(57)【要約】本開示は、メタンまたは天然ガス等、Ｃ１基質を原料として利用する組換えＣ１代謝微生物から、脂肪アシル−ＣｏＡ、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、脂肪エステルワックス、アルカンおよびケトン等、極長炭素鎖化合物（Ｃ２４よりも長い）を生物学的に産生するための組成物および方法を提供する。ある特定の実施形態では、脂肪アシル−ＣｏＡレダクターゼをコードする組換え核酸分子を含有する非天然メタン資化性菌であって、Ｃ１基質を極長鎖脂肪アルデヒドに変換することができるメタン資化性菌が提供される。
2017515480.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
極長炭素鎖化合物を作製するための方法であって、
（ａ）非天然Ｃ１代謝非光合成微生物をＣ１基質原料と共に培養するステップであって、該Ｃ１代謝非光合成微生物が、次の酵素：
（ｉ）β−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ（ＫＣＳ）、
（ｉｉ）β−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ（ＫＣＲ）、
（ｉｉｉ）β−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＨＣＤ）および
（ｉｖ）エノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣＲ）
をコードする１種または複数種の組換え核酸分子を含み、
該Ｃ１代謝非光合成微生物が該Ｃ１基質を極長炭素鎖化合物に変換する、ステップと、
（ｂ）該極長炭素鎖化合物を回収するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記極長炭素鎖化合物が、極長鎖脂肪アシル−ＣｏＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｃ１代謝非光合成微生物が、極長鎖脂肪アルコールを生成することができる脂肪アルコール生成アシル−ＣｏＡレダクターゼ（ＦＡＲ）をコードする核酸分子をさらに含み、前記極長炭素鎖化合物が、極長鎖脂肪一級アルコールである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｃ１代謝非光合成微生物が、極長鎖脂肪アルデヒドを生成することができる脂肪アシル−ＣｏＡレダクターゼと、極長鎖脂肪アルコールを生成することができるアルデヒドレダクターゼとをコードする核酸分子をさらに含み、前記極長炭素鎖化合物が、極長鎖脂肪一級アルコールである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｃ１代謝非光合成微生物が、極長鎖脂肪アルデヒドを生成することができる脂肪アシル−ＣｏＡレダクターゼをコードする核酸分子（複数可）をさらに含み、前記極長炭素鎖化合物が、極長鎖脂肪アルデヒドである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｃ１代謝非光合成微生物が、極長鎖脂肪アルデヒドを生成することができる脂肪アシル−ＣｏＡレダクターゼと、極長鎖アルカンを生成することができるアルデヒドデカルボニラーゼとをコードする核酸分子（複数可）を含み、前記極長炭素鎖化合物が、極長鎖アルカンである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｃ１代謝非光合成微生物（ｍｉｃｒｏｏｇａｎｉｓｍ）が、極長鎖脂肪アルデヒドを生成することができる脂肪アシル−ＣｏＡレダクターゼと、極長鎖アルカンを生成することができるアルデヒドデカルボニラーゼと、極長鎖脂肪二級アルコールを生成することができるアルカンヒドロキシラーゼと、極長鎖ケトンを生成することができるアルコールデヒドロゲナーゼとをコードする核酸分子（複数可）を含み、前記極長炭素鎖化合物が、極長鎖ケトンである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｃ１代謝非光合成微生物が、極長鎖脂肪アルコールを生成することができる脂肪アルコール生成アシル−ＣｏＡレダクターゼと、極長鎖脂肪エステルワックスを生成することができるエステルシンターゼとをコードする核酸分子（複数可）を含み、前記極長炭素鎖化合物が、極長鎖脂肪エステルワックスである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＫＣＳが、ＣＥＲ６、Ｅｌｏ１、Ｆｅｎ１／Ｅｌｏ２、Ｓｕｒ４／Ｅｌｏ３、ＫＣＳ１またはＦＤＨである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＫＣＲが、Ｙｂｒ１５９ｗ、ＡＹＲ１、ＧＬ８Ａ、ＧＬ８ＢまたはＡｔ１ｇ６７７３０である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＨＣＤが、ＰＨＳ１、ＰＡＳ２またはＰＡＳ２−１である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＥＣＲが、ＣＥＲ１０またはＴＳＣ１３である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記脂肪アルコール生成アシル−ＣｏＡレダクターゼが、ＦＡＲ、ＣＥＲ４またはＭａｑｕ＿２２２０である、請求項３に記載の方法。
【請求項１４】
前記脂肪アシル−ＣｏＡレダクターゼが、ＡＣＲ１またはＣＥＲ３である、請求項５または６に記載の方法。
【請求項１５】
前記アルデヒドレダクターゼが、アルコールデヒドロゲナーゼであり、該アルコールデヒドロゲナーゼが、ＹｑｈＤである、請求項４に記載の方法。
【請求項１６】
前記エステルシンターゼが、ＷＳＤ１である、請求項８に記載の方法。
【請求項１７】
前記アルデヒドデカルボニラーゼが、ＣＥＲ１またはＣＥＲ２２である、請求項６に記載の方法。
【請求項１８】
前記アルカンヒドロキシラーゼが、ＭＡＨ１である、請求項７に記載の方法。
【請求項１９】
前記アルコールデヒドロゲナーゼが、ＭＡＨ１である、請求項７に記載の方法。
【請求項２０】
前記Ｃ１代謝非光合成微生物が、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｏｎａｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、ＲｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓからなる群から選択される、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記Ｃ１代謝非光合成微生物が、細菌である、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記Ｃ１代謝細菌が、メタン資化性菌またはメチロトローフである、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記Ｃ１代謝細菌が、メタン資化性菌である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記メタン資化性菌が、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｏｎａｓまたはこれらのいずれかの組合せである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記メタン資化性菌が、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．１６ａ（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ２４０２）、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９６）、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｓｐｏｒｉｕｍ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９７）、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ  ｐａｒｖｕｓ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９８）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｍｅｔｈａｎｉｃａ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９９）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ａｌｂｕｓ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，２００）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，２０１）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｏｒｇａｎｏｐｈｉｌｕｍ（ＡＴＣＣ  ２７，８８６）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＡＪ−３６７０（ＦＥＲＭ  Ｐ−２４００）、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ  ｓｉｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ  ｉｎｆｅｒｎｏｒｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｉｂｉｕｍ  ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍまたはこれらのいずれかの組合せである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記メタン資化性菌が、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．１６ａ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｍまたはこれらの高成長バリアントである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記培養物が、異種細菌をさらに含む、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記Ｃ１代謝細菌が、メチロトローフである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
前記メチロトローフが、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｏｐｕｌｉ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｏｄｕｌａｎｓまたはこれらのいずれかの組合せである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記Ｃ１代謝細菌が、天然ガス、非従来型天然ガスまたはシンガス代謝細菌である、請求項２１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記シンガス代謝細菌が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ、Ａｃｅｔｏｇｅｎｉｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｃｅｔｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｅｔｅｒｉｕｍ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓまたはこれらのいずれかの組合せである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記シンガス代謝細菌が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｙｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｎｅｏｐｒｏｐａｎｏｌｏｇｅｎまたはこれらの組合せである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記Ｃ１代謝非光合成微生物が、偏性Ｃ１代謝非光合成微生物である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
チオエステラーゼをコードする組換え核酸分子をさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記チオエステラーゼが、シグナルペプチドを欠くｔｅｓＡ、ＵｃＦａｔＢまたはＢＴＥである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
内因性チオエステラーゼ活性が、無変更の内因性チオエステラーゼ活性と比較して低下される、最小であるまたは消失される、請求項３４または請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
アシル−ＣｏＡシンテターゼをコードする組換え核酸分子をさらに含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
前記アシル−ＣｏＡシンテターゼが、ＦａｄＤ、ｙｎｇ１またはＦＡＡ２である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
内因性アシル−ＣｏＡシンテターゼ活性が、無変更の内因性アシル−ＣｏＡシンテターゼ活性と比較して低下される、最小であるまたは消失される、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記Ｃ１代謝非光合成微生物が、１種または複数種のＣ２５〜Ｃ３０、Ｃ３１〜Ｃ４０、Ｃ４１〜Ｃ６０、Ｃ６１〜Ｃ８０、Ｃ８１〜Ｃ１００、Ｃ１０１〜Ｃ１２０、Ｃ１２１〜Ｃ１４０、Ｃ１４１〜Ｃ１６０、Ｃ１６１〜Ｃ１８０またはＣ１８１〜Ｃ２００鎖化合物を含む極長炭素鎖化合物を産生する、請求項１〜３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
前記Ｃ１代謝非光合成微生物が、Ｃ２５〜Ｃ５０鎖化合物を含む極長炭素鎖化合物を産生する、請求項１〜３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
前記Ｃ１代謝非光合成微生物が、Ｃ２５〜Ｃ５０脂肪アルコールを含む脂肪アルコールを産生し、該Ｃ２５〜Ｃ５０脂肪アルコールが、総脂肪アルコールの少なくとも７０％を構成する、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記Ｃ１代謝非光合成微生物が、メタンを含む天然ガス、非従来型天然ガスまたはシンガスを、極長鎖アシル−ＣｏＡ、極長鎖脂肪アルデヒド、極長鎖脂肪アルコール、極長鎖脂肪エステルワックス、極長鎖アルカン、極長鎖ケトンまたはこれらのいずれかの組合せに変換することができる、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
極長鎖アシル−ＣｏＡ、極長鎖脂肪アルデヒド、極長鎖脂肪アルコール、極長鎖脂肪エステルワックス、極長鎖アルカン、極長鎖ケトンまたはこれらのいずれかの組合せの産生される量が、約１ｍｇ／Ｌ〜約５００ｇ／Ｌの範囲である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記Ｃ１基質が、メタン、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸もしくはその塩、一酸化炭素、二酸化炭素、メチルアミン、メチルチオールまたはメチルハロゲンである、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記Ｃ１基質が、メタン、天然ガス、非従来型天然ガスまたはシンガスである、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記Ｃ１代謝非光合成微生物が、メタン資化性菌細菌であり、前記Ｃ１基質が、メタンであり、前記細菌が、好気性条件下で培養される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
制御された培養ユニットにおいてＣ１代謝非光合成微生物を培養するステップをさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記Ｃ１基質が、メタン、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸もしくはその塩、一酸化炭素、二酸化炭素、天然ガス、非従来型天然ガス、シンガス、メチルアミン、メチルチオールまたはメチルハロゲンである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記制御された培養ユニットが、発酵槽またはバイオリアクターである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
次の酵素：
（ｉ）β−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ（ＫＣＳ）、
（ｉｉ）β−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ（ＫＣＲ）、
（ｉｉｉ）β−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＨＣＤ）および
（ｉｖ）エノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣＲ）
をコードする１種または複数種の組換え核酸分子を含む非天然メタン資化性菌であって、Ｃ１基質を、極長鎖脂肪アシル−ＣｏＡ、極長鎖脂肪アルデヒド、極長鎖脂肪一級アルコール、極長鎖脂肪エステルワックス、極長鎖アルカン、極長鎖脂肪二級アルコール、極長鎖ケトンまたはこれらのいずれかの組合せから選択される極長炭素鎖化合物に変換することができる非天然メタン資化性菌。
【請求項５２】
前記ＫＣＳが、ＣＥＲ６、Ｅｌｏ１、Ｆｅｎ１／Ｅｌｏ２、Ｓｕｒ４／Ｅｌｏ３、ＫＣＳ１またはＦＤＨである、請求項５１に記載の非天然メタン資化性菌。
【請求項５３】
前記非天然メタン資化性菌が、少なくとも２種の異なるＫＣＳ酵素をコードする組換え核酸分子を含む、請求項５１または５２に記載の非天然メタン資化性菌。
【請求項５４】
前記ＫＣＲが、Ｙｂｒ１５９ｗ、ＡＹＲ１、ＧＬ８Ａ、ＧＬ８ＢまたはＡｔ１ｇ６７７３０である、請求項５１〜５３のいずれか一項に記載の非天然メタン資化性菌。
【請求項５５】
前記ＨＣＤが、ＰＨＳ１、ＰＡＳ２またはＰＡＳ２−１である、請求項５１〜５４のいずれか一項に記載の非天然メタン資化性菌。
【請求項５６】
前記ＥＣＲが、ＣＥＲ１０またはＴＳＣ１３である、請求項５１〜５５のいずれか一項に記載の非天然メタン資化性菌。
【請求項５７】
極長鎖脂肪アルコールを生成することができる脂肪アルコール生成アシル−ＣｏＡレダクターゼをコードする組換え核酸分子をさらに含む、請求項５１〜５６のいずれか一項に記載の非天然メタン資化性菌。
【請求項５８】
前記脂肪アルコール生成アシル−ＣｏＡレダクターゼが、ＦＡＲ、ＣＥＲ４またはＭａｑｕ＿２２２０である、請求項５７に記載の非天然メタン資化性菌。
【請求項５９】
極長鎖脂肪アルデヒドを生成することができる脂肪アシル−ＣｏＡレダクターゼと、極長鎖脂肪アルコールを生成することができるアルデヒドレダクターゼとをコードする組換え核酸分子をさらに含む、請求項５１〜５６のいずれか一項に記載の非天然メタン資化性菌。
【請求項６０】
前記脂肪アシル−ＣｏＡレダクターゼが、ＡＣＲ１またはＣＥＲ３である、請求項５９に記載の非天然メタン資化性菌。
【請求項６１】
前記アルデヒドレダクターゼが、ＹｑｈＤである、請求項５９または６０に記載の非天然メタン資化性菌。
【請求項６２】
極長鎖脂肪アルコールを生成することができる脂肪アルコール生成アシル−ＣｏＡレダクターゼと、極長鎖脂肪エステルワックスを生成することができるエステルシンターゼとをコードする組換え核酸分子をさらに含む、請求項５１〜５６のいずれか一項に記載の非天然メタン資化性菌。
【請求項６３】
前記脂肪アルコール生成アシル−ＣｏＡレダクターゼが、ＦＡＲ、ＣＥＲ４またはＭａｑｕ＿２２２０である、請求項６２に記載の非天然メタン資化性菌。
【請求項６４】
前記エステルシンターゼが、ＷＳＤ１である、請求項６２または６３に記載の非天然メタン資化性菌。
【請求項６５】
極長鎖脂肪アルデヒドを生成することができる脂肪アシル−ＣｏＡレダクターゼと、極長鎖アルカンを生成することができるアルデヒドデカルボニラーゼとをコードする組換え核酸分子をさらに含む、請求項５１〜５６のいずれか一項に記載の非天然メタン資化性菌。
【請求項６６】
前記脂肪アシル−ＣｏＡレダクターゼが、ＡＣＲ１またはＣＥＲ３である、請求項６５に記載の非天然メタン資化性菌。
【請求項６７】
前記アルデヒドデカルボニラーゼが、ＣＥＲ１またはＣＥＲ２２である、請求項６５または６６に記載の非天然メタン資化性菌。
【請求項６８】
極長鎖脂肪アルデヒドを生成することができる脂肪アシル−ＣｏＡレダクターゼと、極長鎖アルカンを生成することができるアルデヒドデカルボニラーゼと、極長鎖脂肪二級アルコールを生成することができるアルカンヒドロキシラーゼと、極長鎖ケトンを生成することができるアルコールデヒドロゲナーゼとをコードする核酸分子をさらに含む、請求項５２〜５７のいずれか一項に記載の非天然メタン資化性菌。
【請求項６９】
前記脂肪アシル−ＣｏＡレダクターゼが、ＡＣＲ１またはＣＥＲ３である、請求項６８に記載の非天然メタン資化性菌。
【請求項７０】
前記アルデヒドデカルボニラーゼが、ＣＥＲ１またはＣＥＲ２２である、請求項６８または６９に記載の非天然メタン資化性菌。
【請求項７１】
前記アルカンヒドロキシラーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼが、ＭＡＨ１である、請求項６８〜７０のいずれか一項に記載の非天然メタン資化性菌。
【請求項７２】
チオエステラーゼをコードする組換え核酸分子をさらに含む、請求項５１〜７１のいずれか一項に記載の非天然メタン資化性菌。
【請求項７３】
前記チオエステラーゼが、リーダー配列を欠くｔｅｓＡ、ＵｃＦａｔＢまたはＢＴＥである、請求項７２に記載の非天然メタン資化性菌。
【請求項７４】
内因性チオエステラーゼ活性が、無変更の内因性チオエステラーゼ活性と比較して低下される、最小であるまたは消失される、請求項７２または７３に記載の非天然メタン資化性菌。
【請求項７５】
アシル−ＣｏＡシンテターゼをコードする組換え核酸分子をさらに含む、請求項５１〜７４のいずれか一項に記載の非天然メタン資化性菌。
【請求項７６】
前記アシル−ＣｏＡシンテターゼが、ＦａｄＤ、ｙｎｇ１またはＦＡＡ２である、請求項７５に記載の非天然メタン資化性菌。
【請求項７７】
内因性アシル−ＣｏＡシンテターゼ活性が、無変更の内因性アシル−ＣｏＡシンテターゼ活性と比較して低下される、最小であるまたは消失される、請求項７５または７６に記載の非天然メタン資化性菌。
【請求項７８】
前記メタン資化性菌が、１種または複数種のＣ２５〜Ｃ３０、Ｃ３１〜Ｃ４０、Ｃ４１〜Ｃ６０、Ｃ６１〜Ｃ８０、Ｃ８１〜Ｃ１００、Ｃ１０１〜Ｃ１２０、Ｃ１２１〜Ｃ１４０、Ｃ１４１〜Ｃ１６０、Ｃ１６１〜Ｃ１８０またはＣ１８１〜Ｃ２００鎖化合物を含む極長炭素鎖化合物を産生する、請求項５１〜７７のいずれか一項に記載の非天然メタン資化性菌。
【請求項７９】
前記メタン資化性菌が、Ｃ２５〜Ｃ５０鎖化合物を含む極長炭素鎖化合物を産生する、請求項５１〜７７のいずれか一項に記載の非天然メタン資化性菌。
【請求項８０】
前記メタン資化性菌が、Ｃ２５〜Ｃ５０脂肪ワックスエステルを含む脂肪ワックスエステルを産生し、該Ｃ２５〜Ｃ５０脂肪ワックスエステルが、総脂肪ワックスエステルの少なくとも７０％を構成する、請求項５１〜７７のいずれか一項に記載の非天然メタン資化性菌。
【請求項８１】
産生される極長鎖脂肪アシル−ＣｏＡ、極長鎖脂肪アルデヒド、極長鎖脂肪一級アルコール、極長鎖脂肪エステルワックス、極長鎖アルカン、極長鎖脂肪二級アルコール、極長鎖ケトンまたはこれらのいずれかの組合せの量が、約１ｍｇ／Ｌ〜約５００ｇ／Ｌの範囲である、請求項５１〜８０のいずれか一項に記載の非天然メタン資化性菌。
【請求項８２】
前記Ｃ１基質が、メタン、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸もしくはその塩、一酸化炭素、二酸化炭素、メチルアミン、メチルチオールまたはメチルハロゲンである、請求項５１〜８１のいずれか一項に記載の非天然メタン資化性菌。
【請求項８３】
前記Ｃ１基質が、メタン、天然ガスまたは非従来型天然ガスである、請求項５１〜８１のいずれか一項に記載の非天然メタン資化性菌。
【請求項８４】
前記メタン資化性菌が、メタンを含む天然ガス、非従来型天然ガスまたはシンガスを、Ｃ２５〜Ｃ５０極長鎖脂肪アルデヒド、極長鎖脂肪一級アルコール、極長鎖脂肪ワックスエステル、極長鎖アルカン、極長鎖脂肪二級アルコールまたは極長鎖ケトンに変換することができる、請求項８２に記載の非天然メタン資化性菌。
【請求項８５】
前記宿主メタン資化性菌が、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ株、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  １６ａ（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ２４０２）、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９６）、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｓｐｏｒｉｕｍ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９７）、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ  ｐａｒｖｕｓ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９８）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｍｅｔｈａｎｉｃａ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９９）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ａｌｂｕｓ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，２００）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，２０１）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｏｒｇａｎｏｐｈｉｌｕｍ（ＡＴＣＣ  ２７，８８６）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ  ＡＪ−３６７０（ＦＥＲＭ  Ｐ−２４００）、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ  ｓｉｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ（ＡＴＣＣ  ７００７９９）、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ  ｔｕｎｄｒａｅ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ  ｄａｌｔｏｎａ株ＳＢ２、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ  ｂｒｙｏｐｈｉｌａ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃａｐｓａ  ａｕｒｅａ  ＫＹＧ、Ｍｅｔｈｙｌａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ  ｉｎｆｅｒｎｏｒｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｉｂｉｕｍ  ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｍまたはこれらのいずれかの組合せである、請求項５１〜８４のいずれか一項に記載の非天然メタン資化性菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、極長鎖炭素化合物を生物学的に産生するための、より具体的には、組換えＣ１代謝微生物を使用して、Ｃ１基質（メタンまたは天然ガス等）から極長鎖脂肪アルコール、極長鎖アルデヒド、極長鎖アルカン、極長鎖ケトンまたは極長鎖脂肪エステルワックスを産生するための組成物および方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
極長鎖脂肪酸は、２４個を超える炭素を有する脂肪族尾部を有する脂肪酸である。これは、非極性（親油性）、飽和または不飽和炭化水素鎖と、末端炭素に結合している極性（親水性）カルボキシル基で構成される。極長鎖脂肪酸は、ワックスに取り込まれる、またはアルカン、一級および二級アルコール、ケトン、アルデヒドならびにアシル−エス尾部を含む、ワックス中に見出される他の脂肪族炭化水素の前駆体として機能することができる。極長鎖脂肪酸およびその誘導体は、栄養補助食品、食品、医薬製剤、潤滑剤、洗剤、界面活性物質、化粧品、ナイロン、コーティング、接着剤およびバイオ燃料の生産において使用することができる価値の高い化学物質である。
【０００３】
天然源および化学合成からの極長脂肪酸の供給は、商業的なニーズに十分ではない。天然源または化学合成により極長脂肪酸を得ることは、苛酷な生産環境、高価な出発材料、限定された環境資源の使用または有害な副生成物の産生のいずれかを要する。極長鎖脂肪酸の生物工学的生産の試みが増えつつある。多くの研究は、トランスジェニック植物の種子油における生産に集中した。Ｅ．ｃｏｌｉおよび様々な酵母等、組換え微生物も、バイオマス由来の原料から極長鎖脂肪酸への変換に使用されてきた。しかし、原料として相対的に安価なセルロース性バイオマスを使用する場合であっても、炭水化物原料の質量の半分超が酸素で構成されており、これが変換効率における有意な限界を表す。極長鎖脂肪酸およびその誘導体（極長鎖脂肪アルコール、極長鎖脂肪アルデヒド、極長鎖アルカン、極長鎖ワックスエステルおよび極長鎖ケトン等）は、炭水化物原料よりも有意に低い酸素含有量を有し、これが理論上の収率を限定する。なぜなら炭水化物酸素の大半を廃棄物として排除しなければならないからである。よって、炭水化物原料からの極長鎖脂肪酸およびその誘導体の産生の経済は、法外に高価である。
【発明の概要】
【０００４】
極長鎖脂肪酸および関連化合物の産生のための炭水化物に基づく発酵方法に関連する限界を踏まえて、当該分野において、代替的な、対費用効果の高い、環境に優しい極長鎖脂肪酸産生方法の必要がある。本開示は、このような必要を満たし、他の関連する利点をさらに提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
ある特定の態様では、本開示は、（Ａ）次の酵素：β−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ（ＫＣＳ）；β−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ（ＫＣＲ）；β−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＨＣＤ）；エノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣＲ）をコードする１種または複数種の組換え核酸分子を含む非天然Ｃ１代謝非光合成微生物であって、Ｃ１基質を、極長鎖脂肪アシル−ＣｏＡ、極長鎖脂肪アルデヒド、極長鎖脂肪アルコール、極長鎖脂肪エステルワックス、極長鎖アルカン、極長鎖ケトンまたはこれらの組合せを含む極長炭素鎖化合物に変換する非天然Ｃ１代謝非光合成微生物をＣ１基質原料と共に培養すること、および（Ｂ）該極長炭素鎖化合物を回収することにより、極長炭素鎖化合物を作製するための方法を対象にする。
【０００６】
関連する態様では、本開示は、次の酵素：β−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ（ＫＣＳ）；β−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ（ＫＣＲ）；β−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＨＣＤ）；エノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣＲ）をコードする１種または複数種の組換え核酸分子を含む非天然メタン資化性菌であって、Ｃ１基質を、極長鎖脂肪アシル−ＣｏＡ、極長鎖脂肪アルデヒド、極長鎖脂肪アルコール、極長鎖脂肪エステルワックス、極長鎖アルカン、極長鎖ケトンまたはこれらの組合せを含む極長炭素鎖化合物に変換することができるメタン資化性菌を提供する。ある特定の実施形態では、脂肪アシル−ＣｏＡレダクターゼをコードする組換え核酸分子を含有する非天然メタン資化性菌であって、Ｃ１基質を極長鎖脂肪アルデヒドに変換することができるメタン資化性菌が提供される。
【０００７】
ある特定の実施形態では、異種脂肪アルコール生成アシル−ＣｏＡレダクターゼ（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｆａｔｔｙ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）をコードする組換え核酸分子または異種脂肪アシル−ＣｏＡレダクターゼをコードする組換え核酸分子および異種アルデヒドレダクターゼをコードする組換え核酸分子を含有する非天然メタン資化性菌であって、Ｃ１基質を極長鎖脂肪アルコールに変換することができるメタン資化性菌が提供される。
【０００８】
さらなる実施形態では、異種脂肪アルコール生成アシル−ＣｏＡレダクターゼをコードする組換え核酸分子および異種エステルシンターゼをコードする組換え核酸分子を含有する非天然メタン資化性菌であって、Ｃ１基質を極長鎖脂肪エステルワックスに変換することができるメタン資化性菌が提供される。
【０００９】
ある特定の実施形態では、異種脂肪アシル−ＣｏＡレダクターゼをコードする組換え核酸分子および異種アルデヒドデカルボニラーゼ（ｄｅｃａｒｂｏｎｙｌａｓｅ）をコードする組換え核酸分子を含有する非天然メタン資化性菌であって、Ｃ１基質を極長鎖アルカンに変換することができるメタン資化性菌が提供される。
【００１０】
さらなる実施形態では、異種脂肪アシル−ＣｏＡレダクターゼをコードする組換え核酸分子、異種アルデヒドデカルボニラーゼをコードする組換え核酸分子および異種アルカンヒドロキシラーゼをコードする組換え核酸分子を含有する非天然メタン資化性菌であって、Ｃ１基質を極長鎖ケトンに変換することができるメタン資化性菌が提供される。
【００１１】
別の態様では、本開示は、極長鎖炭素化合物の組成物を含むＣ１代謝微生物バイオマスを提供し、該極長炭素鎖化合物含有バイオマスまたはそれに由来する極長炭素鎖化合物の組成物は、約−３５‰〜約−５０‰、−４５‰〜約−３５‰または約−５０‰〜約−４０‰または約−４５‰〜約−６５‰または約−６０‰〜約−７０‰または約−３０‰〜約−７０‰のδ１３Ｃを有する。ある特定の実施形態では、極長炭素鎖化合物の組成物は、極長鎖脂肪アシル−ＣｏＡ、極長鎖脂肪アルデヒド、極長鎖脂肪アルコール、極長鎖脂肪エステルワックス、極長鎖アルカン、極長鎖ケトンまたはこれらのいずれかの組合せを含む。なおさらなる実施形態では、極長炭素鎖化合物の組成物は、Ｃ２５〜Ｃ５０極長鎖脂肪アシル−ＣｏＡ、Ｃ２５〜Ｃ５０極長鎖脂肪アルデヒド、Ｃ２５〜Ｃ５０極長鎖脂肪アルコール、Ｃ２５〜Ｃ５０極長鎖脂肪エステルワックス、Ｃ２５〜Ｃ５０極長鎖アルカンまたはＣ２５〜Ｃ５０極長鎖ケトンを含む。またさらなる実施形態では、極長炭素鎖化合物の組成物は、Ｃ２５〜Ｃ５０の範囲の炭素鎖長を有する大部分（５０％ｗ／ｗ超）の極長炭素鎖化合物またはＣ２４を超える炭素鎖長を有する大部分の極長炭素鎖化合物、または総極長炭素鎖化合物の少なくとも７０％がＣ２５〜Ｃ５０極長炭素鎖化合物を含む極長炭素鎖化合物を含有する組成物を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、極長鎖アシルＣｏＡ産生のための脂肪酸伸長経路の概要を示す。
【００１３】
【図２】図２は、極長鎖脂肪一級アルコール産生の概要を示す。
【００１４】
【図３】図３は、極長鎖脂肪エステルワックス産生の概要を示す。
【００１５】
【図４】図４は、極長鎖アルカン産生および極長鎖ケトン産生の概要を示す。
【００１６】
【図５】図５は、脂肪アルコール産生のためのアシル−ＣｏＡ依存性ＦＡＲ経路の概要を示す。
【００１７】
【図６】図６は、脂肪アルコール産生のためのアシル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＲ経路の概要を示す。
【００１８】
【図７】図７は、脂肪アルコール産生のためのアシル−ＣｏＡ非依存性ＣＡＲ経路の概要を示す。
【００１９】
【図８】図８は、ω−ヒドロキシ脂肪酸産生経路の概要を示す。
【００２０】
【図９】図９は、ジカルボン酸産生経路の概要を示す。
【００２１】
【図１０】図１０は、脂肪エステル産生のためのアシル−ＣｏＡ依存性ＦＡＲ経路の概要を示す。
【００２２】
【図１１】図１１は、様々な炭素源のδ１３Ｃ分布の模式図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本開示は、極長鎖炭素化合物を生成するための組成物および方法を提供する。例えば、組換えＣ１代謝微生物は、Ｃ１基質原料（例えば、メタン）と共に培養されて、Ｃ２４を超える脂肪アシル−ＣｏＡ、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、脂肪エステルワックス、アルカン、ケトンまたはこれらのいずれかの組合せを生成する。この新たなアプローチは、例えば、栄養補助食品、食品、医薬製剤、潤滑剤、洗剤、界面活性物質、化粧品、ナイロン、コーティング、接着剤またはバイオ燃料の産生における使用のための極長鎖脂肪酸誘導体を生成するための新たな宿主系としての、メチロトローフ菌またはメタン資化性菌の使用を可能にする。
【００２４】
背景として、天然ガスを含む種々の供給源由来のメタンは、豊富な国内資源を表す。上に記す通り、炭水化物に基づく原料は、その質量の半分超を酸素が含有し、極長鎖脂肪酸は、これらの原料よりも有意に低い酸素含有量を有するため、これが変換効率における有意な限界となる。現在のシステムの限界に取り組むための解法は、変換のための原料としてメタンまたは天然ガスを利用することである。天然ガス由来のメタンは、安価かつ豊富であり、重要なことに、酸素を含有しないことから、理論上の変換効率における有意な改善を可能にする。さらに、Ｃ１炭素源が、炭水化物原料と比較して安価かつ豊富であることも、極長鎖脂肪酸産生の経済の改善に寄与する。
【００２５】
極長鎖脂肪酸産生は、皮膚バリア形成、網膜機能、炎症の消散、ミエリンの維持、精子発生および成熟、肝臓恒常性、核膜孔における高い膜湾曲、ＧＰＩ脂質アンカーの合成、ならびに植物種子におけるトリアシルグリセロールの貯蔵等、多様な生理的機能に必要とされるため、多くの異なる生物における重要な経路である。極長鎖脂肪酸は、植物クチクラワックスおよび膜スフィンゴ脂質の構成成分でもある。脂肪酸は、脂肪酸がチオエステル結合によりコエンザイムＡに連結されたアシル−ＣｏＡの形態で伸長される。本開示において、代謝工学技法が適用されて、脂肪酸伸長経路（例えば、β−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ、β−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ、β−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼおよびエノイル−ＣｏＡレダクターゼのうち１種または複数種）を提供して、脂肪アシル−ＣｏＡ基質（例えば、Ｃ１６またはＣ１８脂肪アシル−ＣｏＡ）からの極長鎖脂肪アシル−ＣｏＡの産生を可能にする。追加的な実施形態では、アルカン生成経路の様々な酵素の導入により、極長鎖脂肪アシル−ＣｏＡがさらに改変されて、極長鎖脂肪アルデヒド、極長鎖アルカン、極長鎖脂肪二級アルコール、極長鎖ケトンまたはこれらのいずれかの組合せを産生する。他の実施形態では、アルコール生成経路の様々な酵素の導入により、極長鎖脂肪アシル−ＣｏＡがさらに改変されて、極長鎖アルデヒド、極長鎖脂肪一級アルコール、極長鎖ワックスエステルまたはこれらのいずれかの組合せを産生する。
【００２６】
一態様では、本開示は、Ｃ１基質原料の存在下で非天然Ｃ１代謝非光合成微生物を培養するステップであって、該Ｃ１代謝非光合成微生物が、次の酵素：β−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ、β−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ、β−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼおよびエノイル−ＣｏＡレダクターゼをコードする１種または複数種の組換え核酸分子を含み、該Ｃ１代謝非光合成微生物が該Ｃ１基質を極長炭素鎖化合物に変換する、ステップと、該極長炭素鎖化合物を回収するステップとを含む、極長炭素鎖化合物を産生するための方法を提供する。別の態様では、本開示は、次の酵素：β−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ、β−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ、β−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼおよびエノイル−ＣｏＡレダクターゼをコードする１種または複数種の組換え核酸分子を含む非天然メタン資化性菌であって、Ｃ１基質を極長炭素鎖化合物に変換することができるメタン資化性菌を提供する。
【００２７】
より詳細に本開示を表記する前に、本明細書に使用されるある特定の用語の定義を提示することが、その理解に役立つ。追加的な定義は、本開示を通して表記されている。
【００２８】
本明細書中で使用する場合、他に断りがなければ、いずれかの濃度範囲、パーセンテージ範囲、比率範囲または整数範囲は、列挙された範囲内のいずれかの整数の値と、適切であれば、その分数（整数の１０分の１および１００分の１等）を含むものと理解されたい。また、ポリマーサブユニット、サイズまたは厚さ等、いずれかの物理的特色に関する本明細書に列挙されているいずれかの数値範囲は、他に断りがなければ、列挙されている範囲内のいずれかの整数を含むものと理解されたい。本明細書中で使用する場合、用語「約」は、他に断りがなければ、表示の範囲、値または構造の±２０％を意味する。用語「から本質的になる」は、指定の材料もしくはステップ、または請求されている発明の基本および新規の特徴に実質的に影響を与えないものに特許請求の範囲を限定する。用語「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」が、本明細書中で使用する場合、列挙されている構成成分のうち「１種または複数種」を指すことを理解されたい。選択肢（例えば、「または（もしくは）」）の使用は、選択肢のいずれか一方、両方またはこれらのいずれかの組合せを意味するものと理解されたい。本明細書中で使用する場合、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有する（ｈａｖｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は、同義に使用されており、この用語およびその変種は、非限定的なものとして解釈されることを目的とする。
【００２９】
本明細書中で使用する場合、用語「組換え」または「非天然」は、少なくとも１個の遺伝的変更を含む、または外因性核酸の導入によって改変された、生物、微生物、細胞、核酸分子またはベクターを指す、あるいは内因性核酸分子または遺伝子の発現が制御できるように変更された細胞を指し、かかる変更または改変は、遺伝子操作によって導入される。遺伝的変更は、例えば、タンパク質もしくは酵素をコードする発現できる核酸分子を導入する改変、他の核酸付加、核酸欠失、核酸置換または細胞の遺伝子材料の他の機能破壊を含む。かかる改変は、例えば、参照されている種に対し異種または相同ポリペプチドのコード領域およびその機能断片を含む。追加的な改変は、例えば、改変が、遺伝子またはオペロンの発現を変更する非コード調節領域を含む。例示的なタンパク質または酵素は、極長鎖脂肪酸伸長経路内のタンパク質または酵素（すなわち、構成成分）を含む（例えば、β−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ、β−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ、β−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ、エノイル−ＣｏＡレダクターゼまたはこれらの組合せ）。酵素またはその機能断片をコードする核酸分子に対する遺伝子改変は、その天然起源状態から変更された組換え細胞に生化学的反応能力または代謝経路能力を付与することができる。
【００３０】
本明細書において、酵素名の次の略語が使用される：「脂肪酸エロンガーゼ（ｅｌｏｎｇａｓｅ）」は、「ＦＡＥ」と称され；「β−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ」または「３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ」は、「ＫＣＳ」と称され；「β−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ」または「３−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ」は、「ＫＣＲ」と称され；「β−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ」または「３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ」は、「ＨＣＤ」と称され；「エノイル−ＣｏＡレダクターゼ」は、「ＥＣＲ」と称され；「ジアシルグリセロールＯ−アシルトランスフェラーゼ」は、「ＤＧＡＴ」と称され；「脂肪アシルレダクターゼ」または「脂肪アルコール生成アシル−ＣｏＡレダクターゼ」は、「ＦＡＲ」と称され；「アシルキャリアータンパク質」は、「ＡＣＰ」と称され；「コエンザイムＡ」は、「ＣｏＡ」と称され；「チオエステラーゼ」は、「ＴＥ」と称され；「脂肪酸シンターゼ」または「脂肪酸シンテターゼ」は、「ＦＡＳ」と称され；「脂肪アシル−ＣｏＡレダクターゼ」は、「ＦＡＣＲ」と称され；「脂肪アシル−ＣｏＡシンターゼ」または「脂肪アシル−ＣｏＡシンテターゼ」または「アシル−ＣｏＡシンターゼ」または「アシル−ＣｏＡシンテターゼ」は、本明細書において互換的に使用され、「ＦＡＣＳ」と称され；「アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ」は、「ＡＣＣ」と称される。
【００３１】
マロニル−ＣｏＡは、本明細書中で使用する場合、構造ＣＯＯＨ−（ＣＯ）−Ｓ−ＣｏＡのマロン酸のコエンザイムＡ誘導体を指す。マロニル−ＣｏＡは、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）酵素を使用してアセチル−ＣｏＡをカルボキシル化することにより生成される。
【００３２】
脂肪酸エロンガーゼ（ＦＡＥ）は、本明細書中で使用する場合、マロニル−ＣｏＡから供与されるＣ２部分を脂肪アシル−ＣｏＡ基質に逐次に付加して極長鎖脂肪酸を産生する、４個の別個の酵素からなるヘテロ四量体酵素複合体を指す。反復ＦＡＥ触媒性脂肪酸伸長サイクルのそれぞれは、それぞれβ−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ、β−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ、β−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼおよびエノイル−ＣｏＡレダクターゼによって触媒される４連続した酵素反応（縮合、還元、脱水および還元）を含み、これは、脂肪アシル−ＣｏＡ鎖を２炭素鎖単位づつ伸長する。
【００３３】
図１に示され、本明細書において使用される、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼまたは脂肪酸エロンガーゼとしても公知のβ−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ（ＫＣＳ）は、脂肪酸伸長過程の律速酵素を指し、これは、脂肪アシル−ＣｏＡをマロニル−ＣｏＡと縮合して、３−ケトアシル−ＣｏＡとしても公知のβ−ケトアシル−ＣｏＡを産生する。極長鎖脂肪酸伸長サイクルのアシル鎖長基質特異性は、ＫＣＳによって決定されると考えられる。単一のＫＣＳは、数回の連続した伸長サイクルにおいて縮合を触媒することができる。様々なＫＣＳ酵素は、アシル−ＣｏＡ基質鎖長の重複する範囲を有することができる。
【００３４】
β−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ（ＫＣＲ）または３−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼは、本明細書中で使用する場合、β−ケトアシル−ＣｏＡを３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡとしても公知のβ−ヒドロキシアシル−ＣｏＡに還元する酵素を指す（図１を参照）。ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）は、この反応における還元剤として使用される。ＫＣＲは、基質鎖長に対し幅広い適合性を有することができる。
【００３５】
β−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＨＣＤ）または３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼは、本明細書中で使用する場合、β−ヒドロキシアシル−ＣｏＡを２，３−トランス−エノイル−ＣｏＡとしても公知のトランス−エノイル−ＣｏＡに脱水する酵素を指す（図１を参照）。ＨＣＤは、基質鎖長に対し幅広い適合性を有することができる。
【００３６】
エノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣＲ）または２，３−トランス−エノイル−ＣｏＡレダクターゼは、本明細書中で使用する場合、トランス−エノイル−ＣｏＡを還元して、本来の脂肪アシル−ＣｏＡよりも２個の追加的な炭素鎖単位を有する脂肪アシル−ＣｏＡを生成する酵素を指す（図１を参照）。ＮＡＤＰＨは、この反応における還元剤として使用される。ＥＣＲは、基質鎖長に対し幅広い適合性を有することができる。
ジアシルグリセロールＯ−アシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）または「Ｏ−アシルトランスフェラーゼ」は、本明細書中で使用する場合、ジアシルグリセロール基質および脂肪アシル−ＣｏＡからトリアシルグリセロールを生成する酵素を指す。
【００３７】
アルデヒドデカルボニラーゼは、本明細書中で使用する場合、極長鎖脂肪アルデヒドを脱カルボニルして（ｄｅｃａｒｂｏｎｙｌａｔｅ）、極長鎖脂肪アルデヒド基質よりも１個少ない炭素鎖単位を有する極長鎖アルカンを生成する酵素を指す（図４を参照）。
【００３８】
アルカンヒドロキシラーゼは、本明細書中で使用する場合、極長鎖アルカンの鎖中央（ｍｉｄｃｈａｉｎ）ヒドロキシル化を触媒して、極長鎖脂肪二級アルコールを生成する酵素を指す（図４を参照）。
【００３９】
本明細書に使用され、かつ図１に示す語句「脂肪酸伸長経路」は、ＫＣＳ、ＫＣＲ、ＨＣＤおよびＥＣＲによって触媒される１または複数の伸長サイクルに関与する、長鎖脂肪酸基質（例えば、Ｃ８〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡ）から極長鎖脂肪アシル−ＣｏＡ（Ｃ２４超）への伸長を指す。反復伸長サイクルのそれぞれは、一連の４反応（縮合、還元、脱水および還元）により、脂肪アシル−ＣｏＡ炭化水素鎖を２炭素づつ延長する。
【００４０】
図１および図２に示され、かつ本明細書に使用されている「脂肪アシルレダクターゼ」または「脂肪アルコール生成アシル−ＣｏＡレダクターゼ」（ＦＡＲ）は、脂肪アシル−ＣｏＡ、脂肪アシル−ＡＣＰまたは他の脂肪アシルチオエステル複合体（それぞれ、Ｒ−（ＣＯ）−Ｓ−Ｒ１、式Ｉの構造を有する）から脂肪アルコール（構造Ｒ−ＯＨ、式ＩＩ）への還元を触媒する酵素を指す。例えば、２分子のＮＡＤＰＨが、ＮＡＤＰ＋に酸化されるときに、Ｒ−（ＣＯ）−Ｓ−Ｒ１（式Ｉ）は、Ｒ−ＯＨ（式ＩＩ）およびＲ１−ＳＨ（式ＩＩＩ）に変換される（式中、Ｒは、Ｃ８〜Ｃ２４飽和、不飽和、直鎖状、分枝状または環状炭化水素であり、Ｒ１は、ＣｏＡ、ＡＣＰまたは他の脂肪アシルチオエステル基質を表す）。ＦＡＲは、極長鎖脂肪アシル−ＣｏＡから極長鎖脂肪アルコールへの還元を触媒することもできる。ＣｏＡは、脂肪酸の合成および酸化に関与する非タンパク質アシルキャリアー基である。「ＡＣＰ」は、脂肪酸の合成において使用されるＦＡＳのポリペプチドまたはタンパク質サブユニットである。ＦＡＲは、脂肪アシル−ＣｏＡレダクターゼ（ＦＡＣＲ）とは別個のものである。ＦＡＣＲは、脂肪アシル−ＣｏＡまたは極長鎖脂肪アシル−ＣｏＡ中間体のみを還元して、それぞれ脂肪アルデヒドまたは極長鎖脂肪アルデヒドとし、相当する脂肪アルコールの生成に追加的なオキシドレダクターゼ酵素を必要とする。脂肪アルデヒドは、本明細書中で使用する場合（図５を参照）、Ｒが上に定義されている通りである、飽和または不飽和脂肪族アルデヒドを指す。極長鎖脂肪アルデヒドは、Ｒが少なくともＣ２５飽和、不飽和、直鎖状、分枝状または環状炭化水素である、脂肪アルデヒドである。
【００４１】
用語「脂肪酸」は、本明細書中で使用する場合、構造Ｒ−ＣＯＯＨ（式ＩＶ）（式中、Ｒは、Ｃ８〜Ｃ２４飽和、不飽和、直鎖状、分枝状または環状炭化水素であり、カルボキシル基は、１位に存在する）の化合物を指す。飽和または不飽和脂肪酸は、「Ｃｘ：ｙ」（式中、「ｘ」は、炭素原子の総数を表す整数であり、「ｙ」は、炭素鎖における二重結合の数を指す整数である）として記載することができる。例えば、Ｃ１２：０と称される脂肪酸または１−ドデカン酸は、この化合物が、１２個の炭素およびゼロ個の二重結合を有することを意味する。用語「極長鎖脂肪酸」は、本明細書中で使用する場合、Ｒが、少なくともＣ２５飽和、不飽和、直鎖状、分枝状または環状炭化水素であり、カルボキシル基が１位に存在する、脂肪酸を指す。
【００４２】
用語「極長鎖脂肪ワックスエステル」または「極長鎖脂肪エステルワックス」は、本明細書中で使用する場合、炭素単位の数が少なくとも２５の脂肪アシル−ＣｏＡおよび脂肪アルコールのエステルを指す。
【００４３】
用語「極長鎖アルカン」は、本明細書中で使用する場合、少なくともＣ２５直鎖状または分枝状飽和炭化水素を指す。
【００４４】
用語「極長鎖ケトン」は、本明細書中で使用する場合、構造Ｒ−ＣＯ−Ｒ１（式中、ＲおよびＲ１は独立に、飽和、不飽和、直鎖状、分枝状または環状炭化水素であり、炭素単位の数は、少なくとも２５である）の化合物を指す。
【００４５】
用語「極長炭素鎖化合物」は、本明細書中で使用する場合、少なくとも２５個の炭素原子を有する飽和、不飽和、実質的に直鎖状の炭素骨格を含む化合物を指す。極長炭素鎖化合物は、極長鎖脂肪アシル−ＣｏＡ、極長鎖脂肪アルデヒド、極長鎖脂肪一級アルコール、極長鎖脂肪二級アルコール、極長鎖脂肪エステルワックス、極長鎖アルカン、極長鎖ケトンまたはこれらのいずれかの組合せを含む。
【００４６】
用語「ワックスシンターゼ」または「エステルシンターゼ」は、本明細書中で使用する場合、エステル結合により脂肪アシル−ＣｏＡに脂肪アルコールをコンジュゲートする酵素を指す。
【００４７】
用語「アルデヒドレダクターゼ」は、本明細書中で使用する場合、極長鎖脂肪アルデヒドを還元して、極長鎖脂肪一級アルコールを生成する酵素を指す。ＮＡＤＰＨは、この反応のための還元剤として使用される。アルデヒドレダクターゼは、極長鎖脂肪アルデヒドを還元して極長鎖脂肪一級アルコールを生成するために使用することもできるアルコールデヒドロゲナーゼ酵素を指すこともできる。
【００４８】
用語「ヒドロキシル脂肪酸」は、本明細書中で使用する場合、構造ＯＨ−Ｒ−ＣＯＯＨ（式Ｖ）（式中、Ｒは、Ｃ８〜Ｃ２４飽和、不飽和、直鎖状、分枝状または環状炭化水素である）の化合物を指す。オメガヒドロキシ脂肪酸（ω−ヒドロキシ酸としても公知）は、カルボキシル基を１位に、ヒドロキシルをｎ位に有する、ある数の炭素原子長を有する天然起源の直鎖脂肪族有機酸のクラスである。例えば、例示的なＣ１６ω−ヒドロキシ脂肪酸は、１６−ヒドロキシパルミチン酸（１６個の炭素原子を有し、カルボキシル基を１位に、ヒドロキシル基を１６位に有する）および１０，１６−ジヒドロキシパルミチン酸（１６個の炭素原子を有し、カルボキシル基を１位に、第１のヒドロキシル基を１０位に、第２のヒドロキシル基を１６位に有する）である。
【００４９】
用語「脂肪アルコール」は、本明細書中で使用する場合、式ＩＩ（式中、Ｒは、Ｃ８〜Ｃ２４飽和、不飽和、直鎖状、分枝状または環状炭化水素である）の脂肪族アルコールを指す。飽和または不飽和脂肪アルコールは、「Ｃｘ：ｙ−ＯＨ」（式中、「ｘ」は、脂肪アルコールにおける炭素原子の総数を表す整数であり、「ｙ」は、炭素鎖における二重結合の数を指す整数である）として記載することができる。「極長鎖脂肪アルコール」は、Ｒが少なくともＣ２５飽和、不飽和、直鎖状、分枝状または環状炭化水素である、脂肪アルコールを指す。極長鎖脂肪一級アルコールは、第１級炭素原子に結合した（ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ）ヒドロキシル基を有する極長鎖アルコールを指す。極長鎖脂肪二級アルコールは、ヒドロキシル基が結合している（ａｔｔａｃｈｅｄ）炭素が、２個のアルキル基に直接的に結合した（ｊｏｉｎｅｄ）極長鎖アルコールを指す。
【００５０】
不飽和脂肪酸または脂肪アルコールは、「シスΔｚ」または「トランスΔｚ」と称することができ、「シス」および「トランス」は、二重結合周囲の炭素鎖立体配置を指し、「ｚ」は、二重結合の第１の炭素の番号を示し、このナンバリングは、脂肪酸のカルボン酸を有する炭素または脂肪アルコールの−ＯＨ基に結合した炭素から始まる。
【００５１】
用語「脂肪アシル−チオエステル」または「脂肪アシル−チオエステル複合体」は、脂肪アシル部分がチオエステル結合を介してキャリアー部分に共有結合により連結される式Ｉの化合物を指す。脂肪アシル−チオエステルは、本明細書に記載されているＦＡＲ酵素の基質である。
【００５２】
用語「脂肪アシル−ＣｏＡ」は、Ｒ１がコエンザイムＡである式Ｉの化合物を指し、用語「脂肪アシル−ＡＣＰ」は、Ｒ１がアシルキャリアータンパク質ＡＣＰ）である式Ｉの化合物を指す。用語「極長鎖脂肪アシル−ＣｏＡ」は、Ｒが少なくともＣ２５飽和、不飽和、直鎖状、分枝状または環状炭化水素である脂肪アシル−ＣｏＡを指す。
【００５３】
語句「アシル−ＣｏＡ非依存性経路」は、脂肪アシル−ＡＣＰ基質から脂肪アルコールへの直接的な酵素変換による脂肪アルコールの産生を指し、遊離脂肪酸または脂肪アシル−ＣｏＡ中間体の使用を必要としない。この生合成経路は、２種類の脂肪アシル−ＣｏＡ依存性経路とは異なる−１種類は、アシル転移反応により脂肪アシル−ＡＣＰを脂肪アシルＣｏＡに直接的に変換し、第２の種類は、遊離脂肪酸中間体を経て脂肪アシル−ＡＣＰを脂肪アシル−ＣｏＡに変換する（図５を参照）。アシル−ＣｏＡ非依存性経路は、ＡＴＰの使用を必要とする、遊離脂肪酸から脂肪アシル−ＣｏＡ基質を生成するステップを迂回する利点を有する。したがって、アシル−ＣｏＡ非依存性経路は、遊離脂肪酸中間体を利用するアシル−ＣｏＡ依存性経路よりも少ないエネルギーを使用することができる。
【００５４】
本明細書中で使用する場合、「アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）」は、アルコールをその相当するアルデヒド、ケトンまたは酸に変換することができるいずれかの酵素を指し、逆反応を触媒することもできる。アルコールデヒドロゲナーゼは、少なくとも数種類のアルコール基質を変換することができる広い特異性（ｇｅｎｅｒａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）を有することができる、あるいは１、２または数種のアルコール基質を受け入れる狭い特異性を有することができる。アルコールデヒドロゲナーゼを使用して、極長鎖二級脂肪アルコールの酸化を触媒して、極長鎖ケトンを生成することができる。アルコールデヒドロゲナーゼを使用して、極長鎖脂肪アルデヒドから極長鎖脂肪一級アルコールへの変換を触媒することができる。
【００５５】
本明細書中で使用する場合、「粒子状メタンモノオキシゲナーゼ（ｐＭＭＯ）」は、メタン資化性細菌におけるメタンからメタノールへの酸化を触媒する膜結合型粒子状酵素を指す。用語ｐＭＭＯは、多成分酵素または酵素の活性部位を含むサブユニットのいずれかを意味する。
【００５６】
本明細書中で使用する場合、「可溶性メタンモノオキシゲナーゼ（ｓＭＭＯ）」は、メタン資化性細菌におけるメタンからメタノールへの酸化を触媒する細胞ライセートの可溶性画分（細胞質）に見出される酵素を指す。用語ｓＭＭＯは、多成分酵素または酵素の活性部位を含むサブユニットのいずれかを意味する。
【００５７】
本明細書中で使用する場合、「チトクロムＰ４５０」または「ＣＹＰ」としても公知の「Ｐ４５０」は、脂質、ステロイド系ホルモンおよび生体異物の物質を含む有機化合物の酸化を触媒する、幅広い基質特異性を有する酵素の群を指す。Ｐ４５０酵素は、最も一般的には、酸素原子を有機基質のＲ−Ｈ結合に挿入することにより、モノオキシゲナーゼ（ｍｏｎｏｏｘｇｅｎａｓｅ）反応を触媒する。
【００５８】
「変換」は、基質から１個または複数の相当する生成物への酵素変換を指す。「パーセント変換」は、指定の条件下で期間内に１個または複数の生成物に還元される（ｒｅｄｕｃｅｄ）基質のパーセントを指す。よって、ポリペプチド酵素の「酵素活性」または「活性」は、基質から生成物への「パーセント変換」として表現することができる。
【００５９】
本明細書中で使用する場合、用語「宿主」は、Ｃ１基質原料を少なくともＣ２５脂肪アシル−ＣｏＡ、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、脂肪エステルワックス、アルカン、ケトンまたはこれらのいずれかの組合せに変換するように、極長鎖脂肪酸生合成構成成分（例えば、ＫＣＳ、ＫＣＲ、ＨＣＤ、ＥＣＲまたはこれらのいずれかの組合せ）により遺伝子改変されている微生物（例えば、メタン資化性菌）を指す。宿主細胞は、本明細書に開示されている極長鎖脂肪酸生合成経路とは無関係の所望の特性を付与する他の遺伝子改変を既に保有していてよい。例えば、宿主細胞は、高度な成長、汚染物質もしくは特定の培養条件に対する耐性、追加的な炭素基質を代謝する能力、または望ましい生成物もしくは中間体を合成する能力を付与する遺伝子改変を保有することができる。
【００６０】
本明細書中で使用する場合、用語「メタン資化性菌」、「メタン資化性細菌（ｍｅｔｈａｎｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）」または「メタン資化性細菌（ｍｅｔｈａｎｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ）」は、その主要なまたは唯一の炭素およびエネルギー源として、メタンまたは非従来型天然ガス等、Ｃ１基質を利用することができるメチロトローフ細菌を指す。本明細書中で使用する場合、「メタン資化性細菌」は、炭素およびエネルギー源のためにＣ１基質のみを利用できる「偏性メタン資化性細菌」と、その唯一の炭素およびエネルギー源としてのＣ１基質に加えてアセテート、ピルベート、サクシネート、マレートまたはエタノール等の多炭素基質を天然に使用することができる「通性メタン資化性細菌」とを含む。通性メタン資化性菌は、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ、ＭｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓおよびＭｅｔｈｙｌｏｃａｐｓａのいくつかの種（例えば、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ  ｓｉｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ  ｔｕｎｄｒａｅ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ  ｄａｌｔｏｎａ  ＳＢ２、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ  ｂｒｙｏｐｈｉｌａおよびＭｅｔｈｙｌｏｃａｐｓａ  ａｕｒｅａ  ＫＹＧ）ならびにＭｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｏｒｇａｎｏｐｈｉｌｕｍ（ＡＴＣＣ  ２７，８８６）を含む。
【００６１】
本明細書中で使用する場合、用語「Ｃ１基質」または「Ｃ１化合物」は、炭素−炭素結合を欠く有機化合物を指す。Ｃ１基質は、シンガス、天然ガス、非従来型天然ガス、メタン、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸（ギ酸塩）、一酸化炭素、二酸化炭素、メチル化アミン（例えば、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン等）、メチル化チオール、メチルハロゲン（例えば、ブロモメタン、クロロメタン、ヨードメタン、ジクロロメタン等）およびシアン化物を含む。
【００６２】
本明細書中で使用する場合、「Ｃ１代謝微生物」または「Ｃ１代謝非光合成微生物」は、エネルギーの供給源またはその主要なエネルギーの供給源またはその唯一のエネルギーおよびバイオマスの供給源としてＣ１基質を使用する能力を有するいずれかの微生物を指し、エネルギーおよびバイオマスのために他の炭素基質（糖および複合糖質等）を使用してもしなくてもよい。例えば、Ｃ１代謝微生物は、メタン、天然ガスまたはメタノール等、Ｃ１基質を酸化することができる。Ｃ１代謝微生物は、細菌（メタン資化性菌およびメチロトローフ等）を含む。ある特定の実施形態では、Ｃ１代謝微生物は、藻類等、光合成微生物を含まない。ある特定の実施形態では、Ｃ１代謝微生物は、その主要なエネルギー供給源がＣ１基質であることを意味する「偏性Ｃ１代謝微生物」である。さらなる実施形態では、Ｃ１代謝微生物（例えば、メタン資化性菌）は、Ｃ１基質原料の存在下で（すなわち、主要なまたは唯一のエネルギー供給源としてＣ１基質を使用して）培養される。
【００６３】
本明細書中で使用する場合、用語「メチロトローフ」または「メチロトローフ細菌」は、炭素−炭素結合を含有しない有機化合物を酸化することができるいずれかの細菌を指す。ある特定の実施形態では、メチロトローフ細菌は、メタン資化性菌であり得る。例えば、「メタン資化性細菌」は、その主要な炭素およびエネルギーの供給源としてメタンを酸化する能力を有するいずれかのメチロトローフ細菌を指す。例示的なメタン資化性細菌は、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ、ＭｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍまたはＭｅｔｈａｎｏｍｏｎａｓを含む。ある特定の他の実施形態では、メチロトローフ細菌は、エネルギーの生成のためにＣ１基質の使用に限定される細菌を指す「偏性メチロトローフ細菌」である。
【００６４】
本明細書中で使用する場合、用語「ＣＯ利用細菌」は、炭素およびエネルギーの供給源として一酸化炭素（ＣＯ）を酸化する能力を天然に保有する細菌を指す。一酸化炭素は、石炭、石炭油（ｃｏａｌ  ｏｉｌ）、天然ガス、バイオマスおよび廃棄有機物等、いずれかの有機原料のガス化法によって産生される一酸化炭素および水素の混合物である「合成ガス」または「シンガス」から利用することができる。ＣＯ利用細菌は、その炭素源としてＣＯを用いた成長のために遺伝子改変しなければならない細菌を含まない。
【００６５】
本明細書中で使用する場合、「天然ガス」は、多孔質貯留層において生成された、従来プロセス（例えば、掘削）によって入手することができる、主にメタンで構成されているが、二酸化炭素、窒素または硫化水素等、他の構成成分を有していてもよい天然起源のガス混合物を指す。
【００６６】
本明細書中で使用する場合、「非従来型天然ガス」は、水圧破砕、水平掘削または傾斜掘削等、非従来方法によって入手する必要がある、低い透過性を有する地層において生成された天然起源のガス混合物を指す。例示的な非従来型天然ガス鉱床として、砂岩または炭酸塩に形成されるタイトガスサンド（ｔｉｇｈｔ  ｇａｓ  ｓａｎｄ）、石炭鉱床に形成され石炭粒子に吸着される炭層メタン、細粒頁岩に形成され粘土粒子に吸着されるまたは小孔もしくは微細穴（ｍｉｃｒｏｆｒａｃｔｕｒｅ）内に保持されるシェールガス、海洋および永久凍土下などの場所において低温高圧で形成される天然ガスおよび水の結晶性組合せであるメタンハイドレートが挙げられる。
【００６７】
本明細書中で使用する場合、「シンガス」は、一酸化炭素（ＣＯ）および水素（Ｈ２）の混合物を指す。シンガスは、ＣＯおよびＨ２と比べてより少量のＣＯ２、メタンおよび他のガスを含むこともできる。
【００６８】
本明細書中で使用する場合、「メタン」は、化学式ＣＨ４を有する最も単純なアルカン化合物を指す。メタンは、室温および室内の圧力で無色および無臭のガスである。メタンの供給源は、天然ガス田等の天然源、「非従来型天然ガス」供給源（含有量が、供給源に応じて変動する、シェールガスまたは炭層メタン等）ならびに例えば、メタン生成微生物および産業的または研究室合成によって合成される生物学的供給源を含む。メタンは、９５〜９８％パーセントメタンである「パイプライン品質の天然ガス」または「乾性天然ガス」等、実質的に精製された組成物である純粋メタンと、他の炭化水素が未だ除去されていない、メタンが組成の６０％超を構成する「湿性天然ガス」等、非精製組成物とを含む。
【００６９】
本明細書中で使用する場合、ポリヌクレオチドとしても公知の「核酸分子」は、共有結合により連結されたヌクレオチドと呼ばれるサブユニットで構成されたポリマー化合物を指す。核酸分子は、両者共に一本鎖であっても二本鎖であってもよい、ポリリボ核酸（ＲＮＡ）、ポリデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含む。ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、半合成ＤＮＡなどを含む。
【００７０】
本明細書中で使用する場合、「形質転換」は、宿主への核酸分子（例えば、外因性または異種核酸分子）の移入を指す。形質転換された宿主は、外因性または異種核酸分子を染色体外に保有し得るか、あるいは核酸分子は、染色体中に組み込まれていてよい。宿主ゲノムおよび自己複製ベクターへの組み込みは、一般に、形質転換された核酸分子の遺伝的に安定的な継承をもたらす。形質転換された核酸を含有する宿主細胞は、「組換え」または「非天然起源の」または「遺伝子操作された」または「形質転換された」または「トランスジェニック」細胞（例えば、細菌）と称される。
【００７１】
本明細書中で使用する場合、用語「内因性」または「未変性（ｎａｔｉｖｅ）」は、宿主細胞において正常に存在する遺伝子、タンパク質、化合物または活性を指す。
【００７２】
本明細書中で使用する場合、「異種」核酸分子、構築物または配列は、宿主細胞に対し未変性ではない、または同様の条件での未変性発現レベルと比較して変更された発現を有する核酸分子である、核酸分子または核酸分子配列の部分を指す。例えば、異種制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサー）を使用して、未変性遺伝子または核酸分子が、天然にまたは培養で正常に発現される方法とは異なる方法で、未変性遺伝子または核酸分子の発現を調節することができる。ある特定の実施形態では、異種核酸分子は、宿主細胞または宿主ゲノムに対して内因性でなくてもよいが、代わりに、接合、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーションなどによって宿主細胞に付加されていてよく、付加された分子は、宿主ゲノムに組み込まれていても、染色体外遺伝子材料として（例えば、プラスミドまたは他の自己複製ベクターとして）存在してもよい。加えて、「異種」は、宿主細胞に見出されるものとは異なるもしくは変更された、または宿主細胞に対して未変性ではないが、代わりに宿主細胞に導入された核酸分子によってコードされた、酵素、タンパク質または他の活性を指すことができる。用語「相同」または「ホモログ」は、宿主細胞、種または株に見出されるまたは由来する分子または活性を指す。例えば、異種核酸分子は、未変性宿主細胞遺伝子に対し相同であり得るが、変更された発現レベルを有するかもしくは異なる配列を有するかまたはその両方を有することができる。
【００７３】
ある特定の実施形態では、２種以上の異種核酸分子は、別々の核酸分子として、ポリシストロニック核酸分子として、融合タンパク質をコードする単一の核酸分子として、またはこれらのいずれかの組合せとして宿主細胞に導入することができ、これらは依然として、２種以上の異種核酸として考慮され得る。例えば、本明細書に開示されている通り、Ｃ１代謝微生物は、所望の極長鎖脂肪酸伸長経路構成成分（例えば、β−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ、β−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ、β−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼおよびエノイル−ＣｏＡレダクターゼ）をコードする２種またはそれを超える異種または外因性核酸分子を発現するように改変することができる。極長鎖脂肪酸伸長経路構成成分をコードする２種またはそれを超える外因性核酸分子が、宿主Ｃ１代謝微生物に導入されるときに、この２種またはそれを超える（ｔｈｅ  ｔｗｏ  ｍｏｒｅ）外因性核酸分子が、例えば、単一の核酸分子として単一のベクターに、別々のベクターに導入されてよく、宿主染色体の単一の部位または複数の部位に組み込まれてよく、これらは依然として、２種またはそれを超える外因性核酸分子とみなされ得ることが理解される。よって、参照される異種核酸分子またはタンパク質活性の数は、宿主細胞に導入された別々の核酸分子の数ではなく、コード核酸分子の数またはタンパク質活性の数を指す。
【００７４】
用語「キメラ」は、内因性ではなく、天然では普通一緒に接続または連結しているとは見出されていない、一緒に接続または連結された配列を含む、いずれかの核酸分子またはタンパク質を指す。例えば、キメラ核酸分子は、異なる供給源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ供給源に由来するが、天然に見出されるものとは異なる様式で配置された調節配列およびコード配列を含むことができる。
【００７５】
２種またはそれを超える核酸配列の間の「パーセント同一性」は、２種またはそれを超える配列のアライメントを最適化するために導入される必要のあるギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れた、配列によって共有される同一位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一位置の数／位置の総数×１００）。２種またはそれを超える配列の間の配列の比較およびパーセント同一性の決定は、デフォルトパラメーターのＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラム等、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２１５巻：４０３頁、１９９０年；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴのＢＬＡＳＴＮも参照されたい）。
【００７６】
「保存的置換」は、あるアミノ酸の、同様の特性を有する別のアミノ酸に代えての置換として当該分野において認識される。例示的な保存的置換は、当該分野で周知である（例えば、ＷＯ９７／０９４３３、１０頁、１９９７年３月１３日に公開；Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版；Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｉｎｃ．  ＮＹ：ＮＹ（１９７５年）、７１〜７７頁；Ｌｅｗｉｎ、Ｇｅｎｅｓ  ＩＶ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹおよびＣｅｌｌ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ（１９９０年）、８頁を参照）。
【００７７】
「阻害する」または「阻害される」は、本明細書中で使用する場合、コントロール、内因性または基準の分子と比較した、標的遺伝子の発現または標的分子（例えば、チオエステラーゼ、アシル−ＣｏＡシンテターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ）の活性の直接的または間接的な変更、減少、下方制御または抑止を指し、ここで変更、減少、下方制御または抑止は、統計的、生物学的、産業的にまたは臨床的に有意である。
【００７８】
本明細書中で使用する場合、用語「誘導体」は、酵素によるまたはよらない、化学的または生物学的手段による化合物の改変を指し、この改変された化合物は、親化合物と構造的に同様であり、（実際にまたは理論上）この親化合物から誘導できる。誘導体は、親化合物と比較してより親水性であるまたは変更された反応性を有する等、親化合物と異なる化学的、生物学的または物理的特性を有することができる。誘導体化（すなわち、改変）は、分子内の１個または複数の部分の置換（例えば、官能基の変化）をもたらすことができる。例えば、水素は、フッ素または塩素等、ハロゲンで置換することができる、あるいはヒドロキシル基（−ＯＨ）は、カルボン酸部分（−ＣＯＯＨ）で置き換えることができる。他の例示的な誘導体化は、グリコシル化、アルキル化、アシル化、アセチル化、ユビキチン化（ｕｂｉｑｕｔｉｎａｔｉｏｎ）、エステル化およびアミド化を含む。本明細書中で使用する場合、「脂肪酸誘導体」は、例えば、脂肪アシルキャリアータンパク質、活性化脂肪酸（例えば、アシルまたはＣｏＡ含有）、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、脂肪エステルワックス、ヒドロキシ脂肪酸、ジカルボン酸、分枝状脂肪酸など、細胞に見出される脂肪酸生合成経路の中間体および生成物を含む。本明細書中で使用する場合、「極長鎖脂肪酸誘導体」は、例えば、極長鎖脂肪酸（例えば、アシルまたはＣｏＡ含有）、極長鎖脂肪アルデヒド、極長鎖脂肪アルコール、極長鎖脂肪エステルワックス、極長鎖アルカン、極長鎖ケトンなど、極長鎖脂肪酸伸長経路、アルカン生成経路およびアルコール生成経路の極長鎖炭素化合物中間体および生成物を含む。
【００７９】
用語「誘導体」は、親化合物のあらゆる溶媒和物、例えば、水和物または付加物（例えば、アルコールによる付加物）、活性代謝物および塩も指す。調製することができる塩の種類は、化合物内の部分の性質に依存する。例えば、カルボン酸基等、酸性基は、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩およびカルシウム塩および、さらに、生理的に容認できる四級アンモニウムイオンによる塩ならびにアンモニアおよび例えば、トリエチルアミン、エタノールアミンまたはｔｒｉｓ−（２−ヒドロキシエチル）アミン等の生理的に容認できる有機アミンによる酸付加塩）を生成することができる。塩基性基は、例えば、塩酸、硫酸もしくはリン酸等、無機酸によりまたは酢酸、クエン酸、乳酸、安息香酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、メタンスルホン酸もしくはｐ−トルエンスルホン酸等、有機カルボン酸およびスルホン酸により酸付加塩を生成することができる。塩基性基および酸性基、例えば、塩基性窒素原子に加えてカルボキシル基を同時に含有する化合物は、双性イオンとして提示することができる。塩は、当業者に公知の慣習的な方法によって、例えば、溶媒または希釈液において無機もしくは有機酸または無機もしくは有機塩基と化合物を組み合わせることにより、またはカチオン交換もしくはアニオン交換により他の塩から得ることができる。
【００８０】
極長炭素鎖化合物を作製するための組成物および方法
本明細書に記載されている通り、極長炭素鎖化合物生合成は、１または複数サイクルによる、脂肪酸エロンガーゼ（β−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ、β−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ、β−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼおよびエノイル−ＣｏＡレダクターゼのうち１種または複数種）による脂肪酸基質（例えば、Ｃ８〜Ｃ２４脂肪アシル−ＣｏＡ）の伸長をもたらす（図１を参照）。所望の長さまで伸長されたら、極長鎖脂肪酸はその後、極長鎖脂肪アルデヒド、極長鎖アルカン、極長鎖脂肪二級アルコールもしくは極長鎖ケトンを生じるアルカン生成（脱カルボニル）経路（図４を参照）、または極長鎖脂肪アルデヒド、極長鎖脂肪一級アルコールもしくは極長鎖脂肪ワックスエステルを生じるアルコール生成（アシル還元）経路（図２〜図３を参照）のいずれかにより改変することができる。極長鎖脂肪酸への伸長のための脂肪酸基質は、宿主Ｃ１代謝非光合成微生物において天然に合成することができる。あるいは、宿主Ｃ１代謝非光合成微生物は、極長鎖脂肪酸への伸長のための脂肪酸基質を産生するように、または内因性産生を増強するように生物工学的に作製する（ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）ことができる。
【００８１】
極長炭素鎖化合物の産生に使用されるＣ１代謝微生物は、目的のポリペプチドを発現または過剰発現する核酸配列を含むように組換えにより改変することができる。例えば、Ｃ１代謝微生物は、アシル−ＣｏＡの産生を増加させる、アシル−ＣｏＡ等、脂肪酸生合成経路における脂肪酸誘導体および中間体の異化反応を低下させる、または脂肪酸生合成経路における特異的な個所でのフィードバック阻害を低下させるように改変することができる。本明細書に記載されている遺伝子の改変に加えて、追加的な細胞資源を転用して脂肪酸を過剰産生させることができ、例えば、乳酸経路、コハク酸経路または酢酸経路を減弱させ、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ａｃｃ）を過剰発現させることができる。本明細書に記載されているＣ１代謝微生物に対する改変は、ゲノム変更、組換え発現系の付加またはこれらの組合せによって為すことができる。
【００８２】
極長炭素鎖化合物生合成経路は、図１〜図４に図解されている。経路における異なるステップは、異なる酵素によって触媒され、各ステップは、より多くの酵素を産生するための遺伝子の過剰発現のための潜在的な場であり、よって、より多くの極長炭素鎖化合物の産生を駆動する。経路に必要とされる酵素をコードする核酸分子は、かかる酵素を欠くＣ１代謝微生物に組換えにより付加することもできる。最後に、所望の生成物の産生を増加させるために、極長炭素鎖化合物の産生をもたらす経路と競合するステップを減弱または遮断することができる。
【００８３】
一態様では、（ａ）Ｃ１基質原料と共に非天然Ｃ１代謝非光合成微生物を培養することを含む、極長炭素鎖化合物を作製するための方法であって、該Ｃ１代謝非光合成微生物が、次の酵素：（ｉ）β−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ、（ｉｉ）β−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ、（ｉｉｉ）β−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼおよび（ｉｖ）エノイル−ＣｏＡレダクターゼをコードする１種または複数種の組換え核酸分子を含み、該Ｃ１代謝非光合成微生物が、該Ｃ１基質を極長炭素鎖化合物に変換する、方法が本明細書に提供される。ある特定の実施形態では、Ｃ１代謝非光合成微生物は、次の酵素：（ｉ）β−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ、（ｉｉ）β−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ、（ｉｉｉ）β−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼおよび（ｉｖ）エノイル−ＣｏＡレダクターゼをコードする２種またはそれを超える組換え核酸分子を含む。ある特定の実施形態では、Ｃ１代謝非光合成微生物は、次の酵素：（ｉ）β−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ、（ｉｉ）β−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ、（ｉｉｉ）β−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼおよび（ｉｖ）エノイル−ＣｏＡレダクターゼをコードする３種またはそれを超える組換え核酸分子を含む。ある特定の実施形態では、Ｃ１代謝非光合成微生物は、次の酵素：（ｉ）β−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ、（ｉｉ）β−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ、（ｉｉｉ）β−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼおよび（ｉｖ）エノイル−ＣｏＡレダクターゼの全てをコードする組換え核酸分子を含む。ある特定の実施形態では、極長炭素鎖化合物は、極長脂肪アシル−ＣｏＡである。
【００８４】
脂肪酸エロンガーゼは、マロニル−ＣｏＡから供与されたＣ２部分をアシル−ＣｏＡ基質に付加して、極長鎖脂肪酸を産生する、４個の別個の酵素で構成されたヘテロ四量体複合体である。各ＦＡＥ触媒性脂肪酸伸長サイクルは、一緒にアシル−ＣｏＡ基質鎖を２炭素鎖単位づつ伸長する、それぞれβ−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ、β−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ、β−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼおよびエノイル−ＣｏＡレダクターゼによって触媒される４種の連続した酵素反応（縮合、還元、脱水および還元）からなる。この伸長サイクルは、Ｓａｍｕｅｌｓら（Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．５９巻：６８３〜７０７頁、２００８年）およびＫｉｈａｒａら（Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５２巻：３８７〜３９５頁、２０１２年）によって記載されている。
【００８５】
β−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ（ＫＣＳ）は、脂肪酸伸長過程の律速酵素である。ＫＣＳは、アシル−ＣｏＡとマロニル−ＣｏＡの縮合を触媒して、３−ケトアシル−ＣｏＡとしても公知のβ−ケトアシル−ＣｏＡを産生する。極長鎖脂肪酸伸長サイクルのアシル鎖長基質特異性は、ＫＣＳによって決定されると考えられる。単一のＫＣＳは、数回の連続した伸長サイクルにおいて縮合を触媒することができる。様々なＫＣＳは、重複する範囲のアシル−ＣｏＡ基質鎖長を有することができる。例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＫＣＳ２／ＤＡＩＳＹ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託識別子ＮＭ＿１００３０３．３）およびＫＣＳ２０（Ｇｅｎｂａｎｋ受託識別子ＮＭ＿１２３７４３．３）は、Ｃ２０〜Ｃ２２極長鎖脂肪酸の伸長に関与する（Ｌｅｅら、２００９年、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．６０巻：４６２〜７５頁）。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＫＣＳ９（Ｇｅｎｂａｎｋ受託識別子ＮＭ＿１２７１８４．２）は、Ｃ２２〜Ｃ２４極長鎖脂肪酸の伸長に関与する（Ｋｉｍら、２０１３年、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｓｙｉｏｌ．１６２巻：５６７〜８０頁）。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＫＣＳ１（Ａｔ１ｇ０１１２０）（Ｇｅｎｂａｎｋ受託識別子ＡＦ０５３３４５．１）は、飽和およびモノ不飽和Ｃ１６〜Ｃ２４アシル−ＣｏＡに対し幅広い基質特異性を有する（ＢｌａｃｋｌｏｃｋおよびＪａｗａｏｒｓｋｉ、２００６年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．３４６巻：５８３〜９０頁）。哺乳動物は、７種のＫＣＳ遺伝子（ＥＬＯＶＬ１〜７）を有し、それぞれ、特徴的な基質特異性を有する（Ｇｕｉｌｌｏｕら、２０１０年、Ｐｒｏｇ．  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．４９巻：１８６〜１９９頁；Ｏｈｎｏら、２０１０年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０７巻：１８４３９〜１８４４４頁）。ＥＬＯＶＬ６は、Ｃ１６：０−ＣｏＡまたはより短い、飽和アシル−ＣｏＡを伸長する。ＥＬＯＶＬ３およびＥＬＯＶＬ７は、飽和および不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２アシル−ＣｏＡの両方を伸長する。ＥＬＯＶＬ２およびＥＬＯＶＬ５は、ポリ不飽和脂肪酸に対し厳密な特異性を有し、それぞれＣ２２−アシル−ＣｏＡおよびＣ１８−ＣｏＡを伸長することができ、両者共に、Ｃ２０−アシル−ＣｏＡに対し重複する特異性を有する。ＥＬＯＶＬ１は、飽和Ｃ１８：０〜Ｃ２６：０ならびにモノ不飽和Ｃ２０：１ｎ−９およびＣ２２：１ｎ−９アシル−ＣｏＡを伸長する。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＣＥＲ６（Ｇｅｎｂａｎｋ受託識別子ＮＭ＿１７９５３０．１）は、脂肪アシル−ＣｏＡ＞Ｃ２２に対し特異性を有する。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＥＬＯ１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託識別子ＮＭ＿００１１８１６２９）は、１４：０〜１６：０脂肪酸を伸長することができる（Ｔｏｋｅ、１９９６年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２７１巻：１８４１３〜１８４２２頁）。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＥＬＯ２（Ｇｅｎｂａｎｋ受託識別子ＮＭ＿００１１７８７４８．１）は、最大２４個の炭素の脂肪酸を伸長することができ、ＥＬＯ３（Ｇｅｎｂａｎｋ受託識別子ＮＭ＿００１１８２２６１．３）は、より幅広い基質特異性を有し、Ｃ２４〜Ｃ２６種の伸長に必須である（Ｏｈら、１９９７年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２７２巻：１７３７６〜８４頁）。他のＫＣＳ遺伝子のＧｅｎｂａｎｋ受託識別子は、例えば、ＥＵ００１７４１．１（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、ＥＵ００１７４１．１（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、ＥＵ６１６５３８．１（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、ＮＭ＿００１１２４６３６．１（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ  ｍｙｋｉｓｓ）、ＪＸ４３６４８７．１（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）を含む。ある特定の実施形態では、ＫＣＳ遺伝子は、ＣＥＲ６、Ｅｌｏ１、Ｆｅｎ１／Ｅｌｏ２、Ｓｕｒ４／Ｅｌｏ３、ＫＣＳ１、ＫＣＳ２、ＫＣＳ１１、ＫＣＳ２０、ＫＣＳ９、ＥＬＯＶＬ１、ＥＬＯＶＬ２、ＥＬＯＶＬ３、ＥＬＯＶＬ４、ＥＬＯＶＬ５、ＥＬＯＶＬ６、ＥＬＯＶＬ７またはＦＤＨである。
【００８６】
３−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼとしても公知のβ−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ（ＫＣＲ）は、β−ケトアシル−ＣｏＡを還元して、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡとしても公知のβ−ヒドロキシアシル−ＣｏＡとする。ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）は、この反応における還元剤として使用される。ＫＣＲは、基質鎖長に対し幅広い適合性を有すると考えられる。ＫＣＲ遺伝子は、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＢＲ１５９ｗ（Ｂｅａｕｄｏｉｎら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２００２年、２７７巻：１１４８１〜８頁）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＡｔＫＣＲ１（Ａｔ１ｇ６７７３０）（Ｂｅａｕｄｏｉｎら、２００９年、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１５０巻：１１７４〜１１９１頁）、Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．ＧＬ８ＡおよびＧＬ８Ｂ（Ｄｉｅｔｒｉｃｈら、２００５年、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．４２巻：８４４〜６１頁）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＣＥＲ１０（Ｚｈａｎｇら、２００５年、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １７巻：１４６７〜１４８１頁）およびＡＹＲ１を含む。ある特定の実施形態では、ＫＣＲ遺伝子は、ＣＥＲ１０、ＫＡＲ、ＧＬ８Ａ、ＧＬ８Ｂ、Ｙｂｒ１５９ｗ、ＡＹＲ１またはＡｔ１ｇ６７７３０である。
【００８７】
３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼとしても公知のβ−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＨＣＤ）は、β−ヒドロキシアシル−ＣｏＡを脱水して、２，３−トランス−エノイル−ＣｏＡとしても公知のトランス−エノイル−ＣｏＡとする。ＨＣＤは、基質鎖長に対し幅広い適合性を有すると考えられる。ＨＣＤ遺伝子は、例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＰＡＳ２（Ｇｅｎｂａｎｋ受託識別子ＮＭ＿００１２０３３４８．１）（Ｂａｃｈら、２００８年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．１０５巻：１４７２７〜１４７３１頁）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＰＨＳ１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託識別子ＮＭ＿００１１８１５３０．１）ならびに哺乳動物アイソザイムＨＡＣＤ１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託識別子ＮＭ＿０１４２４１．３、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、ＨＡＣＤ２（Ｇｅｎｂａｎｋ受託識別子ＮＭ＿１９８４０２．３、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、ＨＡＣＤ３（Ｇｅｎｂａｎｋ受託識別子ＮＭ＿０１６３９５．２、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）およびＨＡＣＤ４（Ｇｅｎｂａｎｋ受託識別子ＮＭ＿００１０１０９１５．３、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）を含む。ある特定の実施形態では、ＨＣＤ遺伝子は、ＰＨＳ１、ＰＡＳ２、ＨＡＣＤ１、ＨＡＣＤ２、ＨＡＣＤ３、ＨＡＣＤ４またはＰＡＳ２−１である。
【００８８】
２，３−トランス−エノイル−ＣｏＡレダクターゼとしても公知のエノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣＲ）は、トランス−エノイル−ＣｏＡを還元して、本来の脂肪アシル−ＣｏＡ基質よりも２個の追加的な炭素鎖単位を有する脂肪アシル−ＣｏＡを生成する。ＮＡＤＰＨは、この反応において還元剤として使用される。ＥＣＲは、基質鎖長に対し幅広い適合性を有すると考えられる。ＥＣＲ遺伝子は、例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＣＥＲ１０（Ｇｅｎｂａｎｋ受託識別子ＮＭ＿１１５３９４．３）、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＴＥＲ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託識別子ＮＭ＿１３８５０１．５）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＴＳＣ１３（Ｇｅｎｂａｎｋ受託識別子ＮＭ＿０１１８００７４．１）、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ  ＧｈＥＣＲ１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託識別子ＥＵ００１７４２．１）、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ  ＧｈＥＣＲ２（Ｇｅｎｂａｎｋ受託識別子ＥＵ００１７４３．１）を含む。ある特定の実施形態では、ＥＣＲは、ＣＥＲ１０、ＴＥＲ、ＴＳＣ１３またはＧｈＥＣＲ１、ＧｈＥＣＲ２である。
【００８９】
本開示において有用な、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｏｃｕｌａｔａ由来の例示的なＫＣＳ、ＫＣＲ、ＨＣＤおよびＥＣＲ遺伝子は、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１２／０５２４６８にも提示されている。
【００９０】
適切な長さの飽和脂肪酸が作製されるまで、伸長サイクルは反復される。極長鎖脂肪アシル−ＣｏＡの奇数鎖長は、α−ヒドロキシラーゼ酵素によるアルファ炭素のヒドロキシル化および偶数鎖長極長鎖脂肪アシル−ＣｏＡ基質の脱炭酸（ｄｅｃａｒｂｏｙｘｌａｔｉｏｎ）をもたらすα−酸化によって生成され得る。
【００９１】
特定の炭素鎖長（複数可）の極長炭素鎖化合物の均質なまたは混合型集団の産生のためにＣ１代謝微生物を操作するために、選択されたアシル鎖長特異性を有する１種または複数種のＫＣＳ酵素をＣ１代謝微生物において発現させることができる。その上、望ましくない長さの極長鎖脂肪酸を産生する１種または複数種の内因性遺伝子は、減弱、阻害または機能的に欠失させることができる。
【００９２】
伸長サイクルのための最初の脂肪アシル−ＣｏＡ基質は、Ｃ１代謝微生物における内因性脂肪酸産生に由来し得る。関与する脂肪アシル−ＣｏＡ経路および酵素を図５に示す。ある特定の実施形態では、伸長サイクルのための最初の脂肪アシル−ＣｏＡ基質は、約８〜２４個の炭素原子、約１４〜２４個の炭素原子、約１０〜２０個の炭素原子、約１２〜１８個の炭素原子または約１６〜１８個の炭素原子の炭素鎖を有する脂肪アシルｃｏ−Ａである。
【００９３】
ある特定の実施形態では、Ｃ１代謝非光合成微生物は、極長鎖脂肪アルコールを生成することができる脂肪アルコール生成アシル−ＣｏＡレダクターゼ（ＦＡＲ）をコードする核酸分子をさらに含み、この場合の極長炭素鎖化合物は、極長鎖脂肪一級アルコールである。極長鎖脂肪アシル−ＣｏＡの改変のための一経路は、アルコール生成経路（アシル還元）である。極長鎖脂肪酸からその相当する極長鎖脂肪一級アルコールへの還元は、極長鎖脂肪アルデヒド中間体を経由し、反応ステップ毎の還元剤としてＮＡＤＰＨを使用する。ＦＡＲ酵素は、遊離アルデヒドを放出することなく、両方の反応を触媒することができる。ＦＡＲ遺伝子は、例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＣＥＲ４（Ｇｅｎｂａｎｋ受託識別子ＮＭ＿１１９５３８．６）およびＭａｑｕ＿２２２０（Ｇｅｎｂａｎｋ受託識別子ＹＰ＿９５９４８６．１）を含む。極長鎖脂肪アシル−ＣｏＡを改変するためのアルコール生成経路は、Ｓａｍｕｅｌｓら、２００８年、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ．  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．５９巻：６８３〜７０７頁に記載されている。
【００９４】
あるいは、極長鎖アシル−ＣｏＡからその相当する極長鎖脂肪一級アルコールへの還元は、２種の独立した酵素によって触媒することができる。ある特定の実施形態では、Ｃ１代謝非光合成微生物は、極長鎖脂肪アルデヒドを生成することができる脂肪アシル−ＣｏＡレダクターゼと、極長鎖脂肪アルコールを生成することができるアルデヒドレダクターゼとをコードする核酸分子をさらに含み、この場合の極長炭素鎖化合物は、極長鎖脂肪一級アルコールである。脂肪アシル−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子は、例えば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｙｌｙｉ  ＡＣＲ１（Ｕ７７６８０．１）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＡＣＲ（Ｌｉｎら、２０１３年、ＦＥＢＳ  Ｊ．２８０巻：４７７３〜８１頁）およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＣＥＲ３（Ｇｅｎｂａｎｋ受託識別子ＮＭ＿１２５１６４．２）を含む。アルデヒドレダクターゼまたはＮＡＤＰＨ依存性アルコールデヒドロゲナーゼ（例えば、ＹｑｈＤ）により、極長鎖脂肪アルデヒドを還元して、脂肪アルコールとすることができる。アルデヒドレダクターゼ遺伝子は、例えば、ＹｑｈＤを含む。
【００９５】
ある特定の実施形態では、Ｃ１代謝非光合成微生物は、極長鎖脂肪アルデヒドを生成することができる脂肪アシル−ＣｏＡレダクターゼをコードする核酸分子（複数可）をさらに含み、この場合の極長炭素鎖化合物は、極長鎖脂肪アルデヒドである。脂肪アシル−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子は、例えば、ＡＣＲ１、ＡＣＲおよびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＣＥＲ３（Ｇｅｎｂａｎｋ受託識別子ＮＭ＿１２５１６４．２）を含む。
【００９６】
ある特定の実施形態では、Ｃ１代謝非光合成微生物は、極長鎖脂肪アルコールを生成することができる脂肪アルコール生成アシル−ＣｏＡレダクターゼと、極長鎖脂肪エステルワックスを生成することができるエステルシンターゼとをコードする核酸分子を含み、この場合の極長炭素鎖化合物は、極長鎖脂肪エステルワックスである。本明細書に詳細に記載されている通り、脂肪一級アルコール（少なくともＣ２５）は、本明細書に詳細に記載されている通り、エステルシンターゼによって脂肪アシル−ＣｏＡ（≦Ｃ２４）とエステル結合によりコンジュゲートして、極長鎖脂肪エステルワックス（＞Ｃ２４）を生成することもできる。他の実施形態では、極長鎖脂肪エステルワックスは、エステルシンターゼ酵素により、極長鎖脂肪一級アルコールを脂肪アシル−ＣｏＡと、脂肪一級アルコールを極長鎖脂肪アシル−ＣｏＡと、または極長鎖脂肪一級アルコールを極長鎖脂肪アシル−ＣｏＡとコンジュゲートすることにより生成することができる。例示的なエステルシンターゼ遺伝子は、例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＷＳＤ１（Ｌｉら、２００８年、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｓｙｉｏｌ．１４８巻：９７〜１０７頁；Ｇｅｎｂａｎｋ受託識別子ＮＭ＿１２３０８９．２）を含む。
【００９７】
極長鎖脂肪エステルワックスは、ワックスの主要な構成成分である。種々の天然および合成ワックスは、産業的に重要である。一部の実施形態では、Ｃ１代謝微生物は、天然または合成ワックスの極長鎖脂肪エステルワックス構成成分を産生するように改変される。天然ワックスの例として、蜜ろう、鯨ろう、ホホバ、カルナウバ、虫白蝋（Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｗａｘ）（昆虫ワックス）、カンデリラろうおよび米糠油が挙げられる。蜜ろうの主な構成成分は、極長鎖（Ｃ３０〜Ｃ３２）脂肪族アルコールのパルミチン酸エステル、パルミトレイン酸エステルおよびオレイン酸エステルである。マッコウクジラ油は、パルミチン酸セチル（Ｃ３２）およびミリスチン酸セチル（Ｃ３０）の脂肪ワックスエステル（６５〜９５％）を主に含有する。ホホバ種子油は、Ｃ３８〜Ｃ４４極長鎖脂肪エステルワックスを生成する、２０：１、２２：１および２４：１脂肪アルコールに連結された１８：１、２０：１および２２：１脂肪酸から主になる。カルナウバワックスは、Ｃ４６〜Ｃ５４ワックスエステルを生成する、Ｃ３０〜Ｃ３４アルコールに連結されたＣ１６〜Ｃ２０脂肪酸を構成する極長鎖脂肪ワックスエステルで主に構成される。Ｃｏｃｃｕ  ｃｅｒｉｆｅｒｕｓによって分泌される中国の昆虫ワックスの主要構成成分は、４６〜最大６０個の炭素原子を有する鎖から生成されるワックスエステルであり、大部分のアルコールおよび酸は、２６または２８個の炭素原子を有する。カンデリラろうは、偶数の炭素鎖（Ｃ２８〜Ｃ３４）を有する酸およびアルコールのエステルと共に、奇数の飽和炭化水素（Ｃ２９〜Ｃ３３）から主になる。米糠油は、極長鎖脂肪酸（Ｃ２６〜Ｃ３０）および極長鎖アルコール（Ｃ２６〜Ｃ３０）のエステルを含有する。
【００９８】
極長鎖脂肪アシル−ＣｏＡの改変のための第２の経路は、アルカン生成（脱カルボニル）経路である。ある特定の実施形態では、Ｃ１代謝非光合成微生物は、極長鎖脂肪アルデヒドを生成することができる脂肪アシル−ＣｏＡレダクターゼと、極長鎖アルカンを生成することができるアルデヒドデカルボニラーゼとをコードする核酸分子（複数可）を含み、この場合の極長炭素鎖化合物は、極長鎖アルカンである。第１のステップは、アシル−ＣｏＡレダクターゼによる極長鎖脂肪アシル−ＣｏＡからその相当する極長鎖脂肪アルデヒドへの還元である。アルデヒドデカルボニラーゼによるカルボニル基の除去は、その極長鎖脂肪アシル−ＣｏＡ前駆体よりも１個少ない炭素原子を有する極長鎖アルカンを生成する。アルカン生成（脱カルボニル）経路は、Ｓａｍｕｅｌｓら、２００８年、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ．  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．５９巻：６８３〜７０７頁に記載されている。脂肪アシル−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子は、例えば、ＡＣＲ１およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＣＥＲ３（Ｇｅｎｂａｎｋ受託識別子ＮＭ＿１２５１６４．２）を含む。アルデヒドデカルボニラーゼ遺伝子は、例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＣＥＲ１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託識別子Ｄ６４１５５．１）およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＣＥＲ２２を含む。
【００９９】
アルカンヒドロキシラーゼによる極長鎖アルカンのさらなる改変は、ヒドロキシル基を鎖中央に挿入して、極長鎖脂肪二級アルコールを生成する。ヒドロキシル基置換の位置は、ヒドロキシラーゼの特異性に依存する。ヒドロキシラーゼ遺伝子は、例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＭＡＨ１（ＣＹＰ９６Ａ１５）（Ｇｒｅｅｒら、２００７年、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１４５巻：６５３〜６６７頁；Ｇｅｎｂａｎｋ受託識別子ＮＭ＿００１１２４０３７．１）を含む。
【０１００】
アルコールデヒドロゲナーゼによって触媒される極長鎖脂肪二級アルコールの第２の酸化反応は、極長鎖ケトンを生成する。ある特定の実施形態では、Ｃ１代謝非光合成微生物は、極長鎖脂肪アルデヒドを生成することができる脂肪アシル−ＣｏＡレダクターゼと、極長鎖アルカンを生成することができるアルデヒドデカルボニラーゼと、極長鎖脂肪二級アルコールを生成することができるアルカンヒドロキシラーゼと、極長鎖ケトンを生成することができるアルコールデヒドロゲナーゼとをコードする核酸分子（複数可）を含み、この場合の極長炭素鎖化合物は、極長鎖ケトンである。ＭＡＨ１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託識別子ＮＭ＿００１１２４０３７．１）も、この第２の酸化反応を行うことができる。
【０１０１】
２４炭素単位またはそれに満たない脂肪アシル−ＣｏＡ基質および脂肪酸誘導体を生成するための本明細書に記載されている酵素（例えば、アシル−ＣｏＡレダクターゼ、脂肪アルコール生成アシル−ＣｏＡレダクターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ）を使用して、極長鎖脂肪アシル−ＣｏＡをその誘導体にさらに改変することもできる。
【０１０２】
ある特定の実施形態では、極長炭素鎖化合物は、約Ｃ２５〜Ｃ３０、Ｃ３１〜Ｃ４０、Ｃ４１〜Ｃ６０、Ｃ６１〜Ｃ８０、Ｃ８１〜Ｃ１００、Ｃ１０１〜Ｃ１２０、Ｃ１２１〜Ｃ１４０、Ｃ１４１〜Ｃ１６０、Ｃ１６１〜Ｃ１８０またはＣ１８１〜Ｃ２００の炭素鎖長を有する。代替的な実施形態では、極長炭素鎖化合物は、Ｃ２５〜Ｃ４０、Ｃ２５〜Ｃ５０、Ｃ２５〜Ｃ７５、Ｃ２５〜Ｃ１００、Ｃ２５〜Ｃ１２５、Ｃ２５〜Ｃ１５０、Ｃ２５〜Ｃ１７５またはＣ２５〜Ｃ２００極長炭素鎖化合物である。
【０１０３】
極長鎖脂肪アシル−ＣｏＡを産生する伸長反応のための脂肪アシル−ＣｏＡ基質は、Ｃ１代謝微生物によって内因性に産生することができる。あるいは、Ｃ１代謝微生物は、伸長のための脂肪アシル−ＣｏＡ基質を合成するように生物工学的に作製することができる。関与する脂肪酸生合成経路は、図５〜図１０に図解されている。経路における異なるステップは、異なる酵素によって触媒され、各ステップは、より多くの酵素を産生する遺伝子の過剰発現のための潜在的な場であり、よって、より多くの脂肪酸および脂肪酸誘導体の産生を駆動する。経路に必要とされる酵素をコードする核酸分子は、かかる酵素を欠くＣ１代謝微生物に組換えにより付加することもできる。最後に、所望の生成物の産生を増加させるために、脂肪酸および脂肪酸誘導体の産生をもたらす経路と競合するステップは、減弱または遮断することができる。
【０１０４】
脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）は、アシル鎖の開始および伸長を触媒する酵素の群である（Ｍａｒｒａｋｃｈｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ３０巻：１０５０頁、２００２年）。アシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）は、ＦＡＳ経路において、この酵素と共に、産生される脂肪酸の長さ、飽和の程度および分枝を制御する。この経路におけるステップは、脂肪酸生合成（ｆａｂ）およびアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ａｃｃ）遺伝子ファミリーの酵素によって触媒される。所望の生成物に依存して、これらの遺伝子のうち１種または複数種は、減弱、発現または過剰発現させることができる（各酵素の酵素活性およびその酵素分類番号の描写に関して図５〜図１０を参照）。
【０１０５】
産生宿主における脂肪酸生合成経路は、前駆体アセチル−ＣｏＡおよびマロニル−ＣｏＡを使用する（例えば、図５を参照）。この経路におけるステップは、脂肪酸生合成（ｆａｂ）およびアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ａｃｃ）遺伝子ファミリーの酵素によって触媒される。この経路は、Ｈｅａｔｈら、Ｐｒｏｇ．  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．４０巻：４６７頁、２００１年に記載されている。
【０１０６】
アセチル−ＣｏＡは、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（Ａｃｃ、４種の別々の遺伝子、ａｃｃＡＢＣＤによってコードされるマルチサブユニット酵素）によってカルボキシル化されて、マロニル−ＣｏＡを生成する。マロン酸基は、マロニル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスアシラーゼ（ＦａｂＤ）によってＡＣＰに転移されて、マロニル−ＡＣＰを生成する。次に、縮合反応が起こり、マロニル−ＡＣＰは、アセチル−ＣｏＡと結合し（ｍｅｒｇｅ）、β−ケトアシル−ＡＣＰをもたらす。β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩＩ（ＦａｂＨ）は、ＦＡＳサイクルを開始する一方、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ（ＦａｂＢ）およびβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ（ＦａｂＦ）は、その後のサイクルに関与する。
【０１０７】
次に、ステップのサイクルは、適切な長さの飽和脂肪酸が作製されるまで反復される。先ず、β−ケトアシル−ＡＣＰは、ＮＡＤＰＨによって還元されて、β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰを生成する。このステップは、β−ケトアシル−ＡＣＰレダクターゼ（ＦａｂＧ）によって触媒される。次に、β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰが脱水されて、トランス−２−エノイル−ＡＣＰを生成する。β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰデヒドラターゼ／イソメラーゼ（ＦａｂＡ）またはβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰデヒドラターゼ（ＦａｂＺ）は、このステップを触媒する。ＮＡＤＰＨ依存性トランス−２−エノイル−ＡＣＰレダクターゼＩ、ＩＩまたはＩＩＩ（それぞれＦａｂＩ、ＦａｂＫおよびＦａｂＬ）は、トランス−２−エノイル−ＡＣＰを還元して、アシル−ＡＣＰを生成する。その後のサイクルは、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩまたはβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ（それぞれＦａｂＢおよびＦａｂＦ）による、アシル−ＡＣＰとマロニル−ＡＣＰとの縮合によって開始される。
【０１０８】
本明細書に記載されているＣ１代謝微生物は、アセチル−ＣｏＡおよびマロニル−ＣｏＡを過剰産生するように操作することができる。Ｃ１代謝微生物に対し、数種類の異なる改変を組み合わせてまたは個々に為して、アセチル−ＣｏＡ／マロニル−ＣｏＡ／脂肪酸、脂肪酸誘導体産生および極長炭素鎖化合物産生の増加を得ることができる。
【０１０９】
例えば、アセチル−ＣｏＡ産生を増加させるために、Ｃ１代謝微生物において次の遺伝子のうち１種または複数種を発現させることができる：ｐｄｈ、ｐａｎＫ、ａｃｅＥＦ（ピルビン酸および２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体のＥ１ｐデヒドロゲナーゼ構成成分およびＥ２ｐジヒドロリポアミドアシルトランスフェラーゼ構成成分をコードする）、ｆａｂＨ、ｆａｂＤ、ｆａｂＧ、ａｃｐＰまたはｆａｂＦ。他の例において、脂肪アシル−ＣｏＡレダクターゼおよびアルデヒドデカルボニラーゼをコードする追加的なＤＮＡ配列を、Ｃ１代謝微生物において発現させることができる。全て構成的または他の方法で制御可能なプロモーターの制御下の、上述の遺伝子のうち１種または複数種を含有するプラスミドを構築することができることは、当該分野で周知である。これらの遺伝子の例示的なＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、ｐｄｈ（ＢＡＢ３４３８０、ＡＡＣ７３２２７、ＡＡＣ７３２２６）、ｐａｎＫ（ｃｏａＡとしても公知、ＡＡＣ７６９５２）、ａｃｅＥＦ（ＡＡＣ７３２２７、ＡＡＣ７３２２６）、ｆａｂＨ（ＡＡＣ７４１７５）、ｆａｂＤ（ＡＡＣ７４１７６）、ｆａｂＧ（ＡＡＣ７４１７７）、ａｃｐＰ（ＡＡＣ７４１７８）、ｆａｂＦ（ＡＡＣ７４１７９）である。
【０１１０】
その上、ｆａｄＥ、ｇｐｓＡ、ｌｄｈＡ、ｐｆｌｂ、ａｄｈＥ、ｐｔａ、ｐｏｘＢ、ａｃｋＡまたはａｃｋＢの発現レベルは、相当する遺伝子のヌルもしくは欠失変異を含有する条件的複製または非複製プラスミドによる形質転換により、またはプロモーターもしくはエンハンサー配列の置換により、操作された微生物において低下、阻害またはノックアウトさせることができる。これらの遺伝子の例示的なＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、ｆａｄＥ（ＡＡＣ７３３２５）、ｇｓｐＡ（ＡＡＣ７６６３２）、ｌｄｈＡ（ＡＡＣ７４４６２）、ｐｆｌｂ（ＡＡＣ７３９８９）、ａｄｈＥ（ＡＡＣ７４３２３）、ｐｔａ（ＡＡＣ７５３５７）、ｐｏｘＢ（ＡＡＣ７３９５８）、ａｃｋＡ（ＡＡＣ７５３５６）およびａｃｋＢ（ＢＡＢ８１４３０）である。その結果得られる操作されたＣ１代謝微生物は、Ｃ１基質原料による等、適切な環境において成長させた場合、増加したアセチル−ＣｏＡ産生レベルを有する。
【０１１１】
さらに、マロニル−ＣｏＡ過剰産生は、ｄｅ  ｎｏｖｏ合成されたプラスミドに含まれるａｃｃＡＢＣＤ（例えば、受託番号ＡＡＣ７３２９６、ＥＣ６．４．１．２）により、本明細書に記載されているＣ１代謝微生物を操作することにより影響され得る。脂肪酸過剰産生は、ｄｅ  ｎｏｖｏ合成されたプラスミドにおいてリパーゼ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＣＡＡ８９０８７、ＣＡＡ９８８７６）をコードする核酸分子をさらに含めることにより達成することができる。
【０１１２】
その結果、いくつかの例では、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼが過剰発現されて、その細胞内濃度を、未変性発現レベルと比べて少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも約５倍またはより好ましくは少なくとも約１０倍増加させる。
【０１１３】
一部の実施形態では、ｐｌｓＢ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＣ７７０１１）Ｄ３１１Ｅ変異を使用して、利用できるアシル−ＣｏＡの量を増加させることができる。さらなる実施形態では、Ｃ１代謝微生物においてｓｆａ遺伝子（ＦａｂＡのサプレッサー、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＮ７９５９２）の過剰発現が含まれて、モノ不飽和脂肪酸の産生を増加させることができる（Ｒｏｃｋら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７８巻：５３８２頁、１９９６年）。
【０１１４】
本明細書に記載されている通り、アセチル−ＣｏＡおよびマロニル−ＣｏＡは、いくつかのステップにおいてプロセシングされて、アシル−ＡＣＰ鎖を生成する。酵素ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＰｌｓＢ）は、アシル−ＡＣＰまたはアシル−ＣｏＡからグリセロール−３−リン酸のｓｎ−１位へのアシル基の転移を触媒する。よって、ＰｌｓＢは、脂肪酸経路の一部であるリン脂質合成における鍵となる調節酵素である。ＰｌｓＢの阻害は、長鎖アシル−ＡＣＰのレベルの増加をもたらし、このフィードバックは、経路における初期ステップを阻害する（例えば、ａｃｃＡＢＣＤ、ｆａｂＨおよびｆａｂＩ）。例えば、チオエステラーゼ過剰発現によるこの調節のアンカップリングは、脂肪酸産生の増加をもたらす。ｔｅｓおよびｆａｔ遺伝子ファミリーは、チオエステラーゼを発現する。長鎖アシル−ＣｏＡによってｉｎ  ｖｉｔｒｏでＦａｂＩも阻害される。
【０１１５】
脂肪酸誘導体の均一なまたは混合型集団の産生のためにＣ１代謝微生物を操作するために、１種または複数種の内因性遺伝子を減弱、阻害または機能的に欠失させることができ、その結果、１種または複数種のチオエステラーゼを発現させることができる。例えば、Ｃ１０脂肪酸誘導体は、Ｃ１８：１−ＡＣＰを使用するチオエステラーゼＣ１８（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＣ７３５９６およびＰ０ＡＤＡ１）を減弱し、同時に、Ｃ１０−ＡＣＰを使用するチオエステラーゼＣ１０（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｑ３９５１３）を発現させることにより産生することができる。これは、炭素鎖長１０を有する脂肪酸誘導体の相対的に均一な集団をもたらす。別の例において、Ｃ１４脂肪酸誘導体は、非Ｃ１４脂肪酸を産生する内因性チオエステラーゼを減弱し、チオエステラーゼ受託番号Ｑ３９４７３（Ｃ１４−ＡＣＰを使用する）を発現させることにより産生することができる。さらに別の例において、Ｃ１２脂肪酸誘導体は、Ｃ１２−ＡＣＰを使用するチオエステラーゼ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｑ４１６３５）を発現させ、非Ｃ１２脂肪酸を産生するチオエステラーゼを減弱することにより産生することができる。よって、Ｃ１代謝微生物は、ＫＣＳによって開始されるその後伸長反応のための基質として、好まれる鎖長（複数可）の脂肪アシル−ＣｏＡを産生するように操作することができる。アセチル−ＣｏＡ、マロニル−ＣｏＡおよび脂肪酸過剰産生は、当該分野で公知の方法を使用して、例えば、細胞溶解後の放射性前駆体、ＨＰＬＣおよびＧＣ−ＭＳを使用することにより検証することができる。請求されている方法および本開示のＣ１代謝微生物において有用なチオエステラーゼの非限定例は、米国特許第８，２８３，１４３号の表１に収載されており、この表は、これによりその全体が本明細書中に参考として援用される。
【０１１６】
アシル−ＣｏＡシンターゼ（ＡＣＳ）は、二段階機構により、遊離脂肪酸をエステル化してアシル−ＣｏＡとする。遊離脂肪酸は先ず、ＡＴＰの加ピロリン酸分解（ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｏｌｙｓｉｓ）によりアシル−ＡＭＰ中間体（アデニラート）に変換される。次に、アデニラートの活性化カルボニル炭素は、ＣｏＡのチオール基にカップリングさせ、ＡＭＰおよびアシル−ＣｏＡ最終生成物を放出する。Ｓｈｏｃｋｅｙら、Ｐｌａｎｔ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２９巻：１７１０頁、２００２年を参照されたい。
【０１１７】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＣＳ酵素ＦａｄＤおよび脂肪酸輸送タンパク質ＦａｄＬは、脂肪酸取り込み系の必須構成成分である。ＦａｄＬは、細菌細胞への脂肪酸の輸送を媒介し、ＦａｄＤは、アシル−ＣｏＡエステルの生成を媒介する。他の炭素源が利用できない場合、外因性脂肪酸が、細菌によって取り入れられ、アシル−ＣｏＡエステルに変換され、これは転写因子ＦａｄＲに結合し、脂肪酸輸送（ＦａｄＬ）、活性化（ＦａｄＤ）およびβ−酸化（ＦａｄＡ、ＦａｄＢ、ＦａｄＥおよびＦａｄＨ）の原因となるタンパク質をコードするｆａｄ遺伝子の発現を抑制解除する。代替的な炭素源が利用できる場合、細菌は、リン脂質合成に使用されるがβ−酸化のための基質ではないアシル−ＡＣＰとして脂肪酸を合成する。よって、アシル−ＣｏＡおよびアシル−ＡＣＰは両者共に、異なる最終生成物をもたらす脂肪酸の独立的な供給源である。Ｃａｖｉｇｌｉａら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２７９巻：１１６３頁、２００４年を参照されたい。
【０１１８】
公知ポリペプチドをコードする核酸分子を使用してＣ１代謝微生物を操作して、様々な長さの脂肪酸を産生し、次にこれをアシル−ＣｏＡおよび最終的に極長炭素鎖化合物に変換することができる。極長炭素鎖化合物を作製する一方法は、１種または複数種のアシル−ＣｏＡシンターゼペプチド（ＥＣ６．２．１．−）の発現の増加またはそのより多くの活性型の発現をもたらす。アシル−ＣｏＡおよび脂肪酸誘導体を産生するために発現させることができるアシル−ＣｏＡシンターゼのリストは、米国特許第８，２８３，１４３号の表２に示されており、この表は、これによりその全体が本明細書中に参考として援用される。これらのアシル−ＣｏＡシンターゼを使用して、基質として脂肪アシル−ＣｏＡを使用するいずれかの経路を改善することができる。
【０１１９】
アシル−ＣｏＡは、ＮＡＤＨ依存性アシル−ＣｏＡレダクターゼ（例えば、Ａｃｒ１）によって脂肪アルデヒドに還元される。次に、脂肪アルデヒドは、ＮＡＤＰＨ依存性アルコールデヒドロゲナーゼ（例えば、ＹｑｈＤ）によって脂肪アルコールに還元される。あるいは、脂肪アルコール生成アシル−ＣｏＡレダクターゼ（ＦＡＲ）は、アシル−ＣｏＡから脂肪アルコールおよびＣｏＡＳＨへの還元を触媒する。ＦＡＲは、この４電子還元における補因子としてＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを使用する。アルコール生成ＦＡＲ反応は、アルデヒド中間体を経て進むが、遊離アルデヒドは放出されない。よって、アルコール生成ＦＡＲは、アシル−ＣｏＡの２電子還元を行い、生成物として遊離脂肪アルデヒドを生じる酵素とは別個である（ＣｈｅｎｇおよびＲｕｓｓｅｌｌ、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２７９巻：３７７８９頁、２００４年；Ｍｅｔｚら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２２巻：６３５頁、２０００年を参照）。
【０１２０】
Ｃ１代謝微生物は、公知ポリペプチドを使用して、アシル−ＣｏＡから脂肪アルコールを産生するように操作することができる。脂肪アルコールを作製する一方法は、脂肪アルコール生成アシル−ＣｏＡレダクターゼ（ＦＡＲ由来のａｃｒ１等の遺伝子によってコードされる、ＥＣ１．２．１．５０／１．１．１）またはアシル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．５０）およびアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１）の発現の増加またはそのより多くの活性型の発現をもたらす。例示的なＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、米国特許第８，２８３，１４３号の図１に収載されており、この図は、これによりその全体が本明細書中に参考として援用される。
【０１２１】
脂肪アルコールは、炭化水素に基づく界面活性物質として記載することができる。界面活性物質産生のため、Ｃ１代謝微生物は、Ｃ１基質原料から界面活性物質を産生するように改変される。かかるＣ１代謝微生物は、脂肪酸を脂肪アルデヒドに変換することができるタンパク質をコードする第１の外因性核酸分子と、脂肪アルデヒドをアルコールに変換することができるタンパク質をコードする第２の外因性核酸分子とを含む。いくつかの例では、第１の外因性核酸分子は、脂肪酸レダクターゼ（ＦＡＲ）をコードする。一実施形態では、第２の外因性核酸分子は、哺乳動物ミクロソームアルデヒドレダクターゼまたは長鎖アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする。さらなる例において、第１および第２の外因性核酸分子は、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ＡＫ  １９、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｎｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．Ｍ−１またはＣａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａに由来する。一実施形態では、第１および第２の異種核酸分子は、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．Ｍ−１またはＣａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来の多酵素複合体に由来する。
【０１２２】
界面活性物質産生において使用することができる、脂肪酸から長鎖アルコールに変換するタンパク質をコードする異種核酸分子の追加的な供給源は、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ（ＡＴＣＣ  ３２２２２）、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ（Ａｐｉｏｔｒｉｃｕｍ  ｃｕｒｖａｔｕｍとも称される）、Ａｋａｎｉｖｏｒａｘ  ｊａｄｅｎｓｉｓ（Ｔ９Ｔ＝ＤＳＭ  １２７１８＝ＡＴＣＣ  ７００８５４）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．ＨＯ１−Ｎ（ＡＴＣＣ  １４９８７）およびＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ（ＰＤ６３０  ＤＳＭＺ  ４４１９３）を含む。
【０１２３】
一例において、脂肪酸誘導体は、約８〜約２４炭素原子、約８〜約１８炭素原子、約８〜約１４炭素原子、約１０〜約１８炭素原子または約１２〜約１６炭素原子の炭素鎖長を有する飽和または不飽和界面活性物質生成物である。別の例において、界面活性物質生成物は、約１０〜約１４炭素原子または約１２〜約１４炭素原子の炭素鎖長を有する。
【０１２４】
界面活性物質の産生に適切なＣ１代謝微生物は、真核生物または原核生物微生物のいずれかであってよい。アセチルＣｏＡカルボキシラーゼを発現するように操作されたメタン生成菌等、脂肪酸誘導体の形態のＣ１原料から高レベルの界面活性物質前駆体を合成する生得的な能力を実証するＣ１代謝微生物が使用される。
【０１２５】
産生宿主は、公知ポリペプチドを使用して、様々な長さの脂肪エステルを産生するように操作することができる。脂肪エステルを作製する一方法は、１種または複数種のアルコールＯ−アセチルトランスフェラーゼペプチド（ＥＣ２．３．１．８４）の発現を増加させること、またはそのより多くの活性型を発現させることを含む。このようなペプチドは、アセチル−ＣｏＡおよびアルコールをＣｏＡおよびエステルに変換することにより、アルコールのアセチル化を触媒する。いくつかの例では、アルコールＯ−アセチルトランスフェラーゼペプチドは、選択されたチオエステラーゼペプチド、ＦＡＳペプチドおよび脂肪アルコール生成ペプチドと併せて発現させ、これにより、炭素鎖長、飽和および分枝の程度を制御することができる。いくつかの事例において、ｂｋｄオペロンを共発現させて、分枝状脂肪酸前駆体を産生させることができる。
【０１２６】
本明細書中で使用する場合、アルコールＯ−アセチルトランスフェラーゼペプチドは、酵素分類番号ＥＣ２．３．１．８４のペプチドと共に、アセチル−ＣｏＡおよびアルコールの変換を触媒してＣｏＡおよびエステルを生成することができる他のいずれかのペプチドを含む。その上、当業者であれば、アルコールＯ−アセチルトランスフェラーゼペプチドが、他の反応を触媒することを認められよう。
【０１２７】
例えば、いくつかのアルコールＯ−アセチルトランスフェラーゼペプチドは、他のアルコールおよび他のアシル−ＣｏＡチオエステル等、脂肪アルコールまたはアセチル−ＣｏＡチオエステルに加えて他の基質を受け入れる。したがって、かかる非特異的または多岐にわたる特異性アルコールＯ−アセチルトランスフェラーゼペプチドも含まれる。アルコールＯ−アセチルトランスフェラーゼペプチド配列は、公的に入手可能であり、例示的なＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、米国特許第８，２８３，１４３号の図１に収載されており、この図は、これによりその全体が本明細書中に参考として援用される。特定のアルコールＯ−アセチルトランスフェラーゼペプチドの活性を特徴付けるためのアッセイは、当該分野で周知である。Ｏ−アシルトランスフェラーゼは、ドナーアシル基またはアクセプターアルコール部分に対する新たな活性および特異性を有するように操作することができる。操作された酵素は、十分に裏付けられた合理的および進化的アプローチにより生成することができる。
【０１２８】
脂肪エステルは、エステル結合により脂肪アシル−ＣｏＡに長鎖脂肪アルコールをコンジュゲートする、アシル−ＣｏＡ：脂肪アルコールアシルトランスフェラーゼ（例えば、エステルシンターゼ）によって合成される。エステルシンターゼおよびコード遺伝子は、ホホバ植物および細菌Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．ＡＤＰ１（以前はＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ  ＡＤＰ１）由来が公知である。細菌エステルシンターゼは、エステルシンターゼ活性ならびにジアシルグリセロール基質および脂肪アシル−ＣｏＡからトリアシルグリセロールを生成する能力（アシル−ＣｏＡ：ジグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）活性）を示す二官能性酵素である。遺伝子ｗａｘ／ｄｇａｔは、エステルシンターゼおよびＤＧＡＴの両方をコードする。Ｃｈｅｎｇら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２７９巻：３７７９８頁、２００４年；ＫａｌｓｃｈｅｕｅｒおよびＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２７８巻：８０７５頁、２００３年を参照されたい。エステルシンターゼを使用して、ある特定の脂肪エステルを産生することもできる。
【０１２９】
アシル−ＣｏＡおよびアルコールからのワックスを含む脂肪エステルの産生は、公知ポリペプチドを使用して操作することができる。脂肪エステルを作製する一方法は、１種または複数種のエステルシンターゼ（ＥＣ２．３．１．２０、２．３．１．７５）の発現を増加させること、またはそのより多くの活性型を発現させることを含む。エステルシンターゼペプチド配列は、公的に入手可能であり、例示的なＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、米国特許第８，２８３，１４３号の図１に収載されており、この図は、これによりその全体が本明細書中に参考として援用される。エステルシンターゼ活性を同定するための方法は、米国特許第７，１１８，８９６号に提示されている。
【０１３０】
特定の例において、所望の生成物が、脂肪酸エステルワックスである場合、Ｃ１代謝微生物は、エステルを産生するように改変される。かかるＣ１代謝微生物は、Ｃ１代謝微生物に、Ｃ１基質原料から飽和、不飽和または分枝状脂肪エステルを合成する能力を付与するように発現される、エステルシンターゼをコードする外因性核酸分子を含む。一部の実施形態では、Ｃ１代謝微生物は、次の例示的なタンパク質：脂肪酸エロンガーゼ、アシル−ＣｏＡレダクターゼ、アシルトランスフェラーゼ、エステルシンターゼ、脂肪アシルトランスフェラーゼ、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、アシル−ｃｏＡワックスアルコールアシルトランスフェラーゼまたはこれらのいずれかの組合せをコードする核酸分子を発現することもできる。代替実施形態において、Ｃ１代謝微生物は、二官能性エステルシンターゼ／アシル−ＣｏＡ：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼをコードする核酸分子を含む。例えば、二官能性エステルシンターゼ／アシル−ＣｏＡ：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼは、Ｓｉｍｍｏｎｄｓｉａ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．ＡＤＰ１（以前はＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ  ＡＤＰ１）、Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ  ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｆｕｎｄｉｂａｃｔｅｒ  ｊａｄｅｎｓｉｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａまたはＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ（後に、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａと新たに命名）由来の多酵素複合体から選択することができる。一実施形態では、脂肪酸エロンガーゼ、アシル−ＣｏＡレダクターゼまたはワックスシンターゼは、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａまたはワックスもしくは脂肪エステル等、エステルを産生することが文献において公知の他の生物由来の多酵素複合体に由来する。
【０１３１】
脂肪エステル産生において有用なエステル合成タンパク質をコードする異種核酸分子の追加的な供給源は、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ（例えば、ＡＴＣＣ  ３２２２２）、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ（Ａｐｉｏｔｒｉｃｕｍ  ｃｕｒｖａｔｕｍとも称される）、Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ  ｊａｄｅｎｓｉｓ（例えば、Ｔ９Ｔ＝ＤＳＭ  １２７１８＝ＡＴＣＣ  ７００８５４）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．ＨＯ１−Ｎ（例えば、ＡＴＣＣ  １４９８７）およびＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ（例えば、ＰＤ６３０、ＤＳＭＺ  ４４１９３）を含む。一例において、遺伝子座ＡＡ０１７３９１におけるＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．ＡＤＰ１由来のエステルシンターゼ（ＫａｌｓｃｈｅｕｅｒおよびＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２７８巻：８０７５頁、２００３年に記載）が使用される。別の例において、遺伝子座ＡＡＤ３８０４１におけるＳｉｍｍｏｎｄｓｉａ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ由来のエステルシンターゼが使用される。
【０１３２】
任意選択で、ＦＡＴＰファミリーのメンバー等、エステル排出輸送体（ｅｘｐｏｒｔｅｒ）を使用して、細胞外環境へのエステルの放出を容易にすることができる。使用することができるエステル排出輸送体の非限定例は、遺伝子座ＮＰ＿５２４７２３におけるＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ由来の脂肪酸（長鎖）輸送タンパク質ＣＧ７４００−ＰＡ、アイソフォームＡである。
【０１３３】
輸送タンパク質は、Ｃ１代謝微生物外に脂肪酸誘導体を輸出する。多くの輸送および流出タンパク質は、多種多様な化合物の排出に役立ち、特定の種類の脂肪酸誘導体に対し選択的となるように天然に改変することができる。適した輸送タンパク質の非限定例は、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）輸送タンパク質、流出タンパク質および脂肪酸輸送体タンパク質（ＦＡＴＰ）である。適した輸送タンパク質の追加的な非限定例として、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌａｎｉａ、Ａｌｋａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ等の生物由来のＡＢＣ輸送タンパク質が挙げられる。使用することができる例示的なＡＢＣ輸送タンパク質は、ＣＥＲ５、ＡｔＭＲＰ５、ＡｍｉＳ２またはＡｔＰＧＰ１である。好まれる実施形態では、ＡＢＣ輸送タンパク質は、ＣＥＲ５（例えば、ＡＹ７３４５４２）である。適した輸送タンパク質を発現する遺伝子を含有するベクターをタンパク質産生宿主に挿入して、脂肪酸誘導体の放出を増加させることができる。
【０１３４】
Ｃ１代謝微生物は、脂肪酸誘導体を放出するその内因性能力のために選択することもできる。生成物産生および発酵ブロスへの放出の効率は、細胞内生成物対細胞外生成物の比として表現することができる。いくつかの例では、比は、約５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４または１：５であってよい。
【０１３５】
特定の枝分かれ個所、飽和のレベル、炭素鎖長およびエステル特徴を有する脂肪酸誘導体を所望の通りに産生することができる。特定の誘導体を天然に産生するＣ１代謝微生物を初期宿主細胞として選択することができる。あるいは、特定の脂肪酸誘導体を産生する酵素を発現する遺伝子を、本明細書に記載されている通り、Ｃ１代謝微生物に挿入することができる。
【０１３６】
いくつかの例では、異なる種または操作されたバリアントに起源をもつ外因性ＦＡＳ遺伝子の発現をＣ１代謝微生物に導入して、未変性宿主細胞のものとは構造的に異なる（長さ、分枝、不飽和の程度等において）脂肪酸の生合成を可能にすることができる。このような異種遺伝子生成物は、宿主細胞における天然の調節機構による影響を受けないように選択または操作することもでき、したがって、所望の商業製品の産生の制御を可能にする。例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ、油性酵母など由来のＦＡＳ酵素を、本開示のＣ１代謝微生物において発現させることができる。かかる外因性酵素の発現は、産生される脂肪酸および最終的には脂肪酸誘導体の構造を変更する。
【０１３７】
Ｃ１代謝微生物が、特異的なレベルの不飽和、分枝または炭素鎖長を有する脂肪酸を産生するように操作されると、その結果得られる操作された脂肪酸は、脂肪酸誘導体の産生において使用することができる。かかるＣ１代謝微生物から生成された脂肪酸誘導体は、操作された脂肪酸の特徴を呈することができる。
【０１３８】
例えば、産生宿主は、分枝状、短鎖脂肪酸を作製するように操作することができ、これを次に産生宿主が使用して、分枝状、短鎖脂肪アルコールを産生することができる。同様に、定義されたレベルの分枝、不飽和または炭素鎖長を有する脂肪酸を産生するように産生宿主を操作することにより、炭化水素を産生することができ；よって、均一な炭化水素集団を産生することができる。追加的なステップを用いて、得られる生成物の均一性を改善することができる。例えば、不飽和アルコール、脂肪エステルまたは炭化水素が所望の場合、Ｃ１代謝微生物は、低レベルの飽和脂肪酸を産生するように操作することができ、加えて、飽和生成物の産生を低減または低下させるために、追加的なデサチュラーゼを発現するように改変することができる。
【０１３９】
脂肪酸は、脂肪酸誘導体の産生における鍵となる中間体である。分枝状または環状脂肪酸を使用して脂肪酸誘導体を作製することにより、脂肪酸誘導体は、枝分かれ個所、環状部分およびこれらの組合せを含有するように産生することができる。
【０１４０】
例えば、Ｃ１代謝微生物は、直鎖脂肪酸を天然に産生することができる。分枝鎖脂肪酸を産生するようにＣ１代謝微生物を操作するために、分枝状前駆体をもたらす数種類の遺伝子（例えば、ｂｋｄオペロン）をＣ１代謝微生物（例えば、メタン生成菌）に導入し、発現させて、分枝状前駆体（例えば、ｆａｂＨ）から脂肪酸生合成を開始させることができる。ｂｋｄ、ｉｌｖ、ｉｃｍおよびｆａｂ遺伝子ファミリーを発現または過剰発現させて、分枝鎖脂肪酸誘導体を産生することができる。同様に、環状脂肪酸を産生するために、環状前駆体をもたらす遺伝子を産生宿主に導入し、発現させて、環状前駆体から脂肪酸生合成を開始させることができる。ａｎｓ、ｃｈｃおよびｐｌｍ遺伝子ファミリーを発現または過剰発現させて、環状脂肪酸を産生することができる。本方法および本開示のＣ１代謝微生物において使用することができるこれらの遺伝子ファミリーにおける遺伝子の非限定例は、米国特許第８，２８３，１４３号（図１、この図は、本明細書中に参考として援用される）に収載されている。
【０１４１】
その上、産生宿主は、分枝状脂肪酸の伸長のためのタンパク質をコードする遺伝子（例えば、ＡＣＰ、ＦａｂＦ等）を発現するように、または直鎖脂肪酸を正常にもたらす相当する遺伝子を欠失もしくは減弱させるように操作することができる。この点に関して、導入された遺伝子（例えば、ｆａｂＨ、ｆａｂＦ）と競合する内因性遺伝子は、欠失、阻害または減弱される。
【０１４２】
分枝状アシル−ＣｏＡ（例えば、２−メチル−ブチリル−ＣｏＡ、イソバレリル−ＣｏＡ、イソブチリル−ＣｏＡ等）は、分枝状脂肪酸の前駆体である。分枝状脂肪酸を含有する大部分の微生物において、分枝状脂肪酸は、分枝状アミノ酸（例えば、イソロイシン、ロイシンおよびバリン）から２ステップで合成される（Ｋａｄｅｎａ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．５５巻：２８８頁、１９９１年）。Ｃ１代謝微生物は、これら２ステップに関与する酵素のうち１種または複数種を発現または過剰発現するように操作して、分枝状脂肪酸誘導体を産生する、または分枝状脂肪酸誘導体を過剰産生することができる。例えば、Ｃ１代謝微生物は、分枝状脂肪酸誘導体をもたらす１ステップを達成することができる内因性酵素を有することができ；したがって、第２のステップに関与する酵素をコードする遺伝子のみを、組換えにより導入する必要がある。
【０１４３】
分枝状脂肪酸誘導体の生成における第１のステップは、分枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼによる、相当するα−ケト酸の産生である。メタン資化性菌等、Ｃ１代謝微生物は、かかる酵素をコードする遺伝子を内因性に含むことができる、またはかかる遺伝子は、組換えにより導入することができる。いくつかのＣ１代謝微生物において、異種分枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼは、発現されなくてもよい。したがって、ある特定の実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＩｌｖＥまたは他のいずれかの分枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（例えば、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ由来のＩｌｖＥ（ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＡＦ３４４０６）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ由来のＩｌｖＥ（ＧｅｎＢａｎｋ受託ＮＰ＿７４５６４８）またはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ由来のＩｌｖＥ（ＧｅｎＢａｎｋ受託ＮＰ＿６２９６５７））を、本開示のＣ１代謝微生物に導入することができる。アミノトランスフェラーゼ反応が、選択されたＣ１代謝微生物の分枝状脂肪酸生合成において律速である場合、アミノトランスフェラーゼを過剰発現させることができる。
【０１４４】
第２のステップは、α−ケト酸から相当する分枝鎖アシル−ＣｏＡへの酸化的脱カルボキシル化である。この反応は、Ｅ１α／β（デカルボキシラーゼ）、Ｅ２（ジヒドロリポイルトランスアシラーゼ）およびＥ３（ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ）サブユニットを含む、分枝鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ複合体（ｂｋｄ；ＥＣ１．２．４．４．）によって触媒することができる（Ｄｅｎｏｙａら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７巻：３５０４頁、１９９５年）。このような分枝鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ複合体は、ピルビン酸およびα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体と同様である。分枝状脂肪酸を保有するまたは分枝鎖アミノ酸で成長するあらゆる微生物を供給源として使用して、メタン資化性菌等、Ｃ１代謝微生物における発現のためのｂｋｄ遺伝子を単離することができる。さらに、Ｃ１代謝微生物が、そのピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体（ｌｐｄ、ＥＣ１．８．１．４）の一部としてＥ３構成成分を有する場合、次にＥ１α／βおよびＥ２  ｂｋｄ遺伝子を発現させることのみで十分であり得る。
【０１４５】
別の例において、イソブチリル−ＣｏＡは、クロトニル−ＣｏＡレダクターゼ（Ｃｃｒ、ＥＣ１．６．５．５、１．１．１．１）およびイソブチリル−ＣｏＡムターゼ（大サブユニットＩｃｍＡ、ＥＣ５．４．９９．２；小サブユニットＩｃｍＢ、ＥＣ５．４．９９．２）の共発現により、Ｃ１代謝微生物、例えば、メタン資化性菌において作製することができる（ＨａｎおよびＲｅｙｎｏｌｄｓ、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９巻：５１５７頁、１９９７年）。クロトニル−ＣｏＡは、Ｅ．ｃｏｌｉおよび他の微生物の脂肪酸生合成における中間体である。
【０１４６】
ｂｋｄ遺伝子の発現に加えて、ｂｒＦＡ生合成の開始は、分枝鎖アシル−ＣｏＡに対し特異性を有するβ−ケトアシル−アシルキャリアータンパク質シンターゼＩＩＩ（ＦａｂＨ、ＥＣ２．３．１．４１）を利用する（Ｌｉら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８７巻：３７９５頁、２００５年）。いずれかの分枝状脂肪酸含有微生物の脂肪酸生合成に関与するｆａｂＨ遺伝子は、本開示のＣ１代謝微生物において発現させることができる。分枝状脂肪酸またはその誘導体を天然に作製しない産生宿主由来のＢｋｄおよびＦａｂＨ酵素は、分枝状脂肪酸産生を支持し得ない；したがって、ＢｋｄおよびＦａｂＨは、組換えにより発現することができる。ｂｋｄおよびｆａｂＨ遺伝子を含有するベクターをかかるＣ１代謝微生物に挿入することができる。同様に、ＢｋｄおよびＦａｂＨ産生の内因性レベルは、分枝状脂肪酸誘導体の産生に十分ではない場合があるため、ある特定の実施形態では、これらは過剰発現される。その上、アシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）およびβ−ケトアシル−アシルキャリアータンパク質シンターゼＩＩ（ｆａｂＦ、ＥＣ２．３．１．４１）等、脂肪酸生合成経路の他の構成成分を発現または過剰発現させることができる。これらの遺伝子の発現に加えて、内因性脂肪酸生合成経路におけるいくつかの遺伝子を、本開示のＣ１代謝微生物において減弱させることができる。基質に関してｂｒＦＡ産生をもたらす経路の酵素と競合する酵素をコードする遺伝子を減弱または阻害して、分枝状脂肪酸誘導体産生を増加させることができる。
【０１４７】
上述の通り、分枝鎖アルコールは、分枝状脂肪酸合成およびアルコール合成を支持する発現遺伝子の組合せにより産生することができる。例えば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｙｌｙｉ  ＡＤＰ１由来のＡｃｒ１等、アルコールレダクターゼが、ｂｋｄオペロンと共発現される場合、本開示のＣ１代謝微生物は、イソペンタノール、イソブタノールまたは２−メチルブタノールを合成することができる。同様に、Ａｃｒ１が、ｃｃｒ／ｉｃｍ遺伝子と共発現される場合、本開示のＣ１代謝微生物は、イソブタノールを合成することができる。
【０１４８】
メタン資化性菌等、本開示のＣ１代謝微生物を、ω−環状脂肪酸（ｃｙＦＡ）を合成することができる生物に変換するために、環状前駆体シクロヘキシルカルボニル−ＣｏＡ（ＣＨＣ−ＣｏＡ）（Ｃｒｏｐｐら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８巻：９８０頁、２０００年）をもたらす遺伝子を本開示のＣ１代謝微生物において導入し、発現させる。
【０１４９】
ＣＨＣ−ＣｏＡをもたらす遺伝子の非限定例として、Ｓ．ｃｏｌｌｉｎｕｓ、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓまたはＳ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ由来のｃｈｃＢ遺伝子（Ｐａｔｔｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３９巻：７５９５頁、２０００年）と共に、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｌｌｉｎｕｓのアンサトリエニン（ａｎｓａｔｒｉｅｎｉｎ）遺伝子クラスター由来のａｎｓＪ、ａｎｓＫ、ａｎｓＬ、ｃｈｃＡおよびａｎｓＭ（Ｃｈｅｎら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６１巻：９８頁、１９９９年）、またはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＨＫ８０３のホスラクトマイシン（ｐｈｏｓｌａｃｔｏｍｙｃｉｎ）Ｂ遺伝子クラスター由来のｐｌｍＪ、ｐｌｍＫ、ｐｌｍＬ、ｃｈｃＡおよびｐｌｍＭ（Ｐａｌａｎｉａｐｐａｎら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２７８巻：３５５５２頁、２００３年）が挙げられる。ＦａｂＨ、ＡＣＰおよびｆａｂＦ遺伝子を発現させて、共環状（ｃｏ−ｃｙｃｌｉｃ）脂肪酸を開始および伸長させることができる。あるいは、相同遺伝子は、ｃｙＦＡを作製する微生物から単離し、本開示のＣ１代謝微生物において発現させることができる。
【０１５０】
遺伝子ｆａｂＨ、ａｃｐおよびｆａｂＦは、幅広い基質特異性を有することができるため、ω−環状脂肪酸を開始および伸長させるのに十分である。これらの遺伝子のいずれかと、ａｎｓＪＫＬＭ／ｃｈｃＡＢまたはｐｍｌＪＫＬＭ／ｃｈｃＡＢ遺伝子との共発現が、ｃｙＦＡを生じない場合、ｃｙＦＡを作製する微生物由来のｆａｂＨ、ａｃｐまたはｆａｂＦホモログを単離（例えば、縮重ＰＣＲプライマーまたは異種ＤＮＡ配列プローブを使用することにより）および共発現することができる。
【０１５１】
脂肪酸は、脂肪酸誘導体の産生における鍵となる中間体である。脂肪酸誘導体における飽和の程度は、脂肪酸中間体の飽和の程度を調節することにより制御することができる。遺伝子のｓｆａ、ｇｎｓおよびｆａｂファミリーを発現または過剰発現させて、脂肪酸の飽和を制御することができる。本方法においておよび本開示のＣ１代謝微生物と共に使用することができるこれらの遺伝子ファミリーにおける遺伝子の非限定例は、米国特許第８，２８３，１４３号の図１に収載されており、この図は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０１５２】
本開示のＣ１代謝微生物は、ｆａｂＢを過剰発現するようにＣ１代謝微生物（例えば、メタン資化性菌）を操作することにより、またはＣ１代謝微生物を低温（例えば、３７℃未満）で成長させることにより、不飽和脂肪酸誘導体を産生するように操作することができる。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、ＦａｂＢは、シスΔ３デセノイル−ＡＣＰに対する嗜好性を有し、不飽和脂肪酸産生をもたらす。ＦａｂＢの過剰発現は、有意なパーセンテージの不飽和脂肪酸の産生をもたらす（ｄｅ  Ｍｅｎｄｏｚａら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２５８巻：２０９８頁、１９８３年）。ｆａｂＢをコードする核酸分子を、この遺伝子を天然に持たないＣ１代謝微生物（例えば、メタン資化性菌）に挿入し、この中で発現させることができる。次に、このような不飽和脂肪酸は、脂肪アルコール、脂肪エステル、ワックス、ヒドロキシ脂肪酸、ジカルボン酸など、脂肪酸誘導体を産生するように操作されたＣ１代謝微生物において中間体として使用することができる。
【０１５３】
あるいは、脂肪酸生合成のリプレッサー、例えば、ｆａｂＲをＣ１代謝微生物（例えば、メタン資化性菌）において阻害または欠失することができ、これは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて認められる通り（Ｚｈａｎｇら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２７７巻：１５５５８頁、２００２年）、不飽和脂肪酸産生の増加をもたらすこともできる。不飽和脂肪酸のさらなる増加は、例えば、ｆａｂＩ（トランス−２−エノイル−ＡＣＰレダクターゼ）を欠失しつつ、ｆａｂＭ（トランス−２，シス−３−デセノイル−ＡＣＰイソメラーゼ）を過剰発現およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のｆａｂＫ（トランス−２−エノイル−ＡＣＰレダクターゼＩＩ）（Ｍａｒｒａｋｃｈｉら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２７７巻：４４８０９頁、２００２年）を発現制御することにより達成することができる。その上、不飽和脂肪エステルのパーセンテージを増加させるために、Ｃ１代謝微生物（例えば、メタン資化性菌）は、ｆａｂＢ（β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩをコードする、受託番号ＥＣ：２．３．１．４１）、ｓｆａ（ｆａｂＡのサプレッサーをコードする）ならびにｇｎｓＡおよびｇｎｓＢ（両者共にｓｅｃＧヌル変異体サプレッサーをコードする、すなわち、寒冷ショックタンパク質）を過剰発現することもできる。いくつかの例では、内因性ｆａｂＦ遺伝子を減弱することができ、これは、産生されるパルミトレエート（Ｃ１６：１）のパーセンテージを増加させることができる。
【０１５４】
別の例において、所望の脂肪酸誘導体は、ヒドロキシル化脂肪酸である。ヒドロキシル改変は、特異的な酵素を使用して、鎖の至る所で生じ得る。特に、ω−ヒドロキシル化は、分子両端に官能基を含有する特に有用な分子を産生する（例えば、ポリエステルプラスチックを産生する直鎖状重合を可能にする）。ある特定の実施形態では、Ｃ１代謝微生物（例えば、メタン資化性菌）は、ＣＹＰ５２Ａ１３、ＣＹＰ５２Ａ１４、ＣＹＰ５２Ａ１７、ＣＹＰ５２Ａ１８、ＣＹＰ５２Ａ１２およびＣＹＰ５２Ａ１２Ｂから選択される１種または複数種の改変されたＣＹＰ５２Ａ型チトクロムＰ４５０を含むことができ、このチトクロムは、脂肪酸を例えば、ω−ヒドロキシ脂肪酸に改変する。異なる脂肪酸は、異なるチトクロムＰ４５０によって異なる比率でヒドロキシル化される。所望の脂肪酸原料の効率的なヒドロキシル化を達成するために、Ｃ１代謝微生物が、広範囲の高度に豊富な脂肪酸基質をω−ヒドロキシル化することができる１種または複数種のＰ４５０酵素を発現するように作製される。ラウリン酸（Ｃ１２：０）、ミリスチン酸（Ｃ１４：０）、パルミチン酸（Ｃ１６：０）、ステアリン酸（Ｃ１８：０）、オレイン酸（Ｃ１８：１）、リノール酸（Ｃ１８：２）およびα−リノレン酸（ω３、Ｃ１８：３）のω−ヒドロキシル化を触媒するＰ４５０酵素が特に興味深い。Ｃ１代謝非光合成微生物にクローニングすることができる異なる脂肪酸に対して公知ω−ヒドロキシル化活性を有するＰ４５０酵素の例として、Ｖｉｃｉａ  ｓａｔｉｖａ由来のＣＹＰ９４Ａ１（Ｔｉｊｅｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．３３２巻：５８３頁、１９８８年）；Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ由来のＣＹＰ  ９４Ａ５（Ｌｅ  Ｂｏｕｑｕｉｎら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８巻：３０８３頁、２００１年）；Ｚｅａ  ｍａｙｓ由来のＣＹＰ７８Ａ１（Ｌａｒｋｉｎ、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２５巻：３４３頁、１９９４年）；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来のＣＹＰ  ８６Ａ１（Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．２４３巻：６８８頁、１９９８年）およびＣＹＰ８６Ａ８（Ｗｅｌｌｅｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９８巻：９６９４頁、２００１年）；Ｐｅｔｕｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ由来のＣＹＰ  ９２Ｂ１（Ｐｅｔｋｏｖａ−Ａｎｄｏｎｏｖａら、Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．６６巻：１８１９頁、２００２年）；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来のＣＹＰ１０２Ａ１（ＢＭ−３）変異体Ｆ８７（Ｏｌｉｖｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３６巻：１５６７頁、１９９７年）；ならびに哺乳動物および昆虫由来のＣＹＰ  ４ファミリー（Ｈａｒｄｗｉｃｋ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７５巻：２２６３頁、２００８年）が挙げられる。
【０１５５】
ある特定の実施形態では、Ｃ１代謝非光合成微生物は、脂肪酸またはω−ヒドロキシ脂肪酸の特異的な部位に追加的な内部ヒドロキシル化を導入することができるＰ４５０酵素をコードする核酸分子を含み、ここで、この組換えＣ１代謝微生物は、内部に酸化された脂肪酸またはω−ヒドロキシ脂肪酸またはアルデヒドまたはジカルボン酸を産生することができる。本開示のＣ１代謝微生物において使用することができる、異なる脂肪酸における公知の鎖内（ｉｎ−ｃｈａｉｎ）ヒドロキシル化活性を有するＰ４５０酵素の例として、ω−１からω−５ヒドロキシル化を有するＨｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｓ由来のＣＹＰ８１Ｂ１（Ｃａｂｅｌｌｏ−Ｈｕｒｔａｄｏら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２７３巻：７２６０頁、１９９８年）；ω−１およびω−２ヒドロキシル化を有するＨｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｓ由来のＣＹＰ７９０Ｃ１（Ｋａｎｄｅｌら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２８０巻：３５８８１頁、２００５年）；脂肪酸不飽和におけるエポキシ化を有するＥｕｐｈｏｒｂｉａ  ｌａｇｓｃａｅ由来のＣＹＰ７２６Ａ１（Ｃａｈｏｏｎら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２８巻：６１５頁、２００２年）；α−ヒドロキシル化を有するＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ由来のＣＹＰ１５２Ｂ１（Ｍａｔｓｕｎａｇａら、Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．３５巻：３６５頁、２０００年）；ω−１ヒドロキシル化を有するヒト肝臓由来のＣＹＰ２Ｅ１および４Ａ１（Ａｄａｓら、Ｊ．  Ｌｉｐ．  Ｒｅｓ．４０巻：１９９０頁、１９９９年）；α−およびβ−ヒドロキシル化を有するＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｓｔｉｌｉｓ由来のＰ４５０ＢＳβ（Ｌｅｅら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２７８巻：９７６１頁、２００３年）；ならびにω−１、ω−２およびω−３ヒドロキシル化を有するＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来のＣＹＰ１０２Ａ１（ＢＭ−３）（Ｓｈｉｒａｎｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２巻：１３７３２頁、１９９３年）が挙げられる。
【０１５６】
ある特定の実施形態では、ω−ヒドロキシル化を含むように脂肪酸を改変することができるＰ４５０酵素をコードする核酸分子を含むＣ１代謝非光合成微生物は、ω−ヒドロキシ脂肪酸誘導体をさらに酸化して、ジカルボン酸を生じるようにさらに改変することができる。多くの事例において、第１の事例におけるヒドロキシル化を行うことができるＰ４５０酵素は、さらなる酸化を行って、ジカルボン酸を生じることもできる。他の実施形態では、宿主生物における非特異的未変性アルコールデヒドロゲナーゼは、ω−ヒドロキシ脂肪酸を酸化して、ジカルボン酸とすることができる。さらなる実施形態では、Ｃ１代謝非光合成生物は、１種または複数種の脂肪アルコールオキシダーゼ（ＦＡＯ１、ＦＡＯ１Ｂ、ＦＡＯ２、ＦＡＯ２Ｂ等）またはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ−Ａ４、ＡＤＨ−Ａ４Ｂ、ＡＤＨ−Ｂ４、ＡＤＨ−Ｂ４Ｂ、ＡＤＨ−Ａ１０およびＡＤＨ−Ｂ１１等）（例えば、米国特許出願公開第２０１０／０２９１６５３号に収載されているＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ由来、このリストは、その全体が本明細書中に援用される）をコードする核酸分子をさらに含み、ジカルボン酸の産生を容易にする。
【０１５７】
本明細書に記載されている方法は、変動する炭素鎖長を有する脂肪エステルおよび脂肪酸誘導体の産生を可能にする。鎖長は、ｔｅｓおよびｆａｔ遺伝子ファミリーの発現によって産生されるチオエステラーゼならびに脂肪酸エロンガーゼ（すなわち、ＫＣＳ、ＫＣＲ、ＨＣＤおよびＥＣＲ）によって制御される。特異的なチオエステラーゼを発現することにより、脂肪酸エロンガーゼの基質としての使用のための所望の炭素鎖長を有する脂肪酸誘導体を産生することができる。適したチオエステラーゼの非限定例は、本明細書に記載されており、米国特許第８，２８３，１４３号に収載されている（図１、この図は、本明細書中に参考として援用される）。特定の炭素鎖長の脂肪酸誘導体が産生されるように、特定のチオエステラーゼをコードする核酸分子をＣ１代謝微生物（例えば、メタン資化性菌）に導入することができる。ある特定の実施形態では、内因性チオエステラーゼの発現が、阻害、抑制または下方制御される。
【０１５８】
ある特定の実施形態では、脂肪酸誘導体は、約８〜２４炭素原子、約８〜１８炭素原子、約１０〜１８炭素原子、約１０〜１６炭素原子、約１２〜１６炭素原子、約１２〜１４炭素原子、約１４〜２４炭素原子、約１４〜１８炭素原子、約８〜１６炭素原子または約８〜１４炭素原子の炭素鎖を有する。代替的な実施形態では、脂肪酸誘導体は、約２０未満の炭素原子、約１８未満の炭素原子、約１６未満の炭素原子、約１４未満の炭素原子または約１２未満の炭素原子の炭素鎖を有する。他の実施形態では、脂肪エステル生成物は、８〜２４個の間の炭素原子の炭素原子含有量を有する飽和または不飽和脂肪エステル生成物である。さらなる実施形態では、脂肪エステル生成物は、８〜１４個の間の炭素原子の炭素原子含有量を有する。なおさらなる実施形態では、脂肪エステル生成物は、１４および２０個の炭素の炭素含有量を有する。さらに他の実施形態では、脂肪エステルは、Ｃ１８：１のメチルエステルである。さらなる実施形態では、脂肪エステルは、Ｃ１６：１のエチルエステルである。他の実施形態では、脂肪エステルは、Ｃ１６：１のメチルエステルである。さらに他の実施形態では、脂肪エステルは、オクタノールのオクタデシルエステルである。
【０１５９】
いくつかの微生物は、偶数または奇数の炭素鎖脂肪酸および脂肪酸誘導体を優先的に産生する。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉは、偶数の炭素鎖脂肪酸および脂肪酸エチルエステル（ＦＡＥＥ）を正常に産生する。ある特定の実施形態では、奇数の炭素鎖脂肪酸誘導体を産生するＣ１代謝微生物（例えば、メタン資化性菌）を作製することができるように、本明細書に開示されている方法を使用して、Ｃ１代謝微生物（例えば、メタン資化性菌）におけるこの産生を変更することができる。
【０１６０】
エステルは、「Ａ」面（ｓｉｄｅ）および「Ｂ」面と命名され得るものを含む。Ｂ面は、本開示のＣ１代謝微生物（例えば、メタン資化性菌）におけるｄｅ  ｎｏｖｏ合成から産生される脂肪酸によって寄与され得る。一部の実施形態では、Ｃ１代謝微生物（例えば、メタン資化性菌）が、脂肪アルコールを含むアルコールを作製するように追加的に操作される場合、Ｃ１代謝微生物（例えば、メタン資化性菌）によってＡ面も産生される。さらに他の実施形態では、Ａ面は、中間（ｍｅｄｉｕｍ）に配置することができる。所望のチオエステラーゼコード核酸分子を選択することにより、Ｂ面（および脂肪アルコールが作製されている場合はＡ面）は、ある特定の炭素鎖特徴を有するように設計することができる。このような特徴は、分枝の個所、不飽和および所望の炭素鎖長を含む。
【０１６１】
特定のチオエステラーゼおよびＦＡＥ遺伝子が選択される場合、ＡおよびＢ面は、両者共に、脂肪酸生合成経路中間体を使用するＣ１代謝微生物（例えば、メタン資化性菌）によって寄与されるのであれば、同様の炭素鎖特徴を有する。例えば、産生される脂肪エステルの少なくとも約５０％、６０％、７０％または８０％は、長さが約２、４、６、８、１０、１２または１４炭素まで様々であるＡ面およびＢ面を有する。Ａ面およびＢ面は、同様の分枝および飽和レベルを呈することもできる。
【０１６２】
Ａ面に対する寄与のための脂肪アルコールの産生に加えて、Ｃ１代謝微生物（例えば、メタン資化性菌）は、Ａ面における取り込みのために、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、イソブタノールおよびブタノール等、他の短鎖アルコールを産生することができる。例えば、Ｃ１代謝微生物（例えば、メタン資化性菌）によってブタノールを作製することができる。ブタノール産生細胞を作出するために、例えば、Ｃ１代謝微生物（例えば、メタン資化性菌）は、例えば、ｐｒｐＢＣＤＥプロモーター系に置かれたｐＢＡＤ２４発現ベクターにおいて、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２由来のａｔｏＢ（アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ）、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ由来のβ−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ由来のクロトナーゼ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ由来のブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｆｕｌｖｕｍ由来のＣｏＡ−アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍのａｄｈＥコードアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼを発現するようにさらに操作することができる。Ｃ１代謝微生物（例えば、メタン資化性菌）は、他の短鎖アルコールを産生するように同様に改変することができる。例えば、エタノールは、Ｋａｌｓｃｈｅｕｅｒら（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５２巻：２５２９頁、２００６年）によって教示される方法を使用して、産生宿主において産生することができる。
【０１６３】
Ｃ１代謝微生物−宿主細胞
本開示のＣ１代謝微生物は、天然の株、適応された株（例えば、発酵を行って、親株と比較して改善された成長速度および増加した総バイオマス収率を有する株を選択する）であってよい、あるいは目的の極長炭素鎖化合物を産生するように、または増加された成長速度を有するようにまたはその両方となるように組換えにより改変することができる（例えば、ＫＣＳ、ＫＣＲ、ＨＣＤ、ＥＣＲまたはこれらの組合せを発現するように遺伝的に変更される）。ある特定の実施形態では、Ｃ１代謝微生物は、藻類または植物等、光合成微生物ではない。
【０１６４】
ある特定の実施形態では、本開示は、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｏｎａｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、ＲｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓまたはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ等、原核生物または細菌であるＣ１代謝微生物を提供する。
【０１６５】
さらなる実施形態では、Ｃ１代謝細菌は、メタン資化性菌またはメチロトローフである。例示的なメタン資化性菌は、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｏｎａｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａまたはこれらのいずれかの組合せを含む。例示的なメチロトローフは、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｏｐｕｌｉ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｏｄｕｌａｎｓまたはこれらのいずれかの組合せを含む。
【０１６６】
ある特定の実施形態では、メタン資化性細菌は、Ｃ１基質原料を極長炭素鎖化合物に変換する能力に関して遺伝子操作されている。メタン資化性細菌は、炭素およびエネルギー源としてメタンを酸化する能力を有する。メタン資化性細菌は、その炭素同化経路および内膜構造に基づき３群に分類される：Ｉ型（ガンマプロテオバクテリア）、ＩＩ型（アルファプロテオバクテリア）およびＸ型（ガンマプロテオバクテリア）。Ｉ型メタン資化性菌は、炭素同化のためにリブロース一リン酸（ＲｕＭＰ）経路を使用する一方、ＩＩ型メタン資化性菌は、セリン経路を使用する。Ｘ型メタン資化性菌は、ＲｕＭＰ経路を使用するが、セリン経路の低レベルの酵素も発現する。メタン資化性細菌は、炭素およびエネルギー源のためにＣ１基質のみを利用することができる偏性メタン資化性菌と、唯一の炭素およびエネルギー源としていくつかの多炭素基質を利用する能力を天然に有する通性メタン資化性菌とを含む。
【０１６７】
例示的な通性メタン資化性菌は、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ、ＭｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓおよびＭｅｔｈｙｌｏｃａｐｓａのいくつかの種（例えば、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ  ｓｉｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ  ｔｕｎｄｒａｅ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ  ｄａｌｔｏｎａ株ＳＢ２、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ  ｂｒｙｏｐｈｉｌａおよびＭｅｔｈｙｌｏｃａｐｓａ  ａｕｒｅａ  ＫＹＧ）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｏｒｇａｎｏｐｈｉｌｕｍ（ＡＴＣＣ  ２７，８８６）、Ｍｅｔｈｙｌｉｂｉｕｍ  ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍまたはこれらの高成長バリアントを含む。例示的な偏性メタン資化性細菌は、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  １６ａ（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ２４０２）、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９６）、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｓｐｏｒｉｕｍ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９７）、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ  ｐａｒｖｕｓ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９８）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｍｅｔｈａｎｉｃａ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９９）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ａｌｂｕｓ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，２００）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，２０１）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｆｌａｇｅｌｌａｔａ  ｓｐ  ＡＪ−３６７０（ＦＥＲＭ  Ｐ−２４００）、Ｍｅｔｈｙｌａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ  ｉｎｆｅｒｎｏｒｕｍおよびＭｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｍまたはこれらの高成長バリアントを含む。
【０１６８】
なおさらなる実施形態では、本開示は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ、Ａｃｅｔｏｇｅｎｉｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｃｅｔｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｅｔｅｒｉｕｍ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓまたはこれらのいずれかの組合せ等、シンガス代謝細菌であるＣ１代謝微生物を提供する。例示的なメチロトローフは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｙｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｎｅｏｐｒｏｐａｎｏｌｏｇｅｎまたはこれらのいずれかの組合せを含む。
【０１６９】
本明細書に記載されている実施形態のいずれかでは、Ｃ１代謝非光合成微生物は、Ｙａｒｒｏｗｉａ等、酵母ではない。
【０１７０】
一定の他の実施形態では、Ｃ１代謝非光合成微生物は、偏性メタン資化性菌またはメチロトローフ等、偏性Ｃ１代謝非光合成微生物である。さらなる実施形態では、Ｃ１代謝非光合成微生物は、ＫＣＳ、ＫＣＲ、ＨＣＤ、ＥＣＲ、これらの組合せまたは全４種をコードする異種ポリヌクレオチドを含む組換え微生物である。
【０１７１】
Ｃ１代謝微生物−非天然または組換え
一部の実施形態では、本明細書に記載されている通り、極長鎖脂肪アシル−ＣｏＡ等、＞Ｃ２４極長炭素鎖化合物の生成にＣ１基質原料（例えば、メタン）を利用する、β−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ、β−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ、β−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼおよびエノイル−ＣｏＡレダクターゼを有する組換えＣ１代謝微生物（例えば、非天然メタン資化性菌）が提供される。様々な実施形態では、組換えＣ１代謝微生物は、ＫＣＳ酵素をコードする核酸分子を発現または過剰発現する。ある特定の実施形態では、ＫＣＳ酵素は、このＣ１代謝微生物に対し内因性であってよい、またはＫＣＳ酵素は、このＣ１代謝微生物に対し異種であってよい。
【０１７２】
一態様では、本開示は、次の酵素：（ｉ）β−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ、（ｉｉ）β−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ、（ｉｉｉ）β−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼおよび（ｉｖ）エノイル−ＣｏＡレダクターゼをコードする組換え核酸分子を有する非天然メタン資化性菌であって、Ｃ１基質を、極長鎖脂肪アシル−ＣｏＡ、極長鎖脂肪アルデヒド、極長鎖脂肪アルコール（一級または二級）、極長鎖脂肪エステルワックス、極長鎖アルカン、極長鎖ケトンまたはこれらの組合せから選択される極長炭素鎖化合物に変換することができるメタン資化性菌を提供する。ある特定の実施形態では、ＫＣＳは、ＣＥＲ６、Ｅｌｏ１、Ｆｅｎ１／Ｅｌｏ２、Ｓｕｒ４／Ｅｌｏ３、ＫＣＳ１、ＫＣＳ２、ＫＣＳ１１、ＫＣＳ２０、ＫＣＳ９、ＥＬＯＶＬ１、ＥＬＯＶＬ２、ＥＬＯＶＬ３、ＥＬＯＶＬ４、ＥＬＯＶＬ５、ＥＬＯＶＬ６、ＥＬＯＶＬ７またはＦＤＨである。ある特定の実施形態では、非天然メタン資化性菌は、少なくとも２種の異なるＫＣＳ酵素をコードする組換え核酸分子を含む。ある特定の実施形態では、ＫＣＲは、ＣＥＲ１０、ＫＡＲ、ＧＬ８Ａ、ＧＬ８Ｂ、Ｙｂｒ１５９ｗ、ＡＹＲ１またはＡｔ１ｇ６７７３０である。ある特定の実施形態では、ＨＣＤは、ＰＨＳ１、ＰＡＳ２、ＨＡＣＤ１、ＨＡＣＤ２、ＨＡＣＤ３、ＨＡＣＤ４またはＰＡＳ２−１である。ある特定の実施形態では、ＥＣＲは、ＣＥＲ１０、ＴＥＲ、ＴＳＣ１３またはＧｈＥＣＲ１、ＧｈＥＣＲ２である。
【０１７３】
ある特定の実施形態では、非天然メタン資化性菌は、極長鎖脂肪アルコールを生成することができる脂肪アルコール生成アシル−ＣｏＡレダクターゼをコードする組換え核酸をさらに含む。ある特定の実施形態では、脂肪アルコール生成アシル−ＣｏＡレダクターゼは、ＦＡＲ、ＣＥＲ４（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＪＮ３１５７８１．１）またはＭａｑｕ＿２２２０である。ある特定の実施形態では、非天然メタン資化性菌は、極長鎖脂肪アルデヒドを生成することができる脂肪アシル−ＣｏＡレダクターゼと、極長鎖脂肪アルコールを生成することができるアルデヒドレダクターゼとをコードする組換え核酸分子をさらに含む。ある特定の実施形態では、脂肪アシル−ＣｏＡレダクターゼは、ＡＣＲ１またはＣＥＲ３である。ある特定の実施形態では、アルデヒドレダクターゼは、ＹｑｈＤである。一部の実施形態では、この過程は、Ｃ２４を超える長さの炭素を含む脂肪アルコールの産生をもたらす。
【０１７４】
ある特定の実施形態では、非天然メタン資化性菌は、極長鎖脂肪アルコールを生成することができる脂肪アルコール生成アシル−ＣｏＡレダクターゼと、極長鎖脂肪エステルワックスを生成することができるエステルシンターゼとをコードする組換え核酸分子をさらに含む。ある特定の実施形態では、脂肪アルコール生成アシル−ＣｏＡレダクターゼは、ＦＡＲ、ＣＥＲ４（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＪＮ３１５７８１．１）またはＭａｑｕ＿２２２０である。ある特定の実施形態では、エステルシンターゼは、ＷＳＤ１である。一部の実施形態では、この過程は、Ｃ２４を超える長さの炭素を含む脂肪エステルワックスの産生をもたらす。
【０１７５】
ある特定の実施形態では、非天然メタン資化性菌は、極長鎖脂肪アルデヒドを生成することができる脂肪アシル−ＣｏＡレダクターゼと、極長鎖アルカンを生成することができるアルデヒドデカルボニラーゼとをコードする組換え核酸分子をさらに含む。ある特定の実施形態では、脂肪アシル−ＣｏＡレダクターゼは、ＡＣＲ１またはＣＥＲ３である。ある特定の実施形態では、アルデヒドデカルボニラーゼは、ＣＥＲ１またはＣＥＲ２２である。一部の実施形態では、この過程は、Ｃ２４を超える長さの炭素を含む極長鎖アルカンの産生をもたらす。
【０１７６】
ある特定の実施形態では、非天然メタン資化性菌は、極長鎖脂肪アルデヒドを生成することができる脂肪アシル−ＣｏＡレダクターゼと、極長鎖アルカンを生成することができるアルデヒドデカルボニラーゼと、極長鎖脂肪二級アルコールを生成することができるアルカンヒドロキシラーゼと、極長鎖ケトンを生成することができるアルコールデヒドロゲナーゼとをコードする組換え核酸分子をさらに含む。ある特定の実施形態では、脂肪アシル−ＣｏＡレダクターゼは、ＡＣＲ１またはＣＥＲ３である。ある特定の実施形態では、アルデヒドデカルボニラーゼは、ＣＥＲ１またはＣＥＲ２２である。ある特定の実施形態では、アルカンヒドロキシラーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼは、ＭＡＨ１である。
【０１７７】
本開示によって包含される極長炭素鎖化合物を産生することができる上述の組換えＣ１代謝微生物のいずれかにおいて、非天然メタン資化性菌は、リーダー配列を欠くｔｅｓＡ、ＵｃＦａｔＢまたはＢＴＥ等、チオエステラーゼをコードする組換え核酸分子をさらに含む。ある特定の実施形態では、内因性チオエステラーゼ活性は、無変更の内因性チオエステラーゼ活性と比較して低下される、最小であるまたは消失される。
【０１７８】
本開示によって包含される極長炭素鎖化合物を産生することができる上述の組換えＣ１代謝微生物のいずれかにおいて、非天然メタン資化性菌は、ＦａｄＤ、ｙｎｇ１またはＦＡＡ２等、アシル−ＣｏＡシンテターゼをコードする組換え核酸分子をさらに含む。ある特定の実施形態では、内因性アシル−ＣｏＡシンテターゼ活性は、無変更の内因性アシル−ＣｏＡシンテターゼ活性と比較して低下される、最小であるまたは消失される。
【０１７９】
さらなる実施形態では、本開示は、異種ＫＣＳ、ＫＣＲ、ＨＣＤおよびＥＣＲをコードする組換え核酸分子と、異種チオエステラーゼをコードする組換え核酸分子と、異種アシル−ＣｏＡシンテターゼをコードする組換え核酸分子とを有する非天然メタン資化性菌であって、Ｃ１基質を極長鎖アシル−ＣｏＡに変換することができるメタン資化性菌を提供する。ある特定の実施形態では、非天然メタン資化性菌が、脂肪アシル−ＣｏＡレダクターゼまたは脂肪アルコール生成アシル−ＣｏＡレダクターゼをコードする核酸分子をさらに含む場合、脂肪アシル−ＣｏＡレダクターゼまたは脂肪アルコール生成アシル−ＣｏＡレダクターゼは、それぞれ未変性脂肪アシル−ＣｏＡレダクターゼまたは脂肪アルコール生成アシル−ＣｏＡレダクターゼの発現レベルと比較して、該非天然メタン資化性菌において過剰発現される。ある特定の実施形態では、脂肪アルデヒドを生成することができる脂肪アシル−ＣｏＡレダクターゼは、ＡＣＲ１またはＣＥＲ３である、あるいは脂肪アルコールを生成することができる脂肪アルコール生成アシル−ＣｏＡレダクターゼは、ＦＡＲ、ＣＥＲ４またはＭａｑｕ＿２２２０である。ある特定の実施形態では、アシル−ＣｏＡシンテターゼは、ＦａｄＤ、ｙｎｇ１またはＦＡＡ２である。
【０１８０】
ＦＡＲ酵素またはその機能断片を有することができる上述の組換えＣ１代謝微生物（例えば、非天然メタン資化性菌）のいずれかは、Ｍ．ａｌｇｉｃｏｌａ、Ｍ．ａｌｋａｌｉｐｈｉｌｕｓ、Ｍ．ａｑｕａｅｏｌｅｉ、Ｍ．ａｒｃｔｉｃｕｓ、Ｍ．ｂｒｙｏｚｏｏｒｕｍ、Ｍ．ｄａｅｐｏｅｎｓｉｓ、Ｍ．ｅｘｃｅｌｌｅｎｓ、Ｍ．ｆｌａｖｉｍａｒｉｓ、Ｍ．ｇｕａｄｏｎｅｎｓｉｓ、Ｍ．ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｍ．ｋｏｒｅｅｎｉｓ、Ｍ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｍ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｍ．ｌｕｔａｏｅｎｓｉｓ、Ｍ．ｍａｒｉｔｉｍｕｓ、Ｍ．ｓｅｄｉｍｉｎｕｍ、Ｍ．ｓｑｕａｌｅｎｉｖｉｒａｎｓ、Ｍ．ｖｉｎｉｆｉｒｍｕｓまたはこれらの均等および同義の種等、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒの種に由来するまたはこれから得ることができる。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されている組成物および方法における使用のためのＦＡＲ酵素は、海洋性細菌Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ａｌｇｉｃｏｌａ  ＤＧ８９３（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＥＤＭ４９８３６．１、ＦＡＲ「Ｍａａ＿８９３」）またはＭａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ａｑｕａｅｏｌｅｉ  ＶＴ８（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＹＰ＿９５９４８６．１、ＦＡＲ「Ｍａｑｕ＿２２２０」）またはＯｃｅａｎｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．ＲＥＤ６５（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＥＡＴ１３６９５．１、ＦＡＲ「Ｏｃｓ＿６５」）に由来する。
【０１８１】
上述の組換えＣ１代謝微生物（例えば、非天然メタン資化性菌）のいずれかのなおさらなる実施形態では、ＦＡＲ酵素またはその機能断片は、ＦＡＲ＿Ｈｃｈ（Ｈａｈｅｌｌａ  ｃｈｅｊｕｅｎｓｉｓ  ＫＣＴＣ  ２３９６、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＹＰ＿４３６１８３．１）；ＦＡＲ＿Ａｃｔ（海洋性Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株ＰＨＳＣ２０Ｃ１由来、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＡＲ２５４６４．１由来）、ＦＡＲ＿Ｍｍｅ（海洋性メタゲノム、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＤＤ４００５９．１）、ＦＡＲ＿Ａｅｃ（Ａｃｒｏｍｙｒｍｅｘ  ｅｃｈｉｎａｔｉｏｒ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＧＩ６１７３１．１）、ＦＡＲ＿Ｃｆｌ（Ｃａｍｐｏｎｏｔｕｓ  ｆｌｏｒｉｄａｎｕｓ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＦＮ６２２３９．１）およびＦＡＲ＿Ｓｃａ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃａｔｔｌｅｙａ  ＮＲＲＬ  ８０５７、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＹＰ＿００６０５２６５２．１）である。他の実施形態では、ＦＡＲ酵素またはその機能断片は、Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ（ＦＡＲ＿Ｖｖｉ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＯ２２３０５．１またはＣＡＯ６７７７６．１）、Ｄｅｓｕｌｆａｔｉｂａｃｉｌｌｕｍ  ａｌｋｅｎｉｖｏｒａｎｓ  ＡＫ−０１（ＦＡＲ＿Ｄａｌ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＹＰ＿００２４３０３２７．１）、Ｓｉｍｍｏｎｄｓｉａ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ（ＦＡＲ＿Ｓｃｈ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＤ３８０３９．１）、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ（ＦＡＲ＿Ｂｍｏ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＡＣ７９４２５．１）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（ＦＡＲ＿Ａｔｈ；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＤＱ４４６７３２．１またはＮＭ＿１１５５２９．１）またはＯｓｔｒｉｎｉａ  ｓｃａｐｕｌａｌｉｓ（ＦＡＲ＿Ｏｓｃ；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＵ８１７４０５．１）から単離されるまたはこれに由来する。
【０１８２】
ある特定の実施形態では、ＦＡＲ酵素またはその機能断片は、Ｍ．ａｌｇｉｃｏｌａ  ＤＧ８９３またはＭａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ａｑｕａｅｏｌｅｉ  ＹＴ８に由来するまたはこれから得られ、それぞれＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＥＤＭ４９８３６．１もしくはＹＰ＿９５９４８６．１に表記されている配列またはその機能断片と、少なくとも少なくとも７５％、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、組換えコードＦＡＲ酵素（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ＦＡＲ  ｅｎｚｙｍｅ）は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＥＤＭ４９８３６．１またはＹＰ＿９５９４８６．１に表記されている配列と同一のアミノ酸配列を有する。
【０１８３】
別の態様では、本開示は、ω−ヒドロキシ脂肪酸を産生するためにＰ４５０酵素またはモノオキシゲナーゼ（ｍｏｎｏｘｙｇｅｎａｓｅ）酵素をコードする組換え核酸分子をさらに含む、上述のＣ１代謝微生物または非天然メタン資化性菌のいずれかを提供する。ある特定の実施形態では、内因性アルコールデヒドロゲナーゼ活性は、無変更の内因性アルコールデヒドロゲナーゼ活性と比較して阻害される。他の実施形態では、内因性アルコールデヒドロゲナーゼ活性は、無変更の内因性アルコールデヒドロゲナーゼ活性と比較して増加または上昇して、ジカルボン酸が産生される。
【０１８４】
上述の非天然メタン資化性菌のいずれかにおいて、約Ｃ２５〜Ｃ３０、Ｃ３１〜Ｃ４０、Ｃ４１〜Ｃ６０、Ｃ６１〜Ｃ８０、Ｃ８１〜Ｃ１００、Ｃ１０１〜Ｃ１２０、Ｃ１２１〜Ｃ１４０、Ｃ１４１〜Ｃ１６０、Ｃ１６１〜Ｃ１８０、Ｃ１８１〜Ｃ２００、Ｃ２５〜Ｃ４０、Ｃ２５〜Ｃ５０、Ｃ２５〜Ｃ７５、Ｃ２５〜Ｃ１００、Ｃ２５〜Ｃ１２５、Ｃ２５〜Ｃ１５０、Ｃ２５〜Ｃ１７５またはＣ２５〜Ｃ２００極長炭素鎖化合物のうち１種または複数種を含む極長炭素鎖化合物が産生される。ある特定の実施形態では、メタン資化性菌は、Ｃ２５〜Ｃ５０極長脂肪鎖アルコールを含む極長脂肪アルコールを産生し、このＣ２５〜Ｃ５０極長脂肪鎖アルコールは、総脂肪アルコールの少なくとも７０％を構成する。さらなる実施形態では、メタン資化性菌は、極長分枝鎖脂肪アルコールを含む極長脂肪アルコールを産生する。ある特定の実施形態では、メタン資化性菌は、Ｃ２５〜Ｃ５０極長脂肪ワックスエステルを含む極長鎖ワックスエステルを産生し、このＣ２５〜Ｃ５０極長鎖ワックスエステルは、総ワックスエステルの少なくとも７０％を構成する。ある特定の実施形態では、メタン資化性菌は、Ｃ２５〜Ｃ５０極長鎖アルカンを含む極長鎖アルカンを産生し、このＣ２５〜Ｃ５０極長鎖アルカンは、総アルカンの少なくとも７０％を構成する。ある特定の実施形態では、メタン資化性菌は、Ｃ２５〜Ｃ５０極長鎖ケトンを含む極長鎖ケトンを産生し、このＣ２５〜Ｃ５０極長鎖ケトンは、総ケトンの少なくとも７０％を構成する。
【０１８５】
上述の非天然メタン資化性菌のいずれかにおいて、非天然メタン資化性菌によって産生される極長鎖脂肪アシル−ＣｏＡ、極長鎖脂肪アルデヒド、極長鎖脂肪アルコール、極長鎖脂肪エステルワックス、極長鎖アルカンまたは極長鎖ケトンの量は、約１ｍｇ／Ｌ〜約５００ｇ／Ｌの範囲である。一定の他の実施形態では、記載されているＣ１代謝微生物または非天然メタン資化性菌のためのＣ１基質原料は、メタン、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸もしくはその塩、一酸化炭素、二酸化炭素、メチルアミン、メチルチオール、メチルハロゲン、天然ガスまたは非従来型天然ガスである。ある特定の実施形態では、Ｃ１代謝微生物または非天然メタン資化性菌は、天然ガス、非従来型天然ガスまたはシンガス（またはメタンを含むシンガス）を、Ｃ２４を超える極長脂肪アシル−ＣｏＡ、極長脂肪アルデヒド、極長脂肪アルコール、極長鎖脂肪エステルワックス、極長鎖アルカンまたは極長鎖ケトンに変換することができる。
【０１８６】
上述のＣ１代謝微生物または非天然メタン資化性菌のいずれかにおいて、宿主メタン資化性菌は、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ株、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  １６ａ（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ２４０２）、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９６）、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｓｐｏｒｉｕｍ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９７）、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ  ｐａｒｖｕｓ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９８）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｍｅｔｈａｎｉｃａ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９９）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ａｌｂｕｓ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，２００）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，２０１）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｏｒｇａｎｏｐｈｉｌｕｍ（ＡＴＣＣ  ２７，８８６）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ  ＡＪ−３６７０（ＦＥＲＭ  Ｐ−２４００）、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ  ｓｉｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ（ＡＴＣＣ  ７００７９９）、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ  ｔｕｎｄｒａｅ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ  ｄａｌｔｏｎａ株ＳＢ２、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ  ｂｒｙｏｐｈｉｌａ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃａｐｓａ  ａｕｒｅａ  ＫＹＧ、Ｍｅｔｈｙｌａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ  ｉｎｆｅｒｎｏｒｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｉｂｉｕｍ  ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｍまたはこれらの組合せであってよい。
【０１８７】
上述のＣ１代謝微生物または非天然メタン資化性菌のいずれかは、組換え核酸分子の導入前または後に、脂肪酸誘導体産生のための改善された特性を有するバリアントを産生するように、選択的条件下で株適応を起こしていてもよい。改善された特性は、増加された成長速度、所望の生成物（例えば、極長鎖炭素化合物）の収率、またはプロセスもしくは培養汚染物質に対する耐性を含むことができる。特定の実施形態では、高成長バリアントＣ１代謝微生物またはメタン資化性菌は、メタン原料を主要炭素およびエネルギー源として成長することができ、その親細菌、参照細菌または野生型細菌よりも速い指数期成長速度（すなわち、より短い倍加時間）を保有する宿主細菌を含む（例えば、米国特許第６，６８９，６０１号を参照）。
【０１８８】
本開示の各微生物を、成長を助けることができる異種生物を有する単離培養物として成長させることができるか、またはこれらの細菌のうちの１つもしくはそれより多くを混合培養物が生成されるように組み合わせることができる。なおさらなる実施形態では、本開示のＣ１代謝非光合成微生物は、偏性Ｃ１代謝非光合成微生物である。
【０１８９】
Ｃ１代謝微生物−極長炭素鎖化合物の産生
別の態様では、本明細書に記載されている通り、非天然Ｃ１代謝非光合成微生物をＣ１基質原料と共に培養すること、および極長炭素鎖化合物を回収することにより、極長炭素鎖化合物を作製するための方法が提供され、このＣ１代謝非光合成微生物は、β−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ、β−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ、β−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼおよびエノイル−ＣｏＡレダクターゼをコードする１種または複数種の組換え核酸分子を含み、このＣ１代謝非光合成微生物は、Ｃ１基質を、極長鎖アシル−ＣｏＡ、極長鎖脂肪アルデヒド、極長鎖脂肪アルコール（一級または二級）、極長鎖アルカン、極長鎖ケトンまたはこれらの組合せを含むＣ２４を超える極長炭素鎖化合物に変換する。
【０１９０】
ある特定の実施形態では、培養されているＣ１代謝非光合成微生物は、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｏｎａｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、ＲｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓまたはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓである。さらなる実施形態では、培養されているＣ１代謝非光合成微生物は、メタン資化性菌またはメチロトローフ等、細菌である。
【０１９１】
メタン資化性菌は、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．１６ａ（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ２４０２）、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９６）、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｓｐｏｒｉｕｍ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９７）、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ  ｐａｒｖｕｓ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９８）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｍｅｔｈａｎｉｃａ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９９）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ａｌｂｕｓ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，２００）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，２０１）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｏｒｇａｎｏｐｈｉｌｕｍ（ＡＴＣＣ  ２７，８８６）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＡＪ−３６７０（ＦＥＲＭ  Ｐ−２４００）、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ  ｓｉｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ  ｉｎｆｅｒｎｏｒｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｉｂｉｕｍ  ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍまたはこれらの組合せであってよい。ある特定の実施形態では、メタン資化性菌培養物は、１種または複数種の異種細菌をさらに含む。
【０１９２】
メチロトローフは、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｏｐｕｌｉ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｏｄｕｌａｎｓまたはこれらの組合せであってよい。
【０１９３】
さらなる実施形態では、Ｃ１代謝微生物または細菌は、天然ガス、非従来型天然ガスまたはシンガスを代謝することができる。ある特定の実施形態では、シンガス代謝細菌は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｙｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｎｅｏｐｒｏｐａｎｏｌｏｇｅｎまたはこれらの組合せを含む。一定の他の実施形態では、代謝非光合成微生物は、偏性Ｃ１代謝非光合成微生物である。一定の他の実施形態では、代謝非光合成微生物は、通性Ｃ１代謝非光合成微生物である。
【０１９４】
上述の方法のいずれかにおいて、培養されるＣ１代謝微生物は、極長鎖脂肪アルコールを生成することができるＦＡＲ、ＣＥＲ４（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＪＮ３１５７８１．１）またはＭａｑｕ＿２２２０等、脂肪アルコール生成脂肪アシル−ＣｏＡレダクターゼを含有する。ある特定の実施形態では、培養されているＣ１代謝微生物は、ａｃｒ１またはＣＥＲ３等、脂肪アルデヒドを生成することができる脂肪アシル−ＣｏＡレダクターゼを含有する。一部の実施形態では、この過程は、Ｃ２４を超える長さの炭素を含む脂肪アルコールの産生をもたらす。
【０１９５】
本方法によって包含される極長炭素鎖化合物を産生することができる上述の組換えＣ１代謝微生物のいずれかにおいて、Ｃ１代謝微生物は、リーダー配列を欠くｔｅｓＡ、ＵｃＦａｔＢまたはＢＴＥ等、チオエステラーゼをコードする組換え核酸分子をさらに含む。ある特定の実施形態では、内因性チオエステラーゼ活性は、無変更の内因性チオエステラーゼ活性と比較して低下される、最小であるまたは消失される。
【０１９６】
本方法によって包含される極長炭素鎖化合物を産生することができる上述の組換えＣ１代謝微生物のいずれかにおいて、Ｃ１代謝微生物は、ＦａｄＤ、ｙｎｇ１またはＦＡＡ２等、アシル−ＣｏＡシンテターゼをコードする組換え核酸分子をさらに含む。ある特定の実施形態では、内因性アシル−ＣｏＡシンテターゼ活性は、無変更の内因性アシル−ＣｏＡシンテターゼ活性と比較して低下される、最小であるまたは消失される。
【０１９７】
さらなる実施形態では、本方法は、異種ＫＣＳをコードする組換え核酸、異種ＫＣＲをコードする組換え核酸、異種ＨＣＤをコードする組換え核酸、異種ＥＣＲをコードする組換え核酸、異種脂肪アルコール生成アシル−ＣｏＡレダクターゼをコードする組換え核酸分子、異種チオエステラーゼをコードする組換え核酸分子および異種アシル−ＣｏＡシンテターゼをコードする組換え核酸分子を有するＣ１代謝微生物であって、Ｃ１基質を、Ｃ２４を超える脂肪アルコールに変換することができるＣ１代謝微生物を提供する。ある特定の実施形態では、脂肪アルコール生成アシル−ＣｏＡレダクターゼは、未変性脂肪アルコール生成アシル−ＣｏＡレダクターゼの発現レベルと比較して、培養されるＣ１代謝微生物において過剰発現される。ある特定の実施形態では、脂肪アルコールを生成することができる脂肪アルコール生成アシル−ＣｏＡレダクターゼは、ＦＡＲ、ＣＥＲ４またはＭａｑｕ＿２２２０である。ある特定の実施形態では、アシル−ＣｏＡシンテターゼは、ＦａｄＤ、ｙｎｇ１またはＦＡＡ２である。
【０１９８】
上述の培養されるＣ１代謝微生物のいずれかにおいて、本方法は、Ｃ２５〜Ｃ３０、Ｃ３１〜Ｃ４０、Ｃ４１〜Ｃ６０、Ｃ６１〜Ｃ８０、Ｃ８１〜Ｃ１００、Ｃ１０１〜Ｃ１２０、Ｃ１２１〜Ｃ１４０、Ｃ１４１〜Ｃ１６０、Ｃ１６１〜Ｃ１８０、Ｃ１８１〜Ｃ２００、Ｃ２５〜Ｃ４０、Ｃ２５〜Ｃ５０、Ｃ２５〜Ｃ７５、Ｃ２５〜Ｃ１００、Ｃ２５〜Ｃ１２５、Ｃ２５〜Ｃ１５０、Ｃ２５〜Ｃ１７５またはＣ２５〜Ｃ２００極長炭素鎖化合物のうち１種または複数種を含む極長炭素鎖化合物を産生する。ある特定の実施形態では、Ｃ１代謝微生物は、Ｃ２５〜Ｃ５０極長脂肪鎖アルコールを含む極長脂肪アルコールを産生し、このＣ２５〜Ｃ５０極長脂肪鎖アルコールは、総脂肪アルコールの少なくとも７０％を構成する。さらなる実施形態では、メタン資化性菌は、極長分枝鎖脂肪アルコールを含む極長脂肪アルコールを産生する。ある特定の実施形態では、Ｃ１代謝微生物は、Ｃ２５〜Ｃ５０極長脂肪ワックスエステルを含む極長鎖ワックスエステルを産生し、このＣ２５〜Ｃ５０極長鎖ワックスエステルは、総ワックスエステルの少なくとも７０％を構成する。ある特定の実施形態では、Ｃ１代謝微生物は、Ｃ２５〜Ｃ５０極長鎖アルカンを含む極長鎖アルカンを産生し、このＣ２５〜Ｃ５０極長鎖アルカンは、総アルカンの少なくとも７０％を構成する。ある特定の実施形態では、Ｃ１代謝微生物は、Ｃ２５〜Ｃ５０極長鎖ケトンを含む極長鎖ケトンを産生し、このＣ２５〜Ｃ５０極長鎖ケトンは、総ケトンの少なくとも７０％を構成する。
【０１９９】
上述の培養されるＣ１代謝微生物のいずれかにおいて、Ｃ１代謝微生物によって産生される極長鎖脂肪アシル−ＣｏＡ、極長鎖脂肪アルデヒド、極長鎖脂肪アルコール、極長鎖ワックスエステル、極長鎖アルカンまたは極長鎖ケトンの量は、約１ｍｇ／Ｌ〜約５００ｇ／Ｌの範囲である。一定の他の実施形態では、極長炭素鎖化合物を作製する方法において使用されるＣ１代謝微生物のためのＣ１基質原料は、メタン、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸もしくはその塩、一酸化炭素、二酸化炭素、メチルアミン、メチルチオール、メチルハロゲン、天然ガスまたは非従来型天然ガスである。ある特定の実施形態では、Ｃ１代謝微生物は、メタンを含む天然ガス、非従来型天然ガスまたはシンガスを、Ｃ２４を超えるアシル−ＣｏＡ、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、ワックスエステル、アルカンまたはケトンに変換する。
【０２００】
上述の方法のいずれかにおいて、Ｃ１代謝微生物は、発酵槽またはバイオリアクター等、制御された培養ユニットにおいて培養することができる。
【０２０１】
コドン最適化
組換えタンパク質の発現は、多くの場合、その本来の宿主の外側では困難である。例えば、コドン使用バイアスにおける変種が、細菌の異なる種にわたって観察されてきた（Ｓｈａｒｐら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．３３巻：１１４１頁、２００５年）。組換えタンパク質の過剰発現は、その未変性宿主内であっても、困難となる場合もある。本発明のある特定の実施形態では、本明細書に記載されている宿主メタン資化性細菌に導入するべき核酸（例えば、脂肪酸伸長酵素をコードする核酸）は、タンパク質発現を増強するためにコドン最適化を受けることができる。コドン最適化は、ＤＮＡがコードするポリペプチドを変更しない、宿主細菌種の典型的なコドン使用を反映するための、メタン資化性細菌の形質転換のための核酸の遺伝子またはコード領域におけるコドンの変更を指す。異種宿主における最適な遺伝子発現のためのコドン最適化方法は、以前に記載されている（例えば、Ｗｅｌｃｈら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ４巻：ｅ７００２頁、２００９年；Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２巻：３４６頁、２００４年；Ｗｕら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３５巻：Ｄ７６頁、２００７年；Ｖｉｌｌａｌｏｂｏｓら、ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ７巻：２８５頁、２００６年；米国特許出願公開番号ＵＳ２０１１／０１１１４１３；ＵＳ２００８／０２９２９１８を参照；これらの開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される）。
【０２０２】
形質転換方法
本明細書に記載されている組換えＣ１代謝微生物またはメタン資化性細菌のいずれかは、新たなまたは増強された活性（例えば、酵素活性）を有する宿主細菌を提供するために、少なくとも１種の外因性核酸を含むように形質転換することができる、あるいは当該分野で公知の種々の方法を使用して、内因性遺伝子機能を除去または実質的に低下させるように遺伝子改変することができる。
【０２０３】
形質転換は、遺伝的に安定的な継承をもたらす、宿主細胞のゲノムへの核酸（例えば、外因性核酸）の移行を指す。形質転換された核酸分子を含有する宿主細胞は、「非天然起源の」または「組換え」または「形質転換された」または「トランスジェニック」細胞と称される。
【０２０４】
Ｃ１代謝微生物、または、メタン資化性細菌内での異種核酸の発現に有用な発現系および発現ベクターは公知である。
【０２０５】
Ｃ１代謝細菌のエレクトロポレーションは、Ｔｏｙａｍａら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１６６：１，１９９８；Ｋｉｍ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４８：１０５，１９９７；Ｙｏｓｈｉｄａら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２３：７８７，２００１，および米国特許出願公開第２００８／００２６００５号に以前に記載されている。
【０２０６】
ドナー細胞とレシピエント細胞との直接的接触を含む特定のタイプの形質転換をいう細胞接合は、Ｃ１代謝細菌への核酸の移入のためにより頻繁に使用されている。細菌接合は、相互に密接して接触させた「ドナー」細胞および「レシピエント」細胞の混合を含む。接合は、新規に合成されたドナー核酸分子がレシピエント細胞に一方向性に移入される、ドナー細菌とレシピエント細菌との間の細胞質連結の形成によって生じる。接合反応におけるレシピエントは、ドナー細菌からの水平伝播によって核酸を受容することができる任意の細胞である。接合反応におけるドナーは、接合性プラスミド、接合性トランスポゾン、または可動化プラスミドを含む細菌である。ドナープラスミドの物理的移入は、自己伝達性プラスミドによるか、または「ヘルパー」プラスミドの補助によって行うことができる。Ｃ１代謝細菌に関する接合は、Ｓｔｏｌｙａｒら，Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌｏｇｉｙａ  ６４：６８６，１９９５；Ｍｏｔｏｙａｍａら，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．４２：６７，１９９４；Ｌｌｏｙｄら，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１７１：３６４，１９９９；およびＯｄｏｍら、ＰＣＴ公開第０２／１８６１７号；Ａｌｉら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５２：２９３１，２００６に以前に記載されている。
【０２０７】
Ｃ１代謝細菌における異種核酸の発現は、当該分野で公知である（例えば、米国特許第６，８１８，４２４号；米国特許出願公開番号ＵＳ２００３／０００３５２８を参照）。メチロトローフ細菌のＭｕトランスポゾンに基づく形質転換について記載されている（Ａｋｈｖｅｒｄｙａｎら、Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９１巻：８５７頁、２０１１年）。Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍにおける宿主遺伝子の挿入不活性化を伴わない、異種遺伝子のシングルおよびマルチコピー発現のためのｍｉｎｉ−Ｔｎ７トランスポゾン系について記載されている（米国特許出願公開番号ＵＳ２００８／００２６００５）。
【０２０８】
Ｃ１代謝細菌における内因性遺伝子機能を不活性化、ノックアウトまたは欠失するための様々な方法を使用することができる。成長が遅いＣ１代謝細菌における欠失／挿入変異体を構築するための、自殺ベクターを使用した対立遺伝子交換も、ＴｏｙａｍａおよびＬｉｄｓｔｒｏｍ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４４巻：１８３頁、１９９８年；Ｓｔｏｌｙａｒら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４５巻：１２３５頁、１９９９年；Ａｌｉら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５２巻：２９３１頁、２００６年；Ｖａｎ  Ｄｉｅｎら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４９巻：６０１頁、２００３年に記載されている。
【０２０９】
外因性核酸の高発現に適した相同または異種プロモーターを利用することができる。例えば、米国特許第７，０９８，００５号は、Ｃ１代謝細菌における異種遺伝子発現のための、メタンまたはメタノールの存在下で高度に発現されるプロモーターの使用について記載する。使用することができる追加的なプロモーターは、デオキシ−キシルロースリン酸シンターゼメタノールデヒドロゲナーゼオペロンプロモーター（Ｓｐｒｉｎｇｅｒら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔ．１６０巻：１１９頁、１９９８年）；ＰＨＡ合成のためのプロモーター（Ｆｏｅｌｌｎｅｒら、Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４０巻：２８４頁、１９９３年）；またはメチロトローフにおける未変性プラスミドから同定されたプロモーター（欧州特許第ＥＰ２９６４８４）を含む。非未変性プロモーターは、ｌａｃオペロンＰｌａｃプロモーター（Ｔｏｙａｍａら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４３巻：５９５頁、１９９７年）またはＰｔｒｃ等のハイブリッドプロモーター（Ｂｒｏｓｉｕｓら、Ｇｅｎｅ  ２７巻：１６１頁、１９８４年）を含む。ある特定の実施形態では、宿主メタン資化性細菌におけるグリセロール利用経路酵素をコードする外因性核酸の高い構成的発現のために、プロモーターまたはコドン最適化が使用される。宿主メタン資化性細菌における外因性核酸の調節された発現を利用することもできる。特に、グリセロール利用酵素をコードする外因性核酸の調節された発現が、非天然起源のメタン資化性細菌の成長速度の最適化に望ましい場合がある。グリセロールの非存在下で（例えば、メタンを炭素源とした成長において）、グリセロール利用経路が逆行し、細菌からのグリセロールの分泌をもたらし、これにより成長速度を低下させることが可能である。グリセロールの存在に応答した、グリセロール利用経路酵素をコードする核酸の制御された発現は、種々の炭素源条件における細菌成長を最適化することができる。例えば、米国特許出願公開番号ＵＳ２０１０／０２２１８１３に記載されている、メチロトローフおよびメタン資化性細菌における組換えタンパク質発現の誘導性／調節可能系を使用することができる。細菌におけるグリセロール利用遺伝子の調節は、十分に確立されている（ＳｃｈｗｅｉｚｅｒおよびＰｏ、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８巻：５２１５頁、１９９６年；Ａｂｒａｍら、Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７４巻：５９４頁、２００８年；Ｄａｒｂｏｎら、Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３巻：１０３９頁、２００２年；Ｗｅｉｓｓｅｎｂｏｒｎら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２６７巻：６１２２頁、１９９２年）。グリセロール利用経路酵素をコードする外因性核酸分子の所望の発現レベルのために、グリセロール利用調節エレメントを宿主メタン資化性細菌において導入または不活性化することもできる。
【０２１０】
スクリーニング方法は、Ｂｒｏｃｋ、上記参照に開示されている。対立遺伝子交換変異体を同定するための選択方法は、当該分野で公知である（例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２００６／００５７７２６、Ｓｔｏｌｙａｒら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４５巻：１２３５頁、１９９９年；およびＡｌｉら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５２巻：２９３１頁、２００６年を参照）。
【０２１１】
培養方法
本明細書に記載されている組換えメタン資化性細菌に対し種々の培養方法論を使用することができる。例えば、メタン資化性細菌は、バッチ培養または連続培養方法によって成長させることができる。ある特定の実施形態では、培養物は、例えば、発酵槽、バイオリアクター、または中空繊維膜バイオリアクターなど、制御された培養ユニットにおいて成長させる。
【０２１２】
古典的なバッチ培養方法は、培養の初めに培地の組成が設定され、培養過程において外部からの変更に付されない閉鎖系である。よって、培養過程の初めに、培地に、所望のＣ１代謝微生物（例えば、メタン資化性菌）を接種し、系に何も加えることなく、成長または代謝活性を行わせる。しかし典型的には、「バッチ」培養は、炭素源の添加に関してバッチであり、ｐＨおよび酸素濃度等の因子の制御に関する試みは頻繁に為される。バッチ系において、系の代謝物およびバイオマス組成は、培養終了のときまでたえず変化する。バッチ培養物内では、細胞は、静的遅滞期から高成長対数期へ、最後に定常期に落ち着き（ｍｏｄｅｒａｔｅ）、そこで成長速度が減少または停止する。何も処置しなければ、定常期の細胞は、最終的に死ぬ。対数成長期の細胞は多くの場合、いくつかの系における最終生成物または中間体の大量産生に関与する。他の系において、定常期または指数期後の産生を得ることができる。
【０２１３】
フェドバッチ（Ｆｅｄ−Ｂａｔｃｈ）系は、標準バッチ系の変種である。フェドバッチ培養過程は、培養が進行するにつれて基質が徐々に添加されるという点を改変した、典型的なバッチ系を含む。異化代謝産物抑制が、細胞の代謝を阻害する傾向があり、培地中に限定された量の基質が存在することが望ましい場合、フェドバッチ系が有用である。フェドバッチ系における実際の基質濃度の測定は、困難であり、したがって、ｐＨ、溶存酸素およびＣＯ２等の廃ガスの分圧等、測定可能な因子の変化に基づいて推定される。バッチおよびフェドバッチ培養方法は、当該分野で一般的かつ公知である（例えば、Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．  Ｂｒｏｃｋ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２版（１９８９年）Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、ＭＡ；Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ、Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６巻：２２７頁、１９９２年を参照）。
【０２１４】
連続培養は、規定培養培地をバイオリアクターに連続的に添加し、処理のために同量の馴化培地を同時に除去する「開放」系である。連続培養は、一般的に、細胞が主に対数増殖期にあるように細胞の液相密度を高度に一定に維持する。あるいは、連続培養を、固定化細胞を使用して実施することができ、この培養は、炭素および栄養素を連続的に添加し、価値のある生成物、副生成物、および廃棄物を細胞集団から連続的に取り出す。細胞固定化を、天然材料および／または合成材料から構成される広範な固体支持体を使用して行うことができる。
【０２１５】
連続培養または半連続培養は、細胞成長または最終生成物濃度に影響を与える一因子またはいずれかの数の因子のモジュレーションを可能にする。例えば、一方法は、炭素源または窒素レベル等、限定された栄養素を固定された比率で維持し、他の全パラメーターをモジュレートさせる。他の系において、培地濁度によって測定される細胞濃度を一定に維持しつつ、成長に影響を与える多数の因子を連続的に変更させることができる。連続系は、定常状態成長条件を維持するように努めるため、培地輸出による細胞損失は、培養における細胞成長速度に対してバランスを保つ必要がある。連続培養過程のために栄養素および成長因子をモジュレートする方法ならびに生成物生成速度を最大化するための技法は、当該分野で周知であり、種々の方法が、Ｂｒｏｃｋ、上記参照によって詳述されている。
【０２１６】
極長炭素鎖化合物の組成物
背景として、安定同位体測定および物質収支アプローチは、メタンのグローバルなソースおよびシンクを評価するために広く使用されている（Ｗｈｉｔｉｃａｒ  ａｎｄ  Ｆａｂｅｒ，Ｏｒｇ．Ｇｅｏｃｈｅｍ．１０：７５９，１９８６；Ｗｈｉｔｉｃａｒ，Ｏｒｇ．Ｇｅｏｃｈｅｍ．１６：５３１，１９９０を参照のこと）。酸化量を決定するために残留メタンのδ１３Ｃ値を使用するために、メタンの微生物酸化に原因する同位体分留度を知ることが必要である。例えば、好気性メタン資化性菌は、特異的酵素であるメタンモノオキシゲナーゼ（ｍｅｔｈａｎｅ  ｍｏｎｏｘｙｇｅｎａｓｅ（ＭＭＯ））によってメタンを代謝することができる。メタン資化性菌は、メタンをメタノールに変換し、その後にホルムアルデヒドに変換する。ホルムアルデヒドを、ＣＯ２にさらに酸化して還元等価物（ＮＡＤＨ）の形態で細胞にエネルギーを供給することができるか、または光合成生物における炭素同化経路と直接的に類似するＲｕＭＰサイクルまたはセリンサイクル（Ｈａｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｈａｎｓｏｎ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６０：４３９，１９９６）のいずれかによってバイオマスに組み込むことができる。
【０２１７】
より詳細には、タイプＩメタン資化性菌は、バイオマス合成のためにＲｕＭＰ経路を使用して完全にＣＨ４に由来するバイオマスを生成するのに対して、タイプＩＩメタン資化性菌は、５０〜７０％のＣＨ４由来の細胞炭素および３０〜５０％のＣＯ２由来の細胞炭素を同化するセリン経路を使用する（Ｈａｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｈａｎｓｏｎ，１９９６）。炭素同位体組成の測定方法は、例えば、Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎら（Ｇｅｏｃｈｉｍ．Ｃｏｓｍｏｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ７０：１７３９，２００６）（その方法全体が本明細書中で参考として援用される）に示されている。
バイオマス由来の油組成物の１３Ｃ／１２Ｃ安定炭素比（「デルタ」値‰、δ１３Ｃとして提示）は、使用したＣ１基質の供給源および純度に応じて変動し得る（例えば、図７を参照）。
【０２１８】
本明細書に記載されているＣ１代謝非光合成微生物および方法を使用して産生された極長炭素鎖化合物の組成物は、カーボン・フィンガープリンティングによって、石油化学物質または光合成微生物もしくは植物から産生された極長炭素鎖化合物から区別することができる。ある特定の実施形態では、Ｃ２４を超える脂肪アシル−ＣｏＡ、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、脂肪エステルワックス、アルカン、ケトンまたはこれらのいずれかの組合せの組成物は、−３０‰未満の、−３１‰未満の、−３２‰未満の、−３３‰未満の、−３４‰未満の、−３５‰未満の、−３６‰未満の、−３７‰未満の、−３８‰未満の、−３９‰未満の、−４０‰未満の、−４１‰未満の、−４２‰未満の、−４３‰未満の、−４４‰未満の、−４５‰未満の、−４６‰未満の、−４７‰未満の、−４８‰未満の、−４９‰未満の、−５０‰未満の、−５１‰未満の、−５２‰未満の、−５３‰未満の、−５４‰未満の、−５５‰未満の、−５６‰未満の、−５７‰未満の、−５８‰未満の、−５９‰未満の、−６０‰未満の、−６１‰未満の、−６２‰未満の、−６３‰未満の、−６４‰未満の、−６５‰未満の、−６６‰未満の、−６７‰未満の、−６８‰未満の、−６９‰未満のまたは−７０‰未満のδ１３Ｃを有する。
【０２１９】
一部の実施形態では、Ｃ１代謝微生物バイオマスは、本明細書に記載されている極長炭素鎖化合物の組成物を含み、この極長炭素鎖化合物含有バイオマスまたは極長炭素鎖化合物の組成物は、約−３５‰〜約−５０‰、−４５‰〜約−３５‰または約−５０‰〜約−４０‰または約−４５‰〜約−６５‰または約−６０‰〜約−７０‰または約−３０‰〜約−７０‰のδ１３Ｃを有する。ある特定の実施形態では、極長炭素鎖化合物の組成物は、少なくとも５０％極長炭素鎖化合物を含む。さらなる実施形態では、極長炭素鎖化合物の組成物は、極長鎖脂肪アシル−ＣｏＡ、極長鎖脂肪アルデヒド、極長鎖脂肪アルコール、極長鎖脂肪エステルワックス、極長鎖アルカン、極長鎖ケトンまたはこれらのいずれかの組合せを含む。なおさらなる実施形態では、極長鎖炭素化合物の組成物は、Ｃ２５〜Ｃ３０、Ｃ３１〜Ｃ４０、Ｃ４１〜Ｃ６０、Ｃ６１〜Ｃ８０、Ｃ８１〜Ｃ１００、Ｃ１０１〜Ｃ１２０、Ｃ１２１〜Ｃ１４０、Ｃ１４１〜Ｃ１６０、Ｃ１６１〜Ｃ１８０、Ｃ１８１〜Ｃ２００、Ｃ２５〜Ｃ４０、Ｃ２５〜Ｃ５０、Ｃ２５〜Ｃ７５、Ｃ２５〜Ｃ１００、Ｃ２５〜Ｃ１２５、Ｃ２５〜Ｃ１５０、Ｃ２５〜Ｃ１７５またはＣ２５〜Ｃ２００極長鎖脂肪アシル−ＣｏＡ、極長鎖脂肪アルデヒド、極長鎖脂肪アルコール、極長鎖脂肪エステルワックス、極長鎖アルカンまたは極長鎖ケトンを含む。またさらなる実施形態では、極長鎖炭素化合物の組成物は、Ｃ２５〜Ｃ４０、Ｃ２５〜Ｃ５０、Ｃ２５〜Ｃ７５、Ｃ２５〜Ｃ１００、Ｃ２５〜Ｃ１２５、Ｃ２５〜Ｃ１５０、Ｃ２５〜Ｃ１７５またはＣ２５〜Ｃ２００の範囲の炭素鎖長を有する大部分（５０％ｗ／ｗ超）の極長鎖炭素化合物、またはＣ２５を超える炭素鎖長を有する大部分の極長炭素鎖化合物、または総極長鎖炭素化合物の少なくとも７０％が、Ｃ２５〜Ｃ５０極長炭素鎖化合物を含む組成物を含有する極長炭素鎖化合物を含む。
【０２２０】
さらなる実施形態では、Ｃ１代謝非光合成微生物極長鎖化合物含有バイオマスまたは極長鎖化合物含有組成物は、約−３０‰未満のδ１３Ｃを有するか、または約−４０‰〜約−６０‰の範囲である。一定の実施形態では、極長鎖化合物含有バイオマスは使用済み培地と共に組換えＣ１代謝非光合成微生物を含むか、または極長鎖化合物含有バイオマスは組換えＣ１代謝非光合成微生物の培養物由来の使用済み培地上清組成物を含み、ここで、極長鎖化合物含有バイオマスまたはそこから得られた極長鎖化合物組成物のδ１３Ｃは約−３０‰未満である。一定の他の実施形態では、極長鎖化合物組成物を極長鎖化合物含有バイオマス（このバイオマスは、培養物由来の使用済み培地と共に組換えＣ１代謝非光合成微生物を含み得る）または組換えＣ１代謝非光合成微生物の培養物由来の使用済み培地上清組成物から単離、抽出または濃縮する。
【０２２１】
ある特定の実施形態では、極長炭素鎖化合物含有バイオマスまたは極長炭素鎖化合物の組成物は、Ｃ１代謝非光合成微生物における効率的発現のためにコドン最適化された、本明細書に開示されている１種または複数種のエロンガーゼ複合体酵素を含む組換えＣ１代謝非光合成微生物のものである。
【０２２２】
極長炭素鎖化合物含有バイオマスまたは極長炭素鎖化合物の組成物の生成における使用のための例示的な生物は、細菌等、本開示の組換えＣ１代謝非光合成微生物のものである。ある特定の実施形態では、極長炭素鎖化合物含有バイオマスまたは極長炭素鎖化合物の組成物は、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．１６ａ（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ２４０２）、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９６）、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｓｐｏｒｉｕｍ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９７）、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ  ｐａｒｖｕｓ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９８）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｍｅｔｈａｎｉｃａ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，１９９）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ａｌｂｕｓ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，２００）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｙ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１，２０１）、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ（ＮＣＩＭＢ  １１１３２）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｏｒｇａｎｏｐｈｉｌｕｍ（ＡＴＣＣ  ２７，８８６）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＡＪ−３６７０（ＦＥＲＭ  Ｐ−２４００）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ  ｓｉｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ  ｉｎｆｅｒｎｏｒｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｉｂｉｕｍ  ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｏｐｕｌｉ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｏｄｕｌａｎｓまたはこれらのいずれかの組合せ等、メタン資化性菌またはメチロトローフ由来のＣ１代謝細菌のものである。
【０２２３】
さらなる実施形態では、極長炭素鎖化合物含有バイオマスまたは極長炭素鎖化合物の組成物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｙｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｎｅｏｐｒｏｐａｎｏｌｏｇｅｎまたはこれらの組合せ等、シンガス代謝細菌である本開示の組換えＣ１代謝細菌由来のＣ１代謝細菌のものである。
【実施例】
【０２２４】
（実施例１）
Ｃ１代謝微生物からの脂質抽出
２０℃（すなわち、室温）で、２容量のクロロホルム中１容量のメタノールで構成された抽出溶液（ＣＭ溶液）において行われる、Ｆｏｌｃｈの抽出プロトコール（Ｆｏｌｃｈら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２２６巻：４９７頁、１９５７年）の修正バージョンを使用して、収集された細菌バイオマス内に含有される脂肪酸油組成物を抽出した。新鮮な細菌バイオマス（または−８０℃で貯蔵され、その後に解凍された細菌バイオマス）のいずれかの約５ｇ湿細胞重量（ＷＣＷ）を抽出に使用した。１００ｍＬ  ＣＭ溶液を細胞材料に添加し、この混合物を分液漏斗において激しく抽出した。少なくとも１０分後に、３相が分離された。抽出された脂質を含有する有機相は、分液漏斗の底に沈降し、これをきれいなガラスビンに輸出した。中間層は、主に溶解した細胞材料を含有し、塩および他の可溶性細胞構成成分を含有する軽い水相から分離することができた。
【０２２５】
任意選択で、遠心分離機または他の機械的濃縮器材を使用して、水相における固体を濃縮することができる。固体から除去された水をリサイクルすることができる一方、残留水を少々含む固体は、固体処理ユニットに与えることができる。
【０２２６】
脂質抽出効率を増強するために、さらに１００ｍＬの新鮮ＣＭ溶液を、残留する溶解した細胞集団および残留水を含有する分液漏斗に直接添加することにより、第２の抽出ステップを行った。この混合物を徹底的に再度混合し、相を分離させ、２回の抽出から得た底の有機相をプールした。次に、プールされた有機相を分液漏斗において１００ｍＬ脱イオン水で洗浄して、いかなる残留水溶性材料も除去した。分離された有機画分を、分液漏斗の底から再度単離し、好ましくは酸素の非存在下で加熱して回転蒸発を行うことにより、または窒素気流下５５℃での蒸発により溶媒を除去した。
【表１】
2017515480.tif 000003
【０２２７】
Ｍ．ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  ＢａｔｈおよびＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．１６ａの収集培養物から抽出された凝固した脂肪酸組成物をそれぞれ秤量し、本来の乾燥細胞重量（ＤＣＷ）の重量分率として表１に示す。これらのデータは、これらのＣ１代謝微生物由来のＤＣＷの有意な分率が、脂質で構成されていることを示す。
【０２２８】
ＨａｒａおよびＲａｄｉｎ（Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．９０巻：４２０頁、１９７８年）のヘキサン：イソプロパノール（ＨＩＰ）抽出方法も使用して、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．１６ａバイオマス由来の脂肪酸組成物を抽出した。ＨＩＰ方法を使用して抽出された脂肪酸組成物の解析は、脂肪酸組成物が、修正Ｆｏｌｃｈ方法を使用して抽出された脂肪酸組成物と基本的に同一であったことを示した（データ図示せず）。
【０２２９】
（実施例２）
Ｃ１代謝微生物由来の脂質の脂肪酸メチルエステル変換
Ｍ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ、Ｍ．ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂおよびＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．１６ａ培養バイオマスから抽出された、乾燥固体の形態の脂質画分を、水酸化カリウム（ＫＯＨ）で個々に加水分解し、単一のステップにおけるメタノールとの反応により、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）に変換した。１０ｍＬガラスビン内の約５ｇの抽出固体脂質を、５ｍＬのトルエン：メタノール（１：１ｖ／ｖ）の０．２Ｍ  ＫＯＨ溶液で溶解した。ビンを激しく撹拌し、続いて２５０ｒｐｍ、４２℃で６０分間混合し、その後、溶液を周囲温度まで冷却し、分液漏斗に移した。およそ５ｍＬ蒸留水および５ｍＬ  ＣＭ溶液を分液漏斗に添加し、混合し、続いて相を重力によるかまたは遠心分離（３，０００ｒｐｍ、２５℃）により５分間分離させた。溶解したグリセロールリン酸エステルを含有する上の水性層を除去する一方、重い油相（底）を採取し、回転蒸発または一定の窒素流により濃縮乾固させた。
【０２３０】
ガスクロマトグラフ／質量分析計（ＧＣ／ＭＳ）を使用して、各メタン資化性菌培養物由来の脂質中に存在するＦＦＡおよびＦＡＭＥの解析を行った。加水分解／エステル交換反応ステップ前および後に採取された固体を、ＧＣ／ＭＳ解析の内部標準としてウンデカン酸を含有する３００μＬ酢酸ブチルに溶解した。得られた溶液を５分間１４，０００ｒｐｍで遠心分離して、不溶性残渣を除去した。Ｎ，Ｏ−Ｂｉｓ（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミドの等容量均等物を、遠心分離ステップから得た上清に添加し、短時間ボルテックスした。質量分析計検出器（ＨＰ  ５７９２）を備えるＧＣに試料をロードし、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰ−５ＭＳ  ＧＣ／ＭＳカラム（３０．０ｍ×２５０μｍ×０．２５μｍフィルム厚）を使用して、ＦＦＡおよびＦＡＭＥを分離した。その標準の保持時間および質量スペクトルの電子イオン化により、ＦＦＡおよびＦＡＭＥの同一性を確認した。ＧＣ／ＭＳ方法は、流速１．２ｍＬ／ｍｉｎのキャリアーガスとしてヘリウムを利用した。注入ポートを分割比２０：１で２５０℃に保持した。オーブン温度を６０℃に１分間保持し、続いて３００℃となるまで８℃増加／ｍｉｎを含む温度勾配を行った。質量検出器応答からの全イオンに基づき、各ＦＦＡおよびＦＡＭＥの％面積を計算した。
【０２３１】
加水分解／エステル交換反応の前後に採取された固体残渣をＧＣ／ＭＳによりＦＦＡおよびＦＡＭＥに関して解析した（表２を参照）。
【表２−１】
2017515480.tif 000004
【表２−２】
2017515480.tif 000005
【０２３２】
表２から明らかな通り、加水分解／エステル交換反応前の抽出された脂質組成物は、豊富な遊離脂肪酸を有し、追加的な脂肪酸が存在するが、ＦＦＡは、加水分解／エステル交換反応後に様々な長さの脂肪酸メチルエステルに変換される。これらのデータは、本開示のＣ１代謝微生物由来の油組成物を精製および使用して、価値の高い分子を作製することができることを示す。
【０２３３】
（実施例３）
Ｃ１代謝微生物由来の脂質中の安定炭素同位体分布
Ｍ．ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍのバイオマスおよび脂質画分の乾燥サンプルを、ＩｓｏＰｒｉｍｅ１００  ＩＲＭＳ（Ｉｓｏｐｒｉｍｅ，Ｃｈｅａｄｌｅ，ＵＫ）を取り付けたＣＨＮＯＳ元素分析器（ｖａｒｉｏ  ＩＳＯＴＯＰＥ  ｃｕｂｅ，Ｅｌｅｍｅｎｔａｒ，Ｈａｎａｕ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した元素分析器／連続フロー型同位体比質量分析によって、炭素および窒素含有量（％乾燥重量）、ならびに炭素（１３Ｃ）および窒素（１５Ｎ）安定同位体比について分析した。発酵槽または血清ボトルで培養したメタン資化性バイオマスのサンプルを遠心分離し、脱イオン水に再懸濁し、０．２〜２ｍｇの炭素（約０．５〜５ｍｇ乾燥細胞重量）に対応する体積を５×９ｍｍスズカプセル（Ｃｏｓｔｅｃｈ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）に移し、８０℃で２４時間乾燥させた。同様に、事前に抽出した脂質画分をクロロホルムに懸濁し、０．１〜１．５ｍｇの炭素を含む体積をスズカプセルに移し、８０℃で２４時間蒸発乾固させた。０．１ｍｇの炭素を含む標準によって信頼性の有るδ１３Ｃ値を得た。
【０２３４】
同位体比を「δ」記号（‰）で示し、ここで、百万分の一（ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｏｎ）偏差方式での、標準の同位体組成と比較した材料の同位体組成はδ１３Ｃ（またはδ１５Ｎ）＝（Ｒサンプル／Ｒ標準−１）×１，０００（式中、Ｒは重い同位体型対軽い同位体型の分子比である）で与えられる。炭素標準はウィーンピーディーベレムナイト（Ｖ−ＰＤＢ）であり、窒素については大気である。ＮＩＳＴ（国立標準技術研究所）は、ＳＲＭ（標準参照物質）番号１５４７（モモの葉）を較正標準として使用することを推奨していた。全同位体分析を、カリフォルニア大学バークレー校の安定同位体生物地質化学センターで行った。Ｃ同位体およびＮ同位体分析の長期外部精度は、それぞれ０．１０‰および０．１５‰である。
【０２３５】
Ｍ．ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂ株を３つの異なる発酵バッチ内のメタンで成長させ、Ｍ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈを２つの異なる発酵バッチ内のメタンで成長させ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．１６ａを単一の発酵バッチ内のメタンで成長させた。これらの各培養物由来のバイオマスを、安定炭素同位体分布（δ１３Ｃ値；表３を参照のこと）について分析した。
【０２３６】
【表３−１】
2017515480.tif 000006
【表３−２】
2017515480.tif 000007
【０２３７】
さらに、安定炭素同位体分析を、バイオリアクター中でメタンで成長させたＭｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂ株（Ｍｔ  ＯＢ３ｂ）、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ株（Ｍｃ  Ｂａｔｈ）、およびＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．１６ａ株（Ｍｍｓ  １６ａ）由来のバイオマスおよび対応する脂質画分（表４を参照のこと）について行った。
【０２３８】
【表４】
2017515480.tif 000008
【０２３９】
Ｍｔ  ＯＢ３ｂ株、Ｍｃ  Ｂａｔｈ株、およびＭｍｓ  １６ａ株由来のバイオマスを、それぞれ９４時間（３．１４ｇのＤＣＷ／Ｌ）、２６時間（２．２ｇのＤＣＷ／Ｌ）、および３９時間（１．１４ｇのＤＣＷ／Ｌ）で収集した。表４中の脂質についてのδ１３Ｃ値は、２連の決定値の平均を示す。
【０２４０】
実施例４
脂質における安定炭素同位体分布に及ぼすメタン供給源および純度の影響
【０２４１】
メタン含有天然ガス成分で成長させたメタン資化性菌を試験するために、１００ｍＬ特定培地ＭＭＳ１．０を含む一連の０．５リットル血清ボトルに、メタンおよび空気の１：１（ｖ／ｖ）混合物を供給した同一培地中で成長させた血清ボトルバッチ培養（５％ｖ／ｖ）由来のＭｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂまたはＭｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈを接種した。ＭＭＳ１．０培地の組成は以下であった：０．８ｍＭのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３０ｍＭのＮａＮＯ３、０．１４ｍＭのＣａＣｌ２、１．２ｍＭのＮａＨＣＯ３、２．３５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、３．４ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、２０．７μＭのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、６μＭのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、１０μＭのＦｅＩＩＩ−Ｎａ−ＥＤＴＡ、および１ｍＬ／リットルの微量金属溶液（Ｌあたり以下を含む：５００ｍｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、４００ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２０ｍｇのＭｎＣｌ２・７Ｈ２Ｏ、５０ｍｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１０ｍｇのＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１５ｍｇのＨ３ＢＯ３、２５０ｍｇのＥＤＴＡ）。培地をオートクレーブし、冷却した後に、リン酸塩、重炭酸塩、およびＦｅＩＩＩ−Ｎａ−ＥＤＴＡを添加した。培地の最終ｐＨは７．０±０．１であった。
【０２４２】
接種したボトルをゴムスリーブストッパーで密封し、滅菌０．４５μｍフィルターおよび滅菌２７Ｇ針を通してシリンジを介して添加した６０ｍＬメタンガスを注入した。二連の培養物に６０ｍＬの体積の（Ａ）純度９９％のメタン（グレード２．０，Ｐｒａｘａｉｒ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  Ｇａｓ，Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ）、（Ｂ）天然ガス標準を示す純度７０％のメタン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；９％エタン、６％プロパン、３％メチルプロパン、３％ブタン、および他の微量炭化水素成分も含む）、（Ｃ）メタン供給源ＡおよびＢの１：１混合物として送達させた純度８５％のメタン；ならびに（Ｄ）９３％超のメタン（グレード１．３，Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｓｏｕｔｈ  Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ；インハウス分析ではメタン９９％超の組成を示した）をそれぞれ注入した。培養物を、２５０ｒｐｍでの回転振盪を使用して３０℃（Ｍ．ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂ株）または４２℃（Ｍ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ）でインキュベートし、１ｍＬのサンプルを取り出してＯＤ６００を決定することによっておよそ１２時間間隔で成長を測定した。この時ボトルを通気し、上部空間を６０ｍＬの各メタン供給源（Ａ、Ｂ、Ｃ、またはＤ）および６０ｍＬの濃縮酸素（少なくとも純度８５％）と置換した。約２４時間間隔で、５ｍＬのサンプルを取り出し、遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１０分間）によって細胞を回収し、次いで、分析するまで−８０℃で保存した。
【０２４３】
Ｍ．ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂ株およびＭ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ由来のメタン資化性バイオマスについての炭素含有量および窒素含有量（％乾燥重量）ならびに炭素（１３Ｃ）および窒素（１５Ｎ）安定同位体比の分析を実施例３に記載の通りに行った。表５は、異なるレベルの純度を有するメタンでボトル培養の種々のバッチで成長させたＭ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ由来のバイオマスサンプルについての安定炭素同位体分析の結果を示す。
【０２４４】
【表５−１】
2017515480.tif 000009
【表５−２】
2017515480.tif 000010
【０２４５】
１つのメタン供給源（Ａ、９９％）で成長させたＭ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈの平均δ１３Ｃは−４１．２±１．２であった一方で、異なるメタン供給源（Ｂ、７０％）で成長させたＭ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈの平均δ１３Ｃは−４４．２±１．２であった。メタン供給源ＡおよびＢを混合した場合、−４３．８±２．４という中間の平均δ１３Ｃが認められた。これらのデータは、メタン供給源ＡおよびＢで成長させた細胞材料のδ１３Ｃが投入メタンのδ１３Ｃの相違に起因して相互に有意に異なることを示す。しかし、２つのガスの混合物で成長させた細胞は１２Ｃを優先的に利用し、したがって、より負のδ１３Ｃ値となる傾向を示す。
【０２４６】
異なるメタン供給源およびボトル培養の種々のバッチにおいて成長させた２つの異なるメタン資化性菌（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  ＢａｔｈおよびＭｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３ｂ）がδ１３Ｃ分布の相違を示すかどうかを試験するために、類似の実験を行った（表６を参照のこと）。
【０２４７】
【表６】
2017515480.tif 000011
【０２４８】
第１のメタン供給源（Ａ）で成長させたＭ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓの平均δ１３Ｃは−４４．５±８．８であった一方で、同一メタン供給源で成長させたＭ．ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍの平均δ１３Ｃは−４７．８±２．０であった。第２のメタン供給源（Ｂ）で成長させたＭ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓの平均δ１３Ｃが−３７．９±０．４であった一方で、Ｍ．ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍの平均δ１３Ｃは−３９．８±４．５であった。これらのデータは、メタン供給源で成長させた細胞材料のδ１３Ｃが同一のメタン供給源で成長させた異なる株由来の細胞材料のδ１３Ｃと高度に類似することを示す。したがって、細胞材料のδ１３Ｃの実測値は、研究された特定の細菌株の性質よりもむしろ投入ガスの組成に主に依存するようである。
【０２４９】
上記の種々の実施形態を組み合わせてさらなる実施形態を得ることができる。本明細書中で言及されており、そして／または出願データシートに列挙されている米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許刊行物（２０１４年５月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／９９４，０４２号が含まれる）の全ては、その全体が本明細書中で参考として援用される。様々な特許、出願および刊行物の概念を用いて、なおさらに別の実施形態を提供する必要がある場合、実施形態の態様を修正することができる。
【０２５０】
上の詳細な記載を踏まえて、上述および他の変更を実施形態に為すことができる。一般に、以下の特許請求の範囲では、使用した用語は、明細書および特許請求の範囲中に開示した特定の実施形態に特許請求の範囲を制限すると解釈すべきでないが、特許請求の範囲は、かかる特許請求の範囲が権利を付与される均等物の全範囲と共に全ての可能な実施形態を含むと解釈すべきである。したがって、特許請求の範囲は、開示により制限されない。
【図１】
2017515480.tif 000012
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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