(57)【要約】  ＭＤＭ２ｉまたはＭＤＭ２−ｐ５３相互作用のアンタゴニストに対するがんまたは腫瘍の感受性を予測する遺伝子シグネチャーが提供される。提供された遺伝子シグネチャーにおける差次的に発現される遺伝子は、ＭＤＭ２ｉでの治療または療法に対するがんおよび腫瘍試料の感受性を決定および評価するためのバイオマーカーとして役立つ。仮に全ての参照試料のＭＤＭ２ｉ治療に対する感受性が不明であったとしても参照試料および試験試料において、種々のがんおよび腫瘍タイプならびにサブタイプ等の試験試料のＭＤＭ２ｉ感受性をＭＤＭ２ｉ感受性遺伝子シグネチャーにおける遺伝子の発現に基づいて決定し、記載された方法の実施に基づいてそれらのがんがＭＤＭ２ｉ感受性であると決定される場合、ＭＤＭ２ｉで個体を治療する方法も提供される。ＭＤＭ２ｉ感受性に関する分析を受けている試料に関するＴＰ５３遺伝子およびｐ５３タンパク質状態も決定することができる。本発明の方法、プラットフォーム、キット、試薬、および組成物は、記載された方法に従って、対照と比較した遺伝子シグネチャーにおける遺伝子の差次的発現によって示される、そのがんがＭＤＭ２阻害剤に対する感受性を提示するがん患者の個別化されたまたは個人に合わせた治療のための有利な手法およびツールを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＤＭ２ｉ治療に対する対象のがんまたは腫瘍の感受性を予測する方法であって、対象から得られたがんまたは腫瘍試料中の図１Ａ〜１Ｅに列挙された遺伝子から選択される少なくとも３つの遺伝子の発現のレベルを測定することを含む方法。
【請求項２】
ＭＤＭ２ｉ治療に対する対象のがんまたは腫瘍の感受性を予測する方法であって、
ａ）対象から得られたがんまたは腫瘍試料中の図１Ａ〜１Ｅに列挙された遺伝子から選択される少なくとも３つの遺伝子の発現のレベルを測定すること；および
ｂ）がんまたは腫瘍試料が野生型ＴＰ５３遺伝子を有するかどうかを決定すること
を含む方法。
【請求項３】
図１Ａ〜１Ｅに列挙された遺伝子から選択される遺伝子が、図１Ａ〜１Ｅに列挙された遺伝子の全てである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
図１Ａ〜１Ｅに列挙された遺伝子から選択される遺伝子が、ＢＡＸ、Ｃ１ＱＢＰ、ＦＤＸＲ、ＧＡＭＴ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＳＬＣ２５Ａ１１、ＴＰ５３、ＴＲＩＡＰ１、ＺＭＡＴ３、ＡＥＮ、Ｃ１２ｏｒｆ５、ＧＲＳＦ１、ＥＩＦ２Ｄ、ＭＰＤＵ１、ＳＴＸ８、ＴＳＦＭ、ＤＩＳＣ１、ＳＰＣＳ１、ＰＲＰＦ８、ＲＣＢＴＢ１、ＳＰＡＧ７、ＴＩＭＭ２２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＡＣＡＤＳＢ、ＤＤＢ２、ＦＡＳ、ＧＤＦ１５、ＧＲＥＢ１、ＰＤＥ１２、ＰＯＬＨ、Ｃ１９ｏｒｆ６０、ＨＨＡＴ、ＩＳＣＵ、ＭＤＭ２、ＭＥＤ３１、ＭＥＴＲＮ、ＰＨＬＤＡ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＳＥＳＮ１およびＸＰＣである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
図１Ａ〜１Ｅに列挙された遺伝子から選択される遺伝子が、ＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲ、ＣＤＫＮ１ＡおよびＡＥＮである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
遺伝子の発現のレベルを測定することがｍＲＮＡの発現のレベルを測定することを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
遺伝子の発現のレベルを測定することが遺伝子によってコードされるタンパク質の発現のレベルを測定することを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ＭＤＭ２ｉが、スピロオキシインドール誘導体、インドール誘導体、ピロリジン−２−カルボキサミド誘導体、ピロリジノン誘導体、イソインドリノン誘導体、またはイミダゾチアゾール誘導体である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ＭＤＭ２ｉが、化合物Ａもしくはその塩、化合物Ｂもしくはその塩、ＣＧＭ０９７、ＲＧ７３８８、ＭＫ−８２４２（ＳＣＨ９００２４２）、ＭＩ−２１９、ＭＩ−３１９、ＭＩ−７７３、ＭＩ−８８８、Ｎｕｔｌｉｎ−３ａ、ＲＧ７１１２（ＲＯ５０４５３３７）、ＴＤＰ５２１２５２、ＴＤＰ６６５７５９、ＰＸＮ７２７、またはＰＸＮ８２２である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ＭＤＭ２ｉが、化合物Ａもしくはその塩、または化合物Ｂもしくはその塩である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
がんまたは腫瘍を有する個体を治療する方法であって、
ａ）ＭＤＭ２ｉ治療に対する対象のがんまたは腫瘍の感受性を評価することであって、対象から得られたがんまたは腫瘍試料中の図１Ａ〜１Ｅに列挙された遺伝子から選択される少なくとも３つの遺伝子の発現のレベルを測定することを含むこと；および
ｂ）評価が、がんまたは腫瘍がＭＤＭ２ｉに対して感受性であることを示す場合、個体に有効量のＭＤＭ２ｉを投与して、がんまたは腫瘍を治療すること
を含む方法。
【請求項１２】
がんまたは腫瘍を有する個体を治療する方法であって、
ａ）ＭＤＭ２ｉ治療に対する対象のがんまたは腫瘍の感受性を評価することであって、対象から得られたがんまたは腫瘍試料中の図１Ａ〜１Ｅに列挙された遺伝子から選択される少なくとも３つの遺伝子の発現のレベルを測定することを含むこと；
ｂ）がんまたは腫瘍が野生型ＴＰ５３遺伝子を有するかどうかを決定すること；および
ｃ）評価ａ）が、がんまたは腫瘍がＭＤＭ２ｉに対して感受性であることを示し、かつ、がんまたは腫瘍検体が野生型ＴＰ５３遺伝子を有する場合、個体に有効量のＭＤＭ２ｉを投与して、がんまたは腫瘍を治療すること
を含む方法。
【請求項１３】
図１Ａ〜１Ｅに列挙された遺伝子から選択される遺伝子が、図１Ａ〜１Ｅに列挙された遺伝子の全てである、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
図１Ａ〜１Ｅに列挙された遺伝子から選択される遺伝子が、ＢＡＸ、Ｃ１ＱＢＰ、ＦＤＸＲ、ＧＡＭＴ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＳＬＣ２５Ａ１１、ＴＰ５３、ＴＲＩＡＰ１、ＺＭＡＴ３、ＡＥＮ、Ｃ１２ｏｒｆ５、ＧＲＳＦ１、ＥＩＦ２Ｄ、ＭＰＤＵ１、ＳＴＸ８、ＴＳＦＭ、ＤＩＳＣ１、ＳＰＣＳ１、ＰＲＰＦ８、ＲＣＢＴＢ１、ＳＰＡＧ７、ＴＩＭＭ２２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＡＣＡＤＳＢ、ＤＤＢ２、ＦＡＳ、ＧＤＦ１５、ＧＲＥＢ１、ＰＤＥ１２、ＰＯＬＨ、Ｃ１９ｏｒｆ６０、ＨＨＡＴ、ＩＳＣＵ、ＭＤＭ２、ＭＥＤ３１、ＭＥＴＲＮ、ＰＨＬＤＡ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＳＥＳＮ１およびＸＰＣである、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１５】
図１Ａ〜１Ｅに列挙された遺伝子から選択される遺伝子が、ＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲ、ＣＤＫＮ１ＡおよびＡＥＮである、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１６】
遺伝子の発現のレベルが、ｍＲＮＡの発現である、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
遺伝子の発現のレベルが、遺伝子によってコードされるタンパク質の発現である、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ＭＤＭ２ｉが、スピロオキシインドール誘導体、インドール誘導体、ピロリジン−２−カルボキサミド誘導体、ピロリジノン誘導体、イソインドリノン誘導体、またはイミダゾチアゾール誘導体である、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ＭＤＭ２ｉが、化合物Ａもしくはその塩、化合物Ｂもしくはその塩、ＣＧＭ０９７、ＲＧ７３８８、ＭＫ−８２４２（ＳＣＨ９００２４２）、ＭＩ−２１９、ＭＩ−３１９、ＭＩ−７７３、ＭＩ−８８８、Ｎｕｔｌｉｎ−３ａ、ＲＧ７１１２（ＲＯ５０４５３３７）、ＴＤＰ５２１２５２、ＴＤＰ６６５７５９、ＰＸＮ７２７、またはＰＸＮ８２２である、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ＭＤＭ２ｉが、化合物Ａもしくはその塩または化合物Ｂもしくはその塩である、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
図１Ａ〜１Ｅに列挙された遺伝子から選択される少なくとも３つの遺伝子からなる、ＭＤＭ２ｉ治療に対する対象のがんまたは腫瘍の感受性を予測するための遺伝子シグネチャー。
【請求項２２】
図１Ａ〜１Ｅに列挙された遺伝子から選択される遺伝子が、ＢＡＸ、Ｃ１ＱＢＰ、ＦＤＸＲ、ＧＡＭＴ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＳＬＣ２５Ａ１１、ＴＰ５３、ＴＲＩＡＰ１、ＺＭＡＴ３、ＡＥＮ、Ｃ１２ｏｒｆ５、ＧＲＳＦ１、ＥＩＦ２Ｄ、ＭＰＤＵ１、ＳＴＸ８、ＴＳＦＭ、ＤＩＳＣ１、ＳＰＣＳ１、ＰＲＰＦ８、ＲＣＢＴＢ１、ＳＰＡＧ７、ＴＩＭＭ２２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＡＣＡＤＳＢ、ＤＤＢ２、ＦＡＳ、ＧＤＦ１５、ＧＲＥＢ１、ＰＤＥ１２、ＰＯＬＨ、Ｃ１９ｏｒｆ６０、ＨＨＡＴ、ＩＳＣＵ、ＭＤＭ２、ＭＥＤ３１、ＭＥＴＲＮ、ＰＨＬＤＡ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＳＥＳＮ１およびＸＰＣである、請求項２１に記載の遺伝子シグネチャー。
【請求項２３】
図１Ａ〜１Ｅに列挙された遺伝子から選択される遺伝子が、ＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲ、ＣＤＫＮ１ＡおよびＡＥＮである、請求項２１に記載の遺伝子シグネチャー。
【請求項２４】
ＭＤＭ２ｉが、スピロオキシインドール誘導体、インドール誘導体、ピロリジン−２−カルボキサミド誘導体、ピロリジノン誘導体、イソインドリノン誘導体、またはイミダゾチアゾール誘導体である、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の遺伝子シグネチャー。
【請求項２５】
ＭＤＭ２ｉが、化合物Ａもしくはその塩、化合物Ｂもしくはその塩、ＣＧＭ０９７、ＲＧ７３８８、ＭＫ−８２４２（ＳＣＨ９００２４２）、ＭＩ−２１９、ＭＩ−３１９、ＭＩ−７７３、ＭＩ−８８８、Ｎｕｔｌｉｎ−３ａ、ＲＧ７１１２（ＲＯ５０４５３３７）、ＴＤＰ５２１２５２、ＴＤＰ６６５７５９、ＰＸＮ７２７、またはＰＸＮ８２２である、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の遺伝子シグネチャー。
【請求項２６】
図１Ａ〜１Ｅに列挙された少なくとも３つの遺伝子を検出するための複数の核酸プローブを含む組成物。
【請求項２７】
図１Ａ〜１Ｅに列挙された少なくとも３つの遺伝子が、図１Ａ〜１Ｅに列挙された遺伝子の全てである、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
図１Ａ〜１Ｅに列挙された少なくとも３つの遺伝子が、ＢＡＸ、Ｃ１ＱＢＰ、ＦＤＸＲ、ＧＡＭＴ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＳＬＣ２５Ａ１１、ＴＰ５３、ＴＲＩＡＰ１、ＺＭＡＴ３、ＡＥＮ、Ｃ１２ｏｒｆ５、ＧＲＳＦ１、ＥＩＦ２Ｄ、ＭＰＤＵ１、ＳＴＸ８、ＴＳＦＭ、ＤＩＳＣ１、ＳＰＣＳ１、ＰＲＰＦ８、ＲＣＢＴＢ１、ＳＰＡＧ７、ＴＩＭＭ２２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＡＣＡＤＳＢ、ＤＤＢ２、ＦＡＳ、ＧＤＦ１５、ＧＲＥＢ１、ＰＤＥ１２、ＰＯＬＨ、Ｃ１９ｏｒｆ６０、ＨＨＡＴ、ＩＳＣＵ、ＭＤＭ２、ＭＥＤ３１、ＭＥＴＲＮ、ＰＨＬＤＡ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＳＥＳＮ１およびＸＰＣである、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２９】
図１Ａ〜１Ｅに列挙された少なくとも３つの遺伝子が、ＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲ、ＣＤＫＮ１ＡおよびＡＥＮである、請求項２６に記載の組成物。
【請求項３０】
複数の核酸プローブがアレイまたはマイクロアレイを含む、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３１】
ＭＤＭ２ｉに対する感受性を示す図１Ａ〜１Ｅに列挙された少なくとも３つの遺伝子の検出のための試薬および使用説明書を含むキット。
【請求項３２】
ＭＤＭ２ｉに対するがんまたは腫瘍試料の感受性を予測するためのキットであって、図１Ａ〜１Ｅに列挙された少なくとも３つの遺伝子に対応するヌクレオチド配列に特異的に結合する核酸プローブ、および核酸を標識する手段を含むキット。
【請求項３３】
ＭＤＭ２ｉに対するがんまたは腫瘍試料の感受性を予測するためのキットであって、図１Ａ〜１Ｅに列挙された少なくとも３つの遺伝子によってコードされるポリペプチドに特異的に結合する抗体またはリガンド、および遺伝子によってコードされるポリペプチドまたはペプチドに特異的に結合する抗体またはリガンドを標識する手段を含むキット。
【請求項３４】
図１Ａ〜１Ｅに列挙された少なくとも３つの遺伝子が、図１Ａ〜１Ｅに列挙された遺伝子の全てである、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３５】
図１Ａ〜１Ｅに列挙された少なくとも３つの遺伝子が、ＢＡＸ、Ｃ１ＱＢＰ、ＦＤＸＲ、ＧＡＭＴ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＳＬＣ２５Ａ１１、ＴＰ５３、ＴＲＩＡＰ１、ＺＭＡＴ３、ＡＥＮ、Ｃ１２ｏｒｆ５、ＧＲＳＦ１、ＥＩＦ２Ｄ、ＭＰＤＵ１、ＳＴＸ８、ＴＳＦＭ、ＤＩＳＣ１、ＳＰＣＳ１、ＰＲＰＦ８、ＲＣＢＴＢ１、ＳＰＡＧ７、ＴＩＭＭ２２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＡＣＡＤＳＢ、ＤＤＢ２、ＦＡＳ、ＧＤＦ１５、ＧＲＥＢ１、ＰＤＥ１２、ＰＯＬＨ、Ｃ１９ｏｒｆ６０、ＨＨＡＴ、ＩＳＣＵ、ＭＤＭ２、ＭＥＤ３１、ＭＥＴＲＮ、ＰＨＬＤＡ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＳＥＳＮ１およびＸＰＣである、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３６】
図１Ａ〜１Ｅに列挙された少なくとも３つの遺伝子が、ＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲ、ＣＤＫＮ１ＡおよびＡＥＮである、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３７】
ＭＤＭ２ｉが、スピロオキシインドール誘導体、インドール誘導体、ピロリジン−２−カルボキサミド誘導体、ピロリジノン誘導体、イソインドリノン誘導体、またはイミダゾチアゾール誘導体である、請求項３１〜３６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３８】
ＭＤＭ２ｉが、化合物Ａもしくはその塩、化合物Ｂもしくはその塩、ＣＧＭ０９７、ＲＧ７３８８、ＭＫ−８２４２（ＳＣＨ９００２４２）、ＭＩ−２１９、ＭＩ−３１９、ＭＩ−７７３、ＭＩ−８８８、Ｎｕｔｌｉｎ−３ａ、ＲＧ７１１２（ＲＯ５０４５３３７）、ＴＤＰ５２１２５２、ＴＤＰ６６５７５９、ＰＸＮ７２７、またはＰＸＮ８２２である、請求項３１〜３６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３９】
ＭＤＭ２ｉが、化合物Ａもしくはその塩または化合物Ｂもしくはその塩である、請求項３１〜３６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４０】
ＭＤＭ２ｉ治療に対する対象のがんまたは腫瘍の感受性を予測する方法であって、
ａ）前記対象から得られたがんまたは腫瘍試料において、図１Ａ〜１Ｅに列挙された遺伝子から選択される少なくとも３つの遺伝子を含む遺伝子の発現レベルを測定することと、
ｂ）ステップａ）において得られた遺伝子の発現レベルをスコア化して対象の感受性スコアを得ることと、
ｃ）少なくとも一部の試料においてＭＤＭ２ｉ治療に対する感受性が不明である、複数のがん試料または腫瘍試料において前記遺伝子の発現レベルを測定することと、
ｄ）ステップｃ）で得られた遺伝子発現レベルをスコア化して各試料における参照スコアを得ることと、参照スコアの分布に基づいて閾値を決定することと、
ｅ）対象の感受性スコアが閾値を超えたら当該対象はＭＤＭ２ｉ治療に対して感受性であると予測し、対象の感受性スコアが閾値を下回ったら当該対象はＭＤＭ２ｉ治療に対して耐性であると予測することと
を含む、方法。
【請求項４１】
請求項４０に記載の方法であって、
ｆ）ステップｅ）において耐性であると予測された対象がＭＤＭ２の過剰発現を示す場合には当該対象はＭＤＭ２ｉ治療に対して感受性であると予測すること
をさらに含む、方法。
【請求項４２】
請求項４０に記載の方法であって、
ｆ）ステップｅ）において耐性であると予測された対象がＭＤＭ２の過剰発現を示し、かつ野生型ＴＰ５３遺伝子を有する場合には当該対象はＭＤＭ２ｉ治療に対して感受性であると予測すること
をさらに含む、方法。
【請求項４３】
請求項４１または４２に記載の方法であって、ＭＤＭ２の過剰発現が対象のゲノムにおけるＭＤＭ２遺伝子の増幅によって生じたものである、方法。
【請求項４４】
請求項４０〜４３のいずれか一項に記載の方法であって、
ステップｂ）およびｄ）が、遺伝子発現レベルの標準化スコア（Ｚ−スコア）を合計して対象の感受性スコアを得ることを含む、方法。
【請求項４５】
請求項４４に記載の方法であって、
ｅ）における閾値が、−０．２〜０．５の範囲である、方法。
【請求項４６】
請求項４０〜４４のいずれか一項に記載の方法であって、
ｅ）における閾値が、試料のうちＴＰ５３変異型試料の参照スコアの第３四分位値と最大値との間の範囲であるか；または、試料のうちＴＰ５３野生型試料の参照スコアの第１四分位値と最小値との間の範囲である、方法。
【請求項４７】
請求項４０〜４４のいずれか一項に記載の方法であって、
閾値が、１個抜き交叉検証（ＬＯＯＣＶ）解析によってもよい、受信者動作特性（ＲＯＣ）プロットに基づいて決定される、方法。
【請求項４８】
請求項４７に記載の方法であって、閾値が、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線のＹｏｕｄｅｎ指数±０．３の範囲にある、方法。
【請求項４９】
請求項４０〜４４のいずれか一項に記載の方法であって、
閾値が二値化アルゴリズムを用いることによって参照スコアの分布の形状から決定される、方法。
【請求項５０】
請求項４０〜４４のいずれか一項に記載の方法であって、
閾値が混合ガウスモデルにより決定される、方法。
【請求項５１】
請求項５０に記載の方法であって、
閾値が、ステップｄ）において混合ガウスモデルにおける２つのガウス分布を用いることによって、感受性であると示す遺伝子数の耐性であると示す遺伝子数に対する比に基づいて決定される、方法。
【請求項５２】
請求項５１に記載の方法であって、
ステップｅ）における閾値が、試料のうちＴＰ５３変異型試料の比の第３四分位値と最大値との間に範囲するか；または、試料のうちＴＰ５３野生型試料の比の第１四分位値と最小値の間に範囲する、方法。
【請求項５３】
請求項４０〜５２のいずれか一項に記載の方法であって、
図１Ａ〜１Ｅに列挙された遺伝子から選択された遺伝子が、図１Ａ〜１Ｅに列挙された全遺伝子である、方法。
【請求項５４】
請求項４０〜５２のいずれか一項に記載の方法であって、
図１Ａ〜１Ｅに列挙された遺伝子から選択された遺伝子が、ＢＡＸ、Ｃ１ＱＢＰ、ＦＤＸＲ、ＧＡＭＴ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＳＬＣ２５Ａ１１、ＴＰ５３、ＴＲＩＡＰ１、ＺＭＡＴ３、ＡＥＮ、Ｃ１２ｏｒｆ５、ＧＲＳＦ１、ＥＩＦ２Ｄ、ＭＰＤＵ１、ＳＴＸ８、ＴＳＦＭ、ＤＩＳＣ１、ＳＰＣＳ１、ＰＲＰＦ８、ＲＣＢＴＢ１、ＳＰＡＧ７、ＴＩＭＭ２２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＡＣＡＤＳＢ、ＤＤＢ２、ＦＡＳ、ＧＤＦ１５、ＧＲＥＢ１、ＰＤＥ１２、ＰＯＬＨ、Ｃ１９ｏｒｆ６０、ＨＨＡＴ、ＩＳＣＵ、ＭＤＭ２、ＭＥＤ３１、ＭＥＴＲＮ、ＰＨＬＤＡ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＳＥＳＮ１およびＸＰＣである、方法。
【請求項５５】
請求項４０〜５２のいずれか一項に記載の方法であって、
図１Ａ〜１Ｅに列挙された遺伝子から選択された遺伝子が、ＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲ、ＣＤＫＮ１ＡおよびＡＥＮである、方法。
【請求項５６】
請求項４０〜５２のいずれか一項に記載の方法であって、
図１Ａ〜１Ｅに列挙された遺伝子から選択された遺伝子が、ＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲ、ＣＤＫＮ１Ａ、ＡＥＮおよびＭＤＭ２である、方法。
【請求項５７】
請求項４０〜５６のいずれか一項に記載の方法であって、
遺伝子の発現レベルの測定が、ｍＲＮＡの発現レベルの測定を含む、方法。
【請求項５８】
請求項４０〜５６のいずれか一項に記載の方法であって、
遺伝子の発現レベルの測定が、遺伝子によるコードされるタンパク質の発現レベルの測定を含む、方法。
【請求項５９】
請求項４０〜５８のいずれか一項に記載の方法であって、
ＭＤＭ２ｉが、スピロオキシインドール誘導体、インドール誘導体、ピロリジン−２−カルボキサミド誘導体、ピロリジノン誘導体、イソインドリノン誘導体、またはイミダゾチアゾール誘導体である、方法。
【請求項６０】
請求項４０〜５９のいずれか一項に記載の方法であって、
ＭＤＭ２ｉが、化合物Ａ若しくはその塩、化合物Ｂ若しくはその塩、ＣＧＭ０９７、ＲＧ７３８８、ＭＫ−８２４２（ＳＣＨ９００２４２）、ＭＩ−２１９、ＭＩ−３１９、ＭＩ−７７３、ＭＩ−８８８、Ｎｕｔｌｉｎ−３ａ、ＲＧ７１１２（ＲＯ５０４５３３７）、ＴＤＰ５２１２５２、ＴＤＰ６６５７５９、ＰＸＮ７２７、またはＰＸＮ８２２である、方法。
【請求項６１】
請求項６０に記載の方法であって、
ＭＤＭ２ｉが、化合物Ａ若しくはその塩、または化合物Ｂ若しくはその塩である、方法。
【請求項６２】
ＭＤＭ２ｉ治療に対する対象のがんまたは腫瘍の少なくとも一部の感受性を予測する方法であって、
ａ’）ＭＤＭ２ｉ治療に対する感受性が不明である対象の全てから得られた全てのがんまたは腫瘍試料において、図１Ａ〜１Ｅに列挙された遺伝子から選択されるう少なくとも３つの遺伝子を含む遺伝子の発現レベルを測定することと、
ｂ’）ステップａ’）において得られた遺伝子の発現レベルをスコア化して感受性スコアの分布に基づいて閾値を決定することと、
ｅ）感受性スコアが閾値を超える対象はＭＤＭ２ｉ治療に対して感受性であると予測し、感受性スコアが閾値を下回る対象はＭＤＭ２ｉ治療に対して耐性であると予測することと、
を含む、方法。
【請求項６３】
請求項６２に記載の方法であって、
ｆ）ステップｅ）において耐性と予測された対象がＭＤＭ２の過剰発現を示す場合には当該対象はＭＤＭ２ｉ治療に感受性であると予測すること、をさらに含む、方法。
【請求項６４】
請求項６２に記載の方法であって、
ｆ）ステップｅ）において耐性であると予測された対象がＭＤＭ２の過剰発現を示し、かつ、野生型ＴＰ５３遺伝子を有する場合には当該対象はＭＤＭ２ｉ治療に対して感受性であると予測すること、をさらに含む、方法。
【請求項６５】
請求項６３または６４に記載の方法であって、
ＭＤＭ２の過剰発現が、対象のゲノムにおけるＭＤＭ２遺伝子の増幅によって生じている、方法。
【請求項６６】
がんまたは腫瘍を有する対象を治療する方法であって、
ａ）請求項４０〜６１のいずれか一項に記載の方法によってＭＤＭ２ｉ治療に対する対象のがんまたは腫瘍の感受性を評価することと、
ｂ）評価がＭＤＭ２ｉに対して当該がんまたは腫瘍が感受性であることを示す場合には、当該対象にＭＤＭ２ｉを投与して当該がんまたは腫瘍を治療することと、
を含む方法。
【請求項６７】
対象においてがんまたは腫瘍を治療することに用いるための医薬組成物であって、ＭＤＭ２ｉを含み、対象は、請求項４０〜６１のいずれか一項に記載の方法によってＭＤＭ２ｉ治療に対する対象のがんまたは腫瘍の感受性を評価することにより、ＭＤＭ２ｉ治療に感受性であると予測された対象である、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、臨床適用のための予測的分子ツールを提供する遺伝子シグネチャーおよび遺伝子発現プロファイルに関する。本発明は、がんまたは腫瘍の治療に影響し得る抗がん剤、特に、ＭＤＭ２活性の阻害剤ならびにＭＤＭ２およびｐ５３タンパク質の相互作用のアンタゴニストに対するがんまたは腫瘍の感受性を予測する方法にも関する。本発明は、さらに、医師および患者のために、有効な個別化されたがんおよび腫瘍治療を行うことを支援する、がんバイオマーカーおよびコンパニオン診断としての遺伝子シグネチャーの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんの治療は、がんと正常細胞の両方に影響する非特異的細胞傷害性薬剤の使用から、より個別化され標的化されたがん療法へと進化している。標的療法には、がん治療および療法を受けている個体にとって毒性がより少なくかつ効力がより大きくなるように方向付けられた治療をもたらすために、がん細胞のユニークな遺伝シグネチャーの決定を含み得る。
【０００３】
現在まで、がん患者のための治療は通常、典型的には数百人の患者を対象とした無作為化臨床試験において効力が実証された薬剤およびレジメンに頼っている。かかる治療は、個々の患者のがんまたは疾患に個別化も標的化もされておらず、結果的にしばしば無効ながん治療になることがある。がん患者のためのかかる不成功なまたは標準以下の治療は、不要な毒性、疾患進行、および患者の死亡、最終的により高額な医療費という結果に至る可能性がある。
【０００４】
いくつかの腫瘍およびがんの発生および進行は、最終的に細胞成長の停止と死に影響を及ぼす細胞分子間の相互作用を伴う可能性がある。がんにおいて重要な役割を果たすことが決定された２つの分子は、ｐ５３タンパク質およびＨｕｍａｎ  Ｄｏｕｂｌｅ  Ｍｉｎｕｔｅ  ２（ＨＤＭ２）としても公知であるＭｏｕｓｅ  Ｄｏｕｂｌｅ  Ｍｉｎｕｔｅ  ２（ＭＤＭ２）タンパク質である。
【０００５】
ｐ５３腫瘍抑制タンパク質（ＴＰ５３遺伝子によってコードされる）は、様々な細胞ストレス、例えば、ＤＮＡ損傷、紫外線照射および低酸素に応答する重要な転写制御因子である。ｐ５３タンパク質は、ＤＮＡ修復、細胞周期進行、血管形成およびアポトーシスなどの生命維持に必要な細胞プロセスを制御しており；その活性化により、影響を受けた細胞中の様々な分子および下流経路が開始され得る。これらのｐ５３依存性経路は、細胞周期停止またはアポトーシスを通して損傷された細胞をシャットダウンする。ｐ５３機能および活性の喪失または阻害は、がんの多くの症例において寄与する因子であると信じられている。
【０００６】
ＭＤＭ２は、ｐ５３腫瘍サプレッサータンパク質の負の制御因子である。９０ｋＤａのＭＤＭ２タンパク質は、そのＮ末端にあるｐ５３結合ドメインおよびｐ５３をユビキチン化するＥ３リガーゼとして機能する、そのＣ末端にあるＲＩＮＧ（Really Interesting New Gene）ドメインを含有する。細胞刺激およびストレスによる野生型ｐ５３の活性化は、Ｎ末端でＭＤＭ２をｐ５３に結合させて、ｐ５３の転写活性化を阻害し、ユビキチン−プロテアソーム経路を介したｐ５３の分解を促進する。したがって、ＭＤＭ２は、ｐ５３媒介アポトーシスおよびがん細胞増殖の停止に干渉し、がん細胞中の重要な発癌活性はＭＤＭ２に起因する可能性がある。いくつかの場合では、ＭＤＭ２は、例えばＭＤＭ２の代替のスプライス型を有する細胞中において、ｐ５３経路に依存しない発癌を引き起こす可能性がある。（Ｈ．Ａ．Ｓｔｅｉｎｍａｎら，２００４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９（６）：４８７７〜４８８６）。さらに、ヒトがんの約５０％は、ＴＰ５３遺伝子に変異またはこの欠失を有することが観察されている。ＭＤＭ２は、例えば、メラノーマ、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、乳がん、食道がん、白血病、非ホジキンリンパ腫および肉腫を含めたいくつかのヒトがんにおいて過剰発現されている。ＭＤＭ２の過剰発現は、肉腫、神経膠腫および急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を有する個体における予後不良と正に相関することが報告されている。
【０００７】
がんのための治療を受けているどの個体が所与の治療、薬物、化合物、または療法に応答するまたは応答しないかを同定および決定する能力は、現在および将来のがん治療を成功させるための、より個別化および方向付けられた手法の礎石である。医師および臨床家は、所与の抗がん剤および薬剤にがんおよび腫瘍細胞の感受性または耐性を関連づけて同定する際の遺伝子発現プロファイルまたは遺伝子シグネチャーに関わる診断システムに基づいて、患者のがんまたは腫瘍細胞および組織試料の遺伝子シグネチャーが抗がん剤、薬剤、または化学療法剤に対する感受性または耐性を示すものであるかどうかを決定することによって、がん治療をよりうまく調整することができることになる。
【０００８】
より安全、より効率的で、方向付けられた経済的ながん治療を提供するために、どのがん、およびかかるがんに罹患した個体が所与の治療または薬物に対して感受性または耐性であるかを予測および評価するための対費用効果の高いツールおよび手順が、大いに必要とされる。かかるツール、例えば、薬物感受性に関連する遺伝子シグネチャーによるコンパニオン診断は、患者疾患の様々な段階およびその治療において、例えば薬物治療が開始されるべきであるかどうかを決定する、薬物治療の効力を予測する、またはがんに罹患した個体の治療後状態を評価する等の必要とされるまたは望まれる場合に、一般に患者治療決定のためのより良いガイダンスを提供することにより、臨床家およびがん患者にとって有益である。
【発明の概要】
【０００９】
本明細書では、化学療法もしくは抗がん剤、薬物、化合物、またはその併用に対するがんまたは腫瘍の感受性を示す遺伝子シグネチャーおよび遺伝子発現プロファイルを含む方法、システム、プラットフォーム、試薬およびキットが提供される。より具体的には、本発明の遺伝子シグネチャーおよび遺伝子発現プロファイルは、ＭＤＭ２タンパク質の活性を阻害する薬剤で治療されるがんおよび腫瘍を有する患者の治療応答または生存などの臨床成績を予測するために使用され得る。本明細書では、「ＭＤＭ２阻害剤」という用語は、「ＭＤＭ２ｉ」と称され、これと同義である。
【００１０】
本発明の遺伝子シグネチャーおよび遺伝子シグネチャー内の遺伝子の発現を検出する方法は、ＭＤＭ２ｉ薬剤または薬物併用に応答し得る、または応答する可能性がある、がん、腫瘍、または新生物に罹患した個体の同定および決定を可能にする。
【００１１】
本発明の遺伝子シグネチャーおよび遺伝子シグネチャーにおける差次的に発現される遺伝子を検出する方法は、ＭＤＭ２ｉでの治療に対するがんおよび腫瘍の感受性を予測する利便性が高く効率的な手段をもたらす。本発明の遺伝子シグネチャーおよび方法は、ＭＤＭ２ｉを含む療法またはレジメンでがんまたは腫瘍を有する患者を効率的に治療する見込みを予測し、それによって、より方向付けられ個別化されたがん治療のための情報およびガイダンスを提供することにも有用である。本発明は、ＭＤＭ２ｉ、または候補のＭＤＭ２ｉを含む治療に対するがんのまたは腫瘍の感受性に関し対費用効果が高くかつ正確な結果をもたらすことで、ＭＤＭ２阻害剤によるカスタマイズされ、個別化されたがん療法レジメンを改善し得る方法およびシステムをさらに提供する。ＭＤＭ２ｉが治療可能ながんおよび腫瘍は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、メラノーマ、肉腫および癌腫を含むが、これらに限定されない。
【００１２】
ある態様では、本発明は、がんまたは腫瘍組織、そこから由来する細胞などを含めたがんまたは腫瘍試料中のＭＤＭ２の阻害に対する細胞応答と関連する、本明細書で遺伝子発現シグネチャーまたはＭＤＭ２ｉ遺伝子感受性シグネチャーとも称される遺伝子シグネチャーを提供する。理論によって束縛されることを望まないが、ＭＤＭ２の活性を阻害することは、多くの場合、細胞内でｐ５３タンパク質とＭＤＭ２タンパク質の相互作用を拮抗阻害することと同義であると考えられ得ることが理解されよう。
【００１３】
より詳細には、本発明のＭＤＭ２ｉ遺伝子感受性シグネチャーは、がんもしくは腫瘍試料、またはそこから由来する細胞中のその差次的発現が、対照と比較して、ＭＤＭ２ｉ薬剤または化合物に対するがんまたは腫瘍試料の感受性を予測するまたは示す遺伝子のプロファイル、または遺伝子のサブセットを提供する。ＭＤＭ２ｉに対して感受性であるがんまたは腫瘍試料は、一部の実施形態では、本明細書に記載のＭＤＭ２ｉ遺伝子感受性シグネチャー内の少なくとも３つまたは少なくとも４つの遺伝子の増加した発現を有することになり、例えば、細胞死、老化、アポトーシス、細胞運動性および／または成長の減少または休止などによって示される阻害剤に対する細胞傷害性応答を最適に提示することになる。
【００１４】
本発明の一つの態様によれば、図１Ａ〜１Ｅの遺伝子シグネチャーに含有される遺伝子の少なくとも３つの遺伝子、少なくとも４つの遺伝子または全てのがんもしくは腫瘍試料または細胞中の差次的発現は、ＭＤＭ２ｉに対する試料または細胞の感受性を予測する。別の態様では、遺伝子ＢＡＸ、Ｃ１ＱＢＰ、ＦＤＸＲ、ＧＡＭＴ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＳＬＣ２５Ａ１１、ＴＰ５３、ＴＲＩＡＰ１、ＺＭＡＴ３、ＡＥＮ、Ｃ１２ｏｒｆ５、ＧＲＳＦ１、ＥＩＦ２Ｄ、ＭＰＤＵ１、ＳＴＸ８、ＴＳＦＭ、ＤＩＳＣ１、ＳＰＣＳ１、ＰＲＰＦ８、ＲＣＢＴＢ１、ＳＰＡＧ７、ＴＩＭＭ２２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＡＣＡＤＳＢ、ＤＤＢ２、ＦＡＳ、ＧＤＦ１５、ＧＲＥＢ１、ＰＤＥ１２、ＰＯＬＨ、Ｃ１９ｏｒｆ６０、ＨＨＡＴ、ＩＳＣＵ、ＭＤＭ２、ＭＥＤ３１、ＭＥＴＲＮ、ＰＨＬＤＡ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＳＥＳＮ１およびＸＰＣの少なくとも３つ、少なくとも４つ、または全てのがんもしくは腫瘍試料または細胞中の差次的発現は、ＭＤＭ２ｉに対する試料または細胞の感受性を予測する。これらの４０の遺伝子は、本発明のＭＤＭ２ｉ感受性遺伝子シグネチャーに含有されており、図１Ａ〜１Ｅに列挙された遺伝子のサブセットを構成する。別の態様では、遺伝子ＭＤＭ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＺＭＡＴ３、ＤＤＢ２、ＦＤＸＲ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＢＡＸ、ＲＲＭ２Ｂ、ＳＥＳＮ１、ＣＣＮＧ１、ＸＰＣ、ＴＮＦＲＳＦ１０ＢおよびＡＥＮの少なくとも３つ、または全てのがんもしくは腫瘍試料または細胞中の差次的発現。別の態様では、遺伝子ＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲ、ＣＤＫＮ１ＡおよびＡＥＮの少なくとも３つ、または全てのがんもしくは腫瘍試料または細胞中の差次的発現は、ＭＤＭ２ｉに対する試料または細胞の感受性を予測する。特定の実施形態では、図１Ａ〜１Ｅの遺伝子シグネチャーに含有される少なくとも３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれ以上の遺伝子のがんもしくは腫瘍試料または細胞中の差次的発現は、ＭＤＭ２ｉに対する試料または細胞の感受性を予測する。特定の実施形態では、差次的発現は、がんもしくは腫瘍試料または細胞中で検出されるまたは同定されるｍＲＮＡまたはタンパク質の増加した発現レベルである。
【００１５】
ある態様では、本発明は、ＭＤＭ２阻害剤治療に対する対象のがんまたは腫瘍の感受性を予測する方法であって、対象から得られたがんまたは腫瘍試料中の図１Ａ〜１Ｅに列挙された遺伝子から選択される少なくとも３つまたは少なくとも４つの遺伝子の発現のレベルを測定することを含む方法を提供する。
【００１６】
ある態様では、本発明は、がんまたは腫瘍を有する対象を治療する方法であって、ａ）ＭＤＭ２阻害剤治療に対する対象のがんまたは腫瘍の感受性を評価することであって、対象から得られたがんまたは腫瘍試料中の図１Ａ〜１Ｅに列挙された遺伝子から選択される少なくとも３つまたは少なくとも４つの遺伝子の発現のレベルを測定することを含むこと；およびｂ）評価が、がんまたは腫瘍がＭＤＭ２阻害剤に対して感受性であることを示す場合、有効量のＭＤＭ２阻害剤を対象に投与して、がんまたは腫瘍を治療することを含む方法を提供する。
【００１７】
一般に、ＭＤＭ２ｉでの治療は、がんまたは腫瘍細胞中、特に野生型または非変異ｐ５３を含めた機能的ｐ５３を有するもの中の、ｐ５３腫瘍サプレッサー機能または活性をもたらし、アポトーシス、成長阻害、老化、または腫瘍細胞死などの効果的な抗腫瘍効果につながる。かかる抗腫瘍効果はｐ５３下流経路の活性化に典型的に関わり、カスパーゼ活性化またはサイクリン依存性キナーゼの阻害を含むが、これらに限定されない。
【００１８】
したがって、ある態様では、本発明の方法は、対照と比較した、がんまたは腫瘍のＭＤＭ２ｉ感受性を示す、本発明の遺伝子シグネチャーに含有される遺伝子の差次的発現を患者のがんまたは腫瘍試料中で検出または測定することを含み、ＭＤＭ２ｉ感受性分析または評価を受けているがんまたは腫瘍試料中のＴＰ５３遺伝子および／またはｐ５３タンパク質の機能的状態の評価をさらに含み得る。本明細書では、「ｐ５３」は、サプレッサータンパク質を表し、「ＴＰ５３」は、ｐ５３サプレッサータンパク質をコードする遺伝子を表す。機能的ｐ５３タンパク質は、下流分子の発現を転写活性化を通じて上昇させる能力を保持し、これは、腫瘍成長抑制および／またはアポトーシスにつながる。ある態様では、活性または機能的ｐ５３タンパク質は、野生型ＴＰ５３遺伝子状態；またはｐ５３タンパク質活性もしくは機能に有害に影響しない変異ＴＰ５３遺伝子状態；または、例えば、ヒトパピローマウイルスＥ６腫瘍性タンパク質（ＨＰＶ  Ｅ６）などのｐ５３阻害剤または阻害物質の非存在から生じ得る。別の態様では、ＴＰ５３が野生型で活性であるとき、ｐ５３タンパク質は活性で機能的である。別の態様では、ＭＤＭ２ｉ感受性遺伝子シグネチャー遺伝子の発現、ならびにＴＰ５３遺伝子状態および／またはｐ５３タンパク質状態は、ＭＤＭ２ｉ感受性に関する評価を受けているがんまたは腫瘍試料中で決定される。
【００１９】
ある態様では、本発明は、ＭＤＭ２阻害剤治療に対する対象のがんまたは腫瘍の感受性を予測する方法であって、ａ）対象から得られたがんまたは腫瘍試料中の図１Ａ〜１Ｅに列挙された遺伝子から選択される少なくとも３つまたは少なくとも４つの遺伝子の発現のレベルを測定することおよびｂ）がんまたは腫瘍試料が野生型ＴＰ５３遺伝子を有するかどうかを決定することを含む方法も提供する。
【００２０】
ある態様では、本発明は、ＭＤＭ２ｉ治療に対する対象のがんまたは腫瘍の感受性を予測する方法であって、ａ）対象から得られたがんまたは腫瘍試料中の図１Ａ〜１Ｅに列挙された遺伝子から選択される少なくとも３つの遺伝子を含む遺伝子群の発現のレベルを測定すること、ｂ）ステップａ）において得られた発現レベルをスコア化して対象の感受性スコアを得ること、ｃ）複数のがんまたは腫瘍試料における前記少なくとも３つの遺伝子の発現レベルを測定すること｛ここで、当該試料の少なくとも一部のＭＤＭ２ｉ治療に対する感受性は不明である｝、ｄ）ステップｃ）において得られた発現レベルをスコア化して各試料の参照スコアを得ることと、参照スコアの分布に基づいて閾値を決定すること、および、ｅ）対象の感受性スコアが閾値を超える場合には対象はＭＤＭ２ｉ治療に対して感受性であり、対象の感受性スコアが閾値を下回る場合には対象はＭＤＭ２ｉ治療に対して耐性であると予測すること、を含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、ステップｅ）は、耐性と予測された対象がＭＤＭ２の過剰発現を示す場合、好ましくは、野生型ＴＰ５３遺伝子をさらに有している場合には、対象はＭＤＭ２ｉ治療に対して感受性であると予測すること、である。ある実施形態では、ＭＤＭ２の過剰発現は、対象のゲノムにおけるＭＤＭ２遺伝子の増幅により生じ得る。ある実施形態では、ステップｂ）およびｄ）は、遺伝子発現レベルの正規化スコアを合計して対象の感受性スコアを得ることを含む。ある実施形態では、閾値は、受信者動作特性（ＲＯＣ）プロットに基づいて決定され、これは、一個抜き交差検証（ＬＯＯＣＶ）解析によってもよい。ある実施形態では、閾値は、参照スコアの分布の形状から決定され、例えば、大津法などの二値化アルゴリズムによる。ある態様では、閾値は、混合ガウスモデルにより決定される。ある実施形態では、本発明は、ＭＤＭ２ｉ治療に対する対象のがんまたは腫瘍の感受性を予測する方法であって、複数の予測を実行することと、ここで、各予測は、上記ステップａ）〜ｄ）またはステップａ）〜ｅ）を含み、対象が感受性であると予測される予測の回数が全予測回数の５０％を超える、６０％を超える、７０％を超える、８０％を超える、または９０％を超える場合に対象がＭＤＭ２ｉ治療に対して感受性であると評価することを含む。
【００２１】
ある態様では、本発明は、ＭＤＭ２ｉ治療に対する対象のがんまたは腫瘍の少なくとも一部の感受性を予測する方法であって、ａ’）ＭＤＭ２ｉ治療に対する感受性が不明である対象の全てから得られた全てのがんまたは腫瘍試料中の図１Ａ〜１Ｅに列挙された遺伝子から選択される少なくとも３つの遺伝子を含む遺伝子群の発現レベルを測定することと、ｂ’）ステップａ）で得られた遺伝子発現レベルをスコア化して全ての対象の感受性スコアを得て、感受性スコアの分布に基づいて閾値を決定することと、ｅ）感受性スコアが閾値を超える対象は、ＭＤＭ２ｉ治療に対して感受性であると評価し、かつ、感受性スコアが閾値を下回る対象は、ＭＤＭ２ｉ治療に対して耐性であると予測することを含む、方法が提供される。ある特定の実施形態では、ステップｅ）は、耐性であると予測された対象がＭＤＭ２の過剰発現を示す場合には、好ましくは、野生型ＴＰ５３遺伝子をさらに有する場合には、対象はＭＤＭ２ｉ治療に対して感受性であると評価すること、である。ある実施形態では、ＭＤＭ２の過剰発現は、対象のゲノムにおけるＭＤＭ２遺伝子の増幅によって生じうる。ある実施形態では、ステップｂ’）は、遺伝子発現レベルの正規化スコアを合計して対象の感受性スコアを得ることを含む。ある実施形態では、閾値は、受信者動作特性（ＲＯＣ）プロットに基づいて決定され、これは、一個抜き交差検証（ＬＯＯＣＶ）解析によってもよい。ある実施形態では、閾値は、参照スコアの分布の形状から決定され、例えば、大津法などの二値化アルゴリズムによる。ある実施形態では、閾値は、混合ガウスモデルにより決定される。ある態様では、本発明は、ＭＤＭ２ｉ治療に対する対象のがんまたは腫瘍の感受性を予測する方法であって、複数の予測を実行することと、ここで、各予測は、上記ステップａ’）およびｂ’）またはステップａ’）、ｂ’）およびｅ）を含み、対象が感受性であると予測される予測の回数が全予測回数の５０％を超える、６０％を超える、７０％を超える、８０％を超える、または９０％を超える場合に対象がＭＤＭ２ｉ治療に対して感受性であると予測することを含む。
【００２２】
ある態様では、本発明は、がんまたは腫瘍を有する対象を治療する方法であって、ａ）本発明の感受性を予測する方法によってＭＤＭ２ｉ治療に対する対象のがんまたは腫瘍の感受性を評価することと、ｂ）もし評価が、がんまたは腫瘍がＭＤＭ２ｉに感受性であることを示す場合には、有効量のＭＤＭ２ｉを対象に投与してがんまたは腫瘍を治療することとを含む、方法が提供される。
【００２３】
ある態様では、本発明は、対象においてがんまたは腫瘍を治療することに用いるための医薬組成物であって、対象は、感受性を予測する本発明の方法によりＭＤＭ２ｉ治療に対する対象のがんまたは腫瘍の感受性が評価されることによりＭＤＭ２ｉ治療に対して感受性であると決定された対象である、医薬組成物を提供する。
【００２４】
ある態様では、本発明は、がんまたは腫瘍を有する対象を治療する方法であって、ａ）ＭＤＭ２阻害剤治療に対する対象のがんまたは腫瘍の感受性を評価するステップ（ここで評価するステップは、対象から得られたがんまたは腫瘍試料中の図１Ａ〜１Ｅに列挙された遺伝子から選択される少なくとも３つまたは少なくとも４つの遺伝子の発現のレベルを測定するステップを含む）；ｂ）がんまたは腫瘍が野生型ＴＰ５３遺伝子を有するかどうかを決定するステップ；およびｃ） ステップａ）の評価が、がんまたは腫瘍がＭＤＭ２阻害剤に対して感受性であることを示し、かつがんまたは腫瘍検体が野生型ＴＰ５３遺伝子を有する場合、対象に有効量のＭＤＭ２阻害剤を投与して、がんまたは腫瘍を治療するステップを含む方法を提供する。
【００２５】
本発明の上記の方法のそれぞれでは、図１Ａ〜１Ｅに列挙された遺伝子から選択される遺伝子は、図１Ａ〜１Ｅに列挙された遺伝子のいくつか、例えば、少なくとも３つもしくは少なくとも４つ、または全てを含み得る。あるいは、図１Ａ〜１Ｅに列挙された遺伝子から選択される遺伝子は、遺伝子：ＢＡＸ、Ｃ１ＱＢＰ、ＦＤＸＲ、ＧＡＭＴ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＳＬＣ２５Ａ１１、ＴＰ５３、ＴＲＩＡＰ１、ＺＭＡＴ３、ＡＥＮ、Ｃ１２ｏｒｆ５、ＧＲＳＦ１、ＥＩＦ２Ｄ、ＭＰＤＵ１、ＳＴＸ８、ＴＳＦＭ、ＤＩＳＣ１、ＳＰＣＳ１、ＰＲＰＦ８、ＲＣＢＴＢ１、ＳＰＡＧ７、ＴＩＭＭ２２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＡＣＡＤＳＢ、ＤＤＢ２、ＦＡＳ、ＧＤＦ１５、ＧＲＥＢ１、ＰＤＥ１２、ＰＯＬＨ、Ｃ１９ｏｒｆ６０、ＨＨＡＴ、ＩＳＣＵ、ＭＤＭ２、ＭＥＤ３１、ＭＥＴＲＮ、ＰＨＬＤＡ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＳＥＳＮ１およびＸＰＣの少なくとも３つ、少なくとも４つ、または全てを含む。あるいは、図１Ａ〜１Ｅに列挙された遺伝子から選択される遺伝子は、遺伝子ＭＤＭ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＺＭＡＴ３、ＤＤＢ２、ＦＤＸＲ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＢＡＸ、ＲＲＭ２Ｂ、ＳＥＳＮ１、ＣＣＮＧ１、ＸＰＣ、ＴＮＦＲＳＦ１０ＢおよびＡＥＮの少なくとも３つ、または全てを含む。あるいは、図１Ａ〜１Ｅに列挙された遺伝子から選択される遺伝子は、遺伝子ＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲ、ＣＤＫＮ１ＡおよびＡＥＮ（および場合によりＭＤＭ２）の少なくとも３つ、または全てを含む。方法の実施形態では、記載された遺伝子シグネチャーに含有される少なくとも３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０以上の遺伝子の発現レベルは、ＭＤＭ２ｉに対するがんもしくは腫瘍試料または細胞の感受性を予測する。
【００２６】
上記の方法の実施形態では、遺伝子の発現のレベルを測定することは、ｍＲＮＡの発現のレベルを測定することを含む。方法の実施形態では、遺伝子の発現のレベルを測定することは、遺伝子によってコードされるタンパク質の発現のレベルを測定することを含む。方法の実施形態では、遺伝子の発現レベルは、対照と比較した、遺伝子の増加した発現レベルとして測定される。
【００２７】
本発明の態様では、ＭＤＭ２ｉは、本明細書でさらに定義される小分子化学化合物である。ある実施形態では、ＭＤＭ２ｉ化合物は、ＭＤＭ２を標的とし、ＭＤＭ２とｐ５３タンパク質の相互作用を阻害することによって機能する。「他の実施形態では、ＭＤＭ２ｉは、抗体、例えば、モノクローナル抗体、ポリペプチド、ペプチド、もしくはリガンド、またはＭＤＭ２機能の核酸エフェクターなどの生物製剤とすることができる。使用に適したＭＤＭ２阻害剤は、好ましくは、ＭＤＭ２とｐ５３タンパク質間の相互作用を直接的または間接的に阻害、遮断、破壊、または妨害する。
【００２８】
本発明のより特定の態様では、ＭＤＭ２ｉは、化合物Ａ：［（５Ｒ，６Ｓ）−５−（４−クロロ−３−フルオロフェニル）−６−（６−クロロピリジン−３−イル）−６−メチル−３−（プロパン−２−イル）−５，６−ジヒドロイミダゾ［２，１−ｂ］［１，３］チアゾール−２−イル］［（２Ｓ，４Ｒ）−２−｛［（６Ｒ）−６−エチル−４，７−ジアザスピロ［２．５］オクタ−７−イル］カルボニル｝−４−フルオロピロリジン−１−イル］メタノン）およびその塩（ＷＯ２０１０／０８２６１２の実施例６および米国特許第８，４０４，６９１号の実施例６を参照されたい）；または化合物Ｂ：（３’Ｒ，４’Ｓ，５’Ｒ）−Ｎ−［（３Ｒ，６Ｓ）−６−カルバモイルテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３−イル］−６”−クロロ−４’−（２−クロロ−３−フルオロピリジン−４−イル）−４，４−ジメチル−２”−オキソ−１”，２”−ジヒドロジスピロ［シクロヘキサン−１，２’−ピロリジン−３’，３”−インドール］−５’−カルボキサミド）およびその塩（ＷＯ２０１２／１２１３６１の実施例７０および米国特許出願公開第２０１２／０２６４７３８Ａ号の実施例７０を参照されたい）である。ＭＤＭ２ｉは、スピロオキシインドール誘導体、インドール誘導体、ピロリジン−２−カルボキサミド誘導体、ピロリジノン誘導体、イソインドリノン誘導体、またはイミダゾチアゾール誘導体とすることもできる。他には、上記の方法では、ＭＤＭ２ｉは、本明細書でさらに記載されるように、ＣＧＭ０９７、ＲＧ７３８８、ＭＫ−８２４２（ＳＣＨ９００２４２）、ＭＩ−２１９、ＭＩ−３１９、ＭＩ−７７３、ＭＩ−８８８、Ｎｕｔｌｉｎ−３ａ、ＲＧ７１１２（ＲＯ５０４５３３７）、ＴＤＰ５２１２５２、ＴＤＰ６６５７５９、ＰＸＮ７２７、またはＰＸＮ８２２である。これらのＭＤＭ２阻害剤の２つ以上の組合せも、方法における使用に関して包含される。
【００２９】
ある態様では、本発明は、図１Ａ〜１Ｅに列挙された３つ以上、または４つ以上の遺伝子を検出するための複数の核酸プローブを含む組成物も提供する。ある実施形態では、図１Ａ〜１Ｅに列挙された３つ以上、または４つ以上の遺伝子は、図１Ａ〜１Ｅに列挙された遺伝子の全てである。ある実施形態では、図１Ａ〜１Ｅに列挙された３つ以上、または４つ以上の遺伝子は、ＢＡＸ、Ｃ１ＱＢＰ、ＦＤＸＲ、ＧＡＭＴ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＳＬＣ２５Ａ１１、ＴＰ５３、ＴＲＩＡＰ１、ＺＭＡＴ３、ＡＥＮ、Ｃ１２ｏｒｆ５、ＧＲＳＦ１、ＥＩＦ２Ｄ、ＭＰＤＵ１、ＳＴＸ８、ＴＳＦＭ、ＤＩＳＣ１、ＳＰＣＳ１、ＰＲＰＦ８、ＲＣＢＴＢ１、ＳＰＡＧ７、ＴＩＭＭ２２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＡＣＡＤＳＢ、ＤＤＢ２、ＦＡＳ、ＧＤＦ１５、ＧＲＥＢ１、ＰＤＥ１２、ＰＯＬＨ、Ｃ１９ｏｒｆ６０、ＨＨＡＴ、ＩＳＣＵ、ＭＤＭ２、ＭＥＤ３１、ＭＥＴＲＮ、ＰＨＬＤＡ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＳＥＳＮ１およびＸＰＣである。ある実施形態では、図１Ａ〜１Ｅに列挙された遺伝子から選択される３以上または４以上の遺伝子は、遺伝子ＭＤＭ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＺＭＡＴ３、ＤＤＢ２、ＦＤＸＲ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＢＡＸ、ＲＲＭ２Ｂ、ＳＥＳＮ１、ＣＣＮＧ１、ＸＰＣ、ＴＮＦＲＳＦ１０ＢおよびＡＥＮである。ある実施形態では、図１Ａ〜１Ｅに列挙された３つ以上、または４つ以上の遺伝子は、遺伝子ＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲ、ＣＤＫＮ１ＡおよびＡＥＮ（および場合によりＭＤＭ２）である。ある実施形態では、複数の核酸プローブは、アレイまたはマイクロアレイを含む。
【００３０】
ある態様では、本発明は、対照と比較した、がんもしくは腫瘍試料またはそこから由来する細胞中のその差次的発現または発現のパターンがＭＤＭ２ｉでの治療に対するがんまたは腫瘍の感受性と相関する遺伝的バイオマーカーのセットを提供する。その態様のいくつかでは、本発明は、遺伝子バイオマーカーのセット、すなわち、その発現が本明細書に記載のＭＤＭ２阻害剤などのＭＤＭ２ｉへの曝露またはこれでの治療に対する個体のがんおよび腫瘍細胞の感受性を示す遺伝子シグネチャーを構成する遺伝子または遺伝子のセット、および試験を受けている対象におけるがんおよび腫瘍試料中の遺伝子バイオマーカー発現を検出するためのアッセイプラットフォームを提供する。別の態様では、本発明の遺伝子シグネチャーは、ＭＤＭ２ｉでのがん治療を受けている患者の臨床成績を評価または予測する方法において使用され得る。臨床成績の評価または予測のためのかかる方法は、本明細書に記載の本発明の遺伝子シグネチャーの遺伝子または遺伝子産物の発現のレベルの検出のためのマイクロアレイ、ＰＣＲ、核酸プライマーおよび／またはプローブのセット、免疫組織化学的検査、ＥＬＩＳＡなどを含む。
【００３１】
その態様のいくつかでは、本発明は、がんまたは腫瘍試料中のその差次的発現がＭＤＭ２ｉ感受性および個体のがんまたは腫瘍におけるｐ５３腫瘍サプレッサーシグナル伝達経路、例えば、機能的ｐ５３タンパク質の状態と相関する遺伝的バイオマーカーのセットを提供する。本発明の方法によって検出される遺伝的バイオマーカーの発現パターンまたはレベルは、ＭＤＭ２ｉでの治療またはこれへの曝露に対して感受性であるかまたは応答する可能性があるがんまたは腫瘍を分類または予測するために使用することができる。
【００３２】
ある態様では、本発明は、例えば、対象の腫瘍およびがん細胞中のｐ５３機能の回復を最終的にもたらし得るようなＭＤＭ２阻害剤によるがん治療および療法とともに使用される診断または予後プラットフォームとしての遺伝子シグネチャーその使用を提供する。かかるプラットフォームは、ＭＤＭ２ｉ薬剤または特定のＭＤＭ２ｉを用いた臨床的使用に予定されているコンパニオン診断（例えば、検出可能なプローブまたはリガンドのマイクロアレイまたは複数遺伝子同時測定システムなどの利便性の高い、測定が可能なフォーマットにおける診断アッセイまたは試験）を含み得る。ＭＤＭ２ｉに対して感受性である個体のがんまたは腫瘍試料中の遺伝子発現プロファイルを示す１つまたは複数のユニークな遺伝子シグネチャーに関わるコンパニオン診断は、個体が所与のＭＤＭ２ｉに応答するかどうかの決定をもたらし、ＭＤＭ２ｉに対するがんまたは腫瘍の感受性を予測する。したがって、ＭＤＭ２ｉを含むがんまたは腫瘍治療レジメンは、がん治療を個別化するために、その成功的または効果的な使用から利益を最も得そうである者たちに適合させることができる。この態様に従って、本発明はさらに、本発明の遺伝子シグネチャー内の遺伝子の発現に関して対象からのがんまたは腫瘍試料をアッセイまたは試験し、その後、ＭＤＭ２ｉ遺伝子感受性シグネチャー内の遺伝子の差次的発現が、対照と比較して、検出された場合、ＭＤＭ２ｉを対象に投与することによって、ＭＤＭ２ｉに対する対象のがんまたは腫瘍の感受性、またはＭＤＭ２ｉでの治療に対する感受性を治療する、診断する、または予後診断する方法を提供する。
【００３３】
当業者によって認識されるように、適した対照は、試料のタイプ、例えば、単離腫瘍細胞または腫瘍組織生検試料、および／または行なわれるアッセイに依存することになる。これらに限定されないが、対照は、正常もしくは非がん細胞、またはＭＤＭ２ｉに抵抗性である細胞のアッセイを含んでいてもよく、あるいは対照は、その発現がＭＤＭ２ｉによって影響されないハウスキーピング遺伝子などの１つまたは複数の構成的に発現される遺伝子による正規化、またはより大きい集団もしくはアッセイされた遺伝子の数に対する遺伝子シグネチャーの遺伝子の発現のグローバルノーマライゼーションも含み得る。当業者は認識するように、特にマイクロアレイアッセイプラットフォームに関する正規化は、ＲＮＡ試料などの試料間の、またはアドレス可能なプローブ間の生物学的差異からよりもむしろ、マイクロアレイ技術における変動から生じる効果に適応するために慣習的に行なわれている。一般に、マイクロアレイまたはＧＥＮＥＣＨＩＰ（商標）技術におけるグローバルノーマライゼーションは、平均測定値が各アレイ（および各色）に関して同じであるようにデータをスケールすることによって、アレイ全体に影響する誤差に適合するための解決策を提供する。スケーリングは、各アレイに関する平均発現レベルをコンピューター処理し、実際の平均で割った所望の平均に等しいスケール因子を計算し、アレイからの全ての測定値にそのスケール因子を掛けることによって典型的に達成される。所望の平均は、任意であってよいか、またはそれは、アレイのグループの平均からコンピューター処理されてもよい。
【００３４】
ある態様では、本発明は、試験を受けている対象のがんおよび腫瘍試料由来のまたはこれから培養されたがんおよび腫瘍細胞中のＭＤＭ２ｉ阻害剤感受性遺伝子シグネチャーにおける遺伝子の発現を評価する方法を提供する。本発明は、以下でさらに記載されるように、がんもしくは腫瘍試料のまたは細胞のＭＤＭ２ｉに対する感受性の程度またはレベルを示す遺伝子シグネチャー内の遺伝子の発現レベルに基づく感受性スコアの決定にも関する。ある実施形態では、遺伝子発現を評価する方法は、アレイまたはマイクロアレイフォーマットである。追加の態様では、本発明は、ＭＤＭ２ｉでの治療に対する患者のがんまたは腫瘍の感受性を予測するためのＭＤＭ２ｉ感受性を示す遺伝子シグネチャーの使用であって、対照と比較した、がんまたは腫瘍試料中で測定または検出される本明細書に記載の遺伝子シグネチャーにおける遺伝子のいくつかまたは全ての差次的発現レベルがＭＤＭ２ｉに対するがんまたは腫瘍の感受性を予測する使用を提供する。
【００３５】
別の態様では、本発明は、ＭＤＭ２ｉ治療に対する感受性を予測するまたはがんもしくは腫瘍を有する対象のＭＤＭ２ｉでの成功的な治療の見込みを予後診断する方法であって、対象から得られたがんまたは腫瘍試料が、対照と比較して、図１Ａ〜１Ｅに列挙された遺伝子、またはそのサブセットの少なくとも３〜５、６〜１０、１１〜２０、２１〜３０、３１〜４０、４１〜５０、５１〜６０、６１〜７０、７１〜８０、８１〜９０、９１〜１００、１０１〜１２０、１２１〜１３０、１３１〜１４０、１４１〜１５０、１５１〜１６０、１６１〜１７０、１７１〜１８０の差次的発現を提示することが決定される方法を提供する。ある実施形態では、遺伝子のサブセットは、遺伝子ＢＡＸ、Ｃ１ＱＢＰ、ＦＤＸＲ、ＧＡＭＴ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＳＬＣ２５Ａ１１、ＴＰ５３、ＴＲＩＡＰ１、ＺＭＡＴ３、ＡＥＮ、Ｃ１２ｏｒｆ５、ＧＲＳＦ１、ＥＩＦ２Ｄ、ＭＰＤＵ１、ＳＴＸ８、ＴＳＦＭ、ＤＩＳＣ１、ＳＰＣＳ１、ＰＲＰＦ８、ＲＣＢＴＢ１、ＳＰＡＧ７、ＴＩＭＭ２２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＡＣＡＤＳＢ、ＤＤＢ２、ＦＡＳ、ＧＤＦ１５、ＧＲＥＢ１、ＰＤＥ１２、ＰＯＬＨ、Ｃ１９ｏｒｆ６０、ＨＨＡＴ、ＩＳＣＵ、ＭＤＭ２、ＭＥＤ３１、ＭＥＴＲＮ、ＰＨＬＤＡ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＳＥＳＮ１およびＸＰＣの少なくとも３〜５、６〜１０、１１〜２０、２１〜３０、３１〜４０である。ある実施形態では、遺伝子のサブセットは、遺伝子ＭＤＭ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＺＭＡＴ３、ＤＤＢ２、ＦＤＸＲ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＢＡＸ、ＲＲＭ２Ｂ、ＳＥＳＮ１、ＣＣＮＧ１、ＸＰＣ、ＴＮＦＲＳＦ１０ＢおよびＡＥＮの少なくとも３つまたは全てである。ある実施形態では、遺伝子のサブセットは、遺伝子ＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲ、ＣＤＫＮ１ＡおよびＡＥＮ（および場合によりＭＤＭ２）の少なくとも３つまたは全てである。関連する態様では、本発明は、該方法の実施により、がんまたは腫瘍がＭＤＭ２ｉに対して感受性であることが予測される場合、対象にがんまたは腫瘍を治療するのに有効な量でＭＤＭ２ｉを投与することを提供する。ある実施形態では、該方法は、遺伝子発現評価を受けているがんまたは腫瘍試料から得られた結果と、同時に評価される、または対照としてのＭＤＭ２ｉ遺伝子感受性スコアが決定された正常、非がん、もしくは非腫瘍、またはＭＤＭ２ｉ耐性細胞から得られた結果の比較を含む。別の実施形態では、いろいろながんまたは腫瘍試料がＭＤＭ２ｉに対する感受性に関して評価することができ、その発現レベルがＭＤＭ２ｉに対する感受性と相関する細胞の遺伝子シグネチャー遺伝子が対照と比較した発現のそれらの程度またはレベルに関してランク付けされ得る。
【００３６】
本発明の態様では、遺伝子シグネチャー発現プロファイルは、例えば、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）などの核酸、またはコードされたタンパク質を腫瘍試料もしくは検体（例えば、生検試料および検体）から直接的に抽出または単離し、遺伝子シグネチャーにおける遺伝子、またはそこからコードされたタンパク質の差次的発現に関してアッセイすることによって、患者の腫瘍試料または検体から直接的に作成され得る。対照と比較した、遺伝子シグネチャー遺伝子、またはコードされたタンパク質の差次的発現の決定は、試料のＭＤＭ２ｉ感受性を示す。ある態様では、患者のがん試料または検体が培養することができる細胞を含む場合、細胞は、培養で濃縮または増やされてもよく、その後、遺伝子シグネチャー発現プロファイルを決定するための分析を受けてもよい。生じた遺伝子シグネチャー発現プロファイルは、患者のがんまたは腫瘍検体から直接的に作成されていても、またはそこに由来するまたはそこから培養された細胞から作成されていても、ＭＤＭ２ｉに対するがんまたは腫瘍の感受性を予測する本発明の遺伝子シグネチャーにおける遺伝子、またはそのコードされたタンパク質の転写レベル（または「発現レベル」）を含有する。一部の実施形態では、遺伝子シグネチャーにおける遺伝子の差次的発現は、対照と比較して増加した発現であり、がんまたは腫瘍がＭＤＭ２ｉに対して感受性であることを示す。
【００３７】
本発明の態様では、ＭＤＭ２ｉ感受性を示す遺伝子シグネチャーにおける遺伝子の発現は、ＭＤＭ２ｉ薬剤での治療に対するおよび／またはＭＤＭ２ｉ薬剤での特定の一連の治療に関する、例えば、白血病、リンパ腫、メラノーマ、または骨髄腫、および本明細書に記載の他のものなどのがんの特定のタイプの感受性を予測し得る。ＭＤＭ２ｉ感受性を示す遺伝子シグネチャーにおける遺伝子の発現は、個体の生存、または生存期間、治療に対する病理学的完全奏効（ｐＣＲ）、または無増悪生存期間、もしくは腫瘍サイズ、体積などのＭＤＭ２ｉでの個体の治療結果の別の尺度も予測し得る。本明細書で記載および例証されるように、ＭＤＭ２ｉ遺伝子感受性シグネチャーは、ＭＤＭ２ｉに対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ感受性のレベルをがん細胞中の特定の遺伝子の発現のレベルと関連づけることによって、多数のがん細胞株において同定されてきた。遺伝子シグネチャーにおける遺伝子の発現プロファイルは、本明細書で実施例に記載されたｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍化動物モデル実験において適用される感受性スコアをもたらした。
【００３８】
ある態様では、本発明は、対象のがんもしくは腫瘍試料、またはそこから由来する細胞をＭＤＭ２ｉ感受性を示す本発明の遺伝子シグネチャーにおける遺伝子の発現に関して試験またはアッセイすることに関わる、それを必要とする対象を診断する、予後診断するおよび／または治療する方法を提供する。好ましくは、遺伝子発現はｍＲＮＡの産生として検出されるが、タンパク質発現としても検出される。そのがんまたは腫瘍が本発明の遺伝子シグネチャーの遺伝子のいくつかまたは全てを差次的に発現する対象は、ＭＤＭ２ｉに対して感受性であり、これで治療可能であると考えられる。様々な実施形態では、遺伝子シグネチャーにおける遺伝子の少なくとも３つ、少なくとも４つ、または全ての発現が、試験またはアッセイにおいて検出され、ＭＤＭ２ｉ感受性を予測する。ある態様では、対象のがんまたは腫瘍試料を本発明のＭＤＭ２ｉ遺伝子感受性シグネチャー内の遺伝子の発現に関してアッセイすることを含む診断、予後診断、および／または治療の方法は、がんまたは腫瘍試料が野生型ＴＰ５３遺伝子を有するかどうかを決定することをさらに含む。
【００３９】
その態様の別のものでは、本発明は、ＭＤＭ２ｉに対する感受性を示す図１Ａ〜１Ｅに列挙された少なくとも３つまたは少なくとも４つの遺伝子の検出のための試薬、および使用説明書を含有するキットを提供する。
【００４０】
別の態様では、本発明は、ＭＤＭ２ｉに対するがんまたは腫瘍試料の感受性を予測するためのキットであって、図１Ａ〜１Ｅに列挙された遺伝子に相当するヌクレオチド配列に特異的に結合する核酸プローブ、および核酸を標識する手段を含むキットを提供する。
【００４１】
別の態様では、本発明は、ＭＤＭ２ｉに対するがんまたは腫瘍試料の感受性を予測するためのキットであって、図１Ａ〜１Ｅに列挙された少なくとも３つまたは少なくとも４つの遺伝子によってコードされるポリペプチドまたはペプチドに特異的に結合する抗体またはリガンド、および遺伝子によってコードされるポリペプチドまたはペプチドに特異的に結合する抗体またはリガンドを標識する手段を含むキットを提供する。
【００４２】
本発明による上記のキットのそれぞれでは、図１Ａ〜１Ｅに列挙された少なくとも３つまたは少なくとも４つの遺伝子は、図１Ａ〜１Ｅに列挙された遺伝子の全てとすることができる。あるいは、キットのそれぞれでは、図１Ａ〜１Ｅに列挙された遺伝子の少なくとも３つ、少なくとも４つ、または全ては、ＢＡＸ、Ｃ１ＱＢＰ、ＦＤＸＲ、ＧＡＭＴ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＳＬＣ２５Ａ１１、ＴＰ５３、ＴＲＩＡＰ１、ＺＭＡＴ３、ＡＥＮ、Ｃ１２ｏｒｆ５、ＧＲＳＦ１、ＥＩＦ２Ｄ、ＭＰＤＵ１、ＳＴＸ８、ＴＳＦＭ、ＤＩＳＣ１、ＳＰＣＳ１、ＰＲＰＦ８、ＲＣＢＴＢ１、ＳＰＡＧ７、ＴＩＭＭ２２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＡＣＡＤＳＢ、ＤＤＢ２、ＦＡＳ、ＧＤＦ１５、ＧＲＥＢ１、ＰＤＥ１２、ＰＯＬＨ、Ｃ１９ｏｒｆ６０、ＨＨＡＴ、ＩＳＣＵ、ＭＤＭ２、ＭＥＤ３１、ＭＥＴＲＮ、ＰＨＬＤＡ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＳＥＳＮ１およびＸＰＣである。あるいは、キットのそれぞれでは、図１Ａ〜１Ｅに列挙された少なくとも３つまたは少なくとも４つの遺伝子は、遺伝子ＭＤＭ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＺＭＡＴ３、ＤＤＢ２、ＦＤＸＲ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＢＡＸ、ＲＲＭ２Ｂ、ＳＥＳＮ１、ＣＣＮＧ１、ＸＰＣ、ＴＮＦＲＳＦ１０ＢおよびＡＥＮである。あるいは、キットのそれぞれでは、図１Ａ〜１Ｅに列挙された少なくとも３つまたは少なくとも４つの遺伝子は、遺伝子ＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲ、ＣＤＫＮ１ＡおよびＡＥＮ（および場合によりＭＤＭ２）である。
【００４３】
本発明による上記のキットのそれぞれでは、ＭＤＭ２ｉは、本明細書に記載の化合物Ａおよびその塩形態または化合物Ｂおよびその塩形態である。他の態様では、キットにおけるＭＤＭ２ｉは、スピロオキシインドール誘導体、インドール誘導体、ピロリジン−２−カルボキサミド誘導体、ピロリジノン誘導体、イソインドリノン誘導体、またはイミダゾチアゾール誘導体である。あるいは、上記のキットのそれぞれでは、ＭＤＭ２ｉは、本明細書に記載の化合物Ａおよびその塩、化合物Ｂおよびその塩、ＣＧＭ０９７、ＲＧ７３８８、ＭＫ−８２４２（ＳＣＨ９００２４２）、ＭＩ−２１９、ＭＩ−３１９、ＭＩ−７７３、ＭＩ−８８８、Ｎｕｔｌｉｎ−３ａ、ＲＧ７１１２（ＲＯ５０４５３３７）、ＴＤＰ５２１２５２、ＴＤＰ６６５７５９、ＰＸＮ７２７、またはＰＸＮ８２２とすることができる。ＭＤＭ２ｉ化合物の１つまたは複数の組合せが本発明のキットに包含される。
【００４４】
本発明およびその実施形態の前述のおよび他の態様、特色および利点は、添付の図面の記述および本明細書で提供される実施形態において明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｅは、本明細書に記載のＭＤＭ２ｉ、化合物Ａに対して感受性であるがんもしくは腫瘍試料または細胞中で差次的に発現される１７７遺伝子シグネチャーバイオマーカーを、表を用いたフォーマットで示す図である。図１Ａ〜Ｅに示された表は、遺伝子同定またはＧｅｎＢａｎｋ番号（「レポーター」）；遺伝子名（「遺伝子」）；各試験遺伝子に関する偽陽性率の観点からの統計的有意性の公知の尺度であり、２クラスのスチューデントｔ検定と関連するｐ値；複数試験仮説に関する偽発見率の観点からの統計的有意性の公知の尺度であるｑ値（例えば、J.D.Storeyら,2003,Statistical significance for genome-wide studies,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,100(16):9440-45を参照されたい）；および各試験試料に関するスチューデント２クラスｔ検定の適用から生じるｔ検定値（「ｔ統計量」）を示す。
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｅは、本明細書に記載のＭＤＭ２ｉ、化合物Ａに対して感受性であるがんもしくは腫瘍試料または細胞中で差次的に発現される１７７遺伝子シグネチャーバイオマーカーを、表を用いたフォーマットで示す図である。図１Ａ〜Ｅに示された表は、遺伝子同定またはＧｅｎＢａｎｋ番号（「レポーター」）；遺伝子名（「遺伝子」）；各試験遺伝子に関する偽陽性率の観点からの統計的有意性の公知の尺度であり、２クラスのスチューデントｔ検定と関連するｐ値；複数試験仮説に関する偽発見率の観点からの統計的有意性の公知の尺度であるｑ値（例えば、J.D.Storeyら,2003,Statistical significance for genome-wide studies,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,100(16):9440-45を参照されたい）；および各試験試料に関するスチューデント２クラスｔ検定の適用から生じるｔ検定値（「ｔ統計量」）を示す。
【図１Ｃ】図１Ａ〜１Ｅは、本明細書に記載のＭＤＭ２ｉ、化合物Ａに対して感受性であるがんもしくは腫瘍試料または細胞中で差次的に発現される１７７遺伝子シグネチャーバイオマーカーを、表を用いたフォーマットで示す図である。図１Ａ〜Ｅに示された表は、遺伝子同定またはＧｅｎＢａｎｋ番号（「レポーター」）；遺伝子名（「遺伝子」）；各試験遺伝子に関する偽陽性率の観点からの統計的有意性の公知の尺度であり、２クラスのスチューデントｔ検定と関連するｐ値；複数試験仮説に関する偽発見率の観点からの統計的有意性の公知の尺度であるｑ値（例えば、J.D.Storeyら,2003,Statistical significance for genome-wide studies,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,100(16):9440-45を参照されたい）；および各試験試料に関するスチューデント２クラスｔ検定の適用から生じるｔ検定値（「ｔ統計量」）を示す。
【図１Ｄ】図１Ａ〜１Ｅは、本明細書に記載のＭＤＭ２ｉ、化合物Ａに対して感受性であるがんもしくは腫瘍試料または細胞中で差次的に発現される１７７遺伝子シグネチャーバイオマーカーを、表を用いたフォーマットで示す図である。図１Ａ〜Ｅに示された表は、遺伝子同定またはＧｅｎＢａｎｋ番号（「レポーター」）；遺伝子名（「遺伝子」）；各試験遺伝子に関する偽陽性率の観点からの統計的有意性の公知の尺度であり、２クラスのスチューデントｔ検定と関連するｐ値；複数試験仮説に関する偽発見率の観点からの統計的有意性の公知の尺度であるｑ値（例えば、J.D.Storeyら,2003,Statistical significance for genome-wide studies,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,100(16):9440-45を参照されたい）；および各試験試料に関するスチューデント２クラスｔ検定の適用から生じるｔ検定値（「ｔ統計量」）を示す。
【図１Ｅ】図１Ａ〜１Ｅは、本明細書に記載のＭＤＭ２ｉ、化合物Ａに対して感受性であるがんもしくは腫瘍試料または細胞中で差次的に発現される１７７遺伝子シグネチャーバイオマーカーを、表を用いたフォーマットで示す図である。図１Ａ〜Ｅに示された表は、遺伝子同定またはＧｅｎＢａｎｋ番号（「レポーター」）；遺伝子名（「遺伝子」）；各試験遺伝子に関する偽陽性率の観点からの統計的有意性の公知の尺度であり、２クラスのスチューデントｔ検定と関連するｐ値；複数試験仮説に関する偽発見率の観点からの統計的有意性の公知の尺度であるｑ値（例えば、J.D.Storeyら,2003,Statistical significance for genome-wide studies,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,100(16):9440-45を参照されたい）；および各試験試料に関するスチューデント２クラスｔ検定の適用から生じるｔ検定値（「ｔ統計量」）を示す。
【図２】実施例２に記載されたＭＤＭ２感受性または耐性の細胞株分析から生じる応答表現型の特徴付けを描写する図である。細胞株は、ＩＣ50値によってランク付けされ、ＭＤＭ２ｉ治療に対して、感受性であるものに関して「Ｓ」、中程度であるものに関して「Ｍ」、耐性であるものに関して「Ｒ」と命名された。ＩＣ50値は、それらの間の中程度レスポンダーとともに、２つの一般的な応答表現型、ＳおよびＲを示した。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｆは、１７７遺伝子（すなわち、図１Ａ〜１Ｅに示された遺伝子）、１７５遺伝子（すなわち、ＥＤＡ２ＲおよびＳＰＡＴＡ１８を除く図１Ａ〜１Ｅに示された遺伝子）、４０遺伝子（すなわち、本明細書で表１に示された遺伝子）、４遺伝子（すなわち、ＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲ、ＣＤＫＮ１ＡおよびＡＥＮ）、および３遺伝子（すなわち、ＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲおよびＣＤＫＮ１Ａ）の分析から得られる各細胞株のＭＤＭ２ｉ遺伝子感受性シグネチャースコアまたは値を示す図である。
【図３Ｂ】図３Ａ〜３Ｆは、１７７遺伝子（すなわち、図１Ａ〜１Ｅに示された遺伝子）、１７５遺伝子（すなわち、ＥＤＡ２ＲおよびＳＰＡＴＡ１８を除く図１Ａ〜１Ｅに示された遺伝子）、４０遺伝子（すなわち、本明細書で表１に示された遺伝子）、４遺伝子（すなわち、ＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲ、ＣＤＫＮ１ＡおよびＡＥＮ）、および３遺伝子（すなわち、ＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲおよびＣＤＫＮ１Ａ）の分析から得られる各細胞株のＭＤＭ２ｉ遺伝子感受性シグネチャースコアまたは値を示す図である。
【図３Ｃ】図３Ａ〜３Ｆは、１７７遺伝子（すなわち、図１Ａ〜１Ｅに示された遺伝子）、１７５遺伝子（すなわち、ＥＤＡ２ＲおよびＳＰＡＴＡ１８を除く図１Ａ〜１Ｅに示された遺伝子）、４０遺伝子（すなわち、本明細書で表１に示された遺伝子）、４遺伝子（すなわち、ＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲ、ＣＤＫＮ１ＡおよびＡＥＮ）、および３遺伝子（すなわち、ＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲおよびＣＤＫＮ１Ａ）の分析から得られる各細胞株のＭＤＭ２ｉ遺伝子感受性シグネチャースコアまたは値を示す図である。
【図３Ｄ】図３Ａ〜３Ｆは、１７７遺伝子（すなわち、図１Ａ〜１Ｅに示された遺伝子）、１７５遺伝子（すなわち、ＥＤＡ２ＲおよびＳＰＡＴＡ１８を除く図１Ａ〜１Ｅに示された遺伝子）、４０遺伝子（すなわち、本明細書で表１に示された遺伝子）、４遺伝子（すなわち、ＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲ、ＣＤＫＮ１ＡおよびＡＥＮ）、および３遺伝子（すなわち、ＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲおよびＣＤＫＮ１Ａ）の分析から得られる各細胞株のＭＤＭ２ｉ遺伝子感受性シグネチャースコアまたは値を示す図である。
【図３Ｅ】図３Ａ〜３Ｆは、１７７遺伝子（すなわち、図１Ａ〜１Ｅに示された遺伝子）、１７５遺伝子（すなわち、ＥＤＡ２ＲおよびＳＰＡＴＡ１８を除く図１Ａ〜１Ｅに示された遺伝子）、４０遺伝子（すなわち、本明細書で表１に示された遺伝子）、４遺伝子（すなわち、ＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲ、ＣＤＫＮ１ＡおよびＡＥＮ）、および３遺伝子（すなわち、ＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲおよびＣＤＫＮ１Ａ）の分析から得られる各細胞株のＭＤＭ２ｉ遺伝子感受性シグネチャースコアまたは値を示す図である。
【図３Ｆ】図３Ａ〜３Ｆは、１７７遺伝子（すなわち、図１Ａ〜１Ｅに示された遺伝子）、１７５遺伝子（すなわち、ＥＤＡ２ＲおよびＳＰＡＴＡ１８を除く図１Ａ〜１Ｅに示された遺伝子）、４０遺伝子（すなわち、本明細書で表１に示された遺伝子）、４遺伝子（すなわち、ＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲ、ＣＤＫＮ１ＡおよびＡＥＮ）、および３遺伝子（すなわち、ＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲおよびＣＤＫＮ１Ａ）の分析から得られる各細胞株のＭＤＭ２ｉ遺伝子感受性シグネチャースコアまたは値を示す図である。
【図４】図４は、ＭＤＭ２ｉ治療に対する感受性が不明である試料を訓練セットとして用いた予測の結果を示す。予測モデルＡ〜Ｅは、実施例において詳解される。予測モデルＦにおいては、ヒストグラムにおいてスコアの分布が谷間を形成した箇所のスコアの値として閾値が決定された。予測モデルＧにおいては、ＴＰ５３野生型の試料において平均Ｚスコアの第一四分位の値として閾値が決定された。
【図５】図５は、ＭＤＭ２ｉ治療に対する感受性が不明である試料を訓練セットとして用いたメラノーマ細胞株における感受性の予測の結果を示す。「ｗｔにおけるスコア」予測モデルでは、ＴＰ５３野生型の試料において平均Ｚスコアの第一四分位の値として閾値が決定された。「スコア分布」予測モデルでは、大津法によって、ヒストグラムにおいてスコア分布が谷間を形成した箇所のスコアの値として、閾値が決定された。
【図６】図６は、ＭＤＭ２ｉ治療に対する感受性が不明である試料を訓練セットとして用いたＰｄｘモデルにおける感受性の予測結果を示す。「ｗｔにおけるスコア」および「スコア分布」予測モデルは、上記で説明される通りである。
【図７】図７は、ＭＤＭ２ｉ治療に対する感受性が不明である試料を訓練セットとして用いて、訓練セットにおける最適化された閾値の分布に対する、訓練セットにおけるｐ５３変異の割合の影響を示す。
【図８】図８は、予測の感受性および特異性が訓練セットにおけるｐ５３変異の割合によらず変動しないことを示す。
【図９】図９は、ゲノム上でＭＤＭ２遺伝子の増幅を伴う細胞株のいくつかで予測精度が影響を受けることを示す。
【図１０】図１０は、ＭＤＭ２の発現レベルが予測精度を改善することを示す。
【図１１】図１１は、様々な訓練セットのサイズにおいてＭＤＭ２ｉ治療に対する感受性が精度良く予測できることを示す。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｋは、実施例で解析された全てのＣＣＬＥデータセットの細胞株のリストを、そのｐ５３変異状況およびＭＤＭ２ｉ治療に対する感受性と共に示す。ＴＰ５３カラムにおける「Ｍ」および「Ｗ」はそれぞれ、「変異体」および「野生型」を表す。Ｓ／Ｒカラムにおける「Ｓ」および「Ｒ」はそれぞれ、「感受性」および「耐性」を示す。
【図１３】図１３Ａおよび１３Ｂは、実施例において解析されたＰＤｘモデルのリストを、そのｐ５３変異状況およびＭＤＭ２ｉ（化合物Ｂ）治療に対する感受性と共に示す。ＴＰ５３カラムにおける「Ｍ」および「Ｗ」はそれぞれ、「変異体」および「野生型」を表す。Ｓ／Ｒカラムにおける「Ｓ」および「Ｒ」はそれぞれ、「感受性」および「耐性」を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本発明は、がんおよび腫瘍におけるその発現がＭＤＭ２阻害剤および類似した活性を有する他の化合物または薬剤に対するがんおよび腫瘍の感受性を予測する遺伝子、および遺伝子のセットを含有する遺伝子シグネチャーの発見に関する。本発明の方法において使用されるように、遺伝子シグネチャーは、その発現がＭＤＭ２ｉに対するおよびＭＤＭ２ｉ治療に対するがんおよび腫瘍試料、ならびにそこから由来する細胞の感受性を示すバイオマーカー、またはバイオマーカーのセットを提供する。本明細書では、「を示す」という用語は、「に相当する」、「と相関または関連している」、または「を予測する」という用語と互換的にも使用され得る。
【００４７】
遺伝子シグネチャーは、生物学的試料のいろいろな生物学的および臨床的に関連する特徴を分子レベルで明らかにし得る一般的に重要で強力な分子ツールである。遺伝子シグネチャーは、遺伝子バイオマーカーの特定のセットを包含すると考えられ得る。より具体的には、その発現が種々のがんおよび腫瘍のタイプならびにサブタイプの治療に使用される本明細書に記載のＭＤＭ２阻害剤などの臨床的に重要な薬物に対する感受性を示し得る遺伝子を含有する遺伝子シグネチャーが提供される。遺伝子シグネチャーは、がんまたは腫瘍を有する患者をＭＤＭ２ｉ薬剤で治療することにおいて起こり得る臨床応答または結果を予測するためにさらに利用され得る。
【００４８】
本発明の方法によって提供され、これに従って使用される遺伝子シグネチャーの基本的な特徴は、腫瘍もしくはがん試料または検体中のその発現パターンがＭＤＭ２ｉ、または他の類似した作用をする化合物に対する腫瘍またはがんの感受性の決定を可能にする、遺伝子、または遺伝子のセットの同定である。本発明の遺伝子シグネチャーは、ＭＤＭ２ｉ化合物、薬物、またはその組合せに対して感受性である細胞中で発現される、例えば、差次的発現を示す遺伝子を含む。ある実施形態では、本発明は、小分子、低分子量ＭＤＭ２ｉでの治療に対するがんの感受性または応答に関連する遺伝子シグネチャーを提供する。かかる遺伝子感受性シグネチャーは、例えば、ＭＤＭ２ｉでの治療に対する個体のがんの感受性を評価する、決定する、診断する、予測または予後診断するための、ＭＤＭ２ｉ治療および療法と関連した使用のための遺伝的バイオマーカーとしても役立つ。本発明によるＭＤＭ２ｉ感受性を示す遺伝子シグネチャーは、本明細書で実施例においてさらに記載されるように、ＭＤＭ２阻害剤に曝露された多数のがんまたは腫瘍由来細胞株における遺伝子の差次的発現を分析することによって決定された。
用語および定義
【００４９】
本明細書で使用される技術的および科学的用語は、別段の指示がない場合、記載された発明が属する当業者に一般的におよび慣習的に公知の意味を有することが意図されている。かかる用語は、当技術分野で公知であり、実行される方法、プロセス、手順、試薬、デバイス、生物学的分子および化合物を包含する。本明細書での用語の定義および説明は、徹底的または限定的ではないものとし、その代わりに、記載された発明の様々な態様および実施形態のレビューを促進するために提供される。
【００５０】
「ＭＤＭ２」という用語は、ｐ５３を相互作用でき、ｐ５３の分解を引き起こすことができるＥ３ユビキチンリガーゼを言う。本明細書で用いられるＭＤＭ２としては、特に限定されないが、マウスＭＤＭ２およびヒトＭＤＭ２オーソログ（「ヒトｄｏｕｂｌｅ  ｍｉｎｕｔｅ  ２」または「ＨＤＭ２」とも呼ばれる）が挙げられる。
【００５１】
「ＭＤＭ２阻害剤」という用語は、ｐ５３分解に対するＭＤＭ２機能または活性を阻害する阻害剤を言う。本明細書では、「ＭＤＭ２ｉ」という用語は、「１以上のＭＤＭ２阻害剤」または「ＭＤＭ２ｉの組合せ」を包含し得ることが理解される。
【００５２】
「アレイ」という用語は、本明細書では、表面、マトリックスまたは基板の上またはその中に、別々の割り当てられたアドレス可能な位置に置かれた、生物学的分子、例えば核酸、ポリペプチド、ペプチド、生物学的試料の配置、典型的には秩序のある配置を表す。マイクロアレイは、典型的に顕微鏡的に評価されるまたは分析されるアレイの小型化されたバージョンである。核酸、例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡアレイは、固体表面またはマトリックス上の割り当てられたアドレス可能な位置における核酸（プローブなど）の配置である。核酸アレイは、ｃＤＮＡアレイおよびオリゴヌクレオチドアレイおよびマイクロアレイを包含し；それらは、バイオチップ、またはＤＮＡ／ｃＤＮＡチップと称される場合もある。マイクロアレイ、ならびにそれらの構築、試薬構成要素および使用は、当業者に公知である。例として、遺伝子発現状態を決定および測定するのに有用なマイクロアレイ技術は、ＵＳ２０１１／００１５８６９に示されている。
【００５３】
「バイオマーカー」という用語は、その発現レベルがいくつかの条件下で変化する、またはＭＤＭ２阻害剤に対して非感受性であるものとは対照的に、ＭＤＭ２阻害剤に対して感受性である細胞中でなど、いくつかの細胞状況において異なる、遺伝子、その遺伝子に由来する発現された配列タグ（ＥＳＴ）、遺伝子のセット、またはタンパク質もしくはペプチドのセットを一般的に表す。一般に、遺伝子または遺伝子セットの発現レベルがいくつかの条件に相応する場合、遺伝子は、その条件に関する１つまたは複数のバイオマーカーとして役立つ。バイオマーカーは、予後および疾患状況に従って、個体（例えば、がんまたは腫瘍型を有するもの）間で差次的に発現され得；したがって、バイオマーカーは、種々の生存結果、ならびに利益薬物敏感性および感受性を予測し得る。
【００５４】
「結合」という用語は、ある核酸分子から別のもの（またはそれ自体への）へのハイブリダイゼーションなどの、２つの物質または分子間の相互作用または会合；ポリペプチド、タンパク質、またはペプチドと抗体の会合；または別のタンパク質もしくは核酸分子とタンパク質の会合を一般的に表す。その結合の検出を可能にするのに十分な量のオリゴヌクレオチド分子がその標的核酸分子と塩基対を形成するかまたはハイブリダイズしている場合、オリゴヌクレオチド分子は、標的核酸分子に結合または安定に結合する。優先的に、結合は、ある分子が別の分子に高親和性で結合し、異種分子に低親和性で結合する関連を表す。結合は、標的／オリゴヌクレオチド複合体の物理的または機能的性質によってなどの当業者に公知の任意の手順によって検出され得る。例えば、結合は、生合成プロセス、例えば、遺伝子の発現、ＤＮＡ複製、転写、翻訳などに及ぼす観察可能な効果があるかどうかを決定することによって機能的に検出され得る。
【００５５】
「遺伝子」という用語は、本明細書では、ＲＮＡ転写物として試料中で発現されるＤＮＡ配列を表し；遺伝子は、全長遺伝子（タンパク質コードまたは非コード）または発現された配列タグもしくは「ＥＳＴ」などの発現されたその部分とすることができる。したがって、図１Ａ〜１Ｅおよび表１および本明細書の他のところで本発明の遺伝子シグネチャーの構成要素として列挙された遺伝子は、それぞれ独立的に、その発現産物が試料中に存在するか、または発現された配列、例えば、ＥＳＴ配列の部分である、試料中で検出可能である全長遺伝子配列である。本明細書で参照によって組み込まれている、図１Ａ〜１Ｅに列挙された遺伝子およびその配列は、図において提供されたそれらの遺伝子同定名またはＥｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ名称により、公的に入手可能なＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいて見出される。したがって、全てのＧｅｎＢａｎｋ同定番号およびそれに関連する配列は、本明細書にその全体が参照によって組み込まれている。
【００５６】
「遺伝子シグネチャー」、「遺伝子発現シグネチャー」および「遺伝子感受性シグネチャー」という用語は、それらが本発明に従ってＭＤＭ２ｉに対して感受性であるがんまたは腫瘍における細胞応答を予測する遺伝子の差次的発現などの発現、または発現パターンを表すので、本明細書で互換的に使用される。例えば、ある実施形態では、ＭＤＭ２ｉに対する感受性を示す腫瘍またはがん試料は、本発明の遺伝子シグネチャーに含有される遺伝子の発現の対照と比較して増加したまたは上昇したレベルを有する。
【００５７】
本発明では、「遺伝子発現」は、遺伝子でコードされた遺伝情報を遺伝子の転写（例えば、ＲＮＡポリメラーゼの酵素作用によって媒介される）を通してＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、またはｓｎＲＮＡ）に、タンパク質コード遺伝子に関しては、ｍＲＮＡの「翻訳」を通してタンパク質に変換するプロセスを意味する。遺伝子発現は、ＤＮＡからＲＮＡ、タンパク質につながる経路における任意のポイントで制御され得る。遺伝子発現の制御は、転写、翻訳、ＲＮＡ運搬およびプロセシング、ならびにｍＲＮＡなどの中間分子の分解の調節を含み得る。制御は、それらが作製された後の特定のタンパク質分子の活性化、不活性化、区画化、または分解にも関わり得る。核酸分子の発現は、正常または野生型核酸分子と比較して、改変され得る。
【００５８】
差次的発現などの遺伝子発現の変化は、これらに限定されないが、非がん細胞などの対照と比較した、または正規化された発現レベルに関連した、過剰発現、増加した発現、低発現、または抑制された発現を含み得る。核酸分子の発現の変化は、相当するタンパク質の発現の変化と関連しており、ある場合には、これを引き起こし得る。例証的に、ＭＤＭ２ｉを対象に投与する、および／またはＭＤＭ２ｉでの効果的な治療を個別化する、および／または対象の生存時間を予測する目的でＭＤＭ２ｉ治療に応答する対象の見込みを予測するために、遺伝子発現を測定して、対象のがんまたは腫瘍試料のＭＤＭ２ｉ感受性を示す遺伝子シグネチャーにおける遺伝子の差次的発現を決定することができる。
【００５９】
遺伝子または核酸分子に関連して使用される、上方制御されたまたは活性化された発現とも称され得る発現の増加は、ＲＮＡまたはタンパク質の全ての型などの遺伝子産物の産生の増加または上昇を引き起こす、またはもたらす任意のプロセスを表す。増加したまたは上昇した遺伝子発現は、遺伝子の転写またはタンパク質へのｍＲＮＡの翻訳を増加させる任意のプロセスを含む。増加した（または上方制御された）遺伝子発現は、遺伝子産物の産生の任意の検出可能なまたは測定可能な増加を含み得る。例証的に、遺伝子産物の産生（図１Ａ〜１Ｅの遺伝子の少なくとも３つ、少なくとも４つ、または全てなど；または遺伝子シグネチャー遺伝子ＢＡＸ、Ｃ１ＱＢＰ、ＦＤＸＲ、ＧＡＭＴ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＳＬＣ２５Ａ１１、ＴＰ５３、ＴＲＩＡＰ１、ＺＭＡＴ３、ＡＥＮ、Ｃ１２ｏｒｆ５、ＧＲＳＦ１、ＥＩＦ２Ｄ、ＭＰＤＵ１、ＳＴＸ８、ＴＳＦＭ、ＤＩＳＣ１、ＳＰＣＳ１、ＰＲＰＦ８、ＲＣＢＴＢ１、ＳＰＡＧ７、ＴＩＭＭ２２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＡＣＡＤＳＢ、ＤＤＢ２、ＦＡＳ、ＧＤＦ１５、ＧＲＥＢ１、ＰＤＥ１２、ＰＯＬＨ、Ｃ１９ｏｒｆ６０、ＨＨＡＴ、ＩＳＣＵ、ＭＤＭ２、ＭＥＤ３１、ＭＥＴＲＮ、ＰＨＬＤＡ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＳＥＳＮ１およびＸＰＣの少なくとも３つ、少なくとも４つ、または全て；遺伝子シグナチャー遺伝子ＭＤＭ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＺＭＡＴ３、ＤＤＢ２、ＦＤＸＲ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＢＡＸ、ＲＲＭ２Ｂ、ＳＥＳＮ１、ＣＣＮＧ１、ＸＰＣ、ＴＮＦＲＳＦ１０ＢおよびＡＥＮの少なくとも３つ、または全て；または遺伝子シグネチャー遺伝子ＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲ、ＣＤＫＮ１ＡおよびＡＥＮ（および場合によりＭＤＭ２）の少なくとも３つ、または全てなど）は、測定可能な相対量、例えば、これらに限定されないが、対照と比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、または少なくとも６〜１０倍増加する。対照は、正常細胞などの生物学的試料中の遺伝子発現の量、または細胞遺伝子発現の基準値もしくは正規化された値とすることができる。ある例では、対照は、腫瘍を有さない対象に由来する、問題になっている（試験を受けている）対象が有するのと同じ組織型の生検材料における遺伝子発現の相対量である。別の例では、対照は、腫瘍を有し、試験を受けている対象から採取された腫瘍のものと同じ組織型の非腫瘍化組織からの組織生検材料における遺伝子発現の相対量である。
【００６０】
あるいは、遺伝子または核酸分子に関連して使用される、下方制御された発現とも称され得る発現の減少は、ＲＮＡまたはタンパク質の全ての型などの遺伝子産物の産生の減少を引き起こす、またはもたらす任意のプロセスを表す。減少したまたは下方制御された遺伝子発現は、遺伝子転写またはタンパク質へのｍＲＮＡの翻訳の減少を引き起こす、またはもたらすプロセスを典型的に含む。遺伝子下方制御は、遺伝子産物の産生の任意の測定可能なまたは検出可能な減少、例えば、これらに限定されないが、対照、例えば、正常細胞中の遺伝子発現の量、または基準値と比較しての少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、または少なくとも６〜１０倍の減少を含む。
【００６１】
「がん」という用語は、本明細書では、治療されない場合、周囲の組織に侵入し、他の器官に広がる、すなわち、悪性になり得る異常な腫瘍または異常に成長している細胞を表す、新生物および腫瘍を包含すると理解される。新生物は、悪性または良性細胞の異常な成長および増殖である新生物形成の結果として形成する細胞からなる組織の異常な腫瘍（または腫瘤）である。新生物および腫瘍は、治療されない場合、正常細胞よりも急速に成長し、成長し続け、正常細胞と栄養素を求めて競争することになる、前がん性およびがん性細胞ならびに組織の異常な腫瘍を含み得る。新生物は、これらに限定されないが、中空または液性腫瘍さらに、血液細胞新生物形成または新生物、例えば、リンパ腫、白血病および骨髄腫などの固形および非固形腫瘍を含み得る。
【００６２】
「がん」という用語は、身体内または身体上の様々な起源、様々なタイプおよびサブタイプ、ならびに器官、組織および細胞試料ならびに検体、例えば、その生物学的試料または検体の新生物および腫瘍を包含することも意図されている。例証的に、適切ながん試料または検体は、ヒト、例えば、がんのための治療を受けている患者、または獣医学的対象から得られた臨床試料を含めた、任意の従来の生物学的試料または検体を含む。試料は、組織の疾患したまたは健康な部分である組織の一部、または組織全体を表し得る。組織試料は、当技術分野で公知であり、実行されている任意の方法または手順を用いることによって、対象から得ることができる。
【００６３】
例示的な試料または検体は、これらに限定されないが、細胞、細胞溶解物、血液塗抹標本、細胞遠心分離調製物、細胞塗抹標本、体液、例えば、末梢血、血液、血漿、血清、尿、唾液、痰、肺胞洗浄液、精液など、組織生検もしくは剖検試料または検体、例えば、新生物生検材料、細針生検材料、細胞擦過物、外科検体、末梢循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、および／または組織切片、例えば、クライオスタット組織切片および／またはパラフィン包埋組織切片を含む。いくつかの場合では、試料は、全身性または末梢循環腫瘍または新生物細胞を含む。いくつかの例では、腫瘍または新生物試料は、例えば、新鮮または凍結され、直接的に使用されるか、または例えば、例えばホルマリンを使用した固定化、および／またはホルマリン固定もしくはパラフィン包埋組織試料などのワックス中での埋め込みによって、使用前に操作されてもよい。試料は、対象から採取されたゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ（ｍＲＮＡを含めた）、タンパク質、またはその組合せなどを含有し得る。好ましい実施形態では、試料は、遺伝子シグネチャー内の遺伝子の発現レベルの分析を可能にするためのｍＲＮＡを含有する。
【００６４】
「対照」という用語は、１つまたは複数の実験または試験試料との比較に関する基礎として使用される試料、基準、または標準を典型的に表す。当該の場合では、実験試料は、ＭＤＭ２ｉで治療されたまたは治療されるべき個体から得られた腫瘍検体または試料を含み得る。いくつかの場合では、対照は、健康な、非腫瘍化個体から得られる試料であり；いくつかの場合では、対照は、ＭＤＭ２ｉで治療されたまたは治療されるべき腫瘍を有する個体から採取された非腫瘍組織試料である。他の場合では、対照は、標準基準値、または値の範囲、または歴史的対照とすることができる。例として、値の標準範囲は、以前試験された対照試料、例えば、非腫瘍組織におけるＭＤＭ２ｉ遺伝子感受性シグネチャーの遺伝子のレベルなどのベースラインまたは正常値を表す試料の群；またはその腫瘍がＭＤＭ２ｉに対して感受性である個体の以前試験された群；またはその腫瘍がＭＤＭ２ｉに非感受性である個体の以前試験された群から得られ得る。さらに、差次的遺伝子発現の決定のための試験試料との比較の標準として役立ち得る対照は、がんまたは腫瘍を有さない対象からなどの正常、すなわち、所望の特徴に関して改変されていないと信じられている試料を含む。実験室値またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験から得られた値などの値の範囲も、かかる値は、局所的に決定された実験室条件に基づいてしばしば樹立され、いくらかより可変的でありやすいけれども、対照として使用され得る。さらに、これらに限定されないが、対照は、当業者は理解するように、生物学的試料、または試験集団における遺伝子発現の相対量とすることができ、本明細書でさらに考察される、ＤＮＡアレイ内の全ての遺伝子の発現レベルへの正規化、例えば、グローバルノーマライゼーション、または構成的に発現され、細胞の全てではないとしても大部分の型において一定の発現レベルを提示する１つまたは複数の内部対照遺伝子、例えば、いわゆる「ハウスキーピング遺伝子」の発現レベルへの正規化も包含し得る。
【００６５】
ハウスキーピング遺伝子は、典型的に、基本的な細胞機能の維持に必要である構成遺伝子であり、正常および病態生理学的条件下で生物の全ての細胞中で発現される。最適に、ハウスキーピング遺伝子は、大部分の非病理学的状況において比較的一定のレベルで発現され、それらの発現は、異なる実験条件下で著しく変動しない。かかるハウスキーピング遺伝子の例は、これらに限定されないが、アクチン（βアクチン；RefSeq ID：：ＮＭ＿００１１０１．３）、グルクロニダーゼ（ＧＵＳ；RefSeq ID：：ＮＭ＿０００１８１．３）、トランスフェリン受容体（ＴＦＲＣ；RefSeq ID：：ＮＭ＿００１１２８１４８．１）、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（Ｇ３ＰＤＨ；RefSeq ID：：ＮＭ＿００２０４６）、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１；RefSeq ID：：ＮＭ＿０００１９４）、ペプチジルプロリルイソメラーゼ（ＰＰＩＡ；RefSeq ID：  ＮＭ＿０２１１３０．３）、１８ｓ  ｒＲＮＡ（RefSeq ID：：ＮＲ＿００３２８６．２）などを含む。他の例では、対照は、例えば、Ｏ．Ｔｈｅｌｌｉｎ  ら，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７５（２〜３）：２９１〜５に報告されている、アルブミン、チューブリン、シクロフィリン、Ｌ３２、および２８Ｓ  ｒＲＮＡなどの１つまたは複数のハウスキーピング遺伝子の発現レベルを含む。
【００６６】
いくつかの場合では、開示された遺伝子の発現レベル（図１Ａ〜１Ｅの遺伝子シグネチャーに；表１に列挙された遺伝子の少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも１０、または全て；または遺伝子セットＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲ、ＣＤＫＮ１ＡおよびＡＥＮ（および場合によりＭＤＭ２）における遺伝子の少なくとも３つ、または全ての発現など）は、例えば、同じもしくは異なるがんまたは新生物試料中の１つまたは複数のハウスキーピング遺伝子の発現レベルと比較して、正規化される。集約値は、いくつかの場合では、遺伝子のそれぞれ（例えば、遺伝子シグネチャーにおける遺伝子のそれぞれ）の発現のレベルを計算し、遺伝子が条件（例えば、ＭＤＭ２ｉ治療に対する感受性または生存リスクスコア）によって正にまたは負に制御されるかどうかに依存して、各遺伝子に関する正または負の加重を使用することによって得られる。ある場合では、遺伝子または遺伝子シグネチャーの正規化された発現、または集約値は、がんまたはがんのタイプのセットに関して、遺伝子または遺伝子シグネチャーの正規化された発現中央値と、または集約値と比較して、増加したまたは減少したと決定される。ある場合では、正規化された発現中央値または集約値は、白血病、リンパ腫、メラノーマ、または骨髄腫がんマイクロアレイデータセットなどの公的に入手可能なマイクロアレイデータセットから得られる。ある例では、遺伝子シグネチャーの発現遺伝子に関する正規化された発現中央値または集約値は、マイクロアレイデータセットを使用して決定される。
【００６７】
いくつかの場合では、スコア（感受性スコア）は、正規化された発現レベル測定値から計算される。スコアは、ＭＤＭ２ｉに対して感受性である、または感受性である可能性が低いがんもしくは腫瘍および／またはＭＤＭ２ｉ治療もしくは療法に対するがんまたは腫瘍を有する対象の低、中、または高感受性などの様々なパラメーターを同定するためのカットオフポイントまたは値を提供するために利用され得る。いくつかの場合では、カットオフポイントは、訓練および検証データセットを使用して、しばしば決定される。他のある場合では、カットオフポイントは、ＭＤＭ２ｉ感受性データを伴わない訓練データセットのみを用いて決定される。例として、監督された手法が、例えば、レスポンダーおよび非レスポンダーにおける遺伝子シグネチャー発現を比較することによって、ＭＤＭ２ｉ治療に応答しないものから感受性であるもの（レスポンダー）を区別するカットオフを樹立するために利用され得る。別の例では、無監督の手法が、結果、すなわち、ＭＤＭ２ｉ治療に対する感受性を予測するカットオフレベル（例えば、上位５０％対下位５０％、または上位三分位値対下位三分位値）を経験的に決定するために利用され得る。訓練セットにおいて決定されたカットオフは、１つまたは複数の独立的な検証データセットにおいて試験され得る。
【００６８】
「診断する」という用語は、外部試験、評価および分析の使用にしばしば関わる、徴候または症状による疾患または状態の認識または同定を表す。疾患または状態の診断は、疾患または状態を同定するための結論を下すおよび出すことを含む手順の全体の結果として生じる。本発明によれば、ＭＤＭ２ｉに対する患者のがんまたは腫瘍の感受性、および患者がＭＤＭ２ｉ治療に応答するという見込みは、遺伝子シグネチャー内の遺伝子の発現レベルが測定される記載された方法の実行によって診断され得る。様々な実施形態では、図１Ａ〜１Ｅの遺伝子の少なくとも３つ、少なくとも４つ、または全ての発現レベルが測定される；または遺伝子シグネチャー遺伝子ＢＡＸ、Ｃ１ＱＢＰ、ＦＤＸＲ、ＧＡＭＴ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＳＬＣ２５Ａ１１、ＴＰ５３、ＴＲＩＡＰ１、ＺＭＡＴ３、ＡＥＮ、Ｃ１２ｏｒｆ５、ＧＲＳＦ１、ＥＩＦ２Ｄ、ＭＰＤＵ１、ＳＴＸ８、ＴＳＦＭ、ＤＩＳＣ１、ＳＰＣＳ１、ＰＲＰＦ８、ＲＣＢＴＢ１、ＳＰＡＧ７、ＴＩＭＭ２２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＡＣＡＤＳＢ、ＤＤＢ２、ＦＡＳ、ＧＤＦ１５、ＧＲＥＢ１、ＰＤＥ１２、ＰＯＬＨ、Ｃ１９ｏｒｆ６０、ＨＨＡＴ、ＩＳＣＵ、ＭＤＭ２、ＭＥＤ３１、ＭＥＴＲＮ、ＰＨＬＤＡ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＳＥＳＮ１およびＸＰＣの少なくとも３つ、または少なくとも４つ、または全ての発現が測定される；遺伝子シグナチャー遺伝子ＭＤＭ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＺＭＡＴ３、ＤＤＢ２、ＦＤＸＲ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＢＡＸ、ＲＲＭ２Ｂ、ＳＥＳＮ１、ＣＣＮＧ１、ＸＰＣ、ＴＮＦＲＳＦ１０ＢおよびＡＥＮの少なくとも３つまたは全ての遺伝子発現；または遺伝子シグネチャー遺伝子ＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲ、ＣＤＫＮ１ＡおよびＡＥＮ（および場合によりＭＤＭ２）の少なくとも３つ、または全ての発現が測定される。例として、ＭＤＭ２ｉ感受性を示す試験を受けている対象のがんまたは腫瘍試料中の遺伝子シグネチャー遺伝子の発現は、そのがんまたは腫瘍がＭＤＭ２ｉ治療に対して感受性であるものとして対象を診断するのに役立つ。
【００６９】
本明細書では、「差次的に発現した」は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）への遺伝子コード情報（ＭＤＭ２ｉ感受性と関連する遺伝子など）の変換および／またはタンパク質へのｍＲＮＡの変換の増加または減少などの発現の差異または改変を表す。ある場合では、差異または改変は、対照または基準値と、または対照もしくは基準値の範囲、例えば、ＭＤＭ２ｉ治療に対する優れた応答または貧弱な応答を有する対象の群（例えば、ＭＤＭ２ｉ感受性対ＭＤＭ２ｉ非感受性集団）などの対象の群または集団の平均発現と比較したものである。ある場合では、差異または改変は、同じ対象または健康な対象からの非腫瘍組織と比較したものとすることができる。差次的発現の検出は、ＭＤＭ２ｉ感受性と関連する図１Ａ〜１Ｅの遺伝子シグネチャー遺伝子の少なくとも３つ、または少なくとも４つの発現の変化などの遺伝子またはタンパク質発現の変化を測定することを含み得る。
【００７０】
遺伝子産物の発現を検出すること、および遺伝子産物の差次的発現を検出することは、当技術分野で公知の１つまたは複数の適した手段によって、例えば、マイクロアレイ分析、ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、免疫組織化学的検査、免疫蛍光法、質量分析、ノーザンブロット、ウエスタンブロットなどによって、試料中の核酸またはタンパク質の発現のレベルを定性的にまたは定量的に測定または決定することを表す。
【００７１】
「ＭＤＭ２ｉ」という用語は、本発明による使用に適したいくつかの低分子量ＭＤＭ２阻害剤を包含する。より明確には、ＭＤＭ２阻害剤は、化合物Ａ（ＷＯ２０１０／０８２６１２の実施例６および米国特許第８，４０４，６９１号の実施例６：［（５Ｒ，６Ｓ）−５−（４−クロロ−３−フルオロフェニル）−６−（６−クロロピリジン−３−イル）−６−メチル−３−（プロパン−２−イル）−５，６−ジヒドロイミダゾ［２，１−ｂ］［１，３］チアゾール−２−イル］［（２Ｓ，４Ｒ）−２−｛［（６Ｒ）−６−エチル−４，７−ジアザスピロ［２．５］オクタ−７−イル］カルボニル｝−４−フルオロピロリジン−１−イル］メタノンを参照されたい）ならびにその塩および水和物；ならびに化合物Ｂ（ＷＯ２０１２／１２１３６１の実施例７０および米国特許出願公開第２０１２／０２６４７３８Ａ号の実施例７０：（３’Ｒ，４’Ｓ，５’Ｒ）−Ｎ−［（３Ｒ，６Ｓ）−６−カルバモイルテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３−イル］−６”−クロロ−４’−（２−クロロ−３−フルオロピリジン−４−イル）−４，４−ジメチル−２”−オキソ−１”，２”−ジヒドロジスピロ［シクロヘキサン−１，２’−ピロリジン−３’，３”−インドール］−５’−カルボキサミドを参照されたい）およびそのｐトルエンスルホン酸塩を含めたその塩を含む。
【００７２】
ＭＤＭ２−ｐ５３結合部位を標的にするＭＤＭ２阻害剤の例が報告されており、スピロオキシインドール誘導体（ＷＯ２００６／０９１６４６、ＷＯ２００６／１３６６０６、ＷＯ２００７／１０４６６４、ＷＯ２００７／１０４７１４、ＷＯ２００８／０３４７３６、ＷＯ２００８／０３６１６８、ＷＯ２００８／０５５８１２、ＷＯ２００８／１４１９１７、ＷＯ２００８／１４１９７５、ＷＯ２００９／０７７３５７、ＷＯ２００９／０８０４８８、ＷＯ２０１０／０８４０９７、ＷＯ２０１０／０９１９７９、ＷＯ２０１０／０９４６２２、ＷＯ２０１０／１２１９９５；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００５，１２７，１０１３０〜１０１３１；Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２００６，４９，３４３２〜３４３５；およびＪ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２００９，５２，７９７０〜７９７３）；インドール誘導体（ＷＯ２００８／１１９７４１）；ピロリジン−２−カルボキサミド誘導体（ＷＯ２０１０／０３１７１３）；ピロリジノン誘導体（ＷＯ２０１０／０２８８６２、ＷＯ２０１０／０３１７１３、ＷＯ２０１１／０６１１３９、ＷＯ２０１１／０９８３９８、ＷＯ２０１２０／３４９５４、ＷＯ２０１２／０７６５１３）；イソインドリノン誘導体（ＷＯ２００６／０２４８３７；およびＪ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２００６，４９，６２０９〜６２２１）；および他のもの（ＷＯ２０１１／０７６７８６、ＷＯ２０１２／１７５４８７、ＷＯ２０１２／１７５５２０、ＷＯ２０１２／０６６０９５およびＷＯ２０１１／０４６７７１）を含む。
【００７３】
記載された発明による使用のための好ましいＭＤＭ２ｉ化合物の例は、化合物Ａ（ＷＯ２０１０／０８２６１２の実施例６および米国特許第８，４０４，６９１号の実施例６）；化合物Ｂ（ＷＯ２０１２／１２１３６１の実施例７０および米国特許出願公開第２０１２／０２６４７３８Ａ号の実施例７０）；ＣＧＭ０９７；ＲＧ７３８８；ＭＫ−８２４２（ＳＣＨ９００２４２）；ＭＩ−２１９；ＭＩ−３１９；ＭＩ−７７３；ＭＩ−８８８；Ｎｕｔｌｉｎ−３ａ；ＲＧ７１１２（ＲＯ５０４５３３７）、（Ｙ．Ｙｕａｎら，２０１１，Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．，４：１６）；ベンゾジアゼピンジオン、例えば、ＴＤＰ５２１２５２およびＴＤＰ６６５７５９；ならびにイソキノリノン、例えば、ＰＸＮ７２７およびＰＸＮ８２２（Ｙ．Ｙｕａｎら，２０１１，Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．，４：１６；Ｓ．Ｗａｎｇら，Ｔｏｐ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ８：５７〜８０，２０１２；およびＱ．Ｄｉｎｇら，Ｊ．Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２０１３）を含む。スピロオキシインドール含有化合物、ピペリジノン含有化合物、１，４−ジアゼピン化合物、またはイソインドリノン化合物、およびその塩などのＭＤＭ２−ｐ５３相互作用の他の小分子阻害剤は、例えば、Ｙ．Ｚｈａｏら，２０１３，ＢｉｏＤｉｓｃｏｖｅｒｙ，８（４）：１〜１５に報告されている。
【００７４】
「予後」という用語は、その疾患または状態の通常の経過から予測される、または対象によって表される特別な特色によって示される、疾患または状態からの予期される生存および回復の予測を表す。予後は、例えば、１つまたは複数の薬物または化合物に関わる所与の療法または治療レジメンに対する患者の応答または感受性に依存して、例えば、患者が所与の期間生存するまたは生存する可能性があることを決定することによって、特定の治療と関連する疾患の経過も予測し得る。したがって、ＭＤＭ２ｉに対する患者のがんまたは腫瘍の感受性が記載されたＭＤＭ２ｉ感受性遺伝子シグネチャーの遺伝子の発現レベルを測定することによって決定される本発明の方法の実行は、患者がＭＤＭ２ｉ治療に応答するまたは応答する可能性があるという予後と関連する。様々な実施形態では、図１Ａ〜１Ｅの遺伝子の少なくとも３つ、少なくとも４つ、または全ての発現レベルが測定される；または遺伝子シグネチャー遺伝子ＢＡＸ、Ｃ１ＱＢＰ、ＦＤＸＲ、ＧＡＭＴ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＳＬＣ２５Ａ１１、ＴＰ５３、ＴＲＩＡＰ１、ＺＭＡＴ３、ＡＥＮ、Ｃ１２ｏｒｆ５、ＧＲＳＦ１、ＥＩＦ２Ｄ、ＭＰＤＵ１、ＳＴＸ８、ＴＳＦＭ、ＤＩＳＣ１、ＳＰＣＳ１、ＰＲＰＦ８、ＲＣＢＴＢ１、ＳＰＡＧ７、ＴＩＭＭ２２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＡＣＡＤＳＢ、ＤＤＢ２、ＦＡＳ、ＧＤＦ１５、ＧＲＥＢ１、ＰＤＥ１２、ＰＯＬＨ、Ｃ１９ｏｒｆ６０、ＨＨＡＴ、ＩＳＣＵ、ＭＤＭ２、ＭＥＤ３１、ＭＥＴＲＮ、ＰＨＬＤＡ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＳＥＳＮ１およびＸＰＣの少なくとも３つ、少なくとも４つ、または全ての発現が測定される；遺伝子シグネチャー遺伝子ＭＤＭ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＺＭＡＴ３、ＤＤＢ２、ＦＤＸＲ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＢＡＸ、ＲＲＭ２Ｂ、ＳＥＳＮ１、ＣＣＮＧ１、ＸＰＣ、ＴＮＦＲＳＦ１０ＢおよびＡＥＮの少なくとも３つまたは全ての発現；または遺伝子シグネチャー遺伝子ＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲ、ＣＤＫＮ１ＡおよびＡＥＮ（および場合によりＭＤＭ２）の少なくとも３つ、または全ての発現が測定される。
【００７５】
本明細書では、「対象」は、典型的に、ヒトおよび非ヒト哺乳動物を含めた多細胞脊椎動物生物である。「対象」という用語は、個体という用語と本明細書で互換的に使用され得；しばしば、対象または個体は、がん、腫瘍、新生物形成、または新生物状態に罹患した患者である。したがって、本発明の実行は、ヒトおよび獣医学的使用に適している。
【００７６】
「治療する」という用語は、一般的な意味では、所望の生理学的および／または薬理的効果を達成するまたは得ることを表し、予防的であるか、療法的であるか、またはその両方であるかを問わない。本明細書では、「治療すること」または「治療」は、非良性もしくは悪性がん、腫瘍、または新生物などの疾患状況、疾患進行、疾患原因物質、または他の異常な状態の有害な効果を予防する、阻害する、治癒させる、逆転させる、減弱する、緩和する、抑止する、最小化する、抑制する、低下させる、減らす、安定化させるまたは排除することを表することができる。例えば、治療は、必ずしも症状の全てではないが、疾患の症状を緩和すること、または疾患の症状または進行を減弱することに関わる場合もある。がんの治療は、本明細書では、がん転移または悪性腫瘍を含めたがんの進行および／またはがん転移もしくは悪性腫瘍を含めたがんの再発を部分的または完全に阻害する、排除する、遅延させる、逆転させる、低下させる、または予防すること；または哺乳動物、特に、ヒトにおけるがんの発症または発生を予防することを表す場合がある。がんを治療することは、転移の発生を予防することによってまたは腫瘍負荷を小さくすることによってなど、腫瘍または新生物の完全な発生を阻害することを含む場合がある。
【００７７】
それを必要とする対象の治療は、有効量または治療有効量の薬剤、薬物、または化合物、すなわち、本発明のＭＤＭ２ｉの使用または投与を典型的に含む。有効量は、対象への投与または送達時に対象における所望の応答を誘発する薬剤の数量（量）を表す。最適には、有効量は、対象において有害作用または細胞障害性がないか、または最低限からゼロで、または達成される治療的利益が有害作用に勝る治療的効果をもたらす。有効量の投与された薬剤に対する所望の応答は、例えば、所望のまたは意義ある量の、例えば、薬剤の非存在下での応答と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％以上、または１００％の腫瘍のサイズ、数、または体積の減少とすることができる。代わりに、所望の応答は、例えば、ここでも上記の所望のまたは意義ある百分率量の生存時間または無進行生存の時間の増加であってもよい。
【００７８】
「治療結果」に関して、本発明の方法は、ＭＤＭ２ｉでの治療の結果の予測を助ける。つまり、がんまたは腫瘍試料中の本明細書に記載の遺伝子シグネチャーの遺伝子のいくつか（例えば、少なくとも３つまたは少なくとも４つ）、または全ての発現の検出は、ＭＤＭ２ｉでの治療時の結果を予測する。結果の定量化は、ＭＤＭ２ｉでの治療に対する客観的応答、臨床応答、または病理学的応答とすることができる。例えば、結果は、Ｔｈｅｒａｓｓｅら，２０００，Ｎｅｗ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｔｏ  Ｅｖａｌｕａｔｅ  ｔｈｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｔｕｍｏｒｓ，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９２（３）：２０５〜２０７に報告されている固形腫瘍の治療に対する応答を評価するための技法を利用することによって決定され得る。結果を決定するためのかかる技法は、生存（全体的な生存または生存の持続時間を含めた）、無進行間隔、または再発後の生存を評価または測定することを含んでもよい。これらの事象のタイミングまたは持続時間は、おおよそ診断の時間から、またはおおよそＭＤＭ２ｉでの治療の開始の時間から決定され得る。代わりに、結果は、腫瘍サイズ、腫瘍体積、または腫瘍代謝の低下に基づき得る、またはそれは、特に、かかるマーカーが疾患状況（例えば、ＰＳＡ）において上昇する場合、全体的な腫瘍負荷評価、または血清マーカーのレベルに基づき得る。したがって、結果は、ＭＤＭ２ｉに対する完全応答（ＣＲ）、ＭＤＭ２ｉに対する部分応答（ＰＲ）、安定疾患（ＳＤ）、および進行性疾患（ＰＤ）と特徴付けられ得るが、これらの用語は慣習的に当技術分野で公知である。
【００７９】
本明細書では、「治療に対する感受性」は、最初の、いくつかの場合ではそれに続くまたは進行中の療法または治療に対して応答性である疾患または状態、例えば、がんまたは腫瘍に関する。例として、最初の、それに続く、または進行中の療法または治療に対して統計的に有意に応答性である疾患または状態は、治療に対する感受性を提示すると考えられる。感受性は、治療薬もしくは薬物、例えば、ＭＤＭ２ｉなどの治療薬もしくは薬物に対する、または薬剤の併用、例えば、１つもしくは複数のＭＤＭ２阻害剤、および／もしくは他の抗がん薬物の組合せに対する疾患、症状、またはがんもしくはがん細胞の成長などのその進行の応答性を表し得る。例えば、増加した（相対的な）感受性は、がんが、治療に対して感受性でないがんと比較して、所与の療法または治療薬または治療に対してより応答性である状況を表す。
【００８０】
本明細書では、「感受性スコア」という用語は、試料から得られるスコアであり、ＭＤＭ２ｉ治療に対する試料の感受性を反映するスコアを言う。感受性スコアは、閾値と比較され、ＭＤＭ２ｉ治療に対して感受性であるか否かを決定することができる。感受性スコアは、以下に記載される通り、当業者に公知の様々な統計学的手法により得られ得る。
【００８１】
本明細書では、「閾値」、「カットオフ値」および「カットオフポイント」という用語は、対象の試料の感受性スコアが比較される境界値を意味し、これらは相互互換的に用いられる。対象の試料の感受性スコアが閾値を超える場合には、試料は、ＭＤＭ２ｉ治療に対して感受性であると予測され得る。対象の試料の感受性スコアが閾値を下回る場合には、試料は、ＭＤＭ２ｉ治療に対して耐性であると予測され得る。対象の試料の感受性スコアが閾値と同じである場合には、試料は、ＭＤＭ２ｉ治療に対して感受性であるとも耐性であるとも予測され得る。
【００８２】
本明細書では、「訓練セット」という用語は、閾値を決定するために用いられる試料のセットを言う。本明細書では、「試験セット」という用語は、試料のセットにおける各試料がＭＤＭ２ｉ治療に対して感受性であるか否かを予測するために本発明の方法に供される試料のセットを言う。訓練セットは、ＭＤＭ２ｉ治療に対する感受性が知られている試料、ＭＤＭ２ｉ治療に対する感受性が不明である試料、またはこれらの組合せからなっていてよい。訓練セットは、ＭＤＭ２ｉ治療に対する感受性が不明である試料のみからなっていてもよいし、後述するようにＭＤＭ２ｉ治療に対する感受性が知られた試料との組合せからなっていてもよい。
【００８３】
本明細書では、「参照スコア」という用語は、訓練セットのそれぞれの試料から得られた感受性スコアを意味し、対象の感受性スコアが計算されるのと同じ方法で計算されうる。閾値は、下記の通り、統計学的手法により訓練セットから得られた参照スコアの分布に基づいて決定され得る。
【００８４】
統計分野では、閾値が高くなるほど、偽陽性率が低下し、閾値が低くなるほど、偽陰性率が低下する。従って、当業者であれば、本明細書に基づいて閾値を容易にかつ適切に決定することができる。例えば、ＭＤＭ２ｉ投与に供されるＭＤＭ２ｉの非レスポンダー数を減らすことが望まれるならば、閾値を増大させることができる。閾値を増大させると、より多くのレスポンダーがＭＤＭ２ｉ治療に供される対象群から除外されるであろう。ＭＤＭ２ｉ投与に供されるＭＤＭ２ｉ応答者数を増加させることが望まれるならば、閾値を低下させることができる。閾値を低下させると、より多くの非レスポンダーがＭＤＭ２ｉ治療に供される対象群に含まれるであろう。
【００８５】
本明細書では、「レスポンダー」という用語は、ＭＤＭ２ｉ治療に応答する対象を言う。本明細書では、「非レスポンダー」という用語は、ＭＤＭ２ｉ治療に有意な応答を示さない対象を言う。
【００８６】
ある場合では、がんまたは腫瘍の感受性または応答性は、これらに限定されないが、（ｉ）成長速度低下、進行の低下、および完全な成長停止を含めたがん、腫瘍、または新生物成長の阻害の程度；（ｉｉ）がん、腫瘍、または新生物細胞の数の低下；（ｉｉｉ）がん、腫瘍、もしくは新生物サイズまたは体積の低下；（ｉｖ）隣接する末梢器官および／または組織中へのがん、腫瘍、または新生物細胞浸潤の阻害、例えば、低下、縮小、または完全な休止；（ｖ）転移の阻害、例えば、低下、縮小、または完全な休止；（ｖｉ）がん、腫瘍、または新生物の退縮または拒絶を最適にもたらす抗がん、腫瘍、または新生物免疫応答の増強；（ｖｉｉ）がん、腫瘍、または新生物と関連する１つまたは複数の症状のある程度の軽減、；（ｖｉｉｉ）治療後の生存の持続時間／生存時間の長さの増加；および／または（ｉｘ）治療の開始または維持後の減少した死亡率を含めた、対象への利益を示す任意のパラメーターまたはエンドポイントを使用して、評価することができる。
【００８７】
実施形態の記述
ＭＤＭ２ｉ感受性を予測する遺伝子シグネチャー
本明細書に記載のＭＤＭ２阻害剤に対する、または類似した活性を有する化合物に対するがんおよび腫瘍の感受性を予測するための遺伝子シグネチャーおよびバイオマーカーの同定が本発明によって提供される。遺伝子シグネチャーにおける遺伝子の発現は、ＭＤＭ２阻害剤に対して感受性であるがんを示すので、かかる遺伝子シグネチャーは、「ＭＤＭ２ｉ遺伝子感受性シグネチャー」とも称される。対象からのがんもしくは腫瘍試料または検体中の遺伝子感受性シグネチャーにおける発現された遺伝子の同定は、対象、すなわち、対象のがんまたは腫瘍がＭＤＭ２ｉ曝露、治療、または療法に対して感受性であるということを予測する。さらに、遺伝子感受性シグネチャーにおける発現された遺伝子の同定は、対象のがんまたは腫瘍を治療するために使用するＭＤＭ２ｉの治療有効量またはＭＤＭ２ｉ治療レジメンを判断するおよび決定するために使用することができる。
【００８８】
ある実施形態では、試験を受けている対象からのがんまたは腫瘍試料中の本発明の遺伝子シグネチャーにおける遺伝子の遺伝子発現の検出または測定は、ＭＤＭ２ｉを用いる療法に対する対象の応答または感受性に関する有益または陽性である可能性がある治療結果または予後を示す。ある実施形態では、遺伝子シグネチャーは、その発現ががんまたは腫瘍を有する対象におけるＭＤＭ２−ｐ５３相互作用に及ぼすまたは関連するシグナル伝達経路に及ぼすＭＤＭ２ｉ治療薬の薬力学的効果と相関する遺伝子を含む。
【００８９】
本発明の遺伝子シグネチャーは、本明細書で定義した小分子ＭＤＭ２ｉ、化合物Ａに対して感受性であるマルチがん細胞株パネル；すなわち、小分子ＭＤＭ２ｉに対して感受性ではないがん細胞株と比較して、ある閾値またはｐ値未満の小分子阻害剤に関するＩＣ50を提示した細胞株のパネルにおいて差次的に発現した遺伝子の同定によって、前臨床適用において得られた。ある例では、差次的発現分析結果は、スチューデント２クラスｔ検定によるｐ値による遺伝子のランク付けを可能にした。次いで、細胞株遺伝子シグネチャーデータを、臨床データセットにおける前もって指定された発現、分散および相関閾値を満たす感受性シグネチャー遺伝子の中心的なセットの同定を通して、臨床適用、例えば、がんを有する患者および個体からの組織および細胞試料に関連づけた。（例えば、実施例１および２を参照されたい）。さらに、正常、前臨床および臨床系における野生型ＴＰ５３を有する腫瘍において上昇し、非がん性細胞および組織と比較して、がん細胞および組織における増加した発現を有した遺伝子を選択した。
【００９０】
より具体的には、１７７遺伝子をマルチがん細胞株パネル（図１Ａ〜１Ｅ）から得られたデータから同定した；これらの遺伝子の１６４を、性染色体によってコードされる遺伝子を除外した後、選択した。遺伝子の数を本来の１７７遺伝子シグネチャーとのそれらの相関および＞２８，０００臨床検体を含有するU133 Based Expression Reference（Compendia Bioscience,Inc.、Ann Arbor、MI）による目的のがんのタイプ（７腫瘍タイプ）における変動しうる発現に基づいてさらに１３９に低下させた。これらの１３９遺伝子のうち、表３に示された３８を発現に関するそれらのＴＰ５３への依存に基づいて選択した。これらの３８遺伝子の３７（すなわち、ＰＥＢＰ１を除く表３に示された遺伝子）は、正常組織と比較して、がんにおける上方制御された発現を示した。ｐ５３の下流エフェクターである３つの遺伝子、つまり、ＣＤＫＮ１Ａ、ＳＥＮＳＮ１およびＸＰＣを３７遺伝子のこのセットに追加し、これは、表１に示された４０遺伝子の最終的な中心的遺伝子セットを構成する。
【００９１】
本発明に従って、図１Ａ〜１Ｅ、表１の遺伝子シグネチャー内の少なくとも３つの遺伝子、またはＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲ、ＣＤＫＮ１ＡおよびＡＥＮ遺伝子を含有する遺伝子セットは、ＭＤＭ２ｉに対するがんまたは腫瘍試料の感受性の予測的バイオマーカーとすることができることが見出された。好ましくは、ＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲ、ＣＤＫＮ１ＡおよびＡＥＮを含有する遺伝子セットの少なくとも３つの遺伝子は、ＭＤＭ２ｉに対するがんまたは腫瘍試料の感受性の予測的バイオマーカーとすることができる。
【００９２】
本発明の実施形態によって、がんまたは腫瘍試料中のその中の遺伝子の差次的発現（一般に、増加した発現）がそのがんまたは腫瘍試料のＭＤＭ２ｉ感受性を予測する図１Ａ〜１Ｅに示された１７７遺伝子バイオマーカーを含有する遺伝子シグネチャーが提供される。この遺伝子シグネチャーの遺伝子構成要素のいくつかまたは全ての差次的発現は、ＭＤＭ２ｉに対するがんまたは腫瘍試料の感受性を予測し示す。一部の実施形態では、図１Ａ〜１Ｅの遺伝子シグネチャー内の遺伝子の少なくとも３つ、少なくとも４つ、または全ての発現は、ＭＤＭ２ｉに対するがんまたは腫瘍試料の感受性を予測する。一部の実施形態では、図１Ａ〜１Ｅの遺伝子シグネチャー内の遺伝子の少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１０、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、または１７７の発現は、ＭＤＭ２ｉに対するがんまたは腫瘍試料の感受性を予測し、本発明の遺伝子シグネチャー発現分析においてアッセイされる。ある実施形態では、この遺伝子シグネチャーの遺伝子のいくつかまたは全ては、対照と比較して、がんまたは腫瘍試料中の増加した発現を有する。実施形態では、ＭＤＭ２ｉは、本明細書で定義された、化合物Ａおよびその塩、または化合物Ｂおよびその塩である。図１Ａ〜１Ｅの遺伝子シグネチャーは、対照と比較した、ＭＤＭ２ｉ治療に対して感受性であるがんまたは腫瘍細胞中の差次的（例えば、増加したまたは上昇した）発現を示す遺伝子を含む。
【００９３】
一部の実施形態では、対照または標準値と比較した、がんもしくは腫瘍における、またはがんもしくは腫瘍からの試料中の表１に示された遺伝子シグネチャー内の遺伝子の少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３１、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６、少なくとも３７、少なくとも３８、少なくとも３９、または少なくとも４０の発現、例えば、増加した発現がＭＤＭ２ｉの感受性を予測する。ある実施形態では、標準値は、ＭＤＭ２阻害剤に対する公知の感受性または耐性を有する細胞株でのアッセイから生成される。ある実施形態では、ＭＤＭ２ｉ感受性は、本明細書で定義された、化合物Ａおよびその塩でのまたは化合物Ｂおよびその塩での治療に関する。
【００９４】
【表１】
2017532959.tif 000002
【００９５】
本発明は、がんまたは腫瘍試料中のその発現がＭＤＭ２ｉに対するがんまたは腫瘍の感受性を示す以下の遺伝子ＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲ、ＣＤＫＮ１ＡおよびＡＥＮの少なくとも３つ、または全てを含むまたはこれらからなる遺伝子シグネチャーをさらに包含する。ある例では、ＭＤＭ２ｉは、本明細書で定義された、化合物Ａおよびその塩または化合物Ｂおよびその塩である。他の実施形態では、ＭＤＭ２ｉは、スピロオキシインドール誘導体、インドール誘導体、ピロリジン−２−カルボキサミド誘導体、ピロリジノン誘導体、イソインドリノン誘導体、またはイミダゾチアゾール誘導体から選択される。他の実施形態では、ＭＤＭ２ｉは、ＣＧＭ０９７、ＲＧ７３８８、ＭＫ−８２４２（ＳＣＨ９００２４２）、ＭＩ−２１９、ＭＩ−３１９、ＭＩ−７７３、ＭＩ−８８８、Ｎｕｔｌｉｎ−３ａ、ＲＧ７１１２（ＲＯ５０４５３３７）、ＴＤＰ５２１２５２、ＴＤＰ６６５７５９、ＰＸＮ７２７、またはＰＸＮ８２２の１つまたは複数である。
【００９６】
本発明の遺伝子シグネチャー内の遺伝子の発現は、当業者に公知の任意の適した手段を使用して検出され得る。例として、遺伝子発現の検出は、マイクロアレイを含めたアレイ分析を行なうことによって、およびＲＴ−ＰＣＲを使用することによって行なわれ得る。遺伝子発現を検出する追加の方法は、当技術分野で公知であり、以下で詳細に記載されている。ＭＤＭ２ｉ感受性遺伝子シグネチャーにおける遺伝子の差次的発現（発現の増加または減少など）は、対照と比較した、ＭＤＭ２ｉおよび／またはＭＤＭ２ｉ治療に対する感受性と相関している任意の測定可能な増加または減少とすることができる。
【００９７】
本発明は、コンパニオン診断としてのＭＤＭ２阻害剤に対するがんまたは腫瘍試料の感受性を示す遺伝子シグネチャーをさらに提供し、これは、がんを有する個体のがん治療、療法レジメン、またはプログラムを監督している医師または臨床家によって使用され得る。コンパニオン診断は、内科医および臨床医（例えば、腫瘍専門医）ならびに医療従事者が療法、特に、ＭＤＭ２ｉを含む療法に対する最良の応答に基づいてそれらの患者の治療の決定を行なうのを補助し得る。コンパニオン診断は、薬物開発プロセスも補助し得、より安全で、より対費用効果が高く、薬物の特定の型、形、またはクラスから利益を得ることになるもののためのより良い治療効力を有する薬物候補のより迅速な商業化につながる。本発明の遺伝子シグネチャーの使用は、ＭＤＭ２ｉの投与に関わる治療経過が、個体に有益であるように、がんまたは腫瘍のサイズ、成長、増殖、存在などを低下させる、減らす、軽減する、排除する、抑止する、またはさもなければこれらに影響するかどうかの観点から個体のためになりそうであるかどうかの決定を補助し得る。したがって、コンパニオン診断は、ＭＤＭ２ｉでの様々なタイプのがんおよび腫瘍の治療の決定と一緒に利用される場合、有益で有利であり得る。
【００９８】
ＭＤＭ２ｉ感受性遺伝子シグネチャーの使用を含む方法
本発明は、一般に、ＭＤＭ２ｉでの治療が肯定的な結果をもたらすことになるように、がんまたは腫瘍に罹患した個体がＭＤＭ２ｉでの治療に対して感受性であるかどうかを同定する、決定する、または予測する方法を提供する。方法は、個体の生物学的試料、例えば、がんもしくは腫瘍組織または細胞試料が、対照と比較して、ＭＤＭ２ｉに対する感受性を示す本明細書に記載の遺伝子感受性シグネチャーの遺伝子を差次的に発現するかどうかの評価に関わる。肯定的な結果は、がんまたはがん細胞の低下、減少、排除、または寛解、およびがん細胞のアポトーシスまたは死の１つまたは複数を包含し得る。より低い、低下した、または小さくなった腫瘍量も、ＭＤＭ２ｉ治療の肯定的な結果を示す。
【００９９】
ある実施形態では、本発明は、個体がＭＤＭ２ｉ治療の結果として肯定的な結果を有する可能性があることを決定した後、ＭＤＭ２ｉでがんまたは腫瘍を有する個体を治療する方法も提供する。方法は、個体に、がんまたは腫瘍を治療するのに治療的に有効な量で、効果的な期間、１つまたは複数のＭＤＭ２阻害剤を投与することに関わる。がんまたは腫瘍を有する個体から得られた試料中の本発明のＭＤＭ２ｉ遺伝子感受性シグネチャーにおける遺伝子の差次的発現の最初の決定、およびその後のＭＤＭ２ｉでの個体の治療は、ＭＤＭ２ｉ治療の肯定的な結果と相関する。
【０１００】
ある実施形態では、本発明は、がんまたは腫瘍を有する個体がＭＤＭ２ｉでの治療によって利益を得る、またはこれに好ましく応答するかどうかを、がんまたは腫瘍を有する個体から得られた試料中の本発明のＭＤＭ２ｉ遺伝子感受性シグネチャーにおける遺伝子の発現を測定することによって予後診断する方法も提供する。したがって、ＭＤＭ２ｉ治療に対するがんまたは腫瘍の感受性は、がんまたは腫瘍（またはかかる病態を有する個体）が治療に応答する可能性があるかどうかを決定するために、ＭＤＭ２ｉでの治療が始まる前に評価される。遺伝子シグネチャーの遺伝子が個体のがんまたは腫瘍試料中で発現されることを決定することは、例えば、試料中の遺伝子発現が、前もって指定された閾値を超えており、がんまたは腫瘍がＭＤＭ２ｉ療法に対して感受性であることを示し予測する、遺伝子感受性シグネチャーから計算された感受性スコアまたは評点を有することを決定することを含み得る。方法の一部の実施形態では、治療を受けている個体に投与されるＭＤＭ２ｉは、本明細書で定義された化合物の１つまたは複数である。特定の実施形態では、ＭＤＭ２ｉは、化合物Ａおよびその塩、または化合物Ｂおよびその塩である。
【０１０１】
ある実施形態では、感受性スコアの使用は、スコアが、がんまたは腫瘍がＭＤＭ２ｉに対して感受性であるかどうかを定義するための基礎として使用することができ、したがって、ＭＤＭ２ｉ感受性がんまたは腫瘍を有する個体がＭＤＭ２ｉ治療に好ましく応答することを予測し得るので、有利であり得る。例えば、ＭＤＭ２ｉに対するがんまたは腫瘍試料の感受性を示す感受性スコアの決定に基づいて、医師は、がんまたは腫瘍を有する患者をＭＤＭ２ｉ薬剤または化合物で治療することを選択し得る。あるいは、がんまたは腫瘍試料のＭＤＭ２ｉに対する非感受性を示す感受性スコアの決定に基づいて、医師は、患者がＭＤＭ２ｉ治療から臨床的または医学的利益を受けないと予測されるので、がんまたは腫瘍を有する患者をＭＤＭ２ｉ薬剤または化合物で治療しないことを選択し得る。患者のがんまたは腫瘍の試料が、がん薬物治療または療法の経過中にＭＤＭ２ｉ感受性に関して評価される場合、ＭＤＭ２ｉ感受性を示す感受性スコアは、医師が患者のがんもしくは腫瘍治療または療法を継続するもしくは改変するおよび／またはＭＤＭ２ｉで治療することを決定するのを補助し得る。
【０１０２】
本発明によれば、各試料の感受性スコアおよび対象の感受性を予測するための閾値は、ＭＤＭ２ｉ治療への感受性が不明である試料からも得られ得る。例えＭＤＭ２ｉ治療への感受性が試料の特定の群において全くまたはほとんど不明であったとしても、本発明ではその対象のＭＤＭ２ｉ治療への感受性が予測し得るため、このことは本発明の非常に重要な特徴の１つである。例えば、ＭＤＭ２ｉの感受性についてのヒト臨床試験データは入手可能ではない。従って、ＭＤＭ２ｉ治療に対して誰が耐性であるのか、または誰がＭＤＭ２ｉ治療により処置されるべきでないのかは、誰にも分からないのである。しかし、ある態様では、本発明は、ＭＤＭ２ｉ治療への感受性が不明である試料を用いて、対象（好ましくは、ヒト対象）のＭＤＭ２ｉ治療への感受性を予測する方法を提供する。
【０１０３】
ある実施形態では、閾値は試料の感受性スコアの分布から決定されるが、ここで、この試料の少なくとも一部または全てのＭＤＭ２ｉ治療への感受性は不明である。特に、感受性スコアと閾値は、スコア外挿法、混合ガウスモデル、及びその他の当業者に既知のモデルなどの統計手法を用いて得られ得る。この実施形態においては、閾値が決定される試料の５０％を超えて、６０％を超えて、７０％を超えて、８０％を超えて、９０％を超えて、または１００％が、そのＭＤＭ２ｉ治療への感受性が不明である試料であり得る。
【０１０４】
スコア外挿モデルにおいては、試料の感受性スコアは当該試料における各遺伝子の発現レベルの正規化スコア（「標準スコア」、「Ｚ−値」、「Ｚ−スコア」、「正規スコア」または「標準化変数」とも呼ばれる）を合計することにより求められ得るが、以下の式：（正規化スコア）＝｛（遺伝子発現の生の値）−（分布の平均）｝／（分布の標準偏差）から算出することができる。本発明によれば、閾値は、ＭＤＭ２ｉ治療への感受性が不明である試料から、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線をプロットすること、および場合によって一個抜き交差検証（ＬＯＯＣＶ）解析を行うことにより決定することもできる。ある実施形態では、閾値は、ＲＯＣ曲線のＹｏｕｄｅｎ指数±０．３、±０．２、±０．１の範囲内またはＹｏｕｄｅｎ指数であってよく、−０．２〜０．５の間、好ましくは−０．０２〜０．２の間の範囲であってもよく、より好ましくは約−０．０２、約０．１４または約０．２であってもよい。他の実施形態では、ＲＯＣ曲線上の真陽性率が１であり、偽陰性率が０である場所に最も近くに位置する点のカットオフ値とすることができる。ある実施形態では、閾値は、周知のクラスタリングに基づく画像閾値決定法であり、「大津閾値」としても知られる大津法(M. Sezgin and B. Sankur (2004), Journal of Electronic Imaging 13 (1): 146-165, および N. Otsu (1979), IEEE Trans. Sys., Man., Cyber. 9 (1): 62-66参照)などの二値化アルゴリズムによって決定することもできる。ある実施形態では、ステップｄ）において、閾値が試料中のＴＰ５３変異型試料の参照スコアの第３四分位値と最大値との間の範囲であるか；または、閾値が試料中のＴＰ５３野生型試料の参照スコアの第１四分位値と最小値との間の範囲である。他の実施形態では、ステップｄ）において、閾値は、試料中のＴＰ５３変異型試料の参照スコアの第３四分位値または最大値として決定してもよい。あるいは、他の実施形態では、閾値は、試料中のＴＰ５３野生型試料の参照スコアの第１四分位値または最小値として決定してもよい。試料は、閾値よりもその感受性スコアが高い場合には感受性であると予測され、閾値よりもその感受性スコアが低い場合には耐性であると予測される。本明細書で用いられる用語「第１四分位」および「第３四分位」はそれぞれ、下位２５％値および上位２５％値を意味する。
【０１０５】
混合ガウスモデルでは、感受性スコアは、下記の通りに２つのガウス分布をまず決定することにより算出することができる。混合ガウスモデルを生成するために、C. Fraley et.al. (Technical Report no. 597, Department of Statistics, University of Washington, June 2012.)により開発された商用利用可能な「ｍｃｌｕｓｔ」パッケージ（バージョン４．３）をＲ統計学ソフトウェア（バージョン３．０．２）上で用いることができる。特に、混合ガウスモデルは以下のように生成することができる。感受性細胞株および耐性細胞株からなる細胞株パネルにおいて、シグネチャー遺伝子のｍＲＮＡ発現の分布は、感受性細胞株に由来する分布と耐性細胞株に由来する分布の混合として記述することができる。分布が正規分布であると想定すれば、混合分布は、混合ガウスモデル：
【数１】
2017532959.tif 000003
｛式中、λは、パラメーターセット：λ＝｛ωi、μi、σ｝、ｉ＝１，２であり、かつ、ωi、ｉ＝１，２は、混合重み付け値であり、ｇ（χ｜μi、σ）、ｉ＝１，２は、ガウス密度成分である。｝により記述される。それぞれの密度成分は、平均値μi、ｉ＝１，２を伴う、
【数２】
2017532959.tif 000004
の形態のガウス関数である。便宜的にμiは、μ1＜μ2の制約を満たすものとする。標準偏差σは、感受性細胞株および耐性細胞株の間で共通している、すなわちσ＝σ1＝σ2と仮定する。各パラメーターは、最尤推定法（これは訓練データが与えられたモデルの尤度を最大化するモデルのパラメーターを見つけることである）により、推定することができる。訓練ベクトルＸ＝｛χ1，．．．，χτ｝の配列に対して、尤度は、
【数３】
2017532959.tif 000005
と記載できる。最大尤度パラメーターは、期待値最大化（ＥＭ）アルゴリズムにより得ることができる。ＥＭアルゴリズムの基本的アイデアは、
【数４】
2017532959.tif 000006
となるように、新しいパラメーター
【数５】
2017532959.tif 000007
を前のパラメーターλから推定することである。λは、尤度が極大値に収束するまで繰り返し更新される。
混合ガウスモデルにおいては、閾値は、各種方法により得ることができる。その発現が細胞が感受性であることを示す遺伝子の数は、閾値の決定に有用であり得る。Ｍ種類の遺伝子に対して、各遺伝子の発現を、χm，ｍ＝１，．．．，Ｍと記述すると、遺伝子ｍのクラスは、
【数６】
2017532959.tif 000008
｛式中、Ｃmは、１または２であり、Ｃm＝１のとき遺伝子は「低い」（ｌｏｗｅｒ）、Ｃm＝２のとき「高い」（ｕｐｐｅｒ）と呼ばれる｝により記述できる。変数：
【数７】
2017532959.tif 000009
は、遺伝子ｍが属するクラスを記述するために導入され、「高い方の比率」（ｕｐｐｅｒ  ｒａｔｉｏ）は、
【数８】
2017532959.tif 000010
により与えられる。ある実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤に対する感受性スコアの閾値は、高い方の比率（ｕｐｐｅｒ  ｒａｔｉｏ）（６）を参照することにより決定することができる。例えば、閾値は、試料から選択されたＴＰ５３変異型試料の高い方の比率（ｕｐｐｅｒ  ｒａｔｉｏ）の第３四分位または最大値のレベルとして決定することができる。代わりに、閾値は、試料から選択されたＴＰ５３野生型試料の高い方の比率（ｕｐｐｅｒ  ｒａｔｉｏ）の第１四分位または最小値のレベルとして決定することもできる。試料は、その高い方の比率が閾値よりも高ければ感受性であると予測され、その高い方の比率（ｕｐｐｅｒ  ｒａｔｉｏ）が閾値よりも低ければ耐性であると予測される。
【０１０６】
スコア分布モデルでは、閾値は、各遺伝子のスコア分布ヒストグラムの形状に基づいて得ることができる。ある実施形態では、閾値は、スコア分布が谷間（すなわち、ヒストグラムの凹状部の最も低い部分）を形成する場所のスコア値に基づいて、好ましくは大津法により決定することができる。ある実施形態では、スコア分布ヒストグラムは、分析された遺伝子の発現レベルから算出されるＺ−スコアを合計することによって得ることができる。試料は、そのスコアが閾値よりも高い場合には感受性であると予測され、そのスコアが閾値よりも低い場合には耐性であると予測される。スコア分布モデルでは、代わりに、閾値は、全てのスコアがＴＰ５３野生型試料から得られている場合にはスコア分布ヒストグラムから決定することができ、好ましくは、スコアの第１四分位として決定することができる。
【０１０７】
ある実施形態では、閾値は、以下式（７）を用いて決定することもできる。
【数９】
2017532959.tif 000011
目的の試料のＭＤＭ２阻害剤に対する感受性は、試料の尤度比（Ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  ｒａｔｉｏ）を参照することにより決定することができ、例えば、この比が閾値を超えるなら感受性であると、この比が閾値を下回るなら耐性であると決定することができるが、ここで閾値は、０．２〜５、好ましくは０．５〜２、より好ましくは０．８〜１．２５の範囲であり、さらにより好ましくは約１である。
【０１０８】
他の実施形態では、本発明は、がんに罹患した個体のための治療および治療選択肢の改善に貢献する方法、試薬および情報であって、個体がＭＤＭ２ｉ薬剤、薬剤、または化合物での治療または療法から利益を得ることができる方法、試薬および情報を提供する。当業者が認識するように、本発明による治療または治療レジメンにおいてがんを治療すると決定されたまたはこれに必要な薬物、化合物、活性成分、組成物、または薬剤などのＭＤＭ２阻害剤が好ましくは使用され、治療有効量で対象に投与されるが、治療上有効量は、治療の量または用量として認定されることが意図されたものである。これは、組み合わせた量が所望の生物学的治療応答を達成することになる、第１および第２の治療の組み合わせた量などの複数のＭＤＭ２阻害剤、または複数の治療薬の使用に関わる併用療法を含む。
【０１０９】
本発明に従って、ＭＤＭ２ｉは、薬物投与に慣習的に使用され、当業者に公知の任意の経路によって投与され得る。非限定的な例として、ＭＤＭ２ｉは、経口で、非経口で、静脈内に、皮下に、頬側に、唇下に、鼻腔内に、皮内に、舌下に、くも膜下腔内に、筋肉内に、腹腔内に、直腸に、腟内に、胃に、または腸管に投与されてもよい。例えば、錠剤、カプセル剤、または液剤形での経口投与が好ましい。ＭＤＭ２ｉは、所望の応答を得るために、単一用量として、または必要に応じて複数用量で投与され得る。当業者によって認識されるように、投与のための用量は、治療を受けている個体、治療されている状態の重症度およびタイプならびに投与の様式に依存することになる。
【０１１０】
本発明の方法は、療法、特に、ＭＤＭ２ｉまたはアンタゴニスト療法に対するがんまたは腫瘍の感受性または応答性を決定するために、またはがんまたは新生物を有する対象の予後を決定するために使用することができる。このようにして、本発明は、がんに罹患している患者を治療する方法であって、がんが、がん組織における遺伝子感受性シグネチャーにおける遺伝子の発現の検出に基づいて（または遺伝子シグネチャーの分析によって得られた感受性スコアまたは評点によって）ＭＤＭ２ｉに対して感受性である方法を提供する。
【０１１１】
ある実施形態では、本発明は、ＭＤＭ２ｉでの治療に対するがん、腫瘍、または新生物を有する対象の感受性を予測する方法であって、対象から得られたがん、腫瘍、または新生物試料中の本発明のＭＤＭ２ｉ感受性遺伝子シグネチャーにおける複数の遺伝子の差次的発現を検出することを含み、複数の遺伝子が図１Ａ〜１Ｅに記載された；または遺伝子ＢＡＸ、Ｃ１ＱＢＰ、ＦＤＸＲ、ＧＡＭＴ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＳＬＣ２５Ａ１１、ＴＰ５３、ＴＲＩＡＰ１、ＺＭＡＴ３、ＡＥＮ、Ｃ１２ｏｒｆ５、ＧＲＳＦ１、ＥＩＦ２Ｄ、ＭＰＤＵ１、ＳＴＸ８、ＴＳＦＭ、ＤＩＳＣ１、ＳＰＣＳ１、ＰＲＰＦ８、ＲＣＢＴＢ１、ＳＰＡＧ７、ＴＩＭＭ２２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＡＣＡＤＳＢ、ＤＤＢ２、ＦＡＳ、ＧＤＦ１５、ＧＲＥＢ１、ＰＤＥ１２、ＰＯＬＨ、Ｃ１９ｏｒｆ６０、ＨＨＡＴ、ＩＳＣＵ、ＭＤＭ２、ＭＥＤ３１、ＭＥＴＲＮ、ＰＨＬＤＡ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＳＥＳＮ１およびＸＰＣを有する遺伝子シグネチャーにおける；または遺伝子ＭＤＭ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＺＭＡＴ３、ＤＤＢ２、ＦＤＸＲ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＢＡＸ、ＲＲＭ２Ｂ、ＳＥＳＮ１、ＣＣＮＧ１、ＸＰＣ、ＴＮＦＲＳＦ１０ＢおよびＡＥＮを有する遺伝子シグネチャーにおける；または遺伝子ＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲ、ＣＤＫＮ１Ａ、およびＡＥＮ（および場合によりＭＤＭ２）を有する遺伝子シグネチャーにおける遺伝子の少なくとも３つ、少なくとも４つ、または全てを含むまたはこれらからなる；がん、腫瘍、または新生物試料中の遺伝子シグネチャー遺伝子の発現を対照と比較する方法を提供する。方法では、対照と比較した、がん、腫瘍、または新生物試料中の図１Ａ〜１Ｅに記載された；または遺伝子ＢＡＸ、Ｃ１ＱＢＰ、ＦＤＸＲ、ＧＡＭＴ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＳＬＣ２５Ａ１１、ＴＰ５３、ＴＲＩＡＰ１、ＺＭＡＴ３、ＡＥＮ、Ｃ１２ｏｒｆ５、ＧＲＳＦ１、ＥＩＦ２Ｄ、ＭＰＤＵ１、ＳＴＸ８、ＴＳＦＭ、ＤＩＳＣ１、ＳＰＣＳ１、ＰＲＰＦ８、ＲＣＢＴＢ１、ＳＰＡＧ７、ＴＩＭＭ２２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＡＣＡＤＳＢ、ＤＤＢ２、ＦＡＳ、ＧＤＦ１５、ＧＲＥＢ１、ＰＤＥ１２、ＰＯＬＨ、Ｃ１９ｏｒｆ６０、ＨＨＡＴ、ＩＳＣＵ、ＭＤＭ２、ＭＥＤ３１、ＭＥＴＲＮ、ＰＨＬＤＡ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＳＥＳＮ１およびＸＰＣを有する遺伝子シグネチャーにおける；または遺伝子ＭＤＭ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＺＭＡＴ３、ＤＤＢ２、ＦＤＸＲ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＢＡＸ、ＲＲＭ２Ｂ、ＳＥＳＮ１、ＣＣＮＧ１、ＸＰＣ、ＴＮＦＲＳＦ１０ＢおよびＡＥＮを有する遺伝子シグネチャーにおける；または遺伝子ＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲ、ＣＤＫＮ１Ａ、およびＡＥＮ（および場合によりＭＤＭ２）を有する遺伝子シグネチャーにおける遺伝子の少なくとも３つ、少なくとも４つ、または全ての発現の増加がＭＤＭ２ｉに対するがん、腫瘍、または新生物の感受性を示し、それによって、ＭＤＭ２ｉ治療に対する対象の感受性を予測する。例として、一部の実施形態は、基準値、または健康な対象からの、もしくは試験を受けている対象からの非腫瘍化組織試料からの非がん、腫瘍、もしくは新生物組織試料などの対照と比較した、がんまたは腫瘍を有する対象から得られたがんまたは腫瘍試料中のＭＤＭ２ｉ感受性シグネチャー遺伝子の３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、または全て（少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または少なくとも４０など）の発現レベルにおける差異を検出することを含む。方法の実施形態では、対照と比較した発現の増加は、これらに限定されないが、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約８倍、または少なくとも約１０倍の増加とすることができる。
【０１１２】
本発明は、個体のがんまたは腫瘍がＭＤＭ２ｉでの治療に対して感受性である、または感受性である可能性があるかどうかを決定する方法と、この決定をそのがんがＭＤＭ２ｉを有する阻害剤に対して感受性である個体を治療するために利用する方法をさらに提供する。がんを有する個体がＭＤＭ２ｉでの治療に応答する可能性があるかまたはこれから利益を得る可能性があるかどうかを予測または予後診断する方法も提供される。実施形態によれば、本発明の方法では、例えば、保管された試料または新鮮生検材料の形の患者のがんまたは腫瘍の試料が、ＭＤＭ２ｉ療法の前に、対照と比較した本明細書に記載のＭＤＭ２ｉ感受性遺伝子シグネチャー内の遺伝子の発現レベルに関して分析され、ここで、遺伝子シグネチャーにおける遺伝子の複合発現レベルが感受性スコアとして報告され得る。当業者によって認識されるように、患者（例えば、ＭＤＭ２ｉ薬剤を用いた臨床研究における対象）から採取された実際の腫瘍試料から感受性スコアを引き出すことは、前臨床研究からかかるスコアを引き出すこととは異なることもあり得る。例として、臨床試料からの腫瘍試料に関して引き出された感受性スコアは、１つまたは複数の構成的に発現される遺伝子の発現レベルを利用する一方、前臨床研究からの試料では、スコアは、集団における他の試料の遺伝子レベルと比較して引き出され得る。それにもかかわらず、あるカットオフ値を超える感受性スコアを有する腫瘍試料は、ＭＤＭ２ｉに応答するより高い見込みを有することになることが予想される。カットオフ値は、公知のＴＰ５３遺伝子型判定状態を有する臨床試料を使用した検証研究に基づいてさらに決定され得、さらに、特徴付けられたｐ５３変異体は、低感受性スコアを示すことが予想される。さらに、カットオフ値は、ＭＤＭ２ｉ、例えば、化合物Ｂおよびその塩での治療に関わる臨床治験中の腫瘍応答の相関に基づいて調整もされ得る。
【０１１３】
ある実施形態では、本発明は、対象から得られたがんもしくは腫瘍試料中の図１Ａ〜１Ｅに列挙された遺伝子シグネチャーにおける、またはＢＡＸ、Ｃ１ＱＢＰ、ＦＤＸＲ、ＧＡＭＴ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＳＬＣ２５Ａ１１、ＴＰ５３、ＴＲＩＡＰ１、ＺＭＡＴ３、ＡＥＮ、Ｃ１２ｏｒｆ５、ＧＲＳＦ１、ＥＩＦ２Ｄ、ＭＰＤＵ１、ＳＴＸ８、ＴＳＦＭ、ＤＩＳＣ１、ＳＰＣＳ１、ＰＲＰＦ８、ＲＣＢＴＢ１、ＳＰＡＧ７、ＴＩＭＭ２２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＡＣＡＤＳＢ、ＤＤＢ２、ＦＡＳ、ＧＤＦ１５、ＧＲＥＢ１、ＰＤＥ１２、ＰＯＬＨ、Ｃ１９ｏｒｆ６０、ＨＨＡＴ、ＩＳＣＵ、ＭＤＭ２、ＭＥＤ３１、ＭＥＴＲＮ、ＰＨＬＤＡ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＳＥＳＮ１および／もしくはＸＰＣを含む遺伝子セットにおける、またはＭＤＭ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＺＭＡＴ３、ＤＤＢ２、ＦＤＸＲ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＢＡＸ、ＲＲＭ２Ｂ、ＳＥＳＮ１、ＣＣＮＧ１、ＸＰＣ、ＴＮＦＲＳＦ１０ＢおよびＡＥＮを含む遺伝子セットにおける、またはＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲ、ＣＤＫＮ１Ａ、およびＡＥＮ（および場合によりＭＤＭ２）を含む遺伝子セットにおける遺伝子の少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または全ての差次的発現レベル（例えば、対照と比較して増加した発現レベル）を検出し、対照と比較して、がん試料中の遺伝子のいくつかまたは全ての発現のレベルの差異がある場合、または決定された閾値もしくはカットオフ値を超えており、したがって、ＭＤＭ２ｉに対する試料の感受性を示す試料の遺伝子感受性シグネチャーから生成された感受性スコアもしくは評点に基づいて、がんまたは腫瘍をＭＤＭ２ｉでの治療に対して感受性であると同定することによって、がんまたは腫瘍がＭＤＭ２ｉでの治療に対して感受性であるかどうかを同定する、またはＭＤＭ２ｉに対するがんまたは腫瘍の感受性を予測する方法を提供する。対象からのがんまたは腫瘍試料中のＭＤＭ２ｉ感受性を示す遺伝子の発現のレベルを検出および測定することは、当技術分野で公知であり、本明細書に記載の方法によって行なわれ得る。様々な実施形態では、ＭＤＭ２ｉは、化合物Ａおよびその塩、化合物Ｂおよびその塩、スピロオキシインドール誘導体、インドール誘導体、ピロリジン−２−カルボキサミド誘導体、ピロリジノン誘導体、イソインドリノン誘導体、またはイミダゾチアゾール誘導体、およびその塩である。一部の実施形態では、ＭＤＭ２ｉは、ＣＧＭ０９７、ＲＧ７３８８、ＭＫ−８２４２（ＳＣＨ９００２４２）、ＭＩ−２１９、ＭＩ−３１９、ＭＩ−７７３、ＭＩ−８８８、Ｎｕｔｌｉｎ−３ａ、ＲＧ７１１２（ＲＯ５０４５３３７）、ＴＤＰ５２１２５２、ＴＤＰ６６５７５９、ＰＸＮ７２７またはＰＸＮ８２２、およびその塩である。
【０１１４】
一部の実施形態では、本発明は、対照と比較した、がんまたは新生物試料中の図１Ａ〜１Ｅに；表１に；または遺伝子ＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲ、ＣＤＫＮ１ＡおよびＡＥＮ（および場合によりＭＤＭ２）を含有する遺伝子シグネチャーに列挙された遺伝子シグネチャーバイオマーカー遺伝子の３つ以上、４つ以上、５つ以上（少なくとも６つなど）、または全ての発現のレベルの差異を検出することを含む、がんまたは腫瘍試料に及ぼすＭＤＭ２ｉ治療または療法の薬力学的効果を決定する方法を提供する。例として、一部の実施形態は、療法が開始される前に対象から得られた対照がんもしくは腫瘍試料などの対照、または他の適切な対照と比較した、がんまたは腫瘍を有する対象から得られたがんまたは腫瘍試料中のＭＤＭ２ｉ感受性シグネチャー遺伝子の３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、または全て（少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または少なくとも４０など）の発現レベルの差異を検出することを含み、ここで、遺伝子は、本明細書で図１Ａ〜１Ｅおよび表１に記載されたものなどの本明細書に記載の遺伝子シグネチャーを含む。
【０１１５】
方法の実施形態では、分析を受けるがんまたは腫瘍試料はまた、それが野生型ＴＰ５３遺伝子を有するかどうかを当技術分野で公知の方法によって決定するためにアッセイされてもよい。ある実施形態では、野生型ＴＰ５３遺伝子は、ｐ５３−ＭＤＭ２タンパク質間相互作用の阻害剤またはアンタゴニストに対する腫瘍細胞の感受性と関連し得るが；しかしながら、かかる薬剤に対する応答におけるいくらかの多様性がＴＰ５３野生型がん細胞型および腫瘍モデル間で観察され得る。ある実施形態では、本発明は、個体から得られたがんもしくは腫瘍試料中の本発明の遺伝子シグネチャーにおける、例えば、図１Ａ〜１Ｅにおける；表１における；または遺伝子セットＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲ、ＣＤＫＮ１Ａ、およびＡＥＮ（および場合によりＭＤＭ２）における遺伝子から選択される少なくとも３つ、もしくは少なくとも４つの遺伝子の発現のレベルを測定することと、がんまたは腫瘍試料が野生型ＴＰ５３遺伝子を有するかどうかを決定することとによって、ＭＤＭ２ｉでの治療に対する個体のがんまたは腫瘍の感受性を予測する方法を提供する。
【０１１６】
別の実施形態では、本発明は、ＭＤＭ２阻害剤治療に対する対象のがんまたは腫瘍の感受性を予測する方法であって、ａ）対象から得られたがんまたは腫瘍試料中の図１Ａ〜１Ｅに列挙された遺伝子から選択される少なくとも３つまたは少なくとも４つの遺伝子の発現のレベルを測定するステップ、およびｂ）がんまたは腫瘍試料が野生型ＴＰ５３遺伝子を有するかどうかを決定するステップを含む方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、がんまたは腫瘍を有する対象を治療する方法であって、ａ）ＭＤＭ２阻害剤治療に対する対象のがんまたは腫瘍の感受性を評価するステップであって、対象から得られたがんまたは腫瘍試料中の図１Ａ〜１Ｅに列挙された遺伝子から選択される少なくとも３つまたは少なくとも４つの遺伝子の発現のレベルを測定することを含むステップ；ｂ）がんまたは腫瘍が野生型ＴＰ５３遺伝子を有するかどうかを決定するステップ；およびｃ）ステップａ）の評価が、がんまたは腫瘍がＭＤＭ２阻害剤に対して感受性であることを示し、かつがんまたは腫瘍検体が野生型ＴＰ５３遺伝子を有する場合、対象に有効量のＭＤＭ２阻害剤を投与して、がんまたは腫瘍を治療するステップを含む方法を提供する。
【０１１７】
本発明によってもたらされる利点は、ＭＤＭ２阻害剤に対するがんまたは腫瘍試料の感受性を予測することにおいて、開示された遺伝子シグネチャーにおける遺伝子の発現レベルを評価する記載された方法がＴＰ５３遺伝子型判定単独をしのぐということである。したがって、記載された方法は、がんおよび腫瘍に関するＭＤＭ２ｉでの治療の決定に関する当技術分野における利益および改善を提供する。かかる場合の例示的であるが、非限定的な例は、全体的にみて、ｐ５３機能を下方制御するＥ６腫瘍性タンパク質を産生するヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に感染している子宮頸がんに関して生じる。子宮頸がん細胞は、ＴＰ５３に関して野生型であることがしばしば見出される一方、それらは、典型的に、ＭＤＭ２阻害に対して非感受性である。例えば、表２に示すように、ＨＰＶに感染したＴＰ５３野生型Ｃ４ＩＩ、Ｃ４Ｉ、ＳｉＨａおよびＨｅｌａ（ＨＰＶ１８：Ｃ４ＩＩおよびＣ４Ｉ；ＨＰＶ１６：ＳｉＨａおよびＨｅｌａ）は、ＭＤＭ２ｉに対して非感受性であり、ＨＰＶによるそれらの感染およびその関連する細胞内効果とおそらく関連がある結果である、本発明のＭＤＭ２ｉ遺伝子シグネチャー内の遺伝子の低発現レベルを示した。したがって、本発明のＭＤＭ２ｉ遺伝子感受性シグネチャーおよびそれらの使用を含む方法は、所与のがんまたは腫瘍型がＭＤＭ２ｉでの治療に対して感受性である可能性があるかどうかをより正確に予測するための唯一の手段、または最も信頼できる手段とすることができる。そういうものとして、本発明は、患者治療および個別化された医療のための時間と費用の両方を節約する利益を提供する。
【０１１８】
ある態様では、本発明は、対象のがんまたは腫瘍のＭＤＭ２ｉ治療への感受性を予測する方法であって、ａ）対象から得られたがんまたは腫瘍試料において図１Ａ〜１Ｅに列挙された遺伝子から選択される少なくとも３つの遺伝子の発現レベルを測定することと；ｂ）ステップａ）において得られた発現レベルをスコア化して対象の感受性スコアを得ることと；ｃ）複数のがんまたは腫瘍における前記少なくとも３つの遺伝子の発現レベルを測定することと、ここで、これら試料の少なくとも一部のＭＤＭ２ｉ治療への感受性は不明であり；ｄ）ステップｃ）において得られた発現レベルをスコア化して各試料における参照スコアを得て、参照スコアの分布に基づいて閾値を決定すること；およびｅ）対象の感受性スコアが閾値を超えたら対象はＭＤＭ２ｉ治療に対して感受性であると予測し、対象の感受性スコアが閾値を下回ったら対象はＭＤＭ２ｉ治療に対して耐性であると予測すること、を含む方法を提供する。ある実施形態では、ステップｃ）において測定されるがんまたは腫瘍試料の数は、４以上、６以上、８以上、１０以上、１５以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、１００以上、２００以上、３００以上、４００以上、５００以上、または１０００以上とし得る。ある特定の実施形態では、ステップｃ）において測定されるがんまたは腫瘍試料の数は、６〜２０の範囲とし得る。
ある実施形態では、ステップｄ）は、試料をＴＰ５３野生型の試料群とＴＰ５３変異型の試料群とに分けることと、その後、ＴＰ５３野生型試料および／またはＴＰ５３変異型試料の参照スコアの分布に基づいて閾値を決定することを含んでいてもよい。ある特定の実施形態では、本発明の方法のｅ）における閾値は、試料のうちＴＰ５３変異型試料の参照スコアの第３四分位値および最大値の間の範囲である。他の実施形態では、ｅ）における閾値は、試料のうちＴＰ野生型試料の参照スコアの第１四分位値または最小値の間の範囲である。
【０１１９】
ある特定の実施形態では、本発明は、ステップｆ）耐性であると予測された対象がＭＤＭ２の過剰発現を示す場合には当該対象はＭＤＭ２ｉ治療に対して感受性であると予測することをさらに含む。本発明者らは、ＭＤＭ２ｉ治療に対して感受性である腫瘍が、時折、本発明のステップａ）〜ｄ）により耐性であると予測されること、および、この誤った予測が腫瘍におけるＭＤＭ２の過剰発現に起因することを見出した。本発明者らはまた、この誤った予測が腫瘍におけるＭＤＭ２の過剰発現を決定することにより正しく修正できることを見出した。従って、ある実施形態では、本発明は、ＭＤＭ２ｉ治療に対する対象のがんまたは腫瘍の感受性を予測する方法であって、ａ）対象から得られたがんまたは腫瘍試料において図１Ａ〜１Ｅに列挙された遺伝子から選択される少なくとも３つの遺伝子の発現レベルを測定することと；ｂ）ステップａ）において得られた発現レベルをスコア化して対象の感受性スコアを得ることと；ｃ）複数のがんまたは腫瘍における前記少なくとも３つの遺伝子の発現レベルを測定することと、ここで、これら試料の少なくとも一部のＭＤＭ２ｉ治療への感受性は不明であり；ｄ）ステップｃ）において得られた発現レベルをスコア化して各試料における参照スコアを得て、参照スコアの分布に基づいて閾値を決定すること；ｅ）対象の感受性スコアが閾値を超えたら対象はＭＤＭ２ｉ治療に対して感受性であると予測し、対象の感受性スコアが閾値を下回ったら対象はＭＤＭ２ｉ治療に対して耐性であると予測すること；およびｆ）耐性であると予測された対象がＭＤＭ２の過剰発現を示す場合には当該対象はＭＤＭ２ｉ治療に対して感受性であると予測すること、を含む方法を提供する。本発明者らはさらにまた、ＴＰ５３遺伝子が野生型である腫瘍が、時折、本発明のステップａ）〜ｄ）により耐性であると予測されるが、当該腫瘍は実際にはＭＤＭ２ｉ治療に対して感受性であり、この誤った予測が腫瘍におけるＭＤＭ２の過剰発現に起因することを見出した。従って、ある実施形態では、ステップｆ）は、耐性であると予測された対象がＭＤＭ２の過剰発現を示し、かつ、野生型ＴＰ５３遺伝子を有する場合には、当該対象をＭＤＭ２ｉ治療に対して感受性であると予測するステップとしもよい。当業者であれば、訓練セット（ここで、試料の少なくとも一部のＭＤＭ２ｉ治療への感受性が不明である）におけるＭＤＭ２の平均発現レベルと、対象におけるＭＤＭ２の発現レベルを比較して、当該対象がＭＤＭ２の過剰発現を示しているか否かを決定することができる。当業者であれば、その発現レベルが平均よりも５倍以上、１０倍以上、２０倍以上、５０倍以上、１００倍以上、２００倍以上、５００倍以上、１０００倍以上、２０００倍以上、または３０００倍以上強いときに、当該対象がＭＤＭ２の過剰発現を示していると決定し得る。ある実施形態では、ＭＤＭ２の過剰発現は、当該対象のゲノムにおけるＭＤＭ２遺伝子の増幅により生じ得る。
【０１２０】
また、本発明は、ＭＤＭ２ｉ治療に対する対象のがんまたは腫瘍の感受性を予測する方法であって、ｘ）当該対象のがんまたは腫瘍におけるＴＰ５３の遺伝子型とＭＤＭ２の発現レベルを決定すること、ｙ）ＴＰ５３が野生型であり、がんまたは腫瘍がＭＤＭ２ｉ治療への感受性が不明である試料におけるＭＤＭ２の発現の平均を超えてＭＤＭ２の過剰発現を示す場合には、治療に感受性であると対象を予測すること、ＴＰ５３が野生型で、かつＭＤＭ２の発現レベルが平均を超える場合でなければ、以下のステップを実施すること：ａ）対象から得られたがんまたは腫瘍試料において図１Ａ〜１Ｅに列挙された遺伝子から選択される少なくとも３つの遺伝子の発現レベルを測定することと；ｂ）ステップａ）において得られた発現レベルをスコア化して対象の感受性スコアを得ることと；ｃ）複数のがんまたは腫瘍における前記少なくとも３つの遺伝子の発現レベルを測定することと、ここで、これら試料の少なくとも一部のＭＤＭ２ｉ治療への感受性は不明であり；ｄ）ステップｃ）において得られた発現レベルをスコア化して各試料における参照スコアを得て、参照スコアの分布に基づいて閾値を決定すること；ｅ）対象の感受性スコアが閾値を超えたら対象はＭＤＭ２ｉ治療に対して感受性であると予測し、対象の感受性スコアが閾値を下回ったら対象はＭＤＭ２ｉ治療に対して耐性であると予測すること、を含む方法を提供する。
【０１２１】
ある実施形態では、ステップｂ）およびｄ）は、遺伝子の発現レベルの正規化スコアを合計することを含む。ある実施形態では、閾値は、受信者動作特性（ＲＯＣ）プロットに基づいて、場合により、一個抜き交差検証（ＬＯＯＣＶ）解析を行って決定される。ある特定の実施形態では、閾値は、受信者動作特性（ＲＯＣ）プロットのＹｏｕｄｅｎ指数±０．３、好ましくは±０．２、より好ましくは±０．１の範囲であり、さらに好ましくは、Ｙｏｕｄｅｎ指数と実質的に等価である。
【０１２２】
ある実施形態では、閾値は、大津法などの二値化アルゴリズムによって参照スコアの形状から決定される。
【０１２３】
ある実施形態では、閾値は、混合ガウスモデルにより決定される。ある実施形態では、閾値は、ステップｄ）の混合ガウスモデルにおける２つのガウス分布を用いることにより、対象が耐性であることを示す遺伝子の数に対する対象が感受性であることを示す遺伝子の数の比に基づいて決定される。ある特定の実施形態では、ステップｅ）における閾値は、試料のうち、ＴＰ５３変異型試料の当該割合の第３四分位値と最大値の間か；または試料のうち、ＴＰ５３野生型試料の当該割合の第１四分位値と最小値の間に範囲する。
ある実施形態では、本発明は、ＭＤＭ２ｉ治療に対する対象のがんまたは腫瘍の感受性を予測する方法であって、複数の予測を実施すること、ここで各予測は上記したステップａ）〜ｄ）、ステップａ）〜ｅ）、またはステップａ）〜ｆ）を含み、かつ、ステップｃ）におけるがん試料または腫瘍試料の少なくとも一部または全てが予測間で異なり、および、当該対象が感受性であることを示す予測結果の数が実施した総予測数の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、または９０％以上である場合に、当該対象がＭＤＭ２ｉ治療に対して感受性であると予測し、当該対象が感受性であることを示す予測結果の数が上記パーセンテージを下回る場合に、当該対象がＭＤＭ２ｉ治療に対して抵抗性であると予測することを含む、方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明の方法は、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上、または１００以上の予測を実施することを含み、各予測は、上記したステップａ）〜ｄ）、ステップａ）〜ｅ）、またはステップａ）〜ｆ）を含み、ステップｃ）においてがん試料または腫瘍試料の少なくとも一部または全部が予測間で異なる、方法を提供する。
【０１２４】
ある態様では、本発明は、がんまたは腫瘍を有する対象を治療する方法であって、ａ）訓練セットとしてＭＤＭ２ｉ治療に対する感受性が不明である試料を用いた本発明の方法によってＭＤＭ２ｉ治療に対する対象のがんまたは腫瘍の感受性を評価することと、ｂ）評価が、がんまたは腫瘍がＭＤＭ２ｉに対して感受性であることを示す場合に、有効量のＭＤＭ２ｉを当該対象に投与してがんまたは腫瘍を治療することとを含む、方法を提供する。
【０１２５】
ある態様では、本発明は、対象においてがんまたは腫瘍を治療することに用いるための医薬組成物であって、ＭＤＭ２ｉを含み、対象は、訓練セットとしてＭＤＭ２ｉ治療に対する感受性が不明である試料を用いた本発明の方法によってＭＤＭ２ｉ治療に対する対象のがんまたは腫瘍の感受性を予測することによって、ＭＤＭ２ｉ治療に対して感受性であると決定された対象である、医薬組成物を提供する。
【０１２６】
ある実施形態では、がんまたは腫瘍は、メラノーマである。
【０１２７】
ある実施形態では、本発明の方法によってもたらされる遺伝子発現／遺伝子シグネチャー分析の結果は、臨床家もしくは他の医療専門家もしくはヘルスケア従事者、実験室職員、または患者などの開業医またはユーザーに分析の結果に関する情報を提供する知覚可能なアウトプットで提供され得る。ある場合には、アウトプットは、書かれたもしくは印刷されたコピー、または図表、グラフ、またはダイヤグラム、またはディスプレイ（例えば、コンピュータースクリーン）上で可視のものなどの紙もしくはグラフィックの形であってもよいし、または可聴のアウトプットのようなものであってもよい。ある実施形態では、アウトプットは、試料中の数値、または対照と比較した、試料中の遺伝子シグネチャー遺伝子の１つまたは複数の相対量である。数値は、例えば、ＭＤＭ２ｉ感受性に関する本明細書に記載の遺伝子シグネチャーに関する、またはｐ５３状態に関する、または対照値と比較した、例えば、本明細書に記載の遺伝子シグネチャーを含む遺伝子もしくは遺伝子のセットの発現レベルに関するものであってもよい。アウトプットがグラフの形である場合、グラフ表示は、検量線に対してプロットされた対象からの試料における、本明細書で遺伝子シグネチャーにおいて記載された遺伝子または遺伝子セットの値、例えば、量または相対量を示すグラフとすることができる。アウトプット、またはグラフィックアウトプットは、がんがＭＤＭ２ｉに対して感受性であることを示すカットオフ値またはレベルを実証または提供し得る。アウトプットは、値またはレベルがカットオフ値を超えている場合、対象がＭＤＭ２ｉ治療に対してより感受性である可能性があるがんまたは腫瘍を有することを予測し得る。アウトプットは、電子的、可聴または物理的手段によって、例えば、郵便、電子メール、ファクシミリ、電話、または電子的診療記録コミュニケーションによってそれが提供または伝えられることを通してユーザーに伝達され得る。代わりに、アウトプットは、値またはレベルがカットオフ未満である場合、対象のがんまたは新生物がＭＤＭ２ｉ治療に対して感受性である可能性が低いことを示し得る。
【０１２８】
一部の実施形態では、アウトプットは、例えば、物理的、可聴、または電子的手段（例えば、郵便、電話、ファクシミリ送信、電子メール、または電子的診療記録へのコミュニケーションによって）を通してアウトプットを提供することによって、ユーザーに伝達される。アウトプットの様々な型は、定量的情報、例えば、試料中で見出される遺伝子シグネチャーにおける遺伝子もしくは遺伝子のセットのレベルもしくは量、または対照試料もしくは対照値と比較して記載された遺伝子もしくは遺伝子セットの量またはレベルを提供し得る。かかるアウトプットはまた、定性的情報、例えば、ＭＤＭ２ｉ感受性の決定またはＭＤＭ２ｉ感受性の予後診断を提供し得る。アウトプットはさらに、対照と比較した、記載された遺伝子または遺伝子セットの１つまたは複数、少なくとも３つ、または少なくとも４つの発現の増加もしくは減少、または対照と比較して、記載された遺伝子または遺伝子セットの１つまたは複数間の差異がないことを同定するまたは明らかにするなどの、試料中の遺伝子シグネチャー内の遺伝子の１つまたは複数の相対量に関する定性的情報を提供し得る。いくつかの場合では、遺伝子発現分析は、試料中の１つまたは複数の追加のがんバイオマーカーの量またはレベルの決定などの他の臨床情報の決定を含み得る。いくつかの場合では、遺伝子発現分析または試験は、オリゴヌクレオチドまたは抗体アレイなどのアレイを含み得、分析または試験のアウトプットは、本発明の遺伝子シグネチャーの開示された遺伝子構成要素の１つまたは複数に関する定量的および／または定性的情報、ならびに１つまたは複数の追加の遺伝子に関する定量的および／または定性的情報を含み得る。
【０１２９】
がんおよび腫瘍タイプならびにサブタイプ
ＭＤＭ２ｉに対する彼／彼女のがんまたは腫瘍検体の感受性を決定するための試験を受ける患者は、本質的に任意の組織または器官のがんまたは腫瘍に罹患していてもよく、がんまたは腫瘍検体は、本明細書に記載のＭＤＭ２ｉ治療の選択または開始前の手順によって患者から得られ得る。がんまたは腫瘍は、原発性でも再発性でもよく、（本明細書に記載の）任意のタイプ、ステージ（例えば、ステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、もしくはＩＶまたは他のステージ分類システムの同等のもの）、および／または組織学的検査のものとすることができる。患者は、任意の年齢、性別、活動状態、および／または疾患もしくは寛解の任意の程度および持続時間のものとすることができる。遺伝子発現プロファイルは、外科手術または生検によって患者から除去された腫瘍試料などの腫瘍組織または細胞試料に関して決定され得る。ある場合では、がんもしくは腫瘍試料、またはそこからの細胞は、細胞培養物でまたは免疫欠損動物における異種移植片として樹立され得る。ある場合では、試料は、患者からの除去後に凍結され、後のＲＮＡ単離のために保存され得る。ＲＮＡ単離に関する試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織とすることができる。培養物中の悪性細胞を濃縮するまたは増やすためのプロセスは、例えば、米国特許第５，７２８，５４１号、第６，９００，０２７号、第６，８８７，６８０号および第６，９３３，１２９号に見出され得る。
【０１３０】
一部の実施形態では、対象が罹患したおよび／または本発明の方法による評価を受けているがんまたは腫瘍は、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸がん、膵がん、乳がん、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、滑膜腫、扁平上皮がん、基底細胞がん、汗腺がん、脂腺がん、乳頭がん、乳頭状腺がん、髄様がん、気管支原性肺がん、腎細胞がん、腺がん、肝がん、肝細胞がん、胆管がん、絨毛がん、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、膀胱がん、ならびに神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽細胞腫および網膜芽細胞腫などの脳および中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍を含めた、がん腫または肉腫などの固形腫瘍または新生物である。
【０１３１】
他の実施形態では、腫瘍または新生物は、血液がん、例えば、白血病、例えば、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病、骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病および赤白血病；慢性白血病、例えば、慢性骨髄性（顆粒球）白血病、慢性骨髄性白血病、および慢性リンパ球性白血病などの白血病；真性赤血球増加症；リンパ腫；リンパ系腫瘍、ホジキン病；非ホジキンリンパ腫、例えば、バーキットリンパ腫およびマントル細胞リンパ腫を含めた無痛性および高悪性度形；多発性骨髄腫；形質細胞腫；ワルデンシュトレームマクログロブリン血症；重鎖病；骨髄異形成症候群ならびに脊髄形成異常症において生じる異常な細胞増殖を含む。
【０１３２】
特定の実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤が治療として使用され得、本発明の遺伝子シグネチャーおよび関連する方法が特に適用され得るがんまたは腫瘍は、軟部組織腫瘍を含めたいろいろな固形腫瘍、および血液がんを含む。例証的に、これらに限定されないが、本発明の遺伝子シグネチャーが特定の関連性を有し得るがん型（またはサブタイプ）は、骨髄腫、多発性骨髄腫、メラノーマ、リンパ腫、白血病（例えば、ＡＬＬ、ＡＭＬ）、腎臓、脳および中枢神経系（ＣＮＳ）、肉腫、胃、頸部、前立腺、乳房、肝臓、腎、膀胱、肺（例えば、ＮＳＣＬＣ）、膵臓、頭頸部、結腸直腸、食道、精巣、前立腺、卵巣、頸部、および他のものを含む。ある実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤に対する感受性を示す遺伝子シグネチャーの使用は、メラノーマ、骨髄腫、神経膠芽腫、リンパ腫（例えば、ＤＬＢＣＬ）、白血病、脳およびＣＮＳがん、ならびに肉腫などのがんのタイプを治療するのに特に有益である。ある実施形態では、がんまたは腫瘍は、機能的ｐ５３タンパク質を有する。
【０１３３】
他の実施形態では、腎ウィルムス腫瘍、顆粒腎細胞癌、腎膨大細胞腫、バーキットリンパ腫、意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症、乳頭状腎細胞癌、メラノーマ、多発性骨髄腫、皮膚骨髄腫、嫌色素性腎細胞癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（例えば、菌状息肉腫およびセザリー症候群）、乏突起膠腫、星状細胞腫、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、神経膠芽腫、子宮内膜混合腺癌、結腸直腸腺腫、副甲状腺腺腫、滑膜肉腫、線維肉腫および甲状腺腫などの特定のがんサブタイプは、ＭＤＭ２ｉ感受性に関して高いスコアを得、それによってそれらはＭＤＭ２阻害剤での治療に関しておよびＭＤＭ２ｉ治療に対する可能性のある陽性の応答を達成することに関して特に関連のあるものとなる。これらのがんサブタイプは、本発明の遺伝子シグネチャーにおける遺伝子の発現を示す可能性があり、ＭＤＭ２ｉでの治療に対して感受性である可能性がある。
【０１３４】
特定の実施形態では、本明細書に記載の化合物ＡおよびＢなどのＭＤＭ２阻害剤に対する感受性の高頻度を有することが決定されるものに含まれるがんのタイプおよびサブタイプの非限定的な例は、腎腫瘍（例えば、ウィルムス腫瘍）、リンパ腫（例えば、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、メラノーマ（例えば、皮膚メラノーマ）、がん腫（例えば、乳頭状腎細胞がん、嫌色素性腎細胞がん、骨髄腫（例えば、多発性骨髄腫）、白血病（例えば、ＡＬＬおよびＡＭＬ）、神経膠芽腫、星状細胞腫、乏突起膠腫などである。
【０１３５】
遺伝子発現およびＭＤＭ２ｉ感受性
当技術分野で公知であり使用されるいろいろな方法、技術および手順は、本発明のＭＤＭ２ｉ遺伝子感受性シグネチャーと関連する遺伝子の発現レベルの検出のために、がん、または非がん細胞、組織もしくは器官試料および検体をアッセイするために用いられ得る。ある実施形態では、試料中の記載されたバイオマーカー遺伝子（本明細書で、図１Ａ〜１Ｅに；表１に；または遺伝子ＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲ、ＣＤＫＮ１ＡおよびＡＥＮ（および場合によりＭＤＭ２）を含有する遺伝子シグネチャーセットに列挙された遺伝子の少なくとも３つ、または少なくとも４つ、または全てなど）の発現レベルは、各バイオマーカー遺伝子から転写される核酸の量またはレベルを定量化することによって決定され得る。様々な態様では、遺伝子発現プロファイルは、試料中のＲＮＡ転写物レベルを決定するための任意の定量的または半定量的方法を使用して、作成され得る。かかる方法の例は、これらに限定されないが、マイクロアレイ分析および類似したフォーマット（例えば、Whole Genome DASL Assay、Illumina、Inc.、San Diego、CA）などのハイブリダイゼーションに基づくアッセイ、ＲＴ−ＰＣＲ（例えば、ＴＡＱＭＡＮ（商標））、またはリアルタイム定量的逆転写ＰＣＲ（リアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲ）（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；またはＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって商品化されているような）などのポリメラーゼに基づくアッセイ、フラップエンドヌクレアーゼに基づくアッセイ（例えば、ＩＮＶＡＤＥＲ（商標）アッセイ）、および本明細書でさらに記載される分岐ＤＮＡでの直接的なＲＮＡ（ｍＲＮＡ）捕獲（ＱＵＡＮＴＩＧＥＮＥ（商標）ＶｉｅｗＲＮＡ，Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）、ＨＹＢＲＩＤ  ＣＡＰＴＵＲＥ（商標）（Ｄｉｇｅｎｅ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、またはＮＣＯＵＮＴＥＲ（商標）Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ）に関わるマルチプレックスアッセイを含む。あるいは、またはさらに、バイオマーカー遺伝子から転写されたｍＲＮＡから翻訳された特異的なタンパク質のレベルは、本明細書でさらに記載される方法により、決定してもよい。
【０１３６】
アッセイフォーマットは、図１Ａ〜１Ｅ、表１に示された遺伝子シグネチャーに；および遺伝子ＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲ、ＣＤＫＮ１ＡおよびＡＥＮ（および場合によりＭＤＭ２）を含有するＭＤＭ２ｉ遺伝子感受性シグネチャーに列挙された遺伝子の組合せに関する遺伝子発現レベルを決定することに加えて、試験間の内因性シグナル強度変動などのパラメーターの調節も可能にすることになる。かかる調節は、例えば、バックグラウンドシグナル強度および／または試料プロセシングに関する調節、および／または試料にわたる遺伝子発現定量化に関する他の望ましい調節を含み得る。例えば、試料間の発現レベルは、ＭＤＭ２ｉ感受性細胞中で高度に発現されるもしくはされない、または集団にわたって類似したレベルで一般に発現される１つまたは複数の遺伝子、例えば、少なくとも３つまたは少なくとも４つの遺伝子の発現レベルを試験することによって調節され得る。かかる遺伝子は、当技術分野で公知であり、本明細書で記載された構成的に発現される遺伝子を含み得る。遺伝子発現レベルを決定するため、したがって遺伝子発現プロファイルおよび薬物感受性を作成するための例示的なアッセイフォーマットが本明細書で記載される。
【０１３７】
核酸試料
本発明の方法における核酸検出に関して、核酸試料は、典型的に、試験を受けているがんまたは腫瘍からの細胞、組織、もしくは器官試料または検体から得られたまたは単離されたｍＲＮＡまたは逆転写されたｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）の形である。ある実施形態では、試料中の核酸は、一般に、試料内の転写物の表示を片寄らせないように、クローニングまたは増幅され得る。一部の実施形態では、追加のプロセシングステップを回避するために、クローニングまたは増幅なしに、供給源として全ＲＮＡまたはポリＡ＋ＲＮＡを使用することが好ましい場合がある。ＲＮＡは、市販のキットの使用を含めた当業者に公知の方法を使用して、対象からのがん試料、例えば、腫瘍または新生物、例えば、メラノーマ、リンパ腫、または多発性骨髄腫腫瘍もしくは新生物、および／または対象からの隣接する非腫瘍組織の１つまたは複数の試料、正常もしくは健康な対象からの腫瘍のない組織の試料から単離することができる。全ｍＲＮＡを単離する方法は、当技術分野で公知であり、Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９７）を含めた、詳細なプロトコールおよびガイダンスを提供する分子生物学の標準な教科書に報告されている。パラフィン包埋組織からのＲＮＡ抽出に関する方法は、例えば、Ｒｕｐｐ  ａｎｄ  Ｌｏｃｋｅｒ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：５６〜６０（１９８８）、およびＤｅ  Ａｎｄｒｅｓら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １８：４２〜４４（１９９５）に開示されている。さらに、核酸の単離および精製の方法は、多数の学術的および商業的供給源に報告されているおり、この非限定的な例は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２０１２，Ｂｙ  Ｍ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（５th  Ｅｄｉｔｉｏｎ），２００２，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ら，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．；Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３，Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ：Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｅｄ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３（および後の版）を含む。核酸試料は、ＲＮＡ試料および目的の細胞または検体から単離されたｍＲＮＡ試料から合成されたｃＤＮＡを含む。かかる試料は、ｃＤＮＡから増幅されたＤＮＡ、および増幅されたＤＮＡから転写されたＲＮＡも含む。
【０１３８】
遺伝子発現検出に関して、図１Ａ〜１Ｅにおける；表１における；または遺伝子セットＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲ、ＣＤＫＮ１ＡおよびＡＥＮにおける遺伝子などの本発明の遺伝子シグネチャーにおいて列挙された遺伝子またはそのサブセットの少なくとも３つ、少なくとも４つ、または全てのヌクレオチド配列などのヌクレオチド配列の特定された長さを含む単離された核酸分子、例えば、オリゴヌクレオチドまたはプローブは、本明細書に記載されたように包含される。
【０１３９】
一例では、ＲＮＡの単離は、ＱＩＡＧＥＮ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）などの商業的製造者製の精製キット、緩衝液セットおよびプロテアーゼを製造者の説明書に従って使用して、行なうことができる。例えば、がん細胞（例えば、がんを有する対象から得られた）からの全ＲＮＡは、ＱＩＡＧＥＮ  ＲＮｅａｓｙ（商標）ミニカラムを使用して単離することができる。他の市販のＲＮＡ単離キットとしては、ＭＡＳＴＥＲＰＵＲＥ（商標）Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（商標）Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、およびＰａｒａｆｆｉｎ  Ｂｌｏｃｋ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ、Ｉｎｃ．）が挙げられる。組織試料からの全ＲＮＡは、ＲＮＡ  Ｓｔａｔ−６０（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ）を使用して単離され得る。生物学的試料（がん試料または検体）から調製されたＲＮＡは、例えば、当業者に公知の塩化セシウム密度勾配遠心法によっても単離することができる。本明細書で考察されるように、検出方法のいくつかの例では、１つまたは複数の「ハウスキーピング」遺伝子または「内部対照」の発現レベルも評価され得る。かかる対照は、その存在が開示された遺伝子発現シグネチャーの遺伝子（またはタンパク質）レベルの評価を可能にする任意の構成的にまたは普遍的に発現される遺伝子（またはタンパク質）を含む。かかる評価は、遺伝子転写の全体的な構成レベルの決定およびＲＮＡ（またはタンパク質）回収における変動に関する調節を含む。
【０１４０】
ハイブリダイゼーションに基づくフォーマット、手順およびアッセイ
本発明の遺伝子シグネチャーの遺伝子の発現に関する遺伝子発現プロファイリングは、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション分析、ポリヌクレオチドの配列決定、および、プロテオミクスをベースとした方法に基づいた方法を使用して、行なわれ得る。一部の実施形態では、試料中のｍＲＮＡ発現レベルは、ノーザンブロッティングまたはｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（Ｐａｒｋｅｒ＆Ｂａｒｎｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０６：２４７〜２８３，１９９９）；ＲＮＡｓｅ保護アッセイ（Ｈｏｄ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：８５２〜４，１９９２）；および逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）（Ｗｅｉｓら，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８：２６３〜４，１９９２）、または定量的リアルタイムＰＣＲなどのＰＣＲに基づく方法を使用して定量化される。代わりに、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖またはＤＮＡ−タンパク質二本鎖を含めた特定の二本鎖を認識する抗体が使用され得る。ビーズに基づくマルチプレックスアッセイ、例えば、Ｌｕｍｉｎｅｘ  ｘＭＡＰ（商標）アッセイも利用され得る。これらに限定されないが、配列決定に基づく遺伝子発現分析の方法は、Ｓｅｒｉａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＳＡＧＥ）および大規模並列シグネチャー配列決定（ＭＰＳＳ）による遺伝子発現分析を含む。一例では、ＲＴ−ＰＣＲは、正常およびがん組織中などの種々の試料中のｍＲＮＡレベルを比較して、遺伝子発現レベルのパターンを特徴付ける、密接に関連するｍＲＮＡ間を区別する、およびＲＮＡ構造を分析するために使用され得る。
【０１４１】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）は、核酸ハイブリダイゼーションの技術を単一細胞レベルに適用し外挿する、目的の遺伝子の発現レベルを検出し比較する方法を提供する。細胞化学、免疫細胞化学および免疫組織化学技法と組み合わせて、ＩＳＨは、細胞マーカーの形態が維持され同定されることを可能にし、組織および血液試料などの集団内の特定の細胞に対して配列の場所をつきとめることをさらに可能にする。ＩＳＨのハイブリダイゼーションは、相補的核酸を利用して、１つまたは複数の特定の核酸配列の場所を組織の部分もしくは切片において、すなわち、ｉｎ  ｓｉｔｕで、または組織が十分小さい場合、組織全体（ホールマウントＩＳＨ）においてつきとめる。ＲＮＡ  ＩＳＨは、開示された遺伝子の発現レベルなどの組織における発現パターン（ｍＲＮＡ）をアッセイするために使用することができる。本方法では、試料細胞または組織は、遺伝子特異的プローブなどのプローブが細胞に入ることを可能にするために、それらの透過性を増加させるために処理される。プローブは、処理細胞に加えられ、適切な温度でハイブリダイズするようにおかれ、過剰なプローブは、洗い流される。相補的プローブは、例えば、オートラジオグラフィー、蛍光顕微鏡法またはイムノアッセイを使用して、分析を受けている組織においてプローブの位置および量を決定することができるように標識される。試料は、がん試料または非がん試料などの本明細書に記載の試料のいかなるタイプでもよい。目的の遺伝子の配列は公知であるので、プローブは、プローブが目的の遺伝子に特異的に結合するのを可能にするように適切に設計することができる。
【０１４２】
ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲは、ＩＳＨ検出の前に行なわれる、標的核酸配列のＰＣＲに基づく増幅である。ＲＮＡの検出のために、細胞内逆転写ステップがｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲの前に導入されて、ＲＮＡ鋳型から相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が生成される。これは、低コピー数のものであるＲＮＡ配列の検出を可能にする。ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲの前に、細胞または組織試料は、形態を保存し、増幅されることになる細胞内配列へのＰＣＲ試薬の接近を可能にするために固定され、透過処理される。次いで、標的配列のＰＣＲ増幅が懸濁液中の無傷の細胞上で、または直接的にスライドガラス上の細胞遠心機調製物もしくは組織切片において行なわれる。前者の手法では、ＰＣＲ反応混合物に懸濁された固定された細胞は、従来のサーマルサイクラーを使用して熱的にサイクルされる。ＰＣＲ増幅後、細胞は、スライドガラス上に細胞遠心分離されて、ＩＳＨまたは免疫組織化学的検査による細胞内ＰＣＲ産物の可視化を可能にする。スライドガラス上での細胞または組織試料のｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲは、試料をＰＣＲ混合物で覆い、カバースリップを適用し、次いで、反応混合物の蒸発を防ぐために密封することによって行なわれる。サーマルサイクリングは、当業者に公知のように、スライドガラスを従来のまたは特別に設計されたサーマルサイクラーの加熱ブロックの上部に直接的に置くことによってまたはサーマルサイクリングオーブンを使用することによって行なわれる。一般に、細胞内ＰＣＲ産物は、２つの異なる技法：ＰＣＲ産物特異的プローブを使用したＩＳＨによる間接的ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ、またはサーマルサイクリング中にＰＣＲ産物中に組み込まれた標識されたヌクレオチド（ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ、フルオレセイン−ｄＵＴＰ、3Ｈ−ＣＴＰまたはビオチン−１６−ｄＵＴＰなど）の直接的検出を通したＩＳＨなしの直接的ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲのうちの１つによって検出される。
【０１４３】
ＳＡＧＥ法は、各転写物に関する個々のハイブリダイゼーションプローブを提供する必要がない多数の遺伝子転写物の同時および定量的分析を可能にする。簡潔に述べると、このタイプの方法を実施するために、タグが各転写物内のユニークな位置から得られるという条件で、転写物をユニークに同定するのに十分な核酸配列情報を含有する短い配列タグ（約１０〜１４塩基対）が生成される。次いで、多くの転写物が一緒に連結されて、配列決定され得る長い連続的な分子を形成し、したがって、複数のタグのアイデンティティを同時に提供する。転写物の任意の集団の発現パターンは、個々のタグの存在量を決定し、各タグに相当する遺伝子を同定することによって定量的に評価することができる（例えば、Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７０：４８４〜７，１９９５；およびＶｅｌｃｕｌｅｓｃｕら，Ｃｅｌｌ，８８：２４３〜５１，１９９７を参照されたい）。
【０１４４】
ある実施形態では、ハイブリダイゼーションに基づくアッセイは、がんまたは腫瘍試料のＭＤＭ２ｉ感受性遺伝子発現プロファイルを決定するために、または本発明によるＭＤＭ２ｉ感受性遺伝子シグネチャーの遺伝子の発現を決定するために使用することができる。核酸ハイブリダイゼーションは、試料中のプローブおよびその相補的標的配列（存在する場合）が相補的塩基対形成を通して安定なハイブリッド二本鎖を形成し得る条件下で、プローブと標的試料を接触させることを含む。分析を受けているがん、腫瘍、または新生物試料から発現プロファイルを作成するための本明細書に記載の遺伝子の配列に基づくプローブは、任意の適した方法によって調製され得る。プローブは、１つまたは複数のタイプの化学結合を通して、典型的には、相補的塩基対形成および水素結合形成を通して、相補的配列の標的核酸に結合する能力がある核酸である。プローブは、天然のヌクレオチド塩基（すなわち、Ａ、Ｇ、Ｕ、Ｃ、またはＴ）または修飾ヌクレオチド塩基（例えば、７−デアザグアノシン、イノシンなど）、またはロックド核酸（ＬＮＡ）を含み得る。さらに、プローブを含むヌクレオチド塩基は、結合がハイブリダイゼーションに干渉しない限りは、ホスホジエステル結合以外の結合によって結合され得る。したがって、プローブは、成分塩基がホスホジエステル結合よりもむしろペプチド結合によって結合されているペプチド核酸であってもよい。
【０１４５】
ハイブリダイゼーションに基づくアッセイのためのオリゴヌクレオチドプローブは、適切な相補的核酸（例えば、正確にもしくは実質的に相補的なＲＮＡ転写物（ｍＲＮＡ）またはｃＤＮＡ）に特異的にハイブリダイズする（または結合する）のに十分な長さまたは組成（ヌクレオチド類似体を含めた）を有すると予想される。一般に、オリゴヌクレオチドプローブは、直線的であり、長さが少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２５、または少なくとも３０ヌクレオチド（連続したヌクレオチド）であると予想される。いくつかの場合では、例えば、長さが少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０ヌクレオチド、または最大約２００ヌクレオチドのより長いプローブが使用され得る。これらの配列は、開示された遺伝子、例えば、図１Ａ〜１Ｅ；表１に示された遺伝子の少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、または全て；または遺伝子ＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲ、ＣＤＫＮ１ＡおよびＡＥＮ（および場合によりＭＤＭ２）を含有する遺伝子セットにおける遺伝子の少なくとも３つ、もしくは全ての任意の領域から得られ得る。一部の実施形態では、プローブ核酸と標的核酸間の相補的ハイブリダイゼーションは、標的ポリヌクレオチド配列の所望の検出を達成するためにハイブリダイゼーション培地のストリンジェンシーを低下させることによって適応され得る小数のミスマッチ（例えば、１つ、２つ、または３つのミスマッチ）を含み得る。当然、プローブは、意図された標的プローブ配列との完全なマッチとすることができ、例えば、プローブは、標的配列（例えば、図１Ａ〜１Ｅ；表１に；または本発明によるＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲ、ＣＤＫＮ１ＡおよびＡＥＮ（および場合によりＭＤＭ２）遺伝子シグネチャーに列挙された遺伝子の配列に完全に相補的であるプローブ配列をそれぞれ有し得る。
【０１４６】
ハイブリッド二本鎖を形成しない核酸は、洗い流され、それによって、典型的に、付加された検出可能な標識の検出を通してハイブリダイズした核酸が検出されるのが可能になる。試料核酸に付加された１つまたは複数の標識は、ハイブリダイズした核酸を検出するために使用され得る。標識は、当業者に慣習的に公知であるいろいろな手段によって組み込まれ得る。例えば、ＵＳ２０１２／０２６４６３９を参照されたい。核酸分子の相補鎖の結合を物理的に検出する方法は、これらに限定されないが、ＤＮＡｓｅ  Ｉまたは化学的フットプリンティング、ゲルシフトおよび親和性切断アッセイ、ドットブロット、ノーザンブロット、ならびに光吸収検出方法を含む。ある例示的な方法では、オリゴヌクレオチド（またはその類似体）および標的核酸を含有する溶液の光吸収の変化が、温度増加するにつれて、２２０から３００ｎｍの分光光度的波長で観察される。オリゴヌクレオチドまたは類似体がその標的に結合している場合、吸収の迅速な増加が、オリゴヌクレオチド（または類似体）およびその標的が互いに解離または溶解する特徴的な温度で生じる。別の例では、方法は、シグナル、例えば、１つまたは両方の核酸分子（または必要に応じて抗体もしくはタンパク質）上に存在する検出可能な標識の検出に関わる。免疫組織化学的またはウエスタンブロット技法などのタンパク質への抗体の結合を検出する方法は、通例である。
【０１４７】
当業者は理解するように、核酸は、核酸を含有する緩衝液の温度を増加させるまたは塩濃度を減少させることによって変性させることができる。低ストリンジェンシー条件（例えば、低い温度および／または高い塩濃度）下で、ハイブリッド二本鎖（例えば、ＤＮＡ：ＤＮＡ、ＲＮＡ：ＲＮＡ、またはＲＮＡ：ＤＮＡ）が、アニールした配列が完全に相補的でない場合でさえも形成することになる。したがって、ハイブリダイゼーションの特異性がより低いストリンジェンシーで低下する。逆に、より高いストリンジェンシー（例えば、より高い温度またはより低い塩濃度）で、成功的なハイブリダイゼーションがより少ないミスマッチを許容する。当業者は、ハイブリダイゼーション条件がストリンジェンシーの任意の程度を提供するために選択され得ることを認識するだろう。ハイブリダイゼーションに基づくアッセイは、差異が同定できるように、プローブが他のまたは無関係な配列は非実質的なハイブリダイゼーションのみで、意図された標的サブ配列にハイブリダイズすることになる、いわゆるストリンジェントな条件下で一般的に行なわれる。ストリンジェントな条件は、配列依存的であり、種々の環境下で変動し得る。例えば、より長いプローブ配列は、より高い温度で完全に相補的な配列に一般的にハイブリダイズする（完全に相補的未満の配列に対して）。一般に、ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度およびｐＨでの特定の配列に関する熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択され得る。ストリンジェントな条件の例は、短いプローブ（例えば、１０から５０ヌクレオチド）に関して塩濃度がｐＨ７．０から８．３で少なくとも約０．０１から１．０Ｍ  Ｎａ+イオン濃度（または他の塩）であり、温度が少なくとも約３０℃であるものを含む。所望のハイブリダイゼーションおよびストリンジェンシー条件は、ホルムアミドまたは塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）などの薬剤の追加を通しても達成することができる。
【０１４８】
ある例では、ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーションを保証するために、３７℃（０．００５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）で６×ＳＳＰＥＴなどの低ストリンジェンシー条件下で行なわれ；次いで、後の洗浄がより高いストリンジェンシー条件（例えば、３７℃で１×ＳＳＰＥＴ）下で行なわれて、ミスマッチハイブリッド二本鎖を排除する。連続的な洗浄がハイブリダイゼーション特異性の所望のレベルが得られるまで次第に高くなるストリンジェンシー（例えば、３７℃から５０℃で０．２５×ＳＳＰＥＴまでも低く下がる）で行なわれ得る。ハイブリダイゼーション特異性は、試験プローブへのハイブリダイゼーションを以下に記載された、存在し得る様々な対照（例えば、発現レベル対照、正規化対照、ミスマッチ対照など）へのハイブリダイゼーションと比較することによって評価され得る。当業者は理解することになるように、ハイブリダイゼーション特異性（ストリンジェンシー）とシグナル強度間のトレードオフがしばしばある。したがって、ある例では、洗浄は、一貫した結果を生み出し、バックグラウンド強度の約１０％を超えるシグナル強度を提供する最も高いストリンジェンシーで行なわれる。ハイブリダイズしたアレイは、連続的により高いストリンジェンシー溶液で洗浄され、各洗浄間で評価され得る。生成されたデータセットの分析は、その上でハイブリダイゼーションパターンが顕著に改変されず、目的の特定のオリゴヌクレオチドプローブに関する十分なシグナルを提供する洗浄ストリンジェンシーを明らかにする。
【０１４９】
ハイブリダイゼーションに基づくアッセイは、標的配列に関する、および／または発現レベル対照に関するもしくは正規化対照に関するミスマッチ対照も用い得る。ミスマッチ対照は、１つまたは複数のミスマッチ塩基の存在を除いて、それらの相当する試験または対照プローブと同一であるように設計されたプローブである。ミスマッチ塩基は、プローブがさもなければ特異的にハイブリダイズする標的配列における相当する塩基に相補的でないように選択された塩基である。１つまたは複数のミスマッチが、適切なハイブリダイゼーション条件（例えば、ストリンジェントな条件）下で、試験または対照プローブがその標的配列とハイブリダイズすることが予想されるが、ミスマッチプローブはハイブリダイズしない（または著しくより少ない程度までハイブリダイズする）ように選択される。好ましくは、ミスマッチプローブは、中心的なミスマッチを含有する。したがって、例えば、プローブが２０塩基長である場合では、相当するミスマッチプローブは、位置６から１４のいずれか（中心的なミスマッチ）での単一塩基ミスマッチ（例えば、ＡをＧ、ＣまたはＴと置換する）以外は、同一配列を有することになる。したがって、ミスマッチプローブは、プローブが向けられた標的以外の試料中の核酸への非特異的結合またはクロスハイブリダイゼーションに関する対照を提供する。例えば、標的核酸が試料中に存在する場合、完全にマッチするプローブは、ミスマッチであるプローブよりも強いシグナルを提供するはずである。完全なマッチとミスマッチプローブ間の強度の差異は、ハイブリダイズした材料の濃度の信頼できる尺度を提供するのを助ける。
【０１５０】
複数のハイブリダイゼーションアッセイフォーマットが公知であり、本発明の方法と関連した使用に適している。かかるハイブリダイゼーションに基づくフォーマットは、溶液に基づくおよび固体支持体に基づくアッセイフォーマットを含む。差次的に発現される、例えば、高発現される遺伝子（例えば、図１Ａ〜１Ｅに；表１に；および本明細書に記載の構成要素ＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲ、ＣＤＫＮ１ＡおよびＡＥＮ（および場合によりＭＤＭ２）を有する遺伝子シグネチャーに列挙された）を検出するように設計されたオリゴヌクレオチドプローブを含有する固体支持体は、フィルター、ポリ塩化ビニルプレート、粒子、ビーズ、微小粒子またはシリコンもしくはガラスに基づくチップなどとすることができる。オリゴヌクレオチドが共有結合的または非共有結合的に、直接的または間接的に結合され得る任意の固体表面が使用できる。ビーズまたはマイクロスフェアに基づくアッセイが、例えば、米国特許第６，３５５，４３１号、第６，３９６，９９５号、および第６，４２９，０２７号に報告されている。チップに基づくアッセイが、例えば、米国特許第６，６７３，５７９号、第６，７３３，９７７号、および第６，５７６，４２４号に報告されており、本明細書でさらに記載される。バイオマーカー遺伝子の発現を測定するためのポリヌクレオチドマイクロアレイを調製し、使用するための技法および一般的方法は、例えば、米国特許出願公開ＵＳ２０１１／００１５８６９に報告されており、本明細書の他の部分でも記載される。
【０１５１】
当業者によって認識されるように、バックグラウンドシグナルは、ハイブリダイゼーションに基づくアッセイを使用する場合、調節される必要があり得る。「バックグラウンド」または「バックグラウンドシグナル強度」という用語は、非特異的結合または標識された標的核酸とオリゴヌクレオチドアレイ（例えば、オリゴヌクレオチドプローブ、対照プローブ、アレイ基板など）の構成要素間の他の相互作用から生じるハイブリダイゼーションシグナルを表す。バックグラウンドシグナルは、アレイ構成要素自体の内因性蛍光によっても生み出され得る。単一バックグラウンドシグナルがアレイ全体に関して計算され得る、または異なるバックグラウンドシグナルがアレイの各位置に関して計算され得る。例として、バックグラウンドは、アレイにおけるプローブの最低から５％〜１０％の平均ハイブリダイゼーションシグナル強度として計算され得る。あるいは、バックグラウンドは、試料中に見出される任意の配列に相補的でないプローブ（例えば、反対のセンスの核酸にまたは試料が哺乳類（ヒト）核酸である場合の細菌遺伝子などの試料中に見出されない遺伝子に向けられたプローブ）へのハイブリダイゼーションによって生み出される平均ハイブリダイゼーションシグナル強度として計算され得る。バックグラウンドは、プローブが全くないアレイの領域または位置によって生み出される平均シグナル強度としても計算され得る。さらに、バックグラウンドハイブリダイゼーションシグナルは、上記の手法の１つまたは組合せを含めた、公知の手法の１つまたは組合せを使用して調節され得る。
【０１５２】
ハイブリダイゼーションに基づくアッセイは、「試験プローブ」（例えば、例えば図１Ａ〜１Ｅに；表１に；またはＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲ、ＣＤＫＮ１ＡおよびＡＥＮ（および場合によりＭＤＭ２）遺伝子のセットに列挙された本発明の遺伝子シグネチャーにおける遺伝子を含むものなどの目的の標的配列を結合するもの）に加えて、正規化対照、発現レベル対照、およびミスマッチ対照などの対照プローブの１つまたは組合せを含んでいてもよい。例えば、患者または対照試料中の遺伝子発現のレベルを決定する場合、発現値は、例えばｍＲＮＡ分析によって、例えば各試料中の１つまたは複数の構成的に発現される遺伝子の発現のレベルを決定することによって試験および対照試料間で対照に正規化され得る。典型的に、発現レベル対照プローブは、薬物感受性試料対薬物非感受性試料において増加した発現を通常提示しない、本明細書で定義された構成的に発現されるヒトハウスキーピング遺伝子のサブ配列に相補的である配列を有する。
【０１５３】
他の対照は、例えば、アッセイされる核酸試料に加えられた標識された参照オリゴヌクレオチドに相補的であるように設計されたプローブを使用することを含んでいてもよい。ハイブリダイゼーション後に対照から得られるシグナルは、正確なハイブリダイゼーションのシグナルをアレイ間で変動させることができ、ハイブリダイゼーション条件、標識強度、「読み」効率および他の因子における変動に関する対照を提供する。一実施形態では、アレイにおける全ての他のプローブから読まれたシグナル（例えば、蛍光強度）は、対照プローブからのシグナル（例えば、蛍光強度）で除され、それによって測定値を正規化する。正規化に関する例示的なプローブは、アレイに存在する他のプローブ（例えば、試験プローブ）の平均長さを反映するように選択されるが、しかしながら、それらは、長さの範囲をカバーするように選択され得る。対照は、アレイにおける他のプローブの（平均）塩基組成を反映するようにも選択され得る。いくつかの場合では、アッセイは、二次構造を持たず、また、任意の潜在的な標的にハイブリダイズすることなくハイブリダイズするように選択される１つまたはいくつかの対照プローブを利用することになる。
【０１５４】
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）
一部の実施形態では、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）が用いられ得る。ＲＴ−ＰＣＲは、臨床試料にしばしば存在する豊富ではないｍＲＮＡを含むｍＲＮＡの検出のための敏感な方法である。適した計測手段と組み合わせた、ＲＴ−ＰＣＲへの蛍光技法の適用は、閉鎖系において増幅、検出および定量化を組み合わせる定量的ＲＴ−ＰＣＲ方法をもたらした。例えば、２つの通例使用される定量的ＲＴ−ＰＣＲ技法は、ＴＡＱＭＡＮ（商標）ＲＴ−ＰＣＲアッセイ（ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＵＳＡ）およびＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（商標）アッセイ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）である。
【０１５５】
ＲＴ−ＰＣＲなどのｍＲＮＡを定量化する方法は、当技術分野で公知である。例として、抽出されたＲＮＡは、製造者の説明書に従ってＧＥＮＥＡＭＰ（商標）ＲＮＡ  ＰＣＲ試薬キット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、逆転写され得る。一部の実施形態では、遺伝子発現レベルは、溶液中のｍＲＮＡを測定する遺伝子発現分析技術を使用して決定することができる。かかる遺伝子発現分析技術の例は、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（商標）、ＲＴ−ＰＣＲ、ＮＡＮＯＳＴＲＩＮＧ（商標）、ＱＵＡＮＴＩＧＥＮＥ（商標）、ｇＮＰＡ（商標）、マイクロアレイ、および配列決定を含むが、これらに限定されない。ＮＡＮＯＳＴＲＩＮＧ（商標）法、例えば、ＮＣＯＵＮＴＥＲ（商標）Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）は、個々の標的分子に結合し得る、標識された「ナノレポーター」と称される標識されたレポーター分子を使用する（例えば、米国特許第７，４７３，７６７号；Ｇｅｉｓｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２６，３１７〜３２５，２００８；ＷＯ２００７／０７６１２８；およびＷＯ２００７／０７６１２９を参照されたい）。ナノレポーターの標識コードに基づき、標的分子へのナノレポーターの結合は、標的分子の同定をもたらす。
【０１５６】
本発明の実施形態によれば、試料または検体からの患者の遺伝子発現プロファイルの作成、または薬物感受性（または薬物耐性）プロファイルの作成は、試料由来のＲＮＡおよび対照ＲＮＡを用いてリアルタイム、定量的ＰＣＲ（ＴＡＱＭＡＮ（商標）ｑＲＴ−ＰＣＲ）アッセイを行なうことを含む。ＴＡＱＭＡＮ（商標）アッセイは公知であり、当業者に使用される；それは、例えば、Ｈｏｌｌａｎｄら，１９９１，ＰＮＡＳ  ８８：７２７６〜７２８０にも報告されている。さらに、ＴＡＱＭＡＮ（商標）アッセイのバージョンが米国特許第５，２１０，０１５号（Ｇｅｌｆａｎｄら）、および米国特許第５，４９１，０６３号（Ｆｉｓｈｅｒら）に報告されている。ＴＡＱＭＡＮ（商標）ＲＴ−ＰＣＲは、サーモサイクラー、レーザー、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ、およびコンピューターを含み得る市販の方法およびシステムを使用して行なわれ得る。システムは、サーモサイクラー上の９６ウェルフォーマットにおいて試料を増幅する。定量的ＲＴ−ＰＣＲは、二重標識された蛍光発生プローブ（例えば、ＴＡＱＭＡＮ（商標）プローブ）を通してＰＣＲ産物の蓄積を測定する。増幅中に、レーザー誘発蛍光シグナルが光学繊維ケーブルを通して９６ウェル全てに関してリアルタイムで回収され、ＣＣＤで検出される。本システムは、機器を動かすためのおよびデータを分析するためのソフトウェアを含む。
【０１５７】
ＴＡＱＭＡＮ（商標）法および検出アッセイ系は、クロスコンタミネーションのない多数の試料の効率的な取り扱いなどの利点を提供し；結果的に、それは、機械的な試料採取に高度に適用可能である。その利点の別のものは、多重化に関する潜在力である。つまり、種々の蛍光レポーター色素がプローブを構築するために使用され得るので、ＭＤＭ２ｉ薬剤感受性と関連するいくつかの異なる遺伝子の発現が同じＰＣＲ反応でアッセイされ得、それによって、各反応／試験を個々に行なうことと比較して、費用低下につながる。したがって、ＴＡＱＭＡＮ（商標）アッセイフォーマットは、患者の試料からの遺伝子発現プロファイル、および相当するＭＤＭ２ｉ感受性プロファイルが、約４０以下、または約２０以下、または約１０以下、または約７以下、または約５以下、または約４以下の遺伝子、例えば、図１Ａ〜１Ｅ、表１、または本発明の遺伝子シグネチャーを含む遺伝子ＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲ、ＣＤＫＮ１ＡおよびＡＥＮ（および場合によりＭＤＭ２）の１つまたは複数に列挙された遺伝子の少なくとも３つ、少なくとも４つ、または全ての発現レベルに関わる場合に好ましい。
【０１５８】
試料間の変動の誤差および効果を最小化するために、ＲＴ−ＰＣＲは、内部標準を使用して行なわれ得る。最適には、内部標準は、種々の組織間で一定のレベルで発現され、実験的処理に影響されない。遺伝子発現のパターンを正規化するために使用される典型的なＲＮＡは、ＧＡＰＤＨ、βアクチンおよび１８ＳリボソームＲＮＡなどのハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡである。ＲＴ−ＰＣＲは、各標的配列に関する内部競合物が正規化に使用される定量的競合的ＰＣＲと試料内に含有される正規化遺伝子、またはハウスキーピング遺伝子がＲＴ−ＰＣＲに関して使用される定量的比較的ＰＣＲの両方に適合性である。（例えば、Ｈｅｉｄら，１９９６，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６：９８６〜９９４）。定量的ＰＣＲ、関連するプローブおよび定量的増幅手順が、例えば、米国特許第５，５３８，８４８号；米国特許第５，７１６，７８４号および米国特許第５，７２３，５９１号に報告されている。定量的ＰＣＲは、この目的のために設計された機器（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して、マイクロタイタープレートにおいて行うことができる。
【０１５９】
遺伝子発現レベルは、例えば、いくつかの刊行物、例えば、Ｇｏｄｆｒｅｙら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇ．２：８４〜９１，２０００；Ｓｐｅｃｈｔら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５８：４１９〜２９，２００１に報告されているように、ｍＲＮＡ単離、精製、プライマー伸長および増幅後に固定されたパラフィン包埋組織をＲＮＡ源として使用して、定量化できる。簡潔に述べると、かかるプロセスは、パラフィン包埋がん組織試料または隣接する非がん性組織の切片を約１０μｍの厚さに切断することで始まる。ＲＮＡが抽出され、タンパク質およびＤＮＡが除去される。あるいは、ＲＮＡががん試料または他の組織試料から直接単離される。必要なまたは所望の場合、ＲＮＡ濃度の分析後、ＲＮＡ修復および／または増幅ステップが含まれていてもよく、ＲＮＡが遺伝子特異的プロモーターを使用して逆転写され、ＲＴ−ＰＣＲがこれに続く。
【０１６０】
一部の実施形態では、増幅に使用されるプライマーが、目的の遺伝子のユニークなセグメントを増幅するために選択される（図１Ａ〜１Ｅに；または例えば、遺伝子ＢＡＸ、Ｃ１ＱＢＰ、ＦＤＸＲ、ＧＡＭＴ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＳＬＣ２５Ａ１１、ＴＰ５３、ＴＲＩＡＰ１、ＺＭＡＴ３、ＡＥＮ、Ｃ１２ｏｒｆ５、ＧＲＳＦ１、ＥＩＦ２Ｄ、ＭＰＤＵ１、ＳＴＸ８、ＴＳＦＭ、ＤＩＳＣ１、ＳＰＣＳ１、ＰＲＰＦ８、ＲＣＢＴＢ１、ＳＰＡＧ７、ＴＩＭＭ２２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＡＣＡＤＳＢ、ＤＤＢ２、ＦＡＳ、ＧＤＦ１５、ＧＲＥＢ１、ＰＤＥ１２、ＰＯＬＨ、Ｃ１９ｏｒｆ６０、ＨＨＡＴ、ＩＳＣＵ、ＭＤＭ２、ＭＥＤ３１、ＭＥＴＲＮ、ＰＨＬＤＡ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＳＥＳＮ１、および／またはＸＰＣの少なくとも３つ、４つ、５つ、６つ以上、または全て；または遺伝子ＭＤＭ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＺＭＡＴ３、ＤＤＢ２、ＦＤＸＲ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＢＡＸ、ＲＲＭ２Ｂ、ＳＥＳＮ１、ＣＣＮＧ１、ＸＰＣ、ＴＮＦＲＳＦ１０ＢおよびＡＥＮの少なくとも３つまたは全て；または遺伝子ＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲ、ＣＤＫＮ１ＡおよびＡＥＮ（およびばあいによりＭＤＭ２）の少なくとも３つ、または全てなどの本発明によって提供される他の遺伝子シグネチャーに列挙された遺伝子シグネチャー遺伝子の少なくとも３つ、４つ、５つ、６つ以上、または全てをコードするｍＲＮＡなど。一部の実施形態では、他の遺伝子、例えば、１つまたは複数の対照またはハウスキーピング遺伝子の発現レベルも検出される。遺伝子シグネチャーの１つまたは複数を増幅するために使用され得るプライマーは、市販されているかまたは公知の慣習的に使用される方法に従って設計および合成することができる。代替の定量的核酸増幅手順は、米国特許第５，２１９，７２７号に記載されており、それは、試料中の標的配列の量が標的配列および内部標準核酸セグメントを同時に増幅することによって決定される手順に関する。各セグメントから増幅されたＤＮＡの量が決定され、検量線と比較されて、増幅前に試料に存在する標的核酸セグメントの量が決定される。
【０１６１】
他の実施形態では、本発明による使用に従った方法は、分子指標検出分子と組み合わせられた、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）を使用したリアルタイムでのＲＮＡレベルの検出および定量化を用い得る。ＮＡＳＢＡは、例えば、Ｃｏｍｐｔｏｎ  Ｊ．，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３５０（６３１３）：９１〜２に記載されている。単一ステップ等温ＲＮＡ特異的増幅方法であるＮＡＳＢＡは、以下を含む：ＲＮＡ鋳型が反応混合液に導入され、ここで、第１のプライマーが鋳型の３’末端でその相補的部位に付着し；逆転写酵素が逆の、相補的ＤＮＡ鎖を合成し；ＲＮＡｓｅ  ＨがＲＮＡ鋳型を破壊し（ＲＮＡｓｅ  Ｈは、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド中のＲＮＡのみを破壊し、一本鎖ＲＮＡは破壊しない）；第２のプライマーがＤＮＡ鎖の３’末端に付着し、逆転写酵素がＤＮＡの第２の鎖を合成し；Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼが二本鎖ＤＮＡを結合し、１において再び使用され得る相補的ＲＮＡ鎖を作製する循環反応を提供する。
【０１６２】
他の実施形態では、アッセイフォーマットは、ＩＮＶＡＤＥＲ（商標）アッセイ（Ｈｏｌｏｇｉｃ（商標），以前は、Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）などのフラップエンドヌクレアーゼに基づくフォーマットとすることができる。簡潔に述べると、ＩＮＶＡＤＥＲ（商標）法は、２つの同時等温反応からなる。第１の反応では、プローブおよびＩＮＶＡＤＥＲ（商標）オリゴヌクレオチドである２つのオリゴヌクレオチドが、患者の腫瘍試料から得られたＤＮＡなどの標的ＤＮＡの特定の領域と結合する。所望の配列が存在する場合、重複構造が標的上でプローブおよびＩｎｖａｄｅｒ（商標）オリゴヌクレオチドで創出される。専売のＣＬＥＡＶＡＳＥ（商標）酵素は、ＩＮＶＡＤＥＲ（商標）オリゴヌクレオチドを有する重複構造を形成する第１のプローブを特異的に切断し、５’フラップに加えて１つのヌクレオチドを遊離する。より具体的には、第１の反応では、複数のプローブ分子が標的分子ごとに切断され、切断された５’フラップから生成されるシグナルが増幅される。プローブは、標的に付くことと離れることを迅速に繰り返し；毎回、インタクトなプローブ分子がＩＮＶＡＤＥＲ（商標）オリゴヌクレオチドの存在下で特定の標的に結合し、重複基質が形成され、切断が生じ得る。放出されるフラップの数は、試料中の標的の量に比例し、遺伝子の定量的検出を可能にする。第１の反応から放出されたフラップは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）プローブと称される、標識された、合成オリゴヌクレオチド上での第２の、同時の、重複切断反応におけるＩＮＶＡＤＥＲ（商標）オリゴヌクレオチドとして役立つ。ＦＲＥＴプローブの切断は、蛍光シグナルの生成をもたらす。非重複フルオロフォアで２つの異なる５’フラップ配列およびそれらの相補的ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドを使用することにより、２つの別々の配列が単一ウェルにおいて検出されることが可能になる。第１の反応から放出された５’フラップのそれぞれは、切断されたおよび切断されていないＦＲＥＴプローブに付くことと離れることを循環し、それによって標的特異的シグナルをさらに増幅するための第２の反応における多くのＦＲＥＴプローブの切断が可能になる。
【０１６３】
さらに他の実施形態では、アッセイフォーマットは、分岐ＤＮＡ（ＱＵＡＮＴＩＧＥＮＥ（商標），Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ／Ｐａｎｏｍｉｃｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）またはＨＹＢＲＩＤ  ＣＡＰＴＵＲＥ（商標）（Ｄｉｇｅｎｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）での直接的なｍＲＮＡ捕獲を利用することができる。特定の標的核酸へのハイブリダイズおよび任意の適切な核酸検出アッセイに関する配置に適した適切なプローブの設計は、公知であり、当業者によって常法に従って実施される。
【０１６４】
アレイおよびマイクロアレイ
一部の実施形態では、遺伝子発現レベルは、マイクロアレイプラットフォームおよび技法を使用して、同定または確認される。アレイおよびマイクロアレイ方法では、目的の核酸配列（ｃＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを含めた）は、マイクロチップなどの基板上で表面に塗られる、蒔かれる、または並べられる。次いで、並べられた配列は、目的の細胞または組織から単離された核酸（ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡなど）とハイブリダイズされる。例として、ＭＤＭ２ｉ感受性遺伝子シグネチャーにおける発現された遺伝子は、マイクロアレイ技術を使用して、新鮮またはパラフィン包埋がん／腫瘍／新生物組織において測定することができる。
【０１６５】
ＲＴ−ＰＣＲ方法と類似して、マイクロアレイ技術に関して、ｍＲＮＡ源は、典型的に、がんまたは新生物から、ならびに任意選択で、相当する非がん性組織、および正常組織または細胞株から単離された全ＲＮＡである。マイクロアレイ技法の特定の例では、ｃＤＮＡクローンのＰＣＲ増幅挿入断片が高密度なアレイにおける基板に適用される。いくつかの例では、アレイは、図１Ａ〜１Ｅにまたは表１に提供されたものなどの本発明による遺伝子シグネチャーにおける開示された遺伝子の例えば、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、または全てのそれぞれに特異的な少なくとも１つのプローブを含む。一部の態様では、図１Ａ〜１Ｅ、表１、つまり、ＢＡＸ、Ｃ１ＱＢＰ、ＦＤＸＲ、ＧＡＭＴ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＳＬＣ２５Ａ１１、ＴＰ５３、ＴＲＩＡＰ１、ＺＭＡＴ３、ＡＥＮ、Ｃ１２ｏｒｆ５、ＧＲＳＦ１、ＥＩＦ２Ｄ、ＭＰＤＵ１、ＳＴＸ８、ＴＳＦＭ、ＤＩＳＣ１、ＳＰＣＳ１、ＰＲＰＦ８、ＲＣＢＴＢ１、ＳＰＡＧ７、ＴＩＭＭ２２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＡＣＡＤＳＢ、ＤＤＢ２、ＦＡＳ、ＧＤＦ１５、ＧＲＥＢ１、ＰＤＥ１２、ＰＯＬＨ、Ｃ１９ｏｒｆ６０、ＨＨＡＴ、ＩＳＣＵ、ＭＤＭ２、ＭＥＤ３１、ＭＥＴＲＮ、ＰＨＬＤＡ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＳＥＳＮ１、および／またはＸＰＣに列挙された遺伝子の少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、もしくは全て、または遺伝子ＭＤＭ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＺＭＡＴ３、ＤＤＢ２、ＦＤＸＲ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＢＡＸ、ＲＲＭ２Ｂ、ＳＥＳＮ１、ＣＣＮＧ１、ＸＰＣ、ＴＮＦＲＳＦ１０ＢおよびＡＥＮの少なくとも３つまたは全て、または遺伝子ＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲ、ＣＤＫＮ１ＡおよびＡＥＮ（およびばあいによりＭＤＭ２）の少なくとも３つ、もしくは全てのそれぞれのヌクレオチド配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブが基板上で並べられる。並べられた配列は、これらのヌクレオチド配列を含み得る、本質的にこれらからなり得る、またはこれらからなり得る。マイクロアレイにおける核酸は、例えば、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションに適している。
【０１６６】
標識されたｃＤＮＡプローブは、例えば、目的の組織から抽出されたＲＮＡの逆転写による蛍光ヌクレオチドの組込みを通して生成され得る。アレイに適用される標識されたｃＤＮＡプローブは、アレイに適用されたＤＮＡの各スポットに特異的にハイブリダイズする。非特異的に結合した核酸プローブを除去するためのストリンジェントな洗浄後、アレイは、共焦点レーザー顕微鏡法などの適した検出方法によってまたはＣＣＤカメラの使用によってスキャンされる。並べられたエレメントそれぞれのハイブリダイゼーションの定量化は、相当するｍＲＮＡ存在量が評価されるのを可能にする。二色蛍光を用いて、ＲＮＡの２つの供給源から生成された別々に標識されたｃＤＮＡプローブがアレイにペアでハイブリダイズされ得る。したがって、各特定された遺伝子に相当する２つの供給源からの転写物の相対的存在量が、同時に決定され得る。ハイブリダイゼーションの小型化されたスケールは、図１Ａ〜１Ｅ、表１に列挙された遺伝子の少なくとも３つ、少なくとも４つ、または全て、ならびにその発現が本発明によるＭＤＭ２ｉ感受性を示す遺伝子ＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲ、ＣＤＫＮ１ＡおよびＡＥＮ（および場合によりＭＤＭ２）の少なくとも３つ、または全てのがんまたは腫瘍試料中の発現レベルおよび発現レベルパターンの便利で迅速な評価をもたらす。
【０１６７】
遺伝子発現に関する情報を得るためのハイスループットな方法が、数十、数百から数千以上の固定化核酸試料を含有する顕微鏡スライドなどの透明な支持体がノーザンおよびサザンブロットにおけるハイブリダイゼーションに類似した様式でハイブリダイズされる核酸マイクロアレイによって提供される。最適の支持体は、その表面上への核酸配列（すなわち、プローブ）の効果的な固定化、およびプローブと標的核酸配列の効率的および効果的なハイブリダイゼーションを可能にする。色素でタグを付けられた核酸とのハイブリダイゼーション後、アレイは、支持体上のプローブにハイブリダイズした核酸標的に付着した色素を刺激する（蛍光を発させる）ためのレーザースキャナーを使用して「読まれる」。電動化の段階では、アレイをＸ方向に順次横切り、次いでＹ方向に画素幅を進み、双方向的なラスターパターンを作製する、プログラムされたコームスキャンパターンが実行される。色素蛍光の一部は、スキャナー対物レンズによって捕獲され、各それぞれの光電子増倍管（ＰＭＴ）に経路を定められた赤および緑のシグナルにろ過され、そこでそれらは、アナログデジタル（Ａ／Ｄ）変換器によって増幅される、ろ過される、および標本抽出される電気的シグナルに変換される。スキャナーソフトウェアは、Ａ／Ｄ変換器アウトプットを、各スポットの画素強度が色素分子の数と、およびアレイ上で標的核酸とハイブリダイズしているプローブ核酸の数と比例する高解像度の画像に変換する。コンピューターは、アレイ上の特定のアドレスを情報、例えば、シグナル強度を含めた、その位置での試料に関するハイブリダイゼーションまたは結合データと関連づけるようにプログラムされ得るという点で、アドレス可能なアレイは、通常、コンピューター可読である。コンピューター可読フォーマットのいくつかの例では、アレイにおける個々の特色は、例えば、コンピューターによるアドレス情報と相関しているデカルト格子パターンで規則的に配置される。
【０１６８】
マイクロアレイ分析は、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧＥＮＥＣＨＩＰ（商標）技術（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）またはＡｇｉｌｅｎｔマイクロアレイ技術（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）で提供される製造者の説明書およびプロトコールに従って、最適な市販のシステム、キットおよび機器を使用して行なうことができる。あるいは、本明細書で他で記載されるように、アッセイフォーマットは、ＮＣＯＵＮＴＥＲ（商標）Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および例えば、Ｇ．Ｋ．Ｇｅｉｓｓら，２００８，Ｄｉｒｅｃｔ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｃｏｌｏｒ−Ｃｏｄｅｄ  Ｐｒｏｂｅ  Ｐａｉｒｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２６（３）：３１７〜２５に報告されている手法を用いることができる。システムは、分子「バーコード」技術および単一分子画像処理を使用して、単一反応で数百のユニークなｍＲＮＡ転写物を検出および計数する。他の方法とは異なり、プロトコールは、バイアスを結果に導入し得る増幅ステップを全く含まない。
【０１６９】
好ましい実施形態では、がんもしくは腫瘍試料または検体中の図１Ａ〜１Ｅにおける、表１における、またはＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲ、ＣＤＫＮ１ＡおよびＡＥＮ（および場合によりＭＤＭ２）を含む遺伝子のセットにおける遺伝子の少なくとも３つ、少なくとも４つ、または全ての発現が、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）によって提供されるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧＥＮＥＣＨＩＰ（商標）ＤＮＡマイクロアレイなどのマイクロアレイまたは遺伝子チップ技術を使用して、算定されるか、評価されるか、または測定される。かかるアレイは、チップあたりの高度に特異的な感受性プローブの最大数および優れた検出能力を提供する。当業者によって認識されるように、核酸アレイを使用して比較できる遺伝子発現を作る手順は、グローバルノーマライゼーションの手法を含み得る。この手法では、アレイにわたる発現分布の平均（ＤＮＡアレイ内の全ての遺伝子に関する発現レベル）は、等しくなるように設定される。この広範に使用される手法は、試料の遺伝子は、差次的に発現され得る一方、転写の量は、試料にわたって本質的に類似しているという仮説から生じる。したがって、グローバルノーマライゼーションは、マイクロアレイチップ上のプローブの全ての発現シグナルを利用し、チップ間の中央シグナル値に調整される。
【０１７０】
本発明のＭＤＭ２ｉ感受性遺伝子シグネチャーの遺伝子の遺伝子発現の決定および測定は、分析の特定の方法によってもまたは遺伝子発現レベルを正規化するための特定の手法によっても限定されないことが理解されよう。例えば、グローバルノーマライゼーションがアレイ全体の平均遺伝子発現に正規化するために本発明の方法の実行に使用され得る一方、ハウスキーピング遺伝子を使用した正規化も、使用されるハウスキーピング遺伝子の平均発現に正規化するために利用することができる。
【０１７１】
したがって、任意の数のアレイ設計が本発明の実行に適していることが明らかとなる。本発明での使用のためのアレイは、目的の配列に特異的にハイブリダイズするいくつかの試験プローブを典型的に含むことになる。つまり、アレイは、図１Ａ〜１Ｅ、表１に、または本明細書に記載の遺伝子シグネチャーのいずれかに列挙された遺伝子の任意の領域にハイブリダイズするように設計されたプローブを含むことになる。本発明の遺伝子シグネチャーにおける遺伝子参照がＥＳＴであってもよい場合、プローブは、その配列から、または公共の配列データベースのいずれかにおいて入手可能であり得る相当する全長転写物の他の領域から設計され得る。所与の遺伝子のためのプローブを作製する方法は、例えば、ＵＳ２０１２／０２６４６３９において見出され得る。特定のプローブ配列を設計するためのコンピューターソフトウェアも市販されている。典型的に、アレイは、ミスマッチプローブ、または１つもしくは複数の構成的に発現される遺伝子に特異的なプローブなどの１つまたは複数の対照プローブも含むことになり、それによって、種々のハイブリダイゼーションからのデータが比較されることが可能になる。
【０１７２】
分子の秩序のある配置、すなわち、マイクロアレイの「特色」は、試料に関する一度での非常に多数の分析を可能にする。例えば、いくつかのアレイでは、１つまたは複数の分子（オリゴヌクレオチドプローブまたは抗体など）がアレイ上で複数回（例えば、２回など）生じて、内部対照を提供する。アレイ上のアドレス可能な位置の数は、例えば、少なくとも４から少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも５００、少なくとも５５０、少なくとも６００、少なくとも８００、少なくとも１０００、少なくとも１０，０００以上まで変動し得る。いくつかの場合では、アレイは、３〜４０、３〜５０、または３〜１７７のアドレス可能な位置などの３〜２００のアドレス可能な位置を含む。特定の例では、アレイは、本発明の遺伝子シグネチャーの遺伝子のいくつかまたは全て、例えば、図１Ａ〜１Ｅにおける遺伝子；遺伝子ＢＡＸ、Ｃ１ＱＢＰ、ＦＤＸＲ、ＧＡＭＴ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＳＬＣ２５Ａ１１、ＴＰ５３、ＴＲＩＡＰ１、ＺＭＡＴ３、ＡＥＮ、Ｃ１２ｏｒｆ５、ＧＲＳＦ１、ＥＩＦ２Ｄ、ＭＰＤＵ１、ＳＴＸ８、ＴＳＦＭ、ＤＩＳＣ１、ＳＰＣＳ１、ＰＲＰＦ８、ＲＣＢＴＢ１、ＳＰＡＧ７、ＴＩＭＭ２２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＡＣＡＤＳＢ、ＤＤＢ２、ＦＡＳ、ＧＤＦ１５、ＧＲＥＢ１、ＰＤＥ１２、ＰＯＬＨ、Ｃ１９ｏｒｆ６０、ＨＨＡＴ、ＩＳＣＵ、ＭＤＭ２、ＭＥＤ３１、ＭＥＴＲＮ、ＰＨＬＤＡ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＳＥＳＮ１および／またはＸＰＣ；または遺伝子ＭＤＭ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＺＭＡＴ３、ＤＤＢ２、ＦＤＸＲ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＢＡＸ、ＲＲＭ２Ｂ、ＳＥＳＮ１、ＣＣＮＧ１、ＸＰＣ、ＴＮＦＲＳＦ１０ＢおよびＡＥＮ；または遺伝子ＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲ、ＣＤＫＮ１ＡおよびＡＥＮ（および場合によりＭＤＭ２）の少なくとも３つ、少なくとも４つ、または全てに特異的なプローブまたはプライマーまたは抗体（増幅または検出を可能にするものなど）、およびいくつかの例では、さらに１から１０の対照分子（ハウスキーピング遺伝子にアドレス可能なプローブ、プライマー、または抗体など）から本質的になる。
【０１７３】
タンパク質に基づくアレイは、タンパク質であるまたはタンパク質を含むプローブ分子、またはタンパク質であるまたはタンパク質を含む標的分子を含む。いくつかの場合では、アレイは、タンパク質が結合している核酸、または、逆も同様に含む。例としては、アレイは、本発明のＭＤＭ２ｉ感受性遺伝子シグネチャーの遺伝子と関連する少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも１０の異なる分子に対する抗体、およびいくつかの例では、１から１０のハウスキーピング遺伝子も含有する。
【０１７４】
ある実施形態では、ポリヌクレオチドマイクロアレイは、本発明のＭＤＭ２ｉ感受性遺伝子シグネチャーの遺伝子バイオマーカーの発現を測定するために使用することができる。本発明によって提供されるマイクロアレイは、対照と比較して、１つまたは複数のＭＤＭ２阻害剤に対するがん細胞および試料の感受性を示す、図１Ａ〜１Ｅの；表１の遺伝子の少なくとも３つ、または少なくとも４つ、または全て；またはＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲ、ＣＤＫＮ１ＡおよびＡＥＮ（および場合によりＭＤＭ２）を含む遺伝子セットの少なくとも３つの遺伝子にハイブリダイズ可能（特異的にハイブリダイズ可能）であるオリゴヌクレオチドまたはｃＤＮＡプローブを含み得る。遺伝子のそれぞれの発現は、同時に評価してもよい。本発明は、ＭＤＭ２ｉ治療に対して感受性であるがんおよび腫瘍において差次的に発現される、例えば、発現が増加する、図１Ａ〜１Ｅ、表１、および本発明の他の遺伝子シグネチャーのＭＤＭ２ｉ遺伝子感受性シグネチャーバイオマーカーを構成する遺伝子または遺伝子のサブセットの少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、最大１７７に対するプローブ、および１つまたは複数の対照遺伝子に対するプローブを含むポリヌクレオチドアレイを提供する。特定の実施形態では、マイクロアレイは、例えば、ＡｌｔｓｃｈｕｌｅｒらへのＷＯ２００２／１８６４６に；ＳｃｈｅｒｅｒらへのＷＯ２００２／１６６５０に；およびＵＳ２０１１／００１５８６９に報告されている、スクリーニングまたはスキャンニングアレイである。簡潔に述べると、スクリーニングおよびスキャンニングアレイは、発現されるものと発現されないものの両方のゲノム核酸配列由来の規則的間隔の位置的にアドレス可能なプローブを含む。
【０１７５】
一部の実施形態では、アレイは、独立的および包括的に、図１Ａ〜１Ｅに；表１に列挙された遺伝子シグネチャー構成要素遺伝子の少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６、少なくとも８、少なくとも１０、または全て；または、より明確には、以下の遺伝子シグネチャー遺伝子ＢＡＸ、Ｃ１ＱＢＰ、ＦＤＸＲ、ＧＡＭＴ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＳＬＣ２５Ａ１１、ＴＰ５３、ＴＲＩＡＰ１、ＺＭＡＴ３、ＡＥＮ、Ｃ１２ｏｒｆ５、ＧＲＳＦ１、ＥＩＦ２Ｄ、ＭＰＤＵ１、ＳＴＸ８、ＴＳＦＭ、ＤＩＳＣ１、ＳＰＣＳ１、ＰＲＰＦ８、ＲＣＢＴＢ１、ＳＰＡＧ７、ＴＩＭＭ２２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＡＣＡＤＳＢ、ＤＤＢ２、ＦＡＳ、ＧＤＦ１５、ＧＲＥＢ１、ＰＤＥ１２、ＰＯＬＨ、Ｃ１９ｏｒｆ６０、ＨＨＡＴ、ＩＳＣＵ、ＭＤＭ２、ＭＥＤ３１、ＭＥＴＲＮ、ＰＨＬＤＡ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＳＥＳＮ１、および／またはＸＰＣの少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６、少なくとも８、少なくとも１０、または全て）；またはＭＤＭ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＺＭＡＴ３、ＤＤＢ２、ＦＤＸＲ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＢＡＸ、ＲＲＭ２Ｂ、ＳＥＳＮ１、ＣＣＮＧ１、ＸＰＣ、ＴＮＦＲＳＦ１０ＢおよびＡＥＮを含む遺伝子シグネチャーにおける遺伝子の少なくとも３つ、若しくは全て；またはＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲ、ＣＤＫＮ１ＡおよびＡＥＮ（および場合によりＭＤＭ２）を含有する遺伝子シグネチャーにおける遺伝子の少なくとも３つ、もしくは全て、またはこれらの遺伝子によってコードされるタンパク質に特異的なプローブ、プライマー、または抗体を含有する。一部の実施形態では、アレイは、１つまたは複数の対照プローブ、プライマー、または抗体をさらに含む。対照プローブの非限定的な例は、ＧＡＰＤＨ、βアクチンおよび１８Ｓ  ＲＮＡ遺伝子に関するもの、またはこれらの遺伝子によってコードされるタンパク質を認識する抗体を含む。任意選択で、および／または最適に、がんまたは腫瘍のタイプは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの一貫したＴＰ５３および／またはｐ５３依存性発現を示す。
【０１７６】
アレイに関する基板
アレイ基板または固体支持体は、例えば、有機ポリマーから形成され得る。固体支持体に適した材料は、例えば、米国特許第５，９８５，５６７号に、および公開された米国出願ＵＳ２０１１／０２０６７０３におけるように、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリイソブチレン、ポリブタジエン、ポリイソプレン、ポリビニルピロリジン、ポリテトラフルオロエチレン、フッ化ポリビニリデン、ポリフルオロエチレン−プロピレン、ポリエチレンビニルアルコール、ポリメチルペンテン、ポリクロロトリフルオロエチレン、ポリスルホン、水酸化二軸延伸ポリプロピレン、アミノ化二軸延伸ポリプロピレン、チオール化二軸延伸ポリプロピレン、エチレンアクリル酸、エチレンメタクリル酸、およびそのコポリマーの混合物を含むが、これらに限定されない。
【０１７７】
固体支持体または基板を形成するのに適した材料の一般的な特徴およびパラメーターは、これらに限定されないが、活性化時に、支持体の表面がオリゴヌクレオチドまたは抗体などの生体分子をそこに共有結合的に付着することができるための表面活性化への従順性；生体分子の「ｉｎ  ｓｉｔｕ」合成への従順性；オリゴヌクレオチドまたはタンパク質（抗体など）によって占められていない支持体上の領域が非特異的結合に従順ではない、または非特異的結合が生じた場合、かかる材料が、結合した目的のオリゴヌクレオチドまたはタンパク質（抗体など）を除去することなく、表面から容易に除去され得るための化学的不活性を含む。例えば、固体支持体表面として使用される表面活性化有機ポリマーは、高周波プラズマ放電を通してアミノ化されたポリプロピレン材料である。カルボキシル化、水酸化、チオール化、または活性エステル群などの他の反応性群も使用され得る。
【０１７８】
アレイのフォーマット
いくつかのアレイフォーマットを本発明での使用に用いることができる。アレイフォーマットは、固体支持体が添付され得るもの、例えば、マイクロタイタープレート（例えば、マルチウェルプレート）、試験管、無機シート、ディップスティックなどを含み得る。固体支持体がポリプロピレン糸である場合、１つまたは複数のポリプロピレン糸がプラスチックディップスティック型デバイスに付着され得る；あるいは、ポリプロピレン膜がスライドガラスに付着され得る。特定のフォーマットは、本質的に必要ではない。最小限、固体支持体は、固体支持体またはそこに吸収された任意の生体高分子の機能的挙動に影響することなく、アレイフォーマットに最適に付着され、フォーマット（ディップスティックまたはスライドなど）は、デバイスが導入される任意の材料（臨床試料および反応溶液など）と非反応性（これらに安定）であるべきである。
【０１７９】
本発明で使用されるアレイは、いくつかの方法で調製され得る。例として、オリゴヌクレオチドまたはタンパク質配列は、別々に合成され、次いで、固体支持体に付着される（例えば、米国特許第６，０１３，７８９号を参照されたい）。別の例として、配列は、支持体上に直接的に合成されて、所望のアレイを提供する（例えば、米国特許第５，５５４，５０１号またはＵＳ２０１１／０２０６７０３を参照されたい）。オリゴヌクレオチドおよびタンパク質を固体支持体に共有結合的にカップリングするためのおよびオリゴヌクレオチドまたはタンパク質を支持体上に直接的に合成するための適した方法は、当業者に公知であり、当業者によって実行されている。ガイダンスのために；適した方法の概要が、例えば、Ｍａｔｓｏｎら，１９９４，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１７：３０６〜１０に見出され得る。別の例では、オリゴヌクレオチドは、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ８５／０１０５１およびＷＯ８９／１１０９７７、または米国特許第５，５５４，５０１号に提供されている、固体支持体上でオリゴヌクレオチドを調製するための従来の化学技法を使用して、支持体上に合成される。
【０１８０】
例示的であるが、非限定的な例は、当技術分野で一般的にディップスティックと称されるオリゴヌクレオチドまたは抗体バンドの直線的アレイである。別の適したフォーマットは、別々の細胞の二次元パターン（６４×６４アレイにおける４０９６区画など）を含む。当業者は理解するように、他のアレイフォーマットは、例えば、米国特許第５，９８１，１８５号におけるスロット（長方形）および円形アレイ、またはマルチウェルプレートを含むが、これらに限定されない。別の例として、アレイは、糸、膜またはフィルム（免疫クロマトグラフィー媒体または膜など）であるポリマー媒体上で形成される。有機ポリマー媒体の例は、約１ミル（０．００１インチ）から約２０ミルの厚さを有するポリプロピレンシートである。フィルムの厚さは、決定的ではなく、かなり広い範囲にわたって変更が可能である。アレイは、二軸延伸ポリプロピレン（ＢＯＰＰ）フィルムを含み得、これは、その耐久性に加えて、低バックグラウンド蛍光を提示する。本明細書での使用に企図されるアレイフォーマットは、フォーマットの様々なタイプを構成し得る。
【０１８１】
本発明の遺伝子シグネチャーおよびそれに関連するコンパニオン診断での使用に適したアレイは、４つのヌクレオチド塩基に関する前駆体を所定のパターンで横たえることによって、アレイのセルにおいてオリゴヌクレオチドを合成するための自動化されたプロセスおよび／またはデバイスを使用して、生成され得る。簡潔に述べると、例として、複数のチャネル自動化化学送達システムが用いられて、ポリプロピレン支持体などの基板にわたってオリゴヌクレオチドプローブ集団を平行な並び（数において送達システムにおけるチャネルの数に相当する）で創出する。第１の方向でのオリゴヌクレオチド合成の完了後、次いで、基板は、９０°回転されて、合成がここで第１のセットに垂直である並びの第２のセット内で進むことを可能にする。このプロセスは、その交差が複数の異なるセルを生成する複数のチャネルアレイを創出する。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの３’末端を通してまたはオリゴヌクレオチドの５’末端を通してポリプロピレン支持体に結合され得る。ある例では、オリゴヌクレオチドは、３’末端によって固体支持体に結合される。当業者は理解するように、オリゴヌクレオチドの３’末端の使用が固体支持体への結合に適しているかまたは５’末端の使用が適しているかは、当業者によって容易に決定され得る。一般に、３’末端および５’末端の領域におけるオリゴヌクレオチドプローブの内部相補性は、支持体への結合、または結合方向を決定する。本明細書で言及したように、アレイ上のオリゴヌクレオチドプローブまたは抗体は、オリゴヌクレオチドプローブ／標的配列または抗体／タンパク質複合体を含むハイブリダイゼーション複合体の検出を可能にする１つまたは複数の標識を含んでいてもよい。
【０１８２】
タンパク質発現レベルの検出
一部の態様では、記載されたＭＤＭ２ｉ感受性遺伝子シグネチャーに従って開示された遺伝子によってコードされるタンパク質の例えば、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０、または全てのがんまたは腫瘍試料中の発現レベルが分析される。特定の例では、本発明のＭＤＭ２ｉ遺伝子感受性シグネチャーにおける遺伝子によってコードされるタンパク質の３つ以上、４つ以上、５つ以上（例えば、６つ以上、１０以上、３０以上、３７以上、３８以上、４０以上、または全て）の試料中の発現レベルが分析される。ある実施形態では、図１Ａ〜１ＥのＭＤＭ２ｉ遺伝子シグネチャー遺伝子の少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または全てによってコードされるタンパク質が分析され、これらの遺伝子のタンパク質産物に向けられた抗体が使用される。ある実施形態では、ＭＤＭ２ｉ遺伝子シグネチャー遺伝子ＢＡＸ、Ｃ１ＱＢＰ、ＦＤＸＲ、ＧＡＭＴ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＳＬＣ２５Ａ１１、ＴＰ５３、ＴＲＩＡＰ１、ＺＭＡＴ３、ＡＥＮ、Ｃ１２ｏｒｆ５、ＧＲＳＦ１、ＥＩＦ２Ｄ、ＭＰＤＵ１、ＳＴＸ８、ＴＳＦＭ、ＤＩＳＣ１、ＳＰＣＳ１、ＰＲＰＦ８、ＲＣＢＴＢ１、ＳＰＡＧ７、ＴＩＭＭ２２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＡＣＡＤＳＢ、ＤＤＢ２、ＦＡＳ、ＧＤＦ１５、ＧＲＥＢ１、ＰＤＥ１２、ＰＯＬＨ、Ｃ１９ｏｒｆ６０、ＨＨＡＴ、ＩＳＣＵ、ＭＤＭ２、ＭＥＤ３１、ＭＥＴＲＮ、ＰＨＬＤＡ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＳＥＳＮ１、および／またはＸＰＣの少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または全てによってコードされるタンパク質が分析され、これらの遺伝子のタンパク質産物に向けられた抗体が使用される。ある実施形態では、遺伝子ＭＤＭ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＺＭＡＴ３、ＤＤＢ２、ＦＤＸＲ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＢＡＸ、ＲＲＭ２Ｂ、ＳＥＳＮ１、ＣＣＮＧ１、ＸＰＣ、ＴＮＦＲＳＦ１０ＢおよびＡＥＮの少なくとも３つ、または全てによってコードされるタンパク質が分析される。ある実施形態では、遺伝子ＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲ、ＣＤＫＮ１ＡおよびＡＥＮ（および場合によりＭＤＭ２）の少なくとも３つ、または全てによってコードされるタンパク質が分析され、これらの遺伝子のタンパク質産物に向けられた抗体が使用される。
【０１８３】
タンパク質レベルを検出するための適した試料は、対象のがんまたは腫瘍（例えば、メラノーマまたは多発性骨髄腫腫瘍もしくは新生物など）から、対象の非がん組織から得られたタンパク質、および／またはがんを有さないまたは正常な対象から得られた１つまたは複数の試料から得られたタンパク質を含有する生物学的試料を含む。対象からのがんまたは腫瘍試料中の、対照と比較した、本発明の遺伝子シグネチャー（すなわち、図１Ａ〜１Ｅにおける遺伝子；遺伝子ＢＡＸ、Ｃ１ＱＢＰ、ＦＤＸＲ、ＧＡＭＴ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＳＬＣ２５Ａ１１、ＴＰ５３、ＴＲＩＡＰ１、ＺＭＡＴ３、ＡＥＮ、Ｃ１２ｏｒｆ５、ＧＲＳＦ１、ＥＩＦ２Ｄ、ＭＰＤＵ１、ＳＴＸ８、ＴＳＦＭ、ＤＩＳＣ１、ＳＰＣＳ１、ＰＲＰＦ８、ＲＣＢＴＢ１、ＳＰＡＧ７、ＴＩＭＭ２２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＡＣＡＤＳＢ、ＤＤＢ２、ＦＡＳ、ＧＤＦ１５、ＧＲＥＢ１、ＰＤＥ１２、ＰＯＬＨ、Ｃ１９ｏｒｆ６０、ＨＨＡＴ、ＩＳＣＵ、ＭＤＭ２、ＭＥＤ３１、ＭＥＴＲＮ、ＰＨＬＤＡ３、ＣＤＫＮ１Ａ、ＳＥＳＮ１、および／またはＸＰＣ；または遺伝子ＭＤＭ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＺＭＡＴ３、ＤＤＢ２、ＦＤＸＲ、ＲＰＳ２７Ｌ、ＢＡＸ、ＲＲＭ２Ｂ、ＳＥＳＮ１、ＣＣＮＧ１、ＸＰＣ、ＴＮＦＲＳＦ１０ＢおよびＡＥＮ；または遺伝子ＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲ、ＣＤＫＮ１ＡおよびＡＥＮ（および場合によりＭＤＭ２））内の遺伝子によってコードされるタンパク質の例えば、少なくとも３つまたは少なくとも４つ（またはそれ以上、最大全て）のレベルの差異、または量の変化、例えば、タンパク質発現レベルの増加を検出することは、対象のＭＤＭ２ｉに対する感受性、したがって、ＭＤＭ２ｉ治療に応答する対象の潜在力を予測するまたは示す。
【０１８４】
任意の従来から公知のまたは標準的なイムノアッセイフォーマット、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、またはＲＩＡアッセイを分析または試験を受ける試料中のタンパク質レベルを測定するために使用することができる。本明細書に記載の遺伝子シグネチャーにおける、例えば、図１Ａ〜１Ｅ、表１における、または遺伝子セットＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲ、ＣＤＫＮ１ＡおよびＡＥＮ（および場合によりＭＤＭ２）における遺伝子によってコードされるタンパク質に特異的な抗体は、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８、およびその後の版）に示されたものなどの当技術分野で公知であるいくつかの適したイムノアッセイ方法の１つによるタンパク質の検出および定量化に使用され得る。開示された遺伝子シグネチャーの遺伝子によってコードされるタンパク質に向けられた特異的な抗体は、当業者に公知の標準的な方法を使用して生成され得る。
【０１８５】
例えばＶｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｓｃｏｎ，ＡＺおよび他の商業的ベンダーから入手可能である自動化されたスライドステイナーは、例えば、任意選択で共に使用されるホルマリン固定、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）スライドを使用した免疫組織化学的／染色技法も遺伝子検出および定量化に利用され得る。これらの技法を行なうための一般的なガイダンスは、例えば、Ｂａｎｃｒｏｆｔ  ａｎｄ  Ｓｔｅｖｅｎｓ，１９８２，Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  ＬｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅおよびＡｕｓｕｂｅｌら，１９９８，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、およびそれより最近の版に見出され得る。
【０１８６】
表面増強レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）などの定量的分光学的方法は、がんもしくは腫瘍組織または細胞試料、および非がん性細胞または組織、およびがんを有さない対象からの細胞または組織におけるタンパク質発現を分析するために使用することができる。ＳＥＬＤＩは、分析物が分析物捕獲または脱離を増強する表面上のエネルギー流に提示される、脱離に関する固相法である。一例では、ＳＥＬＤＩ飛行時間型（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析が、例えば、ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（商標）（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用することによって、タンパク質発現を検出するために使用される。これらのタイプの方法は、当業者に公知であり、当業者によって実行されている。例えば、米国特許第５，７１９，０６０号；第６，８９７，０７２号；および第６，８８１，５８６号を参照されたい。あるいは、抗体は、Ｆｃ結合支持体、または細菌Ｆｃ結合支持体を使用して、クロマトグラフィー表面上に固定化される。その後、表面は、がん試料などの試料と共にインキュベートされ、表面上の抗体は、試料に存在する抗原を認識し結合し得る。結合していないタンパク質および質量分析干渉化合物は、洗い流され、抗体によって結合され、クロマトグラフィー表面上に保持されたタンパク質がＳＥＬＤＩ−ＴＯＦなどによって分析され、検出される。試料からの質量分析プロファイルは、特定の分子量のタンパク質の相対的発現レベルがいろいろな統計的技法およびバイオインフォマティクスソフトウェアシステムによって比較される差次的タンパク質発現マッピングを使用して比較され得る。
【０１８７】
ある実施形態では、本発明の遺伝子シグネチャー内のＭＤＭ２ｉ感受性遺伝子の発現は、組織マイクロアレイを使用して、複数のがんまたは腫瘍組織検体において特徴付けられ得る。（例えば、Ｋｏｎｏｎｅｎら，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，４（７）：８４４〜４７を参照されたい）。かかる組織アレイでは、例えば、がん、腫瘍、または新生物を有する対象からの複数の組織試料が同じマイクロアレイ上で評価することができる。ＲＮＡおよびタンパク質の発現レベルは、ｉｎ  ｓｉｔｕで検出可能であり、所望の場合、複数の試料が連続した切片において同時に分析することができる。
【０１８８】
キットおよび関連する試薬
本発明は、本発明の方法の１つまたは複数を実行するための試薬およびキットを提供する。企図される試薬は、方法を実行することおよび本発明によるＭＤＭ２ｉ感受性を示す記載された遺伝子シグネチャーの利用における使用のために設計されたものである。ある例では、試薬は、目的の遺伝子シグネチャー遺伝子が表されたプローブ核酸のアレイである。本明細書で記載されるように、いろいろな異なるアレイフォーマットが当技術分野で公知であり、使用されており、多種多様な異なるプローブ構造体、基質組成物および付着技術を含み得る。ガイダンスのために、これらに限定されないが、代表的なアレイ構造体が米国特許第５，１４３，８５４号；第５，２８８，６４４号；第５，３２４，６３３号；第５，４７０，７１０号；第５，４９２，８０６号；第５，５０３，９８０号；第５，５１０，２７０号；第５，５２５，４６４号；第５，５４７，８３９号；第５，５８０，７３２号；第５，６６１，０２８号；第５，８００，９９２号；第６，４８９，１５９号；ＷＯ１９９６／３１６２２；ＷＯ１９９７／１０３６５；およびＷＯ１９９７／２７３１７に例証されている。ある特定の実施形態では、アレイ上に表されるＭＤＭ２ｉ遺伝子感受性シグネチャーの遺伝子の数は、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも１０、少なくとも２５であり、ＭＤＭ２ｉ感受性を示す遺伝子シグネチャー遺伝子の少なくとも４０、５０、１００、最大全てとすることができる。
【０１８９】
ＭＤＭ２ｉ感受性遺伝子シグネチャー内の遺伝子の発現プロファイルは、本発明のキットの含有物に合わせられた試薬を用いることによって生成され得る。かかる試薬は、任意のアッセイフォーマット、例えば、ポリメラーゼに基づくアッセイ（ＲＴ−ＰＣＲ、ＴＡＱＭＡＮ（商標））、例えば、ＤＮＡマイクロアレイまたは他の固体支持体を使用したハイブリダイゼーションに基づくアッセイ、核酸配列に基づく増幅アッセイ、またはフラップエンドヌクレアーゼに基づくアッセイ、または他の核酸定量化方法を使用することによって、遺伝子発現レベルを検出することにおける使用のための遺伝子シグネチャー遺伝子を選択的に検出するおよび／または増幅するように設計された遺伝子特異的核酸プライマーおよび／またはプローブの集合物を含む。遺伝子特異的プライマーおよびそれらの使用に関する方法の例は、米国特許第５，９９４，０７６号に見出され得る。ＭＤＭ２ｉ感受性遺伝子シグネチャー遺伝子の少なくとも３、４、５、８、１０、または全てに関する、または複数のこれらの遺伝子、例えば、図１Ａ〜１Ｅに；表１に示された遺伝子シグネチャーにおける遺伝子の例えば、少なくとも２５、少なくとも３０、４０、５０、１００以上、最大１７７の包含、または遺伝子ＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲ、ＣＤＫＮ１ＡおよびＡＥＮ（および場合によりＭＤＭ２）を有する遺伝子シグネチャーサブセットに関する遺伝子特異的プローブおよび／またはプライマーの収集物を含む試薬が特定の目的のものである。遺伝子特異的プローブおよび／またはプライマー収集物は、遺伝子シグネチャー遺伝子のみを含んでいてもよく、またはそれらは、追加の遺伝子に関するプローブおよび／またはプライマーを含んでいてもよい。
【０１９０】
したがって、キットにおいて使用されるプローブおよび／またはプライマーは、特にキットの使用と関連して、ＭＤＭ２ｉに対する試験を受ける試料の感受性を予測して示す標的として役立つ、本発明の遺伝子シグネチャーを含む遺伝子バイオマーカーに全体的にまたは部分的に相補的であるオリゴヌクレオチドまたはアンチセンス核酸を包含する。キットは、当該方法を実行するための説明書、および適宜、キットの使用から得られる結果の解釈を可能にするための感受性スコア、カットオフ値、または対照データなどの値およびパラメーターを含むことになることが企図される。留意されるように、説明書は、キットの包装における、添付文書における、ラベルなどにおける１つまたは複数の紙の文書などの適した媒体上に印刷された情報として提供され得る。さらに、説明書は、コンピューター可読媒体、例えば、情報が記録されたディスケット、ＣＤ、ＤＶＤ、テープなどで提供され得る。あるいは、説明書は、インターネットおよびコンピューターまたは情報に遠くから、もしくは現地外でアクセスするための他の適したデバイスを通してアクセスまたは使用され得るウェブサイトアドレスを通して提供され得る。
【０１９１】
キットは、ＭＤＭ２ｉ治療に対する試料の感受性に関連した１つまたは複数の結果の統計的分析のためのソフトウェアパッケージも含んでいてもよく、阻害剤に対する感受性の確率を計算するための参照データベースを含んでいてもよい。キットは、標的核酸を生成するためのプライマー、プレミックスされていてもまたは別々であってもよいｄＮＴＰおよび／またはｒＮＴＰ、ビオチン化またはＣｙ３もしくはＣｙ５タグを付けられたｄＮＴＰなどの１つまたは複数のユニークに標識されたｄＮＴＰおよび／またはｒＮＴＰ、種々の散乱スペクトルを有する金もしくは銀粒子、または蛍光色素の化学的に活性な誘導体などの他の合成後標識試薬、酵素、例えば、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼなど、様々な緩衝媒体、例えば、ハイブリダイゼーションおよび洗浄緩衝液、前もって作られたプローブアレイ、標識されたプローブ精製試薬および構成要素、例えば、スピンカラムなど、シグナル生成および検出試薬、例えば、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲート試薬、化学蛍光もしくは化学発光基質試薬などの様々な方法において用いられる試薬を含んでいてもよい。
【０１９２】
別の実施形態では、本発明のキットは、本明細書に記載の遺伝子シグネチャーによって包含されるＭＤＭ２ｉ感受性遺伝子バイオマーカーのセットを含む。ある実施形態では、キットは、標的ポリヌクレオチド分子へのハイブリダイゼーションの用意が整っているマイクロアレイ、構成要素の使用に関する説明書、および／または以下に記載され、当業者に公知であるコンピューターシステムを使用したデータ分析のためのソフトウェアを含有する。ある実施形態では、キットは、遺伝子シグネチャー（本発明のＭＤＭ２ｉ遺伝子感受性シグネチャー遺伝子（および／またはＴＰ５３のステータス指標遺伝子）において提供された遺伝子などの複数の遺伝子の対象のがんもしくは腫瘍試料または検体における、または細胞培養物における発現のレベルを決定するための核酸プライマーおよび／またはプローブを含有するプローブアレイを含む。プローブアレイは、本明細書に記載の遺伝子発現シグネチャーおよびプロファイルを同定するためのカスタマイズされたセットを提供するために、例えば、１７７プローブ以下、または１００プローブ以下、または５０プローブ以下、または４０プローブ以下、または３〜１０プローブ（それらの間の数を含めた）を含有し得る。ある実施形態では、キットは、ＭＤＭ２ｉに対する試料の感受性を評価するためのプライマーおよび／またはプローブ、ならびに発現レベル調節などの必要なまたは適切なアッセイ調節を行なうためのプライマーおよび／またはプローブを含有し得る。
【０１９３】
別の実施形態では、ＭＤＭ２ｉ治療に対する患者のがんまたは腫瘍の感受性の予測を可能にする本発明の方法であって、ａ）図１Ａ〜１Ｅまたは表１にまたは遺伝子セットＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲ、ＣＤＫＮ１ＡおよびＡＥＮに示されたＭＤＭ２ｉ遺伝子感受性シグネチャー内の遺伝子の少なくとも３つの遺伝子、少なくとも４つの遺伝子、少なくとも５つの遺伝子、少なくとも６つの遺伝子、少なくとも１０遺伝子、少なくとも２０の遺伝子、少なくとも３０の遺伝子、少なくとも４０の遺伝子、または全ての患者から得られた試料中の発現レベルを分析すること；およびｂ）試料中の少なくとも３つなどの遺伝子シグネチャー遺伝子の発現レベルを対照発現レベルと比較し；がんまたは腫瘍を公知のＭＤＭ２感受性結果の以前分析された患者試料コホートにおいて観察される発現レベルとの相関に基づいてＭＤＭ２ｉ感受性であると割り当て、それによって、患者のがんまたは腫瘍をＭＤＭ２ｉに対して感受性であると予測することを含む方法を行なうためのキットが提供される。
【０１９４】
別の実施形態では、図１Ａ〜１Ｅ、表１において、または遺伝子ＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲ、ＣＤＫＮ１ＡおよびＡＥＮ（および場合によりＭＤＭ２）を有する遺伝子シグネチャーにおいて提供された遺伝子シグネチャーの少なくとも３つなどの遺伝子によってコードされるタンパク質産物のタンパク質発現レベルを患者のがんまたは腫瘍試料中で分析するためのキットであって、タンパク質産物またはその断片に免疫学的に特異的な抗体、タンパク質産物と抗体間の免疫複合体形成を検出するための手段および試料のＭＤＭ２ｉ感受性と関連する発現レベルの範囲を含む教育的資料を含むキットが提供される。
【０１９５】
別の実施形態では、図１Ａ〜１Ｅ、表１において、または遺伝子ＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲ、ＣＤＫＮ１ＡおよびＡＥＮ（および場合によりＭＤＭ２）を有する遺伝子シグネチャーにおいて提供された遺伝子シグネチャー内の遺伝子に相当する核酸またはその情報配列断片の少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つなど、または全ての発現レベルを患者のがんまたは腫瘍試料中で分析するためのキットであって、遺伝子シグネチャー遺伝子の核酸に特異的にハイブリダイズする核酸；ハイブリダイズ核酸間のハイブリダイゼーションを検出するための手段；および試料のＭＤＭ２感受性と関連する発現レベルまたはカットオフ値の範囲を含む教育的資料を含むキットが提供される。
【０１９６】
別の実施形態では、本発明は、ＭＤＭ２ｉに対する患者のがんまたは腫瘍感受性を評価するためのキットであって、評価が試験装置を用いて行なわれ、キットが患者からの試験試料を採取するための試薬；および患者の試験試料中の、図１Ａ〜１Ｅにおける；表１における；またはＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲ、ＣＤＫＮ１ＡおよびＡＥＮ（および場合によりＭＤＭ２）遺伝子、もしくはその変異体を有する遺伝子シグネチャーにおける遺伝子などの本発明の遺伝子シグネチャーにおける遺伝子の少なくとも３つ、少なくとも４つ、または全ての発現を測定するための試薬、ならびにそのための包装および説明書を含むキットを提供する。キットに関する実施形態では、試験試料を採取するための試薬は、血液または組織試料を採取するための試薬である。キットに関する実施形態では、遺伝子シグネチャーの発現プロファイルを測定するための試薬は、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、アレイもしくはマイクロアレイ、または免疫化学的アッセイもしくは特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションのための試薬である。
【０１９７】
医薬組成物
ある態様では、本発明は、対象においてがんまたは腫瘍を治療することに用いるための医薬組成物であって、上記で定義される少なくとも１つのＭＤＭ２ｉを含み、当該対処欧は感受性を予測する上記方法のいずれかによって対象のがんまたは腫瘍のＭＤＭ２ｉ治療に対する感受性が評価されることにより、ＭＤＭ２ｉ治療に対して感受性であると決定された対象である、医薬組成物を提供する。
【０１９８】
ある実施形態では、医薬組成物は、メラノーマを治療することに用いられ得る。
【０１９９】
本発明の医薬組成物を投与する対象を選択するために用いることができる方法は、ＭＤＭ２ｉ治療に対する対象のがんまたは腫瘍の感受性を予測する方法であって、ａ）対象から得られたがんまたは腫瘍試料中の図１Ａ〜１Ｅに列挙された遺伝子から選択される少なくとも３つの遺伝子の発現のレベルを測定すること、ｂ）その発現レベルをスコア化して対象の感受性スコアを得ること、ｃ）複数のがんまたは腫瘍試料における当該少なくとも３つの遺伝子の発現レベルを測定すること｛ここで、当該試料の少なくとも一部のＭＤＭ２ｉ治療に対する感受性は不明である｝、ｄ）当該少なくとも３つの遺伝子の発現レベルをスコア化して各試料の参照スコアを得ることと、参照スコアの分布に基づいて閾値を決定すること、および、ｅ）対象の感受性スコアが閾値を超える場合には対象はＭＤＭ２ｉ治療に対して感受性であり、対象の感受性スコアが閾値を下回る場合には対象はＭＤＭ２ｉ治療に対して耐性であると予測すること、を含む方法である。
【０２００】
ある特定の実施形態では、ステップｅ）は、耐性であると予測された対象がそのゲノムに増幅したＭＤＭ２遺伝子を有する場合には、当該対象をＭＤＭ２ｉ治療に対して感受性であると予測することである。ある実施形態では、ステップｂ）およびｄ）は、遺伝子の発現レベルの正規化スコアを合計することを含む。ある実施形態では、閾値は、受信者動作特性（ＲＯＣ）プロットに基づいて決定され、１個抜き交差検定（ＬＯＯＣＶ）解析がなされてもよい。ある実施形態では、閾値は、参照スコアの分布の形状から決定され、例えば、大津法などの二値化アルゴリズムによってもよい。ある実施形態では、閾値は、上記の通り混合ガウスモデルにより決定される。
【０２０１】
本発明の医薬組成物では、ＭＤＭ２ｉは、本明細書に記載されるように、化合物Ａおよびその塩、化合物Ｂおよびその塩、ＣＧＭ０９７、ＲＧ７３８８、ＭＫ−８２４２（ＳＣＨ９００２４２）、ＭＩ−２１９、ＭＩ−３１９、ＭＩ−７７３、ＭＩ−８８８、Ｎｕｔｌｉｎ−３ａ、ＲＧ７１１２（ＲＯ５０４５３３７）、ＴＤＰ５２１２５２、ＴＤＰ６６５７５９、ＰＸＮ７２７、ＰＸＮ８２２、並びにその組合せからなる群から選択され得る。  
【０２０２】
コンピューターで促進される分析
ある特定の実施形態では、その態様の１つまたは複数における本発明の実行は、コンピューターならびにその関連システムおよびコンポーネントの使用に関わり得る。かかるコンピューターシステムおよびコンポーネントは、本明細書では、これらに限定されないが、本発明のいくつかの実施形態からの情報を分析および評価するために使用されるハードウェア、ソフトウェアおよびデータ記憶手段を意味する。一部の実施形態では、コンピューターシステムは、中央処理装置（ＣＰＵ）、ならびにインプット手段、アウトプット手段、およびデータ記憶手段を含む。現在入手可能なコンピューターに基づくシステムの任意の１つ、またはいくつかは、当業者によって認識されるように、本発明による使用に適している。データ記憶手段は、本発明の方法から生成されたデータおよび情報の記録を含む任意の手段もしくはデバイス、またはかかる手段もしくはデバイスにアクセスし得るメモリアクセス手段を含み得る。本発明に適用可能な関連するコンピューター関連情報のかかる記述は、例えば、ＷＯ２０１３／０７１２４７において見出すことができる。
【０２０３】
記載された発明の態様と関連する分析的方法を含む比較ステップのいずれかは、コンピューターまたは他の（電子的）情報機械、またはデジタルデバイスにロードされたまたはプログラムされたソフトウェアコンポーネントを用いて行なわれ得る。その場合、適切なコンポーネント、データ、および含まれる情報を用いて、コンピューター、機械、またはデバイスは、１つまたは複数の遺伝子と関連する値（例えば、上記の様式で特定の遺伝子の発現と相関する、またはかかる関連している値を比較するための値）の分析を補助するための必要なステップを行ない得る。１つまたは複数のコンピュータープログラムにおいて具体化された特色は、かかるプログラムを実行する１つまたは複数のコンピューターによって行なわれ得る。一部の実施形態では、本発明に関する分析的方法の実施に適したコンピューターシステムは、内部コンポーネントを含み、これは、主メモリと相互接続されたプロセッサエレメントを含む。コンピューターシステムは、大容量記憶装置（例えば、典型的にプロセッサおよびメモリと一緒にひとまとめにされ、可変性の記憶容量を有する１つまたは複数のハードディスク）；「マウス」、または他のグラフィックのインプットデバイス、および／またはキーボードとすることができるインプット用デバイスと一緒のユーザーインターフェースデバイス（例えば、モニター）を含む外部コンポーネントにさらに連結されている）。プリンターまたはプリント用デバイスも、コンピューターに付属され得る。典型的に、コンピューターシステムは、ＷＯ２０１３／０７１２４７にも報告されている、他のローカルコンピューターシステム、リモートコンピューターシステムへの、またはインターネットなどの広域コミュニケーションネットワークへのイーサネット（商標）リンクの一部とすることができる共有ネットワークリンクにも連結されている。
【０２０４】
そのオペレーションのために、システムは、そのメモリ中に、当技術分野で標準的であり、本明細書に記載のＭＤＭ２ｉ感受性遺伝子シグネチャーに特別であるいくつかのソフトウェアコンポーネントを典型的にロードしている。これらのソフトウェアコンポーネントは、集合的に、コンピューターシステムを開示された方法に従って機能させる。一部の実施形態では、ソフトウェアコンポーネントは、大容量記憶装置に保管されている。一部の実施形態では、ソフトウェアコンポーネントは、コンピューターシステムおよびそのネットワーク相互接続の管理を司るオペレーティングシステム（ＯＳ）を含む。例えば、ＯＳは、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｉｎｄｏｗファミリー、例えば、Ｗｉｎｄｏｗｓ  ７、または旧もしくはより新しいバージョン、または例えば、Ａｐｐｌｅを含めた他のプロバイダーのものとすることができる。さらに、ソフトウェアコンポーネントは、プログラムが開示された方法を実行するのを補助するためにシステムに好都合に存在する共通言語およびファンクションを含む。いくつかの高または低水準コンピューター言語が、分析的方法をプログラムするために使用され得る。命令は、実行時間中に翻訳されるまたはコンパイルされ得る。例示的なコンピューター言語は、これらに限定されないが、Ｃ／Ｃ＋＋、ＦＯＲＴＲＡＮおよびＲａｎｄ  ＪＡＶＡ（商標）を含む。ある実施形態では、方法は、方程式の記号的エントリーおよび使用されるアルゴリズムを含めた処理の高水準仕様を可能にし、それによって、個々の方程式またはアルゴリズムのユーザープログラムミングを楽にする数学ソフトウェアパッケージでプログラムされる。かかるパッケージは、これらに限定されないが、Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ製のＭａｔｌａｂ（Ｎａｔｉｃｋ，Ｍａｓｓ．）、Ｗｏｌｆｒａｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ製のＭａｔｈｅｍａｔｉｃａ（Ｃｈａｍｐａｉｇｎ，Ｉｌｌ．）、およびＭａｔｈ  Ｓｏｆｔ製のＳ−Ｐｌｕｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）を含む。
【０２０５】
本方法の実行のための実施の例として、ユーザー、例えば、臨床家、医療もしくはヘルスケア技術者、開業医、情報スペシャリスト、またはその組合せは、第１のステップとして、マイクロアレイ実験データをコンピューターシステムにロードする。これらのデータは、ユーザーによってまたはネットワークコネクションによって連結された他のコンピューターシステムから、またはＣＤ−ＲＯＭ、データ記憶デバイス（例えば、ＵＳＢフラッシュドライブ）、テープドライブ、ＺＩＰ（商標）ドライブなどの携帯型、リムーバブル保存媒体上でまたはネットワークを通して直接的に入力され得る。次いで、ユーザーは、開示された方法を行なう発現プロファイル分析ソフトウェアを実行させる。別の例示的な実施は、マイクロアレイ実験データをコンピューターシステムにロードするユーザーを含む。このデータは、記憶媒体からまたはネットワークを通してダイナミックジーンセットデータベースシステムからなどのリモートコンピューターからメモリにロードされる。次に、ユーザーは、（本明細書に記載の）対照とのがん試料からの遺伝子発現データの比較を行なって、がん試料と対照間の遺伝子発現の差異を検出するソフトウェアを実行する。本発明と関連する分析的方法を実施するための代替のコンピューターシステムおよびソフトウェアは、当業者に公知、かつ、明らかである。
【０２０６】
したがって、記載された方法のいずれかは、１つまたは複数のコンピューター可読記憶媒体（例えば、１つまたは複数の光媒体ディスク、揮発性メモリコンポーネント（ＤＲＡＭまたはＳＲＡＭなど）、または不揮発性メモリコンポーネント（ハードドライブなど）などの非一過性コンピューター可読媒体に保存されたコンピューター実行可能命令として実施され、コンピューター（例えば、スマートフォン、ｉＰａｄ（商標）など、またはコンピューターハードウェアを含む他のモバイルデバイスを含めた任意の市販のコンピューター）上で実行され得る。開示された技法を実施するためのコンピューター実行可能命令のいずれか、ならびに記載された方法および実施形態の実施中に創出および使用された任意のデータは、１つまたは複数のコンピューター可読媒体（例えば、非一過性コンピューター可読媒体）に保存され得る。コンピューター実行可能命令は、例えば、ウェブブラウザーまたは他のソフトウェアアプリケーション（リモートコンピューターアプリケーションなど）を通してアクセスまたはダウンロードされる専用ソフトウェアアプリケーションまたはソフトウェアアプリケーションの一部とすることができる。かかるソフトウェアは、例えば、単一のローカルコンピューター（例えば、任意の適した市販のコンピューター）でまたは１つまたは複数のネットワークコンピューターを使用したネットワーク環境（例えば、インターネット、ワイドエリアネットワーク、ローカルエリアネットワーク、クラウドコンピューティングネットワークなどのクライアントサーバネットワーク、または他のかかるネットワークを通して）で実行され得る。当業者によって認識されるように、ソフトウェアに基づく実施のいくつかの選択された態様のみが記載される。本明細書で記載されていない任意の詳細は、当業者に公知であるおよび／または慣習的である。さらに、本発明の態様に関連した技術は、任意の特定のコンピューターまたはハードウェア型に限定されない。適したコンピューター、ハードウェアおよび関連コンポーネントの特定の詳細は、公知であり、当業者が有する一般常識を考慮して、本明細書で詳細に記載されない。
【０２０７】
さらに、例えば、コンピューターに開示された方法のいずれかを行なわせるためのコンピューター実行可能命令を含めたソフトウェアに基づく態様のいずれかは、これらに限定されないが、インターネット、Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ、Ｃｌｏｕｄ、イントラネット、ソフトウェアアプリケーション、ケーブル（光ファイバーケーブルを含めた）、磁気コミュニケーション、電磁気コミュニケーション（ＲＦ、マイクロ波および赤外線コミュニケーションを含めた）、電子的コミュニケーションなどを含めたコミュニケーションの適した手段を通してアップロード、ダウンロード、またはリモートアクセスされ得る。さらに、本明細書での使用のコンピューター可読媒体のいずれかは、非一過性（例えば、メモリ、磁気記憶、光学記憶など）とすることができる。方法での使用の記憶操作のいずれかは、１つまたは複数のコンピューター可読媒体（例えば、コンピューター可読記憶媒体または他の有形媒体）で記憶することによって実施され得る。記憶されたもの全ては、本明細書に記載の方法およびシステムが１つまたは複数のコンピューター可読および／または携帯型媒体（例えば、コンピューター可読記憶媒体、記憶デバイス、または他の有形媒体）における（例えば、ここで符号化された）コンピューター実行可能命令によって実施され得るように、１つまたは複数のコンピューター可読媒体（例えば、コンピューター可読記憶媒体または他の有形媒体）にあってもよい。そういうものとして、命令は、コンピューターに方法を行なわせることができ、本明細書に記載の技術は、いろいろなプログラムミング言語で実施され得る。
【０２０８】
本発明の一部の実施形態は、少なくとも部分的にコンピューターシステムによって行なわれる方法を含んでいてもよく、コンピューターシステムは、スクリーン、スクリーン上に遺伝子発現レベルを表示するソフトウェア、ソフトウェアをインターフェースするキーボードおよび／またはマウス、ならびにＭＤＭ２ｉ感受性に関する試験、評価、または分析を受けるがん試料または検体中の遺伝子の発現レベルのリストを記憶するメモリを含む。本方法は、例えば、遺伝子の同じ数の発現データセットの対照レベルと比較して、本発明の遺伝子シグネチャーの遺伝子、例えば、図１Ａ〜１Ｅに；表１に；または遺伝子ＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲ、ＣＤＫＮ１Ａ、およびＡＥＮ（および場合によりＭＤＭ２）を有する遺伝子シグネチャーに列挙された遺伝子の例えば、３つ以上、４つ以上、または５つ以上、または６つ以上など、または全てのがん試料または検体における発現のレベルをＭＤＭ２ｉ遺伝子感受性シグネチャーと関連する遺伝子のリストにおいて分析すること；および、対照と比較した、がん、腫瘍、または新生物試料中の遺伝子の特定された数の発現のレベルの増加が予め定義された限界を超える、または感受性スコアもしくはカットオフ値と関連があり得る場合、がん（または腫瘍もしくは新生物）をＭＤＭ２ｉでの治療に対して感受性であると同定することを含む。非限定的な例として、予め定義された限界（すなわち、カットオフ値）は、０．２とすることができる。この場合、＞０．２の値は、高スコアまたはカットオフ値と考えられ、ＭＤＭ２ｉに対する高感受性を意味する一方、＜０．２の値は、低スコアまたはカットオフ値と考えられ、ＭＤＭ２ｉに対する低感受性を意味する。
【０２０９】
ある実施形態では、本発明は、少なくとも部分的にコンピューターによる実施を含む方法であって、図１Ａ〜１Ｅ、表１、または遺伝子ＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲ、ＣＤＫＮ１Ａ、およびＡＥＮ（および場合によりＭＤＭ２）を有する遺伝子シグネチャーの遺伝子シグネチャー遺伝子のそれぞれに関する遺伝子発現レベルを含む遺伝子発現データセット（例えば、遺伝子発現レベルのリスト）が受信される方法を提供する。データセットにおける遺伝子の発現レベルは、同じ遺伝子の対照遺伝子発現レベルと比較され、同じ遺伝子の対照遺伝子発現レベルと比較した、データセットにおける遺伝子の遺伝子発現レベルの差異が計算される。一部の実施形態では、同じ遺伝子の対照遺伝子発現レベルと比較して、または対照（ハウスキーピング）遺伝子発現レベルに正規化して計算されたデータセットにおける遺伝子の遺伝子発現レベルの差異は、ユーザーインターフェースに表示される。他の実施形態では、方法は、同じ遺伝子の対照発現レベルと、または正規化された値と比較して、データセットにおける遺伝子の発現レベルの差異がある場合、例えば、データセットにおける遺伝子の発現の感受性スコアまたはカットオフ値がＭＤＭ２ｉに対するがん、腫瘍、または新生物の感受性を示す閾値またはカットオフ値を超える場合、がん、腫瘍、または新生物（またはその試料）をＭＤＭ２ｉでの治療に対して感受性であると同定することをさらに含む。さらなる実施形態では、本明細書に記載の方法の任意の１つまたは複数を行なうためのコンピューター実行可能命令を含む１つまたは複数のコンピューター可読記憶デバイスが提供される。
【０２１０】
ある実施形態では、本発明は、対象のがんまたは腫瘍がＭＤＭ２ｉでの治療に対して感受性であるかどうかを決定するためのコンピュータープログラム製品であって、コンピューターにロードされた場合、コンピュータープログラム製品が対象由来のがんまたは腫瘍試料からの遺伝子発現結果を用いて、対象のがんまたは腫瘍がＭＤＭ２ｉ感受性であるかどうかを決定するように構成されており、前記遺伝子発現結果が図１Ａ〜１Ｅに；表１に；または遺伝子ＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲ、ＣＤＫＮ１Ａ、およびＡＥＮを含有する遺伝子シグネチャーに列挙されたまたはさもなければ本発明によって提供された遺伝子シグネチャーの（例えば、３、４、５、６、８、１０以上の）遺伝子の全てまたはサブセットに関する発現データを含む、コンピュータープログラム製品を提供する。
【実施例】
【０２１１】
以下の例は、本発明の特定の特色および／または実施形態を例示するために提供される。例示された特色および／または実施形態は、本発明を例証するのに役立ち、限定することは意図されていない。
【実施例１】
【０２１２】
この実施例は、マルチがん細胞株パネルにおける細胞の成長に及ぼす代表的な小分子ＭＤＭ２ｉの効果の評価を記載する。この実施例では、使用したＭＤＭ２阻害剤は、化合物Ａおよび化合物Ｂ  ｐ−トルエンスルホン酸塩であった。パネルは、ハイコンテント薬物スクリーニング分析において評価された２５０のヒトがん細胞株（ＯｎｃｏＰａｎｅｌ（商標），Ｒｉｃｅｒｃａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐａｉｎｅｓｖｉｌｌｅ，ＯＨ）を含んだ。細胞株に関する相対的ＩＣ50値を決定した。
【０２１３】
材料および方法
化合物を電子はかり（ＡＸ２０５，Ｓｅｒｉａｌ  Ｎｏ．１１２６０５１６８５，Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ  Ｋ．Ｋ．）を使用して秤量し、その市販のＯｎｃｏＰａｎｅｌ細胞毒性アッセイにおけるがん細胞株のそのパネルを使用した試験のためにＲｉｃｅｒｃａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓに提供した。
【０２１４】
Ｏｎｃｏｐａｎｅｌ（商標）細胞毒性アッセイ
細胞を３７℃で５％ＣＯ2の湿気のある環境で、ＲＰＭＩ  １６４０、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、または特別な培地において成長させた。細胞を３８４ウェルプレートに播種し、３７℃で５％ＣＯ2の加湿環境でインキュベートした。試験化合物を細胞播種後２４時間で加えた。同時に、時間ゼロで、非処置細胞プレートを対照として作成した。７２時間のインキュベーション期間後、細胞を固定し、核色素で染色して、核の可視化を可能にした。
【０２１５】
化合物を試料情報の章で特定された最も高い試験濃度から連続的に３．１６倍に希釈し、０．１％ＤＭＳＯの最終アッセイ濃度において阻害剤の１０の濃度にわたってアッセイした。自動化された蛍光顕微鏡法をＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＩｎＣｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００を使用して行ない、画像を４×対物レンズで回収した。１２ビットのｔｉｆｆ画像をＩｎＣｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００  ３．２を使用して取得し、Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ  Ｔｏｏｌｂｏｘ  １．６ソフトウェアで分析した。
【０２１６】
組み込まれた核色素のシグナル強度によって細胞増殖を測定した。細胞増殖アッセイアウトプットを、相対的細胞数と称する。細胞増殖エンドポイントを決定するために、細胞増殖データアウトプットを以下の式を使用して対照（ＰＯＣ）のパーセントに変換する：
ＰＯＣ＝相対的細胞数（化合物ウェル）／相対的細胞数（ビークルウェル）×１００。
【０２１７】
相対的細胞数ＩＣ50（ＩＣ50）は、細胞増殖阻害応答の５０％または５０％細胞毒性レベルを生ずる試験化合物の濃度である。ＩＣ50値を非線形回帰を使用して計算して、データをシグモイド４ポイント、４パラメーターＯｎｅ−Ｓｉｔｅ用量応答モデルに合わせた｛ここで、ｙ（ｆｉｔ）＝Ａ＋［（Ｂ−Ａ）／（１＋（（Ｃ／ｘ）＾Ｄ））］であった｝。カーブフィッティング、ＩＣ50計算および報告書生成をカスタムデータ整理エンジンＭａｔｈＩＱに基づくソフトウェア（ＡＩＭ）を使用して行なった。さらに、化合物Ａが処置細胞の成長を４０．０μＭの最も高い濃度での非処置細胞の半分まで低下させなかった、および化合物Ｂ  ｐ−トルエンスルホン酸塩が処置細胞の成長を１０．０μＭの最も高い濃度での非処置細胞の半分まで低下させなかった細胞株においては、ＩＣ50値を計算しなかった。これらの場合では、ＩＣ50値を、それぞれ、４０μＭおよび１０μＭと表した（表２）。
【表２】
2017532959.tif 000012
2017532959.tif 000013
2017532959.tif 000014
2017532959.tif 000015
2017532959.tif 000016
【実施例２】
【０２１８】
ＭＤＭ２ｉ感受性に関連する遺伝子発現および遺伝子シグネチャー情報の決定
【０２１９】
バイオマーカーの発見
ＭＤＭ２ｉ阻害剤の細胞株応答／感受性データを分析のために化合物ＡをＣｏｍｐｅｎｄｉａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．，（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）に送った。Ｏｎｃｏｐａｎｅｌ（商標）データ由来のＩＣ50エンドポイント値を使用して、細胞株をＭＤＭ２ｉに対して感受性または非感受性と指定した。ＩＣ50値における１−ｌｏｇ差異がＭＤＭ２ｉに対して感受性と指定された細胞または非感受性と指定された細胞間で維持された。実施例１において示したように、ＩＣ50エンドポイント値を表２に示す。細胞株を遺伝子変異、遺伝子増幅または欠失、および遺伝子過剰発現に関して特徴付けた。さらに、関連する機能を有する遺伝子の経路をアノテートし、別々のバイオマーカー型として含めた。遺伝子変異データは、２４０のマルチがん細胞株パネルに存在する１８６細胞株に関して入手可能であった。遺伝子変異を数百の細胞株における６１の選択されたがん関連遺伝子のコードエキソンおよび直接隣接するイントロン配列の配列を決定したＷｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｓａｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔから精選した。遺伝子変異データを公的に入手可能なＳａｎｇｅｒデータベースｖ４８（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｇｅｎｅｔｉｃｓ／ＣＧＰ／ＣｅｌｌＬｉｎｅｓ）から抽出した。ＤＮＡコピー数データおよび遺伝子発現データは、全ての細胞株に関して入手可能であった。
【０２２０】
単一ヌクレオチド多形性データを以下の方法を使用してＤＮＡコピー数推定値に変換した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ５００Ｋアレイからの細胞強度ファイルをａｒｏｍａ−ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＲパッケージにおいてＣＲＭＡｖ２を使用してプロセシングした。チップ強度値を全ての細胞株にわたって中央レポーター値で割り、次いでｌｏｇ変換して、ｌｏｇ２コピー数比を得た。Ｌｏｇ２コピー数比をＲ／ＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒからのＤＮＡＣｏｐｙパッケージからの円形バイナリーセグメント化を使用してプロセシングした。ＵＣＳＣ  ＲｅｆＳｅｑ  Ｇｅｎｅ  ｈｇ１８座標由来の遺伝子座標と交差したセグメント座標を使用して、遺伝子レベルコピー数を生成した。各細胞株では、ｌｏｇ２コピー数比＞１を有する遺伝子を増幅されたとアノテートし、ｌｏｇ２コピー数比＜−１を有する遺伝子を欠失したとアノテートした。
【０２２１】
遺伝子発現データをＧＣ  Ｒｏｂｕｓｔ  Ｍｕｌｔｉ−ａｒｒａｙ  Ａｖｅｒａｇｅ（ＧＣＲＭＡ）バックグラウンド調整アルゴリズムを使用してプロセシングした。代替のチップ定義ファイル（ａｌｔＣＤＦ）を使用して、プローブをＥｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ識別子と関連するプローブセットに要約した。ＨＧ−Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０  Ｈｓ＿ＥＮＴＲＥＺＧ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ＣＤＦ（バージョン１２．１．０）は、ＢｒａｉｎＡｒｒａｙウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｂｒａｉｎａｒｒａｙ．ｍｂｎｉ．ｍｅｄ．ｕｍｉｃｈ．ｅｄｕ／Ｂｒａｉｎａｒｒａｙ／Ｄａｔａｂａｓｅ／ＣｕｓｔｏｍＣＤＦ／ｇｅｎｏｍｉｃ＿ｃｕｒａｔｅｄ＿ＣＤＦ．ａｓｐ）から入手可能であった。このＣＤＦでは、各プローブセットは、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅデータベースにおける命名された遺伝子に相当する。ａｌｔＣＤＦをＨｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０  Ａｒｒａｙ  ｃｈｉｐに適用することにより、１７，５４５遺伝子が測定された。各遺伝子の中央発現レベルが決定された。各細胞株では、中央値を超えた≧６４倍の発現を有する遺伝子を「Ｇｅｎｅ  Ｏｖｅｒｅｘ」とアノテートした。
【０２２２】
ＭＤＭ２ｉ感受性（ｎ＝６２）および非感受性（ｎ＝１６４）細胞株由来のｍＲＮＡデータセットの差次的発現分析を行なって、カスタム遺伝子薬物感受性シグネチャーを作成した。片側スチューデントｔ検定を行なって、感受性または耐性細胞株内の各遺伝子の差次的上方制御に関するｐ値を計算した。遺伝子をｐ値によってランク付けし、ＭＤＭ２ｉ感受性および非感受性に関するカスタム遺伝子シグネチャーをそれぞれ任意にランク付けされた遺伝子の上位１％に限定した（ｎ＝１７７）、（例えば、図１Ａ〜１Ｅ）。
【０２２３】
バイオマーカーとＭＤＭ２ｉ応答間の関連の潜在的有意性をバイオマーカー（正または負）と薬物応答（感受性または耐性）間の関連なしの帰無仮説でＦｉｓｈｅｒ’ｓ  Ｅｘａｃｔ  Ｔｅｓｔを使用して特徴付けた。関連試験を感受性（ｎ＝６２）および／または耐性（ｎ＝１６４）細胞株における≧２細胞株（ｎ＝６，９９６）で正と称される全ての候補ゲノムバイオマーカーに関してコンピューター処理した。薬物応答と関連していたバイオマーカーを最初にｐ値およびオッズ比によってランク付けした。Ｑ値を、行なわれた多数の関連試験による偽発見率の尺度として計算した。Ｑ値を（ｐ値／ｐ値ランク）＊各バイオマーカータイプ内の測定されたバイオマーカーの数として計算した。
【０２２４】
臨床集団分析
有意なｉｎ  ｖｉｔｒｏ遺伝子変異バイオマーカーをコンセプト分析を用いて２０，０００＋臨床腫瘍試料にわたって特徴付けられたバイオマーカーに位置づけた。遺伝子シグネチャーの有意な関連を特定のがんサブタイプで同定した。より明確には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ薬物感受性または耐性と関連するバイオマーカープロファイルを臨床ゲノムデータにわたって調べた。Ｏｎｃｏｍｉｎｅ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｇｅｎｅ  ＢｒｏｗｓｅｒおよびＭｕｔａｔｉｏｎ  Ｂｒｏｗｓｅｒ  Ｐｏｗｅｒ  Ｔｏｏｌｓを使用して、広くがんのタイプ超えて選択されたバイオマーカー遺伝子の変異、過剰発現および増幅の頻度を捕らえた。Ｐｏｗｅｒ  Ｔｏｏｌｓは、ＯｎｃｏｍｉｎｅおよびＣＯＳＭＩＣからのデータを組み込んだ。変異頻度を測定された変異／試料を含有する試料の数によって決定した。過剰発現頻度を≧１０×中央発現／試料の数の発現値を有する試料の数によって決定した。増幅頻度を推定のコピー数値≧４／試料の数を有する試料の数によって決定した。
【０２２５】
Ｆｉｓｈｅｒ’Ｅｘａｃｔ  Ｔｅｓｔを使用して、Ｏｎｃｏｍｉｎｅにおける臨床検体由来の＞１３，０００の存在する遺伝子シグネチャーのそれぞれとのカスタム遺伝子シグネチャーの関連を計算した。計算における空集合は、Ｏｎｃｏｍｉｎｅデータベースにおける全てのＥｎｔｒｅｚ遺伝子のリストであった。ｐ値を遺伝子リスト間の関連なしの帰無仮説でＯｎｃｏｍｉｎｅにおいて計算した。Ｑ値を（ｐ値／ｐ値ランク）*Ｏｎｃｏｍｉｎｅにおける遺伝子リストの数として決定した。
【０２２６】
感受性および耐性シグネチャーを個々のＯｎｃｏｍｉｎｅデータセット内で患者試料においてスコア化し、シグネチャー発現をがんサブタイプ、分子サブタイプ、組織学的グレード、または患者結果などのメタデータによって定義された患者サブセットにおいて特徴付けた。がんタイプにわたる相対的シグネチャー発現を特徴付けるために、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３マイクロアレイフォーマットプラットフォーム上で測定された全てのＯｎｃｏｍｉｎｅデータセット（＞１５，０００患者腫瘍試料）を組み合わせたカスタムデータセットを創出した。種々のデータセットからの試料にわたる遺伝子発現分布を正規化するために、遺伝子発現データを分位正規化した。シグネチャーにおける各遺伝子の寄与を正規化するために、シグネチャー遺伝子をＺ−スコア正規化（各遺伝子の平均発現値を各試料内の値から引き算し、差を標準偏差で割る）に供した。分位正規化されたデータセットにわたるシグネチャースコアを各シグネチャー遺伝子のＺ−スコア正規化発現値の非加重平均を決定することによって作成した。シグネチャースコアをがん型およびがんサブタイプによって要約した。薬物応答とのｉｎ  ｖｉｔｒｏ関連由来の感受性および耐性スコアに関する閾値を臨床腫瘍データに適用して、がんタイプおよびサブタイプにわたるシグネチャー発現の頻度を作成した。
【０２２７】
ＭＤＭ２ｉ化合物Ａに対する選択的応答
細胞株をＩＣ50値によってランク付けし、ＭＤＭ２ｉに対して感受性（Ｓ）、中程度（Ｍ）および耐性（Ｒ）と称した。ＩＣ50値による細胞株応答の特徴付けは、２つの一般的応答表現型を示した。細胞株の約２５％は、＜１μＭのＩＣ50値を有し、約７０％は、＞１０μＭのＩＣ50値を有した。細胞株ＩＣ50値は、０．１２から＞５０μＭに及んだ。細胞株をＩＣ50ウォータフォールプロット上の最も急な勾配の領域にわたる１ｌｏｇ  ＩＣ50の中程度ビンに中心を置くカスタムビンニング戦略に基づいて、感受性または非感受性と称した。中程度ビンと比較して低ＩＣ50値を有する６２の細胞株を感受性と称し、中程度ビンを超えるＩＣ50値を有する１６４細胞株を耐性と称した。（図２）。関連分析を感受性（ｎ＝６２）および耐性（ｎ＝１６４）細胞株名称とほぼ７，０００候補ゲノムバイオマーカー（正または負として分類される）との間で行なった。ＴＰ５３遺伝子変異は、化合物Ａ  ＭＤＭ２ｉ（ｐ  ３Ｅ−２４、Ｑ  ８Ｅ−２３）に対する耐性と強く関連しており、高度に感受性（０．８７）であり、ほぼ完璧に特異的であった（０．９４）。
【０２２８】
多変量決定木分析
単一木帰納的分類アルゴリズム（Ａｃｃｅｌｙｒｓ）またはＳｐｏｔｆｉｒｅ（Ｄｅｃｉｓｉｏｎ  Ｔｒｅｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｓｐｏｔｆｉｒｅ  Ｄｅｃｉｓｉｏｎ  Ｓｉｔｅ）を通した区分化を使用して、どのようにＭＤＭ２ｉ感受性および非感受性／耐性と関連する複数のバイオマーカーが組み合わされて薬物応答に関して最も効果的に濃縮され得るのかを調査した。決定木インプットは、≦０．５のＱ値閾値を満たす全てのマルチがんバイオマーカーを含んだ。オッズ比およびｐ値をＦｉｓｈｅｒ’Ｅｘａｃｔ  Ｔｅｓｔによってコンピューター処理した。ＴＰ５３変異を第１の区分化ノードとして選択した。後のノードは、さらなる濃縮を達成するための遺伝子変異バイオマーカーまたはカスタム遺伝子シグネチャーの使用を実証した。
【０２２９】
がんサブタイプにおけるバイオマーカー頻度
がんサブタイプにわたるＴＰ５３変異の頻度および感受性シグネチャースコア≧０．２を比較した。がんサブタイプにわたるＴＰ５３変異の頻度をＯｎｃｏｍｉｎｅ  Ｐｏｗｅｒｔｏｏｌ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｂｒｏｗｓｅｒ  ｖ２．０から得た。独立的に、感受性シグネチャー（シグネチャースコア≧０．２）の発現の頻度をＣｏｍｐｅｎｄｉａ’ｓ  カスタム  Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３  データセットを使用し決定した。独立的な患者コホートをＯｎｃｏｍｉｎｅ  Ｐｏｗｅｒｔｏｏｌ  ＭｕｔａｔｉｏｎＢｒｏｗｓｅｒおよびカスタムＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３  データセットにおいて表した。低頻度ＴＰ５３変異および高頻度ＭＤＭ２ｉ感受性遺伝子シグネチャー遺伝子発現を有するがんサブタイプは、ＭＤＭ２ｉ感受性を予測するバイオマーカーに関して濃縮された患者集団を表す。
【０２３０】
ＴＰ５３野生型細胞株における訓練セットの受信者動作特性および１つ抜き交差検定（ＬＯＯＣＶ）感受性シグネチャー
ＬＯＯＣＶ分析を全ての感受性（ｎ＝６２）および耐性（ｎ＝１６４）細胞株に行なった。感受性または非感受性／耐性と称される全ての細胞株に関して、１つ抜き（ＬＯＯ）シグネチャーを、残りの感受性と耐性系間の差次的発現分析を行なうことによって構築した。各細胞株を各ＬＯＯシグネチャーに関してスコア化し、レフトアウト試料のクラスを、レフトアウト試料スコアを残りの感受性および耐性試料の平均シグネチャースコアと比較することによって予測し；レフトアウト試料スコアが耐性平均値よりも感受性平均値に近い場合、レフトアウト試料を感受性と分類した。レフトアウト試料におけるシグネチャースコアが感受性を予測する能力を受信者動作特性（ＲＯＣ）分析を使用して評価した。
【０２３１】
ＲＯＣプロットを真陽性率（ｙ軸）対偽陽性率（ｘ軸）をＴＰ５３野生型細胞株における化合物Ａ訓練セットおよびＬＯＯＣＶ感受性スコアに関してプロットすることによって作成した。Ｗｉｌｃｏｘｏｎ  ｐ値をシグネチャースコア対真の感受性コール状態のそれぞれに関して計算し、有意であると見出された。訓練セットスコアおよびＬＯＯＣＶスコアは、それぞれ、８．３Ｅ−７（すなわち、８．３×１０-7）および２．４Ｅ−４（すなわち、２．４×１０-4）のｐ値、ならびに０．９２および０．８のＡＵＣ値を有した。この分析は、化合物Ａ  ＭＤＭ２ｉに対する感受性を示す遺伝子シグネチャーにおける遺伝子の発現の予測能力を支持する。
【０２３２】
上記の結果を以下のように要約する：図１Ａ〜１Ｅに示された１７７遺伝子の１３９遺伝子が多発がんを含めた目的のがん型における明瞭な可変性の発現（すなわち、Ｒ＞０．２；分散＞０．２）を示した。表３に示された３８の遺伝子は、例えば、前臨床動物腫瘍モデルにおけるｉｎ  ｖｉｔｒｏとｉｎ  ｖｉｖｏの両方での一貫したＴＰ５３依存性発現を示し；３７の遺伝子（すなわち、ＰＥＢＰ１を除く表３における遺伝子）は、正常組織と比較して、がん組織における増加した発現を示した。表３では、「全て」は、以下のがんタイプ：急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、神経膠芽腫（ＧＢＭ）、メラノーマ、多発がんおよび骨髄腫を表す。
【表３】
2017532959.tif 000017
2017532959.tif 000018
【実施例３】
【０２３３】
ＭＤＭ２ｉ感受性と関連する遺伝子発現プロファイルの洗練化
【０２３４】
いろいろながん型／サブタイプにおけるＭＤＭ２ｉ感受性と高く相関する遺伝子セットを決定する目的で、ＭＤＭ２ｉに対する感受性を示す遺伝子シグネチャーをさらに洗練した。コンピューターソフトウェア、アルゴリズムおよびバイオインフォマティクスの手法を利用した。
【０２３５】
当業者によって認識されるように、Ｒａｎｄｏｍ  Ｆｏｒｅｓｔは、分類および回帰分析のためのＬ．Ｂｒｅｉｍａｎ（２００１，Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ，４５，５〜３２）によって報告されている機械学習アルゴリズムである。アルゴリズムは、元のデータから繰り返しランダムに選択されたサンプルおよび変数からなる多くの決定木を構築することによって機能する。Ｒａｎｄｏｍ  Ｆｏｒｅｓｔモデルが構築された後、モデルは、分類に重要ではない変数を除外することによって単純化され得る。変数選択方法がＲ．Ｄｉａｚ−Ｕｒｉａｒｔｅら（２００６，ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，７（３）：１４７１〜１４２１）によって開発され、変数減少法と変数重要度スコアに基づく選択の両方を使用して、Ｒａｎｄｏｍ  Ｆｏｒｅｓｔモデルから重要な変数を選択し得る。これらの技法をＯｎｃｏｐａｎｅｌ（商標）、例えば、実施例２における細胞株の感受性データに適用して、それらの感受性の効果的な分類に寄与する遺伝子セットを選択した。
【０２３６】
最初の遺伝子セットとして、Ｃｏｍｐｅｎｄｉａによって提供された３５０遺伝子を使用した。これらの遺伝子は、実施例１に記載されたＭＤＭ２ｉ化合物Ａの分析から同定された１７５の総遺伝子から感受性および耐性シグネチャー遺伝子として選択された遺伝子である。感受性スコアを「感受性」および「耐性」として二値化し；２μＭ（≦２μＭ）以下のＩＣ50値を有する７０細胞株を感受性と定義し、２０μＭ（≧２０μＭ）以上のＩＣ50値を有する１６３細胞株を耐性と定義した。境界の感受性を有する、すなわち、２μＭから２０μＭのＩＣ50値を有する７細胞株を分析から除外した。これもＲｉｃｅｒｃａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって提供されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）発現値を説明変数として使用した。
【０２３７】
Ｒａｎｄｏｍ  ＦｏｒｅｓｔモデルをＲ統計ソフトウェア（ｖｅｒ．２．１３）の商用利用可能な「ｒａｎｄｏｍＦｏｒｅｓｔ」パッケージ（ｖｅｒ．４．６）によって構築した。木の数に関するパラメーターを５０００に設定した。変数選択アルゴリズムをＲの「ｖａｒＳｅｌＲＦ」パッケージ（ｖｅｒ．０．７）において実施した。最初のデータを使用してｒａｎｄｏｍＦｏｒｅｓｔのオブジェクトをいったん構築すると、続けてｖａｒＳｅｌＲＦ方法がそれに適用された。結果として、８つの遺伝子（ＢＡＸ、ＣＤＫＮ１Ａ、ＤＤＢ２、ＥＤＡ２Ｒ、ＦＤＸＲ、ＭＤＭ２、ＲＰＳ２７Ｌ、およびＳＰＡＴＡ１８）をＭＤＭ２ｉ感受性分類に関する重要な遺伝子として選択した。ＢＡＸ、ＣＤＫＮ１Ａ、ＤＤＢ２、ＦＤＸＲ、ＭＤＭ２およびＲＰＳ２７Ｌ遺伝子は、表３に示された３８遺伝子の遺伝子セットにも含まれる。８つの遺伝子が細胞株をＭＤＭ２ｉに対して感受性であると分類するのに十分であるかどうかを評価するために、アウトオブバッグ（ＯＯＢ）誤差推定値を元の３５０遺伝子を使用して構築されたモデルと選択された８つの遺伝子間で比較した。３５０−遺伝子モデルのＯＯＢ誤差率は１０％であった一方、８−遺伝子モデルの誤差率は、９．４％であり、遺伝子の数を３５０から８に減少させることは、予測モデルがＭＤＭ２ｉ感受性を予測する能力に影響しなかったことを示している。
【実施例４】
【０２３８】
遺伝子シグネチャーは、ｉｎ  ｖｉｖｏヒト腫瘍移植片モデル研究において腫瘍化動物のＭＤＭ２ｉ処置に対する感受性を予測する
【０２３９】
この実施例は、本発明に基づく遺伝子シグネチャーおよびそれに関連する感受性シグネチャースコアが、かかる腫瘍を有し、ＭＤＭ２ｉで処置された動物における特定のＭＤＭ２ｉに対する様々な腫瘍型の感受性を予測するのに効果的であることを実証する腫瘍化動物モデルを使用したｉｎ  ｖｉｖｏ実験を記載する。
【０２４０】
材料および方法
患者由来異種移植片モデル（Ｃｈａｍｐｉｏｎｓ  ＴｕｍｏｒＧｒａｆｔ（商標）；Ｃｈａｍｐｉｏｎｓ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｈａｃｋｅｎｓａｃｋ，ＮＪ）を使用した。Ｃｈａｍｐｉｏｎｓ  ＴｕｍｏｒＧｒａｆｔｓ（商標）は、高度に集中された、促進的なトランスレーショナルプラットフォームを提供し、これは、本来のヒト腫瘍の生物学的特徴を保存するような様式での免疫不全マウスにおける原発性ヒト腫瘍の移植、それに続く少ない継代数でのＣｈａｍｐｉｏｎｓ  ＴｕｍｏｒＧｒａｆｔｓ（商標）の増殖に基づく。その企業によって提供される情報によれば、組織学および分子研究は、Ｃｈａｍｐｉｏｎｓ  ＴｕｍｏｒＧｒａｆｔ（商標）モデルががん幹細胞およびストローマを含めた本来の腫瘍の基礎的な遺伝子型および表現型特色を維持し；がんの遺伝的な不均質性を表し；患者における腫瘍学的薬物の有効性を予測し；高度に応答性の患者集団の同定を可能にし；複数の継代にわたって遺伝的に変化せず；本来の患者腫瘍と遺伝的に相関し；標準薬剤に対する一貫した増殖および応答を示すことを明らかにした。ＴｕｍｏｒＧｒａｆｔｓ（商標）モデルは、マイクロアレイ発現分析によって患者のがん試料およびＣｈａｍｐｉｏｎｓ  ＴｕｍｏｒＧｒａｆｔ（商標）試料の遺伝子発現分析の比較を可能にする。多数（例えば、３０，０００）の遺伝子を分析する。ピアソン相関は、腫瘍移植片におけるがん遺伝子発現と本来の腫瘍におけるがん遺伝子発現間の相関を高い割合（例えば、９４％）で示す。
【０２４１】
動物
６〜９週齢の雌の免疫不全ｎｕ／ｎｕマウス（Ｈａｒｌａｎ）を個々のＨＥＰＡ換気ケージ（Ｉｎｎｏｃａｇｅ（商標）ＩＶＣ，Ｉｎｎｏｖｉｖｅ  ＵＳＡ）中の放射線照射済みのペーパーツイスト強化１／８インチコーンコブ床敷（Ｓｈｅｐｅｒｄ）に収容し、６８〜７４°Ｆ（２０〜２３℃）および３０〜７０％湿度での１２時間明暗周期で保った。動物に適宜、水（逆浸透、２ｐｐｍ  Ｃｌ２）ならびに１９％のタンパク質、９％の脂肪、および４％の繊維からなる放射線照射されたＴｅｓｔ齧歯動物の食事（Ｔｅｋｌａｄ  ２９１９）を与えた。
【０２４２】
感受性スコア計算
感受性および耐性シグネチャーをＣｈａｍｐｉｏｎｓ  ＴｕｍｏｒＧｒａｆｔ（商標）モデルにおいてスコア化した。モデル内の相対的シグネチャー発現の特徴を明らかにするために、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ２１９マイクロアレイフォーマットプラットフォーム上で測定された全てのＣｈａｍｐｉｏｎｓ  ＴｕｍｏｒＧｒａｆｔ（商標）モデル（＞１４５モデル）を結合したカスタムデータセットを構築した。遺伝子発現データをＧＣ  Ｒｏｂｕｓｔ  Ｍｕｌｔｉ−ａｒｒａｙ  Ａｖｅｒａｇｅ（ＧＣＲＭＡ）バックグラウンド調整アルゴリズムを使用してプロセシングした。代替のチップ定義ファイル（ａｌｔＣＤＦ）を使用して、プローブをＥｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ識別子と関連するプローブセットに集約した。当業者は認識するように、以下のインターネットアドレス（すなわち、ｈｔｔｐ：／／ｂｒａｉｎａｒｒａｙ．ｍｂｎｉ．ｍｅｄ．ｕｍｉｃｈ．ｅｄｕ／Ｂｒａｉｎａｒｒａｙ／Ｄａｔａｂａｓｅ／ＣｕｓｔｏｍＣＤＦ／ｇｅｎｏｍｉｃ＿ｃｕｒａｔｅｄ＿ＣＤＦ．ａｓｐ）を通して入手可能およびダウンロード可能であるＨＧＵ２１９＿Ｈｓ＿ＥＮＴＲＥＺＧ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ＣＤＦ（バージョン１５．１．０）を利用した。シグネチャーにおける各遺伝子の寄与を正規化するために、シグネチャー遺伝子をＺ−スコア正規化（各遺伝子の平均発現値を各試料内の値から引き、差を標準偏差で割る）に供した。モデルにわたるシグネチャースコアを各シグネチャー遺伝子のＺ−スコア正規化発現値の非加重平均を決定することによって生成した。
【０２４３】
腫瘍モデルの記述
いくつかのヒト腫瘍組織型に関する動物腫瘍モデルを以下に記載したように作製し、以下に示す表５に示した。ＮＳＣＬＣは、非小細胞肺がんを表す。シグネチャースコアは、研究において使用されたＭＤＭ２ｉ、つまり、この実施例における化合物Ｂ（３’Ｒ，４’Ｓ，５’Ｒ）−Ｎ−［（３Ｒ，６Ｓ）−６−カルバモイルテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３−イル］−６”−クロロ−４’−（２−クロロ−３−フルオロピリジン−４−イル）−４，４−ジメチル−２”−オキソ−１”，２”−ジヒドロジスピロ［シクロヘキサン−１，２’−ピロリジン−３’，３”−インドール］−５’−カルボキサミド、および化合物Ｂ  ｐ−トルエンスルホン酸塩に対する各腫瘍型の感受性のレベルと相関する、１７７遺伝子（図１Ａ〜１Ｅに表された遺伝子）、１７５遺伝子（ＥＤＡ２ＲおよびＳＰＡＴＡ１８を除く図１Ａ〜１Ｅに表された遺伝子）、４０遺伝子（表１に表された遺伝子）、４遺伝子（ＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲ、ＣＤＫＮ１ＡおよびＡＥＮ）および３遺伝子（（ＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲおよびＣＤＫＮ１Ａ）の分析から得られた代表的なＭＤＭ２ｉ遺伝子感受性シグネチャースコアまたは値である。
【０２４４】
腫瘍移植
動物に、それぞれ特定の継代ロットの腫瘍化宿主動物から収集された腫瘍断片を両側側腹部領域に移植した。研究前の腫瘍体積を各実験に関して記録し、これをその推定開始日約１週間前に開始した。腫瘍が約１２５〜２５０ｍｍ3に達した時、動物を腫瘍体積によって処置および対照群に当てはめ、投薬を開始した（第０日）。全ての研究における動物にタグを付け、実験を通して個々にフォローした。
【０２４５】
投薬レジメン
標準薬剤に関する最初の投薬を第０日に開始し；全ての群における動物に体重によって投薬した（グラムあたり０．０１ｍｌ；１０ｍｌ／ｋｇ）。各群に関する用量濃度、投与の経路およびスケジュールを実験デザイン項に列挙し、ここで、「ｐ．ｏ．／ｑｄ×１０」は、１０日間の毎日の経口（口による）を示す。
【０２４６】
実験デザイン
ヒト腫瘍移植片モデル研究の実験デザインを以下の表４に示す。「ｎ」は、群あたりの動物の数を示し；「ＲＯＡ」は、試験薬剤、すなわち、ＭＤＭ２ｉ薬剤の投与の経路を示す。
【表４】
2017532959.tif 000019
【０２４７】
試験薬剤効力の評価
腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）：第０日に開始し、腫瘍寸法をデジタルカリパスで週２回測定し、個々のおよび平均の推定腫瘍体積（Ｍｅａｎ  ＴＶ±ＳＥＭ）を含むデータを各群に関して記録した。腫瘍体積を式（１）：ＴＶ＝幅2×長さ×０．５２を使用して計算した。研究完了時に、パーセント腫瘍成長阻害（％ＴＧＩ）値を最初の（ｉ）および最終（ｆ）腫瘍測定値ならびに式（２）：％ＴＧＩ＝１−Ｔf−Ｔi／Ｃf−Ｃを使用して各処置群（Ｔ）対対照（Ｃ）に関して計算し、報告した。最後の投与に最も近くスケジュールされた日の腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）値を以下の表５に要約した。この例では、研究期間をビークル対照の腫瘍サイズによって定義した。いくつかの場合では、例えば、表５におけるＣＴＧ−０２１３は、腫瘍が閾値サイズに達するのにより長い期間を必要とした。結果として、ＭＤＭ２ｉ化合物Ｂで処置された試験動物は長い期間、ＣＴＧ−０２１３の場合は４０日、ＭＤＭ２ｉ未処置の状態に置かれた。ＭＤＭ２ｉ処置のない時間の長さは、ＣＴＧ−０２１３動物のいくつかにおいて腫瘍の再成長を引き起こした。したがって、ＴＧＩの評価を第７〜１１日あたり（第９日あたり）などの処置期間の最後近くに設定した。
【０２４８】
表５における％ＴＧＩとシグネチャースコア値の比較は、高シグネチャースコアを有する腫瘍型がＴＧＩ評価時の腫瘍成長阻害の高百分率と相関したことを示している。
【表５】
2017532959.tif 000020
【実施例５】
【０２４９】
訓練セットとしてＭＤＭ２ｉ感受性が不明である２０の試料を用いることによるＭＤＭ２ｉ処理に対する感受性の予測
【０２５０】
ＣＣＬＥデータセット
訓練セットとして薬理データを有しない試料から、がん細胞株のＭＤＭ２阻害剤処理に対する感受性を予測するために、発明者らは、Broad Institute、Novartis Institutes for Biomedical Research、およびそのGenomics Institute of the Novartis Research Foundationにより提供されるCancer Cell Line Encyclopedia (CCLE)による細胞株のｍＲＮＡ発現データを使った。発明者らは、ＭＤＭ２ｉ感受性データを持つ１８５の細胞株、ＭＤＭ２ｉ感受性データを持たない２４２のｐ５３野生型細胞株、および、ＭＤＭ２ｉ感受性データを持たない５１２のｐ５３変異型細胞株をＣＣＬＥデータセット中に見出した。本予測に用いたＣＣＬＥデータベースの細胞株は、図１２に示されている。
【０２５１】
患者由来異種移植モデル（Champions TumorGraft（商標）；Champions Oncology, Inc., Hackensack, NJ）
図１３に列挙したＰＤｘモデルは、Champions Oncology, Inc.から購入した。ＰＤｘモデルは、患者腫瘍と良く似た特性を有するが、ヒト体内における腫瘍に対して同様の効果を奏する高い蓋然性をもって目的の薬物の効果を調べるために開発された。特に、従来の腫瘍モデルは、患者の腫瘍から樹立された腫瘍細胞株をマウスに移植して生み出され、移植した腫瘍細胞株の特性を強く反映させるのに対して、ＰＤｘモデルは、マウスに対してストローマおよびがん幹細胞を含む患者の腫瘍を移植することにより生み出されるものであり、それ故に患者の腫瘍に良く類似する。本予測で用いられたＰＤｘモデルは図１３に示されている。ＰＤｘモデルは、ＭＤＭ２ｉ感受性データを伴う１２のモデルと、ＭＤＭ２ｉ感受性データを伴わない１０５のｐ５３野生型モデルと、ＭＤＭ２ｉ感受性データを伴わない１０３のｐ５３変異体モデルを含んでいた。
【０２５２】
ＴＰ５３の変異情報
ＴＰ５３の変異情報は、Broad-Novartis Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) (http://www.broadinstitute.org/ccle/home)、Sanger COSMIC Cell Line Project (CLP) (http://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cell_lines/)、および International Agency for Research on Cancer (IARC) (http://www.iarc.fr/)のウェブサイトからダウンロードした。ＣＣＬＥのハイブリッドキャプチャー配列データは、２０１２年５月２２日版であり、ＣＬＰは、バージョン６９であり、ＩＡＲＣ  ＴＰ５３データベースは、バージョンＲ１７であった。これらのデータベース間でいくつかの不整合が存在したので、これら全てのデータベースで一貫した変異情報を有する場合にのみ、各細胞株に対して発明者らは「野生型」（ｗｔ）および「変異型」（ｍｕｔ）をラベルした。例えば、ある細胞株は、ＣＬＰおよびＩＡＲＣでは「変異型」であったが、ＣＣＬＥでは「野生型」であったとき、その変異情報は不明と決定した。１つまたは２つのデータベースにおいて情報がない細胞株の場合は、その細胞株の変異ステータスは、残りのデータベースに基づいて決定した。例えば、ある細胞株がＣＣＬＥおよびＩＡＲＣの両方で「野生型」であり、ＣＬＰにおいて情報がない場合には、その細胞株は、「野生型」であるとラベルされた。
【０２５３】
ＭＤＭ２阻害剤に対する感受性
細胞増殖の５０％の抑制が観察される濃度であるＩＣ50は、Ricerca Biosciences (Eurofins)により決定された。ＭＤＭ２阻害剤に対する感受性は、本実施例では、ＩＣ50を参照することにより、ＩＣ50≦１μＭのとき感受性であり、ＩＣ50＞１μＭのとき耐性であると決定された。
【０２５４】
予測
ＭＤＭ２ｉ処理に対する感受性は、ＭＤＭ２ｉ感受性データを伴う１８５の細胞株のそれぞれで予測した。本予測は、ＭＤＭ２ｉ感受性データを伴わない細胞株からランダムにピックアップされた訓練セットとしての２０の細胞株において４または４０の遺伝子の発現プロファイルを用いて行った。本予測は、毎回異なる訓練セットを用いて１００回反復実施した。その後、予測結果は、予測が正確か否かを知るために、実験的に決定された感受性データと比較された。予測精度においてＴＰ５３変異の効果を検証するために、各訓練セットは、各図において指定されたＴＰ５３野生型細胞株とＴＰ５３変異型細胞株の数を有するように、ＴＰ５３野生型細胞とＴＰ５３変異型細胞の数が選択された。
【０２５５】
予測精度
ＦＰＲおよびＦＮＲに加えて、予測精度が算出された。感受性細胞株が感受性であると予測され、または耐性細胞株が耐性であると予測されたとき、予測は正しいと評価された。１００回のシミュレーションの後、正しい予測のパーセンテージを各細胞株に対して算出した。
【０２５６】
メラノーマ
メラノーマ細胞株に焦点を当てるために、１０のＴＰ５３変異型メラノーマ細胞株と１０のＴＰ５３野生型メラノーマ細胞株を、ＣＣＬＥデータベースからランダムにピックアップし、２０のメラノーマ細胞株セットを作成した。ＣＣＬＥデータセットは、ＭＤＭ２ｉ感受性データを伴う１８５の細胞株と、感受性データを伴わない２９のｐ５３野生型細胞株と、感受性データを伴わない１４のｐ５３変異型細胞株とを含んだ。
【０２５７】
リンパ腫
リンパ腫細胞株に対する予測性を検証するため、１０のＴＰ５３変異型リンパ腫細胞株と１０のＴＰ５３野生型リンパ腫細胞株を、ＣＣＬＥデータベースからランダムにピックアップし、２０のリンパ腫細胞株セットを作成した。ＣＣＬＥデータセットは、ＭＤＭ２ｉ感受性データを伴う１８５の細胞株と、感受性データを伴わない４４のｐ５３野生型細胞株と、感受性データを伴わない６０のｐ５３変異型細胞株とを含んだ。
【０２５８】
スコア外挿モデル
細胞株における遺伝子の発現プロファイルを取得した後に、各遺伝子の発現量を平均が０となり、標準偏差（ＳＤ）が１となるように正規化し、各遺伝子の正規化スコアを得た。試料のスコアは、解析した全ての遺伝子の正規化スコアを平均することによって算出した。目的の試料が感受性か耐性かを予測するために、真陽性率を最大化し、偽陽性率を最小化する最適化閾値を、受信者動作特性（ＲＯＣ）プロットをプロットし、一個抜き交差検定（ＬＯＯＣＶ）解析を実施することにより決定した。−０．０２（ＬＯＯＣＶから）および０．２（元の解析から）が閾値として得られ、それぞれ「ｆｉｅｘｅｄ（−０．０２）」および「ｆｉｘｅｄ（０．２）」と呼ばれる。閾値は、大津法（M. Sezgin and B. Sankur (2004), Journal of Electronic Imaging 13 (1): 146-165,および N. Otsu (1979), IEEE Trans. Sys., Man., Cyber. 9 (1): 62-66参照）によっても決定され、これは図中では"score distribution"モデルと呼ばれる。閾値は、試料のうち、ＴＰ５３野生型試料の参照スコアの第１四分位値としても決定され、これは図中では"score in wt"と呼ばれる。
【０２５９】
混合ガウスモデル（以後、"high-percentage models"とも呼ばれる）
混合ガウスモデルを作成するために、C. Fraley et.al. (Technical Report no. 597, Department of Statistics, University of Washington, June 2012.)により開発された、商用利用可能な「ｍｃｌｕｓｔ」パッケージ（バージョン４．３）を、Ｒ統計ソフトウェア（バージョン３．０．２）上で用いた。混合ガウスモデルは以下のように作成することができる。感受性細胞株と耐性細胞株とからなる細胞株パネルにおいては、シグネチャー遺伝子のｍＲＮＡ発現の分布を感受性細胞株および耐性細胞株から由来する分布の混合として記述することができる。分布が正規分布であると推定すると、混合した分布は、混合ガウスモデルとして記述される：
【数１０】
2017532959.tif 000021
｛式中、λは、パラメーターセット：λ＝｛ωi、μi、σ｝、ｉ＝１，２であり、かつ、ωi、ｉ＝１，２は、混合重み付け値であり、ｇ（χ｜μi、σ）、ｉ＝１，２は、ガウス密度成分である。｝。それぞれの密度成分は、平均値μi、ｉ＝１，２を伴う、
【数１１】
2017532959.tif 000022
の形態のガウス関数である。便宜的にμiは、μ1＜μ2の制約を満たすものとする。標準偏差σは、感受性細胞株および耐性細胞株の間で共通している、すなわちσ＝σ1＝σ2と仮定する。各パラメーターは、最尤推定法（これは訓練データが与えられたモデルの尤度を最大化するモデルのパラメーターを見つけることである）により、推定することができる。訓練ベクトルＸ＝｛χ1，．．．，χτ｝の配列に対して、尤度は、
【数１２】
2017532959.tif 000023
と記載できる。最大尤度パラメーターは、期待値最大化（ＥＭ）アルゴリズムにより得ることができる。ＥＭアルゴリズムの基本的アイデアは、
【数１３】
2017532959.tif 000024
となるように、新しいパラメーター
【数１４】
2017532959.tif 000025
を前のパラメーターλから推定することである。λは、尤度が極大値に収束するまで繰り返し更新される。Ｍ種類の遺伝子に対して、各遺伝子の発現を、χm，ｍ＝１，．．．，Ｍであると記述すると、遺伝子ｍのクラスは、
【数１５】
2017532959.tif 000026
｛式中、Ｃmは、１または２であり、Ｃm＝１のとき遺伝子は「低い」（ｌｏｗｅｒ）、Ｃm＝２のとき「高い」（ｕｐｐｅｒ）と呼ばれる｝により記述できる。変数：
【数１６】
2017532959.tif 000027
は、遺伝子ｍが属するクラスを記述するために導入され、「高い方の比率」（ｕｐｐｅｒ  ｒａｔｉｏ）は、
【数１７】
2017532959.tif 000028
により与えられる。ＭＤＭ２阻害剤に対する感受性スコアの閾値は、高い方の比率（ｕｐｐｅｒ  ｒａｔｉｏ）（６）を参照することにより決定することができる。この戦略は、ＴＰ５３変異を伴う細胞株のほとんどがＭＤＭ２阻害剤に対して耐性であるため、可能である。閾値は、ＴＰ５３変異型細胞株がその高い方の比率（ｕｐｐｅｒ  ｒａｔｉｏ）に基づいて並べられたときに、高い方の比率（ｕｐｐｅｒ  ｒａｔｉｏ）の第３四分位値（「High%[quartile]」または単に「quantile」）、または最大値（「High %[max]」または単に「max」）として決定された。細胞株は、高い方の比率（ｕｐｐｅｒ  ｒａｔｉｏ）が閾値よりも高い場合には感受性であると予測され、高い方の比率（ｕｐｐｅｒ  ｒａｔｉｏ）が閾値よりも低い場合には耐性であると予測される。
【数１８】
2017532959.tif 000029
ＭＤＭ２阻害剤に対する感受性はまた、尤度比（７）を参照することによって、前記比≧１なら感受性であると、前記比＜１なら耐性であると決定され、図中では、"distribution-only"モデルと呼ばれる。
【０２６０】
シミュレーション
２０の細胞株の各セットに対して、２つの予測モデルを作成した：１つはＴＰ５３変異型細胞株の最大値から感受性閾値を決定するモデル（"max"モデル）およびもう１つはＴＰ５３変異型細胞株の７５パーセンタイル（第３四分位）から感受性閾値を決定するモデル（"quartile"モデル）であった。各予測モデルは、１８５の細胞株に適用され、偽陽性率（ＦＰＲ）と偽陰性率（ＦＮＲ）とが以下の通り算出された：
【数１９】
2017532959.tif 000030
｛式中、ＴＰは、真陽性件数、ＴＮは真陰性件数、ＦＰは偽陽性件数、ＦＮは偽陰性件数である。｝。このシミュレーションも１００回繰り返され、結果は、Ｘ軸およびＹ軸がそれぞれＦＰＲおよびＦＮＲを表すグラフ上にプロットされた。
【０２６１】
結果
図４に示されるように、ＭＤＭ２ｉ処理への感受性は、訓練セット中のいずれの細胞株の感受性も不明である訓練セットを用いたいずれの予測モデルによっても良好に予測された。「fixed (0.2)」モデルは、ＭＤＭ２ｉ処理への感受性を、用いた訓練セットによらず、ＴＰ５３変異によらず、最も良好に予測した。わずか４遺伝子を用いた予測もまた、ＭＤＭ２ｉ処理に対するがん細胞の感受性を良好に予測した（データ掲載省略）。
【０２６２】
訓練セットとしてメラノーマ細胞株のみを用いたメラノーマ細胞株の感受性の予測結果は、図５Ａに示された。メラノーマ細胞株においては、全ての予測モデルがメラノーマ細胞株の感受性を精度高く予測した。これらの結果は、予測精度が他のがん種を除外することによって改善しうること、およびメラノーマにおいてＭＤＭ２ｉ治療に対する感受性が正確に予測できることを示す。
【０２６３】
訓練セットとしてリンパ腫細胞株を用いた、または特定の種類の細胞株を用いない場合のリンパ腫細胞株の感度の予測結果は、図５Ｂに示された。図５Ｂに示されるように、全ての予測モデルがリンパ腫細胞株の感度を正確に予測した。これらの結果もまた、予測精度が他のがん種を除外することによって改善しうることを示している。
【０２６４】
これらの結果を検証するため、ＭＤＭ２ｉ処理に対する感受性をＰＤｘモデルにおいて予測した。図６に示されるように、全ての予測モデルが、インビボのがん環境を有するＰＤｘモデルにおいて腫瘍の感受性を正確に予測した。
【実施例６】
【０２６５】
ＭＤＭ２ｉ治療に対するその感受性の予測性に対するがんにおけるｐ５３変異の影響
【０２６６】
２０のがん細胞株がＣＣＬＥデータセットからランダムにピックアップされ、訓練セットとして用いられた。予測性に対するがんにおけるｐ５３変異の影響を評価するために、ｐ５３変異を伴う０、５、１０、１５、または２０のがん細胞株を各訓練セットに含ませた。偽陽性率を最小化し、真陽性率を最大化する最適化閾値が各訓練セットにおいてＬＯＯＣＶ解析により決定された。各最適化閾値は１００の異なる訓練セットから繰り返し得られた。これらの最適化閾値は、図７にプロットされた。
【０２６７】
図７に示されるように、閾値の分布は、訓練セットが増加した数のｐ５３変異を含むと増加する傾向がある。感受性は、その後、最適化閾値のそれぞれを用いることによって実施例５に記載されたスコア外挿モデルを用いて予測された。驚くべきことに、感受性は、訓練セットにおけるｐ５３変異の割合によらず正確に予測された。これらの結果は、訓練セットにおけるｐ５３変異の割合は閾値には影響しうるが、予測精度には影響しないことを示す（図８）。
【０２６８】
本実施例は、感受性が、感受性が不明である細胞株を用いて予測できることも示している。
【実施例７】
【０２６９】
ＭＤＭ２ｉ治療に対する感受性の予測性に対するがんにおけるＭＤＭ２遺伝子増幅の影響
【０２７０】
実施例５に記載の通り、スコア外挿モデルおよび混合ガウスモデルにより予測を実施した。予測マーカーとして図１Ａ〜１Ｅの上位４、上位４０、上位１７５または上位１７７の遺伝子を用いると、良好な感受性の予測が得られた（図９参照）。しかし、ＳＪＳＡ−１およびＣＣＦ−ＳＴＴＧ１などの感受性細胞株のいくつかでは、図９において耐性であると予測された。
【０２７１】
感受性の予測性に対するＭＤＭ２遺伝子増幅（または続く当該遺伝子の過剰発現）の影響を評価するために、発明者らは、１００の訓練セットにおいて、線形判別分析による説明変数として４遺伝子（ＲＰＳ２７Ｌ、ＦＤＸＲ、ＣＤＫＮ１ＡおよびＡＥＮ）の遺伝子発現値にＭＤＭ２の発現値を加えた場合と加えなかった場合の結果から算出される予測精度を比較した。図９で列挙された２３の細胞株の１個抜き交叉検証がなされ、各細胞は、感受性である（感受性である可能性≧０．５）、または、耐性である（感受性である可能性＜０．５）と予測された。
【０２７２】
発明者らはまた、前記４つの予測マーカーにＭＤＭ２を加えることが予測精度を顕著に改善することを発見した（図１０Ａ〜１０Ｄ参照）。発明者らはまた、ＳＪＳＡ−１およびＣＣＦ−ＳＴＴＧ１細胞株がＭＤＭ２の増幅をそのゲノム上に有していること、および、ＳＪＳＡ−１およびＣＣＦ−ＳＴＴＧ１細胞株におけるＭＤＭ２の発現レベルが残りの細胞株における発現レベルを遙かに超えていることを見出した（図９）。予測精度が、ゲノム上でＭＤＭ２の増幅を有するＳＪＳＡ−１およびＣＣＦ−ＳＴＴＧ１細胞株以外の、残りのすべての細胞株についても改善されたことは注目すべきである。
【実施例８】
【０２７３】
ＭＤＭ２ｉ治療に対する感受性の予測精度に対する訓練セットの規模の影響
【０２７４】
本実施例では、訓練セットの規模がＭＤＭ２ｉ処理に対する感受性の予測精度に影響するか否かを確かめた。図１１Ａ〜１１Ｃに示されるように、ＴＰ５３野生型とＴＰ５３変異型細胞株を同数ずつ含む、記載された数のＣＣＬＥ細胞株をランダムに選択し、訓練セットとして用いて、各予測において、high %[max]モデル、high %[quantile]モデル、およびdistribution-onlyモデルなどの予測モデルにおいて閾値を得た。閾値の取得後、図に示された１５の細胞株の感受性を各モデルにおいて予測した。各細胞株の感受性は、各予測において細胞株からランダムに選択された１００の異なる訓練セットを用いて１００回予測された。その後、予測精度（％）がその結果から算出された。
【０２７５】
図１１Ａ〜１１Ｃ〜１１Ｃに示されるように、精度は、全ての予測モデルにおいて、様々な訓練セットの規模において良好に保たれた。特に、いずれの予測モデルにおいても、訓練セットの規模として４細胞で良好な結果を得るに十分であることが実証された。訓練セットの規模が６細胞以上であったときに訓練セットの規模への明確な依存性は何ら観察されなかった（図１１Ａ〜１１Ｃ）。
【０２７６】
適した方法および材料が実施形態の実行のために本明細書で記載されるが；しかしながら、本明細書に記載のものと類似したまたは同等の方法および材料が本発明および記載された実施形態の実行または試験に使用され得ることが理解されるべきである。本明細書で言及した公共利用が可能なＧｅｎＢａｎｋ登録番号に対応する核酸配列は、その全体が参照により組み込まれている。
【０２７７】
本明細書で言及した全ての刊行物、特許出願、特許、および他の公開された参考文献は、その全体が参照により組み込まれている。
【図１Ａ】
2017532959.tif 000031
【図１Ｂ】
2017532959.tif 000032
【図１Ｃ】
2017532959.tif 000033
【図１Ｄ】
2017532959.tif 000034
【図１Ｅ】
2017532959.tif 000035
【図２】
2017532959.tif 000036
【図３Ａ】
2017532959.tif 000037
【図３Ｂ】
2017532959.tif 000038
【図３Ｃ】
2017532959.tif 000039
【図３Ｄ】
2017532959.tif 000040
【図３Ｅ】
2017532959.tif 000041
【図３Ｆ】
2017532959.tif 000042
【図４】
2017532959.tif 000043
【図５Ａ】
2017532959.tif 000044
【図５Ｂ】
2017532959.tif 000045
【図６】
2017532959.tif 000046
【図７】
2017532959.tif 000047
【図８】
2017532959.tif 000048
【図９】
2017532959.tif 000049
【図１０Ａ】
2017532959.tif 000050
【図１０Ｂ】
2017532959.tif 000051
【図１０Ｃ】
2017532959.tif 000052
【図１０Ｄ】
2017532959.tif 000053
【図１１Ａ】
2017532959.tif 000054
【図１１Ｂ】
2017532959.tif 000055
【図１１Ｃ】
2017532959.tif 000056
【図１２Ａ】
2017532959.tif 000057
【図１２Ｂ】
2017532959.tif 000058
【図１２Ｃ】
2017532959.tif 000059
【図１２Ｄ】
2017532959.tif 000060
【図１２Ｅ】
2017532959.tif 000061
【図１２Ｆ】
2017532959.tif 000062
【図１２Ｇ】
2017532959.tif 000063
【図１２Ｈ】
2017532959.tif 000064
【図１２Ｉ】
2017532959.tif 000065
【図１２Ｊ】
2017532959.tif 000066
【図１２Ｋ】
2017532959.tif 000067
【図１３Ａ】
2017532959.tif 000068
【図１３Ｂ】
2017532959.tif 000069
【国際調査報告】
2017532959.tif 000070
2017532959.tif 000071
2017532959.tif 000072