(57)【要約】  本発明は、抗体の特異性多価抗体が単一特異性か否か、特に、二価抗体が単一特異性または二価特異性か否かを決定するための方法に関する。さらに、本発明は、サンプルに存在する二重特異性二価抗体の量を定量化する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップを含む、二価抗体のサンプルが、可変領域１（ＶＲ１）および可変領域２（ＶＲ２）を有する任意の二重特異性抗体を含むか否かを決定するためのインビトロでの方法：
ａ）抗原の半分は、第１の検出可能なマーカー（Ｍ１）を有し、他の半分は、第２の検出可能なマーカー（Ｍ２）を有するＶＲ１に特異的に結合する抗原を添加するステップ；および
ｂ）サンプルが、Ｍ１とＭ２の両方が特異的に結合される抗体を含むか否かを決定するステップ；
ここで、Ｍ１およびＭ２が結合される抗体が検出される場合、サンプルは、二重特異性抗体を含む、上記方法。
【請求項２】
以下のステップを含む、サンプルにおいて、可変領域１（ＶＲ１）および可変領域２（ＶＲ２）を有する、二重特異性二価抗体の量を定量化するためのインビトロでの方法：
ａ）抗体が、ＶＲ１のみを有する単一特異性である参照サンプル、および二重特異性抗体が未知である試験サンプルを提供するステップ；
ｂ）各サンプルに対して、抗原の半分は、第１の検出可能なマーカー（Ｍ１）を有し、他の半分は、第２の検出可能なマーカー（Ｍ２）を有するＶＲ１に特異的に結合する抗原を添加するステップ；および
ｃ）Ｍ１とＭ２の両方が、各サンプルにおいて、特異的に結合される抗体の量を決定するステップ、および
ｄ）参照および試験サンプルにおいて、Ｍ１またはＭ２の量を比較するステップ。
【請求項３】
以下のステップを含む、二価単一特異性抗体（Ａｂ１）のＦａｂアーム置換を定量化するためのインビトロでの方法：
ａ）Ｆａｂアーム置換が起こることができるような条件下で、少なくとも第２の抗体を有する抗体（Ａｂ１）をインキュベートするステップ；および
ｂ）請求項２の方法に係る生じた二価抗体の量を定量化するステップ。
【請求項４】
分析される二価抗体が、ＩｇＧ４である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
Ｍ１とＭ２の両方が結合される抗体の量の決定が、Ｍ１をマトリクスに結合させること、および抗体に結合され、マトリクスによって捕捉されるＭ２の量を測定することによって実施される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
Ｍ２が、電気化学発光マーカーである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ステップａ）が、血漿中で実施される、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
血漿は内因性ＩｇＧ４ｓが枯渇し、抗体（Ａｂ１）および第２の抗体が添加された、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ステップａ）が、グルタチオン、メルカプトエタノール、ジチオスレイトールまたはトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン、およびそれらの組み合わせの中から選択される還元剤の存在下で実施される、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
チオール基を不活性化することによって、ステップａ）後のＦａｂアーム置換を防止することを含む、請求項３〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記不活性化が、アルキル化剤を添加することによって実施される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記アルキル化剤は、Ｎ−エチルマレイミド、ヨードアセトアミド、ヨード酢酸、およびそれらの組み合わせから選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
以下のステップを含む、別の定量化を実施することをさらに含む、請求項３〜１２のいずれかに記載の方法：
ａ２）Ｆａｂアーム置換が発生することができるような条件下で、第２の抗体（Ａｂ２）と一緒に抗体（Ａｂ１）をインキュベートするステップ；
ｂ２）抗体は、ＶＲ１のみを有する単一特異性である参照サンプル、およびａ２）から生じた試験サンプルを提供するステップ；
ｃ２）５０％は、Ａｂ１に対して特異的でＭ１に結合された抗原１（Ａｇ１）であり、５０％は、Ａｂ２に対して特異的でＭ２に結合された抗原２（Ａｇ２）である、抗原分子の混合物を添加するステップ；および
ｄ２）Ｍ１とＭ２の両方が特異的に結合される抗体の量を決定するステップ。
【請求項１４】
ｃ２）でのその参照サンプルに対するＭ２シグナルの増加は、請求項５で測定されるＭ２シグナルの損失に相関する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
参照サンプルは、ステップａ）が、Ｆａｂアーム置換が発生できないような条件下で実施される方法を実施することによって得られる、請求項３〜１３のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多価抗体が単一特異性であるか否か、特に、二価抗体が単一特異性または二重特異性であるか否かを決定するための方法に関する。本発明は、サンプルにおいて、二重特異性二価抗体の量を定量化するための方法にさらに関連し、より特異的には、本発明は、抗体のＦａｂアーム置換を定量化するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）は、ヒト血清中で最も豊富な抗体（Ａｂ）であり、４つのサブクラスに細分される：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４。ＩｇＧ１およびＩｇＧ４の両方は、２つの中間ヒンジジスルフィド結合を有し、ＩｇＧ２は、４つの中間ヒンジジスルフィド結合を有し、ＩｇＧ３は、１１の中間ヒンジジスルフィド結合を有する。ＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、それらが、抗体依存性細胞媒介細胞毒性および補体依存性細胞媒介細胞毒性を引き起こすので、一般的に、活性サブクラスとして記載される。逆に、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４が、それらが、エフェクター分子に不完全に結合し、比較的低いエフェクター機能誘導を生じるので、不活性なサブクラスとして記載される。
【０００３】
治療の設定において、抗体の選択は、一般的に、異なる抗体サブクラスに関連する異なる特性によって左右されている。ＩｇＧ抗体は、一般的に、免疫エフェクター機能の補充が望まれない選択のサブクラスであり、治療効果は、例えば、接合されるエフェクター分子の受容体遮断または標的化送達を介して達成される。
【０００４】
ＩｇＧサブクラスの中で、ＩｇＧ４分子は、「半分子置換」または「Ｆａｂアーム置換」（ＦＡＥ）として知られる動的なスワッピングイベントを受けることができるユニークな特徴を有する。この生理学的プロセスは、１つのＩｇＧ４抗体の重−軽鎖対（半分子）と、もう１つのＩｇＧ４抗体の重−軽鎖対（半分子）との置換および組換えを含む。この効果は、還元に特に影響を受けやすい重鎖間のジスルフィド結合を生じさせる異常なヒンジ配列の存在による。さらに、IｇＧ４ ＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ１抗体と比べて、より安定性の低いホモ二量体を形成し、またその置換を促進する（Ａａｌｂｅｒｓｅら、２００９年）。
【０００５】
Ｆａｂアーム置換を受ける二価、単一特異性ＩｇＧ４抗体のこの固有の能力は、二価、二重特異性抗体、すなわち、異なる抗原に対して各アームと結合し、したがって、同一抗原を架橋できない抗体の形成を生じる。異なる、未知の可変領域を有する抗体間で生じる置換は、未知で、そしておそらく望ましくない特異性を有する二重特異性抗体を生じる。さらに、内因性ＩｇＧ４抗体とのＦａｂアーム置換を受ける生物治療的二価、単一特異性ＩｇＧ４抗体は、置換される二価ではあるが、機能的には一価で、二重特異性の抗体の形成を生じることができるが、これは、標的抗原に結合する場合、親和性の損失を生じる。これは、薬物動態および生物治療的有効性に影響を与え、非架橋の挙動に対して元の標的抗原の相同的架橋を変え得うる。その後、Ｆａアーム置換は、ヒト免疫療法にとって望ましくない薬力学的予測不可能性をもたらし得る。したがって、Ｆａｂアーム置換に関与するＩｇＧ４抗体の傾向は、生物学的治療薬のためのバックボーンとして、もしそうでなければ不活性であったＩｇＧ４アイソタイプの使用を可能にするためのものであると理解されなければならない。したがって、サンプルでの二重特異性二価抗体の量を定量化し、抗体、特に、ＩｇＧ４抗体に対するＦａｂアーム置換を測定（定量化）するために、一価抗体が単一特異性であるか否か、二価抗体が単一特異性または二価特異性であるか否かを決定するためのアッセイを提供するための当該技術分野での必要性がある。
【０００６】
この意味において、ｖａｎ ｄｅｒ Ｎｅｕｔ Ｋｏｆｓｃｈｏｔｅｎら、２００７年は、抗イディオタイプ抗体を使用して、抗ＣＤ２０ ＩｇＧ４と抗ＥＧＦＲ ＩｇＧ４の間のＦａｂアーム置換の測定を可能にしたサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを記載した。
【０００７】
２０１１年に、Ｓｈａｐｉｒｏらはまた、ＥＬＩＳＡアッセイに基づいて、内因性ＩｇＧ４との抗α４ ＩｇＧ４のＦａｂアーム置換を決定するための方法を報告した。
【０００８】
上記にもかかわらず、抗体のＦａｂアーム置換を定量化するための信頼できる方法を提供するさらなる改善された方法のための当該技術分野での必要性がある。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１：ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシィー染色による抗体分析。各抗体の当量は、変性、非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシィー染色によって分析された。各抗体のアイソタイプ、特異性およびヒンジ配列（野生型またはＳ２２８Ｐ変異）は、上記に記載される。白抜き矢印は、無傷の、完全長抗体の位置を示し；黒塗り矢印は、半分子の位置を示す。抗ＩＬ−６臨床候補Ｓ２２８Ｐ ＩｇＧ４調製における検出可能な半分子が存在しないことに留意すべきである（レーン２）。タンパク質マーカーの位置および分子量は、左側に示される。
【００１０】
【図２】図２：Ｆａｂアーム置換。Ａ、インビトロＦＡＥの略図および本発明のアッセイ。：サンプルは、２つの異なる検出可能なマーカーの１つまたはもう１つに結合される同じ抗原分子の混合物とインキュベートされる。１６時間のインキュベーションのシグナルの損失は、ＦＡＥが起こったことを推察する（方法１）。同時に、サンプルは、異なる検出可能なマーカーにそれぞれ結合される２つの異なる抗原の混合物とインキュベートされる。１６時間のインキュベーション後のシグナルの獲得は、ＦＡＥから生じる新たに形成された二重特異性抗体の存在を推察する（方法２）。ライトグレーのＹ形状、抗ＩＬ−６（野生型またはＳ２２８Ｐ）抗体；濃いグレーのＹ形状、抗ＴＮＦ野生型抗体；黒の壊れた楕円、新たに形成された二重特異性（抗ＩＬ−６／抗ＴＮＦ）抗体を強調する；黒の実線、ストレプトアビジン被覆メソスケールディスカバリー（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）（ＭＳＤ）プレート；ライトグレーの円、ビオチン化ＩＬ−６；ライトグレーダイアモンド、Ｓｕｌｆｏ−ｔａｇ（登録商標）標識ＩＬ−６；濃いグレーのダイアモンド、Ｓｕｌｆｏ−ｔａｇ（登録商標）標識ＴＮＦ；巻き矢印、発生したシグナルを示す。ＢおよびＣ、２つのＭＳＤベースの方法によって、インビトロでＦＡＥを定量化および検出する。さらなるＦＡＥを防止するＧＳＨの存在下または非存在下で、３７℃で、一晩インキュベーション前または後の急冷された抗体サンプル（それぞれ、Ｔ＝０およびＴ＝１６時間）は、Ａで示される２つのアッセイによって分析された。ライトグレーの斜線の棒、サンプルを含む抗ＩＬ−６野生型ＩｇＧ４抗体；濃いグレーの斜線の棒、サンプルを含む抗ＩＬ−６ Ｓ２２８Ｐ ＩｇＧ４抗体。注：ＧＳＨの存在下でインキュベートされた抗ＩＬ−６野生型抗体および抗ＴＮＦ野生型ＩｇＧ４抗体は、方法１によるアッセイの場合（Ｂ）、シグナルの損失を示し、および方法２によるアッセイの場合（Ｃ）、シグナルの関連する獲得を示す。データポイントは、３つの独立した測定の平均±ＳＥＭ値を表す。＊Ｐ＜０．０５、対応のあるｔ−検定。
【００１１】
【図３】図３：ＩｇＧ枯渇生理学的マトリクスの調製および分析。Ａ、内因性ＩｇＧ４抗体を枯渇するために用いられる抗ＩｇＧ４（および対照）ビーズを使用するプロセスの概略図。血液を遠心分離した後、続いて、血漿の当量（負荷）を、２つの抗ＩｇＧ４カラム（左側）に、または並行して２つの対照カラム（右側）に入れた。各ランからの非結合、フロースルー（ＦＴ）材料は、ビーズが洗浄され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液（それぞれ、Ｅ１および２）で溶出される前に、回収された（それぞれ、ＦＴ１および２）。抗ＩｇＧ４ビーズからのＦＴ２は、直接使用されたか（ＩｇＧ４枯渇血漿）、またはＩｇＧ４枯渇血液を得るために、使用前に、洗浄赤血球（ＲＢＣ）に加えられたかのいずれかであった。Ｂ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＷＢおよびクーマシィー染色によって得られたサンプルの分析。（Ａからの）サンプルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＨＲＰ接合抗ＩｇＧ４、１、２および３Ｆｃ特異的抗体とのＷＢによって分析された（主な画像の左側に記載）。黒塗り矢印、半分子の位置を示す（抗ＩｇＧ４抗体との免疫反応性のみ）。抗ＩｇＧ４ビーズとのインキュベーションからの画分Ｅ１およびＥ２は、結合され（Ｅ合計）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシィー染色によって分析された（右側の画像）。タンパク質マーカーの位置および分子量を、右側に示す。
【００１２】
【図４】図４：ｅｘ  ｖｉｖｏＩｇＧ４枯渇生理学的マトリクスにおけるＦＡＥの分析。ＡおよびＢ、サンプルを含む抗ＩｇＧ４野生型抗体（ライトグレーの斜線の棒）またはそのＳ２２８Ｐ修飾変異体（ダークグレーの斜線の棒）は、ＧＳＨの存在下または非存在下で、ＩｇＧ４枯渇血液（左側）またはＩｇＧ４枯渇血漿（右側）のいずれかにおいて１：９のモル比で、抗ＴＮＦ野生型ＩｇＧ４抗体とインキュベートした。３７℃で一晩インキュベーション後、サンプルを急冷し、本発明の方法によって、ＦＡＥについて分析した。Ａ、サンプルは、２つの異なる検出可能なマーカーの１つまたはもう１つに結合される同じ抗原分子の混合物とインキュベートされる（方法１）。Ｂ、サンプルは、異なる検出可能なマーカーにそれぞれ結合される２つの異なる抗原の混合物とインキュベートされる（方法２）。注：生理学的関連のインビトロ還元条件の下で、すなわち、補充ＧＳＨの非存在下で、ＦＡＥのみが、血漿中ではなく血液中で発生する。データポイントは、３つの独立した測定の平均±ＳＥＭ値を表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、対応のあるｔ−検定。
【００１３】
【図５】図５：２つの投与された対象の総および無傷のＳ２２８Ｐ抗ＩＬ−６抗体血漿濃度−時間プロファイル。健康なボランティアは、Ｓ２２８Ｐ抗ＩＬ−６抗体の３ｍｇ／ｋｇ静脈内投与を与えられた。血漿サンプルを定期的に採取し、２つの別個の方法によって分析した。総アッセイ；全ての単一特異性、一価Ｓ２２８Ｐ抗ＩＬ−６抗体半分子（すなわち、非置換または交換種）を検出する。無傷の（ｉｎｔａｃｔ）アッセイ；完全なサイズ、単一特異性、二価Ｓ２２８Ｐ抗ＩＬ６抗体分子のみ（すなわち、非置換種のみ）を検出する。黒矢印、Ｓ２２８Ｐ抗ＩＬ−６抗体投与を示す。黒のプロファイル、総アッセイ；グレイのプロファイル、無傷のアッセイ；半減期、（ｔ１／２）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
発明の詳細な説明
本発明は、多価抗体が、単一特異性であるか否か、特に、二価抗体が、単一特異性または二重特異性であるか否かを決定するための新規方法を提供することによって、上記の要求に対処するものである。本発明は、サンプル中の二重特異性二価抗体の量を定量化するための新規方法、より具体的には、抗体のＦａｂアーム置換を定量化するための方法をさらに提供する。
【００１５】
第１の態様において、本発明は、二価抗体のサンプルが、可変領域１（ＶＲ１）および可変領域２（ＶＲ２）を有する任意の二重特異性抗体を含むか否かを決定するためのインビトロ方法を提供し、これは以下のステップを含む：
ａ）抗原の半分は、第１の検出可能なマーカー（Ｍ１）を有し、他の半分は、第２の検出可能なマーカー（Ｍ２）を有するＶＲ１に特異的に結合する抗原を添加するステップ；および
ｂ）サンプルが、Ｍ１とＭ２の両方が特異的に結合される抗体を含むか否かを決定するステップ；
ここで、サンプルは、Ｍ１およびＭ２が結合される抗体が検出される場合、二重特異性抗体を含む。
【００１６】
第２の態様において、本発明は、サンプルにおいて、可変領域１（ＶＲ１）および可変領域２（ＶＲ２）を有する、二重特異性二価抗体の量を定量化するためのインビトロ方法を提供し、これは以下のステップを含む：
ａ）抗体が、ＶＲ１のみを有する単一特異性である参照サンプル、および二重特異性抗体が未知である試験サンプルを提供するステップ；
ｂ）各サンプルに対して、抗原の半分は、第１の検出可能なマーカー（Ｍ１）を有し、他の半分は、第２の検出可能なマーカー（Ｍ２）を有するＶＲ１に特異的に結合する同じ抗原を加えるステップ；および
ｃ）Ｍ１とＭ２の両方が、各サンプルにおいて特異的に結合される抗体の量を決定するステップ、および
ｄ）参照および試験サンプルにおいて、Ｍ１またはＭ２の量を比較するステップ。
【００１７】
第３の態様において、本発明は、二価単一特異性抗体（Ａｂ１）のＦａｂアーム置換を定量化するためのインビトロ方法を提供し、これは以下のステップを含む：
ａ）Ｆａｂアーム置換が起こることができるような条件下で、抗体（Ａｂ１）を少なくとも第２の抗体とともにインキュベートするステップ；および
ｂ）第２の態様の方法に係る生じた二価抗体の量を定量化するステップ。
【００１８】
本発明の第４の態様において、本発明の第１および第２の態様の二価抗体、または本発明の第３の態様に係る抗体（Ａｂ１）は、ＩｇＧ４である。代替の態様において、本発明の方法の第３の態様に係る第２の抗体は、ＩｇＧ４である。第３の態様に係る本発明の方法のさらなる態様において、抗体Ａｂ１および第２の抗体の両方は、ＩｇＧ４である。当業者が理解するように、本発明の第３の態様に係る方法は、任意の抗体サブクラスのＦａｂアーム置換を確立するために、使用されうる。これは、遺伝子操作された突然変異を含む抗体の開発という文脈において、特に関連するものであり、特に、これらの突然変異は、抗体でのヒンジ領域またはＣＨ３−ＣＨ３インターフェイスに影響を与える。
【００１９】
本発明の方法の第５の態様において、Ｍ１とＭ２の両方が結合される抗体の量の決定が、Ｍ１をマトリクスに結合させ、抗体に結合され、マトリクスによって捕捉されるＭ２の量を測定することによって実施される。
【００２０】
本発明の方法の第６の態様において、Ｍ２は、電気化学発光マーカーである。
【００２１】
本発明の第７の態様において、第３の態様に係るＦａｂアーム置換を定量化するための方法は、ステップａ）が、血漿中で実施されることを特徴とする。
【００２２】
本発明の第８の態様において、Ｆａｂアーム置換を定量化するための方法は、前記血漿は、内因性ＩｇＧ４が枯渇し、抗体（Ａｂ１）および第２の抗体（Ａｂ２）が追加されていることを特徴とする。
【００２３】
当該技術分野で以前に記載されているように、血液または血漿などの生理学的マトリクスは、Ｆａｂアーム置換が生じる自然な還元的環境を提供する。しかしながら、インビトロ状況で、典型的に、還元剤の添加によって、そのような環境などを提供する必要がある。当業者は、サンプルの酸化還元電位を制御することができる代替手段を認識しており、したがって、そのような環境を提供する。
【００２４】
本発明の第９の態様において、前記ステップａ）が、グルタチオン、メルカプトエタノール、ジチオスレイトールまたはトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン、およびそれらの組み合わせの中から選択される還元剤の存在下で実施される。
【００２５】
Ｆａｂアーム置換が発生すると、当業者は、さらなるＦａｂアーム置換が起こることを防止しようと望むかもしれない。当業者であれば知っているように、抗体間のＦａｂアーム置換がサンプルを凍結することによって、例えば、−２０℃で貯蔵することによって、または抗体上に存在するチオール基を不活性化することによって、防止されうる。
【００２６】
本発明の第１０の態様において、本発明の第３の態様に係るＦａｂアーム置換を定量化するための方法は、チオール基を不活性化することによるステップａ）後のＦａｂアーム置換を防止することをさらに含む。
【００２７】
本発明の第１１の態様において、前記不活性化は、アルキル化剤を添加することによって実施される。
当業者に公知のアルキル化剤の例としては、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）、ヨードアセトアミド（ＩＡＭ）、ヨード酢酸（ＩＡＡ）、アクリルアミド、２−ビニルピリジン、または４−ビニルピリジンが挙げられるが、それらに限定されない。
【００２８】
本発明の第１２の態様において、前記アルキル化剤は、Ｎ−エチルマレイミド、ヨードアセトアミド、ヨード酢酸、およびそれらの組み合わせから選択される。
【００２９】
本発明の第１３の態様において、本発明の第３の態様に係るＦａｂアーム置換を定量化するための方法は、以下のステップを含む別の定量化を行うことをさらに含む：
ａ２）Ｆａｂアーム置換が発生することができるような条件下で、第２の抗体（Ａｂ２）と一緒に抗体（Ａｂ１）をインキュベートするステップ；
ｂ２）抗体は、ＶＲ１のみを有する単一特異性である参照サンプル、およびａ２）から生じる試験サンプルを提供するステップ；
ｃ２）５０％は、Ａｂ１に対して抗原１（Ａｇ１）特異的であり、Ｍ１に結合され、５０％は、Ａｂ２に対して抗原２（Ａｇ２）特異的であり、Ｍ２に結合される抗原分子の混合物を添加するステップ；および
ｄ２）Ｍ１とＭ２の両方が特異的に結合される抗体の量を決定するステップ。
【００３０】
本発明の第３の態様に係るＦａｂアーム置換を定量化するための方法の第１４の態様において、ｃ２）でのその参照サンプルに対するＭ２シグナルの増加は、本発明の第５の態様で測定されるＭ２シグナルの損失に相関する。
【００３１】
当業者であれば理解できるように、第１の定量化でのシグナルの損失と第２の定量化でのシグナルの獲得の間のこの相関により、新たに形成された二重特異性抗体の存在の確認をすることができる。
【００３２】
本発明の第１５の態様において、本発明の第３の態様の方法に係る参照サンプルは、ステップａ）が、Ｆａｂアーム置換が生じることができないような条件下で実施される方法を実施することによって得られる。
【００３３】
実験的な観点から実用的な目的のために、参照サンプルが、両方の抗体との接触後すぐに得られる場合、得られたサンプルからの測定は、時間＝０と考えられる。
【００３４】
本発明の特定の態様において、Ｆａｂアーム置換を定量化するための方法において、アッセイを測定するために使用される検出可能なマーカーのいずれかは、放射性マーカー、蛍光マーカー、酵素マーカー、発光性等である。当業者は、本発明の方法に有用な他のマーカーを知っているだろう。
【００３５】
本発明に係るＦａｂアーム置換を定量化するための方法のさらなる特定の態様において、ステップａ）は、２０℃〜４２℃、好ましくは、３０℃〜３８℃、好ましくは、３５℃〜３８℃、および好ましくは、３７℃の温度で実施される。
【００３６】
本発明に係るＦａｂアーム置換を定量化する方法のさらなる特定の態様において、抗体（Ａｂ１）は、所定量の時間の間、少なくとも１つの他の抗体と接触される。一般的に、生理学的範囲内で、そのような反応が起こるのに必要な時間の量は、温度に反比例し、温度がより低ければ低いほど、より反応速度が遅い。所定の温度で最高の反応時間、逆に、所定の時間枠に対して理想的な温度を確立することは、当業者にとって日常的である。特定の態様において、この時間は、好ましくは、２時間〜４８時間、４時間〜４０時間、８時間〜２６時間、１０時間〜２４時間、好ましくは、１２時間〜２０時間、および好ましくは、１６時間〜１８時間である。
【００３７】
本発明に係るＦａｂアーム置換を定量化するための方法のさらなる特定の態様において、還元剤は、グルタチオンであり、好ましくは、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ、好ましくは、０．０１ｍＭ〜５ｍＭ、好ましくは、０．０２ｍＭ〜３ｍＭ、好ましくは、０．２ｍＭ〜０．８ｍＭ、好ましくは、０．３ｍＭ〜０．７ｍＭ、および好ましくは、０．５ｍＭの濃度で存在する。当業者は、他の還元剤を使用する場合、必要相当の濃度を日常的に確立するだろう。
【００３８】
本発明のさらなる特定の態様において、検出可能なマーカーＭ１は、Ｍ１に対して特異的な抗体を介して、マトリクスに結合される。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体（単数）」または「抗体（複数）」は、モノクロナール抗体またはポリクロナール抗体を指す。本明細書中で使用される場合、用語「抗体（単数）」または「抗体（複数）」は、当該技術分野で公知のような組換え技術によって生成される組換え抗体が挙げるが、それらに限定されない。「抗体（単数）」または「抗体（複数）」は、任意の種の抗体、特に、哺乳動物種の抗体を包含するが、例えば；ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ，ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥおよびＩｇＭおよびそれらの修飾された変異体を含む任意のアイソタイプのヒト抗体、例えば、チンパンジー、ヒヒ、アカザルまたはカニクイザルからの非ヒト霊長類抗体；例えば、マウス、ラット、ウサギからのげっ歯類抗体；ヤギまたは馬の抗体；およびラクダ科の動物の抗体（例えば、ナノボディＴＭ（ＮａｎｏｂｏｄｉｅｓＴＭ）などのラクダまたはラマからの）およびそれらの誘導体；または鶏抗体などの鳥種またはサメ抗体などの魚種の抗体を含む。
【００４０】
用語「抗体（単数）」または「抗体（複数）」はまた、少なくとも１つの重鎖および／または軽鎖抗体配列は、第１の種からであり、および重鎖および／または軽鎖抗体配列の第２の部分は、第２の種からである「キメラ」抗体を指す。本明細書中で目的のキメラ抗体は、非ヒト霊長類（例えば、ヒヒ、アカゲザルまたはカニクイザルなどの旧世界ザル）由来の可変ドメイン抗原結合配列およびヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体を含む。「ヒト化」抗体は、非ヒト抗体に由来する配列を含むキメラ抗体である。大部分にとって、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域からの残基が、所望の特異性、親和性および活性を有するマウス、ラット、ウサギ、鶏などの非ヒト種（ドナー抗体）または非ヒト霊長類の超可変領域［または相補性決定領域（ＣＤＲ）］からの残基によって置換されるヒト抗体（レシピエント抗体）である。ほとんどの場合、ＣＤＲのヒト（レシピエント）抗体の外側の残基は；すなわち、フレームワーク流域（ＦＲ）において、対応する非ヒト残基によって、さらに置換される。
【００４１】
さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体中でまたはドナー抗体中で検出されない残基を含んでもよい。これらの修飾は、抗体性能をさらに洗練するために行われる。ヒト化は、ヒトでの非ヒト抗体の免疫原性を低下させ、したがって、ヒト疾患の治療への抗体の適用を容易にする。それらを生成するヒト化抗体およびいくつかの異なる技術は、当該分野で周知である。用語「抗体（単数）」または「抗体（複数）」はまた、ヒト抗体を指し、それは、ヒト化に代わるものとして、生成されることができる。例えば、免疫化の際に、内因性マウス抗体の産生の非存在下で、ヒト抗体の完全なレパートリーを産生することができるトラスジェニック動物（例えば、マウス）を作製することが可能である。例えば、キメラおよび構造遺伝子突然変異マウスにおいて、抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合体欠失は、内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。そのような構造遺伝子突然変異マウスにおけるヒト生殖系免疫グロブリン遺伝子アレイの転移は、前記抗原とのヒト生殖系免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニック動物の免疫化の際に、特定の抗原に対して特異性を有するヒト抗体の産生をもたらす。そのようなトランスジェニック動物を産生するための技術およびそのようなトランスジェニック動物からヒト抗体を単離および産生するための技術は、当該分野で公知である。
【００４２】
また、トランスジェニック動物、；例えば、マウスにおいて、マウス抗体の可変領域をコードする免疫グロブリン遺伝子のみは、対応するヒト可変免疫グロブリン遺伝子配列で置換される。抗体定常領域をコードするマウス生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子は、変更されないままである。このようにして、トランスジェニックマウスの免疫系での抗体エフェクター機能および結果としてＢ細胞の成長は、本質的に不変であり、これは、インビボで抗原投与の際に、改善された抗体反応を導き得る。目的の特定の抗体をコードする遺伝子は、そのようなトランスジェニック動物から単離されると、定常領域をコードする遺伝子は、完全なヒト抗体を得るために、ヒト定常領域遺伝子で置換されることができる。インビトロでヒト抗体／抗体断片を得るための他の方法は、ファージ提示法またはリボソーム提示法技術のような提示技術に基づき、ここで、組換えＤＮＡライブラリーが使用され、これは、人工的に少なくとも部分的に生成されるか、またはドナーの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリー由来のいずれかである。ヒト抗体を生成するためのファージおよびリボソーム提示法技術は、当該分野で周知である。ヒト抗体はまた、目的の抗原でｅｘｖｉｖｏ免疫される単離されたヒトＢ細胞から生成され、続いて、最適なヒト抗体についてスクリーニングされることができるハイブリドーマを生成するために融合され得る。本明細書中で使用される場合、用語「抗体（単数）」または「抗体（複数）」はまた、非グリコシル化抗体を指す。
【００４３】
本発明の特定の態様において、抗体は、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレングリコール）とポリ（プロピレングリコール）のコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）またはポリ（プロリン）などの水溶性ポリマーなどの官能部分の共有結合によって修飾される抗体であり、これらの全ては、対応する非修飾タンパク質よりも静脈内注射後の血液中で実質的に長い半減期を示すことが知られている。
【００４４】
いくつかの態様において、本発明の抗体は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分などの官能部分に結合する抗体である。１つの特定の態様において、抗体は、抗体断片であり、ＰＥＧ分子は、抗体断片に位置する任意に利用可能なアミノ酸側鎖または末端アミノ酸官能基、例えば、任意の遊離アミノ、イミノ、チオール、水酸基またはカルボキシル基を介して結合され得る。そのようなアミノ酸は、抗体断片中に自然に発生するか、または組換えＤＮＡ方法を使用してその断片中に操作され得る（例えば、ＵＳ ５，２１９，９９６； ＵＳ ５，６６７，４２５； ＷＯ ９８/２５９７１参照）。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体（単数）」または「抗体（複数）」は、ヒト（例えば、ＩｇＧ）および他の哺乳動物種由来を含む任意の種の非切断抗体だけではなく、抗体断片も指す。抗体の断片は、当該分野で知られているような少なくとも１つの重または軽鎖免疫グロブリンドメインを含み、１つ以上の抗原（複数可）に結合する。本発明に係る抗体断片の例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、およびＦｖおよびｓｃＦｖ断片；ならびに抗体断片または抗体から形成されるダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ドメイン抗体、単鎖抗体、二重特異性、三重特異性、四重特異性または多重特異性抗体が挙げられ、Ｆａｂ−Ｆｖ構成を含むが、これに限定されない。上記で定義されるような抗体断片は、当該分野で公知である。
【００４６】
本明細書中で使用される場合、用語「二価抗体」は、２つの抗原結合部位を有する抗体を意味する。
【００４７】
本明細書中で使用される場合、用語「単一特異性抗体」は、同一可変領域を含む抗体を意味する。
【００４８】
本明細書中で使用される場合、用語「二重特異性抗体」は、２つの異なる可変領域を含む抗体を意味する。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、用語「Ｆａｂアーム置換」または「ＦＡＥ」は、１つの抗体の１つの完全な重−軽鎖対（半分子）と別の抗体の重−軽鎖対（半分子）との置換および組換えを意味する。ＩｇＧ４抗体は、Ｆａｂアーム置換を最も受けやすい。
【００５０】
本明細書中で使用される場合、用語「Ｆａｂアーム置換が起こることができるような条件」は、１つの抗体の重−軽鎖対（半分子）と別の抗体の重−軽鎖対（半分子）の置換および組換えが起こることができる条件を意味する。典型的には、Ｆａｂアーム置換は、還元性環境の存在下で起こる。当業者であれば、前記還元性環境が、インビボで血流中に、したがって、また、ドナーから得られた血液および血清サンプル中で、自然に存在することを知っているであろう。しかしながら、還元性環境は、以下で定義され、本文を通じて開示されるように、還元剤を添加することによって、インビトロ状況で、再作成されることができる。
【００５１】
逆に、本明細書中で使用される場合、「Ｆａｂアーム置換が起こることができないような条件」は、１つの抗体の重−軽鎖対（半分子）と別の抗体の重−軽鎖対（半分子）の置換および組換えが起こることができない条件を意味する。当業者が知っているように、これは、一般的に、分子が反応することができないようにサンプルを凍結することによって、または抗体上に存在する遊離チオールを不活性化することによって、達成される。遊離チオールの不活性化は、典型的に、上記で定義され、本文を通じて開示されるようなアルキル化剤を用いて抗体をインキュベートすることによって達成される。
【００５２】
「Ｆａｂアーム置換を防止する」は、前記置換が実質的に減少され、好ましくは、９０％減少され、９５％減少され、またはより好ましくは、９９％減少される作成条件を意味する。典型的には、これは、サンプルを凍結することによって、反応性チオール基を不活性化することによって、または両方を組み合わせることによって、達成される。当業者は、例えば、非還元条件の使用によってなど、前記Ｆａｂアーム置換を防止する代替手段を理解するだろう。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、用語「アルキル化剤」は、アルキル基による水素の置換を引き起こす物質を意味する。本発明の意味の範囲内で、アルキル化剤の例としては、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）、ヨードアセトアミド、およびヨード酢酸が挙げられるが
これらに限定されず、他のアルキル化剤としてはまた、アクリルアミド、２−ビニルピリジン、４−ビニルピリジンが挙げられる。
【００５４】
本明細書中で使用される場合、所定の抗原への抗体の結合の文脈において、用語「結合」、「特異的に結合」、「特異的に結合される」は、例えば、検体として抗体を使用してＢＩＡｃｏｒｅ ３０００装置で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって決定される場合、約１０−７Ｍ以下、約１０−８Ｍ以下など、１０−９Ｍ以下など、約１０−１０Ｍ以下、または約１０−１１Ｍもしくはさらにそれ以下のＫＤに相当する親和性を有する結合を意味する。この用語はまた、抗体が、所定の抗原または密接に関連する抗原以外の非特異的抗原（例えば；ウシ血清アルブミン、カゼイン）に結合するその親和性よりも、少なくとも１０倍より低い、例えば少なくとも１００倍より低い、例えば、少なくとも１０００倍より低い、例えば少なくとも１０，０００倍より低い、例えば、少なくとも１００，０００倍より低いＫＤに相当する親和性で所定の抗原に結合することを意味する。親和性がより低い量は、抗体のＫＤに依存するので、抗体のＫＤが非常に低い場合（すなわち、抗体が非常に特異的である場合）、その場合、抗原に対する親和性が、非特異的抗原に対する親和性より低い量は、少なくとも１０，０００倍であってもよい。
【００５５】
本明細書中で使用される場合、用語「ＫＤ」は、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度定数を意味する。
【００５６】
本明細書中で使用される場合、用語「抗原」は、上記で定義される意味において、特定の抗体分子に特異的に結合することができる分子を意味する。
【００５７】
本明細書中で使用される場合、用語「マーカー」または「検出可能なマーカー」は、特異的に検出されることができる構造を意味する。マーカーは、典型的に、目的のタンパク質または他の分子に化学的に結合される、または結合されることができる分子である。当業者に公知のように、本発明の方法で使用され得る多くの異なるマーカーがある。マーカーの非限定的な例としては、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）またはグルコースオキシダーゼなどの酵素が挙げられる。これらの酵素は、特定の試薬の存在下で、観察可能な色の変化を生成するので、これらの酵素は、多くの場合、検出を可能にする。いくつかの場合、これらの酵素は、それらに光を発生させる試薬に暴露される。それは、電子的に励起された状態から基底状態に戻る場合、発光は、物質からの発光として記載される。発光の様々な形態（生物発光、化学発光、フォトルミネセンス）は、励起状態に到達する経路が異なる。例えば、フォトルミネセンスは、単に蛍光であり；励起は、特定の波長の光によって開始される。生物発光は、ルシフェリンおよび蛍ルシフェラーゼのような生物発光化合物の使用によって特徴付けられる。化学発光は、化学反応によって生成される光である一方、電気化学発光は、電流に応答して生成される。電気化学発光マーカーの非限定的な例としては、ルテニウムおよびオスミウムポリピリジン錯体系が挙げられる。マーカーのさらなる例としては、放出される放射能が、従来の方法を使用して、容易に検出されることができる放射性同位体が挙げられる。ＤＮＡレポーターはまた、マーカー、およびまた、フィコエリトリンなどの、しかしそれらに限定されない蛍光レポーターとして使用され得る。
【００５８】
本明細書中で使用される場合、用語「マトリクス」は、結合分子が結合できる物理的担体を意味する。当業者であれば、本発明の範囲内でわかるように、マトリクスのさまざまな形態が、例えば、固体マトリクスのように、選択されうる。当該分野で一般的に使用される固体マトリクスとしては、ビーズ（例えば、アガロース、セファロース、ラテックス、磁性ナノ粒子）、マルチウェルプレート（例えば、ポリスチレン、ガラス）、膜（例えば、ニトロセルース、ＰＶＤＦ）が挙げられる。
【００５９】
本明細書中で使用される場合、用語「還元剤（ｒｅｄｕｃｉｎｇ ａｇｅｎｔ、ｒｅｄｕｃｔａｎｔまたはｒｅｄｕｃｅｒ）」は、酸化還元化学反応において、別の化学種に電子を失う（または供与する）元素または化合物を意味する。還元剤は、電子を失っているので、酸化さているといえる。本発明の意味の範囲内で、当業者が理解するように、還元剤はチオール（−ＳＨ）基を生成することによって、ジスルフィド基が反応性になることを可能にする。還元剤の非限定的な例としては、グルタチオン、メルカプトエタノール（ｂ−ＭＥ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）またはトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）が挙げられる。
【００６０】
本明細書中で使用される場合、用語「反応性チオール基を不活性化する」は、不要なチオール−ジスルフィド置換反応を防止するため、目的のタンパク質または他の分子に存在する全ての遊離チオール基をブロックすることを意味する。これは、典型的に、アルキル化剤を使用して、達成される。
【実施例】
【００６１】
材料および方法
抗体および試薬
ヒト化抗ＩＬ−６野生型ＩｇＧ４抗体、そのＳ２２８Ｐ点突然変異体抗ＩＬ−６ Ｓ２２８Ｐ ＩｇＧ抗体、ヒト化抗ＴＮＦ野生型ＩｇＧ４抗体およびヒト化抗ＣＤ２２ ＩｇＧ１野生型抗体は、Ｐｅｔｅｒｓら、２０１２年で記載されるように、発現され、精製された。ＩｇＧ４の野生型定常領域について配列番号１、および突然変異定常領域について配列番号２を参照（元の参照が全長抗体配列に基づいていると仮定して、この配列において、セリンからプロリンへの突然変異は１０８位に現われる）。さらに、配列番号３は、ＩｇＧ４軽鎖の定常領域に相当する一方、配列番号４および５は、それぞれ、ＩｇＧ１定常領域の重および軽鎖に相当する。
【００６２】
組換えＩＬ−６、ＴＮＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）および抗ヒトκ−軽鎖特異的抗体（Jaｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は、製造業者のプロトコルに従って、それぞれ、スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）またはルテニウム−ＮＨＳ−エステル（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を使用してビオチン化されたか、またはスルホタグ（Ｓｕｌｆｏ−ｔａｇ）（登録商標）で標識された。
【００６３】
患者サンプル−インビボＦａｂアーム置換。
静脈内注射によってＳ２２８Ｐ抗ＩＬ−６抗体の単回３ｍｇ／ｋｇ用量を受けた健康なボランティアからの非特定化血漿サンプルは、第１相、無作為、二重盲検、プラセボ対照試験から得られた。
【００６４】
Ｆａｂアーム置換
抗ＩＬ−６野生型ＩｇＧ４または抗ＩＬ−６ Ｓ２２８Ｐ ＩｇＧ４抗体およびそれらの潜在的な置換パートナー、すなわち、抗ＴＮＦ野生型ＩｇＧ４または抗ＣＤ２２野生型ＩｇＧ１抗体のいずれかは、次のように混合された。
【００６５】
インビトロ試験について：ｐＨ７．４のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で１００μｇ／ｍｌの総濃度で１：１のモル比で。
【００６６】
ｅｘｖｉｖｏ試験について：ＩｇＧ４枯渇血漿またはＩｇＧ４枯渇血液のいずれかの中で、６００μｇ／ｍｌの総濃度で１：９のモル比で（結果参照）。
【００６７】
ジスルフィド結合の還元を可能にするために、サンプルを、０．５ｍＭの最終濃度に還元型グルタチオン（ＧＨＳ）（Ｓｉｇｍａ）を用いて補足した。実験の開始時（ｔ＝０時間）に、混合物のアリコートは、１０ｍＭの最終濃度にＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）を受け（潜在的に、反応性チオール基を不活性化するため、したがって、Ｆａｂアーム置換を阻害する）、そして、３７℃で１６時間の間、反応の残りと一緒に、インキュベートした（ｔ＝１６時間）。一晩のインキュベーション後、サンプル中のｔ＝１６時間のチオール基はまた、上記のように、不活性化された。
【００６８】
非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、クマシー染色およびウエスタンブロット法。
ＩｇＧ４枯渇プロセスから得られた抗体およびサンプルは、（１０ｍＭの最終濃度に）ＮＥＭで補足された１×ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）のサンプル緩衝液において、３分間、１００℃でインキュベートして、アーチファクトを最小化し、次に、４〜２０％勾配トリス−グリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ゲルは、ウエスタンブロット法のために、クマシーで染色されるか、またはニトロセルロース膜に移されるかのいずれかであった。膜は、適切なセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合一次抗体（ブロッキング緩衝液中でＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ １ ：２，０００）を用いたインキュベーション前に、撹拌しながら２０℃で１時間、ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ、ブロッキング緩衝液）中５％ミルク（ｗ／ｖ）中で、ブロックされた。次に、膜をＰＢＳＴで洗浄し、化学発光基質を用いてインキュベートし、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ４０００ ＬＡＳアナライザ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、撮像した。総タンパク質濃度は、２８０ｎｍで吸光度を測定することによって、定量化された。
【００６９】
ＩｇＧ４枯渇および生理学的マトリクスの調製。
健康なヒトドナーからの全血を、ヘパリン含有バイアル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）中に回収し、２０℃で１０分間、１，５００ｇで遠心分離し、細胞から血漿を分離した。１．５ｍｌの血漿を、続いて、２０℃で、撹拌しながら１時間、２×２５０μｌのキャプチャ選択ＩｇＧ４（Ｃａｐｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ ｌｇＧ４）ビーズ（ＢＡＣ オランダ）を用いてインキュベートした。インキュベーション後、未結合フロースルー材料（ＩｇＧ４枯渇血漿）を回収し、４℃で保存した。ビーズを、１００μｌの１×ＳＤＳサンプル緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）での溶出前に、１ｍｌの生理食塩水（ｍＭでＰＳＳ：１４５ＮａＣｌ、５．６ＫＣｌ、５．６グルコース、１ＭｇＣｌ２、１ＣａＣｌ２、１５ＨＥＰＥＳ；ｐＨ７．４）を用いて３回洗浄した。次に、得られた画分を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（下記参照）。
【００７０】
血漿からＩｇＧ４枯渇中、最初の全血の遠心分離からペレット化された血液細胞を、上記のように、ＰＳＳ中で再懸濁および遠心分離によって、３回洗浄した。次に、洗浄した血液細胞を、「ＩｇＧ枯渇血漿」（すなわち、キャプチャ選択（Ｃａｐｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ）ＩｇＧ４ビーズからのフロースルー）中で再懸濁し、「ＩｇＧ４枯渇全血」を得た。
【００７１】
インビトロでのＦａｂアーム置換（ＦＡＥ）の検出および定量化。
抗ＴＮＦ野生型抗体との抗ＩＬ−６（野生型またはＳ２２８Ｐ）抗体のインビトロＦａｂアーム置換が、定量化され、新たに形成された抗ＩＬ−６／抗ＴＮＦ二重特異性抗体（二重特異性抗体）の存在は、本発明の方法を使用して、証明された。この場合、本発明の方法は、マトリクスとして、ＭＳＤ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）マルチアレイプレートを使用して、実施された。これらのプレートは、各ウェルで、高容量炭素電極を含み、それは、セクターイメージャー（Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ）６０００アナライザー（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）において、電気化学発光シグナルの測定を可能にする。
【００７２】
第１に、ＦＡＥの間接的な定量化は、既存の、親の、二価の、単一特異性の抗ＩＬ−６抗体の、同じ抗原の２つの異なるタグ付けされた変異体を架橋する能力の「損失」によって決定された。（さらなるＦＡＥを防止するために）ＮＥＭとのインキュベーション後の回収された反応サンプルは、ＰＢＳ／１％ウシ血清アルブミン（ＰＢ）中で１：４，０００に希釈され、撹拌しながら２０℃で１時間、ビオチン化ＩＬ−６およびスルホタグ（Ｓｕｌｆｏ―ｔａｇ）標識ＩＬ−６の１：１の混合物の２μｇ／ｍｌでインキュベートされた。インキュベート後、サンプルをＰＢ前ブロックされたストレプトアビジン被覆ＭＳＤプレートに移し、以下に記載されるように処理される前に２０℃で１時間、その中で、撹拌しながらインキュベートされた。
【００７３】
第２に、ＦＡＥは、新たに形成された抗ＩＬ−６／抗ＴＮＦ二重特異性抗体の２つの異なる抗原を架橋する能力の「獲得」によって決定されるように直接的にモニターされた。１:４，０００のＰＢ希釈反応サンプルを、撹拌しながら、２０℃で１時間、ＰＢ中でビオチン化ＩＬ−６およびスルホタグ（Ｓｕｌｆｏ−ｔａｇ）（登録商標）標識ＴＮＦの１：１の混合物の２μ／ｍｌでインキュベートされた。インキュベーション後、サンプルをＰＢ前ブロックされたストレプトアビジン被覆ＭＳＤプレートに移し、２０℃で１時間、その中で、撹拌しながら、インキュベートした。
【００７４】
タグが付された抗原とのインキュベーション後、ウェルを、Ｓｅｃｔｏｒｌｍａｇｅｒ ６０００アナライザー（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）でシグナルが製造業者の読み込みバッファーを使用して明らかにされ、測定される前に、ＰＢＳＴを用いて、３回、洗浄した。非ビオチン化ＩＬ−６が、ビオチン化変異体に対して置換される対照平行反応から得られえたバックグラウンド値は、全てのシグナルから減算された。少なくとも３つの独立した実験からの重複値は、全ての計算について使用された。平均標準誤差（ＳＥＭ）値との平均データが、プロットされる。平均データは、ＭＳＤ値と一緒に加算し、反復測定値の数で割ることによって、計算された。平均標準誤差（ＳＥＭ）は、独立した実験の数の平方根で測定値の標準偏差を割ることによって計算された。
【００７５】
インビボでのＤ２２８Ｐ抗ＩＬ−６ ＩｇＧ４抗体Ｆａｂアーム置換の検出。
Ｓ２２８Ｐ抗ＩＬ−６ ＩｇＧ４抗体を投与した健康なボランティアからの血漿サンプルは、規則的な時間間隔で採取され、２つの異なるＭＳＤアッセイ、すなわち、総および無傷によって、分析された。総アッセイは、全ての一価抗体半分子（すなわち、非置換および置換種の両方）を検出する一方、無傷のアッセイは、単一特異的、二価抗体分子（すなわち、非置換種のみ）のみを検出する。
【００７６】
簡単にいえば、総アッセイのために、血漿サンプルは、ＰＢ中で連続的に希釈され、ビオチン化ＩＬ−６の１μｇ／ｍｌを用いて、２０℃で１時間、撹拌しながらインキュベートされた。インキュベーション後、サンプルをＰＢ前ブロックされたストレプトアビジン被覆ＭＳＤプレートに移し、その中で、撹拌しながら、インキュベートした。次に、ウェルを、撹拌しながら、２０℃で別の１時間の間、ＰＢ中で、（捕捉されたＳ２２８Ｐ抗ＩＬ−６ ＩｇＧ４抗体κ−軽鎖半分子を標識するために）スルホタグ（Ｓｕｌｆｏ−ｔａｇ）（登録商標）標識ヤギ抗ヒトκ−軽鎖抗体の１μｇ／ｍｌとのインキュベーション前に、ＰＢＳＴで３回洗浄し、以下の無傷アッセイ毎に処理した。
【００７７】
無傷のアッセイのために、ＰＢで希釈後、血漿サンプルを、ビオチン化ＩＬ−６およびスルホタグ（Ｓｕｌｆｏ−ｔａｇ）（登録商標）標識ＩＬ−６の１:１の混合物の２ｇ／ｍｌを用いて、２０℃で１時間、撹拌しながらインキュベートした。インキュベーション後、ウェルを、前に詳述したように、ＰＢＳＴで洗浄し、シグナルを明らかにし、測定した。
【００７８】
連続希釈されたＳ２２８Ｐ抗ＩＬ−６ ＩｇＧ４抗体の既知量が、検量線を得るための平行アッセイで使用され、それから血漿Ｓ２２８Ｐ抗ＩＬ−６ ＩｇＧ４抗体濃度を算出した。２つの独立した実験からの重複値は、全ての計算について使用された。Ｓ２２８Ｐ抗ＩＬ−６ ＩｇＧ４抗体ＦＡＥの量は、２つの生成されたプロファイルを比較することによって、評価された。インビボ血漿Ｓ２２８Ｐ抗ＩＬ−６ ＩｇＧ４半減期は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して算出された。
【００７９】
結果
非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる抗体の分析
ＦＡＥを調査するために、４つの異なる抗体が使用された：抗ＩＬ−６野生型ＩｇＧ４、抗ＩＬ−６ Ｓ２２８Ｐ ＩｇＧ４、抗ＴＮＦ野生型ＩｇＧ４および抗ＣＤ２２野生型ＩｇＧ１。変性、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシー染色による分析は、図１に示される。ゲルからわかるように、野生型ＩｇＧ４抗体は、２つの主要な種を含む不均一調製：フルサイズ、二価、単一特異的抗体（図１の白抜き矢印）および一価、単一特異性、重−軽鎖半分子に相当するより低い分子量種（図１の黒塗り矢印）である。Ａｎｇａｌら、１９９３年で前に記載されるように、このＩｇＧ４野生型特異的不均一性は、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされた単一Ｓ２２８Ｐ点突然変異の導入によって、破壊される（Ｋａｂａｔら、１９９１年）。図１、レーン２（Ｓ２２８Ｐ ＩｇＧ４）よびレーン４（野生型ＩｇＧ１）における重−軽鎖バンドの非存在に注意。
【００８０】
インビトロでのＦａｂアーム置換の調査。
インビトロで抗ＩＬ−６ ＩｇＧ４ ＦＡＥに対するＳ２２８Ｐ突然変異の効果を研究するために、抗ＩＬ−６野生型ＩｇＧ４または抗ＩＬ−６ Ｓ２２８Ｐ ＩｇＧ４抗体は、１：１のモル比で、抗ＴＮＦ野生型ＩｇＧ４または抗ＣＤ２２野生型ＩｇＧ１抗体のいずれか一方と混合され、サンプルは、還元剤、グルタチオン（ＧＳＨ）の存在下または非存在下で、３７℃でインキュベートされた。ＧＨＳの潜在的な有害な効果を制御するために、我々はまた、反応の並行セットにおいて、ＧＨＳの存在下、抗ＩＬ−６野生型ＩｇＧ４または抗ＩＬ−６ Ｓ２２８Ｐ ＩｇＧ４をそれだけでインキュベートした。インキュベーション後、サンプルを、本発明の方法によってＦＡＥについて分析した（図２Ａ）。まず、ＭＳＤベースの方法を用いたが、これは親抗体の二価、単一特異性の性質を引き出し、同じ抗原の異なるタグ付けされた変異体との反応混合物のインキュベーションを含む。この方法によるＭＳＤシグナルの損失は、反応混合物からの親のＩｇＧ４単一特異性、二価抗体の損失、対応抗体とのＦＡＥによる可能性（方法１）を推察する。この方法による反応混合物の分析は、ＧＨＳを補充する抗ＩＬ−６野生型ＩｇＧ４抗体および抗ＴＮＦ野生型ＩｇＧ４抗体の両方を含むサンプルからのシグナルの有意な損失（約２８％）をもたらした（図２Ｂ）。興味深いことに、そのような損失は、ＧＳＨ、抗ＩＬ−６野生型ＩｇＧ４単独の非存在下、または野生型ＩｇＧ１、またはサンプルを含むＳ２２８Ｐ ＩｇＧ４のいずれかとのインキュベーション時には観察されなかった。
【００８１】
まとめると、これらの結果は、抗ＩＬ−６野生型単一特異性、二価ＩｇＧ４抗体が、野生型抗ＴＮＦ ＩｇＧ４（野生型ＩｇＧ１でない）抗体とのＧＨＳ依存性ＦＡＥにより反応混合物から特異的な「損失」されることを暗示する。もし真実であれば、このプロセスは、抗ＩＬ−６／抗ＴＮＦ二価特異性抗体の形成をもたらすはずである。
【００８２】
抗ＩＬ−６／抗ＴＮＦ二重特異性抗体の存在を直接調査するために、全ての反応混合物の同等のアリコートは、第二のＭＳＤベースの方法を使用して、アッセイされた（図２Ａ参照）。この方法は、新たに形成された抗体の二価、二重特異性の性質を利用し、第１の捕捉に対する抗原の組み合わせとの反応混合物のインキュベーションを含み、次に、二重特異性抗体を明らかにする。この方法によるＭＳＤシグナルの獲得は、異種、単一特異性親抗体のＦＡＥから新たに形成された二重特異性抗体の形成を推察する（方法２）。この分析の結果、図２Ｃは、方法１によるシグナルの損失を前に示した同じ反応におけるシグナルの関連する相補的な、特異的および重要な獲得を示す（すなわち、ＧＳＨ補足、抗ＩＬ−６野生型ＩｇＧ４抗体および抗ＴＮＦ野生型ＩｇＧ４抗体のサンプル）。シグナルのそのような獲得は、ＧＨＳ，抗ＩＬ−６野生型ＩｇＧ４単独、またはサンプルを含むＳ２２８Ｐ ＩｇＧ４のいずれかの非存在下で検出されなかった。
【００８３】
まとめると、これらの結果は、これらの条件下、溶液からの野生型ＩｇＧ４の「損失」（図２Ｂの方法１で観察されるような）は、抗ＩＬ−６／抗ＴＮＦ二重特異性抗体の形成をもたらす野生型ＩｇＧ４（野生型ＩｇＧ１ではない）抗体とのＧＨＳ依存性ＦＡＥをもたらしていることを証明する（図２Ｃの方法２で観察される）。
【００８４】
内因性ＩｇＧ４抗体の枯渇した血漿および血液。
ＰＢＳは、Ｆａｂアーム置換をモニターする抗体フリーおよび緩衝環境を提供する一方、細胞および内因性因子の欠如は、このインビトロ緩衝が、生理学的に関連からほど遠いことを意味する。ＦＡＥをモニターする非常により適切な生理学的媒体は、血液または血漿であろう。しかしながら、これらのｅｘｖｉｖｏマトリクスの欠点は、未知の特異性の内因性ＩｇＧ４野生型抗体の存在と存在量であり、これは、ＦＡＥをもたらすそれらの固有の能力により、目的の我々の二重特異性抗体の形成の希釈をもたらすだろう（すなわち、抗ＩＬ−６／抗ＴＮＦ）。これは、最終的に、ＦＡＥの過少評価につながる。したがって、生理学的に関連する条件下で、目的の抗体のインビトロＦＡＥを正確にモニターするために、新規の、ＩｇＧ４フリー緩衝培地は、図３Ａの抗ＩｇＧ４ビーズ（Ｃａｐｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ ｌｇＧ４, ＢＡＣオランダ）を使用して、内因性ＩＧ４抗体の枯渇した血液によって確立された。血液を遠心分離した後、上部血漿層は、採取され、徹底的なＩｇＧ４枯渇を確実にするため、抗ＩｇＧ４ビーズの２つのラウンドに付された。親和性マトリクスに対するＩｇＧ４抗体の非特異的吸収を制御するため、対照ビーズが並行して使用された。得られたサンプルは、ＨＲＰ結合抗ＩｇＧ４抗体を使用して非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットによって分析された（図３Ｂ、左上パネル）。ＩｇＧ４抗体のみが、このプロセス中に単離されていたことを検証し、確認するために、サンプルは、抗ＩｇＧ１、２および３ＨＲＰ結合抗体を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットによってさらに分析された（図３Ｂ左下パネル）。ＩｇＧ４抗体を含む画分は、プールされ、純度（＞９９％）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシー染色によって評価された（図３Ｂ、右）。２８０ｎｍで吸光度を測定することによって、プールされた抗ＩｇＧ４溶出液の総タンパク質含量は、６００μｇ／ｍｌであることが決定された。抗ＩｇＧ４ビーズとのインキュベーション後に回収された非結合材料は、「ＩｇＧ４枯渇血漿」を与え、洗浄血細胞の添加後に回収されたものは「ＩｇＧ４枯渇全血」を与えた（図３Ａ）。これらの２つの生理学的に関連する、バッファリングされた、ＩｇＧ４フリーのマトリクスは、続いて、ＦＡＥをモニターするために使用された。
【００８５】
ＩｇＧ４枯渇生理学的マトリクスにおけるインビトロＳ２２８Ｐ抗ＩＬ−６ ＩｇＧ４ Ｆａｂアーム置換。
生理学的に関連する抗体濃度が、実験的に、ＦＡＥを研究するために使用されたことを証明するため、抗ＩｇＧ４ビーズを使用して全血漿から除去された６００μｇ／ｍｌの内因性ＩｇＧ４抗体（上記参照）は、事前混合抗ＩＬ−６（野生型またはＳ２２８Ｐのいずれか一方）ＩｇＧ４抗体および抗ＴＮＦ野生型ＩｇＧ４抗体の等量で置換された。抗体の臨床的に関連する量が使用されたことを証明するため、６０μｇ／ｍｌの抗ＩＬ−６ ＩｇＧ４抗体（３ｍｇ／ｋｇ静脈内投与のＣｍａｘにほぼ等しい、Ｊ. Ｊｏｓｅ私信）は、５４０μｇ／ｍｌ（すなわち、９倍モル過剰）の抗ＴＮＦ野生型ＩｇＧ４抗体と混合された。抗体は、前述のＭＳＤベースの方法によるＦＡＥの分析前の１６時間の間、３７℃で、ＧＳＨの非存在下または存在下、２つのＩｇＧ４枯渇マトリクスのいずれかでインキュベートされた。
【００８６】
本発明の方法による反応混合物の分析は、３７℃でのＧＨＳ依存性インキュベーション中、抗ＴＮＦ野生型ＩｇＧ４抗体とインキュベートされた野生型（Ｓ２２８Ｐでない）抗ＩＬ−６ ＩｇＧ４抗体のＭＳＤシグナル（ＩｇＧ４枯渇血で約６６％およびＩｇＧ４枯渇血漿で約６３％）の有意な損失を証明した（図４Ａ、方法１）。
【００８７】
抗原としてＩＬ−６およびＴＮＦの組み合わせとのインキュベーションを使用するさらなるＭＳＤベースの方法によって、これらの同じサンプルのさらなる分析は、シグナルの損失を以前に証明した同じ反応でのＭＳＤシグナルの特異的および有意な獲得を示した（図４Ｂ）。まとめると、これらの結果は、Ｓ２２８Ｐ ＩｇＧ４でない抗ＩＬ−６野生型抗体は、これらの生体外条件の下、ＧＳＨの存在下、抗ＴＮＦ野生型ＩｇＧ４抗体とのＦＡＥを受けることを示唆する。
【００８８】
興味深いことに、補充ＧＨＳの非存在下でさえ、野生型抗体変異体（Ｓ２２８Ｐ変異体でない）はまた、ＩｇＧ４枯渇全血（ＩｇＧ４枯渇血漿でない）におけるＦＡＥの有意なおよび検出可能なレベルに関与する（図４）。これらの２つのマトリクスの間の唯一の違いは血液細胞の存在にあるので、これらのデータが示唆することは、ＦＡＥ反応を触媒しているのが、これらまたはこれらの成分であるということである。
【００８９】
インビボＳ２２８Ｐ抗ＩＬ−６ ＩｇＧ４ Ｆａｂアーム置換。
現在までに、生理学的および臨床的に関連するインビボ条件を再現することによって、インビトロＦＡＥに参加するＳ２２８Ｐ 抗ＩＬ−６ ＩｇＧ４の傾向が、調査されている。しかしながら、（材料および方法で説明するように）インビボＳ２２８Ｐ抗ＩＬ−６ ＩｇＧ４ ＦＡＥを直接調査するために、血漿サンプルは、２つのＭＳＤアッセイによって、Ｓ２２８Ｐ抗ＩＬ−６ ＩｇＧ４臨床試験の非特定のヒトボランティアから採取された血漿サンプルを、アッセイした。最初のＭＳＤアッセイ（合計）は、ＩＬ−６抗原に結合できる置換および非置換一価Ｓ２２８Ｐ 抗ＩＬ−６ ＩｇＧ４半分子の両方を測定するために設計され、一方、第２のアッセイ（無傷）は、非交換、単一特異性、二価Ｓ２２８Ｐ抗ＩＬ−６ ＩｇＧ４分子のみを測定するために設計された。これらの２つの方法からの血漿濃度プロファイルの比較は、インビボＳ２２８Ｐ抗ＩＬ−６ ＩｇＧ４ ＦＡＥの程度を示すだろう。しかしながら、図５からわかるように、２つの方法によるＳ２２８Ｐ抗ＩＬ−６ ＩｇＧ４の分析は、試験された臨床対象の両方に対するＳ２２８Ｐ抗ＩＬ−６ ＩｇＧ４血漿濃度プロファイルの重複を生じた。これは、Ｓ２２８Ｐ抗ＩＬ−６ ＩｇＧ４は、インビボＦａｂアーム置換で、任意の有意なレベルでは参加しないことを推測させる。
【００９０】
引用文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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