(57)【要約】キヌレニナーゼ活性を有するタンパク質の使用に関する方法及び組成物を記載する。例えば、ある種の態様において、キヌレニンを分解することが可能な改変型キヌレニナーゼが開示されてよい。更に、本発明のある種の態様は、開示したタンパク質または核酸を使用した、キヌレニン枯渇による癌の治療のための組成物及び方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された改変型ヒトキヌレニナーゼ酵素であって、前記改変型酵素が、天然型ヒトキヌレニナーゼ（配列番号：８を参照）に比べて少なくとも１つの置換を有し、前記少なくとも１つの置換が、（ａ）Ａ９９、Ｆ３０６、及びＡ４３６；  （ｂ）Ｆ３０６；  （ｄ）Ａ４３６；  （ｅ）Ａ９９、Ｇ１１２、Ｆ３０６、Ｖ３３９、Ｉ４０５、及びＳ４０８；  （ｆ）Ａ９９、Ｉ１３１、及びＦ２４９；  （ｇ）Ａ９９、Ｉ１３１、Ｆ２４９、及びＥ２５９；  （ｈ）Ａ９９、Ｉ１３１、Ｆ２４９、Ｅ２５９、及びＦ３０６；  （ｉ）Ａ９９及びＦ３０６；  （ｊ）Ａ９９、Ｔ１３８、Ｆ３０６、及びＡ４３６；  （ｋ）Ａ９９、Ｇ１１２、Ｆ３０６、Ｌ３３７、Ｉ４０５、及びＳ４０８；  （ｌ）Ａ９９、Ｇ１１２、Ｆ３０６、Ｌ３３７、Ｖ３３９、Ｉ４０５、及びＳ４０８；  （ｍ）Ａ９９、Ｇ１１２、Ｆ３０６、Ｖ３３９、Ｉ４０５、及びＳ４０８；  （ｎ）Ａ９９、Ｇ１１２、Ｔ１３８、Ｖ３３９、及びＩ４０５；    （ｏ）Ｆ３０６、Ｌ３３７、Ｖ３３９、Ｉ４０５、及びＳ４０８；  （ｐ）Ｆ７１、Ａ９９、及びＥ２５９；  （ｑ）Ｆ７１、Ａ９９、Ｉ１３１、Ｅ２５９、及びＡ２８２；  （ｒ）Ｆ７１、Ａ９９、Ｉ１３１、Ｅ２５９、及びＶ３０３；  （ｓ）Ｆ７１、Ａ９９、Ｉ１３１、Ｆ２４９、及びＬ３２２；  （ｔ）Ｆ７１、Ｅ２５９、及びＬ３２２；  （ｕ）Ｆ７１、Ｆ２４９、Ｅ２５９、及びＶ３０３；  （ｖ）Ｇ１１２、Ｆ３０６、Ｌ３３７、及びＩ４０５；  （ｗ）Ｇ１１２、Ｆ３０６、Ｖ３３９、及びＩ４０５；  （ｙ）Ｇ１１２、Ｆ３０６、Ｖ３３９、及びＳ４０８；  （ａ’）Ｉ１１０；  （ｂ’）Ｉ１１０及びＦ３０６；  （ｃ’）Ｉ１３１、Ｆ２４９、及びＳ２７４；  （ｄ’）Ｉ１３１及びＦ２４９；  （ｅ’）Ｔ１３８；  （ｆ’）Ｌ５９、Ｇ１１２、Ｆ３０６、Ｖ３３９、Ｉ４０５、及びＳ４０８；  （ｇ’）Ｈ４１、Ｑ１７５、及びＡ４３６；  並びに（ｈ’）Ｔ１３８及びＡ４３６からなる群より選択される位置にある、前記酵素。
【請求項２】
前記少なくとも１つの置換が、（ａ）Ａ９９Ｓ、Ｆ３０６Ｌ及びＡ４３６Ｔ；（ｂ）Ｆ３０６Ｍ；（ｃ）Ｆ３０６Ｌ；（ｄ）Ａ４３６Ｔ；（ｅ）Ａ９９Ｆ、Ｇ１１２Ａ、Ｆ３０６Ｙ、Ｖ３３９Ａ、Ｉ４０５Ｌ及びＳ４０８Ｎ；（ｆ）Ａ９９Ｉ、Ｉ１３１Ｖ及びＦ２４９Ｗ；（ｇ）Ａ９９Ｉ、Ｉ１３１Ｖ、Ｆ２４９Ｗ及びＥ２５９Ｐ；（ｈ）Ａ９９Ｉ、Ｉ１３１Ｖ、Ｆ２４９Ｗ、Ｅ２５９Ｐ及びＦ３０６Ｌ；（ｉ）Ａ９９Ｓ及びＦ３０６Ｌ；（ｊ）Ａ９９Ｓ、Ｔ１３８Ｓ、Ｆ３０６Ｌ及びＡ４３６Ｔ；（ｋ）Ａ９９Ｖ、Ｇ１１２Ａ、Ｆ３０６Ｙ、Ｌ３３７Ｖ、Ｉ４０５Ｌ及びＳ４０８Ｎ；（ｌ）Ａ９９Ｖ、Ｇ１１２Ａ、Ｆ３０６Ｙ、Ｌ３３７Ｖ、Ｖ３３９Ｉ、Ｉ４０５Ｆ、及びＳ４０８Ｎ；（ｍ）Ａ９９Ｖ、Ｇ１１２Ａ、Ｆ３０６Ｙ、Ｖ３３９Ａ、Ｉ４０５Ｌ及びＳ４０８Ｎ；（ｎ）Ａ９９Ｖ、Ｇ１１２Ａ、Ｔ１３８Ｓ、Ｖ３３９Ａ、及びＩ４０５Ｆ；（ｏ）Ｆ３０６Ｉ、Ｌ３３７Ｖ、Ｖ３３９Ｉ、Ｉ４０５Ｆ及びＳ４０８Ｔ；（ｐ）Ｆ７１Ｌ、Ａ９９Ｉ及びＥ２５９Ｐ；（ｑ）Ｆ７１Ｌ、Ａ９９Ｉ、Ｉ１３１Ｖ、Ｅ２５９Ｐ及びＡ２８２Ｐ；（ｒ）Ｆ７１Ｌ、Ａ９９Ｉ、Ｉ１３１Ｖ、Ｅ２５９Ｐ及びＶ３０３Ｓ；（ｓ）Ｆ７１Ｌ、Ａ９９Ｉ、Ｉ１３１Ｖ、Ｆ２４９Ｗ及びＬ３２２Ｐ；（ｔ）Ｆ７１Ｌ、Ｅ２５９Ｐ及びＬ３２２Ｐ；（ｕ）Ｆ７１Ｌ、Ｆ２４９Ｗ、Ｅ２５９Ｐ及びＶ３０３Ｓ；（ｖ）Ｇ１１２Ａ、Ｆ３０６Ｙ、Ｌ３３７Ｖ及びＩ４０５Ｌ；（ｗ）Ｇ１１２Ａ、Ｆ３０６Ｙ、Ｖ３３９Ｍ及びＩ４０５Ｌ；（ｘ）Ｇ１１２Ａ、Ｆ３０６Ｙ、Ｖ３３９Ｓ、Ｉ４０５Ｌ；（ｙ）Ｇ１１２Ｓ、Ｆ３０６Ｌ、Ｖ３３９Ｔ及びＳ４０８Ｔ；（ｚ）Ｇ１１２Ｓ、Ｆ３０６Ｙ、Ｖ３３９Ｔ及びＩ４０５Ｌ；（ａ’）Ｉ１１０Ｌ；（ｂ’）Ｉ１１０Ｌ及びＦ３０６Ｌ；（ｃ’）Ｉ１３１Ｍ、Ｆ２４９Ｗ、及びＳ２７４Ｇ；（ｄ’）Ｉ１３１Ｖ及びＦ２４９Ｗ；（ｅ’）Ｔ１３８Ｓ；（ｆ’）Ｌ５９Ｍ、Ｇ１１２Ｓ、Ｆ３０６Ｙ、Ｖ３３９Ａ、Ｉ４０５Ｌ、及びＳ４０８Ｎ；（ｇ’）Ｈ４１Ｒ、Ｑ１７５Ｌ、及びＡ４３６Ｔ；並びに（ｈ’）Ｔ１３８Ｓ及びＡ４３６Ｔからなる群より選択される、請求項１に記載の酵素。
【請求項３】
単離された改変型ヒトキヌレニナーゼ酵素であって、前記改変型酵素が、天然型ヒトキヌレニナーゼ（配列番号：８を参照）に比べて少なくとも１つの置換を有し、前記少なくとも１つの置換が、（ａ）Ａ９９、Ｆ３０６、及びＡ４３６；（ｂ）Ａ９９、Ｇ１１２、Ｆ３０６、Ｌ３３７、Ｉ４０５、Ｓ４０８；（ｃ）Ｇ１１２、Ｆ３０６、Ｌ３３７、及びＩ４０５；（ｄ）Ａ９９、Ｔ１３８、Ｆ３０６、及びＡ４３６；（ｅ）Ａ９９、Ｇ１１２、Ｆ３０６、Ｖ３３９、Ｉ４０５、及びＳ４０８；（ｆ）Ａ９９及びＦ３０６；（ｇ）Ｆ３０６、Ｌ３３７、Ｖ３３９、Ｉ４０５、及びＳ４０８；（ｈ）Ｇ１１２、Ｆ３０６、Ｖ３３９、及びＩ４０５；（ｉ）Ｇ１１２、Ｆ３０６、Ｖ３３９、Ｓ４０８；（ｋ）Ｆ７１、Ａ９９、Ｇ１１２、Ｔ１３８、Ｆ３０６、Ｌ３３７、Ｖ３３９、Ｉ４０５、Ｓ４０８、及びＡ４３６；（ｌ）Ａ９９、Ｇ１１２、Ｆ３０６、Ｌ３３７、Ｖ３３９、Ｉ４０５、及びＳ４０８；（ｍ）Ａ４３６；（ｎ）Ａ９９、Ｇ１１２、Ｔ１３８、Ｖ３３９、及びＩ４０５；（ｐ）Ａ９９、Ｇ１１２、Ｆ３０６、Ｉ４０５、Ｓ４０８、及びＡ４３６；（ｑ）Ｆ７１、Ａ９９、Ｉ１３１、Ｆ２４９、及びＬ３２２；（ｒ）Ａ９９、Ｉ１３１、Ｆ２４９、Ｅ２５９、及びＦ３０６；（ｓ）Ｆ７１、Ａ９９、及びＥ２５９；（ｔ）Ｆ７１、Ａ９９、Ｓ１６７、及びＥ２５９；（ｕ）Ｉ１３１、Ｆ２４９、及びＳ２７４；（ｖ）Ｌ５９、Ｇ１１２、Ｆ３０６、Ｖ３３９、Ｉ４０５、及びＳ４０８；（ｗ）Ｉ１１０及びＦ３０６；（ｘ）Ａ９９、Ｉ１３１、Ｆ２４９、及びＥ２５９；（ｙ）Ｆ７１、Ｅ２５９、及びＬ３２２；（ｚ）Ｈ４１、Ｑ１７５、及びＡ４３６；（ａ’）Ａ９９、Ｉ１３１、及びＦ２４９；（ｂ’）Ｉ１３１及びＦ２４９；（ｃ’）Ｔ１３８及びＡ４３６；（ｄ’）Ｔ１３８；（ｅ’）Ｆ７１、Ａ９９、Ｉ１３１、Ｅ２５９、及びＶ３０３；（ｆ’）Ａ９９、Ｇ１１２、Ｆ３０６、Ｖ３３９、Ｉ４０５、及びＳ４０８；（ｇ’）Ｆ７１、Ａ９９、Ｉ１３１、Ｅ２５９、及びＡ２８２；（ｈ’）Ｆ７１、Ｆ２４９、Ｅ２５９、及びＶ３０３；（ｉ’）Ｉ１１０；並びに（ｊ’）Ｆ３０６からなる群より選択される位置にある、前記酵素。
【請求項４】
前記少なくとも１つの置換が、（ａ）Ａ９９Ｓ、Ｆ３０６Ｌ及びＡ４３６Ｔ；（ｂ）Ａ９９Ｖ、Ｇ１１２Ａ、Ｆ３０６Ｙ、Ｌ３３７Ｖ、Ｉ４０５Ｌ、Ｓ４０８Ｎ；（ｃ）Ｇ１１２Ａ、Ｆ３０６Ｙ、Ｌ３３７Ｖ、及びＩ４０５Ｌ；（ｄ）Ａ９９Ｓ、Ｔ１３８Ｓ、Ｆ３０６Ｌ、及びＡ４３６Ｔ；（ｅ）Ａ９９Ｖ、Ｇ１１２Ａ、Ｆ３０６Ｙ、Ｖ３３９Ａ、Ｉ４０５Ｌ、及びＳ４０８Ｎ；（ｆ）Ａ９９Ｓ及びＦ３０６Ｌ；（ｇ）Ｆ３０６Ｉ、Ｌ３３７Ｖ、Ｖ３３９Ｉ、Ｉ４０５Ｆ、及びＳ４０８Ｔ；（ｈ）Ｇ１１２Ａ、Ｆ３０６Ｙ、Ｖ３３９Ｍ、及びＩ４０５Ｌ；（ｉ）Ｇ１１２Ｓ、Ｆ３０６Ｌ、Ｖ３３９Ｔ、Ｓ４０８Ｔ；（ｊ）Ｇ１１２Ａ、Ｆ３０６Ｙ、Ｖ３３９Ｓ、Ｉ４０５Ｌ；（ｋ）Ｆ７１Ｌ、Ａ９９Ｉ、Ｇ１１２Ａ、Ｔ１３８Ｓ、Ｆ３０６Ｙ、Ｌ３３７Ｖ、Ｖ３３９Ｉ、Ｉ４０５Ｌ、Ｓ４０８Ｎ、及びＡ４３６Ｔ；（ｌ）Ａ９９Ｖ、Ｇ１１２Ａ、Ｆ３０６Ｙ、Ｌ３３７Ｖ、Ｖ３３９Ｉ、Ｉ４０５Ｆ、及びＳ４０８Ｎ；（ｍ）Ａ４３６Ｔ；（ｎ）Ａ９９Ｖ、Ｇ１１２Ａ、Ｔ１３８Ｓ、Ｖ３３９Ａ、及びＩ４０５Ｆ；（ｏ）Ｇ１１２Ｓ、Ｆ３０６Ｙ、Ｖ３３９Ｔ、及びＩ４０５Ｌ；（ｐ）Ａ９９Ｉ、Ｇ１１２Ａ、Ｆ３０６Ｙ、Ｉ４０５Ｌ、Ｓ４０８Ｎ、及びＡ４３６Ｔ；（ｑ）Ｆ７１Ｌ、Ａ９９Ｉ、Ｉ１３１Ｖ、Ｆ２４９Ｗ、及びＬ３２２Ｐ；（ｒ）Ａ９９Ｉ、Ｉ１３１Ｖ、Ｆ２４９Ｗ、Ｅ２５９Ｐ、及びＦ３０６Ｌ；（ｓ）Ｆ７１Ｌ、Ａ９９Ｉ、及びＥ２５９Ｐ；（ｔ）Ｆ７１Ｌ、Ａ９９Ｉ、Ｓ１６７Ｔ、及びＥ２５９Ｐ；（ｕ）Ｉ１３１Ｍ、Ｆ２４９Ｗ、及びＳ２７４Ｇ；（ｖ）Ｌ５９Ｍ、Ｇ１１２Ｓ、Ｆ３０６Ｙ、Ｖ３３９Ａ、Ｉ４０５Ｌ、及びＳ４０８Ｎ；（ｗ）Ｉ１１０Ｌ及びＦ３０６Ｌ；（ｘ）Ａ９９Ｉ、Ｉ１３１Ｖ、Ｆ２４９Ｗ、及びＥ２５９Ｐ；（ｙ）Ｆ７１Ｌ、Ｅ２５９Ｐ、及びＬ３２２Ｐ；（ｚ）Ｈ４１Ｒ、Ｑ１７５Ｌ、及びＡ４３６Ｔ；（ａ’）Ａ９９Ｉ、Ｉ１３１Ｖ、及びＦ２４９Ｗ；（ｂ’）Ｉ１３１Ｖ及びＦ２４９Ｗ；（ｃ’）Ｔ１３８Ｓ及びＡ４３６Ｔ；（ｄ’）Ｔ１３８Ｓ；（ｅ’）Ｆ７１Ｌ、Ａ９９Ｉ、Ｉ１３１Ｖ、Ｅ２５９Ｐ、及びＶ３０３Ｓ；（ｆ’）Ａ９９Ｆ、Ｇ１１２Ａ、Ｆ３０６Ｙ、Ｖ３３９Ａ、Ｉ４０５Ｌ、及びＳ４０８Ｎ；（ｇ’）Ｆ７１Ｌ、Ａ９９Ｉ、Ｉ１３１Ｖ、Ｅ２５９Ｐ、及びＡ２８２Ｐ；（ｈ’）Ｆ７１Ｌ、Ｆ２４９Ｗ、Ｅ２５９Ｐ、及びＶ３０３Ｓ；（ｉ’）Ｉ１１０Ｌ；並びに（ｊ’）Ｆ３０６Ｙからなる群より選択される、請求項３に記載の酵素。
【請求項５】
異種ペプチドセグメントを更に含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の酵素。
【請求項６】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と結合している、請求項１〜４のいずれか一項に記載の酵素。
【請求項７】
１つ以上のＬｙｓまたはＣｙｓ残基を介してＰＥＧと結合している、請求項１〜４のいずれか一項に記載の酵素。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の酵素をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
【請求項９】
細菌、真菌、昆虫、または哺乳類における発現についてコドン最適化されている、請求項８に記載の核酸。
【請求項１０】
請求項８に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項１１】
請求項８に記載の核酸を含む、宿主細胞。
【請求項１２】
細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、または哺乳類細胞である、請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
製薬上許容できる担体の中に請求項１〜４のいずれか一項に記載のキヌレニナーゼを含む、医薬製剤。
【請求項１４】
前記キヌレニナーゼが異種ペプチドセグメントを更に含む、請求項１３に記載の製剤。
【請求項１５】
前記キヌレニナーゼがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と結合している、請求項１３に記載の製剤。
【請求項１６】
前記キヌレニナーゼが、１つ以上のＬｙｓまたはＣｙｓ残基を介してＰＥＧと結合している、請求項１５に記載の製剤。
【請求項１７】
前記キヌレニナーゼをコードする核酸が、細菌、真菌、昆虫、または哺乳類における発現についてコドン最適化されている、請求項１３に記載の製剤。
【請求項１８】
核酸が発現ベクターの中にある、請求項１３に記載の製剤。
【請求項１９】
腫瘍を有する対象の治療方法であって、有効量の請求項１３に記載の製剤を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項２０】
腫瘍を有する対象の治療で使用するための、有効量の請求項１３に記載の製剤を含む組成物。
【請求項２１】
前記対象が、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、またはＴＤＯを発現する腫瘍を有すると特定されている、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記腫瘍が固形腫瘍である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２３】
前記腫瘍が血液腫瘍である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２４】
前記対象がヒト患者である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２５】
前記製剤が、腫瘍内に、静脈内に、皮内に、動脈内に、腹腔内に、病変内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、胸膜腔内に、気管内に、眼内に、鼻内に、硝子体内に、膣内に、直腸内に、筋肉内に、皮下に、結膜下に、膀胱内に、粘膜に、心膜内に、臍内に、経口で、吸入によって、注射によって、点滴によって、持続点滴によって、標的細胞を直接浸す局所潅流によって、カテーテルを介して、または潅注によって投与される、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２６】
少なくとも第２の抗癌化合物を更に含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記第２の抗癌化合物が、抗ＰＤ１、抗ＣＴＬＡ−４、または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
発現したキメラ抗原Ｔ細胞受容体（ＣＡＲ）、及び発現した請求項１に記載のキヌレニナーゼ酵素を含む、トランスジェニックＴ細胞。
【請求項２９】
ヒトＴ細胞である、請求項２８に記載の細胞。
【請求項３０】
前記ＣＡＲ及び前記キヌレニナーゼをコードするＤＮＡが、細胞のゲノムに組み込まれている、請求項２８に記載の細胞。
【請求項３１】
前記ＣＡＲが癌細胞抗原を標的とする、請求項２８に記載の細胞。
【請求項３２】
前記癌細胞抗原がＨＥＲ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、またはＧＤ２である、請求項３１に記載の細胞。
【請求項３３】
腫瘍を有するヒト対象においてＴ細胞応答を提供する方法であって、有効量の請求項２８に記載のトランスジェニック細胞を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項３４】
腫瘍を有する対象の治療で使用するための、有効量の請求項２８に記載のトランスジェニック細胞を含む組成物。
【請求項３５】
前記トランスジェニック細胞が自己由来である、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
前記トランスジェニック細胞が異種由来である、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３７】
腫瘍の治療のための医薬の製造における、請求項１〜４のいずれか一項に記載のキヌレニナーゼ、または請求項１〜４のいずれか一項に記載のキヌレニナーゼをコードする核酸の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国仮出願番号第６２／１２０，４１８号（２０１５年２月２５日出願）、及び同６２／０４３，６６３号（２０１４年８月２９日出願）の優先権の利益を主張し、これらそれぞれの内容全体が参考として本明細書に組み込まれている。
【０００２】
本発明はアメリカ国立衛生研究所によって認可された助成金番号Ｒ０１ＣＡ１５４７５４のもとで政府の支援によってなされた。政府は本発明に特定の権利を有する。
【０００３】
１．発明の分野
本発明は一般に、Ｌ−キヌレニンまたはＬ−３−ヒドロキシキヌレニンを枯渇させる酵素による癌の治療のための組成物及び方法に関する。より詳細には、本発明は、ヒトの治療法に好適なＬ−キヌレニン分解活性を持つ細菌及び哺乳類の酵素の組み換え、薬理学的最適化及び使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
２．関連技術の説明
癌細胞によるインドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼアイソフォーム（ＩＤＯ１もしくはＩＤＯ２）の過剰発現、または、これらの酵素のいずれかを発現するように癌浸潤白血球を再プログラムすることは、癌に対する適応免疫応答を弱めることに関して深刻な影響を有することが示されている。間質細胞によるその発現が一部の腫瘍によって誘導されるＩＤＯ１及びＩＤＯ２、並びに酵素のトリプトファン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ）は、トリプトファン（Ｔｒｐ）のＬ−キヌレニン（ＫＹＮ）への異化における律速段階を触媒する（Ｇｏｄｉｎ−Ｅｔｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。免疫細胞に関してＫＹＮの濃度を局所的に上げる一方でＴｒｐの濃度を局所的に枯渇させる二重効果を有するＬＡＴ１様アミノ酸交換体（Ｋａｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）を用いて、腫瘍は細胞質基質のＫＹＮ分子を細胞外のＴｒｐ分子と交換する。近隣の免疫細胞がＫＹＮを内部移行させ、内部において、ＫＹＮは、免疫細胞の分化及び／またはアポトーシスの誘導を介して腫瘍の寛容をもたらす多数のサイトカイン及びケモカインの発現を生じるアリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）の活性化リガンドとなる（Ｄｅｌｌａ  Ｃｈｉｅｓａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；  Ｏｐｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。更に、キヌレニンから形成される他のＫＹＮ関連の化合物、最も顕著にはキヌレン酸もまた、オーファンＧＰＣＲ  ＧＰＣＲ３５のアゴニストとして作用することによって免疫抑制効果を発揮する。ＩＤＯ１またはＴＤＯの阻害によるＫＹＮ形成の阻害（従って、キヌレン酸、３−ヒドロキシキヌレニン及びキノリン酸を含むＫＹＮ代謝副産物の形成の阻害）は、癌の標的として著しく注目を浴びている（Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｇｕｉｌｌｅｍｉｎ，２００９；Ｒｕｔｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｐｒｅｎｄｅｒｇａｓｔ，２０１１）。ＩＤＯ１に対する、例えば、１−ＤＬ−メチルトリプトファンのような基質類似体阻害剤が開発されており、癌が誘導する腫瘍寛容を克服するので癌と闘う内因性免疫系の能力を回復することにおいて最初の有望さを示している（Ｌｏｂ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。しかし、ＫＹＮは腫瘍で発現されることも多いトリプトファン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ）によっても作られ、この酵素は１−ＤＬ−メチルトリプトファンによって阻害されない（Ｐｉｌｏｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。現在第１相及び第２相の臨床試験中である１−ＤＬ−メチルトリプトファンのＤ異性体（１−Ｄ−ＭＴ）にも、更なる関心が存在する。逆説的なことに、１−Ｄ−ＭＴはＩＤＯ１の発現を上方制御することができ、現にＫＹＮの濃度を上昇させ、特定の癌では免疫抑制を誘導する（Ｏｐｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。
【０００５】
腫瘍によるＫＹＮの産生を制御することがより多くの研究の焦点であり、とりわけ、乳癌、卵巣癌、膠芽腫及び膵臓癌を治療する潜在力を有する。ＫＹＮは、Ｔ細胞及びＮＫ細胞にて増殖を抑制すると共にアポトーシスを誘導し（Ｏｐｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｍａｎｄｉ  ａｎｄ  Ｖａｃｓｅｉ，２０１２）、腫瘍が患者の免疫系による検出及び破壊から免れるのを可能にすることが知られている。ＫＹＮは、Ｔ細胞におけるその活性化がＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）への分化を誘導する、アリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）の強力なリガンドである（Ｍｅｚｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。ＫＹＮはまた、ＡＨＲに対するアゴニスト効果が介在する可能性もある作用である、ＮＫが介在する細胞による腫瘍細胞株の殺傷に必要とされる、特定の受容体（ＮＫｐ４６及びＮＫＧ２Ｄ）のサイトカインが介在する上方制御（Ｄｅｌｌａ  Ｃｈｉｅｓａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）を妨げることが示されている（Ｓｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。血清ＫＹＮ濃度の上昇と複数の種類の癌における生存率の低下を結びつける臨床的な証拠もある。健常な患者では、血清におけるＫＹＮの濃度は０．５〜１μＭの範囲である。びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫等の、ＫＹＮを産生する種類の癌患者では、血清ＫＹＮ濃度は１０倍ほど高く測定され（Ｙｏｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；ｄｅ  Ｊｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；  Ｙａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）、この濃度は、同じ治療レジメンを受けているリンパ腫患者間での生存率の予後診断であり、１．５μＭを超えるＫＹＮ濃度の患者はたった５８％の生存率であったのに比べて、１．５μＭ未満の血清濃度の患者は８９％の３年生存率を示した。生存率におけるこの差異はＫＹＮの免疫抑制効果に起因した（Ｙｏｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。１−Ｄ−ＭＴ等の小分子ＩＤＯ阻害剤の使用は、免疫機能を回復することにおけるＫＹＮ濃度の制御の有用性を明らかにしているが、１−Ｄ−ＭＴによるＩＤＯ１上方制御の的外れな効果、並びに、ＴＤＯ及びＩＤＯ１アイソフォームに対する阻害の欠如が懸念される。
【０００６】
本発明は、腫瘍及び／または血液におけるＫＹＮ及びその代謝産物を特異的に枯渇させるための酵素の使用を開示する。ＫＹＮを枯渇させる酵素を使用してＩＤＯ１、ＩＤＯ２、またはＴＤＯを発現する腫瘍を治療するためのＫＹＮの濃度を下げることにより、腫瘍が介在する寛容原性の効果を妨げ、代わりに腫瘍除去型の炎症誘発性反応に介在する。特に、ＫＹＮ及びＫＹＮの代謝副産物を枯渇させるための酵素を使用することにより、上述のＩＤＯアイソフォーム及びＴＤＯの小分子阻害剤に関連する問題が回避され、更に、小分子薬剤に一般的に非常に付随し、予測されない毒性及び副作用をもたらす非特異的な効果が完全に回避される。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の態様は、Ｌ−キヌレニン及び３−ヒドロキシ−Ｌ−キヌレニンを分解し、癌治療にとって所望される、血清における好ましい薬物動態を示すことが可能である細菌及び哺乳類のポリペプチド配列を含む酵素を提供することによって、当該技術における主要な欠陥を克服する。いくつかの態様では、キヌレニナーゼ酵素は３’ＯＨ−キヌレニンよりもキヌレニンに対してより高い触媒活性を有し得る。細菌種に由来するキヌレニナーゼを使用してもよい。かかる酵素は、配列番号：７及び１３〜５２、またはそれらの改変体からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し得る。特に、治療剤は、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）の酵素であるキヌレニナーゼ（Ｐｆ−ＫＹＮＵ）に由来し得る。あるいは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはアカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）に由来するキヌレニナーゼを使用してもよい。治療薬はムチラギニバクター・パルジス（Ｍｕｃｉｌａｇｉｎｉｂａｃｔｅｒ  ｐａｌｕｄｉｓ）のキヌレニナーゼ酵素に由来してもよい。更に、異種のキヌレニナーゼの免疫原性による悪影響を防ぐために、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）の酵素、またはヒト酵素に対して＞９５％の配列同一性を示す他の霊長類のキヌレニナーゼを使用してもよい。例えば、新規の酵素は配列番号：７〜９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有してもよい。  
【０００８】
他の態様では、ＫＹＮを分解することが可能であり、かつ３−ヒドロキシキヌレニンまたはキヌレン酸の分解に対する活性を有することが可能である天然型または改変型のヒトまたは霊長類のキヌレニナーゼのいずれかを含むポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは生理的条件下でＫＹＮを分解することが可能である。例えば、ポリペプチドは、少なくとも、または約０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０４、１０５、１０６Ｍ−１ｓ−１またはこれらの中の任意の範囲変数の、ＫＹＮに対する触媒効率（ｋｃａｔ／ＫＭ）を有する。
【０００９】
上述の改変ポリペプチドは、非改変ポリペプチド（たとえば、天然型ポリペプチド）、または本明細書で開示される任意のポリペプチド配列と比べて、一定の比率の同一性を有することを特徴とし得る。例えば、非改変ポリペプチドは、少なくとも、または約１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００残基（またはこれらの任意の範囲変数）の天然型キヌレニナーゼを含んでもよい。％同一性は、改変ポリペプチドと非改変ポリペプチドとの間で、または比較における任意の２つの配列の間で、多くても、または少なくとも約４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％（またはこれらの任意の範囲変数）であってよい。上述の同一性の割合は、ポリペプチドの非改変領域と比較したポリペプチドの特定の改変領域に関し得ることもまた想到される。例えば、ポリペプチドは、同じ種に由来するかまたは種をまたいでの非改変型または変異型のキヌレニナーゼのアミノ酸配列の同一性に基づいて特徴付けることができる、キヌレニナーゼの改変型または変異型の基質認識部位を含有してもよい。たとえば、非改変型キヌレニナーゼに対して少なくとも９０％の同一性を有することを特徴とする改変型または変異型のヒトポリペプチドとは、その改変型または変異型のヒトポリペプチド内のアミノ酸の少なくとも９０％が、非改変ポリペプチド内のアミノ酸と同一であることを意味する。
【００１０】
かかる非改変ポリペプチドは、天然型キヌレニナーゼ、特にヒトのアイソフォームまたは他の霊長類のアイソフォームであってもよい。たとえば、天然型ヒトキヌレニナーゼは配列番号：８の配列を有してもよい。他の霊長類の天然型キヌレニナーゼの非限定例としては、Ｐｏｎｇｏ  ａｂｅｌｉｉキヌレニナーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＩＤ：ＸＰ＿００９２３５９６２．１，ＧＩ：６８６７０８６５６；配列番号：１０）、Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓキヌレニナーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＩＤ：ＥＨＨ５４８４９．１，ＧＩ：３５５７５０５２２；配列番号１１）、及びＰａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓキヌレニナーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＩＤ：ＸＰ＿００３３０９３１４．１，ＧＩ：３３２８１４５２１；配列番号１２）が挙げられる。例示的な天然型ポリペプチドとしては、配列番号：８もしくは１０〜１２、またはそれらの断片の約、多くても、または少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％（またはこれらの任意の範囲変数）の同一性を有する配列が挙げられる。例えば、天然型ポリペプチドは、配列番号：８、または１０〜１２の配列の少なくとも、または最大で約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４１５残基（またはこれらの任意の範囲変数）を含んでもよい。
【００１１】
いくつかの実施形態において、天然型キヌレニナーゼは、化学修飾、置換、挿入、欠失及び／または切断等の１つ以上の他の改変によって改変される。例えば、改変は天然型酵素の基質認識部位である。特定の実施形態では、天然型キヌレニナーゼは置換によって改変される。例えば、置換の数は１、２、３、４つ以上であってもよい。更なる実施形態では、天然型キヌレニナーゼは基質認識部位にて、または基質特異性に影響を与えうる任意の位置にて改変される。
【００１２】
一実施形態では、単離された改変型ヒトキヌレニナーゼ酵素が提供され、ここでは、改変型酵素は天然型ヒトキヌレニナーゼ（配列番号：８を参照）に比べて少なくとも１つの置換を有し、少なくとも１つの置換としては、天然型ヒトキヌレニナーゼの位置３０６で通常見いだされるＰｈｅに対するＭｅｔまたはＬｅｕによる置換が挙げられる。したがって、一態様では、Ｐｈｅ３０６Ｍｅｔ置換を含む、単離された、改変型ヒトキヌレニナーゼ酵素が提供される。別の態様では、Ｐｈｅ３０６Ｌｅｕ置換を含む、単離された、改変型ヒトキヌレニナーゼ酵素が提供される。
一実施形態では、単離された、改変ヒトキヌレニナーゼ酵素が提供され、改変型酵素は、天然型ヒトキヌレニナーゼ（配列番号：８を参照）に比べて少なくとも１つの置換を有し、少なくとも１つの置換は、少なくとも、配列番号：８に対してアミノ酸位置Ｈ４１、Ｌ５９、Ｆ７１、Ａ９８、Ａ９９、Ｇ１０１、Ｈ１０２、Ｉ１１０、Ｇ１１２、Ｍ１２０、Ｋ１２１、Ｄ１２２、Ｉ１３１、Ｎ１３５、Ａ１３６、Ｔ１３８、Ｈ１４２、Ｆ１４８、Ｆ１４９、Ｋ１５７、Ｓ１６７、Ａ１７１、Ｑ１７５、Ｑ２２９、Ｎ２３２、Ｇ２４８、Ｆ２４９、Ｅ２５９、Ｗ２７２、Ｓ２７４、Ａ２８２、Ｉ２８５、Ｇ２８７、Ａ２８８、Ｐ３００、Ｖ３０３、Ｆ３０６、Ｌ３２０、Ｌ３２２、Ｓ３３２、Ｎ３３３、Ｐ３３４、Ｌ３３７、Ｖ３３９、Ｔ４０４、Ｉ４０５、Ｓ４０８、またはＡ４３６での置換を含む。更なる態様において、少なくとも１つの置換は、（ａ）Ａ９９、Ｆ３０６、及びＡ４３６；（ｂ）Ａ９９、Ｇ１１２、Ｆ３０６、Ｌ３３７、Ｉ４０５、Ｓ４０８；（ｃ）Ｇ１１２、Ｆ３０６、Ｌ３３７、及びＩ４０５；（ｄ）Ａ９９、Ｔ１３８、Ｆ３０６、及びＡ４３６；（ｅ）Ａ９９、Ｇ１１２、Ｆ３０６、Ｖ３３９、Ｉ４０５、及びＳ４０８；（ｆ）Ａ９９及びＦ３０６；（ｇ）Ｆ３０６、Ｌ３３７、Ｖ３３９、Ｉ４０５、及びＳ４０８；（ｈ）Ｇ１１２、Ｆ３０６、Ｖ３３９、及びＩ４０５；（ｉ）Ｇ１１２、Ｆ３０６、Ｖ３３９、Ｓ４０８；（ｋ）Ｆ７１、Ａ９９、Ｇ１１２、Ｔ１３８、Ｆ３０６、Ｌ３３７、Ｖ３３９、Ｉ４０５、Ｓ４０８、及びＡ４３６；（ｌ）Ａ９９、Ｇ１１２、Ｆ３０６、Ｌ３３７、Ｖ３３９、Ｉ４０５、及びＳ４０８；（ｍ）Ａ４３６；（ｎ）Ａ９９、Ｇ１１２、Ｔ１３８、Ｖ３３９、及びＩ４０５；（ｐ）Ａ９９、Ｇ１１２、Ｆ３０６、Ｉ４０５、Ｓ４０８、及びＡ４３６；（ｑ）Ｆ７１、Ａ９９、Ｉ１３１、Ｆ２４９、及びＬ３２２；（ｒ）Ａ９９、Ｉ１３１、Ｆ２４９、Ｅ２５９、及びＦ３０６；（ｓ）Ｆ７１、Ａ９９、及びＥ２５９；（ｔ）Ｆ７１、Ａ９９、Ｓ１６７、及びＥ２５９；（ｕ）Ｉ１３１、Ｆ２４９、及びＳ２７４；（ｖ）Ｌ５９、Ｇ１１２、Ｆ３０６、Ｖ３３９、Ｉ４０５、及びＳ４０８；（ｗ）Ｉ１１０及びＦ３０６；（ｘ）Ａ９９、Ｉ１３１、Ｆ２４９、及びＥ２５９；（ｙ）Ｆ７１、Ｅ２５９、及びＬ３２２；（ｚ）Ｈ４１、Ｑ１７５、及びＡ４３６；（ａ’）Ａ９９、Ｉ１３１、及びＦ２４９；（ｂ’）Ｉ１３１及びＦ２４９；（ｃ’）Ｔ１３８及びＡ４３６；（ｄ’）Ｔ１３８；（ｅ’）Ｆ７１、Ａ９９、Ｉ１３１、Ｅ２５９、及びＶ３０３；（ｆ’）Ａ９９、Ｇ１１２、Ｆ３０６、Ｖ３３９、Ｉ４０５、及びＳ４０８；（ｇ’）Ｆ７１、Ａ９９、Ｉ１３１、Ｅ２５９、及びＡ２８２；（ｈ’）Ｆ７１、Ｆ２４９、Ｅ２５９、及びＶ３０３；（ｉ’）Ｉ１１０；並びに（ｊ’）Ｆ３０６からなる群より選択される位置におけるものである。種々の態様において、少なくとも１つの置換は、（ａ）Ａ９９Ｓ、Ｆ３０６Ｌ、及びＡ４３６Ｔ；（ｂ）Ａ９９Ｖ、Ｇ１１２Ａ、Ｆ３０６Ｙ、Ｌ３３７Ｖ、Ｉ４０５Ｌ、Ｓ４０８Ｎ；（ｃ）Ｇ１１２Ａ、Ｆ３０６Ｙ、Ｌ３３７Ｖ、及びＩ４０５Ｌ；（ｄ）Ａ９９Ｓ、Ｔ１３８Ｓ、Ｆ３０６Ｌ、及びＡ４３６Ｔ；（ｅ）Ａ９９Ｖ、Ｇ１１２Ａ、Ｆ３０６Ｙ、Ｖ３３９Ａ、Ｉ４０５Ｌ、及びＳ４０８Ｎ；（ｆ）Ａ９９Ｓ及びＦ３０６Ｌ；（ｇ）Ｆ３０６Ｉ、Ｌ３３７Ｖ、Ｖ３３９Ｉ、Ｉ４０５Ｆ、及びＳ４０８Ｔ；（ｈ）Ｇ１１２Ａ、Ｆ３０６Ｙ、Ｖ３３９Ｍ、及びＩ４０５Ｌ；（ｉ）Ｇ１１２Ｓ、Ｆ３０６Ｌ、Ｖ３３９Ｔ、Ｓ４０８Ｔ；（ｊ）Ｇ１１２Ａ、Ｆ３０６Ｙ、Ｖ３３９Ｓ、Ｉ４０５Ｌ；（ｋ）Ｆ７１Ｌ、Ａ９９Ｉ、Ｇ１１２Ａ、Ｔ１３８Ｓ、Ｆ３０６Ｙ、Ｌ３３７Ｖ、Ｖ３３９Ｉ、Ｉ４０５Ｌ、Ｓ４０８Ｎ、及びＡ４３６Ｔ；（ｌ）Ａ９９Ｖ、Ｇ１１２Ａ、Ｆ３０６Ｙ、Ｌ３３７Ｖ、Ｖ３３９Ｉ、Ｉ４０５Ｆ、及びＳ４０８Ｎ；（ｍ）Ａ４３６Ｔ；（ｎ）Ａ９９Ｖ、Ｇ１１２Ａ、Ｔ１３８Ｓ、Ｖ３３９Ａ、及びＩ４０５Ｆ；（ｏ）Ｇ１１２Ｓ、Ｆ３０６Ｙ、Ｖ３３９Ｔ、及びＩ４０５Ｌ；（ｐ）Ａ９９Ｉ、Ｇ１１２Ａ、Ｆ３０６Ｙ、Ｉ４０５Ｌ、Ｓ４０８Ｎ、及びＡ４３６Ｔ；（ｑ）Ｆ７１Ｌ、Ａ９９Ｉ、Ｉ１３１Ｖ、Ｆ２４９Ｗ、及びＬ３２２Ｐ；（ｒ）Ａ９９Ｉ、Ｉ１３１Ｖ、Ｆ２４９Ｗ、Ｅ２５９Ｐ、及びＦ３０６Ｌ；（ｓ）Ｆ７１Ｌ、Ａ９９Ｉ、及びＥ２５９Ｐ；（ｔ）Ｆ７１Ｌ、Ａ９９Ｉ、Ｓ１６７Ｔ、及びＥ２５９Ｐ；（ｕ）Ｉ１３１Ｍ、Ｆ２４９Ｗ、及びＳ２７４Ｇ；（ｖ）Ｌ５９Ｍ、Ｇ１１２Ｓ、Ｆ３０６Ｙ、Ｖ３３９Ａ、Ｉ４０５Ｌ、及びＳ４０８Ｎ；（ｗ）Ｉ１１０Ｌ及びＦ３０６Ｌ；（ｘ）Ａ９９Ｉ、Ｉ１３１Ｖ、Ｆ２４９Ｗ、及びＥ２５９Ｐ；（ｙ）Ｆ７１Ｌ、Ｅ２５９Ｐ、及びＬ３２２Ｐ；（ｚ）Ｈ４１Ｒ、Ｑ１７５Ｌ、及びＡ４３６Ｔ；（ａ’）Ａ９９Ｉ、Ｉ１３１Ｖ、及びＦ２４９Ｗ；（ｂ’）Ｉ１３１Ｖ及びＦ２４９Ｗ；（ｃ’）Ｔ１３８Ｓ及びＡ４３６Ｔ；（ｄ’）Ｔ１３８Ｓ；（ｅ’）Ｆ７１Ｌ、Ａ９９Ｉ、Ｉ１３１Ｖ、Ｅ２５９Ｐ、及びＶ３０３Ｓ；（ｆ’）Ａ９９Ｆ、Ｇ１１２Ａ、Ｆ３０６Ｙ、Ｖ３３９Ａ、Ｉ４０５Ｌ、及びＳ４０８Ｎ；（ｇ’）Ｆ７１Ｌ、Ａ９９Ｉ、Ｉ１３１Ｖ、Ｅ２５９Ｐ、及びＡ２８２Ｐ；（ｈ’）Ｆ７１Ｌ、Ｆ２４９Ｗ、Ｅ２５９Ｐ、及びＶ３０３Ｓ；（ｉ’）Ｉ１１０Ｌ；並びに（ｊ’）Ｆ３０６Ｙからなる群より選択される。いくつかの態様では、キヌレニナーゼ酵素は、前述のアミノ酸置換の１つまたは置換の組み合わせを含み、更に、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個以下の更なるアミノ酸置換を含む。種々の態様において、単離された、改変型ヒトキヌレニナーゼ酵素は、配列番号：５５、５６、及び５８〜９３のいずれか１つに従った配列を有する。
【００１３】
いくつかの態様では、本発明はまた、異種アミノ酸配列に結合したキヌレニナーゼを含むポリペプチドを想到する。例えば、キヌレニナーゼは、融合タンパク質として異種アミノ酸配列に結合してよい。特定の実施形態では、キヌレニナーゼは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を増加させるために、ＩｇＧ  Ｆｃ、アルブミン、アルブミン結合タンパク質、またはＸＴＥＮポリペプチド等のアミノ酸配列に結合する。
【００１４】
血清安定性を増加させるために、キヌレニナーゼは１つ以上のポリエーテル分子に結合してよい。特定の実施形態では、ポリエーテルはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。  ポリペプチドは、リジンまたはシステイン等の特定のアミノ酸残基を介してＰＥＧに結合（例えば共有結合）してよい。治療的投与のために、キヌレニナーゼを含むかかるポリペプチドを製薬上許容できる担体に分散させてよい。
【００１５】
いくつかの態様では、かかるキヌレニナーゼをコードする核酸を想到する。いくつかの実施形態において、核酸は、細菌での発現のためにコドン最適化されている。特定の実施形態では、細菌はＥ．  ｃｏｌｉである。他の態様では、核酸は真菌（例えば酵母菌）、昆虫、または哺乳類での発現のためにコドン最適化されている。本発明は更に、かかる核酸を含有するベクター、例えば発現ベクターを想到する。特定の実施形態では、キヌレニナーゼをコードする核酸は、異種プロモーターを含むがこれに限定されないプロモーターに作用可能に結合している。一実施形態では、キヌレニナーゼはベクター（例えば遺伝子治療ベクター）により標的細胞に送達される。かかるウイルスは組み換えＤＮＡ技術により改変され、標的細胞内でキヌレニナーゼをコードする核酸の発現を可能にし得る。これらのベクターは、非ウイルス（例えばプラスミド）、またはウイルス（例えばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、もしくはワクシニア・ウイルス）起源のベクターから誘導してもよい。非ウイルスベクターは、作用物質と複合体を形成し、細胞膜を通ってＤＮＡが流入するのを容易にするのが好ましい。かかる非ウイルスベクター複合体の例としては、ＤＮＡの縮合を促進するポリカチオン性作用物質による製剤、及び脂質ベースのデリバリーシステムが挙げられる。脂質ベースのデリバリーシステムの例としては、核酸のリポソームベースの送達が挙げられる。
【００１６】
また更なる態様において、本発明は更に、かかるベクターを含む宿主細胞を想到する。宿主細胞は、細菌（例えばＥ．  ｃｏｌｉ）、真菌細胞（例えば酵母菌）、昆虫細胞、または哺乳類細胞であってよい。
【００１７】
いくつかの実施形態において、ベクターは、キヌレニナーゼを発現させるために宿主細胞内に導入される。好適な方法でタンパク質が発現されてもよい。一実施形態では、タンパク質は宿主細胞内で、タンパク質がグリコシル化されるように発現される。別の実施形態において、タンパク質は宿主細胞内で、タンパク質が非グリコシル化されるように発現される。
【００１８】
本発明の特定の態様はまた、キヌレニナーゼペプチド、遺伝子治療ベクター内でキヌレニナーゼをコードする核酸、または本発明の製剤を投与することによる治療方法、特に、腫瘍細胞または癌を患う対象の治療方法も想到する。対象は任意の動物、例えばマウスであってよい。例えば、対象は哺乳類、特に霊長類、より詳細にはヒト患者であってよい。いくつかの実施形態において、本方法は、癌の患者を選択することを含んでよい。
【００１９】
いくつかの実施形態において、癌はキヌレニンの枯渇に対して感受性のある任意の癌である。一実施形態では、本発明は、かかるポリペプチドを含む製剤を投与することを含む、腫瘍細胞または癌患者の治療方法を想到する。いくつかの実施形態において、投与は、癌細胞の少なくとも一部が殺傷されるような条件下にて発生する。別の実施形態において、製剤は、生理学的条件にてキヌレニン分解活性を有するかかるキヌレニナーゼを含み、更に、結合したポリエチレングリコール鎖を含む。いくつかの実施形態においては、製剤は、上述のキヌレニナーゼのいずれか、及び製薬上許容できる賦形剤を含む医薬製剤である。かかる製薬上許容できる賦形剤は、当業者には周知である。上記キヌレニナーゼの全てが、ヒトの治療法において有用であると想到され得る。
【００２０】
更なる実施形態において、キヌレニン分解活性を有する非細菌性（哺乳類、例えば霊長類もしくはマウス）キヌレニナーゼ、またはそれをコードする核酸を含む製剤を投与することを含む腫瘍細胞の治療方法もまた提供されてよい。
【００２１】
投与または治療は細胞の栄養源に向けられてよく、必ずしも細胞自体に向けられる必要はない。したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏ用途において、腫瘍細胞を治療することは、腫瘍細胞の集団のための栄養媒体をキヌレニナーゼと接触させることを含む。本実施形態において、媒体は、血液、リンパ液、脊髄液、及び、キヌレニンの枯渇が所望される同様の体液とすることができる。
【００２２】
本発明の特定の態様に従い、キヌレニナーゼを含有するかかる製剤は、吸入、点滴、連続点滴、局所潅流により、カテーテルを介して、潅注により、脂質組成物（例えばリポソーム）内で、もしくは他の方法、または当業者に知られている前述の組み合わせにより、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、滑液嚢内、気管内、鼻孔内、硝子体内、腟内、直腸内、腫瘍内、筋肉内、皮下、結膜下、膀胱内、粘膜、心膜内、臍帯内、眼内、経口、局所投与されることができる。
【００２３】
更なる実施形態において、本方法は、対象に、少なくとも第２の抗癌治療法を施すこともまた含む。第２の抗癌治療法は外科治療法、化学療法、放射線治療、凍結治療、ホルモン療法、免疫療法またはサイトカイン治療法であってよい。ある種の態様において、第２の抗癌治療法は抗ＰＤ−１、抗ＣＴＬＡ−４、または抗ＰＤ−Ｌ１抗体であってよい。
【００２４】
いくつかの実施形態においては、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及びキヌレニナーゼ酵素を含む細胞は、癌を患う対象の治療での使用が想到される。いくつかの態様では、細胞は、ＣＡＲ及びキヌレニナーゼ、かつ、場合によってはトランスポーゼースをコードするＤＮＡによりトランスフェクションされてよい。
【００２５】
ＣＡＲは、例えばＨＥＲ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＧＤ２を含む、対象の任意の癌細胞抗原を標的化し得る。抗原結合領域またはドメインは、米国特許第７，１０９，３０４号（その全体が本明細書に参照として組み込まれる）に記載されているもの等の、特定のヒトモノクローナル抗体に由来する、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）のＶＨ及びＶＬ鎖の断片を含むことができる。断片はまた、ヒト抗原特異的抗体の、任意数の異なる抗原結合ドメインを含むこともできる。より特異的な実施形態においては、断片は、ヒト細胞内での発現のために、ヒトコドンでの使用に最適化された配列によりコードされた抗原特異的ｓｃＦｖである。ＣＡＲの更なる例については、例えばＷＯ２０１２／０３１７４４、ＷＯ２０１２／０７９０００、ＷＯ２０１３／０５９５９３、及び米国特許第８，４６５，７４３号（これら全ての明細書の全体が、参考として本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
【００２６】
キヌレニナーゼは、本明細書にて開示した任意のキヌレニナーゼであってよい。細胞をトランスフェクションする方法は、当該技術分野において周知であるが、ある種の態様においては、エレクトロポレーション法等の、非常に効率的なトランスフェクション方法が用いられる。例えば、ヌクレオフェクション装置を使用して核酸を細胞内に導入してよい。好ましくは、トランスフェクション工程は、遺伝毒性を引き起こすことができ、かつ／または治療した対象におけるウイルス配列を含有する免疫応答を導くことができる、細胞にウイルスを感染させるかまたは形質導入することを伴わない。
【００２７】
広範囲のＣＡＲ構築物、及びその発現ベクターは当技術分野において周知であり、本明細書において更に詳細に記述される。例えば、いくつかの態様では、ＣＡＲ発現ベクターは、プラスミド、線状発現ベクターまたはエピソーム等のＤＮＡ発現ベクターである。いくつかの態様では、ベクターは、ＣＡＲの発現を促進する配列等の追加の配列、例えばプロモーター、エンハンサー、ポリ−Ａシグナル、及び／または１つ以上のイントロンを含む。好ましい態様において、ＣＡＲコード配列は、トランスポーゼースが存在することにより、コード配列がトランスフェクション細胞のゲノム内に組み込まれることが可能となるとなるように、トランスポゾン配列に隣接する。
【００２８】
ある種の態様において、細胞は更に、トランスフェクト細胞のゲノム内にＣＡＲコード配列の組み込みを促進するトランスポーゼースによりトランスフェクションされる。いくつかの態様では、トランスポーゼースはＤＮＡ発現ベクターとして提供される。しかし、好ましい態様においては、トランスポーゼースは、トランスポーゼースの長期間にわたる発現がトランスジェニック細胞内で生じないように、発現可能なＲＮＡまたはタンパク質として提供される。実施形態に従い任意のトランスポーゼースシステムを使用してよい。他の態様では、細胞をレンチウイルスで感染させ、ＣＡＲコード配列及びキヌレニナーゼコード配列の、細胞のゲノム内への組み込みを容易にしてよい。
【００２９】
一実施形態では、キヌレニナーゼ、またはキヌレニナーゼをコードする核酸を含む組成物を、対象の腫瘍の治療に使用するために提供する。別の実施形態において、キヌレニナーゼ、またはキヌレニナーゼをコードする核酸を、腫瘍の治療用医薬の製造で用いることを提供する。前記キヌレニナーゼは、実施形態の任意のキヌレニナーゼであってよい。
【００３０】
本発明の方法及び／または組成物の文脈で論じられる実施形態は、本明細書で記載される任意の他の方法または組成物と共に使用してもよい。したがって、一方法または組成物に関する実施形態を、本発明の他の方法及び組成物に同様に適用してよい。
【００３１】
本明細書で使用する場合、核酸に関しての用語「ｅｎｃｏｄｅ（コードする）」または「ｅｎｃｏｄｉｎｇ（コードする）」は、本発明が当業者により速やかに理解されるようにするために用いられる。しかし、これらの用語はそれぞれ、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（〜を含む）」または「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（〜を含む）」と同じ意味で用いられてよい。
【００３２】
本明細書で用いる場合、「ａ」または「ａｎ」は１つ以上を意味し得る。本明細書の特許請求の範囲内で用いる場合、単語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（〜を含む）」と共に使用する場合、単語「ａ」または「ａｎ」は、１つ、または２つ以上を意味し得る。
【００３３】
特許請求の範囲内では、用語「または」は、代替物のみを指すか、または代替物が相互排他的であることを指すことが明示的に指示されない限り、本開示が、代替物のみ、そして「及び／または」を指す定義を支持するにも関わらず、「及び／または」を意味するように用いられる。本明細書で使用する場合、「別の」は、少なくとも第２の、またはそれ以上を意味し得る。
【００３４】
本明細書を通して、用語「約」は、ある値が、その値、または研究用対象間で存在する差を測定するのに用いたデバイス、方法に関しての、固有の誤差変動を含むことを意味するように用いられる。
【００３５】
本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。しかし、本発明の趣旨及び範囲内での種々の変化及び変更は、この詳細の説明より当業者には明らかとなるため、詳細の説明及び特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しているものの、実例としてのみ与えられることが理解されなければならない。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
本明細書の、以下の図面形成部分が、本発明の特定の態様を更に示すために包含される。本発明は、本明細書で提示される特定の実施形態の詳細の説明と組み合わせられた、１つ以上のこれらの図面を参照することで、よりよく理解され得る。
【００３７】
【図１】（レーン１）ＰＲＥＣＩＳＩＯＮ  ＰＬＵＳ  ＰＲＯＴＥＩＮ（商標）ＭＷスタンダード（ＢｉｏＲａｄ）、（レーン２〜４）濃度増加したＰｆ−ＫＹＮＵ、及び（レーン５）ＰＥＧ５，０００ＭＷの改変Ｐｆ−ＫＹＮＵのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。
【図２】ＰＢＳ（無色の正方形）、及びプールしたヒト血清（無色の円）でのＰｆ−ＫＹＮＵの安定性。
【図３】腫瘍増殖速度で測定した、自家移植Ｂ１６マウス黒色腫モデルにおけるＰＥＧ−Ｐｆ−ＫＹＮＵの効果。（濃い正方形）熱不活性化ＰＥＧ−Ｐｆ−ＫＹＮＵ。（濃い円）活性ＰＥＧ−Ｐｆ−ＫＹＮＵ。
【図４】生残により測定した、自家移植Ｂ１６マウス黒色腫モデルにおけるＰＥＧ−Ｐｆ−ＫＹＮＵの効果。（濃い正方形）熱不活性化ＰＥＧ−Ｐｆ−ＫＹＮＵ。（濃い円）活性ＰＥＧ−Ｐｆ−ＫＹＮＵ。
【図５】図５Ａ〜Ｂ：加熱不活性化ＰＥＧ−Ｐｆ−ＫＹＮＵで治療したマウス。（●）活性ＰＥＧ−Ｐｆ−ＫＹＮＵで治療したマウス。図５Ａ：血中循環ＣＤ４＋制御Ｔ細胞の集団は、活性ＰＥＧ−Ｐｆ−ＫＹＮＵで治療した群より著しく少ない。図５Ｂ：腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞の集団は、グランザイムＢ及びインターフェロンγの著しく高い発現を示す。
【図６】Ｅ．  ｃｏｌｉ内でのキヌレニナーゼ活性の遺伝選択。Ｍ９最小培地に植菌したＥ．  ｃｏｌｉ−ΔｔｒｐＥを、Ｌ−Ｔｒｐ（Ｔｒｐ）、緩衝液（−）、アントラニル酸（ＡＡ）、またはＬ−Ｋｙｎ（Ｋｙｎ）で浸した濾紙円盤法でプレーティングする。
【図７】ムチラギニバクター・パルジスのキヌレニナーゼ（Ｍｕ−ＫＹＮＵ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ安定性。７４％が残っている活性の振幅を有する１Ｔ１／２＝６時間、続いて２Ｔ１／２＝１５０時間での、３７℃でのＰＢＳ中（無色の正方形）での、及び、３０％が残っている活性の振幅を有する１Ｔ１／２＝５時間、続いて２Ｔ１／２＝７３時間での、３７℃のプールしたヒト血清（濃い円）でのＭｕ−ＫＹＮＵの、時間の関数としての活性。
【図８】ＰＥＧ−Ｐｆ−ＫＹＮＵ（−−・）、不活性化ＰＥＧ−Ｐｆ−ＫＹＮＵ（−・・）、抗ＰＤ１（・・・）、または抗ＣＴＬＡ−４（━）で処理した、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ内のＢ１６同種異系移植片のカプラン・マイヤープロット。矢印は処理日を示し、（Ａ）は抗体による処理を示し、（Ｅ）は酵素による処理を示す。
【図９】図９Ａ：ＰＢＳ（円）（対照）、抗ＰＤ１のみ（正方形）、抗ＰＤ１／ＰＥＧ−Ｍｕ−ＫＹＮＵ（逆三角形）、または抗ＰＤ１／ＰＥＧ−Ｐｆ−ＫＹＮＵ（上下正しい向きの三角形）で治療した、Ｂ１６腫瘍同種異系移植片を有するＣ５７ＢＬ／６Ｊ。図９Ｂ：抗ＰＤ１のみでは０％の腫瘍除去であったことと比較して、腫瘍の６０％を取り除いた抗ＰＤ１／ＰＥＧ−Ｐｆ−ＫＹＮＵの組み合わせ処理、及び腫瘍の２０％を取り除いた抗ＰＤ１／ＰＥＧ−Ｍｕ−ＫＹＮＵの組み合わせにおいて相加効果が観察された。図９Ｃ：対応するカプラン・マイヤープロット。
【図１０】図１０Ａ：熱不活性化ＰＥＧ−Ｍｕ−ＫＹＮＵ（■）または活性ＰＥＧ−Ｍｕ−ＫＹＮＵ（▲）で処理した、Ｂ１６腫瘍同種異系移植片を有するＣ５７ＢＬ／６Ｊ。図１０Ｂ：ＰＥＧ−Ｍｕ−ＫＹＮＵに関する、２５日間の中央生残生残時間（−−−）、及び、熱不活性化ＰＥＧ−Ｍｕ−ＫＹＮＵに関する、２２日間の中央生残時間（━）を示す、対応するカプラン・マイヤープロット。矢印は処理日を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
例示的態様の説明
キヌレニンは、インドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）またはトリプトファン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ）のいずれかの作用により生成される、アミノ酸であるトリプトファンの代謝産物である。キヌレニンは細胞の生理学性に多数の影響を与え、その最も重要な影響の１つが、Ｔ細胞応答の調整である。多くの腫瘍細胞は、ＩＤＯ及び／またはＴＤＯの合成を制御して、キヌレニンの局所濃度を上昇させ、これにトリプトファンの枯渇が伴う。高濃度のキヌレニンは強力に機能し、別様では腫瘍を攻撃する腫瘍浸潤Ｔ細胞の機能を阻害する。
【００３９】
本発明は、キヌレニン分解酵素を、腫瘍微小環境内、及び血清内で局所キヌレニン濃度を激減させることにより、Ｔ細胞作用が腫瘍により抑制されることを防止する手段として使用する方法を提供する。キヌレニン加水分解酵素（キヌレニナーゼ）は、キヌレニンをアラニンとアントラニル酸に転換し、後者はＴ細胞機能に影響を及ぼすことが知られていない。発明者らは、酵素が長い時間生理的条件下にあり続けることを可能にする、キヌレニナーゼ酵素の医薬品を生成した。次に、発明者らは、酵素を腫瘍内投与することで、マウスの浸潤性腫瘍の増殖が劇的に遅くなることを示した。
【００４０】
Ｉ．定義
本明細書で使用する場合、用語「タンパク質」及び「ポリペプチド」とは、ペプチド結合を介して結合したアミノ酸を含む化合物を意味し、これらは互換的に用いられる。
【００４１】
本明細書で使用する場合、用語「融合タンパク質」とは、非天然的に作用可能に結合したタンパク質またはタンパク質断片を含有するキメラタンパク質を意味する。
【００４２】
本明細書で使用する場合、用語「半減期」とは、例えば哺乳類への注射の後で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで、ポリペプチドの濃度が半分にまで低下するのに必要な時間を意味する。
【００４３】
用語「作用可能な組み合わせで」「作用可能な順番で」及び「作用可能に結合した」とは、記載した構成成分が、意図した方法で機能することを可能にする関係にある結合、例えば、所与の遺伝子の転写及び／もしくは所望のタンパク質分子の合成を指令することが可能な核酸分子となるような核酸配列の結合、または、融合タンパク質が作製されるようなアミノ酸配列の結合を意味する。
【００４４】
用語「リンカー」とは、分子架橋として作用し、２つの異なる分子を作用可能に結合した化合物または部分を意味し、ここでは、リンカーの一部分が第１の分子に作用可能に結合し、リンカーの別の部分が第２の分子に作用可能に結合している。
【００４５】
用語「ＰＥＧ化」とは、その生体適合性の高さ及び改変の容易性を考慮して薬剤担体として幅広く使用されている、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とのコンジュゲーションを意味する。ＰＥＧは、ＰＥＧ鎖の末端のヒドロキシ基を介して、化学的方法により活性薬剤とカップリング（例えば共有結合）することが可能であるが、ＰＥＧそのものは、１分子あたり多くても２つの活性薬剤に制限されている。異なるアプローチにおいては、ＰＥＧとアミノ酸とのコポリマーは、ＰＥＧの生体適合性を維持するものの、１分子あたりで多数の結合点を有するという更なる利点を有し（したがって、より多くの薬剤担持をもたし）、かつ、合成により、多様な用途に適するように設計されることができる新規のバイオマテリアルとして見出されている
【００４６】
用語「遺伝子」とは、ポリペプチド、またはその前駆体の作製に必要な調節配列及びコード配列を含むＤＮＡ配列を意味する。ポリペプチドは、完全長コード配列、または所望の酵素活性が維持されるようなコード配列の任意の部分によりコードされることができる。
【００４７】
用語「天然型」とは、天然源から単離した場合の、遺伝子、遺伝子産物、またはその遺伝子もしくは遺伝子産物の特性の典型的形態を意味する。天然型の形態は、天然集団にて最も頻繁に見られ、したがって恣意的に通常または野生型形態と呼ばれるものである。対照的に、用語「改変型」「変異型（variant）」または「変異型（mutant）」とは、天然型の遺伝子または遺伝子産物と比較した場合に、配列及び機能的性質において変性（即ち、変化した特性）を示す遺伝子または遺伝子産物を意味する。
【００４８】
用語「ベクター」とは、複製可能な細胞内への導入のために核酸配列を挿入可能な担体核酸分子を指すために使用される。核酸配列は「外来性」であることができ、これは、ベクターが導入される細胞に対して外来であるか、または、配列が細胞内の配列に対して相同であるが、配列が通常発見されない宿主細胞核酸内の位置にあることを意味する。ベクターとしては、プラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルス、及び植物ウイルス）、並びに人工染色体（例えばＹＡＣ）が挙げられる。当業者は、標準的な組み換え技術（例えばＭａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４（両方が参考として本明細書に組み込まれている）を参照）によりベクターを構築するのに十分な装備を有している。
【００４９】
用語「発現ベクター」とは、転写可能なＲＮＡをコードする核酸を含む任意の種類の遺伝子構築物を意味する。場合によっては、ＲＮＡ分子は次いで、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに翻訳される。他の場合、例えば、アンチセンス分子またはリボザイムの作製において、これらの配列は翻訳されない。発現ベクターは、種々の「調節配列」を含有することができ、「調節配列」とは、特定の宿主細胞内で作用可能に結合したコード配列での転写、及び場合により翻訳に必要な核酸配列を意味する。転写及び翻訳を管理する調節配列に加えて、ベクター及び発現ベクターは他の機能を果たす核酸配列を含有してよく、これらは以下に記載する。
【００５０】
本明細書で使用する場合、用語「治療に有効な量」とは、治療効果を得るための方法で用いられる、ある量の細胞及び／または治療用組成物（治療用ポリヌクレオチド及び／または治療用ポリペプチド等）を意味する。本出願を通して用いられる用語「治療的効果」または「治療的に有効な」とは、この状態の治療に関する、対象の健康状態を促進するか、または向上させるあらゆることを意味する。これは、病気の徴候または症状の頻度または重症度の低下を含むが、これに限定されない。例えば、癌治療は、例えば、腫瘍サイズの減少、腫瘍の侵襲性の低下、癌の増殖速度の低下、または転移の予防を伴い得る。癌治療はまた、癌を患う対象の生存を延ばすことを意味してもよい。
【００５１】
本明細書で使用する場合、用語「ＫＭ」とは、酵素に対するミカエリス・メンテン定数を意味し、所与の酵素が、酵素触媒反応における最大速度の半分となる、特異的基質の濃度として定義される。本明細書で使用する場合、用語「ｋｃａｔ」とは、ターンオーバー数、即ち、各酵素部位が単位時間あたりで生成物に転換し、酵素が最大効率で作用する、基質分子の数を意味する。本明細書で使用する場合、用語「ｋｃａｔ／ＫＭ」は特異的定数であり、ある酵素が基質を生成物にどれほど効率的に転換するかの指標となっている。
【００５２】
本明細書で使用する場合、用語「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」とは、例えば人工Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、またはキメラ免疫受容体を意味し、特定の免疫エフェクター細胞に人工的特異性をグラフトする組み換え受容体を包含する。ＣＡＲを使用して、Ｔ細胞にモノクローナル抗体の特異性を付与してよく、これにより多数の特異的Ｔ細胞が、例えば養子細胞療法で使用するために、生成されることが可能となる。特定の実施形態において、ＣＡＲは例えば、細胞の特異性を腫瘍関連抗原に向ける。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、細胞内活性化ドメイン、膜貫通ドメイン、及び腫瘍関連抗原結合領域を含む細胞外ドメインを含む。特定の態様において、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ膜貫通及びエンドドメインに融合したモノクローナル抗体（米国特許第７，１０９，３０４号（その全体が本明細書に参照として組み込まれる）に記載されているもの等）に由来する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の融合を含む。他のＣＡＲ設計の特異性は、受容体（例えばペプチド）のリガンド、またはデクチン等のパターン認識受容体に由来してよい。特定の実施形態では、Ｂ細胞系統分子であるＣＤ１９に特異的なＣＡＲを使用することにより、Ｔ細胞の特異性を変更することで、悪性Ｂ細胞を標的化することができる。特定の場合において、抗原認識ドメインの間隔を変更して、活性化により誘導される細胞死を減少させることができる。特定の場合において、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ、ＦｃＲ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＤＡＰ１０、及び／またはＯＸ４０等の更なる共刺激シグナル伝達のためのドメインを含む。場合によっては、分子は、共刺激分子、イメージング（例えば陽電子放出断層撮影）用のレポーター遺伝子、プロドラッグを加える際にＴ細胞を条件次第で取り除く遺伝子産物、ホーミング受容体、ケモカイン、ケモカイン受容体、サイトカイン、及びサイトカイン受容体を含むＣＡＲにより同時発現することができる。
【００５３】
「治療」及び「治療すること」とは、病気または健康に関係する状態の治療的効果を得る目的のために、対象に治療薬を投与することもしくは適用すること、または対象において手順もしくは様式を実施することを意味する。例えば、治療は、薬学的に有効な量のキヌレニナーゼを投与することを含んでもよい。
【００５４】
「対象」及び「患者」とは、ヒトまたは非ヒト（例えば霊長類、哺乳類、及び脊椎動物）のいずれかを意味する。特定の実施形態では、対象はヒトである。
【００５５】
ＩＩ．キヌレニナーゼポリペプチド
いくつかの実施形態は、改変タンパク質及びポリペプチドに関する。特定の実施形態は、非改変体に相当する少なくとも１つの機能活性、好ましくはキヌレニン分解活性または３’−ヒドロキシ−キヌレニン分解活性を示す改変タンパク質またはポリペプチドに関する。更なる態様において、タンパク質またはポリペプチドを更に改変して、血清安定性を増加させてよい。したがって、本出願が「改変タンパク質」または「改変ポリペプチド」の機能または活性を指す場合、当業者は、この言葉は、例えば、非改変タンパク質またはポリペプチドを超える更なる利点、例えばキヌレニン分解活性または３’−ヒドロキシ−キヌレニン分解活性を有するタンパク質またはポリペプチドを含むことを理解するであろう。特定の実施形態において、非改変タンパク質またはポリペプチドは、天然型キヌレニナーゼ、好ましくはヒトキヌレニナーゼまたはシュードモナス・フルオレッセンスのキヌレニナーゼである。「改変タンパク質」に関する実施形態は「改変ポリペプチド」に関して実行され得、またこの逆も然りであることが特に想到される。
【００５６】
活性の測定は、当業者に知られている、特にタンパク質の活性に関するアッセイを使用して達成可能であり得、比較の目的のために、改変または非改変タンパク質またはポリペプチドのいずれかの天然型及び／または組み換え体を使用することを含んでよい。
【００５７】
ある種の実施形態において、改変型キヌレニナーゼ等の改変ポリペプチドは、キヌレニン及び／または３’−ヒドロキシ−キヌレニン分解活性の増加に基づいて識別されてよい。例えば、非改変ポリペプチドの基質の基質認識部位が識別されてよい。この識別は、構造解析または相同性解析に基づいてよい。かかる基質認識部位の改変を伴う変異体の集団が生成されてよい。更なる実施形態において、キヌレニン分解活性が増強された変異体が、変異体集団から選択されてよい。所望の変異体の選択としては、キヌレニン分解による副産物または生成物の検出といった方法を挙げてよい。
【００５８】
改変タンパク質はアミノ酸の欠失及び／または置換を有し得る。したがって、欠失を有するタンパク質、置換を有するタンパク質、及び、欠失と置換を有するタンパク質は、改変タンパク質である。いくつかの実施形態において、これらの改変タンパク質は、例えば融合タンパク質またはリンカーを有するタンパク質と同様に、挿入または追加のアミノ酸を更に含んでもよい。「改変型の欠失タンパク質」は、天然型タンパク質の１つ以上の残基を欠いているが、天然型タンパク質の特異性及び／または活性を有してよい。「改変型の欠失タンパク質」は、免疫原性または抗原性が低下していてもよい。改変型の欠失タンパク質の例は、少なくとも１つの抗原性領域（即ち、特定の生物（例えば、当該改変型のタンパク質が投与され得る生物の種類）において抗原性であると判定される、タンパク質の領域）から欠失したアミノ酸残基を有するものである。
【００５９】
置換（Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎまたはｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）変異体は通常、タンパク質内の１つ以上の部位において、あるアミノ酸の別のアミノ酸との交換を含有し、ポリペプチドの１つ以上の性質、特にエフェクター機能及び／または生物学的利用能を制御するように設計されてよい。置換は、即ち、あるアミノ酸が類似の形状及び電荷のアミノ酸で置換されている保存的置換であっても、またはなくてもよい。保存的置換は当該技術分野において周知であり、例えば、アラニンのセリンへの；アルギニンのリジンへの；アスパラギンのグルタミンまたはヒスチジンへの；アスパルテートのグルタメートへの；システインのセリンへの；グルタミンのアスパラギンへの；グルタメートのアスパルテートへの；グリシンのプロリンへの；ヒスチジンのアスパラギンまたはグルタミンへの；イソロイシンのロイシンまたはバリンへの；ロイシンのバリンまたはイソロイシンへの；リジンのアルギニンへの；メチオニンのロイシンまたはイソロイシンへの；フェニルアラニンのチロシン、ロイシン、またはメチオニンへの；セリンのスレオニンへの；スレオニンのセリンへの；トリプトファンのチロシンへの；チロシンのトリプトファンまたはフェニルアラニンへの；及び、バリンのイソロイシンまたはロイシンへの変更が挙げられる。
【００６０】
欠失または置換に加えて、改変タンパク質は、通常ポリペプチド内への少なくとも１つの残基の付加を伴う、残基の挿入を有してよい。挿入は、標的化ペプチドもしくはポリペプチド、または単純に１つの残基の挿入を含んでよい。融合タンパク質と呼ばれる末端付加を以下で論じる。
【００６１】
用語「生物学的に機能が等価な」は当該技術分野において十分に理解されおり、本明細書で更に詳細を規定する。したがって、タンパク質の生物活性が維持される場合、対照ポリペプチドのアミノ酸に同一または機能的に等価なアミノ酸の約７０％〜約８０％、または約８１％〜約９０％、あるいは約９１％〜約９９％を有する配列が含まれる。改変タンパク質は、ある種の態様において、相当する天然型のタンパク質に生物学的に機能が等価であり得る。
【００６２】
アミノ酸及び核酸配列は、タンパク質の発現が関係する生物学的なタンパク質の活性の維持といった上述の基準を配列が満たす限り、追加の残基、例えば追加のＮもしくはＣ末端アミノ酸、または５’もしくは３’配列を含んでよく、かつ、依然として、本明細書にて開示した配列の１つにおいて説明されるものと実質的に等価であることもまた理解されよう。末端配列の付加は特に、例えば、コード領域の５’もしくは３’部分のいずれかに隣接する種々の非コード配列を含み得るか、または、遺伝子内で発生することが知られている種々の内部配列、即ちイントロンを含み得る核酸配列に適用される。
【００６３】
ＩＩＩ．治療のための酵素によるキヌレニン分解
ある種の態様において、腫瘍が仲介する寛容原性効果を予防し、代わりに腫瘍を除去するプロ炎症性応答を仲介させるために、ポリペプチドを、キヌレニンを枯渇させる酵素により、キヌレニンの枯渇に感受性のある癌を含む病気を治療するために使用してよい。ある種の態様において、キヌレニナーゼは、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、及び／またはＴＤＯを発現する腫瘍の治療に使用するのために想到される。
【００６４】
本発明のある種の態様は、腫瘍等の病気を治療するための改変型キヌレニナーゼを提供する。特に、改変ポリペプチドはヒトポリペプチド配列を有してよく、したがって、ヒト患者にてアレルギー反応を防止し、繰り返しの投薬が可能となり、治療効果を増加させる。
【００６５】
本治療方法が有用な腫瘍としては、固形腫瘍または血液腫瘍で見出されるもの等の、任意の悪性細胞型が挙げられる。例示的な固形腫瘍としては、膵臓、結腸、盲腸、胃、脳、頭、首、卵巣、腎臓、喉頭、肉腫、肺、膀胱、黒色腫、前立腺、及び胸からなる群より選択される器官の腫瘍を挙げることができるが、これらに限定されない。例示的な血液腫瘍としては、骨髄腫瘍、ＴまたはＢ細胞の悪性腫瘍、白血病、リンパ腫、芽腫、骨髄腫等が挙げられる。本明細書において提供する方法を使用して治療され得る癌の更なる例としては、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、白血病、扁平上皮細胞癌、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、及び肺扁平上皮癌等）、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌（胃腸癌及び消化管間質腫瘍等）、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮体または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌または腎癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、様々な種類の頭頸癌、黒色腫、表在拡大型黒色腫、悪性黒子型黒色腫、末端黒子型黒色腫、結節型黒色腫、及びＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ性ＮＨＬ；高悪性度小型非分割細胞ＮＨＬ；巨大腫瘤病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳに伴うリンパ腫；及びワルデンストレームマクログロブリン血症、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、毛様細胞性白血病、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）並びに慢性骨髄芽球性白血病が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
癌は特に、以下の組織学的種類のものであってよいが、これらに限定されない：腫瘍（悪性）；癌腫；癌（未分化）；巨大紡錘体細胞癌；小細胞癌；乳頭状癌；扁平上皮細胞癌；リンパ上皮癌；基底細胞癌；毛母癌；移行上皮癌；乳頭移行上皮癌；腺癌；ガストリン産生腫瘍（悪性）；胆管癌；肝細胞癌；混合型肝細胞癌および胆管癌；小柱腺癌；腺様嚢胞癌；腺腫性ポリープ腺癌；腺癌（家族性大腸ポリポージス）；固体癌腫；カルチノイド腫瘍（悪性）；細気管支肺胞腺癌；乳頭腺癌；嫌色素性癌；好酸癌；酸親和性腺癌；好塩基性癌；透明細胞腺癌；顆粒細胞癌腫；濾胞性腺癌；乳頭及び濾胞性腺癌；非カプセル化硬化性癌（ｎｏｎｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｎｇ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）；副腎皮質癌；類内膜癌（ｅｎｄｏｍｅｔｒｏｉｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）；皮膚付属器癌；アポクリン腺癌；皮脂性腺癌；耳垢腺癌；粘液性類表皮癌；嚢胞腺癌；乳頭嚢胞腺癌；乳頭状漿液性嚢胞腺癌；粘液性嚢胞腺癌；粘液性腺癌；印環細胞癌；浸潤性導管癌；髄様癌；小葉癌；炎症性癌；乳房ページェット病；腺房細胞癌；腺扁平上皮癌；扁平上皮化生随伴腺癌；胸腺腫（悪性）；卵巣支質腫瘍（悪性）；卵胞膜細胞腫（悪性）；顆粒膜細胞腫（悪性）；男性ホルモン産生細胞腫（悪性）；セルトリ細胞癌；ライディッヒ細胞腫瘍（悪性）；脂質細胞腫瘍（悪性）；傍神経節腫（悪性）；乳房外パラガングリオーマ（悪性）；褐色細胞腫；血管球血管肉腫；悪性黒色腫；メラニン欠乏性黒色腫；表在拡大型黒色腫；巨大色素性母斑での悪性黒色腫；類上皮細胞黒色腫；青色母斑（悪性）；肉腫；線維肉腫；線維性組織球腫（悪性）；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎児性横紋筋肉腫；肺胞横紋筋肉腫；間質性肉腫；混合腫瘍（悪性）；ミュラー混合腫瘍；腎芽腫；肝芽細胞腫；癌肉腫；間葉細胞腫（悪性）；ブレンナー腫瘍（悪性）；仮葉腫瘍（悪性）；滑膜肉腫；中皮腫（悪性）；未分化胚細胞腫；胎児性癌；奇形腫（悪性）；卵巣甲状腺腫（悪性）；絨毛癌；中腎腫（悪性）；血管肉腫；血管内皮腫（悪性）；カポジ肉腫；血管周囲細胞腫（悪性）；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫；軟骨芽細胞腫（悪性）；間葉軟骨肉腫；骨巨細胞腫；ユーイング肉腫；歯原性腫瘍（悪性）；エナメル芽細胞歯肉腫；エナメル上皮腫（悪性）；エナメル芽細胞線維肉腫；松果体腫（悪性）；脊索腫；膠腫（悪性）；脳室上衣腫；星状膠細胞腫；原形質性星状細胞腫；線維性星細胞腫；神経膠星状芽細胞腫；膠芽腫；乏突起膠腫；乏突起神経膠芽細胞腫；原始神経外胚葉腫瘍；小脳肉腫；神経節芽細胞腫；神経芽細胞腫；網膜芽細胞腫；嗅神経原性腫瘍；髄膜腫（悪性）；神経線維肉腫；神経鞘腫（悪性）；顆粒細胞腫（悪性）；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキン側肉芽腫（ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ；ｐａｒａｇｒａｎｕｌｏｍａ）；小リンパ性悪性リンパ腫；びまん性大型細胞悪性リンパ腫；濾胞性悪性リンパ腫；菌状息肉症；明記した他の非ホジキンリンパ腫；悪性組織球症；多発性骨髄腫；肥満細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ系白血病；形質細胞性白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；肥満細胞性白血病；巨核芽球性白血病；骨髄性肉腫；及び毛様細胞性白血病。
【００６７】
キヌレニナーゼは本明細書において、腫瘍組織からのキヌレニン及び／もしくは３’−ヒドロキシ−キヌレニンの枯渇、もしくは癌を患う哺乳類の血液循環のため、または、枯渇が望ましいと考えられる場合にキヌレニンを枯渇させるための種々の様式における抗癌剤として使用してよい。
【００６８】
枯渇は、哺乳類の血液循環内のｉｎ  ｖｉｖｏ、組織培養液または他の生物学的培地でのキヌレニン及び３’−ヒドロキシ−キヌレニンの枯渇が望まれる場合のｉｎ  ｖｉｔｒｏ、及び、生物学的流体、細胞、または組織が体外で操作され、続いて哺乳類の患者の体内に戻されるｅｘ  ｖｉｖｏ操作にて実施することができる。血液循環、培養培地、生物学的流体、または細胞からキヌレニンを枯渇させることにより、治療される物質に到達可能なキヌレニンの量が低下し、それ故、この操作は、接触させている物質にて周囲にあるキヌレニンを分解するためのキヌレニンを枯渇させる条件下において、キヌレニンを枯渇させる量のキヌレニナーゼを、物質と接触させることを含む。
【００６９】
枯渇は、細胞用の栄養源に向けられてよく、必ずしも細胞そのものに向けられる必要はない。したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏ用途において、腫瘍細胞を治療することは、腫瘍細胞の集団のための栄養媒体をキヌレニナーゼと接触させることを含む。本実施形態において、媒体は血液、リンパ液、脊髄液、及びキヌレニンの枯渇が望まれる類似の体液である。
【００７０】
キヌレニン、及び３’−ヒドロキシ−キヌレニンを枯渇させる効果は用途に応じて広範囲にわたり変更することができ、通常、物質内に存在するキヌレニンの量、所望の枯渇速度、及びキヌレニナーゼに曝される物質の耐性に応じて変化する。物質内でのキヌレニン及びキヌレニン代謝産物の量、またそれ故、物質からのキヌレニン及びキヌレニン代謝産物の枯渇速度は、当該技術分野において周知の種々の化学的及び生化学的手法により速やかに監視されることができる。キヌレニンを枯渇させる例示的な量は本明細書で更に説明され、治療される物質１ミリリットル（ｍＬ）当たりのキヌレニナーゼは、０．００１〜１００ユニット（Ｕ)、好ましくは約０．０１〜１０Ｕ、より好ましくは約０．１〜５Ｕの範囲であり得る。典型的な投与量は体重に基づいて投与され得、その範囲は、約５〜１０００Ｕ／キログラム（ｋｇ）／日、好ましくは約５〜１００Ｕ／ｋｇ／日、より好ましくは約１０〜５０Ｕ／ｋｇ／日、及びより好ましくは約２０〜４０Ｕ／ｋｇ／日である。
【００７１】
キヌレニンを枯渇させる条件は、キヌレニナーゼの生物活性に適合する緩衝液及び温度条件であり、適度な温度、塩、及び酵素と適合するｐＨ条件（例えば生理学的条件）が挙げられる。例示的条件としては、約４〜４０℃、約０．０５〜０．２ＭのＮａＣｌに等しいイオン強度、及び約５〜９のｐＨが挙げられるが、生理学的条件も含まれる。
【００７２】
特定の実施形態では、本発明は、キヌレニナーゼを抗癌剤として使用する方法を想到し、それ故、腫瘍細胞を阻害するのに十分な時間、腫瘍細胞の集団を治療に有効な量のキヌレニナーゼと接触させることを含む。
【００７３】
一実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏでの接触は、静脈内、腹腔内、または腫瘍内注射により、本発明のキヌレニナーゼを含む、治療に有効な量の生理学的に許容される組成物を患者に投与することにより、患者内の腫瘍細胞のキヌレニン源を枯渇させることで達成される。
【００７４】
治療に有効な量のキヌレニナーゼは、所望の効果、即ち、腫瘍組織または患者の血液循環中のキヌレニンを枯渇させることにより、腫瘍を除去するプロ炎症性応答を仲介させることを達成するために計算された所定の量である。したがって、本発明のキヌレニナーゼの投与のための用量範囲は、腫瘍細胞の分裂及び細胞周期の症状が減少する所望の効果を生み出すのに十分大きな範囲である。用量は、過粘稠度症候群、肺水腫、うっ血性心不全、神経学的効果等の副作用を引き起こすほど大きなものであってはならない。通常、用量は、患者の年齢、状態、性別、及び病気の程度により変化し、当業者により決定することができる。合併症の場合、用量は個々の医師により調節することが可能である。
【００７５】
キヌレニナーゼは注射、または時間の経過とともに徐々に注入することにより非経口投与されることができる。キヌレニナーゼは静脈内、腹腔内、経口、筋肉内、皮下、膣内、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌｌｙ）、経皮（ｄｅｒｍａｌｌｙ）投与することができるか、蠕動的方法により送達することができるか、腫瘍細胞を含有する組織内に直接注射することができるか、またはキヌレニンに対する潜在的な生体内感知装置を含有するカテーテルに接続したポンプにより投与されることができる。
【００７６】
キヌレニナーゼを含有する治療用組成物は例えば、１回用量を注射することにより従来的に静脈内投与される。用語「１回用量」とは、治療用組成物に関して使用する場合、対象にとって一体型用量として好適な物理的に個別の単位であって、各単位が、必要な希釈剤、即ち担体またはビヒクルと共同で所望の治療効果をもたらすように計算された、所定の量の活性物質を含有する単位を意味する。
【００７７】
組成物は、剤形に適合した方法で、治療に有効な量が投与される。投与される量は、治療される対象、活性成分を利用する対象の系の能力、及び所望の治療効果の程度に依存する。投与されるのに必要な活性成分の正確な量は、施術者の判断に応じて変わり、各個体で固有である。しかし、全身適用のための好適な用量範囲が本明細書にて開示され、この範囲は投与経路に応じて変化する。初期投与及び追加投与に好適なレジメンもまた想到され、これらは初期投与、続いて後続の注射または他の投与により１時間以上の間隔で繰り返される反復投薬により典型的に表される。例示的な複数の投与が本明細書で記載され、これらは特に、キヌレニナーゼの血清での濃度及び組織での濃度を持続的に高く維持し、キヌレニンの血清及び組織での濃度を逆に低く維持するのが好ましい。あるいは、ｉｎ  ｖｉｖｏ治療用に指定した範囲に血液内での濃度を十分に維持するための連続的静脈内注射が想到される。
【００７８】
ＩＶ．コンジュゲート
本発明の組成物及び方法は、例えば、異種ペプチド断片またはポリマー（例えばポリエチレングリコール）とコンジュゲートを形成することによる改変型キヌレニナーゼを伴う。更なる態様において、キヌレニナーゼをＰＥＧに結合させ、酵素の流体力学的半径を増加させることにより血清耐性を増加させることができる。ある種の態様において、開示したポリペプチドは、腫瘍細胞の外部受容体または結合部位に特異的に、かつ安定して結合する能力を有するリガンド等の任意の標的化作用物質（米国特許公報第２００９／０３０４６６６号）にコンジュゲートしてよい。
【００７９】
Ａ．融合タンパク質
本発明のある種の実施形態は、融合タンパク質に関する。これらの分子は、ＮまたはＣ末端にて異種ドメインに結合した、天然型または改変型のキヌレニナーゼを有してよい。例えば、融合には他の種からのリーダー配列もまた用いて、異種宿主におけるタンパク質の組み換え発現を可能にしてもよい。別の有用な融合としては、タンパク質親和性タグ（例えば血清アルブミン親和性タグもしくは６個のヒスチジン残基）、または、好ましくは切断可能であり、融合タンパク質の精製を促進する免疫活性ドメイン（例えば抗体エピトープ）の付加が挙げられる。非限定的な親和性タグとしては、ポリヒスチジン、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、及びグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）が挙げられる。
【００８０】
特定の実施形態では、  キヌレニナーゼは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を増大させるペプチド、例えばＸＴＥＮポリペプチド（Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、アルブミン、またはアルブミン結合ペプチドに結合してよい。
【００８１】
融合タンパク質を生成する方法は、当業者には周知である。かかるタンパク質は、例えば、完全な融合タンパク質の新規合成により、または、異種ドメインをコードするＤＮＡ配列の結合に続く、インタクトな融合タンパク質の発現により、作製することができる。
【００８２】
親タンパク質の機能活性を回復させる融合タンパク質の作製は、一列に接続したポリペプチドの間でスプライシングされたペプチドリンカーをコードする架橋ＤＮＡセグメントに遺伝子を接続することにより促進され得る。リンカーは、得られる融合タンパク質の適切な折り畳みを可能にするのに十分な長さである。
【００８３】
Ｂ．リンカー
ある種の実施形態において、キヌレニナーゼは、二官能性架橋試薬を用いて化学的にコンジュゲートされるか、またはペプチドリンカーによりタンパク質レベルで融合されてよい。
【００８４】
二官能性架橋試薬は、親和性マトリクスの調製、多様な構築物の改変及び安定化、リガンド及び受容体結合部位の識別、並びに構造研究等の種々の目的で幅広く用いられている。好適なペプチドリンカー（例えばＧｌｙ−Ｓｅｒリンカー）はまた、キヌレニナーゼを結合させるために使用してもよい。
【００８５】
２つの同一の官能基を有するホモ二官能性試薬は、同一及び異なる巨大分子または巨大分子のサブユニット間での架橋の誘発、並びに、ポリペプチドリガンドをその特異的結合部位に結合させることにおいて非常に効率的であることが証明された。ヘテロ二官能性試薬は、２つの異なる官能基を含有する。２つの異なる官能基の異なる反応性を利用することにより、架橋を選択的かつ逐次的の両方で調節可能である。二官能性架橋試薬は、その官能基（例えばアミノ、スルフヒドリル、グアニジン、インドール、カルボキシル特異的基）の特異性に従い分けることができる。これらのうち、遊離アミノ基に働きかける試薬は、その商業的入手可能性、合成の容易性、及び適用される穏やかな反応条件のために特に普及している。
【００８６】
ヘテロ二官能性架橋試薬の大部分は、第一級アミン反応性基及びチオール反応性基を含有する。別の例において、ヘテロ二官能性架橋試薬、及び当該架橋試薬の使用方法が記載されている（米国特許第５，８８９，１５５号、特異的にその全体が本明細書に参照として組み込まれる）。当該架橋試薬は、求核性ヒドラジド残基を求電子性マレイミド残基と組み合わせることで、例えばアルデヒドを遊離チオールに結合させることができる。当該架橋試薬は、種々の官能基を架橋するように改変され得る。
【００８７】
更に、当業者に既知の任意の他の結合／カップリング剤、及び／またはメカニズム、例えば、抗体−抗原相互作用、アビジンビオチン結合、アミド結合、エステル結合、チオエステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、リン酸エステル結合、ホスホラミド結合、無水物結合、ジスルフィド結合、イオン及び疎水性相互作用、二重特異性抗体及び抗体断片、またはこれらの組み合わせを使用して、キヌレニナーゼを結合させてよい。
【００８８】
血液中にて合理的な安定性を有する架橋剤を使用することが好ましい。標的化剤、及び治療／予防剤をコンジュゲートするのに首尾よく使用可能な、様々な種類のジスルフィド結合を含有するリンカーが知られている。立体障害のあるジスルフィド結合を含有するリンカーは、ｉｎ  ｖｉｖｏにてより大きな安定性を付与することが証明され得る。これらのリンカーはしたがって、結合剤の１グループである。
【００８９】
立体障害を有する架橋剤に加えて、立体障害のないリンカーもまた、本明細書においては使用可能である。保護されたジスルフィドを含有するかまたは生成することが考慮されない他の有用な架橋剤としては、ＳＡＴＡ、ＳＰＤＰ、及び２−イミノチオラン（Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ  ａｎｄ  Ｔｈｏｒｐｅ，１９８７）が挙げられる。かかる架橋剤の使用は、当該技術分野において十分に理解されている。別の実施形態は、柔軟なリンカーの使用に関する。
【００９０】
化学的にコンジュゲートされると、ペプチドは一般に精製され、コンジュゲートを非コンジュゲート剤及び他の夾雑物と分離する。化学的に有用とするためにコンジュゲートに十分な純度を付与して使用するために、多数の精製技術が利用可能である。
【００９１】
ゲル濾過、ゲル浸透、または高速液体クロマトグラフィー等のサイズ分離に基づく精製方法が、通常最も有用である。ブルーセファロース分離等の他のクロマトグラフィー技術もまた、使用してよい。Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム（ＳＬＳ）等の弱い界面活性剤を使用するような、封入体から融合タンパク質を精製する従来の方法が有用であり得る。
【００９２】
Ｃ．ＰＥＧ化
ある種の本発明の態様において、キヌレニナーゼのＰＥＧ化に関係する方法及び組成物が開示される。例えば、本明細書で開示される方法に従いキヌレニナーゼがＰＥＧ化されてよい。
【００９３】
ＰＥＧ化は、ポリ（エチレングリコール）ポリマー鎖を他の分子、通常は薬剤または治療用タンパク質に共有結合させるプロセスである。ＰＥＧ化は、標的巨大分子とＰＥＧの反応性誘導体のインキュベーションによりルーチン的に達成される。ＰＥＧを薬剤または治療用タンパク質に共有結合することにより、宿主免疫系から作用物質を「マスク」する（免疫原性及び抗原性が低下）ことができるか、または作用物質の流体力学的サイズ（溶液中でのサイズ）を増加させて、腎クリアランスを低下させることにより循環時間を延ばすことができる。ＰＥＧ化はまた、疎水性の薬剤及びタンパク質に水溶性を付与することもできる。
【００９４】
ＰＥＧ化の第１工程は、ＰＥＧポリマーの一端または両端を好適に官能基化することである。各末端が同じ反応性部位で活性化されたＰＥＧは「ホモ二官能性」として知られる一方、存在する官能基が異なる場合、ＰＥＧ誘導体は「ヘテロ二官能性」または「ヘテロ官能性」と呼ばれる。ＰＥＧポリマーの化学的に活性な、または活性化された誘導体は、ＰＥＧに所望の分子を付加して調製される。
【００９５】
ＰＥＧ誘導体での好適な官能基の選択は、ＰＥＧに結合する分子において利用可能な反応性基の種類に基づく。タンパク質に関して、典型的な反応性アミノ酸としては、リジン、システイン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、及びチロシンが挙げられる。Ｎ末端アミノ基及びＣ末端カルボン酸もまた使用可能である。
【００９６】
第１世代のＰＥＧ誘導体の形成に使用する技術は通常、ＰＥＧポリマーをヒドロキシル基、通常は無水物、酸塩化物、クロロホルメート、及び炭酸塩と反応する群である。第２世代のＰＥＧ化化学作用においては、より効率的な官能基、例えばアルデヒド、エステル、アミド等がコンジュゲーションに利用可能となる。
【００９７】
ＰＥＧ化の用途はより一層発達し洗練されているため、コンジュゲーション用のヘテロ二官能性ＰＥＧの必要性が増加している。親水性で柔軟、かつ生体適合性のスペーサーが必要とされる場合において、これらのヘテロ二官能性ＰＥＧは２つの構成要素を結合するのに非常に有用である。ヘテロ二官能性ＰＥＧのための好ましい末端基は、マレイミド、ビニルスルホン、ピリジルジスルフィド、アミン、カルボン酸、及びＮＨＳエステルである。
【００９８】
最も一般的な修飾剤またはリンカーは、メトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）分子に基づく。これらの活性は、アルコール末端へのタンパク質修飾基の付加に依存する。場合によっては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧジオール）を前駆体分子として使用する。ジオールはその後、ヘテロまたはホモ二量体ＰＥＧ結合分子を作製するために、両端が修飾される。
【００９９】
タンパク質は通常、非プロトン化チオール（システイニル残基）またはアミノ基等の求核性部位にてＰＥＧ化される。システイニル特異的修飾剤の例としては、ＰＥＧマレイミド、ＰＥＧヨードアセテート、ＰＥＧチオール、及びＰＥＧビニルスルホンが挙げられる。４種類は全て、穏やかな条件下にて強力にシステイニル特異的であり、わずかにアルカリｐＨである中性だが、それぞれいくつかの欠点がある。マレイミドと共に形成されるチオエーテルはアルカリ条件下にて幾分不安定となり得るため、このリンカーを用いた製剤の選択肢にいくつか制限が生じ得る。ヨードＰＥＧと共に形成されるカルバモチオエート結合はより安定しているが、遊離ヨウ素が条件によってはチロシン残基を修飾する可能性がある。ＰＥＧチオール類はタンパク質チオールと共にジスルフィド結合を形成するが、この結合もまた、アルカリ条件下にて不安定となる可能性がある。ＰＥＧビニルスルホン反応性はマレイミド及びヨードＰＥＧと比較して遅いものの、形成されるチオエーテル結合は非常に安定している。より遅い反応速度はまた、ＰＥＧ−ビニルスルホン反応をより簡単に調節することも可能になる。
【０１００】
天然システイニル残基における部位特異的ＰＥＧ化は、これらの残基が通常、ジスルフィド結合の形態をとっているか、または生物活性のために必要とされるため、滅多に行われない。他方、部位特異的変異誘発を使用して、システイニルＰＥＧ化部位をチオール特異的リンカーに組み込むことができる。システイン変異は、ＰＥＧ化試薬に接近可能となりながら、ＰＥＧ化の後で依然として生物学的に活性であるように設計されなければならない。
【０１０１】
アミン特異的修飾試薬としては、ＰＥＧ  ＮＨＳエステル、ＰＥＧトレシレート、ＰＥＧアルデヒド、ＰＥＧイソチオシアネート、及び他のいくつかのものが挙げられる。全てが穏やかな条件にて反応し、アミノ基に対して非常に特異的である。ＰＥＧ  ＮＨＳエステルは恐らく、より反応性の高い作用物質の１つであるが、その高反応性のために、規模が大きくなるとＰＥＧ化反応の調節が難しくなる可能性がある。ＰＥＧアルデヒドはアミノ基と共にイミンを形成し、これが次に、シアノ水素化ホウ素ナトリウムにより二級アミンに還元される。ホウ化水素ナトリウムとは異なり、シアノ水素化ホウ素ナトリウムはジスルフィド結合を還元しない。しかし、この化学物質は非常に有毒性であり、揮発性となる低ｐＨにおいては特に、注意深く取り扱われなければならない。
【０１０２】
大部分のタンパク質上にある複数のリジン残基のために、部位特異的ＰＥＧ化は困難な可能性がある。幸運なことに、これらの試薬は非プロトン化アミノ基と反応するため、低ｐＨにて反応を実施することにより、より低いｐＫのアミノ酸にＰＥＧ化を行うことが可能である。通常、αアミノ基のｐＫは、リジン残基のεアミノ基よりも１〜２ｐＨ単位低い。分子をｐＨ７以下でＰＥＧ化することにより、Ｎ末端に対する高い選択性を頻繁に得ることができる。しかしこのことは、タンパク質のＮ末端部分が生物活性には必要ない場合にのみ実行できる。また、ＰＥＧ化による薬物動態学的利点は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生物活性の著しい喪失を上回り、ＰＥＧ化の化学的作用に関係なく、ｉｎ  ｖｉｖｏでの生物活性がより大きい生成物が得られる。
【０１０３】
ＰＥＧ化の手順を開発する際に考慮するパラメータがいくつか存在する。幸運なことに、鍵となるパラメータは通常、４つまたは５つ以下である。ＰＥＧ化条件を最適化するための「実験設計」アプローチが非常に有用である。チオール特異的ＰＥＧ化反応に関して、考慮するパラメータとしては、タンパク質濃度、タンパク質に対するＰＥＧの比率（モル基準）、温度、ｐＨ、反応時間、及び場合によっては、酸素の除外が挙げられる。（酸素は、タンパク質による分子内でのジスルフィド形成に関与する可能性があり、これによりＰＥＧ化生成物の収率が低下する。）特にＮ末端アミノ基を標的化する場合にｐＨがより一層重要となり得ることを除いて、アミン特異的修飾についても（酸素の除外を合わせて）同じ因子が考慮されなければならない。
【０１０４】
アミン及びチオール特異的修飾の両方に関して、反応条件はタンパク質の安定性に影響を及ぼし得る。この影響は、温度、タンパク質濃度、及びｐＨを限定し得る。更に、ＰＥＧリンカーの反応性は、ＰＥＧ化反応を開始する前に知られなければならない。例えば、ＰＥＧ化剤が７０％しか活性でない場合、使用するＰＥＧの量は、活性ＰＥＧ分子のみのタンパク質−ＰＥＧ反応化学量論で確実に考慮されなければならない。
【０１０５】
Ｖ．タンパク質及びペプチド
ある種の実施形態において、本発明は、少なくとも１つのタンパク質またはペプチド、例えばキヌレニナーゼを含む新規組成物に関する。これらのペプチドは、融合タンパク質に含まれるか、または上述の作用物質にコンジュゲートされてよい。
【０１０６】
本明細書で使用する場合、タンパク質またはペプチドは一般に、遺伝子から翻訳された完全長配列までの、約２００個のアミノ酸より大きいタンパク質；約１００個のアミノ酸より大きいポリペプチド；及び／または約３〜約１００個のアミノ酸のペプチドを意味するが、これらに限定されない。便宜上、用語「タンパク質」「ポリペプチド」及び「ペプチド」は、本明細書では互換的に用いられる。
【０１０７】
本明細書で使用する場合、「アミノ酸残基」とは、任意の天然型アミノ酸、任意のアミノ酸誘導体、または当該技術分野において公知の任意のアミノ酸模倣物を意味する。ある種の実施形態において、アミノ酸残基の配列を中断するいかなる非アミノ酸が存在することなく、タンパク質またはペプチドの残基は連続している。別の実施形態において、配列は１つ以上の非アミノ酸部位を含んでよい。特定の実施形態では、タンパク質またはペプチドの残基の配列は、１つ以上の非アミノ酸部位により中断されてよい。
【０１０８】
したがって、用語「タンパク質またはペプチド」は、天然型タンパク質に見出される２０個の共通のアミノ酸の少なくとも１つ、または、少なくとも１つの修飾アミノ酸もしくは異常アミノ酸を含むアミノ酸配列を包含する。
【０１０９】
タンパク質またはペプチドは、標準的な分子生物学的技術による、タンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドの発現、天然源からのタンパク質もしくはペプチドの単離、または、タンパク質もしくはペプチドの化学合成等の、当業者に既知の任意の技術により作製されてよい。種々の遺伝子に対応するヌクレオチド及びタンパク質、ポリペプチド、並びにペプチド配列が以前に開示されており、当業者に既知のコンピュータ化されたデータベースにて発見され得る。かかる１つのデータベースは、国立生物工学情報センターのＧｅｎｂａｎｋ及びＧｅｎＰｅｐｔデータベース（ワールドワイドウェブのｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／で利用可能）である。既知の遺伝子に対するコード領域は、本明細書にて開示された、または当業者に既知の技術を使用して増幅及び／または発現してよい。あるいは、タンパク質、ポリペプチド、及びペプチドの種々の商業的調製物が当業者に既知である。
【０１１０】
ＶＩ．核酸及びベクター
ある種の本発明の態様において、キヌレニナーゼをコードする核酸配列またはキヌレニナーゼを含有する融合タンパク質が開示され得る。どの発現系を使用するかに応じて、従来の方法に基づいて核酸配列を選択することができる。例えば、キヌレニナーゼがヒトキヌレニナーゼに由来し、Ｅ．  ｃｏｌｉでは滅多に利用されない複数のコドンを含有する場合、このキヌレニナーゼは発現を妨げ得る。したがって、対応する遺伝子またはその変異体は、Ｅ．  ｃｏｌｉの発現に最適化されたコドンであってよい。種々のベクターもまた、対象のタンパク質を発現させるために使用してよい。例示的なベクターとしては、プラスミドベクター、ウイルスベクター、トランスポゾン、またはリポソーム系ベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１１】
ＶＩＩ．宿主細胞
宿主細胞は、キヌレニナーゼとそのコンジュゲートの発現及び分泌を可能にするよう形質転換され得る任意の宿主細胞であってよい。宿主細胞は、細菌、哺乳類細胞、酵母菌、または糸状菌であってよい。種々の細菌としては、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属及びバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属が挙げられる。サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クルイベロミセス（Ｋｉｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属またはピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属に所属する酵母菌は、適切な宿主細胞としての使用が見出される。以下の属：アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）、アクリャ（Ａｃｈｌｙａ）、ポドスポラ（Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ）、エンドチア（Ｅｎｄｏｔｈｉａ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、コクリオボルス（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ）、及びピリキュラリア（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ）を含む種々の種の糸状菌が、発現細胞として使用されてよい。  
【０１１２】
利用可能な宿主生物の例としては、細菌、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＭＣ１０６１、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＲＢ１の誘導体（Ｓｉｂａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）ＳＡＩ１２３（Ｌｏｒｄａｎｅｓｃｕ，１９７５）またはストレプトコッカス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）（Ｈｏｐｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）；酵母菌、例えばサッカロミセス・セレビシエＡＨ２２（Ｍｅｌｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３）またはシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）；及び糸状菌、例えばアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）（Ｗａｒｄ，１９８９）、またはトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）（Ｐｅｎｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７；Ｈａｒｋｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）が挙げられる。
【０１１３】
哺乳類宿主細胞の例としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１）、ラット下垂体細胞（ＧＨ１；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ８２）、ＨｅＬａ  Ｓ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２．２）、ラット肝癌細胞（Ｈ−４−ＩＩ−Ｅ；ＡＴＣＣＣＲＬ  １５４８）、ＳＶ４０形質転換サル腎臓細胞（ＣＯＳ−１；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５０）、及びマウス胚細胞（ＮＩＨ−３Ｔ３；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５８）が挙げられる。前述は例示的なものであり、当該技術分野において公知の可能性のある多くの宿主生物を限定するものではない。原則として、分泌を行うことが可能な全ての宿主を、原核生物か真核生物かに関わらず使用することができる。
【０１１４】
キヌレニナーゼ及び／またはその融合タンパク質を発現する哺乳類の宿主細胞を、通常は親細胞株を培養するために使用する条件下にて培養する。通常、典型的にはウシ胎児血清等の５％〜１０％血清を補充した、標準的なＲＰＭＩ、ＭＥＭ、ＩＭＥＭ、またはＤＭＥＭ等の生理学的塩及び栄養素を含有する標準的な培地で細胞を培養する。培養条件もまた標準的であり、例えば、所望の水準のタンパク質が得られるまで、静止またはローラー培養器にて培養液を３７℃でインキュベーションする。
【０１１５】
ＶＩＩＩ．タンパク質の精製
タンパク質の精製技術は当業者には周知である。これらの技術は、あるレベルで、細胞、組織、または器官の、ポリペプチド及び非ポリペプチド画分への均質化及び粗分画を伴う。別に明記されない限り、対象のタンパク質またはポリペプチドを更に、クロマトグラフィー及び電気泳動を使用して精製し、部分的または完全な精製（または精製による均質化）を達成してよい。純粋なペプチドの調製に特に適した分析方法は、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル排除クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、アフィニティクロマトグラフィー、イムノアフィニティークロマトグラフィー、及び等電点電気泳動である。特に効率的なペプチドの精製方法は、高速液体クロマトグラフィー（ｆａｓｔ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（ＦＰＬＣ）、あるいは高性能液体クロマトグラフィー（ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（ＨＰＬＣ）である。
【０１１６】
精製したタンパク質またはペプチドは、その他の構成成分から単離可能な組成物を意味することが意図される。タンパク質またはペプチドは、自然で入手可能な状態と比較して少しでも精製されている。単離した、または精製したタンパク質またはペプチドはそれ故、自然に生じ得る環境にはないタンパク質またはペプチドもまた意味する。通常、「精製した」とは、分画化を行い種々の他の構成要素を取り除いたタンパク質またはペプチド組成物であって、この組成物が実質的に、発現する生物活性を維持している組成物を意味する。用語「実質的に精製した」が用いられる場合、この呼称は、タンパク質またはペプチドが、組成物中のタンパク質の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、またはそれ以上を構成するように、組成物の主要構成成分を形成する組成物を意味する。
【０１１７】
タンパク質精製での使用に好適な各種技術は、当業者には周知である。これらとしては、例えば、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体等による沈殿、または熱変性、それに続く遠心分離；イオン交換、ゲル濾過、逆相、ヒドロキシアパタイト、及びアフィニティクロマトグラフィー等のクロマトグラフィー工程；等電点電気泳動；ゲル電気泳動；並びに、これら及び他の技術の組み合わせが挙げられる。当該技術分野において一般に公知であるように、種々の精製工程の実施順序は変更可能であるか、または、特定の工程を省略してよく、依然として、実質的に精製したタンパク質またはペプチドの調製に好適な方法が得られると考えられている。
【０１１８】
タンパク質またはペプチドの精製の度合いを定量化する各種方法が、本開示の見地から当業者に知られている。これらとしては、例えば、活性な画分の特異的活性を測定すること、または、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析により画分内でのポリペプチドの量を評価することが挙げられる。画分の純度を評価するための好ましい方法は、画分の特異的活性を計算し、初期抽出物の特異的活性と比較することにより、「〜倍の精製数」による評価される画分の純度を計算することである。活性の量を表すのに使用される実際の単位はもちろん、精製の後に行うのに選択される特定のアッセイ技術に依存し、発現したタンパク質またはペプチドが検出可能な活性を示すか否かは関係ない。
【０１１９】
タンパク質またはペプチドが常に最も精製された状態で提供されるという一般的な必要条件は存在しない。実際、実質的により精製されていない生成物が、ある種の実施形態においては活用され得ることが想到される。部分精製は、組み合わせたより少ない精製工程を用いることにより、または、一般的な同じ精製スキームの異なる形態を利用することにより達成される。例えば、ＨＰＬＣ装置を利用して実施する陽イオン交換カラムクロマトグラフィーは通常、低圧クロマトグラフィーシステムを利用する同じ技術よりも一層「〜倍」高い精製を一般にもたらすと理解されている。相対的に精製の低さを示す方法は、タンパク質生成物の全体での回収、または発現したタンパク質の活性を維持する点において利点を有する。
【０１２０】
特定の実施形態において、タンパク質またはペプチドは単離または精製されてよく、例えばキヌレニナーゼ、キヌレニナーゼを含有する融合タンパク質、またはＰＥＧ化後の改変型キヌレニナーゼであってよい。例えば、Ｈｉｓタグまたは親和性エピトープは、精製を容易にするためにかかるキヌレニナーゼを含んでよい。親和性クロマトグラフィーは、単離される基質と、基質に特異的に結合することができる分子との特異的親和性に依存するクロマトグラフィー手順である。これは受容体−リガンドタイプの相互作用である。カラム材料は、結合パートナーの１つを不溶性マトリックスに共有結合させることにより合成される。次に、カラム材料は溶液から物質を特異的に吸着することが可能となる。結合が生じない条件（例えばｐＨの変更、イオン強度、温度等）へ条件を変化させることにより溶出が生じる。マトリックスは、分子をいかなる著しい量でも吸着せず、幅広い化学的、物理的、及び熱安定性を有する物質でなければならない。リガンドは、結合特性に影響を与えないような方法で結合されなければならない。リガンドはまた、比較的強力な結合をもたらさなければならない。サンプルまたはリガンドを破壊することなく物質を溶出することが可能でなければならない。
【０１２１】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、溶液中の分子がそのサイズ、または、より専門用語では流体力学的体積に基づいて分離されるクロマトグラフ法である。この方法は通常、タンパク質及び工業用ポリマー等の大型分子または巨大分子複合体に適用される。通常、カラムを通してサンプルを輸送するのに水溶液を使用する場合、技術はゲル濾過クロマトグラフィーとして知られ、一方で、名称ゲル透過クロマトグラフィーは、有機溶媒を移動相として使用する場合に用いられる。
【０１２２】
ＳＥＣの基本原理は、異なるサイズの粒子が異なる速度で固定相を通過して溶出（濾過）されるというものである。これにより、サイズに基づいた粒子溶液の分離がもたらされる。粒子全てが同時に、またはほぼ同時にロードされるとすると、同じサイズの粒子は一緒に溶出するはずである。各サイズ排除カラムは、分離可能な分子量の範囲を有する。排除限界は、この範囲の上限における分子量を規定し、この上限は、分子が大きすぎて固定相にトラップされるものである。浸透限界は、分離範囲の下限における分子量を規定し、この下限は、十分に小さいサイズの分子が固定相の孔を完全に通過することができ、この分子量以下の分子全てが小さいため単一バントとして溶出するものである。
【０１２３】
高性能液体クロマトグラフィー（または高圧液体クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ）は、化合物を分離、識別、及び定量化するための、生化学及び分析化学で頻繁に使用されるカラムクロマトグラフィーの一形態である。ＨＰＬＣは、クロマトグラフ用担持材料（固定相）を有するカラム、カラムを通して移動相（複数可）を移動させるポンプ、及び分子の保持時間を示す検出器を利用する。保持時間は、固定相間の相互作用、分析される分子、及び使用する溶媒（複数可）に応じて変化する。
【０１２４】
ＩＸ．医薬組成物
新規のキヌレニナーゼは、腫瘍細胞の増殖を阻害するため、そしてより好ましくは、局所的に進行した、または転移性癌を患う癌患者における癌細胞を殺傷するために、全身的に、または局所的に投与することができると想到されている。これらは静脈内、髄腔内、及び／または腹腔内投与することができる。これらは単独で、または抗増殖剤と共に投与することができる。一実施形態では、これらは手術、または他の手技の前に、患者の癌の負荷を減らすために投与される。あるいは、これらを手術後に投与して、残っていたいかなる癌（例えば、手術で駆除できなかった癌）も生存していないことを確実にすることができる。
【０１２５】
これは、本発明は治療用調製物の特定の性質により限定されることを意味するものではない。例えば、かかる組成物は、生理学的に許容される液体、ゲル、または固体担体、希釈剤、及び賦形剤を共に有する製剤で提供することができる。これらの治療用調製物は、獣医学的用途のために、家畜等の哺乳類に、そして、他の治療薬と類似の方法で、臨床的用途のためにヒトに投与することができる。一般に、治療効果のために必要な用量は、使用及び投与方法の種類、並びに、個々の対象にとっての特定の必要条件に従って変化する。
【０１２６】
かかる組成物は、溶液または懸濁液、そして注射液として通常は調製される。好適な希釈剤及び賦形剤は例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール等、及びこれらの組み合わせである。更に、所望する場合、組成物は、少量の補助物質、例えば湿潤剤もしくは乳化剤、安定化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有してよい。
【０１２７】
臨床的用途が想到される場合、タンパク質、抗体、及び目的の用途に適切な形態の作用物質を含む医薬組成物を調製する必要が生じ得る。通常、医薬組成物は、製薬上許容できる担体中に溶解または分散した、有効量の１つ以上のキヌレニナーゼまたは追加の作用物質を含んでよい。語句「薬学的または薬理学的に許容される」とは、動物、例えばヒトに適切に投与された場合に、有害反応、アレルギー反応、または他の副作用を生み出さない分子単位及び組成物を意味する。本明細書にて開示した方法で単離した少なくとも１つのキヌレニナーゼ（ｋｙｕｒｅｎｉｎａｓｅ）、または追加の活性成分を含有する医薬組成物の調製は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．，１９９０（参考として本明細書に組み込まれている）に例示されているように、本開示の観点から当業者に既知である。更に、動物（例えばヒト）への投与については、調製物は、ＦＤＡのＯｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄにより必要とされる無菌性、発熱原性、一般の安全性、及び純度基準を満たさなければならないと理解されよう。
【０１２８】
本明細書で使用する場合、「製薬上許容できる担体」としては、当業者に既知の全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（例えば、抗菌物質、抗カビ剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、防腐剤、薬剤、薬剤安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香料、染料、かかる類似の材料及びこれらの組み合わせが挙げられる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．，１９９０を参照のこと：参考として本明細書に組み込まれている）。任意の従来の担体が活性成分と非相溶性である場合を除き、医薬組成物での使用が想到される。
【０１２９】
本発明のある種の実施形態は、固体、液体、またはエアゾール形態で投与されるか、そして、注射等の投与経路のために滅菌される必要があるかに応じて、異なる種類の担体を含んでよい。組成物は、吸入（例えばエアゾール吸入）により、注射により、注入により、連続注入により、標的細胞を直接浸す局所潅流（ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｂａｔｈｉｎｇ  ｔａｒｇｅｔ  ｃｅｌｌｓ  ｄｉｒｅｃｔｌｙ）、カテーテルにより、潅注により、脂質組成物（例えばリポソーム）内で、もしくはその他の方法によって、または当業者に既知の前述の方法の任意の組み合わせにより、静脈内、皮内、経皮、髄腔内、動脈内、腹腔内、鼻孔内、腟内、直腸内、筋肉内、皮下、粘膜、経口、局所（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）、局所（ｌｏｃａｌｌｙ）投与されることができる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．，１９９０を参照のこと：参考として本明細書に組み込まれている）。
【０１３０】
改変ポリペプチドは遊離塩基、中性、または塩形態の組成物中に配合されてよい。製薬上許容できる塩としては、酸付加塩、例えば、タンパク様組成物の遊離アミノ基と共に形成されたもの、または、無機酸と共に形成されたもの（例えば、塩酸もしくはリン酸）、または有機酸（例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、もしくはマンデル酸）が挙げられる。遊離カルボキシル基と共に形成された塩もまた、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、もしくは水酸化第二鉄等の無機塩基、またはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、もしくはプロカイン等の有機塩基に由来することができる。配合の際に、溶液は製剤と適合性がある方法で、かつ治療的に有効な量で投与される。製剤は、非経口的投与のために配合されたもの等、例えば注射可能な溶液、もしくは肺へ送達するためのエアゾール、または食事投与のために配合されたもの、例えば薬物放出性カプセル等、種々の投薬形態で容易に投与される。
【０１３１】
更に、本発明のある種の態様に従うと、投与に適した組成物は、不活性希釈剤と共に、またはそれ無しで、製薬上許容できる担体内で提供されてよい。担体は吸収可能でなければならず、液体、半固体（即ちペースト）、または固体担体が挙げられる。任意の従来の媒体、作用物質、希釈剤、または担体が、レシピエント、またはこれらの中に含有される組成物の治療効果に有害作用を及ぼす場合を除いて、本方法を実施するのに用いるために、投与可能な組成物中でのこれらを使用することは適切なことである。担体または希釈剤の例としては、脂肪、油類、水、食塩水、脂質、リポソーム、樹脂、結合剤、充填剤等、またはこれらの組み合わせが挙げられる。組成物はまた、１つ以上の組成物の酸化を遅らせる種々の酸化防止剤を含んでよい。更に、微生物作用の防止は、パラベン（例えばメチルパラベン、プロピルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、またはこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない種々の抗菌及び抗カビ剤等の防腐剤によりもたらされることができる。
【０１３２】
本発明の特定の態様に従い、組成物は、任意の便利かつ実践的な方法、即ち溶液、懸濁液、乳化、混合、封入、吸収等により、担体と組み合わせられる。かかる手順は当業者にとってはルーチンである。
【０１３３】
本発明の特定の実施形態においては、組成物は半固体または固体担体と共に完全に組み合わせられるか混合される。混合は、粉砕等の任意の便利な方法で実施することができる。治療活性の損失（即ち、胃での変性）から組成物を守るために、安定化剤を混合プロセスに加えることもできる。組成物中で使用するための安定剤の例としては、緩衝液、グリシン及びリジン等のアミノ酸、炭化水素（例えばデキストロース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、スクロース、マルトース、ソルビトール、マンニトール等）が挙げられる。
【０１３４】
更なる実施形態では、本発明は、キヌレニナーゼ、１種以上の脂質、及び水性溶媒を含む薬剤用脂質ビヒクル組成物の使用に関してよい。本明細書で使用する場合、用語「脂質」は、水には不溶であり、有機溶媒で抽出可能であることを特徴とする、広範囲の物質のいずれかを含むように規定される。この幅広い部類の化合物は当業者に周知であり、用語「脂質」が本明細書で使用されているように、任意の特定の構造に限定されない。例としては、長鎖脂肪族炭化水素及びそれらの誘導体を含有する化合物が含まれる。脂質は天然のものであっても、合成のもの（即ち人間により設計されたか、または作製されたもの）であってもよい。しかし、脂質は通常は生物学的物質である。生物学的脂質は当該技術分野において周知であり、例えば、中性脂肪、リン脂質、ホスホグリセリド、ステロイド、テルペン、リゾ脂質、グリコスフィンゴリピド、糖脂質、サルファタイド、エーテル及びエステルが結合した脂肪酸を有する脂質、重合性脂質、並びにこれらの組み合わせが挙げられる。もちろん、当業者により脂質として理解される本明細書で特に記載したもの以外の化合物もまた、組成物及び方法により包含される。
【０１３５】
当業者は、組成物を脂質ビヒクルに分散させるのに用いることが可能な技術範囲に精通している。例えば、キヌレニナーゼまたはその融合タンパク質は、脂質を含有する溶液に分散するか、脂質と共に溶解させるか、脂質と共に乳化するか、脂質と混合するか、脂質と組み合わせるか、脂質に共有結合させるか、脂質中に懸濁液として含有させるか、ミセルもしくはリポソームと共に含有させるかもしくは複合体を形成するか、または別様では、当業者に既知の任意の方法により、脂質もしくは脂質構造体と会合させてよい。分散はリポソームの形成をもたらし得るか、またはもたらし得ない。
【０１３６】
動物患者に投与される組成物の実際の用量は、体重、状態の重症度、治療されている病気の種類、以前の、または併発している治療介入、患者の突発性疾患、及び投与経路等の物理的及び生理学的因子により決定することができる。用量及び投与経路に応じて、好ましい用量の投与回数及び／または有効量は、対象の応答に従い変化してよい。投与に責任を持つ施術者はいずれにせよ、組成物中の活性成分（複数可）の濃度、及び個々の対象での適切な用量（複数可）を決定する。
【０１３７】
ある種の実施形態において、医薬組成物は例えば、約０．１％の活性化合物を含んでよい。他の実施形態では、活性化合物は、例えば、単位の約２重量％〜約７５重量％、または約２５重量％〜約６０重量％、及びこれらの中のあらゆる範囲変数を含んでよい。本来は、治療に有用なそれぞれの組成物中での活性化合物の量（複数可）は、好適な用量が化合物の任意の所与の１回用量で得られるように調製されてよい。溶解度、生物学的利用能、生物学的半減期、投与経路、生成物の保管寿命等の因子、及び他の薬理学的事象が、かかる医薬製剤の調製を行う当業者により想到され、このために、かかる種々の用量及び治療レジメンが望ましい場合がある。
【０１３８】
別の非限定的例において、用量はまた、１回の投与あたり、約１マイクログラム／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重、約１０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約１００マイクログラム／ｋｇ／体重、約２００マイクログラム／ｋｇ／体重、約３５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５００マイクログラム／ｋｇ／体重、約１ミリグラム／ｋｇ／体重、約５ミリグラム／ｋｇ／体重、約１０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約１００ミリグラム／ｋｇ／体重、約２００ミリグラム／ｋｇ／体重、約３５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５００ミリグラム／ｋｇ／体重、から約１０００ミリグラム／ｋｇ／体重まで、またはそれ以上、及びこれらの中の任意の範囲変数を含んでよい。本明細書で一覧にした数から誘導可能な範囲の非限定的例において、約５ミリグラム／ｋｇ／体重〜約１００ミリグラム／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重〜約５００ミリグラム／ｋｇ／体重といった範囲が、上述の数に基づき投与される。
【０１３９】
Ｘ．組み合わせ治療
ある種の実施形態において、本実施形態の組成物及び方法は、キヌレニナーゼを第２または追加の治療法と組み合わせて投与することを伴う。かかる治療法は、キヌレニンの依存性に関係する任意の病気の治療に適用することができる。例えば、病気は癌であってよい。
【０１４０】
併用療法を含む方法及び組成物は、治療もしくは保護効果を高め、かつ／または、別の抗癌もしくは抗増殖過剰療法の治療効果を増加させる。治療及び予防方法、及び組成物は、癌細胞の殺傷及び／または細胞の過剰増殖の阻害といった所望の効果を達成するのに効果的な組み合わせた量で提供されることができる。本プロセスは、キヌレニナーゼ及び第２の治療法を投与することを伴ってよい。第２の治療法は直接的な細胞毒性効果を有していても、有していなくてもよい。例えば、第２の治療法は、直接的な細胞毒性効果を有することなく免疫系を上方制御する作用物質であってよい。組織、腫瘍、または細胞を、１つ以上の作用物質（例えばキヌレニナーゼもしくは抗癌剤）を含む１つ以上の組成物または薬理学的配合物に曝すことが可能であり、または、組織、腫瘍、及び／もしくは細胞を２種以上の異なる組成物もしくは配合物に曝すことが可能であり、ここで、ある組成物は１）キヌレニナーゼ、２）抗癌剤、または３）キヌレニナーゼと抗癌剤の両方、を提供する。また、かかる併用療法は、化学療法、放射線治療、外科的療法、または免疫療法と共に使用することができると考えられている。
【０１４１】
細胞に適用される場合、用語「接触した」及び「曝された」は、本明細書において、治療用構築物及び化学療法薬または放射線治療薬が標的細胞に送達されるプロセスが、標的細胞に直接近い位置に配置されることを説明するために使用される。殺傷を達成するために、例えば、両方の作用物質が、細胞を殺傷するか、または細胞が分裂することを防止するのに有効な組み合わせた量で細胞に送達される。
【０１４２】
キヌレニナーゼは、癌治療に対して前、間、後、または種々の組み合わせにて投与されてよい。投与は、同時投与から、数分〜数日〜数週間の範囲にわたる間隔であってよい。キヌレニナーゼが抗癌剤とは別に患者に提供される実施形態においては、２つの化合物が依然として、有利に組み合わせた効果を患者に発揮することが可能であるように、各送達の間の時間が著しく延びないことが一般的に確実に行われる。かかる例において、患者に、キヌレニナーゼ及び抗癌剤を、互いに約１２〜２４、または７２時間、及びより詳細には、互いに約６〜１２時間以内に投与してよいと想到されている。場合によっては、それぞれの投与の間が数日（２、３、４、５、６、または７日）から数週間（１、２、３、４、５、６、７、または８週間）かかる場合、治療のための期間を著しく延ばすのが望ましい場合がある。
【０１４３】
ある種の実施形態において、治療の過程は１〜９０日、またはそれ以上続く（かかる範囲には間の日も含む）。ある作用物質は、１日目〜９０日目（かかる範囲には間の日も含む）のいずれかの日、またはこれらの任意の組み合わせに投与されてよく、別の作用物質は、１日目〜９０日目（かかる範囲には間の日も含む）の任意の日、またはこれらの任意の組み合わせに投与されると想到されている。１日（２４時間の期間）以内に、患者は作用物質（複数可）を１回、または複数回投与されてよい。更に、治療の過程の後で、抗癌剤が投与されない期間が存在すると想到される。この期間は、患者の状態、例えば患者の予後、強さ、健康等に応じて、１〜７日、及び／または１〜５週間、及び／または１〜１２ヶ月、またはそれ以上（かかる範囲には間の日も含む）続いてよい。治療サイクルは必要に応じて繰り返されることが予想される。
【０１４４】
種々の組み合わせを使用してよい。以下の例に関して、キヌレニナーゼが「Ａ」であり、癌治療が「Ｂ」である。
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【０１４５】
本実施形態の任意の化合物または治療法を患者に投与することは、存在する場合、作用物質の毒性を考慮に入れた、かかる化合物の投与のための一般的な手順に従う。したがって、いくつかの実施形態では、併用療法に起因する毒性を監視する工程が存在する。
【０１４６】
Ａ．化学療法
多種多様の化学療法剤を、本実施形態に従い使用してよい。用語「化学療法」とは、癌を治療するために薬剤を使用することを意味する。「化学療法剤」とは、癌の治療で投与される化合物または組成物を含むように使用される。これらの作用物質または薬剤は、例えば、細胞周期に影響を与えるか、そしてどの段階で影響を与えるかにより、細胞内での活性様式によりカテゴライズされる。あるいは、作用物質は、ＤＮＡを直接架橋する能力、ＤＮＡ内に入り込む能力、または核酸合成に影響を与えることにより、染色体及び有糸分裂異常を誘発する能力に基づき特性化してよい。
【０１４７】
化学療法剤の例としては、チオテパ及びシクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｓｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）等のアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン、及びピポスルファン等のスルホン酸アルキル；ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、及びウレドーパ等のアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド（ｔｒｉｅｔｈｉｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、及びトリメチローロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）等のエチレンイミン及びメチラメラミン；アセトゲニン（特にブラタシン及びブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体トポテカン等）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成類似体等）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１等）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンギスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニマスチン、トロホスファミド、及びウラシルマスタード等のナイトロジェンマスタード；カルマスティン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムスチン（ｒａｎｉｍｎｕｓｔｉｎｅ）等のニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）；エンジイン抗生物質（例えばカリケアマイシン、特にカリケアマイシンγ１Ｉ及びカリケアマイシンωＩ１）等の抗生物質；ジネミシンＡ等のジネミシン；クロドロネート等のビスホスホネート；エスペラミシン；並びに、ネオカルチノスタチン発色団及び関係する色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン（ａｕｔｈｒａｒｎｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモミコーシス（ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎｉｓ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン及びデオキシドクソルビシン等）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン（例えばマイトマイシンＣ）、マイコフェノール酸、ノガラマイシン（ｎｏｇａｌａｒｎｙｃｉｎ）、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、及びゾルビシン；メトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）等の代謝拮抗薬；デノプテリン、プテロプテリン、及びトリメトレキセート等の葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、及びチオグアニン等の��リン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジネン、ドキシフルリジン、エノシタビン、及びフロクシウリジン等のピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、及びテストラクトン等のアンドロゲン；マイトテイン及びトリロスタン等の抗副腎剤；フォリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）等の葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エルフォミチン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）、エリプチニウムアセテート；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；メイタンシン及びアンサマイトシン等のメイタンシノイド；ミトグアゾン；マイトキサントロン；モピダンモール；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット：ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ多糖複合体；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２毒素、ベラキュリンＡ、ロリジンＡ及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ）；シクロホスファミド；タキソイド（例えばパクリタキセル及びドセタキセルゲムシタビン）；６−チオグアニン；メルカプトプリン；シスプラチン、オキサリプラチン、及びカルボプラチン等の白金錯体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン（例えばＣＰＴ−１１）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ  ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｌｈｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸等のレチノイド；カペシタビン；カルボプラチン、プロカルバジン、プリカマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｅｎ）、ナベルビン、タンパク質ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、トランス白金（ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、並びに製薬上許容できる塩、酸、または上記のいずれかの誘導体が挙げられる。
【０１４８】
Ｂ．放射線治療
ＤＮＡの損傷を引き起こす、幅広く使用されてきた他の因子としては、γ線、Ｘ線として一般に知られているもの、及び／または放射性同位体を腫瘍細胞に意図して送達することが挙げられる。マイクロ波、陽子ビーム照射（米国特許第５，７６０，３９５号及び同４，８７０，２８７号）、並びに紫外線照射等の、他の形態のＤＮＡを損傷する因子もまた想到される。これらの因子全てが、ＤＮＡ、ＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製及び修復、並びに染色体の集合及び維持の広範囲に影響を及ぼす可能性が最も高い。Ｘ線の照射範囲は、長期間（３〜４週間）では１日あたり５０〜２００レントゲンの照射から、１回の照射では２０００〜６０００レントゲンの範囲で変動する。放射性同位体の照射範囲は広範に変化し、同位体の半減期、放射される放射線の強さ及び種類、並びに新生細胞による取り込みに依存する。
【０１４９】
Ｃ．免疫療法
当事者は、免疫療法を、実施形態の方法と組み合わせて、または共に使用してよいことを理解するであろう。癌治療との関係においては、免疫治療薬は通常、癌細胞を標的化し破壊するための、免疫エフェクター細胞及び分子の使用に依存する。リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））は、かかる一例である。チェックポイント阻害剤（例えばイピリムマブ等）は、別のかかる例である。免疫エフェクターは例えば、腫瘍細胞の表面でのいくつかのマーカーに特異的な抗体であってよい。抗体単独では治療のエフェクターとして機能し得るか、または、他の細胞を、実際に細胞殺傷に影響を及ぼすように動員し得る。抗体はまた、薬剤または毒素（化学療法、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素等）にコンジュゲートしてよく、また、単に標的化剤として機能してよい。あるいは、エフェクターは、腫瘍細胞標的と直接または間接的のいずれかで相互作用する表面分子を担持するリンパ球であってよい。種々のエフェクター細胞としては、細胞障害性Ｔ細胞及びＮＫ細胞が挙げられる。
【０１５０】
免疫療法の一態様において、腫瘍細胞は標的化しやすい、即ち、他の細胞の大多数には存在しないいくつかのマーカーを有しなければならない。多くの腫瘍マーカーが存在し、これらはいずれも、本実施形態との関係における標的化に好適であり得る。一般的な腫瘍マーカーとしては、ＣＤ２０、癌胎児性抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ−７２、ＨＭＦＧ、シアリルルイス抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、ラミニン受容体、ｅｒｂ  Ｂ、及びｐ１５５が挙げられる。免疫療法の代替の態様は、抗癌効果を免疫刺激効果と組み合わせることである。免疫刺激分子もまた、サイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、γ−ＩＦＮ等）、ケモカイン（ＭＩＰ−１、ＭＣＰ−１、ＩＬ−８）、及び増殖因子（ＦＬＴ３リガンド等）等が存在する。
【０１５１】
現在研究されている、または使用されている免疫療法の例は、免疫アジュバント、例えば、ウシ型結核菌、熱帯熱マラリア原虫、ジニトロクロロベンゼン、及び芳香族化合物（米国特許第５，８０１，００５号及び同５，７３９，１６９号；Ｈｕｉ  ａｎｄ  Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，１９９８；Ｃｈｒｉｓｔｏｄｏｕｌｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）；サイトカイン療法、例えばインターフェロンα、β、及びγ、ＩＬ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、並びにＴＮＦ（Ｂｕｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｈｅｌｌｓｔｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）；遺伝子治療、例えば（ＴＮＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、及びｐ５３（Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ａｕｓｔｉｎ−Ｗａｒｄ  ａｎｄ  Ｖｉｌｌａｓｅｃａ，１９９８；米国特許第５，８３０，８８０号及び同５，８４６，９４５号）；並びにモノクローナル抗体、例えば抗ＣＤ２０、抗ガングリオシドＧＭ２、及び抗ｐ１８５（Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ，２０１２；  Ｈａｎｉｂｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；  Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  ５，８２４，３１１）である。１種以上の抗癌療法を、本明細書で記載される抗体療法と共に使用してよいと想到される。
【０１５２】
Ｄ．手術
癌を患うおよそ６０％のヒトが、いくつかの種類の手術を受け、これには予防用、診断用、または病期分類用の治癒手術及び姑息手術が含まれる。治癒手術としては、癌性組織の全てまたは一部が物理的に除去、切除、及び／または破壊される切除術が挙げられ、他の治療法、例えば本実施形態の治療法の化学療法、放射線治療、ホルモン療法、遺伝子治療、免疫療法、及び／または代替の治療法と共に使用されてよい。腫瘍切除とは、腫瘍の少なくとも一部を物理的に除去することを意味する。腫瘍切除に加えて、手術による治療としては、レーザー手術、凍結手術、電気外科手術、及び顕微鏡で制御する手術（モース手術）が挙げられる。
【０１５３】
癌性の細胞、組織、または腫瘍の一部または全てを切除する際に、空洞が体内に形成される場合がある。治療は、更なる抗癌治療が必要な領域の灌流、直接注射、または局所適用により達成されてよい。かかる治療は例えば、１、２、３、４、５、６、もしくは７日毎、または１、２、３、４、及び５週毎、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２日毎に繰り返されてよい。これらの治療は同じように、種々の用量であってよい。
【０１５４】
Ｅ．他の作用物質
処置の治療効果を改善するために、他の作用物質を本実施形態の特定の態様と組み合わせて使用してよいことが想到されている。これらの追加の作用物質としては、細胞表面受容体及びギャップ結合、間隙接合の上方制御に影響を及ぼす作用物質、細胞増殖抑制剤及び分化剤、細胞接着阻害剤、増殖過剰細胞のアポトーシス誘導因子に対する感受性を増加させる作用物質または他の生物学的作用物質が挙げられる。ギャップ結合の数を増加させることによって細胞内シグナル伝達を増加させることにより、隣接する増殖過剰細胞集団の抗増殖過剰効果が増加する。他の実施形態では、細胞増殖抑制剤または分化剤を、本実施形態の特定の態様と組み合わせて使用し、治療の抗有効性効果を改善することができる。細胞接着阻害剤は、本実施形態の効果を向上させることが考えられている。細胞接着阻害剤の例は、局所接着キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤及びロバスタチンである。増殖過剰細胞のアポトーシスに対する感受性を増加させる他の作用物質（例えば抗体ｃ２２５）を、本実施形態の特定の態様と組み合わせて使用して治療効果を向上させることができることもまた想到される。
【０１５５】
ＸＩ．キット
本発明のある種の態様は、治療用キット等のキットを提供してよい。例えば、キットは本明細書に記載した１種以上の医薬組成物、及び所望により、これらの使用のための取扱説明書を含んでよい。キットは更に、かかる組成物の投与を達成するための１つ以上のデバイスも含んでよい。例えば、対象キットは、医薬組成物、及び組成物を癌性腫瘍への直接静脈内注射を達成するためのカテーテルを含んでよい。他の実施形態では、対象キットは、送達デバイスとともににより使用するために、所望により薬剤として配合されるか、または凍結乾燥した、キヌレニナーゼが予め満たされたアンプルを含んでよい。
【０１５６】
キットは、ラベルが付いた容器を含んでよい。好適な容器としては例えば、ボトル、バイアル瓶、及び試験管が挙げられる。容器はガラスまたはプラスチック等の種々の材料から形成されてよい。容器は、上述のもの等の、治療用または非治療用用途に効果的なキヌレニナーゼ等を含む組成物を収容してよい。容器のラベルは、組成物が特定の治療法、または非治療用途のために使用されてよいことを示してよく、また、上述したもの等の、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用のいずれかのための指示を示してもよい。本発明のキットは通常、上述の容器と、緩衝剤、希釈剤、充填剤、針、シリンジ等の、商業的及び使用者の見地から望ましい材料を含む、１つ以上の他の容器と、使用のための取扱説明書が付いた添付文書を含む。
【実施例】
【０１５７】
ＸＩＩ．実施例
以下の実施例は、好ましい本発明の実施形態を示すために含まれる。後に続く実施例で開示される技術は、発明者により発見された、本発明の実施に際して十分に機能する技術を示すためであり、そしてまた本発明の実施の好ましい様式を構成するために考慮することができるということが、当業者によって理解されなければならない。しかし、本開示の見地から、当業者は、開示された特定の実施形態において、本発明の精神及び範囲から逸脱することなしに多くの変更を行うことができ、かつ同様または類似の結果が得られることを理解しなければならない。
【０１５８】
実施例１−シュードモナス・フルオレッセンス由来のキヌレニナーゼの遺伝子構築物、発現、及び精製
シュードモナス・フルオレッセンス由来のキヌレニナーゼ酵素（Ｐｆ−ＫＹＮＵ）を発現させるための遺伝子を、ＤＮＡ−Ｗｏｒｋｓソフトウェア（Ｈｏｏｖｅｒ  ａｎｄ  Ｌｕｂｋｏｗｓｋｉ，２００２）を使用して設計した４つのコドン最適化遺伝子のブロックを、オーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により構築した。完全長遺伝子は、Ｎ末端ＸｂａＩ制限酵素部位（ヌクレオチド１〜６）、最適化したリボソーム結合部位（ＲＢＳ；ヌクレオチド２９〜５５）、開始コドン（ヌクレオチド５６〜５８）、Ｎ末端Ｈｉｓ６タグ（ヌクレオチド５９〜９１）、Ｅ．  ｃｏｌｉコドン最適化Ｐｆ−ＫＹＮＵ遺伝子（ヌクレオチド９２〜１３３６）、終止コドン（ヌクレオチド１３３７〜１３４２）、及びＣ末端ＢａｍＨＩ制限酵素部位（ヌクレオチド１３４２〜１３４７）を含む（配列番号：１を参照のこと）。上述の制限酵素部位を使用して、組み立てた遺伝子をｐＥＴ−２８ａ＋ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）内にクローニングした。この構築物を使用して次に、発現用のＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．  ｃｏｌｉを形質転換した。細胞を、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）培地内にて２１０ｒｐｍで振盪しながら、３７℃で増殖させた。ＯＤ６００  約１．０に到達した際に、ＩＰＴＧ（０．５ｍＭの終濃度）を加え、３７℃で引き続き一晩攪拌することにより発現を誘発した。次に、細胞を遠心分離により回収し、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、３００ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのピリドキサールリン酸（ｐｙｒｉｄｏｘｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（ＰＬＰ）、１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル、及び１μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅからなる細胞溶解緩衝液内に再懸濁させた。細胞溶解をフレンチプレスにより完了させ、溶解物を２０，０００×ｇで４℃にて１時間遠心分離することにより、微粒子を除いた。次に上清を５μｍの注射器フィルターに通して濾過し、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、３００ｍＭのＮａＣｌ、及び０．１ｍＭのＰＬＰ（ｐＨ７．４）からなる緩衝液で予め平衡化したＮｉ−ＮＴＡ／アガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎ）にアプライした。溶解物をカラム上にロードした後、樹脂を５カラム体積（ＣＶ）の５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、３００ｍＭのＮａＣｌ、及び３０ｍＭのイミダゾールを含む０．１ｍＭのＰＬＰで洗浄した。次に、０．１ｍＭのＰＬＰ及び１％ｖ／ｖのＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ１１４を含む、エンドトキシン非含有のＰＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）１００ＣＶでカラムを一晩ゆっくりと洗浄するように流速を設定した。この一晩の洗浄により、細菌発現系における典型的な汚染物質であるリポ多糖体（ＬＰＳ、即ちエンドトキシン）を除去する。洗浄した酵素を次に、０．１ｍＭのＰＬＰと２５０ｍＭのイミダゾールを含むエンドトキシン非含有のＰＢＳ（５ＣＶ）に溶出し、樹脂を、０．１ｍＭのＰＬＰを含む第２のエンドトキシン非含有ＰＢＳ部分（５ＣＶ）で洗い流した。この時点で、酵素の緩衝液を新鮮なＰＢＳに交換してイミダゾールを取り除き、１０％グリセロールを加えて、アリコートを液体窒素内で急速に、保管のために−８０℃に冷凍した。あるいは、酵素の緩衝液を速やか���、新鮮に作られた滅菌した１００ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ８．４）に交換して、イミダゾールを取り除くとともに、ＰＥＧ化のために調製する（実施例４を参照）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に基づくと通常の酵素純度は＞９５％であり、典型的な収率は平均で７５ｍｇ／Ｌ培養物であった。Ａｂｓ２８０ｎｍを測定し、計算した酵素吸光係数（６３，７４５Ｍ−１ｃｍ−１）を使用して、タンパク質の量を評価した。
【０１５９】
実施例２−ヒト由来のキヌレニナーゼの遺伝子構築物、発現、及び精製
ヒト由来のキヌレニナーゼ酵素（ｈ−ＫＹＮＵ）を発現させるための遺伝子を、ＤＮＡ−Ｗｏｒｋｓソフトウェア（Ｈｏｏｖｅｒ  ａｎｄ  Ｌｕｂｋｏｗｓｋｉ，２００２）を使用して設計した、４つのコドン最適化遺伝子のブロックをオーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により得た。完全長遺伝子は、Ｎ末端ＸｂａＩ制限酵素部位（ヌクレオチド１〜６）、最適化したＲＢＳ（ヌクレオチド２８〜６０）、  開始コドン（ヌクレオチド６１〜６３）、Ｎ末端Ｈｉｓ６タグ（ヌクレオチド６４〜９６）、Ｅ．  ｃｏｌｉコドン最適化ｈ−ＫＹＮＵ遺伝子（ヌクレオチド９７〜１４８８）、終止コドン（ヌクレオチド１４８９〜１４９１）、及びＣ末端ＢａｍＨＩ制限酵素部位（ヌクレオチド１４９２〜１４９７）を含む（配列番号：２を参照のこと）。上述の制限酵素部位を使用して、組み立てた遺伝子をｐＥＴ−２８ａ＋ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）内にクローニングした。この構築物を使用して次に、発現用のＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．  ｃｏｌｉを形質転換した。細胞を、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）培地内にて２１０ｒｐｍで振盪しながら、３７℃で増殖させた。ＯＤ６００  約１．０に到達した際に、ＩＰＴＧ（０．５ｍＭの終濃度）を加え、３７℃で引き続き一晩攪拌することにより発現を誘発した。次に、細胞を遠心分離により回収し、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、３００ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのピリドキサールリン酸（ｐｙｒｉｄｏｘｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（ＰＬＰ）、１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル、及び１μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅからなる細胞溶解緩衝液内に再懸濁させた。細胞溶解をフレンチプレスにより完了させ、溶解物を２０，０００×ｇで４℃にて１時間遠心分離することにより、微粒子を除いた。次に上清を５μｍの注射器フィルターに通して濾過し、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、３００ｍＭのＮａＣｌ、及び０．１ｍＭのＰＬＰの緩衝液で予め平衡化したＮｉ−ＮＴＡ／アガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎ）にアプライした。溶解物をカラム上にロードした後、樹脂を５カラム体積（ＣＶ）の５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、３００ｍＭのＮａＣｌ、及び３０ｍＭのイミダゾールを含む０．１ｍＭのＰＬＰで洗浄した。次に、０．１ｍＭのＰＬＰ及び１％ｖ／ｖのＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ１１４を含む、エンドトキシン非含有のＰＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）１００ＣＶでカラムを、一晩ゆっくりと洗浄するように流速を設定した。この一晩の洗浄により、酵素の細菌発現における典型的な汚染物質であるリポ多糖体（ＬＰＳ、即ちエンドトキシン）を取り除く。洗浄した酵素を次に、０．１ｍＭのＰＬＰと２５０ｍＭのイミダゾールを含むエンドトキシン非含有ＰＢＳ（５ＣＶ）に溶出し、樹脂を０．１ｍＭのＰＬＰを含む第２のエンドトキシン非含有ＰＢＳ部分（５ＣＶ）で洗い流した。この時点で、酵素の緩衝液を新鮮なＰＢＳに交換してイミダゾールを取り除き、１０％グリセロールを加えて、アリコートを液体窒素内で急速に、保管のために−８０℃に冷凍した。あるいは、酵素の緩衝液を、新鮮に作られた滅菌した１００ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ８．４��に交換して共にイミダゾールを取り除き、  ＰＥＧ化のために調製することができる（実施例４を参照）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により評価した酵素純度は通常＞９５％であり、典型的な収率の平均は２０ｍｇ／Ｌの液体培養物であった。Ａｂｓ２８０ｎｍを測定し、計算した酵素吸光係数（７６，０４０Ｍ−１ｃｍ−１）を使用して、タンパク質の量を評価した。
【０１６０】
実施例３−マウス由来のキヌレニナーゼの遺伝子構築物、発現、及び精製
マウス由来のキヌレニナーゼ酵素（ｍ−ＫＹＮＵ）を発現させるための遺伝子を、ＤＮＡ−Ｗｏｒｋｓソフトウェア（Ｈｏｏｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）を使用して設計した、３つのコドン最適化遺伝子のブロックをオーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により得た。完全長遺伝子は、Ｎ末端ＸｂａＩ制限酵素部位（ヌクレオチド１〜６）、最適化したＲＢＳ（ヌクレオチド２９〜５８）、  開始コドン（ヌクレオチド５９〜６１）、Ｎ末端Ｈｉｓ６タグ（ヌクレオチド６２〜９４）、Ｅ．  ｃｏｌｉコドン最適化ｍ−ＫＹＮＵ遺伝子（ヌクレオチド９５〜１４８３）、終止コドン（ヌクレオチド１４８４〜１４８６）、及びＣ末端ＢａｍＨＩ制限酵素部位（ヌクレオチド１４８７〜１４９２）を含んだ（配列番号：３を参照のこと）。上述の制限酵素部位を使用して、組み立てた遺伝子をｐＥＴ−２８ａ＋ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）内にクローニングした。この構築物を使用して次に、発現用のＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．  ｃｏｌｉを形質転換した。細胞を、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）内にて２１０ｒｐｍで振盪させながら３７℃で増殖させた。ＯＤ６００  〜１．０に到達した際に、０．５ｍＭのＩＰＴＧを加え、３７℃で一晩振盪を続けることにより発現を誘発した。細胞を遠心分離により回収し、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、３００ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのピリドキサールリン酸（ｐｙｒｉｄｏｘｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（ＰＬＰ）、１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル及び１μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅからなる細胞溶解緩衝液内に再懸濁させた。細胞溶解をフレンチプレスにより完了させ、溶解物を２０，０００×ｇで４℃にて１時間遠心分離することにより、微粒子を除いた。上清を５μｍの注射器フィルターを通して濾過し、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、３００ｍＭのＮａＣｌ、及び０．１ｍＭのＰＬＰの緩衝液で予め平衡化したＮｉ−ＮＴＡ／アガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎ）にアプライした。溶解物をカラム上にロードした後、樹脂を５カラム体積（ＣＶ）の５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、３００ｍＭのＮａＣｌ、及び３０ｍＭのイミダゾールを含む０．１ｍＭのＰＬＰで洗浄した。次に、０．１ｍＭのＰＬＰと１％ｖ／ｖのＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ１１４を含むエンドトキシン非含有のＰＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）（１００ＣＶ）で一晩ゆっくりと洗浄するように流速を設定した。この一晩の洗浄により、酵素の細菌発現において典型的な汚染物質であるリポ多糖体（ＬＰＳ、即ちエンドトキシン）を取り除いた。洗浄した酵素を、０．１ｍＭのＰＬＰと２５０ｍＭのイミダゾールを含むエンドトキシン非含有のＰＢＳ（５ＣＶ）で溶出し、樹脂を、０．１ｍＭのＰＬＰを含む第２のエンドトキシン非含有のＰＢＳ部分（５ＣＶ）で洗い流した。この時点で、酵素の緩衝液を新鮮なＰＢＳに交換してイミダゾールを取り除き、１０％グリセロールを加えて、アリコートを保存のために、液体窒素内で−８０℃で急速に凍結した。
【０１６１】
実施例４−シュードモナス・フルオレッセンス由来のキヌレニナーゼの薬理学的調製
ｉｎ  ｖｉｖｏでの酵素の循環時間を改善するために、ＫＹＮＵ酵素の流体力学的半径を、タンパク質中の表面反応性基をＰＥＧにコンジュゲートすることにより官能化することで増加させた。一実施形態では、表面リジン残基をメトキシＰＥＧサクシニミジルカーボネート５０００ＭＷ（ＮＡＮＯＣＳ）と反応させることによりＰｆ−ＫＹＮＵを官能化させた。精製したエンドトキシン非含有酵素の緩衝液を、新鮮に調製した１００ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ８．４）に完全に交換し、１０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。得られた溶液を、１００：１でモル過剰の固体ＰＥＧ試薬に直接加え、室温で１時間反応させた（図１）。１００ｋＤａのカットオフ遠心分離濾過装置（ＡＭＩＣＯＮ（登録商標））内で新鮮なエンドトキシン非含有のＰＢＳに完全に緩衝液を交換することにより、未反応のＰＥＧを溶液から取り除いた。次に、酵素の見かけの分子量を、ＰＢＳでのサイズ排除ＨＰＬＣカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）で確認した。ＢｉｏＲａｄのＭＷ標準液を使用して、標準タンパク質と比較しての、検量線及び酵素保持時間を作製した。検量線に基づくと、非ＰＥＧ化酵素の見かけの質量は４０ｋＤａであり、この値はＰｆ−ＫＹＮＵのあるモノマーの質量に近い。酵素のＰＥＧ化体は見かけの質量が１，３００ｋＤａのようであり、即ちこれは、改変されていない酵素よりも実質的に大きかった。Ｃｈｒｏｍｏ−ＬＡＬカイネティック比色式エンドトキシン試験キット（Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｏｆ  Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ，Ｉｎｃ．）を使用してエンドトキシンの濃度を定量化した。上述の方法で洗浄した酵素は通常、生成したＰｆ−ＫＹＮＵにおいて０．１９±０．０７ＥＵ／ｍｇの量のエンドトキシンであった。
【０１６２】
実施例５−ヒトからのキヌレニナーゼの薬理学的調製
ヒト酵素のｉｎ  ｖｉｖｏでの循環保持時間を改善するために、ｈ−ＫＹＮＵの流体力学的半径を、タンパク質内の表面反応性基をＰＥＧにコンジュゲートすることにより官能化することで増加させた。一実施形態では、表面リジン残基をメトキシＰＥＧサクシニミジルカーボネート５０００ＭＷ（ＮＡＮＯＣＳ）と反応させることによりｈ−ＫＹＮＵを官能化させた。精製したエンドトキシン非含有酵素の緩衝液を、新鮮に調製した１００ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ８．４）に完全に交換し、１０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。得られた溶液を、１００：１でモル過剰の固体ＰＥＧ試薬に直接加え、室温にて１時間反応させた。１００ｋＤａのカットオフ遠心分離濾過装置（ＡＭＩＣＯＮ（登録商標））内で新鮮なエンドトキシン非含有のＰＢＳに完全に緩衝液を交換することにより、未反応のＰＥＧを溶液から取り除いた。ＰＢＳで平衡化したサイズ排除ＨＰＬＣカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を使用して酵素の見かけの分子量を測定し、ＭＷ標準液（ＢｉｏＲａｄ）と比較しての保持時間を測定した。Ｃｈｒｏｍｏ−ＬＡＬカイネティック比色式エンドトキシン試験キット（Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｏｆ  Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ，Ｉｎｃ．）を使用してエンドトキシンの濃度を定量化した。
【０１６３】
実施例６−キヌレニナーゼの反応速度パラメータを測定するためのアッセイ
Ｐｆ−ＫＹＮＵ及びｈ−ＫＹＮＵ、並びに実施例４及び５で記載したこれらのＰＥＧ化版の反応速度パラメータを、分光光度アッセイにより定量化し、ここでは、酵素基質であるＬ−キヌレニンの最大吸光度の減衰を時間の関数として監視した。Ｌ−キヌレニン溶液をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で調製し、８μＭ〜２５０μＭの終濃度を得た。Ｌ−キヌレニンは３６５ｎｍにてλｍａｘが４，５００Ｍ−１ｃｍ−１の吸光係数を有する一方、キヌレニナーゼ反応の生成物であるＬ−アントラニル酸及びＬ−アラニンは３６５ｎｍにて認識可能な程度の吸光を行わない。基質溶液に酵素溶液（約２０ｎＭの終濃度）を加えて速やかに混合して反応を開始し、時間の経過とともにＡｂｓ３６５ｎｍを測定することにより、２５℃における基質ＫＹＮの喪失を監視した。得られたデータを加工し、反応速度定数を決定するためのミカエリス・メンテン式に当てはめた。ＰＥＧ化Ｐｆ−ＫＹＮＵ酵素の反応速度を同一の方法で測定した。非ＰＥＧ化酵素については、ｋｃａｔ／ＫＭ＝１．０×１０５Ｍ−１ｓ−１であり、ＰＥＧ化形態については、ｋｃａｔ／ＫＭ＝１．３×１０５Ｍ−１ｓ−１である。３−ヒドロキシ−Ｌ−キヌレン酸の加水分解についての反応速度パラメータもまた、本明細書に記載の方法で決定した。
【０１６４】
実施例７−キヌレニナーゼのｉｎ  ｖｉｔｒｏ安定性
Ｐｆ−ＫＹＮＵのｉｎ  ｖｉｔｒｏ安定性を測定するために、酵素をＰＢＳ緩衝液またはプールしたヒト血清のいずれかに加え、終濃度を１０μＭにし、３７℃でインキュベーションした。測定時点ごとにそれぞれの一部（１０μＬ）を取り出し、Ｌ−キヌレニン／ＰＢＳの２５０μＭ溶液（９９０μＬ）に加えた。実施例３に記載のように、時間の経過とともに３６５ｎｍでの吸光度の減衰を測定することにより反応の初速度を監視した。それぞれの時点におけるＬ−キヌレニン触媒作用の初速度を比較し、かつ、時間＝０における速度と比較することにより酵素の安定性を測定した。得られたデータを％活性対時間でプロットし、指数方程式に当てはめて半減期（Ｔ１／２）を測定した。Ｐｆ−ＫＹＮＵ酵素は、ＰＢＳではＴ１／２＝３４．３時間、  プールしたヒト血清ではＴ１／２＝２．４時間であることが判明した（図２）。
【０１６５】
実施例８−ｉｎ  ｖｉｖｏでのキヌレニン及びトリプトファンの量を定量化するためのアッセイ
Ｌ−キヌレニン、トリプトファン、キヌレン酸（ｋｙｎｕｒｅｎｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、３−ヒドロキシ−Ｌ−キヌレニン、及びＬ−アントラニル酸（Ｌ−ａｎｔｈｒａｎｌｉｌｉｃ  ａｃｉｄ）（キヌレニナーゼ触媒作用での生成物の１つ）のｉｎ  ｖｉｖｏレベルを、ＨＰＬＣにより定量化し監視した。マウスの剖検の際に、血液サンプル、腫瘍、脾臓、及び肝臓を回収した。血液サンプルを遠心分離し、全血から血清を分離した。組織サンプルをまず均質化し、次に遠心分離して固体部分を取り除いた。各液体部分に１：１０ｖ／ｖ部分の１００％トリクロロ酢酸を加え、巨大分子を沈殿させた。固体を再び遠心分離により取り除き、上清を０．４５μｍの注射器フィルターに通した。処理した上清を直接ＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）にアプライし、０％溶液Ｂから開始し１００％溶液Ｂまでの勾配を使用して、標準的な分析用Ｃ１８カラム上で分離した。ここで、溶液ＡはＨ２Ｏ＋０．１％トリフルオロ酢酸であり、溶液Ｂはアセトニトリル＋０．１％トリフルオロ酢酸である。１９０ｎｍ〜９００ｎｍの範囲にわたる全ての吸光度を連続的に集めて可能性のあるあらゆる分子を監視し、蛍光分光法（Ｅｘ＝３６５ｎｍ、Ｅｍ＝４８０ｎｍ）を同時に集めてキヌレニンの量を特異的に監視した。純粋な分子（Ｓｉｇｍａ）から作製した標準液を使用して、濃度及び保持時間を測定した。
【０１６６】
実施例９−自家移植Ｂ１６マウス黒色腫モデルにおけるＰＥＧ−Ｐｆ−ＫＹＮＵの効果
皮下脇腹注射により、２．５×１０５個のＢ１６マウス黒色腫細胞をＢ６−ＷＴマウス（ｎ＝２０）にそれぞれ播種した。腫瘍を１０日間で形成させた後（腫瘍平均＝２０ｍｍ２）、マウスをそれぞれｎ＝１０の２つのグループに分けた。次に、対照群を、腫瘍内注射を３日毎に行うことにより、腫瘍のサイズが３５０ｍｍ２に達するまで熱不活性化ＰＥＧ−Ｐｆ−ＫＹＮＵ（２０ｍｇ／ｋｇ）で処理した。腫瘍のサイズが３５０ｍｍ２のエンドポイントに達するまで、３日毎に活性ＰＥＧ−Ｐｆ−ＫＹＮＵ（２０ｍｇ／ｋｇ）を腫瘍内注射することを除いて、実験群を同様の方法で処理した。Ｂ１６黒色腫腫瘍の増殖速度は、同様に処理した熱不活性化ＰＥＧ−Ｐｆ−ＫＹＮＵ群と比較して、活性ＰＥＧ−Ｐｆ−ＫＹＮＵを投与した治療群において著しく遅くなり、（図３）寿命の著しい延長がもたらされた（図４）。対照及び実験処理群から単離したリンパ球を、抗体パネル（即ち、抗ＣＤ４５、ＣＤ４、Ｎｋ１．１、ＣＤ２５、ＦｏｘＰ３、ＣＤ８、グランザイムＢ、ＩＦＮγ、ＣＴＬＡ４、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｂ、Ｆ４／８０、ＧＲ−１、及びＬｙ６−Ｃ）で評価した。循環ＣＤ４＋  ＣＤ２５＋  ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞が、活性ＰＥＧ−Ｐｆ−ＫＹＮＵで処理した群において著しく減少した（４．８±０．８％対８．６±０．８％）ことが明らかとなった。更に、グランザイムＢ及びインターフェロンγを発現する腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞の集団は、活性酵素で処理したマウスにおいて著しく多かった（２６±１９％対４±２％）（図５Ａ〜Ｂ）。
【０１６７】
実施例１０−腫瘍標的化のためのキヌレニナーゼ−ｓｃＦｖ融合タンパク質
いくつかの態様では、本発明はまた、異種アミノ酸配列に結合した改変型の細菌または哺乳類キヌレニナーゼを含むポリペプチドを想到する。例えば、天然型または改変型のキヌレニナーゼは、特異的細胞表面腫瘍抗原に結合する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）抗体と結合してよい。本実施形態において、既知の腫瘍抗原、好ましくは、より低速で内在化する腫瘍特異的抗原、例えばＭＵＣ−１に対して特異的親和性を有するタンパク質のｓｃＦｖ部分とのｓｃＦｖ−キヌレニナーゼ融合タンパク質は、融合タンパク質のキヌレニナーゼ部分が腫瘍細胞に送達され、ＫＹＮを分解することを可能にさせる。一例は、ｓｃＦｖ部分が、ある種の乳癌において上方制御されるヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）を標的化して結合する、ｓｃＦｖ−キヌレニナーゼ融合タンパク質である。
【０１６８】
本実施形態において、天然型または改変型のキヌレニナーゼ−抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ融合タンパク質は、キヌレニナーゼを腫瘍表面に直接標的化して濃縮するように作用し、かつ腫瘍が産生したＫＹＮを分解するように作用する。
【０１６９】
実施例１１−キヌレニナーゼ−抗ＣＴＬＡ４ｓｃＦｖ融合タンパク質
いくつかの態様では、本発明はまた、異種アミノ酸配列に結合した改変型の細菌または哺乳類キヌレニナーゼを含むポリペプチドを想到する。例えば、天然型または改変型のキヌレニナーゼは、細胞毒性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）受容体、プログラム細胞死１（ＰＤ−１）、またはプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）に結合する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）抗体と結合してよい。抗体または抗体断片を拮抗させることによりＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、またはＰＤ−Ｌ１を遮断することにより、阻害性Ｔ細胞シグナルを反転させ、これによりＣＤ２８がＴ細胞活性化を刺激する。本実施形態において、天然型または改変型のキヌレニナーゼ−抗ＣＴＬＡ４−、抗ＰＤ−１−、または抗ＰＤ−Ｌ１−ｓｃＦｖ融合タンパク質は、タンパク質間の阻害性相互作用と、阻害性キヌレニンシグナル伝達の両方を除去するように作用する。天然型または改変型キヌレニナーゼ−ｓｃＦｖ融合タンパク質の本実施形態は、Ｔ細胞活性化を潜在的に上方制御し、抗腫瘍応答を強力に促進することが予想される。
【０１７０】
実施例１２−キヌレニナーゼをＴ細胞に送達するためのキメラ抗原受容体構築物
いくつかの態様では、本発明はまた、改変型の細菌または哺乳類キヌレニナーゼが、ＣＡＲ構築物と共に同時発現するような、Ｔ細胞をキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物でトランスフェクションするのに好適なレンチウイルスベクターを想到する。ＣＡＲ構築物は、ＣＤ３−ζ鎖、及び多くの場合ＣＤ２８分子からの膜貫通及び細胞質シグナル伝達ドメインに融合した細胞外抗原結合ドメインを含有するタンパク質である（Ａｈｍｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。抗原結合ドメインは、腫瘍細胞により発現する抗原を結合するように設計されたｓｃＦｖであってよく、例としては、膠芽腫もしくは骨肉腫により発現するＨＥＲ２、種々のＢ細胞悪性腫瘍により発現するＣＤ１９もしくはＣＤ２０、もしくは神経芽細胞腫により発現するＧＤ２（Ｌｉｐｏｗｓｋａ−Ｂｈａｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）、または任意の他の関係する標的がある。本実施形態において、適切なＣＡＲ構築物をＴ細胞に送達するレンチウイルスベクターは加えて、細胞質基質内で天然型または改変型の細菌または哺乳類キヌレニナーゼを同時発現する。このＣＡＲ／キヌレニナーゼ構築物を含有するＴ細胞は、１）特異的腫瘍細胞に結合し、かつ２）ＫＹＮを分解する２つの能力を有し、これにより、制御性表現型及び／またはアポトーシスのＫＹＮ誘導を防止する。別の実施形態において、Ｔ細胞はＣＤ１９＋またはＣＤ２０＋びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫に結合するＣＡＲ構築物を発現する一方、キヌレニナーゼを同時発現し、多くの場合この腫瘍型により作製される高濃度のＫＹＮを分解する（Ｙｏｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；ｄｅ  Ｊｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｙａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。
【０１７１】
実施例１３−キヌレニナーゼ活性のための遺伝子選択
アミノ酸のＬ−トリプトファン（Ｌ−Ｔｒｐ）を、ｔｒｐ生合成遺伝子の発現により、ペントース由来の前駆体であるコリスメートから合成する。Ｅ．  ｃｏｌｉ等の細菌においては、ｔｒｐ生合成遺伝子は５つの遺伝子：ｔｒｐＥ、ｔｒｐＤ、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＢ、及びｔｒｐＡからなるオペロン内で形成される。ＴｒｐＥ及びＴｒｐＤタンパク質は、コリスメート及びＬ−グルタミンをアントラニル酸及びＬ−グルタメートに転換する第１工程を触媒するアントラニル酸シンターゼ複合体の構成成分である。次に、ＴｒｐＣ、ＴｒｐＡ、及びＴｒｐＢの作用により順次アントラニル酸をＬ−Ｔｒｐに転換する。機能性アントラニル酸シンターゼ遺伝子を欠く細胞はＬ−Ｔｒｐに対して栄養素要求性であり、トリプトファンなしでは最小培地で増殖できない。キヌレニンは多くの生命の細胞質基質中に輸送されることができるため、十分高い触媒活性を示す組み換えＬ−キヌレニナーゼ酵素を発現する細胞は、サイトゾルのＬ−キヌレニンをアントラニル酸に転換することができるはずであり、後者はその後、Ｌ−Ｔｒｐの合成を行うことを可能にすると発明者らは仮定した。対照的に、酵素を発現しないか、または低い触媒活性を有する変異体を発現する細胞は、Ｌ−キヌレニンを含む最小培地ではそれぞれ、増殖を示さないか、または非常に遅い増殖を示すはずである。
【０１７２】
Ｅ．  ｃｏｌｉｔｒｐＥ及びｔｒｐＤ欠失変異体を、Ｙａｌｅ  ＣＧＳＣのＧｅｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓから入手した。株の遺伝子型は、それぞれ（Ｆ−、Δ（ａｒａＤ−ａｒａＢ）５６７、ΔｌａｃＺ４７８７（：：ｒｒｎＢ−３）、λ−、ΔｔｒｐＥ７７２：：ｋａｎ、ｒｐｈ−１、Δ（ｒｈａＤ−ｒｈａＢ）５６８、ｈｓｄＲ５１４）、及び（Ｆ−、Δ（ａｒａＤ−ａｒａＢ）５６７、ΔｌａｃＺ４７８７（：：ｒｒｎＢ−３）、λ−、ΔｔｒｐＤ７７１：：ｋａｎ、ｒｐｈ−１、Δ（ｒｈａＤ−ｒｈａＢ）５６８、ｈｓｄＲ５１４）であった。細胞をＭ９最小培地プレートに植菌した。Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｋｙｎ、アントラニル酸、または緩衝液のいずれかに浸した濾紙ディスクを次にプレート上に配置し、３７℃にてインキュベーションした。Ｅ．  ｃｏｌｉ−ΔｔｒｐＤ細胞はＬ−Ｔｒｐの存在下においてのみ増殖したが、Ｅ．  ｃｏｌｉ−ΔｔｒｐＥは、緩衝液またはＬ−Ｋｙｎでは増殖しないものの、アントラニル酸の存在下においても増殖することができた。このことは、ｔｒｐＣ、ｔｒｐＡ、及びｔｒｐＢが発現し、中間体代謝産物としてのアントラニル酸によりＬ−Ｔｒｐの栄養要求性の救出を可能にすることを示している（図６）。更に、Ｐｆ−ＫＹＮＵ遺伝子を有するプラスミドにより形質転換したＥ．  ｃｏｌｉ−ΔｔｒｐＥ細胞は、Ｌ−Ｋｙｎの存在下においてＭ９最小培地プレート上で強力に増殖した。
【０１７３】
実施例１４−キヌレニンに対して高い触媒活性を示し、ヒトキヌレニナーゼに対して高い同一性を示す細菌キヌレニナーゼの遺伝子構築物、発現、及び精製
他の真核細胞キヌレニナーゼと同様に、ヒト酵素は３’−ＯＨキヌレニンの加水分解に対して選択性が高く、キヌレニンに対しては約１０００倍低い触媒活性を有する。キヌレニンに対する触媒活性が低いために、ヒト酵素は治療用目的には適していない。ＰＥＧ化Ｐｆ−ＫＹＮＵ（実施例９）、Ｍｕ−ＫＹＮＵ（実施例２２及び実施例２３）、またはＣｐ−ＫＹＮＵ（実施例１７）（全て、３’−ＯＨキヌレニンの代わりにキヌレニンに高い触媒活性を示す）を投与することにより、実施例９（図３）に示すように、腫瘍増殖の遅延がもたらされた。しかし、同様、またはより多くの用量でＰＥＧ化ヒトキヌレニナーゼを投与することでは、Ｂ１６黒色腫腫瘍の増殖に対する効果は見られなかった（ｎ＝４）。しかし、実施例２０に示すように、ｈ−ＫＹＮＵを組み換えることにより、ヒト酵素のＬ−キヌレニン分解活性を向上させることができる。かかる組み換えｈ−ＫＹＮＵ変異体は、ＰＥＧ化Ｐｆ−ＫＹＮＵ（実施例９）、Ｍｕ−ＫＹＮＵ（実施例２２及び実施例２３）、並びにＣｐ−ＫＹＮＵ（実施例１７）に見られるように、腫瘍増殖の遅延をもたらす場合がある。
【０１７４】
Ｐｆ−ＫＹＮＵはヒトＫＮＹＵに対して低い配列同一性を示す（２４％のアミノ酸同一性）。ヒトタンパク質に対する低い配列同一性のために、Ｐｆ−ＫＹＮＵは有害な免疫応答、及び中和抗体の産生を誘発する場合がある。したがって、キヌレニンに対して高い触媒活性及び選択性を示し、ヒトキヌレニナーゼに対して高いアミノ酸同一性を有するキヌレニナーゼ酵素を発見することが重要である。発明者らは、ヒトキヌレニナーゼに対して＞３８％のアミノ酸同一性を示し、高いキヌレニン加水分解活性もまた示す多数の細菌酵素を認めた。これらの酵素の配列は配列番号：１３〜５２として提供する。ヒトキヌレニナーゼと比較してのこれらの酵素の％同一性を表１に提供する。例示的実施例として、ムチラギニバクター・パルジス由来のキヌレニナーゼ酵素（Ｍｕ−ＫＹＮＵ）を発現させるための遺伝子（配列番号：３３）を、ＤＮＡ−Ｗｏｒｋｓソフトウェア（Ｈｏｏｖｅｒ  ａｎｄ  Ｌｕｂｋｏｗｓｋｉ，２００２）を使用して設計した２つのコドン最適化遺伝子のブロックのオーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により構築した。完全長遺伝子は、Ｎ末端ＮｃｏＩ制限酵素部位、最適化したＲＢＳ、Ｎ末端Ｈｉｓ６タグ、Ｅ．  ｃｏｌｉコドン最適化Ｍｕ−ＫＹＮＵ遺伝子、終止コドン、及びＣ末端ＥｃｏＲＩ制限酵素部位を含む。上述の制限酵素部位を使用して、組み立てた遺伝子をｐＥＴ−２８ａ＋ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）内にクローニングした。この構築物を使用して次に、発現用のＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．  ｃｏｌｉを形質転換した。細胞を、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）培地内で２１０ｒｐｍで振盪しながら、３７℃で増殖させた。ＯＤ６００  約１．０に到達した際に、ＩＰＴＧ（０．５ｍＭの終濃度）を加え、３７℃で引き続き一晩攪拌することにより発現を誘発した。次に、細胞を遠心分離により回収し、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、３００ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのピリドキサールリン酸（ｐｙｒｉｄｏｘｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（ＰＬＰ）、１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル、及び１μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅからなる細胞溶解緩衝液内に再懸濁させた。細胞溶解をフレンチプレスにより完了させ、溶解物を２０，０００×ｇで４℃にて１時間遠心分離することにより、微粒子を除いた。次に上清を５μｍの注射器フィルターに通して濾過し、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、３００ｍＭのＮａＣｌ、及び０．１ｍＭのＰＬＰの緩衝液で予め平衡化したＮｉ−ＮＴＡ／アガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎ）にアプライした。溶解物をカラム上にロードした後、樹脂を５カラム体積（ＣＶ）の５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、３００ｍＭのＮａＣｌ、及び３０ｍＭのイミダゾールを含む０．１ｍＭのＰＬＰで洗浄した。洗浄した酵素を次に、０．１ｍＭのＰＬＰと２５０ｍＭのイミダゾールを含む５ＣＶのＰＢＳに溶出した。この時点で、酵素の緩衝液を新鮮なＰＢＳに交換してイミダゾールを取り除き、１０％グリセロールを加えて、アリコートを液体窒素内で急速に、保管のために−８０℃に冷凍した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に基づくと通常の酵素純度は＞９５％であり、典型���な収率は平均で７５ｍｇ／Ｌ培養物であった。Ａｂｓ２８０ｎｍを測定し、計算した酵素吸光係数７８，１８５Ｍ−１ｃｍ−１を使用してタンパク質の量を測定した。
（表１）ヒトキヌレニナーゼと比較した、真正細菌キヌレニナーゼ酵素の％同一性。
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【０１７５】
実施例１５−ムチラギニバクター・パルジスのキヌレニナーゼ（Ｍｕ−ＫＹＮＵ）の反応速度パラメータ
分光光度アッセイによりＭｕ−ＫＹＮＵの反応速度パラメータを定量化した。ここでは、酵素基質であるＬ−キヌレニンの最大吸光度の減衰を時間の関数として監視した。Ｌ−キヌレニン溶液をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中で調製し、１６μＭ〜５００μＭの範囲の終濃度となった。Ｌ−キヌレニンは３６５ｎｍにおけるλｍａｘが４，５００Ｍ−１ｃｍ−１の吸光係数を有する一方、キヌレニナーゼ反応の生成物であるＬ−アントラニル酸及びＬ−アラニンは３６５ｎｍにて認識可能な程度の吸光を行わない。酵素溶液（約２０ｎＭの終濃度）を加えて酵素溶液を基質溶液と速やかに混合することにより反応を開始し、２５℃における基質の喪失を、時間の経過とともにＡｂｓ３６５ｎｍを測定することにより監視した。得られたデータを加工し、反応速度係数を決定するためにミカエリス・メンテン式に当てはめた。Ｍｕ−ＫＹＮＵはｋｃａｔ／ＫＭ＝１．２×１０５Ｍ−１ｓ−１であると測定された。
【０１７６】
実施例１６−ムチラギニバクター・パルジスのキヌレニナーゼ（Ｍｕ−ＫＹＮＵ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ安定性
Ｍｕ−ＫＹＮＵのｉｎ  ｖｉｔｒｏ安定性を測定するために、酵素をＰＢＳ緩衝液またはプールしたヒト血清のいずれかに加え、終濃度を１０μＭにし、３７℃でインキュベーションした。この時点で、それぞれの一部（１０μＬ）を取り出し、Ｌ−キヌレニン／ＰＢＳの２５０μＭ溶液（９９０μＬ）に加えた。実施例３に記載のように、時間の経過とともに３６５ｎｍでの吸光度の減衰を測定することにより反応の初速度を監視した。それぞれの時点におけるＬ−キヌレニン触媒作用の初速度を比較し、かつ、時間＝０における速度と比較することにより酵素の安定性を測定した。得られたデータを％活性対時間でプロットし、二相性減衰モデル（Ｓｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）に当てはめて半減期（Ｔ１／２）を測定した。ＰＢＳ中のＭｕ−ＫＹＮＵ酵素の活性は、７４％が残っている活性の振幅を有する１Ｔ１／２＝６時間、続いて２Ｔ１／２＝１５０時間であることが判明した（図７）。プールしたヒト血清中でのＭｕ−ＫＹＮＵ酵素の安定性は、３０％の活性が残っている振幅を有する１Ｔ１／２＝５時間、続いて２Ｔ１／２＝７３時間であることが判明した（図７）。
【０１７７】
実施例１７−クラミドフィラ・ペコルム（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｅｃｏｒｕｍ）からのキヌレニナーゼの遺伝子構築物、発現、及び精製
クラミドフィラ・ペコルム由来のキヌレニナーゼ酵素（Ｃｐ−ＫＹＮＵ）を発現させるための遺伝子を、Ｅ．  ｃｏｌｉコドン最適化遺伝子のブロックを使用して合成した。完全長遺伝子は、Ｎ末端ＮｃｏＩ制限酵素部位（ヌクレオチド１〜６）、開始コドン（ヌクレオチド３〜５）、Ｎ末端Ｈｉｓ６タグ（ヌクレオチド６〜３５）、Ｅ．  ｃｏｌｉコドン最適化Ｃｐ−ＫＹＮＵ遺伝子（ヌクレオチド３６〜１２９５）、終止コドン（ヌクレオチド１２９６〜１２９８）、及びＣ末端ＥｃｏＲＩ制限酵素部位（ヌクレオチド１２９９〜１３０４）を含む（配列番号：５３）。上述の制限酵素部位を使用して、組み立てた遺伝子をｐＥＴ−２８ａ＋ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）内にクローニングした。この構築物を使用して次に、発現用のＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．  ｃｏｌｉを形質転換した。細胞を、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）培地内で２１０ｒｐｍで振盪しながら、３７℃で増殖させた。ＯＤ６００が約１．０に到達した際に、ＩＰＴＧ（０．５ｍＭの最終濃度）を加え、１６℃で引き続き一晩攪拌することにより発現を誘発した。次に、細胞を遠心分離により回収し、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、３００ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのピリドキサールリン酸（ｐｙｒｉｄｏｘｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（ＰＬＰ）、１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル、及び１μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅからなる細胞溶解緩衝液内に再懸濁させた。細胞溶解をフレンチプレスにより完了させ、溶解物を２０，０００×ｇで４℃にて１時間遠心分離することにより、微粒子を除いた。次に上清を５μｍの注射器フィルターに通して濾過し、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、３００ｍＭのＮａＣｌ、及び０．１ｍＭのＰＬＰの緩衝液で予め平衡化したＮｉ−ＮＴＡ／アガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎ）にアプライした。溶解物をカラム上にロードした後、樹脂を１０カラム体積（ＣＶ）の５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、３００ｍＭのＮａＣｌ、及び３０ｍＭのイミダゾールを含む０．１ｍＭのＰＬＰで洗浄した。洗浄した酵素を次に、０．１ｍＭのＰＬＰ及び２５０ｍＭのイミダゾールを含有するＰＢＳ（５ＣＶ）で溶出した。溶出した酵素の緩衝液を新鮮なＰＢＳに交換してイミダゾールを取り除き、１０％グリセロールを加え、アリコートを液体窒素中で保存のために−８０℃で急速に凍結した。
【０１７８】
実施例１８−クラミドフィラ・ペコルムのキヌレニナーゼ（Ｃｐ−ＫＹＮＵ）の反応速度パラメータ
分光光度アッセイによりＣｐ−ＫＹＮＵ（配列番号：５７）の反応速度パラメータを定量化し、ここでは、酵素基質であるＬ−キヌレニンの最大吸光度の減衰が時間の関数として監視された。Ｌ−キヌレニン溶液をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中で調製し、１６μＭ〜５００μＭの範囲の終濃度となった。Ｌ−キヌレニンは３６５ｎｍにおけるλｍａｘが４，５００Ｍ−１ｃｍ−１の吸光係数を有する一方、キヌレニナーゼ反応の生成物であるアントラニレート及びＬ−アラニンは、３６５ｎｍにて認識可能な程度の吸光を行わない。酵素溶液（２００ｎＭの終濃度）を加えて酵素溶液を基質溶液と混合することにより反応を開始し、２５℃における基質の喪失を、時間の経過とともにＡｂｓ３６５ｎｍを測定することにより監視した。得られたデータを加工し、反応速度係数を決定するためにミカエリス・メンテン式に当てはめた。Ｃｐ−ＫＹＮＵはｋｃａｔ／ＫＭ＝３×１０４Ｍ−１ｓ−１であると測定された。
【０１７９】
実施例１９−ムチラギニバクター・パルジスからのキヌレニナーゼの薬理学的調製
ｉｎ  ｖｉｖｏでの酵素の循環時間を向上させるために、Ｍｕ−ＫＹＮＵの流体力学的半径を、タンパク質内の表面反応性基をＰＥＧにコンジュゲートすることにより官能化することで増加させた。一実施形態では、表面リジン残基をメトキシＰＥＧサクシニミジルカーボネート５０００ＭＷ（ＮＡＮＯＣＳ）と反応させることによりＭｕ−ＫＹＮＵをＰＥＧ化した。精製したＭｕ−ＫＹＮＵは、後述のように非常に少ないエンドトキシン量（＜２０ＥＵ／ｍｇ）を含有することが測定された。精製したＭｕ−ＫＹＮＵの緩衝液を、新鮮に調製した１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．４）に完全に交換し、１ｍｇ／ｍＬを超えるまで濃縮した。得られた溶液を、１００：１でモル過剰の固体ＰＥＧ試薬に直接加え、撹拌しながら１時間室温で反応させた。１００ｋＤａのカットオフ遠心分離濾過装置（Ａｍｉｃｏｎ）内の緩衝液を新鮮なエンドトキシン非含有のＰＢＳに完全に交換することにより、未反応のＰＥＧを溶液から取り除いた。次に、酵素の見かけの分子量を、ＢｉｏＲａｄのＭＷ標準液を使用してＰＢＳでのサイズ排除ＨＰＬＣカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）にて確認し、酵素保持時間を標準タンパク質の保持時間と比較した。Ｃｈｒｏｍｏ−ＬＡＬカイネティック比色式エンドトキシン試験キット（Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｏｆ  Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ，Ｉｎｃ．）を使用してエンドトキシンの濃度を定量化した。
【０１８０】
実施例２０−組み換えヒトヒトキヌレニナーゼ変異体での向上したＬ−キヌレニン分解
ｈ−ＫＹＮＵ酵素は３’−ＯＨキヌレニンの加水分解に対して非常に選択的であり、Ｌ−キヌレニンに対しては約１０００倍低い触媒活性を有する。Ｌ−キヌレニンに対しては触媒活性が不十分であるため、野生型ヒト酵素は治療目的には適していない。改善されたＬ−キヌレニン分解活性をｈ−ＫＹＮＵ内に組み込むために、ｈ−ＫＹＮＵ遺伝子、及びアミノ酸Ｆ３０６に対応するコドンの変異を誘発するように設計された一対のオリゴヌクレオチドを使用したオーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により飽和変異誘発ライブラリーを構築した。Ｆ３０６はｈ−ＫＹＮＵの活性部位内に位置し、基質結合に役割を果たしていると思われる。実施例６のマイクロタイタープレートキヌレニナーゼアッセイを使用して、Ｆ３０６飽和ライブラリーを活性に関してスクリーニングした。１２個を超えるクローンが野生型ｈ−ＫＹＮＵよりも著しく高い活性を示し、これらを更なる分析のために選択した。これらのクローンの配列を決定することで、位置Ｆ３０６の２つのアミノ酸置換、即ちｈ−ＫＹＮＵ−Ｆ３０６Ｍ（配列番号：：５５）及びｈ−ＫＹＮＵ−Ｆ３０６Ｌ（配列番号：：５６）がＬ−キヌレニン分解活性の増加をもたらしたことが明らかとなった。次にこれらの変異体を精製して均質にし、詳しく動態を分析することにより、野生型ｈ−ＫＹＮＵと比較して、ｈ−ＫＹＮＵ−Ｆ３０６Ｍ及びｈ−ＫＹＮＵ−Ｆ３０６Ｌのそれぞれに関して、Ｌ−キヌレニンに対するｋｃａｔ／ＫＭが２倍及び５倍増加したことが明らかとなった。
【０１８１】
改善されたＬ−キヌレニン分解活性をｈ−ＫＹＮＵに更に組み込むために、ｈ−ＫＹＮＵ遺伝子全体のエラープローンＰＣＲ法、またはオリゴヌクレオチドに対しての、構造解析及び系統解析（Ｃｏｌｅ  ａｎｄ  Ｇａｕｃｈｅｒ，２０１１）から選択された、潜在的に向上した活性及び／または基質選択性に寄与するアミノ酸の位置に対応するコドンの飽和変異誘発のいずれかにより一連のライブラリーを構築した。これらの位置としては、残基Ｈ４１、Ｌ５９、Ｆ７１、Ａ９８、Ａ９９、Ｇ１０１、Ｈ１０２、Ｉ１１０、Ｇ１１２、Ｍ１２０、Ｋ１２１、Ｄ１２２、Ｉ１３１、Ｎ１３５、Ａ１３６、Ｔ１３８、Ｈ１４２、Ｆ１４８、Ｆ１４９、Ｋ１５７、Ｓ１６７、Ａ１７１、Ｑ１７５、Ｑ２２９、Ｎ２３２、Ｇ２４８、Ｆ２４９、Ｅ２５９、Ｗ２７２、Ｓ２７４、Ａ２８２、Ｉ２８５、Ｇ２８７、Ａ２８８、Ｐ３００、Ｖ３０３、Ｆ３０６、Ｌ３２０、Ｌ３２２、Ｓ３３２、Ｎ３３３、Ｐ３３４、Ｌ３３７、Ｖ３３９、Ｔ４０４、Ｉ４０５、Ｓ４０８、及びＡ４３６が挙げられる。これらのライブラリーを２段階プロセスで分析した。まず、各ライブラリーを構築した後、得られたプラスミドをＥ．  ｃｏｌｉ−ΔｔｒｐＥ細胞に形質転換し、Ｌ−ｋｙｎの存在下においてＭ９最小培地プレート上に植菌し、実施例１３に記載の通り、この株のＬ−Ｔｒｐ栄養要求性の救出を可能にした変異体を選択した。次に、最も大きく成長したコロニーを選択し、続いて、実施例６に記載のマイクロタイタープレートキヌレニナーゼアッセイを使用して触媒活性を評価した。対照よりも明らかに大きな活性を示すクローンを配列決定して変異を識別し、続いて実施例２に記載のように精製してほぼ均質にし、定常期の反応速度パラメータについて詳細に評価した。本手法により、ＷＴ  ｈ−ＫＹＮＵと比較してＬ−Ｋｙｎの触媒が著しく改善された多くの変異体が得られた。表２は、ｋｃａｔ／ＫＭが≧２倍改善されたｈ−ＫＹＮＵ変異体を示す。
（表２）ＷＴ  ｈ−ＫＹＮＵよりも≧２倍大きなｋｃａｔ／ＫＭを示すｈ−ＫＹＮＵ変異体の反応速度
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【０１８２】
実施例２１−自家移植Ｂ１６マウス黒色腫モデルにおけるＰｆ−ＫＹＮＵ、抗ＰＤ１、及び抗ＣＴＬＡ−４治療の比較
ＰＥＧ化されたシュードモナス・フルオレッセンスのキヌレニナーゼ（ＰＥＧ−Ｐｆ−ＫＹＮＵ）を、抗ＰＤ１（クローンＲＭＰ１−１４、ＢｉｏＸＣｅｌｌ番号ＢＥ０１４６）または抗ＣＴＬＡ−４（クローンＵＣ１０−４Ｆ１０−１１、ＢｉｏＸＣｅｌｌ番号ＢＥ００３２）免疫チェックポイント阻害抗体と並べての比較においてＢ１６黒色腫マウスモデルで評価した。５００００個のＢ１６細胞をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの脇腹に注入した（０日目、各群においてｎ＝８匹のマウス）。明らかな腫瘍が成長すると（１０日目）、動物を２５０μｇの抗ＰＤ１、１００μｇの抗ＣＴＬＡ−４（Ｈｏｌｍｇａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）の通り、２００μｇが最初の用量）、または５００μｇのＰＥＧ−Ｐｆ−ＫＹＮＵのいずれかで、示す時間（図８）において処理した。熱不活性化ＰＥＧ−Ｐｆ−ＫＹＮＵを対照として使用した。ＰＥＧ−Ｐｆ−ＫＹＮＵを投与することにより、ＰＥＧ−Ｐｆ−ＫＹＮＵ対不活性化酵素またはＰＢＳのみに関しての、抗ＰＤ１または抗ＣＴＬＡ−４チェックポイント阻害抗体（図８）で観察されたものとは区別可能な腫瘍増殖の著しい遅延、そして生残の延長がもたらされた。
【０１８３】
実施例２２−自家移植Ｂ１６マウス黒色腫モデルにおけるＭｕ−ＫＹＮＵまたはＰｆ−ＫＹＮＵ及び抗ＰＤ１併用療法の効果
ＰＥＧ化酵素（ＰＥＧ−Ｐｆ−ＫＹＮＵ及びＰＥＧ−Ｍｕ−ＫＹＮＵ）を、抗ＰＤ１免疫チェックポイント阻害抗体（Ｃｕｒｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）と組み合わせてＢ１６黒色腫同種異系移植片で評価した。４つのグループのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（グループあたり１０匹）に５０，０００個のＢ１６細胞を注入し（０日目）、腫瘍を成長させた。明らかに腫瘍が成長すると（１０日目）、動物を、１０、１３、及び１６日目に、腫瘍部位付近で５００μｇのＰＥＧ−Ｐｆ−ＫＹＮＵまたは５００μｇのＰＥＧ−Ｍｕ−ＫＹＮＵを皮下投与するかまたはしないかのいずれかと、ＩＰ注射により２５０μｇの抗ＰＤ１で処理した（クローンＲＭＰ１−１４、ＢｉｏＸＣｅｌｌ番号ＢＥ０１４６）。マウスは１０日目から２５日目の間に、合計で６回のＫＹＮＵ投与を受けた。あるグループはＰＤ−１の対照としてＰＢＳの腹腔内注射を受けた。ＰＢＳ対照と比較して、処理した群の全てにおいて、腫瘍増殖は劇的に減少したか、あるいは消滅した（図９Ａ）。重要なことに、ＫＹＮＵとの組み合わせた抗ＰＤ１では相加効果が観察され、ＰＥＧ−Ｐｆ−ＫＹＮＵ／抗ＰＤ１処理では腫瘍の６０％が完全に寛解し、ＰＥＧ−Ｍｕ−ＫＹＮＵ／抗ＰＤ１処理では腫瘍の２０％が寛解した（図９Ｂ）。対応するカプラン・マイヤープロットを図９Ｃに提供する。
【０１８４】
実施例２３−自家移植Ｂ１６マウス黒色腫モデルにおけるＰＥＧ−Ｍｕ−ＫＹＮＵ治療法の効果
ＰＥＧ化されたムチラギニバクター・パルジスのキヌレニナーゼ（ＰＥＧ−Ｍｕ−ＫＹＮＵ）をＢ１６黒色腫マウスモデルで評価した。５０，０００個のＢ１６細胞をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの脇腹に注入する（０日目、グループあたり９匹のマウス）ことにより同種異系移植を開始した。明らかな腫瘍が成長すると（１０日目）、  腫瘍部位付近に３日毎に合計６回の投与を皮下注射することにより、５００μｇのＰＥＧ−Ｍｕ−ＫＹＮＵで動物を処理した。熱不活性化ＰＥＧ−Ｍｕ−ＫＹＮＵによる同一の治療レジメンを対照として使用した。ＰＥＧ−Ｍｕ−ＫＹＮＵの投与により、熱不活性化ＰＥＧ−Ｍｕ−ＫＹＮＵ対照（図１０Ｂ）の２２日目と比較して、腫瘍の増殖が遅延して（図１０Ａ）２５日目での生残期間の中央値が延びた。
【０１８５】
実施例２４−向上したキヌレニナーゼ活性に対する競合遺伝子選択の開発及び検証
規定の培地を利用した遺伝子選択法を考案し、コンビナトリアルライブラリーにおける、より活性の低いキヌレニナーゼ変異体を発現する大過剰のクローンからの、活性の増加を示すキヌレニナーゼ変異体を発現するＥ．  ｃｏｌｉクローンの単離を可能とした。混合したＭ９−ＫＹＮ培地である規定した培地は、Ｍ９最小塩、２ｍＭの硫酸マグネシウム、０．１ｍＭの塩化カルシウム、２％グルコース、１０μＭのＩＰＴＧ、アンピシリン、１００μＭのキヌレニン、及び水を含有した。実施例１３に記載の通り、Ｅ．  ｃｏｌｉΔｔｒｐＥ欠失変異体を遺伝子選択実験に利用した。Ｅ．  ｃｏｌｉΔｔｒｐＥ株をＹａｌｅ  ＣＧＳＣのＧｅｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓから入手し、株は遺伝子型（Ｆ−、Δ（ａｒａＤ−ａｒａＢ）５６７、ΔｌａｃＺ４７８７（：：ｒｒｎＢ−３）、λ−、ΔｔｒｐＥ７７２：：ｋａｎ、ｒｐｈ−１、Δ（ｒｈａＤ−ｒｈａＢ）５６８、ｈｓｄＲ５１４）を有した。ＩＰＴＧを誘導可能なｔａｃプロモーターの転写制御下において、ｈ−ＫＹＮＵ、Ｍｕ−ＫＹＮＵ、またはＰｆ−ＫＹＮＵのいずれかを発現するＥ．  ｃｏｌｉΔｔｒｐＥ細胞はＭ９−ＫＹＮ液体培地中で増殖することが可能であったが、キヌレニナーゼ酵素を有しないＥ．  ｃｏｌｉΔｔｒｐＥ細胞はＭ９−ＫＹＮ培地中で増殖することができず、このことは、Ｍ９−ＫＹＮ培地内での増殖に関して、Ｅ．  ｃｏｌｉΔｔｒｐＥ細胞に対する活性キヌレニナーゼ酵素が必要であることを示している。同様に、キヌレニンを欠く培地内では、ｈ−ＫＹＮＵ、Ｍｕ−ＫＹＮＵ、またはＰｆ−ＫＹＮＵを有するＥ．  ｃｏｌｉΔｔｒｐＥ細胞は増殖することができなかった。特に、活性が高いＰｆ−ＫＹＮＵを有する１０４個のＥ．  ｃｏｌｉΔｔｒｐＥ細胞を、２５ｍＬのＭ９−ＫＹＮ液体培地内に、２２０ｒｐｍで振盪させながら３７℃で播種した後、培養物は１８時間後にＯＤ６００＝２にて飽和に達した。対照的に、同じ数（１０４個）の、Ｍｕ−ＫＹＮＵを有するＥ．  ｃｏｌｉΔｔｒｐＥ細胞（４倍低い触媒活性）を播種すると、１８〜２４時間以内に飽和（ＯＤ６００＝２）に達した。同一条件下で、同一数の細胞を有するが、代わりに活性が低いｈ−ＫＹＮＵを発現する培養物を播種すると、＞４８時間で飽和（ＯＤ６００＝２）に達した。
【０１８６】
Ｍ９−ＫＹＮ培地を用いて、より活性の低いキヌレニナーゼ変異体からより活性の高いキヌレニナーゼ変異体の単離を可能にする、一般化した遺伝子選択プロセスを考案した。一般化した遺伝子選択において、変異したキヌレニナーゼ変異体のライブラリーを有する１０４〜１０１０個のＥ．  ｃｏｌｉΔｔｒｐＥ細胞の初期接種材料を、ＬＢ寒天＋０．１ｍｇ／ｍＬのアンピシリンプレートから掻き取り、２５ｍＬのＭ９−ＫＹＮ培地に播種した。初期接種材料として日常的に利用される細胞の数は、キヌレニナーゼの所与のライブラリーに関する変異体の推定数の１０倍の数であった。初期接種材料を、３０００×ｇで５分間遠心分離することによりペレッティングで３回洗浄し、上清を廃棄した後、１ｍＬの滅菌ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）中に再懸濁した。２５ｍＬのＭ９−ＫＹＮ培地内に播種した後、前の段落で記述したのと同一条件下にて、細胞をＯＤ６００＞１．０及び＜２．０まで増殖させた（１回継代培養）。１ｍＬの培養物からの細胞を、３０００ｘｇで５分間遠心分離することによりペレッティングで洗浄し、上清を廃棄した後、１ｍＬの滅菌ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）中に再懸濁した。この洗浄プロセスを３回繰り返した。その後、１回継代培養物を播種するために使用した細胞の数の２０％に等しい多数の細胞を使用して、新鮮なＭ９−ＫＹＮ培地（２５ｍＬ）を播種した。次に細胞を、上述のようにＯＤ６００＞１．０かつ＜２．０まで増殖させた。この継代、及び後に続くそれぞれの継代に関して、前の継代で接種材料として使用した細胞の、前のラウンドでの数の２０％に等しい細胞を選択培地で増殖させ、ＯＤ６００＞１．０及び＜２．０まで増殖させた。複数ラウンドの継代を必要に応じて実施した。最終ラウンドの選択からの１０４個の細胞を、更なる分析のためにＬＢ寒天＋０．１ｍｇ／ｍＬのアンピシリンプレート上に植菌した。例えば、計算サイズ＝１．０×１０７のエラープローンライブラリーに関して、初期接種材料では１×１０８個の細胞を利用し、その後のラウンド２〜６では、それぞれ前のラウンドからの、２×１０７、４×１０６、８×１０５、１．６×１０５及び３．２×１０４個の細胞を利用し、続いて、選択用の６回目のラウンドからの１０４個の細胞を、更なる分析のためにＬＢ寒天＋０．１ｍｇ／ｍＬのアンピシリンプレートに植菌した。
【０１８７】
上の遺伝子選択プロセスを、より活性が低いキヌレニナーゼ変異体を発現する、１００または１０，０００倍超の細胞から、より活性が高いキヌレニナーゼ変異体を発現する細胞が向上を正しく行うことを実証することにより検証した。Ｐｆ−ＫＹＮＵを発現する１０４個のＥ．  ｃｏｌｉΔｔｒｐＥ細胞を、より活性が低いＭｕ−ＫＹＮＵを発現する１０８個のＥ．  ｃｏｌｉΔｔｒｐＥ細胞と混合した。これらの細胞をＬＢ培地＋０．１ｍｇ／ｍＬのアンピシリン内で一晩増殖させ、これらを３０００×ｇで５分間遠心分離することによりペレッティングで３回洗浄し、上清を廃棄し、続いて１ｍＬの滅菌ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）内に再懸濁し、その後、２５ｍＬのＭ９−ＫＹＮ液体培地内に播種し、２２０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で、ＯＤ６００＞１．０かつ＜２．０まで増殖させた。２回目、３回目、４回目、５回目、及び６回目のラウンドの選択に関して、接種材料はそれぞれ、前の培養物からの、洗浄した２×１０７、４×１０６、８×１０５、１．６×１０５、そして続いて３．２×１０４個の細胞を含んだ。選択培地の６ラウンドにわたる増殖の後、１０４個の細胞をＬＢ培地＋０．１ｍｇ／ｍＬのアンピシリンを含む寒天プレート上に植菌し、プラスミドＤＮＡを５つのコロニーから抽出し、ＤＮＡ塩基配列決定法に供した。５つのうち４つのプラスミドがＰｆ−ＫＹＮＵをコードし、１つが８０００倍の向上を示すＭｕ−ＫＹＮＵをコードした。別の実験では、野生型ｈ−ＫＹＮＵよりも１４倍高い活性を示す、ｈ−ＫＹＮＵのＦ７１Ｌ／Ａ９９Ｉ／Ｇ１１２Ａ／Ｔ１３８Ｓ／Ｆ３０６Ｙ／Ｌ３３７Ｖ／Ｖ３３９Ｉ／Ｉ４０５Ｌ／Ｓ４０８Ｎ／Ａ４３６Ｔ変異体（配列番号：９０）を発現する１０８個のＥ．  ｃｏｌｉΔｔｒｐＥ細胞を、野生型Ｍｕ−ＫＹＮＵ（野生型ｈ−ＫＹＮＵよりも３７０倍活性が高い）をコードする１０４個のＥ．  ｃｏｌｉΔｔｒｐＥ細胞と混合し、上記のＭ９−ＫＹＮ選択培地（２５ｍＬ）で増殖させた。選択培地での後の増殖ラウンドでは、前の選択ラウンドからの、洗浄した２×１０７、４×１０６、８×１０５、１．６×１０５、及び最後は３．２×１０４個の細胞を含む接種材料を利用した。６ラウンドの選択の後、１０４個の細胞をＬＢ培地＋０．１ｍｇ／ｍＬのアンピシリンを含む寒天プレート上に植菌し、プラスミドＤＮＡを５つのコロニーから抽出し、ＤＮＡ塩基配列決定法に供した。５つのプラスミド全てが、１０，０００倍の向上を示し、活性に基づいた選択を完全に示すことより活性なＭｕ−ＫＹＮＵをコードすることを示した。
【０１８８】
実施例２５−競合的遺伝子選択を利用して、キヌレニナーゼ活性が非常に向上したｈ−ＫＹＮＵ変異体を、シャッフル部位特異的飽和変異誘発、またはエラープローンＰＣＲライブラリーから単離する
改善されたＬ−キヌレニン分解活性をｈ−ＫＹＮＵに更に組み込むために、ＤＮＡシャッフリング、部位特異的飽和変異誘発、またはエラープローンＰＣＲにより、変異型酵素をコードする一連のライブラリーを構築した。これらのライブラリーからのプラスミドＤＮＡをＥ．  ｃｏｌｉΔｔｒｐＥ細胞に形質転換し、選択Ｍ９−ＫＹＮ培地内で増殖させた。実施例２４で記載した選択培地への連続的移動により数ラウンドの選択を行った後で、ＬＢ培地＋０．１ｍｇ／ｍＬのアンピシリンを含む寒天プレートに細胞を植菌した。個々のコロニーを取り出して９６ウェルプレート内で増殖させ、触媒活性を実施例６に記載の通りに測定した。対照よりも明らかに高い活性を示すクローンを配列決定して変異を測定した後、実施例２に記載のように精製してほぼ均質にし、定常状態での反応速度パラメータを詳細に評価した。これらの努力の結果、キヌレニン分解活性が向上した４つの変異体（配列番号：９０〜９３）の単離がもたらされた。
【０１８９】
本明細書で開示及び権利主張する方法は全て、本開示の見地から、過度な実験をすることなく作製及び実施可能である。好ましい実施態様の点から本発明の組成物及び方法について説明してきたが、本発明の発想、精神及び範囲から逸脱することなく、本明細書で記載される方法、及び方法の工程または一連の工程に変更を加えてよいことが、当業者に明らかとなるであろう。より具体的には、化学的及び生理学的の両方で関係するある種の作用物質が、本明細書で記載される作用物質と置換されてよいが、同一または同様の結果がもたらされることが明らかとなるであろう。当業者に明らかである、かかる全ての同様の代用品及び修正は、添付の特許請求の範囲により規定される本発明の精神、範囲及び発想の中にあると見なされる。
【０１９０】
参照文献
以下の参考文献は、本明細書で説明したものを補足する例示的手順または他の詳細を提供する程度においてまで、特異的に参考として本明細書に組み込まれている。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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