(57)【要約】本発明は、ヒト神経芽細胞腫細胞が神経堤に移植されているキジ科鳥類胚に関する。本発明はまた、このようなキジ科鳥類胚を調製するための方法、及びこのキジ科鳥類胚の使用に基づいて、神経芽細胞腫瘍の処置のための治療分子をスクリーニングする方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト神経芽細胞腫細胞が神経堤のレベルで移植されている、キジ科鳥類胚。
【請求項２】
ヒト神経芽細胞腫細胞が、胚の神経管の第７体節と第２８体節との間に、好ましくは第１２体節と第２４体節との間に、より好ましくは第１８体節と第２４体節との間に移植されていることを特徴とする、請求項１に記載のキジ科鳥類胚。
【請求項３】
ヒト神経芽細胞腫細胞が、約１５０００細胞〜約７５０００細胞／移植の量で移植されていることを特徴とする、請求項１又は２に記載のキジ科鳥類胚。
【請求項４】
４８〜５５時間の発生段階の胚において移植を行うことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のキジ科鳥類胚。
【請求項５】
移植後に、胚を少なくとも２４時間インキュベーションすることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載のキジ科鳥類胚。
【請求項６】
ヒト神経芽細胞腫細胞がマーカータンパク質を発現することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載のキジ科鳥類胚。
【請求項７】
ヒト神経芽細胞腫細胞が少なくとも１つの不死化細胞株に由来することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載のキジ科鳥類胚。
【請求項８】
ヒト神経芽細胞腫細胞が、それぞれ異なるマーカータンパク質を発現する２つの不死化細胞株に由来することを特徴とする、請求項７に記載のキジ科鳥類胚。
【請求項９】
ヒト神経芽細胞腫細胞が、患者由来の腫瘍に由来することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載のキジ科鳥類胚。
【請求項１０】
キジ科鳥類胚を調製するための方法であって、以下の工程：
−ヒト神経芽細胞腫細胞を、キジ科鳥類胚の神経堤のレベルで移植すること、及び
−該移植胚を少なくとも２４時間インキュベーションすること
を含む、方法。
【請求項１１】
ヒト神経芽細胞腫細胞を、胚の神経管の第７体節と第２８体節との間に、好ましくは第１２体節と第２４体節との間に、より好ましくは第１８体節と第２４体節との間に移植することを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ヒト神経芽細胞腫細胞を、約１５０００細胞〜約７５０００細胞／移植の量で移植することを特徴とする、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
４８〜５５時間の発生段階の胚において移植を行うことを特徴とする、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ヒト神経芽細胞腫細胞が少なくとも１つの不死化細胞株に由来することを特徴とする、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ヒト神経芽細胞腫細胞が、患者由来の腫瘍に由来することを特徴とする、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
神経芽細胞腫を患っている患者をモニタリングするための方法であって、
ａ）請求項１５に記載の方法にしたがって、Ｔ１時点における前記患者由来の神経芽細胞腫細胞を用いて、第１の胚を調製し、この第１の胚において発生する腫瘍の腫瘍形成を評価すること、
ｂ）請求項１５に記載の方法にしたがって、Ｔ２時点における前記患者由来の神経芽細胞腫細胞を用いて、第２の胚を調製し、この第２の胚において発生する腫瘍の腫瘍形成を評価すること、
ｃ）該第１の胚及び該第２の胚において発生する腫瘍の腫瘍形成を比較すること
を含む、方法。
【請求項１７】
神経芽細胞腫瘍の処置を目的とする治療分子をスクリーニングするための方法であって、以下の工程：
ａ）請求項１０〜１５の一項に記載の方法にしたがって、胚を調製すること；
ｂ）候補治療分子をこれらの胚に投与すること；
ｃ）前記候補分子の投与の少なくとも２４時間後に、該胚に存在する腫瘍の腫瘍形成を評価すること
からなる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、子供におけるガンの１０％を占める小児固形腫瘍である神経芽細胞腫の動物研究モデルに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来技術
神経芽細胞腫（ＮＢ）は、小児腫瘍疾患である。子供における発見の平均年齢は、１〜２歳である。その事例は、子供１０００００人当たり約１症例であり、非常に珍しい症例が成人で確認されている。疾患の進行は非常に変わりやすく、単離された腫瘍を伴う形態は、転移を伴う形態よりも非常に予後良好である。その発生原因は不明であり、症例の大部分は散発的かつ非家族性である。
【０００３】
この腫瘍は、胚神経堤神経芽細胞（ＮＣＣ）に由来し、交感神経節及び副腎髄質で主に発生する。神経堤は、神経管の最も背側の領域から生成された多能性細胞の集団を意味する。これらの細胞は、発生中の胚全体で遊走し、成体における多種多様な細胞型を生じさせる。これらの中で、神経芽細胞は、ニューロンに発達する。
【０００４】
神経芽細胞腫が出現する胚微小環境は特異的であり、動物腫瘍形成モデルの大部分（特に、マウス及びラット）において研究することができないので、候補治療分子の前臨床試験の可能性が制限される。
【０００５】
ヒト神経芽細胞腫において一般に観察されるＭＹＣＮ又はＡＬＫ発ガン遺伝子の増幅の役割を研究することを可能にする遺伝子改変動物モデルが記載されている：それらは、ＭＹＣＮを発現するように遺伝子改変されたマウスであるか（Weiss et al., 1997）、又はＭＹＣＮ及び／若しくはＡＬＫを過剰発現するゼブラフィッシュである（Zhu et al., 2012）。
【０００６】
しかしながら、ＭＹＣＮ及び／又はＡＬＫ発ガン遺伝子は、患者において観察される全種類の神経芽細胞腫において過剰発現されるわけではない。
【０００７】
現時点では、神経芽細胞腫の全ての形態の動物モデルであって、ヒトの体内（すなわち、交感神経節及び副腎髄質）と同じ立体配置で、腫瘍が動物の体内で発生する動物モデルは存在しない。しかしながら、疾患のより詳細な知識を得るために、及びin vivoで新たな治療分子を試験するためにも、このようなモデルが必要である。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、ヒト神経芽細胞腫細胞が神経堤のレベルで移植されているキジ科鳥類胚（好ましくは、ニワトリ胚又はウズラ胚）に関する。
【０００９】
この移植は、移植の約４８時間後に、これらの神経芽細胞腫細胞が、交感神経節及び／又は副腎髄において腫瘍を形成することを可能にする適切な条件下で実施される。この動物モデルの調製の安易性は、本発明の大きな利点である。
【００１０】
この胚は、神経芽細胞腫であるヒト小児病変の動物研究モデルである。この研究モデルは、起源と類似の環境（すなわち、胚環境）において腫瘍を再現するという利点を有する。このモデルでは、移植されたヒト神経芽細胞腫細胞は、ヒト病変と同じように動物胚において遊走し、神経芽細胞が通常定着する部位：交感神経節及び副腎髄質において腫瘍を形成する。
【００１１】
本発明はまた、キジ科鳥類胚を調製するための方法であって、以下の工程：
−ヒト神経芽細胞腫細胞を、キジ科鳥類胚の神経堤のレベルで移植すること、及び
−該移植胚を少なくとも２４時間インキュベーションすること
を含む方法に関する。
【００１２】
本発明はまた、神経芽細胞腫を患っている患者をモニタリングするための方法であって、
ａ）上記方法にしたがって、Ｔ１時点における前記患者由来の神経芽細胞腫細胞を用いて、第１の胚を調製し、この第１の胚において発生する腫瘍の腫瘍形成を評価すること、
ｂ）上記方法にしたがって、Ｔ２時点における前記患者由来の神経芽細胞腫細胞を用いて、第２の胚を調製し、この第２の胚において発生する腫瘍の腫瘍形成を評価すること、
ｃ）該第１の胚及び該第２の胚において発生する腫瘍の腫瘍形成を比較すること
を含む方法に関する。
【００１３】
このモデルは、特に成長能及び播種能に関して、患者由来の腫瘍の特徴を決定することを可能にする。特に患者から採取されて、次いでニワトリ胚又はウズラ胚に移植され得るこれらの腫瘍細胞は、in vivoで様々な治療の有効性を試験するために特に使用され得る。これは、キジ科鳥類胚に移植された患者自身の腫瘍由来の細胞において事前に試験された治療分子を患者に投与することを可能にし、それにより、高度に個別的な治療アプローチが可能になる。
【００１４】
したがって、本発明はまた、in vivoにおける神経芽細胞腫瘍の処置のための治療分子をスクリーニングするための方法であって、以下の工程：
ａ）上記方法にしたがって、胚を調製すること；
ｂ）候補治療分子をこれらの胚に投与すること；
ｃ）前記分子の投与の少なくとも２４時間後に、該胚に存在する腫瘍の腫瘍形成を評価すること
からなる方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ニワトリ胚の発生初期の説明。
【図２】ウズラ（Japanese quail）及びニワトリ（chick）胚の発生初期の対応表。
【図３】キジ科鳥類胚を調製するための方法（移植）、及び移植細胞の遊走（４８時間の時点における分析）の概略図。
【図４】ヒト神経芽細胞腫細胞（破線円）の移植の４８時間後の腫瘍病巣の位置。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
発明の詳細な説明
キジ科鳥類胚（特に、ニワトリ胚又はウズラ胚）は、in vivoで実験を行うための、特に胚発生を研究するための、及び異種移植実験のための有利なモデルである。実際、それは安価であり、非常に入手容易であり、取り扱いが容易である。それは、細胞の増殖、分化及び遊走を研究するための最適なモデルである。
【００１７】
特に、標識細胞、例えば蛍光タンパク質をコードする遺伝子でトランスフォーメーションされた細胞は、発生中の細胞の遊走を視覚化するために使用されている。N. Le Douarinによって開発されたウズラ及びニワトリのキメラは、胚形成中の細胞遊走を研究するために広く使用されている。
【００１８】
より最近では、ニワトリ胚へのヒト細胞の異種移植は、前記胚の発生中に、これらのヒト細胞に何が起こるかを研究することを可能にした。
【００１９】
米国特許出願公開第２０１３／０１７１６８０号には、ニワトリ胚への悪性ヒト造血細胞の異種移植が記載されており、これらの細胞は、胚内において腫瘍を形成する。このモデルは、導入されたこれらの腫瘍細胞に対する効果を経時的に決定するために、新たな治療分子を試験することを可能にする。
【００２０】
Carterら（Oncogenesis, 2012）は、ＭＹＣＮ発ガン遺伝子を過剰発現する予後不良の腫瘍由来のヒト神経芽細胞腫細胞をニワトリ胚（ステージ３及び６日）の血管に注射した。血流に注射されたこれらの神経芽細胞腫細胞は、交感神経節に向かうが、副腎には向かわない。胚微小環境と接触すると、細胞は、特に神経組織に結合する場合に、より良性の表現型に再プログラミングされる。したがって、この方法は、ニワトリ胚において、ヒト疾患に特徴的な特異的に局在した腫瘍を再現することができない。
【００２１】
本発明は、ヒト疾患と同じ部位において（すなわち、交感神経節及び副腎髄質の位置において）、ヒト神経芽細胞腫細胞が腫瘍を形成することを可能にする条件下で、これらの神経芽細胞腫細胞が神経堤のレベルで移植されているキジ科鳥類胚（好ましくは、ニワトリ胚又はウズラ胚）に関する。
【００２２】
以下の用語は、本発明をより良く理解するために定義される：
【００２３】
「キジ科鳥類」という用語は、ニワトリ、ウズラ、シチメンチョウ、キジ、ホロホロチョウ及び他の農場動物を含むキジ目（又はキジ類）の鳥を意味する。好ましくは、胚は、ニワトリ（Gallus gallus）又はウズラ（Coturnix japonica）（これらは、研究室で一般に使用される２種である）に由来するであろう。
【００２４】
「キジ科鳥類胚」という用語は、適切な条件下で、特にそれを加温インキュベーター内に置く場合には３７℃〜３９℃の温度で、胚が正常に発生するキジ科鳥類受精卵を意味する。いくつかの発生段階が図２に列挙されており、ウズラ胚は左側の列に示されており、ニワトリ胚は右側の列に示されている。
【００２５】
「胚」、「キジ科鳥類胚」及び「移植胚」という用語は、本出願では区別なく使用され、本発明の目的では「キメラ胚」（すなわち、少なくとも２つの異なる個体由来の細胞を有する胚）を意味する。ウズラ／ニワトリキメラ胚は、これらの種の胚発生を研究するためによく使用されている。これらの実験では、胚のフラグメント全体を第２の胚由来の同等のフラグメントと交換し、これにより、レシピエント胚の細胞と区別可能な移植細胞がどうなるのかを決定することが可能になる。
【００２６】
本発明との関連では、「レシピエント」又は「レセプター」胚は、それ自体の全細胞を含むキジ科鳥類胚であって、ヒト神経芽細胞腫細胞（これは、移植されて、レシピエント胚内においてそれらが移植片として受け入れられた後に、胚の不可欠な要素となっている）も含むキジ科鳥類胚である。
【００２７】
このキメラ胚は、真の意味において「キメラ」ではなく、胚が成体生物を作り出すのに十分なほど発生するものではないが、単にヒト細胞の保持体として短期間機能する動物研究モデルを意味すると理解される。いずれにしても、このキジ科鳥類胚は、生きているキメラ生物を生じさせることはなく、移植ヒト細胞がどうなるのかという研究の終了後直ぐに破壊されると理解される。
【００２８】
「移植された」又は「移植」という用語は、レセプター生物の正確な部位、特に特定の組織において、血流への注射によらずに、外因性細胞をレセプター生物に導入することを意味する。導入細胞は、レシピエント生物と異なる種由来の生物に由来するので、本出願は、特に「異種移植」に関する。
【００２９】
本発明の目的では、これらの外来起源の細胞は多能性細胞ではなく、特に、これらの細胞は「幹細胞」能を有しないと理解される。
【００３０】
「神経堤」という用語は、脊椎動物の胚において、神経管の最も背側の領域から生成された一過性の多能性細胞の集団を意味する。これらの細胞は、発生中の胚全体で遊走し、成体における多種多様な細胞型を生じさせる。神経堤は、全てのグリア細胞及び末梢神経系のニューロンの大部分に特に関与する。
【００３１】
胚の神経堤内において、神経芽細胞は、交感神経系を生じさせる前駆細胞である。神経芽細胞腫は、神経芽細胞由来の悪性腫瘍である。結果として、それは、脊柱の全長にわたって、及び副腎の内部において見られ得る。それは、特に、交感神経系の一部を形成する交感神経節において、及び副腎の一部である副腎髄質において確認されている。有利には、副腎は、哺乳動物及び鳥類の両方において存在する。
【００３２】
「ヒト神経芽細胞腫細胞」という用語は、ヒトの子供において神経芽細胞の調節不全から生じる腫瘍から単離された腫瘍細胞、又はこれらの腫瘍細胞由来の他の不死化細胞株を意味する。
【００３３】
本発明は、交感神経節及び副腎髄質において、ヒト神経芽細胞腫細胞が腫瘍を形成することを可能にする条件下で、前記細胞が神経堤のレベルで移植されているキジ科鳥類胚（特に、ニワトリ胚又はウズラ胚）から構成される胚に関する。
【００３４】
これらの「適切な条件」は、動物モデルにおいて、ヒト疾患、特に、神経芽細胞腫を患っている患者において観察される腫瘍形成の特定部位（交感神経節及び／又は副腎髄質）における腫瘍の形成を再現することを可能にする。
【００３５】
これらの「適切な条件」は、移植の部位、キジ科鳥類胚の発生段階、及び移植されるヒト細胞の量に本質的に基づく。
【００３６】
ヒト神経芽細胞腫細胞は、キジ科鳥類胚の神経堤のレベルで移植される。本発明の好ましい一態様によれば、ヒト神経芽細胞腫細胞は、胚の神経管の第７体節と第２８体節との間に、好ましくは第１２体節と第２４体節との間に、好ましくは第１８体節と第２４体節との間に、より好ましくはキジ科鳥類胚の第２０体節と第２１体節との間に移植される。特に、細胞の移植を可能にする切開は、第２０体節及び第２１体節の反対側の神経管の蓋板において行われる。
【００３７】
神経管は、胚の原始的な神経系を含む。体節は、神経管及び索状物の両側に位置する胚構造を意味し、それらは、胚の前後軸に沿って反復単位から構成される。受精の４８〜５５時間後の発生段階では、キジ科鳥類胚は、１９〜２８対の体節を含む。１４〜５４対の体節を含む様々な発生段階のニワトリ胚の説明は、図１に示されている。
【００３８】
キジ科鳥類胚へのヒト神経芽細胞腫細胞の移植は、当業者に周知の方法にしたがって行われる。実際、キジ科鳥類胚は、卵殻に小孔を作った後に、容易に入手可能である。特に、ヒト細胞の移植は、加圧マイクロインジェクター（Picopump PV830, World Precision Instruments）を使用して行われる。細胞をキジ科鳥類胚に移植するための他の技術は、従来技術に、例えばKulesa et al. (PNAS, 2006)に記載されている。
【００３９】
本発明の好ましい一実施態様によれば、ヒト神経芽細胞腫細胞は、細胞約１５０００個〜細胞約７５０００個／移植の範囲の量で移植される。特に、移植片は、約１５０００個の細胞、約２００００個、約２５０００個、約３００００個、約３５０００個、約４００００個、約４５０００個、約５００００個、約５５０００個、約６００００個、約６５０００個、約７００００個又は約７５０００ヒト神経芽細胞腫細胞を含むであろう。
【００４０】
細胞をカウントすることを可能にする方法は、当業者に周知である。特に、マイクロインジェクターを用いて移植された細胞の数は、移植前に、Malassez counting cellを使用して、所定の時間及び所定の圧力でキャピラリーから放出される細胞の数をカウントすることによって決定される。
【００４１】
好ましい一実施態様によれば、移植時に、キジ科鳥類胚（特に、ニワトリ胚又はウズラ胚）は、受精の４８〜５５時間後、好ましくは５０〜５３時間後の発生段階にある。
【００４２】
適切な条件下、特に３７℃〜３９℃の温度で、胚をインキュベーションした場合にのみ、胚の発生が開始すると理解される。したがって、「４８〜５５時間の」発生段階は、卵が、その発生の最適条件下でこの期間維持されたことを意味する。受精卵は、その発生の最適条件下に置かれる前に、１４℃で維持され得る；この１４℃の待機期間は、上記継続期間に考慮されない。
【００４３】
この発生段階では、ニワトリ胚又はウズラ胚は、１９〜２８対の体節を含む。ニワトリ胚の発生段階は、当業者に周知の、Hamburger and Hamilton (1951, J. Morphol.)によって定義される基準にしたがって決定される。図２は、ニワトリ胚とウズラ胚との間の発生段階の同等性を示す。
【００４４】
移植後に、キジ科鳥類胚は、標準的な技術にしたがって、湿度飽和インキュベーター内において、３７℃〜３９℃、好ましくは３８．５℃の温度で、少なくとも２４時間インキュベーションされる。
【００４５】
早ければ２４時間のインキュベーションで、第１の腫瘍が、キジ科鳥類胚の副腎髄質及び交感神経節において観察される。
【００４６】
本発明の特定の一態様によれば、胚は、ヒト神経芽細胞腫細胞の移植後に、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、少なくとも６０時間、少なくとも７２時間、少なくとも４日間、少なくとも５日間又は孵化までインキュベーションされる。本発明の好ましい一態様によれば、胚は、移植後に、約４８〜５２時間インキュベーションされる。
【００４７】
したがって、キジ科鳥類胚におけるヒト神経芽細胞腫細胞を区別するために、特に、それらの分布及びそれらの増殖能をモニタリングするために、有利には、移植細胞は標識される。
【００４８】
このような標識は、色素を使用して行われ得る。特に、細胞は、それらが組み込まれる細胞膜に対して親和性を有する生体染色色素であって、赤色蛍光を細胞に付与する生体染色色素（例えば、カルボシアニド）を使用して標識され得る。細胞内タンパク質と反応すると緑色蛍光を発するカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル型（ＣＦＳＥ）の色素も使用され得る。
【００４９】
本発明の特定の一態様によれば、移植ヒト神経芽細胞腫細胞は、マーカータンパク質を発現する。
【００５０】
マーカータンパク質は、従来の遺伝子工学方法によって細胞に導入された外因性遺伝子によってコードされるタンパク質を意味し、この遺伝子の発現は、この細胞において活性なプロモーターのコントロール下にあり、このタンパク質は可視的であるか、又は化学試薬と反応して可視的になることができる。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの多くのマーカータンパク質が公知である。
【００５１】
本発明の第１の態様によれば、ヒト神経芽細胞腫細胞は、少なくとも１つの不死化細胞株に由来する。
【００５２】
当業者であれば、本出願の実施例で使用したいくつかの不死化神経芽細胞腫細胞株（特に、以下の株）を認識している：
・IGR-N-91及びLA-N-5：例えば、書籍“Neuroblastoma Cell Lines” by CJ Thiele (1998)を参照のこと。
・SH-EP及びSH-SY5Y: Cancer Res-1989-Ciccarone-219-25。これらの株は、以下の名称：SH-SY5Y (ATCC（登録商標）CRL-2266（商標）)及びSH-EP (ATCC（登録商標）CRL-2269（商標）)でATCCによって販売されている。
・IMR-32: Cancer Res-1970-Tumilowicz-2110-8。この株は、以下の名称：IMR-32 (ATCC（登録商標）CCL-127（商標）)でATCCによって販売されている。
【００５３】
本発明の特定の一態様によれば、いくつかのヒト神経芽細胞腫細胞株は、胚に移植され得る。特定の一実施態様によれば、キジ科鳥類胚において、ヒト神経芽細胞腫細胞は、少なくとも２つの不死化細胞株、特に、それぞれ異なるマーカータンパク質を発現する２つの株に由来する。
【００５４】
本発明の第２の態様によれば、胚に移植されたヒト神経芽細胞腫細胞は、患者由来の腫瘍に由来する。手術による摘出後に、前記腫瘍を解剖して、少なくとも１５０００個の神経芽細胞腫細胞を単離する；次いで、これらの細胞を、カルボシアニド又はカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）など生体染色色素で標識し、次いで、受精の４８〜５５時間後の発生段階の胚に移植する。
【００５５】
本発明はまた、キジ科鳥類胚（特に、ニワトリ胚又はウズラ胚）を調製するための方法であって、該キジ科鳥類胚の交感神経節及び／又は副腎髄質において、ヒト神経芽細胞腫細胞が腫瘍を形成することを可能にする適切な条件下で、前記細胞を、該胚の神経堤のレベルで移植することを含む方法に関する。
【００５６】
特に、キジ科鳥類胚を調製するためのこの方法は、以下の工程：
−ヒト神経芽細胞腫細胞を、キジ科鳥類胚の神経堤のレベルで移植すること、及び
−該移植胚を少なくとも２４時間インキュベーションすること
を含む。
【００５７】
前記方法の好ましい一態様によれば、ヒト神経芽細胞腫細胞は、胚の神経管の第７体節と第２８体節との間に、好ましくは第１２体節と第２４体節との間に、より好ましくは第１８体節と第２４体節との間に移植される。
【００５８】
好ましくは、ヒト神経芽細胞腫細胞は、細胞約１５０００個〜細胞約７５０００個／移植の割合で移植される。
【００５９】
前記方法の好ましい一態様によれば、移植は、４８〜５５時間の発生段階の胚において行われる。
【００６０】
胚のインキュベーションは、標準的な条件下、３７℃〜３９℃の温度で行われる。本発明の特定の一態様によれば、胚は、ヒト神経芽細胞腫細胞の移植後に、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、少なくとも６０時間、少なくとも７２時間、少なくとも４日間、少なくとも５日間又は孵化までインキュベーションされる。本発明の好ましい一態様によれば、前記方法は、移植胚を約４８〜５２時間インキュベーションする工程を含む。
【００６１】
この方法は、図３に図示されている。
【００６２】
この方法の第１の実施によれば、ヒト神経芽細胞腫細胞は、少なくとも１つの不死化細胞株に由来する。
【００６３】
したがって、本発明は、キジ科鳥類胚を調製するための方法であって、以下の連続工程：
−神経芽細胞腫細胞の少なくとも１つの不死化株を、適切な培地中で培養すること；
−これらの細胞を、細胞約１５０００個〜細胞約７５０００個／移植の割合で、（受精後）４８〜５５時間の発生段階のキジ科鳥類胚の第７体節と第２８体節との間に、好ましくは第１２体節と第２４体節との間に、より好ましくは第１８体節と第２４体節との間に移植すること、
−該移植胚を少なくとも２４時間インキュベーションすること
を含む方法に関する。
【００６４】
「適切な培養培地」は、細胞の成長に適切な培養培地、例えば抗生物質を補充し、ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ培地又はＲＰＭＩ１６４０培地（Gibco）を意味する。
【００６５】
好ましくは、不死化株の細胞は、先に示されているように、マーカータンパク質を発現するか、又は色素で標識される。
【００６６】
交感神経節及び／又は副腎髄質における腫瘍は、早ければ２４時間で出現し、移植胚の４８時間のインキュベーション後において明確に識別可能である。交感神経節及び／又は副腎髄質におけるこれらの腫瘍は、移植後少なくとも９６時間存続する。
【００６７】
前記方法の第２の実施によれば、ヒト神経芽細胞腫細胞は、患者由来の腫瘍に由来する。
【００６８】
したがって、本発明は、キジ科鳥類胚を調製するための方法であって、以下の工程：
−特に腫瘍内の細胞のサンプルを採取することによって、患者由来の神経芽細胞腫細胞を得ること；
−これらの細胞を、４８〜５５時間の発生段階のキジ科鳥類胚の第７体節と第２８体節との間に、好ましくは第１２体節と第２４体節との間に、より好ましくは第１８体節と第２４体節との間に移植すること、
−該移植胚を少なくとも２４時間インキュベーションすること
を含む方法に関する。
【００６９】
患者から採取されたヒト細胞はカウントされ、少なくとも細胞１５０００個／移植、好ましくは細胞約１５０００〜約７５０００個／移植の割合で移植される。
【００７０】
移植後に、レシピエント胚においてこれらの細胞を検出することが可能であろう。当業者に周知のいくつかの手順にしたがって、この検出を行うことが可能であり、特に：
−神経芽細胞腫細胞によって特異的に発現される膜抗原を認識する抗体を使用して視覚化することによって。例として、ジスアロガングリオシド２（ＧＤ２）（ヒト神経芽細胞腫細胞によって最も一般に発現される表面抗原）を認識する抗体が使用され得る；
−移植前に、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ＲＦＰ（赤色蛍光タンパク質）又は（オレンジ色の蛍光を発する）mCherryなどの蛍光タンパク質をコードする核酸カセットで神経芽細胞腫細胞を遺伝的にトランスフォーメーションすることによって；
−移植前に、生体細胞染色色素で神経芽細胞腫細胞を染色することによって。赤色膜蛍光を細胞に付与する生体細胞染色色素（例えば、カルボシアニド）、又は緑色細胞間蛍光を発するカルボキシフロセシンスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）などの生体染色色素が使用され得る。
【００７１】
本発明はまた、神経芽細胞腫を患っている患者をモニタリングするための方法であって、
ａ）上記方法にしたがって、Ｔ１時点における前記患者由来の神経芽細胞腫細胞を用いて、第１のキジ科鳥類胚を調製し、この第１の胚において発生する腫瘍の腫瘍形成を評価すること、
ｂ）上記方法にしたがって、Ｔ２時点における前記患者由来の神経芽細胞腫細胞を用いて、第２のキジ科鳥類胚を調製し、この第２の胚において発生する腫瘍の腫瘍形成を評価すること、
ｃ）該第１の胚及び該第２の胚において発生する腫瘍の腫瘍形成を比較すること
を含む方法に関する。
【００７２】
胚において発生する腫瘍は、移植ヒト神経芽細胞腫細胞の遊走に由来する。これらの腫瘍は、交感神経節及び／又は副腎髄質において発生する。これらの腫瘍は、ヒト神経芽細胞腫細胞からなる。
【００７３】
「腫瘍の腫瘍形成の評価」は、いくつかの相補的アプローチによって行われる：顕微解剖による腫瘍のサンプリング後に、前記腫瘍は、様々な分析に供される：
−生化学研究及びトランスクリプトーム研究；並びに
−その再培養によるin vitro研究。
【００７４】
これらの様々な分析は、特に以下の「腫瘍形成因子」を決定することを可能にする：
−組織学的分析による腫瘍病巣の局在性；
−３次元再構成画像からの腫瘍体積の測定；
−Ｋｉ６７マーカーの検出による腫瘍病巣における増殖指数の決定；
−血管新生マーカーの検出による腫瘍病巣の血管新生指数の決定；
−細胞死事象（ＤＮＡフラグメンテーション、壊死、シトクロムｃの放出、プロアポトーシスプロテアーゼの活性化）の検出による腫瘍病巣における細胞死指数の決定；
−in situで抽出された腫瘍のトランスクリプトーム及びプロテオームの分析；
−再培養後の細胞挙動の研究。
【００７５】
当業者に周知のこれら全ての因子の複合分析は、腫瘍の重症度及び侵襲性の定量を可能にする「腫瘍形成指数」を決定することを可能にする。実際、これらのパラメータは全て、神経芽細胞の分化の状態、並びにさらに生物におけるそれらの増殖能及び播種能を評価することを可能にする。これらのパラメータは、神経芽細胞腫の解剖学的分類の不可欠な要素であり、医師は、治療的処置を指示するための根拠としてこれらを使用する。
【００７６】
したがって、
−キジ科鳥類胚において、Ｔ１時点における患者由来の神経芽細胞腫細胞の移植後に発生する腫瘍、及び
−キジ科鳥類胚において、Ｔ２時点における患者由来の神経芽細胞腫細胞の移植後に発生する腫瘍
を区別することが可能である。
【００７７】
このような方法は、患者の疾患の発症、特にＴ０時点（例えば、処置開始前）及びＴ１、Ｔ２、Ｔ３時点（例えば、患者の処置開始の数カ月後）におけるそれらの腫瘍細胞の腫瘍形成指数をex vivoでモニタリングすることを可能にする。
【００７８】
当然のことながら、前記方法は、所定の患者における疾患進行をモニタリングするために、必要回数だけ反復され得る。
【００７９】
最後に、本発明は、in vivoで神経芽細胞腫瘍の処置のための治療分子をスクリーニングするための方法であって、以下の連続工程：
ａ）上記方法の１つにしたがって、不死化神経芽細胞腫細胞又は患者由来の神経芽細胞腫細胞から、キジ科鳥類胚を調製すること；
ｂ）候補治療分子をこれらの胚に投与すること；
ｃ）前記候補分子の投与の少なくとも２４時間後に、該胚に存在する腫瘍の腫瘍形成を評価すること
からなる方法に関する。
【００８０】
「候補治療分子」という用語は、神経芽細胞腫を処置するために潜在的に有効な化学的分子又は生物学的分子を意味することを意図する。
【００８１】
腫瘍の腫瘍形成の評価は、顕微解剖による腫瘍のサンプリング後に、上記のアプローチによって行われる。Ｔ０時点における腫瘍の腫瘍形成と、試験分子の投与の少なくとも２４時間後、特に１日後（Ｔ１）、２日後（Ｔ２）又は３日後（Ｔ３）日後における腫瘍の腫瘍形成との比較は、投与される治療分子の効果を決定することを可能にする。当然のことながら、腫瘍がキジ科鳥類胚に常に存在するという条件で、この分子の投与は、様々な時間、特に少なくとも２４時間、４８時間、７２時間、９６時間及び５日間まで、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日又は孵化まで行われ得る。
【００８２】
本発明をより良く理解するために、特定の事例を以下に詳細に記載する：
−患者由来の腫瘍細胞の移植によって、キジ科鳥類胚を調製する；
−胚を４８時間インキュベーションした後に、この胚において、腫瘍を観察する；
−これらの腫瘍の１つの第１のサンプルを採取し（Ｔ０）、分析する；
−当業者に公知の通常の技術によって、特に、胚の血管への注射によって、治療分子をこのキジ科鳥類胚に投与する；胚を、その発生に適切な温度及び湿度条件下で維持する；
−治療分子をキジ科鳥類胚に投与した３日後（Ｔ３）に、腫瘍の第２のサンプルを採取し、このサンプルを、上記に詳細に記載されているように分析する。
【００８３】
Ｔ０においてサンプリングした腫瘍の腫瘍形成指数が高い場合（重度かつ侵襲性の腫瘍）、及びＴ３（治療分子を投与した３日後）における腫瘍のこの腫瘍形成指数が「高」から「中」に減少している場合、実験者は、これから、試験治療分子の効果が陽性であると結論することができるであろう。
【実施例】
【００８４】
材料及び方法
細胞株
ヒト神経芽細胞腫株は、ATCC（SH-EP、IMR-32、SH-SY5Y、LAN-5）から入手したか、又はDr. J. Benard (IGR-N-91, Institut Gustave Roussy, Villejuif, France)による寄贈であった。SH-EP、IMR-32及びLAN-5株をＲＰＭＩ１６４０培地（Gibco）中で培養し、IGR-N-91及びSH-SY5Y株をＤＭＥＭ培地（Gibco）中で培養した。２５単位／mlのペニシリン−ストレプトマイシン（Gibco）、２．５μg/mlのアンホテリシンＢ（Gibco）及び１０％ウシ胎児血清（Gibco）を各培地に補充した。
【００８５】
ニワトリ胚
地元の供給業者（EARL Morizeau, Dangers, France）からニワトリ（Gallus gallus）受精卵を購入し、使用まで１４℃で維持した。飽和レベルの湿度のインキュベーター内において、卵を３８．５℃で５２時間インキュベーションし、ＨＨ１３〜ＨＨ１６発生段階の胚を得た。
【００８６】
ニワトリ胚におけるヒト腫瘍株移植
５×１０６個の腫瘍細胞を採取し、培地３０μlに懸濁した。
【００８７】
３８．５℃で５２時間インキュベーションした後に、胚を視覚化及びアクセスするために、殻においてウィンドウを切り取った。卵黄膜を神経管の位置で切断し、第２０体節及び第２１体節の反対側の神経管の蓋板において創傷を作った。細胞をガラスマイクロキャピラリーに挿入し、加圧マイクロインジェクター（Picopump PV830, World Precision Instruments）を使用して堆積させた。このようにして、細胞を、第１〜２体節に対応する領域の神経管の背側蓋板の位置に移植した。次いで、卵を、３８．５℃のインキュベーター内に５２時間戻した。
【００８８】
ニワトリ胚の切片
胚を採取し、４％パラホルムアルデヒド中、４℃で一晩固定した。所望の分析の種類に応じて、胚を切断して矢状切片及び横断切片を生産した。切片を、使用まで、暗所において４℃のＰＢＳ中で維持した。ＧＦＰ又はＲＦＰ（マーカータンパク質）を発現するように事前にトランスダクションした腫瘍細胞の蛍光の様々な免疫標識の検出によって、腫瘍の局在性を研究した。
【００８９】
in situにおける腫瘍サンプリング及び分析
腫瘍を顕微解剖によってサンプリングし、様々な分析に供する：
−生化学的研究及びトランスクリプトーム研究（公知の又は新たな分子マーカーの特性評価及び探索）、並びに
−その再培養によるin vitro研究。
【００９０】
画像の撮影及び処理
共焦点顕微鏡（Olympus IX81）を使用して、切片を分析した。XuvTools softwareを使用して、切片の全体画像を再構成した。
【００９１】
様々な分析によって、腫瘍形成を評価した：
−組織学的分析による腫瘍病巣の局在性の決定；
−３次元再構成画像からの腫瘍体積の測定；
−Ｋｉ６７マーカーの検出による腫瘍病巣における増殖指数の決定；
−血管新生マーカーの検出による腫瘍病巣の血管新生指数の決定；
−細胞死事象（ＤＮＡフラグメンテーション、壊死、シトクロムｃの放出、プロアポトーシスプロテアーゼの活性化）の検出による腫瘍病巣における細胞死指数の決定；
−in situで抽出された腫瘍のトランスクリプトーム及びプロテオームの分析；
−再培養後の細胞挙動の研究。
【００９２】
結果
５つのステージ４ヒト神経芽細胞腫株：IGR-N-91、Lan5、SH-SY5Y、SH-EP及びIMR32を、ニワトリ胚の脊髄の背側蓋板（これは、交感神経副腎神経堤の部位である）の位置に移植した。各胚において、単一の細胞株を、細胞約１５０００〜７５０００個／移植の割合で導入した。
【００９３】
移植の４８時間後に、胚の６０％〜９５％において、移植した株に応じて、蛍光細胞が移植部位に残り、内因性神経堤細胞が取るものと同様の腹側経路を取った。交感神経節において、副腎髄質において、及び／又は脊髄と背側脊髄神経節との間に、腫瘍塊の形成が専ら観察された。これらの腫瘍病巣の局在性は、子供における神経芽細胞腫の発生部位と同一である。
【００９４】
移植の７２時間後及び９６時間後に、これらの腫瘍塊を維持し、増幅し、後腹膜（ヒトにおける神経芽細胞転移の主な発生部位）の位置で主に検出された二次病巣に関連付ける。興味深いことに、この挙動は、神経芽細胞腫株に特異的であると思われる。実際、同一のプロトコールにしたがって、ニワトリ胚に移植した蛍光黒色腫又は肺ガン細胞は、「腹側」経路にしたがって遊走せず、交感神経副腎派生物において確立されない。
【００９５】
さらに、同じニワトリ胚において、異なる蛍光タンパク質を発現する２つの神経芽細胞腫株を移植する可能性を研究した。結果として、移植の４８時間後に、各細胞株の組織局在性を明確に観察することができる。これは、胚間の考えられる変動に関係するあらゆるバイアスを回避しながら、２つの神経芽細胞腫株の挙動を直接比較することを可能にする。例えば、移植の前処置に供された細胞を、未処置のホモログと直接比較することができる。同様に、薬物処置の前後の患者由来の腫瘍サンプルの任意の挙動差を容易に測定することができる。
【００９６】
参考文献
特許文献
米国特許出願公開第２０１３／０１７１６８０号
非特許文献
【表１】
2017527265.tif 000002
【図１】
2017527265.tif 000003
【図２】
2017527265.tif 000004
【図３】
2017527265.tif 000005
【図４】
2017527265.tif 000006
【国際調査報告】
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2017527265.tif 000008
2017527265.tif 000009
2017527265.tif 000010
2017527265.tif 000011
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