(57)【要約】【課題】核酸の酵素的合成のための修飾ヌクレオチドを提供する。核酸の酵素的合成のための修飾ヌクレオチドであって、「天然」窒素塩基又は天然窒素塩基の類似体、リボース又はデオキシリボース炭水化物、及び少なくとも一つのリン酸基を有し、修飾基と呼ばれる少なくとも一つのＲ基又はＲ’基から成ることを特徴とし、核酸合成中に：前記天然窒素塩基又はその類似体、及び／又はリボース分子もしくはデオキシリボース分子の３’位置の酸素により担持されており、前記ヌクレオチドの重合を抑止し及び／又は前記ヌクレオチドの他の分子との相互作用を可能にし、タンパク質などの他のヌクレオチドとは異なるものであって、ここでＲは少なくとも一つの官能性末端基から成る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸の酵素的合成のための修飾ヌクレオチドであって、「天然」窒素塩基又は天然窒素塩基の類似体、リボース又はデオキシリボース炭水化物、及び少なくとも一つのリン酸基を有し、
修飾基と呼ばれる少なくとも一つのＲ基又はＲ’基を、前記天然窒素塩基もしくはその類似体、及び／又は、リボース分子もしくはデオキシリボース分子の３’位置の酸素により、担持されて含んでおり、それは核酸合成中に、前記ヌクレオチドの重合を抑止し及び／又は前記ヌクレオチドのタンパク質などの、他のヌクレオチドとは異なる、他の分子との相互作用を可能にし、ここでＲは少なくとも一つの官能性末端基を含み、下記化学式（Ｉ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）のうちの１つの形態である修飾ヌクレオチド：
【化１】
2017527556.tif 000009
（ここで（ＰＰ）ＰＯは、モノ−、ジ−、又は三リン酸塩基を示し、
（ＯＨ）はリボース又はデオキシリボース分子であって良く、
Ｔは水素、又は、−ＮＨ２、−Ｎ３、−（Ｃ＝Ｏ）Ｈ、−ＣｎＨ２ｎ＋１（ｎ＝１〜３０、好ましくは１〜１２）、−トリメチルシリル、−リン酸塩、−ＳＯ３、−（Ｃ＝Ｏ）ＯＣｎＨ２ｎ＋１（ｎ＝１〜３０、好ましくは１〜１２）、−（Ｃ＝Ｏ）ＳＣｎＨ２ｎ＋１（ｎ＝１〜３０、好ましくは１〜１２）、−ニトロベンゼン、−ベンジル、−ハロベンジル、−アミド、−炭酸塩、−ベンゾイル、−パーオキシル、−ニトリル、−チオール、−イミド、−カルバミン酸塩、−シアン酸塩、−アルキン、−フェニル、−ハロフェニル、並びに−ピコリルよりなる群から選択される切断可能ラジカルを示し、
Ｍは任意に存在し、ＱとＺとに共有結合し、アルキル、アルケニル、アルキン、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリール、アシル、アルキルオキシ、アルキルアミノ、アルコキシアミノ、アミド、アルキルイミド、アルケニルイミド、アリールイミド、フルオロアルキル、アルキルリン酸、アルキルチオ、チオアシル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アルキルスルフィニル、アルキルアンモニウム、アルキルスルホニウム、アルキルシリル、アルキルカルボニル、アルキルカルバニル、アルキルカルバモイル及びアルキルヒドロキシルアミノよりなる群から選択される基を示し、
Ｚは切断可能基であって、−Ｏ−、−Ｓ−、＝ＳＨ−、＝Ｓ＝、≡Ｓ−、−ＳｉＨ２−、＝ＳｉＨ−、＝Ｓｉ＝、≡Ｓｉ−、−Ｓｅ−、＝ＳｅＨ−、≡Ｓｅ−、＝Ｓｅ＝、−ＳｅＨ２−、−ＰＨ−、＝Ｐ−、＝ＰＨ＝、≡Ｐ＝、≡ＰＨ−、−ＰＨ３−、−ＡｓＨ−、＝Ａｓ−、＝ＡｓＨ＝、≡Ａｓ＝、≡ＡｓＨ−、−ＡＳＨ３−、アミン、エステル、シリル、アルキル、ベンジル、ニトロベンジル、アミド、炭酸塩、ベンゾイル、パーオキシル、ニトリル、チオール、イミド、カルバミン酸塩、シアン酸塩、ヒドロキシルアミン、スルホキシド、スルホン酸塩、チオスルフィン酸塩、チオエステル、ハロゲン化アシル、ヒポヨージル、アルキン、ハロフェニル、ハロベンジル、ピコイル、ジオール及びジスルフィドよりなる群から選択される基であるか、Ｍが−ニトロベンジル−、−ニトロトリル−、−ニトロキシリル−、−ニトロナフチル−、若しくは−ニトロフェニル−基である場合はＺは−ＣＨ２及び−ＮＨよりなる群から選択される基を示し、
ＱはＲ基又はＲ’基の末端官能基又はエフェクター基であってビオチン、タンパク質、定義された配列のポリヌクレオチド、炭水化物、抗原、ホルモン、神経伝達物質、ジゴキシンなどのグリコシド、特に、グルタチオンなどの、チオール官能基を有する硫黄含有ラジカル、及びカテコールなどの二座配位子よりなる群から選択される基を示し、
Ｒ及びＲ’は個別に又は同時に存在することができ、ＲとＲ’とが同時に存在する場合は：
各Ｚ基は同一でも互いに異なっていても良く、
Ｍ基は同一でも互いに異なっていても良く、
Ｑ基は同一でも互いに異なっていても良く、
「base」は、アデニン、チミン、シトシン、グアニン及びウラシルよりなる群から選択される「天然」窒素塩基並びに当該天然窒素塩基の類似体を示すが、チミンについてはＲ’が存在しかつＱがビオチンから成る場合には、チミンを除外する）
ことを特徴とするヌクレオチド。
【請求項２】
修飾基Ｒが、窒素塩基に担持され下記の構造（Ｖ）のうちの１つを成す：
【化２】
2017527556.tif 000010
（ここで、前記各構造において：「Ｓｕｇａｒ」は、窒素塩基とヌクレオチド分子におけるリボース又はデオキシリボース分子との間における結合を示し、Ｚ１及びＺ２は、同一又は異なる切断可能なＺ基である。）
ことを特徴とする請求項１に記載のヌクレオチド。
【請求項３】
窒素塩基に担持された修飾基Ｒが、下記の構造（ＶＩ）のうちの１つを形成することができる：
【化３】
2017527556.tif 000011
（ここで、「Ｓｕｇａｒ」は、窒素塩基とヌクレオチド分子におけるリボース又はデオキシリボース分子との間における結合を示し、Ｘ１及びＸ２は互いに同一又は異なる窒素原子、酸素原子、又は硫黄原子であってＭに担持されており、前記修飾ヌクレオチドの窒素塩基と分子内水素結合（この時、この水素結合はそれぞれ相補的ヌクレオチド間における従来の塩基対の形成時に観察される分子間水素結合と同様のものである）を形成することができる。）
ことを特徴とする請求項２に記載のヌクレオチド。
【請求項４】
合成に係る鎖に対し相補的な鋳型核酸鎖の存在に通常依存するポリメラーゼの基質として、相補的鎖が存在しない場合においてさえ用いることができることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１つに記載のヌクレオチド。
【請求項５】
Ｒ基又はＲ’基の末端官能基Ｑが、以下の相互作用対の一方又は他方により、核酸以外の分子と相互に作用することができることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１つに記載のヌクレオチド。：抗原／抗体、ホルモン／受容体、ビオチン／（ストレプト）アビジン、神経伝達物質／受容体、ポリメラーゼ／プロモータ、ジゴキシン／アンチジゴキシン、炭水化物／レクチン、硫黄含有基／金などの金属、グルタチオン／グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、及び二座配位子／金属酸化物。
【請求項６】
Ｘ１及びＸ２が−ＮＨ、Ｔが−ＮＨ２、Ｚが−ＣＨ２、Ｍがメチルニトロベンジル−、Ｑが−ビオチンであることを特徴とする請求項３に記載のヌクレオチド。
【請求項７】
Ｘ１及びＸ２が−ＮＨ、Ｔが−ＮＨ２、Ｚ、Ｚ１及びＺ２がそれぞれ−Ｏ−、Ｍが−ニトロナフチル−、Ｑが−ビオチンであることを特徴とする請求項３に記載のヌクレオチド。
【請求項８】
化学式（Ｉ）のヌクレオチドであって、修飾基としてＲ’基のみ含んでおり：Ｚが−（Ｃ＝Ｏ）−、Ｍが−Ｃ８Ｈ１６−、Ｑが−ＮＨ−ビオチニルであることを特徴とする請求項１に記載のヌクレオチド。
【請求項９】
Ｚ、Ｚ１及びＺ２がそれぞれ−（ＣＯＯ）−、Ｍが−ｔｅｒｔ−ブチルニトロベンジル−、Ｑが−ＮＨ−ビオチニルである所定の構造（Ｖ）であることを特徴とする請求項２に記載のヌクレオチド。
【請求項１０】
Ｔ並びにＺもしくはＺ１及びＺ２は、核酸合成において前記ヌクレオチドに対する波長１０−３〜１０−１１メートルの電磁放射線、特に紫外線への曝露により切断可能であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１つに記載のヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１つに記載のヌクレオチドの、特に酵素合成法を用いた遺伝子、合成核酸配列、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は核酸ポリマーの製造方法における使用。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１つに記載のヌクレオチドの、前記ヌクレオチドを固体担持体上に予め固定したポリヌクレオチド鎖に組み込むための使用。
【請求項１３】
前記ポリヌクレオチド鎖がその５’末端において結合しかつその３’末端に前記ヌクレオチドを組み込むことによる請求項１２に記載のヌクレオチドの使用。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１つに記載の修飾ヌクレオチドを少なくとも１つ含む核酸合成のためのキット。
【請求項１５】
複数の修飾ヌクレオチド、伸長酵素及び前記ヌクレオチドの少なくとも一つを結合させることができる固体担持体を含む、請求項１２との組合せる請求項１４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的重要性のある官能化されたコポリマーの合成の分野に関する。
特に、核酸、特に非常に長い核酸の合成のために必要なヌクレオチド及び当該ヌクレオチドを含むキット、並びに合成核酸配列又は遺伝子の製造のためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、核酸の生体外での合成には、主に化学的合成と酵素的合成との２つのカテゴリがある。
核酸の生体外における化学的合成方法の最も一般的なものとして、ホスホラミダイトを利用した重合法がある（非特許文献１及び非特許文献２）。この方法では、加える各ヌクレオチドは、同種の複数のヌクレオチドの重合が制御不能になることを抑止するため、５’−ＯＨ基で保護されている。通常、この５’−ＯＨ基の保護にはトリチル基を用いる。強力な試薬を用いることによるいかなる分解も抑止するため、ヌクレオチドが担持する基部も保護できる。この保護基を用いる場合、通常、イソブチリル基を用いる（Ｒｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．１９９７，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １６：１５８９）。新しいヌクレオチドの各取込後、次の重合ステップにおいて使用可能とするために、鎖の最後のヌクレオチドの５’−ＯＨ基が脱保護反応を受ける。核酸を形成するヌクレオチドが担持する窒素塩基自体の脱保護は、完全な重合の終了後にのみ行う。
【０００３】
これらの化学的合成方法は、用いる試薬の性質のため、コストが高くまたその使用において危険性を有することが分かっている。更に、これらの化学的合成方法は、長い核酸断片（約１００のヌクレオチドより大きい断片）の合成には非効率的である。
【０００４】
核酸合成方法、特に非常に長い断片の高収量での製造のための核酸合成方法であってＤＮＡプラスミドなどの既存の遺伝因子に適合する方法を開発するため、鋳型鎖がなくてもヌクレオチド間においてカップリング反応を行うための酵素触媒を使用する合成技術が開発されてきた。
【０００５】
これらの酵素的合成方法において、重合を可能とする酵素を天然ヌクレオチドに対し直接加える場合がある（非特許文献３）。プライマとして知られる出発核酸断片から始めて、重合酵素と１種以上のヌクレオチドをも添加する。その後重合反応が開始すると、核酸は、この重合が物理的方法又は化学的方法により停止されるまで、ホスホジエステル結合形成ステップを繰り返して順次成長する。
【０００６】
天然ヌクレオチド（すなわち、修飾されておらずかつ保護されていないヌクレオチド）を用いた場合、核酸分子の極めて異質な混合物をもたらす制御不能な重合を導く。これは、最初の添加の後に同一種の複数のヌクレオチドを添加することを妨げるものが無いためである。よって、このような合成方法は、所望の配列を有する核酸断片の合成には実用的ではないことが分かっている。
【０００７】
被保護ヌクレオチドの使用により、この重合の制御不能という現象をある程度解決することができる。被保護ヌクレオチドは、所望の反応に続いて生じるホスホジエステル結合の形成を全部又は部分的に妨げることにより合成を停止させることができる。
【０００８】
ヌクレオチドは、核酸合成に用いる「モノマー」である。ヌクレオチドの化学的特性及び反応を生じる否かが、所望の合成が正しく生じることを保証する。所望の配列から成る核酸断片の合成を可能とするためには、各ヌクレオチドを１つずつ所望の順序に従って重合させることを可能とすることが重要である。この重合は、ヌクレオチドを結合させる順番に厳密に従って添加することに等しい。特に、同一の窒素塩基から成っており同時に投入される複数のヌクレオチドが連鎖反応を起こしてしまうと、オリゴマー鎖の成長が制御不能となり、その結果、誤った配列の核酸が製造されてしまうため、このような連鎖反応を生じないよう注意することが必要である。
【０００９】
修飾ヌクレオチドは天然ヌクレオチドと比べ修飾された特定の構造を有し、核酸合成に用いた場合に特定の効果を発揮する。修飾ヌクレオチドは、通常、細胞に自然に存在するヌクレオチドの化学的又は酵素的修飾により得られる。修飾ヌクレオチドには、他の反応中に保存される化学官能基の修飾を抑止する化学基を有するため保護されるといわれるものがある。保護基は、ヌクレオチド分子の種々の部位に配置して良い。
【００１０】
被保護ヌクレオチドの特定の１種に、重合反応停止機能を有するものがある。これら「鎖終止」ヌクレオチドの役割は、反応媒体に投入するヌクレオチドの過剰かつ望ましくない重合を抑止することにある。核酸分子にターミネーターヌクレオチドを組み込むと、他のヌクレオチドの引き続く重合が抑止される。このように、単一のヌクレオチドは、伸長ステップ中に各核酸分子に加えることができる。合成すべき核酸断片を形成する種々のヌクレオチドが順次投入される場合であっても、望ましくない反復現象を防止するために「ターミネーター」ヌクレオチドを使用することが必要である。
【００１１】
「ターミネーター」ヌクレオチドの使用は、化学的方法と酵素的方法とのいずれによるかに関わらず、核酸合成方法の信頼性及び再現性を保証する。「ターミネーター」ヌクレオチドは、所定の方法による合成の性能レベルに大きな影響を及ぼし得る。
【００１２】
核酸の化学的合成のために使用する被保護ヌクレオチドは、５’−ＯＨ位置において、ＤＭＴ（４，４’−ジメトキシトリチル）基に対する共有結合による保護基を、及び、３’−ＯＨ位置において、ヌクレオチド間の重合反応用触媒として作用するホスホラミダイト基を有する。ＤＭＴ基とホスホラミダイト基とから成るこれらのヌクレオチドは、「保護されたホスホラミダイトヌクレオチド」と呼ばれている。重合の制御不能に対する保護は、５’−ＯＨ位置を保護しているＤＭＴ基により行われる。化学的核酸合成における「脱トリチル化」と呼ばれる第１の脱保護相は、ＤＭＴ基を外すため及び挿入するヌクレオチドとの反応のために用い得る５’−ＯＨ基を得るために行われる。いかなる場合においても、次のヌクレオチドの追加を可能とするために可能な限り効果的な脱保護反応を得ることは特に重要である。
【００１３】
保護されたホスホラミダイトヌクレオチドは、核酸の化学的合成の場合にのみ使用される。保護されたホスホラミダイトヌクレオチドの「ターミネーター」機能は、実際には、５’−ＯＨに結合するＤＭＴ基により提供される。化学的合成が３’〜５’方向において生じるので、５’−ＯＨを保護するＤＭＴ基の存在により、次の脱保護ステップまで、過剰な重合の発生を一切抑止することが可能となる。
【００１４】
このように、保護されたホスホラミダイトヌクレオチドは酵素的合成方法に適さない。
【００１５】
「ターミネーター」ヌクレオチドには、「第二世代」塩基配列決定法のために開発されたものもある。しかしながら、塩基配列決定のために使用するターミネーターヌクレオチドには、核酸合成に全く適さないことに加え、いくつかの点において全く適さないといえる制限が存在する。
【００１６】
この制限の主なものとして、伸長酵素により使用されることができるという能力がある。これは、塩基配列決定のためのターミネーターヌクレオチドに結合する蛍光標識のサイズが大きいためである。しかしながら、ヌクレオチドの重合に際し、伸長酵素は、活性部位において極小の空間しか有さないため、共役芳香環から成る基などの付加された蛍光基を収容するターミネーターヌクレオチドをほとんど受容できない。
【００１７】
最新のＤＮＡ塩基配列決定技術は、鋳型鎖と配列鎖と伸長鎖との間における相補的相互作用に基づく。一般に、塩基配列決定に用いる修飾ヌクレオチドは、相補的ヌクレオチドと対を成すという特性を完全に有していなければならない。修飾ヌクレオチドは、その使用において重要となる相互作用特性を保持するものでなければならない。しかしながら、塩基配列決定に用いる修飾ヌクレオチドを構成する窒素塩基は、天然窒素のアデニン、グアニン、チミン、ウラシル及びシトシンなどの塩基の類似体であり、そのため同一の化学的構造を有していない：いくつかの原子が別の原子に置換されておりいくつかの基が追加又は削除されている。これらの非天然窒素塩基には、例えば生体により認識されないなど多くの欠点がある。
【００１８】
ターミネーターヌクレオチドは、いったん組み込まれた後、次のヌクレオチドの追加を可能とするために脱保護される。脱保護ステップは、ターミネーターとしての機能を発揮すべき基を削除することができる物理的又は化学的手段を含む。修飾ヌクレオチドと関連する他の官能基は、同様の脱保護ステップにおいて削除される。このように、通常、次のヌクレオチドの決定に進むためには、種々の塩基配列決定プロセスにおいて種々の脱保護ステップが必要となる。これらの種々の脱保護ステップを用いる場合、反応媒体中に存在する種々の種の分解及び特に核酸の分解を促進する強力な試薬の使用又は極度の物理的条件の適用が増加する。更に、脱保護ステップを多数回行う場合、当該プロセスの速度とその性能レベルとを著しく低下させる。
【００１９】
塩基配列決定用修飾ヌクレオチドの使用に関し、脱保護ステップ後の瘢痕の発生が更なる大きな課題となる。官能基とヌクレオチドとの間におけるリンクとして機能する種々の化学的構造は、脱保護ステップ中は切断されていて良い。しかしながら、この切断において、化学結合構造を全て切り離すことはできない。このように、これら構造の比較的大きな部分は、種々の脱保護ステップ時以外はヌクレオチドと結合したままである。これら残部は通常、塩基配列決定プロセスに対し並びに核酸のいかなる使用又は修飾に対し非常に有害な影響を及ぼす。
【００２０】
担持されたヌクレオチドがどのような構造を有しているかに関わらず、既存の修飾ヌクレオチドは、酵素的合成法に対する期待を実現可能なものではない。伸長酵素により既存の修飾ヌクレオチドが単に使用されてしまうこと、種々の官能基の位置の決定、修飾された窒素塩基の多用、相補的ヌクレオチドとの相互作用を保持する必要性、多数の脱保護ステップを行うこと、及び残留瘢痕の存在は、核酸の酵素的合成法におけるこれらヌクレオチドの使用を妨げる要因となる。
【００２１】
このように従来、核酸、特に非常に長い核酸断片の酵素的合成に適した被保護ヌクレオチドを提供する十分な技術的解決法は存在しない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２２】
【非特許文献１】Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０５（１９８３），６６１）
【非特許文献２】Ｆｒｏｅｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２４（１９８３），３１７１）
【非特許文献３】Ｄｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００（１９８３），９６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
本発明の第１の目的は、核酸の酵素的合成に適した修飾ヌクレオチドを提供することにある。
【００２４】
本発明の別の目的は、種々の官能基によって修飾された、核酸合成プロセスにおける使用に適した天然ヌクレオチドを提供することにある。
【００２５】
本発明の別の目的は、特に本願と同一の出願人による未公表出願であるＦＲ１４−５３４５５に記載の方法に従い製造される、非常に長い核酸の合成を可能とする修飾ヌクレオチド、すなわち少なくとも数百又は数千のヌクレオチドを含む核酸を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
上記目的のため、本発明は、長鎖核酸などの核酸の酵素的合成のための修飾ヌクレオチドであって、「天然」窒素塩基又は天然窒素塩基の類似体、リボース又はデオキシリボース炭水化物、及び少なくとも一つのリン酸基を有し、修飾基と呼ばれる少なくとも一つのＲ基又はＲ’基を前記天然窒素塩基もしくはその類似体、及び／又はリボース分子もしくはデオキシリボース分子の３’位置の酸素により担持されて含んでおり、それは核酸合成中に、前記ヌクレオチドの重合を抑止し（このとき前記修飾基は保護基である）及び／又は前記ヌクレオチドのタンパク質などの、他のヌクレオチドとは異なる、他の分子との相互作用を可能にし、ここでＲは少なくとも一つの官能性末端基（エフェクター基ともいう）を含むことを特徴とする修飾ヌクレオチドを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明の主題である修飾ヌクレオチドの種々の一般的な構造を示す図である。
【図２】化学式（Ｖ）における修飾ヌクレオチドの具体的構造を示す図である。
【図３】アデニン、チミン、シトシン及びグアニンを塩基とする天然窒素塩基の化学式を示す図である。
【図４】化学式（ＶＩ）に示す分子内水素結合型の相互作用が可能な修飾基の例を示す図である。
【図５】ＮＨ２−ｄＴＴＰ−ニトロＢ−ビオの合成を模式的に示す図である。
【図６】ＮＨ２−ｄＧＴＰ−ニトロＮ−ビオの合成を模式的に示す図である。
【図７】ＦＡ−ビオ−ｄＮＴＰの合成を模式的に示す図である。
【図８】ｄＡＴＰ−ニトロＢ−ビオの合成を模式的に示す図である。
【図９】ｄＣＴＰ−ニトロＢ−ビオの合成を模式的に示す図である。
【図１０】高分子化合物ＮＨ２−ｄＴ−ニトロＢ−ビオの脱保護の例を示す図である。
【図１１】高分子化合物ＮＨ２−ｄＧ−ニトロＢ−ビオの脱保護の例を示す。
【図１２】高分子化合物ＦＡ−ビオ−ｄＮＴＰの脱保護の例を示す図である。
【図１３】高分子化合物ｄＡ−ニトロＢ−ビオの光切断による脱保護の例を示す図である。
【図１４】高分子化合物ｄＣ−ニトロＢ−ビオの化学的切断による脱保護の例を示す図である。
【図１５】Ｑ基をカテコールとした本発明に係る修飾ヌクレオチドの例を示す図である。
【図１６】ＦＡ−Ｃａｔ−ｄＮＴＰの合成を模式的に示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
より詳細には、前記修飾基は有利には、特に反応部位への前記酵素のアクセスを可能とするため、共役芳香環などを含む大きな基ではない。
本発明に係るヌクレオチドは、モノリン酸塩、二リン酸塩又は三リン酸塩であって良く、これらリン酸塩基は遊離基、すなわち非修飾基であって良い。
【００２９】
本発明に係るヌクレオチドは、下記化学式（Ｉ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）のうちの１つの形態である：
【００３０】
【化１】
2017527556.tif 000002
【００３１】
ここで（ＰＰ）ＰＯは、モノ−、ジ−、又は三リン酸塩基を示し、
（ＯＨ）はリボース又はデオキシリボース分子であって良く、
Ｔは水素又は−ＮＨ２、−Ｎ３、−（Ｃ＝Ｏ）Ｈ、−ＣｎＨ２ｎ＋１（ｎ＝１〜３０、好ましくは１〜１２）、−トリメチルシリル、−リン酸塩、−ＳＯ３、−（Ｃ＝Ｏ）ＯＣｎＨ２ｎ＋１（ｎ＝１〜３０、好ましくは１〜１２）、−（Ｃ＝Ｏ）ＳＣｎＨ２ｎ＋１（ｎ＝１〜３０、好ましくは１〜１２）、−ニトロベンゼン、−ベンジル、−ハロベンジル、−アミド、−炭酸塩、−ベンゾイル、−パーオキシル、−ニトリル、−チオール、イミド、−カルバミン酸塩、−シアン酸塩、−アルキン、−フェニル、−ハロフェニル、並びに−ピコリルよりなる群から選択される切断可能ラジカルを示し、
Ｍは任意に存在し、ＱとＺとに共有結合し、アルキル、アルケニル、アルキン、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリール、アシル、アルキルオキシ、アルキルアミノ、アルコキシアミノ、アミド、アルキルイミド、アルケニルイミド、アリールイミド、フルオロアルキル、アルキルリン酸、アルキルチオ、チオアシル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アルキルスルフィニル、アルキルアンモニウム、アルキルスルホニウム、アルキルシリル、アルキルカルボニル、アルキルカルバニル、アルキルカルバモイル及びアルキルヒドロキシルアミノよりなる群から選択される基を示し、
Ｚは切断可能基であって−Ｏ−、−Ｓ−、＝ＳＨ−、＝Ｓ＝、≡Ｓ−、−ＳｉＨ２−、＝ＳｉＨ−、＝Ｓｉ＝、≡Ｓｉ−、−Ｓｅ−、＝ＳｅＨ−、≡Ｓｅ−、＝Ｓｅ＝、−ＳｅＨ２−、−ＰＨ−、＝Ｐ−、＝ＰＨ＝、≡Ｐ＝、≡ＰＨ−、−ＰＨ３−、−ＡｓＨ−、＝Ａｓ−、＝ＡｓＨ＝、≡Ａｓ＝、≡ＡｓＨ−、−ＡＳＨ３−、アミン、エステル、シリル、アルキル、ベンジル、ニトロベンジル、アミド、炭酸塩、ベンゾイル、パーオキシル、ニトリル、チオール、イミド、カルバミン酸塩、シアン酸塩、ヒドロキシルアミン、スルホキシド、スルホン酸塩、チオスルフィン酸塩、チオエステル、ハロゲン化アシル、ヒポヨージル、アルキン、ハロフェニル、ハロベンジル、ピコイル、ジオール及びジスルフィドよりなる群から選択される基である、Ｍが−ニトロベンジル−、−ニトロトリル−、−ニトロキシリル−、−ニトロナフチル−、若しくは−ニトロフェニル−基である場合はＺは−ＣＨ２及び−ＮＨよりなる群から選択される基を示し、
ＱはＲ基又はＲ’基の末端官能基又はエフェクター基であってビオチン、タンパク質、定義された配列のポリヌクレオチド、炭水化物、抗原、ホルモン、神経伝達物質、ジゴキシンなどのグリコシド、特に、グルタチオンなどの、チオール官能基を有する硫黄含有ラジカル、及びカテコールなどの二座配位子よりなる群から選択される基を示し、
Ｒ及びＲ’は個別に又は同時に存在することができ、ＲとＲ’とが同時に存在する場合は：各Ｚ基は同一でも互いに異なっていても良く、
Ｍ基は同一でも互いに異なっていても良く、
Ｑ基は同一でも互いに異なっていても良く、
「base」は、アデニン、チミン、シトシン、グアニン及びウラシルよりなる群から選択される「天然」窒素塩基並びに当該天然窒素塩基の類似体を示すが、チミンについてはＲ’が存在しかつＱがビオチンから成る場合には、チミンを除外する。
【００３２】
好ましくは、Ｔ（水素でない場合）、Ｒ及びＲ’が核酸合成プロセスにおける伸長ステップの鎖終止を成す基を形成する。
【００３３】
本書において「切断可能ラジカル」又は「切断可能基」という文言は、リボース分子の３’位置又は２’位置の酸素、デオキシリボース分子の３’位置の酸素、又は窒素塩基の原子に対する共有結合により形成される遊離基又は基を意味し、前記結合は化学的に又は光化学的に切断可能である。切断可能ラジカル若しくは切断可能基における結合全ての切断又は本発明に係るヌクレオチド分子のＴ基及びＺ基の切断は完全に同時に、すなわち同一の「脱保護」ステップにおいて行うことが好ましく、特に同一の条件下又は同一の試薬による作用の組合せにより行うことが好ましい。
【００３４】
この修飾基の削除は、修飾基を全く含まないヌクレオチドを生成するために完全に行うこと、すなわち天然ヌクレオチドと（窒素塩基の構造を除き）同様とすることが好ましい。
【００３５】
上述の通り、Ｒ基及びＲ’基は、核酸合成プロセスにおける伸長ステップのを終了する鎖を有利に提供する基である。これらのＲ基及びＲ’基は、ＲとＲ’の自由末端に配置される官能基Ｑにより、担持体に存在する分子などの核酸とは異なる他の分子と結合するという特性を有していて良い。
【００３６】
これは、上記ＦＲ１４−５３４５５に記載の方法などの核酸合成プロセスにおける特定のステップにおいて、使用する修飾ヌクレオチドが固体担持体と相互に作用可能であると考えられるためである。これら固体担持体は、その表面に、当該ヌクレオチドの修飾基に適合する分子、タンパク質又は化学官能基を担持している。この修飾ヌクレオチドの官能性は、その後に正しい核酸合成プロセスを生じさせるために重要である。好ましい一実施形態において、前記修飾ヌクレオチドは、例えば、固体担持体表面に存在する分子との間で非常に低い分離定数、具体的には１０−6ｍｏｌ／ｌ未満の結合複合体を形成して精製されるために固体担持体との結合を可能とする基を有している。この結合官能基を形成する基は、脱保護ステップ後に切断して良く、これによりヌクレオチド及び固体担持体の間の相互作用を抑止する。この場合、本発明に係るヌクレオチドは、精製を可能とする基の存在、及びこの基を同一のヌクレオチドから他の修飾基と同時に切断する能力、という二重の利点を有する。
【００３７】
好ましくは、修飾基Ｒは、窒素塩基に担持され下記の構造（Ｖ）のうちの１つを成す：
【００３８】
【化２】
2017527556.tif 000003
【００３９】
ここで、前記各構造において：「Ｓｕｇａｒ」は、窒素塩基とヌクレオチド分子におけるリボース又はデオキシリボース分子との間における結合を示し、Ｚ１及びＺ２は、同一又は異なる切断可能なＺ基である。
【００４０】
「Ｚ基」、「Ｍ基」及び「Ｑ基」はそれぞれ上述の意味である。
【００４１】
本実施形態において、前記ヌクレオチドは、ワトソン・クリック型塩基対構造を通常有する窒素塩基の原子に担持された基、すなわち通常相補的ヌクレオチドと対を成すアミン官能基の窒素原子に担持された基によって修飾されている。種々の修飾基と窒素塩基の原子との結合は必ず切断可能なＺ基による共有結合により成される。
【００４２】
アデニン型窒素塩基の場合、本発明の好ましい一実施形態において、修飾基を１級アミン基６−ＮＨ２と結合する（構造Ｖａ）。
チミン型窒素塩基の場合、他の本発明の好ましい実施形態において、修飾基を２級アミン基３−ＮＨと結合する（構造Ｖｔ）。
シトシン型窒素塩基の場合、他の本発明の好ましい実施形態において、修飾基を１級アミン基４−ＮＨ２と結合する（構造Ｖｃ）。
ウラシル型窒素塩基の場合、他の本発明の好ましい実施形態において、修飾基を２級アミン基３−ＮＨと結合する（構造Ｖｕ）。
【００４３】
グアニン型窒素塩基の場合、他の本発明の好ましい実施形態において、修飾基を、切断可能基を用いて前記２種のアミノ基、すなわち２級アミノ基１−ＮＨ及び１級アミノ基２−ＮＨ２のうちの１つ又は両方と結合する（構造Ｖｇ）。特に、修飾基を担持するためにこれら２つのアミン基１−ＮＨ及びＮＨ２を同時に用いる場合、優先的に６つの原子から成る環が、種々の分離したサブグループとの間に生じる。この環は、必要に応じて修飾基の構造の安定化をもたらす。
【００４４】
修飾基が窒素塩基に担持されるこれらの実施形態において、ヌクレオチドの３’ＯＨ及び／又は２’ＯＨ部位は遊離部位であり、これにより、核酸合成においてヌクレオチドの、伸長酵素の基質としての使用を促進している。
【００４５】
これにより分子間水素結合が生じ得る。実際、窒素塩基に担持された修飾基Ｒは、下記の構造（ＶＩ）のうちの１つを形成することができる：
【００４６】
【化３】
2017527556.tif 000004
【００４７】
ここで、「Ｓｕｇａｒ」は、窒素塩基とヌクレオチド分子におけるリボース又はデオキシリボース分子との間における結合を示し、
Ｘ１及びＸ２は互いに同一又は異なる窒素原子、酸素原子、又は硫黄原子であってＭに担持されており、前記修飾ヌクレオチドの窒素塩基と分子内水素結合（この時、この水素結合はそれぞれ相補的ヌクレオチド間における従来の塩基対の形成時に観察される分子間水素結合と同様のものである）を形成することができる。
【００４８】
この構成により、修飾ヌクレオチドの安定性が向上する。また、この構成は修飾基の小型化を可能とし、これにより、通常鋳型鎖の存在に依存する伸長酵素における修飾基の使用が可能となる。
【００４９】
アデニン型窒素塩基の場合、本発明の好ましい一実施形態においては、修飾基を１級アミン基６−ＮＨ２に結合する（構造ＶＩａ）。この構造中に存在するＸ１基は、プリン環の窒素原子１との分子内水素結合の形成を促進する。このように相補的チミンの存在を擬似的に模倣している。
【００５０】
チミン型窒素塩基の場合、本発明の好ましい一実施形態においては、修飾基を２級アミン基３−ＮＨに結合する（構造ＶＩｔ）。この構造中に存在するＸ１基は、ピリミジン環の位置４に存在する酸素原子との分子内水素結合の形成を促進する。このように相補的アデニンの存在を擬似的に模倣している。
【００５１】
シトシン型窒素塩基の場合、本発明の好ましい一実施形態においては、修飾基を１級アミン基４−ＮＨ２に結合する（構造ＶＩｃ）。この構造中に存在するＸ１基及びＸ２基は、ピリミジン環の位置３に存在する窒素原子及び位置２に存在する酸素原子との分子内水素結合の形成を促進する。このように、相補的グアニンの存在を擬似的に模倣している。
【００５２】
グアニン型窒素塩基の場合、本発明の好ましい一実施形態においては、切断可能なＺ１基及びＺ２基を用いて、修飾基を２級１−ＮＨ基及び１級２−ＮＨ２基の２つのアミン基に結合する（構造ＶＩｇ）。この構造中に存在するＸ１基は、プリン環の位置６に存在する酸素原子との分子内水素結合の形成を促進する。このように、相補的シトシンの存在を擬似的に模倣している。
【００５３】
ウラシル型窒素塩基の場合、本発明の好ましい一実施形態においては、修飾基を２級アミン基３−ＮＨに結合する（構造ＶＩｕ）。この構造中に存在するＸ１基は、ピリミジン環の位置４の酸素との水素結合の形成を促進する。このように、相補的アデニンの存在を擬似的に模倣している。
【００５４】
本発明に係る修飾ヌクレオチドは、何らかの鋳型鎖に担持された相補的ヌクレオチドとなり得るものと塩基対を成さなくとも良い。本発明の主題である修飾ヌクレオチドの使用に関し、核酸の生成において、前記ヌクレオチドは鋳型鎖となり得るものとの相補的相互作用により組み込まれなくとも良い。
【００５５】
本発明の主題である修飾ヌクレオチドは、特定のステップにおいて修飾基を外して良いという特徴を備える。本発明のヌクレオチドは、修飾基が全て取り外されると、鋳型鎖に担持された相補的ヌクレオチドと塩基対を形成する能力を回復する。
【００５６】
一実施形態によれば、本発明に係るヌクレオチドは、合成に係る鎖に対し相補的な鋳型核酸鎖の存在に通常依存するポリメラーゼの基質として、相補的鎖が存在しない場合においてさえ用いることができる。
【００５７】
好ましくは、Ｒ基又はＲ’基の末端官能基Ｑは、核酸合成において、前記担持体の表面に担持されたタンパク質などの核酸以外の分子により、固体担持体に対し前記ヌクレオチドを結合させることができ、また特に以下の相互作用対の一方又は他方により、核酸以外の分子と相互に作用することができる：抗原／抗体、ホルモン／受容体、ビオチン／（ストレプト）アビジン、神経伝達物質／受容体、ポリメラーゼ／プロモータ、ジゴキシン／アンチジゴキシン、炭水化物／レクチン、硫黄含有基／金などの金属、グルタチオン／グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、及び二座配位子／金属酸化物。
【００５８】
前記金属酸化物は例えば以下のものであって良い：ＴｉＯ２、ＺｒＯ２、ＣｅＯ２、Ｆｅ３Ｏ４、Ｇａ２Ｏ３、Ｉｎ２Ｏ３、Ｃｒ２Ｏ３、Ａｌ２Ｏ３、ＺｎＯ、ＣｕＯ、Ｃｕ２Ｏ３、Ｍｎ３Ｏ４、Ｍｎ２Ｏ３、Ｖ２Ｏ３、及びＭｏＯ２。
【００５９】
前記二座配位子は、カテコール、ヒドロオキサメート又はヒドロキシカルボン酸塩であっても良い。
【００６０】
Ｔラジカルは、炭水化物の３’ヒドロキシル基又は２’ヒドロキシル基を追加的に添加されるヌクレオチドから完全に保護するため、「ブロッカー」と呼ばれている。
【００６１】
Ｔ並びにＺもしくはＺ１及びＺ２は、核酸合成において前記ヌクレオチドに対する波長１０−３〜１０−１１メートルの電磁放射線、特に紫外線への曝露により切断可能であることが好ましい。
【００６２】
本発明の有利な実施形態は、以下のヌクレオチドに関する：
−Ｘ１及びＸ２が−ＮＨ、Ｔが−ＮＨ２、Ｚが−ＣＨ２、Ｍがメチルニトロベンジル−、Ｑが−ビオチンであるヌクレオチド、
−Ｘ１及びＸ２が−ＮＨ、Ｔが−ＮＨ２、Ｚ、Ｚ１及びＺ２がそれぞれ−Ｏ−、Ｍが−ニトロナフチル−、Ｑが−ビオチンであるヌクレオチド、
−Ｚが−（Ｃ＝Ｏ）−、Ｍが−Ｃ８Ｈ１６−、Ｑが−ＮＨ−ビオチニルであるＲ’基のみ含む化学式（Ｉ）のヌクレオチド、
−Ｚ、Ｚ１及びＺ２がそれぞれ−（ＣＯＯ）−、Ｍが−ｔｅｒｔ−ブチルニトロベンジル−、Ｑが−ＮＨ−ビオチニルである所定の構造（Ｖ）を備えたヌクレオチド。
【００６３】
本発明は特に酵素合成法を用いた遺伝子、合成核酸配列、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は核酸ポリマーの製造方法における、上述の通りのヌクレオチドの使用にも関する。
【００６４】
有利な使用としては、前記固体担持体に固定したポリヌクレオチド鎖に前記ヌクレオチドを組み込むことによる使用、特に前記ポリヌクレオチド鎖がその５’末端において結合しかつその３’末端に前記ヌクレオチドを組み込むことによる使用がある。
【００６５】
しかしながら、本発明に係るヌクレオチドは遊離型であり、適宜対イオンと結合して良い。前記ヌクレオチドは固体担持体に対する結合能を有するが、このヌクレオチドは、ポリヌクレオチド鎖に組み込む際に担持体を要しない。すなわち、前記ヌクレオチドの化学的構造は、固体担持体とは関連性が全くない。前記修飾ヌクレオチドは未公表出願ＦＲ１４−５３４５５に記載の方法においてそれ自体固定された核酸の断片に添加されるため、このヌクレオチドが遊離性を備えていることは前記方法における使用において重要である。前記断片は、放出された後、直前に組み込まれたヌクレオチドのエフェクター基により第２の固体担持体に対向する端部において結合する。このように前記断片が結合し、前記ポリヌクレオチドの形成に用いる本発明に係るヌクレオチドに結合するのではなく固体担持体に結合した所望の配列を有する完全な核酸鎖又はポリヌクレオチドを形成する。
【００６６】
本発明は、本発明に係る少なくとも一つの修飾ヌクレオチドを含むキット、特に、少なくとも一つの前記ヌクレオチドを結合させることができる複数の修飾ヌクレオチド、伸長酵素及び固体担持体を含むキットにも関する。
【００６７】
次に、下記の添付図面を参照して、具体的な実施例により本発明をより詳細に説明する。図１は本発明の主題である修飾ヌクレオチドの種々の一般的な構造を示す。図２は化学式（Ｖ）における修飾ヌクレオチドの具体的構造を示す。図３はアデニン、チミン、シトシン及びグアニンを塩基とする天然窒素塩基の化学式を示す。図４は化学式（ＶＩ）に示す分子内水素結合型の相互作用が可能な修飾基の例を示す。図５はＮＨ２−ｄＴＴＰ−ニトロＢ−ビオの合成を模式的に示す。図６はＮＨ２−ｄＧＴＰ−ニトロＮ−ビオの合成を模式的に示す。図７はＦＡ−ビオ−ｄＮＴＰの合成を模式的に示す。図８はｄＡＴＰ−ニトロＢ−ビオの合成を模式的に示す。図９はｄＣＴＰ−ニトロＢ−ビオの合成を模式的に示す。図１０は高分子化合物ＮＨ２−ｄＴ−ニトロＢ−ビオの脱保護の例を示す。図１１は高分子化合物ＮＨ２−ｄＧ−ニトロＢ−ビオの脱保護の例を示す。図１２は高分子化合物ＦＡ−ビオ−ｄＮＴＰの脱保護の例を示す。図１３は高分子化合物ｄＡ−ニトロＢ−ビオの光切断による脱保護の例を示す。図１４は高分子化合物ｄＣ−ニトロＢ−ビオの化学的切断による脱保護の例を示す。図１５はＱ基をカテコールとした本発明に係る修飾ヌクレオチドの例を示す。図１６はＦＡ−Ｃａｔ−ｄＮＴＰの合成を模式的に示す。
【実施例】
【００６８】
修飾された（保護された）ヌクレオチドの合成−実施例１〜６
【００６９】
実施例１−ＮＨ２−ｄＴＴＰ−ニトロＢ−ビオ（図５）の合成
【００７０】
ステップＡ１：Ｅｔ３Ｎ（トリエチルアミン）（（２．２ｍｌ）、ＤＭＡＰ（４−ジメチルアミノピリジン）（（１７５ｍｇ）を２’−デオキシチミジンのピリジン溶液（５ｇ）に加えた後、ＤＭＴＣｌ（塩化４，４’−ジメトキシトリチル）（（５．２５ｇ）を加え、室温で一晩撹拌した。その後Ｅｔ３Ｎ（２．４ｍｌ）及びＭｓＣｌ（メタンスルホニルクロリド）（１．２７ｍｌ）を混合物に加えた。室温で２時間培養後、混合物を酢酸エチルで濾過し洗浄した。濾液を濃縮しエタノール（７５ｍｌ）に溶解させ、ＮａＯＨ（１モル）を加えた。１．５時間還流後、混合物を室温に冷却し、ＨＣｌ（１モル）を加えた。ロータリーエバポレータを用いてエタノールを留去し、残渣をＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。シリカゲルカラムにより精製して生成物ｄＴＴＰ−Ａ１を得た。
【００７１】
ステップＡ２：ｄＴＴＰ−Ａ１（２．２３７ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（２．１ｇ）及びＮ−ヒドロキシフタルイミド（１．３ｇ）のテトラヒドロフラン（５０ｍｌ）溶液にＮ，Ｎ’−ジイソプロピルアゾジカルボキシレート（１．７５ｍｌ）を０℃で加えた。室温で一晩再加熱後、反応液を水（０．３ｍｌ）で処理し、溶媒を減圧雰囲気下で留去した。不純物の大部分をクロマトグラフィによって除去して生成物ｄＴＴ−Ａ２を得た。
【００７２】
ステップＡ３：１当量の化合物ｄＴＴ−Ａ２に１０当量のＬｉＨを含むＤＭＦ溶液を室温で加えた。混合物を３０分間反応させた。３−アミノ−４−（ブロモメチル）−５−ニトロフェニルビオチンを加えて反応を進め、混合物を数時間撹拌した。これにより生成物ｄＴＴ−Ａ３を得た。
【００７３】
ステップＡ４：化合物ｄＴＴＰ−Ａ３をメタノールで再懸濁させ、濃塩酸水溶液で処理した。反応液を−２０℃で一晩冷却して生成物ｄＴＴＰ−Ａ４を得た。
【００７４】
ステップＡ５：２−クロロ−４Ｈ−１，２，３−ベンゾジオキサホスホリン−４−オン（１３０ｍｇ）のジオキサン（１．３ｍｌ）溶液を、５’−ＯＨヌクレオシド類似体ｄＴＴＰ−Ａ４（（４２５ｍｇ）のピリジン（２ｍｌ）及びジオキサン（１．７ｍｌ）溶液に加えた。混合物を室温で２０分間放置した。反応液に、トリブチルアンモニウムピロリン酸塩（１．４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液とトリブチルアミン（３．２ｍｍｏｌ）との混合物を加えた。２０分後、ヨウ素（１８０ｍｇ）及び水（０．２８ｍｌ）のピリジン（１４ｍｌ）溶液を加えた。３０分後、５％Ｎａ２ＳＯ３水溶液を加えて反応を停止させた。溶媒を減圧雰囲気下で留去した。残渣に水（２５ｍｌ）及びＣＨ３ＣＮ（２０ｍｌ）を加えた。混合物を濾過後逆相ＨＰＬＣで精製して、三リン酸塩化合物、すなわち本例ではｄＴＴＰ−Ａ５を得た。
【００７５】
ステップＡ６：冷温のメチルヒドラジン（０．３８５ｍｌ）を化合物ｄＴＴＰ−Ａ５（３．７２５ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ３Ｃｌ２溶液に−５℃で加えた。１０分後、１，２−ジヒドロ−４−ヒドロキシ−２−メチル−１−オキソフサリジンの沈殿物が形成された。混合物を室温で１時間撹拌した。沈殿物を濾去し、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄した。その後、濾液をロータリーエバポレータで濃縮し、クロマトグラフィで精製して生成物ＮＨ２−ｄＴＴＰ−ニトロＢ−ビオを得た。
【００７６】
実施例２−ＮＨ２−ｄＧＴＰ−ニトロＮ−ビオ（図６）の合成
ステップＢ１：ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（２．４ｍｍｏｌ）を、無水ＤＭＦ中に１．８４５ｍｍｏｌの２’−デオキシグアニンと３２６ｍｇのイミダゾールを含む撹拌溶液に加えた。反応液を室温で２０時間撹拌し培養した。溶媒を減圧雰囲気下で除去し、その後残渣をクロマトグラフィで精製して生成物ｄＧＴＰ−Ｂ１を得た。
【００７７】
ステップＢ２：ｄＧＴＰ−Ｂ１（２．２３７ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（２．１ｇ）及びＮ−ヒドロキシフタルイミド（１．３ｇ）のテトラヒドロフラン（５０ｍｌ）溶液にＮ，Ｎ’−ジイソプロピルアゾジカルボキシレート（１．７５ｍｌ）を０℃で加えた。室温で一晩再加熱後、反応液を水（０．３ｍｌ）で処理し、溶媒を減圧雰囲気下で留去した。不純物の大部分をクロマトグラフィで除去して生成物ｄＧＴＰ−Ｂ２を得た。
【００７８】
ステップＢ３：化合物ｄＧＴＰ−Ｂ２（３．７８５ｍｍｏｌ）をピリジン（１０ｍｌ）を用いて減圧雰囲気下で気化させることにより数回乾燥させた。残渣をＣＨ２Ｃｌ２（１２．５ｍｌ）に溶解させた。ジイソプロピルエチルアミン（９ｍｍｏｌ）及び６−アミノ−４，５−ビス（ヨードキシ）−３−ニトロナフタレン−１−イル−５−ビオチン（７．５７ｍｍｏｌ）を加えた。反応終了後、混合物をＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍｌ）で希釈し、その後有機相を重炭酸ナトリウム（５０ｍｌ）及び水（５０ｍｌ）で洗浄した。その後得られた残渣を硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧雰囲気下で留去し、クロマトグラフィで精製して生成物ｄＧＴＰ−Ｂ３を得た。
【００７９】
ステップＢ４：化合物ｄＧＴＰ−Ｂ３（３．７５ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２０ｍｌ）に溶解させ、ＴＢＡＦ（テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムフルオリド）（１モル）のＴＨＦ溶液で処理した。約２時間撹拌後、反応を停止させた。混合物をＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、クロマトグラフィで精製して生成物ｄＧＴＰ−Ｂ４を得た。
【００８０】
ステップＢ５：５’−ＯＨヌクレオシド類似体（（４２５ｍｇ）を実施例１のステップＡ５と同様に処理した。得られた混合物を濾過後、逆相ＨＰＬＣで精製して三リン酸塩合成物、本例ではｄＧＴＰ−Ｂ５を得た。
【００８１】
ステップＢ６：冷温メチルヒドラジン（０．３８５ｍｌ）を化合物ｄＧＴＰ−Ｂ５（３．７２５ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ２Ｃｌ２溶液に−５℃で加えた。１０分後、１，２−ジヒドロ−４−ヒドロキシ−２−メチル−１−オキソフサリジンの沈殿物が形成された。混合物を室温で１時間撹拌した。沈殿物を濾去し、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄した。その後濾液をロータリーエバポレータで濃縮し、クロマトグラフィで精製して生成物ＮＨ２−ｄＧＴＰ−ニトロＮ−ビオを得た。
【００８２】
実施例３−ＦＡ−ビオ−ｄＮＴＰ（図７）の合成
ステップＣ１：ω１−ビオチンノナン酸（１モル、１００μｌ）のＤＭＦ溶液とカルボニルジイミダゾール（１モル、１００μｌ）のＤＭＦ溶液とを混合した。室温で３０秒放置してイミダゾリドを得た。次いで、混合物にジオキシリボヌクレオチド  ５’−三リン酸（５０ｍＭ、１００μｌ）の水溶液を加えた。反応液を室温で１２時間放置して生成物を得た。次いで、反応生成物をアセトンで沈殿後水に溶解させ、クロマトグラフィで精製して生成物ＦＡ−ビオ−ｄＮＴＰを得た。
【００８３】
実施例４−化合物ｄＡＴＰ−ニトロＢ−ビオ（図８）の合成
ステップＤ１：Ｅｔ３Ｎ（２．２ｍｌ）及びＤＭＡＰ（１７５ｍｇ）を２’−デオキシアデニン（５ｇ）のピリジン溶液に加え、その後ＤＭＴＣｌ（５．２５ｇ）を加えた。混合物を室温で一晩反応させた。次いで、混合物にＥｔ３Ｎ（２．４ｍｌ）及びＭｓＣｌ（１．２７ｍｌ）を加えた。室温で２時間培養後、混合物を濾過した後、濾液を酢酸エチルによって洗浄した。濾液を濃縮しエタノール（７５ｍｌ）に溶解し、ＮａＯＨ（１モル）を加えた。１．５時間還流後、混合物を室温に冷却し、ＨＣｌ（１モル）を加えた。エタノールはロータリーエバポレータを用いて留去し、残渣をＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。抽出物をシリカゲルカラムで精製して生成物ｄＡＴＰ−Ｄ１を得た。
【００８４】
ステップＤ２：ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（２．４ｍｍｏｌ）を、撹拌されている、ｄＡＴＰ−Ｄ１（１．８４５ｍｍｏｌ）及びイミダゾール（３２６ｍｇ）の無水ＤＭＦ溶液に加えた。反応液を撹拌しながら室温で２０時間培養した。溶媒を減圧留去し、その後残渣をクロマトグラフィで精製して生成物ｄＡＴＰ−Ｄ２を得た。
【００８５】
ステップＤ３：化合物ｄＡＴＰ−Ｄ２をメタノールで再懸濁させ、濃塩酸水溶液で処理した。溶液を、−２０℃で一晩冷却して生成物ｄＡＴＰ−Ｄ３を得た。
【００８６】
ステップＤ４：５’−ＯＨヌクレオシド類似体（４２５ｍｇ）を実施例１のステップＡ５と同様に処理した。得られた混合物を濾過後、逆相ＨＰＬＣで精製して三リン酸塩合成物、本例ではｄＡＴＰ−Ｄ４を得た。
【００８７】
ステップＤ５：化合物ｄＡＴＰ−Ｄ４（３．１μｍｏｌ）のＮａＨＣＯ３（０．１モル、２００μｌ）溶液（ｐＨ：８．０）を、２，２−ｔｅｒｔ−ブチル−１−（２−ニトロ−４−ビオチン）フェニル）ヘキシル（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）炭酸塩（３．４μｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（２００μｌ）溶液と混合した。反応液を室温で一晩放置して生成物ｄＡＴＰ−Ｄ５を得た。（Ｏｌｅｊｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，１９９５，Ｖｏｌ  ９２，７５９０−７５９４）。
【００８８】
ステップＤ６：化合物ｄＡＴＰ−Ｄ５（３．７５ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２０ｍｌ）に溶解させ、ＴＢＡＦ（テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムフルオリド）（１モル）のＴＨＦ溶液で処理した。約２時間撹拌後、反応を停止させた。混合物をＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、クロマトグラフィで精製して生成物ｄＡＴＰ−ニトロＢ−ビオを得た。。
【００８９】
実施例５−化合物ｄＣＴＰ−ニトロＢ−ビオ（図９）の合成
ステップＥ１：Ｅｔ３Ｎ（２．２ｍｌ）及びＤＭＡＰ（１７５ｍｇ）を２’−デオキシシチジン（５ｇ）のピリジン溶液に加え、次いでＤＭＴＣｌ（５．２５ｇ）を加え、混合物を室温で一晩撹拌した。次いで、Ｅｔ３Ｎ（２．４ｍｌ）及び（１．２７ｍｌ）ＭｓＣｌを混合物に加えた。室温で２時間培養後、混合物を酢酸エチルによって濾過後、洗浄した。濾液を濃縮しエタノール（７５ｍｌ）に溶解させ、ＮａＯＨ（１モル）を加えた。１．５時間還流後、混合物を室温に冷却し、ＨＣｌ（１モル）を加えた。エタノールはロータリーエバポレータを用いて留去し、残渣をＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。次いで、シリカゲルカラムで精製して生成物ｄＣＴＰ−Ｅ１を得た。
【００９０】
ステップＥ２：ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（２．４ｍｍｏｌ）をｄＣＴＰ−Ｅ１（１．８４５ｍｍｏｌ）の撹拌溶液及びイミダゾール（３２６ｍｇ）の無水ＤＭＦ溶液に加えた。反応液を室温で２０時間撹拌し培養した。溶媒を減圧留去し、その後残渣をクロマトグラフィで精製して生成物ｄＣＴＰ−Ｅ２を得た。。
【００９１】
ステップＥ３：化合物ｄＣＴＰ−Ｅ２を無水エタノールに溶解させ、０℃まで冷却した。等モルの２，２−ｔｅｒｔ−ブチル−１−（２−ニトロ−４−ビオチン）フェニル）プロピルフェニル炭酸塩の無水エタノール溶液を滴下した。混合物を室温で一晩撹拌した。溶液を濾過し、水で洗浄し、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出して生成物ｄＣＴＰ−Ｅ３を得た。
【００９２】
ステップＥ４：化合物ｄＣＴＰ−Ｅ３をメタノールで再懸濁させ、濃塩酸水溶液で処理した。反応液を−２０℃で一晩冷却して生成物ｄＣＴＰ−Ｅ４を得た。
【００９３】
ステップＥ５：５’−ＯＨヌクレオシド類似体（４２５ｍｇ）を実施例１のステップＡ５と同様に処理した。得られた混合物を濾過後、逆相ＨＰＬＣで精製して三リン酸塩合成物、本例ではｄＣＴＰ−Ｅ５を得た。
【００９４】
ステップＥ６：化合物ｄＣＴＰ−Ｅ５（３．７５ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２０ｍｌ）に溶解させ、ＴＢＡＦ（テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムフルオリド）（１モル）のＴＨＦ溶液で処理した。約２時間撹拌後、反応を停止させた。混合物をＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、クロマトグラフィで精製して生成物ｄＣＴＰ−ニトロＢ−ビオを得た。。
【００９５】
実施例６−ＦＡ−Ｃａｔ−ｄＮＴＰ（図１６）の合成
ステップＦ１：修飾子カテコールエステル（１００μｌ）のＤＭＦ溶液（１モル）をジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（１モル、１１０μｌ）及び４−（ジメチルアミノ）ピリジン（１００％、５μｌ）のＤＭＦ溶液と混合した。混合物を０℃で５分間培養した。次いでデオキシリボヌクレオチド５’−三リン酸（５０ｍＭ、５００μｌ）のＤＭＦ溶液を混合物に加えた。室温で３時間放置し生成物を得た。次いで得られた生成物をアセトンで沈殿させ、水に溶解させ、クロマトグラフィで精製して生成物ＦＡ−Ｃａｔ−ｄＮＴＰを得た。
【００９６】
脱保護
ヌクレオチドの核酸鎖への添加後に実施した以下の実施例７〜１１により、前記分子の脱保護の実施例、すなわち修飾基の除去を説明する。
【００９７】
実施例７−重合ヌクレオチドＮＨ２−ｄＴ−ニトロＢ−ビオ（図１０）の脱保護
複数の修飾基の切断を以下のプロセスにおいて、同時に実施した。化合物ＮＨ２−ｄＴ−ニトロＢ−ビオの２０ｍＭ水溶液を３５０〜７００ｍＭのＮａＮＯ２及び１モルのＮａＯＡｃを含む溶液（ｐＨ：５．５）で処理した。波長３６５ナノメートルの紫外線を照射し、室温で１〜２分間培養後、１モルのリン酸塩バッファ（ｐＨ：７．０）を加えて反応を停止させ、照射を停止した。脱保護反応液はｄＴとした。
【００９８】
実施例８−重合ヌクレオチドＮＨ２−ｄＧ−ニトロＮ−ビオ（図１１）の脱保護
複数の修飾基の切断を以下のプロセスにおいて同時に実施した：ＮＨ２−ｄＧ−ニトロＮ−ビオの２０ｍＭ水溶液を３５０〜７００ｍＭのＮａＮＯ２及び１モルのＮａＯＡｃを含む溶液（ｐＨ：５．５）で処理した。波長３６５ナノメートルの紫外線を照射し、室温で１〜２分間培養後、１モルのリン酸塩バッファ（ｐＨ：７．０）を加えて反応を停止させ、照射を停止した。脱保護反応液はｄＧとした。
【００９９】
実施例９−重合ヌクレオチドＦＡ−ビオ−ｄＮ型（図１２）の脱保護
３’−ＯＨ端に担持された修飾基の切断を、１〜１００ｍＭのアンモニア水溶液中におけるエステル官能基の加水分解（室温、１時間）により実施した。これによりｄＮ型の生成物を得た。
【０１００】
実施例１０−光切断（図１３）による重合ヌクレオチドｄＡ−ニトロＢ−ビオの脱保護
窒素塩基に担持された修飾基の切断を光切断により実施した。化合物ｄＡ−ニトロＢ−ビオに対し、室温で波長３００〜３７０ナノメートルのＵＶ源からの紫外線照射を行った。ＵＶ源からの紫外線照射を３０〜３００秒後に停止させ、生成物ｄＡを得た。。
【０１０１】
実施例１１−化学的切断（図１４）による重合ヌクレオチドｄＣ−ニトロＢ−ビオールの脱保護
窒素塩基に担持された修飾基の切断を化学的切断により実施した。化合物ｄＣ−ニトロＢ−ビオ（０．０１ｍｍｏｌ）をエタノール（０．１ｍｌ）中に溶解させた。テトラクロロパラジウム（ＩＩ）酸ナトリウム（０．０２ｍｍｏｌ）のエタノール溶液を加えた。混合物を２０分間撹拌後、混合物に二水素ガスが泡立った。これにより生成物ｄＣを得た。
【０１０２】
固定パラジウムを使用し１ｍｌ／分の水素気流下でＴＨＦ溶液を用いる同様の手順は、小林らによる記載（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００４，３０４，１３０５−１３０８）があり、
変形例として使用することができる。。
【０１０３】
実施例１２−核酸合成のための本発明のヌクレオチドの使用
【０１０４】
本発明の主題である修飾ヌクレオチドは、特許出願ＦＲ１４−５３４５５に記載の方法により鋳型鎖の非存在下における核酸の酵素的合成に有利に用いることができる。修飾ヌクレオチド添加ステップの実施にあたり選択される酵素としては、市販のＴｅｒｍｉｎａｌ  Ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ又はＴｄＴがある。
【０１０５】
合成開始に用いるプライマには以下のものがある：
【０１０６】
【化４】
2017527556.tif 000005
【０１０７】
実施例１に従って調製されるＮＨ２−ｄＴＴＰ−ニトロＢ−ビオを、修飾ヌクレオチドとして使用した。この修飾ヌクレオチドにおいては、Ｔを上記配列番号１に加えることができる。後述するように、各伸長ステップにおいて、１つのヌクレオチドだけ各ＤＮＡ断片に対し加えられることとしている。
【０１０８】
以下の配列を有する「捕獲」断片：
【０１０９】
【化５】
2017527556.tif 000006
【０１１０】
であってガラスプレートに３’末端において担持されたものを、配列１のプライマを捕獲するために使用した。このガラスプレートは、容積５０μｌの平行六面体の反応室の基部を構成する。捕獲の実施には、以下を含む緩衝液を使用した：２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ＝７．５）、５００ｍＭのＬｉＣｌ、及び２ｐｍｏｌのプライマを加えた１ｍＭのＥＤＴＡ。捕獲ステップは室温で３０分間実施した。プライマの捕獲後、プレートは、以下を含む緩衝液（５０μｌ）を加えてその後除去することによって３回洗浄した：２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ＝７．５）、２００ｍＭのＬｉＣｌ及び１ｍＭのＥＤＴＡ。
【０１１１】
合成は、反応室に対する以下の試薬の投入により開始した：ＴｄＴ（５０Ｕ）、１モルのカリウムカコジル酸塩、１２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００、５ｍＭのＣｏＣｌ２（ｐＨ：７．２）。次いで、遊離性ＮＨ２−ｄＴＴＰ−ニトロＢ−ビオヌクレオチド（１００μＭ）の対イオン溶液を添加した。最後に、付加反応を開始するために、２μＭの酵素を加えた。総反応量は、５０μｌであった。混合物を３７℃で５分間培養した。
【０１１２】
合成反応終了後、プレートを、以下を含む緩衝液によって３回洗浄した：２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ＝７．５）、２００ｍＭのＬｉＣｌ及び１ｍＭのＥＤＴＡ。これは、投入するＮＨ２−ｄＴＴＰ−ニトロＢ−ビオヌクレオチドの余剰分を確実に除去し、反応室と固体担持体とに未反応のヌクレオチドが残留しないようにする効果を有する。洗浄終了後、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌバッファ（ｐＨ＝７．５、５０μｌ）を反応室に加え、温度を９０℃に上昇させた。これは、修飾ヌクレオチドＮＨ２−ｄＴＴＰ−ニトロＢ−ビオを組み込んだ断片の分離を確実にする効果を有する。断片を回収し、新しいエッペンドルフ管に移した。
【０１１３】
被保護ヌクレオチドＮＨ２−ｄＴＴＰ−ニトロＢ−ビオを組み込んだＤＮＡ断片は、その後以下の手順により精製した。製造業者の手順に従って調製したストレプトアビジン（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）でコーティングされた市販の磁気ビーズを、前記反応混合物（５０μｌ）に加えた。室温で１時間培養後、磁気ビーズを適切な磁石を用いて回収した。次いで、上澄みを除去した。次いで以下を含む洗浄バッファによりビーズを３回洗浄した：トリスバッファ（ｐＨ：７．２、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む）。
【０１１４】
修飾ヌクレオチドＮＨ２−ｄＴＴＰ−ニトロＢ−ビオを組み込んだＤＮＡ断片が結合した磁気ビーズを、ｐＨ：５．５で、３５０〜７００ｍＭのＮａＮＯ２及び１モルのＮａＯＡｃを含む溶液中に再懸濁した。混合物をＵＶ（３６５ナノメートル）に曝露し、室温で１〜２分間培養した。リン酸塩バッファ（ｐＨ：７．０、１モル）を加え、照射を停止して反応を停止させた。この操作により、担持体（ビーズ）からのＤＮＡ断片の「分離」が可能となった。
【０１１５】
磁気ビーズを適切な磁石により回収した。上澄みを回収し、９９％以上のケースで配列番号１の３’末端にＴ塩基が正しく組み込まれたか確認するため、電気泳動ゲル及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分光計を用いて分析した。
【０１１６】
同様の手順にて新たな伸長ステップをその後必要に応じ実施して良い。
【０１１７】
実施例１３−核酸合成のための本発明のヌクレオチドの使用の他の実施例
本発明の主題である修飾ヌクレオチドは、特許出願ＦＲ１４−５３４５５に記載の方法により鋳型鎖の非存在下における核酸の酵素的合成に有利に用いることができる。修飾ヌクレオチド添加ステップの実施にあたり選択される酵素としては、市販のＴｅｒｍｉｎａｌ  Ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ又はＴｄＴがある。
【０１１８】
合成開始に用いるプライマには以下のものがある：
【０１１９】
【化６】
2017527556.tif 000007
【０１２０】
実施例２に従って調製されるＮＨ２−ｄＧＴＰ−ニトロＢ−ビオを修飾ヌクレオチドとして使用した。この修飾ヌクレオチドにおいては、Ｇを上記配列番号１に加えることができる。後述するように、各伸長ステップにおいて、１つのヌクレオチドだけ各ＤＮＡ断片に対し加えられることとしている。
【０１２１】
以下の配列を有する「捕獲」断片：
【０１２２】
【化７】
2017527556.tif 000008
【０１２３】
であってガラスプレートに３’末端において担持されたものを、配列１のプライマを捕獲するために使用した。このガラスプレートは、容積５０μｌの平行六面体の反応室の基部を構成する。捕獲の実施には、以下を含む緩衝液を使用した：２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ＝７．５）、５００ｍＭのＬｉＣｌ、及び２ｐｍｏｌのプライマを加えた１ｍＭのＥＤＴＡ。捕獲ステップは室温で３０分間実施した。プライマの捕獲後、プレートは、以下を含む緩衝液（５０μｌ）を加えてその後除去することによって３回洗浄した：２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ＝７．５）、２００ｍＭのＬｉＣｌ及び１ｍＭのＥＤＴＡ。
【０１２４】
合成は、反応室に対する以下の試薬の投入により開始した：ＴｄＴ（５０Ｕ）、１モルのカリウムカコジル酸塩、１２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００、５ｍＭのＣｏＣｌ２（ｐＨ：７．２）。次いで、遊離性ＮＨ２−ｄＧＴＰ−ニトロＢ−ビオヌクレオチド（１００μＭ）の対イオン溶液を添加した。最後に、付加反応を開始するために、２μＭの酵素を加えた。総反応量は、５０μｌであった。混合物を３７℃で５分間培養した。
【０１２５】
合成反応終了後、プレートを、以下を含む緩衝液によって３回洗浄した：２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ＝７．５）、２００ｍＭのＬｉＣｌ及び１ｍＭのＥＤＴＡ。これは、投入するＮＨ２−ｄＧＴＰ−ニトロＢ−ビオヌクレオチドの余剰分を確実に除去し、反応室と固体担持体とに未反応のヌクレオチドが残留しないようにする効果を有する。洗浄終了後、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌバッファ（ｐＨ＝７．５、５０μｌ）を反応室に加え、温度を９０℃に上昇させた。これは、修飾ヌクレオチドＮＨ２−ｄＧＴＰ−ニトロＢ−ビオを組み込んだ断片の分離を確実にする効果を有する。断片を回収し、新しいエッペンドルフ管に移した。
【０１２６】
被保護ヌクレオチドＮＨ２−ｄＧＴＰ−ニトロＢ−ビオを組み込んだＤＮＡ断片は、その後以下の手順により精製した。製造業者の手順に従って調製したストレプトアビジン（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）でコーティングされた市販の磁気ビーズを、前記反応混合物（５０μｌ）に加えた。室温で１時間培養後、磁気ビーズを適切な磁石を用いて回収した。次いで、上澄みを除去した。次いで以下を含む洗浄バッファによりビーズを３回洗浄した：トリスバッファ（ｐＨ：７．２、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む）。
【０１２７】
修飾ヌクレオチドＮＨ２−ｄＧＴＰ−ニトロＢ−ビオを組み込んだＤＮＡ断片が結合した磁気ビーズを、ｐＨ：５．５で、３５０〜７００ｍＭのＮａＮＯ２及び１モルのＮａＯＡｃを含む溶液の中に再懸濁した。混合物をＵＶ（３６５ナノメートル）に曝露し、室温で１〜２分間培養した。リン酸塩バッファ（ｐＨ：７．０、１モル）を加え、照射を停止して反応を停止させた。この操作により、担持体（ビーズ）からのＤＮＡ断片の「分離」が可能となった。
【０１２８】
磁気ビーズを適切な磁石により回収した。上澄みを回収し、９９％以上のケースで配列番号１の３’末端にＴ塩基が正しく組み込まれたか確認するため、電気泳動ゲル及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分光計を用いて分析した。
【０１２９】
同様の手順にて新たな伸長ステップをその後必要に応じ実施して良い。
【産業上の利用可能性】
【０１３０】
本発明の主題である修飾ヌクレオチドは、特に非常に長い核酸の非常に高品質な合成を可能とし、これにより核酸合成法の性能を向上させる。前記ヌクレオチドは合成核酸配列又は遺伝子の製造のために比較的大規模に使用することができる。前記修飾ヌクレオチドは、特に生物工学分野又は広く一般に生物学分野における研究開発用あるいは商用ＤＮＡもしくはＲＮＡなどの核酸の合成を目的とする。
【図１】
2017527556.tif 000012
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2017527556.tif 000024
【図１４】
2017527556.tif 000025
【図１５】
2017527556.tif 000026
【図１６】
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【配列表】
2017527556000001.app
【国際調査報告】
2017527556.tif 000028
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2017527556.tif 000030
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2017527556.tif 000032
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