(57)【要約】本発明は、向上した熱安定性、向上した熱反応性、及び／または向上した阻害物質耐性といった望ましい特性を有する新規な逆転写酵素（ＲＴ）を提供する。ある特定の実施形態において、本発明は、そのような新規な逆転写酵素を含有するキット、組成物、及び／または反応混合物を使用して、核酸分子（特にｃＤＮＡ分子）の生成、増幅、及び／または配列決定を行う方法を提供する。2017503521.tif 000009
2017503521.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（配列番号２）のＳ６７、Ｔ１９７、及びＥ３０２からなる群より選択されるアミノ酸位置に少なくとも１つの変異を含む、単離された変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
【請求項２】
Ｓ６７Ｒ、Ｓ６７Ｎ、Ｓ６７Ｋ、Ｔ１９７Ａ、Ｔ１９７Ｓ、Ｔ１９７Ｇ、Ｅ３０２Ｋ、Ｅ３０２Ｒ、及びＥ３０２Ｇからなる群より選択される少なくとも１つの変異を含む、請求項１に記載の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
【請求項３】
野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（配列番号２）のＰ５１、Ｅ６９、Ｐ１９６、Ｄ２００、Ｈ２０４、Ｍ２８９、Ｔ３０６、Ｆ３０９、Ｗ３１３、Ｔ３３０、Ｌ４３５、Ｎ４５４、Ｄ５２４、Ｅ５６２、Ｄ５８３、Ｈ５９４、Ｌ６０３、Ｄ６５３、及びＬ６７１からなる群より選択されるアミノ酸位置に少なくとも１つの変異をさらに含む、請求項１に記載の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
【請求項４】
Ｐ５１Ｌ、Ｅ６９Ｋ、Ｐ１９６Ｓ、Ｄ２００Ｎ、Ｈ２０４Ｒ、Ｍ２８９Ｌ、Ｔ３０６Ｋ、Ｆ３０９Ｎ、Ｆ３０９Ｙ、Ｆ３０９Ｉ、Ｗ３１３Ｆ、Ｗ３１３Ｌ、Ｗ３１３Ｃ、Ｔ３３０Ｐ、Ｌ４３５Ｇ、Ｌ４３５Ｖ、Ｌ４３５Ｒ、Ｎ４５４Ｋ、Ｄ５２４Ｇ、Ｅ５６２Ｑ、Ｄ５８３Ｎ、Ｈ５９４Ｑ、Ｌ６０３Ｗ、Ｄ６５３Ｎ、Ｄ６５３Ｈ、及びＬ６７１Ｐからなる群より選択される少なくとも１つの変異を含む、請求項３に記載の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
【請求項５】
野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（配列番号２）のＰ５１、Ｓ６７、Ｅ６９、Ｔ１９７、Ｈ２０４、Ｅ３０２、Ｆ３０９、Ｗ３１３、Ｔ３３０、Ｌ４３５、Ｎ４５４、Ｄ５２４、Ｄ５８３、Ｈ５９４、Ｄ６５３、及びＬ６７１からなる群より選択される各アミノ酸位置に変異を有する、請求項３に記載の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
【請求項６】
以下の変異：Ｐ５１Ｌ、Ｓ６７Ｒ、Ｅ６９Ｋ、Ｔ１９７Ａ、Ｈ２０４Ｒ、Ｅ３０２Ｋ、Ｆ３０９Ｎ、Ｗ３１３Ｆ、Ｔ３３０Ｐ、Ｌ４３５Ｇ、Ｎ４５４Ｋ、Ｄ５２４Ｇ、Ｄ５８３Ｎ、Ｈ５９４Ｑ、Ｄ６５３Ｎ、及びＬ６７１Ｐを含む、請求項５に記載の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
【請求項７】
ＲＮａｓｅ Ｈ活性を欠く、請求項１に記載の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
【請求項８】
以下の特性：
ａ．熱安定性、
ｂ．熱反応性、
ｃ．逆転写酵素阻害物質に対する向上した耐性、
ｄ．難しい鋳型を逆転写する向上した能力、
ｅ．向上した速度、
ｆ．向上した処理能力、
ｇ．向上した特異性、または
ｈ．向上した感受性
のうちの１つ以上を有する、請求項１に記載の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
【請求項９】
熱反応性である、請求項８に記載の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
【請求項１０】
野生型Ｍ−ＭＬＶによって３７℃で５分後に合成される逆転写酵素生成物の量よりも少なくとも５０％多い逆転写酵素生成物を６０℃で５分以内に合成する、請求項１に記載の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
【請求項１１】
野生型Ｍ−ＭＬＶによって３７℃で５分後に合成される逆転写酵素生成物の量よりも少なくとも７５％多い逆転写酵素生成物を６０℃で５分以内に合成する、請求項１に記載の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
【請求項１２】
野生型Ｍ−ＭＬＶによって３７℃で５分後に合成される逆転写酵素生成物の量よりも少なくとも１００％多い逆転写酵素生成物を６０℃で５分以内に合成する、請求項１に記載の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
【請求項１３】
野生型Ｍ−ＭＬＶによって３７℃で５分後に合成される逆転写酵素生成物の量よりも少なくとも２００％多い逆転写酵素生成物を６０℃で５分以内に合成する、請求項１に記載の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
【請求項１４】
前記野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素の逆転写酵素活性と比較して向上した６０℃の反応温度における逆転写酵素活性を示す、請求項１に記載の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
【請求項１５】
前記向上した逆転写酵素活性が、野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素活性と比較して少なくとも５０％高い、請求項１４に記載の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
【請求項１６】
前記向上した逆転写酵素活性が、野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素活性と比較して少なくとも７５％高い、請求項１４に記載の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
【請求項１７】
前記向上した逆転写酵素活性が、野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素活性と比較して少なくとも１００％高い、請求項１４に記載の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
【請求項１８】
前記向上した逆転写酵素活性が、野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素活性と比較して少なくとも２００％高い、請求項１４に記載の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
【請求項１９】
野生型Ｍ−ＭＬＶ（配列番号２）のＰ５１、Ｅ６９、Ｐ１９６、Ｄ２００、Ｈ２０４、Ｍ２８９、Ｔ３０６、Ｆ３０９、Ｗ３１３、Ｔ３３０、Ｌ４３５、Ｎ４５４、Ｄ５２４、Ｅ５６２、Ｄ５８３、Ｈ５９４、Ｌ６０３、Ｄ６５３、及びＬ６７１からなる群より選択されるアミノ酸位置に少なくとも６つの変異を含む、単離された変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
【請求項２０】
Ｐ５１Ｌ、Ｅ６９Ｋ、Ｐ１９６Ｓ、Ｄ２００Ｎ、Ｈ２０４Ｒ、Ｍ２８９Ｌ、Ｔ３０６Ｋ、Ｆ３０９Ｎ、Ｆ３０９Ｙ、Ｆ３０９Ｉ、Ｗ３１３Ｆ、Ｗ３１３Ｌ、Ｗ３１３Ｃ、Ｔ３３０Ｐ、Ｌ４３５Ｇ、Ｌ４３５Ｖ、Ｌ４３５Ｒ、Ｎ４５４Ｋ、Ｄ５２４Ｇ、Ｅ５６２Ｑ、Ｄ５８３Ｎ、Ｈ５９４Ｑ、Ｌ６０３Ｗ、Ｄ６５３Ｎ、Ｄ６５３Ｈ、及びＬ６７１Ｐからなる群より選択される少なくとも６つの変異を含む、請求項１９に記載の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
【請求項２１】
野生型Ｍ−ＭＬＶ（配列番号２）のＳ６７、Ｔ１９７、及びＥ３０２からなる群より選択されるアミノ酸位置に少なくとも１つの変異をさらに含む、請求項１９に記載の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
【請求項２２】
前記逆転写酵素が、Ｓ６７Ｒ、Ｓ６７Ｎ、Ｓ６７Ｋ、Ｔ１９７Ａ、Ｔ１９７Ｓ、Ｔ１９７Ｇ、Ｅ３０２Ｋ、Ｅ３０２Ｒ、及びＥ３０２Ｇからなる群より選択される少なくとも１つの変異を含む、請求項２１に記載の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
【請求項２３】
ＲＮａｓｅ Ｈ活性を欠く、請求項１９に記載の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
【請求項２４】
前記向上した逆転写酵素活性が、
ａ．向上した熱安定性、
ｂ．向上した熱反応性、
ｃ．逆転写酵素阻害物質に対する向上した耐性、
ｄ．難しい鋳型を逆転写する向上した能力、
ｅ．向上した速度、
ｆ．向上した処理能力、
ｇ．向上した特異性、及び
ｈ．向上した感受性、
のうちの１つ以上を含む、請求項１９に記載の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
【請求項２５】
熱反応性である、請求項２４に記載の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
【請求項２６】
野生型Ｍ−ＭＬＶによって３７℃で５分後に合成される逆転写酵素生成物の量よりも少なくとも５０％多い逆転写酵素生成物を６０℃で５分以内に合成する、請求項１９に記載の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
【請求項２７】
野生型Ｍ−ＭＬＶによって３７℃で５分後に合成される逆転写酵素生成物の量よりも少なくとも７５％多い逆転写酵素生成物を６０℃で５分以内に合成する、請求項１９に記載の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
【請求項２８】
野生型Ｍ−ＭＬＶによって３７℃で５分後に合成される逆転写酵素生成物の量よりも少なくとも１００％多い逆転写酵素生成物を６０℃で５分以内に合成する、請求項１９に記載の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
【請求項２９】
野生型Ｍ−ＭＬＶによって３７℃で５分後に合成される逆転写酵素生成物の量よりも少なくとも２００％多い逆転写酵素生成物を６０℃で５分以内に合成する、請求項１９に記載の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
【請求項３０】
前記野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素の逆転写酵素活性と比較して向上した６０℃の反応温度における逆転写酵素活性を示す、請求項１９に記載の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
【請求項３１】
前記向上した逆転写酵素活性が、野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素活性と比較して少なくとも５０％高い、請求項１９に記載の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
【請求項３２】
前記向上した逆転写酵素活性が、野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素活性と比較して少なくとも７５％高い、請求項１９に記載の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
【請求項３３】
前記向上した逆転写酵素活性が、野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素活性と比較して少なくとも１００％高い、請求項１９に記載の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
【請求項３４】
前記向上した逆転写酵素活性が、野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素活性と比較して少なくとも２００％高い、請求項１９に記載の前記変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素。
【請求項３５】
配列番号４に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、単離された変異型逆転写酵素。
【請求項３６】
配列番号４を含む、請求項３５に記載の前記変異型逆転写酵素。
【請求項３７】
配列番号４からなる、請求項３５に記載の前記変異型逆転写酵素。
【請求項３８】
６０℃で熱安定性である、請求項３５に記載の前記変異型逆転写酵素。
【請求項３９】
６０℃で少なくとも５分間熱安定性である、請求項３５に記載の前記変異型逆転写酵素。
【請求項４０】
６０℃で少なくとも５分間熱反応性である、請求項３５に記載の前記変異型逆転写酵素。
【請求項４１】
６０℃で少なくとも１５分間熱反応性である、請求項４０に記載の前記変異型逆転写酵素。
【請求項４２】
野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素と比較して熱安定性を向上させるかまたは強化するように変異している、単離されたＭ−ＭＬＶ逆転写酵素であって、
ａ．Ｓ６７Ｒ、
ｂ．Ｔ１９７Ａ、及び
ｃ．Ｅ３０２Ｋ
からなる群より選択される少なくとも１つの変異を含む、前記単離されたＭ−ＭＬＶ逆転写酵素。
【請求項４３】
ａ．Ｐ５１Ｌ、
ｂ．Ｅ６９Ｋ、
ｃ．Ｈ２０４Ｒ、
ｄ．Ｆ３０９Ｎ、
ｅ．Ｗ３１３Ｆ、
ｆ．Ｔ３３０Ｐ、
ｇ．Ｌ４３５Ｇ、
ｈ．Ｎ４５４Ｋ、
ｉ．Ｄ５２４Ｇ、
ｊ．Ｄ５８３Ｎ、
ｋ．Ｈ５９４Ｑ、
ｌ．Ｄ６５３Ｎ、及び
ｍ．Ｌ６７１Ｐ
からなる群より選択される少なくとも１つの変異をさらに含む、請求項４２に記載の前記逆転写酵素。
【請求項４４】
４５℃に１分間加熱した後に少なくとも５０％の逆転写酵素活性を保持する、請求項４２に記載の前記逆転写酵素。
【請求項４５】
５０℃に１分間加熱した後に少なくとも５０％の逆転写酵素活性を保持する、請求項４２に記載の前記逆転写酵素。
【請求項４６】
５５℃に１分間加熱した後に少なくとも５０％の逆転写酵素活性を保持する、請求項４２に記載の前記逆転写酵素。
【請求項４７】
６０℃に１分間加熱した後に少なくとも５０％の逆転写酵素活性を保持する、請求項４２に記載の前記逆転写酵素。
【請求項４８】
６０℃に１分間加熱した後に少なくとも７０％の逆転写酵素活性を保持する、請求項４２に記載の前記逆転写酵素。
【請求項４９】
６０℃に１分間加熱した後に少なくとも８０％の逆転写酵素活性を保持する、請求項４２に記載の前記逆転写酵素。
【請求項５０】
６０℃に１分間加熱した後に少なくとも９０％の逆転写酵素活性を保持する、請求項４２に記載の前記逆転写酵素。
【請求項５１】
５０℃に５分間加熱した後に少なくとも５０％の逆転写酵素活性を保持する、請求項４２に記載の前記逆転写酵素。
【請求項５２】
５０℃に１５分間加熱した後に少なくとも５０％の逆転写酵素活性を保持する、請求項４２に記載の前記逆転写酵素。
【請求項５３】
５０℃に６０分間加熱した後に少なくとも５０％の逆転写酵素活性を保持する、請求項４２に記載の前記逆転写酵素。
【請求項５４】
野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素と比較して熱安定性を向上させるかまたは強化するように変異している、単離されたＭ−ＭＬＶ逆転写酵素であって、
ａ．Ｐ５１Ｌ、
ｂ．Ｅ６９Ｋ、
ｃ．Ｈ２０４Ｒ、
ｄ．Ｆ３０９Ｎ、
ｅ．Ｗ３１３Ｆ、
ｆ．Ｔ３３０Ｐ、
ｇ．Ｌ４３５Ｇ、
ｈ．Ｎ４５４Ｋ、
ｉ．Ｄ５２４Ｇ、
ｊ．Ｄ５８３Ｎ、
ｋ．Ｈ５９４Ｑ、
ｌ．Ｄ６５３Ｎ、及び
ｍ．Ｌ６７１Ｐ
からなる群より選択される少なくとも６つの変異を含む、前記単離されたＭ−ＭＬＶ逆転写酵素。
【請求項５５】
ａ．Ｓ６７Ｒ、
ｂ．Ｔ１９７Ａ、及び
ｃ．Ｅ３０２Ｋ
からなる群より選択される少なくとも１つの変異をさらに含む、請求項５４に記載の前記逆転写酵素。
【請求項５６】
４５℃に１分間加熱した後に少なくとも５０％の逆転写酵素活性を保持する、請求項５４に記載の前記逆転写酵素。
【請求項５７】
５０℃に１分間加熱した後に少なくとも５０％の逆転写酵素活性を保持する、請求項５４に記載の前記逆転写酵素。
【請求項５８】
５５℃に１分間加熱した後に少なくとも５０％の逆転写酵素活性を保持する、請求項５４に記載の前記逆転写酵素。
【請求項５９】
６０℃に１分間加熱した後に少なくとも５０％の逆転写酵素活性を保持する、請求項５４に記載の前記逆転写酵素。
【請求項６０】
６０℃に１分間加熱した後に少なくとも７０％の逆転写酵素活性を保持する、請求項５４に記載の前記逆転写酵素。
【請求項６１】
６０℃に１分間加熱した後に少なくとも８０％の逆転写酵素活性を保持する、請求項５４に記載の前記逆転写酵素。
【請求項６２】
６０℃に１分間加熱した後に少なくとも９０％の逆転写酵素活性を保持する、請求項５４に記載の前記逆転写酵素。
【請求項６３】
５０℃に５分間加熱した後に少なくとも５０％の逆転写酵素活性を保持する、請求項５４に記載の前記逆転写酵素。
【請求項６４】
５０℃に１５分間加熱した後に少なくとも５０％の逆転写酵素活性を保持する、請求項５４に記載の前記逆転写酵素。
【請求項６５】
５０℃に６０分間加熱した後に少なくとも５０％の逆転写酵素活性を保持する、請求項５４に記載の前記逆転写酵素。
【請求項６６】
６０℃で５分以内に少なくとも７．５ｋｂのｃＤＮＡを生成することができる、単離された変異型逆転写酵素。
【請求項６７】
６０℃で１５分以内に少なくとも９．５ｋｂのｃＤＮＡを生成することができる、単離された変異型逆転写酵素。
【請求項６８】
６０℃で少なくとも５分間熱安定性である、単離された変異型逆転写酵素。
【請求項６９】
６０℃で少なくとも１５分間熱安定性である、請求項６８に記載の前記変異型逆転写酵素。
【請求項７０】
６０℃で少なくとも３０分間熱安定性である、請求項６８に記載の前記変異型逆転写酵素。
【請求項７１】
６０℃で少なくとも５分間熱反応性である、単離された変異型逆転写酵素。
【請求項７２】
６０℃で少なくとも１５分間熱反応性である、請求項７１に記載の前記変異型逆転写酵素。
【請求項７３】
６０℃で少なくとも３０分間熱反応性である、請求項７１に記載の前記変異型逆転写酵素。
【請求項７４】
変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素である、請求項６６〜７３のいずれか１項に記載の前記変異型逆転写酵素。
【請求項７５】
変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素と緩衝液とを含む、核酸合成のための組成物であって、前記変異型逆転写酵素が、野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（配列番号２）の配列に対応するアミノ酸位置に少なくとも１つの変異を含み、少なくとも１つの前記アミノ酸位置が、Ｓ６７、Ｔ１９７、及びＥ３０２からなる群より選択される、前記組成物。
【請求項７６】
１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のＤＮＡポリメラーゼ、１つ以上の界面活性剤、１つ以上のプライマー、１つ以上のホットスタート用成分、及び１つ以上の停止剤からなる群より選択される１つ以上の構成要素をさらに含む、請求項７５に記載の前記組成物。
【請求項７７】
前記停止剤がジデオキシヌクレオチドである、請求項７６に記載の前記組成物。
【請求項７８】
変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素と緩衝液とを含む、核酸合成のための組成物であって、前記変異型逆転写酵素が、野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（配列番号２）の配列に対応するアミノ酸位置に少なくとも６つの変異を含み、少なくとも６つの前記アミノ酸位置が、Ｐ５１、Ｅ６９、Ｈ２０４、Ｆ３０９、Ｗ３１３、Ｔ３３０、Ｌ４３５、Ｎ４５４、Ｄ５２４、Ｄ５８３、Ｈ５９４、Ｄ６５３、及びＬ６７１からなる群より選択される、前記組成物。
【請求項７９】
１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のＤＮＡポリメラーゼ、１つ以上の界面活性剤、１つ以上のプライマー、１つ以上のホットスタート用成分、及び１つ以上の停止剤からなる群より選択される１つ以上の構成要素をさらに含む、請求項７８に記載の前記組成物。
【請求項８０】
前記停止剤がジデオキシヌクレオチドである、請求項７９に記載の前記組成物。
【請求項８１】
変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素と緩衝液とを含む、核酸合成のための組成物であって、前記変異型逆転写酵素が、配列番号４に少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、前記組成物。
【請求項８２】
１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のＤＮＡポリメラーゼ、１つ以上の界面活性剤、１つ以上のプライマー、１つ以上のホットスタート用成分、及び１つ以上の停止剤からなる群より選択される１つ以上の構成要素をさらに含む、請求項８１に記載の前記組成物。
【請求項８３】
前記停止剤がジデオキシヌクレオチドである、請求項８２に記載の前記組成物。
【請求項８４】
野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（配列番号２）の配列に対応するアミノ酸位置に少なくとも１つの変異を有する変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素の使用を含む、核酸合成のための方法であって、少なくとも１つの前記アミノ酸位置が、Ｓ６７、Ｔ１９７、及びＥ３０２からなる群より選択される、前記方法。
【請求項８５】
１つ以上の核酸分子の逆転写のための方法であって、
ａ．１つ以上の核酸鋳型を１つ以上の逆転写酵素とともに含む混合物を調製する工程と、
ｂ．前記１つ以上の核酸鋳型の全てまたは一部分に相補的な１つ以上の第１の核酸分子を作製するのに十分な条件下で、前記混合物をインキュベートする工程と、を含み、
前記１つ以上の逆転写酵素が、野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（配列番号２）の配列に対応するアミノ酸位置に少なくとも１つの変異を含み、少なくとも１つの前記アミノ酸位置が、Ｓ６７、Ｔ１９７、及びＥ３０２からなる群より選択される、前記方法。
【請求項８６】
前記核酸鋳型が、メッセンジャーＲＮＡ分子、またはｍＲＮＡ分子の集団である、請求項８５に記載の前記方法。
【請求項８７】
前記１つ以上の第１の核酸分子の全てまたは一部分に相補的な１つ以上の第２の核酸分子を作製するのに十分な条件下で、前記１つ以上の第１の核酸分子をインキュベートする工程をさらに含む、請求項８５に記載の前記方法。
【請求項８８】
前記インキュベートする工程が約６０℃の温度で行われる、請求項８５に記載の前記方法。
【請求項８９】
１つ以上の核酸分子を増幅させるための方法であって、
ａ．１つ以上の核酸鋳型を、１つ以上の逆転写酵素及び１つ以上のＤＮＡポリメラーゼと混合する工程と、
ｂ．前記１つ以上の鋳型の全てまたは一部分に相補的な１つ以上の核酸分子を増幅させるのに十分な条件下で、前記混合物をインキュベートする工程と、を含み、
前記１つ以上の逆転写酵素が、野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（配列番号２）の配列に対応するアミノ酸位置に少なくとも１つの変異を含み、少なくとも１つの前記アミノ酸位置が、Ｓ６７、Ｔ１９７、及びＥ３０２からなる群より選択される、前記方法。
【請求項９０】
前記インキュベートする工程が約６０℃の温度で行われる、請求項８９に記載の前記方法。
【請求項９１】
前記１つ以上の鋳型の全てまたは一部分に相補的な前記増幅された核酸分子の全てまたは一部分のヌクレオチド配列を決定する工程をさらに含む、請求項８９に記載の前記方法。
【請求項９２】
野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（配列番号２）の配列に対応するアミノ酸位置に少なくとも１つの変異を有する変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素の使用を含む、核酸合成のための方法であって、少なくとも６つの前記アミノ酸位置が、Ｐ５１、Ｅ６９、Ｈ２０４、Ｆ３０９、Ｗ３１３、Ｔ３３０、Ｌ４３５、Ｎ４５４、Ｄ５２４、Ｄ５８３、Ｈ５９４、Ｄ６５３、及びＬ６７１からなる群より選択される、前記方法。
【請求項９３】
１つ以上の核酸分子の逆転写のための方法であって、
ａ．１つ以上の核酸鋳型を１つ以上の逆転写酵素とともに含む混合物を調製する工程と、
ｂ．前記１つ以上の核酸鋳型の全てまたは一部分に相補的な１つ以上の第１の核酸分子を作製するのに十分な条件下で、前記混合物をインキュベートする工程と、を含み、
前記１つ以上の逆転写酵素が、野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（配列番号２）の配列に対応するアミノ酸位置に少なくとも６つの変異を含み、少なくとも６つの前記アミノ酸位置が、Ｐ５１、Ｅ６９、Ｈ２０４、Ｆ３０９、Ｗ３１３、Ｔ３３０、Ｌ４３５、Ｎ４５４、Ｄ５２４、Ｄ５８３、Ｈ５９４、Ｄ６５３、及びＬ６７１からなる群より選択される、前記方法。
【請求項９４】
前記核酸鋳型が、メッセンジャーＲＮＡ分子、またはｍＲＮＡ分子の集団である、請求項９３に記載の前記方法。
【請求項９５】
前記１つ以上の第１の核酸分子の全てまたは一部分に相補的な１つ以上の第２の核酸分子を作製するのに十分な条件下で、前記１つ以上の第１の核酸分子をインキュベートする工程をさらに含む、請求項９３に記載の前記方法。
【請求項９６】
前記インキュベートする工程が約６０℃の温度で行われる、請求項９３に記載の前記方法。
【請求項９７】
１つ以上の核酸分子を増幅させるための方法であって、
ａ．１つ以上の核酸鋳型を、１つ以上の逆転写酵素及び１つ以上のＤＮＡポリメラーゼと混合する工程と、
ｂ．前記１つ以上の鋳型の全てまたは一部分に相補的な１つ以上の核酸分子を増幅させるのに十分な条件下で、前記混合物をインキュベートする工程と、を含み、
前記１つ以上の逆転写酵素が、野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（配列番号２）の配列に対応するアミノ酸位置に少なくとも６つの変異を含み、少なくとも６つの前記アミノ酸位置が、Ｐ５１、Ｅ６９、Ｈ２０４、Ｆ３０９、Ｗ３１３、Ｔ３３０、Ｌ４３５、Ｎ４５４、Ｄ５２４、Ｄ５８３、Ｈ５９４、Ｄ６５３、及びＬ６７１からなる群より選択される、前記方法。
【請求項９８】
前記インキュベートする工程が約６０℃の温度で行われる、請求項９７に記載の前記方法。
【請求項９９】
前記１つ以上の鋳型の全てまたは一部分に相補的な前記増幅された核酸分子の全てまたは一部分のヌクレオチド配列を決定する工程をさらに含む、請求項９７に記載の前記方法。
【請求項１００】
１つ以上のパッケージ化格納容器に変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素を含むキットであって、前記変異型逆転写酵素が、野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（配列番号２）の配列に対応するアミノ酸位置に少なくとも１つの変異を含み、少なくとも１つの前記アミノ酸位置が、Ｓ６７、Ｔ１９７、及びＥ３０２からなる群より選択される、前記キット。
【請求項１０１】
１つ以上のパッケージ化格納容器に変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素を含むキットであって、前記変異型逆転写酵素が、野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（配列番号２）の配列に対応するアミノ酸位置に少なくとも６つの変異を含み、少なくとも６つの前記アミノ酸位置が、Ｐ５１、Ｅ６９、Ｈ２０４、Ｆ３０９、Ｗ３１３、Ｔ３３０、Ｌ４３５、Ｎ４５４、Ｄ５２４、Ｄ５８３、Ｈ５９４、Ｄ６５３、及びＬ６７１からなる群より選択される、前記キット。
【請求項１０２】
逆転写酵素活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸であって、前記ポリペプチドが、配列番号４に少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記単離された核酸。
【請求項１０３】
請求項１０２に記載の前記核酸を含む、ベクター。
【請求項１０４】
請求項１０２に記載の前記核酸に機能的に連結されたプロモーターを含む、発現ベクター。
【請求項１０５】
請求項１０２に記載の前記核酸を含む、宿主細胞。
【請求項１０６】
請求項３５に記載の前記変異型逆転写酵素を含む、宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸分子の逆転写のための、逆転写酵素（ＲＴ）、ならびに新規な酵素を含む組成物、方法、及びキットを提供する。
【背景技術】
【０００２】
逆転写酵素は、ＲＮＡをＤＮＡに変換する、生物工学における基礎的な酵素である。これらの酵素は、生物の基本的過程の多くを見出すために使用されている有益な研究ツールの基礎を成している。分子診断に関して、これらの酵素は、そのような診断の重要な構成要素であり、したがって、例えば癌を含む多数の疾患の診断及び管理を容易にする新しいツールである。このように、改善された特性、例えば改善された効率を有する改善された逆転写酵素は、分子診断の向上につながるため、そのような改善された酵素が望ましい。
【０００３】
逆転写の効率に影響を及ぼす要因は、二次構造を形成するＲＮＡの能力である。そのような二次構造は、例えば、ＲＮＡ分子の領域が、ハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡを形成するのに十分な相補性を有する場合に、形成され得る。一般に、ＲＮＡ二次構造の形成は、ＲＮＡ分子を含有する溶液の温度を上昇させると低減され得る。したがって、多くの事例では、３７℃を超える温度でＲＮＡを逆転写することが望ましい。しかしながら、逆転写酵素は、通常、３７℃を上回る温度（例えば、５０℃）でインキュベートすると、失活する。
【０００４】
逆転写酵素を用いる方法（そのような酵素を用いた分子診断方法を含む）の精度は、向上した熱安定性及び／または熱反応性を有する逆転写酵素の発見によって改善されるであろう。そのような酵素が利用可能となれば、精度を向上させるために他の熱安定性酵素に用いられている方法を、熱安定性逆転写酵素を用いた新しい方法の想起に用いることができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方法の精度を向上させるために、「ホットスタート」アプローチが熱安定性ポリメラーゼとともに用いられている。一例では、米国特許第５，３３８，６７１号（特許文献1）には、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに特異的な抗体を用いて低温（例えば、７０℃未満）でのＤＮＡポリメラーゼ活性を阻害することが記載されている。シトラコン酸無水物による化学処理は、ホットスタートＰＣＲが達成されている別の方法である（例えば、米国特許第５，７７３，２５８号（特許文献2）及び米国特許第５，６７７，１５２号（特許文献3）を参照されたい）。そのようなホットスタートアプローチを逆転写に適用することは、困難であることが示されている。これは、例えば、多くの逆転写酵素が熱安定性でないことに起因する。
【０００５】
さらに、核酸が抽出される生体試料は、逆転写に阻害性である追加の化合物を含有していることが多い。土壌、植物、及び糞便中のフミン酸、血液中のヘマチン、血清中の免疫グロブリンＧ、ならびにヘパリン及びクエン酸等の種々の血液抗凝固薬は、全て、そのような阻害物質の例である。そのような阻害物質は、核酸の抽出及び生成プロセス中に完全に除去することができず、そのため、逆転写の結果として生成されるｃＤＮＡ生成物の減少に反映されるように、下流の核酸に負の影響を及ぼす。
【０００６】
したがって、上述の欠点のうちのいくつかを克服する、改善された逆転写酵素、ならびにそのような逆転写酵素を含む組成物、キット、及び方法が、本発明によって達成される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５，３３８，６７１号
【特許文献２】米国特許第５，７７３，２５８号
【特許文献３】米国特許第５，６７７，１５２号
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、改善された特性を有する変異型逆転写酵素、ならびにそのような新規な酵素を含む組成物、キット、及び方法を提供する。したがって、本発明は、ある特定の実施形態において、熱安定性の向上、熱反応性の向上、及び／または速度の向上、ならびに阻害耐性の向上、例えば、ポリフェノール様化合物に対する耐性、難しいＲＮＡ鋳型によるｃＤＮＡ生成の向上、及び特異性の向上といった追加の有益な特性を呈する、変異型逆転写酵素を提供し、そのような逆転写酵素を使用して、核酸分子、例えば、ｍＲＮＡ分子を逆転写、増幅、または配列決定すること等による、生成方法を提供する。例示的な実施形態において、本発明の変異型逆転写酵素は、前述の特性のうちの２つ以上を含む。他の有益な特性を有する変異型逆転写酵素が本明細書に提供され、そのうちのいくつかには、さらなる前述の特徴のうちの１つ以上が含まれる。ある特定の実施形態において、本発明は、本明細書に提供される変異型逆転写酵素を含む、保管組成物及び反応混合物といった、キット及び組成物を提供する。
【０００９】
ある特定の例示的な実施形態において、変異型逆転写酵素は、特に、高い温度で行われる逆転写に関して、逆転写効率の向上をもたらす。したがって、ある特定の例示的な実施形態において、本発明は、核酸合成反応中の酵素の熱安定性及び／熱反応性を向上させる、１つ以上のアミノ酸の変化がなされた変異型逆転写酵素を提供する。
【００１０】
一部の実施形態では、本発明は、マロニーマウス白血病ウイルス（Ｍａｌｏｎｅｙ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ）（Ｍ−ＭＬＶ）逆転写酵素に由来する変異型逆転写酵素を対象とする。具体的には、本発明は、配列番号２で表されるＭ−ＭＬＶ逆転写酵素の野生型アミノ酸配列の１つ以上のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基と置換することによって、熱安定性が向上した逆転写酵素を提供する。一部の実施形態において、より高い熱安定性及び／熱反応性（ならびに本明細書に開示される他の特性）を得るための変異または修飾の標的となるアミノ酸位置が、表１に列挙される。例えば、本発明は、Ｐ５１、Ｓ６７、Ｅ６９、Ｔ１９７、Ｈ２０４、Ｅ３０２、Ｆ３０９、Ｗ３１３、Ｔ３３０、Ｌ４３５、Ｎ４５４、Ｄ５２４、Ｄ５８３、Ｈ５９４、Ｄ６５３、及び／またはＬ６７１からなる群より選択される野生型Ｍ−ＭＬＶに対応するアミノ酸位置に特定の変異（またはそれらの組み合わせ）を有する、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素を含む。本発明の好ましい実施形態において、以下の変異、Ｐ５１Ｌ、Ｓ６７Ｒ、Ｅ６９Ｋ、Ｔ１９７Ａ、Ｈ２０４Ｒ、Ｅ３０２Ｋ、Ｆ３０９Ｎ、Ｗ３１３Ｆ、Ｔ３３０Ｐ、Ｌ４３５Ｇ、Ｎ４５４Ｋ、Ｄ５２４Ｇ、Ｄ５８３Ｎ、Ｈ５９４Ｑ、Ｄ６５３Ｎ、及びＬ６７１Ｐの全てを有する、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素が提供される。一部の実施形態では、本発明の逆転写酵素はまた、低減されたか、または実質的に低減された、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を有することが好ましい。
【００１１】
他の種に由来する逆転写酵素の対応するアミノ酸位置の類似または同等の部位が、本明細書に開示される熱安定性及び／または熱反応性逆転写酵素を生成するように変異されてもよい。例えば、一部の実施形態において、本発明は、配列番号４に少なくとも５０％（例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％等）のアミノ酸配列同一性を有する逆転写酵素を提供する。
【００１２】
一部の実施形態において、本発明の変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素は、野生型Ｍ−ＭＬＶと比較すると、少なくとも５０℃（例えば、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、及び７５℃）の反応温度で、向上した逆転写酵素活性を呈する。例えば、一部の実施形態において、５０℃〜６０℃での向上した逆転写酵素活性は、さらに低い反応温度（例えば、３７℃）における野生型Ｍ−ＭＬＶと比較して、少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、または２００％高い。同様に、一部の実施形態において、本発明の逆転写酵素は、５０℃〜６０℃で少なくとも５分間、少なくとも５０％（例えば、５０％、７０％、８０％、９０％等）の逆転写酵素活性を保持する。他の実施形態では、逆転写酵素は、少なくとも５０℃まで少なくとも５分間加熱した後、少なくとも５０％の活性を保持する。同様に、他の実施形態において、本明細書に記載される逆転写酵素は、約７．３〜８．３の範囲のｐＨにおいて少なくとも５０℃まで少なくとも１０分間（例えば、１０分間、１５分間、６０分間等）加熱した後、類似のｐＨ条件下でさらにより低い反応温度（例えば、３７℃）での野生型Ｍ−ＭＬＶと比較して、少なくとも５０％（例えば、５０％、７０％、８０％、９０％等）の活性を保持する。
【００１３】
一部の実施形態では、本発明の逆転写酵素は、約６０℃の反応温度で５分以内に少なくとも７．５ｋｂのｃＤＮＡを生成することができる。他の実施形態では、本発明の逆転写酵素は、約６０℃の反応温度で１５分以内に少なくとも９．５ｋｂのｃＤＮＡを生成することができる。
【００１４】
本発明はまた、本発明の変異型逆転写酵素をコードする遺伝子または核酸分子を含有するＤＮＡ分子（好ましくは、ベクター）、ならびにそのようなＤＮＡ分子を含有する宿主細胞を対象とする。目的の遺伝子または核酸分子を発現させるために、原核生物細胞及び真核生物細胞を含む、多数の宿主を使用することができる。好ましくは、本発明のポリメラーゼを発現させるために、原核生物細胞が使用される。本発明による好ましい原核生物宿主は、大腸菌である。
【００１５】
本発明はまた、本明細書に開示される１つ以上の変異型または修飾型逆転写酵素またはポリペプチドを含む、核酸分子の逆転写に使用するための組成物及び反応混合物を提供する。そのような組成物は、１つ以上のヌクレオチド、好適な緩衝液、及び／または１つ以上のＤＮＡポリメラーゼをさらに含んでもよい。本発明の組成物はまた、１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーまたは停止剤（例えば、ジデオキシヌクレオチド）も含み得る。そのような組成物はまた、グリセロールまたは表面活性剤といった安定化剤も含み得る。そのような組成物は、核酸合成の際に、不要な重合生成物を防止または低減させるために、ホットスタート機序を使用することをさらに含んでもよい。
【００１６】
本発明は、ある特定の実施形態において、増幅反応に使用するための、１つ以上の本発明の逆転写酵素と１つ以上のＤＮＡポリメラーゼとを含む組成物を提供する。そのような組成物は、１つ以上のヌクレオチド及び／または増幅に好適な緩衝液をさらに含んでもよい。本発明の組成物はまた、１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーも含み得る。そのような組成物はまた、グリセロールまたは表面活性剤といった安定化剤も含み得る。そのような組成物は、核酸合成の際に、不要な重合生成物を防止または低減させるために、１つ以上のホットスタート機序を使用することをさらに含んでもよい。
【００１７】
本発明はさらに、本明細書に開示される１つ以上の変異型逆転写酵素またはポリペプチドを使用した核酸分子の合成のための方法を提供する。具体的には、本発明は、１つ以上の核酸分子を作製するための方法を対象とし、この方法は、１つ以上の核酸鋳型（好ましくは、１つ以上のＲＮＡ鋳型、最も好ましくは１つ以上のメッセンジャーＲＮＡ鋳型）を１つ以上の本発明の逆転写酵素と混合し、１つ以上の核酸鋳型の全てまたは一部分に相補的な第１の核酸分子（複数可）を作製するのに十分な条件下で、その混合物をインキュベートする工程を含む。一部の実施形態では、第１の核酸分子は、一本鎖ｃＤＮＡである。本発明のこの態様による逆転写に好適な核酸鋳型としては、任意の核酸分子または核酸分子の集団（好ましくはＲＮＡであり、最も好ましくはｍＲＮＡである）、特に、細胞または組織に由来するものが挙げられる。一部の実施形態では、核酸鋳型の細胞源としては、細菌細胞、真菌細胞、植物細胞、及び動物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１８】
ある特定の実施形態において、本発明は、１つ以上の二本鎖核酸分子を作製するための方法を提供する。そのような方法は、（ａ）１つ以上の核酸鋳型（好ましくはＲＮＡまたはｍＲＮＡ、より好ましくはｍＲＮＡ鋳型の集団）を１つ以上の本発明の逆転写酵素と混合する工程、（ｂ）１つ以上の鋳型の全てまたは一部分に相補的な第１の核酸分子（複数可）を作製するのに十分な条件下で、その混合物をインキュベートする工程、ならびに（ｃ）第１の核酸分子（複数可）の全てまたは一部分に相補的な第２の核酸分子（複数可）を作製するのに十分な条件下で、第１の核酸分子（複数可）をインキュベートする工程であって、それによって第１及び第２の核酸分子を含む１つ以上の二本鎖核酸分子を形成する、工程を含む。そのような方法は、１つ以上の二本鎖核酸分子を作製するプロセスの一部として、１つ以上のＤＮＡポリメラーゼの使用を含んでもよい。本発明はまた、そのような二本鎖核酸分子を作製するのに有用な組成物にも関する。そのような組成物は、１つ以上の本発明の逆転写酵素、ならびに場合によっては１つ以上のＤＮＡポリメラーゼ、好適な緩衝液、１つ以上のプライマー、及び／または１つ以上のヌクレオチドを含む。
【００１９】
本発明はまた、核酸分子を増幅させるための方法も提供する。そのような増幅方法には、上述のように生成された二本鎖核酸分子（複数可）を１つ以上のＤＮＡポリメラーゼと混合し、二本鎖核酸分子を増幅させるのに十分な条件下で、その混合物をインキュベートする工程が含まれる。第１の好ましい実施形態において、本発明は、核酸分子を増幅させるための方法に関し、この方法は、（ａ）１つ以上の核酸鋳型（好ましくは１つ以上のＲＮＡまたはｍＲＮＡ鋳型であり、より好ましくはｍＲＮＡ鋳型の集団である）を１つ以上の本発明の逆転写酵素及び１つ以上のＤＮＡポリメラーゼと混合する工程、ならびに（ｂ）１つ以上の鋳型の全てまたは一部分に相補的な核酸分子を増幅させるのに十分な条件下で、その混合物をインキュベートする工程を含む。
【００２０】
本発明はまた、１つ以上の核酸分子の逆転写のための方法も対象とし、この方法は、好ましくはＲＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であり、より好ましくはｍＲＮＡ分子の集団である１つ以上の核酸鋳型を、１つ以上の本発明の逆転写酵素と混合し、１つ以上の鋳型の全てまたは一部分に相補的な核酸分子（複数可）を作製するのに十分な条件下で、その混合物をインキュベートする工程を含む。１つ以上の鋳型に相補的な核酸分子（複数可）を作製するために、プライマー（例えば、オリゴ（ｄＴ）プライマー）及び１つ以上のヌクレオチドを、５′から３′の方向での核酸合成に使用することが好ましい。本発明のこの態様による逆転写に好適な核酸分子としては、任意の核酸分子、特に、原核生物細胞または真核生物細胞に由来するものが挙げられる。そのような細胞としては、正常細胞、疾患細胞、形質転換細胞、樹立細胞、前駆細胞、始原細胞、前駆細胞、胎児細胞、胚細胞、細菌細胞、酵母細胞、動物細胞（ヒト細胞を含む）、鳥類細胞、植物細胞等、または植物もしくは動物（例えば、ヒト、ウシ、ブタ、マウス、ヒツジ、ウマ、サル、イヌ、ネコ、ラット、ウサギ、鳥、魚、昆虫等）から単離された組織を挙げることができる。逆転写に好適な核酸分子はまた、ウイルス及び／またはウイルス感染細胞から単離及び／または取得することもできる。
【００２１】
本発明はさらに、核酸分子を本発明の逆転写酵素と接触させることを含む、核酸分子の増幅または配列決定のための方法を提供する。一部の実施形態において、そのような方法は、１つ以上のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む。一部の実施形態において、逆転写反応は、ＲＴ−ＰＣＲのように、ＰＣＲと組み合わされてもよい。
【００２２】
本発明はまた、本発明の逆転写酵素をパッケージ化形式で含む、逆転写のためのキットも提供する。本発明の逆転写のためのキットには、例えば、逆転写酵素、逆転写に必要な任意の従来的な構成要素、例えば、ヌクレオチドプライマー、少なくとも１つのｄＮＴＰ、及び反応緩衝液、ならびに場合によってはＤＮＡポリメラーゼが含まれ得る。
【００２３】
本発明はまた、本発明の方法で使用するためのキットも対象とする。そのようなキットは、核酸分子（一本鎖または二本鎖）の作製、配列決定、または増幅に使用することができる。本発明のキットは、バイアル、チューブ、瓶等といった１つ以上の格納容器を緊密に有する、箱または段ボール箱といった保持手段を含む。本発明のキットのある特定の実施形態において、第１の格納容器は、本発明の逆転写酵素のうちの１つ以上を格納する。本発明のキットはまた、同じかまたは異なる格納容器に、１つ以上のＤＮＡポリメラーゼ（好ましくは熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ）、核酸合成に好適な１つ以上の緩衝液、及び１つ以上のヌクレオチドも含み得る。あるいは、キットの構成要素は、別個の格納容器に分割されてもよい（例えば、各酵素及び／または構成要素毎に１つの格納容器）。本発明のキットはまた、本発明の方法を実行するための説明書またはプロトコルも含み得る。本発明の好ましいキットにおいて、逆転写酵素は、ｃＤＮＡ合成が起こる温度が高くなるように変異されている。本発明の追加の好ましいキットにおいて、格納容器中の酵素（逆転写酵素及び／またはＤＮＡポリメラーゼ）は、作用濃度で存在している。
【００２４】
したがって、上記に詳細に記載されるように、一態様において、変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素が提供される。そのような逆転写酵素は、野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（配列番号２）の配列に対応するアミノ酸位置に少なくとも１つの変異を含み、少なくとも１つのアミノ酸位置は、Ｓ６７、Ｔ１９７、及びＥ３０２から選択される。一部の実施形態では、少なくとも１つの変異は、次のアミノ酸置換変異：（Ｓ６７Ｒ、Ｓ６７Ｎ、またはＳ６７Ｋ）、（Ｔ１９７Ａ、Ｔ１９７Ｓ、またはＴ１９７Ｇ）、及び（Ｅ３０２Ｋ、Ｅ３０２Ｒ、またはＥ３０２Ｇ）から選択される。一部の実施形態では、変異型逆転写酵素は、Ｐ５１、Ｅ６９、Ｐ１９６、Ｄ２００、Ｈ２０４、Ｍ２８９、Ｔ３０６、Ｆ３０９、Ｗ３１３、Ｔ３３０、Ｌ４３５、Ｎ４５４、Ｄ５２４、Ｅ５６２、Ｄ５８３、Ｈ５９４、Ｌ６０３、Ｄ６５３、及びＬ６７１から選択されるアミノ酸位置に少なくとも１つの変異をさらに含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの追加の変異は、以下のアミノ酸置換変異：Ｐ５１Ｌ、Ｅ６９Ｋ、Ｐ１９６Ｓ、Ｄ２００Ｎ、Ｈ２０４Ｒ、Ｍ２８９Ｌ、Ｔ３０６Ｋ、（Ｆ３０９Ｎ、Ｆ３０９Ｙ、またはＦ３０９Ｉ）、（Ｗ３１３Ｆ、Ｗ３１３Ｌ、またはＷ３１３Ｃ）、Ｔ３３０Ｐ、（Ｌ４３５Ｇ、Ｌ４３５Ｖ、またはＬ４３５Ｒ）、Ｎ４５４Ｋ、Ｄ５２４Ｇ、Ｅ５６２Ｑ、Ｄ５８３Ｎ、Ｈ５９４Ｑ、Ｌ６０３Ｗ、（Ｄ６５３ＮまたはＤ６５３Ｈ）、及びＬ６７１Ｐから選択される。
【００２５】
別の態様において、野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（配列番号２）の配列に対応するアミノ酸位置に少なくとも６つの変異を含む変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素が提供され、少なくとも６つのアミノ酸位置は、Ｐ５１、Ｅ６９、Ｐ１９６、Ｄ２００、Ｈ２０４、Ｍ２８９、Ｔ３０６、Ｆ３０９、Ｗ３１３、Ｔ３３０、Ｌ４３５、Ｎ４５４、Ｄ５２４、Ｅ５６２、Ｄ５８３、Ｈ５９４、Ｌ６０３、Ｄ６５３、及びＬ６７１から選択される。一部の実施形態において、少なくとも６つの変異は、以下のアミノ酸置換：Ｐ５１Ｌ、Ｅ６９Ｋ、Ｐ１９６Ｓ、Ｄ２００Ｎ、Ｈ２０４Ｒ、Ｍ２８９Ｌ、Ｔ３０６Ｋ、（Ｆ３０９Ｎ、Ｆ３０９Ｙ、またはＦ３０９Ｉ）、（Ｗ３１３Ｆ、Ｗ３１３Ｌ、またはＷ３１３Ｃ）、Ｔ３３０Ｐ、（Ｌ４３５Ｇ、Ｌ４３５Ｖ、またはＬ４３５Ｒ）、Ｎ４５４Ｋ、Ｄ５２４Ｇ、Ｅ５６２Ｑ、Ｄ５８３Ｎ、Ｈ５９４Ｑ、Ｌ６０３Ｗ、（Ｄ６５３ＮまたはＤ６５３Ｈ）、及びＬ６７１Ｐから選択される。一部の実施形態において、変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素は、Ｓ６７、Ｔ１９７、及びＥ３０２から選択されるアミノ酸位置に少なくとも１つの追加の変異をさらに含む。一部の実施形態において、少なくとも１つの追加の変異は、以下のアミノ酸置換：（Ｓ６７Ｒ、Ｓ６７Ｎ、またはＳ６７Ｋ）、（Ｔ１９７Ａ、Ｔ１９７Ｓ、またはＴ１９７Ｇ）、及び（Ｅ３０２Ｋ、Ｅ３０２Ｒ、またはＥ３０２Ｇ）から選択される。
【００２６】
一部の実施形態において、アミノ酸位置：Ｐ５１、Ｓ６７、Ｅ６９、Ｔ１９７、Ｈ２０４、Ｅ３０２、Ｆ３０９、Ｗ３１３、Ｔ３３０、Ｌ４３５、Ｎ４５４、Ｄ５２４、Ｄ５８３、Ｈ５９４、Ｄ６５３、及びＬ６７１のそれぞれに変異を有する、変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素が提供される。一部の実施形態において、変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素は、以下のアミノ酸置換変異：Ｐ５１Ｌ、Ｓ６７Ｒ、Ｅ６９Ｋ、Ｔ１９７Ａ、Ｈ２０４Ｒ、Ｅ３０２Ｋ、Ｆ３０９Ｎ、Ｗ３１３Ｆ、Ｔ３３０Ｐ、Ｌ４３５Ｇ、Ｎ４５４Ｋ、Ｄ５２４Ｇ、Ｄ５８３Ｎ、Ｈ５９４Ｑ、Ｄ６５３Ｎ、及びＬ６７１Ｐのそれぞれを含む。
【００２７】
一部の実施形態において、変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素は、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を欠く。さらなる他の実施形態では、変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素は、少なくとも５０℃の反応温度で、対応する野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素の逆転写酵素活性と比較して向上した逆転写酵素活性を呈する。一部の実施形態において、変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素は、野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素活性よりも少なくとも１０％（例えば、１０％、２５％、５０％、７５％、８０％、９０％、１００％、２００％等）高い、向上した逆転写酵素活性を呈する。一部の実施形態において、変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素は、６０℃で５分後に逆転写酵素活性を有し、これは、３７℃で５分後の野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素の逆転写酵素活性の少なくとも２５％（例えば、５０％、１００％、２００％等）である。一部の実施形態において、変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素は、以下の特性：向上した熱安定性、向上した熱反応性、逆転写酵素阻害物質に対する向上した耐性、難しい鋳型を逆転写する向上した能力、向上した速度／処理能力、ならびに向上した特異性（例えば、プライマーのない逆転写の減少）のうちの１つ以上を呈する。
【００２８】
別の態様において、配列番号４に少なくとも５０％（例えば、５０％、６０％、７０５、８０％、９０％、９５％等）のアミノ酸配列同一性を有する、変異型逆転写酵素が提供される。一部の実施形態において、変異型逆転写酵素は、配列番号４を含む。一部の実施形態において、変異型逆転写酵素は、配列番号４からなる。
【００２９】
一部の実施形態において、変異型逆転写酵素は、５０℃〜６５℃（例えば、５０℃、５２℃、５５℃、５８℃、６０℃、及び６２℃）の温度で熱安定性である。一部の実施形態において、それらは、５０℃〜６５℃（例えば、５５℃、６０℃等）の温度で少なくとも１分間（例えば、１分間、５分間、１５分間、６０分間、１２０分間等）熱安定性である。一部の実施形態において、変異型逆転写酵素は、５０℃〜６５℃（例えば、５０℃、５２℃、５５℃、５８℃、６０℃、及び６２℃）の温度で熱反応性である。一部の実施形態において、変異型逆転写酵素は、５０℃〜６５℃（例えば、５５℃、６０℃等）の温度で少なくとも１分間（例えば、１分間、５分間、１５分間、６０分間、１２０分間等）熱反応性である。一部の実施形態において、変異型逆転写酵素は、少なくとも５０℃（例えば、５０℃、５５℃、６０℃、６２℃、６５℃等）まで少なくとも１分間（例えば、１分間、２分間、５分間、１０分間、１５分間等）加熱した後、少なくとも１０％（例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、及び１００％）の逆転写酵素活性を保持する。一部の実施形態において、逆転写酵素は、少なくとも６０℃（例えば、６０℃、６２℃、６５℃等）まで少なくとも１分間（例えば、１分間、２分間、５分間、１０分間、１５分間等）加熱した後、少なくとも１０％（例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％。及び１００％）の逆転写酵素活性を保持する。一部の実施形態において、逆転写酵素は、少なくとも５０℃（例えば、５０℃、５５℃、６０℃、６２℃、６５℃等）まで少なくとも１分間（例えば、１分間、２分間、５分間、１０分間、１５分間等）加熱した後、少なくとも５０％（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、及び１００％）の逆転写酵素活性を保持する。一部の実施形態において、逆転写酵素は、少なくとも５０℃（例えば、５０℃、５５℃、６０℃、６２℃、６５℃）まで少なくとも５分間（例えば、５分間、１０分間、１５分間、３０分間等）加熱した後、少なくとも１０％（例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、及び１００％）の逆転写酵素活性を保持する。
【００３０】
一部の実施形態において、変異型逆転写酵素は、変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素である。他の実施形態において、変異型逆転写酵素は、例えば、鶏痘、イノシシ、コアラ、及びヒヒを含む、他の種から得られた変異型逆転写酵素である。一部の実施形態において、変異型逆転写酵素は、図１Ａ〜１Ｄに列挙されるコンセンサス配列によって表されるもの等、アミノ酸相同性及び同一性の領域を含む。
【００３１】
別の態様において、核酸合成のための組成物が提供される。そのような組成物は、緩衝液と、本明細書に記載される変異型逆転写酵素のうちのいずれかとを含み得る。一部の実施形態において、本組成物は、１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のＤＮＡポリメラーゼ、１つ以上の界面活性剤、１つ以上のプライマー、１つ以上のホットスタート用成分、及び／または１つ以上の停止剤といった、核酸合成に有用な１つ以上の構成要素をさらに含む。一部の実施形態では、停止剤は、ジデオキシヌクレオチドである。
【００３２】
別の態様において、核酸合成（逆転写及び増幅）のための方法が提供される。そのような方法は、本明細書に記載される変異型逆転写酵素のうちのいずれかの使用を含み得る。一部の実施形態において、本方法は、（ａ）１つ以上の核酸鋳型と１つ以上の本明細書に記載される逆転写酵素とを含む混合物を調製する工程、及び（ｂ）１つ以上の核酸鋳型の全てまたは一部分に相補的な１つ以上の第１の核酸分子を作製するのに十分な条件下で、その混合物をインキュベートする工程を含む。
【００３３】
他の実施形態では、本方法は、（ａ）１つ以上の核酸鋳型を、１つ以上の本明細書に記載される逆転写酵素及び１つ以上のＤＮＡポリメラーゼと混合する工程、ならびに（ｂ）１つ以上の鋳型の全てまたは一部分に相補的な１つ以上の核酸分子を増幅させるのに十分な条件下で、その混合物をインキュベートする工程を含む。
【００３４】
一部の実施形態において、核酸鋳型は、メッセンジャーＲＮＡ分子、またはｍＲＮＡ分子の集団である。一部の実施形態において、本方法は、１つ以上の第１の核酸分子の全てまたは一部分に相補的な１つ以上の第２の核酸分子を作製するのに十分な条件下で、１つ以上の第１の核酸分子をインキュベートする工程を含む。他の実施形態では、本方法は、１つ以上の鋳型の全てまたは一部分に相補的である、増幅された核酸分子の全てまたは一部分のヌクレオチド配列を決定する工程をさらに含む。記載される方法の一部の実施形態において、インキュベートする工程は約６０℃の温度で行われる。
【００３５】
別の態様では、１つ以上のパッケージ化格納容器に本明細書に記載される変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素を含む、キットが提供される。
【００３６】
なおも別の態様では、本明細書に記載される変異型逆転写酵素をコードする単離された核酸が提供される。
【００３７】
別の態様において、本明細書に記載される変異型逆転写酵素をコードする核酸を含むベクターが提供される。一実施形態において、本明細書に記載される変異型逆転写酵素をコードする核酸に機能的に連結されたプロモーターを含む発現ベクターが提供される。
【００３８】
別の態様において、本明細書に記載される変異型逆転写酵素をコードする核酸を含む宿主細胞が提供される。別の態様において、本明細書に記載される逆転写酵素活性を有する変異型逆転写酵素またはポリペプチドを含む宿主細胞が提供される。
【００３９】
本発明の他の好ましい実施形態は、添付の図面及び本発明の説明、ならびに特許請求の範囲を踏まえると、当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
本発明のこれら及び他の特徴、態様、及び利点は、以下の説明及び添付の特許請求の範囲、ならびに添付の図面を参照することでより良好に理解されるであろう。
【００４１】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｄは、野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（ＭＭＬＶ）と他の動物種（すなわち、ヒヒ、鶏痘、コアラ、及びイノシシ）に特異的なウイルス逆転写酵素との間のアミノ酸配列アライメントを比較した表を示す。アミノ酸の類似性及び同一性の領域が、種々のＲＴ全体にわたり確認される。種々のＲＴ間のコンセンサス配列も示す。
【図１Ｂ】図１Ａの続きを示す。
【図１Ｃ】図１Ｂの続きを示す。
【図１Ｄ】図１Ｃの続きを示す。
【図２】本明細書に開示される例示的な変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（「Ｍｕｔ  Ｄ９」、配列番号４）のＲＴ活性を、野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（「ＷＴ  ＭＭＬＶ」、配列番号２）、ならびに他の市販入手可能な（「従来的な」）変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（「ＳＳＩＩ」、「ＳＳＩＩＩ」、及び「Ｑ−ＲＴ」）と比較して示す蛍光画像である。各レーンは、示される様々な長さの時間（すなわち、５分間、１５分間、または６０分間）及び様々な反応温度（すなわち、３７℃、４２℃、５０℃、または６０℃）で行われたＲＴ反応から得られたｃＤＮＡ生成物を示す。０．２４〜９．５ｋｂのＲＮＡラダーを各反応の鋳型核酸として用いた。
【図３】本明細書に開示される例示的な変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（「Ｍｕｔ  Ｄ９」、配列番号４）のＲＴ活性を、野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（「ＷＴ  ＭＭＬＶ」、配列番号２）と比較して示す蛍光画像である。各レーンは、示される様々な長さの時間（すなわち、１０分間、３０分間、または６０分間）及び３７℃（ＷＴ  ＭＭＬＶについて）または５０℃（Ｍｕｔ  Ｄについて）のいずれかで、ｐＨ８．３または７．３において行われたＲＴ反応から得られたｃＤＮＡ生成物を示す。０．５〜１０ｋｂのＲＮＡラダーを各反応の鋳型核酸として用いた。
【図４】本明細書に開示される例示的な変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（「Ｍｕｔ  Ｄ９」、配列番号４）のＲＴ活性を、野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（「ＷＴ  ＭＭＬＶ」、配列番号２）、ならびに他の市販入手可能な（「従来的な」）変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（「ＳＳＩＩＩ」及び「Ｃ−ＲＴ」）と比較して示す蛍光画像である。各レーンは、様々な長さの時間（すなわち、５分間、１０分間、３０分間、または６０分間）、６０℃でｐＨ８．３において行われたＲＴ反応から得られたｃＤＮＡ生成物を示す。０．５〜１０ｋｂのＲＮＡラダーを各反応の鋳型核酸として用いた。
【図５】本明細書に開示される例示的な変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（「Ｍｕｔ  Ｄ９」、配列番号４）のＲＴ活性を、他の市販入手可能な（「従来的な」）変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（「ＳＳＩＩＩ」及び「Ｍ−ＲＴ」）と比較して示す臭化エチジウム染色ゲルの写真である。各レーンは、示されるように、また実施例４により詳細に記載されるように、異なるプライマー：（１）プライマーなし、（２）オリゴ（ｄＴ）２０プライマー、（３）オリゴ（ｄＴ）２０ＬＮＡプライマー、または（４）ＰｏｌＥ  ２．５逆方向遺伝子特異的プライマーを用いて、様々な反応条件下（すなわち、「ＮＯＮ−ＨＳ−ＲＴ反応」、ＨＳ＝ホットスタート）行われたＲＴ反応から得られた生成物（ＰＣＲにより増幅）を示す。１ｋｂの標的（「Ｈｅｌａ  ＲＮＡ」）を異なる量（すなわち、１０ｎｇ、５０ｎｇ、または１００ｎｇ）で、各反応の鋳型核酸として使用した。
【図６】本明細書に開示される例示的な変異型逆転写酵素（「Ｍｕｔ  Ｄ９」、配列番号４）のＲＴ活性を、野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（「ＷＴ  ＭＭＬＶ」、配列番号２）、ならびに他の市販入手可能な（「従来的な」）変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（「ＳＳＩＩＩ」及び「Ｃ−ＲＴ」）と比較して示す蛍光画像である。各レーンは、示されるように、５０℃で６０分間かつ様々な濃度の様々な阻害物質の存在下において行われたＲＴ反応から得られたｃＤＮＡ生成物を示す。０．５〜１０ｋｂのＲＮＡラダーを各反応の鋳型核酸として用いた。
【図７】図６に示されるように、阻害物質の存在下における異なるＲＴのＲＴ活性をグラフ形式で示す。ＲＴ活性は、阻害物質を含まない反応（活性１００％として示される）に対して正規化した。濃い陰影は最も低いＲＴ活性を表し、一方で薄い陰影は最も高いＲＴ活性を表す（黒から白＝低い活性から高い活性）。
【図８Ａ】野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素の核酸配列（配列番号１）を列挙する。
【図８Ｂ】図８Ａの続きを示す。
【図９】野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素のアミノ酸配列（配列番号２）を列挙する。
【図１０Ａ】本発明の例示的な変異型（「Ｍｕｔ  Ｄ９」Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素の核酸配列（配列番号３）を列挙する。
【図１０Ｂ】図１０Ａの続きを示す。
【図１１】本発明の例示的な変異型（「Ｍｕｔ  Ｄ９」）Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素のアミノ酸配列（配列番号４）を列挙する。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
詳細な説明
本明細書において、熱安定性及び／または熱反応性、逆転写酵素阻害物質耐性、難しいＲＮＡ鋳型によるｃＤＮＡ生成、ならびに特異性を向上させるように変異されている逆転写酵素が提供される。ある特定の実施形態において、本発明は、対応する野生型逆転写酵素の特定のアミノ酸を変異または修飾することによって、そのような逆転写酵素を作製する方法を提供する。他の実施形態では、本発明は、核酸分子、例示される実施形態では、ｃＤＮＡ分子の生成、増幅、及び／または配列決定を、そのような変異型逆転写酵素を含む組成物及び／または反応混合物を使用して行う方法を提供する。例えば、本発明の逆転写酵素は、ＲＮＡの配列決定、ならびに粗製試料、難しい鋳型、及び遺伝子特異的配列の逆転写を含むがこれらに限定されない、核酸合成方法に適している。
【００４３】
定義
以下の説明では、以下の意味を有する多数の用語が使用される。
【００４４】
機能的に連結されている。本明細書に使用されるとき、「機能的に連結されている」とは、核酸が、構造遺伝子または他の核酸分子によってコードされるポリペプチドの発現の開始に影響を及ぼし得るように配置されていることを意味する。
【００４５】
実質的に純粋。本明細書に使用されるとき、「実質的に純粋」とは、所望される材料が、所望される材料の性質と関連する混入細胞成分を本質的に含まないことを意味する。好ましい態様において、本発明の逆転写酵素は、２５％以下、好ましくは１５％以下、より好ましくは１０％以下、さらに好ましくは５％以下、なおもさらに好ましくは１％以下の混入細胞成分を有する。別の態様において、本発明の逆転写酵素は、タンパク質ゲル上に２００ユニットの逆転写酵素を泳動させ（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、クマシンブルーで染色した場合に、検出可能なタンパク質混入物質を有さない。混入細胞成分としては、ホスファターゼ、エクソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、または不要なＤＮＡポリメラーゼ酵素といった、酵素活性が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明の逆転写酵素は、実質的に純粋である。
【００４６】
実質的に単離された。本明細書に使用されるとき、「実質的に単離された」とは、本発明のポリペプチドが、事実上及び／または組み換え宿主において、本発明のポリペプチドと関連し得る混入タンパク質を本質的に含まないことを意味する。一態様において、実質的に単離された本発明の逆転写酵素は、２５％以下、好ましくは１５％以下、より好ましくは１０％以下、さらに好ましくは５％以下、なおもさらに好ましくは１％以下の混入タンパク質を有する。別の態様において、実質的に単離された本発明のポリペプチドの試料において、試料中の７５％以上（好ましくは、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％以上）のタンパク質が、所望される本発明の逆転写酵素である。試料中の混入タンパク質及び／または目的のタンパク質の割合は、当該技術分野で既知の技法を使用して、例えば、タンパク質ゲル（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を使用して、タンパク質色素（例えば、クマシンブルー、銀染色、アミドブラック等）でゲルを染色することによって、判定することができる。別の態様において、本発明の逆転写酵素は、タンパク質ゲル上に２００ユニットの逆転写酵素を泳動させ（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、クマシンブルーで染色した場合に、検出可能なタンパク質混入物質を有さない。
【００４７】
停止剤。「停止塩基」と互換的に使用されることもある「停止剤」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼによって伸長させることができないヌクレオチドを指す。そのようなヌクレオチドには、例えば、ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）または種々の糖修飾ヌクレオチドを挙げることができる。
【００４８】
逆転写酵素。本明細書に使用されるとき、「逆転写酵素」という用語は、逆転写酵素活性を呈するタンパク質、ポリペプチド、またはポリペプチドフラグメントを指す。
【００４９】
逆転写酵素活性。本明細書に使用されるとき、「逆転写酵素活性」、「逆転写活性」、または「逆転写」という用語は、酵素が、ＲＮＡを鋳型として使用してＤＮＡ鎖（すなわち、相補的ＤＮＡまたはｃＤＮＡ）を合成することができることを指す。
【００５０】
変異。本明細書に使用されるとき、「変異」または「変異型」という用語は、野生型ＤＮＡ配列または野生型アミノ酸配列に導入された変化（複数可）を示す。変化の例としては、置換、挿入、欠失、及び点変異が挙げられるが、これらに限定されない。変異は、核酸レベルまたはアミノ酸レベルのいずれかで行われ得る。
【００５１】
熱安定性（ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ）。本開示の目的で、「熱安定性」とは、一般に、逆転写酵素（「熱安定性逆転写酵素」）等の酵素が、同一の処理後に野生型の熱安定性を有する同じ酵素が保持するものよりも多くの割合または量の活性を保持することを指す。したがって、向上した／強化された熱安定性を有する逆転写酵素は、熱安定性が野生型である逆転写酵素の活性の低減を引き起こすのに十分な熱処理後に、熱安定性における任意の向上、好ましくは約１．２〜約１０，０００倍、約１．５〜約１０，０００倍、約２〜約５，０００倍、または約２〜約２０００倍（好ましくは、約５倍超、より好ましくは約１０倍超、さらにより好ましくは約５０倍超、なおもより好ましくは約１００倍超、なおもさらに好ましくは約５００倍超、最も好ましくは約１０００倍超）の活性の保持を有する逆転写酵素として定義され得る。好ましくは、本発明の変異型逆転写酵素は、熱安定性の相対的な強化または向上を判定するために、対応する非変異型または野生型の逆転写酵素と比較される。例えば、６０℃で５分間の熱処理後に、熱安定性逆転写酵素は、熱処理前に存在していた活性のおよそ９０％を保持することができるが、熱安定性が野生型である逆転写酵素は、その元々の活性の１０％しか保持できない。同様に、６０℃で１５分間の熱処理後に、熱安定性逆転写酵素は、その元々の活性のおよそ８０％を保持することができるが、熱安定性が野生型である逆転写酵素は、測定可能な活性を有することができない。同様に、６０℃で１５分間の熱処理後に、熱安定性逆転写酵素は、その元々の活性のおよそ５０％、およそ５５％、およそ６０％、およそ６５％、およそ７０％、およそ７５％、およそ８０％、およそ８５％、およそ９０％、またはおよそ９５％を保持することができるが、熱安定性が野生型である逆転写酵素は、測定可能な活性を有することができないか、またはその元々の活性の２０％、１５％、１０％しか有することができないか、もしくは全く有することができない。第１の事例では（すなわち、６０℃で５分間の熱処理後）、熱安定性逆転写酵素は、野生型逆転写酵素よりも９倍高い熱安定性であると言える（１０％と比較して９０％）。逆転写酵素等の酵素の熱安定性を測定するために使用することができる条件の例は、以下及び実施例により詳細に記載されている。
【００５２】
逆転写酵素の熱安定性は、例えば、熱処理に供した、例えば、所与の期間、例えば５分間、６０℃でインキュベートした逆転写酵素の残存活性を、熱処理と同じ長さの期間室温でインキュベートした同じ逆転写酵素の対照試料と比較することによって、判定することができる。典型的に、残存活性は、相補的オリゴリボヌクレオチド鋳型を使用して、放射標識したデオキシリボヌクレオチドをオリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーに組み込んだ後に、測定することができる。例えば、ポリ（リボＣ）鋳型を使用して逆転写酵素が［α−３２Ｐ］−ｄＧＴＰをオリゴ−ｄＧプライマーに組み込む能力をアッセイして、逆転写酵素の残存活性を判定してもよい。標識していないヌクレオチドを蛍光標識したプライマーに組み込むことによるもの等、残存活性を測定するための他の方法は、当業者に既知である。例えば、Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖ，Ｔ．Ｔ．，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０１１，４１２（２）：２２９−３６を参照されたく、これは、参照により本明細書に組み込まれる。
【００５３】
別の態様において、本発明の熱安定性逆転写酵素には、対応する野生型の非変異型逆転写酵素と比較してより高い温度で不活性化される任意の逆転写酵素が含まれ得る。好ましくは、本発明の熱安定性逆転写酵素の不活性化温度は、対応する野生型の非変異型逆転写酵素の不活性化温度よりも約２℃〜約５０℃（例えば、約２℃、約４℃、約６℃、約８℃、約１０℃、約１２℃、約１４℃、約１６℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２６℃、約２８℃、約３０℃、約３２℃、約３４℃、約３６℃、約３８℃、約４０℃、約４２℃、約４４℃、約４６℃、約４８℃、または約５０℃）高い。より好ましくは、本発明の逆転写酵素の不活性化温度は、同じ条件下で比較すると、対応する野生型の非変異型逆転写酵素の不活性化温度よりも約５℃〜約５０℃、約５℃〜約４０℃、約５℃〜約３０℃、または約５℃〜約２５℃高い。一部の実施形態では、本発明の変異型逆転写酵素は、高い温度（例えば、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃）で少なくとも１分（例えば、１分、２分、５分、１０分、１５分、３０分等）後に、低温（例えば、５０℃、４５℃、４２℃、４０℃、３７℃）で５分後の野生型逆転写酵素の逆転写酵素活性の少なくとも１０％（例えば、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、３００％等）である逆転写酵素活性を有する。
【００５４】
本発明の逆転写酵素をその対応する野生型の非変異型逆転写酵素と比較したときの不活性化温度における相違は、そのような逆転写酵素の試料を所定の期間異なる温度で処理し、次いで、試料を処置した後に、残存する逆転写酵素活性（存在する場合）を測定することによって判定することができる。試験逆転写酵素と比較した野生型の非変異型対照との間の不活性化温度における相違または差分の判定は、各逆転写酵素が不活性化される温度の相違を比較することによって判定される（すなわち、使用した特定のアッセイにおいて残存する逆転写酵素活性が測定可能でない）。理解されるように、任意の数の逆転写酵素アッセイを使用して、試験した任意の逆転写酵素の不活性化温度の相違または差分を判定することができる。
【００５５】
別の態様では、本発明の逆転写酵素の熱安定性は、目的の逆転写酵素の逆転写酵素活性の半減期を測定することによって判定される。そのような半減期を、対照または野生型の逆転写酵素と比較して、半減期の相違（または差分）を判定してもよい。本発明の逆転写酵素の半減期は、好ましくは、高い温度（例えば、３７℃超）、好ましくは４０℃〜８０℃の範囲の温度、より好ましくは４５℃〜７５℃、５０℃〜７０℃、５５℃〜６５℃、及び５８℃〜６２℃の範囲の温度で判定される。本発明の逆転写酵素の好ましい半減期は、用いられる温度に応じて、４分間〜１０時間、４分間〜７．５時間、４分間〜５時間、４分間〜２．５時間、または４分間〜２時間の範囲に及び得る。例えば、本発明の逆転写酵素の逆転写酵素活性は、４８℃、５０℃、５２℃、５４℃、５６℃、５８℃、６０℃、６２℃、６４℃、６６℃、６８℃、及び／または７０℃の温度で、少なくとも４分間、少なくとも５分間、少なくとも６分間、少なくとも７分間、少なくとも８分間、少なくとも９分間、少なくとも１０分間、少なくとも１１分間、少なくとも１２分間、少なくとも１３分間、少なくとも１４分間、少なくとも１５分間、少なくとも２０分間、少なくとも２５分間、少なくとも３０分間、少なくとも４０分間、少なくとも５０分間、少なくとも６０分間、少なくとも７０分間、少なくとも８０分間、少なくとも９０分間、少なくとも１００分間、少なくとも１１５分間、少なくとも１２５分間、少なくとも１５０分間、少なくとも１７５分間、少なくとも２００分間、少なくとも２２５分間、少なくとも２５０分間、少なくとも２７５分間、少なくとも３００分間、少なくとも４００分間、少なくとも５００分間の半減期を有し得る。
【００５６】
熱反応性．本明細書に使用されるとき、「熱反応性（ｔｈｅｒｍｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）」または「熱反応性（ｔｈｅｒｍｏｒｅａｃｔｉｖｅ）」は、逆転写酵素が高い温度で酵素活性を呈する能力を指す。
【００５７】
熱安定性（ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ）．本明細書に使用されるとき、「熱安定性（ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ）」または「熱安定性（ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ）」は、高い温度への曝露に耐えるが、必ずしもそのような高い温度で活性を示すわけではない、能力を指す。
【００５８】
処理能力．本明細書に使用されるとき、「処理能力」とは、逆転写酵素が、核酸鋳型から解離することなくプライマーを連続的に伸長させる能力を指す。酵素が複製できる鋳型の長さ（例えば、「Ｘ酵素は、９ｋｂの鋳型をポリメラーゼできる」または「Ｘ酵素は長さが約６０００塩基であるｃＤＮＡを生成できる」）もまた、所与の酵素の処理能力を説明するために使用され得る。
【００５９】
阻害物質耐性．本明細書に使用されるとき、「阻害物質耐性」とは、逆転写酵素に対して典型的に阻害性である（逆転写酵素活性を防止または阻害する）化合物、化学物質、タンパク質、緩衝液等の存在下において、逆転写酵素が逆転写を行う能力を指す。
【００６０】
忠実性．忠実性とは、重合の正確さ、または鋳型に相補的な核酸分子を合成する際に、逆転写酵素が正しい物質と誤った物質（例えば、ヌクレオチド）とを区別する能力を指す。逆転写酵素の忠実性が高いほど、核酸合成中に逆転写酵素が成長している鎖内に誤ってヌクレオチドを組み込むことが少なくなる、すなわち、忠実性の向上または強化は、低下したエラー率または低下した誤組み込み率を有するより忠実な逆転写酵素をもたらす。
【００６１】
約．本明細書に使用される「約」という用語は、言及される数の±１０％を意味する。したがって、「約１００」には、９０〜１１０の範囲に含まれる値の全範囲が含まれる。
【００６２】
逆転写酵素の供給源
本発明によると、酵素の熱安定性及び／または熱反応性を向上させるため、あるいは、例えば、向上した特異性、逆転写酵素阻害物質に対する耐性の向上、及び／または難しいＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡを生成する能力の向上といった他の特性を酵素に与えるために、逆転写酵素活性を有する任意の逆転写酵素またはポリペプチドに、変異または修飾を行うことができる。
【００６３】
本発明の組成物、方法、及びキットに使用するための逆転写酵素には、逆転写酵素活性を有する任意の酵素またはポリペプチドが含まれる。そのような酵素には、レトロウイルス逆転写酵素、レトロトランスポゾン逆転写酵素、Ｂ型肝炎逆転写酵素、カリフラワーモザイクウイルス逆転写酵素、最近逆転写酵素、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：４８７−４９１（１９８８）、米国特許第４，８８９，８１８号及び同第４，９６５，１８８号）、Ｔｎｅ  ＤＮＡポリメラーゼ（国際公開第ＷＯ９６／１０６４０号）、Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第５，３７４，５５３号）、及びそれらの変異型、フラグメント、変化形、または誘導体（例えば、同一所有者の（ｃｏｍｍｏｎｌｙ  ｏｗｎｅｄ）米国特許第５，９４８，６１４号及び同第６，０１５，６６８号を参照されたく、これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６４】
好適な逆転写酵素には、レトロウイルス逆転写酵素、例えば、マロニーマウス白血病ウイルス（Ｍａｌｏｎｅｙ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ）（Ｍ−ＭＬＶ）逆転写酵素、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）逆転写酵素、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）逆転写酵素、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素、ラウス関連肉腫ウイルス（ＲＡＶ）逆転写酵素、及び骨髄芽球症関連ウイルス（ＭＡＶ）逆転写酵素、または他のトリ肉種白血病ウイルス（ＡＳＬＶ）逆転写酵素が挙げられる。本発明の逆転写酵素が作製されるように変異させることができるさらなる逆転写酵素には、細菌逆転写酵素（例えば、大腸菌逆転写酵素）（例えば、Ｍａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２７：４８９−９３（１９９６）を参照されたい）及び出芽酵母の逆転写酵素（例えば、Ｔｙ１またはＴｙ３レトロトランスポゾンの逆転写酵素）（例えば、Ｃｒｉｓｔｏｆａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３６６４３−３６６４８（１９９９）、Ｍｕｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒ．Ｖｉｒｏｌ．７２：６４９０−６５０３（１９９８）を参照されたい）が挙げられる。記載される発明により使用することができる他の逆転写酵素には、例えば、ヒヒ、鶏痘、コアラ、及びイノシシの種から単離されたウイルスから単離された逆転写酵素が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６５】
本発明はさらに、本発明に含まれる逆転写酵素と同一であるか、または同じ機能を有する、ポリヌクレオチドを提供する。本明細書における「同一である」または「同じ機能を有する」という語句は、２つのポリヌクレオチドを詳細なコンピュータ化されたアルゴリズムにより適切に並べた場合に、それらが、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を呈することを示す。
【００６６】
本発明は、野生型逆転写酵素（例えば、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素、配列番号２）、ＡＭＶ逆転写酵素、ＲＳＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素等）にアミノ酸レベルで５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり、向上した熱安定性及び／または本発明の他の所望される特性を呈する、逆転写酵素をさらに含む。以下の配列番号４に記載されるアミノ酸配列を含む逆転写酵素にアミノ酸レベルで７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり、向上した熱安定性及び／または熱反応性を呈する逆転写酵素もまた、本発明に含まれる。
【００６７】
本発明はまた、少なくとも２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、または７００個のアミノ酸残基を含み、逆転写酵素と関連する１つ以上の活性を保持する、逆転写酵素のフラグメントも含む。そのようなフラグメントは、欠失変異によって、当該技術分野において日常的かつ周知の組み換え技法によって、またはいくつかの周知のタンパク質分解酵素のうちのいずれかを用いて目的の逆転写酵素（複数可）の酵素分解を行うことによって、得ることができる。本発明の逆転写酵素のフラグメントは、上述のフラグメントのうちの１つに７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリペプチドをさらに含む。本発明はまた、任意の数のこれらのフラグメントの様々な組み合わせにも関する。
【００６８】
参照アミノ酸配列に少なくとも、例えば、７０％「同一である」アミノ酸配列を有するタンパク質またはタンパク質フラグメントとは、そのタンパク質のアミノ酸配列が、タンパク質配列が参照タンパク質のアミノ酸配列のアミノ酸１００個毎に最大３０個のアミノ酸改変を含み得ることを除き、参照配列に同一であることを意図する。換言すると、参照アミノ酸配列に少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質を得るためには、参照配列内のアミノ酸残基の最大３０％が欠失もしくは別のアミノ酸と置換されていてもよく、または参照配列内の全アミノ酸残基の最大３０％の個数のアミノ酸が参照配列に挿入されていてもよい。参照配列のこれらの改変は、参照アミノ酸配列のアミノ（Ｎ）及び／もしくはカルボキシ（Ｃ）末端位、ならびに／またはそれらの末端位の間の任意の場所で、参照配列内の残基の間に個別に、及び／もしくは参照配列内の１つ以上の連続した基でのいずれかで散在して、生じ得る。実際には、所与のアミノ酸配列が、例えば、参照タンパク質のアミノ酸配列に少なくとも７０％同一であるかどうかは、核酸配列同一性判定に関して上述のもの等、既知のコンピュータプログラムを使用して、またはＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０（１９９４））を使用して、判定することができる。
【００６９】
配列同一性は、参照配列または参照配列の部分配列を試験配列と比較することによって、判定することができる。参照配列及び試験配列は、比較枠と称される任意の数の残基にわたって最適にアライメントされる。最適なアライメントを得るために、付加または欠失、例えば、ギャップが、試験配列に導入されてもよい。配列同一性パーセントは、同じ残基が両方の配列に存在する位置の数を判定し、一致する位置の数を比較枠内の配列の全長で除し、１００を乗じて百分率を得ることによって判定される。一致する位置の数に加えて、ギャップの数及びサイズも、配列同一性パーセントを計算する際に考慮される。
【００７０】
配列同一性は、典型的にはコンピュータプログラムを用いて判定される。代表的なプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）で公的にアクセス可能なＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）プログラムである。このプログラムは、試験配列内のセグメントをデータベースの配列と比較して、一致の統計学的有意性を判定した後、閾値レベルよりも有意な一致のみを特定し、報告する。ＢＬＡＳＴプログラムの好適なバージョンは、ギャップを許容するもの、例えば、バージョン２．Ｘである（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−４０２，１９９７）。ヌクレオチド配列（ｂｌａｓｔｎ）またはタンパク質（ｂｌａｓｔｐ）を検索するための標準的なＢＬＡＳＴを使用してもよい。クエリ配列が翻訳される、すなわち、ヌクレオチド配列からタンパク質に翻訳される翻訳クエリ検索（ｂｌａｓｔｘ）またはタンパク質から核酸配列に翻訳される翻訳クエリ検索（ｔｂｂｌａｓｔｎ）も、ヌクレオチドクエリ配列が６つ全てのリーディングフレームにおいてタンパク質に翻訳され、次いで６つ全てのリーディングフレームが翻訳されているＮＣＢＩヌクレオチドデータベースと比較されるクエリ（ｔｂｂｌａｓｔｘ）と同様に使用することができる。
【００７１】
本発明のタンパク質に対する配列同一性または類似性を有するタンパク質を特定するためのさらなる好適なプログラムとしては、ＰＨＩ−ＢＬＡＳＴ（Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｈｉｔ  Ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  ＢＬＡＳＴ、Ｚｈａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６（１７）：３９８６−９０，１９９８）及びＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（Ｐｏｓｉｔｉｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｔｅｒａｔｅｄ  ＢＬＡＳＴ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−４０２，１９９７）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７２】
プログラムは、デフォルトの検索パラメータで使用することができる。あるいは、１つ以上の検索パラメータを調節してもよい。好適な検索パラメータ値を選択することは、当業者の技能の範囲内である。
【００７３】
本発明で使用するための一部の逆転写酵素には、ＲＮａｓｅ Ｈ活性が低減されたか、実質的に低減されたか、またはそれを欠くものが含まれる。ＲＮａｓｅ Ｈ活性が低減されたかまたは実質的に低減されたそのような酵素には、上述の逆転写酵素のいずれかのＲＮａｓｅ Ｈ−誘導体が挙げられ、これは、例えば、本明細書の他の箇所に記載される１つ以上の（例えば、１、２、３、４、５、１０、１２、１５、２０、３０個等の）点変異、１つ以上の（例えば、１、２、３、４、５、１０、１２、１５、２０、３０個等の）欠失変異、及び／または１つ以上の（例えば、１、２、３、４、５、１０、１２、１５、２０、３０個等の）挿入変異を導入することにより、例えば、目的の逆転写酵素内のＲＮａｓｅ Ｈドメインを変異させることによって得ることができる。例えば、そのような変異は、米国特許第８，５４１，２１９号及び同第８，７５３，８４５号に記載され、これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００７４】
「ＲＮａｓｅ Ｈ活性が実質的に低減された」酵素とは、その酵素が、対応する野生型ＲＮａｓｅ Ｈ＋酵素、例えば、野生型マロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）逆転写酵素の約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、好ましくは約１５％未満、約１０％未満、約７．５％未満、または約５％、最も好ましくは約５％未満または約２％未満のＲＮａｓｅ Ｈ活性を有することを意味する。ＲＮａｓｅ Ｈ活性の低減は、例えば、対応する野生型または非変異型逆転写酵素と比較した、活性における任意の低減を意味する。したがって、一態様において、本発明の逆転写酵素は、対応する野生型逆転写酵素と比較して、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、１％のＲＮａｓｅ Ｈ活性を有してもよく、またはＲＮａｓｅ Ｈ活性を全く有さない場合もある。
【００７５】
ＲＮａｓｅ Ｈ活性が低減されたか、実質的に低減されたか、検出不可能であるか、またはＲＮａｓｅ Ｈ活性を欠く逆転写酵素は、既述されている（米国特許第５，６６８，００５号、米国特許第６，０６３，６０８号、及びＰＣＴ国際公開第ＷＯ９８／４７９１２号を参照されたい）。いずれの酵素のＲＮａｓｅ Ｈ活性も、例えば、米国特許第５，２４４，７９７号、Ｋｏｔｅｗｉｃｚ，Ｍ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：２６５（１９８８）、Ｇｅｒａｒｄ，Ｇ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，ＦＯＣＵＳ  １４（５）：９１（１９９２）、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９８／４７９１２号、及び米国特許第５，６６８，００５号に記載のもの等、種々のアッセイによって判定することができ、これらは全て、その開示が参照により本明細書に完全に組み込まれる。
【００７６】
記載されるアッセイのうちの１つ以上によって検出可能なＲＮａｓｅ Ｈ活性を有さないか、またはＲＮａｓｅ Ｈ活性を欠く逆転写酵素もまた、本発明により企図される。したがって、一部の実施形態において、本発明で使用するための変異型酵素には、Ｍ−ＭＬＶ  Ｈ−逆転写酵素、ＲＳＶ  Ｈ−逆転写酵素、ＡＭＶ  Ｈ−逆転写酵素、ＲＡＶ  Ｈ−逆転写酵素、ＭＡＶ  Ｈ−逆転写酵素、及びＨＩＶ  Ｈ−逆転写酵素が挙げられるが、これらに限定されない。しかしながら、当業者であれば、ＲＮａｓｅ Ｈ活性が低減されたか、または実質的に低減された、リボ核酸分子からＤＮＡ分子を生成することができる（すなわち、逆転写酵素活性を有する）任意の酵素を、本発明により同等に使用することができることを理解するであろう。
【００７７】
あるいは、本発明の逆転写酵素は、ＲＮａｓｅ Ｈドメインに、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を低減させるいずれの修飾または変異も含まない場合がある。したがって、他の実施形態では、本発明の逆転写酵素は、１００％のＲＮａｓｅ Ｈ活性を有してもよく、これは、対応する野生型逆転写酵素に等しい。
【００７８】
本発明で使用するための逆転写酵素またはポリヌクレオチドには、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）活性が低減されているか、実質的に低減されているか、または排除されているものも含まれる。末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性が低減もしくは実質的に低減されたか、またはＴｄＴ活性が排除されているそのような酵素は、例えば、１つ以上の（例えば、１、２、３、４、５、１０、１２、１５、２０、３０個等の）点変異、１つ以上の欠失変異、及び／または１つ以上の挿入変異を導入することにより、例えば、鋳型プライマーと近接しているかまたは接触している目的の逆転写酵素内のアミノ酸残基を変異させることによって、得ることができる。減少したＴｄＴ活性を呈する逆転写酵素は、２００６年６月６日に発行された米国特許第７，０５６，７１６号に記載されている（その全開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。
【００７９】
本発明に使用するための酵素には、向上した忠実性を呈するものも含まれる。向上した忠実性を呈する逆転写酵素は、２０００年３月１５日に出願された米国出願第６０／１８９，４５４号及び２００６年６月６日に発行された米国特許第７，０５６，７１６号に記載されている（その全開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。
【００８０】
したがって、特定の実施形態では、本発明は、熱安定性の向上及び／または熱反応性の向上を呈し、場合によっては、以下の特徴：（１）ＲＮａｓｅ Ｈ活性の低減または実質的な低減、（２）ＴｄＴ活性の低減もしくは実質的な低減、及び／または（３）忠実性の向上のうちの１つ以上も呈する、逆転写酵素を含む。
【００８１】
本発明はさらに、上述の変異型逆転写酵素及び逆転写酵素フラグメントをコードする核酸分子を提供する。一部の実施形態では、変異型逆転写酵素及び逆転写酵素フラグメントをコードする核酸分子は、配列番号３に少なくとも８０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％）同一である。一部の実施形態では、変異型逆転写酵素及び逆転写酵素フラグメントをコードする核酸分子は、配列番号３を含む。
【００８２】
当業者には理解されるように、本発明による変異型逆転写酵素は、当該技術分野において日常的かつ周知の組み換えまたは遺伝子工学技法によって得ることができる（例えば、Ｋｏｔｅｗｉｃｚ，Ｍ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：２６５（１９８８）、Ｓｏｌｔｉｓ，Ｄ．Ａ．，ａｎｄ  Ｓｋａｌｋａ，Ａ．Ｍ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：３３７２−３３７６（１９８８））、米国特許第５，６６８，００５号、及びＰＣＴ国際公開第ＷＯ９８／４７９１２号を参照されたい。変異型逆転写酵素は、例えば、上述のもの等、逆転写酵素活性を有する逆転写酵素またはポリヌクレオチドをコードする遺伝子（複数可）または核酸配列を、部位特異的またはランダムな変異生成によって変異させることによって得ることができる。そのような変異には、点変異、欠失変異、及び挿入変異を挙げることができる。好ましくは、１つ以上の点変異（例えば、１つ以上のアミノ酸と１つ以上の別のアミノ酸との置換）が、本発明の変異型逆転写酵素の構築に使用される。逆転写酵素のフラグメントは、欠失変異によって、当該技術分野において日常的かつ周知の組み換え技法によって、またはいくつかの周知のタンパク質分解酵素のうちのいずれかを用いて目的の逆転写酵素（複数可）の酵素分解を行うことによって、得ることができる。
【００８３】
本発明により変異される逆転写酵素をコードする遺伝子または他の核酸分子をクローニングするために、逆転写酵素の遺伝子またはオープンリーディングフレームを含む単離されたＤＮＡが、組み換えＤＮＡライブラリを構築するために使用され得る。当該技術分野で周知の任意のベクターを使用して、目的の逆転写酵素をクローニングしてもよい。しかしながら、使用されるベクターは、組み換えベクターが形質転換される宿主と適合性でなければならない。
【００８４】
本発明はまた、発現ベクターによって形質転換された形質転換体も提供する。本発明の形質転換体は、該発現ベクターをランダムな原核生物細胞または真核生物細胞に挿入することによって容易に構築することができる。特定のベクターを細胞内に導入するための方法は、当業者に周知である。本発明の好ましい実施形態において、本発明の変異型遺伝子またはポリヌクレオチド（±追加の無関係の配列、例えば、Ｈｉｓタグ）を含むｐＢＡＤベクターを、大腸菌Ｔｏｐ１０細胞に導入し、形質転換体の構築を促す。
【００８５】
本発明はまた、本発明の遺伝子またはポリヌクレオチドを含む発現ベクターも提供する。本発明の発現ベクターの構築に使用されるベクターは、限定されておらず、原核生物または真核生物の形質転換のための任意の従来的なベクターを使用することができる。本発明の一部の実施形態において、組み換え発現ベクターは、配列番号３によって表される変異型遺伝子を挿入することによって構築される。
【００８６】
プラスミドライブラリを構築するための原核生物ベクターには、大腸菌での複製が可能なもの、例えば、ｐＢＲ３２２、ＣｏｌＥ１、ｐＳＣ１０１、ｐＵＣ−ベクター（ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等：Ｉｎ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８２）、及びＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｄ  ｅｄ．）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））といった、プラスミドが含まれる。桿菌プラスミドには、ｐＣ１９４、ｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＣ２２１、ｐＣ２１７等が挙げられる。そのようなプラスミドは、Ｇｌｙｃｚａｎ，Ｔ．によりＴｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｂａｃｉｌｌｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｙｏｒｋ（１９８２），３０７−３２９に開示されている。好適なストレプトマイセスプラスミドには、ｐＩＪ１０１（Ｋｅｎｄａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：４１７７−４１８３（１９８７））が挙げられる。シュードモナスプラスミドは、Ｊｏｈｎら（Ｒａｄ．Ｉｎｓｅｃ．Ｄｉｓ．８：６９３−７０４（１９８６））及びＩｇａｋｉ，（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．３３：７２９−７４２（１９７８））によって考察されている。宿主が広範囲なプラスミドまたはコスミド、例えばｐＣＰ１３（Ｄａｒｚｉｎｓ  ａｎｄ  Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｙ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５９：９−１８（１９８４））もまた、本発明に使用することができる。本発明の遺伝子及び核酸分子をクローニングするのに好適なベクターは、原核生物ベクターである。好ましくは、ｐＢＡＤ、ｐＣＰ１３、及びｐＵＣベクターが、本発明の遺伝子のクローニングに使用される。他の好適なベクターは当業者に既知であり、市販入手可能である。
【００８７】
目的の逆転写酵素遺伝子及び核酸分子をクローニングするのに好適な宿主は、原核生物宿主である。原核生物宿主の一例は、大腸菌である。しかしながら、本発明の所望される逆転写酵素遺伝子及び核酸分子は、大腸菌属、バチルス属、ストレプトマイセス属、シュードモナス属、サルモネラ属、セラチア属、及びプロテウス属の宿主を含むがこれらに限定されない、他の原核生物宿主においてクローニングすることができる。特に興味深い細菌宿主としては、大腸菌ＤＨ１０Ｂが挙げられ、これは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒｐ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）から入手可能である。
【００８８】
目的の逆転写酵素のクローニング及び発現のための真核生物宿主には、酵母、真菌、及び哺乳動物細胞が挙げられる。そのような真核生物細胞における所望される逆転写酵素の発現は、真核生物プロモーターを含む、真核生物制御領域の使用が必要な場合がある。真核生物細胞における逆転写酵素遺伝子または核酸分子のクローニング及び発現は、周知の真核生物ベクター系を用いて周知の技法により達成することができる。
【００８９】
ＤＮＡライブラリが特定のベクターに構築された後、適切な宿主が、周知の技法によって形質転換される。一部の実施形態では、形質転換した細胞は、ペトリ皿当たりおよそ２００〜３００個の形質転換コロニーをもたらす密度で播種される。逆転写酵素の選択のために、コロニーを、次いで、当業者に周知の方法を使用して、逆転写酵素または熱安定性逆転写酵素の発現に関してスクリーニングしてもよい。例えば、一部の実施形態では、個々の形質転換体の一晩培養物を溶解させ、５０℃で１５分間加熱し、蛍光標識したステムループ鋳型（例えば、ＦＲＥＴアッセイ）を使用して、逆転写酵素もしくは熱安定性逆転写酵素の活性及び／または他の望ましい活性に関して、アッセイする。例えば、Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖ，Ｔ．Ｔ．，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０１１，４１２（２）：２２９−３６を参照されたい。一部の実施形態では、熱安定性逆転写酵素活性及び／または他の望ましい活性が検出され、どのアミノ酸が逆転写酵素活性を維持するかを判定するために、この変異体に配列決定を行う。本発明の逆転写酵素をコードする遺伝子または核酸分子は、当業者に既知の技法を使用してクローニングすることができる。
【００９０】
変異型逆転写酵素
本発明によると、示されるいくつかの変異を逆転写酵素に行うことができ、好ましい態様では、記載されるように、熱安定性の向上、熱活性、阻害物質耐性の向上をもたらし、かつ／または逆転写酵素に他の所望される特性を与えるために、複数の変異がなされてもよい。そのような変異には、点変異、フレームシフト変異、欠失、及び挿入が挙げられる。好ましくは、１つ以上のアミノ酸置換をもたらす１つ以上の点変異を使用して、強化もしくは向上した熱安定性及び／もしくは熱反応性または向上した阻害物質耐性を有する逆転写酵素が生成される。
【００９１】
変異は、当業者に既知の任意の手法を用いて本発明の逆転写酵素に導入することができる。変異は、例えば、二価金属イオン補助因子としてマンガンの存在下でＰＣＲ反応を行うことによって、ランダムに導入することができる。あるいは、オリゴヌクレオチド指向性変異生成を用いて、コードするＤＮＡ分子の任意の決定された部位で可能性のある全てのクラスの塩基対変化を可能にする変異型ポリメラーゼを作出してもよい。一般に、この技法は、目的の逆転写酵素をコードする一本鎖ヌクレオチド配列に相補的な（１つ以上の不一致を除く）オリゴヌクレオチドをアニーリングすることを伴う。不一致のオリゴヌクレオチドを、次いで、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長させて、一本の鎖の配列に所望される変化を有する二本鎖ＤＮＡ分子を生成する。配列の変化は、例えば、アミノ酸の欠失、置換、または挿入をもたらし得る。二本鎖ポリヌクレオチドは、次いで、適切な発現ベクターに挿入することができ、このようにして変異型ポリペプチドが生成され得る。上述のオリゴヌクレオチド指向性変異生成は、例えば、ＰＣＲにより実行することができる。
【００９２】
一般に、本発明は、部分的に、逆転写酵素をその非変異型対応物と比較してより熱安定性及び／または熱反応性にする、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、１０、１２、１５、１８、２０個等）の変異または修飾を指定されるアミノ酸部位に有する逆転写酵素を提供する。本発明はまた、逆転写酵素を対応する非変異型逆転写酵素よりも効率的（例えば、速度及び／または処理能力の向上）、特異的、逆転写酵素阻害物質に対して耐性にし、かつ／または難しいＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡを生成する能力を高める１つ以上の指定の変異または修飾を有する逆転写酵素を提供する。
【００９３】
一部の実施形態において、本発明によって提供される逆転写酵素の変異または修飾は、向上したまたは強化された熱安定性及び／または熱反応性を有する変異型逆転写酵素を生成することができるような手段で、逆転写酵素の認識された領域（例えば、ｐｏｌまたはＲＮａｓｅ Ｈ領域）に行われる。修飾または変異はまた、本発明により他の領域に行われてもよい（例えば、酵素Ｋｄ、熱安定性、忠実性、基質結合等に役割を果たすことが既知の領域等）。したがって、本発明は、本明細書の他の箇所に記載されるように、向上した熱安定性（ならびに他の特性）を呈し、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０個等）の指定される変異もしくは修飾または変異もしくは修飾の組み合わせを有する、逆転写酵素を含む。
【００９４】
本発明のある特定の実施形態において、以下の表１に列挙される野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（配列番号２）の配列に対応するアミノ酸位置のうちの１つ以上に、アミノ酸置換がなされる（例えば、アミノ酸位置５１、６７、６９、１９６、１９７、２００、２０４、２８９、３０２、３０６、３０９、３１３、４３５、４５４、５２４、５６２、５８３、５９４、６０３、６５３、及び６７１）。本発明によると、これらの位置の野生型アミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＶａｌを含む任意の他のアミノ酸と置換され得る。これらの位置におけるある特定の例示的なアミノ酸は、表１に列挙されるものである（例えば、Ｌ／Ｐ５１、Ｓ／Ｒ／Ｎ／Ｋ６７、Ｋ／Ｅ６９、Ｓ／Ｐ１９６、Ｔ／Ａ／Ｓ／Ｇ１９７、Ｎ／Ｄ２００、Ｈ／Ｒ２０４、Ｌ／Ｍ２８９、Ｋ／Ｒ／Ｅ／Ｇ３０２、Ｔ／Ｋ３０６、Ｆ／Ｙ／Ｉ／Ｎ３０９、Ｆ／Ｌ／Ｃ／Ｗ３１３、Ｐ／Ｔ３３０、Ｌ／Ｖ／Ｒ／Ｇ４３５、Ｎ／Ｋ４５４  Ｄ／Ｇ５２４、Ｑ／Ｅ５６２、Ｎ／Ｄ５８３、Ｎ／Ｄ５９４、Ｈ／Ｑ６０３、Ｈ／Ｎ／Ｄ６５３、及びＬ／Ｐ６７１。したがって、向上した熱安定性及び／または熱反応性を呈する本発明による逆転写酵素の特定の例としては、（１）５１位の残基がプロリン（Ｐ）またはリジン（Ｌ）である、（２）６７位の残基がセリン（Ｓ）、アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、またはアスパラギン（Ｎ）である、（３）６９位の残基がグルタミン酸（Ｅ）またはリジン（Ｋ）である、（４）１９６位の残基がプロリン（Ｐ）またはセリン（Ｓ）である、（５）１９７位の残基がスレオニン（Ｔ）、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、またはアラニン（Ａ）である、（６）２００位の残基がアスパラギン酸（Ｄ）またはアスパラギン（Ｎ）である、（７）２０４位の残基がヒスチジンまたはアスパラギン（Ｒ）である、（８）２８９位の残基がメチオニン（Ｍ）またはロイシン（Ｌ）である、（９）３０２位の残基がグルタミン酸残基（Ｅ）、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはグリシン（Ｇ）である、（１０）３０６位の残基がスレオニン（Ｔ）またはリジン（Ｋ）である、（１１）３０９位の残基がフェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、イソロイシン（Ｉ）、またはアスパラギン（Ｎ）である、（１２）３１３位の残基がトリプトファン（Ｗ）、フェニルアラニン（Ｆ）、ロイシン（Ｌ）、またはシステイン（Ｃ）である、（１３）３３０位の残基がチロシン（Ｙ）またはプロリン（Ｐ）である、（１４）４３５位の残基がロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、アルギニン（Ｒ）、またはグリシン（Ｇ）である、（１５）４５４位の残基がアスパラギン（Ｎ）またはリジン（Ｋ）である、（１６）５２４位の残基がアスパラギン酸（Ｄ）またはグリシン（Ｇ）である、（１７）５６２位の残基がグルタミン酸（Ｅ）またはグルタミン（Ｑ）である、（１８）５８３位の残基がアスパラギン酸（Ｄ）またはアスパラギン（Ｎ）である、（１９）５９４位の残基がヒスチジン（Ｈ）またはグルタミン（Ｑ）である、（２０）６０３位の残基がロイシン（Ｌ）またはトリプトファン���Ｗ）である、（２１）６５３位の残基がアスパラギン酸（Ｄ）、ヒスチジン（Ｈ）、またはアスパラギン（Ｎ）である、及び（２２）６７１位の残基がロイシン（Ｌ）またはプロリン（Ｐ）である、Ｍ−ＭＬＶ−逆転写酵素が挙げられる。
【表１】
2017503521.tif 000003
2017503521.tif 000004
【００９５】
一部の実施形態において、逆転写酵素における熱反応性及び／または熱安定性特性を改変させる変異または修飾は、通常逆転写酵素と関連する活性（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ活性、逆転写酵素もしくはポリメラーゼ活性、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴａｓｅ）活性等）に対する影響がほとんどもしくは全くないか、通常逆転写酵素と関連するこれらの活性のうちの１つ以上を実質的に改変させるかのいずれかである改変とともに存在してもよい。
【００９６】
一部の実施形態において、野生型Ｍ−ＭＬＶ（配列番号２）逆転写酵素の位置Ｓ６７、Ｔ１９７、及びＥ３０２に相当または対応する位置における１つ以上の変異が、所望される結果（例えば、熱安定性の向上、熱反応性の向上、効率の向上（速度及び処理能力）、特異性の向上、逆転写酵素阻害物質に対する耐性の向上、及び難しいＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡを生成する能力の向上）を得るために行われ得る。したがって、一部の実施形態において、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素のアミノ酸位置を参照フレームとして使用することにより、本発明の逆転写酵素は、以下の改変：（Ｓ６７Ｒ、Ｓ６７Ｎ、またはＳ６７Ｋ）、（Ｔ１９７Ａ、Ｔ１９７Ｓ、Ｔ１９７Ｇ）、及び（３０２Ｋ、Ｅ３０２Ｒ、またはＥ３０２Ｇ）のうちの１つ以上に位置が対応する改変を有する任意の逆転写酵素（例えば、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素、ＲＳＶ逆転写酵素、例えば、ヒヒ、鶏痘、コアラ、及びイノシシ種から単離されたウイルスに由来する逆転写酵素）、ならびに、これらの変異型タンパク質、これらのタンパク質をコードする核酸分子、及びこれらの核酸分子を含む宿主細胞を含む、組成物、キット、及び反応混合物を含む。
【００９７】
他の実施形態では、野生型Ｍ−ＭＬＶ（配列番号２）逆転写酵素の位置Ｐ５１、Ｅ６９、Ｐ１９６、Ｄ２００、Ｈ２０４、Ｍ２８９、Ｔ３０６、Ｆ３０９、Ｗ３１３、Ｔ３３０、Ｌ４３５、Ｎ４５４、Ｄ５２４、Ｅ５６２、Ｄ５８３、Ｈ５９４、Ｌ６０３、Ｄ６５３、及びＬ６７１に相当または対応する位置における６つ以上の変異が、所望される結果（例えば、熱安定性の向上、熱反応性の向上、効率の向上（速度及び処理能力）、特異性の向上、逆転写酵素阻害物質に対する耐性の向上、及び／または難しいＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡを生成する能力の向上）を得るために行われ得る。したがって、特定の実施形態において、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素のアミノ酸位置を参照フレームとして使用することにより、本発明の逆転写酵素は、以下の改変：Ｐ５１Ｌ、Ｅ６９Ｋ、Ｐ１９６Ｓ、Ｄ２００Ｎ、Ｈ２０４Ｒ、Ｍ２８９Ｌ、Ｔ３０６Ｋ、（Ｆ３０９Ｎ、Ｆ３０９Ｙ、またはＦ３０９Ｉ）、（Ｗ３１３Ｆ、Ｗ３１３Ｌ、またはＷ３１３Ｃ）、Ｔ３３０Ｐ、（Ｌ４３５Ｇ、Ｌ４３５Ｖ、またはＬ４３５Ｒ）、Ｎ４５４Ｋ、Ｄ５２４Ｇ、Ｅ５６２Ｑ、Ｄ５８３Ｎ、Ｈ５９４Ｑ、Ｌ６０３Ｗ、（Ｄ６５３ＮまたはＤ６５３Ｈ）、及びＬ６７１Ｐのうちの６つ以上を有する任意の逆転写酵素（例えば、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素、ＲＳＶ逆転写酵素、例えば、ヒヒ、鶏痘、コアラ、及びイノシシ種から単離されたウイルスに由来する逆転写酵素）、ならびに、これらの変異型タンパク質、これらのタンパク質をコードする核酸分子、及びこれらの核酸分子を含む宿主細胞を含む、組成物及び反応混合物を含む。
【００９８】
他の実施形態では、野生型Ｍ−ＭＬＶ（配列番号２）逆転写酵素の位置Ｓ６７、Ｔ１９７、及びＥ３０２に相当または対応する位置における１つ以上の変異、ならびに追加として、位置Ｐ５１、Ｅ６９、Ｐ１９６、Ｄ２００、Ｈ２０４、Ｍ２８９、Ｔ３０６、Ｆ３０９、Ｗ３１３、Ｔ３３０、Ｌ４３５、Ｎ４５４、Ｄ５２４、Ｅ５６２、Ｄ５８３、Ｈ５９４、Ｌ６０３、Ｄ６５３、及びＬ６７１に相当または対応する位置における１つ以上の変異が、所望される結果（例えば、熱安定性の向上、熱反応性の向上、効率の向上（速度及び処理能力）、特異性の向上、逆転写酵素阻害物質に対する耐性の向上、及び／または難しいＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡを生成する能力の向上）を得るために行われ得る。したがって、特定の実施形態において、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素のアミノ酸位置を参照フレームとして使用することにより、本発明のタンパク質は、以下の改変：（Ｓ６７Ｒ、Ｓ６７Ｎ、またはＳ６７Ｋ）、（Ｔ１９７Ａ、Ｔ１９７Ｓ、Ｔ１９７Ｇ）、及び（３０２Ｋ、Ｅ３０２Ｒ、またはＥ３０２Ｇ）のうちの１つ以上、ならびに追加として、以下の改変：Ｐ５１Ｌ、Ｅ６９Ｋ、Ｐ１９６Ｓ、Ｄ２００Ｎ、Ｈ２０４Ｒ、Ｍ２８９Ｌ、Ｔ３０６Ｋ、（Ｆ３０９Ｎ、Ｆ３０９Ｙ、またはＦ３０９Ｉ）、（Ｗ３１３Ｆ、Ｗ３１３Ｌ、またはＷ３１３Ｃ）、Ｔ３３０Ｐ、（Ｌ４３５Ｇ、Ｌ４３５Ｖ、またはＬ４３５Ｒ）、Ｎ４５４Ｋ、Ｄ５２４Ｇ、Ｅ５６２Ｑ、Ｄ５８３Ｎ、Ｈ５９４Ｑ、Ｌ６０３Ｗ、（Ｄ６５３ＮまたはＤ６５３Ｈ）、及びＬ６７１Ｐのうちの１つ以上を有する逆転写酵素（例えば、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素、ＲＳＶ逆転写酵素、例えば、ヒヒ、鶏痘、コアラ、及びイノシシ種から単離されたウイルスに由来する逆転写酵素）、ならびに、これらの変異型タンパク質、これらのタンパク質をコードする核酸分子、及びこれらの核酸分子を含む宿主細胞を含む、組成物及び反応混合物を含む。
【００９９】
他の実施形態では、野生型Ｍ−ＭＬＶ（配列番号２）逆転写酵素の位置Ｐ５１、Ｅ６９、Ｐ１９６、Ｄ２００、Ｈ２０４、Ｍ２８９、Ｔ３０６、Ｆ３０９、Ｗ３１３、Ｔ３３０、Ｌ４３５、Ｎ４５４、Ｄ５２４、Ｅ５６２、Ｄ５８３、Ｈ５９４、Ｌ６０３、Ｄ６５３、及びＬ６７１に相当または対応する位置における６つ以上の変異、ならびに追加として、位置Ｓ６７、Ｔ１９７、及びＥ３０２に相当または対応する位置における１つ以上の変異が、所望される結果（例えば、熱安定性の向上、熱反応性の向上、効率の向上（速度及び処理能力）、特異性の向上、逆転写酵素阻害物質に対する耐性の向上、及び／または難しいＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡを生成する能力の向上）を得るために行われ得る。したがって、特定の実施形態において、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素のアミノ酸位置を参照フレームとして使用することにより、本発明のタンパク質は、以下の改変：Ｐ５１Ｌ、Ｅ６９Ｋ、Ｐ１９６Ｓ、Ｄ２００Ｎ、Ｈ２０４Ｒ、Ｍ２８９Ｌ、Ｔ３０６Ｋ、（Ｆ３０９Ｎ、Ｆ３０９Ｙ、またはＦ３０９Ｉ）、（Ｗ３１３Ｆ、Ｗ３１３Ｌ、またはＷ３１３Ｃ）、Ｔ３３０Ｐ、（Ｌ４３５Ｇ、Ｌ４３５Ｖ、またはＬ４３５Ｒ）、Ｎ４５４Ｋ、Ｄ５２４Ｇ、Ｅ５６２Ｑ、Ｄ５８３Ｎ、Ｈ５９４Ｑ、Ｌ６０３Ｗ、（Ｄ６５３ＮまたはＥ３０２Ｇ）、及びＬ６７１Ｐのうちの６つ以上、ならびに追加として、以下の改変：（Ｓ６７Ｒ、Ｓ６７Ｎ、またはＳ６７Ｋ）、（Ｔ１９７Ａ、Ｔ１９７Ｓ、Ｔ１９７Ｇ）、及び（Ｅ３０２Ｋ、Ｅ３０２Ｒ、またはＥ３０２Ｇ）のうちの１つ以上を有する逆転写酵素（例えば、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素、ＲＳＶ逆転写酵素、例えば、ヒヒ、鶏痘、コアラ、及びイノシシ種から単離されたウイルスに由来する逆転写酵素）、ならびに、これらの変異型タンパク質、これらのタンパク質をコードする核酸分子、及びこれらの核酸分子を含む宿主細胞を含む、組成物及び反応混合物を含む。
【０１００】
他の実施形態では、野生型Ｍ−ＭＬＶ（配列番号２）逆転写酵素の位置Ｓ６７、Ｔ１９７、及びＥ３０２に相当または対応する各位置における変異、ならびに追加として、位置Ｐ５１、Ｅ６９、Ｈ２０４、Ｆ３０９、Ｗ３１３、Ｔ３３０、Ｌ４３５、Ｎ４５４、Ｄ５２４、Ｄ５８３、Ｈ５９４、Ｄ６５３、及びＬ６７１に相当または対応する各位置における１つ以上の変異が、所望される結果（例えば、熱安定性の向上、熱反応性の向上、効率の向上（速度及び処理能力）、特異性の向上、逆転写酵素阻害物質に対する耐性の向上、及び／または難しいＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡを生成する能力の向上）を得るために行われ得る。したがって、特定の実施形態において、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素のアミノ酸位置を参照フレームとして使用することにより、本発明のタンパク質は、以下：（Ｓ６７Ｒ、Ｓ６７Ｎ、またはＳ６７Ｋ）、（Ｔ１９７Ａ、Ｔ１９７Ｓ、Ｔ１９７Ｇ）、及び（３０２Ｋ、Ｅ３０２Ｒ、またはＥ３０２Ｇ）、ならびに追加として、位置Ｐ５１Ｌ、Ｅ６９Ｋ、Ｈ２０４Ｒ、（Ｆ３０９Ｎ、Ｆ３０９Ｙ、またはＦ３０９Ｉ）、（Ｗ３１３Ｆ、Ｗ３１３Ｌ、またはＷ３１３Ｃ）、Ｔ３３０Ｐ、（Ｌ４３５Ｇ、Ｌ４３５Ｖ、またはＬ４３５Ｒ）、Ｎ４５４Ｋ、Ｄ５２４Ｇ、Ｄ５８３Ｎ、Ｈ５９４Ｑ、（Ｄ６５３ＮまたはＤ６５３Ｈ）、及びＬ６７１Ｐに改変を有する逆転写酵素（例えば、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素、ＲＳＶ逆転写酵素、例えば、ヒヒ、鶏痘、コアラ、及びイノシシ種から単離されたウイルスに由来する逆転写酵素）、ならびに、これらの変異型タンパク質、これらのタンパク質をコードする核酸分子、及びこれらの核酸分子を含む宿主細胞を含む、組成物及び反応混合物を含む。一部の実施形態において、本発明の逆転写酵素は、以下の変異：Ｐ５１Ｌ、Ｓ６７Ｒ、Ｅ６９Ｋ、Ｔ１９７Ａ、Ｈ２０４Ｒ、Ｅ３０２Ｍ、Ｆ３０９Ｎ、Ｗ３１３Ｆ、Ｔ３３０Ｐ、Ｌ４３５Ｇ、Ｎ４５４Ｋ、Ｄ５２４Ｇ、Ｄ５８３Ｎ、Ｈ５９４ＱＤ６５３Ｎ、及びＬ６７１Ｐを有し、「Ｍｕｔ  Ｄ９」（配列番号４）とも称される。
【０１０１】
一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載される特性及び配列番号４に少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有する、変異型逆転写酵素またはポリペプチドを提供する。例えば、一部の実施形態において、本発明の逆転写酵素は、配列番号４に少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である。一部の実施形態において、本発明は、配列番号４を含む変異型逆転写酵素またはポリペプチドを提供する。一部の好ましい実施形態において、本明細書に記載される変異型逆転写酵素またはポリペプチドの特性は、次のもののうちの１つ以上を含む：（ａ）熱安定性の向上、（ｂ）熱反応性の向上、（ｃ）逆転写酵素阻害物質に対する耐性の向上、（ｄ）速度の向上、（ｅ）プライマーのない逆転写の減少、及び（ｆ）処理能力の向上。
【０１０２】
上記で特定されるＭ−ＭＬＶ逆転写酵素の対応する位置は、当業者によって他の逆転写酵素に関して容易に特定することができる。したがって、本出願において記載される規定の領域及びアッセイを考慮すると、当業者であれば、熱安定性の向上、熱反応性の向上、及び／または目的の任意の逆転写酵素の他の所望される特徴をもたらすであろう指定の修飾を行うことができる。本発明により変異を受ける他の既知の逆転写酵素の特定された領域及び残基には、図１Ａ〜１Ｄに列挙されるものが含まれ得る。
【０１０３】
野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素のヌクレオチド配列（配列番号１）は、当業者に周知である。例えば、Ｓｈｉｎｎｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ  ２９３：５４３−５４８、Ｇｅｏｒｇｉａｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ３：８７９−８９２）を参照されたく、この開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１０４】
一部の好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチド指向性変異生成を用いて、コードするＤＮＡ分子の任意の決定された部位で可能性のある全ての塩基対変化を可能にする変異型逆転写酵素が作出される。当業者であれば、一度置換されたアミノ酸が、類似の特徴を有する別のアミノ酸と再度置き換えられた場合であっても、類似の生理学的及び生化学的特性が依然として観察されることを十分に認識している。アミノ酸置換が種々のアミノ酸の特性ならびにタンパク質の構造及び機能に及ぼす影響が、当業者により十分に研究されている。
【０１０５】
本発明の一部の実施形態において、本明細書に記載される変異型逆転写酵素は、対応する野生型逆転写酵素よりも高い熱安定性及び／または熱反応性を呈する。一部の実施形態において、以下の変異：Ｐ５１Ｌ、Ｓ６７Ｒ、Ｅ６９Ｋ、Ｔ１９７Ａ、Ｈ２０４Ｒ、Ｅ３０２Ｋ、Ｆ３０９Ｎ、Ｗ３１３Ｆ、Ｔ３３０Ｐ、Ｌ４３５Ｇ、Ｎ４５４Ｋ、Ｄ５２４Ｇ、Ｄ５８３Ｎ、Ｈ５９４Ｑ、Ｄ６５３Ｎ、及びＬ６７１Ｐを有するＭ−ＭＬＶ変異型逆転写酵素は、６０℃で向上した熱安定性を呈する。具体的には、一部の実施形態において、本明細書に開示される変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素は、野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素と比較して、ならびに他の市販のＭ−ＭＬＶ誘導体逆転写酵素（例えば、Ｑ−ＳＳ、ＳＳＩＩ、及びＳＳＩＩＩ）の６０℃よりも随分低い温度（すなわち、それぞれ、３７℃、４２℃、及び５０℃）におけるものと比較して、６０℃において向上した逆転写酵素活性を呈する。例えば、図２を参照されたい。
【０１０６】
本発明の一部の実施形態において、本明細書に記載される変異型逆転写酵素は、対応する野生型逆転写酵素と比較して、向上した逆転写酵素活性を呈する。一部の好ましい実施形態において、変異型逆転写酵素は、３７℃を上回る反応温度において、向上した逆転写酵素活性を呈する。例えば、本明細書に記載される変異型逆転写酵素は、３８℃、４０℃、４２℃、４５℃、４８℃、５０℃、５２℃、５５℃、５８℃、６０℃、６２℃、６５℃、６８℃、７０℃、７２℃、７５℃、７８℃等の反応温度において、向上した逆転写酵素活性を呈する。例えば、図４を参照されたい。
【０１０７】
本発明の一部の実施形態において、本明細書に記載される変異型逆転写酵素は、対応する野生型逆転写酵素と比較して少なくとも１０％高い、向上した逆転写酵素活性を呈する。例えば、本明細書に記載される変異型逆転写酵素は、対応する野生型逆転写酵素と比較して少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％等高い、逆転写酵素活性を呈する。一部の実施形態において、本明細書に記載される変異型逆転写酵素は、野生型逆転写酵素が呈する逆転写酵素活性の１１０％、１１５％、１２０％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％、５００％等の量を呈する。一部の実施形態にいて、本明細書に記載される変異型逆転写酵素は、対応する野生型逆転写酵素よりも少なくとも約１．１倍、１．５倍、１．８倍、２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、３０倍、４０倍、５０倍等高く熱反応性である。一部の実施形態において、本発明の野生型逆転写酵素は、変異型逆転写酵素の反応またはインキュベーション温度が、野生型ポリメラーゼの反応またはインキュベーション温度と比較して高い温度である場合ですら、対応する野生型逆転写酵素と比較して向上した活性を呈する。
【０１０８】
本発明の一部の実施形態において、本明細書に記載される変異型逆転写酵素は、対応する野生型逆転写酵素と比較して、両方の逆転写酵素が同じ反応温度（例えば、３７℃、４０℃、４２℃、５０℃、５２℃、５５℃、５８℃、６０℃、６２℃、６５℃、７０℃、または７５℃）にあるとき、改善または向上した特性を呈する。一部の実施形態において、本明細書に記載される変異型逆転写酵素は、対応する野生型逆転写酵素がより低温（例えば、３７℃、４０℃、４２℃、５０℃）で呈する同じ特性と比較して、上昇した反応温度（例えば、５２℃、５５℃、５８℃、６０℃、６２℃、６５℃、７０℃、７５℃）において、改善または向上した特性を呈する。
【０１０９】
別の態様において、本明細書に記載される変異型逆転写酵素は、同じｐＨで対応する野生型逆転写酵素が呈する活性と比較して、改善または向上した活性（例えば、熱安定性または熱反応性）をより低いｐＨで呈する。例えば、図３を参照されたい。
【０１１０】
一部の実施形態において、本発明の逆転写酵素は、類似または同じ条件下にある非変異型または従来のＲＴと比較して、より広範囲のｐＨで、向上した活性を呈する。例えば、本明細書に記載される変異型逆転写酵素は、約ｐＨ５．５〜約ｐＨ９．０（例えば、約ｐＨ６．０、約ｐＨ６．５、約ｐＨ７．０、約ｐＨ７．１、約ｐＨ７．２、約ｐＨ７．３、約ｐＨ７．４、約ｐＨ７．５、約ｐＨ７．６、約ｐＨ７．７、約ｐＨ７．８、約ｐＨ７．９、約ｐＨ８．０、約ｐＨ８．１、約ｐＨ８．２、約ｐＨ８．３、約ｐＨ８．４、約ｐＨ８．５、約ｐＨ８．６、約ｐＨ８．７、約ｐＨ８．８、約ｐＨ８．９、約ｐＨ９．０、約ｐＨ６．０〜約ｐＨ８．５、約ｐＨ６．５〜約ｐＨ８．５、約ｐＨ７．０〜約ｐＨ８．５、約ｐＨ７．５〜約ｐＨ８．５、約ｐＨ６．０〜約ｐＨ８．０、約ｐＨ６．０〜約ｐＨ７．７、約ｐＨ６．０〜約ｐＨ７．５、約ｐＨ６．０〜約ｐＨ７．０、約ｐＨ７．２〜約ｐＨ７．７、約ｐＨ７．３〜約ｐＨ７．７、約ｐＨ７．４〜約ｐＨ７．６、約ｐＨ７．０〜約ｐＨ７．４、約ｐＨ７．６〜約ｐＨ８．０、約ｐＨ７．６〜約ｐＨ８．５、約ｐＨ７．７〜約ｐＨ８．５、約ｐＨ７．９〜約ｐＨ８．５、約ｐＨ８．０〜約ｐＨ８．５、約ｐＨ８．２〜約ｐＨ８．５、約ｐＨ８．３〜約ｐＨ８．５、約ｐＨ８．４〜約ｐＨ８．５、約ｐＨ８．４〜約ｐＨ９．０、約ｐＨ８．５〜約ｐＨ９．０等）のｐＨ範囲で、野生型逆転写酵素と比較して向上した活性を呈する。一部の実施形態において、本発明の変異型逆転写酵素は、同じｐＨにおいて野生型ＲＴと比較して、少なくとも１０％（例えば、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、７５％、１００％、２００％、３００％、５００％等）高い活性を呈する。他の実施形態では、本発明の変異型逆転写酵素は、同じｐＨにおいて野生型ＲＴと比較して、少なくとも１０％（例えば、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、７５％、１００％、２００％、３００％、５００％等）高いｃＤＮＡ生成物を生成する。さらなる他の実施形態では、本発明の変異型逆転写酵素は、同じｐＨにおいて対応する野生型ＲＴが生成するｃＤＮＡ生成物よりも少なくとも１０％（例えば、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、７５％、１００％、２００％、３００％、５００％等）長いｃＤＮＡ生成物を生成する。なおも他の実施形態では、本発明の変異型逆転写酵素は、同じｐＨにおいて対応する野生型ＲＴのものよりも少なくとも１０％（例えば、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、７５％、１００％、２００％、３００％、５００％等）速い速度で、ｃＤＮＡ生成物を生成する。例えば、本発明の変異型逆転写酵素は、同じｐＨにおいて対応する野生型ＲＴよりも少なくとも２倍（例えば、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍等）多いｃＤＮＡ生成物を生成する。
【０１１１】
本発明の一部の実施形態において、本明細書に記載される変異型逆転写酵素は、５５℃〜７５℃の温度に加熱した後、少なくとも２０％の逆転写酵素活性を保持する。例えば、変異型逆転写酵素は、５５℃〜７５℃の温度に加熱した後、少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の逆転写酵素活性を保持する。一部の実施形態では、変異型逆転写酵素は、５５℃〜７５℃の温度まで少なくとも５分間加熱した後、少なくとも２０％の逆転写酵素活性を保持する。例えば、変異型逆転写酵素は、５５℃〜７５℃の温度まで少なくとも５分間加熱した後、少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の逆転写酵素活性を保持する。
【０１１２】
本発明の一部の実施形態において、本明細書に記載される変異型逆転写酵素は、５０℃〜７５℃の温度に加熱した後、少なくとも２０％の逆転写酵素活性を保持する。例えば、変異型逆転写酵素は、５０℃、５５℃、５８℃、６０℃、６２℃、６４℃、６８℃、７０℃、７２℃、または７５℃の温度に加熱した後、少なくとも２０％の逆転写酵素活性を保持する。一部の実施形態において、変異型逆転写酵素は、５０℃〜７５℃の温度まで少なくとも５分間加熱した後、少なくとも２０％の逆転写酵素活性を保持する。例えば、変異型逆転写酵素は、５０℃、５８℃、６０℃、６２℃、６４℃、６８℃、７０℃、７２℃、または７５℃の温度まで少なくとも５分間加熱した後、少なくとも２０％の逆転写酵素活性を保持する。
【０１１３】
本発明の一部の実施形態において、本明細書に記載される変異型逆転写酵素は、５０℃〜７５℃の温度まで少なくとも１分間加熱した後、少なくとも２０％の逆転写酵素活性を保持する。例えば、変異型逆転写酵素は、５０℃〜７５℃の温度まで少なくとも１分間、２分間、５分間、１０分間、１５分間、２０分間、３０分間、４０分間、５０分間、６０分間等加熱した後、少なくとも２０％の逆転写酵素活性を保持する。一部の実施形態において、変異型逆転写酵素は、約５０℃、約５５℃、約５８℃、約６０℃、約６２℃、約６４℃、約６８℃、約７０℃、約７２℃、または約７５℃の温度まで少なくとも約１分間、約２分間、約５分間、約１０分間、約１５分間、約２０分間、約３０分間、約４０分間、約５０分間、または約６０分間加熱した後、少なくとも約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％、または約１００％の逆転写酵素活性を保持する。
【０１１４】
本発明の一部の実施形態において、本明細書に記載される変異型逆転写酵素は、長さが少なくとも０．２ｋｂであるｃＤＮＡを生成することができる。例えば、変異型逆転写酵素は、長さが０．２ｋｂ、０．５ｋｂ、１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、７．５ｋｂ、８ｋｂ、８．５ｋｂ、９ｋｂ、９．５ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、または２０ｋｂ等であるｃＤＮＡを生成することができる。一部の実施形態において、本明細書に記載される変異型逆転写酵素は、長さが約０．２ｋｂ〜１０ｋｂであるｃＤＮＡを生成することができる。一部の実施形態において、本明細書に記載される変異型逆転写酵素は、２５℃〜７５℃の温度で１分〜６０分以内に、長さが約０．２ｋｂ〜１０ｋｂであるｃＤＮＡを生成することができる。一部の実施形態において、変異型逆転写酵素は、少なくとも３７℃（例えば、３７℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、７０℃、または７５℃）の温度で１分、５分、１０分、１５分、２０分、３０分、４０分、５０分、または６０分以内に、長さが約０．２ｋｂ〜１０ｋｂであるｃＤＮＡを生成することができる。
【０１１５】
一部の好ましい実施形態では、本発明の変異型または変異生成した逆転写酵素は、対応する野生型逆転写酵素よりも高い熱安定性を呈する。具体的には、本明細書に記載される変異型逆転写酵素は、向上した熱安定性及び／または向上した熱反応性を呈する。本明細書に記載の可能性のある変異型逆転写酵素の中でも、例示的な変異体「Ｄ９」（配列番号４）（図１１を参照されたい）は、少なくとも５０℃で向上した熱安定性を呈する。一部の実施形態において、６０℃において、この例示的な変異型逆転写酵素は、３７℃の温度で野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素よりも効率的にｃＤＮＡを生成する。
【０１１６】
別の態様において、本明細書に記載される変異型逆転写酵素は、例えば、血液、汗、涙、土壌、糞便、唾液、尿、及び胆汁を含む、生物試料に見られる酵素阻害物質に対して耐性である。そのような阻害物質としては、フミン酸、ヘパリン、エタノール、胆汁酸塩、フルボ酸、多糖類、金属イオン、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ＥＤＴＡ、グアニジウム塩、ホルムアミド、ピロリン酸ナトリウム、及びスペルミジンが挙げられるがこれらに限定されない。阻害物質耐性逆転写酵素（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐａｔａｓｅ）とは、本明細書に使用されるとき、反応混合物中の阻害物質（複数可）の存在下にいて、少なくとも１０％の逆転写酵素活性を呈する逆転写酵素を指し得る。例えば、本明細書に記載される変異型逆転写酵素は、阻害物質を含まない反応と比較して、阻害物質の存在下において最大約９０％（例えば、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％等）の逆転写酵素活性を呈する。任意の所与の反応混合物中における阻害物質の量は、アッセイされる核酸が抽出される生物試料内に存在する阻害性物質の種類に依存し得る。一般には、本明細書に記載される変異型逆転写酵素は（高い温度のときであっても）、対応する野生型逆転写酵素と比較して、少なくとも２倍（例えば、２倍、３倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍）高い濃度のこれらの阻害性物質に耐え得る。試料中の阻害性物質の濃度を判定するアッセイは、当該技術分野で既知である。阻害物質耐性は、本明細書に記載されるアッセイによって容易に判定することができる。
【０１１７】
逆転写酵素の発現
本発明の逆転写酵素の発現を最適化するためには、誘導性または構成性プロモーターが周知であり、これらを、組み換え宿主において高レベルの逆転写酵素の構造遺伝子を発現させるために用いることができる。同様に、当該技術分野で周知の高コピー数ベクターを用いて高レベルの発現を達成することもできる。誘導性高コピー数を有するベクターもまた、組み換え宿主における本発明の逆転写酵素の発現を強化するのに有用であり得る。
【０１１８】
原核生物細胞（例えば、大腸菌、枯草菌、シュードモナス等）において所望される構造遺伝子を発現させるためには、所望される構造遺伝子を機能性原核生物プロモーターに機能的に連結させることが好ましい。しかしながら、逆転写酵素遺伝子の天然のプロモーターが、原核生物宿主において機能し、逆転写酵素遺伝子の発現を可能にさせることができる。したがって、天然のプロモーターまたは他のプロモーターを、逆転写酵素遺伝子を発現させるのに用いることができる。発現を強化するために使用することができるそのような他のプロモーターには、構成性または制御性（すなわち、誘導性または抑制解除性）プロモーターが挙げられる。構成性プロモーターの例としては、バクテリオファージλのｉｎｔプロモーター、及びｐＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子のｂｌａプロモーターが挙げられる。誘導性原核生物プロモーターの例としては、バクテリオファージの主な右側及び左型のプロモーター（ＰＲ及びＰＬ）、ｔｒｐ、ｒｅｃＡ、ｌａｃＺ、ｌａｄ、ｔｅｔ、ｇａｌ、ｔｒｃ、ａｒａ  ＢＡＤ（Ｇｕｚｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７（１４）：４１２１−４１３０）、ならびに大腸菌のｔａｃプロモーターが挙げられる。枯草菌プロモーターには、α−アミラーゼ（Ｕｌｍａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １６２：１７６−１８２（１９８５））及び桿菌バクテリオファージプロモーター（Ｇｒｙｃｚａｎ，Ｔ．，Ｉｎ：Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２））が挙げられる。ストレプトマイセスプロモーターは、Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０３：４６８４７８（１９８６））によって記載されている。原核生物プロモーターはまた、Ｇｌｉｃｋ，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１：２７７−２８２（１９８７）、Ｃｅｎａｔｉｅｍｐｔｏ，Ｙ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ６８：５０５−５１６（１９８６）、及びＧｏｔｔｅｓｍａｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１８：４１５−４４２（１９８４）によっても考察されている。原核生物細胞における発現にはまた、遺伝子コード配列の上流にリボソーム結合部位の存在を要する。そのようなリボソーム結合部位は、例えば、Ｇｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５：３６５４０４（１９８１）によって開示されている。
【０１１９】
真核生物細胞における本発明の逆転写酵素の発現を強化するためには、周知の真核生物プロモーター及び宿主を使用することができる。逆転写酵素の発現の強化は、原核生物宿主において達成してもよい。本発明での使用に好適な原核生物宿主の一例は、大腸菌である。
【０１２０】
逆転写酵素の単離及び精製
本発明の酵素（複数可）は、好ましくは、所望される逆転写酵素を含み、それを発現する組み換え宿主の培養での成長によって生成される。しかしながら、本発明の逆転写酵素は、本発明の逆転写酵素を生成する任意の株、生物、または組織から単離してもよい。逆転写酵素のフラグメントもまた、本発明に含まれる。そのようなフラグメントには、タンパク質分解性フラグメント及び逆転写酵素活性を有するフラグメントが挙げられる。そのようなフラグメントはまた、目的の逆転写酵素遺伝子の部分をクローニング及び発現させ、フレームシフト変異を起こすことによって、ならびに／または切断されたタンパク質もしくはポリペプチドの発現のために目的の遺伝子に１つ以上の停止コドンを付加することによって、生成することができる。好ましくは、本発明のポリペプチドは、それらを発現する細胞または生物（野生型細胞もしくは生物または組み換え細胞もしくは生物であり得る）から精製及び／または単離することができる。一部の実施形態において、そのようなポリペプチドは、それらが発現される細胞または生物から実質的に単離してもよい。
【０１２１】
クローニングした逆転写酵素遺伝子を含む宿主によって吸収され得る任意の栄養素が、培養培地に添加されてもよい。最適な培養条件は、使用される株及び培養培地の組成によって事例毎に選択されるはずである。また、発現される所望の遺伝子を含むベクターＤＮＡを確実に維持するために、抗生物質を成長培地に添加してもよい。培地の調合は、ＤＳＭまたはＡＴＣＣのカタログ、ならびにＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）に記載されている。
【０１２２】
本発明の逆転写酵素を生成する組み換え宿主細胞は、例えば、遠心分離によって、液体培養物から分離してもよい。一般に、収集した微生物細胞を、好適な緩衝液中に分散させた後、緩衝溶液による酵素の抽出を可能にするように、超音波処理または他の周知の手順によって強制的に開ける。超遠心分離または遠心分離により細胞破壊片を除去した後、例えば、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、電気泳動等の標準的なタンパク質精製技法によって、逆転写酵素を精製することができる。精製中に逆転写酵素の存在を検出するためのアッセイが当該技術分野で周知であり、それらのアッセイを従来的な生化学的精製中に用いて、これらの酵素の存在を判定することができる。
【０１２３】
一部の実施形態において、本発明の逆転写酵素は、逆転写酵素の精製を促進するために、親和性タグを含むように変異させることができる。好適な親和性タグは当業者に周知であり、これらのタグとしては、６つのヒスチジン等のアミノ酸の繰り返し配列、赤血球凝集素エピトープ及びｍｙｃエピトープ等のエピトープ、ならびに逆転写酵素の単純な精製を許容する他のアミノ酸配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２４】
本発明はさらに、（１）逆転写酵素と関連する１つ以上の活性を有するタンパク質またはそのフラグメントと、（２）タグ（例えば、親和性タグ）とを含む、融合タンパク質を提供する。特定の実施形態において、本発明は、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８つ等）のタグを有する、本明細書に記載される逆転写酵素（例えば、熱安定性逆転写酵素）を含む。これらのタグは、例えば、逆転写酵素と関連する１つ以上の活性を有するタンパク質またはそのフラグメントの（１）Ｎ末端、（２）Ｃ末端、または（３）Ｎ末端とＣ末端の両方に位置付けられ得る。タグはまた、内部（例えば、逆転写酵素に由来するかアミノ酸側鎖に付加された、アミノ酸配列の領域の間）に位置付けられてもよい。例えば、Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．７：１６３６−１６３８（１９９８）は、親和性タグ（すなわち、ヘキサヒスチジン配列）が挿入された大腸菌由来のシデロフォア受容体ＦｈｕＡについて記載している。このタグは、金属キレート親和性クロマトグラフィーを用いた精製プロトコルにおいて機能することが示された。内部タグを有する追加の融合タンパク質は、米国特許第６，１４３，５２４号に記載されており、その全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２５】
本発明の組成物を調製するために使用されるタグは、長さが多様であり得るが、典型的には、約５〜約５００個、約５〜約１００個、約１０〜約１００個、約１５〜約１００個、約２０〜約１００個、約２５〜約１００個、約３０〜約１００個、約３５〜約１００個、約４０〜約１００個、約４５〜約１００個、約５０〜約１００個、約５５〜約１００個、約６０〜約１００個、約６５〜約１００個、約７０〜約１００個、約７５〜約１００個、約８０〜約１００個、約８５〜約１００個、約９０〜約１００個、約９５〜約１００個、約５〜約８０個、約１０〜約８０個、約２０〜約８０個、約３０〜約８０個、約４０〜約８０個、約５０〜約８０個、約６０〜約８０個、約７０〜約８０個、約５〜約６０個、約１０〜約６０個、約２０〜約６０個、約３０〜約６０個、約４０〜約６０個、約５０〜約６０個、約５〜約４０個、約１０〜約４０個、約２０〜約４０個、約３０〜約４０個、約５〜約３０個、約１０〜約３０個、約２０〜約３０個、約５〜約２５個、約１０〜約２５個、または約１５〜約２５個のアミノ酸残基の長さである。
【０１２６】
本発明の組成物を調製するために使用されるタグには、融合タンパク質の熱安定性に寄与するものが含まれる。したがって、これらのタグは、例えば、向上した熱安定性を有する特定のタンパク質（例えば、逆転写酵素活性の１つ以上の活性を有するタンパク質）に少なくとも部分的に関与している。逆転写酵素（すなわち、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素）の熱安定性を強化するタグの例としては、以下のアミノ酸配列：
2017503521.tif 000005
を有するタグが挙げられるがこれらに限定されない。これらのタグのフラグメント（好ましくは、３個以上、５個以上、１０個以上、または１５個以上のアミノ酸を有するもの）もまた、本発明に従って使用することができるしたがって、本発明は、部分的に、タグを含み、強化された熱安定性を呈する逆転写酵素またはそのフラグメントを含む。周知の方法を使用して、当業者であれば、上述のタグの１つ以上を１つ以上のＲＴ酵素または逆転写酵素活性を有するそのフラグメントに結合させて、熱安定性逆転写酵素またはそのフラグメントを生成することができる。
【０１２７】
本発明の実施に使用されるタグは、任意の多数の目的を果たし得、多数のタグが、本発明の逆転写酵素に１つ以上の異なる機能を付与するために付加され得る。例えば、タグは、（１）タンパク質内部でのものと他のタンパク質分子とのものと両方のタンパク質間相互作用に寄与し得る、（２）タンパク質を特定の生成方法に適したものにし得る、（３）タンパク質が組成物中に存在するかどうかを特定することを可能にし得る、または（４）タンパク質に他の機能的特徴を与え得る。
【０１２８】
本発明の実施で使用することができるタグの例としては、金属結合ドメイン（例えば、３、４、５、６、または７個のヒスチジン領域等のポリ−ヒスチジンセグメント）、免疫グロブリン結合ドメイン（例えば、（１）プロテインＡ、（２）プロテインＧ、（３）Ｔ細胞、Ｂ細胞、及び／もしくはＦｃ受容体、ならびに／または（４）相補的タンパク質抗体結合ドメイン）、糖結合ドメイン（例えば、マルトース結合ドメイン、キチン結合ドメイン）、ならびに検出可能ドメイン（例えば、β−ガラクトシダーゼの少なくとも一部分）が挙げられる。融合タンパク質は、上述のもの等のタグを１つ以上含み得る。典型的には、１つを上回るタグを含む融合タンパク質は、逆転写酵素の１つの末端または両方の末端（すなわち、Ｎ末端及びＣ末端）にこれらのタグを含むが、１つ以上のタグは、末端に存在するものの代わりにかまたはそれに加えて、内部に位置付けられてもよい。さらに、１つを上回るタグは、逆転写酵素の一方の末端に、内部に、及び／または両方の末端に存在してもよい。例えば、３つの連続したタグが、末端と末端とで（ｅｎｄ−ｔｏ−ｅｎｄ）逆転写酵素のＮ末端に連結されてもよい。本発明はさらに、上述の融合タンパク質を含む組成物及び反応混合物、ならびにこれらの融合タンパク質、これらの融合タンパク質をコードする核酸分子（例えば、ベクター）、及びこれらの核酸分子を含む組み換え宿主細胞を調製するための方法を含む。本発明はまた、本明細書の他の箇所に記載されるように、これらの融合タンパク質を使用する方法（例えば、核酸分子を逆転写するための方法）を含む。
【０１２９】
融合タンパク質が組成物中に存在するかどうかを特定することを可能にするタグには、例えば、電気泳動ゲル中のタンパク質を特定するために使用することができるタグが挙げられる。多数のそのようなタグが当該技術分野で既知であり、それらには、ウェスタンブロットで使用することができるエピトープ及び抗体結合ドメインが挙げられる。
【０１３０】
本発明において使用するためのタグのアミノ酸組成は、多様であり得る。一部の実施形態において、タグは、約１％〜約５％の生理学的ｐＨで正の電荷を有するアミノ酸、例えば、リジン、アルギニン、及びヒスチジン、または約５％〜約１０％の生理学的ｐＨで正の電荷を有するアミノ酸、または約１０％〜約２０％の生理学的ｐＨで正の電荷を有するアミノ酸、または約１０％〜約３０％の生理学的ｐＨで正の電荷を有するアミノ酸、または約１０％〜約５０％の生理学的ｐＨで正の電荷を有するアミノ酸、または約１０％〜約７５％の生理学的ｐＨで正の電荷を有するアミノ酸を含み得る。一部の実施形態において、タグは、約１％〜約５％の生理学的ｐＨで負の電荷を有するアミノ酸、例えば、アスパラギン酸及びグルタミン酸、または約５％〜約１０％の生理学的ｐＨで負の電荷を有するアミノ酸、または約１０％〜約２０％の生理学的ｐＨで負の電荷を有するアミノ酸、または約１０％〜約３０％の生理学的ｐＨで負の電荷を有するアミノ酸、または約１０％〜約５０％の生理学的ｐＨで負の電荷を有するアミノ酸、または約１０％〜約７５％の生理学的ｐＨで負の電荷を有するアミノ酸を含み得る。一部の実施形態において、タグは、同じかまたは異なってもよく、同じかまたは異なる荷電のものであってもよい、２つ以上の連続した荷電アミノ酸の配列を含み得る。例えば、タグは、同じかまたは異なってもよい、一連の（例えば、２、３、４、５、６、１０個等の）正に荷電したアミノ酸を含み得る。タグは、同じかまたは異なってもよい、一連の（例えば、２、３、４、５、６、１０個等の）負に荷電したアミノ酸を含み得る。一部の実施形態において、タグは、同じかまたは異なってもよい、一連の（例えば、２、３、４、５、６、１０個等の）正の電荷と負の電荷が交互に荷電した（例えば、正、負、正、負等）アミノ酸を含み得る。上述の一連のアミノ酸（例えば、正電荷、負電荷、または交互の電荷）のいずれも、荷電アミノ酸間に間隔をあけて１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、１０個等）の中性の極性または非極性アミノ酸を含んでもよい。そのような中性アミノ酸は、一連の荷電アミノ酸全体に均等に分配されてもよく（例えば、荷電、中性、荷電、中性）、または連なり全体に不規則に分配されてもよい（例えば、荷電、複数の中性、荷電、中性、複数の荷電等）。一部の実施形態において、本発明のポリペプチドに結合したタグは、生理学的ｐＨにおいて全体として電荷を有してもよい（例えば、正電荷または負電荷）。全体としての電荷の大きさは多様であり得、タグは、正味の正電荷１、２、３、４、５等を有してもよく、または正味の負電荷１、２、３、４、５等を有してもよい。本発明はまた、上述のタグ配列のうちの１つ以上を含む逆転写酵素（例えば、熱安定性逆転写酵素）、そのような逆転写酵素をコードするベクター、そのような逆転写酵素を含む宿主細胞反応混合物、組成物、及び反応混合物、ならびにそのような逆転写酵素を格納する格納容器を含むキットを提供する。
【０１３１】
一部の実施形態において、タグ配列及び逆転写酵素（ＲＴ）活性を有する配列を含む融合タンパク質から、タグ配列の全てまたは一部分を除去することが望ましい場合がある。この種の実施形態では、例えばプロテアーゼ酵素の切断部位を形成する１つ以上のアミノ酸が、融合タンパク質の一次配列に組み込まれ得る。切断部位は、その部位での切断により、融合タンパク質からタグ配列の全てまたは一部分を除去できるように、位置付けられ得る。一部の実施形態において、切断部位は、切断部位を認識するプロテアーゼ酵素でも切断によりタグ配列の全てが除去されるように、タグ配列とＲＴ活性を有する配列との間に位置付けられ得る。好適な切断部位の例としては、配列Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇを有するＸａ因子切断部位（血液凝固因子Ｘａによって認識され切断される）、及び配列Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇを有するトロンビン切断部位（トロンビンにより認識され切断される）が挙げられるがこれらに限定されない。他の好適な切断部位が当業者に既知であり、本発明と併せて使用され得る。
【０１３２】
一部の実施形態では、本発明の逆転写酵素は、約５ユニット／ｍｇを上回る、好ましくは約５０ユニット／ｍｇを上回る、より好ましくは約１００ユニット／ｍｇを上回る、２５０ユニット／ｍｇを上回る、５００ユニット／ｍｇを上回る、１０００ユニット／ｍｇを上回る、５０００ユニット／ｍｇ、または１０，０００ユニット／ｍｇを上回る、最も好ましくは約１５，０００ユニット／ｍｇを上回る、約１６，０００ユニット／ｍｇを上回る、約１７，０００ユニット／ｍｇを上回る、約１８，０００ユニット／ｍｇを上回る、約１９，０００ユニット／ｍｇを上回る、及び約２０，０００ユニット／ｍｇを上回る、特異活性（例えば、ＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ活性及び／またはＲＮａｓｅ Ｈ活性）を有する。一部の実施形態において、本発明の逆転写酵素は、約５０，０００ユニット／ｍｇを上回る、約１００，０００ユニット／ｍｇを上回る、約１５０，０００ユニット／ｍｇを上回る、約２００，０００ユニット／ｍｇを上回る、約２５０，０００ユニット／ｍｇを上回る、及び約３００，０００ユニット／ｍｇを上回る、特異活性を有し得る。本発明の逆転写酵素の特異活性の好ましい範囲としては、約５ユニット／ｍｇ〜約７５０，０００ユニット／ｍｇの特異活性、約５ユニット／ｍｇ〜約５００，０００ユニット／ｍｇの特異活性、約５ユニット／ｍｇ〜約３００，０００ユニット／ｍｇ、約５０ユニット／ｍｇ〜約７５０，０００ユニット／ｍｇの特異活性、約１００ユニット／ｍｇ〜約７５０，０００ユニット／ｍｇの特異活性、約２５０ユニット／ｍｇ〜約７５０，０００ユニット／ｍｇの特異活性、約５００ユニット／ｍｇ〜約７５０，０００ユニット／ｍｇの特異活性、約１０００ユニット／ｍｇ〜約７５０，０００ユニット／ｍｇの特異活性、約５０００ユニット／ｍｇ〜約７５０，０００ユニット／ｍｇの特異活性、約１０，０００ユニット／ｍｇ〜約７５０，０００ユニット／ｍｇの特異活性、約２５，０００ユニット／ｍｇ〜約７５０，０００ユニット／ｍｇの特異活性、約１００ユニット／ｍｇ〜約５００ユニット／ｍｇの特異活性、約１００ユニット／ｍｇ〜約４００ユニット／ｍｇの特異活性、及び約２００ユニット／ｍｇ〜約５００ユニット／ｍｇの特異活性が挙げられる。他の好適な特異活性範囲としては、約２００，０００ユニット／ｍｇ〜約３５０，０００ユニット／ｍｇの特異活性、約２２５，０００ユニット／ｍｇ〜約３００，０００ユニット／ｍｇの特異活性、約２５０，０００ユニット／ｍｇ〜約３００，０００ユニット／ｍｇの特異活性、約２００，０００ユニット／ｍｇ〜約７５０，０００ユニット／ｍｇの特異活性、約２００，０００ユニット／ｍｇ〜約５００，０００ユニット／ｍｇの特異活性、約２００，０００ユニット／ｍｇ〜約４００，０００ユニット／ｍｇの特異活性、約２５０，０００ユニット／ｍｇ〜約７５０，０００ユニット／ｍｇの特異活性、約２５０，０００ユニット／ｍｇ〜約５００，０００ユニット／ｍｇの特異活性、及び約２５０，０００ユニット／ｍｇ〜約４００，０００ユニット／ｍｇの特異活性が挙げられる。好ましくは、特異活性範囲の下限は、５０、１００、２００、３００、４００、５００、７００、９００��１，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、５５，０００、６０，０００、６５，０００、７０，０００、７５，０００、及び８０，０００ユニット／ｍｇで多様であり得、一方で範囲の上限は７５０，０００、６５０，０００、６００，０００、５５０，０００、５００，０００、４５０，０００、４００，０００、３５０，０００、３００，０００、２５０，０００、２００，０００、１５０，０００、１４０，０００、１３０，０００、１２０，０００、１１０，０００、１００，０００、及び９０，０００ユニット／ｍｇであり得る。特異活性は、当該技術分野で周知の酵素アッセイ及びタンパク質アッセイを用いて判定することができる。ＤＮＡポリメラーゼアッセイ及びＲＮａｓｅ Ｈアッセイは、例えば、米国特許第５，２４４，７９７号及び国際公開第ＷＯ９８／４７９１２号に記載されており、これらの開示は、参照により完全に本明細書に組み込まれる。本発明の一部の実施形態において、本発明に従って調製した熱安定性逆転写酵素の特異活性は、非熱安定性（野生型）逆転写酵素の特異活性よりも高くなり得る。一部の実施形態において、熱安定性逆転写酵素の特異活性は、対応する非熱安定性逆転写酵素の特異活性よりも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、またはそれ以上高くなり得る。一部の好ましい実施形態において、本発明による熱安定性逆転写酵素の特異活性は、対応する非熱安定性逆転写酵素の特異活性よりも３０％以上であり得る。本発明によると、特異活性は、反応に使用されるタンパク質または酵素の合計量に対する、タンパク質または酵素の酵素活性（ユニット単位）の測定値である。特異活性の測定値は、当業者に周知の標準的な技法により決定することができる。
【０１３３】
逆転写酵素を含む組成物及び反応混合物
本教示は、様々な構成要素を様々な組み合わせで含む組成物を提供する。本発明の一部の実施形態において、本組成物は、緩衝塩溶液中に１つ以上の逆転写酵素を混合することによって調合される。場合によっては、１つ以上のＤＮＡポリメラーゼ及び／もしくは１つ以上のヌクレオチド、ならびに／または１つ以上のプライマーを添加して、本発明の組成物を作製してもよい。これらの組成物は、核酸分子の生成、分析、定量化、及びそれ以外では操作（例えば、逆転写または１工程（連結）ＲＴ−ＰＣＲ手順を用いて）を行うために、本方法で使用され得る。
【０１３４】
一部の実施形態において、酵素は、安定な緩衝塩溶液中に作業濃度（例えば、１倍）で提供される。本明細書に使用される「安定な」及び「安定性」という用語は、一般に、酵素または酵素を含有する組成物を約４℃の温度で約１週間、約−２０℃の温度で約２〜６ヶ月間、約−８０℃の温度で約６ヶ月以上保管した後に、酵素組成物等の組成物により、元の酵素活性（ユニット単位）の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％が保持されることを意味する。本明細書に使用されるとき、「作業濃度」とは、特定の機能（核酸の逆転写等）を行うための、溶液中で使用される最適濃度またはほぼ最適濃度である、酵素の濃度を意味する。
【０１３５】
そのような組成物は、濃縮ストック溶液（例えば、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、１０倍等）として調合してもよい。一部の実施形態において、組成物を濃縮（例えば、５倍）ストック溶液として有することにより、より多量の核酸試料を添加することが可能となる（例えば、組成物を核酸合成に使用する場合等）。
【０１３６】
本発明の組成物を形成するのに使用する水は、好ましくは、蒸留水、脱イオン水、及び滅菌濾過水（０．１〜０．２マイクロメートルフィルタを通したもの）であり、ＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅ酵素の混入がないものである。そのような水は、例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から市販されているか、または当業者に周知の方法により必要に応じて作製してもよい。
【０１３７】
酵素成分に加えて、本組成物は、ｃＤＮＡ分子等の核酸の合成に必要とされる１つ以上の緩衝液及び補助因子を含んでもよい。一部の実施形態において、本組成物を形成するのに使用するための緩衝液は、トリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ（登録商標））または４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）の酢酸塩、硫酸塩、塩酸塩、リン酸塩、または遊離酸の形態であるが、およそのイオン強度及びｐＫａがＴＲＩＳ（登録商標）またはＨＥＰＥＳと同じ代替的な緩衝液を使用して同等の結果を得てもよい。例えば、記載される酵素とともに使用することができる緩衝液には、３−｛［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ビドロキシエチル）グリシン（ビシン）、（ヒドロキシメチル）メチルアミン（トリス）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン（トリシン）、３−［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、４−２−ヒドロキシエチル−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−｛［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ′−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、及びジメチルアルシン酸（カコジル酸）を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０１３８】
緩衝塩に加えて、カリウム（好ましくは、塩化カリウムまたは酢酸カリウム）及びマグネシウム（好ましくは、塩化マグネシウムまたは酢酸マグネシウム）のもの等、補助因子の塩が、本発明の組成物での使用に企図される。
【０１３９】
本組成物及び／または合成反応混合物への１つ以上の炭水化物及び／または糖の添加もまた、保管時の組成物の安定性の強化及び／または合成時の反応混合物を補助するのに有利であり得る。一部の実施形態において、本発明の組成物及び／または合成反応混合物に含めるための炭水化物または糖としては、スクロース、トレハロース、グリセロール等が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態において、トレハロースは、０．０１Ｍ〜５Ｍの範囲の濃度（例えば、０．０１Ｍ、０．０５Ｍ、０．１Ｍ、０．５Ｍ、０．７５Ｍ、１．０Ｍ、２．０Ｍ、３．０Ｍ、４．０Ｍ、または５．０Ｍ）で提供される。一部の実施形態において、グリセロールは、５％〜６０％の範囲の濃度（例えば、５％、１０％、１５％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％）で提供される。さらに、そのような炭水化物及び／または糖は、本発明の酵素組成物及びキットの生成に使用される酵素の保管緩衝液に添加してもよく、液体または乾燥形態（例えば、凍結乾燥）のいずれかである組成物に提供される。そのような炭水化物及び／または糖は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）を含め、多数の供給業者から市販されている。
【０１４０】
同様に、本組成物及び／または合成反応混合物への１つ以上の表面活性剤及び／または界面活性剤の添加もまた、保管時の組成物及び／または反応混合物の安定性の強化を補助するのに有利であり得る。本発明の組成物及び／または合成反応混合物に含めるのに好ましいそのような界面活性剤には、Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ  ４０（ＮＰ−４０）、Ｂｒｉｊ５８、ＣＨＡＰＳ、Ｂｉｇ  ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳ等が挙げられるがこれらに限定されない。他の表面活性剤または界面活性剤、例えば、係属中の米国出願第１３／４９２，５７６号及び同第６１／８９５，８７６号（これらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるものもまた、本発明の組成物及び／または合成反応混合物に含まれ得る。さらに、そのような界面活性剤は、本発明の酵素組成物及びキットの生成に使用される酵素の保管緩衝液に添加されてもよい。そのような界面活性剤の例は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）を含め、多数の供給業者から市販されている。
【０１４１】
まず、緩衝塩、補助因子塩、炭水化物もしくは糖、または界面活性剤を作業濃度で水中に溶解させ、酵素添加の前に溶液のｐＨを調節するのが好ましい場合が多い。このようにすると、ｐＨ感受性酵素が、本組成物の調合中に酸またはアルカリに媒介される不活性化を受けることが少なくなる。したがって、一部の実施形態において、緩衝塩溶液は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ（登録商標））の塩またはその塩酸塩といった緩衝塩を、十分な量の水と合わせることによって、調合される。一部の実施形態において、この組み合わせにより、５〜１５０ミリモル、好ましくは１０〜６０ミリモル、最も好ましくは約２０〜６０ミリモルのＴＲＩＳ（登録商標）濃度を有する溶液が得られる。この溶液に、マグネシウムの塩（好ましくは、その塩化物塩もしくは酢酸塩のいずれか）または他の二価カチオンの塩を添加して、１〜１０ミリモル、好ましくは１．５〜８．０ミリモル、最も好ましくは約３〜７．５ミリモルの作業濃度のものを得てもよい。また、カリウムの塩（好ましくは、カリウムの塩化物塩または酢酸塩）、または他の一価カチオン（例えば、Ｎａ）の塩を、１０〜１００ミリモル、好ましくは約７５ミリモルの作業濃度で、この溶液に添加してもよい。ジチオスレイトール等の還元剤を、好ましくは、約１〜１００ｍＭの最終濃度、より好ましくは約５〜５０ｍＭまたは約７．５〜２０ｍＭの濃度、最も好ましくは約１０ｍＭの濃度で溶液に添加してもよい。本発明の組成物に含めるのに好ましい炭水化物及び／または糖の濃度は、約５％（ｗ／ｖ）〜約３０％（ｗ／ｖ）、約７．５％（ｗ／ｖ）〜約２５％（ｗ／ｖ）、約１０％（ｗ／ｖ）〜約２５％（ｗ／ｖ）、約１０％（ｗ／ｖ）〜約２０％（ｗ／ｖ）、好ましくは約１０％（ｗ／ｖ）〜約１５％（ｗ／ｖ）の範囲に及ぶ。本発明の組成物に含めるのに好ましい表面活性剤及び／または界面活性剤の濃度は、約０．００１％（ｗ／ｖ）〜約５％（ｗ／ｖ）、約０．００２％（ｗ／ｖ）〜約２％（ｗ／ｖ）、約０．００４％（ｗ／ｖ）〜約１％（ｗ／ｖ）、約０．０１％（ｗ／ｖ）〜約０．５％（ｗ／ｖ）、好ましくは約０．０５％（ｗ／ｖ）〜約０．１％（ｗ／ｖ）の範囲に及ぶ。少量のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の塩、例えば、ＥＤＴＡ二ナトリウムもまた、添加され得る（好ましくは約０．１ミリモル）。一部の実施形態において、全ての緩衝液及び塩を添加した後、この緩衝塩溶液を、全ての塩が溶解するまで十分に混合し、当該技術分野で既知の方法を用いてｐＨを調節する。一部の実施形態において、最終的な緩衝液のｐＨは、約６．０〜約９．５、約６．９〜約８．７、または約７．３〜約８．３の範囲に及ぶ。
【０１４２】
これらの緩衝塩溶液に、酵素（逆転写酵素）を添加して、本発明の組成物が生成される。一部の実施形態において、逆転写酵素は、１ミリリットル当たり約１，０００〜約５０，０００ユニット、１ミリリットル当たり約２，０００〜約３０，０００ユニット、１ミリリットル当たり約２，５００〜約２５，０００ユニット、１ミリリットル当たり約３，０００〜約２２，５００ユニット、１ミリリットル当たり約４，０００〜約２０，０００ユニット、または１ミリリットル当たり約５，０００〜約２０，０００ユニットの溶液中作業濃度で添加される。一部の実施形態において、本発明の逆転写酵素（例えば、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素）は、第１の鎖反応混合物（例えば、ｍＲＮＡ分子を逆転写するための反応物）及び／またはポリメラーゼ連鎖反応を伴う逆転写反応物中に、上述の作業濃度で添加され得る。これらの反応に好適な本発明の逆転写酵素の濃度は、約５，０００ユニット／ｍｌ〜約５０，０００ユニット／ｍｌ、約５，０００ユニット／ｍｌ〜約４０，０００ユニット／ｍｌ、約５，０００ユニット／ｍｌ〜約３０，０００ユニット／ｍｌ、または約５，０００ユニット／ｍｌ〜約２０，０００ユニット／ｍｌの逆転写酵素であり得る。反応は、２０μｌ〜５０μｌの量で行われてもよく、そのような反応物は、５０ユニット、１００ユニット、２００ユニット、３００ユニット、４００ユニット以上の本発明の逆転写酵素を含み得る。当業者であれば、追加の逆転写酵素を添加することにより、酵素使用量の増加に伴う第１の鎖（例えば、ｍＲＮＡ鎖に相補的なＤＮＡ鎖）の合成の増加が可能となり得ることを理解するであろう。当業者であれば、許容できる費用で所望される量の生成物を生成するために反応物に添加される本発明の逆転写酵素の量を、不要な実験を行うことなく判定することができる。
【０１４３】
一部の実施形態において、本明細書に記載される変異型逆転写酵素は、１ミリリットル当たり約１００〜約５０００ユニット、１ミリリットル当たり約１２５〜約４０００ユニット、１ミリリットル当たり約１５０〜約３０００ユニット、１ミリリットル当たり約２００〜約２５００ユニット、１ミリリットル当たり約２２５〜約２０００ユニットの溶液中作業濃度で、最も好ましくは１ミリリットル当たり約２５０〜約１０００ユニットの作業濃度で、提供される。酵素は、任意の順序で溶液に添加してもよく、または同時に添加してもよい。
【０１４４】
本発明の組成物は、好ましくはデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）またはジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）である、１つ以上のヌクレオチドをさらに含み得る。本組成物のｄＮＴＰ成分は、新たに合成される核酸の「構成単位」として機能し、ポリメラーゼの作用により中に組み込まれ、ｄｄＮＴＰは、本発明による配列決定方法に使用することができる。本組成物での使用に好適なヌクレオチドの例としては、ｄＵＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＩＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰ、α−チオ−ｄＡＴＰ、α−チオ−ｄＴＴＰ、α−チオ−ｄＧＴＰ、α−チオ−ｄＣＴＰ、ｄｄＵＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ、７−デアザ−ｄｄＧＴＰ、α−チオ−ｄｄＡＴＰ、α−チオ−ｄｄＴＴＰ、α−チオ−ｄｄＧＴＰ、α−チオ−ｄｄＣＴＰ、またはそれらの誘導体が挙げられるがこれらに限定されず、これらは全て、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）、及びＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）を含む供給業者から市販されている。ヌクレオチドは、標識されていなくてもよく、あるいは、それらは、当該技術分野で既知の方法によってそれらを放射性同位体（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、または３５Ｓ）、ビタミン類（例えば、ビオチン）、蛍光性部分（例えば、フルオレセイン、ローダミン、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、またはフィコエリトリン）、化学発光標識（例えば、ＰＨＯＴＯ−ＧＥＮＥ（商標）またはＡＣＥＳ（商標）化学発光系、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）から市販）、ジオキシゲニン等と結合させることによって、検出可能に標識付けしてもよい。標識したヌクレオチドはまた、例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）またはＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）から市販で入手することもできる。本組成物の一部の実施形態において、ヌクレオチドは、各ヌクレオチドの作業濃度が約１０〜４０００ミリモル、約５０〜２０００ミリモル、約１００〜１５００ミリモル、または約２００〜１２００ミリモル、または約１０００ミリモルとなるように添加される。
【０１４５】
本教示によると、核酸の調製、単離、または精製に使用される試料中に見られることが多い様々な化合物によるＲＴ反応の阻害を克服することを補助するために、１つ以上の薬剤を本組成物に添加してもよい。そのような阻害物質には、例えば、ヘパリン（血液）、ヘマチン（血液）、ＥＤＴＡ（血液）、クエン酸（血液）、免疫グロブリンＧ（血液、血清）、フミン酸（土壌、糞便）、ラクトフェリン（乳、唾液、他の分泌液）、尿素（尿）、植物性多糖類（植物）、メラニン（皮膚、毛髪）、ミオグロビン（組織）、及びインディゴ染料（布地）が挙げることができるが、これらに限定されない。ＲＴ阻害を克服するのに使用するためのそのような薬剤には、例えば、アルブミン（例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、組み換えＢＳＡ、及び他の種に由来するアルブミン）、α−ラクアルブミン（α−ｌａｃａｌｂｕｍｉｎ）、β−ラクトブログリン（β−ｌａｃｔｏｂｌｏｇｕｌｉｎ）、カゼイン、アポトランスフェリン、スペルミン、ゼラチン（例えば、ヒト組み換えゼラチン、魚ゼラチン、及び他の種に由来するゼラチン）、ならびにＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ファージＴ４遺伝子３２（Ｔ４ｇＰ３２））等であるがこれらに限定されないタンパク質、またはそれらのペプチドもしくはポリペプチド変化形、フラグメント、もしくは誘導体を挙げることができる。本教示で使用するための他の非タンパク質系ＰＣＲ阻害物質遮断剤としては、例えば、メシル酸デフェロキサミンを挙げることができる。ＰＣＲ阻害物質遮断剤として使用するためのいくつかの好ましいタンパク質としては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、魚ゼラチン、及びＴ４ｇＰ３２タンパク質が挙げられる。一部の実施形態において、抗ＲＴ阻害物質剤は、作業溶液中の最終濃度が約１ｎｇ／μＬ〜約１０，０００ｎｇ／μＬ〜約５０ｎｇ／μＬ〜約８０００ｎｇ／μＬ、約１００ｎｇ／μＬ〜約６０００ｎｇ／μＬ、約２００ｎｇ／μＬ〜約５０００ｎｇ／μＬ、または好ましくは約５００ｎｇ／μＬ〜約３０００ｎｇ／μＬとなるように、本組成物に添加される。抗ＲＴ阻害物質剤はまた、例えば、最終濃度約０．００１％〜約１５％、約０．０５％〜約１０％、約０．０１％〜約５％、または好ましくは約０．１％〜約１％として作業溶液中に添加されてもよい。これらの抗ＲＴ阻害物質剤の添加は、個別または組み合わせての両方で、そのようなＲＴ阻害物質の混入に対する耐容性を向上させ得る。したがって、本組成物は、単独または組み合わせで、例えばエタノール、胆汁酸塩、フミン酸、ヘマチン、及びヘパリンを含む様々な阻害物質に対する耐容性を向上させるように作用する薬剤をさらに含んでもよい。
【０１４６】
一部の実施形態において、成分の劣化は、約−８０℃の温度（最大２年間）または約−２０℃の温度（最大１年間）で試薬組成物を保管することにより低減させることができる。
【０１４７】
一部の実施形態において、本組成物は、本組成物を保持することができ、本組成物の成分と著しく相互作用しない好適な格納容器または容器にパッケージ化することができる。格納容器または容器は、個体による、または液体処理装置による剤形の容易な分注ができるように設計され得る。そのような組成物の格納容器または容器は、さらに、複数パッケージのユニットにパッケージ化され得る。
【０１４８】
別の態様において、本発明の組成物及び逆転写酵素は、１つ以上の炭水化物、糖、または合成ポリマーの存在下で調製され、乾燥形態（例えば、凍結乾燥）で保管され得る。乾燥組成物または逆転写酵素の調製に好ましい炭水化物、糖、またはポリマーとしては、スクロース、トレハロース、及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、またはこれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。例えば、米国特許第５，０９８，８９３号、同第４，８９１，３１９号、及び同第５，５５６，７７１号を参照されたく、これらの開示は、参照により全体が本明細書に組み込まれる。そのような乾燥組成物及び酵素は、本発明の組成物中の酵素または成分の著しい劣化を伴うことなく、様々な温度で長期間保管することができる。一部の好ましい実施形態において、乾燥逆転写酵素または組成物は、約−２０℃〜約２５℃で保管される。
【０１４９】
本発明はさらに、核酸分子を逆転写するための組成物、ならびにそのような組成物を用いる逆転写方法及びそのような方法を使用して生成した生成物の核酸分子を含む。多くの事例において、本発明の組成物は、以下の構成成分のうちの１つ以上を含有し得る：（１）１つ以上の緩衝剤（例えば、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、２−（Ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、トリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）、３−（シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、クエン酸塩、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、酢酸塩、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｏ  ａｃｉｄ）（ＴＡＰＳ）等）、（２）１つ以上の一価カチオンの塩（例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ等）、（３）１つ以上の二価カチオンの塩（例えば、ＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、ＣａＣｌ２等）、（４）１つ以上の還元剤（例えば、ジチオスレイトール、β−メルカプトエタノール等）、（５）１つ以上のイオン性もしくは非イオン性界面活性剤（例えば、ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標）、ＮＯＮＩＤＥＴ  Ｐ４０（商標）、ドデシル硫酸ナトリウム等）、（６）１つ以上のＤＮＡポリメラーゼ阻害剤（例えば、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ  Ｄ等）、（７）ヌクレオチド（例えば、ｄＮＴＰ、例えば、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ等）、（８）逆転写及び／もしくは増幅させるＲＮＡ、（９）１つ以上のＲＮａｓｅ阻害剤（例えば、ＲＮＡＳＥＯＵＴ（商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．、カタログ番号１０７７７−０１９等）、（１０）逆転写酵素（例えば、本発明の逆転写酵素、ならびに／または（１１）１つ以上の希釈剤（例えば、水）。他の構成成分及び／また構成要素（例えば、プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ等）もまた、組成物中に存在し得る。ある特定の実施形態において、配列決定に使用される組成物は、以下の構成成分のうちの１つ以上を含有し得る：（１）一本鎖ＲＮＡ鋳型、（２）プライマー、（３）ヌクレオチド、（４）ヌクレオチド塩基に接合された放射活性標識もしくはプライマーに接合された蛍光標識等の標識、及び／または（５）停止剤、例えば、ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰ、もしくはｄｄＴＴＰを含む鎖停止塩基。
【０１５０】
本発明の組成物中の緩衝剤の濃度は、使用される具体的な緩衝剤に応じて多様であろう。典型的には、緩衝剤の作業濃度（すなわち、反応混合物中の濃度）は、約５ｍＭ〜約５００ｍＭ（例えば、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、約７５ｍＭ、約８０ｍＭ、約８５ｍＭ、約９０ｍＭ、約９５ｍＭ、約１００ｍＭ、約５ｍＭ〜約５００ｍＭ、約１０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約２０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約２５ｍＭ〜約５００ｍＭ、約３０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約４０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約７５ｍＭ〜約５００ｍＭ、約１００ｍＭ〜約５００ｍＭ、約２５ｍＭ〜約５０ｍＭ、約２５ｍＭ〜約７５ｍＭ、約２５ｍＭ〜約１００ｍＭ、約２５ｍＭ〜約２００ｍＭ、約２５ｍＭ〜約３００ｍＭ等）となる。Ｔｒｉｓ（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）を用いる場合、Ｔｒｉｓの作業濃度は、典型的に、約５ｍＭ〜約１００ｍＭ、約５ｍＭ〜約７５ｍＭ、約１０ｍＭ〜約７５ｍＭ、約１０ｍＭ〜約６０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約２５ｍＭ〜約５０ｍＭ等となる。
【０１５１】
本発明の溶液の最終的なｐＨは、一般に、本発明の組成物中に存在する緩衝剤によって決定され、維持されることになる。本発明の組成物のｐＨ、したがって、本発明の反応混合物のｐＨは、具体的な用途及び存在する緩衝剤に応じて多様であり得るが、約ｐＨ５．５〜約ｐＨ９．０（例えば、約ｐＨ６．０、約ｐＨ６．５、約ｐＨ７．０、約ｐＨ７．１、約ｐＨ７．２、約ｐＨ７．３、約ｐＨ７．４、約ｐＨ７．５、約ｐＨ７．６、約ｐＨ７．７、約ｐＨ７．８、約ｐＨ７．９、約ｐＨ８．０、約ｐＨ８．１、約ｐＨ８．２、約ｐＨ８．３、約ｐＨ８．４、約ｐＨ８．５、約ｐＨ８．６、約ｐＨ８．７、約ｐＨ８．８、約ｐＨ８．９、約ｐＨ９．０、約ｐＨ６．０〜約ｐＨ８．５、約ｐＨ６．５〜約ｐＨ８．５、約ｐＨ７．０〜約ｐＨ８．５、約ｐＨ７．５〜約ｐＨ８．５、約ｐＨ６．０〜約ｐＨ８．０、約ｐＨ６．０〜約ｐＨ７．７、約ｐＨ６．０〜約ｐＨ７．５、約ｐＨ６．０〜約ｐＨ７．０、約ｐＨ７．２〜約ｐＨ７．７、約ｐＨ７．３〜約ｐＨ７．７、約ｐＨ７．４〜約ｐＨ７．６、約ｐＨ７．０〜約ｐＨ７．４、約ｐＨ７．６〜約ｐＨ８．０、約ｐＨ７．６〜約ｐＨ８．５、約ｐＨ７．７〜約ｐＨ８．５、約ｐＨ７．９〜約ｐＨ８．５、約ｐＨ８．０〜約ｐＨ８．５、約ｐＨ８．２〜約ｐＨ８．５、約ｐＨ８．３〜約ｐＨ８．５、約ｐＨ８．４〜約ｐＨ８．５、約ｐＨ８．４〜約ｐＨ９．０、約ｐＨ８．５〜約ｐＨ９．０等）となることが多い。
【０１５２】
示されるように、１つ以上の一価カチオンの塩（例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ等）が、本発明の組成物中に含まれてもよい。多くの事例において、本発明の組成物に使用される塩は、溶液中で解離して、一価の種（例えば、Ｎａ＋、Ｋ＋等）を少なくとも１つもたらす。本発明の組成物中に含まれる場合、これらの塩は、個別または組み合わせてのいずれかで、約０．５ｍＭ〜約５００ｍＭ（例えば、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約１２ｍＭ、約１５ｍＭ、約１７ｍＭ、約２０ｍＭ、約２２ｍＭ、約２３ｍＭ、約２４ｍＭ、約２５ｍＭ、約２７ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６４ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、約７５ｍＭ、約８０ｍＭ、約８５ｍＭ、約９０ｍＭ、約９５ｍＭ、約１００ｍＭ、約１２０ｍＭ、約１４０ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１７５ｍＭ、約２００ｍＭ、約２２５ｍＭ、約２５０ｍＭ、約２７５ｍＭ、約３００ｍＭ、約３２５ｍＭ、約３５０ｍＭ、約３７５ｍＭ、約４００ｍＭ、約１ｍＭ〜約５００ｍＭ、約５ｍＭ〜約５００ｍＭ、約１０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約２０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約３０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約４０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約６０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約６５ｍＭ〜約５００ｍＭ、約７５ｍＭ〜約５００ｍＭ、約８５ｍＭ〜約５００ｍＭ、約９０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約１００ｍＭ〜約５００ｍＭ、約１２５ｍＭ〜約５００ｍＭ、約１５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約２００ｍＭ〜約５００ｍＭ、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約１０ｍＭ〜約７５ｍＭ、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約２０ｍＭ〜約２００ｍＭ、約２０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約２０ｍＭ〜約１２５ｍＭ、約２０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約２０ｍＭ〜約８０ｍＭ、約２０ｍＭ〜約７５ｍＭ、約２０ｍＭ〜約６０ｍＭ、約２０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約３０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約３０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約３０ｍＭ〜約７０ｍＭ、約３０ｍＭ〜約５０ｍＭ等）の濃度で存在することが多いであろう。
【０１５３】
示されるように、１つ以上の二価カチオンの塩（ＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、ＣａＣｌ２等）が、本発明の組成物中に含まれてもよい。多くの事例において、本発明の組成物に使用される塩は、溶液中で解離して、一価の種（例えば、Ｍｇ＋＋、Ｍｎ＋＋、Ｃａ＋＋等）を少なくとも１つもたらす。本発明の組成物中に含まれる場合、これらの塩は、個別または組み合わせてのいずれかで、約０．５ｍＭ〜約５００ｍＭ（例えば、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１２ｍＭ、約１５ｍＭ、約１７ｍＭ、約２０ｍＭ、約２２ｍＭ、約２３ｍＭ、約２４ｍＭ、約２５ｍＭ、約２７ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６４ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、約７５ｍＭ、約８０ｍＭ、約８５ｍＭ、約９０ｍＭ、約９５ｍＭ、約１００ｍＭ、約１２０ｍＭ、約１４０ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１７５ｍＭ、約２００ｍＭ、約２２５ｍＭ、約２５０ｍＭ、約２７５ｍＭ、約３００ｍＭ、約３２５ｍＭ、約３５０ｍＭ、約３７５ｍＭ、約４００ｍＭ、約１ｍＭ〜約５００ｍＭ、約５ｍＭ〜約５００ｍＭ、約１０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約２０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約３０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約４０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約６０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約６５ｍＭ〜約５００ｍＭ、約７５ｍＭ〜約５００ｍＭ、約８５ｍＭ〜約５００ｍＭ、約９０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約１００ｍＭ〜約５００ｍＭ、約１２５ｍＭ〜約５００ｍＭ、約１５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約２００ｍＭ〜約５００ｍＭ、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約１０ｍＭ〜約７５ｍＭ、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約２０ｍＭ〜約２００ｍＭ、約２０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約２０ｍＭ〜約１２５ｍＭ、約２０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約２０ｍＭ〜約８０ｍＭ、約２０ｍＭ〜約７５ｍＭ、約２０ｍＭ〜約６０ｍＭ、約２０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約３０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約３０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約３０ｍＭ〜約７０ｍＭ、約３０ｍＭ〜約５０ｍＭ等）の濃度で存在することが多いであろう。
【０１５４】
本発明の組成物中に含まれる場合、還元剤（例えば、ジチオスレイトール、β−メルカプトエタノール等）は、個別または組み合わせてのいずれかで、約０．１ｍＭ〜約５０ｍＭ（例えば、約０．２ｍＭ、約０．３ｍＭ、約０．５ｍＭ、約０．７ｍＭ、約０．９ｍＭ、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約１０ｍＭ、約１２ｍＭ、約１５ｍＭ、約１７ｍＭ、約２０ｍＭ、約２２ｍＭ、約２３ｍＭ、約２４ｍＭ、約２５ｍＭ、約２７ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約５０ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約５０ｍＭ、約１ｍＭ〜約５０ｍＭ、約２ｍＭ〜約５０ｍＭ、約３ｍＭ〜約５０ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約２０ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約１０ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約５ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約２．５ｍＭ、約１ｍＭ〜約２０ｍＭ、約１ｍＭ〜約１０ｍＭ、約１ｍＭ〜約５ｍＭ、約１ｍＭ〜約３．４ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約３．０ｍＭ、約１ｍＭ〜約３．０ｍＭ、約１．５ｍＭ〜約３．０ｍＭ、約２ｍＭ〜約３．０ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約２．５ｍＭ、約１ｍＭ〜約２．５ｍＭ、約１．５ｍＭ〜約２．５ｍＭ、約２ｍＭ〜約３．０ｍＭ、約２．５ｍＭ〜約３．０ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約２ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約１．５ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約１．１ｍＭ、約５．０ｍＭ〜約１０ｍＭ、約５．０ｍＭ〜約１５ｍＭ、約５．０ｍＭ〜約２０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約１５ｍＭ、約１０ｍＭ〜約２０ｍＭ等）の濃度で存在することが多いであろう。
【０１５５】
本発明の組成物はまた、１つ以上のイオン性または非イオン性界面活性剤（例えば、ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標）、ＮＯＮＩＤＥＴ  Ｐ４０（商標）、Ｔｗｅｅｎ  ２０、ドデシル硫酸ナトリウム等）を含有してもよい。本発明の組成物中に含まれる場合、界面活性剤は、個別または組み合わせてのいずれかで、約０．００１％〜約５．０％（例えば、約０．００１％、約０．００２％、約０．００３％、約０．００４％、約０．００５％、約０．００６％、約０．００７％、約０．００８％、約０．００９％、約０．０１％、約０．０２％、約０．０５％、約０．１、約０．５％、約１％、約２％、約５％、約０．００１％〜約５．０％、約０．００１％〜約４．０％、約０．００１％〜約３．０％、約０．００１％〜約２．０％、約０．００１％〜約１．０％、約０．００５％〜約５．０％、約０．０１％〜約３．０％、約０．０１％〜約２．０％、約０．０１％〜約１．０％、約０．１％〜約５．０％、約０．１％〜約４．０％、約０．１％〜約３．０％、約０．１％〜約２．０％、約０．１％〜約１．０％、約０．１％〜約０．５％等）の濃度で存在することが多いであろう。例えば、本発明の組成物は、約０．０１％〜約２．０％、約０．０３％〜約１．０％、約０．０４％〜約１．０％、約０．０５％〜約０．５％、約０．０４％〜約０．６％、約０．０４％〜約０．３％等の濃度で、Ｔｗｅｅｎ  ２０、ＮＰ−４０、及び／またはＴＲＩＴＯＮ  Ｘ１００（商標）を含有し得る。
【０１５６】
本明細書に開示されるもの以外の逆転写、増幅、または両方の反応の組み合わせを促進または強化することができる他の添加剤（例えば、ＲＴ−ＰＣＲを促進または強化する薬剤）は、当該技術分野で既知である。本組成物及び方法によると、これらの添加剤のうちの１つ以上が、リボ核酸またはデオキシリボ核酸の鋳型からの核酸の生成及び複製を最適化するために、本組成物に組み込まれてもよい。添加剤は、有機または無機化合物であり得る。本組成物、方法、及びキットにおいて有用な一部の添加剤には、ポリペプチドならびに非ポリペプチドの添加剤が含まれる。そのような添加剤としては、数例挙げるとして、例えば、ＲＮａｓｅ阻害剤タンパク質（ＲＩＰ）、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）、レクチン、大腸菌一本鎖結合（ＳＳＢ）タンパク質、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、７−デアザ−２′−デオキシグアノシン（ｄＣ７ＧＴＰ）、硫黄含有化合物、酢酸含有化合物、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、リボヌクレアーゼ阻害剤（例えば、Ｒｎａｓｅ  ＯＵＴ（商標））ホルムアミド、ベタイン、塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エクトイン、アジ化ナトリウム、カトン（ｋａｔｈｏｎ）、及びポリオールを挙げることができる。当業者であれば、本組成物、方法、及びキットより使用するためのさらなる添加剤を特定することができるであろう。
【０１５７】
本発明の組成物はまた、１つ以上のプライマーを含有してもよい。一部の実施形態において、本発明の組成物は、オリゴ（ｄＴ）プライマーを含む。これらのプライマーは、典型的に、長さが約２０塩基であり、ｍＲＮＡのポリＡ尾部にアニーリングする。ｍＲＮＡの一部分を標的とすることにより、結果として得られるｃＤＮＡ集団の複雑性が劇的に低減されるが、これは、ｒＲＮＡ及びｔＲＮＡ種が、反応において鋳型として機能しないためである。オリゴ（ｄＴ）プライマーを用いる欠点としては、結果として得られるｃＤＮＡ集団が、３'バイアスを有し、したがって、転写生成物の５'末端を標的とするＰＣＲプライマーの有効性が低下することであろう。加えて、３'バイアスに起因して、ポリＡ尾部を欠くフラグメント化試料は、逆転写されないことになる。
【０１５８】
他の実施形態において、本発明の組成物は、ランダムプライマーを含む。一部の実施形態において、ランダムプライマーは、指定されるオリゴ長の４つの塩基のランダムな混合物である。ランダムヘキサマー混合物が、例えば、使用され得る。ランダムプライマーのそれぞれが、所与のＲＮＡ分子（ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍＲＭＡ、及びこれらの種の任意のフラグメントを含む）内の相補的配列が存在する場所にアニーリングされる。ランダムプライマーを用いた逆転写により、ＲＮＡ二次構造、及びオリゴ（ｄＴ）プライマーを使用する際の一般的な課題であるＲＮＡフラグメントに関する懸念が克服される。
【０１５９】
一部の他の実施形態では、本発明の組成物は、ロックド核酸（ＬＮＡ）プライマーを含む。ＬＮＡをオリゴヌクレオチドプライマーに組み込むことにより、ＤＮＡ増幅のための鋳型結合強度及び特異性が向上することが示されている。例えば、Ｂａｌｌａｎｔｙｎｅ，Ｋ．Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２００８  Ｍａｒ；９１（３）：３０１−５．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｇｅｎｏ．２００７．１０．０１６を参照されたい。ＬＮＡプライマーは、ＬＮＡを含まないものよりも高い融点（Ｔｍ）でポリＡ配列に結合する。
【０１６０】
他の実施形態において、本発明の組成物は、配列特異的（または遺伝子特異的）プライマーを含む。配列特異的プライマーは、典型的に、最も優れた特異性を提供し、逆転写のためのプライマーの選択肢のうち最も整合性のあるものであることが示されている。しかしながら、それらは、オリゴ（ｄＴ）及びランダムプライマーの柔軟性は提供しない、すなわち、研究がなされる各遺伝子に対して、新たなｃＤＮＡ合成反応を行わなければならない。このため、配列特異的プライマーは、プロセシングが制限される組織または細胞試料には最適ではない。一部の実施形態では、異なる種類のプライマー（例えば、オリゴ（ｄＴ）、ランダム、ＬＮＡ、及び／または配列特異的プライマーの混合物が使用される。
【０１６１】
本発明の組成物はまた、１つ以上のホットスタート用成分を含んでもよい。ホットスタートは、室温での核酸合成反応の組立てに起因する非特異的増幅を低減するための一般的な技法である。低温では、オリゴヌクレオチドプライマーは、完全に相補的でない鋳型配列にアニーリングすることができる。しばしば、これらの低温で、逆転写酵素等の酵素は、誤ってアニーリングしたプライマーを伸長させてしまう場合がある。この新たに合成された領域は、プライマー伸長の鋳型として作用し、所望されない核酸合成生成物が合成される。しかしながら、重合が始まる前に反応温度を（例えば、６０℃以上の温度まで）上昇させると、プライマーがアニーリングするストリンジェンシーが高まり、所望されない核酸合成生成物の生成を回避または低減させることができる。
【０１６２】
核酸合成反応にホットスタート用成分を含めることによっても、プライマーがアニーリングするストリンジェンシーを高めることによって合成されるプライマーダイマーの量を低減させることができる。低温では、オリゴヌクレオチドプライマーは、例えば、相補性の領域を介して互いにアニーリングしてヘアピンを形成し得、逆転写酵素が、アニーリングしたプライマーを伸長させてプライマーダイマーを生成し得る。非特異的生成物の形成とプライマーダイマーの形成は、所望される生成物の合成のための試薬の利用可能性に関して競合し得る。したがって、ホットスタート技法により、特異的な核酸合成生成物の収率が改善され得る。
【０１６３】
一部の実施形態において、ホットスタート反応は、氷上または室温で構築され、重要な成分は反応物が約６０℃に加熱されるまでは省かれており、この時点で欠けていた試薬が添加される。この省略により、プライマーのアニーリングがよりストリンジェントな高温で重要な成分が添加されるまで、逆転写酵素がプライマーを伸長させることを防止する。
【０１６４】
一部の他の実施形態では、逆転写酵素は、可逆的に不活性化されているか、または反応における１つ以上の重要な成分から物理的に分離している。例えば、マグネシウムがワックスビーズ中に隔離されていてもよく、反応が加熱されるとこれが溶融し、高温でのみ成分が放出される（例えば、Ｃａｒｏｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．１９８９、Ｋｒｉｓｈｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９１、Ｃｌａｒｋ，１９８８を参照されたい）。逆転写酵素はまた、アプタマー（例えば、Ｌｉｎ  ａｎｄ  Ｊａｙａｓｅｎａ，１９９７、Ｄａｎｇ  ａｎｄ  Ｊａｙａｓｅｎａ，１９９６を参照されたい）または抗体（例えば、Ｓｃａｌｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９４、Ｓｈａｒｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．１９９４を参照されたい）としても既知である、オリゴヌクレオチドへの結合により不活性状態で保つことができる。この結合は、次いで、高温で破壊され、機能的な逆転写酵素が放出され得る。
【０１６５】
さらに他の実施形態において、逆転写酵素は、化学修飾（例えば、Ｍｏｒｅｔｔｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ  １９９８を参照されたい）により不活性状態で維持してもよい。一部の実施形態において、化学修飾は、可逆的である。したがって、一部の実施形態において、逆転写酵素は、低温（例えば、約５５℃未満）では不活性状態にあり、高い温度（例えば、約５５℃超）では完全に機能的／活性となるように、化学的に修飾される。
【０１６６】
本発明の組成物はまた、１つ以上のＤＮＡポリメラーゼ阻害剤（例えば、アクチノマイシンＤ等）を含んでもよい。本発明の組成物中に含まれる場合、そのような阻害剤は、個別または組み合わせのいずれかで、約０．１μｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌ（例えば、約０．１μｇ／ｍｌ、約０．２μｇ／ｍｌ、約０．３μｇ／ｍｌ、約０．４μｇ／ｍｌ、約０．５μｇ／ｍｌ、約０．６μｇ／ｍｌ、約０．７μｇ／ｍｌ、約０．８μｇ／ｍｌ、約０．９μｇ／ｍｌ、約１．０μｇ／ｍｌ、約１．１μｇ／ｍｌ、約１．３μｇ／ｍｌ、約１．５μｇ／ｍｌ、約１．７μｇ／ｍｌ、約２．０μｇ／ｍｌ、約２．５μｇ／ｍｌ、約３．５μｇ／ｍｌ、約５．０μｇ／ｍｌ、約７．５μｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌ、約１５μｇ／ｍｌ、約２０μｇ／ｍｌ、約２５μｇ／ｍｌ、約３０μｇ／ｍｌ、約３５μｇ／ｍｌ、約４０μｇ／ｍｌ、約５０μｇ／ｍｌ、約６０μｇ／ｍｌ、約７０μｇ／ｍｌ、約８０μｇ／ｍｌ、約９０μｇ／ｍｌ、約１００μｇ／ｍｌ、約０．５μｇ／ｍｌ〜約３０μｇ／ｍｌ、約０．７５μｇ／ｍｌ〜約３０μｇ／ｍｌ、約１．０μｇ／ｍｌ〜約３０μｇ／ｍｌ、約２．０μｇ／ｍｌ〜約３０μｇ／ｍｌ、約３．０μｇ／ｍｌ〜約３０μｇ／ｍｌ、約４．０μｇ／ｍｌ〜約３０μｇ／ｍｌ、約５．０μｇ／ｍｌ〜約３０μｇ／ｍｌ、約７．５μｇ／ｍｌ〜約３０μｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌ〜約３０μｇ／ｍｌ、約１５μｇ／ｍｌ〜約３０μｇ／ｍｌ、約０．５μｇ／ｍｌ〜約２０μｇ／ｍｌ、約０．５μｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌ、約０．５μｇ／ｍｌ〜約５μｇ／ｍｌ、約０．５μｇ／ｍｌ〜約２μｇ／ｍｌ、約０．５μｇ／ｍｌ〜約１μｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ〜約５μｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ〜約２μｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌ、約２０μｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌ、約４０μｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌ、約３０μｇ／ｍｌ〜約８０μｇ／ｍｌ、約３０μｇ／ｍｌ〜約７０μｇ／ｍｌ、約４０μｇ／ｍｌ〜約６０μｇ／ｍｌ、約４０μｇ／ｍｌ〜約７０μｇ／ｍｌ、約４０μｇ／ｍｌ〜約８０μｇ／ｍｌ等）の濃度で存在することが多いであろう。
【０１６７】
多くの事例において、ヌクレオチド（例えば、ｄＮＴＰ、例として、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ等）が本発明の反応混合物中に存在するであろう。典型的には、ヌクレオチドは個々に、約０．０５ｍＭ〜約５０ｍＭ（例えば、約０．０７ｍＭ、約０．１ｍＭ、約０．１５ｍＭ、約０．１８ｍＭ、約０．２ｍＭ、約０．３ｍＭ、約０．５ｍＭ、約０．７ｍＭ、約０．９ｍＭ、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約１０ｍＭ、約１２ｍＭ、約１５ｍＭ、約１７ｍＭ、約２０ｍＭ、約２２ｍＭ、約２３ｍＭ、約２４ｍＭ、約２５ｍＭ、約２７ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約５０ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約５０ｍＭ、約１ｍＭ〜約５０ｍＭ、約２ｍＭ〜約５０ｍＭ、約３ｍＭ〜約５０ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約２０ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約１０ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約５ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約２．５ｍＭ、約１ｍＭ〜約２０ｍＭ、約１ｍＭ〜約１０ｍＭ、約１ｍＭ〜約５ｍＭ、約１ｍＭ〜約３．４ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約３．０ｍＭ、約１ｍＭ〜約３．０ｍＭ、約１．５ｍＭ〜約３．０ｍＭ、約２ｍＭ〜約３．０ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約２．５ｍＭ、約１ｍＭ〜約２．５ｍＭ、約１．５ｍＭ〜約２．５ｍＭ、約２ｍＭ〜約３．０ｍＭ、約２．５ｍＭ〜約３．０ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約２ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約１．５ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約１．１ｍＭ、約５．０ｍＭ〜約１０ｍＭ、約５．０ｍＭ〜約１５ｍＭ、約５．０ｍＭ〜約２０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約１５ｍＭ、約１０ｍＭ〜約２０ｍＭ等）の濃度で存在するであろう。１つを上回るヌクレオチドが存在する場合、合わせたヌクレオチドの濃度は、個々のヌクレオチドの濃度を加算することによって決定することができる。１つを上回るヌクレオチドが本発明の組成物中に存在する場合、個々のヌクレオチドは、等モル量で存在しなくてもよい。したがって、組成物は、例えば、１ｍＭのｄＧＴＰ、１ｍＭのｄＡＴＰ、０．５ｍＭのｄＣＴＰ、及び１ｍＭのｄＴＴＰを含有してもよい。
【０１６８】
典型的には、ＲＮＡが本発明の組成物中に存在することになる。ほとんどの事例において、ＲＮＡは、逆転写の直前に組成物に添加される。したがって、組成物は、ＲＮＡなしで提供されてもよい。これは、組成物がキットで提供される場合に典型的である。ＲＮＡは、組成物中に存在する場合、１ピコグラム〜１００μｇ／反応混合物２０μｌ（例えば、約１ピコグラム／２０μｌ、約１０ピコグラム／２０μｌ、約５０ピコグラム／２０μｌ、約１００ピコグラム／２０μｌ、約２００ピコグラム／２０μｌ、約１０ピコグラム／２０μｌ、約５００ピコグラム／２０μｌ、約８００ピコグラム／２０μｌ、約１．０ナノグラム／２０μｌ、約５．０ナノグラム／２０μｌ、約１０ナノグラム／２０μｌ、約２５ナノグラム／２０μｌ、約５０ナノグラム／２０μｌ、約７５ナノグラム／２０μｌ、約１００ナノグラム／２０μｌ、約１５０ナノグラム／２０μｌ、約２５０ナノグラム／２０μｌ、約４００ナノグラム／２０μｌ、約５００ナノグラム／２０μｌ、約７５０ナノグラム／２０μｌ、約１．０μｇ／２０、約５．０μｇ／２０μｌ、約１０μｇ／２０μｌ、約２０μｇ／２０μｌ、約３０μｇ／２０μｌ、約４０μｇ／２０μｌ、約５０μｇ／２０μｌ、約７０μｇ／２０μｌ、約８５μｇ／２０μｌ、約１００μｇ／２０μｌ、約１０ピコグラム／２０μｌ〜約１００μｇ／２０μｌ、約１０ピコグラム／２０μｌ〜約１００μｇ／２０μｌ、約１００ピコグラム／２０μｌ〜約１００μｇ／２０μｌ、約１．０ナノグラム／２０μｌ〜約１００μｇ／２０μｌ、約１００ナノグラム／２０μｌ〜約１００μｇ／２０μｌ、約１０ピコグラム／２０μｌ〜約１０μｇ／２０μｌ、約１０ピコグラム／２０μｌ〜約５μｇ／２０μｌ、約１００ナノグラム／２０μｌ〜約５μｇ／２０μｌ、約１μｇ／２０μｌ〜約１０μｇ／２０μｌ、約１μｇ／２０μｌ〜約５μｇ／２０μｌ、約１００ナノグラム／２０μｌ〜約１μｇ／２０μｌ、約５００ナノグラム／２０μｌ〜約５μｇ／２０μｌ等）の濃度で存在することが多いであろう。当業者には理解されるように、異なる逆転写反応が、２０μｌ以外の量で行われてもよい。そのような事例では、存在するＲＮＡの総量は、使用される量に応じて多様であろう。したがって、上述の量は、ＲＮＡ／組成物２０μｌの例として提供される。
【０１６９】
本発明の変異型逆転写酵素は、本明細書に記載される組成物（保管組成物及び／または反応混合物）中に存在する場合、約０．０１〜約１，０００ユニットの逆転写酵素活性／μｌ（例えば、約０．０１ユニット／μｌ、約０．０５ユニット／μｌ、約０．１ユニット／μｌ、約０．２ユニット／μｌ、約０．３ユニット／μｌ、約０．４ユニット／μｌ、約０．５ユニット／μｌ、約０．７ユニット／μｌ、約１．０ユニット／μｌ、約１．５ユニット／μｌ、約２．０ユニット／μｌ、約２．５ユニット／μｌ、約５．０ユニット／μｌ、約７．５ユニット／μｌ、約１０ユニット／μｌ、約２０ユニット／μｌ、約２５ユニット／μｌ、約５０ユニット／μｌ、約１００ユニット／μｌ、約１５０ユニット／μｌ、約２００ユニット／μｌ、約２５０ユニット／μｌ、約３５０ユニット／μｌ、約５００ユニット／μｌ、約７５０ユニット／μｌ、約１，０００ユニット／μｌ、約０．１ユニット／μｌ〜約１，０００ユニット／μｌ、約０．２ユニット／μｌ〜約１，０００ユニット／μｌ、約１．０ユニット／μｌ〜約１，０００ユニット／μｌ、約５．０ユニット／μｌ〜約１，０００ユニット／μｌ、約１０ユニット／μｌ〜約１，０００ユニット／μｌ、約２０ユニット／μｌ〜約１，０００ユニット／μｌ、約５０ユニット／μｌ〜約１，０００ユニット／μｌ、約１００ユニット／μｌ〜約１，０００ユニット／μｌ、約２００ユニット／μｌ〜約１，０００ユニット／μｌ、約４００ユニット／μｌ〜約１，０００ユニット／μｌ、約５００ユニット／μｌ〜約１，０００ユニット／μｌ、約０．１ユニット／μｌ〜約３００ユニット／μｌ、約０．１ユニット／μｌ〜約２００ユニット／μｌ、約０．１ユニット／μｌ〜約１００ユニット／μｌ、約０．１ユニット／μｌ〜約５０ユニット／μｌ、約０．１ユニット／μｌ〜約１０ユニット／μｌ、約０．１ユニット／μｌ〜約５．０ユニット／μｌ、約０．１ユニット／μｌ〜約１．０ユニット／μｌ、約０．２ユニット／μｌ〜約０．５ユニット／μｌ等をもたらす濃度で存在し得る。
【０１７０】
本発明の組成物は、最終的な使用のために作業濃度に希釈される濃縮溶液（例えば、５倍溶液）として調製されてもよい。５倍組成物に関して、そのような５倍溶液を作業濃度にするためには、５：１希釈が必要である。本発明の組成物は、例えば、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍等の溶液として調製されてもよい。そのような溶液の倍濃度に対する制限の１つは、化合物が特定の溶液中濃度に達したときに、沈殿が起こり得ることである。したがって、濃縮組成物は、通常、緩衝液成分の沈殿が生じないように種々の成分の濃度が十分に低くなるように調製される。当業者には理解されるように、各溶液の実行可能な濃度の上限は、具体的な溶液及び存在する成分に応じて多様であろう。
【０１７１】
多くの事例において、本発明の組成物は、滅菌形態で提供されるであろう。滅菌は、混合の前に組成物の個々の成分に対して行われてもよく、または調製後に組成物に対して行われてもよい。そのような溶液の滅菌は、オートクレーブまたは限外濾過を含む任意の好適な手段により行うことができる。
【０１７２】
逆転写酵素を使用する方法
本発明の逆転写酵素を使用して、１つ以上の鋳型から核酸分子を作製することができる。そのような方法は、１つ以上の核酸鋳型（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、及び小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）といった分子）を、本発明の逆転写酵素のうちの１つ以上と混合する工程、ならびに１つ以上の核酸鋳型の全てまたは一部分に相補的な１つ以上の核酸分子を作製するのに十分な条件下で、その混合物をインキュベートする工程を含み得る。
【０１７３】
本発明はまた、そのような方法によって生成される核酸分子（全長ｃＤＮＡ分子であり得る）、これらの核酸を含むベクター（特に、発現ベクター）、ならびにこれらのベクター及び核酸分子を含む宿主細胞にも関する。
【０１７４】
本発明を有利に用いることができるｃＤＮＡ合成の他の方法は、当業者には容易に明らかであろう。
【０１７５】
本発明はまた、１つ以上の核酸鋳型を本発明の逆転写酵素と混合する工程、ならびに１つ以上の核酸鋳型の全てまたは一部分に相補的な１つ以上の核酸分子を増幅させるのに十分な条件下で、その混合物をインキュベートする工程を含む、１つ以上の核酸分子の増幅のための方法も提供する。そのような増幅方法は、１つ以上のＤＮＡポリメラーゼの使用をさらに含んでもよく、また標準的な逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）反応で用いられ得る。
【０１７６】
本発明のこの態様による核酸増幅方法は、１ステップ（例えば、１ステップＲＴ−ＰＣＲ）または２ステップ（例えば、２ステップＲＴ−ＰＣＲ）であり得る。本発明によると、１ステップＲＴ−ＰＣＲ型の反応は、１つのチューブで達成することができ、それによって混入の可能性が低下し得る。そのような１ステップ反応には、（ａ）核酸鋳型（例えば、ｍＲＮＡ）を１つ以上の本発明の逆転写酵素及び１つ以上のＤＮＡポリメラーゼと混合する工程、ならびに（ｂ）鋳型の全てまたは一部分に相補的な核酸分子を増幅させるのに十分な条件下で、その混合物をインキュベートする工程が含まれる。そのような増幅は、単独でか、またはＤＮＡポリメラーゼ活性と組み合わせて、逆転写酵素活性によって達成され得る。２ステップＲＴ−ＰＣＲは、２つの別個の工程で達成することができる。そのような方法には、（ａ）核酸鋳型（例えば、ｍＲＮＡ）を本発明の逆転写酵素と混合する工程、（ｂ）鋳型の全てまたは一部分に相補的な核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子）を作成するのに十分な条件下で、その混合物をインキュベートする工程、（ｃ）核酸分子を１つ以上のＤＮＡポリメラーゼと混合する工程、ならびに（ｄ）核酸分子を増幅させるのに十分な条件下で、工程（ｃ）の混合物をインキュベートする工程が含まれる。長い核酸分子（すなわち、長さが約３〜５ｋｂを上回るもの）の増幅については、一方が３′エクソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼであり、もう一方が３′エクソヌクレアーゼ活性が実質的に低減されたＤＮＡポリメラーゼであるもの等、ＤＮＡポリメラーゼの組み合わせを使用してもよい。
【０１７７】
本発明に従って使用することができる増幅方法としては、ＰＣＲ（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号及び同第４，６８３，２０２号を参照されたい）、等温増幅（１つ以上のＲＮＡポリメラーゼを用いた（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００６／０８１２２２号を参照されたい）、鎖置換増幅（ＳＤＡ、例えば、米国特許第５，４５５，１６６号、欧州特許第ＥＰ０  ６８４  ３１５号を参照されたい）、及び核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ、例えば、米国特許第５，４０９，８１８号、欧州特許第ＥＰ  ０  ３２９  ８２２号を参照されたい）、ならびにより複雑なＰＣＲに基づく核酸判別技法、例えば、ランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）分析（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｊ．Ｇ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８（２２）：６５３１−６５３５，１９９０を参照されたい）、任意プライム型ＰＣＲ（ＡＰ−ＰＣＲ、例えば、Ｗｅｌｓｈ，Ｊ．，ａｎｄ  ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄ，Ｍ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８（２４）：７２１３−７２１８，１９９０を参照されたい）、ＤＮＡ増幅判別法（ＤＡＦ、例えば、Ｃａｅｔａｎｏ−Ａｎｏｌｌeｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：５５３−５５７，１９９１を参照されたい）、マイクロサテライトＰＣＲまたはミニサテライト領域ＤＮＡの特異的増幅（Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｎｉｓａｔｅｌｌｉｔｅ−ｒｅｇｉｏｎ  ＤＮＡ）（ＤＡＶＩＤ、例えば、Ｈｅａｔｈ，Ｄ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１（２４）：５７８２−５７８５（１９９３）を参照されたい、ならびにフラグメント長多型増幅（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）（ＡＦＬＰ）分析（例えば、欧州特許第ＥＰ  ０  ５３４  ８５８号、Ｖｏｓ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３（２１）：４４０７−４４１４（１９９５）、Ｌｉｎ，Ｊ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｋｕｏ，Ｊ．ＦＯＣＵＳ  １７（２）：６６−７０（１９９５）を参照されたい。本組成物を用いることができる核酸配列決定技法には、米国特許第４，９６２，０２２号及び同第５，４９８，５２３号に開示されるもの等のジデオキシ配列決定方法が含まれる。一部の実施形態において、本発明は、１つ以上のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、例えば、上述のＰＣＲに基づく方法のうちの任意のものを含む、核酸分子の増幅または配列決定の方法に使用することができる。
【０１７８】
本発明はまた、（ａ）配列決定する１つ以上の核酸分子を１つ以上のプライマー核酸分子、１つ以上の本発明の逆転写酵素、１つ以上のヌクレオチド、及び１つ以上の停止剤と混合する工程、（ｂ）配列決定する１つ以上の核酸分子の全てまたは一部分に相補的な核酸分子の集団を合成するのに十分な条件下で、その混合物をインキュベートする工程、ならびに（ｃ）配列決定する１つ以上の核酸分子の全てまたは一部分のヌクレオチド配列を決定するために、核酸分子の集団を分離する工程を含む、１つ以上の核酸分子の配列決定のための方法に関する。
【０１７９】
本発明のこの態様による核酸配列決定方法は、サイクルシーケンシング（増幅と組み合わせた配列決定）及び標準的な配列決定反応の両方を含み得る。本発明の配列決定方法は、したがって、（ａ）配列決定する核酸分子を１つ以上のプライマー、１つ以上の本発明の逆転写酵素、１つ以上のヌクレオチド、及び１つ以上の停止剤と混合する工程、（ｂ）配列決定する分子の全てまたは一部分に相補的な核酸分子の集団を合成するのに十分な条件下で、その混合物をインキュベートする工程、及び（ｃ）配列決定する分子の全てまたは一部分のヌクレオチド配列を決定するために、その集団を分離する工程を含む。本発明によると、１つ以上のＤＮＡポリメラーゼ（好ましくは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ）を、本発明の逆転写酵素と組み合わせて、または本発明の逆転写酵素とは別個に、使用してもよい。
【０１８０】
本発明によると、ｃＤＮＡ分子（一本鎖または二本鎖）は、本明細書に提供される新規な変異型逆転写酵素を用いて、種々の核酸鋳型分子から調製することができる。本発明での使用に好ましい核酸分子には、一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡ分子、ならびに二本鎖ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドが挙げられる。より好ましい核酸分子としては、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、及びリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）分子が挙げられるが、ｍＲＮＡ分子が、本発明による好ましい鋳型である。ある特定の実施形態では、遺伝子特異的プライマーが使用され得る。本明細書に提供される変異型逆転写酵素のうちの少なくともいくつかが十分に適しているある特定の他の実施形態では、オリゴｄＴプライマーが使用される。これらのｄＴプライマーは、一部の実施形態ではＬＮＡプライマーであってもよい。さらに、例示的な実施例において、そのような反応の鋳型は、ｍＲＮＡであり得る。
【０１８１】
本発明の方法によりｃＤＮＡ分子を調製するのに使用される核酸分子は、標準的な有機化学合成法により合成で調製することができ、これらの方法は、当業者には十分に知られているであろう。より好ましくは、核酸分子は、種々の細胞、組織、器官、または生物といった、天然の供給源から得ることができる。核酸分子の供給源として用いることができる細胞は、原核生物細胞（大腸菌属、バチルス属、セラチア属、サルモネラ属、ブドウ球菌属、連鎖球菌属、クロストリジウム属、クラミジア属、ナイセリア属、トレポネーマ属、マイコプラズマ属、ボレリア属、レジオネラ属、シュードモナス属、マイコバクテリウム属、ヘリコバクター属、エルウイニア属、アグロバクテリウム属、リゾビウム属、キサントモナス属、及びストレプトマイセス属を含むがこれらに限定されない、細菌細胞）、または真核生物細胞（真菌（特に酵母）、植物、原虫、及び他の寄生生物、ならびに動物、例えば昆虫（特にショウジョウバエ細胞）、線虫（特にカエノラブディティス・エレガンス細胞）、及び哺乳動物（特にヒト細胞）を含む）であり得る。
【０１８２】
核酸の供給源として用いることができる哺乳動物の体細胞としては、血液細胞（網状赤血球及び白血球）、内皮細胞、上皮細胞、神経細胞（中枢神経系または末梢神経系由来）、筋肉細胞（骨格筋、平滑筋、または心筋由来の筋細胞及び筋芽細胞を含む）、結合組織細胞（線維芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、軟骨芽細胞、骨細胞、及び骨芽細胞を含む）、ならびに他の間質細胞（例えば、マクロファージ、樹状細胞、シュワン細胞）が挙げられる。哺乳動物胚細胞（精母細胞及び卵母細胞）もまた、本発明で使用するための核酸の供給源として用いることができ、上述の体細胞及び胚細胞を生じさせる始原細胞、前駆細胞、及び幹細胞も同様であり得る。脳、腎臓、肝臓、膵臓、血液、骨髄、筋肉、神経、皮膚、尿生殖器、循環器官、リンパ系、胃腸、及び結合組織源に由来するものといった、哺乳動物組織または器官もまた、核酸供給源として使用するのに好適である。
【０１８３】
上述の原核生物または真核生物の細胞、組織、及び器官のいずれも、正常細胞、疾患細胞、形質転換細胞、株化細胞、始原細胞、前駆細胞、胎児細胞、または胚性細胞であってよい。疾患細胞としては、例えば、感染性疾患（細菌、真菌、もしくは酵母、ウイルス（ＡＩＤＳ、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ、ヘルペス、肝炎等を含む）、または寄生生物によって引き起こされる）、遺伝的もしくは生化学的病因（例えば、嚢胞性線維症、血友病、アルツハイマー病、筋ジストロフィー、もしくは多発性硬化症）、または癌進行に関与するものを挙げることができる。形質転換または株化された動物細胞系としては、例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｋ５６２細胞、２９３細胞、Ｌ９２９細胞、Ｆ９細胞等を挙げることができる。本発明において核酸の供給源として使用するのに好適な他の細胞、細胞系、組織、器官、及び生物が、当業者には明らかであろう。
【０１８４】
一部の実施形態において、組成物は、ゲノム核酸を含み得る。一部の実施形態において、組成物は、母体核酸、胎児核酸、または母体核酸と胎児核酸殿混合物を含んでもよい。一部の実施形態において、組成物は、ゲノム核酸のフラグメントを含んでもよい。一部の実施形態では、組成物は、ウイルス、細菌、酵母、真菌、哺乳動物、またはそれらの混合物に由来する核酸を含んでもよい。核酸試料は、１つ以上の供給源に由来し得る。試料は、例えば、生物、鉱物、もしくは地質学的部位（例えば、土壌、岩石、鉱床、化石）、または法医学現場（例えば、犯行現場、禁制品、もしくは疑わしい禁制品）から採取され得る。したがって、供給源は、例えば、地質、農業、戦域、または土壌といった、環境上の供給源であり得る。供給源はまた、任意の種類の生物、例えば、任意の植物、真菌、原核生物、モネラ生物、ウイルス、または動物、例えば、ヒト、非ヒト哺乳動物、爬虫類、畜牛、ネコ、イヌ、ヤギ、ブタ（ｓｗｉｎｅ）、ブタ（ｐｉｇ）、サル、類人猿、ゴリラ、雄ウシ、雌ウシ、クマ、ウマ、ヒツジ、家禽、マウス、ラット、魚、イルカ、クジラ、及びサメを含むがこれらに限定されないもの、または検出可能な核酸を有し得る任意の動物または生物に由来し得る。供給源はまた、生物の別の部分、例えば、内部の部位、外部の部位、生または非生細胞、組織、流体等を指し得る。試料は、したがって、「生体試料」であってもよく、生体試料とは、生きた供給源または生きていた供給源、例えば、ヒトもしくは他の哺乳動物等の動物、植物、細菌、真菌、原核生物、またはウイルスから得られた任意の材料を指す。供給源は、組織、細胞、細胞ペレット、細胞抽出物、もしくは生検といった固体材料、または尿、血液、唾液、羊水、感染もしくは炎症の領域からの浸出液、または口腔細胞を含有するマウスウォッシュ、毛髪、脳脊髄液、及び滑液等の生物学的流体、ならびに器官を含むがこれらに限定されない、任意の形態であり得る。試料はまた、別の試料と比較して異なる時点で単離されてもよく、この場合、試料のそれぞれは、同じかまたは異なる供給源に由来する。核酸は、例えば、ｃＤＮＡまたはＲＮＡライブラリ等の核酸ライブラリに由来してもよい。核酸は、試料からの核酸精製もしくは単離及び／または核酸分子の増幅の結果であってもよい。本明細書に記載される配列分析プロセスに提供される核酸は、１つの試料または２つ以上の試料（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００個以上の試料）に由来する核酸を含んでもよい。核酸は、種々の方式で処置することができる。例えば、核酸に、サイズ縮小（例えば、剪断、ヌクレアーゼもしくは制限酵素による消化、脱リン酸化、脱メチル化）、サイズ拡大（例えば、リン酸化、メチル化特異的試薬での反応、検出可能ラベルへの結合）、核酸切断阻害剤での処置等が行われてもよい。
【０１８５】
ある特定の実施形態において、プロセシングなしで本明細書に記載される方法を行うための核酸が提供され得る。一部の実施形態において、プロセシング後に本明細書に記載される方法を行うための核酸が提供される。例えば、核酸は、試料から抽出、単離、精製、または増幅され得る。本明細書に使用される「単離された」という用語は、核酸がその元々の環境（例えば、天然に存在する場合は天然の環境、または外因的に発現する場合は宿主細胞）から取り出されていることを指し、したがって、その元々の環境から「人為的に」改変されている。単離された核酸は、通常、非核酸構成要素（例えば、タンパク質、脂質）の量が、供給源試料中に存在する構成要素の量よりも少ない状態で得られる。単離された核酸を含む組成物は、実質的に単離可能である（例えば、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％以上、非核酸構成要素が含まれない）。本明細書に使用される「精製」という用語は、核酸が由来する試料源よりも少ない核酸種を有する核酸が提供されることを指す。核酸を含む組成物は、実質的に精製可能である（例えば、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％以上、他の核酸種が含まれない）。
【０１８６】
核酸は、ある特定の実施形態において、本明細書に記載されるプロセスのための核酸を提供する前に、核酸フラグメントが生成される方法によって処理され得る。一部の実施形態において、フラグメント化または切断に供される核酸は、名目上、平均（ａｖｅｒａｇｅ）、または平均（ｍｅａｎ）の長さが、約５〜約１０，０００塩基対、約１００〜約１，００塩基対、約１００〜約５００塩基対、または約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、もしくは１００００塩基対であり得る。フラグメントは、当該技術分野で既知の任意の好適な方法によって生成することができ、核酸フラグメントの平均（ａｖｅｒａｇｅ）、平均（ｍｅａｎ）、または名目上の長さは、適切なフラグメント生成手順を選択することによって制御することができる。ある特定の実施形態において、配列の変動性がほとんどなく、かつ／または比較的多くの既知のヌクレオチド配列情報を有する、配列を分析するためには、比較的長さが短い核酸が用いられ得る。一部の実施形態において、配列の変動性が大きく、かつ／または比較的少ない未知のヌクレオチド配列情報を有する配列を分析するためには、比較的長い核酸が用いられ得る。本明細書に使用されるとき、「標的核酸」または「標的核酸種」という用語は、試料中の目的の任意の核酸種を指す。標的核酸種には、限定することなく、（ｉ）２つ以上の可能性のあるアレルのうちの特定のアレル、及び（ｉｉ）特定の変異、ヌクレオチド置換、配列の変動性、繰り返し配列、マーカー、または特徴的な配列が含まれる。
【０１８７】
開始細胞、組織、器官、または他の試料が得られた後、核酸分子（ｍＲＮＡ等）を、当該技術分野で周知の方法によりそこから単離することができる（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １５：６８７−７０１（１９７８）、Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，Ｐ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２：１６１−１７０（１９８２）、Ｇｕｂｌｅｒ，Ｕ．，ａｎｄ  Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｂ．Ｊ．，Ｇｅｎｅ  ２５：２６３−２６９（１９８３）を参照されたい）。核酸分子は、したがって、本発明に従ってｃＤＮＡ分子またはｃＤＮＡライブラリを調製するために使用してもよい。
【０１８８】
キット
別の実施形態において、本発明をまとめて、核酸分子の逆転写もしくは増幅に使用することができるキット、または核酸分子の配列決定に使用するためのキットにすることができる。本発明のこの態様によるキットは、バイアル、チューブ、アンプル、瓶等といった１つ以上の格納手段を緊密に有する、箱、段ボール、チューブ等の運搬手段を含み、ここで、第１の格納手段は、逆転写酵素活性を有する本発明の１つ以上のポリペプチドを格納する。逆転写酵素活性を有する１つを上回るポリペプチドを使用するとき、それらは、２つ以上のポリペプチドの混合物として単一の格納容器に入れられてもよく、または別個の格納容器に入れられてもよい。本発明のキットはまた、１つ以上のＤＮＡポリメラーゼ、好適な緩衝液、１つ以上のヌクレオチド、及び／または１つ以上のプライマーも（同じかまたは別個の格納容器に）含み得る。本発明のキットはまた、核酸（例えば、ベクターを含むＤＮＡ分子）を取り込むのに適したものを含む、１つ以上の宿主または細胞も含み得る。好ましい宿主には、大腸菌（ＤＨ５、ＤＨ５α、ＤＨ１０Ｂ、ＨＢ１０１、Ｔｏｐ  １０、及び他のＫ−１２株、ならびに大腸菌Ｂ及び大腸菌Ｗ株を含む）等の化学的に適した、または電気穿孔に適した（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）な細菌を挙げることができる。
【０１８９】
本発明の特定の態様において、本発明のキット（例えば、逆転写及び増幅キット）は、本発明の逆転写酵素活性を有する１つ以上のポリペプチド、核酸分子の合成に使用される１つ以上のヌクレオチド（そのうち１つ以上が、標識、例えば蛍光標識されていてもよい）、及び／または１つ以上のプライマー（例えば、逆転写のためのオリゴ（ｄＴ））を含む、１つ以上の構成要素を（混合物でかまたは別個に）含み得る。そのようなキット（逆転写及び増幅キットを含む）は、１つ以上のＤＮＡポリメラーゼをさらに含んでもよい。本発明の配列決定キットは、本発明の逆転写酵素活性を有する１つ以上のポリペプチド、ならびに、場合によっては１つ以上のＤＮＡポリメラーゼ、核酸分子の配列決定に使用される１つ以上の停止剤（例えば、ジデオキシヌクレオシド三リン酸分子）、１つ以上のヌクレオチド、及び／または１つ以上のプライマーを含み得る。本発明の逆転写、増幅、及び配列決定キットで使用するのに好適な逆転写酵素活性を有する好ましいポリペプチド、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド、プライマー、及び他の構成要素には、上述のものが挙げられる。本発明のこの態様に包含されるキットは、標準的な核酸の逆転写、増幅、または配列決定プロトコルを実行するために必要な追加の試薬及び化合物をさらに含んでもよい。本発明の逆転写酵素活性を有するそのようなポリペプチド、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド、プライマー、及び追加の試薬、構成要素、または化合物は、１つ以上の格納容器に格納されてもよく、また上述の構成要素のうちの２つ以上の混合物で、そのような格納容器に格納されてもよく、または別個の格納容器で本発明のキットに含まれてもよい。そのようなキットはまた、（例えば、本発明に従って核酸分子を標識するため等、本発明の方法を実行するための）説明書も含み得る。
【０１９０】
ある特定の例示的な実施形態において、本発明のキットは、分子診断アッセイのために調製される。このキットは、ヒト診断、動物診断、環境診断、及び／または食品安全性のための診断製品の販売を規制する政府の規制機関によって承認されている場合がある。本発明の逆転写酵素は、そのようなキットにおける現在の逆転写酵素の代わりに提供され得る。さらに、本発明の新規な逆転写酵素の有益かつ驚くべき特性のため、これらの酵素はこれらの用途に特に適したものとなっている。
【０１９１】
一部の実施形態において、本発明のキットは、内部及び／または外部の陽性対照、標的遺伝子（例えば、プライマー及び／もしくはプローブ）の検出のための１組のオリゴヌクレオチド、溶解緩衝液、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）、マスターミックス、ならびに検出色素を含むがこれらに限定されない、１つ以上の構成要素を含む。
【０１９２】
当業者であれば、本明細書に記載される方法及び用途に対する他の好適な修正及び適合が明らかであり、本発明またはその任意の実施形態の範囲から逸脱することなくなされ得ることを容易に理解するであろう。本明細書に記載される節の見出しは、便宜上のものに過ぎない。本発明を詳細に記載してきたが、本発明は以下の実施例への参照によってより明確に理解され、これらの実施例は、例示目的で本明細書に含まれるに過ぎず、本発明を制限することを意図するものではない。
【実施例】
【０１９３】
実施例１
種々の逆転写酵素の熱安定性及び処理能力の比較
２μｇの０．２４〜９．５ｋｂのＲＮＡラダー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１５６２００１６）及び５μＭの５'標識オリゴ（ｄＴ）２０プライマー（Ａｌｅｘａ−６４７）を、１０ｍＭのＤＴＴ、５００μＭの各ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＣＴＰ）、及び２ＵのＲＮａｓｅＯｕｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１０７７７−０１９）を補充した、最終反応体積が１９μＬの１倍第１鎖ｃＤＮＡ合成緩衝液ｐＨ８．４（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｙ０２３２１）に添加し、氷上でインキュベートした。次いで、１μＬの逆転写酵素（２００Ｕ／μｌ）を（最終体積２０μＬまで）添加した後、６０℃、３７℃、４２℃、または５０℃（図２に示されるように）で種々の時間（すなわち、５分間、１５分間、及び６０分間）インキュベートすることによって、反応を開始させた。各時点の終わりに、１０μｌのアルカリ負荷染料（３００ｍＭのＮａＯＨ、２ｍＭのＥＤＴＡ、２０％グリコール、１０％飽和チモールブルー）の添加により反応を終了させ、３０ボルトで２〜４時間、緩衝液（３０ｍＭのＮａＯＨ、２ｍＭのＥＤＴＡ  ｐＨ７．５）中において１％アルカリアガロースゲル（３０ｍＭのＮａＯＨ、２ｍＭのＥＤＴＡ  ｐＨ７．５）での電気泳動により可視化させた。次いで、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアを使用して、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｔｙｐｈｏｏｎ  ８６００  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｍｏｄｅ  Ｉｍａｇｅｒ（Ｈａｒｌｏｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によりゲルを分析した。
【０１９４】
図２に示されるように、本明細書の教示を用いて構築した例示的な変異型Ｍ−ＭＬＶである変異型Ｍ−ＭＬＶ  ＲＴ「Ｍｕｔ  Ｄ９」（配列番号４）を含む反応は、インキュベーション５分後程度の早期に最大７．５ｋｂのｃＤＮＡを生成し、６０℃でのインキュベーションのたった１５分後に最大９．５ｋｂのｃＤＮＡを生成した。これは、３７℃でインキュベートした野生型Ｍ−ＭＬＶ  ＲＴを含む反応とは対照的であり、これは、同程度の７．５ｋｂの量のｃＤＮＡを生成するのに最大６０分間を要した。同様に、７．５ｋｂのｃＤＮＡは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ（「ＳＳＩＩ」）またはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ（「ＳＳＩＩＩ」）ＲＴのいずれかを含む反応では、それぞれ、４２℃または５０℃でのインキュベーション後５分を超えるまで、検出されなかった。別の市販入手可能なＲＴ（「Ｑ−ＲＴ」）を試験したが、これは３７℃で６０分のインキュベーション後ですら同様のｃＤＮＡを全く生成しなかった。これにより、変異型Ｍ−ＭＬＶ（「Ｍｕｔ  Ｄ９」）ＲＴの処理能力が高く、６０℃程度の高温で行われる逆転写反応において、向上した熱安定性ならびに熱反応性を呈したことが示される。
【０１９５】
実施例２
低ｐＨでの変異型逆転写酵素の安定性
野生型Ｍ−ＭＬＶ  ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、カタログ番号２８０２５−０１３）（「ＷＴ  ＭＭＬＶ」）と例示的な変異型Ｍ−ＭＬＶ  ＲＴ（「Ｍｕｔ  Ｄ９」）との比較を行って、様々なｐＨで合成されるｃＤＮＡの速度及び長さを評価した。これらのアッセイには、０．５〜１０ｋｂのＲＮＡラダー（Ａｍｂｉｏｎ（登録商標）、カタログ番号１５６２３−２００）及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７オリゴ（ｄＴ）２０が含まれており、標準的なｐＨ８．３の緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．３、７２．５ｍＭのＫＣｌ、及び３ｍＭのＭｇＣｌ２）またはｐＨ７．３の緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．３、７２．５ｍＭのＫＣｌ、及び３ｍＭのＭｇＣｌ２）を用いて行った。反応温度は、野生型Ｍ−ＭＬＶについては３７℃であり、Ｍｕｔ  Ｄ９については５０℃であり、ＲＴ反応は、様々な長さの時間で行った（例えば、図３に示されるように、１０分間、３０分間、または６０分間）。生成された第１のｃＤＮＡ鎖を、アルカリアガロースゲル電気泳動によって分析し、Ｃｙ５蛍光モードに設定したＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｔｙｐｈｏｏｎ  ８６００  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｍｏｄｅ  Ｉｍａｇｅｒ（Ｈａｒｌｏｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて可視化させた。
【０１９６】
図３に示されるように、Ｍｕｔ  Ｄ９は、１０分以内に４ｋｂに達しているが、一方で野生型Ｍ−ＭＬＶは、同じ時間で３ｋｂにしか達していない。ｐＨ７．３において、変異体Ｄ９は、３０分以内に４ｋｂに達し得るが、一方で野生型Ｍ−ＭＬＶは、６０分間のＲＴ反応時間後ですら、６ｋｂを超えるｃＤＮＡを生成することができない。Ｍｕｔ  Ｄ９は、したがって、より広範なｐＨで野生型Ｍ−ＭＬＶよりも活性であり、野生型Ｍ−ＭＬＶよりも高い温度であっても、ｐＨ８．３及びｐＨ７．３の両方でより多くのｃＤＮＡ及びより長いｃＤＮＡを生成する。
【０１９７】
実施例３
変異型逆転写酵素の熱安定性
実施例２に記載の実験を、様々な時間（すなわち、図４に示されるように、５分間、１０分間、３０分間、または６０分間）６０℃でも行って、本明細書に記載される例示的な変異型ＲＴ（「Ｍｕｔ  Ｄ９」）の熱安定性を、野生型Ｍ−ＭＬＶ（「ＷＴ  ＭＭＬＶ」）及び他の市販入手可能なＲＴ（「ＳＳＩＩＩ」及び「Ｃ−ＲＴ」）と比較して評価した。この温度では、標準的なオリゴ（ｄＴ）２０は、融解温度が５０℃付近であるため、ＲＮＡ標的のポリアデニル化尾部にアニーリングできない。代わりに、５０％のＬＮＡを含有するＬＮＡ（商標）オリゴ−Ｔ２０（Ｅｘｉｑｏｎ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた。この実験における別の相違は、緩衝液、ＲＮＡ標的、及びプライマーを含有する反応混合物をまず６０℃に加熱した後、ＲＴ酵素を添加したことである（「手作業によるホットスタート」）。手作業によるホットスタートは、反応の構成時間中及び温度上昇中のｃＤＮＡの合成を排除するために行った。ｐＨ８．３で６０℃において、Ｍｕｔ  Ｄ９を除く全ての酵素は、機能しない。Ｍｕｔ  Ｄ９の速度、ｃＤＮＡ収率、及びｃＤＮＡ長さに関する性能は、５０℃（図３と比較）と比較して、６０℃（図４を参照されたい）で変化しないままであった。したがって、Ｍｕｔ  Ｄ９は、熱安定性かつ熱反応性であり、高温に加熱された後にリフォールディングして活性酵素となることができ（熱安定性）、同様に、高温でｃＤＮＡを合成することができる（熱反応性）（例えば、図４を参照されたい）。
【０１９８】
実施例４
逆転写の感受性及び熱安定性の評価
全ての反応について、２０μＬの反応につき１００、５０、または１０ｎｇのＨｅｌａ  ＲＮＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＡＭ７８５２、子宮頸部腺癌（Ｈｅｌａ−Ｓ３）全ＲＮＡ）を、（１）プライマーの不在下、（２）オリゴ（ｄＴ）２０プライマーの存在下、（３）ＬＮＡ  Ｔ２０プライマー（Ｅｘｉｑｏｎ）の存在下、（４）遺伝子特異的プライマー（ＰｏｌＥ  ２．５ｋｂ−逆方向プライマー配列：
2017503521.tif 000006
）の存在下において、示される温度及び時間でインキュベートした。各反応混合物は、示される量のＨｅｌａ  ＲＮＡ（図５に示される）、１ｍＭの各ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＣＴＰ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１０２９７０１８）、５ｍＭのＤＴＴ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｙ００１４７）、１倍の第１の鎖の緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｙ０２３２１）、１μＭのプライマー（上に記載され、図５に示されるように、１、２、３、または４）、４０ＵのＲＮａｓｅＯｕｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１０７７７０１９）、及び１００Ｕの他の市販入手可能な変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（「ＳＳＩＩＩ」及び「Ｍ−ＲＴ」）、または本明細書に開示される例示的な変異型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（「Ｍｕｔ  Ｄ９」）を含有していた。
【０１９９】
非ホットスタート（「ＮＯＮ−ＨＳ−ＲＴ」）反応条件については、タンパク質（逆転写酵素及びＲＮａｓｅＯｕｔ）を含まない反応混合物を、６５℃で５分間インキュベートした後、氷上で１０分間インキュベートした。ＲＮａｓｅＯｕｔ及び逆転写酵素を各反応物に添加し、これらの反応物を、次いで、室温で１０分間インキュベートした。この後に、５０℃で５０分間さらにインキュベートし、次いで、全ての反応を９５℃で１０分間の加熱により停止させた。
【０２００】
手作業によるホットスタート（「ＨＳ−ＲＴ」）反応条件については、タンパク質（逆転写酵素及びＲＮａｓｅＯｕｔ）を含まない反応混合物を、６５℃で５分間インキュベートした後、氷上で１０分間インキュベートした。ＲＮａｓｅＯｕｔを各反応物に添加し、これらの反応物を、逆転写酵素の不在下において６０℃で１０分間インキュベートした。逆転写酵素を、次いで、６０℃でインキュベートしながら反応物に直接添加し、反応を６０℃で５０分間進行させた。全ての反応を、９５℃で１０分間の加熱により停止させた。
【０２０１】
上述の逆転写反応によるｃＤＮＡ生成物を使用して、ＰＣＲ混合物を調製した。簡単に言うと、１μＬの上述のＲＴ反応物を、２４μＬのＰＣＲ混合物に添加した。ＰＣＲ反応物は、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１１３０４１０２）を使用して製造業者が推奨するように構築し、３０サイクル増幅させた。ｐｏｌ  Ｅ遺伝子の遺伝子特異的プライマーをＰＣＲに使用して、１ｋｂのフラグメントを得た。プライマー配列は次の通りであった。
順方向
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逆方向
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１０μＬの各ＰＣＲ反応物を２％Ｅゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｇ５０１８０２）に使用して、ゲル生成物を可視化させた。
図５に示されるように、３つ全ての逆転写酵素が、室温及び５０℃でインキュベートした場合には（「ＮＯＮ−ＨＳ−ＲＴ」反応を参照）任意のプライマーの不在下（１）であっても、１０〜１００ｎｇの鋳型ＤＮＡを用いて転写生成物を生成し、５０〜１００ｎｇの鋳型ＤＮＡに（２）オリゴ（ｄＴ）２０プライマー、（３）ロックド核酸（ＬＮＡ）Ｔ２０プライマー、及び（４）遺伝子特異的プライマーのいずれかを用いて同様の量の１ｋｂのｃＤＮＡが生成された。「ＨＳ−ＲＴ」反応については、プライマーの不在下またはプライマーのいずれか（２、３、もしくは４）を添加して、１０、５０、または１００ｎｇの鋳型ＤＮＡについて、１ｋｂのｃＤＮＡがＳＳＩＩＩによって生成されなかった。他の市販入手可能なＲＴ（「Ｍ−ＲＴ」）もまた、プライマーの不在下ではいずれのｃＤＮＡも生成せず、ＬＮＡ  Ｔ２０プライマーまたは遺伝子特異的プライマーのいずれかを用いた場合に１０、５０、または１００ｎｇの鋳型ＤＮＡについてごく少量のｃＤＮＡを生成したに過ぎなかった。変異型Ｍ−ＭＬＶ  Ｍｕｔ  Ｄ９（配列番号４）は、一方で、ＬＮＡ  Ｔ２０プライマーまたは遺伝子特異的プライマーのいずれかを用いた場合に、１０ｎｇの鋳型ＤＮＡについて相当な量のｃＤＮＡを生成し、試験した３つ全てのプライマー（２、３、及び４）について５０及び１００ｎｇの鋳型ＤＮＡのｃＤＮＡを相当な量で生成した。これは、Ｍｕｔ  Ｄ９が、６０℃で機能するだけでなく、非特異的（例えば、ｄＴまたはＬＮＡ）プライマー、ならびに特異的プライマー種を使用して、鋳型ＤＮＡを逆転写することもできることを示す。たった１０ｎｇのＲＮＡ投入により野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素または任意の他の市販入手可能な（「従来の」）変異型Ｍ−ＭＬＶ  ＲＴよりも多くの生成物を生成するＭｕｔ  Ｄ９の能力は、感受性の向上をさらに示す。
【０２０２】
さらに、高温、例えば６０℃で逆転写反応を行う能力は、「ＮＯＮ−ＨＳ−ＲＴ」反応で試験した全てのＲＴで見られたプライマーなしのｃＤＮＡ合成の防止を補助する。したがって、本明細書に開示されるもの等、６０℃で効率的に実行できるＲＴを有することにより、ＲＴ反応中に生じる可能性が高い自己プライミング事象に起因する非特異的プライミングの量を低減させる効果が提供される。このプライマーなしのｃＤＮＡの低減は、高い温度（例えば、５０℃、５５℃、６０℃等）で大幅に強化される。
【０２０３】
実施例５
阻害物質の存在下における変異型逆転写酵素の性能
実施例２に記載されたものと同様のアッセイを、種々の阻害物質の存在下において行った。ＲＴ反応温度は、野生型Ｍ−ＭＬＶについては３７℃であったが、他の市販入手可能な変異型Ｍ−ＭＬＶ  ＲＴ（「ＳＳＩＩＩ」及び「Ｃ−ＲＴ」）、ならびにＭｕｔ  Ｄ９の反応温度は５０℃であった。各ＲＴ反応を、６０分間実行した。試験したＲＴを阻害物質には、ＳＤＳ（０．００６〜０．０１％）、エタノール（２６〜３０％）、フミン酸（２１〜２５ｎｇ／μＬ）、胆汁酸塩（０．１６〜０．２％）、ヘパリン（０．００３１〜０．００４２Ｕ／μＬ）、及びヘマチン（４６〜５０μＭ）が挙げられる。図６に示されるように、野生型Ｍ−ＭＬＶは、ＳＤＳ、フミン酸、胆汁酸塩、及びヘマチンのあらゆる濃度で機能しない。それは、エタノール中ではわずかに機能するが、０．５ｋｂの全長ｃＤＮＡを合成することはできない。しかしながら、ヘパリンの存在下では、野生型Ｍ−ＭＬＶは、０．５ｋｂのｃＤＮＡを合成することができる。ＳＳＩＩＩは、ＳＤＳ、フミン酸、及びヘマチンのあらゆる濃度で機能しない。それは、エタノール及び胆汁酸塩中ではわずかに機能するが、０．５ｋｂの全長ｃＤＮＡを合成することはできない。それは、ヘパリンが存在する場合には、最大１．５ｋｂまで逆転写することができる。Ｍｕｔ  Ｄ９は、試験した阻害物質の全ての濃度において、野生型Ｍ−ＭＬＶ及びＳＳＩＩＩのいずれよりも優れた活性を示す。他の市販入手可能なＲＴ（すなわち、Ｃ−ＲＴ）と比較して、Ｍｕｔ  Ｄ９は、活性がほぼ同等であるエタノール及びヘパリンを除き、試験した全ての阻害物質濃度で優れた活性を示す。
【０２０４】
上述のように、種々の阻害物質の存在下における試験したＲＴの活性％を、ＴｏｔａｌＬａｂ  ＴＬ１００ソフトウェアを使用して濃度測定法により定量化した。各バンドの体積強度を各レーンで合計した。阻害物質なしのレーンの体積強度は１００％に設定し、阻害物質ありのレーンを、阻害物質なしに対する％として正規化して、活性％を得た。図７は、図６に示された様々なＲＴのＲＴ活性の比較を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年10月14日(2016.10.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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2017503521.tif 000027
2017503521.tif 000028
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