(57)【要約】生理学的に関連性のある条件下におけるペプチド／タンパク質分子上の選択的システイン及びセレノシステイン修飾の方法が開示される。本方法は、他の求核物質（例えば、アミン、ヒドロキシル）に勝るチオール及びセレノールに対する特異性、優れた官能基許容性、及び穏やかな反応条件などの、ペプチド修飾の既存の方法に勝るいくつかの利点を特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
チオールまたはセレノールを官能基化する方法であって、前記方法が、スキーム１によって表され、
【化１】
2017523964.tif 000091
式中、
Ａ１が、Ｈ、アミン保護基、アルキル、アリールアルキル、アシル、アリール、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、天然もしくは非天然アミノ酸、複数の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、または抗体断片であり、
Ａ２が、ＮＨ２、ＮＨ（アミド保護基）、Ｎ（アミド保護基）、ＯＨ、Ｏ（カルボキシレート保護基）、天然もしくは非天然アミノ酸、複数の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、または抗体断片であり、
Ｙが、ＳまたはＳｅであり、
Ｒ１が、Ｈ、アルキル、アリールアルキル、アシル、アリール、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、天然もしくは非天然アミノ酸、複数の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、または抗体断片であり、
Ｍが、Ｎｉ、Ｐｄ、Ｐｔ、Ｃｕ、またはＡｕであり、
Ａｒ１が、任意に置換されたアリール、ヘテロアリール、アルケニル、またはシクロアルケニルであり、
Ｘが、ハロゲン化物、トリフレート、テトラフルオロボレート、テトラアリールボレート、ヘキサフルオロアンチモネート、ビス（アルキルスルホニル）アミド、テトラフルオロホスフェート、ヘキサフルオロホスフェート、アルキルスルホネート、ハロアルキルスルホネート、アリールスルホネート、過塩素酸塩、ビス（フルオロアルキルスルホニル）アミド、ビス（アリールスルホニル）アミド、（フルオロアルキルスルホニル）（フルオロアルキル−カルボニル）アミド、硝酸塩、亜硝酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、アルキル硫酸塩、アリール硫酸塩、炭酸塩、重炭酸塩、カルボン酸塩、リン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、ホスフィン酸塩、または次亜塩素酸塩であり、
Ｌが、各出現につき独立して、トリアルキルホスフィン、トリアリールホスフィン、ジアルキルアリールホスフィン、アルキルジアリールホスフィン、（アルケニル）（アルキル）（アリール）ホスフィン、アルケニルジアリールホスフィン、アルケニルジアルキルホスフィン、酸化ホスフィン、ビス（ホスフィン）、ホスホラミド、トリアリールホスホネート、Ｎ−複素環状カルベン、任意に置換されたフェナントロリン、任意に置換されたイミノピリジン、任意に置換された２，２’−ビピリジン、任意に置換されたジイミン、任意に置換されたトリアゾリルピリジン、または任意に置換されたピラゾリルピリジンであり、
ｎが、１〜５の整数であり、
ｍが、１または２であり、
溶媒が、極性プロトン性溶媒、極性非プロトン性溶媒、または非極性溶媒である、方法。
【請求項２】
Ｌが、ＰＰｈ３、Ｐｈ２Ｐ−ＣＨ３、ＰｈＰ（ＣＨ３）２、Ｐ（ｏ−ｔｏｌ）３、ＰＣｙ３、Ｐ（ｔＢｕ）３、ＢＩＮＡＰ、ｄｐｐｂ、ｄｐｐｅ、ｄｐｐｆ、ｄｐｐｐ、
【化２−１】
2017523964.tif 000092
【化２−２】
2017523964.tif 000093
【化２−３】
2017523964.tif 000094
からなる群から選択され、
Ｒｘが、各出現につき独立して、アルキル、アラルキル、シクロアルキル、またはアリールであり、
Ｘ１が、ＣＨまたはＮであり、
Ｒ２が、Ｈまたはアルキルであり、
Ｒ３が、Ｈまたはアルキルであり、
Ｒ４が、Ｈ、アルコキシ、またはアルキルであり、
Ｒ５が、アルキルまたはアリールであり、
Ｒ６が、アルキルまたはアリールであり、
ｑが、１、２、３、または４である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｌが、ＰＰｈ３、Ｐｈ２Ｐ−ＣＨ３、ＰｈＰ（ＣＨ３）２、Ｐ（ｏ−ｔｏｌ）３、ＰＣｙ３、Ｐ（ｔＢｕ）３、ＢＩＮＡＰ、ｄｐｐｂ、ｄｐｐｅ、ｄｐｐｆ、ｄｐｐｐ、
【化３−１】
2017523964.tif 000095
【化３−２】
2017523964.tif 000096
【化３−３】
2017523964.tif 000097
からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
Ｍが、ＰｄまたはＮｉである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ＭがＰｄであり、Ｌが、
【化４−１】
2017523964.tif 000098
【化４−２】
2017523964.tif 000099
である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
Ｌが、
【化５】
2017523964.tif 000100
である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
Ｌが、
【化６】
2017523964.tif 000101
である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＭがＮｉであり、Ｌが、ＢＩＮＡＰ、ｄｐｐｂ、ｄｐｐｅ、ｄｐｐｆ、ｄｐｐｐ、
【化７】
2017523964.tif 000102
である、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
Ｌがｄｐｐｆである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
Ｌが、
【化８】
2017523964.tif 000103
である、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
Ｌが、
【化９】
2017523964.tif 000104
である、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
Ｘが、ハロゲン化物またはトリフレートである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
Ａｒ１が、（Ｃ６〜Ｃ１０）炭素環式アリール、（Ｃ３〜Ｃ１２）ヘテロアリール、（Ｃ３〜Ｃ１４）多環式アリール、またはアルケニルであり、かつＡｒ１が、任意に、ハロゲン化物、アシル、アジド、イソチオシアネート、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニルまたは保護されたアルキニル、アルコキシル、アリールカルボニル、シクロアルキル、ホルミル、ハロアルキル、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、アミド、ホスホネート、ホスフィネート、アルキルチオ、スルホニル、スルホンアミド、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、−ＣＦ３、−ＣＦ２Ｒ７、−ＣＦＲ７２、−ＣＮ、ポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン、及び−（ＣＨ２）ｐ−ＦＧ−Ｒ７からなる群から独立して選択される１つ以上の置換基によって置換され、
ｐが、各出現につき独立して、０〜１０の整数であり、
ＦＧが、各出現につき独立して、Ｃ（Ｏ）、ＣＯ２、Ｏ（ＣＯ）、Ｃ（Ｏ）ＮＲ７、ＮＲ７Ｃ（Ｏ）、Ｏ、Ｓｉ（Ｒ７）２、Ｃ（ＮＲ７）、（Ｒ７）２Ｎ（ＣＯ）Ｎ（Ｒ７）２、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ７、ＮＲ７Ｃ（Ｏ）Ｏ、及びＣ（Ｎ＝Ｎ）からなる群から選択され、
Ｒ７が、各出現につき独立して、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、アルケニル、及びアルキニルからなる群から選択され、
２つ以上の置換基がＡｒ１上に存在する場合には、前記置換基のうちの２つが一緒になって、環を形成してもよい、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
Ａｒ１が、蛍光体、造影剤、検出試薬、生体分子、治療薬、親油性部分、高親和性結合対の成員、または細胞−受容体標的化剤に共有結合される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
Ａｒ１が、ビオチンに共有結合される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
Ａｒ１が、フルオレセインに共有結合される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
Ａｒ１が、治療薬に共有結合され、前記治療薬が、トラメチニブ、トポテカン、アビラテロン、ダブラフェニブ、またはバンデタニブである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
Ａｒ１が、蛍光体によって構成される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
Ａｒ１が、治療薬によって構成される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記治療薬が、トラメチニブ、トポテカン、アビラテロン、ダブラフェニブ、またはバンデタニブである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
Ａ１及びＡ２が、独立して、天然もしくは非天然アミノ酸、複数の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
Ａ１が、アルギニン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、プロリン、チロシン、またはトリプトファンを含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
Ａ２が、アルギニン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、プロリン、チロシン、またはトリプトファンを含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
Ａ１及びＡ２が、システインまたはセレノシステインを含まない、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
限定試薬が、
【化１０】
2017523964.tif 000105
である、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
Ａ１及びＡ２が、−ＳＨまたは−ＳｅＨ部分を含むとき、
2017523964.tif 000106
の量対
2017523964.tif 000107
の量に  
2017523964.tif 000108
中の−ＳＨ及び−ＳｅＨ部分の総数を乗じたモル比が、１：１超である、請求項１〜２３及び２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
Ｒ１がＨである、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
Ｘがハロゲン化物である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
Ｘが塩化物である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
Ｘがトリフレートである、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
Ａ１及びＡ２が、共有結合される、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
溶媒が水を含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記溶媒が水性緩衝液を含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
バイオポリマー中のチオールまたはセレノールを官能基化する方法であって、チオールまたはセレノール部分を含むバイオポリマーを、構造式ＩＩの試薬と接触させ、これによって、前記チオールまたはセレノール部分が、−Ｓ−Ａｒ１または−Ｓｅ−Ａｒ１に変換された官能基化バイオポリマーを生成することを含み、
【化１１】
2017523964.tif 000109
式中、
Ｍが、Ｎｉ、Ｐｄ、またはＰｔであり、
Ａｒ１が、任意に置換されたアリール、ヘテロアリール、アルケニル、またはシクロアルケニルであり、
Ｘが、ハロゲン化物、トリフレート、テトラフルオロボレート、テトラアリールボレート、ヘキサフルオロアンチモネート、ビス（アルキルスルホニル）アミド、テトラフルオロホスフェート、ヘキサフルオロホスフェート、アルキルスルホネート、ハロアルキルスルホネート、アリールスルホネート、過塩素酸塩、ビス（フルオロアルキルスルホニル）アミド、ビス（アリールスルホニル）アミド、（フルオロアルキルスルホニル）（フルオロアルキル−カルボニル）アミド、硝酸塩、亜硝酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、アルキル硫酸塩、アリール硫酸塩、炭酸塩、重炭酸塩、カルボン酸塩、リン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、ホスフィン酸塩、または次亜塩素酸塩であり、
Ｌが、各出現につき独立して、トリアルキルホスフィン、トリアリールホスフィン、ジアルキルアリールホスフィン、アルキルジアリールホスフィン、（アルケニル）（アルキル）（アリール）ホスフィン、アルケニルジアリールホスフィン、アルケニルジアルキルホスフィン、酸化ホスフィン、ビス（ホスフィン）、ホスホラミド、トリアリールホスホネート、Ｎ−複素環状カルベン、任意に置換されたフェナントロリン、任意に置換されたイミノピリジン、任意に置換された２，２’−ビピリジン、任意に置換されたジイミン、任意に置換されたトリアゾリルピリジン、または任意に置換されたピラゾリルピリジンであり、
ｍが、１または２である、方法。
【請求項３５】
前記バイオポリマーが、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、オリゴ糖、または多糖である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
Ｌが、ＰＰｈ３、Ｐｈ２Ｐ−ＣＨ３、ＰｈＰ（ＣＨ３）２、Ｐ（ｏ−ｔｏｌ）３、ＰＣｙ３、Ｐ（ｔＢｕ）３、ＢＩＮＡＰ、ｄｐｐｂ、ｄｐｐｅ、ｄｐｐｆ、ｄｐｐｐ、
【化１２−１】
2017523964.tif 000110
【化１２−２】
2017523964.tif 000111
【化１２−３】
2017523964.tif 000112
からなる群から選択され、
Ｒｘが、各出現につき独立して、アルキル、アラルキル、シクロアルキル、またはアリールであり、
Ｘ１が、ＣＨまたはＮであり、
Ｒ２が、Ｈまたはアルキルであり、
Ｒ３が、Ｈまたはアルキルであり、
Ｒ４が、Ｈ、アルコキシ、またはアルキルであり、
Ｒ５が、アルキルまたはアリールであり、
Ｒ６が、アルキルまたはアリールであり、
ｑが、１、２、３、または４である、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
Ｌが、ＰＰｈ３、Ｐｈ２Ｐ−ＣＨ３、ＰｈＰ（ＣＨ３）２、Ｐ（ｏ−ｔｏｌ）３、ＰＣｙ３、Ｐ（ｔＢｕ）３、ＢＩＮＡＰ、ｄｐｐｂ、ｄｐｐｅ、ｄｐｐｆ、ｄｐｐｐ、
【化１３−１】
2017523964.tif 000113
【化１３−２】
2017523964.tif 000114
からなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
Ｍが、ＰｄまたはＮｉである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
ＭがＰｄであり、Ｌが、
【化１４−１】
2017523964.tif 000115
【化１４−２】
2017523964.tif 000116
である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
Ｌが、
【化１５】
2017523964.tif 000117
である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
Ｌが、
【化１６】
2017523964.tif 000118
である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
ＭがＮｉであり、Ｌが、ＢＩＮＡＰ、ｄｐｐｂ、ｄｐｐｅ、ｄｐｐｆ、ｄｐｐｐ、
【化１７】
2017523964.tif 000119
である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４３】
Ｌがｄｐｐｆである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
Ｌが、
【化１８】
2017523964.tif 000120
である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４５】
Ｌが、
【化１９】
2017523964.tif 000121
である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４６】
Ｘが、ハロゲン化物またはトリフレートである、請求項３４〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
Ａｒ１が、（Ｃ６〜Ｃ１０）炭素環式アリール、（Ｃ３〜Ｃ１２）ヘテロアリール、（Ｃ３〜Ｃ１４）多環式アリール、またはアルケニルであり、かつＡｒ１が、任意に、ハロゲン化物、アシル、アジド、イソチオシアネート、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニルまたは保護されたアルキニル、アルコキシル、アリールカルボニル、シクロアルキル、ホルミル、ハロアルキル、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、アミド、ホスホネート、ホスフィネート、アルキルチオ、スルホニル、スルホンアミド、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、−ＣＦ３、−ＣＦ２Ｒ７、−ＣＦＲ７２、−ＣＮ、ポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン、及び−（ＣＨ２）ｐ−ＦＧ−Ｒ７からなる群から独立して選択される１つ以上の置換基によって置換され、
ｐが、各出現につき独立して、０〜１０の整数であり、
ＦＧが、各出現につき独立して、Ｃ（Ｏ）、ＣＯ２、Ｏ（ＣＯ）、Ｃ（Ｏ）ＮＲ７、ＮＲ７Ｃ（Ｏ）、Ｏ、Ｓｉ（Ｒ７）２、Ｃ（ＮＲ７）、（Ｒ７）２Ｎ（ＣＯ）Ｎ（Ｒ７）２、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ７、ＮＲ７Ｃ（Ｏ）Ｏ、及びＣ（Ｎ＝Ｎ）からなる群から選択され、
Ｒ７が、各出現につき独立して、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、アルケニル、及びアルキニルからなる群から選択され、
２つ以上の置換基がＡｒ１上に存在する場合には、前記置換基のうちの２つが一緒になって、環を形成してもよい、請求項３４〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
Ａｒ１が、蛍光体、造影剤、検出試薬、生体分子、治療薬、親油性部分、高親和性結合対の成員、または細胞−受容体標的化剤に共有結合される、請求項３４〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
Ａｒ１が、ビオチンに共有結合される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
Ａｒ１が、フルオレセインに共有結合される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
Ａｒ１が、治療薬に共有結合され、前記治療薬が、トラメチニブ、トポテカン、アビラテロン、ダブラフェニブ、またはバンデタニブである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
Ａｒ１が、蛍光体によって構成される、請求項３４〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
Ａｒ１が、治療薬によって構成される、請求項３４〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記治療薬が、トラメチニブ、トポテカン、アビラテロン、ダブラフェニブ、またはバンデタニブである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
方法であって、前記方法が、スキーム４によって表され、
【化２０】
2017523964.tif 000122
式中、
Ａ１が、Ｈ、アミン保護基、アルキル、アリールアルキル、アシル、アリール、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、天然もしくは非天然アミノ酸、複数の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、または抗体断片であり、
Ａ２が、ＮＨ２、ＮＨ（アミド保護基）、Ｎ（アミド保護基）、ＯＨ、Ｏ（カルボキシレート保護基）、天然もしくは非天然アミノ酸、複数の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、または抗体断片であり、
Ａ３、Ａ４、及びＡ５が、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、及び複数の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸からなる群から選択され、
Ｙが、ＳまたはＳｅであり、
Ｒ１が、Ｈ、アルキル、アリールアルキル、アシル、アリール、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、天然もしくは非天然アミノ酸、複数の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、または抗体断片であり、
Ｍが、Ｎｉ、Ｐｄ、Ｐｔ、Ｃｕ、またはＡｕであり、
Ｒｙが、芳香族基、ヘテロ芳香族基、アルケン基、またはシクロアルケン基を含む任意に置換された架橋部分であり、
ｙが、２、３、４、５、または６であり、
Ｘが、ハロゲン化物、トリフレート、テトラフルオロボレート、テトラアリールボレート、ヘキサフルオロアンチモネート、ビス（アルキルスルホニル）アミド、テトラフルオロホスフェート、ヘキサフルオロホスフェート、アルキルスルホネート、ハロアルキルスルホネート、アリールスルホネート、過塩素酸塩、ビス（フルオロアルキルスルホニル）アミド、ビス（アリールスルホニル）アミド、（フルオロアルキルスルホニル）（フルオロアルキル−カルボニル）アミド、硝酸塩、亜硝酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、アルキル硫酸塩、アリール硫酸塩、炭酸塩、重炭酸塩、カルボン酸塩、リン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、ホスフィン酸塩、または次亜塩素酸塩であり、
Ｌが、各出現につき独立して、トリアルキルホスフィン、トリアリールホスフィン、ジアルキルアリールホスフィン、アルキルジアリールホスフィン、（アルケニル）（アルキル）（アリール）ホスフィン、アルケニルジアリールホスフィン、アルケニルジアルキルホスフィン、酸化ホスフィン、ビス（ホスフィン）、ホスホラミド、トリアリールホスホネート、Ｎ−複素環状カルベン、任意に置換されたフェナントロリン、任意に置換されたイミノピリジン、任意に置換された２，２’−ビピリジン、任意に置換されたジイミン、任意に置換されたトリアゾリルピリジン、または任意に置換されたピラゾリルピリジンであり、
ｎが、１〜５の整数であり、
ｍが、１または２であり、
各Ｚが、独立して
【化２１】
2017523964.tif 000123
−Ｓ−アルキル、−ＳＨ、−Ｓ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ２Ｈ、−ＳＣＨ（ＣＨ３）−ＣＯ２Ｈ、または−ＳＣＨ（ＣＯ２Ｈ）−ＣＨ２ＣＯ２Ｈであり、
溶媒が、極性プロトン性溶媒、極性非プロトン性溶媒、または非極性溶媒である、方法。
【請求項５６】
Ｌが、ＰＰｈ３、Ｐｈ２Ｐ−ＣＨ３、ＰｈＰ（ＣＨ３）２、Ｐ（ｏ−ｔｏｌ）３、ＰＣｙ３、Ｐ（ｔＢｕ）３、ＢＩＮＡＰ、ｄｐｐｂ、ｄｐｐｅ、ｄｐｐｆ、ｄｐｐｐ、
【化２２−１】
2017523964.tif 000124
【化２２−２】
2017523964.tif 000125
【化２２−３】
2017523964.tif 000126
からなる群から選択され、
Ｒｘが、各出現につき独立して、アルキル、アラルキル、シクロアルキル、またはアリールであり、
Ｘ１が、ＣＨまたはＮであり、
Ｒ２が、Ｈまたはアルキルであり、
Ｒ３が、Ｈまたはアルキルであり、
Ｒ４が、Ｈ、アルコキシ、またはアルキルであり、
Ｒ５が、アルキルまたはアリールであり、
Ｒ６が、アルキルまたはアリールであり、
ｑが、１、２、３、または４である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
Ｌが、ＰＰｈ３、Ｐｈ２Ｐ−ＣＨ３、ＰｈＰ（ＣＨ３）２、Ｐ（ｏ−ｔｏｌ）３、ＰＣｙ３、Ｐ（ｔＢｕ）３、ＢＩＮＡＰ、ｄｐｐｂ、ｄｐｐｅ、ｄｐｐｆ、ｄｐｐｐ、
【化２３−１】
2017523964.tif 000127
【化２３−２】
2017523964.tif 000128
【化２３−３】
2017523964.tif 000129
からなる群から選択される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
Ｍが、ＰｄまたはＮｉである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
ＭがＰｄであり、Ｌが、
【化２４−１】
2017523964.tif 000130
【化２４−２】
2017523964.tif 000131
である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
Ｌが、
【化２５】
2017523964.tif 000132
である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
Ｌが、
【化２６】
2017523964.tif 000133
である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
ＭがＮｉであり、Ｌが、ＢＩＮＡＰ、ｄｐｐｂ、ｄｐｐｅ、ｄｐｐｆ、ｄｐｐｐ、
【化２７】
2017523964.tif 000134
である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６３】
Ｌがｄｐｐｆである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
Ｌが、
【化２８】
2017523964.tif 000135
である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６５】
Ｌが、
【化２９】
2017523964.tif 000136
である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６６】
Ｘが、ハロゲン化物またはトリフレートである、請求項５５〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
Ｒｙが、芳香族基を含む、請求項５５〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
ｙが２であり、Ｒｙが、
【化３０】
2017523964.tif 000137
からなる群から選択される、請求項５５〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
Ａ１及びＡ２が、独立して、天然もしくは非天然アミノ酸、複数の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である、請求項５５〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
Ａ１が、アルギニン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、プロリン、チロシン、またはトリプトファンを含む、請求項５５〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
Ａ２が、アルギニン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、プロリン、チロシン、またはトリプトファンを含む、請求項５５〜７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
Ａ１及びＡ２が、システインまたはセレノシステインを含まない、請求項５５〜７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
Ｒ１がＨである、請求項５５〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
Ｘがハロゲン化物である、請求項５５〜７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
Ｘが塩化物である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
Ｘがトリフレートである、請求項５５〜７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
Ａ１及びＡ２が、共有結合される、請求項５５〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
溶媒が水を含む、請求項５５〜７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記溶媒が水性緩衝液を含む、請求項５５〜７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
方法であって、
第１のチオール部分または第１のセレノール部分と、第２のチオールまたは第２のセレノール部分とを含むバイオポリマーを、式ＩＶの試薬と接触させて、これによって、前記第１のチオール部分または前記第１のセレノール部分が、−Ｒｙによって前記第２のチオール部分または前記第２のセレノール部分に共有結合された、官能基化バイオポリマーを生成することを含み、
【化３１】
2017523964.tif 000138
式中、各出現につき独立して、
Ｍが、Ｎｉ、Ｐｄ、Ｐｔ、Ｃｕ、またはＡｕであり、
Ｒｙが、芳香族基、ヘテロ芳香族基、アルケン基、またはシクロアルケン基を含む任意に置換された架橋部分であり、
ｙが、２、３、４、５、または６であり、
Ｘが、ハロゲン化物、トリフレート、テトラフルオロボレート、テトラアリールボレート、ヘキサフルオロアンチモネート、ビス（アルキルスルホニル）アミド、テトラフルオロホスフェート、ヘキサフルオロホスフェート、アルキルスルホネート、ハロアルキルスルホネート、アリールスルホネート、過塩素酸塩、ビス（フルオロアルキルスルホニル）アミド、ビス（アリールスルホニル）アミド、（フルオロアルキルスルホニル）（フルオロアルキル−カルボニル）アミド、硝酸塩、亜硝酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、アルキル硫酸塩、アリール硫酸塩、炭酸塩、重炭酸塩、カルボン酸塩、リン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、ホスフィン酸塩、または次亜塩素酸塩であり、
Ｌが、各出現につき独立して、トリアルキルホスフィン、トリアリールホスフィン、ジアルキルアリールホスフィン、アルキルジアリールホスフィン、（アルケニル）（アルキル）（アリール）ホスフィン、アルケニルジアリールホスフィン、アルケニルジアルキルホスフィン、酸化ホスフィン、ビス（ホスフィン）、ホスホラミド、トリアリールホスホネート、Ｎ−複素環状カルベン、任意に置換されたフェナントロリン、任意に置換されたイミノピリジン、任意に置換された２，２’−ビピリジン、任意に置換されたジイミン、任意に置換されたトリアゾリルピリジン、または任意に置換されたピラゾリルピリジンであり、
ｍが、１または２である、方法。
【請求項８１】
前記バイオポリマーが、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、オリゴ糖、または多糖である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
Ｌが、ＰＰｈ３、Ｐｈ２Ｐ−ＣＨ３、ＰｈＰ（ＣＨ３）２、Ｐ（ｏ−ｔｏｌ）３、ＰＣｙ３、Ｐ（ｔＢｕ）３、ＢＩＮＡＰ、ｄｐｐｂ、ｄｐｐｅ、ｄｐｐｆ、ｄｐｐｐ、
【化３２−１】
2017523964.tif 000139
【化３２−２】
2017523964.tif 000140
【化３２−３】
2017523964.tif 000141
からなる群から選択され、
Ｒｘが、各出現につき独立して、アルキル、アラルキル、シクロアルキル、またはアリールであり、
Ｘ１が、ＣＨまたはＮであり、
Ｒ２が、Ｈまたはアルキルであり、
Ｒ３が、Ｈまたはアルキルであり、
Ｒ４が、Ｈ、アルコキシ、またはアルキルであり、
Ｒ５が、アルキルまたはアリールであり、
Ｒ６が、アルキルまたはアリールであり、
ｑが、１、２、３、または４である、請求項８０または８１に記載の方法。
【請求項８３】
Ｌが、ＰＰｈ３、Ｐｈ２Ｐ−ＣＨ３、ＰｈＰ（ＣＨ３）２、Ｐ（ｏ−ｔｏｌ）３、ＰＣｙ３、Ｐ（ｔＢｕ）３、ＢＩＮＡＰ、ｄｐｐｂ、ｄｐｐｅ、ｄｐｐｆ、ｄｐｐｐ、
【化３３−１】
2017523964.tif 000142
【化３３−２】
2017523964.tif 000143
【化３３−３】
2017523964.tif 000144
からなる群から選択される、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
Ｍが、ＰｄまたはＮｉである、請求項８２に記載の方法。
【請求項８５】
ＭがＰｄであり、Ｌが、
【化３４−１】
2017523964.tif 000145
【化３４−２】
2017523964.tif 000146
【化３４−３】
2017523964.tif 000147
である、請求項８２に記載の方法。
【請求項８６】
Ｌが、
【化３５】
2017523964.tif 000148
である、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
Ｌが、
【化３６】
2017523964.tif 000149
である、請求項８５に記載の方法。
【請求項８８】
ＭがＮｉであり、Ｌが、ＢＩＮＡＰ、ｄｐｐｂ、ｄｐｐｅ、ｄｐｐｆ、ｄｐｐｐ、
【化３７】
2017523964.tif 000150
である、請求項８２に記載の方法。
【請求項８９】
Ｌがｄｐｐｆである、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
Ｌが、
【化３８】
2017523964.tif 000151
である、請求項８２に記載の方法。
【請求項９１】
Ｌが、
【化３９】
2017523964.tif 000152
である、請求項８２に記載の方法。
【請求項９２】
Ｘが、ハロゲン化物またはトリフレートである、請求項８０〜９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
Ｒｙが、芳香族基を含む、請求項８０〜９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
ｙが２であり、Ｒｙが、
【化４０】
2017523964.tif 000153
からなる群から選択される、請求項８０〜９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
Ａｒ１が、少なくとも１つのハロゲン化物置換基によって置換され、かつアシル、アジド、イソチオシアネート、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニルまたは保護されたアルキニル、アルコキシル、アリールカルボニル、シクロアルキル、ホルミル、ハロアルキル、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、アミド、ホスホネート、ホスフィネート、アルキルチオ、スルホニル、スルホンアミド、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、−ＣＦ３、−ＣＦ２Ｒ７、−ＣＦＲ７２、−ＣＮ、ポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン、及び−（ＣＨ２）ｐ−ＦＧ−Ｒ７からなる群から独立して選択される１つ以上の置換基によって任意に置換された（Ｃ６〜Ｃ１０）炭素環式アリール、（Ｃ３〜Ｃ１２）ヘテロアリール、（Ｃ３〜Ｃ１４）多環式アリール、またはアルケニルであり、
ｐが、各出現につき独立して、０〜１０の整数であり、
ＦＧが、各出現につき独立して、Ｃ（Ｏ）、ＣＯ２、Ｏ（ＣＯ）、Ｃ（Ｏ）ＮＲ７、ＮＲ７Ｃ（Ｏ）、Ｏ、Ｓｉ（Ｒ７）２、Ｃ（ＮＲ７）、（Ｒ７）２Ｎ（ＣＯ）Ｎ（Ｒ７）２、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ７、ＮＲ７Ｃ（Ｏ）Ｏ、及びＣ（Ｎ＝Ｎ）からなる群から選択され、
Ｒ７が、各出現につき独立して、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、アルケニル、及びアルキニルからなる群から選択される、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
化合物ＩＩＩ、
【化４１】
2017523964.tif 000154
を、チオール部分またはセレノール部分を含有する化合物と接触させ、これによって、カップリング生成物を得ることを更に含む、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
チオール部分またはセレノール部分を含有する前記化合物が、約５００ｇ／モル未満の分子量を有する小分子である、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
チオール部分またはセレノール部分を含有する前記化合物が、天然もしくは非天然アミノ酸、複数の天然もしくは非天然アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質などの生体分子である、請求項９６に記載の方法。
【請求項９９】
化合物ＩＩＩをチオール部分またはセレノール部分を含有する化合物と接触させる前記ステップが、スキーム１に示された前記反応からのＰｄ副産物の存在下で起こる、請求項９５〜９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
方法であって、前記方法が、スキーム５によって表され、
【化４２】
2017523964.tif 000155
式中、
Ａ１が、Ｈ、アミン保護基、アルキル、アリールアルキル、アシル、アリール、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、天然もしくは非天然アミノ酸、複数の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、または抗体断片であり、
Ａ２が、ＮＨ２、ＮＨ（アミド保護基）、Ｎ（アミド保護基）、ＯＨ、Ｏ（カルボキシレート保護基）、天然もしくは非天然アミノ酸、複数の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、または抗体断片であり、
Ａ３、Ａ４、及びＡ５が、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、及び複数の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸からなる群から選択され、
Ｙが、ＳまたはＳｅであり、
Ｒ１が、Ｈ、アルキル、アリールアルキル、アシル、アリール、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、天然もしくは非天然アミノ酸、複数の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、または抗体断片であり、
Ｍが、Ｎｉ、Ｐｄ、Ｐｔ、Ｃｕ、またはＡｕであり、
Ｘが、ハロゲン化物、トリフレート、テトラフルオロボレート、テトラアリールボレート、ヘキサフルオロアンチモネート、ビス（アルキルスルホニル）アミド、テトラフルオロホスフェート、ヘキサフルオロホスフェート、アルキルスルホネート、ハロアルキルスルホネート、アリールスルホネート、過塩素酸塩、ビス（フルオロアルキルスルホニル）アミド、ビス（アリールスルホニル）アミド、（フルオロアルキルスルホニル）（フルオロアルキル−カルボニル）アミド、硝酸塩、亜硝酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、アルキル硫酸塩、アリール硫酸塩、炭酸塩、重炭酸塩、カルボン酸塩、リン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、ホスフィン酸塩、または次亜塩素酸塩であり、
Ｌが、各出現につき独立して、トリアルキルホスフィン、トリアリールホスフィン、ジアルキルアリールホスフィン、アルキルジアリールホスフィン、（アルケニル）（アルキル）（アリール）ホスフィン、アルケニルジアリールホスフィン、アルケニルジアルキルホスフィン、酸化ホスフィン、ビス（ホスフィン）、ホスホラミド、トリアリールホスホネート、Ｎ−複素環状カルベン、任意に置換されたフェナントロリン、任意に置換されたイミノピリジン、任意に置換された２，２’−ビピリジン、任意に置換されたジイミン、任意に置換されたトリアゾリルピリジン、または任意に置換されたピラゾリルピリジンであり、
2017523964.tif 000156
が、アリール、ヘテロアリール、アルケニル、またはシクロアルケニルであり、
2017523964.tif 000157
が、任意に、ハロゲン化物、アシル、アジド、イソチオシアネート、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニルまたは保護されたアルキニル、アルコキシル、アリールカルボニル、シクロアルキル、ホルミル、ハロアルキル、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、アミド、ホスホネート、ホスフィネート、アルキルチオ、スルホニル、スルホンアミド、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、−ＣＦ３、−ＣＦ２Ｒ７、−ＣＦＲ７２、−ＣＮ、ポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン、−（ＣＨ２）ｐ−ＦＧ−Ｒ７、及びＺから選択される１つ以上の置換基によって更に置換され、
Ｚが、
【化４３】
2017523964.tif 000158
−Ｓ−アルキル、−ＳＨ、−Ｓ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ２Ｈ、−ＳＣＨ（ＣＨ３）−ＣＯ２Ｈ、または−ＳＣＨ（ＣＯ２Ｈ）−ＣＨ２ＣＯ２Ｈであり、
ｐが、各出現につき独立して、０〜１０の整数であり、
ＦＧが、各出現につき独立して、Ｃ（Ｏ）、ＣＯ２、Ｏ（ＣＯ）、Ｃ（Ｏ）ＮＲ７、ＮＲ７Ｃ（Ｏ）、Ｏ、Ｓｉ（Ｒ７）２、Ｃ（ＮＲ７）、（Ｒ７）２Ｎ（ＣＯ）Ｎ（Ｒ７）２、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ７、ＮＲ７Ｃ（Ｏ）Ｏ、及びＣ（Ｎ＝Ｎ）からなる群から選択され、
Ｒ７が、各出現につき独立して、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、アルケニル、及びアルキニルからなる群から選択され、
ｎが、１〜５の整数であり、
ｍが、１または２であり、
溶媒が、極性プロトン性溶媒、極性非プロトン性溶媒、または非極性溶媒である、方法。
【請求項１０１】
Ｌが、ＰＰｈ３、Ｐｈ２Ｐ−ＣＨ３、ＰｈＰ（ＣＨ３）２、Ｐ（ｏ−ｔｏｌ）３、ＰＣｙ３、Ｐ（ｔＢｕ）３、ＢＩＮＡＰ、ｄｐｐｂ、ｄｐｐｅ、ｄｐｐｆ、ｄｐｐｐ、
【化４４−１】
2017523964.tif 000159
【化４４−２】
2017523964.tif 000160
【化４４−３】
2017523964.tif 000161
からなる群から選択され、
Ｒｘが、各出現につき独立して、アルキル、アラルキル、シクロアルキル、またはアリールであり、
Ｘ１が、ＣＨまたはＮであり、
Ｒ２が、Ｈまたはアルキルであり、
Ｒ３が、Ｈまたはアルキルであり、
Ｒ４が、Ｈ、アルコキシ、またはアルキルであり、
Ｒ５が、アルキルまたはアリールであり、
Ｒ６が、アルキルまたはアリールであり、
ｑが、１、２、３、または４である、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
Ｌが、ＰＰｈ３、Ｐｈ２Ｐ−ＣＨ３、ＰｈＰ（ＣＨ３）２、Ｐ（ｏ−ｔｏｌ）３、ＰＣｙ３、Ｐ（ｔＢｕ）３、ＢＩＮＡＰ、ｄｐｐｂ、ｄｐｐｅ、ｄｐｐｆ、ｄｐｐｐ、
【化４５−１】
2017523964.tif 000162
【化４５−２】
2017523964.tif 000163
からなる群から選択される、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
Ｍが、ＰｄまたはＮｉである、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０４】
ＭがＰｄであり、Ｌが、
【化４６−１】
2017523964.tif 000164
【化４６−２】
2017523964.tif 000165
である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０５】
Ｌが、
【化４７】
2017523964.tif 000166
である、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
Ｌが、
【化４８】
2017523964.tif 000167
である、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
ＭがＮｉであり、Ｌが、ＢＩＮＡＰ、ｄｐｐｂ、ｄｐｐｅ、ｄｐｐｆ、ｄｐｐｐ、
【化４９】
2017523964.tif 000168
である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０８】
Ｌがｄｐｐｆである、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
Ｌが、
【化５０】
2017523964.tif 000169
である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１１０】
Ｌが、
【化５１】
2017523964.tif 000170
である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１１１】
Ｘが、ハロゲン化物またはトリフレートである、請求項１００〜１１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１２】
2017523964.tif 000171
が、
【化５２】
2017523964.tif 000172
からなる群から選択される、請求項１００〜１１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
Ａ１及びＡ２が、独立して、天然もしくは非天然アミノ酸、複数の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である、請求項１００〜１１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１４】
Ａ１が、アルギニン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、プロリン、チロシン、またはトリプトファンを含む、請求項１００〜１１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１５】
Ａ２が、アルギニン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、プロリン、チロシン、またはトリプトファンを含む、請求項１００〜１１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１６】
Ａ１及びＡ２が、システインまたはセレノシステインを含まない、請求項１００〜１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１７】
Ｒ１がＨである、請求項１００〜１１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１８】
Ｘがハロゲン化物である、請求項１００〜１１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１９】
Ｘが塩化物である、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
Ｘがトリフレートである、請求項１００〜１１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２１】
Ａ１及びＡ２が、共有結合される、請求項１００〜１２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２２】
溶媒が水を含む、請求項１００〜１２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２３】
前記溶媒が水性緩衝液を含む、請求項１００〜１２１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、２０１４年７月１５日出願の米国特許出願第６２／０２４，７６９号、及び２０１４年１２月１５日出願の同第６２／０９１，７２０号に対する優先権の利益を主張するものであり、これらの内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府支援
本出願は、米国国立衛生研究所により授与された認可番号ＧＭ０４６０５９及びＧＭ１０１７６２の下で、政府支援を受けてなされた。政府は、本発明における一定の権利を有する。
【技術分野】
【０００３】
本発明は、生体分子中のカルコゲンの遷移金属をベースとする選択的官能基化に関する。
【背景技術】
【０００４】
翻訳後修飾は、タンパク質の機能を大幅に拡大する。生体分子（例えば、アミド、酸、アルコール、アミン）中に存在する潜在的に反応性の官能基の多様性は、高速の反応速度及び穏やかな反応条件（例えば、水性溶媒、ＰＨ６〜８、Ｔ＜３７℃）のための必要条件と相まって、タンパク質を官能基化するための新しい技術の開発に高いハードルを設定する。タンパク質分子中の天然及び非天然アミノ酸の生体共役反応のための特定の方法が浮上しているが、システイン残基の官能基化は未だ課題である。システインは、（１）チオール官能基の特有の反応性、及び（２）天然起源のタンパク質中のシステイン残基の低含有量のために、タンパク質の化学修飾のために重要な残基である。
【０００５】
システインの官能基化、より一般的にはチオール修飾は、化学、生物学、医学、及び材料科学における重要なツールである。チオールを含有する唯一のアミノ酸であるために、システインは、通常、チオールをベースとする反応を用いるタンパク質修飾に利用される。現在、生体分子中のシステイン官能基化を可能にするいくつかの化学修飾技術が存在する。その１つの化学的官能基化であるアリール化は、優れた安定特性を有する強固なアリールチオエーテル抱合体の形成を可能にする。しかしながら、最先端のアリール化法は、いくつかの欠点に悩まされている。これらのアリール化法は、ＳＮＡｒの化学的性質に依存し、例えば、全フッ素置換されたアリール化剤などの電子欠乏芳香族試薬に基本的に限定される。更に、これらの試薬は、生体分子中に広く存在する窒素系求核種と非特異的に反応する生成物の複雑な混合物を生成する。更に悪いことに、現行法は、ゆっくりとした反応速度を示し、過酷なｐＨ及び／または溶媒条件を必要とする。したがって、システイン官能基化の方法、特に様々な官能基、反応条件を許容することができ、かつ安定な生成物を生成することができる方法を開発する必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００６】
ある特定の実施形態では、本発明は、チオールまたはセレノールを官能基化する方法を提供し、該方法は、スキーム１によって表され、
【化１】
2017523964.tif 000002
式中、
Ａ１は、Ｈ、アミン保護基、アルキル、アリールアルキル、アシル、アリール、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、天然もしくは非天然アミノ酸、複数の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、または抗体断片であり、
Ａ２は、ＮＨ２、ＮＨ（アミド保護基）、Ｎ（アミド保護基）、ＯＨ、Ｏ（カルボキシレート保護基）、天然もしくは非天然アミノ酸、複数の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、または抗体断片であり、
Ｙは、ＳまたはＳｅであり、
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、アリールアルキル、アシル、アリール、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、天然もしくは非天然アミノ酸、複数の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、または抗体断片であり、
Ｍは、Ｎｉ、Ｐｄ、Ｐｔ、Ｃｕ、またはＡｕであり、
Ａｒ１は、任意に置換されたアリール、ヘテロアリール、アルケニル、またはシクロアルケニルであり、
Ｘは、ハロゲン化物、トリフレート、テトラフルオロボレート、テトラアリールボレート、ヘキサフルオロアンチモネート、ビス（アルキルスルホニル）アミド、テトラフルオロホスフェート、ヘキサフルオロホスフェート、アルキルスルホネート、ハロアルキルスルホネート、アリールスルホネート、過塩素酸塩、ビス（フルオロアルキルスルホニル）アミド、ビス（アリールスルホニル）アミド、（フルオロアルキルスルホニル）（フルオロアルキル−カルボニル）アミド、硝酸塩、亜硝酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、アルキル硫酸塩、アリール硫酸塩、炭酸塩、重炭酸塩、カルボン酸塩、リン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、ホスフィン酸塩、または次亜塩素酸塩であり、
Ｌは、各出現につき独立して、トリアルキルホスフィン、トリアリールホスフィン、ジアルキルアリールホスフィン、アルキルジアリールホスフィン、（アルケニル）（アルキル）（アリール）ホスフィン、アルケニルジアリールホスフィン、アルケニルジアルキルホスフィン、酸化ホスフィン、ビス（ホスフィン）、ホスホラミド、トリアリールホスホネート、Ｎ−複素環状カルベン、任意に置換されたフェナントロリン、任意に置換されたイミノピリジン、任意に置換された２，２’−ビピリジン、任意に置換されたジイミン、任意に置換されたトリアゾリルピリジン、または任意に置換されたピラゾリルピリジンであり、
ｎは、１〜５の整数であり、
ｍは、１または２であり、
溶媒は、極性プロトン性溶媒、極性非プロトン性溶媒、または非極性溶媒である。
【０００７】
ある特定の実施形態では、本発明は、方法に関し、該方法は、スキーム４によって表され、
【化２】
2017523964.tif 000003
式中、各出現につき独立して、
Ａ１は、Ｈ、アミン保護基、アルキル、アリールアルキル、アシル、アリール、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、天然もしくは非天然アミノ酸、複数の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、または抗体断片であり、
Ａ２は、ＮＨ２、ＮＨ（アミド保護基）、Ｎ（アミド保護基）、ＯＨ、Ｏ（カルボキシレート保護基）、天然もしくは非天然アミノ酸、複数の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、または抗体断片であり、
Ａ３、Ａ４、及びＡ５は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、及び複数の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸からなる群から選択され、
Ｙは、ＳまたはＳｅであり、
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、アリールアルキル、アシル、アリール、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、天然もしくは非天然アミノ酸、複数の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、または抗体断片であり、
Ｍは、Ｎｉ、Ｐｄ、Ｐｔ、Ｃｕ、またはＡｕであり、
Ｒｙは、芳香族基、ヘテロ芳香族基、アルケン基、またはシクロアルケン基を含む任意に置換された架橋部分であり、
ｙは、２、３、４、５、または６であり、
Ｘは、ハロゲン化物、トリフレート、テトラフルオロボレート、テトラアリールボレート、ヘキサフルオロアンチモネート、ビス（アルキルスルホニル）アミド、テトラフルオロホスフェート、ヘキサフルオロホスフェート、アルキルスルホネート、ハロアルキルスルホネート、アリールスルホネート、過塩素酸塩、ビス（フルオロアルキルスルホニル）アミド、ビス（アリールスルホニル）アミド、（フルオロアルキルスルホニル）（フルオロアルキル−カルボニル）アミド、硝酸塩、亜硝酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、アルキル硫酸塩、アリール硫酸塩、炭酸塩、重炭酸塩、カルボン酸塩、リン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、ホスフィン酸塩、または次亜塩素酸塩であり、
Ｌは、各出現につき独立して、トリアルキルホスフィン、トリアリールホスフィン、ジアルキルアリールホスフィン、アルキルジアリールホスフィン、（アルケニル）（アルキル）（アリール）ホスフィン、アルケニルジアリールホスフィン、アルケニルジアルキルホスフィン、酸化ホスフィン、ビス（ホスフィン）、ホスホラミド、トリアリールホスホネート、Ｎ−複素環状カルベン、任意に置換されたフェナントロリン、任意に置換されたイミノピリジン、任意に置換された２，２’−ビピリジン、任意に置換されたジイミン、任意に置換されたトリアゾリルピリジン、または任意に置換されたピラゾリルピリジンであり、
ｎは、１〜５の整数であり、
ｍは、１または２であり、
各Ｚは、独立して
【化３】
2017523964.tif 000004
【化４】
2017523964.tif 000005
−Ｓ−アルキル、−ＳＨ、−Ｓ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ２Ｈ、−ＳＣＨ（ＣＨ３）−ＣＯ２Ｈ、または−ＳＣＨ（ＣＯ２Ｈ）−ＣＨ２ＣＯ２Ｈであり、
溶媒は、極性プロトン性溶媒、極性非プロトン性溶媒、または非極性溶媒である。
【０００８】
本発明はまた、スキーム５による方法も提供し、
【化５】
2017523964.tif 000006
式中、各出現につき独立して、
Ａ１は、Ｈ、アミン保護基、アルキル、アリールアルキル、アシル、アリール、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、天然もしくは非天然アミノ酸、複数の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、または抗体断片であり、
Ａ２は、ＮＨ２、ＮＨ（アミド保護基）、Ｎ（アミド保護基）、ＯＨ、Ｏ（カルボキシレート保護基）、天然もしくは非天然アミノ酸、複数の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、または抗体断片であり、
Ａ３、Ａ４、及びＡ５は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、及び複数の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸からなる群から選択され、
Ｙは、ＳまたはＳｅであり、
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、アリールアルキル、アシル、アリール、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、天然もしくは非天然アミノ酸、複数の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、または抗体断片であり、
Ｍは、Ｎｉ、Ｐｄ、Ｐｔ、Ｃｕ、またはＡｕであり、
Ｘは、ハロゲン化物、トリフレート、テトラフルオロボレート、テトラアリールボレート、ヘキサフルオロアンチモネート、ビス（アルキルスルホニル）アミド、テトラフルオロホスフェート、ヘキサフルオロホスフェート、アルキルスルホネート、ハロアルキルスルホネート、アリールスルホネート、過塩素酸塩、ビス（フルオロアルキルスルホニル）アミド、ビス（アリールスルホニル）アミド、（フルオロアルキルスルホニル）（フルオロアルキル−カルボニル）アミド、硝酸塩、亜硝酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、アルキル硫酸塩、アリール硫酸塩、炭酸塩、重炭酸塩、カルボン酸塩、リン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、ホスフィン酸塩、または次亜塩素酸塩であり、
Ｌは、各出現につき独立して、トリアルキルホスフィン、トリアリールホスフィン、ジアルキルアリールホスフィン、アルキルジアリールホスフィン、（アルケニル）（アルキル）（アリール）ホスフィン、アルケニルジアリールホスフィン、アルケニルジアルキルホスフィン、酸化ホスフィン、ビス（ホスフィン）、ホスホラミド、トリアリールホスホネート、Ｎ−複素環状カルベン、任意に置換されたフェナントロリン、任意に置換されたイミノピリジン、任意に置換された２，２’−ビピリジン、任意に置換されたジイミン、任意に置換されたトリアゾリルピリジン、または任意に置換されたピラゾリルピリジンであり、
2017523964.tif 000007
は、アリール、ヘテロアリール、アルケニル、またはシクロアルケニルであり、
2017523964.tif 000008
は、任意に、ハロゲン化物、アシル、アジド、イソチオシアネート、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニルまたは保護されたアルキニル、アルコキシル、アリールカルボニル、シクロアルキル、ホルミル、ハロアルキル、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、アミド、ホスホネート、ホスフィネート、アルキルチオ、スルホニル、スルホンアミド、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、−ＣＦ３、−ＣＦ２Ｒ７、−ＣＦＲ７２、−ＣＮ、ポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン、−（ＣＨ２）ｐ−ＦＧ−Ｒ７、及びＺから選択される１つ以上の置換基によって更に置換され、
Ｚは、
【化６】
2017523964.tif 000009
−Ｓ−アルキル、−ＳＨ、−Ｓ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ２Ｈ、−ＳＣＨ（ＣＨ３）−ＣＯ２Ｈ、または−ＳＣＨ（ＣＯ２Ｈ）−ＣＨ２ＣＯ２Ｈであり、
ｐは、各出現につき独立して、０〜１０の整数であり、
ＦＧは、各出現につき独立して、Ｃ（Ｏ）、ＣＯ２、Ｏ（ＣＯ）、Ｃ（Ｏ）ＮＲ７、ＮＲ７Ｃ（Ｏ）、Ｏ、Ｓｉ（Ｒ７）２、Ｃ（ＮＲ７）、（Ｒ７）２Ｎ（ＣＯ）Ｎ（Ｒ７）２、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ７、ＮＲ７Ｃ（Ｏ）Ｏ、及びＣ（Ｎ＝Ｎ）からなる群から選択され、
Ｒ７は、各出現につき独立して、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、アルケニル、及びアルキニルからなる群から選択され、
ｎは、１〜５の整数であり、
ｍは、１または２であり、
溶媒は、極性プロトン性溶媒、極性非プロトン性溶媒、または非極性溶媒である。
【０００９】
ある特定の実施形態では、Ｌは、ＰＰｈ３、Ｐｈ２Ｐ−ＣＨ３、ＰｈＰ（ＣＨ３）２、Ｐ（ｏ−ｔｏｌ）３、ＰＣｙ３、Ｐ（ｔＢｕ）３、ＢＩＮＡＰ、ｄｐｐｂ、ｄｐｐｅ、ｄｐｐｆ、ｄｐｐｐ、
【化７】
2017523964.tif 000010
【化８】
2017523964.tif 000011
【化９】
2017523964.tif 000012
からなる群から選択され、
Ｒｘは、各出現につき独立して、アルキル、アラルキル、シクロアルキル、またはアリールであり、
Ｘ１は、ＣＨまたはＮであり、
Ｒ２は、Ｈまたはアルキルであり、
Ｒ３は、Ｈまたはアルキルであり、
Ｒ４は、Ｈ、アルコキシ、またはアルキルであり、
Ｒ５は、アルキルまたはアリールであり、
Ｒ６は、アルキルまたはアリールであり、
ｑは、１、２、３、または４である。
【００１０】
ある特定の実施形態では、Ｍは、ＮｉまたはＰｄである。
【００１１】
ある特定の実施形態では、Ｘはトリフレートまたはハロゲン化物である。
【００１２】
ある特定の実施形態では、Ａｒ１は、（Ｃ６〜Ｃ１０）炭素環式アリール、（Ｃ３〜Ｃ１２）ヘテロアリール、（Ｃ３〜Ｃ１４）多環式アリール、またはアルケニルであり、かつＡｒ１は、任意に、ハロゲン化物、アシル、アジド、イソチオシアネート、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニルまたは保護されたアルキニル、アルコキシル、アリールカルボニル、シクロアルキル、ホルミル、ハロアルキル、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、アミド、ホスホネート、ホスフィネート、アルキルチオ、スルホニル、スルホンアミド、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、−ＣＦ３、−ＣＦ２Ｒ７、−ＣＦＲ７２、−ＣＮ、ポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン、及び−（ＣＨ２）ｐ−ＦＧ−Ｒ７からなる群から独立して選択される１つ以上の置換基によって置換され、
ｐは、各出現につき独立して、０〜１０の整数であり、
ＦＧは、各出現につき独立して、Ｃ（Ｏ）、ＣＯ２、Ｏ（ＣＯ）、Ｃ（Ｏ）ＮＲ７、ＮＲ７Ｃ（Ｏ）、Ｏ、Ｓｉ（Ｒ７）２、Ｃ（ＮＲ７）、（Ｒ７）２Ｎ（ＣＯ）Ｎ（Ｒ７）２、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ７、ＮＲ７Ｃ（Ｏ）Ｏ、及びＣ（Ｎ＝Ｎ）からなる群から選択され、
Ｒ７は、各出現につき独立して、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、アルケニル、及びアルキニルからなる群から選択され、
２つ以上の置換基がＡｒ１上に存在する場合には、該置換基のうちの２つは一緒になって、環を形成してもよい。
【００１３】
ある特定の実施形態では、Ａｒ１は、蛍光体、造影剤、検出試薬、生体分子、治療薬、親油性部分、高親和性結合対の成員、または細胞−受容体標的化剤に共有結合される。一実施形態では、Ａｒ１は、ビオチンに結合される。別の実施形態では、Ａｒ１は、フルオレセインに結合される。一実施形態では、治療薬は、トラメチニブ、トポテカン、アビラテロン、ダブラフェニブ、またはバンデタニブである。
【００１４】
ある特定の実施形態では、Ａｒ１は、蛍光体によって構成される。
【００１５】
ある特定の実施形態では、Ａｒ１は、治療薬によって構成される。
【００１６】
ある特定の実施形態では、Ａ１及びＡ２は、独立して、天然もしくは非天然アミノ酸、複数の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である。
【００１７】
ある特定の実施形態では、Ａ１及びＡ２は、アルギニン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、プロリン、チロシン、またはトリプトファンを含む。
【００１８】
ある特定の実施形態では、本発明は、チオールまたはセレノールを官能基化する方法であり、限定試薬は、
【化１０】
2017523964.tif 000013
である。
【００１９】
ある特定の実施形態では、Ａ１及びＡ２が、−ＳＨまたは−ＳｅＨ部分を含むとき、
【化１１】
2017523964.tif 000014
の量対
【化１２】
2017523964.tif 000015
の量に
【化１３】
2017523964.tif 000016
中の−ＳＨ及び−ＳｅＨ部分の総数を乗じたモル比は、１：１超である。
【００２０】
本発明の方法のある特定の実施形態では、Ａ１及びＡ２は、共有結合されている。
【００２１】
ある特定の実施形態では、本発明の方法で使用される溶媒は、水を含む。
【００２２】
ある特定の実施形態では、本発明の方法で使用される溶媒は、水性緩衝液を含む。
【００２３】
他の実施形態では、本発明は、バイオポリマー中のチオールまたはセレノールを官能基化する方法に関し、方法は、チオールまたはセレノール部分を含むバイオポリマーを構造式ＩＩの試薬と接触させ、これにより、チオールまたはセレノール部分が−Ｓ−Ａｒ１または−Ｓｅ−Ａｒ１に変換された、官能基化バイオポリマーを生成することを含む。
【００２４】
ある特定の実施形態では、バイオポリマーは、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、オリゴ糖、または多糖である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明において有用な例示のリガンド（例えば、ｔＢｕＢｒｅｔｔＰｈｏｓ＝Ｌ１５；ＡｄＢｒｅｔｔＰｈｏｓ＝Ｌ１６；及びＲｏｃｋＰｈｏｓ＝Ｌ１７）を描写する。
【図２】本発明において有用な例示のリガンドを描写する。
【図３】システイン及びセレノシステインのアリール化のためのＰｄをベースとする試薬の代表的合成を描写する。
【図４（ａ）】非保護モデルペプチドにおける選択的システインＳ−アリール化を描写する。
【図４（ｂ）】非保護モデルペプチドのＳ−アリール化の生成物のＬＣＭＳトレースを描写する。
【図５】アリール化がないこと（例えば、スレオニンまたはリシンにおいて）を立証する、アリール化条件下のＡＫＬＴＧＦ−ＮＨ（ＣＨ２Ｃ６Ｆ５）についてのＬＣＭＳトレースである。
【図６】水性媒体中のＣｙｓ含有ペプチドのアリール化からの生成物のＬＣＭＳトレースである。
【図７（ａ）】対応するＰｄ（ＩＩ）試薬を用いて、ペプチド６から調製されたＳ−アリール化生成物のＬＣＭＳトレースを描写する。
【図７（ｂ）】対応するＰｄ（ＩＩ）試薬を用いて、ペプチド６から調製されたＳ−アリール化生成物のＬＣＭＳトレースを描写する。
【図７（ｃ）】対応するＰｄ（ＩＩ）試薬を用いて、ペプチド６から調製されたＳ−アリール化生成物のＬＣＭＳトレースを描写する。
【図７（ｄ）】対応するＰｄ（ＩＩ）試薬を用いて、ペプチド６から調製されたＳ−アリール化生成物のＬＣＭＳトレースを描写する。
【図７（ｅ）】対応するＰｄ（ＩＩ）試薬を用いて、ペプチド６から調製されたＳ−アリール化生成物のＬＣＭＳトレースを描写する。
【図７（ｆ）】対応するＰｄ（ＩＩ）試薬を用いて、ペプチド６から調製されたＳ−アリール化生成物のＬＣＭＳトレースを描写する。
【図８（ａ）】対応するＰｄ（ＩＩ）試薬を用いて得られたペプチド６のＳ−アリール化型の例示の種を描写する。
【図８（ｂ）】ペプチドへの生体共役反応に好適な例示の医薬品を描写する。
【図９】フルオレセイン含有Ｐｄ（ＩＩ）試薬（左）、及び標識化のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（右）を用いるＤＡＲＰｉｎの代表的なアリール化を示す。
【図１０】Ｐｄをベースとする試薬を用いる抗体中のＣｙｓ側鎖のアリール化のための例示の戦略を描写する。
【図１１】ヒトＩｇＧ１抗体のフルオレセインアリール化についての実験的スキーム及びその結果を描写する。
【図１２（ａ）】環状またはステープルペプチドの形成のための多金属試薬（二官能性）の例示の合成を描写する。
【図１２（ｂ）】環状、多環、またはステープルペプチドの形成のための多金属試薬（三官能性）の例示の合成を描写する。
【図１３】本発明の方法を用いる、トラスツズマブのバンデタニブ（星印で表された）の抗体−薬物複合体についての代表的な手順の概略図を描写する。
【図１４】Ｐ２システイン抱合体の酸化条件下での安定性を示すグラフである。
【図１５】本発明のパラジウム試薬を用いるタンパク質修飾を描写する４つのパネル（上部、ａ、ｂ、及びｃ）を有する。反応スキームは、上部パネルに示される。パネルａ、ｂ、及びｃは、パラジウム錯体１Ｄとの反応後の、タンパク質のａ）Ｎ末端（Ｐ４）、ｂ）ループ（Ｐ５）、及びｃ）Ｃ末端（Ｐ６）における、クマリンによるシステイン残基の定量的修飾を示す。
【図１６】パラジウム錯体１Ｄによるタンパク質標識化についての比較対照反応を描写する４つのパネル（上部、ａ、ｂ、及びｃ）を有する。反応スキームは、上部パネルに示される。パネルａ、ｂ、及びｃは、得られたタンパク質Ｐ７〜Ｐ９が、システイン残基を含有しないことを示す。
【図１７】パラジウム錯体１Ｊを用いるタンパク質修飾を描写する４つのパネル（上部、ａ、ｂ、及びｃ）を有する。反応スキームは、上部パネルに示される。パネルａ、ｂ、及びｃは、パラジウム錯体１Ｊとの反応後の、タンパク質のａ）Ｎ末端（Ｐ４）、ｂ）ループ（Ｐ５）、及びｃ）Ｃ末端（Ｐ６）における、薬物分子によるシステイン残基の定量的修飾を示す。
【図１８】パラジウム錯体１Ｊによるタンパク質標識化についての比較対照反応を描写する４つのパネル（上部、ａ、ｂ、及びｃ）を有する。反応スキームは、上部パネルに示される。パネルａ、ｂ、及びｃは、得られたタンパク質Ｐ７〜Ｐ９が、システイン残基を含有しないことを示す。
【図１９】３つのパネル（上部、中間、及び下部）を有し、二重クロスカップリング反応の反応スキーム（上部）、ならびに１：１のＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ（中間）及び５：９５のＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ（下部）での様々な生成物を示すトレースを描写する。
【図２０】Ｐｄをベースとするハロアリール化試薬を用いる、ステープルペプチドの合成についての代表的手順の概略図を描写する。
【図２１】空気中で安定するＰｈ−メシレートパラジウムプレ触媒及びハロゲン化アリールを用いるＣｙｓ残基のアリール化についての代表的手順の概略図を描写する。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
概要
ある特定の実施形態では、本発明は、チオールまたはセレノールを官能基化する方法に関し、この方法は、スキーム１によって表され、
【化１４】
2017523964.tif 000017
式中、
Ａ１は、Ｈ、アミン保護基、アルキル、アリールアルキル、アシル、アリール、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、天然もしくは非天然アミノ酸、複数の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、または抗体断片であり、
Ａ２は、ＮＨ２、ＮＨ（アミド保護基）、Ｎ（アミド保護基）、ＯＨ、Ｏ（カルボキシレート保護基）、天然もしくは非天然アミノ酸、複数の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、または抗体断片であり、
Ｙは、ＳまたはＳｅであり、
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、アリールアルキル、アシル、アリール、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、天然もしくは非天然アミノ酸、複数の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、または抗体断片であり、
Ｍは、Ｎｉ、Ｐｄ、Ｐｔ、Ｃｕ、またはＡｕであり、
Ａｒ１は、任意に置換されたアリール、ヘテロアリール、アルケニル、またはシクロアルケニルであり、
Ｘは、ハロゲン化物、トリフレート、テトラフルオロボレート、テトラアリールボレート、ヘキサフルオロアンチモネート、ビス（アルキルスルホニル）アミド、テトラフルオロホスフェート、ヘキサフルオロホスフェート、アルキルスルホネート、ハロアルキルスルホネート、アリールスルホネート、過塩素酸塩、ビス（フルオロアルキルスルホニル）アミド、ビス（アリールスルホニル）アミド、（フルオロアルキルスルホニル）（フルオロアルキル−カルボニル）アミド、硝酸塩、亜硝酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、アルキル硫酸塩、アリール硫酸塩、炭酸塩、重炭酸塩、カルボン酸塩、リン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、ホスフィン酸塩、または次亜塩素酸塩であり、
Ｌは、各出現につき独立して、トリアルキルホスフィン、トリアリールホスフィン、ジアルキルアリールホスフィン、アルキルジアリールホスフィン、（アルケニル）（アルキル）（アリール）ホスフィン、アルケニルジアリールホスフィン、アルケニルジアルキルホスフィン、酸化ホスフィン、ビス（ホスフィン）、ホスホラミド、トリアリールホスホネート、Ｎ−複素環状カルベン、任意に置換されたフェナントロリン、任意に置換されたイミノピリジン、任意に置換された２，２’−ビピリジン、任意に置換されたジイミン、任意に置換されたトリアゾリルピリジン、または任意に置換されたピラゾリルピリジンであり、
ｎは、１〜５の整数であり、
ｍは、１または２であり、
溶媒は、極性プロトン性溶媒、極性非プロトン性溶媒、または非極性溶媒である。
【００２７】
この方法は、他の反応性官能基（例えば、ヒドロキシル、アミン）に勝るチオール及びセレノールの官能化に対する特異性、優れた官能基許容性、ならびに極性有機溶媒及び緩衝水性溶媒両方の媒体おける穏やかな反応条件などの、既存の官能基化法に勝るいくつかの大きな利点を特徴とする。更に、反応速度研究は、本発明の方法が高速であり、数分以内に生体分子のマイクロモル濃度において完全な標識化をもたらすことを立証している。本明細書に提示される方法は、チオールまたはセレノールを担持するアミノ酸を含有する生体分子の修飾に広範囲に適用可能である。生体分子を選択的に化学的に修飾するための能力は、医薬品及びバイオテクノロジー産業における研究及び開発に関連する重要な用途である。
【００２８】
ある特定の実施形態では、本発明は、生理学的に関連性のある条件下での、非保護ペプチド／タンパク質分子上の選択的システイン及びセレノシステイン修飾に関する。このプロセスは、他の競合する求核性アミノ酸（例えば、セリン、スレオニン、リシン）に勝る、システイン（Ｃｙｓ）及びセレノシステイン（Ｓｅｃ）に対する特異性、優れた官能基許容性、ならびに穏やかな反応条件を示す。
【００２９】
ある特定の実施形態では、本発明は、スキーム１による方法であり、式中、ｍは、０〜３の整数である。
【００３０】
ある特定の実施形態では、本発明の方法において官能基化されるチオールまたはセレノールは、式（Ｉ）の構造を有するアルファアミノ酸であり、
【化１５】
2017523964.tif 000018
式中、Ａ１、Ａ２、Ｙ、ｎ、及びＲ１は、上記で定義された通りである。ある特定の実施形態では、チオールはシステインであり、セレノールはセレノシステインである。ある特定の実施形態では、ｎは１または２である。
【００３１】
例示の官能基化複合体
ある特定の実施形態では、本発明は、スキーム１に従ってチオールまたはセレノールを官能基化する（例えば、アリール化する）方法に関し、この官能基化剤は、式（ＩＩ）の化合物であり、
【化１６】
2017523964.tif 000019
式中、Ｌはリガンドであり、Ｘは、ハロゲン化物またはトリフレートであり、ｍは、１または２であり、Ａｒ１は、任意に置換されたアリール、ヘテロアリール、アルケニル、またはシクロアルケニルである。
【００３２】
ある特定の実施形態では、本発明は、スキーム１による方法に関し、この官能基化剤は、式（ＩＩ）の化合物であり、式中、ｍは、０〜３の整数である。ある特定の実施形態では、ｍは、１〜３の整数である。ある特定の実施形態では、ｍは、１または２である。より具体的な実施形態では、ｍは、１である。ｍが２または３である特定の実施形態では、Ｌの１つの出現例は、リンカー部分を介して、Ｌの１つ以上の他の出現例に共有的に結合される。このような特定の実施形態では、Ｍは、リガンドの２つまたは３つの出現例と一緒になっての環式または二環式構造である。
【００３３】
ある特定の実施形態では、式（ＩＩ）のリガンドＬは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，８５８，７８４号に記載されるリガンドである。
【００３４】
ある特定の実施形態では、式（ＩＩ）のリガンドＬは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１１／００１５４０１号に記載されるリガンドである。
【００３５】
ある特定の実施形態では、式（ＩＩ）のリガンドＬは、トリアルキルホスフィン、トリアリールホスフィン、ジアルキルアリールホスフィン、アルキルジアリールホスフィン、（アルケニル）（アルキル）（アリール）ホスフィン、アルケニルジアリールホスフィン、アルケニルジアルキルホスフィン、酸化ホスフィン、ビス（ホスフィン）、ホスホラミド、トリアリールホスホネート、Ｎ−複素環状カルベン、任意に置換されたフェナントロリン、任意に置換されたイミノピリジン、任意に置換された２，２’−ビピリジン、任意に置換されたジイミン、任意に置換されたトリアゾリルピリジン、または任意に置換されたピラゾリルピリジンである。ある特定の実施形態では、式（ＩＩ）のリガンドＬは、トリアルキルホスフィン、トリアリールホスフィン、ジアルキルアリールホスフィン、アルキルジアリールホスフィン、（アルケニル）（アルキル）（アリール）ホスフィン、アルケニルジアリールホスフィン、アルケニルジアルキルホスフィン、酸化ホスフィン、ビス（ホスフィン）、ホスホラミド、またはトリアルキルホスフォネートである。
【００３６】
ある特定の実施形態では、式（ＩＩ）のリガンドＬは、ＰＰｈ３、Ｐｈ２Ｐ−ＣＨ３、ＰｈＰ（ＣＨ３）２、Ｐ（ｏ−ｔｏｌ）３、ＰＣｙ３、Ｐ（ｔＢｕ）３、ＢＩＮＡＰ、ｄｐｐｂ、ｄｐｐｅ、ｄｐｐｆ、ｄｐｐｐ、
【化１７】
2017523964.tif 000020
【化１８−１】
2017523964.tif 000021
【化１８−２】
2017523964.tif 000022
からなる群から選択され、
Ｒｘは、アルキル、アラルキル、シクロアルキル、またはアリールであり、
Ｘ１は、ＣＨまたはＮであり、
Ｒ２は、Ｈまたはアルキルであり、
Ｒ３は、Ｈまたはアルキルであり、
Ｒ４は、Ｈ、アルコキシ、またはアルキルであり、
Ｒ５は、アルキルまたはアリールであり、
Ｒ６は、アルキルまたはアリールであり、
ｑは、１、２、３、または４である。
【００３７】
ある特定の実施形態では、式（ＩＩ）のＸは、Ｘは、ハロゲン化物（例えば、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物）またはトリフレートである。
【００３８】
ある特定の実施形態では、式（ＩＩ）のＸは、四フッ化ホウ素、テトラアリールボレート（Ｂ（Ｃ６Ｆ５）４−及び（Ｂ［３，５−（ＣＦ３）２Ｃ６Ｈ３］４）−など）、ヘキサフルオロアンチモネート、四フッ化リン、六フッ化リン、アルキルスルホネート、ハロアルキルスルホネート、アリールスルホネート、過塩素酸塩、ビス（アルキルスルホニル）アミド、ハロゲン化物、ビス（フルオロアルキルスルホニル）アミド、ビス（アリールスルホニル）アミド、（フルオロアルキルスルホニル）（フルオロアルキル−カルボニル）アミド、硝酸塩、亜硝酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、アルキル硫酸塩、アリール硫酸塩、炭酸塩、重炭酸塩、カルボン酸塩、リン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、ホスフィン酸塩、及び次亜塩素酸塩からなる群から選択される。
【００３９】
ある特定の実施形態では、式（ＩＩ）のＸは、アルキルスルホネートであり、このアルキルは置換アルキルである。ある特定の実施形態では、式（ＩＩ）のＸは、アルキルスルホネートであり、このアルキルは非置換のアルキルである。
【００４０】
ある特定の実施形態では、式（ＩＩ）のＸは、アルキルスルホネートであり、このアルキルは、メチル、エチル、プロピル、またはブチルである。ある特定の実施形態では、式（ＩＩ）のＸは、アルキルスルホネートであり、このアルキルは、メチルまたはエチルである。
【００４１】
ある特定の実施形態では、式（ＩＩ）のＸは、ハロアルキルスルホネートである。ある特定の実施形態では、式（ＩＩ）のＸは、フルオロアルキルスルホネートである。
【００４２】
ある特定の実施形態では、式（ＩＩ）のＸは、フルオロメチルスルホネートである。ある特定の実施形態では、Ｘは、トリフルオロメチルスルホネートである。
【００４３】
ある特定の実施形態では、式（ＩＩ）のＸは、シクロアルキルアルキルスルホネートである。ある特定の実施形態では、Ｘは、
【化１９】
2017523964.tif 000023
またはその鏡像異性体である。
【００４４】
ある特定の実施形態では、式（ＩＩ）のｍは、１または２である。ある特定の実施形態では、ｍは、１である。
【００４５】
ある特定の実施形態では、式（ＩＩ）のＡｒ１は、任意に置換されたアリール、ヘテロアリール、アルケニル、またはシクロアルケニルである。ある特定の実施形態では、Ａｒ１は、任意に置換されたアリールまたはヘテロアリール基である。
【００４６】
ある特定の実施形態では、式（ＩＩ）のＡｒ１は、（Ｃ６〜Ｃ１０）炭素環式アリール、（Ｃ３〜Ｃ１２）ヘテロアリール、（Ｃ３〜Ｃ１４）多環式アリール、またはアルケニルであり、かつＡｒ１は、任意に、ハロゲン化物、アシル、アジド、イソチオシアネート、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニルまたは保護されたアルキニル、アルコキシル、アリールカルボニル、シクロアルキル、ホルミル、ハロアルキル、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、アミド、ホスホネート、ホスフィネート、アルキルチオ、スルホニル、スルホンアミド、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、−ＣＦ３、−ＣＦ２Ｒ７、−ＣＦＲ７２、−ＣＮ、ポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン、及び−（ＣＨ２）ｎ−ＦＧ−Ｒ７からなる群から独立して選択される１つ以上の置換基によって置換され、
ｎは、各出現につき独立して、０〜１０の整数であり、
ＦＧは、各出現につき独立して、Ｃ（Ｏ）、ＣＯ２、Ｏ（ＣＯ）、Ｃ（Ｏ）ＮＲ７、ＮＲ７Ｃ（Ｏ）、Ｏ、Ｓｉ（Ｒ７）２、Ｃ（ＮＲ７）、（Ｒ７）２Ｎ（ＣＯ）Ｎ（Ｒ７）２、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ７、ＮＲ７Ｃ（Ｏ）Ｏ、及びＣ（Ｎ＝Ｎ）からなる群から選択され、
Ｒ７は、各出現につき独立して、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、アルケニル、及びアルキニルからなる群から選択され、
２つ以上の置換基がＡｒ１上に存在する場合には、該置換基のうちの２つは一緒になって、環を形成してもよい。
【００４７】
ある特定の実施形態では、式（ＩＩ）のＡｒ１は、蛍光体、造影剤、検出試薬、生体分子、治療薬、親油性部分、高親和性結合対の成員、または細胞−受容体標的化剤に共有結合される。ある特定の実施形態では、本発明は、前述の化合物のうちのいずれか１つに関し、式中、Ａｒ１はビオチンに共有結合される。ある特定の実施形態では、本発明は、前述の化合物のうちのいずれか１つに関し、式中、Ａｒ１はフルオレセインに共有結合される。ある特定の実施形態では、本発明は、前述の化合物のうちのいずれかに関し、式中、Ａｒ１は治療薬に共有結合され、この治療薬は、トラメチニブ、トポテカン、アビラテロン、ダブラフェニブ、またはバンデタニブである。
【００４８】
ある特定の実施形態では、式（ＩＩ）のＡｒ１は、蛍光体によって構成される。ある特定の実施形態では、本発明は、前述の化合物のうちのいずれかに関し、式中、Ａｒ１は治療薬によって構成される。ある特定の実施形態では、この治療薬は、トラメチニブ、トポテカン、アビラテロン、ダブラフェニブ、またはバンデタニブである。
【００４９】
ある特定の実施形態では、蛍光体は、キサンテン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、ナフタレン、アントラセン、オキサジアゾール、ピレン、アクリジン、テトラピロール、アリールメチン、ホウ素−ジピロメテン（ＢＯＤＩＰＹ）の誘導体、またはシアニン色素である。特定の他の実施形態では、蛍光体は、蛍光タンパク質である。ある特定の実施形態では、検出試薬は、例えば、ナノ粒子、ＭＲＩ造影剤、色素部分、または放射性核種である。特定の他の実施形態では、生体分子は、タンパク質、ペプチド、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖、脂質、糖脂質、グリセロ脂質、リン脂質、ホルモン、神経伝達物質、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ステロール、代謝産物、ビタミン、または天然産物である。
【００５０】
ある特定の実施形態では、治療薬は、薬剤が投与される対象において治療的効果をもたらす化合物または化合物の部分構造である。ある特定の実施形態では、治療薬は、ある特定の細胞に対して毒性である。式（ＩＩ）のＡｒ１に共有結合される例示の治療薬としては、トラメチニブ、トポテカン、アビラテロン、ダブラフェニブ、またはバンデタニブが含まれる。
【００５１】
ある特定の実施形態では、親油性部分は、Ａｒ１を担持する化合物が、本明細書に記載される脂質、脂肪、油、及び非極性溶媒に対して親和性を有するか、またはこれらに可溶性であることを可能にする。例示の親油性部分としては、ケイ皮酸などの両親媒性界面活性剤が含まれる。
【００５２】
ある特定の実施形態では、細胞−受容体標的化剤は、エピトープなどのリガンド、ペプチド、抗体、小有機化合物、神経伝達物質である。高親和性結合対としては、ビオチン−アビジン、ビオチン−ストレプトアビジ、リガンド−細胞受容体、Ｓ−ペプチドならびにリボヌクレアーゼＡ、ジゴキシゲニンならびにその受容体、及び相補的オリゴヌクレオチド対が含まれる。
【００５３】
例示の方法
ある特定の実施形態では、本発明は、スキーム１の方法に関し、
【化２０】
2017523964.tif 000024
式中、
Ａ１は、Ｈ、アミン保護基、アルキル、アリールアルキル、アシル、アリール、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、天然もしくは非天然アミノ酸、複数の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、または抗体断片であり、
Ａ２は、ＮＨ２、ＮＨ（アミド保護基）、Ｎ（アミド保護基）、ＯＨ、Ｏ（カルボキシレート保護基）、天然もしくは非天然アミノ酸、複数の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、または抗体断片であり、
Ｙは、ＳまたはＳｅであり、
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、アリールアルキル、アシル、アリール、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、天然もしくは非天然アミノ酸、複数の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、または抗体断片であり、
Ｍは、Ｎｉ、Ｐｄ、Ｐｔ、Ｃｕ、またはＡｕであり、
Ａｒ１は、任意に置換されたアリール、ヘテロアリール、アルケニル、またはシクロアルケニルであり、
Ｘは、ハロゲン化物、トリフレート、テトラフルオロボレート、テトラアリールボレート、ヘキサフルオロアンチモネート、ビス（アルキルスルホニル）アミド、テトラフルオロホスフェート、ヘキサフルオロホスフェート、アルキルスルホネート、ハロアルキルスルホネート、アリールスルホネート、過塩素酸塩、ビス（フルオロアルキルスルホニル）アミド、ビス（アリールスルホニル）アミド、（フルオロアルキルスルホニル）（フルオロアルキル−カルボニル）アミド、硝酸塩、亜硝酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、アルキル硫酸塩、アリール硫酸塩、炭酸塩、重炭酸塩、カルボン酸塩、リン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、ホスフィン酸塩、または次亜塩素酸塩であり、
Ｌは、各出現につき独立して、トリアルキルホスフィン、トリアリールホスフィン、ジアルキルアリールホスフィン、アルキルジアリールホスフィン、（アルケニル）（アルキル）（アリール）ホスフィン、アルケニルジアリールホスフィン、アルケニルジアルキルホスフィン、酸化ホスフィン、ビス（ホスフィン）、ホスホラミド、トリアリールホスホネート、Ｎ−複素環状カルベン、任意に置換されたフェナントロリン、任意に置換されたイミノピリジン、任意に置換された２，２’−ビピリジン、任意に置換されたジイミン、任意に置換されたトリアゾリルピリジン、または任意に置換されたピラゾリルピリジンであり、
ｎは、１〜５の整数であり、
ｍは、１または２であり、
溶媒は、極性プロトン性溶媒、極性非プロトン性溶媒、または非極性溶媒である。
【００５４】
ある特定の実施形態では、本発明は、方法に関し、該方法は、スキーム４によって表され、
【化２１】
2017523964.tif 000025
式中、各出現につき独立して、
Ａ１は、Ｈ、アミン保護基、アルキル、アリールアルキル、アシル、アリール、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、天然もしくは非天然アミノ酸、複数の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、または抗体断片であり、
Ａ２は、ＮＨ２、ＮＨ（アミド保護基）、Ｎ（アミド保護基）、ＯＨ、Ｏ（カルボキシレート保護基）、天然もしくは非天然アミノ酸、複数の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、または抗体断片であり、
Ａ３、Ａ４、及びＡ５は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、及び複数の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸からなる群から選択され、
Ｙは、ＳまたはＳｅであり、
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、アリールアルキル、アシル、アリール、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、天然もしくは非天然アミノ酸、複数の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、または抗体断片であり、
Ｍは、Ｎｉ、Ｐｄ、Ｐｔ、Ｃｕ、またはＡｕであり、
Ｒｙは、芳香族基、ヘテロ芳香族基、アルケン基、またはシクロアルケン基を含む任意に置換された架橋部分であり、
ｙは、２、３、４、５、または６であり、
Ｘは、ハロゲン化物、トリフレート、テトラフルオロボレート、テトラアリールボレート、ヘキサフルオロアンチモネート、ビス（アルキルスルホニル）アミド、テトラフルオロホスフェート、ヘキサフルオロホスフェート、アルキルスルホネート、ハロアルキルスルホネート、アリールスルホネート、過塩素酸塩、ビス（フルオロアルキルスルホニル）アミド、ビス（アリールスルホニル）アミド、（フルオロアルキルスルホニル）（フルオロアルキル−カルボニル）アミド、硝酸塩、亜硝酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、アルキル硫酸塩、アリール硫酸塩、炭酸塩、重炭酸塩、カルボン酸塩、リン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、ホスフィン酸塩、または次亜塩素酸塩であり、
Ｌは、各出現につき独立して、トリアルキルホスフィン、トリアリールホスフィン、ジアルキルアリールホスフィン、アルキルジアリールホスフィン、（アルケニル）（アルキル）（アリール）ホスフィン、アルケニルジアリールホスフィン、アルケニルジアルキルホスフィン、酸化ホスフィン、ビス（ホスフィン）、ホスホラミド、トリアリールホスホネート、Ｎ−複素環状カルベン、任意に置換されたフェナントロリン、任意に置換されたイミノピリジン、任意に置換された２，２’−ビピリジン、任意に置換されたジイミン、任意に置換されたトリアゾリルピリジン、または任意に置換されたピラゾリルピリジンであり、
ｎは、１〜５の整数であり、
ｍは、１または２であり、
各Ｚは、独立して、
【化２２】
2017523964.tif 000026
−Ｓ−アルキル、−ＳＨ、−Ｓ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ２Ｈ、−ＳＣＨ（ＣＨ３）−ＣＯ２Ｈ、または−ＳＣＨ（ＣＯ２Ｈ）−ＣＨ２ＣＯ２Ｈであり、
溶媒は、極性プロトン性溶媒、極性非プロトン性溶媒、または非極性溶媒である。
【００５５】
本明細書に記載される本発明は、ハロアリール基を担持するモノ金属化触媒を用いてステープルペプチドを生成するための方法も提供する。このような方法は、ステープルペプチドの代替的不斉合成を提供する。例えば、このような合成は、段階的様式で生じることができ、ここでは、第１の結合形成ステップが、ペプチド中の第１のシステイン残基とモノ金属化ハロアリール化試薬との間で起こる。次いで、第２のクロスカップリングステップが、第２のシステイン残基とアリールハロゲン化物との間で起こり、目的のステープルペプチド生成物を得ることができる。
【００５６】
ある特定の実施形態では、本発明は、方法に関し、該方法は、スキーム５によって表され、
【化２３】
2017523964.tif 000027
式中、各出現につき独立して、
Ａ１は、Ｈ、アミン保護基、アルキル、アリールアルキル、アシル、アリール、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、天然もしくは非天然アミノ酸、複数の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、または抗体断片であり、
Ａ２は、ＮＨ２、ＮＨ（アミド保護基）、Ｎ（アミド保護基）、ＯＨ、Ｏ（カルボキシレート保護基）、天然もしくは非天然アミノ酸、複数の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、または抗体断片であり、
Ａ３、Ａ４、及びＡ５は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、及び複数の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸からなる群から選択され、
Ｙは、ＳまたはＳｅであり、
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、アリールアルキル、アシル、アリール、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、天然もしくは非天然アミノ酸、複数の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、または抗体断片であり、
Ｍは、Ｎｉ、Ｐｄ、Ｐｔ、Ｃｕ、またはＡｕであり、
Ｘは、ハロゲン化物、トリフレート、テトラフルオロボレート、テトラアリールボレート、ヘキサフルオロアンチモネート、ビス（アルキルスルホニル）アミド、テトラフルオロホスフェート、ヘキサフルオロホスフェート、アルキルスルホネート、ハロアルキルスルホネート、アリールスルホネート、過塩素酸塩、ビス（フルオロアルキルスルホニル）アミド、ビス（アリールスルホニル）アミド、（フルオロアルキルスルホニル）（フルオロアルキル−カルボニル）アミド、硝酸塩、亜硝酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、アルキル硫酸塩、アリール硫酸塩、炭酸塩、重炭酸塩、カルボン酸塩、リン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、ホスフィン酸塩、または次亜塩素酸塩であり、
Ｌは、各出現につき独立して、トリアルキルホスフィン、トリアリールホスフィン、ジアルキルアリールホスフィン、アルキルジアリールホスフィン、（アルケニル）（アルキル）（アリール）ホスフィン、アルケニルジアリールホスフィン、アルケニルジアルキルホスフィン、酸化ホスフィン、ビス（ホスフィン）、ホスホラミド、トリアリールホスホネート、Ｎ−複素環状カルベン、任意に置換されたフェナントロリン、任意に置換されたイミノピリジン、任意に置換された２，２’−ビピリジン、任意に置換されたジイミン、任意に置換されたトリアゾリルピリジン、または任意に置換されたピラゾリルピリジンであり、
2017523964.tif 000028
は、アリール、ヘテロアリール、アルケニル、またはシクロアルケニルであり、
2017523964.tif 000029
は、任意に、ハロゲン化物、アシル、アジド、イソチオシアネート、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニルまたは保護されたアルキニル、アルコキシル、アリールカルボニル、シクロアルキル、ホルミル、ハロアルキル、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、アミド、ホスホネート、ホスフィネート、アルキルチオ、スルホニル、スルホンアミド、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、−ＣＦ３、−ＣＦ２Ｒ７、−ＣＦＲ７２、−ＣＮ、ポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン、−（ＣＨ２）ｐ−ＦＧ−Ｒ７、及びＺから選択される１つ以上の置換基によって更に置換され、
Ｚは、
【化２４】
2017523964.tif 000030
−Ｓ−アルキル、−ＳＨ、−Ｓ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ２Ｈ、−ＳＣＨ（ＣＨ３）−ＣＯ２Ｈ、または−ＳＣＨ（ＣＯ２Ｈ）−ＣＨ２ＣＯ２Ｈであり、
ｐは、各出現につき独立して、０〜１０の整数であり、
ＦＧは、各出現につき独立して、Ｃ（Ｏ）、ＣＯ２、Ｏ（ＣＯ）、Ｃ（Ｏ）ＮＲ７、ＮＲ７Ｃ（Ｏ）、Ｏ、Ｓｉ（Ｒ７）２、Ｃ（ＮＲ７）、（Ｒ７）２Ｎ（ＣＯ）Ｎ（Ｒ７）２、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ７、ＮＲ７Ｃ（Ｏ）Ｏ、及びＣ（Ｎ＝Ｎ）からなる群から選択され、
Ｒ７は、各出現につき独立して、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、アルケニル、及びアルキニルからなる群から選択され、
ｎは、１〜５の整数であり、
ｍは、１または２であり、
溶媒は、極性プロトン性溶媒、極性非プロトン性溶媒、または非極性溶媒である。
【００５７】
ある特定の実施形態では、本発明は、前述の方法のうちのいずれか１つに関し、ここでは溶媒は不活性溶媒であり、好ましくは、触媒を含む反応成分がその中で実質的に可溶性であるものである。好適な溶媒としては、エーテル、例えば、ジエチルエーテル、１，２−ジメトキシエタン、ジグリム、ｔ−ブチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン、水など；ハロゲン化溶媒、例えば、クロロホルム、ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロベンゼンなど；脂肪族もしくは芳香族炭化水素溶媒、例えば、ベンゼン、キシレン、トルエン、ヘキサン、ペンタンなど；エステルならびにケトン、例えば、酢酸エチル、アセトン、及び２−ブタノン；極性非プロトン性溶媒、例えば、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなど；または２つ以上の溶媒の組み合わせが含まれる。
【００５８】
ある特定の実施形態では、本発明は、前述の方法のうちのいずれか１つに関し、ここでは、溶媒は、溶媒混合物である。ある特定の実施形態では、溶媒混合物は、極性非プロトン性溶媒を含む水性溶媒混合物である。ある特定の実施形態では、本発明は、前述の方法のうちのいずれか１つに関し、ここでは、溶媒混合物は、水と、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、またはジメチルホルムアミドなどの極性非プロトン性溶媒とを含む。ある特定の実施形態では、溶媒は、水とアセトニトリルとを含む溶媒混合物である。ある特定の実施形態では、本発明は、前述の方法のうちのいずれか１つに関し、ここでは、溶媒は、水とジメチルホルムアミドとを含む溶媒混合物である。ある特定の実施形態では、溶媒混合物は、約２０：１の水対極性非プロトン性溶媒〜約１：２０の水対極性非プロトン溶媒、約約１９：１の水対極性非プロトン性溶媒〜約１：１９の水対極性非プロトン溶媒、または約１８：１の水対極性非プロトン性溶媒〜約１：１８の水対極性非プロトン溶媒を含む。ある特定の実施形態では、溶媒混合物は、約５：１の水対極性非プロトン性溶媒〜約１：５の水対極性非プロトン溶媒を含む。ある特定の実施形態では、溶媒混合物は、緩衝液を更に含む。例えば、緩衝液は、トリス、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＥＳ、またはＮａ２ＨＰＯ４：ＮａＨ２ＰＯ４であってもよい。ある特定の実施形態では、緩衝液の濃度は、約０．０１Ｍ〜約１Ｍ、例えば、約２５ｍＭまたは約０．１Ｍである。
【００５９】
ある特定の実施形態では、本発明は、前述の方法のうちのいずれか１つに関し、ここでは、反応は約４℃〜約４０℃で行われる。ある特定の実施形態では、本発明は、反応が、約１０℃、約１５℃、約２０℃、約２５℃、約３０℃、または約３５℃で行われる、前述の方法のうちのいずれか１つに関する。
【００６０】
ある特定の実施形態では、本発明は、前述の方法のうちのいずれか１つに関し、ここでは、反応は、約１０秒後、約２０秒後、約３０秒後、約４０秒後、約５０秒後、約１分後、約２分後、約３分後、約４分後、約５分後、約１０分後、約１５分後、約２０分後、約２５分後、約３０分後、約３５分後、約４０分後、約４５分後、約５０分後、約５５分後、約６０分後、約６５分後、約７０分後、約７５分後、約８０分後、約８５分後、または約９０分後に実質的に完了する。ある特定の実施形態では、本発明は、前述の方法のうちのいずれか１つに関し、ここでは、反応は、約２時間後、約３時間後、約４時間後、約５時間後、約６時間後、約７時間後、約８時間後、約９時間後、約１０時間後、約１１時間後、または約１２時間後に実質的に完了する。
【００６１】
本明細書に挙げられた溶媒及び温度範囲は限定的ではなく、本発明のプロセスの例示の様式に相当するにすぎないことが理解されるが、本発明の反応は、広範囲にわたる条件下で行われてもよい。
【００６２】
一般に、反応は、反応物質、プレ触媒、または生成物に悪影響を及ぼさない穏やかな条件を用いて行われることが望ましいであろう。例えば、反応温度は、反応の速度、及び反応物質ならびに触媒の安定性に影響を及ぼす。反応は、通常、２０℃〜３００℃の範囲で、より好ましくは２０℃〜１５０℃の範囲の温度で行われるであろう。ある特定の実施形態では、反応は、室温で（すなわち、約２０℃〜約２５℃）で行われるであろう。ある特定の実施形態では、反応混合物のｐＨは、約８．５であってもよい。ある特定の実施形態では、反応混合物のｐＨは、約８．０、約７．５、約７．０、約６．５、約６．０、約５．５、約５．０、約４．５、約４．０、約３．５、約３．０、約２．５、約２．０、または約１．５であってもよい。
【００６３】
本発明の別の態様は、チオールまたはセレノール部分を含むバイオポリマーを、上で定義された構造式ＩＩの試薬と接触させることを含む、バイオポリマー中のチオールまたはセレノールを官能基化する方法に関する。バイオポリマー及びＩＩが互いに接触する条件は、Ａｒ１が、バイオポリマーのチオールまたはセレノールに導入されている官能基化バイオポリマーを生成するために十分なものである。ある特定の実施形態では、バイオポリマーは、オリグヌクレオチド、ポリヌクレオチド、オリゴ糖、または多糖である。
【００６４】
ある特定の実施形態では、本発明は、バイオポリマー中のチオールまたはセレノールを官能基化する方法に関し、この官能基化試薬は、上述された式（ＩＩ）の化合物である。
【００６５】
本発明の別の態様は、第１のチオール部分または第１のセレノール部分と第２のチオール部分または第２のセレノール部分とを含むバイオリマーを、本明細書で定義される式ＩＶの試薬と接触させ、これによって、第１のチオール部分または第１のセレノール部分が、Ｒｙを介して第２のチオール部分または第２のセレノール部分に共有結合された、官能基化バイオポリマーを生成することを含む方法に関する。バイオポリマー及びＩＶが互いに接触する条件は、官能基化バイオポリマーを生成するために十分なものである。ある特定の実施形態では、バイオポリマーは、オリグヌクレオチド、ポリヌクレオチド、オリゴ糖、または多糖である。
【００６６】
ある特定の実施形態では、バイオポリマー中のチオールまたはセレノールを官能基化する方法に関し、官能基化試薬は、本明細書に記載される式（ＩＶ）の化合物である。
【００６７】
スキーム１によって表された方法の特定の実施形態では、Ａｒ１は、ハロゲン化物、アシル、アジド、イソチオシアネート、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニルまたは保護されたアルキニル、アルコキシル、アリールカルボニル、シクロアルキル、ホルミル、ハロアルキル、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、アミド、ホスホネート、ホスフィネート、アルキルチオ、スルホニル、スルホンアミド、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、−ＣＦ３、−ＣＦ２Ｒ７、−ＣＦＲ７２、−ＣＮ、ポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン、及び−（ＣＨ２）ｐ−ＦＧ−Ｒ７からなる群から独立して選択される１つ以上の置換基によって置換された、（Ｃ６〜Ｃ１０）炭素環式アリール、（Ｃ３〜Ｃ１２）ヘテロアリール、（Ｃ３〜Ｃ１４）多環式アリール、またはアルケニルであり、
ｐは、各出現につき独立して、０〜１０の整数であり、
ＦＧは、各出現につき独立して、Ｃ（Ｏ）、ＣＯ２、Ｏ（ＣＯ）、Ｃ（Ｏ）ＮＲ７、ＮＲ７Ｃ（Ｏ）、Ｏ、Ｓｉ（Ｒ７）２、Ｃ（ＮＲ７）、（Ｒ７）２Ｎ（ＣＯ）Ｎ（Ｒ７）２、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ７、ＮＲ７Ｃ（Ｏ）Ｏ、及びＣ（Ｎ＝Ｎ）からなる群から選択され、
Ｒ７は、各出現につき独立して、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、アルケニル、及びアルキニルからなる群から選択され、
１つ以上の置換基のうちの少なくとも１つは、ハロゲン化物である。
【００６８】
特定のアリール化生成物は、生成物の更なる官能基化を可能にする官能基を含有する。ある特定の実施形態では、アリール−ハロゲン化物結合は、このような更なる官能基化のための有用なきっかけを提供する。例えば、アリール−ハロゲン化物結合は、追加のチオール含有試薬との金属触媒反応または金属媒介クロスカップリング反応を起こすことができる。
【００６９】
したがって、Ａｒ１が、少なくとも１つのハロゲン化物によって置換された（Ｃ６〜Ｃ１０）炭素環式アリール、（Ｃ３〜Ｃ１２）ヘテロアリール、（Ｃ３〜Ｃ１４）多環式アリール、またはアルケニルである特定の実施形態では、スキーム１によって表された方法は、化合物ＩＩＩを、チオール部分またはセレノール部分を含有する化合物と接触させて、これによって、カップリング生成物を得ることを更に含む。
【化２５】
2017523964.tif 000031
【００７０】
ある特定の実施形態では、チオール部分またはセレノール部分を含有する化合物は、約５００ｇ／モル未満の分子量を有する小分子である。
【００７１】
ある特定の実施形態では、チオール部分またはセレノール部分を含有する化合物は、天然もしくは非天然アミノ酸、複数の天然もしくは非天然アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質などの生体分子である。
【００７２】
ある特定の実施形態では、化合物ＩＩＩをチオール部分またはセレノール部分を含有する化合物と接触させるステップは、スキーム１に示された反応からのＰｄ副産物の存在下で起こる。
【００７３】
例示の化合物
ある特定の実施形態では、部分構造ＩＩＩを含む化合物に関し、
【化２６】
2017523964.tif 000032
式中、
Ａ１は、Ｈ、アミン保護基、アルキル、アリールアルキル、アシル、アリール、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、天然もしくは非天然アミノ酸、複数の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、または抗体断片であり、
Ａ２は、ＮＨ２、ＮＨ（アミド保護基）、Ｎ（アミド保護基）、ＯＨ、Ｏ（カルボキシレート保護基）、天然もしくは非天然アミノ酸、複数の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、または抗体断片であり、
Ｙは、ＳまたはＳｅであり、
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、アリールアルキル、アシル、アリール、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、天然もしくは非天然アミノ酸、複数の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、または抗体断片であり、
ｎは、１〜５の整数であり、
Ａｒ１は、任意に置換されたアリール、ヘテロアリール、アルケニル、またはシクロアルケニルである。
【００７４】
ある特定の実施形態では、本発明は、部分構造ＩＩＩを含む化合物に関し、式中、Ａｒ１は、蛍光体、造影剤、検出試薬、生体分子、治療薬、親油性部分、高親和性結合対の成員、または細胞−受容体標的化剤に共有結合される。ある特定の実施形態では、本発明は、前述の化合物のうちのいずれか１つに関し、式中、Ａｒ１はビオチンに共有結合される。ある特定の実施形態では、本発明は、前述の化合物のうちのいずれか１つに関し、式中、Ａｒ１はフルオレセインに共有結合される。ある特定の実施形態では、本発明は、前述の化合物のうちのいずれかに関し、式中、Ａｒ１は治療薬に共有結合される、この治療薬は、トラメチニブ、トポテカン、アビラテロン、ダブラフェニブ、またはバンデタニブである。
【００７５】
ある特定の実施形態では、本発明は、部分構造ＩＩＩを含む化合物に関し、式中Ａｒ１は、蛍光体によって構成される。ある特定の実施形態では、本発明は、前述の化合物のうちのいずれかに関し、式中、Ａｒ１は治療薬によって構成される。ある特定の実施形態では、この治療薬は、トラメチニブ、トポテカン、アビラテロン、ダブラフェニブ、またはバンデタニブである。
【００７６】
ある特定の実施形態では、蛍光体は、キサンテン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、ナフタレン、アントラセン、オキサジアゾール、ピレン、アクリジン、テトラピロール、アリールメチン、ホウ素−ジピロメテン（ＢＯＤＩＰＹ）の誘導体、またはシアニン色素である。特定の他の実施形態では、蛍光体は、蛍光タンパク質である。ある特定の実施形態では、検出試薬は、例えば、ナノ粒子、ＭＲＩ造影剤、色素部分、または放射性核種である。特定の他の実施形態では、生体分子は、タンパク質、ペプチド、単糖、オリゴ糖、多糖、脂質、糖脂質、グリセロ脂質、リン脂質、ホルモン、神経伝達物質、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ステロール、代謝産物、ビタミン、または天然産物である。
【００７７】
ある特定の実施形態では、治療薬は、薬剤が投与される対象において治療的効果をもたらす化合物または化合物の部分構造である。ある特定の実施形態では、治療薬は、ある特定の細胞に対して毒性である。部分構造ＩＩＩ中のＡｒ１に共有結合される例示の治療薬としては、トラメチニブ、トポテカン、アビラテロン、ダブラフェニブ、またはバンデタニブが含まれる。
【００７８】
ある特定の実施形態では、親油性部分は、部分構造ＩＩＩの化合物が、本明細書に記載される脂質、脂肪、油、及び非極性溶媒に対して親和性を有するか、またはこれらに可溶性であることを可能にする。例示の親油性部分としては、ケイ皮酸などの両親媒性界面活性剤が含まれる。
【００７９】
ある特定の実施形態では、細胞−受容体標的化剤は、エピトープなどのリガンド、ペプチド、抗体、小有機化合物、神経伝達物質である。高親和性結合対としては、ビオチン−アビジン、ビオチン−ストレプトアビジ、リガンド−細胞受容体、Ｓ−ペプチドならびにリボヌクレアーゼＡ、ジゴキシゲニンならびにその受容体、及び相補的オリゴヌクレオチド対が含まれる。
【００８０】
ある特定の実施形態では、本発明は、部分構造ＩＩＩを含む化合物に関し、式中、Ａ１及びＡ２は、独立して、天然もしくは非天然アミノ酸、複数の天然もしくは非天然アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である。
【００８１】
ある特定の実施形態では、部分構造ＩＩＩのＡ１及びＡ２は、それぞれ独立して、アルギニン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、プロリン、チロシン、またはトリプトファンを含む。ある特定の実施形態では、Ａ１及びＡ２は、システインまたはセレノシステインを含まない。ある特定の実施形態では、Ａ１及びＡ２は、−ＳＨまたは−ＳｅＨ部分を含有するいかなるアミノ酸も含まない。
【００８２】
ある特定の実施形態では、本発明は、部分構造ＩＩＩを含む化合物に関し、式中、Ｒ１は、Ｈである。ある特定の実施形態では、本発明は、部分構造ＩＩＩを含む化合物に関し、式中、Ｘは、塩化物などのハロゲン化物である。ある特定の実施形態では、Ｘはトリフレートである。
【００８３】
ある特定の実施形態では、本発明は、部分構造ＩＩＩを含む化合物に関し、式中、Ａ１及びＡ２は、共有結合されている。ある特定の実施形態では、部分構造ＩＩＩは、官能基化Ｓ部分または官能基化Ｓｅ部分を有する環状ペプチドを含む。ある特定の実施形態では、官能基化Ｓ部分または官能基化Ｓｅ部分は、それぞれアリール化Ｓ部分またはアリール化Ｓｅ部分である。
【００８４】
ある特定の実施形態では、Ａ１またはＡ２は、抗体または抗体断片を含む。ある特定の実施形態では、抗体は無処置であり、官能基化（例えば、アリール化）Ｃｙｓ、Ｓｅｃによる単一点突然変異、または−Ｓ（官能基）もしくは−Ｓｅ（官能基）をその主鎖末端に含む人工アミノ酸を含む。代替的な実施形態では、Ａ１またはＡ２は、部分的抗体還元後に、抗体断片を含む。
【００８５】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される化合物のいずれか１つに関する。
【００８６】
例示のステープル化合物
ある特定の実施形態では、本発明は、部分構造Ｖを含む化合物に関し、
【化２７】
2017523964.tif 000033
式中、各出現につき独立して、
Ａ１は、Ｈ、アミン保護基、アルキル、アリールアルキル、アシル、アリール、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、天然もしくは非天然アミノ酸、複数の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、または抗体断片であり、
Ａ２は、ＮＨ２、ＮＨ（アミド保護基）、Ｎ（アミド保護基）、ＯＨ、Ｏ（カルボキシレート保護基）、天然もしくは非天然アミノ酸、複数の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、または抗体断片であり、
Ａ３、Ａ４、及びＡ５は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、及び複数の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸からなる群から選択され、
Ｙは、ＳまたはＳｅであり、
ｎは、１〜５であり、
Ｒｙは、芳香族基、ヘテロ芳香族基、アルケン基、またはシクロアルケン基を含む任意に置換された架橋部分であり、
ｙは、２、３、４、５、または６であり、
各Ｚは、独立して、
【化２８】
2017523964.tif 000034
−Ｓ−アルキル、−ＳＨ、−Ｓ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ２Ｈ、−ＳＣＨ（ＣＨ３）−ＣＯ２Ｈ、または−ＳＣＨ（ＣＯ２Ｈ）−ＣＨ２ＣＯ２Ｈであり、
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、アリールアルキル、アシル、アリール、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、天然もしくは非天然アミノ酸、複数の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、または抗体断片である。
【００８７】
ある特定の実施形態では、本発明は、本明細書記載される化合物のいずれかに関し、式中、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、及びＡ５のいずれもシステインを含まない。
【００８８】
ある特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載される化合物のいずれかに関し、式中、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、及びＡ５のうちの１つ以上は、アルギニン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、グリシン、プロリン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンを含む。
【００８９】
ある特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載される化合物のいずれかに関し、式中、Ｒｙは、任意に置換された二官能性架橋部分または任意に置換された三官能性架橋部分である。
【００９０】
ある特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載される化合物のいずれかに関し、式中、Ｒｙは芳香族基である。
【００９１】
ある特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載される化合物のいずれかに関し、式中、Ｒｙは、任意に置換された、
【化２９】
2017523964.tif 000035
またはである。
【００９２】
ある特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載される化合物のいずれかに関し、式中、Ｒｙは、全フッ素置換されたアリールパラ置換ジラジカルではない。
【００９３】
ある特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載される化合物のいずれか１つに関し、式中、ｙは、２であり、Ｒｙは、
【化３０】
2017523964.tif 000036
からなる群から選択され、二官能性架橋部分のいずれかは、任意に置換されてもよい。
【００９４】
ある特定の実施形態では、本発明は、部分構造ＶＩを含む化合物に関し、
【化３１】
2017523964.tif 000037
式中、各出現につき独立して、
Ａ１は、Ｈ、アミン保護基、アルキル、アリールアルキル、アシル、アリール、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、天然もしくは非天然アミノ酸、複数の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、または抗体断片であり、
Ａ２は、ＮＨ２、ＮＨ（アミド保護基）、Ｎ（アミド保護基）、ＯＨ、Ｏ（カルボキシレート保護基）、天然もしくは非天然アミノ酸、複数の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、または抗体断片であり、
Ａ３、Ａ４、及びＡ５は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、及び複数の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸からなる群から選択され、
Ｙは、ＳまたはＳｅであり、
Ｒ１は、Ｈ、アルキル、アリールアルキル、アシル、アリール、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、天然もしくは非天然アミノ酸、複数の天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、または抗体断片であり、
Ｍは、Ｎｉ、Ｐｄ、Ｐｔ、Ｃｕ、またはＡｕであり、
Ｘは、ハロゲン化物、トリフレート、テトラフルオロボレート、テトラアリールボレート、ヘキサフルオロアンチモネート、ビス（アルキルスルホニル）アミド、テトラフルオロホスフェート、ヘキサフルオロホスフェート、アルキルスルホネート、ハロアルキルスルホネート、アリールスルホネート、過塩素酸塩、ビス（フルオロアルキルスルホニル）アミド、ビス（アリールスルホニル）アミド、（フルオロアルキルスルホニル）（フルオロアルキル−カルボニル）アミド、硝酸塩、亜硝酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、アルキル硫酸塩、アリール硫酸塩、炭酸塩、重炭酸塩、カルボン酸塩、リン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、ホスフィン酸塩、または次亜塩素酸塩であり、
Ｌは、各出現につき独立して、トリアルキルホスフィン、トリアリールホスフィン、ジアルキルアリールホスフィン、アルキルジアリールホスフィン、（アルケニル）（アルキル）（アリール）ホスフィン、アルケニルジアリールホスフィン、アルケニルジアルキルホスフィン、酸化ホスフィン、ビス（ホスフィン）、ホスホラミド、トリアリールホスホネート、Ｎ−複素環状カルベン、任意に置換されたフェナントロリン、任意に置換されたイミノピリジン、任意に置換された２，２’−ビピリジン、任意に置換されたジイミン、任意に置換されたトリアゾリルピリジン、または任意に置換されたピラゾリルピリジンであり、
2017523964.tif 000038
は、アリール、ヘテロアリール、アルケニル、またはシクロアルケニルであり、
2017523964.tif 000039
は、任意に、ハロゲン化物、アシル、アジド、イソチオシアネート、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニルまたは保護されたアルキニル、アルコキシル、アリールカルボニル、シクロアルキル、ホルミル、ハロアルキル、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、アミド、ホスホネート、ホスフィネート、アルキルチオ、スルホニル、スルホンアミド、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、−ＣＦ３、−ＣＦ２Ｒ７、−ＣＦＲ７２、−ＣＮ、ポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン、−（ＣＨ２）ｐ−ＦＧ−Ｒ７、及びＺから選択される１つ以上の置換基によって更に置換され、
Ｚは、
【化３２】
2017523964.tif 000040
−Ｓ−アルキル、−ＳＨ、−Ｓ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ２Ｈ、−ＳＣＨ（ＣＨ３）−ＣＯ２Ｈ、または−ＳＣＨ（ＣＯ２Ｈ）−ＣＨ２ＣＯ２Ｈであり、
ｐは、各出現につき独立して、０〜１０の整数であり、
ＦＧは、各出現につき独立して、Ｃ（Ｏ）、ＣＯ２、Ｏ（ＣＯ）、Ｃ（Ｏ）ＮＲ７、ＮＲ７Ｃ（Ｏ）、Ｏ、Ｓｉ（Ｒ７）２、Ｃ（ＮＲ７）、（Ｒ７）２Ｎ（ＣＯ）Ｎ（Ｒ７）２、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ７、ＮＲ７Ｃ（Ｏ）Ｏ、及びＣ（Ｎ＝Ｎ）からなる群から選択され、
Ｒ７は、各出現につき独立して、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、アルケニル、及びアルキニルからなる群から選択され、
ｎは、１〜５の整数であり、
ｍは、１または２である。
【００９５】
部分構造ＶＩを含む化合物の特定の実施形態では、
2017523964.tif 000041
は、
【化３３】
2017523964.tif 000042
からなる群から選択される。
【００９６】
ある特定の実施形態では、式中、Ａ１及びＡ２は、独立して、天然もしくは非天然アミノ酸、複数の天然もしくは非天然アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である。
【００９７】
ある特定の実施形態では、Ａ１は、アルギニン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、プロリン、チロシン、またはトリプトファンを含む。
【００９８】
ある特定の実施形態では、Ａ２は、アルギニン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、プロリン、チロシン、またはトリプトファンを含む。
【００９９】
ある特定の実施形態では、Ａ１及びＡ２は、システインまたはセレノシステインを含まない。
【０１００】
ある特定の実施形態では、Ｒ１はＨである。
【０１０１】
例示の多金属試薬
ある特定の実施形態では、本発明は、式ＩＶの化合物に関し、
【化３４】
2017523964.tif 000043
式中、各出現につき独立して、
Ｍは、Ｎｉ、Ｐｄ、Ｐｔ、Ｃｕ、またはＡｕであり、
Ｒｙは、芳香族基、ヘテロ芳香族基、アルケン基、またはシクロアルケン基を含む任意に置換された架橋部分であり、
ｙは、２、３、４、５、または６であり、
Ｘは、ハロゲン化物、トリフレート、テトラフルオロボレート、テトラアリールボレート、ヘキサフルオロアンチモネート、ビス（アルキルスルホニル）アミド、テトラフルオロホスフェート、ヘキサフルオロホスフェート、アルキルスルホネート、ハロアルキルスルホネート、アリールスルホネート、過塩素酸塩、ビス（フルオロアルキルスルホニル）アミド、ビス（アリールスルホニル）アミド、（フルオロアルキルスルホニル）（フルオロアルキル−カルボニル）アミド、硝酸塩、亜硝酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、アルキル硫酸塩、アリール硫酸塩、炭酸塩、重炭酸塩、カルボン酸塩、リン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、ホスフィン酸塩、または次亜塩素酸塩であり、
Ｌは、各出現につき独立して、トリアルキルホスフィン、トリアリールホスフィン、ジアルキルアリールホスフィン、アルキルジアリールホスフィン、（アルケニル）（アルキル）（アリール）ホスフィン、アルケニルジアリールホスフィン、アルケニルジアルキルホスフィン、酸化ホスフィン、ビス（ホスフィン）、ホスホラミド、トリアリールホスホネート、Ｎ−複素環状カルベン、任意に置換されたフェナントロリン、任意に置換されたイミノピリジン、任意に置換された２，２’−ビピリジン、任意に置換されたジイミン、任意に置換されたトリアゾリルピリジン、または任意に置換されたピラゾリルピリジンであり、
ｍは、１または２である。
【０１０２】
ある特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載される化合物のうちのいずれか１つに関し、式中、Ｒｙは、任意に置換された二官能性架橋部分または任意に置換された三官能性架橋部分である。
【０１０３】
ある特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載される化合物のうちのいずれか１つに関し、式中、Ｒｙは芳香族基を含む。
【０１０４】
ある特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載される化合物のうちのいずれか１つに関し、式中、Ｒｙは、任意に置換された
【化３５】
2017523964.tif 000044
である。
【０１０５】
ある特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載される化合物のうちのいずれか１つに関し、式中、ｙは２であり、Ｒｙは、
【化３６】
2017523964.tif 000045
からなる群から選択され、式中、二官能性架橋部分のいずれかは、任意に置換されてもよい。
【０１０６】
ある特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載される化合物のうちのいずれか１つに関し、式中、ｙは３であり、Ｒｙは、
【化３７】
2017523964.tif 000046
からなる群から選択され、式中、三官能性架橋部分のいずれかは、任意に置換されてもよい。
【０１０７】
例示のプレ触媒及び方法
【化３８】
2017523964.tif 000047
【０１０８】
本発明はまた、金属プレ触媒をＡｒ１Ｘ（例えば、ハロゲン化アリール）試薬とともに用いて、（例えば、スキーム６によって表される代表的な反応のように）チオールまたはセレノールを官能基化する方法（例えば、アリール化）を提供する。
【０１０９】
ある特定の実施形態では、プレ触媒は、空気安定性の有利な特性を示す。例示のプレ触媒としては、Ｐｈ−メシレートパラジウムプレ触媒（例えば、第２世代ブッフワルド触媒などの２−アミノビフェニルＰｄ種）が含まれる。
【０１１０】
スキーム６によって表された反応の実施形態では、
Ａｒ１は、任意に置換されたアリール、ヘテロアリール、アルケニル、またはシクロアルケニルであり、
Ｘは、ハロゲン化物、トリフレート、テトラフルオロボレート、テトラアリールボレート、ヘキサフルオロアンチモネート、ビス（アルキルスルホニル）アミド、テトラフルオロホスフェート、ヘキサフルオロホスフェート、アルキルスルホネート、ハロアルキルスルホネート、アリールスルホネート、過塩素酸塩、ビス（フルオロアルキルスルホニル）アミド、ビス（アリールスルホニル）アミド、（フルオロアルキルスルホニル）（フルオロアルキル−カルボニル）アミド、硝酸塩、亜硝酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、アルキル硫酸塩、アリール硫酸塩、炭酸塩、重炭酸塩、カルボン酸塩、リン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、ホスフィン酸塩、または次亜塩素酸塩であり、
Ｒ１０は、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アラルキル、アリール、ヘテロアラルキル、またはヘテロアリールを表し、
Ａ１、Ａ２、Ｒ１、Ｙ、Ｌ、Ｍ、ｍ、及びｎは、スキーム１について定義された通りである。
【０１１１】
例示の抱合化合物
ある特定の実施形態では、本発明は、ハイブリッド組成物に関し、ハイブリッド組成物は、リンカーと、部分構造ＩＩＩの化合物と、検出可能な部分とを含み、リンカーは、化合物を検出可能な部分に結合させる。
【０１１２】
ある特定の実施形態では、本発明は、前述のハイブリッド組成物のうちのいずれか１つに関し、検出可能な部分は、蛍光体部分、色素部分、放射性核種、薬物分子、エピトープ、またはＭＲＩ造影剤である。
【０１１３】
ある特定の実施形態では、本発明はハイブリッド組成物に関し、ハイブリッド組成物は、リンカーと、部分構造ＩＩＩの化合物と、生体分子とを含み、リンカーは、化合物を生体分子に結合させる。
【０１１４】
ある特定の実施形態では、本発明は、前述のハイブリッド組成物のうちのいずれか１つに関し、生体分子はタンパク質である。
【０１１５】
ある特定の実施形態では、本発明は、前述のハイブリッド組成物のうちのいずれか１つに関し、生体分子は抗体である。
【０１１６】
ある特定の実施形態では、本発明は、前述のハイブリッド組成物のうちのいずれか１つに関し、生体分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）である。
【０１１７】
ある特定の実施形態では、本発明は、前述のハイブリッド組成物のうちのいずれか１つに関し、生体分子は、ｓｉＲＮＡである。
【０１１８】
ある特定の実施形態では、本発明はハイブリッド組成物に関し、ハイブリッド組成物は、リンカーと、部分構造ＩＩＩの化合物と、ポリマーとを含み、リンカーは、化合物をポリマーに結合させる。
【０１１９】
ある特定の実施形態では、本発明は、前述のハイブリッド組成物のうちのいずれか１つに関し、ポリマーはポリエチレングリコールである。
【０１２０】
ある特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるハイブリッド組成物のうちのいずれか１つに関する。
【０１２１】
例示のペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質
ある特定の実施形態では、本発明は、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質を生成するための方法に関し、これらのペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質は、部分構造ＩＩＩを含む。
【０１２２】
ある特定の実施形態では、本発明は、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質に関し、これらのペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質は、部分構造ＩＩＩを含む複数の部分構造を含む。
【０１２３】
ある特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質のうちのいずれか１つに関する。
【０１２４】
ある特定の実施形態では、本発明は、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質を生成するための方法に関し、これらのペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質は、部分構造Ｖを含む。
【０１２５】
ある特定の実施形態では、本発明は、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質に関し、これらのペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質は、部分構造Ｖを含む複数の部分構造を含む。
【０１２６】
ある特定の実施形態では、本発明は、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質を生成するための方法に関し、これらのペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質は、部分構造ＶＩを含む。
【０１２７】
ある特定の実施形態では、本発明は、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質に関し、これらのペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質は、部分構造ＶＩを含む複数の部分構造を含む。
【０１２８】
ある特定の実施形態では、本発明は、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質に関し、あるいはその全体が参照により本明細書に組み込まれる、公開された米国特許出願公開第ＵＳ２０１４／０１１３８７１号に記載される、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質に関与する方法に関する。
【０１２９】
例示の治療方法
抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）は、抗癌治療薬の発展段階の部類である。高細胞毒性の小分子薬剤が、抗体に結合され、単一の分子実体を作り出す。ＡＤＣは、小分子の高い有効性を目的の抗体の特異性と組み合わせて、癌性組織への薬理量の選択的送達を可能にし、従来の小分子薬剤の全身毒性を低減する。
【０１３０】
慣例的に、ＡＤＣは、小分子薬剤を、内部ジスルフィド結合を還元することから生じたシステイン、または表面露出されたリシンのいずれかに結合することによって調製される。複数のリシン及びシステインが抗体中に存在するために、これらの従来的なアプローチは、通常、不明確な薬物−抗体比を有する異種生成物をもたらし、このことが、製造及び特性評価の困難を引き起こす場合がある。更に、それぞれの個々の抗体−薬物複合体は、異なる薬物動態、有効性、及び安全性プロファイルを呈し、最適化ＡＤＣベースの癌治療への合理的なアプローチを妨げることがある。
【０１３１】
最近の研究は、部位特異的結合技術を用いて調製されたＡＤＣが、改善された薬理学的プロファイルを呈することを示した。
【０１３２】
したがって、ある特定の実施形態では、本発明は、薬物結合の明確にされた位置及び明確にされた薬物の抗体に対する比を有するＡＤＣに関する。ある特定の実施形態では、本発明のＡＤＣは、ＡＤＣベースの療法の合理的な最適化を可能にする。ある特定の実施形態では、ＡＤＣは、本明細書に記載される方法によって生成された化合物のうちのいずれか１つの構造を含む。ある特定の実施形態では、薬物対抗体比は、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、約１０：１、約１１：１、または約１２：１である。
【０１３３】
ある特定の実施形態では、本発明は、抗体に共有的に結合されたモノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）を含む、本明細書に言及されたＡＤＣのうちのいずれか１つに関し、この抗体は、癌細胞中で過剰発現される細胞表面受容体を標的化する。ＭＭＡＥは、チューブリン重合を遮断することによって、細胞分裂を阻害する高毒性の有糸分裂阻害剤である。ＭＭＡＥは、ヒトＣＤ３０を標的化する抗体に首尾よく結合され、ホジキンリンパ腫ならびに分化大細胞型リンパ腫を治療するためにＦＤＡに承認されたＡＤＣを作り出す。ある特定の実施形態では、本発明は、抗体に共有的に結合されたＭＭＡＥを含むＡＤＣの選択的合成のための方法に関する。
【０１３４】
ある特定の実施形態では、本発明は、本明細書に言及されるＡＤＣのうちのいずれか１つに関し、この抗体は、細胞受容体ＣＤ３０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ヒト上皮細胞増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、または上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）を標的化する。薬物を異なる受容体を標的化する抗体に結合させることによって、調製されたＡＤＣは、異なる癌を治療するために有用であるはずであることに留意するべきである。
【０１３５】
定義
便宜上、本発明の更なる説明の前に、本明細書、実施例、及び添付の特許請求の範囲で使用される特定の用語がここで集められている。
【０１３６】
本明細書で使用される冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、冠詞の文法的目的語のうちの１つまたは２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指すためのものである。例として、「ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ」は、１つの要素または２つ以上の要素を意味する。
【０１３７】
用語「ヘテロ原子」は、当該技術分野において承認されており、炭素または水素以外の任意の元素の原子を指す。例示的なヘテロ原子としては、ホウ素、窒素、酸素、リン、イオウ、及びセレンが含まれる。
【０１３８】
用語「アルキル」は、飽和脂肪族基のラジカルを指し、直鎖アルキル基、分岐鎖アルキル基、シクロアルキル（脂環式）基、アルキル置換シクロアルキル基、及びシクロアルキル置換アルキル基が含まれる。好ましい実施形態では、直鎖または分岐鎖アルキルは、３０個以下の炭素原子をその主鎖に有し（例えば、直鎖ではＣ１〜Ｃ３０、分岐鎖ではＣ３〜Ｃ３０）、より好ましくは２０個以下の炭素原子を有する。同様に、好ましいシクロアルキルは、３〜１０個の炭素原子をそれらの環構造中に有し、より好ましくは、５、６、または７個の炭素原子を環構造中に有する。
【０１３９】
炭素の数が特に指定されない限り、本明細書で使用される「低級アルキル」は、上記で定義されたアルキル基を意味するが、１〜１０個の炭素、より好ましくは１〜６個の炭素原子をその主鎖構造中に有するものを意味する。同様に「低級アルケニル」及び「低級アルキニル」は、同様な鎖長であるが、少なくとも２つの炭素原子を有する。好ましいアルキル基は、低級アルキルである。好ましい実施形態では、本明細書でアルキルと示された置換基は、低級アルキルである。
【０１４０】
本明細書で使用される用語「アラルキル」は、本明細書で定義されるアルキル基を介して親分子部分に付加される本明細書で定義されるアリール基を意味する。アリールアルキルの代表的な例としては、ベンジル、２−フェニルエチル、３−フェニルプロピル、及び２−ナフタ−２−イルエチルが含まれるが、これらに限定されない。
【０１４１】
用語「アルコキシ」は、酸素原子を介して親分子部分に付加された、本明細書に定義されるアルキル基を意味する。アルコキシの代表的な例としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、２−プロポキシ、ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペンチルオキシ、及びヘキシルオキシが含まれるが、これらに限定されない。
【０１４２】
用語「アルコキシカルボニル」は、本明細書で定義される、−Ｃ（＝Ｏ）−によって表されるカルボニル基を介して親分子部分に付加される、本明細書に定義されるアルコキシ基を意味する。アルコキシカルボニルの代表的な例としては、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、及びｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルが含まれるが、これらに限定されない。
【０１４３】
本明細書で使用される用語「カルボキシ」は、−ＣＯ２Ｈ基を意味する。
【０１４４】
本明細書で使用される用語「アルキルチオ」は、イオウ原子を介して親分子部分に付加される、本明細書で定義されるアルキル基を意味する。アルキルチオの代表的な例としては、メチルチオ、エチルチオ、ｔｅｒｔ−ブチルチオ、及びヘキシルチオが含まれるが、これらに限定されない。例えば、用語「アリールチオ」、「アルケニルチオ」、及び「アリールアルキルチオ」も同様に定義される。
【０１４５】
本明細書で使用される用語「アミド」は、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−を意味し、このアミド基は、窒素を介して親分子部分に結合される。アミドの例としては、ＣＨ３Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）−及びＣＨ３ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）−などのアルキルアミドが含まれる。
【０１４６】
本明細書で使用される用語「アリール」は、０〜４個のヘテロ原子を含み得る５員、６員、及び７員の芳香族基であり、例えば、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ピレン、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、トリアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジンならびにピリミジンなどを含む。
環構造中にヘテロ原子を有するこれらのアリール基は、「アリール複素環」または「ヘテロ芳香族」と称されてもよい。芳香族環は、例えば、ハロゲン、アジド、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスホネート、ホスフィネート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、スルホアミド、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロシクリル、芳香族もしくはヘテロ芳香族部分、−ＣＦ３、−ＣＮなどの上述されたこのような置換基で、１つ以上の環位置において置換され得る。用語「アリール」は、２つ以上の炭素が２つの隣接する環（これらの環は「縮合環」である）に共通する、２つ以上の環を有する多環式環系も含み、これらの環のうちの少なくとも１つは芳香族であり、例えば、他の環は、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール及び／またはヘテロシクリルとすることができる。
【０１４７】
略語Ｍｅ、Ｅｔ、Ｐｈ、Ｔｆ、Ｎｆ、Ｔｓ、Ｍｓ、及びｄｂａは、それぞれ、メチル、エチル、フェニル、トリフルオロメタンスルホニル、ノナフルオロブタンスルホニル、ｐ−トルエンスルホニル、メタンスルホニル、及びジベンジリデンアセトンを表す。また「ＤＣＭ」は、ジクロロメタンを表し、「ｒｔ」は、室温を表し、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、または約２６℃を意味してもよい。「ＴＨＦ」は、テトラヒドロフランを表し、「ＢＩＮＡＰ」は、２，２’−ビス（ジフェニルホスフィノ）−１，１’−ビナフチルを表し、「ｄｐｐｆ」は、１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセンを表し、「ｄｐｐｂ」は、１，４−ビス（ジフェニルホスフィノブタンを表し、「ｄｐｐｐ」は、１，３−ビス（ジフェニルホスフィノ）プロパンを表し、「ｄｐｐｅ」は、１，２−ビス（ジフェニルホスフィノ）エタンを表す。当業者の有機化学者によって利用される略語のより包括的なリストは、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  
Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙの各巻の創刊号に出ており、このリストは、略語標準表（Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｌｉｓｔ  ｏｆ  Ａｂｂｒｅｖｉａｔｉｏｎｓ）と題された表に提示されている。該リストに含まれる略語、及び当業者の有機化学者によって利用される全ての略語は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４８】
用語オルト、メタ、及びパラは、それぞれ、１，２−、１，３−、及び１，４−ニ置換ベンゼンに適用する。例えば、名称１，２−ジメチルベンゼン及びオルト−ジメチルベンゼンは同義である。
【０１４９】
用語「ヘテロシクリル」または「複素環基」は、３員〜１０員の環構造、より好ましくは３員〜７員環を指し、これらの環構造は、１〜４個のヘテロ原子を含む。複素環は、多環とすることもできる。ヘテロシクリル基としては、例えば、チオフェン、チアントレン、フラン、ピラン、イソベンゾフラン、クロメン、キサンテン、フェノキサチイン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、イソチアゾール、イソキサゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドリジン、イソインドール、インドール、インダゾール、プリン、キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、ピリミジン、フェナントリン、フェナジン、フェナルサジン、フェノチアジン、フラザン、フェノキサジン、ピロリジン、オキソラン、チオラン、オキサゾール、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、ラクトン、アゼチジノン及びピロリジノンなどのラクタム、スルタム、スルトンなどが含まれる。複素環は、例えば、ハロゲン、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスホネート、ホスフィネート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロシクリル、芳香族もしくはヘテロ芳香族部分、−ＣＦ３、−ＣＮなどの上述されたこのような置換基で、１つ以上の環位置において置換され得る。
【０１５０】
用語「非配位アニオン」とは、カチオンと弱く相互作用する陰性荷電部分に関するものである。非配位アニオンは、求電子性カチオンの反応性を研究する上で有用であり、一般ン、不飽和配位球圏を有するカチオン性金属錯体についての対イオンとして見いだされる。多くの場合、非配位アニオンは、多くの電気的に陰性の原子にわたって対称的に分配される負電荷を有する。これらのアニオンの塩は、多くの場合、ジクロロメタン、トルエン、またはアルカンなどの可溶性非極性有機溶媒である。
【０１５１】
用語「ポリシクリル」または「多環式基」は、２つ以上の炭素が２つの隣接する環、例えば、環が「縮合環」であるものに共通である、２つ以上の環（例えば、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール及び／またはヘテロシクリル）を指す。非隣接原子を介して結合される環は、「架橋」環と呼ばれる。多環の環のそれぞれは、例えば、ハロゲン、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスホネート、ホスフィネート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロシクリル、芳香族もしくはヘテロ芳香族部分、−ＣＦ３、−ＣＮなどの上述されたこのような置換基で置換され得る。
【０１５２】
本明細書で使用される用語「ヘテロ原子」は、炭素または水素以外の任意の元素の原子を意味する。好ましいヘテロ原子は、窒素、酸素、イオウ、及びリンである。
【０１５３】
本明細書で使用される用語「ニトロ」は、−ＮＯ２を意味し、用語「ハロゲン」または「ハロ」は、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、または−Ｉを示し、用語「スルフヒドリル」は、−ＳＨを意味し、用語「ヒドロキシル」は、−ＯＨを意味し、用語「スルホニル」は、−ＳＯ２−を意味し、用語「シアノ」は、−ＣＮ基を意味する。
【０１５４】
用語「ハロアルキル」は、本明細書に定義されるアルキル基を介して親分子部分に付加された、本明細書で定義される少なくとも１つのハロゲンを意味する。ハロアルキルの代表的な例としては、クロロメチル、２−フルオロエチル、トリフルオロメチル、ペンタフルオロエチル、及び２−クロロ−３−フルオロペンチルが含まれるが、これらに限定されない。
【０１５５】
用語「アミン」及び「アミノ」は、当該技術分野において承認されており、非置換及び置換アミンの両方、例えば、一般式によって表すことができる部分を指す。
【化３９】
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式中、Ｒ９、Ｒ１０、及びＲ’１０は、それぞれ独立して、水素、アルキル、アルケニル、−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ８を表すか、あるいはＲ９及びＲ１０は、それらが結合しているＮ原子と一緒になり、環構造中に４〜８個の炭素原子を有する複素環を完成し、Ｒ８は、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、複素環、または多環を表し、ｍは、０であるか、または１〜８の範囲の整数である。好ましい実施形態では、Ｒ９またはＲ１０のうちの１つのみがカルボニルであることができ、例えば、Ｒ９、Ｒ１０、及び窒素は一緒にイミドを形成しない。更により好ましい実施形態では、Ｒ９及びＲ１０（及び任意にＲ’１０）は、それぞれ独立して、水素、アルキル、アルケニル、または−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ８を表す。したがって、本明細書で使用される用語「アルキルアミン」は、それに結合した置換または非置換のアルキルを有する、上で定義されたアミン基を意味し、すなわち、Ｒ９及びＲ１０のうちの少なくとも１つは、アルキル基である。
【０１５６】
各表現、例えば、アルキル、ｍ、ｎなどの定義は、それが任意の構造において複数回出現するとき、同一構造におけるどこか他の場所のその定義とは無関係であることを意図する。
【０１５７】
用語トリフリル（−Ｔｆ）、トシル（−Ｔｓ）、メシル（−Ｍｓ）、及びノナフリルは、当該技術分野において承認されており、それぞれ、トリフルオロメタンスルホニル、ｐ−トルエンスルホニル、メタンスルホニル、及びノナフルオロブタンスルホニル基を指す。用語トリフレート（−ＯＴｆ）、トシレート（−ＯＴｓ）、メシレート（−ＯＭｓ）、及びノナフレートは、当該技術分野において承認されており、それぞれ、トリフルオロメタンスルホネートエステル、ｐ−トルエンスルホネートエステル、メタンスルホネートエステル、及びノナフルオロブタンスルホネートエステル官能基ならびに該基を含有する分子を指す。
【０１５８】
本明細書で使用されるフレーズ「保護基」は、潜在的に反応性の官能基を、望ましくない化学的変換から保護する、その一時的修飾を意味する。このような保護基の例としてはアルコールのシリルエーテル、及びアルデヒドならびにケトンのそれぞれアセタール及びケタールが含まれる。本発明の実施形態では、カルボキシレート保護基は、カルボン酸をエステルとして覆い隠す。特定の他の実施形態では、アミドは、アミドの−ＮＨ２を、例えば−ＮＨ（アルキル）、または−Ｎ（アルキル）２として覆い隠すアミド保護基によって保護される。保護基化学の分野がレビューされている（Ｇｒｅｅｎｅ，Ｔ．Ｗ．；Ｗｕｔｓ，Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  ｅｄ．；Ｗｉｌｅｙ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１）。
【０１５９】
「置換」または「で置換される」は、このような置換が、置換原子及び置換基の許容された原子価に従うこと、及び置換が、例えば、転位、環化、脱離などの変換を自然に受けることがない安定な化合物をもたらすことの暗黙の条件を含む。
【０１６０】
本明細書で使用される用語「置換された」は、有機化合物の全ての許容し得る置換基を含むよう企図される。広義の態様において、許容し得る置換基としては、有機化合物の非環式ならびに環式、分岐ならびに非分岐、炭素環式ならびに複素環式、芳香族ならびに非芳香族置換基が含まれる。例示的な置換基としては、例えば、本明細書で上述されたものが含まれる。許容し得る置換基は、適切な有機化合物に対して、１つ以上であり、かつ同一また異なることができる。本発明の目的のために、窒素などのヘテロ原子は、水素置換基及び／またはヘテロ原子の原子価を満たす、本明細書に記載される有機化合物の任意の許容し得る置換基を有してもよい。
【０１６１】
本明細書で使用される「極性プロトン性溶媒」は、約１．４〜４．０Ｄの双極子モーメントを有し、Ｏ−Ｈ結合またはＮ−Ｈ結合などの水素結合にあずかる化学部分を含む溶媒である。例示の極性プロトン性溶媒としては、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、アンモニア、水、及び酢酸が含まれる。
【０１６２】
本明細書で使用される「極性非プロトン性溶媒」は、Ｏ−ＨまたはＮ−Ｈなどの水素結合基を欠如する、約１．４〜４．０Ｄの双極子モーメントを有する溶媒を意味する。例示の極性非プロトン性溶媒としては、アセトン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、酢酸エチル、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、及びジメチルスルホキシドが含まれる。
【０１６３】
本明細書で使用される「非極性溶媒」は、低誘電率（＜５）及び約０．０〜約１．２の低双極子モーメントを有する溶媒を意味する。例示の非極性溶媒としては、ペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、クロロホルム、及びジエチルエーテルが含まれる。
【０１６４】
本発明の目的のために、化学元素は、元素周期表（Ｐｅｒｉｏｄｉｃ  Ｔａｂｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ）、ＣＡＳ式、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，６７ｔｈ  Ｅｄ．，１９８６−８７、内表紙に従って特定される。
例示
【０１６５】
本発明は、以下の実施例を参照して理解することができ、これらの実施例は、例示の目的で提示されたものにすぎず、限定するものではない。これらの実施例で利用された基質は、市販されていたものであるか、または市販の試薬から調製されたかもののいずれかであった。
【０１６６】
一般試薬情報
トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ・ＨＣｌ）は、Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ａｌｉｓｏ  Ｖｉｅｊｏ，ＣＡ）から購入した。１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム３−オキシドヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、Ｄ−ビオチン、Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミドリンカー、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＨ、  Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、及びＦｍｏｃ−Ｌ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨは、Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｗｏｏｄ  Ｄａｌｅ，ＩＬ）から購入した。アミノメチルポリスチレン樹脂は、自社プロトコル１に従って調製した。ペプチド合成グレードのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）ジクロロメタン（ＤＣＭ）、ジエチルエーテル、ＨＰＬＣグレードのアセトニトリル、及び塩酸グアニジンは、ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）から入手した。ハロゲン化アリール及びアリールトリフルオロメタンスルホネートは、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ、またはＭａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入し、更なる精製を行うことなく使用した。全ての重溶媒は、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅｓから購入し、更なる精製を行うことなく使用した。全ての他の試薬は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、受け取ったままの状態で使用した。トラスツズマブは、ＭＩＴのＫ．Ｄａｎｅ  Ｗｉｔｔｒｕｐ博士より有難くも贈呈された。
【０１６７】
ペプチド、タンパク質、及び抗体を用いる全ての反応は、ベンチトップ上で設定し、周囲条件下で行った。窒素充填グローブボックス内で行われる手順については、活性アルミナカラムを通過させ、その後アルゴンでパージすることによって、乾燥脱気ＴＨＦを得た。無水ペンタン、シクロヘキサン、及びアセトニトリルを、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＣｏｍｐａｎｙからＳｕｒｅｓｅａｌ（登録商標）ボトル内で購入し、使用前にアルゴンでパージした。
【０１６８】
一般分析情報
全ての小分子有機及び有機金属化合物は、１Ｈ、１３Ｃ  ＮＭＲ、及びＩＲ分光法、ならびに元素分析によって特性評価した（特記しない限り）。１９Ｆ  ＮＭＲ分光法は、トリフルオロメタンスルホネート対イオンを含有する有機金属錯体に使用した。３１Ｐ  ＮＭＲ分光法は、パラジウム錯体の特性評価に使用した。１Ｈ、１３Ｃ、３１Ｐ、及び１９Ｆ  ＮＭＲのコピーは、補足情報（Ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）の終わりに見出すことができる。各磁気共鳴スペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ  ４００ＭＨｚ装置及びＶａｒｉａｎ  ３００ＭＨｚ装置で記録した。特に明記しない限り、全ての１Ｈ  ＮＭＲ実験は、σ単位、百万分率（ｐｐｍ）で報告し、重溶媒中の残留プロトン共鳴ＣＨ２Ｃｌ２（５．３２ｐｐｍ）またはＣＨ３ＣＮ（１．９４ｐｐｍ）の信号に対して測定した。全ての１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルは、１Ｈ核からのデカップリングとして測定し、特に明記されない限り、ＣＤ２Ｃｌ２（５４．００ｐｐｍ）またはＣＤ３ＣＮ（１１８．６９ｐｐｍ）に対するσ単位（ｐｐｍ）で報告する。全ての３１Ｐ  ＮＭＲスペクトルは、１Ｈ核からのデカップリングとして測定し、Ｈ３ＰＯ４（０．００ｐｐｍ）に対するｐｐｍで報告する。１９Ｆ  ＮＭＲスペクトルは、１Ｈ核からのデカップリングとして測定し、ＣＦＣｌ３（０．００ｐｐｍ）またはα，α，α−トリフルオロトルエン（−６３．７２ｐｐｍ）に対するｐｐｍで報告する。全てのＦＴ−ＩＲスペクトルは、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  −  Ｎｉｃｏｌｅｔ  ｉＳ５分光光度計（ｉＤ５  ＡＴＲ−ダイヤモンド）で記録した。元素分析は、Ａｔｌａｎｔｉｃ  Ｍｉｃｒｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡによって行った。
【０１６９】
ＬＣ−ＭＳ分析
ＬＣ−ＭＳクロマトグラム及び関連する質量スペクトルは、Ａｇｉｌｅｎｔ  ６５２０  ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ質量分析装置を用いて取得した。大部分の実験において使用された溶媒組成は、Ｈ２Ｏ中、０．１％のＴＦＡ（溶媒Ａ）及びアセトニトリル中、０．１％のＴＦＡ（溶媒Ｂ）である。以下のＬＣ−ＭＳ法を使用した。
【０１７０】
方法Ａ  ＬＣ条件：Ｚｏｒｂａｘ  ＳＢ  Ｃ３カラム：２．１×１５０ｍｍ、５μｍ、カラム温度：４０℃、勾配：０〜３分  ５％のＢ、３〜２２分  ５〜９５％のＢ、２２〜２４分  ９５％のＢ、流速：０．８ｍＬ／分。ＭＳ条件：質量範囲３００〜３０００ｍ／ｚにおいて動的モードで拡張された正エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、乾燥ガスの温度＝３５０℃、乾燥ガスの流速＝１１Ｌ／分、ネブライザガスの圧力＝６０ｐｓｉ、キャピラリ−、フラグメンター、及び八極子高周波電圧は、それぞれ、４０００、１７５、及び７５０に設定した。
【０１７１】
方法Ｂ  ＬＣ条件：Ｚｏｒｂａｘ  ＳＢ  Ｃ３カラム：２．１×１５０ｍｍ、５μｍ、カラム温度：４０℃、勾配：０〜２分  ５％のＢ、２〜１１分  ５〜６５％のＢ、１１〜１２分  ６５％のＢ、流速：０．８ｍＬ／分。ＭＳ条件は、方法Ａと同様である。
【０１７２】
方法Ｃ  ＬＣ条件：Ｚｏｒｂａｘ  ＳＢ  Ｃ３カラム：２．１×１５０ｍｍ、５μｍ、カラム温度：４０℃、勾配：０〜２分  ５％のＢ、２〜１０分  ５〜９５％のＢ、１０〜１１分  ９５％のＢ、流速：０．８ｍＬ／分。ＭＳ条件は、方法Ａと同様である。
【０１７３】
データを、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒソフトウェアパッケージを用いて処理した。タンパク質のデコンボリュートされた質量を、最大エントロピーアルゴリズムを用いて得た。
【０１７４】
示されたＬＣ−ＭＳデータは、特に明記しない限り、方法Ａを用いて取得し、補足図中に示された全てのクロマトグラムのＹ軸は、全イオン電流（ＴＩＣ）を表し、質量スペクトル挿入図は、特に明記しない限り、ＴＩＣピークの積分に相当する。
【０１７５】
反応収率の決定
全ての報告された収率は、ＴＩＣスペクトルを積分することによって決定した。初めに、クロマトグラム上の全ての関連するペプチド含有種についてのピーク面積を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒソフトウェアパッケージを用いて積分した。この実験においては、ペプチドベースの副産物が生成されなかったために、表２に示された収率を、以下のように決定した：収率％＝Ｓｐｒ／Ｓｔｏｔａｌ（式中、Ｓｐｒは、生成物のピーク面積であり、Ｓｔｏｔａｌは、組み合わされたペプチド含有種（生成物及び出発物質）のピーク面積である）。ステープルペプチド（実施例１９）の収率を、以下の通りに算出した：収率％＝ｋ・Ｓｐｒ／Ｓｓｔ（式中、Ｓｐｒは、反応生成物のピーク面積であり、Ｓｓｔは、既知の量の精製生成物のピーク面積であり、ｋは、出発物質の初期量で割られた標準物質の既知量の比に等しい）。ペプチド安定性実験については、変換を以下の通りに計算した：残りのペプチド％＝Ｓｔ／Ｓ０（式中、Ｓｔは、対応のシステイン抱合体の時間ｔにおけるピーク面積であり、Ｓ０は、時間０におけるシステイン抱合体のピーク面積である）。
【０１７６】
実施例１−アリール化試薬の調製
Ｃｙｓ部分を選択的に認識し、かつアリール基を移動させることができる、一連のＰｄ（ＩＩ）試薬を設計した。これらの試薬は、嵩高の立体的及び電子過剰環境を、求電子基質の容易な酸化付加を好む金属中心に付与するビアリールホスフィンリガンドを特徴とする。例えば、錯体１ａ−ｂを、空気安定性固体として単離し、Ｐｄ（０）前駆体及びホスフィンリガンドから、それぞれアリールトリフレートまたは塩化物求電子の存在下で、好都合に合成した（図３）。代替的な合成では、トリフレート種を、Ａｇ（Ｉ）塩との塩メタセシスによって、塩化物錯体１ｂから調製した。全般的に、これらの合成変換は、広範なＰｄ（ＩＩ）をベースとする試薬にいくつかの補完ルートを提供する。
【０１７７】
実施例２−モデルポリペプチド
１ａと非保護モデルポリペプチド２との間の反応（図４）は、反応混合物のＬＣ−ＭＳ分析によって示唆されたように、出発ペプチド材料の完全な変換をもたらした。重要なことには、Ｃｙｓ  Ｓ−アリール化生成物３のみが、ＬＣ−ＭＳ運転溶媒混合物中に存在する酸による急冷の際に生成された１のいくつかの分解生成物と組み合わせて、この変換の結果として観察された。これらの分解生成物は、アリール化ＲｕＰｈｏｓホスホニウム塩及び連結されたＰｄ（Ｉ）−Ｐｄ（Ｉ）二量体種として特定され、これらのどちらも、ペプチド生成物３に比較して、著しく遅く溶離した。Ｐｄ（Ｉ）−Ｐｄ（Ｉ）二量体副産物を、独立して調製し、溶液中でＮＭＲ分光法を介して、及び固体状態で単結晶Ｘ線回折を介して構造的に特性評価し、反応混合物中のその同一性を確認した。
【０１７８】
実施例３−比較対照ペプチド
Ｃｙｓ残基またはＳｅｃ残基を欠如する比較対照ペプチドを、アリール条件に置いた。例えば、ＡＫＬＴＧＦ−ＮＨ（ＣＨ２Ｃ６Ｆ５）及びＶＴＬＰＳＴＦ＊ＧＡＳは、変換及び／または分解を示さず、アリール化がＣｙｓまたはＳｅｃ残基で限定的に起こることを示唆している。アリール条件下のＡＫＬＴＧＦ−ＮＨ（ＣＨ２Ｃ６Ｆ５）についてのＬＣＭＳトレースを図５に示す。
【０１７９】
実施例４−反応条件の変化
本明細書に記載されるＣｙｓアリール化は、水を含有する溶媒混合物においても作動する。アリール化実験を、モデルペプチド４（γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ）と試薬１ａとの間で、それぞれ、１：１  ＤＭＦ：Ｈ２Ｏ及び２：１  Ｈ２Ｏ：ＭｅＣＮ混合物中で行った。どちらの場合も、Ｓ−アリール化ペプチド５（γ−Ｇｌｕ−ＣｙｓＴｏｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ）を生成する選択的変換が、数分以内に起こり、非常に高速の反応速度を示唆した（図６）。
【０１８０】
実施例５−官能基許容性
この変換の官能基許容性に対処するために、いくつかのＰｄ系トリフレート試薬と、ＯＨ（例えば、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）及びＮＨ／ＮＨ２（例えば、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ）などの他の共通の求核性アミノ酸残基を特徴とする非保護ペプチド６（ＦＲＳＮＬＹＧＣＥＫＨＫＡＴ−ＮＨ２）との間で試験を行った。アリール化反応は、特に明記しない限り、ｐＨ８．５の０．１Ｍトリスの存在下で、１：２  ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏの溶媒系で、５分間行った。試験された全てのアリール化試薬（６ａ〜ｆ）について、使用されたＰｄ（ＩＩ）の性質に関わりなく、選択的かつほぼ定量的なＳ−アリール化を観察した（図７）。更に、トリフレートの代わりに塩化物リガンドを含有するＰｄをベースとする種１ｂを用いた試験は、１ｍＭのペプチド濃度において、Ｓ−アリール化ペプチド６ａを５分以内に生成する同様な反応性を示した。アリール化戦略は、複雑な薬物分子を含有するＰｄ（ＩＩ）種による生体共役反応にも従順である（図８）。
【０１８１】
実施例６−モデルタンパク質
次に、アリール化の化学作用を、単一のＣｙｓ残基を含有するモデルタンパク質を用いて評価した。Ｃｙｓ残基を配列鎖のＮ末端に組み込む単一点突然変異を有するＤＡＲＰｉｎタンパク質を、これらの試験のために設計し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現させた（最終的アミノ酸配列：ＧＧＣＧＧＳＤＬＧＫＫＬＬＥＡＡＲＡＧＱＤＤＥＶＲＩＬＭＡＮＧＡＤＶＮＡＹＤＤＮＧＶＴＰＬＨＬＡＡＦＬＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＹＧＡＤＶＮＡＡＤＳＷＧＴＴＰＬＨＬＡＡＴＷＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＨＧＡＤＶＮＡＱＤＫＦＧＫＴＡＦＤＩＳＩＤＮＧＮＥＤＬＡＥＩＬＱＫＬＮ）。５０ｕＭのタンパク質と５当量の１ａとの間の反応は、出発物質の５分間以内の完全な消費をもたらした。得られた生成混合物を、ＬＣ−ＭＳによって分析し、タンパク質の定量的モノアリール化を確認した。
【０１８２】
トリプシン消化の後の生成混合物のＭＳ／ＭＳ分析は、修飾がＣｙｓ残基上で限定的に起こり、ペプチド基質を用いて得られた結果を更に裏付けた（上記参照）。試薬１ａに加えて、Ｃｙｓアリール化を、ビオチン化されたフルオレセインをベースとする種を含む他の試薬を用いて成功裏に行った。例えば、ＤＡＲＰｉｎとフルオレセインを含有するＰｄ（ＩＩ）試薬との間の反応は、Ｓ標識タンパク質種の定量的形成をもたらした（図９）。反応混合物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、フルオレセイン標識の組み込みを確認した（図９）。
【０１８３】
実施例７−抗体中のＣｙｓ−Ｓ−アリール化
更なる試験は、ＩｇＧ抗体中の天然性ならびに非天然性Ｃｙｓ残基の官能基化を目指した。具体的には、部分的な抗体還元後に天然性Ｃｙｓ部分を官能基化することができるか、または主鎖末端上のＣｙｓもしくはセレノシステイン部分による単一点突然変異を含有する完全な抗体で官能基化を実行することができるかのいずれかの２つの独立したアプローチを検討した（図１０）。どちらの場合も、得られた構築物は、それらのアルキル、ジスルフィド、及びマレイミド同類物よりも、分解に対して著しく化学的に安定である。この安定性の改良は、Ｐｄ（ＩＩ）試薬により付与される高度に選択的かつ迅速な生体共役反応と併せて、大幅に改善された処理能力及び得られた抗体−薬物複合体についての拡張された治療特性を提供するはずである。図１１は、フルオレセインをアリール化部分として用いる、ヒトＩｇＧ１抗体基質における更なるＳ−アリール化のスキームを示す。反応条件（１）は、０．７５ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ、０．１Ｍのトリス、１５ｍＭのＴＣＥＰ、ｐＨ８．５、室温、２時間において行った。反応条件（２）は、０．５ｍｇ／ｍＬの部分的に還元されたＩｇＧ、０．１Ｍのトリス、１００ｍＭのＰｄ試薬、５％のアセトニトリル、ｐＨ８．５で、室温にて３０分で行った。
【０１８４】
実施例８−パラジウム試薬の合成
【化４０】
2017523964.tif 000049
窒素充填したグローブボックス内で、磁気撹拌棒を装備し、テフロン（登録商標）製スクリューキャップセプタムを備え付けた、オーブン乾燥したシンチレーションバイアル（１０ｍＬ）に、ＲｕＰｈｏｓ（６６ｍｇ、０．１４ミリモル）、４−ブロモトルエン（２４．２ｍｇ、０．１４ミリモル）、及びシクロヘキサン（１．０ｍＬ）を充填した。固体（ＣＯＤ）Ｐｄ（ＣＨ２ＳｉＭｅ３）２（５０．０ｍｇ、０．１３ミリモル）を素早く一度に添加し、得られた溶液を、室温で１６時間撹拌した。その後、ペンタン（３ｍＬ）を添加し、得られた混合物を、−２０℃の冷凍庫に３時間配置した。次いで、バイアルをグローブボックスの外に取り出し、得られた沈殿物を濾過し、ペンタン（３×３ｍＬ）で洗浄し、減圧下で乾燥させて、酸化的付加錯体を得た（７８．４ｍｇ、８２％）。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ２Ｃｌ２）  δ  ７．６１（ｍ、２Ｈ）、７．４３（ｔｔ、Ｊ＝７．５、１．６Ｈｚ、１Ｈ）、７．３７（ｍ、１Ｈ）、６．９１（ｄｄ、Ｊ＝８．２、２．３Ｈｚ、２Ｈ）、６．８６（ｄｄｄ、Ｊ＝７．８、３．１、１．５Ｈｚ、１Ｈ）、６．７６（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、２Ｈ）、６．６４（ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、２Ｈ）、４．６０（ｈｅｐｔ、Ｊ＝６．１Ｈｚ、２Ｈ）、２．２２（ｓ、３Ｈ）、２．１４（ｍ、２Ｈ）、１．７７（ｍ、６Ｈ）、１．６０（ｍ、６Ｈ）、１．３８（ｄ、Ｊ＝６．０Ｈｚ、６Ｈ）、１．１７（ｍ、６Ｈ）、１．０１（ｄ、Ｊ＝６．０Ｈｚ、６Ｈ）、０．７８（ｍ、２Ｈ）。
１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ、ＣＤ２Ｃｌ２）  δ  １５９．４２、１４５．３８、１４５．２０、１３７．７４、１３７．７０、１３４．８８、１３４．１８、１３３．８４、１３３．１１、１３３．０１、１３２．９４、１３１．６２、１３１．５６、１３０．９９、１３０．９７、１２８．２０、１２６．８１、１２６．７６、１１２．４４、１１２．４１、１０７．８８、７１．４４、３４．４０、３４．１４、２８．７３、２８．１７、２８．１５、２７．８２、２７．６９、２７．４９、２７．４６、２７．３５、２６．６０、２２．４６、２１．９３、２０．７９（観測された複雑性は、Ｃ−Ｐカップリングに起因する）。
３１Ｐ  ＮＭＲ（１２１ＭＨｚ、ＣＤ２Ｃｌ２）  δ  ２９．８９。
【０１８５】
実施例９−システインアリール化
【化４１】
2017523964.tif 000050
【０１８６】
ペプチドＰ１（上記の４μＬ、１５０μＭ）、Ｈ２Ｏ（４７μＬ）、有機溶媒（１μＬ）、及び緩衝液（６μＬ、１Ｍ）を、０．６ｍＬのプラスチック製エッペンチューブ内で混ぜ合わせ、ボルテクサーを用いて、得られた溶液を混合した。有機溶媒中のパラジウム錯体の原液（２μＬ、６００μＭ）を一度に添加し、反応チューブをボルテックスし、適切な試薬混合を確実にし、室温で５分間放置した。３−メルカプトプロピオン酸（６．３μＬ、０．０５μＬ／ｍＬの溶液）の添加によって、反応物を急冷させた。更に５分後に、ＬＣＭＳ溶液（６０μＬ）をエッペンチューブに添加し、反応混合物をＬＣＭＳにより分析した。
【０１８７】
急冷前の反応物の最終濃度：
ペプチド−１０μＭ、
Ｐｄ錯体−２０μＭ、
トリス緩衝液−１００ｍＭ、
ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ＝５：９５
【０１８８】
実施例１０−多金属種の合成
【化４２】
2017523964.tif 000051
窒素充填したグローブボックス内で、磁気撹拌棒を装備し、「テフロン」製スクリューキャップセプタムを備え付けた、オーブン乾燥したシンチレーションバイアル（１０ｍＬ）に、ＲｕＰｈｏｓ（１３９．４ｍｇ、０．３０ミリモル）、４，４’−ジクロロベンゾフェノン（３０．０ｍｇ、０．１２ミリモル、１当量）、及びシクロヘキサン（１．２ｍＬ）を充填した。固体（ＣＯＤ）Ｐｄ（ＣＨ２ＳｉＭｅ３）２（１１６．２ｍｇ、０．３０ミリモル、２．５当量）を素早く一度に添加し、得られた溶液を、室温で１６時間撹拌した。その後、ペンタン（３ｍＬ）を添加し、得られた混合物を、−２０℃の冷凍庫に３時間配置した。次いで、バイアルをグローブボックスの外に取り出し、得られた沈殿物を濾過し、ペンタン（３×３ｍＬ）で洗浄し、減圧下で乾燥させて、酸化的付加錯体を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ２Ｃｌ２）  δ  ７．６４（ｍ、４Ｈ）、７．４５（ｍ、２Ｈ）、７．３９（ｍ、２Ｈ）、７．３２（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、４Ｈ）、７．２５（ｄｄ、Ｊ＝８．４、２．１Ｈｚ、４Ｈ）、６．８８（ｄｄｄ、Ｊ＝７．７、３．１、１．３Ｈｚ、２Ｈ）、６．６５（ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ、４Ｈ）、４．６４（ｈｅｐｔ、Ｊ＝６．１Ｈｚ、４Ｈ）、２．１４（ｍ、４Ｈ）、１．７０（ｍ、２４Ｈ）、１．３９（ｄ、Ｊ＝６．０Ｈｚ、１２Ｈ）、１．２０（ｍ、１２Ｈ）、１．０２（ｄ、Ｊ＝６．０Ｈｚ、１２Ｈ）、０．７５（ｍ、４Ｈ）。
１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ、ＣＤ２Ｃｌ２）  δ  １９７．０１、１５９．７８、１４９．０９、１４５．４７、１４５．３０、１３７．２５、１３７．２１、１３５．４９、１３４．０６、１３３．９４、１３３．５８、１３３．０６、１３２．９５、１３１．５５、１３１．２３、１３１．２１、１２８．３４、１２６．９８、１２６．９２、１１１．５０、１０７．６９、７１．５３、３４．３９、３４．１２、２８．７８、２８．３２、２７．７３、２７．５９、２７．３８、２７．２７、２６．５９、２２．４４、２１．８９（観測された複雑性は、Ｃ−Ｐカップリングに起因する）。
３１Ｐ  ＮＭＲ（１２１ＭＨｚ、ＣＤ２Ｃｌ２）  δ  ３３．２７。
【０１８９】
実施例１１−ステープル処理
【化４３】
2017523964.tif 000052
【０１９０】
ペプチド（４μＬ、１５０μＭ）、Ｈ２Ｏ（２３μＬ）、及びトリス緩衝液（３μＬ、１Ｍ、ｐＨ＝７．５）を、０．６ｍＬのプラスチック製エッペンチューブ内で混ぜ合わせ、ボルテクサーを用いて、得られた溶液を混合した。ＣＨ３ＣＮ中のパラジウム錯体の原液（３０μＬ、４０μＭ）を一度に添加し、反応チューブをボルテックスし、適切な試薬混合を確実にし、室温で１０分間放置した。３−メルカプトプロピオン酸（６．３μＬ、０．１μＬ／ｍＬの溶液）の添加によって、反応物を急冷させた。更に５分後に、ＬＣＭＳ溶液（６０μＬ）をエッペンチューブに添加し、反応混合物をＬＣＭＳにより分析した。
【０１９１】
急冷前の反応物の最終濃度：
ペプチド−１０μＭ、
ＯＡ−２０μＭ、
トリス緩衝液−１００ｍＭ、
ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ＝１：１
【０１９２】
実施例１２−パラジウム試薬による薬物分子の抗体への抱合
結合プロトコル：トラスツズマブを、２０μＬスケールで、ＴＣＥＰで部分的に還元した。反応条件：１０μＭのトラスツズマブ（１．５ｍｇ／ｍＬまで）、３０μＭのＴＣＥＰ、０．１Ｍのトリス、ｐＨ８．０、３７℃、２時間。
【０１９３】
ＤＭＦ中に溶解した０．４ｍＭのパラジウム−バンデタニブ複合体１μＬを、部分的に還元された抗体２０μＬに添加し、得られた混合物を、室温で３０分間放置した。図１３を参照されたい。
【０１９４】
ＬＣ−ＭＳ分析：２０μＬの粗反応混合物を、４ｍＭのメルカプトプロピオン酸１μＬの添加によって急冷させた。得られた溶液を室温で５分間放置し、次いで、１０Ｋスピンコンセントレータを用いて、緩衝液を緩衝液Ｐ（２０ｍＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）に交換した。Ｎ−結合グリカンを、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）１μＬの添加によって除去し、抗体１００μｇに添加し、４５℃で１時間インキュベーションした。得られた溶液を、２００ｍＭのＴＣＥＰ溶液（ｐＨ７．５）の１／１０容量の添加によって完全に還元させ、３７℃で３０分間インキュベーションし、その後、ＬＣ−ＭＳ分析にかけた。この分析に基づいて、薬物対抗体比（ＤＡＲ）を計算し、約５．５であった（データ図示せず）。
【０１９５】
実施例１３−酸化的付加錯体の合成
酸化的付加錯体の合成のための一般手順
窒素充填したグローブボックス内で、磁気撹拌棒を装備した、オーブン乾燥したシンチレーションバイアル（１０ｍＬ）に、ＲｕＰｈｏｓ（１．１当量）、Ａｒ−Ｘ（１．１当量）、及びシクロヘキサンを充填した。固体（ＣＯＤ）Ｐｄ（ＣＨ２ＳｉＭｅ３）２（ＭｃＡｔｅｅ，Ｊ．Ｒ．Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．５１，３６６３−３６６７（２０１２））（１当量）を素早く一度に添加し、得られた溶液を、室温で１６時間撹拌した。その後、ペンタン（３ｍＬ）を添加し、得られた混合物を、−２０℃の冷凍庫に３時間配置した。次いで、バイアルをグローブボックスの外に取り出し、得られた沈殿物を濾過し、ペンタン（３×３ｍＬ）で洗浄し、減圧下で乾燥させて、酸化的付加錯体を得た。
【０１９６】
例示の酸化的付加錯体
【化４４】
2017523964.tif 000053
一般手順に従って、４−クロロトルエン（１７μＬ、０．１４ミリモル）、ＲｕＰｈｏｓ（６６ｍｇ、０．１４ミリモル）、及び（ＣＯＤ）Ｐｄ（ＣＨ２ＳｉＭｅ３）２（５０ｍｇ、０．１３ミリモル）を含有する混合物を、シクロヘキサン（１．５ｍＬ）中、室温で１６時間撹拌した。一般ワークアップ作業を行い、１Ａ−Ｃｌを白色固体（６８．７ｍｇ、７７％）として得た。
【化４５】
2017523964.tif 000054
【０１９７】
一般手順に従って、４−ブロモトルエン（２４．２ｍｇ、０．１４ミリモル）、ＲｕＰｈｏｓ（６６．０ｍｇ、０．１４ミリモル）、及び（ＣＯＤ）Ｐｄ（ＣＨ２ＳｉＭｅ３）２（５０．０ｍｇ、０．１３ミリモル）を含有する混合物を、シクロヘキサン（１ｍＬ）中、室温で１６時間撹拌した。一般ワークアップ作業を行い、１Ａ−Ｂｒを灰白色固体（７８．４ｍｇ、８２％）として得た。
【化４６】
2017523964.tif 000055
【０１９８】
一般手順に従って、４−ヨードトルエン（６１．７ｍｇ、０．２８ミリモル）、ＲｕＰｈｏｓ（１３１．９ｍｇ、０．２８ミリモル）、及び（ＣＯＤ）Ｐｄ（ＣＨ２ＳｉＭｅ３）２（１００．０ｍｇ、０．２６ミリモル）を含有する混合物を、シクロヘキサン（１．５ｍＬ）中、室温で１６時間撹拌した。一般ワークアップ作業を行い、１Ａ−Ｉを鮮黄色固体（１８０．０ｍｇ、８９％）として得た。
【化４７】
2017523964.tif 000056
【０１９９】
一般手順に従って、４−トリルトルフルオロメタンスルホネート（１００．０ｍｇ、０．４２ミリモル）、ＲｕＰｈｏｓ（１９４．０ｍｇ、０．４２ミリモル）、及び（ＣＯＤ）Ｐｄ（ＣＨ２ＳｉＭｅ３）２（１４７．０ｍｇ、０．３８ミリモル）を含有する混合物を、シクロヘキサン（１．５ｍＬ）中、室温で１６時間撹拌した。一般ワークアップ作業を行い、１Ａ−ＯＴｆを灰白色固体（２７０．０ｍｇ、８８％）として得た。
【化４８】
2017523964.tif 000057
【０２００】
一般手順に従って、２−エチル−６−メチルピリジン−３−イルトリフルオロメタンスルホネート（７６．０ｍｇ、０．２８ミリモル、注記：２．２当量を使用した）、ＲｕＰｈｏｓ（６６．０ｍｇ、０．１４１ミリモル）、及び（ＣＯＤ）Ｐｄ（ＣＨ２ＳｉＭｅ３）２（５０．０ｍｇ、０．１２９ミリモル）を含有する混合物を、シクロヘキサン（０．７５ｍＬ）中、室温で１６時間撹拌した。一般ワークアップ作業を行い、１Ｂを淡黄色固体（９５．０ｍｇ、８８％）として得た。
【化４９】
2017523964.tif 000058
【０２０１】
一般手順に従って、フルオレセインモノトリフルオロメタンスルホネート（５２．５ｍｇ、０．１１ミリモル、注記：限定試薬として使用した）、ＲｕＰｈｏｓ（６６．０ｍｇ、０．１４ミリモル）、及び（ＣＯＤ）Ｐｄ（ＣＨ２ＳｉＭｅ３）２（５０．０ｍｇ、０．１３ミリモル）を含有する混合物を、ＴＨＦ（０．７５ｍＬ）中、室温で１６時間撹拌した。一般ワークアップ作業を行い、１Ｃを明橙色の沈殿物（１０７．５ｍｇ、９２％）として得た。
【化５０】
2017523964.tif 000059
【０２０２】
一般手順に従って、２−オキソ−２Ｈ−クロメン−６−イルトリフルオロメタンスルホネート（３８．２ｍｇ、０．１３ミリモル、注記：１．０１当量を使用した）、ＲｕＰｈｏｓ（６６．０ｍｇ、０．１４ミリモル）、及び（ＣＯＤ）Ｐｄ（ＣＨ２ＳｉＭｅ３）２（５０．０ｍｇ、０．１３ミリモル）を含有する混合物を、ＴＨＦ（０．７５ｍＬ）中、室温で１６時間撹拌した。一般ワークアップ作業を行い、１Ｄを淡黄色固体（１０３．３ｍｇ、９３％）として得た。
【化５１】
2017523964.tif 000060
【０２０３】
一般手順に従って、アリールトリフルオロメタンスルホネートＳ１（１００．０ｍｇ、０．２１ミリモル、注記：１当量を使用した）、ＲｕＰｈｏｓ（１０９．８ｍｇ、０．２４ミリモル）、及び（ＣＯＤ）Ｐｄ（ＣＨ２ＳｉＭｅ３）２（８３．２ｍｇ、０．２１ミリモル）を含有する混合物を、ＴＨＦ（１．５ｍＬ）中、室温で１６時間撹拌した。一般ワークアップ作業を行い、１Ｅを淡橙色固体（１７９．０ｍｇ、８０％）として得た。
【化５２】
2017523964.tif 000061
【０２０４】
一般手順に従って、４−クロロベンズアルデヒド（３９．７ｍｇ、０．２８ミリモル、注記：１当量を使用した）、ＲｕＰｈｏｓ（１３１．９ｍｇ、０．２８ミリモル）、及び（ＣＯＤ）Ｐｄ（ＣＨ２ＳｉＭｅ３）２（１００．０ｍｇ、０．２６ミリモル）を含有する混合物を、シクロヘキサン（１．５ｍＬ）中、室温で１６時間撹拌した。一般ワークアップ作業を行い、１Ｆを白色固体（１６６．０ｍｇ、９１％）として得た。
【化５３】
2017523964.tif 000062
【０２０５】
一般手順に従って、４−クロロアセトフェノン（３６．７μＬ、０．２８ミリモル）、ＲｕＰｈｏｓ（１３１．９ｍｇ、０．２８ミリモル）、及び（ＣＯＤ）Ｐｄ（ＣＨ２ＳｉＭｅ３）２（１００．０ｍｇ、０．２６ミリモル）を含有する混合物を、シクロヘキサン（１．５ｍＬ）中、室温で１６時間撹拌した。一般ワークアップ作業を行い、１Ｇを白色固体（１８７．１ｍｇ、８０％）として得た。
【化５４】
2017523964.tif 000063
【０２０６】
一般手順に従って、４−クロロベンゾフェノン（６１．２ｍｇ、０．２８ミリモル）、ＲｕＰｈｏｓ（１３１．９ｍｇ、０．２８ミリモル）、及び（ＣＯＤ）Ｐｄ（ＣＨ２ＳｉＭｅ３）２（１００．０ｍｇ、０．２６ミリモル）を含有する混合物を、シクロヘキサン（１．５ｍＬ）中、室温で１６時間撹拌した。一般ワークアップ作業を行い、１Ｈを白色固体（１７０．３ｍｇ、８４％）として得た。
【化５５】
2017523964.tif 000064
【０２０７】
一般手順に従って、（４−クロロフェニルエチニル）トリメチルシラン（７１．６ｍｇ、０．３４ミリモル）、ＲｕＰｈｏｓ（１３１．９ｍｇ、０．２８ミリモル）、及び（ＣＯＤ）Ｐｄ（ＣＨ２ＳｉＭｅ３）２（１００．０ｍｇ、０．２６ミリモル）を含有する混合物を、シクロヘキサン（１．５ｍＬ）中、室温で１６時間撹拌した。一般ワークアップ作業を行い、１Ｉを白色固体（１５７．７ｍｇ、７８％）として得た。
【化５６】
2017523964.tif 000065
【０２０８】
一般手順に従って、バンデタニブ（６１．７ｍｇ、０．１３ミリモル、注記：１．０１当量を使用した）、ＲｕＰｈｏｓ（６６．０ｍｇ、０．１４ミリモル）、及び（ＣＯＤ）Ｐｄ（ＣＨ２ＳｉＭｅ３）２（５０．０ｍｇ、０．１３ミリモル）を含有する混合物を、ＴＨＦ（１．５ｍＬ）中、室温で１６時間撹拌した。一般ワークアップ作業を行い、１Ｊを灰白色固体（１１９．０ｍｇ、８８％）として得た。
【化５７】
2017523964.tif 000066
【０２０９】
若干修正された一般手順に従って、４，４’−ジクロロベンゾフェノン（３０．０ｍｇ、０．１２ミリモル、１当量）、ＲｕＰｈｏｓ（１３９．４ｍｇ、０．３０ミリモル、２．５当量）、及び（ＣＯＤ）Ｐｄ（ＣＨ２ＳｉＭｅ３）２（１１６．２ｍｇ、０．３０ミリモル、２．５当量）の混合物を、シクロヘキサン（１．２ｍＬ）中、室温で１６時間撹拌した。一般ワークアップ作業を行い、２Ａをベージュ色固体（１４６．８ｍｇ、８８％）として得た。
【化５８】
2017523964.tif 000067
【０２１０】
一般手順に従って、４−クロロベンゾニトリル（４２．４ｍｇ、０．３１ミリモル、１当量）、ＲｕＰｈｏｓ（１４４．０ｍｇ、０．３１ミリモル）、及び（ＣＯＤ）Ｐｄ（ＣＨ２ＳｉＭｅ３）２（１００．０ｍｇ、０．２６ミリモル）の混合物を、シクロヘキサン（１．５ｍＬ）中、室温で１６時間撹拌した。一般ワークアップ作業を行い、１−ベンゾニトリルを白色固体（１８６．４ｍｇ、９９％）として得た。
【化５９】
2017523964.tif 000068
【０２１１】
一般手順に従って、４−ブロモ−１，２，３，６−テトラヒドロ−１，１’−ビフェニル（３０．０ｍｇ、０．１２７ミリモル）、ＲｕＰｈｏｓ（５９．０ｍｇ、０．１２７ミリモル）、及び（ＣＯＤ）Ｐｄ（ＣＨ２ＳｉＭｅ３）２（４４．７ｍｇ、０．１１５ミリモル）を含有する混合物を、シクロヘキサン（０．７５ｍＬ）中、室温で１６時間撹拌した。一般ワークアップ作業を行い、１−ビニルを黄色固体（８０．０ｍｇ、８６％）として得た。
【０２１２】
実施例１４−アリール化反応条件
例示されたシステイン抱合反応の多くは、ほぼ中性からわずかに塩基性のｐＨ値で動作する。パラジウム試薬を用いる反応条件の更なる評価は、様々な緩衝液中の共通の有機共溶媒（５％のＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ＣＨ３ＣＮ）を用いる、広範なｐＨ範囲内（５．５〜８．５）の出発ペプチドの対応するＳ−アリールシステイン抱合体への定量的変換を明らかにした。注目すべきことには、０．１％のＴＦＡ溶液（ｐＨ２．０）中であっても、反応は、７時間後に、５９％のＳ−アリール化生成物を得た。このプロセスは、マレイミド及びα−ハロアシル基と反応することによって、生体共役反応を妨害することが示されているタンパク質ジスルフィド還元剤のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）とも互換性があった。
【化６０】
2017523964.tif 000069
【表１−１】
2017523964.tif 000070
【表１−２】
2017523964.tif 000071
【表２】
2017523964.tif 000072
【０２１３】
実施例１５−例示のアリール化反応
パラジウム媒介抱合は、完全な生成物形成が４℃において１５秒以内に起こり、高速である。反応速度を、通常使用されるＮ−メチルマレイミドシステイン連結に対する競合実験によって推定した（Ｇｏｒｉｎ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１１５，５９３−５９７（１９６６））。ｐＨ７．５においては、パラジウム媒介反応の速度は、マレイミド連結に匹敵し、生成物の７０％がパラジウム−トリル錯体（１Ａ−ＯＴｆ）から生じた。とりわけ、パラジウム媒介抱合は、ｐＨ５．５においてマレイミド連結を上回り、ここではアリール化生成物のみが生成された。
【０２１４】
最適化条件（０．１Ｍのトリス緩衝液、５％のＣＨ３ＣＮ、ｐＨ７．５、室温）を基質範囲の更なる評価に用いた（一般アリール化手順Ａ）。塩化物、臭化物、及びヨウ化物対イオンを含有するパラジウム錯体は、全てが、所望の生成物（１Ａ−Ｃｌ、１Ａ−Ｂｒ、及び１Ａ−Ｉ）を生成することが判明した。この方法は、非保護ペプチドを、蛍光タグ（１Ｃ、１Ｄ）、親和性標識（１Ｅ）、生体共役反応ハンドル（アルデヒド１Ｆ、ケトン１Ｇ、及びアルキン１Ｈ）、光化学架橋剤（１Ｉ）、ならびに複合体薬物分子（１Ｊ）を含む様々な重要な基で官能基化するために用いることができる。重要なことには、パラジウム（ＩＩ）錯体は、周囲条件下で安定であり、密閉されたバイアル中で、４℃の空気下で、４か月以上にわたって保管することができる。「時間を経過した」試薬は、新たに作製された錯体に匹敵する反応性をなお示した。
【化６１】
2017523964.tif 000073
一般アリール化手順Ａ。ペプチドＰ１（４μＬ、水中１５０μＭ）、Ｈ２Ｏ（４７μＬ）、有機溶媒（１μＬ）、及び緩衝液（６μＬ、１Ｍ）を、０．６ｍＬのプラスチック製エッペンチューブ内で混ぜ合わせ、１０秒間ボルテックスすることによって、得られた溶液を混合した。有機溶媒中のパラジウム錯体の原液（２μＬ、６００μＭ）を一度に添加し、反応チューブをボルテックスし、適切な試薬混合を確実にし、室温で５分間放置した。３−メルカプトプロピオン酸（６．３μＬ、水中０．０５μＬ／ｍＬの溶液、パラジウム錯体に対して３当量）の添加によって、反応物を急冷させた。更に５分後に、（例えば、５０％Ａ：５０％Ｂ（ｖ／ｖ、６０μＬ））の溶媒混合物をエッペンチューブに添加し、反応混合物をＬＣ−ＭＳにより分析した。
急冷前の反応物の最終濃度：ペプチドＰ１−１０μＭ、Ｐｄ錯体−２０μＭ、緩衝液−１００ｍＭ、有機溶媒：Ｈ２Ｏ＝５：９５。
【化６２】
2017523964.tif 000074
【０２１５】
アリール化ペプチドＰ１−Ａを、一般手順Ａに従って合成した。急冷前の最終濃度：ペプチド−１０μＭ、１Ａ−ＯＴｆ−２０μＭ、０．１Ｍのトリス（ｐＨ７．５）、ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ＝５：９５
【化６３】
2017523964.tif 000075
【０２１６】
アリール化ペプチドＰ１−Ｂを、一般手順Ａに従って合成した。急冷前の最終濃度：ペプチド−１０μＭ、１Ｂ−２０μＭ、０．１Ｍのトリス（ｐＨ７．５）、ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ＝５：９５
【化６４】
2017523964.tif 000076
【０２１７】
アリール化ペプチドＰ１−Ｃを、一般手順Ａに従って合成した。３−メルカプトプロピオン酸（１２．５μＬ、水中０．０５μＬ／ｍＬ溶液、１Ｃに対して２当量）の添加によって、反応を急冷させた。急冷前の最終濃度：ペプチド−１０μＭ、１Ｃ−３０μＭ、０．１Ｍのトリス（ｐＨ７．５）、ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ＝５：９５
【化６５】
2017523964.tif 000077
【０２１８】
アリール化ペプチドＰ１−Ｄを、一般手順Ａに従って合成した。３−メルカプトプロピオン酸（６．３μＬ、水中０．０５μＬ／ｍＬ溶液、１Ｄに対して２当量）の添加によって、反応を急冷させた。急冷前の最終濃度：ペプチド−１０μＭ、１Ｄ−３０μＭ、０．１Ｍのトリス（ｐＨ７．５）、ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ＝５：９５
【化６６】
2017523964.tif 000078
【０２１９】
アリール化ペプチドＰ１−Ｅを、一般手順Ａに従って合成した。急冷前の最終濃度：ペプチド−１０μＭ、１Ｅ−２０μＭ、０．１Ｍのトリス（ｐＨ７．５）、ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ＝５：９５
【化６７】
2017523964.tif 000079
【０２２０】
アリール化ペプチドＰ１−Ａを、一般手順Ａに従って合成した。急冷前の最終濃度：ペプチド−１０μＭ、１Ａ−Ｘ（Ｘ＝Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）−２０μＭ、０．１Ｍのトリス（ｐＨ７．５）、ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ＝５：９５
【化６８】
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【０２２１】
アリール化ペプチドＰ１−Ｆを、一般手順Ａに従って合成した。急冷前の最終濃度：ペプチド−１０μＭ、１Ｆ−２０μＭ、０．１Ｍのトリス（ｐＨ７．５）、ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ＝５：９５
【化６９】
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【０２２２】
アリール化ペプチドＰ１−Ｇを、一般手順Ａに従って合成した。急冷前の最終濃度：ペプチド−１０μＭ、１Ｇ−２０μＭ、０．１Ｍのトリス（ｐＨ７．５）、ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ＝５：９５
【化７０】
2017523964.tif 000082
【０２２３】
アリール化ペプチドＰ１−Ｈを、一般手順Ａに従って合成した。急冷前の最終濃度：ペプチド−１０μＭ、１Ｈ−２０μＭ、０．１Ｍのトリス（ｐＨ７．５）、ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ＝５：９５
【化７１】
2017523964.tif 000083
【０２２４】
アリール化ペプチドＰ１−Ｉを、一般手順Ａに従って合成した。３−メルカプトプロピオン酸（６．３μＬ、水中０．０５μＬ／ｍＬ溶液、１Ｉに対して１当量）の添加によって、反応を急冷させた。急冷前の最終濃度：ペプチド−１０μＭ、１Ｉ−６０μＭ、０．１Ｍのトリス（ｐＨ７．５）、ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ＝５：９５
【化７２】
2017523964.tif 000084
【０２２５】
アリール化ペプチドＰ１−Ｊを、一般手順Ａに従って合成した。急冷前の最終濃度：ペプチド−１０μＭ、１Ｊ−２０μＭ、０．１Ｍのトリス（ｐＨ７．５）、ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ＝５：９５
【化７３】
2017523964.tif 000085
【０２２６】
ビニル化ペプチドＰ１−ビニルを、一般手順Ａに従って合成した。３−メルカプトプロピオン酸（６．３μＬ、水中０．０５μＬ／ｍＬ溶液、１−ビニルに対して１．５当量）の添加によって、反応を急冷させた。急冷前の最終濃度：ペプチド−１０μＭ、１−ビニル−４０μＭ、０．１Ｍのトリス（ｐＨ７．５）、ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ＝５：９５
【０２２７】
実施例１６−アリール化ペプチドの安定性評価
アリール化ペプチドの安定性を、Ｎ−エチルマレイミド、２−ブロモアセトアミド、及び臭化ベンジルを含む試薬との反応から形成された抱合体のものと比較した。Ｓ−アリール化ペプチドは、酸、塩基、及び外部チオール求核試薬に対して安定であることを示した。対照的に、対応するアセトアミド誘導体は、酸性及び塩基性条件下で不安定であり、マレイミド抱合体は、塩基及び外因性チオールの存在下で分解した。最終的に、過ヨウ素酸酸化剤による処理に対するアリール及びベンジル抱合体の両方の同程度の安定性が、３７℃で観察された。
【０２２８】
塩基、酸、または外部チオール求核試薬の存在下での安定性評価
【化７４】
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ペプチドＰ１抱合体を、プラスチック製エッペンチューブ内で水に予め溶解し、安定性評価実験で使用される１．１１ｍＭの原液を得た。各実験については、対応するシステイン抱合体（１．１１ｍＭ、１８μＬ）及び安定性試験試薬（２μＬ、Ｈ２Ｏ中５０ｍＭまたは１Ｍのトリス、ｐＨ７．４中５０ｍＭ）を、プラスチック製エッペンチューブ内で混ぜ合わせ、室温で２日間放置し、その後、３７℃で４日まで放置した。その後、個々の反応を、５０％Ａ：５０％Ｂ（ｖ／ｖ、２００μＬ）の溶液で急冷させ、得られた試料をＬＣ−ＭＳにより分析した。
基本条件
安定性試験試薬：Ｋ２ＣＯ３（２μＬ、水中、５０ｍＭ）；
急冷後の最終条件：１ｍＭのペプチド、５ｍＭのＫ２ＣＯ３；室温で２日間、その後３７℃で４日間。
酸性条件
安定性試験試薬：ＨＣｌ（２μＬ、水中、１Ｍ）；
急冷後の最終条件：１ｍＭのペプチド、０．１ＭのＨＣｌ；室温で２日間、その後３７℃で４日間。
外部チオール求核試薬：ＧＳＨの存在
安定性試験試薬：グルタチオン（２μＬ、１Ｍのトリス；ｐＨ７．４中、５０ｍＭ）
急冷後の最終条件：１ｍＭのペプチド、５ｍＭのＧＳＨ、０．１Ｍのトリス、ｐＨ７．４；室温で２日間、その後３７℃で４日間。
【表３】
2017523964.tif 000087
【０２２９】
酸化に対するシステイン抱合体の安定性
パラ電子求引性シアノ基を取り付けることによって、アリール化ペプチドの芳香族環の電子特性の更なる同調を達成することができた。この修飾は、酸化の量を著しく減少させ、全ての評価された抱合体にわたって、最も安定なペプチドを生成した。とりわけ、ベンジル抱合体中にパラシアノ基を取り付けることは、酸化に対していかなる影響も有さなかった。
【化７５】
2017523964.tif 000088
【０２３０】
ペプチドＰ２抱合体を、プラスチック製エッペンチューブ内で水に予め溶解し、酸化安定性評価実験で使用される１１１．１μＭの原液を得た。次いで、対応するシステイン抱合体（１８μＬ、Ｈ２Ｏ中、１１１．１μＭ）及びＨ５ＩＯ６（２μＬ、Ｈ２Ｏ中、４ｍＭ）を、プラスチック製エッペンチューブ内で混ぜ合わせ、ボルテクサーを用いて混合し、３７℃に予熱した水浴に移した。個々の反応物を、１０分、３０分、１時間、２時間、４時間、及び６時間後に、Ｎａ２ＳＯ３（２０μＬ、Ｈ２Ｏ中、４ｍＭ）で急冷し、得られた混合物を、室温で更に１０分間保持した。その後、５０％Ａ：５０％Ｂ（ｖ／ｖ、１６０μＬ）の溶液を添加し、得られた試料をＬＣ−ＭＳにより分析した（図１４）。急冷前の最終条件：１００μＭのペプチド、４００μＭのＨ５ＩＯ６、３７℃。
【０２３１】
実施例１７−タンパク質修飾
この反応は、タンパク質を用いて探究した。Ｎ末端、Ｃ末端、及びループを含む構造的に別個の位置にシステインを含有する、３つの抗体模倣物タンパク質（Ｐ４〜Ｐ６）を発現させた。反応の選択性を確認するために、システインを含まない同じタンパク質を比較対照として用いた（Ｐ７〜Ｐ９）。全ての３つのタンパク質（Ｐ４〜Ｐ６）を、クマリン（図１５）または薬物分子（図１７）のいずれかで、１μＭのタンパク質濃度にて３０分以内に定量的にタグ付きした。システインを欠如するタンパク質では、アリール化生成物は生成しなかった（図１８）。低マイクロモルタンパク質濃度におけるこの反応の高反応速度及び高効率は、より長い反応時間が必要とされ、かつ一般的により低い変換が観察された、報告された有機金属試薬を用いる生体共役反応法（Ｋｕｎｇ，Ｋ．Ｋ．−Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．５０，１１８９９−１１９０２（２０１４））とは、対照的である。修飾タンパク質は、標準脱塩技術を用いて、残りのパラジウム種、リガンド、及び多の小分子から容易に分離することができる。
【０２３２】
タンパク質標識付け
２０ｍＭのトリス及び１５０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）の４７５μＬ中、タンパク質（５００ピコモル）の溶液に、ＤＭＦ中、パラジウム−クマリン錯体１Ｄまたはパラジウム−薬物錯体１Ｊ（２５μＬ、２００μＭ）を添加した。この溶液を、上下に２０回ピペッティングし、適切な試薬混合を確実にした。反応混合物を、室温で３０分間放置した。その後、２０ｍＭのトリス及び１５０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）中に溶解した３−メルカプトプロピオン酸（２５μＬ、２ｍＭ）の添加によって、反応物を急冷させた。室温で更に５分間放置した後に、０．２％のＴＦＡを含有する１：１のＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ）の５００μＬを添加し、得られた混合物を、ＬＣ−ＭＳにより分析した。
【表４】
2017523964.tif 000089
【０２３３】
実施例１８−ハロアリール化生成物の反応性
ハリアリール化ペプチド（すなわち、アリール−ハロゲン化物結合を含有する）は、外部チオールにより更なるクロスカップリング反応を受け、更なる複雑さを備えたアリール化ペプチドを生成することができる。図１９で実証されるように、ペプチドアリール化反応の生成物は、他のチオール含有ペプチドとの反応、または更にはチオール含有冷却剤との反応も受けた。
【０２３４】
実施例１９−ステープルペプチド
本明細書で論じられるステープルペプチドもまた、代替的な非対称プロセスによって生成することができる。ものパラジウムハロアリール化試薬（すなわち、アリール−ハロゲン化物結合を含有する試薬）は、システイン含有ペプチドとの反応を受けた。この第１のクロスカップリング反応ステップ後の、ペプチド中の第２のシステイン残基との第２のクロスカップリング反応は、目的のペプチド生成物を得た（図２０）。
【０２３５】
実施例２０−プレ触媒による生体分子アリール化
【化７６】
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空気安定性Ｐｈ−メシレートパラジウムプレス触媒（例えば、第２世代ブッフワルド触媒などの２−アミノビフェニルＰｄ種）もまた、生体分子アリール化反応のための触媒として使用することができる。ハロゲン化アリール試薬とともに使用されたとき、これらのプレ触媒は、アリール化ペプチド生成物を生成した（図２１）。
参照による援用
【０２３６】
本明細書に挙げられた米国特許及び米国特許出願公開の全ては、参照により本明細書に組み込まれる。
均等物
【０２３７】
当業者は、本明細書に記載される本発明の多くの均等物を認識し、またはわずかな日常的な実験を用いるだけでこれらを確認することができるであろう。このような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されるよう意図される。
【図１】
2017523964.tif 000173
【図２】
2017523964.tif 000174
【図３】
2017523964.tif 000175
【図４（ａ）】
2017523964.tif 000176
【図４（ｂ）】
2017523964.tif 000177
【図５】
2017523964.tif 000178
【図６】
2017523964.tif 000179
【図７（ａ）】
2017523964.tif 000180
【図７（ｂ）】
2017523964.tif 000181
【図７（ｃ）】
2017523964.tif 000182
【図７（ｄ）】
2017523964.tif 000183
【図７（ｅ）】
2017523964.tif 000184
【図７（ｆ）】
2017523964.tif 000185
【図８（ａ）】
2017523964.tif 000186
【図８（ｂ）】
2017523964.tif 000187
【図９】
2017523964.tif 000188
【図１０】
2017523964.tif 000189
【図１１】
2017523964.tif 000190
【図１２（ａ）】
2017523964.tif 000191
【図１２（ｂ）】
2017523964.tif 000192
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2017523964.tif 000195
【図１６】
2017523964.tif 000196
【図１７】
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【図１８】
2017523964.tif 000198
【図１９】
2017523964.tif 000199
【図２０】
2017523964.tif 000200
【図２１】
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【国際調査報告】
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