(57)【要約】  本発明は、デング病に対してヒト被験者を保護する方法において有用なワクチン組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血清型２のデング熱ウイルスによって引き起こされるデング病に対してヒト被験者を保護する方法における使用のためのワクチン組成物であって、
（ｉ）血清型１〜４の各々のデング熱抗原であって、血清型１〜４の前記デング熱抗原は各々、独立して
（ａ）弱毒生デング熱ウイルス；および
（ｂ）弱毒生キメラデング熱ウイルス；
からなる群から選択される、デング熱抗原
または
（ｉｉ）前記ヒト被験者において血清型１〜４の各々のデングＶＬＰであるデング熱抗原を発現させることができる１つもしくは複数の核酸構築物
を含む、組成物。
【請求項２】
前記デング病が重症デング病である、請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項３】
前記方法が、前記デング病に起因する入院の発生率または可能性における低下をもたらす、請求項１または請求項２に記載の使用のための組成物。
【請求項４】
前記方法がまた、血清型１のデング熱ウイルスによって引き起こされるデング病、血清型３のデング熱ウイルスによって引き起こされるデング病および血清型４のデング熱ウイルスによって引き起こされるデング病に対して前記ヒト被験者を保護する、請求項１で請求される方法における使用のための組成物。
【請求項５】
血清型１のデング熱ウイルスによって引き起こされる前記デング病が重症デング病であり、血清型２のデング熱ウイルスによって引き起こされる前記デング病が重症デング病であり、血清型３のデング熱ウイルスによって引き起こされる前記デング病が重症デング病であり、かつ血清型４のデング熱ウイルスによって引き起こされる前記デング病が重症デング病である、請求項４で請求される方法における使用のための組成物。
【請求項６】
前記方法が、血清型１のデング熱ウイルスによって引き起こされるデング病、血清型２のデング熱ウイルスによって引き起こされるデング病、血清型３のデング熱ウイルスによって引き起こされるデング病および血清型４のデング熱ウイルスによって引き起こされるデング病に起因する入院の発生率または可能性における低下をもたらす、請求項４に記載の使用のための組成物。
【請求項７】
前記ヒト被験者がデング熱に免疫性がある、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項８】
前記被験者が２〜６０歳の間である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項９】
前記被験者が６〜６０歳の間である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１０】
前記被験者が少なくとも９歳である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１１】
前記被験者が少なくとも１２歳である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１２】
前記被験者が９〜６０歳の間である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１３】
前記被験者が１２〜６０歳の間である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１４】
前記被験者が２〜１６歳の間である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１５】
前記被験者が６〜１６歳の間である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１６】
前記被験者が９〜１６歳の間である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１７】
前記組成物が、各々独立して（ａ）弱毒生デング熱ウイルスおよび（ｂ）弱毒生キメラデング熱ウイルスからなる群から選択される、血清型１〜４の各々のデング熱抗原を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１８】
前記組成物が血清型１〜４の各々のデング熱抗原を含み、ここで血清型１、３および４の前記デング熱抗原が各々、弱毒生キメラデング熱ウイルスであり、かつ血清型２の前記デング熱抗原が弱毒生デング熱ウイルスおよび弱毒生キメラデング熱ウイルスからなる群から選択される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１９】
前記組成物が血清型１〜４の各々のデング熱抗原を含み、ここで血清型１、３および４の前記デング熱抗原が各々、独立して（ａ）弱毒生デング熱ウイルスおよび（ｂ）弱毒生キメラデング熱ウイルスからなる群から選択され、かつ血清型２の前記デング熱抗原が弱毒生キメラデング熱ウイルスである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項２０】
前記組成物が血清型１〜４の各々のデング熱抗原を含み、ここで前記デング熱抗原の各々が弱毒生キメラデング熱ウイルスである、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項２１】
前記弱毒生キメラデング熱ウイルスが、デング熱ウイルス由来の１つ以上のタンパク質および異なるフラビウイルス由来の１つ以上のタンパク質を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項２２】
前記異なるフラビウイルスが弱毒化黄熱病ウイルスである、請求項２１に記載の使用のための組成物。
【請求項２３】
前記弱毒生キメラデング熱ウイルスが、ｐｒＭ−Ｅ配列がデング熱ウイルスのｐｒＭ−Ｅ配列と置換されている黄熱病ウイルスゲノムを含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項２４】
前記被験者が黄熱病に免疫性がある、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項２５】
前記被験者がデング熱流行地域内に居住する、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項２６】
前記方法が前記組成物を３用量以上で投与するステップを含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項２７】
前記方法が、血清型２のデング熱ウイルスによって引き起こされるデング病の発生率または可能性における低下をもたらす、請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項２８】
血清型２のデング熱ウイルスによって引き起こされる前記デング病が、アメリカ、アジア／アメリカ、または普遍種の遺伝子型を有する血清型２のデング熱ウイルスによって引き起こされるデング病である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項２９】
前記組成物が、薬学的に許容できる担体または賦形剤をさらに含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項３０】
請求項１〜１０および１７〜２９のいずれか一項に記載の保護する方法における使用のための組成物であって、前記保護する方法が、流行地域内で生活する９〜６０歳の個体におけるデング熱ウイルス血清型１、２、３および４によって引き起こされるデング病の予防と定義される、使用のための組成物。
【請求項３１】
請求項１〜１０および１７〜２９のいずれか一項に記載の保護する方法における使用のための組成物であって、前記保護する方法が、流行地域内で生活する１２〜６０歳の個体におけるデング熱ウイルス血清型１、２、３および４によって引き起こされるデング病の予防と定義される、使用のための組成物。
【請求項３２】
請求項１〜３１のいずれか一項に記載の保護する方法における使用のための組成物であって、前記保護する方法が、発生率または可能性における統計学的に有意な低下、例えば、１４日を超える間隔で発生する異なる血清型に起因する≧２のデング熱のエピソードと定義される、任意の血清型に起因するウイルス学的に確認された反復性の症候性デング熱症例の予防をもたらす、使用のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デング病に対してヒト被験者を保護する方法におけるワクチン組成物およびかかる組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
デング熱は、マラリアに次いで２番目に重大な感染性の熱帯病であり、世界人口の約半数が流行性伝播の危険性がある地域で生活している。毎年のデング熱の症例が３億９０００万であると推定されており、約９６００万人が、臨床的に明らかな疾患を有している。毎年、子供を含む５００，０００人が入院を必要とする重症形態のデング熱を有し、これは大流行の間に医療制度に対して大規模な歪みをもたらす（非特許文献１；非特許文献２で入手可能）。重症形態のデング熱への罹患者の約２．５％が死亡することになる（非特許文献３）。
【０００３】
デング病は、フラビウイルス（ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）属の４種のデング熱ウイルス血清型によって引き起こされ、これらは抗原的に異なるが密接に関連している（非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７）。デング熱ウイルスは、プラスセンス一本鎖ＲＮＡウイルスである。
【０００４】
デング病は通常、デング熱ウイルスに感染したネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ  ｍｏｓｑｕｉｔｏ）が血を吸う間のデング熱ウイルスの注入により伝播される。４〜１０日間の潜伏期間の後、その病気は突然始まり、続いて、３つの段階：発熱期（２〜７日）、重症期（２４〜４８時間−その間に重篤な合併症が生じ得る）および回復期（４８〜７２時間）が生じる。重症期の間、出血、ショックおよび急性臓器障害などの重篤な合併症が生じ得る。これらの予測不能な転帰の適切な管理によって、症例致死率が低下し得る。デング熱は７〜１０日後には完治するが、通常、遷延性の無力症が生じる。白血球および血小板数の減少が頻繁に認められる。
【０００５】
デング出血熱（ＤＨＦ）を含む重症形態のデング病は、潜在的にはデング熱ウイルス感染の致死性合併症である。ＤＨＦは、高熱およびデング病の諸症状によって特徴づけられるが、極度の嗜眠および傾眠を伴う。血管透過性の亢進および異常なホメオスタシスは、血液量の減少、低血圧を、また重篤な場合には、血液量減少性ショックおよび内出血を引き起こし得る。２つの要素、すなわち、高レベルのウイルス血症を伴う急激なウイルス複製（その疾患の重症度はウイルス血症のレベルに関連している；非特許文献８）および高レベルな炎症性メディエーターの放出を伴う主な炎症性応答（非特許文献９；非特許文献１０）がＤＨＦの発生率において主要な役割を果たすように思われる。ＤＨＦにおける死亡率は、治療しない場合には１０％に達し得るが、治療へのアクセスを有する大部分の施設では１％未満である。デング病感染は１００を超える熱帯諸国では風土病であり、ＤＨＦはこれらの国々の６０か国で記録されている（非特許文献１１）。
【０００６】
デングショック症候群（ＤＳＳ）は、ＤＨＦの一般的な進行形であり、致死性であることが多い。ＤＳＳは、血管外スペースへの血漿漏出を引き起こす全身性血管炎に起因する。ＤＳＳは、迅速かつ弱い容積脈拍、低血圧、四肢冷感、および不穏状態によって特徴づけられる。
【０００７】
アジアでは、ＤＨＦおよびＤＳＳは、主に子供に認められ、ＤＨＦを有する子供の約９０％が１５歳未満である（非特許文献１２；非特許文献１３）。それに対して、カリブおよび中央アメリカでの大流行は主に成人に波及している（非特許文献１２）。デング病の発生率は、デング熱が風土性である多くの国々における老年群で増加している（非特許文献１４；非特許文献１５）。
【０００８】
デング熱ウイルスの４種の血清型は、約６０〜８０％の配列相同性を有する。１種のデング熱血清型による感染は、持続的な同属免疫をもたらすが、異種免疫は制限される（非特許文献１６）。したがって、デング熱の１種の血清型に感染している個人は、その後、異なる血清型への感染状態になることがある。ＤＨＦを呈する患者の大多数が以前にデング熱ウイルスの他の４種の血清型の少なくとも１種に曝露されていることから、異なるデング熱ウイルス血清型から生じる２回目の感染が理論的にＤＨＦの発生における危険因子であると考えられる。
【０００９】
これまで、デング病に対して特異的な治療は存在しない。デング病に対する治療は、対症療法であり、ベッド安静、解熱剤および鎮痛剤による発熱および疼痛の管理、ならびに適切な水分摂取を伴う。ＤＨＦの治療は、水分喪失の均衡、凝固因子の置換およびヘパリン注入を必要とする。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ＷＨＯ）−Ｇｌｏｂａｌ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｄｅｎｇｕｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｏｌ：２０１２−２０２０
【非特許文献２】ｈｔｔｐ：／／ｒｅｌｉｅｆｗｅｂ．ｉｎｔ／ｓｉｔｅｓ／ｒｅｌｉｅｆｗｅｂ．ｉｎｔ／ｆｉｌｅｓ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／９７８９２４１５０４０３４＿ｅｎｇ．ｐｄｆ
【非特許文献３】Ｐａｎ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ  Ｍａｙ  ２０１４−ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐａｈｏ．ｏｒｇ／ｈｑ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ｏｐｔｉｏｎ＝ｃｏｍ＿ｃｏｎｔｅｎｔ＆ｖｉｅｗ＝ａｒｔｉｃｌｅ＆ｉｄ＝９６５７＆Ｉｔｅｍｉｄ＝１９２６
【非特許文献４】Ｇｕｂｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，ｉｎ：Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ａｒｔｈｒｏｐｏｄ−ｂｏｒｎｅ  ｖｉｒａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｍｏｎａｔｈ  ＴＰＭ，ｅｄｉｔｏｒ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ（ＦＬ）：ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ：２２３−６０
【非特許文献５】Ｋａｕｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．ｏｆ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，１３１：５１６−５２４；
【非特許文献６】Ｒｉｇａｕ−Ｐｅｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｌａｎｃｅｔ，３５２：９７１−９７７
【非特許文献７】Ｖａｕｇｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１７６：３２２−３０
【非特許文献８】Ｖａｕｇｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．，１８１：２−９
【非特許文献９】Ｒｏｔｈｍａｎ  ａｎｄ  Ｅｎｎｉｓ，１９９９，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２５７：１−６
【非特許文献１０】Ａｌａｎ  Ｌ．Ｒｏｔｈｍａｎ．２０１１，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１１：５３２−５４３
【非特許文献１１】Ｇｕｂｌｅｒ，２００２，ＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１０：１００−１０３
【非特許文献１２】Ｍａｌａｖｉｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｐｏｓｔｇｒａｄ  Ｍｅｄ．Ｊ．，８０：５８８−６０１
【非特許文献１３】Ｍｅｕｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｉｎｔ．Ｈｅａｌｔｈ，５：３２５−９
【非特許文献１４】Ｓａｂｃｈａｒｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１２，Ｌａｎｃｅｔ，３８０，１５５９−１５６７
【非特許文献１５】Ｍｅｓｓｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２２，１３８−１４６
【非特許文献１６】Ｓａｂｉｎ，１９５２，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．，１：３０−５０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
デング熱予防手段、例えば蚊防除および咬刺傷からの個人的防御は、効果に限界があり、実行するのが困難であり、かつ高価であるので、安全かつ有効なデング熱ワクチンがあれば最良の予防策となる。しかしながら、現在利用可能なこの種の認可ワクチンは存在しない。したがって、デング熱ウイルスの４種の血清型の各々に対してヒト被験者を保護する方法において有用なワクチン組成物を開発することは望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、血清型２のデング熱ウイルスによって引き起こされるデング病に対してヒト被験者を保護する方法における使用のためのワクチン組成物であって、
（ｉ）血清型１〜４の各々のデング熱抗原であって、血清型１〜４の前記デング熱抗原は各々、独立して
（ａ）弱毒生デング熱ウイルス；および
（ｂ）弱毒生キメラデング熱ウイルス；
からなる群から選択される、デング熱抗原
または
（ｉｉ）前記ヒト被験者において血清型１〜４の各々のデングＶＬＰであるデング熱抗原を発現させることができる１つもしくは複数の核酸構築物
を含む、組成物に関する。
【００１３】
本発明はさらに、血清型２のデング熱ウイルスによって引き起こされるデング病に対してヒト被験者を保護するための薬剤の作製を意図した、本明細書で定義される、ワクチン組成物の使用に関する。好ましくは、前記保護は、血清型１のデング熱ウイルス、血清型３のデング熱ウイルスおよび血清型４のデング熱ウイルスによって引き起こされるデング病に関しても示される。
【００１４】
本発明はさらに、血清型２のデング熱ウイルスによって引き起こされるデング病に対してヒト被験者を保護する方法であって、前記ヒト被験者に本明細書に定義されるワクチン組成物を有効量投与するステップを含む、方法に関する。好ましくは、前記方法は、血清型１のデング熱ウイルス、血清型３のデング熱ウイルスおよび血清型４のデング熱ウイルスによって引き起こされるデング病に対しても保護する。
【００１５】
加えて、本発明は、本明細書で定義される、ワクチン組成物を含むキット、および血清型２のデング熱ウイルスによって引き起こされるデング病に対するヒト被験者を保護する方法における前記組成物を用いるための使用説明書に関する。好ましくは、前記方法は、血清型１のデング熱ウイルス、血清型３のデング熱ウイルスおよび血清型４のデング熱ウイルスによって引き起こされるデング病に対しても保護する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】治療企図（ＩＴＴ）集団での０日目からの（実施例１で記載される）試験中の任意の時刻に生じる任意の血清型に起因するウイルス学的に確認された症候性デング熱（ＶＣＤ）におけるカプラン・マイヤー曲線である。２つの線の上側はワクチン群を表し、２つの線の下側は対照群を表す。
【図２】３回投与後１２か月間にわたる全体的なワクチン有効性（全血清型）を示す（実線）。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
定義
用語「デング病」は、本明細書で用いられるとき、デング熱ウイルスによる個別の以下の感染によって示される、重症度の全グレードの臨床症状を指す。本明細書で用いられるとき、デング病という用語は、本明細書で定義される通りのデング熱などのデング病のより穏やかな徴候および重症デング熱などのデング熱のより重篤な徴候の双方または本明細書で定義される通りのデング出血熱（ＤＨＦ）を包含する。１９７５年以来、臨床デング熱は、世界保健機関（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）ガイドライン（１９９７年に更新）に従い、（ｉ）デング熱または（ｉｉ）デング出血熱として分類されている（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ．Ｄｅｎｇｕｅ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｆｅｖｅｒ：Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ２ｎｄ  Ｅｄ．Ｇｅｎｅｖａ：ＷＨＯ，１９９７；ＩＳＢＮ９２  ４  １５４５００  ３）。２００９年には、ＷＨＯは、臨床デング熱を（ｉ）兆候の有無と無関係のデング熱または（ｉｉ）重症デング熱として分類する新ガイドラインを発行した。両分類は、Ｓｒｉｋｉａｔｋａｃｈｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．（２０１１）５３（６）：５６３の図１および２に示されている。より早期の１９９７年のＷＨＯ分類によると、デング熱は、（ｉ）頭痛、関節痛、後眼窩痛、発疹、筋肉痛、出血症状、および白血球減少から選択される少なくとも２つの症状を伴う発熱の存在；併せて（ｉｉ）他の確認されたデング熱症例と同じ位置および時間での支持的な血清学または発生率により診断される。デング出血熱への進行は、発熱、出血症状、血小板減少および血漿漏出の証拠がすべて認められる場合、確認される。２００９年のＷＨＯ分類によると、デング熱の診断には、（ｉ）発熱や、悪心、嘔吐、発疹、疼痛（ａｃｈｅｓ）および疼痛（ｐａｉｎ）から選択される少なくとも２つの臨床症状、ターニケットテスト陽性、または腹痛および圧痛、持続性嘔吐、臨床的体液貯留、粘膜出血、嗜眠もしくは不穏状態、肝腫大＞２ｃｍまたは血小板数の急劇な減少と同時発生のヘマトクリットの増加から選択される任意の危険性のある兆候；併せて（ｉｉ）他の確認されたデング熱症例と同じ位置および時間での支持的な血清学または発生率、の存在が必要である。２００９年のＷＨＯ分類によると、重症デング熱は、以下の追加的事象、すなわち、（ｉ）ショックまたは呼吸困難を引き起こす重篤な血漿漏出（体液貯留）；（ｉｉ）臨床医によって評価される重篤な出血；または（ｉｉｉ）重篤な臓器障害（すなわち、肝臓：ＡＳＴ、ＡＬＴ≧１０００；ＣＮＳ：意識または心臓または他の臓器の傷害）のいずれかの観察を伴うデング熱の診断として定義される。
【００１８】
用語「デング出血熱」または「ＤＨＦ」は、本明細書で用いられるとき、１９９７年のＷＨＯ定義と一致し、以下の症状、すなわち、１）臨床症状：（ａ）発熱：急性発症、高熱（≧３８℃）および２〜７日にわたる持続性；（ｂ）ターニケットテスト陽性、点状出血、紫斑病、斑状出血、鼻出血（ｅｐｉｔａｘｉｓ）、歯肉出血、および吐血（ｈｅｍａｔｅｓｉｓ）および／またはメレナといった出血症状のいずれか；２）検査所見：（ａ）血小板減少（血小板数≦１００×１０９／Ｌ）；（ｂ）血液濃縮によって示される血漿漏出（ヘマトクリットの２０％以上の増加）または（胸部Ｘ線で見られる）胸水貯留および／または腹水および／または低アルブミン血症を指す。最初の２つの臨床基準（すなわち、発熱および出血症状）に加えて、血小板減少および血漿漏出の徴候は、ＤＨＦの臨床診断を確立するのに十分である。（胸部Ｘ線で見られる）胸水貯留および／または低アルブミン血症は、血漿漏出の支持的証拠を提供する。ＤＨＦは、本明細書で用いられるとき、その重症度に基づいてさらに定義してもよい。したがって、ＤＨＦは、グレードＩ、グレードＩＩ、グレードＩＩＩまたはグレードＩＶに属するものとして定義してもよい（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ．Ｄｅｎｇｕｅ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｆｅｖｅｒ：Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ２ｎｄ  Ｅｄ．Ｇｅｎｅｖａ：ＷＨＯ，１９９７；ＩＳＢＮ９２  ４  １５４５００  ３）。グレードＩは、非特異的全身症状を伴う発熱と定義されており、唯一の出血症状は、ターニケットテスト陽性である。グレードＩＩは、グレードＩの患者の徴候に加えて自発的出血があると定義されており、これは通常、皮膚またはその他の出血の形態である。グレードＩＩＩは、寒冷皮膚の存在および不穏状態を伴う、迅速な虚脈および脈圧の狭小化（２０ｍｍＨｇ以下）または低血圧を呈する循環不全と定義される。グレードＩＶは、測定不能な血圧または脈拍を伴う重篤なショックと定義される。当業者によって理解されるように、本発明、例えばＤＨＦに対して保護する方法の実施において、前記ＤＨＦは、ウイルス学的に確認される必要はない。
【００１９】
用語「ウイルス学的に確認されたデング熱」は、本明細書で用いられるとき、例えば逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）および／またはデング非構造１（ＮＳ１）タンパク質酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）によって、デング熱ウイルスによって誘発されることが確認された急性熱性エピソード（すなわち、少なくとも２連続日で温度≧３８℃）を指す。ＲＴ−ＰＣＲ法では、潜在的なＴａｑポリメラーゼ阻害剤または干渉因子を廃棄するため、ＲＮＡが市販のキットを用いて血清から抽出される。次いで、デング熱スクリーニング用ＲＴ−ＰＣＲ反応は、デング熱ウイルス中に保存された遺伝子配列からのプライマーを用いて実施される。結果は、ウイルスゲノム核酸配列を既知濃度で含有する標準と比べることによって、ｌｏｇ１０プラーク形成単位（ＰＦＵ）／ｍＬの濃度で表される。感染後デング熱ウイルス血症の血清型同定は、Ｓｉｍｐｌｅｘａ（商標）Ｄｅｎｇｕｅ  ＲＴ−ＰＣＲアッセイ（Ｆｏｃｕｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて血清試料を試験することにより決定される。簡潔に述べると、潜在的なポリメラーゼ阻害剤または干渉因子を廃棄するため、ＲＮＡが市販のキットを用いて血清から抽出される。次いで、Ｓｉｍｐｌｅｘａ（商標）アッセイが、デング熱配列からの血清型特異的プライマーを組み込んで実施される。結果は、定性的に表され、検出または非検出として各デング熱血清型について報告される。Ｓｉｍｐｌｅｘａ（商標）アッセイは、血清型同定のため、すべてのデング熱スクリーニング用ＲＴ−ＰＣＲ陽性またはデング熱ＮＳ１  Ａｇ  ＥＬＩＳＡ陽性試料に対して用いられる。ＮＳ１  ＥＬＩＳＡは、市販のキット（Ｐｌａｔｅｌｉａ（商標）Ｄｅｎｇｕｅ  ＮＳ１  Ａｇ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｍａｒｎｅｓ−ｌａ−Ｃｏｑｕｅｔｔｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて実施される。製造業者の使用説明書は以下の通りである。デングＮＳ１  Ａｇ試験は、血清中のＮＳ１  Ａｇの検出を可能にする１ステップサンドイッチ−ＥＬＩＳＡに基づくアッセイである。同試験では、捕獲および顕色用にマウスモノクローナルＡｂ（ＭＡｂ）が用いられる。試料および対照は、ＭＡｂでコーティングされたマイクロプレートウェル内で抱合体とともに直接的かつ同時にインキュベートされる。ＮＳ１  Ａｇが試料中に存在する場合、免疫複合体ＭＡｂ−ＮＳ１−ＭＡｂ／ペルオキシダーゼが形成されることになる。免疫複合体の存在は、着色反応を開始させる発色溶液の添加により実証される。室温でのインキュベーションの３０分後、酵素反応は酸性溶液に添加により停止される。４５０／６２０ｎｍに設定された分光光度計で得られる光学密度（ＯＤ）の読み取り値は、試料中に存在するＮＳ１  Ａｇの量に比例する。個別の試料中のＮＳ１  Ａｇの存在は、試料のＯＤ読み取り値をカットオフ対照血清のＯＤと比較することにより判定される。＜０．５、≧０．５〜＜１．０、および≧１の試料比は各々、陰性、不確定、および陽性の結果を示す。
【００２０】
用語「重症デング」または「重症デング病」は、本明細書で用いられるとき、本明細書中に報じられる第ＩＩＩ相臨床試験を監視するために樹立された独立データモニタリング委員会（Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｄａｔａ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（ＩＤＭＣ）によって定義された重症デングを指す。ＩＤＭＣの定義によると、デング熱の症例では、以下の診断基準のいずれか１つの出現が、重症デングの診断、すなわち、（ｉ）ショック（小児もしくは青年における脈圧≦２０ｍｍＨｇ、または頻脈、虚脈および灌流低下を伴う低血圧［≦９０ｍｍＨｇ］）；（ｉｉ）輸血を必要とする出血；（ｉｉｉ）脳症、すなわち意識不明または意識状態低下または単純な熱性痙攣もしくは局所神経徴候に起因しない痙攣（意識状態低下または意識不明は、グラスゴーコーマスケール（ＧＣＳ）スコアによって支持される必要がある）；（ｉｖ）肝臓障害（ＡＳＴ＞１０００Ｕ／Ｌまたはプロトロンビン時間［ＰＴ］国際標準化比［ＩＮＲ］＞１．５）；（ｖ）腎機能障害（血清クレアチニン≧１．５ｍｇ／ｄＬ）または（ｖｉ）胸部Ｘ線（ＣＸＲ）、心エコー、心電図（ＥＣＧ）または心筋酵素（これらが利用可能な場合）によって支持される心筋炎、心膜炎または心不全（臨床的心不全）、をもたらす。当業者によって理解されるように、本発明、例えば重症デング熱に対する保護して方法の実施においては、前記重症デング熱は、ウイルス学的に確認される必要はなく、単にデング病の他のウイルス学的に確認された症例と同じ位置で生じ得る。
【００２１】
用語「デング熱ウイルス」、「デング熱ウイルス」および「ＤＥＮ」は、交換可能に用いられる。それらは、フラビウイルス科（ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）のファミリーのフラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）属に属する正の一本鎖ＲＮＡウイルスを指す。４種類の異なる血清型のデング熱ウイルス（血清型１、２、３および４）があり、それらは約６０〜８０％の配列相同性を有する。ゲノムの構成は、以下の要素、すなわち５’非コード領域（ＮＣＲ）、構造タンパク質（キャプシド（Ｃ）、プレメンブラン（ｐｒＭ）およびエンベロープ（Ｅ））をコードする領域、および非構造タンパク質（ＮＳ１−ＮＳ２Ａ−ＮＳ２Ｂ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５）をコードする領域、ならびに３’ＮＣＲを含む。デング熱ウイルスゲノムは、翻訳後プロセシングを受ける単一のポリタンパク質へ翻訳される中断なしのコード領域をコードする。
【００２２】
用語「弱毒生デング熱ウイルス」は、本明細書で用いられるとき、病原性の減弱と対応する野生型デング熱ウイルスに関連する同じ症状セットによって特徴づけられる病態を誘発する能力の喪失とをもたらす遺伝子操作によって病原性野生型デング熱ウイルスから誘導される生デング熱ウイルスを指す。弱毒生デング熱ウイルスは、例えば、組換え核酸技術、部位特異的突然変異誘発、複製可能細胞に対する連続継代、化学的突然変異誘発、電磁放射またはウイルス核酸の小片の欠失などの遺伝子操作によって、野生型ウイルスから調製してもよい。本発明の実行において有用な弱毒生デング熱ウイルスの例として、ＶＤＶ１（国際公開第２００６／１３４４３３号パンフレット）、ＶＤＶ２（国際公開第２００６／１３４４４３号パンフレット）、および例えば、出願された国際公開第０２／０６６６２１号パンフレット、国際公開第００／５７９０４号パンフレット、国際公開第００／５７９０８号パンフレット、国際公開第００／５７９０９号パンフレット、国際公開第００／５７９１０号パンフレット、国際公開第０２／０９５００７５号パンフレットおよび国際公開第０２／１０２８２８号パンフレットに記載の株が挙げられる。本発明の方法における血清型１のデング熱抗原として用いてもよい血清型１の弱毒生デング熱ウイルスは、ＬＡＶ１およびＶＤＶ１を含む。本発明の方法における血清型２のデング熱抗原として用いてもよい血清型２の弱毒生デング熱ウイルスは、ＬＡＶ２およびＶＤＶ２を含む。用語「ＶＤＶ」は、ベロ細胞内で複製可能であり、かつヒトにおける特異的な体液性応答を誘導可能な（中和抗体の誘導を含む）弱毒生デング熱ウイルスを指す。
【００２３】
「ＬＡＶ１」とも称される１６００７／ＰＤＫ１３として公知の血清型１の弱毒生デング熱ウイルスは、野生型株に対して初代イヌ腎（ＰＤＫ）細胞での１３回の継代を行うことによって、野生型ＤＥＮ−１（デング熱ウイルス血清型１）１６００７株から誘導された。ＬＡＶ１は、欧州特許出願公開第１１５９９６８号明細書に記載されており、番号Ｉ−２４８０のもとＮａｔｉｏｎａｌ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＮＣＭ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ，Ｐａｒｉ，Ｆｒａｎｃｅ）に提出されている。「ＶＤＶ１」は、続けてベロ細胞に適用することによって、ＬＡＶ１から誘導されたウイルスであり、これに関連して、ＬＡＶ１由来のＲＮＡは、ベロ細胞へ遺伝子導入される前に抽出され、精製されている。ＶＤＶ１株は、続いて、プレート精製およびベロ細胞内での増幅により得られている。ＶＤＶ１株は、ＤＥＮ−１  １６００７／ＰＤＫ１３株と比較して、３個のさらなる突然変異を有する。ＶＤＶ１株の完全ヌクレオチド配列、ならびにＶＤＶ１株を調製し、特徴づけるための方法は、国際公開第２００６／１３４４３３号パンフレットに記載されている。ＶＤＶ１株の完全核酸配列は、配列番号６に示される通りである。
【００２４】
「ＬＡＶ２」とも称される１６６８１／ＰＤＫ５３として公知の血清型２の弱毒生デング熱ウイルスは、野生型株に対してＰＤＫ細胞での５３回の継代を行うことによって、野生型ＤＥＮ−２（デング熱ウイルス血清型２）１６６８１株から得られている。ＬＡＶ２は、欧州特許第１１５９９６８号明細書に記載されており、番号１−２４８１のもとＮａｔｉｏｎａｌ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＮＣＭ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ，Ｐａｒｉ，Ｆｒａｎｃｅ）に提出されている。「ＶＤＶ２」は、続けてベロ細胞に適用することによって、ＬＡＶ１から誘導されたウイルスであり、これに関連して、ＬＡＶ２由来のＲＮＡは、ベロ細胞へ遺伝子導入される前に抽出され、精製されている。ＶＤＶ２株は、続いて、プレート精製およびベロ細胞内での増幅により得られている。ＶＤＶ２株は、１６６８１／ＰＤＫ５３株と比較して、非コード領域内の３個のサイレント突然変異および１個の突然変異を含む、１０個のさらなる突然変異を有する。ＶＤＶ２株の完全ヌクレオチド配列、ならびにＶＤＶ２株を調製し、特徴づけるための方法は、国際公開第２００６／１３４４４３号パンフレットに記載されている。ＶＤＶ２株の完全核酸配列は、配列番号７に示される通りである。
【００２５】
本発明に関連して、「デング熱キメラ」または「キメラデング熱ウイルス」は、遺伝子骨格が、レシピエントフラビウイルスの少なくともＥタンパク質の配列をデング熱ウイルスの対応する配列に交換することにより修飾されているレシピエントフラビウイルスを意味する。その代わり、またより好ましくは、レシピエントフラビウイルスの遺伝子骨格は、レシピエントフラビウイルスのｐｒＭおよびＥタンパク質の双方をコードする核酸配列をデング熱ウイルスの対応する配列に交換することにより修飾される。典型的には、レシピエントフラビウイルスは、弱毒化され得る。レシピエントフラビウイルスは黄熱病（ＹＦ）ウイルスであってもよく、その場合、キメラは本明細書中で「キメラＹＦ／デング熱ウイルス」と称される。好ましくは、本発明に記載のキメラＹＦ／デング熱ウイルスのＹＦ骨格は、弱毒化ＹＦウイルスに由来する。レシピエントフラビウイルスはまた、デング熱ウイルスであってもよく、その場合、キメラデング熱ウイルスは本明細書中で「キメラデング熱／デング熱ウイルス」と称され、ＥまたはｐｒＭおよびＥタンパク質のデング熱ウイルス血清型特徴は、遺伝子骨格のレシピエントデング熱ウイルス血清型特徴と同一であるかまたは異なる。レシピエントフラビウイルスがデング熱ウイルスである場合、前記デング熱ウイルスは、好ましくは弱毒化される。レシピエントおよびドナーデング熱ウイルスの血清型が同一である場合、レシピエントデング熱ウイルスと、ｐｒＭおよびＥタンパク質をコードする配列の起源であるドナーデング熱ウイルスは、同じ血清型の２つの異なるウイルス株である。本発明で用いるためのキメラデング熱ウイルスは、典型的にはキメラＹＦ／デング熱ウイルスである。
【００２６】
一実施形態では、キメラＹＦ／デング熱ウイルスは、弱毒化黄熱病ウイルス株ＹＦ１７Ｄのゲノム骨格（Ｔｈｅｉｌｅｒ  Ｍ．ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ  Ｈ．Ｈ．，１９３７，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，６５．７６７−７８６）を含む。用いてもよい他の弱毒化ＹＦ株の例として、ＹＦ１７Ｄ２０４（ＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）、Ｓａｎｏｆｉ−Ｐａｓｔｅｕｒ、Ｓｗｉｆｔｗａｔｅｒ、ＰＡ、ＵＳＡ；Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標）、Ｓａｎｏｆｉ−Ｐａｓｔｅｕｒ、ＭａｒｃｙＩ’Ｅｔｏｉｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ；ＡＲＩＬＶＡＸ（ＴＭ）、Ｃｈｉｒｏｎ、Ｓｐｅｋｅ、Ｌｉｖｅｒｐｏｏｌ，ＵＫ；ＦＬＡＶＩＭＵＮ（登録商標）、Ｂｅｒｎａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｅｒｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；ＹＦ１７Ｄ−２０４  Ｆｒａｎｃｅ（Ｘ１５０６７、Ｘ１５０６２）；ＹＦ１７Ｄ−２０４，２３４ＵＳ（Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：７２６−７３３）、または関連株であるＹＦ１７ＤＤ（ジェンバンク受入番号Ｕ１７０６６）、ＹＦ１７Ｄ−２１３（ジェンバンク受入番号Ｕ１７０６７）およびＧａｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８，Ｖａｃｃｉｎｅｓ，１６（９／１０）：１０２４−１０２８）に記載されるＹＦ１７ＤＤ株が挙げられる。有利には、本発明の弱毒生キメラＹＦ／デング熱ウイルスのレシピエントフラビウイルスは、ＹＦ１７ＤまたはＹＦ１７Ｄ２０４である。
【００２７】
本発明の実施において有用なキメラデング熱ウイルスの例として、特許出願の国際公開第９８／３７９１１号パンフレットに記載のキメラＹＦ／デング熱ウイルス、ならびに特許出願の国際公開第９６／４０９３３号パンフレットおよび国際公開第０１／６０８４７号パンフレットに記載されるようなキメラデング熱／デング熱ウイルスが挙げられる。
【００２８】
本発明の実施における使用に特に適したキメラＹＦ／デング熱ウイルスの一例がＣｈｉｍｅｒｉｖａｘ（登録商標）ＹＦ／デング熱ウイルスであり、それはまた、本明細書中で「ＣＹＤ」ウイルスと称される。本明細書で用いられるとき、Ｃｈｉｍｅｒｉｖａｘ（登録商標）ＹＦ／デング（またはＣＹＤ）ウイルスは、プレメンブラン（ｐｒＭ）タンパク質およびエンベロープ（Ｅ）タンパク質をコードする核酸配列がデング熱ウイルスの対応する構造タンパク質をコードする核酸配列に置き換えられている好適な弱毒化ＹＦウイルス（例えば、ＹＦ１７ＤまたはＹＦ１７Ｄ２０４（ＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）））のゲノム骨格を含む弱毒生キメラＹＦ／デング熱ウイルスである。かかるＣｈｉｍｅｒｉｖａｘ（登録商標）ウイルスの構築は、Ｃｈａｍｂｅｒｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７３（４）：３０９５−３１０１）の教示に従って、または実質的に従って、行ってもよい。例示される特定のＣｈｉｍｅｒｉｖａｘ（登録商標）（ＣＹＤ）ウイルスは、ＤＥＮ１  ＰＵＯ３５９（ＴＹＰ１  １４０）、ＤＥＮ２  ＰＵＯ２１８、ＤＥＮ３  ＰａＨ８８１／８８およびＤＥＮ４  １２２８（ＴＶＰ９８０）株由来のｐｒＭ配列およびＥ配列を用いて作製されている。便宜上、例示されるこれらの特定のＣｈｉｍｅｒｉｖａｘ（登録商標）（ＣＹＤ）ウイルスは、本明細書中で、それぞれ、「ＣＹＤ１」、「ＣＹＤ２」、「ＣＹＤ３」および「ＣＹＤ４」と称される。これら特定の株の調製は、国際特許出願の国際公開第９８／３７９１１号パンフレット、国際公開第０３／１０１３９７号パンフレット、国際公開第０７／０２１６７２号パンフレット、国際公開第０８／００７０２１号パンフレット、国際公開第０８／０４７０２３号パンフレットおよび国際公開第０８／０６５３１５号パンフレットに詳述されており、それらの調製方法に関する正確な説明についてこれらを参照してもよい。ＣＹＤ１、ＣＹＤ２、ＣＹＤ３およびＣＹＤ４のｐｒＭ−Ｅ領域のヌクレオチド配列に対応する配列番号は、表１６に示される。あるいは、他のデング熱ウイルス株は、例えば他のＣｈｉｍｅｒｉｖａｘ（登録商標）ＹＦ／デング熱ウイルスの構築において、本明細書中の他所に記載の通り、本発明の実施において有用なキメラウイルスの構築を促進するための核酸の供給源として用いてもよい。本発明の保護方法において使用可能なキメラデング熱ウイルスの他の実施形態は、遺伝子骨格が、（ｉ）レシピエントフラビウイルスのＥタンパク質をコードする配列をデング熱ウイルスの対応する配列と、また（ｉｉ）レシピエントフラビウイルスのｐｒＭタンパク質をコードする配列を非デングフラビウイルス、例えばＪＥＶウイルスの対応する配列と、交換することにより修飾されているレシピエントフラビウイルスである。かかるキメラデング熱ウイルスの例が、国際公開第２０１１／１３８５８６号パンフレットに記載されている。
【００２９】
用語「デング熱ウイルス様粒子」または「デングＶＬＰ」は、本明細書で用いられるとき、複製遺伝物質を含有しないが、その表面に天然ビリオン構造と類似の反復秩序配列においてデングＥタンパク質を提示するウイルス粒子を指す。典型的には、デングＶＬＰはまた、デングｐｒＭおよび／またはＭタンパク質を含有する。ＶＬＰは、インビトロで作製され得る（Ｚｈａｎｇｅｔａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２０１１）３０（８）：３３３）。ＶＬＰはまた、インビボで作製してもよい。そのために、当該技術分野で公知の方法によって、例えば少なくとも１つのウイルスベクターの使用によって、ｐｒＭデングタンパク質およびＥデングタンパク質をコードする１つもしくは複数の核酸構築物（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を被験者、例えばヒト被験者の細胞に導入してもよい。次に、ＶＬＰ粒子はインビボで形成される。本発明の方法において使用可能なウイルスベクターの非限定例として、ポックスウイルス（例えば、弱毒化ポックスアンカラ（ｐｏｘ  Ａｎｋａｒａ）ウイルス）および麻疹ウイルスが挙げられる。本発明で用いるため、インビボでＶＬＰを発現するウイルスベクターの特定のカテゴリーとして、例えばＲｅｐｌｉｖａｘ（商標）技術に従う複製欠損偽感染性（ＰＩＶ）ウイルスが挙げられる（Ｒｕｍｙａｎｔｓｅｖ  ＡＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ．２０１１  Ｊｕｌ  １８；２９（３２）：５１８４−９４）。
【００３０】
本発明のワクチン組成物の被験者において免疫応答を誘発する（すなわち、中和抗体の産生を誘発する）能力は、例えば、組成物中に含まれる１つもしくは複数のデング熱ウイルス血清型に対して生じた中和抗体力価を測定することにより評価され得る。中和抗体力価は、Ｐｌａｑｕｅ  Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔ（ＰＲＮＴ５０）試験によって測定してもよい（Ｔｉｍｉｒｙａｓｏｖａ，Ｔ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．（２０１３），ｖｏｌ．８８（５），９６２−９７０）。簡単に述べると、中和抗体力価は、デング中和抗体のレベルについて試験されるべき被験者から収集された血清中にて測定される。被験者がワクチン接種された被験者である場合、試料は、本発明のワクチン組成物の投与から少なくとも２８日後に前記被験者から収集される。（予め加熱不活化された）血清の連続２倍希釈物が、必要に応じて、血清型１、２、３または４の各デング熱ウイルスの一定の負荷用量（ＰＦＵ／ｍＬで表される）と混合される。ＣＹＤデング熱ワクチン構築物の親デング熱ウイルス株が負荷株として用いられる。次に、混合物は、コンフルエントなベロ細胞単層を有するマイクロプレートのウェルに接種される。吸着後、細胞単層は数日間インキュベートされる。デング熱ウイルス感染細胞の存在は感染巣（すなわちプラーク）の形成によって示され、このようにして血清試料中の中和抗体の存在に起因するウイルス感染性の低下（すなわち、プラークの数の減少）が検出され得る。報告された値（エンドポイント中和力価）は、（１００％のウイルス負荷を表す）負の対照ウェル中のウイルスプラークの平均数と比べると（プラーク数で）デング負荷ウイルスの≧５０％が中和される、血清の最高希釈を表す。エンドポイント中和力価は、連続的値として表される。アッセイの定量化の下限（ＬＬＯＱ）は、１０（１／希釈率）である。一般的に、力価が１０（１／希釈率）を超えるかまたはそれと等しい場合に抗体陽転が生じると考えられている。ＰＲＮＴ試験は研究室によってわずかに変動し得るので、ＬＬＯＱもまたわずかに変動し得る。したがって、一般的に、力価が試験のＬＬＯＱを超えるかまたはそれと等しい場合に抗体陽転が生じると考えられる。中和抗体力価は、以下の参考文献において検討されたが、著者は保護との相関を確立しなかった（Ｇｕｉｒａｋｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２００４）７８（９）：４７６１；Ｌｉｂｒａｔｙ  ｅｔ  ａｌ，ＰＬｏＳ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２００９）６（１０）；Ｇｕｎｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｖａｃｃｉｎｅ（２０１１）２９：３８９５）およびＥｎｄｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．（２００４），１８９（６）：９９０−１０００）。
【００３１】
用語「ＣＣＩＤ５０」は、細胞培養液の５０％に感染するウイルス（例えばワクチンウイルス）の量を指す。ＣＣＩＤ５０アッセイは、統計学的力価算出法を用いた限界希釈アッセイである（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．２０１０；２０１（３）：３７０−７）。
【００３２】
本明細書で用いられるとき、「デングナイーブ」被験者は、デング熱ウイルスによる感染を受けておらず、かつ予めデング熱ワクチンで免疫されていない被験者を指し、すなわち、前記被験者から採取された血清試料は、デングＥＬＩＳＡまたはＰＲＮＴ５０アッセイで陰性の結果をもたらすであろう。
【００３３】
本明細書で用いられるとき、「デング熱に免疫性のある」被験者とは、デング熱ウイルスによる感染を受けているか、または本発明のワクチン組成物の投与前にデング熱ワクチンによって免疫された被験者を指し、すなわち、前記被験者から採取された血清試料は、デングＥＬＩＳＡまたはＰＲＮＴ５０アッセイで陽性の結果をもたらすであろう。
【００３４】
本発明によると、「保護する方法」は、本明細書で用いられるとき、デング熱ウイルスに曝露されたヒト被験者においてデング病を発生させる重症度または可能性における低下をもたらす。有利なことに、前記低下は統計学的に有意である。本発明によると、保護する方法は、以下、すなわち
（ｉ）血清型２のデング熱ウイルスによって引き起こされるデング病の発生率または可能性における統計学的に有意な低下、例えば予防；
（ｉｉ）血清型１のデング熱ウイルスによって引き起こされるデング病、血清型２のデング熱ウイルスによって引き起こされるデング病、血清型３のデング熱ウイルスによって引き起こされるデング病および血清型４のデング熱ウイルスによって引き起こされるデング病の発生率または可能性における統計学的に有意な低下、例えば予防；
（ｉｉｉ）血清型１、２、３および４によって引き起こされる、重症度とは無関係のデング病の予防；
（ｉｖ）血清型２のデング熱ウイルスによって引き起こされる重症デング病の発生率または可能性における統計学的に有意な低下、例えば予防；
（ｖ）血清型１のデング熱ウイルスによって引き起こされる重症デング病、血清型２のデング熱ウイルスによって引き起こされる重症デング病、血清型３のデング熱ウイルスによって引き起こされる重症デング病および血清型４のデング熱ウイルスによって引き起こされる重症デング病の発生率または可能性における統計学的に有意な低下、例えば予防；
（ｖｉ）血清型２のデング熱ウイルスによって引き起こされるＤＨＦの発生率または可能性における好ましくは統計学的に有意な低下、例えば予防；
（ｖｉｉ）血清型１のデング熱ウイルスによって引き起こされるＤＨＦ、血清型２のデング熱ウイルスによって引き起こされるＤＨＦ、血清型３のデング熱ウイルスによって引き起こされるＤＨＦおよび血清型４のデング熱ウイルスによって引き起こされるＤＨＦの発生率または可能性における好ましくは統計学的に有意な低下、例えば予防；
（ｖｉｉｉ）血清型２のデング熱ウイルスによって引き起こされるデング病に起因する入院の発生率または可能性における統計学的に有意な低下、例えば予防；
（ｉｘ）血清型１のデング熱ウイルスによって引き起こされるデング病；血清型２のデング熱ウイルスによって引き起こされるデング病；血清型３のデング熱ウイルスによって引き起こされるデング病および血清型４のデング熱ウイルスによって引き起こされるデング病に起因する入院の発生率または可能性における統計学的に有意な低下、例えば予防；
（ｘ）１４日を超える間隔で発生する異なる血清型に起因するデングの≧２のエピソードと定義される、任意の血清型に起因するウイルス学的に確認された反復性の症候性デング熱症例の発生率または可能性における統計学的に有意な低下、例えば予防；
（ｘｉ）少なくとも５歳であるヒト被験者における（ｉ）〜（ｘ）のいずれか１つ；
（ｘｉｉ）少なくとも７歳であるヒト被験者における（ｉ）〜（ｘ）のいずれか１つ；
（ｘｉｉｉ）少なくとも９歳であるヒト被験者における（ｉ）〜（ｘ）のいずれか１つ；
（ｘｉｖ）少なくとも１２歳であるヒト被験者における（ｉ）〜（ｘ）のいずれか１つ；
（ｘｖ）９〜１６歳の間であるヒト被験者における（ｉ）〜（ｘ）のいずれか１つ；
（ｘｖｉ）１２〜１６歳の間であるヒト被験者における（ｉ）〜（ｘ）のいずれか１つ；
（ｘｖｉｉ）流行地域内で生活する９〜６０歳の個人におけるデング熱ウイルス血清型１、２、３および４によって引き起こされるデング病の予防；
（ｘｖｉｉｉ）流行地域内で生活する１２〜６０歳の個人におけるデング熱ウイルス血清型１、２、３および４によって引き起こされるデング病の予防；
（ｘｉｘ）血清型２の前記デング熱ウイルスがアメリカ、アジア／アメリカまたは普遍種の遺伝子型を有する（ｉ）〜（ｘｖｉｉｉ）のいずれか１つ
の任意の１つ以上をもたらし得る。
【００３５】
発明の概要
本発明は、血清型２のデング熱ウイルスによって引き起こされるデング病に対してヒト被験者を保護する方法における使用のためのワクチン組成物であって、
（ｉ）血清型１〜４の各々のデング熱抗原であって、血清型１〜４の前記デング熱抗原は各々、独立して
（ａ）弱毒生デング熱ウイルス；および
（ｂ）弱毒生キメラデング熱ウイルス；
からなる群から選択される、デング熱抗原
または
（ｉｉ）前記ヒト被験者において血清型１〜４の各々のデングＶＬＰであるデング熱抗原を発現させることができる１つもしくは複数の核酸構築物
を含む、組成物に関する。
【００３６】
好ましくは、血清型２のデング熱ウイルスによって引き起こされる前記デング病は重症デング病である。好ましくは、前記方法は、血清型２のデング熱ウイルスによって引き起こされるデング病に起因する入院の発生率または可能性における低下をもたらす。好ましくは、血清型２のデング熱ウイルスによって引き起こされる前記デング病はＤＨＦである。
【００３７】
好ましくは、前記方法はまた、血清型１のデング熱ウイルスによって引き起こされるデング病、血清型３のデング熱ウイルスによって引き起こされるデング病および血清型４のデング熱ウイルスによって引き起こされるデング病に対して前記ヒト被験者を保護する。好ましくは、前記方法は、血清型１のデング熱ウイルスによって引き起こされるデング病；血清型２のデング熱ウイルスによって引き起こされるデング病；血清型３のデング熱ウイルスによって引き起こされるデング病および血清型４のデング熱ウイルスによって引き起こされるデング病に起因する入院の発生率または可能性における低下をもたらす。好ましくは、本発明のワクチン組成物が本明細書に記載される方法において用いられる場合、前記方法は、血清型１のデング熱ウイルスによって引き起こされるデング熱、血清型２のデング熱ウイルスによって引き起こされるデング熱、血清型３のデング熱ウイルスによって引き起こされるデング熱および血清型４のデング熱ウイルスによって引き起こされるデング熱に対する前記ヒト被験者の保護をもたらす。好ましくは、本発明のワクチン組成物が本明細書に記載される方法において用いられる場合、前記方法は、血清型１のデング熱ウイルスによって引き起こされる重症デング病、血清型２のデング熱ウイルスによって引き起こされる重症デング病、血清型３のデング熱ウイルスによって引き起こされる重症デング病および血清型４のデング熱ウイルスによって引き起こされる重症デング病に対する前記ヒト被験者の保護をもたらす。好ましくは、本発明のワクチン組成物が本明細書に記載される方法において用いられる場合、前記方法は、血清型１のデング熱ウイルスによって引き起こされるＤＨＦ、血清型２のデング熱ウイルスによって引き起こされるＤＨＦ、血清型３のデング熱ウイルスによって引き起こされるＤＨＦおよび血清型４のデング熱ウイルスによって引き起こされるＤＨＦに対する前記ヒト被験者の保護をもたらす。
【００３８】
好ましくは、本発明のワクチン組成物は、デング熱に免疫性のあるヒト被験者に投与される。好ましくは、本発明のワクチン組成物は、少なくとも２歳であるヒト被験者に投与される。好ましくは、前記ヒト被験者は、少なくとも５歳である。好ましくは、前記ヒト被験者は、少なくとも７歳である。好ましくは、前記ヒト被験者は、少なくとも９歳である。好ましくは、前記ヒト被験者は、少なくとも１２歳である。好ましくは、前記ヒト被験者は、２〜６０歳の年齢である。好ましくは、前記ヒト被験者は、６〜６０歳の年齢である。好ましくは、前記ヒト被験者は、７〜６０歳の年齢である。好ましくは、前記ヒト被験者は、９〜６０歳の年齢である。好ましくは、前記ヒト被験者は、１２〜６０歳の年齢である。好ましくは、前記ヒト被験者は、２〜１６歳の年齢である。好ましくは、前記ヒト被験者は、５〜１６歳の年齢である。好ましくは、前記ヒト被験者は、９〜１６歳の年齢である。
【００３９】
本発明に記載のヒト被験者は、好ましくは、妊娠、授乳してないかもしくは子育ての可能性がなく、自己報告されるまたは疑われる先天性もしくは後天性免疫不全を有しておらず、ワクチン接種に先立つ６か月以内での免疫抑制治療またはワクチン接種に先立つ３か月以内での２週間を超える全身性コルチコステロイド治療を受けておらず、ＨＩＶ血清陽性でなく、また本明細書で定義されるようなワクチン成分のいずれかに対して全身性過敏症を有しない。
【００４０】
好ましくは、本発明に記載のワクチン組成物は、血清型１〜４の各々のデング熱抗原（各々独立して、（ａ）弱毒生デング熱ウイルスおよび（ｂ）弱毒生キメラウイルスからなる群から選択される）を含む。
【００４１】
好ましくは、本発明に記載のワクチン組成物は、血清型１〜４の各々のデング熱抗原を含み、ここで血清型１、３および４の前記デング熱抗原は各々、弱毒生キメラデング熱ウイルスであり、かつ血清型２の前記デング熱抗原は、弱毒生デング熱ウイルスおよび弱毒生キメラデング熱ウイルスからなる群から選択される。例えば、本発明のワクチン組成物は、血清型１〜４の各々のデング熱抗原を含んでもよく、ここで血清型１、３および４の前記デング熱抗原は各々、弱毒生キメラデング熱／デング熱ウイルスであり、かつ血清型２の前記デング熱抗原は弱毒生デング熱ウイルスである。例えば、本発明に記載のワクチン組成物は、Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｎｅｇｌ  Ｔｒｏｐ  Ｄｉｓ７（５）：ｅ２２４３（２０１３）に開示される、（ＤＥＮＶａｘと称される）血清型１〜４の各々のデング熱抗原の四価混合物であってもよい。あるいは、本発明のワクチン組成物は、血清型１〜４の各々のデング熱抗原を含んでもよく、ここで血清型１、３および４の前記デング熱抗原は各々、弱毒生キメラＹＦ／デング熱ウイルスであり、かつ血清型２の前記デング熱抗原は弱毒生デング熱ウイルスである。
【００４２】
好ましくは、本発明に記載のワクチン組成物は、血清型１〜４の各々のデング熱抗原を含み、ここで血清型１、３および４の前記デング熱抗原は各々独立して、（ａ）弱毒生デング熱ウイルスおよび（ｂ）弱毒生キメラデング熱ウイルスからなる群から選択され、かつ血清型２の前記デング熱抗原は弱毒生キメラデング熱ウイルスである。例えば、本発明のワクチン組成物は、血清型１〜４の各々のデング熱抗原を含んでもよく、ここで血清型１、３および４の前記デング熱抗原は各々、弱毒生デング熱ウイルスであり、かつ血清型２の前記デング熱抗原は弱毒生キメラデング熱／デング熱ウイルスである。例えば、本発明に記載のワクチン組成物は、Ｄｕｒｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ（２０１３），２０７，９５７−９６５に開示される、（ＴＶ００１、ＴＶ００２、ＴＶ００３およびＴＶ００４’と称される）血清型１〜４の各々のデング熱抗原の四価混合物のいずれかであってもよい。好ましくは、本発明の本実施形態に記載のワクチン組成物はＴＶ００３である。
【００４３】
好ましくは、本発明に記載のワクチン組成物は、血清型１〜４の各々のデング熱抗原を含み、ここで前記デング熱抗原の各々は、弱毒生キメラデング熱ウイルス、好ましくはキメラＹＦ／デング熱ウイルス、より好ましくはキメラＹＦ／デング熱ウイルス（ｐｒＭ−Ｅ配列がデング熱ウイルスのｐｒＭ−Ｅ配列と置換されている弱毒化ＹＦゲノム骨格を含む）である。
【００４４】
好ましくは、本発明の弱毒生キメラデング熱ウイルスは、デング熱ウイルス由来の１つ以上のタンパク質および異なるフラビウイルス由来の１つ以上のタンパク質を含む。好ましくは、異なるフラビウイルスは、黄熱病ウイルス（ｙｅｌｌｏｗ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）（すなわち、キメラＹＦ／デング熱ウイルス）である。好ましくは、本発明に記載の弱毒生キメラデング熱ウイルスは、ｐｒＭ−Ｅ配列がデング熱ウイルスのｐｒＭ−Ｅ配列と置換されている弱毒化黄熱病ウイルスゲノムを含む。あるいは、本発明の弱毒生キメラデング熱ウイルスは、第１のデング熱ウイルス由来の１つ以上のタンパク質および第２のデング熱ウイルス（すなわち、キメラデング熱／デング熱ウイルス）由来の１つ以上のタンパク質を含む。好ましくは、前記第１のデング熱ウイルスおよび前記第２のデング熱ウイルスは、血清型が異なる。前記第１のデング熱ウイルスおよび前記第２のデング熱ウイルスの血清型が同じである場合、前記第１および第２のデング熱ウイルスは異なる株である。
【００４５】
本発明における使用のための血清型１のデング熱抗原の好例が、配列番号１に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む弱毒生キメラＹＦ／デング熱ウイルスである。本発明における使用のための血清型１のデング熱抗原の別の好例が、配列番号６に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む弱毒生デング熱ウイルスである。好ましくは、配列番号６に対して１００％未満の同一性を有するヌクレオチド配列は、配列番号６の位置１３２３、１５４１、１５４３、１５４５、１５６７、１６０８、２３６３、２６９５、２７８２、５０６３、５９６２、６０４８、６８０６、７３３０、７９４７および９４４５に対応する前記核酸配列内の位置に突然変異を含まない。
【００４６】
本発明における使用のための血清型２のデング熱抗原の好例が、配列番号２に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む弱毒生キメラＹＦ／デング熱ウイルスである。本発明における使用のための血清型２のデング熱抗原の別の好例が、配列番号５に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む弱毒生キメラＹＦ／デング熱ウイルスである。本発明における使用のための血清型２のデング熱抗原の別の好例が、配列番号７に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む弱毒生デング熱ウイルスである。好ましくは、配列番号７に対して１００％未満の同一性を有するヌクレオチド配列は、配列番号７の位置７３６、１６１９、４７２３、５０６２、９１９１、１００６３、１０５０７、５７、５２４、２０５５、２５７９、４０１８、５５４７、６５９９および８５７１に対応する前記核酸配列内の位置に突然変異を含まない。
【００４７】
本発明における使用のための血清型３のデング熱抗原の好例が、配列番号３に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む弱毒生キメラＹＦ／デング熱ウイルスである。
【００４８】
本発明における使用のための血清型４のデング熱抗原の好例が、配列番号４に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む弱毒生キメラＹＦ／デング熱ウイルスである。
【００４９】
本発明に記載の（四価剤形中の）ワクチン組成物（すなわち、血清型１〜４の各々のデング熱抗原を含有するもの）を形成するため、先行する４つの段落内に開示される血清型１、２、３および４のデング熱抗原の好例は、可能な任意の組み合わせで組み合わせてもよい。あるいは、本発明に記載のワクチン組成物は、２つの二価剤形として被験者に投与してもよく、ここで先行する４つの段落内に開示される血清型１、２、３および４のデング熱抗原の好例は、可能な二価の組み合わせの任意のペアで組み合わせてもよい。したがって、血清型１、２、３および４のデング熱抗原の特に好ましい組み合わせでは、血清型３および４のデング熱抗原は各々、配列番号３に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む弱毒生キメラＹＦ／デング熱ウイルスおよび配列番号４に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む弱毒生キメラＹＦ／デング熱ウイルスである。かかる特に好ましい組み合わせでは、血清型１および２のデング熱抗原は各々、
（ｉ）配列番号１に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む弱毒生キメラＹＦ／デング熱ウイルスおよび配列番号２に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む弱毒生キメラＹＦ／デング熱ウイルス；または
（ｉｉ）配列番号１に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む弱毒生キメラＹＦ／デング熱ウイルスおよび配列番号５に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む弱毒生キメラＹＦ／デング熱ウイルス；または
（ｉｉｉ）配列番号１に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む弱毒生キメラＹＦ／デング熱ウイルスおよび配列番号７に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む弱毒生デング熱ウイルス（好ましくは、配列番号７に対して１００％未満の同一性を有するヌクレオチド配列は、配列番号７の位置７３６、１６１９、４７２３、５０６２、９１９１、１００６３、１０５０７、５７、５２４、２０５５、２５７９、４０１８、５５４７、６５９９および８５７１に対応する前記核酸配列内の位置に突然変異を含まない）；または
（ｉｖ）配列番号６に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む弱毒生デング熱ウイルス（好ましくは、配列番号６に対して１００％未満の同一性を有するヌクレオチド配列は、配列番号６の位置１３２３、１５４１、１５４３、１５４５、１５６７、１６０８、２３６３、２６９５、２７８２、５０６３、５９６２、６０４８、６８０６、７３３０、７９４７および９４４５に対応する前記核酸配列内の位置に突然変異を含まない）および配列番号７に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む弱毒生デング熱ウイルス（好ましくは、配列番号７に対して１００％未満の同一性を有するヌクレオチド配列は、配列番号７の位置７３６、１６１９、４７２３、５０６２、９１９１、１００６３、１０５０７、５７、５２４、２０５５、２５７９、４０１８、５５４７、６５９９および８５７１に対応する前記核酸配列内の位置に突然変異を含まない）
であってもよい。
【００５０】
好ましくは、本発明のワクチン組成物は、特定のレベルのワクチン有効性をもたらす。例えば、本発明のワクチン組成物は、血清型２によって引き起こされるデング病に関して少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％のワクチン有効性を有する。例えば、本発明のワクチン組成物は、（任意の血清型によって引き起こされる）デング病に関して少なくとも６０％の全体的なワクチン有効性を有する。例えば、本発明のワクチン組成物は、血清型２によって引き起こされるデング病に関して少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％のワクチン有効性および（任意の血清型によって引き起こされる）デング病に関して少なくとも６０％の全般的なワクチン有効性を有する。
【００５１】
好ましくは、本発明のワクチン組成物は、黄熱病に免疫性のあるヒト被験者に投与される。本明細書で用いられるとき、黄熱病に免疫性のある被験者は、本発明のワクチン組成物、すなわち前記被験者から採取された血清試料の投与がＹＦ  ＥＬＩＳＡまたはＹＦ  ＰＲＮＴ５０アッセイにおける陽性結果をもたらすことになる前に、ＹＦウイルスによる感染またはＹＦワクチンによる免疫を受けている被験者を指す。簡潔に述べると、ＹＦ  ＰＲＮＴ５０アッセイは以下のように実施される。（予め熱不活化された）試験対象の血清の連続２倍希釈物が、（ＰＦＵ／ｍＬとして表される）一定濃度のＹＦワクチン株１７Ｄと混合される。混合物は、コンフルエントベロ細胞のプレートのウェルに２連に接種される。吸着後、細胞単層は、数日間、表面を覆われ、インキュベートされる。報告される値（エンドポイント中和力価）は、（プラーク数における）ＹＦ負荷ウイルスの≧５０％が、１００％のウイルス負荷を表す負の対照ウェルと比較すると中和される場合の血清の最高希釈を表す。ＹＦ  ＰＲＮＴ５０アッセイにおけるＬＬＯＱは１０（１／ｄｉｌ）である。代わりに、また有利なことに、黄熱病に免疫性のあるヒト被験者を画定するため、よりストリンジェントなアッセイを用いてもよい。例えば、ＹＦに免疫性のある被験者は、血清試料がＰＲＮＴ８０またはＰＲＮＴ９０アッセイにおける陽性結果をもたらすような被験者と定義してもよい。報告された値（エンドポイント中和力価）は、（プラーク数における）ＹＦ負荷ウイルスの≧８０％または≧９０％が負の対照ウェルと比べて中和される場合の血清の最高希釈を表す。好ましくは、本発明のワクチン組成物は、黄熱病およびデング熱に免疫性のあるヒト被験者に投与される。好ましくは、本発明のワクチン組成物は、多型（ｍｕｌｔｉｔｙｐｉｃ）デング熱に免疫性のあるヒト被験者に投与される。本明細書で用いられるとき、多型デング熱に免疫性のある被験者は、（自然感染またはワクチン接種のいずれかにより）２種以上の血清型のデング熱ウイルスによる感染を受けている被験者を指す。多型デング熱に免疫性のある被験者は、デング熱ＰＲＮＴ５０アッセイにおける少なくとも２つの血清型に対する陽性結果（抗体力価＞１０）および陽性血清型間での６倍未満の差異をもたらすことになる被験者と定義される。単一型のデング熱に免疫性のある被験者は、デング熱ＰＲＮＴ５０アッセイにおいて１つの血清型のみに対する陽性結果（抗体力価＞１０）をもたらすことになる被験者、またはデング熱ＰＲＮＴ５０アッセイにおいて単一の血清型に対して残りの３種の血清型への応答と比べると少なくとも６倍高い応答を有する被験者と定義される。好ましくは、本発明のワクチン組成物は、黄熱病に免疫性があり、かつ単一型のデング熱に免疫性のある被験者に投与される。好ましくは、本発明のワクチン組成物は、黄熱病に免疫性があり、かつ多型デング熱に免疫性のあるヒト被験者に投与される。
【００５２】
本発明に記載のワクチン組成物は、複数回用量で投与してもよい。例えば、本発明に記載のワクチン組成物は、１回、２回もしくは３回の用量で投与してもよい。本発明に記載のワクチン組成物が３回の用量で投与される場合、１回目用量および３回目用量は、好ましくは約１２か月間隔で投与される。例えば、本発明のワクチン組成物は、１回目用量、２回目用量および３回目用量で投与してもよく、ここで前記２回目用量は前記１回目用量から約６か月後に投与されるべきであり、また前記３回目用量は前記１回目用量から約１２か月後に投与されるべきである。あるいは、３回の用量は、０か月目、約３〜４か月目（例えば約３．５か月目）および約１２か月目に投与してもよい（すなわち、組成物の２回目用量が１回目用量から約３．５か月後に投与され、また組成物の３回目用量が１回目用量から約１２か月後に投与されるというレジメン）。
【００５３】
本発明に記載のワクチン組成物は、２回用量で投与してもよい。好ましくは、１回目用量および２回目用量は、およそ約３、６、８もしくは９か月間隔で投与される。好ましくは、２回目用量は、１回目用量から約６か月後に投与される。あるいは、本発明に記載のワクチン組成物の２回用量は、同時にまたはほぼ同時に（例えば互いに２４時間以内で）被験者に投与してもよい。好ましくは、本発明に記載のワクチン組成物が２回用量で投与される場合、ワクチン組成物が投与されるヒト被験者はデング熱に免疫性がある。前記被験者が先行的ワクチン接種に起因してデング熱に免疫性がある場合、前記先行的ワクチン接種は、好ましくは、本発明に記載のワクチン組成物の２回用量の１回目の少なくとも３か月前、より好ましくは少なくとも６か月前に投与された。
【００５４】
本発明に記載のワクチン組成物は、単回用量で投与してもよい。好ましくは、本発明に記載のワクチン組成物が単回用量で投与される場合、ワクチン組成物が投与されるヒト被験者はデング熱に免疫性がある。前記被験者が先行的ワクチン接種に起因してデング熱に免疫性がある場合、前記先行的ワクチン接種は、好ましくは、本発明に記載のワクチン組成物の単回用量の少なくとも３か月前、より好ましくは少なくとも６か月前に投与された。
【００５５】
任意選択的に、本発明に記載のワクチン組成物の追加免疫投与は、例えば初期免疫後（すなわち、初期免疫レジメンにおいて計画された最終用量の投与後）の６か月と１０年の間、例えば６か月目、１年目、３年目、５年目もしくは１０年目に用いてもよい。
【００５６】
（本発明のワクチン組成物が投与される）本発明に記載のヒト被験者は、好ましくは、デング熱流行地域に居住しているかまたは旅行中である。より好ましくは、前記ヒト被験者はデング熱流行地域に居住している。本発明に記載のヒト被験者はまた、デング熱流行病を経験している地域内に居住していてもよい。居住するという用語は、本明細書中でその従来の意味が示され、通常は問題の地域内に定住している人を指す。デング熱流行地域は、当業者に周知であり、本発明によると、熱帯および亜熱帯の大部分、例えばＷＨＯにより流行国として同定された任意の国を含む。デング熱流行地域は、集団における少なくとも５０％がデング熱に免疫性があるかまたは少なくとも６０％がデング熱に免疫性がある地域として本明細書中で定義してもよい。より好ましくは、デング熱流行地域は、集団における少なくとも７０％がデング熱に免疫性があるか、少なくとも８０％がデング熱に免疫性があるか、または少なくとも９０％がデング熱に免疫性がある地域と定義してもよい。したがって、本発明に記載のヒト被験者は、好ましくはデング熱流行地域に居住しており、ここで前記地域の集団における少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％がデング熱に免疫性がある。例えば、本発明に記載のデング熱流行地域は、熱帯および亜熱帯に含まれるそのアメリカの国々または地域を含んでもよい。それ故、本発明に記載のデング熱流行地域は、その以下の国々または地域、すなわち、ブラジル、ベネズエラ、コロンビア、エクアドル、ペルー、ボリビア、パラグアイ、パナマ、コスタリカ、ニカラグア、ホンジュラス、エルサルバドル、グアテマラ、ベリーズ、メキシコ、米国およびカリブ諸島のうちの任意の１つ以上を含んでもよい。特定の実施形態では、本発明のデング熱流行地域は、以下、すなわち、ブラジル、コロンビア、ホンジュラス、メキシコおよびプエルトリコからなってもよい。別の特定の実施形態では、本発明のデング熱流行地域は、以下、すなわち、ブラジル、コロンビアおよびホンジュラスからなってもよい。本発明に記載のデング熱流行地域はまた、熱帯および亜熱帯内の南アジアおよびオセアニア諸国を含んでもよい。それ故、本発明に記載のデング熱流行地域は、以下、すなわち、インド、ミャンマー（ビルマ）、タイ、ラオス、ベトナム、カンボジア、インドネシア、マレーシア、シンガポール、フィリピン、台湾、パプアニューギニアおよびオーストラリアのうちの任意の１つ以上からなってもよい。
【００５７】
（本発明のワクチン組成物が投与される）本発明に記載のヒト被験者は、有利にも、デングの支配的な循環系統が血清型１、３および４であるデング熱流行地域内に居住している。例えば、前記デング熱流行地域内でのデング病の症例の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％は、血清型１、３または４のデング熱ウイルスによって引き起こされる。（本発明のワクチン組成物が投与される）本発明に記載のヒト被験者は、有利にも、デングの支配的な循環系統が血清型３および４であるデング熱流行地域内に居住している。例えば、前記デング熱流行地域内でのデング病の症例の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％は、血清型３または４のデング熱ウイルスによって感染される。
【００５８】
（本発明のワクチン組成物が投与される）本発明に記載のヒト被験者は、有利にも、血清型２の循環デング株が位置Ｅ−２２６およびＥ−２２８でのＴｈｒおよびＧｌｙの存在によって特徴づけられる遺伝子型を有するデング熱流行地域内に居住している。有利にも、血清型２の循環デング株は、位置ｐｒＭ−１６、Ｅ−８３、Ｅ−２０３、Ｅ−２２６、Ｅ−２２８およびＥ−３４６各々の残基Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、ＧｌｙおよびＨｉｓの少なくとも５つもしくは６つ全部の存在によって特徴づけられる遺伝子型を有し、ここで位置Ｅ−２２６およびＥ−２２８の残基は各々、ＴｈｒおよびＧｌｙである必要がある。これに関連して、例えば、ｐｒＭ−１６はｐｒＭタンパク質の位置１６を指し、Ｅ−８３はＥタンパク質の位置８３を指す。（本発明のワクチン組成物が投与される）本発明に記載のヒト被験者は、好ましくは、循環血清型２デング熱ウイルスがこの段落で定義されるような遺伝子型を有するデング熱流行地域内に居住する、すなわち、前記デング熱流行地域内での血清型２のデング病の症例の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは１００％は、前記遺伝子型を有する血清型２のデング熱ウイルスによって引き起こされる。血清型２のデング熱ウイルスによって引き起こされるデング病は、本明細書中に参照されるとき、好ましくは、この段落で定義されるような遺伝子型を有する血清型２のデング熱ウイルスによって引き起こされるデング病である。
【００５９】
（本発明のワクチン組成物が投与される）本発明に記載のヒト被験者は、有利にも、血清型２の循環デング系統がアジア−１遺伝子型を有しない場合のデング熱流行地域内に居住している。血清型２のデング熱ウイルスは、アメリカ、アジア／アメリカ、アジア−１、アジア−２、普遍種および森林型（Ｓｙｌｖａｔｉｃ）と称される幾つかの遺伝子型に細分化され得る（Ｔｗｉｄｄｙ  ＳＳ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｐｒｅｓｓｕｒｅｓ  ａｍｏｎｇ  ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｄｅｎｇｕｅ−２  ｖｉｒｕｓ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；２９８（１）：６３−７２）。したがって、（本発明のワクチン組成物が投与される）本発明に記載のヒト被験者は、有利にも、血清型２の循環デング系統がアメリカ、アジア／アメリカ、アジア−２、普遍種または森林型の遺伝子型を有する場合のデング熱流行地域内に居住している。より好ましくは、（本発明のワクチン組成物が投与される）本発明に記載のヒト被験者は、有利にも、血清型２の循環デング系統がアメリカ、アジア／アメリカ、または普遍種遺伝子型を有する場合のデング熱流行地域内に居住している。（本発明のワクチン組成物が投与される）本発明に記載のヒト被験者は、好ましくは、循環血清型２デング熱ウイルスがこの段落で定義されるような遺伝子型を有する場合のデング熱流行地域内に居住している、すなわち、前記デング熱流行地域内での血清型２のデング病の症例の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは１００％が、アメリカ、アジア／アメリカ、アジア−２、普遍種または森林型の遺伝子型、好ましくは、アメリカ、アジア／アメリカ、または普遍種遺伝子型を有する血清型２のデング熱ウイルスによって引き起こされる。血清型２のデング熱ウイルスによって引き起こされるデング病は、本明細書中に参照されるとき、好ましくは、アメリカ、アジア／アメリカ、アジア−２、普遍種または森林型の遺伝子型を有する血清型２のデング熱ウイルスによって引き起こされるデング病である。より好ましくは、血清型２のデング熱ウイルスによって引き起こされるデング病は、本明細書中に参照されるとき、好ましくは、アメリカ、アジア／アメリカ、または普遍種遺伝子型を有する血清型２のデング熱ウイルスによって引き起こされるデング病である。特定のデング−２ウイルス株の遺伝子型は、配列アラインメントおよび系統樹分析により決定される。簡潔に述べると、（Ｔｗｉｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．に記載される、各遺伝子型の代表的な株のＥタンパク質をコードする選択されたヌクレオチド配列である）参照配列は、遺伝子型同定すべき血清型２株のＥタンパク質をコードするヌクレオチド配列と整列される。次に、系統樹が算出され、遺伝子型が、各々の未知の血清型２株に、それら各々の参照−遺伝子型配列とのクラスタリングにより割り当てられる。系統樹は、ＦａｓｔＴｒｅｅ２ソフトウェア（Ｐｒｉｃｅ  ＭＮ  ｅｔ  ａｌ．，ＦａｓｔＴｒｅｅ  ２−−ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ  ｍａｘｉｍｕｍ−ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  ｔｒｅｅｓ  ｆｏｒ  ｌａｒｇｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１０；５（３）：ｅ９４９０）ならびにアミノ酸進化のＷｈｅｌａｎおよびＧｏｌｄｍａｎモデル（Ｗｈｅｌａｎ  Ｓ，Ｇｏｌｄｍａｎ  Ｎ．Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｅｍｐｉｒｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆａｍｉｌｉｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｍａｘｉｍｕｍ−ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．２００１；１８（５）：６９１−６９９）を用いた最大尤度法により算出される。
【００６０】
本発明に記載のデング病は、ウイルス学的に確認されたデング病であってもよい。
【００６１】
好ましくは、本発明に記載の組成物、すなわち本発明に記載の方法における使用のための組成物は、デング病の発生率または可能性を低下させる。
【００６２】
好ましくは、本発明に記載の組成物、すなわち本発明に記載の方法における使用のための組成物は、流行地域内で生活する９〜６０歳の個人における、デング熱ウイルス血清型１、２、３および４によって引き起こされるデング病の予防をもたらす（すなわち、デング病の予防における使用が意図される）。これに関連して、個人はヒト被験者であることが理解されている。
【００６３】
好ましくは、本発明に記載の組成物、すなわち、本発明に記載の方法における使用のための組成物は、流行地域内で生活する１２〜６０歳の個人におけるデング熱ウイルス血清型１、２、３および４によって引き起こされるデング病の予防をもたらす（すなわち、デング病の予防における使用が意図される）。これに関連して、個人はヒト被験者であることが理解されている。
【００６４】
投与されるべき本発明の弱毒生デング熱ウイルスまたは弱毒生キメラデング熱ウイルスの正確な量は、ワクチン接種されている被験者の年齢および体重、投与の頻度、ならびに組成物中のその他の成分により変動し得る。一般に、本発明のワクチン組成物の用量中に含まれる弱毒生デング熱ウイルス（例えばＶＤＶ１またはＶＤＶ２）の量は、約１０３〜約１０６ＣＣＩＤ５０の範囲内、例えば約５×１０３〜約５×１０５の範囲内にあり、例えば約１０４ＣＣＩＤ５０である。本発明のワクチン組成物中に含まれるキメラデング熱ウイルス（キメラＹＦ／デング熱ウイルスまたはＣｈｉｍｅｒｉｖａｘ（登録商標）（ＣＹＤ）ウイルスなど）の量は、約１０５ＣＣＩＤ５０〜約１０６ＣＣＩＤ５０の範囲内にある。本発明に記載の四価剤形または二価剤形中に含まれる血清型１〜４の各々の弱毒生デング熱ウイルスまたは弱毒生キメラデング熱ウイルスの量は、好ましくは等しい。有利にも、本発明に記載のワクチン組成物は、本明細書に定義されるようなデング熱抗原を有効量含む。
【００６５】
本発明のワクチン組成物は、本明細書に定義されるようなデング熱抗原の全部で４つの血清型を含む単一の四価剤形、すなわち単一の剤形としてヒト被験者に投与してもよい。あるいは、本発明のワクチン組成物は、２つの二価剤形（すなわち、デング熱抗原の２つの血清型を含有する第１の二価剤形とデング熱抗原の残りの２つの血清型を含有する第２の二価剤形）としてヒト被験者に投与してもよい。好ましくは、前記二価剤形は、前記ヒト被験者の解剖学的に分かれた部位に同時投与される。用語「同時に」は、本明細書で定義されるとき、２４時間以内、好ましくは３時間以内、好ましくは１０分以内を意味する。用語「解剖学的に分かれた部位」は、本明細書で定義されるとき、異なるリンパ節によって流出される身体上の部位、例えば各腕の三角筋領域を意味する。好ましくは、本発明に記載のワクチン組成物は、単一の四価剤形として被験者に投与される。
【００６６】
本発明に記載のワクチン組成物は、薬学的に許容できる担体または賦形剤をさらに含んでもよい。本発明に記載の薬学的に許容できる担体または賦形剤は、活性剤の安定性、無菌性およびデリベラビリティを増強するために医薬品およびワクチンの製剤中で一般に用いられ、かつヒトにおいて任意の二次反応、例えばアレルギー反応をもたらさない任意の溶媒または分散媒などを意味する。賦形剤は、選択される医薬品形態、方法および投与経路に基づいて選択される。適切な賦形剤、および医薬製剤に関する要件は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（１９ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９９５））に記載されている。薬学的に許容できる賦形剤の特殊な例として、水、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液および０．３％グリシン溶液が挙げられる。本発明に記載のワクチン組成物は、有利にも、０．４％生理食塩水を含んでもよい。
【００６７】
本発明の方法における使用のためのワクチン組成物は、任意選択的に、生理的条件に近づくのに必要とされるような薬学的に許容できる補助物質、例えば、ｐＨ調整剤および緩衝剤、等張化剤、浸潤剤など、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンラウリン酸モノエステル、オレイン酸トリエタノールアミン、ヒト血清アルブミン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、塩酸Ｌ−アルギニン（ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒａｔｅ）、サッカロース、無水Ｄ−トレハロース、ソルビトール、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンおよび／または尿素を含有してもよい。さらに、ワクチン組成物は、任意選択的に、例えば、希釈剤、結合剤、安定剤、および保存料を含む薬学的に許容できる添加剤を含んでもよい。好ましい安定剤は、国際公開第２０１０／００３６７０号パンフレットに記載されている。
【００６８】
当業者によって理解されているように、本発明のワクチン組成物は、意図される投与経路と適合できるように好適に調合される。好適な投与経路の例として、例えば、筋肉内、経皮、皮下、鼻腔内、経口または皮内が挙げられる。有利には、投与経路は皮下である。
【００６９】
本発明のワクチン組成物は、従来の皮下注射器もしくは安全注射器、例えばＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅ、ＮＪ，ＵＳＡ）製の市販のものまたはジェット式注射器を用いて投与してもよい。皮内投与においては、従来の皮下注射器をＭａｎｔｏｕｘ技術を用いて利用してもよく、または特化された皮内送達装置、例えばＢＤ  Ｓｏｌｕｖｉａ（商標）マイクロインジェクションシステム（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅ、ＮＪ，ＵＳＡ）を用いてもよい。
【００７０】
投与される本発明のワクチン組成物の容積は、投与方法に依存することになる。皮下注射の場合、容積は一般に、０．１〜１．０ｍｌの間、好ましくは約０．５ｍｌである。
【００７１】
一実施形態によると、本発明はまた、本発明のワクチン組成物およびデング病に対してヒト被験者を保護する方法における前記ワクチン組成物の使用のための使用説明書を含むキットを提供する。キットは、前記ワクチン組成物を単一の四価剤形の形態で含んでもよく、または前記キットは、前記ワクチン組成物を２つの二価剤形の形態で含んでもよい。キットは、本明細書で検討される任意のワクチン組成物を（典型的には注射器内の）少なくとも１用量で含み得る。一実施形態によると、キットは、本明細書に記載のような任意のワクチン組成物の複数回用量製剤を含んでもよい。キットは、デング病の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）のための前記ワクチン組成物の使用またはデング病の予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）のための前記ワクチン組成物の使用について記述したパンフレットをさらに含む。パンフレットは、ワクチン接種計画およびワクチン接種されるべきヒト被験者集団についてさらに記述してもよい。
【００７２】
デング病の可能性または重症度を低下させる場合の本発明のワクチン組成物の有効性は、幾つか方法で測定してもよい。例えば、デング病の可能性または重症度を低下させる場合の本発明のワクチン組成物の有効性は、前記ワクチン組成物を少なくとも１用量で投与後（例えば、前記ワクチン組成物を１、２もしくは３用量で投与後）、前記ワクチン組成物を受けている被験者の群における
（ｉ）任意の血清型のデング熱ウイルスによって引き起こされるデング病の症例の数；
（ｉｉ）任意の血清型のデング熱ウイルスによって引き起こされる重症デング熱症例の数；
（ｉｉｉ）任意の血清型のデング熱ウイルスによって引き起こされるＤＨＦ症例の数；および／または
（ｉｖ）任意の血清型のデング熱ウイルスによって引き起こされるデング病の入院症例の数；
を測定し、それら測定値を前記ワクチン組成物を受けていない被験者の対照群からの対応する測定値と比較することにより算出してもよく、ここで前記群の双方における被験者はデング熱流行地域内に居住している。被験者のワクチン接種群における（ｉ）〜（ｉｖ）の任意の１つ以上の、被験者のワクチン未接種対照群と比べた場合の統計学的に決定的な低下は、本発明に記載のワクチン組成物の有効性を示している。
【００７３】
デング病の重症度または可能性を低下させる場合の本発明に記載のワクチン組成物の有効性はまた、前記ワクチン組成物を少なくとも１用量で投与後（例えば、前記ワクチン組成物を１、２もしくは３用量で投与後）、前記ワクチン組成物を受けており、かつウイルス学的に確認されたデング病を発症している被験者の群における
（ｉ）発熱の平均持続時間および／または強度；
（ｉｉｉ）ヘマトクリットにおける変化によって定義される通りの血漿漏出における平均値；
（ｉｉｉ）血小板減少（血小板数）における平均値；および／または
（ｉｖ）アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）を含む肝酵素のレベルの平均値；
を測定し、それら測定値を前記ワクチン組成物を受けておらず、かつウイルス学的に確認されたデング病を発症している被験者の対照群からの対応する測定値と比較することにより算出してもよい。ウイルス学的に確認されたデング病を発症している被験者のワクチン接種群における（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれか１つ以上の、ウイルス学的に確認されたデング病を発症している被験者の対照群と比べた場合の統計学的に有意な低下は、デング病の重症度または可能性を低下させる場合の本発明に記載のワクチン組成物の有効性を示している。
【００７４】
典型的には、例えば実施例１に記載の方法（各群におけるワクチン有効性（ＶＥ）＝１００＊（１−ＩＤＣＹＤ／ＩＤＣｏｎｔｒｏｌ）（式中、ＩＤは罹患密度（すなわち、ウイルス学的に確認されたデング熱を有するヒト被験者の数をリスク人年の数で除したもの））による測定としてのデング病に対する本発明の保護の方法の有効性は、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％である。血清型３または４により引き起こされるデング病に対する保護の方法の有効性は、有利なことに少なくとも７０％である。
【００７５】
本明細書に開示される核酸配列と他の核酸配列とのアラインメントは、当業者に周知の好適な配列アラインメント法のいずれかにより行ってもよい。例えば、配列アラインメントは手作業で行ってもよい。より便宜的には、アラインメントは、専用化されたコンピュータプログラムを用いて行ってもよい。例えば、グローバルな配列アラインメントアルゴリズム、例えば、多重配列アラインメント（ＭＳＡ）アルゴリズムＣｌｕｓｔａｌ  ＷおよびＣｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａアルゴリズム、またはログ期待値による多重配列比較（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｂｙ  Ｌｏｇ−Ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ）（ＭＵＳＣＬＥ）アルゴリズムにより、最適な配列アラインメントを行うことができ、パーセント同一性を決定することができる（Ｅｄｇａｒ  ＲＣ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（２００４）：３２（５）：１７９２）。これらのアルゴリズムは、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（ＥＢＩ）ウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓで利用可能である。かかるアルゴリズムがユーザ定義パラメータを有する場合、デフォルトパラメータを用いる必要がある。
【００７６】
本明細書に開示される通りの本発明の様々な特徴および好ましい実施形態は一緒に組み合わせられることは理解されている。
【００７７】
本願全体を通して、様々な参考文献が引用される。これらの参考文献の開示は、ここで本開示中に参照により援用される。
【００７８】
本発明は、以下の実施例によりさらに例示されることになる。しかし、本発明が特許請求の範囲により定義され、またこれらの実施例があくまで本発明の例示を目的として与えられ、決してそれを限定しないことは理解されるべきである。
【実施例】
【００７９】
実施例１：
中南米の９〜１６歳の健常小児および青年における四価ＣＹＤワクチンの試験
方法
試験の設計および参加者
ウイルス学的に確認されたデング病に対する（ＣＹＤ１、ＣＹＤ２、ＣＹＤ３およびＣＹＤ４株を含む）四価ＣＹＤワクチンの無作為化、観察者盲検、プラセボ対照、多施設第ＩＩＩ相有効性試験を実施した。試験は、以下のデング流行国、すなわち、ブラジル、コロンビア、ホンジュラス、メキシコ、およびプエルトリコにおける施設で実施した。
【００８０】
病歴および身体検査に基づいて良好な健康状態にある９〜１６歳の被験者２０，８７５名を試験に登録した。試験の実行もしくは完了に干渉する可能性がある慢性疾患、先天性もしくは後天性免疫不全を有する被験者、および免疫抑制治療または試験の実行もしくは完了に干渉する可能性がある他の禁止された治療もしくはワクチンを受けている被験者を除外した。
【００８１】
参加者を、０、６および１２か月後に３回の用量のＣＹＤワクチンまたは対照製品を受けるように２：１に無作為に割り当てた。したがって、被験者１３，９１７名がＣＹＤワクチン、また６，９５８名がＮａＣｌプラセボを受けた。免疫原性、およびベースラインのデング抗体レベルについての国特有のデータの生成を可能にするため、各国からの被験者のサブセットの免疫原性についても評価した。免疫原性サブセットは、全部で被験者１９４４名（ＣＹＤワクチン群での１，３０１名および対照群での６４３名）を含んだ。
【００８２】
製品
キメラウイルスの各々を、国際公開第０３／１０１３９７号パンフレット、Ｇｕｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｈｕｍ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ（２０１０）６（９）：６９６；Ｇｕｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｖａｃｃｉｎｅ（２０１０）２８：６３２；Ｇｕｉｒａｋｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２０００）７４：５４７７；Ｇｕｉｒａｋｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２００１）７５（１６）：７２９０；Ｇｕｉｒａｋｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｖｉｒｏｌ．（Ｊｕｎｅ  ２０，２００２）２９８：１４６；およびＧｕｉｒａｋｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２００４）７８（９）：４７６１に記載のように、ベロ細胞上で生成し、培養した。
【００８３】
ワクチンは、注射用に０．５ｍＬの溶媒（０．４％ＮａＣｌ）で再構成した凍結乾燥粉末（２℃〜８℃の間の温度で予め貯蔵）として提供した。再構成として、０．５ｍＬの用量の各ワクチンは、５±１ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０の各弱毒生キメラデング熱血清型１、２、３、４ウイルスおよび賦形剤（必須アミノ酸、非必須アミノ酸、Ｌ−アルギニンクロルヒドレート（Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｃｈｌｏｒｈｙｄｒａｔｅ）、サッカロース、無水Ｄ−トレハロース、ソルビトール、トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタンおよび尿素）を含有した。対照製品は、０．９％ＮａＣｌ生理食塩水プラセボであった。すべての製品は、上腕の三角筋領域に皮下注射した。
【００８４】
評価
重症度と無関係に症候性デング熱を予防する場合のＣＹＤワクチンの有効性の評価を得るため、試験の活動期（３用量後の０日目〜１３か月目、すなわち２５か月間）におけるサーベイランスは、ウイルス学的に確認された症候性デング熱の検出を最大化するように設計した。３用量後１２か月のサーベイランスは、有効性の評価を可能にするのに十分な数のウイルス学的に確認されたデング熱症例の検出をもたらすことが想定された。３用量後の１３か月間の活動期の継続は、３用量後２８日目に開始するこの１２か月間に基づくものであった。活動期の後、試験は、より長期間におけるデング熱ワクチンの安全性に関する理解を得るように設計された４年の長期追跡調査（ＬＴＦＵ）期を含んだ。
【００８５】
全被験者が少なくとも５回の計画された訪問に参加した。免疫原性サブセットからの被験者は、７回の追加的訪問に参加した。全被験者が、初期には週毎に１回の接触という最小頻度で定期的に接触した（例えば、通話、ＳＭＳ、家庭への訪問、および学校ベースのサーベイランス）。
【００８６】
急性熱性疾患（すなわち少なくとも２連続日で体温≧３８℃）の場合でのデング熱症例を確認するため、２つの血液試料を採取した。これら２つのエピソード間の間隔が＞１４日である場合、２つの連続した熱性エピソードを別々のエピソードと考えた。急性熱性エピソードは、一旦温度が＜３８℃になると、終結していると考えた。
【００８７】
第１の血液試料は、疾患の急性期の間、できるだけ早く、発熱発症から５日以内に採取した。試験は、デングＩｇＭ／ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ（Ｆｏｃｕｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳ製キット「ＥＬ１５００Ｍ」）、デングＮＳ１  ＥＬＩＳＡ  Ａｇ（キット：Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｍａｒｎｅｓ−ｌａ−Ｃｏｑｕｅｔｔｅ，Ｆｒａｎｃｅ製「Ｐｌａｔｅｌｉａ（商標）Ｄｅｎｇｕｅ  ＮＳ１  Ａｇ」）、デングスクリーン（ＤＳ）ＲＴ−ＰＣＲ、デング熱血清型に特異的なＲＴ−ＰＣＲ（Ｆｏｃｕｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳ製Ｓｉｍｐｌｅｘａ（商標）Ｄｅｎｇｕｅ  ＲＴ−ＰＣＲ）、ヘマトクリット、血小板数、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）およびアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）を含んだ。デングスクリーン（ＤＳ）ＲＴ−ＰＣＲは、デング熱ウイルス中で保存される遺伝子配列からのプライマーを用いて実施される定量的逆転写ＰＣＲである。各実行中に含まれるウイルス標準に基づいて、結果は、ｌｏｇ１０プラーク形成単位（ＰＦＵ）／ｍＬの濃度で表すことができる。血清型同定のため、デング熱血清型に特異的なＲＴ−ＰＣＲを、すべてのＤＳ  ＲＴ−ＰＣＲ陽性またはデングＮＳ１  Ａｇ  ＥＬＩＳＡ陽性試料に対して用いた。
【００８８】
第２の血液試料は、回復期の間（すなわち急性期の試料採取後７〜１４日の間）に採取した。試験は、デング熱ＩｇＭ／ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ、ヘマトクリット、血小板数、ＡＳＴおよびＡＬＴを含んだ。
【００８９】
試料がＤＳ  ＲＴ−ＰＣＲについて陽性であり（すなわち、≧定量化の下限［ＬＬＯＱ］）、および／またはＮＳ１アッセイが陽性であり、および／またはＳｉｍｐｌｅｘａデングＲＴ−ＰＣＲアッセイが陽性である場合、これをウイルス学的に確認されたデング熱感染として分類した。
【００９０】
すべての重篤な有害事象（ＳＡＥ）に関する情報を、サーベイランス期間全体を通じて収集し、評価した。
【００９１】
デング中和抗体レベルを、ＣＹＤワクチン構築物の親デング熱ウイルス株を用いるプラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）により測定した。アッセイの定量限界は１０（１／ｄｉｌ）である。免疫原性エンドポイントのため、ＰＲＮＴアッセイデータを用いた。
【００９２】
統計学的分析
主目的は、９〜１６歳の子供および青年の登録時での４種の血清型のいずれかに起因するウイルス学的に確認された症候性デング熱症例を重症度と無関係に予防する場合の、ＣＹＤデング熱ワクチンの０、６および１２か月目での３回のワクチン接種後の有効性を評価することであった。パープロトコル（ＰＰ）集団は、プロトコルに従って３用量を受ける全参加者を含んだ。ＰＰ集団における確認されたデング熱症例は、３用量後２８日経て（すなわち１３か月目）から２５か月目まで生じる症例であった。
【００９３】
有効性分析は、治療企図（ＩＴＴ）集団における０日目から２５か月目にかけて（すなわち全活動期）の任意の時期に生じるウイルス学的に確認されたデング熱に対するワクチン有効性の評価を含んだ。ＩＴＴ集団は、少なくとも１用量を受けるすべての参加者を含んだ。
【００９４】
統計学的方法は、ＶＥの両側９５％信頼区間（ＣＩ）の使用に基づいた。ＣＩは、ＢｒｅｓｌｏｗおよびＤａｙによって記載された正確な方法を用いて算出した（Ｂｒｅｓｌｏｗ  ＮＥ，Ｄａｙ  ＮＥ．Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｖｏｌｕｍｅ  ＩＩ：Ｔｈｅ  ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｈｏｒｔ  ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｏｘｆｏｒｄ（ＵＫ）：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；１９８７）。ＣＹＤワクチンの有効性は、９５％ＣＩの下限が２５％を超える場合に有意であると考えた。ワクチン有効性は、症例（すなわちウイルス学的に確認されたデング熱の１つ以上のエピソードを有する参加者）の数および各群における罹患密度を算出するための累積リスク人−時間（ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ  ｐｅｒｓｏｎ−ｔｉｍｅ  ａｔ  ｒｉｓｋ）を考慮して評価した（Ｔｒａｎ  ＮＨ，Ｌｕｏｎｇ  ＣＱ，Ｖｕ  ＴＱＨ，ｅｔ  ａｌ．Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ，ｌｉｖｅ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ  ｄｅｎｇｕｅ  ｖａｃｃｉｎｅ（ＣＹＤ−ＴＤＶ）ｉｎ  ｈｅａｌｔｈｙ  Ｖｉｅｔｎａｍｅｓｅ  ａｄｕｌｔｓ  ａｎｄ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ．Ｊ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ｖａｃｃｉｎ  ２０１２；３：１−７）。
【００９５】
二次的目的として、ウイルス学的に確認された症例に対して、各デング熱血清型によりＶＥを評価した。
【００９６】
ＶＥ推定値をウイルス学的に確認されたデング熱症例における重症度（ＷＨＯ診断基準および臨床基準）により評価するため、類似の計算を行った。活動期の間に生じる各々または任意の血清型に起因するウイルス学的に確認された入院デング熱症例についても検討した。疑われるデング熱症例の血清学的特性は、ＩｇＧおよびＩｇＭ  ＥＬＩＳＡ結果に基づく。
【００９７】
安全性および免疫原性エンドポイントにおける分析は、９５％信頼区間（ＣＩ）を用いて記述する。免疫原性は、初回注射前と２回目および３回目注射から２８日後、ならびに３回目注射から１年後、各血清型（親株）における力価の幾何平均（ＧＭＴ）を用いて評価した。
【００９８】
結果
登録した被験者２０，８７５名のうちの９５．５％が全免疫計画を完了した。２年間の活性デング熱のサーベイランス中での中断率は４．５％であり、被験者の９．７％をＰＰ集団から除外した。ワクチン群および対照群は年齢および性別について同等であり、ベースラインでサンプリングした約８０％の被験者はデング熱に対する抗体について陽性であった。
【００９９】
有効性
試験中、ウイルス学的に確認されたデング熱の３９７のデング熱症例（３９７のエピソード）をＰＰ集団内で同定した（３回の投与を完了した）。これらのエピソードのすべてが、３用量後２８日経てから活動期の終結までに生じ、一次分析に含まれる。ワクチン群内では１７６の症例が１１７９３リスク人年の間に生じた一方、対照群内では２２１の症例が５８０９リスク人年の間に生じた。対応するワクチン有効性は６０．８％（９５％ＣＩ：５２．０−６８．０）であった。
【０１００】
活動期の間の（少なくとも１用量を受けた）ＩＴＴ群における全体的なワクチン有効性は６４．７％（９５％ＣＩ：５８．７−６９．８）であった。ＩＴＴ群においては、ワクチン群内では２７７の症例が２６８８３リスク人年の間に生じた一方、対照群内では３８５の症例が１３２０４リスク人年の間に生じた。それ故、ワクチン有効性はＩＴＴおよびＰＰ集団において一致していた。
【０１０１】
事後分析によると、血清型により有効性が異なることが示された。少なくとも１用量後の４種の血清型の各々に対する有効性（ＩＴＴ集団）は、５０．２％〜８０．９％の範囲内であった。３用量後の４種の血清型の各々に対する有効性（ＰＰ集団）は、範囲４２．３％〜７７．７％の範囲内であった。それ故、試験によると、任意の血清型に対する統計学的に有意な有効性（ＶＥ＝６０．８％）ならびに個別に各血清型に対する決定的な有効性（血清型２を含む）が示されている。
【０１０２】
ＰＰ群およびＩＴＴ群についてのこれらの知見は、下の表１および２に詳細に示す。
【０１０３】
【表１】
2017526689.tif 000002
【０１０４】
【表２】
2017526689.tif 000003
【０１０５】
重症デングに対するワクチン有効性および活動期の間のデングに起因する入院における低下
ウイルス学的に確認されたデング熱を有するＩＴＴ集団内の被験者では、任意の血清型に起因する重症デング熱症例に対する９５．５％のワクチン有効性が、対照群と比べると、ワクチン接種群で認められた。治験責任医師は、すべてのウイルス学的に確認されたデング熱症例における重症度についての以下の有望な診断基準、すなわち、１）ショック（小児または青年における脈圧≦２０ｍｍＨｇ、または頻脈、虚脈および灌流低下を伴う低血圧［≦９０ｍｍＨｇ］）；２）輸血を必要とする出血；３）脳症、すなわち意識不明または意識状態低下または単純な熱性痙攣もしくは局所神経徴候に起因しない痙攣（意識状態低下または意識不明は、グラスゴーコーマスケール（ＧＣＳ）スコアによって支持される必要がある）；４）肝臓障害（ＡＳＴ＞１０００Ｕ／Ｌまたはプロトロンビン時間［ＰＴ］国際標準化比［ＩＮＲ］＞１．５）；５）腎機能障害（血清クレアチン≧１．５ｍｇ／ｄＬ）；６）胸部Ｘ線（ＣＸＲ）、心エコー、心電図（ＥＣＧ）または心筋酵素（これらが利用可能な場合）によって支持される心筋炎、心膜炎または臨床的心不全、を検討した。６つの診断基準のうちの少なくとも１つの出現は、重症デング熱の診断をもたらすのに十分であった。さらに、任意の既存の慢性共存症、例えば、制御されないてんかん、慢性肝疾患、既存の心疾患もしくは急性共存症、例えば急性肝炎を同定し、記録するため、あらゆる努力がなされた。すべてのデング熱症例は、デング病との関連での重度という用語の一貫性のある適用を保証するため、独立データモニタリング委員会（Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｄａｔａ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（ＩＤＭＣ）によってレビューされた。
【０１０６】
任意の血清型に関して、また個別での各血清型に関しての重症デング熱（ＩＤＭＣ定義）に対するワクチン有効性の結果（特に血清型２によって引き起こされる重症デング熱に関しての有効性を示す）を下の表３に提示する。
【０１０７】
【表３】
2017526689.tif 000004
【０１０８】
ウイルス学的に確認されたデング熱を有するＩＴＴ集団内の被験者では、任意の血清型に起因する入院の発生率における統計学的に有意な低下が、対照群と比べると、ワクチン接種群で認められた。この決定的な低下はまた、血清型２を含む各血清型に対して個別に認められた。少なくとも１用量後のすべてのデング熱症例に関しての相対リスク（ＲＲ）は０．１９７であった（表４参照）。
【０１０９】
【表４】
2017526689.tif 000005
【０１１０】
活動期の間の年齢群による有効性の推定値
活動期の間、ＩＴＴ集団内の９〜１１歳群におけるワクチン有効性は６１．７％であった（９５％ＣＩ：５２．３−６９．３）。１５０の症例および１５１のエピソードがワクチン群における１２１７２リスク人年の間に生じた一方、１９２の症例および１９５のエピソードが対照群における５９６７リスク人年の間に生じた。
【０１１１】
活動期の間、ＩＴＴ集団内の１２〜１６歳群におけるワクチン有効性は６７．６％であった（９５％ＣＩ：５９．３−７４．３）。１２７の症例および１２９のエピソードがワクチン群における１４７１１リスク人年の間に生じた一方、１９３の症例およびエピソードが対照群における７２３７リスク人年の間に生じた。１国当たりのワクチン有効性を以下の表に示す。
【０１１２】
【表５】
2017526689.tif 000006
【０１１３】
免疫原性
１用量前の免疫原性サブセットにおけるデング熱血清型１〜４に対する中和抗体の幾何平均力価（ＧＭＴ）は、ワクチン群において各々、１２８（９５％ＣＩ：１１２−１４５）、１３８（１２３−１５６）、１２１（１０８−１３６）、および４３．６（３９．６−４８）である。対照群では、これらの値は各々、１１９（９８．７−１４２）、１１５（９７．２−１３６）、１１４（９５．９−１３６）、および３９（３３．９−４４．７）である。
【０１１４】
３回目注射後２８日目の免疫原性サブセットにおけるデング熱血清型１〜４に対する中和抗体の幾何平均力価（ＧＭＴ）は、ワクチン群において各々、３９５（９５％ＣＩ：３５３−４４１）、５７４（５２８−６２４）、５０８（４６５−５５５）、および２４１（２２６−２５８）である。対照群では、これらの値は、１２１（１０１−１４５）、１２９（１０９；１５２）、１２４（１０５；１４７）、および４４．３（３８．６；５０．８）である。
【０１１５】
安全性
活動期における全被験者（ワクチン群での１３１９５名および対照群での６９３９名）から、４．１％（９５％ＣＩ：３．７；４．４）の重篤な有害事象（ＳＡＥ）がワクチン群中で報じられ、また４．４％（４．０；４．９）のＳＡＥが対照群で報じられた。ワクチンに関連したＳＡＥまたは関連死はなく、また重症デング熱の増加はなかった。活動期のＳＡＥのレビューから、安全性への懸念は生じなかった。
【０１１６】
【表６】
2017526689.tif 000007
【０１１７】
考察
この試験からの主な知見は、デング熱ウイルスの４種全部の血清型に対する安全で有効なワクチンが見込まれることであった。試験によると、ＩＴＴおよびＰＰ集団の双方（活動期）において、任意の血清型に対する統計学的に有意なワクチン有効性が示されるとともに、各血清型に対する決定的な有効性が示された。さらに、ワクチン有効性は、ＩＴＴおよびＰＰ集団において一致した。
【０１１８】
したがって、この試験によると、血清型２に対する、特に血清型２により特異的に引き起こされる重症デング熱に対する決定的なワクチン有効性が初めて示されている。これらの結果は、血清型２に対するＣＹＤワクチンの有効性に関して不確定であった先行的な臨床試験を踏まえて評価する必要がある。
【０１１９】
ウイルス学的に確認されたデング熱を有する被験者では、デング熱に起因する入院における統計学的に有意な低下が対照群と比べるとワクチン接種群で認められることも示された。この低下は、任意の血清型に関して、またさらに血清型２を含む各血清型に対して個別に認められた（表４を参照）。
【０１２０】
試験によると、ベースラインでの少なくとも１つの血清型に対してデング血清陽性である（すなわちデング熱に免疫性のある）患者においてワクチン有効性が高まる方向への傾向が認められること（表６を参照）や、ワクチン有効性が国別に異なること（表５を参照）も示された。国による変動は特に、各国における集団の基礎的なデング熱血清陽性状態および／または各国における１つもしくは複数の循環系統の血清型に起因し得る。
【０１２１】
図２から分かるように、ワクチン有効性の漸減の証拠は、３用量後の１２か月間にわたり全く見られなかった。（任意の血清型に対する）全体的なワクチン有効性は実線で示す。
【０１２２】
ワクチンの安全性特性は良好であり、またワクチン関連ＳＡＥおよび安全性シグナルは、ＡＥおよびＳＡＥのレビューの間、全く同定されなかった。２年にわたっての突発感染における疾患の増加は全く認められなかった。
【０１２３】
結論として、本試験は、デング熱ワクチン開発における主要な節目を表す。
【０１２４】
実施例２：
アジアでの２〜１４歳の健常小児における四価ＣＹＤワクチンの試験
方法
２〜１４歳の小児１０，２７５名におけるアジア太平洋地域内の５か国で多施設、無作為化、観察者盲検、プラセボ対照第ＩＩＩ相試験を実施した。試験設計は、投与されるワクチン（ＣＹＤ１〜４）、用量および投与計画ならびに有効性および免疫原性分析がすべて同じである点で、実施例１に記載の中南米での試験に酷似した。その試験の完全な詳細は、Ｃａｐｅｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（ｗｗｗ．ｔｈｅｌａｎｃｅｔ．ｃｏｍ；ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／Ｓ０１４０−６７３６（１４）６１０６０−６にオンラインで公表された）に提供される。
【０１２５】
ベースラインでデング熱に免疫性がある、試験の免疫原性サブセットにおける被験者を、彼らのデング熱への免疫性が単一型または多型のいずれかを判定するため、さらに分析した（単一型：１つのＤＥＮＶまたは１つの血清型（他の３つと比べて少なくとも６倍高い応答を有する）に対してＡｂ＞＝１０；多型：少なくとも２つの血清型＞＝１０であり、陽性血清型間での６倍未満の差異）。
【０１２６】
結果
探索的な事後分析では、（免疫原性サブセットにおける）ワクチン有効性に対するデング熱のベースライン状態（デングナイーブ、単一型のデング熱に免疫性がある、または多型デング熱に免疫性がある）の効果を、各亜群でのウイルス学的に確認されたデング熱の相対リスク（ＲＲ）を決定することにより検討した。結果を下表に示す。
【０１２７】
【表７】
2017526689.tif 000008
【０１２８】
考察
表７中のデータは、デング熱ナイーブ被験者と比べて単一型のデング熱に免疫性のある被験者において、ひいては単一型のデング熱に免疫性のある被験者に対して多型デング熱に免疫性のある被験者において、より高いワクチン有効性への傾向が認められることを示す。
【０１２９】
実施例３：
実施例１および２で報じられる臨床試験からのデータの総合分析
以下の実施例では、統計学的な分析能力を高め、また四価ＣＹＤワクチンの有効性のよりグローバルな概念を提示するため、実施例１および２に記載の中南米およびアジアでの第ＩＩＩ相臨床試験からの特定のデータを組み合わせている。
【０１３０】
各々の試験における、また両方の試験を通じてプールされた、任意の血清型に関して、また各血清型に関して（任意の重症度の）ウイルス学的に確認されたデング熱に対する３用量後のワクチン有効性（ＰＰ集団）を下表に示す。
【０１３１】
【表８】
2017526689.tif 000009
【０１３２】
各々の試験における、また両方の試験を通じてプールされた、任意の血清型に関して、また各血清型に関して（任意の重症度の）ウイルス学的に確認されたデング熱に対するワクチン有効性（ＩＴＴ集団、活動期）を下表に示す。
【０１３３】
【表９】
2017526689.tif 000010
【０１３４】
活動期の間の重症デング（ＩＤＭＣ定義）、ＤＨＦおよび入院デング熱症例に対するワクチン有効性（任意の血清型）についての類似のプール分析を下表に示す。データは、少なくとも１用量を受けた集団（すなわちＩＴＴ集団）に関して示す。ＰＰ集団に関してのデータは一致した。
【０１３５】
【表１０】
2017526689.tif 000011
【０１３６】
両方の臨床試験からのプールデータに基づく血清型ごとの重症デング熱に対するワクチン有効性（ＩＤＭＣ定義）を、両方の試験からの症例の数を加算して、ワクチン群および対照群における数を比較することにより評価した（この計算では２対１の無作為化および試験プロトコルへの良好な遵守を仮定する）。データを下表に示す。
【０１３７】
【表１１】
2017526689.tif 000012
【０１３８】
両方の臨床試験からのプールデータに基づく血清型ごとの入院デングに対するワクチン有効性（活動期、ＩＴＴ分析）を下表に示す。
【０１３９】
【表１２】
2017526689.tif 000013
【０１４０】
ベースラインでの少なくとも９歳の全試験被験者および彼らのベースラインのデング血清状態の関数としての同年齢群での個体およびプールされた試験データセットにおける任意の血清型に起因するウイルス学的に確認された症候性デング熱に対するワクチン有効性（活動期、ＩＴＴ分析）を下表に示す。
【０１４１】
【表１３】
2017526689.tif 000014
【０１４２】
表１３から明らかなように、総合分析では、９５％信頼区間の下限が、≧９歳の血清陰性個体において０を上回った。
【０１４３】
個体≧９歳（この亜集団における全患者）でのプールされたワクチン有効性データのさらなる分析によると、以下、すなわち、血清型１に対する有効性が５８．４％（４７．７；６６．９）であり；血清型２に対する有効性が４７．１％（３１．３；５９．２）であり；血清型３に対する有効性が７３．６％（６４．４；８０．４）であり；血清型４に対する有効性が８３．２％（７６．２；８８．２）であり；入院デングに対する有効性が８０．８％（７０．１；８７．７）であり；重症（ＩＤＭＣ定義）デングに対する有効性が９３．２％（７７．３；９８．０）であり、かつＤＨＦに対する有効性が９２．９％（９６．１；９７．９）であることが示された。いずれの場合にも、括弧内の数字は９５％信頼区間を示し、データはＩＴＴ集団から取得する。
【０１４４】
治療企図分析セットでの個体およびプールされた試験データセットにおける、任意の血清型に起因するウイルス学的に確認された症候性デング熱の＞１のエピソードを有することについての相対リスク（ＲＲ）（活動期）を下表に示す。
【０１４５】
【表１４】
2017526689.tif 000015
【０１４６】
表１４中のデータは、任意の血清型に起因するウイルス学的に確認された症候性デング熱の＞１のエピソードを有するリスクがワクチン群でより低かった、すなわち試験の活動サーベイランス期の間での初期感染後、ワクチン群でのその後の感染のリスクが対照群と比べて低下した。
【０１４７】
実施例４：
長期追跡調査データ
任意の血清型に起因する任意の重症度のＶＣＤにおける入院の発生率を用いて安全性をさらに検討するため、実施例１および２に記載の試験は、４年継続の長期追跡調査（ＬＴＦＵ）期を有する。さらに、実施例１および２に記載の試験と同様に安全性をさらに検討するため、実施例１および２に記載のワクチンを含むさらなる試験（Ｓａｂｃｈａｒｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ，ｖ．３８０：１５５９−１５６７（２０１２）に記載の、実施例１および２に記載の試験の活動期と同様の設計を有する、タイでの４〜１１歳の参加者４，００２名を含む単一施設第ＩＩｂ相試験）における参加者もまた、４年のＬＴＦＵ期を有する。試験の各々では、ＬＴＦＵ期は活動期の直後に続く、すなわちＬＴＦＵ期の１年目はワクチンの１用量後２５か月目に開始する。
【０１４８】
ここで提示する長期追跡調査分析は、アジア太平洋５か国（実施例２）および中南米５か国（実施例１）で実施された第３相有効性試験の４年のＬＴＦＵ期の１年目ならびにタイでの第ＩＩｂ相試験の４年のＬＴＦＵ期の最初の２年に収集されたデータに基づく。試験のスポンサーは、ＬＴＦＵ期分析中での治療の割当に対して非盲検であった。しかし、長期追跡調査中の任意のバイアスを最小化するため、全参加者、彼らの親および現地スタッフは、盲検状態にする。
【０１４９】
ＬＴＦＵ期の間、全参加者は、毎年の訪問に参加し、訪問間に定期的な連絡をとる（電話、ＳＭＳもしくは家庭の訪問により、３か月ごとに≧１の連絡）。急性発熱のための入院は、試験の連絡および訪問の間や同定された非試験病院での自己報告およびサーベイランスにより記録し、急性の血液試料をデング熱感染のウイルス学的確認用に採取する。年齢は、初期登録時の年齢を指す。
【０１５０】
目的は、入院を必要とする任意の血清型に起因する任意の重症度のＶＣＤの発生率、ならびに、それら入院者の中での活動サーベイランス期の終結後４年間の重症デング熱（ＩＤＭＣの評価）およびＤＨＦ（ＷＨＯ１９９７の定義）の発生率を記述することであった。
【０１５１】
年間発生率および９５％ＣＩは、全参加者と登録時の＜９歳および≧９歳の参加者での各試験における、ＬＴＦＵ期の間に毎年発生する任意の血清型および各血清型に起因する入院ＶＣＤ症例（任意の重症度、重症（ＩＤＭＣ）、ＤＨＦ（ＷＨＯ））について算出した。ＲＲは、ワクチン群および対照群における年間発生率の比として算出した。そのデータを下表に示す。
【０１５２】
【表１５】
2017526689.tif 000016
【０１５３】
【表１６】
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【０１５４】
【表１７】
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【０１５５】
【表１８】
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【０１５６】
Ｍ：各年の初めに存在する参加者の数または検討された期間内に含まれる数年の間に追跡した参加者の数の平均。＊１人の参加者は、１年目および３年目に２つのエピソードを有した。＃長期追跡調査期の１年目に同定された各血清型（ＳＴ）の総数（ワクチン対対照−無作為化２：１）：第３相−アジア：ＳＴ１：１１対１；ＳＴ２：３対０；ＳＴ３：１３対７、ＳＴ４：０対５；第３相−中南米：ＳＴ１：５対５；ＳＴ２：８対１１；ＳＴ３：３対０、ＳＴ４：０対０；第２ｂ相−１年目：ＳＴ１：５対５；ＳＴ２：１７対４；ＳＴ３：１対１、ＳＴ４：０対０；第２ｂ相−２年目、ＳＴ１：４対３；ＳＴ２：４対６；ＳＴ３：６対３、ＳＴ４：２対４。
【０１５７】
３つ全部の試験にわたるＬＴＦＵの１年目におけるプールされたＲＲは０．８４（９５％ＣＩ：０．５６；１．２４）であった。大部分の症例が血清型１または血清型２であり；血清型４は最小頻度であった。アジアでの第３相試験では、予め規定された年齢群による分析によると、若年小児でのこのアウトカムにてより高いＲＲへの明確な傾向が示されたが、症例の数は少なかった（２〜５歳の被験者：ＲＲ＝７．４５、９５％ＣＩ：１．１５；３１３．８０）。この観察により、追跡調査の１年目に４〜５歳の被験者において２．４４のＲＲ（９５％ＣＩ：０．２７；１１５．３４）を示すタイでの第２ｂ相試験において年齢に特異的な分析が得られた。タイでの第２ｂ相試験におけるＬＴＦＵの２年目では、ＲＲは４〜５歳の被験者において０．８１であったが、９５％ＣＩの上限は＞１を維持した（９５％ＣＩ：０．１６；５．２４）。９〜１６歳の参加者を登録した中南米での第３相試験におけるさらなる分析によると、９〜１１歳と１２〜１６歳の被験者における年齢群の間で傾向は全く示されなかった。若年群およびＣＹＤ１５における観察により、３つすべての試験における＜９歳および≧９歳の２つの亜群に対する臨時分析がもたらされた。
【０１５８】
２つのアジアでの試験におけるＬＴＦＵの１年目では、＜９歳の参加者におけるＲＲは、１．５８のプールされたＲＲ推定値（９５％ＣＩ：０．８３；３．０２）と類似し、これはワクチン群におけるリスク増加への全体的傾向を示唆しているが、９５％ＣＩの下限は＜１であった。≧９歳の被験者におけるＲＲは、アジアでの第３相試験では０．５７（９５％ＣＩ：０．１８；１．８６）であり、タイでの第２ｂ相試験では０．３１（９５％ＣＩ：０．０５；１．５８）であり、これは全参加者が≧９歳である中南米での第３相試験における場合（ＲＲ＝０．５３，９５％ＣＩ：０．２５；１．１６）と類似していた。アジアでの第３相試験では、探索分析によると、ＲＲが、１２〜１４歳の被験者での０．２５（９５％ＣＩ：０．０２；１．７４）に対して、９〜１１歳の被験者では１．０１（９５％ＣＩ：０．２２；６．２３）であることが示された。この傾向は、ＣＹＤ１５およびＣＹＤ５７では認められなかった。３つすべての試験を通じての≧９歳の参加者におけるプールされたＲＲは、０．５０（９５％ＣＩ：０．２９；０．８６）であった。
【０１５９】
タイでの第２ｂ相試験におけるＬＴＦＵの２年目では、≧９歳の参加者におけるＲＲ（０．３１，９５％ＣＩ：０．０９；０．９３）は、１年目（０．３１，９５％ＣＩ：０．０５；１．５８）と類似した一方、（ＬＴＦＵの２年目での）＜９歳の参加者におけるＲＲは低下していた（０．５４，９５％ＣＩ：０．２３；１．２９）。
【０１６０】
ＩＤＭＣは、アジアおよび中南米での第３相試験のＬＴＦＵの１年目において、各々、１２および８の入院ＶＣＤ症例を重症として分類した（ワクチン群および対照群において、各々、アジアでの試験では１１／２７および１／１３、ならびに中南米での試験では３／１６および５／１５）。アジアでの試験では、ワクチン群およびプラセボ群において、＜９歳の参加者では各々、８／１９および０／６の症例、それに対し、≧９歳の参加者では３／８および１／７が、ＩＤＭＣにより重症として分類された。３つのアジアでの試験におけるワクチン群での症例が、登録時、９〜１１歳の参加者中で発生した。すべての症例をグレードＩ／ＩＩのＤＨＦとして分類した。
【０１６１】
ＩＤＭＣは、タイでの第２ｂ相試験のＬＴＦＵの１年目に、専らワクチン群において、入院ＶＣＤの４／２２の症例を重症として分類した。ＩＤＭＣは、タイでの第２ｂ相試験のＬＴＦＵの２年目に、ワクチン群および対照群において、各々、１／１６および２／１７の症例を重症として分類した。すべての重症症例が、＜９歳の参加者において発生した。１年目でのワクチン群における２症例がグレードＩＩＩのＤＨＦとして分類され、いずれも臨床ショックを有する一方、それ以外はグレードＩ／ＩＩであった。
【０１６２】
入院の長さならびに発熱および臨床症状の持続期間は、３つすべての試験における活動サーベイランス期およびＬＴＦＵ期の間、入院者において類似した（データは示さず）。入院参加者によって呈される様々な徴候および症状の頻度における臨床的に重要な差異は、試験のいずれかにおける活動サーベイランス期およびＬＴＦＵ期の間、またはワクチン群および対照群の間、認められず、これはＬＴＦＵ中の入院症例の臨床像における変化がないことを示唆した。
【０１６３】
考察
アジアでの第３相試験におけるＬＴＦＵ期の１年目の間、入院ＶＣＤにおけるＲＲは、認められる症例数が少ないにもかかわらず、１．０に変化した。さらなる分析によると、この変化は、特に≦５歳の若年子供において、≧９歳の参加者の場合と比べてＲＲが高めであることに起因することが示された。３つの試験におけるＬＴＦＵの１年目の複合分析によると、ワクチン群での≧９歳の参加者において、対照群の場合と比べて入院ＶＣＤのリスクが低めであることが示された。しかし、タイでの第２ｂ相試験における１年目（１．０１，９５％ＣＩ：０．４７；２．３０）および２年目（０．４７，９５％ＣＩ：０．２２；１．００）でのＲＲの可変性は、ＣＹＤ１４およびＣＹＤ１５におけるＬＴＦＵの１年目からの結果が慎重に解釈されるべきであることを示唆している。
【０１６４】
【表１９】
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【０１６５】
上掲のヌクレオチド配列は、列挙されるデング熱ウイルスの正鎖ＲＮＡ（すなわち、対応するウイルス粒子中に見出されるヌクレオチド配列）を構成する。（対応するウイルスを操作し、発現させるために用いてもよいばかりか、本願の開示の一部を形成する）それに等価なＤＮＡ配列は、ヌクレオチドＵをヌクレオチドＴと置換することにより作製することができる。かかるＤＮＡ配列は、対応するデング熱ウイルスのｃＤＮＡ配列を構成する。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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