(57)【要約】本発明は、プロストラチンもしくはプロストラチン類似体またはその塩もしくは異性体の治療的な量を対象へ投与する工程を含む、対象におけるK-Ras発現癌を処置する方法を提供する。対象におけるK-Ras発現癌を処置するための組成物およびキットも提供する。2017527583.tif 000013
2017527583.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロストラチンもしくはプロストラチン類似体またはその塩もしくは異性体の治療的な量を対象へ投与する工程を含む、対象におけるK-Ras発現癌を処置する方法。
【請求項２】
K-Ras発現癌が野生型K-Rasを発現する癌である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
K-Ras発現癌が変異型K-Rasを発現する癌である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
K-Ras発現癌が膵臓癌、結腸直腸癌、または肺癌である、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
K-Ras発現癌が膵臓癌である、請求項4記載の方法。
【請求項６】
膵臓癌が膵管腺癌である、請求項5記載の方法。
【請求項７】
プロストラチンまたはその塩もしくは異性体が対象へ投与される、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
プロストラチン類似体またはその塩もしくは異性体が対象へ投与される、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
プロストラチン類似体が、以下の構造式：
2017527583.tif 000011
式中、Rは、エチル、ホルメート、プロピオネート、ブチレート、ペンタノエート、ヘキサノエート、ベンゾエート、フェニルアセテート、シクロヘキシルアセテート、ペンタフルオロフェニルアセテート、1-ナフチルアセテート、2-ナフチルアセテート、(5,6,7,8)テトラヒドロ-1-ナフチルアセテート、ビフェニルアセテート、アダマンチルアセテート、またはp-ベンジルフェニルアセテートである、
を有する、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
プロストラチンもしくはプロストラチン類似体またはその塩もしくは異性体が経口投与されるか、静脈内投与されるか、または腹腔内投与される、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
プロストラチンもしくはプロストラチン類似体またはその塩もしくは異性体が化学療法剤と組み合わせて投与される、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
化学療法剤がゲムシタビンである、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
プロストラチンもしくはプロストラチン類似体またはその塩もしくは異性体および化学療法剤が同時に投与される、請求項11または12記載の方法。
【請求項１４】
プロストラチンもしくはプロストラチン類似体またはその塩もしくは異性体および化学療法剤が連続的に投与される、請求項11または12記載の方法。
【請求項１５】
プロストラチンもしくはプロストラチン類似体またはその塩もしくは異性体の治療的な量を対象へ投与する工程を含む、対象における膵臓癌を処置する方法。
【請求項１６】
膵臓癌が膵管腺癌である、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
プロストラチンまたはその塩もしくは異性体が対象へ投与される、請求項15または16記載の方法。
【請求項１８】
プロストラチン類似体またはその塩もしくは異性体が対象へ投与される、請求項15または16記載の方法。
【請求項１９】
プロストラチン類似体が以下の構造式：
2017527583.tif 000012
式中、Rは、エチル、ホルメート、プロピオネート、ブチレート、ペンタノエート、ヘキサノエート、ベンゾエート、フェニルアセテート、シクロヘキシルアセテート、ペンタフルオロフェニルアセテート、1-ナフチルアセテート、2-ナフチルアセテート、(5,6,7,8)テトラヒドロ-1-ナフチルアセテート、ビフェニルアセテート、アダマンチルアセテート、またはp-ベンジルフェニルアセテートである、
を有する、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
プロストラチンもしくはプロストラチン類似体またはその塩もしくは異性体が経口投与されるか、静脈内投与されるか、または腹腔内投与される、請求項15〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
プロストラチンもしくはプロストラチン類似体またはその塩もしくは異性体が化学療法剤と組み合わせて投与される、請求項15〜20のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
化学療法剤がゲムシタビンである、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
プロストラチンもしくはプロストラチン類似体またはその塩もしくは異性体および化学療法剤が同時に投与される、請求項21または22記載の方法。
【請求項２４】
プロストラチンもしくはプロストラチン類似体またはその塩もしくは異性体および化学療法剤が連続的に投与される、請求項21または22記載の方法。
【請求項２５】
プロストラチンもしくはプロストラチン類似体またはその塩もしくは異性体；および化学療法剤を含む、K-Ras発現癌を処置するためのキット。
【請求項２６】
プロストラチンまたはその塩もしくは異性体を含む、請求項25記載のキット。
【請求項２７】
プロストラチン類似体またはその塩もしくは異性体を含む、請求項25記載のキット。
【請求項２８】
化学療法剤がゲムシタビンである、請求項25〜27のいずれか一項記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、2014年9月10日出願の米国仮出願第62/048,761号に基づく優先権を主張するものであり、その内容全体が、事実上、参照によって本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
膵臓癌は、初期に検出された場合ですら、しばしば予後不良の癌である。膵臓癌の全ての期を合わせて、診断の5年後に生存する患者は6％に過ぎないと推定されている。膵臓癌の最も一般的な型、膵管腺癌（PDAC）は、極めて予後不良であることが公知である。外科的切除を受けた患者については生存時間が改善されるが、PDACは、外科的切除が実現可能であるうちに診断されないことが多い。
【０００３】
癌遺伝子K-Rasは、膵臓癌、肺癌、および結腸直腸癌のような癌において高頻度に変異しており、90％を超えるPDACにおいて活性化K-Ras変異が存在する。しかしながら、K-Rasの機能を直接阻止し、前臨床モデルにおいて効力を示す低分子阻害剤の開発は、現在まで、成功していない。
【発明の概要】
【０００４】
一つの局面において、対象における癌を処置する方法が提供される。いくつかの態様において、方法は、プロストラチンもしくはプロストラチン類似体またはその塩もしくは異性体の治療的な量を対象へ投与する工程を含む。
【０００５】
いくつかの態様において、癌はK-Ras発現癌である。いくつかの態様において、K-Ras発現癌は野生型K-Rasを発現する癌である。いくつかの態様において、K-Ras発現癌は変異型K-Rasを発現する癌である。
【０００６】
いくつかの態様において、癌は膵臓癌、結腸直腸癌、または肺癌である。いくつかの態様において、癌は膵臓癌（例えば、膵管腺癌）である。
【０００７】
いくつかの態様において、プロストラチンまたはその塩もしくは異性体が対象へ投与される。いくつかの態様において、プロストラチン類似体またはその塩もしくは異性体が対象へ投与される。いくつかの態様において、プロストラチン類似体は以下の構造式：
2017527583.tif 000003
（Rは、エチル、ホルメート、プロピオネート、ブチレート、ペンタノエート、ヘキサノエート、ベンゾエート、フェニルアセテート、シクロヘキシルアセテート、ペンタフルオロフェニルアセテート、1-ナフチルアセテート、2-ナフチルアセテート、(5,6,7,8)テトラヒドロ-1-ナフチルアセテート、ビフェニルアセテート、アダマンチルアセテート、またはp-ベンジルフェニルアセテートである）を有する。
【０００８】
いくつかの態様において、プロストラチンもしくはプロストラチン類似体またはその塩もしくは異性体は、経口投与されるか、静脈内投与されるか、または腹腔内投与される。
【０００９】
いくつかの態様において、プロストラチンもしくはプロストラチン類似体またはその塩もしくは異性体は化学療法剤と組み合わせて投与される。いくつかの態様において、化学療法剤はゲムシタビンである。いくつかの態様において、プロストラチンもしくはプロストラチン類似体またはその塩もしくは異性体および化学療法剤は同時に投与される。いくつかの態様において、プロストラチンもしくはプロストラチン類似体またはその塩もしくは異性体および化学療法剤は連続的に投与される。
【００１０】
もう一つの局面において、癌を処置するための組成物およびキットが提供される。いくつかの態様において、組成物またはキットは、プロストラチンもしくはプロストラチン類似体またはその塩もしくは異性体；および化学療法剤を含む。
【００１１】
いくつかの態様において、組成物およびキットは、K-Ras発現癌である癌を処置するためのものである。いくつかの態様において、K-Ras発現癌は野生型K-Rasを発現する癌である。いくつかの態様において、K-Ras発現癌は変異型K-Rasを発現する癌である。いくつかの態様において、組成物またはキットは、膵臓癌、結腸直腸癌、または肺癌である癌を処置するためのものである。いくつかの態様において、組成物またはキットは、膵臓癌（例えば、膵管腺癌）である癌を処置するためのものである。
【００１２】
いくつかの態様において、組成物またはキットは、プロストラチンまたはその塩もしくは異性体を含む。いくつかの態様において、組成物またはキットは、プロストラチン類似体またはその塩もしくは異性体を含む。
【００１３】
いくつかの態様において、化学療法剤はゲムシタビンである。
【００１４】
もう一つの局面において、癌の処置において使用するための、プロストラチンもしくはプロストラチン類似体またはその塩もしくは異性体を含む組成物が提供される。いくつかの態様において、癌は膵臓癌（例えば、膵管腺癌）である。いくつかの態様において、癌はK-Ras発現癌である。いくつかの態様において、K-Ras発現癌は野生型K-Rasを発現する癌である。いくつかの態様において、K-Ras発現癌は変異型K-Rasを発現する癌である。いくつかの態様において、プロストラチンもしくはプロストラチン類似体またはその塩もしくは異性体を含む組成物は、化学療法剤と組み合わせて使用される。いくつかの態様において、プロストラチンまたはプロストラチン類似体を含む組成物は、化学療法剤をさらに含む。いくつかの態様において、化学療法剤はゲムシタビンである。
【００１５】
さらにもう一つの局面において、癌の処置のための医薬の製造のための、プロストラチンもしくはプロストラチン類似体またはその塩もしくは異性体を含む組成物の使用が提供される。いくつかの態様において、癌は膵臓癌（例えば、膵管腺癌）である。いくつかの態様において、癌はK-Ras発現癌である。いくつかの態様において、K-Ras発現癌は野生型K-Rasを発現する癌である。いくつかの態様において、K-Ras発現癌は変異型K-Rasを発現する癌である。いくつかの態様において、プロストラチンまたはプロストラチン類似体を含む組成物は、化学療法剤をさらに含む。いくつかの態様において、化学療法剤はゲムシタビンである。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】K-RasV12およびH-RasV12は、比較可能な標準シグナリングアウトプットにも関わらず、異なる腫瘍開始特性を有する。（A）Raf-RBDプルダウンアッセイまたはRal-GDS-RBDプルダウンアッセイによって測定されたような全Rasタンパク質およびGTP結合型Rasの比較可能なレベル。（B）H-RasV12またはK-RasV12によって形質転換された細胞におけるリン酸化されたErkおよびAktの比較可能なレベル。（C）K-RasV12形質転換NIH3T3細胞は増加したスフィア形成を提示した。左パネル：形成されたスフィアの肉眼形態。右パネル：スフィア形成効率（N＝6）。（D）注射された細胞の数が1,000個（左上）または100個（右上）であった時の、H-RasV12形質転換NIH/3T3細胞およびK-RasV12形質転換NIH/3T3細胞の腫瘍開始能力。K-RasV12形質転換細胞は、注射される細胞の数が限定された時、H-RasV12形質転換細胞と比較して、増加した腫瘍開始能力を提示した（下表）。（E）EGFによるBxPC3スフィア形成の促進。上パネル：形成されたスフィアの形態。下パネル：播種された細胞の数によって標準化されたスフィアの数によって計算されたようなスフィア形成効率（N＝6）。（F）K-Rasのノックダウンは、EGFによるBxPC3スフィア形成の刺激（下パネル）またはスフィア形成効率の増強（上パネル）を弱めたが、H-Rasはそうでなかった（N＝6）。（G）変異K-Rasのノックダウンは、PANC1スフィア形成効率を抑止した。左上パネル：ウエスタンブロットはノックダウン効率を確認した。左下および右のパネル：K-Ras shRNA発現を有するPANC1は、ベクター対照と比較した時、より小さいサイズおよび数のスフィアを形成した（N＝6）。（H）変異K-RasのノックダウンはPANC1腫瘍開始能力を低下させた。左パネル：無腫瘍生存曲線。右パネル：腫瘍形成頻度。N.S.非有意；*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001；****P＜0.0001。
【図２】K-RasはFzd8を抑制するが、H-Rasはそうでない。（A）qPCRarrayによって評価されたようなH-RasV12形質転換NIH/3T3細胞およびK-RasV12形質転換NIH/3T3細胞においてディファレンシャルに発現された幹細胞因子のヒートマップ（N＝3）。（B）H-RasV12形質転換NIH/3T3細胞およびK-RasV12形質転換NIH/3T3細胞においてディファレンシャルに発現される遺伝子としてのBmpr1b、Fzd8、およびGli2の散布図（左）および同定。（C）ベクター対照もしくはH-RasV12形質転換細胞と比較した時のK-Ras形質転換NIH/3T3細胞（上8パネル）、および変異Rafを含むものと比較した時の腫瘍形成性K-Ras変異を含むマウスPDAC細胞（下4パネル）における、低下したFzd8発現およびWnt/Ca2+シグナリング。（D）それぞれH-Rasv12またはB-Rafを含むものと比較した時のK-RasV12形質転換NIH/3T3細胞（上パネル）およびK-Ras変異を含むマウスPDAC細胞（下パネル）における増加したTCF4およびβカテニン複合体。（E）ベクター対照またはH-RasV12形質転換NIH/3T3細胞と比較して増加したK-RasV12形質転換NIH/3T3細胞におけるTCF/βカテニン活性（N＝4）。（F）K-Rasのノックダウンは、PANC2.13細胞およびPANC1細胞において増加したmRNAレベルでのFzd8発現をもたらした（N＝3）。（G）Kras対立遺伝子およびHrasKI対立遺伝子のいずれかの変異を含むwt H-Ras KOを保有する皮膚腫瘍におけるFzd8発現およびCaMKiiリン酸化のレベルの低下。（H）K-Rasのノックダウンは、Fzd8タンパク質レベル、非標準Wntシグナリング（p-CaMKii）を増加させ、βカテニンのリン酸化を増加させた。（I）PANC2.13細胞におけるK-Rasのノックダウンは、TOPFlashアッセイによって明らかにされたように、標準Wntシグナリングを低下させた（N＝4）。
【図３】Fzd8によって媒介される非標準Wnt/Ca2+シグナリングは、H-RasV12形質転換NIH/3T3細胞の腫瘍促進特性を抑制する。（A）非標準Wnt/Ca2+シグナリング経路におけるFzd8の模式図および標準Wntシグナリングとのクロストーク。以下の実験のため、低分子KN-93およびFzd8に対するshRNAを、CaMKii活性およびFzd8発現を阻止するために使用した。（B）KN-93によるCaMKiiの阻害は、CaMKiiのリン酸化を低下させ、Fzd8の発現を低下させた。（C）KN-93処理は、H-RasV12形質転換NIH/3T3細胞におけるβカテニン転写活性を刺激した（N＝4）。（D）KN-93によるCaMKiiの阻害は、H-RasV12形質転換NIH/3T3細胞においてスフィア形成を増強したが、K-RasV12形質転換NIH/3T3細胞においてはそうでなかった（N＝6）。（E〜F）H-RasV12形質転換NIH/3T3細胞におけるFzd8のノックダウンは、ホスホCaMKiiレベルを低下させ（E）、βカテニン転写活性を刺激した（N＝4）（F）。（G）H-RasV12形質転換NIH/3T3細胞におけるFzd8のノックダウンは、スフィア形成および再コロニー形成効率を促進した（N＝6）。（H）H-RasV12形質転換NIH/3T3細胞におけるFzd8のノックダウンは、腫瘍開始能力を増強した。*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001。
【図４】K-Rasが腫瘍開始を増強するためにはFzd8のダウンレギュレーションが必要とされる。（A〜B）K-RasV12形質転換NIH/3T3細胞におけるFzd8発現の回復は、Wnt/Ca2+シグナリングを増強し（A）、βカテニン転写活性を低下させた（B）（N＝4）。（C）K-RasV12形質転換NIH/3T3細胞におけるFzd8の回復は、スフィア形成および再コロニー形成効率を低下させた（N＝6）。（D）Fzd8の回復は、K-RasV12形質転換NIH/3T3細胞の腫瘍開始能力を低下させた。（E）PANC1細胞におけるFzd8回復は、NF-AT転写活性によって明らかにされるようなWnt/Ca2+シグナリングを増強し（N＝4）、βカテニン活性を低下させた（N＝4）。（F）Fzd8回復は、PANC1細胞の腫瘍開始能力を低下させた。（G）ヒト膵臓腫瘍組織におけるFzd8のダウンレギュレーション。左パネル：ヒト膵臓の正常組織および悪性組織においてFzd8について免疫染色された組織切片の顕微鏡写真。（H）正常膵組織または悪性膵組織を含む膵組織アレイにおけるFzd8免疫反応性のHスコア。（I）癌に隣接する膵臓正常組織および膵臓腺癌においてヒトFzd8について探索されたRNAscopeインサイチューハイブリダイゼーション。*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001。
【図５】K-RasV12形質転換NIH/3T3細胞におけるカルモジュリンキナーゼII（CaMKii）活性およびFzd8発現の抑制にはカルモジュリン（CaM）-K-Ras相互作用が不可欠である。（A）EDTAまたはCa2+の存在下でCaMプルダウンアッセイによって明らかにされたように、カルモジュリンはK-RasV12と相互作用するが、H-RasV12とは相互作用しない。（B）K-RasV12またはK-RasV12-S181A変異体と比較した時の、CaMとK-RasV12-S181D変異体との間の相互作用の喪失。（C）K-RasV12-S181D変異体は、K-RasV12またはK-RasV12-S181A変異体と比較した時、Fzd8プロモーター活性を抑制する能力の低下を提示した。（D）K-RasV12群またはK-RasV12-S181A群と比較した時のNIH/3T3-K-RasV12-S181D細胞におけるRNAレベルでのFzd8発現の増加（N＝3）。（E）K-RasV12-S181D発現NIH/3T3細胞は、NIH/3T3-K-RasV12細胞またはNIH/3T3-K-RasV12-S181A細胞と比較した時、Fzd8発現およびホスホCaMKiiのレベルの増加を示した。3種の細胞株の間に、K-Rasタンパク質およびホスホErkのレベルの有意差は存在しなかった。（F）NIH/3T3-K-RasV12-S181D細胞は、K-RasV12群またはK-RasV12-S181A群と比較した時、有意に増加したNF-AT転写活性（左パネル）および低下したWnt/βカテニン活性（右パネル）を提示した（N＝4）。（G）Wnt/βカテニンシグナリング経路を通してK-Rasによって媒介されるFzd8発現の抑止および促進される幹細胞性におけるCaM-K-Ras相互作用の模式図。プロストラチンはPKCの活性化によるK-Rasのリン酸化を通して相互作用に干渉することが提唱されている。（H）カルモジュリンのK-RasV12との相互作用は、CaMプルダウンアッセイによって明らかにされたように、プロストラチンの処理によって抑制された。WCB：全細胞溶解物。IB：イムノブロッティング。（I）K-RasV12によって形質転換されたNIH/3T3細胞においてはプロストラチン処理によってCaMKiiの活性化が上昇したが、K-RasV12-S181A変異体またはH-RasV12についてはそうでなかった。（J）プロストラチン処理に対する応答におけるK-RasV12、K-RasV12-S181A変異体、およびH-RasV12によって形質転換されたNIH/3T3細胞の細胞形態。DMSOを媒体対照として使用した。*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001。
【図６】プロストラチンは変異K-Rasを含むヒト膵臓癌の腫瘍開始を防止した。（A）媒体またはプロストラチンのいずれかによる処理に対する応答における皮下注射されたPANC1およびPANC2.13における腫瘍開始率。上パネル：実験設計の模式図。経口プロストラチン投与を腫瘍植え込みの1日前に与えた。皮下注射にはヌードマウスを使用し、同所植え込みにはSCIDマウスを使用した。（B）薬物処理に対する応答におけるPANC2.13に由来する皮下腫瘍の腫瘍成長曲線（N＝10）。（C）薬物処理に対する応答におけるPANC2.13に由来する皮下腫瘍の生物発光イメージング（BLI）シグナリング変化（N＝10）。（D）薬物処理に対する応答におけるPANC2.13に由来する皮下腫瘍の腫瘍増殖率およびKi67染色。腫瘍増殖率（D27-36）＝（D36における腫瘍のサイズ-D27における腫瘍のサイズ）/D36における腫瘍のサイズ*100。（E）薬物処理に対する応答におけるPANC2.13に由来する同所腫瘍の腫瘍開始率およびBLIシグナリング活性。（F）正常マウス膵臓およびPANC2.13に由来する同所腫瘍のH＆E染色。（G）薬物処理に対する応答におけるPANC2.13に由来する同所腫瘍のKi67染色。*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001；****P＜0.0001。（B）＆（C）についてのデータは平均値±SEMである。
【図７】プロストラチンは腫瘍形成性K-Rasによって駆動されたインビボ悪性を抑止する。（A）プロストラチンは、0.5×106個のPANC1細胞またはPANC2.13細胞に由来する確立された皮下腫瘍に対して抗腫瘍効果を示した（N＝7；データは平均値±SEMである）。（B）プロストラチンはcfDNA値によって測定される同所腫瘍量を抑制した（PANC2.13群についてN＝5；PANC2.03群についてN＝6）。（C）プロストラチンはLRIG1cre/ER/LSL-RasG12V GEMMにおける乳頭腫形成の発生率を低下させた。左パネル：LRIG1cre/ER/LSL-RasG12Vマウスにおける乳頭腫の生成の模式図。右パネル：媒体またはプロストラチンによって処理されたK-RasG12Vによって誘導された乳頭腫を保持するマウスの写真。（D）プロストラチンは、LRIG1cre/ER/LSL-H-RasG12VマウスおよびLRIG1cre/ER/LSL-K-RasG12Vマウスにおいて乳頭腫開始に異なる影響を与えた。（E）媒体（上パネル）またはプロストラチン（下パネル）によって処理されたK-RasG12Vによって誘導された乳頭腫におけるH＆E染色ならびにE-カドヘリンおよびビメンチンについて染色されたIHC。
【図８】（A）培養培地中の血清濃度に関わらない、H-RasV12またはK-RasV12によって形質転換されたNIH/3T3細胞におけるホスホErkの類似したレベル。（B）K-LISAによって測定されたようなH-RasV12またはK-RasV12によって形質転換された細胞における類似したAkt活性（N＝4）。（C）K-RasV12形質転換NIH/3T3細胞によって形成されたスフィアの増加した再コロニー形成効率。左パネル：スフィアの形態およびその後の血清含有培地中に置いた後の変化。中央パネル：生細胞のクリスタルバイオレット染色。右パネル：再コロニー形成効率（N＝8）。（D）Erkリン酸化によって示されたような野生型Rasタンパク質を含むBxPC3細胞におけるEGFのシグナリング効力。（E〜F）shRNAによるBxPC3細胞におけるH-RasまたはK-Rasの選択的ノックダウン。（G）K-Rasがノックダウンされた後のPANC2.13細胞（左）およびPANC1細胞（右）の形態。（H〜I）K-Rasのノックダウンは、PANC2.13細胞またはPANC1細胞において、タンパク質レベル（H）またはmRNAレベル（I）で幹細胞性サインを低下させた。（J）変異K-Rasのノックダウンは、PANC2.13細胞において、スフィアの形成および再コロニー形成を低下させた（N＝6）。*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001。
【図９】（A）ベクター対照およびH-RasV12と比較した時の、K-RasV12によって形質転換されたNIH/3T3細胞におけるmRNAレベルでのc-MycおよびTCF1の発現の増加（N＝3）。（B）Ras欠損MEF-K-RasG12V細胞におけるFzd8によって媒介される非標準シグナリング経路の抑止。（左パネル）ウエスタンブロットはK-RasG12Vを発現するRas欠損MEFにおけるホスホCaMKiiの減少を示した。（右パネル）H-RasG12VおよびK-RasG12Vを発現するRas欠損MEFにおけるマウスFzd8のqPCRアレイ（N＝3）。（C）Ras欠損MEF K-RasG12V細胞は、同一の注射細胞数で、Ras欠損MEF H-RasG12V細胞より高い腫瘍開始頻度を示した。（D）Ras欠損MEF K-RasG12V細胞に由来する腫瘍は劇的に増加した増殖速度を示した。データは平均値±SEMである。（E）H-RasV12およびK-RasV12によって形質転換されたNIH/3T3はWnt3aおよびWnt5aの類似した発現レベルを示した。（F）Wnt3aまたはWnt5aの存在下または非存在下で無血清培地において培養されたNIH/3T3細胞におけるホスホCaMKiiについて探索されたウエスタンブロット。（G）培養培地中のWnt3aまたはWnt5aの存在下または非存在下でのNIH/3T3細胞におけるTOPFlashアッセイ（N＝4）。（H）Wnt3aまたはWnt5aに対する応答におけるNIH/3T3細胞におけるスフィア形成アッセイ。**P＜0.01；***P＜0.001；****P＜0.0001。
【図１０】（A）変異K-Rasのノックダウンは、結腸癌細胞株において、Fzd8の発現、およびCaMKiiのリン酸化またはNFAT転写活性を増加させた（N＝3）。（B）K-Rasがノックダウンされた結腸癌細胞株におけるTOPFlash（N＝3）。（C）K-Rasがノックダウンされた結腸癌細胞株におけるオルガノイド形成アッセイ（N＝6）。（D）K-Rasがノックダウンされた結腸癌細胞株における細胞増殖速度を評価するため、BrdU取り込みアッセイを使用した。pLKO.1発現細胞を標準化のための対照として使用した（N＝6）。（E）異なるタンキラーゼ阻害剤によって12時間処理されたNIH/3T3細胞における相対的なTOPFlash活性。DMSOによって処理された細胞を標準化のために使用した（濃度：各化合物について0.5μM）（N＝4）。（F）異なるタンキラーゼ阻害剤によって12時間処理されたNIH/3T3細胞におけるスフィア形成アッセイ。DMSOによって処理された細胞を標準化のために使用した（N＝6）。*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001；****P＜0.0001。
【図１１】（A）Wnt3aまたはWnt5aの存在は、Fzd8過剰発現を含むかまたは含まないNIH/3T3-K-RasV12細胞においてホスホCaMKiiのレベルに影響を与えなかった。（B）Wnt3aまたはWnt5aによって処理されたFzd8過剰発現NIH/3T3-K-RasV12細胞におけるTOPFlashアッセイ。GFPベクター発現細胞を対照として使用した（N＝3）。（C〜D）PANC2.13細胞におけるFzd8の回復は、幹細胞性サインを低下させ、CaMKiiのリン酸化を増強し（C）、標準Wnt経路における標的遺伝子の発現を低下させた（D）（N＝3）。（E）Fzd8の過剰発現は、PANC1細胞において、mRNAでのCD44およびCD24の発現を低下させた（N＝3）。（F）PANC2.13細胞またはPANC1細胞におけるFzd8回復はK-Rasノックダウンを表現型模写した。（G）ヒト膵臓の正常組織および悪性組織ならびに異なる期のヒト膵臓腫瘍組織においてFzd8について免疫染色された組織切片の顕微鏡写真。（H）異なる発表されたデータセットにおけるヒトFzd8発現のOncomine分析。*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001。
【図１２】（A）NIH/3T3形質転換のために使用されたK-RasV12発現構築物における点変異の模式図。（B）K-RasV12、K-RasV12-S181D、およびK-RasV12-S181Aの発現を有するNIH/3T3細胞におけるK-Rasタンパク質の膜局在。（C）EDTAまたはCa2+の存在下でCaMプルダウンアッセイによって明らかにされたように、カルモジュリンはK-RasV12と相互作用するが、N-RasV12とは相互作用しない。（D）N-RasG12Vを過剰発現するRas欠損MEFは、Ras欠損MEF-K-RasG12Vより高いホスホCaMKiiのレベルを示した。（E）N-RasG12Vは、K-RasG12Vと比較した時、Ras欠損MEFにおいてmRNAでのFzd8発現を増強した（N＝3）。（F）N-RasG12VまたはK-RasG12Vを過剰発現するRas欠損MEFにおけるTOPFlashアッセイ（N＝4）。**P＜0.01。
【図１３】（A）プロストラチンに対する応答における複数の細胞株におけるDMSO処理群によって標準化された相対PKC活性（N＝3）。（B）異なる投薬量でプロストラチンによって処理されたPANC1およびPANC2.13におけるFzd8およびLEF1のmRNA発現レベル（N＝3）。（C）プロストラチンは、K-RasG12Vを過剰発現するRas欠損MEFにおいてCaMKiiのリン酸化レベルを増加させ、細胞生存率を減少させたが、H-RasG12Vについてはそうでなかった（細胞生存度アッセイについてN＝6）。（D）（左パネル）プロストラチンは、i.p.注射または経口胃管栄養を介して、ヌードマウスにおいて、K-RasV12形質転換NIH/3T3細胞の腫瘍開始率を減少させたが、H-RasV12形質転換細胞についてはそうでなかった。（右パネル）体重変化は、プロストラチン処理が、動物において全身毒性効果を及ぼさないことを示した。（E）プロストラチンは、K-RasV12によって形質転換されたNIH/3T3細胞に由来する腫瘍においてCaMKiiのリン酸化レベルを増加させた。（F）プロストラチン処理後の異なる時点で採集された無胸腺ヌードマウスの血清または膵臓におけるPKC活性。*P＜0.05；**P＜0.01。
【図１４】（A）（左パネル）プロストラチン処理によるPANC1およびPANC2.13における細胞形態。（右パネル）プロストラチン処理によるPANC1およびPANC2.13の相対的な細胞生存度または増殖率（N＝6）。（B）（左パネル）同所注射されたPANC1の腫瘍開始率。（右パネル）PANC1に由来する同所腫瘍のH＆E染色およびKi67染色。（C）媒体またはプロストラチンのいずれかによって処理されたPANC2.13の同所注射を保持するNOD SCIDマウスの腹膜を比較するための写真。（D）PANC2.13から確立された腫瘍は、毎日のプロストラチン処理に応答して、増加した開裂カスパーゼ3を示した。（E）K-RasG12Vに由来する乳頭腫は媒体処理腫瘍と比較した時、劇的に減少した腫瘍増殖速度を示した。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
発明の詳細な説明
I.導入
本発明は、K-RasおよびH-Rasは同一のエフェクターを共有し、類似した特性を有するが、腫瘍形成性K-Rasのみが非標準Wnt/Ca2+シグナリングを抑制し、H-Rasはそうでなく、この効果がK-Rasの腫瘍形成特性に強く寄与するという驚くべき発見に一部分基づく。K-Rasは、カルモジュリン依存性キナーゼIIの活性を低下させ、Fzd8発現の低下をもたらすカルモジュリンとの結合によって、その腫瘍形成効果を発揮することが発見された。K-Rasのカルモジュリンとの解離を促進するプロストラチンを使用して、Fzd8によって媒介されるWnt/Ca2+シグナリングを回復することによって、腫瘍の形成および成長が抑制されることがさらに示された。従って、一つの局面において、本発明は、プロストラチンまたはプロストラチン類似体の治療的な量を投与することによって、対象における野生型K-Rasを発現する癌または変異型K-Rasを発現する癌のような癌を処置する方法を提供する。
【００１８】
もう一つの局面において、本発明は、プロストラチンまたはプロストラチン類似体を含む、K-Ras発現癌のような癌を処置するための組成物およびキットも提供する。
【００１９】
II.定義
本明細書において使用されるように、「K-Ras」とう用語は、「カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子相同体」をさす。K-Ras遺伝子によってコードされるタンパク質は、細胞内シグナル伝達において機能する低分子量GTPアーゼである。ヒトK-Rasの遺伝子およびタンパク質の配列は、例えば、Genbankアクセッション番号M54968.1およびAAB414942.1に示される。ヒト癌において見出されるいくつかの一般的なK-Rasの遺伝子およびタンパク質は、コドン12、コドン、コドン61、コドン146、および／またはその他の同時発生的な部位に変異を含有している。K-Ras変異の非限定的な例には、コドン5（例えば、K5E）、コドン9（例えば、V9I）、コドン12（例えば、G12A、G12C、G12D、G12F、G12R、G12S、G12V、G12Y）、コドン13（例えば、G13C、G13D、G13V）、コドン14（例えば、V14I、V14L）、コドン18（例えば、A18D）、コドン19（例えば、L19F）、コドン22（例えば、Q22K）、コドン23（例えば、L23R）、コドン24（例えば、I24N）、コドン26（例えば、N26K）、コドン33（例えば、D33E）、コドン36（例えば、I36L、I36M）、コドン57（例えば、D57N）、コドン59（例えば、A59E、A59G、A59T）、コドン61（例えば、Q61H、Q61K、Q61L、Q61R）、コドン62（例えば、E62G、E62K）、コドン63（例えば、E63K）、コドン64（例えば、Y64D、Y64H、Y64N）、コドン68（例えば、R68S）、コドン74（例えば、T74P）、コドン92（例えば、D92Y）、コドン97（例えば、R97I）、コドン110（例えば、P110H、P110S）、コドン117（例えば、K117N）、コドン118（例えば、C118S）、コドン119（例えば、D119N）、コドン135（例えば、R135T）、コドン138（例えば、G138V）、コドン140（例えば、P140H）、コドン146（例えば、A146T、A146V）、コドン147（例えば、K147N）、コドン153（例えば、D153N）、コドン156（例えば、F156L）、コドン160（例えば、V160A）、コドン164（例えば、R164Q）、コドン171（例えば、I171M）、コドン176（例えば、K176Q）、コドン185（例えば、C185R、C185S）、およびコドン188（例えば、M188V）における変異が含まれる。
【００２０】
「K-Ras発現癌」とは、検出可能なレベルのK-Ras（野生型または変異型のいずれか）の発現を有する癌をさす。いくつかの態様において、癌組織試料中の細胞の少なくとも0.1％が、K-Ras活性化（例えば、野生型K-Ras、またはコドン12、コドン13、コドン61、および／もしくはその他のコドンにおけるK-Ras活性化変異）について陽性である時、その癌は、検出可能なレベルの発現を有する。いくつかの態様において、癌は、検出可能なレベルの野生型K-Rasの発現を有する。いくつかの態様において、癌は、検出可能なレベルの変異型K-Rasの発現を有する。いくつかの態様において、K-Ras発現癌は、対照（例えば、正常ヒト末梢リンパ球のような、K-Rasを発現しない非疾患の細胞または組織）におけるK-Ras発現のレベルより少なくとも5％、10％、20％、30％、40％、50％、75％、100％、150％、または200％大きいレベルのK-Ras（例えば、野生型K-Rasまたは変異型K-Ras）の発現を有する。
【００２１】
「癌」という用語は、異常細胞の無調節の成長を特徴とする疾患をさす。この用語には、悪性、良性、軟部組織、または固形のいずれとして特徴決定されるかに関わらず、全ての公知の癌および新生物状態が含まれ、転移前の癌および転移後の癌を含む、全ての期およびグレードの癌が含まれる。異なる型の癌の例には、胃癌（gastric cancer）（例えば、胃癌（stomach cancer））、結腸直腸癌、胃腸間質腫瘍、消化管カルチノイド腫瘍、結腸癌、直腸癌、肛門癌、胆管癌、小腸癌、および食道癌のような消化器および胃腸の癌；乳癌；肺癌；胆嚢癌；肝臓癌；膵臓癌；虫垂癌；前立腺癌、卵巣癌；腎臓癌；中枢神経系の癌；皮膚癌（例えば、黒色腫）；リンパ腫；神経膠腫；絨毛癌；頭頸部癌；骨肉腫；ならびに血液癌が含まれるが、これらに限定されない。本明細書において使用されるように、「腫瘍」は1個以上の癌細胞を含む。いくつかの態様において、癌は膵臓癌である。
【００２２】
「生物学的試料」には、血液および血液画分または血液製剤（例えば、血清、血漿、血小板、赤血球等）；痰または唾液；腎臓、肺、肝臓、心臓、脳、神経組織、甲状腺、眼、骨格筋、軟骨、または骨組織；培養細胞、例えば、初代培養物、外植片、および形質転換細胞、幹細胞、便、尿等が含まれる。そのような生物学的試料には、生検試料および剖検試料のような組織の切片、ならびに組織学的目的のために採取された凍結切片も含まれる。生物学的試料は、典型的には、「対象」、即ち、真核生物、最も好ましくは、霊長類、例えば、チンパンジーもしくはヒトなどの哺乳動物；ウシ；イヌ；ネコ；齧歯類、例えば、モルモット、ラット、もしくはマウス；ウサギ；またはトリ；爬虫類；または魚から入手される。
【００２３】
薬剤（例えば、プロストラチンもしくはプロストラチン類似体またはその塩もしくは異性体）の「治療的な量」または「治療的に有効な量」とは、対象における癌（例えば、K-Ras発現癌）の症状を防止するか、緩和するか、軽減するか、またはその重症度を低下させる薬剤の量である。
【００２４】
12-デオキシホルボール-13-アセテートとも呼ばれる「プロストラチン」という用語は、以下の構造を有する化合物をさす：
2017527583.tif 000004
【００２５】
「プロストラチン類似体」という用語は、1個以上の原子または官能基がプロストラチンとは異なるプロストラチンの構造的誘導体である化合物をさす。
【００２６】
本明細書において使用されるように、「塩」という用語は、化合物、例えば、プロストラチンまたはプロストラチン類似体の酸性塩または塩基性塩をさす。薬学的に許容される塩の例示的な例は、（ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、およびマグネシウムのような）アルカリ金属およびアルカリ土類金属の塩、アンモニウム（アンモニウム、トリメチルアンモニウム、ジエチルアンモニウム、およびtris-(ヒドロキシメチル)-メチル-アンモニウム）の塩、鉱酸（塩酸、臭化水素酸、リン酸等）の塩、有機カルボン酸（酢酸、プロピオン酸、グルタミン酸、クエン酸等）の塩、有機スルホン酸（メタンスルホン酸）の塩、ならびに四級アンモニウム（ヨウ化メチル、ヨウ化エチル等）の塩である。薬学的に許容される塩は無毒であることが理解される。適当な薬学的に許容される塩に関するさらなる情報は、参照によって本明細書に組み入れられる、Remington's,Pharmaceutical Sciences(current edition),Mack Publishing Co.,Easton,PAに見出され得る。
【００２７】
本明細書において使用されるように、「異性体」という用語は、同一の化学式を有するが、構造的に区別可能な化合物をさす。
【００２８】
「投与する」、「投与される」、または「投与すること」という用語は、薬剤、化合物、または組成物を生物学的作用の所望の部位へ送達する方法をさす。これらの方法には、局所送達、非経口送達、静脈内送達、皮内送達、筋肉内送達、結腸送達、直腸送達、または腹腔内送達が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に記載された薬剤および方法と共に任意で利用される投与技術には、例えば、Goodman and Gilman,The Pharmacological Basis of Therapeutics,current ed.;Pergamon；およびRemington's,Pharmaceutical Sciences(current edition),Mack Publishing Co.,Easton,PAに記述されたようなものが含まれる。
【００２９】
III.癌を処置する方法
一つの局面において、対象における癌を処置または防止する方法が提供される。いくつかの態様において、方法は、プロストラチンもしくはプロストラチン類似体またはその塩もしくは異性体の治療的な量を対象へ投与する工程を含む。いくつかの態様において、対象は、ヒト、例えば、ヒト成人またはヒト子供である。
【００３０】
いくつかの態様において、癌は、K-Ras発現癌、例えば、野生型K-Rasを発現するかもしくは過剰発現する癌、または変異型K-Rasを発現する癌である。いくつかの態様において、K-Ras発現癌は、膵臓癌、結腸直腸癌、または肺癌である。いくつかの態様において、K-Ras発現癌は、膵臓癌、例えば、膵管腺癌である。いくつかの態様において、方法は、対象由来の試料（例えば、腫瘍組織試料）中のK-Ras発現のレベルを測定する工程をさらに含む。いくつかの態様において、方法は、対象由来の試料（例えば、腫瘍組織試料）中の発現されているK-Ras遺伝子型を決定する工程をさらに含む。
【００３１】
いくつかの態様において、方法は、以下の工程をさらに含む：
対象由来の試料（例えば、対象由来の腫瘍細胞または腫瘍組織の試料）中のK-Ras発現のレベルを検出する工程；
対象由来の試料におけるK-Ras発現のレベルが、対照（例えば、正常ヒト末梢リンパ球のような、K-Rasを発現しない非疾患の細胞または組織）のK-Ras発現のレベルより大きいか否かを決定する工程；および
対象由来の試料におけるK-Ras発現のレベルが対照のK-Ras発現のレベルより大きい時、プロストラチンもしくはプロストラチン類似体またはその塩もしくは異性体を対象へ投与する工程。
【００３２】
いくつかの態様において、癌は、K-Rasを発現するかまたは過剰発現する癌ではない。非限定的な例として、いくつかの態様において、癌は、K-Rasを発現または過剰発現しない膵臓癌（例えば、膵管腺癌）である。
【００３３】
K-Ras発現癌
いくつかの態様において、癌は、検出可能なレベルでK-Rasを発現する癌である。いくつかの態様において、癌組織試料中の細胞の少なくとも0.1％が、K-Ras活性化（例えば、野生型K-Ras、またはコドン12、コドン13、コドン61、および／もしくはその他のコドンにおけるK-Ras活性化変異）について陽性である時、その癌は、検出可能なレベルのK-Ras発現を有する。いくつかの態様において、癌は、検出可能なレベルの野生型K-Rasの発現を有する。いくつかの態様において、癌は、検出可能なレベルの変異型K-Rasの発現を有する。いくつかの態様において、K-Ras変異は、コドン5（例えば、K5E）、コドン9（例えば、V9I）、コドン12（例えば、G12A、G12C、G12D、G12F、G12R、G12S、G12V、G12Y）、コドン13（例えば、G13C、G13D、G13V）、コドン14（例えば、V14I、V14L）、コドン18（例えば、A18D）、コドン19（例えば、L19F）、コドン22（例えば、Q22K）、コドン23（例えば、L23R）、コドン24（例えば、I24N）、コドン26（例えば、N26K）、コドン33（例えば、D33E）、コドン36（例えば、I36L、I36M）、コドン57（例えば、D57N）、コドン59（例えば、A59E、A59G、A59T）、コドン61（例えば、Q61H、Q61K、Q61L、Q61R）、コドン62（例えば、E62G、E62K）、コドン63（例えば、E63K）、コドン64（例えば、Y64D、Y64H、Y64N）、コドン68（例えば、R68S）、コドン74（例えば、T74P）、コドン92（例えば、D92Y）、コドン97（例えば、R97I）、コドン110（例えば、P110H、P110S）、コドン117（例えば、K117N）、コドン118（例えば、C118S）、コドン119（例えば、D119N）、コドン135（例えば、R135T）、コドン138（例えば、G138V）、コドン140（例えば、P140H）、コドン146（例えば、A146T、A146V）、コドン147（例えば、K147N）、コドン153（例えば、D153N）、コドン156（例えば、F156L）、コドン160（例えば、V160A）、コドン164（例えば、R164Q）、コドン171（例えば、I171M）、コドン176（例えば、K176Q）、コドン185（例えば、C185R、C185S）、およびコドン188（例えば、M188V）のうちの1個以上における活性化変異である。いくつかの態様において、K-Ras変異は、アミノ酸残基G12における変異（例えば、G12C、G12V、G12D、G12A、G12S、G12R、またはG12Fの置換）である。いくつかの態様において、K-Ras変異は、アミノ酸残基G13における変異（例えば、G13CまたはG13Dの置換）である。いくつかの態様において、K-Ras変異は、アミノ酸残基Q61における変異（例えば、Q61HまたはQ61Kの置換）である。いくつかの態様において、K-Ras変異は、アミノ酸残基A146における変異（例えば、A146TまたはA146Vの置換）である。いくつかの態様において、検出可能なレベルで野生型または変異型のK-Rasを発現する癌は、膵臓癌、肺癌、または結腸直腸癌である。
【００３４】
いくつかの態様において、癌はK-Rasを過剰発現する癌である。本明細書において使用されるように、K-Ras（例えば、野生型K-Rasまたは変異型K-Ras）の発現のレベルが閾値または対照試料（例えば、正常ヒト末梢リンパ球のような、K-Rasを発現しない非疾患の細胞もしくは組織、またはK-Rasの発現について陰性であることが既知の対象由来の癌試料）と比べて増加している場合、その癌はK-Rasを「過剰発現する」。いくつかの態様において、K-Ras（例えば、野生型K-Rasまたは変異型K-Ras）の発現のレベルが、閾値または対照試料（例えば、K-Rasの発現について陰性であることが既知の癌）におけるK-Ras発現のレベルより少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、75％、100％、150％、または200％大きい場合、その癌はK-Rasを過剰発現する。いくつかの態様において、K-Ras（例えば、野生型K-Rasまたは変異型K-Ras）の発現のレベルが、閾値または対照試料（例えば、K-Rasの発現について陰性であることが既知の癌）におけるK-Ras発現のレベルと比べて、少なくとも2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、またはそれ以上である場合、その癌はK-Rasを過剰発現する。いくつかの態様において、野生型K-Rasまたは変異型K-Rasを過剰発現する癌は、膵臓癌、肺癌、または結腸直腸癌である。
【００３５】
癌におけるK-Rasの発現のレベルは、当技術分野において公知の方法によって測定され得る。いくつかの態様において、癌におけるK-Ras遺伝子の発現のレベルが測定される。いくつかの態様において、癌におけるK-Rasタンパク質の発現のレベルが測定される。K-Ras遺伝子もしくはK-Rasタンパク質の発現のレベル、またはK-Ras遺伝子型の検出は、対象由来の生物学的試料において測定され得る。いくつかの態様において、生物学的試料は、癌細胞（例えば、腫瘍から入手されたかまたは由来する細胞）を含む。いくつかの態様において、生物学的試料は腫瘍組織試料である。
【００３６】
K-Rasタンパク質の発現のレベルは、当技術分野において公知の多数のイムノアッセイのいずれかを使用して測定され得る。イムノアッセイの技術およびプロトコルは、Price and Newman,"Principles and Practice of Immunoassay,"2nd Edition,Grove's Dictionaries,1997；およびGosling,"Immunoassays:A Practical Approach,"Oxford University Press,2000に一般に記載されている。競合イムノアッセイおよび非競合イムノアッセイを含む多様なイムノアッセイ技術が使用され得る（例えば、Self et al.,Curr.Opin.Biotechnol.,7:60-65(1996)を参照すること）。イムノアッセイという用語には、非限定的に、EMIT（enzyme multiplied immunoassay technique）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、IgM抗体キャプチャーELISA（MAC ELISA）、および微粒子酵素イムノアッセイ（MEIA）のような酵素イムノアッセイ（EIA）；キャピラリー電気泳動イムノアッセイ（CEIA）；ラジオイムノアッセイ（RIA）；イムノラジオメトリックアッセイ（IRMA）；免疫蛍光（IF）；蛍光偏光イムノアッセイ（FPIA）；ならびに化学発光アッセイ（CL）を含む技術が包含される。所望により、そのようなイムノアッセイは自動化されてもよい。イムノアッセイはレーザー誘起蛍光と共に使用されてもよい（例えば、Schmalzing et al.,Electrophoresis,18:2184-93(1997)；Bao,J.Chromatogr.B.Biomed.Sci.,699:463-80(1997)を参照すること）。
【００３７】
抗体のタンパク質（例えば、K-Ras）との特異的な免疫学的結合は、直接または間接的に検出され得る。直接標識には、抗体に付着した蛍光性または発光性のタグ、金属、色素、放射性核種等が含まれる。ヨウ素125（125I）によって標識された抗体が使用され得る。タンパク質マーカーに特異的な化学発光性抗体を使用する化学発光アッセイは、タンパク質レベルの高感度の非放射性の検出のために適当である。蛍光色素によって標識された抗体も適当である。蛍光色素の例には、非限定的に、DAPI、フルオレセイン、ヘキスト33258、R-フィコシアニン、B-フィコエリトリン、R-フィコエリトリン、ローダミン、テキサスレッド、およびリサミンが含まれる。間接標識には、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）、アルカリホスファターゼ（AP）、βガラクトシダーゼ、ウレアーゼ等のような、当技術分野において周知の様々な酵素が含まれる。西洋ワサビペルオキシダーゼ検出系は、例えば、過酸化水素の存在下で450nmにおいて検出可能な可溶性の生成物を与える発色性基質テトラメチルベンジジン（TMB）と共に使用され得る。アルカリホスファターゼ検出系は、例えば、405nmにおいて容易に検出可能な可溶性の生成物を与える発色性基質p-ニトロフェニルリン酸と共に使用され得る。同様に、βガラクトシダーゼ検出系は、410nmにおいて検出可能な可溶性の生成物を与える発色性基質o-ニトロフェニル-β-D-ガラクトピラノシド（ONPG）と共に使用され得る。ウレアーゼ検出系は、ウレア-ブロモクレゾールパープル（urea-bromocresol purple）（Sigma Immunochemicals；St.Louis,MO）のような基質と共に使用され得る。
【００３８】
直接標識または間接標識からのシグナルは、例えば、発色性基質からの色を検出する分光光度計；125Iの検出のためのガンマカウンターのような放射線を検出する放射線計数管；またはある種の波長の光の存在下で蛍光を検出する蛍光光度計を使用して分析され得る。酵素に連結された抗体の検出のため、EMAX Microplate Reader（Molecular Devices；Menlo Park,CA）のような分光光度計を、製造業者の説明書に従って使用して、定量分析を行うことができる。所望により、本発明のアッセイを自動化するかまたはロボットを利用して実施することができ、複数の試料からのシグナルを同時に検出することができる。いくつかの態様において、自動化されたハイコンテンツイメージングシステムを使用してシグナルの量を定量化することができる。ハイコンテンツイメージングシステムは、市販されている（例えば、ImageXpress、Molecular Devices Inc.,Sunnyvale,CA）。
【００３９】
抗体を、磁性粒子またはクロマトグラフィマトリックス粒子、アッセイプレート（例えば、マイクロタイターウェル）の表面、固体基質材料または膜の片（例えば、プラスチック、ナイロン、ペーパー）等のような多様な固体支持体へ固定化することができる。抗体または複数の抗体のアレイを固体支持体上にコーティングすることによって、アッセイストリップを調製することができる。次いで、このストリップを試験試料に浸し、洗浄および検出の工程を通して迅速に処理し、有色スポットのような測定可能なシグナルを生成することができる。
【００４０】
K-Ras核酸発現レベルまたはK-Ras遺伝子型の分析は、サザン分析、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）、または関心対象のコード配列の一部分に相補的な核酸配列とのハイブリダイゼーションに基づくその他の方法（例えば、スロットブロットハイブリダイゼーション）のようなルーチンの技術を使用して、達成され得、本発明の範囲内である。適用可能なPCR増幅技術は、例えば、Ausubel et al.およびInnis et al.（前記）に記載されている。一般的な核酸ハイブリダイゼーション法は、Anderson,"Nucleic Acid Hybridization,"BIOS Scientific Publishers,1999に記載されている。マイクロアレイに配置されたmRNAまたはcDNAの配列から、複数の核酸配列（例えば、ゲノムDNA、mRNA、またはcDNA）の増幅またはハイブリダイゼーションを実施することもできる。マイクロアレイ法は、Hardiman,"Microarrays Methods and Applications:Nuts & Bolts,"DNA Press,2003；およびBaldi et al.,"DNA Microarrays and Gene Expression:From Experiments to Data Analysis and Modeling,"Cambridge University Press,2002に一般に記載されている。
【００４１】
核酸発現レベルまたは遺伝子型の分析は、非限定的に、マイクロアレイ、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）に基づく分析、配列分析、および電気泳動分析を含む当技術分野において公知の技術を使用して実施されてもよい。PCRに基づく分析の非限定的な例には、Applied Biosystemsから入手可能なTaqman（登録商標）対立遺伝子識別アッセイが含まれる。配列分析の非限定的な例には、マクサム・ギルバート配列決定、サンガー配列決定、キャピラリーアレイDNA配列決定、サーマルサイクル配列決定（Sears et al.,Biotechniques,13:626-633(1992)）、固相配列決定（Zimmerman et al.,Methods Mol.Cell Biol.,3:39-42(1992)）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（MALDI-TOF/MS；Fu et al.,Nat.Biotechnol.,16:381-384(1998)）のような質量分析による配列決定、ピロシーケンシング（Ronaghi et al.,Science,281:363-365(1998)）、およびシーケンシングバイハイブリダイゼーションが含まれる。Chee et al.,Science,274:610-614(1996)；Drmanac et al.,Science,260:1649-1652(1993)；Drmanac et al.,Nat.Biotechnol.,16:54-58(1998)。電気泳動分析の非限定的な例には、アガロースゲル電気泳動またはポリアクリルアミドゲル電気泳動のようなスラブゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、および変性勾配ゲル電気泳動が含まれる。いくつかの態様において、核酸バリアントを検出する方法には、例えば、Third Wave Technologies,Inc.からのINVADER（登録商標）アッセイ、制限断片長多形（RFLP）分析、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、ヘテロ二本鎖移動度アッセイ、一本鎖高次構造多形（SSCP）分析、一塩基プライマー伸長（SNUPE）、およびピロシーケンシングが含まれる。
【００４２】
検出可能モエティが、本明細書に記載されたアッセイにおいて使用され得る。多様な検出可能モエティが使用され得、標識の選択は、必要とされる感度、抗体とのコンジュゲーションの容易さ、安定性要件、ならびに入手可能な機器および廃棄規定に依る。適当な検出可能モエティには、放射性核種、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、Oregon Green（商標）、ローダミン、テキサスレッド、テトラローダミンイソチオシアネート（TRITC）、Cy3、Cy5等）、蛍光マーカー（例えば、緑色蛍光タンパク質（GFP）、フィコエリトリン等）、腫瘍関連プロテアーゼによって活性化される自己消光（autoquenched）蛍光化合物、酵素（例えば、ルシフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等）、ナノ粒子、ビオチン、ジゴキシゲニン等が含まれるが、これらに限定されない。
【００４３】
多様な物理的フォーマットで分析を実施することができる。例えば、多数の試験試料の処理を容易にするため、マイクロタイタープレートの使用または自動化を使用することができる。
【００４４】
あるいは、タンパク質または核酸の発現レベルの検出のため、抗体または核酸プローブを、顕微鏡スライドに固定化された対象試料へ適用することができる。得られた抗体染色またはインサイチューハイブリダイゼーションのパターンを、当技術分野において公知の多様な光学顕微鏡法または蛍光顕微鏡法のいずれかを使用して可視化することができる。
【００４５】
例えば、単独の、または質量分析（例えば、MALDI/MS、MALDI-TOF/MS、タンデムMS等）と組み合わせられた高圧液体クロマトグラフィ（HPLC）によっても、タンパク質または核酸の分析を達成することができる。
【００４６】
K-Ras遺伝子型を決定する方法は、当技術分野において記載されている。例えば、Kramer et al.,Cell Oncol.31:161-167(2009)；Chen et al.,J.Chromatogr.A 1216:5147-5154(2009)；Lamy et al.,Modern Pathology 24:1090-1100(2011)；Galbiati et al.,PLoS ONE 8(3):359939(2013)；およびWO 2010/048691を参照すること。
【００４７】
プロストラチンまたはプロストラチン類似体
いくつかの態様において、プロストラチンまたはその塩もしくは異性体の治療的な量が、その必要がある対象（例えば、癌、例えば、K-Rasを発現するかまたは過剰発現する癌を有する対象）へ投与される。プロストラチン（12-デオキシホルボール-13-アセテート；CAS 60857-08-1）は、例えば、Santa Cruz Biotechnology (Dallas,TX）およびabcam Biochemicals（Cambridge,MA）から市販されている。
【００４８】
いくつかの態様において、プロストラチン類似体またはその塩または異性体の治療的な量が、その必要がある対象（例えば、癌、例えば、K-Rasを発現するかまたは過剰発現する癌を有する対象）へ投与される。いくつかの態様において、プロストラチン類似体は、プロストラチンと比較可能なプロテインキナーゼC（PKC）結合親和性を有する、プロストラチンと構造的に関連する化合物である。いくつかの態様において、プロストラチン類似体は、プロストラチンと比べて改善されたPKC結合親和性を有する、プロストラチンと構造的に関連する化合物である。
【００４９】
いくつかの態様において、プロストラチン類似体は、各々、参照によって本明細書に組み入れられる、米国特許第5,021,549号、米国特許第8,536,378号、WO 2009/126949、米国特許第2011/0014699号、または米国特許第2011/0224297号に開示された化合物である。
【００５０】
いくつかの態様において、プロストラチンの構造的類似体は、親プロストラチン化合物と1個以上の構造的特徴を共有するが、選択されているエステル基が異なっていてよい。いくつかの態様において、プロストラチン類似体は、以下の構造式を有する化合物である：
2017527583.tif 000005
（R3は、OR、ハロ、SeR、SR、SOR、SO2R、アリール、NHR、NR2、およびNHCOR（Rは、1〜15炭素(C1〜C15)の低級アルキルである）からなる群より選択され;
R4は、水素、アルキル(C1〜C20)、環式アルキル(C3〜C15)、アリール(C6〜C10)、ヒドロキシル、アルキルカーボネート、カルバメート、エステル、エーテル、チオール、アミン、ホスフィン、ホスフェート、ホスホラミド、ホスホラミダイト、ホスホラミデート、ホスファイト、ホスホネート、スルフェート、スルホネート、スルホンアミド、スルホン、スルファイト、アミド、グアニジン、および尿素からなる群より選択され;
R5は、水素、アルキル(C1〜C20)、環式アルキル(C3〜C15)、アリール(C6〜C10)、ヒドロキシル、アルキルカーボネート、カルバメート、エステル、エーテル、チオール、アミン、ホスフィン、ホスフェート、ホスホラミド、ホスホラミダイト、ホスホラミデート、ホスファイト、ホスホネート、スルフェート、スルホネート、スルホンアミド、スルホン、スルファイト、アミド、グアニジン、および尿素からなる群より選択される）。
【００５１】
いくつかの態様において、プロストラチン類似体は、以下の構造式を有する化合物である：
2017527583.tif 000006
（Rは、エチル、ホルメート、プロピオネート、ブチレート、ペンタノエート、ヘキサノエート、ベンゾエート、フェニルアセテート、シクロヘキシルアセテート、ペンタフルオロフェニルアセテート、1-ナフチルアセテート、2-ナフチルアセテート、(5,6,7,8)テトラヒドロ-1-ナフチルアセテート、ビフェニルアセテート、アダマンチルアセテート、またはp-ベンジルフェニルアセテートである）。
【００５２】
プロストラチンおよびプロストラチン類似体を合成する方法は、当技術分野において記載されている。例えば、各々、参照によって組み入れられる、Wender et al.,Science 320:649-652(2008);およびBeans et al.,Proc.Natl.Acad.Sci USA 110:11698-11703(2013)を参照すること。例えば、PKC結合親和性アッセイによって、プロストラチンおよびプロストラチン類似体の活性を試験する方法も、当技術分野において記載されている。例えば、Beans et al.,Proc.Natl.Acad.Sci USA 110:11698-11703(2013)を参照すること。
【００５３】
投与および組み合わせ治療
治療剤（例えば、プロストラチンもしくはプロストラチン類似体またはその塩もしくは異性体）の投与ルートは、経口、腹腔内、経皮、皮下、静脈内注射、筋肉内注射、吸入、局所、病巣内、注入；リポソームによって媒介される送達；局所、くも膜下腔内、歯肉ポケット、直腸、気管支内、鼻、経粘膜、腸、眼、もしくは耳への送達、または当技術分野において公知のその他の方法であり得る。いくつかの態様において、プロストラチンもしくはプロストラチン類似体またはその塩もしくは異性体は、経口投与されるか、静脈内投与されるか、または腹腔内投与される。
【００５４】
いくつかの態様において、プロストラチンもしくはプロストラチン類似体またはその塩もしくは異性体は、治療的に有効な量または用量で投与される。約0.01mg/kg〜約500mg/kg、または約0.1mg/kg〜約200mg/kg、または約1mg/kg〜約100mg/kg、または約10mg/kg〜約50mg/kgの1日用量範囲を使用することができる。しかしながら、投薬量は、選ばれた投与ルート、組成物の製剤、患者の応答、状態の重症度、対象の体重、および処方する医師の判断を含むいくつかの因子によって変動し得る。投薬量は、個々の患者による必要に応じて、経時的に増加させられてもよいしまたは減少させられてもよい。ある種の場合において、最初に低用量を患者に与え、次いで、患者にとって許容される有効な投薬量に増加させることができる。有効量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。
【００５５】
いくつかの態様において、プロストラチンもしくはプロストラチン類似体またはその塩もしくは異性体は、第2の治療剤と組み合わせて投与される。いくつかの態様において、第2の治療剤は化学療法剤である。いくつかの態様において、化学療法剤は、アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、イホスファミド、クロラムブシル、ブスルファン、メルファラン、メクロレタミン、ウラムスチン（uramustine）、チオテパ、ニトロソウレア、もしくはテモゾロミド）、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン、アドリアマイシン、ダウノルビシン、エピルビシン、もしくはミトキサントロン）、細胞骨格破壊剤（例えば、パクリタクセルもしくはドセタキセル）、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（例えば、ボリノスタットもしくはロミデプシン）、トポイソメラーゼの阻害剤（例えば、イリノテカン、トポテカン、アムサクリン、エトポシド、もしくはテニポシド）、キナーゼ阻害剤（例えば、ボルテゾミブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、ベムラフェニブ、もしくはビスモデギブ）、ヌクレオシド類似体もしくは前駆物質類似体（例えば、アザシチジン、アザチオプリン、カペシタビン、シタラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、メルカプトプリン、メトトレキサート、もしくはチオグアニン）、ペプチド抗生物質（例えば、アクチノマイシンもしくはブレオマイシン）、白金に基づく薬剤（例えば、シスプラチン、オキサリプラチン、もしくはカルボプラチン）、または植物アルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン、ポドフィロトキシン、パクリタクセル、もしくはドセタキセル）である。いくつかの態様において、化学療法剤はゲムシタビンである。
【００５６】
同時投与される治療剤（例えば、プロストラチンもしくはプロストラチン類似体またはその塩もしくは異性体および本明細書に記載される第2の治療剤）は、共にまたは別々に、同時にまたは異なる時点で投与され得る。投与される時、治療剤は、独立に、必要に応じて、1日1回、2回、3回、4回、またはそれより多いかもしくは少ない頻度で投与され得る。いくつかの態様において、投与される治療剤は1日1回投与される。いくつかの態様において、投与される治療剤は、同時に、例えば、混合物として投与される。いくつかの態様において、治療剤のうちの1種以上が、徐放性製剤で投与される。
【００５７】
いくつかの態様において、プロストラチンもしくはプロストラチン類似体またはその塩もしくは異性体および第2の治療剤は同時に投与される。いくつかの態様において、プロストラチンまたはプロストラチン類似体が、例えば、約1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、15日、20日、25日、30日、40日、50日、60日、70日、80日、90日、100日、またはそれ以上、まず投与された後、第2の治療剤（例えば、化学療法剤）が投与される。いくつかの態様において、第2の治療剤（例えば、化学療法剤）が、例えば、約1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、15日、20日、25日、30日、40日、50日、60日、70日、80日、90日、100日、またはそれ以上、まず投与された後、プロストラチンまたはプロストラチン類似体が投与される。
【００５８】
いくつかの態様において、プロストラチンもしくはプロストラチン類似体またはその塩もしくは異性体（および、任意で、第2の治療剤、例えば、本明細書に記載される化学療法剤）は、長期間にわたり、例えば、少なくとも30日、40日、50日、60日、70日、80日、90日、100日、150日、200日、250日、300日、350日、またはそれ以上の間、対象へ投与される。
【００５９】
IV.組成物およびキット
もう一つの局面において、対象における癌（例えば、K-Rasを発現するかまたは過剰発現する癌）の処置または防止において使用するための組成物およびキットが提供される。
【００６０】
いくつかの態様において、癌（例えば、野生型K-Rasまたは変異型K-Rasが発現されるかまたは過剰発現される癌）を有する対象への投与において使用するための、プロストラチンもしくはプロストラチン類似体またはその塩もしくは異性体を含む薬学的組成物が提供される。いくつかの態様において、プロストラチンまたはプロストラチン類似体（またはそれらの塩もしくは異性体）は、前記セクションIIIに記載されたようなものである。いくつかの態様において、プロストラチンもしくはプロストラチン類似体またはその塩もしくは異性体と第2の治療剤（例えば、本明細書に記載される化学療法剤）との組み合わせは、適切な薬学的に許容される担体または希釈剤による製剤化によって、共にまたは別々に、薬学的組成物へ製剤化され、錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、顆粒剤、糖衣錠、ゲル剤、スラリー剤、軟膏剤、液剤、坐剤、注射剤、吸入剤、およびエアロゾル剤のような、固体、半固体、液体、または気体の形態の調製物へ製剤化され得る。
【００６１】
本発明において使用するための製剤を調製するための案内は、例えば、参照によって本明細書に組み入れられる、Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21st Ed.,2006（前記）；Martindale:The Complete Drug Reference,Sweetman,2005,London:Pharmaceutical Press；Niazi,Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations,2004,CRC Press；およびGibson,Pharmaceutical Preformulation and Formulation:A Practical Guide from Candidate Drug Selection to Commercial Dosage Form,2001,Interpharm Pressに見出される。本明細書に記載された薬学的組成物は、当業者に公知の様式で、即ち、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠作成、粉砕、乳化、封入、捕捉、または凍結乾燥の過程によって製造され得る。以下の方法および賦形剤は、例示に過ぎず、決して限定的なものではない。
【００６２】
いくつかの態様において、プロストラチンもしくはプロストラチン類似体またはその塩もしくは異性体（および、任意で、第2の治療剤、例えば、本明細書に記載される化学療法剤）は、徐放性、放出制御型（controlled release）、持続放出型（extended-release）、タイムリリース型（timed-release）、または遅延放出型（delayed-release）の製剤で、例えば、治療剤を含有する固体の疎水性ポリマーの半浸透性マトリックスで、送達のために調製される。様々な型の徐放性材料が確立されており、当業者に周知である。現在の持続放出型製剤には、フィルムコート錠、マルチパーティクル系またはマルチペレット系、親水性または親油性の材料を使用するマトリックステクノロジー、および孔形成賦形剤を含むロウに基づく錠剤が含まれる（例えば、Huang,et al.Drug Dev.Ind.Pharm.29:79(2003)；Pearnchob,et al.Drug Dev.Ind.Pharm.29:925(2003)；Maggi,et al.Eur.J.Pharm.Biopharm.55:99(2003)；Khanvilkar,et al.,Drug Dev.Ind.Pharm.228:601(2002)；およびSchmidt,et al.,Int.J.Pharm.216:9(2001)を参照すること）。徐放性送達系は、設計に依って、数時間または数日、例えば、4時間、6時間、8時間、10時間、12時間、16時間、20時間、24時間、またはそれ以上にわたり化合物を放出する。一般的には、徐放性製剤は、天然に存在するポリマーまたは合成ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン（PVP）のようなポリマービニルピロリドン；カルボキシビニル親水性ポリマー；メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、およびヒドロキシプロピルメチルセルロースのような疎水性および／または親水性の親水コロイド；ならびにカルボキシポリメチレンを使用して調製され得る。
【００６３】
徐放性製剤または持続放出型製剤は、二酸化チタン、二酸化ケイ素、酸化亜鉛、および粘土を含む鉱物のような天然成分を使用して調製されてもよい（参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第6,638,521号を参照すること）。例示的な持続放出型製剤には、各々、参照によって本明細書に組み入れられる、米国特許第6,635,680号；6,624,200号；第6,613,361号；第6,613,358号、第6,596,308号；第6,589,563号；第6,562,375号；第6,548,084号；第6,541,020号；第6,537,579号；第6,528,080号、および第6,524,621号に記載されたものが含まれる。例示的な放出制御型製剤には、各々、参照によって本明細書に組み入れられる、米国特許第6,607,751号；第6,599,529号；第6,569,463号；第6,565,883号；第6,482,440号；第6,403,597号；第6,319,919号；第6,150,354号；第6,080,736号；第5,672,356号；第5,472,704号；第5,445,829号；第5,312,817号、および第5,296,483号に記載されたものが含まれる。当業者は、その他の適用可能な徐放性製剤を容易に認識するであろう。
【００６４】
経口投与のため、プロストラチンもしくはプロストラチン類似体またはその塩もしくは異性体（および、任意で、第2の治療剤、例えば、本明細書に記載される化学療法剤）を、当技術分野において周知の薬学的に許容される担体と組み合わせることによって、容易に製剤化することができる。そのような担体は、処置される患者による経口摂取のため、化合物を、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、乳剤、親油性および親水性の懸濁剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤等として製剤化することを可能にする。経口使用のための薬学的調製物は、化合物を固体の賦形剤と混合し、任意で、得られた混合物を破砕し、錠剤または糖衣錠コアを入手するため、所望により、適当な助剤を添加した後、顆粒の混合物を処理することによって入手することができる。適当な賦形剤には、例えば、乳糖、ショ糖、マンニトール、もしくはソルビトールを含む糖のような増量剤；例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、イネデンプン、ジャガイモデンプンのようなセルロース調製物、ゼラチン、トラガントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリドン（PVP）が含まれる。所望により、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウムのようなその塩のような崩壊剤を添加することができる。
【００６５】
プロストラチンもしくはプロストラチン類似体またはその塩もしくは異性体（および、任意で、第2の治療剤、例えば、本明細書に記載される化学療法剤）を、注射、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与のために製剤化することができる。注射のため、化合物は、植物油またはその他の類似した油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸またはプロピレングリコールのエステルのような水性または非水性の溶媒において、所望により、可溶化剤、等張剤、懸濁化剤、乳化剤、安定剤、および保存剤のような従来の添加剤と共に、それらを溶解させるか、懸濁させるか、または乳化することによって、調製物へ製剤化され得る。いくつかの態様において、化合物は、水性溶液、好ましくは、ハンクス液、リンゲル液、または緩衝生理食塩水のような生理学的に適合性の緩衝液において製剤化され得る。注射用の製剤は、単位剤形、例えば、アンプルで、または保存剤が添加された多用量容器で提示され得る。組成物は、油性または水性の媒体による懸濁液、溶液、または乳濁液のような形態をとることができ、懸濁化剤、安定剤、および／または分散剤のような製剤化のための薬剤を含有していてよい。
【００６６】
プロストラチンもしくはプロストラチン類似体またはその塩もしくは異性体（および、任意で、第2の治療剤、例えば、本明細書に記載される化学療法剤）は、経粘膜的または経皮的な手段によって全身投与され得る。経粘膜的または経皮的な投与のため、透過すべき関門にとって適切な浸透剤が製剤中に使用される。局所投与のため、薬剤は、軟膏剤、クリーム剤、膏薬、散剤、およびゲル剤へ製剤化される。一つの態様において、経皮送達剤はDMSOであり得る。経皮送達系には、例えば、パッチ剤が含まれ得る。経粘膜投与のため、透過すべき関門にとって適切な浸透剤が製剤中に使用される。そのような浸透剤は、当技術分野において一般に公知である。例示的な経皮送達製剤には、各々、参照によって本明細書に組み入れられる、米国特許第6,589,549号；第6,544,548号；第6,517,864号；第6,512,010号；第6,465,006号；第6,379,696号；第6,312,717号、および第6,310,177号に記載されたものが含まれる。
【００６７】
いくつかの態様において、薬学的組成物は、許容される担体および／または賦形剤を含む。薬学的に許容される担体には、生理学的に適合性であり、好ましくは、治療剤の活性に干渉せずその他の方法でも阻害しない任意の溶媒、分散媒、またはコーティングが含まれる。いくつかの態様において、担体は、静脈内投与、筋肉内投与、経口投与、腹腔内投与、経皮投与、局所投与、または皮下投与のために適当である。薬学的に許容される担体は、例えば、組成物を安定化するため、または活性薬剤の吸収を増加させるかもしくは減少させるために作用する1種以上の生理学的に許容される化合物を含有することができる。生理学的に許容される化合物には、例えば、グルコース、ショ糖、もしくはデキストランのような炭水化物、アスコルビン酸もしくはグルタチオンのような抗酸化剤、キレート剤、低分子量タンパク質、活性薬剤の除去もしくは加水分解を低下させる組成物、または賦形剤もしくはその他の安定剤および／もしくは緩衝剤が含まれ得る。その他の薬学的に許容される担体およびそれらの製剤は、周知であり、例えば、Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21st Edition,Philadelphia,PA.Lippincott Williams & Wilkins,2005に一般に記載されている。様々な薬学的に許容される賦形剤が、当技術分野において周知であり、例えば、Handbook of Pharmaceutical Excipients(5th ed.,Ed.Rowe et al.,Pharmaceutical Press,Washington,D.C.)に見出され得る。
【００６８】
いくつかの態様において、癌（例えば、野生型K-Rasまたは変異型K-Rasが発現されるかまたは過剰発現される癌）を有する対象への投与において使用するためのキットが提供される。いくつかの態様において、キットは、プロストラチンもしくはプロストラチン類似体またはその塩もしくは異性体；および第2の治療剤を含む。
【００６９】
いくつかの態様において、プロストラチンまたはプロストラチン類似体（またはそれらの塩もしくは異性体）は、前記セクションIIIに記載されたようなものである。いくつかの態様において、第2の治療剤は化学療法剤である。いくつかの態様において、化学療法剤は、アルキル化剤、アントラサイクリン、細胞骨格破壊剤、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、トポイソメラーゼの阻害剤、キナーゼ阻害剤、ヌクレオシド類似体もしくは前駆物質類似体、ペプチド抗生物質、白金に基づく薬剤、または植物アルカロイドである。いくつかの態様において、化学療法剤はヌクレオシド類似体である。いくつかの態様において、化学療法剤はゲムシタビンである。
【００７０】
いくつかの態様において、キットは、本発明の方法の実施のための指示（即ち、プロトコル）を含有している説明材料（例えば、癌を処置するためにキットを使用するための説明書）をさらに含むことができる。説明材料には、典型的には、文書または印刷物が含まれるが、これらに限定されない。そのような説明を記憶することができ、エンドユーザに伝達することができる任意の媒体が、本発明によって企図される。そのような媒体には、電子的な記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えば、CD ROM）等が含まれるが、これらに限定されない。そのような媒体には、そのような説明材料を提供するインターネットサイトのアドレスが含まれ得る。
【実施例】
【００７１】
V.実施例
以下の実施例は、特許請求の範囲に記載された本発明を例示するために提示されるのであって、限定するために提示されるのではない。
【００７２】
実施例1：K-Rasは非標準Wntシグナリングの抑制を通して腫瘍形成性を促進する
導入
Rasスーパーファミリーの低分子量GTPアーゼは、複数のシグナリング経路の重大な成分である。Rasサブファミリーの3種の標準メンバー、H-Ras、N-Ras、およびK-Rasは、ヒト腫瘍において高頻度に変異しており、遺伝子発現、細胞周期進行、およびアポトーシスの回避のような多数の細胞過程を妨害する(Giehl,Biol Chem 386:193-205,2005)。過去30年間の広範な研究は、悪性形質転換、腫瘍開始、ならびに腫瘍の進行および転移の駆動因子としてRasタンパク質を確立し、腫瘍形成性Rasが高度に魅力的な治療標的であることを示唆した（Stephen et al.,Cancer Cell 25:272-281,2014）。未解決の疑問は、H-Rasタンパク質、N-Rasタンパク質、およびK-Rasタンパク質が、生理学的過程および病理学的過程において独特の役割を果たすのかそれとも重複性の役割を果たすのかである。高度の配列相同性ならびにオーバーラップしている上流活性化因子および下流エフェクターのため、これらの3種のRasアイソフォームは、機能的に重複していると長い間考えられてきた。しかしながら、これらのRasアイソフォームが別個の生物学的特性も有することを示唆する証拠が増加しつつある。第1に、トランスジェニック動物において、3種のRas遺伝子座の各々の遺伝学的異常は、劇的に異なる表現型をもたらす。K-Ras4B欠損は、胚致死をもたらすが、N-Ras、H-Ras、およびK-Ras4Aのノックアウトマウスは、明らかな異常を示さない（Johnson et al.,Genes Dev.11:2468-2481,1997；Koera et al.,Oncogene 15:1151-1159,1997；Malumbres and Barbacid,Nat RevCancer 3:459-465,2003）。しかしながら、K-Rasのこの独特の生物学的表現型が、遺伝子産物の特異的な機能によって引き起こされるのか、それとも別個の発現パターンによって引き起こされるのかは未だ決定されていない(Esteban et al.,Mol.Cell Biol 21:1444-1452,2001)。第2に、H-Ras、N-Ras、またはK-Rasの活性化変異は、全てのヒト腫瘍の20％〜30％に見出されているが、著しい組織特異性の程度を示す。急性白血病において、N-Ras変異は高頻度であるが、H-RasおよびK-Rasの変異は希少である(Sakamoto et al.,Hum Pathol 32:1225-1231,2001)。反対に、膵臓癌(90％)、結腸直腸癌(50％)、および肺癌(35％)においては、腫瘍形成性K-Ras変異が、高頻度に存在し、N-RasおよびH-Rasの変異は極めて稀である(Prior et al.,Cancer Res.72:2457-2467,2012)。
【００７３】
K-Ras4Bは胚発生にとって不可欠であるが、N-Ras、H-Ras、またはK-Ras4Aはそうでないことから、K-Ras4Bは胚性幹細胞(ESC)において致命的な独特の役割を果たす可能性がある。実際、Myc、ノッチシグナリング、およびWntシグナリングのような数種の胚遺伝子およびシグナリング経路が、正常ESCおよび癌細胞の腫瘍開始の両方において、オーバーラップする制御的な役割を有することが示されている（Harris et al.,Expert Opin Ther Targets 16:131-145,2012）。従って、興味をそそることに、腫瘍形成性K-Rasが、幹細胞様特徴である腫瘍開始の誘導において、重大であるが、以前には未知であった役割を果たし、これらの特徴が、K-RAS変異腫瘍の侵襲性に寄与するという可能性がある。
【００７４】
Rasタンパク質のうち、K-Rasは最も高頻度に変異しており、従って、特に、有効な治療が存在しない膵臓癌において、癌治療のための魅力的な標的である。しかしながら、K-Rasは治療標的として極めて興味深いにも関わらず、K-Rasの機能を直接阻止し、前臨床モデルにおいて効力を示す低分子阻害剤の開発は未だに成功していない（Downward,Nat RevCancer 3:11-22,2003；Karnoub and Weinberg,Nat Rev Mol Cell Biol 9:517-531,2008；Stephen et al.,2014）。本研究において、本発明者らは、腫瘍形成性K-Rasが、非標準Wnt/Ca2+シグナリングのダウンレギュレーションおよびFzd8発現の抑止を通して、腫瘍形成表現型を誘発するという証拠を提供する。これは、H-Ras形質転換細胞においては観察されず、従って、K-Rasについての真のアイソフォーム特異的な役割が確立された。カルモジュリン（CaM）の、H-Rasではなく、K-Ras（具体的には、4Bアイソフォーム）との結合が、この主要な差の原因であるようである：CaMのK-Rasとの結合は、Wnt/Ca2+シグナリング経路の主要下流エフェクターであるCaM依存性キナーゼII（CaMKii）の活性を低下させ、Fzd8発現の低下をもたらす。Fzd8によって媒介されるWnt/Ca2+シグナリングのFzd8発現の増加による回復、またはK-RasのCaMとの結合の防止は、K-Rasによって媒介される腫瘍形成性を損ない、この「新薬の開発につながらない」タンパク質を阻害するための可能性のある新規の道を提供した。実際、CaMからのK-Rasの解離を促進する天然生成物プロストラチンによるマウスの処理は、K-RasG12Vによって特異的に駆動された膵臓癌モデルおよび乳頭腫において、腫瘍の形成および成長を抑制したが、H-RasG12Vについてはそうでなかった。
【００７５】
K-RasV12およびH-RasV12は比較可能な標準MAPKシグナリングおよびAktシグナリングにも関わらず腫瘍形成の開始において異なる
K-RasおよびH-Rasの別個の特性を解明するため、本発明者らは、同質遺伝子NIH/3T3細胞においてサイトメガロウイルスプロモーターの調節下で、腫瘍形成性のH-RasおよびK-Rasを発現させ、これらの2種の癌遺伝子を有する細胞の間の表現型の差を調査した。H-RasV12形質転換NIH/3T3細胞およびK-RasV12形質転換NIH/3T3細胞の両方が、形質転換を示す類似した形態学的変化を示した（示されないデータ）。GTP結合型Rasは、多数の下流エフェクターに結合しそれらを活性化し、Ras-GTPのレベルは、C-RafまたはRalGDSのRas結合ドメイン（RBD）によるRas-GTPの免疫共沈降によって測定され得る（Santarpia et al.,Expert Opin Ther Targets 16:103-119,2012）。H-RasV12形質転換細胞およびK-RasV12形質転換細胞は、C-Raf-RBDプルダウンアッセイおよびRalGDS-RBDプルダウンアッセイによって明らかにされたように、GTP負荷Rasの比較可能なレベルを有し（図1A）、培養条件における血清の存在に関わらず（図1B；図8A）、リン酸化されたErk1/2およびAktの類似したレベルを示した（図1B）。さらに、Aktのビオチン化ペプチド基質を利用したELISAに基づくアッセイは、H-RasV12形質転換NIH/3T3細胞およびK-RasV12形質転換NIH/3T3細胞が、類似したAktキナーゼ活性を有し、それらの両方が、ベクター対照細胞と比較した時、上昇していることを確認した（図8B）。総合すると、これらのデータは、RasV12形質転換細胞が、活性型のH-RasおよびK-Rasの類似したレベル、ならびに標準下流シグナリング経路の活性化の比較可能なレベルを含有することを示唆する。
【００７６】
次に、本発明者らは、RasV12形質転換細胞がインビトロで単細胞レベルで幹細胞様特質および自己再生能を示すか否かを調査した。インビトロの幹細胞性または自己再生の一つの尺度は、スフィア形成、およびその後の2D培養において細胞の指数関数的成長を再現するスフィアの能力である（Fang et al.,Cancer Res 65:9328-9337,2005；Fujii et al.,Int J Oncol 34:1381-1386,2009；Gou et al.,Pancreas 34:429-435,2007；Ponti et al,Cancer Res.65:5506-5511,2005；Singh et al.,Cancer Res.63:5821-5828,2003）。播種される細胞の数を限定すると、K-RasV12形質転換NIH/3T3細胞は、H-RasV12形質転換およびベクター対照と比較した時、有意に増加したスフィア形成効率を示した（図1C）。再コロニー形成は、H-RasV12形質転換細胞由来のスフィアの低下した生存度および再コロニー形成効率とは対照的に、K-RasV12形質転換NIH/3T3細胞由来のスフィアが、生存可能であり、2D培養において指数関数的に成長する細胞を再開させ得ることを明らかにした（図8C）。低密度で播種された時、H-RasV12形質転換細胞は実際にK-Ras形質転換細胞より高いDNA合成の速度を有していたため、K-RasV12形質転換NIH/3T3細胞の増加したスフィア形成効率は、より高い増殖速度によるものではなかった（示されないデータ）。
【００７７】
本発明者らは、次に、インビボで限定連続（limited and serial）移植を使用してK-RasV12形質転換NIH/3T3細胞の腫瘍形成可能性を評価した（Clarke et al.,Cancer Res.66:9339-9344,2006）。H-RasV12形質転換NIH/3T3細胞またはK-RasV12形質転換NIH/3T3細胞をマウスに皮下注射し、無腫瘍生存を決定した。1,000個の細胞を生着させた時、H-RasV12腫瘍およびK-RasV12腫瘍は類似した率で発生した。しかしながら、生着させる細胞の数を100個へ低下させた時、K-RasV12形質転換細胞は、H-RasV12細胞と比較した時、有意に増強された腫瘍開始率を示した（図1D、左パネル）。インビボでの再生能力をさらに調査するため、本発明者らは、（1,000個の生着細胞によって開始された）原発腫瘍から単離された細胞を、レシピエントマウスの第2のコホートへ再移植した。500個のNIH/3T3-K-RasV12細胞の注射によって、10回の注射は、全て、腫瘍を生じさせた。対照的に、H-RasV12細胞の10回の注射のうちの2回のみが、成功裡に腫瘍を開始した（図1D、右パネル）。従って、K-RasV12形質転換NIH/3T3細胞は、H-RasV12形質転換細胞と比較した時、増加した腫瘍開始頻度および上昇した腫瘍形成再現能力をインビボで示した。
【００７８】
ヒト癌において、異なるRasアイソフォームの活性化変異は、高度に組織特異的に存在するが（Hezel et al.,Genes Dev.20:1218-1249,2006）、これらの差が各アイソフォームの別個の特性を反映するか否かは不明である。K-RasおよびH-Rasが腫瘍形成性の誘導において別個の役割を果たすか否かを調査するため、本発明者らは、野生型のH-RasおよびK-Rasを発現する膵臓癌細胞株であるBxPC3細胞において、悪性の制御におけるH-RasおよびK-Rasの役割を調査した。EGFによるBxPC3細胞の刺激は、MAPKシグナリング経路を活性化し、スフィア形成効率を有意に増加させた（図1Eおよび図8D）。K-Rasのノックダウンは、EGFによって刺激されるスフィア形成効率を有意に低下させ、開始されたスフィアのサイズを低下させたが、H-Rasについてはそうでなく、このことから、K-Rasがヒト膵臓癌細胞の悪性に寄与し得る独特の特性を有するという概念が支持された（図1Fおよび図8E〜F）。
【００７９】
本発明者らは、次に、ヒト膵臓腫瘍細胞の腫瘍形成特性の維持のために腫瘍形成性K-Rasが必要とされるか否かを決定した。PANC2.13細胞株およびPANC1細胞株は、異なる変異を保有し、K-Rasに対する異なる依存性を示す。両方の細胞株は、shRNAによるK-Rasのノックダウンによって分化形態学を示した（図8G）。細胞表面抗原CD44およびCD24の発現は、膵臓癌患者において不良の臨床診断と高度に相関することが示されている（Ohara et al.,Cancer Sci 104:1127-1134,2013）。PANC2.13細胞およびPANC1細胞における腫瘍形成性K-Rasの枯渇は、CD44およびCD24の発現を著しく低下させた（図9H〜I）。K-Rasが枯渇したPANC2.13細胞は、インビトロの再コロニー形成可能性を有するスフィアを形成する能力の有意な低下を示し（図1Gおよび図9J）、このことから、悪性に関する表現型の維持におけるK-Rasの重大な役割が再び示唆された。
【００８０】
PANC1は、K-Ras非依存性の細胞株として従来記載されている（Scholl et al.,Cell 137:821-834,2009；Singh et al.,Cancer Cell 15:489-500,2009；Wei et al.,Cancer Lett 322:58-69,2012）。これらの報告と一致して、K-Rasノックダウンは、細胞増殖を遅くしたが、2Dで成長するPANC1細胞の生存度には影響を与えなかった（示されないデータ）。しかしながら、本発明者らは、限定された数の移植細胞を使用すると、K-Rasノックダウンが、対照PANC1細胞と比較した時、腫瘍開始率を有意に低下させることを見出した（図1H）。これらのデータは、腫瘍形成性K-Rasが、ヒト膵臓癌細胞株における腫瘍形成表現型を媒介し、その機能が、2D培養における細胞の生存度および増殖の維持における役割とは別個のようであることを示唆している。
【００８１】
K-Rasはフリズルド（Frizzled）8およびCaMKii活性を抑制する
次に、本発明者らは、標準Rasシグナリングの比較可能なレベルにも関わらず、K-RasがH-Rasよりはるかに効率的に腫瘍形成性を促進する基礎となる機序を調査しようと努力した。K-Ras4Bは、遺伝学的に操作された動物モデルにおける胚発生のために不可欠であるが、N-Ras、H-Ras、またはK-Ras4Aはそうでない（Johnson et al.,Genes Dev.11:2468-2481,1997；Koera et al.,Oncogene 15:1151-1159,1997；Malumbres and Barbacid,Nat RevCancer 3:459-465,2003）。さらに、K-Ras(4B)V12は、増殖および幹細胞性を維持しつつ、マウス胚性癌幹細胞においてレチノイン酸によって誘導される分化を防止するが、H-RasV12またはN-RasV12はそうでない（Quinlan et al.,Mol Cell Biol 28:2659-2674,2008）。従って、K-Ras4Bは、胚性幹細胞（ESC）において致命的な独特の役割を果たす可能性がある。シグナリングに焦点を置いたPCRアレイ（SABioscience、PAMM047A）を、H-RasまたはK-Rasによって媒介される幹細胞関連遺伝子をプロファイリングするために使用した（図2A；下記の表1および表2）。H-RasV12形質転換NIH/3T3細胞とK-RasV12形質転換NIH/3T3細胞との間で発現が4倍を超えて変化する3種のマウス幹細胞シグナリング関連遺伝子が同定された（図2B;下記の表3）。骨髄タンパク質受容体1B型（bmpr1b）は、K-RasV12形質転換細胞においてアップレギュレートされており、Gli2およびフリズルド8（Fzd8）は、NIH/3T3-K-RasV12細胞において有意にダウンレギュレートされていた。本発明者らは、低い内在性発現レベルのため、bmpr1bを探究しないことに決め、N末端リプレッサードメインがマウスと比較した時にヒトにおいて短縮されており、これらの2つの種における異なる役割が示唆されるため、Gli2も探究しないことに決めた（Sasaki et al.,Development 126:3915-3924,1999）。
【００８２】
（表１）H-Ras形質転換NIH/3T3細胞についてのqPCRアレイの品質管理
2017527583.tif 000007
【００８３】
（表２）K-Ras形質転換NIH/3T3細胞についてのqPCRアレイの品質管理
2017527583.tif 000008
【００８４】
（表３）H-RasV12形質転換NIH/3T3細胞およびK-RasV12形質転換NIH/3T3細胞のqPCRアレイにおける遺伝子のレイアウトおよび遺伝子の発現変化
2017527583.tif 000009
【００８５】
7回膜貫通型Gタンパク質共役型受容体であるフリズルド 8（Fzd8）は、Wnt/βカテニンシグナリング経路の制御に関与するフリズルド遺伝子ファミリーのメンバーである。10種のフリズルドファミリーメンバーのうち、Fzd1、Fzd4、およびFzd10は、Wnt/βカテニン経路の活性化因子として同定されている（Lhomond et al.,Development 139:816-825,2012；Nagayama et al.,Cancer Sci 100:405-412,2009）。最近、Fzd8は、造血幹細胞の静止状態を維持する非標準Wnt/Ca2+シグナリングの主要メディエーターとして報告された（Sugimura et al.,Cell 150:351-365,2012）。CaMKiiおよび転写因子NF-ATの活性化を伴う非標準Wnt/Ca2+経路は、βカテニン/TCFシグナリングを阻害する（Saneyoshi et al.,Nature 417:295-299,2002；Semenov et al.,Cell 131:1378,2007；Sugimura and Li.,Birth Defects Res C Embryo Today 90:243-256,2010）。従って、本発明者らは、腫瘍形成性K-Ras形質転換細胞におけるFzd8のダウンレギュレーションが、非標準Wnt/Ca2+シグナリングの抑止およびその後のβカテニン/TCF活性の活性化をもたらすか否かを決定した。
【００８６】
ウエスタンブロット分析は、Fzd8が、H-RasV12形質転換細胞およびベクター対照と比較して、K-RasV12形質転換NIH/3T3細胞においてダウンレギュレートされていることを確認した（図2C）。K-RasV12形質転換細胞は、Thr286における自己リン酸化の減少によって示されるように、活性化されたCaMKiiの強烈に低下したレベルも有していた（図2C）。活性型NF-ATの遺伝子産物は、ディシブルド（disheveled）によって媒介されるGSK3β抑止を阻害し、βカテニンのリン酸化、サイトゾル蓄積、および分解をもたらす（Saneyoshi et al.,Nature 417:295-299,2002）。細胞分画分析は、NF-ATの活性化および核移行が、ベクター対照およびNIH/3T3H-RasV12細胞と比較して、NIH/3T3-K-RasV12細胞において低下していることを明らかにした（図2C）。ウエスタンブロット分析は、これらの細胞において、βカテニンのリン酸化型が低下していることをさらに示唆した（図2C）。興味深いことに、腫瘍形成性K-Rasによって駆動されたマウスPDAC（mPDAC）から単離された腫瘍細胞は、腫瘍形成性B-Rafによって誘導されたmPDACと比較した時、低下したFzd8発現および抑止されたホスホCaMKiiのレベルも示した（図2C）。
【００８７】
CaMKii経路の活性化も、βカテニンとTCFとの相互作用を阻止し、従って、βカテニン依存性の転写を阻害することによって、標準Wntシグナリングを抑制する（Semenov et al.,Cell 131:1378,2007；Sugimura and Li.,Birth Defects Res C Embryo Today 90:243-256,2010）。免疫共沈降は、CaMKiiがほとんどリン酸化されていないK-RasV12形質転換NIH3T3細胞が、CaMKii活性が上昇しているH-RasV12形質転換細胞と比較した時、βカテニンとTCF4との間の相互作用の増加を示すことを示した（図2D）。さらに、NIH/3T3-K-RasV12細胞におけるCaMKiiおよびNF-ATの活性化の低下は、βカテニンの核移行の増加をもたらしたが、CaMKiiおよびNF-ATが高度に活性化されているベクター対照およびNIH/3T3-H-RasV12細胞においては、核βカテニンがほとんど検出不可能であった（図2C）。B-Rafmtによって誘導されたマウスmPDACと比較して、変異K-Rasを保有する腫瘍細胞は、増加したβカテニン-TCF4相互作用を示した（図2D）。TOPFlashアッセイは、ベクターおよびNIH/3T3H-RasV12細胞と比較した時、βカテニンの転写活性が、NIH/3T3-K-RasV12細胞において大きく上昇していることをさらに確認した（図2E）。結果として、βカテニン標的遺伝子、c-MycおよびTCF1のmRNA発現は、ベクター対照またはH-RasV12形質転換細胞と比較して、K-RasV12形質転換細胞においてアップレギュレートされていた（図9A）。
【００８８】
変異／腫瘍形成性Rasによって駆動されるシグナリング活性および腫瘍形成性は、野生型Rasアイソフォームと無関係であると長い間考えられていた。しかしながら、腫瘍形成性K-Rasの生物学的アウトプットが野生型Rasタンパク質依存性のモジュレーションを受けることを示唆する証拠が増えつつある（Grabocka et al.,Cancer Cell 25:243-256,2014；Young et al.,Cancer Discov 3:112-123,2013）。野生型Ras対立遺伝子の存在が、腫瘍形成性K-Rasによって別個に媒介されるFzd8-CaMKiiシグナリング経路に影響を与えるか否かを決定するため、本発明者らは、Rasタンパク質を欠くマウス胚性繊維芽細胞（MEF）（H-Ras-/-；N-Ras-/-、かつK-Raslox/lox）（Drosten et al.,EMBO J 29:1091-1104,2010）において、N-RasV12、H-RasV12、またはK-RasV12を発現させた。図9Bに示されるように、K-Ras(4B)V12のみを発現する「Ras欠損」MEFは、H-RasV12のみを発現する細胞より低いFzd8およびホスホCaMKiiの発現を示した。興味深いことに、インビボ限定移植アッセイは、Ras-/-MEF-K-Ras(4B)V12が、Ras-/-MEF-H-RasV12より高い頻度で腫瘍形成を開始することを示唆した（図9C）。さらに、Ras-/-MEF-K-Ras(4B)V12由来の腫瘍は、Ras-/-MEF-H-RasV12によって開始された腫瘍より有意に高い成長速度を示した（図9D）。総合すると、NIH/3T3および救済されたRas欠損細胞における本発明者らのデータは、野生型Rasタンパク質が存在するか否かに関わらず、K-RasとH-Rasとが、腫瘍形成性においても、非標準Wnt/Ca2+シグナリング経路を通したシグナリングにおいても明解に異なることを示唆している。
【００８９】
次に、本発明者らは、H-RasまたはK-Rasによって駆動された腫瘍において非標準Wnt/Ca2+シグナリングが異なるか否かを問うた。これを行うため、本発明者らは、野生型マウス由来の腫瘍を、内在性H-Rasを欠くが、内在性K-Ras遺伝子座へノックインされた野生型H-Rasを発現する遺伝学的に操作されたマウスモデル由来の腫瘍と比較した。次いで、DMBA/TPAによる局所処理によって、腫瘍形成およびK-RasまたはH-Rasの変異を誘導した。このモデルは、同一の細胞バックグラウンドにおける同一の内在性制御要素の調節下でのK-Ras癌遺伝子およびH-Ras癌遺伝子の等しい比較を可能にする（Potenza et al.,EMBO Rep 6:432-437,2005；To et al.,Nat Genet 40:1240-1244,2008）。興味をそそることに、このモデルにおいて、変異H-Rasによって駆動された皮膚腫瘍は、K-Ras変異を有する皮膚腫瘍と比較した時、上昇したFzd8タンパク質のレベルおよび増加したリン酸化CaMKiiのレベルを有していた（図2G）。データは、さらに、この独特のK-Rasによって媒介されるシグナリングが、K-Ras遺伝子座にノックインされた時ですら、H-Rasによっては再現され得ないことを示唆している。
【００９０】
異なる下流エフェクターにも関わらず、活性型の標準Wntシグナル伝達カスケードおよび非標準Wntシグナル伝達カスケードは、共通して、フリズルド受容体のWntリガンドとの結合によって制御される。Wnt/βカテニン/TCFシグナリング伝達を好ましくは活性化するWNT3aのような他のWNTファミリーメンバーとは異なり、WNT5aは、古典的な非標準Wntシグナリング経路活性化因子である（Weekes and Winn,Cancers 3:3676-3686,2011）。腫瘍形成性のH-RasおよびK-Rasの区別可能なWnt/Ca2+シグナリング活性のモジュレーションに、異なるWNTリガンドが関与するか否かを評価するため、本発明者らは、RasV12形質転換NIH/3T3細胞におけるWNT-5aおよびWNT-3aの発現レベルおよび機能をさらに評価した。図9Eに示されるように、腫瘍形成性RasV12形質転換細胞は、対照細胞より多くのWNT-3aタンパク質およびWNT-5aタンパク質を発現したが、H-RasV12とK-RasV12との間に発現レベルの明瞭な差は存在しなかった。さらに、WNTリガンドの付加的な存在は、H-RasV12形質転換細胞またはK-RasV12形質転換細胞において、CaMKii活性、βカテニン/TCF/LEF転写活性、およびスフィア形成効率を改変しなかった（図9F〜H）。データは、非標準Wnt/Ca2+シグナリングにおけるH-RasとK-Rasとの間の実質的な違いが、WNTリガンドの存在に依存性でないことを示唆している。
【００９１】
腫瘍形成性K-Rasは、NIH/3T3細胞においてFzd8発現の抑制およびCaMKiiリン酸化の減少をもたらしたため、本発明者らは、次に、癌由来細胞株におけるFzd8に対する腫瘍形成性K-Rasのノックダウンの効果を決定した。ヒト膵臓癌細胞において、K-Rasノックダウンは、ヒト膵臓癌細胞株において、Fzd8発現を増加させ、CaMKiiのリン酸化を増加させた（図2H）。K-Ras発現がノックダウンされた時、PANC2.13細胞は、TOPFlashアッセイによって評価されたように、有意に低下したβカテニン活性を示した（図2I）。上記の結果に基づき、本発明者らは、腫瘍形成性K-Rasは、マウスおよびヒトの癌細胞において、Wnt/Ca2+経路の主要なエフェクターであるFzd8発現およびCaMKii活性を抑止するが、H-Rasはそうでないとの結論を下す。
【００９２】
ここで、本発明者らは、K-RasV12形質転換細胞および腫瘍形成性K-Rasを含有している膵臓癌細胞において、標準Wnt/βカテニンシグナリング経路の活性が、Fzd8によって媒介される非標準Wnt/Ca2+経路によってモジュレートされることを報告する。しかしながら、標準Wnt/βカテニン活性に関与する遺伝子の変異が、多くの型の癌において存在する。症例のおよそ50％においてK-Ras変異が存在する結腸直腸癌においては、Wnt/βカテニンシグナリング経路の変異が、一般的には、APC（大腸腺腫症）遺伝子を不活化する変異を通して、主要な開始駆動因子として作用する。従って、本発明者らは、APC喪失／変異のため、K-Rasに関連した悪性特色が、結腸直腸癌細胞におけるFzd8ダウンレギュレーションおよび幹細胞性と無関係になるか否かを調査しようと努力した。K-Rasのノックダウンは、野生型APCまたは変異APCの状態に関わらず、複数の結腸癌細胞株において、Fzd8の発現およびNF-ATまたはCaMKiiの活性化を促進した（図10A）。本発明者らのモデルから予想される通り、K-Rasのノックダウンは、野生型βカテニンを発現するSW480（変異APC）においてはβカテニン/TCF/LEF転写活性を有意に抑止したが、βカテニンの機能獲得型変異を有するHCT15（変異APC）またはHCT116（野生型APC）の両方においてはそうでなかった（図10B）。shRNAによるK-Ras発現の抑止は、HCT15細胞およびHCT116細胞においてβカテニン/TCF/LEF転写活性を改変しなかったが、3D培養におけるスフィア形成能を阻害した（図10C）。しかしながら、BrdU取り込みによって示される細胞増殖速度は、K-Rasノックダウンによって、HCT15およびHCT116において阻害されなかった（図10D）。この結果は、K-Rasによって媒介される悪性は標準Wnt/βカテニン/TCF/LEF転写活性に依存しないのかという興味深い疑問をもたらした。
【００９３】
この疑問に取り組むため、本発明者らは、腫瘍形成性のH-RasV12またはK-RasV12によって形質転換されたNIH/3T3細胞を、一連のタンキラーゼ阻害剤、JW55、JW67、およびカルジオノーゲン（cardionogen）1によって処理した。JW55およびJW67は、βカテニンを直接分解することによって標準Wnt/βカテニンシグナリング経路の強力な阻害剤として機能し、カルジオノーゲン1は、Wnt/βカテニン/TCF/LEFの転写活性を阻害する。TOPFlashアッセイは、タンキラーゼ阻害剤がRasV12形質転換細胞においてβカテニン/TCF/LEF転写活性を成功裡に抑止することを明らかにした（図10E）。しかしながら、抑止されたβカテニン機能は、3D培養における成長に相応じて影響を与えることはなく：K-RasV12形質転換細胞は、JW55、JW67、またはカルジオノーゲン1の存在下でスフィア形成効率を未だ維持していたが、これらの化合物は、ベクター対照またはH-RasV12形質転換NIH/3T3においてはスフィア形成を阻害した（図10F）。データは、野生型βカテニンを有する細胞における非標準Wnt/Ca2+シグナリング活性のリードアウトとしてβカテニン/TCF/LEF転写活性の変化が使用されたという事実にも関わらず、K-Rasによって駆動される悪性がWnt/βカテニンシグナリング経路の機能に依存しないことを示唆している。
【００９４】
CaMKiiの阻害はH-RasV12細胞によるスフィア形成を増強する
K-Ras形質転換細胞において観察されたWnt/Ca2+シグナリング経路の抑制が、幹細胞様特性の獲得の原因であるか否かを決定するため、本発明者らは、選択的なCaMKii阻害剤であるKN-93によってNIH/3T3-H-RasV12細胞およびベクター対照細胞を処理した（図3A）。処理は、CaMKiiのリン酸化を低下させた（図3B）。際だったことに、KN-93は、NIH/3T3-H-RasV12細胞において、Fzd8発現も低下させ（図3B）、βカテニン転写活性も増加させ、このことから、標準Wnt経路に対するWnt/Ca2+/CaMKiiシグナリングの阻害効果が確認された（図3C）。さらに、KN-93処理は、NIH/3T3H-RasV12細胞におけるスフィア形成効率および球状コロニーのサイズを劇的に増強し（図3D）、このことから、CaMKii活性のダウンレギュレーションがK-Ras形質転換細胞において観察された悪性特色の誘導にとって不可欠であることが示唆された。
【００９５】
Fzd8のノックダウンはH-RasV12細胞における腫瘍形成性を誘導する
Wnt/Ca2+シグナリングにおけるFzd8の役割をさらに決定するため、本発明者らは、NIH/3T3-H-RasV12細胞において、shRNAによってFzd8をノックダウンした（図3A＆E）。低下したホスホCaMKiiレベルおよび増強されたβカテニン活性が観察された（図3E〜F）。NIH/3T3-H-RasV12細胞におけるFzd8ノックダウンによって、再コロニー形成能力を有するスフィアのインビトロ形成も増強された（図3G）。重要なことに、限定移植アッセイにおいて、50個のNIH/3T3-H-RasV12shFzd8細胞を皮下注射されたマウスは、Fzd8を発現する親対照細胞と比較した時、有意に低下した無腫瘍生存を示した（図3H）。従って、Fzd8発現の抑制およびその後のWnt/Ca2+経路の抑止は、H-RasV12形質転換NIH/3T3細胞における腫瘍開始を増強し、腫瘍形成性K-Rasの効果を表現型模写する。
【００９６】
K-Rasによって駆動される癌におけるFzd8の役割
次に、本発明者らは、NIH/3T3-K-RasV12細胞が腫瘍形成を開始するためにFzd8のダウンレギュレーションが必要とされるか否かを試験した。NIH/3T3-K-RasV12細胞におけるFzd8発現の回復は、リン酸化CaMKiiのレベルを増強し、細胞増殖を低下させ、βカテニン活性を低下させた（図4A〜B）。さらに、Fzd8の回復は、NIH/3T3-K-RasV12細胞におけるインビトロスフィア形成効率、および連続継代後の再現能力を有意に低下させた（図4C）。Fzd8過剰発現は、50個のNIH3T3-K-RasV12細胞が皮下注射されたヌードマウスにおいて腫瘍形成を完全に消失させたが、対照細胞は高いインビボ腫瘍開始率を未だ維持していた（9/10） （図4D）。
【００９７】
興味深いことに、外因的に添加されたWNT3aまたはWNT5aのリガンドは、NIH3T3-K-RasV12細胞においてFzd8の過剰発現によって引き起こされるホスホCaMKiiの増加およびβカテニン活性の阻害に影響を与えなかった（図11A〜B）。これらのデータは、Fzd8過剰発現の結果として改変されたK-RasV12形質転換細胞におけるWnt/Ca2+シグナリング経路およびβカテニン活性が、標準Wnt経路または非標準Wnt経路のリガンドによって救済され得ないことを示唆する。
【００９８】
K-Ras依存性のヒト膵臓癌PANC2.13細胞においてFzd8を過剰発現させた時、ホスホCaMKiiのレベルの増加と同時に、CD44およびCD24の発現の低下が観察された（図11C）。対照細胞と比較した時、Fzd8を過剰発現するPANC2.13細胞は、抑止されたβカテニン/TCF転写活性と一致して、CCND-1、LEF1、およびc-Mycを含む複数のβカテニン標的遺伝子の有意なダウンレギュレーションを示した（図11D）。PANC1細胞におけるFzd8の過剰発現は、NF-AT転写活性の上昇、ルシフェラーゼレポーターアッセイによって査定されるようなβカテニンの活性の減少、ならびにCD44およびCD24の発現の低下をもたらした（図4Eおよび図11E）。興味深いことに、これらの膵臓癌株におけるFzd8の過剰発現は、分化様の形態学的変化を誘導し、K-Rasノックダウンによって観察されたものを表現型複写した（図11F）。さらに、対照群と比較した時、Fzd8の過剰発現を有するPANC1の皮下異種移植片を有するヌードマウスは、注射後90日まで増加した無腫瘍生存率を有した（図4F）。結果は、Wnt/Ca2+シグナリングを増強し、標準Wntシグナリングを抑制する、Fzd8発現の回復が、K-RasV12形質転換細胞または腫瘍形成性K-Rasを保有する膵臓腫瘍細胞による腫瘍形成を低下させることを確証する。
【００９９】
ヒトFzd8は、通常、脳、心臓、腎臓、骨格筋、および膵臓において発現される（Saitoh et al.,Int J Oncol 18:991-996,2001）。しかしながら、膵臓腫瘍の開始および進行の間のFzd8の発現パターンは調査されていない。4種の異なるヒト膵組織アレイ（BioMax、PAN241、PA242a、PA483b、およびT143）の免疫組織化学は、Fzd8発現が、正常な膵臓の腺房細胞および島細胞には多量に存在するが、悪性膵組織においては発現がしばしば失われていることを明らかにした（図4Gおよび図11G）。興味深いことに、組織アレイT143、B1、B2、B5、およびB6は、大部分が良性であり、K-Rasが稀にしか変異していない膵島細胞腫瘍においては、Fzd8発現の明瞭な低下が存在しないことを明らかにした（図11G）。さらに、Fzd8発現は、I期膵臓腺癌において強く抑止されており（図4G）、このことから、K-Rasの腫瘍形成性活性化が既に起こっている可能性が最も高い膵臓の発癌の初期に、Fzd8発現の抑制が起こることが示唆された。Hスコアリングは、Fzd8が、正常組織と比較した時、ヒト悪性膵臓標本において有意に抑止されていることを示す半定量分析をさらに提供した（図4H）。
【０１００】
ヒト膵組織におけるFzd8の発現をさらに確認するため、本発明者らは、新規のRNAインサイチューハイブリダイゼーション法であるRNAscopeを使用した。シグナルの増幅およびバックグラウンドの抑制を同時に行うための、新規のプローブ設計戦略およびハイブリダイゼーションに基づくシグナル増幅系の使用を通して、個々の細胞における一分子可視化が達成される（Wang et al.,J.Mol Diagn 14:22-29,2012）。図4Iに示されるように、正常な膵組織および癌隣接正常組織は、ヒトFzd8のためのプローブ（Advanced Cell Diagnostics）と特異的にハイブリダイズしたが、悪性膵組織は、RNAcopeインサイチューハイブリダイゼーションアッセイにおいてFzd8発現の検出を示さなかった。さらに、複数の発表されたマイクロアレイデータセットにおいてRNAレベルでヒトFzd8発現レベルを調査することを可能にするOncomineオンラインソフトウェア（Life Technologies）は、Fzd8が、ヒト膵管腺癌のみならず、乳癌、膠芽腫、および結腸癌を含む複数の型のヒト癌においても有意にダウンレギュレートされていることを示唆した（例えば、図11Hを参照すること）。
【０１０１】
K-Ras-CaM相互作用によってモジュレートされるWnt/Ca2+シグナリング
直接結合を通してCaMKiiを活性化するカルシウム結合メッセンジャータンパク質カルモジュリン（CaM）は、GTP結合型K-Ras4Bに優先的に結合し、H-Ras、N-Ras、またはK-Ras4Aには結合しない（Klee and Vanaman,Adv Protein Chem 35:213-321,1982；Schulman,Curr Opin Cell Biol 5:247-253,1993；Villalonga et al.,Mol Cell Biol 21:7345-7354,2001）。この結合は、CaMの細胞内局在を変化させ、従って、CaMKiiを活性化し、その後、非標準Wnt/Ca2+シグナリング経路を活性化するために利用可能なCaMのプールを低下させることができる。従って、本発明者らは、K-RasとCaMとの間の相互作用が、K-RasによるWnt/Ca2+シグナリングのダウンレギュレーションの原因であるか否かを決定しようと努力した。
【０１０２】
本発明者らは、K-RasV12は、CaMに結合し、それをカルシウム依存的に行うが、H-RasV12はそうでないことをまず確認した（図5A）。K-Rasの超可変領域がCaMとの相互作用にとって不可欠であり、K-Ras 4BのSer181のリン酸化は、この相互作用を消失させる（Lopez-Alcala et al.,J Biol Chem 283:10621-10631,2008；Villalonga et al.,Mol Cell Biol 21:7345-7354,2001）。本発明者らは、リン酸化を模倣するK-RasV12の変異型（S181D）またはリン酸化を受けることができない変異型（S181A）のいずれかをコードするレトロウイルス構築物を生成し、次いで、これらの変異体をNIH/3T3細胞へ導入した（図12A）。K-RasV12-S181Dは、NIH/3T3細胞においてCaMによって免疫共沈降しなかったが、野生型およびS181A変異体は、類似した条件の下でCaMとの相互作用を維持していた（図5B）。K-RasV12変異体、S181DおよびS181Aは、未だファルネシル化されており、細胞膜へ正確に輸送され、K-RasV12と比較した時、NIH/3T3細胞の形態学的な違いをもたらさなかった（図12Bおよび示されないデータ）。K-Ras-CaM相互作用が消失しており、ホスホCaMKiiのレベルが増加しているK-RasV12-S181D発現NIH/3T3細胞は、K-RasV12形質転換細胞またはK-RasV12-S181A形質転換細胞と比較して、Fzd8プロモーター活性ならびにmRNAレベルおよびタンパク質レベルでのFzd8の発現の著しい増加を有していた（図5C〜E）。興味深いことに、比較可能なレベルのK-Rasタンパク質発現およびホスホErkを示すにも関わらず、K-RasV12-S181D感染NIH/3T3細胞は、K-RasV12形質転換細胞またはK-RasV12-S181A形質転換細胞と比較した時、活性型CaMKiiのレベルの上昇を示した（図5E）。K-RasV12-S181D発現細胞は、Wnt/Ca2+シグナリング経路のもう一つの主要な下流メディエーターNF-ATの転写活性の増加およびβカテニン転写活性の抑止をさらに示した（図5F）。これらのデータは、K-Rasが、カルモジュリンとの特異的な相互作用によって、Fzd8によって媒介される非標準Wnt/Ca2+シグナリングを制御し、結果として、標準Wntシグナリングを制御することを示す（図5G）。対照的に、腫瘍形成性H-Ras形質転換腫瘍細胞は、CaMKiiを活性化し、Wnt/Ca2+シグナリングの活性化およびWnt/βカテニンシグナリング経路の抑止をもたらすために十分なCaMを含有している（図5G）。N-Rasは、H-Rasと同様に、CaMに結合することができない（図12C）。その結果、N-Rasによって形質転換された細胞は、CaMKiiのリン酸化、Fzd8の発現の上昇、およびβカテニン/TCF/LEF転写活性の減少を含め、H-Rasによって形質転換されたものに類似している（図12D〜F）。
【０１０３】
総合すると、これらのデータは、S181のリン酸化を刺激することによる、K-RasとCaMとの間の相互作用の破壊が、腫瘍形成性K-Rasによって駆動される悪性を抑制するための魅力的なアプローチであり得ることを示唆する。
【０１０４】
プロストラチンによるK-Rasのリン酸化はK-RasのCaMとの結合および腫瘍形成性を損なう
プロテインキナーゼC（PKC）は、多塩基領域内のS181のリン酸化によってK-Rasを制御することが既知である（Bivona et al.,Mol Cell 21:481-483,2006）。PKC活性化因子として作用するホルボール-12-ミリステート-13-アセテート（PMA）のような典型的なホルボールエステルは腫瘍促進性であるが、非定型のPKC活性化因子プロストラチン（12-デオキシホルボール-13-アセテート）は、腫瘍促進効力がはるかに弱い（Szallasi et al.,Nat Genet 40:1240-1244,1993；Zayed et al.,Planta Med 50:65-69,1984）。プロストラチンは、CD4受容体をダウンレギュレートし、新たなHIV感染を排除しながら、潜伏プロウイルスを保有する記憶CD4+T細胞においてHIV-1を再活性化するため、エイズを処置するための新規の治療剤として最近提唱された（Hezareh,Drug News Prespect 18:496-500,2005；Williams et al.,J Biol Chem 279:42008-42017,2004；Witvrouw et al.,Antivir Chem Chemother 14:321-328,2003）。ここで、本発明者らは、この非腫瘍促進性のPKC活性化因子を、K-Rasによって媒介される悪性を低下させるための新規薬剤として再利用し得るか否かを決定した。
【０１０５】
PKCを用量依存的に活性化する（図13A）プロストラチンは、RasV12形質転換細胞および複数のヒト膵臓癌細胞株において、K-RasとCaMとの間の内在性の相互作用を消失させた（図5H）。細胞は、その後、プロストラチンに応答して、ホスホCaMKiiのレベルの劇的な上昇を示した（図5H〜I）。さらに、プロストラチンによる処理は、ヒト膵臓癌細胞において、Fzd8の発現を増加させ、βカテニン標的遺伝子LEF1の発現を低下させ、このことから、プロストラチンによるPKCの活性化が、腫瘍形成性K-Rasによって媒介される下流Wnt/Ca2+シグナリングの活性を変化させることがさらに示唆された（図13B）。注目すべきことに、プロストラチンによる処理は、CaM結合能力を有していないH-RasV12またはK-RasV12-S181Dによって形質転換された細胞においては、CaMKiiの活性を改変しなかった（図5I）。さらに、K-RasV12形質転換NIH/3T3細胞は、プロストラチンに感受性であり、劇的に低下した細胞生存度を示したが、H-RasV12形質転換NIH/3T3細胞またはK-RasV12-S181D形質転換NIH/3T3細胞はそうでなかった（図5J）。さらに、本発明者らは、救済された「Ras欠損」MEFにおいて、H-RasV12およびK-RasV12によって媒介されるFzd8の発現およびその結果としてのWnt/Ca2+シグナリングが異なることを示した。同様に、K-Ras(4B)V12によって救済されたRas欠損MEFは、プロストラチンによる処理によって、増加したホスホCaMKiiおよび減少した細胞生存度を示したが、H-RasV12によって救済されたRas欠損MEFは、プロストラチンに対する最小の応答を示した（図13C）。これらの劇的なインビトロの応答から、K-Rasによって駆動される悪性を処置するための新規薬剤として、プロストラチンを用いることができるかということが問われた。
【０１０６】
興味深いことに、経口投与または腹腔内投与されたプロストラチンは、全身毒性の証拠なしにK-RasV12形質転換細胞の腫瘍形成性を劇的に抑制した（図13D）。K-RasV12-NIH/3T3細胞に由来した単一の皮下腫瘍は、プロストラチンの存在下で、媒体対照によって処理されたものと比較した時、はるかに小さく、大いに増加したホスホCaMKiiを示した（図13D〜E）。
【０１０７】
プロストラチンはヒト膵臓癌の腫瘍の開始および成長を抑制する
プロストラチン処理に応答して、変異K-Rasの異なるアイソフォームを保有するヒト膵臓癌細胞株は、K-RasのノックダウンまたはFzd8の過剰発現によって観察されたものを表現型模写する細胞形態変化を発現した（図14A、左パネル）。さらに、プロストラチンの処理は、ヒト膵臓癌細胞の細胞生存度および増殖率を有意に低下させた（図14A、右パネル）。
【０１０８】
インビボのK-Rasによって駆動されたヒト膵臓癌に対するプロストラチンの抗癌効果を試験するため、本発明者らは、プロストラチンが異種移植片モデルにおいて膵臓腫瘍形成を防止し得るか否かをまず調査した。図6Aが示すように、プロストラチンは、媒体処理群と比較した時、皮下部位において確立された異種移植膵臓腫瘍における腫瘍形成の頻度を有意に低下させた。さらに、プロストラチンの存在下での確立された腫瘍の平均サイズは、対照群における腫瘍よりはるかに小さかった（図6B）。腫瘍形成をより正確に検出するため、膵臓腫瘍細胞をルシフェラーゼによって標識した。生物発光イメージング（BLI）は、プロストラチンによる処理が腫瘍開始および腫瘍サイズを顕著に抑制することを確認した（図6C）。さらに、対照群における腫瘍と比較した時、プロストラチンによって処理された異種移植された膵臓腫瘍は、治療中の腫瘍成長率の劇的な低下およびKi67の発現の低下を示した（図6D）。
【０１０９】
皮下腫瘍の防止に対する効果の試験に加えて、本発明者らは、変異K-Rasを有するヒト膵臓癌細胞の同所モデルにおいてプロストラチンの抗癌効果を評価した。ELISAに基づくPKC活性アッセイは、プロストラチンを膵臓へ効率的に送達するため、経口経路が腹腔内経路と比べて好ましいことを明らかにした（図13F）。プロストラチンの毎日の経口処理を受けた免疫低下NOD-SCIDマウスは、対照処理マウスと比較して、同所部位により低い腫瘍量を有していた：BLI分析は、プロストラチンが、対照と比較した時、動物における同所腫瘍のサイズを劇的に低下させることを明らかにした（図6Eおよび図14B）。さらに、プロストラチンによる処理は、同所膵臓癌モデルにおいて、腹膜への転移を低下させた（図6Eおよび図14C）。図6Fおよび図14Bに示されるように、H＆E染色は、プロストラチン処理マウスの大部分は、膵臓における原発腫瘍の形成を示さないが、対照群のマウスは、明白な同所腫瘍を有し、正常な膵組織がほとんど検出不可能であることを明らかにした。さらに、プロストラチン処理群における同所腫瘍は、対照腫瘍と比較した時、はるかに低いKi67を発現した（図6Gおよび図14B）。総合すると、本発明者らのデータは、プロストラチンが、異種移植モデルにおけるヒト膵臓癌の腫瘍開始頻度を有意に低下させることを示唆している。
【０１１０】
次に、本発明者らは、確立されたヒト膵臓異種移植腫瘍に対するプロストラチンの抗腫瘍効果を試験した。ヒト膵臓癌細胞を免疫低下マウスへ皮下移植または同所移植した。毎日の経口プロストラチン処理を、実験細胞株および実験モデルに依って、注射後およそ10〜14日目に開始した（図7A）。興味をそそることに、プロストラチンは、媒体処理腫瘍と比較した時、有意に低下した成長速度によって定義された、ヒト膵臓皮下腫瘍に対する抗腫瘍活性を示した（図7A）。さらに、プロストラチンによって処理された皮下腫瘍は、開裂カスパーゼ3の増強された発現を示し（図14D）、このことから、プロストラチンが確立された腫瘍に対して細胞傷害効果を及ぼすことが示唆された。
【０１１１】
癌患者の血流には無細胞DNA（cfDNA）が上昇したレベルで見出されており、その濃度は、有効な治療の後の原発腫瘍サイズまたは腫瘍再発とのほぼ完璧な相関を示した（Anker et al.,Cancer Metastasis Reviews 18:65-73,1999；Sozzi et al.,J.Clin Oncol 21:3902-3908,2003）。従って、血漿cfDNAの絶対レベルの定量化は、膵臓悪性疾患を含むある種の型の癌の診断またはモニタリングのための有用なツールであり得る（Sikora et al.,The International Journal of Biological Markers 30,e136-141,2015）。ここで、本発明者らは、ヒト膵臓癌細胞が同所性に植え込まれたマウスにおいて、ヒトcfDNAを特異的に検出するTaqmanプローブを適用した（Cheng et al.,Cancer Sci 100:303-309,2009）（図7B）。ヒトcfDNAのレベルは、腫瘍植え込み後14日目に基線より6倍を超えて増加し、その時点で、プロストラチン処理を開始した。ヒト特異的cfDNAの濃度は、プロストラチンによって処理された動物において経時的に劇的に減少したが、媒体処理群においては正の動的変化を示した（図7B）。これらのデータは、プロストラチンが同所異種移植モデルにおいてヒト膵臓癌の負荷を有意に抑止することを証明する。
【０１１２】
総合すると、本発明者らのデータは、非定型のPKCの活性化因子プロストラチンが、K-RasとCaMとの相互作用を効率的に低下させ、Wnt/Ca2+シグナリングを復活させ、膵臓癌における腫瘍形成性K-Rasによって媒介される悪性を抑制することができることを示唆する。
【０１１３】
プロストラチンはK-RasG12Vによって誘導された乳頭腫を特異的に抑止する
本発明者らは、さらに、遺伝学的に操作されたマウスモデル（GEMM）において、腫瘍形成性Rasによって誘導された腫瘍に対するプロストラチンの効果を調査した。本発明者らは、皮膚幹細胞プロモーターLrig1の調節下で、H-RasG12VまたはK-RasG12Vによって駆動された乳頭腫モデルをまず使用した（図7C）（Jaks et al.,Exp Cell Res 316:1422-1428,2010；Page et al.,Cell Stem Cell 13,471-482,2013）。このGEMMにおいては、タモキシフェンによって誘導可能なCreリコンビナーゼが、腫瘍形成性のH-RasG12VまたはK-RasG12Vの発現を開始させ、強化された腫瘍形成性Ras発現が、創傷治癒中の皮膚ホメオスタシスを破壊し、乳頭腫形成をさらに誘導する（図7C）。
【０１１４】
毎日のプロストラチン処理は、K-RasG12Vによって駆動される乳頭腫の形成を有意に遅延させ／低下させたが、H-RasG12Vによって誘導される腫瘍の開始に対しては効果を示さなかった（図7D）。同一の遺伝的背景において、腫瘍形成性K-Rasが腫瘍形成性H-Rasよりはるかに高い頻度で皮膚腫瘍開始を駆動したこと、およびGEMMからの結果がRasV12形質転換MEFを移植された異種移植モデルにおいて観察されたものと一致していることに注意すべきである。
【０１１５】
表皮のような上皮組織の周知の特色は、複数の幹細胞集団の共存である。Lrig1は、上部毛嚢脂腺単位の幹細胞に関連した複数のマーカーのうちの1種である（Jaks et al.,2010；Jensen et al.,Nat Protoc 5:898-911,2010）。表皮において、これらのLrig1+細胞は、皮膚再構築アッセイにおいて全ての表皮系統に寄与することができる（Jensen et al.,2010）。ここで、本発明者らは、K-RasG12Vが、同一のLrig1プロモーターの下で、H-RasG12Vよりはるかに高い率で皮膚腫瘍を開始したことを示し、従って、腫瘍形成性K-Rasは癌幹細胞または腫瘍開始細胞に対して機能的役割を有するが、H-Rasはそうでないことをさらに支持する。さらに、プロストラチンは、腫瘍開始頻度を低下させるのみならず、K-RasG12Vによって誘導される乳頭腫の成長速度も有意に遅くした（図14E）。興味深いことに、対照群におけるK-RasG12Vによって駆動される皮膚腫瘍は、E-カドヘリンの低下した発現およびビメンチンの増加した発現を含む上皮間葉転換（EMT）特性を示したが、プロストラチンによって処理された腫瘍は、上皮マーカーの強力な発現を維持していた（図7E）。これらのデータは、プロストラチンが、このGEMMにおいて、腫瘍形成性K-Rasによって駆動される乳頭腫の形成および進行を選択的に抑制し得ることを示唆している。
【０１１６】
要約すると、本発明者らの結果は、プロストラチンが免疫適格マウスにおいて腫瘍形成性K-Rasの結果としての皮膚腫瘍の形成を選択的に阻害することを示した。異種移植モデルにおけるデータと合わせると、プロストラチンが、腫瘍形成性K-Rasによって駆動される癌に対する選択的な活性を有する新規の有効な薬物であり得ることが示唆される。
【０１１７】
考察
変異癌遺伝子H-Ras、N-Ras、およびK-Rasは、高度の配列相同性を有し、培養細胞を形質転換し、共通の細胞シグナリング経路を活性化するという類似した能力も有するため、歴史的に、これらの3種のRas遺伝子産物は機能的に重複しているという概念が支持されていた。本明細書において、本発明者らは、H-RasおよびK-Rasが、腫瘍開始を誘導する能力について異なっており、Fzd8によって媒介される非標準Wnt/Ca2+シグナリング経路を抑制するK-Rasの能力に、これが直接関係することを報告する。
【０１１８】
負の制御因子APCの機能喪失型変異および／またはβカテニンの機能獲得型変異によって駆動された標準Wnt/βカテニンシグナリング経路の構成性の活性化は、いくつかの型の腫瘍、最も顕著には、結腸癌の開始に直接関連している。しかしながら、古典的なβカテニン制御タンパク質におけるそのような遺伝学的病変は、ヒト膵臓癌においては極めて稀にしか起こらず（Abraham et al.,Am J Pathol 160:1361-1369,2002；Gerdes et al.,Digestion 60:544-548,1999；Seymour et al.,Cancer Res 54:2761-2764,1994）、このことから、PDACにおけるWnt/βカテニンシグナリング経路の活性化の別の経路が示唆される。siRNAによるβカテニン発現の枯渇は、変異K-Rasに関連したマウス膵臓癌の増殖を減少させ、アポトーシスを加速させる（Pasca di Magliano et al.,PLoS One 2:e1155,2007）。さらに、βカテニンのレベルは、PanINグレードおよび侵襲性PDACの発症と正に相関し（Al-Aynati et al.,ClinCancer Res 10:1235-1240,2004；Pasca di Magliano et al.,2007；Wang et al.,Cancer Cell 15:207-219,2009）、このことは、PDAC維持へのWnt/βカテニンシグナリングの可能性のある寄与を示す。しかしながら、腺房細胞および内分泌細胞においてβカテニンの活性化変異を発現するマウスは、核βカテニンの齢依存性の蓄積およびWnt/βカテニン標的遺伝子発現の増加を示し、最終的に膵臓腫瘍を発症しなかった（Strom et al.,Development 134:2719-2725,2007）。Creによって誘導されたβカテニン安定化／活性化が、トランスジェニックマウスにおいて膵臓上皮内病変（PanIN）またはPDACを駆動するため、K-Rasと協力することができなかったという証拠（Heiser et al.,Gastroenterology 135:1288-1300,2008）と合わせると、Wnt/βカテニンシグナリング経路はPDACを開始させるのに十分ではないようである。ここで、本発明者らは、タンキラーゼ阻害剤によるβカテニン活性の阻害が、インビトロのK-Rasによって媒介される悪性に対して負の効果を示さなかったことを報告する（図10）。さらに、結腸癌細胞株におけるshRNAによる腫瘍形成性K-Ras発現の抑制は、変異型APCまたは野生型APCの存在に関わらず、「オルガノイド」培養物において成長を有意に抑制した（図10）。総合すると、本発明者らは、H-Rasより大きい腫瘍形成性K-Rasの腫瘍開始能力が、標準Wnt/βカテニンシグナリングの増加のみによるのではないとの結論を下す。非標準Wnt/Ca2+シグナリング経路が、腫瘍形成性Rasによって媒介される腫瘍開始において重要な役割を果たしており、標準βカテニンシグナリングカスケードは、腫瘍形成性K-Rasによって駆動される腫瘍の悪性特色をモジュレートするための唯一の下流経路ではない。従って、Fzd8によって媒介される非標準Wnt/Ca2+シグナリングの他の可能性のある下流経路を同定する必要がある。
【０１１９】
非標準Wnt/Ca2+シグナリング経路の主要メディエーターは、カルモジュリン依存性キナーゼII（CaMKii）である。CaMKiiは、カルモジュリンとの結合によって制御される（Bachs et al.,CellCalcium 16:289-296,1994；Klee and Vanaman,Adv Protein Chem 35:213-321,1982；Stewart et al.,FEBS Lett 137:80-84,1982）。興味深いことに、カルモジュリンは、K-Ras4Bに排他的に結合し、他のN-Ras、H-Ras、またはK-Ras4Aには結合しないことが見出されており、カルモジュリンのCaMKii結合ドメインの配列を含むペプチドは、この特異的な相互作用を阻止することができる（Villalonga et al.,Mol Cell Biol 21:7345-7354,2001）。本発明者らの研究は、K-RasV12がCa2+依存的にカルモジュリンに結合することができ、H-RasV12はそうでないことを確認した。腫瘍形成性K-Rasは、カルモジュリンに構成的に結合するが、野生型K-Rasタンパク質は、例えば、BxPC3細胞においてEGFによって活性化された時にのみ、カルモジュリンに結合することができる。さらに、K-RasのSer181リン酸化型を模倣するK-RasV12バリアント（S181D）はカルモジュリンに結合しないため、K-Rasのカルモジュリンとの結合は、超可変領域のSer181のリン酸化によって弱められる。K-RasV12S181Dバリアントは、CaMKii活性およびFzd8発現を抑制する能力を失い、このことから、アイソフォーム特異的であり、GTP依存性であり、高度に制御されている、K-Rasとカルモジュリンとの間の相互作用が、Fzd8によって媒介される非標準Wnt/Ca2+シグナリングをK-Rasが阻害するための重要な経路であることが示唆された。従って、K-Rasとカルモジュリンとの間のこの特異的な相互作用の阻止は、K-Rasを選択的に標的とするための新規のアプローチを提供する可能性がある。
【０１２０】
本明細書において、本発明者らは、プロストラチンによるPKCの活性化が、K-Ras-CaM相互作用の解離をもたらし、非標準Wnt/Ca2+シグナリングを活性化し、腫瘍形成性K-Rasによって媒介される悪性を抑制することを報告する。本発明者らの所見より、ホルボールエステルによるPKCアイソザイムの活性化は、腫瘍形成を促進すると長い間見なされてきたが、プロストラチンによるPKC活性化と、PMAのような他の典型的な活性化因子によるPKC活性化との間の違いを駆動するのは何であるのかという未解決の疑問がもたらされる。
【０１２１】
プロテインキナーゼC（PKC）は、腫瘍促進性のホルボールエステルのための受容体として最初に特徴決定されて以来（Castagna et al.,J.Biol Chem 257:7847-7851,1982）、30年以上にわたり腫瘍形成に関与するとされてきた。しかしながら、最近の研究は、従来型（α、βI、βII、およびγ）、新規型（δ、ε、η、およびθ）、ならびに非定型（ζ、λ/ι）として分類される、関連するアイソフォームのファミリーとしてPKCを特徴決定しており（Basu and Pal,Scientific World Journal 10:2272-2284,2010）、PKCアイソザイムはオーバーラップする機能を示す場合もあるし、反対の機能を示す場合もある（Steinberg,Physiol Rev 88:1341-1378,2008）。例えば、PKCδの活性化ではなくダウンレギュレーションが腫瘍促進に関連しているため、PKCδは腫瘍抑制因子として機能すると考えられる（Lu et al.,Mol Cell Biol 17:3418-3428,1997）。驚いたことに、最近の研究は、PKCサブグループにおける癌関連変異の大多数が機能喪失型（LOF）であることを明らかにした （Antal et al.,Cell 160:489-502,2015）。CRISPRによって媒介されるゲノム編集によるPKCβにおけるLOF変異の補正は、患者由来の結腸癌細胞のインビトロおよびインビボの悪性を抑制した（Antal et al.,2015）。より重要なことには、PKCアイソザイムにおいて見出されたいくつかの変異は、全体的なPKCシグナリングアウトプットを抑制するよう機能するドミナントネガティブであった（Antal et al.,2015）。これは新しい仮説を確立する: PKCアイソザイムは一般に腫瘍抑制因子として機能し、従って、抗癌治療はPKC活性の阻害ではなく、回復に焦点を当てるべきである。このことは、PKCによって媒介されるセリン-181におけるK-Rasのリン酸化がK-Ras活性に影響を与えるという観察に基づき、Bivonaら（Bivona et al.,Mol Cell 21:481-493,2006）によっても提唱されている。興味深いことに、PMAおよびプロストラチンは、PKCαおよびPKCδに対する生物学的活性（活性化対細胞内移行）について実質的に異なることが示されており（Marquez et al.,Biochem Pharmacol 75:1370-1380,2008）、それが、腫瘍促進に対する別個の特性を説明する可能性がある。
【０１２２】
要約すると、K-Rasは、カルモジュリンとの直接結合によって、Wnt/Ca2+シグナリング経路を抑制し、CaMKii活性の低下をもたらし、Fzd8発現をダウンレギュレートする。K-RasによるFzd8発現のダウンレギュレーションが、Wnt/Ca2+シグナリングの持続的な抑制をもたらし、それが、次に、標準Wntシグナリングおよび腫瘍形成性の増加を引き起こす。記載されたK-Rasのアイソフォーム特異的な活性は、他のRasアイソフォームに影響を与えることなく、K-Rasの腫瘍形成活性を阻止するための別の標的として活用され得る。
【０１２３】
実験手法
細胞株
NIH/3T3細胞、BxPC3細胞、PANC1細胞、およびPANC2.03細胞は、ATCCからであった。マウス膵臓腺癌細胞は、UCSFのDr.Eric Collissonからの寄贈であった。H-Ras、N-Ras、またはK-Rasを発現するRas欠損MEFは、UCSFのCameron Pittからの寄贈であった。マウス細胞株は、37℃、5％CO2で、10％FBS（またはNIH/3T3細胞の場合、CS）が補足されたダルベッコ修飾イーグル培地（DMEM）において成長させられた。ヒト膵臓癌細胞株は、15％FBSおよびヒト組換えインスリンが補足されたATCC修飾RPMI-1640培地（Gibco 12585-014）において維持された。
【０１２４】
K-RasおよびH-Rasの構築物を、pBabeレトロウイルス発現ベクターへサブクローニングし、標準的な変異誘発技術（Agilent QuikChange II XL部位特異的変異誘発キット）を使用して、セリン181点変異を導入した。各発現構築物のためのウイルス粒子を293細胞にパッケージングし、NIH/3T3細胞をおよそ1 MOIで形質導入した。次いで、形質導入された細胞を、2μg/mlピューロマイシンが補足された成長培地において選択した。
【０１２５】
タンキラーゼ阻害剤、JW55、カルジノーゲン（Cardinogen）1、およびJW67は、R＆D Systemsから購入された。TOPFlashアッセイのため、細胞を、12時間、0.5μMの阻害剤によって処理した。スフィア形成アッセイのため、細胞を、異なるタンキラーゼ阻害剤を含む完全培地において培養した。
【０１２６】
動物研究
全ての実験が、IACUC of the University of California（San Francisco）によって承認された。RasV12形質転換NIH/3T3細胞を、各側腹部に50個、100個、または1,000個、雌ヌードマウス（Nu/Nu）へ皮下注射した。触知可能腫瘍を週2回測定した。動物を各群5匹に分割した。BrafCAマウスおよびKrasLSL-G12Dマウスに由来する膵臓腺癌細胞は、Eric Collissonによって提供され、記載されたように（Collison et al.,Nat Med 17:500-503,2011；Dankort et al.,Genes Dev 21:379-384,2007；Hingorani et al.,Cancer Cell 4:37-450,2003）遺伝子型決定される。100個の細胞を、28.5ゲージ針を使用して、20μLの50％マトリゲルで、6〜8週齢FVB/nマウスに同所性に植え込んだ。マウスを1ヶ月間モニタリングし、窮迫時に安楽死させた。
【０１２７】
以前に記載されたように（Balmain and Pragnell,Nature 303:72074,1983）、7,12-ジメチルベンザアントラセン（DMBA）および12-O-テトラデカノイルホルボール-13-アセテート（TPA）を使用した二段階化学発癌プロトコルによって、皮膚腫瘍を誘導した。組織学的に確認された皮膚癌を、従来の方法によって、分子的分析のため、DNA、RNA、およびタンパク質へ処理した。KrasおよびHrasKIの対立遺伝子の変異を、以前に記載されたような直接配列決定によって同定した（To et al.,Nat Genet 40:1240-1244,2008）。
【０１２８】
動物処理のためのプロストラチンは、Santa Cruz Biotechnology（sc-203422A）から購入された。薬物を、経口胃管栄養（OG）によって1mg/kgで、または腹腔内（I.P）注射によって0.5mg/kgで、NOD-SCIDマウスまたは無胸腺ヌードマウスのいずれかへ毎日投与した。10％DMSO、10％クレモフォール、および80％生理食塩水溶液を、溶媒および媒体対照として使用した。媒体またはプロストラチンのいずれかの毒性効果を、少なくとも30日間、体重の変化をモニタリングすることによって評価した。
【０１２９】
腫瘍発症に対する遺伝子不均一性の効果を最小化するため、Lrig1Cre/ER/LSL HrasマウスおよびLrig1Cre/ER/LSL-KrasG12Dマウスを、複数世代にわたりFVB/Nバックグラウンドへ戻し交配した。8週齢で局所適用された4oht（タモキシフェン）の単回投与によって、両方のマウス群において、Creリコンビナーゼを活性化した。7日目以降、乳頭腫発症のため、2cmの切開を入れることによって、背部において創傷を誘導した。
【０１３０】
マウス血漿試料からのDNA抽出
全ての血液試料を、K2EDTA含有チューブ（BD Microtainer、Ref 365974）に収集し、1,500gで10分間遠心分離した。次いで、細胞混入の可能性を排除するため、血漿の上部から注意深く上清を収集した。血漿をさらなる使用まで-80℃で保管した。NucleoSpin Plasma XSキット（Macherey-Nagel；740900）を使用して、100μLの血漿からcfDNAを抽出した。
【０１３１】
マウス血漿中のヒト核酸の定量化
全ての血漿試料中の核酸濃度を、製造業者のプロトコルに従って、AB7900HT（Applied Biosystems,Foster City,CA,USA）およびTaqMan Universal PCR Master Mix（Applied Biosystems）を使用して、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって測定した。マウス血漿試料中のヒトβアクチンゲノムDNAの定量化のため、以下のカスタムプライマーおよびプローブセットを使用した：
順方向プライマー、
2017527583.tif 000010
【０１３２】
RNA干渉
H-Ras、K-Ras、およびFzd8に対するshRNAベクターは、Open Biosystemsから購入された。標準的なプロトコルを使用して、第3世代のレンチウイルスパッケージング系を使用することによって、shRNA構築物をレンチウイルスとしてパッケージングした。パッケージングプラスミドはAddgeneからであった。
【０１３３】
RasGTPプルダウンアッセイ
細胞を氷冷PBSで2回洗浄し、1mmol/L DTTならびにプロテアーゼおよびホスファターゼの阻害剤（Sigma-Aldrich）が補足された1％TX100-TNM溶解緩衝液（20mmol/LトリスpH7.5、5mmol/L MgCl2、150mmol/L NaCl、1％トリトンX-100）で溶解した。各試料からの等量のタンパク質を、300〜500μLの1％TX100-TNM溶解緩衝液で、10μLの充填されたGST-Raf-RBDビーズまたはRal-GDS-RBDビーズに添加し、1〜2時間4℃で回転させた。ビーズを1mLの冷溶解緩衝液で3回洗浄し、ドデシル硫酸リチウム（LDS）試料緩衝液（Invitrogen）において煮沸した。
【０１３４】
K-LISA Akt活性アッセイ
K-LISA Akt活性キットはEMD Millipore（CBA019）から購入された。細胞を、氷冷PBSで2回洗浄し、1mmol/L DTTならびにプロテアーゼおよびホスファターゼの阻害剤（Sigma-Aldrich）が補足された1％TX100-TNM溶解緩衝液（20mmol/LトリスpH 7.5、5mmol/L MgCl2、150mmol/L NaCl、1％トリトンX-100）で溶解した。等量のタンパク質を含む細胞溶解物を、Akt1、Akt2、およびAkt3によってリン酸化され得るビオチン化されたペプチド基質と共にインキュベートした。完全な手法およびプレート読み取りは、製造業者の説明書に従って実施された。
【０１３５】
ウエスタンブロッティング分析
実験細胞を氷冷PBSで2回洗浄し、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche）が補足された1％Triton溶解緩衝液［25mmol/LトリスpH7.5、150mmol/L NaCl、1％トリトンX-100、1mmol/L EDTA、1mmol/L EGTA、20mmol/L NaF、1mmol/L Na2VO4、および1mmol/L DTT］で溶解し、遠心分離によって清浄化した。タンパク質濃度をBio-Rad Protein Assay（Bio-Rad）によって決定した。等量のタンパク質抽出物を、SDS-PAGE（NuPAGE；Invitrogen）を使用して分解し、ニトロセルロース膜へ移し、示された一次抗体によってイムノブロットした後、IRDye800（Rockland）またはAlexa Fluor 680（Molecular Probes）のいずれかによって標識された二次抗体によってイムノブロットし、LI-COR Odysseyスキャナを使用して可視化した。一次抗体の完全なリストは、拡張的な実験手法（Extended Experimental Procedures）に提供される。
【０１３６】
スフィア形成および再コロニー形成アッセイ
細胞を採集し、計数し、1ウェル当たり10細胞または100細胞で、Ultra Low Attachment Culture 96穴プレート（Corning Life Science、カタログ番号3261）へ播種した。播種された細胞および形成されたスフィアを、0.1％FBSまたはCSを含む低血清含有培地において維持した。開始されたスフィアを週2回観察した。播種の1ヶ月後に、形成されたスフィアの数を計数した。スフィアを採集し、1ウェル当たり1スフィアで、完全成長培地を含む12穴プレートまたは24穴プレートへ再播種した。再形成されたコロニーを、（0.1％メタノール中）0.05％クリスタルバイオレット染色によって染色し可視化した。
【０１３７】
薬物感作アッセイ
まず、細胞を、1ウェル当たり10,000細胞で96穴プレートへ播種し、プロストラチン（Santa Cruz Biotech、sc-203422A）によって72時間処理した。死細胞を除去し、製造業者の説明書に従って、生細胞の百分率を決定するため、MTSアッセイ（Promega、G5430）を実施した。DMSOを、媒体対照として、そして標準化のため、使用した。
【０１３８】
定量的PCR
QIAGEN RNAeasyキットを使用して、全RNAを単離し精製した。RT-PCRのためのSuperScript（商標）First-Strand Synthesis System（Invitrogen）を使用して、1標本当たり1μgのRNAをcDNAへ逆転写した。ゲノムDNAの可能性のある混入を、DNアーゼIの処理によって除外した。定量的リアルタイムPCRアレイ分析を、SYBR Green（Applied Biosystem）を使用して実施した。変化倍率および統計分析をGraphPad Prism 4.00 for Windows（GraphPad Software）を使用して計算した。96穴プレート（PAMM-047Z）上のマウスStem Cell Signaling RT2Profiler PCRアレイは、SABiosciencesから購入された。
【０１３９】
TOPFlashアッセイおよびNFatルシフェラーゼアッセイ
Fugene6（Roche）を使用することによって、TOPFlash（Addgene＃12456）、FOPFlash（Addgene＃12457）、またはpGL3-NFAT（Addgene＃17870）ルシフェラーゼレポーター構築物によって細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後に、細胞溶解物中のルシフェラーゼ活性を、製造業者の説明書に従って、Bright-Glo Luciferase Assay System（Promega）を使用して測定した。
【０１４０】
免疫組織化学
厚さ5μmの膵組織マイクロアレイ（PAN241、PA242a、PA483b、およびT143）は、Biomax,Incから購入された。脱パラフィン組織を、電気炊飯器においてCell MarqueTM Trilogy試薬（ALS）によって30分間アンマスクした。スライドを、室温で、10分間、H2O2/メタノール中に置くことによって消光させた。ヒトおよびマウスの膵組織の染色は、Histostain（登録商標）SPキット（Invitrogen）を使用して行われ、完全な手法は、製造業者の説明書に従って実施された。一次抗体の希釈は、製品アプリケーションノートに従って使用された。
【０１４１】
RNAscopeインサイチューハイブリダイゼーション
非特異的なハイブリダイゼーションからのバックグラウンドノイズではなく標的特異的なシグナルを増幅することによって、RNA ISHの信号雑音比を求めるため、本発明者らは新規のカスタマー設計ヒトFzd8標的プローブおよびRANSCOPE2.0 High Definition-Brown染色キット（Advanced Cell Diagnostics）を使用した。完全な手法は、製造業者の説明書に従って実施された。
【０１４２】
以上、本発明を、理解の明確性のため、図および例によってある程度詳細に説明したが、当業者は、添付の特許請求の範囲の範囲内で、ある種の変化および修飾を実施し得ることを認識するであろう。さらに、各参照が参照によって個々に組み入れられるのと同一の程度に、本明細書中に提供された各参照は、参照によってその全体が組み入れられる。
【図１Ａ】
2017527583.tif 000014
【図１Ｂ】
2017527583.tif 000015
【図１Ｃ】
2017527583.tif 000016
【図１Ｄ】
2017527583.tif 000017
【図１Ｅ】
2017527583.tif 000018
【図１Ｆ】
2017527583.tif 000019
【図１Ｇ】
2017527583.tif 000020
【図１Ｈ】
2017527583.tif 000021
【図２Ａ】
2017527583.tif 000022
【図２Ｂ】
2017527583.tif 000023
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
2017527583.tif 000027
【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図２Ｉ】
2017527583.tif 000030
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図４Ｉ】
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【図５Ａ】
2017527583.tif 000048
【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
2017527583.tif 000053
【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ】
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【図５Ｊ】
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【図６Ａ】
2017527583.tif 000058
【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
2017527583.tif 000061
【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
2017527583.tif 000063
【図６Ｇ】
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【図７Ａ】
2017527583.tif 000065
【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８Ａ】
2017527583.tif 000070
【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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【図８Ｉ】
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【図８Ｊ】
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【図９Ａ】
2017527583.tif 000080
【図９Ｂ】
2017527583.tif 000081
【図９Ｃ】
2017527583.tif 000082
【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図９Ｈ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１１Ｇ】
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【図１１Ｈ−１】
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【図１１Ｈ−２】
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【図１１Ｈ−３】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【国際調査報告】
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