(57)【要約】本発明は、標的特異的ヌクレアーゼを用いた遺伝子型分析方法に関し、具体的には、標的特異的ヌクレアーゼまたはその変異体を利用して野生型ＤＮＡまたは特定の遺伝子型ＤＮＡを除去して突然変異などの変異または遺伝子型の差異がある目的とする少量のＤＮＡのみを増幅するか、濃縮して癌の診断または遺伝子型の分析をする方法、及び標的特異的ヌクレアーゼまたはその変異体を利用して目的とするＤＮＡを分離する方法に関する。このような方法は、既存の単純なＰＣＲの後、正常遺伝子型と発癌遺伝型を認識する標的特異的ヌクレアーゼとは反対の新しいパラダイムの方法により癌の早期診断または類似の遺伝子型の分析に有用に用いることができる。
2017516500.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）二つ以上の遺伝子型ＤＮＡの混合物を含む分離された試料内の特定の遺伝子型ＤＮＡを、前記特定の遺伝子型特異的なヌクレアーゼを用いて切断して除去するステップ、及び（ｉｉ）前記特定の遺伝子型ＤＮＡが除去された試料内に存在する他の遺伝子型ＤＮＡを分析するステップを含む、遺伝子型分析方法。
【請求項２】
前記遺伝子型分析方法が、（ａ）二つ以上の遺伝子型ＤＮＡの混合物を含む分離された試料内の特定の遺伝子型ＤＮＡを、前記特定の遺伝子型特異的なヌクレアーゼを用いて切断して除去するステップ、（ｂ）前記特定の遺伝子型ＤＮＡが除去された試料内に存在する他の遺伝子型ＤＮＡを増幅するステップ、及び（ｃ）前記増幅された他の遺伝子型ＤＮＡを分析するステップを含めて行うものである、請求項１に記載の遺伝子型分析方法。
【請求項３】
前記ヌクレアーゼが、ＺＦＮ（ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）、ＴＡＬＥＮ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ
ｎｕｃｌｅａｓｅ）、及びＲＧＥＮ（ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）からなる群から選択されたヌクレアーゼである、請求項１に記載の遺伝子型分析方法。
【請求項４】
前記ステップ（ｉ）において特定の遺伝子型ＤＮＡが野生型ＤＮＡであり、分離された試料内の野生型ＤＮＡに特異的なヌクレアーゼを用いて前記野生型ＤＮＡを切断して試料内から除去するステップであり、前記ステップ（ｉｉ）の他の遺伝子型ＤＮＡが癌特異的な突然変異を含むＤＮＡであり、前記野生型ＤＮＡが除去された試料内の癌特異的な突然変異ＤＮＡを分析するステップを含む、癌の診断のためのものである、請求項１に記載の遺伝子型分析方法。
【請求項５】
前記癌の診断が癌の初期診断である、請求項４に記載の遺伝子型分析方法。
【請求項６】
前記癌の診断が癌の予後を予測するものである、請求項４に記載の遺伝子型分析方法。
【請求項７】
二つ以上の遺伝子型ＤＮＡの混合物を含む分離された試料が、癌の疑いのある個体から分離された血液試料である、請求項４に記載の遺伝子型分析方法。
【請求項８】
前記ステップ（ｉ）において特定の遺伝子型ＤＮＡが細胞または臓器移植を受けた個体のＤＮＡであり、前記ステップ（ｉ）が、二つ以上の遺伝子型ＤＮＡが含まれた、細胞または臓器移植を受けた個体の分離された試料から前記個体のＤＮＡを、これに特異的なヌクレアーゼを用いて切断して除去するステップであり、前記ステップ（ｉｉ）において他の遺伝子型ＤＮＡが移植された細胞または臓器のＤＮＡであり、前記ステップ（ｉｉ）が前記個体のＤＮＡが除去された試料内に、移植された細胞または臓器のＤＮＡを分析するステップを含む、細胞または臓器移植を受けた個体の予後予測のためのものである、請求項１に記載の遺伝子型分析方法。
【請求項９】
前記ステップ（ｉ）において特定の遺伝子型ＤＮＡが被害者のＤＮＡであり、前記ステップ（ｉ）が、二つ以上の遺伝子型ＤＮＡが含まれた、犯罪現場に由来する分離されたＤＮＡ試料から前記被害者のＤＮＡを、これに特異的なヌクレアーゼを用いて切断して除去するステップであり、前記ステップ（ｉｉ）において他の遺伝子型ＤＮＡが加害者のＤＮＡであり、前記ステップ（ｉｉ）が、前記被害者のＤＮＡが除去された試料内に加害者のＤＮＡを分析するステップを含む、犯罪現場に関する情報を収集するためのものである、請求項１に記載の遺伝子型分析方法。
【請求項１０】
前記ステップ（ｉ）において特定の遺伝子型ＤＮＡが加害者のＤＮＡであり、前記ステップ（ｉ）が、二つ以上の遺伝子型ＤＮＡが含まれた、犯罪現場に由来する分離されたＤＮＡ試料から前記加害者のＤＮＡを、これに特異的なヌクレアーゼを用いて切断して除去するステップであり、前記ステップ（ｉｉ）において他の遺伝子型ＤＮＡが被害者のＤＮＡであり、前記ステップ（ｉｉ）が、前記加害者のＤＮＡが除去された試料内に、被害者のＤＮＡを分析するステップを含む、犯罪現場に関する情報を収集するためのものである、請求項１に記載の遺伝子型分析方法。
【請求項１１】
（ｉ）特定の遺伝子型ＤＮＡに特異的なガイドＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ、ｇＲＮＡ）及び不活性化されたＣａｓヌクレアーゼタンパク質（ｄＣａｓ）を利用して二つ以上の遺伝子型ＤＮＡの混合物を含む分離された試料内の特定の遺伝子型ＤＮＡを、他の遺伝子型ＤＮＡを認識するＲＧＥＮの切断からマスキングして保護し、前記他の遺伝子型ＤＮＡを切断して除去するステップ、及び（ｉｉ）前記他の遺伝子型ＤＮＡが除去された試料内に存在する特定の遺伝子型ＤＮＡを分析するステップを含む、遺伝子型分析方法。
【請求項１２】
前記分析方法が、（ａ）特定の遺伝子型ＤＮＡに特異的なガイドＲＮＡ及び不活性化されたＣａｓヌクレアーゼタンパク質（ｄＣａｓ）を利用して二つ以上の遺伝子型ＤＮＡの混合物を含む分離された試料内の前記特定の遺伝子型ＤＮＡを、他の遺伝子型ＤＮＡを認識するＲＧＥＮの切断からマスキングして保護し、前記他の遺伝子型ＤＮＡを切断して除去するステップ、（ｂ）前記他の遺伝子型ＤＮＡが除去された試料内の特定の遺伝子型ＤＮＡを増幅するステップ、及び（ｃ）前記増幅された特定の遺伝子型ＤＮＡを分析するステップを含めて行うものである、請求項１１に記載の遺伝子型分析方法。
【請求項１３】
前記ステップ（ｉ）において他の遺伝子型ＤＮＡが野生型ＤＮＡであり、特定の遺伝子型ＤＮＡは癌特異的な突然変異を含むＤＮＡであり、前記癌特異的な突然変異を含む特定の遺伝子型ＤＮＡに特異的に結合するガイドＲＮＡ及び不活性化されたＣａｓヌクレアーゼタンパク質（ｄＣａｓ）を利用して野生型ＤＮＡに特異的なＲＧＥＮの切断から特定の遺伝子型ＤＮＡをマスキングして保護し、分離された試料内の野生型ＤＮＡを切断して除去するステップ、及び（ｉｉ）前記野生型ＤＮＡが除去された試料内に存在する癌特異的突然変異を含むＤＮＡを分析するステップを含む、癌の診断のためのものである、請求項１１に記載の遺伝子型分析方法。
【請求項１４】
前記癌の診断が癌の初期診断である、請求項１３に記載の遺伝子型分析方法。
【請求項１５】
前記癌の診断が癌の予後を予測するものである、請求項１３に記載の遺伝子型分析方法。
【請求項１６】
二つ以上の遺伝子型ＤＮＡの混合物を含む分離された試料が、癌の疑いのある個体から分離された血液試料である、請求項１３に記載の遺伝子型分析方法。
【請求項１７】
前記ステップ（ｉ）において他の遺伝子型ＤＮＡが細胞または臓器移植を受けた個体のＤＮＡであり、特定の遺伝子型ＤＮＡが移植された細胞または臓器のＤＮＡであり、前記移植された細胞または臓器のＤＮＡに特異的に結合するガイドＲＮＡ及び不活性化されたＣａｓヌクレアーゼタンパク質（ｄＣａｓ）を利用して細胞または臓器移植を受けた個体のＤＮＡに特異的なＲＧＥＮの切断から前記特定の遺伝子型ＤＮＡをマスキングして保護し、分離された試料内の細胞または臓器移植を受けた個体のＤＮＡを切断して除去するステップ、及び（ｉｉ）前記細胞または臓器移植を受けた個体のＤＮＡが除去された試料内に存在する移植された細胞または臓器のＤＮＡを分析するステップを含む、細胞または臓器移植を受けた個体の予後予測のためのものである、請求項１１に記載の遺伝子型分析方法。
【請求項１８】
前記ステップ（ｉ）において他の遺伝子型ＤＮＡが被害者のＤＮＡであり、特定の遺伝子型ＤＮＡは加害者のＤＮＡであり、前記加害者のＤＮＡに特異的に結合するガイドＲＮＡ及び不活性化されたＣａｓヌクレアーゼタンパク質（ｄＣａｓ）を利用して被害者のＤＮＡに特異的なＲＧＥＮの切断から前記特定の遺伝子型ＤＮＡをマスキングして保護し、分離された試料内の被害者のＤＮＡを切断して除去するステップ、及び（ｉｉ）前記被害者のＤＮＡが除去された試料内に存在する加害者のＤＮＡを分析するステップを含む、犯罪現場に関する情報を収集するためのものである、請求項１１に記載の遺伝子型分析方法。
【請求項１９】
前記ステップ（ｉ）において他の遺伝子型ＤＮＡが加害者のＤＮＡであり、特定の遺伝子型ＤＮＡが被害者のＤＮＡであり、前記被害者のＤＮＡに特異的に結合するガイドＲＮＡ及び不活性化されたＣａｓヌクレアーゼタンパク質（ｄＣａｓ）を利用して加害者のＤＮＡに特異的なＲＧＥＮの切断から前記特定の遺伝子型ＤＮＡをマスキングして保護し、分離された試料内の加害者のＤＮＡを切断して除去するステップ、及び（ｉｉ）前記加害者のＤＮＡが除去された試料内に存在する被害者のＤＮＡを分析するステップを含む、犯罪現場に関する情報を収集するためのものである、請求項１１に記載の遺伝子型分析方法。
【請求項２０】
前記不活性化されたＣａｓタンパク質が、Ｃａｓタンパク質のＤＮＡ切断活性の欠如したものである、請求項１１に記載の遺伝子型分析方法。
【請求項２１】
前記不活性化されたＣａｓタンパク質が、Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０ＡまたはＤ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ突然変異を有するＣａｓ９タンパク質の変異体である、請求項２０に記載の遺伝子型分析方法。
【請求項２２】
（ｉ）細菌またはウイルスＤＮＡを含む分離された試料に非病原性細菌または非病原性ウイルスＤＮＡに特異的なヌクレアーゼを処理して非病原性細菌または非病原性ウイルスＤＮＡを切断して試料内から除去するステップ、及び（ｉｉ）前記非病原性細菌またはウイルスＤＮＡが除去された試料内に病原性細菌または病原性ウイルスＤＮＡを分析するステップを含む、試料内ＤＮＡの遺伝子型分析方法。
【請求項２３】
前記分析方法が、（ａ）細菌またはウイルスＤＮＡを含む分離された試料に非病原性細菌または非病原性ウイルスＤＮＡに特異的なヌクレアーゼを処理して非病原性細菌または非病原性ウイルスＤＮＡを切断して試料内から除去するステップ、（ｂ）前記非病原性細菌またはウイルスＤＮＡが除去された試料内の病原性細菌または病原性ウイルスＤＮＡを増幅するステップ、及び（ｃ）前記増幅された病原性細菌または病原性ウイルスＤＮＡを分析するステップを含めて行うものである、請求項２２に記載の試料内ＤＮＡの遺伝子型分析方法。
【請求項２４】
前記ヌクレアーゼが、ＺＦＮ（ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）、ＴＡＬＥＮ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ
ｎｕｃｌｅａｓｅ）、及びＲＧＥＮ（ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）からなる群から選択されたヌクレアーゼである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
（ｉ）病原性細菌またはウイルスＤＮＡ特異的ガイドＲＮＡ及び不活性化されたＣａｓヌクレアーゼタンパク質（ｄＣａｓ）を利用して病原性細菌またはウイルスＤＮＡを非病原性細菌またはウイルスに特異的なＲＧＥＮの切断からマスキングして保護し、分離された試料内の非病原性細菌またはウイルスＤＮＡを試料内から切断して除去するステップ、
及び（ｉｉ）前記非病原性細菌またはウイルスＤＮＡが除去された試料に病原性細菌またはウイルスＤＮＡを分析するステップを含む、試料内ＤＮＡの遺伝子型分析方法。
【請求項２６】
前記分析方法が、（ａ）病原性細菌またはウイルスＤＮＡ特異的ガイドＲＮＡ及び不活性化されたＣａｓヌクレアーゼタンパク質（ｄＣａｓ）を利用して病原性細菌またはウイルスＤＮＡを非病原性細菌またはウイルスに特異的なＲＧＥＮの切断からマスキングして保護し、分離された試料内の非病原性細菌またはウイルスＤＮＡを試料内から切断して除去するステップ、（ｂ）前記非病原性細菌またはウイルスＤＮＡが除去された試料内の病原性細菌またはウイルスＤＮＡを増幅するステップ、及び（ｃ）前記増幅された病原性細菌またはウイルスＤＮＡを分析するステップを含めて行うものである、請求項２５に記載の試料内ＤＮＡの遺伝子型分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的特異的ヌクレアーゼを用いた遺伝子型分析方法に関し、具体的には、標的特異的ヌクレアーゼまたはその変異体を利用して野生型ＤＮＡまたは特定の遺伝子型ＤＮＡを除去して突然変異などの変異または遺伝子型の差異がある目的とする少量のＤＮＡのみを増幅したり、濃縮して癌の診断または遺伝子型の分析をする方法、及び標的特異的ヌクレアーゼまたはその変異体を利用して目的とするＤＮＡを分離する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血漿ＤＮＡは身体の種々の細胞に由来するＤＮＡ断片を有している。ヒトのすべての細胞は同じ遺伝情報を有しているが、外部の細胞が加わる場合（細胞治療または臓器移植など）または内部の細胞において突然変異が起こる場合、非均一（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）の状態になることがある。
【０００３】
このような状況の例としては、１）癌（癌は、様々な突然変異により発生）２）妊娠（胎児のＤＮＡは母体と一致していない）、３）細胞及び臓器移植（ドナーのＤＮＡは、移植される患者のＤＮＡと一致していない）などがある。それぞれの場合、非常に低い比率であっても、同じ遺伝子に対する少しずつ異なる配列の断片が血漿ＤＮＡに存在し得る。したがって、これを敏感に分子診断的方式によって観察する技術が重要である。
【０００４】
特に、既に発生した癌患者の血液などの試料内には過量の正常ＤＮＡと突然変異が誘発された少量の癌由来ＤＮＡが混在するため、これを分析するための方法が必要である。しかし、既存の方法であるＰＣＲ−ＲＦＬＰなどの診断方法は、ＰＣＲを通じた試料ＤＮＡを増幅した後、突然変異特異的制限酵素で切断して切断如何をチェックする方法が主に用いられてきた（非特許文献１）。このような方式は、様々な診断において容易に診断が可能であるという利点があるが、依然として癌の初期診断などでは、偽陽性／陰性などに検索され正確な情報の提供には限界があるという欠点がある。
【０００５】
一方、従来の分子診断方法であるＰＣＲまたはＩＣＡ（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ｃｈａｉｎ  ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ）などは、類似した配列を有する類似種の遺伝子型の分析が困難であるという点があった。例えば、病原性細菌／ウイルスと非病原性細菌／ウイルスと非常に類似した配列を有する場合、韓牛と輸入牛のようにほぼ類似するが、特定の部位で異なる配列を有する場合など、類似種または同種内の他の個体のゲノムを特異的に検出する方式が必要である。既存の分子診断方法が類似した配列を完全に区別しなければ偽陽性／陰性が発生する可能性が高いためである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００６／０１８８９８７号明細書
【特許文献３】米国特許第６，４７９，６２６号明細書
【特許文献４】米国特許第６，９０３，１８５号明細書
【特許文献５】米国特許第７，１５３，９４９号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ．２００３  Ｍａｙ；２１（５）：５３５−４１
【非特許文献２】Ｂｅｅｒｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５−１４１
【非特許文献３】Ｐａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３−３４０
【非特許文献４】Ｉｓａｌａｎ  ｅｔ  ａｌ，（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６−６６０
【非特許文献５】Ｓｅｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２−６３７
【非特許文献６】Ｃｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１−４１６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、より正確な診断及び遺伝子型分析方法を見出すために鋭意努力した結果、驚くべきことに、既存の診断または遺伝子型分析方法のパラダイムとは反対に、標的特異的ヌクレアーゼを用いて目的としないＤＮＡを切断してあらかじめ除去したり、目的ＤＮＡに対するガイドＲＮＡ及び不活性化されたＣａｓ９タンパク質の複合体を利用して目的ＤＮＡは切断からマスキング（ｍａｓｋｉｎｇ）して目的としないＤＮＡを切断して除去することにより、突然変異などの変異または遺伝子型に差異がある、目的とする少量のＤＮＡを濃縮し得ることを確認した。また、目的ＤＮＡに対するガイドＲＮＡ及び不活性化されたＣａｓ９タンパク質の複合体を利用して目的のＤＮＡを分離精製することにより、目的とする少量のＤＮＡを濃縮し得ることを確認した。特に、細胞由来のＤＮＡを対象に不活性化されたＣａｓタンパク質及びガイドＲＮＡを利用して、目的ＤＮＡを非共有結合により分離することができることを確認した。このように濃縮された目的とするＤＮＡを分子検出または分離精製することにより、癌の診断、癌の予後予測、妊娠産前診断、細胞／臓器移植など様々な分野に利用できることを確認し、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一つの目的は、（ｉ）二つ以上の遺伝子型ＤＮＡの混合物を含む分離された試料内の特定の遺伝子型ＤＮＡを、前記特定の遺伝子型特異的なヌクレアーゼを用いて切断して除去するステップ、及び（ｉｉ）前記特定の遺伝子型ＤＮＡが除去された試料内に存在する他の遺伝子型ＤＮＡを分析するステップとを含む、遺伝子型分析方法を提供することにある。
【００１０】
本発明の他の一つの目的は、（ｉ）特定の遺伝子型ＤＮＡに特異的なガイドＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ）及び不活性化されたＣａｓヌクレアーゼタンパク質（ｄＣａｓ）を利用して二つ以上の遺伝子型ＤＮＡの混合物を含む分離された試料内の特定の遺伝子型ＤＮＡを、他の遺伝子型ＤＮＡを認識するＲＧＥＮの切断からマスキングして保護し、前記他の遺伝子型ＤＮＡを切断して除去するステップ、及び（ｉｉ）前記他の遺伝子型ＤＮＡが除去された試料内に存在する特定の遺伝子型ＤＮＡを分析するステップとを含む、遺伝子型分析方法を提供することにある。
【００１１】
また、本発明の他の目的は、（ｉ）細菌ＤＮＡを含む分離された試料に非病原性細菌または非病原性ウイルスＤＮＡに特異的なヌクレアーゼを処理して非病原性細菌または非病原性ウイルスＤＮＡを切断して試料内から除去するステップ、及び（ｉｉ）前記非病原性細菌またはウイルスＤＮＡが除去された試料内に病原性細菌または病原性ウイルスＤＮＡを含む、試料内ＤＮＡの遺伝子型分析方法を提供することにある。
【００１２】
さらに、本発明の他の目的は、（ｉ）病原性細菌ＤＮＡ特異的ガイドＲＮＡ及び不活性化されたＣａｓヌクレアーゼタンパク質（ｄＣａｓ）を利用して病原性細菌またはウイルスＤＮＡを非病原性細菌またはウイルスに特異的なＲＧＥＮの切断からマスキングして保
護し、分離された試料内の非病原性細菌またはウイルスＤＮＡを試料内から切断して除去するステップ、及び（ｉｉ）前記非病原性細菌またはウイルスＤＮＡが除去された試料に病原性細菌またはウイルスＤＮＡを分析するステップを含む、試料内ＤＮＡの遺伝子型分析方法を提供することにある。
【００１３】
さらに、本発明の他の目的は、二種類以上のＤＮＡを含む分離された試料から目的とするＤＮＡを、前記目的とするＤＮＡに特異的な、不活性化されたヌクレアーゼを用いて分離するステップとを含む、目的とするＤＮＡを分離する方法を提供することにある。
【００１４】
さらに、本発明の他の目的は、遺伝体ＤＮＡを含む分離された試料から目的とするＤＮＡを、前記目的とするＤＮＡに特異的な、不活性化されたヌクレアーゼを用いて分離するステップを含む、目的とするＤＮＡを分離する方法を提供することにある。
【００１５】
さらに、本発明の他の目的は、（ｉ）二つ以上の遺伝子型ＤＮＡの混合物を含む分離された試料内の特定の遺伝子型ＤＮＡを、前記特定の遺伝子型に特異的な不活性化されたヌクレアーゼを用いて分離するステップ、及び（ｉｉ）前記分離された特定の遺伝子型ＤＮＡを分析するステップとを含む、遺伝子型分析方法を提供することにある。
【発明の効果】
【００１６】
本発明は、従来の遺伝子型分析方法または診断方法とは全く反対の概念で、試料内の目的とするＤＮＡの増幅前に目的としないＤＮＡ、例えば、正常ＤＮＡを標的特異的ヌクレアーゼ、例えばＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＲＧＥＮを利用して切断したり、目的とするＤＮＡを不活性化されたＣａｓ９：ｇＲＮＡ複合体を利用して目的とするＤＮＡを分離するなど、目的とするＤＮＡを濃縮することにより、遺伝子型分析または癌の診断をもたらすことができる。本発明の方法では、目的ＤＮＡの検出前に、これを濃縮する過程を経ることにより偽陽性／陰性の信号などを除去して癌の初期に診断を可能にする方法を提供するだけでなく、癌患者の予後予測において正確な診断が可能な新たなパラダイムの方法を提供する。また、これにより癌細胞を早期診断したり、癌の予後予測、手術及び化学療法後の転移癌の発生のモニタリングなどが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＲＧＥＮを利用して標的ＤＮＡを濃縮する本発明に係る二つの方法に関する模式図を示した図である。
【図２】遺伝子ハサミにより誘導された突然変異の割合を増加させる方法の模式図を示した図である。
【図３】０．００５４％〜５４％の突然変異率を有している遺伝体ＤＮＡの混合物において切断前と切断後の突然変異率の変化を確認した図である。
【図４】癌遺伝子の突然変異の診断を、本発明の新たなパラダイムを適用して行えるかどうかを確認する方法に関する模式図を示した図である。
【図５】癌遺伝子の突然変異に関するＲＦＬＰ用ＲＧＥＮの開発及びその結果を示した図である。
【図６】癌遺伝子の突然変異に関するＲＦＬＰ用ＲＧＥＮを利用して確認した結果を示した図である。
【図７】ＣＵＴ−ＰＣＲを用いた変異遺伝子の増幅及び検出過程の模式図を示した図である。
【図８】プラスミドを用いたＫＲＡＳ変異遺伝子検出の実験結果を示した図である。右側の図は野生型及び変異ＫＲＡＳを含むプラスミドを示す。ＷＴ：野生型の正常遺伝子、ＭＴ：変異遺伝子。
【図９】ＫＲＡＳ正常及び変異遺伝子の割合（左）とＫＲＡＳ変異遺伝子の割合の増加率（右）を示した図である。
【図１０】様々な進行段階の大腸癌患者と健常者の血漿から得た細胞遊離ＤＮＡ（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ＤＮＡ）を利用してＣＵＴ−ＰＣＲを２回行った結果を示す図である。血漿から得たそれぞれの細胞遊離ＤＮＡに対して発生頻度の高いＫＲＡＳのｃ．３５Ｇ＞  Ａ、ｃ．３５Ｇ＞  Ｔ変異遺伝子をそれぞれターゲットし、１番目及び２番目のサイクルで増幅された変異遺伝子数（％）を示した。ＲＧＥＮ  １ｓｔ：正常遺伝子特異的なＲＧＥＮを一回処理してＰＣＲした結果、ＲＧＥＮ  ２ｎｄ：正常遺伝子特異的なＲＧＥＮを二回処理してＰＣＲした結果。
【図１１】ｄＣａｓ９を利用した標的ＤＮＡ断片精製実験過程に対する模式図を示した図である。
【図１２】プラスミド断片をｄＣａｓ９を利用して精製する実験過程に対する模式図を示した図である。
【図１３】それぞれの標的ＤＮＡを１つのｓｇＲＮＡまたは２つのｓｇＲＮＡで精製した結果を示した図である。Ｉｎｐｕｔは精製前のプラスミドＤＮＡを制限酵素で切断したサンプルである。
【図１４】３つの標的ＤＮＡ中、２つの標的ＤＮＡを精製した結果を示した図である。Ｉｎｐｕｔは精製前のプラスミドＤＮＡを制限酵素で切断したサンプルである。
【図１５】標的ＤＮＡの精製後に観察される各標的ＤＮＡのアガロースゲルバンドの強度（％）を示した図である。
【図１６】ＨｅＬａ細胞とＳＷ４８０細胞のＴＰ５３遺伝子エクソン（ｅｘｏｎ）を精製し、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ｑＰＣＲを行った結果を示した図である。
【図１７】類似した配列の病原性細菌ＤＮＡを区別して診断・確認する方法に対する模式図を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
前記目的を達成するための一つの様態として、本発明は、二つ以上の遺伝子型ＤＮＡの混合物を含む分離された試料内の特定の遺伝子型ＤＮＡを除去し、目的とする他の遺伝子型ＤＮＡを分析する方法を提供する。
【００１９】
具体的には、前記遺伝子型分析方法は、（ｉ）二つ以上の遺伝子型ＤＮＡの混合物を含む分離された試料内の特定の遺伝子型ＤＮＡを、前記特定の遺伝子型特異的なヌクレアーゼを用いて切断して除去するステップ、及び（ｉｉ）目的とする他の遺伝子型ＤＮＡを分析するステップとを含む、遺伝子型分析の方法によって行うことができる。
【００２０】
前記他の遺伝子型ＤＮＡはＰＣＲによる増幅、またはその他の当業界の公知の方法で検出する方法により確認することができる。
具体的には、ＰＣＲ、シーケンシング（例えば、ｄｅｅｐ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、Ｓａｎｇｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ＮＧＳ）、標的特異的ヌクレアーゼを用いるＲＦＬＰ（例えば、ＲＧＥＮ  ＲＦＬＰ）を利用して他の遺伝子型ＤＮＡを分析することができる。
【００２１】
前記記述された除去は、特定の遺伝子型ＤＮＡを切断してＰＣＲなどで増幅することができないという概念を含むものであり、試料内における完全または一部の除去を含む概念である。
【００２２】
より具体的には、前記方法は、（ａ）二つ以上の遺伝子型ＤＮＡの混合物を含む分離された試料内の特定の遺伝子型ＤＮＡを、前記特定の遺伝子型特異的なヌクレアーゼを用いて切断して除去するステップ、（ｂ）前記特定の遺伝子型ＤＮＡが除去された試料内に存在する他の遺伝子型ＤＮＡを増幅するステップ、  及び（ｃ）前記増幅された他の遺伝子型ＤＮＡを分析するステップを含めて行う、遺伝子型分析方法を提供することができる。
【００２３】
さらに、前記遺伝子型分析方法は、他の遺伝子型ＤＮＡが癌由来ＤＮＡである場合、癌の診断のための情報を提供するための、遺伝子型分析方法であってもよい。
具体的には、前記癌の診断方法は、前記ステップ（ａ）の特定の遺伝子型ＤＮＡは野生型ＤＮＡであり、分離された試料内の野生型ＤＮＡに特異的なヌクレアーゼにより前記野生型ＤＮＡを切断して試料内から除去するステップであり、前記ステップ（ｂ）の他の遺伝子型ＤＮＡは癌特異的な突然変異を含むＤＮＡであり、前記野生型ＤＮＡが除去された試料内の癌特異的な突然変異ＤＮＡを増幅するステップであり、及び前記ステップ（ｃ）の配列を分析して癌の診断のための情報を提供するための、方法であってもよい。
【００２４】
本発明者らは、従来の診断方法または遺伝子型分析方法のパラダイムとは異なる全く新たな方法である、正常ＤＮＡを標的特異的ヌクレアーゼで切断して試料内で除去した後、少量の癌由来ＤＮＡのみを増幅してＲＦＬＰまたは配列分析を行う場合、偽陽性／偽陰性が現われずに診断できることを確認して本発明を完成した。このようにＰＣＲなどの増幅前に突然変異ＤＮＡではなく、正常ＤＮＡを切断して除去するという概念は、本発明者らによって初めて開発された概念である。
【００２５】
本発明において、用語「標的特異的ヌクレアーゼ」とは、目的とするゲノム上のＤＮＡの特定の位置を認識して切断可能なヌクレアーゼであってもよい。前記ヌクレアーゼは、ゲノム上の特定の標的配列を認識するドメインと切断するドメインが融合されたヌクレアーゼが含まれてもよく、その例としてメガヌクレアーゼ（ｍｅｇａｎｕｃｌｅａｓｅ）、ゲノム上の特定の標的配列を認識するドメインである植物病原性遺伝子に由来するＴＡＬＥＮ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ
ｎｕｃｌｅａｓｅ）であるＴＡＬ作動因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ）ドメインと切断するドメインが融合された融合タンパク質、ジンク−フィンガーヌクレアーゼ（ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）、またはＲＧＥＮ（ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）を制限なく含むことができる。本発明の目的上、ＲＧＥＮを利用した方法は、簡単でありながらも、より好ましい結果をもたらすことができる。
【００２６】
本発明の他の具現例において、前記ヌクレアーゼは、ジンク−フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）であってもよい。ＺＦＮは、選択された遺伝子及び切断ドメインまたは切断ハーフ−ドメイン内の標的部位に結合するように操作されたジンク−フィンガータンパク質を含む。ジンク−フィンガー結合ドメインは、選択された配列に結合するように操作することができる。例えば、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６を参照する。自然発生したジンクフィンガータンパク質と比較し、操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、新規な結合特異性を有することができる。操作方法は、合理的な設計及び様々なタイプの選択が含まれるが、これに限定されない。合理的設計としては、例えば、三重（または四重）ヌクレオチド配列、及び個別ジンクフィンガーのアミノ酸配列を含むデータベースの利用が含まれるが、このとき、各三重または四重ヌクレオチド配列は、特定の三重または四重の配列に結合するジンクフィンガーの一つ以上の配列と連合される。
【００２７】
標的配列の選択、融合タンパク質（及びそれを暗号化するポリヌクレオチド）の設計と構成は、当業者において公知となっており、全文が参考資料として添付される特許文献１及び特許文献２に詳しく説明される。また、このような参考文献及び他の文献に開示された通り、ジンクフィンガードメイン及び／または多重−フィンガージンクフィンガータンパク質が、任意の適切なリンカー配列、例えば、５個以上のアミノ酸の長さのリンカーを含むリンカーにより共に連結することができる。６個以上のアミノ酸の長さのリンカー配列の例は、特許文献３、特許文献４、特許文献５を参照とする。ここで説明するタンパク質は、タンパク質の各ジンクフィンガーの間に適切なリンカーの任意の組み合わせを含む
ことができる。
【００２８】
また、ＺＦＮ及び／またはメガヌクレアーゼのようなヌクレアーゼは、切断ドメインまたは切断ハーフ−ドメインを含む。前記周知のように、例えばジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインと一つのヌクレアーゼからの切断ドメインまたはメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインとは異なるヌクレアーゼからの切断ドメインのように、切断ドメインは、ＤＮＡ結合ドメインに異種性であってもよい。異種性切断ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼ剤やエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインが由来しうる例示的なエンドヌクレアーゼは、制限エンドヌクレアーゼ及びメガヌクレアーゼを含むが、これに限定されない。
【００２９】
類似して、切断ハーフ−ドメインは、上述したように、切断活性のために二量体化を必要とする任意のヌクレアーゼまたはその一部に由来し得る。融合タンパク質が切断ハーフ−ドメインを含む場合、一般的に２つの融合タンパク質が切断に必要である。代案として、２つの切断ハーフ−ドメインを含む単一タンパク質が使用されてもよい。２つの切断ハーフ−ドメインは、同一なエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来することもでき、または各切断ハーフ−ドメインが異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来することもできる。また、２つの融合タンパク質の標的部位は、２つの融合タンパク質と、その各標的部位の結合により切断−ハーフドメインが互いに対して空間的に配向されて位置されることにより、切断ハーフ−ドメインが、例えば、二量体化により機能性切断ドメインを形成することができるようにする関係で配置されることが好ましい。したがって、一具現例において、５−８個のヌクレオチドまたは１５〜１８個のヌクレオチドにより標的部位の隣接エッジが分離される。しかし、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が２つの標的部位の間に介在され得る（例えば、２〜５０個のヌクレオチド対またはそれ以上）。一般に、切断部位は標的部位の間に置かれる。
【００３０】
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種に存在し、ＤＮＡに配列−特異的に結合し（標的部位で）、すぐに結合部位やその付近でＤＮＡを切断することができる。如何なる制限酵素（例えば、Ｔｙｐｅ  ＩＩＳ）は、認識部位から除去された部位でＤＮＡを切断し、分離可能な結合と切断可能なドメインを有する。例えば、Ｔｙｐｅ  ＩＩＳ酵素ＦｏｋＩは、一本鎖上の認識部位から９個のヌクレオチドで、そして残りの一本鎖上の認識部位から１３個のヌクレオチドからのＤＮＡの二重鎖の切断を触媒する。したがって、一具現例において、融合タンパク質は、少なくとも１つのＴｙｐｅ  ＩＩＳ制限酵素からの切断ドメイン（または切断ハーフ−ドメイン）と１つ以上の亜鉛−フィンガー結合ドメイン（操作されることもあり、そうでないこともある）を含む。
【００３１】
本発明において、用語「ＴＡＬＥＮ」とは、ＤＮＡのターゲット領域を認識及び切断することができるヌクレアーゼを指す。ＴＡＬＥＮはＴＡＬＥドメイン及びヌクレオチド切断ドメインを含む融合タンパク質を指す。本発明において、「ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ」及び「ＴＡＬＥＮ」という用語は、互換が可能である。ＴＡＬエフェクターはキサントモナスウイルスが様々な植物種に感染されるとき、これらのタイプＩＩＩ分泌システムを通じて分泌されるタンパク質である。前記タンパク質は、宿主植物内のプロモーター配列と結合してバクテリア感染を助ける植物遺伝子の発現を活性化させることができる。前記タンパク質は、３４個以下の様々な数のアミノ酸の繰り返しで構成された中心繰り返しドメインを通じて植物のＤＮＡ配列を認識する。したがって、ＴＡＬＥはゲノム工学のツールのための新規なプラットフォームになることができると考えられる。ただし、ゲノム−編集活性を有する機能ＴＡＬＥＮを製作するために、次のように、現在まで知られていなかった少数の主要なパラメータが定義されなければならない。ｉ）ＴＡＬＥの最小ＤＮＡ−結合ドメイン、ｉｉ）一つのターゲット領域を構成する２つの半分−座間のスペーサーの長さ、及びｉｉｉ）ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインをｄＴＡＬＥに連結するリン
カーまたは融合接合（ｆｕｓｉｏｎ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）。
【００３２】
本発明のＴＡＬＥドメインは、一つ以上のＴＡＬＥ−繰り返しモジュールを介して配列−特異的な方式でヌクレオチドに結合するタンパク質ドメインを指す。前記ＴＡＬＥドメインは、少なくとも一つのＴＡＬＥ−繰り返しモジュール、好ましくは１〜３０個のＴＡＬＥ−繰り返しモジュールを含むが、これに限定されない。本発明において、「ＴＡＬエフェクタードメイン」及び「ＴＡＬＥドメイン」という用語は、互換可能である。前記ＴＡＬＥドメインはＴＡＬＥ−繰り返しモジュールの半分を含むことができる。
【００３３】
本発明において、用語「ＲＧＥＮ」とは、標的ＤＮＡ特異的ガイドＲＮＡ及びＣａｓタンパク質からなるヌクレアーゼを意味する。
本発明において、用語「Ｃａｓタンパク質」とは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの主要タンパク質構成要素であり、ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ）及びｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｃｒＲＮＡ）と複合体を形成して活性化されたエンドヌクレアーゼまたはニッカーゼ（ｎｉｃｋａｓｅ）を形成する。
【００３４】
前記Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質であってもよいが、これに限定されない。また、前記Ｃａｓ９タンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｓ）由来であってもよいが、これに限定されない。
【００３５】
Ｃａｓタンパク質または遺伝子情報は、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＧｅｎＢａｎｋのような公知のデータベースから得ることができるが、これに限定されない。
【００３６】
Ｃａｓタンパク質は、タンパク質伝達ドメイン（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ）と連結されてもよい。前記タンパク質伝達ドメインは、ポリ−アルギニンまたはＨＩＶ由来のＴＡＴタンパク質であってもよいが、これに限定されない。
【００３７】
Ｃａｓタンパク質は、目的に応じて分離及び／または精製に有利なタグと連結され得る。その例として、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｓタグ、ＧＳＴ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ
Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）タグ、ＭＢＰ（Ｍａｌｔｏｓｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）タグ、ＣＢＰ（ｃｈｉｔｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）タグ、Ａｖｉタグ、カルモジュリン（ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）タグ、ポリグルタミン酸（ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍａｔｅ）タグ、Ｅタグ、ＨＡタグ、ｍｙｃタグ、ＳＢＰタグ、ソフタグ１（ｓｏｆｔａｇ  １）、ソフタグ３（ｓｏｆｔａｇ  ３）、ストレプ（ｓｔｒｅｐ）タグ、ＴＣタグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、ＢＣＣＰ（ｂｉｏｔｉｎ  ｃａｒｂｏｘｙｌ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）タグ、またはＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）タグなどを目的に応じて連結することができるが、これに限定されない。
【００３８】
本発明において、用語「ガイド（ｇｕｉｄｅ）ＲＮＡ」とは、標的ＤＮＡ特異的なＲＮＡを意味し、Ｃａｓタンパク質と結合してＣａｓタンパク質を標的ＤＮＡに導くことができる。前記標的ＤＮＡは、目的とするＤＮＡと混合することができる。
【００３９】
本発明においてガイドＲＮＡは、二つのＲＮＡ、即ち、ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ）及びｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｃｒＲＮＡ）で構成されてもよい。またはｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの主要部分の融合で製造されたｓｇＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ＲＮＡ）であってもよい。
【００４０】
ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む二重ＲＮＡ（ｄｕａｌＲＮＡ）であってもよい。
ｃｒＲＮＡは、標的ＤＮＡと結合することができる。
【００４１】
ＲＧＥＮは、Ｃａｓタンパク質及びｄｕａｌＲＮＡで構成されるか、またはＣａｓタンパク質及びｓｇＲＮＡで構成されてもよい。ガイドＲＮＡは、ｓｇＲＮＡまたはｄｕａｌＲＮＡのｃｒＲＮＡの５’末端に１つ以上の追加のヌクレオチドを含むことができる。
【００４２】
ガイドＲＮＡは、細胞内にＲＮＡまたは前記ＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で伝達されてもよい。
前記癌の診断は、初期診断であってもよい。
【００４３】
前記癌の診断は、癌の予後を予測する方法であってもよい。
前記突然変異を含むＤＮＡは、癌細胞由来であってもよい。
前記二つ以上の遺伝子型ＤＮＡの混合物を含む分離された試料は、癌の疑いのある個体から分離された血液試料であってもよい。
【００４４】
前記遺伝子型分析方法は、細胞または臓器移植を受けた個体の予後予測に関する情報を提供するために用いることができ、この場合、前記ステップ（ｉ）において特定の遺伝子型ＤＮＡは、細胞または臓器移植を受けた個体のＤＮＡであり、前記ステップ（ｉ）は、二つの以上の遺伝子型ＤＮＡが含まれた、細胞または臓器移植を受けた個体の分離された試料から、前記個体のＤＮＡを、これに特異的なヌクレアーゼを用いて切断して除去するステップであり、前記ステップ（ｉｉ）において他の遺伝子型ＤＮＡは、移植を受けた細胞または臓器のＤＮＡであり、前記ステップ（ｉｉ）は、前記個体のＤＮＡが除去された試料内に、移植を受けた細胞または臓器のＤＮＡを分析するステップを含むものであってもよい。
【００４５】
前記遺伝子型分析方法は、また、犯罪現場に関する情報を収集するために用いることができ、この場合、前記ステップ（ｉ）において特定の遺伝子型ＤＮＡは被害者のＤＮＡであり、前記ステップ（ｉ）は、二つ以上の遺伝子型ＤＮＡが含まれた、犯罪現場に由来する分離されたＤＮＡ試料から前記被害者のＤＮＡを、これに特異的なヌクレアーゼを用いて切断して除去するステップであり、前記ステップ（ｉｉ）において他の遺伝子型ＤＮＡは加害者のＤＮＡであり、前記ステップ（ｉｉ）は、前記被害者のＤＮＡが除去された試料内に、加害者のＤＮＡを分析するステップを含むものであってもよい。または、前記ステップ（ｉ）において特定の遺伝子型ＤＮＡは加害者のＤＮＡであり、前記ステップ（ｉ）は、二つ以上の遺伝子型ＤＮＡが含まれた、犯罪現場に由来する分離されたＤＮＡ試料から前記加害者のＤＮＡを、これに特異的なヌクレアーゼを用いて切断して除去するステップであり、前記ステップ（ｉｉ）において他の遺伝子型ＤＮＡは被害者のＤＮＡであり、前記ステップ（ｉｉ）は、前記加害者のＤＮＡが除去された試料内に、被害者のＤＮＡを分析するステップを含むものであってもよい。
【００４６】
もう一つの態様として、本発明は、特定の遺伝子型ＤＮＡに特異的なガイドＲＮＡ及び不活性化されたＣａｓヌクレアーゼタンパク質（ｄＣａｓ）を利用する、遺伝子型分析方法を提供する。
【００４７】
具体的には、前記方法は、（ｉ）特定の遺伝子型ＤＮＡに特異的なガイドＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ、ｇＲＮＡ）及び不活性化されたＣａｓヌクレアーゼタンパク質を利用して二つ以上の遺伝子型ＤＮＡの混合物を含む分離された試料内の特定の遺伝子型ＤＮＡを、他の遺伝子型ＤＮＡを認識するＲＧＥＮの切断からマスキングして保護し、前記他の遺伝子型ＤＮＡを切断して除去するステップ、及び（ｉｉ）前記他の遺伝子型ＤＮＡが除去された試料内に存在する特定の遺伝子型ＤＮＡを分析するステップを含む、遺伝子型分析方法であってもよい。
【００４８】
より具体的には、前記方法は、（ａ）特定の遺伝子型ＤＮＡに特異的なガイドＲＮＡ及び不活性化されたＣａｓヌクレアーゼタンパク質を利用して二つ以上の遺伝子型ＤＮＡの混合物を含む分離された試料内の前記特定の遺伝子型ＤＮＡを、他の遺伝子型ＤＮＡを認識するＲＧＥＮの切断からマスキングして保護し、前記他の遺伝子型ＤＮＡを切断して除去するステップ、（ｂ）前記他の遺伝子型ＤＮＡが除去された試料内の特定の遺伝子型ＤＮＡを増幅するステップ、及び（ｃ）前記増幅された特定の遺伝子型ＤＮＡを分析するステップを含めて行う、遺伝子型分析方法を提供する。
【００４９】
さらに、前記遺伝子型分析方法は、他の遺伝子型ＤＮＡが癌由来のＤＮＡである場合、癌の診断のための情報を提供するための、遺伝子型分析方法であってもよい。
具体的には、前記癌の診断は、前記ステップ（ａ）の他の遺伝子型ＤＮＡは野生型ＤＮＡであり、特定の遺伝子型ＤＮＡは癌特異的な突然変異を含むＤＮＡであり、突然変異を含む特定の遺伝子型ＤＮＡに特異的に結合するガイドＲＮＡ及び不活性化されたＣａｓ９ヌクレアーゼタンパク質からなる、不活性化されたＲＧＥＮ（ｄＣａｓ９：ｇＲＮＡ複合体）を利用して野生型ＤＮＡに特異的なＲＧＥＮの切断から特定の遺伝子型ＤＮＡをマスキングして保護し、分離された試料内野生型ＤＮＡを切断して除去するステップ、（ｂ）前記野生型ＤＮＡが除去された試料内の癌特異的突然変異を含むＤＮＡを増幅するステップ、及び（ｃ）前記増幅された突然変異を含むＤＮＡを分析して癌の診断のための情報を提供するための、方法であってもよい。
【００５０】
前記癌の診断は、癌の初期診断であってもよい。
前記癌の診断は、癌の予後を予測する方法であってもよい。
前記突然変異を含むＤＮＡは癌細胞由来であってもよい。
【００５１】
前記二つ以上の遺伝子型ＤＮＡの混合物を含む分離された試料は、癌の疑いのある個体から分離された試料であってもよい。具体的には、ｃｆＤＮＡを含む分離された血液試料またはｃｆＤＮＡ試料であってもよい。
【００５２】
本発明において、用語「不活性化されたＲＧＥＮ」とは、ヌクレアーゼの機能が全部又は一部不活性化されたＣａｓヌクレアーゼタンパク質を含むＲＧＥＮを意味する。前記不活性化されたＣａｓはｄＣａｓと命名される。前記ＣａｓはＣａｓ９タンパク質であってもよい。不活性化されたＣａｓ９ヌクレアーゼタンパク質の製造は、ヌクレアーゼの活性が不活性化される方法は、制限なく含まれるが、その例として、Ｃａｓ９ヌクレアーゼタンパク質にＤ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ変異を導入して製造することができる。Ｄ１０Ａ  Ｃａｓ９、Ｈ８４０Ａ  Ｃａｓ９ヌクレアーゼタンパク質、即ち、Ｃａｓ９ヌクレアーゼタンパク質中、一つの活性部位（ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ）にのみ変異を導入して作製したＣａｓ９ヌクレアーゼタンパク質は、ガイドＲＮＡと結合したとき、ニッカーゼ（ｎｉｃｋａｓｅ）として作用することができる。
【００５３】
このようなニッカーゼは、２つを使用する場合、両方のＤＮＡ鎖の両方とも切断してＤＳＢ（ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋａｇｅ）を引き起こすことができるため、ＲＧＥＮのカテゴリに含まれる。
【００５４】
また他の例としてＣａｓ９ヌクレアーゼタンパク質にＤ１０ＡとＨ８４０Ａ突然変異をいずれも導入してＤ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ  Ｃａｓ９タンパク質、即ち、Ｃａｓ９ヌクレアーゼの両活性部位にいずれも突然変異を導入して作製したｄＣＡＳ９タンパク質は、ガイドＤＮＡと結合したとき、ＤＮＡを切断しないＤＮＡ結合複合体として作用し得る。
【００５５】
前記遺伝子型分析方法は、細胞または臓器移植を受けた個体の予後予測に関する情報を
提供するために用いることができ、この場合、前記ステップ（ｉ）において特定の遺伝子型ＤＮＡは、細胞または臓器移植を受けた個体のＤＮＡであり、前記ステップ（ｉ）は、二つの以上の遺伝子型ＤＮＡが含まれた、細胞または臓器移植を受けた個体の分離された試料から、前記個体のＤＮＡを、これに特異的なヌクレアーゼを用いて切断して除去するステップであり、前記ステップ（ｉｉ）において他の遺伝子型ＤＮＡは、移植された細胞または臓器のＤＮＡであり、前記ステップ（ｉｉ）は、前記個体のＤＮＡが除去された試料内に、移植された細胞または臓器のＤＮＡを分析するステップを含むものであってもよい。
【００５６】
前記遺伝子型分析方法は、また、犯罪現場に関する情報を収集するために用いることができ、この場合、前記ステップ（ｉ）において特定の遺伝子型ＤＮＡは被害者のＤＮＡであり、前記ステップ（ｉ）は、二つ以上の遺伝子型ＤＮＡが含まれた、犯罪現場に由来する分離されたＤＮＡ試料から前記被害者のＤＮＡを、これに特異的なヌクレアーゼを用いて切断して除去するステップであり、前記ステップ（ｉｉ）において他の遺伝子型ＤＮＡは加害者のＤＮＡであり、前記ステップ（ｉｉ）は、前記被害者のＤＮＡが除去された試料内に、加害者のＤＮＡを分析するステップを含むものであってもよい。または、前記ステップ（ｉ）において特定の遺伝子型ＤＮＡは加害者のＤＮＡであり、前記ステップ（ｉ）は、二つ以上の遺伝子型ＤＮＡが含まれた、犯罪現場に由来する分離されたＤＮＡ試料から前記加害者のＤＮＡを、これに特異的なヌクレアーゼを用いて切断して除去するステップであり、前記ステップ（ｉｉ）において他の遺伝子型ＤＮＡは被害者のＤＮＡであり、前記ステップ（ｉｉ）は、前記加害者のＤＮＡが除去された試料内に、被害者のＤＮＡを分析するステップを含むものであってもよい。
【００５７】
もう一つの態様として、本発明は、（ｉ）細菌またはウイルスＤＮＡを含む分離された試料に非病原性細菌または非病原性ウイルスＤＮＡに特異的なヌクレアーゼを処理して非病原性細菌または非病原性ウイルスＤＮＡを切断して試料内から除去するステップ、（ｉｉ）前記非病原性細菌またはウイルスＤＮＡが除去された試料内に病原性細菌または病原性ウイルスＤＮＡを分析するステップを含む、試料内ＤＮＡの遺伝子型分析方法を提供する。
【００５８】
具体的には、前記方法は、（ａ）細菌またはウイルスＤＮＡを含む分離された試料に非病原性細菌または非病原性ウイルスＤＮＡに特異的なヌクレアーゼを処理して非病原性細菌または非病原性ウイルスＤＮＡを切断して試料内から除去するステップ、（ｂ）前記非病原性細菌またはウイルスＤＮＡが除去された試料内の病原性細菌または病原性ウイルスＤＮＡを増幅するステップ、及び（ｃ）前記増幅された病原性細菌または病原性ウイルスＤＮＡを分析するステップを含めて行う、試料内ＤＮＡの遺伝子型分析方法を提供する。
【００５９】
前記ヌクレアーゼは、ＺＦＮ（ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）、ＴＡＬＥＮ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ
ｎｕｃｌｅａｓｅ）、及びＲＧＥＮ（ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）からなる群から選択されたヌクレアーゼであるものであってもよいが、これに限定されない。
【００６０】
もう一つの態様として、本発明は、（ｉ）病原性細菌またはウイルスＤＮＡ特異的ガイドＲＮＡ及び不活性化されたＣａｓ９ヌクレアーゼタンパク質からなる不活性化されたＲＧＥＮ（ｄＣａｓ９：ｇＲＮＡ複合体）を利用して病原性細菌またはウイルスＤＮＡを非病原性細菌またはウイルスに特異的なＲＧＥＮの切断からマスキングして保護し、分離された試料内の非病原性細菌またはウイルスＤＮＡを試料内から切断して除去するステップ、及び（ｉｉ）前記非病原性細菌またはウイルスＤＮＡが除去された試料に病原性細菌またはウイルスＤＮＡを分析するステップを含む、試料内ＤＮＡの遺伝子型分析方法を提供
する。
【００６１】
具体的には、前記方法は、（ａ）病原性細菌またはウイルスＤＮＡ特異的ガイドＲＮＡ及び不活性化されたＣａｓ９ヌクレアーゼタンパク質からなる不活性化されたＲＧＥＮ（ｄＣａｓ９：ｇＲＮＡ複合体）を利用して病原性細菌またはウイルスＤＮＡを非病原性細菌またはウイルスに特異的なＲＧＥＮの切断からマスキングして保護し、分離された試料内の非病原性細菌またはウイルスＤＮＡを試料内から切断して除去するステップ、（ｂ）前記非病原性細菌またはウイルスＤＮＡが除去された試料内の病原性細菌またはウイルスＤＮＡを増幅するステップ、及び（ｃ）前記増幅された病原性細菌またはウイルスＤＮＡを分析するステップを含めて行う、試料内ＤＮＡの遺伝子型分析方法を提供する。
【００６２】
もう一つの態様として、本発明は、二種類以上のＤＮＡを含む分離された試料から目的とするＤＮＡを、前記目的とするＤＮＡに特異的な、不活性化されたヌクレアーゼを用いて分離するステップを含む、目的とするＤＮＡを分離する方法を提供する。
【００６３】
具体的には、前記目的とするＤＮＡを分離する方法は、目的とするＤＮＡに特異的に結合するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）及び不活性化されたＣａｓタンパク質（ｄＣａｓ）が、目的とするＤＮＡとｄＣａｓ−ｇＲＮＡ−目的とするＤＮＡの複合体を形成するステップ、及び前記複合体を前記試料から分離するステップを含む、目的とするＤＮＡを分離する方法により行うことができる。
【００６４】
前記目的とするＤＮＡは、ＰＣＲによる増幅、または公知の方法で検出する方法により確認することができる。
前記分離方法は、イン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で細胞−遊離  ＤＮＡ（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ＤＮＡ）に適用することができ、ＤＮＡとｇＲＮＡ及びｄＣａｓタンパク質間の架橋共有結合（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋ  ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｂｏｎｅ）の形成なしに行われるものであってもよい。
【００６５】
前記分離方法は、前記複合体から目的とするＤＮＡを分離するステップをさらに含むことができる。
目的とするＤＮＡを分離するために、前記不活性化されたＣａｓタンパク質は、分離のための親和性タグ（ｔａｇ）を含むことができ、例えば、前記親和性タグは、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｓタグ、ＧＳＴ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）タグ、ＭＢＰ（Ｍａｌｔｏｓｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）タグ、ＣＢＰ（ｃｈｉｔｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）タグ、Ａｖｉタグ、カルモジュリン（ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）タグ、ポリグルタミン酸（ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍａｔｅ）タグ、Ｅタグ、ＨＡタグ、ｍｙｃタグ、ＳＢＰタグ、ソフタグ１（ｓｏｆｔａｇ  １）、ソフタグ３（ｓｏｆｔａｇ  ３）、ストレプ（ｓｔｒｅｐ）タグ、ＴＣタグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、ＢＣＣＰ（ｂｉｏｔｉｎ  ｃａｒｂｏｘｙｌ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）タグ、またはＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）タグであってもよいが、これに限定されるものではない。
【００６６】
前記不活性化されたＣａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質のＤＮＡ切断活性が欠如したものであってもよく、具体的には、前記不活性化されたＣａｓタンパク質は、Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０ＡまたはＤ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ突然変異を有するＣａｓ９タンパク質変異体であってもよいが、これに限定されるものではない。
【００６７】
前記Ｃａｓ９タンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｓ）由来であってもよい。
前記方法は、前記タグに結合する親和性カラムまたは磁性ビーズ（ｍａｇｎｅｔｉｃ  
ｂｅａｄ）を利用して目的とするＤＮＡを分離するものであってもよい。例えば、前記分離のための親和性タグはＨｉｓタグであり、前記Ｈｉｓタグに結合する金属親和性カラム（ｍｅｔａｌ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｏｌｕｍｎ）または磁性ビーズを用いて目的とするＤＮＡを分離するものであってもよく、前記磁性ビーズは、例えば、Ｎｉ−ＮＴＡ磁性ビーズであってもよいが、これに限定されるものではない。
【００６８】
前記複合体から目的とするＤＮＡの分離は、ＲＮａｓｅ及びタンパク質加水分解酵素を利用して行われるものであってもよい。
前記目的とするＤＮＡを分離する方法を利用して二種類以上の遺伝子型ＤＮＡの混合物を含む分離された試料から特定の遺伝子型ＤＮＡを分離することができ、二つ以上の目的とするＤＮＡを分離することもできる。二つ以上の目的とするＤＮＡを分離する場合、二つ以上の目的とするＤＮＡのそれぞれに特異的なガイドＲＮＡを利用して目的とするＤＮＡを分離することができる。
【００６９】
前記ガイドＲＮＡは、単鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であってもよく、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む二重ＲＮＡ（ｄｕａｌＲＮＡ）であってもよい。また、前記ガイドＲＮＡは、分離されたＲＮＡ形態であるか、またはプラスミドにコードされている形態であってもよい。
【００７０】
もう一つの態様として、本発明は、遺伝体ＤＮＡを含む分離された試料から目的とするＤＮＡを、前記目的とするＤＮＡに特異的な、不活性化されたヌクレアーゼを用いて分離するステップを含む、目的とするＤＮＡを分離する方法を提供する。
【００７１】
具体的には、前記方法は、目的とするＤＮＡに特異的に結合するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）及び不活性化されたＣａｓタンパク質（ｄＣａｓ）が、目的とするＤＮＡとｄＣａｓ−ｇＲＮＡ−目的とするＤＮＡの複合体を形成するステップ、及び前記複合体を前記試料から分離するステップを含めて行われるものであってもよい。
【００７２】
前記目的とするＤＮＡを分離する方法の各ステップの構成は、前述した通りである。
もう一つの態様として、本発明は、（ｉ）二つ以上の遺伝子型ＤＮＡの混合物を含む分離された試料内の特定の遺伝子型ＤＮＡを、前記特定の遺伝子型に特異的な、不活性化されたヌクレアーゼを用いて分離するステップ、及び（ｉｉ）前記分離された特定の遺伝子型ＤＮＡを分析するステップを含む、遺伝子型分析方法を提供する。
【００７３】
具体的には、前記分析方法は、（ａ）二つ以上の遺伝子型ＤＮＡの混合物を含む分離された試料から特定の遺伝子型ＤＮＡを、前記特定の遺伝子型特異的な、不活性化されたヌクレアーゼを用いて分離するステップ、（ｂ）前記分離された特定の遺伝子型ＤＮＡを増幅するステップ、及び（ｃ）前記増幅された特定の遺伝子型ＤＮＡを分析するステップを含めて行うものであってもよい。
【００７４】
併せて、前記遺伝子型分析方法は、特定の遺伝子型ＤＮＡが癌由来のＤＮＡである場合、癌の診断用の情報を提供するための遺伝子型分析方法であってもよい。
具体的には、前記癌の診断方法は、前記特定の遺伝子型ＤＮＡは、癌特異的な突然変異を含むＤＮＡであり、前記特定の遺伝子型ＤＮＡを分析して癌の診断用の情報を提供するための方法であってもよい。
【００７５】
本発明者らは、特定の遺伝子型に特異的な、不活性化されたヌクレアーゼを用いて特定の遺伝子型ＤＮＡを精製した後、少量の癌由来ＤＮＡのみを増幅してＲＦＬＰまたは配列分析を行う場合、偽陽性／偽陰性が現われずに診断できることを確認し、本発明を完成した。
【００７６】
前記ヌクレアーゼは、例えば、ＺＦＮ（ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）、ＴＡＬＥＮ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）、またはＲＧＥＮ（ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）であってもよいが、これに限定されるものではない。
【００７７】
前記癌の診断は、癌の初期診断であってもよく、癌の予後を予測するものであってもよい。
前記方法は、具体的には、（ｉ）特定の遺伝子型ＤＮＡに特異的に結合するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）及び不活性化されたＣａｓタンパク質（ｄＣａｓ）を前記試料に処理してｄＣａｓ−ｇＲＮＡ−特定の遺伝子型ＤＮＡの複合体を形成するステップ、及び前記複合体を前記試料から分離するステップ、（ｉｉ）前記複合体に分離された特定の遺伝子型ＤＮＡを分析するステップを含むものであってもよい。
【００７８】
前記不活性化されたＣａｓタンパク質は分離のための親和性タグ（ｔａｇ）を含むことができ、その例は先に説明した通りである。
前記不活性化されたＣａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質の切断活性が欠如したものであってもよく、これについては前述した通りである。
【００７９】
前記方法は、前記タグに結合する親和性カラムまたは磁性ビーズ（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｂｅａｄ）を利用して特定の遺伝子型ＤＮＡを分離するものであってもよい。
前記複合体からの特定遺伝子型ＤＮＡの分離は、ＲＮａｓｅ及びタンパク質加水分解酵素を利用して行われるものであってもよい。
【００８０】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。これら実施例は、単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されるものとは解釈されない。
【００８１】
（実施例）
実施例１：標的特異的ヌクレアーゼを用いた標的ＤＮＡの濃縮の確認
標的特異的ヌクレアーゼを用いた標的ＤＮＡの濃縮が可能であるかを確認するために、標的特異的ヌクレアーゼの代表的な例であるＲＧＥＮ（ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）を利用して標的ＤＮＡの濃縮を確認した。
【００８２】
その模式図を図１に示した。
即ち、図１で示されるように、正常ＤＮＡではなく、突然変異したＤＮＡ配列（ボックスに表示された部分）を含むゲノムを下記の二種類の方法により標的ＤＮＡを濃縮することを確認する。
【００８３】
１）突然変異したＤＮＡをマスキング（ｍａｓｋｉｎｇ）して捕獲する方法：  
標的配列特異的ガイドＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ、ｇＲＮＡ）及び不活性化されたＣａｓ９ヌクレアーゼタンパク質（ｄｅａｄ  Ｃａｓ９タンパク質またはｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃａｓ９タンパク質）からなるＲＧＥＮを利用して、突然変異したＤＮＡをランダム切断酵素の切断からマスキングして保護したり、捕獲して標的ＤＮＡを増幅して濃縮する方法。
【００８４】
２）正常ＤＮＡを除去した後、増幅する方法：
正常ＤＮＡを非標的配列特異的ガイドＲＮＡ及びＣａｓ９ヌクレアーゼタンパク質からなるＲＧＥＮで切断して除去した後、標的ＤＮＡを増幅して濃縮する方法。
【００８５】
実施例２：遺伝子ハサミにより誘導された極小量の突然変異観測
ＲＧＥＮにより細胞内の標的、または標的の類似配列に誘導された突然変異の割合が非常に低いとき、これを観察するためには、正常ＤＮＡに対する突然変異ＤＮＡの割合を増加させる過程が必要である。そのため、ＲＧＥＮが処理された細胞から遺伝体ＤＮＡを分離した後、標的の正常配列のみを認識するＲＧＥＮを処理して突然変異がある遺伝体ＤＮＡは残して正常遺伝体ＤＮＡだけを切り取った（図２）。その後、ＰＣＲを通じて標的の周りの配列を増幅させると、切断されない突然変異遺伝体ＤＮＡから増幅されたＰＣＲ産物の割合が、切断された正常遺伝体ＤＮＡから増幅されたＰＣＰ産物より相対的に増えるようになる。
【００８６】
具体的には、ＶＥＧＦＡ遺伝子を切断するＲＧＥＮを細胞内に処理して突然変異を誘導した後、この細胞の遺伝体ＤＮＡを分離し、突然変異を観測しようとする標的類似配列に対するそれぞれのＲＧＥＮを利用して正常ＤＮＡを切断した。その後、切断された配列の周辺をＰＣＲで増幅させた後、シーケンス（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）機械で配列を読み出して正常ＤＮＡと突然変異ＤＮＡの割合を観察した。その結果、ＲＧＥＮで切断されない場合と比較したとき、最高１．４〜３０倍程度の突然変異率の増加が観察された（表１）。
【００８７】
【表１】
2017516500.tif 000003
（Ｍｏｃｋ＿ｕｎｃｕｔ：正常細胞のｇＤＮＡを切断していないサンプル、Ｍｏｃｋ＿ｃｕｔ：正常細胞のｇＤＮＡを切断したサンプル、ＲＧＥＮ＿ｕｎｃｕｔ：ＲＧＥＮによる突然変異が誘導された細胞のｇＤＮＡを切断していないサンプル、ＲＧＥＮ＿ｃｕｔ：ＲＧＥＮによる突然変異が誘導された細胞のｇＤＮＡを切断したサンプル）
次に、非常に少ない突然変異の割合でどれだけの突然変異配列の増加が見られたかを確認するために、ＦＡＮＣＦ遺伝子に対するＲＧＥＮを細胞に処理し、５４％の突然変異を含む遺伝体ＤＮＡの混合物を得た。
【００８８】
その後、前記突然変異遺伝体ＤＮＡの混合物に、正常遺伝体ＤＮＡの量を１０倍ずつ増やしながら混ぜて０．００５４％から５４％までの割合で突然変異が混在している遺伝体ＤＮＡの混合物を得、これを再び前記ＦＡＮＣＦ遺伝子の正常配列だけを切断するＲＧＥＮで切断した。その結果、すべての突然変異の割合の範囲で、切断した後の突然変異の割合が増加し、最大５２０倍（２．８％／０．００５４％）増加する効果を確認した（図３）。
【００８９】
前記実験で使用されたＲＧＥＮの標的塩基配列及びｓｇＲＮＡ配列は、表２にまとめた。
【００９０】
【表２】
2017516500.tif 000004
実施例３：癌遺伝子（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）に高い頻度で発生する突然変異の診断確認
一般的な癌遺伝子（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）は、野生型の正常ＤＮＡとは異なり、突然変異を有している。このような癌遺伝子の突然変異を有している断片は、試料内に１％以下、一般的には０．０１％〜０．１％以下で混在しているので観察が困難で、初期癌の診断が困難である。
【００９１】
よって、このような癌遺伝子の突然変異の診断を、本発明の新たなパラダイムを適用して行うことができるかどうかを確認する方法を図４に模式図で示した。
即ち、検診患者の血漿ＤＮＡ内の突然変異が存在する癌遺伝子の存在を確認する方法において、本発明の新しいパラダイムの方法の優秀性を確認するために、正常なＤＮＡを切断しない対照区（濃縮前）及び正常なＤＮＡをＲＧＥＮを利用して切断した後、突然変異が存在する癌遺伝子の切片だけを増幅した実験区（濃縮後）を利用してそれぞれＲＦＬＰ（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）及び配列分析を行った結果、ＲＦＬＰ分析の際、対照群では１％以下で混在している標的ＤＮＡ切片の観察が困難であることが確認された。しかし、実験区は標的ＤＮＡ切片である突然変異癌遺伝子を容易に確認することができる。
【００９２】
さらに、配列分析結果も対照区は０．０１％〜０．１％以下で混在している標的ＤＮＡ断片の観察は困難であるが、実験区は正確に標的ＤＮＡだけを対象に配列分析を行うことができるため、観察が容易なことを確認することができる。
【００９３】
実施例４：癌遺伝子の突然変異に対するＲＦＬＰ用ＲＧＥＮ製造
本発明者らは、癌遺伝子の突然変異に対するＲＦＬＰ用ＲＧＥＮの製造を試みた。
例えば、様々な癌から高頻度で突然変異が発生するＫ−Ｒａｓ癌遺伝子の突然変異ホットスポット（ｈｏｔｓｐｏｔ）の１２番目のアミノ酸の位置に対する突然変異（Ｇ１２Ｓ）特異的または正常なＤＮＡ特異的ＲＧＥＮを開発した（図５）。
【００９４】
よって、このようなＫ−Ｒａｓ  Ｇ１２Ｓ突然変異を含む癌患者の血漿ＤＮＡから、前記実施例１の二つの方法が適用されるか否かを実験を通じて確認し、その結果を図６に示した。図６に示されるように、偽陰性などがなく、Ｋ−ＲＡＳ  Ｇ１２Ｓ突然変異を正確に確認できることが分かる。
【００９５】
実施例５：ＲＧＥＮを利用した極小量のｃｔＤＮＡ突然変異の高感度観測技術の開発
次に、癌特異的マーカーであるｃｔＤＮＡ（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ＤＮＡ）を標的として癌の早期診断を試みた。早期癌患者のｃｔＤＮＡは、正常遺伝子に混在し、血液中に非常に少量存在するため、体液内に循環する細胞遊離ＤＮＡ（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ＤＮＡ）中に微量存在するｃｔＤＮＡを増幅して検出する。発癌遺伝子中に頻繁に発生する変異を含むＤＮＡを残し、正常遺伝子にのみ特異的に作動するＲＧＥＮ（ＲＮＡ  Ｇｕｉｄｅｄ  Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）を製作して処理することによって、正常遺伝子のみを切断して変異遺伝子がＰＣＲにより正常遺伝子に比べて相対的に増幅されるようになる。その後Ｉｎｄｅｘ  ＰＣＲと標的化されたディープシーケンシング（ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｅｅｐ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を行って得た塩基配列情報によって、正常遺伝子に比べて増加した変異遺伝子の割合を算出することができる（図７）。
【００９６】
まず、高濃度の正常遺伝子と混合した変異遺伝子が検出できるかどうかをＣＵＴ−ＰＣＲで確認するために、大腸癌に発生頻度の高い遺伝子（ＫＲＡＳ）の変異遺伝子（ＫＲＡＳ  ｃ．３５Ｇ＞  Ａ、ｃ．３５Ｇ＞  Ｔ）と、正常遺伝子（ＫＲＡＳ  ｃ．３５Ｇ）を含むプラスミドをそれぞれ作成し、様々な割合で混合して変異遺伝子が正常遺伝子に比べて少ない割合（１／１０００の水準まで）で希釈した状態で、ＣＵＴ−ＰＣＲ（正常遺伝子特異的ＲＧＥＮ処理後のＰＣＲ）を行った。ＫＲＡＳ正常遺伝子を切断し、Ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ比ＫＲＡＳ、正常遺伝子が増幅された割合を算出した。また、発生頻度の高い癌誘発変異遺伝子を正常遺伝子で１／１０００に希釈した濃度でＣＵＴ−ＰＣＲを通じて変異遺伝子が増加される倍率を算出した。前記正常遺伝子特異的ＲＧＥＮの標的塩基配列及びｓｇＲＮＡ塩基配列は表３で示した。
【００９７】
【表３】
2017516500.tif 000005
その結果、対照群プライマーで増幅された産物に比べてＫＲＡＳ遺伝子を増幅したとき、正常遺伝子特異的に製作されたＲＧＥＮが正常遺伝子に正確に作動することを確認した（図８）。さらに、増幅された産物の変異が起こった部分をディープシーケンシング（ｄｅｅｐ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）で分析したとき、ＫＲＡＳ変異遺伝子が正常遺伝子に１／１０００に希釈された程度で、最大３０〜４０倍程度が増幅されて正確に検出されることを示した（図９、表４）。
【００９８】
【表４】
2017516500.tif 000006
＜大腸癌変異中、発生頻度が最も高い５つの単一塩基置換変異の塩基配列情報と、ＰＡＭと認識される領域の変異を利用して正常遺伝子のみを切断することができるｓｇＲＮＡの標的塩基配列情報を示した。正常遺伝子特異的ＲＧＥＮの処理前、処理後のそれぞれの変異の増加率を算出した。太い色文字：ＰＡＭ塩基配列、下線で示された部分：置換で生じた変異＞
前記プラスミド検証の後、人体の血漿から得た細胞遊離ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）においても癌特異的な遺伝子変異を含んでいるｃｔＤＮＡ検出実験を行った。血漿中ｃｔＤＮＡが極少量含まれているため、ＣＵＴ−ＰＣＲ（正常遺伝子に特異的なＲＧＥＮ処理（表５）とＰＣＲ増幅）の過程を繰り返して行いながら変異遺伝子を増幅させた。その結果、健常者のサンプルよりも大腸癌患者から得られるサンプルにおいて発生頻度が高いＫＲＡＳ変異（ｃ．３５Ｇ＞  Ａ（最大１９２倍）、ｃ．３５Ｇ＞  Ｔ（最大７９倍））が観測された（図１０）。ＣＵＴ−ＰＣＲで増幅された結果は、従来のパイロシーケンシング（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）で測定した結果よりも大幅に増加した敏感度を示す（表５）
。
【００９９】
【表５】
2017516500.tif 000007
実施例６：ｄＣＡＳ９：ｇＲＮＡ複合体を用いた標的ＤＮＡの濃縮
本発明では、特定の遺伝子型ＤＮＡを精製するためにガイドＲＮＡ及び不活性化されたＣａｓ９ヌクレアーゼ（ｎｕｃｌｅａｓｅ）タンパク質からなる不活性化されたＲＧＥＮ（ｄＣａｓ９：ｇＲＮＡ複合体）を用いた。前記ｄＣａｓ９タンパク質には、精製のためのヒスチジンタグ（Ｈｉｓ  ｔａｇ）が付いており、Ｈｉｓ  ｔａｇと選択的に結合するＮｉ−ＮＴＡ磁石ビーズを用いてｄＣａｓ９タンパク質のみを選択的に精製することができる。また、ＤＮＡの塩基配列に特異的に結合することができるリボヌクレアーゼ活性を持たないｄＣａｓ９−タンパク質−ｓｇＲＮＡ複合体の性質を利用して目的とする標的ＤＮＡだけを選択的に精製することができる（図１１）。
【０１００】
実施例６−１．プラスミド断片の選択的分離
ガイドＲＮＡ及び不活性化されたＣａｓ９ヌクレアーゼタンパク質からなる不活性化されたＲＧＥＮ（ｄＣａｓ９：ｇＲＮＡ複合体）によって目的とする標的ＤＮＡのみを分離できるか否かを確認するために、まず、プラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ、ｐＵＣ１９）をサイズで区別できるように制限酵素（ＳｐｅＩ、ＸｍａＩ、ＸｈｏＩ）で切断し、それぞれ４１３４  ｂｐ、２５７０  ｂｐ、及び１２６３  ｂｐのサイズのプラスミドＤＮＡ断片を製造した（図１２）。
【０１０１】
その後、前記過程で制限酵素で切断されたそれぞれのプラスミドＤＮＡ断片に対するｓｇＲＮＡを２本ずつ製作し（４１３４ｂｐ＿ｓｇ＃１、４１３４ｂｐ＿ｓｇ＃２、２５７０ｂｐ＿ｓｇ＃１、２５７０ｂｐ＿ｓｇ＃２、１２６３ｂｐ＿ｓｇ＃１、及び１２６３ｂｐ＿ｓｇ＃２）、各標的ＤＮＡに対応するそれぞれのｓｇＲＮＡまたはこれらの組み合わせ（４１３４ｂｐ＿ｓｇ＃１＋２、２５７０ｂｐ＿ｓｇ＃１＋２、及び１２６３ｂｐ＿ｓｇ＃１＋２）を利用して精製過程を行った。それぞれのｓｇＲＮＡ塩基配列は下記表６の通りである。
【０１０２】
【表６】
2017516500.tif 000008
＊ｓｇＲＮＡ配列は標的塩基配列と同一であり、ただし、ＴはＵである。
【０１０３】
その後、ＤＮＡ：ｄＣａｓ９タンパク質：ｓｇＲＮＡ＝１：２０：１００のモル濃度比で計２００μｌの混合溶液を製造して混ぜた後、３７℃で１時間３０分間反応させた。その後、前記溶液をヒスチジンタグと特異的に結合することができるＮｉ−ＮＴＡ磁石ビーズ５０μｌと混合し、２００μｌの洗浄緩衝液で２回洗浄した後、２００μｌの溶出緩衝液（Ｂｉｏｎｅｅｒ、Ｋ−７２００）を用いてｄＣａｓ９−ｓｇＲＮＡ−標的ＤＮＡ複合体を精製した。
【０１０４】
その後、ＲＮａｓｅ  Ａ（Ａｍｒｅｓｃｏ、Ｅ８６６）を０．２ｍｇ／ｍｌの濃度で添加し、３７℃で２時間反応させ、分解タンパク質加水分解酵素Ｋ（Ｂｉｏｎｅｅｒ、１３０４Ｇ）を０．２ｍｇ／ｍｌの濃度で添加して５５℃で４５分間反応させてｓｇＲＮＡ及びｄＣａｓ９タンパク質を除去した後、エタノール精製を通じて標的ＤＮＡだけを精製した。
【０１０５】
その結果、ｓｇＲＮＡそれぞれまたは標的タンパク質に対するｓｇＲＮＡ  ２種類を混合して使用した場合のいずれにも、３つのＤＮＡ断片から各サイズ別に目的とする標的ＤＮＡ断片のみ分離されて検出されることを確認することができた（図１３）。
【０１０６】
また、２種類の標的ＤＮＡに対してｓｇＲＮＡをそれぞれ２個ずつ使用し、計４個のｓｇＲＮＡを利用して一度に複数の標的ＤＮＡを精製したとき、使用されたｓｇＲＮＡに対する標的ＤＮＡが混合されて精製されることを確認した（図１４）。
【０１０７】
それぞれのプラスミドＤＮＡ断片を精製した結果を図１５に示した。これを通じてそれぞれの標的ＤＮＡが９５％以上純粋な状態で精製されることを確認することができた。
実施例６−２．標的エクソン（ｅｘｏｎ）の選択的分離の確認
次に、ガイドＲＮＡ及び不活性化されたＣａｓ９ヌクレアーゼタンパク質からなる不活性化されたＲＧＥＮ（ｄＣａｓ９：ｇＲＮＡ複合体）を通じて、実際細胞の遺伝体ＤＮＡ
（ｇＤＮＡ）上のエクソン（ｅｘｏｎ）を精製することができるかどうか確認するために、ＨｅＬａ細胞とＳＷ４８０細胞のｇＤＮＡを抽出し、４００ｂｐのサイズの断片に切断した後、標的エクソンを精製する実験を行った。
【０１０８】
具体的には、癌細胞のＴＰ５３遺伝子のエクソンを標的とし、それぞれの標的エクソン別に３つのｓｇＲＮＡを使用し、それぞれのｓｇＲＮＡの配列は下記表７に示した。前記実施例６−１と同一条件で標的ＤＮＡを精製した。
【０１０９】
【表７】
2017516500.tif 000009
＊ｓｇＲＮＡ配列は標的塩基配列と同一であり、ただし、ＴはＵである。
【０１１０】
その後、標的エクソンが精製されたかを確認するために、サンプル中の標的ＤＮＡの量
を測定することができるＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲを行い、その結果、各エクソンが実際に増幅されたことを確認し、標的エクソン部位が他のエクソンに比べて２〜２０倍増幅されたことを確認することができた（図１６）。
【０１１１】
実施例７：類似した配列の病原性細菌ＤＮＡを区別して診断を確認
既存の分子診断の方式により区分して診断し難い同等性の高い配列を、本発明の方法により区分が可能かどうかを確認しようとした。例えば、病原性細菌／ウイルスと非病原性細菌／ウイルスは非常に類似した配列を有しているため、このような病原性及び非病原性細菌を区分した診断を、本発明の新しいパラダイムを適用して行うことができるかどうかを確認する方法を図１７に模式図で示した。
【０１１２】
即ち、非病原性細菌ＤＮＡ及び病原性細菌ＤＮＡを単に増幅すれば、配列の類似性により非特異的増幅が起こり、非病原性細菌ＤＮＡ及び病原性細菌ＤＮＡを区別することができない（図１７の上段）。
【０１１３】
しかし、個体の正常な反応を引き起こす非病原性細菌ＤＮＡ特異的ガイドＲＮＡ及びＣａｓ９ヌクレアーゼタンパク質を利用して切断して増幅し、病原性細菌ＤＮＡ特異的ガイドＲＮＡ及び不活性化されたＣａｓ９ヌクレアーゼタンパク質（ｄｅａｄ  Ｃａｓ９タンパク質）からなるＲＧＥＮを利用して病原性細菌のＤＮＡを捕獲して分離して増幅を行う場合、類似した配列により容易に  区分できない病原性細菌のみを特異的に増幅できることを確認することができる（図１７の下段）。
【０１１４】
前記のような結果は、本発明の新しい遺伝子型分析方法である標的特異的ヌクレアーゼ、特にＲＧＥＮを、既存の遺伝子型分析方法とは異なり、試料内の正常ＤＮＡを切断して除去した後に標的ＤＮＡだけを増幅するか、または標的ＤＮＡだけを捕獲して増幅させる場合、既存のＰＣＲ方法などとは異なり、偽陽性／陰性などが現われることなく、正確に分析することができることを示唆するものである。
【０１１５】
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形で実施できることを理解するであろう。なお、以上で記述した実施例は、すべての面において例示的なものであり、限定的なものではないことを理解しなければならない。本発明の範囲は前記詳細な説明ではなく、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲そしてその等価概念から導き出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
【図１】
2017516500.tif 000010
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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