(57)【要約】本発明は、それを必要とする対象にて線維症、慢性炎症、慢性膵炎、癌、または炎症性筋線維芽細胞性腫瘍（ＩＭＴ）を治療する方法を提供する。該方法は、Ｌｙｎ阻害剤を含む組成物を提供することと、線維症、慢性炎症、慢性膵炎、癌、または炎症性筋線維芽細胞性腫瘍（ＩＭＴ）を治療するために対象に有効量の組成物を投与することとを含む。線維症、慢性炎症、慢性膵炎、癌、または炎症性筋線維芽細胞性腫瘍（ＩＭＴ）。【選択図】図２Ｆ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする対象における病状を治療する、抑制する、その重症度を軽減する及び／またはその予防を促進する方法であって、
（ｉ）Ｌｙｎ阻害剤を含む組成物を提供することと、
（ｉｉ）前記対象における前記病状を治療するように治療上有効な量の前記組成物を前記対象に投与することと
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記病状が、健常対象に比べて前記対象にて上昇したＬｙｎキナーゼ活性に関連する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記上昇したＬｙｎキナーゼ活性は活性化された星細胞にある、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記病状が、線維症、慢性炎症、慢性膵炎、膵臓線維症、癌、または炎症性筋線維芽細胞性腫瘍（ＩＭＴ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記癌が膵臓癌であり、かつ慢性膵炎及び／または膵臓線維症に関連する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記癌が、活性化された星細胞または筋線維芽細胞に関連する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記炎症性筋線維芽細胞性腫瘍が、膀胱、骨、乳房、ＣＮＳ腫瘍、結腸腫瘍、眼（眼窩）、心臓腫瘍、腎臓腫瘍、肝臓腫瘍、肺腫瘍、リンパ節、縦隔、膵臓、唾液腺、小腸、脾臓、及び／または甲状腺の任意の１以上におけるものである、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記線維症が、縦隔線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、進行性塊状線維症、腎性全身性線維症、クローン病、ケロイド、強皮症／全身性硬化症、関節線維症、ペイロニー病、デュピュイトラン拘縮、癒着性関節包炎、肝臓の線維症、肺の線維症、膵臓の線維症、腸管の線維症、クローン病、心臓の線維症、放射線療法の結果生じる線維症、放射線への職業上の曝露の結果生じる線維症、またはそれらの組み合わせの任意の１以上である、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記癌が、リンパ腫、肉腫、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、肺癌、肝細胞癌、胃癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿管癌、甲状腺癌、腎臓癌、癌腫、黒色腫、頭頚部の癌、脳腫瘍及び前立腺癌の任意の１以上である、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法によって癌の転移を防ぐ方法。
【請求項１１】
前記Ｌｙｎ阻害剤が、小分子、ペプチド、タンパク質、アプタマー、抗体又はその断片、核酸分子、ＬｙｎとＣＸＣＲ４に特異的な結合部位を含む二重特異性ポリペプチド剤から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記二重特異性ポリペプチドが、Ｌｙｎを特異的に結合させる抗体またはその抗原結合部分と、ＣＸＣＲ４を特異的に結合させる抗体またはその抗原結合部分とを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記核酸分子がＬｙｎのｓｉＲＮＡ分子である、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体が、モノクローナル抗体またはその断片、ポリクローナル抗体またはその断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、アンタゴニスト抗体、二重特異性抗体及び単鎖抗体から成る群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｌｙｎ阻害剤がバフェチニブである、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記組成物が、静脈内に、筋肉内に、腹腔内に、経口でまたは吸入を介して投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｌｙｎ阻害剤の有効量が、約０．１〜０．５ｍｇ／ｋｇ／日、０．５〜５ｍｇ／ｋｇ／日、５〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、１０〜２０ｍｇ／ｋｇ／日、２０〜５０ｍｇ／ｋｇ／日、５０〜１００ｍｇ／ｋｇ／日、１００〜２００ｍｇ／ｋｇ／日、２００〜３００ｍｇ／ｋｇ／日、３００〜４００ｍｇ／ｋｇ／日、４００〜５００ｍｇ／ｋｇ／日、５００〜６００ｍｇ／ｋｇ／日、６００〜７００ｍｇ／ｋｇ／日、７００〜８００ｍｇ／ｋｇ／日、８００〜９００ｍｇ／ｋｇ／日または９００〜１０００ｍｇ／ｋｇ／日である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記対象がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記組成物は、前記対象が前記病状を発症する前に、発症している最中に、または発症した後で前記対象に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記組成物が、１日あたり１〜３回、または１週間あたり１〜７回前記対象に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記組成物が１〜５日間、１〜５週間、１〜５ヵ月間または１〜５年間前記対象に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記対象を手術、放射線療法、化学療法またはそれらの組み合わせで治療することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記組成物が化学療法剤をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
（ｉ）Ｌｙｎ阻害剤と
（ｉｉ）薬学上許容されるキャリアと
を含む、医薬組成物。
【請求項２５】
（ｉ）Ｌｙｎ阻害剤を含むある量の組成物と、
（ｉｉ）線維化疾患及び／または癌を治療する、抑制する、その重症度を軽減する及び／またはその予防を促進する必要のある哺乳類対象に治療上有効な量の前記組成物を投与するための指示書と
を含む、キット。
【請求項２６】
Ｌｙｎの阻害剤を特定する方法であって、
（ｉ）Ｌｙｎ陽性細胞内のＬｙｎを関心対象の分子に接触させることと、
（ｉｉ）前記接触が活性化された星細胞または筋線維芽細胞の移動の減少をもたらすかどうかを判定することと
を含み、前記活性化された星細胞または筋線維芽細胞の移動の減少は関心対象の前記分子がＬｙｎ阻害剤であることを示す、前記方法。
【請求項２７】
前記Ｌｙｎ阻害剤が、小分子、ペプチド、抗体またはその断片、及び核酸分子から成る群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
調べられる複数の試料のそれぞれを別々に接触させることを含む、請求項２３に記載のスクリーニング法。
【請求項２９】
前記複数の試料が約１０４個を超える試料を含む、請求項２６に記載のスクリーニング法。
【請求項３０】
前記複数の試料が約５×１０４個を超える試料を含む、請求項２６に記載のスクリーニング法。
【請求項３１】
前記活性化された星細胞が慢性膵炎、膵臓癌の患者から得られる、請求項２４に記載の方法。
【請求項３２】
前記筋線維芽細胞が、線維化疾患のヒト組織から、またはヒト癌から得られる、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の権利
本発明は国立衛生研究所によって授与された助成金番号ＣＡ１６３２００−０１Ａ１及びＡＡ０１１９９９のもとで政府の援助によって為された。政府は本発明に対して特定の権利を有する。
【０００２】
発明の分野
本明細書で提供されるのは、それを必要とする対象にて線維症、慢性炎症、慢性膵炎、癌または炎症性筋線維芽細胞性腫瘍（ＩＭＴ）を治療する、抑制する、軽減する及び／またはその予防を促進するための組成物及び方法である。組成物はＬｙｎチロシンキナーゼの阻害剤を含む。
【背景技術】
【０００３】
背景
本明細書で引用される出版物はすべて、各個々の出版物または特許出願が具体的に且つ個々に参照によって組み入れられるように指示されたかのような同じ程度にその全体が参照によって組み入れられる。以下の記載には本発明を理解するのに有用であってもよい情報が含まれる。それは、本明細書で提供される情報のいずれかが従来技術であるもしくは現在請求されている発明に関連する、または具体的にもしくは暗に参照される任意の出版物が従来技術であるという承認ではない。
【０００４】
慢性膵炎（ＣＰ）は、実質の損傷、腺の緩慢な線維性置換、及び外分泌や内分泌の機能喪失を含む重篤な合併症、及び癌を招く膵臓の持続する炎症である。活性化されたα平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）陽性の星細胞が膵臓実質の浸潤及び置き換えに重大な役割を担うことが判明しているが、ＣＰの膵臓内でこれらの細胞の移動を調節することに直接関与する具体的なシグナル伝達分子は特定されていない。膵臓星細胞における重要な作動シグナル伝達メカニズムの限られた理解のために有効な抗炎症療法及び抗線維化療法は今日まで存在しない。肝臓及び同様に治療標的が未知である他の臓器の慢性炎症の間でも実質は星細胞で置き換えられる。
【０００５】
間質細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１）ケモカイン及びその受容体ＣＸＣＲ４は、局所組織の微細環境内における幹細胞／前駆細胞、白血球及び他の細胞の移動の主な調節因子として知られており、ＣＸＣＲ４の発現は炎症組織で上昇する。Ｌｙｎキナーゼは化学誘引物質のシグナル伝達に関与し、造血細胞及びマクロファージのＣＸＣＲ４が介在する走化性に必要とされる。しかしながら、慢性炎症の間の膵臓または他の線維性臓器の炎症の際の星細胞の移動におけるＬｙｎキナーゼの役割は今日まで報告されていない。本発明者らは、Ｌｙｎキナーゼ活性がＣＰにおける膵臓微細環境の星状筋線維芽細胞にて選択的に上昇し、膵臓内での活性化星細胞の機能亢進性のＣＸＣＲ４介在性の移動をもたらすという証拠を提供する。
【発明の概要】
【０００６】
従って、本明細書で提供されるのは、Ｌｙｎキナーゼが介在する１以上の過程、メカニズム、影響、応答、機能、活性または経路における質的なまたは量的な阻害、低下または軽減を阻害する、引き起こすまたは促進する、たとえば、Ｌｙｎキナーゼアンタゴニストポリペプチド、Ｌｙｎキナーゼ特異的阻害性核酸、Ｌｙｎキナーゼ特異的アンタゴニスト抗体またはその抗原結合断片、Ｌｙｎキナーゼ特異的小分子のようなＬｙｎキナーゼの阻害剤を含む組成物、及びＬｙｎキナーゼ阻害剤を含む方法である。
【０００７】
一部の実施形態では、本明細書で提供されるのは、Ｌｙｎキナーゼを特異的に標的とし、Ｌｙｎキナーゼの発現を阻害するのに使用することができるＬｙｎキナーゼ特異的なＲＮＡ干渉剤である。一部の実施形態では、ＲＮＡ干渉剤またはｓｉＲＮＡはＬｙｎキナーゼ特異的な二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である。一部の実施形態では、ＲＮＡ干渉剤またはｓｉＲＮＡはＬｙｎキナーゼ特異的な小分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。一部の態様では、Ｌｙｎキナーゼ特異的な阻害剤はバフェチニブである。
【０００８】
本明細書で提供されるのは、それを必要とする対象における病状を治療する、抑制する、その重症度を軽減する及び／またはその予防を促進する方法である。該方法は、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤を含む組成物を提供することと、病状を治療する、抑制する、その重症度を軽減する及び／またはその予防を促進するように有効量の組成物を対象に投与することとを含む、それらから成る、またはそれらから本質的に成る。種々の実施形態では、病状は線維症、慢性炎症、慢性膵炎、癌または炎症性筋線維芽細胞性腫瘍（ＩＭＴ）である。一部の実施形態では、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤はＬｙｎキナーゼに特異的なｓｉＲＮＡである。実施形態では、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤はバフェチニブである。一実施形態では、対象はヒトである。一部の実施形態では、方法は、Ｌｙｎキナーゼを阻害する作用剤を提供することと有効量の作用剤を対象に投与することとを含む、それらから成る、またはそれらから本質的に成る。
【０００９】
本明細書で提供されるのは、それを必要とする対象にて慢性膵炎を治療する、抑制する、その重症度を軽減するまたはその予防を促進する方法である。該方法は、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤を含む組成物を提供することと、対象にて慢性膵炎を治療する、抑制する、その重症度を軽減する及び／またはその予防を促進するように有効量の組成物を対象に投与することとを含む、それらから成る、またはそれらから本質的に成る。一部の実施形態では、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤はＬｙｎキナーゼに特異的なｓｉＲＮＡである。実施形態では、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤はバフェチニブである。一実施形態では、対象はヒトである。一部の実施形態では、方法はさらに、慢性膵炎の既存の治療を投与することと、たとえば、腹痛の薬理学的緩和、消化及び吸収の薬理学的回復、内視鏡治療、外科療法、食事療法またはそれらの組み合わせを用いて慢性膵炎を管理することとを含んでもよい。Ｌｙｎキナーゼ阻害剤を含む組成物及び既存の治療法は順次または同時に投与されてもよい。一部の実施形態では、方法はＬｙｎキナーゼを阻害する作用剤を提供することと、対象に有効量の作用剤を投与することとを含む、それらから成る、またはそれらから本質的に成る。
【００１０】
本明細書で提供されるのは、それを必要とする対象にて線維症を治療する、抑制する、その重症度を軽減するまたはその予防を促進する方法である。該方法は、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤を含む組成物を提供することと、線維症を治療する、抑制する、その重症度を軽減する及び／またはその予防を促進するように有効量の組成物を対象に投与することとを含む、それらから成る、またはそれらから本質的に成る。一部の実施形態では、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤はＬｙｎキナーゼに特異的なｓｉＲＮＡである。実施形態では、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤はバフェチニブである。本明細書に記載されている方法の種々の実施形態では、線維症は、膵臓の線維症、嚢胞性線維症、縦隔線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、進行性塊状線維症、腎性全身性線維症、クローン病、ケロイド、強皮症／全身性硬化症、関節線維症、ペイロニー病、デュピュイトラン拘縮、癒着性関節包炎、肝臓の線維症、肺の線維症、腸管の線維症（たとえば、クローン病における）、心臓の線維症またはそれらの組み合わせの任意の１以上である。一部の実施形態では、方法はＬｙｎキナーゼを阻害する作用剤を提供することと、対象に有効量の作用剤を投与することとを含む、それらから成る、またはそれらから本質的に成る。
【００１１】
一部の実施形態では、続発性の臓器の線維症は放射線療法の副作用である。従って、一実施形態では、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤を用いて線維症を治療される対象は、第１の臓器にて癌のために放射線療法を受けたことがあり、または受けており、且つ第２の臓器にて線維症の症状または他の所見を示すまたは示してもよい対象であり、その際、第１の臓器と第２の臓器は異なる。一部の実施形態では、線維症を治療される対象は、第１の臓器にて癌のために放射線療法を受けたことがあり、または受けており、且つ同一臓器の別の場所で線維症の症状または他の所見を示す対象である。一部の実施形態では、線維症を治療される対象は、癌の治療のために放射線を受けている対象であり、且つ癌の部位にて線維症の症状または他の所見を示すまたは示してもよい。一部の実施形態では、線維症を治療される対象は、たとえば、放射線療法の施行者、軍人等のような職業上の理由のために放射線に曝露されたことがある対象である。
【００１２】
線維症を治療する、抑制する、その重症度を軽減するまたはその予防を促進する方法はさらに、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤と組み合わせて、臓器特異的な線維症に対する既存の治療法を（同時にまたは順次）投与することを含んでもよい。
【００１３】
例となる実施形態では、方法はさらに、膵臓における線維症のために腹痛の薬理学的緩和、消化及び吸収の薬理学的回復、内視鏡治療、外科療法、食事療法またはそれらの組み合わせを含んでもよい。
【００１４】
別の例となる実施形態では、方法はさらに、肺線維症のために酸素療法、プレドニゾン、アザチオプリン及び／またはＮ−アセチルシステインを含んでもよい。
【００１５】
追加の例となる実施形態では、方法はさらに心筋線維症のためにアンジオテンシン変換酵素阻害剤またはリシノプリルを投与することを含んでもよい。
【００１６】
本明細書で提供されるのは、それを必要とする対象にて慢性炎症を治療する、抑制する、その重症度を軽減するまたはその予防を促進する方法である。該方法は、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤を含む組成物を提供することと、対象にて慢性炎症を治療する、抑制する、その重症度を軽減する及び／またはその予防を促進するように有効量の組成物を対象に投与することとを含む、それらから成る、またはそれらから本質的に成る。一部の実施形態では、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤はＬｙｎキナーゼに特異的なｓｉＲＮＡである。実施形態では、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤はバフェチニブである。一部の実施形態では、方法は、Ｌｙｎキナーゼを阻害する作用剤を提供することと、対象に有効量の作用剤を投与することとを含む、それらから成る、またはそれらから本質的に成る。
【００１７】
本明細書で提供されるのは、細胞における（たとえば、活性化された星細胞における）機能亢進性のＬｙｎキナーゼ活性と関連する病状ならびに／または活性化された星細胞の増殖及び／もしくは移動に関連する病状を治療する、抑制する、その重症度を軽減するまたはその予防を促進する方法である。該方法は、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤を含む組成物を提供することと、細胞における機能亢進性のＬｙｎキナーゼ活性と関連する病状ならびに／または活性化された星細胞の増殖及び／もしくは移動に関連する病状を治療する、抑制する、それらの重症度を軽減する及び／またはそれらの予防を促進するように有効量の組成物を対象に投与することとを含む、それらから成る、またはそれらから本質的に成る。一部の実施形態では、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤はＬｙｎキナーゼに特異的なｓｉＲＮＡである。実施形態では、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤はバフェチニブである。例となる実施形態では、病状には、慢性膵炎、慢性炎症、線維症、癌、またはそれらの組み合わせが挙げられる。一部の実施形態では、方法は、Ｌｙｎキナーゼを阻害する作用剤を提供することと、対象に有効量の作用剤を投与することとを含む、それらから成る、またはそれらから本質的に成る。
【００１８】
本明細書で提供されるのは、それを必要とする対象にて癌を治療するまたは癌の転移を治療するもしくは予防する方法である。該方法は、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤を含む組成物を提供することと、対象にて癌の転移を治療するまたは予防するように対象に有効量の組成物を投与することとを含む、それらから成る、またはそれらから本質的に成る。一部の実施形態では、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤はＬｙｎキナーゼに特異的なｓｉＲＮＡである。実施形態では、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤はバフェチニブである。一実施形態では、対象はヒトである。種々の実施形態では、癌は、膵臓、肺、肝臓、骨、気道、尿管、リンパ系臓器またはニューロンにおける活性化された星細胞を含むが、これらに限定されない臓器における活性化された星細胞に関連する。活性化星細胞は膵臓及び肝臓における活性化された筋線維芽細胞に適用される名称である。しかしながら、名称、活性化された筋線維芽細胞は膵臓及び肝臓と同様に他の臓器におけるこれらの細胞に与えられる一般名である。一部の実施形態では、方法は、Ｌｙｎキナーゼを阻害する作用剤を提供することと、対象に有効量の作用剤を投与することとを含む、それらから成る、またはそれらから本質的に成る。種々の実施形態では、方法はさらに、たとえば、手術、放射線療法、または化学療法、またはそれらの組み合わせで対象を治療することを含んでもよい。手術、放射線療法、または化学療法、またはそれらの組み合わせは治療上有効な量の組成物を対象に投与する前に、投与している最中に、または投与した後に、実施されてもよい。本明細書に記載されている方法の種々の実施形態では、癌は、リンパ腫、肉腫、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、肺癌、肝細胞癌、胃癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿管癌、甲状腺癌、腎臓癌、癌腫、黒色腫、頭頚部の癌、脳腫瘍及び前立腺癌の任意の１以上である。
【００１９】
本明細書で提供されるのは、それを必要とする対象にて炎症性筋線維芽細胞性腫瘍を治療する、抑制する、その重症度を軽減するまたはその予防を促進する方法である。該方法は、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤を含む組成物を提供することと、対象にて炎症性筋線維芽細胞性腫瘍を治療する、抑制する、その重症度を軽減する及び／またはその予防を促進するように有効量の組成物を対象に投与することとを含む、それらから成る、またはそれらから本質的に成る。一部の実施形態では、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤はＬｙｎキナーゼに特異的なｓｉＲＮＡである。実施形態では、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤はバフェチニブである。一実施形態では、対象はヒトである。本明細書に記載されている方法の種々の実施形態では、炎症性筋線維芽細胞性腫瘍は、膀胱、骨、乳房、ＣＮＳ腫瘍、結腸腫瘍、眼（眼窩）、心臓腫瘍、腎臓腫瘍、肝臓腫瘍、肺腫瘍、リンパ節、縦隔、膵臓、唾液腺、小腸、脾臓、及び／または甲状腺の任意の１以上におけるものである。一部の実施形態では、方法は、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤を提供することと、対象に有効量の阻害剤を投与することとを含む、それらから成る、またはそれらから本質的に成る。
【００２０】
本明細書で提供されるのはまた、Ｌｙｎキナーゼの阻害剤を特定する方法である。該方法は、Ｌｙｎキナーゼ陽性細胞内のＬｙｎキナーゼを関心対象の分子に接触させることと、接触が、活性化された星細胞または筋線維芽細胞の増殖及び／または移動の減少をもたらすかどうかを判定することとを含む。種々の実施形態では、星細胞または筋線維芽細胞の増殖及び／または移動の減少は関心対象の分子がＬｙｎキナーゼ阻害剤であることを示す。例となる実施形態では、活性化された星細胞は活性化された膵臓星細胞である。種々の実施形態では、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤は、小分子、ペプチド、抗体またはその断片及び核酸分子から成る群から選択される。一部の実施形態では、スクリーニング法は調べられる複数の試料のそれぞれを別々に接触させることを含む。一部の実施形態では、複数の試料は約１０４個を超える試料を含む。一部の実施形態では、複数の試料は約５×１０４個を超える試料を含む。一部の実施形態では、星細胞は活性化された星細胞である。一部の実施形態では、活性化された星細胞は慢性膵炎の患者から得られる。一部の実施形態では、活性化された星細胞は膵臓癌の患者から得られる。一部の実施形態では、筋線維芽細胞は線維化疾患のヒト組織から得られ、使用される。一部の実施形態では、筋線維芽細胞はヒト癌から得られる。
【００２１】
例となる実施形態を参照される図面で説明する。本明細書で開示される実施形態及び図面は制約ではなく説明に役立つと見なされるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１Ａ〜１Ｆは、本発明の種々の実施形態に従って、ヒト慢性膵炎での活性化されたα−ＳＭＡ陽性星細胞における高いＬｙｎキナーゼ活性及びＣＸＣＲ４受容体発現を示す図である。膵臓星細胞は慢性膵炎患者（ｈＣＰ）及び健常ドナー（ｈＮＰ）から単離された。続いて、我々はこれらの細胞にてＬｙｎ及びＳｒｃのキナーゼアッセイ（図１Ａ、図１Ｂ）及びＬｙｎキナーゼ、Ｓｒｃ、α−ＳＭＡについてのウエスタンブロット（図１Ｃ）及びＣＸＣＲ４総タンパク質（図１Ｄ）のウエスタンブロットを実施した。キナーゼアッセイ及びウエスタンブロット解析はハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対して基準化した。図１Ｅは慢性膵炎（ｈＣＰ）及び健常対象（ｈＮＰ）の星細胞におけるＣＸＣＲ４受容体発現のフローサイトメトリー解析を示す。抗ヒトＣＸＣＲ４抗体と共にまたはそれを含まずに（対照）、その後二次抗体で細胞を染色し、解析した。図１Ａ〜図１Ｅは同一の膵炎及び健常対象について示される。我々は４つの異なる対象（ｎ＝４）について一貫した結果を得た。図１Ｆは慢性膵炎及び正常な膵臓について代表的な顕微鏡視野を示す（ｎ＝６）。棒グラフは、組織群当たり１５０の画像で実施された形態学的及び統計的な解析を表し、α−ＳＭＡとのＣＸＣＲ４の高い同時発現（矢印）及び膵炎組織における萎縮した実質へのＣＸＣＲ４＋／α−ＳＭＡ＋細胞の浸潤（矢印、左上、４分割分画）を示し、それは正常な膵臓におけるインタクトな実質組織（右上、４分割分画）と対照的である。これは、膵炎患者（ｈＣＰ）におけるＣＸＣＲ４とのα−ＳＭＡの高い同時発現を示すウエスタンブロットに一致している（図１Ｃ、図１Ｄ及び図１Ｅ）。
【図２】図２Ａ〜２Ｈは、本発明の種々の実施形態に従って、慢性膵炎（ｈＣＰ）と健常ドナー（ｈＮＰ）の活性化された星細胞の間でのＣＸＣＲ４／Ｌｙｎキナーゼシグナル伝達の刺激または阻害に対するはっきりと差のある走化性応答を示す図である。図２Ａでは、ｓｉＲＮＡによるエレクトロポレーションの４８時間後に対照のウエスタンブロットを行った。図２Ｂでは、細胞を対照緩衝液または０．０２５μＭのＳＤＦ−１で２時間刺激した。示した結果は４つの異なる細胞ドナーによる実験の代表である。図２Ｃ、図２Ｄ及び図２Ｅでは、細胞を示したようにＡＭＤ３１００、ｓｉＲＮＡ、またはＩＮＮＯ−４０６で処理し、続いて、ＳＤＦ−１で刺激したまたは刺激しなかった細胞（ｎ＝４）にて走化性アッセイを行った。図２Ｆは、増殖している慢性膵炎（ｈＣＰ）対健常（ｈＮＰ）の星細胞における対照の細胞数を示し、対照のＭＴＴ生存率アッセイはｓｉＲＮＡのエレクトロポレーションの２４時間後と７２時間後に行った（ｎ＝６）。図２Ｇは、セルレインで誘導した膵臓線維症がＩＮＮＯ−４０６による処理によって改善することを示す。ヘマトキシリン／エオシンまたはピクロシリウス赤による染色は線維症を示し、結合組織は暗灰色で示される。セルレイン及びＩＮＮＯ−４０６はセルレイン単独に比べて膵臓線維症を減らす（未処理：２．００±０．８４％、セルレイン：１６．３９±３．０８％、セルレイン及びＩＮＮＯ−４０６：７．５０±４．７７％）。生理食塩水で処理したマウスは陰性対照として用いた（無処理）。１０×拡大。図２Ｈは、図２Ｇと同じ領域であるが、２０×拡大を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
発明の詳細な説明
本明細書で引用される参考文献はすべて、あたかも完全に述べられるかのようにその全体が参照によって組み入れられる。特に定義されない限り、本明細書で使用される専門用語及び科学用語は本発明が属する技術における当業者によって共通して理解されるものと同じ意味を有する。Ａｌｌｅｎら，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，第２２版，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ（２０１２年９月１５日）；Ｈｏｒｎｙａｋら，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｎａｎｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（２００８）；Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ及びＳａｉｎｓｂｕｒｙ，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第３版，改訂版，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００６）；Ｓｍｉｔｈ，Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，第７版，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２０１３）；Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，第３版，Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ（２０１２年１１月２８日）；ならびにＧｒｅｅｎ及びＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第４版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２０１２）は、本出願で使用される用語の多くに対する一般的な指針を当業者に提供する。抗体の調製の仕方に関する参照については、Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＮＹ，２０１３）；Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｌｉｎｅｓ  ｂｙ  ｃｅｌｌ  ｆｕｓｉｏｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９７６，Ｊｕｌ，６（７）：５１１−９；Ｑｕｅｅｎ及びＳｅｌｉｃｋ，Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，米国特許第５，５８５，０８９号（１９９６，Ｄｅｃ）；ならびにＲｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ，Ｎａｔｕｒｅ，１９８８，Ｍａｒ，２４，３３２（６１６２）：３２３−７を参照のこと。
【００２４】
小児科に関する参照については、Ｓｃｈｗａｒｔｚら，Ｔｈｅ  ５−Ｍｉｎｕｔｅ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｃｏｎｓｕｌｔ，第４版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ及びＷｉｌｋｉｎｓ，（２００５年６月１６日）；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら，Ｔｈｅ  Ｈａｒｒｉｅｔ  Ｌａｎｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｈｏｕｓｅ  Ｏｆｆｉｃｅｒｓ，第１７版，Ｍｏｓｂｙ（２００５年６月２４日）；ならびにＨａｙら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ＆  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ），第１８版，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ（２００６年９月２５日）を参照のこと。
【００２５】
当業者は、本明細書に記載されているものに類似するまたはそれと同等の、本発明の実践で使用されてもよい多数の方法及び材料を認識するであろう。実際、本発明は記載されている方法及び材料に決して限定されない。本発明の目的で以下の用語が以下で定義される。
【００２６】
本明細書で使用されるとき、用語「含んでいる」または「含む」は、組成物、方法及びそれらの各成分を参照して使用され、それは実施形態に有用であるが、有用であろうとなかろうと特定されない要素の包含を受け入れる。一般に、本明細書で使用される用語は一般に「開放性」の用語として意図されることが当業者によって理解されるであろう（たとえば、用語「含んでいる」は、「含んでいるが、これらに限定されない」として解釈されるべきであり、用語「有する」は「少なくとも有する」として解釈されるべきであり、用語「含む」は「含むが、これらに限定されない」として解釈されるべきである）。
【００２７】
特に述べられない限り、出願の特定の実施形態を記載する文脈（特にクレームの文脈）で使用される用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び類似の参照は単数及び複数の双方を網羅するように解釈することができる。本明細書での値の範囲の引用は単に、その範囲に入る各別々の値を個々に参照する簡単な方法として役立つように意図される。本明細書で特に指示されない限り、各個々の値は、それが本明細書で個々に引用されるかのように明細書に組み入れられる。本明細書に記載されている方法はすべて、本明細書で指示されない限り、または文脈によって明瞭に否定されない限り、任意の好適な順で実施することができる。本明細書の特定の実施形態に関して提供される任意の例及び例すべて、または例となる言語（たとえば、「たとえば〜など」）の使用は、単に本出願をさらに良好に説明するように意図されるのであって、他の形で請求される本出願の範囲に限定を課すものではない。略記「ｅ．ｇ．」はラテン語ｅｘｅｍｐｌｉ  ｇｒａｔｉａに由来し、本明細書では非限定例を示すのに使用される。従って、略記「ｅ．ｇ．」は用語「たとえば」と同義語である。明細書における言語は本出願の実践に必須の請求されない要素を示すと解釈されるべきではない。
【００２８】
「有益な成績」には、病状の重症度を軽減することまたは緩和すること、病状が悪化するのを防ぐこと、病状を治癒させること、病状が発症するのを防ぐこと、病状を発症する患者の機会を減らすこと、及び患者の生命または平均余命を延ばすことが挙げられてもよいが、決してこれらに限定されない。有益なまたは所望の臨床成績には、１以上の症状の緩和、欠損の程度の低下、癌の進行の安定した（すなわち、悪化しない）状態、転移または侵襲の遅延または鈍化、及び癌に関連する症状の改善または緩和が挙げられるが、これらに限定されない。治療には、治療を受けていない対象に比べた死亡率の低下及び寿命の延びも含まれる。
【００２９】
本明細書で使用されるとき、用語「投与すること」は、所望の部位での作用剤の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路によって対象に本明細書で開示されるような作用剤を配置することを指す。
【００３０】
「癌」または「腫瘍」は本明細書で使用されるとき、身体の器官及び系の正常な機能を妨害する細胞の制御されない増殖を指す。癌または腫瘍を有する対象は対象の体内に存在する客観的に測定できる癌細胞を有する対象である。この定義に含まれるのは、良性及び悪性の癌と同様に休眠中の腫瘍または微小転移巣である。元々の位置から移動し、重要臓器に播種する癌は冒された臓器の機能的な劣化を介して最終的に対象の死をもたらし得る。本明細書で使用されるとき、用語「癌腫」は上皮細胞から生じる癌を指す。本明細書で使用されるとき、用語「侵襲性」は周囲の組織に浸潤し、破壊する能力を指す。黒色腫は皮膚腫瘍の侵襲性形態である。癌の例には、Ｂ細胞リンパ腫（ホジキンリンパ腫及び／または非ホジキンリンパ腫）、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、肺癌、肝細胞癌、胃癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿管癌、甲状腺癌、腎臓癌、癌腫、黒色腫、頭頚部の癌、脳腫瘍ならびにアンドロゲン非依存性の前立腺癌及びアンドロゲン依存性の前立腺癌を含むが、これらに限定されない前立腺癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
本明細書で使用されるとき、「Ｌｙｎ」または「Ｌｙｎキナーゼ」はＬｙｎチロシンキナーゼを指す。
【００３２】
本明細書で使用されるとき、「対象」はヒトまたは動物を意味する。普通、動物は、たとえば、霊長類、齧歯類、家畜または狩猟動物のような脊椎動物である。霊長類にはチンパンジー、カニクイザル、クモザル、及びマカクザル、たとえば、アカゲザルが挙げられる。齧歯類にはマウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギ及びハムスターが挙げられる。家畜及び狩猟動物にはウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、水牛、ネコ種、たとえば、イエネコ及びイヌ種、たとえば、イヌ、キツネ、オオカミが挙げられる。用語「患者」、「個人」及び「対象」は本明細書では相互交換可能に使用される。実施形態では、対象は哺乳類である。哺乳類は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマまたはウシであることができるが、これらの例に限定されない。加えて、本明細書に記載されている方法を用いて家畜及び／またはペットを治療することができる。該用語は特定の年齢または性別を意味しない。従って、成人及び新生児の対象、と同様に胎児は男であろうと女であろうとこの用語の範囲内に含められるように意図される。
【００３３】
本明細書で使用されるとき、用語「治療する」、「治療」または「改善」は治療処置を指し、その際、目的は疾患または障害に関連する状態の進行または重症度を反転させる、緩和する、改善する、抑制する、鈍化させるまたは停止させることである。用語「治療すること」には、たとえば、慢性膵炎、線維症、自己免疫疾患、慢性感染または癌のような状態、疾患または障害の少なくとも１つの有害効果または症状を軽減することまたは緩和することが含まれる。１以上の症状または臨床マーカーが低減すれば、治療は一般に「有効」である。或いは、疾患の進行が軽減するまたは停止すれば、治療は「有効」である。すなわち、「治療」には、症状またはマーカーの改善だけでなく、治療の非存在下で予想されることになる症状の進行または悪化の停止または少なくとも鈍化も含まれる。有益なまたは所望の臨床成績には、検出可能であろうと検出不能であろうと、１以上の症状の緩和、疾患の程度の低下、疾患の安定した（すなわち、悪化しない）状態、疾患の進行の遅延または鈍化、病状の改善または緩和、及び寛解（部分的であれ、全体的であれ）が挙げられるが、これらに限定されない。用語、疾患の「治療」にはまた、疾患の症状又は副作用の緩和（緩和医療を含む）を提供することも含まれる。
【００３４】
「治療上有効な量」は本明細書で使用されるとき、線維症、慢性炎症、慢性膵炎、癌または炎症性筋線維芽細胞性腫瘍（ＩＭＴ）の哺乳類対象にて有益な成績を達成することが可能であるその量を指す。治療上有効な量は個人ベースで決定することができ、少なくとも部分的には、哺乳類の生理的特徴の考慮、送達系の種類または使用される治療法及び疾患の進行に対する投与の時間に基づくであろう。
【００３５】
「治療剤」は本明細書で使用されるとき、たとえば、疾患の影響を治療する、抑制する、予防する、和らげる、疾患の重症度を軽減する、疾患を発症する可能性を減らす、疾患の進行を鈍化させる及び／または疾患を治癒させるのに使用される作用剤を指す。治療剤によって標的とされる疾患には、線維症、慢性炎症、慢性膵炎、癌または炎症性筋線維芽細胞性腫瘍（ＩＭＴ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
用語「ＲＮＡ干渉剤」及び「ＲＮＡ干渉」は本明細書で使用されるとき、ＲＮＡ干渉剤がｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたは他の二本鎖ＲＮＡ分子を含んでいるかどうかにかかわらず、二本鎖ＲＮＡが介在するＬｙｎキナーゼの遺伝子サイレンシングの形態を包含するように意図される。本明細書では「小分子干渉ＲＮＡ」とも呼ばれる「短分子干渉ＲＮＡ」（ｓｉＲＮＡ）は、たとえば、ＲＮＡｉによって標的遺伝子の発現を阻害するように機能するＲＮＡ剤として定義される。ｓｉＲＮＡは、化学的に合成されてもよく、試験管内の転写によって作出されてもよく、または宿主細胞内にて産生されてもよい。一実施形態では、ｓｉＲＮＡは、長さ約１５〜約４０ヌクレオチド、好ましくは約１５〜約２８ヌクレオチド、さらに好ましくは長さ約１９〜約２５ヌクレオチド、及びさらに好ましくは長さ約１９、２０、２１、２２または２３ヌクレオチドの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子であり、約０、１、２、３、４、または５ヌクレオチドの長さを有する各鎖において３’及び／または５’のオーバーハングを含有してもよい。オーバーハングの長さは２つの鎖の間で独立しており、すなわち、一方の鎖におけるオーバーハングの長さは、第２の鎖におけるオーバーハングの長さに左右されない。好ましくは、ｓｉＲＮＡは、標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の分解または特異的な転写後の遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）を介してＲＮＡ干渉を促進することが可能である。従って、一部の実施形態では、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤はＬｙｎキナーゼのＲＮＡ干渉剤である。例となる実施形態では、ＲＮＡｉ剤は本明細書に記載されているようにＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから得られるｓｉＲＮＡである。
【００３７】
本明細書で使用されるとき、「星細胞」は、たとえば、膵臓及び肝臓における線維芽細胞様細胞または線維芽細胞のような細胞を指す。線維芽細胞様細胞または線維芽細胞のような細胞は多数の臓器に存在し、休眠状態または活性化状態であってもよい。
【００３８】
本明細書で使用されるとき、「休眠星細胞」は、たとえば、コラーゲンを産生し、臓器の構造の正常な組織化に重要な結合組織を形成する線維芽細胞様細胞または線維芽細胞のような細胞である。
【００３９】
本明細書で使用されるとき、「活性化された星細胞」または「筋線維芽細胞」は、他の臓器における、休眠ではなく、大量で過剰のコラーゲン及び炎症性分子を産生すると共にアルファ−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）を産生し、増殖し、且つ移動する星細胞または筋線維芽細胞の前駆細胞を指す。α−ＳＭＡは、膵臓及び肝臓における活性化された星細胞ならびに他の臓器における活性化された筋線維芽細胞のマーカーである。Ｌｙｎキナーゼは、休眠中の星細胞及び他の前駆細胞の筋線維芽状態の活性化された星細胞への活性化に介在する。臓器特異的である筋線維芽細胞の幾つかのサブクラスがある。一部の実施形態では、活性化された星細胞におけるＬｙｎキナーゼの機能亢進性は癌をもたらす。一部の実施形態では、活性化された星細胞におけるＬｙｎキナーゼの機能亢進性は癌に繋がり得る線維症をもたらす。
【００４０】
用語「作用剤」はＬｙｎキナーゼ阻害剤を参照して本明細書で使用されるとき、小分子、核酸、ポリペプチド、ペプチド、薬剤、イオン等のような、しかし、これらに限定されない任意の化合物または物質を意味する。「作用剤」は、限定しないで合成の及び天然に存在するタンパク性及び非タンパク性の実体を含む化学物質、実体または部分であることができる。一部の実施形態では、作用剤は核酸、核酸類似体、タンパク質、抗体、ペプチド、アプタマー、核酸のオリゴマー、アミノ酸、または炭水化物であり、それには限定しないで、タンパク質、オリゴヌクレオチド、リボザイム、ＤＮＡザイム、糖タンパク質、ｓｉＲＮＡ、リポタンパク質、アプタマー、及びそれらの修飾物及び組み合わせが含まれる。一部の実施形態では、作用剤は化学部分を有する小分子である。たとえば、化学部分には、非置換のまたは置換されたアルキル、芳香族、またはヘテロシクリルの部分が挙げられる。化合物は、所望の活性及び／または特性を有する、たとえば、Ｌｙｎキナーゼを阻害することが知られることができ、または、たとえば、スクリーニング法を用いて多様な化合物のライブラリから選択することができる。
【００４１】
慢性膵炎には星細胞による浸潤及び正常実質の星細胞による置き換えが関与する。本発明者らは、慢性膵炎の星細胞にて機能亢進性のＣＸＣＲ４／Ｌｙｎキナーゼの走化性シグナル伝達を特定した。ＣＸＣＲ４受容体及びＬｙｎキナーゼの活性化は活性化された星細胞のマーカー（α−平滑筋アクチン）と共に同時発現し、正常に対して慢性膵炎ではそれぞれ１５倍及び１１倍上昇する。Ｌｙｎキナーゼ阻害剤（ｓｉＲＮＡまたはバフェチニブ）が活性化された星細胞のＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４が介在する移動を妨げるということは、ＣＸＣＲ４／Ｌｙｎキナーゼがヒトの慢性膵炎、線維症、慢性炎症、及び／または癌（たとえば、慢性膵炎及び／または臓器における線維化に関連する癌）における新規の標的とし得る経路であることができることを示している。特定の臓器における活性化された星細胞または筋線維芽細胞は健常対象に比べて高い活性（機能亢進性のＬｙｎキナーゼ）のための線維症及び／または癌の原因となり得る。たとえば、膵臓における活性化された星細胞でのＬｙｎキナーゼの機能亢進性は膵炎、膵臓線維症及び膵臓癌をもたらし得る。同様に、肝臓における活性化された星細胞または肺もしくは腎臓における筋線維芽細胞は、癌をもたらし得る前記臓器の線維症をもたらし得る。
【００４２】
本明細書で示されるように、本明細書に記載されている阻害剤（たとえば、Ｌｙｎキナーゼに特異的なｓｉＲＮＡまたはバフェチニブ）によるＬｙｎキナーゼの阻害は、同時に（１）活性化された膵臓星細胞の増殖（図２Ｆ）、（２）活性化された膵臓星細胞の移動、及び（３）線維症（図２Ｇ）を阻止する。従って、Ｌｙｎキナーゼは、活性化された星細胞の移動、増殖及びコラーゲン産生の積極的な調節因子であり、膵臓、肺、肝臓または腎臓の線維症及び／または癌を含むが、これらに限定されない線維症及び／または癌における決定的で且つ独特の治療標的である。
【００４３】
方法
従って、本明細書で提供されるのは、それを必要とする対象における病状を治療する、抑制する、その重症度を軽減する及び／またはその予防を促進する方法である。該方法は、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤を含む組成物を提供することと、対象における病状を治療する、抑制する、その重症度を軽減する及び／またはその予防を促進するように有効量の組成物を対象に投与することとを含む。種々の実施形態では、病状は線維症、慢性膵炎、慢性炎症、癌または炎症性筋線維芽細胞性腫瘍（ＩＭＴ）である。一部の実施形態では、癌は臓器における慢性炎症及び／または線維症に関連する。一部の実施形態では、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤はＬｙｎキナーゼに特異的なｓｉＲＮＡである。実施形態では、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤はバフェチニブである。一実施形態では、対象はヒトである。種々の実施形態では、組成物は、対象が病状を発症する前に、発症している最中にまたは発症した後に対象に投与される。一部の実施形態では、組成物は１日あたり１〜３回または１週間あたり１〜７回対象に投与される。一部の実施形態では、組成物は１〜５日間、１〜５週間、１〜５ヵ月間または１〜５年間対象に投与される。種々の実施形態では、方法はさらに、手術、放射線療法、または化学療法、またはそれらの組み合わせで対象を治療することを含む。手術、放射線療法、または化学療法、またはそれらの組み合わせは治療上有効な量の組成物を対象に投与する前に、投与している最中にまたは投与した後に提供されてもよい。一部の実施形態では、方法は、Ｌｙｎキナーゼを阻害する作用剤を提供することと、対象に有効量の作用剤を投与することとを含む、それらから成る、またはそれらから本質的に成る。
【００４４】
本明細書で提供されるのは、それを必要とする対象にて慢性膵炎を治療する、抑制する、その重症度を軽減するまたはその予防を促進する方法である。該方法は、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤を含む組成物を提供することと、対象にて慢性膵炎を治療する、抑制する、その重症度を軽減する及び／またはその予防を促進するように有効量の組成物を対象に投与することとを含む。一部の実施形態では、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤はＬｙｎキナーゼに特異的なｓｉＲＮＡである。実施形態では、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤はバフェチニブである。一実施形態では、対象はヒトである。一部の実施形態では、方法はさらに、慢性膵炎の既存の治療を投与することと、たとえば、腹痛の薬理学的緩和、消化及び吸収の薬理学的回復、内視鏡治療、外科療法、食事療法またはそれらの組み合わせを用いて慢性膵炎を管理することとを含んでもよい。Ｌｙｎキナーゼ阻害剤を含む組成物及び既存の治療法は順次または同時に投与されてもよい。一部の実施形態では、方法はＬｙｎキナーゼを阻害する作用剤を提供することと、対象に有効量の作用剤を投与することとを含む、それらから成る、またはそれらから本質的に成る。
【００４５】
本明細書で提供されるのは、それを必要とする対象にて線維症を治療する、抑制する、その重症度を軽減するまたはその予防を促進する方法である。該方法は、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤を含む組成物を提供することと、対象にて線維症を治療する、抑制する、その重症度を軽減する及び／またはその予防を促進するように有効量の組成物を対象に投与することとを含む。一部の実施形態では、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤はＬｙｎキナーゼに特異的なｓｉＲＮＡである。実施形態では、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤はバフェチニブである。一実施形態では、対象はヒトである。一部の実施形態では、二次的な臓器線維症は放射線療法の副作用である。従って、一実施形態では、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤を用いて線維症を治療される対象は、第１の臓器にて癌のために放射線療法を受けたことがあり、または受けており、且つ第２の臓器にて線維症の症状もしくは他の所見を示すまたは示してもよい対象であり、その際、第１の臓器と第２の臓器は異なる。一部の実施形態では、線維症を治療される対象は、第１の臓器にて癌の治療のために放射線療法を受けたことがあり、または受けており、且つ同一臓器の別の場所で線維症の症状または他の所見を示す対象である。一部の実施形態では、線維症を治療される対象は、癌の治療のために放射線を受けている、且つ癌の部位にて線維症の症状または他の所見を示す対象である。一部の実施形態では、線維症を治療される対象は、たとえば、放射線療法の施行者、軍人等のような職業上の理由のために放射線に曝露されたことがある対象である。線維症を治療する、抑制する、その重症度を軽減するまたはその予防を促進する方法はさらに、臓器特異的な線維症に対する既存の治療法を投与することを含んでもよい。例となる実施形態では、方法はさらに、膵臓における線維症のために腹痛の薬理学的緩和、消化及び吸収の薬理学的回復、内視鏡治療、外科療法、食事療法またはそれらの組み合わせを含んでもよい。例となる実施形態では、方法はさらに、肺の線維症のために酸素療法、プレドニゾン、アザチオプリン及び／またはＮ−アセチルシステインを含んでもよい。別の例となる実施形態では、方法はさらに、心筋線維症のためにアンジオテンシン変換酵素阻害剤またはリシノプリルを投与することを含んでもよい。Ｌｙｎキナーゼ阻害剤を含む組成物及び既存の治療法は順次または同時に投与されてもよい。一部の実施形態では、方法はＬｙｎキナーゼを阻害する作用剤を提供することと、対象に有効量の作用剤を投与することとを含む、それらから成る、またはそれらから本質的に成る。
【００４６】
本明細書に記載されている方法の種々の実施形態では、線維症／線維化疾患は、膵臓の線維症、嚢胞性線維症、縦隔線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、進行性塊状線維症、腎性全身性線維症、クローン病、ケロイド、強皮症／全身性硬化症、関節線維症、ペイロニー病、デュピュイトラン拘縮、癒着性関節包炎、肝臓の線維症、肺の線維症、腸管の線維症（たとえば、クローン病における）、心臓の線維症またはそれらの組み合わせの任意の１以上である。
【００４７】
本明細書で提供されるのは、それを必要とする対象にて慢性炎症を治療する、抑制する、その重症度を軽減するまたはその予防を促進する方法である。該方法は、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤を含む組成物を提供することと、対象にて慢性炎症を治療する、抑制する、その重症度を軽減する及び／またはその予防を促進するように有効量の組成物を対象に投与することとを含む。一部の実施形態では、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤はＬｙｎキナーゼに特異的なｓｉＲＮＡである。実施形態では、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤はバフェチニブである。一実施形態では、対象はヒトである。一部の実施形態では、方法はさらに、非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）を投与することを含む。Ｌｙｎキナーゼ阻害剤を含む組成物及びＮＳＡＩＤは順次または同時に投与されてもよい。一部の実施形態では、方法はＬｙｎキナーゼを阻害する作用剤を提供することと、対象に有効量の作用剤を投与することとを含む、それらから成る、またはそれらから本質的に成る。
【００４８】
本明細書で提供されるのは、活性化された星細胞及び他の筋線維芽細胞における機能亢進性のＬｙｎキナーゼ活性に関連する病状を治療する、抑制する、その重症度を軽減するまたはその予防を促進する方法である。該方法は、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤を含む組成物を提供することと、星細胞における機能亢進性のＬｙｎキナーゼ走化性シグナル伝達に関連する病状を治療する、抑制する、その重症度を軽減する及び／またはその予防を促進するように有効量の組成物を対象に投与することとを含む。一部の実施形態では、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤はＬｙｎキナーゼに特異的なｓｉＲＮＡである。実施形態では、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤はバフェチニブである。一実施形態では、対象はヒトである。例となる実施形態では、病状には、慢性膵炎、慢性炎症、線維症、癌またはそれらの組み合わせが挙げられる。一部の実施形態では、方法はＬｙｎキナーゼを阻害する作用剤を提供することと、対象に有効量の作用剤を投与することとを含む、それらから成る、またはそれらから本質的に成る。
【００４９】
本明細書で提供されるのは、活性化された星細胞の増殖及び／または活性化された星細胞の移動に関連する病状を治療する、抑制する、その重症度を軽減するまたはその予防を促進する方法である。該方法は、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤を含む組成物を提供することと、活性化された星細胞の増殖及び／または活性化された星細胞の移動に関連する病状を治療する、抑制する、その重症度を軽減する及び／またはその予防を促進するように有効量の組成物を対象に投与することとを含む。一部の実施形態では、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤はＬｙｎキナーゼに特異的なｓｉＲＮＡである。実施形態では、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤はバフェチニブである。一実施形態では、対象はヒトである。例となる実施形態では、病状には、慢性膵炎、慢性炎症、線維症、癌またはそれらの組み合わせが挙げられる。一部の実施形態では、方法はＬｙｎキナーゼを阻害する作用剤を提供することと、対象に有効量の作用剤を投与することとを含む、それらから成る、またはそれらから本質的に成る。
【００５０】
本明細書で提供されるのは、それを必要とする対象にて癌を治療するまたは癌の転移を治療するもしくは予防する方法である。該方法は、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤を含む組成物を提供することと、対象にて癌の転移を予防するように有効量の組成物を対象に投与することとを含む。一部の実施形態では、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤はＬｙｎキナーゼに特異的なｓｉＲＮＡである。実施形態では、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤はバフェチニブである。一実施形態では、対象はヒトである。一部の実施形態では、方法はＬｙｎキナーゼを阻害する作用剤を提供することと、対象に有効量の作用剤を投与することとを含む、それらから成る、またはそれらから本質的に成る。一部の実施形態では、癌は慢性膵炎及び／または臓器における線維症に関連する。種々の実施形態では、方法はさらに、手術、放射線療法、または化学療法、またはそれらの組み合わせで対象を治療することを含む。手術、放射線療法、または化学療法、またはそれらの組み合わせは治療上有効な量のＬｙｎキナーゼ阻害剤を含む組成物を対象に投与する前に、投与している最中に、または投与した後に提供されてもよい。本明細書に記載されている方法の種々の実施形態では、癌は、リンパ腫、肉腫、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、肺癌、肝細胞癌、胃癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿管癌、甲状腺癌、腎臓癌、癌腫、黒色腫、頭頚部の癌、脳腫瘍及び前立腺癌の任意の１以上である。一部の実施形態では、癌は特定の臓器における線維症に関連する。
【００５１】
本明細書で提供されるのは、それを必要とする対象にて炎症性筋線維芽細胞性腫瘍を治療する、抑制する、その重症度を軽減するまたはその予防を促進する方法である。該方法は、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤を含む組成物を提供することと、対象にて炎症性筋線維芽細胞性腫瘍を治療する、抑制する、その重症度を軽減する及び／またはその予防を促進するように有効量の組成物を対象に投与することとを含む。一部の実施形態では、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤はＬｙｎキナーゼに特異的なｓｉＲＮＡである。実施形態では、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤はバフェチニブである。一実施形態では、対象はヒトである。一部の実施形態では、方法はＬｙｎキナーゼを阻害する作用剤を提供することと、対象に有効量の作用剤を投与することとを含む、それらから成る、またはそれらから本質的に成る。本明細書に記載されている方法の種々の実施形態では、炎症性筋線維芽細胞性腫瘍は、膀胱、骨、乳房、ＣＮＳ腫瘍、結腸腫瘍、眼（眼窩）、心臓腫瘍、腎臓腫瘍、肝臓腫瘍、肺腫瘍、リンパ節、縦隔、膵臓、唾液腺、小腸、脾臓、及び／または甲状腺の任意の１以上におけるものである。本明細書に記載されている方法の一部の実施形態では、炎症性筋線維芽細胞性腫瘍は、膀胱、骨、乳房、ＣＮＳ腫瘍、結腸腫瘍、眼（眼窩）、心臓腫瘍、腎臓腫瘍、肝臓腫瘍、肺腫瘍、リンパ節、縦隔、膵臓、唾液腺、小腸、脾臓、及び／または甲状腺の任意の１以上におけるものである。
【００５２】
治療剤
種々の実施形態では、Ｌｙｎキナーゼを阻害する作用剤またはＬｙｎキナーゼを阻害する作用剤を含む組成物は、化学療法剤、放射線療法、免疫療法剤またはホルモン療法剤を含むが、これらに限定されない他の治療剤と共に同時にまたは順次投与されてもよい。
【００５３】
一部の実施形態では、化学療法剤は、細胞傷害性抗生剤、代謝拮抗剤、有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、ヒ素化合物、ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤、タキサン、ヌクレオシド類似体、植物アルカロイド、及び毒素、及びそれらの合成誘導体の任意の１以上から選択されてもよい。例となる化合物には、アルキル化剤：トレオスルファン、及びトロフォスファミド；植物アルカロイド：ビンブラスチン、パクリタキセル、ドセタキソール；ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤：ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、テニポシド、クリスナトール、及びマイトマイシン；抗葉酸：メソトレキセート、ミコフェノール酸、及びヒドロキシ尿素；ピリミジン類似体：５−フルオロウラシル、ドキシフルリジン、及びシトシンアラビノシド；プリン類似体：メルカプトプリン及びチオグアニン；ＤＮＡ代謝拮抗剤：２’−デオキシ−５−フルオロウリジン、グリシン酸アフィッディコリン、及びピラゾロイミダゾール；ならびに有糸分裂阻害剤：ハリコンドリン、コルヒチン、及びリゾキシンが挙げられるが、これらに限定されない。１以上の化学療法剤（たとえば、ＦＬＡＧ、ＣＨＯＰ）を含む組成物が使用されてもよい。ＦＬＡＧは、フルダラビン、シトシンアラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）及びＧ−ＣＳＦを含む。ＣＨＯＰはシクロホスファミド、ビンクリスチン、ドキソルビシン及びプレドニゾンを含む。別の実施形態では、ＰＡＲＰ（たとえば、ＰＡＲＰ−１及び／またはＰＡＲＰ−２）阻害剤が使用され、そのような阻害剤は当該技術で周知である（たとえば、オラパリブ、ＡＢＴ−８８８、ＢＳＩ−２０１、ＢＧＰ−１５（Ｎ−Ｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）；ＩＮＯ−１００１（Ｉｎｏｔｅｋ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）；ＰＪ３４（Ｓｏｒｉａｎｏら、２００１；Ｐａｃｈｅｒら、２００２ｂ）；３−アミノベンズアミド（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）；４−アミノ−１，８−ナフタルイミド；（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）；６（５Ｈ）−フェナントリジノン（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）；ベンズアミド（米国特許Ｒｅ．３６，３９７）；及びＮＵ１０２５（Ｂｏｗｍａｎら）。
【００５４】
種々の実施形態では、治療法には、たとえば、放射線療法が含まれる。放射線療法で使用される放射線は電離放射線であることができる。放射線療法はまた、ガンマ線、Ｘ線または陽子線であることもできる。放射線療法の例には、外照射療法、放射線同位元素（Ｉ−１２５、パラジウム、イリジウム）の壁内埋め込み、ストロンチウム−８９のような放射線同位元素、胸部放射線療法、腹腔内Ｐ−３２放射線療法、及び／または全腹部及び骨盤放射線療法が挙げられるが、これらに限定されない。放射線療法の一般的な概説については、Ｈｅｌｌｍａｎ，１６章：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ：Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ，第６版，２００１，ＤｅＶｉｔａら編，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａを参照のこと。放射線療法は、体外照射または放射線が遠隔源から向けられる遠隔療法として投与することができる。放射線治療は、内科療法または放射活性源が癌細胞もしくは腫瘍塊の近傍で体内に置かれる近接照射療法として投与することもできる。包含されるのはまた、たとえば、ヘマトポルフィリン及びその誘導体、ベルトポルフィン（ＢＰＤ−ＭＡ）、フタロシアニン、光線感作物質Ｐｃ４、デメトキシ−ヒポクレリンＡ及び２ＢＡ−２−ＤＭＨＡのような光線感作物質の投与を含む光力学療法の使用である。
【００５５】
種々の実施形態では、治療法には、たとえば、免疫療法が含まれる。免疫療法は、たとえば、癌ワクチン及び／または感作された抗原提示細胞の使用を含んでもよい。一部の実施形態では、治療法には腫瘍の微細環境における細胞を標的とすることまたは免疫細胞を標的とすることが含まれる。免疫療法には、癌抗原または疾患抗原に対して向けられた予め形成された抗体の投与（たとえば、化学療法剤または毒素に任意で連結された腫瘍抗原に対するモノクローナル抗体の投与）によって達成される宿主の短期保護のための受動免疫が関与することができる。免疫療法は癌細胞株の細胞傷害性リンパ球に認識されるエピトープを使用することにも焦点を当てることができる。
【００５６】
種々の実施形態では、治療法には、たとえば、ホルモン療法が含まれる。ホルモン療法治療は、たとえば、ホルモンのアゴニスト、ホルモンのアンタゴニスト（たとえば、フルタミド、ビカルタミド、タモキシフェン、ラロキシフェン、リュープロリド酢酸塩（ルプロン）、ＬＨ−ＲＨアンタゴニスト）、ホルモンの生合成及び処理の阻害剤、及びステロイド（たとえば、デキサメタゾン、レチノイド、デルトイド、ベタメタゾン、コルチゾール、コルチゾン、プレドニゾン、デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、ミネラルコルチコイド、エストロゲン、テストステロン、プロゲスチン）、ビタミンＡ誘導体（たとえば、オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ））；ビタミンＤ３類似体；抗ゲスターゲン（たとえば、ミフェプリストン、オナプリストン）、または抗アンドロゲン（たとえば、シプロテロン酢酸塩）を含むことができる。
【００５７】
種々の実施形態では、組成物は、小分子、ペプチド、抗体またはその断片、核酸分子及びＬｙｎキナーゼとＣＸＣＲ４に特異的な結合部位を含む二重特異性ポリペプチド剤から成る群から選択されるＬｙｎキナーゼ阻害剤を含む。一部の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体またはその断片、ポリクローナル抗体またはその断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、阻止抗体またはアンタゴニスト抗体及び単鎖抗体から成る群から選択される。実施形態では、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤はＬｙｎキナーゼに特異的なｓｉＲＮＡ分子である。実施形態では、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤はバフェチニブである。
【００５８】
一部の実施形態では、本明細書で提供されるのは、ＬｙｎキナーゼとＣＸＣＲ４との間の相互作用を減らすまたは阻害する作用剤または作用剤を含む組成物である。組成物は、ＬｙｎキナーゼとＣＸＣＲ４との間の相互作用が介在するシグナル伝達を阻害する（減らすまたは阻止する）作用剤を含む。そのような作用剤には、抗体（「抗体」には、エピトープまたは抗原結合ペプチドのような抗体の抗原結合部分、パラトープ、機能的ＣＤＲ；組換え抗体；キメラ抗体；三重特異性抗体；ミディボディ；または抗原に結合する誘導体、類似体、変異体またはそれらの断片が含まれる）、タンパク質結合剤、小分子、組換えタンパク質、ペプチド、アプタマー、アビマー、及びタンパク質に結合する誘導体、その部分または断片が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、特にＬｙｎキナーゼ及び／またはＣＸＣＲ４のアンタゴニストとして、本明細書に記載されている組成物及び方法で有用である作用剤の別のクラスを表す。このクラスの作用剤及びそれらを調製し、使用する方法は、リボザイム及びｍｉＲＮＡ分子のように当該技術ですべて周知である。たとえば、十分な議論については、ＰＣＴＵＳ２００７／０２４０６７を参照のこと。或いは、本明細書に記載されている組成物及び方法の一部の実施形態では、ＬｙｎキナーゼとＣＸＣＲ４との間の相互作用を阻害する作用剤には、たとえば、組換えＬｙｎキナーゼまたは抱合体、またはタンパク質または抗体、ＬｙｎキナーゼｍＲＮＡに特異的なまたはそれに対して標的指向された小分子干渉ＲＮＡ、及びＬｙｎキナーゼのｍＲＮＡとハイブリッド形成するアンチセンスＲＮＡを挙げることができる。
【００６０】
本明細書で使用されるとき、「阻止」抗体または抗体「アンタゴニスト」は、それが結合する抗原の生物活性を阻害するまたは低下させるものである。たとえば、Ｌｙｎキナーゼ／ＣＸＣＲ４二重特異性の阻止抗体またはアンタゴニスト抗体は、星細胞にてＬｙｎキナーゼ及びＣＸＣＲ４を結合し、Ｌｙｎキナーゼ／ＣＸＣＲ４が介在する走化性シグナル伝達を阻害する。特定の実施形態では、本明細書に記載されている阻止抗体またはアンタゴニスト抗体またはその一部はＬｙｎキナーゼとＣＸＣＲ４との間の相互作用を完全に阻害する。特定の実施形態では、本明細書に記載されている阻止抗体またはアンタゴニスト抗体またはその一部はＬｙｎキナーゼとＣＸＣＲ４との間の相互作用を低減する／低下させる。実施形態では、抗体はＬｙｎキナーゼを特異的に結合させるモノクローナル抗体である。
【００６１】
本明細書に記載されている組成物及び方法の一部の実施形態では、Ｌｙｎキナーゼを阻害する作用剤はＬｙｎキナーゼを特異的に標的とするＲＮＡ干渉剤であり、生体内でのＬｙｎキナーゼの発現の阻害に使用することができる。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、選択的な分解のために標的ポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡを標的とする小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）二本鎖を使用し、選択された標的ポリペプチドの発現を阻害するための強力なアプローチである。遺伝子発現のｓｉＲＮＡ依存性の転写後サイレンシングにはｓｉＲＮＡによって導かれた部位で標的メッセンジャーＲＮＡ分子を切断することが関与する。「ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）」は本明細書で使用されるとき、標的遺伝子と同一であるまたは高度に類似する配列のＲＮＡの発現または導入がその標的遺伝子から転写されるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の配列特異的な分解または特異的な転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）を生じ（Ｃｏｂｕｒｎ，Ｇ．及びＣｕｌｌｅｎ，Ｂ．（２００２），Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７６（１８）：９２２５を参照のこと）、それによって標的遺伝子の発現を阻害する進化上保存された過程を指す。一部の実施形態では、ＲＮＡ干渉剤またはｓｉＲＮＡは二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である。この過程は植物、無脊椎動物及び哺乳類の細胞で記載されている。自然界では、ＲＮＡｉはｄｓＲＮＡに特異的なエンドヌクレアーゼ、Ｄｉｃｅｒによって開始され、それは長いｄｓＲＮＡのｓｉＲＮＡと呼ばれる二本鎖断片への順次切断を促進する。ｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡを認識し、切断するタンパク質複合体（「ＲＮＡ誘導のサイレンシング複合体」または「ＲＩＳＣ」と呼ばれる）に組み込まれる。ＲＮＡｉは核酸分子、たとえば、合成ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡ干渉剤を導入することによっても開始され、標的遺伝子（たとえば、Ｌｙｎキナーゼをコードする遺伝子）の発現を阻害するまたはサイレンシングすることができる。本明細書で使用されるとき、「標的遺伝子発現の阻害」には、ＲＮＡ干渉が誘導されていない状況と比べて、標的遺伝子（たとえば、Ｌｙｎキナーゼをコードする遺伝子）または標的遺伝子によってコードされるタンパク質（たとえば、Ｌｙｎキナーゼ）の発現またはタンパク質活性またはレベルの低下が含まれる。低下は、ＲＮＡ干渉剤によって標的とされていない標的遺伝子の発現または標的遺伝子によってコードされるタンパク質の活性もしくはレベルに比べて、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％以上であろう。
【００６２】
本明細書で使用されるとき、ｓｉＲＮＡには小分子ヘアピン（ステムループとも呼ばれる）ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）も含まれる。一部の実施形態では、これらのｓｈＲＮＡは短い（たとえば、約１９〜約２５のヌクレオチド）アンチセンス鎖とそれに続く約５〜約９ヌクレオチドのヌクレオチドループ及び類似のセンス鎖で構成される。或いは、他の実施形態では、センス鎖がヌクレオチドループ構造に先行することができ、アンチセンス鎖が続くことができる。これらのｓｈＲＮＡは、プラスミド、レトロウイルス及びレンチウイルスに含有され、ｐｏｌＩＩＩＵ６プロモータまたは別のプロモータから発現させることができる（たとえば、その全体が参照によって本明細書に組み入れられるＳｔｅｗａｒｔら．（２００３）ＲＮＡ，Ａｐｒ；９（４）：４９３−５０１を参照のこと）。標的遺伝子またはＲＮＡ干渉剤の配列は細胞の遺伝子またはゲノム配列、たとえば、ヒトＬｙｎキナーゼのゲノム配列であることができる。ｓｉＲＮＡは標的遺伝子またはゲノム配列またはその断片、すなわち、Ｌｙｎキナーゼの遺伝子またはｍＲＮＡに対して実質的に相同であることができる。この文脈で使用されるとき、用語「相同性の」は、標的のＬｙｎキナーゼｍＲＮＡまたはその断片に対して実質的に同一であり、十分に相補性であり、または類似し、標的ＬｙｎキナーゼのＲＮＡ干渉を達成すると定義される。ネイティブのＲＮＡ分子に加えて、標的配列の発現を阻害するまたは妨害するのに好適なＲＮＡにはＲＮＡの誘導体及び類似体が含まれる。好ましくは、ｓｉＲＮＡはその標的と同一である。ｓｉＲＮＡは好ましくはたった１つの配列を標的とする。
【００６３】
ｓｉＲＮＡのようなＲＮＡ干渉剤のそれぞれは、たとえば、発現プロファイリングによる潜在的な的外れの効果についてスクリーニングすることができる。そのような方法は当業者に既知であり、たとえば、Ｊａｃｋｓｏｎら．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：６３５−６３７，２００３にて記載されている。発現プロファイリングに加えて、配列データベースにて類似の配列について可能性のある標的配列もスクリーニングして的外れの効果を有し得る可能性のある配列を特定することができる。たとえば、Ｊａｃｋｓｏｎら（同上）に従って、配列同一性の１５、または多分、１１もの少ない隣接ヌクレオチドが非標的転写物の直接サイレンシングを指向するのに十分である。従って、提案されたｓｉＲＮＡを先ずスクリーニングし、たとえば、ＢＬＡＳＴのような既知の配列比較法による配列同一性解析を用いて可能性のある的外れなサイレンシングを回避することができる。ｓｉＲＮＡ配列は、ｓｉＲＮＡのアンチセンス（ガイド）鎖のＲＩＳＣへの取り込みを最大化し、それによって分解のためにヒトＧＧＴｍＲＮＡを標的とするＲＩＳＣの能力を最大化するように選択される。このことは、アンチセンス鎖の５’末端にて結合の最低の自由エネルギーを有する配列について走査することによって達成することができる。さらに低い自由エネルギーは、ｓｉＲＮＡ二本鎖のアンチセンス鎖の５’末端の巻き戻しの向上をもたらし、それによって、アンチセンス鎖がＲＩＳＣによって取り込まれ、ヒトＬｙｎキナーゼｍＲＮＡの配列特異的切断を指向することを保証する。
【００６４】
ｓｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡのみを含有するそれらの分子に限定される必要はないが、たとえば、化学的の修飾されたヌクレオチド及び非ヌクレオチドをさらに包含し、リボース糖分子が別の糖分子または類似の機能を実施する分子に置換されている分子も含む。さらに、たとえば、ホスホロチオエート結合のような、ヌクレオチド残基間の非天然の結合を使用することができる。ＲＮＡ鎖はたとえば、蛍光色素分子のようなレポーター基の反応性官能基によって誘導体化され得る。特に有用な誘導体はＲＮＡ鎖の末端（単数）または末端（複数）、通常、センス鎖の３’末端で修飾される。たとえば、３’末端における２’−ヒドロキシルは種々の基によって容易に且つ選択的に誘導体化することができる。たとえば、２’Ｏ−アルキル化残基または２’−Ｏ−メチルリボシル誘導体及び２’−Ｏ−フルオロリボシル誘導体のような他の有用なＲＮＡ誘導体は、修飾された糖質部分を有するヌクレオチドを組み込む。ＲＮＡ塩基も修飾することができる。標的配列の発現を阻害するまたは妨害するのに有用な任意の修飾された塩基が使用されてもよい。たとえば、ハロゲン化塩基、たとえば、５−ブロモウラシル及び５−ヨードウラシルを組み込むことができる。塩基をアルキル化することもでき、たとえば、７−メチルグアノシンをグアノシン残基の代わりに組み込むことができる。阻害が上手く行く非天然の塩基も組み込むことができる。最も好まれるｓｉＲＮＡの修飾には、２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンまたはロックド核酸（ＬＡＮ）ヌクレオチド及びホスホジエステルもしくは種々の数のホスホロチオエート結合のいずれかを含有するＲＮＡ二本鎖が挙げられる。そのような修飾は当業者に既知であり、たとえば、Ｂｒａａｓｃｈら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４２：７９６７−７９７５，２００３にて記載されている。ｓｉＲＮＡ分子に対する有用な修飾のほとんどはアンチセンスオリゴヌクレオチド技術で確立された化学的性質を用いて導入することができる。好ましくはそのような修飾を除外して、好ましくは、修飾には、最小限２’−Ｏ−メチル修飾が関与する。修飾はまた、ｓｉＲＮＡの遊離の５’−ヒドロキシル基の修飾を好ましくは除外する。本明細書の実施例は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入されるｓｉＲＮＡ（カタログ番号Ｌ−００３１５３−００−００１０）を含む、ＬｙｎキナーゼｍＲＮＡを効果的に標的とするＲＮＡ干渉剤の特定の例と、Ｌｙｎキナーゼ阻害活性を調べるためのアッセイとを提供する。
【００６５】
一部の実施形態では、Ｌｙｎキナーゼを標的とするＲＮＡ干渉剤は薬学上許容されるキャリアにて送達されるまたは投与される。たとえば、リポソームのような追加のキャリア剤を薬学上許容されるキャリアに加えることができる。別の実施形態では、ＲＮＡ干渉剤は、薬学上許容されるキャリアにて小分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードするベクターによって個体の臓器における細胞に送達される。ｓｈＲＮＡは転写の後、細胞によってＬｙｎキナーゼを標的とすることが可能なｓｉＲＮＡに変換される。
【００６６】
一部の実施形態では、ベクターはテトラサイクリン誘導性のベクターのように調節することができるものである。たとえば、ｐＴｅｔ−Ｏｎベクターを用いたＷａｎｇら．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１００：５１０３−５１０６（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）にて記載された方法を使用することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載されている方法で使用されるＲＮＡ干渉剤は、ベクターを使用することなく、静脈内注射、たとえば、水圧注入に続いて生体内で細胞に能動的の取り込まれるということは、ＲＮＡ干渉剤の効率的な生体内送達を説明している。ｓｉＲＮＡを送達する方法の１つは、標的臓器の血液供給血管へのカテーテル挿入である。たとえば、ベクター、たとえば、プラスミドベクターまたはウイルスベクター、たとえば、レンチウイルスベクターによる送達のような本明細書に記載されている方法で使用されるＲＮＡ干渉剤、たとえば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの送達についての他の戦略を採用することもできる。そのようなベクターは、たとえば、Ｘｉａｏ−Ｆｅｎｇ  Ｑｉｎら．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１００：１８３−１８８にて記載されたように使用することができる。他の送達方法には、ＲＮＡ干渉剤を塩基性ペプチド、たとえば、ＴＡＴペプチドの断片と抱合するまたは混合する、カチオン性脂質と混合するまたは粒子に製剤化することによって塩基性ペプチドを用いて、ＲＮＡ干渉剤、たとえば、本明細書に記載されているＬｙｎキナーゼを標的とするｓｉＲＮＡを送達することが挙げられる。ＲＮＡ干渉剤、たとえば、ＬｙｎキナーゼｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡは単独で送達することができ、または他のＲＮＡ干渉剤、たとえば、ｓｉＲＮＡ、たとえば、他の細胞性遺伝子に向けられたｓｉＲＮＡとの組み合わせで送達することができる。
【００６７】
ｓｈＲＮＡ分子を含む合成ｓｉＲＮＡ分子は、当業者に既知の多数の技法を用いて生成することができる。たとえば、ｓｉＲＮＡ分子は、当該技術で既知の方法を用いて、たとえば、適当に保護されたリボヌクレオシドホスホロアミダイト及び従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を用いて化学的に合成することができ、または組換えで製造することができる（たとえば、Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．ら．（２００１），Ｎａｔｕｒｅ，４１１：４９４−４９８；Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．，Ｗ．Ｌｅｎｄｅｃｋｅｌ及びＴ．Ｔｕｓｃｈｌ（２００１），Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１５：１８８−２００；Ｈａｒｂｏｒｔｈ，Ｊ．ら．（２００１），Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１１４：４５５７−４５６５；Ｍａｓｔｅｒｓ，Ｊ．Ｒ．ら．（２００１），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９８：８０１２−８０１７；ならびにＴｕｓｃｈｌ，Ｔ．ら（１９９９），Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３：３１９１−３１９７を参照のこと）。或いは、Ｐｒｏｌｉｇｏ（ドイツ、Ｈａｍｂｕｒｇ）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（米国、Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（米国、Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅの一部、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（米国、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（Ａｓｈｌａｎｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）、及びＣｒｕａｃｈｅｍ（英国、Ｇｌａｓｇｏｗ）を含むが、これらに限定されない幾つかの市販のＲＮＡ合成供給業者が利用可能である。そのようなものとして、ｓｉＲＮＡ分子は合成するのに過度に困難ではなく、ＲＮＡｉに好適な品質で容易に提供される。加えて、ｄｓＲＮＡはプラスミドベクター、レトロウイルス及びレンチウイルスによってコードされるステムループ構造として発現させることができる（Ｐａｄｄｉｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．ら．（２００２），Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１６：９４８−９５８；ＭｃＭａｎｕｓ，Ｍ．Ｔ．ら．（２００２），ＲＮＡ，８：８４２−８５０；Ｐａｕｌ，Ｃ．Ｐ．ら．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５０５−５０８；Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ，Ｍ．ら．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４９７−５００；Ｓｕｉ，Ｇ．ら．（２００２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９９：５５１５−５５２０；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，Ｔ．ら．（２００２），Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，２：２４３；Ｌｅｅ，Ｎ．Ｓ．，ら．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５００−５０５；Ｙｕ，Ｊ．Ｙ．，ら．（２００２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９９：６０４７−６０５２；Ｚｅｎｇ，Ｙ．，ら．（２００２），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，９：１３２７−１３３３；Ｒｕｂｉｎｓｏｎ，Ｄ．Ａ．，ら．（２００３），Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３３：４０１−４０６；Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｓ．Ａ．，ら．（２００３），ＲＮＡ，９：４９３−５０１）。これらのベクターは一般にｄｓＲＮＡの上流にｐｏｌＩＩＩプロモータを有し、センス及びアンチセンスのＲＮＡ鎖を別々に及び／またはヘアピン構造として発現することができる。細胞内では、Ｄｉｃ��ｒが短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を有効なｓｉＲＮＡに処理する。
【００６８】
本明細書に記載されている組成物及び方法で使用するためのｓｉＲＮＡの標的とされる領域は、所与の標的遺伝子配列、たとえば、開始コドンの下流の約２５ヌクレオチドから開始して５０ヌクレオチドまで、約５０〜７５ヌクレオチドまで、または約７５〜１００ヌクレオチドまでのＬｙｎキナーゼのコーディング配列から選択することができる。ヌクレオチド配列は５’または３’ＵＴＲ及び開始コドンの近傍の領域を含有することができる。本明細書に記載されている組成物及び方法で使用するためのｓｉＲＮＡ分子を設計する方法の１つには、２３ヌクレオチドの配列モチーフＡＡ（Ｎ１９）ＴＴ（Ｎは任意のヌクレオチドであることができる）を特定することと、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％または７５％のＧ／Ｃ含量のヒットを選択することとが関与する。配列の「ＴＴ」部分は任意である。或いは、そのような配列が見つからなければ、Ｎが任意のヌクレオチドであることができるモチーフＮＡ（Ｎ２１）を用いて検索を拡大することができる。この状況では、センスｓｉＲＮＡの３’末端をＴＴに変換してセンス及びアンチセンスの３’オーバーハングの配列組成に関して対称な二本鎖の生成を可能にする。次いで２３ヌクレオチドの配列モチーフのヌクレオチド位置１〜２１に対する相補体としてアンチセンスｓｉＲＮＡ分子を合成することができる。対称の３’ＴＴオーバーハングの使用は、小分子干渉リボ核タンパク質粒子（ｓｉＲＮＰ）がほぼ同等の比のセンスとアンチセンスの標的ＲＮＡを切断するｓｉＲＮＰで形成されるのを保証することに有利であり得る（Ｅｌｂａｓｈｉｒら，（２００１）、上記及びＥｌｂａｓｈｉｒら，２００１、上記）。ＮＣＢＩ、ＢＬＡＳＴ、Ｄｅｒｗｅｎｔ及びＧｅｎＳｅｑと同様にたとえば、ＯＬＩＧＯＥＮＧＩＮＥ（登録商標）のような市販のオリゴ合成会社を含むが、これらに限定されない配列データベースの解析も用いて、ＥＳＴライブラリに対するｓｉＲＮＡを選択してたった１つの遺伝子が標的とされることを保証することができる。
【００６９】
ＲＮＡ干渉剤の送達
取り込みのために標的細胞に、たとえば、星細胞または他の所望の標的細胞にＲＮＡ干渉剤、たとえば、ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡ干渉剤を含有するベクターを送達する方法には、ＲＮＡ干渉剤、たとえば、Ｌｙｎキナーゼを標的とするｓｉＲＮＡを含有する組成物の注射、または細胞に、たとえば、星細胞をＲＮＡ干渉剤、たとえば、Ｌｙｎキナーゼを標的とするｓｉＲＮＡを含有する組成物に直接接触させることが挙げられる。他の実施形態では、たとえば、水圧注入またはカテーテル挿入を介して、ＲＮＡ干渉剤、たとえば、Ｌｙｎキナーゼを標的とするｓｉＲＮＡを含有する組成物を血管、たとえば、静脈、動脈、小静脈または小動脈に直接注射することができる。投与は単回注射または２回以上の注射によることができる。ＲＮＡ干渉剤は薬学上許容されるキャリアにて送達される。１以上のＲＮＡ干渉剤を同時に使用することができる。一部の好まれる実施形態では、ヒトＬｙｎキナーゼを標的とするたった１つのｓｉＲＮＡが使用される。
【００７０】
一部の実施形態では、ＲＮＡ干渉によって特定の細胞が標的とされ、ＲＮＡ干渉の非特異的標的指向が原因で生じるＲＮＡ干渉の副作用の可能性を制限する。方法は、たとえば、細胞を標的指向する部分とＲＮＡ干渉を細胞に効果的に送達するのに使用されるＲＮＡ干渉結合部分とを含む複合体分子または融合分子を使用することができる。たとえば、抗体−プロタミン融合タンパク質はｓｉＲＮＡと混合するとｓｉＲＮＡを結合し、抗体によって認識される抗原を発現している細胞にｓｉＲＮＡを選択的に送達し、抗原を発現している細胞においてのみ遺伝子発現のサイレンシングを生じる。ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡ干渉を誘導する分子を結合させる部分は、タンパク質またはタンパク質の核酸結合のドメインまたは断片であり、結合部分は標的指向部分の一部に融合される。標的指向部分の位置は、構築物のカルボキシ末端もしくはアミノ末端または融合タンパク質の中間部のいずれかであることができる。Ｘｉａ，Ｈら（２００２），Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０（１０）：１００６によって記載されたように、ウイルスが介在する送達メカニズムを用いて試験管内及び生体内でｓｉＲＮＡを細胞に送達することもできる。Ｒｕｂｉｎｓｏｎ，Ｄ．Ａ．ら．（２００３），Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３３：４０１−４０６）及びＳｔｅｗａｒｔ，Ｓ．Ａ．，ら．（２００３），ＲＮＡ，９：４９３−５０１）にて記載されたように、ｓｈＲＮＡのプラスミドまたはウイルスが介在する送達メカニズムを用いて試験管内または生体内でｓｈＲＮＡを細胞に送達することもできる。以下の活性：細胞、たとえば、星細胞または他の細胞によるＲＮＡ干渉剤、たとえば、ｓｉＲＮＡの取り込みを高めること；一本鎖のアニーリングを阻害すること；一本鎖を安定させること；またはさもなければ標的細胞への送達を促進し、標的Ｌｙｎキナーゼの阻害を高めることの１以上を行う成分と共にＬｙｎキナーゼを標的とするＲＮＡ干渉剤、たとえば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを導入することができる。特定のＲＮＡ干渉剤の用量は、ＲＮＡ干渉、たとえば、特定の標的遺伝子の翻訳後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）を達成し、それによって標的遺伝子発現の阻害または標的遺伝子によってコードされるタンパク質の活性もしくはレベルの阻害をもたらすのに必要な量であろう。
【００７１】
種々の実施形態では、本明細書に記載されている方法と共に使用するためのＬｙｎキナーゼを阻害する作用剤またはＬｙｎキナーゼ阻害剤を含む組成物は対象が病状を発症する前に、発症している最中にまたは発症した後に対象に投与される。一部の実施形態では、組成物は１日あたり１〜３回または１週間あたり１〜７回対象に投与される。一部の実施形態では、組成物は１〜５日間、１〜５週間、１〜５カ月間、または１〜５年間、対象に投与される。種々の実施形態では、病状は、線維症、慢性炎症、慢性膵炎、癌または炎症性筋線維芽細胞性腫瘍（ＩＭＴ）である。一部の実施形態では、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤はＬｙｎキナーゼに特異的なｓｉＲＮＡまたはバフェチニブである。
【００７２】
種々の実施形態では、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤は静脈内に、筋肉内に、腹腔内に、経口でまたは吸入を介して投与される。
【００７３】
種々の実施形態では、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤の有効量は、約０．０１〜０．０５μｇ／ｋｇ／日、０．０５〜０．１μｇ／ｋｇ／日、０．１〜０．５μｇ／ｋｇ／日、０．５〜５μｇ／ｋｇ／日、５〜１０μｇ／ｋｇ／日、１０〜２０μｇ／ｋｇ／日、２０〜５０μｇ／ｋｇ／日、５０〜１００μｇ／ｋｇ／日、１００〜１５０μｇ／ｋｇ／日、１５０〜２００μｇ／ｋｇ／日、２００〜２５０μｇ／ｋｇ／日、２５０〜３００μｇ／ｋｇ／日、３００〜３５０μｇ／ｋｇ／日、３５０〜４００μｇ／ｋｇ／日、４００〜５００μｇ／ｋｇ／日、５００〜６００μｇ／ｋｇ／日、６００〜７００μｇ／ｋｇ／日、７００〜８００μｇ／ｋｇ／日、８００〜９００μｇ／ｋｇ／日、９００〜１０００μｇ／ｋｇ／日、０．０１〜０．０５ｍｇ／ｋｇ／日、０．０５〜０．１ｍｇ／ｋｇ／日、０．１〜０．５ｍｇ／ｋｇ／日、０．５〜１ｍｇ／ｋｇ／日、１〜５ｍｇ／ｋｇ／日、５〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、１０〜１５ｍｇ／ｋｇ／日、１５〜２０ｍｇ／ｋｇ／日、２０〜５０ｍｇ／ｋｇ／日、５０〜１００ｍｇ／ｋｇ／日、１００〜２００ｍｇ／ｋｇ／日、２００〜３００ｍｇ／ｋｇ／日、３００〜４００ｍｇ／ｋｇ／日、４００〜５００ｍｇ／ｋｇ／日、５００〜６００ｍｇ／ｋｇ／日、６００〜７００ｍｇ／ｋｇ／日、７００〜８００ｍｇ／ｋｇ／日、８００〜９００ｍｇ／ｋｇ／日、９００〜１０００ｍｇ／ｋｇ／日またはそれらの組み合わせの任意の１以上である。Ｌｙｎキナーゼ阻害剤の有効量の典型的な投与量は、既知の治療用化合物が使用される製造元によって推奨される範囲内、及び試験管内の応答または動物モデルにおける応答によって技量のある熟練者に指示されるような範囲内であることができる。そのような投与量は通常、関連する生物活性を失うことなく、濃度または量にておよそ一桁分まで減らすことができる。実際の投与量は、内科医の判断、患者の状態、及びたとえば、生検した悪性腫瘍のような関連する培養された細胞もしくは組織培養した組織の試験管内での応答性、または適当な動物モデルで認められた応答に基づいた治療法の有効性に左右され得る。種々の実施形態では、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤を含む本発明の組成物は、有効量のＬｙｎキナーゼ阻害剤を対象に投与するように、１日１回（ＳＩＤ／ＱＤ）、１日２回（ＢＩＤ）、１日３回（ＴＩＤ）、１日４回（ＱＩＤ）またはそれ以上投与されてもよく、その際、有効量は本明細書に記載されている用量の任意の１以上である。
【００７４】
種々の実施形態では、対象はヒト、非ヒト霊長類、サル、類人猿、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、マウス及びラットから成る群から選択される。
【００７５】
医薬組成物
種々の実施形態では、本発明は、治療上有効な量のバフェチニブのようなＬｙｎキナーゼ阻害剤、Ｌｙｎキナーゼ特異的なｓｉＲＮＡまたはそれらの組み合わせと共に薬学上許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。種々の実施形態では、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤は、小分子、ペプチド、タンパク質、アプタマー、抗体もしくはその断片、核酸分子またはＬｙｎキナーゼとＣＸＣＲ４に特異的な結合部位を含む二重特異性ポリペプチド剤である。
【００７６】
「薬学上許容される賦形剤」は、一般に安全で、非毒性であり、且つ望ましい医薬組成物を調製するのに有用である賦形剤であり、ヒト医薬品用途と同様に動物医薬品用途について許容される賦形剤が含まれる。そのような賦形剤は固形、液状、半固形であってもよく、またはエアロゾル組成物の場合、気体であってもよい。
【００７７】
種々の実施形態では、本発明に係る医薬組成物は任意の投与経路を介した送達のために製剤化されてもよい。「投与の経路」は、エアロゾル、鼻内、経口、経皮、非経口または経腸を含むが、これらに限定されない、当該技術で既知の投与の経路を指してもよい。「非経口」は、眼窩内、点滴、動脈内、関節包内、心臓内、皮内、筋肉内、腹腔内、肺内、脊髄内、胸骨内、髄腔内、子宮内、静脈内、クモ膜下、被膜下、皮下、経粘膜または経気管への注射を含む注射に一般に関連する投与の経路を指す。非経口の経路を介して、組成物は、点滴用または注射用の溶液または懸濁液の形態であってもよく、または凍結乾燥した粉末としての形態であってもよい。非経口の経路を介して、組成物は、点滴用または注射用の溶液または懸濁液の形態であってもよい。経腸の経路を介して、医薬組成物は錠剤、ゲルカプセル剤、糖衣錠、シロップ、懸濁液、溶液、粉末、顆粒、エマルション、ミクロスフェア、またはナノスフェア、または制御放出を可能にする脂質小胞もしくはポリマー小胞の形態であることができる。
【００７８】
本発明に係る医薬組成物はまた薬学上許容されるキャリアも含有することができる。「薬学上許容されるキャリア」は本明細書で使用されるとき、１つの組織、臓器または身体の一部から別の組織、臓器または身体の一部に関心対象の化合物を運ぶまたは輸送する際に必要とされる、薬学上許容される物質、組成物またはビヒクルを指す。たとえば、キャリアは液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、または被包材またはそれらの組み合わせであってもよい。キャリアの各成分は製剤の他の成分と相溶性でなければならないという点で「薬学上許容され」なければならない。それはまた、それが接触してもよい組織または臓器への接触で使用するのにも好適でなければならないということは、それが毒性、刺激、アレルギー反応、免疫原性のリスク、またはその治療利益を過度に上回る他の合併症を運んではならないことを意味する。
【００７９】
本発明に係る医薬組成物はまた、経口投与用のエマルションまたはシロップにてカプセル化され、打錠され、または調製されてもよい。薬学上許容される固体または液体のキャリアが添加されて組成物を向上させもしくは安定化させ、または組成物の調製を円滑にしてもよい。液体キャリアには、シロップ、ピーナッツ油、オリーブ油、グリセリン、生理食塩水、アルコール類及び水が挙げられる。固体のキャリアには、デンプン、ラクトース、硫酸カルシウム、二水和物、白土、ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸、タルク、ペクチン、アカシアゴム、寒天またはゼラチンが挙げられる。キャリアにはまた、たとえば、単独でのまたはワックスを伴ったモノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルのような持続放出材料も含んでもよい。
【００８０】
医薬製剤は、錠剤形態については必要とあれば粉砕、混合、造粒及び圧縮を含み、または硬質ゼラチンカプセル剤の形態については粉砕、混合及び充填を含む調剤の従来の技法に従って作製される。液体キャリアを使用する場合、製剤はシロップ、エリキシル、エマルションまたは水性もしくは非水性の懸濁液の形態であるであろう。そのような液体製剤は、直接経口で、または軟質ゼラチンカプセル剤に充填して投与されてもよい。
【００８１】
本発明に係る医薬組成物は治療上有効な量で送達されてもよい。正確な治療上有効な量は、所与の対象における治療の有効性という点で最も効果的な成績が得られるであろう組成物のその量である。この量は、治療用化合物の特徴（活性、薬物動態、薬物力学、及び生体利用効率を含む）、対象の生理的状態（年齢、性別、疾患の種類及び段階、一般的な身体状態、所与の投与への応答性、ならびに薬物の種類）、製剤における薬学上許容されるキャリア（単数）またはキャリア（複数）の性質、及び投与の経路を含むが、これらに限定されない種々の因子に応じて変化するであろう。臨床及び薬理学の技術における当業者は、日常の実験を介して、たとえば、化合物の投与への対象の応答をモニターし、それに応じて投与量を調整することによって治療上有効な量を決定することができるであろう。追加の指針については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ｇｅｎｎａｒｏ編．第２０版，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  ＰＡ，ＵＳＡ）（２０００）を参照のこと。
【００８２】
種々の実施形態では、組成物は１日あたり１〜３回または１週間あたり１〜７回対象に投与される。種々の実施形態では、組成物は１〜５日間、１〜５週間、１〜５ヵ月間、または１〜５年間対象に投与される。
【００８３】
キット
本発明は、それを必要とする対象における癌及び／または線維化疾患の治療、癌及び／または線維化疾患の抑制、癌及び／または線維化疾患の軽減、または癌及び／または線維化疾患の予防の促進のためのキットも提供する。キットは、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤を含む組成物と、それを必要とする対象にて癌及び／または線維化疾患を治療する、抑制する及び／またはその重症度を軽減するのに組成物を使用するための指示書とを含む。一部の実施形態では、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤は、小分子、ペプチド、タンパク質、アプタマー、抗体もしくはその断片、核酸分子またはＬｙｎキナーゼとＣＸＣＲ４に特異的な結合部位を含む二重特異性ポリペプチド剤である。
【００８４】
キットは、本明細書に記載されている組成物の少なくとも１つを含む材料または成分の集合体である。従って、一部の実施形態では、キットはＬｙｎキナーゼ阻害剤を含む組成物を含有し、その際、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤は、本明細書に記載されているようなＬｙｎキナーゼに特異的なｓｉＲＮＡ分子またはバフェチニブである。
【００８５】
本発明のキットにて構成される成分の正確な性質はその意図される目的に左右される。一実施形態では、キットは特にヒト対象について構成される。さらなる実施形態では、キットは、動物適用のために、たとえば、家畜動物、家畜類及び実験動物のような、しかし、これらに限定されない対象を治療することについて構成される。
【００８６】
使用のための指示書がキットに含まれてもよい。「使用のための指示書」には通常、所望の転帰を達成する、たとえば、対象にて癌及び／または線維化疾患を治療する、その重症度を軽減する、癌及び／または線維化疾患を抑制するまたは予防するためにキットの成分を使用することにおいて採用される技法を記載する具体的な表現が含まれる。任意で、キットはまた、たとえば、測定ツール、希釈剤、緩衝液、薬学上許容されるキャリア、注射器、または当業者によって容易に認識される他の有用な手回り品のような他の有用な成分も含有する。
【００８７】
キットにて組み立てられる材料または成分は施術者に提供され、その操作性及び有用性を保つ好都合な且つ好適な方法で保管され得る。たとえば、成分は溶解された形態、脱水された形態、または凍結乾燥の形態であることができ、それらは、室温、冷蔵温度または冷凍温度で提供することができる。成分は通常、好適な包装材に含有される。本明細書で採用されるとき、語句「包装材」は、たとえば、本発明の組成物等のようなキットの内容物を収納するのに使用される１以上の物理的構造体を指す。包装材は、周知の方法によって構築され、好ましくは、無菌の、混入のない環境を提供する。本明細書で使用されるとき、用語「包装」は、個々のキット成分を保持することができる、たとえば、ガラス、プラスチック、紙、ホイル等のような好適な固体の母材または材料を指す。従って、包装は、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤を含有する本発明の組成物の好適な量を含有するのに使用されるビンであることができる。包装材は一般にキットの内容及び／または目的及び／またはその成分を示す外部ラベルを有する。
【００８８】
スクリーニング法
本明細書で提供されるのはまた、Ｌｙｎキナーゼの阻害剤を特定する方法である。該方法は、Ｌｙｎキナーゼ陽性細胞内のＬｙｎキナーゼを関心対象の分子に接触させることと、接触が、活性化された星細胞または筋線維芽細胞の移動の減少をもたらすかどうかを判定することとを含み、星細胞の移動の減少または筋線維芽細胞の減少は関心対象の分子がＬｙｎキナーゼ阻害剤であることを示す。別の実施形態では、合成されるＬｙｎキナーゼの量の低下が、の対象関心分子はＬｙｎキナーゼの阻害剤であることを示す。さらなる実施形態では、Ｌｙｎキナーゼをコードする核酸（たとえば、ｍＲＮＡ）の量の低下が関心対象の分子はＬｙｎキナーゼの阻害剤であることを示す。一部の実施形態では、阻害剤はＬｙｎキナーゼのチロシンキナーゼ活性を阻害する。一部の実施形態では、阻害剤はＬｙｎキナーゼの合成を減らすまたは阻害する。例となる実施形態では、活性化された星細胞は活性化された膵臓星細胞である。
【００８９】
種々の実施形態では、Ｌｙｎキナーゼ阻害剤は、小分子、ペプチド、抗体またはその断片、ＬｙｎキナーゼとＣＸＣＲ４に特異的な抗原結合部位を有する二重特異性抗体及び核酸分子から成る群から選択される。一部の実施形態では、スクリーニング法は調べられる複数の試料のそれぞれを別々に接触させることを含む。一部の実施形態では、複数の試料は約１０４個を超える試料を含む。一部の実施形態では、複数の試料は約５×１０４個を超える試料を含む。一部の実施形態では、星細胞は活性化された星細胞である。一部の実施形態では、活性化された星細胞は慢性膵炎の患者から得られる。一部の実施形態では、活性化された星細胞は膵臓癌の患者から得られる。一部の実施形態では、線維化疾患のヒト組織から得られる筋線維芽細胞が使用される。一部の実施形態では、筋線維芽細胞はヒト癌から得られる。
【００９０】
Ｌｙｎキナーゼを阻害する関心対象の化合物は、小分子、ペプチド、タンパク質、アプタマー、抗体もしくはその断片、核酸分子、ＬｙｎキナーゼとＣＸＣＲ４に特異的な結合部位を含む二重特異性ポリペプチド剤の任意の１以上であってもよい。
【００９１】
Ｌｙｎキナーゼを阻害する化合物を特定するのに採用されてもよいアッセイには、マイクロアレイアッセイ、定量ＰＣＲ、ノーザンブロットアッセイ、サザンブロットアッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、免疫組織化学アッセイ、結合アッセイ、ゲル遅延アッセイ、または酵母２ハイブリッド系を用いたアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。当業者は当該技術で既知の多数の技法を容易に採用して特定の作用剤がＬｙｎキナーゼを阻害するかどうかを判定することができる。
【００９２】
一部の実施形態では、スクリーニング法は調べられる複数の試料のそれぞれを別々に接触させることを含む。一部の実施形態では、複数の試料は約１０４個を超える試料を含む。一部の実施形態では、複数の試料は約５×１０４個を超える試料を含む。一部の実施形態では、星細胞は活性化された星細胞である。一部の実施形態では、活性化された星細胞は慢性膵炎の患者から得られる。
【実施例】
【００９３】
実施例１
ヒト膵臓の星細胞
新しく採取した膵臓組織または新しく単離した初代培養のヒト星細胞を用いてヒト星細胞を調べた。ロスアンゼルスのＣｅｄａｒｓ−Ｓｉｎａｉメディカルセンター及びシアトルのワシントン大学の施設内倫理委員会によって認可された指針を用いて、手術の膵臓試料は、１０人の慢性膵炎患者または膵臓疾患ではないドナーから得た。
【００９４】
ヒト膵臓組織からの星細胞の単離
ラットの膵臓組織についてＡｐｔｅら（Ａｐｔｅ，ＭＶ．ら．Ｇｕｔ．，４３，１２８−１３３  （１９９８）によって詳細に記載されたのと同じ方法を用いて、星細胞をヒト膵臓組織から単離し（プロナーゼ、コラゲナーゼ及びＤＮＡ分解酵素による組織消化法を用いることによって）、特定し、培養で増やした。我々の実験では、我々は、早期継代細胞を用い、初代細胞における長い培養の潜在的な影響を出来るだけ抑えた。慢性膵炎細胞または正常細胞の継代数は１〜３の範囲であり、実験の各セットの間、継代数は慢性膵炎細胞及び正常細胞について常に同一だった。
【００９５】
培養２４時間で、少なくとも９５％の細胞はウェルに接着し、細胞質に目立つ液滴を伴った星状で角のある外観を呈した。この特定の方法に従って、休眠中の星細胞におけるビタミンＡ自己蛍光及び活性化星細胞（筋線維芽細胞）におけるα−ＳＭＡによって評価したとき、調製物の純度は最終的に約１００％（組織培養のわずかな継代で）だった。
【００９６】
ヒト膵臓組織における免疫蛍光法（形態的及び統計的な解析を含む）
改変を伴った間接免疫蛍光の方法（Ｃｉｒｕｌｌｉ，Ｖ．ら．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１５０，１４４５−１４５９（２０００）；Ｙｅｂｒａ，Ｍ．ら．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ，５，６９５−７０７（２００３）；Ｄｉａｆｅｒｉａ，ＧＲ．ら．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１４０，３３６０−３３７２（２０１３））に従って、膵炎の症例及び正常な膵臓から得た膵臓組織検体にてＣＸＣＲ４及びα−ＳＭＡの免疫局在化を行った。手短には、脱パラフィン、その後の抗原回復、グリシンによるアルデヒド残基のブロック、及び一次抗体との一晩のインキュベートの標準手順を用いてパラフィン切片にて２色及び３色の免疫蛍光法を実施した。使用した一次抗体は、ウサギ抗−ＣＸＣＲ４（カタログ番号ａｂ２０７４、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、マウス抗−ＣＸＣＲ４（カタログ番号ａｂ５８１７６、Ａｂｃａｍ）、マウス抗−α−ＳＭＡ（カタログ番号Ａ２５４７、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）だった。一次抗体の反応後、切片を種特異性蛍光色素分子で標識したＦ（ａｂ）２二次抗体ＬＲＳＣ−ロバ抗ウサギ及びＦＩＴＣ−ロバ抗マウス（カタログ番号ａｂ１５０１０３，Ａｂｃａｍ）で負荷した。染色後、ＤＡＰＩ標本作製培地によって切片を標本にし、核を視覚化し、ＣｏｏｌＳＮＡＰ−ＨＱ２  ＣＣＤカメラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ）を搭載したＮＩＫＯＮ  Ｅｃｌｉｐｓｅ９０ｉ顕微鏡で解析した。ＮＩＳエレメント３．２２ソフトウエア（Ｎｉｋｏｎ）を用いて、膵炎の症例及び正常な膵臓から採取された組織試料当たり少なくとも３０切片で拡大形態解析を行った。まとめると、形態的解析は、合計１８０の組織切片から回収された組織群（すなわち、膵炎または正常な膵臓）当たり１５０の画像で行った。次いで染色された切片をＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ９０ｉで検分し、Ｎｉｋｏｎ  Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓソフトウエア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）を用いて形態学的な測定を行った。統計。データ値における差の統計的な有意性は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）とその後のＰｒｉｓｍ−４統計パッケージ（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄソフトウエア，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いたボンフェローニの多重比較検定によってまたはスチューデントの両側ｔ検定によって検証し、有意性限界はｐ＜０．０５に設定した。
【００９７】
免疫複合体キナーゼアッセイ
予備的なｑＰＣＲ実験は、Ｓｒｃファミリーのたった２つのメンバー、Ｓｒｃ及びＬｙｎしか正常な膵臓星細胞及びＣＰのヒト膵臓星細胞では実質的に発現されていないことを明らかにした。従って、我々は、ＳｒｃとＬｙｎの免疫沈降物（Ｐｔａｓｚｎｉｋ，Ａ．ら．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，１９９６９−１９９７３（１９９５））で試験管内でキナーゼアッセイを行い、自己リン酸化（それ自体によるキナーゼのリン酸化はその活性化状態を持続させ、酵素活性の上昇をもたらす）を測定した。免疫沈降。ＣＰまたは健常対象の星細胞のアリコートを細胞数について基準化し（３．５ｍｌｎ／アッセイ）、１×ＰＢＳで洗浄し、記載されたようなプロテアーゼ阻害剤混合物で補完された氷冷溶解緩衝液（２％ＮＰ−４０、１０ｍＭのＴｒｉｓ、５０ｍＭのＮａＣｌ、３０ｍＭのピロリン酸ナトリウム、５０ｍＭのＮａＦ）にて溶解した。細胞溶解物全体のタンパク質濃度はＢＣＡタンパク質アッセイによって決定した。免疫沈降については、等量の細胞溶解物を４℃にて５μｇのＬｙｎまたはＳｒｃのＡｂと４時間インキュベートし、その後、３０μＬのパンソルビンビーズと共に２時間インキュベートした。Ｌｙｎ、Ｓｒｃ、α−ＳＭＡ、ＣＸＣＲ４及びＧＡＰＤＨの発現の免疫ブロット解析は、上述のように生成された免疫沈降物で実施し、または３０μｇのタンパク質を含有する細胞融解物で直接実施した。キナーゼアッセイ。Ｌｙｎ及びＳｒｃの免疫沈降物を溶解緩衝液（上記参照）で２回洗浄し、１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．１）、１００ｍＭのＮａＣｌ及び１００μＭのオルソバナジウム酸ナトリウムを含有する緩衝液で１回洗浄した。ＬｙｎまたはＳｒｃの免疫沈降物を３０μＬのキナーゼ反応混合物（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．１］、１０ｍＭのＭｎＣｌ２、１０μＣｉ［３２Ｐ−γ］−ＡＴＰ，１μＭの未標識ＡＴＰ）に再懸濁することによってキナーゼアッセイを実施した。キナーゼ反応は２０℃で２分間行い、次いで３０μＬのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ゲル負荷緩衝液の添加と煮沸によって反応を止め、８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解し、オートラジオグラフィによって視覚化した。
【００９８】
ｓｉＲＮＡ
Ｐｔａｓｚｎｉｋ，Ａ．ら．ＮａｔＭｅｄ．１０，１１８７−１１９（２００４）にて記載されたように、１つのプールにて組み合わせたヒトＬｙｎを標的とする４つの小分子干渉ｓｉＲＮＡ及び４つの標的としないｓｉＲＮＡ（対照）（それぞれ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログ番号Ｌ−００３１５３−００−００１０及びＤ−００１２１０−０１−２０）を調製し、−２０℃にてアリコートで凍結保存した。エレクトロポレーション前の初代線維芽細胞様星細胞の調製、と同様にｓｉＲＮＡによるエレクトロポレーションは製造元の推奨（初代哺乳類線維芽細胞のためのＡｍａｘａ  ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ基本プロトコール及び初代細胞のためのＡｍａｘａ  ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ最適化プロトコール、オンラインを参照のこと）に従って行った。
【００９９】
ｓｉＲＮＡ、ＡＭＤ３１００及びＩＮＮＯ−４０６で処理した細胞におけるＳＤＦ−１によるトランスウェル移動アッセイ
ＳＤＦ−１αはＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社から入手し、ＡＭＤ３１００はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。ＩＮＮＯ−４０６はＣｅｌｌａｇｅｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）にて合成され、精製された。移動アッセイは、線維芽細胞様細胞の移動に最適である８μｍの孔サイズのポリカーボネート製の膜インサートを伴ったトランスウェル移動アッセイ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，ＮＹ，カタログ番号３４２２）を用いて実施した。星細胞をｓｉＲＮＡ（１００ｎＭ）で４８時間処理し、または漸増する濃度のＡＭＤ３１００（５μＭ〜５０μＭ）もしくはＩＮＮＯ−４０６（１０ｎＭ〜１００ｎＭ）で６０分間処理した。次いで下部チャンバーにおける２％ＦＢＳを伴ったＳＤＦ−１（０．０２５μＭ）の存在下または非存在下で細胞を移動用上部チャンバーに入れた。２時間のインキュベート後、下部チャンバーに移動した細胞を数え、走化性指標は以下のように決定した：
（ＳＤＦ−１ケモカインに向かって移動する細胞の数）／（培地のみで移動する細胞の数）
【０１００】
化学運動性に対して走化性を区別するために、対照チェッカーボード解析を行った。データは、誘引物質（ＳＤＦ−１）を下部チャンバーのみに加えた場合、最大数で細胞が移動することを示した（方向性を持った移動）。しかしながら、細胞（特に慢性膵炎の細胞−ｈＣＰ）は、確立された勾配の非存在下でＳＤＦ−１に応答して移動することも認められた（無作為移動の増加）。従って、我々は、走化性（ＳＤＦ−１ケモカインの勾配に向かう指向性の動き）及び化学運動性（ＳＤＦ−１ケモカインの存在が原因で生じる非指向性の動き）の双方が、正常な星細胞（ｈＮＰ）に比べて慢性膵炎の星細胞（ｈＣＰ）で有意に増加することを検出したが、慢性膵炎の星細胞における機能亢進性のＣＸＣＲ４／Ｌｙｎのシグナル伝達と矛盾しない（図１ａ、１ｅ、１ｆ）。結果的に、ＳＤＦ−１の非存在下では、慢性膵炎の星細胞と正常な星細胞との間で自然発生的な星細胞の移動には差異はなかった。
【０１０１】
生存率／増殖の測定
ｓｉＲＮＡまたはＡＭＤ３１００またはＩＮＮＯ−４０６で処理した細胞における星細胞の移動で見られた低下に意図されない細胞傷害性の効果が関与しないことを確信するために、これらの実験の経過の間に、トリパンブルー排除アッセイ及びＭＴＴアッセイによって対照の生存率測定を行った。我々の生存率測定の陽性対照として、我々は２４〜４８時間血清欠乏にした星細胞を用いた。我々は一貫して、慢性膵炎の患者（ｈＣＰ）から単離された星細胞が健常ドナー（ｈＮＰ）から単離された細胞よりも高い増殖／生存率を有し、Ｌｙｎ依存性の生存率はｈＮＰに比べてｈＣＰで増加することを観察した。慢性膵炎における星細胞蓄積の課題は平衡方程式であり、その際、
星細胞蓄積の速度＝星細胞増殖の速度−星細胞死の速度である。
【０１０２】
従って、我々はＭＴＴ生存率アッセイがこの特定の場合に使用するのに最も適すると考えている。
【０１０３】
マウスモデルにおける慢性膵炎が誘導する線維症に対するＩＮＮＯ−４０６の生体内での効果
今日まで、ヒトの膵炎が誘導する線維症に利用できる最適な動物モデルはない。しかしながら、ヒトの疾患を部分的に繰り返す慢性膵炎（ＣＰ）の最も一般に使用される実験モデルはセルレインのマウスへの反復注射である（Ｕｌｍａｓｏｖ，Ｂ．ら．Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１８３，６９２−７０８（２０１３））。Ｃ５７ＢＬ／６はこの種の生物医学研究で最も頻繁に使用されるマウスの系統である。我々の現在の実験では、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（２ヵ月齢のオス及びメス）を以下：（１）無処理のマウス（生理食塩水のみ）；（２）セルレインで６週間処理したマウス（１日構成の１処理で１時間当たり５０μｇ／ｋｇを６時間注入、週に２回）；（３）セルレイン（上記のような）に加えて１日あたり１２０ｍｇのＩＮＮＯ−４０６／ｋｇで６週間（経口強制投与）処理したマウス、のように３群（各群は１５匹の動物から成る）に分けた。１日あたり１２０ｍｇのＩＮＮＯ−４０６／ｋｇを経口でマウスに投与した場合、以前記載された薬物動態試験（Ｋｉｍｕｒａ，Ｓ．ら．Ｂｌｏｏｄ．，１０６，３９４８−３９５４（２００５）；Ｙｏｋｏｔａ，Ａ，ら．Ｂｌｏｏｄ，１０９，３０６−３１４（２００７））によれば、軟組織におけるＩＮＮＯ−４０６の濃度は０．２４μＭであると推定される。急性の炎症性変化の解消を可能にするために（線維症を明瞭に目に見え、検出可能にするために）、最終のセルレインとＩＮＮＯ−４０６の処理の５日後、マウスをすべて安楽死させた。
【０１０４】
マウスの膵臓の組織学的な定量的及び統計的解析
処理後、安楽死させたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの膵臓を氷上にて氷冷ＰＢＳで洗浄した。組織をＯＣＴコンパウンド（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ，Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）で包埋し、液体窒素を用いて急速に凍結した。切片を作製し、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔスライド（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で標本にするためにと同様にヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色するために凍結ブロックをＣｅｄａｒｓ−Ｓｉｎａｉ  Ｂｉｏｂａｎｋ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｅに提出した。ピクロシリウス赤染色については、凍結組織スライドの１セットを−２０℃に冷却したアセトンで１０分間固定し、３０分間室温で風乾した。スライドをＰＢＳで５分間水和し、ピクロシリウス赤溶液（ピクロシリウス赤染色キット，カタログ番号ａｂ１５０６８１，Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）で３０分間染色し、０．５％酢酸（キットで提供される）で２回洗浄した。標本媒体（Ａｃｒｙｍｏｕｎｔ，カタログ番号ＳＬ８０−４，ＳｔａｔＬａｂ，ＭｃＫｉｎｎｅｙ，ＴＸ）でカバーガラスを載せる前にスライドを無水エタノールによる３回の洗浄で脱水した。スライドはすべてデジタル処理でＡｐｅｒｉｏ  ＳｃａｎＳｃｏｐＡＴ  Ｔｕｒｂｏ（Ｌｅｉｃａ，Ｂｕｆａｌｏ  Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）にて２０×で走査し、Ｃｅｄａｒｓ−Ｓｉｎａｉ共焦点顕微鏡コア施設によるＣｅｄａｒｓ−Ｓｉｎａｉサーバーに保存した。ピクロシリウス赤の定量は、１０×拡大で領域当たりの陽性染色強度を測定するＬｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  Ｔｉｓｓｕｅ  ＩＡ  Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒウェブに基づくプログラムを用いて実施した。陽性に染色された領域は各スライドについてバックグランドのセットを上回る強度によって定義される。各スライドについて、６０の無作為な重複しない領域を選択し、調べた全領域（μｍ２）当たり陽性の染色領域（μｍ２）のパーセンテージとして平均した。ｐ＜０．０５の統計設定で無処理とセルレイン処理、無処理とセルレイン／ＩＮＮＯ−４０６処理、及びセルレイン処理とセルレイン／ＩＮＮＯ−４０６処理との間で両側ｔ検定を行った。
【０１０５】
実施例２
我々は先ず、ＣＰを伴うまたは伴わないドナーの膵臓から単離された星細胞にて既知のＳｒｃキナーゼの発現及び活性をスクリーニングした（図１）。ヒト膵臓組織から星細胞を単離した後、キナーゼアッセイはＬｙｎ及びＳｒｃの免疫沈降物で活性を示した。我々は、健常対象から単離した細胞に比べてＣＰから単離した細胞にてＬｙｎチロシンキナーゼ活性の約１１倍の上昇を検出した（図１Ａ）。重要なことに、我々は正常細胞に比べてＣＰの星細胞にてＳｒｃキナーゼ活性（Ｌｙｎに類似の構造及び機能のキナーゼ）の上昇を見いださなかった（図１Ｂ）。従って、ＣＰの星細胞におけるＬｙｎ活性の上昇は選択的であった。ウエスタンブロットによって判定されたようにＬｙｎタンパク質またはＳｒｃタンパク質のレベルに変化はなかった（図１Ｃ）。重要なことに、我々が記載した（Ｏｍａｒｙ，ＭＢ．ら．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１７，５０−５９（２００７））ような星細胞の活性化のマーカーであるα−ＳＭＡは、健常対象に由来するものに比べてＣＰの対象に由来する星細胞では上昇していた（図１Ｃ）。これらのデータは、上昇したＬｙｎキナーゼ活性はＣＰ患者における星細胞の活性化に関連することを示した。
【０１０６】
次に、我々は、培養した初代ヒト細胞及びヒト膵臓切片にてＣＰ患者及び健常対象から単離した星細胞におけるＣＸＣＲ４の発現を比較した。ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨに対して基準化した総タンパク質のウエスタンブロット解析は、ＣＰ患者から単離された星細胞及び健常対象から単離された星細胞にてＣＸＣＲ４の合計の（表面＋細胞内）細胞性発現に差異がないことを示した（図１Ｄ）。対照的に、フローサイトメトリー解析によって示されるように、表面ＣＸＣＲ４を発現している星細胞の平均比率は正常細胞に比べてＣＰで有意に増加していた（図１Ｅ）。我々の結果は膵臓実質に浸潤しているＣＸＣＲ４陽性の星細胞の数は正常の膵臓に比べてＣＰでは劇的に上昇することを示した。
【０１０７】
正常星細胞に対するＣＰ星細胞におけるＬｙｎの差次的キナーゼ活性（図１Ａ）は治療剤としてＬｙｎを選択することを支持している。我々は、ｓｉＲＮＡ（Ｐｔａｓｚｎｉｋ，Ａ．ら．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１０，１１８７−１１８９（２００４））を用いてそれぞれＣＰ患者由来の星細胞及び健常ドナー由来の星細胞にてＬｙｎの発現をサイレンシングした。細胞の処理の後、ウエスタンブロットはＬｙｎタンパク質の約８０〜９５％の減少を示した（図２Ａ）。重要なことに、我々は、類似の構造及びサイズの別のＳｒｃファミリーキナーゼであるＳｒｃに対して阻害効果を見いださなかった（図２Ａ）。従って、ｓｉＲＮＡによるＬｙｎの阻害は妥協がなく且つ選択的である。我々はまた、記載されているようなＬｙｎチロシンキナーゼ阻害剤ＩＮＮＯ−４０６（ＮＳ−１８７、バフェチニブ）を用いて星細胞にてＬｙｎを阻害するメカニズム上異なるアプローチも採用した。ＩＮＮＯ−４０６は、Ｓｒｃ及び幾つかの他のＳｒｃファミリーメンバーのリン酸化に影響を与えることなく臨床的に関連する濃度で有効なＬｙｎ阻害剤であることが判明した（Ｋｉｍｕｒａ，Ｓ．ら．Ｂｌｏｏｄ．，１０６，３９４８−３９５４（２００５））。
【０１０８】
次いで我々は、ＣＰ及び正常の星細胞のＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４が誘導する走化性反応を比較した。ＳＤＦ−１の勾配に向かった走化性指標の上昇がＣＰ及び正常の細胞の双方で観察され（図２Ｂ）、それはＳＤＦ−１受容体ＣＸＣＲ４の特異的なアンタゴニストであるＡＭＤ３１００による処理によって阻止することができた（図２Ｃ）。しかしながら、ＣＰ細胞は正常細胞に比べてＣＸＣＲ４が誘導する走化性の約３倍の上昇を示した（図２Ｂ）。ｓｉＲＮＡによるＬｙｎの選択的除去（図２Ａ）はＣＰ星細胞の走化性を効果的に阻害した（図２Ｄ）。我々はまたＩＮＮＯ−４０６による処理に続いて走化性の強力な阻害も観察した（図２Ｅ）。特に、Ｌｙｎ阻害剤（ｓｉＲＮＡまたはＩＮＮＯ−４０６）による走化性の阻害は、正常細胞よりもＣＰの星細胞ではるかに強力であるということは、差次的なＬｙｎキナーゼ活性（図１Ａ）に一致する。加えて、正常星細胞の増殖に影響を与えないままで、ＭＴＴアッセイで測定されたように、ｓｉＲＮＡによるＬｙｎの選択的除去（図２Ａ）は７２時間で（対照ｓｉＲＮＡと比べると）ＣＰ星細胞の増殖を効果的に阻害した（図２Ｆ）。一緒に、これらの知見は、Ｌｙｎが星細胞の走化性及び増殖の双方を刺激し（Ｌｙｎのこの機能は他の細胞系で以前確立された（Ｐｔａｓｚｎｉｋ，Ａ．ら．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９６，６６７−６７８（２００２）；Ｏ’Ｌａｕｇｈｌｉｎ−Ｂｒｕｎｎｅｒ，Ｂ．ら．Ｂｌｏｏｄ．９８，３４３−３５０（２００１））、Ｌｙｎが介在する走化性及び増殖はＣＰの星細胞にて上昇することを示したが、これはＣＰにおける機能亢進性のＬｙｎキナーゼと矛盾しない（図１Ａ）。
【０１０９】
ヒト初代星細胞による我々の知見は、ＣＸＣＲ４受容体及びＬｙｎの活性が健常対象と比べてＣＰの星細胞で差次的に発現され、正常星細胞の走化性及び増殖は軽く影響を受けるにすぎないままである一方で、Ｌｙｎの阻害は試験管内でのＣＰの初代星細胞の走化性及び増殖の強力な遮断をもたらすことを示すことによってＣＰ患者にてＣＸＣＲ４／Ｌｙｎを標的とすることを支持している。しかしながら、ＣＰを含む慢性の炎症では、多数のケモカイン受容体の１つの選択的な遮断が他の炎症性ケモカイン及びその受容体によって生体内で容易に迂回され得ることが知られている。従って、この種の治療は普通有効ではない。このことは、正常星細胞に比べてＣＰでは表面ＣＣＲ５（ＣＸＣＲ４に加えて）を発現する星細胞の平均比率が有意に上昇したために重要である。対照的に、Ｌｙｎは、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５及びｆＭＬＰの受容体を含む幾つかの重要な炎症誘発性の化学誘引物質受容体の共通した下流の標的なので、Ｌｙｎの阻害は生体内で迂回されそうにない（Ｐｔａｓｚｎｉｋ，Ａ．ら．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，１９９６９−１９９７３（１９９５）；Ｐｔａｓｚｎｉｋ，Ａ．ら．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９６，６６７−６７８（２００２）；Ｍａｌｉｋ，Ｍ．ら．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８１，４６３２−４６３７（２００８）；Ｔｏｍｋｏｗｉｃｚ，Ｂ．ら．Ｂｌｏｏｄ．１０８，１１４５−１１５０（２００６））。従って、Ｌｙｎの阻害は幾つかの受容体の走化性及び増殖性の作用を妨げる（Ｐｔａｓｚｎｉｋ，Ａ．らｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，１９９６９−１９９７３（１９９５）；Ｐｔａｓｚｎｉｋ，Ａ．ら．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９６，６６７−６７８（２００２）；Ｍａｌｉｋ，Ｍ．ら．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８１，４６３２−４６３７（２００８）；Ｔｏｍｋｏｗｉｃｚ，Ｂ．ら．Ｂｌｏｏｄ．１０８，１１４５−１１５０（２００６）；Ｏ’Ｌａｕｇｈｌｉｎ−Ｂｒｕｎｎｅｒ，Ｂ．ら．Ｂｌｏｏｄ．９８，３４３−３５０（２００１）；Ｎａｋａｔａ，Ｙ．ら．  Ｂｌｏｏｄ．１０７，４２３４−４２３９．（２００６））。
【０１１０】
従って、我々は膵臓線維症における可能性のある治療標的としてのＬｙｎの生体内での検証を行った。我々は、セルレインまたはセルレインとＩＮＮＯ−４０６の双方で６週間処理したマウスにおける膵臓線維症を比較した。その後、マウスを屠殺し、膵臓を組織学的分析に供した。ヘマトキシリン／エオシン及びピクロシリウス赤による染色は、コラーゲンと、セルレインのみで処理した慢性膵炎マウスにおける重度の線維症を視覚化した（図２Ｇ）。特に、線維症の程度は、セルレイン及びＩＮＮＯ−４０６の双方で６週間処理したマウスで有意に低下した（図２Ｇ、図２Ｈ）。これらのデータはＬｙｎキナーゼの阻害剤であるＩＮＮＯ−４０６が生体内でセルレイン誘導の膵臓線維症を改善することを示した。我々は、Ｌｙｎは抗線維症の治療戦略における新たに出現した関連する標的であり、Ｌｙｎの阻害は、膵臓、及びたぶん肝臓、肺及び他の臓器における正常実質の線維性組織による置き換えを妨げることができると結論付けている。
【０１１１】
上記で記載されている種々の方法及び技法は本出願を実施するための多数の方法も提供する。当然、記載されている目的または利点の必ずしもすべてが本明細書に記載されている特定の実施形態に従って達成され得るわけではないことが理解されるべきである。従って、たとえば、当業者は、方法が、本明細書で教示されているまたは提案されているような他の目的または利点を必ずしも達成することなく、本明細書で教示されているような１つの利点または利点の群を達成するまたは最適化するようなやり方で実施され得ることを理解するであろう。種々の代替が本明細書で言及される。一部の好まれる実施形態が具体的に１つの、別のまたは幾つかの特徴を含む一方で、他のものは具体的に１つの、別のまたは幾つかの特徴を排除し、さらに他のものは１つの、別のまたは幾つかの有利な特徴の包含によって特定の特徴を軽減することが理解されるべきである。
【０１１２】
さらに、技量のある熟練者は、異なる実施形態に由来する種々の特徴の適応可能性を認識するであろう。同様に、上記で議論された種々の要素、特徴及び工程と同様にそのような要素、特徴または工程それぞれについての同等物が当業者によって種々の実施形態にて採用されて、本明細書に記載されている原理に従って方法を実施することができる。種々の要素、特徴及び工程の中で、一部は多様な実施形態に具体的に含まれ、他は多様な実施形態にて具体的に排除される。
【０１１３】
特定の実施形態及び実施例を背景として本出願を開示してきたが、本出願の実施形態は具体的に開示されている実施形態を超えて他の代わりの実施形態及び／またはその使用及びその修飾物及び同等物まで拡大することが当業者によって理解されるであろう。
【０１１４】
本出願を実施するための本発明者に既知の最良の方法を含む、本出願の好まれる実施形態が本明細書に記載されている。それらの好まれる実施形態における変化は、前述の記載を読む際に当業者に明らかになるであろう。技量のある熟練者は適宜そのような変化を採用することができ、本出願は本明細書に具体的に記載されている以外に実践され得ることが熟考される。従って、本出願の多数の実施形態は、適用法令で許容されるとき、本明細書に添付されているクレームで引用される主題の修飾物及び同等物すべてを包含する。さらに、本明細書で特に指示されない限り、または文脈によって明瞭に否定されない限り、考えられるそのすべての変化における上述の要素の任意の組み合わせは本出願によって包含される。
【０１１５】
本明細書で参照される特許、特許出願、特許出願の公報、及びたとえば、論文、書籍、明細書、出版物、文書、物体等のような他の資料のすべては、それに関連する審査経過ファイル、本文書に対して矛盾するもしくは係争中であるそれのいずれか、または現在クレームの最も広い範囲に関して限定効果を有し得るもしくは本文書に後に関連するそれのいずれかを除いて、その全体があらゆる目的で本参照によって本明細書に組み入れられる。例として、組み入れられた物質及び本文書に関連するもののいずれかに関連する用語の記載、定義及び／または使用の間で矛盾または対立がありそうなときは、本文書における用語の記載、定義及び／または使用が優先すべきである。
【０１１６】
最後に、本明細書で開示されている本出願の実施形態は本出願の実施形態の原理の説明に役立つものであることが理解されるべきである。採用することができる他の修飾は本出願の範囲内にあることができる。従って、例として限定ではなく、本出願の実施形態の代わりの構成を本明細書の教示に従って利用することができる。従って、本出願の実施形態は正確に示され、記載されるようなものに限定されない。
【図１Ａ】
2017527615.tif 000003
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
2017527615.tif 000009
【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【国際調査報告】
2017527615.tif 000017