(57)【要約】ＨＩＶコレセプターＣＣＲ５の標的ノックアウトのための新規ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）に関し、一態様では、第１および第２のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーを含むＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ対であって、各ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーが、ＩＩ型エンドヌクレアーゼ活性を有するエンドヌクレアーゼドメインと、それぞれが可変アミノ酸対ＲＶＤを持つ複数の反復単位を有するＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインとを含み、かつ、ａ）第１のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーのＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインが、標的配列ＧＣＴＧＧＴＣＡＴＣＣＴＣＡＴＣＣＴＧ（配列番号１）に結合し、および／またはＲＶＤ配列ＮＨ  ＨＤ  ＮＧ  ＮＨ  ＮＨ  ＮＧ  ＨＤ  ＮＩ  ＮＧ  ＨＤ  ＨＤ  ＮＧ  ＨＤ  ＮＩ  ＮＧ  ＨＤ  ＨＤ  ＮＧ  ＮＮを含み、ｂ）第２のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーのＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインが、標的配列ＡＧＡＴＧＴＣＡＧＴＣＡＴＧＣＴＣＴＴ（配列番号２）に結合し、および／またはＲＶＤ配列ＮＩ  ＮＮ  ＮＩ  ＮＧ  ＮＮ  ＮＧ  ＨＤ  ＮＩ  ＮＨ  ＮＧ  ＨＤ  ＮＩ  ＮＧ  ＮＨ  ＨＤ  ＮＧ  ＨＤ  ＮＧ  ＮＧを含むＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ対を提供する。【選択図】図１
2017514525.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１および第２のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーを含むＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ対であって、各ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーが、ＩＩ型エンドヌクレアーゼ活性を有するエンドヌクレアーゼドメインと、それぞれが可変アミノ酸対ＲＶＤを持つ複数の反復単位を有するＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインとを含み、かつ、
ａ）前記第１のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーのＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインが、標的配列ＧＣＴＧＧＴＣＡＴＣＣＴＣＡＴＣＣＴＧ（配列番号１）に結合し、および／またはＲＶＤ配列ＮＨ  ＨＤ  ＮＧ  ＮＨ  ＮＨ  ＮＧ  ＨＤ  ＮＩ  ＮＧ  ＨＤ  ＨＤ  ＮＧ  ＨＤ  ＮＩ  ＮＧ  ＨＤ  ＨＤ  ＮＧ  ＮＮを含み、
ｂ）前記第２のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーのＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインが、標的配列ＡＧＡＴＧＴＣＡＧＴＣＡＴＧＣＴＣＴＴ（配列番号２）に結合し、および／またはＲＶＤ配列ＮＩ  ＮＮ  ＮＩ  ＮＧ  ＮＮ  ＮＧ  ＨＤ  ＮＩ  ＮＨ  ＮＧ  ＨＤ  ＮＩ  ＮＧ  ＮＨ  ＨＤ  ＮＧ  ＨＤ  ＮＧ  ＮＧを含む
ことを特徴とするＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ対。
【請求項２】
前記ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーのそれぞれに、前記ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインのＣ末端に関連するエンドヌクレアーゼドメインがあり、かつ、各反復単位が、前記エンドヌクレアーゼドメインにもっとも近い反復単位を除いて、３３〜３５アミノ酸、好ましくは３４アミノ酸を含み、ＲＶＤが、各反復単位において、１２位および１３位に存在する
請求項１に記載のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ対。
【請求項３】
前記ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーのエンドヌクレアーゼドメインが、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼのＤＮＡ開裂ドメインである
請求項１または２に記載のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ対。
【請求項４】
前記第１のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーが、配列番号３に示すアミノ酸配列を、かつ前記第２のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーが、配列番号４に示すアミノ酸配列を有する
請求項１ないし３のいずれかに記載のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ対。
【請求項５】
ａ）第１のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーをコードする第１の核酸であって、前記第１のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーが、ＩＩ型エンドヌクレアーゼ活性を有するエンドヌクレアーゼドメインと、それぞれが可変アミノ酸対ＲＶＤを持つ複数の反復単位を有するＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインとを含み、かつ、前記ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインが、標的配列ＧＣＴＧＧＴＣＡＴＣＣＴＣＡＴＣＣＴＧ（配列番号１）に結合し、および／またはＲＶＤ配列ＮＨ  ＨＤ  ＮＧ  ＮＨ  ＮＨ  ＮＧ  ＨＤ  ＮＩ  ＮＧ  ＨＤ  ＨＤ  ＮＧ  ＨＤ  ＮＩ  ＮＧ  ＨＤ  ＨＤ  ＮＧ  ＮＮを含む第１の核酸と、
ｂ）第２のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーをコードする第２の核酸であって、前記第２のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーが、ＩＩ型エンドヌクレアーゼ活性を有するエンドヌクレアーゼドメインと、それぞれが可変アミノ酸対ＲＶＤを持つ複数の反復単位を有するＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインとを含み、かつ、前記ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインが、標的配列ＡＧＡＴＧＴＣＡＧＴＣＡＴＧＣＴＣＴＴ（配列番号２）に結合し、および／またはＲＶＤ配列ＮＩ  ＮＮ  ＮＩ  ＮＧ  ＮＮ  ＮＧ  ＨＤ  ＮＩ  ＮＨ  ＮＧ  ＨＤ  ＮＩ  ＮＧ  ＮＨ  ＨＤ  ＮＧ  ＨＤ  ＮＧ  ＮＧを含む第２の核酸と、を含む
ことを特徴とする核酸。
【請求項６】
請求項５に記載する核酸を含む
ことを特徴とするベクター。
【請求項７】
ａ）第１のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーをコードする第１の核酸であって、前記第１のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーが、ＩＩ型エンドヌクレアーゼ活性を有するエンドヌクレアーゼドメインと、それぞれが可変アミノ酸対ＲＶＤを持つ複数の反復単位を有するＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインとを含み、かつ、前記ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインが、標的配列ＧＣＴＧＧＴＣＡＴＣＣＴＣＡＴＣＣＴＧ（配列番号１）に結合し、および／またはＲＶＤ配列ＮＨ  ＨＤ  ＮＧ  ＮＨ  ＮＨ  ＮＧ  ＨＤ  ＮＩ  ＮＧ  ＨＤ  ＨＤ  ＮＧ  ＨＤ  ＮＩ  ＮＧ  ＨＤ  ＨＤ  ＮＧ  ＮＮを含む第１の核酸と、
ｂ）第２のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーをコードする第２の核酸であって、前記第２のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーが、ＩＩ型エンドヌクレアーゼ活性を有するエンドヌクレアーゼドメインと、それぞれが可変アミノ酸対ＲＶＤを持つ複数の反復単位を有するＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインとを含み、かつ、前記ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインが、標的配列ＡＧＡＴＧＴＣＡＧＴＣＡＴＧＣＴＣＴＴ（配列番号２）に結合し、および／またはＲＶＤ配列ＮＩ  ＮＮ  ＮＩ  ＮＧ  ＮＮ  ＮＧ  ＨＤ  ＮＩ  ＮＨ  ＮＧ  ＨＤ  ＮＩ  ＮＧ  ＮＨ  ＨＤ  ＮＧ  ＨＤ  ＮＧ  ＮＧを含む第２の核酸と、を含む
ことを特徴とする核酸組成物。
【請求項８】
前記第１の核酸が、第１のｍＲＮＡであり、前記第２の核酸が、第２のｍＲＮＡである
請求項７に記載の核酸組成物。
【請求項９】
前記第１の核酸が、配列番号１７に示す配列を含み、前記第２の核酸が、配列番号１８に示す配列を含む
請求項８に記載の核酸組成物。
【請求項１０】
単離宿主細胞であって、前記宿主細胞が、ヒト生殖細胞またはヒト胚性生殖細胞でなく、かつ獲得の際にヒト胚を破壊した、または破壊するヒト胚性幹細胞でないという条件で、請求項５に記載の核酸、請求項７ないし９のいずれかに記載の核酸組成物、または請求項６に記載のベクターを含む
ことを特徴とする単離宿主細胞。
【請求項１１】
請求項５に記載の核酸、請求項７ないし９のいずれかに記載の核酸組成物、または請求項６に記載のベクターを含む
ことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１２】
請求項５に記載の核酸、請求項７ないし９のいずれかに記載の核酸組成物、請求項６に記載のベクター、または請求項１１に記載の医薬組成物を含む
ことを特徴とする医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＩＶコレセプターＣＣＲ５の標的ノックアウトのための新規ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）に関する。
【背景技術】
【０００２】
ケモカイン受容体ＣＣＲ５は、細胞内におけるその本来の機能に加え、ＨＩＶ感染において重要な役割を果たしている。この場合、ＣＣＲ５は、ヒト免疫不全ウイルスのいわゆるＣＣＲ５指向性株のコレセプターとして現れ、これがＨＩＶ初感染を媒介する。ヘルパーＴ細胞の表面にＣＣＲ５が存在しなければ、ヒト免疫不全ウイルスは宿主細胞と融合しないため、感染が生じることはない。そのため、西欧人および「白人」のアメリカ人（「コーカサス人」）の約１％で見られるＣＣＲ５遺伝子のホモ欠失（ＣＣＲ５Δ３２）があれば、ＣＣＲ指向性株によるＨＩＶ感染からほぼ完全に守られる。ゆえに、ＣＣＲ５は、ＨＩＶ治療にとって非常に興味深い標的である。
【０００３】
ＣＣＲ５の遮断を目指すこれまでの薬理学的アプローチでは、抗レトロウイルス併用療法（ＡＲＴ）の枠内で生涯治療が必要となる。これは長期的には重度の副作用を引き起こす可能性があり、また患者のコンプライアンス欠如や耐性発現にも結び付く。これに対し、ＣＣＲ５の遺伝子破壊（「ノックアウト」）（遺伝子療法の意味において）は、全娘細胞に遺伝子の保護が伝わるため、単回治療として理想的であろう。これは、ＣＣＲ５Δ３２ホモ接合体の個体の自然抵抗力だけでなく、ＣＣＲ５Δ３２ホモ接合体のドナー細胞を用いた同種幹細胞移植による、いわゆる「ベルリン患者」のＨＩＶ感染症治療成功の症例報告によっても裏付けられる（非特許文献１、２）。
【０００４】
この観察に基づいて、ＨＩＶ患者におけるＣＣＲ５の遺伝子ノックアウトというコンセプトが生み出された。現在有望な戦略は、いわゆる「デザイナーヌクレアーゼ」（例えば、非特許文献３）に基づいている。このデザイナーヌクレアーゼは２つの構成要素から成る。すなわち、ゲノムの特異性を確定し、ほぼ完全に自由にデザインできる認識ドメインと、ゲノムの選択した部位で二本鎖切断を誘導するヌクレアーゼドメインである。この二本鎖切断が不正確に修復されると、標的遺伝子のオープンリーディングフレームのシフトが生じ、それにより理想的なノックアウトとなる。すでに適用可能な初のデザイナーヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）であった。例えばＳａｎｇａｍｏ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．は、現在、ＳＢ−７２８という名称で、開発中のＣＣＲ５特異的ジンクフィンガーヌクレアーゼ（非特許文献４）の臨床応用について試験している（非特許文献５）。この臨床試験では、このアプローチの実現性が示されたが、ウイルス量に対する長期的な臨床的有用性が観察できたのは、ＣＣＲ５Δ３２の自然突然変異のヘテロ接合体保因者である被験者においてのみであった。
【０００５】
ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ）は次世代のデザイナーヌクレアーゼである（例えば、非特許文献６、特許文献１〜６）。ＴＡＬＥＮはＺＦＮと比べて、特に特異性の高さが傑出しており、そのため、オフターゲット効果、つまりゲノムの所望の部位以外で変異が起こるリスクが明らかに低減する（非特許文献７、８）。
【０００６】
ＣＣＲ５特異的ＴＡＬＥＮはすでに知られているが（例えば、非特許文献８、特許文献５、７、８）、臨床的有用性については、これまでのところ説明されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２０１１／０７２２４６号
【特許文献２】欧州特許出願公開第２５１００９６号
【特許文献３】国際公開第２０１１／１５４３９３号
【特許文献４】国際公開第２０１１／１５９３６９号
【特許文献５】国際公開第２０１２／０９３８３３号
【特許文献６】国際公開第２０１３／１８２９１０号
【特許文献７】国際公開第２０１１／１４６１２１号
【特許文献８】米国特許出願公開第２０１３／０２１７１３１号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｈｕｅｔｔｅｒ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ＨＩＶ  ｂｙ  ＣＣＲＤｅｌｔａ３２／Ｄｅｌｔａ３２  ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２００９，３６０：６９２−６９８
【非特許文献２】Ａｌｌｅｒｓ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｕｒｅ  ｏｆ  ＨＩＶ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ＣＣＲ５Δ３２／Δ３２  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ  ２０１１；１１７：２７９１−２７９９
【非特許文献３】Ｍａｎｊｕｎａｔｈ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ，Ｎｅｗｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｅｄｉｔｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｔｏｗａｒｄ  ＨＩＶ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｉｒｕｓｅｓ  ２０１３，５，２７４８−２７６６
【非特許文献４】ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇａｍｏ．ｃｏｍ／ｐｉｐｅｌｉｎｅ／ｓｂ−７２８．ｈｔｍｌ
【非特許文献５】Ｔｅｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｅｄｉｔｉｎｇ  ｏｆ  ＣＣＲ５  ｉｎ  Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ＣＤ４  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  Ｐｅｒｓｏｎｓ  Ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ＨＩＶ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０１４；３７０：９０１−１０
【非特許文献６】Ｍｕｓｓｏｌｉｎｏ，Ｃ，Ｃａｔｈｏｍｅｎ  Ｔ．ＴＡＬＥ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ：ｔａｉｌｏｒｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｍａｄｅ  ｅａｓｙ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２，２３（５）：６４４−５０
【非特許文献７】Ｈａｅｎｄｅｌ  Ｅ−Ｍ，Ｃａｔｈｏｍｅｎ  Ｔ．Ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｂａｓｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｕｒｇｅｒｙ：ｉｔ'ｓ  ａｌｌ  ａｂｏｕｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２０１１，１１：２８−３７
【非特許文献８】Ｍｕｓｓｏｌｉｎｏ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｎｏｖｅｌ  ＴＡＬＥ  ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｅｎａｂｌｅｓ  ｈｉｇｈ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｌｏｗ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１１；３９：９２８３−９２９３
【非特許文献９】“Ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ  ｎｕｃｌｅａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｉａｌｌｅｌｉｃ  ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ  ｉｓ  ｎｏｔ  ｙｅｔ  ｔｅｎａｂｌｅ”，ｓ．Ｋａｙ，Ｍ．Ａ．ｕｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，Ｂ．Ｄ．，２０１４，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ＨＩＶ，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３７０：９６８−９６９
【非特許文献１０】Ｋａｌｌｅｎ  Ｋ．−Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｎｏｖｅｌ，ｄｉｓｒｕｐｔｉｖｅ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍ  Ｖａｃｃｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．Ｏｃｔ  １，２０１３；９（１０）：２２６３−２２７６，ｄｏｉ：１０．４１６１／ｈｖ．２５１８１
【非特許文献１１】Ｋａｌｌｅｎ  Ｋ．−Ｊ．ｕｎｄ  Ｔｈｅｓｓ  Ａ．，Ａ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｔｈａｔ  ｍａｙ  ｅｖｏｌｖｅ  ｉｎｔｏ  ａ  ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ：ｍＲＮＡ  ａｓ  ｔｈｅ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｎｏｖｅｌ，ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｂａｓｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｄｒｕｇｓ，Ｔｈｅｒ  Ａｄｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｊａｎ  ２０１４；２（１）：１０−３１，ｄｏｉ：１０．１１７７／２０５１０１３６１３５０８７２９
【非特許文献１２】Ｂｅｒｄｉｅｎ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．，ＴＡＬＥＮ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｏｆ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｏｆ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｂｙ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｇｔ．２０１４．２６
【非特許文献１３】Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＴＡＬ  ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１１，２９，１４９−１５３
【非特許文献１４】Ｓａｎｊａｎａ  ＮＥ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ＴＡＬ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｔｏｏｌｂｏｘ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２０１２，７：１７１−１９２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
依然として、ＨＩＶ感染を効果的に治療する方法が必要とされている。そのため、本発明の課題は、そうした方法を提供することである。特に、本発明の課題は、従来よりも効率的なＨＩＶコレセプターＣＣＲ５のノックアウトを実現できる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
請求項１およびさらに従属する請求項の対象により、この課題を解決する。本発明による解決策の目的にかなった実施形態は、従属請求項に記載する。
【００１１】
本発明第１の態様では、第１および第２のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーを含むＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ対であって、各ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーが、ＩＩ型エンドヌクレアーゼ活性を有するエンドヌクレアーゼドメインと、それぞれが可変アミノ酸対ＲＶＤを持つ複数の反復単位を有するＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインとを含み、かつ、ａ）第１のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーのＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインが、標的配列ＧＣＴＧＧＴＣＡＴＣＣＴＣＡＴＣＣＴＧ（配列番号１）に結合し、および／またはＲＶＤ配列ＮＨ  ＨＤ  ＮＧ  ＮＨ  ＮＨ  ＮＧ  ＨＤ  ＮＩ  ＮＧ  ＨＤ  ＨＤ  ＮＧ  ＨＤ  ＮＩ  ＮＧ  ＨＤ  ＨＤ  ＮＧ  ＮＮを含み、ｂ）第２のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーのＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインが、標的配列ＡＧＡＴＧＴＣＡＧＴＣＡＴＧＣＴＣＴＴ（配列番号２）に結合し、および／またはＲＶＤ配列ＮＩ  ＮＮ  ＮＩ  ＮＧ  ＮＮ  ＮＧ  ＨＤ  ＮＩ  ＮＨ  ＮＧ  ＨＤ  ＮＩ  ＮＧ  ＮＨ  ＨＤ  ＮＧ  ＨＤ  ＮＧ  ＮＧを含むＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ対を提供する。
【００１２】
本発明によるＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ対は、これまでに実現されていない５０％超という高い効率で、一次Ｔリンパ球におけるＣＣＲ５のノックアウトを引き起こすことができる。これに関して、驚くことに、本発明では、ＣＣＲ５対立遺伝子両方の一貫した２対立遺伝子ノックアウトも可能であり、それにより、先行技術における指導的な専門家が述べた、現時点では不可能であるという見解（非特許文献９）に反し、改変細胞をＨＩＶの侵入から完全に保護することが可能となる。さらに、本発明によるＴＡＬＥＮ対は、ｍＲＮＡ導入に基づく（それにより、特に保護的で、安全で、ＧＭＰに適合した）遺伝子導入にすばらしく適していることが判明している。そのため、本発明は初めて、高いノックアウト効率と選択性に加え、オフターゲット効果がわずかであり、その他、薬理学的見地から有利な特性を併せ持った、デザイナーヌクレアーゼに基づくＨＩＶ治療手段を提供する。
【００１３】
「ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ」または「ＴＡＬＥＮ」（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）は、本明細書では、ＴＡＬエフェクター（ＴＡＬＥ）のＤＮＡ結合ドメインと、制限エンドヌクレアーゼのＤＮＡ開裂ドメインとを含む融合タンパク質と理解される。ＴＡＬエフェクターとは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ種のような植物病原菌から生成されるＤＮＡ結合タンパク質である。ＴＡＬエフェクターのＤＮＡ結合は、さまざまな数（通常は５〜３０）の、３３〜３５アミノ酸の反復単位（「ｒｅｐｅａｔｓ」）を含むドメインによって媒介される。このとき、各反復単位は、通常、１２位および１３位に、２つの高可変アミノ酸残基（ｒｅｐｅａｔ−ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｉｒｅｓｉｄｕｅ，ＲＶＤ）を持ち、これがＤＮＡ標的配列のちょうど１つの塩基に結合する。ＲＶＤとＤＮＡ標的ヌクレオチドとの関係を以下に示す。
【００１４】
ＲＶＤ（１文字表記）  ＲＶＤ（３文字表記）  ヌクレオチド
ＮＨ  Ａｓｎ−Ｈｉｓ  Ｇ
ＨＤ  Ｈｉｓ−Ａｓｐ  Ｃ
ＮＧ  Ａｓｎ−Ｇｌｙ  Ｔ
ＮＩ  Ａｓｎ−Ｉｌｅ  Ａ
ＮＮ  Ａｓｎ−Ａｓｎ  Ｒ（Ｇ、Ａ）
ＮＫ  Ａｓｎ−Ｌｙｓ  Ｇ
ＮＳ  Ａｓｎ−Ｓｅｒ  Ｎ（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）
【００１５】
「ＲＶＤ配列」は、本明細書では、ＴＡＬエフェクター結合ドメインにおけるＲＶＤの連続する順番と理解され、配列は、他に記載がない限り、本明細書では、Ｎ−Ｃ方向、つまりＮ末端からＣ末端で表す。当然のことながら、当業者には知られているように、「ＲＶＤ配列」のＲＶＤは、それ自体が直接共有結合的に相互に結合しているという意味ではなく、ＲＶＤを含む反復単位（「ｒｅｐｅａｔｓ」）が直接相互に結合しているという意味で直接的に連続しており、それにより、ＲＶＤはそれぞれ反復単位のフレームワークのアミノ酸によって分離されている。
【００１６】
「標的配列」または「ターゲット配列」は、本明細書では、ヌクレオチド配列、通常はＤＮＡ配列と理解され、これはＴＡＬエフェクター結合ドメインによって結合される。
【００１７】
本明細書で開示するそれぞれ１９のＲＶＤに基づくＲＶＤ配列は、以下の標的配列（５’−３’方向に；アミノ酸は１文字表記）を有する。
ＮＨ  ＨＤ  ＮＧ  ＮＨ  ＮＨ  ＮＧ  ＨＤ  ＮＩ  ＮＧ  ＨＤ  ＨＤ  ＮＧ  ＨＤ  ＮＩ  ＮＧ  ＨＤ  ＨＤ  ＮＧ  ＮＮ
ＧＣＴＧＧＴＣＡＴＣＣＴＣＡＴＣＣＴＧ（配列番号１）
ＮＩ  ＮＮ  ＮＩ  ＮＧ  ＮＮ  ＮＧ  ＨＤ  ＮＩ  ＮＨ  ＮＧ  ＨＤ  ＮＩ  ＮＧ  ＮＨ  ＨＤ  ＮＧ  ＨＤ  ＮＧ  ＮＧ
ＡＧＡＴＧＴＣＡＧＴＣＡＴＧＣＴＣＴＴ（配列番号２）
【００１８】
ＴＡＬエフェクター結合ドメインに関連する「反復単位」（「ｒｅｐｅａｔ」）は、本明細書では、通常３３〜３５アミノ酸、多くの場合３４アミノ酸の連続する順番と理解され、この順番は、１２位および１３位の高可変アミノ酸残基以外はほぼ同一のアミノ酸配列を有する。反復単位の保存フレームワーク内でも、すなわち、高可変ＲＶＤが組み込まれている本質的に不変の構造内でも、例えば３４アミノ酸の反復単位の４位、１０位、および／または３２位で、個々のアミノ酸が変化することは可能である。例えば、典型的な反復単位は、以下のアミノ酸配列を有する（下付き文字は、反復単位内の位置を示す）。
ＬＴＰＸ4ＱＶＶＡＩＸ10ＳＸ12Ｘ13ＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＸ32ＨＧ（配列番号５）
【００１９】
Ｘは任意のアミノ酸を示し、１２位および１３位にＲＶＤの超可変アミノ酸が存在する。４位（Ｘ4）には、例えばアミノ酸Ｅ、Ｑ、ＤまたはＡが、３２位（Ｘ32）にはアミノ酸ＡまたはＤが存在できる。１０位には、例えばＡまたはＶが存在できる。反復単位の例は、以下に示す（ＸＸはＲＶＤの超可変アミノ酸を示し、可変アミノ酸は下線で識別している）。
ＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＸＸＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧ（配列番号６）
ＬＴＰＱＱＶＶＡＩＡＳＸＸＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧ（配列番号７）
ＬＴＰＤＱＶＶＡＩＡＳＸＸＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤＨＧ（配列番号８）
ＬＴＰＡＱＶＶＡＩＡＳＸＸＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤＨＧ（配列番号９）
ＬＴＰＥＱＶＶＡＩＶＳＸＸＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧ（配列番号１０）
【００２０】
ＴＡＬエフェクター結合ドメインは、１つまたは複数のこの種の反復単位のバリエーションを含むことができ、さまざまなバリエーションの混合も考慮される。
【００２１】
ヌクレアーゼドメインにもっとも近い外側の反復単位は、より少なく、例えば残りの反復単位の第１の１５、１６、１７、１８、１９または２０アミノ酸のみを含むことができる。そのような反復単位は、「半反復単位」または「ｈａｌｆ  ｒｅｐｅａｔ」とも呼ばれる。
【００２２】
「ＤＮＡ結合ドメイン」は、本明細書では、タンパク質とＤＮＡの結合をもたらすタンパク質の領域と理解される。ＴＡＬエフェクターのＤＮＡ結合ドメインの場合、これは、上に詳しく説明した反復単位（「ｒｅｐｅａｔ」）によって生じる。
【００２３】
ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインが、標的配列に結合するという表現は、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインが、そのＲＶＤ配列に基づいて標的配列に特異的に結合することと理解される。このとき、好ましい場合でも、ＲＶＤが結合ドメインで標的配列の各ヌクレオチドに割り当てられている必要はない。ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインのＲＶＤ配列と標的配列との関係は、単に、標的配列への特異的な結合が生じるというものでなければならない。この関連で、「特異的」とは、基本的に標的配列のみに結合が生じることを意味する。
【００２４】
「ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマー」は、単一のポリペプチド鎖から成るＴＡＬエフェクターヌクレアーゼと理解される。「ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ対」または「ＴＡＬＥＮ対」は、２つのＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーで構成されるＴＡＬＥＮと理解される。モノマーは、ＤＮＡの対向する鎖に結合し、共に、ある部位でのＤＮＡの開裂を引き起こす、ＴＡＬＥＮの左腕または右腕を表す。
【００２５】
本明細書で、ＴＡＬＥＮ対に関して、「左」もしくは「右」のＴＡＬＥＮ、またはＴＡＬＥＮの「左腕」もしくは「右腕」と述べる場合、これは、ＴＡＬＥＮ対では、ＴＡＬＥＮモノマーが対で挿入され、すなわち、１つのモノマーが、センス鎖上の標的配列に結合し、一方でＴＡＬＥＮ対のもう１つのＴＡＬＥＮモノマーが、これに相補的なアンチセンス鎖上の標的配列に結合して、それにより、ヌクレアーゼドメインは相互に向かい合い、「スペーサー」と呼ばれる標的配列間の共通ＤＮＡ領域にくることになり、そこでそれぞれ個々の鎖切断を引き起こすことにより、二本鎖ＤＮＡ内で鎖切断をもたらすという事実を反映している。そのため、「左」または「右」のＴＡＬＥＮモノマーは、そのようなＴＡＬＥＮ対の一部であり、センス鎖に結合するＴＡＬＥＮは、しばしば「左」のＴＡＬＥＮと呼ばれるのに対し、「右」のＴＡＬＥＮは相補鎖に結合する。ただし、それにより、本明細書で、「左」または「右」のＴＡＬＥＮについて述べる場合、「左」のＴＡＬＥＮがセンス鎖に、「右」のＴＡＬＥＮがその相補鎖に結合すると確定されるわけではない。
【００２６】
したがって、本発明は、「ＴＡＬＥＮ対」、つまり、それぞれＴＡＬＥＮの左腕または右腕を表す本発明による２つのモノマーにも関する。ゆえに、本発明は、そのＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインが、標的配列ＧＣＴＧＧＴＣＡＴＣＣＴＣＡＴＣＣＴＧ（配列番号１）に結合し、および／またはＲＶＤ配列ＮＨ  ＨＤ  ＮＧ  ＮＨ  ＮＨ  ＮＧ  ＨＤ  ＮＩ  ＮＧ  ＨＤ  ＨＤ  ＮＧ  ＨＤ  ＮＩ  ＮＧ  ＨＤ  ＨＤ  ＮＧ  ＮＮを含むＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーと、そのＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインが、標的配列ＡＧＡＴＧＴＣＡＧＴＣＡＴＧＣＴＣＴＴ（配列番号２）に結合し、および／またはＲＶＤ配列ＮＩ  ＮＮ  ＮＩ  ＮＧ  ＮＮ  ＮＧ  ＨＤ  ＮＩ  ＮＨ  ＮＧ  ＨＤ  ＮＩ  ＮＧ  ＮＨ  ＨＤ  ＮＧ  ＨＤ  ＮＧ  ＮＧを含むＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーとを含むＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ対にも関する。
【００２７】
「ＩＩ型エンドヌクレアーゼ活性を有するエンドヌクレアーゼドメイン」は、制限エンドヌクレアーゼのＤＮＡ開裂活性化を持ち、認識配列内、またはそのすぐ近くでＤＮＡを切断し、ＡＴＰを必要とせず、メチル基転移酵素活性を備えていないポリペプチドと理解される。「ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼ活性を有するエンドヌクレアーゼドメイン」は、切断部位が、認識配列のすぐ近くではあるものの、その内部にはないＩＩ型エンドヌクレアーゼのドメインと理解される。
【００２８】
「ＣＣＲ５」は、本明細書では、ヒトＣＣモチーフケモカインレセプター５（ＣＤ１９５、ＣＭＫＢＲ５またはＣＣ−ＣＫＲ５とも呼ばれる）と理解される。ヒトＣＣＲ５の配列は、配列番号１１で表される（ＮＣＢＩ−Ｚｕｇｒｉｆｆｓｎｕｍｍｅｒ  ＮＣ＿０１８９１４．２）。
【００２９】
「ベクター」は、本明細書では、たいていは外来核酸を、導入または形質転換によって、生きた受容細胞に移動する運搬体と理解される。「遺伝子導入ベクター」は、本明細書では、遺伝子を細胞に運び入れることのできるベクターと理解される。（遺伝子導入）ベクターは当業者によく知られている。遺伝子導入ベクターの例として、プラスミド、ウイルスベクター、またはｍＲＮＡがある。
【００３０】
「核酸」は、モノマーがヌクレオチドであるポリマーと理解される。ヌクレオチドは、糖残基と窒素含有複素環有機塩基（ヌクレオチド塩基または核酸塩基）とリン酸基の化合物である。糖残基は、通常、五炭糖であり、ＤＮＡの場合はデオキシリボース、ＲＮＡの場合はリボースである。ヌクレオチドの結合は、通常、ヌクレオシド（核酸塩基と糖の化合物）の糖成分の３’−Ｃ原子と、隣のヌクレオシドの糖成分の５’−Ｃ原子とのホスホジエステル結合によってリン酸基を介して行われる。「核酸」という用語には、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＤＮＡ／ＲＮＡ混合配列が含まれる。ゆえに、本明細書で用いるように、「核酸」という用語は、とりわけ単離核酸に該当する。「単離核酸」は、自然の環境もしくは本来の環境から取り出された、または合成的に作成された核酸と理解される。
【００３１】
「含む」という用語は、本明細書では、その概念のもとで把握される特徴のみを有する対象物も、その概念のもとで把握される特徴を超えて、さらなる特徴も有する対象物も定義するものとして使用される。したがって、ある対象物が特定の特徴を含むことによる当該対象物の定義は、こうした特徴の網羅的なリストによる、つまり、こうした特徴のみの存在によるこの対象物の定義も包含する。
【００３２】
本発明によるＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ対の好ましい実施形態では、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーのそれぞれに、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインのＣ末端に関連するエンドヌクレアーゼドメインがある。好ましくは、各反復単位が、エンドヌクレアーゼドメインにもっとも近い反復単位を除いて、３３〜３５アミノ酸、好ましくは３４アミノ酸を含み、ＲＶＤが、各反復単位において、１２位および１３位に存在する。特に好ましくは、反復単位全体が、「ｈａｌｆ  ｒｅｐｅａｔ（半反復）」を除いて、配列番号５に示すアミノ酸配列を有し、４位にＥ、Ｑ、ＤまたはＡ、１０位にＡまたはＶ、および３２位にＡまたはＤが存在し得る。反復単位のフレームワークは、すべての反復単位で同じ、または異なっていてよい。アミノ酸に関して、フレームワーク内の位置、例えば４位、１０位および／または３２位で１つまたは複数の反復単位が異なっていてよい。エンドヌクレアーゼドメインにもっとも近い反復単位は、より少ない数のアミノ酸、例えば１５、１６、１７、１８、１９または２０アミノ酸を含むことができ、この場合、アミノ酸は、好ましくは残りの反復単位の第１の１５、１６、１７、１８、１９または２０アミノ酸に相当する。このとき、例えば４位のアミノ酸が異なり、例えばＥ、Ｑ、ＤおよびＡであり、および／または１０位のアミノ酸が異なり、例えばＡの代わりにＶであってよい。
【００３３】
特に好ましくは、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーのエンドヌクレアーゼドメインはＩＩＳ型エンドヌクレアーゼドメインであり、特に好ましくは、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼのＤＮＡ開裂ドメインである。適切なＦｏｋＩ開裂ドメインのアミノ酸配列は、配列番号１２で表される。しかしながら、別のＩＩ型エンドヌクレアーゼ開裂ドメインも考慮される。ＩＩ型エンドヌクレアーゼは当業者に知られており、適切な開裂ドメインは日常の試験で確認できる。
【００３４】
特に好ましい実施形態では、第１のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーは配列番号３に示すアミノ酸配列を、第２のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーは配列番号４に示すアミノ酸配列を有する。このとき、配列番号３では、ＴＡＬＥＮ対の左のＴＡＬＥＮ（以下、ＣＣＲ５−ＵｃｏのＣＣＲ５−Ｕｃｏ−Ｌまたは左腕ともいう）、および配列番号４では、右のＴＡＬＥＮ（以下、ＣＣＲ５−ＵｃｏのＣＣＲ５−Ｕｃｏ−Ｒまたは右腕ともいう）が示され、これらは共に、ＣＣＲ５のＤＮＡ配列で、配列番号１に示す標的配列と配列番号２に示す標的配列との間にあるスペーサー内で二本鎖切断を引き起こす。細胞の修復システム（ｎｏｎ-ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｎｄ  ｊｏｉｎｉｎｇ［非相同末端結合］、ＮＨＥＪ）によるこの二本鎖切断の修復により、高い確率で、リーディングフレームのシフトが生じ、それに伴いＣＣＲ５のノックアウトに至る。
【００３５】
第２の態様において、本発明は、ａ）第１のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーをコードする第１の核酸であって、第１のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーが、ＩＩ型エンドヌクレアーゼ活性を有するエンドヌクレアーゼドメインと、それぞれが可変アミノ酸対ＲＶＤを持つ複数の反復単位を有するＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインとを含み、かつ、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインが、標的配列ＧＣＴＧＧＴＣＡＴＣＣＴＣＡＴＣＣＴＧ（配列番号１）に結合し、および／またはＲＶＤ配列ＮＨ  ＨＤ  ＮＧ  ＮＨ  ＮＨ  ＮＧ  ＨＤ  ＮＩ  ＮＧ  ＨＤ  ＨＤ  ＮＧ  ＨＤ  ＮＩ  ＮＧ  ＨＤ  ＨＤ  ＮＧ  ＮＮを含む第１の核酸と、ｂ）第２のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーをコードする第２の核酸であって、第２のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーが、ＩＩ型エンドヌクレアーゼ活性を有するエンドヌクレアーゼドメインと、それぞれが可変アミノ酸対ＲＶＤを持つ複数の反復単位を有するＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインとを含み、かつ、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインが、標的配列ＡＧＡＴＧＴＣＡＧＴＣＡＴＧＣＴＣＴＴ（配列番号２）に結合し、および／またはＲＶＤ配列ＮＩ  ＮＮ  ＮＩ  ＮＧ  ＮＮ  ＮＧ  ＨＤ  ＮＩ  ＮＨ  ＮＧ  ＨＤ  ＮＩ  ＮＧ  ＮＨ  ＨＤ  ＮＧ  ＨＤ  ＮＧ  ＮＧを含む第２の核酸とを含む核酸にも関する。
【００３６】
本発明によるＴＡＬＥＮ対を形成するＴＡＬＥＮモノマーは、本発明のこの態様において、一緒に共通の核酸でコードされている。核酸は、例えばプラスミド、または別の適切な（遺伝子導入）ベクターであり得る。適切なベクター、およびその作成方法と使用方法は、先行技術でよく知られている。必要に応じて、核酸は、ＴＡＬＥＮコードの他に、他の要素、例えば１つまたは複数のプロモーター、およびポリアデニル化シグナルなどを含むことができる。
【００３７】
本発明によるＴＡＬＥＮ対を形成するＴＡＬＥＮモノマーは、２つの核酸で別々にコードすることも可能である。したがって、第３の態様において、本発明は、ａ）第１のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーをコードする第１の核酸であって、第１のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーが、ＩＩ型エンドヌクレアーゼ活性を有するエンドヌクレアーゼドメインと、それぞれが可変アミノ酸対ＲＶＤを持つ複数の反復単位を有するＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインとを含み、かつ、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインが、標的配列ＧＣＴＧＧＴＣＡＴＣＣＴＣＡＴＣＣＴＧ（配列番号１）に結合し、および／またはＲＶＤ配列ＮＨ  ＨＤ  ＮＧ  ＮＨ  ＮＨ  ＮＧ  ＨＤ  ＮＩ  ＮＧ  ＨＤ  ＨＤ  ＮＧ  ＨＤ  ＮＩ  ＮＧ  ＨＤ  ＨＤ  ＮＧ  ＮＮを含む第１の核酸と、ｂ）第２のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーをコードする第２の核酸であって、第２のＴＡＬエフェクターヌクレアーゼモノマーが、ＩＩ型エンドヌクレアーゼ活性を有するエンドヌクレアーゼドメインと、それぞれが可変アミノ酸対ＲＶＤを持つ複数の反復単位を有するＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインとを含み、かつ、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインが、標的配列ＡＧＡＴＧＴＣＡＧＴＣＡＴＧＣＴＣＴＴ（配列番号２）に結合し、および／またはＲＶＤ配列ＮＩ  ＮＮ  ＮＩ  ＮＧ  ＮＮ  ＮＧ  ＨＤ  ＮＩ  ＮＨ  ＮＧ  ＨＤ  ＮＩ  ＮＧ  ＮＨ  ＨＤ  ＮＧ  ＨＤ  ＮＧ  ＮＧを含む第２の核酸とを含む核酸組成物にも関する。
【００３８】
好ましくは、第１および第２の核酸は、それぞれ、ｍＲＮＡ、特に好ましくは、安定化されたｍＲＮＡである（例えば、非特許文献１０、１１）。必要に応じて、第１および第２の核酸は、ＴＡＬＥＮコードの他に、他の要素、例えば１つまたは複数のプロモーター、およびポリアデニル化シグナルなどを含むことができる。本発明によるＴＡＬＥＮの左腕および右腕の適切なｍＲＮＡは、例えば配列番号１７および１８で表される。
【００３９】
ｍＲＮＡの場合、標的細胞、例えばＴリンパ球への輸送は、特に好ましくは、Ｂｅｒｄｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（非特許文献１２）が説明する方法によって行う。特に好ましくは、ＴＡＬＥＮの両腕（右腕および左腕）は同時に細胞に運ばれる。
【００４０】
ｍＲＮＡを介して本発明によるＴＡＬＥＮ対を挿入することは、臨床適用にとって多数の大きな利点がある。ＤＮＡに基づく遺伝子導入ベクターを用いると、作成と実際的な適用をまったく簡略化できない可能性がある。ｍＲＮＡは標的細胞ですぐさま分解されるため、ＴＡＬＥＮのｍＲＮＡ媒介発現は比較的短時間で生じる。それにより、オフターゲット効果のリスクはさらに低減する。加えて、標的細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養は、非常に短時間にすぎないはずである。相応する技術は、ＧＭＰの必要条件に容易に適合できる。ウイルスベクターやプラスミドベクターとは異なり、望ましくないベクターの挿入による、遺伝子導入自体による副作用（例えば、挿入突然変異）、またはＴＡＬＥＮ発現に長時間かかることによる副作用（オフターゲット効果、ＴＡＬＥＮ特異的免疫応答の活性化）は予想されない。
【００４１】
さらなる態様において、本発明は、本発明による核酸を含むベクター、特に遺伝子導入ベクターと、本発明によるベクターまたは本発明による核酸もしくは核酸組成物を含む単離宿主細胞であって、人間の生殖系列細胞でなく、特に、ヒト生殖細胞またはヒト胚性生殖細胞でなく、かつ獲得の際にヒト胚を破壊した、または破壊するヒト胚性幹細胞でない単離宿主細胞とに関する。
【００４２】
さらに他の態様において、本発明は、本発明による核酸、核酸組成物、またはベクターを含む医薬組成物に関する。医薬組成物は、アジュバント、例えば、溶媒、溶解剤、溶解促進剤、塩形成剤、塩、緩衝剤、粘度および硬度影響剤、ゲル化剤、乳化剤、可溶化剤、湿潤剤、拡散剤、酸化防止剤、防腐剤、充填剤、および担体などを含んでよい。
【００４３】
さらに他の態様において、本発明は、本発明による核酸、核酸組成物、ベクター、または医薬組成物を含む医薬品に関する。
【００４４】
以下に、例示を目的として、実施例および添付の図面に従って本発明を詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】本発明によるＣＣＲ５特異的ＴＡＬＥＮ対（「ＣＣＲ５−Ｕｃｏ」）のＤＮＡ結合ドメインおよびＣＣＲ５遺伝子におけるその標的配列の概略説明図。下の行はそれぞれＴＡＬＥＮのａ）左腕およびｂ）右腕の標的配列を、上の行はそれぞれ対応するＴＡＬＥモノマーの関連ＲＶＤ（ｒｅｐｅａｔ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｉｒｅｓｉｄｕｅｓ［反復可変二残基］）を小さな枠で囲って示し（アミノ酸は１文字表記で記載）、ｃ）は、相補鎖を有するＣＣＲ５−ＤＮＡの領域（配列番号１１に示す配列のｎｔ１３５〜ｎｔ２２１）を示す。ＣＣＲ５−Ｕｃｏ−ＴＡＬＥＮの左腕（上）および右腕（下、相補鎖の上）の標的配列は、四角で囲んで際立たせている。
【図２】本発明によるＣＣＲ５−ＴＡＬＥＮ（「Ｕｃｏ」）と、先行技術による対照ＣＣＲ５−ＴＡＬＥＮ（「Ｍｃｏ」）との効率比較を示すグラフ。試験は、ＣＣＲ５陽性の２９３Ｔ細胞ベースのレポーター細胞株にプラスミド導入して行った。試験したコンストラクトすべてで、同等の導入効率が観察された（ｅＧＦＰの共導入に基づく）。ＣＣＲ５ノックアウトは、特異抗体（ａｎｔｉ−ＣＤ１９５−ＡＰＣ−Ｃｙ−７  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を用いたＣＣＲ５＋２９３Ｔ細胞クローン導入の６日後に確定された（ｎ＝２）。「モック」対照では、意味のない対照プラスミド（ｐＵＣ）を有する細胞、つまりＴＡＬＥＮをコードしない細胞を導入した。
【図３ａ】ｍＲＮＡ−導入後の、ＣＣＲ５−Ｕｃｏを有する一次Ｔリンパ球におけるＣＣＲ５ノックアウトを示す。ｅｘ  ｖｉｖｏ活性化後、健康な被験者ＣＣＲ５の一次Ｔリンパ球のおよそ半分が発現した（＝点線の右側の細胞、「導入されていないもの」と比較）。ＣＣＲ５特異的ＴＡＬＥＮ（Ｕｃｏ）の導入後、ＣＣＲ５陽性細胞の割合は、導入されたｍＲＮＡ量の増加に伴って（反比例して）減少することを示すグラフ。
【図３ｂ】ｍＲＮＡ−導入後の、ＣＣＲ５−Ｕｃｏを有する一次Ｔリンパ球におけるＣＣＲ５ノックアウトを示す。ｅｘ  ｖｉｖｏ活性化後、健康な被験者ＣＣＲ５の一次Ｔリンパ球のおよそ半分が発現した（＝点線の右側の細胞、「導入されていないもの」と比較）。上グラフに対し、個々のＴＡＬＥＮ腕の対照導入では、ＣＣＲ５陽性細胞の割合は減少しないことを示すグラフ。ＣＣＲ５ノックアウトは、特異抗体（ａｎｔｉ−ＣＤ１９５−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を用いたｍＲＮＡ−導入の６日後に確定された。
【図３ｃ】ｍＲＮＡ−導入後の、ＣＣＲ５−Ｕｃｏを有する一次Ｔリンパ球におけるＣＣＲ５ノックアウトを示す。ｅｘ  ｖｉｖｏ活性化後、健康な被験者ＣＣＲ５の一次Ｔリンパ球のおよそ半分が発現した（＝点線の右側の細胞、「導入されていないもの」と比較）。ＣＣＲ５−Ｕｃｏ−ＴＡＬＥＮの標的部位の分析から、分析した一次Ｔリンパ球１７個のうち９個（＞５０％）で遺伝子ノックアウトが示される説明図。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００４６】
本発明によるＣＣＲ５特異的ＴＡＬＥＮ（以下「ＣＣＲ５−Ｕｃｏ」）を作成して調べた。本発明によるＴＡＬＥＮは、これまでに説明されているＴＡＬＥＮのＣＣＲ５遺伝子（図１）で認識される標的配列とは異なる。
【００４７】
Ｔｏｎｉ  Ｃａｔｈｏｍｅｎ教授の研究所（ドイツ、フライブルク）の公表論文に基づく（非特許文献８）コドン最適化したＣＣＲ５−ＴＡＬＥＮ（「Ｍｃｏ」；配列番号１３、１４）と比べて、本発明によるＣＣＲ５−Ｕｃｏ−ＴＡＬＥＮは、レポーター細胞株へのプラスミド導入後のＣＣＲ５ノックアウトで明らかに高い誘導率を示す（図２）。ヒト細胞で使用するためにコドン最適化したＴＡＬＥＮの構成要素の核酸配列は、Ｆｅｎｇ  Ｚｈａｎｇのグループの公表文献（非特許文献１３、１４）に基づく。
【００４８】
先行技術によるＣＣＲ５−Ｍｃｏ−ＴＡＬＥＮのＲＶＤ配列は以下の通りである。
左腕（Ｌ）＝ＮＮ  ＮＧ  ＮＮ  ＮＮ  ＮＮ  ＨＤ  ＮＩ  ＮＩ  ＨＤ  ＮＩ  ＮＧ  ＮＮ  ＨＤ  ＮＧ  ＮＮ  ＮＮ  ＮＧ  ＨＤ
右腕（Ｒ）＝ＨＤ  ＮＧ  ＮＧ  ＨＤ  ＮＩ  ＮＮ  ＨＤ  ＨＤ  ＮＧ  ＮＧ  ＮＧ  ＮＧ  ＮＮ  ＨＤ  ＮＩ  ＮＮ  ＮＧ  ＮＧ
【００４９】
それに対応するＤＮＡレベルでの認識配列は以下の通りである。
センス鎖上のＬ＝ＧＴＧＧＧＣＡＡＣＡＴＧＣＴＧＧＴＣ（配列番号１５）
アンチセンス鎖上のＲ＝ＣＴＴＣＡＧＣＣＴＴＴＴＧＣＡＧＴＴ（配列番号１６）
【００５０】
スペーサーの長さは１５ｎｔである。ここでも、ＴＡＬＥＮプラスミドの作成は、Ｚｈａｎｇ  ＦまたはＳａｎｊａｎａ  ＮＥ  ｅｔ  ａｌ．の公表文献（上記参照、非特許文献１３、１４）に基づく。
【００５１】
本発明によるＣＣＲ５−Ｕｃｏを用いたｍＲＮＡ導入（非特許文献１２）によって、一次Ｔリンパ球でＣＣＲ５ノックアウトが引き起こされた（図３）。これに用いたｍＲＮＡの核酸配列は、配列番号１７および１８で表される。ＴＡＬＥＮの左腕のｍＲＮＡは配列番号１７で、ＴＡＬＥＮの右腕のｍＲＮＡは配列番号１８で表される。配列番号１７および１８におけるｍＲＮＡのヌクレオチド１０−３２２５は、アミノ酸配列が配列番号３、４で表されるＴＡＬＥＮの腕（モノマー）をそれぞれコードする。
【００５２】
導入したｍＲＮＡは、ベクターのＡｖｒＩＩ直線化後にＴ７プロモーターを用いて作成した。ＡｖｒＩＩ切断部位５６３ｂｐは終止コドンの後ろにあるため、表した配列はオープンリーディングフレームよりも長い。直線化後に、Ｃｅｌｌｓｃｒｉｐｔ（米国５３７１３ウィスコンシン州マディソン）のＴ７  ｍＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｍＲＮＡ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いたｍＲＮＡ作成のひな型として、Ｕｃｏ−ＴＡＬＥＮ−ＤＮＡを使用した。説明書に従って、ｍＲＮＡに５’キャップとポリＡ尾部とを付加した。ｍＲＮＡの導入は、一次Ｔ細胞の電気穿孔法（３００ボルト、１０ミリ秒）によって実施した。これに対し、Ｍｃｏ−ＣＣＲ５−ＴＡＬＥＮを用いた場合、一次Ｔ細胞またはＺ細胞株でＣＣＲ５ノックアウトを実現することはできなかった（一方、Ｔ細胞レセプターのノックアウトは可能であった。非特許文献１２。上記参照）。本発明によるＣＣＲ５−Ｕｃｏ−ＴＡＬＥＮを用いて初めて、ｍＲＮＡの移動によって、ＣＣＲ５対立遺伝子の５０％超という有意な割合を無力化することに成功した（図３ｃ）。これは、十分に活性なＴＡＬＥＮのみ、ｍＲＮＡ導入後に、一次Ｔ細胞でその機能を発揮できることを示唆している。したがって、本発明によるＣＣＲ５−ＴＡＬＥＮは、ｍＲＮＡ導入による使用にとりわけよく適しており、このため臨床適用にとって非常に魅力的となっている。
【００５３】
配列一覧：
配列番号：  種類  説明
０１  ＤＮＡ  標的配列ＴＡＬＥＮ  ＣＣＲ５−Ｕｃｏ  Ｌ
０２  ＤＮＡ  標的配列ＴＡＬＥＮ  ＣＣＲ５−Ｕｃｏ  Ｒ
０３  ＰＲＴ  ＴＡＬＥＮ  ＣＣＲ５−Ｕｃｏ  Ｌ
０４  ＰＲＴ  ＴＡＬＥＮ  ＣＣＲ５−Ｕｃｏ  Ｒ
０５  ＰＲＴ  反復配列（共通）
０６  ＰＲＴ  反復配列
０７  ＰＲＴ  反復配列
０８  ＰＲＴ  反復配列
０９  ＰＲＴ  反復配列
１０  ＰＲＴ  反復配列
１１  ＤＮＡ  ｈＣＣＲ５
１２  ＰＲＴ  ＦｏｋＩ開裂ドメイン
１３  ＰＲＴ  ＴＡＬＥＮ  ＣＣＲ５−Ｍｃｏ  Ｌ
１４  ＰＲＴ  ＴＡＬＥＮ  ＣＣＲ５−Ｍｃｏ  Ｒ
１５  ＤＮＡ  標的配列ＴＡＬＥＮ  ＣＣＲ５−Ｍｃｏ  Ｌ
１６  ＤＮＡ  標的配列ＴＡＬＥＮ  ＣＣＲ５−Ｍｃｏ  Ｒ
１７  ｍＲＮＡ  ｍＲＮＡ  ＣＣＲ５−Ｕｃｏ  Ｌ
１８  ｍＲＮＡ  ｍＲＮＡ  ＣＣＲ５−Ｕｃｏ  Ｒ
【００５４】
配列プロトコル−フリーテキスト
ＴＡＬＥＮ  ｒｅｐｅａｔ＝ＴＡＬＥＮ−  反復単位
Ａｎｙ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ，  ｏｒ  Ｅ，  Ｑ，  Ｄ  ｏｒ  Ａ＝任意のアミノ酸、またはＥ、Ｑ、ＤもしくはＡ
Ａｎｙ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ，  ｏｒ  Ａ  ｏｒ  Ｖ＝任意のアミノ酸、またはＡもしくはＶ
Ａｎｙ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ，  ｏｒ  Ａ  ｏｒ  Ｄ＝任意のアミノ酸、またはＡもしくはＤ
Ｒｅｐｅａｔ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｉｒｅｓｉｄｕｅ（ＲＶＤ）＝「Ｒｅｐｅａｔ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｉｒｅｓｉｄｕｅ（ＲＶＤ；反復単位の可変二残基）
ＦｏｋＩ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｄｏｍａｉｎ＝ＦｏｋＩ開裂ドメイン
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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