(57)【要約】  本発明は、シナラ・スコリムスの滴定抽出物、シナラ・スコリムス抽出物の滴定画分、又は前記抽出物と１つ以上の前記滴定画分の滴定混合物、又は前記画分の混合物、並びに、悪性胸膜中皮腫を予防及び／又は処置するためのそれらを含む組成物及びキットに関する。
2017535617.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
悪性胸膜中皮腫の予防及び／又は処置において使用するための、総カフェオイルキナ酸、クロロゲン酸、及びシナロピクリンについて滴定したシナラ・スコリムス（Ｃｙｎａｒａ  ｓｃｏｌｙｍｕｓ）の抽出物、又はシナラ・スコリムスの抽出物の画分、又は前記抽出物と１つ以上の前記画分との混合物、又は前記画分の混合物であって、
総カフェオイルキナ酸が、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の８重量％から１６重量％までを示し、クロロゲン酸が、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の３．５重量％から７重量％までを示し、前記シナロピクリンが、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の０．２重量％から４重量％までを示すか、又は
総カフェオイルキナ酸が、乾燥形態の前記画分の２５重量％から４８重量％までを示し、クロロゲン酸が、乾燥形態の前記画分の１１重量％から２１重量％までを示し、及び前記シナロピクリンが、乾燥形態の前記画分の１重量％から１０重量％までを示す、
上記抽出物、画分、又は混合物。
【請求項２】
請求項１に記載の使用のための、シナラ・スコリムスの抽出物、又はシナラ・スコリムスの抽出物の画分、又は前記抽出物と１つ以上の前記画分との混合物、又は前記画分の混合物であって、
前記総カフェオイルキナ酸が、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の９重量％から１５重量％までを示し、前記クロロゲン酸が、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の３．５重量％から５．５重量％までを示し、前記シナロピクリンが、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の０．２重量％から３重量％までを示すか、又は、
前記総カフェオイルキナ酸が、乾燥形態の前記画分の２５重量％から３５重量％までを示し、前記クロロゲン酸が、乾燥形態の前記画分の１１重量％から１５重量％までを示し、前記シナロピクリンが、乾燥形態の前記画分の１重量％から８重量％までを示す、
上記抽出物、画分、又は混合物。
【請求項３】
前記抽出物、前記画分又は前記混合物が、乾燥形態、凍結乾燥形態又は流体形態であり、シナラの葉、頭状花又はそれらの混合物から得られる、請求項１又は２に記載のシナラ・スコリムスの抽出物、又はシナラ・スコリムスの抽出物の画分、又は前記抽出物と１つ以上の前記画分との混合物、又は前記画分の混合物。
【請求項４】
悪性胸膜中皮腫の予防及び／又は処置において使用するための、１種以上の抗腫瘍化合物と併用する、請求項１から３までのいずれか一項に記載のシナラ・スコリムスの抽出物、又はシナラ・スコリムスの抽出物の画分、又は前記抽出物と１つ以上の前記画分との混合物、又は前記画分の混合物。
【請求項５】
前記併用が、前記抽出物又は前記画分又は前記混合物を前記１種以上の抗腫瘍化合物と同時投与又は連続投与することによって実施される、請求項４に記載のシナラ・スコリムス（ｃｙｎａｒａ  ｓｃｏｌｙｍｕｓ）の抽出物、又はシナラ・スコリムス（ｃｙｎａｒａ  ｓｃｏｌｙｍｕｓ）の抽出物の画分、又は前記抽出物と１つ以上の前記画分との混合物、又は前記画分の混合物。
【請求項６】
前記１種以上の抗腫瘍化合物が、シスプラチン、ドキソルビシン、ペメトレキセド、メトトレキサート、ビノレルビン、ゲムシタビン及びタキソールを含む群から選択される、請求項４又は５のいずれか一項に記載のシナラ・スコリムスの抽出物、又はシナラ・スコリムスの抽出物の画分、又は前記抽出物と１つ以上の前記画分との混合物、又は前記画分の混合物。
【請求項７】
悪性胸膜中皮腫の予防及び／又は処置において使用するための組成物であって、
単独の活性医薬成分として、総カフェオイルキナ酸、クロロゲン酸、及びシナロピクリンについて滴定したシナラ・スコリムス（ｃｙｎａｒａ  ｓｃｏｌｙｍｕｓ）の抽出物、又はシナラ・スコリムスの抽出物の画分、又は前記抽出物と１つ以上の前記画分との混合物、又は前記画分の混合物であって、
総カフェオイルキナ酸が、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の８重量％から１６重量％までを示し、クロロゲン酸が、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の３．５重量％から７重量％までを示し、前記シナロピクリンが、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の０．２重量％から４重量％までを示すか；又は、
総カフェオイルキナ酸が、乾燥形態の前記画分の２５重量％から４８重量％までを示し、クロロゲン酸が、乾燥形態の前記画分の１１重量％から２１重量％までを示し、前記シナロピクリンが、乾燥形態の前記画分の１重量％から１０重量％までを示す、
上記抽出物、画分、又は混合物と；
担体及び／又は希釈剤及び／又は添加剤と
を含む組成物。
【請求項８】
前記総カフェオイルキナ酸が、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の９重量％から１５重量％までを示し、前記クロロゲン酸が、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の３．５重量％から５．５重量％までを示し、前記シナロピクリンが、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の０．２重量％から３重量％までを示すか；又は、
前記総カフェオイルキナ酸が、乾燥形態の前記画分の２５重量％から３５重量％までを示し、前記クロロゲン酸が、乾燥形態の前記画分の１１重量％から１５重量％までを示し、前記シナロピクリンが、乾燥形態の前記画分の１重量％から８重量％までを示す、
請求項７に記載の使用のための組成物。
【請求項９】
前記活性医薬成分に加えて、１種以上の抗腫瘍化合物をさらに含む、請求項７又は８に記載の使用のための組成物。
【請求項１０】
前記１種以上の抗腫瘍化合物が、シスプラチン、ドキソルビシン、ペメトレキセド、メトトレキサート、ビノレルビン、ゲムシタビン及びタキソールを含む群から選択される、請求項７から９までのいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１１】
悪性胸膜中皮腫の予防及び／又は処置において使用するための、シナラ・スコリムス（ｃｙｎａｒａ  ｓｃｏｌｙｍｕｓ）の抽出物、又はシナラ・スコリムス（ｃｙｎａｒａ  ｓｃｏｌｙｍｕｓ）の抽出物の画分、又は前記抽出物と１つ以上の前記画分との混合物、又は前記画分の混合物と１種以上の抗腫瘍化合物との同時投与又は連続投与用のキットであって、
−  総カフェオイルキナ酸が、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の８重量％から１６重量％までを示し、クロロゲン酸が、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の３．５重量％から８重量％までを示し、前記シナロピクリンが、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の０．２重量％から４重量％までを示す、総カフェオイルキナ酸、クロロゲン酸、及びシナロピクリンについて滴定された、シナラ・スコリムスの抽出物、又はシナラ・スコリムスの抽出物の画分、又は前記抽出物と１つ以上の前記画分との混合物、又は前記画分の混合物の１つ以上のアリコートと、
−  １種以上の抗腫瘍化合物の１つ以上のアリコートと
を含む、上記キット。
【請求項１２】
前記総カフェオイルキナ酸が、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の９重量％から１５重量％までを示し、前記クロロゲン酸が、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の３．５重量％から５．５重量％までを示し、前記シナロピクリンが、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の０．２重量％から３重量％までを示す、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
前記１種以上の抗腫瘍化合物が、シスプラチン、ドキソルビシン、ペメトレキセド、メトトレキサート、ビノレルビン、ゲムシタビン及びタキソールを含む群から選択される、請求項１１又は１２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シナラ・スコリムス（Ｃｙｎａｒａ  ｓｃｏｌｙｍｕｓ）の滴定抽出物、シナラ・スコリムス抽出物の滴定画分、又は前記抽出物と１つ以上の前記滴定画分との滴定混合物、又は前記画分の混合物、並びに悪性胸膜中皮腫（ＭＰＭ）を予防及び／又は処置するためのそれらを含む組成物及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
悪性胸膜中皮腫（ＭＰＭ）は、胸腔中皮細胞由来の侵襲性の高い腫瘍である。化学療法（多くの場合、ペメトレキセドが使用される）によって手術不可能なＭＰＭ罹患患者の生存期間が改善されるが、その平均の全体生存期間は非常に短い。近年、ＭＰＭに対する可能性のある分子治療標的が、ＭＰＭ罹患患者の胸膜液中に存在する高レベルＩＬ−６によって活性化されるインターロイキン−６シグナル経路（ＩＬ−６）／ＪＡＫ／ＳＴＡＴ３であると報告された。ＩＬ−６のその受容体への結合は、ＪＡＫ活性化を開始する受容体中の構造変化を引き起こし、次いでそれがＳＴＡＴ３転写因子の二量体化を開始し、ＳＴＡＴ３二量体は核内へ移行し、それによって、様々な標的遺伝子の転写活性化の開始が決定される。
【０００３】
この経路は、造血の発生、免疫応答の発生、及び腫瘍形成の発生にとって重要である。さらに、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ３系の機能障害が癌の発症に関係していることも実証された。
【０００４】
また文献では、アスベストへの暴露が中皮腫の原因の１つであることが報告されている。
【０００５】
さらに、先進国の中皮腫の発病率は次の１５年で上昇することも予想されており、また、いくつかの予測では１９９８年から２０１８年まで、毎年ｈＭＰＭの症例が絶えず倍増していくことが想定される。必要な予防措置が取られることなくアスベストの使用が指数関数的に上昇し続けている、第三世界、特にインドにおける中皮腫の劇的な上昇も予想される。現在、中皮腫の症例は、米国では１年に約３，０００人、ヨーロッパでは約５，０００人の死亡をもたらす。中皮腫の頻度は、アスベストの除去プログラムにもかかわらず、過去２０年間、大きく変化しておらず、次の２５年でヨーロッパ諸国において１年に５％〜１０％まで上昇すると推測される。
【０００６】
ＷＨＯは、約１億２５００万人が職場でアスベストにさらされていると推定している。
【０００７】
米国では、５０年の間に男性人口における中皮腫の症例数の予測総数は７１，０００件になると推定される。
【０００８】
アスベストの商業的利用が長年禁止されているヨーロッパでは、最初の分析は、男性人口における中皮腫原因の死亡は上昇し続け、ほぼ２０２０年頃に最大ピークを迎えると推定しており、また最新の予測ではほぼ２０１５年ごろと推定している（平均潜伏期を４４．６年と考慮する）。
【０００９】
疾患の年間発病率は国によって変動するが、新興市場での症例数は、アスベスト鉱山における規制が欠如していることと産業レベル及び国内レベルでのアスベストの使用の広範囲の普及によって大幅に上昇することが疑われている。
【００１０】
ヒトＭＰＭ（ｈＭＰＭ）は、典型的には、それの様々な予後因子が同定されている４つのサブグループに分類される。現在の治療法としては、手術、放射線療法、化学療法及び多手法治療が挙げられるが、これまで、どちらかというと不本意な結果となっている。中皮腫が根本的な外科的切除に適するというのは稀であり、また、化学療法及び放射線療法に対するその耐性についても文献で一般に報告されている。診断時点からの平均の生存は８〜１８か月である。
【００１１】
中皮腫を処置するための有効な薬剤は未だ存在していない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の発明者らは、多数の実験及び悪性胸膜中皮腫の様々な細胞系に関する本出願の実験の部分から明らかなように、本明細書に記載の抽出物が悪性胸膜中皮腫細胞及び形質転換していない中皮細胞に対して（様々な機序によってそれらの増殖を阻害する）特異な方式で作用することを実証した。
【００１３】
また本発明の発明者らは、臨床上での使用に適し得る標準化調製物を提供することができるように、いくつかの成分について抽出物を滴定してそれを特性決定し、次いで、シナラ・スコリムスの抽出物の異なる画分を単離し、同定ができるように同一成分についてそれらを滴定し、他方では、シナラ・スコリムスの抽出物の滴定と似た滴定を有する個々の画分を報告した実験において使用し、さらにまた、本抽出物の滴定と似た滴定を有する最終化合物が得られるように、それらの中の異なる画分を混合すること又は異なる画分を前記抽出物と混合することができるよう実施例及び図面において報告した。
【００１４】
本開示の発明者らは、本特許出願に記載のように滴定したシナラ・スコリムスの抽出物がＳＴＡＴ３の構造的活性化又は異常活性化を阻害できること、またＭＰＭ腫瘍細胞の培養におけるアポトーシスの再活性化を誘導できることを実証した。さらに、本発明の発明者らは、ＭＰＭ腫瘍細胞の培養に関する実験において、シナラ・スコリムスの抽出物は創傷治癒を抑制し、実際、腫瘍細胞の浸潤を阻止することも実証した。さらに、本発明の発明者らは、マウスの腫瘍細胞移植実験により、本発明の抽出物がインビボにおいてＭＰＭ細胞に対する抗腫瘍効果を発揮することも実証した。
【００１５】
したがって、本発明の第１の主題は、悪性胸膜中皮腫の予防及び／又は処置において使用するための、総カフェオイルキナ酸、クロロゲン酸、及びシナロピクリンについて滴定したシナラ・スコリムスの抽出物、又はシナラ・スコリムスの抽出物の画分、又は前記抽出物と１つ以上の前記画分との混合物、又は前記画分の混合物であって、
総カフェオイルキナ酸が、乾燥形態の前記抽出物若しくは前記画分若しくは前記混合物の８重量％から１６重量％までを示し、クロロゲン酸が、乾燥形態の前記抽出物若しくは前記画分若しくは前記混合物の３．５重量％から７重量％までを示し、前記シナロピクリンが、乾燥形態の前記抽出物若しくは前記画分若しくは前記混合物の０．２重量％から４重量％までを示す、上記抽出物、上記画分又は上記混合物である。
【００１６】
本発明の第２の主題は、悪性胸膜中皮腫の予防及び／又は処置において使用するための、シナラ・スコリムスの抽出物、又はシナラ・スコリムスの抽出物の画分、又は前記抽出物と１つ以上の前記画分との混合物、又は前記画分の混合物であって、総カフェオイルキナ酸が、乾燥形態の前記抽出物若しくは前記画分若しくは前記混合物の８重量％から１６重量％までを示し、クロロゲン酸が、乾燥形態の前記抽出物若しくは前記画分若しくは前記混合物の３．５重量％から７重量％までを示し、前記シナロピクリンが、乾燥形態の前記抽出物若しくは前記画分若しくは前記混合物の０．２重量％から４重量％までを示す、上記抽出物、上記画分又は上記混合物である。
【００１７】
本発明の第３の主題は、悪性胸膜中皮腫の予防及び／又は処置において使用するための、単独の活性医薬成分として、シナラ・スコリムスの抽出物、又はシナラ・スコリムスの抽出物の画分、又は前記抽出物と１つ以上の前記画分との混合物、又は前記画分の混合物であって、総カフェオイルキナ酸が、乾燥形態の前記抽出物若しくは前記画分若しくは前記混合物の８重量％から１６重量％までを示し、クロロゲン酸が、乾燥形態の前記抽出物若しくは前記画分若しくは前記混合物の３．５重量％から７重量％までを示し、前記シナロピクリンが、乾燥形態の前記抽出物若しくは前記画分若しくは前記混合物の０．２重量％から４重量％までを示す、上記抽出物、上記画分又は上記混合物と、担体及び／又は希釈剤及び／又は添加剤とを含む組成物である。
【００１８】
本発明の第４の主題は、悪性胸膜中皮腫の予防及び／又は処置において使用するための、１種以上の抗腫瘍活性を有する薬剤と併用する、シナラ・スコリムスの抽出物、又はシナラ・スコリムスの抽出物の画分、又は前記抽出物と１つ以上の前記画分との混合物、又は前記画分の混合物であって、総カフェオイルキナ酸が、乾燥形態の前記抽出物若しくは前記画分若しくは前記混合物の８重量％から１６重量％までを示し、クロロゲン酸が、乾燥形態の前記抽出物若しくは前記画分若しくは前記混合物の３．５重量％から７重量％までを示し、前記シナロピクリンが、乾燥形態の前記抽出物若しくは前記画分若しくは前記混合物の０．２重量％から４重量％までを示す、上記抽出物、上記画分又は上記混合物と、担体及び／又は希釈剤及び／又は添加剤とを含む、又はからなる組成物である。
【００１９】
本発明の第５の主題は、悪性胸膜中皮腫の予防及び／又は処置において使用するための、シナラ・スコリムスの抽出物、又はシナラ・スコリムスの抽出物の画分、又は前記抽出物と１つ以上の前記画分との混合物、又は前記画分の混合物であって、総カフェオイルキナ酸が、乾燥形態の前記抽出物若しくは前記画分若しくは前記混合物の８重量％から１６重量％までを示し、クロロゲン酸が、乾燥形態の前記抽出物若しくは前記画分若しくは前記混合物の３．５重量％から７重量％までを示し、前記シナロピクリンが、乾燥形態の前記抽出物若しくは前記画分若しくは前記混合物の０．２重量％から４重量％までを示す、上記抽出物又は上記画分又は上記混合物と、抗炎症作用及び／又は抗腫瘍活性を有する１種以上の化合物を併用する同時投与又は連続投与用のキットであって、上記で定義したシナラ・スコリムスの抽出物、若しくはシナラ・スコリムスの抽出物の画分、若しくは前記抽出物と１つ以上の前記画分との混合物、若しくは前記画分の混合物の１つ以上のアリコート、又は、活性医薬成分として、上記で定義したシナラ・スコリムスの抽出物、若しくはシナラ・スコリムスの抽出物の画分、若しくは前記抽出物と１つ以上の前記画分との混合物、若しくは前記画分の混合物と、化学療法剤、若しくは化学療法剤と適切な医薬として許容可能な担体の混合物の１つ以上の別のアリコートを含む組成物の１つ以上のアリコートを含む、上記キットである。
【００２０】
本発明の第６の主題は、悪性胸膜中皮腫を予防及び／又は処置するための治療方法であって、それを必要とする個体に、シナラ・スコリムスの抽出物、又はシナラ・スコリムスの抽出物の画分、又は前記抽出物と１つ以上の前記画分との混合物、又は前記画分の混合物であって、総カフェオイルキナ酸が、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の８重量％から１６重量％までを示し、クロロゲン酸が、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の３．５重量％から７重量％までを示し、前記シナロピクリンが、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の０．２重量％から４重量％までを示す、上記抽出物又は上記画分又は上記混合物、或いは上記で定義した医薬組成物の治療上有効な量を、任意選択で抗腫瘍及び／又は抗炎症活性を有する１種以上の薬剤と併用して、投与するステップを含む、上記治療方法である。
【００２１】
記載したすべての主題は、悪性胸膜中皮腫に関係している。
【００２２】
本明細書の目的において、シナラ・スコリムスという用語は、シナラ・カルドンクルス亜種スコリムス（Ｃｙｎａｒａ  ｃａｒｄｕｎｃｕｌｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ｓｃｏｌｙｍｕｓ）という用語に相当し、本明細書及び特許請求の範囲の任意の箇所においてそれらと置き換えることができる。
【００２３】
本明細書の目的において、「含む」という用語は、本明細書及び特許請求の範囲の任意の箇所において、「からなる」と置き換えることができる。
【００２４】
注：本図面において、使用されているシナラ属種の抽出物は、多くの場合、ＡＢＯ−１の略語で示されている。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】様々な用量のシナラ・スコリムス抽出物を用いたヒト悪性胸膜中皮腫細胞系でのクローン原性アッセイ（条件については実験の項目を参照のこと）である。        図１ａは、ヒト中皮腫細胞系ＭＳＴＯ２１１Ｈで実施したアッセイである。        図１ｂは、ヒト中皮腫細胞系ＮＣＩ−Ｈ２８で実施したアッセイである。        図１ｃは、ヒト中皮腫細胞系ＭＰＰ−８９で実施したアッセイである。        図１ｄは、ヒト中皮腫細胞系ＮＣＩ−Ｈ２０５２で実施したアッセイである。
【図２】悪性胸膜中皮腫細胞系（ＭＳＴＯ２１１Ｈ、ＭＰＰ−８９、ＮＣＩ−Ｈ２８）でのＡＴＰｌｉｔｅアッセイを使用する細胞生存能力アッセイである（条件については実験の項目を参照のこと）。このアッセイは、細胞生存能力が様々な中皮腫細胞系において用量依存的に本発明のシナラ・スコリムス抽出物によって阻害されることを示す。
【図３】正常中皮細胞（ＨＭＣ）をシナラ・スコリムス抽出物で処置して得られた増殖曲線と比較した図２の３種の生存能力曲線の比較（図３ａ：ＭＳＴＯ２１１Ｈ、図３ｂ：ＭＭＰ−８９、図３ｃ：ＮＣＩ−Ｈ２８）である。悪性中皮腫細胞系（ＭＰＭ）は、明らかに、ＨＭＣと比べ、シナラ・スコリムス抽出物の抗増殖作用を示す。
【図４】中皮腫細胞系ＭＰＭ（図４ａ  ＭＳＴＯ２１１Ｈ及び図４ｂ  ＮＣＩ−Ｈ２０５２）と転換中皮細胞（図４ｃ  ＨＭＣ）でのペメトレキセド（ＰＭＴＸ）と併用してアーティチョーク抽出物で処置した後の細胞生存能力アッセイ（ＡＴＰＩｉｔｅアッセイ）。ＰＭＴＸによる処置はＭＰＭ細胞には細胞障害性であり、且つ非腫瘍細胞には毒性が高い。本発明の抽出物＋ＰＭＴＸによる細胞の併用処置は、ＭＰＭ細胞系における細胞生存能力に有意な効果があり、一方、非形質転換細胞（ＨＣＭ）ではペメトレキセドによって誘発される死滅率を低減した。結果として、本発明のアーティチョーク抽出物は、腫瘍細胞のみをペメトレキセド感受性にすることが明らかである。
【図５】ヒト中皮腫細胞系ＭＳＴＯ２２１Ｈにおける創傷治癒アッセイである（条件については実験の項目を参照のこと）。          図５ａは、濃度６μｇ／ｍｌの担体単独、及び生成物を含む対照プレートにおける創傷治癒を示す。          図５ｂは、示した時間、本発明の抽出物で、また担体で処置した創傷を閉じる効果に関する棒グラフを示す（細胞数の定量を％で示す）。
【図６】細胞周期に対するシナラ・スコリムス抽出物の影響の評価（ＦＡＣＳ法）である。抽出物は、４８時間の処置の後（図６ａ）及び７２時間の処置の後（図６ｂ）の両方において、サブＧ１期の細胞割合を増加させ、ＭＰＭ細胞（ＭＳＴＯ２１１Ｈ）の死滅を誘導する。
【図７】アポトーシスの誘導を評価するアッセイ（ウェスタン法）である。本発明の抽出物は、用量１００μｇ／ｍｌで、細胞系ＭＳＴＯ２１１ＨのＰＡＲＰ形態、並びにカスパーゼ３及び７切断形態などのいくつかのアポトーシスマーカーのレベル上昇によって明らかなように、アポトーシスを誘導する。
【図８】アネキシンＶのレベル測定によるアポトーシス誘導を評価するアッセイである。本発明の抽出物は、時間依存的及び用量依存的に、アネキシンＶの呈色で判定したとおり、細胞系ＭＳＴＯ２１１Ｈにおいてアポトーシスを誘導する。          図９及び図１０は、６〜７週齢の雌ＣＤ１ヌードマウス（ＭＰＭ腫瘍移植）で実施した、細胞系ＭＳＴＯ２１１Ｈにおけるアーティチョーク抽出物の抗腫瘍活性の評価に関する。
【図９】ＭＰＭ細胞系移植に対するアーティチョークの効果である。          ＭＳＴＯ２１１Ｈは、２４時間、アーティチョークで前処置を行った。次いで、それらをＣＤ１ヌードマウスに接種した。アーティチョーク抽出物による前処置は腫瘍移植に影響を及ぼし、腫瘍体積の統計的有意差（ｐ＝０．０１）を誘導した。
【図１０】ＭＰＭ細胞移植に対するアーティチョーク抽出物の効果である。ＭＳＴＯの異種移植片を有するＣＤ１マウスを３週間、アーティチョーク抽出物の量を増やしながら処置した。用量依存的治療効果がアーティチョーク抽出物に対して確認された。ペメトレキセド（ＰＭＴＸ）は、既知の治療薬濃度でポジティブ対照として使用した。図は、既知の治療薬濃度のペメトレキセドと比べた本発明の抽出物の効果を示す＊ｐ＜０．０１。
【図１１】悪性胸膜中皮腫細胞系でのＡＴＰｌｉｔｅアッセイを使用する３種の生存能力曲線の比較である（図１１ａ及び図１１ｂのＭＳＴＯ２１１Ｈ、図１１ｃ及び図１１ｄのＭＭＰ−８９）。  グラフａ及びｃにおいて、アッセイは、総カフェオイルキナ酸が、乾燥形態の抽出物又は画分の混合物（ミックス）の９重量％から１５重量％までを示し、クロロゲン酸が、乾燥形態の抽出物若しくは画分の混合物の３．５重量％から５．５重量％までを示し、シナロピクリンが、乾燥形態の抽出物若しくは画分の混合物の０．２重量％から３重量％までを示す、シナラ・スコリムスの様々な抽出物、又はシナラ・スコリムスの抽出物の画分のミックスにより実施される。  グラフｂ及びグラフｄにおいて、アッセイは、グラフａ及びグラフｃでも報告した滴定抽出物を用いて、下記で述べた画分３、画分４及び画分５と共に実施した。  明らかに、画分３及び画分４は、上記のように滴定した全抽出物又はミックスと少なくとも同程度有効であるが、画分５は単独では全く効果がない。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
したがって、本出願は、悪性胸膜中皮腫（ＭＰＭ）の予防及び／又は処置において使用するための、総カフェオイルキナ酸、クロロゲン酸、及びシナロピクリンについて滴定した、シナラ・スコリムスの抽出物、又はシナラ・スコリムスの抽出物の画分、又は前記抽出物と１つ以上の前記画分との混合物、又は前記画分の混合物であって、
総カフェオイルキナ酸が、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物（ミックス）の８重量％から１６重量％までを示し、クロロゲン酸が、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の３．５重量％から７重量％までを示し、前記シナロピクリンが、０．２％から４％までを示し、
又は
総カフェオイルキナ酸が、乾燥形態の前記画分の２５重量％から４８重量％までを示し、クロロゲン酸が、乾燥形態の前記画分の１１重量％から２１重量％までを示し、前記シナロピクリンが、乾燥形態の前記画分の１重量％から１０重量％までを示す、上記抽出物、上記画分又は上記混合物に関する。
【００２７】
さらなる実施形態において、またこの出願は、悪性胸膜中皮腫（ＭＰＭ）の予防及び／又は処置において使用するための、総カフェオイルキナ酸、クロロゲン酸、及びシナロピクリンについて滴定した、シナラ・スコリムスの抽出物、又はシナラ・スコリムスの抽出物の画分、又は前記抽出物と１つ以上の前記画分との混合物、又は前記画分の混合物であって、
総カフェオイルキナ酸が、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物（ミックス）の９重量％から１５重量％までを示し、クロロゲン酸が、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の３．５重量％から５．５重量％までを示し、前記シナロピクリンが、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の０．２重量％から３重量％までを示し、
又は
総カフェオイルキナ酸が、乾燥形態の前記画分の２５重量％から３５重量％までを示し、クロロゲン酸が、乾燥形態の前記画分の１１重量％から１５重量％までを示し、前記シナロピクリンが、乾燥形態の前記画分の１重量％から８重量％までを示す、上記抽出物、上記画分又は上記混合物に関する。
【００２８】
本発明の目的におけるアーティチョーク又はシナラ・スコリムスは、シナラ属（シナラ属種）、特にシナラ・カルドンクルス亜種スコリムス（Ｃｙｎａｒａ  ｃａｒｄｕｎｃｕｌｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ｓｃｏｌｙｍｕｓ）に属する植物を意味する。
【００２９】
本発明を実施する目的において、抽出物又はその画分は、葉及び／若しくは頭状花又はその混合物のものであってもよく、新鮮なものでも乾燥されたものであってもよい。
【００３０】
「頭状花」という用語は、植物によって形成される花の頂部、例えば、アーティチョークそのもの（食品として一般に使用されている部分）を意味する。抽出物は、流体抽出物、又は既知の乾燥技術によって凍結乾燥又は乾燥された抽出物であってよい。抽出物は、以下の溶媒：水、エタノール、メタノール、アセトン又はイソプロパノールによる抽出によって、それぞれの場合、純粋な形態又は相互の混合物で取得することができる。アルコールはメタノール、エタノール、イソプロパノールであってよく、好ましくはエタノールである。エタノールは、純粋な形態で、又は以下のパーセンテージの水との混合物で使用することができる：９６％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、１％。本発明の限定されない実施形態において、抽出で使用される溶媒は、５０：５０の割合のエチルアルコールと水によって形成される混合物であってもよい。流体抽出物は、１：２〜１：１００の薬剤／溶媒比率で、好ましくは１：１０の比でアーティチョークの葉を浸出／温浸するヒドロアルコール抽出によって調製することができる。抽出時間は当業者によって一般に使用されている時間であり、例えば、最低１時間から約８時間までであってよい。抽出温度は通常コントロールされ、好ましくは、例えば約５０℃の温度であってよい。水性アルコール抽出物からのアルコール蒸発とその後の水性濃縮物の乾燥は、凍結乾燥又は乾燥によって実施し、凍結乾燥抽出物又は乾燥抽出物を得ることができる。
【００３１】
こうした抽出物の調製は、一般に当業者には公知であり、本開示において特に詳細に記述する必要はない。本発明の実施目的において、従来の技術に従って調製される、上記に示したうちのすべての抽出物を使用することができる。
【００３２】
特に、本発明の目的において、本抽出物は、上述の滴定基準が満たされる限り、シナラ・スコリムスの抽出物の画分によって、若しくはシナラ・スコリムスの抽出物の画分の混合物によって、又はシナラ・スコリムスの抽出物の混合物及び上述の抽出物の１つ以上の画分の混合物によって置き換えることもできる。
【００３３】
気候条件、環境条件から、栽培地及び／又は栽培技術の違いから生じ得る、或いは栽培植物の異なる品種によっても生じ得る植物抽出物の多様性を考えると、臨床上の使用において、生成物を標準化すること、及び定義した特徴を有する生成物が得られる標準化パラメーターを同定することが重要である。
【００３４】
したがって、本発明の発明者らは、臨床診療において使用される最終生成物を標準化することができるパラメーターを同定するため、実験で使用される抽出物、例えば、図面及び実験プロトコルにおいて報告したものを特性決定した。
【００３５】
次いで、使用した抽出物をいくつかの活性成分について滴定し、また上記で示したパラメーターの範囲内にある最終生成物を得るために、様々な技術を用いて画分化を行い、同一成分について滴定及び滴定可能であり、それにより、個々の画分を使用することも、又は２つ以上の前記画分を混合することもできる抽出物の画分を得ることが可能である。
【００３６】
パラメーターの滴定は、例えば、乾燥、脱水又は凍結乾燥（フリーズドライ）した乾燥サンプルで実施する。
【００３７】
本発明によれば、総カフェオイルキナ酸は、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の８重量％から１６重量％まで、又は９重量％から１５重量％まで、例えば、約８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％を示す。本明細書での「約」という表示は、８から１６までの非整数も意味し、例えば、１６までの８．１；８．２；８．３等は本発明に包含される。
【００３８】
好ましい実施形態において、総カフェオイルキナ酸は、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の１１重量％から１３重量％まで、例えば、約１１％、１２％、１３％を示し、１１から１３までの非整数も含まれる。
【００３９】
本発明によれば、総カフェオイルキナ酸は、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の３．５重量％から７重量％まで、又は３．５重量％から５．５重量％まで、又は４．５重量％から５．５重量％まで、例えば、約４．５％、４．６％、４．７％、４．８％、４．９及び５．０％、５．１％、５．２％、５．３％、５．４％、５．５％を示す。
【００４０】
本発明によれば、総シナロピクリンは、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の０．２重量％から４重量％まで、又は０．２重量％から３重量％までを示す。シナロピクリンは分解する傾向があるので、最初のシナロピクリン含量（すなわち、ちょうど抽出又は画分が行われた時）は、好ましくは２％から３％までの範囲である。いかなる場合においても、抽出物、画分又は画分の混合物が、抽出から又は画分化から＋４℃から＋４０℃までの範囲の温度、好ましくは２５℃で保存された場合に、抽出から＋３６か月で少なくとも０．２％に等しいシナロピクリン含量に達することが許容される。
【００４１】
また本発明は、シナラ・スコリムスの抽出物の画分であって、上記で示した成分のそれぞれ１つの重量パーセンテージ（パーセント）が上記で報告したものの約２倍である上記画分、したがって、総カフェオイルキナ酸、クロロゲン酸及びシナロピクリンについて滴定した画分であって、総カフェオイルキナ酸が、乾燥形態の前記画分の２５重量％から４８重量％まで、又は２５％から３５重量％までを示し、クロロゲン酸が、乾燥形態の前記画分の１１重量％から２１重量％まで、又は１１重量％から１５重量％までを示し、前記シナロピクリンが、乾燥形態の前記画分の１重量％から１０重量％まで、又は１重量％から８重量％までを示す画分に関する。
【００４２】
この画分は、総カフェオイルキナ酸が、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の８重量％から１６重量％まで、又は９重量％から１５重量％までを示し、クロロゲン酸が、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の３．５重量％から７重量％まで、又は３．５重量％から５．５重量％までを示し、前記シナロピクリンが、乾燥形態中の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の０．２％から４％まで、又は０．２％から又は３重量％までを示す、総カフェオイルキナ酸、クロロゲン酸及びシナロピクリンについて滴定した抽出物、画分及び画分の混合物に関する記述で示した組成物及びキット及び治療方法としてのすべての使用及び実施に適している。
【００４３】
本発明によれば、シナラ・スコリムスの抽出物の多数の画分は、下記で示した様々な方法によって得ることができる。いったん得られた画分は、総カフェオイルキナ酸、クロロゲン酸、及びシナロピクリンについて滴定され、その後、本明細書に記載の最適な滴定濃度によって、単独使用が可能な画分、又は上記で定義した３種の滴定成分のそれぞれ１つの重量濃度を有する画分の混合物を選択することができる。
【００４４】
例として、様々な画分は、以下に列挙した様々な方法及びステップに従って取得することができる：
【００４５】
１．シナラ・スコリムスの乾燥させた葉及び／又は頭状花を分別し、３５℃から４５℃の範囲の温度で４時間から１０時間の間、９６°のエチルアルコールと接触させる。アルコール部分を葉及び／又は頭状花から単離し、濾過して植物残留物を除去する。清澄化したアルコール溶液を回収する。
【００４６】
２．植物残留物を水でさらに抽出し、好ましくは脱塩し、水性成分を回収し、さらにそれを濾過して残留植物部分を除去する。清澄化した水溶液を回収する。
【００４７】
３．回収した清澄（アルコール性及び水性）溶液を混合し、４０°から６０°の範囲のアルコール溶液（本発明において、アルコールに関し、記号°はアルコール度数を示す）を取得し、沈殿及び遠心分離の処理を行い、上清を回収しこれを濾過する。
【００４８】
４．上清の除去後に得られた沈殿物を回収し、これが抽出物の第１の画分に相当する。次いでこれを、例えば、凍結乾燥により乾燥させ、滴定することができる。得られた第１の画分において、平均で、総カフェオイルキナ酸は、抽出物の乾燥画分総重量の約２〜３％を示し、クロロゲン酸は、抽出物の乾燥画分総重量の約０．２〜０．６％を示し、シナロピクリンは、抽出物の乾燥画分総重量の約０．１〜０．３％を示す。
【００４９】
５．項目３で上述したように沈殿及び遠心分離の処理を行った４０°〜５０°水性アルコール画分の上清を真空下で濃縮し、アルコールを除去し、したがって、画分をアルコール０°にし、得られた濃縮水溶液に沈殿及び遠心分離の処理を行い、清澄化のため上清を濾過する。
【００５０】
６．上清の除去後に得られた沈殿物を回収し、これが抽出物の第２の画分に相当する。次いでこれを、例えば、凍結乾燥により乾燥させ、滴定することができる。
得られた第２の画分において、平均で、総カフェオイルキナ酸は、抽出物の乾燥画分総重量の約１〜２．５％を示し、クロロゲン酸は、抽出物の乾燥画分総重量の約０．０５〜０．１％を示し、シナロピクリンは、抽出物の乾燥画分総重量の約０．３〜０．５％を示す。
【００５１】
７．遠心分離後の上清から得られ、項目５で濾過した濾液は水溶液であり、これを、例えば真空の下で濃縮し、次いで、例えば凍結乾燥によって乾燥させると、これはしたがって第３の画分に相当する。
得られた第３の画分において、平均で、総カフェオイルキナ酸は、抽出物の乾燥画分総重量の約１２〜１４％を示し、クロロゲン酸は、抽出物の乾燥画分総重量の約５〜７％を示し、シナロピクリンは、抽出物の乾燥画分総重量の約２．５〜３．５％を示す。
【００５２】
８．或いは、遠心分離後に上清から得られ、項目５で濾過された濾液は水溶液であり、これを高多孔性吸着樹脂上に吸着させる。
【００５３】
９．次いで、樹脂吸着画分を回収し、濃縮し、例えば凍結乾燥によって乾燥させると、これは第４の画分に相当する。
得られた第４の画分において、平均で、総カフェオイルキナ酸は、抽出物の乾燥画分総重量の約２９〜３２％を示し、クロロゲン酸は、抽出物の乾燥画分総重量の約１３〜１５％を示し、シナロピクリンは、抽出物の乾燥画分総重量の約３〜４．５％を示す。
【００５４】
１０．樹脂に吸着されていない画分を例えば凍結乾燥によって乾燥させ、これが第５の画分に相当する。
得られた第４の画分において、平均で、総カフェオイルキナ酸は、抽出物の乾燥画分総重量の約０．５〜０．７％を示し、クロロゲン酸は、抽出物の乾燥画分総重量の約０．１〜０．２％を示し、シナロピクリンは、抽出物の乾燥画分総重量の約０．０４〜０．０６％を示す。
【００５５】
本発明によれば、工程８は、芳香族物質又は高度不飽和部分を高含有する物質、又はアルキル基若しくはシクロアルキル基を高含有する物質を吸着し、非関連物質、例えば、多くの極性非芳香族物質を溶離させることが可能なカラム又は樹脂を用いたベッドで行うことができる。樹脂吸着分は、他での使用のため、好適な溶媒等、例えばエタノール又は水性アルコール溶媒などにより脱着される。
【００５６】
適切なクロマトグラフィー樹脂は、例えば、スチレン−ジビニルベンゼンコポリマー等の高多孔性吸着樹脂、例えば、アンバーライトＸＡＤ−２、セドリットＰＡＤ−ＩＩ、ＡＤＳ  ＴＱ  ３１８であってもよい。
【００５７】
特に、樹脂は、芳香族物質及び／又は非極性物質を吸着し得る樹脂等、例えば疎水性吸着樹脂であり、樹脂は、スチレン及び活性基を含まないＤＶＢの重合によって得られる、均等係数が≦１．５である直径０．２ｍｍ〜０．８ｍｍのミクロスフェアからなり、好ましくは芳香族性質の有機物質の吸着及び選択的溶出を可能にする、約１．３ｍｌ／ｇに等しい細孔容積関連パラメーターを有する高多孔性物理的構造を特徴とする。
【００５８】
以下の表は、報告した実験（ＡＢＯ−１）で使用したシナラ・スコリムスの抽出物及び上記で報告した方法に従って得られるその画分（すなわち、第１、第２、第３、第４及び第５の画分）について得た正確な滴定データを報告する。
【表Ａ】
2017535617.tif 000003
【００５９】
したがって、例として、画分の混合物は、約１２％までの画分１、約６％までの画分２、及び約８２％までの画分３を含む混合物であってもよく、また約１２％までの画分１、約６％までの画分２、約５５％までの画分４及び約２７％までの画分５を含む混合物であってもよい。
【００６０】
当業者は、得られた画分を滴定することによって、上記で示した最適な滴定を有する化合物を得るために画分の混合物を再構成する方法又は医薬的活性成分が特に不足している抽出物を補う方法を確実に理解するであろう。
【００６１】
画分３及び画分４は、図１１で報告したデータから明らかなように、そのように有用である。本発明において、［イタリア語の］用語「活性医薬成分」は、英語の用語「活性医薬成分」（ＡＰＩ）に相当する。
【００６２】
また用語「活性医薬成分」は、薬理活性を有する分子のセットを意味した用語「活性成分」（又は「有効成分」）と置き換えることもできる。
【００６３】
ａ．総カフェオイルキナ酸、クロロゲン酸、及びシナロピクリンについて滴定した、シナラ・スコリムスの抽出物、又はシナラ・スコリムスの抽出物の画分、又は前記抽出物と１つ以上の前記画分との混合物、又は前記画分の混合物であって、総カフェオイルキナ酸が、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の８重量％から１６重量％まで、又は９重量％から１５重量％までを示し、クロロゲン酸が、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の３．５重量％から７重量％まで、又は３．５重量％から５．５重量％までを示し、前記シナロピクリンが、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の０．２重量％から４重量％まで、又は０．２重量％から３重量％までを示す、上記抽出物、画分、又は混合物（上述の詳細な実施形態が含まれる）。
【００６４】
ｂ．総カフェオイルキナ酸、クロロゲン酸、及びシナロピクリンについて滴定したシナラ・スコリムスの抽出物の画分であって、総カフェオイルキナ酸が、乾燥形態の前記画分の２５重量％から４８重量％まで、又は２５重量％から３５重量％までを示し、クロロゲン酸が、乾燥形態の前記画分の１１重量％から２１重量％まで、又は１１重量％から１５重量％までを示し、前記シナロピクリンが、乾燥形態の前記画分の１重量％から１０重量％まで、又は重量％から８重量％までを示す、上記画分。
【００６５】
本発明によれば、総カフェオイルキナ酸、クロロゲン酸、及びシナロピクリンについて滴定した、シナラ・スコリムスの抽出物、又はシナラ・スコリムスの抽出物の画分、又は前記画分の混合物は、上記の詳細及び特許請求の範囲において記載されているように、活性医薬成分として、悪性胸膜中皮腫ＭＰＭの予防及び／又は処置で使用することができる。
【００６６】
こうした疾患は、例えば、また文献に記載されているように、炎症性及び／又は前腫瘍及び／又は腫瘍のタイプの疾患であり得る。
【００６７】
特に、本発明は、アスベストに暴露され、したがって悪性胸膜中皮腫のリスクのある個体群の処置、及びこうした患者の個体群の中皮腫の発生の低減に適し得る。
【００６８】
また、中皮腫腫瘍細胞系で得られた下記及び図面で示した実験データは、本明細書に開示されているように滴定した、シナラ・スコリムスの抽出物若しくはそれらの画分又はそれらの画分の混合物が１種以上の抗腫瘍薬と有利に関連付けられ、それによって、薬剤自体の抗腫瘍効果も相乗的に増加することを示す。
【００６９】
したがって、本発明の実施形態に従い、本明細書に記載され、また特許請求されているシナラ・スコリムスの抽出物若しくはそれらの画分、又はそれらの画分の混合物は、抗腫瘍活性を有する１種以上の化合物（抗腫瘍化合物）と併用して、悪性胸膜中皮腫（ＭＰＭ）の予防及び／又は処置で使用され得る。
【００７０】
実施形態に従い、抗腫瘍活性を有する化合物は化学療法剤であってもよく、シスプラチン、ドキソルビシン、ペメトレキセド、メトトレキサート、ビノレルビン、ゲムシタビン及びタキソールを含む群から選択することができる。
【００７１】
また本発明は、悪性胸膜中皮腫を予防及び／又は処置するための、１種以上の化学療法剤と併用する、本明細書で開示した内容に従って滴定したシナラ・スコリムスの抽出物の抽出物、又はシナラ・スコリムスの抽出物の画分、又は前記抽出物と１つ以上の前記画分との混合物、又は前記画分の混合物の使用を含む。
【００７２】
特に、本発明による抽出物、画分又は混合物は、総カフェオイルキナ酸、クロロゲン酸、及びシナロピクリンについて滴定され、総カフェオイルキナ酸が、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物（ミックス）の８重量％から１６重量％まで、又は９重量％から１５重量％までを示し、クロロゲン酸が、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の３．５重量％から７重量％まで、又は３．５重量％から５．５重量％までを示し、前記シナロピクリンが、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の０．２重量％から４重量％まで、又は０．２重量％から３重量％までを示し、或いは、画分は、総カフェオイルキナ酸が、乾燥形態の前記画分の２５重量％から４８重量％まで、又は２５重量％から３５重量％までを示し、クロロゲン酸が、乾燥形態の前記画分の１１重量％から２１重量％まで、又は１１重量％から１５重量％までを示し、前記シナロピクリンが、乾燥形態の前記画分の１重量％から１０重量％まで、又は１重量％から８重量％までを示す画分である。
【００７３】
上記で提供した総カフェオイルキナ酸、クロロゲン酸及びシナロピクリンの滴定範囲の詳細な記載はまた、この特定の実施形態に適用する。
【００７４】
１種以上の化学療法剤との併用は同時併用若しくは連続併用であってよく、又は、本発明の活性医薬成分と化学療法剤は、（単回投与若しくは個別投与において）同時に、又は数分の一定時間にわたって投与することができるか、或いは、治療的処置の日又は期間にわたって、連続して、又はそれぞれを数分以上離して異なる時間に投与することができる。
【００７５】
投与計画は、患者の性別、年齢、疾患の状態、体重及び病歴に基づき、処置を行う医師によって決定される。
【００７６】
上述のような単独及び併用の両方において、処置は、例えば、上記に示した腫瘍原性作用を有し得ることが知られている感染症の場合、又は前記腫瘍が変性するのを予防するような腫瘍の切除の場合に予防することができる。
【００７７】
本発明の活性医薬成分は、上記のような同一目的に使用することができる組成物で製剤化することができる。
【００７８】
したがって、本発明は、さらに、悪性胸膜中皮腫（ＭＰＭ）の予防及び／又は処置において使用するための、活性医薬成分として、上述の記載及び特許請求の範囲のような総カフェオイルキナ酸、クロロゲン酸、及びシナロピクリンについて滴定した、シナラ・スコリムスの抽出物、それらの画分、又はそれらの画分の混合物又は前記抽出物と１つ以上の前記それらの画分の混合物の混合物と、担体及び／又は希釈剤及び／又は添加剤とを含む組成物に関する。
【００７９】
本組成物は、凍結乾燥形態、乾燥形態又は流体形態の本明細書で定義した本発明の活性医薬成分を含み得る。
【００８０】
既に記載のように、抽出物及びそれらの画分は、上述の方法に従って、新鮮な、又は乾燥させたアーティチョークの葉、又はアーティチョークの頭状花、又は前述の部分の混合物の抽出によって得ることができる。
【００８１】
本発明によれば、上記で定義した組成物は、悪性胸膜中皮腫の予防及び／又は処置において使用することができる。
【００８２】
本組成物は、例えば、単独の活性成分として、総カフェオイルキナ酸、クロロゲン酸、及びシナロピクリンについて滴定した、シナラ・スコリムス、又はシナラ・スコリムスの抽出物の画分、又は前記抽出物と１つ以上の前記画分との混合物、又は前記画分の混合物であって、総カフェオイルキナ酸が、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の８重量％から１６重量％まで、又は９重量％から１５重量％までを示し、クロロゲン酸が、乾燥形態の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の３．５重量％から７重量％まで、又は３．５重量％から５．５重量％までを示し、前記シナロピクリンが、乾燥形態中の前記抽出物又は前記画分又は前記混合物の０．２％から４％まで、又は０．２％から又は３重量％までを示す、上記抽出物、上記画分又は上記混合物を含有し得る。
【００８３】
或いは、本組成物は、単独の活性成分として、シナラ・スコリムスの抽出物の画分であって、総カフェオイルキナ酸が、乾燥形態の前記画分の２５重量％から４８重量％まで、又は２５重量％から３５重量％までを示し、クロロゲン酸が、乾燥形態の前記画分１１重量％から２１重量％まで、又は１１重量％から２５重量％までを示し、前記シナロピクリンが、乾燥形態の前記画分の１重量％から１０重量％まで、又は１重量％から８重量％までを示す、上記画分を含み得る。
【００８４】
さらに、本組成物は選択した製剤のタイプに適した添加剤を含むことができる。
【００８５】
当業者は最良の製剤を容易に同定することができる。
【００８６】
単なる例示として、本組成物は硬質ゼラチンカプセルの形態で製造することができ、凍結乾燥形態の上記で定義した３０％から６０％までの活性成分と、７０％から４０％までの適切な薬理学的に不活性な添加剤（例えば微結晶性セルロース等）を含有する。
【００８７】
カプセルは、例えば３００〜５００ｍｇの最終重量を有するカプセルであり得る。
【００８８】
本明細書に記載の活性化合物は凍結乾燥形態、乾燥形態又は流体形態であり得るので、当業者は選択した使用に適した医薬組成物を容易に製造することができる。
【００８９】
本発明の限定されない例によれば、本明細書で定義した組成物は、悪性胸膜中皮腫の予防及び／又は処置において使用することができる。
【００９０】
したがって、本発明はさらに、悪性胸膜中皮腫の予防及び／又は処置において使用するための、本発明の活性医薬成分に加えて、１種以上の抗腫瘍活性を有する化合物（抗腫瘍化合物）を含む組成物に関する。
【００９１】
実施形態によれば、抗腫瘍活性を有するこうした化合物（抗腫瘍化合物）は、例えば、シスプラチン、ドキソルビシン、ペメトレキセド、メトトレキサート、ビノレルビン、ゲムシタビン及びタキソールを含む群から選択される化学療法剤であってよい。
【００９２】
本発明の組成物は、単位投与用量で、又は各患者のそれぞれのニーズに適合した治療法をさらに可能にする目的で処置を行う医師によって投薬可能な方法で製剤化することができる。
【００９３】
したがって、本発明は、悪性胸膜中皮腫の予防及び／又は処置における、任意選択で抗腫瘍活性を有する１種以上のさらなる活性医薬成分と併用する、単独の活性医薬成分として本発明の活性医薬成分を含む組成物の使用を意図する。
【００９４】
こうしたさらなる活性医薬成分は、例えば、化学療法化合物であってもよい。
【００９５】
１種以上の化学療法剤との併用は同時併用若しくは連続併用であってよく、又は、活性医薬成分と化学療法剤は、（単回投与若しくは個別投与において）同時に、又は数分の一定時間にわたって投与することができるか、或いは、治療的処置の日又は期間にわたって、連続して、又はそれぞれを数分以上離して異なる時間に投与することができる。
【００９６】
投与計画は、患者の性別、年齢、疾患の状態、体重及び病歴に基づき、処置を行う医師によって決定される。
【００９７】
記載の処置は、前記腫瘍が変性するのを予防するような腫瘍の切除の場合に予防することができる。
【００９８】
上述の（任意選択で１種以上の抗腫瘍薬と併用して本発明の活性医薬成分及び少なくとも１種の医薬として許容可能な賦形剤又はアジュバントからなる）組成物において、少なくとも１種の医薬として許容可能な賦形剤又はアジュバントは、通常の製薬業若しくは化粧品業で、又は食品産業で技術的に使用されてい添加剤又はアジュバントの中から選択することができる。使用される添加剤は、希釈剤、可溶化剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、界面活性剤、スリップ剤及び抗接着剤のカテゴリーに属するものであってよい。
【００９９】
必要に応じて、本組成物は、製薬、化粧品及び食品産業において一般に使用されている着香料、着色剤及び保存剤を含有していてもよい。
【０１００】
本組成物は、経口投与（例えば、粉末、顆粒、カプセル剤、ハード又はソフトゼラチンのカプセル、錠剤、シロップ剤、ドロップ、溶液及び経口エマルジョン）、吸入（例えば、エアロゾル、液体及び粉末噴霧剤）、局所投与（ゲル剤、軟膏剤、エマルジョン、泥膏、フォーム剤、局所使用の無水固形剤型、及び貼付剤）、並びに当業者によって現在使用され既知である技術による非経口投与（例えば、皮下使用、筋肉内使用、静注使用又は皮内使用）向けの製剤を調製する当業者によって適切であると考えられるすべての製剤であってよい。すべての製剤において、技術上の添加剤又はアジュバントの使用は、製薬実務において一般に使用されているものに基づいて使用する物質を選択することにより決定される。
【０１０１】
抗腫瘍活性を有する薬剤を併用する、又は併用しない本発明の活性医薬成分をベースとした製剤の調製において、当業者は、治療法での使用に適し得る安定製剤を得るために、従来技術により有用であると考えられるいずれかの添加剤を使用することができる。例えば、希釈剤のカテゴリーにおいて、固形剤において希釈剤を使用することが可能であり、例えば、糖、多価アルコール（例えばラクトース、マンニトール、ソルビトール）、セルロース、無機酸の塩類（例えば第二リン酸カルシウム）、有機酸の塩類（例えばナトリウム、カリウム及びカルシウムの塩類の形態のクエン酸塩、炭酸塩及び重炭酸塩）、或いは液体の形態の希釈剤、例えば水、経口用途の食用油（ヒマワリ油、オリーブ油、トウモロコシ油、スイートアーモンド油、落花生油）又は局所製剤で使用される油（ホホバ油、短鎖、中鎖又は長鎖トリグリセリド）、多価アルコール（グリセリン、プロピレングリコール、ヘキシレングリコール）がある。
【０１０２】
崩壊剤のカテゴリーにおいて、例えば、天然又は加工デンプン（トウモロコシデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン）、クロスカルメロースナトリウム、グリコール酸ナトリウムデンプン、クロスポビドン；ゴム系の天然産物を含む使用可能な結合剤（グアーガム、キサンタンガム、アラビアゴム）、スクロース及び合成品、例えば、ポリビニルピロリドン及びセルロースの半合成誘導体を使用することができる。
【０１０３】
ステアリン酸及びそれらの塩、例えばマグネシウムの塩、エチレングリコールのポリマー、トリグリセリド及び滑沢剤としての天然又は合成ワックスが有効であることが判明している。
【０１０４】
界面活性剤は、水でより溶解し得るか、洗浄可能である本発明の基剤を形成する製剤に含まれる１種以上の活性成分を調製するために使用され、これらの活性成分は、単独で作用するか、１種以上の希釈剤によって担持される。例えば、ソルビタンエステル、ソルビタンポリオキシエチレンエステル、スクロースエステル及びラウリル硫酸ナトリウムを挙げることができる。
【０１０５】
スリップ剤は、例えば、コロイダルシリカ、沈降性シリカから選択することができ、一方、使用可能な付着防止剤としては、例えば、タルク又はデンプンが挙げられる。
【０１０６】
注射用製剤の調製において、活性物質（単数又は複数）を有効に可溶化又は分散させることができる添加剤を選択することができる。例えば、注射よる投与に適したｐＨ及び浸透圧を得るために、水とともに、他の水溶性担体、例えば、多価アルコール及び有機酸又は無機酸の塩を使用することができる。
【０１０７】
特定の事例において、非水溶性担体、例えば油、又は注射での使用について承認されている合成物質を使用することができる。
【０１０８】
当業者は、公知の通常の調製スキーマを使用して、すべての製剤を調製することができる。
【０１０９】
単なる例ではあるが、カプセル剤の製剤は、本発明の活性医薬成分を事前に粉砕し、通常のミキサーで得られた粉末と、１種以上の他の抗腫瘍薬及び製剤の調製に選択した添加剤、例えば、上述のもの又は市販の経口使用が承認されているものから選択される希釈剤、崩壊剤、滑沢剤及びスリップ剤とを一緒に混合することによって簡易に製造することができる。
【０１１０】
錠剤の場合には、従来技術による造粒方法のアジュバントとして水を使用し、混合物の一部又は全部を、事前に水に溶解させておいた結合剤、又は混合物に入れておいた結合剤とともに造粒することが必要である。
【０１１１】
顆粒剤は、乾燥させ、篩にかけ、さらに、当業者に公知のものに従い、錠剤を得るのに好適な混合物を得るための他の粉末と混合することができる。
【０１１２】
非経口使用の場合には、本組成物はまた、所定の操作要件に従って簡単に混和できる個別の容器中の本発明の活性医薬成分及び１種以上の抗腫瘍薬とともに提供することができる。
【０１１３】
本明細書に記載の組成物の使用を容易にするために、これらは、悪性胸膜中皮腫の予防的及び／又は治療的使用に有効な、本発明の活性医薬成分及び任意選択で１種以上の抗腫瘍薬を含有する単位投与用量の形態で提供することができる。
【０１１４】
本発明はさらに、悪性胸膜中皮腫の予防及び／又は処置において使用するための、本発明の活性医薬成分と抗腫瘍活性を有する１種以上の化合物との同時投与又は連続投与用のキットであって、前記キットが本明細書で定義した本発明の活性医薬成分の１つ以上のアリコートと、抗腫瘍活性を有する１種以上の化合物の１つ以上のアリコートとを含む、上記キットに関する。
【０１１５】
或いは、本キットは、単独の活性医薬成分として、本明細書で定義した本発明の活性医薬成分と、抗腫瘍活性を有する１種以上の化合物の１つ以上のアリコートを含有する組成物の１つ以上のアリコートを含んでいてもよい。
【０１１６】
上述のように、こうした化合物は、例えば、シスプラチン、ドキソルビシン、ペメトレキセド、メトトレキサート、ビノレルビン、ゲムシタビン及びタキソールを含む群から選択される化学療法剤であってよい。
【０１１７】
本発明によれば、本明細書に記載の組成物がそれらの治療活性を及ぼす病理は、悪性胸膜中皮腫に代表される。
【０１１８】
最後に、本明細書はまた、悪性胸膜中皮腫を予防及び／又は処置する治療方法であって、それを必要とする個体に、治療上有効な量の活性医薬成分又は単独の活性医薬成分として本発明の活性医薬成分を含む医薬組成物を、任意選択で１種以上の抗腫瘍化合物と併用して投与するステップを含む、上記治療方法に関する。
【０１１９】
本発明の基礎を形成する方法は、悪性胸膜中皮腫の前腫瘍及び／又は腫瘍病理学的状態を示す対象に、本明細書で定義した活性医薬成分の治療上有効な量を、任意選択で、１種以上の抗腫瘍薬と併用して投与することにより；或いは、任意選択で、１種以上の抗腫瘍薬をさらに含む、本明細書で定義した組成物の治療上有効な量を投与することにより、或いは、本明細書で定義したキットを使用して、本抽出物と１種以上の抗腫瘍薬を投与することにより実施することができる。
【０１２０】
上述の投与は、医師によって選択される投与計画に従って、同時に又は連続して実施することができる。
【０１２１】
本発明の好ましい実施形態において、病理は悪性胸膜中皮腫に代表される。
【０１２２】
本発明に記載の抽出物の効果を証明する多くの実験データを報告した。
【０１２３】
使用した細胞系
−  構造的に活性化されたＳＴＡＴ３を有するＭＳＴＯ２１１Ｈヒト肺二相性中皮腫細胞系。ＡＴＣＣ  ＃ＣＬＲ−２０８１から入手可能。
過去にいかなる治療も受けていなかった中皮腫（二相性悪性腫瘍）のある６２歳のヒト胸膜流出から樹立された、ヒト中皮腫細胞系。細胞系ＭＳＴＯ２１１Ｈは高レベルのｐＳｔａｔ３を発現する（Ｔｓａｏら、悪性胸膜中皮腫組織におけるｃ−Ｓｒｃ発現及び活性化の阻害は、アポトーシス、細胞周期停止、遊走及び浸潤の低下を導く（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃ−Ｓｒｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｐｌｅｕｒａｌ  ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ａｒｒｅｓｔ，ａｎｄ  ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｖａｓｉｏｎ．）、ＭｏｌＣａｎｃｅｒＴｈｅｒ  ２００７；６：１９６２〜１９７２）。
−  ＮＣＩ−Ｈ２０５２ヒト中皮腫細胞系。この細胞系はｐＳＴＡＴ３を発現する（Ｔｓａｏ  ｅｔ  ａｌ．、「悪性胸膜中皮腫組織におけるｃ−Ｓｒｃの発現及び活性化を阻害すると、アポトーシス、細胞周期停止、並びに遊走及び浸潤の減少が生じる（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃ−Ｓｒｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｐｌｅｕｒａｌ  ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ａｒｒｅｓｔ，ａｎｄ  ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｖａｓｉｏｎ．）」。ＭｏｌＣａｎｃｅｒＴｈｅｒ  ２００７；６：１９６２−１９７２）。ＡＴＣＣ番号ＣＬＲ−５９１５から入手可能。
−  ＮＣＩ−ｈ２８ヒトステージ−４中皮腫細胞系。ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−５８２０から入手可能。
−  ＭＰＰ−８９ヒト中皮腫細胞系。ＣＡＢＲＩから入手可能、アクセス番号ＩＣＬＣ  ＨＴＬ０００１２。
【０１２４】
以下の実施例は、本発明のシナラ・スコリムス抽出物によって次に記載のことがどの程度可能であるかを示す：
非形質転換中皮細胞（ＨＭＣ）にはそれほど強く作用することなく、中皮腫細胞（ＭＳＴＯ２１１Ｈ、ＭＰＰ−８９、ＮＣＩ−Ｈ２０５２、ＮＣＩ−Ｈ２８）の生存能力を用量依存的に低減する；
同一細胞系に対するクローン原性生存アッセイにおいてコロニーの形成能力を低下させ、アポトーシスアッセイにおいて悪性中皮腫細胞ＭＭの細胞死を誘導する；
創傷治癒アッセイにおいてＭＭ細胞の遊走及び増殖を阻害する；
ペメトレキセドなどの化学療法剤による連続処置でＭＭ細胞を感受性にする；
ＭＭ細胞のＤＮＡの損傷は誘導するが、ＨＭＣ細胞のＤＮＡの損傷は誘導しない；
抽出物で前処置した細胞においてＭＳＴＯ細胞による腫瘍移植の可能性を低減する；
ＭＳＴＯの異種間臓器移植の処置において用量依存的な効果を有する。
【実施例】
【０１２５】
１．  方法
１．１．  細胞溶融及びウェスタンブロッティング。
細胞を氷中で３０分間、プロテアーゼ及びホスファターゼの阻害剤（５ｍＭ  ＰＭＳＦ、３ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＮａＶＯ４）を補充した溶融バッファーＮＰ４０（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶融させた。タンパク質の全抽出物の等量（３０μｇ）を８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で変性させることによって分解させ、２時間ニトロセルロース膜に移した。１時間、０．０５％のＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０に溶解させた５％のミルク溶液で膜をブロックし、特異的一次抗体とインキュベートした。一次抗体は以下のものを使用した：抗ベータアクチン（Ａ−２２２８、ＳＩＧＭＡ）、抗ｐＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ−７０５）（ｓｃ８０５９、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）及び抗ＳＴＡＴ３（ｓｃ７１７９、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）。二次抗体をペルオキシダーゼ結合されており（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、化学発光にはＥＣＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）を使用した。
【０１２６】
１．２．  ＭＰＭの細胞系、及び一般的に市販されている中皮細胞（ＨＭＣ）のシナラ・スコリムス抽出物による処置
ＭＰＭの細胞系（ＭＳＴＯ−２１１Ｈ、ＮＣＩ−Ｈ２８、ＮＣＩ−Ｈ２０５２、ＭＰＰ８９）はＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から取得し、一方、ＨＭＣ（ヒト中皮細胞）はＴｅｂｕ−Ｂｉｏ（Ｆｒａｎｃｅ）から取得した。すべての細胞系は、所定の培地中、３７℃及び５％ＣＯ２で単層において増殖させた。アーティチョーク抽出物は、３０ｍｇ／ｍｌの初期濃度で、比率１：１の注射用溶液用の水及びエタノールの溶液中に都合よく溶解させた。次いで、抗腫瘍特性を試験するため、図面に示したように、生成物を様々な細胞系の培地に、様々な濃度及び様々な回数で直接添加した。
【０１２７】
２．  悪性胸膜中皮腫（ＭＰＭ）の細胞に対するクローン原性アッセイ
ＭＰＭ細胞（ＭＳＴＯ２１１Ｈ、ＮＣＩ−Ｈ２８；ＭＰＰ−８９；ＮＣＩ−Ｈ２０５２）を１ウェル当たり２００個の細胞で接種し、本明細書による様々な増殖濃度のシナラ・スコリムス抽出物（対照担体単独；１２．５μｇ／ｍｌ；２５μｇ／ｍｌ；５０μｇ／ｍｌ；１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ）で処置した。各ポイントは、６ウェルのマルチウェルに二連でプレーティングした。形成されたコロニーは、１５〜２１日後にクリスタルバイオレットを用いて染色した。クローン原性アッセイとして知られているコロニー形成アッセイは、腫瘍細胞が単一細胞からコロニーを形成する能力の観点から抗腫瘍化合物の効果を評価する際に使用されている技術である。コロニーは、単一細胞に由来する５０個以上の細胞（クローン）の群であると考えられる。
【０１２８】
図１ａ〜図１ｄに示した実験結果は、本発明の抽出物がアッセイしたすべてのＭＰＭ細胞系におけるコロニー形成を用量依存的に阻害する、用量依存的能力を示す。
【０１２９】
３．  ＡＴＰｌｉｔｅ（商標）細胞活性アッセイ
様々な濃度の本発明の抽出物に暴露した後の各種細胞系の活性を、ＡＴＰｌｉｔｅ（商標）アッセイ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を製造者の説明書に従って使用し、評価した。表示されている場合、「担体」という用語は、処置で用いる同一容量で使用される濃度１：１の注射溶液用の水とエタノールの溶液を意味する。
【０１３０】
ＡＴＰＬｉｔｅ（商標）は、ホタル（フォチヌス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ））ルシフェラーゼの活性に基づいたアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）のレベルをモニタリングする系である。この発光アッセイは、培地中に含まれている可能性物質で処置した培養哺乳動物細胞の増殖を定量的に評価するための比色定量試験、蛍光定量試験及び放射性同位体試験に代わるものである。ＡＴＰのモニタリングは、実際、広範囲の薬剤、生物学的応答調節物質及び生物学的化合物の細胞増殖抑制効果及び抗増殖効果を評価するために使用されている。ＡＴＰＬｉｔｅ（商標）試験の系は、ＡＴＰルシフェラーゼ及びＤ−ルシフェリンを添加する反応によって生じる光の生成に基づいている。放出された光は、ある一定範囲内でＡＴＰ濃度に比例する。細胞内のＡＴＰ量は、細胞の生存能力と相関する。
【０１３１】
ＭＰＭ細胞系（ＭＳＴＯ２１１Ｈ、ＭＰＰ８９、ＮＣＩ−Ｈ２８）及びＨＭＣ細胞（ドナーの好意によって提供された非形質転換中皮細胞）の様々なタイプの細胞生存能力は、様々な濃度の本発明に記載の抽出物（対照担体単独；１２．５μｇ／ｍｌ；２５μｇ／ｍｌ；５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ）を使用した処置後にアッセイした。
【０１３２】
アッセイの結果を示す図２のグラフは、本抽出物が細胞生存能力を用量依存的に有意に低下させることができることを示す。
【０１３３】
これに対し、細胞生存能力に対する効果を非形質転換中皮細胞（ＨＭＣ）においても試験したところ、本発明の基礎を形成する抽出物は、腫瘍細胞系と比べた場合（図３ａ〜図３ｃ）、細胞毒性が低いことが示された（図３ａ〜図３ｃ）。
【０１３４】
４．  化学療法剤との同時処置における細胞生存能力アッセイ
細胞系ＭＳＴＯ２１１Ｈ及びＮＣＩ−Ｈ２０５２を使用し、シナラ・スコリムス抽出物＋抗腫瘍薬の併用効果を評価した。
【０１３５】
図４（ａ〜ｃ）に示したアッセイは、製造者の説明書に従ってＡＴＰＩｉｔｅ（商標）アッセイ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用し実施した。
【０１３６】
濃度１：１の注射溶液用の水とエタノールの溶液は、処置で使用した同一容量で用いた。
【０１３７】
試薬：
ペメトレキセド（Ａｌｉｍｔａ、Ｌｉｌｌｙ）は、製造者の説明書に従い希釈した。
【０１３８】
４．１  シナラ属種の抽出物とペメトレキセドの併用に関するＡＴＰＩｉｔｅ（商標）アッセイ
図４は、ペメトレキセド、及びシナラ属種の抽出物を併用したペメトレキセドで処置した７２時間後のＭＳＴＯ２１１Ｈに関する生存能力曲線を示す。図ａは、ＭＳＴＯ２１１Ｈ細胞に対する非細胞障害用量（６μｇ／ｍｌ）の抽出物及びペメトレキセドを用いた処置を示し、図ｂは、ＮＣＩ−Ｈ２０５２細胞に対する非細胞障害性用量（６μｇ／ｍｌ）の抽出物による処置及び（様々な濃度の）ペメトレキセドを用いた処置を示し、図ｃは、非形質転換ＨＭＣ細胞に対する非細胞障害性用量（６μｇ／ｍｌ）の抽出物による処置及び（様々な濃度の）ペメトレキセドによる処置を示す。アッセイした化合物の濃度を横座標上にプロットし、パーセンテージで表した細胞生存能力を縦座標上にプロットしている。
【０１３９】
図４ａ及び図４ｂは、抽出物による処置は、ペメトレキセドによる処置に対し腫瘍系をどのように感受性にするかを示す。二重処置の曲線において、ちょうど１０μΜのペメトレキセド濃度が被試験系の細胞生存能力を低下させるのに十分であることが明らかである。非腫瘍細胞系において、本抽出物がペメトレキセドに対する保護作用を有することを示していることは興味深い。
【０１４０】
５．  創傷治癒アッセイ
創傷治癒アッセイ（図１６）は、インビトロでの細胞指向性遊走を研究するために開発された、簡単で、安価な、最初の方法の１つである。この方法は、インビボにおける創傷治癒の間の細胞遊走を模倣する。基本的なステップは、細胞単層に「創傷」を生じさせ、次いで、「創傷」を閉じるのに必要な細胞遊走の間、開始時及び一定の間隔で画像を取り込むことにより「創傷」の特定領域をモニタリングすることを含む。９５％の密集度により培養されたＭＳＴＯ２１１Ｈ細胞を６ウェルのプレートに接種し、１０マイクロリットルの滅菌ピペットによって穴を開けることによって「創傷」（又は切り込み）を調製し、細胞を取り除いた。創傷後の示した時間にデジタル顕微鏡写真を得た。最後の棒グラフは、示した時間に担体又はＡＢＯ１で処置した切り込みを閉じる効果（定量した細胞の数を％で表示）を示す。
【０１４１】
６．アポトーシス誘導の評価アッセイ
図（６〜８）を参照されたい。
６．１  ウェスタンブロッティング
１．１の項目で述べたものと同じ技術を使用し、以下の一次抗体を使用した：抗ベータアクチン（Ａ−２２２８、ＳＩＧＭＡ）、抗カスパーゼ−３（３１Ａ１０６７、Ａｌｅｘｉｓ）、抗カスパーゼ−７（＃９４９２、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）及び抗ＰＡＲＰ（＃９５４２Ｓ、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）。
【０１４２】
６．２  ＦＡＣＳ分析、並びにＰＩ染色及びＰＩ／アネキシンＶ染色分析
細胞周期に対する本発明抽出物の効果を判定するために、ＦＡＣＳ分析を実施した。
【０１４３】
ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）による染色については、１０４細胞／ｍｌの密度で細胞を６ウェルプレートに接種した。２４時間後、様々な時間間隔で腫瘍細胞を提示濃度の本発明抽出物を用いて処置した。懸濁液中の細胞を収集し、付着細胞をＰＢＳで洗浄し、凍結エタノール（７０％ｖ／ｖ）で固定し、−２０℃で保存した。分析については、細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ  １Ｚ、ＰＩ（２５ｍｇ／ｍｌ）及びＲｎａｓｅ  Ａ（２００ｍｇ／ｍｌ）の溶液に懸濁した。
【０１４４】
ＰＩ／アネキシンＶ二重染色法については、処置細胞を収集し、結合バッファー（ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、ＣａＣｌ２  ２．５ｍＭ、ＮａＣｌ  １４０ｍＭ）に再懸濁した。細胞のアリコートをアネキシンＶ  ＦＩＴＣ及びＰＩ（５ｍｇ／ｍＬ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに１５分間インキュベートした。
【０１４５】
すべてのＦＡＣＳ分析の間、１０５の事象を各々のサンプルについて分析した。フローサイトメトリー分析は、ＧｕａｖａＥａｓｙＣｙｔｅ  ８ＨＴ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）フローサイトメーターで実施した。
【０１４６】
図８から明らかなように、本発明の抽出物は、アネキシンＶ染色法で判定したとおり、時間依存的及び用量依存的にＭＳＴＯ２１１Ｈの細胞でアポトーシスを誘導する。
【０１４７】
７．  本発明の抽出物による処置又は未処置腫瘍細胞の移植
第１移植実験の説明。
ＭＳＴＯ２１１Ｈ細胞を２４時間、５０μｇ／ｍｌ濃度のアーティチョークで処置した。ＰＢＳ／Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に２×１０６細胞の懸濁液を収集し、４週齢の雌ヌードマウスの右臀部に接種した。腫瘍の体積は、週に２回、２１日目までモニターした。マウスを屠殺し、塊を除去した。
【０１４８】
８．  マウスにおける腫瘍細胞の移植とシナラ・スコリムス及びペメトレキセドによる処置
第２移植実験の説明。
細胞を移植までに増殖させ、それらの活性及び混成の観点から評価した。すなわち、細胞を計数し、２０×１０６／ｍｌの濃度でＰＢＳに再懸濁した。Ｍａｔｒｉｇｅｌを懸濁液に加え、ＰＢＳ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ  １／１の最終濃度１０×１０６細胞／ｍｌを得た。ＭＳＴＯ細胞を４８匹のマウスの皮下に接種した。
【０１４９】
腫瘍が６０ｍｍ３の平均体積に達した時、異なる処置を受ける一群当たり６匹の動物によって形成される８群にマウスを分けた。
【０１５０】
２群は、３週間の間、週７日間、飲用水中のアーティチョークを摂取した；他の群は、３週間の間、週５日、ペメトレキセドを腹腔内投与した。
【０１５１】
これらの群を下記の表５に概説した：
【表５】
2017535617.tif 000004
【０１５２】
腫瘍の進行が出現したならば（すなわち、腫瘍が６０ｍｍ３に達した時）、処置は、以下のように投与するＡｂｏ１及びペメトレキセドで開始した：連続５日間、マウス１匹当たり８８ｍｌで用量１００ｍｇ／ｋｇのペメトレキセドを腹腔内投与、濃度が２５、５０及び７５マイクログラム／ｍｌの飲用水中アーティチョーク抽出物を投与。３週間の間、隔日で測定した。
【０１５３】
マウスに対し、あらゆる徴候を評価するため、毎日モニターした；体重は週に２回モニターした。
【０１５４】
実験の終了時に（接種４２日後）、腫瘍塊を回収し、１０％ホルマリンに固定した（２４時間後に７０％エタノールに移した）。
【０１５５】
腫瘍直径は週２回、Ｍｉｔｕｔｏｙｏキャリパーを使用して測定した。
【０１５６】
９．シナラ・スコリムス中のクロロゲン酸及びシナロピクリンの定量
サンプル調製：０．２５ｇの凍結乾燥抽出物（葉粉砕物０．５ｇ）を秤量し、５０ｍｌの７５％ＭｅＯＨ／０．１％ＨＣＯＯＨで、光から保護して１５分間超音波下にて抽出する。遠心分離を行い、１００ｍｌメスフラスコにデカントする。残留物について同じ条件下で第２の抽出を繰り返す。遠心分離を行い、同じ１００ｍｌフラスコにデカントする。２０℃の再統合した有機抽出物を同じ抽出溶媒を用いて容量にする。０．４５μｍ酢酸セルロースフィルターで濾過し、ＵＨＰＬＣシステム又はＨＰＬＣシステムに注入する。
【０１５７】
クロマトグラフィー条件（ＵＨＰＬＣ）：
カラム：Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ  １２０  ＥＣ−Ｃ１８、３×１００ｍｍ  ２．７μｍ＋インラインフィルター  ４．６ｍｍ、０．２μｍ
フィルター；カラム温度：３０℃±０．８℃
検出器：ダイオードアレイ検出器
クロロゲン酸：波長＝３２５ｎｍ−帯域幅４。
シナロピクリン：波長＝２１２ｎｍ−帯域幅４。
流速：０．４３ｍｌ／分。
注入量：５μｌ
移動相：Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＨＣＯＯＨ、Ｂ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＨＣＯＯＨ。
溶出条件：
【表Ｂ】
2017535617.tif 000005
【０１５８】
標準品調製：
標準品：シナロピクリン−可溶化溶媒：ＨＰＬＣ用のＭｅＯＨ。作業濃度：０．００４０４ｍｇ／ｍｌから０．０６４６２４ｍｇ／ｍｌ。保管条件：作業溶液は−２０℃で保存され、光から保護されている。
標準品：クロロゲン酸−可溶化溶媒：ＨＰＬＣ用の５０％ＭｅＯＨ。作業濃度：０．０２５４８ｍｇ／ｍｌから０．１０１９２ｍｇ／ｍｌ。保管条件：作業溶液は＋４℃で保存され、光から保護されている。
クロマトグラフィー条件（ＨＰＬＣ方法）：
カラム：Ｌｕｎａ  Ｃ１８  １５０×４．６ｍｍ  ５μｍ
カラム温度：３０℃±０．８℃
検出器：ダイオードアレイ検出器
クロロゲン酸：波長＝３２５ｎｍ−帯域幅４。Ｒｅｆ．オフ
シナロピクリン：波長＝２１２ｎｍ−  帯域幅４。Ｒｅｆ．オフ
流速：０．５ｍｌ／分
注入量：１０μｌ
移動相：Ａ＝Ｈ２Ｏ／０．１％ＨＣＯＯＨ、Ｂ＝ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＨＣＯＯＨ
溶出条件：
【表Ｃ】
2017535617.tif 000006
【０１５９】
計算：
固体生成物中のクロロゲン酸の含量パーセントは次式により計算される：
【数１】
2017535617.tif 000007
【０１６０】
式中、
ＡＣ＝サンプル中のクロロゲン酸に関連するピーク面積；
Ａｓｔ＝標準品中のクロロゲン酸に関連するピーク面積；
ｃｏｎｃ．ｓｔ＝標準品中のクロロゲン酸の濃度（ｍｇ／ｍｌ）；
Ｖ＝抽出物の総体積（ｍｌ）；
ｐ＝サンプル重量（グラム）；
Ｆ＝希釈係数。
【０１６１】
固形生成物中のシナロピクリンの含量パーセントは同じ式で計算する。
１５．シナラ・スコリムス中のクロロゲン酸として示される総カフェオイルキナ酸の定量。
【０１６２】
１０．シナラ・スコリムス中のクロロゲン酸として示される総カフェオイルキナ酸の定量。
サンプルの調製：凍結乾燥した抽出物サンプルの０．３０ｇ±０．０１５ｇを正確に秤量する（粉砕した葉の場合は０．５０ｇ）。４０ｍｌの超純水Ｈ２Ｏを添加し、９５℃±２℃の温度の磁気撹拌下に置く。沸騰温度に達したら、５０ｍｌの遠心チューブに綿を通して濾過する。２ｍｌの飽和酢酸鉛溶液を（まだ温かい）溶液に加える。
【０１６３】
冷却し、遠心分離を行い、上清を廃棄する。残留物に５ｍｌの超純粋Ｈ２Ｏを加え、遠心チューブを撹拌する。再度遠心分離を行い、上清を廃棄する。７０ｍｌの希酢酸（１１．４ｍｌを超純粋Ｈ２Ｏで１００ｍｌにしたもの）で残留物を抽出し、ゆっくりと撹拌しながら沸騰するまで加熱する。また温かい溶液を、綿を通して濾過し、２ｍｌの硫酸の溶液（２００ｍｌ／ｌ）を加える。遠心分離を行い、１００ｍｌのメスフラスコに透明な溶液をデカントする。残留物に５ｍｌの希酢酸を加える。遠心分離を行い、同じ１００ｍｌのメスフラスコに透明な溶液をデカントする。室温で、希酢酸で１００ｍｌの容量にする。
試験溶液：１ｍｌの溶液をとる。メスフラスコによって、メタノールで２５ｍｌにし、撹拌する。
基準溶液：１ｍｌの酢酸をとる。メスフラスコによって、メタノールで２５ｍｌにし、撹拌する。
【０１６４】
分光光度測定：
ブランクとして基準溶液を使用し、３２５ｎｍで試験溶液の吸光度を測定する。
【０１６５】
Ａ１％、１ｃｍ（ヨーロッパ薬局方Ｅｄ８．０，２．２．２５で定義されている）の定義＝長さ１ｃｍのセルに入れた、濃度１０ｇ／リットルで溶解させた基準物質を所定の波長で測定した比吸光度。
【０１６６】
３２５ｎｍでのクロロゲン酸の値をＡ１％、１ｃｍを４８５と仮定すると、クロロゲン酸として示されるカフェオイルキナ酸のパーセントは、次式により計算される：
計算：
【数２】
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【０１６７】
式中：
Ａ＝３２５ｎｍでのサンプルの吸光度。
Ｖｅ＝抽出物の最終体積。
Ｖｆ＝希釈液の最終体積。
ｐ＝サンプル重量グラム。
Ｖｐ＝最終希釈のために得たサンプル容量。
Ａ１％、１ｃｍ＝４８５（Ａ１％、波長３２５ｎｍでの１ｃｍのクロロゲン酸）。
【０１６８】
（参考文献）
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１１ｄ】
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【国際調査報告】
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