(57)【要約】  本発明は、腫瘍形成及び腫瘍転移の低減と関連している寿命及び健康な期間が延びた遺伝子改変非ヒト動物モデルと、寿命及び健康な期間を延ばす、腫瘍形成及び腫瘍転移を低減させる、並びに、寿命若しくは健康な期間を延ばす、又は、腫瘍形成若しくは腫瘍転移を低減させる活性薬剤を同定する、関連の方法を含む。【選択図】図なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型EKLFポリペプチドと比較して1又は複数のアミノ酸改変を含む改変型EKLFポリペプチドをエンコードしている1又は複数の改変型赤血球クルッペル様因子(EKLF)遺伝子含む非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２】
1又は複数の内因性EKLF遺伝子は、前記1又は複数の改変型EKLF遺伝子と置き換えられている、請求項１に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項３】
前記1又は複数の改変型EKLF遺伝子の発現は、内因性EKLFプロモーターの制御下にある、請求項１又は２に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項４】
前記1又は複数のアミノ酸改変は、前記野生型EKLFポリペプチドにおいてSUMO化又はリン酸化されるアミノ酸の位置の改変を含む、請求項１から３のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項５】
前記1又は複数のアミノ酸改変は、全長野生型マウスEKLFポリペプチドの位置74に対応するアミノ酸の改変を含む、請求項４に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項６】
位置74に対応するアミノ酸の改変は、ArgでのLysの置換(K74R)である、請求項５に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項７】
前記1又は複数のアミノ酸改変は、全長野生型マウスEKLFポリペプチドの位置68に対応するアミノ酸の改変を有する、請求項４に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項８】
前記改変型EKLFポリペプチドは、前記野生型EKLFポリペプチドと比較して、SUMO化が低減又はリン酸化が低減されている、請求項４に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項９】
前記改変型EKLFポリペプチドは、前記野生型EKLFポリペプチドと比較して、細胞質から核へトランスロケーションが低減されている、及び/又は、前記野生型EKLFポリペプチドと比較して、トランスアクチベーター活性又はリプレッサー活性が改変されている、請求項１に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１０】
前記改変型EKLFポリペプチドの発現は、前記非ヒトトランスジェニック動物の生存期間を延ばすこと又は健康な期間を延ばすことと関連している、又は、前記改変型EKLFポリペプチドの発現は、前記非ヒトトランスジェニック動物の腫瘍発生又は腫瘍転移を低減させることと関連している、請求項１に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１１】
前記野生型EKLFポリペプチドは、前記非ヒトトランスジェニック動物と同じ属又は種の動物由来である、請求項１に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１２】
齧歯類であり、任意に、マウス又はラットである、請求項１に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１３】
野生型EKLFポリペプチドと比較して1又は複数のアミノ酸改変を含む改変型EKLFポリペプチドをエンコードしているポリヌクレオチド配列を含むノックインベクター。
【請求項１４】
請求項1の非ヒトトランスジェニック動物由来の細胞、組織又は臓器。
【請求項１５】
細胞増殖障害を治療若しくは予防する、又は腫瘍転移若しくは腫瘍発生の発生率を阻害若しくは低減する必要がある対象において、それを行なう方法であって、
前記方法は、投与ステップを有し、
前記投与ステップにおいて、
a)    ポリペプチド若しくは前記ポリペプチドをエンコードしている核酸、
又は
b)    内因性EKLFポリペプチド、任意に内因性ヒトEKLFポリペプチドの1又は複数の活性を変化させる第一活性薬剤、
が有効量で前記対象に投与され、
前記ポリペプチドは、野生型EKLFポリペプチドと比較して、SUMO化を低減させる1又は複数のアミノ酸改変を含む改変型EKLFポリペプチドであり、任意に改変型ヒトEKLFポリペプチドである、方法。
【請求項１６】
前記ポリペプチド又は前記核酸は、投与され、
前記改変型EKLFポリペプチドは、前記野生型EKLFポリペプチドと比較して、細胞質から核へのトランスロケーションが低減している、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ポリペプチド又は前記核酸は、投与され、
前記改変型EKLFポリペプチドは、前記野生型EKLFポリペプチドと比較して、トランスアクチベーター活性又はリプレッサー活性が改変されている、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記核酸は、発現ベクターである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記発現ベクターは、ウイルスベクターである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ウイルスベクターは、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、弱毒化されたワクシニアウイルス、カナリア痘ウイルス、アデノウイルス又はアデノ随伴ウイルス由来である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記1又は複数のアミノ酸改変は、前記野生型EKLFポリペプチドにおいてSUMO化又はリン酸化されるアミノ酸の位置の改変を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記1又は複数のアミノ酸改変は、全長野生型ヒトEKLFポリペプチドの位置54に対応するアミノ酸の改変を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
位置54のアミノ酸の改変は、ArgでのLysの置換(K54R)である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記1又は複数のアミノ酸改変は、全長野生型マウスEKLFポリペプチドの位置68に対応するアミノ酸の改変を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記第一活性薬剤は、投与され、
前記第一活性薬剤は、細胞質から核への内因性EKLFポリペプチドのトランスロケーションを低減する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２６】
前記第一活性薬剤は、投与され、
前記第一活性薬剤は、内因性EKLFポリペプチドのトランスアクチベーター活性又はリプレッサー活性を改変する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２７】
前記第一活性薬剤は、前記内因性EKLFポリペプチドに結合する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２８】
前記第一活性薬剤は、有機小分子又はポリペプチド、任意に、抗体又はその機能的断片である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記内因性EKLFポリペプチドに対する前記第一活性薬剤の結合は、細胞質から核へのそのトランスロケーションを阻害する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記ポリペプチド又は前記核酸は、投与され、
前記方法は、前記内因性EKLFポリペプチドの発現を阻害する第二活性薬剤を投与するステップを更に有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項３１】
前記第二活性薬剤は、前記内因性EKLFポリペプチドをエンコードするmRNA又はその相補体に結合する核酸分子であり、任意に、アンチセンスRNA、siRNA、shRNA又はmiRNAである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記第二活性薬剤は、前記内因性EKLFポリペプチドの転写又は翻訳を阻害する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞増殖障害、腫瘍又は腫瘍転移は、肝がん、結腸がん、乳がん、前立腺がん、肝細胞癌腫、メラノーマ、肺がん、グリア芽細胞腫、脳腫瘍、造血器悪性腫瘍(hematopoetic malignancy)、胆管癌腫、網膜芽細胞腫、腎細胞癌腫、頭頸部がん、子宮頸がん、膵臓がん、食道がん又は扁平上皮癌腫である、請求項１５に記載の方法。
【請求項３４】
前記対象に有効量の抗増殖薬剤を投与するステップを更に有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項３５】
前記抗増殖薬剤は、アルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤、アンチメタボライ又は細胞毒性抗生物質である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記アルキル化剤は、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、メクロレタミン、シクロホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、イホスファミド、ブスルファン、N-ニトロソ-N-メチル尿素(MNU)、カルマスティン、ロムスチン、セムスチン、フォテムスチン、ストレプトゾトシン、ダカルバジン、ミトゾロミド、テモゾロマイド、チオテパ、マイトマイシン(mytomycin)、及び、ジアジクオンからなる群より選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記トポイソメラーゼ阻害剤は、カンプトセシン、イリノテカン、トポテカン、エトポシド、ドキソルビシン、テニポシド、ノボビオシン、メルバロン、及び、アクラルビシンからなる群より選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記アンチメタボライは、フルオロピリミジン(fluoropymidine)、デオキシヌクレオシドアナログ、チオプリン、メトトレキサート、及び、ペメトレキセドからなる群より選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞毒性抗生物質は、アクチノマイシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ピラルビシン(piraubicin)、アクラルビシン(alcarubicin)、及び、ミトキサントロンからなる群より選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
対象の生存期間又は健康な期間を延ばす方法であって、
前記方法は、投与ステップを有し、
前記投与ステップにおいて、
a)    ポリペプチド若しくは前記ポリペプチドをエンコードしている核酸、
又は
b)    内因性EKLFポリペプチド、任意に内因性ヒトEKLFポリペプチドの1又は複数の活性を変化させる第一活性薬剤、
が有効量で前記対象に投与され、
前記ポリペプチドは、野生型EKLFポリペプチドと比較して、SUMO化を低減させる1又は複数のアミノ酸改変を含む改変型EKLFポリペプチドであり、任意に改変型ヒトEKLFポリペプチドである、方法。
【請求項４１】
前記ポリペプチド又は前記核酸は、投与され、
前記改変型EKLFポリペプチドは、野生型EKLFポリペプチドと比較して、細胞質から核へのトランスロケーションが低減されている、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ポリペプチド又は前記核酸は、投与され、
前記改変型EKLFポリペプチドは、前記野生型EKLFポリペプチドと比較して、トランスアクチベーター活性又はリプレッサー活性が改変されている、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記核酸は、発現ベクターである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記発現ベクターは、ウイルスベクターである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記ウイルスベクターは、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、弱毒化されたワクシニアウイルス、カナリア痘ウイルス、アデノウイルス、又は、アデノ随伴ウイルス由来である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記1又は複数のアミノ酸改変は、前記野生型EKLFポリペプチドにおいてSUMO化又はリン酸化されるアミノ酸の位置の改変を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４７】
前記1又は複数のアミノ酸改変は、全長野生型ヒトEKLFポリペプチドの位置54に対応するアミノ酸の改変を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
位置54に対応するアミノ酸の改変は、ArgでのLysの置換(K54R)である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記1又は複数のアミノ酸改変は、全長野生型マウスEKLFポリペプチドの位置68に対応するアミノ酸の改変を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記第一活性薬剤は、投与され、
前記1又は複数の活性は、細胞質から核へのトランスロケーションの低減を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項５１】
前記第一活性薬剤は、投与され、
前記1又は複数の活性は、トランスアクチベーター活性又はリプレッサー活性の改変を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項５２】
前記第一活性薬剤は、前記内因性EKLFポリペプチドに結合する、請求項４０に記載の方法。
【請求項５３】
前記第一活性薬剤は、有機小分子又はポリペプチド、任意に抗体又はその機能的断片である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記内因性EKLFポリペプチドに対する前記第一活性薬剤の結合は、細胞質から核へのそのトランスロケーションを阻害する、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記内因性EKLFポリペプチドに対する前記第一活性薬剤の結合は、そのトランスアクチベーター活性を改変させる又はそのリプレッサー活性を改変させる、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
前記ポリペプチド又は前記核酸は、投与され、
前記方法は、前記内因性EKLFポリペプチドの発現を阻害する第二活性薬剤を投与するステップを更に有する、請求項１５又は４０に記載の方法。
【請求項５７】
前記第二活性薬剤は、前記内因性EKLFポリペプチドをエンコードするmRNA又はその相補体に結合する核酸分子であり、任意にアンチセンスRNA、siRNA、shRNA又はmiRNAである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記方法は、前記対象において、毛髪の灰色化の低減、協調運動の向上、筋力の向上、筋脱力の低減、協調運動の向上、骨粗鬆症の低減、骨容量の増大、骨密度の増大、骨梁数の増大、骨梁間隔の低減又はバランス低下の低減という結果となる、請求項４０に記載の方法。
【請求項５９】
前記対象は、哺乳動物、任意にヒトである、請求項１５又は４０に記載の方法。
【請求項６０】
対象の寿命を延ばす及び/又は腫瘍発生若しくは腫瘍転移を阻害若しくは低減することができる活性薬剤を同定する方法であって、
前記方法は、a)接触ステップと、b)測定ステップと、を有し、
前記接触ステップにおいて、候補薬剤とEKLFポリペプチド又はEKLFポリペプチド発現細胞とを接触させ、
任意に、EKLFポリペプチドは、ヒトEKLFポリペプチドであり、
前記測定ステップにおいて、前記EKLFポリペプチドに存在する翻訳後修飾の量を測定する又は前記EKLFポリペプチドの活性の量を測定し、
前記翻訳後修飾の量又は前記活性の量がコントロール量と比較して変化している場合、前記候補薬剤は、前記対象の寿命若しくは生存期間を延ばす及び/又は腫瘍形成又は腫瘍転移を阻害することができる活性薬剤である、方法。
【請求項６１】
前記翻訳後修飾の量が測定され、測定された量が前記コントロール量よりも低い場合、前記候補薬剤は、前記活性薬剤である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
測定された翻訳後修飾は、SUMO化又はリン酸化である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記SUMO化は、前記ヒトEKLFポリペプチドの位置54に対応するアミノ酸で生じる、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
測定された活性は、細胞質から核への前記EKLFポリペプチドのトランスロケーションであり、測定された量が前記コントロール量より低い場合、前記候補薬剤は、前記活性薬剤である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６５】
測定された活性は、トランスアクチベーター活性であり、測定された量が改変されている場合、任意に前記コントロール量よりも少ない場合、前記候補薬剤は、前記活性薬剤である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６６】
測定された量は、リプレッサー活性であり、測定された量が改変されている場合、任意に前記コントロール量よりも大きい場合、前記候補薬剤は、前記活性薬剤である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６７】
前記コントロール量は、所定の値又は、前記候補薬剤と接触していないEKLFポリペプチド又は細胞と関連した量である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６８】
前記EKLFポリペプチドは、内因性EKLFポリペプチド又は外因性EKLFポリペプチドである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６９】
前記外因性EKLFポリペプチドは、野生型EKLFポリペプチドである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記細胞は、前記EKLFポリペプチドを発現することができる外因性核酸を有する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
対象の生存期間を延ばすこと及び/又は腫瘍発生若しくは腫瘍転移を阻害若しくは低減することができる活性薬剤を同定する方法であって、
前記方法は、a)投与ステップと、b)比較ステップと、を有し、
前記投与ステップにおいて、請求項1の非ヒトトランスジェニック動物に候補薬剤を投与し、
前記比較ステップにおいて、前記候補薬剤の投与後の請求項1の非ヒトトランスジェニック動物の生存期間と、前記候補薬剤を投与されていないコントロール動物のそれとを比較し、
前記候補薬剤が投与された前記非ヒトトランスジェニック動物の生存期間が前記コントロール動物のそれよりも長い場合、前記候補薬剤は、前記対象の生存期間を延ばすこと及び/又は腫瘍形成を阻害することができる活性薬剤である、方法。
【請求項７２】
対象の寿命を延ばすこと及び/又は腫瘍発生若しくは腫瘍転移を阻害若しくは低減することができる活性薬剤を同定する方法であって、
前記方法は、a)接触ステップと、b)測定ステップと、を有し、
前記接触ステップにおいて、野生型EKLFポリペプチドと比較して1又は複数のアミノ酸改変を含む改変型EKLFポリペプチドをエンコードしている改変型EKLFアレルを発現することができる細胞と候補薬剤とを接触させ、
前記測定ステップにおいて、前記改変型EKLFポリペプチドの発現レベルを測定し、
前記改変型EKLFポリペプチドの発現レベルが前記候補薬剤と接触していないコントロール細胞の発現レベルより高い場合、前記候補薬剤は、前記対象の寿命を延ばすこと及び/又は腫瘍形成を阻害するができる活性薬剤である、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願についての相互参照
この出願は、2014年9月1日に出願した米国仮出願第62/044411号の優先権を主張し、本願明細書に完全に引用したものとする。
【０００２】
発明の分野
本発明は、生存期間を延ばすため、健康な期間を延ばすため、腫瘍化及び腫瘍転移を阻害するための方法、寿命及び腫瘍化に関する新規の非ヒト動物モデル、並びに、生存期間若しくは健康な期間を延ばすのに用いる又は腫瘍化若しくは腫瘍転移を阻害するのに用いる治療薬剤を同定する方法に関する。
【０００３】
発明の背景
寿命遺伝子は、生存期間の延長の潜在性及び生活の質の向上に関与する可能性に関して、非常に興味深く且つ重要な遺伝子である。しかしながら、これらの遺伝子うちごく少数の遺伝子しか同定されておらず、これらの遺伝子がどのように老化を防止して寿命の延長を促進するかについては、殆ど理解されていない。加えて、老化に関連するものを含む細胞増殖障害のリスクの減少に関連した遺伝子の同定に関する技術について、関連したニーズが存在する。
【０００４】
従って、寿命期間の延長及び/又は細胞増殖障害の低減に関連する機能を有する遺伝子を発見する必要性が存在する。これらの遺伝子及びそれらの産物は、老化防止及び/又は抗がん薬剤のスクリーニングに有効であり、様々な抗老化及び抗がん治療法の鍵となる標的の役割を果すだろう。加えて、これらの遺伝子の知識によって、疾患経路を更に同定及び研究し且つ治療薬剤を同定及び確認するために用いることができる疾患動物モデルの開発が可能になる。最後に、かかるツール及び治療薬剤は、老人における認識性及び運動機能欠如を軽減するのを助けることができ、老人及び一般人の両方におけるがんの転移及び発生率を低減することができることから、高齢者の自立期間を長くし、健康が向上する。
【発明の概要】
【０００５】
第一本発明の態様は、野生型EKLFポリペプチドと比較して1又は複数のアミノ酸改変を含む改変型EKLFポリペプチドをエンコードしている1又は複数の改変型赤血球クルッペル様因子(EKLF)遺伝子アレルを含む非ヒトトランスジェニック動物を提供する。ある種の実施形態では、野生型EKLFポリペプチドは、非ヒトトランスジェニック動物と同じ属又は種の動物由来である。特定の実施形態において、非ヒトトランスジェニック動物は、ノックイン動物である。ある種の実施形態では、動物の1又は複数の内因性EKLF遺伝子アレルは、1又は複数の改変型EKLF遺伝子と置き換えられている。特定の実施形態において、1又は複数の改変型EKLF遺伝子アレルの発現は、内因性EKLFプロモーターの制御下にある。ある種の実施形態では、両方の内因性EKLF遺伝子アレルは、改変型EKLF遺伝子と置き換えられている。一実施形態として、非ヒトトランスジェニック動物は、ノックイン動物であり、EKLF遺伝子の両方のアレルは、野生型と比較して改変されており、本願明細書に記載されている改変型EKLFポリペプチド(例えば、SUMO化されない変異SUMO化サイトを含む改変型EKLFポリペプチド)をエンコードしている。ある種の実施形態では、動物は、齧歯類であり、任意にマウス又はラットである。
【０００６】
第一本発明の態様の特定の実施形態において、1又は複数であるアミノ酸改変は、野生型EKLFポリペプチドにおいてSUMO化又はリン酸化されるアミノ酸の位置における改変を含む。一実施形態として、1又は複数のアミノ酸改変は、全長野生型マウスEKLFポリペプチドの位置74に対応するアミノ酸の改変を含む。マウス以外の動物に関連したある種の実施形態において、1又は複数のアミノ酸改変は、マウスEKLFポリペプチドにおけるSUMO化アミノ酸残基の改変に対応するが、その位置は異なっている可能性がある残基の改変を含む。例えば、ヒトEKLFポリペプチドにおいて、マウスEKLFポリペプチドの位置74に対応するSUMO化サイトは、アミノ酸残基54に位置する。特定の実施形態において、それは、Lys残基である。ある種の実施形態では、位置74に対応するアミノ酸の改変は、ArgでのLysの置換(K74R)である。特定の実施形態において、1又は複数のアミノ酸改変は、全長野生型マウスEKLFポリペプチドの位置68に対応するアミノ酸の改変を含む。マウス以外の動物に関連したある種の実施形態において、1又は複数のアミノ酸改変は、リン酸化アミノ酸残基(例えば、マウスEKLFポリペプチドにおけるこの残基に対応するアミノ酸残基)であるが、その位置とは異なっている可能性がある残基の改変を含む。
【０００７】
本発明の第一、第二、第三又は第四の態様のある種の実施形態において、改変型EKLFポリペプチドは、野生型EKLFポリペプチドと比較して、SUMO化又はリン酸化が低減されている。ある種の実施形態では、改変型EKLFポリペプチドは、野生型EKLFポリペプチドと比較して細胞質から核へのトランスロケーションが低減している、及び/又は、野生型EKLFポリペプチドと比較してトランスアクチベーター活性又はリプレッサー活性が改変されている。関連した実施形態において、野生型動物と比較して、改変型EKLFポリペプチドの発現は、非ヒトトランスジェニック動物の生存期間を延ばすこと又は健康な期間を延ばすことと関連している、又は、改良型EKLFポリペプチドの発現は、非ヒトトランスジェニック動物の腫瘍発生又は腫瘍転移を低減させることと関連している。
【０００８】
第二態様において、本発明は、野生型EKLFポリペプチドと比較して、1又は複数のアミノ酸改変を含む改変型EKLFポリペプチドをエンコードしているポリヌクレオチド配列又はその部分を含むノックインベクターを含む。
【０００９】
関連した第三の態様において、本発明は、本願明細書に記載されている非ヒトトランスジェニック動物由来の細胞、組織又は臓器を含む。
【００１０】
第四の態様において、本発明は、細胞増殖障害を治療若しくは予防する、又は、腫瘍発生又は転移の発生率を阻害若しくは低減する必要がある対象において、それを行なう方法であって、上記方法は、投与ステップを有し、上記投与ステップにおいて、ポリペプチド若しくは上記ポリペプチドをエンコードしている核酸及び/又は内因性又は野生型EKLFポリペプチドの1又は複数の活性を変化させる第一活性薬剤が有効量で上記対象に投与され、上記ポリペプチドは、野生型EKLFポリペプチドと比較して、SUMO化を低減させる1又は複数のアミノ酸改変を含む改変型EKLFポリペプチドである。ある種の実施形態において、改変型EKLFポリペプチドは、改変型ヒトEKLFポリペプチドであり、ある種の実施形態において、第一活性薬剤は、野生型ヒトEKLFポリペプチドの1又は複数の活性を変化させる。いくつかの実施形態において、細胞増殖障害は、腫瘍又は腫瘍転移であり、限定するものではないが、例えば、肝がん、結腸がん、乳がん、前立腺がん、肝細胞癌腫、メラノーマ、肺がん、グリア芽細胞腫、脳腫瘍、造血器悪性腫瘍(hematopoetic malignancy)、胆管癌腫、網膜芽細胞腫、腎細胞癌腫、頭頸部がん、子宮頸がん、膵臓がん、食道がん又は扁平上皮癌腫である。
【００１１】
ポリペプチド又は核酸を投与する第四の態様の特定の実施形態において、改変型EKLFポリペプチドは、野生型EKLFポリペプチドと比較して、細胞質から核へのトランスロケーションが低減している。ある種の実施形態では、改変型EKLFポリペプチドは、野生型EKLFポリペプチドと比較して、トランスアクチベーター活性又はレプレッサー活性が改変されている。一実施形態として、核酸は、発現ベクターである。一実施形態として、発現ベクターは、ウイルスベクターである。特定の実施形態において、ウイルスベクターは、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、弱毒化されたワクシニアウイルス、カナリア痘ウイルス、アデノウイルス又はアデノ随伴ウイルス由来である。
【００１２】
本発明の第四の態様の特定の実施形態において、1又は複数のアミノ酸改変は、野生型EKLFポリペプチド(例えば、野生型ヒトEKLFポリペプチド)においてSUMO化又はリン酸化されるアミノ酸の位置の改変を含む。ある種の実施形態では、1又は複数のアミノ酸改変は、全長野生型ヒトEKLFポリペプチドの位置54に対応するアミノ酸の改変を含む。一実施形態として、位置54のアミノ酸の改変は、例えば、ArgでのLysの置換(K54R)である。ある種の実施形態では、1又は複数のアミノ酸改変は、例えば、ヒトEKLFポリペプチドにおけるリン酸化アミノ酸(限定するものではないが、例えば、全長野生型マウスEKLFポリペプチドの位置68に対応するリン酸化アミノ酸)の改変を含む。
【００１３】
第一活性薬剤を投与する第四の態様の特定の実施形態において、第一活性薬剤は、細胞質から核への内因性EKLFポリペプチドのトランスロケーションを低減する。ある種の実施形態では、第一活性薬剤は、内因性EKLFポリペプチドのトランスアクチベーター活性を改変する又はリプレッサー活性を改変する。いくつかの実施形態において、第一活性薬剤は、内因性EKLFポリペプチドに結合する。各種実施形態において、第一活性薬剤は、有機小分子又はポリペプチド、任意に抗体又はその機能的断片である。ある種の実施形態では、内因性EKLFポリペプチドに対する第一活性薬剤の結合は、細胞質から核へのそのトランスロケーションを阻害する。
【００１４】
ポリペプチド又は核酸は、投与され、又は、第一活性薬剤を投与する第四の態様のある種の実施形態において、この方法は、内因性EKLFポリペプチドの発現を阻害する第二活性薬剤を投与するステップを更に有する。特定の実施形態において、第二活性薬剤は、内因性EKLFポリペプチドをエンコードするmRNA又はその相補体に結合する核酸分子であり、任意に、アンチセンスRNA、siRNA、shRNA又はmiRNAである。一実施形態として、EKLF cDNA又はmRNA配列は、GenBank Acession番号BC033580.1にて提供されるヒト配列である。
【００１５】
本発明の第四の態様のある種の実施形態は、対象に細胞増殖障害を治療するのに適した有効量の抗増殖薬剤を投与するステップを更に有する。特定の実施形態において、抗増殖薬剤は、アルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤、アンチメタボライ又は細胞毒性抗生物質である。ある種の実施形態では、アルキル化剤は、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、メクロレタミン、シクロホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、イホスファミド、ブスルファン、N-ニトロソ-N-メチル尿素(MNU)、カルマスティン、ロムスチン、セムスチン、フォテムスチン、ストレプトゾトシン、ダカルバジン、ミトゾロミド、テモゾロマイド、チオテパ、マイトマイシン(mytomycin)又はジアジクオンである。特定の実施形態において、トポイソメラーゼ阻害剤は、カンプトセシン、イリノテカン、トポテカン、エトポシド、ドキソルビシン、テニポシド、ノボビオシン、メルバロン又はアクラルビシンである。ある種の実施形態では、アンチメタボライは、フルオロピリミジン(fluoropymidine)、デオキシヌクレオシドアナログ、チオプリン、メトトレキサート又はペメトレキセドである。特定の実施形態において、細胞毒性抗生物質は、アクチノマイシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ピラルビシン(piraubicin)、アクラルビシン(alcarubicin)又はミトキサントロンである。
【００１６】
第五の態様において、本発明は、対象の生存期間又は健康な期間を延ばす方法であって、上記方法は、投与ステップを有し、上記投与ステップにおいて、ポリペプチド若しくは上記ポリペプチドをエンコードしている核酸及び/又は内因性EKLFポリペプチドの1又は複数の活性を変化させる第一活性薬剤、が有効量で上記対象に投与され、上記ポリペプチドは、野生型EKLFポリペプチドと比較して、SUMO化を低減させる1又は複数のアミノ酸改変を含む改変型EKLFポリペプチドである。ある種の実施形態において、改変型EKLFポリペプチドは、改変型ヒトEKLFポリペプチドであり、ある種の実施形態において、第一活性薬剤は、野生型ヒトEKLFポリペプチドの1又は複数の活性を変化させる。
【００１７】
ポリペプチド又は核酸を投与する第五の態様の特定の実施形態において、改変型EKLFポリペプチドは、野生型EKLFポリペプチドと比較して、細胞質から核へのトランスロケーションが低減されている。ある種の実施形態では、改変型EKLFポリペプチドは、野生型EKLFポリペプチドと比較して、トランスアクチベーター活性又はリプレッサー活性が改変されている。一実施形態として、核酸は、発現ベクターである。特定の実施形態において、ウイルスベクターは、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、弱毒化されたワクシニアウイルス、カナリア痘ウイルス、アデノウイルス又はアデノ随伴ウイルス由来である。
【００１８】
本発明の第五の態様の特定の実施形態において、1又は複数のアミノ酸改変は、野生型EKLFポリペプチド(例えば、野生型ヒトEKLFポリペプチド)においてSUMO化又はリン酸化されるアミノ酸の位置の改変を含む。ある種の実施形態では、1又は複数のアミノ酸改変は、全長野生型ヒトEKLFポリペプチドの位置54に対応するアミノ酸の改変を含む。一実施形態として、位置54のアミノ酸の改変は、例えば、ArgでのLysの置換(K54R)である。ある種の実施形態では、1又は複数のアミノ酸改変は、例えば、ヒトEKLFポリペプチドにおけるリン酸化アミノ酸(限定するものではないが、例えば、全長野生型マウスEKLFポリペプチドの位置68に対応するリン酸化アミノ酸)の改変を含む。
【００１９】
第一活性薬剤を投与する第五の態様の特定の実施形態において、第一活性薬剤は、細胞質から核への内因性EKLFポリペプチドのトランスロケーションを低減又は阻害する。ある種の実施形態では、第一活性薬剤は、内因性EKLFポリペプチドのトランスアクチベーター活性を改変させる又はリプレッサー活性を改変させる。いくつかの実施形態において、第一活性薬剤は、内因性EKLFポリペプチドに結合する。各種実施形態において、第一活性薬剤は、有機小分子又はポリペプチド、任意に抗体又はその機能的断片である。ある種の実施形態では、内因性EKLFポリペプチドに対する第一活性薬剤の結合は、細胞質から核へのそのトランスロケーションを阻害する。
【００２０】
ポリペプチド又は核酸を投与する、又は、第一活性薬剤を投与する第五の態様のある種の実施形態において、この方法は、内因性EKLFポリペプチドの発現を阻害する第二活性薬剤を投与するステップを更に有する。特定の実施形態において、第二活性薬剤は、内因性EKLFポリペプチドをエンコードするmRNA又はその相補体に結合する核酸分子であり、任意に、アンチセンスRNA、siRNA、shRNA又はmiRNAである。
【００２１】
本発明の第五の態様の特定の実施形態において、この方法は、対象において、毛髪の灰色化の低減、協調運動の向上、筋力の向上、筋脱力の低減、協調運動の向上、骨粗鬆症の低減、骨容量の増大、骨密度の増大、骨梁数の増大、骨梁間隔の低減又はバランス低下の低減という結果となる。
【００２２】
第四又は第五の態様のある種の実施形態において、対象は、哺乳動物であり、任意にヒトである。
【００２３】
更に関連した第六の態様において、本発明は、対象の寿命を延ばす、生存期間若しくは健康な期間を延ばす及び/又は腫瘍形成若しくは腫瘍発生若しくは腫瘍転移を阻害若しくは低減することができる活性薬剤を同定する方法であって、上記方法は、接触ステップと、測定ステップと、を有し、上記接触ステップにおいて、候補薬剤とEKLFポリペプチド又はEKLFポリペプチド発現細胞とを接触させ、上記測定ステップにおいて、上記EKLFポリペプチドに存在する翻訳後修飾の量を測定する又は上記EKLFポリペプチドの活性の量を測定し、上記翻訳後修飾の量又は上記活性の量がコントロール量と比較して変化している場合、上記候補薬剤は、上記対象の寿命若しくは生存期間を延ばす及び/又は腫瘍形成若しくは腫瘍転移を阻害することができる活性薬剤である。特定の実施形態において、EKLFポリペプチドは、野生型ヒトEKLFポリペプチド又はその変異体若しくは断片である。特定の実施形態において、翻訳後修飾の量が測定され、測定された量がコントロール量より低い場合、候補薬剤は、活性薬剤である。いくつかの実施形態において、測定された翻訳後修飾は、SUMO化又はリン酸化である。特定の実施形態において、SUMO化は、ヒトEKLFポリペプチドの位置54に対応するアミノ酸で生じる。ある種の実施形態では、測定された活性は、細胞質から核へのEKLFポリペプチドのトランスロケーションであり、測定された量がコントロール量よりも低い場合、候補薬剤は、活性薬剤である。特定の実施形態において、測定された活性は、トランスアクチベーター活性であり、測定された量が改変されている場合、任意にコントロール量よりも低い場合、候補薬剤は、活性薬剤である。ある種の実施形態では、測定された量は、リプレッサー活性であり、測定された量が改変されている場合、任意にコントロール量よりも高い場合、候補薬剤は、活性薬剤である。各種実施形態において、コントロール量は、所定の値又はEKLFポリペプチド(例えば、野生型ヒトEKLFポリペプチド若しくはその断片、又は、候補薬剤と接触していない細胞)と関連した量である。いくつかの実施形態において、EKLFポリペプチドは、内因性EKLFポリペプチド又は外因性EKLFポリペプチドである。いくつかの実施形態において、外因性EKLFポリペプチドは、野生型EKLFポリペプチドである。ある種の実施形態では、細胞は、EKLFポリペプチドを発現することができる外因性核酸を有する。
【００２４】
関連した第七の態様において、本発明は、対象の寿命を延ばすこと、生存期間を延ばすこと、健康な期間を延ばすこと及び/又は腫瘍形成若しくは腫瘍発生若しくは腫瘍転移を阻害することができる活性薬剤を同定する方法であって、上記方法は、投与ステップと、比較ステップと、を有し、上記投与ステップにおいて、本願明細書に記載されている非ヒトトランスジェニック動物(例えば、第一態様の非ヒト動物)に候補薬剤を投与し、上記比較ステップにおいて、上記候補薬剤の投与後の非ヒトトランスジェニック動物の生存期間と、コントロール動物(候補薬剤を投与されなかった動物)の生存期間とを比較し、上記候補薬剤を投与された上記非ヒトトランスジェニック動物の生存期間が上記コントロール動物の生存期間よりも長い場合、上記候補薬剤は、上記対象の寿命を延ばすこと、生存期間を延ばすこと、健康な期間を延ばすこと及び/又は腫瘍形成を阻害することができる活性薬剤である。
【００２５】
更に関連した第八の態様において、本発明は、対象の寿命を延ばすこと及び/又は腫瘍形成若しくは腫瘍転移を阻害することができる活性薬剤を同定する方法であって、上記方法は、接触ステップと、測定ステップと、を有し、上記接触ステップにおいて、野生型EKLFポリペプチドと比較して1又は複数のアミノ酸改変を含む改変型EKLFポリペプチドをエンコードしている改変型EKLFアレルを発現することができる細胞を候補薬剤とを接触させ、上記測定ステップにおいて、上記改変型EKLFポリペプチドの発現レベルを測定し、上記改変型EKLFポリペプチドの発現レベルが上記候補薬剤と接触していないコントロール細胞の発現レベルよりも高い場合、上記候補薬剤は、上記対象の寿命を延ばすこと及び/又は腫瘍形成を阻害することができる活性薬剤である。本発明の第八の態様の特定の実施形態において、1又は複数のアミノ酸改変は、野生型EKLFポリペプチド(例えば、野生型ヒトEKLFポリペプチド)においてSUMO化又はリン酸化されるアミノ酸の位置の改変を含む。ある種の実施形態では、1又は複数のアミノ酸改変は、全長野生型ヒトEKLFポリペプチドの位置54に対応するアミノ酸の改変を含む。一実施形態として、位置54のアミノ酸の改変は、例えば、ArgでのLysの置換(K54R)である。ある種の実施形態では、1又は複数のアミノ酸改変は、例えば、ヒトEKLFポリペプチドにおけるリン酸化アミノ酸(限定するものではないが、例えば、全長野生型マウスEKLFポリペプチドの位置68に対応するリン酸化アミノ酸)の改変を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図1A-Dは、相同組換によるEKLF K74Rマウスの誕生を示す。図1Aの上側は、EKLF遺伝子座及び標的座を表す。図1Aの下側は、Cre媒介組換前(I)及び後(II)の組換えアレルを表す。EKLF遺伝子のエクソン2のタンパク質コード部分をloxP-PGK-gb2-neo-loxP EKLF K74Rレトロウイルスベクターに置き換えた。ネオマイシンカセット(Neo、開放四角)は、複数のlox Pサイト(黒四角)の側面に位置する。ハッチング領域は、削除された内因性EKLF座の部分とEKLF座中に挿入された標的ベクターの部分を示すものであり、(I)及び(II)は、それぞれ、Cre媒介組換によってネオマイシンカセットを削除するCreリコンビナーゼを用いた処理前と処理後を示すものである。Nfixは、Nfix遺伝子座を指す。Fbwx9は、Fbwx9遺伝子座を指す。E1、E2及びE3は、それぞれ、EKLF遺伝子のエクソン1、エクソン2及びエクソン3を指す。イントロン1及びイントロン2は、それぞれ、EKLF遺伝子の第一及び第二イントロンを指す。Neoは、ネオマイシンカセットを指す。PGKは、真核生物プロモーターPGKを指す。gb2は、gb2原核生物プロモーターを指す。削除は、EKLFのイントロン1を形成する50ヌクレオチドの削除を指す。5FA、5RA、gt EKLF d 5'、gt EKLF 3'、gt EKLF PGK 5'、Kin 5'及びKin 3'は、それぞれ、遺伝子タイピングのためのPCRプライマーを指す。左矢及び右矢は、それぞれ、遺伝子タイピングプライマーの位置を指す。K74Rは、K74R置換となるDNA改変を示す。ポリAとは、ポリA領域を指す。LoxPとは、LoxPサイトを指す。図1Bは、野生型(+/+)マウス、ヘテロ接合体EKLF K74Rマウス(Kin/+)及びホモ接合体EKLF K74Rマウス(Kin/Kin)の遺伝子タイピングを示す。図1Cは、野生型(WT)及びホモ接合体EKLF K74Rマウス(Kin)のE13.5胚を示す。図1Dは、WT及びEKLF K74RマウスのEKLF mRNAの相対的レベルを示す。
【００２７】
【図２】図2A及びBは、EKLF K74R置換がEKLFポリペプチドの転写活性に影響を及ぼすことを示している。図2Aは、野生型(WT)及びEKLF K74R(Kin)マウスのE14.5胎児肝臓のCol1a1のmRNAの相対的レベルを示している。図2Bは、野生型(WT)及びEKLF K74R(Kin)マウスのE14.5胎児肝臓のMpv171のmRNAの相対的レベルを示している。データは、3つの独立した実験から得ている。**p < 0.01、***p<0.001。
【００２８】
【図３】図3A及びBは、EKLF K74R(Kin)と野生型(WT)の同腹の子間の生存期間の比較を示している。図3Aは、WT及びKinマウスの生存曲線を示している。図3Bは、Kinマウスにおける遅発性色素消失を証明している画像を示している。
【００２９】
【図４】図4A-Dは、野生型(WT)及びEKLF K74R(Kin)代謝の分析を示している。図4Aは、生後3ヵ月の野生型(WT)とEKLF K74R(Kin)マウスの画像を示している。図4Bは、生後3、6、12、18及び24ヶ月のEKLF K74R(Kin)及びWTマウスの体重を示している。食餌摂取(図4C)及び水摂取(図4D)を含むカノニカル日周代謝パラメーターを、それぞれ生後3及び24ヵ月のWT及びEKLF K74R(Kin)マウスについて測定した。データは、平均±SEMである。統計的有意差は、両側スチューデントt検定によって評価した。
【００３０】
【図５】図5A-Dは、野生型(WT)及びEKLF K74R(Kin)マウスの全身エネルギー消費の比較を示している。生後3ヵ月及び24ヵ月のマウスについて測定されたカノニカル日周代謝パラメーターは、VO2(図5A)、VCO2(図5B)、熱発生量(図5C)及び呼吸交換率(RER)(図5D)を含む。データは、平均±SEMとして提示している。統計的有意差は、両側スチューデントt検定によって評価した。
【００３１】
【図６】図6A-Cは、野生型(WT;丸)及びEKLF K74Rマウス(Kin;四角)についての空腹時血糖(図6A)及びインシュリン(図6B)の濃度並びにブドウ糖負荷試験(図6C)の測定値を示している。データは、各グループにおいてn= 3〜9にて、平均±SEMとして提示している。統計的有意差は、両側スチューデントt検定によって評価した。
【００３２】
【図７】図7A及びBは、生後3ヵ月及び24ヵ月の野生型(WT)及びEKLF K74R(Kin)マウスの身体的特性の比較を示している。図7Aは、握力試験の結果を示している。図7Bは、ローターロッド試験の結果を示している。データは、平均±SEM(それぞれn=20)として提示している。p値は、二元配置反復測定分散分析での遺伝子型効果の有意差を示す。データは、平均±SEMとして提示している。統計的有意差は、両側スチューデントt検定によって評価した。
【００３３】
【図８】図8は、雄マウスの骨粗鬆症の評価を示している。生後3ヵ月(上側パネル)又は24ヵ月(下側パネル)の年齢の野生型(WT;左側パネル)及びEKLF K74R(Kin;右パネル)マウスの骨梁を、高解像度マイクロコンピューター断層装置(mCT)イメージングによって分析した。n=3-6。
【００３４】
【図９】図9A及び図Bは、生後24ヵ月の野生型(WT)及びEKLF K74R(tg)マウスのMicroPET画像を示している。図9Aは、100Ciの18F-FDGを投与され、注入後、0.5時間スキャンしたマウスのMicroPET画像を示している。白矢は、野生型マウスの肝臓、膵臓及び脾臓の腫瘍を示す一方でEKLF K74Rマウス(Kin)にはない。図9Bは、体の解剖後に調べると、3匹のWTマウスのうちの2匹にがんが発生したが、3匹のKinマウスのいずれにも発生していなかったことをまとめている表を示している。
【００３５】
【図１０】図10は、EKLF K74Rマウスの抗発がん能力を示している。図10Aにおいて、B16F10メラノーマ細胞の注入の14日後の野生型(WT)及びEKLF K74R(Kin)マウスからの肺の代表的な写真が示されている。注入された3匹全てのWTマウスの肺に腫瘍が発生していた(左側パネル)一方で、3匹のKinマウスのいずれにも肺に腫瘍がなかった(右パネル)。スケールバーは、5mmである。図10Bは、腫瘍の比較に関するバーグラフを示している。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
発明の詳細な説明
本発明の実施は、逆のことが具体的に明示されない限り、当業者にとって分子生物学及び組換えDNA技術の従来の方法を使用する。それらの多くは、説明のために後述する。かかる技術は、論文において完全に説明されている。例えば、Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Edition, 2000); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Oligonucleotide Synthesis: Methods and Applications (P. Herdewijn, ed., 2004); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985);Nucleic Acid Hybridization: Modern Applications (Buzdin and Lukyanov, eds., 2009); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); Freshney, R.I. (2005) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, 5th Ed. Hoboken NJ, John Wiley & Sons; B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (3rd Edition 2010);Farrell, R., RNA Methodologies: A Laboratory Guide for Isolation and Characterization (3rd Edition 2005).Poly(ethylene glycol), Chemistry and Biological Applications, ACS, Washington, 1997;Veronese, F., and J.M.Harris, Eds., Peptide and protein PEGylation, Advanced Drug Delivery Reviews, 54(4) 453-609 (2002);Zalipsky, S., et al., "Use of functionalized Poly(Ethylene Glycols) for modification of polypeptides" in Polyethylene Glycol Chemistry:Biotechnical and Biomedical Applicationsを参照。
【００３７】
定義
便宜上、本開示の文脈において使用されるある種の用語は、ここに集めている。別途規定されない限り、本願明細書において用いられる全ての技術的及び科学的な用語は、本発明が属する分野の当業者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。
【００３８】
「寿命を延長する」て「寿命を延ばす」及び「生存期間を延ばす」は、本願明細書に互いに置換可能に用いられ、動物(例えば、生命を危うくする障害(例：がん又は腫瘍)を患っている動物)の生存期間の延長及び/又は正常加齢過程の遅延を指す。好ましくは、寿命は、幼少期の延長ではなく成人期の延長に起因するものであり、本方法による治療の結果である。
【００３９】
「健康な期間を延ばす」とは、老化と関連した身体的悪化、疾患又は障害の発病又は重症化の遅延を指す。また、延びた健康な期間は、例えば、特定の年齢にある老化と通常関連した身体的悪化、疾患又は障害の低減又は量の低減を指す。
【００４０】
本明細書で用いらる「アレル」という用語は、細胞内又は集団内の遺伝子の1つの特異的形態を指すものであり、この特異的形態は、遺伝子配列内における少なくとも一つ、多くの場合、複数の変異体サイトの配列が、同じ遺伝子の他の形態と異なっていてもよい。種々のアレル間で異なるこれらの変異体サイトの配列は、「相違」、「多型」又は「変異」と称される。対象が、ある遺伝子について2つの同一アレルを有する場合は、その対象は、その遺伝子又はアレルに関してホモ接合体であると言われる。対象が、ある遺伝子について2つの異なるアレルを有する場合は、その対象は、その遺伝子に関してヘテロ接合体であると言われる。特定の遺伝子のアレルは、単一のヌクレオチド又はいくつかのヌクレオチドが互いに異なっていてもよく、そして、ヌクレオチドの置換、欠失及び挿入を含んでいてもよい。また、遺伝子のアレルは、変異を含む遺伝子の形態であってもよい。
【００４１】
本明細書で用いられる「発現」という用語は、条件を満たすとmRNAが生じて通常はエンコードされたタンパク質が生じる遺伝子の転写を指すことを意図する。発現は、細胞によって自然に(即ち、人為的な介入なく)成し遂げられ得る若しくは実行され得る又は人為的に(即ち、例えば、化学薬品を用いて調節されるプロモーターを用いて人為的な介入の関与によって)成し遂げられ得る若しくは実行され得る。発現は、(例えば、Cre媒介組換による)サイト特異的リコンビナーゼによって引き起こされる組換イベントによって開始してもよい。発現は、遺伝子から転写されたmRNAを測定することによって、又は、遺伝子からエンコードされたタンパク質を測定することによって測定してもよい。
【００４２】
「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸(DNA)、必要に応じて、リボ核酸(RNA)のようなポリヌクレオチドを指す。核酸には、一本鎖及び二本鎖のポリヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されるものではない。例示的なポリヌクレオチドとして、DNA、一重鎖DNA、cDNA及びmRNAが挙げられる。また、上記用語には、ヌクレオチドアナログ、そして、適用可能であれば、一本鎖(センス又はアンチセンス)及び二本鎖ポリヌクレオチドから出来ているDNA又はRNAアナログが含まれる。上記用語には、改変されたDNA及び改変されたRNA(例えば、1又は複数の非天然ヌクレオチド又はヌクレオシドを含むDNA及びRNA)を含む改変されたポリヌクレオチドが更に含まれる。「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、本願明細書において互いに置換可能に用いられ、一本鎖又は二本鎖の形態でデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド及びそのポリマーを指す。上記用語には、合成、天然及び非天然の、並びに/又は、参照核酸と類似の結合特性を有する、並びに/又は、参照ヌクレオチドと類似の様式で代謝する、公知のヌクレオチドアナログ又は改変された主鎖残基又は連結を含む核酸が含まれる。かかるアナログの例として、限定するものではないが、ホスホロチオネート、ホスホロジアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、2-O-メチルリボヌクレオチド、ペプチド-核酸(PNA)が挙げられる。特に明記しない限り、特定の塩基配列には、明確に明示される配列だけでなく、その保存的に改変された変異体(例えば、縮重コドン置換)及び相補配列も含まれる。具体的には、縮重コドン置換は、1又は複数の選択された(又は、全ての)コドンの三番目の位置を混合塩基及び/又はデオキシイノシン残基で置換した配列を生じさせることによって成し遂げることができる(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994))。
【００４３】
「単離された」核酸分子は、天然の源由来の核酸に一般的に関連する核酸分子である。単離された核酸分子は、自然界でみられるその形態又は設定以外のものである。従って、単離された核酸分子は、天然の細胞中に存在する核酸分子から区別される。
【００４４】
「ベクター」という用語は、連結した他の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。「発現ベクター」という用語は、実施可能な状態で連結された核酸が発現できるように核酸に実施可能な状態で連結したプロモーターを含むベクターを指す。従って、本明細書で用いられるベクター又は発現ベクターには、ベクターに搭載されたそれぞれの組換遺伝子によってエンコードされる対象タンパク質を合成することができるプラスミド又はバクテリオファージが含まれる。ベクター又は発現ベクターは、核酸を細胞(例えば、哺乳類細胞)に導入することができるウイルスに基づくベクターも含まれる。ある種のベクターは、連結した核酸の自律複製及び/又は発現ができる。
【００４５】
本開示において、核酸が、他の塩基配列と機能的な関係で配置される場合、「実施可能な状態で連結」されているといえる。例えば、プロモーターは、それがコード配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に実施可能な状態で連結されている;又はリボソーム結合部位は、それが翻訳を容易にするように配置される場合、コード配列に実施可能な状態で連結されているといえる。一般的に、「実施可能な状態で連結」は、DNA配列が連結して、隣接し且つリーディング相にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、隣接する必要はない。連結は、適した制限サイトでのライゲーションによって達成される。そのような部位が存在しない場合は、通常の手法に従って、合成されたオリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
【００４６】
「トランスフェクション」という用語は、核酸媒介遺伝子導入によってレシピエント細胞への核酸(例えば、発現ベクター)の導入を指す。「トランスフォーメーション」は細胞の遺伝子型が外来性DNA又はRNAの細胞取り込みの結果として変えられるプロセスを指し、トランスフォームされた細胞は所望の異種タンパク質を発現する。
【００４７】
本願明細書において使用する「導入遺伝子」という用語は、導入先であるトランスジェニック動物又は細胞に対して部分的に又は完全に異種(すなわち、外来)である塩基配列、又は、導入先であるトランスジェニック動物又は細胞の内因性遺伝子に対して同種である塩基配列を指すが、かかる塩基配列は、挿入される細胞のゲノムが変化するように動物のゲノムに導入される、又は、導入するように設計されている。導入遺伝子は、1又は複数の転写調節配列、及び選択された核酸の最適発現のために必要な任意の他の核酸(例えば、イントロン)に実施可能な状態で連結することができる。従って、「トランスジェニック」という用語は、本願明細書において、導入遺伝子を収容する動物又は構築物の特性を記載する形容詞として用いられる。例えば、「トランスジェニック動物」は、非ヒト動物(好ましくは非ヒト哺乳動物)、より好ましくは、齧歯類であり、1又は複数の動物細胞は、ヒトによる介入(例えば、遺伝子ノックイン技術を含む公知技術のトランスジェニック技術)で導入された異種核酸を含む。核酸は、意図的な遺伝子操作を介して（例えばマイクロインジェクション又は組換えウイルスの感染により）前駆体細胞への導入によって直接的又は間接的に細胞に導入される。トランスジェニック動物としては、限定するものではないが、ノックイン動物が挙げられる。
【００４８】
「ノックイン(Kin)」は、導入遺伝子が発現するホスト細胞ゲノムへの導入遺伝子の標的挿入を指す。「ノックイン」トランスジェニクスは、導入遺伝子のヘテロ接合ノックインを含むことができる。ある種の実施形態では、「ノックイン」は、外因性遺伝子(又は、その一部)での内因性遺伝子(又は、その一部)の置換であり、例えば、1つ又は両方のアレルに関する目的変異である。「ノックイン」には、標的挿入サイトでの組換を促進する酵素(例えば、Cre-loxシステムのCre)を導入することによって、又は、いくつかの他の方法によって、かかる発現を促進する物質に動物を曝すことによる導入遺伝子の発現も含まれる。
【００４９】
「ホモ接合」状態は、同じアレルが相同染色体上の対応する座に存在する遺伝的状態を意味する。対照的に、「ヘテロ接合」状態は、異なるアレルが相同染色体上の対応する座に存在する遺伝的状態を意味する。
【００５０】
「哺乳動物」という用語は、ヒト、霊長類、家畜及び経済動物(例えばラビット、ブタ、ヒツジ及びウシ)動物園の動物、スポーツ動物又はペット動物、並びに齧歯類(例えばマウス及びラット)を含む哺乳綱の全てのメンバーを指す。「非ヒト哺乳動物」という用語は、ヒトを除く哺乳綱の全てのメンバーを指す。
【００５１】
本明細書で用いられる「治療」という用語は、所望の薬理学的及び/又は生理的効果(例えば、がんの発生、成長若しくは転移の遅延若しくは阻害、又は、臓器(例えば、脳)への虚血性損害の改善)を得ることを意味することを意図する。効果は、疾患又はその症状の発生を完全に又は部分的に予防又は阻害する観点から防止的であってもよく、及び/又は、疾患及び/又は疾患に起因する副作用を部分的に又は完全に治癒する観点から治療的であってもよい。本明細書で用いられる「治療」は、哺乳動物(特にヒト)の疾患の予防(例えば、防止)、治癒又は一時的に軽くする治療を含み、そして、(1) 疾患の傾向にあるが、まだ診断されていない個人で生じる疾患又は状態(例えば、がん又は心不全)の予防（例えば、防止）、治癒又は一時的に軽くする治療、(2) (例えば、疾患の発症を抑制することによって)疾患を阻害すること、又は(3) 疾患を緩和する(例えば、疾患と関連した症状を低減する)こと、を含む。
【００５２】
「投与される」、「投与する」又は「投与」という用語は、本願明細書において互いに置換可能に用いており、限定するものではないが、静脈内、筋肉内、腹膜内、動脈内、頭蓋内又は皮下に本発明の薬剤(例えば、化合物又は組成物)を投与することを含む送達モードを指す。
【００５３】
本明細書で用いられる「有効量」という用語は、疾患又は状態(例えば老化)の治療に関する所望の結果を成し遂げるために必要な期間及び用量での有効量を指す。例えば、がんの治療において、がんの任意の症状を低減、阻害、予防、遅延又は抑制する薬剤(即ち、化合物、ポリペプチド又は治療ポリペプチドをエンコードしているポリ核酸)は、有効である。薬剤の有効量は、疾患又は状態の治癒に必須ではなく、疾患又は状態の発病が遅延、妨害又は予防されるように、又は、疾患又は状態の症状を改善するように疾患又は状態を治療するだろう。有効量は、指定期間全体にわたって1、2又は3回以上で投与される適切な形態で1、2又は3以上の用量に分けてもよい。
【００５４】
「対象」という用語は、本発明の方法によって治療可能なヒト種を含む動物をいう。「対象」という用語は、1つの性別を具体的に明示しない限り、男女両方の性別を指すことを意図とする。従って、「対象」という用語は、本開示の治療方法から利益を得ることができる任意の哺乳動物を含む。
【００５５】
「細胞増殖障害」、「腫瘍」及び「がん」という用語は、本願明細書において互いに置換可能に用いており、悪性及び非悪性成長、分化の欠損並びに局部組織への侵入及び転移能力を含む、制御が解除された又は制御されていない自律的な細胞成長によって特徴付けられる任意の障害を意味することを意図とする。この障害の例には、限定するものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫及び白血病又はリンパ性悪性腫瘍が含まれる。かかる障害のより特定の例には、肝がん、結腸がん、乳がん、前立腺がん、肝細胞癌腫、メラノーマ、肺がん、グリア芽細胞腫、脳腫瘍、造血悪性腫瘍、網膜芽細胞腫、腎細胞癌腫、頭頸部がん、子宮頸がん、膵臓がん、食道がん及び胸膜細胞癌腫が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５６】
本願明細書で使用する単数形「a」、「an」及び「the」は、文脈別途明確に明示しない限り、複数形の言及を含む。
【００５７】
「減少した」、「低減した」又は「低下した」量は、一般的に「統計的に有意な」量であり、例えば、コントロールと比較して5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、又は、100%(その間の全ての整数及び範囲を含む)の減少を含んでいてもよい。比較及び「統計的に有意な」量の他の例は、本願明細書に記載されている。本明細書で用いられる「下がる」は、「阻害」、「軽減」、「抑制」、「低減」、「減衰」、「減少」又は「低下」を指すことができる。
【００５８】
「増加した」又は「向上した」量は、一般的に「統計的に有意な」量であり、例えば、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%又は、100%の増加を含むことができる。増加した又は向上した量は、コントロールと比較して、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、1,000倍、10,000倍又は、10,000倍超(その間の全ての整数及び範囲を含む)の増加を含んでいてもよい。と相対して増加する。比較及び「統計的に有意な」量の他の例は、本願明細書に記載されている。本明細書で用いられる「増加」は、「苦悩」、「向上」、「膨張」、「拡大」、「拡張」、「増大」、「拡大」又は「上昇」を指すことができる。
【００５９】
「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本願明細書において互いに置換可能に用いており、アミノ酸残基のポリマー並びにその変異体及び合成アナログを指す。従って、これらの用語は、天然アミノ酸ポリマーだけでなく、1又は複数のアミノ酸残基が合成非天然アミノ酸(例えば、対応する天然アミノ酸の化学アナログ)であるアミノ酸ポリマーにも適用される。本願明細書に記載されているポリペプチドは、産物の特定長さに限定されないことから、ペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質は、ポリペプチドの定義内に含まれ、かかる用語は、具体的に別途明示されない限り、本願明細書において互いに置換可能に用いることができる。本願明細書に記載されているポリペプチドは、従来技術において知られている他の(天然及び非天然の)改変だけでなく、発現後改変(例えば糖修飾、アセチル化及びリン酸化等)を含むこともできる。ポリペプチドは、完全なタンパク質又はその部分配列、断片、変異体若しくは誘導体であってもよい。
【００６０】
測定及び/又は定量することができる特性、特徴、作用又は活性を指す際に本明細書で用いられる「同様」という用語は、検出可能な及び/又は統計的に有意な相違の欠如を指す。
【００６１】
「野生型」という用語は、天然源から単離された遺伝子又は遺伝子産物の特徴を有する遺伝子又は遺伝子産物を指す。野生型遺伝子又は遺伝子産物(例えば、ポリペプチド)は、集団において最も頻繁に観察されるものであり、従って、任意に設計された、遺伝子の「正常」又は「野生型」の形態である。
【００６２】
本明細書で用いられる「コントロール動物」は、実験動物(例えば、改変型EKLFポリペプチドを発現する遺伝子改変された動物)にかなり近いが、実験的な特徴(例えば、改変型EKLFポリペプチドの発現)を有していない動物を指す。所定の実験又は比較実験のために、当業者は、実験又は比較の性質、遺伝子改変動物の種及び年齢及び実験の実現可能性（これらに限定するものではない）を含み得る考慮点に応じて適切なコントロール動物を選択することが可能である。特に明記しない限り、コントロール動物は、EKLF座での改変を含まず、改変型EKLFポリペプチドを発現しない。いくつかのケースでは、コントロール動物は、遺伝子改変動物と同じ性の同腹の子であってもよい。
【００６３】
本明細書で用いられる「老化」動物は、正常老化と関連した少なくとも一つの表現型を示す成体動物を指す。「老化」と考えられる動物の正確な年齢は、動物の種及び/又は株と、問題にしている表現型に依存し、当業者によって容易に決定することができる。
【００６４】
「相同」は、同一又は保存的置換を構成するアミノ酸のパーセント数を指す。相同は、GAP等の配列比較プログラム(Deveraux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12, 387-395、本願明細書に引用したものとする)を使用して決定することができる。このようにして、GAPにより用いられる比較アルゴリズムによって、本願明細書に引用される配列に対する同様又は実質的に異なる長さの配列は、例えば、アライメントにおけるギャップの挿入によって比較することができる。このようなギャップは、例えば、GAPを用いた比較アルゴリズムによって決定される。
【００６５】
「統計的に有意」とは、ある結果が偶然に発生しそうにないことを意味する。統計的有意差は、従来技術において知られている任意の方法によって決定することができる。有意差に関する一般に使用される測定は、帰無仮説が真である場合、観察されたイベントが起こる頻度又は確率であるp値を含む。得られたp値が有意水準より小さい場合、帰無仮説は否定される。単純なケースにおいて、有意水準は、0.05以下のp値で規定される。「有意」という用語は、「統計的に有意」という用語を包含及び含む。
【００６６】
本願明細書で用いる「配列同一性」(例えば、「50%の配列同一性」)は、配列が、比較領域を通じてヌクレオチド対ヌクレオチド基準又はアミノ酸対アミノ酸基準で同一であるという程度を指す。従って、「配列同一性のパーセント」は、比較領域を通じて2つの最適に整列させた配列を比較し、両方の配列における同一の核酸塩基(例えば、A、T、C、G、I)又は同一のアミノ酸残基(例えば、Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys及びMet)が生じている位置の数を決定して一致した位置の数を取得し、比較領域における位置の合計数(すなわち、領域サイズ)によって、一致した位置の数を分けて、そして、結果に100を掛けて配列同一性のパーセントを算出することによって計算することができる。
【００６７】
2以上のポリペプチド間の配列関係を記載するために用いる用語は、「参照配列」、「比較領域」、「配列同一性」、「配列同一性のパーセント」及び「実質的な同一性」を含む。「参照配列」は、長さが少なくとも12、しかし、しばしば15〜18、多くの場合、少なくとも25モノマー単位(ヌクレオチド及びアミノ酸残基を含む)である。2つのポリペプチドがそれぞれ(1) 2つのポリペプチドの間に類似している配列(すなわち、完全なポリペプチド配列の一部だけ)、及び(2) 2つのポリペプチドの間で異なる配列を含み得るため、2つの(又は、より多くの)ポリペプチド間の配列比較は、一般的に、局所領域の配列類似性を同定及び比較するために「比較領域」を通じて2つのポリペプチドの配列を比較することによって実行される。「比較領域」は、2つの配列を最適に整列させた後、配列が同じ数の隣接位置の参照配列と比較される少なくとも6つの隣接位置、通常約50〜約100の隣接位置、より通常約100〜約150の隣接位置の概念上のセグメントを指す。比較領域は、2つの配列の最適アライメントに関して参照配列(追加又は欠失を含まない配列)と比較して約20%未満の追加又は欠失(すなわち、ギャップ)を含むことができる。比較領域を整列させるための最適配列アライメントは、コンピューター実装アルゴリズム(ウィスコンシンジェネティクスソフトウェアパッケージリリース7.0、ジェネティクスコンピューターグループ、575サイエンスドライブマディソン、WI、米国のTFASTA、FASTA、BESTFIT及びGAP)によって、又は、選択される様々な方法のいずれかによって生じる最善のアライメント(即ち、比較領域を通じて相同性が最も高いパーセントになるアライメント)及び調査によって実施することができる。例えば、アルチュール達によって開示(1997, Nucl. Acids Res. 25:3389)されたBLASTファミリーのプログラムも言及できる。配列分析に関する詳細な議論は、オースベル達のCurrent Protocols in Molecular Biology," John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Chapter 15のUnit 19.3に見つけることができる 。
【００６８】
配列間の配列類似性又は配列同一性(これらの用語は、本願明細書において互いに置換可能に用いている)の算出は、以下の通りに実行することができる。2つのアミノ酸配列の又は2つの塩基配列の同一性のパーセントを決定するために、最適な比較のために配列を整列させることができる(例えば、ギャップを最適アライメントのために第一及び第二アミノ酸又は塩基配列の1方又は両方に導入することができ、そして、非相同配列を比較のために無視することができる)。ある種の実施形態において、比較のために整列させた参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも30%、好ましくは少なくとも40%、より好ましくは少なくとも50%、60%、さらにより好ましくは少なくとも70%、80%、90%、100%である。そして、対応するアミノ酸位又はヌクレオチド位置のアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第一配列の位置が第二配列の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドである場合、その場合は、その分子はその位置で同一である。
【００６９】
2つの配列間の同一性のパーセントは、2つの配列の最適アライメントのために導入する必要があるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮しての、配列によって共有される同一の位置の数の関数である。
【００７０】
2つの配列間の配列の比較及び同一性のパーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。好ましい実施形態において、2つのアミノ酸配列間の同一性のパーセントは、Blossum 62マトリックス又はPAM250マトリックス並びに16、14、12、10、8、6、又は4のギャップウェイト及び1、2、3、4、5、又は6の長さウェイトを用いてGCGソフトウェアパッケージのGAPプログラムに組み込まれたニードルマン及びブンシュ(1970, J. Mol. Biol. 48: 444-453)のアルゴリズムを使用して決定される。さらにもう一つの好適な実施形態において、2つのヌクレオチド配列間の同一性のパーセントは、NWSgapdna.CMPマトリックス並びに40、50、60、70、又は80のギャップウェイト及び1、2、3、4、5、又は6の長さウェイトを用いてGCGソフトウェアパッケージのGAPプログラムを使用して決定される。パラメーターの特に好ましいセット(そして、特に明記しない限り使用するのが望ましいもの)は、ギャップペナルティーとして12、ギャップ拡張ペナルティーとして4、そして、フレームシフトギャップペナルティーとして5用いたBlossum 62スコアリングマトリックスである。2つのアミノ酸又はヌクレオチド配列間の同一性のパーセントは、PAM120ウェイト残基表、ギャップ長ペナルティーとして12及びギャップペナルティーとして4を使用するALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み込まれているE.メイヤーズ及びW.ミラー(1989, Cabios, 4: 11-17)のアルゴリズムを使用して決定することもできる。
【００７１】
本願明細書に記載されている核酸及びタンパク質配列を「問い合わせ配列」として使用し、公共データベースに対して調査を実行して、例えば、他のファミリーのメンバー又は関連配列を同定することができる。アルチュール達(1990, J. Mol. Biol, 215: 403-10)のNBLAST及びXBLASTプログラム(バージョン2.0)を使用してかかる調査を実行することができる。BLASTヌクレオチドサーチは、本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得るために、NBLASTプログラム、スコア= 100、ワード長 = 12によって実行することができる。BLASTタンパク質サーチは、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るために、XBLASTプログラム、スコア= 50、ワード長 = 3によって実行することができる。比較のためにギャップがあるアライメントを得るために、Gapped BLASTは、アルチュール達(1997, Nucleic Acids Res, 25: 3389-3402)が説明しているように利用することができる。BLAST及びGapped BLASTプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム(例えば、XBLAST及びNBLAST)のデフォルトパラメーターを用いることができる。
【００７２】
本願明細書に「抗体」という用語は、最も広い意味において用いられ、具体的には、完全なモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも2つの完全な抗体から形成された多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)及び、所望の抗原結合性活性を示す限り抗体断片を包含する。「抗体断片」は、完全な抗体の一部、好ましくはその抗原結合性又は可変領域を含む。抗体断片の例として、Fab、Fab'、F(ab')2、scFv及びFv断片;二重特異性抗体;ナノボディ;リニア抗体(linear antibodies);単鎖抗体分子;及び、抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられる。
【００７３】
遺伝子改変動物
本開示は、寿命、抗老化、抗発がん及び/又は抗転移に関する動物モデルとして役割を果すノックイン動物(例えばノックインマウス)の開発に部分的に基づくものであり、内因性赤血球クルッペル様因子(EKLF)遺伝子アレルの一方又は両方は、本願明細書に具体的に記載されているもののいずれかを含む改変型EKLFポリペプチドをエンコードするように改変されている。遺伝子改変動物における改変型EKLFポリペプチドの発現は、動物の生存期間及び/若しくは健康な期間を延ばす、並びに/又は、腫瘍形成及び/若しくはがん性細胞の転移を抑制若しくは阻害する。従って、改良型EKLFアレルの導入は、対象の生存期間又は健康な期間を延ばすための手段、細胞増殖障害を治療する(例えば、腫瘍形成又は腫瘍転移を阻害する)ための手段、及び、抗老化並びに/又は抗腫瘍薬として適切な候補薬剤をスクリーニングするための手段をもたらす。
【００７４】
特定の実施形態によって、本願明細書で開発した遺伝子改変非ヒト動物のモデルが、老化、寿命並びに細胞増殖障害(例えば、がん)の進行及び治療を調査する有益なツールであることが予想される。この動物のモデルは、正常動物と比較して、障害がある又は改変された代謝を示さないという点で特に有利である。特に、本開示の非ヒト遺伝子改変動物モデルは、ユーティリティを老化及び寿命の研究並びに転移がんを含むがんの治療又は予防のための薬剤と老化防止のための薬剤としての候補のスクリーニングに役に立つことが明らかである。
【００７５】
特定の実施形態は、改変型EKLFポリペプチドをエンコードする核酸(例えば、DNA)配列を含む遺伝子改変動物に関する。「改変型EKLFポリペプチド」は、野生型EKLFタンパク質と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を有する、野生型EKLFタンパク質と比較して少なくとも一つのアミノ酸改変及び少なくとも100、200、300、又は350アミノ酸を有するその断片を有するEKLF変異体を含む。
【００７６】
ある種の実施形態は、改変型EKLFポリペプチドをエンコードする塩基配列を含む遺伝子改変動物に関するものであり、動物は、野生型EKLFをエンコードする塩基配列も有する。特定の実施形態、改変型EKLFポリペプチドをエンコードする核酸(例えば、DNA)配列を含む遺伝子改変動物に関するものであり、動物は、野生型EKLFをエンコードする塩基配列も含む。各種実施形態において、動物は、改変型EKLFポリペプチド及び内因性EKLFポリペプチドを発現する一方で、いくつかの実施形態において、動物は、改変型EKLFポリペプチドだけを発現する。
【００７７】
いくつかの実施形態において、改変型EKLFをエンコードしている塩基配列は、内因性EKLF遺伝子プロモーターによって調節される。ある種の実施形態は、改変型EKLFタンパク質を発現する遺伝子改変非ヒト動物に関するものであり、遺伝子改変動物は、改変型EKLFタンパク質をエンコードする塩基配列を含み、EKLFタンパク質は、内因性EKLFプロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態は、改変型EKLFタンパク質を発現する遺伝子改変非ヒト動物に関するものであり、遺伝子改変動物は、改変型EKLFタンパク質及び外因性プロモーターをエンコードする塩基配列(例えば、DNA)を含み、改変型EKLFをエンコードする塩基配列は、外因性プロモーターの制御下にある、又は、外因性プロモーターに実施可能な状態で連結されている。いくつかの実施形態において、外因性プロモーターは、構成的様式での導入遺伝子発現を目的とするプロモーター、組織特異的様式での発現を目的とするプロモーター、誘導性プロモーター(例えばTet-On誘導性プロモーター)及び成長又はタイミング依存的様式での発現を目的とするプロモーターから選択される。ある種の実施形態は、改変型EKLFタンパク質を発現する遺伝子改変非ヒト動物に関するものであり、遺伝子改変動物は、改変型EKLFタンパク質をエンコードする塩基配列を含み、EKLFタンパク質は、内因性EKLFプロモーターの制御下にある。「プロモーター」は、特定の遺伝子の転写を開始するDNAの領域を意味する。「内因性プロモーター」は、細胞又は対象において関心を引く遺伝子の発現を直接目的とするプロモーター(すなわち、ネイティブプロモーター)を意味する。ノックインマウスの場合、改変された遺伝子の発現は、その遺伝子の内因性マウスプロモーターによって誘導されてもよい。
【００７８】
特定の実施形態は、非ヒトEKLFノックイン動物に関する。本明細書で用いられる「ノックイン動物」は、生物の染色体の特定の座におけるDNA配列(例えば、cDNA配列)の挿入を伴う遺伝子工学的方法によって生産されたトランスジェニック動物を指す。挿入物は、重要でない座由来のDNAの傍に位置し、相同組換によって、導入遺伝子が、その重要でない特定の組み込みサイトを標的とすることができる。「ノックイン」という用語は、第一世代動物とその後代動物を含み、後代動物は、その少なくとも一つのアレルにおいて導入遺伝子を有することを意図する。いくつかの実施形態において、挿入物は、EKLF遺伝子座を標的とするDNA又はその断片を含み、挿入物は、改変型EKLFポリペプチド又はその領域若しくは部分をエンコードする。いくつかの実施形態において、挿入物は、EKLF遺伝子座におけるタンパク質をエンコードしている領域を標的にする。ある種の実施形態では、挿入物は、改変型EKLFポリペプチド及び改変型EKLFプロモーターをエンコードしている。
【００７９】
本明細書で用いられる「EKLFノックイン」は、改変型EKLFポリペプチド又はその部分若しくは領域をエンコードする核酸が、例えば、対応する野生型EKLFポリペプチド又はその部分若しくは領域をエンコードする、動物の核酸を置き換えるためにEKLF座に挿入されていることによるトランスジェニック非ヒト動物を指す。いくつかの実施形態において、ノックイン動物は、1コピーの内因性EKLF遺伝子及び1コピーの改変型ノックインEKLF遺伝子を含むヘテロ接合体である。特定の実施形態において、遺伝子改変動物は、EKLFノックインマウスである。ある種の実施形態では、ノックイン動物は、2コピーの改変型ノックインEKLF遺伝子を含むホモ接合体である。
【００８０】
ある種の実施形態では、非ヒト動物は、改変型EKLFゲノム配列(又は、その部分)での、内因性EKLF座における内因性EKLFゲノム配列(又は、その部分)の置換によって遺伝子が改変されて、改変された座が形成され、改変型EKLFゲノム配列は、少なくとも一つの改変型タンパク質-コーディングエクソンを有する。いくつかの実施形態において、置換は、EKLFのタンパク質-コーディングエクソンを少なくとも2つ含む改変型ゲノム断片を含む。いくつかの実施形態において、置換は、改変型EKLFのタンパク質-コーディングエクソンを少なくとも3つ含む改変型ゲノム断片を含む。特定の実施形態において、非ヒト動物は、EKLF遺伝子(又は、その部分)の改変されたエクソン2でのEKLF遺伝子の内因性エクソン2の置換によって遺伝子が改変されている。特定の実施形態において、EKLFタンパク質のSUMO化サイト又はリン酸化サイトをエンコードする、内因性EKLFゲノム配列の領域は、改変型EKLFゲノム配列によって置換されている。
【００８１】
特定の実施形態は、本願明細書に記載されているもののいずれかを含む、内因性の野生型EKLFと比較して1又は複数のアミノ酸の改変を含むEKLFポリペプチドをエンコードする改変型EKLF座を含む遺伝子改変非ヒト動物に関する。特定の実施形態において、改変型EKLFポリペプチドは、そのSUMO化を阻害する改変を含む。生物は、後代に改変を(すなわち、生殖細胞系伝達を通じて)通すことが一般的に可能である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変非ヒト動物は、改変型EKLFポリペプチドをエンコードする改変型EKLF座を有する親の子孫である。いくつかの実施形態において、子孫は、改変型EKLF座に関してホモ接合体である。ある種の実施形態では、子孫は、改変型EKLF座に関してヘテロ接合体である。
【００８２】
ある種の実施形態は、内因性の野生型EKLFと比較して1又は複数のアミノ酸の改変を含むEKLFポリペプチドをエンコードする改変型EKLF座を有し、1又は複数の追加の座に改変を更に有する遺伝子改変非ヒト動物に関する。いくつかの実施形態において、遺伝子改変動物は、1つの追加の座、2つの追加の座、3つの追加の座、4つの追加の座、5つの追加の座、6つの追加の座、7つの追加の座、8つの追加の座、9つの追加の座、10の追加の座又は10を超える追加の座において改変を含む。いくつかの実施形態において、追加の座の改変は、遺伝子ノックアウト、遺伝子ノックイン又は外因性遺伝子の挿入である。
【００８３】
特定の実施形態は、少なくとも一つの追加の座の改変を含む遺伝子改変動物と交配させた非ヒトEKLFノックイン動物に関する。ある種の実施形態は、EKLFノックイン動物と少なくとも一つの追加の非EKLF座に改変を有する遺伝子改変動物との交配産物である、改変型EKLFポリペプチドを発現する子孫に関する。遺伝子改変動物は、従来技術において知られており、外因性ペプチドを誘導発現するトランスジェニック動物、誘導性ノックアウト動物モデル(例えばCRE-loxP)、誘導性ノックイン動物(例えばクリスパー/Cas)を含むことができる。ある種の実施形態では、EKLFノックインは、トランスジェニック動物(例えば、ノックイン動物及び/又はノックアウト動物)と交配される。いくつかの実施形態において、EKLFノックイン動物は、疾患(例えばがん)又は寿命の態様(例えばS6K1ノックアウト)をモデル化している遺伝子改変動物と交配される。
【００８４】
いくつかの実施形態において、遺伝子改変非ヒト動物は、マウス、ラット、ラビット、ブタ、ウシ(例えば、メスウシ、オスウシ、バッファロー)、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長類(例えば、マーモセット、アカゲザル)からなる群より選択することができる。ある種の実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物(例えば、非ヒト哺乳動物)である。ある種の実施形態では、非ヒト動物は、小さい哺乳動物(例えば、ネズミ上科の動物)である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変動物は、齧歯類である。いくつかの実施形態において、齧歯類は、マウス、ラット及びハムスターから選択される。いくつかの実施形態において、齧歯類は、ネズミ上科から選択される。一実施形態として、遺伝子改変動物は、カンガルーハムスター科(Calomyscidae)(例えば、カンガルーハムスター)、キヌゲネズミ科(例えば、ハムスター、新世界ラット及びマウス、ハタネズミ)、ネズミ科(真正マウス及びラット、スナネズミ、トゲマウス、タテガミラット(crested rat))、アシナガマウス科(クライミングマウス(climbing mouse)、ロックマウス(rock mouse)、ウィズテイルドラット(with-tailed rat)、マダガスカルラット及びマウス)、トゲヤマネ科(例えば、トゲヤマネ)及びメクラネズミ科(例えば、デバネズミ、タケネズミ及びモグラネズミ)から選択される科(ファミリー)由来である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変齧歯類は、真正マウス又はラット(ネズミ科)、スナネズミ、トゲマウス及び、タテガミラット(crested rat)から選択される。一実施形態として、遺伝子改変マウスは、ネズミ科のメンバー由来である。一実施形態として、動物は、齧歯類である。特定の実施態様において、齧歯類は、マウス及びラットから選択される。一実施形態として、非ヒト動物は、マウスである。特定の実施形態において、遺伝子改変非ヒト動物は、EKLFノックインマウスである。
【００８５】
ある種の実施形態では、非ヒト動物は、齧歯類であり、C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr及びC57BL/Olaから選択されるC57BL株のマウスである。別の実施形態において、マウスは、129P1、129P2、129P3、129X1、129S1(例えば、129S1/SV、129S1/SvIm)、129S2、129S4、129S5、129S9/SvEvH、129S6(129/SvEvTac)、129S7、129S8、129T1、129T2である株からなる群より選択される129株(Festing et al. (1999) Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome 10:836を参照、例えば、Auerbach et al. (2000) Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv- and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Linesを参照)である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変マウスは、上述した129株及び上述したC57BL/6株の混血である。他の特定の実施形態において、マウスは、上述した129株の混血又は上述したBL/6株の混血である。いくつかの実施形態において、混血に関する129株は、129S6(129/SvEvTac)株である。別の実施形態において、マウスは、BALB株(例えば、BALB/c株)である。さらに別の実施形態では、マウスは、BALB株及び他の上述した株の混血である。さらに別の実施形態では、マウスは、交雑系(例えば、50%BALB/c-50%12954/Sv;、又は、50% C57BL/6-50% 129;例えば、F1H4細胞、Auerbach et al. (2000)を参照)。
【００８６】
ある種の実施形態では、非ヒト動物は、ラットである。いくつかの実施形態において、ラットは、ウィスターラット、LEA株、スプラーグドーリー株、フィッシャー株、F344、F6及びダークアグーチから選択される。いくつかの実施形態において、ラット株は、ウィスター、LEA、スプラーグドーリー、フィッシャー、F344、F6及びダークアグーチからなる群より選択される2以上の株の混血である。
【００８７】
本願明細書に記載されている改変を含む遺伝子改変細胞も提供されるが、多くの態様及び実施形態において、遺伝子改変非ヒト動物は、この動物の生殖細胞系における内因性EKLF座の改変を含む。
【００８８】
各種実施形態において、非ヒト動物は、哺乳動物である。ある種の実施形態では、哺乳動物は、齧歯類である。特定の実施形態は、一方又は両方の内因性齧歯類EKLF座のEKLF遺伝子の改変を含む齧歯類に関する。一方又は両方の内因性EKLF座において、改変型EKLF遺伝子又はその断片での内因性EKLF遺伝子又はその断片(例えば、1又は複数のエクソンを含む断片)の置換を含む齧歯類(例えば、マウス)を作製するための方法が提供される。特定の実施形態は、改変型EKLF遺伝子を含む細胞、組織及びマウスと、内因性非ヒトEKLF座由来のヒトEKLFを発現する細胞、組織及びマウスに関する。内因性齧歯類プロモーターの制御下で改変型EKLFタンパク質を発現する齧歯類も提供される。
【００８９】
ある種の実施形態は、改変型EKLFポリペプチドを発現する遺伝子改変ノックイン動物(野生型EKLFポリペプチドではない改変型EKLFポリペプチドを発現するホモ接合体を含むが、これに限定されるものではない)を発生させる方法に関する。ノックイン動物(例えばマウス)を発生させる技術及び戦略は、公知技術であり、(Doyle et al. 2012 Transgenic Res. 21(2): 327-349;及びRoebroek et al. Chapter 10 In: Hofker MH, Deursen Jv, editors. Transgenic mouse: Methods and protocols. Humana Press; Totowa, NJ: 2003. pp. xiiipp. 3741pp. 3187-3200)で概説されている。
【００９０】
かかる一つの戦略において、ノックインマウスは、マウスにおいて実験的遺伝子操作をメンデル遺伝する特性に翻訳するビヒクルとして多能性胚性幹(ES)細胞を利用する2ステージのプロセスにおいて生産される。ある種の戦略において、マウスから単離された胚性幹細胞は、相同組換を容易にする、内因性遺伝子又は染色体配列に対する相同領域を含むDNA標的構築物を用いてトランスフェクションされる。DNA標的構築物は、遺伝子相同の特定の領域を含むだけでなく、一意となるよう技術的に施された変異又は配列修正も有し、ES細胞へのトランスフェクションに続いて、標的構築物由来の配列での内因性遺伝子(又は、その部分)の1対1の置換によって、この新規な配列変異体を含むこれらの細胞のゲノムにアレルが生じる。適切な遺伝子修正を含む標的ES細胞クローンは、3.5日の胚盤胞胚の胞胚腔のキャビティに輸送される。次に、胚を代理母に移し、そこで、妊娠が完了して、新規な配列変異体(すなわち、ノックイン変異)を継承したES細胞由来樹立マウスが誕生し、選択したこの遺伝子座に機能獲得アレルが生じる。当業者は、ノックイン動物を誕生させるための他の適切な戦略(例えばCre-loxPシステムを利用している戦略及びクリスパー/Cas9技術)を認識している。
【００９１】
遺伝的に改変可能な適切なES細胞が容易に利用できない非ヒト動物に関しては、他の方法を用いて遺伝子改変を含む非ヒト動物を作製する。かかる方法は、限定するものではないが、例えば、非ES細胞ゲノム(例えば、繊維芽細胞又は誘導された多能性細胞)を改変するステップと、改変されたゲノムを適切な細胞(例えば、卵母細胞)に移植するために核移植を使用するステップと、胚を形成するために、改変された細胞(例えば、改変された卵母細胞)を適切な条件下で非ヒト動物において妊娠させるステップと、を有する。
【００９２】
ある実施形態は、Cre-loxPシステムを利用して、改変型EKLFポリペプチドを発現する遺伝子改変動物を誕生させる方法に関する。Cre-loxPシステムは、単離された細胞又はトランスジェニック動物のゲノムにおける組換の誘導によって、選択された遺伝子の発現を改変するか又は制御された様式において染色体再配置を誘導するために利用されてきた。このシステムは、loxPと呼ばれる短い(34bp)非対称のコンセンサス配列を認識するPIバクテリオファージ酵素であるCreリコンビナーゼに依拠する。同じ方向にあるかかる2つの配列がDNA分子に配置されていると、酵素によって、これらの2つのサイトの間で組換が触媒作され、間にあるDNAセグメントが削除される。2つのloxP配列が2つの異なるDNA分子(例えば2つの染色体上)に配置されていると、Creは分子間組換を媒介する。組換の結果は、loxPサイトの配向に依存し、同じ染色体腕上の2つのloxサイトに関しては、互いに逆方向のloxPサイトは、挿入を引き起こす一方で、loxPサイトのダイレクトリピートは、欠失イベントを引き起こす。本願明細書に記載されているCre-loxP組換システムの他に、他の部位特異的組換システムを用いて、本開示の実施例において例証されている非ヒトトランスジェニック動物モデルを誕生させることもできる。
【００９３】
関心を引く表現型を有する遺伝子改変動物を選択するために、それらの動物をスクリーニングして評価する。最初のスクリーニングは、例えば、サザンブロット分析又はPCR技術を使用して、動物の組織の分析を実行し、導入遺伝子の組み込みが生じたことを確かめることができる。トランスジェニック動物の組織における導入遺伝子のmRNA発現のレベルは、動物から得られた組織サンプルのノーザンブロット解析、in situハイブリダイゼーション分析及び逆転写酵素-PCR(RT-PCR)を含むが、これらに限定されるものではない技術を使用して評価することもできる。適切な組織のサンプルは、導入遺伝子の特異的抗体を使用して、免疫細胞化学的に評価することができる。導入遺伝子の存在を評価する代わりの又は追加の方法としては、限定するものではないが、適切な生化学アッセイ(例えば酵素及び/又は免疫学的アッセイ) 、特定のマーカー又は酵素活性に関する組織学的染色法並びにフローサイトメトリー解析等が挙げられる。血液分析は、血液中の導入遺伝子産物の存在を検出するために有効であろう。
【００９４】
特定の実施形態は、遺伝子改変動物を生産する方法に関するものであり、その結果、遺伝子改変動物は、多能性又は全能性細胞(例えば、ES細胞)から生産される。ある種の実施形態では、非ヒト動物は、核注入ステップを使用することによって生産され、(任意に上流及び/又は下流の内因性非ヒト調節配列を含む)改変型EKLF遺伝子又はその部分を含む核酸構築物は、プロ核注入によって導入される。いくつかの実施形態において、核酸構築物は、少なくとも一つの改変型タンパク質-コーディングエクソンEKLFを含むゲノム断片を含む。ある種の実施形態では、上記断片は、改良型EKLFエクソン2の部分を含む。
【００９５】
ある実施形態は、改良型EKLFポリペプチドを発現する遺伝子改変動物を誕生させる方法であって、上記方法は、a) 改変型EKLFポリペプチド又はその部分をエンコードしているポリヌクレオチドを備えるベクターを取得するステップと、b) 非ヒト動物の胚性幹(ES)細胞にベクターを注入するステップと、c) ベクターを含むES細胞を胚盤胞胚に移すステップと、d) 胚の妊娠が完了する代理母に胚盤胞胚を移し、それによって、改変型EKLFポリペプチドをエンコードしているポリヌクレオチドを含む樹立動物を生み出し、遺伝子改変動物を誕生させるステップと、を有する。いくつかの実施形態において、遺伝子改変動物は、ノックイン動物であり、ベクターは、改良型EKLFをエンコードするポリヌクレオチドの3'及び5'末端に位置する、動物の内因性DNAに相同するポリヌクレオチドを含む標的ベクターである。特定の実施形態において、動物の内因性DNAに相同するポリヌクレオチドを含むベクターをES細胞に注入するステップによって、相同組換による、ES細胞のゲノムへのポリヌクレオチドの挿入となる。ある種の実施形態では、相同DNAは、EKLF遺伝子座位に相同である。特定の実施形態において、標的ベクターは、ES細胞へのベクターの注入の後にベクターを含むES細胞を同定するために使用する選択カセットを更に備える。特定の実施形態において、選択カセットは、PGK-gb2-neoカセットである。ある種の実施形態では、選択カセットは、loxPサイトが側面に並んでおり、遺伝子改変動物を誕生させる方法は、e)生殖細胞系細胞においてCreを発現するトランスジェニック動物と成体樹立動物とを交配させるステップと、交配の結果である後代を取得して、その結果、ゲノムに選択カセットを含まない改変型EKLFポリペプチドを発現している動物を取得するステップと、を更に有する。
【００９６】
特定の実施形態は、改変型EKLFポリペプチドを発現しているノックインマウスを誕生させる方法に関するものであり、上記方法は、a) 内因性マウスEKLF遺伝子に相同するポリヌクレオチドを5'及び3'末端の側面に並べられている改変型EKLFポリペプチド(又は、その部分)をエンコードしているポリヌクレオチドを備えるベクターを取得するステップと、b) 非ヒト動物のマウスES細胞にベクターを注入するステップと、改変型EKLFをエンコードしているポリヌクレオチドは、相同組換によってEKLF遺伝子座位においてES細胞のゲノムに挿入され、c) ベクターを含むES細胞を3.5日齢のマウス胚盤胞胚に移すステップと、d) 妊娠の残りの期間のための代理母マウスに上記胚盤胞胚を移し、その結果、改変型EKLFポリペプチド又はその部分をエンコードしているポリヌクレオチドを含む樹立動物を生み出し、遺伝的ノックインマウスを誕生させるステップと、を有する。ある種の実施形態では、ベクターは、選択カセットを更に含む。いくつかの実施形態において、選択カセットは、PGK-gb2-neoカセットである。いくつかの実施形態において、ベクターは、loxPサイトが側面に並んでいる選択カセットを備え、上記方法は、e)生殖細胞系細胞においてCreを発現するトランスジェニックマウスと成体樹立動物を交配させるステップと、交配の結果である後代を取得して、その結果、ゲノムに選択カセットを含まないEKLFノックインマウスを取得するステップと、を更に有する。いくつかの実施形態において、ベクターは、位置74においてアルギニンでリジンが置換(K74R)されたEKLFをエンコードしているポリヌクレオチドを備える。
【００９７】
一旦樹立動物が生産されると、それらを、ホモ接合体動物を含む特定の動物の群体を生産するために繁殖、同系交配、異系交配又は交雑することができる。かかる繁殖戦略の例として、限定するものではないが、別々の株を確立するために複数の組み込みサイトを有する樹立動物の異型交配、各導入遺伝子の追加の発現の効果のために、ハイレベルで導入遺伝子を発現するトランスジェニクス(例えばノックイン動物)を生産するための、別々の株の同系交配、そして、DNA分析による動物のスクリーニングの必要性を排除するために所定の組み込みサイトとホモ接合であるマウスを生産するヘテロ型接合体トランスジェニックマウスの交配、複合ホモ接合体又はヘテロ接合体株を生産するために別々のヘテロ接合体株の交配、導入遺伝子の発現に対するアレルの改変の効果及び発現の効果を試験するように、種々の同系交配の遺伝的背景に対する動物の繁殖が挙げられる。
【００９８】
具体例は、一方又は両方のEKLF座において改変型EKLFポリペプチドをエンコードしているDNAを含む遺伝子改変動物の(例えば、それ由来の又はそれから得られた)細胞に関する。いくつかの実施形態において、細胞は、1つのEKLF座において改変型EKLFポリペプチドをエンコードしているDNAを含む。ある種の実施形態では、細胞は、両方のEKLF座において改良型EKLFポリペプチドをエンコードしているDNAを含む。いくつかの実施形態において、細胞は、遺伝子改変動物から単離される。特定の実施形態において、細胞は、改良型EKLFポリペプチドを発現する。ある種の実施形態では、細胞は、改良型EKLFポリペプチドを発現しない。ある種の実施形態では、細胞は、外胚葉系列を有する。いくつかの実施形態において、細胞は、毛胞、ケラチン細胞、性腺刺激ホルモン分泌細胞、副腎皮質刺激ホルモン分泌細胞、甲状腺刺激ホルモン産生細胞、成長ホルモン産生細胞、乳腺刺激ホルモン分泌細胞、神経細胞、グリア細胞、シュワン細胞、サテライト・グリア細胞、クロム親和性細胞、傍濾胞細胞、グロムス細胞、メラニン細胞、母斑細胞、メルケル細胞、象牙芽細胞、セメント芽細胞、角膜実質細胞、乏突起膠細胞、星状膠細胞、脳室上衣細胞及び松果体細胞から選択される。ある種の実施形態では、細胞は、内胚葉系列を有する。ある実施形態において、細胞は、I型肺胞上皮細胞、II型肺胞上皮細胞、クラブ細胞、杯細胞、胃主細胞、壁細胞、小窩細胞、腸内分泌細胞、G細胞、デルタ細胞、クロム親和性様細胞、腸内分泌細胞、胃抑制ポリペプチドS細胞、デルタ細胞、コレシストキニン、杯細胞、パネート細胞、腸細胞、小襞細胞、肝細胞、肝星細胞、クッパー細胞、胆嚢細胞、房心細胞、膵星細胞、アルファ細胞、ベータ細胞、デルタ細胞、F細胞、PP細胞、イプシロン細胞、濾胞細胞、上皮小体主細胞、好酸性細胞及び尿路上皮細胞から選択される。いくつかの実施形態において、細胞は、中胚葉系列を有する。いくつかの実施形態において、細胞は、骨芽細胞、骨細胞、軟骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪芽細胞、含脂肪細胞、筋芽細胞、筋細胞、筋衛星細胞、腱細胞、心筋細胞、繊維芽細胞、繊維芽細胞、カハール介在細胞、血管芽細胞、内皮細胞、糸球体間質細胞、糸球体内糸球体間質細胞、糸球体外糸球体間質細胞、傍糸球体細胞、緻密斑細胞、間質細胞、間細胞、テロサイト、単純上皮細胞、被蓋細胞、腎臓近位尿細管刷子縁細胞、セルトリ細胞、ライディッヒ細胞、顆粒膜細胞、peg細胞、生殖細胞、精子、卵子、リンパ、リンパ芽球、リンパ球、骨髄、内皮前駆細胞、内皮コロニー形成細胞、内皮幹細胞、血管芽細胞、中胚葉性血管芽細胞、周細胞及び壁細胞から選択される。いくつかの実施形態において、細胞は、幹細胞である。ある種の実施形態では、細胞は、全能性幹細胞、多能性幹細胞、多分化能幹細胞、少能性幹細胞又は分化単能幹細胞である。
【００９９】
【０１００】
特定の実施形態は、改変型EKLFポリペプチドをエンコードする改変型EKLF座を含む遺伝子改変動物の(例えば、それ由来又はそれから得られた)組織に関する。いくつかの実施形態において、組織は、遺伝子改変動物から単離される。特定の実施形態において、組織は、改変型EKLFポリペプチドをエンコードする改変型EKLF座を含み、組織は、改変型EKLFポリペプチドを発現する。ある種の実施形態では、組織は、改変型EKLFポリペプチドをエンコードする改変型EKLF座を含み、組織は、改良型EKLFポリペプチドを発現しない。いくつかの実施形態において、組織は、結合組織、神経組織、上皮組織又は筋肉組織である。
【０１０１】
ある種の実施形態は、改変型EKLFポリペプチドをエンコードする改変型EKLF座を含む遺伝子改変動物の(例えば、それ由来又はそれから得られた)臓器に関する。いくつかの実施形態において、臓器は、遺伝子改変動物から単離される。特定の実施形態において、臓器は、改変型EKLFポリペプチドをエンコードする改変型EKLF座を含み、臓器は、改変型EKLFポリペプチドを発現する。ある種の実施形態では、臓器は、改変型EKLFポリペプチドをエンコードする改変型EKLF座を含み、臓器は、改変型EKLFポリペプチドを発現しない。いくつかの実施形態において、臓器は、外皮系、骨格系、筋肉系、リンパ系、呼吸器系、消化器系、神経系、内分泌系、心血管系、尿路系又は生殖器系の臓器である。いくつかの実施形態において、臓器は、皮膚、毛髪、爪、骨、関節、骨格筋、赤色骨髄、胸腺、リンパ管、胸管、脾臓、リンパ節、鼻腔、咽頭、喉頭、気管、気管支、肺、口腔、食道、肝臓、胃、小腸、大腸、直腸、肛門、脳、脊髄、神経、松果腺、脳下垂体、甲状腺、胸腺、副腎、膵臓、卵巣、精巣、心臓、血管、腎臓、尿管、膀胱、尿道、前立腺、陰茎、精巣、陰嚢、精管、乳腺、卵巣、子宮、膣又は輸卵管である。
【０１０２】
細胞、組織又は臓器は、「単離」によって、動物から取り除かれていることを意味する。いくつかの実施形態において、細胞、組織又は臓器は、生きている(例えば、培養に適している)。いくつかの実施形態において、細胞、組織又は臓器は、生きているとは考えられず(例えば、固定されており)、分析に適している。
【０１０３】
ある種の実施形態は、改変型EKLFポリペプチドを発現する遺伝子改変動物を発生させるのに用いる構築物(例えば、ノックイン標的ベクター)に関する。特定の実施形態において、構築物は、改変型EKLF遺伝子の転写領域の少なくとも一部をエンコードしている改変型配列を含む核酸(例えばDNA又はcDNA)を含む。いくつかの実施形態において、構築物は、1又は複数の改良型EKLFエクソンを含む塩基配列を含む。特定の実施形態において、構築物は、選択マーカー(例えばネオマイシン/カナマイシン耐性遺伝子をエンコードしているPGK-gb2-neoテンプレート)を含む。いくつかの実施形態において、構築物は、loxPが側面に並んでいる選択マーカーを含む。特定の実施形態は、2つのLoxPサイトが側面にならんでいる、改変型マウスEKLFエクソン2(又は、その部分)及び選択可能なマーカー(例えば、aPGK-gb2-neo選択カセット)を含む標的ベクターを含むノックインマウスを誕生させるのに用いるための構築物に関する。一実施形態として、ノックイン標的構築物は、(i) 第一EKLF遺伝子配列の少なくとも一部と、(ii) 改変を含む第二EKLF遺伝子配列の少なくとも一部と、を備える。一実施形態として、ノックイン標的構築物は、(i) 第一EKLF遺伝子配列の少なくとも一部と、(ii) ポリA配列と、(iii) 選択可能マーカー(例えばネオマイシン耐性)遺伝子配列と、(iv) プロモーター(例えば、PGK(ホスホグリセリン酸キナーゼ1))配列と、(v) 改変を含む第二EKLF遺伝子配列の少なくとも一部と、を備える。一実施形態として、ノックイン標的構築物は、(i) 第一EKLF遺伝子配列の少なくとも一部と、(ii) loxPサイトと、(iii) ポリA配列と、(iv) 選択可能マーカー(例えば、ネオマイシン耐性)遺伝子配列と、(v) プロモーター(例えば、PGK(ホスホグリセリン酸キナーゼ1))配列と、(vi) loxPサイトと、(vii) 改変を含む第二EKLF遺伝子配列の少なくとも一部と、を備える。各種実施形態において、第一EKLF遺伝子配列は、EKLFのイントロン1及びエクソン1の少なくとも一部を含み、第二EKLF遺伝子配列は、EKLFのエクソン3と、イントロン2と、エクソン2の少なくとも一部を含み、エクソン2は、内因性EKLFタンパク質に存在しないアミノ酸残基をエンコードする改変型コドンを含む改変(例えば、EKLFタンパク質のSUMO化サイト又はリン酸化サイトの改変)を含む。特定の実施形態において、第一EKLF配列の一部及び第二EKLF配列の一部は、内因性EKLF遺伝子座との相同組換を許容するのに十分な長さ(例えば、長さが少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも50ヌクレオチド又は少なくとも100ヌクレオチド)である。特定の実施形態において、EKLFタンパク質は、マウスEKLFタンパク質であり、ある種の実施形態で、改変型コドンは、アミノ酸位74にて改変をエンコードしている。特定の実施形態において、EKLFタンパク質は、ヒトEKLFタンパク質であり、ある種の実施形態において、改変型コドンは、アミノ酸位54にて改変をエンコードしている。特定の実施形態において、改変型マウスエクソン2は、EKLFポリペプチドのSUMO化又はリン酸化を防止するアミノ酸改変を含むマウスEKLFポリペプチドの領域をエンコードしている。特定の実施形態において、改変型マウスエクソン2は、位置74におけるリジンのアミノ酸置換(例えば、アルギニンでのリジンの置換)を含むマウスEKLFポリペプチドの領域をエンコードしている。特定の実施形態に��いて、改変は、本願明細書に記載されているもののいずれかである。
【０１０４】
ある種の実施形態では、遺伝子改変動物は、改変型EKLFポリペプチドを発現し、改変型EKLFポリペプチドは、上記動物と同じ種の野生型EKLFから改変される。ある種の実施形態では、遺伝子改変動物は、改変型EKLFポリペプチドを発現し、改変型EKLFポリペプチドは、上記動物とは異なる種の野生型EKLFから改変される。いくつかの実施形態において、改変型EKLFポリペプチドは、マウスEKLFポリペプチド(アクセッション: NP_034765.2;配列番号: 1)から改変されている。いくつかの実施形態において、改変型EKLFポリペプチドは、ラットEKLFポリペプチド(アクセッション: NP_001100634.1;配列番号: 2)から改変されている。いくつかの実施形態において、改変型EKLFポリペプチドは、ヒトEKLFポリペプチド(アクセッション: NP_006554.1;配列番号: 3)から改変されている。いくつかの実施形態において、改変型EKLFポリペプチドは、チンパンジーEKLFポリペプチド(アクセッション: XP_524128;配列番号: 4)から改変されている。いくつかの実施形態において、改変型EKLFポリペプチドは、アカゲザルEKLFポリペプチド(アクセッション: NP_001181384 XP_001109612;配列番号: 5)から改変されている。いくつかの実施形態において、改変型EKLFポリペプチドは、イヌEKLFポリペプチド(アクセッション: XP_542040;配列番号: 6)から改変されている。いくつかの実施形態において、改変型EKLFポリペプチドは、ウシEKLFポリペプチド(アクセッション: NP_001073828 XP_001251865;配列番号: 7)から改変されている。特定の実施形態において、本願明細書に記載されているベクターに含まれる改変型EKLF座又は一部は、ヒトEKLF遺伝子配列(アクセッションENSMUSG00000105610;配列番号:9)又はマウスEKLF遺伝子配列(アクセッションENSMUSG00000054191;配列番号:10)又は関連した遺伝子から改変されている。これらの配列の一部は、本発明のベクターに存在していてもよい。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、遺伝子改変非ヒト動物は、野生型EKLFと比較して少なくとも一つのアミノ酸改変を含む改変型EKLFポリペプチドを発現する。特定の実施形態において、トランスジェニック動物は、野生型EKLFポリペプチドと比較して、1又は複数のアミノ酸改変を含むポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態において、改変型EKLFポリペプチドは、野生型EKLFポリペプチドと比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、20超、25超、30超、35超、40超、45超又は50超のアミノ酸改変含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸改変は、置換、追加、欠失又はその組み合わせである。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、遺伝子改変非ヒト動物は、野生型EKLFに対して100%未満の同一性を含む改変型EKLFポリペプチドを発現する。特定の実施形態において、トランスジェニック動物は、内因性野生型EKLFに対して同一性が80%超、同一性が85%超、同一性が90%超、同一性が91%超、同一性が92%超、同一性が93%超、同一性が94%超、同一性が95%超、同一性が96%超、同一性が97%超、同一性が98%超、同一性が99%超であるが同一性が100%未満のポリペプチドを発現する。
【０１０７】
特定の実施形態は、EKLFポリペプチドの機能が種々の補因子ポリペプチドとの相互作用によって、そして、翻訳後修飾によっても厳密に調節されることが予想される。EKLFは、内因性ヒストンアセチルトランスフェラーゼ(HAT)活性を有する転写アクチベーター(例えばp300、CBP及びP/CAF )と関連し、EKLF自体は、2つのサイトにおいてp300及びCBPによってアセチル化されて、その転写が活性化される。EKLF安定性は、そのユビキチン結合状態によって調節される(Quadrini, K. J., and J. J. Bieker. 2006. FEBS Lett. 580: 2285-2293)。スレオニン41のリン酸化は、最適転写活性にとって重要である(Ouyang, L., X. Chen, and J. J. Bieker. 1998. J. Biol. Chem. 273:23019-23025.)。更に、リジン74のSUMO化は、EKLFの転写リプレッサー活性を調節することができ(Siatecka et al. 2007 Mol Cell Biol.: 27(24): 8547-8560)、そして、EKLFの核内移行を調節することができる(Shyu et al. 2014. Developmental Cell 28, 409-422)。
【０１０８】
ある種の実施形態では、トランスジェニック動物は、野生型EKLFポリペプチドと比較して翻訳後修飾が変化している(例えば、欠如した)改変型EKLFポリペプチドを発現する。特定の実施形態において、トランスジェニック動物は、少なくとも一つのアミノ酸改変を含む改変型EKLFポリペプチドを発現し、少なくとも一つのアミノ酸置換は、翻訳後修飾のサイトにおけるEKLFポリペプチドの翻訳後修飾を防止する。いくつかの実施形態において、翻訳後修飾は、タンパク質合成の間又はその後のポリペプチドの改変を指す。翻訳後修飾としては、リン酸化、アセチル化、メチル化、糖修飾、脂質化、ミリストイル化、パルミトイル化、ファルネシル化、ゲラニルゲラニル化、ホルミル化、アミド化、グリコシルホスファチジルイノシトール化、リポイル化、アシル化、ブチリル化、マロニル化、ヒドロキシル化、S-ニトロシル化、スクシニル化、SUMO化、ユビキチン結合及びNEDD化を挙げられるが、これらに限定されるものではない。ある種の実施形態では、トランスジェニック動物は、リン酸化を防止又は阻害するアミノ酸改変を有する改変型EKLFポリペプチドを発現する。特定の実施形態において、トランスジェニック動物は、SUMO化を防止又は阻害するアミノ酸を有する改変型EKLFポリペプチドを発現する。ある種の実施形態では、トランスジェニック動物は、野生型EKLFポリペプチドと比較して、翻訳後修飾が変化している改変型EKLFポリペプチドを発現するEKLFノックインマウスである。
【０１０９】
本明細書で用いられる「リン酸化」とは、ポリペプチドのアミノ酸残基に対するリン酸(PO43-)基の追加を指す。主にセリン、スレオニン又はチロシン残基における可逆的タンパク質リン酸化は、最も重要且つよく研究された翻訳後修飾の1つである。リン酸化は、細胞周期、成長、アポトーシス及びシグナル伝達経路を含む多くの細胞過程の調節において重要な役割を果たす。ある種の実施形態では、トランスジェニック動物は、改変型EKLFポリペプチドのリン酸化を防止するアミノ酸改変を含む改変型EKLFポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態において、改変型EKLFポリペプチドは、改良型アミノ酸残基上のリン酸化を防止するアミノ酸改変を含む。
【０１１０】
「SUMO化」は、従来技術において「スモー化」としても称され、SUMOタンパク質(Small Ubiquitin-related MOdifier)に対するポリペプチドの共有結合である。SUMOタンパク質は、細胞において他のタンパク質に共有結合的に脱着してそれらの機能を改変する小タンパク質のファミリーである。SUMO化は、様々な細胞過程(例えば、核-サイトゾル輸送、転写調節、アポトーシス、タンパク質安定化、ストレスに対する反応及び細胞周期を通じた進行)に関係する翻訳後修飾である。ある種の実施形態では、トランスジェニック動物は、改変型EKLFのSUMO化を防止するアミノ酸改変を含む改変型EKLFポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態において、改変型EKLFポリペプチドは、改変型アミノ酸残基上おけるSUMO化を防止するアミノ酸改変を含む。
【０１１１】
特定の実施形態において、EKLFポリペプチドは、単一サイトにおいてSUMO化による翻訳後修飾を受け、そして、E3リガーゼPIAS1がこのプロセスにおいて重要な役割を果たすことが予想される。ある種の実施形態において、EKLFポリペプチドは、マウスにおいては位置74のリジンで、ヒトにおいては位置54のリジンで、又は、対応するSUMO化サイトでSUMO化されることが予想される。特定の実施形態において、ヒトEKLFポリペプチドは、位置54のリジンでSUMO化されることが予想される。ある種の実施形態では、マウスEKLFポリペプチドの位置74のリジンに対応するSUMO化サイトは、ヒトEKLFポリペプチドの位置54のリジンである。いくつかの実施形態において、マウスEKLFポリペプチドのリジン74の改変、ヒトEKLFポリペプチドのリジン54の改変、又は、他のEKLFポリペプチドにおける対応するSUMO化サイトの改変は、EKLFポリペプチドのSUMO化を防止することが予想される。特定の実施形態において、遺伝子改変動物は、改変型EKLFポリペプチドのSUMO化を防止するリジン74又は対応するSUMO化サイトの改変を含む改変型EKLFポリペプチドを発現する。特定の実施形態において、改変は、置換である。ある種の実施形態では、改変は、マウスEKLFポリペプチドの位置74でのリジンからアルギニンへの置換である。
【０１１２】
特定の実施形態において、PKCθによる、マウスにおける位置68のセリン又は、対応するリン酸化サイトのリン酸化は、EKLFポリペプチドのSUMO化を誘発することが予想される。いくつかの実施形態において、セリン68でのEKLFのリン酸化を防止するアミノ酸改変は、位置74のリジンへのEKLF SUMO化の可能性を防止又は低減することが予想される。ある種の実施形態では、遺伝子改変動物は、セリン68のリン酸化を防止し、改変型EKLFポリペプチドのSUMO化を低減又は防止するアミノ酸改変を含む改変型EKLFポリペプチドを発現する。ある種の実施形態では、遺伝子改変動物は、位置68のリン酸化を防止し、改変型EKLFポリペプチドのSUMO化を低減又は防止する位置68のアミノ酸改変を含む改変型EKLFポリペプチドを発現する。特定の実施形態において、改変は、置換である。ある種の実施形態では、改変は、位置68でのセリンからアラニンへの置換である。
【０１１３】
ある種の実施形態において、ヒトEKLFポリペプチドは、1又は複数のリン酸化サイトを含むことが予想される。特定の実施形態において、ヒトEKLFポリペプチドのリン酸化サイトのリン酸化は、ヒトEKLFポリペプチドのSUMO化を誘発する。いくつかの実施形態において、ヒトEKLFポリペプチドのリン酸化を防止するアミノ酸改変は、位置54のリジンにおけるEKLF SUMO化の可能性を防止又は低減することが予想される。ある種の実施形態では、改変型ヒトEKLFは、リン酸化を防止し、改変型ヒトEKLFポリペプチドのSUMO化を低減又は防止するリン酸化サイトのアミノ酸改変を含む。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、遺伝子改変非ヒト動物は、少なくとも一つのアミノ酸の改変を含む改変型EKLFポリペプチドを発現し、少なくとも一つのアミノ酸の改変は、EKLFポリペプチドのSUMO化を防止又は低減する。いくつかの実施形態において、遺伝子改変非ヒト動物は、少なくとも一つのアミノ酸の改変を含む改変型EKLFポリペプチドを発現し、少なくとも一つのアミノ酸の改変は、EKLFポリペプチドのSUMO化を防止する。いくつかの実施形態において、少なくとも一つのアミノ酸の改変は、野生型EKLFポリペプチドと比較して、SUMO化される改変型EKLFポリペプチドの量を低減する。いくつかの実施形態において、少なくとも一つのアミノ酸の改変は、野生型EKLFポリペプチドと比較して約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%又は約100%(その間の全ての整数及び範囲を含む)、SUMO化される改変型EKLFポリペプチドの量を低減する。いくつかの実施形態において、少なくとも一つのアミノ酸の改変は、改変型EKLFポリペプチドがSUMO化される確率を低減する。いくつかの実施形態において、少なくとも一つのアミノ酸の改変は、改変型EKLFポリペプチドがSUMO化されるという確率を約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%又は約100%(その間の全ての整数及び範囲を含む)低減する。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、遺伝子改変非ヒト動物は、少なくとも一つのアミノ酸の改変を含む改変型EKLFポリペプチドを発現し、少なくとも一つのアミノ酸の改変は、EKLFポリペプチドのリン酸化を防止又は低減する。いくつかの実施形態において、遺伝子改変非ヒト動物は、少なくとも一つのアミノ酸の改変を含む改変型EKLFポリペプチドを発現し、少なくとも一つのアミノ酸の改変は、EKLFポリペプチドのリン酸化を防止する。いくつかの実施形態において、少なくとも一つのアミノ酸の改変は、野生型EKLFポリペプチドと比較してリン酸化される改変型EKLFポリペプチドの量を低減する。いくつかの実施形態において、少なくとも一つのアミノ酸の改変は、野生型EKLFポリペプチドと比較してリン酸化される改変型EKLFポリペプチドの量が約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%又は約100%(その間の全ての整数及び範囲を含む)低減する。いくつかの実施形態において、少なくとも一つのアミノ酸の改変は、改変型EKLFポリペプチドがSUMO化される確率を低減する。いくつかの実施形態において、少なくとも一つのアミノ酸の改変は、改変型EKLFポリペプチドが SUMO化されるという確率を約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%又は約100%(その間の全ての整数及び範囲を含む)低減する。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、遺伝子改変非ヒト動物は、アミノ酸の改変を含む改変型EKLFポリペプチドを発現し、アミノ酸の改変は、セリン68又は対応するリン酸化サイトでの改変型EKLFポリペプチドのリン酸化を防止する。いくつかの実施形態において、遺伝子改変非ヒト動物は、セリン68又は対応するリン酸化サイトの改変を含む改変型EKLFポリペプチドを発現し、改変は、EKLFポリペプチドのSUMO化のリン酸化を防止する。ある種の実施形態では、改変は、位置68又は対応するリン酸化サイトにおけるセリンからアラニンへの置換である。いくつかの実施形態において、セリン68又は対応するリン酸化サイトのリン酸化を防止する改変は、SUMO化される改変型EKLFポリペプチドの量を低減する。いくつかの実施形態において、セリン68又は対応するリン酸化サイトのリン酸化を防止する少なくとも一つのアミノの改変は、野生型EKLFポリペプチドと比較してSUMO化される改変型EKLFポリペプチドの量を約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%又は約100%(その間の全ての整数及び範囲を含む)低減する。いくつかの実施形態において、位置68又は対応する若しくは種々のリン酸化サイトにおけるアミノ酸のリン酸化を防止する改変は、野生型EKLFポリペプチドと比較して改変型EKLFポリペプチドがSUMO化されるという確率を約5%、約6%、約7%、約8%、約9%、約10%、約11%、約12%、約13%、約14%、約15%、約16%、約17%、約18%、約19%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%又は約100%(その間の全ての整数及び範囲を含む)低減する。
【０１１７】
ある種の実施形態において、遺伝子改変動物によって発現した改変型EKLFポリペプチドは、改変型EKLFポリペプチドが発現している細胞タイプ又は組織タイプに応じて、野生型EKLFポリペプチドと比較して特性又は活性(例えば安定性、細胞内局在又は転写活性)を変化せてもよいことが予想される。従って、遺伝子改変動物の所定の細胞タイプ又は組織タイプにおいて、改変型EKLFポリペプチドの特性は、等価な細胞又は組織において、野生型EKLFポリペプチドの特性と類似していてもよいし、異なっていてもよい。従って、いくつかの実施形態において、遺伝子改変動物は、改変型EKLFポリペプチドの特性又は活性が野生型EKLFポリペプチドと異なる細胞タイプ又は組織タイプを含み、そして、改変型EKLFポリペプチドの特性又は活性が野生型EKLFポリペプチドと同様である細胞タイプ又は組織タイプも含む。特定の実施形態において、改変型EKLFポリペプチドの特性又は活性は、EKLFが発現している遺伝子改変動物の全ての細胞タイプ及び組織タイプにおいて、野生型EKLFポリペプチドと異なる。
【０１１８】
ある実施形態において、EKLFポリペプチドの改変は、内因性の野生型EKLFポリペプチドと比較して、改変型EKLFポリペプチドの発現を変化させないことが予想される。ある実施形態では、遺伝子改変動物の所定の細胞又は組織において、改変型EKLFポリペプチドをエンコードしているmRNAのレベルは、コントロール動物(例えば同じ性の同腹の子)の等価な細胞又は組織タイプにおいて、野生型EKLFポリペプチドをエンコードしているmRNAのレベルと類似していることが予想される。特定の実施形態では、遺伝子改変動物の所定の細胞又は組織において、改変型EKLFポリペプチドのレベルは、同じ種の非遺伝子改変動物の等価な細胞又は組織タイプにおいて、野生型EKLFポリペプチドをエンコードしているmRNAのレベルと類似していることが予想される。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、遺伝子改変動物は、改変型EKLFポリペプチドを発現し、改変は、内因性の野生型EKLFポリペプチドと比較して、改変型EKLFの安定性を変化させる。ある実施形態において、EKLFポリペプチドの改変は、改変型EKLFの半減期を、内因性の野生型EKLFポリペプチドと比較して、約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約100%、約110%、約120%、約130%、約140%、約150%、約200%、又は、約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍、約20倍、約30倍、約40倍、約50倍、約60倍、約70倍、約80倍、約90倍、約100倍、若しくは、10倍超 (その間の全ての整数及び範囲を含む)増加させる。いくつかの実施形態において、EKLFポリペプチドの改変は、改変型EKLFの半減期を、野生型EKLFポリペプチドと比較して約5%、約6%、約7%、約8%、約9%、約10%、約11%、約12%、約13%、約14%、約15%、約16%、約17%、約18%、約19%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%又は約100%(その間の全ての整数及び範囲を含む)低減する。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、遺伝子改変動物は、改変型EKLFポリペプチドを発現し、改変は、内因性の野生型EKLFポリペプチドと比較して、改変型EKLFの細胞内局在を変化させる。ある実施形態において、EKLFポリペプチドの改変は、改変型EKLFのサイトゾル局在を、内因性の野生型EKLFポリペプチドと比較して約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約100%、約110%、約120%、約130%、約140%、約150%、約200%、又は、約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍、約20倍、約30倍、約40倍、約50倍、約60倍、約70倍、約80倍、約90倍、約100倍、又は、100倍超(その間の全ての整数及び範囲を含む)増加させる。いくつかの実施形態において、EKLFポリペプチドの改変は、改変型EKLFの核移行を、野生型EKLFポリペプチドと比較して約5%、約6%、約7%、約8%、約9%、約10%、約11%、約12%、約13%、約14%、約15%、約16%、約17%、約18%、約19%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%又は約100%(その間の全ての整数及び範囲を含む)低減する。特定の実施形態において、改変型EKLFポリペプチドの細胞内局在は、赤血球系列の前駆細胞及び前駆体細胞において変化する。いくつかの実施形態では、細胞内局在は、前赤芽球(Pro-E)から好塩基性赤芽球(Baso-E)への移行間、赤血球成熟を経る細胞において変化する。ある種の実施形態では、細胞内局在は、DMSO誘導マウス赤白血病(MEL)細胞分化の間又はその後に変化する。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、遺伝子改変動物は、改変型EKLFポリペプチドを発現し、改変は、内因性の野生型EKLFポリペプチドと比較して、改変型EKLFの転写活性(すなわち1又は複数の標的遺伝子の転写の促進)を高める。いくつかの実施形態において、改変型EKLFポリペプチドは、少なくとも一つの遺伝子の転写を、野生型EKLFによって促進される遺伝子の転写と比較して約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍、約20倍、約30倍、約40倍、約50倍、約60倍、約70倍、約80倍、約90倍、約100倍、又は、約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約100%、約110%、約120%、約130%、約140%、約150%、約200%、又は、100倍超(その間の全ての整数及び範囲を含む)高める。ある実施形態において、改変型EKLFポリペプチドは、野生型EKLFポリペプチドによって転写的に促進されない1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10超の、15超の、20超の、25超の、30超の、40超の、50超の、60超の、70超の、80超の、90超の、100超の、200超の、300超の、400超の、500超の、又は、1,000超の遺伝子の転写の増加を促進する。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、遺伝子改変動物は、改変型EKLFポリペプチドを発現し、改変は、内因性の野生型EKLFポリペプチドと比較して、改変型EKLFの転写抑制活性(すなわち1又は複数の標的遺伝子の転写の抑制)を高める。いくつかの実施形態において、改変型EKLFポリペプチドは、少なくとも一つの遺伝子の転写を、野生型EKLFによって促進される遺伝子の転写と比較して約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約100%、約110%、約120%、約130%、約140%、約150%、約200%、又は、約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍、約20倍、約30倍、約40倍、約50倍、約60倍、約70倍、約80倍、約90倍、約100倍又は100倍超(その間の全ての整数及び範囲を含む)抑制する。ある実施形態において、改変型EKLFポリペプチドは、野生型EKLFポリペプチドによって抑制されない1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10超の、15超の、20超の、25超の、30超の、40超の、50超の、60超の、70超の、80超の、90超の、100超の、200超の、300超の、400超の、500超の、又は、1,000超の遺伝子の転写を抑制する。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、遺伝子改変動物は、改変型EKLFポリペプチドを発現し、改変は、内因性の野生型EKLFポリペプチドと比較して、改変型EKLFの転写活性(すなわち1又は複数の標的遺伝子の転写の促進)を低下させる。いくつかの実施形態において、改変型EKLFポリペプチドは、少なくとも一つの遺伝子の転写を、野生型EKLFによって促進される遺伝子の転写と比較して約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%又は約100%(その間の全ての整数及び範囲を含む)減少させる。ある実施形態において、改変型EKLFポリペプチドは、野生型EKLFポリペプチドによって転写的に促進される1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10超の、15超の、20超の、25超の、30超の、40超の、50超の、60超の、70超の、80超の、90超の、100超の、200超の、300超の、400超の、500超の、又は、1,000超の遺伝子の転写の増加を促進する。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、遺伝子改変動物は、改変型EKLFポリペプチドを発現し、改変は、内因性の野生型EKLFポリペプチドと比較して、改変型EKLFの転写抑制活性(すなわち標的遺伝子又は遺伝子の転写の抑制)を減少させる。いくつかの実施形態において、改変型EKLFポリペプチドは、少なくとも一つの遺伝子の転写の抑制を、野生型EKLFポリペプチドによって抑制される遺伝子の転写と比較して約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%又は約100%(その間の全ての整数及び範囲を含む)低減させる。ある実施形態において、改変型EKLFポリペプチドは、野生型EKLFポリペプチドによって抑制される1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10超の、15超の、20超の、25超の、30超の、40超の、50超の、60超の、70超の、80超の、90超の、100超の、200超の、300超の、400超の、500超の、又は、1,000超の遺伝子の転写を抑制する。
【０１２５】
ある種の実施形態は、野生型EKLFポリペプチドを発現するコントロール動物と比較して生存期間、健康な期間及び/又はがん抵抗性が向上した、改変型EKLFポリペプチドを発現する遺伝子改変動物に関する。特定の実施形態において、既存の動物モデルの寿命及びがん抵抗性と異なる機構を通じて、生存期間、健康な期間及び/又はがん抵抗性が改変型EKLFポリペプチドによって向上したモデルが予想される。このモデルは、改変型EKLFを発現している動物において観察される表現型が先に述べた寿命モデル(例えば、カロリー制限された動物、メトホルミン投与された動物、IGF1受容体ノックアウト動物、トランスジェニックPTEN動物、ヘテロ接合体Mycノックアウト動物、ラパマイシンを投与された動物、S6K1ノックアウト動物、Fat10ノックアウト動物、Sirt1変異動物及びトランスジェニックCisd2動物)において観察される表現型と異なるという観察に基づく。特定の実施形態において、改変型EKLFポリペプチドの発現は、一又は複数の代謝、受胎能、オートファジー恒常性、ゲノム安定性又はミトコンドリア機能を変化させることなく生存期間及び健康な期間を延ばすことが予想される。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、改変型EKLFポリペプチドを発現する遺伝子改変動物は、野生型EKLFポリペプチドを発現するコントロール動物と比較して生存期間を延ばす。特定の実施形態において、生存期間の延長は、コントロール動物と比較しての平均生存期間の延長として表される。ある種の実施形態では、生存期間の延長は、コントロール動物と比較して、動物が達することができる最大年齢の延長として表される。いくつかの実施形態において、生存期間の延長は、最大の生存期間(すなわち、集団のうち最も長く生きられた10%の平均生存期間)の延長として表される。特定の実施形態において、改変型EKLFポリペプチドを発現する遺伝子改変動物は、生存期間を、野生型EKLFを発現するコントロール動物と比較して約5%、約6%、約7%、約8%、約9%、約10%、約11%、約12%、約13%、約14%、約15%、約16%、約17%、約18%、約19%、約20%、約21%、約22%、約23%、約24%、約25%、約26%、約27%、約28%、約29%、約30%、約35%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%又は約100%(その間の全ての整数及び範囲を含む)延びている。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、改変型EKLFポリペプチドを発現する遺伝子改変動物は、野生型EKLFポリペプチドを発現するコントロール動物と比較して健康な期間が延びている。健康な期間は、生物が適切な健康(例えば年齢関連性疾患を患っていない)にある期間を指す。特定の実施形態において、改変型EKLFポリペプチドを発現する遺伝子改変動物は、健康な期間が、野生型EKLFを発現するコントロール動物と比較して約5%、約6%、約7%、約8%、約9%、約10%、約11%、約12%、約13%、約14%、約15%、約16%、約17%、約18%、約19%、約20%、約21%、約22%、約23%、約24%、約25%、約26%、約27%、約28%、約29%、約30%、約35%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約100%(その間の全ての整数及び範囲を含む)、又は、100%超で延びている。健康な期間の延長は、健康の延長と関連した1又は複数の物理的属性(本願明細書に記載されているもののいずれかを含むが、これに限定されるものではない)に関して測定することができる。
【０１２８】
ある種の実施形態では、改変型EKLFポリペプチドを発現する遺伝子改変動物は、老化関連症状の発病遅延及び/又は低速な進行を有する。特定の実施形態において、老化遺伝子改変動物は、少なくとも一つの老化関連症状(例えば白髪、筋脱力、協調運動、骨粗鬆症、バランス低下、がん発生率、化学的ストレスに対する感受性、感染に対する感受性又は炎症に対する感受性)の重症度が、年齢が一致したコントロールよりも低い。特定の実施形態において、改変型EKLFポリペプチドを発現している遺伝子改変動物は、年齢が一致したコントロール動物と比較して、老化関連症状の発病遅延を経験する。ある種の実施形態では、改変型EKLFポリペプチドを発現している遺伝子改変動物は、年齢が一致したコントロール動物と比較して、老化関連症状の低速な進行を感じる。
【０１２９】
ある種の実施形態では、改変型EKLFポリペプチドを発現する遺伝子改変動物は、(例えば、筋力及び協調運動における)年齢関連変化の発病遅延及び/又は低速な進行を有する。特定の実施形態において、正常な老化は、進行性の脱力感及び協調運動の欠落を伴うことが予想される。ある種の実施形態では、改変型EKLFポリペプチドを発現する遺伝子改変若年動物は、野生型EKLFポリペプチドを発現するコントロール若年動物として類似の筋力及び協調運動を有する;改変型EKLFポリペプチドを発現する遺伝子改変老齢動物は、野生型EKLFポリペプチドを発現するコントロール若年動物と比較して、筋力及び協調運動が大きい。特定の実施形態において、改変型EKLFを発現する遺伝子改変動物は、それらの生存期間の進行を通じて、それらの筋力及び協調運動の約50%、約51%、約52%、約53%、約54%、約55%、約56%、約57%、約58%、約59%、約60%、約61%、約62%、約63%、約64%、約65%、約66%、約67%、約68%、約69%、約70%、約71%、約72%、約73%、約74%、約75%、約76%、約77%、約78%、約79%、約80%、約80%超、約85%超、約90%超、約95%超、約99%超を維持する。当業者は、筋力及び協調運動を測定及び評価することに適している方法(ローターロッド試験及び握力試験を含むが、これらに限定されるものではない)を認識している。
【０１３０】
ある種の実施形態では、改変型EKLFを発現する遺伝子改変老齢動物は、年齢が一致したコントロール動物と比較して、筋力が約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約100%、約110%、約120%、約130%、約140%、約150%、約200%、又は、約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍(その間の全ての範囲及び整数を含む)、又は、10倍超増加している。特定の実施形態において、改変型EKLFを発現する遺伝子改変老齢動物は、協調運動が、年齢が一致したコントロール動物と比較して約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約100%、約110%、約120%、約130%、約140%、約150%、約200%又は約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍(その間の全ての範囲及び整数を含む)又は10倍超増加している。
【０１３１】
特定の実施形態において、骨粗鬆症は、正常老化の症状として発症する可能性があり、そして、正常老化は、骨容量及び骨梁数の減少及び骨梁間隔の増加が付随する可能性があることが予想される。ある種の実施形態では、改変型EKLFを発現する遺伝子改変動物は、それらの生存期間の進行中に骨粗鬆症を発症しない。いくつかの実施形態において、改変型EKLFを発現する遺伝子改変動物は、それらの生存期間の進行を通じて、骨容量及び/又は骨梁数の減少を経験しない。いくつかの実施形態において、改変型EKLFを発現する遺伝子改変動物は、それらの生存期間の進行を通じて、骨梁間隔の増加を経験しない。ある種の実施形態では、改変型EKLFを発現する遺伝子改変動物は、野生型EKLFを発現する年齢が一致したコントロール動物と比較して、それらの生存期間の進行中に骨粗鬆症が進行する速度が遅い。いくつかの実施形態において、改変型EKLFを発現する遺伝子改変動物は、年齢が一致したコントロール動物と比較して、それらの生存期間の進行を通じて、骨容量及び/又は骨梁数の減少の進行が遅い。いくつかの実施形態において、改変型EKLFを発現する遺伝子改変動物は、それらの生存期間の進行の全体にわたって、骨梁間隔の増加のより遅い進行を有する。
【０１３２】
ある種の実施形態では、改変型EKLFを発現する遺伝子改変老齢動物は、骨容量を、年齢が一致したコントロール動物に比較して約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約100%、約110%、約120%、約130%、約140%、約150%、約200%、又は、約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍(その間の全ての範囲及び整数を含む)、又は、10倍超で増加している。ある種の実施形態では、改変型EKLFを発現する遺伝子改変老齢動物は、骨梁数が、年齢が一致したコントロール動物に比較して約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約100%、約110%、約120%、約130%、約140%、約150%、約200%、又は、約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍(その間の全ての範囲及び整数を含む)、又は、10倍超で増加している。ある種の実施形態では、改変型EKLFを発現する老いた遺伝子改変動物は、骨梁間隔が、年齢がマッチしたコントロール動物と比較して約5%、約6%、約7%、約8%、約9%、約10%、約11%、約12%、約13%、約14%、約15%、約16%、約17%、約18%、約19%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%又は約100%(間に全ての整数及び範囲を含む)減少している。
【０１３３】
特定の実施形態において、改変型EKLFポリペプチドを発現する遺伝子改変動物は、それらの生存期間を通じて、野生型EKLFを発現するコントロール動物と比較して細胞増殖障害(すなわちがん)が発症する確率が低いことが予想される。いくつかの実施形態において、改変型EKLFポリペプチドを発現している遺伝子改変動物は、その終生にわたってがんが発症する確率が、コントロール動物と比較して約5%、約6%、約7%、約8%、約9%、約10%、約11%、約12%、約13%、約14%、約15%、約16%、約17%、約18%、約19%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%又は約100%(その間の全ての整数及び範囲を含む)低下している。特定の実施形態において、遺伝子改変動物は、年齢が一致したコントロールと比較して、肝がん、結腸がん、乳がん、前立腺がん、肝細胞癌腫、メラノーマ、肺がん、グリア芽細胞腫、脳腫瘍、造血性悪性腫瘍、網膜芽細胞腫、腎細胞癌腫、頭頸部がん、子宮頸がん、膵臓がん、食道がん又は冠弁細胞癌腫から選択される細胞増殖障害を発症しそうにない。いくつかの実施形態において、改変型EKLFを発現する遺伝子改変動物は、その生存期間にわたって、コントロール動物よりもメラノーマが出現する確率が低い。
【０１３４】
ある種の実施形態において、遺伝子改変動物による改変型EKLFポリペプチドの発現は、腫瘍又はがんの成長を抑制する、又は、腫瘍、がん細胞又は前癌細胞の転移能力を抑制することが予想される。ある実施形態において、遺伝子改変動物による改変型EKLFポリペプチドの発現は、腫瘍、がん細胞又は前癌細胞の転移能力を抑制するが、腫瘍成長の速度を変化させないことが予想される。特定の実施形態は、それを予想する改変型EKLFポリペプチドを発現する遺伝子改変動物への前癌又はがん細胞(例えばB16F10メラノーマ細胞)の静脈内注入は、前癌又はがん細胞が静脈内に注入されたコントロール動物と比較してがん転移及び腫瘍形成が著しく低減することが予想される。ある種の実施形態では、がん細胞又は前癌細胞は、コントロール動物のがん細胞又は前癌細胞と比較して、改変型EKLFを発現する遺伝子改変動物に腫瘍を形成する可能性が低下している。特定の実施形態において、がん細胞又は前癌細胞は、コントロール動物のがん細胞又は前癌細胞と比較して、改変型EKLFを発現する遺伝子改変動物の転移の発生率が低減している。いくつかの実施形態において、がん細胞又は前癌細胞は、EKLF座での改変を含まず、改変型EKLFを発現しない。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、前癌又はがん細胞は、改変型EKLFポリペプチドを発現する遺伝子改変動物に存在し、そして、細胞の成長又は転移は、コントロール動物における等価な細胞と比較して約5%、約6%、約7%、約8%、約9%、約10%、約11%、約12%、約13%、約14%、約15%、約16%、約17%、約18%、約19%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%又は約100%(その間の全ての整数及び範囲を含む)低減される。いくつかの実施形態において、前癌又はがん細胞は、遺伝子改変動物に静脈内に注入される。いくつかの実施形態において、細胞は、B16F10メラノーマ細胞である。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、前癌又はがん細胞は改変型EKLFポリペプチドを発現する遺伝子改変動物に存在し、そして、腫瘍細胞の数は、コントロール動物の等価な細胞と比較して約5%、約6%、約7%、約8%、約9%、約10%、約11%、約12%、約13%、約14%、約15%、約16%、約17%、約18%、約19%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%又は約100%(間に全ての整数及び範囲を含む)低減される。いくつかの実施形態において、前癌又はがん細胞は、遺伝子改変動物に静脈内に注入される。いくつかの実施形態において、細胞は、B16F10メラノーマ細胞である。
【０１３７】
特定の実施形態は、改変型EKLFポリペプチドを発現するEKLFノックインマウスに関するものであり、改変型EKLFポリペプチドは、改変型EKLFポリペプチドのSUMO化を防止する少なくとも一つのアミノ酸改変を含み、EKLFノックインマウスは、寿命が延びている、健康な期間が延びている、腫瘍形成及びがん転移に耐性を有する。ある種の実施形態は、改変型EKLFポリペプチドを発現するEKLFノックインマウスに関するものであり、改変型EKLFポリペプチドは、位置74においてリジンからアルギニンへ置換されており、EKLFノックインマウスは、寿命が延びている、健康な期間が延びている、腫瘍形成及びがん転移に耐性を有する。
【０１３８】
寿命を延ばす及び/又は腫瘍形成能若しくは腫瘍転移を低減させる薬剤を同定する方法
本発明は、対象(例えば、哺乳動物(例：ヒト))に対する、寿命を延ばす、生存期間を延長する、腫瘍形成及び/又は腫瘍転移を低減する活性薬剤を同定する方法を含む。本発明のかかる方法は、EKLFの改変が哺乳動物においてこれらの効果を発揮するという予想外の発見に基づく。本願明細書に記載されている「腫瘍形成」という用語は、腫瘍の発生又は発病(すなわち、腫瘍の発生)を指す。本願明細書に記載されている組成物及び方法は、例えば、同じ年齢の無治療対象と比較して、本願明細書に記載又は証明されているもの(例えば、毛髪の灰色化の低減、協調運動の向上、筋力の向上、筋脱力の低減、協調運動の向上、骨粗鬆症の低減、骨容量の増大、骨密度の増大、骨梁数の増大、骨梁間隔の低減、バランス低下の低減) かのいずれかを含む、若さ又は寿命の延長に関連した特異的表現型又は特徴を、長い間、保持又は成し遂げるために用いることもできる。従って、後述する方法は、治療した対象対して、これらの表現型又は特徴のいずれかを与える活性薬剤を同定するために用いることができる。
【０１３９】
ある種の実施形態では、対象の寿命、生存期間又は健康な期間を延ばす及び/又は腫瘍形成又は腫瘍転移を阻害することができる活性薬剤を同定する方法は、EKLFポリペプチド(例えば、ヒトEKLFタンパク質)の1又は複数の翻訳後修飾を変化させる薬剤を同定するステップを含む。特定の実施形態において、翻訳後修飾は、SUMO化又はリン酸化である。SUMO化及びリン酸化を含む可逆的翻訳後修飾は、EKLFを含むある種のタンパク質の核移入に重要な役割を果たす。マウスのEKLFは、コンセンサス負電荷アミノ酸依存的SUMO化モチーフ内に位置しているLys74でSUMO化されることが明らかになっている。ヒトEKLFの対応するSUMO化サイトは、Lys54に位置している。任意の特定の理論に縛られていることを望むものではないが、SUMO化は、EKLFの核転座を低減してもしなくてもよいと考えられる。加えて、SUMO化は、1又は複数のEKLF標的遺伝子上のEKLFの転写活性(例えば、アクチベーター又はリプレッサー活性)を変化させることができると考えられる。
【０１４０】
SUMO(small ubiquitin related modifier)は、哺乳類タンパク質の修飾因子として発見された(Sarge, K. and Parke-Sarge, O-K., Methods in Mol. Biol. 2009; 590: 265-277 (2010))。本願明細書に記載されているタンパク質のSUMO化は、タンパク質の分解を促進せず、その代わりに標的タンパク質の機能的な特性(例えば、細胞内局在、タンパク質のパートナー化)及び転写要因のトランスアクチベーション機能を調節する。SUMOタンパク質は、コンセンサスモチーフΨKXE(Ψは、疎水性アミノ酸であり、Xは、任意の残基である)中に一般的に見つかるタンパク質のリジン残基に共有結合的に付加される。他のタンパク質に対するSUMOの共有結合的付加は、一連のインビボ酵素ステップを伴う。第１に、SUMOタンパク質は、それらのC末端末端付近でタンパク分解処理を受けて成熟タンパク質を形成する(SUMOプロテアーゼ(Ulp's)によって実行されるステップ)。これらのプロテアーゼは、SUMO基を、それらが結合しているイソペプチド結合を切断することによって基体タンパク質から切断する役割を果すため、二重機能的である。成熟化処理されたSUMOタンパク質は、ATP依存的反応において、ヘテロ二量体SUMO E1活性化酵素のSAE2(Uba2)サブユニットにチオエステル結合を介して共有結合的に付加される。SUMOモチーフは、E1からubc9(SUMO E2酵素)に移る。次に、SUMO E2酵素は、標的タンパク質のΨKXEコンセンサス配列に結合し、この配列内のリジンのε-アミノ基とSUMOポリペプチドのC末端グリシンのカルボキシル基との間でイソペプチド結合を形成する。SUMO E3タンパク質は、ubc9(E2酵素)及び基体の両方と相互作用することによってSUMO結合の効率を高め、その結果、架橋因子として作用するとして同定された。脊椎動物の細胞は、3つのSUMOパラログを含む。SUMO-2及びSUMO-3は、配列が互いに非常に類似しており、脊椎動物の3つのSUMOタンパク質の中で最も特徴づけられているSUMO-1とおよそ50%の配列同一性を有する。
【０１４１】
EKLFのプロテインキナーゼCシータ(PKCθ)媒介Ser68リン酸化サイトは、Lys74の近くにあり、そして、そのLys74でのSUMO化に関連するSer68リン酸化は、EKLFの核内移行を容易にし、EKLFのSer68リン酸化は、FOEからEKLFを解離するだけでなく、EKLFのSUMO化にも影響を及ぼす可能性があることから、赤血球成熟中におけるEKLFの核内移行を調節する役割を果たすことが仮説として取り上げられている(Yang et al. (2006) EMBO J. 25, 5083-5093)。任意の特定の理論に縛られることを望むものではないが、Ser68のリン酸化又はLys74のSUMO化を阻害する活性薬剤は、核へのEKLFのトランスロケーションを阻害するか否か不明であるが、標的遺伝子を転写的に活性化又は抑制するその能力に影響を及ぼすと考えられている。加えて、Ser68のリン酸化又はLys74のSUMO化を阻害する活性薬剤は、1又は複数のEKLF標的遺伝子に対するEKLFの転写活性(例えば、アクチベーター又はリプレッサー活性)を変化させることができると考えられる。
【０１４２】
一実施形態として、活性薬剤を同定する方法は、候補薬剤とEKLFポリペプチド(例えば、ヒトEKLFタンパク質)とを接触させるステップと、EKLFポリペプチドに存在する翻訳後修飾の量を測定するステップと、を有し、EKLFポリペプチドに対する翻訳後修飾の測定量が所定の量と著しく異なる(例えば、より少ない)、又は、候補薬剤と接触していないコントロールEKLFポリペプチドに対する量と著しく異なる(例えば、より少ない)場合、候補薬剤は活性薬剤とみなす。特定の実施形態において、上記方法は、候補薬剤と接触していないEKLFポリペプチドに存在する翻訳後修飾の量を測定するステップを更に有する。特定の実施形態において、所定の量は、ゼロである、又は所定の量は、10%未満、20%未満又は50%未満を示す、又はEKLFポリペプチドは、翻訳後修飾を含む。
【０１４３】
各種実施形態において、EKLFポリペプチドは、翻訳後修飾の存在を検出するアッセイ(例えば、インビトロリン酸化又はSUMO化アッセイ)を実行する前に及び/又はその間に候補薬剤と接触する。特定の実施形態において、上記アッセイは、例えば、EKLFポリペプチドに付加される化学基(例えば、リン酸基又はSUMOタンパク質)の存在下において、翻訳後修飾が生じることができる条件下及び充分な時間で、EKLFポリペプチドの翻訳後修飾を行なう酵素とEKLFポリペプチドとを接触させるステップと、次に、翻訳後修飾を含むEKLFポリペプチドの量又はEKLFポリペプチドに存在する翻訳後修飾の量を決定するステップと、を有する。EKLFポリペプチドは、様々な量の候補薬剤と接触させて、例えば、候補薬剤のIC50を測定してもよい。
【０１４４】
翻訳後修飾がSUMO化である特定の実施形態において、ELKLポリペプチドは、インビトロSUMO化アッセイを行なう前に又はその間に候補薬剤と接触される。かかるアッセイは、従来技術において知られており、かかるアッセイを実行するためのキットは、利用可能であり、例えば、ENZOSUMO化キット(Farmingdale、NY、米国)である。特定の実施形態において、EKLFポリペプチドは、SUMO-1、-2、及び/又は-3の存在下において、SUMO化が可能になる条件下及び十分な時間で、候補薬剤と接触させ、次に、SUMO特異的抗体を用いて、例えば、SDS-PAGE又はウェスタンブロッティングを介して、SUMO化EKLFタンパク質が検出される。
【０１４５】
翻訳後修飾がSUMO化である、ある種の実施形態において、EKLFポリペプチドは、放射性ラベル(例えば、35S-Met)の存在下においてインビトロで翻訳され、次に、SUMO E1及びE2酵素及びSUMO-1を含む反応においてインキュベートされる前又は間に、EKLFポリペプチドのSUMO化が可能になる充分な時間及び条件下で候補薬剤と接触させ、続いて、SDS-PAGE及びオートラジオグラフィーによって、EKLFポリペプチドのSUMO化形態が存在するか否かを決定する。
【０１４６】
翻訳後修飾がリン酸化である、ある種の実施形態において、EKLFポリペプチドは、放射性ラベル(例えば、35S-Met)の存在下において、インビトロで翻訳され、PKC及びリン酸基と共にインキュベートされる前又は間に、EKLFポリペプチドのリン酸化を可能にする充分な時間及び条件下で候補薬剤と接触させ、次に、オートラジオグラフィー又はIBによって分析される。あるいは、リン酸化タンパク質は、SDS-PAGEによって単離することができ、マススペクトル分析によって分析することができる。関連した方法は、Shyu, Y-C. et al., (2014) Developmental Cell 28: 409-422に記載されている。
【０１４７】
別の実施形態において、活性薬剤を同定する方法は、候補薬剤とEKLFポリペプチドを含む細胞を接触させるステップと、EKLFポリペプチドに存在する翻訳後修飾の量を測定するステップと、を有し、EKLFポリペプチドに対する翻訳後修飾の測定量が所定の量と著しく異なる(例えば、より少ない)、又は、候補薬剤と接触していないコントロールEKLFポリペプチドに対する量と著しく異なる(例えば、より少ない)場合、候補薬剤は、活性薬剤とみなす。特定の実施形態において、上記方法は、候補薬剤と接触していないEKLFポリペプチドに存在する翻訳後修飾の量を測定するステップを更に有する。
【０１４８】
各種実施形態において、EKLFポリペプチドを含む細胞は、外因的に導入されたEKLFポリペプチド(例えば、ヒトEKLFタンパク質)を含む。ある種の実施形態では、上記細胞は、外因性EKLFタンパク質を発現する発現ベクターを含む。上記発現ベクターは、細胞のゲノムに安定して組み込まれていてもよい、又は、細胞において一時的に存在していてもよい。ある種の実施形態では、EKLFタンパク質は、マイクロインジェクション又は脂質デリバリービヒクルの使用によって細胞に導入される。特定の実施形態において、上記アッセイは、翻訳後修飾を生じさせることができる条件下及び充分な時間で、EKLFポリペプチドの翻訳後修飾を促進又は刺激する薬剤(例えばPMA、EPO、PKCθアクチベーター又はSUMOポリペプチド)とEKLFポリペプチドを含む細胞とを接触させるステップと、次に、翻訳後修飾を含むEKLFポリペプチドの量又はEKLFポリペプチドに存在する翻訳後修飾の量を決定するステップと、を有する。EKLFポリペプチドを含む細胞は、様々な量の候補薬剤と接触させて、例えば、候補薬剤のIC50を測定してもよい。
【０１４９】
翻訳後修飾がSUMO化である特定の実施形態において、ポリペプチド又は細胞は、EKLFポリペプチドのSUMO化が生じるのに充分な時間及び条件下で活性薬剤と接触され、次に、SUMO化アッセイが実行される。かかるアッセイは、従来技術(例えばインビボSUMO化アッセイ)において知られている。例えば、細胞を溶解し、SUMO化されたタンパク質を、EKLFに結合する一次抗体(種が一致した非特異性IgG)と、SUMO-1、SUMO-2又はSUMO-3(Invitrogen)に対する抗体を使用する免疫沈降(IP)分析によって検出してもよい。採用することができる他の方法としては、インビボIPウェスタンブロッティング、IPMS、DNAトランスフェクション、DNAトランスフェクション-IPウェスタンブロッティングを挙げられるが、これらに限定されるものではない。実例となる方法は、Sarge, K. and Parke-Sarge, O-K., Methods in Mol. Biol. 2009; 590: 265-277 (2010))にも記載されている。
【０１５０】
翻訳後修飾がリン酸化である、ある種の実施形態において、ポリペプチド又は細胞は、EKLFポリペプチドのリン酸化が生じるのに充分な時間及び条件下で、活性薬剤と接触され、次に、リン酸化EKLFタンパク質を、従来技術(例えば、インビトロリン酸化反応)で利用可能且つ周知の様々なアッセイのいずれかを使用して検出される。例えば、細胞を溶解し、リン酸化EKLFタンパク質をEKLFのリン酸化(Ser68でのリン酸化)形態に特異的に結合する一次抗体と、検出可能な二次抗体を用いた免疫沈降分析法によって検出してもよい。採用することができる他の例示的な方法として、インビボIPウェスタンブロッティング、IPMS、DNAトランスフェクション、DNAトランスフェクション-IPウェスタンブロッティング及びウェスタンブロッティングが挙げられる。
【０１５１】
EKLFポリペプチドに対する翻訳後修飾の量を測定するステップを含む様々な実施形態において、翻訳後修飾は、SUMO化又はリン酸化である。特定の実施形態において、それは、マウスEKLF Lys74又はヒトEKLF Lys54のSUMO化又はマウスのEKLF Ser68のリン酸化である。特定の実施形態において、それは、P-PKC(S676)によるリン酸化である。ポリペプチドのSUMO化又はリン酸化の存在又は量を決定する方法は、従来技術において公知であり利用可能である。例えば、採用することができる例示的な方法は、Yang et al. (2006) EMBO J. 25, 5083-5093; Shyu et al. (2006) Cell Res. 16, 347-355; Siatecka et al. (2007) Mol Cell Biol. 27(24):8547-60;、及び、Shyu, et al. (2014) Developmental Cell, 28, 409-422に記載されている。
【０１５２】
EKLFポリペプチドに対する翻訳後修飾の量を測定するステップを含むある種の実施形態において、候補薬剤と接触したEKLFポリペプチドに存在する翻訳後修飾の量が、候補薬剤と接触していないEKLFポリペプチドに対する量と比較して90%未満、80%未満、70%未満、60%未満、50%未満、40%未満、30%未満、20%未満、10%未満、又は0%である場合、候補薬剤は、活性薬剤であると決定される。ある種の実施形態では、EKLFポリペプチドに存在する翻訳後修飾の量は、リン酸化又はSUMO化を阻害することが知られている薬剤を使用して決定することができる所定のカットオフ値以下である場合、候補薬剤は、活性薬剤であると決定される。特定の実施形態において、所定のカットオフ値は、ゼロである。
【０１５３】
ある種の実施形態では、対象の寿命、生存期間又は健康な期間を延ばす及び/又は腫瘍形成又は腫瘍転移を阻害することができる活性薬剤を同定する方法は、EKLFポリペプチド(例えば、ヒトEKLFタンパク質)の1又は複数の活性を変化させる薬剤を同定するステップを有する。特定の実施形態において、活性は、核転座、転写活性化又は転写抑制である。データによれば、赤血球系列の前駆細胞及び前駆体細胞において、EKLFは、細胞質に主に位置し、赤血球成熟の間、細胞質から核に転位することが示唆されている(Yang et al. (2006) EMBO J. 25, 5083-5093)。任意の特定の理論に縛られることを望むものではないが、EKLFの核内移行は、成人βグロビン遺伝子転写の有効な活性化に必要であると考えられている。EKLF相互作用因子であるEKLFのFoe(FOE)は、細胞質においてEKLFと相互作用して捕捉することから、赤血球前駆細胞におけるEKLFの機能的な抑制が決まり、赤血球系列のCFU-E/Pro-EからBaso-Eへの転移の間に、一組の赤血球遺伝子のEKLFによって活性化又は抑制を次々と調節する。
【０１５４】
別の実施形態において、活性薬剤を同定する方法は、候補薬剤と、EKLFポリペプチド(例えば、ヒトEKLFタンパク質)を含む細胞を接触させるステップと、EKLFポリペプチドの活性の量を測定するステップと、を有し、EKLFポリペプチドの活性の測定量は、所定の量とは著しく異なる(例えば、より多い又は、より少ない)、又は、候補薬剤と接触していないコントロールEKLFポリペプチドの量と著しく異なる(例えば、より多い又は、より少ない)場合、候補薬剤は、活性薬剤とみなす。特定の実施形態において、上記方法は、候補薬剤と接触していないEKLFポリペプチドの活性の量を測定するステップを更に有する。ある種の実施形態では、上記方法は、例えば、上記活性がトランスアクチベーター活性又はリプレッサー活性である場合、EKLFポリペプチドを含む細胞の代わりにEKLFポリペプチドを使用して実施される。
【０１５５】
ポリペプチドの核移行を測定する方法は、従来技術において公知且つ利用可能である。例えば、採用することができる方法は、Yang et al. (2006) EMBO J. 25, 5083-5093に記載されており、例えば、免疫蛍光法によるEKLFポリペプチドの細胞内(例えば、細胞質又は核)局在の測定である。従って、1つの方法において、EKLFポリペプチドを含む細胞は、核移行に充分な時間及び条件下で、候補薬剤と接触させ、次に、EKLFポリペプチドの細胞内局在が、EKLF特異的抗体を用いた免疫蛍光法によって決定される。特定の実施形態において、上記アッセイは、巨核細胞/赤血球前駆体細胞又は成熟赤血球を使用して実行される。ある種の実施形態では、アッセイは、CFU-E/Pro-EからBaso-Eへの転移の前、その間、又は、その後に、分化ステージの細胞を使用して実行される。特定の実施形態において、細胞は、CFU-E/ProE、Baso-E、PolyCh-E又はOrthoCh-E細胞に区別される。関連した方法は、Shyu, Y-C. et al., (2014) Developmental Cell 28: 409-422に記載されている。
【０１５６】
EKLFポリペプチドの転写活性(例えば、トランスアクチベーション又は抑制)を測定する方法は、従来技術において公知且つ利用可能でもあり、例えば、標的ポリヌクレオチド配列に対するEKLFの結合又はトランスアクチベーター又はリプレッサー活性を測定するアッセイ(例：標的プロモーター又はエンハンサー配列に対するEKLFの結合を測定するバンド-シフトアッセイ、EKLFポリペプチド及びリポーター構築物を使用するインビトロ転写アッセイ及び(例えば、細胞中の)EKLFによって活性化又は抑制される遺伝子のmRNA発現レベルを測定する定量的ポリメラーゼ連鎖反応法(PCR))。が挙げられる。EKLFによって調節される遺伝子の例として、EKLFによって上方制御される遺伝子(例えばアルファグロブリン、ベータグロビン、Epb4.9、Tspo2及びFn3k)及びEKLFによって下方制御される遺伝子(例えばHecw1、Nrip3及びJak3)が挙げられるが、これらに限定されるものではない。EKLFによって調節される更なる遺伝子は、従来技術において公知であり、例えば、Bieker et al. 1995, Mol. Cell. Biol. 15:852-860; Chen and Bieker, 2004, Mol. Cell. Biol. 24:10416-10424; Chen and Bieker, 2001, Mol. Cell. Biol. 21:3118-3125; Miller and Bieker, 1993, Mol. Cell. Biol. 13:2776-2786に記載されているものが挙げられる。特定の実施形態において、Col1a及び/又はMpv171遺伝子のmRNAが測定される。添付の実施例に示すように、両方の遺伝子のmRNAレベルは、寿命が延び腫瘍発生率及び転移が低減したEKLF変異体マウスにおいて低下した。ある種の実施形態では、EKLFポリペプチドを含む細胞は、候補薬剤と接触させ、これらの遺伝子のいずれかの発現レベルは、例えば、それらの発現がそれらの発現レベルと比較して(例えば、コントロール値又は、候補薬剤と接触していない細胞におけるものと比較して)変わるか否かを測定するRT-PCRによって測定される
【０１５７】
特定の実施形態において、EKLFポリペプチドは、ポリヌクレオチドへのEKLFの結合を可能にする充分な時間及び条件下で、EKLF結合部位(例えば、プロモーター又はエンハンサー要素)を含む標識ポリヌクレオチドと共にインキュベーション前又は間に候補薬剤と接触させる。ポリヌクレオチドに結合したEKLFの量は、バンド-シフトアッセイを使用して測定される。
【０１５８】
特定の実施形態において、EKLFポリペプチド(例えば、ヒトEKLFタンパク質)は、レポーター遺伝子の転写が可能になる充分な時間及び条件下で、EKLFが結合するプロモーター又はエンハンサー要素に実施可能な状態で連結したリポーター遺伝子を使用するインビトロ転写アッセイの前又は間に候補薬剤と接触させる。転写されたリポーターmRNA又はタンパク質の量は、定量的PCRを用いて、又は、リポータータンパク質の検出によって(例えば、蛍光(例：蛍光レポーター)又はリポータータンパク質に結合する抗体によって)測定してもよい。
【０１５９】
ある種の実施形態では、EKLFポリペプチド(例えば、ヒトEKLFタンパク質)を含む細胞は、EKLFが任意の標的遺伝子を活性化又は抑制するには充分な時間で、候補薬剤と接触し、次に、発現した標的遺伝子の量は、例えば、定量的PCR又は標的遺伝子特異的抗体を用いた免疫学的測定法によって標的遺伝子mRNA又はエンコードされたタンパク質レベルを測定することによって測定される。
【０１６０】
EKLFの核転座を測定するステップを含むある種の実施形態において、細胞質に存在する候補薬剤と接触したEKLFポリペプチドの量が、細胞質において候補薬剤と接触していないEKLFポリペプチドの量と比較して90%未満、80%未満、70%未満、60%未満、50%未満、40%未満、30%未満、20%未満、10%未満、又は、0%である場合、候補薬剤は、活性薬剤であると決定される。ある種の実施形態において、細胞質に存在するEKLFポリペプチドの量が、巨核細胞/赤血球前駆体細胞、成熟赤血球、CFU-E/Pro-EからBaso-Eへの転移の前、その間又はその後の分化ステージにある細胞又はソートされたCFU-E/ProE、Baso-E、PolyCh-E又はOrthoCh-E細胞の細胞質において観察される量に基づいて決定してもよい所定のカットオフ値以下である場合、候補薬剤は、活性薬剤であると決定される。特定の実施形態において、所定のカットオフ値は、80%、50%又は10%である。EKLFの核転座を測定するステップを含むある種の実施形態において、核に存在する候補薬剤と接触したEKLFポリペプチドの量が、核において候補薬剤と接触していないEKLFポリペプチドの量と比較して90%超、80%超、 70%超、60%超、50%超、40%超、30%超、20%超又は10%超である場合、候補薬剤は、活性薬剤であると決定される。ある種の実施形態において、核に存在するEKLFポリペプチドの量は、Baso-Eにおける核で観察された量に基づいて決定することができる所定のカットオフ値以下である場合、候補薬剤は、活性薬剤であると決定される。特定の実施形態において、所定のカットオフ値は、80%、50%又は10%である。
【０１６１】
EKLFのトランスアクチベーター活性を測定するステップを含むある種の実施形態において、検討されている候補薬剤と接触したEKLFポリペプチドの存在下において発現した標的遺伝子の量が、候補薬剤と接触していないEKLFポリペプチドの存在下において発現した標的遺伝子の量と比較して90%未満、80%未満、70%未満、60%未満、50%未満、40%未満、30%未満、20%未満、10%未満又は0%の場合、候補薬剤は、活性薬剤であると決定される。EKLFのリプレッサー活性を測定するステップを含むある種の実施形態において、検討されている候補薬剤と接触したEKLFポリペプチドがある場合には、発現される標的遺伝子の量が、候補薬剤と接触していないEKLFポリペプチドの存在下において発現した標的遺伝子の量と比較して少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも100%、少なくとも200%、少なくとも500%又は少なくとも1000%増加した場合、候補薬剤は、活性薬剤であると決定される。
【０１６２】
他の実施態様において、対象の生存期間又は健康な期間を延ばす及び/又は腫瘍形成又は腫瘍転移を阻害することができる活性薬剤を同定する方法は、本願明細書に記載されてトランスジェニック動物(例えば、ノックイン動物)に候補薬剤を投与するステップと、候補薬剤の投与後のトランスジェニック(例えば、ノックイン)動物の生存期間を、候補薬剤を投与されなかったコントロール動物の生存期間と比較するステップと、を有し、候補薬剤が投与されたトランスジェニック動物の生存期間が、コントロール動物の生存期間を超える場合、候補薬剤は、対象の生存期間又は健康な期間を延ばす及び/又は腫瘍形成又は腫瘍転移を阻害することができる活性薬剤である。特定の実施形態において、活性薬剤で治療される動物の生存期間は、活性薬剤で治療されていない動物の生存期間と比較して少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも100%延びている。特定の実施形態において、トランスジェニック動物は、非ヒト哺乳動物ノックインであり、両EKLFアレルは、Lys74でのSUMO化又はSer68でのリン酸化を低減するように改変されている。特定の実施形態において、両EKLFアレルは、Lys74又はSer68の位置でのアミノ酸置換(substation)を含む。特定の実施形態において、アミノ酸置換は、K74Rである。
【０１６３】
候補薬剤は、寿命活性の延長又は腫瘍形成の低減を検討するために、薬剤デリバリーに所望及び/又は適切な任意の方法で動物に投与することができる。例えば、候補薬剤は、注入によって(例えば、皮下、筋肉内、静脈内注入によって)、投入によって、経口的に又は任意の他の適当手段によって投与することができる。
【０１６４】
動物への候補薬剤の投与は、候補薬剤の量を変化させて投与することを伴っていてもよく、種々の剤型及びルートでの薬剤デリバリーを含んでいてもよい。通常の老化過程を停止又は減速させる候補薬剤の能力は、動物(例えば、トランスジェニック動物)に候補薬剤を投与して、トランスジェニック動物の生存期間に対するその効果を判断することによって評価されることができる。老化を防止する候補薬剤の能力は、生存期間の向上となるEKLF K74R変異の誘導なしに候補薬剤を野生型動物に投与することによって評価することができる。
【０１６５】
別の実施形態において、本発明は、寿命、生存期間又は健康な期間を延ばす又は腫瘍形成又は腫瘍転移を低減する候補標的を同定する方法を提供するものであり、上記方法は、EKLFポリペプチドによって調節される1又は複数の遺伝子に関する、野生型動物(又は、野生型細胞)における発現レベルを測定するステップと、EKLFポリペプチドによって調節される1又は複数である遺伝子に関する、本願明細書に記載されている改変型EKLFポリペプチドを発現する動物(又は、細胞)における発現レベルを測定するステップと、を有し、2匹の動物(又は、細胞)間での発現レベルの有意な相違を示す遺伝子は、候補治療標的として同定される。ある種の実施形態では、遺伝子は、EKLFによって調節されるとして本願明細書に記載されている1又は複数の様々な遺伝子を含む。特定の実施形態において、測定された発現レベルは、1又は複数の遺伝子から転写されたmRNAの量又は1又は複数の遺伝子によってエンコードされたポリペプチドの量である。サンプルのmRNAの量を決定する方法は、従来技術において公知且つ利用可能であり、例えば、定量的ポリメラーゼ連鎖反応法(qPCR)が挙げられる。サンプルのポリペプチドの量を決定する方法は、従来技術において公知且つ利用可能であり、例えば、エンコードされたポリペプチドに特異的に結合する抗体を一般的に使用するELISA、免疫沈降又はFACSが挙げられる。特定の実施形態において、1又は複数の遺伝子の発現レベルは、動物の1又は複数の特定の細胞タイプ(例えば、骨髄細胞、赤血球、血液細胞、赤血球及び/又は巨核始原細胞又は多能性始原細胞)において決定される。かかる細胞は、従来技術において知られている手法(例えば、FACSを使用しているこれらの細胞型に本特異的細胞表面マーカーに結合する抗体を含む)を使用して動物から単離してもよい。特定の実施形態において、トランスジェニック動物は、非ヒト哺乳動物ノックインであり、両EKLFアレルは、Lys74でのSUMO化又はSer68でのリン酸化を低減するように改変されている。特定の実施形態において、両EKLFアレルは、Lys74又はSer68の位置でのアミノ酸置換(substation)を含む。特定の実施形態において、アミノ酸置換は、K74Rである。
【０１６６】
EKLFによって調節される遺伝子の例として、限定するものではないが、EKLFによって上方制御される遺伝子(例えばアルファグロブリン、ベータグロビン、Epb4.9、Tspo2、Fn3k)と、EKLFによって下方制御される遺伝子(例えばHecw1、Nrip3及びJak3)と、が挙げられる。ある種の実施形態では、本発明の改変型EKLF動物(又は、細胞)と比較して野生型動物(又は、細胞)より高い発現を有する遺伝子(そして、エンコードされたそれらのタンパク質)は、例えば、発現レベルで又はタンパク質レベルで、それらの発現を低減する又はそれらの活性を阻害する薬剤の標的である。ある種の実施形態では、本発明の改変型EKLF動物(又は、細胞)と比較して野生型動物(又は、細胞)より低い発現を有する遺伝子(そして、エンコードされたそれらのタンパク質)は、それらの発現を増加させる又はそれらの活性を増加させる薬剤の標的である(例えば遺伝子治療ベクター)。
【０１６７】
遺伝子又はエンコードされたそれらのタンパク質の発現の種々の量に基づいて活性薬剤を同定する方法の特定の実施形態において、上記方法は、改変型EKLF動物又は細胞と比較して、野生型動物又は細胞において特異に発現しているとして同定された遺伝子又はエンコードされたタンパク質の発現又は活性を調節すると知られている薬剤を同定するステップを更に有する。かかる薬剤は、例えば、ある種の化合物が特定の遺伝子にどのような影響を及ぼすかの情報、又は、特異に発現されたタンパク質の公知の機能的活性に基づく情報を含む科学的な刊行物又はデータベースの参照を含む様々な手段によって同定してもよい。
【０１６８】
一実施形態において、本発明は、対象の寿命を延ばす及び/又は腫瘍形成又は腫瘍転移を阻害することができる活性薬剤を同定する方法を含み、上記方法は、候補薬剤と、野生型EKLFポリペプチドと比較して1又は複数のアミノ酸改変を含む改変型EKLFポリペプチドをエンコードしている改変型EKLFアレルを発現することができる細胞とを接触させるステップと、改変型EKLFポリペプチドの発現レベルを測定するステップと、を有し、改変型EKLFポリペプチドの発現レベルが、候補薬剤と接触していないコントロール細胞の発現レベルより高い場合、候補薬剤は、対象の寿命を延長する及び/又は腫瘍形成を阻害することができる活性薬剤である。
【０１６９】
ある種の実施形態では、本願明細書に記載されている活性薬剤を同定する方法のいずれかは、1又は複数の更なるステップ(例えば、候補薬剤が哺乳動物に所望の影響を及ぼすことを確認又は検証すること)を更に含む。一実施形態として、上記方法は、同定された活性薬剤を哺乳動物に提供するステップと、哺乳動物が、活性薬剤で治療されていない哺乳動物と比較して寿命が延びていること、生存期間が延びていること又は健康な期間が延びていることに関連した1又は複数の特徴を有するかどうかを決定するステップと、を更に有する。かかる特徴の例として、例えば、同じ年齢の無治療の哺乳動物と比較した、毛髪の灰色化の低減、協調運動の向上、筋力の向上、骨粗鬆症の低減、骨容量の増大、骨密度の増大、骨梁数の増大又は骨梁間隔の低減が挙げられる。加えて、老化と関連した細胞変化を検討してもよく、組織又は臓器構造又は機能の変化を検討してもよい。一実施形態として、上記方法は、同定された活性薬剤を哺乳動物に提供するステップと、哺乳動物が、活性薬剤で治療されていない哺乳動物と比較して腫瘍形成又は腫瘍転移が低減していることに関連した1又は複数の特徴を有するかどうか決定するステップと、を有する。
【０１７０】
スクリーニングアッセイのいずれかに関する特定の実施形態において、EKLFポリペプチドは、リン酸化及び/又はSUMO化され得る野生タイプEKLFポリペプチド又はその断片である。ある種の実施形態では、断片は、EKLFポリペプチドの連続したアミノ酸の少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも70%、少なくとも80%又は少なくとも90%の長さを有する。特定の実施形態において、EKLFポリペプチドは、野生型EKLFポリペプチド又はその断片に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%又は少なくとも98%の同一性を有する。特定の実施形態において、野生型EKLFポリペプチドは、本願明細書に記載されているもののいずれかを含む(しかしながら、これらに限定されない)哺乳類のEKLF(例えばマウス、ヒト、ラット又はラビットEKLFポリペプチド)である。ある種の実施形態では、EKLFポリペプチドは、本願明細書に記載されているSUMO化サイト又はリン酸化サイトにおいて、アミノ酸改変(例えば、置換)を含むEKLFポリペプチドを含む(しかしながら、これらに限定されない)改変型EKLFポリペプチドである。特定の実施形態において、EKLFポリペプチドは、細胞に対して内因性であり、他の実施形態では、EKLFポリペプチドは、細胞に対して外因性である又は細胞に導入されている。特定の実施形態において、細胞は、EKLFポリペプチドを発現することができる外因性核酸を含む。特定の実施形態において、細胞は、本願明細書に記載されているトランスジェニック細胞である、又は本願明細書に記載されているトランスジェニック動物から誘導される。
【０１７１】
例えば、本願明細書で確立された非ヒトトランスジェニック動物のモデルを使用して寿命活性を延ばす又は腫瘍形成活性を低減させることに関してスクリーニングすることができる候補薬剤は、限定するものではないが、低分子、ペプチド、抗体及びポリペプチドを含む、合成、天然又はリコンビナント的に生産された分子を含む。候補薬剤は、合成又は天然化合物のライブラリーを含む多種多様な源から得ることができる。例えば、候補薬剤は、従来技術において知られている組合せライブラリー(生物学的ライブラリー、空間的にアドレス指定可能な平行固相又は溶相ライブラリーを含む)法、逆重畳積分を必要とする合成ライブラリー法、「1-ビーズ1化合物」ライブラリー法、及び親和性クロマトグラフィー選別を用いる合成ライブラリー法の多数のアプローチのいずれかを使用して得られることができる。生物学的ライブラリーアプローチは、ペプチドライブラリーを含む一方で、他のアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマー又は低分子化合物のライブラリーに適用できる。
【０１７２】
ある種の実施形態では、活性薬剤(そして、候補薬剤)は、低分子有機化合物、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、非ペプチド化合物、合成化合物、発酵産物又は細胞抽出物である。ある種の実施形態では、低分子有機化合物は、50ダルトン超及び約20,000ダルトン未満の分子量を有する。特定の実施形態において、タンパク質は、抗体又はその断片(例えばscFv、ナノボディ等)である。特定の実施形態において、活性薬剤は、EKLFに結合してSer68でのそのリン酸化及び/又はLys74でのSUMO化を防止する抗体又はその断片である。ある種の実施形態では、抗体又はその断片は、EKLFのアミノ酸残基68-74の領域を含む又はその領域と重複するEKLFの領域に結合する。
【０１７３】
ある種の実施形態では、ポリヌクレオチドは、一本鎖か二本鎖のDNA又はRNAであり、これには、例えば、安定性を高める又は力価を高める改良型核酸塩基及び/又は改変型ヌクレオシド間連結を含む改変型形態も含まれる。ある種の実施形態では、ポリヌクレオチドは、EKLF遺伝子又はmRNAに結合する及び/又はEKLF遺伝子又はmRNAの発現又は翻訳を阻害する。ある種の実施形態では、ポリヌクレオチドは、RNA干渉薬剤、siRNA、shRNA、多価siRNA又はmiRNAである。遺伝子又はmRNA内の最適標的領域を同定する、EKLF遺伝子又はmRNAに結合するポリヌクレオチドは、利用可能なコンピューターモデリングプログラムに基づいて設計してもよい(例えば、Halo-Bio RNAi Therapeutics、シアトル、WAを参照)。特定の実施形態において、ポリヌクレオチド薬剤は、EKLF DNA又はmRNA配列に対して相同の領域又は相補的な領域(例えば、少なくとも6つのヌクレオチド、少なくとも8つのヌクレオチド、少なくとも12のヌクレオチド、少なくとも16のヌクレオチド、少なくとも24のヌクレオチド又は少なくとも30のヌクレオチドの相同領域又は相補的領域)を含む。特定の実施形態において、候補薬剤は、リン酸化又はSUMO化を低減又は阻害することが知られている化合物である。
【０１７４】
特定の実施形態において、本願明細書に記載されているアッセイを用いて、活性薬剤を同定するために複数の候補薬剤を含むライブラリーをスクリーニングする。特定の実施形態において、ライブラリーは、複数の低分子有機化合物、ペプチド、タンパク質又はポリヌクレオチドを含む。低分子有機化合物の様々なライブラリーは、公知であり且つ商業的に入手可能であり、本発明に用いてもよい。
【０１７５】
寿命、生存期間又は健康な期間を延ばし、腫瘍形成又は腫瘍転移を低減する方法
本発明は、更に対象の寿命、生存期間又は健康な期間を延ばす方法と、腫瘍形成又は腫瘍転移の阻害を必要とする対象の腫瘍形成又は腫瘍転移を阻害する方法を提供する。添付の実施例に示すように、哺乳動物のEKLFポリペプチドのSUMO化サイトの改変は、哺乳動物の寿命を延ばす、生存期間を延ばす及び健康な期間を延ばす結果並びに哺乳動物の腫瘍形成を低減する及び腫瘍転移を低減する結果になるという予想外のことが証明された。加えて、がん性細胞上でのEKLF K74R改変の役割を、メラノーマ発現マウスにおいて試験した。驚くべきことに、EKLF K74Rアレルの発現は、がん性メラノーマ細胞の転移を防止した。従って、本開示の1つの更なる態様は、細胞増殖障害を患っている対象を治療する方法を提供することである。任意の特定の理論に縛られることを望むものではないが、SUMO化サイトの改変は、EKLFポリペプチドのSUMO化を阻害又は破壊し、その活性を、寿命を延ばし健康を向上させ、そして、腫瘍形成及び腫瘍転移を低減する結果となるように変化させると考えられる。
【０１７６】
従って、本発明は、対象の寿命、生存期間又は健康な期間を延ばす又は向上させる方法と、腫瘍形成又は腫瘍転移を阻害する方法を含み、これらには、本発明の改変型EKLFポリペプチドを対象に提供するステップ、及び/又は、内因性又は野生型EKLFポリペプチドの活性を変化させる第一薬剤を対象に提供するステップが含まれる。ある種の実施形態では、対象における内在性の野生型EKLFポリペプチドの活性又は発現を低減させる第二薬剤も対象に提供する。特定の実施形態において、対象は、哺乳動物(例えば、ヒト又は非ヒト哺乳動物)である。第一活性薬剤、第二活性薬剤及び/又は改変型EKLFポリペプチドは、有効量で対象に提供することができる。改変型EKLFポリペプチドは、改変型EKLFポリペプチド又は改変型EKLFポリペプチドをエンコードしているポリヌクレオチドを投与することによって対象に提供される。特定の実施形態において、改変型EKLFポリペプチドは、改変型ヒトEKLFポリペプチドである。特定の実施形態において、それはSUMO化を阻害する変異を含む。ある種の実施形態では、それは、Lys54の改変を含む。これらの方法は、例えば、同じ年齢の無治療対象と比較して、本願明細書に記載又は証明されているもの(例えば、毛髪の灰色化の低減、協調運動の向上、筋力の向上、骨粗鬆症の低減、骨容量の増大、骨密度の増大、骨梁数の増大又は骨梁間隔の低減)かのいずれかを含む、若さ又は寿命の延長に関連した特異的表現型又は特徴を、長い間、保持又は成し遂げるために用いることもできる。
【０１７７】
特定の実施形態において、対象は、哺乳動物(例えば、ヒト)である。ある種の実施形態では、対象は、腫瘍の進行又は腫瘍転移のリスクがある診断されている、又は、腫瘍の出現又は腫瘍転移のリスクがあると思われる。特定の実施形態において、対象は、老化と関連した疾患又は障害を発症するリスクがあると診断されている、又は、老化と関連した疾患又は障害を発症するリスクがあると思われる。ある種の実施形態では、対象は、少なくとも20歳、少なくとも30歳、少なくとも40歳、少なくとも50歳、少なくとも60歳、少なくとも70歳又は少なくとも80歳である。
【０１７８】
一実施形態として、本発明は、細胞増殖障害(例えば、腫瘍形成又は腫瘍転移)の治療又は予防を必要とする対象における細胞増殖障害を治療又は予防する方法であって、上記方法は、有効量のポリペプチド又はポリペプチドをエンコードしている核酸を対象に投与するステップを有し、ポリペプチドは、野生型EKLFポリペプチドと比較して、改変型EKLFポリペプチドのSUMO化及び/又は核転座が低減する1又は複数のアミノ酸改変を含む改変型EKLFポリペプチドである。ある種の実施形態において、改変型EKLFポリペプチドは、改変型ヒトEKLFポリペプチドである。ある種の実施形態では、改変型EKLFポリペプチドは、野生型EKLFポリペプチドと比較して、SUMO化が低減される。ある種の実施形態では、改変型EKLFポリペプチドは、野生型EKLFポリペプチドと比較して、細胞質から核へのトランスロケーションが低減される。ある種の実施形態では、改変型EKLFポリペプチドは、野生型EKLFポリペプチドと比較して、トランスアクチベーター活性又はリプレッサー活性が改変されている。各種実施形態において、1又は複数のアミノ酸改変は、野生型EKLFポリペプチドにおいてSUMO化又はリン酸化されるアミノ酸の位置での改変(例えば、全長マウス野生型EKLFポリペプチドの位置74のアミノ酸の改変(例：ArgでのLysの置換(K74R))、又は全長ヒト野生型EKLFポリペプチドの位置54のアミノ酸の改変(例えば、ArgでのLysの置換(K54R))、又は全長野生型EKLFポリペプチドの位置68のアミノ酸の改変)を含む。1つの方法は、有効量のポリペプチド又はポリペプチドをエンコードしている核酸を対象に投与するステップを含み、ポリペプチドは、改変型ヒトEKLFであり、位置54のリジン残基は、任意にアルギニンに変異している。特定の実施形態において、改変型ヒトEKLFは、位置54でSUMO化されない。
【０１７９】
ポリペプチドは、「ネイキッド」ポリペプチドとして又はデリバリー向上薬剤との併用を含む様々な様式で対象に投与してもよい。特定の実施形態において、ポリペプチドは、細胞内取り込みを高める薬剤を伴う。核酸は、「ネイキッド」DNA若しくはRNAとして又は脂質との複合体として又は脂質粒子にカプセル化することを含む様々な様式で対象に投与してもよい。核酸(すなわち、ポリヌクレオチド)を対象に投与する特定の実施形態において、核酸は、発現ベクターに存在する。ある種の実施形態では、核酸は、ウイルスベクターに存在する。ウイルスベクターは、複製欠損又は複製可能ウイルスベクターであってよい。各種実施形態において、ウイルスベクターは、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、弱毒化されたワクシニアウイルス、カナリア痘ウイルス、アデノウイルス又はアデノ随伴ウイルスから導き出される。核酸は、発現ベクターに存在していてもよく、改変型EKLFポリペプチドをエンコードしている塩基配列は、プロモーター又はエンハンサーとプロモーターの組み合わせに動作可能に連結される。適切な発現ベクターとして、プラスミド及びウイルスベクター(例えばヘルペスウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、弱毒化されたワクシニアウイルス、カナリア痘ウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス)が挙げられる。特定の実施形態において、核酸は、プロモーター配列に、そして任意にエンハンサー要素に実施可能な状態で連結されている。特定の実施形態において、プロモーター及び/又はエンハンサー要素は、核酸及びそのエンコードされたポリペプチドの組織特異発現を与える。特定の実施形態において、プロモーター及び/又はエンハンサー要素は、EKLF遺伝子プロモーター及び/又はエンハンサー要素であり、内因性EKLFとして核酸に同一又は類似の発現パターンを与える。
【０１８０】
上述した核酸又はポリヌクレオチドは、従来技術において知られているポリマー、生分解性マイクロ粒子又はマイクロカプセルデリバリーデバイスを用いてデリバリーすることができる。核酸の取り込みを宿主において成し遂げる他の方法は、標準的な方法によって調製されるリポソームの使用である。ポリヌクレオチドは、単独でこれらのデリバリービヒクルに組み込むことができる、又は、組織特異抗体と併用して組み込むことができる。あるいは、静電力又は共有結合力によってポリ-L-リジンに取り付けられる、プラスミド又は他のベクターで構成される分子複合体を調製してもよい。ポリ-L-リジンは、標的細胞上の受容体に結合することができるリガンドに結合する(Cristiano, et al., 1995, J. Mol. Med. 73:479)。あるいは、組織特異的標的は、従来技術において知られている組織特異転写調節エレメントを用いて成し遂げることができる。筋肉内、皮内又は皮下部位への「ネイキッドDNA」(即ち、デリバリービヒクルがないDNA)のデリバリーは、インビボ発現を成し遂げる別の手段である。
【０１８１】
ポリペプチドは、従来技術において知られている方法を使用して合成することができる、又は、組換技術を使用して調製することができる。例えば、1つは、ポリペプチド(例えば、K74R変異を有する改変型EKLF)をエンコードしている核酸を発現ベクターにクローニングすることができ、 核酸は、宿主細胞においてポリペプチドを発現することに適している調節配列に実施可能な状態で連結されている。そして、ベクターを適切な宿主細胞に導入してポリペプチドを発現することができる。発現した組換えポリペプチドは、硫安沈殿及び分画カラムクロマトグラフィー等の方法によって、宿主細胞から精製することができる。従って、調製されたポリペプチドは、本願明細書に記載されている方法に従ってその活性を試験することができる。
【０１８２】
ポリペプチド又は核酸が対象に投与されるある種の実施形態において、上記方法は、内因性EKLFポリペプチドの発現を阻害する第二活性薬剤を対象に投与するステップを更に有する。特定の実施形態において、第二活性薬剤は、内因性EKLFポリペプチドをエンコードするmRNA又はその相補物に結合する核酸分子(任意に、アンチセンスRNA、siRNA、shRNA又はmiRNA)である。
【０１８３】
一実施形態として、本発明は、細胞増殖障害(例えば、腫瘍形成又は腫瘍転移)を治療又は予防する必要がある対象の細胞増殖障害を治療又は予防する方法であって、上記方法は、内因性EKLFポリペプチドのSUMO化を阻害する及び/又は細胞質から核への内因性EKLFポリペプチドのトランスロケーションを低減する活性薬剤を対象に有効量投与するステップを有する。一実施形態として、活性薬剤は、SUMO化を阻害する。一実施形態として、活性薬剤は、トランスロケーションを低減する。
【０１８４】
一実施形態として、本発明は、細胞増殖障害(例えば、腫瘍形成又は腫瘍転移)を治療又は予防する必要がある対象の細胞増殖障害を治療又は予防する方法であって、上記方法は、内因性EKLFポリペプチドの1又は複数の活性を変化させる活性薬剤を対象に有効量投与するステップを有する。一実施形態として、活性薬剤は、SUMO化を阻害する。一実施形態として、活性薬剤は、トランスロケーションを低減する。ある種の実施形態では、活性薬剤は、トランスアクチベーター活性を改変する、又は内因性EKLFポリペプチドのリプレッサー活性を改変する。
【０１８５】
特定の実施形態において、本発明の方法で使用する活性薬剤は、内因性EKLFポリペプチドに結合する。特定の実施形態において、活性薬剤は、有機小分子又はポリペプチド(任意に抗体又はその機能的断片)である。
【０１８６】
本発明の方法は、様々な細胞増殖障害を治療又は防止するために用いることができ、細胞増殖障害としては、限定するものではないが、腫瘍及び腫瘍転移が挙げられ、限定するものではないが、本願明細書に記載されているもののいずれかを挙げることができる。特定の実施形態において、腫瘍又は腫瘍転移は、肝がん、結腸がん、乳がん、前立腺がん、肝細胞癌腫、メラノーマ、肺がん、グリア芽細胞腫、脳腫瘍、造血器悪性腫瘍(hematopoetic malignancy)、網膜芽細胞腫、腎細胞癌腫、頭頸部がん、子宮頸がん、膵臓がん、食道がん又は扁平上皮癌腫である。
【０１８７】
特定の実施形態において、増殖障害を治療又は予防する方法は、細胞増殖障害を治療するための抗増殖薬剤を対象に有効量投与するステップを更に有する。特定の実施形態において、抗増殖薬剤は、アルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤、アンチメタボライ又は細胞毒性抗生物質である。いくつかの実施形態において、アルキル化剤は、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、メクロレタミン、シクロホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、イホスファミド、ブスルファン、N-ニトロソ-N-メチル尿素(MNU)、カルマスティン、ロムスチン、セムスチン、フォテムスチン、ストレプトゾトシン、ダカルバジン、ミトゾロミド、テモゾロマイド、チオテパ、マイトマイシン(mytomycin)又はジアジクオンである。いくつかの実施形態において、トポイソメラーゼ阻害剤は、カンプトセシン、イリノテカン、トポテカン、エトポシド、ドキソルビシン、テニポシド、ノボビオシン、メルバロン又はアクラルビシンである。いくつかの実施形態において、アンチメタボライは、フルオロピリミジン(fluoropymidine)、デオキシヌクレオシドアナログ、チオプリン、メトトレキサート又はペメトレキセドである。いくつかの実施形態において、細胞毒性抗生物質は、アクチノマイシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ピラルビシン(piraubicin)、アクラルビシン(alcarubicin)又はミトキサントロンである。
【０１８８】
他の実施態様において、本発明は、対象の生存期間又は健康な期間を延長する方法であって、上記方法は、ポリペプチド又はポリペプチドをエンコードしている核酸を対象に有効量投与するステップを有し、ポリペプチドは、野生型EKLFポリペプチドと比較して、改変型EKLFポリペプチドのSUMO化を低減する及び/又は核転座を低減する1又は複数のアミノ酸改変を含む改変型EKLFポリペプチドである。ある種の実施形態では、改変型EKLFポリペプチドは、野生型EKLFポリペプチドと比較して、SUMO化が低減されている。ある種の実施形態では、改変型EKLFポリペプチドは、野生型EKLFポリペプチドと比較して、細胞質から核へのトランスロケーションが低減されている。ある種の実施形態では、改変型EKLFポリペプチドは、野生型EKLFポリペプチドと比較して、改変型トランスアクチベーター活性又は改変型リプレッサー活性を有する。特定の実施形態において、核酸は、発現ベクターに存在している。ある種の実施形態では、核酸は、ウイルスベクターに存在している。各種実施形態において、ウイルスベクターは、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、弱毒化されたワクシニアウイルス、カナリア痘ウイルス、アデノウイルス又はアデノ随伴ウイルスから導き出される。各種実施形態において、1又は複数のアミノ酸改変は、野生型EKLFポリペプチドにおいてSUMO化又はリン酸化されるアミノ酸の位置での改変(例えば、全長マウス野生型EKLFポリペプチドの位置74のアミノ酸の改変(例：ArgでのLysの置換(K74R))、又は全長ヒト野生型EKLFポリペプチドの位置54のアミノ酸の改変を含む。
【０１８９】
ポリペプチド又は核酸が対象に投与されるある種の実施形態において、上記方法は、内因性EKLFポリペプチドの発現を阻害する第二活性薬剤を対象に投与するステップを更に有する。特定の実施形態において、第二活性薬剤は、内因性EKLFポリペプチドをエンコードするmRNA又はその相補物に結合する核酸分子(任意に、アンチセンスRNA、siRNA、shRNA又はmiRNA)である。
【０１９０】
一実施形態として、本発明は、対象の生存期間又は健康な期間を延長する方法であって、上記方法は、内因性EKLFポリペプチドのSUMO化を阻害する及び/又は細胞質から核への内因性EKLFポリペプチドのトランスロケーションを低減する活性薬剤を対象に有効量投与するステップを有する。一実施形態として、活性薬剤は、SUMO化を阻害する。一実施形態として、活性薬剤は、トランスロケーションを低減する。
【０１９１】
一実施形態として、本発明は、対象の生存期間又は健康な期間を延長する方法であって、上記方法は、内因性EKLFポリペプチドの1又は複数の活性を変化させる活性薬剤を対象に有効量投与するステップを有する。一実施形態として、活性薬剤は、SUMO化を阻害する。一実施形態として、活性薬剤は、トランスロケーションを低減する。ある種の実施形態では、活性薬剤は、トランスアクチベーター活性を改変する、又は内因性EKLFポリペプチドのリプレッサー活性を改変する。
【０１９２】
本発明は、改変型EKLFをエンコードしているポリヌクレオチド、改変型EKLFポリペプチド、候補薬剤又は活性薬剤及び1又は複数の医薬的に許容可能な賦形剤、希釈液又はキャリアを含む医薬組成物を更に含む。本発明の方法は、これらのいずれかを含む医薬組成物を使用して実行してもよい。本発明の実施形態は、1又は複数の他の種類の治療法単独又は併用で、細胞、対象又は動物に投与するための医薬的に許容可能又は生理的に許容可能な溶液に調製される、改変型EKLFポリペプチド、改変型EKLFポリペプチドをエンコードしているポリヌクレオチド又は活性薬剤を有する組成物を含む。本発明の組成物は、必要に応じて、他の薬剤(例えば、他のタンパク質又はポリペプチド又は様々な医薬的に活性薬剤)と併用して投与してもよいことも、よく理解されている。追加の薬剤が、成し遂げられることが望まれている調節効果又は他の効果に悪影響を与えないのであれば、組成物に含めることもできる他のコンポーネントに事実上制限はない。
【０１９３】
本発明の医薬組成物において、医薬的に許容可能な賦形剤及びキャリア溶液の剤型は、様々な治療計画において本願明細書に記載されている特定の組成物を使用するための適切な投薬及び治療計画が開発されているように、当業者には周知である（例えば、経口的、非経口的、静脈内、鼻腔内及び筋肉内投与及びそれら用の剤型を含む）。
【０１９４】
ある種の状況において、本願明細書に開示される医薬組成物を、例えば、米国特許第5,543,158号;米国特許第5,641,515号及び米国特許第5,399,363号(それぞれ、詳細に、その全部が本願明細書に引用したものとする)に記載されているように、非経口的に、皮下に、静脈内に、筋肉内に、動脈内に、クモ膜下腔内に、実質内に、大槽内に、脳室内に、尿道内に、胸骨下に(intrasternally)、頭蓋内に、滑液嚢内に、又は、更には腹膜内に送達することが望ましい。非経口投与に適したデバイスは、(マイクロニードルを含む)ニードル注射器、無針注射器及び投入技術を含む。
【０１９５】
遊離塩基としての活性化合物又は薬理的に許容可能な塩の溶液は、界面活性剤(例えばヒドロキシプロピルセルロース)と最適に混合された水において調製してもよい。分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール及びそれらの混合物並びにオイルにおいて調製してもよい。通常の貯蔵及び使用の条件下で、これらの調製物は微生物の成長を防止するための保存剤を含む。
【０１９６】
注入用途に適している医薬形態は、滅菌水溶液又は分散液及び注射可能な無菌溶液又は分散液を即座調製するための無菌粉末を含む(米国特許第5,466,468号は、詳細に、その全部が本願明細書に引用したものとする)。全てのケースにおいて、上記形態は、無菌でなくてはならず、注射器の操作が容易となる程度に流体でなければならない。それは、製造条件及び保管条件下で安定でなければならず、微生物(例えば、細菌及び菌類)の汚染作用に対して保護されなければならない。キャリアは、例えば、水、エチルアルコール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール等)、適切なそれらの混合物及び/又は植物油を含む溶媒又は分散媒とすることができる。適切な流動性は、例えば、コーティング(例えばレシチン)の使用によって、分散液の場合必要な粒子径の維持管理によって、及び、界面活性剤を用いて維持してもよい。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤(例えば、パラベン、クロロブタノール、石炭酸、ソルビン酸及びチメロサール等)によって容易することができる。多くの場合、等張剤(例えば、糖又は塩化ナトリウム)が含まれていることが好ましい。注入可能な組成物の持続吸収は、吸収を遅延させる薬剤(例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン)の組成物の使用によってもたらされることができる。
【０１９７】
水溶性溶液の非経口投与に関して、例えば、溶液は、必要に応じて最適に緩衝作用が働く状態にされなければならず、液体希釈液は、最初に、充分な生理食塩水又はグルコースを用いて等張としなければならない。これらの特定の水溶性溶液は、特に静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内投与に適している。この点について、使用することができる滅菌水性培地は、本開示の観点から当業者に公知である。例えば、1用量は、1mlの等張NaCl溶液に溶解して、1000mlの皮下注入流体に加えてもよく、企図する投入サイトに注入してもよい(例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Edition, pp. 1035-1038 and 1570-1580を参照)。用量のいくつかのバリエーションは、治療される対象の状態に応じて、必然的に生じる。投与責任者は、いずれにしても、個々の対象に適した用量を決定する。そのうえ、ヒト投与のために、調製品は、食品医薬品局の生物製剤基準が要求する無菌性、発熱原性及び一般的な安全性及び純度基準を満たさなければならない。
【０１９８】
注入可能な無菌溶液は、適切な溶媒中に必要な量の活性化合物を、必要に応じて上記列挙した様々な他の成分と共に組み込み、次に、フィルター殺菌することによって調製することができる。一般的に、分散液は、殺菌された様々な活性成分を、基礎分散媒及び上記列挙されたものから必要な他の成分を含む無菌のビヒクルに組み込むことによって調製される。注入可能な無菌溶液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調整法は、事前に無菌フィルター処理した溶液から活性成分プラス任意の更なる所望の成分の粉末を産生する減圧乾燥及び凍結乾燥技術である。
【０１９９】
本願明細書に開示されている組成物は、中性形態又は塩形態に製剤化してもよい。医薬的に許容可能な塩は、無機酸(例えば塩酸又はリン酸)又は有機酸(例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸及びマンデル酸等)と形成された(タンパク質の遊離アミノ基と形成された)酸付加塩を含む。遊離カルボキシル基と形成された塩は、無機塩(例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム又は水酸化第二鉄)及び有機塩(例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン及びプロカイン等)から誘導することもできる。製剤に応じて、溶液は、服用製剤と適合する様式において、そして、治療的に有効な量において投与される。製剤は、注入可能な溶液、薬物放出カプセル等の様々な投与形態で容易に投与される。
【０２００】
本明細書で用いられている「キャリア」は、任意の及び全ての溶媒、分散媒、ビヒクル、被覆材、希釈液、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤、バッファー、キャリア溶液、懸濁液及びコロイド等を含む。医薬活性物質にかかる媒体及び薬剤の使用は、公知技術である。任意の従来型媒体又は薬剤が活性成分と不適合である場合を除いて、治療的組成物におけるその使用は予想される。補助活性成分を組成物に組み込むこともできる。
【０２０１】
「医薬的に許容可能な」というフレーズは、ヒトに投与された場合アレルギー又は類似の厄介な反応が生じない分子種及び組成物を指す。活性成分としてタンパク質を含む水溶性組成物の調製は、従来技術において周知である。一般的に、かかる組成物は、液溶又は懸濁液としての注入可能薬物として調製され、注入前の液体中の溶液又は懸濁液に適した固体形態を調製することもできる。調製を乳状にすることもできる。
【０２０２】
ある種の実施形態では、デリバリーは、リポソーム、ナノカプセル、マイクロ粒子、マイクロスフェア、脂質粒子及び小胞等を用いて行ってもよい。特に、本発明の組成物は、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフェア又はナノ粒子等にカプセル化してのデリバリーのために製剤化してもよい。かかるデリバリービヒクルの製剤化及び使用は、公知及び従来技術を用いて実行することができる。
【０２０３】
ある種の実施形態において、本願明細書に提供される薬剤は、(生体適合性及び生分解性基質(例：ポリマー及びマトリックス)を含む)医薬的に許容可能な固形基質に取り付けてもよい。かかる固形基質の例として、限定するものではないが、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール))、ポリ乳酸(米国特許第3,773,919号)、L-グルタミン酸のコポリマー及びγ-エチル-L-グルタメート、非分解性エチレン-酢酸ビニル、分解可能な乳酸-グリコール酸コポリマー(例えば、ポリ(乳酸-コ-グリコール酸酸)(PLGA)及びLUPRON DEPOTTM(乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドで構成される注入可能なマイクロスフェア)、ポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸、コラーゲン、金属、ヒドロキシアパタイト、生体ガラス、アルミン酸、バイオセラミック材料及び精製タンパク質が挙げられる。
【０２０４】
製剤化方法は、公知技術であり、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 19th Edition (1995)に開示されている。本願明細書で提供される組成物及び薬剤は、任意の治療的に有効投薬計画において、本発明の方法に従って投与することができる。用量及び頻度は、有害な効果のない有効薬剤レベルとなるように選択される。本発明の化合物の有効量は、投与ルート、治療されている温血動物のタイプ及び考慮中の特定の温血動物の物理的特徴に依存する。この量を決定するこれらの要因及びそれらの関係は、医療技術に熟知した実践者にとって周知である。この量及び投与の方法は、最適な効能を成し遂げるように変えることができるが、医療技術に熟知した人々が認識する要因(例えば、重量、食事、併用医薬品及び他の要因)に依存する。
【０２０５】
本発明の実施形態は、他の態様において、本願明細書に記載されているように、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、活性薬剤等を含む1又は複数の医薬組成物で満たされた1又は複数の容器を備えるキットを提供する。キットは、(例えば、寿命、生存期間又は健康な期間を延ばす、又は腫瘍形成又は腫瘍転移を阻害又は低減する)かかる組成物の使用方法に関する説明書を備えることができる。
【０２０６】
本願明細書に記載のキットは、1又は複数の追加の治療薬剤又は治療される症状又は所望の診断用アプリケーションに適切又は所望の他のコンポーネントを含むこともできる。必要に応じて、追加の治療薬剤を第二容器に含めてもよい。追加の治療薬剤の例としては、例えば抗腫瘍剤が挙げられる。
【０２０７】
本願明細書に記載のキットは、1又は複数の注射器又は意図するデリバリーモードを容易にするために必要な又は所望の他のコンポーネント(例えば、ステント、植込み型デポー等)を備えることもできる。
【実施例】
【０２０８】
材料及び方法
実験動物
成体C57BLマウス(18〜25g)を台湾国立研究所動物センターから取得した。全てのマウスは、実験動物委員会(アカデミアシニカ(台湾、R.O.C.))が承認した手順に従って動物施設に維持した。
【０２０９】
EKLF(K74R)ノックインマウスの誕生
ノックインマウスは、Cre-loxP組換システム(Invitrogen)、ターゲッティングBAC Clone RP24-319P23及び対抗選択BAC改変キット(Gene brides)を用いたスタンダード遺伝子-標的アプローチによってES細胞においてEKLFのSUMO化サイト変異(K74R)を相同組み換えによってマウスEKLF(klf1)遺伝子の第二エクソンに導入することによって誕生させた。テンプレートとしてC57B/6J ES細胞由来のマウスゲノムDNAを用いて、EKLFエクソン2の一部を含む断片をPCR増幅して、標的ベクターを構築するために用いた。テンプレートを標的ベクターにクローニングする前に、エクソン2によってエンコードされているコドン74を、スタンダード変異誘発技術を用いてアルギニン(K74R)となるコードに変異させた。大腸菌のカナマイシン耐性の発現のための原核生物プロモーター(gb2)と哺乳動物細胞のネオマイシン耐性の発現のための真核生物プロモーター(PGK)とを組み合わせたネオマイシン/カナマイシン耐性遺伝子をエンコードするPGK-gb2-neoテンプレートである、ネオマイシンカセットを標的ベクターに構築した。加えて、改変型野生型DNAは、その除去を容易にするために、「loxP」サイトが側面に並べた(図1A)。loxP-PGK-loxPカセットを、EKLF遺伝子のイントロン1に挿入した。次に、標的構築物を、C57B/6J ES細胞にエレクトロポレーションにて導入し、ネオマイシン耐性で選択した。適切に標的とされたESクローンを、5'及び3'サザンブロッティングによって同定した。ネオカセットの除去及びEKLF K74Rをエンコードしている改変型ゲノム領域のアーキテクチャーの確認後、ESクローンを胚細胞に注入してキメラマウスを誕生させた。ノックインアレルを含むヘテロ接合体マウスを得るために、生殖細胞系を伝達しているF1株を、全身でCreリコンビナーゼを発現しているEIIa-Creマウスと交配させた。ホモ接合体eklf(K74R)ノックインマウスとなるように、点変異を含む1つのアレルを載せているeklfヘテロ接合体を交雑させた。
【０２１０】
配列は、下記表E1に示している。配列は、5'から3'の順番でリストされている。ヌクレオチド位置は、5'から3'方向で、第一5'ヌクレオチドを1として番号付けしている。標的ベクターの領域(例えば、EKLF遺伝子のエクソン及びイントロン、loxPサイト、PolyAサイト、Neo並びにPGKプロモーター)は、それらのヌクレオチド領域(すなわち、その領域にわたるヌクレオチド位置の範囲)によって明示されている。
【表Ｅ１】
2017532013.tif 000002
2017532013.tif 000003
2017532013.tif 000004
【０２１１】
TaqMan遺伝子発現アッセイ
標準的な手順に従って、TRIzol試薬(Invitrogen)を使用してRNA調製し、そして、オリゴ-5 dTプライマー及びSuperScript III Reverse Transcriptase(RT)(Invitrogen)を使用して逆転写した。有効なTaqManアッセイを使用する定量的PCR(qPCR)をApplied Biosystems7500 Real-Time PCR System(Applied Biosystems)機器にてデフォルトのサイクル条件(50℃で2分間、95℃で10分間、95℃で15秒間及び60℃で1分間えお40サイクル)で実施した。相対的EKLF( Mm04208330_g1及びMm00516096_m1;Applied Biosystems)発現レベルを、cDNAサンプルの階段希釈の検量線から決定し、β-アクチン(Actb:Mm00607939_s1; Applied Biosystems)、又は、Gapdh(Mm99999915_g1; Applied Biosystems)発現レベルに正規化した。
【０２１２】
生存期間測定
生存期間を、標準的な手順を用いて測定した。EKLF(K74R)ノックインマウスの生存期間を、特定病原体除去(SPF)動物の施設において追跡した。
【０２１３】
腫瘍形成に対する抵抗性のアッセイEKLF(K74R)ノックインマウスの抗発がん効果を調査するために、以前開示した肺コロニー形成アッセイ(Cha et al., 2003; Stackpole, 1981)を調査のために使用した。マウス転移メラノーマ細胞であるB16-F10(106細胞/0.2mL)を、EKLF(K74R) Kinマウス及び野生型マウス(グループ当たり3匹のマウス)のそれぞれの尾静脈に静脈内注入(i.v.注入)して、これらの細胞からの腫瘍形成及び転移の可能性を検討した。B16F10細胞を試験のために選択した。理由は、それらが、C57BL/6マウス由来であり、C57BL/6マウス(野生型及びEKLF(K74R)ノックインマウス)と免疫学的に適合するためである。2週後、マウスをCO2により窒息死させて、それらの肺を更なる検査のために取り出した。肺の表面上の転移性瘤を画像分析ソフトウェア(Image Inc.; Cha et al., 2003)で測定した。各マウスの腫瘍数の測定を、注入の14日後に実行した。
【０２１４】
マイクロアレイ実験
WT及びEklf K74Rノックインマウス由来のE14.5マウス胎児肝臓又は3ヵ月マウス骨髄を、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)(10mMのホスファート、0.15MのNaCl[pH 7.4])中にて繰り返しピペッティングしてホモジナイズした。次に、全RNAをTrizol試薬(Invitrogen)によって単離して、Mouse Genome Array 430A2.0(Affymetrix, Inc.)を用いたゲノム-スケール遺伝子発現プロファイリングを受けさせた。スタンダードMAS5.0法は、遺伝子発現データを正規化するために用いた。遺伝子発現値を、後の比較分析のために対数変換した。統計解析は、R 3.0.2 language(R Development Core Team, 2013, www.R-project.org)を用いて実施した。
【０２１５】
EKLF標的遺伝子のqPCR
製造業者のプロトコール(Invitrogen)に従って、合計RNAを市販のTrizol試薬(Invitrogen)によって抽出して、SuperScriptIIIを用いて逆転写した。マウスCola1、Mpv17l及びアクチンmRNAレベルを、Mission Biotech (台湾、 ROC)からの適切なプライマーを使用して、リアルタイムPCR又は半定量RT-PCRによって決定した。qPCRアッセイを、Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System(Applied Biosystems、フォスターシティー、CA、米国)を使用して、50℃2分間を1サイクル、95℃10分間を1サイクル、及び95℃15秒及び60℃1分間をそれぞれ35サイクルのプロファイルで実行した。閾値サイクル(ct)は、機器のソフトウェア(7500 System SDS software vers. 1.3.1)によって算出した。アクチンは、内部標準としての役割を果たした。Cola1又はMpv17l mRNAの相対的量は、アクチンを基準にした。データは、各バーが3回から導き出されたデータの平均±SEMを表すヒストグラムとして提示されている。半定量RT-PCRは、94℃で5分間、次に、それぞれ、94℃で30秒間、55℃で40秒間及び72℃で30秒間を22サイクル(アクチン)；94℃で30秒間、52℃で30秒間及び72℃で27秒間を28サイクル(Cola1及び94℃で30秒間、52℃で40秒間及び20秒間で72℃の24サイクル(Mpv17l)でインキュベートするポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)をからなるものとしたデータは、各バーが2回から導き出されたデータの平均±SEMを表すヒストグラムとして提示されている。
【０２１６】
食事/水摂取測定
自発的ホームケージ活動度を、連続録画の完全自動コンピューター映像分析を使用してモニタリングした。
【０２１７】
代謝測定
O2消費量、CO2生産量、食餌及び水分摂取量を、総合実験動物モニタリングシステム(CLAMS, Oxymax Open Circuit Calorimeter, Columbus Instruments)を使用して測定した。
【０２１８】
インシュリン及びグルコース測定
血液サンプルをマウスから集めた。遠心後、血漿を用いて、製造業者の推奨に従ってELISA(Mediagnost、ドイツ)でインシュリン及びグルコースを定量した。また、血漿を使用してグルコースを定量した。
【０２１９】
握力試験
握力試験は、ムロマチ(MK-380CM/R装置)を用いて実施した。実験を記録した。
【０２２０】
ローターロッド試験
ローターロッド試験は、Ugo Basile Rota-Rod 47600装置を用いて実施した。試験セッションの間、ローターロッドは、1分につき2から80回転継続的に加速させた。
【０２２１】
骨イメージング
骨密度を、安楽死直後に全動物に対してScanco Medical Micro-CT 40機器を使用して評価した。
【０２２２】
腫瘍イメージング
マウスのMicroPETイメージ(MicroPET R4)を、100Ciの18F-FDGを用いたマウス投与の0.5時間後でマウスをスキャンすることによって撮影した。
【０２２３】
実施例1
EKLF K74Rマウスの誕生
EKLF K74R変異アレルを載せているトランスジェニックマウスは、「材料及び方法」のセクションに記載した手順に従って誕生させた。EKLF K74Rマウスを誕生させるための標的ベクター構築物の模式図を図1Aに図示している。マウス尾部からのゲノムDNAをPCRによって分析し、ヘテロ接合体及びホモ接合体マウスの両方がEKLF K74R変異アレルを含むことを確認した(図1B)。EKLF K74R ノックインマウスは、正常に繁殖し、予想されるメンデル比で子孫を産んだことから、この改変型EKLF遺伝子は、野生型EKLFアレルに類似的に機能し、胎生期致死を引き起こさない。胚の定量的mRNA分析は、EKLF K74Rマウス及び野生型同腹の子が、同程度のレベルの合計EKLF mRNAを有していたことを示した(図1D)。
【０２２４】
EKLFタンパク質は、プロモーター及びリプレッサー活性を有する転写因子である。トランスクリプトームは、K74R変異によって変えられる。マイクロアレイハイブリダイゼーションによって分析されるように、骨髄又はE14.5胎児肝臓のいずれかにおいて、少なくとも40の遺伝子は、それぞれ、下方制御及び上方制御される。図2において例証されているように、これらの発現変化のいくつかは、PCRによって確認された。Col1a1のmRNAは、野生型マウスと比較して、成体EKLF K74Rノックインマウスの骨髄において著しく低減した(図2A)。mRNA Mpv171は、野生型マウスと比較して、EKLF K74RノックインマウスのE14.5胎児肝臓において著しく低減した(図2B)。
【０２２５】
実施例2
EKLF K74R変異は、生存期間を延ばす
EKLF K74Rトランスジェニックマウスは、野生型同腹の子と比較して生存期間が延びていた。具体的に、EKLF K74Rマウス(n=45)の生存期間の中央値は、野生型マウス(n =33)と比較して3ヵ月長かった(図3A)。生存期間調査の結果を表E2にまとめた。
【表Ｅ２】
2017532013.tif 000005
【０２２６】
表1から明らかなように、EKLF K74R雄マウスの最大生存期間(コホートの中で最も年配の10%の生存期間を意味する)は、野生型同腹の子と比較して6.5ヵ月増加した。EKLF K74Rマウスの最大生存期間は、約40ヵ月であり、それは、論文(Wu et al., Human Molecular Genetics (2012) 21, 3965-3968)に報告されている他の長寿マウス(例えば、CISD2)よりも長かった。さらに、32ヵ月齢のEKLF K74Rマウスは、17ヵ月齢の野生型マウスと比較して、白髪が少なかった(図3B)。EKLF K74Rマウスは、それらの長い生存期間に加えて、健常であり、正常に育つことがわかった。
【０２２７】
生物学的加齢過程を減速させるために、食餌制限又はカロリー制限を、酵母、魚、齧歯類及びイヌを含む様々な種に実行した結果、生存期間及び健康な期間が延びた。代謝の直接的な変化も生存期間を延ばすと報告されてきた。通常固形飼料に対するマウスの小規模表現型分析の予備的データは、図4及び5に示している。図のように、3ヵ月齢から24ヵ月齢の野生型及びEKLF K74Rマウスの両方の体重変化パターンは、類似していた(図4B)。実際、48時間の自発的食物摂取は、体重に正規化した又は絶対値として表すと、水摂取の野生型及びEKLF K74Rマウスと類似していた(図4C及び4D)。
【０２２８】
通常の固形飼料で育てられたマウスは、代謝表現型(例えば、酸素消費(VO2、図5A)、二酸化炭素生産量(VCO2、図5B)、熱発生量(図5C)及び呼吸交換率(RER)(図5D))の明らかな変化を示さなかった。これらのデータから、EKLF K74Rマウスのエネルギー源としての脂質及び糖質の使用は、野生型マウスと類似していることが示された。
【０２２９】
食餌制限又はカロリー制限が多くの場合グルコース耐性を変えることと関連しているため、我々は、空腹時のグルコース及びインシュリン血中濃度と通常の固形飼料を供給されたマウスの血行からグルコースを取り除く能力を測定した。図6に示されるように、EKLF K74Rと野生型マウスとの間に、空腹時のグルコース濃度(図6A)、空腹時のインシュリン濃度(図6B)又はグルコース耐性(図6C)に有意な差異がなかった。
【０２３０】
筋力及び協調運動を評価する試験を行った。3ヵ月齢のEKLF K74Rマウスは、3ヵ月齢の野生型マウスと類似の握力を示したが、同じ年齢の野生型マウスと比較すると、24ヵ月のEKLF K74Rマウスに有意な握力増加が観察された(図7A)。一方で、ローターロッドから落ちるまでの時間は、3ヵ月齢又は12ヵ月齢のEKLF K74Rマウスと野生型マウスで類似していた(図7B)。加速するローターロッドから落ちるまでの時間は、1日につき3回の実験において測定した。
【０２３１】
老化の重要な要素は、骨粗鬆症である。図8に示されるように、骨容量及び骨梁数は野生型マウスの年齢によって低下した一方で、骨梁間隔は増加した(図8、左パネル)。反対に、老齢のEKLF K74Rマウスのこれらのパラメーターの全てが、若年のEKLF K74R動物と区別できなかったことから、EKLF K74Rマウスは、老化時に骨粗鬆症を発症しなかった(図8;右パネル)。
【０２３２】
EKLF K74Rマウスにおいて観察される表現型は、先に述べた長命のマウスモデルと異なる。表E3は、他の公知の長寿齧歯類モデルとEKLF K74Rマウスと表現型の比較を示している。野生型マウスと比較して、上矢は、増加を示し、下矢は、減少を示し、等号は、変化を示さない。「老化」の列は、若年の野生型マウスに対する年配の野生型マウスに関する比較である。この表は、Hofmann, et al. (2015) Cell 160, 477-488の表S7から修正している。
【表Ｅ３】
2017532013.tif 000006
【０２３３】
実施例3
EKLF K74R変異は、がん抵抗性に至る
Micro-PETイメージング分析(図9A)及び切開した24ヵ月齢のマウスの検査(図9B)によって例証された通り、EKLF K74Rマウスにおいては、野生型同腹の子よりも年齢関連性がん発生率の低下が表現型観察から示された。
【０２３４】
がん細胞を、静脈内注入によってEKLF K74Rマウス及び野生型同腹の子に移植した。B16F10メラノーマ細胞(ATCC# CRL6475)は、EKLF K74Rマウスと同じ(C57BL/6J)遺伝的背景由来である。インビボ転移アッセイを、B16F10細胞をマウスの尾静脈へ注入(i.v.注入)することによって実施した(図10)。肺は、B16F10細胞の注入の2週間後に検討した。これらのデータから、EKLF K74Rマウスにおけるがん発生率が低下したことを示している。B16F10メラノーマ細胞をマウスに皮下注入すると、Kinマウスの腫瘍成長を低減させる非統計的に有意な小さい傾向が予備的調査から示された。
【０２３５】
同時に、これらのデータから、EKLF K74Rマウスのがん発生率が低下したが示され(図9)、肺腫瘍アッセイのデータ(図10)とよく相関していた。これらのデータは、腫瘍発生を低減又は阻害及びがん細胞の転移を低減又は阻害しているEKLF K74Rと整合している。
【０２３６】
添付の図面に関連して本願明細書に提供される詳細な説明は、本実施例の記述を意図するものであり、本発明を構成及び利用されることができる唯一の形態を表すことを意図するものではない。詳細な説明は、実施例のある種の機能及び実施例を構成及び作動するためのステップの順序を述べている。しかしながら、同一又は等価な機能及び順序は、種々の実施例によって達成することができる。本願明細書に記載されている各種実施形態は、更なる実施形態を提供するために組み合わせることができる。実施形態の態様は、必要に応じて、さらに他の実施形態を提供するために本願明細書に記載されている様々な特許、特許出願及び特許公開公報の概念を使用するために修正することができる。
【０２３７】
上記の詳細な説明を考慮して、これら及び他の変更を実施形態になすことができる。一般に、特許請求の範囲において使用する用語は、明細書及び請求項に開示されている特定の実施形態に請求項を制限するものとすべきではないが、かかる請求項の権利範囲と等価で完全な範囲とともに全ての可能性がある実施形態を含むものとされなければならない。従って、請求項は、本開示によって制限されない。
【０２３８】
本明細書に示され及び/又は出願データシートにリストされている米国特許、米国特許公開公報、米国特許出願、外国特許、外国特許出願及び非特許公報の全ては、それらの全てを本願明細書に引用したものとする。
【図１Ａ】
2017532013.tif 000007
【図１Ｂ】
2017532013.tif 000008
【図１Ｃ】
2017532013.tif 000009
【図１Ｄ】
2017532013.tif 000010
【図２】
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【図３Ａ】
2017532013.tif 000012
【図３Ｂ】
2017532013.tif 000013
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2017532013.tif 000015
【図４Ｃ】
2017532013.tif 000016
【図４Ｄ】
2017532013.tif 000017
【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
2017532013.tif 000021
【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
2017532013.tif 000023
【図６Ｃ】
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【図７】
2017532013.tif 000025
【図８】
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【図９】
2017532013.tif 000027
【図１０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年4月27日(2017.4.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞増殖障害を治療若しくは予防する、又は、腫瘍転移若しくは腫瘍発生の発生率を阻害若しくは低減する必要がある対象において、それを行なうための合成ポリペプチド又は前記合成ポリペプチドをエンコードしている核酸であって、
前記合成ポリペプチドは、野生型EKLFポリペプチド、任意に野生型ヒトEKLFポリペプチドにおいてSUMO化またはリン酸化される1又は複数のアミノ酸改変を含む改変型EKLFポリペプチドである、合成ポリペプチド又は前記合成ポリペプチドをエンコードしている核酸。
【請求項２】
前記改変型EKLFポリペプチドは、前記野生型EKLFポリペプチドと比較して、細胞質から核へのトランスロケーションが低減している、請求項１に記載の合成ポリペプチド又は前記合成ポリペプチドをエンコードしている核酸。
【請求項３】
前記改変型EKLFポリペプチドは、前記野生型EKLFポリペプチドと比較して、トランスアクチベーター活性又はリプレッサー活性が改変されている、請求項2に記載の合成ポリペプチド又は前記合成ポリペプチドをエンコードしている核酸。
【請求項４】
前記核酸は、ウイルスベクターである、請求項1に記載の合成ポリペプチド又は前記合成ポリペプチドをエンコードしている核酸。
【請求項５】
前記ウイルスベクターは、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、弱毒化されたワクシニアウイルス、カナリア痘ウイルス、アデノウイルス又はアデノ随伴ウイルス由来である、請求項4に記載の合成ポリペプチド又は前記合成ポリペプチドをエンコードしている核酸。
【請求項６】
前記1又は複数のアミノ酸改変は、全長野生型ヒトEKLFポリペプチドの位置54に対応するアミノ酸の改変を含む、請求項1に記載の合成ポリペプチド又は前記合成ポリペプチドをエンコードしている核酸。
【請求項７】
位置54のアミノ酸の改変は、ArgでのLysの置換(K54R)である、請求項6に記載の合成ポリペプチド又は前記合成ポリペプチドをエンコードしている核酸。
【請求項８】
前記1又は複数のアミノ酸改変は、全長野生型マウスEKLFポリペプチドの位置68に対応するアミノ酸の改変を含む、請求項1の使用のための合成ポリペプチド又は前記合成ポリペプチドをエンコードしている核酸。
【請求項９】
前記治療又は予防は、前記対象に有効量の抗増殖薬剤を投与するステップを更に有する、請求項1に記載の合成ポリペプチド又は前記合成ポリペプチドをエンコードしている核酸。
【請求項１０】
前記抗増殖薬剤は、アルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤、アンチメタボライ又は細胞毒性抗生物質である、請求項9の使用のための合成ポリペプチド又は前記合成ポリペプチドをエンコードしている核酸。
【請求項１１】
対象の生存期間又は健康な期間を延ばすための合成ポリペプチド又は前記合成ポリペプチドをエンコードしている核酸であって、
前記ポリペプチドは、野生型EKLFポリペプチド、任意に野生型ヒトEKLFポリペプチドにおいてSUMO化またはリン酸化される1又は複数のアミノ酸改変を含む改変型EKLFポリペプチドである、合成ポリペプチド又は前記合成ポリペプチドをエンコードしている核酸。
【請求項１２】
前記改変型EKLFポリペプチドは、前記野生型EKLFポリペプチドと比較して、細胞質から核へのトランスロケーションが低減している、請求項１1に記載の合成ポリペプチド又は前記合成ポリペプチドをエンコードしている核酸。
【請求項１３】
前記改変型EKLFポリペプチドは、前記野生型EKLFポリペプチドと比較して、トランスアクチベーター活性又はリプレッサー活性が改変されている、請求項12に記載の合成ポリペプチド又は前記合成ポリペプチドをエンコードしている核酸。
【請求項１４】
前記核酸は、ウイルスベクターである、請求項11に記載の合成ポリペプチド又は前記合成ポリペプチドをエンコードしている核酸。
【請求項１５】
前記ウイルスベクターは、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、弱毒化されたワクシニアウイルス、カナリア痘ウイルス、アデノウイルス又はアデノ随伴ウイルス由来である、請求項14に記載の合成ポリペプチド又は前記合成ポリペプチドをエンコードしている核酸。
【請求項１６】
前記1又は複数のアミノ酸改変は、全長野生型ヒトEKLFポリペプチドの位置54に対応するアミノ酸の改変を含む、請求項11に記載の合成ポリペプチド又は前記合成ポリペプチドをエンコードしている核酸。
【請求項１７】
位置54に対応するアミノ酸の改変は、ArgでのLysの置換(K54R)である、請求項16に記載の合成ポリペプチド又は前記合成ポリペプチドをエンコードしている核酸。
【請求項１８】
前記1又は複数のアミノ酸改変は、全長野生型マウスEKLFポリペプチドの位置68に対応するアミノ酸の改変を含む、請求項11に記載の合成ポリペプチド又は前記合成ポリペプチドをエンコードしている核酸。
【請求項１９】
医薬品を製造するための活性薬剤を更に有し、
前記活性薬剤は、内因性EKLFポリペプチドの発現を阻害する、請求項11に記載の合成ポリペプチド又は前記合成ポリペプチドをエンコードしている核酸。
【請求項２０】
前記第二活性薬剤は、前記内因性EKLFポリペプチドをエンコードするmRNA又はその相補体に結合する核酸分子であり、任意にアンチセンスRNA、siRNA、shRNA又はmiRNAである、請求項19に記載の合成ポリペプチド又は前記合成ポリペプチドをエンコードしている核酸。
【請求項２１】
使用は、前記対象において、毛髪の灰色化の低減、協調運動の向上、筋力の向上、筋脱力の低減、協調運動の向上、骨粗鬆症の低減、骨容量の増大、骨密度の増大、骨梁数の増大、骨梁間隔の低減又はバランス低下の低減という結果となる、請求項20に記載の合成ポリペプチド又は前記合成ポリペプチドをエンコードしている核酸。
【請求項２２】
前記対象は、哺乳動物、任意にヒトである、請求項19に記載の合成ポリペプチド又は前記合成ポリペプチドをエンコードしている核酸。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2017532013000001.app
【国際調査報告】
2017532013.tif 000029
2017532013.tif 000030
2017532013.tif 000031