(57)【要約】  本発明は、レンチウイルスベクターに基づく日本脳炎（JE）免疫原性組成物に関する。本発明は、膜の前駆体（prM）及びエンベロープ（E）タンパク質、特に日本脳炎ウイルス（JEV）の糖タンパク質又はその免疫原性断片を発現する組換えレンチウイルスベクターを対象とする。また、本発明は、哺乳動物宿主における、特にヒト又は動物宿主、特にブタ又は子ブタ、好ましくは家畜ブタ又は家畜子ブタにおけるJEV感染を予防するための、レンチウイルスベクターを発現する細胞、使用、及び方法を提供する。
2017538417.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
長鎖末端反復（LTR）又は部分的に欠失した3'LTRを含む改変LTR、プサイ（Ψ）パッケージングシグナル、Rev応答エレメント（RRE）、及びDNAフラップセントラルポリプリントラクト（cPPT）/セントラルターミネーション配列（CTS）を含むレンチウイルスシス活性エレメントを、日本脳炎ウイルス（JEV）の膜の前駆体（prM）及びエンベロープ（E）タンパク質、又はその免疫原性断片をコードする転写ユニットと共に含む、組換えレンチウイルスベクターゲノム。
【請求項２】
前記Eタンパク質が、全長Eタンパク質か、又は該全長Eタンパク質の2つのC末端膜貫通ドメインを欠いたその可溶性形態のいずれかである、請求項１に記載の組換えレンチウイルスベクターゲノム。
【請求項３】
前記レンチウイルスの3’LTRにおいて、U3領域のプロモーター及び活性化因子が欠失していおり、prM及びEタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、異種プロモーター、例えばサイトメガロウイルス前初期（CMVie）プロモーターの制御下に置かれている、請求項１又は２に記載の組換えレンチウイルスベクターゲノム。
【請求項４】
前記prMタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、配列番号5の配列を有し、Eタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、配列番号8又は配列番号11の配列を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換えレンチウイルスベクターゲノム。
【請求項５】
HIVのゲノム、特にHIV-1のゲノムに由来する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換えレンチウイルスベクターゲノム。
【請求項６】
FIVのゲノムに由来する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換えレンチウイルスベクターゲノム。
【請求項７】
gag及びpol遺伝子が機能的GAG及びPOLタンパク質をコードすることができなくなるような、前記レンチウイルスゲノムのgag及びpol遺伝子の全て若しくは一部の欠失、又は該レンチウイルスゲノムのgag及びpol遺伝子の変異の結果、複製能力がない、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組換えレンチウイルスベクターゲノム。
【請求項８】
その核酸配列が配列番号34に規定される、pTRIPΔU3.CMV/JEV.prMEベクター、又その核酸配列が配列番号35に規定される、pTRIPΔU3.CMV/JEV.prMEΔTMベクターである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組換えレンチウイルスベクターゲノム。
【請求項９】
prM及びEをコードする配列が、遺伝子型3（G3）のJEV、例えばRP-9株のJEV又はNakayama株のJEVのものである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組換えレンチウイルスベクターゲノム。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換えレンチウイルスベクターゲノムを含むDNAプラスミド。
【請求項１１】
請求項１０に記載のDNAプラスミドを用いてトランスフェクトされたか又は遺伝子的に形質転換された宿主細胞であって、特にHEK 293T（ヒト胎児腎臓）細胞株である、宿主細胞。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換えレンチウイルスベクターゲノムを発現する組換えレンチウイルスベクター粒子であって、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質G（VSV-G）タンパク質、特にVSVインディアナ株のVSV-Gタンパク質又はニュージャージー株のVSVタンパク質で偽型化されている、組換えレンチウイルスベクター粒子。
【請求項１３】
動物又はヒトのいずれかである哺乳類のJEV感染に対する予防的処置における有効成分としての使用のための、請求項１２に記載の組換えレンチウイルスベクター粒子。
【請求項１４】
前記動物が、ブタ又は子ブタ、特に家畜ブタまたは家畜子ブタである、請求項１３に記載の組換えレンチウイルスベクター粒子。
【請求項１５】
レンチウイルスのpol遺伝子の変異又は欠失の結果として、組込み不全である、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の組換えレンチウイルスベクター粒子。
【請求項１６】
有効成分としての使用のためのものであり、単回投与又は複数回投与のいずれかとして、JEV prM及び/又はEタンパク質に対する抗体応答、特にJEV prM及び/又はEタンパク質に対する防御抗体応答を誘発するのに適した用量にて投与される、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の組換えレンチウイルスベクター粒子。
【請求項１７】
動物又はヒトのいずれかである哺乳類のJEV感染に対する予防的処置における有効成分としての使用のためのものであり、前記処置に、プライムブーストレジメンにおける前記組換えレンチウイルスベクターの投与を含む、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の組換えレンチウイルスベクター粒子。
【請求項１８】
免疫学的応答をプライムするためのレンチウイルスベクター粒子及び該応答をブーストするためのレンチウイルスベクター粒子が、異なる非交差反応VSV-Gエンベロープタンパク質で偽型化され、特に、インディアナVSV株のVSV-Gタンパク質で、又はニュージャージーVSV株のVSV-Gタンパク質で偽型化される、請求項１７に記載の組換えレンチウイルスベクター粒子。
【請求項１９】
遺伝子型G1、G3、及び場合によりG5のJEVによる感染に対する予防的処置における、請求項１７又は１８に記載の組換えレンチウイルスベクター粒子。
【請求項２０】
遺伝子型G3のJEVによる感染に対する予防的処置における、請求項１７又は１８に記載の組換えレンチウイルスベクター粒子。
【請求項２１】
請求項１２〜２０のいずれか一項に記載の組換えレンチウイルスベクター粒子を、哺乳動物宿主において免疫抗体応答を誘発するのに十分な用量で含み、付帯的なアジュバントを含むか又は含まない、免疫原性組成物。
【請求項２２】
凍結乾燥形態であり、凍結乾燥が、凍結保護化合物、例えばトレハロースの存在下で行われる、請求項２１に記載の免疫原性組成物。
【請求項２３】
非経口経路、例えば皮下（s.c.）、皮内（i.d.）、筋肉内（i.m.）、腹腔内（i.p.）、又は静脈内（i.v.）注入による投与用に製剤化されている、請求項２１又は２２に記載の免疫原性組成物。
【請求項２４】
一回又は複数回の投与、特にプライムブースト投与レジメンにおける投与用に製剤化されている、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２５】
特にJEVが遺伝子型3又は1又は5のものの場合の、哺乳動物宿主、特にヒト又は動物宿主のJEV感染に対する予防的免疫付与における使用のための、免疫学的に有効な量の、請求項１２〜２０のいずれか一項に記載の組換えレンチウイルスベクター粒子、又は請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物であって、前記粒子又は組成物が、医薬的に許容されるビヒクル、及び/又はアジュバントと混合されている、組換えレンチウイルスベクター粒子又は免疫原性組成物。
【請求項２６】
a）宿主細胞、例えばHEK-293T細胞株において、請求項１〜９のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクターゲノムを保有する組換えレンチウイルストランスファーベクターをトランスフェクトする工程；
b）工程a）の細胞を、エンベロープタンパク質VSG、特にインディアナ又はニュージャージーVSV株のVSV-Gをコードするプラスミドベクターと、パッケージングコンストラクトとして、レンチウイルスのGAG及びPOL又は変異POLタンパク質をコードするプラスミドベクターとでコトランスフェクトする工程；
c）JEV抗原を発現する組換えレンチウイルス粒子を回収する工程
を含むか又はこれらから成る、JEVワクチンの調製に適した組換えレンチウイルスベクター粒子を生産する方法。
【請求項２７】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換えレンチウイルスベクターゲノム又は請求項１２〜２０のいずれか一項に記載の組換えレンチウイルスベクター粒子の、免疫原性組成物のインビトロ生産のための有効成分としての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レンチウイルスベクターに基づく日本脳炎（JE）免疫原性組成物に関する。本発明は、膜の前駆体（prM）及びエンベロープ（E）タンパク質、特に日本脳炎ウイルス（JEV）の糖タンパク質又はその免疫原性断片を発現する組換えレンチウイルスベクターを対象とする。また、本発明は、哺乳動物宿主、特にヒト又は動物宿主、特にブタ又は子ブタ、好ましくは家畜ブタ又は家畜子ブタにおけるJEV感染を予防するための、レンチウイルスベクターを発現する細胞、使用、及び方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
日本脳炎は、フラビウイルス（Flaviviridae）科のフラビウイルス（Flavivirus）属の一種である、蚊媒介性の日本脳炎ウイルス（JEV）の感染に起因する（Go et al., 2014; Hubalek et al., 2014; Weaver and Barrett, 2004; Yun and Lee, 2014）。JEVは、プロセシングを受けて３つの構造タンパク質、カプシド（C）、膜の前駆体（PRM）、及びエンベロープ（E）、並びに７つの非構造タンパク質NS1〜NS5になるポリタンパク質をコードするプラス鎖の一本鎖RNAゲノムを含有する（Yun and Lee, 2014）。ウイルスアセンブリは小胞体膜の内腔で起こり、そこでヌクレオカプシドはヘテロ二量体prMEと会合して未成熟JEVビリオンを形成する。後者は、分泌経路を通過し、そこでビリオンはトランスゴルジ中のフーリン（furin）によるprMの切断によって成熟化され膜（M）タンパク質になる（Yun and Lee, 2014）。加えて、他のフラビウイルスと同様に、JEVは、ウイルス様粒子（VLP）を生成するが、これらはprM及びEタンパク質のみからアセンブルされ、真正ウイルス粒子と同様の成熟プロセスを経る（Kuwahara and Konishi, 2010）。これらのVLPは、任意の他のウイルス成分の非存在下で生成することができ、真正ビリオンと類似の生物学的活性を示すことができる（Kuwahara and Konishi, 2010）。
【０００３】
JEVは、通常、コガタアカイエカ（Culex tritaeniorhynchus）蚊と、水鳥及び家畜ブタ等の増幅性脊椎動物宿主との間の風土病サイクル（enzootic cycle）中に維持される（Go et al., 2014; Hubalek et al., 2014; Impoinvil et al., 2013）。ウマ及びヒトは、蚊に感染するのに十分なレベルのウイルス血症を発症しないため、終末宿主（dead-end host）であると考えられている（Impoinvil et al., 2013）。過去数十年間で、アジアにおいてJEVの地理的分布の拡大があり、また、ヨーロッパにおけるJEVの移入の可能性が近年報告されている（Campbell et al., 2011; Zeller 2012）。
【０００４】
ウイルスエンベロープタンパク質の配列に基づく系統発生的研究により、JEVの株をG1〜G5の遺伝子型に分けることができる（Gao et al., 2014; Hubalek et al., 2014; Le Flohic et al., 2013; Schuh et al., 2013; Solomon et al., 2003; Weaver and Barrett, 2004）。当初、広まっていたJEVの株の大部分はG3に属し、これらは東南アジア諸国の主要な流行の起源であった。近年、JEV G3からG1への流行の変化が、複数のアジア諸国で観察されており、一方で、JEV G5の複数の株が、中国及び韓国で時々単離されている（Gao et al., 2013; Le Flohic et al., 2013; Li et al., 2014; Pan et al., 2011; Schuh et al., 2014; Takhampunya et al., 2011）。
【０００５】
JEVは、年間50,000例の症例及び約10,000人の死亡を有する、アジアにおいて医学的関心を持たれている最も重要なウイルス性脳炎の病原因子である（Campbell et al., 2011; Go et al., 2014; Yun and Lee, 2014）。有症候性のヒトの症例の約20〜30％が致死性であり、一方で非致命的症例の30〜50％が長期の神経学的後遺症を発症する可能性がある。JE疾患には、利用可能な抗ウイルス療法がない。現在、JEVに対するワクチンが、ヒトに対して、並びにウマ及びブタ等の一部の動物用に、利用可能である：これらは、不活性化されたマウス脳由来の、不活性化細胞培養由来の、生弱毒化および生弱毒化キメラの黄熱ウイルス-JEVワクチンである（Bonaparte et al., 2014; Dubischar-Kastner and Kanesan-Thasna, 2012; Erra et al., 2013; Fan et al., 2013; Halstead and Thomas, 2011; Impoinvil et al., 2013; Ishikawa et al., 2014; Marks et al., 2012; Song et al., 2012; Yang et al., 2014; Yun and Lee, 2014）。しかし、これらの中には、長期的な免疫が欠如しているものもあり、また生弱毒化ワクチン株は、病原性に復帰し得るリスクを有している（Yun and Lee, 2014）。また、JEVワクチンの費用対効果は、 主要な障壁と考えられている（Impoinvil et al., 2013）。
【０００６】
レンチウイルスベクターは、遺伝子に基づく免疫付与の新規かつ魅力的なプラットフォームの代表である。非分裂（non-dividing）樹状細胞（DC）を効率的に形質導入（transduce）するレンチウイルスベクターの能力は、内因性経路を介した長期の抗原提示を可能にし、これが続いて、強力で、多エピトープ性、かつ長期間持続する、体液性及び細胞性の免疫応答の誘導となる。その結果、ますます多くの前臨床試験が、感染症及び抗腫瘍ワクチン接種の両方の分野においてレンチウイルスベクターの優れたワクチン有効性を示している（Beignon et al., 2009; Di Nunzio et al., 2012; Fontana et al., 2014; Grasso et al., 2013; Hu et al., 2011; Sakuma et al., 2012）。本発明者らは、以前に、組込み型及び非組込み型のレンチウイルスベクターが、どちらもフラビウイルス属のJE血清型群に属する西ナイルウイルス（WNV）等のアルボウイルスに対する有望なワクチン接種ベクターであることを実証した（Coutant et al., 2008; Iglesias et al., 2006）。これらの報告は、レンチウイルスベクターが感染性病原体に対する防御抗体応答を誘発する能力の最初の実証を示した。実際、可溶性形態のWNV Eタンパク質を発現する組換えレンチウイルスTRIPベクターの単回微量投与での免疫付与は、マウスにおいてWNVによる致死的抗原投与に対する頑強（ロバスト）な殺菌的防御を与える（Coutant et al., 2008; Iglesias et al., 2006）。体液性免疫は、JEV感染からの防御において極めて重要な役割を担い（Konishi, 2013; Dubischar-Kastner and Kanesan-Thasna, 2012）、それゆえ、防御抗体応答の誘発は安全なJEVワクチンの開発に重要である（Larena et al., 2013）。
【０００７】
国際特許出願WO2005/111221は、フラビウイルス科のタンパク質の発現のための組換えレンチウイルスベクター及びワクチンとしてのその用途に関する。特に、感受性の種におけるフラビウイルス感染の予防及び/又は治療を目的とした免疫原性組成物を調製するための、フラビウイルス科のウイルスの少なくとも一つのタンパク質又は該タンパク質の少なくとも8アミノ酸の免疫原性ペプチドをコードするポリヌクレオチド断片を含む、組換えレンチウイルスベクターの使用が記載されている。
【０００８】
国際特許出願WO2007/052165は、動物に投与されたときに抗体を産生することができる医薬を調製するための、抗原をコードする異種核酸を含むレンチウイルスベクターの使用であって、動物の細胞における抗原の発現が、前記動物において体液性応答を誘発する、使用に関する。例えば、抗原の発現は、フラビウイルス、すなわちWNVに対する防御免疫を誘導する。
【０００９】
国際特許出願WO2009/019612は、レンチウイルス遺伝子トランスファーベクター及びそれらの医薬用途に関する。これらのベクターは、ウイルス感染、寄生虫及び細菌感染、又は癌を含む、病原性の状態を予防するか又は治療するための免疫応答を誘発するために使用されてもよい。前記レンチウイルスベクターは、フラビウイルス、例えばJEVに由来する少なくとも一つの抗原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。
【００１０】
国際特許出願WO2005/065707は、2つの組換えアデノウイルス（RAd）、すなわちJEVのprM及び膜アンカー（membrane-anchored）Eタンパク質（Ea）を発現するRAdEa、並びにJEVのprM及び分泌Eタンパク質（Es）を発現するRAdEsに関する。JEVのprM及び前記Ea又はEsをコードするcDNAを含むプラスミドpMEa及びpMEsが、Kaur et al.（2002）により記述されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】WO2005/111221
【特許文献２】WO2007/052165
【特許文献３】WO2009/019612
【特許文献４】WO2005/065707
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
複数のJEV遺伝子型に対するものを含む、JEV感染に対する防御的体液性免疫応答を提供するワクチンの永続的な必要性を考慮し、本発明者らは、種々の遺伝子型の一つ以上のJEVに対する防御的免疫応答を誘発することが証明された、JEVの選択されたタンパク質を発現する、新規なレンチウイルスベクターを設計した。得られた結果は、JEV prM及びEタンパク質を発現する組換えTRIPベクターが、ワクチン接種されたマウスにおいて、抗原特異的な体液性広域中和応答をプライム及びブーストし得ることを示す。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、長鎖末端反復（long terminal repeat）（LTR）又は3'LTR中のU3領域の大部分を部分的に欠失させた改変LTR、プサイ（Ψ）パッケージングシグナル、Rev応答エレメント（RRE）、及びDNAフラップセントラルポリプリントラクト（cPPT）/セントラルターミネーション配列（CTS）を含むレンチウイルスシス活性エレメントを、日本脳炎ウイルス（JEV）の膜の前駆体（prM）タンパク質及びエンベロープ（E）タンパク質、又はその免疫原性断片をコードする転写ユニットと共に含む、組換えレンチウイルスベクターゲノムに関する。さらに、ベクターゲノムは、レンチウイルス由来のWPRE配列を含んでいてもよい。
【００１４】
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、TRIP/JEVベクターの構築ストラテジーを示す。TRIP/JEVベクターを構築するための2つの戦略の概略図を示す。最上段は、prM及びE遺伝子を有するJEV由来のゲノムRNA構造の概略図である。JEV G3のRP-9株由来のprM及びEをコードするコドン最適化された配列を、ヒトサイトメガロウイルス前初期（immediate early）プロモーター（CMVie）の制御下、TRIPレンチウイルスベクターにクローニングした。TRIP/JEV.prMEベクターは、prM（SP）のシグナルペプチド配列、及びその後ろにJEV G3のRP-9株の完全なprM及びE遺伝子領域を含む。TRIP/prMEΔTMベクターは、Eからその2つの膜貫通ドメインTMD1及びTMD2が欠失していることを除いて、同一のJEV配列を含む。
【図２】図２は、TRIP/JEVベクターによる、JEV由来の組換えprM及びEの発現を示す。TRIP/JEV形質導入された293T細胞における組換えJEV prM及びEタンパク質の検出を示す。（A）抗-E mAb 4G2を一次抗体として用いた、形質導入された細胞の免疫蛍光解析。（B、C）TRIP/JE又はTRIP/GFPベクターで形質導入された細胞の、放射性免疫沈降法（RIPA）細胞ライセート（B）又は上清（C）からのprM及びEのイムノブロット解析。（B）では、細胞内prM及びEを、JEV RP-9株に対するマウスポリクローナル血清（JEV抗血清）を用いて検出した。（B）では、形質導入された細胞の上清由来のJEV E及びprMを、それぞれmAb 4G2又はJEV RP-9株に対するマウスポリクローナル血清（JEV抗血清）を用いて、検出した。（C）では、JEV VLPを、TRIP/JEベクターを形質導入した細胞の上清から濃縮し、抗E mAb 4G2及びJEV抗血清でイムノブロッティングすることにより分析した。TRIP/GFPは、ネガティブコントロールの役割を果たす。prM、E、又はEΔTM及びカルネキシン（CNX）に対応するバンドを、ブロットの右側の矢印で示す。
【図３】図３は、抗TRIP/JEV抗体によるJEV prM及びEの認識を示す。JEV RP-9株に感染した（JEV）か又はモック感染した（mock-infected）（mi.）ベロ（Vero）細胞由来のRIPAバッファー中細胞ライセートを、5 log10 TUのTRIP/JEV.prME又はTRIP/JEV.prMEΔTMベクターを2回接種したBalb/cマウス由来のプール免疫血清（抗血清）を用いて、イムノブロットアッセイにより試験した。TRIP/JEV抗血清は、ブースト接種（boosting inoculation）の3週間後に回収した。JEV RP-9株に対するマウスポリクローナル血清（JEV抗血清）は、ポジティブコントロールとしての役割を果たした。JEV E、NS1/NS1’、及びprMタンパク質に対応するバンドを、ブロットの左側の矢印で示す。
【図４】図４は、キメラ生JEVの構築ストラテジー及び抗TRIP/JEV血清によるこれらの認識を示す。（A）G3のJEV（RP-9株）の構造タンパク質領域がG1（CNS_Laos_2009株）又はG5（XZ0934株）のJEVの対応部分に置き換えられている、キメラJEVの概略図。生じたキメラJEV G1/3及びG5/3は、G1又はG5のJEV由来のC、prM、及びEをコードする配列をG3のJEVの骨格中にそれぞれ含む。親JEVは、JEV G3/3として設計された。（B、C）キメラJEVタンパク質のJEV抗血清（左）又はTRIP/JEV抗血清（右）による認識。G3の親JEV（G3/3）、キメラJEV G1/3、及びG5/3に感染したか、又はモック感染した（m.i.）ベロ細胞由来のRIPAバッファー中細胞ライセートを、表示した抗体を用いてイムノブロットすることにより分析した。抗JEV.NS5（NS5）及び抗カルネキシン（CNX）抗体は、タンパク質発現レベルを標準化する役割を果たした。
【図５】図５は、TRIP/JEV抗血清の受動伝達（passive transfer）後のインビボ防御を示す。3週齢のC56Bl/6マウスの群は、JEV感染マウスから回収したプール免疫血清（JEV G3抗血清）、又はブーストの2ヶ月後にTRIP/JEVを接種されたマウスから回収したプール免疫血清0.01 mlを含有する0.1 mlのDPBSの腹腔内接種を受けた。DPBS（PBS）を接種されたマウスは、対照群の役割を果たした。1日後、マウスは、5 log10 TUのJEV RP-9株を腹腔内接種され、死亡率が観察された。生存は、20日間記録された。灰色のボックスは、罹患したマウスの数の情報を与える。黒色のボックスは、ウイルス性脳炎を生き延びなかったマウスの数の情報を与える。
【図６】図６は、JEVレポーターウイルス粒子（RVP）の生産及び特性評価を示す。A.誘導性JEVレプリコン細胞株の生産。JEV構造タンパク質の代わりにウミシイタケ（Renilla）ルシフェラーゼレポーターを発現する、既報のJEV-RP9（g3）レプリコン（Chien H-L, et al. 2011. J Virol 85:4698-4706）を、レプリコンRNAの発現をTet-ExpressTMを用いて誘導することができるように改変した。HEK293T細胞は、JEVレプリコンで安定に形質転換された。ウミシイタケルシフェラーゼシグナルは、レプリコンRNAの定常状態の蓄積のマーカーの役割を果たし、安定JEVレプリコン細胞の誘導4時間後、24時間後、48時間後、及び72時間後にこれを測定した。本願発明者らは、24時間から72時間にかけて、シグナルの漸進的増加を観察し、これは投入したRNAの複製に対応していた。n > 3の繰り返し中、代表的な試験を示す。B. JEV RVPの生産。RVPを生産するために、JEVレプリコン細胞株を、Tet-ExpressTM誘導性プロモーターの制御下でJEV構造遺伝子をコードするJEVプラスミドでトランスフェクトした。JEVレプリコン及び構造遺伝子の発現が誘導され、RVPを含有する上清を、誘導24時間後、48時間後、及び72時間後に回収した。JEV構造遺伝子でトランスフェクトされていない細胞由来の上清は、対照の役割を果たした。RVPがうまく生産されたことは、感染力アッセイを用いて検出され、BHK21細胞を200 μlの上清に感染させ、感染24時間後のウミシイタケ発現を分析した。RVP生産のピークは、誘導後48時間で得られた。n > 3の繰り返し中、代表的な試験を示す。RLUは、ウミシイタケ光単位（Renilla light unit）。C.及びD. JEV g3及びg5 RVPの生産及び特性評価。JEVレプリコン細胞を、JEV g3又はJEV g5構造遺伝子のいずれかを発現するプラスミドでトランスフェクトした。RVPの合成及び生産は、誘導48時間後に解析された。N > 3の繰り返し中、代表的な試験を示す。C.細胞ライセートをウエスタンブロッティングによりJEV Eについて解析し、カルネキシン（CNX）をロード対照とした。細胞内JEV g5 Eの蓄積は、JEV g3タンパク質について観察されたものより低かった。上清中に放出されたRVPを、精製し、JEV E抗体を用いてウエスタンブロッティングにより解析した（細胞外）。JEV g5 RVPの生産は、JEV g3 RVP生産と比べて、有意に低かった。D.培養上清中のRVPの含有量も、レプリコンRNAの定量により分析した。ウイルスタンパク質の蓄積について観察されたように、JEV g5 RVP上清中のレプリコンRNAは、JEV g3 RVP上清中と比べて、はるかに少なかった。レプリコンRNAレベルの定量を、（B.で記述した）対応する感染力アッセイから得られた値と共にプロットした。JEV g5 RVPの収量の減少にもかかわらず、生産された粒子は、新たな細胞への進入に関してJEV g3 RVPと同程度の能力を有しているように思われた。
【図７】図７は、JEV g3又はg5 RVPを、1000 ffuのJEV g3（左）又はJEV g5（右）のいずれかを接種したマウスから20日目に回収した血清の段階希釈液とインキュベートしたことを示す。3匹の個別のマウスから回収した血清を各試験で使用し、DPBSを注射したマウスから回収した血清は対照の役割を果たした。インキュベーション後、RVPを用いてBHK21細胞を感染させた。細胞内ウミシイタケルシフェラーゼ活性を感染24時間後に定量化し、RVP侵入成功の指標とした。感染力を、対照血清で得られたウミシイタケルシフェラーゼ活性の関数として測定した。JEVを接種したマウスから回収した血清は、RVPの進入を強力に阻害した。
【図８】図８は、TRIP/JEV.prMEで免疫付与した子ブタの抗JEV IgG応答を示す。（A）では、4頭の子ブタの2つの群を、6 log10 TU（低用量）又は7 log10 TU（高用量）のTRIP/JEV.prMEを用いて、筋肉注射で免疫付与した。対照として、2頭の動物に低用量又は高用量のいずれかのTRIP/GFPを接種した。動物を、一次免疫付与の4週間後に、同一開始用量でブーストさせた（縦の矢印）。血清サンプルを各週回収し、1:400の希釈で、抗JEV E IgGの存在について間接ELISAにより試験した。（B）では、3頭の動物の群を試験的にJEV Nakayama株に感染させた。免疫血清を、1:400の希釈で、抗JEV E IgGの存在について間接ELISAにより試験した。（C、D）では、低用量（C）及び高用量（D）のTRIP/JEV.prMEでの免疫付与後1〜10週間の抗JEV E IgG1/IgG2の箱ひげ図が示される。縦の矢印はブーストを示す。（E）は、JEV Nakayama株に感染した子ブタ由来の免疫血清中の抗JEV E IgG1/IgG2のレベルである。
【図９】図９は、TRIP/JEV.prMEで免疫付与した子ブタの中和抗体応答を示す。低用量又は高用量のTRIP/JEV. prMEで免疫付与した子ブタ由来の血清を、JEVに対する中和能力について、PRNT50により試験した。（A）では、事前（prior）免疫付与、プライミング後3週間、又はブースト後6週間で回収した子ブタ血清を、JEV G3 RP-9株に対して試験した。（B）では、ブースト後に回収したTRIP/JEV.prME抗血清を、JEV G1及びG3株、並びにJEVキメラG5/G3に対する交差中和能力について試験した。（C）では、JEV Nakayama株に試験的に感染させた動物由来の抗JEV抗体の中和活性を、JEV G1、G3、及びJEVキメラG5/G3に対して、PRNT50により試験した。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の好ましい実施態様において、レンチウイルスベクターゲノムに含まれるレンチウイルスの配列は、以下のシス活性配列を包含する：HIV1-5’LTR（1-636の位置、配列番号26として開示）、RRE（1301-1534の位置、配列番号27として開示）、CPPT-CTS（2056-2179の位置、配列番号28として開示）、WPRE（prMEをコードするポリヌクレオチドを用いて組換えたベクターゲノム中の4916-5520の位置、又はprMEΔTMをコードするポリヌクレオチドを用いて組換えたベクターゲノム中の4772-5376の位置、配列番号30として開示）、HIV1-3’LTR（prMEをコードするポリヌクレオチドを用いて組換えたベクターゲノム中の5605-5866の位置、又はprMEΔTMをコードするポリヌクレオチドを用いて組換えたベクターゲノム中の5461-5722の位置、配列番号31として開示）。有利には、ベクターゲノムは、レンチウイルスの機能的構造タンパク質をコードする配列を欠いている。
【００１７】
本願明細書で用いられる場合、用語「組換えレンチウイルスベクターゲノム」は、ポリヌクレオチドコンストラクトを用いて組換えられたプラスミド（トランスファーベクター）を用いた宿主細胞のトランスフェクションの結果として、又はゲノムとして前記ベクターゲノムを含むベクター粒子を用いた宿主細胞の形質導入の結果として、前記宿主細胞中に移行する、前記コンストラクトを指す。
【００１８】
表現「Eタンパク質」は、本発明によれば、JEVのゲノムから発現される、全長タンパク質又は糖タンパク質と規定され、また、その可溶性形態から成るこのタンパク質又は糖タンパク質のバリアント、すなわち全長タンパク質に対して2つの膜貫通（TM）ドメインの欠失により改変されたタンパク質/糖タンパク質をも包含する。したがって、本願に別段の記述が無い限り、全長タンパク質/糖タンパク質及び可溶性タンパク質/糖タンパク質は、開示された実施形態に同様に関与する。
【００１９】
「その免疫原性断片」は、JEVのprM又はEタンパク質の一部分を指し、前記部分は、本発明の組換えレンチウイルスベクターにより発現されたときに抗体応答を誘発するBエピトープを含む。
【００２０】
また、本発明は、LTR又は部分的に欠失した3’LTRを含む改変LTR、Ψパッケージングシグナル、RRE、及びDNAフラップcPPT/CTSを、JEVのprM及びEタンパク質又はその免疫原性断片をコードする転写ユニットと共に含むレンチウイルスシス活性エレメントから成る、組換えレンチウイルスベクターゲノムにも関する。
【００２１】
本発明によれば、転写ユニットは、JEVタイプ3、例えばJEV RP9株又はNakayama株のJEVの前記タンパク質、をコードするポリヌクレオチドを含む。
【００２２】
特定の実施態様において、転写ユニットは、prM及びEタンパク質をコードする配列に基づいてコドン最適化された配列であり、コドン最適化は、これらのJEVタンパク質の哺乳動物宿主細胞、特にヒト細胞での発現のレベルを向上させるために行われている。当業者は、哺乳類細胞での発現のためのコドン最適化を達成する方法を知っており、コドン最適化された配列の具体的な例は、本願中に開示される。
【００２３】
特定の実施態様において、本発明で用いられるprMのシグナルぺプチドをコードするポリヌクレオチドの天然の及びコドン最適化されたヌクレオチド配列、並びにprMのシグナルぺプチドのアミノ酸配列は、配列番号1、配列番号2、及び配列番号3としてそれぞれ開示される配列である。
【００２４】
特定の実施態様において、本発明で用いられる全長prMタンパク質をコードするポリヌクレオチドの天然の及びコドン最適化されたヌクレオチド配列、並びに全長prMタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号4、配列番号5、及び配列番号6としてそれぞれ開示される配列である。
【００２５】
好ましい実施態様において、Eタンパク質は、あるいは全長Eタンパク質である。別の実施態様において、Eタンパク質は、全長Eタンパク質の2つのC末端膜貫通ドメインを欠いた、可溶性形態（sE又はEΔTM）である。得られたタンパク質は、定められた宿主細胞で発現される場合、糖タンパク質であってもよい。糖付加（グリコシル化）は、Eタンパク質を発現する細胞に応じて異なっていてもよい。
【００２６】
特定の実施態様において、本発明で用いられる全長Eタンパク質をコードするポリヌクレオチドの天然の及びコドン最適化されたヌクレオチド配列、並びに全長Eタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号7、配列番号8、及び配列番号9としてそれぞれ開示される配列である。
【００２７】
特定の実施態様において、本発明の、2つのC末端膜貫通ドメインを欠いた全長Eタンパク質の可溶性形態をコードするポリヌクレオチドの天然の及びコドン最適化されたヌクレオチド配列、並びに2つのC末端膜貫通ドメインを欠いた全長E糖タンパク質の可溶性形態のアミノ酸配列は、配列番号10、配列番号11、及び配列番号12としてそれぞれ開示される配列である。
【００２８】
特定の実施態様において、Eタンパク質の第一の膜貫通ドメイン（TMD1）をコードするポリヌクレオチドの天然の及びコドン最適化されたヌクレオチド配列、並びに第一の膜貫通ドメイン（TMD1）のアミノ酸配列は、配列番号13、配列番号14、及び配列番号15としてそれぞれ開示される配列である。
【００２９】
特定の実施態様において、Eタンパク質の第二の膜貫通ドメイン（TMD2）をコードするポリヌクレオチドの天然の及びコドン最適化されたヌクレオチド配列、並びに第二の膜貫通ドメイン（TMD2）のアミノ酸配列は、配列番号16、配列番号17、及び配列番号18としてそれぞれ開示される配列である。
【００３０】
好ましい実施態様において、prMタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号5の配列を有し、Eタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号8又は配列番号11の配列を有する。
【００３１】
特定の実施態様において、本発明のprMタンパク質及び全長Eタンパク質（prM-Eタンパク質）をコードするポリヌクレオチドの天然の及びコドン最適化されたヌクレオチド配列、並びにprM-Eタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号19、配列番号20、及び配列番号21としてそれぞれ開示される配列である。
【００３２】
特定の実施態様において、本発明のprMタンパク質及び2つのC末端膜貫通ドメインを欠いた全長Eタンパク質の可溶性形態（prMEΔTMタンパク質）をコードするポリヌクレオチドの天然の及びコドン最適化されたヌクレオチド配列、並びにprM-2つのC末端膜貫通ドメインを欠いた可溶性形態のEタンパク質（prMEΔTMタンパク質）のアミノ酸配列は、配列番号22、配列番号23、及び配列番号24としてそれぞれ開示される配列である。
【００３３】
本発明の好ましい実施態様において、prMタンパク質及び全長又は可溶性のいずれかのEタンパク質は、遺伝子型3のJEVのものである。
【００３４】
特定の実施態様において、本発明は、prM及びEタンパク質を与えるJEVが、遺伝子型3（G3）のJEV、例えばRP-9株である、組換えレンチウイルスベクターゲノムに関する。
【００３５】
本願明細書で用いられる場合、用語「コードする」は、選択された細胞又は細胞株において核酸分子が転写のためのプロモーターを含む発現制御配列下に置かれた場合、該分子が転写され、適切な場合には翻訳されて生産物を発現する能力を規定する。したがって、本発明によれば、「をコードするポリヌクレオチド」は、翻訳されてアミノ酸配列になる配列を有する核酸を示し、該核酸はクローニングされてもよいし、発現制御配列、特に異種プロモーターの制御下に置かれて、転写ユニットを与えてもよい。
【００３６】
特定の実施態様において、本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、例えばHIV-1又はHIV-2、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（Caprine Arthritis Encephalitis Virus）（CAEV）、ウマ伝染性貧血ウイルス（Equine Infectious Anaemia Virus）（EIAV）、VISNA、サル免疫不全ウイルス（Simian Immunodeficiency Virus）（SIV）、ネコ免疫不全ウイルス（Feline Immunodeficiency Virus）（FIV）、又はウシ免疫不全ウイルス（Bovine Immunodeficiency Virus）（BIV）に由来することができる、組換えレンチウイルスベクターゲノムに関する。
【００３７】
好ましい実施態様において、レンチウイルスベクターゲノムは、HIVのゲノム、特にHIV-1のゲノムに由来する。
【００３８】
別の好ましい実施態様において、レンチウイルスベクターゲノムは、FIVのゲノムに由来する。
【００３９】
本発明によるレンチウイルスに基づくベクターは、置換（replacement）ベクターであり、これは、レンチウイルスタンパク質をコードする元のレンチウイルスゲノムの配列が、ベクターのゲノムにおいて本質的に削除されており、結果として親のレンチウイルス由来のあらゆるウイルスタンパク質の発現が失われることを意味する。
【００４０】
別の特定の実施態様によれば、組換えレンチウイルスベクターゲノムは、任意のレンチウイルスタンパク質の発現の欠如の結果として、すなわち、gag及びpol遺伝子が機能的GAG及びPOLタンパク質をコードすることができないような、レンチウイルスゲノムのgag及びpol遺伝子の全て又は一部の欠失、又はgag及びpol遺伝子における変異の結果として、複製能力がない（replication-incompetent）。
【００４１】
本願明細書に規定するベクターゲノムは、レンチウイルスの構造遺伝子を欠いているか、又はレンチウイルスの全ての構造遺伝子の一部分を欠いており、それによりその配列からの構造タンパク質の発現を妨げている。結果として、ベクターゲノムは、DNAプラスミドで組換えられる場合、トランスファーベクターである。
【００４２】
したがって、ベクターゲノムは、2つのLTRの間の全てのウイルス性タンパク質をコードする配列が削除され、JEVのポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドと置き換えられており、かつDNAフラップエレメントが、本願明細書で説明される必要なシス作用配列を伴って再挿入されている、置換ベクターであってもよい。ベクターゲノムの組成に関するさらなる特徴は、粒子の調製との関連で開示される。
【００４３】
好ましい実施態様において、前記ベクターゲノムでは、レンチウイルスベクターゲノムの3’ LTR配列は、少なくとも活性化因子（エンハンサー）及びU3領域のプロモーターを欠いている。別の特定の実施態様において、3’ LTR領域は、U3領域を欠いている（デルタU3）。この点においては、WO 01/27300及びWO 01/27304の対応する説明が参照される。
【００４４】
特定の実施態様において、ベクターゲノムでは、LTR 5’のU3領域が、非レンチウイルスU3によって、又はtat非依存性一次転写を作動させるのに適切なプロモーターによって、置き換えられる。そのような場合、ベクターは、tatトランス活性化因子から独立している。
【００４５】
また、ベクターゲノムは、プサイ（Ψ）パッケージングシグナルも含む。パッケージングシグナルは、gag ORFのN末端断片（約15〜30 AA）をコードする配列を含む。特定の実施態様において、gagペプチドの起こり得る転写/翻訳が転写ユニットのそれと干渉するのを防ぐために、その配列をフレームシフト変異又はATG開始コドンの変異により、改変することができる。
【００４６】
また、ベクターゲノムは、場合により、スプライスドナー部位（SD）、スプライスアクセプター部位（SA）、及び/又はRREから選択されるエレメントを含んでもよい。
【００４７】
本発明のベクターゲノムを包含し、DNAフラップを含む、レンチウイルスに基づくベクターは、本発明によるものであり、いわゆるTRIPに基づくベクター（TRIP-based vector）である。
【００４８】
本発明のレンチウイルスベクターを調製するために用いられるベクターゲノムの構造及び組成は、当該技術分野において説明される原理に基づき、（Zennou et al, 2000; Firat H. et al, 2002; VandenDriessche T. et al, 2002）に最初に開示された、そのようなレンチウイルスベクターの例に基づく。例えば、pTRIP[delta]U3 CMV-GFPは、1999年10月11日、CNCMに、I-2330の番号で寄託されている（パスツール研究所、25-28 Rue du Docteur Roux, 75724, パリ, Cedex 15, フランス）。また、特許出願WO 99/55892、WO 01/27300、及びWO 01/27304の開示も参照され、これには寄託された生物材料への参照も含まれる。
【００４９】
DNAフラップレンチウイルス由来のヌクレオチド配列は、2つの必須領域、すなわち、cPPT及びCTS領域を含み、cPPT及びCTS領域は、それが含まれるDNAの複製の間、三本鎖DNA構造を誘導する（Zennou et al., Cell, 2000, 101, 173-185；並びに国際特許出願WO99/55892及びWO01/27300において、以前に規定されている）。
【００５０】
特定の実施態様において、DNAフラップは、目的のポリヌクレオチドの上流に挿入される、有利にはベクターゲノムのおよそ中央の位置に置かれるが、これは必須ではない。本発明に適したDNAフラップは、レンチウイルス、特にヒトレンチウイルスより得ることができる。
【００５１】
代替的に、CAEV（ヤギ関節炎脳炎ウイルス）ウイルス、EIAV（ウマ伝染性貧血ウイルス）ウイルス、VISNAウイルス、SIV（サル免疫不全ウイルス）ウイルス、又はFIV（ネコ免疫不全ウイルス）ウイルスから得ることもできる。DNAフラップは、合成的（化学合成）に調製してもよいし、又は上述した適切な供給源から、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により、DNAフラップを提供するDNAの増幅により調製してもよい。より好ましい実施態様において、DNAフラップは、HIVレトロウイルス、例えばHIV-1又はHIV-2ウイルス（これらの２種類の任意の単離株を含む）から得られる。
【００５２】
上で規定したとおり、本発明は、異種プロモーター（すなわち、シス活性配列を提供するレンチウイルスゲノムに由来しないプロモーター）の制御下に置かれ、それにより転写ユニットを提供する、ポリヌクレオチドをさらに含む、組換えレンチウイルスベクターゲノムに関する。プロモーターは、有利には、B細胞応答に有利に働く（favor）ものであってもよい。特定のプロモーターは、配列番号29の配列を有する、サイトメガロウイルス前初期（CMVie）プロモーターである。他のプロモーターは、恒常的（constitutive）プロモーター、組織特異的プロモーター、又は誘導性プロモーターとしての特性に関して、特に選択されてもよい。適切なプロモーターの例には、以下の遺伝子のプロモーターが包含される：EF１α、ヒトPGK、PPI（プレプロインスリン）、チオデキストリン（thiodextrin）、フェリチン（Ferritin）L鎖若しくはフェリチンH鎖、キモシンベータ4、キモシンベータ10、シスタチンリボソームタンパク質（Cystatin Ribosomal Protein）L41、CAG、SV40、又はMND。
【００５３】
したがって、別のより具体的な実施態様において、本発明は、本願明細書に規定する組換えレンチウイルスベクターであって、そのゲノムが、U3領域のプロモーター及び活性化因子が欠失している3’-LTR、及び異種プロモーターの制御下に置かれたprM及びEタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んで、転写ユニットを形成する、組換えレンチウイルスベクターに関する。
【００５４】
このようにして得られたベクターゲノムは、プラスミドベクターを用いて組換えられるか又はそこにクローニングされて、トランスファーベクターとして用いられる。
【００５５】
したがって、特定の実施態様において、本発明は、TRIPに基づくベクターである、組換えレンチウイルストランスファーベクターに関する。
【００５６】
本発明の特定の実施態様において、ゲノムベクターは、本願明細書に開示するpTRIPプラスミドとして適切に提供され、これは、上で規定する、及びIglesias, M.C et al.（J. Gene Med., 2006, 8: 265-274）で規定する、DNAフラップ配列を含むHIV1に基づくベクターである。
【００５７】
本発明の別の特定の実施態様において、ゲノムベクターは、FIVに由来するDNAフラップ配列を含むFIVに基づくベクターである、pTRIPプラスミドとして提供される。
【００５８】
好ましくは、本発明は、JEVのprM及びEタンパク質（全長又は可溶性E、sEのいずれか）コードするポリヌクレオチドがクローニングされている、組換えレンチウイルストランスファーベクターpTRIPΔU3.CMVに関し、また、これを用いて得られる組換えレンチウイルスベクター粒子に関する。
【００５９】
特定の実施態様において、本発明は、その組換えレンチウイルス骨格が、配列番号34に規定される核酸配列を有する、組換えレンチウイルストランスファーベクターpTRIPΔU3.CMV/JEV.prMEベクターに関し、また、これを用いて組換えレンチウイルスベクター粒子に関する。
【００６０】
別の特定の実施態様において、本発明は、その組換えレンチウイルス骨格が、配列番号35に規定される核酸配列を有する、組換えレンチウイルストランスファーベクターpTRIPΔU3.CMV/JEV.prMEΔTMベクターに関し、また、これを用いて組換えレンチウイルスベクター粒子に関する。
【００６１】
特定の実施態様において、本発明の組換えレンチウイルスベクターゲノムの調製に用いられる上述のコンストラクト中、トランスファーベクターのCMVプロモーターが、上の一覧に開示されるプロモーターに置き換えられる。
【００６２】
また、本発明は、本発明の組換えレンチウイルスベクターゲノムを含むDNAプラスミドにも関する。
【００６３】
また、本発明は、本発明の組換えレンチウイルスベクターゲノムを含むDNAプラスミド（トランスファーベクター）でトランスフェクトされたか又は遺伝子的に形質転換された、宿主細胞にも関する。
【００６４】
また、本発明は、本発明の組換えレンチウイルスベクターゲノムと、パッケージングのための及び偽型化（pseudotyping）用のエンベロープの発現のための追加のプラスミドベクターとでトランスフェクトされたか又は遺伝子的に形質転換された、宿主細胞にも関する。
【００６５】
本発明の宿主細胞は、これらのベクターを用いて、当業者に周知の方法、すなわち、化学的トランスフェクション（リン酸カルシウム、リポフェクタミン（lipofectamine））、脂質に基づく手法（リポソーム）、エレクトロポレーション、フォトポレーション等により、トランスフェクトされる。
【００６６】
本願明細書で用いられる場合、用語「トランスフェクトされた」は、本発明の組換えレンチウイルストランスファーベクターを含む細胞（一過性の発現）を指し、一方で用語「遺伝子的に形質転換された（genetically transformed）」は、そのゲノムが本発明のポリヌクレオチドにより確定的に改変された細胞（永続性の発現）を指す。
【００６７】
前記の一過性の又は安定的に形質転換された細胞は、任意の原核生物（細菌）又は真核生物（酵母、昆虫、又は哺乳類、特にヒトを含む動物）の細胞であってよい。一実施態様において、細胞は非ヒト細胞である。特定の実施態様において、本発明の細胞は、単離されたヒト細胞であり、「単離された」とはそれらの自然環境の外を意味する。
【００６８】
本発明の特定の実施態様において、細胞はHEK 293T（ヒト胎児腎臓）細胞株、特にZennou et al.（Cell, 2000, 101, 173-185）に開示されるものである。
【００６９】
本発明によるDNAプラスミドと、異種エンベロープタンパク質、特にインディアナ株のVSV-G、ニュージャージー株のVSV-Gの中から選択されるVSVのエンベロープタンパク質をコードするDNAプラスミドと、並びにレンチウイルスのGAG及びPOLタンパク質をコードするDNAプラスミドとしてのパッケージングコンストラクトとを用いてトランスフェクトされたか又は遺伝子的に形質転換された、レンチウイルスベクター粒子の発現のための産生細胞。POLタンパク質をコードする遺伝子は、変異させて、非組込み型レンチウイルスベクターを調製できるようにしてもよい。
【００７０】
また、本発明は、本願明細書に開示するトランスファーベクター、特にpTRIPΔU3.CMV/JEV.prMEベクター及びpTRIPΔU3.CMV/JEV.prMEΔTMベクターを用いて得られ、かつ周知の方法により生産され、別のウイルスの少なくとも一種のエンベロープタンパク質を用いて偽型化されている、組換えレンチウイルスベクター粒子にも関する。
【００７１】
「組換えレンチウイルスベクター」又は「組換えレンチウイルスベクター粒子」という表現は、トランスファーベクター、選択されたエンベロープタンパク質をコードするエンベロープベクター、及びイントランス（in trans）でレンチウイルスタンパク質を提供する（例えばレンチウイルスのGAG及びPOLタンパク質、特に組込みを避けるために変異させたPOLタンパク質）パッケージングベクターから成るプラスミドベクターにより、周知の方法に従ってトランスフェクションされた後に宿主細胞または産生細胞中で発現される、取得されたウイルス様粒子（VLP）を規定する。
【００７２】
用語「組換えレンチウイルスベクター粒子」は、組換えウイルス粒子及び組換えウイルス様粒子を包含する。
【００７３】
ウイルス様粒子は、組換えレンチウイルスゲノムのカプシド形成（encapsidation）のために存在するタンパク質の、真のウイルス粒子が形成されないような不完全なアセンブリから生じる。
【００７４】
本発明のレンチウイルスベクター粒子は、本発明のレンチウイルスベクターの細胞への形質導入により形成される。これらの粒子は、小胞体由来の酵素（シグナラーゼ）による、prM/Mタンパク質の最後の15アミノ酸のレベルでの、前駆体prM.EのprM及びEへの切断産物、すなわちそのアミノ酸配列が配列番号25に規定される、VVFTILLLLVAPAYSに対応するEタンパク質と非共有結合的に会合されたprM多量体を含む。。
【００７５】
本発明の別の実施態様において、レンチウイルスベクター粒子は、prM及びsEタンパク質を発現する。
【００７６】
Iglesias M.C. et al（2006）において開示されたことに反して、本発明者らは、レンチウイルスベクター粒子によるJEVのEタンパク質の発現が、粒子を受けた宿主において効果的に抗体応答を誘導しないことを観察している。むしろ、本発明者らは、Eタンパク質がprMタンパク質と共発現される場合に有効な抗体応答を得た。prMEΔTMをコードするレンチウイルスベクター粒子を用いて得られた結果と比較すると、prMEタンパク質をコードするレンチウイルスベクター粒子を用いた場合により高い抗体応答が得られた。
【００７７】
前記偽型化エンベロープタンパク質は、野生型ウイルス粒子の表面被覆として機能する膜貫通タンパク質である、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質G（VSV-G）であってよい。また、これは、遺伝子改変（engineered）レンチウイルスベクターの一般的なコートタンパク質でもある。
【００７８】
水疱性口内炎インディアナウイルス（VSV-G IND）及び水疱性口内炎ニュージャージーウイルス（VSV-NJV）は、本発明のレンチウイルスベクターゲノムを偽型化するための好ましいウイルスである。これらのVSV-Gタンパク質は、Genbankに開示されており、複数の株が提示されている。VSV-Gニュージャージー株については、特に、受託番号V01214を有する配列が参照される。Isfahan、VSV-G CV、Cocal等の他の株を代替的に用いることができる。
【００７９】
最も好ましいVSV-Gは、JO2428株に相当する、Genbankにおいて受託番号AAA48370.1を有する、水疱性口内炎インディアナウイルス（VSV-G IND）である。
【００８０】
本発明の別の特定の実施態様によれば、組換えレンチウイルスベクター粒子は、パッケージングコンストラクトを提供するプラスミドベクターに存在するレンチウイルスのpol遺伝子の変異又は欠失の結果として、組込み不全（又は非組込み型）である。組込み不全粒子の形成を可能にする適切な変異は、当該技術分野において周知であり、WO 2009/019612に例示されている。
【００８１】
特定の実施態様において、組換えレンチウイルスベクター粒子は、動物又はヒトのいずれかである哺乳類のJEV感染に対する予防的処置において、有効成分として用いられる。
【００８２】
本願明細書に規定される場合、用語「動物」は、脊椎動物宿主、好ましくは家畜及び飼育動物（farmed animal）を指す。本発明の組換えレンチウイルス粒子を用いた処置のための好ましい動物の候補は、ブタ、特に家畜ブタ、鳥類、特にサギ科の鳥、及びウマである。標的動物の非網羅的な一覧には、非鳥類脊椎動物、家禽、ロバ、ウシ（bovine）を含む畜牛（cattle）、ヒツジ（ovines）、ヤギ（caprines）、ヒツジ（sheep）、ヤギ（goat）、野生の哺乳類、爬虫類、両生類、ニワトリ、カモ・アヒル（duck）、ガチョウ、シチメンチョウ、ウサギ、ハムスター、ラット、及びマウスを含む齧歯類、イヌ及びネコを含むペット等が含まれる。
【００８３】
最も好ましい実施態様において、前記動物は、ブタ又は子ブタ、特に家畜ブタ又は家畜子ブタである。
【００８４】
別の特定の実施態様において、組換えレンチウイルスベクター粒子は、有効成分として用いられ、単回投与又は複数回投与のいずれかとして、JEV prM及び/又はEタンパク質に対する抗体応答、特にJEV prM及び/又はEタンパク質に対する防御抗体応答を誘発するのに適した用量にて投与される。
【００８５】
より具体的には、組換えレンチウイルスベクター粒子は、動物又はヒトのいずれかである哺乳類のJEV感染に対する予防的処置において、有効成分として用いられ、該処置には、プライムブーストレジメンにおける前記組換えレンチウイルスベクターの投与が含まれる。
【００８６】
好ましくは、免疫学的応答をプライムするための前記レンチウイルスベクター粒子及び応答をブーストするためのレンチウイルスベクター粒子は、上記で規定した異なる非交差反応VSV-Gエンベロープタンパク質で偽型化され、特に、インディアナVSV株のVSV-Gタンパク質を用いて、又はニュージャージーVSV株のVSV-Gタンパク質を用いて、偽型化される。
【００８７】
特定の実施態様において、前記組換えレンチウイルスベクター粒子は、遺伝子型G3のJEVによる感染に対する予防的処置において用いられる。
【００８８】
別の実施態様において、前記組換えレンチウイルスベクター粒子は、遺伝子型G1及びG3の、又は遺伝子型G1、G3、及びG5のJEVによる感染に対する予防的処置において用いられる。
【００８９】
特定の実施態様において、本発明の組換えレンチウイルスベクター粒子は、複数のJEV遺伝子型に対する、特にG1及びG3遺伝子型に対する、又はG1、G3、及びG5遺伝子型に対する、中和抗体を誘発する。
【００９０】
本発明の組換えレンチウイルスベクター粒子は、免疫付与のための、特に哺乳動物宿主、特にヒト又は動物宿主のJEV感染に対する予防的免疫付与ための、免疫原性組成物の調製のために用いられる。
【００９１】
特定の実施態様において、本発明の組換えレンチウイルスベクター粒子は、哺乳動物宿主、特にヒト又は動物宿主のJEV感染に対する防御的体液性免疫応答を誘発する、すなわち、JEV感染に対する防御抗体応答を誘発する、特に宿主において中和抗体を誘発する。
【００９２】
明白な理由により、この免疫応答の観察は、ヒトにおいては未だ行われていないが、開示された動物宿主についての結果は、ヒトにおける類似の予想を高く支持している。
【００９３】
したがって、本発明の特定のレンチウイルスベクター粒子は、JEVに対する予防的ワクチン接種の特定の興味深い候補を提供する。
【００９４】
さらなる態様において、本発明は、本発明による組換えレンチウイルスベクター粒子を、免疫抗体応答を誘発するのに十分な用量で含み、付帯的なアジュバントを含むか又は含まない、免疫原性組成物に関する。
【００９５】
「免疫原性組成物」という表現は、少なくとも本発明のレンチウイルスベクター粒子を活性成分として含む組成物であって、宿主、特に哺乳動物宿主、特にヒト又は動物宿主への投与に適している組成物を指す。この組成物は、全身投与又は局所投与に用いられる場合に、さらに医薬的に許容される賦形剤又は担体及び/若しくはビヒクルを含んでいてもよい。「医薬的に許容される担体」は、非毒性で、個体、半固体、又は液体の、充填剤、希釈剤、封入材料、又は任意の従来型の製剤助剤を指す。「医薬的に許容される担体」は、用いられる投与量及び濃度で、受容者に対し非毒性であり、製剤の他の成分と適合する；適した担体には、リン酸緩衝生理食塩水溶液、蒸留水、油/水エマルジョン等のエマルジョン、様々な型の湿潤化剤滅菌溶液等、デキストロース、グリセロール、生理食塩水、及びエタノール、並びにこれらの組合せが含まれるが、これに限定されない。
【００９６】
本発明の好ましい実施態様において、免疫原性組成物は、凍結乾燥形態であり、凍結乾燥は、トレハロース等の凍結保護化合物の存在下で行われる（Bieganski et al. Biotechnol Prog, 1998, 14, 615-620）。
【００９７】
本発明の免疫原性組成物は、免疫応答、すなわち、宿主の免疫系による少なくとも一種の（前記転写ユニットによりコードされる）前記ポリペプチドに対する任意の反応を、特に抗体応答の誘発により、誘発する能力を有する。また、組込み不全の本発明のレンチウイルスベクターは、宿主において抗体を誘発する能力も示している。
【００９８】
本願明細書で規定されるように、免疫応答は、体液性応答、すなわち、レンチウイルスベクターゲノムにより発現される少なくとも一種の前記JEVポリペプチドに対して生産される、前記組成物により誘発される抗体を包含する。特定の実施態様において、前記体液性応答は、防御的体液性応答である。防御的体液性応答は、主に、IgG等の抗原に高い親和性を有する成熟抗体を生じさせる。特定の実施態様において、防御的体液性応答は、中和抗体の生産を誘導する。
【００９９】
本発明の特定の実施態様において、本発明のレンチウイルスベクターゲノムは、インテグラーゼの欠陥にも関わらず、特に抗体応答を誘導するための初期免疫応答を誘発することができる。「初期免疫応答」という表現は、組成物の「ブースト」投与の約1週間以内に付与される、防御的免疫応答（JEV感染に対する防御）を指す。
【０１００】
別の実施態様において、本発明の組成物により付与される免疫応答は、長期持続免疫応答である、すなわち前記免疫応答は、組成物の投与後少なくとも2ヶ月、好ましくは少なくとも3ヶ月、最も好ましくは少なくとも6ヶ月で、依然として検出することができる。免疫応答が体液性の場合、長期持続応答を、ELISA、免疫蛍光（IFA）、フォーカス減少中和試験（focus reduction neutralization tests）（FRNT）、免疫沈降、又はウエスタンブロッティング等の任意の適切な方法によって、特異的抗体の検出により示すことができる。
【０１０１】
別の実施態様において、上記の実施態様とは独立して、本発明の組成物により付与される免疫応答の強度は、レンチウイルスベクターの注入量に依存する。
【０１０２】
興味深いことに、前記免疫応答、すなわち初期免疫応答及び/又は長期持続免疫応答は、本発明の組成物の単回プライムブースト投与後に、非組込み型遺伝子トランスファーベクターにより誘発される。
【０１０３】
また、本発明は、規定したJEVタンパク質を発現する、本発明による組換えレンチウイルスベクター粒子を含み、付帯的なアジュバントを含むか又は含まない、ワクチン組成物にも関する。
【０１０４】
本発明の組成物（特に本願明細書で規定する組換えレンチウイルスベクターゲノム又は本発明の組換えレンチウイルスベクター粒子）は、免疫付与した宿主をJEVを用いて抗原投与（challenge）した後、本発明の組成物の投与によって防御しようとしている前記JEVの感染後に通常誘発される症状を遅延及び/又は軽減させることができる場合、又は特にJEV感染が遅延される場合、JEV感染に対する防御能力を有すると考えられる。
【０１０５】
本発明の特定の実施態様によれば、免疫原性組成物は、皮下（s.c.）、皮内（i.d.）、筋肉内（i.m.）、腹腔内（i.p.）、又は静脈内（i.v.）注入等の非経口経路による投与用に製剤化されている。
【０１０６】
最も好ましい投与は、筋肉内（i.m.）注入である。
【０１０７】
本発明の別の特定の実施態様によれば、免疫原性組成物は、一回又は複数回の投与、特にプライムブースト投与レジメンにおける投与用に製剤化されている。
【０１０８】
本願明細書で用いられる場合、用語「プライムブーストレジメン」は、免疫応答を誘発する第一の投与工程、及び、該免疫反応をブーストする一つ以上の後の投与工程を包含する。
【０１０９】
したがって、効率的なプライムブースト系を反復投与に用ることができ、これにより引き続いて宿主中での免疫応答のプライミング及びブースティングが、特にそれを必要とする宿主への注入後に、可能になる。「反復」は、活性成分、すなわち本発明の組換えレンチウイルス粒子が、宿主に2回以上投与されることを意味する。プライミング及びブースティング免疫付与は、異なった用量又は同一の用量で、宿主に投与することができ、注入は、複数週間の間隔をおいて、特に4週間以上の間隔をおいて、投与することができる。
【０１１０】
特定の実施態様において、免疫原性組成物は、付帯的なアジュバントを含まない。
【０１１１】
投与する用量（投与量）は、患者の状態、個体の免疫系の状態、投与経路、及び宿主の大きさを含む、処置する対象に依存する。適した投与量は、103 TU（転写単位）〜107 TUの範囲であり、状況に応じて、当業者が変更することができる。
【０１１２】
好ましくは、免疫原性組成物は、一回の投与用量で投与され、0.5 ng〜5000 ng、好ましくは0.5 ng〜50 ng、より好ましくは50〜500 ngに等しい、本発明の組換えレンチウイルスベクター粒子の用量を含む。
【０１１３】
また、本発明は、特にJEVが遺伝子型3又は1又は5のものの場合、哺乳動物宿主において、特にヒト又は動物宿主において、JEV感染に対する予防的免疫付与において使用するための、免疫学的に有効な量の本発明による組換えレンチウイルスベクター粒子、又は本発明による免疫原性組成物、又は本発明によるワクチン組成物にも関し、前記粒子又は組成物は、医薬的に許容されるビヒクル、及び/又はアジュバントと混合されている。
【０１１４】
また、本発明は、医薬的に有効な量の本発明による組換えレンチウイルスベクター粒子、又は本発明による免疫原性組成物、又は本発明によるワクチン組成物を投与することを含む、哺乳動物宿主において、特にヒト又は動物宿主において、JEV感染に対して防御するための方法にも関し、前記粒子又は組成物は、医薬的に許容されるビヒクル、及び/又はアジュバントと混合されている。
【０１１５】
本願明細書で用いられる場合、「JEV感染に対して防御する」という表現は、特に感染に伴うか又はその後に続く症状が軽減、遅延、又は緩和される場合、又は感染ウイルスが宿主から除去される場合の、日本脳炎ウイルス感染が妨害されるか又は遅延される方法を指す。
【０１１６】
本願明細書で規定されるように、「医薬的に許容されるビヒクル」は、本発明の組換えレンチウイルスベクターを組成物中に製剤化することができる、任意の物質を包含する。ビヒクルは、生理学的に許容される、すなわち、宿主、特にヒトに接触する組成物の用途に適しており、したがって非毒性である、任意の物質又は物質の組合せである。そのようなビヒクルの例は、リン酸緩衝生理食塩水溶液、蒸留水、油/水エマルジョン等のエマルジョン、様々な型の湿潤化剤滅菌溶液等である。また、免疫原性組成物が凍結乾燥形態である場合、そのようなビヒクルには、トレハロース等の凍結保護化合物も含まれる。
【０１１７】
本願明細書で規定されるように、「アジュバント」は、例えば、リポソーム、油相、例えばフロイント（Freund）タイプのアジュバントを含み、これらは通常、水相を有するエマルジョンの形態で用いられ、又はアジュバントは、水不溶性の無機塩、例えば水酸化アルミニウム、硫酸亜鉛、コロイド状水酸化鉄、リン酸カルシウム、又は塩化カルシウムを含むことができる。
【０１１８】
また、本発明は、
a）宿主細胞、例えばHEK-293T細胞株において、本発明によるレンチウイルスベクターゲノムを保有する組換えレンチウイルストランスファーベクターをトランスフェクトする工程；
b）工程a）の細胞を、エンベロープタンパク質VSG、特にインディアナ又はニュージャージーVSV株のVSV-Gをコードするプラスミドベクターと、パッケージングコンストラクトとして、レンチウイルスGAG及びPOL又は変異POLタンパク質をコードするプラスミドベクターとでコトランスフェクトする工程；
c）JEV抗原を発現する組換えレンチウイルス粒子を回収する工程
を含むか又はこれらから成る、JEVワクチンの調製に適した組換えレンチウイルスベクター粒子を生産する方法にも関する。
【０１１９】
また、本発明は、本発明の組換えレンチウイルスベクターゲノム又は本発明の組換えレンチウイルスベクター粒子の、免疫原性組成物又はワクチン組成物のインビトロ生産のための有効成分としての使用にも関する。
【０１２０】
本発明の他の特徴及び利点は、続く実施例から明らかであるし、また図面にも例示される。
【実施例】
【０１２１】
「材料と方法」
［細胞及び抗体］
ヒトスジシマカ（Aedes albopictus）蚊のC6/36細胞を28℃で、10%熱不活性化ウシ胎児血清（FBS）を補ったLeibovitz培地（L15）中に維持した。アフリカミドリザル腎臓由来のベロ細胞を、37℃で、5%FBSを補ったダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中に維持した。ヒト神経芽細胞腫由来のSK-N-SH、及びヒト腎臓由来のHEK-293T細胞を、10% FBSを補ったDMEM中に維持した。
【０１２２】
高度に精製した抗panフラビウイルスEモノクローナル抗体（mAb）4G2は、RD Biotech（ブサンソン、フランス）により生産された。マウスmAb抗JEV NS5は、以前に記述されている（Katoh et al. 2011）。カルネキシンに対する抗体及びSNAP-tag（登録商標）は、Enzo Life Sciences及びNew England Biolabsよりそれぞれ購入した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）コンジュゲート化ヤギ抗マウスIgG及び抗ウサギIgG抗体は、Bio-Rad Laboratoriesより入手した。HRPコンジュゲート化ヤギ抗ブタ抗体は、Bethyl Laboratoriesより入手した。Alexa Fluor 488（登録商標）コンジュゲート化ヤギ抗マウスIgG抗体は、Jackson ImmunoResearchより入手した。
【０１２３】
［生キメラJEVの作製］
本試験に用いたJEV G3 RP-9株（Chen et al., 1996; Lin et al., 1996）の分子クローン、pBR322（CMV）-JEV-RP-9は、以前に記述されている（Liang et al. 2009）。JEV G3 Nakayama株は、National Collection of Pathogenic Viruses（NCPV、ソールズベリー、英国）より入手し、ベロ細胞で2回継代した。キメラ生JEVの作製のためのプラスミドの構築は、別の項で詳細に記述する。手短に言えば、2208-2213の位置（ウイルスポリタンパク質の705及び706の残基）に固有の制限制限酵素認識部位（Afl II）を作るサイレント変異をpBR322（CMV）-JEV-RP-9にPCR突然変異導入（mutagenesis）により直接導入した。生じたpBR322（CMV）-JEV-RP-9（Afl II）プラスミドを、キメラJEVを作製するための鋳型として使用した。114〜2213のヌクレオチドに対応し、固有の部位Apa I及びAfl IIを両端に有する（flanked）断片を、JEV G1 CNS769_Laos_2009株（Genbankアクセス番号KC196115）の、JEV cDNAから切り出した115-2214領域に対応する（Aubry et al. 2013）断片、又はJEV G5 XZ0934株（Genbankアクセス番号JF915894）（Li et al. 2011）の、合成遺伝子から取得した114-2213領域に対応する（Genecust）断片のいずれかで置換した。生じたプラスミドは、JEV G3の骨格を有し、構造領域がJEV G1又はG5に由来する対応部分に置き換えられている。生JEVを生産するために、組換え分子クローンpBR322（CMV）-JEV-G1/3及びpBR322（CMV）-JEV-G5/3を、Lipofectamine 2000（Life Technologies）を用いてHEK-293T細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション後、3日目に、ウイルス上清を回収して、C6/36細胞を感染させるために使用し、キメラJEV G1/3及びJEV G5/3の最終ストックを培養した。これらの配列は、ウイルスRNAの抽出、その後の逆転写PCR及びシーケンシングにより確認した。
【０１２４】
［組換えレンチウイルスベクターの作製］
JEVタンパク質を発現する組換えレンチウイルスベクターの構築のために、prM及びE遺伝子の哺乳類細胞での発現を最適化する改変を、JEV G3のRP-9株の元の配列に対して、合成遺伝子（Genecust）を用いて行った。哺乳類コドン最適化された、prM及びE糖タンパク質を後に伴うprMシグナルペプチドをコードする配列を、pTRIPΔU3CMVプラスミドのBamH1及びXho1制限酵素認識部位にクローニングして、pTRIPΔU3CMV/JEVprMEを作製した。最適化された配列を、さらに突然変異導入PCRにより改変して、prMと2つの膜貫通ドメインを欠いているE（EΔTM）とをコードする遺伝子を含有する、TRIPΔU3CMV/JEVprMEΔTMを作製した。
【０１２５】
レンチウイルス粒子を、以前に記述している（Zennou et al., 2000）とおり、293T細胞の一過性カルシウムコトランスフェクションにより生産したが、以下の改変を伴う：トランスフェクションの24時間後、細胞培養培地を血清非含有DMEM（Dulbecco）と置き換えた。上清をトランスフェクションの48時間後に回収し、数回の低速遠心分離により清澄化し、-20℃で保管した。組換えレンチウイルスベクターを、インディアナ（IND）又はニュージャージー（NJ）の血清型のVSV-Gエンベロープタンパク質（Beignon et al., 2009）で偽型化した。生じたベクターTRIP/JEV.prME及びTRIP/JEV.prMEΔTMにおいて、CMV前初期プロモーター（CMVie）が、組換えJEVタンパク質の恒常発現を作動させる。TRIP/JEVベクターストックを、リアルタイムPCRにより、形質導入した293T細胞由来の細胞ライセートにおいて、力価測定し、形質導入単位（TU）/mlとして表現した（Iglesias et al., 2006）。IND又はNJ VSV.Gエンベロープタンパク質を保有する非濃縮TRIP/JEV.prMベクターの力価は、それぞれ6.69 106 TU/ml及び1.78 106 TU/mlであった。IND又はNJ VSV.Gエンベロープタンパク質を保有するTRIP/JEV.prMEΔTMベクターの力価は、それぞれ1.26 107 TU/ml及び1.76 106 TU/mlであった。ワクチンストックを、PBSでの希釈により調整し、更なる濃縮を行うことなくマウス又はブタに接種した。
【０１２６】
［ウイルス力価を測定するためのフォーカス免疫アッセイ（focus immuno assay）］
ベロ細胞を、24ウェルプレートに播種した。ウイルスサンプルの10倍希釈液を、DMEMで2組調製し、各希釈液の200 μlを、細胞に加えた。プレートを、1時間、37℃でインキュベートした。未吸着ウイルスを取り除き、その後1 mlの、1.6%カルボキシメチルセルロース（CMC）、10 mM HEPESバッファー、72 mM重炭酸ナトリウム、及び2% FBSを補ったDMEMを各ウェルに加え、その後37℃で2日間インキュベートした。CMCの上層を吸引し、細胞をPBSで洗浄し、4%パラホルムアルデヒドで15分間固定し、その後0.1% Triton-X100で5分間透過処理した。固定後、細胞をPBSで洗浄し、1時間室温で抗E mAb 4G2と共にインキュベート、その後HRPコンジュゲート化抗マウスIgG抗体と共にインキュベートした。プレートをVector（登録商標）VIPペルオキシダーゼ基質キット（Vector Laboratories）により、メーカーの取扱説明書に従って現像した。
【０１２７】
［JEV抗原の生産］
大型フラスコのベロ細胞単層に、低感染多重度のJEVを接種したか、又はモック感染させた。JEVに感染した細胞（JEV抗原）又はモック感染した細胞（正常細胞抗原、すなわちNCA）の上清液を回収し清澄化した。
【０１２８】
上清を、7% w/v PEG 6,000（Fluka）で沈殿させ、遠心分離し、JEV不活性化のためにウイルスペレットを0.1 M Sorensenバッファー（pH 9.0）中0.1% β-プロピオラクトンを補った冷PBS中に懸濁した。不活性化JEV抗原の実際の（working）希釈（1:200）は、十分に特性評価されたヒト陽性JEV血清サンプル及び既にバリデーション済のJEV抗原を用いた、<<内部の（in-house）>>間接ELISAに基づいて推定した。
【０１２９】
組換えJEV VLPの精製のために、TRIP/JEVを形質導入した細胞由来の上清を3,000gで、5分間、4℃でスクロースクッション（15%スクロース、10 mM Tris-HCl [pH 7.5]、2.5 mM EDTA、50 mM NaCl中）にロードして遠心分離することにより清澄化し、その後100,000 gで、2.5時間、4℃で遠心分離した。遠心分離後、ペレットを50 μlの冷TNEバッファーに懸濁し、イムノブロットアッセイにより分析した。
【０１３０】
DES（登録商標）発現系（Life Technologies）が、Drosophila S2細胞での組換えウイルス抗原の生産のために必要であった。JEV G3のSA-14株（Genbankアクセス番号M55506）由来の、EΔTMを後に伴うprMをコードする合成遺伝子を、派生pMT/BiP/V5-Hisベクター（Life Technologies）であって、SNAPタグ配列（Covalys BioSciences AG）を昆虫BiPシグナルペプチドと共にインフレームで挿入したもの（未発表データ）である、シャトルプラスミドベクターpMT/BiP/SNAPにクローニングした。生じたプラスミドpMT/BiP/JEV.prMEΔTM-SNAPは、SNAPタグ（登録商標）のN末端と融合した、EΔTMを後に伴うprMをコードする。G1のJEV JaNAr0102/Japan/2002/Mosquito株（Genbankアクセス番号AY377577）、G3のJEV GP05株（Genbankアクセス番号FJ979830）、及びG5のJEV 10-1827株（Genbankアクセス番号JN587258）のEタンパク質ドメインIII（EDIII）をコードする合成遺伝子を、プラスミドpMT/BiP/SNAP中のSNAPタグのC末端にインフレームで融合した。生じたプラスミドpMT/BiP/JEV.prMEΔTM-SNAP及びpMT/BiP/SNAP-JEV.EDIIIを、メーカーの取扱説明書（Life Technologies）に従って、S2細胞へトランスフェクトし、G1、G3、及びG5についての安定な細胞株S2/JEV.prMEΔTM-SNAP及びS2/SNAP-JEV.EDIIIを確立した。S2/JEV.prMEΔTM-SNAP及びS2/SNAP-JEV.EDIII細胞株のカドミウム誘導の10日後、分泌された可溶性Hisタグ付キメラタンパク質を、キレート化カラムクロマトグラフィー、その後Superdexカラムで精製した。精製されたキメラタンパク質EΔTM-SNAPタンパク質及びSNAP-JEV.EDIIIタンパク質のタンパク質推定（protein estimation）を、BCAタンパク質アッセイキット（Thermo Scientific）を用いて決定した。組換えSNAPタンパク質は、ネガティブ抗原コントロールの役割を果たした。
【０１３１】
［ウイルスタンパク質の免疫検出（immunodetection）］
イムノブロットアッセイのために、タンパク質サンプルをNuPAGE（登録商標）Bis-Tris 4-12%ゲル（Life Technologies）にアプライし、その後、PDVFメンブレンにエレクトロブロッティングした。タンパク質を、適切な希釈の一次モノクローナル抗体又はマウスポリクローナル免疫血清でプローブした。PBS-Tween中での洗浄後、メンブレンをHRPコンジュゲート化二次抗体と共にインキュベートした。反応を、PierceTM ECL Western Blotting Substrate（Thermo Scientific）を用いて検出した。
【０１３２】
免疫蛍光アッセイのために、細胞をPBS中3.2%パラホルムアルデヒドで固定し、PBS中0.1% Triton X-100で透過処理した。JEV Eタンパク質を、mAb 4G2で検出し、その後AlexaFluor488コンジュゲート化二次抗体と共にインキュベートした。カバーガラスをProLong（登録商標）DAPI含有Gold Antifade Reagent（Life Technologies）と共に載せた。スライドを、蛍光顕微鏡（Axioplan 2 Imaging, Zeiss）を用いて試験した。
【０１３３】
［マウスの免疫付与及び抗原投与］
6週齢の雌Balb/cマウスを、パスツール研究所動物施設の無病原体（pathogen-free）条件下で飼育した。プロトコル及びそれに続く試験は、パスツール研究所のEthic Committee for Control of Experiments on Animals（CETEA）にて、倫理的に承認され、フランスの規則に従って、高等教育・研究省（Ministere de l’Enseignement Superieur et de la Recherche）に申告された（第000762.1号）。
【０１３４】
試験は、パスツール研究所のOffice Laboratory of Animal Careのガイドラインに従って行われた。マウスの群に、0.2%エンドトキシンフリー血清アルブミンを補った0.1 ml DPBS中の組換えレンチウイルスベクターを、腹腔内（i.p.）接種した。免疫付与したマウスを、後眼窩静脈叢レベルで穿刺することにより採血した。組換えレンチウイルスベクターを接種した各マウスの群内で、非常に低い個体変動が存在し、このことは、続く試験におけるプール血清の使用の妥当性を示す（Iglesias et al., 2006）。受動的抗体保有率試験（passive seroprotection experiments）のために、プール免疫血清を、3週齢のC57/Bl6マウスに、腹腔内経路によるJEV RP-9株を用いた抗原投与の一日前に、腹腔内移行した。抗原投与されたマウスを、有病及び死亡の兆候についてモニタリングした。ウイルス性脳炎の症状を示す動物に対して、安楽死が適用された。
【０１３５】
［de Wispelaere et al., PLOS Negl. Trop. Dis. 2015に記述された、子ブタの免疫付与及び抗原投与］
ブタ試験は、Swiss Animal Welfare Regulations（Veterinary Service of LANAT）のガイドラインに従って行った。
【０１３６】
内部で繁殖させた、7週齢の特定病原体を含まないスイスランドレース（Swiss Land Race）子ブタの群を集団で飼育し、試験を開始する前に、1週間の新しい環境への適応期間が与えられた。
【０１３７】
免疫付与のために、TRIP/JEV.prMEレンチウイルスベクターを、最終液量の0.5 mlまで、PBS（Life Technologies）で希釈した。TRIP/GFPレンチウイルスベクターを用いた免疫付与を、ネガティブコントロールとして用いた（Iglesias et al., 2006）。5頭の子ブタの群から、4頭に、様々な用量のTRIP/JEV.prMEベクターを筋肉注射でワクチン接種し、1頭に、同等の用量の対照レンチウイルスベクターTRIP/GFPを注射した。免疫付与した動物を、最初のワクチン接種の前、及びその後は試験の終了まで週1回、採血した。最初のワクチン接種の4週間後、全ての動物に、最初の時点と同一の用量の組換えレンチウイルスベクターを用いてブースターワクチン接種を行った。倫理的理由から、ブタでの防御として致死的抗原投与は行わなかった。対照として、3頭の動物に、口鼻経路により7 log10TCID50の生JEV Nakayama G3を接種した。全てのブタが、一時的な発熱及びウイルス血症を発症し、4〜6日後に完全に回復した。動物の血清を、抗JEV抗体について週1回試験した。
【０１３８】
［間接ELISA及び中和試験による抗体の検出］
間接ELISAにより、免疫付与したマウス及び子ブタ中の抗JEV IgGの生産を測定した。96ウェルELISAプレート（Nunc）を、PBSで1 μg.mL-1の濃度に希釈した0.1 mlの不活性化天然JEV抗原及び高度に精製した組換えJEV抗原で、4℃で一晩被覆した。NCA及びSNAPは、ネガティブ対照抗原の役割を果たした。洗浄後、プレートを、1:100希釈から開始する2倍段階希釈のプール血清サンプルと共にインキュベートし、その後、1:10,000希釈のHRPコンジュゲート化抗マウスIgG抗体と共にインキュベートした。TMB基質の添加後、450 nmで吸光度を測定した。免疫付与したマウス又は子ブタの各群のImmune Status Ratio（ISR）を、JEV抗原OD450値の平均を平均対照抗原OD450値で除することにより得る。マウス血清中の抗JEV抗体の終点力価を、ISR値> 3.0を有する最後の血清の希釈の逆数として計算した。ブタ血清は、マウスについて記述したとおりに試験し、HRPコンジュゲート化ヤギ抗ブタ抗体を二次抗体として用いた。事前免疫付与で得られたブタ血清を、ネガティブコントロールとして用いた。間接ELISAは、de Wispelaere et al, J. Virol. 2015に記述されるとおりに行った。
【０１３９】
マウス及びブタの血清抗体のJEVに対する中和能力を、ベロ細胞でのフォーカス減少中和試験（FRNT）又はプラーク（PRNT）減少中和試験により、それぞれ決定した。各群からのマウス血清サンプルをプールした。ブタ血清は、1:5血清希釈から開始して、個別に三重で試験した。プールしたマウス血清サンプル又は個別のブタ血清サンプルを、2%FBSを補ったDMEMで、1:10の開始希釈で、2倍段階希釈を行い、100 FFUのJEVを含有する等量のウイルス懸濁液と共に、2時間、37℃でインキュベートした。残存する感染力を、ベロ細胞単層上でFFAによりアッセイした（上記参照）。終点力価を、FFUの数を50%（FRNT50）又はPFUを50%（PRNT50）減少させた、試験した最高血清希釈の逆数として計算した。
【０１４０】
［統計解析］
群間の統計学的比較は、一元配置分散分析（one way ANOVA）により、MacOSX用GraphPad Prismバージョン6.0a（GraphPad Software Inc.、ラホヤ、カリフォルニア、米国）を用いて解析した。0.05未満のP値を統計学的に有意とみなした。
【０１４１】
ログランク（Log-rank）（マンテル・コックス（Mantel-Cox））検定を用いて、生存率データを比較した。免疫付与したブタの群間の抗体レベルを、マン・ホイットニー（Mann Whitney）のU検定を用いて比較し、有意水準を5%に設定した。GraphPad Prism（登録商標）（GrapPad Software Inc.、ラホヤ、カリフォルニア、米国）を全ての統計解析に用いた。
【０１４２】
［JEVレプリコン細胞株］
JEV-RP9レプリコンプラスミド、J-R2A（Chien H-L, et al. 2011. J Virol 85:4698-4706）を、デルタ肝炎ウイルスリボザイムが、JEV-RP9 3’末端のすぐ隣に位置し、かつその後にシミアンウイルス40（SV40）のポリ（A）配列が続くように改変した。このようにするために、pBR322（CMV）-JEV-RP9プラスミド中の対応する配列をNsiI及びClaIでの切断（digestion）により切り出し、同様に処理したJ-R2Aにクローニングした。次に、プラスミドを改変してSP6プロモーターを誘導性PTRE3Gプロモーター（Clontech）と置き換えた。PTRE3Gプロモーターは、pTRE3Gベクター（Clontech、カタログ番号631173）より、5’-ctcgagtttactccctatcagtga-3’（配列番号36、XhoI部位に下線を付してある）及び5’-tcacacagataaacttctcggttcactaaacgagct-3’（配列番号37、JEV-RP9ヌクレオチド1〜18に下線を付してある）のプライマーを用いて増幅した。JEV-RP9ゲノムのヌクレオチド1〜249を、5’-agctcgtttagtgaaccgagaagtttatctgtgtga-3’（配列番号38、PTRE3Gプロモーターヌクレオチド291〜308に下線を付してある）及び5’-tgataagagccagcacgaatcg-3’（配列番号39）のプライマーを用いて増幅した。プライマーは、両方の断片が36ヌクレオチドの配列相同性を共有するように設計した。これらの最初の2つの断片を用いた二回目のPCRにより、JEV-RP9のヌクレオチド1〜249に融合したPTRE3Gプロモーターから構成される断片を増幅することができた。この断片を、XhoI及びApaIで切断し、SalI及びApaIで処理したJ-R2Aプラスミドにクローニングした。生じたpTRE3G-JEV-RP9.レプリコンプラスミドを、Stbl2細胞（Life Technologies、カタログ番号10268-019）で増幅した。HEK293T細胞を、pTRE3G-JEV-RP9.レプリコンとpTK-Hyg選択ベクター（Clontech、カタログ番号631750）とでコトランスフェクトし、安定した細胞を、50 μg/mlのハイグロマイシンを用いて選抜した。
【０１４３】
JEVレプリコンの発現を、Tet-ExpressTM系（Clontech、カタログ番号631177）を用いて、メーカーの取扱説明書に従って誘導した。誘導の１時間後、誘導因子を含有する培地を取り除き、2% FBSを補ったDMEMを細胞に加えた。誘導後の表示した時間に、細胞を回収し、指示に従って、ウミシイタケルシフェラーゼアッセイ系（Promega、カタログ番号E2820）中でサンプルを処理した。ルシフェラーゼシグナルを、Centro XS3 LB960（Berthold Technologies）プレートリーダーを使用して読み取った。
【０１４４】
［レポーターウイルス粒子（RVP）］
JEV-RP9の構造遺伝子を含む断片を、5’-gaagatctatgactaaaaaaccaggagggcccggt-3’（配列番号40、BglII部位に下線を付してある）及び5’-ttctgcagtcaagcatgcacattggtcgctaaga-3’（配列番号41、PstI部位に下線を付してある）のプライマーを用いて増幅した。断片を、BglII及びPstIで切断し、同様に処理したpTRE3Gベクター（Clontech、カタログ番号631173）にクローニングした。生じたpTRE3G-JEV-RP9.CprMEプラスミドを、Stbl2細胞（Life Technologies、カタログ番号10268-019）で増幅した。JEV-XZ0934構造遺伝子を含むpTRE3G-JEV-XZ0934.CprMEプラスミドは、pTRE3G-JEV-RP9.CprMEプラスミドと同様に設計し、GeneCustにより合成した。
【０１４５】
JEV g3又はJEV g5 RVPを生産するために、HEK293T-JEV-RP9.レプリコン細胞を10-cmディッシュに設置し、その後、Lipofectamine 2000（Life Technologies、カタログ番号11668-019）をメーカーの取扱説明書に従って用いて、pTRE3G-JEV-RP9.CprME又はpTRE3G-JEV-XZ0934.CprMEでそれぞれトランスフェクトした。JEVレプリコン及び構造遺伝子の発現を、Tet-ExpressTM系（Clontech、カタログ番号631177）をメーカーの取扱説明書に従って用いて、誘導した。RVPを含む上清を、誘導の48時間後に回収し、5分間、1,000 gでの遠心分離によって清澄化し、分注物（アリコート）を-80℃で保存した。
【０１４６】
RVP精製のために、清澄化した上清を、スクロースクッション（15%スクロース、TNE（10 mM Tris-HCl [pH 7.5]、2.5 mM EDTA、50 mM NaCl）中）にロードし、100,000gで、2.5時間、4℃で遠心分離した。上清を廃棄し、精製したRVPをTNEバッファーに懸濁した。
【０１４７】
感染力アッセイのために、BHK21細胞を24ウェル又は96ウェル組織培養プレートの2% FBSを補ったDMEM中に播種した。続いて、精製したRVP又はRVPを含有する上清の一部を細胞に加え、プレートを1時間、37℃でインキュベートした。未吸着のRVPを取り除き、その後2% FBSを補ったDMEMを細胞に加え、その後37℃でインキュベートした。感染の24時間後、ウミシイタケルシフェラーゼアッセイ系（24ウェルフォーマット、Promega、カタログ番号E2820）又はRenilla-Glo（登録商標）Luciferase Assay System（96ウェルフォーマット、Promega、カタログ番号E2720）中で、メーカーの取扱説明書に従って、サンプルを処理した。ウミシイタケルシフェラーゼシグナルを、Centro XS3 LB960（Berthold Technologies）プレートリーダーを使用して読み取った。
【０１４８】
「結果」
［TRIP/JEVベクターの作製］
本発明者らは、以前、西ナイルE糖タンパク質の可溶性形態を発現する非複製レンチウイルスベクターによる単回免疫付与が、WNV脳炎のマウスモデルにおいて頑強な防御的体液性応答を誘導したことを報告している（Iglesias et al., 2006、Coutant et al., 2008）。JEV由来のエンベロープタンパク質を発現するレンチウイルスベクターの、JEV感染に対して防御することができる体液性応答を誘発する潜在能力を評価するために、コドン最適化した、G3のJEV prM及びEをコードする遺伝子を、レンチウイルスTRIPベクターに挿入した（図1）。本発明者らは、膜タンパク質prM及び天然の又は2つのC末端膜貫通ドメインを欠いた（prMEΔTM）エンベロープ糖タンパク質E（prME）がその後に続くprMシグナルぺプチドを発現する、TRIP/JEV.prME及びTRIP/JEV.prMEΔTMレンチウイルスベクターを作製した。これらのコンストラクトにおいて、prMは、糖タンパク質Eの折り畳み、安定性、及び効率的な分泌に寄与する。
【０１４９】
JEVタンパク質を発現したレンチウイルスベクターを、インディアナ血清型のVSV-Gタンパク質で偽型化した。非複製TRIP/JEV.prME及びTRIP/JEV.prMEΔTM粒子は、HEK-293T細胞で生産され、それぞれmlあたり6.8及び7.1 log10 TUの力価を達成した。
【０１５０】
組換えJEVタンパク質の抗原性を、HEK-293T細胞をTRIP/JEV.prME又はTRIP/JEV.prMEΔTMベクターで形質導入することにより評価した。TRIP/GFPベクターは、対照の役割を果たした。形質導入の48時間後、本発明者らは、免疫蛍光アッセイによりE細胞内発現を解析し、prME又はprMEΔTMを発現する、TRIP/JEVを形質導入した細胞において、同様の染色パターンを観察した（図2A）。マウス抗JEV抗血清を用いたイムノブロットアッセイ（図2B）により、TRIP/JEVベクターで形質導入したHEK-293T細胞由来のRIPAライセート中に、細胞内組換えprM及びEを検出した。どちらの組換えJEVタンパク質も、TRIP/JEVベクターで形質導入したHEK-293T細胞の上清中に見出されたが、TRIP/JEV.prMEベクターのみが効率的にprMを分泌し、このことは、可溶性形態のEの発現により、prMの細胞内コンパートメントへの放出が妨げられている可能性があることを示唆している（図2C、上）。JEV prM及びEはVLPへと自己アセンブル（self-assemble）する能力を有しているので、本発明者らは、TRIP/JEVベクターで導入した293T細胞からVLPが分泌されているか、スクロースクッションを用いた細胞上清の超遠心分離により評価することにした。ペレットを、抗E mAb 4G2及び抗JEV血清を用いて、イムノブロットアッセイで解析した（図2C、下）。prM及びEを含有する細胞外JEV VLPは、TRIP/JEV.prMEベクターで形質導入した293T細胞の上清に蓄積したが、TRIP/JEV.prMEΔTMベクターではしなかった。
【０１５１】
TRIP/JEV.prMEΔTMベクターは、prMの放出及びVLPの形成の効率が悪かったことから、EのC末端領域の欠失により、安定なprME複合体の形成が妨げられているようである。全体では、これらの結果は、TRIP/JEV.prMEベクターによる細胞の形質導入が、組換えJEV VLPの効率的な分泌をもたらすことを示している。
【０１５２】
［マウスでのTRIP/JEVベクター免疫付与によるJEV特異的抗体の誘導］
レンチウイルスTRIP/JEVベクターにより誘導される体液性応答を評価するために、成体Balb/cマウスに、TRIP/JEV.prME又はTRIP/JEV.prMEΔTMを、用量を増加させながら（動物あたり3〜5 log10TU）腹腔内経路により接種した。免疫付与の21日後、各マウスの群から血清を回収した。プール血清を、抗JEV IgGの存在に関して、不活性化JEV粒子を被覆ウイルス抗原として用いて、間接ELISAにより試験した（表1）。NCAは、対照抗原の役割を果たした。動物あたり5 log TU未満のTRIP/JEベクター用量では、JEVに対する抗体応答はほとんど無かった。5 log10TUの用量は、抗JEV特異的抗体の有意な生産を誘導し、平均力価は、TRIP/JEV.prMEについては1,600、TRIP/JEV.prMEΔTMについては400に達した（表1、上のパネル）。マウスに接種した最高用量（6 log TU）では、TRIP/JEV.prME抗体の平均力価は、10,000に達した。後者の用量は、腹腔内経路によりマウスに接種される未濃縮TRIP/JEベクターの液量が多すぎることから、これ以降は用いられなかった。したがって、本発明者らは、続いてのマウス免疫付与には、5 log10TUの固有用量を選択することにした。抗JEV生産の経時変化を決定するために、5 log TUのTRIP/JEV.prME又はTRIP/JEV.prMEΔTMを受けたBalb/cマウスを、免疫付与の7日後、14日後、及び21日後に採血した（表1、下のパネル）。抗JEV抗体は、免疫付与の14日目に検出でき、21日目に有意な力価に達した。
【０１５３】
【表１】
2017538417.tif 000003
【０１５４】
抗JEV特異的抗体の生産を強化するために、免疫付与したマウスに、5 log10TUの、異なるVSV株（ニュージャージー）のVSV-Gエンベロープタンパク質を保有する組換えTRIP/JEVベクターのブースター投与を、最初の接種の4週間後に受けさせた。免疫血清を、ブースト接種の3週間後に回収し、ELISA測定は、抗JEV抗体力価の40倍の増加を示した。抗JEV IgGの生産は、TRIP/JEV.prMEについては64,000、TRIP/JEV.prMEΔTMについては16,000の平均力価に達した。
【０１５５】
TRIP/JEV.prMEを受けたマウスは、prM及びEに対する特異的抗体を呈した（図3）。対照的に、TRIP/JEV.prMEΔTMを接種したマウス由来の血清は、抗E抗体のみを含んでおり、これはおそらく形質導入された細胞の細胞内コンパートメント内でのprMの滞留に起因する。
【０１５６】
TRIP/JEV.prMEΔTM又はTRIP/JEV.prMEの2回の投与を受けたBalb/cマウスは、約1,000という類似の範囲の抗E抗体力価を誘発した（表2）。本発明者らは、次に、免疫血清が、異なるJEV遺伝子型由来のEタンパク質とも反応するかを評価した。フラビウイルスEDIIIは、ビリオン表面でアクセス可能であり、サブタイプ特異的な中和エピトープを含有しているので、本発明者らは、G1、G3、及びG5の組換えSNAPタグ付EDIIIタンパク質を、間接ELISAのウイルス抗原として使用した。抗JEV G3抗体は、G1由来のEDIIIを認識し、及びそれより低いレベルでG5由来のEDIIIを認識する（表2）。TRIP/JEV.prME又はTRIP/JEV.prMEΔTMのいずれかを受けた、免疫付与したマウスは、試験したJEV遺伝子型に関わらず、4,000〜8,000という、同様か又はさらに高い抗EDIII抗体力価を誘発した。したがって、TRIP/JE.prME及びTRIP/JE.prMEΔTMは、どちらも同様のレベルの、異なるJEVの遺伝子型に広く反応する抗EDIII抗体を誘導することができる。JEV G3に対するマウスJEV抗血清は、G1及びG5のJEV由来のEDIIIの認識の効率が、TRIP/JEV免疫血清よりも低かったことに留意することが重要である。
【０１５７】
【表２】
2017538417.tif 000004
【０１５８】
［TRIP/JEV免疫付与後にマウスで誘発されたJEV抗血清のインビトロ交差防御活性］
フォーカス減少中和試験（FRNT）を行って、TRIP/JEVベクターがG3のJEVに対する中和抗体応答を誘発する能力を評価した（表3）。JEV RP-9株での致死的抗原投与から回復したBalb/cマウスから得た免疫血清は、150のFRNT50を有していた。10のFRNT50という弱い力価が、5 log10 TUのTRIP/JEVベクターの単回投与を接種したマウスで観察された。プライムの1ヶ月後のブースター投与により、40（TRIP/JEV.prMEΔTM）から80（TRIP/JEV.prME）のJEV-中和抗体力価が誘発された（表3）。
【０１５９】
TRIP/JEVベクターにより発現されたJEV抗原は、JEV G3に由来していたので、本発明者らは、新たに出現したJEV遺伝子型、すなわちG1及びG5に対するこれらの防御能力を評価した。この論点を調査するために、発明者らは、JEV G3の感染性cDNAクローンのC、prM、及びEをコードする領域を、JEV G1又はG5の対応する部分で代替することにした（図4A）。TRIP/JEVベクターでの免疫付与は、JEV構造タンパク質のみに対するものであるため、JEV G1及びG5の非構造タンパク質の寄与は、これまで調査されていなかった。培養された細胞株において、キメラJEV G1/3又はJEV G5/3の増殖は、JEV G3/3と同等であった（図6）。イムノブロット解析は、JEV G3/3感染マウス由来の免疫血清が、JEV遺伝子型に関わらず、JEV由来のprM及びEの両方を認識したことを示した（図4B、左のパネル）。
【０１６０】
本発明者らは、キメラJEV G5/3由来のEが、他のウイルスのものよりも速く移行し、JEV G3/3抗血清でprMが弱く検出されたことを観察した。本発明者らがレンチウイルスベクターワクチン接種により作製したマウス免疫血清を用いてこの試験を行ったところ、本質的に同様の結果が得られた。TRIP/JEVベクターで免疫付与したマウス由来の血清は、全キメラJEVのprM及びE（TRIP/JEV.prME）又はEのみ（TRIP/TRIP/JEV.prMEΔTM）を認識した（図4B、右のパネル）。JEV G3抗血清について観察されるように、TRIP/JEV.prMEでの免疫付与により、キメラJEV G5/3由来のprMとの反応性に乏しい特異的抗JEV抗体が誘発された。対照として、抗NS5抗体は、試験した全てのキメラJEV由来のNS5と同様の反応性を示した。したがって、TRIP/JEV.prME抗血清の、G5のJEV由来のprMに対する低い抗原反応性は、HEK-293T細胞でのより低いウイルス増殖の結果ではない。TRIP/JEV.prMEと対照的に、TRIP/JEV.prMEΔTMは、キメラJEV G1/3、G3/3、及びG5/3由来のEタンパク質を同様に認識できる抗体を誘導することができた。一つの説明としては、可溶性形態のEが、prME複合体又はJEV VLP中で隠れている（crypticである）可能性がある、高度に保存されたエピトープを認識する抗体を作製する、より高い傾向を示すことである。
【０１６１】
FRNTアッセイを行って、TRIP/JEVベクターがJEV G1/3又はG5/3に対する中和抗体応答を誘発する能力を評価した（表3）。Balb/cマウスの、G3のJEVへの感染により、キメラJEV G1/3及びG5/3についてそれぞれ140及び50のFRNT50の血清が得られた。TRIP/JEVベクターを与えられた、免疫付与したマウスは、キメラJEV G1/3及びG5/3に対する中和抗体力価を発達させた（表3）。
【０１６２】
【表３】
2017538417.tif 000005
【０１６３】
TRIP/JEV.prMEベクターは、TRIP/JEV.prMEΔTMと比べると、わずかに高いレベルの中和抗JEV抗体を誘発することができた。TRIP/JE誘導抗体の、G5/3のキメラJEVに対する比較的低い中和能力は、G5のJEV由来のEタンパク質に対する弱い反応性と非常に相関している（図4B、右のパネル）。これらのデータは、TRIP/JEVベクターが、JEVの遺伝子型1、3に対し、及びそれよりは低い程度だがG5に対しよく機能するJEV-中和抗体の生産を刺激することができることを示す。
【０１６４】
［TRIP/JEV免疫付与後にマウスで誘発されたJEV抗血清のインビボ防御活性］
事前のデータは、乳飲み（suckling）C57Bl/6マウスのJEV RP9株感染が、1週間以内に致死であったことを示している。マウスのRP9に対する感受性は齢とともに急速に減少するので、本発明者らは、長期間のTRIP/JEVベクターでのプライムブーストワクチン接種期間後に、マウスに抗原投与することができなかった。したがって、本発明者らは、TRIP/JEV抗血清の受動伝達のプロトコルを、乳飲みC57Bl/6マウスに適用することにした。TRIP/JEV.prME又はTRIP/JEV.prMEΔTMワクチン接種後にマウスで誘発された体液性免疫がインビボで防御的であるかどうかということに取り組むために、12匹のC57Bl/6マウス（3週齢）の群に、TRIP/JEV接種マウスからブースティング2か月後に回収した10 μlのプール免疫血清の腹腔内接種を受けさせた。JEV RP-9株を接種したBalb/cマウスのプール免疫血清は、ポジティブコントロールの役割を果たした。PBSを接種した6匹のマウスの群を含めた。抗血清の受動伝達の1日後、マウスを5 log10 FFUのJEV RP-9株で腹腔内抗原投与した。3週間にわたり、動物を、疾患の臨床的兆候及び死亡について毎日観察した（図5）。
【０１６５】
PBSを接種したおよそ70%のマウスが、抗原投与の9〜11日後に死亡したが、一方で、JEV免疫血清の投与は、85%の生存率を誘導した。2つの対照群間の差は、統計的に有意であった（P < 0.05）。防御的受動免疫が、TRIP/JEV.prME（60%の生存率）又はTRIP/JEV.prMEΔTM（50%の生存率）を2回接種したマウス由来のプール血清の移行後に、C57Bl/6マウスにおいて観察された。TRIP/JEV免疫血清の単回投与を受けたマウスの2つの群と、PBS対照群との間の差は、統計的に有意であった（P < 0.01）。これらのデータは、TRIP/JEV抗血清の単回投与により、致死用量のJEVを抗原投与されたマウスにおいて、部分的防御が付与されることを示す。
【０１６６】
［血清中和（seroneutralization）］
接種の20日後に生存しているマウスから回収した血清の中和活性を、シングルサイクルレポーターウイルス粒子（single-cycle reporter viral particles）（RVP）を用いて試験した。RVPは、ウイルス非構造タンパク質及びウミシイタケルシフェラーゼレポーターを発現する、JEV-RP9（g3）サブゲノムレプリコンで安定的に形質転換された細胞中で生産された（図6A）。それらの細胞は、JEV g3又はJEV g5のいずれかの構造タンパク質（C、prM、及びE）発現するプラスミドでトランスフェクトされ、これによりRVPがうまく放出される（図6C及び6D）。組換えRVPが新しい標的細胞へうまく進入すると、ゲノムが放出され、続いて、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現がもたらされる。そのような系は、感受性であり、血清中和アッセイでの使用に有効であることが示されている（Dowd KA, et al. Jost CA, Durbin AP, Whitehead SS, Pierson TC. 2011. PLoS Pathog. 7:e1002111）。興味深いことに、本発明者らは、JEV g3感染を生き延びたBalb/cマウス由来の血清が、JEV g3及びg5 RVPの両方を強力に中和することを示した（図7、左）。相互的なアッセイにおいて、JEV g5感染を生き延びたBalb/cマウス由来の血清は、JEV g5 RVPに対する非常に強力な中和活性を有していたが、JEV g3 RVPに対しては中和は不十分であった（図7、右）。
【０１６７】
［血清中和アッセイ］
血清サンプルを、3週齢のBalb/cマウスより、1000 ffuのJEV-RP9（g3）又はJEV-XZ0934（g5）接種の20日後に取得した。血清は、56℃で30分間加熱することにより補体除去（decomplement）し、2% FBSを補ったDMEMで、1:10の開始希釈で2倍段階希釈を行った。各希釈液を、1時間、37℃で、等量の精製g3又はg5 RVPと共にインキュベートした。残存するRVP感染力を、96ウェルプレートに播種したBHK細胞上で、上述のとおりアッセイした。
【０１６８】
［TRIP/JEV.prMEは、ブタにおいて中和抗JEV抗体の生産を誘導した］
JEV VLPのレンチウイルスに基づく発現は、特に効率的に中和抗体応答を引き起こすので、本発明者らは、TRIP/JEV.prMEがブタにおいて防御的体液性応答を刺激する能力を評価した。4頭の7週齢の子ブタの群に、6（低用量）又は7（高用量）log10 TUのTRIP/JEV.prMEを、筋肉注射で免疫付与した（図8）。対照として、2頭の動物に、レポーターGFPを発現する低用量または高用量の組換えレンチウイルスベクターを受けさせた。組換えEΔTM-SNAPタンパク質をウイルス抗原として使用する、間接ELISAを用いて、抗JEV E抗体の生産を、免疫付与したブタにおいて、週1回、評価した（図8A）。プライム接種後の最初の4週間の抗体応答のモニタリングにより、抗JEV E抗体が効率的に生産されることが明らかになった。低用量及び高用量の免疫付与を比較したが、この期間全体において、抗JEV E抗体生産の統計的に有意な差は示されなかった。抗JEV E抗体のレベルは、4週目に行ったブーストの後に強化され、プライムの後少なくとも1.5ヶ月でプラトーに達した。低用量と比較すると、高用量のTRIP/JEV.prMEは、高レベルの特異的抗体生産をより効果的に誘発した（P = 0.028）。図8Bに示すとおり、生JEVの単回投与によるブタの試験的感染の3週間後に誘導された抗JEV抗体力価は、7 log10 TUのTRIP/JEV.prMEレンチウイルスベクターでのプライムブースト免疫付与により動物において刺激されたものと同程度であった。
【０１６９】
抗JEV E抗体のアイソタイピングにより、TRIP/JEV.prMEが、IgG1とIgG2の両方の生産を、プライム後2週間までに刺激し、その後は、高用量であっても、3週目に減少することが示された（図8C及び8D）。抗JEV E IgG1及びIgG2のレベルは、どちらも、JEV Nakayama株を抗原投与された子ブタにおいて感染の3週目に観察されたものと同様であった（図8E）。TRIP/JEV.prMEでプライムした動物では、4週目のブーストにより、接種用量に関わりなく、IgG2の生産が、プライム後10週間までに、選択的に強化された。
【０１７０】
レンチウイルスTRIP/JEV.prMEベクターで免疫付与した動物から取得した個々の血清サンプルも、プライムの3週間後及びブーストの6週間後に、中和抗体について試験した（図9）。6〜7 log10 TUのTRIP/JEV.prMEの単回投与を受けた、免疫付与した子ブタは、相同性のJEV G3 RP-9株に対して10〜30の範囲の中和抗体力価を発達させ、ブースト後、最大160の力価に達した（図9A）。高用量のTRIP/JEV.prMEにより、より強い既往中和抗体応答が誘導された。
【０１７１】
子ブタ免疫血清の試験により、TRIP/JEV.prMEは、接種した用量に関わらず、JEV G3のNakayama株、JEV G5のXZ0934株（JEV G5/G3キメラを用いて試験）、及び、それよりは低い程度だが、JEV G1のCNS769_Laos_2009株に対する中和抗体を誘発したことが明らかになった（図9B）。重要なことに、抗TRIP/JEV.prME抗体の中和活性のパターンは、JEV Nakayama株を試験的に感染させた子ブタの群から回収した免疫血清において観察されたものと同様であった（図9C）。
【０１７２】
これらの結果は、TRIP/JEV.prMEが、7 log10 TUのレンチウイルスベクターで、1ヶ月の間隔を空けて2回の接種を受けた子ブタにおいて、高い力価の中和抗体を誘発できることを示した。加えて、本発明者らは、TRIP/JEV.prMEが、JEV G1及びG5を中和する抗JEV抗体の生産を刺激することができることを見出した。
【０１７３】
「考察」
VSV-G偽型化レンチウイルスベクターは、樹状細胞等の分裂細胞と非分裂細胞の両方において、ウイルス抗原の効率的な送達を伴うワクチン目的にとりわけよく適しており、ヒト及び動物において頑強な適応免疫の活性化をもたらす（Hu et al., 2011）。レンチウイルスTRIPに基づくベクターの直接注入により、効率的なウイルス抗原発現及び抗体応答がもたらされる。本発明者らは、WNV由来のエンベロープE糖タンパク質をコードする、レンチウイルスTRIPに基づくベクターが、抗体に基づく応答をプライムすることができ、これがマウスモデルにおいて、WNV脳炎に対する長期間の免疫防御を付与することを報告した（Coutant et al., 2008; Iglesias et al., 2006）。本試験の目的は、JEV由来のprM及びEタンパク質を発現する、2つのレンチウイルスTRIPに基づくベクター、TRIP/JEV.prMEベクター及びTRIP/JEV.prMEΔTMベクターの、マウス及び子ブタにおける防御的体液性免疫応答を誘発する能力について、評価することであった。これらのコンストラクトにおいて、prMは、Eのシャペロンの役割を担い、両者は、自己アセンブルしてVLPになる能力を有している。組換えJEV prM及びEの共発現により、TRIP/JEV.prMEベクターで形質導入したヒト細胞において、VLPの細胞外分泌がもたらされる。TRIP/JEV.prMEΔTMベクターはJEV VLPを分泌することができなかったため、発明者らは、膜貫通ドメインのないEタンパク質は、prMの細胞内コンパートメントへの保持に有利に働く可能性があり、これによりVLPの生産が妨げられていると推論した。
【０１７４】
抗体に基づく免疫応答は、JEVに対するワクチンにおいて重要な役割を担い、Eタンパク質は、JEV関連疾患に対する防御免疫を付与するための主要な標的として作用する（Erra et al., 2013; Konishi）。単回低用量（5 log10TU）のTRIP/JEVベクターを接種したマウスは、有意なレベルのJEV特異的IgGを有し、プライムの1ヶ月後のブースター投与により、抗JEV抗体力価の40倍の増加がもたらされる。抗JEV抗体の反応性は、異なるJEV抗原及びキメラJEVを用いた、間接ELISA及びイムノブロットアッセイにおいて報告された。TRIP/JEV.prMEベクターで免疫付与したマウスは、特異的抗prM抗体を発達させたが、TRIP/JEV.prMEΔTMベクターではしなかった。このような結果は、TRIP/JEV.prMEベクターの細胞外JEV VLPを生産する能力に関係している可能性がある。TRIP/JEV抗血清によるJEV抗原の認識の解析により、2つのTRIP/JEVベクターでの免疫付与によって、Eタンパク質並びにG1、G3、及びG5のJEVの抗原ドメインIII（EDIII）に位置する型特異的なエピトープに対して、同等のレベルの抗体が作製されることが示された。EDIIIがフラビウイルスの複数の中和エピトープ及び宿主細胞受容体認識部位を含んでいる（Samuel et al. 2006）ことから考えると、本発明者らの結果は、組換えEタンパク質が、C末端領域を有していても有していなくても、本質的に保存された天然のEタンパク質の免疫原性を有していることを確認している。中和アッセイにより、TRIP/JEVベクターが、G3の生JEVと同様に、G1、G3、及びG5のJEVに対する中和抗体を誘発することができることが実証された。インビボでは、10 μlのTRIP/JEV抗血清の単回投与により、G3のJEVでの致死的抗原投与に対する部分的防御を付与することができた。しかしながら、TRIP/JEV.prMEは、中和抗JEV抗体の生産において、TRIP/JEV.prMEΔTMよりもわずかにより効率的であった。
【０１７５】
TRIP/JEVベクターが中和抗体を効率的に発達させることができたという事実は、TRIP/JEV.prME及びTRIP/JEV.prMEΔTMの両方が、異なるJEVの遺伝子型に対する防御的体液性応答を刺激することができる可能性があるということを示唆しており、1種より多い遺伝子型が同時に流行（cocirculate）する風土病領域におけるこれらの有用性を示す。たとえ体液性免疫応答がJEV感染に対する防御免疫の必須の要素であることが広く受け入れられているとしても、本発明者らは、細胞性免疫もまたJEVに対する長期間の防御の確立において役割を果たしていることを排除することができない。
【０１７６】
TRIP/JEV.prME及びTRIP/JEV.prMEΔTMは、どちらも、異なるJEV遺伝子型に対する獣医学的ワクチン接種のための有望なJEVワクチンであるように思われる。JEV VLPの際立った利点の一つは、長期持続抗体を介した免疫を刺激する効率性である。
【０１７７】
結論として、本試験の目的は、遺伝子型3のJEV由来のエンベロープprM及びE糖タンパク質を発現する2つのレンチウイルスTRIPに基づくベクター、TRIP/JEV.prMEベクター及びTRIP/JEV.prMEΔTMベクターを、マウス及び子ブタにおける防御的体液性応答を誘導する能力について、評価することであった。
【０１７８】
293T細胞の形質導入により、TRIP/JEV.prMEベクターが、prM及びEからアセンブルされるウイルス様粒子（VLP）の分泌において効率的であるのに対し、TRIP/JEV.prMEΔTMベクターは、2つの膜貫通ドメインを欠いている可溶性形態のEしか分泌しないことが示された。各TRIP/JEVベクターの一回の投与を接種したマウスは、有意なレベルのJEV特異的IgGを有し、プライムの1ヶ月後のブースター投与により、抗JEV抗体力価の有意な増加がもたらされた。TRIP/JEVベクターでのマウスのプライムブーストは、同等のレベルのEタンパク質に対する総抗体、並びに遺伝子型1、3、及び5のJEV由来の型特異的エピトープを誘発した。
【０１７９】
中和アッセイにより、TRIP/JEV.prMEが、中和抗JEV抗体の生産においてTRIP/JEV.prMEΔTMよりもわずかにより効率的であること示された。遺伝子型1又は5のJEV由来のprM及びEを含むキメラJEVを遺伝子型3の骨格内に使用することにより、本発明者らは、TRIP/JEVベクターが、遺伝子型に関わらずJEVに対する中和抗体を誘発することができることを実証した。受動的抗体保有率アッセイにより、TRIP/JEV抗血清の単回投与により、致死的用量のJEVで抗原投与されたマウスにおいて、部分的な防御が付与されることが示された。したがって、TRIP/JEV.prME及びTRIP/JEV.prMEΔTMは、どちらも、異なるJEV遺伝子型に対する獣医学的ワクチン接種のための有望なJEVワクチンであるように思われ、風土病領域におけるこれらの優れた有用性を示す。
【０１８０】
体液性免疫応答が、JEV感染に対する防御免疫の必須の要素であることは、広く受け入れられている（Dubischar-Kastner et al., 2012; Larena et al., 2013）。VLPが日本脳炎を含むアルボウイルス疾患に対するワクチンとして適しているという見解（Kuwahara et al., 2010; Piljman et al., 2015）と一致し、JEVで抗原投与されたマウスにおける受動伝達の後に部分的防御を与える中和抗JEV抗体の生産において、TRIP/JEV. prMEの方が、より効率的なレンチウイルスベクターであった。子ブタにおける、1ヶ月の間隔を空けた、7 log10 TUの2回の投与のTRIP/JEV.prMEベクターの接種は、潜在的にブタをJEV感染から防御することができる、高力価の抗JEV中和抗体の誘発において非常に効率的であった。TRIP/JEV.prMEは、JEV G3及びG5、並びに、それよりは低い程度だが、G1を中和する抗JEV抗体の生産を、刺激することができた。JEV遺伝子型の変化がワクチンの有効性に与える潜在的な影響が推定されており、G3ワクチンを注射したブタから得られた免疫血清は、G1のJEVに対してより低い株特異的交差中和抗体力価を示した（Fan et al. 2012）。このような観察により、特にこの特定のJEVの遺伝子型に対する、ブタ用の新たな獣医学的ワクチンの開発がもたらされた（Yang et al., 2014）。TRIP/JEV.prMEベクターは、ブタにおいてG1ウイルスに対する中和抗体を誘発したものの、本発明者らは、これらのレベルは、試験した他のJEV遺伝子型と比較すると低かったことを指摘した。しかしながら、G1のJEVに対する中和抗体力価は、1:40に達することができ、したがって、ブタにおいて防御を達成するのに十分である可能性がある。
【０１８１】
本試験において、発明者らは、JEV VLPを発現するTRIP/JEVベクターでのブタの免疫付与は、抗原特異的な体液性免疫のプライミングに特に効率的であり、JEVの遺伝子型1、3、及び5に対する中和抗体応答をもたらしたことを実証した。ウイルス中和抗体の生産は、ブタにおけるJEV感染に対する防御に極めて重要であり（Imoto et al., 2010）、少なくとも1:10の力価が、防御的体液性免疫を示す（Van Gessel et al. 2011）。レンチウイルスTRIP/JEV.prMEベクターにより誘発された中和抗体の力価は、家畜ブタにおいてJEVの異なる遺伝子型に対して防御を与えるのに十分であり、1種より多い遺伝子型が流行する風土病領域において、非常に有用である可能性がある。
【０１８２】
【表４】
2017538417.tif 000006
【表５】
2017538417.tif 000007
【図１】
2017538417.tif 000008
【図２】
2017538417.tif 000009
【図３】
2017538417.tif 000010
【図４】
2017538417.tif 000011
【図５】
2017538417.tif 000012
【図６】
2017538417.tif 000013
【図７】
2017538417.tif 000014
【図８】
2017538417.tif 000015
【図９】
2017538417.tif 000016
【配列表】
2017538417000001.app
【国際調査報告】
2017538417.tif 000017
2017538417.tif 000018
2017538417.tif 000019
2017538417.tif 000020
2017538417.tif 000021
2017538417.tif 000022