(57)【要約】  本発明は、結合組織欠損を療治するのに適した結合組織移植片を製造する方法であって、組織欠損のサイズ及び形状を決定し、前記組織欠損の前記サイズ及び前記形状に適合するようにモデル化された患者から脂肪組織を得、１以上の結合組織特異的増殖又は分化因子を前記脂肪組織に接触させること、を含む方法；及びそのような方法のためのキット、を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドナー結合組織、好ましくは脂肪組織を別の結合組織タイプに直接的にトランス分化させることにより、生体工学的結合組織移植片を製造する方法であって、インビトロ又はインビボで、１以上の投与された結合組織特異的増殖若しくは分化因子に、前記ドナー結合組織を接触させること、を含む方法。
【請求項２】
結合組織欠損を療治することに適した結合組織移植片の製造方法であって、組織欠損のサイズ及び形状を決定し、患者から得られたドナー結合組織、好ましくは脂肪組織を、以下の任意の順序：ドナー結合組織、好ましくは脂肪組織を、前記組織欠損の前記サイズ及び形状に適合するためにモデル化し、及び、前記ドナー結合組織、好ましくは脂肪組織を、１以上の結合組織特異的増殖又は分化因子と接触させ、それによって別の結合組織へ組織移植片の分化を開始させること、
によって処置すること、を含む方法。
【請求項３】
患者の前記組織欠損に前記分化組織を配置することをさらに含み、ここで、前記組織欠損を有する前記患者及び前記ドナー組織を提供する前記患者が、同一患者（自己組織）である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ドナー結合組織を培養する工程又は前記接触させる工程が、少なくとも１時間、少なくとも１日、好ましくは少なくとも２又は少なくとも３日間、特に好ましくは少なく少なくとも４日間である、請求項１、２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記別の結合組織が、骨、軟骨、筋肉、腱、靭帯又は神経、好ましくは骨又は軟骨である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記結合組織が軟骨であり、分化が、軟骨細胞分化因子である分化因子を用いた軟骨細胞及び／又は軟骨芽細胞への分化を含み、好ましくは前記因子が、ＴＧＦ−βを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記結合組織が骨であり、及び、分化が、骨形成分化因子である分化因子を用いた骨細胞及び／又は骨芽細胞への分化を含み、好ましくは前記因子が、β−グリセロリン酸を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
結合組織特異的成長因子又は分化因子が、アスコルビン酸又はアスコルビン酸エステル、好ましくはアスコルビン酸−２−リン酸又はその医薬的に許容される塩を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記脂肪組織が、間質細胞及び脂肪細胞、例えば白色及び／又は褐色脂肪細胞を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記分化した組織移植片が組織欠損に挿入される、及び／又は、前記分化した組織移植片が、椎間板コンパートメントに若しくは脊椎固定に対して前記椎間板に挿入するように設計されたケージに挿入されるものであり、さらに好ましくは前記挿入が、組織シーラント、好ましくはフィブリングルーによって固定される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ドナー組織、好ましくは脂肪組織を、結合組織修復に適した分化した移植片に調製するためのエクスビボ方法としてさらに定義される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法であって、前記ドナー組織、好ましくは脂肪組織を、１以上の結合組織特異的増殖因子又は分化因子と接触させ、それによって前記組織移植片の分化を開始させることを含み、ここで前記接触が、３０〜４０℃の温度で、１時間〜６週間の間、０．０１％〜１０％（ｗ／ｖ）ＣＯ2及び７０％〜９８％の湿度であり、ここで前記結合組織特異的増殖又は分化因子が、核酸ではない、又は最大１０ｋＤａのサイズを有するタンパク質、ペプチド及び小分子からなる、方法。
【請求項１２】
前記組織を組織シーラントと接触させること、好ましくは前記結合組織特異的成長因子又は分化因子で処理した後に接触させることをさらに含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法で使用するための結合組織特異的成長因子又は分化因子。
【請求項１４】
結合組織特異的増殖又は分化因子及び組織シーラント、好ましくはフィブリングルーを含む、請求項１０に記載の方法の実施に適するキット。
【請求項１５】
軟骨又は骨組織の標識若しくはマーカーをさらに含む、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記挿入が、前記組織シーラントによって固定されること、を含む、請求項１４又は１５に記載のキットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体工学的組織移植片、例えば骨、軟骨、腱、神経又は筋肉移植片に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨移植は、脊椎固定術において骨治癒を促進するため、顎顔面手術で骨を増大するため、又は外傷性骨欠損の非合併症の場合に適用される。腸骨稜から採取した海綿骨は、依然として脊椎固定術の標準として考慮されているが、高い合併症率と関連している（１）。同種移植骨は頻繁に使用される代替手段であるが、骨形成が不足し、手術部位の感染リスクが上昇する（２）。合成β−リン酸三カルシウム骨移植片は、独立型又は自己幹細胞と組み合わせて使用することができるが、インプラントの失敗が報告書されている（３）。自己細胞と、天然又は合成生体材料の組合せによって作製された組織工学骨（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｂｏｎｅ）は、潜在的な選択肢となる可能性がある。しかし、これらの移植片は、これまでに臨床現場に進んでいない。なぜなら、欠損部位での十分な血管新生の問題が未だ解決されていないからである（４）。
【０００３】
もう１つの主な臨床上の問題は、骨粗鬆症又は外傷性脊椎骨折の治療である：現在、最近の骨折は、経皮的脊椎形成術又は椎骨形成術の手技中に骨セメントを滴下注入することによって治療される（５）。これらの手技の合併症には、セメント溢出、隣接する椎骨骨折及び感染が含まれる（６）。骨セメントを使用する際の別の問題は、限られた生体適合性である：異なるＰＭＭＡセメントに関するインビトロ研究は、細胞損傷及び炎症を引き起こす可能性を実証した（７）。ＰＭＭＡ骨セメントは、重合後に形状変化の可能性がなく、成長期間中の小児及び若者の治療には不適当である。吸収可能なリン酸カルシウムセメントは、この患者グループで使用できるが、不明確な長期の臨床結果では、漏れ率４５％を示す（８）。屈曲性、付着力（ａｔｔｒａｃｔｉｖｅ  ｆｏｒｃｅ）及びせん断力に対する耐性が低いため、セメントの破損及びその後の矯正の喪失リスクが高い（９）。優れた生体適合性と適切な機械的安定性とを組み合わせた適切な生物学的治療法はこれまで存在していない。
【０００４】
固有の治癒能力が低いため、関節軟骨の全厚の欠損は、未解決の臨床的問題として残ったままである。外科的治療の選択肢には、骨髄刺激技術、例えば穿孔（１０）又は微細破砕（ｍｉｃｒｏｆｒａｃｔｕｒｅ）（１１）などが含まれる。どちらの方法も、軟骨病変と骨髄との間のコミュニケーションを確立し、下に存在する骨髄腔からの間葉系幹細胞が欠損に移動することを可能にする（１２）。関節の非体重支持領域からの骨軟骨柱の移植は、別の治療選択枝である。硝子体軟骨は得られず、線維軟骨修復組織は時間の経過に伴う機械的ストレスに耐えることができないため、これらの手術手順のどれもが修復術に向いていない（１４）。
【０００５】
インビトロで単離・増殖された自己軟骨細胞（ＡＣＩ）の移植は、軟骨の修復に対する生物学的アプローチである（１５）。ＡＣＩは、一連の手順を含む：軟骨組織は、影響を受ける関節の非体重支持領域から関節鏡で回収される。軟骨生検を小片にし、酵素的に消化して関節軟骨細胞を単離し、その後数週間インビトロで増殖させる。第２の外科的処置において、欠損部は注意深く清拭され、骨膜フラップ（ｐｅｒｉｏｓｔａｌ  ｆｌａｐ）又は生体膜によって覆われ、その直下に軟骨細胞が注入される。その治療法の変更においては、軟骨細胞がコラーゲンマトリックス上に播種され、その後、それが移植される（１６）。
【０００６】
両アプローチには困難が伴う：再建手術を必要とする骨膜肥大は、骨膜フラップを用いて欠損を封止する場合に、１５．４％の症例で発生する（１５）。一過性移植肥大は、マトリックス支持軟骨細胞移植を受ける患者の２５％においても観察される（１６）。通常はウシ又はブタ起源の生体膜の使用は、アレルギー反応を引き起こす可能性があり、従って動物起源の物質に対する既知の過敏症の患者には禁忌である（１７）。製品は、伝染性感染症について日常的にスクリーニングされないので、医療提供者（１８）及びレシピエントに健康リスクをもたらす可能性がある。
【０００７】
国際公開第２００５／０１８５４９号明細書及び２００９年，Ｅｖａｎｓら（２３）は、ＢＭＰ−２を発現する組換えアデノウイルスベクターを用いた活性化筋肉又は脂肪移植片の作製について記載している。この方法は、ウィルス感染の危険性があり、リスクプロファイルが高く、移植拒絶につながる可能性がある。さらに、アデノウイルス活性化脂肪は、治癒骨の一貫性において高い変動性があり、迅速に治癒しなかった（２３）。さらに、アデノウイルス活性化脂肪は、組織修復への使用を約束したが、筋肉組織に比べて早く治癒しなかった。これらの違いは、アデノウイルス感染に対する脂肪組織の感受性が最終的に低下することによって、方法特異的である可能性がある。Ｏｒｌｉｃｋｙ及びＳｃｈａａｋは、前脂肪細胞系３Ｔ３−Ｌ１がアデノウイルスベクターによって非効率的にトランスフェクトされることを報告している（２５）。総説（２４）では、エクスビボ（エクスビボ）アプローチは、インビボ細胞活性化法と比較して、扱いにくく、非常に高価で、かつ魅力的ではないと考えられていた。
【０００８】
国際公開第２００３／０１５８０３号明細書は、関節における変形性関節症及び関節欠損を治療するための間葉系細胞の提供、さらには移植体の作製に関する。適切な移植を提供する課題は、この文献では触れられていない。
【０００９】
Ｗａｎｇら（２６）は、ウサギから単離され、無細胞軟骨マトリックスに播種された脂肪由来幹細胞の分化について記載している。
【００１０】
Ｓａｎｄｏｒら（２７）及び国際公開第２００６／００９４５２号明細書は、単離された自家脂肪幹細胞に由来する人工構築物を記載している。細胞を単離し、エクスビボで増殖させ、粒状のβ−リン酸三カルシウムスキャフォールドに播種した。
【００１１】
Ｓａｌｉｂｉａｎら（２８）は、整形外科手術における幹細胞に関する。
【００１２】
Ｉｎｏｋ  Ｋｉｍら（２９）及びＪｕｎｇら（３０）は、フィブリングルー中のＭＳＣに関する。
【００１３】
Ｅｕｎ  Ｈｅｅら（３１）は、単離された脂肪由来幹細胞の使用を総説している。
【００１４】
Ｓｔｒｏｍｐｓら（３２）は、単離された脂肪由来幹細胞の軟骨形成性分化を記載している。
【００１５】
Ｓｕｊｅｏｎｇら（３２）は、脂肪組織由来幹細胞の神経分化に関する。細胞は耳たぶから単離され、培養された。
【００１６】
骨細胞形成のための単離された脂肪由来幹細胞に基づく細胞培養物の使用は、Ｈａｌｖｏｒｓｅｎら（１９）によって記載されている。細胞がコラゲナーゼにより組織から取り出され、インビトロで培養される。しかし、これらの細胞のインビトロでの増殖は効率的ではなく、骨修復のためのペースト中のこのような細胞を使用する記載された予測（ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）は失敗した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
従って、患者に耐容性を示す移植片を提供すること、修復された組織によって要求される強度及び耐久性の要件並びに血管新生されたレシピエント組織の場合に十分な血管新生特性を満たす適切な組織再配置を提供する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
これらの必要性を満たすための探索においてに、本発明は、ドナー結合組織、好ましくは脂肪組織を別の結合組織タイプへ直接的にトランス分化させることにより、生体組織工学的結合組織移植片を製造する方法であって、インビトロでａ）少なくとも１時間（好ましくは少なくとも２日間）又はインビボで、及び／又はｂ）１以上の結合組織特異的増殖又は分化因子によって、ドナー結合組織を培養することを含む。さらに提供されるのは、結合組織欠損を療治するのに適した結合組織移植片の製造方法であって、組織欠損のサイズ及び形状を決定し、患者から得られたドナー結合組織、好ましくは脂肪組織を以下の任意の順序：組織欠損のサイズ及び形状に適合させるためにドナー組織をモデル化し、脂肪組織を１以上の結合組織特異的増殖又は分化因子と接触さ、それにより組織移植片の別の結合組織への分化を開始すること、によって処置すること、を含む方法である。本発明の方法は、組織から幹細胞を単離及び培養することなく全組織を使用する。トランス分化工程に供給される本発明の組織は、本来の細胞外マトリックス及び細胞組織（本明細書では全体（ドナー）組織とも称される）中に細胞を含む。従って、本発明の方法は、単離された細胞による間接的分化とは対照的に、「直接的な」分化、すなわち「組織から組織（ｔｉｓｓｕｅ  ｔｏ  ｔｉｓｓｕｅ）」と呼ばれる。単離された細胞及びそれからの増殖した産物は、培地中又は人工スキャフォールド内に存在していても、本発明による組織とはみなされない。本発明によれば、（ドナー患者からの）ドナー組織である結合組織は、ドナー組織タイプとは異なる別の結合組織である移植組織に変換される。ドナー組織は好ましくは脂肪である。本発明の移植片は、例えば、移植片を欠損に挿入することによって、又は、移植片を欠損に適用することによって、対象における結合組織欠損を治療するために使用することができる。特に、本発明は、本明細書に記載の任意の方法の実施形態において、脂肪組織（ドナー組織として）を別の非脂肪組織（移植組織）にトランス分化する方法を提供する。また、方法で使用するための結合組織特異的増殖又は分化因子、並びに、そのような方法、例えば治療方法における使用のための結合組織特異的増殖又は分化因子も提供される。
【００１９】
この組織欠損療治療法に使用するのに適した本発明の移植片を調製するためのエクスビボ又はインビボ方法、並びに、ドナー組織、好ましくは脂肪組織を適切な移植片に調製して分化させるのに適したキットもまた提供される。本発明のさらなる態様及び好ましい実施形態は、特許請求の範囲に記載されている。これらの方法及び実施形態はすべて、相互に関連し、互いに組み合わせてもよく、例えば、キットを本発明の方法で使用してもよく、また逆であっても良く、キットは、本発明の方法のいずれかを実施するのに適するように適合させることができる；エクスビボ法は、治療法の一部として使用されてもよい；エクスビボ工程で産生された移植片は、治療的に使用され得るか、又はそのような治療的使用のための組成物として提供され得る。任意の特定の態様について記載されたすべての好ましい実施形態は、そのような実施形態の一般性を直ちに想定する当業者には明らかであるように、任意の他の発明的態様を説明するものと見なすべきである。さらに、各好ましい実施形態は、互いに好ましい実施形態と組み合わせることもできる；明確に排他的である場合を除いて、本明細書に記載される全ての好ましい推奨に従うことが当然に特に好ましい。
【００２０】
本発明は、スキャフォールドの有無にかかわらず適用され得る、結合組織欠損を療治するのに適した結合組織移植片の製造方法を提供し、患者における欠損組織のサイズ及び形状に適合するようにモデル化された患者からドナー組織、好ましくは脂肪組織を得て、前記ドナー組織、好ましくは脂肪組織を１つ以上の結合組織特異的増殖又は分化因子と接触させ（本明細書では「インキュベーション」）、それにより組織移植片の分化を開始させる。
【００２１】
「接触させること（Ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ）」とは、組織（又は前記組織内の細胞）をそれぞれの増殖因子又は分化因子で処理し、それにより、前記組織は、これらの因子によって引き起こされる新たな状態に順応し、次にトランス分化をもたらすことである。
【００２２】
従来のエクスビボ方法は、単離細胞の細胞培養又はウイルストランスフェクションのいずれかに焦点を当てたものであった。移植前のインビトロでの細胞単離、単層拡大培養及び再分化は、しかしながら煩雑であり、単層培養での脱分化をもたらし得る。単離された細胞の代わりに全体組織の本発明のトランス分化は、これらの欠点を減少させ、インビトロ又はエクスビボでの最小限の取扱いを必要とするだけであり、これはＧＭＰ準拠の完全自動組織処理装置で行うことができる。例えば、好ましい実施形態では、細胞培養培地は、週１〜４回などの通常の間隔で置換又は更新する必要がある。
【００２３】
任意のタイプの脂肪組織は、胸部、腹部及び臀部（ｂｕｔｔｏｃｋ）、臀部（ｈｉｐ）及び腰部のような領域からの皮下デポー（ｄｅｐｏｔ）；又は異所性若しくは内臓脂肪を含むが、これに限定されないドナー組織に利用することができる。脂肪は、本発明のすべての実施形態において好ましいドナー組織タイプであるが、他の結合組織、並びにドナー、例えば、脂肪の代わりに本発明の全ての実施形態に対し、軟骨、筋肉、腱、靭帯又は神経ドナー組織が使用されてもよい。
【００２４】
組織は、移植のための組織を得るための当該分野で標準的な方法を用いて患者から摘出され得る。例えば、このような組織は、標準的又は低侵襲外科技術を使用して外科的に摘出され得る。最小侵襲手術は、患者に強いるストレスが実質的に少ない、例えば一般的な麻酔を用いない、外科的介入が可能であるように、所望の使用場所から体において小さな直径を有する自然又は外科的に創出された開口を通して、脂肪組織を摘出すること、を含んでもよい。
【００２５】
特定の実施形態において、組織は、特定の組織欠損への移植に適したサイズ及び形状で患者から除去される。他の実施形態では、組織は、患者から取り出され、その後、エクスビボで所望のサイズ及び形状に変換される。
【００２６】
ドナー組織、好ましくは、脂肪組織は、間質細胞を含み得る。これはまた、脂肪細胞、例えば、白色脂肪細胞及び／又は褐色脂肪細胞を含み得る。通常、対象の結合組織、すなわち組織欠損の組織に特異的な細胞に分化する幹細胞が脂肪組織に存在する。このような細胞は、間葉系幹細胞又は間質幹細胞であってもよい。驚くべきことに、本発明の脂肪組織に存在する脂肪細胞も除去する必要はないが、残って最終分化組織移植片に包埋することができる。脂肪移植細胞の数は、組織移植片の全細胞の少なくとも２０％、少なくとも３０％又は少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％又はそれ以上であり得る。
【００２７】
好ましくは、脂肪細胞を刺激して脂肪デポーを減少又は除去させる。これは、化学的又は（サイトカイン又はホルモン）受容体刺激又は機械的刺激によって行うことができる。受容体刺激は、脂肪細胞を含むドナー組織をレプチンと接触させることを含む。機械的刺激には、脂肪細胞を含むドナー組織を混練すること又は分散させることが含まれる。脂肪デポーの減少又は除去は、組織を骨組織に分化させる場合に特に好ましいが、軟骨組織の場合にも好ましい。脂肪含量は、５０％（ｗ／ｗ）未満、好ましくは３０％未満又は２０％未満、例えば５０％〜１０％の範囲まで減少させることができる。脂肪組織は、約０．９ｇ／ｍＬの密度を有する。脂肪減少又は除去は、少なくとも０．９３ｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも０．９５ｇ／ｍＬ、さらにより好ましくは少なくとも０．９７ｇ／ｍＬの密度を有する組織をもたらし得る。この処理は、例えば、０．９３ｇ／ｍＬ〜１．１０ｇ／ｍＬの密度を実現するためになされ得る。
【００２８】
サイズ及び形状を組織欠損に適合させる工程及び接触させて、それによってドナー組織の分化を開始する工程の順序は、例えば、開業医が最初に形状を調整してから細胞を分化させることができ、又は細胞を最初に分化させ、組織欠損に適合するように移植片を成形することが可能である。もちろん、成形することは、分化の前後で行うこともできる。例えば、前に粗い形状を提供してから、分化後に形状を微調整することである。同様に、欠損の大きさを決定することは、分化の前後であってもよい。好ましくは、適切なサイズのドナー組織を選択するために、分化の前であり、それは、当然、欠損への挿入時に欠損の大きさに合わせて微調整することが好ましい。
【００２９】
分化は、骨、軟骨、筋肉（筋原性組織）、腱（腱組織）、靭帯又は神経細胞（神経原性組織）を含む移植片結合組織の細胞数、及び好ましくは、移植片結合組織に特異的な細胞外マトリックスの増加をもたらす。しかし、ドナー組織（特に脂肪組織）の細胞外マトリックスもまた、最終的な移植組織に少なくとも部分的に残存することがある。当業者に知られている適切な結合組織特異的増殖又は分化因子及び／又は前記分化に適したインキュベーション時間を選択することにより、当業者は分化を特定のタイプの移植組織に誘導することができる。特に、移植片結合組織タイプは、骨又は軟骨であり得る。
【００３０】
「組織移植片の分化を開始すること」とは、ドナー結合組織、好ましくは脂肪組織（例えば幹細胞）の全ての反応性細胞を完全に分化することは必要ではないが、細胞が、（エクスビボ）インキュベーション後でさえも、特に組織欠損への挿入後も、分化を続けるように、通常は分化反応を開始するのに十分であることを意味する。組織片が、少なくとも欠損の組織の少なくとも５％、好ましくは少なくとも５０％の引張強度（ｔｅｎｓｉｌｅ  ｓｔｒｅｎｇｔｈ）に達するまで、（エクスビボ）分化が起こることが好ましい。骨移植片の場合、移植片組織は、移植片組織の取り扱いを容易にし、移植片組織の柔軟性を維持するために、骨よりも低い引張強度を有する。骨の場合、好ましい引張強度は、欠損の組織の約５％〜１５％である。特に、限定されないが、軟骨、筋肉、腱、靭帯又は神経移植片の場合には、好ましくは、移植片は、欠損の組織の少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％の引張強度に達する。代替的に又は追加的に、少なくとも組織片が、欠損の組織の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも４０％、例えば、２０％〜６０％の密度に達するまで、分化が起こることが好ましい。本明細書に記載の引張強度及び密度は、元のドナー組織から標的移植組織までの比較としての引張強度又は密度の変化を指す。パーセンテージは、前記パーセンテージ値によって標的組織の方向への漸進的変化としてのパラメータの変化（引張強度又は密度）を定義する。移植片パラメータは、Ａ＋（Ｂ−Ａ）＊Ｐによって計算することができ、Ａはドナー組織のパラメータであり、欠損の標的組織のＢであり、Ｐは所与のパーセンテージ値である。骨欠損に対する骨移植片の場合、欠損の組織の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも４０％、例えば、２０〜６０％のミネラル化（ｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）含量に達するまで、少なくとも分化が起こることが好ましい。ミネラル化含量は、組織学及び２Ｄスライス中のミネラル化（ｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄ）領域の含量を決定することによって決定することができる。
【００３１】
椎骨骨折の治療のためには、欠損の組織の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、例えば、１０〜３０％のミネラル化含量に達するまで、少なくとも（エクスビボ）分化が起こることが好ましい。一般に、小さなチャネルを介して移植片組織を装着する場合、例えば椎骨骨折の場合、移植組織は、例えば折りたたまれた状態において、チャネルを介した輸送に十分な弾性を有することが好ましく、及び上記のより低ミネラル化が好ましい。
【００３２】
本発明の方法は、患者の組織欠損部に分化された移植片組織を配置することをさらに含んでもよい。好ましくは、患者及び／又はドナーは、ヒト又は非ヒト動物である。非ヒト動物は哺乳動物を含み、例えば、ウマ、ウシ、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、鳥類、例えばダチョウ又はオウム、爬虫類、例えばワニ、を含む。好ましくは、組織欠損を有する患者及びドナー組織を提供する患者は、同じ患者（自己組織）である。
【００３３】
一実施形態において、移植片は、ドナー組織中の細胞の少なくとも一部が組織移植片の所望の細胞タイプに分化又は分化を開始するのに十分な時間、エクスビボでインキュベートされる。接触工程（インキュベーション）の時間の例は、１時間（ｈ）〜１０週間（ｗ）、好ましくは１時間〜６週間である。好ましい期間は、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも５時間、少なくとも８時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも２４時間（１日；１ｄ）、少なくとも３０時間、少なくとも３６時間、少なくとも２ｄ、少なくとも３ｄ、少なくとも４ｄ、少なくとも５ｄ、少なくとも６ｄ、少なくとも７ｄ、少なくとも８ｄ、少なくとも９ｄ、少なくとも１０ｄ、少なくとも１１ｄ、少なくとも１２ｄ、少なくとも１４ｄである。あるいは、これらの最小期間のいずれかと組み合わせて、接触工程（インキュベーション）は、最大１０ｗ、最大８ｗ、最大６ｗ、最大５ｗ、最大４ｗ、最大３ｗ、最大２ｗ、最大１０ｄ、最大８ｄ、最大６ｄ、最大４ｄ、最大３ｄ、最大２ｄ、最大１ｄ、最大１８ｈである。好ましい範囲は２ｄ〜４ｗである。
【００３４】
エクスビボ分化の代替的又はそれと組み合わせた実施形態において、本発明の移植片はインビボで分化する。従って、エクスビボ分化を用いないドナー移植片又は部分的にエクスビボで分化した移植片は、組織欠損に配置され又は移植され、及び、欠損組織の組織タイプに分化させるために刺激される。これは、結合組織特異的増殖又は分化因子（欠損の組織に特異的）を移植された移植片に、例えば局所注射により、投与することによって行うことができる。投与の用量及び間隔は、組織タイプ及び移植片サイズに応じて選択することができる。結合組織特異的増殖又は分化因子は、本発明の好ましい実施形態である、エクスビボ方法について以下にさらに記載されるものと同一であり得る。
【００３５】
本発明によれば、ドナー組織に対する細胞は、好ましくは単離及び増殖されるものではなく、単にトランス分化される。
【００３６】
好ましい実施形態では、移植片の結合組織は軟骨（軟骨形成分化組織）である。分化は、脂肪組織の細胞を軟骨細胞及び／又は軟骨芽細胞、好ましくはそれらの特異的細胞外マトリックスに分化させることを含み得る。例えば、移植組織は、例えば図２ａ〜ｃに示すような、軟骨細胞外マトリックスのマーカーを含むことができる。従って、分化因子は、軟骨細胞分化因子である。そのような因子又は因子の混合物は、好ましくは、ＴＧＦ−βを含む。ＴＧＦ−βは、ＴＧＦβ−１、ＴＧＦβ−２若しくはＴＧＦβ−３、又はその混合物の任意の１つ、例えばＴＧＦβ−１及びＴＧＦβ−２を含み得る。また、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）が好ましい。さらに、軟骨形成性増殖及び分化因子は、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−９、デキサメタゾン、α−ＦＧＦ、ＦＧＦ−２、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２を含み、これらは全て、任意に追加して（例えば、ＴＧＦ−βに）又は代替物として使用されてもよい。軟骨標的移植組織の場合、血清の非存在下で組織を培養することが好ましい。軟骨組織の質は、トランス分化中又後に、ＢＭＰ−１４（ＧＤＦ−５）を添加することによってさらに改善され得る。
【００３７】
さらに好ましい実施形態では、移植片の結合組織は骨（骨形成分化組織）である。分化は、脂肪組織の細胞の、骨細胞及び／又は骨芽細胞への分化、好ましくはそれらの特定の細胞外マトリックス、例えばミネラル化を含んでもよい。分化因子は、骨形成分化因子である。このような因子又は因子の混合物は、好ましくはβ−グリセロリン酸を含む。さらなる骨形成成長因子及び分化因子には、デキサメタゾン、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ−２、ＰＧＦ、オステオゲニン、ＧＤＦ−５、ＣＴＦＧが含まれ、これらはすべて、任意に追加して（例えば、β−グリセロリン酸に）又は代替物として使用されてもよい。特に好ましいのは、以下でさらに詳細に説明するように、添加剤として血清である。特に好ましいのは、β−グリセロリン酸、デキサメタゾン及びアスコルビン酸の組み合わせであり、好ましくはさらに血清を伴うものである。
【００３８】
さらに好ましい態様において、移植片結合組織は腱（腱形成分化組織（ｔｅｎｏｇｅｎｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｔｉｓｓｕｅ））である。分化は、ドナー組織、好ましくは脂肪組織、の細胞の腱細胞への分化を含んでもよい。分化因子は、腱形成分化因子（ｔｅｎｏｇｅｎｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）である。そのような因子又は因子の混合物は、好ましくは、ＢＭＰ−２、ＰＧＥ2、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１４、ＴＧＦβ3及び血小板リッチ血漿放出物（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｒｉｃｈ  ｐｌａｓｍａ  ｒｅｌｅａｓａｔｅ）、好ましくは血清のいずれか１以上のいずれか１つ若しくは複数を用いた又は伴わない、機械的なインビトロストレッチが好ましい。例示的腱形成分化培地は、１％ＦＣＳ及びＢＭＰ−１２、好ましくは約１０ｎｇ／ｍＬ  ＢＭＰ−１２を補充したＤＭＥＭ−Ｆ１２を含む。
【００３９】
さらに好ましい態様において、移植片結合組織は筋肉（筋原性分化組織）である。分化は、ドナー組織、好ましくは脂肪組織の細胞の筋細胞への分化を含んでもよい。分化因子は筋原性分化因子である。そのような因子又は因子の混合物は、好ましくは、５−アザシチジン、アンホテリシンＢ、ｂＦＧＦのいずれか１つ若しくは複数、及び好ましくは血清を含む。
【００４０】
さらに好ましい態様において、移植片結合組織は神経（神経分化組織）である。分化は、ドナー組織、好ましくは脂肪組織の細胞の神経細胞への分化を含んでもよい。分化因子は神経原性分化因子である。このような好ましい因子又は因子の混合物は、ＦＧＦ−２、レチノイン酸、２−メルカプトエタノール、ヒドロコルチゾン、ｃＡＭＰ、ａＦＧＦ、Ｓｈｈ、脳由来神経栄養因子、神経成長因子、ビトロネクチン、ＡｓＡ、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、フォルスコリン及びミリスチン酸ホルボール（好ましくは２０ｎＭ）の１つ若しくは複数及び好ましくは血清、を含む。
【００４１】
さらに好ましい実施形態では、移植片結合組織は靭帯である。分化は、ドナー組織、好ましくは脂肪組織の細胞の靭帯細胞への分化を含んでもよい。この分化因子は、線維芽細胞分化因子である。そのような好ましい因子又は因子の混合物は、ＴＧＦ−β１、ＩＧＦ−１、ＰＤＧＦ、ＢＭＰ−１２、ｂＦＧＦ及びインスリンのいずれか１つ又は複数、及び好ましくは血清を含むことが好ましい。
【００４２】
軟骨の分化のために、増殖及び分化因子は、デキサメタゾン、アスコルビン酸−２−リン酸、インスリン、亜セレン酸、トランスフェリン、ピルビン酸ナトリウム及びトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、ＢＭＰ−１４及び／又はインスリン様成長因子（例えば、ＩＧＦ−１）から選択される群から１以上を含み得る。特に好ましいのは、ＴＧＦ−β及び／又はＩＧＦ−１である。特に、これらのコンポーネントのすべてで効率的な分化が達成され得る。
【００４３】
含まれ得る追加の栄養素には、ダルベッコ改変イーグル培地及びハム栄養ミックスＦ１２、任意のタンパク質原性アミノ酸、例えば、Ｌ−グルタミンを含む。
【００４４】
骨形成（骨）分化のために、軟骨発生が骨発生の前駆体であることを考慮すると、軟骨増殖及び分化因子を追加の骨成長及び分化因子と共に使用することができる。
【００４５】
骨形成分化因子は、例えば、参考文献２１に記載されているものであり、１〜１０００ｎＭのデキサメタゾン（Ｄｅｘ）、０．０１〜４ｍＭのＬ−アスコルビン酸−２−リン酸（ＡｓＡＰ）又は０．２５ｍＭのアスコルビン酸、及び１〜１０ｍＭのβ−グリセロリン酸（βＧＰ）を含んでもよい。それは、ＤＭＥＭ基本培地＋１００ｎＭのＤｅｘ、０．０５ｍＭのＡｓＡＰ、及び１０ｍＭのβＧＰを含み得る。
【００４６】
好ましくは、骨分化及び成長因子には、アスコルビン酸、任意のタンパク質原性（ｐｒｏｔｅｉｎｏｇｅｎｉｃ）アミノ酸、例えば、Ｌ−グルタミン、デキサメタゾン、β−グリセロールホスフェート及びレプチンがからなる群から１以上を含む。β−グリセロールホスフェート及び／又はレプチンが特に好ましい。特に、これらのコンポーネントのすべてで効率的な分化が達成し得る。
【００４７】
ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）及び／又は血清に含まれるような栄養素も、骨分化の間に使用されることが好ましい。ＤＭＥＭは、分化中及びその後の、任意の分化前脂肪組織を培養するための本発明の任意の方法において使用することができる、アミノ酸を含む基本栄養素を提供する。
【００４８】
好ましくは血清、特にトランス分化組織移植片のレシピエント由来の自己血清は、分化工程中、好ましくはエクスビボ培養で実施される工程中に、ドナー組織、好ましくは脂肪組織に添加される。血清は、哺乳動物血清、例えばウシ血清、特に好ましくはウシ胎仔血清（ｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ）又はウシ胎仔血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）であり得るが、ヒト患者の場合には好ましくはヒト血清であり得る。血清は、１％〜８０％（ｖ／ｖ）、好ましくは２％〜６０％、３％〜５０％、４％〜４０％、５％〜３０％、特に好ましくは６％〜２０％の濃度で提供されてもよい。血清は通常、特定の細胞−軟骨細胞でさえ−を生存可能又は増殖するように維持するためにのみ使用されるが、他の細胞に脱分化し、及び／又は、存在する若しくは血清中のコラーゲン及びグリコサミノグリカン合成を低下させる。血清は、好ましくは、軟骨移植片には使用されない。トランス分化は、通常、血清とは無関係である。本発明の方法にかかる骨、筋肉、腱、靭帯又は神経の生産中に血清が使用され得る。これらの組織の細胞への分化を進めるためにさらなる工程が使用されても良い。
【００４９】
好ましくは、ＩＧＦ、特にＩＧＦ−１は、骨分化に使用される。
【００５０】
好ましくは、結合組織特異的増殖及び／又は分化因子は、組織に対して外的に提供され、例えば、組織はこれらの因子と接触され、前記因子はドナー又は移植組織の細胞で遺伝子組換え的に発現されないものである。
【００５１】
驚くべきことに、骨形成タンパク質、例えばＢＭＰ−２なしで、骨分化が促進され得ることが見出された。従って、本発明の好ましい実施形態において、ＢＭＰ又はＢＭＰをコードする核酸は、軟骨及び／又は骨分化のために脂肪組織に添加されない。他の実施形態では、ＢＭＰ、例えば、ＢＭＰ−５又はＢＭＰ−７を使用してもよい。ＢＭＰ（複数）は、ＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１５である。
【００５２】
好ましくは、核酸、例えば、トランスジーンは、成長因子又は分化因子として使用されない。本発明の分化又は増殖因子は、タンパク質又はペプチドである。付加的又は代替的に、最大１０ｋＤａ、好ましくは最大５ｋＤａ、特に好ましくは最大２ｋＤａのサイズを有する有機小分子を使用することができる。
【００５３】
好ましくは、結合組織特異的成長因子又は分化因子は、アスコルビン酸又はアスコルビン酸エステル、好ましくはアスコルビン酸−２−リン酸、又はその任意の医薬的に許容される塩を含む。アスコルビン酸及びそのエステル、例えばＬ−アスコルビン酸２−リン酸は、皮膚線維芽細胞によるコラーゲン蓄積、細胞増殖、及び三次元構造の形成を刺激する。従って、アスコルビン酸及びその誘導体は、軟骨又は骨の分化を含む、本発明の方法及びその任意の実施形態のいずれかにおいて、結合組織特異的増殖又は分化因子として又はそのような因子の混合物における添加物として好ましい成分である。
【００５４】
好ましくは、分化（インキュベーション）は３０〜４０℃の温度で行われる。また、好ましくは、分化（インキュベーション）は、０．０１％〜１０％（ｗ／ｖ）のＣＯ2を含む雰囲気で実施される。また、好ましくは、分化（インキュベーション）は７０％〜９８％の湿度を含む雰囲気で行われる。好ましくは、必須ではないが、これらのパラメータの組み合わせが使用される。
【００５５】
本発明の方法では、ドナー及び移植組織の細胞、少なくとも組織内でトランス分化された細胞は、生存可能なままである。
【００５６】
特定の態様において、本発明は、ドナー組織、好ましくは脂肪組織を、結合組織修復に適した分化した移植片に調製するためのエクスビボでの方法を提供するものであり、ドナー組織、好ましくは脂肪組織を１以上の結合組織特異的増殖又は分化因子と接触させ、それにより組織移植片の分化を開始すること、を含み、ここで、前記接触が、１時間〜４週間の期間、３０〜４０℃の温度にて、０．０１％〜１０％（ｗ／ｖ）ＣＯ2及び７０％〜９８％の湿度であり、好ましくは、ここで前記方法が、さらに、上記又は以下のさらなる工程によってさらに定義されるものである。特に、結合組織特異的増殖又は分化因子は、最大で１０ｋＤａのサイズを有するタンパク質、ペプチド及び小分子からなり、例えば、脂肪組織の細胞における遺伝子組換え発現は用いられない。
【００５７】
ドナー又は移植片組織は、必要に応じて、最小侵襲挿入を容易にするために、所望のサイズの切片に切開することができる。所望のサイズの長さは、０．３ｍｍ〜１０ｍｍであってもよい。好ましくは、分化前若しくは分化中の本発明のドナー又は移植片は、サイズが０．００１ｍｍ3〜１０００ｃｍ3、好ましくは０．０１ｍｍ3〜１００ｃｍ3、又はサイズが０．１ｍｍ3〜１０ｃｍ3、サイズが１ｍｍ3〜１ｃｍ3、又は１０ｍｍ3〜１００ｍｍ3である。
【００５８】
分化した組織移植片は、組織欠損の中又は上に挿入され、さらに好ましくは、前記挿入は、組織シーラント、好ましくはフィブリングルーで固定される。
【００５９】
上記の分化工程のいずれか１つ、すなわちインキュベーションは、脂肪組織を結合組織の組織移植片に形質転換するためのエクスビボ又はインビボの方法において本発明のさらなる態様として提供されるものであって、前記インキュベーション工程を含んでいる。
【００６０】
好ましくは、本発明の方法の任意の１つは、好ましくは前記結合組織特異的成長因子又は分化因子で処理した後に、及び／又は、患者の結合組織欠損に適合させるために組織移植片のサイズ及び形状を調整する任意の工程の後に、組織に組織シーラントを接触させる工程、をさらに含む。サイズ及び形状を調整することとは、欠損を治癒させるために、組織移植片を欠損空間内又は上に適合させる、すなわち隣接する結合組織へ移植片を付着することを意味する。組織シーラントを用いた治療は、周囲の結合組織への組織片のしっかりとした取り付けを可能にし、結合組織の細胞の成長を促進する。組織シーラントは、組織欠損中にもコーティングすることができる。いずれにせよ、組織シーラントは、組織片を周囲の結合組織と接続するために使用される。
【００６１】
一般的に、組織欠損の治療は、例えば、当然に、怪我や手術欠損による、欠損した組織の体積（組織欠損）に本発明の移植片を移植することを含むことができる。移植片はまた、移植片が上に固定され、下に存在する欠損に強化効果を生じ、例えば移植片組織からの活性化した又は分化した幹細胞が欠損部へと移動することによって、表面組織欠損を治療するために使用することもできる。
【００６２】
特に好ましくは、移植組織は血管を含む。血管はドナー移植組織から維持され、再増殖する必要はない。移植片のそのような血管は、移植後の組織欠損の近傍の血管と接続することができ、元の欠損を有する周囲又は隣接する組織への移植片の良好な結合を可能にする。
【００６３】
欠損は、多くの組織に存在し得、それは、例えば、整形外科手術、顎顔面外科手術、歯科又は形成手術及び再建手術を必要し得る。
【００６４】
例本発明の組織移植片による欠損及び治療の例は、移植片又は欠損組織によって分類される：
【００６５】
軟骨欠損の治療に軟骨移植組織を使用することができる。処置されるべき欠損の軟骨タイプは、骨軟骨欠損症又は外傷性軟骨損傷などの局所的軟骨病変が含まれ、例えば膝関節又は距骨内；変形性関節症、特に変形性関節症による軟骨剥離（ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ａｂｒａｓｉｏｎ）；椎間板の再生；半月板再生；髄核逸脱（ｎｕｃｌｅｕｓ  ｐｕｌｐｏｓｕｓ  ｐｒｏｌａｐｓｅ）及びその後の微小椎間板切除術によって引き起こされる椎間板病変が含まれる。トランス分化された組織移植片は、生物学的髄核代替物としての役割を果たすことができる。それは、髄核代替物としての軟骨形成性分化移植片の移植によって、変性椎間板疾患の治療に使用することができる。軟骨移植組織はさらに、外傷性又は変性半月板状裂傷（ｔｅａｒｓ）の治療に使用することができる。分化した移植片は、裂傷半月板の部分切除後に半月板欠損部に縫合することができる。
【００６６】
靭帯移植組織は、靭帯欠損の治療に使用することができ、それは、膝関節における外傷性十字靱帯裂傷の治療；側方足首靭帯の外傷性裂傷の治療を含む。
【００６７】
腱移植片組織は、腱欠損の治療に使用することができ、それは、外傷性又は変性性回旋腱板裂傷（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｒｏｔａｔｏｒ  ｃｕｆｆ  ｔｅａｒｓ）の治療；アキレス腱裂傷の治療を含む。
【００６８】
骨移植片組織は、脊柱変形又は変性椎間板疾患の場合の、脊髄融合などの骨手術を含む骨欠損の治療に使用することができる：骨形成性トランス分化移植片は、椎間板の除去した後を埋めるケージ（ｃａｇｅ）及び椎間腔、及び椎間腔の準備に用いることができる。移植片は、単独で、又はＢＭＰと組み合わせて使用して、脊椎への移植片の並置による脊椎融合を達成することもできる。移植片は、骨折後の偽関節（ｎｏｎ−ｕｎｉｏｎ）の治療に使用することができ、又は骨治癒を促進するために損傷領域に移植することができる。それは、脊椎骨折の治療又は予防的骨増強のための、脊椎及び椎骨形成術のような予防的治療を含む、骨粗鬆症欠損の治療又は骨増強のために使用することができる。骨形成性のトランス分化移植片が椎体に挿入され、生物学的骨折治癒に寄与し得る。それは、動脈瘤及び若年性骨嚢胞のような骨移植を通常必要とする骨欠損の治療に、又は歯科インプラントの挿入前のような骨増強のために使用することができる。例えば、それは歯科での洞の持ち上げ（ｓｉｎｕｓ  ｌｉｆｔｉｎｇ）に使用することができる。本発明に従って治療されるべき欠損を有する骨は、骨のタイプの一般的な分類に従って、長骨、短骨、平骨、種子骨又は不規則骨であり得る。
【００６９】
本発明の方法によって調製された移植片は、任意の治療的組織欠損処置における使用のために提供され得る。
【００７０】
さらに別の態様では、本発明の方法を実施するのに適したキット、特に、脂肪組織の細胞を分化した細胞を有する適切な結合組織移植片に分化させる方法であって、場合によっては、移植片を組織欠損にその移植片を付着することにさらに適している。キットは、結合組織特異的増殖又は分化因子（好ましくは上記のような）及び組織シーラント、好ましくはフィブリングルーを含んでもよい。上記の他の成分が含まれていてもよい。さらに提供されるのは、培養容器、例えばフラスコ又は培養皿である。また、ＣＯ2フラスコのような適切な雰囲気を調整するための構成要素が提供されてもよい。
【００７１】
キットは、分化の進行をモニターし、結合組織移植片に形質転換されている脂肪組織の所与の分化段階が、欠損への挿入に十分であるかを評価するのに適している、軟骨又は骨組織の標識若しくはマーカーをさらに含んでもよい。分化の段階は上記の通りであってもよい。
【００７２】
本発明は、本発明のこれらの実施形態に限定されることなく、以下の図及び実施例によりさらに特徴づけられる。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】不規則で不均一な表面形成を示す対応する対照（ｂ）と比較した、軟骨形成性トランス分化脂肪移植片（ａ）の平滑表面形質転換。
【図２】軟骨トランス分化脂肪移植片（ａ）及び対応する対照（ｄ）のアルシアンブルーグリコサミノグリカン染色；脂肪移植片（ｂ）及び対照（ｅ）のビスマルクブラウン染色；脂肪移植（ｃ）及び対照（ｆ）のサフラニンＯ染色。
【図３】軟骨形成性トランス分化脂肪移植片のグリコサミノグリカン含量。
【図４】陽性フォンコッサ染色（ａ）及びアリザリンレッド染色（ｂ）によって示された骨形成性トランス分化脂肪移植片のミネラル化。対応する対照（ｄ、ｅ）は、ミネラル化の兆候を示さない。アザン染色は、未分化対照（ｆ）と比較した、トランス分化脂肪移植片（ｃ）における膠原組織の増加を示す。
【図５】骨形成性トランス分化組織片の５μｍ切片におけるミネラル化の定量。
【図６】ＨＥＴ−ＣＡＭ血管新生アッセイを用いた骨形成性トランス分化組織片の血管形成及び組織組み込みの評価。移植片は、良好な組織組込を示し、５日後にレシピエントの血管系に連結される（ａ、ｂ）。組織片内には多数の血管が見える（ｃ；矢印）。陽性フォンコッサ染色（ｄ）によって示されるように、骨形成分化が維持される。
【図７】軟骨形成性トランス分化脂肪組織移植片を移植した１４日後の膝関節の隆起性軟骨。移植片はレシピエント組織によく組み込まれる。
【図８】単離された神経原性分化間葉系幹細胞は、典型的なニューロン及び軸索形成を示す（図８ａ、矢印）。対照群では、軸索及びニューロン形成は観察されなかった（図８ｂ）。神経原性トランス分化脂肪移植片は、対照群（８ｄ）では観察されない陽性ニッスル体染色（図８ｃ、矢印）を示す。
【図９】ａ）典型的な脂肪組織表現型を示す対照脂肪組織。ｂ）６週間後の神経原性トランス分化脂肪パッド：脂肪性小胞が、クレシルバイオレット染色陽性を示す神経原性組織に置換されている。ｃ）髄膜（黒矢印）及び上皮（灰色の矢印）並びに付随する血管（黄色の矢印）を含む末梢神経組織の帯状の分化が観察され得る。ｄ）神経原性内のニッスル小体は、神経原性トランス分化されたサンプル（矢印）中に観察される。
【図１０】ａ）分化開始２週間後の単離された間葉系幹細胞の腱細胞表現型への分化。ｂ）対照群の変化していない表現型。ｃ）円形配向を示す腱細胞分化細胞の島は、トランス分化した脂肪パッドに存在したが、対照組織には存在しなかった（ｄ）。
【図１１】筋分化：ａ）配向筋細胞への早期分化；ｂ）対照群における分化はない。ｃ）脂肪の空胞は、縦配向及び陽性ゴールドナー（Ｇｏｌｄｎｅｒ）染色によって示す、筋組織に部分的に置き換えられた。ｄ）筋肉組織形成は対照サンプル中に存在しなかった。
【実施例】
【００７４】
実施例１：脂肪組織の硝子軟骨移植片へのトランス分化
【００７５】
脂肪移植片の調製：
脊髄減圧手術中に得られた小さな脂肪生検を、組織培養実験室へ輸送するための滅菌容器に入れた。サンプルを滅菌生理食塩水で洗浄して、混入している赤血球を除去した。汚染検査を経た後、サンプルを２つの部分に分けた。パートＡ（トランス分化サンプル）を、間葉系幹細胞の分化に用いることを意図した市販の軟骨形成分化培地（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）でインキュベートした。間葉系幹細胞の分化を得るために、細胞は通常、デキサメタゾン、アスコルビン酸−２−リン酸、インスリン、亜セレン酸、トランスフェリン、ピルビン酸ナトリウム及びトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）（１５）を含む合成培地中で凝集又はペレット培養を行った。パートＢ（対照）を、１０％ウシ胎仔血清及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補充したダルベッコ改変イーグル培地及びハム栄養ミックスＦ１２の１：１混合物中でインキュベートした。細菌汚染を防ぐために、５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを両培地に添加した。インキュベーションは３７℃、５％ＣＯ2及び９０％湿度で２〜３週間行った。培地は週に２回交換した。
【００７６】
組織学的評価：
インキュベーション期間の終わりに、サンプルを４％ホルムアルデヒド中で固定し、リン酸緩衝化生理食塩水で洗浄し、上昇濃度のエタノールで水分を飛ばした。組織をパラプラストに包埋し、５μｍ切片を調製した。軟骨形成分化は、アルシアンブルー、ビスマルクブラウン及びサフラニンＯ染色を介して評価した。
【００７７】
グリコサミノグリカン合成の評価：
２週間のトランス分化の後、サンプルを、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓに溶解した１ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫで一晩消化した。ジメチル−メチレンブルーアッセイを用いてグリコサミノグリカン含量を測定し、吸光度を５２５ｎｍで読み取った。サメのコンドロイチン硫酸を標準曲線の作成に用いた。
【００７８】
形態学的結果：
インビトロで３週間のトランス分化後、脂肪組織は平滑表面リモデリングを有するコンパクトで球状の形態を示した（図１）。
【００７９】
組織学的結果：
軟骨分化の組織学的染色は、トランス分化した脂肪組織において陽性であった：グリコサミノグリカン合成は、アルシアンブルー染色によって検出することができた。プロテオグリカンは陽性のサフラニンＯ染色により可視化され、陽性ビスマルク−ブラウン染色は軟骨組織に典型的な細胞外マトリックスの存在を示した（図２）。
【００８０】
グリコサミノグリカン合成の評価：
トランス分化プロセスの開始２週間後、トランス分化した脂肪移植片は１６．５６μｇグリコサミノグリカン／ｍｇ組織、を含み、対照は１．９２μｇ／ｍｇの平均グリコサミノグリカン含量しか示さなかった（ｐ＜０，０００１；図３）。
【００８１】
実施例２：脂肪組織の骨移植片へのトランス分化
【００８２】
脂肪移植片の調製：
脊髄減圧手術中に得られた小さな脂肪生検を、組織培養実験室へ輸送するための滅菌容器に入れた。サンプルを滅菌生理食塩水で洗浄して、混入している赤血球を除去した。汚染検査を経た後、サンプルを２つの部分に分けた。パートＡ（トランス分化サンプル）を、機械的刺激を繰り返した後、骨形成分化培地でインキュベートした。骨形成分化培地は、１０％ウシ胎児血清、０．０５ｍｇ／ｍＬアスコルビン酸、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１μＭデキサメタゾン、１０ｍＭ  Ｎａ−β−グリセロールホスフェート及び１μｇ／ｍＬレプチンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）からなる。パートＢ（対照）を、１０％ウシ胎仔血清及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補充したダルベッコ改変イーグル培地及びハム栄養ミックスＦ１２の１：１混合物中でインキュベートした。細菌汚染を防ぐために、５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを両培地に添加した。インキュベーションは３７℃、５％ＣＯ2、９５％湿度で３週間行った。培地は週に２回交換した。
【００８３】
組織学的評価：
インキュベーション期間の終わりに、サンプルを４％ホルムアルデヒド中で固定し、リン酸緩衝化生理食塩水で洗浄し、上昇濃度のエタノールで水分を飛ばした。組織をパラプラストに包埋し、５μｍ切片を調製した。サンプルをアザン、フォンコッサ及びアリザリンレッドで染色した。
【００８４】
組織学的結果：
トランス分化した脂肪移植片は、フォンコッサ陽性及びアリザリンレッド染色によって示されるように、コラーゲン含量の増加及びミネラル化の徴候を示す（図４）。
【００８５】
ミネラル化の定量化：
ミネラル化の程度は、３週間の骨形成トランス分化後のアリザリンレッド染色の吸光度（ＯＤ）を測定することによって、５μｍ切片から定量した。
【００８６】
アリザリンレッド染色結果：
骨形成性トランス分化移植片の平均ＯＤは、５μｍ切片当たり０．２５であった。対応する対照切片のＯＤは０．１２であった（ｐ＜０．００５；図５）。
【００８７】
血管新生及び組織組込みの評価：
血管新生及び組織組込みは、ＨＥＴ−ＣＡＭ（鶏卵検査−絨毛尿膜）アッセイを用いて評価した。骨形成性トランス分化された移植片は、肥大化した特定病原体除去鶏卵の暴露された絨毛尿膜に異種移植された。移植の５日後に、ＣＡＭの移植片支持領域を切除し、組織学的分析のために処理した。
【００８８】
ＨＥＴ−ＣＡＭテスト結果：
インプラントは、インビボで５日後に、レシピエントの血管系に十分に組み込まれ、接続された（図６ａ、ｂ）。組織片内には多数の小さな血管が見られた（図６ｃ；矢印）。分化因子の欠乏にもかかわらず、骨形成分化は維持された（図６ｄ）。
【００８９】
実施例３：軟骨病変の治療
【００９０】
組織片収穫と調製：
局所麻酔下で皮下脂肪生検を採取する。これは計画された外科手術の約１４日前に外来でなされ得る。脂肪組織を、無菌的に組織培養培地を含む滅菌容器に入れ、例えば、上記のように処置され、すなわち、移植片は、３７℃、５％ＣＯ2及び９０％湿度で２週間、軟骨トランス分化に供される。計画された処置の日に、移植片は手術室に送られる。インビトロでのトランス分化軟骨移植インプラントを図７に示す。
【００９１】
欠損準備（ｄｅｆｅｃｔ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）：
小さい関節切開術が実施され、欠損は注意深く切除される。ステンシル（例えば、滅菌錫箔）を使用して、欠損の正確な型（モールド）が製造される。
【００９２】
移植片の準備及び移植：
ステンシルを使用して、移植片は欠損のサイズに適合される。次いで、移植片を、フィブリングルーを用いて欠損部に移植される。５分間硬化させた後、過剰な接着剤をメスで除去し、関節を１０回完全に曲げられ、伸ばされる。関節運動中に移植片の安定性及び位置が検査される。続いて、創傷を閉じる。
【００９３】
術後の手順：
患者は、１４日間、関節の部分的重量支持（１０ｋｇ）処置を受け、その後、腫脹に応じて進行性体重支持を受ける。組織片は、約８週間後に完全に体重を支えている。
【００９４】
実施例４：椎骨骨折の治療：
【００９５】
組織片回収及び調製：
局所麻酔下で皮下脂肪生検を採取する。これは、計画された外科処置の約１〜２週間前に外来で行うことができる。脂肪を２ｍｍ2の長さのスライスに無菌的に切開し、組織培養培地を含む滅菌容器に入れ、例えば、上記のように処理され、すなわち、移植片は、３７℃、５％ＣＯ2及び９０％湿度で１〜２週間骨形成トランス分化に付される。計画された処置の日に、移植片は手術室に送られる。
【００９６】
外科的調達：
患者は、放射線透過性のテーブル上の伏臥位に置かれる。透視下で、切開部の位置を決定した後、切開部を切開する。アクセス器具が挿入され、椎弓根接触に達するまで前方に移動される。適切な軌道が確認された後、器具は椎体に前進させられる。椎体へのアクセスは、ガイドワイヤ又はトロカールを介して得ることができる。必要であれば、椎骨の高さは、バルーン椎骨形成術を実施して回復することができる。
【００９７】
移植片の準備及び移植：
移植片は、滅菌された適用装置（ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｄｅｖｉｃｅ）内に送達される。適用装置は、アクセスデバイスに接続される。移植片及びフィブリンは、透視誘導下で椎体に同時に注入される。椎体に所望の量の移植片を挿入した後、アクセス器具を取り外し、創傷を閉じる。
【００９８】
術後の手順：
動員は手術の日ｏに開始され得る。痛みがなくなるまで固定具を使用することが推奨され、鎮痛剤は十分に処方されるべきである。腰の安定化に焦点を当てた運動プログラムは、痛みの状況が許す限りすぐに開始されるべきである。
【００９９】
実施例５：神経原性トランス分化の開始
【０１００】
コンセプトの証明：
脂肪組織生検からコラゲナーゼ消化により、間葉系幹細胞が単離された。細胞を単層培養で増殖させた。十分な量の細胞が得られた後、細胞を３×１０4細胞の密度で４８ウェルプレートの２つのウェルに播種した。神経原性分化は、市販の神経原性分化培地を添加することによって１つのウェルで開始した。残りの細胞を、１０％ウシ胎仔血清及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補充したダルベッコ改変イーグル培地及びハム栄養ミックスＦ１２の１：１混合物からなる対照培地で培養した。細菌汚染を防ぐために、５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを両培地に添加した。インキュベーションは３７℃、５％ＣＯ2及び９０％湿度で行った。培地は週に２回交換した。３日後、ニューロン様細胞に典型的な樹状突起及び軸索の形成が観察された（図８ａ）。対照培地で培養した細胞は、間葉系幹細胞に典型的な多角形を維持した（図８ｂ）。
【０１０１】
脂肪移植片の調製：
小さな脂肪生検を、組織培養実験室へ輸送するための滅菌容器に入れた。サンプルを滅菌生理食塩水で洗浄して、混入している赤血球を除去した。汚染検査を経た後、サンプルを２つの部分に分けた。パートＡ（トランス分化サンプル）を、間葉系幹細胞分化に使用することを意図した市販の神経原性分化培地（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）でインキュベートした。パートＢ（対照）を、１０％ウシ胎仔血清及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補充したダルベッコ改変イーグル培地及びハム栄養ミックスＦ１２の１：１混合物中でインキュベートした。細菌汚染を防ぐために、５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを両培地に添加した。インキュベーションは３７℃、５％ＣＯ2及び９０％湿度で６週間行った。培地は週に２回交換した。
【０１０２】
組織学的評価：
インキュベーション期間の終わりに、サンプルを４％ホルムアルデヒド中で固定し、リン酸緩衝化生理食塩水で洗浄し、上昇濃度のエタノールで水分を飛ばした。組織をパラプラストに包埋し、５μｍ切片を調製した。神経原性分化は、クレシルバイオレットを用いたニッスル体の組織化学染色を介して評価した。
【０１０３】
結果：
形態学的変化は対照組織で観察されなかった（図９ａ）。神経原性のトランス分化された移植片は、細胞質内に黒紫色のニッスル体が存在することによって示される、クレシルバイオレット染色陽性を示した（図８ｃ、矢印）。神経原性トランス分化されたサンプルでは、脂肪細胞は、徐々に神経細胞に典型的な陽性のクレシルバイオレット染色を示す大きな錐体細胞を有する円形細胞を含む神経原性組織に置き換えられた（図９ｂ）。トランス分化したサンプルでは、神経細胞並びに不随する血管を囲む明確に識別可能な周辺−及び神経上膜を含む、末梢神経組織の帯状分化が観察された（図９ｃ）。ニッスル体の形成は対照サンプルでは観察されなかった（図８ｄ）。
【０１０４】
実施例６：腱形成（ｔｅｎｏｇｅｎｉｃ）分化の誘導
【０１０５】
概念の初期証明：
腱形成分化培地の初期評価として、脂肪組織生検からコラゲナーゼ消化によって間葉系幹細胞を単離した。細胞を単層培養で増殖させた。十分な量の細胞が得られた後、細胞を５×１０4細胞の密度で４８ウェルプレートの２つのウェルに播種した。腱形成分化は、１％ＦＣＳ及び１０ｎｇ／ｍＬ  ＢＭＰ−１２を補充したＤＭＥＭ−Ｆ１２からなる腱形成分化培地を添加することによって１つのウェルで開始した。残りの細胞を、１０％ウシ胎仔血清及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補充したダルベッコ改変イーグル培地及びハム栄養ミックスＦ１２の１：１混合物からなる対照培地で培養した。細菌汚染を防ぐために、５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを両培地に添加した。インキュベーションは３７℃、５％ＣＯ2及び９０％湿度で行った。培地は週に２回交換した。分化群では、紡錘形の腱細胞への分化が２週間後に見られた（図１０ａ）。形態学的変化は対照群で観察されなかった（図１０ｂ）。
【０１０６】
脂肪移植片の調製：
小さい脂肪生検を、組織培養実験室へ輸送するための滅菌容器に入れた。サンプルを滅菌生理食塩水で洗浄して、混入している赤血球を除去した。汚染検査を経た後、サンプルを２つの部分に分けた。パートＡ（トランス分化サンプル）を腱形成分化培地でインキュベートした。パートＢ（対照）を、１０％ウシ胎仔血清及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補充したダルベッコ改変イーグル培地及びハム栄養ミックスＦ１２の１：１混合物中でインキュベートした。細菌汚染を防ぐために、５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを両培地に添加した。インキュベーションは３７℃、５％ＣＯ2及び９０％湿度で６週間行った。培地は週に２回交換した。
【０１０７】
組織学的評価：
インキュベーション期間の終わりに、サンプルを４％ホルムアルデヒド中で固定し、リン酸緩衝化生理食塩水で洗浄し、上昇濃度のエタノールで水分を飛ばした。組織をパラプラストに包埋し、５μｍ切片を調製した。腱形成分化は、Ｈ／Ｅ染色を用いて評価した。
【０１０８】
結果：
円配向を示す腱細胞分化組織の島は、トランス分化された脂肪パッドでは存在したが（図１０ｃ）、対照群（ｄ）では存在しなかった。
【０１０９】
実施例７：筋原性分化の誘導
【０１１０】
概念の初期証明：
概念の最初の証明として、間葉系幹細胞は、脂肪組織生検からコラゲナーゼ消化によって単離された。細胞を単層培養で増殖させた。十分な量の細胞が得られた後、細胞を５×１０4細胞の密度で４８ウェルプレートの２つのウェルに播種した。筋原性分化は、市販の筋原性分化培地を添加することによって１つのウェルで開始した。残りの細胞を、１０％ウシ胎仔血清及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補充したダルベッコ改変イーグル培地及びハム栄養ミックスＦ１２の１：１混合物からなる対照培地で培養した。細菌汚染を防ぐために、５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを両培地に添加した。インキュベーションは３７℃、５％ＣＯ2及び９０％湿度で行った。培地は週に２回交換した。配向した筋細胞への分化は、分化群において２週間後に見られ（図１１ａ）、対照群では見られなかった（図１１ｂ）。
【０１１１】
脂肪移植片の調製：
小さな脂肪生検を、組織培養実験室へ輸送するための滅菌容器に入れた。サンプルを滅菌生理食塩水で洗浄して、混入している赤血球を除去した。汚染検査を経た後、サンプルを２つの部分に分けた。パートＡ（トランス分化サンプル）を筋原性分化培地中でインキュベートした。パートＢ（対照）を、１０％ウシ胎仔血清及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補充したダルベッコ改変イーグル培地及びハム栄養ミックスＦ１２の１：１混合物中でインキュベートした。細菌汚染を防ぐために、５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを両培地に添加した。インキュベーションは３７℃、５％ＣＯ2及び９０％湿度で６週間行った。培地は週に２回交換した。
【０１１２】
組織学的評価：
インキュベーション期間の終わりに、サンプルを４％ホルムアルデヒド中で固定し、リン酸緩衝化生理食塩水で洗浄し、上昇濃度のエタノールで排出した。組織をパラプラストに包埋し、５μｍ切片を調製した。筋原性分化は、Ｍａｓｓｏｎ  Ｇｏｌｄｎｅｒ染色を用いて評価した。
【０１１３】
結果：
６週間の分化後、脂肪空胞は、部分的に、縦配向性及び陽性Ｇｏｌｄｎｅｒ染色を示す筋肉組織に置き換えられた（図１１ｃ）。筋肉組織の形成は対照サンプル中に存在しなかった（図１１ｄ）。
【０１１４】
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【図１ａ）】
2017523017.tif 000002
【図１ｂ）】
2017523017.tif 000003
【図２】
2017523017.tif 000004
【図３】
2017523017.tif 000005
【図４】
2017523017.tif 000006
【図５】
2017523017.tif 000007
【図６】
2017523017.tif 000008
【図７】
2017523017.tif 000009
【図８】
2017523017.tif 000010
【図９】
2017523017.tif 000011
【図１０】
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【図１１】
2017523017.tif 000013
【国際調査報告】
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2017523017.tif 000015
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