(57)【要約】  本発明は、抗原がロードされた樹状細胞を調製する方法であって、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）とインターロイキン（ＩＬ−４）とを含有する無血清細胞培養培地を単核細胞に添加する工程、５％二酸化炭素下で５日間３７℃にてインキュベータで培養する工程、標的抗原が被包されたカチオン性リポソームを添加する工程、及び８〜２４時間培養して、前記標的抗原がロードされた樹状細胞を得る工程を含む方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
効率的に抗原がロードされた樹状細胞の調製方法であって、その工程が、
ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４とを含有する無血清細胞培養培地を単核細胞に添加し、培養のために５％ＣＯ２、３７℃のインキュベータに置く工程；及び
５日間後に、標的抗原を被包するカチオン性リポソームを添加し、８〜２４時間培養して、前記標的抗原がロードされた樹状細胞が得られる工程であることを特徴とする調製方法。
【請求項２】
前記カチオン性リポソームが、マンノース修飾カチオン性リポソーム複合体である請求項１に記載の効率的に抗原がロードされた樹状細胞の調製方法。
【請求項３】
前記カチオン性リポソームが、マンノース又はマンノシドをポリエチレングリコール誘導体化リン脂質に結合させ、マンノース修飾ポリエチレングリコール誘導体化リン脂質を得；カチオン性脂質と前記マンノース修飾ポリエチレングリコール誘導体化リン脂質とをクロロホルムとメタノールとの混合溶媒にそれぞれ溶解させ、混合後、混合液を得；前記混合液を、安定した窒素流又は不活性ガス流で回転させながら蒸発させ、均一な膜を形成し；真空乾燥後に、腫瘍抗原を含有するＰＢＳバッファ溶液を添加し、４℃に置いて超音波処理し、水和させ；前記膜を通して押出した後、前記カチオン性リポソームを得ることによって得られ、前記腫瘍抗原のロード量が１〜５００ｇ抗原／ｍｏｌリポソームである請求項１に記載の効率的に抗原がロードされた樹状細胞の調製方法。
【請求項４】
前記カチオン性脂質の前記マンノース修飾ポリエチレングリコール誘導体化リン脂質に対するモル数比範囲が、１：１〜１：１０である請求項３に記載の効率的に抗原がロードされた樹状細胞の調製方法。
【請求項５】
前記カチオン性脂質が、ジデシルジメチルアンモニウムブロミド、ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン、ジオレオイルプロピルトリメチルアンモニウムクロリド、３−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル）コレステロール、及びジオレイルエーテルホスファチジルコリンのいずれかである請求項３から４のいずれかに記載の効率的に抗原がロードされた樹状細胞の調製方法。
【請求項６】
前記標的抗原が、異なるエピトープを有する１つ以上の腫瘍抗原タンパク質又はポリペプチドである請求項１に記載の効率的に抗原がロードされた樹状細胞の調製方法。
【請求項７】
前記抗原が、腫瘍細胞溶解物、自家又は同種の腫瘍抗原タンパク質、遺伝子工学のポリペプチド又はタンパク質産物、合成抗原ポリペプチドからなる群から選択することができる請求項６に記載の効率的に抗原がロードされた樹状細胞の調製方法。
【請求項８】
前記抗原が、ＨＢｓＡｇ抗原、腫瘍組織抗原、電気的に中性なポリペプチド抗原、電気的に陰性なポリペプチド抗原サバイビン、又はＯＶＡ抗原タンパク質である請求項６に記載の効率的に抗原がロードされた樹状細胞の調製方法。
【請求項９】
樹状細胞（ＤＣ細胞）が、末梢血単核球誘導ＤＣ細胞、造血幹細胞及び臍帯血幹細胞誘導ＤＣ細胞を含む請求項１に記載の効率的に抗原がロードされた樹状細胞の調製方法。
【請求項１０】
ヒト末梢血単核細胞を基本培地に懸濁した後、細胞培養プレートに播種して、インキュベータ中３７℃で１〜２時間接着培養し；非接着細胞の除去後、接着細胞に、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４とを含有する無血清細胞培養培地を添加し、ＤＣ細胞の誘導を行うための飽和湿度下において、５％ＣＯ２、３７℃で培養し；３日目に、ＤＣ細胞培養培地をＤＣ細胞培養プレートに半分の量で添加し；５日目に、リポソームに被包された抗原をＤＣ細胞に添加し、８〜２４時間培養し、前記抗原の調整ドーズが、１〜５０ｕｇ／ｍｌであり、腫瘍抗原がロードされたＤＣ細胞が得られ；
好ましくは、前記無血清細胞培養培地が、２５〜５００ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦと５〜１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４とを含有する請求項１に記載の効率的に抗原がロードされた樹状細胞の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞免疫療法の分野に関し、より詳細には、カチオン性リポソームを抗原担体として用いる、樹状細胞を調製するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、免疫細胞治療は、活発な研究分野であり、臨床用途においてますます高い注目を集めている。この治療は、化学放射線療法によって引き起こされる著しい毒性作用及び副作用がなく、比較的安全で、患者の生活の質を向上させるので、この尊厳ある治療は、がん治療の最も有望な方法として認識されている。樹状細胞（ＤＣ）ワクチンに代表されるがん免疫療法は、外科手術、化学療法、放射線療法に続く第４の抗腫瘍療法になり、これは主に、腫瘍細胞の抗原物質を用いて、体を刺激し、腫瘍細胞の特異的な免疫破壊を起こし、腫瘍除去の目的を達成する。従来の抗腫瘍療法に比べて、ＤＣワクチンを用いた免疫療法は、良好な安全性及び高い特異性などの多くの利点を有し、現在、肺がん、大腸がん、前立腺がん、乳がん、及びメラノーマなどの各種悪性腫瘍の治療に広く用いられているが、その臨床効果は、更に改善させる必要がある。体内における最も強力な抗原提示細胞として、樹状細胞（ＤＣ）は、抗腫瘍免疫応答を起こすために、体を刺激する主要な核である。これは、抗原を取り込み、その抗原情報をＭＨＣ−Ｉ分子を介してＣＤ８＋Ｔリンパ球に提示することができ、特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の発生を誘導することができ、腫瘍細胞を殺滅し、各種腫瘍のための免疫療法に適用可能である。そのため、ＤＣの抗原の取り込み量及び提示能力を高めることは、その臨床効果を向上させる重要なストラテジである。
【０００３】
リポソームナノ粒子は、水相核を被包するリン脂質二重層のシェルによって形成される球状物であり、その構造は、生体膜に類似しており、生体適合性且つ非毒性のナノ材料である。これは、水溶性及び脂溶性薬物を被包することができ、薬物用量の低減、持続性放出、及び標的化された薬物放出などの利点があり、そのため、抗腫瘍ナノ薬物の開発に広く用いられている。更に、ナノリポソームも優れた抗原担体であり、各種物理化学的性質を有する一連の抗原と免疫アジュバントを被包し、タンパク質ポリペプチド抗原を分解から保護するだけでなく、抗原に対する抗原提示細胞の食作用及び抗原提示を促進し、体の特異的免疫応答を向上させる。これらの利点に基づき、新規なワクチンベクターとして、リポソームナノ粒子は、細菌ワクチン、ウィルスワクチン、抗寄生虫ワクチン、及び抗腫瘍ワクチンなどの研究開発にますます用いられている。中性リポソーム、及びその表面が正電荷を有するカチオン性リポソームは、最もよく用いられるナノワクチンベクターであり、カチオン性リポソームは、特に注目に値し、これは、優れたタンパク質／ペプチド抗原担体であるだけでなく、抗原提示細胞を直接活性化し、ワクチン誘導免疫応答を向上させることができる新規な免疫アジュバントでもある。現在、カチオン性リポソームは、ＧＳＫ  Ｃｏｍｐａｎｙによるインフルエンザワクチンの新たな開発に用いられている。
【０００４】
自家腫瘍関連完全抗原がロードされた樹状細胞の調製方法（特許文献１）では、その解決策は、ヒト末梢血から分離した単核細胞を回収し、培養したＤＣ細胞を導入し、調製した自家腫瘍関連完全抗原を用いて前記ＤＣ細胞を刺激し、前記ＤＣ細胞を成熟させ、自家腫瘍抗原特異性ＤＣワクチンを調製することである。
【０００５】
樹状細胞標的ナノリポソーム腫瘍ワクチンの調製プロセス（特許文献２）では、その解決策は、α１，３Ｇａｌ糖鎖−トリグリセリドをリポソームのリン脂質二重層に直接埋め込み、ＤＣを標的にできるナノ−ワクチン送達システムを調製し；腫瘍抗原をロードするこのワクチン送達システムを用いて、ＤＣ標的作用を有するナノ腫瘍ワクチンリポソームを調製し、腫瘍抗原に対するＤＣの取り込み及び提示を向上させ、一方で、ＤＣのＴｏｌｌ様受容体シグナル経路を活性化し、その成熟を促進し、特異的な抗腫瘍細胞の免疫応答を更に誘導する。
【０００６】
樹状細胞腫瘍ワクチン及びその調製方法（特許文献３）において、この解決策によって提供されるＤＣ腫瘍ワクチンにロードされる抗原組成物は、腫瘍組織そのものに由来し、主にがん幹細胞を標的にし、多剤耐性腫瘍幹細胞抗原組成物の樹状細胞腫瘍ワクチンがロードされる。
【０００７】
臍帯血幹起源の樹状細胞及び樹状細胞ワクチンの調製方法（特許文献４）において、幹細胞増殖因子及びサイトカインＦｌｔ３−Ｌを用いるその解決策は、臍帯血中の造血細胞の、免疫細胞への誘導且つ増殖を効果的に促進して、ＤＣを得ることができ、次いで、ＤＣを腫瘍特異的抗原で刺激し、ヒト樹状細胞腫瘍ワクチンを得る。
【０００８】
樹状細胞ワクチンの調製方法（特許文献５）において、その解決策は、分離した自家血漿をリサイクルし、ヒト血漿をインビトロヒトＡＢ血清に替え、Ｆｌｔ３をＤＣ培地に添加し、樹状細胞増殖の刺激を向上し、それ自身の特異的ながん幹細胞溶解物を腫瘍抗原として用いてロードし、自家腫瘍ワクチンを調製する。
【０００９】
高活性抗原ロード樹状細胞の調製方法（特許文献６）において、その解決策は、末梢血から単核細胞を回収分離し、誘導して樹状細胞を得、対応する腫瘍抗原及びＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）を添加し、更に培養し、次いで、高活性抗原ロード樹状細胞を得ることができる。
【００１０】
前記解決策のいずれも、抗原でＤＣ細胞をロードするために、標的効果を有するリポソームを抗原担体として用いていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】中国特許公開第１０２０９１３２７Ａ号明細書
【特許文献２】中国特許公開第１０１６９０８０５Ａ号明細書
【特許文献３】中国特許公開第１０２７９３９１２Ａ号明細書
【特許文献４】中国特許公開第１０２６７６４５５Ａ号明細書
【特許文献５】中国特許公開第１０２８４７１４５Ａ号明細書
【特許文献６】中国特許公開第１０３０１３９１５Ａ号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、免疫標的多様性、強力な抗原性、及び良好な安定性を有し、操作及び臨床適用が容易で、簡単且つ利用可能な、カチオン性リポソームを抗原担体として用いて樹状細胞を調製する方法を提供することにある。
【００１３】
前記目的を達成するために、本発明は、効率的に抗原がロードされた樹状細胞の調製方法であって、その工程が、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４とを含有する無血清細胞培養培地を単核細胞に添加し、培養のために５％ＣＯ２、３７℃のインキュベータに置く工程；及び５日間後に、標的抗原を被包するカチオン性リポソームを添加し、８〜２４時間培養して、前記標的抗原がロードされた樹状細胞が得られる工程であることを特徴とする調製方法を提供する。
【００１４】
前記カチオン性リポソームは、マンノース修飾カチオン性リポソーム複合体である。
【００１５】
前記カチオン性リポソームは、マンノース又はマンノシドをポリエチレングリコール誘導体化リン脂質に結合させ、マンノース修飾ポリエチレングリコール誘導体化リン脂質を得；カチオン性脂質と前記マンノース修飾ポリエチレングリコール誘導体化リン脂質とをクロロホルムとメタノールとの混合溶媒にそれぞれ溶解させ、混合後、混合液を得；前記混合液を、安定した窒素流又は不活性ガス流で回転させながら蒸発させ、均一な膜を形成し；真空乾燥後に、腫瘍抗原を含有するＰＢＳバッファ溶液を添加し、４℃に置いて超音波処理し、水和させ；前記膜を通して押出した（ｅｘｔｒｕｄｉｎｇ）後、前記カチオン性リポソームを得ることによって得られ、前記腫瘍抗原のロード量が１〜５００ｇ抗原／ｍｏｌリポソームである。
【００１６】
前記カチオン性脂質の前記マンノース修飾ポリエチレングリコール誘導体化リン脂質に対するモル比の範囲は、１：１〜１：１０である。
【００１７】
前記カチオン性脂質は、ジデシルジメチルアンモニウムブロミド、ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン、ジオレオイルプロピルトリメチルアンモニウムクロリド、３−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル）コレステロール、及びジオレイルエーテルホスファチジルコリンのいずれかである。
【００１８】
前記標的抗原は、異なるエピトープを有する１つ以上の腫瘍抗原タンパク質又はポリペプチドである。
【００１９】
前記抗原は、腫瘍細胞溶解物、自家又は同種の腫瘍抗原タンパク質、遺伝子工学により得られたポリペプチド又はタンパク質産物、及び合成抗原ポリペプチドからなる群から選択することができる。
【００２０】
前記抗原は、ＨＢｓＡｇ抗原、腫瘍組織抗原、電気的に中性なポリペプチド抗原、電気的に陰性なポリペプチド抗原サバイビン、又はＯＶＡ抗原タンパク質である。
【００２１】
ＤＣ細胞は、末梢血単核球誘導ＤＣ細胞、造血幹細胞及び臍帯血幹細胞誘導ＤＣ細胞を含む。
【００２２】
ヒト末梢血単核細胞を基本培地に懸濁した後、細胞培養プレートに播種して、インキュベータ中３７℃で１〜２時間接着培養し；非接着細胞の除去後、接着細胞に、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４とを含有する無血清細胞培養培地を添加し、ＤＣ細胞の誘導を行うための飽和湿度下において、５％ＣＯ２、３７℃で培養し；３日目に、ＤＣ細胞培養培地をＤＣ細胞培養プレートに半分の量で添加し；５日目に、リポソームに被包された抗原をＤＣ細胞に添加し、８〜２４時間培養し、前記抗原の調整ドーズが、１〜５０ｕｇ／ｍｌであり、腫瘍抗原がロードされたＤＣ細胞が得られる。
【００２３】
好ましくは、前記無血清細胞培養培地は、２５〜５００ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦと５〜１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４とを含有する。
【００２４】
そこで、本発明は、ＤＣ細胞の調製プロセスにおける、抗原のローディングにおける困難性及び低免疫効率などの問題点に関連して、ＤＣ細胞の抗原ロード効率と抗腫瘍作用を改善するために、抗原担体としてマンノース修飾リポソームの使用を提案する。
【００２５】
本発明のカチオン性リポソームは、マンノース修飾カチオン性リポソーム複合体であり、その主成分が、カチオン性脂質とマンノース修飾ポリエチレングリコール誘導体化リン脂質であることを特徴とする。前記カチオン性脂質は、両親媒性分子であり、その表面は、正電荷を有する。分子の主鎖は、グリセロールであり、前記グリセロールの２番目の水酸基は、正電荷を有する第４級アンモニウム塩であり、他の２つの水酸基は、飽和又は不飽和脂肪酸でエステル化されている。前記特性を有するカチオン性脂質としては、主に、ジデシルジメチルアンモニウムブロミド（単にＤＤＡＢと称する）、ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン（単にＤＯＴＡＰと称する）、ジオレオイルプロピルトリメチルアンモニウム（単にＤＯＴＭＡと称する）、３−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル）コレステロール（単にＤＣ−Ｃｈｏｌと称する）及びジオレイルエーテルホスファチジルコリン（単にＤＯＥＰＣと称する）を含むカチオン性脂質が挙げられる。
【００２６】
ここで、前記カチオン性脂質の前記マンノース修飾ポリエチレングリコール誘導体化リン脂質に対するモル比の範囲は、１：１〜１：１０である。
【００２７】
前記マンノースは、Ｄ−マンノース、及びマンノース受容体によって同定できる他の単糖類（例えば、Ｄ−ガラクトース、４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マンノピラノシド、４−アミノフェニルα−Ｄ−マンノピラノシド、４−アミノフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、α−Ｄ−マンノシルフェニルイソチオシアネート、及びα−Ｄ−ガラクトピラノシルフェニルイソチオシアネートなど）を含む。
【００２８】
前記マンノース修飾ポリエチレングリコール誘導体化リン脂質は、５）に記載のマンノースをＤＳＰＥ−ＰＥＧ分子に共有結合させることにより得られる。
【００２９】
前記マンノース修飾カチオン性リポソームは、１つ以上の抗原を同時に被包でき、ヒトＤＣの抗原ロード効率と抗原提示能を改善し、その抗腫瘍作用を向上させることができることを特徴とする。
【００３０】
本発明のカチオン性リポソームは、中国特許公開第１０２９７３５０６Ａ号明細書（２０１３年３月２０日公開）に開示されている。
【００３１】
リポソームにロードされる抗原は、異なるエピトープを有する１つ以上の腫瘍抗原タンパク質又はポリペプチドであり、前記抗原は、腫瘍細胞溶解物、自家又は同種の腫瘍抗原タンパク質、遺伝子工学により得られたポリペプチド又はタンパク質産物、合成抗原ポリペプチド、などに由来することができる。
【００３２】
ヒトＤＣ細胞は、末梢血単核細胞誘導ＤＣ、造血幹細胞及び臍帯血幹細胞誘導ＤＣを含む。
【００３３】
本発明は、ＤＣ細胞の調製のための腫瘍抗原を被包するために、マンノース修飾カチオン性リポソームを抗原担体として用いる腫瘍抗原がロードされたＤＣ細胞の方法を開示する。前記カチオン性リポソームは、リン脂質二重層球、ポリエチレングリコール誘導体化リン脂質、及びマンノースを含む。前記リン脂質二重層球は、カチオン性脂質と、ポリエチレングリコール誘導体化リン脂質におけるリン脂質分子とから構成される。前記マンノースは、ポリエチレングリコール誘導体化リン脂質の一端で、マンノース修飾ポリエチレングリコール誘導体化リン脂質を形成する。このようなカチオン性リポソームは、リン脂質分子の極性基にマンノース修飾ポリエチレングリコール誘導体化リン脂質を結合させることにより得られる。腫瘍抗原は、異なるエピトープを有する１つ以上の腫瘍関連抗原タンパク質又はポリペプチドである。新たなナノリポソームと組み合わせられる抗原担体技術は、ＤＣ細胞の抗原ロード及び活性化を向上させ、ＤＣ細胞の抗原提示効率を改善する。
【００３４】
腫瘍環境においては、抗腫瘍免疫の生成を体に惹起するために、ＤＣ細胞は、抗原を取り込み、それぞれＭＨＣ−Ｉ又は−ＩＩ分子によってＣＤ８及びＣＤ４Ｔ細胞に提示しなければならない。しかしながら、ＤＣを用いる腫瘍免疫療法の効率は、腫瘍抗原がロードされたＤＣ量、ＤＣ活性化量、腫瘍抗原の取り込み、これをＴ細胞に提示するＤＣ量に密接に関連している。現在では、従来のＤＣ調製プロセスは、まず、末梢血から単核細胞を分離し、次にこの単核細胞を、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカインと共にＤＣ細胞に導入し、患者の腫瘍細胞を溶解して得た腫瘍抗原を添加し、ＤＣに腫瘍抗原をロードする。このプロセスは、ＤＣに患者の腫瘍抗原を取り込ませることができるが、腫瘍抗原の抗原性の弱さ、及び免疫を活性化する標的の単一性（ｓｉｎｇｌｅｎｅｓｓ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ）のために、腫瘍抗原に対するＤＣの取り込み量がより少なく、抗原提示能もより低く、その結果、ＤＣから生成するＣＴＬ細胞の殺滅活性が不十分であり、抗腫瘍療法の効果に影響を及ぼす。
【００３５】
そこで、本発明は、既存のＤＣ細胞の抗腫瘍効率が乏しいなどの問題点に関連して、１つ以上の腫瘍抗原を被包するため、抗原担体としてマンノース修飾リポソームの使用を提案し、その抗原ローディング効率と抗原提示を改善することによりＤＣの抗腫瘍作用を向上させる。前記マンノース修飾カチオン性リポソームは、各種物理化学的性質を有する各種抗原をロードできるだけでなく、ＤＣ標的能を有し、腫瘍抗原に対するＤＣ細胞の取り込み効率と、抗原提示能を大きく改善し、ＤＣ細胞の抗腫瘍免疫を向上させる。
【００３６】
本発明は、ＤＣ細胞に抗原をロードするために、腫瘍抗原を被包する抗原担体としてマンノース修飾カチオン性リポソームを用いる、腫瘍抗原がロードされたＤＣの方法を開示する。前記カチオン性リポソームは、リン脂質二重層球、ポリエチレングリコール誘導体化リン脂質、及びマンノースを含み；前記リン脂質二重層球は、リン脂質分子と、ポリエチレングリコール誘導体化リン脂質におけるカチオン性脂質とから構成され；前記マンノースは、ポリエチレングリコール誘導体化リン脂質の一端で、マンノース修飾ポリエチレングリコール誘導体化リン脂質を形成する。このようなカチオン性リポソームは、リン脂質分子の極性基にマンノース修飾ポリエチレングリコール誘導体化リン脂質を結合させることにより得られる。腫瘍抗原は、異なるエピトープを有する１つ以上の腫瘍抗原タンパク質又はポリペプチドである。
【００３７】
マンノース修飾カチオン性リポソームの調製方法は、以下の工程を含む。
【００３８】
（１）ポリエチレングリコール誘導体化リン脂質を準備し、マンノース又はマンノシドを前記ポリエチレングリコール誘導体化リン脂質に結合させ、マンノース又はマンノースオリゴ糖修飾ポリエチレングリコール誘導体化リン脂質を得ること。
【００３９】
（２）カチオン性脂質と、マンノース又はマンノシド修飾ポリエチレングリコール誘導体化リン脂質とを、クロロホルムとメタノールとの混合溶媒にそれぞれ溶解させ、混合後、混合液を得ること。
【００４０】
（３）前記混合液を、安定した窒素流又は不活性ガス流で渦状乾燥させ、均一な膜を形成し；真空乾燥後に、腫瘍抗原を含有するＰＢＳバッファ溶液を添加し、４℃に置いて超音波水和させ；前記膜を通して押出した後、前記カチオン性リポソームを得ること。
【００４１】
ＤＣに抗原をロードする方法は、以下の工程を含む。
【００４２】
（１）ヒト末梢血単核細胞を基本培地に懸濁した後、前記ヒト末梢血単核細胞を細胞培養プレートに播種して、インキュベータ中３７℃で１〜２時間接着培養すること。
【００４３】
（２）非接着細胞を除去し、接着細胞に、ＤＣ細胞培養培地を添加し、ＤＣ細胞の誘導を行うための飽和湿度下において、５％ＣＯ２、３７℃で培養する。３日目に、ＤＣ細胞培養培地をＤＣ細胞培養プレートに半分の量で添加する。５日目に、適切な量の、リポソームに被包された抗原をＤＣ細胞に添加し、８〜２４時間培養し、腫瘍抗原がロードされたＤＣ細胞が得られる。
【００４４】
新たなナノリポソームを用いる抗原担体技術は、ＤＣ細胞の抗原ロード及び抗原提示を向上させることができ、ＤＣワクチンの抗腫瘍効率を向上させる。細胞の抗原提示効率を改善する。
【００４５】
従来技術における前記問題点を解決するために、本発明によって提供される技術的解決策は、以下の通りである。
【００４６】
ＤＣ細胞の調製に、腫瘍抗原を被包する抗原担体としてマンノース修飾カチオン性リポソームを用いる。前記カチオン性リポソームは、リン脂質二重層球、ポリエチレングリコール誘導体化リン脂質、及びマンノースを含み；前記リン脂質二重層球は、リン脂質分子と、ポリエチレングリコール誘導体化リン脂質におけるカチオン性脂質とから構成され；前記マンノースは、ポリエチレングリコール誘導体化リン脂質の一端で、マンノース修飾ポリエチレングリコール誘導体化リン脂質を形成する。このようなカチオン性リポソームは、リン脂質分子の極性基でマンノース修飾ポリエチレングリコール誘導体化リン脂質に結合される。腫瘍抗原は、異なるエピトープを有する１つ以上の腫瘍関連特異的抗原タンパク質又はポリペプチドである。
【００４７】
図１に示される一実施形態においては、抗原を被包するカチオン性リポソームは、リン脂質二重層球、ポリエチレングリコール誘導体化リン脂質、及びマンノースを含む。前記リン脂質二重層球は、カチオン性脂質と、ポリエチレングリコール誘導体化リン脂質におけるリン脂質分子とから構成される。前記マンノースは、ポリエチレングリコール誘導体化リン脂質の一端に結合し、マンノース修飾ポリエチレングリコール誘導体化リン脂質を形成する。この実施形態では、リン脂質二重層球の内側が、腫瘍抗原で被覆され、前記抗原は、タンパク質又はポリペプチドの１つ以上の組合せであることができる。抗原は、腫瘍、ウィルス、細菌、又は他の微生物から直接分離抽出することができる。或いは、遺伝子工学により得ることができるタンパク質／ポリペプチド産物であってもよいし、合成ポリペプチドであってもよい。
【００４８】
ポリエチレングリコール誘導体化リン脂質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の一端にリン脂質を結合させ、他端をアミノ化することにより得られる。本実施形態におけるポリエチレングリコールの一端は、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）に結合させる（ＤＳＰＥ−ＰＥＧと称する）。ポリエチレングリコール誘導体化リン脂質におけるポリエチレングリコールの分子量は、１，０００〜５，０００が好ましい。ポリエチレングリコール誘導体化リン脂質のカチオン性脂質に対するモル数比範囲は、１：５〜１：５０である。マンノースは、ポリエチレングリコール誘導体化リン脂質のアミノ端に共有結合される。カチオン性脂質は、両親媒性分子であり、その表面は、正電荷を有する。カチオン性脂質の主鎖は、グリセロールであり、前記グリセロールの３つの水酸基における中央の水酸基は、正電荷を有する第４級アンモニウム塩と結合しており、他の２つの水酸基は、飽和又は不飽和脂肪酸でエステル化されている。
【００４９】
標的作用を有するリポソームナノワクチンベクターは、その方法の具体的操作が以下の通りである点を特徴とする。
【００５０】
まず、マンノース修飾ＰＥＧ−Ｍａｎｎｏｓｅを調製する。マンノースなどの、マンノース受容体で認識され得る一連の単糖類を、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨ２のアミノ基に共有結合させ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−Ｍａｎｎｏｓｅを得る。次いで、カチオン性脂質とＤＳＰＥ−ＰＥＧ−Ｍａｎｎｏｓｅとを、クロロホルム―メタノール（２：１）にそれぞれ溶解させ、一定比率で混合する。この両者を混合して得られた混合液を、丸底フラスコに入れ、安定した窒素流で渦状乾燥し、均一な膜を形成し、真空オーブンに入れ、一晩真空乾燥する。翌日、腫瘍多価抗原を含有する再蒸留水溶液、又はＰＢＳバッファ溶液を添加し、４℃に置いて１２時間水和させる。１０分間超音波浴に置いた後、得られた混合物を、ポリカーボネート膜を通して２回押出し、使用時まで４℃に置く。
【００５１】
腫瘍抗原がロードされた樹状細胞を調製する具体的操作は、以下の通りである。
【００５２】
（１）ヒト末梢血単核細胞を基本培地に懸濁した後、前記ヒト末梢血単核細胞を細胞培養プレートに播種して、インキュベータ中３７℃で１〜２時間接着培養する。
【００５３】
（２）非接着細胞を洗浄除去し、接着細胞に、ＤＣ細胞培養培地を添加し、ＤＣ細胞の誘導を行うための飽和湿度下において、５％ＣＯ２、３７℃で培養する。３日目に、ＤＣ細胞培養培地をＤＣ細胞培養プレートに半分の量で添加する。５日目に、適切な量の、リポソームに被包された抗原をＤＣ細胞に添加し、８〜２４時間培養する。６日目に、ＤＣ成熟促進培地を添加し、２４〜４８時間培養を続けた後、腫瘍抗原がロードされたＤＣ細胞が得られる。
【００５４】
本発明は、腫瘍抗原をロードする標的作用を有するナノリポソームを用いて、樹状細胞を調製する。既存のＤＣ細胞調製技術と比べて、本発明のＤＣ調製技術は、多価腫瘍抗原のロードに新たなナノリポソームを用いて、乏しい免疫原性、腫瘍抗原の弱い抗原性、単一免疫標的、短時間しか存在しないＤＣ細胞中の抗原、など問題点を克服するだけでなく、更に、樹状細胞が活発に腫瘍抗原を取り込むようになり、腫瘍抗原に対するＤＣの取り込み効率とエンリッチメントを向上し、ＤＣ細胞における抗原の輸送及び放出を調節制御し、腫瘍抗原の遅延放出を延ばし、ＤＣの成熟及び活性化並びに抗原提示能を促進し、ＭＨＣ−Ｉ分子により媒介される抗原提示を向上する。更に、本発明のＤＣ調製方法は、簡単且つ利用可能であり、臨床用途における操作及び利用が容易で、免疫標的が多様であり、抗原性が強く、安定性が良好である。
【００５５】
実施例４において、本出願人は、種々の性質を有するポリペプチド、電気的に中性なポリペプチド、電気的に陰性なポリペプチドを用い、このようなリポソーム担体が種々の性質を有するポリペプチドにロードできることを示す。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図１は、担体としてマンノース修飾カチオン性リポソームを用いるナノワクチンの構造の模式図である。
【図２】図２は、マンノース修飾カチオン性リポソームの調製を示す図及びその特性図である。
【図３】図３は、カチオン性リポソームによってロードされる電気的に中性なポリペプチド抗原を効率的に取り込む樹状細胞の効率図である。
【図４】図４は、カチオン性リポソームによってロードされる電気的に陰性なポリペプチド抗原を効率的に取り込む樹状細胞の効率図である。
【図５】図５は、腫瘍抗原がロードされた樹状細胞の効率に対する、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−Ｍａｎｎｏｓｅのパーセンテージの影響を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。実施形態の例は、図に示されるが、図中、同一又は同様な参照番号は、同一又は同様な機能を有する同一又は同様な要素を示す。図面を参照して記載される以下の実施形態は、例示的なものであり、本発明を説明することを意図しているが、本発明を限定するものではない。具体的な技術又は条件を伴って記載されていない実施形態は、本技術分野における文献に記載される技術又は条件に従って、又は製品取扱い説明書に従って行われる。製造業者が示されていない試薬又は器具はいずれも、市販の従来製品である。
【実施例】
【００５８】
実施例１
【００５９】
イソチオシアノ−α−Ｄ−マンノピラノース（すなわち、α−Ｄ−マンノピラノシルフェニルイソチオシアネート、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）をＮＨ２−ＰＥＧ−ＤＳＰＥと塩基性条件下、室温で２４時間反応させ、マンノースのイソチオシアノとＰＥＧのアミノ基とを反応させて、チオウレア結合を形成し、マンオシル化ＰＥＧ−ＤＳＰＥ（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−Ｍａｎ、図２Ａ参照）を得る。ＮＭＲスペクトルは、７．２５ｐｐｍにおけるピーク（ｆピーク）が、イソチオシアノマンノピラノースのベンゼン環であることを示し、これはＤＳＰＥ−ＰＥＧにマンノースが成功裏に標識されていることを示す（図２Ｂ参照）。
【００６０】
ＤＯＴＡＰと前記ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−Ｍａｎとを、体積比２：１のクロロホルムとメタノールとの混合溶媒にそれぞれ溶解させ（ＤＯＴＡＰ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−Ｍａｎ＝９：１、ｍｏｌ／ｍｏｌ）、両者を混合後、得られた混合物を丸底フラスコに入れる。混合液を、安定した窒素流で渦状乾燥し、均一な膜を形成し、真空下で一晩乾燥後、翌日に、抗原タンパク質ＨＢｓＡｇのＰＢＳバッファ溶液（１００ｕｇ抗原／１ｕｍｏｌリポソーム／ｍｌ、フィード比により算出）を添加し、４℃に置いて水和させ、浴を１０分間超音波処理することにより、ＨＢｓＡｇを被包するカチオン性リポソームを得る。コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）凝集試験は、マンノース修飾カチオン性リポソーム（ＬＰ−ｍａｎ）が、ＣｏｎＡと共インキュベートされ、リポソームの粒子サイズが劇的に大きくなり得ることを示した。これとは対照的に、未修飾リポソーム（ＬＰ）は、ＣｏｎＡと共インキュベートされ、その粒子サイズに変化がなかった。この結果は、また、リポソームの表面がマンノース残基で修飾されていることを裏付けている（図２Ｃ参照）。
【００６１】
ヒト末梢血単核細胞を基本培地に懸濁し（１０６細胞／ｍｌ）、細胞培養プレートに播種して、インキュベータ中３７℃で１〜２時間接着培養し；非接着細胞の除去後、接着細胞に、ＧＭ−ＣＳＦ（２５〜５００ｎｇ／ｍｌ）とＩＬ−４（５〜１００ｎｇ／ｍｌ）とを含有する無血清細胞培養培地を添加し、ＤＣ細胞の誘導を行うための飽和湿度下において、５％ＣＯ２中、３７℃で培養し；３日目に、ＤＣ細胞培養培地をＤＣ細胞培養プレートに半分の量で添加し；５日目に、ＨＢｓＡｇを被包する前記カチオン性リポソーム（５ｕｇ抗原／５０ｎｍｏｌリポソーム／ｍｌ）を８〜２４時間培養し、腫瘍抗原がロードされたＤＣ細胞を得る。
【００６２】
実施例２
【００６３】
４−イソチオシアノフェニル−Ａ−Ｄ−マンノシドをＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００に共有結合させ、マンノシド修飾ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−Ｍａｎ）を得る。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＭａｎとＤＯＴＡＰとを、体積比２：１のクロロホルムとメタノールとの混合溶媒にそれぞれ溶解させる。ここで、Ｎ−２アミドグルコサミン修飾ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００のモル数のＤＯＴＡＰの総モル数に対する比は、１：１９である。両者を混合後、得られた混合液を丸底フラスコに入れる。混合液を、安定した窒素流で回転させながら蒸発させ、均一な膜を形成する。真空下で一晩乾燥後、ヒト肝細胞癌細胞ＨｅｐＧ２をＰＢＳバッファ溶液に懸濁する。凍結（−８０℃）と解凍（７０℃）を繰り返し行って細胞を破壊し、遠心分離により、腫瘍抗原を含有する腫瘍細胞溶解物を上清から得る。腫瘍細胞溶解物の一定量（０．２５ｇ抗原タンパク質／ｍｏｌリポソーム）を、リン脂質膜に添加し、４℃に置いて水和させた後、浴を１０分間超音波処理してから、ポリカーボネート膜の押出（ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ）を２回行って、腫瘍抗原を被包するカチオン性リポソームを得る。単核細胞をヒト末梢血からサンプリング及び分離し、ＧＭ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ−４（２５ｎｇ／ｍｌ）を含有するＤＣ細胞培養培地を添加し、５％ＣＯ２、３７℃のインキュベータに置き、培養する。５日後、腫瘍組織抗原を被包するカチオン性リポソームを添加し、８〜２４時間培養して、腫瘍組織抗原がロードされた樹状細胞を得ることができる。
【００６４】
実施例３
【００６５】
ＤＳＰＥ−ＰＥＧの一端をスクシンイミドで修飾し（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳ）、次いで、４−アミノフェニル−Ｄ−マンノシドとアミノ基を介して縮合させ、エステルを形成し、マンノシルＰＥＧ（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−Ｍａｎ）を得る。ＤＯＴＡＰ及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ−Ｍａｎを、体積比２：１のクロロホルムとメタノールとの混合溶媒にそれぞれ溶解させる。次いで、ＤＯＴＡＰとＤＳＰＥ−ＰＥＧ−Ｍａｎをモル比９：１で混合することによって得られる混合液を丸底フラスコに入れる。混合液を、安定した窒素流で回転させながら蒸発させ、均一な膜を形成し、真空下で一晩乾燥後、翌日に、ＦＩＴＣで標識した電気的に中性なサバイビンポリペプチド（サバイビン−ＦＩＴＣ、サバイビンの配列については、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を参照、ＰＩ＝８．１、ＭＷ＝３６１０．１９）を含有するＰＢＳバッファ溶液（０．１ｍｇタンパク質抗原／ｍｏｌリポソーム）を添加する。そして、４℃に置いて水和させた後、浴を１０分間超音波処理し、続いて、ポリカーボネート膜の押出を２回行うことにより、サバイビン−ＦＩＴＣカチオン性リポソームを得る。単核細胞をヒト末梢血からサンプリング及び分離し、ＤＣ無血清培地を添加し、サイトカインＧＭ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ−４（２５ｎｇ／ｍｌ）を培地に添加し、続いて、培地を５％ＣＯ２、３７℃のインキュベータに置き、培養する。５日後、樹状細胞を回収し、電気的に中性なポリペプチド抗原を被包するナノリポソームを添加し、濃度を２．５μｇポリペプチド／ｍｌに調整し、更に２時間培養して、抗原が効率的にロードされた樹状細胞を得ることができる（図３に示す）。同図から分かるように、共焦点及びフローの結果によれば、電気的に中性なポリペプチド抗原サバイビン−ＦＩＴＣを被包するカチオン性リポソームに対するＤＣの取り込み効率は、電気的に中性な遊離ポリペプチド抗原に対するＤＣの取り込み効率よりも良好であることが示される。
【００６６】
実施例４
【００６７】
４−イソチオシアノフェニル−Ａ−Ｄ−マンノシドをＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００に共有結合させ、マンノシド修飾ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−Ｍａｎ）を得る。ＤＯＴＡＰとＤＳＰＥ−ＰＥＧ−Ｍａｎとを、体積比２：１のクロロホルムとメタノールとの混合溶媒にそれぞれ溶解させる。ＤＯＴＡＰとＤＳＰＥ−ＰＥＧ−Ｍａｎとをモル比１９：１で混合して得た混合液を、丸底フラスコに入れる。混合液を、安定した窒素流で回転させながら蒸発させ、均一な膜を形成し、真空下で一晩乾燥後、翌日に、電気的に陰性なポリペプチド抗原サバイビン−ＦＩＴＣ（サバイビンの配列については、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を参照、ＰＩ＝３．８４、ＭＷ＝３５９３．９６）を含有するＰＢＳバッファ溶液（０．１ｍｇタンパク質抗原／ｍｏｌリポソーム）を添加する。そして、４℃に置いて水和させた後、浴を１０分間超音波処理し、続いて、ポリカーボネート膜の押出を２回行うことにより、電気的に陰性なポリペプチド抗原サバイビン−ＦＩＴＣを被包するカチオン性リポソームを得る。単核細胞をヒト末梢血からサンプリング及び分離し、ＤＣ無血清培地を添加し、サイトカインＧＭ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ−４（２５ｎｇ／ｍｌ）を培地に添加し、続いて、培地を５％ＣＯ２、３７℃のインキュベータに置き、培養する。５日後、樹状細胞を回収し、電気的に陰性なポリペプチド抗原を被包するナノリポソームを添加し、濃度を２．５μｇポリペプチド／ｍｌに調整し、更に２時間培養して、抗原が効率的にロードされた樹状細胞を得ることができる（図４に示す）。図４から分かるように、共焦点及びフローの結果によれば、電気的に陰性なポリペプチド抗原を被包するナノリポソームに対するＤＣの取り込み効率は、電気的に陰性な遊離ポリペプチド抗原に対するＤＣの取り込み効率よりも良好であることが示される。
【００６８】
実施例５
【００６９】
４−イソチオシアノフェニル−Ａ−Ｄ−マンノシドをＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００に共有結合させ、マンノシド修飾ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−Ｍａｎ）を得る。カチオン性脂質ＤＯＴＡＰとＤＳＰＥ−ＰＥＧ−Ｍａｎとをモル比９：１、１９：１、及び９９：１で混合して得た混合液を、丸底フラスコに入れ、混合物中におけるＤＳＰＥ−ＰＥＧ−Ｍａｎのモル％を、１％、５％、及び１０％にする。混合物を、安定した窒素流で回転させながら蒸発させ、均一な膜を形成し、真空下で一晩乾燥後、翌日に、抗原タンパク質ＯＶＡ−ＦＩＴＣを含有するＰＢＳバッファ溶液（０．１ｍｇタンパク質抗原／ｍｏｌリポソーム）を添加する。そして、４℃に置いて水和させた後、浴を１０分間超音波処理し、続いて、ポリカーボネート膜の押出を２回行うことにより、フルオレセインで標識された抗原タンパク質オボアルブミン（ＯＶＡ−ＦＩＴＣ）を被包するカチオン性リポソームを得る。単核細胞をヒト末梢血からサンプリング及び分離し、ＤＣ無血清培地を添加し、サイトカインＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を培地に添加し、続いて、培地を５％ＣＯ２、３７℃のインキュベータに置き、培養する。５日後、樹状細胞を回収し、抗原タンパク質ＯＶＡ−ＦＩＴＣを被包するナノリポソームを添加し、濃度を２．５μｇＯＶＡ／ｍｌに調整し、更に２時間培養する。フローサイトメトリの結果を図５に示す。図５から分かるように、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−マンノースのパーセンテージが上昇するにつれて（１％から、５％〜１０％）、抗原がロードされた樹状細胞の効率に対するリポソームの効果が、ますます顕著になる。
【００７０】
本発明の実施形態について、上に例示し記載してきたが、前述の実施形態は、例示的なものであり、本発明を限定するものではない。当業者であれば、本発明の範囲内において、本発明の原理及び精神から逸脱することなく、前記実施形態に対して、各種の変更、置換、及び変形を行うことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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