(57)【要約】  本発明において、数分類のＨＰＰＤ阻害剤に対して完全な耐性を示すＨＰＰＤ酵素およびそれらを含有する植物が記載される。ＨＰＰＤ阻害剤へのアフィニティーを持たないまたは顕著に低減されたアフィニティーのみを持ち、同時に、ＨＰＰＤ阻害剤が遅延結合性または遅延強結合性の阻害剤としてもはや作用しないがその代わりに完全に可逆的な阻害剤になった程度にまで酵素のＨＰＰＤ阻害剤解離速度を増加させたＨＰＰＤ酵素のセットが設計された。詳細には、ＨＰＰＤ阻害剤耐性ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。加えて、当該ポリヌクレオチドに対応するアミノ酸配列が包含される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸位置３３５に相当するアミノ酸位置においてプロリンを、および配列番号１のアミノ酸位置３３６に相当する位置においてフェニルアラニンまたはチロシンを含むアミノ酸配列からなる４−ヒドロキシフェニルピルベートジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）タンパク質をコードする組換え型核酸分子であって、前記ＨＰＰＤタンパク質はＨＰＰＤ阻害除草剤に耐性である、前記核酸分子。
【請求項２】
前記コードされるＨＰＰＤタンパク質が：
ｉ．  配列番号１のアミノ酸位置１８８に相当するアミノ酸位置においてアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンまたはバリンを；および
ｉｉ．  配列番号１のアミノ酸位置１８９に相当するアミノ酸位置においてアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンまたはバリンを；および
ｉｉｉ．  配列番号１のアミノ酸位置２００に相当するアミノ酸位置においてイソロイシン、ロイシンまたはメチオニンを；および
ｉｖ．  配列番号１のアミノ酸位置２１５に相当するアミノ酸位置においてアラニン、ロイシン、プロリンまたはアスパラギンを；および
ｖ．  配列番号１のアミノ酸位置２２６に相当するアミノ酸位置においてヒスチジンまたはグルタミンを；および
ｖｉ．  配列番号１のアミノ酸位置３３９に相当するアミノ酸位置においてヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、グルタミン、アルギニン、アラニン、リジン、セリン、スレオニンまたはバリンを；および
ｖｉｉ．  配列番号１のアミノ酸位置３４０に相当するアミノ酸位置においてアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンまたはバリン
をさらに含むアミノ酸配列からなる、請求項１の組換え型核酸分子。
【請求項３】
前記コードされるＨＰＰＤタンパク質が：
ｉ．  配列番号１のアミノ酸位置１８８に相当するアミノ酸位置においてアラニン、グリシン、ヒスチジン、セリンまたはトリプトファンを；および
ｉｉ．  配列番号１のアミノ酸位置１８９に相当するアミノ酸位置においてアルギニン、システイン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グリシン、ヒスチジン、フェニルアラニンまたはセリンを；および
ｉｉｉ．  配列番号１のアミノ酸位置２００に相当するアミノ酸位置においてイソロイシン、ロイシンまたはメチオニンを；および
ｉｖ．  配列番号１のアミノ酸位置２１５に相当するアミノ酸位置においてアラニン、ロイシン、プロリンまたはアスパラギンを；および
ｖ．  配列番号１のアミノ酸位置２２６に相当するアミノ酸位置においてヒスチジンまたはグルタミンを；および
ｖｉ．  配列番号１のアミノ酸位置３３９に相当するアミノ酸位置においてセリン、アラニン、スレオニン、グルタミンまたはリジンを；および
ｖｉｉ．  配列番号１のアミノ酸位置３４０に相当するアミノ酸位置においてアラニン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、グリシンまたはロイシン
をさらに含むアミノ酸配列からなる、請求項１の組換え型核酸分子。
【請求項４】
前記ＨＰＰＤタンパク質が配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５３％の配列同一性を持つアミノ酸配列を含む、請求項１、２または３の組換え型核酸分子。
【請求項５】
そのヌクレオチド配列が植物内での発現のために設計された合成配列である、請求項１〜４のいずれかの組換え型核酸分子。
【請求項６】
そのヌクレオチド配列が植物細胞内でヌクレオチド配列の発現を指示することが可能なプロモーターと作動可能に連結されている、請求項１〜４のいずれかの組換え型核酸分子。
【請求項７】
前記ＨＰＰＤ阻害除草剤が、Ｎ  （１，２，５−オキサジアゾール−３−イル）ベンズアミド類；Ｎ−（テトラゾール−４−イル）−またはＮ−（トリアゾール−３−イル）アリールカルボキサミド類、Ｎ−（１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）ベンズアミド類、Ｎ−（テトラゾール−５−イル）−またはＮ−（トリアゾール−３−イル）アリールカルボキサミド類、ピリダジノン誘導体類、置換１，２，５−オキサジアゾール類、オキソプラジン誘導体類、トリケトン類、イソオキサゾール類およびピラゾリネート類よりなる群から選択される、請求項１の組換え型核酸分子。
【請求項８】
前記ＨＰＰＤ阻害除草剤が、２−クロロ−３−エトキシ−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミドおよび２−クロロ−３−（メトキシメチル）−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド、２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）−３−（メチルスルホニル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド、２−クロロ−３−エトキシ−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド、４−（ジフルオロメチル）−２−メトキシ−３−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド、２−クロロ−３−（メチルスルファニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド、２−（メトキシメチル）−３−（メチルスルフィニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド、テンボトリオン、スルコトリオン、メソトリオン、イソオキサフルトール、ピラスルホトールおよびトプラメゾンよりなる群から選択される、請求項７の組換え型核酸分子。
【請求項９】
請求項１、２または３の組換え型核酸分子を含有する宿主細胞。
【請求項１０】
細菌宿主細胞である、請求項９の宿主細胞。
【請求項１１】
植物細胞である、請求項９の宿主細胞。
【請求項１２】
請求項１、２または３の組換え型核酸分子を含む遺伝子導入植物。
【請求項１３】
トウモロコシ、ソルガム、コムギ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科植物、コショウ、ジャガイモ、ワタ、イネ、ダイズ、テンサイ、サトウキビ、タバコ、オオムギおよびアブラナよりなる群から選択される、請求項１２の植物。
【請求項１４】
請求項１、２または３の組換え型核酸分子を含む遺伝子導入種子。
【請求項１５】
ＨＰＰＤタンパク質を含む組換え型ポリペプチドであって、前記ＨＰＰＤタンパク質はＨＰＰＤ阻害除草剤に耐性であり、前記ＨＰＰＤタンパク質は配列番号１のアミノ酸位置３３５に相当するアミノ酸位置においてプロリンを、および配列番号１のアミノ酸位置３３６に相当する位置においてフェニルアラニンまたはチロシンを含む、前記ポリペプチド。
【請求項１６】
前記ＨＰＰＤタンパク質が：
ｉ．  配列番号１のアミノ酸位置１８８に相当するアミノ酸位置においてアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンまたはバリンを；および
ｉｉ．  配列番号１のアミノ酸位置１８９に相当するアミノ酸位置においてアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンまたはバリンを；および
ｉｉｉ．  配列番号１のアミノ酸位置２００に相当するアミノ酸位置においてイソロイシン、ロイシンまたはメチオニンを；および
ｉｖ．  配列番号１のアミノ酸位置２１５に相当するアミノ酸位置においてアラニン、ロイシン、プロリンまたはアスパラギンを；および
ｖ．  配列番号１のアミノ酸位置２２６に相当するアミノ酸位置においてヒスチジンまたはグルタミンを；および
ｖｉ．  配列番号１のアミノ酸位置３３９に相当するアミノ酸位置においてヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、グルタミン、アルギニン、アラニン、リジン、セリン、スレオニンまたはバリンを；および
ｖｉｉ．  配列番号１のアミノ酸位置３４０に相当するアミノ酸位置においてアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンまたはバリン
をさらに含む、請求項１５の組換え型ポリペプチド。
【請求項１７】
前記ＨＰＰＤタンパク質が：
ｉ．  配列番号１のアミノ酸位置１８８に相当するアミノ酸位置においてアラニン、グリシン、ヒスチジン、セリンまたはトリプトファンを；および
ｉｉ．  配列番号１のアミノ酸位置１８９に相当するアミノ酸位置においてアルギニン、システイン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グリシン、ヒスチジン、フェニルアラニンまたはセリンを；および
ｉｉｉ．  配列番号１のアミノ酸位置２００に相当するアミノ酸位置においてイソロイシン、ロイシンまたはメチオニンを；および
ｉｖ．  配列番号１のアミノ酸位置２１５に相当するアミノ酸位置においてアラニン、ロイシン、プロリンまたはアスパラギンを；および
ｖ．  配列番号１のアミノ酸位置２２６に相当するアミノ酸位置においてヒスチジンまたはグルタミンを；および
ｖｉ．  配列番号１のアミノ酸位置３３９に相当するアミノ酸位置においてセリン、アラニン、スレオニン、グルタミンまたはリジンを；および
ｖｉｉ．  配列番号１のアミノ酸位置３４０に相当するアミノ酸位置においてアラニン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、グリシンまたはロイシン
をさらに含む、請求項１５の組換え型ポリペプチド。
【請求項１８】
前記ＨＰＰＤタンパク質が配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５３％の配列同一性を持つアミノ酸配列を含む、請求項１５、１６または１７の組換え型ポリペプチド。
【請求項１９】
前記ＨＰＰＤ阻害除草剤が、Ｎ  （１，２，５−オキサジアゾール−３−イル）ベンズアミド類；Ｎ−（テトラゾール−４−イル）−またはＮ−（トリアゾール−３−イル）アリールカルボキサミド類、Ｎ−（１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）ベンズアミド類、Ｎ−（テトラゾール−５−イル）−またはＮ−（トリアゾール−３−イル）アリールカルボキサミド類、ピリダジノン誘導体類、置換１，２，５−オキサジアゾール類、オキソプラジン誘導体類、トリケトン類、イソオキサゾール類およびピラゾリネート類よりなる群から選択される、請求項１５、１６または１７の組換え型ポリペプチド。
【請求項２０】
前記ＨＰＰＤ阻害除草剤が、２−クロロ−３−エトキシ−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミドおよび２−クロロ−３−（メトキシメチル）−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド、２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）−３−（メチルスルホニル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド、２−クロロ−３−エトキシ−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド、４−（ジフルオロメチル）−２−メトキシ−３−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド、２−クロロ−３−（メチルスルファニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド、２−（メトキシメチル）−３−（メチルスルフィニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド、テンボトリオン、スルコトリオン、メソトリオン、イソオキサフルトール、ピラスルホトールおよびトプラメゾンよりなる群から選択される、請求項１９の組換え型ポリペプチド。
【請求項２１】
ＨＰＰＤ阻害除草剤耐性活性を有するポリペプチドを生産する方法であって、前記ポリペプチドをコードする核酸分子が発現される条件下で請求項９の宿主細胞を培養することを含む、前記方法。
【請求項２２】
そのゲノム内にＤＮＡコンストラクトが安定的に組み込まれた植物であって、前記コンストラクトが請求項１、２または３のいずれかの核酸と作動可能に連結したプロモーターを含む、前記植物。
【請求項２３】
植物細胞、植物組織および植物種子よりなる群から選択される、請求項２２の植物。
【請求項２４】
トウモロコシ、ソルガム、コムギ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科植物、コショウ、ジャガイモ、ワタ、イネ、ダイズ、テンサイ、サトウキビ、タバコ、オオムギおよびアブラナよりなる群から選択される、請求項２２の植物。
【請求項２５】
請求項２２の植物の遺伝子導入種子。
【請求項２６】
圃場内に請求項２２の植物またはその種子を植えること、および前記圃場に有効濃度のＨＰＰＤ阻害除草剤を施用することを含む、圃場内の雑草を防除する方法。
【請求項２７】
前記ＨＰＰＤ阻害除草剤が、Ｎ  （１，２，５−オキサジアゾール−３−イル）ベンズアミド類；Ｎ−（テトラゾール−４−イル）−またはＮ−（トリアゾール−３−イル）アリールカルボキサミド類、Ｎ−（１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）ベンズアミド類、Ｎ−（テトラゾール−５−イル）−またはＮ−（トリアゾール−３−イル）アリールカルボキサミド類、ピリダジノン誘導体類、置換１，２，５−オキサジアゾール類、オキソプラジン誘導体類、トリケトン類、イソオキサゾール類およびピラゾリネート類よりなる群から選択される、請求項２６の方法。
【請求項２８】
前記ＨＰＰＤ阻害除草剤が、２−クロロ−３−エトキシ−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミドおよび２−クロロ−３−（メトキシメチル）−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド、２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）−３−（メチルスルホニル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド、２−クロロ−３−エトキシ−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド、４−（ジフルオロメチル）−２−メトキシ−３−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド、２−クロロ−３−（メチルスルファニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド、２−（メトキシメチル）−３−（メチルスルフィニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド、テンボトリオン、スルコトリオン、メソトリオン、イソオキサフルトール、ピラスルホトールおよびトプラメゾンよりなる群から選択される、請求項２７の方法。
【請求項２９】
植物に１または複数のＨＰＰＤ阻害除草剤への耐性を与えるための、請求項１〜３のいずれかの核酸の使用。
【請求項３０】
全粒のまたは加工された種子または穀粒、動物飼料、コーンミールまたは大豆ミール、コーン粉または大豆粉、コーンスターチ、大豆ミール、大豆粉、フレーク、大豆タンパク質濃縮物、大豆タンパク質分離物、調質大豆タンパク質濃縮物、化粧品、ヘアケア製品、ソイナッツバター（ｓｏｙ  ｎｕｔ  ｂｕｔｔｅｒ）、納豆、テンペ、大豆タンパク質加水分解物、ホイップ済みクリーム（ｗｈｉｐｐｅｄ  ｔｏｐｐｉｎｇ）、ショートニング、レシチン、可食全粒大豆、大豆ヨーグルト、大豆チーズ、豆腐、湯葉および調理した、研磨した、蒸した、焼いたまたは湯通しした穀粒よりなる群から選択される、請求項１〜３のいずれかの核酸分子または請求項１５〜１７のいずれかのタンパク質を含む、コモディティー製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は植物分子生物学に関し、詳細にはＨＰＰＤ阻害除草剤に対する改良された耐性を付与する新規ＨＰＰＤポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
４−ヒドロキシフェニルピルベートジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）は、チロシン分解産物であるパラ−ヒドロキシフェニルピルベート（本明細書中でＨＰＰと略記する）を植物におけるトコフェロールおよびプラストキノンの前駆体であるホモゲンチセート（本明細書中でＨＧと略記する）に転換する反応を触媒する酵素である（Ｃｒｏｕｃｈ  Ｎ．Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．（１９９７），Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５３，２０，６９９３−７０１０，Ｆｒｉｔｚｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００４），Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １３４：１３８８−１４００）。トコフェロールは膜結合性抗酸化剤として作用する。プラストキノンは、第一にＰＳＩＩとチトクロムｂ６／ｆ複合体との間の電子伝達体として、第二にカロテノイドの生合成に関わるフィトエンデサチュラーゼの酸化還元補因子として作用する。
【０００３】
今までに、ＮＣＢＩデータベース中に存在する様々な生物からの１０００より多い核酸配列が、ＨＰＰＤドメインを持つ推定タンパク質をコードするものとしてアノテートされた。しかし、それらの大半については、タンパク質がインビトロアッセイまたは植物体内アプローチのいずれかにおいてＨＰＰＤ酵素活性を持つことも、かかるＨＰＰＤタンパク質が植物内で発現するとＨＰＰＤ阻害除草剤に対する除草剤耐性を付与することができることも明らかにされていない。数個のＨＰＰＤタンパク質およびその一次配列が技術水準中に記載されており、これらは具体的には細菌、例えばシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（Ｒｕｅｔｓｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０５，４５９−４６６，１９９２、ＷＯ９６／３８５６７）、コルディア（Ｋｏｒｄｉａ）（ＷＯ２０１１／０７６８８９）、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）（ＷＯ２０１１／０７６８７７）およびロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）（ＷＯ２０１１／０７６８９２）などのＨＰＰＤタンパク質、原生生物、例えばブレファリズマ（Ｂｌｅｐｈａｒｉｓｍａ）（ＷＯ２０１１／０７６８８２）などのＨＰＰＤタンパク質、ユリアーキオータ門（ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａ）、例えばピクロフィルス（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ）（ＷＯ２０１１／０７６８８５）などのＨＰＰＤタンパク質、植物、例えばアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）（ＷＯ９６／３８５６７、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）  ＡＦ０４７８３４）、ニンジン（ＷＯ９６／３８５６７、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）  ８７２５７）、アベナ・サティバ（Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ）（ＷＯ２００２／０４６３８７、ＷＯ２０１１／０６８５６７）、コムギ（ＷＯ２００２／０４６３８７）、ブラキアリア・プラチフィラ（Ｂｒａｃｈｉａｒｉａ  ｐｌａｔｙｐｈｙｌｌａ）（ＷＯ２００２／０４６３８７）、ケンクルス・エキナツス（Ｃｅｎｃｈｒｕｓ  ｅｃｈｉｎａｔｕｓ）（ＷＯ２００２／０４６３８７）、ロリウム・リジドゥム（Ｌｏｌｉｕｍ  ｒｉｇｉｄｕｍ）（ＷＯ２００２／０４６３８７）、フェスツカ・アルンディナケア（Ｆｅｓｔｕｃａ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）（ＷＯ２００２／０４６３８７）、セタリア・ファベリ（Ｓｅｔａｒｉａ  ｆａｂｅｒｉ）（ＷＯ２００２／０４６３８７）、エレウシネ・インディカ（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ  ｉｎｄｉｃａ）（ＷＯ２００２／０４６３８７）、ソルガム（ＷＯ２００２／０４６３８７、ＷＯ２０１２／０２１７８５）、コーン（ＷＯ２０１２／０２１７８５）、コクシコイデス（Ｃｏｃｃｉｃｏｉｄｅｓ）（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）  ＣＯＩＴＲＰ）などのＨＰＰＤタンパク質、コプティス・ジャポニカ（Ｃｏｐｔｉｓ  ｊａｐｏｎｉｃａ）（ＷＯ２００６／１３２２７０）、クラミドモナス・レインハルディ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）（ＥＳ２２７５３６５；ＷＯ２０１１／１４５０１５）のＨＰＰＤタンパク質、または哺乳類、例えばマウスもしくはブタなどのＨＰＰＤタンパク質である。
【０００４】
ＨＰＰＤの阻害は、通常はカロテノイドにより提供される光保護の欠如が原因で、光合成の脱共役、集光性補助色素の欠乏、および最も重要なことにＵＶ照射および活性酸素種によるクロロフィルの破壊（退色）につながる（Ｎｏｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５），Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ７：２１３９−２１４９）。光合成的に活性のある組織の退色は、成長阻害および植物の死につながる。
【０００５】
酵素に特異的に結合しながらＨＰＰＤを阻害し、ＨＰＰのホモゲンチセートへの転換を阻害するいくつかの分子は、非常に有効な除草剤であることが明らかにされている。
【０００６】
現在、大半の市販のＨＰＰＤ阻害除草剤は、これらの化合物ファミリーのうちの１つに属する：
１）  トリケトン類、例としてスルコトリオン［すなわち２−［２−クロロ−４−（メチルスルホニル）ベンゾイル］−１，３−シクロヘキサンジオン］、メソトリオン［すなわち２−［４−（メチルスルホニル）−２−ニトロベンゾイル］−１，３−シクロヘキサンジオン］；テンボトリオン［すなわち２−［２−クロロ−４−（メチルスルホニル）−３−［（２，２，２，−トリ−フルオロエトキシ）メチル］ベンゾイル］−１，３−シクロ−ヘキサンジオン］；テフリルトリオン［すなわち２−［２−クロロ−４−（メチルスルホニル）−３−［［（テトラヒドロ−２−フラニル）メトキシ］メチル］ベンゾイル］−１，３−シクロヘキサンジオン］］；ビシクロピロン［すなわち４−ヒドロキシ−３−［［２−［（２−メトキシエトキシ）メチル］−６−（トリフルオロメチル）−３−ピリジニル］カルボニル］ビシクロ［３．２．１］オクタ−３−エン−２−オン］；ベンゾビシクロン［すなわち３−（２−クロロ−４−メシルベンゾイル）−２−フェニルチオビシクロ［３．２．１］オクタ−２−エン−４−オン］；
２）  ジケトニトリル類、例として２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−メチルスルホニル−４−トリフルオロメチルフェニル）−プロパン−１，３−ジオンおよび２−シアノ−１−［４−（メチルスルホニル）−２−トリフルオロメチルフェニル］−３−（１−メチルシクロプロピル）プロパン−１，３−ジオン；
３）  イソオキサゾール類、例としてイソオキサフルトール［すなわち（５−シクロプロピル−４−イソオキサゾリル）［２−（メチルスルホニル）−４−（トリフルオロメチル）フェニル］メタノン］。植物内で、イソオキサフルトールは、ＨＰＰＤ阻害性を示すジケトニトリル化合物であるＤＫＮに迅速に代謝される；
４）  ピラゾリネート類、例としてトプラメゾン［すなわち［３−（４，５−ジヒドロ−３−イソオキサゾリル）−２−メチル−４−（メチルスルホニル）フェニル］（５−ヒドロキシ−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）メタノン］およびピラスルホトール［すなわち（５−ヒドロキシ−１，３−ジメチルピラゾール−４−イル（２−メシル−４−トリフルオロメチルフェニル）メタノン］；ピラゾフェン［すなわち２−［４−（２，４−ジクロロベンゾイル）−１，３−ジメチルピラゾール−５−イルオキシ］アセトフェノン］；
５）  Ｎ  （１，２，５−オキサジアゾール−３−イル）ベンズアミド類（ＷＯ２０１１／０３５８７４）およびＮ−（１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）ベンズアミド類（ＷＯ２０１２／１２６９３２）、例として２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）−３−（メチルスルホニル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（以下「化合物１」とも称される）；
６）  Ｎ−（テトラゾール−５−イル）−またはＮ−（トリアゾール−３−イル）アリールカルボキサミド類（ＷＯ２０１２／０２８５７９）、例として２−クロロ−３−エトキシ−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド（以下「化合物２」とも称される）；４−（ジフルオロメチル）−２−メトキシ−３−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド（以下「化合物３」とも称される）；２−クロロ−３−（メチルスルファニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（以下「化合物４」とも称される）；２−（メトキシメチル）−３−（メチルスルフィニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（以下「化合物５」とも称される）；
７）  ＷＯ２０１３／０５０４２１およびＷＯ２０１３／０８３７７４中に記載されているピリダジノン誘導体類；
８）  ＷＯ２０１３／０７２３００およびＷＯ２０１３／０７２４０２中に記載されている置換１，２，５−オキサジアゾール類；ならびに
９）  ＷＯ２０１３／０５４４９５中に記載されているオキソプラジン誘導体類。
【０００７】
これらのＨＰＰＤ阻害除草剤は、それらが迅速に分解される代謝的耐性を呈する作物植物、例えばトウモロコシ（ゼア・メイズ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ））、イネ（オリザ・サティバ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ））およびコムギ（トリティカム・エスティバム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ））などの圃場内でイネ科雑草および／または広葉雑草に対して用いることができる（Ｓｃｈｕｌｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３），ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔｅｒｓ，３１８，１６２−１６６；Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００１），Ｐｅｓｔ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ  ５７，１２０−１２８；Ｇａｒｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００），Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３９，７５０１−７５０７；Ｐａｌｌｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００１），Ｐｅｓｔ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ  ５７，１３３−１４２）。これらのＨＰＰＤ阻害除草剤の使用範囲を拡大するため、植物、とりわけ代謝的耐性がないまたは低い植物に農場条件下で許容される耐性レベルを付与するためのいくらかの努力がなされている。
【０００８】
ＨＰＰＤ媒介性のホモゲンチセート生産を回避する試み（ＵＳ６，８１２，０１０）のほか、除草剤との関係で十分な量の標的酵素を植物内で生産するための感受性酵素の過剰発現が実施されている（ＷＯ９６／３８５６７）。ＨＰＰＤの過剰発現はイソオキサフルトール（ＩＦＴ）のジケトニトリル誘導体（ＤＫＮ）へのより良好な出芽前耐性をもたらしたが、この耐性レベルは出芽後処理への耐性に十分なものではなかった（Ｍａｔｒｉｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００５），Ｐｅｓｔ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ６１：２６９−２７６）。
【０００９】
第三のストラテジーは、ＨＰＰのホモゲンチセートへの転換を触媒するその性質を保持しつつも変異前の天然のＨＰＰＤよりもＨＰＰＤ阻害剤への感受性が低い標的酵素を得るため、ＨＰＰＤを変異させることであった。
【００１０】
このストラテジーは、２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−メチルスルホニル−４−トリフルオロメチルフェニル）−プロパン−１，３−ジオンおよび２−シアノ−１−［４−（メチルスルホニル）−２−トリフルオロメチルフェニル］−３−（１−メチルシクロプロピル）プロパン−１，３−ジオンに耐性である植物の生産に成功裏に適用されており（ＥＰ４９６６３０）、この２つのＨＰＰＤ阻害除草剤はジケトニトリルファミリーに属する（ＷＯ９９／２４５８５）。Ｐｒｏ２１５Ｌｅｕ、Ｇｌｙ３３６Ｇｌｕ、Ｇｌｙ３３６Ｉｌｅ、よりとりわけにはＧｌｙ３３６Ｔｒｐ（変異アミノ酸の位置はシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＨＰＰＤを参照して指し示されている）は、これらのジケトニトリル除草剤での処理への耐性向上に関与する変異として同定された。
【００１１】
より近年には、シュードモナス・フルオレッセンスＨＰＰＤ遺伝子のタバコおよびダイズの色素体ゲノムへの導入は核形質転換より有効であり、イソオキサフルトールの出芽後施用への耐性を付与することが示されている（Ｄｕｆｏｕｒｍａｎｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００７），Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｊ．５（１）：１１８−３３）。
【００１２】
ＷＯ２００４／０２４９２８中で、本発明者らは、ＨＰＰ前駆体の植物細胞内への流入を増加させることにより、これらの植物細胞におけるプレニルキノン生合成（例としてプラストキノン類、トコフェロール類の合成）を向上させることを模索した。これは、プレフェネートデヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）酵素の過剰発現により前記前駆体の合成を「シキミ酸」経路につなげることによってなされた。彼らはまた、ＰＤＨ酵素をコードする遺伝子およびＨＰＰＤ酵素をコードする遺伝子での植物の形質転換は前記植物のＨＰＰＤ阻害剤への耐性向上を可能にすることを記している。
【００１３】
ＷＯ２００９／１４４０７９中で、シュードモナス・フルオレッセンスＨＰＰＤタンパク質の位置３３６において特定の変異を有するヒドロキシフェニルピルベートジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）をコードする核酸配列およびＨＰＰＤ阻害除草剤に耐性である植物を得るためのその使用が開示された。
【００１４】
ＷＯ２００２／０４６３８７中で、植物起源のＨＰＰＤタンパク質の数個のドメインが様々なＨＰＰＤ阻害除草剤への耐性付与に関連し得るものと同定されたが、上記のドメイン機能の影響を確認するための植物体内データ、生化学的データのいずれも示されていない。
【００１５】
ＷＯ２００８／１５０４７３中で、ＨＰＰＤ阻害除草剤への改良された耐性を得るため、２つの別個の耐性メカニズム−変異ＨＰＰＤ酵素をコードする改変アベナ・サティバ遺伝子およびＣＹＰ４５０トウモロコシモノオキシゲナーゼ（ｎｓｆ１遺伝子）−の組み合わせが例示されたが、両タンパク質の組み合わせに基づく相乗効果を実証するデータは開示されていない。
【００１６】
さらに、ＵＳ２０１１／０１７３７１８中で、例えばアベナ・サティバからの耐性ＨＰＰＤをコードする遺伝子だけでなく、ＨＳＴ（ホモゲンチセートソラネシルトランスフェラーゼ）タンパク質をコードする数個の植物遺伝子との組み合わせを過剰発現させることによりＨＰＰＤ阻害剤に耐性の植物を作成する方法が開示されている。しかしながら、いくつかの選択されたＨＰＰＤ阻害除草剤への耐性レベルはむしろ制限された。
【００１７】
ＷＯ２０１１／０９４１９９およびＵＳ２０１１／０１８５４４４中で、数百のダイズ野生型株のＨＰＰＤ阻害剤イソオキサフルトールへの耐性が評価された。ほとんどの株は除草剤への合理的な耐性レベルを呈さなかった。耐性に関与する推定ＱＴＬ（量的形質座位）が同定された。このゲノム領域中で、観察されたＨＰＰＤ阻害除草剤への耐性改良に関与する主形質であるものとして、ＡＢＣトランスポーターをコードする遺伝子が同定された。しかしながら、同定された遺伝子を発現する遺伝子導入植物は、試験されたＨＰＰＤ阻害除草剤への耐性に何らかの改良を呈さなかった。
【００１８】
ＷＯ２０１０／０８５７０５中で、アベナ・サティバＨＰＰＤの数個の変異体が開示された。いくつかのバリアントはインビトロでトリケトンである「メソトリオン」への耐性改良を呈したが、タバコ植物中ではほとんどの変異体は発現しなかったことが示された。加えて、これらの変異体を発現するタバコ植物のいずれも、野生型アベナ・サティバＨＰＰＤ遺伝子を発現するタバコ植物と比べてメソトリオンまたはイソオキサフルトールへの耐性改良を呈さなかった。
【００１９】
ＵＳ２０１２／００４２４１３は、ＨＰＰＤ活性を持つが少なくとも１のＨＰＰＤ阻害剤への一定の非感受性を示すポリペプチドを記載し、さらにＨＰＰＤ酵素の異なる位置における一定の変異セットを示唆し、最終的に生化学的データ、同様にかかる変異ＨＰＰＤをほとんど含有しない植物の耐性レベルを開示している。ＥＰ２４５３０１２中に、数個のＨＰＰＤ変異体が記載されている；しかしながら、記載された変異体の数個のＨＰＰＤ阻害除草剤に対する耐性改良は、植物体内で実証されなかった。
【００２０】
現在記載され、一部商業化されているＨＰＰＤ阻害除草剤は、遅延結合性（ｓｌｏｗ−ｂｉｎｄｉｎｇ）または遅延強結合性（ｓｌｏｗ，ｔｉｇｈｔ−ｂｉｎｄｉｎｇ）の阻害剤として作用する（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８２）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．７，１０２−１０５を参照されたい）。これらの阻害剤はＨＰＰＤ酵素に緩徐に（すなわちこれらは遅い会合速度、ｋｏｎを持つ）、しかし共有結合性でなく結合し（すなわちこれらは時間依存的阻害を生ずる）、それらと酵素とのきわめて堅固な相互作用に起因して非常に緩徐に放出される（すなわちこれらは格別に遅い解離速度、ｋｏｆｆを持つ）。
【００２１】
これらの阻害剤は堅固に結合することから、酵素との化学量論的滴定が可能である。
【００２２】
遅延結合性または遅延強結合性の阻害剤は並外れて強力なＨＰＰＤ阻害剤であるだけでなく、それらを雑草防除のための魅力的な農薬にする特徴を持つことがますます認識されるようになった。遅い解離速度は、酵素の活性を完全に阻害するのに、および植物細胞内に遊離の阻害剤分子が存在しなくとも長期間この阻害レベルを維持するのに理想的には酵素活性部位あたりただ１つの阻害剤分子で十分な程度にまで、阻害剤の有効性を高める。このことは、作物が生育する領域内で望まれない雑草を防除するためのこれらの阻害剤の施用量が少ないことに言い換えられる。
【００２３】
遅延結合性または遅延強結合性の阻害剤の性質は、ＨＰＰＤ阻害および除草活性の達成をゴールとするときは有利である。しかしながら、これらの性質は、これらの阻害剤に耐性のＨＰＰＤ酵素が設計されることになるときには主要な不都合である。阻害剤の酵素へのアフィニティー（ｐＩ５０）を低減させるだけのＨＰＰＤ酵素の変異は、阻害剤の結合およびＨＰＰＤ酵素の阻害はなお生じることができ、それゆえに、植物細胞内に遊離の阻害剤分子が存在しなくとも長期間、達成された阻害レベルが維持されることから、ＨＰＰＤ阻害を完全に克服するものではない。
【００２４】
現在記載され、一部商業化されているＨＰＰＤ阻害除草剤の全ての上記動的性質が原因となって、ＨＰＰＤ阻害除草剤に対する完全な耐性を有するＨＰＰＤ阻害剤耐性植物は、それらを作成しようとする多くの努力にもかかわらず、今まで達成されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２５】
【特許文献１】ＷＯ９６／３８５６７
【特許文献２】ＷＯ２０１１／０７６８８９
【特許文献３】ＷＯ２０１１／０７６８７７
【特許文献４】ＷＯ２０１１／０７６８９２
【特許文献５】ＷＯ２０１１／０７６８８２
【特許文献６】ＷＯ２０１１／０７６８８５
【特許文献７】ＷＯ２００２／０４６３８７
【特許文献８】ＷＯ２０１１／０６８５６７
【特許文献９】ＷＯ２０１２／０２１７８５
【特許文献１０】ＷＯ２００６／１３２２７０
【特許文献１１】ＥＳ２２７５３６５
【特許文献１２】ＷＯ２０１１／１４５０１５
【特許文献１３】ＷＯ２０１１／０３５８７４
【特許文献１４】ＷＯ２０１２／１２６９３２
【特許文献１５】ＷＯ２０１２／０２８５７９
【特許文献１６】ＷＯ２０１３／０５０４２１
【特許文献１７】ＷＯ２０１３／０８３７７４
【特許文献１８】ＷＯ２０１３／０７２３００
【特許文献１９】ＷＯ２０１３／０７２４０２
【特許文献２０】ＷＯ２０１３／０５４４９５
【特許文献２１】ＵＳ６，８１２，０１０
【特許文献２２】ＥＰ４９６６３０
【特許文献２３】ＷＯ９９／２４５８５
【特許文献２４】ＷＯ２００４／０２４９２８
【特許文献２５】ＷＯ２００９／１４４０７９
【特許文献２６】ＷＯ２００８／１５０４７３
【特許文献２７】ＵＳ２０１１／０１７３７１８
【特許文献２８】ＷＯ２０１１／０９４１９９
【特許文献２９】ＵＳ２０１１／０１８５４４４
【特許文献３０】ＷＯ２０１０／０８５７０５
【特許文献３１】ＵＳ２０１２／００４２４１３
【特許文献３２】ＥＰ２４５３０１２
【非特許文献】
【００２６】
【非特許文献１】Ｃｒｏｕｃｈ  Ｎ．Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．（１９９７），Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５３，２０，６９９３−７０１０
【非特許文献２】Ｆｒｉｔｚｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００４），Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １３４：１３８８−１４００
【非特許文献３】Ｒｕｅｔｓｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０５，４５９−４６６，１９９２
【非特許文献４】Ｎｏｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５），Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ７：２１３９−２１４９
【非特許文献５】Ｓｃｈｕｌｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３），ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔｅｒｓ，３１８，１６２−１６６
【非特許文献６】Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００１），Ｐｅｓｔ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ  ５７，１２０−１２８
【非特許文献７】Ｇａｒｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００），Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３９，７５０１−７５０７
【非特許文献８】Ｐａｌｌｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００１），Ｐｅｓｔ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ  ５７，１３３−１４２
【非特許文献９】Ｍａｔｒｉｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００５），Ｐｅｓｔ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ６１：２６９−２７６
【非特許文献１０】Ｄｕｆｏｕｒｍａｎｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００７），Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｊ．５（１）：１１８−３３
【非特許文献１１】Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８２）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．７，１０２−１０５
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２７】
本発明において、数分類のＨＰＰＤ阻害剤に対して完全な耐性を示すＨＰＰＤ酵素およびそれらを含有する植物が記載される。阻害剤耐性を達成しようとする場合、ＨＰＰＤ阻害剤に対して最大化されたまたは完全な耐性を有するかかる酵素を作成するために、遅延結合性または遅延強結合性阻害剤の解離速度（ｋｏｆｆ）を増加させることが、酵素へのそのアフィニティー（ｐＩ５０）を減少させることよりも重要になることが明らかになった。理想的には、高レベルの阻害剤耐性を得るため、阻害剤のＨＰＰＤ酵素へのアフィニティー（ｐＩ５０）の低減および阻害剤のＨＰＰＤ酵素から離れる解離速度（ｋｏｆｆ）の増加が、変異酵素において同時に達成されるべきである。
【００２８】
本発明において、このゴールは、ＨＰＰＤ阻害剤へのアフィニティーを持たないまたは顕著に低減されたアフィニティーのみを持ち、同時に、ＨＰＰＤ阻害剤が遅延結合性または遅延強結合性の阻害剤としてもはや作用しないがその代わりに完全に可逆的な阻害剤になった程度にまで酵素のＨＰＰＤ阻害剤解離速度を増加させたＨＰＰＤ酵素のセットを設計することにより達成された。
【００２９】
本発明において、前述の特性を持つＨＰＰＤ酵素（すなわちＨＰＰＤ阻害剤へのアフィニティーなし、または顕著に低減されたアフィニティーのみ、酵素のＨＰＰＤ阻害剤解離速度の増加；ＨＰＰＤ阻害剤が遅延結合性または遅延強結合性の阻害剤としてもはや作用しないが完全に可逆的な阻害剤になった）を得るための組成物および方法が提供される。組成物は、ＨＰＰＤおよびかかるポリペプチドをコードする単離された組換え型またはキメラの核酸分子、それらの核酸分子を含むベクターおよび宿主細胞を包含する。組成物はまた、これらのポリペプチドに対する抗体を包含する。ヌクレオチド配列は、微生物および植物といった生物内での形質転換および発現のためのＤＮＡコンストラクトまたは発現カセット内で用いることができる。ヌクレオチド配列は、微生物または植物を限定されることなく包含する生物内での発現のために設計された合成配列であり得る。
【００３０】
組成物は、除草剤耐性ポリペプチドをコードする核酸分子を包含し、これらとしては配列番号１のアミノ酸位置３３５に相当するアミノ酸位置においてプロリンを、および配列番号１のアミノ酸位置３３６に相当するアミノ酸位置においてフェニルアラニンまたはチロシンを持ち、配列番号１のアミノ酸位置１８８、１８９、２００、２１５、２２６、３３９および３４０に相当する位置において１または複数のアミノ酸置換があってもよいシュードモナス・フルオレッセンスＨＰＰＤタンパク質をコードする核酸分子が挙げられ、配列番号７〜３３のいずれかに記載のＨＰＰＤタンパク質、同様にそれらの断片が挙げられる。
【００３１】
組成物はまた、植物、植物細胞、組織および種子のゲノム内への本発明の核酸配列の導入により形質転換されたＨＰＰＤ阻害除草剤に耐性の植物、植物細胞、組織および種子を含む。この配列の導入は、ＨＰＰＤ阻害剤感受性雑草または他の形質転換されていない植物を選択的に殺滅するが、形質転換された生物を殺滅しないようにＨＰＰＤ阻害除草剤を植物に施用することを可能にする。この配列は加えて、１または複数のＨＰＰＤ阻害除草剤の存在下で生育する植物細胞選抜のためのマーカーとして用いることができる。
【００３２】
ＨＰＰＤ阻害剤耐性活性を有するＨＰＰＤ酵素を同定する方法が加えて提供される。
【００３３】
本発明の組成物および方法は、ＨＰＰＤ阻害除草剤への耐性が高められた生物の生産に有用である。これらの生物および生物を含む組成物は、農業目的のために望ましい。本発明によるＨＰＰＤをコードする核酸配列を含む植物または種子は、圃場において生育することができ、これを収穫して植物生産物を得ることができる。本発明の組成物はまた、生産物または生物中でＨＰＰＤ阻害除草剤耐性タンパク質または核酸の存在を検出するのに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１Ａ】図１Ａは、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｆ、配列番号１）、アベナ・サティバ（配列番号３８）、アベナ・サティバからのＨＰＰＤのバリアント（配列番号３９）、ゼア・メイズ（配列番号４０）、ストレプトマイセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）（配列番号４４）、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）（配列番号４１）、ホルデウム・ブルガレ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）（配列番号４２）、ダウクス・カロタ（Ｄａｕｃｕｓ  ｃａｒｏｔａ）（配列番号４３）、ミコスファエレラ・グラミニコラ（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）（配列番号４５）およびコクシコイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｃｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ）（配列番号４６）といった微生物種および植物種からのＨＰＰＤのアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｆ、配列番号１）、アベナ・サティバ（配列番号３８）、アベナ・サティバからのＨＰＰＤのバリアント（配列番号３９）、ゼア・メイズ（配列番号４０）、ストレプトマイセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）（配列番号４４）、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）（配列番号４１）、ホルデウム・ブルガレ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）（配列番号４２）、ダウクス・カロタ（Ｄａｕｃｕｓ  ｃａｒｏｔａ）（配列番号４３）、ミコスファエレラ・グラミニコラ（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）（配列番号４５）およびコクシコイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｃｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ）（配列番号４６）といった微生物種および植物種からのＨＰＰＤのアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【図２Ａ】図２Ａは、１μＭのＨＰＰＤ阻害剤存在下での、時間依存的ＨＰＰＤ変異酵素の時間依存的阻害の例を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、１０μＭの阻害剤存在下での、可逆的ＨＰＰＤ変異酵素の可逆的阻害の例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明は、ここに、添付の図を参照してより完全に以下に記載され、ここでは本発明のいくつかの、しかし全てではない実施形態が示される。実際に、これらの発明は多くの異なる形態で具体化され得るものであり、本明細書中に記載の実施形態に限定されると解釈されるべきではない；むしろ、これらの実施形態は、この開示が適用可能な法的要件を充足するように提供される。全体を通じて同様の番号は同様の要素を指す。
【００３６】
本明細書中に記載されている本発明の多くの改変および他の実施形態は、これらの発明に関係する当業者にとって、前述の記載および関連した図の中に存在する教示の利益を持って思い浮かぶものである。それゆえに、本発明は開示されている特定の実施形態に限定されるものではなく、改変および他の実施形態が添付の特許請求の範囲内に包含されるように意図されることが理解されるものである。本明細書中で特定の用語が使用されるが、それらは一般的な説明の意味のみで用いられ、限定の目的のために用いられるものではない。
【００３７】
概要
広範囲のＨＰＰＤ阻害除草剤への農学的に許容されるレベルの耐性を植物に付与するためにいくらかの努力がなされており、これらの努力としては、ＨＰＰＤ媒介性のホモゲンチセート生産を回避すること（ＵＳ６，８１２，０１０）、除草剤との関係で十分な量の標的酵素を植物内で生産するために感受性酵素を過剰発現させること（ＷＯ９６／３８５６７）、およびＨＰＰのホモゲンチセートへの転換を触媒するその性質を保持しつつも変異前の天然のＨＰＰＤよりもＨＰＰＤ阻害剤への感受性が低い標的酵素を得るためにＨＰＰＤを変異させることが挙げられる。
【００３８】
上記の数個のＨＰＰＤ阻害除草剤への耐性を示す植物の開発のために得られたこれらの成功にもかかわらず、より新しいまたは数個の異なるＨＰＰＤ阻害剤、とりわけトリケトン類（例としてスルコトリオン、メソトリオン、テンボトリオン、ベンゾビシクロンおよびビシクロピロン）、ピラゾリネート類（例としてトプラメゾンおよびピラスルホトール）、Ｎ−（１，２，５−オキサジアゾール−３−イル）ベンズアミド類（ＷＯ２０１１／０３５８７４）、Ｎ−（テトラゾール−４−イル）−またはＮ−（トリアゾール−３−イル）アリールカルボキサミド類（ＷＯ２０１２／０２８５７９）、ピリダジノン誘導体（ＷＯ２０１３／０５０４２１およびＷＯ２０１３／０８３７７４）；置換１，２，５−オキサジアゾール類（ＷＯ２０１３／０７２３００およびＷＯ２０１３／０７２４０２）；ならびにオキソプラジン誘導体（ＷＯ２０１３／０５４４９５）に属するＨＰＰＤ阻害剤への植物の耐性を開発するおよび／または改良することがなお必要である。
【００３９】
したがって、本発明は、ＨＰＰＤ阻害除草剤耐性を調節するための改良された組成物および方法を提供する。Ｎ  （１，２，５−オキサジアゾール−３−イル）ベンズアミド類；Ｎ−（テトラゾール−４−イル）−もしくはＮ−（トリアゾール−３−イル）アリールカルボキサミド類、例えば２−クロロ−３−エトキシ−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミドおよび２−クロロ−３−（メトキシメチル）−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミドなど；Ｎ−（１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）ベンズアミド類、例えば２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）−３−（メチルスルホニル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（化合物１）など；Ｎ−（テトラゾール−５−イル）−もしくはＮ−（トリアゾール−３−イル）アリールカルボキサミド類、例えば２−クロロ−３−エトキシ−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド（化合物２）、４−（ジフルオロメチル）−２−メトキシ−３−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド（化合物３）、２−クロロ−３−（メチルスルファニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（化合物４）、２−（メトキシメチル）−３−（メチルスルフィニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（化合物５）など；ピリダジノン誘導体類（ＷＯ２０１３／０５０４２１およびＷＯ２０１３／０８３７７４）；置換１，２，５−オキサジアゾール類（ＷＯ２０１３／０７２３００およびＷＯ２０１３／０７２４０２）；ならびにオキソプラジン誘導体類（ＷＯ２０１３／０５４４９５）；トリケトン類、例えばテンボトリオン、スルコトリオンおよびメソトリオンなど；イソオキサゾール類、例えばイソオキサフルトールなど；またはピラゾリネート類、例えばピラスルホトールおよびトプラメゾンなどのようなＨＰＰＤ阻害除草剤は、幅広いスペクトルの経済的に重要な単子葉および双子葉の一年生有害植物に対して際立った除草活性を持つ。活性物質はまた、根茎、台木または他の多年生器官からシュートを生む、防除が難しい多年生有害植物に対して効率的に作用する。本発明の意味の中で、「除草剤」は、単独の除草活性物質であるか、またはその効力を変える添加物、例えばその活性を向上させる剤（相乗剤）もしくはその活性を制限する剤（毒性緩和剤）などと組み合わされる除草活性物質であると理解される。除草剤はさらに、製剤技術において通常使用される固体または液体のアジュバントまたは担体（例として自然のまたは再生された無機物質、溶媒、分散剤、湿潤剤、粘着付与剤、乳化剤、成長促進剤など）、同様に１もしくは複数の付加的な除草剤および／または１もしくは複数の駆除剤（例として殺虫剤、殺ウイルス剤、殺微生物剤、抗アメーバ剤、駆除剤、殺真菌剤、殺菌剤、殺線虫剤、殺軟体動物剤など）を含み得る。
【００４０】
方法は、本発明のＨＰＰＤ阻害剤耐性遺伝子をコードするヌクレオチド配列で生物を形質転換すること、またはそうでなければかかるＨＰＰＤ阻害剤耐性遺伝子を、（例として交配、細胞融合により、または導入された本発明のＨＰＰＤ阻害剤遺伝子を含有する生物をそれを含有しない生物と交配し、かかる遺伝子を含有する子孫を得ることにより）それらを含有しない生物内に導入することを伴う。本発明のヌクレオチド配列は、ＨＰＰＤ阻害除草剤への耐性向上を示す植物、とりわけＮ  （１，２，５−オキサジアゾール−３−イル）ベンズアミド類；Ｎ−（テトラゾール−４−イル）−もしくはＮ−（トリアゾール−３−イル）アリールカルボキサミド類、好ましくは例えば２−クロロ−３−エトキシ−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミドおよび２−クロロ−３−（メトキシメチル）−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミドなど；Ｎ−（１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）ベンズアミド類、好ましくは例えば２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）−３−（メチルスルホニル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（化合物１）など；Ｎ−（テトラゾール−５−イル）−もしくはＮ−（トリアゾール−３−イル）アリールカルボキサミド類、好ましくは例えば２−クロロ−３−エトキシ−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド（化合物２）、４−（ジフルオロメチル）−２−メトキシ−３−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド（化合物３）、２−クロロ−３−（メチルスルファニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（化合物４）および２−（メトキシメチル）−３−（メチルスルフィニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（化合物５）など；ピリダジノン誘導体類（ＷＯ２０１３／０５０４２１およびＷＯ２０１３／０８３７７４）；置換１，２，５−オキサジアゾール類（ＷＯ２０１３／０７２３００およびＷＯ２０１３／０７２４０２）；ならびにオキソプラジン誘導体類（ＷＯ２０１３／０５４４９５）；トリケトン類、好ましくは例えばテンボトリオン、スルコトリオンおよびメソトリオンなど；イソオキサゾール類、好ましくは例えばイソオキサフルトールなど；またはピラゾリネート類、好ましくは例えばピラスルホトールおよびトプラメゾンなどのＨＰＰＤ阻害除草剤への耐性向上を示す植物を調製するのに有用である。本発明のＨＰＰＤ阻害除草剤耐性遺伝子はまた、「クマロン誘導体除草剤」（ＷＯ２００９／０９０４０１、ＷＯ２００９／０９０４０２、ＷＯ２００８／０７１９１８、ＷＯ２００８／００９９０８中に記載されている）に対して耐性を示し得る。この点において、本発明のＨＰＰＤ阻害除草剤耐性遺伝子のうちのいずれか１つを、ＷＯ２０１１／１４５０１５、ＷＯ２０１３／０６４９８７、ＷＯ２０１３／０６４９６４またはＷＯ２０１０／０２９３１１中に記載���れているようにキメラのホモゲンチセートソラネシルトランスフェラーゼ（ＨＳＴ）遺伝子または変異ＨＳＴ遺伝子も発現する植物中で発現させて、ＨＳＴ阻害除草剤に耐性の植物を得ることもできる。本明細書中で用いられる「クマロン誘導体除草剤」または「ＨＳＴ阻害除草剤」は、ＩＵＰＡＣ名称５Ｈ−チオピラノ［４，３−ｂ］ピリジン−８−オール、５Ｈ−チオピラノ［３，４−ｂ］ピラジン−８−オール、オキサチイノ［５，６−ｂ］ピリジン−４−オールおよびオキサチイノ［５，６−ｂ］ピラジン−４−オールに該当する化合物を包含する。
【００４１】
したがって、本発明の「ＨＰＰＤ阻害除草剤耐性」遺伝子とは、そのタンパク質を発現しない細胞もしくは生物よりも高濃度のＨＰＰＤ阻害除草剤に耐える能力、もしくはそのタンパク質を発現しない細胞もしくは生物よりも長時間、一定濃度のＨＰＰＤ阻害除草剤に耐える能力を細胞もしくは生物に対して付与するタンパク質をコードする遺伝子が意図され、またはかかるタンパク質を発現しない細胞もしくは生物よりも観察される損傷もしくは成長阻害が少ないながら光合成を実施する、成長するおよび／もしくは繁殖する能力を細胞もしくは生物に対して付与するタンパク質をコードする遺伝子が意図される。「ＨＰＰＤ阻害剤耐性タンパク質」は、そのタンパク質を発現しない細胞もしくは生物よりも高濃度のＨＰＰＤ阻害除草剤に耐える能力、もしくはそのタンパク質を発現しない細胞もしくは生物よりも長期間、一定濃度のＨＰＰＤ阻害除草剤に耐える能力を細胞もしくは生物に対して付与するタンパク質、またはかかるタンパク質を発現しない細胞もしくは生物よりも観察される損傷もしくは成長阻害が少ないながら光合成を実施する、成長するおよび／もしくは繁殖する能力を細胞もしくは生物に対して付与するタンパク質を包含する。「耐える」または「耐性」とは、特定のＨＰＰＤ阻害除草剤施用から生き延びること、または必須の細胞機能、例えば光合成、タンパク質合成もしくは呼吸および繁殖などを未処理の細胞もしくは生物と容易に識別可能でないように行う能力、またはＨＰＰＤ阻害除草剤で処理された植物の収量がかかる除草剤で処理されない（しかし、ＨＰＰＤ阻害除草剤の施用以外のメカニズム、例えばＷＯ２０１１／１００３０２（この文献は参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる）中に記載されている方法などにより雑草が除去または防がれた）植物と比べて顕著な差がないもしくは収量が改善すらされる能力が意図される。
【００４２】
細胞に対してＨＰＰＤ阻害剤耐性を付与するのに加えて、本発明のＨＰＰＤ核酸配列は、ＨＰＰＤ活性を持つ、すなわちパラ−ヒドロキシフェニルピルベート（ＨＰＰ）をホモゲンチセートに転換する反応を触媒するポリペプチドをコードする。ＨＰＰＤ酵素の触媒活性は、当該技術分野で周知の様々な方法により定義され得る。ＷＯ２００９／１４４０７９は、様々な好適なスクリーニング方法を記載している。
【００４３】
ＨＰＰＤタンパク質の酵素活性は、ＨＰＰもしくはＯ２基質の量の減少を測定すること、または酵素反応に由来する生成物、すなわちホモゲンチセートもしくはＣＯ２のいずれかの蓄積を測定することを可能にする任意の方法により測定することができる。具体的には、ＨＰＰＤ活性は、ＷＯ２００９／１４４０７９；Ｇａｒｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３２５，７６１−７６９；Ｇａｒｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９），Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１９，１５０７−１５１６；またはＷＯ２０１２／０２１７８５中に記載されている方法を使って測定することができ、これらの文献は参照により本明細書中に組み込まれる。
【００４４】
本発明の目的のため、「参照」ＨＰＰＤタンパク質（またはＨＰＰＤ遺伝子）は、本発明のＨＰＰＤタンパク質またはＨＰＰＤ核酸が比較されている任意のＨＰＰＤタンパク質または核酸である。本発明のＨＰＰＤタンパク質を記述する目的のため、用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は交換可能に用いられる。この参照ＨＰＰＤは天然の植物、細菌もしくは動物のＨＰＰＤであることができ、または当該技術分野で公知の変異ＨＰＰＤ、例えば国際特許公開ＷＯ２００９／１４４０７９中に記載され、本明細書中にそれぞれ配列番号２０および２として記載されているＰｆＰ２１５ＬおよびＰｆＧ３３６Ｆ変異体などであることができ、または本明細書中にそれぞれ配列番号６および３４〜３７として記載され、２０１３年９月１３日出願の国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／５９５９８（この文献は参照により本明細書中に組み込まれる）中にも記載されているＰｆＨＰＰＤｅｖｏ３３、ＰｆＨＰＰＤｅｖｏ３６、ＰｆＨＰＰＤｅｖｏ３７、ＰｆＨＰＰＤｅｖｏ４０もしくはＰｆＨＰＰＤｅｖｏ４１タンパク質のいずれかであることもできる。かかる参照ＨＰＰＤは、本発明のＨＰＰＤタンパク質または核酸が目的の特定の性質（例として改良された、同等のまたは減少したＨＰＰＤ阻害除草剤耐性またはＨＰＰＤ酵素活性；宿主細胞における改良された、同等のまたは減少した発現；改良された、同等のまたは減少したタンパク質安定性など）を持つか否かを決定するために用いることができる。
【００４５】
本明細書中の様々な実施形態において、核酸によりコードされるＨＰＰＤ阻害除草剤耐性タンパク質（その単離された組換え型キメラ遺伝子、この核酸を含むベクター、宿主細胞、植物、植物部分および種子、この核酸によりコードされるＨＰＰＤポリペプチドおよびその組成物、同様に植物のＨＰＰＤ阻害除草剤への耐性を向上させるために、とりわけＮ  （１，２，５−オキサジアゾール−３−イル）ベンズアミド類；Ｎ−（テトラゾール−４−イル）−もしくはＮ−（トリアゾール−３−イル）アリールカルボキサミド類、好ましくは例えば２−クロロ−３−エトキシ−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミドおよび２−クロロ−３−（メトキシメチル）−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミドなど；Ｎ−（１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）ベンズアミド類、好ましくは例えば２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）−３−（メチルスルホニル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（化合物１）など；Ｎ−（テトラゾール−５−イル）−もしくはＮ−（トリアゾール−３−イル）アリールカルボキサミド類、好ましくは例えば２−クロロ−３−エトキシ−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド（化合物２）、４−（ジフルオロメチル）−２−メトキシ−３−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド（化合物３）、２−クロロ−３−（メチルスルファニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（化合物４）および２−（メトキシメチル）−３−（メチルスルフィニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（化合物５）など；ピリダジノン誘導体類（ＷＯ２０１３／０５０４２１およびＷＯ２０１３／０８３７７４）；置換１，２，５−オキサジアゾール類（ＷＯ２０１３／０７２３００およびＷＯ２０１３／０７２４０２）；ならびにオキソプラジン誘導体類（ＷＯ２０１３／０５４４９５）；トリケトン類、好ましくは例えばテンボトリオン、スルコトリオンおよびメソトリオンなど；イソオキサゾール類、好ましくは例えばイソオキサフルトールなど；またはピラゾリネート類、好ましくは例えばピラスルホトールおよびトプラメゾンなどのＨＰＰＤ阻害除草剤への耐性向上のためにこの核酸によりコードされるタンパク質を用いる方法を包含する）は、配列番号１のアミノ酸位置３３５に相当するアミノ酸位置においてプロリンを、および配列番号１のアミノ酸位置３３６に相当する位置においてフェニルアラニンまたはチロシンを持ち、ならびに配列番号１のアミノ酸位置１８８、１８９、２００、２１５、２２６、３３９および３４０に相当する位置において１または複数のアミノ酸置換があってもよく、これらは配列番号７〜３３のいずれかに記載のＨＰＰＤタンパク質を包含する。「に相当する」とは、本明細書中の別の場所に記載されている標準的なアラインメントアルゴリズムを用いて２（またはそれ���り多い）配列をアラインしたときに配列番号１中のその位置に相対的なヌクレオチドまたはアミノ酸の位置が意図される。配列番号１と様々な微生物種および植物種からのＨＰＰＤアミノ酸配列との代表的アラインメントを図１中に示す。例えば、配列番号１のアミノ酸位置１８８、２１５、３３５、３３６、３３９および３４０は、それぞれアベナ・サティバからのＨＰＰＤ（配列番号３８）のアミノ酸位置２４１、２７１、４１２、４１３、４１６および４１７に相当し；それぞれホルデウム・ブルガレ（配列番号４２）からのＨＰＰＤのアミノ酸位置２３５、２６５、４０６、４０７、４１０および４１１に相当し、ならびにそれぞれゼア・メイズ（配列番号４０）からのＨＰＰＤのアミノ酸位置２４２、２７２、４１３、４１４、４１７および４１８に相当する。様々な種からの多数のＨＰＰＤアミノ酸配列のアラインメントは、欧州特許公開番号ＥＰ２４５３０１２の表２ａおよび２ｂ中にも見出され、この文献は参照により本明細書中に組み込まれる。したがって、関心ＨＰＰＤアミノ酸配列の長さ、配列番号１の配列より付加的な残基を持つかまたは少ない残基を持つかに応じて、相当する位置を、かかる関心ＨＰＰＤタンパク質中の位置１８８、１８９、２００、２１５、２２６、３３５、３３６、３３９および３４０と異なる位置に置くことができる。
【００４６】
１の実施形態において、本発明のＨＰＰＤ（これをコードするヌクレオチド配列およびその組換え型キメラ遺伝子、本発明のＨＰＰＤをコードするヌクレオチド配列を含むベクター、宿主細胞、植物、植物部分および種子を包含する）は、配列番号１のアミノ酸位置３３５に相当するアミノ酸位置においてプロリンを、および配列番号１のアミノ酸位置３３６に相当する位置においてフェニルアラニンまたはチロシンを含むアミノ酸配列からなる。
【００４７】
別の実施形態において、本発明のＨＰＰＤ（これをコードするヌクレオチド配列およびその組換え型キメラ遺伝子、本発明のＨＰＰＤをコードするヌクレオチド配列を含むベクター、宿主細胞、植物、植物部分および種子を包含する）は、
ｉ．  配列番号１のアミノ酸位置３３５に相当するアミノ酸位置においてプロリンを、および配列番号１のアミノ酸位置３３６に相当する位置においてフェニルアラニンまたはチロシンを、ならびに
ｉｉ．  配列番号１のアミノ酸位置１８８に相当するアミノ酸位置においてアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンまたはバリンを；ならびに
ｉｉｉ．  配列番号１のアミノ酸位置１８９に相当するアミノ酸位置においてアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンまたはバリンを；ならびに
ｉｖ．  配列番号１のアミノ酸位置２００に相当するアミノ酸位置においてイソロイシン、ロイシンまたはメチオニンを；ならびに
ｖ．  配列番号１のアミノ酸位置２１５に相当するアミノ酸位置においてアラニン、ロイシン、プロリンまたはアスパラギンを；ならびに
ｖｉ．  配列番号１のアミノ酸位置２２６に相当するアミノ酸位置においてヒスチジンまたはグルタミンを；ならびに
ｖｉｉ．  配列番号１のアミノ酸位置３３９に相当するアミノ酸位置においてヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、グルタミン、アルギニン、アラニン、リジン、セリン、スレオニンまたはバリンを；ならびに
ｖｉｉｉ．  配列番号１のアミノ酸位置３４０に相当するアミノ酸位置においてアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンまたはバリン
を含むアミノ酸配列からなる。
【００４８】
別の実施形態において、本発明のＨＰＰＤ（これをコードするヌクレオチド配列およびその組換え型キメラ遺伝子、本発明のＨＰＰＤをコードするヌクレオチド配列を含むベクター、宿主細胞、植物、植物部分および種子を包含する）は、
ｉ．  配列番号１のアミノ酸位置３３５に相当するアミノ酸位置においてプロリンを、および配列番号１のアミノ酸位置３３６に相当する位置においてフェニルアラニンまたはチロシンを、ならびに
ｉｉ．  配列番号１のアミノ酸位置１８８に相当するアミノ酸位置においてアラニン、グリシン、ヒスチジン、セリンまたはトリプトファンを；ならびに
ｉｉｉ．  配列番号１のアミノ酸位置１８９に相当するアミノ酸位置においてアルギニン、システイン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グリシン、ヒスチジン、フェニルアラニンまたはセリンを；ならびに
ｉｖ．  配列番号１のアミノ酸位置２００に相当するアミノ酸位置においてイソロイシン、ロイシンまたはメチオニンを；ならびに
ｖ．  配列番号１のアミノ酸位置２１５に相当するアミノ酸位置においてアラニン、ロイシン、プロリンまたはアスパラギンを；ならびに
ｖｉ．  配列番号１のアミノ酸位置２２６に相当するアミノ酸位置においてヒスチジンまたはグルタミンを；ならびに
ｖｉｉ．  配列番号１のアミノ酸位置３３９に相当するアミノ酸位置においてセリン、アラニン、スレオニン、グルタミンまたはリジンを；ならびに
ｖｉｉｉ．  配列番号１のアミノ酸位置３４０に相当するアミノ酸位置においてアラニン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、グリシンまたはロイシン
を含むアミノ酸配列からなる。
【００４９】
別の実施形態において、本発明のＨＰＰＤ（これをコードするヌクレオチド配列およびその組換え型キメラ遺伝子、本発明のＨＰＰＤをコードするヌクレオチド配列を含むベクター、宿主細胞、植物、植物部分および種子を包含する）は、
ｉ．  配列番号１のアミノ酸位置３３５に相当するアミノ酸位置においてプロリンを、および配列番号１のアミノ酸位置３３６に相当する位置においてフェニルアラニンまたはチロシンを、ならびに
ｉｉ．  配列番号１のアミノ酸位置１８８に相当するアミノ酸位置においてアラニンまたはグリシンを；ならびに
ｉｉｉ．  配列番号１のアミノ酸位置１８９に相当するアミノ酸位置においてアルギニン、システイン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはグリシンを；ならびに
ｉｖ．  配列番号１のアミノ酸位置２００に相当するアミノ酸位置においてイソロイシン、ロイシンまたはメチオニンを；ならびに
ｖ．  配列番号１のアミノ酸位置２１５に相当するアミノ酸位置においてアラニン、ロイシン、プロリンまたはアスパラギンを；ならびに
ｖｉ．  配列番号１のアミノ酸位置２２６に相当するアミノ酸位置においてヒスチジンまたはグルタミンを；ならびに
ｖｉｉ．  配列番号１のアミノ酸位置３３９に相当するアミノ酸位置においてアラニンまたはリジンを；ならびに
ｖｉｉｉ．  配列番号１のアミノ酸位置３４０に相当するアミノ酸位置においてアラニン、グルタミン酸、グルタミンまたはグリシン
を含むアミノ酸配列からなる。
【００５０】
別の実施形態において、本発明のＨＰＰＤ（これをコードするヌクレオチド配列およびその組換え型キメラ遺伝子、本発明のＨＰＰＤをコードするヌクレオチド配列を含むベクター、宿主細胞、植物、植物部分および種子を包含する）は、
ｉ．  配列番号１のアミノ酸位置３３５に相当するアミノ酸位置においてプロリンを、および
ａ．  配列番号１のアミノ酸位置３３６に相当する位置においてフェニルアラニンを、または
ｂ．  配列番号１のアミノ酸位置３３６に相当する位置においてチロシンを、ならびに
ｉｉ．  配列番号１のアミノ酸位置３３９に相当するアミノ酸位置においてアラニンを；ならびに
ｉｉｉ．  配列番号１のアミノ酸位置３４０に相当するアミノ酸位置においてグルタミン
を含むアミノ酸配列からなる。
【００５１】
別の実施形態において、本発明のＨＰＰＤ（これをコードするヌクレオチド配列およびその組換え型キメラ遺伝子、本発明のＨＰＰＤをコードするヌクレオチド配列を含むベクター、宿主細胞、植物、植物部分および種子を包含する）は、配列番号１のアミノ酸位置３３５に相当するアミノ酸位置においてプロリンを、および
ａ．  配列番号１のアミノ酸位置３３６に相当する位置においてフェニルアラニンを、または
ｂ．  配列番号１のアミノ酸位置３３６に相当する位置においてチロシンを、および
配列番号１のアミノ酸位置３４０に相当するアミノ酸位置においてグルタミン酸
を含むアミノ酸配列からなる。
【００５２】
別の実施形態において、本発明のＨＰＰＤ（これをコードするヌクレオチド配列およびその組換え型キメラ遺伝子、本発明のＨＰＰＤをコードするヌクレオチド配列を含むベクター、宿主細胞、植物、植物部分および種子を包含する）は、
ｉ．  配列番号１のアミノ酸位置３３５に相当するアミノ酸位置においてプロリンを、および
ａ．  配列番号１のアミノ酸位置３３６に相当する位置においてフェニルアラニンを、または
ｂ．  配列番号１のアミノ酸位置３３６に相当する位置においてチロシンを、ならびに
ｉｉ．  配列番号１のアミノ酸位置２１５に相当するアミノ酸位置においてロイシン
を含むアミノ酸配列からなる。
【００５３】
別の実施形態において、本発明のＨＰＰＤ（これをコードするヌクレオチド配列およびその組換え型キメラ遺伝子、本発明のＨＰＰＤをコードするヌクレオチド配列を含むベクター、宿主細胞、植物、植物部分および種子を包含する）は、
ｉ．  配列番号１のアミノ酸位置３３５に相当するアミノ酸位置においてプロリンを、および
ａ．  配列番号１のアミノ酸位置３３６に相当する位置においてフェニルアラニンを、または
ｂ．  配列番号１のアミノ酸位置３３６に相当する位置においてチロシンを、ならびに
ｉｉ．  配列番号１のアミノ酸位置２１５に相当するアミノ酸位置においてロイシンを、ならびに
ｉｉｉ．  配列番号１のアミノ酸位置３４０に相当するアミノ酸位置においてグルタミン酸
を含むアミノ酸配列からなる。
【００５４】
別の実施形態において、本発明のＨＰＰＤ（これをコードするヌクレオチド配列およびその組換え型キメラ遺伝子、本発明のＨＰＰＤをコードするヌクレオチド配列を含むベクター、宿主細胞、植物、植物部分および種子を包含する）は、
ｉ．  配列番号１のアミノ酸位置３３５に相当するアミノ酸位置においてプロリンを、および
ａ．  配列番号１のアミノ酸位置３３６に相当する位置においてフェニルアラニンを、または
ｂ．  配列番号１のアミノ酸位置３３６に相当する位置においてチロシンを、ならびに
ｉｉ．  配列番号１のアミノ酸位置１８８に相当するアミノ酸位置においてグリシンを、ならびに
ｉｉｉ．  配列番号１のアミノ酸位置１８９に相当するアミノ酸位置においてシステインを、ならびに
ｉｖ．  配列番号１のアミノ酸位置２１５に相当するアミノ酸位置においてロイシンを、ならびに
ｖ．  配列番号１のアミノ酸位置３４０に相当するアミノ酸位置においてグルタミン酸
を含むアミノ酸配列からなる。
【００５５】
別の実施形態において、本発明のＨＰＰＤ（これをコードするヌクレオチド配列およびその組換え型キメラ遺伝子、本発明のＨＰＰＤをコードするヌクレオチド配列を含むベクター、宿主細胞、植物、植物部分および種子を包含する）は、
ｉ．  配列番号１のアミノ酸位置３３５に相当するアミノ酸位置においてプロリンを、および
ａ．  配列番号１のアミノ酸位置３３６に相当する位置においてフェニルアラニンを、または
ｂ．  配列番号１のアミノ酸位置３３６に相当する位置においてチロシンを、ならびに
ｉｉ．  配列番号１のアミノ酸位置１８８に相当するアミノ酸位置においてグリシンを、ならびに
ｉｉｉ．  配列番号１のアミノ酸位置１８９に相当するアミノ酸位置においてシステインを、ならびに
ｉｖ．  配列番号１のアミノ酸位置３４０に相当するアミノ酸位置においてグルタミン酸
を含むアミノ酸配列からなる。
【００５６】
別の実施形態において、本発明のＨＰＰＤ（これをコードするヌクレオチド配列およびその組換え型キメラ遺伝子、本発明のＨＰＰＤをコードするヌクレオチド配列を含むベクター、宿主細胞、植物、植物部分および種子を包含する）は、
ｉ．  配列番号１のアミノ酸位置３３５に相当するアミノ酸位置においてプロリンを、および
ａ．  配列番号１のアミノ酸位置３３６に相当する位置においてフェニルアラニンを、または
ｂ．  配列番号１のアミノ酸位置３３６に相当する位置においてチロシンを、ならびに
ｉｉ．  配列番号１のアミノ酸位置２１５に相当するアミノ酸位置においてアスパラギンを、ならびに
ｉｉｉ．  配列番号１のアミノ酸位置３４０に相当するアミノ酸位置においてグルタミン酸
を含むアミノ酸配列からなる。
【００５７】
別の実施形態において、本発明のＨＰＰＤ（これをコードするヌクレオチド配列およびその組換え型キメラ遺伝子、本発明のＨＰＰＤをコードするヌクレオチド配列を含むベクター、宿主細胞、植物、植物部分および種子を包含する）は、
ｉ．  配列番号１のアミノ酸位置３３５に相当するアミノ酸位置においてプロリンを、および
ａ．  配列番号１のアミノ酸位置３３６に相当する位置においてフェニルアラニンを、または
ｂ．  配列番号１のアミノ酸位置３３６に相当する位置においてチロシンを、ならびに
ｉｉ．  配列番号１のアミノ酸位置２１５に相当するアミノ酸位置においてアラニンを、ならびに
ｉｉｉ．  配列番号１のアミノ酸位置３４０に相当するアミノ酸位置においてグルタミン酸
を含むアミノ酸配列からなる。
【００５８】
別の実施形態において、本発明のＨＰＰＤ（これをコードするヌクレオチド配列およびその組換え型キメラ遺伝子、本発明のＨＰＰＤをコードするヌクレオチド配列を含むベクター、宿主細胞、植物、植物部分および種子を包含する）は、
ｉ．  配列番号１のアミノ酸位置３３５に相当するアミノ酸位置においてプロリンを、および
ａ．  配列番号１のアミノ酸位置３３６に相当する位置においてフェニルアラニンを、または
ｂ．  配列番号１のアミノ酸位置３３６に相当する位置においてチロシンを、ならびに
ｉｉ．  配列番号１のアミノ酸位置２１５に相当するアミノ酸位置においてロイシンを、ならびに
ｉｉｉ．  配列番号１のアミノ酸位置３４０に相当するアミノ酸位置においてグリシン
を含むアミノ酸配列からなる。
【００５９】
別の実施形態において、本発明のＨＰＰＤ（これをコードするヌクレオチド配列およびその組換え型キメラ遺伝子、本発明のＨＰＰＤをコードするヌクレオチド配列を含むベクター、宿主細胞、植物、植物部分および種子を包含する）は、
ｉ．  配列番号１のアミノ酸位置３３５に相当するアミノ酸位置においてプロリンを、および
ａ．  配列番号１のアミノ酸位置３３６に相当する位置においてフェニルアラニンを、または
ｂ．  配列番号１のアミノ酸位置３３６に相当する位置においてチロシンを、ならびに
ｉｉ．  配列番号１のアミノ酸位置２００に相当するアミノ酸位置においてイソロイシンを、ならびに
ｉｉｉ．  配列番号１のアミノ酸位置２１５に相当するアミノ酸位置においてロイシンを、ならびに
ｉｖ．  配列番号１のアミノ酸位置３４０に相当するアミノ酸位置においてグルタミン酸
を含むアミノ酸配列からなる。
【００６０】
別の実施形態において、本発明のＨＰＰＤ（これをコードするヌクレオチド配列およびその組換え型キメラ遺伝子、本発明のＨＰＰＤをコードするヌクレオチド配列を含むベクター、宿主細胞、植物、植物部分および種子を包含する）は、
ｉ．  配列番号１のアミノ酸位置３３５に相当するアミノ酸位置においてプロリンを、および
ａ．  配列番号１のアミノ酸位置３３６に相当する位置においてフェニルアラニンを、または
ｂ．  配列番号１のアミノ酸位置３３６に相当する位置においてチロシンを、ならびに
ｉｉ．  配列番号１のアミノ酸位置２００に相当するアミノ酸位置においてイソロイシンを、ならびに
ｉｉｉ．  配列番号１のアミノ酸位置３４０に相当するアミノ酸位置においてグルタミン酸
を含むアミノ酸配列からなる。
【００６１】
別の実施形態において、本発明のＨＰＰＤ（これをコードするヌクレオチド配列およびその組換え型キメラ遺伝子、本発明のＨＰＰＤをコードするヌクレオチド配列を含むベクター、宿主細胞、植物、植物部分および種子を包含する）は、
ｉ．  配列番号１のアミノ酸位置３３５に相当するアミノ酸位置においてプロリンを、および
ａ．  配列番号１のアミノ酸位置３３６に相当する位置においてフェニルアラニンを、または
ｂ．  配列番号１のアミノ酸位置３３６に相当する位置においてチロシンを、ならびに
ｉｉ．  配列番号１のアミノ酸位置２００に相当するアミノ酸位置においてメチオニンを、ならびに
ｉｉｉ．  配列番号１のアミノ酸位置３４０に相当するアミノ酸位置においてグルタミン酸
を含むアミノ酸配列からなる。
【００６２】
別の実施形態において、本発明のＨＰＰＤ（これをコードするヌクレオチド配列およびその組換え型キメラ遺伝子、本発明のＨＰＰＤをコードするヌクレオチド配列を含むベクター、宿主細胞、植物、植物部分および種子を包含する）は、
ｉ．  配列番号１のアミノ酸位置３３５に相当するアミノ酸位置においてプロリンを、および
ａ．  配列番号１のアミノ酸位置３３６に相当する位置においてフェニルアラニンを、または
ｂ．  配列番号１のアミノ酸位置３３６に相当する位置においてチロシンを、ならびに
ｉｉ．  配列番号１のアミノ酸位置２００に相当するアミノ酸位置においてメチオニンを、ならびに
ｉｉｉ．  配列番号１のアミノ酸位置２１５に相当するアミノ酸位置においてロイシンを、ならびに
ｉｖ．  配列番号１のアミノ酸位置３４０に相当するアミノ酸位置においてグルタミン酸
を含むアミノ酸配列からなる。
【００６３】
別の実施形態において、本発明のＨＰＰＤ（これをコードするヌクレオチド配列およびその組換え型キメラ遺伝子、本発明のＨＰＰＤをコードするヌクレオチド配列を含むベクター、宿主細胞、植物、植物部分および種子を包含する）は、
ｉ．  配列番号１のアミノ酸位置３３５に相当するアミノ酸位置においてプロリンを、および
ａ．  配列番号１のアミノ酸位置３３６に相当する位置においてフェニルアラニンを、または
ｂ．  配列番号１のアミノ酸位置３３６に相当する位置においてチロシンを、ならびに
ｉｉ．  配列番号１のアミノ酸位置２１５に相当するアミノ酸位置においてロイシンを、ならびに
ｉｉｉ．  配列番号１のアミノ酸位置２２６に相当するアミノ酸位置においてヒスチジンを、ならびに
ｉｖ．  配列番号１のアミノ酸位置３４０に相当するアミノ酸位置においてグルタミン酸
を含むアミノ酸配列からなる。
【００６４】
別の実施形態において、本発明のＨＰＰＤ（これをコードするヌクレオチド配列およびその組換え型キメラ遺伝子、本発明のＨＰＰＤをコードするヌクレオチド配列を含むベクター、宿主細胞、植物、植物部分および種子を包含する）は、
ｉ．  配列番号１のアミノ酸位置３３５に相当するアミノ酸位置においてプロリンを、および
ａ．  配列番号１のアミノ酸位置３３６に相当する位置においてフェニルアラニンを、または
ｂ．  配列番号１のアミノ酸位置３３６に相当する位置においてチロシンを、ならびに
ｉｉ．  配列番号１のアミノ酸位置１８８に相当するアミノ酸位置においてグリシンを、ならびに
ｉｉｉ．  配列番号１のアミノ酸位置１８９に相当するアミノ酸位置においてシステインを、ならびに
ｉｖ．  配列番号１のアミノ酸位置２１５に相当するアミノ酸位置においてアスパラギンを、ならびに
ｖ．  配列番号１のアミノ酸位置３４０に相当するアミノ酸位置においてグルタミン酸
を含むアミノ酸配列からなる。
【００６５】
別の実施形態において、本発明のＨＰＰＤ（これをコードするヌクレオチド配列およびその組換え型キメラ遺伝子、本発明のＨＰＰＤをコードするヌクレオチド配列を含むベクター、宿主細胞、植物、植物部分および種子を包含する）は、
ｉ．  配列番号１のアミノ酸位置３３５に相当するアミノ酸位置においてプロリンを、および
ａ．  配列番号１のアミノ酸位置３３６に相当する位置においてフェニルアラニンを、または
ｂ．  配列番号１のアミノ酸位置３３６に相当する位置においてチロシンを、ならびに
ｉｉ．  配列番号１のアミノ酸位置２２６に相当するアミノ酸位置においてヒスチジンを、ならびに
ｉｉｉ．  配列番号１のアミノ酸位置３４０に相当するアミノ酸位置においてグルタミン酸
を含むアミノ酸配列からなる。
【００６６】
参照ＨＰＰＤタンパク質および１または複数のアミノ酸置換を含む本発明によるＨＰＰＤタンパク質の関連するアミノ酸位置を表１中にまとめる。
【００６７】
表１．配列番号１に対する参照ＨＰＰＤタンパク質および本発明によるＨＰＰＤタンパク質のアミノ酸置換。本明細書中の配列プロトコールおよび参考文献によるクローン識別番号カラム１及びそれぞれの配列番号も含有する。空白の場合、その位置に野生型アミノ酸配列（ＰｆＨＰＰＤ）が存在する。
【表１】
2017514457.tif 000002
2017514457.tif 000003
【００６８】
別の実施形態において、本発明によるＨＰＰＤタンパク質は、本明細書中に配列番号１として記載されているアミノ酸配列に対して少なくとも５３％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を持つ。
【００６９】
本発明によって改変することができる例示的なＨＰＰＤ配列としては、細菌からのもの、例えばシュードモナス属種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）型のもの、またはそうでなければラン藻、例えばシネコシスチス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）属のものが挙げられる。配列はまた、植物起源、とりわけ双子葉植物または単子葉植物由来であることもできる。言及され得る有利な例は、植物、例えばタバコ、アラビドプシス・タリアナ（ＷＯ９６／３８５６７）、ダウクス・カロタ（ＷＯ９６／３８５６７）、ゼア・メイズ（コーン、ＷＯ２０１２／０２１７８５）、コムギ（トリティカム・エスティバム、ＷＯ２００２／０４６３８７）、オオムギ（ＥＰ２４５３０１２）、アベナ・サティバ（ＷＯ２００２／０４６３８７／ＷＯ２０１１／０６８５６７）、ブラキアリア・プラチフィラ（ＷＯ２００２／０４６３８７）、ケンクルス・エキナツス（ＷＯ２００２／０４６３８７）、ロリウム・リジドゥム（ＷＯ２００２／０４６３８７）、フェスツカ・アルンディナケア（ＷＯ２００２／０４６３８７）、セタリア・ファベリ（ＷＯ２００２／０４６３８７）、エレウシネ・インディカ（ＷＯ２００２／０４６３８７）またはソルガム（ＷＯ２００２／０４６３８７、ＷＯ２０１２／０２１７８５）などである。本発明の特定の実施形態において、本発明によって改変することができるＨＰＰＤは、細菌または原生生物起源からのもの、とりわけシュードモナス属種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）からのもの、よりとりわけにはシュードモナス・フルオレッセンス、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・テストステロニ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）（コマモナス・テストステロニ（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ））、ロドコッカス属種（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）（ＷＯ２０１１／０７６８９２）、ブレファリズマ・ジャポニカム（Ｂｌｅｐｈａｒｉｓｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）（ＷＯ２０１１／０７６８８２）、シネココッカス属種（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）（ＷＯ２０１１／０７６８７７）、コルディア・アルジシダ（Ｋｏｒｄｉａ  ａｌｇｉｃｉｄａ）（ＷＯ２０１１／０７６８８９）からのものであり、ユリアーキオータ門（ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏａｔｅ）のピクロフィルス・トリダス（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ  ｔｏｒｒｉｄｕｓ）（ＷＯ２０１１／０７６８８５）からのものであり、またはアラビドプシス・タリアナ、ソルガム・ビコロル（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）、オリザ・サティバ、トリティカム・エスティバム、ホルデウム・ブルガレ、ロリウム・リジドゥムもしくはアベナ・サティバからのものといった植物起源のものである。
【００７０】
本発明の目的のため、本発明のＨＰＰＤはまた、さらなる改変、例えばクローニング目的のためにいくつかのアミノ酸（例として１から１０個のアミノ酸）を置き換え、付加もしくは欠失させて輸送ペプチド融合体などを作る改変であって、ＨＰＰＤ活性、すなわちパラ−ヒドロキシフェニルピルベートのホモゲンチセートへの変換を触媒する性質を保持する改変を含み得るものであり、またはさらに改良することができる任意のＨＰＰＤであることができる。例えば、本明細書中に記載されている改変によりさらに改良することができるＨＰＰＤは、本明細書中に配列番号３４〜３７のいずれかとして記載されているシュードモナス・フルオレッセンス由来のバリアントＨＰＰＤ、本明細書中に配列番号３８として記載されているアベナ・サティバからのバリアントＨＰＰＤ、ＷＯ２０１２／０２１７８５（この文献は参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる）中の配列番号３〜３２６、３８３〜３８９、３９３、３９５および３９７〜４５９のいずれかにおいて記載されているバリアントＨＰＰＤ配列；ＷＯ２０１１／０６８５６７（この文献は参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる）の配列番号２〜１４および２０〜５０のいずれかにおいて記載されているＨＰＰＤ配列；ＷＯ２０１０／０８５７０５（この文献は参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる）の配列番号１５〜２６のいずれかにおいて記載されているＨＰＰＤ配列；ＷＯ２００９／１４４０７９もしくは米国特許６，２４５，９６８（各々の文献は参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる）中に記載されている１もしくは複数の置換を持つＨＰＰＤ；ＷＯ２０１０／０８５７０５の表１、２、５もしくは６中に記載されている１もしくは複数の置換を持つＨＰＰＤ；ならびに／またはＷＯ２０１１／０６８５６７の表１中に記載されている１もしくは複数の置換を持つＨＰＰＤであることができる。
【００７１】
いくつかの実施形態において、本発明のヌクレオチド配列（その単離された組換え型キメラ遺伝子、この核酸配列を含むベクター、宿主細胞、植物、植物部分および種子、この核酸配列によりコードされるアミノ酸配列およびその組成物、同様に植物のＨＰＰＤ阻害除草剤への耐性を向上させるため、とりわけＮ  （１，２，５−オキサジアゾール−３−イル）ベンズアミド類；Ｎ−（テトラゾール−４−イル）−もしくはＮ−（トリアゾール−３−イル）アリールカルボキサミド類、好ましくは例えば２−クロロ−３−エトキシ−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミドおよび２−クロロ−３−（メトキシメチル）−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミドなど；Ｎ−（１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）ベンズアミド類、好ましくは例えば２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）−３−（メチルスルホニル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（化合物１）など；Ｎ−（テトラゾール−５−イル）−もしくはＮ−（トリアゾール−３−イル）アリールカルボキサミド類、好ましくは例えば２−クロロ−３−エトキシ−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド（化合物２）、４−（ジフルオロメチル）−２−メトキシ−３−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド（化合物３）、２−クロロ−３−（メチルスルファニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（化合物４）ｔ  ２−（メトキシメチル）−３−（メチルスルフィニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（化合物５）など；ピリダジノン誘導体類（ＷＯ２０１３／０５０４２１およびＷＯ２０１３／０８３７７４）；置換１，２，５−オキサジアゾール類（ＷＯ２０１３／０７２３００およびＷＯ２０１３／０７２４０２）；ならびにオキソプラジン誘導体類（ＷＯ２０１３／０５４４９５）；トリケトン類、好ましくは例えばテンボトリオン、スルコトリオンおよびメソトリオンなど；イソオキサゾール類、好ましくは例えばイソオキサフルトールなど；またはピラゾリネート類、好ましくは例えばピラスルホトールおよびトプラメゾンなどのＨＰＰＤ阻害除草剤への耐性向上のためにこの核酸配列を用いる方法を包含する）は、配列番号７〜３３のいずれか１に記載のアミノ酸配列、ならびにＨＰＰＤ阻害除草剤耐性ポリペプチドをコードするその断片およびバリアントをコードする。
【００７２】
Ａ．ＨＰＰＤ阻害剤耐性を測定する方法
本発明のＨＰＰＤ配列を評価するため、ＨＰＰＤ阻害除草剤への耐性を測定するための任意の好適な方法を用いることができる。耐性は、特定のＨＰＰＤ阻害除草剤施用から生き延びる細胞もしくは生物の能力、または必須の細胞機能、例えば光合成、タンパク質合成もしくは呼吸および繁殖などを未処理の細胞もしくは生物と容易に識別可能でないように行う能力、またはＨＰＰＤ阻害除草剤で処理された植物の収量がかかる除草剤で処理されない（しかし、ＨＰＰＤ阻害除草剤の施用以外のメカニズムにより雑草が除去または防がれた）植物と比べて顕著な差がないもしくは収量が改善すらされる能力をモニターすることにより測定することができる。いくつかの実施形態において、耐性は、それぞれのＨＰＰＤタンパク質をコードする遺伝子を含む核酸で形質転換された細胞もしくは生物の視認できる指標表現型によって、またはＨＰＰＤタンパク質のインビトロアッセイにおいて、異なる濃度の様々なＨＰＰＤ阻害剤の存在下で測定することができる。これらの指標表現型（褐色の形成、成長阻害、退色、除草効果など）に関連した用量応答および用量応答の相対移動は、除草剤の異なる濃度範囲における植物損傷、成長点の退色症状などに基づく通常の方法で、例えばＧＲ５０（成長を５０％低減させる濃度）またはＭＩＣ（最小阻止濃度）値という観点で好都合に表現され、ここで値の増加は発現したＨＰＰＤの固有の耐性の向上に対応する。これらのデータは、例えば「用量」をｘ軸上に、「パーセンテージ殺滅」、「除草効果」、「出芽した緑色植物の数」などをｙ軸上にプロットした用量／応答曲線に由来するＧＲ５０値という観点で表現することができ、ここでＧＲ５０値の増加は発現したＨＰＰＤの固有の耐性レベルの向上に対応する。除草剤は出芽前または出芽後に好適に施用することができる。
【００７３】
様々な実施形態において、本発明によるＨＰＰＤタンパク質をコードする核酸もしくは遺伝子の耐性レベル、または本発明のＨＰＰＤタンパク質の耐性レベルは、試験植物、例えばタバコなど、または作物植物、例えばダイズ、コーンもしくはワタなどの遺伝子組換え、再生、交配および噴霧試験を介してスクリーニングすることができる。かかるスクリーニングにより得られる結果に従うと、かかる植物は、ＨＰＰＤ阻害除草剤（例としてＮ  （１，２，５−オキサジアゾール−３−イル）ベンズアミド類；Ｎ−（テトラゾール−４−イル）−もしくはＮ−（トリアゾール−３−イル）アリールカルボキサミド類、好ましくは例えば２−クロロ−３−エトキシ−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミドおよび２−クロロ−３−（メトキシメチル）−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミドなど；Ｎ−（１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）ベンズアミド類、好ましくは例えば２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）−３−（メチルスルホニル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（化合物１）など；Ｎ−（テトラゾール−５−イル）−もしくはＮ−（トリアゾール−３−イル）アリールカルボキサミド類、好ましくは例えば２−クロロ−３−エトキシ−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド（化合物２）、４−（ジフルオロメチル）−２−メトキシ−３−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド（化合物３）、２−クロロ−３−（メチルスルファニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（化合物４）、２−（メトキシメチル）−３−（メチルスルフィニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（化合物５）など；ピリダジノン誘導体類（ＷＯ２０１３／０５０４２１およびＷＯ２０１３／０８３７７４）；置換１，２，５−オキサジアゾール類（ＷＯ２０１３／０７２３００およびＷＯ２０１３／０７２４０２）；ならびにオキソプラジン誘導体類（ＷＯ２０１３／０５４４９５）；トリケトン類、好ましくは例えばテンボトリオン、スルコトリオンおよびメソトリオンなど；イソオキサゾール類、好ましくは例えばイソオキサフルトールなど；またはピラゾリネート類、好ましくは例えばピラスルホトールおよびトプラメゾンなどのＨＰＰＤ阻害除草剤）に対して、ＨＰＰＤタンパク質をコードする外因性遺伝子を何ら含有しない植物よりも、または本発明のＨＰＰＤタンパク質をコードする核酸と同じプロモーターの制御下に参照ＨＰＰＤをコードするＤＮＡ、例えばシュードモナス・フルオレッセンスＨＰＰＤをコードするＤＮＡを含む遺伝子を含有する植物よりも耐性であり、望ましくは圃場施用のために推奨される通常の用量の少なくとも２倍の用量に、なおより好ましくは圃場施用のために推奨される通常の用量の少なくとも４倍までの用量に耐性である。したがって、用語「ＨＰＰＤに作用する少なくとも１の除���剤への植物の耐性を向上させることが可能である」は、その内因性ＨＰＰＤのみを発現する植物または参照ＨＰＰＤ酵素を発現する植物と比べた、本発明のＨＰＰＤを発現する植物による通常の圃場用量の少なくとも１×、２×、または３×、または４×、またはそれより多いＨＰＰＤ阻害除草剤への耐性を表す。この点において、用語「ＨＰＰＤに対して作用する除草剤」は、除草剤として公知のおよび／または用いられている物質に限定されず、ＨＰＰＤタンパク質の触媒活性を阻害する任意の物質である。
【００７４】
あるいは、定量的レベルにおいて、ｐＩ５０（ｐＩ５０値は、酵素活性の５０％を阻害するのに必要な阻害剤の濃度（モル濃度で表す）の対数値を意味する）のようなデータを、任意のそれぞれのＨＰＰＤ阻害除草剤の存在下または非存在下で、本発明のＨＰＰＤタンパク質について得ることができ、参照ＨＰＰＤ配列と比較することができる。
【００７５】
本発明のＨＰＰＤ配列を評価するために用いることができる、限定されるものではないが具体的なアッセイタイプは、比色分析アッセイである。このアッセイにおいて、１％アガロース、５ｍＭ  Ｌ−チロシンおよび４２ｍＭスクシネートを含むＹＴ−ブロス型の培養培地に、ベクターｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、ドイツ）またはｐＳＥ４２０の改変版（ｐＳＥ４２０（ＲＩ）ＮＸ）の選択剤を含有させ、ディープウェルプレート内に注ぐ。ベクターｐＳＥ４２０−ＨＰＰＤｘ（ＨＰＰＤｘは推定ＨＰＰＤ酵素／タンパク質をコードする任意の遺伝子を意味する）を含有する指数増殖期のＥ．ｃｏｌｉ培養物を各ウェルにアプライする。３７℃で１６時間後、培養培地を含有しないウェル、空ベクターｐＳＥ４２０を含有するＥ．ｃｏｌｉ培養物を播種したウェルは透明であり、または不活性なＨＰＰＤをコードする遺伝子を含有するベクターｐＳＥ４２０−ＨＰＰＤｘを含有するＥ．ｃｏｌｉ培養物を播種したウェルは透明である一方、活性のあるＨＰＰＤをコードするベクターｐＳＥ４２０−ＨＰＰＤｘを含有するＥ．ｃｏｌｉ培養物を播種したウェルは褐色である。この試験は、この活性の起源が何であるかにかかわらずＨＰＰＤ活性を反映すること、およびＨＰＰＤ活性の同定を可能にすること（ＵＳ６，７６８，０４４）が、すなわち定性的レベルにおいて先に実証されている。
【００７６】
Ｂ．ＨＰＰＤ配列内に変異を導入する方法
本発明の核酸によりコードされる変異ＨＰＰＤタンパク質において、上で定義されているように少なくとも１のアミノ酸が置き換えられている。
【００７７】
置き換えは、上で定義されている参照ＨＰＰＤをコードする核酸配列中で、前記配列中で置き換えられることになるアミノ酸をコードするコドンを、それを置き換えることになるアミノ酸に対応するコドンで置き換えるのに適切である任意の手段により実行することができ、ここで前記コドンは文献中に広く記載されていて当業者に周知であるという状況である。
【００７８】
この置き換えを達成するためにいくらかの分子生物学的方法を用いることができる。本発明による変異核酸配列および対応するタンパク質を調製するための有用な方法は、前もって選択される１または複数のアミノ酸をコードするコドンに対して部位特異的突然変異誘発を行うことを含む。これらの部位特異的変異を得る方法は、当業者に周知であって文献（とりわけ：Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｒｃｈ，１９９１，Ｍ．Ｊ．ＭｃＰＨＥＲＳＯＮ編，ＩＲＬ  ＰＲＥＳＳ）中に広く記載されているか、または商用キット（例えばＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ（商標）  ｌｉｇｈｔｅｎｉｎｇ突然変異誘発キット、ＱｉａｇｅｎまたはＳｔｒａｔａｇｅｎｅより）を使用することが可能な方法である。部位特異的突然変異誘発の後、適切なスクリーニング補助を用いることにより、ＨＰＰＤ阻害剤への感受性がより低い変異ＨＰＰＤを含有する細胞を選抜することが有用である。これを達成するための適切なスクリーニング方法は上に記載されている。
【００７９】
あるいは、参照ＨＰＰＤをコードするＤＮＡ配列を、本明細書中に列挙されている１または複数の置換を持つＨＰＰＤタンパク質をコードするようにインシリコで改変し、その後、新たに合成することができる。変異ＨＰＰＤタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、本明細書中の別の場所に記載されている宿主細胞内に導入することができる。
【００８０】
Ｃ．単離されたポリヌクレオチドならびにそのバリアントおよび断片
いくつかの実施形態において、本発明は、単離されたまたは組換え型のポリヌクレオチドを含む。本明細書中で定義される「組換え型」ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド／タンパク質、または生物学的に活性のあるその部分は、例えば異種の宿主細胞内または遺伝子導入の植物細胞、種子もしくは植物内に含有されるときなどに、もはやその起源の天然生物中に存在しない。１の実施形態において、組換え型ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが由来する生物のゲノムＤＮＡ内でその核酸と生来的に隣接している配列（例えば、タンパク質をコードする配列または調節配列）（すなわち核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）を含まない。用語「組換え型」は、天然のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対して、そのポリヌクレオチドまたはポリペプチドが自然に存在するものと（例として化学的組成または構造において）異なるように操作されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドを包含する。別の実施形態において、「組換え型」ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが由来する生物のゲノムＤＮＡ内に生来的にある内部配列（すなわちイントロン）を含まない。かかるポリヌクレオチドの典型的な例は、いわゆる相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）である。例えば、様々な実施形態において、単離されたＨＰＰＤ阻害除草剤耐性をコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが由来する細胞のゲノムＤＮＡ内でそのポリヌクレオチドと生来的に隣接している約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含有することができる。本発明の核酸分子は、本発明のＨＰＰＤをコードするものを包含する。いくつかの実施形態において、本発明の核酸分子は、宿主細胞（例として植物宿主細胞または細菌宿主細胞）内で核酸分子の発現を指示することが可能なプロモーターと作動可能に連結される。
【００８１】
本発明はさらに、配列番号７〜３３のいずれかに記載のアミノ酸配列をコードする任意の核酸配列のバリアントおよび断片を企図する。ポリヌクレオチドの「断片」は、ポリペプチドの生物学的に活性のある部分をコードし得るものであり、または本明細書中の別の場所に開示されている方法を用いてハイブリダイゼーションプローブもしくはＰＣＲプライマーとして用いることができる断片であり得る。ポリヌクレオチドの断片であるポリヌクレオチドは、少なくとも約１５、２０、５０、７５、１００、２００、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０の連続したヌクレオチド、または意図される使用に応じて本明細書中に開示されている完全長のポリヌクレオチド（例として本明細書中に記載されているＨＰＰＤ核酸）内に存在するヌクレオチド数までの連続したヌクレオチドを含む。「連続した」ヌクレオチドとは、互いに直接隣接したヌクレオチド残基が意図される。
【００８２】
本発明のポリヌクレオチドの断片は、一般に、完全長のＨＰＰＤ阻害除草剤耐性タンパク質の生物学的活性；すなわち除草剤耐性活性を保持するポリペプチド断片をコードする。「除草剤耐性活性を保持する」とは、断片が、本明細書中に配列番号７〜３３として開示されている完全長のＨＰＰＤ阻害除草剤耐性タンパク質の除草剤耐性活性の少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、少なくとも約３００％またはそれより高い活性を持つことが意図される。除草剤耐性活性を測定する方法は、当該技術分野で周知であって、例示的方法が本明細書中に記載されている。限定されない例において、本発明の断片は同用量のＨＰＰＤ阻害除草剤に耐性であり、または１×、２×、３×、４×もしくはより高用量のＨＰＰＤ阻害除草剤に耐性であり、または断片は、断片と配列番号７〜３３との間のｐＩ５０もしくはＫｉを基にして同等もしくはより耐性である。
【００８３】
本発明のポリペプチドの生物学的に活性のある部分をコードするポリヌクレオチドの断片は、少なくとも約１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０の連続したアミノ酸、または本発明の完全長ポリペプチド内に存在するアミノ酸の総数までの連続したアミノ酸をコードする。限定されない例において、配列番号１のアミノ酸位置３３５に相当するアミノ酸位置においてプロリンを、および配列番号１のアミノ酸位置３３６に相当する位置においてフェニルアラニンまたはチロシンを持ち、ならびに配列番号１のアミノ酸位置１８８、１８９、２００、２１５、２２６、３３９および３４０に相当する位置において１または複数のアミノ酸置換があってもよいＨＰＰＤタンパク質の生物学的に活性のある部分をコードするポリペプチド断片があり、ここでＨＰＰＤタンパク質は配列番号７〜３３のいずれかに記載のＨＰＰＤタンパク質を包含する。
【００８４】
本発明はまた、上に記載されているバリアントポリヌクレオチドを包含する。ポリヌクレオチドの「バリアント」はまた、本発明のＨＰＰＤをコードするが遺伝暗号の縮重のために保存的に異なる配列、同様に十分に同一である配列を含む。本発明のバリアントは、ＨＰＰＤ酵素活性およびＨＰＰＤ除草阻害剤耐性を保持する。用語「十分に同一である」とは、標準的パラメーターを用いたアラインメントプログラムのうちの１つを用いて参照配列と比較して少なくとも約５３％、少なくとも約６０％または６５％の配列同一性、約７０％または７５％の配列同一性、約８０％または８５％の配列同一性、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を持つポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列が意図される。当業者は、コドン縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレームの位置決めなどを考慮に入れることによって２つのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの対応する同一性を決定するために、これらの値を適切に調整することができることを認識する。
【００８５】
細菌遺伝子は、複数のメチオニン開始コドンをオープンリーディングフレームの始点の近くに頻繁に保有する。しばしば、これらの開始コドンのうちの１または複数における翻訳開始は、機能的タンパク質の作成を導く。これらの開始コドンとしては、ＡＴＧコドンを挙げることができる。しかしながら、細菌、例えばバチルス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）などは開始コドンとしてコドンＧＴＧを認識することもでき、ＧＴＧコドンにおいて翻訳が始まるタンパク質は最初のアミノ酸にメチオニンを含有する。そのうえ、これらのコドンのうちのいずれが細菌内で生来的に用いられるかはあまり演繹的に決定されない。したがって、代替的メチオニンコドンのうちの１つの使用は除草剤耐性を付与するバリアントの作成を導き得ることが理解される。これらの除草剤耐性タンパク質は本発明内に包含され、本発明の方法において用いられ得る。自然起源のアレルバリアントは、後に概説される周知の分子生物学技術、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびハイブリダイゼーション技術などを使用して同定することができる。バリアントポリヌクレオチドはまた、例えば部位特異的または他の突然変異誘発ストラテジーを用いることにより作成されたが所望の生物学的活性を持つポリペプチドをなおコードする、合成に由来するポリヌクレオチドを包含する。
【００８６】
当業者は、本発明のポリヌクレオチドのさらなる変異により変化を導入することができ、それによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列のさらなる変化がポリペプチドの生物学的活性を変えることなく導かれることを、さらに理解する。したがって、バリアントの単離ポリヌクレオチドは、１〜５個、１〜１０個もしくは１〜１５個のアミノ酸の置換、付加もしくは欠失が、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４もしくは１５個のアミノ酸の置換、付加もしくは欠失がコードされるポリペプチド内に導入されるように、本発明のＨＰＰＤをコードする対応するポリヌクレオチド内に１または複数の付加的なヌクレオチド置換、付加または欠失を導入することにより作出することができる。標準的な技術、例えば部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介性の突然変異誘発または遺伝子シャッフリング技術などにより、さらなる変異を導入することができる。かかるバリアントポリヌクレオチドもまた本発明に包含される。
【００８７】
バリアントポリヌクレオチドは、例えば飽和突然変異誘発または置換突然変異誘発などによりコーディング配列の全てまたは一部に沿ってランダムに変異を導入することによって作ることができ、活性を保持する変異体を同定するため、結果として生じる変異体を除草剤耐性活性を付与する能力についてスクリーニングすることができる。
【００８８】
バリアントを作成する付加的な方法は、本明細書中に開示されているタンパク質（またはそのライブラリー）を発現する細胞を、タンパク質活性へのストレスを生じさせる特定の条件に供することを包含する。特定の条件としては、（限定されるものではないが）温度変化、ｐＨ変化、および基質または阻害剤の濃度変化を挙げることができる。タンパク質ライブラリーは、（例としてＥ．ｃｏｌｉまたは他の宿主内での）タンパク質発現またはその後のタンパク質抽出物の作出、またはその後のタンパク質精製の時間のあいだ、これらの条件に供することができる。
【００８９】
次いで、性質が改良されたタンパク質を同定するため、ストレス条件に供されたタンパク質ライブラリーの機能活性または酵素活性を参照タンパク質と比較することができる。この活性比較は、成長スクリーニングの一部として、あるいはタンパク質の活性を定量する酵素アッセイの一部として行うことができる。改良されたと同定することができる性質としては、ＨＰＰＤ阻害除草剤耐性、動力学定数（Ｋｍ、Ｋｉ、ｋｃａｔを包含する）、タンパク質の安定性、タンパク質の熱安定性またはタンパク質の至適温度および至適ｐＨの変化を挙げることができる。
【００９０】
Ｄ．単離されたタンパク質ならびにそのバリアントおよび断片
除草剤耐性ポリペプチドもまた本発明内に包含される。除草剤耐性ポリペプチドは、約３０％、２０％、１０％または５％未満（乾燥重量による）の除草剤耐性でないポリペプチド（本明細書中で「混入タンパク質」とも呼ばれる）を持つポリペプチドの調製物を包含する。本発明において、「除草剤耐性タンパク質」とは、本明細書中に開示されているＨＰＰＤポリペプチドが意図される。断片、生物学的に活性のある部分およびそれらのバリアントもまた提供され、本発明の方法を実施するために用いられ得る。
【００９１】
「断片」または「生物学的に活性のある部分」は、除草剤耐性タンパク質をコードし、除草剤耐性活性を保持するアミノ酸配列の部分を含むポリペプチド断片を包含する。除草剤耐性タンパク質の生物学的に活性のある部分は、例えば１０、２５、５０、１００個またはそれより多いアミノ酸長のポリペプチドであることができる。かかる生物学的に活性のある部分を組換え技術により調製し、除草剤耐性活性について評価することができる。
【００９２】
「バリアント」とは、配列番号７〜３３のいずれかと少なくとも約５３％、６０％、６５％、約７０％、７５％、約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を持つタンパク質またはポリペプチドが意図され、ここで前記バリアントはＨＰＰＤ酵素活性およびＨＰＰＤ阻害除草剤耐性を持つ。当業者は、コドン縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレームの位置決めなどを考慮に入れることによって２つのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの対応する同一性を決定するために、これらの値を適切に調整することができることを認識する。
【００９３】
例えば、保存的アミノ酸置換は、１または複数の非必須アミノ酸残基においてなされ得る。「非必須」アミノ酸残基はその生物学的活性を変えることなくポリペプチドの参照配列から変えることができる残基である一方、「必須」アミノ酸残基は生物学的活性のために必要とされる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似した側鎖を持つアミノ酸残基で置き換えられるものである。類似した側鎖を持つアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖（例としてリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例としてアスパラギン酸、グルタミン酸）、電荷のない極性側鎖（例としてグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例としてアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ−分岐側鎖（例としてスレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例としてチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が挙げられる。アミノ酸置換は、機能を保持する非保存領域においてなされ得る。一般的に、かかる置換は保存アミノ酸残基について、または保存モチーフ内にあるアミノ酸残基についてなされず、ここでかかる残基はポリペプチド活性に必須である。しかしながら、当業者は、機能的バリアントは保存残基内でマイナーな保存または非保存の変化を持ち得ることを理解する。
【００９４】
本発明のＨＰＰＤに対する抗体、またはそのバリアントもしくは断片に対する抗体もまた包含される。抗体を生産する方法は当該技術分野で周知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；米国特許４，１９６，２６５を参照されたい）。
【００９５】
したがって、本発明の１の態様は、本発明のタンパク質またはペプチド分子およびそれらのホモログ、融合体または断片のうちの１または複数に特異的に結合する抗体、一本鎖抗原結合分子または他のタンパク質に関する。とりわけ好ましい実施形態において、抗体は、配列番号７〜３３に記載のアミノ酸配列を持つタンパク質またはその断片に特異的に結合する。別の実施形態において、抗体は、配列番号７〜３３に記載のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む融合タンパク質またはその断片に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、抗体は、配列番号１のアミノ酸位置１８８および１８９に相当するタンパク質の領域に、または配列番号１のアミノ酸位置２００に相当するタンパク質の領域に、または配列番号１のアミノ酸位置２１５に相当するタンパク質の領域に、または配列番号１のアミノ酸位置３３５〜３４０に相当するタンパク質の領域に特異的に結合する。
【００９６】
本発明の抗体は、本発明のタンパク質もしくはペプチド分子を定量的もしくは定性的に検出するために、またはタンパク質の翻訳後修飾を検出するために用いられ得る。本明細書中で用いられる抗体またはペプチドは、その結合が無関係の分子の存在により競合的に阻害されない場合、本発明のタンパク質またはペプチド分子に「特異的に結合する」といわれる。
【００９７】
Ｅ．遺伝子スタッキング
作物の商業的生産において、信頼できる駆除剤管理の下、望まれない植物（すなわち「雑草」）を作物植物の圃場から取り除くことが望ましい。理想的な処理は、圃場全体に施用することができるが、残った作物植物に影響を与えずに望まれない植物だけを取り除くものである。１つのかかる処理システムは、除草剤耐性作物植物の圃場に除草剤を噴霧したときに作物植物は育ち続ける一方で除草剤耐性でない雑草は殺滅されるかまたは重度な損傷を受けるように、除草剤に耐性である作物植物の使用を伴う。理想的には、かかる処理システムは、雑草防除が柔軟性と経済性との最良の可能な組み合わせを提供することができるよう、様々な除草剤の性質を活用するものである。例えば、個々の除草剤は圃場において異なる寿命を持っており、持続性であって圃場に施用された後に比較的長時間有効である除草剤がある一方、他の化合物および／または活性のない化合物へと速やかに分解される除草剤もある。理想的な処理システムは、栽培者が特定の状況に合わせて除草剤を選ぶことができるよう、異なる除草剤の使用を可能にするものである。
【００９８】
多数の除草剤耐性作物植物が現在市販されているが、多くの商業的除草剤および除草剤／作物の組み合わせについて、個々の除草剤が一般的な雑草種に対して不完全な活性スペクトルを典型的に持つという問題が生じている。しばらくの間使用されてきた大半の個々の除草剤について、除草剤抵抗性の雑草種および生物型の個体群がより蔓延してきている（例としてＴｒａｎｅｌ  ａｎｄ  Ｗｒｉｇｈｔ（２００２）  Ｗｅｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ５０：７００−７１２；Ｏｗｅｎ  ａｎｄ  Ｚｅｌａｙａ（２００５）  Ｐｅｓｔ  Ｍａｎａｇ．Ｓｃｉ．６１：３０１−３１１を参照されたい）。１より多い除草剤に耐性である遺伝子導入植物が記述されている（例としてＷ０２００５／０１２５１５を参照されたい）。しかしながら、作物生産のあらゆる面の改良、雑草防除選択肢、残存雑草防除の拡大および作物収量の改善は、絶えず需要がある。
【００９９】
本発明のＨＰＰＤタンパク質またはヌクレオチド配列は、植物内で、当該植物に有用な農学的性質を付与するタンパク質またはＲＮＡをコードする他の遺伝子と好都合に組み合わされる。形質転換された植物に対して有用な農学的性質を付与するタンパク質またはＲＮＡをコードする遺伝子のなかで、それらの化学的構造によるとＨＰＰＤ阻害除草剤と異なる１または複数の除草剤への耐性を付与するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、一定の昆虫への耐性を付与する他のＤＮＡ配列、一定の病害への耐性を付与するＤＮＡ配列、線虫または昆虫防除を提供するＲＮＡをコードするＤＮＡなどに言及することができる。
【０１００】
かかる遺伝子は、とりわけ公開されたＰＣＴ特許出願ＷＯ９１／０２０７１およびＷＯ９５／０６１２８中に、ならびに米国特許７，９２３，６０２および米国特許出願公開番号２０１００１６６７２３中に記載されており、これらの文献の各々は参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる。
【０１０１】
形質転換された植物細胞および植物に対して一定の除草剤への耐性を付与するタンパク質をコードするＤＮＡ配列のなかで、ｂａｒ遺伝子またはＰＡＴ遺伝子、またはグルホシネート除草剤への耐性を付与するＷＯ２００９／１５２３５９中に記載されているストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）遺伝子、ＥＰＳＰＳを標的として持つ除草剤、例えばグリホサートおよびその塩などへの耐性を付与する好適なＥＰＳＰＳをコードする遺伝子（ＵＳ４，５３５，０６０、ＵＳ４，７６９，０６１、ＵＳ５，０９４，９４５、ＵＳ４，９４０，８３５、ＵＳ５，１８８，６４２、ＵＳ４，９７１，９０８、ＵＳ５，１４５，７８３、ＵＳ５，３１０，６６７、ＵＳ５，３１２，９１０、ＵＳ５，６２７，０６１、ＵＳ５，６３３，４３５）、グリホサート−ｎ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（例えばＵＳ８，２２２，４８９、ＵＳ８，０８８，９７２、ＵＳ８，０４４，２６１、ＵＳ８，０２１，８５７、ＵＳ８，００８，５４７、ＵＳ７，９９９，１５２、ＵＳ７，９９８，７０３、ＵＳ７，８６３，５０３、ＵＳ７，７１４，１８８、ＵＳ７，７０９，７０２、ＵＳ７，６６６，６４４、ＵＳ７，６６６，６４３、ＵＳ７，５３１，３３９、ＵＳ７，５２７，９５５およびＵＳ７，４０５，０７４）またはグリホサートオキシドレダクターゼをコードする遺伝子（例えばＵＳ５，４６３，１７５）に言及することができる。
【０１０２】
ＥＰＳＰＳを標的として持つ除草剤への耐性を付与する好適なＥＰＳＰＳをコードするＤＮＡ配列のなかで、よりとりわけには、植物ＥＰＳＰＳ、とりわけトウモロコシＥＰＳＰＳ、とりわけ、２個の変異、とりわけアミノ酸位置１０２における変異およびアミノ酸位置１０６における変異を含むトウモロコシＥＰＳＰＳ（ＷＯ２００４／０７４４４３）をコードする遺伝子であって、特許出願ＵＳ６５６６５８７中に記載されている、以降、二重変異トウモロコシＥＰＳＰＳまたは２ｍＥＰＳＰＳと称される遺伝子、またはアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）から単離されたＥＰＳＰＳをコードする遺伝子であって、米国特許５，６３３，４３５の配列番号２および配列番号３により記載されている、ＣＰ４とも称される遺伝子に言及することができる。
【０１０３】
ＥＰＳＰＳを標的として持つ除草剤への耐性を付与する好適なＥＰＳＰＳをコードするＤＮＡ配列のなかで、よりとりわけには、アルスロバクター・グロビフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）からのＥＰＳＰＳ  ＧＲＧ２３を、これだけでなく変異体ＧＲＧ２３  ＡＣＥ１、ＧＲＧ２３  ＡＣＥ２またはＧＲＧ２３  ＡＣＥ３を、とりわけＷＯ２００８／１００３５３中に記載されているＧＲＧ２３の変異体またはバリアント、例えばＷＯ２００８／１００３５３中の配列番号２９のＧＲＧ２３（ａｃｅ３）Ｒ１７３Ｋなどをコードする遺伝子に言及することができる。
【０１０４】
ＥＰＳＰＳをコードする、よりとりわけには上の遺伝子をコードするＤＮＡ配列の場合、好都合には、これらの酵素をコードする配列の前に輸送ペプチド、とりわけ米国特許５，５１０，４７１または５，６３３，４４８中に記載されている「最適化された輸送ペプチド」をコードする配列がある。
【０１０５】
本発明の核酸配列と組み合わせることができる例示的な除草剤耐性形質としては、さらに、少なくとも１のＡＬＳ（アセトラクテートシンターゼ）阻害剤（ＷＯ２００７／０２４７８２）；変異アラビドプシスＡＬＳ／ＡＨＡＳ遺伝子（米国特許６，８５５，５３３）；代謝により２，４−Ｄ（２，４−ジクロロフェノキシ酢酸）への耐性を付与する２，４−Ｄ−モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子（米国特許６，１５３，４０１）；および代謝によりジカンバ（３，６−ジクロロ−２−メトキシ安息香酸）への耐性を付与するジカンバモノオキシゲナーゼをコードする遺伝子（ＵＳ２００８／０１１９３６１およびＵＳ２００８／０１２０７３９）が挙げられる。
【０１０６】
様々な実施形態において、本発明のＨＰＰＤは、１もしくは複数の付加的なＨＰＰＤ阻害除草剤耐性遺伝子ならびに／またはグリホサートおよび／もしくはグルホシネートに耐性の１もしくは複数の遺伝子といった、１または複数の除草剤耐性遺伝子とスタッキングされる。１の実施形態において、本発明のＨＰＰＤは、２ｍＥＰＳＰＳおよびｂａｒと組み合わされる。
【０１０７】
昆虫への耐性性質に関するタンパク質をコードするＤＮＡ配列のなかで、よりとりわけには、文献中に広く記載されており当業者に周知であるＢｔタンパク質への言及がなされる。また、細菌、例えばフォトラブダス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）などから抽出されるタンパク質（ＷＯ９７／１７４３２およびＷＯ９８／０８９３２）への言及もなされる。
【０１０８】
昆虫への新たな耐性性質を付与する目的タンパク質をコードするかかるＤＮＡ配列のなかで、よりとりわけには、文献中に広く記載されており当業者に周知であるＢｔ  ＣｒｙまたはＶＩＰタンパク質への言及がなされる。これらとしては、Ｃｒｙ１Ｆタンパク質またはＣｒｙ１Ｆタンパク質に由来するハイブリッド（例としてＵＳ６，３２６，１６９；ＵＳ６，２８１，０１６；ＵＳ６，２１８，１８８中に記載されているハイブリッドＣｒｙ１Ａ−Ｃｒｙ１Ｆタンパク質またはその毒性断片）、Ｃｒｙ１Ａタイプのタンパク質またはその毒性断片、好ましくはＣｒｙ１Ａｃタンパク質もしくはＣｒｙ１Ａｃタンパク質に由来するハイブリッド（例としてＵＳ５，８８０，２７５中に記載されているハイブリッドＣｒｙ１Ａｂ−Ｃｒｙ１Ａｃタンパク質）またはＥＰ４５１８７８中に記載されているＣｒｙ１ＡｂもしくはＢｔ２タンパク質もしくはその殺虫性断片、ＷＯ２００２／０５７６６４中に記載されているＣｒｙ２Ａｅ、Ｃｒｙ２ＡｆもしくはＣｒｙ２Ａｇタンパク質またはその毒性断片、ＷＯ２００７／１４０２５６中に記載されているＣｒｙ１Ａ．１０５タンパク質（配列番号７）またはその毒性断片、ＮＣＢＩアクセッションＡＢＧ２０４２８のＶＩＰ３Ａａ１９タンパク質、ＮＣＢＩアクセッションＡＢＧ２０４２９のＶＩＰ３Ａａ２０タンパク質（ＷＯ２００７／１４２８４０中の配列番号２）、ＣＯＴ２０２またはＣＯＴ２０３ワタイベント中で生産されるＶＩＰ３Ａタンパク質（それぞれＷＯ２００５／０５４４７９およびＷＯ２００５／０５４４８０）、ＷＯ２００１／４７９５２中に記載されているＣｒｙタンパク質、Ｅｓｔｒｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６），Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２８；９３（１１）：５３８９−９４およびＵＳ６，２９１，１５６中に記載されているＶＩＰ３Ａａタンパク質またはその毒性断片、ゼノラブドゥス（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ）（ＷＯ９８／５０４２７中に記載されている）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）（とりわけＳ．エントモフィラ（Ｓ．ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ）からの）またはフォトラブダス属種の株からの殺虫性タンパク質、例えばＷＯ９８／０８９３２中に記載されているフォトラブダスからのＴｃ−タンパク質（例としてＷａｔｅｒｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７（１１）：５０１７−２４；Ｆｆｒｅｎｃｈ−Ｃｏｎｓｔａｎｔ  ａｎｄ  Ｂｏｗｅｎ，２０００，Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．；５７（５）：８２８−３３）などが挙げられる。また、これらのタンパク質のうちのいずれか１の任意のバリアントまたは変異体であって、上の配列、とりわけそれらの毒性断片の配列のいずれかからいくつかの（１〜１０個、好ましくは１〜５個の）アミノ酸が異なっているもの、または輸送ペプチド、例えば色素体輸送ペプチドなど、もしくは別のタンパク質もしくはペプチドと融合しているものが、本明細書中に含まれる。
【０１０９】
様々な実施形態において、本発明のＨＰＰＤ配列は、植物内で、望ましい形質、例えば除草剤耐性、昆虫耐性、渇水耐性、線虫防除、水使用効率、窒素使用効率、栄養価改良、病害抵抗性、光合成改良、繊維品質改良、ストレス耐性、繁殖改良などを付与する１または複数の遺伝子と組み合わせることができる。
【０１１０】
同種の植物内で本発明の遺伝子と（例として交配により、または別の遺伝子導入イベントを含有する植物を本発明のキメラ遺伝子で再形質転換することにより）組み合わせ得るとりわけ有用な遺伝子導入イベントとしては、イベント５３１／ＰＶ−ＧＨＢＫ０４（ワタ、昆虫防除、ＷＯ２００２／０４０６７７中に記載されている）、イベント１１４３−１４Ａ（ワタ、昆虫防除、寄託されていない、ＷＯ２００６／１２８５６９中に記載されている）；イベント１１４３−５１Ｂ（ワタ、昆虫防除、寄託されていない、ＷＯ２００６／１２８５７０中に記載されている）；イベント１４４５（ワタ、除草剤耐性、寄託されていない、ＵＳ−Ａ  ２００２−１２０９６４またはＷＯ２００２／０３４９４６中に記載されている）、イベント１７０５３（イネ、除草剤耐性、ＰＴＡ−９８４３として寄託されている、ＷＯ２０１０／１１７７３７中に記載されている）；イベント１７３１４（イネ、除草剤耐性、ＰＴＡ−９８４４として寄託されている、ＷＯ２０１０／１１７７３５中に記載されている）；イベント２８１−２４−２３６（ワタ、昆虫防除−除草剤耐性、ＰＴＡ−６２３３として寄託されている、ＷＯ２００５／１０３２６６またはＵＳ−Ａ  ２００５−２１６９６９中に記載されている）；イベント３００６−２１０−２３（ワタ、昆虫防除−除草剤耐性、ＰＴＡ−６２３３として寄託されている、ＵＳ−Ａ  ２００７−１４３８７６またはＷＯ２００５／１０３２６６中に記載されている）；イベント３２７２（コーン、品質形質、ＰＴＡ−９９７２として寄託されている、ＷＯ２００６／０９８９５２またはＵＳ−Ａ  ２００６−２３０４７３中に記載されている）；イベント３３３９１（コムギ、除草剤耐性、ＰＴＡ−２３４７として寄託されている、ＷＯ２００２／０２７００４中に記載されている）、イベント４０４１６（コーン、昆虫防除−除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１１５０８として寄託されている、ＷＯ１１／０７５５９３中に記載されている）；イベント４３Ａ４７（コーン、昆虫防除−除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１１５０９として寄託されている、ＷＯ２０１１／０７５５９５中に記載されている）；イベント５３０７（コーン、昆虫防除、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−９５６１として寄託されている、ＷＯ２０１０／０７７８１６中に記載されている）；イベントＡＳＲ−３６８（ベントグラス、除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４８１６として寄託されている、ＵＳ−Ａ  ２００６−１６２００７またはＷＯ２００４／０５３０６２中に記載されている）；イベントＢ１６（コーン、除草剤耐性、寄託されていない、ＵＳ−Ａ  ２００３−１２６６３４中に記載されている）；イベントＢＰＳ−ＣＶ１２７−９（ダイズ、除草剤耐性、ＮＣＩＭＢ番号４１６０３として寄託されている、ＷＯ２０１０／０８０８２９中に記載されている）；イベントＢＬＲ１（アブラナ、雄性稔性の回復、ＮＣＩＭＢ  ４１１９３として寄託されている、ＷＯ２００５／０７４６７１中に記載されている）、イベントＣＥ４３−６７Ｂ（ワタ、昆虫防除、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７２４として寄託されている、ＵＳ−Ａ  ２００９−２１７４２３またはＷＯ２００６／１２８５７３中に記載されている）；イベントＣＥ���４−６９Ｄ（ワタ、昆虫防除、寄託されていない、ＵＳ−Ａ  ２０１０−００２４０７７中に記載されている）；イベントＣＥ４４−６９Ｄ（ワタ、昆虫防除、寄託されていない、ＷＯ２００６／１２８５７１中に記載されている）；イベントＣＥ４６−０２Ａ（ワタ、昆虫防除、寄託されていない、ＷＯ２００６／１２８５７２中に記載されている）；イベントＣＯＴ１０２（ワタ、昆虫防除、寄託されていない、ＵＳ−Ａ  ２００６−１３０１７５またはＷＯ２００４／０３９９８６中に記載されている）；イベントＣＯＴ２０２（ワタ、昆虫防除、寄託されていない、ＵＳ−Ａ  ２００７−０６７８６８またはＷＯ２００５／０５４４７９中に記載されている）；イベントＣＯＴ２０３（ワタ、昆虫防除、寄託されていない、ＷＯ２００５／０５４４８０中に記載されている）；）；イベントＤＡＳ２１６０６−３／１６０６（ダイズ、除草剤耐性、ＰＴＡ−１１０２８として寄託されている、ＷＯ２０１２／０３３７９４中に記載されている）、イベントＤＡＳ４０２７８（コーン、除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１０２４４として寄託されている、ＷＯ２０１１／０２２４６９中に記載されている）；イベントＤＡＳ−４４４０６−６／ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１（ダイズ、除草剤耐性、ＰＴＡ−１１３３６として寄託されている、ＷＯ２０１２／０７５４２６中に記載されている）、イベントＤＡＳ−１４５３６−７／ｐＤＡＢ８２９１．４５．３６．２（ダイズ、除草剤耐性、ＰＴＡ−１１３３５として寄託されている、ＷＯ２０１２／０７５４２９中に記載されている）、イベントＤＡＳ−５９１２２−７（コーン、昆虫防除−除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ  １１３８４として寄託されている、ＵＳ−Ａ  ２００６−０７０１３９中に記載されている）；イベントＤＡＳ−５９１３２（コーン、昆虫防除−除草剤耐性、寄託されていない、ＷＯ２００９／１００１８８中に記載されている）；イベントＤＡＳ６８４１６（ダイズ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１０４４２として寄託されている、ＷＯ２０１１／０６６３８４またはＷＯ２０１１／０６６３６０中に記載されている）；イベントＤＰ−０９８１４０−６（コーン、除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８２９６として寄託されている、ＵＳ−Ａ  ２００９−１３７３９５またはＷＯ０８／１１２０１９中に記載されている）；イベントＤＰ−３０５４２３−１（ダイズ、品質形質、寄託されていない、ＵＳ−Ａ  ２００８−３１２０８２またはＷＯ２００８／０５４７４７中に記載されている）；イベントＤＰ−３２１３８−１（コーン、交配系、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−９１５８として寄託されている、ＵＳ−Ａ  ２００９−０２１０９７０またはＷＯ２００９／１０３０４９中に記載されている）；イベントＤＰ−３５６０４３−５（ダイズ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８２８７として寄託されている、ＵＳ−Ａ  ２０１０−０１８４０７９またはＷＯ２００８／００２８７２中に記載されている）；イベントＥＥ−１（ブリンジャル（ｂｒｉｎｊａｌ）、昆虫防除、寄託されていない、ＷＯ０７／０９１２７７中に記載されている）；イベントＦＩ１１７（コーン、除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ２０９０３１として寄託されている、ＵＳ−Ａ  ２００６−０５９５８１またはＷＯ９８／０４４１４０中に記載されている）；イベントＦＧ７２（ダイズ、除草剤耐性、ＰＴＡ−１１０４１として寄託されている、ＷＯ２０１１／０６３４１３中に記載されている）、イベントＧＡ２１（コーン、除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ２０９０３３として寄託されている、ＵＳ−Ａ  ２００５−０８６７１９またはＷＯ９８／０４４１４０中に記載されている）；イベントＧＧ２５（コーン、除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ２０９０３２として寄託されている、ＵＳ−Ａ  ２００５−１８８４３４またはＷＯ９８／０４４１４０中に記載されている）；イベントＧＨＢ１１９（ワタ、昆虫防除−除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８３９８として寄託されている、ＷＯ２００８／１５１７８０中に記載されている）；イベントＧＨＢ６１４（ワタ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６８７８として寄託されている、ＵＳ−Ａ  ２０１０−０５０２８２またはＷＯ２００７／０１７１８６中に記載されている）；イベントＧＪ１１（コーン、除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ２０９０３０として寄託されている、ＵＳ−Ａ  ２００５−１８８４３４またはＷＯ９８／０４４１４０中に記載されている）；イベントＧＭ  ＲＺ１３（テンサイ、ウイルス抵抗性、ＮＣＩＭＢ−４１６０１として寄託されている、ＷＯ２０１０／０７６２１２中に記載されている）；イベントＨ７−１（テンサイ、除草剤耐性、ＮＣＩＭＢ  ４１１５８またはＮＣＩＭＢ  ４１１５９として寄託されている、ＵＳ−Ａ  ２００４−１７２６６９またはＷＯ２００４／０７４４９２中に記載されている）；イベントＪＯＰＬＩＮ１（コムギ、病害耐性、寄託されていない、ＵＳ−Ａ  ２００８−０６４０３２中に記載されている）；イベントＬＬ２７（ダイズ、除草剤耐性、ＮＣＩＭＢ４１６５８として寄託されている、ＷＯ２００６／１０８６７４またはＵＳ−Ａ  ２００８−３２０６１６中に記載されている）；イベントＬＬ５５（ダイズ、除草剤耐性、ＮＣＩＭＢ  ４１６６０として寄託されている、ＷＯ２００６／１０８６７５またはＵＳ−Ａ  ２００８−１９６１２７中に記載されている）；イベントＬＬｃｏｔｔｏｎ２５（ワタ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３３４３として寄託されている、ＷＯ２００３／０１３２２４またはＵＳ−Ａ  ２００３−０９７６８７中に記載されている）；イベントＬＬＲＩＣＥ０６（イネ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ２０３３５３として寄託されている、ＵＳ６，４６８，７４７またはＷＯ２０００／０２６３４５中に記載されている）；イベントＬＬＲｉｃｅ６２（イネ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ２０３３５２として寄託されている、ＷＯ２０００／０２６３４５中に記載されている）、イベントＬＬＲＩＣＥ６０１（イネ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−２６００として寄託されている、ＵＳ−Ａ  ２００８−２２８９０６０またはＷＯ２０００／０２６３５６中に記載されている）；イベントＬＹ０３８（コーン、品質形質、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５６２３として寄託されている、ＵＳ−Ａ  ２００７−０２８３２２またはＷＯ２００５／０６１７２０中に記載されている）；イベントＭＩＲ１６２（コーン、昆虫防除、ＰＴＡ−８１６６として寄託されている、ＵＳ−Ａ  ２００９−３００７８４また��ＷＯ２００７／１４２８４０中に記載されている）；イベントＭＩＲ６０４（コーン、昆虫防除、寄託されていない、ＵＳ−Ａ  ２００８−１６７４５６またはＷＯ２００５／１０３３０１中に記載されている）；イベントＭＯＮ１５９８５（ワタ、昆虫防除、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−２５１６として寄託されている、ＵＳ−Ａ  ２００４−２５０３１７またはＷＯ２００２／１００１６３中に記載されている）；イベントＭＯＮ８１０（コーン、昆虫防除、寄託されていない、ＵＳ−Ａ  ２００２−１０２５８２中に記載されている）；イベントＭＯＮ８６３（コーン、昆虫防除、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−２６０５として寄託されている、ＷＯ２００４／０１１６０１またはＵＳ−Ａ  ２００６−０９５９８６中に記載されている）；イベントＭＯＮ８７４２７（コーン、受粉制御、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−７８９９として寄託されている、ＷＯ２０１１／０６２９０４中に記載されている）；イベントＭＯＮ８７４６０（コーン、ストレス耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８９１０として寄託されている、ＷＯ２００９／１１１２６３またはＵＳ−Ａ  ２０１１−０１３８５０４中に記載されている）；イベントＭＯＮ８７７０１（ダイズ、昆虫防除、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８１９４として寄託されている、ＵＳ−Ａ  ２００９−１３００７１またはＷＯ２００９／０６４６５２中に記載されている）；イベントＭＯＮ８７７０５（ダイズ、品質形質−除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−９２４１として寄託されている、ＵＳ−Ａ  ２０１０−００８０８８７またはＷＯ２０１０／０３７０１６中に記載されている）；イベントＭＯＮ８７７０８（ダイズ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−９６７０として寄託されている、ＷＯ２０１１／０３４７０４中に記載されている）；イベントＭＯＮ８７７１２（ダイズ、収量、ＰＴＡ−１０２９６として寄託されている、ＷＯ２０１２／０５１１９９中に記載されている）、イベントＭＯＮ８７７５４（ダイズ、品質形質、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−９３８５として寄託されている、ＷＯ２０１０／０２４９７６中に記載されている）；イベントＭＯＮ８７７６９（ダイズ、品質形質、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８９１１として寄託されている、ＵＳ−Ａ  ２０１１−００６７１４１またはＷＯ２００９／１０２８７３中に記載されている）；イベントＭＯＮ８８０１７（コーン、昆虫防除−除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−
５５８２として寄託されている、ＵＳ−Ａ  ２００８−０２８４８２またはＷＯ２００５／０５９１０３中に記載されている）；イベントＭＯＮ８８９１３（ワタ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４８５４として寄託されている、ＷＯ２００４／０７２２３５またはＵＳ−Ａ  ２００６−０５９５９０中に記載されている）；イベントＭＯＮ８８３０２（アブラナ、除草剤耐性、ＰＴＡ−１０９５５として寄託されている、ＷＯ２０１１／１５３１８６中に記載されている）、イベントＭＯＮ８８７０１（ワタ、除草剤耐性、ＰＴＡ−１１７５４として寄託されている、ＷＯ２０１２／１３４８０８中に記載されている）、イベントＭＯＮ８９０３４（コーン、昆虫防除、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−７４５５として寄託されている、ＷＯ０７／１４０２５６またはＵＳ−Ａ  ２００８−２６０９３２中に記載されている）；イベントＭＯＮ８９７８８（ダイズ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６７０８として寄託されている、ＵＳ−Ａ  ２００６−２８２９１５またはＷＯ２００６／１３０４３６中に記載されている）；イベントＭＳ１１（アブラナ、受粉制御−除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８５０またはＰＴＡ−２４８５として寄託されている、ＷＯ２００１／０３１０４２中に記載されている）；イベントＭＳ８（アブラナ、受粉制御−除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−７３０として寄託されている、ＷＯ２００１／０４１５５８またはＵＳ−Ａ  ２００３−１８８３４７中に記載されている）；イベントＮＫ６０３（コーン、除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−２４７８として寄託されている、ＵＳ−Ａ  ２００７−２９２８５４中に記載されている）；イベントＰＥ−７（イネ、昆虫防除、寄託されていない、ＷＯ２００８／１１４２８２中に記載されている）；イベントＲＦ３（アブラナ、受粉制御−除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−７３０として寄託されている、ＷＯ２００１／０４１５５８またはＵＳ−Ａ  ２００３−１８８３４７中に記載されている）；イベントＲＴ７３（アブラナ、除草剤耐性、寄託されていない、ＷＯ２００２／０３６８３１またはＵＳ−Ａ  ２００８−０７０２６０中に記載されている）；イベントＳＹＨＴ０Ｈ２／ＳＹＮ−０００Ｈ２−５（ダイズ、除草剤耐性、ＰＴＡ−１１２２６として寄託されている、ＷＯ２０１２／０８２５４８中に記載されている）、イベントＴ２２７−１（テンサイ、除草剤耐性、寄託されていない、ＷＯ２００２／４４４０７またはＵＳ−Ａ  ２００９−２６５８１７中に記載されている）；イベントＴ２５（コーン、除草剤耐性、寄託されていない、ＵＳ−Ａ  ２００１−０２９０１４またはＷＯ２００１／０５１６５４中に記載されている）；イベントＴ３０４−４０（ワタ、昆虫防除−除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８１７１として寄託されている、ＵＳ−Ａ  ２０１０−０７７５０１またはＷＯ２００８／１２２４０６中に記載されている）；イベントＴ３４２−１４２（ワタ、昆虫防除、寄託されていない、ＷＯ２００６／１２８５６８中に記載されている）；イベントＴＣ１５０７（コーン、昆虫防除−除草剤耐性、寄託されていない、ＵＳ−Ａ  ２００５−０３９２２６またはＷＯ２００４／０９９４４７中に記載されている）；イベントＶＩＰ１０３４��コーン、昆虫防除−除草剤耐性、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３９２５として寄託されている、ＷＯ２００３／０５２０７３中に記載されている）、イベント３２３１６（コーン、昆虫防除−除草剤耐性、ＰＴＡ−１１５０７として寄託されている、ＷＯ２０１１／０８４６３２中に記載されている）、イベント４１１４（コーン、昆虫防除−除草剤耐性、ＰＴＡ−１１５０６として寄託されている、ＷＯ２０１１／０８４６２１中に記載されている）、イベントＥＥ−ＧＭ３／ＦＧ７２（ダイズ、除草剤耐性、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１１０４１）、これはイベントＥＥ−ＧＭ１／ＬＬ２７またはイベントＥＥ−ＧＭ２／ＬＬ５５とスタッキングしてもよい（ＷＯ２０１１／０６３４１３Ａ２）、イベントＤＡＳ−６８４１６−４（ダイズ、除草剤耐性、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１０４４２、ＷＯ２０１１／０６６３６０Ａ１）、イベントＤＡＳ−６８４１６−４（ダイズ、除草剤耐性、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１０４４２、ＷＯ２０１１／０６６３８４Ａ１）、イベントＤＰ−０４０４１６−８（コーン、昆虫防除、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１１５０８、ＷＯ２０１１／０７５５９３Ａ１）、イベントＤＰ−０４３Ａ４７−３（コーン、昆虫防除、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１１５０９、ＷＯ２０１１／０７５５９５Ａ１）、イベントＤＰ−００４１１４−３（コーン、昆虫防除、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１１５０６、ＷＯ２０１１／０８４６２１Ａ１）、イベントＤＰ−０３２３１６−８（コーン、昆虫防除、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１１５０７、ＷＯ２０１１／０８４６３２Ａ１）、イベントＭＯＮ−８８３０２−９（アブラナ、除草剤耐性、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１０９５５、ＷＯ２０１１／１５３１８６Ａ１）、イベントＤＡＳ−２１６０６−３（ダイズ、除草剤耐性、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１１０２８、ＷＯ２０１２／０３３７９４Ａ２）、イベントＭＯＮ−８７７１２−４（ダイズ、品質形質、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１０２９６、ＷＯ２０１２／０５１１９９Ａ２）、イベントＤＡＳ−４４４０６−６（ダイズ、除草剤耐性のスタッキング、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１１３３６、ＷＯ２０１２／０７５４２６Ａ１）、イベントＤＡＳ−１４５３６−７（ダイズ、除草剤耐性のスタッキング、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１１３３５、ＷＯ２０１２／０７５４２９Ａ１）、イベントＳＹＮ−０００Ｈ２−５（ダイズ、除草剤耐性、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１１２２６、ＷＯ２０１２／０８２５４８Ａ２）、イベントＤＰ−０６１０６１−７（アブラナ、除草剤耐性、利用可能な寄託番号はない、ＷＯ２０１２０７１０３９Ａ１）、イベントＤＰ−０７３４９６−４（アブラナ、除草剤耐性、利用可能な寄託番号はない、ＵＳ２０１２１３１６９２）、イベント８２６４．４４．０６．１（ダイズ、除草剤耐性のスタッキング、アクセッション番号ＰＴＡ−１１３３６、ＷＯ２０１２０７５４２６Ａ２）、イベント８２９１．４５．３６．２（ダイズ、除草剤耐性のスタッキング、アクセッション番号ＰＴＡ−１１３３５、ＷＯ２０１２０７５４２９Ａ２）、イベントＳＹＨＴ０Ｈ２（ダイズ、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１１２２６、ＷＯ２０１２／０８２５４８Ａ２）、イベントＭＯＮ８８７０１（ワタ、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１１７５４、ＷＯ２０１２／１３４８０８Ａ１）、イベントＫＫ１７９−２（アルファルファ、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１１８３３、ＷＯ２０１３／００３５５８Ａ１）、イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１（ダイズ、除草剤耐性のスタッキング、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１１９９３、ＷＯ２０１３／０１００９４Ａ１）、イベントＭＺＤＴ０９Ｙ（コーン、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１３０２５、ＷＯ２０１３／０１２７７５Ａ１）が挙げられる。
【０１１１】
Ｆ．ポリヌクレオチドコンストラクト
本発明のＨＰＰＤポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、植物細胞内での発現を得るまたは高めるために改変され得る。本明細書中で同定されているポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、目的植物内での発現のための発現カセット内に提供され得る。「植物発現カセット」は、植物細胞内でのポリヌクレオチドの発現をもたらすことが可能な組換えＤＮＡコンストラクトといったＤＮＡコンストラクトを包含する。カセットは、転写の５’〜３’方向において、１もしくは複数の目的ポリヌクレオチドと作動可能に連結された転写開始領域（すなわちプロモーター、とりわけ異種のプロモーター）ならびに／または植物内で機能する翻訳および転写終結領域（すなわち終結領域）を包含することができる。カセットは加えて、生物内に導入されることになる少なくとも１の付加的なポリヌクレオチド、例えば選択可能なマーカー遺伝子などを含有し得る。あるいは、付加的なポリヌクレオチド（複数可）を複数の発現カセット上に提供することができる。かかる発現カセットは、調節領域の転写調節下に入ることになるポリヌクレオチド（複数可）の挿入のための複数の制限部位を備える。
【０１１２】
さらなる実施形態において、本発明は、植物で発現可能なプロモーターに作動可能に連結された本発明の異種核酸を含むコーディング配列を含み、ならびに転写終結およびポリアデニル化領域を含んでもよいキメラ遺伝子に関する。「異種」は、一般に、細胞に対して内因性でないまたはそれが存在する天然のゲノム内の位置に対して内因性でないポリヌクレオチドまたはポリペプチドであって、感染、トランスフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、マイクロプロジェクションなどにより細胞に加えられたものをいう。「作動可能に連結された」とは、２つのポリヌクレオチド間の機能的連結が意図される。例えば、プロモーターがＤＮＡ配列に作動可能に連結されると、プロモーター配列はＤＮＡ配列の転写を開始し、媒介する。作動可能に連結されたポリヌクレオチドは近接してもいなくてもよく、２つのポリペプチドコーディング領域の接合点を言及するために用いられる場合、これらのポリペプチドは同じリーディングフレーム内で発現すると認識される。
【０１１３】
プロモーターは、選ばれた植物細胞、植物部分または植物の中で転写活性を示す任意のポリヌクレオチド配列であり得る。プロモーターは、植物宿主および／または本発明のＤＮＡ配列に対して、天然もしくはアナログであってもよく、または外来もしくは異種であってもよい。プロモーターが植物宿主に対して「天然」または「アナログ」である場合、プロモーターは、プロモーターが導入される天然の植物において見出されることが意図される。プロモーターが本発明のＤＮＡ配列に対して「外来」または「異種」である場合、プロモーターは、作動可能に連結された本発明のＤＮＡ配列にとって天然または自然起源のプロモーターでないことが意図される。プロモーターは、誘導性であっても構成性であってもよい。これは自然起源であってもよく、様々な自然起源のプロモーターの部分から構成されてもよく、または部分合成であっても完全合成であってもよい。プロモーターの設計のためのガイダンスは、プロモーター構造の研究により提供され、例えばＨａｒｌｅｙ  ａｎｄ  Ｒｅｙｎｏｌｄｓ（１９８７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：２３４３−２３６１のそれなどである。また、転写開始点に対するプロモーターの位置は最適化され得る。例としてＲｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：７６０−７６４を参照されたい。植物内での使用に適した多くのプロモーターが当該技術分野で周知である。
【０１１４】
例えば、植物内での使用に適した構成性プロモーターとしては：植物ウイルスからのプロモーター、例えばピーナッツ萎黄病線条カリモウイルス（ｐｅａｎｕｔ  ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ  ｓｔｒｅａｋ  ｃａｕｌｉｍｏｖｉｒｕｓ、ＰＣｌＳＶ）プロモーター（米国特許第５，８５０，０１９号）；カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）からの３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）  Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：８１０−８１２）；クロレラウイルスメチルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーター（米国特許第５，５６３，３２８号）およびゴマノハグサモザイクウイルス（ｆｉｇｗｏｒｔ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ、ＦＭＶ）からの完全長転写産物プロモーター（米国特許第５，３７８，６１９号）；イネアクチン（ＭｃＥｌｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：１６３−１７１および米国特許５，６４１，８７６）；ユビキチン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：６１９−６３２およびＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６７５−６８９）；ｐＥＭＵ（Ｌａｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８１：５８１−５８８）；ＭＡＳ（Ｖｅｌｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）  ＥＭＢＯ  Ｊ．３：２７２３−２７３０および米国特許５，５１０，４７４）；トウモロコシＨ３ヒストン（Ｌｅｐｅｔｉｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３１：２７６−２８５およびＡｔａｎａｓｓｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２（３）：２９１−３００）；ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）ＡＬＳ３（ＰＣＴ出願ＷＯ９７／４１２２８）；植物リブロース−ビスカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（ＲｕＢｉｓＣＯ）小サブユニット遺伝子；サーコウイルス（ＡＵ６８９３１１）またはキャッサバ葉脈モザイクウイルス（ＣｓＶＭＶ、ＵＳ７，０５３，２０５）などの遺伝子からのプロモーター；ならびに様々なアグロバクテリウム遺伝子のプロモーター（米国特許第４，７７１，００２号；第５，１０２，７９６号；第５，１８２，２００号；および第５，４２８，１４７号を参照されたい）が挙げられる。
【０１１５】
植物内での使用に適した誘導性プロモーターとしては：銅に応答するＡＣＥ１系からのプロモーター（Ｍｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）  ＰＮＡＳ  ９０：４５６７−４５７１）；ベンゼンスルホンアミド除草剤毒性緩和剤に応答するトウモロコシＩｎ２遺伝子のプロモーター（Ｈｅｒｓｈｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２２７：２２９−２３７およびＧａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）  Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２４３：３２−３８）；およびＴｎ１０からのＴｅｔリプレッサーのプロモーター（Ｇａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２７：２２９−２３７）が挙げられる。植物内での使用のための別の誘導性プロモーターは、植物が通常は応答しない誘導剤に応答するものである。このタイプの例示的な誘導性プロモーターは、その転写活性がグルココルチコステロイドホルモンにより誘導されるステロイドホルモン遺伝子からの誘導性プロモーター（Ｓｃｈｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１０４２１）であり、または最近の応用である、エストラジオールにより活性化されるエストロゲン受容体に基づく誘導性植物発現系における使用のためのキメラ転写活性化因子ＸＶＥ（Ｚｕｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，２４：２６５−２７３）である。植物内での使用のための他の誘導性プロモーターは、ＥＰ３３２１０４、ＰＣＴ  ＷＯ９３／２１３３４およびＰＣＴ  ＷＯ９７／０６２６９中に記載されており、これらの文献は参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる。他のプロモーターの部分から構成されるプロモーターおよび部分合成または完全合成のプロモーターもまた用いることができる。例として、植物内での使用のためのかかるプロモーターを記載しているＮｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．７：６６１−６７６およびＰＣＴ  ＷＯ９５／１４０９８を参照されたい。
【０１１６】
本発明の１の実施形態において、本発明のＨＰＰＤタンパク質を発現させるため、植物の特定の領域または組織に特異的なプロモーター配列、例えば種子に特異的なプロモーター（Ｄａｔｌａ，Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．３，２６９−２９６）、特にナピンプロモーター（ＥＰ２５５３７８Ａ１）、ファゼオリンプロモーター、グルテニンプロモーター、ヘリアンチニンプロモーター（ＷＯ９２／１７５８０）、アルブミンプロモーター（ＷＯ９８／４５４６０）、オレオシンプロモーター（ＷＯ９８／４５４６１）、ＳＡＴ１プロモーターまたはＳＡＴ３プロモーター（ＰＣＴ／ＵＳ９８／０６９７８）などを用いることができる。
【０１１７】
フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧ）、キチナーゼ、グルカナーゼ、プロテイナーゼ阻害剤（ＰＩ）、ＰＲ１ファミリー遺伝子、ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）およびｖｓｐＢプロモーター（ＵＳ５６７０３４９、表３）、ＨＭＧ２プロモーター（ＵＳ５６７０３４９）、リンゴ  ベータ−ガラクトシダーゼ（ＡＢＧ１）プロモーターおよびリンゴ  アミノシクロプロパンカルボキシレートシンターゼ（ＡＣＣシンターゼ）プロモーター（ＷＯ９８／４５４４５）から好都合に選ばれる誘導性プロモーターもまた使用され得る。連続したプロモーターを包含する複数のプロモーターを本発明のコンストラクト内で用いることができる。
【０１１８】
プロモーターは１もしくは複数のエンハンサーエレメントを包含し得るものであり、または包含するように改変され得る。いくつかの実施形態において、プロモーターは複数のエンハンサーエレメントを包含し得る。エンハンサーエレメントを含有するプロモーターは、それらを包含しないプロモーターと比べてより高い転写レベルを提供する。植物内での使用に適したエンハンサーエレメントとしては、ＰＣｌＳＶエンハンサーエレメント（米国特許第５，８５０，０１９号）、ＣａＭＶ  ３５Ｓエンハンサーエレメント（米国特許第５，１０６，７３９号および第５，１６４，３１６号）およびＦＭＶエンハンサーエレメント（Ｍａｉｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．６：１４３−１５６）；例えば出願ＷＯ８７／０７６４４中に記載されているタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）もしくはＣａｒｒｉｎｇｔｏｎ  ＆  Ｆｒｅｅｄ  １９９０、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：１５９０−１５９７により記載されているタバコエッチウイルス（ＴＥＶ）の翻訳活性化因子、またはイントロン、例えばトウモロコシのａｄｈ１イントロンもしくはイネアクチンのイントロン１などが挙げられる。ＰＣＴ  ＷＯ９６／２３８９８、ＷＯ２０１２／０２１７９４、ＷＯ２０１２／０２１７９７、ＷＯ２０１１／０８４３７０およびＷＯ２０１１／０２８９１４も参照されたい。
【０１１９】
しばしば、かかるコンストラクトは、５’および３’非翻訳領域を含有することができる。かかるコンストラクトは、翻訳と同時のまたは翻訳後の、一定の細胞内構造、例えば葉緑体（または他の色素体）、小胞体もしくはゴルジ体などへの、または分泌されるための目的ペプチドの輸送を促すための「シグナル配列」または「リーダー配列」を含有し得る。例えば、小胞体へのペプチド輸送を促すためのシグナルペプチドを含有するよう、コンストラクトを操作することができる。「シグナル配列」とは、翻訳と同時のまたは翻訳後の、細胞膜を横断したペプチド輸送をもたらすことが知られている、またはもたらすと考えられている配列が意図される。真核生物において、これは典型的にゴルジ体内への分泌を伴い、結果としてグリコシル化がもたらされることもある。「リーダー配列」とは、翻訳されると、翻訳と同時の細胞レベル下の細胞小器官へのペプチド鎖輸送を引き起こすのに十分なアミノ酸配列をもたらす任意の配列が意図される。したがって、これは、小胞体内の通過、液胞、葉緑体といった色素体、ミトコンドリアなどの通過による輸送および／またはグリコシル化を目的とするリーダー配列を包含する。イントロンのｍＲＮＡプロセシングが発現のために必要となるよう、植物発現カセットをイントロンを含有するように操作することも好ましいものであり得る。
【０１２０】
「３’非翻訳領域」とは、コーディング配列の下流に位置するポリヌクレオチドが意図される。ポリアデニル化シグナル配列およびｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸トラクト（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｒａｃｔ）の付加に影響を与えることが可能な調節シグナルをコードする他の配列は、３’非翻訳領域である。「５’非翻訳領域」とは、コーディング配列の上流に位置するポリヌクレオチドが意図される。
【０１２１】
他の上流または下流の非翻訳エレメントとしては、エンハンサーが挙げられる。エンハンサーは、プロモーター領域の発現を増加させるように作用するポリヌクレオチドである。エンハンサーは当該技術分野で周知であり、限定されるものではないが、ＳＶ４０エンハンサー領域および３５Ｓエンハンサーエレメントが挙げられる。
【０１２２】
終結領域は、転写開始領域にとって天然であってもよく、本発明の配列にとって天然であってもよく、または別の供給源に由来してもよい。好都合な終結領域は、Ａ．ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴｉ−プラスミドから利用可能なもの、例えばオクトピンシンターゼおよびノパリンシンターゼ終結領域などである。Ｇｕｅｒｉｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２６２：１４１−１４４；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ（１９９１）  Ｃｅｌｌ  ６４：６７１−６７４；Ｓａｎｆａｃｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．５：１４１−１４９；Ｍｏｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：１２６１−１２７２；Ｍｕｎｒｏｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ｇｅｎｅ  ９１：１５１−１５８；Ｂａｌｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：７８９１−７９０３；Ｊｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１５：９６２７−９６３９；および欧州特許出願ＥＰ０６３３３１７Ａ１も参照されたい。
【０１２３】
本発明の１の態様において、所与のポリペプチド、例えば本発明のポリペプチドなどのために合成のＤＮＡ配列が設計される。合成ＤＮＡ配列のオープンリーディングフレームの細胞内での発現は、本発明のポリペプチドの生産をもたらす。合成ＤＮＡ配列は、望まれない制限エンドヌクレアーゼ部位を単純に除去するのに、ＤＮＡクローニングストラテジーを容易にするのに、任意の潜在的なコドンバイアスを変えるもしくは除去するのに、ＧＣ含量を変えるもしくは改良するのに、代替的リーディングフレームを除去するもしくは変えるのに、および／または天然のＤＮＡ配列中に存在することがあるイントロン／エクソンのスプライス認識部位、ポリアデニル化部位、シャイン・ダルガノ配列、望まれないプロモーターエレメントなどを変えるもしくは除去するのに、有用であることができる。ＤＮＡ配列に他の改良を導入するために、例えばイントロン配列の導入、細胞小器官ターゲティング配列、例えば葉緑体輸送ペプチド、アポプラスト／液胞ターゲティングペプチドなどとの、または結果として得られたペプチドを小胞体内にとどめるペプチド配列とのタンパク質融合体として発現するＤＮＡ配列の作出などのために、合成のＤＮＡ配列を利用することもまた可能である。合成の遺伝子はまた発現改良のために宿主細胞優先的コドンを用いて合成することもでき、または宿主優先的コドン使用頻度でコドンを用いて合成してもよい。例えば、Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ａｎｄ  Ｇｏｗｒｉ（１９９０）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９２：１−１１；米国特許第６，３２０，１００号；第６，０７５，１８５号；第５，３８０，８３１号；および第５，４３６，３９１号、米国出願公開番号２００４０００５６００および２００１０００３８４９、ならびにＭｕｒｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：４７７−４９８を参照されたく、これらの文献は参照により本明細書中に組み込まれる。
【０１２４】
１の実施形態において、目的ポリヌクレオチドは、発現のために葉緑体を標的とする。この様式において、目的ポリヌクレオチドを葉緑体内に直接入れない場合、発現カセットは加えて、目的ヌクレオチドを葉緑体に向かわせるための輸送ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する。かかる輸送ペプチドは当該技術分野で公知である。例えば、Ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．９：１０４−１２６；Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１７５４４−１７５５０；Ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．８４：９６５−９６８；Ｒｏｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９６：１４１４−１４２１；およびＳｈａｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３３：４７８−４８１を参照されたい。
【０１２５】
葉緑体を標的とする目的ポリヌクレオチドは、葉緑体内での発現のため、植物の核とこの細胞小器官とのコドン使用の違いの責任を取るように最適化され得る。この様式において、目的ポリヌクレオチドは、葉緑体優先的コドンを用いて合成され得る。例えば米国特許第５，３８０，８３１号を参照されたく、この文献は参照により本明細書中に組み込まれる。
【０１２６】
この植物発現カセットは、植物形質転換ベクター内に挿入することができる。「形質転換ベクター」とは、細胞の形質転換を可能にするＤＮＡ分子が意図される。かかる分子は１または複数の発現カセットからなり得るものであって、１より多いベクターＤＮＡ分子内に構築され得る。例えば、バイナリーベクターは、植物細胞の形質転換のために必要な全てのシス作用性およびトランス作用性の機能をコードするために２つの近接していないＤＮＡベクターを利用する植物形質転換ベクターである（Ｈｅｌｌｅｎｓ  ａｎｄ  Ｍｕｌｌｉｎｅａｕｘ（２０００）  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ５：４４６−４５１）。「ベクター」とは、異なる宿主細胞間の輸送のために設計されたポリヌクレオチドコンストラクトをいう。「発現ベクター」とは、外来細胞内に異種のＤＮＡ配列または断片を組み入れ、組み込んで発現させる能力を持つベクターをいう。
【０１２７】
植物形質転換ベクターは、植物形質転換を達成するための１または複数のＤＮＡベクターを含む。例えば、１より多い近接したＤＮＡセグメントを含む植物形質転換ベクターの利用は、当該技術分野において通例的に行われる。これらのベクターは、当該技術分野においてしばしばバイナリーベクターと呼ばれる。バイナリーベクター、同様にヘルパープラスミドを伴うベクターは、アグロバクテリウム媒介性の形質転換のために最も頻繁に用いられるものであり、ここでは十分な形質転換を達成するために必要なＤＮＡセグメントのサイズおよび複雑性は相当に大きく、別々のＤＮＡ分子上に機能を分けることが有利である。バイナリーベクターは、典型的に、Ｔ−ＤＮＡ輸送のために必要とされるシス作用性配列（例えば左境界配列および右境界配列など）、植物細胞内での発現が可能なように操作される選択可能なマーカー、および「目的ポリヌクレオチド」（遺伝子導入植物の作成が望まれる植物細胞内での発現が可能なように操作されるポリヌクレオチド）を含有するプラスミドベクターを含有する。このプラスミドベクター上にはまた、細菌の複製に必要とされる配列も存在する。シス作用性配列は、植物細胞内への十分な輸送およびその中での発現を可能にするように配置される。例えば、選択可能なマーカー配列および目的配列は、左右の境界配列間に位置する。しばしば、第二のプラスミドベクターは、アグロバクテリウムから植物細胞へのＴ−ＤＮＡの輸送を媒介するトランス作用性因子を含有する。当該技術分野において理解されているように（Ｈｅｌｌｅｎｓ  ａｎｄ  Ｍｕｌｌｉｎｅａｕｘ（２０００）  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，５：４４６−４５１）、このプラスミドはしばしば、アグロバクテリウムによる植物細胞の感染、ならびに境界配列での切断によるＤＮＡの輸送およびｖｉｒ媒介性のＤＮＡ輸送を可能にする毒性機能（Ｖｉｒ遺伝子）を含有する。数タイプのアグロバクテリウム属株（例としてＬＢＡ４４０４、ＧＶ３１０１、ＥＨＡ１０１、ＥＨＡ１０５など）を植物形質転換のために用いることができる。第二のプラスミドベクターは、他の方法、例えばマイクロプロジェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ポリエチレングリコールなどによる植物内へのポリヌクレオチドの導入に必要ではない。
【０１２８】
Ｇ．植物形質転換
本発明の方法は、ヌクレオチドコンストラクトを植物内に導入することを伴う。「導入すること」とは、ヌクレオチドコンストラクトが植物の細胞の内部にアクセスするように植物にコンストラクトを提示することが意図される。本発明の方法は、ヌクレオチドコンストラクトを植物に導入するための特定の方法を用いることを必要とせず、ヌクレオチドコンストラクトが植物の少なくとも１の細胞の内部にアクセスすることのみを必要とする。ヌクレオチドコンストラクトを植物内に導入する方法は、当該技術分野で公知であり、これらとしては限定されるものではないが、安定的形質転換法、一過性形質転換法およびウイルス媒介性の方法が挙げられる。例えば：ＵＳ４，４５９，３５５、ＵＳ４，５３６，４７５、ＵＳ５，４６４，７６３、ＵＳ５，１７７，０１０、ＵＳ５，１８７，０７３、ＥＰ２６７，１５９Ａ１、ＥＰ６０４６６２Ａ１、ＥＰ６７２７５２Ａ１、ＵＳ４，９４５，０５０、ＵＳ５，０３６，００６、ＵＳ５，１００，７９２、ＵＳ５，３７１，０１４、ＵＳ５，４７８，７４４、ＵＳ５，１７９，０２２、ＵＳ５，５６５，３４６、ＵＳ５，４８４，９５６、ＵＳ５，５０８，４６８、ＵＳ５，５３８，８７７、ＵＳ５，５５４，７９８、ＵＳ５，４８９，５２０、ＵＳ５，５１０，３１８、ＵＳ５，２０４，２５３、ＵＳ５，４０５，７６５、ＥＰ４４２１７４Ａ１、ＥＰ４８６２３３Ａ１、ＥＰ４８６２３４Ａ１、ＥＰ５３９５６３Ａ１、ＥＰ６７４７２５Ａ１、ＷＯ９１／０２０７１、ＷＯ９５／０６１２８およびＷＯ２０１１／０９５４６０中に記載されている植物細胞を形質転換して植物を再生させる方法を参照されたく、これらの文献の各々は、とりわけその中に記載されている形質転換方法に関して参照により本明細書中に組み込まれる。
【０１２９】
一般的に、植物形質転換方法は、異種のＤＮＡを標的植物細胞（例として未成熟のまたは成熟した胚、懸濁培養物、未分化のカルス、プロトプラストなど）内に輸送すること、およびその後に形質転換された植物細胞を形質転換されていない細胞集団の群から回収するために最大閾値レベルの適切な選抜（選択可能なマーカー遺伝子に応じたもの）を適用することを伴う。外植片は、典型的に、新たに供給された同じ培地に移され、ルーチン的に培養される。続いて、形質転換細胞は、最大閾値レベルの選択剤を補った再生培地上に置かれた後、シュートへと分化する。シュートは次いで、発根したシュートまたは小植物を回収するための選択的発根培地に移される。遺伝子導入小植物は次いで、成熟植物へと成長し、稔性種子を生産する（例としてＨｉｅｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）  Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ６：２７１−２８２；Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：７４５−７５０）。外植片は、典型的に、新たに供給された同じ培地に移され、ルーチン的に培養される。遺伝子導入植物を作成するための技術および方法の一般的説明は、Ａｙｒｅｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｋ（１９９４）  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １３：２１９−２３９およびＢｏｍｍｉｎｅｎｉ  ａｎｄ  Ｊａｕｈａｒ（１９９７）  Ｍａｙｄｉｃａ  ４２：１０７−１２０中に見出される。形質転換材料は多くの細胞を含有することから；供された標的カルスまたは組織または細胞群の任意の片の中には形質転換された細胞および形質転換されていない細胞の両方が存在する。形質転換されていない細胞を殺滅し、形質転換された細胞を増殖させる能力は、形質転換植物の培養をもたらす。しばしば、形質転換されていない細胞を除去する能力は、形質転換植物細胞の迅速な回収および遺伝子導入植物の作成成功の制限事項である。遺伝子導入植物のゲノム内の組み込まれた目的異種遺伝子の存在を確認するため、分子生化学的方法を用いることができる。
【０１３０】
遺伝子導入植物の作成は、限定されるものではないが、アグロバクテリウムによる植物細胞内への異種ＤＮＡの導入（アグロバクテリウム媒介性の形質転換）、粒子に付着した異種の外来ＤＮＡの植物細胞への照射、およびＤＮＡを輸送するための他の様々な非粒子の直接媒介性の方法（ｎｏｎ−ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｄｉｒｅｃｔ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ）（例としてＨｉｅｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）  Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ６：２７１−２８２；Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：７４５−７５０；Ａｙｒｅｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｋ（１９９４）  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １３：２１９−２３９；Ｂｏｍｍｉｎｅｎｉ  ａｎｄ  Ｊａｕｈａｒ（１９９７）  Ｍａｙｄｉｃａ  ４２：１０７−１２０）といった数個の方法のうちの１によって実施され得る。
【０１３１】
葉緑体の形質転換のための方法は、当該技術分野で公知である。例えばＳｖａｂ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：８５２６−８５３０；Ｓｖａｂ  ａｎｄ  Ｍａｌｉｇａ（１９９３）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：９１３−９１７；Ｓｖａｂ  ａｎｄ  Ｍａｌｉｇａ（１９９３）  ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：６０１−６０６を参照されたい。この方法は、選択可能なマーカーを含有するＤＮＡのパーティクルガン送達、および相同組換えを介した色素体ゲノムへのＤＮＡターゲティングに依存する。加えて、色素体形質転換は、核がコードする色素体指向性ＲＮＡポリメラーゼの組織優先的発現によるサイレントな色素体産生性導入遺伝子のトランス活性化によって達成することができる。かかる系は、ＭｃＢｒｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：７３０１−７３０５中に報告されている。
【０１３２】
形質転換された植物細胞は、慣用的な方法に従って、植物へと成長させ得る。例えばＭｃＣｏｒｍｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ５：８１−８４を参照されたい。次いでこれらの植物を成長させ、同じ形質転換株または異なる株と受粉し、結果として得られる所望の表現型特性を構成的に発現する雑種を同定し得る。所望の表現型特性の発現が安定的に維持されて遺伝することを確実にするために２またはそれより多い世代を成長させてもよく、次いで、所望の表現型特性の発現が達成されたことを確実にするために種子を収穫してもよい。このように、本発明は、本発明のヌクレオチドコンストラクト、例えば本発明の発現カセットがそのゲノム内に安定的に組み入れられた形質転換種子（「遺伝子導入種子」ともいう）を提供する。様々な実施形態において、少なくとも１の殺真菌剤および／もしくは少なくとも１の殺虫剤、少なくとも１の除草剤、および／もしくは少なくとも１の毒性緩和剤、またはそれらの任意の組み合わせを使用して種子をコーティングすることができる。
【０１３３】
Ｈ  植物形質転換の評価
異種の外来ＤＮＡの植物細胞への導入に続いて、植物ゲノム内での異種遺伝子の形質転換または組み込みが、様々な方法、例えば組み込まれた遺伝子に関連した核酸、タンパク質および代謝物の分析などにより確認される。
【０１３４】
ＰＣＲ分析は、土壌中に移植する前のより早い段階で組み入れられた遺伝子の存在について、形質転換された細胞、組織またはシュートをスクリーニングする迅速な方法である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ））。ＰＣＲは、目的遺伝子またはバックグラウンドのアグロバクテリウムベクターなどに特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて行われる。
【０１３５】
植物形質転換は、ゲノムＤＮＡのサザンブロット分析により確認され得る（上のＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１））。一般的に、全ＤＮＡを形質転換体から抽出し、適切な制限酵素で消化し、アガロースゲル内で分画し、ニトロセルロースまたはナイロンメンブレンにトランスファーする。次いで、標準的な技術に従って、メンブレンまたは「ブロット」を例えば放射性標識された３２Ｐ標的ＤＮＡ断片をプローブとして用いて調べることで、植物ゲノム内での導入遺伝子の組み込みを確認することができる（上のＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１）。
【０１３６】
ノーザン分析においては、当該技術分野においてルーチン的に用いられる標準的な手法に従って、形質転換体の特定組織からＲＮＡを単離し、ホルムアルデヒドアガロースゲル内で分画し、ナイロンフィルター上にブロットする（上のＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１））。次いで本発明のヌクレオチド配列によりコードされるＲＮＡの発現を、当該技術分野で公知の方法により、ＧＤＣ由来の放射性プローブとハイブリダイズさせることによって試験する（上のＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１））。ＲＮＡはまた、当該技術分野で知られているように、逆転写酵素ＰＣＲを用いて検出および／または定量することができる（例としてＧｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ（２０１２）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗｏｏｄｂｕｒｙ，ＮＹ）。
【０１３７】
除草剤耐性遺伝子によりコードされるタンパク質の存在を決定するため、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ラテラルフロー試験および生化学的アッセイなどを、遺伝子導入植物に対して、除草剤耐性タンパク質上に存在する１または複数のエピトープと結合する抗体を用いた標準的な手法（上のＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１））によって行い得る。
【０１３８】
本発明の１の態様において、本明細書中に記載されているＨＰＰＤ遺伝子は、細菌または植物細胞の形質転換を査定するためのマーカーとして有用である。
【０１３９】
Ｉ．形質転換マーカーとしての使用
本発明はまた、植物を形質転換する方法における、マーカー遺伝子としてのまたはＨＰＰＤ阻害剤である除草剤への耐性を植物に付与することを可能にするコーディング配列としての本発明によるＨＰＰＤをコードする核酸の使用、および本発明によるＨＰＰＤをコードする核酸配列を含む植物に対する１または複数のＨＰＰＤ阻害剤の使用に関する。例えば米国特許６，７９１，０１４を参照されたく、この文献は参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる。
【０１４０】
この実施形態において、形質転換ステップの前にコンピテント植物細胞を退色させるため、前記細胞の培養培地中にＨＰＰＤ阻害剤を導入することができる。退色コンピテント細胞は次いで、選択マーカーとしてのＨＰＰＤ阻害剤に耐性の遺伝子で形質転換され、前記選択マーカーがそのゲノム内に組み込まれた形質転換細胞は緑色になり、これによりそれらを選抜することが可能になる。かかるプロセスは、形質転換細胞を選抜するのに必要とされる時間を減らすことを可能にする。
【０１４１】
したがって、本発明の１の実施形態は、選択マーカーとしてＨＰＰＤ阻害剤に耐性の遺伝子を有する前記植物細胞内に異種遺伝子を導入することにより植物細胞を形質転換する方法からなり、この方法は異種遺伝子を受容することが可能なコンピテント植物細胞を調製し好適な培地中で培養すること、および適量のＨＰＰＤ阻害剤をコンピテント植物細胞の好適な培養培地中に導入することを含む。コンピテント細胞を次いで異種遺伝子および選択マーカーで形質転換し、異種遺伝子を含む形質転換細胞を好適な培地中で成長させ、そこから形質転換体を選抜する。次いで、形質転換された細胞を稔性の形質転換植物へと再生させることができる。
【０１４２】
Ｊ．植物および植物部分
「植物」とは、全植物体、植物器官（例として葉、茎、根など）、種子、植物細胞、栄養繁殖体、胚およびこれらの子孫が意図される。植物細胞は分化していても未分化であってもよい（例としてカルス、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉細胞、根細胞、師部細胞、花粉）。本発明は、限定されるものではないが、単子葉植物および双子葉植物といった任意の植物種へのポリヌクレオチドの導入のために用いられ得る。目的植物の例としては、限定されるものではないが、コーン（トウモロコシ）、ソルガム、コムギ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科植物、コショウ、ジャガイモ、ワタ、イネ、ダイズ、テンサイ、サトウキビ、タバコ、オオムギおよびアブラナ、ブラシカ属種（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｓｐ．）、アルファルファ、ライムギ、キビ、ベニバナ、ピーナッツ、サツマイモ、キャッサバ、コーヒー、ココナツ、パイナップル、柑橘類、ココア、チャ、バナナ、アボカド、イチジク、グアバ、マンゴー、オリーブ、パパイヤ、カシュー、マカダミア、アーモンド、カラスムギ、野菜、観賞植物および針葉樹が挙げられる。
【０１４３】
野菜としては、限定されるものではないが、トマト、レタス、アオマメ、アオイマメ、エンドウマメならびにクルクミス（Ｃｕｒｃｕｍｉｓ）属のメンバー、例えばキュウリ、カンタループおよびマスクメロンなどが挙げられる。観賞植物としては、限定されるものではないが、ツツジ、アジサイ、ハイビスカス、バラ、チューリップ、ラッパズイセン、ペチュニア、カーネーション、ポインセチアおよびキクが挙げられる。目的の作物植物としてはまた、例えばトウモロコシ、ソルガム、コムギ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科植物、コショウ、ジャガイモ、ワタ、イネ、ダイズ、テンサイ、サトウキビ、タバコ、オオムギ、アブラナなどが挙げられる。
【０１４４】
本発明は、限定されるものではないが、トウモロコシ、イネ、オオムギ、カラスムギ、コムギ、ソルガム、ライムギ、サトウキビ、パイナップル、ヤマノイモ、タマネギ、バナナ、ココナツおよびナツメヤシといった単子葉植物の科の任意のメンバーに適している。
【０１４５】
Ｋ．植物収量を増加させる方法
植物収量を増加させる方法が提供される。この方法は、本発明のＨＰＰＤをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む植物を用意すること、またはかかるポリヌクレオチドを植物もしくは植物細胞内に導入すること、植物またはその種子を圃場内で生育させること、および前記植物または種子から収穫物を生産することを含む。本明細書中に定義される植物の「収量」とは、植物により生産されるバイオマスの質および／または量をいう。「バイオマス」とは、任意の測定される植物生産物が意図される。バイオマス生産の増加は、測定される植物生産物の収量の何かしらの改善である。植物収量を増加させることには、いくらかの商業的用途がある。例えば、植物の葉のバイオマスを増加させることは、ヒトまたは動物の消費のための葉物野菜の収量を増加させ得る。加えて、葉のバイオマスを増加させることは、植物由来の医薬または工業製品の生産を増加させるために用いることができる。収量の増加は、限定されるものではないが、少なくとも１％の増加、少なくとも３％の増加、少なくとも５％の増加、少なくとも１０％の増加、少なくとも２０％の増加、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも１００％またはそれより多い増加といった任意の統計的に有意な増加を含むことができる。
【０１４６】
特定の方法において、本発明のＨＰＰＤ配列を含む植物は、有効濃度のＨＰＰＤ阻害除草剤、例えば、Ｎ  （１，２，５−オキサジアゾール−３−イル）ベンズアミド類；Ｎ−（テトラゾール−４−イル）−もしくはＮ−（トリアゾール−３−イル）アリールカルボキサミド類、好ましくは例えば２−クロロ−３−エトキシ−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミドおよび２−クロロ−３−（メトキシメチル）−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミドなど；Ｎ−（１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）ベンズアミド類、好ましくは例えば２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）−３−（メチルスルホニル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（化合物１）など；Ｎ−（テトラゾール−５−イル）−もしくはＮ−（トリアゾール−３−イル）アリールカルボキサミド類、好ましくは例えば２−クロロ−３−エトキシ−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド（化合物２）、４−（ジフルオロメチル）−２−メトキシ−３−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド（化合物３）、２−クロロ−３−（メチルスルファニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（化合物４）および２−（メトキシメチル）−３−（メチルスルフィニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（化合物５）など；ピリダジノン誘導体類（ＷＯ２０１３／０５０４２１およびＷＯ２０１３／０８３７７４）；置換１，２，５−オキサジアゾール類（ＷＯ２０１３／０７２３００およびＷＯ２０１３／０７２４０２）；ならびにオキソプラジン誘導体類（ＷＯ２０１３／０５４４９５）；トリケトン類、好ましくは例えばテンボトリオン、スルコトリオンおよびメソトリオンなど；イソオキサゾール類、好ましくは例えばイソオキサフルトールなど；またはピラゾリネート類、好ましくは例えばピラスルホトールおよびトプラメゾンなどのＨＰＰＤ阻害除草剤よりなる群から選択される１または複数のＨＰＰＤ阻害除草剤などで処理され、この除草剤施用は植物収量の増大をもたらす。
【０１４７】
植物または植物部分内に除草剤耐性を付与する方法もまた提供される。かかる方法において、本発明のＨＰＰＤをコードするヌクレオチド配列が植物内に導入され、ここでポリヌクレオチドの発現によりＨＰＰＤ阻害除草剤耐性がもたらされる。この方法を介して生産される植物は、有効濃度のＨＰＰＤ阻害除草剤（例えば、Ｎ  （１，２，５−オキサジアゾール−３−イル）ベンズアミド類；Ｎ−（テトラゾール−４−イル）−もしくはＮ−（トリアゾール−３−イル）アリールカルボキサミド類、好ましくは例えば２−クロロ−３−エトキシ−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミドおよび２−クロロ−３−（メトキシメチル）−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミドなど；Ｎ−（１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）ベンズアミド類、好ましくは例えば２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）−３−（メチルスルホニル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（化合物１）など；Ｎ−（テトラゾール−５−イル）−もしくはＮ−（トリアゾール−３−イル）アリールカルボキサミド類、好ましくは例えば２−クロロ−３−エトキシ−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド（化合物２）、４−（ジフルオロメチル）−２−メトキシ−３−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド（化合物３）、２−クロロ−３−（メチルスルファニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（化合物４）、２−（メトキシメチル）−３−（メチルスルフィニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（化合物５）など；ピリダジノン誘導体類（ＷＯ２０１３／０５０４２１およびＷＯ２０１３／０８３７７４）；置換１，２，５−オキサジアゾール類（ＷＯ２０１３／０７２３００およびＷＯ２０１３／０７２４０２）；ならびにオキソプラジン誘導体類（ＷＯ２０１３／０５４４９５）；トリケトン類、好ましくは例えばテンボトリオン、スルコトリオンおよびメソトリオンなど；イソオキサゾール類、好ましくは例えばイソオキサフルトールなど；またはピラゾリネート類、好ましくは例えばピラスルホトールおよびトプラメゾンなどのＨＰＰＤ阻害除草剤よりなる群から選択される１または複数のＨＰＰＤ阻害除草剤など）で処理され、除草剤への耐性向上を呈することができる。本出願における除草剤の「有効濃度」は、生来的に除草剤に耐性でないまたは耐性を与えられていない植物または植物部分の成長を遅延させるまたは停止させるのに十分な量である。
【０１４８】
Ｌ．圃場内の雑草を防除する方法
それゆえに、本発明はまた、本発明によるＨＰＰＤをコードするヌクレオチド配列を含む植物の作物中で望まれない植物を防除する、または植物の成長を調節する方法に関し、ここで１または複数のＨＰＰＤ阻害除草剤、例えば、Ｎ  （１，２，５−オキサジアゾール−３−イル）ベンズアミド類；Ｎ−（テトラゾール−４−イル）−もしくはＮ−（トリアゾール−３−イル）アリールカルボキサミド類、好ましくは例えば２−クロロ−３−エトキシ−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミドおよび２−クロロ−３−（メトキシメチル）−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミドなど；Ｎ−（１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）ベンズアミド類、好ましくは例えば２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）−３−（メチルスルホニル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（化合物１）など；Ｎ−（テトラゾール−５−イル）−もしくはＮ−（トリアゾール−３−イル）アリールカルボキサミド類、好ましくは例えば２−クロロ−３−エトキシ−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド（化合物２）、４−（ジフルオロメチル）−２−メトキシ−３−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド（化合物３）、２−クロロ−３−（メチルスルファニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（化合物４）および２−（メトキシメチル）−３−（メチルスルフィニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（化合物５）など；ピリダジノン誘導体類（ＷＯ２０１３／０５０４２１およびＷＯ２０１３／０８３７７４）；置換１，２，５−オキサジアゾール類（ＷＯ２０１３／０７２３００およびＷＯ２０１３／０７２４０２）；ならびにオキソプラジン誘導体類（ＷＯ２０１３／０５４４９５）；トリケトン類、好ましくは例えばテンボトリオン、スルコトリオンおよびメソトリオンなど；イソオキサゾール類、好ましくは例えばイソオキサフルトールなど；またはピラゾリネート類、好ましくは例えばピラスルホトールおよびトプラメゾンなどのＨＰＰＤ阻害除草剤よりなる群から選択される１または複数のＨＰＰＤ阻害除草剤が、植物（例えば有害植物、例えば単子葉または双子葉の雑草または望まれない作物植物など）に、種子（例えば穀粒、種子または栄養繁殖体、例えば塊茎または芽を有するシュート部など）に、または植物が生育する領域（例えば耕作下の領域）に施用される。この関連で、有効濃度の１または複数のＨＰＰＤ阻害除草剤、例えば、Ｎ  （１，２，５−オキサジアゾール−３−イル）ベンズアミド類；Ｎ−（テトラゾール−４−イル）−もしくはＮ−（トリアゾール−３−イル）アリールカルボキサミド類、好ましくは例えば２−クロロ−３−エトキシ−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミドおよび２−クロロ−３−（メトキシメチル）−４−（メチルスルホ��ル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミドなど；Ｎ−（１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）ベンズアミド類、好ましくは例えば２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）−３−（メチルスルホニル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（化合物１）など；Ｎ−（テトラゾール−５−イル）−もしくはＮ−（トリアゾール−３−イル）アリールカルボキサミド類、好ましくは例えば２−クロロ−３−エトキシ−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド（化合物２）、４−（ジフルオロメチル）−２−メトキシ−３−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド（化合物３）、２−クロロ−３−（メチルスルファニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（化合物４）および２−（メトキシメチル）−３−（メチルスルフィニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（化合物５）など；ピリダジノン誘導体類（ＷＯ２０１３／０５０４２１およびＷＯ２０１３／０８３７７４）；置換１，２，５−オキサジアゾール類（ＷＯ２０１３／０７２３００およびＷＯ２０１３／０７２４０２）；ならびにオキソプラジン誘導体類（ＷＯ２０１３／０５４４９５）；トリケトン類、好ましくは例えばテンボトリオン、スルコトリオンおよびメソトリオンなど；イソオキサゾール類、好ましくは例えばイソオキサフルトールなど；またはピラゾリネート類、好ましくは例えばピラスルホトールおよびトプラメゾンなど、イソオキサゾール類、好ましくは例えばイソオキサフルトールなど、またはピラゾリネート類、好ましくは例えばピラスルホトールおよびトプラメゾンなどのＨＰＰＤ阻害除草剤よりなる群から選択される１または複数のＨＰＰＤ阻害除草剤、とりわけテンボトリオン、スルコトリオン、トプラメゾン、ビシクロピロン、テフリルトリオン、イソオキサフルトールおよびメソトリオンから選択される１または複数のＨＰＰＤ阻害除草剤を、例えば植え付け前（適切な場合はまた土壌内への組み入れにもよって）、出芽前または出芽後に施用することができ、これは、作物が生来的に耐性である他の除草剤、または１もしくは複数の他の除草剤抵抗性導入遺伝子の発現を介して抵抗性である他の除草剤の施用と組み合わせ得る。例として米国出願公開番号２００４／００５８４２７およびＰＣＴ出願公開番号ＷＯ９８／２０１４４を参照されたい。「有効濃度」とは、ＨＰＰＤ阻害剤耐性植物または植物種子に著しい影響を与えることなく、雑草または他の形質転換されていない植物の成長または拡散を制御する濃度が意図される。当業者は、除草剤の施用は多くの異なる形態をとることができ、種子植え付けおよび成長プロセスの前および／またはこれら全体にわたる多くの異なる時に行うことができることを理解する。「出芽前」施用とは、土壌から植物が目に見えて出芽する前に目的領域（例として圃場または耕作領域）に施用される除草剤をいう。「出芽後」施用とは、土壌から植物が目に見えて出芽した後��領域に施用される除草剤をいう。用語「出芽前」および「出芽後」は目的領域内の雑草に関して用いられることもあり、これらの用語が目的領域内の作物植物に関して用いられることもある。雑草に関して用いられるとき、これらの用語は、目的領域内に存在するまたは存在すると思われる特定のタイプの雑草または雑草種に適用され得る。除草剤の「植え付け前組み入れ」は、植え付け前の土壌内への化合物の組み入れを伴う。
【０１４９】
したがって、本発明は、圃場内に本発明のＨＰＰＤを含む植物またはその種子を植えること、および前記植物または前記植物の周辺領域に有効濃度の１または複数のＨＰＰＤ阻害除草剤を施用することを含む、圃場内の雑草を防除する方法を含む。
【０１５０】
本発明の１の実施形態において、本発明のＨＰＰＤヌクレオチド配列を含有する植物（例としてダイズ、ワタ、コーンまたはコムギ植物など）を植えることになる圃場は、植物が植えられる前または種子が蒔かれる前にＨＰＰＤ阻害除草剤、例えばイソオキサフルトール（ＩＦＴ）などで処理することができ、これは、ＨＰＰＤ阻害剤により殺滅される雑草の圃場をクリーンにして、不耕起の実行を、その後にその同じ前処理圃場内でののちの植物の植え付けまたは播種（ＨＰＰＤ阻害除草剤を用いたバーンダウン施用（ｂｕｒｎｄｏｗｎ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ））を可能にする。ＩＦＴの残存活性はまた、初期の成長段階において雑草による競合から出芽中および生育中の植物を保護する。植物が一定のサイズになって雑草が再び現れがちになったら、グルホシネートもしくはグリホサート、またはＨＰＰＤ阻害剤もしくはＨＰＰＤ阻害剤と別の除草剤、例えばグリホサートなどとの混合物を、かかる植物が前記除草剤に耐性であるときに、植物の頂部上から出芽後除草剤として施用することができる。
【０１５１】
本発明の別の実施形態において、本発明のＨＰＰＤヌクレオチド配列を含有する種子が蒔かれた圃場を、ＨＰＰＤ阻害除草剤、例えばＩＦＴなどで、種子を蒔いた後であるが植物が出芽する前に処理することができ（圃場は、他の手段、典型的には慣用的な耕起の実行、例えばプラウ、チゼルプラウ（ｃｈｉｓｓｅｌ  ｐｌｏｕｇｈｉｎｇ）または苗床の用意などを用いて播種前に雑草をなくすことができる）、ここで残存活性は除草剤により殺滅される雑草のない状態で圃場を維持し、このために出芽中または生育中の植物は雑草と競合しない（ＨＰＰＤ阻害除草剤の出芽前施用）。植物が一定のサイズになって雑草が再び現れがちになったら、グルホシネートもしくはグリホサート、またはＨＰＰＤ阻害剤もしくはＨＰＰＤ阻害剤と別の除草剤、例えばグリホサートなどとの混合物を、かかる植物が前記除草剤に耐性であるときに、植物の頂部上から出芽後除草剤として施用することができる。
【０１５２】
本発明の別の実施形態において、本発明のＨＰＰＤヌクレオチド配列を含有する植物は、蒔かれた種子から出芽した植物の頂部上からＨＰＰＤ阻害除草剤で処理することができ、これは、ＨＰＰＤ阻害剤により殺滅される雑草の圃場をクリーンにするものであり、この施用は、植物の頂部上からの出芽後除草剤としてのグリホサートまたはグルホシネートでの処理（ＨＰＰＤ阻害除草剤の出芽後施用（グリホサートを伴うまたは伴わない））と共に（例としてスプレータンクミックス（ｓｐｒａｙ  ｔａｎｋ  ｍｉｘ）中で）、その後にまたはその前に、かかる植物がかかる除草剤に耐性であるときに行うことができる。
【０１５３】
ＨＰＰＤ阻害除草剤で防除することができる単子葉雑草および双子葉雑草の個々の代表的な例としては、以下が挙げられる：
単子葉有害植物：エギロプス属（Ａｅｇｉｌｏｐｓ）、アグロピロン属（Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ）、アグロスティス属（Ａｇｒｏｓｔｉｓ）、アロペクルス属（Ａｌｏｐｅｃｕｒｕｓ）、アペラ属（Ａｐｅｒａ）、アベナ属（Ａｖｅｎａ）、ブラキアリア属（Ｂｒａｃｈｉａｒｉａ）、ブロムス属（Ｂｒｏｍｕｓ）、ケンクルス属（Ｃｅｎｃｈｒｕｓ）、コメリナ属（Ｃｏｍｍｅｌｉｎａ）、キノドン属（Ｃｙｎｏｄｏｎ）、キペルス属（Ｃｙｐｅｒｕｓ）、ダクチロクテニウム属（Ｄａｃｔｙｌｏｃｔｅｎｉｕｍ）、ジギタリア属（Ｄｉｇｉｔａｒｉａ）、エキノクロア属（Ｅｃｈｉｎｏｃｈｌｏａ）、エレオカリス属（Ｅｌｅｏｃｈａｒｉｓ）、エレウシネ属（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ）、エラグロスティス属（Ｅｒａｇｒｏｓｔｉｓ）、エリオクロア属（Ｅｒｉｏｃｈｌｏａ）、フェスツカ属（Ｆｅｓｔｕｃａ）、フィムブリスチリス属（Ｆｉｍｂｒｉｓｔｙｌｉｓ）、ヘテランテラ属（Ｈｅｔｅｒａｎｔｈｅｒａ）、インペラタ属（Ｉｍｐｅｒａｔａ）、イシェマム属（Ｉｓｃｈａｅｍｕｍ）、レプトクロア属（Ｌｅｐｔｏｃｈｌｏａ）、ロリウム属（Ｌｏｌｉｕｍ）、モノコリア属（Ｍｏｎｏｃｈｏｒｉａ）、パニクム属（Ｐａｎｉｃｕｍ）、パスパルム属（Ｐａｓｐａｌｕｍ）、ファラリス属（Ｐｈａｌａｒｉｓ）、フレウム属（Ｐｈｌｅｕｍ）、ポア属（Ｐｏａ）、ロトボエリア属（Ｒｏｔｔｂｏｅｌｌｉａ）、サジタリア属（Ｓａｇｉｔｔａｒｉａ）、シルプス属（Ｓｃｉｒｐｕｓ）、セタリア属（Ｓｅｔａｒｉａ）、ソルガム属（Ｓｏｒｇｈｕｍ）。
【０１５４】
双子葉雑草：アブチロン属（Ａｂｕｔｉｌｏｎ）、アマランサス属（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ）、アンブロシア属（Ａｍｂｒｏｓｉａ）、アノダ属（Ａｎｏｄａ）、アンテミス属（Ａｎｔｈｅｍｉｓ）、アファネス属（Ａｐｈａｎｅｓ）、アルテミシア属（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ）、アトリプレクス属（Ａｔｒｉｐｌｅｘ）、ベリス属（Ｂｅｌｌｉｓ）、ビデンス属（Ｂｉｄｅｎｓ）、カプセラ属（Ｃａｐｓｅｌｌａ）、カルドゥウス属（Ｃａｒｄｕｕｓ）、カシア属（Ｃａｓｓｉａ）、ケンタウレア属（Ｃｅｎｔａｕｒｅａ）、ケノポディウム属（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ）、キルシウム属（Ｃｉｒｓｉｕｍ）、コンボルブルス属（Ｃｏｎｖｏｌｖｕｌｕｓ）、ダチュラ属（Ｄａｔｕｒａ）、デスモジウム属（Ｄｅｓｍｏｄｉｕｍ）、エメクス属（Ｅｍｅｘ）、エリシマム属（Ｅｒｙｓｉｍｕｍ）、ユーフォルビア属（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ）、ガレオプシス属（Ｇａｌｅｏｐｓｉｓ）、ガリンソガ属（Ｇａｌｉｎｓｏｇａ）、ガリウム属（Ｇａｌｉｕｍ）、ヒビスクス属（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ）、イポメア属（Ｉｐｏｍｏｅａ）、コキア属（Ｋｏｃｈｉａ）、ラミウム属（Ｌａｍｉｕｍ）、レピジウム属（Ｌｅｐｉｄｉｕｍ）、リンデルニア属（Ｌｉｎｄｅｒｎｉａ）、マトリカリア属（Ｍａｔｒｉｃａｒｉａ）、メンタ属（Ｍｅｎｔｈａ）、マーキュリアリス属（Ｍｅｒｃｕｒｉａｌｉｓ）、ムルゴ属（Ｍｕｌｌｕｇｏ）、ミオソティス属（Ｍｙｏｓｏｔｉｓ）、パパベル属（Ｐａｐａｖｅｒ）、ファルビティス属（Ｐｈａｒｂｉｔｉｓ）、プランタゴ属（Ｐｌａｎｔａｇｏ）、ポリゴヌム属（Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ）、ポーチュラカ属（Ｐｏｒｔｕｌａｃａ）、ラヌンクルス属（Ｒａｎｕｎｃｕｌｕｓ）、ラファヌス属（Ｒａｐｈａｎｕｓ）、ロリッパ属（Ｒｏｒｉｐｐａ）、ロタラ属（Ｒｏｔａｌａ）、ルメクス属（Ｒｕｍｅｘ）、サルソラ属（Ｓａｌｓｏｌａ）、セネシオ属（Ｓｅｎｅｃｉｏ）、セスバニア属（Ｓｅｓｂａｎｉａ）、シダ属（Ｓｉｄａ）、シナピス属（Ｓｉｎａｐｉｓ）、ソラヌム属（Ｓｏｌａｎｕｍ）、ソンクス属（Ｓｏｎｃｈｕｓ）、スフェノクレア属（Ｓｐｈｅｎｏｃｌｅａ）、ステラリア属（Ｓｔｅｌｌａｒｉａ）、タラクサクム属（Ｔａｒａｘａｃｕｍ）、タラスピ属（Ｔｈｌａｓｐｉ）、トリフォリウム属（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ）、ウルチカ属（Ｕｒｔｉｃａ）、ベロニカ属（Ｖｅｒｏｎｉｃａ）、ビオラ属（Ｖｉｏｌａ）、キサンチウム属（Ｘａｎｔｈｉｕｍ）。
【０１５５】
限定されるものではないが、Ｎ  （１，２，５−オキサジアゾール−３−イル）ベンズアミド類；Ｎ−（テトラゾール−４−イル）−もしくはＮ−（トリアゾール−３−イル）アリールカルボキサミド類、好ましくは例えば２−クロロ−３−エトキシ−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミドおよび２−クロロ−３−（メトキシメチル）−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミドなど；Ｎ−（１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）ベンズアミド類、好ましくは例えば２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）−３−（メチルスルホニル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（化合物１）など；Ｎ−（テトラゾール−５−イル）−もしくはＮ−（トリアゾール−３−イル）アリールカルボキサミド類、好ましくは例えば２−クロロ−３−エトキシ−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド（化合物２）、４−（ジフルオロメチル）−２−メトキシ−３−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド（化合物３）、２−クロロ−３−（メチルスルファニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（化合物４）、２−（メトキシメチル）−３−（メチルスルフィニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（化合物５）など；ピリダジノン誘導体類（ＷＯ２０１３／０５０４２１およびＷＯ２０１３／０８３７７４）；置換１，２，５−オキサジアゾール類（ＷＯ２０１３／０７２３００およびＷＯ２０１３／０７２４０２）；ならびにオキソプラジン誘導体類（ＷＯ２０１３／０５４４９５）；トリケトン類、好ましくは例えばテンボトリオン、スルコトリオンおよびメソトリオンなど；イソオキサゾール類、好ましくは例えばイソオキサフルトールなど；またはピラゾリネート類、好ましくは例えばピラスルホトールおよびトプラメゾンなどのＨＰＰＤ阻害除草剤といった本発明において有用なＨＰＰＤ阻害除草剤は、支配的な生物学的および／または物理化学的パラメーターに応じて、様々な方法で製剤化することができる。可能な製剤の例は：水和剤（ＷＰ）、水溶剤（ＳＰ）、水溶性濃縮製剤、乳剤（ＥＣ）、エマルション（ＥＷ）、例えば水中油型および油中水型のエマルションなど、噴霧可能溶液（ｓｐｒａｙａｂｌｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、懸濁製剤（ＳＣ）、油または水を基剤とした分散製剤、油混和性溶液（ｏｉｌ−ｍｉｓｃｉｂｌｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、カプセル懸濁剤（ＣＳ）、粉剤（ＤＰ）、種子粉衣剤（ｓｅｅｄ−ｄｒｅｓｓｉｎｇ  ｐｒｏｄｕｃｔ）、全面散布（ｂｒｏａｄｃａｓｔｉｎｇ）および土壌に対する施用のための粒剤、微粒剤、噴霧粒剤、コーティング粒剤および吸着粒剤の形態の粒剤（ＧＲ）、顆粒水和剤（ＷＧ）、顆粒水溶剤（ＳＧ）、ＵＬＶ製剤、マイクロカプセルならびにワックスである。
【０１５６】
これらの個々の製剤タイプは原理的に公知であり、例えば：Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ−Ｋｕｃｈｌｅｒ，“Ｃｈｅｍｉｓｃｈｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ”［Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ］，ｖｏｌｕｍｅ  ７，Ｃ．Ｈａｕｓｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ  Ｍｕｎｉｃｈ，４ｔｈ  Ｅｄ．１９８６；Ｗａｄｅ  ｖａｎ  Ｖａｌｋｅｎｂｕｒｇ，“Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｎ．Ｙ．，１９７３；Ｋ．Ｍａｒｔｅｎｓ，“Ｓｐｒａｙ  Ｄｒｙｉｎｇ”  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，３ｒｄ  Ｅｄ．１９７９，Ｇ．Ｇｏｏｄｗｉｎ  Ｌｔｄ．Ｌｏｎｄｏｎ中に記載されている。
【０１５７】
必要とされる製剤助剤、例えば不活性材料、界面活性剤、溶媒およびさらなる添加物などもまた公知であり、例えば：Ｗａｔｋｉｎｓ，“Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅ  Ｄｕｓｔ  Ｄｉｌｕｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ”，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｄａｒｌａｎｄ  Ｂｏｏｋｓ，Ｃａｌｄｗｅｌｌ  Ｎ．Ｊ．，Ｈ．ｖ．Ｏｌｐｈｅｎ，“Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｌａｙ  Ｃｏｌｌｏｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”；２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．；Ｃ．Ｍａｒｓｄｅｎ，“Ｓｏｌｖｅｎｔｓ  Ｇｕｉｄｅ”；２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．１９６３；ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ  “Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ  Ａｎｎｕａｌ”，ＭＣ  Ｐｕｂｌ．Ｃｏｒｐ．，Ｒｉｄｇｅｗｏｏｄ  Ｎ．Ｊ．；Ｓｉｓｌｅｙ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄ，“Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ａｃｔｉｖｅ  Ａｇｅｎｔｓ”，Ｃｈｅｍ．Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．１９６４；Ｓｃｈｏｎｆｅｌｄｔ，“Ｇｒｅｎｚｆｌａｃｈｅｎａｋｔｉｖｅ  Ａｔｈｙｌｅｎｏｘｉｄａｄｄｕｋｔｅ”［Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ−ａｃｔｉｖｅ  ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｏｘｉｄｅ  ａｄｄｕｃｔｓ］，Ｗｉｓｓ．Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌ．，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ  １９７６；Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ−Ｋｕｃｈｌｅｒ，“Ｃｈｅｍｉｓｃｈｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ”［Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ］，ｖｏｌｕｍｅ  ７，Ｃ．Ｈａｎｓｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ  Ｍｕｎｉｃｈ，４ｔｈ  Ｅｄ．１９８６中に記載されている。
【０１５８】
これらの製剤を基にして、他の駆除活性物質、例えば殺虫剤、殺ダニ剤、除草剤、殺真菌剤との組み合わせを、ならびに毒性緩和剤、肥料および／または成長調節剤との組み合わせを、例えばレディミックス（ｒｅａｄｙ  ｍｉｘ）またはタンクミックス（ｔａｎｋ  ｍｉｘ）の形態で調製することもまた可能である。
【０１５９】
Ｍ．本発明の遺伝子を別の植物内に導入する方法
本明細書中でまた提供されるのは、本発明のＨＰＰＤヌクレオチド配列を別の植物内に導入する方法である。本発明のＨＰＰＤヌクレオチド配列またはその断片は、循環選抜、戻し交配、系統育種、系統選抜、集団選抜、突然変異育種および／または遺伝的マーカー強化選抜により第二の植物に導入することができる。
【０１６０】
したがって、１の実施形態において、本発明の方法は、本発明のＨＰＰＤヌクレオチド配列を含む第一の植物を第二の植物と交配することでＦ１子孫植物を生産すること、およびＨＰＰＤ阻害除草剤に耐性であるまたは本発明のＨＰＰＤヌクレオチド配列を含むＦ１子孫植物を選抜することを含む。方法は、さらに、選抜された子孫植物を本発明のＨＰＰＤヌクレオチド配列を含む第一の植物と交配することで戻し交配子孫植物を生産すること、およびＨＰＰＤ阻害除草剤に耐性であるまたは本発明のＨＰＰＤヌクレオチド配列を含む戻し交配子孫植物を選抜することを含み得る。ＨＰＰＤ阻害除草剤耐性を評価する方法は、本明細書中の別の場所で提供されている。方法は、さらに、これらのステップを１回または連続して複数回繰り返すことでＨＰＰＤ阻害除草剤に耐性であるまたは本発明のＨＰＰＤヌクレオチド配列を含む選抜された第二のまたはより高次の戻し交配子孫植物を生産することを含み得る。
【０１６１】
所望の表現型についての植物の選抜を伴う任意の育種方法を、本発明の方法において用いることができる。いくつかの実施形態において、分離したＦ２世代を生産するため、Ｆ１植物を自家受粉させ得る。育種集団内で形質が均一になるまたは固定されるまで、各世代（Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５など）において所望の表現型（例としてＨＰＰＤ阻害除草剤耐性）を表す個々の植物が選抜され得る。
【０１６２】
第二の植物は、所望の形質、例えば除草剤耐性、昆虫耐性、渇水耐性、線虫防除、水使用効率、窒素使用効率、栄養価改良、病害抵抗性、光合成改良、繊維品質改良、ストレス耐性、繁殖改良などを持つ植物であることができる。第二の植物は、本明細書中の別の場所に記載されている選り抜きのイベントであり得る。
【０１６３】
様々な実施形態において、下流の使用（例えば食料、飼料、バイオ燃料、油、粉類、ミールなど）のため、結果として得られる交配から植物部分（全植物体、植物器官（例として葉、茎、根など）、種子、植物細胞、栄養繁殖体、胚など）を収穫し、繁殖または収集することができる。
【０１６４】
Ｎ．植物生産物を得る方法
本発明はまた、本発明のＨＰＰＤ配列を含む作物から穀粒を収穫および／または製粉することでコモディティー製品を得ることを含む、コモディティー製品を得るためのプロセスに関する。ヒトの消費のための食料としての使用、またはヒトの消費が意図される組成物およびコモディティーにおける使用が意図される、限定されるものではないが動物飼料、コモディティーならびに植物生産物および副産物といった農学的および経済的に重要な物質の生産物および／または組成物、とりわけかかる穀粒／種子から生産される（半）加工品といった失活させた種子／穀粒生産物（前記生産物は、全粒のもしくは加工された種子もしくは穀粒、動物飼料、コーンミールもしくは大豆ミール、コーン粉もしくは大豆粉、コーン、コーンスターチ、大豆ミール、大豆粉、フレーク、大豆タンパク質濃縮物、大豆タンパク質分離物、調質大豆タンパク質濃縮物、化粧品、ヘアケア製品、ソイナッツバター（ｓｏｙ  ｎｕｔ  ｂｕｔｔｅｒ）、納豆、テンペ、大豆タンパク質加水分解物、ホイップ済みクリーム（ｗｈｉｐｐｅｄ  ｔｏｐｐｉｎｇ）、ショートニング、レシチン、可食全粒大豆（生、煎りまたは枝豆として）、大豆ヨーグルト、大豆チーズ、豆腐、湯葉、同様に調理した、研磨した、蒸した、焼いたもしくは湯通しした穀粒などであるか、またはこれらを含むものである）は、これらの物質の生産物および組成物がかかるヌクレオチド配列を含有する任意の植物についての診断としての検出可能な量の本明細書中に記載のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列を含有する場合、本発明の範囲内であることが意図される。
【０１６５】
次の例は説明として提供されるものであり、限定として提供されるものではない。
【実施例】
【０１６６】
実験
実施例１．第１世代点変異体ライブラリー
ＨＰＰＤ  ＰｆＥｖｏ３３変異体（国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／５９５９８（２０１３年９月１３日出願）中に記載され、本明細書中に配列番号５として記載されている）は、位置３３４および３３６において突然変異誘発した。これらの位置の飽和突然変異誘発は、ＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ（登録商標）  ｌｉｇｈｔｎｉｎｇキットを用いて行った。変異体をプールし、ＤＨ５アルファ  Ｅ．ｃｏｌｉ細胞内に形質転換した。６００個の個々のクローンをＨＰＰＤ阻害剤テンボトリオン（ＴＢＴ）への耐性についてスクリーニングした。クローンをＬＢ培地＋カナマイシン中、３７℃、シェーカー内で、ＯＤ６００ｎｍが０．３に達するまで生育させた。培養を次いで３０℃に切り替え、さらに１７時間インキュベートした。培養物をスピンダウンし、細胞ペレットを１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ／ＫＯＨ  ｐＨ７．６、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ中に再懸濁した。細胞をビーズ破砕により溶解し、遠心分離後に可溶性細胞抽出物を得た。
【０１６７】
変異体は、褐色アッセイをもちいて分析した。具体的には、ＨＰＰＤ抽出物をＬＢ寒天、カナマイシン、５ｍＭチロシン、４２ｍＭスクシネートおよびＨＰＰＤ阻害剤を含有する固形培地上にスポットすることにより、ＨＰＰＤ阻害剤耐性について９６ウェル形式でアッセイした。一次スクリーニングにおいて、２０ｕｌの抽出物を、２５０、５００、１０００または２０００ｕＭのテンボトリオンを含有するプレート上に３連でスポットした。プレートをエアポアテープ（ａｉｒｐｏｒｅ  ｔａｐｅ）で覆い、３７℃でインキュベートした。２４時間後、褐色色素形成について、ＰｆＨＰＰＤおよびＰｆＥｖｏ３３を含有する試料と肉眼で比較した。ＴＢＴの存在下でＰｆＥｖｏ３３より濃い褐色形成を示すバリアントを、０、５００、１０００、２０００ｕＭのＴＢＴ、および５００、１０００、２０００ｕＭのジケトニトリル（ＤＫＮ、イソオキサフルトール（ＩＦＴ）の活性化合物）、および５００、１０００、２０００ｕＭのメソトリオンに対して再度アッセイした。より濃い褐色を再度示したバリアントを再度発現させ、抽出物を全ての試験ＨＰＰＤ阻害剤に対して滴定することで、改良の程度を決定した。
【０１６８】
最も濃い色を示す２つのクローンは、二重変異体ＰｆＥ３３５Ｐ−Ｇ３３６ＦおよびＰｆＥ３３５Ｐ−Ｇ３３６Ｙであった（これらは本明細書中でそれぞれＰｆＥｖｏ４３（配列番号７）およびＰｆＥｖｏ４４（配列番号８）と呼ばれる）。これらのタンパク質をＥ．ｃｏｌｉ中で生産、精製し、それらの活性を下に記載されているＨＰＰＤアッセイを用いて試験した。
【０１６９】
実施例２：ＨＰＰＤタンパク質の生産および精製ならびにＨＰＰＤ阻害除草剤存在下でのＨＰＰＤ活性の決定
ＨＰＰＤタンパク質は、ＷＯ２０１１／０７６８８２中に記載されているように生産および精製した。ＨＰＰＤ阻害剤の非存在下または存在下でのＨＰＰＤタンパク質の活性を、いわゆるＯＤアッセイまたはＨＧＤアッセイを用いて決定した。
【０１７０】
ａ）  ＯＤアッセイ：ＨＰＰＤ活性は、アルカリ条件下で２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰ）を使用してＨＰＰを誘導体化することでアンバーブラウン（ａｍｂｅｒ−ｂｒｏｗｎ）の色を持つ２，４−ジニトロフェニルヒドラゾンを形成させた後、インキュベーション時間の終了時にアッセイ混合物中に残っているＨＰＰの量を測定することにより、比色測定で決定した。アッセイは、室温で、Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｆ底９６ウェルマイクロプレート中で行った。アッセイ混合物は、総アッセイ容量１００μｌ中に５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．８、０．５ｍＭ  ＨＰＰ、１０ｍＭアスコルベート、６５０ユニットのカタラーゼおよび適量の精製ＨＰＰＤ酵素を含有していた。酵素の添加により反応を開始した。２４分間のインキュベーション時間の後、３．８Ｎ  ＨＣｌ中に溶解した５０μｌの０．０４％  ＤＮＰ溶液の添加により反応を停止した。さらに１５分間のインキュベーション時間の後、１００μｌの５Ｎ  ＫＯＨ溶液を反応混合物に加え、未消費のＨＰＰの量を測光法により４０５ｎｍにおいて測定した。酵素活性は、酵素を含まないアッセイ（陰性対照）と酵素を含有するアッセイとのＥ４０５の差（ΔＥ４０５＝Ｅ４０５（陰性対照）−Ｅ４０５）として算出した。酵素活性（ｎｍｏｌ基質消費／分）は、ＨＰＰより作成した較正曲線から算出した。ｐＩ５０値（酵素活性の５０％を阻害するのに必要な阻害剤の濃度（モル濃度）の負の対数値）は、試験した阻害剤濃度（５．０×１０−６、１．０×１０−５、２．５×１０−５、４．０×１０−５、７．０×１０−５、１．０×１０−４、２．０×１０−４および５．０×１０−４Ｍ）に対するＨＰＰＤ活性の用量−応答プロットから、ＩＤ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｌｔｄ．  ＸＬｆｉｔソフトウェア一式の４パラメーターロジスティックモデル（４  Ｐａｒａｍｅｔｅｒ  Ｌｏｇｉｓｔｉｃ  Ｍｏｄｅｌ）またはＳ字用量−応答モデル（Ｓｉｇｍｏｉｄａｌ  Ｄｏｓｅ−Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｍｏｄｅｌ）を用いて決定した。結果「＞５．６」は、試験した最も低い阻害剤濃度における阻害が８５％より高く、それゆえに試験した阻害剤の濃度範囲内でｐＩ５０値を正確に算出できないことを意味する。結果「＜２．５」は、試験した最も高い阻害剤濃度における阻害が２５％より低く、それゆえに試験した阻害剤の濃度範囲内でｐＩ５０値を正確に算出できないことを意味する。「ｎ．ｄ．」は、決定されていないことを意味する。
【０１７１】
ｂ）  ＨＧＤアッセイ：ＨＧＤアッセイを使用して、適量のＨＰＰＤを総容量１ｍｌ中の２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６、１０ｍＭアスコルベート、２０μＭ  ＦｅＳＯ４、６５０ユニットのカタラーゼ、８μｇ  ＨＧＡジオキシゲナーゼ（ＨＧＡ：ホモゲンチセート）および６００μＭ  ＨＰＰの溶液に加えることにより、ＨＰＰＤ活性を室温で測定した。阻害剤の非存在下または存在下での初期反応速度は、マレイルアセト酢酸の形成に起因する３１８ｎｍにおける吸光度の増加（ε３１８＝１１，９００Ｍ−１  ｃｍ−１）から決定した。ｐＩ５０値（酵素活性の５０％を阻害するのに必要な阻害剤の濃度（モル濃度）の負の対数値）は、試験した阻害剤濃度に対するＨＰＰＤ活性の用量−応答プロットから、ＩＤ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｌｔｄ．  ＸＬｆｉｔソフトウェア一式の４パラメーターロジスティックモデルまたはＳ字用量−応答モデルを用いて決定した。試験したＨＰＰＤ阻害剤のＵＶ吸収が原因で、＞１００μＭの阻害剤濃度を試験することはできなかった。結果「＜４」は、１００μＭの阻害剤濃度における阻害が２５％より低く、それゆえに試験した阻害剤の濃度範囲内でｐＩ５０値を正確に算出できないことを意味する。「ｎ．ｄ．」は、決定されていないことを意味する。
【０１７２】
ＨＰＰＤ媒介性の経時的なＨＧＡ形成を連続的に続けることを可能にするＨＧＤアッセイをそれゆえに用いて、試験したＨＰＰＤ阻害剤の阻害タイプを決定した。阻害剤の存在下でＨＰＰＤ活性に遅延結合性または遅延強結合性の阻害剤（定義についてはＭｏｒｒｉｓｏｎ（１９８２）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．７，１０２−１０５を参照されたい）に特徴的な時間依存的減少が見出されたとき、この阻害剤を時間依存的（略語「ｔｄ」）と呼んだ）。阻害剤存在下でＨＰＰＤ活性は阻害されたが阻害は時間依存的に減少しないことが見出されたとき、この阻害剤を可逆的（略語「ｒｅｖ」）と呼んだ。
【０１７３】
略語「ｎｏ−ｉｎ」は、１００μＭの阻害剤濃度において対応するＨＰＰＤバリアントの阻害が観察されなかったことが原因で、阻害のタイプを決定できなかったことを意味する。
【０１７４】
ジケトニトリル（ＤＫＮ）およびメソトリオン（ＭＳＴ）に対するＨＰＰＤタンパク質ＰｆＥｖｏ４３およびＰｆＥｖｏ４４の耐性がＯＤアッセイを用いることにより決定されると、それらの耐性は参照ＨＰＰＤタンパク質ＰｆＨＰＰＤ、ＰｆＧ３３６Ｆ、ＰｆＧ３３６Ｙ、ＰｆＧ３３６Ｗ、Ｃ９５９およびＰｆＥｖｏ３３と比べて改良されたことが明らかになった（表２を参照されたい）。
【０１７５】
表２．ＯＤアッセイを用いたジケトニトリル（ＤＫＮ）およびメソトリオン（ＭＳＴ）に対する第１世代ＨＰＰＤ酵素の耐性（ｐＩ５０）の評価
【表２】
2017514457.tif 000004
【０１７６】
ジケトニトリル（ＤＫＮ）、テンボトリオン（ＴＢＴ）およびメソトリオン（ＭＳＴ）に対するＨＰＰＤタンパク質ＰｆＥｖｏ４３およびＰｆＥｖｏ４４の耐性がＨＧＤアッセイを用いて決定されると、それらの耐性は参照ＨＰＰＤタンパク質と比べて顕著に改良されたことが見出された（詳細については下の表７を参照されたい）。より重要なことに、ジケトニトリル（ＤＫＮ）、テンボトリオン（ＴＢＴ）およびメソトリオン（ＭＳＴ）による阻害のタイムコース分析は、ＨＰＰＤタンパク質ＰｆＥｖｏ４３およびＰｆＥｖｏ４４の阻害メカニズムが遅延結合性または遅延強結合性阻害剤の時間依存的阻害特性から完全な可逆的阻害へと変化したように参照ＨＰＰＤタンパク質の阻害メカニズムと著しく異なることを明らかにした（詳細については下の表１１を参照されたい）。
【０１７７】
実施例３：第２世代点変異体ライブラリー
ＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ（登録商標）  ｌｉｇｈｔｎｉｎｇキットを用いて位置３３９および３４０においてアミノ酸交換をさらに含有するＨＰＰＤタンパク質を作出するため、実施例１中に記載されているように得られたＰｆＥｖｏ４３およびＰｆＥｖｏ４４を用いた。ＯＤアッセイで決定されたＨＰＰＤ阻害剤に対するそれらの耐性を表３中にまとめる。
【０１７８】
表３．ＯＤアッセイを用いたジケトニトリル（ＤＫＮ）、テンボトリオン（ＴＢＴ）、メソトリオン（ＭＳＴ）および化合物２（２−クロロ−３−エトキシ−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド）への第２世代ＨＰＰＤ酵素の耐性（ｐＩ５０）の評価
【表３】
2017514457.tif 000005
【０１７９】
ジケトニトリル（ＤＫＮ）および／またはテンボトリオン（ＴＢＴ）および／またはメソトリオン（ＭＳＴ）に対するＨＰＰＤタンパク質ＦＬＰ１２９、ＦＬＰ１３０、Ｋ１３１およびＫ１３２の耐性は、参照ＨＰＰＤタンパク質ＰｆＨＰＰＤ、ＰｆＧ３３６Ｆ、ＰｆＧ３３６Ｙ、ＰｆＧ３３６Ｗ、Ｃ９５９およびＰｆＥｖｏ３３と比べて顕著に改良された。ジケトニトリル（ＤＫＮ）および／またはテンボトリオン（ＴＢＴ）および／またはメソトリオン（ＭＳＴ）に対するＨＰＰＤタンパク質ＦＬＰ１２９およびＦＬＰ１３０の耐性がＨＧＤアッセイを用いて決定されると、それらの耐性もまた参照ＨＰＰＤタンパク質ＰｆＨＰＰＤ、ＰｆＧ３３６Ｆ、ＰｆＧ３３６Ｙ、ＰｆＧ３３６Ｗ、Ｃ９５９およびＰｆＥｖｏ３３と比べて顕著に改良されたことが見出された（詳細については下の表７を参照されたい）。阻害のタイムコース分析は、ジケトニトリル（ＤＫＮ）、テンボトリオン（ＴＢＴ）およびメソトリオン（ＭＳＴ）はＨＰＰＤタンパク質ＦＬＰ１２９およびＦＬＰ１３０の完全な可逆的阻害剤であることを明らかにした（詳細については下の表１１を参照されたい）。ＨＰＰＤタンパク質Ｋ１３１およびＫ１３２に対する化合物２の阻害のタイムコース分析は、化合物２はＨＰＰＤタンパク質Ｋ１３１およびＫ１３２への完全な可逆的阻害剤であることを明らかにした（詳細については下の表１２を参照されたい）。
【０１８０】
実施例４：第３世代点変異体ライブラリー
ＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ（登録商標）  ｌｉｇｈｔｎｉｎｇキットを用いて位置２１５においてアミノ酸交換をさらに含有するＨＰＰＤタンパク質を作出するため、実施例３中に記載されているように得られたＨＰＰＤバリアントを用いた。ＯＤアッセイで決定されたＨＰＰＤ阻害剤に対するそれらの耐性を表４中にまとめる。Ｐ２１５Ｌ変異のみを保有するＫ２９９を、ＰｆＨＰＰＤに加えて２つ目の参照として用いた。
【０１８１】
表４：ＯＤアッセイを用いたジケトニトリル（ＤＫＮ）、テンボトリオン（ＴＢＴ）、メソトリオン（ＭＳＴ）および化合物２（２−クロロ−３−エトキシ−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド）への第３世代ＨＰＰＤ酵素の耐性（ｐＩ５０）の評価
【表４】
2017514457.tif 000006
【０１８２】
ジケトニトリル（ＤＫＮ）、テンボトリオン（ＴＢＴ）およびメソトリオン（ＭＳＴ）に対する、Ｐ２１５Ｌ変異を保有するＨＰＰＤの耐性は、参照ＨＰＰＤタンパク質と比べて顕著に改良された。ジケトニトリル（ＤＫＮ）、テンボトリオン（ＴＢＴ）およびメソトリオン（ＭＳＴ）に対するＨＰＰＤタンパク質ＦＬＰ１３６およびＦＬＰ２０２の耐性がＨＧＤアッセイを用いて決定されると、それらの耐性もまた参照ＨＰＰＤタンパク質と比べて顕著に改良されたことが見出された（詳細については下の表７を参照されたい）。阻害のタイムコース分析は、ジケトニトリル（ＤＫＮ）、テンボトリオン（ＴＢＴ）およびメソトリオン（ＭＳＴ）はＨＰＰＤタンパク質ＦＬＰ１３６およびＦＬＰ２０２の完全な可逆的阻害剤であることを明らかにした（詳細については下の表１１を参照されたい）。ＨＰＰＤタンパク質Ｋ１３７およびＫ２０３に対する化合物２の阻害のタイムコース分析は、化合物２はＨＰＰＤタンパク質Ｋ１３７およびＫ２０３の完全な可逆的阻害剤であることを明らかにした（詳細については下の表１２を参照されたい）。
【０１８３】
実施例５：第４世代点変異体ライブラリー
ＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ（登録商標）  ｌｉｇｈｔｎｉｎｇキットを用いて位置２１５においてさらなるアミノ酸交換を含有するＨＰＰＤを作出するため、実施例４中に記載されているように得られたＨＰＰＤバリアントＦＬＰ２０２を用いた。ＯＤアッセイで決定されたＨＰＰＤ阻害剤に対するそれらの耐性を表５中にまとめる。
【０１８４】
表５：ＯＤアッセイを用いたジケトニトリル（ＤＫＮ）、テンボトリオン（ＴＢＴ）、メソトリオン（ＭＳＴ）および化合物２（２−クロロ−３−エトキシ−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド）への第４世代ＨＰＰＤ酵素の耐性（ｐＩ５０）の評価
【表５】
2017514457.tif 000007
【０１８５】
ジケトニトリル（ＤＫＮ）、テンボトリオン（ＴＢＴ）およびメソトリオン（ＭＳＴ）に対するＨＰＰＤタンパク質Ｋ２５５およびＫ２５８の耐性は、参照ＨＰＰＤタンパク質と比べて顕著に改良された。ＨＰＰＤタンパク質Ｋ２５５およびＫ２５８に対する化合物２の阻害のタイムコース分析は、化合物２はＨＰＰＤタンパク質Ｋ２５５およびＫ２５８の完全な可逆的阻害剤であることを明らかにした（詳細については下の表１２を参照されたい）。
【０１８６】
実施例６：第５世代点変異体ライブラリー
ＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ（登録商標）  ｌｉｇｈｔｎｉｎｇキットを用いて位置２２６および３４０においてさらなるアミノ酸交換を含有するＨＰＰＤを作出するため、実施例３中に記載されているように得られたＨＰＰＤバリアントＦＬＰ１３０および実施例４中に記載されているように得られたＦＬＰ２０２を用いた。ＯＤアッセイで決定されたＨＰＰＤ阻害剤に対するそれらの耐性を表６中にまとめる。
【０１８７】
表６：ＯＤアッセイを用いたジケトニトリル（ＤＫＮ）、テンボトリオン（ＴＢＴ）、メソトリオン（ＭＳＴ）および化合物２（２−クロロ−３−エトキシ−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド）への第４世代のＨＰＰＤ酵素の耐性（ｐＩ５０）の評価
【表６】
2017514457.tif 000008
【０１８８】
ジケトニトリル（ＤＫＮ）、テンボトリオン（ＴＢＴ）およびメソトリオン（ＭＳＴ）に対するＨＰＰＤタンパク質Ｋ３００およびＫ３０６の耐性は、参照ＨＰＰＤタンパク質と比べて改良された。ＨＰＰＤタンパク質Ｋ３００、Ｋ３０６およびＫ３６３に対する化合物２の阻害のタイムコース分析は、化合物２はＨＰＰＤタンパク質Ｋ３００、Ｋ３０６およびＫ３６３の完全な可逆的阻害剤であることを明らかにした（詳細については下の表１２を参照されたい）。
【０１８９】
実施例７：ＨＧＤアッセイで決定された、実施例１から６中に記載されているように作出されたＨＰＰＤバリアントのＨＰＰＤ阻害剤への耐性
ＨＧＤアッセイで決定された、実施例１から６中で作出されたＨＰＰＤバリアントのジケトニトリル（ＤＫＮ）、テンボトリオン（ＴＢＴ）およびメソトリオン（ＭＳＴ）に対する耐性を表７中にまとめる。
【０１９０】
表７：ＨＧＤアッセイを用いた、実施例１から６中で作出されたＨＰＰＤバリアントのジケトニトリル（ＤＫＮ）、テンボトリオン（ＴＢＴ）およびメソトリオン（ＭＳＴ）への耐性（ｐＩ５０）の評価
【表７】
2017514457.tif 000009
2017514457.tif 000010
【０１９１】
ＨＧＤアッセイで決定された、実施例１から６中で作出されたＨＰＰＤバリアントの化合物１（２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）−３−（メチルスルホニル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド）、化合物２（２−クロロ−３−エトキシ−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド）、化合物３（４−（ジフルオロメチル）−２−メトキシ−３−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド）、化合物４（２−クロロ−３−（メチルスルファニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド）および化合物５（２−（メトキシメチル）−３−（メチルスルフィニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド）に対する耐性を表８中にまとめる。
【０１９２】
表８：ＨＧＤアッセイを用いた、実施例１から６中で作出されたＨＰＰＤバリアントの耐性（ｐＩ５０）の評価
【表８】
2017514457.tif 000011
【０１９３】
実施例８：第６世代点変異体ライブラリー
ＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ（登録商標）  ｌｉｇｈｔｎｉｎｇキットを用いて位置１８８および１８９においてさらなるアミノ酸交換を含有するＨＰＰＤタンパク質を作出するため、実施例３中に記載されているように得られたＨＰＰＤバリアントＦＬＰ１３０、実施例４中に記載されているように得られたＦＬＰ２０２ならびに実施例５中に記載されているように得られたＫ２５５およびＫ２５８を用いた。ＯＤアッセイで決定されたＨＰＰＤ阻害剤に対するそれらの耐性を表９中にまとめる。
【０１９４】
表９：ＯＤアッセイを用いたジケトニトリル（ＤＫＮ）、テンボトリオン（ＴＢＴ）、メソトリオン（ＭＳＴ）および化合物２（２−クロロ−３−エトキシ−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド）への第６世代ＨＰＰＤ酵素の耐性（ｐＩ５０）の評価
【表９】
2017514457.tif 000012
【０１９５】
位置１８８および１８９における変異と位置２１５、３３５、３３６および３４０における変異の組み合わせは、酵素の活性レベルにプラスに影響を及ぼし、これは阻害剤への非常に高レベルの耐性をなお呈している。ＨＰＰＤタンパク質Ｋ２５０、Ｋ３２５およびＫ３５７に対する化合物２の阻害のタイムコース分析は、化合物２はＨＰＰＤタンパク質Ｋ２５０、Ｋ３２５およびＫ３５７の完全な可逆的阻害剤であることを明らかにした。ＨＰＰＤタンパク質Ｋ２５０、Ｋ３２５およびＫ３５７に対する化合物２のｐＩ５０値は、それぞれ＜４、５．５および５．１と決定された。
【０１９６】
実施例９：第７世代点変異体ライブラリー
ＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ（登録商標）  ｌｉｇｈｔｎｉｎｇキットを用いて位置２００においてさらなるアミノ酸交換を含有するＨＰＰＤタンパク質を作出するため、実施例３中に記載されているように得られたＨＰＰＤバリアントＦＬＰ１３０および実施例４中に記載されているように得られたＦＬＰ２０２を用いた。ＯＤアッセイで決定されたＨＰＰＤ阻害剤に対する耐性を表１０中にまとめる。
【０１９７】
表１０：ＯＤアッセイを用いたジケトニトリル（ＤＫＮ）、テンボトリオン（ＴＢＴ）、メソトリオン（ＭＳＴ）および化合物２（２−クロロ−３−エトキシ−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド）への第７世代ＨＰＰＤ酵素の耐性（ｐＩ５０）の評価
【表１０】
2017514457.tif 000013
【０１９８】
位置２００における変異と位置２１５、３３５、３３６および３４０における変異の組み合わせは、阻害剤への高レベルの耐性をなお呈するＨＰＰＤバリアントをもたらす。ＨＰＰＤタンパク質Ｋ３０３、Ｋ３０４、Ｋ３６０およびＫ３６１に対する化合物２の阻害のタイムコース分析は、化合物２はＨＰＰＤタンパク質Ｋ３０３、Ｋ３０４、Ｋ３６０およびＫ３６１の完全な可逆的阻害剤であることを明らかにした（下の表１２を参照されたい）。ＨＰＰＤタンパク質Ｋ３０３、Ｋ３０４、Ｋ３６０およびＫ３６１に対する化合物２のｐＩ５０値は、それぞれ５．０、４．７、５．５および５．３と決定された。
【０１９９】
実施例１０：ＨＰＰＤ阻害剤によるＨＰＰＤバリアントの阻害タイプの分析
上記のＨＧＤアッセイを用いて決定された、実施例１から９中に記載されているように得られたＨＰＰＤバリアントの様々なＨＰＰＤ阻害剤による阻害のタイプを表１１および表１２中にまとめる。
【０２００】
表１１．ＨＧＤアッセイを用いて決定された、ＤＫＮ（ジケトニトリル）、ＴＢＴ（テンボトリオン）およびＭＳＴ（メソトリオン）によるＨＰＰＤバリアントの阻害タイプ
【表１１】
2017514457.tif 000014
【０２０１】
表１２．ＨＧＤアッセイを用いて決定された、化合物１（２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）−３−（メチルスルホニル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド）、化合物２（２−クロロ−３−エトキシ−４−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド）、化合物３（４−（ジフルオロメチル）−２−メトキシ−３−（メチルスルホニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）ベンズアミド）、化合物４（２−クロロ−３−（メチルスルファニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド）および化合物５（２−（メトキシメチル）−３−（メチルスルフィニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４  （トリフルオロメチル）ベンズアミド）によるＨＰＰＤバリアントの阻害タイプ
【表１２】
2017514457.tif 000015
2017514457.tif 000016
【０２０２】
実施例１から９中に記載されているように得られたＨＰＰＤバリアントは全て、ＨＰＰＤ阻害剤へのアフィニティーを持たないまたは顕著に低減されたアフィニティーのみを持ち、同時に、ＨＰＰＤ阻害剤が遅延結合性または遅延強結合性としてもはや作用しないが完全な可逆的阻害剤になった程度にまでこれらのＨＰＰＤ酵素から離れるそれぞれの阻害剤の解離速度が増加している。
【０２０３】
実施例１１．ダイズの形質転換
ダイズの形質転換は、当該技術分野で周知の方法、例えばＰａｚ  ｅｔ  ａｌ．（２００６），Ｐｌａｎｔ  ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．２５：２０６により記載された方法を本質的に用いたアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）媒介性の形質転換ダイズ半種子外植片を用いることが記載されているものなどを用いて達成される。形質転換体は、選択マーカーとしてテンボトリオンまたはイソオキサフルトールを用いて同定された。緑色のシュートの出現が観察され、除草剤イソオキサフルトールまたはテンボトリオンへの耐性の指標として文書に記録された。耐性の遺伝子導入シュートはイソオキサフルトールまたはテンボトリオンで処理されていない野生型ダイズシュートと同等の正常な緑化を示した一方、同量のイソオキサフルトールまたはテンボトリオンで処理された野生型ダイズシュートは完全に退色した。このことは、ＨＰＰＤタンパク質の存在がイソオキサフルトールまたはテンボトリオンのようなＨＰＰＤ阻害除草剤への耐性を可能にすることを指し示した。
【０２０４】
耐性の緑色のシュートを発根培地に移す、または移植した。発根した小植物を土壌内に置き、順化期間の後に温室に移した。次いで導入遺伝子を含有する植物に、ＨＰＰＤ阻害除草剤、例えば硫酸アンモニウム  ナタネ油メチルエステルを補ったテンボトリオンを１００ｇ  ＡＩ／ｈａの量でまたはメソトリオンを３００ｇ  ＡＩ／ｈａの量で噴霧した。施用の１０日後、除草剤施用に起因する症状を評価し、同条件下で野生型植物において観察された症状と比較した。
【０２０５】
実施例１２．ダイズ植物のメソトリオンへの耐性
グリホサートへの耐性を付与する遺伝子およびグルホシネートへの耐性を付与する遺伝子と共に、または本発明のＨＰＰＤ阻害剤耐性酵素のみを包含する「植物発現カセット」を持つ、本発明のＨＰＰＤ阻害剤耐性酵素を発現するＴ０ダイズ植物を、メソトリオンへの耐性について試験した。遺伝子導入植物を使用した温室試験の前に、ＥＬＩＳＡタンパク質検出法を用いて、導入遺伝子の発現および存在についてダイズ形質転換体をルーチン的に分析した（項目ＤおよびＨの下の詳細な記載を参照されたい）。選択培地中で回収され、検出可能にＨＰＰＤ導入遺伝子タンパク質を発現している植物のみを、除草剤耐性分析のために用いた。各噴霧の前にＤｅＶｒｉｅｓ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｓｐｒａｙｅｒを較正した。メソトリオン（ＭＳＴ）試験のために用いられる化学製剤は、硫酸アンモニウムおよびメチル化ナタネ油（Ａｃｔｉｒｏｂ）を補ったＣａｌｌｉｓｔｏ（登録商標）  ４  ＳＣ製剤であった。噴霧試験は３×圃場量（４０％の活性成分（ＡＩ）、メソトリオンを含有する９液量オンス／エーカーの同じ除草剤製剤と同等である）を用いて実行され、これは３１６グラムＡＩ／ヘクタールに等しい。噴霧の１週間後に耐性を評価した。同じ除草剤製剤を噴霧した野生型ダイズ植物は全体的に退色し、１００％の葉損傷を示した。耐性評点「０」は、それらのシュート頂端、新たに出芽した三葉およびいくつかの葉腋の芽が完全に退色した植物に与えられた。評点「１」は、わずかに耐性がある、すなわち最新の植物シュート組織が緑色の葉をいくつか持ち、完全に退色していない植物に与えられた。評点「２」は、中程度の耐性を示す、すなわち頂部の３枚の三葉の葉面積の５０％より多くが白化または退色損傷を示さない植物に与えられた。評点「３」は、完全に近い耐性を示す、すなわち葉面積の１０％未満が白化または非常にわずかな退色を示す植物に与えられた。結果を表１３中に示す。
【０２０６】
表１３．３１６グラムＡＩ／ヘクタールと同等である３×圃場量のメソトリオンでの処理から７日後の、異なるＨＰＰＤバリアントを発現する遺伝子導入Ｔ０ダイズイベントからの葉面積損傷の評価。評点「１」は、わずかに耐性がある、すなわち最新の植物シュート組織が緑色の葉をいくつか持ち、完全に退色していない植物に与えられた。評点「２」は、中程度の耐性を示す、すなわち頂部の３枚の三葉の葉面積の５０％より多くが白化または退色損傷を示さない植物に与えられた。評点「３」は、完全に近い耐性を示す、すなわち葉面積の１０％未満が白化または非常にわずかな退色を示す植物に与えられた。ＨＰＰＤ阻害剤への除草剤耐性を単独で付与する酵素（ＨＴ−シングル）、または３つの異なる作用様式の除草剤分類、すなわちＨＰＰＤ阻害剤、グリホサートおよびグルホシネートへの耐性を付与する酵素（ＨＴ−トリプル）を有する、異なる植物発現カセットが設計された。
【表１３】
2017514457.tif 000017
【０２０７】
７１３個の再生および選抜した遺伝子導入形質転換体の中で、２５％より多くが総葉面積の１０％未満の損傷を有する高い耐性レベルを示した。試験された遺伝子導入植物の全体で約７０％が、中程度から高度の耐性評点で目視でランク付けされた。加えて、３つの異なる作用様式分類（ＨＰＰＤ阻害剤化合物、グリホサートおよびグルホシネート）への耐性を付与する３つの異なる酵素の発現は、ＨＰＰＤ阻害剤に対する耐性性能を妨げなかった。本発明のＨＰＰＤ阻害剤耐性酵素バリアントのみで形質転換された遺伝子導入植物は、スタックされたイベントと比べて類似の評点分布を示した。
【０２０８】
実施例１３：ワタＴ０植物の確立および選抜
当該技術分野で周知の方法、特にＰＣＴ特許公開ＷＯ００／７１７３３中に記載されているものの中の好ましい方法を用いて、ワタの形質転換を達成した。再生させた植物を温室に移した。順化期間の後、十分に成長した植物に、ＨＰＰＤ阻害除草剤、例えば硫酸アンモニウムおよびナタネ油メチルエステルを補った１００または２００ｇＡＩ／ｈａと同等のテンボトリオンを噴霧する。噴霧施用の７日後、除草剤での処理に起因する症状を評価し、同条件下で同処理に供された野生型ワタ植物において観察された症状と比較した。
【０２０９】
実施例１４．アグロバクテリウム媒介性の形質転換によるトウモロコシ植物細胞の形質転換
トウモロコシ植物内での安定的発現およびトウモロコシの形質転換のための植物発現カセットの構築は、当該技術分野で周知であり、この特定の例において、方法はＰＣＴ特許公開Ｗ０２０１４／０４３４３５およびＷＯ２００８／１００３５３から記載され、用いられた。本出願におけるＨＰＰＤバリアントをコードするポリヌクレオチド配列は、ＥＰＳＰＳを標的とする除草剤への耐性を付与するためのＥＰＳＰＳタンパク質バリアントをコードするＤＮＡ配列と共にスタックされている。ＥＰＳＰＳ遺伝子をアルスロバクター・グロビフォルミスから単離して突然変異させ（ＷＯ２００８／１００３５３）、翻訳されたタンパク質の葉緑体への転移をガイドするための輸送ペプチド配列とインフレームでつなげた。普遍的プロモーター（サトウキビからのユビキチン４プロモーター、米国特許６，６３８，７６６）およびカリフラワーモザイクウイルスからの３５Ｓ終結配列をそれぞれＥＰＳＰＳ遺伝子の上流および下流にクローニングして、安定的発現を達成した。
【０２１０】
対応するＨＰＰＤバリアントを、ＥＰＳＰＳ遺伝子発現カセットについて記載されているものと同じプロモーター、葉緑体輸送ペプチドおよび終結配列と共にクローニングした。両遺伝子のコーディング配列は、トウモロコシでの発現のためにコドン最適化されている。トウモロコシの形質転換のため、実を受粉の８〜１２日後に最も良好に収集する。胚芽を実から単離し、０．８〜１．５ｍｍの大きさの胚芽が形質転換における使用のために好ましいものであった。胚芽を好適なインキュベーション培地上に胚盤側を上にして置き、２５℃、暗所で一晩インキュベートした。
【０２１１】
しかしながら、胚芽を一晩インキュベートすること自体は必要ではなかった。Ｔｉプラスミド媒介性の輸送のため、胚芽を、本発明のヌクレオチド配列を持つ適切なベクターを含有するアグロバクテリウム属株と約５〜１０分間接触させ、次いで共培養培地上に約３日間置く（暗所、２５℃）。共培養後、外植片を回復期培地に移して約５日間置いた（暗所、２５℃）。外植片を、グリホサートを含む選択培地中で、利用される具体的な選抜の特質および特性に応じて最大８週間までインキュベートした。選抜期の後、結果として得られたカルスを胚成熟培地に移し、成熟体細胞胚の形成が観察されるまで置いた。結果として得られた成熟体細胞胚を次いで低光下に置き、当該技術分野で知られているように再生プロセスを開始した。結果として得られたシュートを発根培地上で発根させ、結果として得られた植物を育苗用ポットに移し、遺伝子導入植物として繁殖させた。ＥＬＩＳＡタンパク質検出法を用いて、導入遺伝子の発現および存在について植物をルーチン的に分析した。選択培地中で回収され検出可能にＨＰＰＤ導入遺伝子タンパク質を発現している植物のみを除草剤耐性分析のために用いた。
【０２１２】
実施例１５．温室研究におけるトウモロコシＴ０植物のＨＰＰＤ除草剤への耐性
組織培養から再生させたＴ０イベントを、合成土壌（Ｆａｆａｒｄ（登録商標）  Ｍｉｘ）および放出制御肥料（Ｈａｉｆａ  ＭｕｌｔｉｃｏｔｅＴＭ；ポリマーコーティングされた放出制御肥料、ＮＰＫ  Ｐｒｏ  １８−６−１２＋Ｍｉｃｒｏｎｕｔｒｉｅｎｔｓ）を有する２インチ四方のポット内に移植し、温室（ＧＨ）内で補助的な高圧ナトリウム灯の下、１２日間、日中に最高３０℃、夜間に最低２２℃において栽培した。完全に回復した植物を、同じ環境条件下の合成土壌および放出制御土壌を充填した５インチ四方のポットに移した。７日後、Ｔ０植物に、エステル化植物油混合物（ＨａｓｔｅｎＴＭ  噴霧アジュバント、０．５７８％  ｖ／ｖ）および硫酸アンモニウム（ＡＭＳ、０．９７％  ｗ／ｖ）を補ったＷＰ２０（水和剤２０％）製剤から調製した２−クロロ−３−（メチルスルファニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（化合物４）を、農学的に適した濃度である１００ｇ  ＡＩ／ｈａ（「ｇ  ＡＩ／ｈａ」は「グラムの活性成分／ヘクタール」を意味する）で噴霧した。除草剤処理は、ＤｅＶｒｉｅｓ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｓｐｒａｙｅｒシステム中で、当該技術分野で周知の標準的な施用プロトコールを使用して実行した。噴霧対照として、除草剤を含まないアジュバント混合物をＴ０イベントに噴霧した。この混合物を噴霧した全てのＴ０イベントは、葉の退色を示さなかった。
【０２１３】
特に明記されない場合、２−クロロ−３−（メチルスルファニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミドの施用から６日後（ＤＡＴ）、遺伝子導入Ｔ０イベントの損傷を評価した。
【０２１４】
ＥＰＳＰＳ選択可能マーカー遺伝子を発現しＨＰＰＤバリアント型を保有しないＴ０イベントが対照トウモロコシ植物として用いられ、２５ｇ  ＡＩ／ｈａの２−クロロ−３−（メチルスルファニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミドにおいて既に１００％の葉損傷を示した。形質転換されていないトウモロコシ植物もまた、２５ｇ  ＡＩ／ｈａの２−クロロ−３−（メチルスルファニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミドにおいて既に１００％の葉損傷を示した。
【０２１５】
表１４は、実施例１４中に記載されているように得られたシュードモナス・フルオレッセンスＨＰＰＤタンパク質の変異体ＦＬＰ２０２およびＦＬＰ１３６を発現する遺伝子導入トウモロコシ植物の結果をまとめたものである。評点「０」に分類された植物は、損傷が総葉面積の４１％から１００％の範囲にある重度の葉退色を示した。評点「１」は、損傷が総葉面積の１６％から４０％の範囲内である中程度の耐性を持つ植物に与えられた。評点「２」は、損傷が総葉面積の６％から１５％の範囲内である良好な耐性を有する植物に与えられた。評点「３」を有する植物はほとんど退色を示さず、除草剤処理により損傷された葉面積は５％以下であった。
【０２１６】
表１４中の結果は、独立したトウモロコシＴ０イベントの顕著な一部は、対照植物と比べ、農学的に適した濃度である１００ｇ  ＡＩ／ｈａにおいてＨＰＰＤ除草剤の２−クロロ−３−（メチルスルファニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミドに耐性であることを示す。
【０２１７】
１００ｇ  ＡＩ／ｈａの除草剤濃度の化合物４での処理後、ＦＬＰ１３６を発現する試験イベント（ｎ＝８４）のうちの約４０％は１５％以下の退色葉面積を有し、良好から高度である耐性を示した。全ての試験されたＦＬＰ１３６発現トウモロコシ植物の中で、約１５％は５％未満の葉損傷を示すか、または目に見える葉損傷を示さない。
【０２１８】
同様の事態がＦＬＰ２０２を発現するＴ０トウモロコシ植物について当てはまる。１００ｇ  ＡＩ／ｈａ除草剤での処理後、総試験イベント（ｎ＝８９）のうちの３０％より多くは１５％以下の退色葉面積を有して良好から高度である耐性を示しており、約１３％は５％未満の葉損傷を示すか、または目に見える葉損傷を示さない。
【０２１９】
表１４
２−クロロ−３−（メチルスルファニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（化合物４）を１００ｇ  ＡＩ／ｈａの量で施用してから６日後の遺伝子導入トウモロコシＴ０イベントからの葉面積損傷の評価。シュードモナス・フルオレッセンスＨＰＰＤタンパク質のバリアントＦＬＰ２０２またはＦＬＰ１３６を発現する遺伝子導入トウモロコシ植物は、実施例４中に記載されているように得られた。次の除草剤耐性分類が定義された：「０」＝わずかな耐性；４１％〜１００％の損傷葉面積；「１」＝中程度の耐性；１６％〜４１％の損傷葉面積；「２」＝良好な耐性；６％〜１５％の損傷葉面積；「３」＝高い耐性；０％〜５％の損傷葉面積
【表１４】
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【０２２０】
本明細書中で言及されている全ての刊行物および特許出願は、本発明に関係する当業者の技術レベルを示している。全ての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願の各々が参照により組み込まれるように具体的かつ個々に指し示された場合と同程度に、参照により本明細書中に組み込まれる。
【０２２１】
前述の発明は理解を明確にする目的のための説明および例としていくらか詳細に記載されているが、一定の変更および修飾が添付の特許請求の範囲内で実行され得ることは明らかである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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