(57)【要約】本発明は、選択された膜抗原へ免疫細胞の特異性および反応性を向け直すことができる組換えキメラタンパク質であるキメラ抗原受容体（CAR）、より具体的には、細胞外リガンド結合が、5T4陽性細胞に対する特異的な免疫を付与する5T4モノクローナル抗体に由来するscFVであるCARに関する。そのようなCARが付与された操作された免疫細胞は、リンパ腫および白血病ならびに結腸、胃、および卵巣の腫瘍などの固形腫瘍の処置のために特に適している。2017527289.tif 000027
2017527289.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
図2に図示されるV1〜V6より選択されるポリペプチド構造のうちの一つを有する5T4（NTRKR1）特異的キメラ抗原受容体（CAR）であって、該構造が、モノクローナル抗5T4抗体由来のVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメインと、ヒンジと、膜貫通ドメインと、CD3ζシグナリングドメインおよび4-1BB由来の共刺激ドメインを含む細胞質ドメインとを含む、5T4（NTRKR1）特異的キメラ抗原受容体（CAR）。
【請求項２】
構造V3がCD8αヒンジおよびCD8α膜貫通ドメインを含む、請求項1記載の5T4特異的CAR。
【請求項３】
構造V5がIgG1ヒンジおよびCD8α膜貫通ドメインを含む、請求項1記載の5T4特異的CAR。
【請求項４】
構造V1がFcγRIIIαヒンジおよびCD8α膜貫通ドメインを含む、請求項1記載の5T4特異的CAR。
【請求項５】
構造V2がFcγRIIIαヒンジおよび4-1BB膜貫通ドメインを含む、請求項1記載の5T4特異的CAR。
【請求項６】
構造V4がCD8αヒンジおよび4-1BB膜貫通ドメインを含む、請求項1記載の5T4特異的CAR。
【請求項７】
構造V6がIgG1ヒンジおよび4-1BB膜貫通ドメインを含む、請求項1記載の5T4特異的CAR。
【請求項８】
VHおよびVLがSEQ ID NO：11〜18より選択されるポリペプチド配列と少なくとも80％、好ましくは90％、より好ましくは95％、さらに好ましくは99％の同一性を有する、請求項1〜7のいずれか一項記載の5T4特異的CAR。
【請求項９】
細胞外リガンド結合ドメインが、SEQ ID NO：54（CDR1）、SEQ ID NO：55（CDR2）、およびSEQ ID NO：56（CDR3）のマウスモノクローナル抗体A1由来のCDRを含むVH鎖、ならびにNO.57（CDR1）、SEQ ID NO：58（CDR2）、およびSEQ ID NO：59（CDR3）のマウスモノクローナル抗体A1由来のCDRを含むVL鎖を含む、請求項1〜8のいずれか一項記載の5T4特異的CAR。
【請求項１０】
VHおよびVLが、それぞれ、SEQ ID NO：13（A1-VH）およびSEQ ID NO：14（A1-VL）と少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、さらに好ましくは少なくとも99％の配列同一性を有する、請求項1〜9のいずれか一項記載の5T4特異的CAR。
【請求項１１】
細胞外リガンド結合ドメインが、SEQ ID NO：61（CDR1）、SEQ ID NO：61（CDR2）、およびSEQ ID NO：63（CSEQ ID NO：DR3）のマウスモノクローナル抗体A2由来のCDRを含むVH鎖、ならびにSEQ ID NO：64（CD1）、SEQ ID NO：65（CD2）、およびSEQ ID NO：65（CDR3）のマウスモノクローナル抗体A2由来のCDRを含むVL鎖を含む、請求項1〜8のいずれか一項記載の5T4特異的CAR。
【請求項１２】
VHおよびVLが、それぞれ、SEQ ID NO：15（A2-VH）およびSEQ ID NO：16（A2-VL）と少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、さらに好ましくは少なくとも99％の配列同一性を有する、請求項1〜8および11のいずれか一項記載の5T4特異的CAR。
【請求項１３】
細胞外リガンド結合ドメインが、SEQ ID NO：66（CDR1）、SEQ ID NO：67（CDR2）、およびSEQ ID NO：68（CDR3）のマウスモノクローナル抗体A3由来のCDRを含むVH鎖、ならびにSEQ ID NO：69（CDR1）、SEQ ID NO：70（CDR2）、およびSEQ ID NO：71（CDR3）のマウスモノクローナル抗体A3由来のCDRを含むVL鎖を含む、請求項1〜8のいずれか一項記載の5T4特異的CAR。
【請求項１４】
VHおよびVLが、それぞれ、SEQ ID NO：17（A3-VH）およびSEQ ID NO：18（A3-VL）と少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、さらに好ましくは少なくとも99％の配列同一性を有する、請求項1〜8および13のいずれか一項記載の5T4特異的CAR。
【請求項１５】
細胞外リガンド結合ドメインが、SEQ ID NO：48（CDR1）、SEQ ID NO：49（CDR2）、およびSEQ ID NO：50（CDR3）のマウスモノクローナル抗体H8由来のCDRを含むVH鎖、ならびにNO.51（CDR1）、SEQ ID NO：52（CDR2）、およびSEQ ID NO：53（CDR3）のマウスモノクローナル抗体H18由来のCDRを含むVL鎖を含む、請求項1〜8のいずれか一項記載の5T4特異的CAR。
【請求項１６】
VHおよびVLが、それぞれ、SEQ ID NO：11（H18-VH）およびSEQ ID NO：12（H18-VL）と少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、さらに好ましくは少なくとも99％の配列同一性を有する、請求項1〜8および15のいずれか一項記載の5T4特異的CAR。
【請求項１７】
4-1BB由来の共刺激ドメインが、SEQ ID NO：8と少なくとも80％、好ましくは90％、より好ましくは95％、さらに好ましくは99％の同一性を有する、請求項1〜16のいずれか一項記載の5T4特異的CAR。
【請求項１８】
CD3ζシグナリングドメインが、SEQ ID NO：9と少なくとも80％、好ましくは90％、より好ましくは95％、さらに好ましくは99％の同一性を有する、請求項1〜17のいずれか一項記載の5T4特異的CAR。
【請求項１９】
FcγRIIIαヒンジが、SEQ ID NO：3と少なくとも80％、好ましくは90％、より好ましくは95％、さらに好ましくは99％の同一性を有する、請求項4、5、または8〜18のいずれか一項記載の5T4特異的CAR。
【請求項２０】
CD8αヒンジが、SEQ ID NO：4と少なくとも80％、好ましくは90％、より好ましくは95％、さらに好ましくは99％の同一性を有する、請求項2、6、または8〜18のいずれか一項記載の5T4特異的CAR。
【請求項２１】
IgG1ヒンジが、SEQ ID NO：5と少なくとも80％、好ましくは90％、より好ましくは95％、さらに好ましくは99％の同一性を有する、請求項3、7、または8〜18のいずれか一項記載の5T4特異的CAR。
【請求項２２】
CD8α膜貫通ドメインが、SEQ ID NO：6と少なくとも80％、好ましくは90％、より好ましくは95％、さらに好ましくは99％の同一性を有する、請求項2〜4または8〜21のいずれか一項記載の5T4特異的CAR。
【請求項２３】
4-1BB膜貫通ドメインが、SEQ ID NO：7と少なくとも80％、好ましくは90％、より好ましくは95％、さらに好ましくは99％の同一性を有する、請求項5〜7または8〜21のいずれか一項記載の5T4特異的CAR。
【請求項２４】
5T4に特異的でない別の細胞外リガンド結合ドメインをさらに含む、請求項1〜23のいずれか一項記載の5T4特異的CAR。
【請求項２５】
SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：33、およびSEQ ID NO：39と少なくとも80％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項2記載の構造V3の5T4特異的CAR。
【請求項２６】
SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：34、およびSEQ ID NO：41と少なくとも80％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項3記載の構造V5の5T4特異的CAR。
【請求項２７】
SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：31、およびSEQ ID NO：37と少なくとも80％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項4記載の構造V1の5T4特異的CAR。
【請求項２８】
SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：32、およびSEQ ID NO：38と少なくとも80％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項5記載の構造V2の5T4特異的CAR。
【請求項２９】
SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：34、およびSEQ ID NO：40と少なくとも80％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項6記載の構造V4の5T4特異的CAR。
【請求項３０】
SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：36、およびSEQ ID NO：42と少なくとも80％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項7記載の構造V6の5T4特異的CAR。
【請求項３１】
シグナルペプチドをさらに含む、請求項1〜30のいずれか一項記載の5T4特異的CAR。
【請求項３２】
シグナルペプチドがSEQ ID NO：1またはSEQ ID NO：2と少なくとも80％の配列同一性を有する、請求項31記載の5T4特異的CAR。
【請求項３３】
請求項1〜32のいずれか一項記載のキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３４】
請求項33記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項３５】
請求項1〜32のいずれか一項記載の5T4特異的キメラ抗原受容体を細胞表面膜に発現する、操作された免疫細胞。
【請求項３６】
炎症性Tリンパ球、細胞傷害性Tリンパ球、制御性Tリンパ球、またはヘルパーTリンパ球に由来する、請求項35記載の操作された免疫細胞。
【請求項３７】
NK細胞に由来する、請求項35記載の操作された免疫細胞。
【請求項３８】
治療において使用するための、請求項35〜37のいずれか一項記載の操作された細胞。
【請求項３９】
ヒトの治療において使用するための、請求項35〜38のいずれか一項記載の操作された細胞。
【請求項４０】
状態が5T4発現細胞を特徴とする前悪性または悪性の癌状態である、治療において使用するための請求項35〜39のいずれか一項記載の操作された細胞。
【請求項４１】
状態が、過剰量の5T4発現細胞を特徴とする状態である、治療において使用するための請求項35〜40のいずれか一項記載の操作された細胞。
【請求項４２】
状態が血液癌状態である、治療において使用するための請求項35〜41のいずれか一項記載の操作された細胞。
【請求項４３】
血液癌状態が白血病である、治療において使用するための請求項35〜42のいずれか一項記載の操作された細胞。
【請求項４４】
血液癌状態が小児前駆B細胞急性リンパ芽球性白血病である、治療において使用するための請求項35〜43のいずれか一項記載の操作された細胞。
【請求項４５】
状態が固形腫瘍である、治療において使用するための請求項35〜41のいずれか一項記載の操作された細胞。
【請求項４６】
腫瘍が、胃、結腸直腸、前立腺、乳房、肺、腎臓、または卵巣の腫瘍である、治療において使用するための請求項45記載の操作された細胞。
【請求項４７】
前記免疫細胞においてTCRの発現が抑制されている、請求項35〜46のいずれか一項記載の操作された細胞。
【請求項４８】
前記免疫細胞において少なくとも1種のMHCタンパク質、好ましくはβ2mまたはHLAの発現が抑制されている、請求項35〜47のいずれか一項記載の操作された細胞。
【請求項４９】
少なくとも1種の免疫抑制薬または化学療法薬に対する耐性を付与するために変異させた、請求項35〜48のいずれか一項記載の操作された細胞。
【請求項５０】
癌細胞の傷害を引き起こすために有効な量の請求項35〜49のいずれか一項記載の操作された細胞と血液癌細胞を接触させる工程を含む、血液癌細胞に傷害を与える方法。
【請求項５１】
（a）免疫細胞を準備する工程、
（b）請求項1〜32のいずれか一項記載の少なくとも1種の5T4特異的キメラ抗原受容体を該細胞の表面に発現させる工程
を含む、免疫細胞を操作する方法。
【請求項５２】
（a）免疫細胞を準備する工程、
（b）5T4特異的キメラ抗原受容体をコードする少なくとも1種のポリヌクレオチドを該細胞へ導入する工程、
（c）該細胞においてポリヌクレオチドを発現させる工程
を含む、請求項51記載の免疫細胞を操作する方法。
【請求項５３】
（a）免疫細胞を準備する工程、
（b）5T4特異的キメラ抗原受容体をコードする少なくとも1種のポリヌクレオチドを該細胞へ導入する工程、
（c）5T4に特異的でない少なくとも1種の他のキメラ抗原受容体を導入する工程
を含む、請求項51記載の免疫細胞を操作する方法。
【請求項５４】
（a）請求項1〜32のいずれか一項記載の5T4特異的キメラ抗原受容体を表面に発現している免疫細胞を準備する工程、
（b）該免疫細胞を患者へ投与する工程
を含む、その必要のある対象を処置する方法。
【請求項５５】
免疫細胞がドナーから提供される、請求項51〜54のいずれか一項記載の方法。
【請求項５６】
免疫細胞が患者自身から提供される、請求項51〜54のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、大部分の骨髄系細胞に見出され患者における、胃、結腸、および卵巣の腫瘍などの固形腫瘍、ならびに前駆B細胞急性リンパ性白血病（ALL）を診断するために使用される細胞表面糖タンパク質5T4へ免疫細胞の特異性および反応性を向け直すことができる組換えキメラタンパク質であるキメラ抗原受容体（CAR）に関する。本発明によるCARは、T細胞またはNK細胞において発現された時、5T4抗原を保持する悪性細胞を処置するために特に有用である。得られた操作された免疫細胞は、免疫療法のための安全性および効率を付与する、悪性細胞に対する高レベルの特異性を示す。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
エクスビボで生成された自己の抗原特異的T細胞の移入を含む養子免疫療法は、ウイルス感染および癌を処置するための有望な戦略である。養子免疫療法のために使用されるT細胞は、抗原特異的T細胞の増大または遺伝子操作を通したT細胞の向け直しのいずれかによって生成され得る（Park, Rosenberg et al. 2011）。ウイルス抗原特異的T細胞の移入は、移植に関連したウイルス感染および稀なウイルス関連悪性疾患の処置のために使用されている、よく確立された手法である。同様に、腫瘍特異的T細胞の単離および移入は、黒色腫の処置において成功が示されている。
【０００３】
T細胞における新規特異性は、トランスジェニックT細胞受容体またはキメラ抗原受容体（CAR）の遺伝子移入を通して、成功裡に生成された（Jena, Dotti et al. 2010）。CARは、単一の融合分子として1つ以上のシグナリングドメインと会合したターゲティング部分からなる合成受容体である。通常CARの結合部分は、フレキシブルリンカーによって結合されたモノクローナル抗体の軽鎖可変断片を含む、単鎖抗体（scFv）の抗原結合ドメインからなる。受容体またはリガンドのドメインに基づく結合部分も、成功裡に使用されている。第一世代CARのためのシグナリングドメインは、CD3ζ鎖またはFc受容体γ鎖の細胞質領域に由来する。第一世代CARは、T細胞の細胞傷害を成功裡に向け直すことが示された。しかしながら、それらは、インビボで、長期にわたる増大および抗腫瘍活性を提供することができなかった。共刺激分子に由来するシグナリングドメインが、膜貫通ドメインおよびヒンジドメインと共に追加されて、第二世代および第三世代のCARが形成され、ヒトにおける治験はいくらかの成功を収め、T細胞をCD19を発現する悪性細胞へ向け直すことができた（June et al.,2011）。しかしながら、CD19 ScFvに関して使用されたシグナリングドメイン、膜貫通ドメイン、および共刺激ドメインの組み合わせは、極めて抗原特異的であり、任意の抗原マーカーへは拡張され得なかった。
【０００４】
Centers for Disease Control and Preventionからのデータ［http://www.cdc.gov/cancer/colorectal/statistics/race.htm］によると、2011年における米国集団における結腸直腸癌の発生率は、黒人集団において、女性については100000人当たり約50人、男性については60人に近く、死亡率は50％であった。この発生率はこの10年間で10％しか減少していない。
【０００５】
結腸直腸腫瘍、卵巣腫瘍、および胃腫瘍を含む固形腫瘍、ならびに小児急性リンパ芽球性白血病（ALL）のような非固形腫瘍のための免疫治療の一つの候補抗原は、TPBGまたは5T4としても公知の栄養膜糖タンパク質（UniProt：Q13641）である。5T4は、（それが最初に発見された）胎児栄養膜における発現のため、しばしば、癌胎児性抗原または栄養膜糖タンパク質（TPBG）と呼ばれる。5T4タンパク質は、7個のロイシンリッチ反復領域を含有しているNグリコシル化膜貫通72kDa糖タンパク質である（Hole et al,1988）。5T4抗原は、胃癌（Starzynska et al.1995）、卵巣癌（Wrigley et al.1995）を含む多数の癌において発現されることが見出された。5T4癌胎児性抗原は、小児前駆B細胞急性リンパ芽球性白血病の再発の高リスク時にも発現される（Castro et al.2012）。それは、正常組織においては極めて限定された発現を有するが、悪性腫瘍においては、発症の間中、広範囲に及ぶ（Carsberg et al.1995）。
【０００６】
従って、本発明者らは、5T4は、CARを発現するT細胞を使用することによって、結腸直腸腫瘍、卵巣腫瘍、および胃腫瘍のような固形腫瘍を処置するための有益な標的抗原であり得ると考えた。
【０００７】
以前の戦略の代替法として、本発明は、有意な臨床的利点を有する、5T4悪性細胞を標的とするために免疫細胞において発現させられ得る5T4特異的CARを提供する。
【０００８】
CAR構成の設計および適当な成分の使用によって、CARの機能性を改善する必要が未だ存在する。なぜなら、これらのパラメータは、重要な役割を果たし、微調整が必要であり得るためである。
【０００９】
本発明者らは、CAR構成を適当な成分の選択と組み合わせることによって、癌標的細胞に対する高い細胞傷害性を有する特異的な5T4単鎖CARを入手することが可能であることを見出した。
【発明の概要】
【００１０】
本発明者らは、異なる構造を有し、異なる5T4特異的抗体に由来する異なるscFVを含む5T4特異的CARを生成した。
【００１１】
本発明の枠組みにおいて、モノクローナル抗5T4抗体由来のVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、ならびにCD3ζシグナリングドメインおよび4-1BB由来の共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含む、図2に図示されるV1〜V6より選択されるポリペプチド構造のうちの一つを有する5T4特異的CARが設計され実装された。本発明の好ましいCARポリペプチドは、SEQ ID NO：19〜42より選択されるアミノ酸配列を含む。（例えば、抗CD3/CD28によってコーティングされたビーズおよび組換えIL2による）インビトロでの非特異的な活性化の後、ウイルス形質導入を使用して、これらのCARを発現するポリヌクレオチドによってドナー由来のT細胞を形質転換した。V3、V5、V1より選択されるポリペプチド構造を有する（即ち、CD8α膜貫通ドメインを有する）より好ましいCARポリペプチドは、最適な予想外の結果を示した。
【００１２】
特に、A1抗体、A2抗体、A3抗体、およびH8抗体に由来するscFvを含有している5T4特異的CARは、5T4抗原を発現する選択された腫瘍細胞株に対して試験された活性および特異性によって示されるように、免疫治療のための適当な候補を表す。
【００１３】
ある種の事例において、移植片対宿主反応を防止するため、非アロ反応性のT細胞を作出するため、より具体的には、TCRの成分（αβ−T細胞受容体）の破壊によって、T細胞をさらに操作した。
【００１４】
得られた操作T細胞は、様々な程度に、5T4陽性細胞に対してインビトロで反応性を示し、このことから、本発明のCARが、T細胞の抗原依存性の活性化に寄与し、その増殖にも寄与し、従って、免疫治療のために有用であることが示された。
【００１５】
本発明のCARをコードするポリペプチドおよびポリヌクレオチドの配列は、本明細書中に詳述される。
【００１６】
本発明の操作された免疫細胞は、治療的な適用のため、例えば、慢性リンパ球性白血病、または乳房腫瘍、結腸腫瘍、肺腫瘍、および腎臓腫瘍のような固形腫瘍の処置のため、特に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明による操作された免疫細胞の模式図。この図に提示された操作された免疫細胞は、CARをコードするレトロウイルスポリペプチドによって形質導入されたT細胞である。このT細胞は、本発明の範囲内で任意である、患者へのより良好でより安全な生着を可能にするため、さらに操作されている。X遺伝子は、例えば、TCRの成分（TCRαまたはTCRβ）を発現する遺伝子であり得、Yは、（Campathに関して）CD52または（6-チオグアニンに関して）HPRTのような免疫抑制薬に対するT細胞の感受性に関与する遺伝子であり得る。
【図２】異なるCAR構成（V1〜V6）の模式図。
【図３】A1抗体、A2抗体、A3抗体、およびH8抗体に由来するVH鎖およびVL鎖を含む図2によるv1〜v6 T細胞CARの模式図。
【図４】A1抗体、A2抗体、A3抗体、およびH8抗体に由来するVH鎖およびVL鎖を含む図2によるv1〜v6 T細胞CARの模式図。
【図５】A1抗体、A2抗体、A3抗体、およびH8抗体に由来するVH鎖およびVL鎖を含む図2によるv1〜v6 T細胞CARの模式図。
【図６】A1抗体、A2抗体、A3抗体、およびH8抗体に由来するVH鎖およびVL鎖を含む図2によるv1〜v6 T細胞CARの模式図。
【図７】活性を査定するための、本発明による8種の5T4-CAR操作T細胞株についてのT細胞脱顆粒試験。
【図８】特異性を査定するための、本発明による7種の5T4-CAR操作T細胞株についてのT細胞特異的溶解。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
（表１）様々なCAR成分の配列
2017527289.tif 000003
【００１９】
（表２）様々なscFvのVH鎖およびVL鎖ならびにそれぞれのCDRの配列
2017527289.tif 000004
2017527289.tif 000005
【００２０】
（表３）構造V-1のCAR
2017527289.tif 000006
【００２１】
（表４）構造V-2のCAR
2017527289.tif 000007
【００２２】
（表５）構造V-3のCAR
2017527289.tif 000008
【００２３】
（表６）構造V-4のCAR
2017527289.tif 000009
【００２４】
（表７）構造V-5のCAR
2017527289.tif 000010
【００２５】
（表８）構造V-6のCAR
2017527289.tif 000011
【００２６】
発明の詳細な説明
本明細書において特に定義されない限り、使用される技術用語および科学用語は、全て、遺伝子治療、生化学、遺伝学、および分子生物学の領域の当業者によって一般的に理解されるのと同一の意味を有する。
【００２７】
適当な方法および材料が本明細書に記載されるが、本明細書に記載されたものに類似しているかまたは等価である全ての方法および材料が、本発明の実施または試行において使用され得る。本明細書において言及された刊行物、特許出願、特許、およびその他の参照は、全て、参照によってその全体が組み入れられる。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先されるであろう。さらに、材料、方法、および実施例は、他に特記されない限り、例示的なものに過ぎず、限定するためのものではない。
【００２８】
本発明の実施は、他に示されない限り、当技術分野の技術の範囲内にある細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えDNA、および免疫学の従来の技術を利用するであろう。そのような技術は、文献中に完全に説明されている。例えば、Current Protocols in Molecular Biology(Frederick M.AUSUBEL,2000,Wiley and son Inc,Library of Congress,USA)；Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Third Edition,(Sambrook et al,2001,Cold Spring Harbor,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed.,1984)；Mullisら、米国特許第4,683,195号；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Harries & S.J.Higgins eds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney,Alan R.Liss,Inc.,1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press,1986)；B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984);the series,Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelson and M.Simon,eds.-in-chief,Academic Press,Inc.,New York)、特に、第154巻および第155巻(Wu et al.eds.)および第185巻、「Gene Expression Technology」(D.Goeddel,ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Calos eds.,1987,Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer and Walker,eds.,Academic Press,London,1987)；Handbook Of Experimental Immunology,Volumes I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell,eds.,1986)；ならびにManipulating the Mouse Embryo,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1986)を参照されたい。
【００２９】
5T4特異的キメラ抗原受容体
本発明は、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、およびシグナリング伝達ドメインを含む、抗5T4キメラ抗原受容体（CAR）の新しい設計に関する。
【００３０】
「細胞外リガンド結合ドメイン」という用語は、本明細書において使用されるように、リガンドと結合することができるオリゴペプチドまたはポリペプチドとして定義される。好ましくは、ドメインは、細胞表面分子と相互作用することができるであろう。例えば、細胞外リガンド結合ドメインは、特定の疾患状態に関連した標的細胞上の細胞表面マーカーとして働くリガンドを認識するよう選択され得る。好ましい態様において、細胞外リガンド結合ドメインは、フレキシブルリンカーによって接合された標的抗原特異的モノクローナル抗5T4抗体の軽鎖（VL）および重鎖（VH）の可変断片を含む単鎖抗体断片（scFv）を含む。
【００３１】
本発明の5T4 CARの抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、およびそれらの機能的断片を含むが、これらに限定されない、オフ組織（off-tissue）抗原に結合する任意のドメインであり得る。
【００３２】
「組換え抗体」という用語は、本明細書において使用されるように、例えば、バクテリオファージ、酵母発現系、または哺乳動物細胞発現系によって、より具体的には、抗体のCDR領域をコードする核酸配列を含むウイルスベクターによって形質導入されたT細胞によって発現された抗体または抗体断片のような、組換えDNAテクノロジーを使用して生成された抗体または抗体断片を意味する。その用語は、抗体もしくは抗体断片をコードしかつ抗体もしくは抗体断片のタンパク質を発現するDNA分子の合成によって生成された抗体もしくは抗体断片、または抗体もしくは抗体断片を特定化するアミノ酸配列も意味するものと解釈されるべきであり、DNAまたはアミノ酸配列は、当技術分野において入手可能であり周知であるDNAまたはアミノ酸配列の組換えまたは合成のテクノロジーを使用して入手されたものである。
【００３３】
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書において使用されるように、天然抗体より多量で、均一であり、ROR1抗原上の単一の部位に特異的に結合することができる、ハイブリドーマまたはウイルスによって形質転換されたリンパ球のいずれかの実験室で培養された細胞クローンによって産生された抗体を意味する。それらは、数種の異なる免疫細胞から作成されるポリクローナル抗体とは対照的に、全てが独特の親細胞のクローンである同一の免疫細胞によって作成される単一特異性抗体である。モノクローナル抗体は、同一のエピトープに結合するため、1価の親和性を有する。
【００３４】
好ましい態様において、細胞外リガンド結合ドメインは、フレキシブルリンカーによって接合された標的抗原特異的モノクローナル抗5T4抗体の軽鎖（VL）および重鎖（VH）の可変断片を含む単鎖抗体断片（scFv）を含む。VLおよびVHは、好ましくは、表2に示されるH8、A1、A2、およびA3と呼ばれる抗体より選択される。それらは、好ましくは、例えば、配列SEQ ID NO：10を含むフレキシブルリンカーによって共に連結されている。換言すると、CARは、優先的には、SEQ ID NO：11〜SEQ ID NO：18からなる群より選択されるアミノ酸配列との少なくとも90％、95％、97％、または99％の同一性を示すポリペプチド配列を含む細胞外リガンド結合ドメインを含む。
【００３５】
好ましい態様によると、本発明による5T4特異的CARは、VHおよびVLが、それぞれ、SEQ ID NO：13（A1-VH）およびSEQ ID NO：14（A1-VL）との少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、さらに好ましくは少なくとも99％の配列同一性を有する、細胞外リガンド結合ドメインを含有している。
【００３６】
別の好ましい態様によると、本発明による5T4特異的CARは、VHおよびVLが、それぞれ、SEQ ID NO：15（A2-VH）およびSEQ ID NO：16（A2-VL）との少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、さらに好ましくは少なくとも99％の配列同一性を有する、細胞外リガンド結合ドメインを含有している。
【００３７】
別の好ましい態様によると、本発明による5T4特異的CARは、VHおよびVLが、それぞれ、SEQ ID NO：17（A3-VH）およびSEQ ID NO：18（A3-VL）との少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、さらに好ましくは少なくとも99％の配列同一性を有する、細胞外リガンド結合ドメインを含有している。
【００３８】
別の好ましい態様によると、本発明による5T4特異的CARは、VHおよびVLが、それぞれ、SEQ ID NO：11（H18-VH）およびSEQ ID NO：12（H18-VL）との少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、さらに好ましくは少なくとも99％の配列同一性を有する、細胞外リガンド結合ドメインを含有している。
【００３９】
本発明は、細胞外リガンド結合ドメインが、ヒト化されているVH鎖およびVL鎖を含む、前記の5T4特異的キメラ抗原受容体（5T4 CAR）を開示する。
【００４０】
「ヒト化抗体」という用語は、本明細書において使用されるように、ポリペプチドがヒト化重鎖可変領域およびヒト化軽鎖可変領域を含むことを意味する。例えば、ポリペプチドは、親モノクローナル抗体の抗原結合特異性を実質的に保持しながら、ヒト抗体の軽鎖および重鎖の可変領域のフレームワーク（FR）領域を含んでいてよい。ヒト化重鎖可変領域および／またはヒト化軽鎖可変領域は、相補性決定領域（CDR）を除き、少なくとも約87％ヒト化されているか、少なくとも約90％ヒト化されているか、少なくとも約95％ヒト化されているか、少なくとも約98％ヒト化されているか、または少なくとも約100％ヒト化されている。抗原結合ポリペプチド分子は、モノクローナル抗体ドナー（例えば、マウスモノクローナル抗体ドナー）に由来してよく、モノクローナル抗体由来のCDR（例えば、マウスモノクローナルCDR）を含んでいてよい。
【００４１】
ヒト化抗体は、CDRグラフティング（例えば、各々参照によってその全体が本明細書に組み入れられる、欧州特許番号EP 239,400；国際公開番号WO 91/09967；ならびに米国特許第5,225,539号、第5,530,101号、および第5,585,089号を参照すること）、ベニヤリング（veneering）またはリサーフェイシング（resurfacing）（例えば、各々参照によってその全体が本明細書に組み入れられる、欧州特許番号EP 592,106およびEP 519,596；Padlan,1991,Molecular Immunology,28(4/5):489-498；Studnicka et al.,1994,Protein Engineering,7(6):805-814を参照すること）、チェーンシャフリング（chain shuffling）（例えば、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる、米国特許第5,565,332号を参照すること）、ならびに、例えば、各々参照によってその全体が本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開番号US2005/0042664、米国特許出願公開番号US2005/0048617、米国特許第6,407,213号、米国特許第5,766,886号、国際公開番号9317105に開示された技術を含むが、これらに限定されない、当技術分野において公知の多様な技術を使用して作製され得る。しばしば、抗原結合を改変するため、例えば、改善するため、フレームワーク領域内のフレームワーク残基が、CDRドナー抗体由来の対応する残基に置換されるであろう。これらのフレームワーク置換は、当技術分野において周知の方法によって、例えば、抗原結合にとって重要なフレームワーク残基を同定するためのCDRおよびフレームワークの残基の相互作用のモデル化、ならびに特定の位置における稀なフレームワーク残基を同定するための配列比較によって、同定される。（例えば、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる、Queenらの米国特許第5,585,089号を参照すること）。
【００４２】
好ましい態様によると、本発明の5T4特異的CARは、少なくとも80％、好ましくは90％を有するVH鎖およびVL鎖を含み、より好ましくは、細胞外リガンド結合ドメインは、
−SEQ ID NO：48（CDR1）、SEQ ID NO：49（CDR2）、およびSEQ ID NO：50（CDR3）のマウスモノクローナル抗体H8由来のCDRを含むVH鎖、ならびにNO.51（CDR1）、SEQ ID NO：52（CDR2）、およびSEQ ID NO：53（CDR3）のマウスモノクローナル抗体H18由来のCDRを含むVL鎖；または
−SEQ ID NO：54（CDR1）、SEQ ID NO：55（CDR2）、およびSEQ ID NO：56（CDR3）のマウスモノクローナル抗体A1由来のCDRを含むVH鎖、ならびにNO.57（CDR1）、SEQ ID NO：58（CDR2）、およびSEQ ID NO：59（CDR3）のマウスモノクローナル抗体A1由来のCDRを含むVL鎖；または
−SEQ ID NO：61（CDR1）、SEQ ID NO：61（CDR2）、およびSEQ ID NO：63（CDR3）のマウスモノクローナル抗体A2由来のCDRを含むVH鎖、ならびにNO.64（CD1）、SEQ ID NO：65（CD2）、およびSEQ ID NO：65（CDR3）のマウスモノクローナル抗体A2由来のCDRを含むVL鎖；または
−SEQ ID NO：66（CDR1）、SEQ ID NO：67（CDR2）、およびSEQ ID NO：68（CDR3）のマウスモノクローナル抗体A3由来のCDRを含むVH鎖、ならびにNO.69（CDR1）、SEQ ID NO：70（CDR2）、およびSEQ ID NO：71（CDR3）のマウスモノクローナル抗体A3由来のCDRを含むVL鎖
を含む。
【００４３】
表2は、H8、A1、A2、およびA3抗5T4抗体に対応するVH鎖およびVL鎖ならびにそれぞれのCDRの配列を示す。
【００４４】
本発明によるCARのシグナル伝達ドメインまたは細胞内シグナリングドメインは、免疫細胞の活性化および免疫応答をもたらす、細胞外リガンド結合ドメインの標的への結合の後の細胞内シグナリングを担う。換言すると、シグナル伝達ドメインは、CARが発現される免疫細胞の正常なエフェクター機能のうちの少なくとも1種の活性化を担う。例えば、T細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性、またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。従って、「シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクターシグナル機能シグナルを伝達し、専門の機能を果たすよう細胞に指図するタンパク質の部分をさす。
【００４５】
CARにおいて使用するためのシグナル伝達ドメインの好ましい例は、抗原受容体会合後にシグナル伝達を開始するために協調的に作用するT細胞受容体および共受容体の細胞質配列、ならびに同一の機能的能力を有するこれらの配列の誘導体またはバリアントおよび合成配列であり得る。シグナル伝達ドメインには、細胞質シグナリング配列の2種の別個のクラス（抗原依存性の一次活性化を開始するもの、および二次的または共刺激的なシグナルを提供するために抗原非依存的に作用するもの）が含まれる。一次細胞質シグナリング配列には、免疫受容活性化チロシンモチーフであるITAMとして公知であるシグナリングモチーフが含まれ得る。ITAMは、syk/zap70クラスチロシンキナーゼのための結合部位として役立つ、多様な受容体の細胞質内テールに見出される十分に定義されたシグナリングモチーフである。本発明において使用されるITAMの例には、非限定的な例として、TCRζ、FcRγ、FcRβ、FcRε、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、およびCD66dに由来するものが含まれ得る。好ましい態様において、CARのシグナリング伝達ドメインには、SEQ ID NO：9からなる群より選択されるアミノ酸配列との少なくとも70％、好ましくは、少なくとも80％、より好ましくは、少なくとも90％、95％、97％、または99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するCD3ζシグナリングドメインが含まれ得る。
【００４６】
具体的な態様において、本発明のCARのシグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル分子を含む。共刺激分子とは、効率的な免疫応答のために必要とされる、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。「共刺激リガンド」とは、T細胞上の同族共刺激分子に特異的に結合し、それによって、例えば、ペプチドが負荷されたMHC分子とのTCR/CD3複合体の結合によって提供される一次シグナルに加えて、増殖活性化、分化等を含むが、これらに限定されないT細胞応答を媒介するシグナルを提供する抗原提示細胞上の分子をさす。共刺激リガンドには、CD7、B7-1（CD80）、B7-2（CD86）、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、誘導性共刺激リガンド（ICOS-L）、細胞間接着分子（ICAM、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、M1CB、HVEM、リンホトキシンβ受容体、3/TR6、ILT3、ILT4、トールリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体、およびB7-H3に特異的に結合するリガンドが含まれ得るが、これらに限定されない。共刺激リガンドには、とりわけ、以下に限定されないが、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原1（LFA-1）、CD2、CD7、LTGHT、NKG2C、B7-H3、CD83に特異的に結合するリガンドのような、T細胞上に存在する共刺激分子と特異的に結合する抗体も包含される。
【００４７】
「共刺激分子」とは、共刺激リガンドと特異的に結合し、それによって、これに限定されないが、増殖のような、細胞による共刺激応答を媒介するT細胞上の同族結合パートナーをさす。共刺激分子には、MHCクラスI分子、BTLA、およびトールリガンド受容体が含まれるが、これらに限定されない。共刺激分子の例には、CD27、CD28、CD8、4-1BB（CD137）、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原1（LFA-1）、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、およびCD83に特異的に結合するリガンド等が含まれる。
【００４８】
好ましい態様において、本発明のCARのシグナル伝達ドメインは、4-1BB（GenBank：AAA53133.）およびCD28（NP_006130.1）の断片からなる群より選択される共刺激シグナル分子の一部を含む。具体的には、本発明のCARのシグナル伝達ドメインは、SEQ ID NO：8からなる群より選択されるアミノ酸配列との少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、より好ましくは、少なくとも90％、95％、97％、または99％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む。
【００４９】
本発明によるCARは、細胞の表面膜上に発現される。従って、そのようなCARは、膜貫通ドメインをさらに含む。適切な膜貫通ドメインの特徴的な特色には、細胞、本発明において好ましくは、免疫細胞、具体的には、リンパ球またはナチュラルキラー（NK）細胞の表面に発現され、予定された標的細胞に対する免疫細胞の細胞性応答を指図するために共に相互作用する能力が含まれる。膜貫通ドメインは、天然起源または合成起源のいずれかに由来し得る。膜貫通ドメインは、任意の膜結合型タンパク質または膜貫通型タンパク質に由来し得る。非限定的な例として、膜貫通型ポリペプチドは、α、β、γ、またはδのようなT細胞受容体のサブユニット、CD3複合体を構成するポリペプチド、IL2受容体p55（α鎖）、p75（β鎖）、またはγ鎖、Fc受容体、具体的には、Fcγ受容体IIIまたはCDタンパク質のサブユニット鎖であり得る。あるいは、膜貫通ドメインは、合成であってもよく、ロイシンおよびバリンのような主に疎水性の残基を含んでいてもよい。好ましい態様において、膜貫通ドメインは、ヒトCD8α鎖（例えば、NP_001139345.1）に由来する。膜貫通ドメインは、細胞外リガンド結合ドメインと膜貫通ドメインとの間にヒンジ領域をさらに含んでいてもよい。本明細書において使用される「ヒンジ領域」という用語は通常、膜貫通ドメインを細胞外リガンド結合ドメインに連結するために機能するオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。具体的には、ヒンジ領域は、細胞外リガンド結合ドメインに、より多くの可動性および接近可能性を提供するために使用される。ヒンジ領域は、300個までのアミノ酸、好ましくは、10〜100個のアミノ酸、最も好ましくは、25〜50個のアミノ酸を含み得る。ヒンジ領域は、天然に存在する分子の全部もしくは一部、例えば、CD8、CD4、もしくはCD28の細胞外領域の全部もしくは一部、または抗体定常領域の全部もしくは一部に由来し得る。あるいは、ヒンジ領域は、天然に存在するヒンジ配列に相当する合成配列であってもよいし、または完全合成ヒンジ配列であってもよい。好ましい態様において、ヒンジドメインは、本明細書において、それぞれ、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、およびSEQ ID NO：5と呼ばれる、ヒトCD8α鎖、FcγRIIIα受容体、もしくはIgG1の一部、またはこれらのポリペプチドとの好ましくは少なくとも80％、より好ましくは、少なくとも90％、95％、97％、もしくは99％の配列同一性を示すヒンジポリペプチドを含む。
【００５０】
本発明によるCARは概して、膜貫通ドメイン（TM）、より具体的には、SEQ ID NO：6または7のポリペプチドとの同一性を示すCD8αおよび4-1BBより選択される膜貫通ドメイン（TM）をさらに含む。
【００５１】
癌細胞においては、抗原欠損エスケープバリアントを作出する標的抗原のダウンレギュレーションまたは変異が、一般的に観察される。従って、腫瘍エスケープを相殺し、免疫細胞を標的とするためより特異的にするために、本発明による5T4特異的CARは、標的内の異なる要素に同時に結合し、それにより、免疫細胞の活性化および機能を強化するため、別の細胞外リガンド結合ドメインを含んでいてもよい。一つの態様において、細胞外リガンド結合ドメインは、同一の膜貫通ポリペプチド上にタンデムに置かれていてよく、任意で、リンカーによって分離されていてもよい。別の態様において、異なる細胞外リガンド結合ドメインは、CARを構成する異なる膜貫通ポリペプチド上に置かれていてもよい。別の態様において、本発明は、各々異なる1個の細胞外リガンド結合ドメインを含むCARの集団に関する。具体的には、本発明は、免疫細胞を準備する工程、および各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むCARの集団を該細胞の表面に発現させる工程を含む、免疫細胞を操作する方法に関する。別の具体的な態様において、本発明は、免疫細胞を準備する工程、および各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むCARの集団を構成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを該細胞へ導入する工程を含む、免疫細胞を操作する方法に関する。CARの集団とは、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む、少なくとも2種、3種、4種、5種、6種、またはそれ以上のCARを意味する。本発明による異なる細胞外リガンド結合ドメインは、好ましくは、標的内の異なる要素に同時に結合し、それによって、免疫細胞の活性化および機能を強化することができる。本発明は、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むCARの集団を含む単離された免疫細胞にも関する
【００５２】
好ましい態様によると、本発明による5T4特異的CARは、図2に示される構造V3を有し、従って、CD8αヒンジおよびCD8α膜貫通ドメインを含む。
【００５３】
別の好ましい態様によると、本発明による5T4特異的CARは、図2に示される構造V5を有し、従って、IgG1ヒンジおよびCD8α膜貫通ドメインを含む。
【００５４】
別の好ましい態様によると、本発明による5T4特異的CARは、図2に示される構造V1を有し、従って、FcγRIIIαヒンジおよびCD8α膜貫通ドメインを含む。
【００５５】
ポリヌクレオチド、ベクター：
本発明は、本発明による前記のCARをコードするポリヌクレオチド、ベクターにも関する。
【００５６】
ポリヌクレオチドは、発現カセットまたは発現ベクター（例えば、細菌宿主細胞への導入のためのプラスミド、または昆虫宿主細胞のトランスフェクションのためのバキュロウイルスベクターのようなウイルスベクター、または哺乳動物宿主細胞のトランスフェクションのためのレンチウイルスのようなプラスミドもしくはウイルスベクター）の中に存在し得る。
【００５７】
具体的な態様において、2Aペプチドをコードする配列のようなリボソームスキップ配列をコードする核酸配列を含む一つのポリヌクレオチドまたはベクターに、異なる核酸配列を含めることができる。ピコルナウイルスのアフトウイルス亜群において同定された2Aペプチドは、コドンによってコードされた2つのアミノ酸の間にペプチド結合が形成されない、あるコドンから次のコドンへのリボソーム「スキップ」を引き起こす（（Donnelly and Elliott 2001；Atkins,Wills et al.2007；Doronina,Wu et al.2008）を参照されたい）。「コドン」とは、リボソームによって1つのアミノ酸残基へ翻訳されるmRNA（またはDNA分子のセンス鎖）上の3ヌクレオチドを意味する。従って、ポリペプチドが、インフレームにある2Aオリゴペプチド配列によって隔てられている時、mRNA内の単一の連続するオープンリーディングフレームから、2つのポリペプチドが合成され得る。そのようなリボソームスキップ機序は、当技術分野において周知であり、単一のメッセンジャーRNAによってコードされた数種のタンパク質の発現のため、数種のベクターによって使用されることが公知である。
【００５８】
膜貫通ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路へ差し向けるためには、（リーダー配列、プレプロ配列、またはプレ配列としても公知の）分泌シグナル配列が、ポリヌクレオチド配列またはベクター配列の中に提供される。分泌シグナル配列は、膜貫通核酸配列に機能的に連結される。即ち、2種の配列は、正確なリーディングフレームにおいて結合され、新たに合成されたポリペプチドが宿主細胞の分泌経路へ差し向けられるよう位置付けられる。分泌シグナル配列は概して、関心対象のポリペプチドをコードする核酸配列の5'に位置するが、ある種の分泌シグナル配列は、関心対象の核酸配列の他の場所に位置し得る（例えば、Welchら、米国特許第5,037,743号；Hollandら、米国特許第5,143,830号を参照されたい）。好ましい態様において、シグナルペプチドは、アミノ酸配列SEQ ID NO：1および2を含む。
【００５９】
当業者は、遺伝暗号の縮重を考慮して、これらのポリヌクレオチド分子において相当の配列変動が可能であることを認識するであろう。好ましくは、本発明の核酸配列は、哺乳動物細胞における発現のため、好ましくは、ヒト細胞における発現のため、コドン最適化される。コドン最適化とは、関心対象の配列において、所定の種の高発現遺伝子において通常は稀であるコドンを、そのような種の高発現遺伝子において概して高頻度であるコドンへ交換することをさす。そのようなコドンは、交換されるコドンとしてアミノ酸をコードする。
【００６０】
CARが付与されるよう免疫細胞を操作する方法：
本発明は、以前に記載されたように、5T4 CARの一つをコードするポリヌクレオチドまたはベクターを免疫細胞へエクスビボで導入する工程を含む、免疫療法のための免疫細胞を調製する方法を包含する。
【００６１】
好ましい態様において、ポリヌクレオチドは、免疫細胞において安定的に発現されることを考慮して、レンチウイルスベクターに含まれている。
【００６２】
さらなる態様によると、方法は、同種移植のためにより適当なものにするため、細胞を遺伝子修飾する工程をさらに含む。
【００６３】
第1の局面によると、免疫細胞は、例えば、HLAまたはβ2mのタンパク質発現をコードするかまたは制御する遺伝子の不活性化と組み合わせられてもよい、WO 2013/176915に記載されたようなT細胞受容体（TCR）の1個以上の成分を発現する少なくとも1種の遺伝子を不活性化することによって、同種にされ得る。従って、移植片対宿主症候群および移植片拒絶のリスクは有意に低下する。
【００６４】
別の局面によると、免疫細胞は、5T4陽性悪性細胞を処置するための標準治療として使用される免疫抑制薬または化学療法処置に対する耐性を改善するため、さらに遺伝子操作され得る。例えば、キャンパス（アレムツズマブ）およびグルココルチコイドによる処置の薬物標的であるCD52およびグルココルチコイド受容体（GR）を、これらの処置に対して細胞を耐性にし、特異的な5T4 CARを付与されていない患者自身のT細胞と比べて競争有利性を与えるため、不活性化することができる。別の免疫抑制薬であるテプリズマブに対する耐性を付与するため、CD3遺伝子の発現を抑制するかまたは低下させることもできる。化学療法において、具体的には、急性リンパ芽球性白血病の処置のため、一般的に使用される細胞分裂阻害剤である6-チオグアニンに対する耐性を付与するため、HPRTの発現を本発明に従って抑制するかまたは低下させることもできる。
【００６５】
本発明のさらなる局面によると、PDCD1またはCTLA-4のようなT細胞活性化の制御因子として働く「免疫チェックポイント」として働くタンパク質をコードする遺伝子を不活性化することによって、より高活性にするためまたは消耗を制限するため、免疫細胞をさらに操作することができる。発現を低下させるかまたは抑制することができる遺伝子の例は、表9に示される。
【００６６】
（表９）免疫チェックポイントタンパク質をコードする遺伝子のリスト
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【００６７】
好ましい態様において、免疫細胞をさらに操作する方法は、DNA切断によって、前述のような、遺伝子を選択的に不活性化する特異的なレアカットエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、具体的にはmRNAを、T細胞へ導入する工程を含む。より好ましい態様において、レアカットエンドヌクレアーゼは、TALEヌクレアーゼまたはCas9エンドヌクレアーゼである。TALヌクレアーゼは、他の型のレアカットエンドヌクレアーゼより高い特異性および切断効率を有することが従来立証されているため、一定のターンオーバーで大規模に操作された免疫細胞を作製するための選り抜きのエンドヌクレアーゼである。
【００６８】
送達方法
上記の様々な方法は、CARを細胞へ導入する工程を含む。非限定的な例として、CARは、1種のプラスミドベクターによってコードされたトランスジーンとして導入され得る。プラスミドベクターは、ベクターを受容した細胞の同定および／または選択を提供する選択マーカーも含有し得る。
【００６９】
ポリペプチドは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞への導入の結果として、細胞においてインサイチューで合成され得る。あるいは、ポリペプチドは、細胞外で作製され、次いで、細胞へ導入されてもよい。ポリヌクレオチド構築物を細胞へ導入する方法は、当技術分野において公知であり、ポリヌクレオチド構築物が細胞のゲノムへ組み込まれる安定的形質転換法、ポリヌクレオチド構築物が細胞のゲノムへ組み込まれない一過性形質転換法、およびウイルスによって媒介される方法を非限定的な例として含む。ポリヌクレオチドは、例えば、組換えウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス）、リポソーム等によって細胞へ導入され得る。例えば、一過性形質転換法には、例えば、微量注入、電気穿孔、または微粒子銃が含まれる。ポリヌクレオチドは、細胞における発現を考慮して、ベクター、より具体的には、プラスミドまたはウイルスに含まれ得る。
【００７０】
操作した免疫細胞
本発明は、細胞を操作する方法によって入手可能な単離された細胞または細胞株にも関する。具体的には、単離された細胞は、少なくとも1種の上記のCARを含む。別の態様において、単離された細胞は、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むCARの集団を含む。具体的には、単離された細胞は、CARをコードする外因性のポリヌクレオチド配列を含む。本発明の遺伝子改変免疫細胞は、活性化されており、抗原結合機序と無関係に増殖する。
【００７１】
既に記載された方法のいずれか一つによって入手された単離された免疫細胞、好ましくは、T細胞も、本発明の範囲に包含される。免疫細胞とは、自然免疫応答および／または適応免疫応答の開始および／または実行に機能的に関与する造血系起源の細胞をさす。本発明による免疫細胞は、幹細胞に由来し得る。幹細胞は、成体幹細胞、非ヒト胚性幹細胞、より具体的には、非ヒト幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、誘導多能性幹細胞、全能性幹細胞、または造血幹細胞であり得る。代表的なヒト細胞はCD34+細胞である。単離された細胞は、樹状細胞、キラー樹状細胞、マスト細胞、NK細胞、B細胞、または炎症性Tリンパ球、細胞傷害性Tリンパ球、制御性Tリンパ球、もしくはヘルパーTリンパ球からなる群より選択されるT細胞であってもよい。別の態様において、細胞は、CD4+Tリンパ球およびCD8+Tリンパ球からなる群に由来し得る。本発明の細胞の増大および遺伝子改変の前に、細胞の起源は、多様な非限定的な方法を通して対象から入手され得る。細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染の部位に由来する組織、腹水、胸水、脾組織、および腫瘍を含む、多数の非限定的な起源から入手され得る。本発明のある種の態様において、当業者に入手可能であり公知である多数のT細胞株が使用され得る。別の態様において、細胞は、健常ドナー、癌を有すると診断された患者、または感染を有すると診断された患者に由来し得る。別の態様において、細胞は、異なる表現型的特徴を提示する細胞の混合集団の一部である。既に記載された方法によって形質転換されたT細胞から入手された細胞株も、本発明の範囲に包含される。免疫抑制処置に対して抵抗性であり、以前の方法によって入手可能である改変された細胞は、本発明の範囲に包含される。
【００７２】
好ましい態様として、本発明は、患者への同種移植のための、機能性のTCRを発現せず、5T4陽性細胞に対して反応性である、前記の5T4 CARを付与されたT細胞またはT細胞の集団を提供する。
【００７３】
T細胞の活性化および増大
本発明の遺伝子改変免疫細胞は、活性化されており、抗原結合機序と無関係に増殖するが、本発明の免疫細胞、具体的には、T細胞は、T細胞の遺伝子改変の前であっても後であっても、例えば、米国特許第6,352,694号；第6,534,055号；第6,905,680号；第6,692,964号；第5,858,358号；第6,887,466号；第6,905,681号；第7,144,575号；第7,067,318号；第7,172,869号；第7,232,566号；第7,175,843号；第5,883,223号；第6,905,874号；第6,797,514号；第6,867,041号；および米国特許出願公開第20060121005号に記載されるような方法を一般に使用して、さらに活性化させ増大させることができる。T細胞は、インビトロまたはインビボで増大させることができる。
【００７４】
概して本発明のT細胞は、T細胞の表面上のCD3 TCR複合体および共刺激分子を刺激してT細胞のための活性化シグナルを作出する薬剤との接触によって増大する。例えば、カルシウムイオノフォアA23187、ホルボール12-ミリステート13-アセテート（PMA）、またはフィトヘマグルチニン（PHA）のような分裂促進性レクチンのような化学物質が、T細胞のための活性化シグナルを作出するために使用され得る。
【００７５】
非限定的な例として、T細胞集団は、例えば、表面に固定化された抗CD3抗体もしくはその抗原結合断片もしくは抗CD2抗体と接触させることによって、またはカルシウムイオノフォアと共にプロテインキナーゼC活性化剤（例えば、ブリオスタチン）と接触させることによって、インビトロで刺激され得る。T細胞の表面上のアクセサリー分子の共刺激のため、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用される。例えば、T細胞の集団は、T細胞の増殖を刺激するために適切な条件の下で、抗CD3抗体および抗CD28抗体と接触させることができる。T細胞培養のために適切な条件には、血清（例えば、ウシ胎仔血清もしくはヒト胎児血清）、インターロイキン2（IL-2）、インスリン、IFN-g、1L-4、1L-7、GM-CSF、-10、-2、1L-15、TGFp、およびTNF-、または当業者に公知の細胞の増殖のためのその他の添加剤を含む、増殖および生存可能性のために必要な因子を含有し得る適切な培地（例えば、最小必須培地またはRPMI培地1640またはX-vivo 5（Lonza））が含まれる。細胞の増殖のためのその他の添加剤には、界面活性剤、プラスマネート（plasmanate）、ならびにN-アセチル-システインおよび2-メルカプトエタノールのような還元剤が含まれるが、これらに限定されない。培地には、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびビタミンが添加されており、無血清であるか、または適切な量の血清（もしくは血漿）もしくはホルモンの定義されたセットおよび／もしくはT細胞の増殖および増大のために十分な量のサイトカインが補足されている、RPMI 1640、A1M-V、DMEM、MEM、a-MEM、F-12、X-Vivo 1、およびX-Vivo 20、Optimizerが含まれ得る。抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験的培養にのみ含まれ、対象へ注入される細胞の培養物には含まれない。標的細胞は、増殖を支持するのに必要な条件、例えば、適切な温度（例えば、37℃）および雰囲気（例えば、空気＋5％C02）で維持される。様々な刺激時間に曝されたT細胞は、異なる特徴を示し得る。
【００７６】
別の具体的な態様において、細胞は、組織または細胞との共培養によって増大させることができる。細胞は、細胞を対象へ投与した後、インビボで、例えば、対象の血液中で増大させてもよい。
【００７７】
治療的適用
別の態様において、既に記載されたような異なる方法によって入手された単離された細胞または単離された細胞に由来する細胞株は、医薬として使用され得る。別の態様において、医薬は、その必要のある患者において、癌を処置するため、具体的には、癌腫および白血病の処置のため、使用され得る。別の態様において、本発明による単離された細胞または単離された細胞に由来する細胞株は、その必要のある患者における癌の処置のための医薬の製造において使用され得る。
【００７８】
別の局面において、本発明は、
（a）既に記載された方法のいずれか一つによって入手可能な免疫細胞を準備する工程、
（b）形質転換された免疫細胞を患者へ投与する工程
のうちの少なくとも一つを含む、その必要のある患者を処置する方法に依る。
【００７９】
一つの態様において、本発明のT細胞は、頑強なインビボT細胞増大を受けることができ、より長時間にわたり、存続することができる。
【００８０】
処置は、寛解、治癒、または予防であり得る。それは、自己免疫療法の一部または同種免疫療法処置の一部のいずれかであり得る。自己とは、患者を処置するために使用される細胞、細胞株、または細胞の集団が、患者またはヒト白血球抗原（HLA）適合ドナーに起因することを意味する。同種とは、患者を処置するために使用される細胞または細胞の集団が、患者ではなくドナーに起因することを意味する。
【００８１】
開示された方法と共に使用され得る細胞は、以前のセクションに記載されている。処置は、5T4発現細胞、具体的には、過剰量の5T4発現細胞を特徴とする前悪性または悪性の癌状態を有すると診断された患者を処置するために使用され得る。そのような状態は、固形腫瘍または小児前駆B細胞急性リンパ芽球性白血病のような血液癌において見出される。
【００８２】
固形腫瘍は、胃腫瘍、結腸直腸腫瘍、前立腺腫瘍、乳房腫瘍、肺腫瘍、腎腫瘍、または卵巣腫瘍であり得る。
【００８３】
より具体的には、そのような処置は、ドセタキセルまたは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）のような薬物と組み合わせて、または単独で、進行性ホルモン不応性前立腺癌のために有用であり得る。
【００８４】
本発明の操作されたT細胞は、インターロイキン-2（IL-2）、ドセタキセル、またはペメトレキセド／シスプラチンのような他の薬物と併せて、非小細胞肺癌、腎明細胞癌、または膵臓癌のような進行固形腫瘍を処置するためにも使用され得る。
【００８５】
さらに、本発明の操作されたT細胞は、シクロホスファミドと共に、または単独で、前立腺癌を処置するために使用され得る。
【００８６】
リンパ増殖性障害は、白血病、具体的には、小児前駆B細胞急性リンパ芽球性白血病であり得る。
【００８７】
処置され得る癌には、前駆B細胞ALL（小児適応症）、成人ALL、マントル細胞リンパ腫、びまん性大B細胞型リンパ腫等を含むが、これらに限定されない、血液腫瘍のような非固形腫瘍が含まれ得る。本発明のCARによって処置される癌の型には、白血病またはリンパ系悪性疾患が含まれるが、これらに限定されない。成人の腫瘍／癌および小児の腫瘍／癌も含まれる。
【００８８】
また、胃、結腸、および卵巣の腫瘍などの固形腫瘍は、本発明のCARによって処置することができる。
【００８９】
本発明による操作された免疫細胞による処置は、抗体治療、化学療法、サイトカイン治療、樹状細胞治療、遺伝子治療、ホルモン治療、レーザー光線治療、および放射線治療の群より選択される、癌に対する1種以上の治療と組み合わせられてもよい。
【００９０】
本発明の好ましい態様によると、処置は、免疫抑制処置を受けている患者へ投与され得る。実際、本発明は、好ましくは、そのような免疫抑制剤の受容体をコードする遺伝子の不活性化によって、少なくとも1種の免疫抑制剤に対して耐性にされた細胞または細胞の集団に頼る。この局面において、免疫抑制処置は、患者における本発明によるT細胞の選択および増大を補助するはずである。
【００９１】
本発明による細胞または細胞の集団の投与は、エアロゾル吸入、注射、経口、輸液、植え込み、または移植を含む、便利な様式で実施され得る。本明細書に記載された組成物は、皮下に、皮内に、腫瘍内に、結節内に、髄内に、筋肉内に、静脈注射もしくはリンパ内注射によって、または腹腔内に、患者へ投与され得る。一つの態様において、本発明の細胞組成物は、好ましくは、静脈注射によって投与される。
【００９２】
細胞または細胞の集団の投与は、これらの範囲内の細胞数の全ての整数値を含む、体重1kg当たり104〜109個の細胞、好ましくは、体重1kg当たり105〜106個の細胞の投与からなり得る。細胞または細胞の集団は、単回投与されてもよいしまたは複数回投与されてもよい。別の態様において、有効量の細胞が、単回投与される。別の態様において、有効量の細胞が、ある期間にわたり複数回投与される。投与のタイミングは、管理する医師の判断にあり、患者の臨床状態に依る。細胞または細胞の集団は、血液バンクまたはドナーのような任意の起源から入手され得る。個々の必要性は変動するが、特定の疾患または状態のための所定の細胞型の有効量の最適範囲の決定は、当技術分野の技術の範囲内にある。有効量とは、治療的または予防的な利益を提供する量を意味する。投与される投薬量は、レシピエントの年齢、健康、および体重、もしあれば、同時処置の種類、処置の頻度、ならびに望まれる効果の性質に依存するであろう。
【００９３】
別の態様において、有効量の細胞またはそれらの細胞を含む組成物は、非経口投与される。投与は、静脈内投与であり得る。投与は、腫瘍内への注射によって直接行われてもよい。
【００９４】
本発明のある種の態様において、細胞は、抗ウイルス治療、シドホビル、およびインターロイキン2、シタラビン（ARA-Cとしても公知）のような薬剤による処置、またはMS患者のためのナタリズマブ処置、または乾癬患者のためのエファリズマブ処置、またはPML患者のためのその他の処置を含むが、これらに限定されない、多数の関連する処置モダリティと共に（例えば、前に、同時に、または後に）患者へ投与される。さらなる態様において、本発明のT細胞は、化学療法、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸、およびFK506のような免疫抑制剤、抗体、またはCAMPATH、抗CD3抗体、もしくはその他の抗体治療のようなその他の免疫除去（immunoablative）剤、シトキシン（cytoxin）、フルダラビン、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、FR901228、サイトカイン、ならびに照射と組み合わせて使用されてもよい。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリンを阻害するか（シクロスポリンおよびFK506）、または増殖因子によって誘導されるシグナリングにとって重要なp70S6キナーゼを阻害する（ラパマイシン）（Henderson,Naya et al.1991；Liu,Albers et al.1992；Bierer,Hollander et al.1993）。さらなる態様において、本発明の細胞組成物は、骨髄移植、フルダラビン、外部照射治療（XRT）、シクロホスファミドのような化学療法剤、またはOKT3もしくはCAMPATHのような抗体のいずれかを使用したT細胞除去治療と共に（例えば、前に、同時に、または後に）患者へ投与される。別の態様において、本発明の細胞組成物は、CD20と反応する薬剤、例えば、リツキサンのようなB細胞除去治療の後に投与される。例えば、一つの態様において、対象は、高用量化学療法による標準的な処置を受けた後、末梢血幹細胞移植を受けることができる。ある種の態様において、移植の後、対象は、増大させた本発明の免疫細胞の注入を受ける。付加的な態様において、増大させた細胞は、手術の前または後に投与される。
【００９５】
他の定義
ポリペプチド配列内のアミノ酸残基は、1文字コードによって本明細書において表記され、例えば、QはGln、すなわちグルタミン残基を意味し、RはArg、すなわちアルギニン残基を意味し、DはAsp、すなわちアスパラギン酸残基を意味する。
【００９６】
アミノ酸置換とは、あるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への交換を意味し、例えば、ペプチド配列内のアルギニン残基のグルタミン残基への交換は、アミノ酸置換である。
【００９７】
ヌクレオチドは以下のように表記される：1文字コードがヌクレオシドの塩基を表記するために使用される：aはアデニンであり、tはチミンであり、cはシトシンであり、gはグアニンである。縮重ヌクレオチドのため、rはgまたはa（プリンヌクレオチド）を表し、kはgまたはtを表し、sはgまたはcを表し、wはaまたはtを表し、mはaまたはcを表し、yはtまたはc（ピリミジンヌクレオチド）を表し、dはg、a、またはtを表し、vはg、a、またはcを表し、bはg、t、またはcを表し、hはa、t、またはcを表し、nはg、a、t、またはcを表す。
【００９８】
本明細書において使用されるように、「核酸」または「ポリヌクレオチド」とは、デオキシリボ核酸（DNA）またはリボ核酸（RNA）のようなヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって生成された断片、ならびにライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用、およびエキソヌクレアーゼ作用のいずれかによって生成された断片をさす。核酸分子は、（DNAおよびRNAのような）天然に存在するヌクレオチド、または天然に存在するヌクレオチドの類似体（例えば、天然に存在するヌクレオチドの鏡像異性体）、または両方の組み合わせであるモノマーから構成され得る。修飾型ヌクレオチドは、糖部分および／またはピリミジン塩基部分もしくはプリン塩基部分に変化を有し得る。糖修飾には、例えば、1つ以上のヒドロキシル基のハロゲン、アルキル基、アミン、およびアジド基への交換が含まれ、または糖がエーテルもしくはエステルとして官能化されていてもよい。さらに、糖部分全体が、アザ糖および炭素環式糖類似体のような立体的かつ電子的に類似した構造に交換されてもよい。塩基部分の修飾の例には、アルキル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンもしくはピリミジン、またはその他の周知の複素環式置換基が含まれる。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合またはそのような結合の類似体によって連結され得る。核酸は、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る。
【００９９】
キメラ抗原受容体（CAR）とは、特異的な抗標的細胞免疫活性を示すキメラタンパク質を生成するため、標的細胞上に存在する成分に対する結合ドメイン、例えば、所望の抗原（例えば、腫瘍抗原）に対する抗体に基づく特異性を、T細胞受容体を活性化する細胞内ドメインと組み合わせた分子を表す。CARは通常、細胞外単鎖抗体（scFvFc）がT細胞抗原受容体複合体ζ鎖の細胞内シグナリングドメインに融合したもの（scFvFc:ζ）からなり、T細胞において発現された時に、モノクローナル抗体の特異性に基づき、抗原認識を向け直す能力を有している。CARはしばしば、WO2014039523に記載のように、複数回膜貫通ポリペプチド（多鎖CAR）を含んでもよい。本発明において使用されるCARの一例は、5T4抗原に対するCARであり、非限定的な例として、アミノ酸配列：SEQ ID NO：19〜42を含み得る。
【０１００】
「エンドヌクレアーゼ」という用語は、DNA分子またはRNA分子、好ましくは、DNA分子の核酸間の結合の加水分解（切断）を触媒することができる野生型酵素またはバリアント酵素をさす。エンドヌクレアーゼは、その配列に関係なくDNA分子またはRNA分子を切断するのではなく、「標的配列」または「標的部位」とさらに呼ばれる特定のポリヌクレオチド配列においてDNA分子またはRNA分子を認識し切断する。エンドヌクレアーゼは、典型的には、12塩基対（bp）より長い、より好ましくは、14〜55bpのポリヌクレオチド認識部位を有する時、レアカットエンドヌクレアーゼとして分類され得る。レアカットエンドヌクレアーゼは、定義された場所においてDNA二本鎖切断（DSB）を誘導することによって、HRを有意に増加させる（Perrin,Buckle et al.1993；Rouet,Smih et al.1994；Choulika,Perrin et al.1995；Pingoud and Silva 2007）。レアカットエンドヌクレアーゼは、例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼ（Paques and Duchateau 2007）、操作したジンクフィンガードメインとFoklのような制限酵素の触媒ドメインとの融合に起因するキメラジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）（Porteus and Carroll 2005）、 CRISPR系に由来するCas9エンドヌクレアーゼ（Gasiunas,Barrangou et al.2012；Jinek,Chylinski et al.2012；Cong,Ran et al.2013；Mali,Yang et al.2013）、または化学的エンドヌクレアーゼ（Eisenschmidt,Lanio et al.2005；Arimondo,Thomas et al.2006）であり得る。化学的エンドヌクレアーゼにおいては、化学的なまたはペプチド性の切断剤が、核酸のポリマーまたは特定の標的配列を認識する他のDNAのいずれかにコンジュゲートされ、それによって、切断活性を特定の配列へターゲティングする。化学的エンドヌクレアーゼには、特定のDNA配列に結合することが公知の、オルトフェナントロリン、DNA切断分子、および三重鎖形成オリゴヌクレオチド（TFO）のコンジュゲートのような合成ヌクレアーゼも包含される（Kalish and Glazer 2005）。そのような化学的エンドヌクレアーゼは、本発明による「エンドヌクレアーゼ」という用語に含まれる。
【０１０１】
「TALEヌクレアーゼ」（TALEN）とは、典型的には、転写活性化因子様（Transcription Activator Like）エフェクター（TALE）に由来する核酸結合ドメイン、および核酸標的配列を切断する1つのヌクレアーゼ触媒ドメインからなる融合タンパク質を表す。触媒ドメインは、好ましくは、ヌクレアーゼドメインであり、より好ましくは、例えば、I-Tevl、ColE7、NucA、Fok-Iのようなエンドヌクレアーゼ活性を有するドメインである。具体的な態様において、TALEドメインは、例えば、I-CrelおよびI-Onulまたはそれらの機能的バリアントのようなメガヌクレアーゼに融合され得る。より好ましい態様において、ヌクレアーゼは単量体TALEヌクレアーゼである。単量体TALEヌクレアーゼとは、WO2012138927に記載された、操作されたTALリピートとI-Tevlの触媒ドメインとの融合のような、特異的な認識および切断のために二量化を必要としないTALEヌクレアーゼである。転写活性化因子様エフェクター（TALE）は、複数の反復配列を含む、細菌種ザントモナス（Xanthomonas）由来のタンパク質であり、各リピートは、核酸標的配列の各ヌクレオチド塩基に対して特異的な2残基（RVD）を12位および13位に含む。類似したモジュラー塩基対塩基核酸結合（modular base-per-base nucleic acid binding）特性を有する結合ドメイン（MBBBD）も、異なる細菌種において出願人によって最近発見された新しいモジュラータンパク質に由来し得る。新しいモジュラータンパク質は、TALリピートより多くの配列可変性を示すという利点を有する。好ましくは、異なるヌクレオチドの認識に関連したRVDは、Cを認識するためのHD、Tを認識するためのNG、Aを認識するためのNI、GまたはAを認識するためのNN、A、C、G、またはTを認識するためのNS、Tを認識するためのHG、Tを認識するためのIG、Gを認識するためのNK、Cを認識するためのHA、Cを認識するためのND、Cを認識するためのHI、Gを認識するためのHN、Gを認識するためのNA、GまたはAを認識するためのSN、Tを認識するためのYG、Aを認識するためのTL、AまたはGを認識するためのVT、およびAを認識するためのSWである。別の態様において、重要なアミノ酸12および13は、ヌクレオチドA、T、C、およびGに対する特異性をモジュレートするため、具体的には、この特異性を増強するため、他のアミノ酸残基に変異させてもよい。TALEヌクレアーゼは、既に記載され、遺伝子ターゲティングおよび遺伝子改変を刺激するために使用されている（Boch,Scholze et al.2009；Moscou and Bogdanove 2009；Christian,Cermak et al.2010；Li,Huang et al.2011）。オーダーメイドのTALヌクレアーゼは、商標TALEN（商標）の下で市販されている（Cellectis,8 rue de la Croix Jarry,75013 Paris,France）。
【０１０２】
本発明によるレアカットエンドヌクレアーゼは、Cas9エンドヌクレアーゼでもあり得る。最近、II型原核生物CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short palindromic Repeats）適応免疫系（概説については（Sorek,Lawrence et al.2013）を参照されたい）から、RNAガイド（RNA-guided）Cas9ヌクレアーゼ（Gasiunas,Barrangou et al.2012；Jinek,Chylinski et al.2012；Cong,Ran et al.2013；Mali,Yang et al.2013）に基づき、新しいゲノム操作ツールが開発された。CRISPR関連（Cas）系は、細菌において最初に発見され、外来DNA、ウイルスまたはプラスミドに対する防御として機能する。CRISPRによって媒介されるゲノム操作は、まず、プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）と呼ばれる短い配列モチーフがしばしば隣接している標的配列の選択によって進行する。標的配列選択の後、この標的配列に相補的な特異的なcrRNAが操作される。CRISPR II型系において必要とされるトランス活性化crRNA（tracrRNA）は、crRNAと対合し、供給されたCas9タンパク質へ結合する。Cas9は、tracRNAのcRNAとの塩基対合を容易にする分子アンカーとして作用する（Deltcheva,Chylinski et al.2011）。この三元複合体において、二重tracrRNA:crRNA構造は、同族標的配列にエンドヌクレアーゼCas9を差し向けるガイドRNAとして作用する。Cas9-tracrRNA:crRNA複合体による標的認識は、標的配列とcrRNAとの間の相同性について標的配列を走査することによって開始される。標的配列-crRNA相補性に加えて、DNAターゲティングは、プロトスペーサーに隣接した短いモチーフ（プロトスペーサー隣接モチーフ−PAM）の存在を必要とする。その後、二重RNAと標的配列との間の対合に続き、Cas9が、PAMモチーフの3塩基上流に平滑末端二本鎖切断を導入する（Garneau,Dupuis et al.2010）。
【０１０３】
レアカットエンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼの名称でも公知のホーミングエンドヌクレアーゼであってもよい。そのようなホーミングエンドヌクレアーゼは、当技術分野において周知である（Stoddard 2005）。ホーミングエンドヌクレアーゼは、DNA標的配列を認識し、一本鎖または二本鎖の切断を生成する。ホーミングエンドヌクレアーゼは、高度に特異的であり、12〜45塩基対（bp）長、通常14〜40bp長の範囲のDNA標的部位を認識する。本発明によるホーミングエンドヌクレアーゼは、例えば、LAGLIDADGエンドヌクレアーゼ、HNHエンドヌクレアーゼ、またはGIY-YIGエンドヌクレアーゼに相当し得る。本発明による好ましいホーミングエンドヌクレアーゼは、I-Crelバリアントであり得る。
【０１０４】
「送達ベクター」とは、本発明において必要とされる薬剤／化学物質および分子（タンパク質または核酸）を、細胞と接触させるため（即ち、「接触」）、または細胞もしくは細胞内区画へ送達するため（即ち、「導入」）、本発明において使用され得る送達ベクターを表す。それには、リポソーム送達ベクター、ウイルス送達ベクター、薬物送達ベクター、化学的担体、ポリマー担体、リポプレックス、ポリプレックス、デンドリマー、微小気泡（超音波造影剤）、ナノ粒子、乳濁液、またはその他の適切な移入ベクターが含まれるが、これらに限定されない。これらの送達ベクターは、分子、化学物質、高分子（遺伝子、タンパク質）、またはプラスミド、Diatosによって開発されたペプチドのようなその他のベクターの送達を可能にする。これらのケースにおいて、送達ベクターは分子担体である。「送達ベクター」とは、トランスフェクションを実施するための送達方法も表す。
【０１０５】
「ベクター」という用語は、それが連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子をさす。本発明における「ベクター」には、ウイルスベクター、プラスミド、RNAベクター、または染色体核酸、非染色体核酸、半合成核酸、もしくは合成核酸からなり得る直鎖状もしくは環状のDNA分子もしくはRNA分子が含まれるが、これらに限定されない。好ましいベクターは、それらが連結された核酸の自律複製が可能なもの（エピソームベクター）および／または発現が可能なもの（発現ベクター）である。多数の適当なベクターが、当業者に公知であり、市販されている。
【０１０６】
ウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）、コロナウイルス、オルソミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病ウイルスおよび水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹およびセンダイ）のようなマイナス鎖RNAウイルス、ピコルナウイルスおよびアルファウイルスのようなプラス鎖RNAウイルス、ならびにアデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス1型および2型、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス）、およびポックスウイルス（例えば、ワクシニア、鶏痘、およびカナリアポックス）を含む二本鎖DNAウイルスが含まれる。他のウイルスには、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポーバウイルス、ヘパドナウイルス、および肝炎ウイルスが含まれる。レトロウイルスの例には、トリ白血病肉腫、哺乳動物C型、B型ウイルス、D型ウイルス、HTLV-BLV群、レンチウイルス、スプーマウイルスが含まれる（Coffin,J.M.,Retroviridae:The viruses and their replication,In Fundamental Virology,Third Edition,B.N.Fields,et al.,Eds.,Lippincott-Raven Publishers,Philadelphia,1996）。
【０１０７】
「レンチウイルスベクター」とは、比較的大きいパッケージング能力、低下した免疫原性、および広範囲の異なる細胞型を高い効率で安定的に形質導入する能力のため、遺伝子送達のために極めて有望である、HIVに基づくレンチウイルスベクターを意味する。レンチウイルスベクターは通常、3種（パッケージング、エンベロープ、および移入）またはそれ以上のプラスミドを産生細胞に一過性トランスフェクションした後、生成される。HIVと同様に、レンチウイルスベクターは、ウイルス表面糖タンパク質の細胞表面上の受容体との相互作用を通して標的細胞に侵入する。侵入後、ウイルスRNAが、ウイルス逆転写酵素複合体によって媒介される逆転写を受ける。逆転写の産物は、感染細胞のDNAへのウイルス組み込みのための基質となる二本鎖の直鎖状ウイルスDNAである。「組込みレンチウイルスベクター（またはLV）」とは、非限定的な例として、標的細胞のゲノムに組み込まれ得るそのようなベクターを意味する。反対に、「非組込みレンチウイルスベクター（またはNILV）」とは、ウイルスインテグラーゼの作用を通して標的細胞のゲノムに組み込まれない効率的な遺伝子送達ベクターを意味する。
【０１０８】
送達ベクターおよびベクターは、ソノポレーション（sonoporation）もしくは電気穿孔のような細胞透過処理技術、またはこれらの技術の変法と関連しているかまたは組み合わせられていてよい。
【０１０９】
細胞とは、真核生物の生存細胞、初代細胞、およびインビトロ培養のためのこれらの生物に由来する細胞株を表す。
【０１１０】
「初代細胞」とは、集団倍化をほとんど受けておらず、従って、腫瘍形成性の連続細胞株または人為的に不死化された細胞株と比較して、それが由来した組織の主な機能的成分および特徴をよりよく表している、生存組織（即ち、生検材料）から直接採取され、インビトロでの増殖のために確立された細胞を表す。
【０１１１】
非限定的な例として、細胞株は、CHO-K1細胞；HEK293細胞；Caco2細胞；U2-OS 細胞；NIH 3T3細胞；NSO細胞；SP2細胞；CHO-S細胞；DG44細胞；K-562細胞、U-937細胞；MRC5細胞；IMR90細胞；ジャーカット細胞；HepG2細胞；HeLa細胞；HT-1080細胞；HCT-116細胞；Hu-h7細胞；Huvec細胞；Molt 4細胞からなる群より選択される。
【０１１２】
これらの細胞株は、全て、関心対象の遺伝子またはタンパク質を作製し、発現させ、定量化し、検出し、研究するための細胞株モデルを提供するため、本発明の方法によって改変され得；これらのモデルは、研究および作製、ならびに非限定的な例としての化学物質、生物燃料、治療薬、および農学のような様々な領域において、関心対象の生理活性分子をスクリーニングするためにも使用され得る。
【０１１３】
「変異」とは、ポリヌクレオチド（cDNA、遺伝子）またはポリペプチドの配列における1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、20個、25個、30個、40個、50個、またはそれ以上までのヌクレオチド／アミノ酸の置換、欠失、挿入を表す。変異は、遺伝子のコード配列またはその制御配列に影響を与える場合がある。また、ゲノム配列の構造またはコードされたmRNAの構造／安定性に影響を与える場合もある。
【０１１４】
「バリアント」とは、親分子のアミノ酸配列における少なくとも1個の残基の変異または交換によって入手されたリピートバリアント、バリアント、DNA結合バリアント、TALEヌクレアーゼバリアント、ポリペプチドバリアントを表す。
【０１１５】
「機能的バリアント」とは、タンパク質またはタンパク質ドメインの触媒活性変異体を表し；そのような変異体は、その親のタンパク質またはタンパク質ドメインと比較して、同一の活性、または付加的な特性、またはより高いかもしくはより低い活性を有し得る。
【０１１６】
「同一性」とは、2種の核酸分子またはポリペプチドの間の配列同一性をさす。同一性は、比較の目的のために整列化され得る各配列の位置を比較することによって決定され得る。比較された配列のある位置が同一の塩基によって占有される時、それらの分子はその位置において同一である。核酸またはアミノ酸配列の間の類似性または同一性の程度は、核酸配列が共有している位置における同一のまたは一致するヌクレオチドの数の関数である。GCG配列分析パッケージ（University of Wisconsin,Madison,Wis.）の一部として入手可能であるFASTAまたはBLASTを含む、様々なアライメントアルゴリズムおよび／またはプログラムが、2種の配列の間の同一性を計算するために使用され得、例えば、デフォルト設定で使用され得る。例えば、本明細書に記載された特定のポリペプチドとの少なくとも70％、85％、90％、95％、98％、または99％の同一性を有しており、好ましくは、実質的に同一の機能を示すポリペプチド、およびそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、企図される。他に示されない限り、類似性スコアは、BLOSUM62の使用に基づくであろう。BLASTPが使用される時、パーセント類似性は、BLASTP陽性スコアに基づき、パーセント配列同一性は、BLASTP同一性スコアに基づく。BLASTP「同一性」は、同一である高スコア配列対における全残基の数および画分を示し；BLASTP「陽性」は、アライメントスコアが正の値を有しており、相互に類似している残基の数および画分を示す。本明細書に開示されたアミノ酸配列との同一性もしくは類似性のこれらの程度または同一性もしくは類似性の中間の程度を有するアミノ酸配列が、本開示によって企図され包含される。類似したポリペプチドのポリヌクレオチド配列は、遺伝暗号を使用して推定され、特に、遺伝暗号を使用して、そのアミノ酸配列を逆翻訳することによって、従来の手段によって入手され得る。
【０１１７】
「シグナル伝達ドメイン」または「共刺激リガンド」とは、T細胞上の同族共刺激分子に特異的に結合し、それによって、例えば、ペプチドが負荷されたMHC分子とのTCR/CD3複合体の結合によって提供される一次シグナルに加えて、増殖活性化、分化等を含むがこれらに限定されないT細胞応答を媒介するシグナルを提供する抗原提示細胞上の分子をさす。共刺激リガンドには、CD7、B7-1（CD80）、B7-2（CD86）、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、誘導性共刺激リガンド（ICOS-L）、細胞間接着分子（ICAM、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、M1CB、HVEM、リンホトキシンβ受容体、3/TR6、ILT3、ILT4、トールリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体、およびB7-H3に特異的に結合するリガンドが含まれ得るが、これらに限定されない。共刺激リガンドには、とりわけ、以下に限定されないが、CD27、CD28、4-IBB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原1（LFA-1）、CD2、CD7、LTGHT、NKG2C、B7-H3、CD83と特異的に結合するリガンドのような、T細胞上に存在する共刺激分子と特異的に結合する抗体も包含される。
【０１１８】
「共刺激分子」とは、共刺激リガンドと特異的に結合し、それによって、これに限定されないが、増殖のような、細胞による共刺激応答を媒介するT細胞上の同族結合パートナーをさす。共刺激分子には、MHCクラスI分子、BTLA、およびトールリガンド受容体が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１９】
「共刺激シグナル」とは、本明細書において使用されるように、TCR/CD3ライゲーションのような一次シグナルと組み合わせて、T細胞増殖および／または重要分子のアップレギュレーションもしくはダウンレギュレーションをもたらすシグナルをさす。
【０１２０】
「細胞外リガンド結合ドメイン」という用語は、本明細書において使用されるように、リガンドと結合することができるオリゴペプチドまたはポリペプチドとして定義される。好ましくは、ドメインは、細胞表面分子と相互作用することができるであろう。例えば、細胞外リガンド結合ドメインは、特定の疾患状態に関連した標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するよう選択され得る。従って、リガンドとして作用し得る細胞表面マーカーの例には、ウイルス、細菌、および寄生虫の感染、自己免疫疾患、ならびに癌細胞に関連したものが含まれる。
【０１２１】
「対象」または「患者」という用語には、本明細書において使用されるように、非ヒト霊長類およびヒトを含む動物界の全てのメンバーが含まれる。
【０１２２】
上記の本発明の説明は、当業者が本発明を作成し使用することが可能になるよう、本発明を作成し使用する様式および過程を提供するものであり、この可能性は、当初明細書の一部を構成する添付の特許請求の範囲の主題のために特に提供される。
【０１２３】
本明細書において数的な限度または範囲が記述される場合、その終点が含まれる。数的な限度または範囲に含まれる全ての値および部分範囲も、明示的に記載されたかのごとく、具体的に含まれる。
【０１２４】
上記の説明は、当業者が本発明を作成し使用することを可能にするために提示され、特定の適用およびその必要条件に関して提供される。好ましい態様に対する様々な改変は、当業者に容易に明白になり、本明細書において定義された一般原理は、本発明の本旨および範囲から逸脱することなく、他の態様および適用に適用され得る。従って、本発明は、示された態様に限定されず、本明細書に開示された原理および特色と一致する最も広い範囲を与えられるものとする。
【０１２５】
本発明を概略的に説明したが、例示のために本明細書に提供されるに過ぎず、他に特記しない限り、限定するためのものではない、いくつかの具体的な例を参照することによって、さらなる理解を得ることができる。
【実施例】
【０１２６】
材料および方法
初代細胞
健常ボランティアドナー（Etablissement Francais du Sang）由来のバフィーコートから、密度勾配遠心分離によって、末梢血単核細胞を単離した。次いで、EasySepヒトT細胞濃縮キット（Stemcell Technologies）を使用して、Tリンパ球を精製し、20ng/ml IL-2（Miltenyi）および5％ヒトAB血清（Seralab）が補足されたX-vivo 15培地（Lonza）においてDynabeads Human T-Activator CD3/CD28（Life Technologies）によって活性化した。
【０１２７】
細胞株
HCT116細胞株、MCF-7細胞株、SK-MEL-28細胞株、およびDaudi細胞株は、American Type Culture Collectionから入手された。HCT116細胞は、10％熱不活化FCS、2mmol/L L-グルタミン、および100単位/mlペニシリン、および100μg/mLストレプトマイシンが補足されたマッコイにおいて培養された。MCF-7細胞は、10％熱不活化FCS、2mmol/L L-グルタミン、および100単位/mlペニシリン、および100μg/mLストレプトマイシン、および0.01mg/mlヒトインスリンが補足されたDMEMにおいて培養された。SK-MEL-28細胞は、10％熱不活化FCS、2mmol/L L-グルタミン、および100単位/mlペニシリン、および100μg/mLストレプトマイシンが補足されたMEMにおいて培養された。Daudi細胞は、10％熱不活化FCS、2mmol/L L-グルタミン、および100単位/mlペニシリン、および100μg/mLストレプトマイシンが補足されたRPMI 1640において培養された。
【０１２８】
scCARコード配列の合成およびクローニング
scCARをコードするDNA配列は、GenScriptによって合成され、CAR mRNAのインビトロ合成のため、T7プロモーターを含有しているプラスミドにクローニングされた。
【０１２９】
CAR mRNAのインビトロ合成
CARをコードする配列がT7プロモーターの調節下にある直鎖化されたプラスミドを鋳型として使用して、scCARをコードするmRNAを合成した。インビトロの転写およびポリアデニル化を、製造業者の説明書に従い、mMessage mMachine T7 Ultraキット（Life technologies）を使用して行った。RNAをRNeasyカラム（Qiagen）によって精製し、cytoporation medium T（Harvard Apparatus）で溶出させ、Nanodrop ND-1000分光光度計を使用して、260nmで吸光度を測定することによって定量化した。RNAの品質を、変性ホルムアルデヒド/MOPSアガロースゲルで確認した。
【０１３０】
T細胞のRNA電気穿孔
11〜12日間の活性化の後、AgilePulse MAX系（Harvard Apparatus）を使用して、メッセンジャーRNAの電気導入によって、Tリンパ球をトランスフェクトした。活性化ビーズの除去の後、細胞をペレット化し、25×106細胞/mlでcytoporation medium Tに再懸濁させた。5×106個の細胞を、0.4cmキュベットで、15μgのscCARをコードするmRNAと混合した。電気穿孔は、1200Vでの2回の0.1msパルスの後の130Vでの4回の0.2msパルスからなっていた。電気穿孔の後、細胞を培養培地で希釈し、37℃/5％CO2でインキュベートした。
【０１３１】
脱顆粒アッセイ
96穴プレートにおいて、1ウェル当たり0.1mlで、5×104個のT細胞のバッチを、5×104個の5T4陽性細胞（MCF7もしくはHCT116）または5T4陰性細胞（Daudi）と共培養した。1μg/mlの抗CD49d（BD Biosciences）、1μg/mlの抗CD28（Miltenyi）、および1×モネンシン溶液（eBioscience）に加えて、APCによって標識された抗CD107a（BD Biosciences）を、共培養の開始時に添加した。6時間のインキュベーションの後、細胞を、固定可能な生死細胞判定色素（eBioscience）およびvioblueによって標識された抗CD8（Miltenyi）によって染色し、MACSQuantフローサイトメーター（Miltenyi）を使用して分析した。脱顆粒する細胞傷害性T細胞は、CD8+CD107a+細胞に相当する。
【０１３２】
細胞傷害アッセイ
5T4陽性細胞および5T4陰性細胞を、それぞれ、CellTrace CFSEおよびCellTrace Violetによって標識した。96穴プレートにおいて、1ウェル当たり0.1mlで、2×104個の5T4陽性細胞（MCF7またはHCT116）を、4×105個のT細胞と共に、2×104個の5T4陰性細胞（SKMEL28）と共培養した。4時間のインキュベーションの後、細胞を採集し、固定可能な生死細胞判定色素（eBiosciences）によって染色し、MACSQuantフローサイトメーター（Miltenyi）を使用して分析した。
【０１３３】
特異的溶解率を以下の式を使用して計算した：
2017527289.tif 000013
【０１３４】
実施例1：TCRα不活性化5T4-CAR発現細胞の増殖
T細胞受容体α定常鎖領域（TRAC）遺伝子内の15bpスペーサーによって分離された2個の17bp長配列（半標的と呼ばれる）を標的とする異種二量体TALEヌクレアーゼを設計し作製した。各半標的は、表10にリストされた半TALEヌクレアーゼのリピートによって認識される。
【０１３５】
（表１０）TCRα遺伝子を標的とするTALヌクレアーゼ
2017527289.tif 000014
【０１３６】
各TALEヌクレアーゼ構築物を、T7プロモーターの調節下で、制限酵素消化を使用して哺乳動物発現ベクターへサブクローニングした。TRACゲノム配列を切断するTALEヌクレアーゼをコードするmRNAを、T7プロモーターの下流にコード配列を保持しているプラスミドから合成した。
【０１３７】
抗CD3/CD28によってコーティングされたビーズによって72時間予め活性化された精製されたT細胞を、両方の半TRAC_T01 TALEヌクレアーゼをコードする2種のmRNAの各々によってトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、同一のドナーに由来するT細胞の異なる群を、以前に記載された5T4 CAR（SEQ ID NO：19〜42）のうちの1種をコードするレンチウイルスベクターによってそれぞれ形質導入した。形質導入の2日後、CD3陰性細胞を抗CD3磁気ビーズを使用して精製し、形質導入の5日後、細胞を可溶性抗CD28（5μg/ml）によって再活性化した。
【０１３８】
週に2回、細胞を計数することによって、再活性化の30日後まで細胞増殖を追跡した。特に、抗CD28によって再活性化された時、非形質導入細胞と比較して、TCRα不活性化5T4 CAR発現細胞の増殖の増加が観察された。
【０１３９】
5T4 CAR発現ヒトT細胞が活性化状態を示すか否かを調査するため、活性化マーカーCD25の発現を、形質導入の7日後に、FACSによって分析する。5T4 CARをコードするレンチウイルスベクターによって形質導入された精製された細胞を、非形質導入細胞と比較して、活性化を査定するため、表面におけるCD25発現についてアッセイする。CD28再活性化条件または非再活性化条件の両方において、CD25発現の増加が予想される。
【０１４０】
実施例2：5T4陽性細胞株および5T4陰性細胞株の選択
8種のヒト細胞株を、ウエスタンブロットおよびフローサイトメトリーによって、5T4発現についてスクリーニングした（下記の表11を参照すること）。
【０１４１】
（表１１）8種のヒト細胞株における5T4抗原の発現
2017527289.tif 000015
【０１４２】
5T4は、Daudi細胞（ATCC CCL-213）、SupT1細胞（ATT CRL-1942）、およびSK-MEL-28細胞（ATCC HTB-72）に由来する抽出物において検出されず、MCF7細胞（ATCC HTB-22）、HCT116細胞（ATCC CCL-247）、MKN45細胞（JCRB0254）、およびLS174T細胞（ATCC CL-188）に由来する抽出物において検出された。ウエスタンブロット分析の後、5T4抗原について陽性であった細胞のうち、2種：MCF7細胞およびHCT116細胞のみが、細胞表面に5T4を発現し、MCF7はHCT116細胞より高レベルの5T4抗原を発現することが見出された。
【０１４３】
実施例3：抗5T4 scCARの生成
図2に表されるように、4種の異なるscFvの配列を、3種の異なるスペーサー、2種の異なる膜貫通ドメイン、1種の共刺激ドメイン、および1種の刺激ドメインの配列と組み合わせることによって、（図3〜6および表3〜表6に模式的に示される）5T4に特異的な第二世代単鎖CARを作出した。
【０１４４】
（表1および表2に提示された）CARにおいて使用された配列は、
- scFvについては、H8抗体、A1抗体、A2抗体、またはA3抗体;
- スペーサードメインについては、IgG1分子、FcεRIIIγ分子、またはCD8α分子;
- 膜貫通ドメインについては、CD8α分子または4-1BB分子;
- 共刺激ドメインについては、4-1BB分子;
- 刺激ドメインについては、CD3ζ分子
に由来する。
【０１４５】
実施例4：抗5T4 scCARのインビトロ試験
5T4特異的単鎖CARの活性を評価するため、健常ボランティア由来のヒトT細胞を、CD3/CD28ビーズによって活性化し、活性化の11日後に、CARをコードするmRNAによって電気穿孔した。トランスフェクションの1〜2日後に、T細胞脱顆粒ならびに5T4陽性標的細胞および5T4陰性標的細胞に対するT細胞細胞傷害を測定することによって、CARの活性および特異性を分析した。
【０１４６】
あるケース（N＝1）での試験についての結果が以下に提示されるが、2つの他のケースでも実験が実施され、類似した結果を示した（示されない）。
【０１４７】
図7は、試験された全てのCARが、MCF7との共培養によって、有意なレベル（≧20％）のT細胞脱顆粒を誘導したが、Daudi細胞との共培養によってはそれを誘導しなかったことを示す。MCF7より低レベルの5T4を発現する細胞株、HCT116細胞との共培養の後にも、試験された8種のCARのうちの7種が、T細胞脱顆粒を媒介することができた。
【０１４８】
図8は、A1-v3、A1-v5、A2-v3、A2-v5、A3-v3、H8-v2、およびH8-v3 CARによって修飾された全てのT細胞が、MCF7細胞を有意に特異的に溶解したことを示す。A1-v3、A1-v5、A2-v3、A2-v5、A3-v3、およびH8-v3 CARによって修飾されたT細胞は、MCF7細胞より低レベルの5T4を発現する細胞株、HCT116細胞も溶解することができた。
【０１４９】
CARポリペプチド配列の例：
組み立てられた配列は、好ましいVH配列およびVL配列に相当する。VHおよびVLはCAR効率を改善するために交換されてもよい。
2017527289.tif 000016
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【０１５０】
参照
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2017527289.tif 000025
2017527289.tif 000026
【図１】
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【図２】
2017527289.tif 000029
【図３】
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【図４】
2017527289.tif 000031
【図５】
2017527289.tif 000032
【図６】
2017527289.tif 000033
【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年5月18日(2017.5.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
図2に図示されるポリペプチド構造V3を有する5T4特異的キメラ抗原受容体（CAR）であって、該構造が、モノクローナル抗5T4抗体由来のVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメインと、CD8αヒンジと、膜貫通ドメインと、CD3ζシグナリングドメインおよび4-1BB由来の共刺激ドメインを含む細胞質ドメインとを含む、5T4特異的キメラ抗原受容体（CAR）。
【請求項２】
VHおよびVLがSEQ ID NO：11〜18より選択されるポリペプチド配列と少なくとも80％、好ましくは90％、より好ましくは95％、さらに好ましくは99％の同一性を有する、請求項1記載の5T4特異的CAR。
【請求項３】
細胞外リガンド結合ドメインが、SEQ ID NO：54（CDR1）、SEQ ID NO：55（CDR2）、およびSEQ ID NO：56（CDR3）のマウスモノクローナル抗体A1由来のCDRを含むVH鎖、ならびにSEQ ID NO：57（CDR1）、SEQ ID NO：58（CDR2）、およびSEQ ID NO：59（CDR3）のマウスモノクローナル抗体A1由来のCDRを含むVL鎖を含む、請求項1または2記載の5T4特異的CAR。
【請求項４】
VHおよびVLが、それぞれ、SEQ ID NO：13（A1-VH）およびSEQ ID NO：14（A1-VL）と少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、さらに好ましくは少なくとも99％の配列同一性を有する、請求項1〜3のいずれか一項記載の5T4特異的CAR。
【請求項５】
細胞外リガンド結合ドメインが、SEQ ID NO：60（CDR1）、SEQ ID NO：61（CDR2）、およびSEQ ID NO：62（CDR3）のマウスモノクローナル抗体A2由来のCDRを含むVH鎖、ならびにSEQ ID NO：63（CDR1）、SEQ ID NO：64（CDR2）、およびSEQ ID NO：65（CDR3）のマウスモノクローナル抗体A2由来のCDRを含むVL鎖を含む、請求項1または2記載の5T4特異的CAR。
【請求項６】
VHおよびVLが、それぞれ、SEQ ID NO：15（A2-VH）およびSEQ ID NO：16（A2-VL）と少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、さらに好ましくは少なくとも99％の配列同一性を有する、請求項1、2、および5のいずれか一項記載の5T4特異的CAR。
【請求項７】
細胞外リガンド結合ドメインが、SEQ ID NO：66（CDR1）、SEQ ID NO：67（CDR2）、およびSEQ ID NO：68（CDR3）のマウスモノクローナル抗体A3由来のCDRを含むVH鎖、ならびにSEQ ID NO：69（CDR1）、SEQ ID NO：70（CDR2）、およびSEQ ID NO：71（CDR3）のマウスモノクローナル抗体A3由来のCDRを含むVL鎖を含む、請求項1または2記載の5T4特異的CAR。
【請求項８】
VHおよびVLが、それぞれ、SEQ ID NO：17（A3-VH）およびSEQ ID NO：18（A3-VL）と少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、さらに好ましくは少なくとも99％の配列同一性を有する、請求項1、2、および7のいずれか一項記載の5T4特異的CAR。
【請求項９】
細胞外リガンド結合ドメインが、SEQ ID NO：48（CDR1）、SEQ ID NO：49（CDR2）、およびSEQ ID NO：50（CDR3）のマウスモノクローナル抗体H8由来のCDRを含むVH鎖、ならびにSEQ ID NO：51（CDR1）、SEQ ID NO：52（CDR2）、およびSEQ ID NO：53（CDR3）のマウスモノクローナル抗体H18由来のCDRを含むVL鎖を含む、請求項1または2記載の5T4特異的CAR。
【請求項１０】
VHおよびVLが、それぞれ、SEQ ID NO：11（H18-VH）およびSEQ ID NO：12（H18-VL）と少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、さらに好ましくは少なくとも99％の配列同一性を有する、請求項1、2、および9のいずれか一項記載の5T4特異的CAR。
【請求項１１】
4-1BB由来の共刺激ドメインが、SEQ ID NO：8と少なくとも80％、好ましくは90％、より好ましくは95％、さらに好ましくは99％の同一性を有する、請求項1〜10のいずれか一項記載の5T4特異的CAR。
【請求項１２】
CD3ζシグナリングドメインが、SEQ ID NO：9と少なくとも80％、好ましくは90％、より好ましくは95％、さらに好ましくは99％の同一性を有する、請求項1〜11のいずれか一項記載の5T4特異的CAR。
【請求項１３】
CD8αヒンジが、SEQ ID NO：4と少なくとも80％、好ましくは90％、より好ましくは95％、さらに好ましくは99％の同一性を有する、請求項1〜12のいずれか一項記載の5T4特異的CAR。
【請求項１４】
前記構造V3が4-1BB膜貫通ドメインまたはCD8α膜貫通ドメインを含む、請求項1〜13のいずれか一項記載の5T4特異的CAR。
【請求項１５】
前記構造V3がCD8α膜貫通ドメインを含む、請求項1〜14のいずれか一項記載の5T4特異的CAR。
【請求項１６】
CD8α膜貫通ドメインが、SEQ ID NO：6と少なくとも80％、好ましくは90％、より好ましくは95％、さらに好ましくは99％の同一性を有する、請求項14または15のいずれか一項記載の5T4特異的CAR。
【請求項１７】
4-1BB膜貫通ドメインが、SEQ ID NO：7と少なくとも80％、好ましくは90％、より好ましくは95％、さらに好ましくは99％の同一性を有する、請求項14記載の5T4特異的CAR。
【請求項１８】
SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：33、およびSEQ ID NO：39と少なくとも80％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項1記載の構造V3の5T4特異的CAR。
【請求項１９】
シグナルペプチドをさらに含む、請求項1〜18のいずれか一項記載の5T4特異的CAR。
【請求項２０】
請求項1〜19のいずれか一項記載のキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２１】
請求項1〜19のいずれか一項記載の5T4特異的キメラ抗原受容体を細胞表面膜に発現する、操作された免疫細胞。
【請求項２２】
炎症性Tリンパ球、細胞傷害性Tリンパ球、制御性Tリンパ球、またはヘルパーTリンパ球に由来する、請求項21記載の操作された免疫細胞。
【請求項２３】
治療において使用するための、請求項21または22のいずれか一項記載の操作された免疫細胞。
【請求項２４】
血液癌状態が小児前駆B細胞急性リンパ芽球性白血病である、血液癌状態の治療において使用するための請求項21〜23のいずれか一項記載の操作された免疫細胞。
【請求項２５】
前記免疫細胞においてTCRの発現が抑制されている、請求項21〜24のいずれか一項記載の操作された免疫細胞。
【請求項２６】
少なくとも1種の免疫抑制薬または化学療法薬に対する耐性を付与するために変異させた、請求項21〜25のいずれか一項記載の操作された免疫細胞。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
本発明の操作された免疫細胞は、治療的な適用のため、例えば、慢性リンパ球性白血病、または乳房腫瘍、結腸腫瘍、肺腫瘍、および腎臓腫瘍のような固形腫瘍の処置のため、特に有用である。
[本発明1001]
図2に図示されるV1〜V6より選択されるポリペプチド構造のうちの一つを有する5T4（NTRKR1）特異的キメラ抗原受容体（CAR）であって、該構造が、モノクローナル抗5T4抗体由来のVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメインと、ヒンジと、膜貫通ドメインと、CD3ζシグナリングドメインおよび4-1BB由来の共刺激ドメインを含む細胞質ドメインとを含む、5T4（NTRKR1）特異的キメラ抗原受容体（CAR）。
[本発明1002]
構造V3がCD8αヒンジおよびCD8α膜貫通ドメインを含む、本発明1001の5T4特異的CAR。
[本発明1003]
構造V5がIgG1ヒンジおよびCD8α膜貫通ドメインを含む、本発明1001の5T4特異的CAR。
[本発明1004]
構造V1がFcγRIIIαヒンジおよびCD8α膜貫通ドメインを含む、本発明1001の5T4特異的CAR。
[本発明1005]
構造V2がFcγRIIIαヒンジおよび4-1BB膜貫通ドメインを含む、本発明1001の5T4特異的CAR。
[本発明1006]
構造V4がCD8αヒンジおよび4-1BB膜貫通ドメインを含む、本発明1001の5T4特異的CAR。
[本発明1007]
構造V6がIgG1ヒンジおよび4-1BB膜貫通ドメインを含む、本発明1001の5T4特異的CAR。
[本発明1008]
VHおよびVLがSEQ ID NO：11〜18より選択されるポリペプチド配列と少なくとも80％、好ましくは90％、より好ましくは95％、さらに好ましくは99％の同一性を有する、本発明1001〜1007のいずれかの5T4特異的CAR。
[本発明1009]
細胞外リガンド結合ドメインが、SEQ ID NO：54（CDR1）、SEQ ID NO：55（CDR2）、およびSEQ ID NO：56（CDR3）のマウスモノクローナル抗体A1由来のCDRを含むVH鎖、ならびにNO.57（CDR1）、SEQ ID NO：58（CDR2）、およびSEQ ID NO：59（CDR3）のマウスモノクローナル抗体A1由来のCDRを含むVL鎖を含む、本発明1001〜1008のいずれかの5T4特異的CAR。
[本発明1010]
VHおよびVLが、それぞれ、SEQ ID NO：13（A1-VH）およびSEQ ID NO：14（A1-VL）と少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、さらに好ましくは少なくとも99％の配列同一性を有する、本発明1001〜1009のいずれかの5T4特異的CAR。
[本発明1011]
細胞外リガンド結合ドメインが、SEQ ID NO：61（CDR1）、SEQ ID NO：61（CDR2）、およびSEQ ID NO：63（CDR3）のマウスモノクローナル抗体A2由来のCDRを含むVH鎖、ならびにSEQ ID NO：64（CD1）、SEQ ID NO：65（CD2）、およびSEQ ID NO：65（CDR3）のマウスモノクローナル抗体A2由来のCDRを含むVL鎖を含む、本発明1001〜1008のいずれかの5T4特異的CAR。
[本発明1012]
VHおよびVLが、それぞれ、SEQ ID NO：15（A2-VH）およびSEQ ID NO：16（A2-VL）と少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、さらに好ましくは少なくとも99％の配列同一性を有する、本発明1001〜1008および1011のいずれかの5T4特異的CAR。
[本発明1013]
細胞外リガンド結合ドメインが、SEQ ID NO：66（CDR1）、SEQ ID NO：67（CDR2）、およびSEQ ID NO：68（CDR3）のマウスモノクローナル抗体A3由来のCDRを含むVH鎖、ならびにSEQ ID NO：69（CDR1）、SEQ ID NO：70（CDR2）、およびSEQ ID NO：71（CDR3）のマウスモノクローナル抗体A3由来のCDRを含むVL鎖を含む、本発明1001〜1008のいずれかの5T4特異的CAR。
[本発明1014]
VHおよびVLが、それぞれ、SEQ ID NO：17（A3-VH）およびSEQ ID NO：18（A3-VL）と少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、さらに好ましくは少なくとも99％の配列同一性を有する、本発明1001〜1008および1013のいずれかの5T4特異的CAR。
[本発明1015]
細胞外リガンド結合ドメインが、SEQ ID NO：48（CDR1）、SEQ ID NO：49（CDR2）、およびSEQ ID NO：50（CDR3）のマウスモノクローナル抗体H8由来のCDRを含むVH鎖、ならびにNO.51（CDR1）、SEQ ID NO：52（CDR2）、およびSEQ ID NO：53（CDR3）のマウスモノクローナル抗体H18由来のCDRを含むVL鎖を含む、本発明1001〜1008のいずれかの5T4特異的CAR。
[本発明1016]
VHおよびVLが、それぞれ、SEQ ID NO：11（H18-VH）およびSEQ ID NO：12（H18-VL）と少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、さらに好ましくは少なくとも99％の配列同一性を有する、本発明1001〜1008および1015のいずれかの5T4特異的CAR。
[本発明1017]
4-1BB由来の共刺激ドメインが、SEQ ID NO：8と少なくとも80％、好ましくは90％、より好ましくは95％、さらに好ましくは99％の同一性を有する、本発明1001〜1016のいずれかの5T4特異的CAR。
[本発明1018]
CD3ζシグナリングドメインが、SEQ ID NO：9と少なくとも80％、好ましくは90％、より好ましくは95％、さらに好ましくは99％の同一性を有する、本発明1001〜1017のいずれかの5T4特異的CAR。
[本発明1019]
FcγRIIIαヒンジが、SEQ ID NO：3と少なくとも80％、好ましくは90％、より好ましくは95％、さらに好ましくは99％の同一性を有する、本発明1004、1005、または1008〜1018のいずれかの5T4特異的CAR。
[本発明1020]
CD8αヒンジが、SEQ ID NO：4と少なくとも80％、好ましくは90％、より好ましくは95％、さらに好ましくは99％の同一性を有する、本発明1002、1006、または1008〜1018のいずれかの5T4特異的CAR。
[本発明1021]
IgG1ヒンジが、SEQ ID NO：5と少なくとも80％、好ましくは90％、より好ましくは95％、さらに好ましくは99％の同一性を有する、本発明1003、1007、または1008〜1018のいずれかの5T4特異的CAR。
[本発明1022]
CD8α膜貫通ドメインが、SEQ ID NO：6と少なくとも80％、好ましくは90％、より好ましくは95％、さらに好ましくは99％の同一性を有する、本発明1002〜1004または1008〜1021のいずれかの5T4特異的CAR。
[本発明1023]
4-1BB膜貫通ドメインが、SEQ ID NO：7と少なくとも80％、好ましくは90％、より好ましくは95％、さらに好ましくは99％の同一性を有する、本発明1005〜1007または1008〜1021のいずれかの5T4特異的CAR。
[本発明1024]
5T4に特異的でない別の細胞外リガンド結合ドメインをさらに含む、本発明1001〜1023のいずれかの5T4特異的CAR。
[本発明1025]
SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：33、およびSEQ ID NO：39と少なくとも80％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、本発明1002の構造V3の5T4特異的CAR。
[本発明1026]
SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：34、およびSEQ ID NO：41と少なくとも80％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、本発明1003の構造V5の5T4特異的CAR。
[本発明1027]
SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：31、およびSEQ ID NO：37と少なくとも80％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、本発明1004の構造V1の5T4特異的CAR。
[本発明1028]
SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：32、およびSEQ ID NO：38と少なくとも80％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、本発明1005の構造V2の5T4特異的CAR。
[本発明1029]
SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：34、およびSEQ ID NO：40と少なくとも80％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、本発明1006の構造V4の5T4特異的CAR。
[本発明1030]
SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：36、およびSEQ ID NO：42と少なくとも80％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、本発明1007の構造V6の5T4特異的CAR。
[本発明1031]
シグナルペプチドをさらに含む、本発明1001〜1030のいずれかの5T4特異的CAR。
[本発明1032]
シグナルペプチドがSEQ ID NO：1またはSEQ ID NO：2と少なくとも80％の配列同一性を有する、本発明1031の5T4特異的CAR。
[本発明1033]
本発明1001〜1032のいずれかのキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド。
[本発明1034]
本発明1033の核酸を含む発現ベクター。
[本発明1035]
本発明1001〜1032のいずれかの5T4特異的キメラ抗原受容体を細胞表面膜に発現する、操作された免疫細胞。
[本発明1036]
炎症性Tリンパ球、細胞傷害性Tリンパ球、制御性Tリンパ球、またはヘルパーTリンパ球に由来する、本発明1035の操作された免疫細胞。
[本発明1037]
NK細胞に由来する、本発明1035の操作された免疫細胞。
[本発明1038]
治療において使用するための、本発明1035〜1037のいずれかの操作された細胞。
[本発明1039]
ヒトの治療において使用するための、本発明1035〜1038のいずれかの操作された細胞。
[本発明1040]
状態が5T4発現細胞を特徴とする前悪性または悪性の癌状態である、治療において使用するための本発明1035〜1039のいずれかの操作された細胞。
[本発明1041]
状態が、過剰量の5T4発現細胞を特徴とする状態である、治療において使用するための本発明1035〜1040のいずれかの操作された細胞。
[本発明1042]
状態が血液癌状態である、治療において使用するための本発明1035〜1041のいずれかの操作された細胞。
[本発明1043]
血液癌状態が白血病である、治療において使用するための本発明1035〜1042のいずれかの操作された細胞。
[本発明1044]
血液癌状態が小児前駆B細胞急性リンパ芽球性白血病である、治療において使用するための本発明1035〜1043のいずれかの操作された細胞。
[本発明1045]
状態が固形腫瘍である、治療において使用するための本発明1035〜1041のいずれかの操作された細胞。
[本発明1046]
腫瘍が、胃、結腸直腸、前立腺、乳房、肺、腎臓、または卵巣の腫瘍である、治療において使用するための本発明1045の操作された細胞。
[本発明1047]
前記免疫細胞においてTCRの発現が抑制されている、本発明1035〜1046のいずれかの操作された細胞。
[本発明1048]
前記免疫細胞において少なくとも1種のMHCタンパク質、好ましくはβ2mまたはHLAの発現が抑制されている、本発明1035〜1047のいずれかの操作された細胞。
[本発明1049]
少なくとも1種の免疫抑制薬または化学療法薬に対する耐性を付与するために変異させた、本発明1035〜1048のいずれかの操作された細胞。
[本発明1050]
癌細胞の傷害を引き起こすために有効な量の本発明1035〜1049のいずれかの操作された細胞と血液癌細胞を接触させる工程を含む、血液癌細胞に傷害を与える方法。
[本発明1051]
（a）免疫細胞を準備する工程、
（b）本発明1001〜1032のいずれかの少なくとも1種の5T4特異的キメラ抗原受容体を該細胞の表面に発現させる工程
を含む、免疫細胞を操作する方法。
[本発明1052]
（a）免疫細胞を準備する工程、
（b）5T4特異的キメラ抗原受容体をコードする少なくとも1種のポリヌクレオチドを該細胞へ導入する工程、
（c）該細胞においてポリヌクレオチドを発現させる工程
を含む、本発明1051の免疫細胞を操作する方法。
[本発明1053]
（a）免疫細胞を準備する工程、
（b）5T4特異的キメラ抗原受容体をコードする少なくとも1種のポリヌクレオチドを該細胞へ導入する工程、
（c）5T4に特異的でない少なくとも1種の他のキメラ抗原受容体を導入する工程
を含む、本発明1051の免疫細胞を操作する方法。
[本発明1054]
（a）本発明1001〜1032のいずれかの5T4特異的キメラ抗原受容体を表面に発現している免疫細胞を準備する工程、
（b）該免疫細胞を患者へ投与する工程
を含む、その必要のある対象を処置する方法。
[本発明1055]
免疫細胞がドナーから提供される、本発明1051〜1054のいずれかの方法。
[本発明1056]
免疫細胞が患者自身から提供される、本発明1051〜1054のいずれかの方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
好ましい態様によると、本発明の5T4特異的CARは、少なくとも80％、好ましくは90％を有するVH鎖およびVL鎖を含み、より好ましくは、細胞外リガンド結合ドメインは、
−SEQ ID NO：48（CDR1）、SEQ ID NO：49（CDR2）、およびSEQ ID NO：50（CDR3）のマウスモノクローナル抗体H8由来のCDRを含むVH鎖、ならびにNO.51（CDR1）、SEQ ID NO：52（CDR2）、およびSEQ ID NO：53（CDR3）のマウスモノクローナル抗体H18由来のCDRを含むVL鎖；または
−SEQ ID NO：54（CDR1）、SEQ ID NO：55（CDR2）、およびSEQ ID NO：56（CDR3）のマウスモノクローナル抗体A1由来のCDRを含むVH鎖、ならびにNO.57（CDR1）、SEQ ID NO：58（CDR2）、およびSEQ ID NO：59（CDR3）のマウスモノクローナル抗体A1由来のCDRを含むVL鎖；または
−SEQ ID NO：60（CDR1）、SEQ ID NO：61（CDR2）、およびSEQ ID NO：62（CDR3）のマウスモノクローナル抗体A2由来のCDRを含むVH鎖、ならびにSEQ ID NO：63（CDR1）、SEQ ID NO：64（CDR2）、およびSEQ ID NO：65（CDR3）のマウスモノクローナル抗体A2由来のCDRを含むVL鎖；または
−SEQ ID NO：66（CDR1）、SEQ ID NO：67（CDR2）、およびSEQ ID NO：68（CDR3）のマウスモノクローナル抗体A3由来のCDRを含むVH鎖、ならびにNO.69（CDR1）、SEQ ID NO：70（CDR2）、およびSEQ ID NO：71（CDR3）のマウスモノクローナル抗体A3由来のCDRを含むVL鎖
を含む。
【国際調査報告】
2017527289.tif 000036
2017527289.tif 000037
2017527289.tif 000038
2017527289.tif 000039
2017527289.tif 000040