(57)【要約】本発明は、皮質下梗塞及び白質脳症を伴う常染色体優性脳動脈症を有する患者の処置に有用な抗Ｎｏｔｃｈ３抗体治療に関する。特に、本発明は、治療に使用するための、Ｎｏｔｃｈ１又はＮｏｔｃｈ２の２倍、４倍又は１０倍高いＮｏｔｃｈ３への親和性を有する抗Ｎｏｔｃｈ３抗体又はその断片に関する。
2017538663.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療に使用するための、Ｎｏｔｃｈ１又はＮｏｔｃｈ２の２倍、４倍又は１０倍高いＮｏｔｃｈ３への親和性を有する抗Ｎｏｔｃｈ３抗体又はその断片。
【請求項２】
Ｎｏｔｃｈ３ＥＣＤ沈着物及び／又は野生型Ｎｏｔｃｈ３ＥＣＤに結合することができる、請求項１に記載の使用のための抗体又はその断片。
【請求項３】
Ｎｏｔｃｈ１又はＮｏｔｃｈ２に本質的に結合しない、請求項１又は２に記載の使用のための抗体又はその断片。
【請求項４】
ヒトＮｏｔｃｈ３のアミノ酸４０〜１６４３（配列番号：３）を含むエピトープに結合する、先行請求項のいずれか一項に記載の使用のための抗体又はその断片。
【請求項５】
ヒトＮｏｔｃｈ３のアミノ酸６５７−８４６（配列番号７）に含まれるエピトープに結合する、請求項５に記載の使用のための抗体又はその断片。
【請求項６】
単離されている、請求項１〜５に記載の使用のための抗体又はその断片。
【請求項７】
以下の少なくとも１つを含む、請求項１〜６に記載の使用のための抗体又は断片：
配列番号：８を含む重鎖可変領域Ｈ−ＣＤＲ１
配列番号：９を含む重鎖可変領域Ｈ−ＣＤＲ２
配列番号：１０を含む重鎖可変領域Ｈ−ＣＤＲ３
配列番号：１２を含む軽鎖可変領域Ｌ−ＣＤＲ１
配列番号：１３を含む軽鎖可変領域Ｌ−ＣＤＲ２、又は
配列番号：１４を含む軽鎖可変領域Ｌ−ＣＤＲ３。
【請求項８】
以下の全てを含む、請求項９に記載の抗体又はその断片：
配列番号：８を含む重鎖可変領域Ｈ−ＣＤＲ１
配列番号：９を含む重鎖可変領域Ｈ−ＣＤＲ２
配列番号：１０を含む重鎖可変領域Ｈ−ＣＤＲ３
配列番号：１２を含む軽鎖可変領域Ｌ−ＣＤＲ１
配列番号：１３を含む軽鎖可変領域Ｌ−ＣＤＲ２、及び
配列番号：１４を含む軽鎖可変領域Ｌ−ＣＤＲ３。
【請求項９】
配列番号：１１を含む重鎖可変領域を含む、請求項７又は８に記載の使用のための抗体又はその断片。
【請求項１０】
配列番号：１５を含む軽鎖可変ドメインを含む、請求項７又は８に記載の使用のための抗体又はその断片。
【請求項１１】
請求項１２及び１３に記載の重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインの両方を含む、請求項７又は８に記載の使用のための抗体又はその断片。
【請求項１２】
ヒト化されている、先行請求項のいずれか一項に記載の使用のための抗体又はその断片。
【請求項１３】
以下：
（Ａ）ヒトＮｏｔｃｈ３のアミノ酸４０−１６４３（配列番号：３）若しくはその断片；
（Ｂ）ヒトＮｏｔｃｈ３のアミノ酸６５７−８４６（配列番号７）若しくはその断片；又は
（Ｃ）（Ａ）及び（Ｂ）；
を含む治療に使用するためのワクチンであって、患者への投与がＮｏｔｃｈ３ＥＣＤ沈着物に結合することができる抗体を誘導する、ワクチン。
【請求項１４】
補助剤をさらに含む、請求項６に記載の使用のためのワクチン。
【請求項１５】
皮質下梗塞及び白質脳症を伴う常染色体優性脳動脈症（ＣＡＤＡＳＩＬ）を処置する際に使用するための、請求項１〜１４に記載の抗体又はワクチン。
【請求項１６】
処置が慢性的である、請求項１６に記載の使用のための抗体又はワクチン。
【請求項１７】
慢性処置が少なくとも２週間、例えば少なくとも１ヶ月、６ヶ月、１年以上である、請求項１７に記載の使用のための抗体又はワクチン。
【請求項１８】
ＣＡＤＡＳＩＬの処置のための医薬の製造のための、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項１９】
ＣＡＤＡＳＩＬを処置するための方法であって、それを必要とする個体に有効量の請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体又はワクチンを投与することによる、方法。
【請求項２０】
処置が慢性的である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２１】
慢性処置が少なくとも２週間、例えば少なくとも１ヶ月、６ヶ月、１年以上である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２２】
治療に使用するための請求項１〜１５に記載の抗体又はワクチンを含むキット。
【請求項２３】
標識Ｎｏｔｃｈ３抗体又はその断片をさらに含む、請求項２３に記載の使用のためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、皮質下梗塞及び白質脳症を伴う常染色体優性脳動脈症を有する患者の処置に有用な抗Ｎｏｔｃｈ３抗体治療に関する。
【０００２】
発明の背景
Ｎｏｔｃｈ遺伝子は、ショウジョウバエの１種であるキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）が切欠けのある（notched）羽根を有していることが発見された１９１７年に最初に記載された（Morgan, Am Nat 51:513 (1917)）。この遺伝子は、およそ７０年後にクローニングされ、そして、多くの異なる細胞型及び組織の発生において重要な役割を担っている細胞表面受容体であることが判明した（Wharton et al., Cell  43:567-581 (1985)）。それ以来、この遺伝子及びその分子機序が幅広く研究されている。Ｎｏｔｃｈ経路の普遍性は、それ自体異なるレベルで現れる。
【０００３】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路は、ショウジョウバエ（Drosophila）から脊椎動物に及ぶ進化的に保存されたシグナル伝達機構であることがまもなく見いだされ、そして、種々の細胞型における発生の間又は後の分化、細胞運命決定、幹細胞の維持、増殖、及びアポトーシスなどの多くの細胞プロセスに関与していることが見いだされた（Artavanis, et al., Science 268:225 (1995) の概説を参照のこと）。胎児マウスにおいてはノックアウト突然変異が致死的であることが見いだされた（Krebs et al. Genes & Dev 14(11):1343-52 (2000）)。アフリカツメガエル（Xenopus）胚の発生においてＮｏｔｃｈの突然変異型の発現は、正常な発生を重度に妨げる（Coffman, et al., Cell 73 (1993)）。ヒトでは、Ｎｏｔｃｈの突然変異に関連したいくつかの遺伝子疾患がある（Artavanis-Tsakonas, et al. Science 284:770-776 (1999)）。
【０００４】
哺乳動物は、４種のＮｏｔｃｈタンパク質（Ｎｏｔｃｈ１〜４と称される）と５種の対応するリガンド（Ｄｅｌｔａ−１、−３及び−４、並びにＪａｇｇｅｄ−１及び−２）を有する。哺乳動物のＮｏｔｃｈ遺伝子は、約３００ｋｄのタンパク質をコードし、このタンパク質は細胞表面への輸送の間に切断され、その結果としてヘテロ二量体（ＮｏｔｃｈＥＣＤ−ＮｏｔｃｈＴＭＩＣ）として存在する。その細胞外部分は、多くの上皮成長因子（ＥＧＦ）様リピートとそれに続く３種のシステインリッチなＮｏｔｃｈ／Ｌｉｎｌ２リピート（ＬＮ）を有する（Wharton, et al, Cell 43:567 (1985); Kidd, et al, MoI Cell Biol 6:3431 (1986); Kopczynski, et al, Genes Dev 2:1723 (1988); Yochem, et al, Nature 335:547 (1988)）。アミノ末端のＥＧＦ様リピートはリガンド結合に関与するが、一方、Ｌｉｎ１２リピートを含む細胞外部分のＣ末端部分は、リガンドの非存在下でシグナル伝達を抑制する。リガンド結合によって誘導されたシグナルは、受容体のタンパク質分解切断と細胞内ドメイン（Ｎｏｔｃｈ−ＩＣ）の核移行を伴うプロセスによって核へと伝達される。核へ侵入した後、Ｎｏｔｃｈ−ＩＣは、阻害性タンパク質と競合し、マスターマインド（mastermind）様（ＭＡＭＬ）タンパク質及びアセチルトランスフェラーゼを含む活性化補助因子をリクルートする。Ｎｏｔｃｈ−ＩＣ複合体は、次に、転写因子ＲＢＰ−Ｊに結合して、それを転写抑制因子から活性化因子へと変換する。これまでに同定されている数種の転写因子は、その性質及び細胞に及ぼす作用は様々である。
【０００５】
皮質下梗塞及び白質脳症を伴う常染色体優性脳動脈症（ＣＡＤＡＳＩＬ）は、ある種の卒中及び認知症を引き起こし、その重要な特徴は、再発性の皮質下虚血イベント及び血管性認知症を含む。神経画像検査における顕著な症状は、広範な白質病変、ラクナ及び進行性の脳萎縮を含む。この疾患は、ＮＯＴＣＨ３の細胞外ドメイン中のシステイン残基の数を変える高度に定型化された突然変異によって引き起こされ（Joutel, A et al. 1997. The Lancet 350(9090):1511-5）、ＮＯＴＣＨ３は、血管平滑筋細胞及び脳毛細血管の周皮細胞において優勢に発現される（Joutel, A et al. 2000. J Clin Invest 105 (5): 597-605）。その２つの特徴的な病理は、脳及び末梢血管中の血管平滑筋細胞並びに脳毛細血管中の周皮細胞の原形質膜のすぐ近くに特徴として見られる、細胞外のＮＯＴＣＨ３及びＧＯＭ沈着物である。ＮＯＴＣＨ３沈着物は、ＮＯＴＣＨ３の細胞外ドメイン（Ｎｏｔｃｈ３ＥＣＤ）の凝集体であり、そして、ＧＯＭは、Ｎｏｔｃｈ３ＥＣＤが１つの重要な構成要素であるタンパク質性凝集体である（Joutel, A et al . 2000. J Clin Invest 105 (5): 597-605)（Ishiko et al. 2006 Acta Neurophatol 112(3):333-39）（Monet-Lepretre et al. 2013. Brain: A journal of Neurology 136 (pt 6): 1830-45）。今日、その疾患症状の進行を抑制又は停止させる治療法はまだない。
【０００６】
本発明の発明者らは、驚くべきことに、抗Ｎｏｔｃｈ３抗体がＣＡＤＡＳＩＬ患者の処置に使用され得ることを見いだした。
【０００７】
発明の概要
本発明は、Ｎｏｔｃｈ３抗体又はその断片に関する。これらの抗体は、とりわけ、Ｎｏｔｃｈ１又はＮｏｔｃｈ２の２倍、４倍又は１０倍高いＮｏｔｃｈ３への親和性を有することを特徴とする。特に、本抗体は、Ｎｏｔｃｈ３ＥＣＤ沈着物、及びヒトＮｏｔｃｈ３のアミノ酸４０−１６４３（配列番号：３）に含まれるエピトープに結合することができる。
【０００８】
特定の実施態様において、本抗体のＣＤＲ領域は、以下を含む：
配列番号：８を含む重鎖可変領域Ｈ−ＣＤＲ１
配列番号：９を含む重鎖可変領域Ｈ−ＣＤＲ２
配列番号：１０を含む重鎖可変領域Ｈ−ＣＤＲ３
配列番号：１２を含む軽鎖可変領域Ｌ−ＣＤＲ１
配列番号：１３を含む軽鎖可変領域Ｌ−ＣＤＲ２、及び
配列番号：１４を含む軽鎖可変領域Ｌ−ＣＤＲ３。
【０００９】
本発明はまた、ヒトＮｏｔｃｈ３のアミノ酸４０−１６４３（配列番号：３）若しくはその断片又はヒトＮｏｔｃｈ３のアミノ酸６５７−８４６（配列番号：７）若しくはその断片を含むワクチンに関する。そのような断片は、Ｎｏｔｃｈ３のエピトープを含む。
【００１０】
本発明の抗体及びワクチンは共に、治療において、より具体的にはＣＡＤＡＳＩＬ患者を処置する際に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＯＣＴＥＴ分析を使用して、ヒトＮｏｔｃｈ３に結合している５Ｅ１を示す。速度論分析を、ForteBio社のOctet RED技術を使用して、製造業者の指示に従って実施した。ビオチン化したＮＯＴＣＨ３  ６５７−８４８を、ストレプトアビジンチップ上に、各々約３ＲＵのレベルで固定化した。その後の５Ｅ１抗体との会合及び解離を、３３３nM〜３，３nMの範囲の濃度で分析した。続いて、ForteBio Data Analysis 7.0 ソフトウェアを使用してデータ分析を行った（実施例３）。
【図２】老齢マウスにおいて、５Ｅ１がＣＮＳに侵入し、血管のＮｏｔｃｈ３ＥＣＤ沈着物に結合することを示す。老齢のＴｇＰＡＣ−Ｎｏｔｃｈ３Ｒ１６９Ｃマウス（１０〜１２月齢）に、１０mg/kgのＡｌｅｘａ４８８コンジュゲート５Ｅ１（Ａ〜Ｉ）又は５Ｃ９Ｅ７対照抗体（Ｊ〜Ｏ）の単回腹腔内注射を受けさせた（実施例８）。注射の３日後に、Ｎｏｔｃｈ３ＥＣＤ沈着物にインビボ結合している抗体を、外因性抗Ｎｏｔｃｈ３ＥＣＤ抗体で免疫標識してＡｌｅｘａ５９４二次抗体で検出した脳（Ａ〜Ｆ；Ｊ〜Ｌ）及び腎臓（Ｇ〜Ｉ；Ｍ〜Ｏ）の凍結切片で評価した。Ａｌｅｘａ４８８（注射された抗体）（左のカラム）、Ａｌｅｘａ５９４（外因性抗体）（中央のカラム）及び統合した画像（右のカラム）による蛍光発光を示す。５Ｅ１は、脳動脈（Ａ〜Ｃ）、脳毛細血管（Ｄ〜Ｆ）及び腎臓動脈（Ｇ〜Ｉ）中のＮｏｔｃｈ３ＥＣＤ沈着物に結合する。Ｇ及びＭ上に表示する画像は４回の短時間露光を使用して取得したが、腎臓動脈は、脳血管よりも鮮やかなシグナルを示す（スケールバーは、パネルＤ〜Ｆ以外は９５μｍを表し、パネルＤ〜Ｆでは６０μｍを表す）。
【図２ｂｉｓ】若齢マウスにおいて、５Ｅ１がＣＮＳに侵入し、血管のＮｏｔｃｈ３ＥＣＤ沈着物に結合することを示す。若齢のＴｇＰＡＣ−Ｎｏｔｃｈ３Ｒ１６９Ｃマウス（２月齢）に、１０mg/kgの非コンジュゲート５Ｅ１抗体の単回腹腔内注射を受けさせた（実施例９）。注射の３日後に、抗体インビボ標的捕捉を、マウス免疫グロブリンに対するＡｌｅｘａ５９４コンジュゲート抗体（Ａ、５Ｅ１結合の検出）及びＡｌｅｘａ４８８コンジュゲート５Ｅ１（Ｂ、総Ｎｏｔｃｈ３ＥＣＤ沈着物の検出）で共免疫標識した脳切片で評価した。統合した画像（Ｃ）は、標的捕捉がほぼ完璧であることを示す（スケールバーは、７６μｍを表す）（実施例９）。
【図３】５Ｅ１処置がＧＯＭ沈着物を抑制しないことを示す。  ２月齢のＴｇＰＡＣ−Ｎｏｔｃｈ３Ｒ１６９Ｃマウスを、１０mg/kgの５Ｅ１（６ｍｏ−５Ｅ１、ｎ＝５匹の雄）又は対照ＩｇＧ１（６ｍｏ−ＩｇＧ１、ｎ＝５匹の雄）抗体の週１回の腹腔内注射で４ヶ月間にわたり処置した。Ａ〜Ｂ：ＩｇＧ１（Ａ）又は５Ｅ１（Ｂ）で処置した６月齢のＴｇＰＡＣ−Ｎｏｔｃｈ３Ｒ１６９Ｃマウスの中大脳動脈の代表的な電子顕微鏡写真。ＧＯＭ沈着物は、赤色の矢印で特定される。Ｃ：６月齢の処置ＴｇＰＡＣ−Ｎｏｔｃｈ３Ｒ１６９Ｃマウス中のＧＯＭ沈着物の数を示すダイアグラムであり、これは５Ｅ１処置がＧＯＭ沈着物の出現を抑制しないことを示す。スケールバーは、５μmである（実施例１０及び１１）。
【図４】５Ｅ１慢性処置が脳血管機能障害を防ぐことを示す。  ２月齢のＴｇＰＡＣ−Ｎｏｔｃｈ３Ｒ１６９Ｃマウスを、１０mg/kgの５Ｅ１（ＴｇＮ３Ｒ１６９Ｃ−５Ｅ１、ｎ＝５匹の雄）又は対照ＩｇＧ１（ＴｇＮ３Ｒ１６９Ｃ−ＩｇＧ１、ｎ＝６匹の雄）抗体の週１回の腹腔内注射で４ヶ月間にわたり処置し、そして、６月齢でレーザードップラー流量計による脳血流（ＣＢＦ）応答について分析した。追加の６月齢の野生型マウスの未処置群（ＷＴ、ｎ＝５匹の雄）を平行して試験した。５Ｅ１処置は、内皮血管拡張剤アセチルコリン、カルシウムイオノホアＡ２３１８７及びブラジキニン（Ａ）、平滑筋弛緩剤アデノシン（Ｂ）並びに神経活動（ひげ刺激）（Ｃ）によってもたらされた増加したＣＢＦの減衰を有意に改善する（＊＊＊ｐ＜０．００１、ＴｇＮ３Ｒ１６９Ｃ−５Ｅ１をＴｇＮ３Ｒ１６９Ｃ−ＩｇＧ１又はＷＴマウスと比較）。データを平均±ＳＥＭとして表し、そして、一元配置分散分析、続く、ボンフェローニの事後検定によって分析した（実施例１０及び１２）。
【図４ｂｉｓ】５Ｅ１慢性処置が内部リモデリング（inward remodeling）を防ぎ、脳動脈の筋原性緊張を低減することを示す。  ２月齢のＴｇＰＡＣ−Ｎｏｔｃｈ３Ｒ１６９Ｃマウスを、１０mg/kgの５Ｅ１（ＴｇＮ３Ｒ１６９Ｃ−５Ｅ１、ｎ＝７匹の雄）又は対照ＩｇＧ１（ＴｇＮ３Ｒ１６９Ｃ−ＩｇＧ１、ｎ＝７匹の雄）抗体の週１回の腹腔内注射で４ヶ月間にわたり処置し、そして、６月齢で、動脈波形システムを使用して、加圧した後大脳動脈のパッシブ直径（内部リモデリング）及びアクティブ直径（筋原性緊張）について分析した。追加の６月齢の野生型マウスの未処置群（ＷＴ、ｎ＝７匹の雄）を平行して試験した。５Ｅ１処置は、パッシブ直径の減少を有意に改善し（Ａ）、そして、筋原性応答を正常化する（Ｂ）（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、ＴｇＮ３Ｒ１６９Ｃ−５Ｅ１をＴｇＮ３Ｒ１６９Ｃ−ＩｇＧ１マウスと比較）。データを平均±ＳＥＭとして表し、そして、二元配置反復測定分散分析、続く、ボンフェローニの事後検定によって分析した（実施例１０及び１３）。
【図５】ヒトＮｏｔｃｈ３の概略図を示す。アミノ酸１−３９はシグナルペプチドを構成し、アミノ酸４０−１６４３は細胞外ドメインを構成し、アミノ酸１６４４−１６６４は膜貫通ドメインを構成し、そして、アミノ酸１６６５−２３２１はＮｏｔｃｈ３細胞内ドメインを構成する。アミノ酸１５７１−１５７２はフリン様プロテアーゼによる切断部位であり、そして、アミノ酸４０−１５７１はＮｏｔｃｈ３ＥＣＤ（ＣＡＤＡＳＩＬ中に異常に蓄積する）を構成する。
【図６】抗体血漿中動態の決定を示す（実施例７）。Ｔ１／２は６〜７日であることが決定され、そして、Ｃｍａｘ（４時間）は約５００ug/mlであった。遊離血漿ｍＡｂレベルの定量化を、標準として５Ｅ１及びＮｏｔｃｈドメインコートプレートを使用して実施した。
【００１２】
発明の詳細な説明
定義
用語「Ｎｏｔｃｈ３」は、Ｎｏｔｃｈ３ポリペプチドと同義語であり、示されている文脈から別の意味が明らかでない限り、配列番号：１（ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｑ９ＵＭ４７）で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。配列番号：１において、アミノ酸１−３９はシグナルペプチド（配列番号：２）を構成し、アミノ酸４０−１６４３は細胞外ドメイン（配列番号：３）を構成し、アミノ酸１６４４−１６６４は膜貫通ドメイン（配列番号：４）を構成し、そして、アミノ酸１６６５−２３２１はＮｏｔｃｈ３細胞内ドメイン（配列番号：５）を構成する。アミノ酸１５７１−１５７２はフリン様プロテアーゼによる切断部位であり、そして、アミノ酸４０−１５７１はＮｏｔｃｈ３ＥＣＤ（配列番号：６）（ＣＡＤＡＳＩＬ中に異常に蓄積する）を構成する。
【００１３】
用語「抗体」は、無傷の免疫グロブリン又はその機能的断片を指す。用語「単離抗体」は、本明細書を通して、自然界に存在し得るものと全く別の物理環境で存在しかつ天然に存在するタンパク質とは化学式又は配列が異なる、免疫グロブリン抗体を意味する。したがって、単離抗体という用語は、天然に存在するポリクローナル抗体などの非単離抗体を含まないが、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）、さらには単離抗体様ポリペプチド、キメラ抗体、ヒト化抗体、及びエピトープに結合する能力を有する単離抗体の断片を含む。
【００１４】
天然に存在する抗体は、典型的には、通常少なくとも２個の重鎖（Ｈ）と少なくとも２個の軽鎖（Ｌ）とから構成される四量体を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＶＨと略する）と通常３個のドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）からなる重鎖定常領域とからなる。重鎖は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２サブタイプ）、ＩｇＭ及びＩｇＥを含む任意のアイソタイプであることができる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬと略する）と軽鎖定常領域（ＣＬ）とからなる。軽鎖は、カッパ鎖及びラムダ鎖を含む。重鎖及び軽鎖可変領域は、典型的には、抗原認識に関与しているが、一方、重鎖及び軽鎖定常領域は、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的な補体系の第一成分（Ｃｌｑ）を含む宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存されている領域が組み入れられた相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分され得る。各ＶＨ及びＶＬは、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置されている３個のＣＤＲと４個のＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖及び軽鎖の可変領域。
【００１５】
用語「モノクローナル抗体」又は「ｍＡｂ」は、本明細書において使用される場合、単一の分子組成の単離抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、ある特定のエピトープに対して単一の結合特異性及び親和性を提示する。したがって、用語「ヒトモノクローナル抗体」は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変及び定常領域を有する、単一の結合特異性を提示する抗体を指す。ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合されているヒト重鎖導入遺伝子及び軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する、遺伝子導入又は染色体導入非ヒト動物（遺伝子導入マウスなど）から得られたＢ細胞を含むハイブリドーマによって産生され得る。
【００１６】
本明細書において使用される場合、「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされている免疫グロブリンクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ又はＩｇＭ）を指す。
【００１７】
用語「ヒト化抗体」は、本明細書において使用される場合、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変及び定常領域を有する単離抗体を含むことを意図する。抗体又はその断片は、当業者に公知の方法によって完全に又は部分的にヒト化され得、それによって、例えば、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植される。
【００１８】
本明細書において上に示したとおり、抗体という用語は、本明細書において、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の断片を含み得る。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片、例えばＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片によって発揮され得ることが示されている。
【００１９】
抗体断片は、従来技術によって、例えば、完全長抗体の断片化によって又は組み換え細胞中での抗体断片をコードする核酸の発現によって得られ得る（例えば、Evans et al.、J. Immunol. Meth. 184, 123-38 (1995) を参照のこと）。断片は、次いで、完全長抗体について本明細書に記載したものと同じ手法で、それらの特性について試験又はスクリーニングされ得る。抗体断片の例は、例えば、以下を含む：
【００２０】
ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結されている２個のＦａｂ断片を含む二価の断片であるＦ（ａｂ’）２断片。これらは、例えば、完全長抗体をペプシンで処理することによって生成され得る。
【００２１】
ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価の断片であるＦａｂ’又はＦａｂ断片。Ｆａｂ断片は、例えば、ＩｇＧ抗体をパパインで処理することによって得られ得る。Ｆａｂ’断片は、例えば、ジチオトレイトールなどの還元剤を使用してＦ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することによって得られ得る。
【００２２】
単一アームの抗体のＶＬ及びＶＨドメインから本質的になるＦｖ断片及びその単鎖抗体。単鎖抗体（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体としても公知）は、ＶＬ及びＶＨ領域が対になって一価の分子を形成した単一のタンパク質鎖として発現されることを可能にする合成リンカーによって、組み換え法を使用してＦｖ断片のＶＬ及びＶＨドメインが接続された構築物である（例えば、Bird et al., Science 242, 423-426 (1988) 及びHuston et al., PNAS USA 85, 5879-5883 (1988) を参照のこと）。
【００２３】
ＶＨドメインから本質的になるドメイン抗体（ｄＡｂ断片とも呼ばれる）（例えば、Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989); Holt et al; Trends Biotechnol. 2003 Nov;21(11):484-90 を参照のこと）。
【００２４】
他の例示的な形式は、カメリド（camelid）又はナノボディを含む（例えば、Revets et al; Expert Opin Biol Ther. 2005 Jan;5(1):111-24 を参照のこと）。
【００２５】
用語「エピトープ」は、抗体が特異的に結合することが可能な抗原の一部分（例えば、抗原のタンパク質決定基）を意味する。エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基、及び結合に直接関与しない他のアミノ酸残基、例えば特異的な抗原結合ペプチドによって効果的にブロック又はカバーされるアミノ酸残基（言い換えれば、このアミノ酸残基は、特異的な抗原結合ペプチドのフットプリント内にある）を含み得る。
【００２６】
本明細書において使用される場合、用語「結合」は、所定の抗原又はエピトープへの抗体の結合に関して、典型的には、例えば、可溶性形態のリガンドとしての抗原及び検体としての抗体を使用したBIAcore 3000 装置での表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって決定された場合の、約１０−７Ｍ以下、例えば約１０−８Ｍ以下、例えば約１０−９Ｍ以下、約１０−１０Ｍ以下、又は約１０−１１Ｍ又はさらにそれ未満のＫＤに相当する親和性での結合である。典型的には、抗体は、所定の抗原に、所定の抗原と同一でない又は密接に関連しない非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）への結合についてのＫＤよりも、少なくとも１０倍低い、例えば少なくとも１００倍低い、例えば少なくとも１，０００倍低い、例えば少なくとも１０，０００倍低い、例えば少なくとも１００，０００倍低いＫＤに相当する親和性で結合する。抗体のＫＤが非常に低い（すなわち、抗体が高い親和性を有する）場合、抗体が抗原と結合するＫＤは、典型的には、非特異的抗原についてのＫＤよりも少なくとも１０，０００倍低い。抗体が抗原又はエピトープに本質的に結合しないと言えるのは、そのような結合が、検出可能でないか（例えば、可溶性形態のリガンドとしての抗原及び検体としての抗体を使用したBIAcore 3000 装置でのプラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を使用して）、あるいは、その抗体及び異なる化学構造又はアミノ酸配列を有する抗原又はエピトープによって検出された結合よりも１００倍、５００倍、１０００倍又は１０００倍超小さいかのいずれかの場合である。
【００２７】
用語「ｋｄ」（sec-1）は、本明細書において使用される場合、特定のＡｂ−抗原相互作用の解離速度定数を指す（［Ａｂ］［抗原］／［Ａｂ−抗原複合体］）。前記の値は、ｋｏｆｆ値とも呼ばれる。
【００２８】
用語「ｋａ」（Ｍ−１×sec-1）は、本明細書において使用される場合、特定のＡｂ−抗原相互作用の会合速度定数を指し、ｋｄの逆数である。
【００２９】
用語「ＫＤ」（Ｍ）は、本明細書において使用される場合、特定のＡｂ−抗原相互作用の解離平衡定数を指し、ｋｄをｋａで割って得られる。
【００３０】
用語「ＫＡ」（Ｍ−１）は、本明細書において使用される場合、特定のＡｂ−抗原相互作用の会合平衡定数を指し、ｋａをｋｄで割って得られる。
【００３１】
本発明の具体的な実施態様及び態様
本発明は、ヒトＮｏｔｃｈ３に結合するがＮｏｔｃｈ１にもＮｏｔｃｈ２にも結合しないマウスモノクローナル抗体である単離抗体５Ｅ１（実施例１及び２）によって例示されるような、ＣＡＤＡＳＩＬ患者の抗Ｎｏｔｃｈ３抗体治療に関する。単離５Ｅ１抗体は、追加的に、ヒト、マウス及びラットの両方において血管のＮｏｔｃｈ３ＥＣＤ沈着物を動脈内（i.a.）検出でき、それによって動物モデルからヒト病理への非常に優れた変換を示す抗体を提供することができる。５Ｅ１抗体は、ヒトＮｏｔｃｈ３に対して作製され、ヒトとラットの両方のＮＯＴＣＨ３を近い結合定数（ＫＤ＝５５nM）で認識する（図１、実施例３）。
【００３２】
末梢投与された抗Ｎｏｔｃｈ３抗体は、５Ｅ１について示されているとおり（図２及び２ｂｉｓ、実施例８）、血管のＮｏｔｃｈ３ＥＣＤ沈着物に直接作用し、そして、その沈着物に到達する前に血液脳関門を通過する。脳血管と末梢動脈の両方において豊富なＮｏｔｃｈ３ＥＣＤ沈着物を示す高齢ＴｇＰＡＣ−Ｎｏｔｃｈ３Ｒ１６９Ｃマウスでの実験では、１０〜１２月齢のＴｇＰＡＣ−Ｎｏｔｃｈ３Ｒ１６９Ｃ及び対照マウスに、Ａｌｅｘａ４８８コンジュゲート抗Ｎｏｔｃｈ３抗体（５Ｅ１）又は５Ｃ９Ｅ７対照抗体（１０mg/kg）の単回注射を受けさせた。続いて、３日後にマウスを屠殺し、そして、脳及び腎臓の凍結切片を直接蛍光によって調べた。抗Ｎｏｔｃｈ３抗体で処置したＴｇＰＡＣ−Ｎｏｔｃｈ３Ｒ１６９Ｃマウスの脳血管（動脈及び毛細血管を含む）を標識したが、一方、５Ｃ９Ｅ７処置群の血管は染色しなかった（図２Ａ、Ｄ及びＪ）。注目すべきは、抗Ｎｏｔｃｈ３抗体で処置したＴｇＰＡＣ−Ｎｏｔｃｈ３Ｒ１６９Ｃマウスにおいて、末梢動脈が脳血管よりもはるかに強く染色された（図２、ＧをＡ及びＤと比較）。抗Ｎｏｔｃｈ３ＥＣＤ抗体を用いた切片の共免疫標識は、５Ｅ１抗体が、突然変異マウスにおける脳と腎臓の両方の血管で、ほとんど全てのＮｏｔｃｈ３ＥＣＤ沈着物に結合していたことを示した（図２Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ）。したがって、データは、抗Ｎｏｔｃｈ３抗体が、血管のＮｏｔｃｈ３ＥＣＤ沈着物にインビボで結合できること、及びごく一部が脳に侵入して脳血管系中のＮｏｔｃｈ３ＥＣＤ沈着物に直接作用できることを示した。
【００３３】
高齢のＴｇＰＡＣ−Ｎｏｔｃｈ３Ｒ１６９Ｃマウスは、微細な血液脳関門欠陥を示すだろう。これは、脳内への抗体の拡散を促し得る。これを調査するために、本発明の発明者らは、より若齢のＴｇＰＡＣ−Ｎｏｔｃｈ３Ｒ１６９Ｃマウスで実験を実施した（実施例９）。２月齢のＴｇＰＡＣ−Ｎｏｔｃｈ３Ｒ１６９Ｃマウスに、非コンジュゲート抗Ｎｏｔｃｈ３抗体（５Ｅ１）又は対照ＩｇＧ１（１０mg/kg）の単回腹腔内注射を受けさせ、続いて、３日後に屠殺して標的捕捉を研究した。抗マウス抗体を用いた脳凍結切片の免疫蛍光分析は、抗Ｎｏｔｃｈ３抗体が脳血管内でＮｏｔｃｈ３ＥＣＤ凝集体を強く捕捉したことを明らかにした（図２ｂｉｓ、Ａ）。さらに、Ａｌｅｘａ４８８コンジュゲート抗Ｎｏｔｃｈ３抗体（５Ｅ１）を用いた共免疫標識を行って、Ｎｏｔｃｈ３ＥＣＤ沈着物の総量を決定し、これは標的捕捉の百分率が１００％に近いことを示した（図２ｂｉｓ−Ｂ、Ｃ）。それ故、抗Ｎｏｔｃｈ３抗体がワクチン治療アプローチに好適であると結論付けることができる。
【００３４】
抗Ｎｏｔｃｈ３抗体がＮｏｔｃｈ３ＥＣＤ沈着物に結合するという所見は、血管のＮｏｔｃｈ３ＥＣＤ又はＧＯＭ沈着物を抑制又は低下させる点でも効果的であり得るため、ＣＡＤＡＳＩＬ患者における有望な治療適用を示す。
【００３５】
脳血管は、脳表面上を伝わる細い動脈（軟膜動脈）の網目構造からなり、この細い動脈はより細い動脈へと広範囲にわたって分岐して、このより細い動脈は脳実質内へと侵入し（穿通動脈）、次いで広範な毛細管網目構造（毛細血管）として終結する。ＴｇＰＡＣ−Ｎｏｔｃｈ３Ｒ１６９Ｃマウスでは、Ｎｏｔｃｈ３ＥＣＤ凝集体は、生まれつき軟膜動脈において検出可能であり、次いで、この凝集体は、２〜６月齢で細い穿通動脈及び毛細血管へと徐々に広がる。１ヶ月目には点在しているＧＯＭ沈着物は、６月齢で軟膜動脈において容易に検出可能になる（Joutel A, Monet-Lepretre M, Gosele C, Baron-Menguy C, Hammes A, Schmidt S, Lemaire-Carrette B, Domenga V, Schedl A, Lacombe P, Hubner N. 2010. “Cerebrovascular dysfunction and microcirculation rarefaction precede white matter lesions in a mouse genetic model of cerebral ischemic small vessel disease.”J Clin Invest 120(2):433-45）。それ故、本発明者らは、軟膜動脈中の前から存在するＮＯＴＣＨ３沈着物の減衰と実質内血管中の新たなＮＯＴＣＨ３ＥＣＤ沈着物の抑制並びにＧＯＭ沈着物の抑制を調査するために、ＴｇＰＡＣ−Ｎｏｔｃｈ３Ｒ１６９Ｃマウスを２〜６ヶ月間にわたり処置する研究を開始した（実施例１０）。抗Ｎｏｔｃｈ３抗体（５Ｅ１で例示されるとおり）が６〜７日の血漿内半減期を有したことを示す薬物動態研究（図６及び実施例７）の結果に基づいて、１０mg/kgの抗Ｎｏｔｃｈ３抗体（５Ｅ１）又は対照ＩｇＧ１の週１回の注射でマウスを処置した。ＴｇＰＡＣ−Ｎｏｔｃｈ３Ｒ１６９Ｃマウスの群を２月齢時（０時間）に屠殺し、処置前に存在しているＮＯＴＣＨ３ＥＣＤ及びＧＯＭ沈着物の広がりを決定した。脳切片を、ＮＯＴＣＨ３のＮ末端（５Ｅ１によって認識されないドメイン）に対する外因性ポリクローナル抗体を使用するか又はラットＮＯＴＣＨ３のＥＧＦＲ１７−２１に対するポリクローナル抗体を使用するＮｏｔｃｈ３ＥＣＤ凝集体の定量的免疫組織化学分析用に処理した（実施例１１）。０時間（２ヶ月）と対照ＩｇＧ１（６ヶ月）の動物の比較は、軟膜及び毛細血管において増加する、Ｎｏｔｃｈ３ＥＣＤ凝集体の年齢依存的な蓄積を示した。また、脳組織を、中大脳動脈の超薄切片でのＧＯＭ沈着物の定量的電子顕微鏡分析用に処理した（実施例１１）。重要なことに、ＧＯＭ沈着物の定量化は、抗Ｎｏｔｃｈ３抗体で処置したマウスと対照抗体で処置したマウス（１群あたりｎ＝５匹の雄）との間に有意差がないことを明らかにした（図３）。
【００３６】
しかしながら、抗Ｎｏｔｃｈ３抗体による処置がインビボにおいて脳血管機能障害を防ぐことが観察され、したがってＣＡＤＡＳＩＬ患者に対する有益な処置オプションを提供する。
【００３７】
麻酔下マウスの体性感覚皮質上に開けた頭蓋窓及び脳血流（ＣＢＦ）を測定するレーザードップラー流量計を使用して、内皮依存性血管拡張剤Ａｃｈ、ブラジキニン及びＣａ２＋イオノフォアＡ２３１８７の両方の新皮質適用によって引き起こされるＣＢＦ増加、並びに平滑筋弛緩剤アデノシンに対する応答は、６月齢のＴｇＰＡＣ−Ｎｏｔｃｈ３Ｒ１６９Ｃマウスにおいて、同様の量の野生型Ｎｏｔｃｈ３を過剰発現する同齢のＴｇＰＡＣ−Ｎｏｔｃｈ３ＷＴマウス及び遺伝子導入のない同腹仔の両方と比較して強く低下したが、このことは平滑筋反応性が突然変異マウスでは機能しなかったことを示唆する（実施例１０及び１２）。また、顔面のひげ刺激（機能的充血）によってもたらされたＣＢＦ増加が、対照マウスと比較して、６月齢のＴｇＰＡＣ−Ｎｏｔｃｈ３Ｒ１６９Ｃマウスで強く減衰されたことも見いだされた（Joutel A, Monet-Lepretre M, Gosele C, Baron-Menguy C, Hammes A, Schmidt S, Lemaire-Carrette B, Domenga V, Schedl A, Lacombe P, Hubner N. 2010. “Cerebrovascular dysfunction and microcirculation rarefaction precede white matter lesions in a mouse genetic model of cerebral ischemic small vessel disease.”J Clin Invest 120(2):433-45）。したがって、この範例は、Ｎｏｔｃｈ３ＥＣＤ沈着物の荷重量に検出可能な変化が全くないにもかかわらず、抗Ｎｏｔｃｈ３抗体による処置が脳血管機能障害を救助し得るか否かを調査するための有望な手段であった。
【００３８】
最初に、２月齢（すなわち、０時間）の突然変異型及び野生型の未処置マウスの平行コホートを評価した。２月齢で、ＴｇＰＡＣ−Ｎｏｔｃｈ３Ｒ１６９Ｃと野生型同腹仔（１群当たりｎ＝５匹のマウス）との間で、機能的充血、並びに内皮依存性血管拡張剤及び平滑筋血管弛緩剤の両方に対する応答に違いがなかったことが見いだされた。次に、１０mg/kgの抗Ｎｏｔｃｈ３抗体（５Ｅ１）又は対照ＩｇＧ１の週１回の注射で処置した２月〜６月齢のＴｇＰＡＣ−Ｎｏｔｃｈ３Ｒ１６９Ｃマウスを調べた。抗Ｎｏｔｃｈ３抗体で処置したＴｇＰＡＣ−Ｎｏｔｃｈ３Ｒ１６９Ｃマウスは、内皮依存性血管拡張剤（図４Ａ）又は平滑筋弛緩剤アデノシン（図４Ｂ）の局所新皮質適用によって引き起こされた、有意に改善されたＣＢＦ応答を有した。これは、未処置の６ｍｏ  ＷＴマウスとは有意に異なることはないが、ＩｇＧ１で処置したＴｇＰＡＣ−Ｎｏｔｃｈ３Ｒ１６９Ｃマウスとは有意に異なった。さらに、抗Ｎｏｔｃｈ３抗体で処置したＴｇＰＡＣ−Ｎｏｔｃｈ３Ｒ１６９Ｃマウスにおける機能的充血もまた顕著に改善された（１群当たりｎ＝５〜６匹の雄）（図４Ｃ）。それ故、これらのデータは、５Ｅ１などの抗Ｎｏｔｃｈ３抗体を用いた受動免疫化が、ＴｇＰＡＣ−Ｎｏｔｃｈ３Ｒ１６９ＣマウスにおけるＣＢＦ応答を野生型レベルまで回復させることができることを示す。
【００３９】
加圧された後大脳動脈のアクティブ及びパッシブ直径を測定する動脈波形システムを使用して、本発明者らは以前に、脳動脈の圧力誘起狭窄（筋原性緊張）が、６月齢のＴｇＰＡＣ−Ｎｏｔｃｈ３Ｒ１６９Ｃマウスにおいて、同齢の野生型とＴｇＰＡＣ−Ｎｏｔｃｈ３ＷＴマウスの両方と比較して顕著に減衰されたことを報告している。また、後大脳動脈のパッシブ直径が、対照マウスと比較して、６月齢のＴｇＰＡＣ−Ｎｏｔｃｈ３Ｒ１６９Ｃマウスでは顕著に減少したが、一方で、これらのマウスにおいて内部リモデリングの指標となる肉厚の変化はなかったことが見いだされた（Joutel A, Monet-Lepretre M, Gosele C, Baron-Menguy C, Hammes A, Schmidt S, Lemaire-Carrette B, Domenga V, Schedl A, Lacombe P, Hubner N. 2010. “Cerebrovascular dysfunction and microcirculation rarefaction precede white matter lesions in a mouse genetic model of cerebral ischemic small vessel disease.”J Clin Invest 120(2):433-45）。したがって、この範例は、抗Ｎｏｔｃｈ３抗体による処置が、脳動脈のレベルで作用して、変化した筋原性緊張及び内部リモデリングを救助するか否かを調査するための有望な手段であった。
【００４０】
１０mg/kgの抗Ｎｏｔｃｈ３抗体（５Ｅ１）又は対照ＩｇＧ１の週１回の注射で処置した２月〜６月齢のＴｇＰＡＣ−Ｎｏｔｃｈ３Ｒ１６９Ｃマウスを調べた。追加の６月齢の野生型マウスの未処置群を平行して試験した。抗Ｎｏｔｃｈ３抗体で処置したＴｇＰＡＣ−Ｎｏｔｃｈ３Ｒ１６９Ｃマウスは、有意に改善されたパッシブ直径を有した。これは、未処置の６ｍｏ  ＷＴマウスとは有意に異なることはないが、ＩｇＧ１で処置したＴｇＰＡＣ−Ｎｏｔｃｈ３Ｒ１６９Ｃマウスとは有意に異なった（図４ｂｉｓ  Ａ）。さらに、抗Ｎｏｔｃｈ３抗体で処置したＴｇＰＡＣ−Ｎｏｔｃｈ３Ｒ１６９Ｃマウスは、正常化された筋原性応答を有し、これは未処置の６ｍｏ  ＷＴマウスと同等であった（図４ｂｉｓ  Ｂ）。それ故、これらのデータは、５Ｅ１などの抗Ｎｏｔｃｈ３抗体を用いた受動免疫化が、脳動脈のレベルで作用して内部リモデリングを防ぎ、筋原性緊張を低減させたことを示す。
【００４１】
したがって、潜在的な仮説に束縛されるものではないが、本発明の発明者らは、Ｎｏｔｃｈ３のエクトドメインドメイン（Ｎｏｔｃｈ３ＥＣＤ）に結合している抗Ｎｏｔｃｈ３抗体が、ＣＡＤＡＳＩＬに罹患している患者を助け得る疾患修飾治療を提供することを示した。
【００４２】
背景の項で概説したように、Ｎｏｔｃｈ３は、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２及びＮｏｔｃｈ４も含むより大きな受容体ファミリーに属する。
【００４３】
Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３及びＮｏｔｃｈ４を過剰発現することによって、異なる生物学的応答が観察されている。これらの作用は、特定のＮｏｔｃｈ受容体に依存して、細胞増殖、アポトーシス、並びに炎症応答及び線維化促進応答を含む。例えば、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２及びＮｏｔｃｈ４は、ヒト及び実験腎疾患における傍糸球体細胞及び尿細管細胞において観察されている（Shanzes-Nino et al., J Pathol 2012:228:266-273）。５Ｅ１などの治療用抗体による任意の副作用を回避するために、可能な限りその標的に対して特異的な抗体であることが望ましい。
【００４４】
これらの副作用を回避するために、本発明は、それ故、Ｎｏｔｃｈ１又はＮｏｔｃｈ２に本質的に結合しない、より好ましくはＮｏｔｃｈ４などの他の関連Ｎｏｔｃｈ受容体にも本質的に結合しない、抗Ｎｏｔｃｈ３抗体又はその断片に関する（実施例２）。抗体５Ｅ１は、これらの特性を有する点で本発明の実例であり、Ｎｏｔｃｈ３に極めて特異的である。５Ｅ１は、ヒトＮｏｔｃｈ１にもヒトＮｏｔｃｈ２にも結合しない（Joutel, A et al. 2000. J Clin Invest 105 (5): 597-605）。
【００４５】
１つの実施態様において、本発明は、Ｎｏｔｃｈ１又はＮｏｔｃｈ２の２倍、４倍又は１０倍高いＮｏｔｃｈ３への親和性を有する治療用Ｎｏｔｃｈ３抗体又はその断片に関する。別の実施態様において、Ｎｏｔｃｈ３抗体又は断片は、Ｎｏｔｃｈ１又は２に本質的に結合しない。なおさらなる実施態様において、Ｎｏｔｃｈ３抗体又は断片は、Ｎｏｔｃｈ１、２又は４に本質的に結合しない。
【００４６】
結合は、例えば、可溶性形態のリガンドとしての抗原及び検体としての抗体を使用したBIAcore 3000 装置での表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって決定され得る。
【００４７】
１つの実施態様において、Ｎｏｔｃｈ３抗体又は断片は、ヒトＮｏｔｃｈ３のアミノ酸４０−１６４３（配列番号：３）を含むエピトープ、例えばヒトＮｏｔｃｈ３のアミノ酸６５７−８４６（配列番号７）に含まれるエピトープに結合している。
【００４８】
本発明は、治療に使用するための抗体又はその断片に関する。したがって、本発明は、ＣＡＤＡＳＩＬに罹患している又はそのリスクのある患者を処置するための動脈内（i.a.）方法であって、Ｎｏｔｃｈ３ＥＣＤに結合する抗体がそのような患者にそのような病態若しくはリスクを処置するのに有効な量で投与されるか、又はＮｏｔｃｈ３の断片がそのような患者にＮｏｔｃｈ３ＥＣＤに結合する抗体の産生を誘導するワクチンを構成するのに十分な量及び処方で投与される方法に関する。そのような断片は、アミノ酸４０−１６４３（配列番号：３）の断片であるか又は前記断片を含み得る（例えば、ヒトＮｏｔｃｈ３のアミノ酸６５７−８４６（配列番号７）であるか又は前記アミノ酸を含む断片）。
【００４９】
特に、本発明は、治療に使用するための抗体又はその断片に関し、前記抗体又は断片は、以下を含む：
配列番号：８を含む重鎖可変領域Ｈ−ＣＤＲ１
配列番号：９を含む重鎖可変領域Ｈ−ＣＤＲ２
配列番号：１０を含む重鎖可変領域Ｈ−ＣＤＲ３
配列番号：１２を含む軽鎖可変領域Ｌ−ＣＤＲ１
配列番号：１３を含む軽鎖可変領域Ｌ−ＣＤＲ２、及び
配列番号：１４を含む軽鎖可変領域Ｌ−ＣＤＲ３。
【００５０】
別の実施態様において、抗体又はその断片は、配列番号：１１を含む重鎖可変領域を含み、かつ／又は、配列番号：１５を含む軽鎖可変ドメインを含む。
【００５１】
抗体又はその断片は、当業者に公知の方法によって完全に又は部分的にヒト化され得、それによって、例えば、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植される。
【００５２】
抗体又はその断片は、治療において、特にＣＡＤＡＳＩＬ患者において有用である。
【００５３】
また、ヒトＮｏｔｃｈ３のアミノ酸４０−１６４３（配列番号：３）、例えばヒトＮｏｔｃｈ３のアミノ酸６５７−８４６（配列番号７）が、治療における及びＣＡＤＡＳＩＬを処置するための活性ワクチン戦略において使用され得ることが想定される。ヒトＮｏｔｃｈ３の前記配列４０−１６４３又は６５７−８４６の、例えば、４アミノ酸、５アミノ酸、７アミノ酸、１０アミノ酸若しくはより長いサイズの断片、又は例えば５〜１０、５〜１５若しくは５〜２０アミノ酸の範囲の断片が、患者へのワクチン接種のために、単独で又は水酸化若しくはリン酸アルミニウムなどの適切な補助剤と組み合わせて使用され得る。
【００５４】
好適な投与量範囲は、１ワクチン接種当たり活性成分が数百マイクログラム程度であり、好ましい範囲は、約０．１pg〜２，０００ug（１〜１０mg範囲のより高い量が検討されるにもかかわらず）、例えば、約０．５ug〜１，０００ugの範囲、好ましくは１ug〜５００ugの範囲、とりわけ約１０ug〜１００ugの範囲である。
【００５５】
初期投与及び追加接種のための好適なレジメンもまた変更可能であるが、初期投与とそれに続くその後の接種又は他の投与が典型的である。
【００５６】
適用の手法は広く変更され得る。ワクチンの投与のための従来法のいずれも適用可能である。これらは、固体の生理学的に許容し得る基剤上での又は生理学的に許容し得る分散液中での経口適用、非経口的に注射による適用などを含む。ワクチンの投与量は、投与経路に依存し、ワクチン接種を受ける人の年齢及び抗原の製剤化に応じて変化する。
【００５７】
また、当該処置が、適切な標識によって標識された抗Ｎｏｔｃｈ３抗体を使用して沈着物の量を測定することによって疾患の治療の進行を診断する工程を含み得ることも想定される。標識の選択は、検出の手段に依存する。例えば、希土類キレート（例えば、ユウロピウムキレート）、フルオレセイン型標識（例えば、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、５−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン）、ローダミン型標識（例えば、ＴＡＭＲＡ又はダンシルクロリド）、フィコエリスリン；ウンベリフェロン、リサミン；シアニン類；フィコエリスリン類、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−ＳＥ、又はその類似体などの蛍光標識が光学検出に好適である。化学発光標識が採用され得る（例えば、ルミノール、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びイクオリン）。常磁性標識及び放射性標識もまた採用され得、好ましくはＰＥＴ又はＳＰＥＣＴを使用して検出される。そのような放射性物質は、限定されないが、ビスマス（２１３Ｂｉ）、炭素（１４Ｃ）、クロム（５１Ｃｒ）、コバルト（５７Ｃｏ）、フッ素（１８Ｆ）、ガドリニウム（１５３Ｇｄ、１５９Ｇｄ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、ゲルマニウム（６８Ｇｅ）、ホルミウム（１６６Ｈｏ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、ランタン（１４０Ｌａ）、ルテチウム（１７７Ｌｕ）、マンガン（５４Ｍｎ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、リン（３２Ｐ）、プラセオジム（１４２Ｐｒ）、プロメチウム（１４９Ｐｍ）、レニウム（１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ）、ロジウム（１０５Ｒｈ）、ルテニウム（９７Ｒｕ）、サマリウム（１５３Ｓｍ）、スカンジウム（４７Ｓｃ）、セレン（７５Ｓｅ）、ストロンチウム（８５Ｓｒ）、硫黄（３５Ｓ）、テクニチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、スズ（１１３Ｓｎ、１１７Ｓｎ）、トリチウム（３Ｈ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、イッテルビウム（１６９Ｙｂ、１７５Ｙｂ）、イットリウム（９０Ｙ）、亜鉛（６５Ｚｎ）；種々の陽電子放射断層撮影を使用する陽電子放出金属、及び非放射性常磁性金属イオンを含む。
【実施例】
【００５８】
実施例１
ハイブリドーマクローン５Ｅ１の生成
６個のヒスチジン残基のＣ末端ストレッチを有するヒトＮｏｔｃｈ３タンパク質の細胞外エピトープ（アミノ酸６５７−８４６）をコードするヒトＮｏｔｃｈ３  ｃＤＮＡを、強力なバキュロウイルスポリヘドリンプロモーターの制御下でｇｐ６７シグナルペプチド融合タンパク質として発現させるために、ｐＡＣＧＰ６７Ｂバキュロウイルス補完導入ベクター（complementing transfer vector）（Pharmingen）に挿入した。Insectin-Plus（商標）試薬（Invitrogen）を使用して、その導入プラスミドと致死欠失を含有する改変バキュロウイルスＤＮＡ（BaculoGold （商標）DNA, Pharmingen）を一緒に、単一層として成長させたＳｆ９細胞にトランスフェクトした。ウイルスプラークアッセイによって組み換えバキュロウイルスを同定及び精製し、そして、サザンブロットによってＮｏｔｃｈ３  ｃＤＮＡの存在を確認した。次に、Ｎｏｔｃｈ３  ｃＤＮＡを有する組み換えバキュロウイルスを増幅させて、高力価溶液（１０８〜１０９個のウイルス粒子／ml）を得た。組み換えタンパク質を産生させるために、Ｔ１７５培養フラスコ内のウシ胎児血清（２０ml）（Biowhittaker, Boehringer）を含有するGrace培地中で単一層として成長させた５．１０７個のＳｆ９細胞に高力価原液１．５mlを感染させ、２７℃で３〜４日間インキュベートした。次に、組み換えタンパク質を含有する上清を採取し、硫酸アンモニウム（６０％）沈殿によって濃縮した。ペレットを、３００mM ＮａＣｌ  ５０mM ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ８．０）中に再懸濁し、同じ緩衝液で一晩透析した。透析した上清をＮｉ２＋アガロースビーズ上で精製して、２５０mMイミダゾールを含有する透析緩衝液中に組み換えタンパク質を溶出させた。タンパク質の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析及びクーマシーブルー染色によってチェックした。
【００５９】
ハイブリドーマを、組み換えタンパク質で免疫化されたマウス由来のミエローマ細胞と脾臓細胞を融合することによって得た。ハイブリドーマの培養上清を、以下の実施例２に記載するとおり免疫蛍光及び免疫ブロットによってスクリーニングして、Ｎｏｔｃｈ３タンパク質産物を認識するがＮｏｔｃｈ１タンパク質産物とＮｏｔｃｈ２タンパク質産物のいずれも認識しない抗体を産生するハイブリドーマのみを同定及び選択した。陽性ハイブリドーマをさらにクローニングして、「５Ｅ１」と呼ばれるものを含む数種のクローンを生成した。
【００６０】
実施例２
５Ｅ１のためのスクリーニングアッセイ
２９３Ｔ細胞を、８ウェルのNunc（登録商標）Lab-Tek（登録商標）II カバーガラスチャンバー（chambered coverglass）中で成長させ、ヒト完全長Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２若しくはＮｏｔｃｈ３  ｃＤＮＡをコードするプラスミド又は空のベクタープラスミドをリン酸カルシウム沈殿によって一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、細胞をエタノール中で固定し、５Ｅ１抗Ｎｏｔｃｈ３、抗ヒトＮｏｔｃｈ１、抗ヒトＮｏｔｃｈ２一次モノクローナル抗体及び適切なＦＩＴＣコンジュゲート抗体を使用する免疫蛍光用に処理した。５Ｅ１抗体は、Ｎｏｔｃｈ３構築物をトランスフェクトした２９３Ｔ細胞を染色し、Ｎｏｔｃｈ１又はＮｏｔｃｈ２構築物をトランスフェクトした細胞を染色しなかったが、抗Ｎｏｔｃｈ１及び抗Ｎｏｔｃｈ２抗体は後者の細胞をそれぞれ標識した。
【００６１】
２９３Ｔ細胞を６ウェルプレート中で培養し、ヒト完全長Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２又はＮｏｔｃｈ３  ｃＤＮＡをコードするプラスミドをリン酸カルシウム沈殿によって一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、細胞を採取し、ＲＩＰＡ緩衝液中で溶解した。試料を１×ＳＤＳ-Laemmli緩衝液に適応させ、６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に流し、そして、ニトロセルロースメンブレン上に転写した。免疫検出を、５Ｅ１抗体又はヒトＮｏｔｃｈ１若しくはＮｏｔｃｈ２に対して特異的な抗体及びセイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウス抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, Pennsylvania, USA）との連続インキュベーション、続く、増強化学発光検出（ＥＣＬ；Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA）によって実施した。５Ｅ１抗体は、Ｎｏｔｃｈ３構築物をトランスフェクトした２９３Ｔ細胞において、完全長Ｎｏｔｃｈ３前駆体（約２８０kDa）並びにＮｏｔｃｈ３ＥＣＤ断片（約２１０kDa）を検出した。重要なことに、Ｎｏｔｃｈ１又はＮｏｔｃｈ２構築物をトランスフェクトした２９３Ｔ細胞では、５Ｅ１抗体は、Ｎｏｔｃｈ１タンパク質産物とＮｏｔｃｈ２タンパク質産物のいずれも検出しなかった。
【００６２】
実施例３
Ｏｃｔｅｔ結合系を使用したＮＯＴＣＨ３に対する５Ｅ１の相対的親和性の決定
速度論分析を、ForteBio社のOctet RED技術を使用して、製造業者の指示に従って実施した。ビオチン化したＮＯＴＣＨ３  ６５７−８４８を、ストレプトアビジンチップ上に、各々約３ＲＵのレベルで固定化した。その後の５Ｅ１抗体との会合及び解離を、３３３nM〜３，３nMの範囲の濃度で分析した。続いて、ForteBio Data Analysis 7.0 ソフトウェアを使用してデータ分析を行った（図１）。
【００６３】
実施例４
５Ｅ１の配列決定
RNeasy Mini Kitを使用し、製造業者のプロトコール（Quiagene Sciences, Valencia, CA）に従って、ハイブリドーマ細胞ペレットからトータルｍＲＮＡを抽出した。Superscriptase III kit（Invitrogene, Carlsbad, CA）を使用し、オリゴ（ｄＴ）プライマーを用いた逆転写によってＲＮＡからｃＤＮＡを作製した。可変ドメインプライマーを使用してモノクローナル抗体のＶＨ領域とＶＬ領域の両方を増幅するＰＣＲ反応は、Ｉｇ可変ドメインプライマーのいくつかの組み合わせを使用する（High Fidelity PCR systems, Roche）。
【００６４】
ＶＨ及びＶＬ産物をInvitrogen sequencing vector pCR2.1中にクローニングし、ＴＯＰ１０細胞に形質転換し、そして、ＰＣＲによって陽性形質転換体についてスクリーニングした。選択したコロニーを選び取り、ABI3130xl Genetic AnalyzerでのＤＮＡ配列決定によってこれを分析した。
【００６５】
ＶＨアミノ酸配列：
【表１】
2017538663.tif 000003
【００６６】
ＶＬアミノ酸配列：
【表２】
2017538663.tif 000004
【００６７】
可変ドメインを太字で強調する。
【００６８】
相補性決定領域（ＣＤＲ）に、ＩＭＧＴナンバリングシステムによって決定されたとおり下線を引いている（Lefranc, M.-P. et al., Nucleic Acids Research, 27, 209-212 (1999)）。
【００６９】
実施例５
方法に使用するためのマウス
ＴｇＰＡＣ−Ｎｏｔｃｈ３Ｒ１６９Ｃ（８８系統）を、以前に記載されているとおりＦＶＢ／Ｎバックグラウンドの異型接合状態で維持した（Joutel A, Monet-Lepretre M, Gosele C, Baron-Menguy C, Hammes A, Schmidt S, Lemaire-Carrette B, Domenga V, Schedl A, Lacombe P, Hubner N. 2010. “Cerebrovascular dysfunction and microcirculation rarefaction precede white matter lesions in a mouse genetic model of cerebral ischemic small vessel disease.”J Clin Invest 120(2):433-45）。これらのマウス及びそれらの野生型の対照同腹仔を、パリ・ディドゥロ大学（Paris Diderot University）（Paris, France）のヴィルマンサイト（Villemin site）の動物施設内で繁殖させた。マウスを通常の明／暗サイクル（１２時間）下で飼育し、標準的な齧歯動物用飼料及び水道水を自由に摂取させた。ここに記載する実験は全て、発明者らの施設内動物管理使用委員会（local institutional animal care and use committee）（n9 Lariboisiere-Villemin）のガイドラインに十分に従い、使用する動物数を最小限に抑えるようあらゆる努力をしながら実施した。
【００７０】
実施例６
方法に使用する注射用抗体
５Ｅ１モノクローナル抗体（アイソタイプＩｇＧ１）を、ヒトＮｏｔｃｈ３のＥＧＦＲ１７−２１（アミノ酸残基６５７−８４６）に由来する組み換えタンパク質に対して作製した；それは、ヒト、マウス及びラットＮｏｔｃｈ３を認識する（Joutel, A et al . 2000. “The Ectodomain of the Notch3 Receptor Accumulates within the Cerebrovasculature of CADASIL Patients.” J Clin Invest 105 (5): 597-605）。ヒトpyro-Glu Abeta に対する５Ｃ９Ｅ７マウスモノクローナル抗体（アイソタイプＩｇＧ１）及びニワトリ卵白リゾチームに対するマウスモノクローナル抗体（アイソタイプＩｇＧ１）を対照抗体として使用した。全ての抗体をＰＢＳで透析した。
【００７１】
実施例７
抗体血漿中動態の決定
ＴｇＰＡＣ−Ｎｏｔｃｈ３Ｒ１６９Ｃマウス（ｎ＝１０匹の雄及び１０匹の雌；６週齢、体重範囲：１６〜２６ｇ）に、１０mg/kgの５Ｅ１の単回腹腔内注射を受けさせた。マウスを５つの別個の群に無作為に割り当てた（１群当たりｎ＝２匹の雄及び２匹の雌）。群１では、血漿試料を注射の１５分及び２４時間後に回収し；群２では、血漿を注射の３０分及び４８時間後に回収し；群３では、血漿を注射の１時間及び９６時間後に回収し；群４では、血漿を注射の４時間及び１週間後に回収し、そして、群５では、血漿を注射の８時間及び２週間後に回収した。５匹の未注射のＴｇＰＡＣ−Ｎｏｔｃｈ３Ｒ１６９Ｃマウス（ｎ＝５匹の雌；６週齢、体重範囲１８〜２２ｇ）を対照として使用した。２回目の血液サンプリング後直ちに、全てのマウスを屠殺して組織を採取した。抗体の血漿中レベルを決定した。Ｔ１／２は６〜７日であることが決定され、そして、Ｃｍａｘ（４時間）は約５００ug/mlであった。遊離血漿ｍＡｂレベルの定量化を、標準として５Ｅ１及びＮｏｔｃｈドメインコートプレートを使用して実施した。
【００７２】
実施例８
Ｎｏｔｃｈ３ＥＣＤ沈着物のインビボ抗体認識の決定
５Ｅ１及び対照５Ｃ９Ｅ７抗体を濃縮し、Ａｌｅｘａ４８８分子にコンジュゲートさせた。１０〜１２月齢で、ＴｇＰＡＣ−Ｎｏｔｃｈ３Ｒ１６９Ｃマウスは、脳血管と末梢血管の両方に広範なＮｏｔｃｈ３ＥＣＤ沈着物を示す。１０〜１２月齢のＴｇＰＡＣ−Ｎｏｔｃｈ３Ｒ１６９Ｃマウス又は野生型マウス（１処置当たりｎ＝４匹）に、１０mg/kg（体重）の５Ｅ１又は対照ＩｇＧ１抗体（Ａｌｅｘａコンジュゲート又は非コンジュゲート）を腹腔内注射した。３日後、ペントバルビタールナトリウム（８０mg/kg）でマウスに深い麻酔をかけ、リン酸緩衝液（ＰＢ）で経心腔的にフラッシュ潅流した。脳及び末梢組織を採取し、液体窒素中で凍結し、−８０℃で保存した。次に、凍結切片（１２μm）を、直接蛍光によって分析するか、あるいは、マウス免疫グロブリンに対するＡｌｅｘａ４８８コンジュゲート抗体（１：５００、Life technologies）を、ｍｕｓＮｏｔｃｈ３のＮ末端（Ａｌａ４０−Ｇｌｕ４６８）に対する抗体（１：２０００希釈；R&D AF 1308）と一緒に用いて共免疫標識し、二次抗ヤギＡｌｅｘａ５９４（１：５００、Life technologies）で検出するか、又は組み換えラットＮＯＴＣＨ３タンパク質（ａａ  ６４９−８５９、配列ＮＰ＿０６４４７２）に対する抗体（１：１６，０００希釈）を一緒に用いて、二次Ａｌｅｘａ５９４抗ウサギ（１：５００、Life technologies）で検出した。切片を洗浄し、ＰＢＳ中のＤＡＰＩ（１：１０，０００；Sigma-Aldrich）を用いて室温で５分間対比染色し、１滴のＤａｋｏ蛍光マウンティングメディウムでマウントし、そして、落射蛍光イメージング（Nikon eclipse 80i）に供した。結果を図２及び２ｂｉｓに示す。
【００７３】
実施例９
インビボ標的捕捉の組織学
５Ｅ１又は対照の卵白ＩｇＧ１の急性標的捕捉を２月齢のＴｇＰＡＣ−Ｎｏｔｃｈ３Ｒ１６９Ｃマウスで評価した。マウス（１処置当たりｎ＝４匹）に１０mg（抗体）/kｇ（体重）を腹腔内注射した。７２時間後、ペントバルビタールナトリウム（８０mg/kg）でマウスに深い麻酔をかけ、リン酸緩衝液（ＰＢ）で経心腔的にフラッシュ潅流し、脳及び腎臓を摘出し、液体窒素中で凍結し、−８０℃で保存した。アセトン固定した凍結連続切片（１２μm）を、Ｎｏｔｃｈ３ＥＣＤ沈着物を捕捉したマウス抗体を可視化するために、Ａｌｅｘａ５９４コンジュゲート抗マウス抗体で染色し、Ａｌｅｘａ４８８コンジュゲート５Ｅ１、又は二次抗ヤギＡｌｅｘａ４８８コンジュゲートＩｇＧで検出するｍｕｓＮｏｔｃｈ３のＮ末端に対する抗体（１：２０００希釈；R&D AF 1308）、又は二次Ａｌｅｘａ４８８抗ウサギ（１：５００、Life technologies）で検出する組み換えラットＮＯＴＣＨ３タンパク質（ａａ  ６４９−８５９、配列ＮＰ＿０６４４７２）に対する抗体（１：１６，０００希釈）のいずれかで共免疫標識して、Ｎｏｔｃｈ３ＥＣＤ沈着物の総量を決定した。結果を図２及び２ｂｉｓに示す。
【００７４】
実施例１０
受動免疫化
実験マウスを２つの群に分けた。第一群について、２月齢のＴｇＰＡＣ−Ｎｏｔｃｈ３Ｒ１６９Ｃ雄性マウスを無作為化し、１０mg/kgの５Ｅ１又は対照卵白ＩｇＧ１を４か月間にわたり週１回腹腔内投与した。投与の最後に、マウス（１処置当たりｎ＝１２〜１４匹）をインビボ脳血管反応性又は加圧軟膜動脈のアクティブ及びパッシブ直径の測定値について分析し、続いて、脳を摘出して血管のＮｏｔｃｈ３ＥＣＤ及びＧＯＭ沈着物を定量化し、そして、血漿を回収して抗体レベルを決定した。第二の群は、未処置ＴｇＰＡＣ−Ｎｏｔｃｈ３Ｒ１６９Ｃ及び野生型雄性マウス（ｎ＝３０）を含み、平均２月齢の研究開始時にＮｏｔｃｈ３ＥＣＤ及びＧＯＭ沈着物の初期荷重量並びに初期脳血管機能を決定し、そして、平均６月齢の研究終了時に脳血管機能障害の範囲を追跡調査するため分析した。結果を図３及び４に示す。
【００７５】
実施例１１
Ｎｏｔｃｈ３ＥＣＤ及びＧＯＭ沈着物の定量分析
マウスにイソフルランを過量投与し、断頭し、そして脳を摘出した。Ｎｏｔｃｈ３ＥＣＤ沈着物の免疫検出のために、半分の脳を液体窒素中で凍結し、−８０℃で保存した。アセトン固定した凍結切片（１２μm）を、（１）ヤギポリクローナル抗Ｎｏｔｃｈ３ＥＣＤ（１：２０００希釈；R&D AF 1308）又は組み換えラットＮＯＴＣＨ３タンパク質（ａａ  ６４９−８５９、配列ＮＰ＿０６４４７２）に対するウサギポリクローナル抗体（１：１６，０００希釈）、（２）ウサギポリクローナル抗コラーゲンＩＶ（αＣｏｌＩＶ）（１：２５０希釈；Novotec 20411）又はラットモノクローナル抗ペルレカン（１：１０００希釈；クローンＡ７Ｌ６、Millipore）及び（３）ＦＩＴＣコンジュゲートアルファ平滑筋アクチン（ＳＭＡ）（１：２５００希釈、Sigma-Aldrich）、続いて、適切な二次抗体（抗ヤギＡｌｅｘａ５９４、抗ウサギＡｌｅｘａ５９４、抗ウサギＡｌｅｘａ３５０又は抗ラットＡｌｅｘａ３５０）（１：５００、Life technologies）で染色した。染色した切片を、Nikon 80i エクリプス顕微鏡を使用して４０×の倍率設定で撮像し、そして、デジタルカメラ（Nikon）及びNIS Elements BR v 3.0 ソフトウェア（Nikon）を使用してこれを取得した。比較した群全体にわたり同一の設定とした。
【００７６】
Ｎｏｔｃｈ３ＥＣＤ沈着物の定量分析のために、本発明者らはImageJソフトウェアを使用した：全ての画像の平均柔組織バックグラウンド強度値を固定値に設定し、血管の境界線について手動で輪郭を描き、次に、血管領域を「粒子解析（Analyze Particles）」機能によって分析した。動脈をＳＭＡで陽性染色された血管として同定し、毛細血管をコラーゲンＩＶ又はペルレカンで陽性染色された血管及びＳＭＡで陰性染色された血管（直径＜１０μm）として規定した。３つの非連続切片の平均を使用して、マウス毎のＮｏｔｃｈ３ＥＣＤの荷重量を表した。結果を血管領域又は長さに対する沈着物の数として表す。全ての分析を盲検的に実施した。
【００７７】
ＧＯＭ沈着物の検出のために、半分の脳をCARSON溶液中で固定した。中大脳動脈及び周囲の脳組織を顕微鏡下で解剖し、以前に記載されているとおりEpon E812 樹脂中に包埋し（Joutel A, Monet-Lepretre M, Gosele C, Baron-Menguy C, Hammes A, Schmidt S, Lemaire-Carrette B, Domenga V, Schedl A, Lacombe P, Hubner N. 2010. “Cerebrovascular dysfunction and microcirculation rarefaction precede white matter lesions in a mouse genetic model of cerebral ischemic small vessel disease.”J Clin Invest 120(2):433-45)。半分の薄切片をウルトラミクロトーム (Leica EM EC7）で切断し、１％トルイジンブルーで染色し、そして、光学顕微鏡検査によってスクリーニングして中大脳動脈を含有する領域を選択した。対象の領域の超薄切片を切断し、銅格子上にマウントし、酢酸ウラニル及びクエン酸鉛で対比染色し、そして、透過型電子顕微鏡（Philips CM100）によって調べた。電子顕微鏡写真画像を、デジタルカメラを使用して倍率７，４００で取得した。マウス毎に、動脈輪（平均直径６０〜８０μm）をPhotoShopで再構築した。ＧＯＭ沈着物の数を、平滑筋細胞の反管腔側の外周上で盲検的にカウントした。結果をＧＯＭ沈着物の数／１００μmとして表し、図３上に示す。
【００７８】
実施例１２
脳血管反応性のインビボ分析
マウスにイソフルラン（維持、２％）で麻酔をかけ、次にマウスに挿管し、そして、動脈のＰＯ２が１２０〜１３０mmHg及びＰＣＯ２が３３〜３６mmHgになるように調整したＯ２／Ｎ２混合物を人工的に通気した。動脈圧の記録のために及び血中ガス決定のための血液サンプリングのために、大腿動脈にカニューレを挿入した。直腸温度を、加温パッドに接続されたサーモスタット制御の直腸プローブを使用して３７℃に維持した。外科手術後、イソフルランを徐々に中断し、ウレタン（７５０mg/kg、i.p.）及びα−クロラロース（５０mg/kg、i.p.）で麻酔を維持した。麻酔のレベルを、角膜反射及びテールピンチに対する応答を試験することによってモニタリングした。
【００７９】
頭頂骨（２×２mm）にドリルで小さな穴を開けることによって体性感覚皮質をむき出しにし、硬膜を摘出し、そして、その部位を改変リンガー（Ringer）溶液（３７℃；ｐＨ７．３〜７．４）で灌流した。この開けた頭蓋窓の脳血流（ＣＢＦ）を、脳表面上に定位に的位置付けてコンピューターデータ収集システム（Powerlab, Chart）に接続したレーザードップラー血流計プローブ（Moor Instruments, MBF3-Dual, Axminster, Devon, UK）を使用してモニタリングした。レーザードップラー血流計プローブは、微小血管の血流を１−ｍｍ３組織体積で検出する。流量計及び血圧トランスデューサーの出力をコンピューターデータ収集システム（Powerlab, Chart）に接続した。動脈圧及び血中ガスが定常状態であった場合に、外科手術及びイソフルラン中断の最後の３０±５分後に実験を開始した。頭蓋窓の反対側のひげを、綿棒を用いて３〜４Ｈｚの周波数で１分間優しく撫で、ひげ刺激に対するＣＢＦ応答を記録した。アセチルコリン（１０μM；Sigma）、ブラジキニン（５０μM；Sigma）、カルシウムイオノホアＡ２３１８７（３μM；Sigma）及びＮＯ非依存性血管拡張剤アデノシン（４００μM；Sigma）に対するＣＢＦ応答もまた試験した。ＣＢＦを安静レベルに対する増加率として表した。結果を図４に示す。
【００８０】
実施例１３
筋原性緊張及び動脈リモデリングのエクスビボ分析
ＣＯ２を過量投与した後、マウスを断頭し、その脳を摘出した。後大脳動脈の動脈セグメントを解剖し、３７℃に維持した生理的食塩水（ＰＳＳ）（ｐＨ７．４）を含有する臓器チャンバー中、２個のガラスマイクロピペットでカニューレを挿入し、そして、動脈波形システム（Living Systems Instrumentation, Inc., VT, USA）を使用して加圧した。作製したら、基礎緊張分析を開始する前に５０mmHgの圧力で少なくとも３０分間動脈を安定化させた。圧力サーボ制御ポンプを使用して１０〜１００mmHgで段階的に管腔内圧を増加させることによって、筋原性緊張を決定した。ＣＣＤカメラ及びエッジ検出ソフトウェア（Biopac MP150 and AcqKnowledge software, Biopac Systems Inc, CA, USA）を使用して血管の内径を連続して記録した。ＰＳＳ中で測定した直径をアクティブ直径とした。各実験の最後に、ＥＧＴＡ（２〜５mmol/L、Sigma）及びニトロプルシドナトリウム（１０μmol/L、Sigma）を含有する公称上Ｃａ２＋フリーのＰＳＳ中で最大膨張を得た。加圧工程を繰り返して動脈のパッシブ直径を決定した。動脈直径をマイクロメーターで示す。筋原性緊張をパッシブ直径の百分率として表す（［パッシブ直径−アクティブ直径］／パッシブ直径×１００）。結果を図４ｂｉｓに示す。
【図１】
2017538663.tif 000005
【図２】
2017538663.tif 000006
【図２ｂｉｓ】
2017538663.tif 000007
【図３】
2017538663.tif 000008
【図４】
2017538663.tif 000009
【図４ｂｉｓ】
2017538663.tif 000010
【図５】
2017538663.tif 000011
【図６】
2017538663.tif 000012
【配列表】
2017538663000001.app
【国際調査報告】
2017538663.tif 000013
2017538663.tif 000014
2017538663.tif 000015
2017538663.tif 000016