(57)【要約】【課題】本開示は、メイトペアシークエンシングに関する事項の、改変された方法及び組成物について説明する。【解決手段】本発明の１つの実施態様では、メイトペア配列データは、宿主システムにおけるクローン化なしに生成される。本発明の１つの実施態様では、核酸断片は、ベクターへと連結される。挿入された核酸断片を含むベクターは、制限エンドヌクレアーゼで消化され、当該制限エンドヌクレアーゼは、挿入断片の２以上の場所を切断するが、ベクターは切断しない。制限エンドヌクレアーゼでの消化に続いて、制限エンドヌクレアーゼで消化した後に残存する核酸断片部分を含むベクターは、再び連結される。この連結によって、挿入断片の切断末端がお互いに結合される。再連結された産物の配列決定をすることで、元々挿入されていた核酸断片の「左」側及び「右」側の両方の配列データを取得することができる。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
シークエンシングに向けた、２本鎖ポリヌクレオチドの調製方法であって、
制限エンドヌクレアーゼでの、第１環状核酸分子の消化であって、前記第１環状核酸分子が、前記制限エンドヌクレアーゼ向けの制限部位を欠いたベクター、及び前記制限エンドヌクレアーゼ向けの制限部位を少なくとも２つ有する挿入断片、を含む前記消化と、
前記制限エンドヌクレアーゼによって切断された前記挿入断片の第１末端を、前記制限エンドヌクレアーゼによって切断された前記挿入断片の第２末端へと連結することで、前記挿入断片の前記第１末端、前記挿入断片の前記第２末端、及び前記ベクターを含む第２環状核酸分子を創出する連結と、
を含む前記調製方法。
【請求項２】
前記消化が、完全消化を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記制限エンドヌクレアーゼが、メチル化ＤＮＡ上の、対応する制限部位を認識する制限エンドヌクレアーゼを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記制限エンドヌクレアーゼが、ＮｓｉＩ及びＥｃｏＲＩを含む郡から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ベクターが、約２０ｋｂより長い挿入断片配列を保持する能力を有するＤＮＡベクターである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ベクターが、バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、Ｐ１由来人工染色体（ＰＡＣ）、及び形質転換受容性人工染色体（ＴＡＣ）を含む郡から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記挿入断片が、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、または葉緑体ＤＮＡの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記消化及び前記連結が、同一緩衝液中で生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記消化及び前記連結が、前記第１環状核酸分子または前記第２核酸分子を宿主細胞へと導入することなく生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記消化の後、かつ前記連結の前に、前記制限エンドヌクレアーゼの不活性化または除去をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
メイトペアの調製方法であって、
メチル化ゲノムＤＮＡ上の、対応する制限部位を認識する制限エンドヌクレアーゼでの、クローン化ベクター構築物の消化であって、前記クローン化ベクター構築物が、前記制限エンドヌクレアーゼ向けの制限部位を欠いているクローン化ベクター、及び前記制限エンドヌクレアーゼ向けの制限部位を少なくとも２つ有するゲノムＤＮＡ挿入断片、を含む前記消化と、
前記制限エンドヌクレアーゼによって切断された前記ゲノムＤＮＡ挿入断片の第１末端の、前記制限エンドヌクレアーゼによって切断された前記ゲノムＤＮＡ挿入断片の第２末端への連結であって、それによって、前記ゲノムＤＮＡの中間部分を除外したクローン化ベクター構築物が再連結される前記連結と、
を含む前記調製方法。
【請求項１２】
前記クローン化ベクターが、バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、Ｐ１由来人工染色体（ＰＡＣ）、及び形質転換受容性人工染色体（ＴＡＣ）を含む郡から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記クローン化ベクターが、ｐＥＣＢＡＣ１、ｐＢＥＬＯ１１、ｐＣＣ１ＢＡＣ、ｐＩｎｄｉｇｏＢＡＣ−５、及びｐＢＡＣｅ３６を含む郡から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記制限エンドヌクレアーゼが、ＮｓｉＩ及びＥｃｏＲＩを含む郡から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記消化及び前記連結が、同一緩衝液中で生じる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記消化及び前記連結が、前記クローン化ベクター構築物を細胞へと導入することなく生じる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記消化の後、かつ前記連結の前の、前記制限エンドヌクレアーゼの不活性化または除去をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも約２０ｋｂのＤＮＡ挿入断片を安定的に保持する能力を有するベクターであって、制限エンドヌクレアーゼ向けの制限部位、及び複製起点を欠いている前記ベクターと、
ＤＮＡ断片の第１末端と、
前記制限エンドヌクレアーゼの制限部位で、前記ＤＮＡ断片の前記第１末端へと連結された前記ＤＮＡ断片の第２末端であって、前記ＤＮＡ断片の前記第１末端及び前記ＤＮＡ断片の前記第２末端の間の、前記ＤＮＡ断片の中間部分が除外されている前記２末端と、
を含む環状核酸分子。
【請求項１９】
前記ＤＮＡ断片が、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、または葉緑体ＤＮＡの少なくとも１つを含む、請求項１８に記載の環状核酸分子。
【請求項２０】
前記ＤＮＡ断片の前記第１末端、前記ＤＮＡ断片の前記第２末端、またはその両方が、少なくとも約１ｋｂである、請求項１８に記載の環状核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、「大きな挿入断片に由来するメイトペア配列」と題する、２０１４年５月１９日出願の米国特許出願第１４／２８１，８２１号に対する優先権を主張する。出願第１４／２８１，８２１号は、参照によって、本明細書に完全に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
次世代に向けてメイトペアライブラリーを使用するとき、ＤＮＡは、ゲノムのデノボＤＮＡシークエンシング、及び既知ゲノムの再シークエンシングのために使用される。メイトペアシークエンシングにより、分子全体をシークエンシングすることなく、単一ポリヌクレオチド分子上の２つの場所に由来する配列の２つの「リード（ｒｅａｄ）」の決定が可能となる。状況によっては、無作為様式にある２つの独立した核酸配列のそれぞれから「ｎ」塩基をシークエンシングすることで得られる情報と比較して、メイトペア手法では、それぞれの長さが「ｎ」塩基である核酸配列の２つの区間をシークエンシングすることで、より多くの情報を得ることが可能である。例えば、配列情報の構築に向けて、適切なソフトウェアツールを使用することで、メイトペア配列が単一の２本鎖上に生じているものであり、それ故に、メイトペア配列がゲノムにおいて幾分かの間隔を挟んで連結または対を形成しているという知見を利用することが、たとえその分離間隔の正確な長さが不明であったとしても可能である。この情報は、短い配列をメイトペア配列で位置合わせすることによって多数の短い配列をコンピューター支援で構築することにおいて、長い配列を正しく構築するために役立ち得るものである。メイトペア配列の情報を使用することで、配列決定が困難／不可能であるモチーフ（すなわち、反復領域）からなるギャップにまたがって隣接する２つのＤＮＡ配列（コンティグ（ｃｏｎｔｉｇ））を結び付ける骨格を構築することが可能である。
【０００３】
ある手法では、メイトペアの生成に向けて、フォスミドベクターへと連結された３５〜４５キロ塩基（ｋｂ）のＤＮＡ鎖を使用し、当該ＤＮＡ鎖は、ラムダファージを使用して、Ｅ．ｃｏｌｉへと遺伝子導入される。関心ＤＮＡ鎖を含むフォスミドベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉの複製に伴って再産生され、その後、得られたフォスミドＤＮＡは、Ｅ．ｃｏｌｉから単離され、ＮｘＳｅｑ（商標）メイトペアライブラリーの構築、及びそれに続く次世代シークエンシングに使用される。
【発明の概要】
【０００４】
本明細書で開示される様々な実施形態は、一般に、メイトペア及びメイトペアライブラリーの作成に向けた組成物及び方法を対象とするものである。核酸の「メイトペア（ｍａｔｅ  ｐａｉｒ）」は、２つのタグ（核酸配列）を含む、一定の長さを有する核酸配列であり、当該タグは、関心ポリヌクレオチドから生成されるものである。一般に、それぞれのタグは、関心ポリヌクレオチドの別々の部分であり、別々のタグでのシークエンシングを可能にすると同時に、さらに、後の配列解析で、２つのタグ配列をまとめて関連付けることを可能にするものであり、これは、最終的には、タグが同一の連続ポリヌクレオチド断片に由来するものであることが知られているためである。
【０００５】
本発明の１つの態様では、２本鎖ポリヌクレオチドは、シークエンシングに向けて調製される。ベクター及び挿入断片を有する環状核酸分子は、制限エンドヌクレアーゼで消化される。１つの実施態様では、ベクターは、ＤＮＡベクターである。ベクターは、バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、Ｐ１由来人工染色体（ＰＡＣ）、形質転換受容性人工染色体（ＴＡＣ）、別の型の人工染色体、または異なる型のベクターであってよい。ベクターは、約２０ｋｂを超える長さの挿入断片などの、長い挿入断片を保持する能力を有していてよい。ベクターは、短い挿入断片を保持する能力を有するか、または挿入断片を含まない環状核酸分子として存在する能力も有していてもよい。本発明の１つの態様では、挿入断片は、関心配列であってよい。本発明の１つの態様では、挿入断片は、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡ、合成ＤＮＡ、クローン化ＤＮＡ、別の型のＤＮＡ、またはそれらの組み合わせであってよい。
【０００６】
本発明の１つの態様では、制限エンドヌクレアーゼでの消化は、完全消化であってよい。制限エンドヌクレアーゼは、それに対応する、メチル化ＤＮＡ上の制限部位を認識する能力を有していてよく、当該メチル化ＤＮＡは、限定はされないが、ゲノムＤＮＡなどである。制限エンドヌクレアーゼは、ＮｓｉＩ、ＥｃｏＲＩ、または別の制限エンドヌクレアーゼであってよい。環状核酸分子のベクター部分は、制限エンドヌクレアーゼ向けの制限部位を欠いているものである。したがって、制限エンドヌクレアーゼで消化しても、環状核酸分子のベクター部分は切断されない。環状核酸分子における挿入断片は、制限エンドヌクレアーゼ向けの制限部位を少なくとも２つ有する。したがって、挿入断片は、制限エンドヌクレアーゼによって、２つ以上の場所で切断されることになる。
【０００７】
本発明の１つの態様では、制限エンドヌクレアーゼでの消化の後に、核酸分子が連結される。挿入断片は、制限エンドヌクレアーゼによって切断される部位を少なくとも２つ有するため、挿入断片の中間部分が除去される。ベクターに結合したままである挿入断片の一方の末端と、同様にベクターに結合している挿入断片のもう一方の末端と、を連結して結合し、それによって、ベクターと、挿入断片の両末端と、を含む、小型化環状核酸分子が創出される。連結反応は、緩衝液を交換することなく、制限エンドヌクレアーゼでの消化反応の後に実施してよい。したがって、本発明の１つの態様では、消化及び連結は、同一緩衝液中で生じてよい。本発明のいくつかの実施態様では、消化の後かつ連結の前に、制限酵素を除去または不活性化してよい。さらに、消化及び連結は、核酸分子が宿主細胞に導入されることなく、任意の段階で生じてよい。したがって、挿入断片は、同一の化学組成を保持し、これは、挿入断片が宿主細胞に導入されず、再生産されることがないためである。
【０００８】
本発明の１つの態様では、制限エンドヌクレアーゼでクローン化ベクター構築物を消化した後、消化したクローン化ベクター構築物を連結することによって、メイトペアを調製してよい。制限エンドヌクレアーゼは、メチル化ゲノムＤＮＡ上の、対応する制限部位を認識する。制限エンドヌクレアーゼは、ＮｓｉＩ、ＥｃｏｒＲＩ、または別の制限エンドヌクレアーゼであってよい。クローン化ベクター構築物は、人工染色体、及びゲノムＤＮＡ挿入断片を含む。人工染色体は、制限エンドヌクレアーゼ向けの、任意の制限部位を欠いているものである。ゲノムＤＮＡ挿入断片は、制限エンドヌクレアーゼ向けの制限部位を少なくとも２つ有する。本発明の１つの実施態様では、人工染色体は、ＢＡＣ、ＹＡＣ、ＰＡＣ、ＴＡＣ、または別の種類の人工染色体である。本発明の１つの実施態様では、人工染色体は、ｐＥＣＢＡＣ１、ｐＢＥＬＯ１１、ｐＣＣ１ＢＡＣ、ｐＩｎｄｉｇｏＢＡＣ−５、及びｐＢＡＣｅ３６であってよい。
【０００９】
連結することで、制限エンドヌクレアーゼによって切断されたゲノムＤＮＡの一方の末端と、制限エンドヌクレアーゼによって切断されたゲノムＤＮＡのもう一方の末端と、が結合され、それによって、中間部分を含まずにクローン化ベクター構築物が再連結される（すなわち、ゲノムＤＮＡ上の制限エンドヌクレアーゼ部位間に存在する挿入断片の一部分が除去される）。
【００１０】
本発明の１つの態様では、消化及び連結は、同一緩衝液中で生じる。いくつかの実施態様では、制限エンドヌクレアーゼは、消化の後かつ連結の前に、不活性化または除去される。本発明の１つの態様では、消化及び連結は、クローン化ベクター構築物を細胞に導入することなく生じてよい。
【００１１】
１つの態様では、本発明は、環状核酸分子を含む。環状核酸分子は、少なくとも２０ｋｂのＤＮＡ挿入断片を安定的に保持する能力を有するベクターを含んでよい。環状核酸分子は、複製起点を欠いていてよく、かつ制限エンドヌクレアーゼ向けの制限部位を欠いていてよい。環状核酸分子は、ＤＮＡ断片の２つの末端も含むが、ＤＮＡ断片の２つの末端の間のＤＮＡ断片中間部分は除外されている。ＤＮＡ断片の両末端は、制限エンドヌクレアーゼの制限部位でお互いに連結され、それによって、中間配列が除外されることにより小型化したベクター構築物が形成される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】高分子量の核酸から開始するフローチャートを示し、本発明の実施形態による配列データを解析するためのものである。
【図２】所望の分子量範囲を有する核酸断片を取得する上で含まれる段階の図解を示す。
【図３】ベクターへ挿入する前の挿入断片の概略図を示す。
【図４】図３に示す挿入断片と、ベクターとの連結によって生成した環状ポリヌクレオチド分子上に存在する制限エンドヌクレアーゼ部位の概略図を示す。
【図５】図４に示す環状ポリヌクレオチド分子を制限エンドヌクレアーゼで消化した後の概略図を示す。
【図６】図５に示す消化産物を連結することによって生成した環状化ポリヌクレオチド分子の概略図を示す。
【図７】挿入断片を含む環状化ベクターのパルスフィールドゲルの図を示す。
【図８】本発明の１つの実施形態に従って、制限エンドヌクレアーゼでの消化に供した挿入断片を含む環状化ベクターを標準電気泳動したゲルの図を示す。
【図９】図９Ａ、図９Ｂ、及び図９Ｃは、本発明の実施形態から生成したＤＮＡ配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
詳細な説明
定義
実施例で明瞭かつ明確に改変されない限り、または意味を適用することで、いかなる解釈も意味をなさないか、もしくは本質的に意味をなさないことにならない限り、本開示で使用される定義及び説明が、いかなる未来の解釈においても優先することを意味及び意図する。用語を解釈したとしても、用語が意味をなさないか、または本質的に意味をなさないであろう場合は、Ｗｅｂｓｔｅｒ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、またはＯｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｄ．Ａｎｔｈｏｎｙ  Ｓｍｉｔｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，２ｎｄ  Ｅｄ．２００６）などの当業者に知られる辞書から定義を取得することになる。
【００１４】
別段の定義がない限り、本明細書で使用される専門用語及び科学用語は、本発明が属する技術領域の当業者が一般に理解する意味と同一の意味を有する。本発明の目的に向けて、下記の用語を以下に定義する。
【００１５】
本明細書では、「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、合成ＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍｔＤＮＡ、ｃｐＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、及びそれらの組み合わせを指す。こうした用語は、典型的には、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、またはそれらのキメラ混合物のいずれかであり、長さが少なくとも１０塩基である、重合形態のヌクレオチドを指す。用語は、ＤＮＡ及びＲＮＡの１本鎖形態及び２本鎖形態の両方を含む。用語は、メチル化ＤＮＡ及び非メチル化ＤＮＡの両方を含む。「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、セグメント及びそのようなセグメントのより小さな断片、ならびに組換えベクターも含み、例えば、人工染色体、プラスミド、コスミド、ファージミド、ファージ、ウイルス、及び同様のものが含まれる。別段の記載がない限り、ポリヌクレオチド配列が示される場合は常に、ヌクレオチドは、左から右に向かって、５’から３’の順であり、「Ａ」は（デオキシ）アデノシンを示し、「Ｃ」は（デオキシ）シチジンを示し、「Ｇ」は、（デオキシ）グアノシンを示し、「Ｔ」は（デオキシ）チミジンを示し、そして「Ｕ」はウリジンを示すと理解されることになる。
【００１６】
ポリヌクレオチドは、１本鎖（コードもしくはアンチセンス）または２本鎖であってよく、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子であってよい。追加のコード配列または非コード配列が、必須ではないが、本発明のポリヌクレオチド内に存在してよく、ポリヌクレオチドは、必須ではないが、他の分子及び／または支持材料に連結される。
【００１７】
「相補的（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」及び「相補性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ）」という用語は、塩基が対を形成する規則によって関連するポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチド配列）を指す。例えば、「Ａ−Ｇ−Ｔ」という配列は、「Ｔ−Ｃ−Ａ」という配列に対して相補的である。相補性は、「部分的（ｐａｒｔｉａｌ）」であってよく、その場合、核酸の塩基のいくつかのみが、対形成の規則に従って適合する。あるいは、核酸の間で、「完全（ｃｏｍｐｌｅｔｅ）」相補性または「全体（ｔｏｔａｌ）」相補性が存在してよい。核酸鎖間に存在する相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び強度に対して影響を与えるものである。
【００１８】
本明細書では、「タグ（ｔａｇ）」、「配列タグ（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇ）」、または「タグ配列（ｔａｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、関心ポリヌクレオチドの部分配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）を指す。
【００１９】
「ＭＰ」、「ペアエンド（ｐａｉｒｅｄ−ｅｎｄ）」、タグメイトペア（ｔａｇ  ｍａｔｅ  ｐａｉｒ）」、または「ペアタグ（ｐａｉｒｅｄ  ｔａｇ）」としても知られる「メイトペア（ｍａｔｅ  ｐａｉｒ）」は、１つの関心ポリヌクレオチドのそれぞれの末端領域に由来する２つのタグ（それぞれのヌクレオチド配列）を含むものである。したがって、ペアタグは、１つのポリヌクレオチドの２つの部分に由来する配列断片情報を含むものである。いくつかの実施形態では、この情報は、配列決定された２つの断片の間の分離間隔を少なくとも最初の概算として知る目的で、ポリヌクレオチドのサイズに関する情報と組み合わせることができる。この情報は、配列タグを得た場所のマッピングにおいて使用することができる。
【００２０】
本明細書では、「出発ポリヌクレオチド（ｓｔａｒｔｉｎｇ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」は、そこから関心ポリヌクレオチドを得ることができる、元のポリヌクレオチドを指す。例えば、細胞に由来する試料であり、その場合、出発ポリヌクオチドは、許容可能なサイズへと断片化されて、関心ポリヌクレオチドとして働く。当然ながら、出発ポリヌクレオチドの選択肢及び変形形態は、少なくとも関心ポリヌクレオチドの選択肢と同じくらい幅広いものである。
【００２１】
「適合性末端（ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  ｅｎｄ）」を有する核酸配列、断片、またはペアタグクローンは、末端が、本明細書で提供されるような別の核酸配列、断片、またはペアタグクローンへの結合に適合性であることを意味する。適合性末端は、５’突出及び／または３’突出を有する「粘着末端」であり得るか、あるいは、適合性末端は、５’突出及び／または３’突出を有さない「平滑末端」であり得る。一般に、粘着末端は、配列依存性の連結が可能であり、一方、平滑末端は、配列非依存性の連結が可能である。適合性末端は、当該技術領域で標準である、任意の既知の方法によって産生することができる。例えば、核酸配列の適合性末端は、５’末端及び／または３’末端を制限エンドヌクレアーゼで消化することによって、産生することができる。
【００２２】
「制限エンドヌクレアーゼ（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）」または「制限酵素（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ）」という用語は、「制限部位」または「制限認識部位」として知られる特異的認識核酸配列でＤＮＡを切断するか、または当該特異的認識核酸配列の付近のＤＮＡを切断する酵素を指す。制限エンドヌクレアーゼは、メチル化ＤＮＡを認識し、切断することができる酵素、及び非メチル化ＤＮＡのみを認識する酵素、の両方を含む。メチル化ＤＮＡには、ｄａｍメチル化、ｄｃｍメチル化、及びＣｐＧメチル化が含まれる。制限エンドヌクレアーゼは、４個、６個、または８個のヌクレオチドからなる長さを有する制限部位を認識し得る。こうした型の制限エンドヌクレアーゼは、それぞれ、４−カッター、６−カッター、及び８−カッターと称される。
【００２３】
「酵素反応性条件（ｅｎｚｙｍｅ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）」は、酵素が機能することを可能にする環境において、任意の必要条件が利用可能であることを意味する（すなわち、温度、ｐＨ、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、及び阻害物質非含有などの因子）。酵素反応性条件は、試験管内などのインビトロ、または細胞内などのインビボのいずれかであり得る。
【００２４】
制限エンドヌクレアーゼを基質と組み合わせ、制限エンドヌクレアーゼが「部分消化（ｐａｒｔｉａｌ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）」または「完全消化（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）」を行う酵素反応性条件に曝露してよい。部分消化は、切断される可能性がある制限部位のすべてを切断するには満たない条件下で、制限エンドヌクレアーゼによって触媒される反応である。完全消化または「完全消化（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ｔｏ  ｃｏｍｐｌｅｔｉｏｎ）」は、切断される可能性がある制限部位のすべてまたは実質的にすべてが切断される反応である。
【００２５】
制限エンドヌクレアーゼの「不活性化（ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）」は、酵素、基質、または酵素反応性条件を変更して、酵素のＤＮＡ切断能力またはＲＮＡ切断能力を停止または実質的に減少させることを指す。不活性化は、高温または低温による不活性化を含む。メチル化制限部位を認識しない制限エンドヌクレアーゼに向けては、不活性化は、ＤＮＡ基質をメチル化することによって達成してもよい。
【００２６】
「に対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｓ  ｔｏ）」または「に対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ  ｔｏ）」は、制限部位が、制限エンドヌクレアーゼによって認識される核酸配列を有することを意味する。制限エンドヌクレアーゼは、制限部位内の位置または制限部位に近接する別の位置で、ＤＮＡまたはＲＮＡを切断し得る。「切断部位（ｃｕｔｔｉｎｇ  ｓｉｔｅ」は、ポリヌクレオチド配列のリン酸骨格鎖が、制限エンドヌクレアーゼによって切断される位置である。切断部位は、常にではないが、通常は制限部位と同一である。
【００２７】
「宿主細胞」という用語は、本発明の任意の組換えベクターまたは単離されたポリヌクレオチドのレシピエントであり得るか、またはそのレシピエントであった個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一宿主細胞の子孫を含み、子孫は、自然的、偶発的、または計画的である変異及び／または変化に起因して、必ずしも元の親細胞と完全に（形態学または全体ＤＮＡ相補体において）同一でなくてよい。宿主細胞は、インビボまたはインビトロで、本発明の組換えベクターまたはポリヌクレオチドを遺伝子導入または感染させた細胞を含む。本発明の組換えベクターを含む宿主細胞は、組換え宿主細胞である。
【００２８】
「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」は、物質が、その天然状態において、それに通常付随する成分を実質的または本質的に含まないことを意味する。例えば、本明細書で使用される「単離されたポリヌクレオチド」は、自然発生状態において、それに隣接する配列から精製されたポリヌクレオチドを指し、例えば、その断片に通常隣接する配列から取り出されたＤＮＡ断片である。あるいは、本明細書で使用される「単離されたペプチド」または「単離されたポリペプチド」及び同様のものは、その自然な細胞環境から、及び他の細胞成分との関連から、インビトロで単離及び／または精製されたペプチド分子またはポリペプチド分子を指す。
【００２９】
「から取得した（ｏｂｔａｉｎｅｄ  ｆｒｏｍ）」は、所望の生物または所望の生物内の特定組織などの特定供給源から、例えば、ポリヌクレオチド抽出物またはポリペプチド抽出物などの試料を単離または得ることを意味する。「から取得した」は、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を、特定の生物または生物内組織から単離または得る状況も指し得る。
【００３０】
「形質転換」は、宿主細胞への外来ＤＮＡの取り込みまたは組み込みに起因する、細胞の永続的な遺伝性改変を指すと共に、ある生物に由来する外来遺伝子の、別の生物のゲノムへの移入も指す。
【００３１】
本明細書では、「ベクター」という言葉は、「挿入断片（ｉｎｓｅｒｔ）」と称される別のポリヌクレオチド分子に連結され、それを安定的に保持する能力を有するポリヌクレオチド分子である。ベクターは、１つまたは複数の特有制限部位を含んでよい。ベクターは、挿入断片と比較して、長いか、または短くてよい。ベクター及び挿入断片の両方が、同一または異なる型の核酸（例えば、ｇＤＮＡ、ｍｔＤＮＡ、ｃｐＤＮＡ、ｃＤＮＡ、プラスミド、コスミド、フォスミド、ＢＡＣ、ＹＡＣ、Ｐ１、ＴＡＣ、合成ＤＮＡ）であってよい。「ベクター」は、自然から得られたポリヌクレオチド及び合成ポリヌクレオチドの両方を含む。
【００３２】
本明細書では、「ベクター」には、限定はされないが、例えば、ポリヌクレオチドを挿入またはクローン化することができるプラスミド、バクテリオファージ、酵母、またはウイルスに由来し得る「クローン化ベクター（ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒ）」が含まれる。クローン化ベクターは、標的細胞もしくは標的組織または前駆細胞もしくはその組織を含む定義された宿主細胞において、自律複製する能力を有し得るか、あるいは、クローン化配列の再産生が可能なように、定義された宿主のゲノムに組み込むことが可能であり得る。したがって、クローン化ベクターは、自律複製するベクターであり得、すなわち、染色体外の実体として存在し、染色体の複製とは無関係に複製されるベクターであり、例えば、直鎖状プラスミドもしくは閉環状プラスミド、染色体外因子、ミニ染色体、または人工染色体である。クローン化ベクターは、自己複製を確実なものとするための任意の手段を含むことができる。あるいは、クローン化ベクターは、宿主細胞に導入されると、ゲノムへと組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであり得る。そのようなベクターは、宿主染色体の所望の特定部位への組換えを可能にする特定配列を含んでよい。クローン化ベクターシステムは、宿主細胞のゲノム、またはトランスポゾンへと導入されることになる全ＤＮＡまたは全ＲＮＡを一緒に含む、単一のベクターまたはプラスミド、２つ以上のベクターまたはプラスミドを含むことができる。クローン化ベクターの選択は、典型的には、クローン化ベクターと、クローン化ベクターが導入されることになる宿主細胞と、の適合性に依存することになる。クローン化ベクターは、宿主細胞において、作動可能に機能的であるものが好ましい。クローン化ベクターは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などのレポーター遺伝子を含むことができ、当該レポーター遺伝子は、コードされるポリペプチドの１つもしくは複数にフレーム内で融合させるか、または別々に発現させることができる。クローン化ベクターは、ＬａｃＺ遺伝子などの選択マーカーを含むこともでき、ＬａｃＺ遺伝子は、挿入断片によって破壊することで、増殖コロニーの色を白色にすることができ、または挿入断片が存在しない場合は、増殖培地に適切な化学物質（例えば、ＩＰＴＧ及びＸｇａｌ）を含めると、コロニーの色を青色に変えるものである。クローン化ベクターは、適した形質転換体の選択に使用可能な抗生物質耐性遺伝子などの選択マーカーも含むことができる。
【００３３】
本明細書では、「ベクター構築物」という用語は、挿入断片に連結されて環状核酸分子を形成したベクターを指す。
【００３４】
本明細書では、「プライマー」という用語は、オリゴヌクレオチドを指し、精製した制限酵素消化物のような自然発生したものであるか、または合成的に産生させたものであるかにかかわらず、当該オリゴヌクレオチドは、核酸鎖に対して相補的であるプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下（すなわち、ヌクレオチド、及びＤＮＡポリメラーゼなどの誘導剤が、適切な温度及びｐＨで存在する）に置かれると、合成の開始点として働く能力を有するものである。プライマーは、増幅効率を最大化するために１本鎖であることが好ましいが、代わりに２本鎖とすることもできる。２本鎖であるならば、伸長産物の調製に使用する前に、プライマーに対して、その鎖を分離する処理が最初に実施される。好ましくは、プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、誘導剤存在下で、伸長産物の合成を開始するために十分な長さを有していなければならない。プライマーの的確な長さは、多くの因子に依存することになり、当該因子には、温度、プライマーの供給源、及び使用する方法が含まれる。
【００３５】
本明細書では、「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）という用語は、Ｋ．Ｂ．Ｍｕｌｌｉｓの方法を指し、当該方法は、当業者に知られており、米国特許第４，６８３，１９５号及び第４，６８３，２０２号において説明されている。ＰＣＲは、クローン化または精製を実施することなく、関心配列であるＤＮＡ配列のセグメントのコピー数を増やすための方法を含むものである。関心ポリヌクレオチドを増幅するための、このプロセスは、関心配列を有する所望のポリヌクレオチド、及び組み込まれていないヌクレオチド（ｄＮＴＰのヌクレオチド）を含むＤＮＡ混合物に対する、大過剰量の２種のオリゴヌクレオチドプライマーの導入と、その後に続く、ＤＮＡポリメラーゼ存在下での、正確な一連の熱サイクリングと、からなるものである。２種のプライマーは、関心配列を有する２本鎖ポリヌクレオチドの、そのそれぞれの鎖に対して相補的である。増幅を引き起こすために、混合物は変性された後、関心分子のポリヌクレオチド内に存在する、その相補配列に対してプライマーがアニールする。アニーリングの後、相補鎖の新しい対が形成されるように、ポリメラーゼがプライマーを伸長する。変性段階、プライマーのアニーリング段階、及びポリメラーゼによる伸長段階を、何度も繰り返して実施（すなわち、変性、アニーリング、及び伸長が、１つの「サイクル」を構成し、多数の「サイクル」が実施され得る）することで、所望の関心ポリヌクレオチドの増幅セグメントを高濃度で取得することができる。所望の関心ポリヌクレオチドの増幅セグメントの長さは、お互いに対するプライマーの相対的位置によって決定されるものであり、したがって、この長さは制御可能なパラメーターである。プロセスを繰り返すことが理由で、方法は、「ポリメラーゼ連鎖反応」（これ以後は「ＰＣＲ」）と称される。関心配列を有するポリヌクレオチドの所望の増幅セグメントが、混合物中で（濃度に関して）優勢な配列となることから、それは、「ＰＣＲ増幅された（ＰＣＲ  ａｍｐｌｉｆｉｅｄ）」と言われる。
メイトペアシークエンシング
したがって、本開示は、一般に、メイトペア配列データの生成に関係する方法及び製品に関する。
【００３６】
図１は、ベクターの調製、ベクターのプロセシング、及びベクターの一部のシークエンシングの方法１００を示す。１０２では、任意の適した手法によって、高分子量の核酸を単離する。１つの実施態様では、高分子量の核酸は、生物の細胞または組織試料から単離されてよい。高分子量の核酸を調製するための手法の１つであって、当業者に知られているであろうものは、Ｚｈａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｇａｂａｓｅ−ｓｉｚｅ  ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  ｐｌａｎｔ  ｎｕｃｌｅｉ．Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ．７（１），１７５-１８４．（１９９５）において説明されるものである。高分子量の核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの組み合わせであってよい。１つの実施態様では、高分子量の核酸は、ゲノムＤＮＡである。
【００３７】
１０４では、高分子量の核酸を、第１制限エンドヌクレアーゼで消化する。消化は、異なる完了レベルを取得するために、様々な時点で消化を停止することによって達成した部分消化であってよい。消化することで、高分子量の核酸に由来する様々なサイズを有した複数断片が創出される。消化は、高分子量の核酸を抽出してすぐに、高分子量の核酸がアガロース内に埋め込まれたままの状態で実施してよい。当業者であれば、高分子量の核酸の型、特異的な制限エンドヌクレアーゼ、及び所望の消化頻度に基づいて、どのように反応条件を変えるかを理解しているであろう。使用し得る制限エンドヌクレアーゼのいくつかは、［３−５のリスト］である。高分子量の核酸を調製し、高分子量の核酸を制限エンドヌクレアーゼでの消化に供すための手法の１つは、Ｔａｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｆｕｌｌ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ（ＢＡＣ）ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  ｇｅｎｏｍｅ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．４，１２７-１３３（１９９４）において説明されている。
【００３８】
１０６では、高分子量の核酸の断片をサイズによって分離する。高分子量の核酸の断片を分離する手法の１つは、パルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）である。ＰＦＧＥを実行するために使用したゲルから切り出すことによって、所望の分子量範囲を有する核酸断片を選択してよい。所望の分子量を有する核酸断片は、透析、エレクトロルーティング（ｅｌｅｃｔｒｏｌｕｔｉｎｇ）、及びゲルの酵素消化（例えば、寒天を分解するアガラーゼ酵素）などの既知の手法を使用して、ゲルから単離してよい。ＰＦＥＧを使用した、サイズによる核酸断片の分離手法の特定の例は、Ｔａｏ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｔａｂｌｅ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｏｖｅｒ  ３００  ｋｂ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｗｉｔｈ  ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ｐｌａｓｍｉｄ−ｂａｓｅｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｖｏｌ．２６，Ｎｏ．２１，４９０１-４９０９（１９９８）、及びＴａｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｆｕｌｌ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ（ＢＡＣ）ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  ｇｅｎｏｍｅ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．４，１２７-１３３（１９９４）において説明されている。
【００３９】
図２は、図１の１０２〜１０６を実施する実施形態２００を示す。制限エンドヌクレアーゼで消化して、高分子量の核酸である２０２を切断し、複数の小型化断片２０４とする。断片は、ＰＦＧＥゲル２０６で分離してよい。ＰＦＧＥゲル２０６にてマーカーを使用することで、ＰＦＧＥゲル２０６のレーンに広がった断片のおよその分子量を同定する。所望のサイズ範囲を有する断片をゲルから切り出してよい。１つの実施態様では、サイズ範囲は、約５０ｋｂ、約７５ｋｂ、約１００ｋｂ、約１２５ｋｂ、約１５０ｋｂ、約１７５ｋｂ、約２００ｋｂ、約３００ｋｂ、約４００ｋｂ、約５００ｋｂ、約６００ｋｂ、約７００ｋｂ、約８００ｋｂ、約９００ｋｂ、または約１ｍｂであってよい。電場２０８を適用して使用することで、エレクトロルーティングによって、ゲル２０６から断片を取り出してよい。
【００４０】
図１に戻り、１０８では、上記の手順によって生成した高分子量の核酸の断片をベクターへと連結する。ベクターにおける挿入断片ＤＮＡの化学組成は、元の関心生物に由来するものであり、挿入断片ＤＮＡは、宿主細胞に一切導入されていないものであるか、または宿主細胞によって一切コピーされていないものである。使用し得る例示ベクターには、限定はされないが、ｐＥＣＢＡＣ１、ｐＢＥＬＯ１１、ｐＣＣ１ＢＡＣ、ｐＩｎｄｉｇｏＢＡＣ−５、及びｐＢＡＣｅ３６が含まれる。断片は、第１制限エンドヌクレアーゼによって切断したものであるため、断片の末端は、同一制限エンドヌクレアーゼで同様に切断した他の核酸と連結し得るものである。したがって、ベクターは、同一制限エンドヌクレアーゼで消化するか、またはベクターの末端が、同一制限エンドヌクレアーゼで切断した末端に対応するように創出したものであってよい。制限エンドヌクレアーゼでヌクレオチド配列を切断した際に、粘着末端または平滑末端が創出されてよい。当業者であれば、ベクター、高分子量の核酸の断片、及び切断を作成するために使用する制限エンドヌクレアーゼに基づいて、適切なリガーゼ及び反応条件を容易に同定することが可能であろう。この連結に使用し得る例示の手順は、Ｔａｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｆｕｌｌ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ（ＢＡＣ）ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  ｇｅｎｏｍｅ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．４，１２７-１３３（１９９４）、Ｚｈａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｇａｂａｓｅ−ｓｉｚｅ  ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  ｐｌａｎｔ  ｎｕｃｌｅｉ．Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ．７（１），１７５-１８４．（１９９５）、及びＴａｏ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｔａｂｌｅ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｏｖｅｒ  ３００  ｋｂ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｗｉｔｈ  ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ｐｌａｓｍｉｄ−ｂａｓｅｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｖｏｌ．２６，Ｎｏ．２１，４９０１-４９０９（１９９８）において説明されている。
【００４１】
図３は、関心核酸配列３０２とベクター３０４との連結の概略図３００を示す。挿入断片３０２及びベクター３０４は、粘着末端を有する形式で示されているが、本発明は、平滑末端を創出する制限エンドヌクレアーゼを使用することによっても実施してよい。連結することによる最終産物は、環状である２本鎖ポリヌクレオチド分子のライブラリーであり、１０４において、制限エンドヌクレアーゼで消化することによって創出した様々な挿入断片３０２を含むものである。
【００４２】
図１の１１０では、挿入断片を含むベクターを、第１制限エンドヌクレアーゼとは異なる第２制限エンドヌクレアーゼで消化する。ベクター配列は知ることとなるであろうし、第２制限エンドヌクレアーゼは、ベクターを切断しないものを選択する。例えば、挿入断片がゲノムＤＮＡから得られたものであるとき、挿入断片の配列は不明であり得る。しかしながら、大きな挿入断片（例えば、１０〜１，０００ｋｂ）では、複数の制限部位が存在するであろう合理的な可能性が存在する。例えば、ヌクレオチドの無作為配列を想定すると、４−カッターであれば、２５６ｂｐごとに切断箇所が存在する可能性があろうし、６−カッターであれば、４ｋｂごとに切断箇所が存在する可能性があろうし、そして８−カッターであれば、６６ｋｂごとに切断箇所が存在する可能性があろう。使用し得る制限エンドヌクレアーゼには、［メチル化ＤＮＡに対して作用する少数の６−カッターのリスト］が含まれる。
【００４３】
図４は、連結後の挿入断片３０２及びベクター３０４の概略図４００を示す。挿入断片３０２は、第２制限エンドヌクレアーゼ向けである、少なくとも２つの制限部位４０２Ａ及び制限部位４０２Ｂを有する。挿入断片３０２は、同一制限エンドヌクレアーゼ向けである、追加の制限部位４０２を含んでよい。環状ポリヌクレオチド分子のベクター３０４部分は、当該制限エンドヌクレアーゼ向けの制限部位を全く含んでいないことに留意されたい。
【００４４】
１つの実施形態では、図１の１１０に記載の、この制限エンドヌクレアーゼでの消化は、完全消化として実施してよい。消化の間に、挿入断片の中間部分は、環状ポリヌクレオチド分子の残りから切り離される。当業者であれば、制限エンドヌクレアーゼでの消化は、選択した制限エンドヌクレアーゼ向けの標準反応条件で実施し得ることを理解されよう。消化反応は、再連結に先立って、完全消化後に停止してよい。
【００４５】
図５は、図４に示す環状ポリヌクレオチド分子を、制限部位４０２Ａ及び制限部位４０２Ｂで消化した後の概略図５００を示す。挿入断片３０２を切断して、第１末端５０２及び第２末端５０４とし、当該両末端は、両方がベクター３０４に依然として結合しているものである。ベクター３０４の中間部分である５０６は、環状ポリヌクレオチド分子の残りから分離される。挿入断片３０２の中間部分である５０６内に制限部位４０２Ａ及び制限部位４０２Ｂが追加で存在すれば、中間部分５０６は、さらに切断されて小型化した断片となるであろう。しかしながら、挿入断片３０２の中間部分である５０６に制限部位４０２が追加で存在によって、挿入断片の第１末端５０２及び第２末端５０４のサイズが影響を受けることはない。制限エンドヌクレアーゼで消化された後、ポリヌクレオチド分子は直鎖化して、挿入断片３０２の第１末端である５０２と、ベクター３０４と、挿入断片３０２の第２末端である５０４と、を含む２本鎖ポリヌクレオチドとなる。
【００４６】
図１に戻り、１１２では、結合している挿入断片末端５０２及び挿入断片末端５０４を含むベクター３０４を再連結する。再連結は、任意の従来手法によって実施してよい。再連結することは、ベクター３０４、ならびに結合している末端５０２及び末端５０４を再環状化することにもなる。１つの実施態様では、制限部位４０２Ａ及び制限部位４０２Ｂでの消化によって創出される末端は、環状核酸分子へと連結することができる適合性粘着末端である。使用し得る連結手法の例は、Ｔａｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｆｕｌｌ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ（ＢＡＣ）ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  ｇｅｎｏｍｅ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．４，１２７-１３３（１９９４）、Ｚｈａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｇａｂａｓｅ−ｓｉｚｅ  ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  ｐｌａｎｔ  ｎｕｃｌｅｉ．Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ．７（１），１７５-１８４．（１９９５）、及びＴａｏ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｔａｂｌｅ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｏｖｅｒ  ３００  ｋｂ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｗｉｔｈ  ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ｐｌａｓｍｉｄ−ｂａｓｅｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｖｏｌ．２６，Ｎｏ．２１，４９０１-４９０９（１９９８）において説明されている。
【００４７】
図６は、再連結した後の環状ポリヌクレオチド分子の概略図６００を示す。ベクター３０４は、挿入断片３０２の第１末端５０２及び第２末端５０４に依然として結合している。２つの末端である５０２及び５０４は、この時点でお互いに結合して、環状である２本鎖ポリヌクレオチド分子を形成しており、当該２本鎖ポリヌクレオチド分子からは、挿入断片３０２の中間部分５０６が除外されている。ベクター３０４は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）でプライマーが結合するのに適する、挿入断片末端５０２側及び挿入断片末端５０４側のいずれかに、少なくとも１つのプライマー部位６０２及びプライマー部位６０４含んでいてもよい。プライマー部位６０２及びプライマー部位６０４は、元のベクターである３０６に存在するものであるが、明確化のために、他の図からは除外してある。したがって、再連結することにより、末端５０２及び末端５０４に対してＰＣＲを実施するための鋳型が得られる。ベクター３０４は、宿主細胞へと遺伝子導入／形質転換していないため、ベクター３０４の複製起点（または従来のプラスミドベクターで見られる他の機能性要素）の有無は、本発明の他の態様に影響を与えるものではないことに留意されたい。
【００４８】
図１の１１４では、ベクターに存在するプライマー部位を使用して、ＰＣＲによって断片の残存末端を増幅する。ＰＣＲは、任意の従来手法によって実施してよい。１つの実施態様では、シークエンシング向けのベクター及び挿入断片の調製を実施する段階は、ベクターの細胞への形質転換または遺伝子導入を伴うものではない。したがって、高分子量である元の核酸断片は、エピジェネティック修飾を保持していてよい。さらに、この手法では、クローン化ベクター及び挿入断片を宿主細胞へクローン化することによって導入される潜在的なバイアスは存在しない。
【００４９】
１１６では、ＰＣＲ産物の配列決定を実施する。適したシークエンシング手法には、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）、及びポリヌクレオチド分子の配列決定に向けて未来に開発される任意の手法が含まれる。例えば、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡのＩｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、またはＭｅｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡのＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって作り出された、ＮＧＳの機器及びシステムをシークエンシングに使用してよい。本発明の１つの実施態様では、配列決定前のＰＣＲ増幅について記載されているが、単一核酸分子を読む、他のシークエンシング技術を使用する際は、ＰＣＲは除外してよいことが想定される。
【００５０】
１１８では、１１６で生成した配列データを解析し、断片末端のヌクレオチド配列を同定する。メイトペア配列から生成した配列データの解析手法は、当業者に知られている。２つのメイトペア配列の間の「中間」推定ギャップを使用して、配列構築ソフトウェアで骨格を構築することができる。適した配列構築ソフトウェア製品の１つは、Ｇｎｅｒｒｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｉｇｈ−ｑｕａｌｉｔｙ  ｄｒａｆｔ  ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ｆｒｏｍ  ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ．（２０１０）において論じられているＡＬＬＰＡＴＨＳ−ＬＧである。上記の手法を使用して生成させた配列データにフィルターをかけて第２制限部位を発見し、解析してＤＮＡ断片の「左末端」及び「右末端」を把握してよい。
結論
本発明の説明との関連において（特に下記の請求の範囲との関連において）使用される「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」という用語、及び類似の指示対象は、本明細書で別段の記載がない限り、または文脈から明確に矛盾しない限り、単数及び複数の両方を含むものであると解釈されることになる。
【００５１】
当業者であれば理解するであろうが、本明細書に開示の実施形態のそれぞれが、記載されているその特定の要素、段階、含有物（ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ）、または成分を、含む、それから本質的になる、またはそれからなる、ことができる。したがって、「ｈａｖｉｎｇ」、「ｈａｓ」、「ｃｏｎｔａｉｎ」、「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｅ」、または「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」という用語は、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ、ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆ、またはｃｏｎｓｉｓｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ」を記載したものであると解釈されるべきである。本明細書では、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」または「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」という移行用語は、限定はされないが、非特定の要素、段階、含有物、または成分を、たとえ多量であっても含有することを、意味し、含み、及び許容するものである。「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ」という移行語句は、非特定である任意の要素、段階、含有物、または成分を除外するものである。「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ」という移行語句は、実施形態の範囲を、特定の要素、段階、含有物、または成分、及び実施形態に実質的に影響を与えないものに限定するものである。
別段の記載がない限り、本明細書及び請求の範囲において使用されるすべての数は、すべての実例おいて、「約（ａｂｏｕｔ）」という用語によって修飾されているものであると理解されることになる。したがって、異なる記載がない限り、本明細書及び添付の請求の範囲において示される数的パラメーターは、本発明が取得することを目指す所望の特性に基づいて変化する近似である。少なくとも、請求の範囲に対して、同等形態の理論適用を限定しようとするものではなく、それぞれの数的パラメーターは、少なくとも、有意な報告桁数の観点から、通常の丸め手法を適用することによって、解釈されるべきものである。さらなる明確さが求められるときには、「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、記載の数値または範囲と共に使用されるとき、当業者がそれを合理的であるとみなす意味を有し、すなわち、記載値の±２０％範囲内、記載値の±１９％範囲内、記載値の±１８％範囲内、記載値の±１７％範囲内、記載値の±１６％範囲内、記載値の±１５％範囲内、記載値の±１４％範囲内、記載値の±１３％範囲内、記載値の±１２％範囲内、記載値の±１１％範囲内、記載値の±１０％範囲内、記載値の±９％範囲内、記載値の±８％範囲内、記載値の±７％範囲内、記載値の±６％範囲内、記載値の±５％範囲内、記載値の±４％範囲内、記載値の±３％範囲内、記載値の±２％範囲内、または記載値の±１％範囲内で、記載値または記載範囲が、幾分か高いか、または幾分か低いことを示す。
本発明の広い範囲を示す数的範囲及び数的パラメーターが近似であるかにかかわらず、特定の実施例において示される数値は、可能な限り正確に報告される。しかしながら、いずれの数値も、そのそれぞれの試験測定において見られる標準偏差から必然的にもたらされる、ある特定の誤差を本質的に含むものである。
【００５２】
本明細書の説明は、本発明に関するある特定のパラメーターを数量化するために、数的範囲を使用している。数的範囲が与えられるとき、そのような範囲は、範囲の低値をただ記載するに過ぎない請求の限定、ならびに範囲の上値をただ記載するに過ぎない請求の限定に向けて、文字通りの裏付けを与えると解釈されることになると理解されるべきである。例えば、数的範囲が１０〜１００であると開示されるなら、「１０を超える」（上限なし）という請求、及び「１００を下回る」（下限なし）という請求に向けて、文字通りの裏付けを与えると共に、１０及び１００の端点に向けた文字通りの裏付けを与え、当該両端点を含む。
【００５３】
本明細書の説明は、本発明に関する、ある特定のパラメーターを数量化するために、特定の数値を使用しており、特定の数値は、数的範囲の部分とは、明確に異なるものである。本明細書で提供される特定の数値はそれぞれ、広い範囲、中間の広さの範囲、及び狭い範囲に向けて文字通りの裏付けを与えると解釈されることになると理解されるべきである。それぞれの特定の数値と関連する広い範囲は、数値プラス数値の６０パーセントから数値マイナス数値の６０パーセントであり、有意な２桁へと丸められる。それぞれの特定の数値と関連する中間の広さの範囲は、数値プラス数値の３０パーセントから数値マイナス数値の３０パーセントであり、有意な２桁へと丸められる。それぞれの特定の数値と関連する狭い範囲は、数値プラス数値の１５パーセントから数値マイナス数値の１５パーセントであり、有意な２桁へと丸められる。こうした広い数的範囲、中間の広さの数的範囲、及び狭い数的範囲は、特定の値のみに対して適用されるべきではなく、こうした特定の値間の差異に対しても適用されるべきものである。
【００５４】
本明細書に記載の方法はすべて、本明細に別段の記載がない限り、または文脈から明確に矛盾しない限り、任意の適した順序で実施することができる。本明細書で与えられる任意及びすべての実施例または例示の言葉（例えば、「など（ｓｕｃｈ  ａｓ）」）の使用は、単に、本発明の理解の容易化を意図しており、そうでなければ請求される本発明の範囲に対する限定を提起するものではない。本明細書中の言葉は、本発明の実施に必須である任意の非請求要素を示すものであると解釈されるべきではない。
【００５５】
本明細書で開示される、本発明の代替の要素のまたは実施形態の群化は、限定ではないと解釈される。群のそれぞれのメンバーは、個々に言及されて請求されるか、または群の他のメンバーもしくは本明細書に記載の他の要素との任意の組み合わせで言及されて請求されてよい。便宜及び／または特許性の理由から、ある群の１つもしくは複数のメンバーを、ある群に組み入れるか、またはある群の１つもしくは複数のメンバーを、ある群から削除することが予想される。そのような任意の組み入れまたは削除が生じると、本明細書は、改変された群を含むとみなされ、したがって、添付の請求の範囲において使用されるすべてのマーカッシュ（Ｍａｒｋｕｓｈ）群の記載説明を満たす。
【００５６】
本発明のある特定の実施形態が、本明細書に記載され、本発明の実施に向けた、発明者らが知る最良の様式を含むものである。当然ながら、先行説明を読んだ際に、こうした記載の実施形態に対する変形形態が、当業者に明らかとなるであろう。発明者は、当業者が、そのような変形形態を適切に用いることを予想し、発明者らは、本明細書に具体的に記載されていなくても、本発明を実施することを意図する。したがって、本発明は、適用可能な法律によって認可されるように、本明細書に添付した請求の範囲に記載の主題の変更形態及びその同等形態のすべてを含む。さらに、本明細書に別段の記載がない限り、または文脈から明確に矛盾しない限り、本発明は、上記の要素の、すべての可能なその変形形態での任意の組み合わせを包含する。
【００５７】
さらに、本明細書全体にわたって、出版物、特許、及び／または特許出願（総称して、「参照文献（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）」）に対する参照がなされている。引用した参照文献のそれぞれが、その特定の引用教示内容を対象として、参照によって本明細書に個々に組み込まれる。
【００５８】
最後に、本明細書に開示の本発明の実施形態は、本発明の原理の例示であると理解されることになる。用いられ得る他の変更形態は、本発明の範囲内である。本発明の基本的な理解に必要となる以上に詳細に、本発明の構造詳細を示そうとはしていないが、図及び／または実施例を使用した説明は、当業者に対して、実施の際に、本発明のいくつかの形態をどのように具体化し得るかを明らかにするものである。したがって、例として、限定はされないが、本明細書の教示内容に従って、本発明の代替構成を利用してよい。したがって、本発明は、明確に示され、記載されているものに限定されるものではない。
【実施例】
【００５９】
以下の実施例は、本開示の特定の実施形態を示すために含めるものである。当業者であれば、本開示の観点から、本明細書に開示の特定の実施形態に対して、多くの変更をなすことができることを認識し、さらに、本開示の趣旨及び範囲から逸脱することなく、同様または類似の結果を取得するであろう。
実施例１
この実施例では、大きなゲノムＤＮＡの挿入断片を含むＤＮＡベクターの創出を例示する。５ｘ１０７個／ｍＬの細胞を低融点アガロースプラグに埋め込むことによって、ヒト試料からｇＤＮＡを単離し、当該ｇＤＮＡをアガロースにおいて精製した。その後に続く細胞溶解及びＤＮＡ精製は、プロテイナーゼＫを拡散させることによって、アガロースプラグにてインサイチュで実施した。当該プロテイナーゼＫは、タンパク質は分解する一方で、高分子量のｇＤＮＡには作用せずにそのまま残すものである。具体的には、高分子量のｇＤＮＡを含むアガロースプラグを溶解緩衝液（０．５ＭのＮａ２ＥＤＴＡ．２Ｈ２Ｏ、１０ｍＭのトリス塩基、１％（ｗ／ｖ）のＮ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩、及び０．５ｍｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫ）に入れ、穏やかに攪拌しながら、５０℃で２４〜４８時間保持した。溶解の後、ＨＭＷのＤＮＡを含むアガロースプラグを、ｐＨ９．０〜９．３の０．５ＭのＥＤＴＡ中、５０℃で１回、ｐＨ８．０の０．０５ＭのＥＤＴＡ中、氷上で１回、それぞれ１時間順次透析した後、ｐＨ８．０の０．０５ＭのＥＤＴＡ中に４℃で保存した。ＤＮＡを消化する前に、ＨＭＷのＤＮＡを含むアガロースプラグを、０．１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を添加した、１０〜２０倍量の氷冷ＴＥ（ｐＨ８．０の１０ｍＭのトリス−ＨＣＩ、ｐＨ８．０の１ｍＭのＥＤＴＡ）中、氷上で３回透析してから、１０〜２０倍量の氷冷ＴＥ中、氷上で３回透析した。当該透析は、それぞれの透析当たり、１時間実施した。３１μｌの水、約５０μｌのＨＭＷのＤＮＡ含むアガロースプラグ、１０μｌの１０ｘ酵素緩衝液、及び５μｌの４０ｍＭのスペルミジンを消化混合物とした。
【００６０】
氷上で１時間インキュベートした後、ヒトｇＤＮＡの部分消化に向けて、ＨｉｎｄＩＩＩの酵素希釈系列をそれぞれ４μｌ添加した。氷上でさらに１時間インキュベートして、酵素がアガロース中のＤＮＡに接近できるようにした後、反応混合物の温度を、ＨｉｎｄＩＩＩ活性の推奨温度（３７℃）まで上昇させた。３７℃で１０分間アガロースプラグをインキュベートした後、ｐＨ８．０の０．５ＭのＥＤＴＡを１／１０量添加することによって、反応を停止した。部分消化したｇＤＮＡ断片のサイズを、０．５ｘＴＢＥ（４５ｍＭのＴｒｉｚｍａ塩基、４５ｍＭのホウ酸、及びｐＨ８．３の１ｍＭのＥＤＴＡ）中で、１％のパルスフィールド低融点アガロースゲルにて選択した。ＰＦＧＥ条件は、ＢＬＫ１、６Ｖ／ｃｍ、リニア、初期時間９０秒、最終時間９０秒、１１℃で１８時間、及びＢＬＫ２、４Ｖ／ｃｍ、リニア、初期時間５秒、最終時間１５秒、１１℃で６時間を使用した。１００ｋｂ〜２００ｋｂのサイズ範囲を選択した。
【００６１】
従来のプラスミドベクターであるｐＥＣＢＡＣ１を、ｇＤＮＡのクローン化に使用した。ｐＥＣＢＡＣ１ベクターのサイズは、約７．５ｋｂで、ＣｏｌＥ１のレプリコンを有しており、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、１つの染色体相当物に存在する。３７℃で１時間、１００ユニットのＨｉｎｄＩＩＩで消化することによって、プラスミドベクターを調製した。１ｐｍｏｌのベクターＤＮＡ末端ごとに、１ユニットの仔ウシの腸のホスファターゼ（ＣＩＰ）でプラスミドベクターを処理し（７．５ｋｂのプラスミドに対して約２．５μｇ）、３７℃で６０分インキュベートした。その後、ベクターＤＮＡをゲル抽出で精製した。
【００６２】
１００〜３００ナノグラムの部分消化ｇＤＮＡを、ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＥＣＢＡＣ１へと、Ｔ７  ＤＮＡリガーゼを使用して１６℃で一晩連結した（５対１のモル比でｐＥＣＢＡＣ１を過剰とした）。これにより、高分子量のヒトｇＤＮＡの無作為断片を含むベクターのライブラリーを創出した。
【００６３】
連結したベクターを、３５０Ｖ、３３０μＦの静電容量、低オームのインピーダンス、及び設定抵抗４０００Ωでの急速充電速度で、電気穿孔によってＥ．ｃｏｌｉの細胞へと形質転換した。
【００６４】
適した抗生物質を含む１ｍｌのＬＢ培地に、無色のクローンを播種し、２５０ｒ．ｐ．ｍ．で振とうしながら、３７℃で一晩増殖させた。細胞を回収し、上記の手法を使用して、アルカリ溶解によってＤＮＡを単離した。ＮｏｔＩでＤＮＡを完全消化し（５ユニットのＮｏｔＩを使用し、１００ｎｇのＤＮＡを３７℃で２時間消化）、挿入断片ＤＮＡを遊離させた。０．５ｘＴＢＥ中の１％のアガロースゲルにて、初期パルス時間５秒、最終パルス時間１５秒、１２０°、６Ｖ／ｃｍ、及び１４℃で、１６時間のパルスフィールドゲル電気泳動に向けて、２８個の試料を選択した。臭化エチジウムでゲルを染色した後、水中で３０分脱色してから、ゲルの写真を撮影した。
【００６５】
図７は、上記の手順によって作成したゲル７００を示す。マーカーレーンである７０２は、２５ｋｂのラダーを含むものである。挿入断片を含まない７．５ｋｂのｐＥＣＢＡＣ１ベクターは、ゲル７００の下部にかすかに見えるバンド７０４によって示されるものである。レーン７０６は、その分子量範囲が約２５ｋｂ〜約１７５ｋｂであり、平均サイズが約１００ｋｂである２８個の試料を含む。したがって、上記の手順によって、高分子量（すなわち、平均１００ｋｂ）であり、ヒトゲノムＤＮＡに由来するｇＤＮＡ断片が生成し、当該ｇＤＮＡ断片は、ベクターへと挿入（及びゲル７００に示すように、後に除去）することが可能なものである。
実施例２
この実施例では、ベクターＤＮＡと、ヒトｇＤＮＡである挿入断片ＤＮＡとの連結に続いて、実施例１で作成したベクターのサイズを減少させることを例示する。実施例１に記載したように、ｇＤＮＡ挿入断片を含むｐＥＣＢＡＣ１ベクターを創出した。しかしながら、実施例１に記載したように、ベクターをＥ．ｃｏｌｉへと形質転換することはせず、その代わりに、連結ベクターをＮｓｉＩで完全消化（２０ユニットのＮｓｉＩを使用し、１４０ｎｇのＤＮＡを３７℃で２時間消化）した。消化後に、非環状ポリヌクレオチドを、連結によって再環状化した。連結は、ＮｓｉＩで消化した混合物６０μｌに対して、Ｔ７  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を１２００ユニット添加し、そのまま１６℃で５時間保持することによって実施した。
【００６６】
その後、再連結ベクターを、３５０Ｖ、３３０μＦの静電容量、低オームのインピーダンス、及び設定抵抗４０００Ωでの急速充電速度で、電気穿孔によってＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０ｂ宿主細胞へと形質転換した。適した抗生物質を含む１ｍｌのＬＢ培地に、無色のクローンを播種し、２５０ｒ．ｐ．ｍ．で振とうしながら、３７℃で一晩増殖させた。細胞を回収し、上記の手法を使用して、アルカリ溶解によってＤＮＡを単離した。ＮｏｔＩでＤＮＡを再び完全消化した（５ユニットのＮｏｔＩを使用し、１００ｎｇのＤＮＡを３７℃で２時間消化）。１ｘＴＢＥ中の０．８％のアガロースゲルにて、１００ボルト、室温で２時間の標準ゲル電気泳動に向けて、４４個の試料を選択した。臭化エチジウムでゲルを染色した後に、水中で３０分脱色してから、ゲルの写真を撮影した。
【００６７】
図８は、上記の手順によって作成したゲル８００を示す。レーン８０２は、ラムダＤＮＡ（λＨ３）をＨｉｎｄＩＩＩによって消化することで生成したラダーを含み、当該ラダーは、２ｋｂ〜２３ｋｂのマーカーバンドを含むものである。すべてのレーンにおいて見られる約７ｋｂのバンド８０４は、ｐＥＣＢＡＣ１ベクター（２つのＮｏｔＩ部位で切断したもの）を示す。ゲル上で観測された他のバンドは、ヒトｇＤＮＡ挿入断片（及びＮｏｔＩ部位からの、ベクターの極短断片）である。これは、図６に示す概略図６００として視覚化することができる。ゲル８００の中央レーン８０６に負荷した４４個の試料は、平均で約７ｋｂであるｇＤＮＡ挿入断片の存在を示しており、これは、実施例１のゲル７００に示した平均１００ｋｂのものと比較して、かなり小さいものである。このことは、挿入断片の平均９３ｋｂの区間が、ＮｓｉＩでの消化によって除去されたことを示している。３つ以上のバンド（例えば、レーンＣ８）を示しているレーン８０６は、ｇＤＮＡ挿入断片が、複数のＮｏｔＩ部位を含んでいたことを示す。挿入断片ＤＮＡがＮｏｔＩ部位を有していないと、ゲルが示すバンドは２つであり、すなわち、ベクターのバンドが１つと、挿入断片のバンドが１つである。挿入断片ＤＮＡがＮｏｔＩ部位を２つ有していると、ゲルが示すバンドは３つであり、すなわち、ベクターのバンドが１つと、挿入断片のバンドが２つである。挿入断片ＤＮＡがＮｏｔＩ部位を３つ有していると、ゲルが示すバンドは４つである（ベクターのバンドが１つと、挿入断片のバンドが３つ）。以後同様である。
実施例３
この実施例では、本発明の実施形態に従って調製したシークエンシングベクターによって作成した大きな挿入断片のメイトペア配列データを例示する。実施例１に記載の手順に従って、高分子量のヒトゲノムＤＮＡを調製した。ｇＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで部分消化してから、実施例１に記載したようにＨｉｎｄＩＩＩで調製したｐＥＣＢＡＣ１ベクターへと連結した。ＨｉｎｄＩＩＩ連結したｇＤＮＡ及びｐＥＣＢＡＣ１を、ＮｓｉＩで完全消化してから、実施例２の手順を使用し、再連結して繋ぎ合わせた。再連結ベクターの、Ｅ．ｃｏｌｉへの形質転換はせずに、再連結ベクター（ヒトｇＤＮＡメイトペアタグを含む）をＤＮＡシークエンシングにおいて出発鋳型として使用した。
【００６８】
製造者が提供する説明書に従って、ＰａｃＢｉｏ次世代ＤＮＡシークエンシング装置を使用して、ベクターを再環状化して作成したヒトｇＤＮＡメイトペア挿入断片の配列決定を実施した。プロトコールでは、１μｇ〜５μｇのＤＮＡから、１０ｋｂのライブラリーを調製する。
【００６９】
図９Ａは、ヒト染色体８のクローンＲＰ１１−５８７Ｈ１０の配列９００であり、これは、シークエンシングデータをＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）で解析することによって同定したものである。配列９００は、２つのＨｉｎｄＩＩＩ制限部位である９０２及び９０４を含んでおり、この場所で、ベクターＤＮＡである９０６及び９０８が、挿入断片ＤＮＡ９１０へと連結されている。ＮｓｉＩ制限部位９１２は、挿入断片ＤＮＡ９１０の中央付近に存在する。ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位９０２からＮｓｉＩ制限部位９２１までの、挿入断片ＤＮＡ９１０の部分は、高分子量ｇＤＮＡ挿入断片の第１末端に対応するものである。ＮｓｉＩ制限部位９１２からＨｉｎｄＩＩＩ制限部位９０４までの、挿入断片ＤＮＡ９１０の部分は、高分子量ｇＤＮＡ挿入断片の第２末端に対応するものである。高分子量ｇＤＮＡ挿入断片の第１末端及び第２末端の間に元々存在したｇＤＮＡの長さは、ヒト染色体８の公開配列データとの比較に基づくと、約９７ｋｂである。
【００７０】
図９Ｂは、ヒト染色体３のクローンＲＰ１１−２５Ｄ１１の配列９１４であり、これは、シークエンシングデータをＢＬＡＳＴで解析することによって同定したものである。配列９１４は、２つのＨｉｎｄＩＩＩ制限部位である９１６及び９１８を含んでおり、この場所で、ベクターＤＮＡである９２０及び９２２が、挿入断片ＤＮＡ９２４へと連結されている。ＮｓｉＩ制限部位９２６は、挿入断片ＤＮＡ９２４の中央付近に存在する。ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位９１６からＮｓｉＩ制限部位９２６までの、挿入断片ＤＮＡ９２４の部分は、高分子量ｇＤＮＡ挿入断片の第１末端に対応するものである。ＮｓｉＩ制限部位９２６からＨｉｎｄＩＩＩ制限部位９１８までの、挿入断片ＤＮＡ９２４の部分は、高分子量ｇＤＮＡ挿入断片の第２末端に対応するものである。高分子量ｇＤＮＡ挿入断片の第１末端及び第２末端の間に元々存在したｇＤＮＡの長さは、ヒト染色体３の公開配列データとの比較に基づくと、約９６ｋｂである。
【００７１】
図９Ｃは、ヒト染色体１の配列９２８であり、この配列は、シークエンシングデータのＢＬＡＳＴ解析によって同定されるような公開ＤＮＡ配列中のいずれにも見当たらない領域を占めるものである。配列９２８は、２つのＨｉｎｄＩＩＩ制限部位である９３０及び９３２を含んでおり、この場所で、ベクターＤＮＡである９３４及び９３６が、挿入断片ＤＮＡ９３８へと連結されている。ＮｓｉＩ制限部位９４０は、挿入断片ＤＮＡ９３８の中央付近に存在する。ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位９３０からＮｓｉＩ制限部位９４０までの、挿入断片ＤＮＡ９３８の部分は、高分子量ｇＤＮＡ挿入断片の第１末端に対応するものである。ＮｓｉＩ制限部位９４０からＨｉｎｄＩＩＩ制限部位９３２までの、挿入断片ＤＮＡ９３８の部分は、高分子量ｇＤＮＡ挿入断片の第２末端に対応するものである。高分子量ｇＤＮＡ挿入断片の第１末端及び第２末端の間に元々存在したｇＤＮＡの長さは、不明であり、これは、同定した配列と一致する公開配列データが全く存在しないためである。
【図１】
2017516498.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2017516498.tif 000014
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