは、図４Ａに示されるノズルと一緒に組み立てた図６Ａに示される加熱部材の底部立面図である。[0035]図７Ｂは、図４Ａに示されるノズルと一緒に組み立てた図６Ａに示される加熱部材の側部立面図である。[0036]図７Ｃは、図４Ａに示されるノズルと一緒に組み立てた図６Ａに示される加熱部材の他の側面図である。
【図８】[0037]図８Ａは、製造中の混合工程を一つの順番で行った場合に得ることができる、形成して脱水した構造体における不均等性を示す。[0038]図８Ｂは、製造中の混合工程を異なる順番で行った場合の、形成して脱水した構造体における均等性、及びアスペクト比に対するＰＧＳ濃度の影響を示す。
【図９】[0039]図９Ａは、５００倍の倍率で示されるコラーゲン線維である。[0040]図９Ｂは、５００倍の倍率で示される本発明の代表的な態様による組成物の４５μｍ繊維である。
【図１０】[0041]図１０は、その断面を横切って安定している多孔性を示し、２５０倍の倍率で示される、代表的な態様による熱的に架橋及び処理した組成物である。
【図１１】[0042]図１１Ａは、混合の添加順によってグリセロール−セバシン酸エステルの大きなポケットが形成される、代表的な態様による形成して脱水した組成物である。[0043]図１１Ｂは、混合の添加順によって均一な分布が与えられ、それによって多孔質の網状組織が生成する、代表的な態様による形成して脱水した組成物である。
【図１２】[0044]図１２は、レオロジー、及びグリセロール−セバシン酸エステルの濃度が代表的な態様による組成物の貯蔵弾性率に対して与える影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
[0045]代表的な態様は、ポリオールと二酸（例えばグリセロールとセバシン酸）の縮合反応生成物である、水和ポリペプチドのマトリクス内のエステルの水分散性の生分解性組成物に関する。代表的な態様はまた、時には３Ｄ印刷とも呼ばれる付加製造プロセスなどにおいてこれらの組成物から製造される物品、並びにこれらの組成物を用いる方法及び装置にも関する。
【００２０】
[0046]ここでは組成物及び他の態様を主として付加製造プロセスに関して議論するが、本発明はそれに限定されず、本組成物は造形、被覆、成形技術、機械加工、又は押出などの任意の他の好適な用途のために用いることができる。
【００２１】
[0047]体内に移植する臓器、組織、及び他の構造体などのバイオプリンティングは、３Ｄ立体リソグラフィー、インクジェット印刷、組織工学、ポリマー化学、及び組織細胞生物学のコンバージングテクノロジーである。組織工学における３Ｄ臓器プリンティングの基本概念は、細胞取込性を有する配合物を用いることによるか、或いはその上で細胞を臓器に成長させることができる自立型の足場材料を生成させることによって組織又は組織構成物を再生することである。
【００２２】
[0048]付加製造としても知られる３Ｄ印刷は、一般に、コンピューター制御下で材料の連続層をｘ−ｙ面内に形成して、ｚ方向の層によって目的物の層を構築するものである。プリントヘッドノズルは、通常のインクジェットプリンターと同様に材料のそれぞれの層を２Ｄ水平面内に堆積させる押出装置であってよい。
【００２３】
[0049]３Ｄ物体は、限定数の水平の平面体にスライスすることができる。これらの平面体を縦方向に再構築することによって物体が再形成される。３Ｄ印刷はこれらの平面体を再構築して、物体を再形成する。本発明の幾つかの態様においては、３Ｄ印刷において伝統的に用いられている「インク」に代えて、３Ｄプリントヘッドノズルによって、生体適合性及び／又は生体再吸収性のポリマーを押出す。生体再吸収性のポリマー組成物が２Ｄ層内に堆積されたら、プリントヘッド又はプラットフォーム台を上下に（即ちｚ方向において）スライドして、次の２Ｄ層を従前の層の上に印刷して完全な構造体を再形成する。
【００２４】
[0050]図１を参照すると、３Ｄ印刷物体１０は組成物１２から印刷される。３Ｄプリンターアセンブリ１００は、プリントヘッド１４及びプラットフォーム２４を含む。プリントヘッド１４は、ノズル１６、及び組成物１２を保持するための貯留タンク１６を含む。プリントヘッド１４は、場合によっては加熱部材２０を更に含む。３Ｄ印刷物体を印刷するためには、組成物１２は、幾つかの態様においては、加熱部材２０によって加熱し、先端部３０を通して貯留タンク１８から押出し、基材２２上に堆積させてｘｙ方向において層を形成することができる。ノズル１６及び／又はプラットフォーム２４を、ｘ、ｙ、及びｚ方向に動かして連続的なｘｙ層の堆積を可能にして、ｚ方向において物体１０を構築することができる。幾つかの態様においては、３Ｄプリンターアセンブリ１００はコンピューター２６を更に含む。コンピューター２６は、ノズル１６及び／又はプラットフォーム２４の動き、並びに加熱部材２０及び／又はプラットフォーム２４の温度を制御するようにプログラムすることができる。
【００２５】
[0051]図１においては不連続の部材として印刷するように示されているが、種々の製造方法が本発明において意図されることが認識されるであろう。幾つかの態様においては、ノズル１６を通して組成物１２を連続的に押出して繊維を形成し、これを物品の直接形成において用いることができ、或いはヤーンを製造するために巻回して、その後に編織布を形成することができる。
【００２６】
[0052]組成物１２は生体再吸収性ポリマー及びポリペプチドの配合物であり、一般に水、ポリペプチド、及び例えばグリセロール−セバシン酸エステル化合物のようなポリオールと二酸の縮合ポリマーを含む。幾つかの態様においては、組成物１２は、米国特許７，７２２，８９４（その全部を参照として本明細書中に包含する）において開示されている代謝産物ビルディングブロックをベースとする１種類以上の生体再吸収性の生体適合性材料を含む。
【００２７】
[0053]グリセロール−セバシン酸エステル化合物は、１０，０００より大きい分子量を有する（ここではＰＧＳとも呼ぶ）か；１０，０００以下の分子量を有する（これはオリゴマー形態（ここではＯＧＳとも呼ぶ）とみなすことができる）か；或いはエステルの高分子量及び低分子量形態の幾つかの組合せのポリマー形態で存在していてよい。
【００２８】
[0054]ＰＧＳ及びＯＧＳを用いることによって、ラクチド及びグリコリドの制限の多くを克服し、例えば瘢痕化を排除することができる。ＰＧＳはバイオエラストマーであり、これに対してラクチド及びグリコリドは硬質の熱可塑性生体再吸収性ポリマーである。更に、バイオエラストマーの特徴によって、自然な組織により近似する足場材料雰囲気を促進する適切なコンプライアンス係数を有する治癒組織が与えられる。生理的に適合した足場材料のコンプライアンスは、プロヒーリング（pro-healing）細胞シグナリングを増大させる細胞外マトリクス（ＥＣＭ）を模倣する。
【００２９】
[0055]幾つかの態様においては、組成物１２のＰＧＳは細胞内代謝物質に加水分解（分解）し、これはクレブス回路によって消費することができ、一方、ラクチド及びグリコリドは非代謝プロセスによって体から取り出さなければならない。理論には縛られないが、ＰＧＳを生体内組織足場材料として用いると、これは外生栄養剤又は前駆細胞を用いないで天然組織の幹細胞を引き寄せることができる。
【００３０】
[0056]幾つかの態様においては、組成物１２は、細胞、生物製剤、栄養剤、成長剤、又は他の生物活性化合物を排除して、水、ポリペプチド、及びグリセロール−セバシン酸エステル化合物のみから構成される。代表的な態様の有利性は、中でも、幹細胞、間葉細胞、栄養剤、又は他の生物製剤のような外生要因の不存在下で組織の再生を行うことができ、組成物１２によって内因性再生を促進することができることである。しかしながら、かかる化合物は全ての場合において組成物１２から排除されるのではなく、他の態様においては１種類以上の生物活性物質を用いることができることが認識される。
【００３１】
[0057]理論に縛られることは望まないが、組成物１２中においてＰＧＳを用いる幾つかの態様においては、組成物の分解／浸食メカニズムは、バルク浸食剤であるラクチド及びグリコリドのようなより通常的な物質と対比して、表面浸食剤としてであると考えられる。表面浸食は、マトリクス足場材料として、且つ薬物又は生物製剤を制御して放出するためのマトリクス材料としての両方のバイオポリマーの制御された分解にとって好適である。したがって、この分解メカニズムは早期の足場材料の弱体化をもたらさない。
【００３２】
[0058]幾つかの態様においては、組成物１２は単一の均一な水相として形成され、分散剤を含まない。
[0059]組成物１２は、生体細胞と適合性であるか、又は「冷間」押出（これは概してより高いポリマーの融点又は流動温度（例えば約２００℃より高い）に関する相対的な用語である）と言われる、幾つかの態様においては約３５℃〜約４０℃の範囲内である押出温度において処理することができる。より高固形分のポリマー流の可能性を増加させ、且つより平滑な押出物を形成するために、ノズル温度を体温範囲内に多少上昇させる改良された「冷間」押出ノズル１６が与えられる。
【００３３】
[0060]３Ｄ印刷の性質により、押出す材料は、ノズルを通して流動させることができ、且つ物体を生成させるためにビルドプラットフォームに対して、又は層の下側に粘着させることができなければならない。通常の融解フィラメント製造（ＦＦＦ）においては、これはポリマーを（例えばアクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）に関しては２３０℃において）溶融し、次にビルドプラットフォームをガラス転移温度（例えばＡＢＳに関しては１１０℃）に設定することによって行う。この低温押出においては、印刷のために用いる材料は流動させることができるが、更には比較的短い時間内に硬化させることができなければならない。幾つかの代表的な態様による組成物は、２分間未満で硬化させることができる。
【００３４】
[0061]冷間押出を用いる現在のバイオプリンターは、細胞培養なしでは従前の層に対する強度及び接着性は限定されている。通常は細胞をマトリクス内に懸濁させて、最終的に成長させてマトリクスと置き換える。しかしながら、上述したように、代表的な態様にしたがって用いる組成物は細胞を用いることを必要としないが、低いメルトフロー温度のためにそれらを含める能力を有している。
【００３５】
[0062]本組成物は、幾つかの代表的な態様に関してはバイオインクと呼ばれるが、全ての場合において液体である必要はなく、半固体又は固体であってもよい。
[0063]幾つかの態様においては、本発明は、ＯＧＳと共変性することができ、可塑剤、分散剤、湿潤剤、加工助剤、又は樹脂安定剤として働くことができるベースポリマーのポリ（グリセロール−セバケート）（ＰＧＳ）をバルクのビヒクルとして用いて、栄養剤の不存在下において細胞増殖を促進する特定の構成材料の組成物を提供する。
【００３６】
[0064]組成物１２の幾つかの態様においては、配合物変性剤として、種々のグリセロール−セバシン酸エステル並びにコラーゲン及びその誘導体を用いる。この組成物の有利性は、ポリマー組成物の均一さ、生理的温度における押出、及び生体適合性材料から構成される完全に生体再吸収性のポリマー組織足場材料を与える即時の固化である。配合化学の要件を達成する天然代謝物質を含むことが、この組成物の更なる有利性である。
【００３７】
[0065]本発明には、「バイオインク」としても知られ、生理的温度において３Ｄプリントノズル１６を通して空間的に堆積させることができる、特異的な生体細胞又はその栄養成分を用いるか又は用いないで生体再吸収性を与える３Ｄ足場材料構築材料として組成物１２を用いることを含ませることができる。組成物１２を配合して、シリンジ及びプランジャーシステム、材料貯留タンク及び空気圧システム、又はオリフィスを通る他の押出を用い、熱を加えないで、冷間押出に通すことができる。一態様においては、本発明は、水、ポリペプチド、及びポリオールと二酸の縮合ポリマーを含む組成物１２を与える。他の態様においては、組成物１２はポリオールと二酸の縮合オリゴマーを更に含む。他の態様においては、本発明の組成物１２は生物活性物質を更に含む。本発明の他の態様においては、組成物１２の縮合ポリマー及び／又はオリゴマーは、官能化して、印刷後の構造体（即ち、印刷によって形成され、更に処理する前の構造体であり、「Ａ段階」構造体とも呼ぶ）における架橋可能な化学的性質を与えることができる。かかる官能基は、例えばＡ段階構造体を加熱又は光硬化させることによって架橋を引き起こすように誘導して印刷後の安定性を与える（そして、「Ｂ段階」構造体と呼ぶことができるものを与える）ことができる。
【００３８】
[0066]上記で議論したように、幾つかの態様においては、組成物１２は、水、ポリペプチド、及びポリオールと二酸、好ましくはグリセロールとセバシン酸の縮合反応生成物であるエステル化合物を含む。幾つかの態様においては、ポリマーグリセロール−セバシン酸エステル及び／又はオリゴマーグリセロール−セバシン酸エステルは官能化することができる。幾つかの態様においては、ポリペプチドはコラーゲン又はゼラチンである。組成物１２の成分の相対量を調節して、組成物１２及び／又は組成物１２から構築される３Ｄ固形物１０の物理特性を微調整することができる。
【００３９】
[0067]一態様においては、代表的な態様による組成物は、
重量基準で約３０％〜約８５％の水；
重量基準で約１０％〜約６０％のグリセロール−セバシン酸エステル化合物；及び
重量基準で約０．１％〜約３０％のポリペプチド；
を含む。
【００４０】
[0068]他の態様においては、本組成物は、
重量基準で約４０％〜約８５％の水；
重量基準で約１０％〜約５０％のグリセロール−セバシン酸エステル化合物；及び
重量基準で約５％〜約３０％のポリペプチド；
を含む。
【００４１】
[0069]具体的な量及び量の範囲は、多少は組成物を用いる用途に応じて左右する可能性があることが認識され、繊維用途のためには現時点ではより少ない量のポリペプチドが好ましい。
【００４２】
[0070]幾つかの態様においては、水成分は重量基準で約３５％〜約８５％の範囲で存在する。幾つかの態様においては、水成分は、重量基準で約４０％〜約８０％；例えば重量基準で約５０％〜約７５％の範囲で存在する。幾つかの態様においては、組成物１２は、重量基準で約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、又は約８５％、或いは上記の任意の値の間の任意の数、範囲、又は下位範囲の水を含む。
【００４３】
[0071]幾つかの態様においては、グリセロール−セバシン酸エステル化合物は、重量基準で約１０％〜約６０％、例えば重量基準で約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、又は約６０％、或いは上記の任意の値の間の任意の数、範囲、又は下位範囲として存在する。グリセロール−セバシン酸エステル化合物は、ＰＧＳ、ＯＧＳ、又はこれら２つの組合せとして存在させることができる。
【００４４】
[0072]幾つかの態様においては、ポリペプチド成分は、重量基準で約０．１％〜約３０％の範囲で存在する。幾つかの態様においては、組成物１２は、重量基準で約０．５％、約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、又は約３０％、或いは上記の任意の値の間の任意の数、範囲、又は下位範囲のポリペプチドを含む。
【００４５】
[0073]幾つかの態様においては、組成物１２は重量基準で約１５％〜約６５％の範囲の全固形分を含む。
[0074]本発明によれば、ポリ、ポリマー、又はポリマー性とは、ポリオールと二酸のエステル化によって形成される中間重量のポリマーを指し、オリゴ、オリゴマー、及びオリゴマー性とは、ポリオールと二酸のエステル化によって形成される低分子量のポリマーを指し、熱硬化性又は硬化ポリマーとは、ポリオールと二酸のエステル化によって形成され、加熱、光硬化、マイクロ波硬化、赤外硬化などによって更に架橋された高分子量のポリマーを指す。ポリオールと二酸の縮合オリゴマー及びポリマーはまた、酸価（カルボン酸基の数の指標）及びヒドロキシル価（ヒドロキシル基の数の指標）によって特徴付けることもできる。酸価とは、１グラムの縮合ポリマー又はオリゴマーを中和するのに必要な水酸化カリウム（ＫＯＨ）の質量（ミリグラム）を指す。ヒドロキシル価とは、１グラムの縮合ポリマー又はオリゴマーのアセチル化で回収される酢酸を中和するのに必要な水酸化カリウムのミリグラム数を指す。本発明において有用な縮合オリゴマーは、通常は約５０ｍｇ／ｇ〜約１００ｍｇ／ｇ、約５５ｍｇ／ｇ〜約８５ｍｇ／ｇ、約５５ｍｇ／ｇ〜約７５ｍｇ／ｇ、又は約５５ｍｇ／ｇ〜約６５ｍｇ／ｇの間の酸価を有し；本発明において有用な縮合ポリマーは、通常は約５ｍｇ／ｇ〜約５５ｍｇ／ｇ、約１５ｍｇ／ｇ〜約５０ｍｇ／ｇ、約２０ｍｇ／ｇ〜約５０ｍｇ／ｇ、又は約３５ｍｇ／ｇ〜約５０ｍｇ／ｇの間の酸価を有する。
【００４６】
[0075]幾つかの態様においては、ポリオール成分は、グリコール、グリセロール、エリトリトール、トレイトール、アラビトール、キシリトール、マンニトール、ソルビトール、マルチトール、又はこれらの組合せであってよい。幾つかの態様においては、二酸は、セバシン酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸（５炭素）、アジピン酸（６炭素）、ピメリン酸（７炭素）、スベリン酸（８炭素）、及びアゼライン酸（９炭素）であってよい。代表的な長鎖二酸としては、１０より多く、１５より多く、２０より多く、及び２５より多い炭素原子を有する二酸が挙げられる。非脂肪族二酸を用いることができる。例えば、上記の二酸の１以上の二重結合を有するバージョンを用いて、グリセロール−二酸コポリマーを生成させることができる。また、炭素鎖中にアミン及び芳香族基を導入することもできる。代表的な芳香族二酸としては、テレフタル酸及びカルボキシフェノキシプロパンが挙げられる。二酸にはまた、置換基を含ませることもできる。アミン及びヒドロキシルのような反応性基は、架橋のために利用できる部位の数を増加させることができる。アミノ酸及び他の生体分子は、ポリマーの生物学的特性を変化させることができる。芳香族基、脂肪族基、及びハロゲン原子は、ポリマー内の鎖間相互作用を変化させることができる。任意の上記にリストしたポリオール又は他のポリオール、及び任意の上記にリストした二酸又は他の二酸から形成される任意の縮合ポリマーを、本発明の組成物中に含ませることができる。
【００４７】
[0076]本発明において用いるためのポリ（ポリオールセバケート）の例としては、次のもの：ポリ（グリコール−セバケート）、ポリ（グリセロール−セバケート）、ポリ（エリトリトール−セバケート）、ポリ（トレイトール−セバケート）、ポリ（アラビトール−セバケート）、ポリ（キシリトール−セバケート）、ポリ（マンニトール−セバケート）、ポリ（ソルビトール−セバケート）、ポリ（マルチトール−セバケート）、及びこれらの組合せの１以上が挙げられるが、これらに限定されない。幾つかの態様においては、ポリ（ポリオール−セバケート）はポリ（グリセロール−セバケート）である。
【００４８】
[0077]本発明において用いるためのオリゴ（ポリオール−セバケート）の例としては、次のもの：オリゴ（グリコール−セバケート）、オリゴ（グリセロール−セバケート）、オリゴ（エリトリトール−セバケート）、オリゴ（トレイトール−セバケート）、オリゴ（アラビトール−セバケート）、オリゴ（キシリトール−セバケート）、オリゴ（マンニトール−セバケート）、オリゴ（ソルビトール−セバケート）、オリゴ（マルチトール−セバケート）、及びこれらの組合せの１以上が挙げられるが、これらに限定されない。幾つかの態様においては、オリゴ（ポリオール−セバケート）はオリゴ（グリセロール−セバケート）である。
【００４９】
[0078]明細書全体にわたって、代表的な縮合オリゴマー及びポリマーとしてＯＧＳ及びＰＧＳが記載されているが、当業者のニーズに応じて任意の縮合オリゴマー又はポリマーを用いるか、又はそれに置き換えることができると意図される。
【００５０】
[0079]本発明において用いる縮合ポリマーにおけるポリオールモノマーと二酸モノマーとのモル比に関しては、かかるモル比は通常は約１：１であるが、他の比は本発明の範囲内である。幾つかの態様においては、ポリオールモノマーと二酸モノマーとのモル比は、約１：０．８、約１：１、約１：１．２、約１：１．５、約１：２、約１：３、約１：４、又は約２：３であってよい。
【００５１】
[0080]幾つかの態様においては、本発明の組成物１２は、縮合ポリマーと縮合オリゴマーを、約１０：１、約９．５：１、約９：１、約８．５：１、約８：１、約７．５：１、約７：１、約６．５：１、約６：１、約５．５：１、約５：１、約４．５：１、約４：１、約３．５：１、約３：１、約２．５：１、約２：１、約１．５：１、約１：１、約１：１．５、約１：２、約１：２．５、約１：３、約１：３．５、約１：４、約１：４．５、約１：５、約１：５．５、約１：６、約１：６．５、約１：７、約１：７．５、約１：８、約１：８．５、約１：９、約１：９．５、又は約１：１０のポリマー：オリゴマーの重量比で含む。
【００５２】
[0081]幾つかの態様においては、組成物１２は、ＯＧＳ及び／又はＰＧＳのグリセロール−セバシン酸エステル化の進行度に基づいて取り扱うことができる。例えば、ＯＧＳ重合度に応じて、ＯＧＳを、界面活性剤、湿潤剤、官能化キャリア、流動及びレベリング剤、希釈剤、可塑剤、樹脂安定剤、又は特殊な加工助剤として作用させることができる。更に、ＰＧＳの重合度に応じて、ポリマーは、ゲル、エラストマー、熱可塑性樹脂、又は熱硬化性樹脂として製造することができる。エステル化の進行度は、酸価及びヒドロキシル価の測定値により当業者によって計算して求められる。
【００５３】
[0082]幾つかの態様においては、本発明のバイオインク組成物において、縮合ポリマーと縮合オリゴマーの組合せを用いる。縮合ポリマーは、通常は約３５ｍｇ／ｇ〜約５０ｍｇ／ｇの範囲の酸価を有し、幾つかの態様においては約３０ｍｇ／ｇ、約３５ｍｇ／ｇ、約４０ｍｇ／ｇ、約４５ｍｇ／ｇ、約５０ｍｇ／ｇ、又は約５５ｍｇ／ｇである。縮合オリゴマーは、通常は約５５ｍｇ／ｇ〜約６５ｍｇ／ｇの範囲の酸価を有し、幾つかの態様においては約５０ｍｇ／ｇ、約５５ｍｇ／ｇ、約６０ｍｇ／ｇ、約６５ｍｇ／ｇ、又は約７０ｍｇ／ｇである。
【００５４】
[0083]幾つかの態様においては、縮合ポリマー及び／又は縮合オリゴマーは官能化されている。官能基の例としては、アクリレート、ペプチド、シンナメートが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
[0084]幾つかの態様においては、グリセロール−セバシン酸エステル樹脂のような縮合ポリマー又はオリゴマーには、親水性、及びこれとは異なり疎水性に「調整」することができる１以上の官能基を与えることができる。即ち、縮合ポリマー及び／又はオリゴマーは、構造を変化させる任意の官能基によって所望の親水性又は疎水性が重合した樹脂に与えられるように選択することができる。したがって、遊離ヒドロキシル及び遊離カルボキシルの化学的性質に基づいて意図に合わせて官能化した樹脂を生成させることが可能である。かかる調整によって組成物を変性して、水分散液中におけるポリペプチドの装填量を最大にすることができる。
【００５６】
[0085]親水性と疎水性のバランスによって完全に生体再吸収性のポリマー構造体の高い固形分が最大になることは、調整可能性の更なる有利性である。
[0086]一態様においては、本発明の組成物は、コラーゲン及びゼラチンのような１種類以上のポリペプチドを含む。ゼラチン又は相当するコラーゲンは、例えばヒト、魚、クラゲ、ブタ、ウマ、又はウシ由来のものであってよい。同じように、コラーゲンをゼラチンＡ又はＢで置き換えることができる。幾つかの態様においては、コラーゲンのタイプ１、タイプ２、タイプ３、タイプ４、タイプ５、タイプ６、タイプ７、タイプ８、タイプ９、タイプ１０、タイプ１１、タイプ１２、タイプ１３、タイプ１４、タイプ１５、タイプ１６、タイプ１７、タイプ１８、タイプ１９、タイプ２０、タイプ２１、タイプ２２、タイプ２３、タイプ２４、タイプ２５、タイプ２６、又はタイプ２７を用いることができる。幾つかの態様においては、ポリ（ポリオール−セバケート）又はオリゴ（ポリオール−セバケート）を加える前にポリペプチドを水中に分散させることによって、ポリ（ポリオール−セバケート）又はオリゴ（ポリオール−セバケート）の溶液中における分散を向上させることができる。組成物１２の幾つかの態様においては、ポリペプチドを含ませることによって、押出した組成物を、ポリペプチドを含まない組成物よりも迅速に硬化させることができる。
【００５７】
[0087]ポリペプチドを本発明の組成物中に含ませることができるが、任意の生物活性組織、及び特に結合組織を用いることができる。幾つかの態様においては、ポリペプチドに代えてポリウレタンを含ませることができる。
【００５８】
[0088]幾つかの態様においては、本発明の組成物は生物活性物質を更に含む。かかる生物活性物質は、例えばビタミンＥ又はＣのようなビタミン、ミネラルであってよく、及び／又はトコフェロール、アスコルベート、レチノイン酸、又はこれらの組合せが挙げられる。或いは、生物活性物質は、幹細胞、前駆細胞、間葉細胞、栄養細胞、体細胞、又はこれらの組合せのような細胞であってよい。他の態様においては、生物活性物質は、生物活性短ペプチド配列、成長因子、プロテオグリカン、糖タンパク質、グリコサミノグリカン、及び多糖、栄養素、サイトカイン、ホルモン、血管新生因子、免疫調節因子、薬物、又はこれらの組合せであってよい。
【００５９】
[0089]他の態様においては、生物活性物質は、例えば形質転換成長因子、インスリン様成長因子１、血小板由来成長因子、骨形成タンパク質（ｂｍｐ）のような成長又は形態形成因子；例えばインターロイキン、ケモカイン、マクロファージ走化因子、サイトカイン由来好中球走化因子（ｇｒｏ−１）のようなサイトカイン；インテグリン、及び成長因子受容体のような内在性膜タンパク質；例えば反発性ガイダンス分子のような成長及び形態形成を促進する膜結合因子；例えばフィブロネクチン及びコンドロネクチンのような細胞付着又は接着タンパク質；例えば成長ホルモン、インシュリン、及びサイロキシンのようなホルモン；アグリン、ラミニン、トロンボスポンジン、テネイシン、ベリスカン、パーリカン、シンデカン、スモールロイシンリッチプロテオグリカン、及びフィブロモジュリンのような細胞周囲マトリクス分子；例えばグルコース及びグルコサミンのような栄養素；例えばＲＮＡ及びＤＮＡのような核酸；例えばメトトリキサート及びアミノプテリンのような抗新生物薬；例えばナプロキセンナトリウム、サリチル酸、ジクロフェナク、及びイブプロフェンのような抗炎症薬；例えばホスホリラーゼ、スルファターゼ、及びキナーゼのような酵素；並びに、例えばＲＮＡｉ、シクロヘキシミド、及びステロイドのような代謝阻害薬；から選択することができる。
【００６０】
[0090]幾つかの態様においては、本発明の組成物は脂肪酸を含む。かかる脂肪酸は、ポリ（ポリオール−セバケート）、オリゴ（ポリオール−セバケート）、及びポリペプチド成分と混合することができ、或いは幾つかの態様においては、脂肪酸は、ポリマーポリオール−セバケート又はオリゴマーポリオール−セバケートと共エステル化される。本発明に関して用いるための脂肪酸としては、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、アラキジン酸、ガドレイン酸、アラキドン酸、酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチル酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、バクセン酸、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、ベヘン酸、エルカ酸、リグノセリン酸、セロチン酸、ミリストレイン酸、サピエン酸、エライジン酸、バクセン酸、リノエライジン酸、及びこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
[0091]本発明の組成物１２には、低温（約４０℃未満）において、ゼラチン又はコラーゲン、或いは他の好適な細胞外マトリクス（ＥＣＭ）結合組織ポリペプチド、多糖、及びこれらの組合せと配合し、場合によっては他の生理学的に許容しうる生体材料及び溶媒を含む（グリセロール−セバケート）エステルの種々の水分散性配合物を含ませることができる。これらの組成物は、押出、印刷、及び成形による組織工学構造体のための３Ｄ足場材料を構築するのに有用である可能性がある。
【００６２】
[0092]ポリオールと二酸の縮合反応生成物を形成する任意の好適な方法を、組成物１２のエステル成分を製造するために用いることができる。１つの特に好適な方法は、２０１５年５月２９日出願の米国出願１４／７２５，６５４（その全部を参照として本明細書中に包含する）に記載されているプロセスである。
【００６３】
[0093]組成物１２を製造する１つの方法は、幾つかの態様においては、固体のポリペプチド粉末（例えばゼラチン又はコラーゲン）を温水又は室温の水に加え、混合下で分散させてポリペプチドヒドロゲルを形成し、このポリペプチドヒドロゲル分散液に、混合下で固体又は溶融したエステルを加えてエステル／ポリペプチドヒドロゲルを形成し；このエステル／ポリペプチドヒドロゲルを低熱下で混合し；そしてエステル／ポリペプチド組成物を冷却することを含む。形成されるポリペプチドヒドロゲルは粘稠な流体分散液であってよい。幾つかの態様においては、温水は、約２５℃〜約８５℃、又は約２５℃〜約７５℃、又は約２５℃〜約６５℃、又は約３０℃〜約５５℃、又は約３５℃〜約５０℃、或いは約４０℃〜約４５℃の温度であってよい。幾つかの態様においては、低熱は、約２５℃〜約１５０℃、約４０℃〜約１３５℃、約５５℃〜約１２０℃、又は約７０℃〜約１１５℃の温度であってよい。幾つかの態様においては、低熱は、約２５℃〜約４０℃、約４０℃〜約７５℃、約７５℃〜約１００℃、約１００℃〜約１１５℃、又は約１００℃〜約１２５℃の温度であってよい。エステル／ポリペプチドヒドロゲルは、約４０℃以下、又は約３５℃〜約４０℃の範囲、或いは約３８℃〜約４０℃の範囲の温度において安定であり（即ち分離せず）、及び幾つかの態様においては液化する。冷却すると、組成物は、室温において多少チーズケーキのものに似た柔らかい感触を有する組成物に固化する。ポリペプチドを溶解するのに用いる元の水溶液の温度にかかわらず、この組成物は約４０℃以下の温度において流動させることができる。
【００６４】
[0094]通常は、組成物１２の成分を混合するために低剪断混合を用いる。幾つかの態様においては、より高い比のポリペプチド及びエステル（例えばグリセロール−セバシン酸エステル）を水中に分散させるために、剪断ブレード、ライトニングミキサー(lightning mixer）、又は他の高剪断混合を用いることができる。
【００６５】
[0095]混合の方法及び順番は、幾つかの特性（これは、用途に応じて望ましい可能性がある）を得るか又は回避するのに役立つ。水中におけるポリペプチドの水和は、常に初めの工程として実施して、その後に溶融形態のエステルを水和混合物に加えて、溶液全体にわたる適当な分配を達成しなければならない。
【００６６】
[0096]他の態様においては、組成物を製造する方法は、親水性及びヒドロキシル官能性に基づく水分散性のために、重合度によって低分子量のグリセロール−セバシン酸エステルの極性を変化させることを含む。このアプローチによって、配合のニーズにしたがって添加成分の順番を変化させることができる。例えば一態様においては、組成物１２を製造する方法には、固体のポリペプチド粉末（ゼラチン又はコラーゲン）を温水に加え、混合力下で分散させてポリペプチドヒドロゲルを形成し；ポリペプチドヒドロゲルにＯＧＳを加え、混合力下で分散させてＯＧＳ／ポリペプチドヒドロゲルを形成し；そして、混合力下でＰＧＳをＯＧＳ／ポリペプチドヒドロゲル分散液に加えてＰＧＳ／ＯＧＳ／ポリペプチドヒドロゲルを形成し；低熱下でＰＧＳ／ＯＧＳ／ポリペプチドヒドロゲルを混合し；そしてＰＧＳ／ＯＧＳ／ポリペプチド組成物を冷却する；ことを含ませることができる。
【００６７】
[0097]更に、ＰＧＳ及びＯＧＳの極性は、ω−＃脂肪酸と共エステル化することによって更に変化させることができる。この変性により、非極性アルキル鎖が付加されることによって得られる組成物の極性が減少する。
【００６８】
[0098]本発明の３Ｄ構造体は、押出及び冷却した後で、しかしながら架橋を誘発するために処理する前（即ちＡ段階）において、硬質であるがスポンジ状で、一般に僅かに変形させた後にその元の形状に戻ることができるチーズケーキに類似のコンシステンシーを有することができる。３Ｄ構造体を形成するために用いる組成物中におけるポリペプチド／ＰＧＳの比に応じて粘度及び粘着性を変化させることができ、ＰＧＳを増加させると、粘度が減少し、粘着性が増加する。粘着性は、ＯＧＳ：ゼラチンの比、又はＰＧＳ：ゼラチンの比、或いは（ＯＧＳ及びＰＧＳ）：ゼラチンの比を増加させるにつれて増加させることができる。
【００６９】
[0099]組成物１２は、Ａ段階組成物として印刷して、更にＢ段階に進めることができ、ここで、組成物１２の堆積した層の中及びその間で架橋を誘発させる。一態様においては、Ａ段階の組成物は、縮合重合によってＢ段階に進めることができる。組成物１２は、インクジェットのような印刷装置又は空間的堆積を与える同様の装置において、幾つかの所定の鉛直角でＸ−Ｙ面内に複数の層で供給することができる。面内堆積を繰り返して、面の連続的な編成によって対照の３Ｄ構造体が構築されるようにする。三次元足場材料を形成する方法には、バイオインク組成物の第１の二次元層を基材上に押出し、そして第三次元で第１の二次元層の上にバイオインク組成物の第２の二次元層を形成することを含ませることができ、ここでバイオインク組成物はポリマーグリセロール−セバケート及びポリペプチドを含む。
【００７０】
[00100]本発明の特徴の１つは、グリセロール−セバシン酸エステル／ポリペプチド組成物によって、生理的温度においてプリントヘッドを通して押出すことができるバイオポリマーの足場材料が与えられることである。この特徴によって更に、生物製剤、栄養剤、及び細胞（即ち、幹細胞、前駆細胞、間葉細胞、又は体細胞）などの生物活性成分を直接導入することが可能になる。ノズルを通して組成物を処理することができる温度によって、ラクチド及びグリコリド組成物を凌ぐ他の有利性を与えることができる。押出物としての通常のラクチド又はグリコリドの３Ｄプリントヘッドノズル温度は、１５０℃〜２５０℃である。これらの温度によって、３Ｄ足場材料印刷において有用な同時バイオポリマー／細胞押出物のために細胞又は生物製剤をラクチド及びグリコリド組成物中に導入することが不可能になる可能性がある。組成物１２のポリ（グリセロール−セバケート）／ポリペプチド組成物は、生理的温度（即ち約３７℃〜約４０℃）において３Ｄプリントヘッドノズルを通して押出すことができる。通常のポリマー押出温度（例えば１５０℃〜２５０℃）と比べると、生理的温度において組成物１２を押し出すことが可能であることにより、通常は約４０℃〜５０℃より高い温度で生物分解する生物活性物質を含めることが可能になる。バイオインク組成物は、約４０℃以下、又は約３５℃〜約４０℃の範囲、或いは約３８℃〜約４０℃の範囲の温度において押出すことができる。
【００７１】
[00101]組成物１２の更なる利益は、バイオエラストマーの生物分解性ポリマー押出物が迅速に固化し、これにより構造体の三次元付加製造及び成形体の迅速な加工が可能になることである。
【００７２】
[00102]３Ｄ構造体を形成する方法には、三次元足場材料を加熱する工程を更に含ませることができる。加熱工程によって、バイオインク組成物の層の間及び層の中で架橋を誘発させて、３Ｄ足場材料を「硬化」させることができる。通常は、三次元構造体を、約３０℃〜約１２０℃の範囲、例えば約３０℃、約４０℃、約５０℃、約６０℃、約７０℃、約８０℃、約９０℃、約１００℃、約１１０℃、約１２０℃、又は上記の任意の値の間の任意の温度、範囲、又は下位範囲の温度に加熱する。
【００７３】
[00103]３Ｄ構造体を形成する方法には、バイオインク組成物を光硬化させる工程を更に含ませることができる。一態様においては、Ａ段階のグリセロール−セバシン酸エステルをアクリル化して、遊離基光硬化性の押出物を生成させることができる。この組成物においては、足場材料は、Ｂ段階において処理する前に、Ａ段階において３Ｄで作成して「光硬化」させることができる。これによって、取扱い性及び貯蔵性を向上させることができる。
【００７４】
[00104]Ａ段階の組成物は、エポキシ化してカチオン性の光硬化性押出物を生成させることができる。この組成物においては、足場材料はＢ段階において処理する前に、Ａ段階において３Ｄで作成して「光硬化」させることができる。これによって、取扱い性及び貯蔵性を向上させることができる。
【００７５】
[00105]Ａ段階の組成物にはω−＃脂肪酸のような遊離の共ブレンドされた脂肪酸を含ませることができ、ここでは３Ｄ構造体を印刷後の硬化のために空気硬化させることができる。
【００７６】
[00106]成形及び押出のような他の態様においては、構造体全体をＩＲ硬化、アセトン洗浄、凍結乾燥等で処理することができる。
[00107]更に、ここに記載する組成物で形成される構造体は空気乾燥することができる。これらは、次に所望のように再水和することができ、未硬化の場合にはそれらの元の寸法よりも大きい寸法に膨張する可能性があるが、架橋して硬化させた構造体はそれらの元の形状及び寸法に戻る。
【００７７】
[00108]上述したように、幾つかの態様においては、ＰＧＳ及びＯＧＳは、更にω−＃脂肪酸と共エステル化することができる。ω系を含む組成物は、室温（例えば約２５℃）、又は僅かに高い温度、例えば約３０℃、約３５℃、約４０℃、約４５℃、又は約５０℃において空気硬化させることができる。
【００７８】
[00109]ＯＧＳ／ＰＧＳ／ポリペプチド／水の組成物は、高い双極子モーメントを有する生体適合性の有機及び無機材料と配合して、マイクロ波硬化させることができる。幾つかのかかる態様においては、ＰＧＳは、存在する遊離ヒドロキシル及びカルボニル基の数に応じて高い双極子モーメントを有する材料として機能させることができる。幾つかの態様においては、高い双極子モーメントを有する材料を、バイオインク組成物１２の一部として混合する。他の態様においては、高い双極子モーメントを有する基によってＰＧＳを官能化する。通常の高双極子モーメント材料としては、グリセロール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びカルボニル又はヒドロキシ基を有する他の材料が挙げられる。
【００７９】
[00110]水相の予期しなかった望ましい利益は、３Ｄ構造体を完成構造物から脱水する際に水がポロゲンのように挙動することである。これにより、かかる３Ｄ組成物が排水されることによって３Ｄ構造物に多孔性が与えられる。一態様においては、水は、図２に見られるように凍結乾燥によって３Ｄ構造体から除去することができる。通常は、３Ｄ構造体は、約０℃〜約−１６０℃、約−２０℃〜約−１４０℃、約−４０℃〜約−１２０℃、又は約−６０℃〜約−１００℃の温度で凍結乾燥する。幾つかの態様においては、三次元構造体は、約０℃、約−１０℃、約−２０℃、約−３０℃、約−４０℃、約−５０℃、約−６０℃、約−７０℃、約−７５℃、約−８０℃、約−８５℃、約−９０℃、約−１００℃、約−１１０℃、約−１２０℃、約−１３０℃、約−１４０℃、約−１５０℃、又は約−１６０℃の温度で凍結乾燥することができる。而して、材料の小穴形成（pocking）又は傷跡形成（scarring）をもたらす可能性があり、洗浄後であっても構造体中に塩を残留させる可能性がある塩化ナトリウムのような伝統的なポロゲンは必要ない。
【００８０】
[00111]３Ｄ物体１０の平均細孔径は、約５μｍ〜約８０μｍ、約１０μｍ〜約７０μｍ、約２０μｍ〜約６０μｍ、又は約３０μｍ〜約５０μｍの範囲であってよい。幾つかの態様においては、脱水後の平均細孔径は、約３０μｍ未満、約２５μｍ未満、又は約２０μｍ未満である。幾つかの態様においては、平均細孔径は、ほぼ白血球の寸法又はこれよりも小さい寸法である。幾つかの態様においては、平均細孔径は、マクロファージが細孔に侵入するのを阻止するのに十分に小さい。
【００８１】
[00112]本組成物の他の予期しなかった利益は、エステルポリマー構造体を支持及び強化することができるポリペプチド繊維状網状組織の均一性である。足場材料構造体に関しては、コラーゲンは重要な細胞外マトリクス（ＥＣＭ）成分である可能性がある。組成物１２は、均一に分散したコラーゲン及びポリペプチド様誘導体の均一な分散液を与えることができる。
【００８２】
[00113]幾つかの場合においては、代表的な態様による組成物は、材料上に直接印刷して、材料上にＰＧＳ被覆を与えることができる。かかる被覆は、織布の増加した引張り強さのような有益な特性を基材材料に与えることができる。幾つかの態様においては、被覆する基材材料はポリマーである。代表的なポリマーとしては、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ乳酸−ｃｏ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、及びこれらの組合せを挙げることができる。
【００８３】
[00114]図１に戻ると、３Ｄプリンターアセンブリ１００は、ノズル１６及び組成物１２を保持するための貯留タンク１８を有するプリントヘッド１４を含み、更に加熱部材２０を含むように示されている。プリンターアセンブリ１００には、物体をスキャンするためのスキャナー２８、及び／又は物体をデザインするためのコンピューター支援デザインプログラムを更に含ませることができる。
【００８４】
[00115]加熱部材２０は、生理的温度の制御のために組成物１２のレオロジー特性を精密に促進させるために用いることができる。
[00116]図６Ａ〜６Ｄ及び図７Ａ〜７Ｃを参照すると、加熱部材２０には、ノズル１６を受容するための内腔４０を含ませることができる。加熱部材２０には、ハウジング部材の外表面から伸長させることができ、内腔４０中に開口する開口４２を更に含ませることができる。開口４２は位置決めネジ（図示せず）を受容することができ、位置決めネジをノズル１６と連通させることができるように構成される。加熱部材２０には、ヒーターカートリッジ（図示せず）を受容するための内腔４４を含ませることができる。開口４６が、ハウジング部材の外表面から位置決めネジ（図示せず）を受容するための内腔４４に伸長し、位置決めネジをヒーターカートリッジと連通させることができるように構成される。加熱部材２０には、熱電対を受容するための内腔４８を含ませることができる。
【００８５】
[00117]加熱部材２０は、組成物が所望の温度に加熱されるように組成物１２に適合させることができる。加熱部材２０はまた、２５〜４０℃の間で僅かに材料を流すことによってより高い割合の固形物を押出すことが可能になるように構成することもできる。
【００８６】
[00118]幾つかの態様においては、加熱部材２０は異なる区域を有していて、１以上の他の貯留タンクを加熱する一方で１以上の貯留タンクを冷却することが可能である。
[00119]ビルドプラットフォーム２４は温度制御することができる。一態様においては、温度は、通常は材料のガラス転移温度に設定される高温のビルドプラットフォームとは対照的に、約２５℃未満に維持することができる。冷却されたプラットフォーム２４によって、上昇した流量レベルを可能にし、押出された構築材料の迅速な硬化を確保することができる。幾つかの態様においては、プラットフォーム２４は、約０℃〜約２５℃、約０℃〜約１０℃、約５℃〜約１５℃、約１０℃〜約２０℃、又は約１５℃〜約２５℃の温度範囲に冷却する。冷却されたプラットフォーム２４は、基材及び／又は３Ｄ構造体をより速い硬化時間の間冷蔵庫内に配置することを模擬することができる。
【００８７】
[00120]図１、４、５、及び７を参照すると、ノズル１６は、シリンジ及びプランジャーシステム、材料貯留タンク及び空気圧システムを用いる冷間押出又は他の押出によってバイオインク組成物１２を押出すことを可能にするように設計することができる。
【００８８】
[00121]図４Ａ〜４Ｅを参照すると、ノズル１６には先端部３０を含ませることができる。ノズル１６には、繊維コアのような第２の材料のための供給ライン３６を含ませることができる。したがって、ノズル１６は、インク組成物が繊維コアを取り囲むことができるシース／コア押出物を生成させるように構成することができる。代表的な繊維としては、コラーゲン、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、及び更なる構造及び強度を最終印刷物に付加するように構成されている任意の他の生体再吸収性繊維が挙げられる。繊維コアは、ポリマーバイオインク組成物のものよりも低い温度であってよい。通常は、繊維コアは、約２５℃、約３０℃、約３５℃、又は約４０℃、約２５℃〜約４０℃、約２５℃〜約３５℃、又は約２５℃〜約３０℃の温度に冷却することができる。幾つかの態様においては、繊維コアは、組成物１２よりも約５℃、約１０℃、約１５℃、約２０℃、又は約２５℃低い温度に冷却することができる。図４Ｅを参照すると、幾つかの態様においては、ノズルには、貯留タンクコネクター部材１９、及び、組成物１２が押出されるにつれてそれを混合することを可能にするノズルの内腔に関連づけられたピッチを更に含ませることができる。
【００８９】
[00122]現時点では、標準的な技術においては、三次元構築物のフィルパターンは無視されている。現在のプラクティスにおいては、外部構造のみを考慮して、充填密度を操作して用いる材料の重量及び量に影響を与えることができる。バイオプリントは、デザインされた細孔又は他の内部構造を三次元印刷物中に導入して、実質的に１００％充填で印刷する。提案する発明はまた、構築物の内部構造も操作して、多層パターンの配合物を与える。繊維コアと合体させると、構築物はシース／コアのパターン及び層形成に基づいて異なる特性を示す。
【００９０】
[00123]図５Ａ及び５Ｂを参照すると、ノズルの一態様は、先端部３０への複数の供給管３６を与えて、単一のノズルが要望に応じて単一共押出物又は多重押出物の組成にすることができるようにすることができ、かかる供給管３６は、当業者のニーズにしたがって異なる配列で配置することができる。図５Ａ及び５Ｂは、典型的な３つの供給管を有するノズルを示しているが、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれ以上の任意の数の供給管を有するノズルは、本発明の範囲内に含まれる。それぞれの供給管は、組成物１２又は組成物１２に加える成分を保持するための貯留タンクに接続することができる。１以上の供給管を温度制御することができる。例えば、組成物１２を第１の温度に加熱することができ、生物製剤を有する供給流を、第１の温度よりも低い第２の温度に維持することができる。図５Ｃを参照すると、一態様は、単一の供給管３６に通じる複数の貯留タンク１８を有していてよい。複数の貯留タンクは、次に図４Ｅに関して上記に記載したように内腔を通して混合する。
【００９１】
[00124]本発明はノズル構造のデザインを与え、かかるノズルは、生体細胞を害することなくノズルを通して本組成物を流すことを可能にするのに十分なエネルギーを与える内蔵ヒートシンクを有する。かかるノズルは、それぞれが異なる組成物、原材料、成長剤、細胞培養物、生理学的に許容しうる媒体、種々のＥＣＭタンパク質（例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、エラスチン、及び／又はプロテオグリカン）、糖類及びアミノ酸のような基本栄養素、成長因子、抗生物質（雑菌混入を最小にするため）を含む複数の貯留タンク１８を有するプリントヘッド中に設計することができる。
【００９２】
[00125]組成物１２には、バイオプリントを可能にする特定の生体力学特性を与える非細胞性物質、又は成長促進物質を更に含ませることができる。
[00126]図１を参照すると、３Ｄプリンターアセンブリには、１以上のプロセッサー及びメモリー（例えば１以上の不揮発性記憶装置）を有する１以上のコンピューター２６を含ませることができる。幾つかの態様においては、メモリー又はメモリーのコンピューター可読記憶媒体は、プロセッサーがここに開示する種々のシステム及び方法を制御及び実行するためのプログラム、モジュール、及びデータ構造、或いはこれらのサブセットを記憶する。一態様においては、非一時的コンピューター可読記憶媒体によって、プロセッサーによって実行された際にここに開示する１以上の方法を実施するコンピューターで実行可能な指示をその上に記憶させる。
【００９３】
[00127]構築指示はソフトウエア指令によって伝達される。本発明の他の形態によれば、３Ｄ物体の固体充填はカスタマイズされたソフトウエアによって操作する。
[00128]図１を参照すると、３Ｄプリントアセンブリにはスキャナー２８を更に含ませることができる。スキャナーを用いて、患者の臓器、骨、又は他の組織をスキャンして、３Ｄプリントアセンブリを用いて同じ寸法及びディメンションの３Ｄ構造体１０を構築することができる。代表的なスキャナーはＣＴスキャナーであるが、患者の臓器、骨、又は他の組織を三次元でスキャンすることができる任意のスキャナーを用いることができる。
【実施例】
【００９４】
[00129]全て重量基準で１０％のゼラチン、５９％の水、及び３１％のＰＧＳを含む組成物である配合物１を形成した。磁気スターラーバーを用いて混合を完了し、ホットプレートで温度を制御した。対照試料の対照例１は、ニートのＰＧＳ（真空下１２０℃において４８時間かけて製造した）であった。
【００９５】
[00130]振動式流量計を用いて、両方の材料について逆温度スイープを行って、貯蔵弾性率（Ｇ’）における変動を温度の関数としてモニターした。試験は、組成物を４０℃において６０秒間保持し、次に温度を２５℃に低下させて３００秒間保持することによって行った。結果を図３にグラフで示す。
【００９６】
[00131]この例においては、約１０ＰａのＧ’は自由流動の粘稠液体を示しており、したがって４０℃においては、配合物１及び対照試料の両方とも液体として挙動していた。配合物１の組成物は、温度低下の後に貯蔵弾性率の劇的な増加を起こし、一方、対照試料の貯蔵弾性率は一定のままであった。Ｇ’の増加は、配合物１の組成物が固化して形態がより固体状になり始めて、バイオインクとして好適な材料が与えられたことを示す。
【００９７】
[00132]図３において、対照試料は、温度を４０℃から２５℃に低下させた後においても流動し続けた。これに対して、配合物１の組成物は、４０℃において流動し、その後２５℃において１００秒後に完全に安定した。対照試料及び配合物１の両方に関して４０℃において見られる不整合、及び２５℃において保持した対照試料の変動は、材料の低い粘度に起因する検出限界以下の平行板トルク検出を示している。
【００９８】
[00133]対照試料は試験中にわたってこの不整合性を維持したので、１５℃の温度低下は対照試料の流動性に対して影響を与えないと推測することができる。配合物１において用いたようなゼラチン又はコラーゲンのようなゲル変性剤は、ＰＧＳを含む組成物を押出す能力を与え、固化プロセスを速める。
【００９９】
[00134]配合物２の組成物は、重量基準で１３％のゼラチン、７４％の水、及び１３％のＰＧＳで形成した。配合物３の組成物は、重量基準で１１．５％のゼラチン、６５．５％の水、及び２３％のＰＧＳで形成した。配合物４は、重量基準で１０％のゼラチン、５９％水、及び３１％のＰＧＳ、配合物５は、重量基準で９．５％のゼラチン、５３％の水、及び３７．５％のＰＧＳで形成した。これらの４つの例におけるそれぞれの組成物は、真空下１３０℃において２５時間かけて製造したＰＧＳを用いて配合した。
【０１００】
[00135]図１２は、材料を４０℃において２４０秒間、及び２５℃において４２０秒間保持した他は、図３に記載するものと同様の方法を用いて試験した幾つかの態様を示す。４つの試料は全て、図３において既に記載したものと同じ特徴的な固化を示し、固化度は配合物中に存在させるＰＧＳのレベルに基づいて調整することができた。ＰＧＳ濃度を減少させると、貯蔵弾性率は増加した（より高い固化度）。配合物５は液相から固相への迅速な硬化時間を有する好ましい態様を示し、これに対して配合物１〜４は液相を示さなかった。
【０１０１】
[00136]他の例においては、配合物を生成させて、押出プロセスによって可撓性が形成されることを示した。ｗ／ｗで０．６％のコラーゲン、４９．４％の水、及び５０％のＰＧＳの配合物を、４８０μｍのオリフィスを通してアセトン処理浴中に押出した。純コラーゲン線維の線条（図９Ａ）は実施例において見られる線条（図９Ｂ）と同様であり、これは微細構造が同様であることを示した。このプロセスは、測定しうるテナシティーを有する繊維を生成させることができた。
【０１０２】
[00137]他の例においては、多孔質構造体の生成において変性剤として低分子量エステルを用いる利益を示した。９．５％のゼラチン、５３％の水、１８．７５％の低ＭＷグリセロール−セバシン酸エステル（ＯＧＳ）、及び１８．７５％の高ＭＷグリセロール−セバシン酸エステル（ＰＧＳ）の配合物を処理浴内で脱水し、次に真空下３０℃において７２時間熱架橋させた。図１０は、得られた生成物の断面ＳＥＭ画像であり、５０μｍ未満の細孔を有する高多孔質の網状組織が示されている。特定の理論には縛られないが、ＯＧＳはアセトン中における材料の増加した溶解度のためにポロゲンとして作用すると考えられる。
【０１０３】
[00138]混合の順番を変化させることによって、配合物２の組成物を形成した。１つの例においては、水、ゼラチン、及び溶融したＰＧＳの剪断混合を行った。他の例においては、加温水に加えたゼラチンの剪断混合を行い、次に水／ゼラチン混合物及び溶融したＰＧＳの剪断混合を行った。次に、組成物を成形して水和した。結果をそれぞれ図１１Ａ及び１１Ｂに示す。図１１Ａは均一に分散していないＰＧＳの明らかな凹みを含んでおり、一方、図１１Ｂは均一な多孔度で均一に分散されていた。
【０１０４】
[00139]本発明の他の態様は、ポリマー／ポリペプチド組成物に治療剤を装填する能力である。９．５％のゼラチン、５３％の水、２８％のＰＧＳ、及び９．５％のヒドロキシアパタイトから構成される配合物４と同様の組成物を形成した。元素マッピングによって、ポリマー／ポリペプチド組成物全体にわたってヒドロキシアパタイトが均一に分布していることが示された。
【０１０５】
[00140]その広い発明概念から逸脱することなく、上記に示し且つ記載した代表的な態様に対して変更を行うことができることが当業者に認識される。したがって、本発明は示され且つ記載された代表的な態様に限定されるものではなく、特許請求の範囲によって規定される本発明の精神及び範囲内の修正をカバーすると意図される。例えば、代表的な態様の具体的な特徴は特許請求する発明の一部であってもなくてもよく、開示されている態様の種々の特徴を組み合わせることができる。ここで具体的に示していない限りにおいては、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」の用語は、１つの構成要素に限定されるものではなく、その代わりに「少なくとも１つ」を意味するものとして読むべきである。
【０１０６】
[00141]図面及び発明の説明の少なくとも一部は本発明を明確に理解するために関係する構成要素に焦点をあてるために簡素化しており、一方、明確にする目的のために当業者が認識する他の構成要素を排除することも本発明を一部を構成する可能性があることを理解すべきである。しかしながら、かかる構成要素は当該技術において周知であり、これらは必ずしも本発明のより良好な理解を促進しないので、かかる構成要素の記載はここでは与えていない。
【０１０７】
[00142]更に、本発明方法がここに示す工程の特定の順番に依拠しない限りにおいては、工程の特定の順番は特許請求の範囲に対する限定と解釈すべきではない。本発明方法に関する特許請求の範囲は、これらの工程を記載されている順番で実施することに限定すべきではなく、当業者であれば、これらの工程を変化させることができ、それでもなお本発明の精神及び範囲内にとどまることを容易に認識することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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