(57)【要約】  細菌中で基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ耐性を生じさせるＣＴＸ−Ｍグループ１および９を含む基質特異性拡張型スペクトルのβ−ラクタマーゼをコードする遺伝子に特異的なプライマーおよびプローブが、ＣＴＸ−Ｍグループ１および９核酸を検出するためのこれらのプライマーおよびプローブを用いる方法およびキットと共に、本明細書に記載される。その記載された方法において、ＣＴＸ−Ｍグループ１および９遺伝子を含有することが疑われる生物学的試料または組織から得られた臨床またはテスト試料中に存在する核酸を増幅し、ＣＴＸ−Ｍグループ１および９につき対応する配列が検出される。増幅された核酸は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、放射標識、酵素標識等を含めた種々の水準の当該技術分野の方法によって検出することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＣＴＸ−Ｍ核酸を含有することが疑われる試料と、式：
【化１】
2017538419.tif 000023
（式中、ＸはＣＴＸ−Ｍ核酸に非相補的であるフラッププライマーの５’部分であり、Ｙは、ＣＴＸ−Ｍ核酸の少なくとも一部に実質的に相補的であるフラッププライマーの３’部分であり、Ｘは、ＡＡＴＡＡＡＴＣＡＴＡＡ（配列番号：５１）の少なくとも一部を含む配列を有し、Ｙは、配列番号：１、１２、１９または２９の少なくとも一部に実質的に相補的である配列を有し、およびｐは０または１である）
を有する少なくとも１つのフラッププライマーとを接触させて、混合物を生成し；
（ｂ）ＣＴＸ−Ｍ核酸を増幅するのに十分な条件下で工程（ａ）の混合物をインキュベートし、それにより、増幅されたＣＴＸ−Ｍ核酸を生成し；次いで
（ｃ）増幅されたＣＴＸ−Ｍ核酸を検出する
ことを含むことを特徴とする、試料中のＣＴＸ−Ｍ核酸の検出方法。
【請求項２】
ＸおよびＹが、各々、約４〜約３０ヌクレオチド長であることを特徴とする請求項１記載の検出方法。
【請求項３】
増幅されたＣＴＸ−Ｍ核酸の検出工程が、配列番号：４、９、１０、１１、１８、２２、２６、２７、２８、３２、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５および４６から選択される配列に対して実質的な同一性を持つ配列を有する、蛍光発生プローブを用いることを含み、ここに、Ｇ＊はグアニンアナログ６−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オンであり、Ｒａは独立して、（Ｍ）ａ−Ｆｌおよび（Ｍ）ａ−Ｑから選択され、Ｒｂは独立して、（Ｍ）ａ−Ｆｌおよび（Ｍ）ａ−Ｑから選択され、Ｍは副溝バインダーであり、ａは０または１、Ｆｌは約４００〜９００ｎｍの発光波長を持つフルオロフォアであり、Ｑは非蛍光性クエンチャーであり、ここに、前記プローブがハイブリダイズしない場合、ＲａおよびＲｂの置換は蛍光をクエンチングさせることを特徴とする請求項１記載の検出方法。
【請求項４】
蛍光発生プローブがさらに副溝バインダーを含むことを特徴とする請求項３記載の検出方法。
【請求項５】
フラッププライマーが、配列番号：２、３、６、７、８、１３、１４、１６、１７、２０、２１、２４、２５、３０、３１、３３および３４から選択される配列に対して実質的な同一性を有する配列を有することを特徴とする請求項１記載の検出方法。
【請求項６】
フラッププライマーが、ＣＴＸ−Ｍ核酸の１を超える部分に相補的である配列を含むことを特徴とする請求項１記載の検出方法。
【請求項７】
Ｘが［Ａ−Ｂ］ｍであって、Ｙが［Ａ−Ｂ］ｎであり、ここに、Ａは、いずれかの組合せにおける、糖リン酸骨格、修飾糖リン酸骨格、ロックされた核酸骨格、またはその変異形を表し、Ｂが、核酸塩基または修飾塩基を表し、ｍおよびｎが、約４〜約３０の整数であることを特徴とする請求項１記載の検出方法。
【請求項８】
さらに、対照核酸の増幅工程を含むことを特徴とする請求項１記載の検出方法。
【請求項９】
対照核酸が、さらに、配列番号：４７に対して実質的な同一性を持つ配列を有することを特徴とする請求項８記載の検出方法。
【請求項１０】
対照核酸の増幅工程が、配列番号：５０に対して実質的な同一性を有する蛍光発生プローブを用いることを含み、ここに、Ｇ＊はグアニンアナログ６−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オンであり、Ｒａは独立して、（Ｍ）ａ−Ｆｌおよび（Ｍ）ａ−Ｑから選択され、Ｒｂは独立して、（Ｍ）ａ−Ｆｌおよび（Ｍ）ａ−Ｑから選択され、Ｍは副溝バインダーであり、ａは０または１、Ｆｌは約４００〜９００ｎｍの発光波長を持つフルオロフォアであり、Ｑは非蛍光性クエンチャーであり、ここに、前記プローブがハイブリダイズしない場合、ＲａおよびＲｂの置換は蛍光をクエンチングさせることを特徴とする請求項８記載の検出方法。
【請求項１１】
対照核酸の増幅工程が、配列番号：４８または４９である配列に対して実質的な同一性を有する１以上のプライマーを用いることを含むことを特徴とする請求項８記載の検出方法。
【請求項１２】
（ａ）ＣＴＸ−Ｍ核酸を含有することが疑われる試料と、配列番号：２、３、６、７、８、１３、１４、１６、１７、２０、２１、２４、２５、３０、３１、３３および３４から選択される配列に対して実質的な同一性を持つ配列を有する少なくとも１つのプライマーとを接触させて、混合物を生成し；
（ｂ）ＣＴＸ−Ｍ核酸を増幅するのに十分な条件下で工程（ａ）の混合物をインキュベートし、それにより、増幅されたＣＴＸ−Ｍ核酸を生成し；次いで
（ｃ）増幅されたＣＴＸ−Ｍ核酸を検出する
ことを含むことを特徴とする、試料中のＣＴＸ−Ｍ核酸の検出方法。
【請求項１３】
増幅されたＣＴＸ−Ｍ核酸の検出工程が、蛍光発生プローブを用いることを含むことを特徴とする請求項１２記載の検出方法。
【請求項１４】
蛍光発生プローブが、配列番号：４、９、１０、１１、１８、２２、２６、２７、２８、３２、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５および４６から選択される配列に対して実質的な同一性を持つ配列を有し、ここに、Ｇ＊はグアニンアナログ６−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オンであり、Ｒａは独立して、（Ｍ）ａ−Ｆｌおよび（Ｍ）ａ−Ｑから選択され、Ｒｂは独立して、（Ｍ）ａ−Ｆｌおよび（Ｍ）ａ−Ｑから選択され、Ｍは副溝バインダーであり、ａは０または１、Ｆｌは約４００〜９００ｎｍの発光波長を持つフルオロフォアであり、Ｑは非蛍光性クエンチャーであり、ここに、前記プローブがハイブリダイズしない場合、ＲａおよびＲｂの置換は蛍光をクエンチングさせることを特徴とする請求項１３記載の検出方法。
【請求項１５】
蛍光発生プローブが、さらに副溝バインダーを含むことを特徴とする請求項１３記載の検出方法。
【請求項１６】
さらに、対照核酸の増幅工程を含むことを特徴とする請求項１２記載の検出方法。
【請求項１７】
対照核酸が、配列番号：４７の配列を有することを特徴とする請求項１６記載の検出方法。
【請求項１８】
対照核酸の増幅工程が、配列番号：５０に対して実質的な同一性を有する蛍光発生プローブを用いることを含み、ここに、Ｇ＊はグアニンアナログ６−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オンであり、Ｒａは独立して、（Ｍ）ａ−Ｆｌおよび（Ｍ）ａ−Ｑから選択され、Ｒｂは独立して、（Ｍ）ａ−Ｆｌおよび（Ｍ）ａ−Ｑから選択され、Ｍは副溝バインダーであり、ａは０または１、Ｆｌは約４００〜９００ｎｍの発光波長を持つフルオロフォアであり、Ｑは非蛍光性クエンチャーであり、ここに、前記プローブがハイブリダイズしない場合、ＲａおよびＲｂの置換は蛍光をクエンチングさせることを特徴とする請求項１６記載の検出方法。
【請求項１９】
対照核酸の増幅工程が、配列番号：４８または４９である配列に対して実質的な同一性を有する１以上のプライマーを用いることを含むことを特徴とする請求項１６記載の検出方法。
【請求項２０】
（ａ）ＣＴＸ−Ｍ核酸を含有することが疑われる試料と、式：
【化２】
2017538419.tif 000024
（式中、ＸはＣＴＸ−Ｍ核酸に非相補的であるフラッププライマーの５’部分であり、Ｙは、ＣＴＸ−Ｍ核酸の少なくとも一部に実質的に相補的であるフラッププライマーの３’部分であり、およびｐは０または１である）
を有する少なくとも１つのフラッププライマーとを接触させて、混合物を生成し；
（ｂ）ＣＴＸ−Ｍ核酸を増幅するのに十分な条件下で工程（ａ）の混合物をインキュベートし、それにより、増幅されたＣＴＸ−Ｍ核酸を生成し；次いで
（ｃ）配列番号：４、９、１０、１１、１８、２２、２６、２７、２８、３２、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５および４６から選択される配列に対して実質的な同一性を持つ配列を有する蛍光発生プローブを用いて増幅されたＣＴＸ−Ｍ核酸を検出し、ここに、Ｇ＊はグアニンアナログ６−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オンであり、Ｒａは独立して、（Ｍ）ａ−Ｆｌおよび（Ｍ）ａ−Ｑから選択され、Ｒｂは独立して、（Ｍ）ａ−Ｆｌおよび（Ｍ）ａ−Ｑから選択され、Ｍは副溝バインダーであり、ａは０または１、Ｆｌは約４００〜９００ｎｍの発光波長を持つフルオロフォアであり、Ｑは非蛍光性クエンチャーであり、ここに、前記プローブがハイブリダイズしない場合、ＲａおよびＲｂの置換は蛍光をクエンチングさせる
ことを含むことを特徴とする、試料中のＣＴＸ−Ｍ核酸の検出方法。
【請求項２１】
ＸがＡＡＴＡＡＡＴＣＡＴＡＡ（配列番号：５１）の少なくとも一部を含む配列を有し、Ｙが配列番号：１、１２、１９または２９の少なくとも一部に実質的に相補的である配列を有することを特徴とする請求項２０記載の検出方法。
【請求項２２】
フラッププライマーが、配列番号：２、３、６、７、８、１３、１４、１６、１７、２０、２１、２４、２５、３０、３１、３３および３４から選択される配列に対して実質的な同一性を持つ配列を有することを特徴とする請求項２０記載の検出方法。
【請求項２３】
さらに、対照核酸の増幅工程を含むことを特徴とする請求項２０記載の検出方法。
【請求項２４】
対照核酸が、配列番号：４７の配列を有することを特徴とする請求項２３記載の検出方法。
【請求項２５】
対照核酸の増幅工程が、配列番号：５０に対して実質的な同一性を有する蛍光発生プローブを用いることを含み、ここに、Ｇ＊はグアニンアナログ６−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オンであり、Ｒａは独立して、（Ｍ）ａ−Ｆｌおよび（Ｍ）ａ−Ｑから選択され、Ｒｂは独立して、（Ｍ）ａ−Ｆｌおよび（Ｍ）ａ−Ｑから選択され、Ｍは副溝バインダーであり、ａは０または１、Ｆｌは約４００〜９００ｎｍの発光波長を持つフルオロフォアであり、Ｑは非蛍光性クエンチャーであり、ここに、前記プローブがハイブリダイズしない場合、ＲａおよびＲｂの置換は蛍光をクエンチングさせることを特徴とする請求項２３記載の検出方法。
【請求項２６】
対照核酸の増幅工程が、配列番号：４８または４９である配列に対して実質的な同一性を有する１以上のプライマーを用いることを含むことを特徴とする請求項２３記載の検出方法。
【請求項２７】
（ａ）ＣＴＸ−Ｍグループ１および９核酸を含有することが疑われる試料と、
（ｉ）少なくとも１つの以下の配列：
【化３】
2017538419.tif 000025
を含む少なくとも１つの順方向フラッププライマー；ならびに
（ｉｉ）少なくとも１つの以下の配列：
【化４】
2017538419.tif 000026
を含む少なくとも１つの逆方向フラッププライマー
とを接触させて、反応混合物を生成し；
（ｂ）ＣＴＸ−Ｍグループ１および９核酸を増幅するのに十分な条件下で工程（ａ）の反応混合物をインキュベートし、それによって、増幅されたＣＴＸ−Ｍグループ１および９核酸を生成し；次いで
（ｃ）増幅されたＣＴＸ−Ｍグループ１および９核酸を検出することを含むことを特徴とする、試料中のＣＴＸ−Ｍグループ１および９核酸の同時検出方法。
【請求項２８】
増幅されたＣＴＸ−Ｍグループ１および９核酸の検出工程が、少なくとも１つの以下の配列：
Ｒａ−Ｇ＊ＴＣＧＧＣＴＣＧＧＴＡＣＧＧ−Ｒｂ（配列番号：２２）および
Ｒａ−Ｇ＊ＴＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＣＧＡＴＣＣ−Ｒｂ（配列番号：２６）
（式中、Ｇ＊はグアニンアナログ６−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オンであり、Ｒａは独立して、（Ｍ）ａ−Ｆｌおよび（Ｍ）ａ−Ｑから選択され、Ｒｂは独立して、（Ｍ）ａ−Ｆｌおよび（Ｍ）ａ−Ｑから選択され、Ｍは副溝バインダーであり、ａは０または１、Ｆｌは約４００〜９００ｎｍの発光波長を持つフルオロフォアであり、Ｑは非蛍光性クエンチャーであり、ここに、前記プローブがハイブリダイズしない場合、ＲａおよびＲｂの置換は蛍光をクエンチングさせる）
を含む蛍光発生プローブを用いることを含むことを特徴とする請求項２７記載の検出方法。
【請求項２９】
さらに、配列番号：４７の配列を有する対照核酸の増幅工程を含む請求項２７記載の検出方法。
【請求項３０】
対照核酸の増幅工程が、配列番号：５０に対して実質的な同一性を有する蛍光発生プローブを用いることを含み、ここに、Ｇ＊はグアニンアナログ６−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オンであり、Ｒａは独立して、（Ｍ）ａ−Ｆｌおよび（Ｍ）ａ−Ｑから選択され、Ｒｂは独立して、（Ｍ）ａ−Ｆｌおよび（Ｍ）ａ−Ｑから選択され、Ｍは副溝バインダーであり、ａは０または１、Ｆｌは約４００〜９００ｎｍの発光波長を持つフルオロフォアであり、Ｑは非蛍光性クエンチャーであり、ここに、前記プローブがハイブリダイズしない場合、ＲａおよびＲｂの置換は蛍光をクエンチングさせることを特徴とする請求項２９記載の検出方法。
【請求項３１】
対照核酸の増幅工程が、配列番号：４８または４９である配列に対して実質的な同一性を有する１以上のプライマーを用いることを含むことを特徴とする請求項２９記載の検出方法。
【請求項３２】
配列番号：２、３、６、７、８、１３、１４、１６、１７、２０、２１、２４、２５、３０、３１、３３および３４から選択される配列に対して実質的な同一性を持つ配列を有する１以上のフラッププライマーを含む、試料中のＣＴＸ−Ｍ核酸の検出用キット。
【請求項３３】
配列番号：４、９、１０、１１、１８、２２、２６、２７、２８、３２、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５および４６から選択される配列に対して実質的な同一性を持つ配列を有する、１以上の蛍光発生プローブをさらに含み、
ここに、Ｇ＊はグアニンアナログ６−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オンであり、Ｒａは独立して、（Ｍ）ａ−Ｆｌおよび（Ｍ）ａ−Ｑから選択され、Ｒｂは独立して、（Ｍ）ａ−Ｆｌおよび（Ｍ）ａ−Ｑから選択され、Ｍは副溝バインダーであり、ａは０または１、Ｆｌは約４００〜９００ｎｍの発光波長を持つフルオロフォアであり、Ｑは非蛍光性クエンチャーであり、ここに、前記プローブがハイブリダイズしない場合、ＲａおよびＲｂの置換は蛍光をクエンチングさせる請求項３２記載のキット。
【請求項３４】
配列番号：４８、４９もしくは５０またはその組合せである配列に対して実質的な同一性を持つ配列を有する対照核酸を増幅するための１以上のプライマーまたはプローブをさらに含む請求項３２記載のキット。
【請求項３５】
配列番号：４、９、１０、１１、１８、２２、２６、２７、２８、３２、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５および４６から選択される配列に対して実質的な同一性を持つ配列を有する、１以上の蛍光発生プローブを含み、
ここに、Ｇ＊はグアニンアナログ６−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オンであり、Ｒａは独立して、（Ｍ）ａ−Ｆｌおよび（Ｍ）ａ−Ｑから選択され、Ｒｂは独立して、（Ｍ）ａ−Ｆｌおよび（Ｍ）ａ−Ｑから選択され、Ｍは副溝バインダーであり、ａは０または１、Ｆｌは約４００〜９００ｎｍの発光波長を持つフルオロフォアであり、Ｑは非蛍光性クエンチャーであり、ここに、前記プローブがハイブリダイズしない場合、ＲａおよびＲｂの置換は蛍光をクエンチングさせることを特徴とする、試料中のＣＴＸ−Ｍ核酸の検出用キット。
【請求項３６】
さらに、配列番号：２、３、６、７、８、１３、１４、１６、１７、２０、２１、２４、２５、３０、３１、３３および３４から選択される配列に対して実質的な同一性を持つ配列を有する１以上のフラッププライマーを含む請求項３５記載のキット。
【請求項３７】
さらに、配列番号：４８、４９もしくは５０、またはその組合せである配列に対して実質的な同一性を持つ配列を有する対照核酸を増幅するための１以上のプライマーまたはプローブを含む請求項３５記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、細菌の診断、より詳細には、基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ（extended spectrum beta-lactamase）をコードする遺伝子に指向される、好ましいプライマー、プローブおよびアッセイを用いる抗生物質耐性菌を検出するための方法および組成物に関する。
【０００２】
本願は、２０１４年１２月１２日付けで出願した「抗生物質耐性菌を検出するための方法および組成物」を発明の名称とする米国仮特許出願シリアル番号第６２／０９０，９０４号に対する優先権を主張し、その全てをここに出典明示して本明細書の一部とみなす。
【背景技術】
【０００３】
β−ラクタム系抗生物質（ベータ−ラクタム系抗生物質）は、それらの分子構造中にβ−ラクタム環を含むすべての抗生物質剤よりなる広範囲のクラスの抗生物質である。これは、ペニシリン誘導体（ペナム系）、セファロスポリン（セフェム系）、モノバクタムおよびカルバペネムを含む（Holten KB 2000）。大部分のβ−ラクタム系抗生物質は細菌生物中の細胞壁生合成の阻害により作用し、最も広範囲に用いられるグループの抗生物質である。β−ラクタム系抗生物質は、感受性生物によって引き起こされた細菌感染の予防および治療に適用される。初めは、β−ラクタム系抗生物質は、グラム陽性菌に対してのみ主として活性であり、最近開発された広域スペクトルのβ−ラクタム系抗生物質は種々のグラム陰性生物に対して活性であり、それらはその有用性を増加させてきている。
【０００４】
β−ラクタマーゼの生成は、グラム陰性菌中のβ−ラクタム抗生物質に対する耐性の主な原因である。ＣＴＸ−Ｍ ベータ−ラクタマーゼ酵素は、セフォタキシムに対するそれらのより大きな活性のために命名された。水平方向の遺伝子移動での過度の抗生物質使用の圧力下の多剤耐性（ＭＤＲ）菌の進化は、ｂｌａ（ＣＴＸ−Ｍ）のごとき遺伝子が異なる細菌の種および株の中で蔓延した手段を提供する(Hawkey PM 2009, Liebanaら 2013)。８０を超えるＣＴＸ−Ｍ酵素が現在知られている。ＣＴＸ−Ｍ１−グループおよびＣＴＸ−Ｍ９−グループは、各々、５つおよび９つの密接に関連する酵素を表し、特に、それらは臨床的に関連している(Garridoら 2014; Helldalら 2013; Onnbergら 2011; Dallenneら 2010)。ＣＴＸ−Ｍ酵素は、特に、サルモネラ菌および大腸菌を含む、腸内菌族の種々のメンバーで観察される。典型的には、ｂｌａＣＴＸ−Ｍ遺伝子は、種々のサイズおよび構造の伝達性プラスミドに位置し、そのグループ１および９は、各々、９７および９８％類似する(Bonnet 2004)。余り臨床的に関連しないＣＴＸ−Ｍグループのバックグラウンドにおける臨床的に関連するグループ１および９の特異的な検出は、特別な課題を示す。
【０００５】
それらは、抗生物質耐性のβ−ラクタマーゼ遺伝子のキャリアーの迅速な検出につき臨床的な必要性が存在し、その中のＣＴＸ−Ｍ１およびＣＴＸ−Ｍ９グループがより高い臨床的な罹患率を有する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本開示は、細菌の診断、より詳細には、基質特異性拡張型β−ラクタマーゼをコードする遺伝子に指向される、好ましいプライマー、プローブおよびアッセイを用いる抗生物質耐性菌を検出するための方法および組成物に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は、細菌中の基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ耐性を引き起こすＣＴＸ−Ｍグループ１および９を含む基質特異性拡張型β−ラクタマーゼをコードする遺伝子に特異的なプライマーおよびプローブに関する。
【０００８】
より詳細には、本開示は、生物学的試料（例えば、直腸スワブ）を含めた試料中のある種のβ−ラクタマーゼをコードする遺伝子の検出用のプライマーおよびプローブに関する。本発明は、好ましくはグラム陰性菌の臨床分離株中の抗生物質耐性遺伝子マーカーを運ぶ特異的なベータラクタマーゼ産生株のファミリーを識別するためのプライマーおよびプローブを開示する。ＣＴＸ−Ｍグループ１および９を含む耐性をコードする遺伝子を増幅し検出する、特異的なプライマーおよびプローブが、本明細書のプライマーおよびプローブの配列に開示される。記載された方法において、ＣＴＸ−Ｍグループ１および９遺伝子を含有することが疑われる生物学的試料または組織から得られた臨床またはテスト試料中に存在する核酸を増幅し、ＣＴＸ−Ｍグループ１および９についての対応する配列を検出する。増幅された核酸は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、放射標識、酵素標識等を含めた当該技術分野の種々の水準によって検出することができる。また、増幅された核酸は、ハイブリダイゼーション検出プローブを含み得るいずれの組合せの検出技術によっても検出することができる。
【０００９】
１つの具体例は、個体からの生物学的試料中のＣＴＸ−Ｍグループ１および９を検出する方法に関する。他の具体例は、ＣＴＸ−Ｍグループ１および９遺伝子配列に特徴的なヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドのプライマーおよびプローブを提供する。この方法は、少なくとも１つの循環工程の増幅およびハイブリダイゼーションを行なうことを含む。増幅工程は、試料核酸と１対以上のプライマーとを接触させて、ＣＴＸ−Ｍグループ１および９核酸が存在する場合に増幅産物を生成することを含む。好ましいプライマーは、耐性生物のＣＴＸ−Ｍ遺伝子の特定領域を標的とする。オリゴヌクレオチドプローブは、増幅された標的を直接的または間接的に検出する。最も好ましいオリゴヌクレオチドプローブは、その相補的に増幅された標的に対するハイブリダイゼーションにおいて蛍光を発する５’−副溝バインダー−フルオロフォア−オリゴヌクレオチド−クエンチャー−３’コンジュゲートである。もう一つの具体例において、好ましいオリゴヌクレオチドプローブは、５’−エンドヌクレアーゼ活性によって切断した場合にその相補的に増幅された標的に対するハイブリダイゼーションにおいて蛍光を発する３’−副溝バインダー−クエンチャー−オリゴヌクレオチド−フルオロフォア−３’コンジュゲートである。
【００１０】
また、キットは、生物学的試料中のＣＴＸ−Ｍグループ１および９遺伝子の検出に提供され、このキットは、ＣＴＸ−Ｍグループ１および９配列の増幅に特異的な少なくとも１つのアニーリング用のオリゴヌクレオチドプライマー試薬を含み、ＣＴＸ−Ｍグループ１および９配列の検出に特異的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを含む。
【００１１】
方法は、本発明のハイブリダイゼーションプローブの蛍光シグナル（例えば、ＦＲＥＴに起因するシグナル）の存在または不存在の検出をさらに含む。蛍光シグナルの存在は、通常、生物学的試料中のＣＴＸ−Ｍグループ１および９遺伝子配列の存在を示し、一方、シグナルの不存在は、通常、生物学的試料中のＣＴＸ−Ｍグループ１および９遺伝子配列の不存在を示す。
【００１２】
加えて、方法は、プローブと増幅産物との間の融解温度プロフィールを決定することを含み得る。融解曲線は、プローブ配列領域のミスマッチを含むＣＴＸ−Ｍグループ１および９遺伝子配列の存在または不存在、およびＣＴＸ−Ｍグループ１および９遺伝子配列の潜在的な存在を確認する。
【００１３】
本発明のプライマーおよびプローブは、より高い臨床的な罹患率を有するＣＴＸ−Ｍグループ１および９遺伝子配列の特異的、高感度でかつ迅速な検出を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、単独または内部標準と組み合せた大腸菌ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−２３２６から抽出したＣＴＸ−Ｍ１５ ＤＮＡのリアルタイム力価測定（１０倍の力価測定（１００ｐｇ〜１ｆｇ））を示す。
【図２】図２は、線形曲線として再プロットした図１に示すＣＴＸ−Ｍ１５−ＩＣおよびＣＴＣ−Ｍ１５＋ＩＣについてのシングルプレックスおよびバイプレックス増幅データを示す。
【図３】図３は、３つの異なる位置について設計したプローブおよびプライマーを持つＣＴＸ−Ｍ１５核酸のリアルタイム検出を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
Ｉ．全般
本開示は、ある種のβ−ラクタマーゼ、すなわち、ＣＴＸ−Ｍグループ１および９をコードする核酸配列の特異的な増幅および／または検出のための方法に用いるプライマーおよびプローブを提供する。
【００１６】
II．定義
本明細書に用いた「ＣＴＸ−Ｍ」なる用語は、様々な種のクルイベラ（Kluyvera）からの染色体のｂｌａＣＴＸ−Ｍ関連遺伝子を獲得した主としてグラム陰性菌において抗生物質耐性を引き起こす基質特異性拡張型β−ラクタマーゼをいう。ＣＴＸ−Ｍ−１グループは、＞９７％の同一性を示す６つのプラスミド媒介酵素（ＣＴＸ−Ｍ−１、ＣＴＸ−Ｍ−３、ＣＴＸ−Ｍ−１０、ＣＴＸ−Ｍ−１２、ＣＴＸ−Ｍ−１５およびＦＥＣ−１）を含み、また、ＣＴＸ−Ｍ−９グループは、＞９８％の同一性を示す９つのプラスミド媒介酵素（ＣＴＸ−Ｍ−９、ＣＴＸ−Ｍ−１３、ＣＴＸ−Ｍ−１４、ＣＴＸ−Ｍ−１６、ＣＴＸ−Ｍ−１７、ＣＴＸ−Ｍ−１９、ＣＴＸ−Ｍ−２１、ＣＴＸ−Ｍ−２７およびＴｏｈｏ−２）(Bonnet, 2004)を含む。
【００１７】
本明細書に用いた「試料」とは、ＣＴＸ−Ｍ核酸を含有することが疑われるいずれの源の試料もいう。これらの試料は本明細書に記載された方法によって試験することができる。試料は、実験室源または非実験室源からのものであり得る。試料は、バッファー、抽出物、溶媒等のごとき液体材料中に懸濁または溶解し得る。また、試料は、動物およびヒトの組織または体液のごとき生物学的試料、例えば、全血、血液画分、血清、血漿、脳脊髄液、リンパ液、乳、尿、呼吸、腸および尿生殖器の種々の外分泌物、涙、および唾液；ならびに細胞抽出液、細胞培養上清、固定組織標本および固定細胞標本のごとき生物学的流体を含む。試料は、鼻咽頭もしくは咽頭スワブ、便または直腸スワブを含む。また、生物学的試料は、組織学的な目的のために採取された生検および剖検試料または凍結切片のごとき組織切片を含み得る。生物学的試料は、例えば、ヒトを含めたいずれの哺乳動物からも得られる。
【００１８】
「フラッププライマー」または「突出プライマー」なる用語は、標的核酸配列（例えば、ＣＴＸ−Ｍグループ１および９核酸配列）に非相補的な５’配列セグメント、および標的核酸配列（例えば、ＣＴＸ−Ｍグループ１および９核酸配列）に相補的な３’配列セグメントを含むプライマーをいう。本発明のフラッププライマーは、標的核酸配列（例えば、ＣＴＸ−Ｍグループ１および９核酸配列）のプライマー伸張または増幅に適している。
【００１９】
「突出配列」なる用語は、プライマー中の非相補的なアダプター、フラップまたは突出配列をいう。「非相補的」な配列は、増幅条件下で標的配列に結合しない。フラッププライマーのフラップ部分は、標的配列に相補的であるヌクレオチドを含むことができるが、但し、そのフラップの一部の５’にすぐ近くの３つのヌクレオチドは標的配列に相補的ではない。
【００２０】
「蛍光発生プローブ」なる用語は、ａ）結合した副溝バインダー、フルオロフォアおよびクエンチャーを有するオリゴヌクレオチド、またはｂ）ＤＮＡ結合試薬のいずれもをいう。プローブは、例えば、５’末端を含めたいずれかの位置の１以上の非相補的または修飾ヌクレオチド（例えば、本明細書に後記されるピラゾロピリミジン）を含み得る。いくつかの具体例において、フルオロフォアは修飾ヌクレオチドに結合する。
【００２１】
「修飾塩基」なる用語は、１以上の官能基の付加または欠失、複素環構造における差異（すなわち、炭素のヘテロ原子への置換、または逆）および／または塩基に対する１以上のリンカーアーム構造の結合による、天然発生の塩基（アデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびウラシル）と異なるそれらの塩基をいう。好ましい修飾ヌクレオチドは、ピリミジン構造またはプリン構造に基づいたものであり、後者は、より好ましくは、７つのデアザプリンおよびそれらの誘導体ならびにピラゾロピリミジン（米国特許第７，０４５，６１０号に記載された）であり；これは、米国特許第６，１２７，１２１号にも記載されている。好ましい修飾塩基は、５−置換ピリミジンおよび３−置換ピラゾロピリミジンである。好ましい修飾塩基として、６−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オン（ＰＰＧまたはＳｕｐｅｒ Ｇ（登録商標））、４−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、１Ｈ−ピラゾロ［５，４−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−６（７Ｈ）−ジオン、６−アミノ−３−プロプ−１−イニル−５−ヒドロピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−オン、６−アミノ−３−（３−ヒドロキシプロプ−１−イニル）−５−ヒドロピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−オン、６−アミノ−３−（３−アミノプロプ−１−イニル）−５−ヒドロピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−オン、４−アミノ−３−（プロプ−１−イニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、４−アミノ−３−（３−ヒドロキシプロプ−１−イニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、４−アミノ−３−（３−アミノプロプ−１−イニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、３−プロプ−１−イニル−４，６−ジアミノピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、２−（４，６−ジアミノピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）エチン−１−オール、３−（２−アミノエチニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン、５−プロプ−１−イニル−１，３−ジヒドロピリミジン−２，４−ジオン、５−（３−ヒドロキシプロプ−１−イニル）−１，３−ジヒドロピリミジン−２，４−ジオン、６−アミノ−５−プロプ−１−イニル−３−ジヒドロピリミジン−２−オン、６−アミノ−５−（３−ヒドロキシプロプ−１−イニ）−ｌ，３−ジヒドロピリミジン−２−オン、６−アミノ−５−（３−アミノプロプ−１−イニ）−１，３−ジヒドロピリミジン−２−オン、５−［４−アミノ−３−（３−メトキシプロプ−１−イニル）ピラゾール［３，４−ｄ］ピリミジニル］−２−（ヒドロキシメチル）オキソラン−３−オール、６−アミノ−１−［４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）オキソラン−２−イル］−３−（３−メトキシプロプ−１−イニル）−５−ヒドロピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−オン、４−（４，６−ジアミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−ブト−３−イン−１−オール（Ｓｕｐｅｒ Ａ（登録商標））、６−アミノ−３−（４−ヒドロキシ−ブト−１−イニル）−１，５−ジヒドロ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−オン、５−（４−ヒドロキシ−ブト−１−イニル）−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオン（���ｕｐｅｒ Ｔ（登録商標））、３−ヨード−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン、３−ブロモ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン、３−クロロ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン、３−ヨード−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−イルアミン、３−ブロモ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−イルアミンおよび３−クロロ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−イルアミンが挙げられる。ユニバーサル塩基の例は、ここに出典明示して本明細書の一部とみなす共有の米国出願第２０１３／０２６１０１４号に見出すことができる。
【００２２】
「蛍光標識」または「フルオロフォア」なる用語は、約４００〜約９００ｎｍの蛍光発光最大を持つ化合物をいう。これらの化合物は、括弧内でｎｍ単位でのそれらの発光最大を示すと、Ｃｙ２（商標）（５０６）、ＧＦＰ（赤色シフト）（５０７）、ＹＯ−ＰＲＯ（商標）−１（５０９）、ＹＯＹＯ（商標）−１（５０９）、カルセイン（５１７）、ＦＩＴＣ（５１８）、ＦｌｕｏｒＸ（商標）（５１９）、アレクサ（商標）（５２０）、ローダミン１１０（５２０）、５−ＦＡＭ（５２２）、オレゴングリーン（商標）５００（５２２）、オレゴングリーン（商標）４８８（５２４）、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（商標）（５２５）、ローダミングリーン（商標）（５２７）、ローダミン１２３（５２９）、マグネシウムグリーン（商標）（５３１）、カルシウムグリーン（商標）（５３３）、ＴＯ−ＰＲＯ（商標）−１（５３３）、ＴＯＴＯ（登録商標）−１（５３３）、ＪＯＥ（５４８）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５３０／５５０（５５０）、Ｄｉｌ（５６５）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５５８／５６８（５６８）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５６４／５７０（５７０）、Ｃｙ３（商標）（５７０）、アレクサ（商標）５４６（５７０）、ＴＲＩＴＣ（５７２）、マグネシウムオレンジ（商標）（５７５）、フィコエリトリンＲ＆Ｂ（５７５）、ローダミンファロイジン（５７５）、カルシウムオレンジ（商標）（５７６）、ピロニンＹ（５８０）、ローダミンＢ（５８０）、ＴＡＭＲＡ（５８２）、ローダミンレッド（商標）（５９０）、Ｃｙ３．５（商標）（５９６）、ＲＯＸ（６０８）、カルシウムクリムソン（商標）（６１５）、アレクサ（商標）５９４（６１５）、テキサスレッド（登録商標）（６１５）、ナイルレッド（６２８）、ＹＯ−ＰＲＯ（商標）−３（６３１）、ＹＯＹＯ（商標）−３（６３１）、Ｒ−フィコシアニン（６４２）、Ｃ−フィコシアニン（６４８）、ＴＯ−ＰＲＯ（商標）−３（６６０）、ＴＯＴＯ（登録商標）−３（６６０）、ＤｉＤ  ＤｉｌＣ（５）（６６５）、Ｃｙ５（商標）（６７０）、チアジカルボシアニン（６７１）およびＣｙ５．５（６９４）を含む。さらなるフルオロフォアは、ＰＣＴ特許公開第ＷＯ０３／０２３３５７号および米国特許第７，６７１，２１８号に開示されている。これらおよび他の適当な色素クラスの例は、Hauglandら, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Sixth Ed., Molecular Probes, Eugene, Ore. (1996)；米国特許第３，１９４，８０５号；第３，１２８，１７９号；第５，１８７，２８８号；第５，１８８，９３４号；第５，２２７，４８７号；第５，２４８，７８２号；第５，３０４，６４５号；第５，４３３，８９６号；第５，４４２，０４５号；第５，５５６，９５９号；第５，５８３，２３６号；第５，８０８，０４４号；第５，８５２，１９１号；第５，９８６，０８６号；第６，０２０，４８１号；第６，１６２，９３１号；第６，１８０，２９５号；および第６，２２１，６０４号；ＥＰ特許第１４０８３６６号に見出すことができ；依然として他の色素は、zeiss.comのごときオンラインサイト経由で提供されている。ホスホネート色素は、共有の米国第７，６７１，２１８号、米国第７，７６７，８３４号および第８，１６３，９１０号に開示��れている。
【００２３】
クエンチャーおよびフルオロフォア対ならびにオリゴヌクレオチドに対するそれらの結合を選択するための当該技術分野における広範囲のガイダンスが存在する（Haugland, 1996；米国特許第３，９９６，３４５号、第４，３５１，７６０号、第８，４１０，２５５号等）。
【００２４】
好ましいクエンチャーは、共有の米国特許第６，７２７，３５６号および第７，６６２，９４２号に記載されている。
【００２５】
本明細書の記載において、Ｍ、ＦＬ、Ｑ、ＣＰＧおよびＯＤＮなる略語は、文脈から明確なように、各々、「副溝バインダー」、「蛍光標識」または「フルオロフォア」、「クエンチャー」、「多孔性ガラス（controlled pore glass）」（固体担体の例として）、および「オリゴヌクレオチド」部分または分子をいう。「プローブ」および「コンジュゲート」なる用語は互換的に用いられ、それらは、好ましくは、結合した副溝バインダー、フルオロフォアおよびクエンチャーを有するオリゴヌクレオチドをいう。
【００２６】
「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「ポリヌクレオチド」なる用語は、本明細書において互換的に用いられる。これらの用語は、一本鎖または二本鎖形態のいずれの核酸、ヌクレオチドまたはそのポリマーを含む化合物、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、天然のヌクレオチドのアナログおよびそれらのハイブリッドをいう。これらの用語は、修飾ヌクレオチドまたは非天然発生ヌクレオチドを含むポリマー、または限定されるものではないが、Nielsenら, Science, 254:1497-1500 (1991)に記載されたペプチド核酸、Bolliら, Nucleic Acids Res., 24:4660-4667 (1996)に記載されたビシクロＤＮＡオリゴマーおよび関連構造を含めた、ＤＮＡまたはＲＮＡへの安定な塩基対合ができるいずれの他のタイプのポリマーも包含する。特に限定されない限りは、それらの用語は、天然発生ヌクレオチドと同様に核酸にハイブリダイズする天然ヌクレオチドの公知のアナログを包含する。かかるアナログとして、限定なくして、ホスホロチオエート、ホスホロアミダート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）およびそれらのいずれかの組合せが挙げられる。「サブシークエンス」または「セグメント」は、より長い配列のヌクレオチドの一部を含むヌクレオチドの配列をいう。
【００２７】
「内部標準」なる用語は、１以上の試薬の欠如、熱サイクルによる増幅の欠如、増幅の抑制、反応の報告の欠如および同様の欠如による標的の偽陰性（false negative）増幅をモニターする対照増幅反応をいう。内部標準としてのバクテリオファージＭＳ２（Dreier 2005）および精製したバチルス・アトロファエウス亜種グロビギ（Bacillus atrophaeus subsp. globigii）胞子の使用が報告されている。また、競合的および非競合的な内部標準の設計における実際的検討も、当該技術分野において知られている(Hoorfar 2004)。
【００２８】
本明細書に記載された方法の実施は、特記されない限りは、有機化学、生化学、オリゴヌクレオチド合成および修飾、バイオコンジュゲート化学、核酸ハイブリダイゼーション、分子生物学、微生物学、遺伝学、組換えＤＮＡおよび当該技術分野の技量内の関連する技術分野における従来技術を使用するであろう。これらの技術は、文献中に十分に説明されている。例えば、Sambrook, Fritsch & Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Ausubel,ら, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons (1987, 1988, 1989, 1990, 1991, 1992, 1993, 1994, 1995, 1996); Gait (ed.), OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS: A PRACTICAL APPROACH, IRL Press (1984);および Eckstein (ed.), OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES: A PRACTICAL APPROACH, IRL Press (1991)ご参照。
【００２９】
III．記載
本明細書における好ましい具体例は、ＣＴＸ−Ｍグループ１および９核酸を特異的に増幅および／または検出する方法に用いるプライマーおよびプローブに指向される。本発明のプライマーおよびプローブは、単一反応または別々の反応のいずれかにおいて同時にＣＴＸ−Ｍグループ１および９配列を検出するための本願発明の方法に用いるのに適当である。典型的には、増幅方法は、ＣＴＸ−Ｍグループ１および９核酸について行なわれる。１つのかかる増幅方法は、ポリメラーゼ連鎖反応である（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および第４，９６５，１８８号；Mullisら, Cold Spring Harb. Symp. Quant.Biol., 51 Pt 1:263-273 (1986)ご参照）。
【００３０】
増幅手順は、連続的な重合および／または連結反応によって、通常、指数関数的な方法で、多数のコピーの標的核酸配列が生成されるものである。後記されたより従来の増幅反応に加えて、本方法は、３元連結（例えば、WO99/37085参照）、シグナル増幅(例えば、Capaldi,ら, Nuc. Acids Res., 28:E21 (2000)参照)、Ｔ７ポリメラーゼ、逆転写酵素、リボヌクレアーゼＨ（RNase H）、ＲＴ−ＰＣＲ、ローリングサークル、クリベース等を含む増幅に有用である。等温増幅方法が概説されている(Niemz, A.ら Trends Biotechnol., 29: 240-50 (2011))。「プローブ領域に隣接するオリゴヌクレオチドプライマー」なる用語は、０または１以上の塩基がプライマーおよびプローブを分離する場合をいう。「前記プローブ領域でオーバーラップする」なる用語は、米国特許第７，３１９，０２２号に開示されるごとく定義される。「Ｃｔ」なる用語は、リポーター蛍光が閾値を超える断片的なＰＣＲサイクル数をいう。
【００３１】
従って、第１の態様において、本発明は、
（ａ）ＣＴＸ−Ｍを含有することが疑われる試料と、式：
【化１】
2017538419.tif 000002
（式中、ＸはＣＴＸ−Ｍ核酸に非相補的であるフラッププライマーの５’部分を表し、Ｙは、ＣＴＸ−Ｍ核酸に相補的であるフラッププライマーの３’部分を表し、Ｘは約３〜３０ヌクレオチド長であり、ｎ＝０または１である）
を有する少なくとも１つのフラッププライマーとを接触させ；次いで、
（ｂ）ＣＴＸ−Ｍ核酸を増幅するのに十分な条件下で工程（ａ）の混合物をインキュベートし、それにより、増幅されたＣＴＸ−Ｍ核酸を生成し；次いで
（ｃ）増幅されたＣＴＸ−Ｍ核酸を検出する
ことを含むことを特徴とする、試料中のＣＴＸ−Ｍ核酸の検出方法を提供する。
【００３２】
いくつかの具体例において、少なくとも１つのフラッププライマーが１を超えるプライマー配列を含む。いくつかの具体例において、蛍光発生（fluorescence-generating）プローブを用いて、増幅されたＣＴＸ−Ｍ核酸を検出する。プローブは副溝バインダーを含み得る。
【００３３】
好ましい方法の実行において、反応混合物は典型的には少なくとも２つのフラッププライマー：順方向フラッププライマーおよび逆方向フラッププライマーを含む。順方向フラッププライマーおよび逆方向フラッププライマーは、等長であることができるが、等長である必要はない。
【００３４】
１つの具体例において、ＣＴＸ−Ｍ核酸に非相補的であるフラッププライマーの５’配列部分（Ｘ）は、約１〜１５ヌクレオチド長であり、通常、約４〜１４または約４〜１３ヌクレオチド長、より通常には、約４〜１２ヌクレオチド長である。ＣＴＸ−Ｍ核酸に非相補的であるフラッププライマーの５’配列部分（Ｘ）は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５ヌクレオチド長であり得る。好ましい具体例において、プライマーは全長が約３０ヌクレオチドである。相補的配列が３０未満のヌクレオチドであるならば、フラップを用いて、３０−ｍｅｒのプライマーを生成し得る。
【００３５】
ある種の例において、ＣＴＸ−Ｍ核酸に相補的であるフラッププライマーの３’配列部分（Ｙ）は、ＣＴＸ−Ｍ核酸に非相補的であるフラッププライマーの５’配列部分（Ｘ）を超えるヌクレオチド数を含む。例えば、ＣＴＸ−Ｍ核酸に相補的であるフラッププライマーの３’配列部分（Ｙ）は、フラッププライマーの全長の約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％または９０％を含むことができる。
【００３６】
ある種の他の例において、ＣＴＸ−Ｍ核酸に非相補的であるフラッププライマーの５’配列部分（Ｘ）は、ＣＴＸ−Ｍ核酸に相補的であるフラッププライマーの３’配列部分（Ｙ）とほぼ等しい数のヌクレオチドを含む。例えば、ＸおよびＹ部分は、各々、約４〜３０、６〜２５、８〜２０または１０〜１５ヌクレオチド長、通常、１０〜１４または１１〜１３ヌクレオチド長、より通常には、約１２ヌクレオチド長であることができる。ＸおよびＹの部分は、各々、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチド長であり得る。
【００３７】
もう一つの具体例において、ＣＴＸ−Ｍ核酸に非相補的であるフラッププライマーの５’配列部分（Ｘ）は、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％または９５％のアデニンまたはチミンヌクレオチド塩基またはその修飾塩基を含む。
【００３８】
いくつかの具体例において、ＣＴＸ−Ｍ核酸に非相補的であるフラッププライマーの５’配列部分（Ｘ）は、以下の配列： ＡＡＴＡＡＡＴＣＡＴＡＡ（配列番号：５１）またはその一部を含む。この非相補的なフラップ配列は、ＡＡＴＡＡＡＴＣＡＴＡＡ−Ｊ（配列番号：５２）（Ｊは付加的なオリゴヌクレオチド配列である）を表すと考え得る。他の具体例において、第１のフラッププライマーのＹ部分は、ＣＴＸ−Ｍグループ１および９核酸の少なくとも一部に実質的に相補的な配列、すなわち、表１に後記された配列番号：１、１２、１９または２９、すなわち、配列番号：２、３、６、７、８、１３、１４、１６、１７、２０、２１、２４、２５、３０、３１、３３および３４に実質的な同一性を持つ配列を有するプライマーを含む。「少なくとも一部に実質的に相補的な」は、ハイブリダイズし、その結果、配列がＣＴＸ−Ｍ配列を増幅させるようにＣＴＸ−Ｍ配列に十分に相補的であることを意味する。「実質的な同一性」は、より詳細には、約８５％相補的であることをを意味する。
【００３９】
試料は、潜在的なＣＴＸ−Ｍ抗生物質耐性に関係する、細菌感染を有することが疑われる哺乳動物から典型的に得られる。好ましくは、哺乳動物はヒトである。本発明の方法の使用に適する試料の例は、限定されるものではないが、直腸スワブを含む。
【００４０】
一般的に、プローブが増幅された標的にハイブリダイズする場合に、方法は検出可能なシグナルを生成する（米国特許：第７，３８１，８１８号および第７，７５９，１２６号）。加えて、この方法は、増幅後融解曲線分析を可能にする。別法としては、５’−３’ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼを用いることにより、蛍光プローブを切断して、蛍光性シグナルを得る（米国特許第５，５３８，８４８号）。さらに、方法は、検出可能なシグナルの連続的モニタリング（「リアルタイム検出」）に特に適する。ある種の具体例において、同時増幅は、蛍光発生プローブ、例えば、ハイブリダイゼーションベースの蛍光プローブまたは核酸結合用蛍光性化合物を用いて検出される。
【００４１】
増幅されたＣＴＸ−Ｍグループ１および９核酸は、当該技術分野において知られたいずれの検出方法を用いても検出することができる。例えば、検出は、増幅反応（例えば、アガロースゲル中で臭化エチジウムを用いる）の完了後に、または増幅反応中に同時に（「リアルタイム検出」）(McPhersonら, PCR Basics, 2000; およびRapid Cycle Real-time PCR Methods and Applications: Quantification, Wittwerら (eds.), Springer-Verlag (2004))実行することができる。好ましくは、増幅されたＣＴＸ−Ｍグループ１および９核酸は、増幅されたＣＴＸ−Ｍグループ１および９核酸に特異的に結合するプローブに対するハイブリダイゼーションによって検出される。ある種の例において、増幅されたＣＴＸ−Ｍグループ１および９核酸は、１以上の蛍光発生プローブを用いて検出される。蛍光発生プローブは、蛍光（例えば、米国特許第：第５，５３８，８４８号等および第７，７９０，３８５号など）、核酸結合化合物（例えば、米国特許：第５，９９４，０５６号；Bengtssonら, Nucl. Acids Res., 31: e45 (2003)）、ハイブリダイゼーションベースのプローブ（例えば、米国特許：第５，９２５，５１７号、第７，２０５，１０５号、第７，３８１，８１８号など）等をリリースするように切断されるプローブを含む。ある種の具体例において、ＣＴＸ−Ｍグループ１および９核酸は、１以上の核酸結合蛍光性化合物（例えば、SYBR（登録商標）グリーン 1 (Molecular Probes; Eugene, OR)、BOXTOX, BEBO (TATAA Biocenter; Gotenborg, Sweeden)など)で検出される。
【００４２】
１つの具体例において、ＣＴＸ−Ｍグループ１および９核酸は、表１に開示され、かつＣＴＸ−Ｍグループ１および９核酸にハイブリダイズする蛍光発生プローブ、ならびに少なくとも１つのフラッププライマー配列（典型的には、相補的な部分、Ｙ）の１以上のヌクレオチド塩基を用いて、検出される。例えば、蛍光発生プローブは、ＣＴＸ−Ｍグループ１および９核酸、および順方向フラッププライマー配列の１以上のヌクレオチド塩基、逆方向フラッププライマー配列の１以上のヌクレオチド塩基、または同時に、順方向および逆方向の双方のフラッププライマー配列の１以上のヌクレオチド塩基にハイブリダイズすることができる。蛍光発生プローブは、所望により、ＣＴＸ−Ｍグループ１および９核酸、ならびに少なくとも１つのフラッププライマー配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のヌクレオチド塩基、特に、フラッププライマーの相補的な部分（Ｙ）にハイブリダイズすることができる。
【００４３】
好ましい具体例において、本発明の蛍光発生プローブは、配列番号：４、９、１０、１１、１８、２２、２６、２７、２８、３２、３５および３６〜４６から選択されるＣＴＸ−Ｍグループ１および９遺伝子に対して実質的な同一性を有する配列を含む。
【００４４】
もう一つの好ましい具体例において、本発明の蛍光発生プローブは、少なくとも１つの以下の配列：
Ｒａ−Ｇ＊ＴＣＧＧＣＴＣＧＧＴＡＣＧＧ−Ｒｂ（配列番号：２２）および
Ｒａ−Ｇ＊ＴＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＣＧＡＴＣＣ−Ｒｂ（配列番号：２６）
（式中、Ｇ＊はグアニンアナログ６−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オンであり、Ｒａは独立して、（Ｍ）ａ−Ｆｌおよび（Ｍ）ａ−Ｑから選択され、Ｒｂは独立して、（Ｍ）ａ−Ｆｌおよび（Ｍ）ａ−Ｑから選択され、Ｍは副溝バインダーであり、ａは０または１、Ｆｌは約４００〜９００ｎｍの発光波長を持つフルオロフォアであり、Ｑは非蛍光性クエンチャーであり、但し、前記プローブがハイブリダイズしない場合、ＲａおよびＲｂの置換は蛍光をクエンチングさせる）
を含む。
【００４５】
好ましい具体例において、Ｆｌは５９３ｎｍの励起波長を持つＡｑｕａＰｈｌｕｏｒ（登録商標）５９３である。
【００４６】
プライマーは、例えば、核酸合成の開始点として作用するように、プライマーの検出または固定を可能にするが、プライマーの基本的な特性を変更しないさらなる特徴を組み込むことができる。いくつかの例において、プライマーは、プライマーの相補的および非相補的な配列領域のいずれかまたは双方において１以上の非天然塩基または修飾塩基を含む。
【００４７】
ある種の例において、増幅はポリメラーゼを用いて実行される。ポリメラーゼは、５’ヌクレアーゼ活性を有することができるが、必要ではない。ある種の他の例において、プライマー伸張は逆転写酵素を用いて実行され、増幅はポリメラーゼを用いて実行される。
【００４８】
もう一つの具体例において、プライマー配列はオーバーラップし、ここに、そのオーバーラップする配列デュプレックスの安定性は、個々のプライマー標的デュプレックスの安定性のものより低い。
【００４９】
もう一つの態様において、本発明は、
（ａ）ＣＴＸ−Ｍグループ１および９核酸を含有することが疑われる試料と、
（ｉ）少なくとも１つの以下の配列：
【化２】
2017538419.tif 000003
（式中、下線強調したヌクレオチド配列は、ＣＴＸ−Ｍグループ１および９配列に非相補的である）
を含む少なくとも１つの順方向フラッププライマー；および
（ｉｉ）少なくとも１つの以下の配列：
【化３】
2017538419.tif 000004
（式中、下線強調したヌクレオチド配列は、ＣＴＸ−Ｍグループ１および９配列に非相補的である）
を含む少なくとも１つの逆方向フラッププライマー
とを接触させて；
（ｂ）ＣＴＸ−Ｍグループ１および９核酸を増幅するのに十分な条件下で工程（ａ）の反応混合物をインキュベートし、それによって、抗生物質耐性を運ぶＣＴＸ−Ｍグループ１および９のラクタマーゼ遺伝子を含む細菌から増幅されたＣＴＸ−Ｍグループ１および９核酸を生成し；次いで
（ｃ）増幅されたＣＴＸ−Ｍグループ１および９核酸を検出することを含むことを特徴とする、試料中のＣＴＸ−Ｍグループ１および９からの核酸の同時検出方法を提供する。
【００５０】
いくつかの具体例は、ＣＴＸ−Ｍグループ１および９核酸の不斉増幅を可能にするプライマー比率を含む。
【００５１】
試料は、典型的には、基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）を運ぶ生物の感染を有することが疑われる哺乳動物から得られる。好ましくは、哺乳動物はヒトである。本発明の方法の使用に適する典型的な試料は、生物を含有するＥＳＢＬ、好ましくは直腸スワブを含む。
【００５２】
いくつかの具体例において、検出可能なシグナルの連続的モニタリング（「リアルタイム検出」）を用いて、シグナルを検出する。ある種の具体例において、同時増幅は、蛍光発生プローブ、例えば、ハイブリダイゼーションベースの蛍光プローブ、切断部位を持つプローブまたは核酸結合蛍光性化合物を用いて検出される。いくつかの具体例において、解離曲線分析を用いる終点の蛍光性測定を用いて、シグナルを検出する。
【００５３】
さらにもう一つの態様において、
少なくとも１つの以下の配列：
【化４】
2017538419.tif 000005
（式中、下線強調されたヌクレオチド配列は、ＣＴＸ−Ｍグループ１および９配列に非相補的である）
を含む少なくとも１つの順方向フラッププライマー；および
（ｉｉ）少なくとも１つの以下の配列：
【化５】
2017538419.tif 000006
（式中、下線強調されたヌクレオチド配列は、ＣＴＸ−Ｍグループ１および９配列に非相補的である）
を含む少なくとも１つの逆方向フラッププライマー
を含む、試料中のＣＴＸ−Ｍグループ１および９核酸の検出用キットが提供される。
【００５４】
ある種の例において、キットは、ハイブリダイゼーションベースの蛍光プローブ、ＣＴＸ−Ｍグループ１および９または核酸結合蛍光性化合物のごとき蛍光発生プローブをさらに含む。好ましい具体例において、蛍光発生プローブは、以下の配列：
Ｒａ−Ｇ＊ＴＧＡＣＩ＊ＴＧＧＡＴＧＡＡＡＧ−Ｒｂ−３’（配列番号：４）
Ｒａ−Ｇ＊ＴＧＡＣＧＴＧＧＣＴＣＡＡＡＧ−Ｒｂ（配列番号：９）
Ｒａ−Ｇ＊ＴＧＡＣＩ＊ＴＧＧＡ＊ＴＧＡＡＡＧＧＣ−Ｒｂ（配列番号：１０）
Ｒａ−Ｇ＊ＴＧＡＣＧＴＧＧＣＴＣＡＡＡＧＧＣ−Ｒｂ（配列番号：１１）
（式中、Ｒａは独立して、（Ｍ）ａ−Ｆｌおよび（Ｍ）ａ−Ｑから選択され、Ｒｂは独立して、（Ｍ）ａ−Ｆｌおよび（Ｍ）ａ−Ｑから選択され、Ｍは副溝バインダーであり、ａは０または１、Ｆｌは約４００〜９００ｎｍの発光波長を持つフルオロフォアであり、Ｑは非蛍光性クエンチャーであり、但し、前記プローブがハイブリダイズしない場合、ＲａおよびＲｂの置換は蛍光をクエンチングさせる）を含む。
【００５５】
もう一つの好ましい具体例において、蛍光発生プローブは、少なくとも１つの以下の配列：
Ｒａ−Ｇ＊ＴＣＧＧＣＴＣＧＧＴＡＣＧＧ−Ｒｂ（配列番号：２２）および
Ｒａ−Ｇ＊ＴＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＣＧＡＴＣＣ−Ｒｂ（配列番号：２６）
（式中、Ｇ＊は６−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オンであり、Ｒａは独立して、（Ｍ）ａ−Ｆｌおよび（Ｍ）ａ−Ｑから選択され、Ｒｂは独立して、（Ｍ）ａ−Ｆｌおよび（Ｍ）ａ−Ｑから選択され、Ｍは副溝バインダーであり、ａは０または１、Ｆｌは約４００〜９００ｎｍの発光波長を持つフルオロフォアであり、Ｑは非蛍光性クエンチャーであり、但し、前記プローブがハイブリダイズしない場合、ＲａおよびＲｂの置換は蛍光をクエンチングさせる）を含む。
【００５６】
好ましい具体例において、Ｆｌは、５９３ｎｍの励起波長を持つＡｑｕａＰｈｌｕｏｒ ５９３(ELITechgroup Molecular Diagnostics, Bothell, WA)である。
【００５７】
ある種の他の例において、キットは、さらに、内部標準としての使用に適する対照核酸を含む。非限定例として、対照核酸は、核酸配列の配列番号：４７を含むことができる。好ましくは、対照核酸は、以下の配列：
５’−ＣＴＧＣＡＣＧＧＡＣＣＡＧＴＴＡＣＴＴＴＡＣＧＧＡＣＣＡＣＧＴＡＣＣＧＣＡＴＴＧＧＴＡＣＡＡＧＡＴＣＴＣＣＧＧＴＡＧＡＡＡＡＡＡＴＧＡＧ−３’（配列番号：４７）を含む。
【００５８】
また、本発明のキットは、対照核酸に向けられたプライマーおよびプローブを含むことができる。非限定例として、対照プローブ（例えば、蛍光発生プローブ）、および核酸配列の配列番号：４７に対して設計された１組の対照プライマーをキットに含むことができる。好ましくは、対照プローブおよびプライマーは、以下の配列：
（ｉ）プローブ：Ｒａ−Ｇ＊ＡＣＣＡＣＧＴＡＣＣＧＣＡＴＴＧ−Ｒｂ（配列番号：５０）
（式中、Ｇ＊はグアニンアナログ６−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オンであり、Ｒａは独立して、（Ｍ）ａ−Ｆｌおよび（Ｍ）ａ−Ｑから選択され、Ｒｂは独立して、（Ｍ）ａ−Ｆｌおよび（Ｍ）ａ−Ｑから選択され、Ｍは副溝バインダーであり、ａは０または１、Ｆｌは約４００〜９００ｎｍの発光波長を持つフルオロフォアであり、Ｑは非蛍光性クエンチャーであり、但し、前記プローブがハイブリダイズしない場合、ＲａおよびＲｂの置換は蛍光をクエンチングさせ、フルオロフォアはＣＴＸ−Ｍグループ１および１５からの核酸を検出するためのプローブのそれとは異なる発光波長を有する）；
（ｉｉ）プライマー：ＣＴＧＣＡＣＧＧＡＣＣＡＧＴＴＡＣＴＴＴＡＣＧ（配列番号：４８）；
ＣＴＣＡＴＴＴＴＴＴＣＴＡＣＣＧＧＡＧＡＴＣＴＴＧＴ（配列番号：４９）
を有する。
【００５９】
好ましい具体例において、Ｆｌは、５２５ｎｍの励起波長を持つＡｑｕａＰｈｌｕｏｒ ５２５(ELITechgroup Molecular Diagnostics, Bothell, WA)であり、「Ｍ」は、例えば、ＤＰＩ３のごとき副溝バインダーであり、「Ｇ＊」はＰＰＧであり、「Ｑ」はEclipse(登録商標) Dark Quencherである。
【００６０】
さらなる具体例において、本発明は、以下の表１に記載された配列を含む、単離された核酸を提供する。表１は、ＣＴＸ−Ｍグループ１および９についてのプライマー、プローブおよび標的配列、ならびに内部標準を示す。
【００６１】
【表１】
2017538419.tif 000007
2017538419.tif 000008
2017538419.tif 000009
2017538419.tif 000010
2017538419.tif 000011
2017538419.tif 000012
【００６２】
ＣＴＸ−Ｍグループ１および９核酸の検出用の最も好ましいプライマーおよびプローブ配列、ならびに最も好ましいＩＣ配列を以下の表２に示す。
【００６３】
【表２】
2017538419.tif 000013
2017538419.tif 000014
【００６４】
１つの態様において、本発明は、ＣＴＸ−Ｍグループ１および９を含む基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ耐性遺伝子の特異的な検出および増幅に適する標的配列を提供する。
【００６５】
より詳細には、ＣＴＸ−Ｍグループ１および１５を含む試料中の基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ耐性核酸の存在または不存在の検出方法、この方法は、グループ１および１５核酸を識別する条件下、前記の試料と、配列番号１、１２、１９もしくは２９またはその相補体のいずれか１つにハイブリダイズするように設計された１以上のオリゴヌクレオチドとを接触させ、次いで、配列番号１、１２、１９もしくは２９またはその相補体への前記の１以上のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが生じたかどうかを検出し、ここに、前記のハイブリダイゼーションが、ＣＴＸ−Ｍグループ１および１５遺伝子の存在または不存在を検出することを含む。
【００６６】
もう一つの具体例において、ＣＴＸ−Ｍグループ９を含む試料中の基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ耐性核酸の存在または不存在の検出方法は、前記試料と、配列番号５、１５もしくは２３またはその相補体のいずれか１つにハイブリダイズするように設計された１以上のオリゴヌクレオチドとを接触させ、次いで、配列番号５、１５もしくは２３またはその相補体への前記の１以上のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが生じたかどうかを検出し、ここに、前記のハイブリダイゼーションが、ＣＴＸ−Ｍグループ９核酸の存在または不存在を検出することを含む。
【００６７】
１つの態様において、ＣＴＸ−Ｍグループ１および９を含む表１に規定された基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ耐性の遺伝子核酸の存在または不存在についてのハイブリダイゼーションによる検出は、核酸ベースの増幅を含む。
【００６８】
もう一つの態様において、生成されたアンプリコンは、少なくとも約３０ヌクレオチド塩基長である。
【００６９】
他の態様は、ＣＴＸ−Ｍグループ１および９に関連し、プライマーおよび／またはプローブを含む表１に規定された基質特異性拡張型β−ラクタマーゼ耐性遺伝子配列の核酸にハイブリダイズする１以上のオリゴヌクレオチドを含む。
【００７０】
ＣＴＸ−Ｍグループ１の核酸にハイブリダイズする１以上のオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号：２、３、１３、１４、２０、２１、３０および３１から選択し得る。
【００７１】
ＣＴＸ−Ｍグループ９の核酸にハイブリダイズする１以上のオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号：６、７、８、１６、１７、２４、２５、３３および３４を含む配列から選択し得る。
【００７２】
ＣＴＸ−Ｍグループ１核酸から生成された核酸ベースの増幅産物は、配列番号：４、１８、２２および２７から選択される１以上のオリゴヌクレオチドプローブによって検出し得る。
【００７３】
いくつかの具体例において、Ｒａ＝Ｍ−Ｆｌ（式中、Ｍは副溝バインダーであって、Ｆｌはフルオロフォアであり、Ｒｂ＝クエンチャー）である。
【００７４】
ＣＴＸ−Ｍグループ９核酸から生成された核酸ベースの増幅産物は、配列番号：９、１１、２６、２８および３６〜４６から選択される配列を含む、１以上のオリゴヌクレオチドプローブによって検出し得る。
【００７５】
本方法は、５’−（Ｘ）ｐ−Ｙ−３’プライマー（式中、ｐ＝０または１、Ｘは、ＣＴＸ−Ｍグループ１および９核酸に非相補的であるプライマーの配列部分を表し、Ｙは、ＣＴＸ−Ｍグループ１および９核酸に相補的であるプライマーの配列部分を表す）として最も一般的に記載されるオリゴヌクレオチドプライマー（「突出プライマー」、「フラッププライマー」または「アダプタープライマー」）を提供する。
【００７６】
従って、１グループの具体例において、プライマーは、以下の式：
【化６】
2017538419.tif 000015
（式中、Ｘは、ＣＴＸ−Ｍグループ１および９核酸に非相補的なプライマーの５’配列を表し、Ｙは、前記プライマーの相補的な３’配列を表し、ｐは０または１であり、Ｘ−Ｙは核酸オリゴマープライマーを表す）を有する。ある種のさらなる具体例において、Ｘは［Ａ−Ｂ］ｍであって、Ｙは［Ａ−Ｂ］ｎであり、ここに、Ａは、核酸調製に用いるいずれかの組合せにおける、糖リン酸骨格、修飾糖リン酸骨格、ロックされた核酸骨格、またはその変異形を表し；Ｂは、核酸塩基または塩基の修飾塩基を表し；および添字ｍおよびｎは、約４〜３０または５〜２５、７〜２０または９〜１５、より通常には約１２の整数である。ある種の具体例において、添字ｍおよびｎの値は等しく、例えば、ｍおよびｎの双方は同時に、約５〜２５、７〜２０または９〜１５、より通常には、約１２の整数であることができる。
【００７７】
プライマーおよびプローブは、伝達性プラスミド上に位置した複数のｂｌａＣＴＸ−Ｍ遺伝子ｂｌａＣＴＸ−Ｍ遺伝子、より詳細には、各グループのメンバー間の実質的または絶対的な相同性を有するＣＴＸ−Ｍグループ１および９核酸の領域を増幅および検出するように設計された。いくつかの具体例において、プライマーは、以下の式：
【化７】
2017538419.tif 000016
（式中、Ｘは、ＣＴＸ−Ｍグループ１および９核酸に非相補的であるフラッププライマーの５’部分を表し、Ｙは、ＣＴＸ−Ｍグループ１および９核酸に相補的であるフラッププライマーの３’部分を表し、ｐは約３〜３０、５〜２５、７〜２０または９〜１５である）
を含むフラッププライマーである。
【００７８】
本発明のプライマーの５’−非相補的配列は、米国特許出願第２００７／００４８７５８号に教示されるごとく修飾することができる。
【００７９】
本発明のプライマーおよびプローブは、当業者に知られた固相法を用いて、一般的に調製される。一般的に、出発原料は商業的に入手できるか、または、例えば、Marchら, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY - Reactions, Mechanisms and Structures, 4th ed., John Wiley & Sons, New York, NY (1992)に記載された適当な官能基操作を用いて、商業的に入手できる出発物質から直接的な方法で調製できる。
【００８０】
１つの具体例において、本発明のプライマーおよびプローブは、当該技術分野において知られたいずれかの天然発生ヌクレオチド、非天然発生ヌクレオチド、または修飾ヌクレオチドを含むことができる（例えば、米国特許公開第２００５０１１８６２３号；および米国特許第６，９４９，３６７号および米国特許公開第２０１２０２４４５３５号参照）。
【００８１】
熱力学的特性に基づいた修飾塩基、副溝バインダー、フルオロフォアおよび／またはクエンチャーの使用または組込みを指令することができるアルゴリズムを用いる予測可能な方法でプローブおよびプライマーを設計する能力は、例えば、米国特許第６，６８３，１７３号に記載されている。従って、修飾核酸でのハイブリダイズした生成物のＴｍ（例えば、約５〜８℃内）を平衡させるか、Ｇ−Ｇ自己会合を低下させるか、またはプライマーまたはプローブ中でのミスマッチを提供するための通常の塩基、非置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン塩基（例えば、ＰＰＧおよびＰＰＡ）、３−置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、修飾プリン、修飾ピリミジン、５−置換ピリミジン、ユニバーサル塩基、糖修飾、骨格修飾および／または副溝バインダーのいずれの組合せの使用も、本発明によって考えられる。ここに出典明示して本明細書の一部とみなす、共有の米国特許出願第２０１２／０２４４５３５号は、プライマー中に５つものミスマッチを持つ、プライマーおよびプローブに対処する方法に関してさらなる説明を提供する。
【００８２】
ホスホロアミダイト法によってオリゴヌクレオチドを合成するために用いられる化学の詳細な記載は、米国特許第４，４５８，０６６号および第４，４１５，７３２号；Caruthersら, Genetic Engineering, 4:1-17 (1982);およびUsers Manual Model 392 and 394 Polynucleotide Synthesizers, pages 6-1〜6-22, Applied Biosystems, Part No. 901237 (1991)に提供されている。標識されたオリゴヌクレオチドは、化学合成によって、例えば、ホスホロアミダイト法、亜リン酸トリエステル法等により合成することができる（例えば、Gait, Oligonucleotide Synthesis, IRL Press (1990)参照）。標識は、標識されたヌクレオシド三リン酸モノマーを利用する酵素的な合成中に導入できるか、または標識された非ヌクレオチドまたはヌクレオチドホスホロアミダイトを用いて化学的な合成中に導入できるか、または合成に引き続いて導入し得る。
【００８３】
オリゴヌクレオチドの５’または３’末端に対するフルオロフォア、クエンチャーおよび副溝バインダーの結合についての種々の連結基および方法が、当業者に知られている。例えば、Eckstein, (ed.), Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press, Oxford (1991); Zuckermanら, Nuc. Acids Res., 15:5305-5321 (1987); Sharmaら, Nuc. Acids Res., 19:3019 (1991); Giustiら, PCR Methods and Applications, 2:223-227 (1993), 米国特許第４，７５７，１４１号および第４，７３９，０４４号; Agrawalら, Tetrahedron Letters, 31:1543-1546 (1990); Sproatら, Nuc. Acids Res., 15:4837 (1987); Nelsonら, Nuc. Acids Res., 17:7187-7194 (1989)等ご参照。合成中にオリゴヌクレオチドに結合できるさらに他の商業的に入手できる連結基を用いることができ、それは、例えば、Clontech Laboratories (Palo Alto, CA.)から入手できる。オリゴヌクレオチド部分にフルオロフォアを結合するための他の方法は、ホスホロアミダイト部分で誘導体化された色素を介して固相合成法の結果でのホスホロアミダイト化学の使用を含む。例えば、米国特許第５，２３１，１９１号；第４，９９７，９２８号；第６，６５３，４７３号；第６，７９０，９４５号；および第６，９７２，３３９号；ならびにＰＣＴ特許公開第ＷＯ０１／４２５０５号ご参照。
【００８４】
ＩＶ．さらなる増幅反応成分
バッファー
使用し得るバッファーは、ホウ酸、リン酸、炭酸、バルビタール、トリス等に基づいたバッファーである（例えば、米国特許第５，５０８，１７８号ご参照）。反応のｐＨは、約４．５〜約９．５の範囲に維持される（例えば、米国特許第５，５０８，１７８号ご参照）。増幅反応に用いる標準バッファーは、ｐＨ 約８．３〜８．８を持つ１０〜５０ｍＭのトリスベースのバッファーである（例えば、Innisら、上記ご参照）。
【００８５】
当業者ならば、バッファー条件が注目する全反応の機能を可能にするように設計されるべきであることを認識するであろう。かくして、バッファー条件は、増幅反応ならびにいずれかの引き続いての制限酵素反応を支持するように設計できる。特定の反応バッファーは、反応を個々におよび組み合わせて双方でテストすることにより種々の反応を支持するその能力につきテストすることができる。
【００８６】
塩濃度
反応に存在する塩の濃度は、標的核酸にアニーリングするプライマーの能力に影響しかねない（例えば、Innisら、上記ご参照）。塩化カリウムは、プライマーアニーリングを促すために反応混合物に約５０ｍＭの濃度まで添加できる。また、塩化ナトリウムは、プライマーアニーリングを促すために添加できる（例えば、Innisら、上記ご参照）。
【００８７】
マグネシウムイオン濃度
反応におけるマグネシウムイオン濃度は、標的核酸配列の増幅に影響しかねない（例えば、Innisら、上記ご参照）。プライマーアニーリング、鎖変性、増幅特異性、プライマー−ダイマー形成および酵素活性の全てが、マグネシウム濃度によって影響されるパラメーターの例である（例えば、Innisら、上記ご参照）。増幅反応は、ｄＮＴＰの濃度を超える約０．５〜６．０ｍＭのマグネシウム濃度を含有すべきである。反応におけるマグネシウムキレート化剤の存在は、至適マグネシウム濃度に影響しかねない。一連の増幅反応は、ある範囲のマグネシウム濃度で実行して、至適マグネシウム濃度を決定することができる。至適マグネシウム濃度は、他のパラメーターのうち、用いられる標的ＣＴＸ−Ｍグループ１および９核酸およびプライマーの性質に依存して変化しかねない。
【００８８】
デオキシリボヌクレオチド三リン酸濃度
デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を約２０μＭ〜約３００μＭの最終濃度まで反応に加える。典型的には、４種の各ｄＮＴＰ（Ｇ、Ａ、Ｃ、Ｔ）は同じ濃度にて存在する（例えば、Innisら、上記ご参照）。いくつかの具体例において、ウラシルＮ−グリコシラーゼは、ＰＣＲ反応中にｄＵＴＰ（ＴＴＰに代えて）と共に用いる。
【００８９】
核酸ポリメラーゼ
本願の方法および組成物を用いて機能する種々のＤＮＡ依存性ポリメラーゼは、商業的に入手できる。例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いて、標的ＤＮＡ配列を増幅し得る。ＰＣＲアッセイは、Thermus aquaticusから精製された天然酵素および／または酵素から遺伝子操作された形態であり得るＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを適切に含む耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの源を酵素成分として用いて実行し得る。他の商業的に入手できるポリメラーゼ酵素は、例えば、Qiagen、New England Biolabs、Applied Biosystems、PromegaまたはPharmaciaによって市販されているＴａｑポリメラーゼを含む。本発明に用いることができる他の例の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、例えば、ThermusおよびPyrococcus 種から得られたＤＮＡポリメラーゼを含む。ポリメラーゼの濃度範囲は、反応混合物当たり１〜５単位の範囲にあり得る。反応混合物は、典型的には約５μｌ〜約１００μｌである。
【００９０】
他剤
さらなる剤を反応に時々加えて、所望の結果を達成する。例えば、ＤＭＳＯを反応に加えることができるが、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの活性を抑制することが報告されている。しかしながら、ＤＭＳＯは、同一反応での複数の標的配列の増幅につき勧めされてきた（例えば、Innisら、上記ご参照）。ゼラチン、ウシ血清アルブミンおよび非イオン性界面活性剤（例えば、Tween-20）のごとき安定化剤は、増幅反応に一般的に加えられる（例えば、Innisら、上記ご参照）。加えて、イソ安定化剤（isostabilizing agent）のベタイン(Sigma-Aldrich; St. Louis, MO)を添加して、核酸デュプレックスの安定性に対するＧＣ塩基対合およびＡＴ塩基対合の寄与を等しくすることができる。
【００９１】
副溝バインダー
副溝バインダーオリゴヌクレオチドコンジュゲート（または「プローブ」）は、例えば、米国特許第６，３１２，８９４号に記載されている。これらのコンジュゲートは、相補的ＤＮＡを持つ高安定化デュプレックスを形成する。特に、短い副溝バインダープローブの配列特異性は、ＰＣＲのごとき高温適用に優れている。また、本発明のプローブ／コンジュゲートは、共有結合した副溝バインダーを所望により有するであろう。種々の適切な副溝バインダーが文献に記載されている（例えば、米国特許第５，８０１，１５５号; Wemmerら, Curr. Opin. Struct. Biol., 7:355-361 (1997); Walkerら, Biopolymers, 44:323-334 (1997); Zimmerら, U. Prog. Biophys. Molec. Bio., 47:31-112 (1986);および Reddyら, J. W., Pharmacol. Therap., 84:1-111 (1999)ご参照）。
【００９２】
副溝バインダー−クエンチャー−オリゴヌクレオチド−フルオロフォアコンジュゲートは、直線配置（式５’−Ｍ−Ｑ−ＯＤＮ−Ｆｌ−３’または５’−Ｍ−Ｆｌ−ＯＤＮ−Ｑ−３’により示唆される）、または分岐鎖配置（クエンチャー（Ｑ）および副溝バインダー（Ｍ）が、ＯＤＮ、ＱおよびＭを連結するように機能する連結基に結合する）にあり得る。加えて、クエンチャーは、副溝バインダーの（ＯＤＮへの結合に対し）遠位末端にて結合できる（例えば、５’−Ｑ−Ｍ−ＯＤＮ−Ｆｌ−３’）。各配置は、直線略号（Ｍ−Ｑ−ＯＤＮ−Ｆｌ）が用いられる場合に含まれることを意味する。加えて、副溝バインダーおよびクエンチャー部分は各々、結合がコンジュゲートのクエンチング機序に干渉しない限りは、オリゴヌクレオチドの３’または５’末端またはオリゴヌクレオチドの内部位置にて結合できる。一般的に、これは、適切な連結基の使用を通じて達成することができる（例えば、米国特許：第７，２０５，１０５号および第７，３８１，８１８号ご参照）。
【００９３】
リンカーを介してオリゴヌクレオチドに副溝バインダー（ならびに後記のごときフルオロフォアおよクエンチャーのごときリポーターグループ）を結合させる適当な方法は、例えば、米国特許第５，５１２，６７７号；第５，４１９，９６６号；第５，６９６，２５１号；第５，５８５，４８１号；第５，９４２，６１０号；および第５，７３６，６２６号に記載されている。
【００９４】
副溝バインダーは、適当な連結基を介してオリゴヌクレオチド部分の３’または５’位置に一般的に結合する。オリゴヌクレオチドデュプレックスの融解が末端にて始まるが、増幅反応の間にプローブのヌクレアーゼ消化を低下および／または防止するために、５’末端での結合は、ハイブリッド安定性の双方の利益を提供する。
【００９５】
また、副溝バインダー・オリゴヌクレオチドコンジュゲート内の副溝バインダーの位置は、かかるコンジュゲートの特徴的な特性に影響しかねない。デュプレックス内の不対領域の結果、不対合塩基（群）の付近の副溝形状に変化をもたらすであろう。副溝バインダーが完全に一致したＤＮＡ二重デュプレックスの副溝内に最良に適合するので、副溝内の形状変化を結果的にもたらすミスマッチは、ミスマッチを含む領域に対する副溝バインダーの結合強度を低下させるであろう。かくして、かかるハイブリッドを安定化させるための副溝バインダーの能力は減少し、それによって、ミスマッチと完全に一致したデュプレックスとを識別するための副溝バインダーオリゴヌクレオチドコンジュゲートの能力を増加させる。他方、ミスマッチが副溝バインダーオリゴヌクレオチドコンジュゲートに相補的な領域外に位置するならば、等しい長さの非コンジュゲートのオリゴヌクレオチドおよび副溝バインダーにコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドについての識別能力が、ほぼ同じであることが期待される。単一塩基対のミスマッチを識別するためのオリゴヌクレオチドプローブの能力がその長さに依存するので、より短いオリゴヌクレオチドはミスマッチを識別するのにより有効である。この文脈において副溝バインダーオリゴヌクレオチドコンジュゲートの使用の主要な有利さは、副溝バインダーコンジュゲートの明白な安定化効果により、より大きな識別力を有する先行技術に用いられるものと比較して、非常に短いオリゴヌクレオチド（すなわち、２０ｍｅｒ以下の短さ）を用いることができるという事実にある。
【００９６】
副溝バインダーおよび利用可能な副溝バインダーの選択は、米国特許：第５，８０１，１５５号、第６，３１２，８９４号および第７，５８２，７３９号に開示されている。
【００９７】
クエンチャー
最近開発された検出方法は、蛍光強度の直接検出よりはむしろプローブハイブリダイゼーションの検出のための蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）のプロセスを使用する。このタイプのアッセイでは、クエンチャー分子の吸収スペクトルがドナーフルオロフォアの発光スペクトルとオーバーラップし、２つの分子が極めて接近している場合、ＦＲＥＴがドナーフルオロフォア（リポーター）と受容体分子（クエンチャー）との間で生じる。ドナーフルオロフォアの励起状態エネルギーは、共鳴双極子−誘導性双極子相互作用によって近隣の受容体に転送され、その結果、ドナー蛍光のクエンチングをもたらす。受容体分子がフルオロフォアであるならば、その蛍光は時々増加し得る。ドナーおよび受容体分子間のエネルギー伝達の効率は、分子間の距離に高度に依存する。この関係を説明する方程式が知られている。フォースター距離（Ｒｏ）は、エネルギー伝達が５０％効率である場合のドナーおよび受容体分子間の距離として記載される。また、衝突および電荷移動クエンチングのごとき蛍光クエンチングの他の機序が知られている。クエンチャーおよびフルオロフォア対ならびにオリゴヌクレオチドへのそれらの結合を選択するための当該技術分野における広範囲のガイダンスが存在する(例えば、Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Ninth Edition, Molecular Probes, Eugene, OR (2002) およびwww.probes.com/handbookでのWeb Edition;および米国特許第３，９９６，３４５号および４，３５１，７６０号ご参照)。好ましいクエンチャーは、米国特許第６，７２７，３５６号および第６，７９０，９４５号に記載されている。さらなるモノおよびビスアゾ色素は、Berry and Associates (Dexter, MI)およびGlen Research (Sterling, VA)から商業的に入手できる。
【００９８】
フルオロフォア
本発明に有用なフルオロフォアは、好ましくは連結基を介して、オリゴヌクレオチドプローブの３’または５’末端炭素への結合のために誘導体化された一般的に蛍光性有機色素である。当業者ならば、適当なフルオロフォアが、典型的には蛍光性であっても蛍光性でなくてもよい有機色素でもあるクエンチャーと組み合わせて選択されることを認識するであろう。これらおよび他の適当な色素クラスの例は、Hauglandら, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Sixth Ed., Molecular Probes,  Eugene, Ore. (1996); 米国特許第３，１９４，８０５号；第３，１２８，１７９号；第５，１８７，２８８号；第５，１８８，９３４号；第５，２２７，４８７号；第５，２４８，７８２号；第５，３０４，６４５号；第５，４３３，８９６号；第５，４４２，０４５号；第５，５５６，９５９号；第５，５８３，２３６号；第５，８０８，０４４号；第５，８５２，１９１号；第５，９８６，０８６号；第６，０２０，４８１号；第６，１６２，９３１号；第６，１８０，２９５号；および第６，２２１，６０４号；第ＥＰ特許第１４０８３６６号に見出すことができ；依然として他の色素は、http://www.zeiss.comのごときオンラインサイト経由で提供されている。好ましいホスホン酸系色素は、共有の米国第７，６７１，２１８号、米国第７，７６７，８３４号および第８，１６３，９１０号に開示されている。
【００９９】
特定のプローブに適切なフルオロフォア−クエンチャー対を選択するために、文献に利用可能な多数の実際的なガイダンスが存在する。上記のHauglandおよびwww.probes.com/handbookでのウェブ版等。これらおよび他の適当な色素クラスの例は、Hauglandら, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Sixth Ed., Molecular Probes, Eugene, Ore. (1996)；米国特許第３，１９４，８０５号；第３，１２８，１７９号；第５，１８７，２８８号；第５，１８８，９３４号；第５，２２７，４８７号；第５，２４８，７８２号；第５，３０４，６４５号；第５，４３３，８９６号；第５，４４２，０４５号；第５，５５６，９５９号；第５，５８３，２３６号；第５，８０８，０４４号；第５，８５２，１９１号；第５，９８６，０８６号；第６，０２０，４８１号；第６，１６２，９３１号；第６，１８０，２９５号；および第６，２２１，６０４号；ＥＰ特許１４０８３６６号に見出すことができ；さらに他の色素は、http://www.zeiss.comのごときオンラインサイト経由で提供されている。共通の反応性基を介して共有結合のためのフルオロフォアおよびクエンチャーを誘導体化する方法はよく知られている。例えば、上記のHaugland；および米国特許第３，９９６，３４５号および第４，３５１，７６０号ご参照。
【０１００】
好ましいフルオロフォアはキサンテン色素に基づいたものであり、その種々のものが、連結基の結合またはオリゴヌクレオチドへの直接的結合に有用な置換基で商業的に入手できる。最も好ましいホスホン酸系色素は、共有の米国第７，６７１，２１８号、米国第７，７６７，８３４号および第８，１６３，９１０号に開示されている。
【０１０１】
実施例
以下の実施例を提供して、限定されるものではないが、本明細書に記載された対象を示す。
【０１０２】
オリゴヌクレオチド
プライマーは、標準的なホスホロアミダイト化学を用いて合成した。５’−Ｍ−Ｆｌ−ＯＤＮ−ＱおよびＦｌ−ＯＤＮ−ＱＭプローブは、各々、５’→３’または３’→５’方向でのオリゴヌクレオチドセグメントの合成用に設計された５−β−シアノエチル（cyaoethyl）−または３’−β−シアノエチルホスホロアミダイト(Glen Research; Sterling, VA)を用いるＭ−ＦＬ−またはＭ−Ｑ−修飾ポリスチレン固体担体上の自動ＤＮＡ合成によって調製した。オリゴヌクレオチド合成は、０．０２Ｍヨウ素溶液を用いて、製造者により供給されたプロトコールによりＡＢＩ ３９４シンセサイザーで行った。修飾およびユニバーサル塩基は、米国特許第６，９４９，３６７号、第６，１２７，１２１号および米国特許公開第２０１２０２４４５３５号に開示された方法に基づいて合成した。フルオロフォア・レポーティング色素またはクエンチャーは、必要に応じて、対応するホスホロアミダイトを用いて、合成の最終工程にて導入した。全オリゴヌクレオチドは、逆相ＨＰＬＣによって精製した。
【０１０３】
ＰＣＲ
リアルタイムＰＣＲは、ＥＳＢＬ ＤＮＡを検出するための診断アッセイにおいて、QIAsymphony SP/AS DNA抽出システム(QIAGEN Inc., Valencia, CA)で抽出した徴候性および無症候性の患者材料からのヒト直腸スワブからの試料に対してＲＧＱ ＭＤｘリアルタイムＰＣＲ増幅計測手段を用いて行なった。そのアッセイ混合物は下記の成分を含む：
【０１０４】
マスター溶液Ａ：ＣＴＸ−Ｍグループ１，９特異的および内部標準のプローブおよびプライマー、ＰＣＲバッファー、HotStartTaq QR2 DNAポリメラーゼ、ウラシルＮ−グリコシラーゼおよびデオキシリボヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＵＴＰ）を含む。２３μＬのマスターＡ試薬ミックスを各４０μＬのＰＣＲ反応に用いる。後記の表３に示すごとく、以下の処方のマスターＡを選択した。
【０１０５】
マスター溶液Ｂ：８０ｍＭのＭｇＣｌ２溶液。４ｍＭの最終濃度のために、２μＬのマスターＢ試薬ミックスを各４０μＬのＰＣＲ反応に用いる。
【０１０６】
試料：１５μＬの抽出試料。
【０１０７】
実施例１
この実施例は、単独および内部標準（バイプレックス）と共に、大腸菌ＡＴＣＣ ＢＡＡ−２３２６から抽出したＣＴＸ−Ｍ１５ ＤＮＡ（ＣＴＸ−Ｍグループ１のメンバー）のリアルタイムＰＣＲ検出を示す。
【０１０８】
核酸は、装置説明書(QIAsymphony（登録商標） SP/AS User Manual, April 2012)により大腸菌ＡＴＣＣ ＢＡＡ−２３２６からQiagen QIAsymphony SP/AS DNA抽出システムで抽出した。バイプレックス MGB TaqManアッセイは、表３に示したプライマー、プローブおよび試薬を含む３５μＬのマスター溶液Ａ、２μＬの前記のマスター溶液Ｂおよび１５μＬの抽出試料を用いて行った。下記の表３は、マスター溶液Ａのプライマー、プローブおよび試薬を示す。
【０１０９】
【表３】
2017538419.tif 000017
2017538419.tif 000018
【０１１０】
ＰＣＲサイクリング条件を以下の表４に示す。
【０１１１】
【表４】
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【０１１２】
図１において、単独および内部標準と共に、大腸菌ＡＴＣＣ ＢＡＡ−２３２６から抽出したＣＴＸ−Ｍ１５ ＤＮＡのリアルタイム力価測定（１０倍の力価測定（１００ｐｇ〜１ｆｇ））を示す。
【０１１３】
図１のシングルプレックスおよびバイプレックス増幅データは、図２ａおよび２ｂ中の線形曲線として再プロットした。図２ａおよび２ｂに示されるごとく、ＣＴＸ−Ｍ１５−ＩＣおよびＣＴＣ−Ｍ１５＋ＩＣ曲線の傾斜は非常に類似し、各々、−３．１８８および−３．１２３であった。
【０１１４】
実施例２
この実施例は、位置１、２および３に対して設計されたプローブおよびプライマーでのＣＴＸ−Ｍ核酸の増幅および検出を示す。
【０１１５】
用いたプライマーおよびプローブを後記の表５に示す。増幅は、実施例１に記載したものと同様に行い、ＣＴＸ−Ｍ１５で増幅した核酸の検出を図３に示す。図３は、３つの異なる位置につき設計したプローブおよびプライマーでのＣＴＸ−Ｍ１５核酸のリアルタイム検出を示す。
【０１１６】
【表５】
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【０１１７】
実施例３
この実施例は、Ｃｔにより測定した９つの異なる単離体から抽出および定量したＣＴＸ−Ｍ核酸を検出するための実施例１のプライマーおよびプローブの効率を示す。表６は、実施例１に記載の手順によって測定した種々のＣＴＸ−Ｍグループにおける種々の単離体のＣｔを示す。
【０１１８】
【表６】
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【０１１９】
表６の結果は、ＣＴＸ−Ｍ１、９および１５を表す種々の単離体からのＣＴＸ−Ｍ標的核酸を検出するための実施例１からのプライマーおよびプローブの能力を示す。
【０１２０】
引用した参考文献
以下の文献および刊行物をここに出典明示して本明細書の一部とみなす。
米国および外国特許文献
ＥＰ特許第１４０８３６６号
ＰＣＴ特許公開
第ＷＯ１９９９／３７０８５号
第ＷＯ２００１／０４２５０５号
第ＷＯ２００３／０２３３５７号
米国特許公開
第２００７−００４８７５８号
第２０１２−０２４４５３５号
第２０１３−０２６１０１４ Ａ１号
【０１２１】
米国特許
第３，１９４，８０５号
第３，１２８，１７９号
第３，９９６，３４５号
第４，３５１，７６０号
第４，４１５，７３２号
第４，４５８，０６６号
第４，６８３，１９５号
第４，７３９，０４４号
第４，７５７，１４１号
第４，９６５，１８８号
第４，９９７，９２８号
第５，１８７，２８８号
第５，１８８，９３４号
第５，２２７，４８７号
第５，２３１，１９１号
第５，２４８，７８２号
第５，３０４，６４５号
第５，４１９，９６６号
第５，４３３，８９６号
第５，４４２，０４５号
第５，５０８，１７８号
第５，５１２，６７７号
第５，５３８，８４８号
第５，５５６，９５９号
第７，５８２，７３９号
第５，５８３，２３６号
第５，５８５，４８１号
第５，６９６，２５１号
第５，７３６，６２６号
第５，８０１，１５５号
第５，８０８，０４４号
第５，８５２，１９１号
第５，９４２，６１０号
第５，９８６，０８６号
第６，０２０，４８１号
第６，１２７，１２１号
第６，１６２，９３１号
第６，１８０，２９５号
第６，２２１，６０４号
第６，３１２，８９４号
第６，６５３，４７３号
第６，６８３，１７３号
第６，６９９，９７５号
第６，７２７，３５６号
第６，７９０，９４５号
第６，９４９，３６７号
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第７，２０５，１０５号
第７，３１９，０２２号
第７，３８１，８１８号
第７，７５９，１２６号
第７，７６７，８３４号
第８，１６３，９１０号．
【０１２２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2017538419.tif 000031
2017538419.tif 000032
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