(57)【要約】増加した増殖能、減少した老化および向上した再生能を得るための改変された細胞であって、その改変は、コード配列を細胞内に挿入できる遺伝子ベクターを使用して得られるＨＯＸＢ７過剰発現を含み、それにより増加したタンパク質産生を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
原形質膜によって囲まれ、核が存在する細胞質を含む、ＨＯＸファミリーのタンパク質を過剰発現する改変細胞であって、前記タンパク質は、細胞質および核に局在化するタンパク質である、改変細胞。
【請求項２】
前記タンパク質は前記細胞からの分泌タンパク質である、請求項１に記載の改変細胞。
【請求項３】
前記細胞はＨＯＸＢ７タンパク質である、請求項１に記載の改変細胞。
【請求項４】
前記細胞はＤＮＡ相互作用ドメインを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の改変細胞。
【請求項５】
前記タンパク質はヒト由来である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の改変細胞。
【請求項６】
骨組織を形成する能力が増加している、請求項１に記載の改変細胞。
【請求項７】
成長因子の産生を増加させるか、または成長因子の放出を増加させる、請求項１または６に記載の改変細胞。
【請求項８】
前記成長因子の少なくとも１つが、ｂＦＧＦ（またはＦＧＦ２）である、請求項７に記載の改変細胞。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のＨＯＸＢ７タンパク質の過剰発現を得る方法であって、
前記タンパク質についてのコード配列を保有する粒子を産生する工程と、
前記粒子を細胞と接触させ、前記粒子を細胞へ導入することによって前記細胞を遺伝子改変する工程と
を含む、方法。
【請求項１０】
前記粒子は、前記タンパク質についてのコード配列を保有するウイルス粒子を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞は動物またはヒト由来の細胞を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞は、幹（ｓｔａｍｉｎａｌ）／間質細胞を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞は、骨髄、脂肪、臍帯、月経液、羊水、滑液、歯髄、肝組織、肺組織、膵臓組織から選択される単離細胞を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
再生組織プロトコルにおける前記改変細胞の使用を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の改変細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、質を向上させるためにＨＯＸファミリーの転写因子を導入することによるヒトまたは動物の真核細胞の遺伝子改変に関する。
【背景技術】
【０００２】
様々な供給源から単離した幹細胞は前臨床および臨床再生医療用途において広範に使用されており、それらは主にそれらの増殖能および分化能を利用する（Ｃａｐｌａｎ  ａｎｄ  Ｂｒｕｄｅｒ、２００１）。
【０００３】
それにも関わらず、幹細胞のそれらの２つの重要な特性の基本的な分子機構は今もなお集中的に調査され続けている。なぜなら、それらのより深い理解は最適化された細胞療法を導く可能性があり、より長期間続く幹細胞作用を提供するからである。
【０００４】
幹細胞の再生能は、患者へそれを注入したとき、一次的であることが見出され（Ｄｏｍｉｎｉｃｉら、２００９；Ｌｉ  ａｎｄ  Ｌｉｎ、２０１２）、それらの比較的短時間の治療能が、造血幹細胞について示されているように、内因性および外因性の因子によって引き起こされ得ることを示唆している（Ｖａｎ  Ｚａｎｔ  ａｎｄ  Ｌｉａｎｇ、２０１２）。
【０００５】
それらの因子のうちの１つは細胞機能を加齢に伴って減少させ得る。加齢に伴う増殖能および分化能の減少に関する多数の証拠が存在する（Ａｌｔら、２０１２；Ｍａｒｅｓｃｈｉら、２００６；Ｓｅｔｈｅら、２００６；Ｓｔｅｎｄｅｒｕｐら、２００３；Ｗａｇｎｅｒら、２００８；Ｚａｉｍら、２０１２；Ｚｈｏｕら、２００８）。
【０００６】
ヒトにおける幹細胞老化は複雑であり、まだ十分に理解されていないプロセスであり、対照的に、老齢に特有の変性疾患を治療するために頻繁に示されているように、細胞療法の臨床改善および開発のために差し迫った必要性が存在している。
【０００７】
このプロセスに内在する分子機構の理解により、治療アプローチを最適化することができ、それにより細胞老化に影響を与え、それに対抗できる重要な因子の同定を導くことができる。
【０００８】
多数の観察研究が、ｍｉＲＮＡおよび遺伝子発現プロファイル評価によって、または老化をインビトロでの細胞の複製老化と関連付ける試みによって幹細胞老化についての分子マーカーを同定するために試みられている（Ａｌｔら、２０１２；Ａｌｖｅｓら、２０１２；Ｂｏｒｋら、２０１０；Ｐａｎｄｅｙら、２０１１；Ｓｉｅｇｅｌら、２０１３；Ｗａｇｎｅｒら、２００９；Ｚｈｏｕら、２００８）。これにも関わらず、幹細胞特性の年齢および老化に関連する機能障害の根底にある遺伝的特徴はまだ十分に理解されていない。
【０００９】
特定の細胞挙動を標的化し、それにより老化の作用に対抗し、組織防御を提供するのに重要な役割を果たし得る分子的因子としては、ホメオボックス（ＨＯＸ）遺伝子が挙げられる。
【００１０】
転写因子のこのファミリーは、胚発生の間、細胞および組織の同定および位置を決定するのに重要な役割を果たし、この活動は成人期の間も持続している可能性が高い。
【００１１】
ＨＯＸタンパク質の活動は、組織損傷に対する反応においてさえ、それらの増殖、分解、移動および付着を制御することによって幹細胞の挙動に顕著に影響を与える可能性がある（Ｇｅｒｓｃｈら、２００５；Ｌｅｕｃｈｔら、２００８）。
【００１２】
造血におけるＨＯＸタンパク質の役割は、レトロウイルス過剰発現の動物モデルならびにノックアウトおよびノックイントランスジェニックアプローチを使用して集中的に調査されており、それらの調節機能について明確な証拠が与えられている（Ａｒｇｉｒｏｐｏｕｌｏｓ  ａｎｄ  Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ、２００７）。
【００１３】
これらの転写因子の非常に重要な作用は、骨髄前駆細胞の増殖および自己再生を促進するそれらの能力である。
【００１４】
特定のＨＯＸ遺伝子の強制発現は骨髄増殖性疾患の発症を導く場合があるが、Ｈｏｘｂ４などの他の遺伝子は白血病発症を引き起こさずに幹細胞の増殖および増加を誘導することができ、臨床応用についての造血幹細胞操作のための有用で安全な治療アプローチとして記載されている（Ｓａｕｖａｇｅａｕら、１９９５）。
【００１５】
ＨＯＸタンパク質はまた、骨髄幹細胞の発生および分化を制御するのに重要な役割を果たす。
【００１６】
ＨＯＸ機能の損失を導く変異は、このファミリーの因子の機能的冗長性の結果として、表現型レベルで現れないので、造血細胞におけるＨＯＸ媒介作用の知見のほとんどは過剰発現の研究に由来する。
【００１７】
これらの研究は、造血前駆細胞におけるＨＯＸ遺伝子の過剰発現は、増殖の増加および分化結果の変化を誘導することを示している。
【００１８】
例えば、ＨＯＸＢ８の異所性発現は顆粒球分化を減少させ、単球分化を向上させるのに対して、ＨＯＸＡ３の過剰発現は顆粒球分化を促進し、単球分化を遮断する。
【００１９】
造血前駆細胞におけるＨＯＸＡ５またはＨＯＸＢ６過剰発現は赤血球生成を阻害し、ＨＯＸＡ１０過剰発現はリンパ球分化を遮断し、単球分化を向上させる。
【００２０】
骨髄前駆細胞の発生および機能におけるＨＯＸの重要な役割の明白な証拠にも関わらず、組織再生および修復の間のこの遺伝子の役割は十分に知られていない（Ｍａｈｄｉｐｏｕｒ  ａｎｄ  Ｍａｃｅ、２０１１）。
【００２１】
ＨＯＸ転写因子はまた、他の幹細胞、例えば間葉系前駆細胞の挙動を調節できる（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、ＭＳＣ）。
【００２２】
マウスモデルにおける観察研究は、ＨＯＸＢ２、ＨＯＸＢ５、ＨＯＸＢ７およびＨＯＸＣ４の存在が細胞増加および自己再生に関連している（Ｐｈｉｎｎｅｙら、２００５）が、ＨＯＸＡ７、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＡ３およびＨＯＸＢ１３などの他のＨＯＸ遺伝子はヒトＭＳＣの内皮細胞分化の制御に関与していることを示す。
【００２３】
さらに、ヒトＭＳＣのインビトロ分化の間のＨＯＸ遺伝子発現の分析は、ＨＯＸＡ７およびＨＯＸＢ３が顕著に上方制御されるのに対して、ＨＯＸＡ３およびＨＯＢ１３が十分に分化した前駆細胞において顕著に下方制御されることを示した（Ｃｈｕｎｇら、２００９）。
【００２４】
最後に、多くの証拠により、骨組織修復におけるＨＯＸタンパク質の重要な役割が示唆されている（Ｇｅｒｓｃｈら、２００５）。
【００２５】
このデータは、ＭＳＣ機能を制御する際のＨＯＸの役割を強く示唆しているが、それはまだ、細胞療法を最適化する目的で組織修復の間のＨＯＸ遺伝子の機能的役割を完全に評価するためのノックアウトおよびノックダウン研究ならびに過剰発現アプローチを実行できるモデルの欠如によって限定された観察データである（Ｍａｈｄｉｐｏｕｒ  ａｎｄ  Ｍａｃｅ、２０１１）。
【００２６】
ＨＯＸ遺伝子は転写因子として作用するので、それらは、それらのＤＮＡ相互作用ドメインを介して遺伝子プロモーターと結合することによって、さらなるタンパク質の産生を特に促進できる。
【００２７】
腫瘍細胞についての以前の研究は、ＨＯＸＢ７がｂＦＧＦ産生を誘導できることを示す（Ｃａｒｅら、２０１１）。
【００２８】
さらに、成長因子ｂＦＧＦが組換え因子として投与される場合、それは細胞増殖を促進でき、分化において重要な機能を有する（Ｔａｓｓｏら、２０１２）。
【００２９】
それにも関わらず、多くの証拠により、組換えタンパク質が細胞培養培地中で制限された安定性を有し、連続的な補充または安定性を増加させる介入を必要とすることが示されている。ＨＯＸＢ７はまた、血管形成に関与するＶＥＧＦを含む、様々なプロセスに関与するさらなる成長因子の産生を活性化する（Ｈｏｗら、２０１３）。
【００３０】
場合により、生体分子の産生および分泌を増加させるために遺伝子改変された幹細胞が、心筋梗塞後の血管再生、椎間板欠陥の再生、梗塞組織の修復、骨格組織の修復などの組織再生を促進する目的で実験モデルにおいて、および神経変性疾患におけるアジュバントとして、または腫瘍成長を阻害するために使用されている（Ｍｅｙｅｒｒｏｓｅら、２０１０）。
【００３１】
それにも関わらず、患者へ注入したときの幹細胞の再生能は一次的である（Ｄｏｍｉｎｉｃｉら、２００９；Ｌｉ  ａｎｄ  Ｌｉｎ、２０１２）。
【００３２】
エキソビボでの増加およびヒトＭＳＣ能力の最適化アプローチもまた、テロメラーゼ酵素タンパク質（ＴＥＲＴ）をコードする遺伝子を導入することによって研究されており、その活性は、テロメアの長さ、高度に反復されたＤＮＡの染色体末端領域を維持し、その進行性短縮は細胞老化と関連する可能性が高い。
【００３３】
テロメアの長さを維持することに加えて、ヒトＭＳＣにおけるＴＥＲＴの異所性発現が細胞生存を延長し、インビトロでの老化を遅延し、新生組織形成を導かずにインビボでの骨形成を向上させる（Ｓｉｍｏｎｓｅｎら、２００２）。
【００３４】
それにも関わらず、ＴＥＲＴの不死化活性に起因して、さらなる調査が、腫瘍を誘発し、それによりヒトの使用に不適切である可能性があり得る、このような改変細胞の安全な使用を確認するために必要とされる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３５】
本発明の１つの目的は従来技術を改善することである。
【００３６】
本発明の別の目的は、最適化されたエキソビボでの増加のために、ＨＯＸＢ７タンパク質を過剰発現させ、その増殖能を増加させ、その老化傾向を減少させるように細胞を誘導することによって細胞を改変することである。
【００３７】
本発明のさらなる目的は、インビボでの注入により、改変されたＨＯＸＢ７過剰発現細胞の治療有効性の期間を延長することである。
【００３８】
本発明の別の目的は、骨組織を産生するＨＯＸＢ７過剰発現細胞の増加した能力を利用することによって組織再生を促進することである。
【００３９】
本発明のさらに別の目的は、ＨＯＸＢ７改変細胞によって成長因子ｂＦＧＦの増加した自己分泌産生を得ることである。
【課題を解決するための手段】
【００４０】
一態様において、本発明は、請求項１に定義されるＨＯＸＢ７タンパク質を過剰発現する改変細胞を提供する。
【００４１】
さらなる態様において、本発明は、請求項９の特徴に定義される改変されたＨＯＸＢ７過剰発現細胞を産生する方法に関連する。
【００４２】
改変細胞を産生する方法は、
−  ＨＯＸＢ７タンパク質を過剰発現する細胞集団；
−  より迅速なエキソビボでの増加のために、改変細胞のより多くの増殖；
−  培養培地中で成長因子ｂＦＧＦを産生し、分泌できる細胞集団；
−  老化が少ない細胞集団；
−  骨組織産生のために適切に刺激された場合、より高い分化能を有する細胞集団；
−  インビボで骨再生を潜在的に促進できる細胞集団
を提供する。
【００４３】
さらなる態様において、本発明は、その特異的ｍｉＲＮＡ調節因子、ｍｉＲ−１９６ａおよびｍｉＲ−１９６ｂの過剰発現または下方制御によって、内因性ＨＯＸＢ７タンパク質の発現を調節することによってヒトまたは動物細胞に対して作用する能力を提供する。
【００４４】
さらなる態様において、本発明は、ｍｉＲ−１９６ａによる調節を受けやすいタンパク質についてのＨＯＸＢ７コード配列の下流に３’−非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）を付加することによって導入されるような遺伝子改変に対して作用する能力を提供する。
【００４５】
成長因子発現のための改変細胞の使用に関して、本発明は、単一の遺伝子配列を導入して様々なタンパク質の発現を制御することによって、より高い調節レベルで作用できる。
【００４６】
ＴＥＲＴタンパク質発現のための改変細胞の使用に関して、本発明の改変は不死化せずに増殖を刺激できる遺伝子を導入する。
【００４７】
本発明のさらなる態様は従属請求項に与えられる。
【００４８】
本発明は以下のさらなる利点を達成する：
−  細胞を不死化させずに改変細胞のより迅速な増加；
−  単一の発現制御遺伝子の挿入による複数のタンパク質産生の誘導；
−  特異的マイクロＲＮＡによってタンパク質発現を制御する可能性。
【００４９】
本発明のさらなる特徴および利点は、ＨＯＸＢ７過剰発現のために改変された細胞の好ましい非排他的な実施形態の詳細な説明を読んで、より容易に明らかになるであろう。それらは添付の図面において非限定的な例として示される。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】細胞の遺伝子改変のために使用された構築物の概略図である。
【図２】使用の際にベクターによってコードされた緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）によって放出された蛍光の量の評価による、構築物を使用した細胞形質導入の効率分析を示すグラフである。
【図３】改変細胞におけるＨＯＸＢ７発現の分析を示すグラフであり、リアルタイムＰＣＴによるメッセンジャー（ｍＲＮＡ）産生として、およびウェスタンブロッティングによるタンパク質としての両方で評価した。
【図４】より高いＨＯＸＢ７発現のために改変された初代細胞（画像ａ）および対応するＧＦＰ対照（画像ｂ）を示す顕微鏡画像を示し、矢印は、個々の細胞が画像（ｂ）よりも画像（ａ）において小さい細胞サイズを強調していることを示す。
【図５】物理的パラメーターＦＳＣおよびＳＳＣの細胞蛍光分析を示すグラフであり、それぞれ細胞サイズおよび内部複雑性を示している。
【図６】使用され、改変がなされている細胞を特徴付ける表面抗原を特徴付けている細胞蛍光分析を示すグラフである。
【図７】リアルタイムＰＣＲによるＫｉ６７  ｍＲＮＡ発現の分析を示すグラフである。
【図８】顕微鏡による細胞計数による改変細胞のインビトロでの細胞増殖および成長評価についてのグラフである。
【図９】クローン形成効率、すなわちインビトロでの細胞のコロニー形成能の評価についてのグラフである。
【図１０】老化細胞を特定する、ベータガラクトシダーゼ染色細胞の顕微鏡画像を示し、ＨＯＸＢ７改変細胞はＧＦＰ対照細胞より老化が少ないことを示す。
【図１１】改変細胞の培養物中のベータガラクトシダーゼ陽性細胞、すなわち老化細胞の定量についてのグラフである。
【図１２】改変細胞によって産生された成長因子ｂＦＧＦ  ｍＲＮＡの発現を示すグラフである。
【図１３】改変細胞によって放出されるｂＦＧＦタンパク質の量のＥＬＩＳＡ評価についてのグラフである。
【図１４】Ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色の顕微鏡画像である。
【図１５】改変細胞における染色した沈着物の定量を示すグラフである。
【図１６】アルカリホスファターゼ骨組織マーカー（ＡＬＰ）の発現を示すグラフであり、黒色は対照、すなわちＧＦＰを発現するが、ＨＯＸＢ７を発現しない空ベクターで改変された細胞を示し、灰色はより高いＨＯＸＢ７発現のために改変された細胞を示す。
【図１７】コラーゲン１（Ｃｏｌ１Ａ１）の発現を示すグラフであり、黒色は対照、すなわちＧＦＰを発現するが、ＨＯＸＢ７を発現しない空ベクターで改変された細胞を示し、灰色はより高いＨＯＸＢ７発現のために改変された細胞を示す。
【図１８】デコリン（ＤＣＮ）の発現を示すグラフであり、黒色は対照、すなわちＧＦＰを発現するが、ＨＯＸＢ７を発現しない空ベクターで改変された細胞を示し、灰色はより高いＨＯＸＢ７発現のために改変された細胞を示す。
【図１９】マイクロＲＮＡ媒介タンパク質発現制御を可能にするＨＯＸＢ７遺伝子の３’ＵＴＲ（３’非翻訳領域）配列の概略図であり、ＨＯＸＢ７の３’ＵＴＲ配列はマイクロＲＮＡ１９６（ｍｉＲ−１９６）配列と対合し、ＨＯＸＢ７タンパク質産生を防ぐ（パネルを参照のこと）。
【図２０】ＨＯＸＢ７遺伝子の発現が、マイクロＲＮＡ  ｍｉＲ−１９６ａによって配列特異的に調節されることを示すために使用されている構築物の概略図であり、構築物は、発光を引き起こす作用がある酵素であるルシフェラーゼを発現し、酵素コード配列から上流のＨＯＸＢ７  ３’ＵＴＲ領域またはｍｉＲ−１９６との相互作用の上記の領域についての欠失した３’ＵＴＲ配列（ＨＯＸＢ７  ３’ＵＴＲ  ９９−２２７）が、それらの間の直接相互作用を示すために配置される。
【図２１】図２０に示される構築物を形質導入した細胞内へのｍｉＲ−１９６ａまたは対照（ｍｉＲ対照）の導入によるルシフェリンの発光の測定によるルシフェラーゼ発現評価を示すグラフである。
【図２２】Ｐ−群よりＰ＋群において高いＫｉ６７発現を示すグラフである。
【図２３】少ない増殖細胞（Ｐ−）および多い増殖細胞（Ｐ＋）によって差次的に発現されたマイクロＲＮＡの表である。
【図２４】ＨＯＸＢ７タンパク質をコードする配列である。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
本発明によれば、ＨＯＸＢ７コード遺伝子が導入され、それによって、ＨＯＸＢ７を過剰発現しない改変を有する対照と比べて、より高い増殖能、低い老化を有し、分化能を増加させる細胞を生成する。
【００５２】
ＨＯＸＢ７遺伝子による細胞の遺伝子改変
このアプローチは、ＨＯＸとして知られているタンパク質の発現を誘導できる「ベクター」として知られている遺伝子配列を使用した細胞の遺伝子改変にある。
【００５３】
図１に示されるように、ＨＯＸＢ７タンパク質コード配列が、挿入部位ＢｇＩＩＩおよびＥｃｏＲＩを使用して環状プラスミドＤＮＡ配列ＭＩＧＲ１内に導入される。
【００５４】
プラスミドＤＮＡは、なされた改変を確認する標識として使用されるＧＦＰタンパク質コード配列を含む。
【００５５】
ＨＯＸ遺伝子は、出産前および出産後の生活の間、ヒト細胞の増殖および分化に影響を与え得る転写因子（すなわち、ＤＮＡと結合し、他のタンパク質の合成を促進できる因子）である。
【００５６】
ＨＯＸＢ７タンパク質産生ベクターの挿入は、骨への分化を促進しながら、成長が増加した改変細胞の産生を与える。
【００５７】
構築物の作製
ＨＯＸＢ７コード遺伝子を産生し、造血細胞から抽出した全ＲＮＡからポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅させ、それはコードＮＭ＿００４５０２によるＰｕｂＭｅｄデータベースにおける配列領域に対応する。
【００５８】
このように得られた配列を、図１に示すように酵素消化およびクローニングによってレトロウイルスベクター内に挿入した。
【００５９】
目的の細胞集団を感染させることができるレトロウイルス粒子のプールを安定に産生できるキャリア細胞の集団を２工程を介して作製した。
【００６０】
第１の工程は一過的様式でレトロウイルスを産生する細胞株の取得に基づき、第２の工程は、レトロウイルス子孫を安定に産生できる産生細胞株（ＰＣＬ）の生成を得ることを目的とする。
【００６１】
一過的工程に関して、胚腎線維芽細胞（２９３Ｔ細胞）に、ポリカチオンを利用してプラスミドＤＮＡをトランスフェクトして、レトロウイルス粒子を含有する上清を産生した。
【００６２】
レトロウイルス上清を回収し、使用してヒト線維肉腫株に由来するＰＬＣを感染させた：感染の２４時間後、細胞蛍光測定（ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ）によって細胞を分析して、感染効率マーカーである、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の陽性を確認した。
【００６３】
次にＰＬＣによって安定に産生したウイルス上清を使用して目的の細胞を感染させた。
【００６４】
ＨＯＸＢ７過剰発現細胞の形質転換
目的の細胞を密度勾配遠心分離（Ｆｉｃｏｌｌ）によって骨髄吸引物から単離し、それらをインビトロで培養する塑性培地に付着するそれらの能力に従って選択した。
【００６５】
ＰＬＣによるレトロウイルス上清産物を使用して細胞に３回の感染サイクルを受けさせた。
【００６６】
次いで緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現の分析によって感染効率を評価した。
【００６７】
図２に示されるように、この分析は、全ての細胞がＧＦＰ対照（黒色のバー）と同様に、首尾良く改変した（灰色のバー）ことを示す。
【００６８】
過剰発現の評価
ＨＯＸＢ７タンパク質過剰発現を定量的ＰＣＲおよびウェスタンブロッティングによって検証した（図３）。
【００６９】
定量的ＰＣＲにより、ＨＯＸＢ７のｍＲＮＡの相対的発現レベル（空ベクター、すなわちＨＯＸＢ７コード配列を含まないベクターで感染させた対照の１６０倍超）の検出を可能にし、一方、ウェスタンブロッティングにより、目的の細胞によって構造的に発現される内因性タンパク質（ＧＡＰＤＨ）に正規化した、より高い発現のＨＯＸＢ７の検出を可能にした。
【００７０】
形態および抗原発現に対する過剰発現の影響
改変細胞の形態を、倒立顕微鏡観察および細胞蛍光測定によって評価した（図４および図５を参照のこと）。
【００７１】
ＨＯＸＢ７過剰発現細胞は対照と形態学的に異なり、特に、矢印によって図４に示されるように、より小さいサイズおよびより低い程度の内部複雑性を有し、図５においてＦＳＣおよびＳＳＣの値を示す。
【００７２】
ＦＳＣ値は細胞サイズを反映し、ＳＳＣ値は内部複雑性を反映し、両方は、ＧＦＰ対照細胞（黒色のバー）についてよりＨＯＸＢ７改変細胞（灰色のバー）について低い。
【００７３】
したがって、ＨＯＸＢ７過剰発現について改変された細胞は、より小さく、複雑性がより少ない細胞である。
【００７４】
ＨＯＸＢ７過剰発現について改変された細胞は、特にコード配列を有し、インビトロで成長する（図４（ａ）を参照のこと）。
【００７５】
細胞、ＣＤ９０、ＣＤ７３およびＣＤ１０５によって典型的に発現される表面マーカーは図６に示されるように維持され、そのグラフは、これらのマーカーが改変に起因する関連した変化を受けないことを示す。
【００７６】
増殖、クローン形成能および老化の評価
ＨＯＸＢ７改変細胞はより高い増殖能を獲得し、それは細胞増殖マーカーＫｉ６７の発現として評価される。
【００７７】
Ｋｉ６７は細胞増殖マーカーであり、その量は細胞成長を反映する。
【００７８】
図７に示されるように、ＨＯＸＢ７過剰発現について改変された細胞はより高いレベルのＫｉ６７を有する。
【００７９】
より多くの増殖を、インビトロでの増加の間、顕微鏡による細胞計数によっても評価した。
【００８０】
図８は、ＧＦＰ対照と比較してＨＯＸＢ７改変細胞のより高い増殖能を示す。
【００８１】
さらに、ＨＯＸＢ７過剰発現について改変された細胞は、ＧＦＰ対照と比較して高いコロニー形成効率（ＣＦＵ−Ｆ）を有する（図９を参照のこと）。
【００８２】
ベータガラクトシダーゼ染色による老化のモニタリングにより、ＨＯＸＢ７改変培養物中で顕著に少ない数の老化細胞を検出できた。
【００８３】
図１０は、対照細胞（ｂ）と比較して改変細胞（ａ）の中での少ない数の老化細胞（ベータガラクトシダーゼ陽性細胞、すなわち染色され、矢印によって示される）を示す。
【００８４】
図１１を参照すると、染色した老化細胞の定量は、ＧＦＰ対照細胞集団が、ＨＯＸＢ７過剰発現について改変された細胞集団より多くの数の老化細胞を含むことを示す。
【００８５】
ＨＯＸＢ７過剰発現細胞におけるＦＧＦレベルの検出
ＨＯＸＢ７過剰発現細胞は、図１２に示されるリアルタイムＰＣＲによるｍＲＮＡ発現として、および図１３のグラフに値を示す、ＥＬＩＳＡにより測定した分泌タンパク質として、より多くの測定したｂＦＧＦレベルを生じる。
【００８６】
より詳細に、ｂＦＧＦタンパク質の分泌は、ＧＦＰ対照よりＨＯＸＢ７改変細胞において４．３〜８．２倍高いことを見出した。
【００８７】
骨形成分化の評価
改変細胞を、デキサメタゾン、アスコルビン酸、ベータ−グリセロホスフェートおよびＢＭＰ２（後者は７日目に加えた）を含む馴化培地を使用して骨組織を形成するように誘導し、対照と比較して高い骨形成能を有することを見出した。
【００８８】
特に、改変細胞は、インビトロでＶｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色によって評価して、顕著に多い量の石灰化マトリクスを生じる。
【００８９】
Ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａは、骨形成的に分化している細胞から放出されたカルシウム沈着を同定することが知られている染料である。
【００９０】
図１４に示されるように、ＨＯＸＢ７過剰発現について改変された細胞（ａ）はＧＦＰ対照（ｂ）より染色する。
【００９１】
さらに、特に図１５を参照して、Ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色定量は、ＨＯＸＢ７過剰発現細胞（灰色のバー）が、適切な骨産生刺激培養培地中での細胞の２週間の誘導または維持後、ＧＦＰ対照細胞（黒色のバー）と比較して８．５〜１２．２倍高いレベルのカルシウム沈着物を生じることを示す。
【００９２】
改変細胞は、図１６、図１７および図１８に示されるように、アルカリホスファターゼ分子マーカー（ＡＬＰ）、アルファ−１Ｉ型コラーゲン（Ｃｏｌ１Ａ１）およびデコリン（ＤＣＮ）のより高い発現を示す。
【００９３】
より詳細に、これらのマーカーの発現の変化は、ＧＦＰ対照よりＨＯＸＢ７改変細胞において２．７〜４１倍高いことが見出される。
【００９４】
発現制御機構の同定
マイクロＲＮＡは、メッセンジャー（ｍＲＮＡ）の３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）の特異的認識によって遺伝子発現を調節する低分子ＲＮＡである。
【００９５】
予測アルゴリズムを使用して、本発明者らはＨＯＸＢ７発現を調節できる潜在的分子としてｍｉＲ−１９６ａを同定した（図１９）。
【００９６】
ｍｉＲ−１９６が細胞内のＨＯＸＢ７の３’ＵＴＲ領域を直接標的とすることを示すためにルシフェラーゼアッセイを使用し、それによってその発現を特異的に制御できる（図２０および図２１）。
【００９７】
図２１を参照して、ｍｉＲ−１９６の存在は、ＨＯＸＢ７の３’ＵＴＲ配列とのｍｉＲ−１９６の特異的相互作用に起因して発光を減少させることが見出される（列２）。
【００９８】
細胞性能の予測としての、少ない増殖の細胞および多い増殖の細胞の差次的に発現したマイクロＲＮＡの同定
一セットのマイクロＲＮＡを同定した。そのマイクロＲＮＡは異なる増殖能を有する細胞によって差次的に発現された（Ｐ−およびＰ＋）。
【００９９】
図２２を参照すると、Ｐ−群はより低いレベルのＫｉ６７を発現するので、より低い増殖能を示し、Ｐ＋群はより高いレベルのＫｉ６７を発現するので、より高い増殖能を示す。
【０１００】
異なる増殖能を有するこれらの２つの群は、図２３に示されるように、ｍＲＮＡ発現：ｍｉＲ−９９、ｍｉＲ−１００、ｍｉＲ−１９６、ｍｉＲ−３３７−５ｐ、ｍｉＲ−３７６、ｍｉＲ−４３１、ｍｉＲ−５４３の差異を示す。このマイクロＲＮＡセットは細胞増殖能についての情報を得るために使用され得る。
【０１０１】
本発明は意図する目的を満たすことが見出された。
【０１０２】
このように想定される本発明は本発明の概念内で変更および変形を受ける。
【０１０３】
さらに、全ての説明は、以下の請求項によって定義される範囲から逸脱せずに他の技術的に等価の要素と置き換えられてもよい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【国際調査報告】
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