(57)【要約】本発明は、単一細胞中の特定の核酸配列における修飾ヌクレオチドまたは特定の核酸配列相互作用を可視化するための方法であって、インサイチュハイブリダイゼーション（ISH）反応を近接ライゲーションアッセイ（PLA）反応と合わせることを含む方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞中の特定の核酸配列における修飾ヌクレオチドを可視化するための方法であって：
a)少なくとも1つの標識で標識され、特定の核酸配列に相補性を有する少なくとも1つの核酸プローブと、調製した細胞を接触させる工程であって、ここで、該核酸プローブが特定の核酸配列とハイブリダイズされ、ハイブリダイズされた細胞を形成する工程；
b)核酸プローブの標識に結合する第1の結合剤および修飾ヌクレオチドに結合する第2の結合剤とハイブリダイズされた細胞を接触させる工程；
c)近接ライゲーションアッセイにより第1および第2の結合剤を検出して、細胞中の特定の核酸配列における修飾ヌクレオチドを可視化する工程
を含む、方法。
【請求項２】
調製した細胞が、固定され、透過性にされ、適宜変性した染色体DNAを含んでもよい、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
修飾ヌクレオチドが、5-メチルシチジン、3-メチルシチジン、5-ヒドロキシメチルシチジン、5-ホルミルシチジン、5-カルボキシルシチジン、1-メチルアデノシン、6-メチルアデノシン、7-メチルグアノシン、キサントシン、イノシン、ジヒドロウリジンまたはシュードウリジンまたは2'-O-メチル化を有する修飾リボースより選択される、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
特定の核酸配列が、プロモーターDNA、エンハンサーDNA、CpGアイランドDNA、コーディングDNA、イントロンDNA、メッセンジャーRNA、マイクロRNA、ノンコーディングRNA、長鎖ノンコーディングRNA、リボソームRNA、トランスファーRNA、核内低分子RNA、核小体低分子RNA、SmY RNA、Y RNA、スプライスドリーダーRNA、テロメラーゼRNAコンポーネント、低分子干渉RNA、Piwi相互作用RNAまたはトランス作動性RNAより選択される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
標識が、ビオチン、ジゴキシゲニン、ジニトロフェニル、フルオレセイン、ジエチルアミノクマリン、ローダミン、シアニン3、シアニン5またはテキサスレッドより選択されるハプタンまたは色素である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
核酸プローブが、直鎖状または環状であり、DNA、RNA、LNA、またはそれらの組合せを含み、約15ヌクレオチド〜約500ヌクレオチドの長さを有する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
細胞が、真核細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、正常細胞もしくは癌細胞より選択される個別細胞であるか、または細胞が、真核生物から得られる組織試料または体液試料内にある、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
修飾ヌクレオチドが5-メチルシチジンであり、特定の核酸配列がSeptin 9プロモーターである、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
細胞中の2つの核酸配列間の相互作用を可視化するための方法であって：
a)第1の標識を含み第1の核酸配列に相補性を有する第1の核酸プローブおよび第2の標識を含み第2の核酸配列に相補性を有する第2の核酸プローブと、調製した細胞を接触させる工程であって、ここで、第1および第2の標識が異なり、第1および第2の核酸プローブがそれぞれ第1および第2の核酸配列とハイブリダイズされる工程；
b)第1の標識に結合する第1の結合剤および第2の標識に結合する第2の結合剤と工程a)からの細胞を接触させる工程；
c)近接ライゲーションアッセイにより第1および第2の結合剤を検出して、細胞中の2つの核酸配列間の相互作用を可視化する工程
を含む、方法。
【請求項１０】
調製した細胞が、固定され、透過性にされ、適宜変性した染色体DNAを含んでもよい、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
第1および第2の核酸配列の各々が、プロモーターDNA、エンハンサーDNA、CpGアイランドDNA、コーディングDNA、イントロンDNA、メッセンジャーRNA、マイクロRNA、ノンコーディングRNA、長鎖ノンコーディングRNA、リボソームRNA、トランスファーRNA、核内低分子RNA、核小体低分子RNA、SmY RNA、Y RNA、スプライスドリーダーRNA、テロメラーゼRNAコンポーネント、低分子干渉RNA、Piwi相互作用RNAまたはトランス作動性RNAより選択される、請求項9または10に記載の方法。
【請求項１２】
第1および第2の標識の各々が、ビオチン、ジゴキシゲニン、ジニトロフェニル、フルオレセイン、ジエチルアミノクマリン、ローダミン、シアニン3、シアニン5またはテキサスレッドより選択される、請求項9〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
第1および第2の核酸プローブの各々が、直鎖状または環状であり、DNA、RNA、LNA、またはそれらの組合せを含み、約15ヌクレオチド〜約500ヌクレオチドの長さを有する、請求項9〜12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
細胞が、真核細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、正常細胞もしくは癌細胞より選択される個別細胞であるか、または細胞が、真核生物から得られる組織試料または体液試料内にある、請求項9〜13のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、単一細胞中の特定の核酸配列における修飾ヌクレオチドまたは特定の核酸配列相互作用を可視化するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エピジェネティックは、DNA配列の変更なしに生じる遺伝子発現における遺伝的変化を指す。主なエピジェネティックな過程は、DNAメチル化およびヒストン共有結合性修飾を含む。分子レベルまたはゲノムスケールでのエピジェネティックマークを研究するのに利用可能な多数の技術がある。しかしながら、必要とされるのは、個別細胞中の単一のゲノム座位でのエピジェネティックマークを可視化する技術である。
【発明の概要】
【０００３】
本開示の様々な態様のうち、細胞中の特定の核酸配列における修飾ヌクレオチドを可視化するための方法の提供がある。当該方法は、a)少なくとも1つの標識で標識され、特定の核酸配列に相補性を有する少なくとも1つの核酸プローブと調製した細胞を接触させる工程であって、ここで、該核酸プローブが特定の核酸配列とハイブリダイズされ、ハイブリダイズされた細胞を形成する工程；b)核酸プローブの標識に結合する第1の結合剤および修飾ヌクレオチドに結合する第2の結合剤とハイブリダイズされた細胞を接触させる工程；およびc)近接ライゲーションアッセイにより第1および第2の結合剤を検出して、細胞中の特定の核酸配列における修飾ヌクレオチドを可視化する工程を含む。いくつかの実施態様において、調製した細胞は、固定され、透過性にされ、そして適宜、変性した染色体DNAを含んでもよい。他の実施態様において、修飾ヌクレオチドは、5-メチルシチジン、3-メチルシチジン、5-ヒドロキシメチルシチジン、5-ホルミルシチジン、5-カルボキシルシチジン、1-メチルアデノシン、6-メチルアデノシン、7-メチルグアノシン、キサントシン、イノシン、ジヒドロウリジンまたはシュードウリジンまたは2'-O-メチル化を有する修飾リボースより選択される。更なる実施態様において、特定の核酸配列は、プロモーターDNA、エンハンサーDNA、CpGアイランド、コーディングDNA、イントロンDNA、メッセンジャーRNA、マイクロRNA、ノンコーディングRNA、長鎖ノンコーディングRNA、リボソームRNA、トランスファーRNA、核内低分子RNA、核小体低分子RNA、SmY RNA、Y RNA、スプライスドリーダーRNA、テロメラーゼRNAコンポーネント、低分子干渉RNA、Piwi相互作用RNA（Piwi-interacting RNA）またはトランス作動性RNAより選択される。他の実施態様において、標識は、ビオチン、ジゴキシゲニン、ジニトロフェニル、フルオレセイン、ジエチルアミノクマリン、ローダミン、シアニン3、シアニン5またはテキサスレッドより選択されるハプタン（haptan）または色素である。更に他の実施態様において、核酸プローブは、直鎖状または環状であり、DNA、RNA、LNA、またはそれらの組合せを含み、約15ヌクレオチド〜約500ヌクレオチドの長さを有する。代替実施態様において、細胞は、真核細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、正常細胞もしくは癌細胞より選択される個別細胞であるか、または細胞は、真核生物から得られる組織試料または体液試料内にある。いくつかの実施態様において、修飾ヌクレオチドは5-メチルシチジンであり、特定の核酸配列はSeptin 9プロモーターである。
【０００４】
本開示の別の一態様は、細胞中の2つの核酸配列間の相互作用を可視化するための方法を包含する。当該方法は、a)第1の標識を含み第1の核酸配列に相補性を有する第1の核酸プローブおよび第2の標識を含み第2の核酸配列に相補性を有する第2の核酸プローブと、調製した細胞を接触させる工程であって、ここで、第1および第2の標識が異なり、第1および第2の核酸プローブがそれぞれ第1および第2の核酸配列とハイブリダイズされる工程；b)第1の標識に結合する第1の結合剤および第2の標識に結合する第2の結合剤と細胞を接触させる工程；およびc)近接ライゲーションアッセイにより第1および第2の結合剤を検出して、細胞中の2つの核酸配列間の相互作用を可視化する工程を含む。いくつかの実施態様において、調製した細胞は、固定され、透過性にされ、そして適宜、変性した染色体DNAを含んでもよい。他の実施態様において、修飾ヌクレオチドは、5-メチルシチジン、3-メチルシチジン、5-ヒドロキシメチルシチジン、5-ホルミルシチジン、5-カルボキシルシチジン、1-メチルアデノシン、6-メチルアデノシン、7-メチルグアノシン、キサントシン、イノシン、ジヒドロウリジンまたはシュードウリジンまたは2'-O-メチル化を有する修飾リボースより選択される。更なる実施態様において、特定の核酸配列は、プロモーターDNA、エンハンサーDNA、CpGアイランド、コーディングDNA、イントロンDNA、メッセンジャーRNA、マイクロRNA、ノンコーディングRNA、長鎖ノンコーディングRNA、リボソームRNA、トランスファーRNA、核内低分子RNA、核小体低分子RNA、SmY RNA、Y RNA、スプライスドリーダーRNA、テロメラーゼRNAコンポーネント、低分子干渉RNA、Piwi相互作用RNAまたはトランス作動性RNAより選択される。他の実施態様において、標識は、ビオチン、ジゴキシゲニン、ジニトロフェニル、フルオレセイン、ジエチルアミノクマリン、ローダミン、シアニン3、シアニン5またはテキサスレッドより選択されるハプタンまたは色素である。更に他の実施態様において、核酸プローブは、直鎖状または環状であり、DNA、RNA、LNA、またはそれらの組合せを含み、約15ヌクレオチド〜約500ヌクレオチドの長さを有する。代替実施態様において、細胞は、真核細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、正常細胞もしくは癌細胞より選択される個別細胞であるか、または細胞は、真核生物から得られる組織試料または体液試料内にある。
【０００５】
本開示の他の態様および特徴を以下に詳述する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
本特許または出願書類は、カラーで作成された少なくとも1つの図面を含む。カラーの図面を有する本特許または特許出願公報は、請求および必要な費用の支払いによって庁より提供される。
【０００７】
【図１】図1は、インサイチュハイブリダイゼーション-近接ライゲーションアッセイ（ISH-PLA）プロトコールを概説する。
【０００８】
【図２】図2は、SEPTIN 9プロモーターの配列、ならびにSEPTIN 9プロモーターのCpGアイランド（イタリック体で示す）周辺のプロモーター領域を標的とするように設計された18個のオリゴプローブ（下線部）の位置を示す。
【０００９】
【図３】図3A、図3Bおよび図3Cは、前立腺癌細胞（DU145）におけるSEPTIN 9プロモーターのメチル化の可視化を示す。図3Aは、DAPIで染色したLacZプローブ（PLAシグナル無し）とインキュベートしたコントロールの前立腺癌（DU145）細胞を示す。図3Bおよび図3Cは、SEPTIN 9オリゴプローブとインキュベートした細胞を示す。PLAシグナルは赤色で示される。核当たり2つの赤色のドットは、SEPTIN 9が位置するDU145細胞における17番染色体の二倍体数を表す。図3Bは、PLAシグナルおよびDAPI染色のオーバーレイを示す。図3Cは、PLAシグナルおよび微分干渉コントラスト（DIC）のオーバーレイを示す。
【００１０】
【図４】図4Aおよび図4Bは、結腸癌細胞（SW480）におけるSEPTIN 9プロモーターのメチル化を示す。PLAシグナルは赤色で示される。核当たり3つの赤色のドットは、SEPTIN 9が位置するSW480細胞における17番染色体の三倍体数を表す。図4Aは、PLAシグナルおよびDAPIのオーバーレイを示す。図4Bは、DICおよびPLAシグナルのオーバーレイを示す。
【００１１】
【図５】図5は、SW480細胞の5-AzaC処理後にSEPTIN 9プロモーターのメチル化が減少することを示す。少数の薬物処理された細胞は、PLA-プローブのトラップをもたらす変形した細胞の形状の点で細胞毒性効果を示し、少数の細胞において観察される拡散した非特異的な赤色蛍光を説明した。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本開示は、単一細胞中の、特定の核酸配列における修飾ヌクレオチド、または特定の核酸配列とタンパク質もしくは他の特定の核酸配列との間の相互作用を可視化するための方法を提供する。当該方法は、インサイチュハイブリダイゼーション（ISH）反応を近接ライゲーションアッセイ（PLA）反応と合わせることを含み、個別細胞中の単一ゲノム座位でのDNAメチル化などのエピジェネティックマークを可視化するために用いられ得る。癌などの多くの疾患は、異常なプロモーター過剰メチル化に関連する。したがって、本明細書に記載の方法は、正常な細胞のバックグラウンドにおいて癌細胞を検出するために用いられ、および／または癌生検組織試料をスクリーニングするための診断ツールとして用いられ得る。
【００１３】
I. 細胞中の修飾ヌクレオチドを可視化するための方法
本開示の一態様は、細胞中の対象とする核酸配列における修飾ヌクレオチドを可視化するための方法を提供する。当該方法は、少なくとも1つの標識で標識され、対象とする特定の核酸配列に相補性を有する少なくとも1つの核酸プローブと調製した細胞を接触させることを含み、ここで、該核酸プローブが特定の核酸配列とハイブリダイズされる。当該方法は更に、核酸プローブの標識に結合する第1の結合剤および対象とする修飾ヌクレオチドに結合する第2の結合剤と細胞を接触させることを含む。最後に、当該方法は、近接ライゲーションアッセイにより第1および第2の結合剤を検出して、細胞中の対象とする特定の核酸配列における修飾ヌクレオチドを可視化することを含む。
【００１４】
(a)工程A - 標識プローブを特定の核酸にハイブリダイズさせる
方法の第1工程は、インサイチュハイブリダイゼーション反応を含む。この工程は、少なくとも1つの標識で標識され、対象とする特定の核酸配列に相補性を有する少なくとも1つの核酸プローブと調製した細胞を、該核酸プローブが修飾ヌクレオチドを含む特定の核酸配列とハイブリダイズされるように接触させることを含む。
【００１５】
(i)修飾ヌクレオチド
本明細書に記載の方法は、種々の修飾ヌクレオチドを検出および可視化するために用いられ得る。修飾ヌクレオチドは、DNAまたはRNA内にあり得て、ヌクレオチドは、メチル化、ヒドロキシル化、アセチル化、ホルミル化、アシル化、カルボキシル化、チオール化、アルキル化、アミノ化、エステル化、リン酸化、またはそれらの組合せにより修飾され得る。修飾ヌクレオチドの特定の例としては、5-メチルシチジン、5-ヒドロキシメチルシチジン、5-ホルミルシチジン、5-カルボキシルシチジン、3-メチルシチジン,N4-メチルシチジン、N4-アセチルシチジン（N4-acetycytidine）、2-チオシチジン、1-メチルアデノシン、2-メチルアデノシン、N6-メチルアデノシン、N6,N6-ジメチルアデノシン、N6,N6,N6-トリメチルアデノシン、N6-イソペンテニルアデノシン（N6-isopenyladenosine）、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデノシン（2-methylthio-N6-isopenyladenosine）、1-メチル-グアノシン、N2-メチルグアノシン、N2,N2-ジメチルグアノシン、N2,N2,N2-トリメチルグアノシン、7-メチルグアノシン、キサントシン、イノシン、1-メチルイノシン、ジヒドロウリジン、シュードウリジン、1-メチルシュードウリジン、3-メチルウリジン、5-メチルウリジン、5-メチルアミノメチルウリジン、5-メトキシアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルウリジン,5-メトキシカルボニルメチル-2-チオウリジン、5-メトキシカルボニルメチルウリジン、5-メトキシウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウリジン（5-carboxymethyaminomethyluridine）、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン（5-carboxymethyaminomethyl-2-thiouridine）、ウリジン-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウリジン-5-オキシ酢酸、5-メチル-2-チオウリジン、2-チオウリジン、4-チオウリジン、ワイブトキソシン、ワイブトシン、キュェオシン、リボシルチミン、ピリミジンダイマー、および標準または修飾リボヌクレオチドの2'-O-メチル誘導体が挙げられる。特定の実施態様において、修飾ヌクレオチドは5-メチルシチジンである。
【００１６】
(ii)特定の核酸配列
修飾ヌクレオチドを含む特定の核酸配列は、変化してもよく、変化するであろう。核酸配列の非限定的例としては、染色体DNA、DNAの転写制御領域、プロモーターDNA、CpG、エンハンサーDNA、サイレンサーDNA、DNAの座位制御領域、タンパク質-コーディングDNA、イントロンDNA、RNA-コーディングDNA、エピソームDNA、ウイルスRNA、メッセンジャーRNA（mRNA）、マイクロRNA（miRNA）、ノンコーディングRNA（ncRNA）、長鎖ノンコーディングRNA（lncRNA）、リボソームRNA（rRNA）、トランスファーRNA（tRNA）、核内低分子RNA（snRNA）、核小体低分子RNA（snoRNA）、SmY RNA、Y RNA、スプライスドリーダーRNA（SL RNA）、テロメラーゼRNAコンポーネント（TERC）、低分子干渉RNA（siRNA）、Piwi相互作用RNA（piRNA）またはトランス作動性RNA（rasiRNA）が挙げられる。
【００１７】
修飾ヌクレオチドを含む特定の核酸配列の同一性は、特定の核酸配列のすべてまたは一部の配列が公知である限り、変化してもよく、変化するであろう。いくつかの実施態様において、特定の核酸配列は、異常な遺伝子発現に関連する疾患または障害に関連するタンパク質をエンコードする染色体配列（すなわち遺伝子）の領域であり得る。異常な遺伝子発現は、過剰メチル化または低メチル化プロモーター制御領域に関連し得る。異常な遺伝子発現に関連する疾患または障害の非限定的例としては、癌（例えば結腸、胃、膵臓、肝臓、腎臓、膀胱、直腸、肺、胸、卵巣、頚部、脳、神経膠腫、白血病、黒色腫、前立腺および頭頸部の癌）、自己免疫性疾患（例えば1型糖尿病、炎症性腸疾患）、炎症性疾患（例えば喘息）および代謝障害が挙げられる。例えば、癌に関連する遺伝子の非限定的例としては、Septin 9、ATM、APC、BRCA1、BRCA2、CDH1、E-Cad、CDKN2B、DAPK、FANCB、FANCF、GATA-4、GATA-5、GSTP1、HER2、HIC1、MGMT、MLH1、MSH2、MSH4、NEIL1、PITX2、p14ARF、p15INK4B、p16INK4A、p53、p73、RAD51C、RASSF1、RB、TIMP3、VHLおよびWRNが挙げられる。自己免疫性または炎症性疾患または障害に関連する遺伝子の例としては、AAA1、ABCB1、ARTS-1、ATG16L1、BSN、CLSTN3、CTLA4、ERBB3、FCER1A、GSTP1、GSDML、HLA、HLA-DQA1、IFIH1、IL2Ra、IL23R、IBD5、IRGM、JAZF1、KIQQ1109、LNPEP、LPP、MYO9B、MST、NKKX2-3、NELL1、NOD2、NOTCH2、PLA2G7、PPATG、PTPN2、RGS1、SH2B3、TAGAP、THADA、TNFおよびWSF1が挙げられるが、これらに限定されない。他の実施態様において、修飾ヌクレオチドは、特定のmRNA配列（例えば上記の遺伝子のいずれかの転写物）、特定のmiRNA（例えば、結腸癌に関連するmiRNAとしては、miR-551a、miR-552、miR-138、miR-451、miR-144、miR548h、miR-658、miR-595、miR-338-3pなどが挙げられる）、または特定のlncRNA（例えばRepA、HOTAIR、Airnm、Kcnq1ot1、Evf-2、HSR1、SRA、NRON、MALAT1、NEAT2など）にあり得る。
【００１８】
(iii)核酸プローブ
方法で用いられる核酸プローブ（またはプローブ）は、少なくとも1つの標識で標識され、修飾ヌクレオチドを含む特定の核酸配列に相補性を有する。核酸プローブは、DNA、RNA、LNA、PNA、またはそれらの組合せであり得て；標準的なヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含み得て；そして標準的な糖-リン酸骨格または修飾骨格（例えばホスホロチオネート）を含み得る。核酸プローブは一本鎖であり得るか、または核酸プローブは2本鎖であり得る（そして使用前に変性され得る）。核酸プローブは直鎖状または環状であり得て、二次構造（例えばヘアピン、ループ、ステム、バルジなど）を含み得る。
【００１９】
核酸プローブの長さは、変化してもよい。例えば、核酸プローブは、約10ヌクレオチドから数千ヌクレオチドの長さの範囲であり得る。いくつかの実施態様において、核酸プローブは、約10〜30ヌクレオチドの長さ、約15〜25ヌクレオチドの長さまたは約20ヌクレオチドの長さであり得る。他の実施態様において、核酸プローブは、約15〜500ヌクレオチド、約30〜100ヌクレオチド、約100〜300ヌクレオチド、約300〜約1000ヌクレオチドまたは約1000〜約10,000ヌクレオチドの長さであり得る。したがって様々な実施態様において、核酸プローブは、約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500または10000ヌクレオチドの長さであり得るか、または前記整数の所定の隣接したセットの間にある任意の整数（例えば11、12、13または14、16、17、18または19；21、22、23または24など）であり得る。
【００２０】
核酸プローブは少なくとも1つの標識で標識される。標識はハプタンまたは色素であり得る。適切なハプタンおよび色素の非限定的例としては、ビオチン、ジゴキシゲニン、ジニトロフェニル、フルオレセイン、ジエチルアミノクマリン、ローダミン、シアニン3、シアニン5およびテキサスレッドが挙げられる。いくつかの実施態様において、標識は、核酸プローブの5'末端または3'末端に位置し得る。例えば、標識は、（例えばテトラ-エチレングリコール（TEG）スペーサー、ポリエチレングリコール（PEG）スペーサー、C6リンカー、または当該技術分野において公知の別のリンカー）を介して核酸プローブの末端いずれかに結合し得る。他の実施態様において、標識は核酸プローブの全体にわたって位置し得て、すなわち核酸プローブは標識ヌクレオチドを含み得る。
【００２１】
核酸プローブは、化学的または酵素的に合成され得る。一実施態様において、核酸プローブは、標準的ホスホルアミダイト固相合成技術を用いて合成され得る。得られたプローブは、標準的な手順を用いて標識で末端標識され得る。別の一実施態様において、標識DNAプローブは、標識ヌクレオチド（例えば標識dATPまたは標識dCTP）の存在下でニックトランスレーションにより合成され得る。更に別の一実施態様において、標識RNAプローブは、標識リボヌクレオチド（例えば標識UTP）を用いる存在下でインビトロ転写より合成され得る。
【００２２】
核酸プローブは、対象とする特定の核酸に相補性を有するように設計される（すなわち、対象とする特定の核酸と塩基対を有し得る）。様々な実施態様において、核酸プローブは、対象とする特定の核酸に対して約75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％または100％の配列相補性を有し得る。特定の実施態様において、核酸プローブは、対象とする特定の核酸に対して少なくとも約90％または95％の配列相補性を有する。
【００２３】
いくつかの実施態様において、核酸プローブは、一般的な対象とする特定の核酸の隣接領域に相補性を各々有する短い核酸配列の集合を含み、ここでハイブリダイゼーションの際、核酸プローブは対象とする特定の核酸の「タイル」である。他の実施態様において、核酸プローブは、プローブの長さ全体にわたって標識ヌクレオチドを含む、より長い核酸配列であり得る。
【００２４】
(iv)細胞
様々な細胞が本明細書に記載の方法において用いられ得る。一般に、細胞は真核細胞である。様々な態様において、細胞は、ヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、非哺乳類脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞または単細胞真核生物であり得る。細胞は、正常細胞、異常細胞または癌細胞であり得る。細胞は、一次細胞または細胞株化細胞であり得る。細胞は、成体細胞または胚性細胞（例えば胚）であり得る。更に他の態様において、細胞は幹細胞であり得る。適切な幹細胞としては、胚性幹細胞、ES様幹細胞、胎児幹細胞、成体幹細胞、多能性幹細胞、誘導多能性幹細胞、多分化能幹細胞、寡占性幹細胞、単能性幹細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な態様において、細胞は哺乳動物細胞である。
【００２５】
いくつかの実施態様において、細胞はヒト細胞株化細胞であり得る。適切な細胞株の非限定的例としては、DU145（転移癌）、SW490（結腸癌）、DLD-1（結腸癌）、KM20L2（結腸癌）、COLO 205（結腸癌）、HCC-2998、（結腸癌）、HCT-116（結腸癌）、HCT-15（結腸癌）、HT29（結腸癌）、KM12（結腸癌）、SW-620（結腸癌）、SF-268（CNS）、SF-295（CNS）、SF-539（CNS）、SNB-19（CNS）、SNB-75（CNS）、U251（CNS）、CCRF-CEM（白血病）、HL-60（TB）（白血病）、K-562（白血病）、MOLT-4（白血病）、RPMI-8226（白血病）、SR（白血病）、A549（非小細胞性肺癌）、EKVX（非小細胞性肺癌）、HOP-62（非小細胞性肺癌）、HOP-92（非小細胞性肺癌）、NCI-H226（非小細胞性肺癌）、NCI-H23（非小細胞性肺癌）、NCI-H322M（非小細胞性肺癌）、NCI-H460（非小細胞性肺癌）、NCI-H522（非小細胞性肺癌）、LOX IMVI（黒色腫）、MALME-3M（黒色腫）、M14（黒色腫）、MDA-MB-435（黒色腫）、SK-MEL-2（黒色腫）、SK-MEL-28（黒色腫）、SK-MEL-5 U（黒色腫）、ACC-257（黒色腫）、UACC-62（黒色腫）、IGR-OV1（卵巣）、OVCAR-3（卵巣）、OVCAR-4 OVCAR-5（卵巣）、OVCAR-8（卵巣）、SK-OV-3（卵巣）、786-0（腎臓）、A498（腎臓）、ACHN（腎臓）、CAKI-1（腎臓）、RXF 393（腎臓）、SN12C（腎臓）、TK-10（腎臓）、UO-31（腎臓）、PC-3（前立腺）、DU-145（前立腺）、MCF7（乳）、MDA-MB-231（乳）、MDA-MB-468（乳）、HS 578T（乳）、BT-549（乳）およびT-47D（乳）が挙げられる。
【００２６】
他の実施態様において、細胞は哺乳類細胞株化細胞であり得て、適切な哺乳類細胞株の非限定的例としては、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、ベビーハムスター腎臓（BHK）細胞；マウス骨髄腫NS0細胞、マウス胚性線維芽細胞3T3細胞（NIH3T3）、マウスBリンパ腫A20細胞；マウス黒色腫B16細胞；マウス筋芽C2C12細胞；マウス骨髄腫SP2/0細胞；マウス胚性間葉性C3H-10T1/2細胞；マウス癌腫CT26細胞、マウス前立腺DuCuP細胞；マウス胸EMT6細胞；マウス肝癌Hepa1c1c7細胞；マウス骨髄腫J5582細胞；マウス上皮性MTD-1A細胞；マウス心筋MyEnd細胞；マウス腎臓RenCa細胞；マウス膵臓RIN-5F細胞；マウス黒色腫X64細胞；マウスリンパ腫YAC-1細胞；ラット神経膠芽腫9L細胞；ラットB リンパ腫RBL細胞；ラット神経芽腫B35細胞；ラット肝癌細胞（HTC）；バッファローラット肝臓BRL3A細胞；イヌ腎臓細胞（MDCK）；イヌ乳腺（CMT）細胞；ラット骨肉腫D17細胞；ラット単球/マクロファージDH82細胞；サル腎臓SV-40形質転換線維芽細胞（COS7）細胞；サル腎臓CVI-76細胞；アフリカミドリザル腎臓（VERO-76）細胞；およびヒト胚性腎臓細胞（HEK293、HEK293T）が挙げられる。哺乳類細胞株の広範なリストは、American Type Culture Collectionカタログ（ATCC、Manassas、VA）で見出され得る。
【００２７】
更に他の実施態様において、細胞は、対象体から得られる組織試料または体液試料内にあり得る。例えば、組織試料または体液試料は、外科的切除、切除生検、切開生検、コア生検または針吸引生検により取り除かれ得る。対象体は、ヒト、非ヒト哺乳類（例えばげっ歯類、ネコ、イヌ、家畜動物など）または非哺乳類脊椎動物（例えば魚、鳥など）であり得る。組織試料は、凍結されるか、または以下に詳述する固定剤を用いて固定され得る。固定された組織試料は、包埋剤、例えばパラフィン、パラプラストまたは同様の包埋剤に包埋され得る。
【００２８】
(v)細胞の調製
細胞は、インサイチュハイブリダイゼーションのために、細胞を固定し、細胞を透過性にして、そして適宜、細胞の染色体DNAを変性させることにより調製され得る。様々な固定剤を、細胞を固定また架橋するために用い得る。適切な固定剤の例としては、アセトン、酢酸、エタノール、ホルムアルデヒド（またはホルマリン、ホルムアルデヒドの37％水溶液）、グルタルアルデヒド、ヨードホルム、乳酸、メタノール、パラホルムアルデヒド、ピクリン酸、およびそれらの組合せが挙げられる。特定の実施態様において、固定剤はパラホルムアルデヒドであり得る。固定剤の濃度および固定工程の継続時間は、細胞の種類（例えば細胞株化細胞または組織中の細胞）に応じて変化するであろう。
【００２９】
固定された細胞は、少なくとも1つの界面活性剤および／またはプロテアーゼを含む溶液とのインキュベーションにより透過性にされる。適切な界面活性剤の非限定的例としては、ツイーン-20、ツイーン-80、トリトンX-100、セチルアルコール、デシルグルコシド、ジギトニン、ラウリルグルコシド、IGEPAL CA-630、ロイコパーム、NP-40、ノノキシノール-9、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、n-オクチルβ-D-チオグルコピラノシド、オレイルアルコール、オクチルグルコシド、ポリソルベート20、ポリソルベート80、サポニン、ステアリルアルコール、またはそれらの組合せが挙げられる。適切なプロテアーゼとしては、プロテイナーゼK、カスパーゼ、キモトリプシン、パパイン、ペプシンおよびトリプシンが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、細胞は、ツイーン-20および／またはトリトンX-100を含む溶液とインキュベートされる。界面活性剤またはプロテアーゼの濃度およびインキュベーション期間の継続時間は、細胞、組織または体液の種類に応じて変化してもよく、変化するであろう。
【００３０】
修飾ヌクレオチドを含む特定の核酸配列が2本鎖である実施態様において、細胞を変性溶液に接触させて、2本鎖核酸を1本鎖核酸に変換する。変性溶液は酸性であり得るか、またはアルカリ性であり得る。酸性溶液は、酸、例えば塩酸を含みおよびアルカリ性溶液は、塩基、例えばアルカリ金属水酸化物（例えばナトリウムまたは水酸化カリウム）を含む。変性溶液中の酸または塩基の濃度および変性工程の継続時間は、細胞、組織または体液の種類に応じて変化してもよく、変化するであろう。
【００３１】
核酸の変性後、細胞をプロテアーゼと接触させて、タンパク質を核酸から取り除き、これにより特定の核酸を核酸プローブにより近づきやすくさせ得る。適切なプロテアーゼの非限定的例としては、カスパーゼ、キモトリプシン、パパイン、ペプシン、プロテイナーゼK、トリプシン、およびそれらの組合せが挙げられる。プロテアーゼおよびの濃度およびインキュベーション期間の継続時間は、細胞、組織または体液の種類に応じて変化してもよく、変化するであろう。
【００３２】
いくつかの実施態様において、細胞は、組織試料または組織試料の部分内であり得る。試料は、凍結した試料、またはホルマリン固定されパラフィン包埋された（FFPE）試料であり得る。試料が凍結した試料である状況において、細胞を固定し、透過性にし得て、染色体DNAを変性し得て、そして細胞を基本的に上記したプロテアーゼと接触させ得る。試料がFFPE試料である状況において、試料をキシレンまたは有機溶媒を用いて脱パラフィンし得て、細胞を透過性にし得て、染色体DNAを変性し得て、そして細胞を基本的に上記したプロテアーゼと接触させ得る。
【００３３】
(vi)ハイブリダイゼーション
当該方法は、調製した細胞を標識核酸プローブと接触させて、ハイブリダイズされた細胞を形成し、ここで標識核酸プローブは修飾ヌクレオチドを含む特定の核酸配列と塩基対をなすことを含む。このために、標識核酸プローブと対象とする核酸配列との間の細胞内（インサイチュ）ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、調製した細胞を標識核酸プローブとインキュベートする。インサイチュハイブリダイゼーションプロトコールおよびインサイチュハイブリダイゼーション溶液は、当該技術分野において公知である。特定の実施態様において、ハイブリダイゼーション溶液は、50％ホルムアミド、10％フィコール400、0.1％SDSおよび2X SSC（生理食塩水-クエン酸ナトリウム）を含有し得る。ハイブリダイゼーション反応の温度および継続時間は、細胞または組織の種類に応じて変化してもよい。例えば、細胞が培養細胞である実施態様において、ハイブリダイゼーションを約37℃で約16時間実施し得る。
【００３４】
(b)工程B - 第1および第2の結合剤の結合
当該方法は、ハイブリダイズされた核酸プローブ-特定の核酸配列の複合体を含むハイブリダイズされた細胞を、核酸プローブの標識に結合する第1の結合剤および対象とする修飾ヌクレオチドに結合する第2の結合剤と接触させることをさらに含む。第1および第2の結合剤の各々は、独立してタンパク質、抗体（例えばモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体）、抗体断片（例えばFc断片またはFab断片）、核酸またはアダプタマーであり得る。特定の実施態様において、第1および第2の結合剤の各々は抗体であり、ここで各抗体が異なる種において製造される。例えば、第1の結合剤は、標識核酸プローブ中の標識を認識するウサギポリクローナル抗体であり得て、第2の結合剤は、修飾ヌクレオチドを認識するマウスモノクローナルであり得る。細胞を抗体とインキュベートする方法は、適切な溶液（例えばブロッキング溶液、リンスまたは洗浄溶液、インキュベーション溶液など）と同様に、当業者に周知である。
【００３５】
(c)工程C - 第1および第2の結合剤の検出
当該方法は、近接している第1および第2の結合剤を検出することをさらに含む。第1の結合剤はハイブリダイズされた核酸プローブの標識に結合し、第2の結合剤は細胞内の1つ1つの修飾ヌクレオチドに結合する。ハイブリダイズされた核酸プローブ-特定の核酸配列の複合体に結合された第1および第2の結合剤を検出する（したがって、対象とする特定の核酸配列における修飾ヌクレオチドを検出する）ために、近接ライゲーションアッセイ（PLA）が、近接している第1および第2の結合剤を検出するのに用いられる（すなわち約40 nm以内、Gomez et al., 2013, Nature Methods, 10 (2):171-177）。PLAキットは市販で入手可能である（例えばDUOLINK（登録商標）、Sigma-Aldrich）。PLAシグナルは、標準的な蛍光顕微鏡および画像分析ソフトウェアプログラムを用いて検出および分析され得る。
【００３６】
(d)特定の実施態様
一実施態様において、修飾ヌクレオチドは5-メチルシチジンであり得て、特定の核酸配列はSeptin 9プロモーターDNAであり得て、細胞はヒト癌細胞（例えば結腸癌細胞）であり得る。特定の核酸配列はビオチンで標識され得て、第1の結合剤はウサギで産生される抗ビオチンポリクローナル抗体であり得る。第2の結合剤はマウスで産生される抗5-メチル-シトシンモノクローナル抗体であり得る。
【００３７】
II. 細胞における核酸相互作用を可視化するための方法
本開示の更なる態様は、細胞中の特定の核酸間の相互作用を可視化するための方法を提供する。当該方法は、第1の標識を含み第1の核酸配列に相補性を有する第1の核酸プローブおよび第2の標識を含み第2の核酸配列に相補性を有する第2の核酸プローブと、調製した細胞を接触させることを含み、ここで、第1および第2の標識が異なり、第1および第2の核酸プローブがそれぞれ第1および第2の核酸配列とハイブリダイズされる。当該方法は、細胞を第1の標識に結合する第1の結合剤および第2の標識に結合する第2の結合剤と接触させ、そして近接ライゲーションアッセイにより第1および第2の結合剤を検出して、細胞中の2つの核酸間の相互作用を可視化することをさらに含む。
【００３８】
種々の核酸相互作用は、開示される方法を用いて検出され得る。非限定的例としては、RNAとDNAとの間の相互作用（例えば転写、複製、組換え、修復、または別の核プロセス中の特定の染色体配列と相互作用するノンコーディングRNAまたは機能性RNA）、異なるクラスのRNAとの間の相互作用（例えばRNAプロセシング、スプライシング（slicing）、翻訳、核移行、および他の細胞事象中）が挙げられる。適切な核酸の例は、上記セクションI(a)(ii)に詳述される。
【００３９】
第1および第2の核酸プローブの各々は、基本的に上記セクションI(a)(iii)に詳述されるが、第1および第2の核酸プローブの各々は、異なる標識で標識される。一実施態様において、第1の核酸プローブはビオチンで標識され得て、第2の核酸プローブはジゴキシゲニンで標識され得る。別の一実施態様において、第1の核酸プローブはビオチンで標識され得て、第2の核酸プローブはフルオレセイン（例えばフルオレセインイソチオシアネート、FITC）で標識され得る。
【００４０】
上記の方法において本発明の範囲から逸脱することなく様々な変更を行い得るので、上記の説明および下記の例に含まれるすべての事項は、例示として解釈され限定する意味ではないことを意図する。
【００４１】
（定義）
他に定義されない限り、本明細書で用いられるすべての技術的および科学的用語は、本発明の属する分野における当業者によって一般的に理解される意味を有する。以下の参考文献は、本発明で用いられる用語の多くの一般的定義を当業者に提供する：Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988)；The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991)；およびHale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書で用いる以下の用語は、他に明記されない限り、それらに帰する意味を有する。
【００４２】
本開示の要素またはそれらの好ましい態様を導入するとき、冠詞「a」、「an」、「the」および「said」は、1または複数の要素があること意味することが意図される。用語「含む（comprising）」、「含む（including）」および「有する（having）」は、包括的であり、列記された要素以外の更なる要素があり得ることを意味することが意図される。
【００４３】
本明細書で用いられる用語「相補的」または「相補性」は、特異的な水素結合を介した塩基対形成による2本鎖核酸の会合を指す。塩基対形成は、標準的なワトソン-クリック塩基対形成であり得る（例えば、5'-A G T C-3'が相補配列3'-T C A G-5'と対となる）。塩基対形成はまた、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン水素結合であり得る。相補性は、典型的には、2本鎖領域に関して測定され、それ故に例えばオーバーハングを除外する。塩基対の一部のみが相補的である場合、2本鎖領域の2つの鎖間の相補性は、部分的であり、パーセンテージ（例えば70％）として表現され得る。相補的でない塩基は、「ミスマッチ」である。2本鎖領域のすべての塩基対が相補的である場合、相補性も完全（すなわち100％）であり得る。
【００４４】
用語「CpGアイランド」は、CpG部位のクラスターを指し、ここでCpG部位は、シトシンヌクレオチドがその長さに沿った塩基の直鎖状配列中のグアニンヌクレオチドの次に生じるDNAの領域を指し、ここで「CpG」は、「-C-リン酸-G-」連結、すなわち1つのリン酸により分離されたシトシンとグアニンについての略語である。
【００４５】
本明細書で用いられる「遺伝子」は、遺伝子産物をコードするDNA領域（エクソンおよびイントロンを含む）、ならびに遺伝子産物の産生を調節するすべてのDNA領域（このような調節配列がコード化するおよび／または転写された配列に隣接するかまたはしないかにかかわらない）を指す。したがって、遺伝子としては、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列、例えばリボソーム結合部位および内部リボソーム進入部位、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス付着部位および座位制御領域が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。
【００４６】
用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、直鎖状または環状構造であって、1本鎖または2本鎖形態いずれかであるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的のために、これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定するものとして解釈されるべきでない。当該用語は、天然ヌクレオチドの公知のアナログ、ならびに塩基、糖および／またはリン酸部分（例えばホスホロチオネート骨格）において修飾されたヌクレオチドを包含し得る。一般的に、特定のヌクレオチドのアナログは、同じ塩基対形成特異性を有する；すなわち、AのアナログはTと塩基対を形成する。
【００４７】
用語「ヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを指す。ヌクレオチドは、標準的なヌクレオチド（すなわちアデノシン、グアノシン、シチジン、チミジンおよびウリジン）またはヌクレオチドアナログであり得る。ヌクレオチドアナログは、修飾プリンもしくはピリミジン塩基または修飾リボース部分を有するヌクレオチドを指す。ヌクレオチドアナログは、天然に存在するヌクレオチド（例えばイノシン）または天然に存在しないヌクレオチドであり得る。ヌクレオチドの糖または塩基部分の修飾の非限定的例としては、アセチル基、アミノ基、カルボキシル基、カルボキシメチル基、ヒドロキシル基、メチル基、ホスホリル基およびチオール基の付加、ならびに塩基の炭素および窒素原子の他の原子との置換（例えば7-デアザプリン）が挙げられる。ヌクレオチドアナログはまた、ジデオキシヌクレオチド、2'-O-メチルヌクレオチド、ロック核酸（LNA）、ペプチド核酸（PNA）およびモルホリノを含む。
【００４８】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すために相互交換可能に用いられる。
【００４９】
核酸およびアミノ酸の配列同一性を決定する技術は当該技術分野において公知である。典型的には、該技術は、遺伝子のmRNAのヌクレオチド配列を決定することおよび／またはそれによりコードされるアミノ酸配列を決定すること、およびこれらの配列を第2のヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較することを含む。ゲノム配列もこの方法で決定し、比較し得る。一般的に、同一性は、2つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列のそれぞれ正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸対応を指す。2以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、それらのパーセント同一性を決定することにより比較され得る。2つの配列のパーセント同一性は、核酸であろうとアミノ酸配列であろうと、より短い配列の長さで割り100を掛けた2つの並んだ配列間の完全一致の数である。核酸配列のおよそのアライメントは、Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)の局所相同性アルゴリズムにより提供される。このアルゴリズムは、Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USAにより開発され、Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986)により標準化されたスコアマトリックスを用いることにより、アミノ酸配列に適用され得る。配列のパーセント同一性を決定するこのアルゴリズムの例示的な実施は、「BestFit」ユーティリティーアプリケーションのGenetics Computer Group（Madison, Wis.）により提供される。配列間のパーセント同一性または類似性を計算するのに適切な他のプログラムは、一般的に当該技術分野において公知であり、例えば、別のアライメントプログラムはBLASTであり、これはデフォルトパラメータで用いられる。例えば、BLASTNおよびBLASTPは、次のデフォルトパラメータを用いて用いられ得る：genetic code=standard；filter=none；strand=both；cutoff=60；expect=10；Matrix=BLOSUM62；Descriptions=50 sequences；sort by=HIGH SCORE；Databases=non-redundant, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+Swiss protein+Spupdate+PIR。これらのプログラムの詳細は、GenBankのウェブサイトに見ることができる。
【実施例】
【００５０】
以下の実施例は、本発明の特定の態様を例示する。
【００５１】
実施例1：個別癌細胞中のSEPTIN 9プロモーター上のDNAメチル化の可視化
以下の実施例の目的は、個別細胞中の単一ゲノム座位におけるDNAメチル化を検出する高感度検出法を開発することであった。この目的で、インサイチュハイブリダイゼーション、続いて近接ライゲーションアッセイ（PLA）（a.k.a.、DUOLINK（登録商標）、Sigma-Aldrich）および細胞イメージングを行い、SEPTIN 9プロモーター上のDNA-メチル化（5meC）を可視化するためのプロトコールを開発した。SEPTIN 9プロモーターメチル化は、結腸癌の公知のバイオマーカーである（Wasserkort et al, 2013, BMC Cancer, 13:398）。細胞架橋（すなわち固定）、細胞透過化およびクロマチン接近性を最適化した後、ヒトSEPTIN 9プロモーターにおいてCpGアイランドを標的とするビオチニル化-オリゴプローブのプールとハイブリダイズすることにより、ゲノム特異性を確認した。抗ビオチンおよび抗5meC抗体、対応する（＋および−）PLAプローブ、およびFar Red検出試薬を用いて、PLAアッセイを実施した。図1は戦略を概説する。
【００５２】
無料オンラインソフトウェア（すなわちStellaris FISH Probe Designer）を用いて、ヒトSEPTIN 9配列に対してオリゴ（20-mer）プローブを設計した。プローブを3'TEG-ビオチン修飾を有するSigmaのカスタム製品により合成し、HPLCにより精製した。図2は、SEPTIN 9プロモーター配列を示し、18個のオリゴプローブの位置を示す。
【００５３】
ヒト癌細胞、すなわちDU145（転移癌；脳に転移した前立腺由来）またはSW480（結腸癌）を、10％ FBSおよびPen/Strep抗生物質を添加したDMEM（ダルベッコ改変イーグル培地）で培養し、8ウェル培養チャンバーカバーガラスプレート（シリコンガスケット付）のウェル当たり播種した（約104細胞）。細胞をHBSSで2回洗浄し、その後、4％パラホルムアルデヒド溶液（40μL/ウェル、16％パラホルムアルデヒドストックを1X PBS中で1：4希釈した）で30分間室温（RT）にて固定した。5μL/ウェルの1.25M グリシンを加え、室温で5分間インキュベートすることにより架橋を停止させた。1時間室温で透過化緩衝液（1X PBS中0.75％ツイーン20および0.75％トリトンX-100）とインキュベートすることにより細胞を透過性にした。細胞を1X PBSでリンスした。5-meC DNAの検出のために、細胞を4N HCLで10分間室温にて処理した。細胞を予め温めた（37℃）0.25％トリプシン-EDTA溶液で1分間処理し、予め温めた（37℃）クエンチ溶液（すなわち10％FBSおよび3 mg/mL BSAを添加したDMEM）と2分間インキュベートすることによりトリプシンを不活性化した。細胞を1X PBSで洗浄し、インサイチュハイブリダイゼーションブロッキング溶液で1時間室温にてブロッキングした。
【００５４】
細胞を、スライドハイブリダイザー（Abbott Molecular）を用いて水中で作られたハイブリダイゼーション緩衝液（50％ホルムアミド、10％フィコール400、0.1％ SDS、2X SSC）と30分間37℃でインキュベートした。オリゴプローブをハイブリダイゼーション緩衝液の添加により変性させ、プローブ（すなわち、(i)すべて18 SEPTIN 9プローブ、(ii)CpGアイランドに最も近い5 SEPTIN 9 プローブ、または(iii)LacZコントロールプローブ；各100μM）をウェルに加え、これをハイブリダイゼーションカバーで密閉し、スライドハイブリダイザーの変性／ハイブリダイゼーションプログラムを実行した（すなわち、80℃で5分間変性させ、続いて37℃で16時間ハイブリダイズさせる）。細胞を洗浄緩衝液（2X SSC、0.1％NP-40）で3回洗浄し、その後、ブロッキング工程から開始するPLAプロトコールに供した。用いられる抗体は、抗ビオチン（Abcam 53494、ウサギで産生されるポリクローナル抗体、PLA抗体希釈液中で1：200希釈）および抗5-メチル-シトシン（Eurogentec BI-MECY-0100、マウスで産生されるモノクローナル抗体、PLA抗体希釈液中で1：200希釈）であった。
【００５５】
SEPTIN 9遺伝子はヒト17番染色体に位置する。したがって、癌細胞株において、それは17番染色体の二倍体であり、SEPTIN 9プロモーターメチル化のコピーを有する；細胞の核において2つの斑点状のPLA（赤色）のドットが見られることが予想される。これは、Septin 9プロモーター特異的プローブ（すなわち、プローブセット(ii)オリゴ#5-9、メチル化CpGアイランドの周囲）とインキュベートしたいくつかのDU145細胞（図3Bおよび3C）において観察された。同様のデータがプローブセット(i)で得られたが（データは示していない）、非特異的LacZプローブでは得られなかった（図3A）。正常な包皮線維芽細胞（BJ）または膵臓癌細胞（BxPC3）ではPLAシグナルは観察されなかった（データは示していない）。
【００５６】
17番染色体の三倍体である結腸癌細胞株SW480において同じISH-PLAアッセイを実施することにより、メチル化SEPTIN 9プロモーター検出の特異性をさらに確認した。確かに、SEPTIN 9プローブセット(ii)とハイブリダイズしたとき、いくつかのSW480細胞において1つの核当たり3つのPLAドットが観察されたが（図4Aおよび4B）、LacZプローブでは観察されなかった（データは示していない）。インビボでDNAメチル化をブロックすると知られている薬物である、5-アザシチジンで処理した（5-AzaC、500 nM、24時間）SW480細胞におけるこの核ISH-PLAシグナルの消失は、PLAシグナルの5-meCエピトープ依存性を確認した（図5）。少数の薬物処理された細胞は、PLA-プローブのトラップをもたらす変形した細胞の形状の点で細胞毒性効果を示し、少数の細胞において観察される拡散した非特異的な赤色蛍光を説明した。5-AzaCは、抗新生物活性を有するシチジンのピリミジンヌクレオシドアナログである。アザシチジンはDNAに組込まれ、そこでDNAメチルトランスフェラーゼを可逆的に阻害し、これによりDNAメチル化をブロックする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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