(57)【要約】  フェノール基質の対応するカテコール生成物への酵素的変換のための方法は、青枯病菌チロシナーゼ酵素がフェノール基質の少なくとも一部をカテコール生成物に変換することを可能にするのに十分な期間、反応混合物中でフェノール基質を前記酵素またはその機能的誘導体とインキュベートするステップを含む。
2017538432.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フェノール基質の対応するカテコール生成物への酵素的変換のための方法であって、前記フェノール基質は、チロソールおよび４−ハロフェノールから選択され、前記方法は、反応混合物中でフェノール基質を青枯病菌（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）チロシナーゼ酵素またはその機能的誘導体と、前記酵素が前記フェノール基質の少なくとも一部を前記カテコール生成物に変換することを可能にするのに十分な期間インキュベートするステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記フェノール基質は、チロソールであり、前記カテコール生成物は、ヒドロキシチロソールであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記フェノール基質は、ハロフェノールであり、前記カテコール生成物は、ハロカテコールであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記反応混合物は、アスコルビン酸またはそのナトリウム塩を含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記反応混合物は、２０〜３５０ｍＭアスコルビン酸を含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記青枯病菌チロシナーゼ酵素の前記機能的誘導体は、１７５ｍＭチロソールのヒドロキシチロソールへの１００％変換の能力がある青枯病菌チロシナーゼ酵素の改変型変異体であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
青枯病菌チロシナーゼ酵素の前記機能的誘導体は、ＲＶＣ１０、ＲＶ１４５およびＣ１０＿Ｎ３２２Ｓからなる群から選択される改変型酵素であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記青枯病菌チロシナーゼ酵素またはその機能的誘導体は、前記青枯病菌チロシナーゼ酵素またはその機能的誘導体を発現する細菌からの抽出物として提供されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記青枯病菌チロシナーゼ酵素またはその機能的誘導体は、前記青枯病菌チロシナーゼ酵素またはその機能的誘導体を発現する細菌として提供されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記青枯病菌チロシナーゼ酵素またはその機能的誘導体は、精製された酵素として提供されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記青枯病菌チロシナーゼ酵素またはその機能的誘導体は、細胞抽出物の形態での粗製混合物として提供されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
基質濃度は、少なくとも７５ｍＭであることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記カテコール生成物は、酵素的変換ステップ後に前記反応混合物を冷却することによって前記反応混合物中に存在する不純物から分離されることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記カテコール生成物は、酵素的変換ステップ後に前記反応混合物を冷蔵するまたは凍結させることによって前記反応混合物中に存在する不純物から分離されることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
序論
チロシナーゼは、天然に広く分布しているポリフェノールオキシダーゼ酵素の型であり、いくつかの生物学的機能および生物工学的適用を有する。分子酸素の存在下で、チロシナーゼは、反応の２つの型を触媒する：モノフェノールのｏ−ジフェノールへのヒドロキシル化（モノフェノラーゼ活性）およびｏ−ジフェノールのｏ−キノンへのその後の酸化（ジフェノラーゼ活性）。反応性キノンは、皮膚および毛髪色素沈着、果実の褐変ならびに植物および節足動物における創傷治癒を担う巨大分子メラニンに自家重合（非酵素的に）する。チロシナーゼは、広範な基質特異性を有し、フェノールおよびジフェノール（カテコール）の多くの型を受け入れ得る。置換フェノールの中で、それは、３−および４−置換フェノールに働き得るが、２−置換フェノールは、その酵素の競合的阻害剤である。
【０００２】
チロシナーゼがモノフェノールをｏ−ジフェノールに変換する能力は、医薬品、農薬、フレーバー、重合阻害剤、インク、および抗酸化剤の合成のための重要な前駆物質である様々なｏ−ジフェノールの製造に関する研究を動機づけた。ハロカテコールは、それらの生物活性ならびに官能化カテコールビルディングブロックの合成を可能にするハロカテコール中間体から始まるいろいろなクロスカップリングおよびハロゲン−金属交換反応に起因する、興味深いシントンである。例えば、フルオロカテコールは、潜在的に、アドレナリン性カテコールアミンおよび生体アミンなどの医薬品の合成のための価値ある前駆物質である。化学的手段による置換カテコールの合成は、強い試薬を用いること、厳しい反応条件および貧弱な収率のために複雑である。チロシナーゼは、これらのカテコールを合成する生物学的手段として大きな可能性を有するが、カテコール合成のためのチロシナーゼの使用は、モノフェノラーゼ対ジフェノラーゼ活性の比が低く、カテコールの蓄積が促進されないことにより制限されてきた。
【０００３】
ヒドロキシチロソールは、食品、化粧品、および医薬において使用される非常に望ましい抗酸化剤である。欧州食品安全機関は、ヒドロキシチロソールの健康上の利益について出されたいくつかの主張を支持する声明を２０１１年に公表した。ヒドロキシチロソールの価格は、困難な製造プロセス（例えば、オリーブの葉からの抽出、化学的合成、およびオリーブ油工業廃水からの抽出）が原因で高い。ヒドロキシチロソール含有生成物の大部分の純度は、フェノール類および他の汚染物質が存在して低い（＜８０％、しばしば３０％未満）。低品質、高コストにより、ヒドロキシチロソールの適用は制限されている。チロシナーゼなどの生物学的触媒の使用により、高品質のヒドロキシチロソールが可能になるであろう。
【０００４】
チロソールからのヒドロキシチロソールの製造のための化学的プロセスが報告されているが、６ｍＭ濃度で５０％のみの変換である（特許文献１）。緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の全細胞がチロソールをヒドロキシチロソールに変換し得る（２５ｍＭで８０〜９６％収率）が、下流プロセスの複雑さおよびコストを増加させる望まれない副生成物（ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸および３，４ジヒドロキシフェニル酢酸）をもたらす（非特許文献１；非特許文献２）。さらに、緑膿菌は、生産設備内の生物学的制御手順にコストを付加する日和見病原体である。ヒドロキシチロソールなどの食品添加物を製造するために使用される見込みはない。
【０００５】
特許文献２は、細菌青枯病菌（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）からの酵素チロシナーゼＮＰ＿５１８４８５を使用してＬ−チロシンからＬ−ＤＯＰＡを得るためのプロセスを記載している。Ｍｏｌｌｏｙら（非特許文献３）は、ランダムおよび部位特異的突然変異誘発法を使用したＤ−チロシンへの改善された触媒効率のための青枯病菌からの改変型チロシン酵素（engineered tyrosine enzyme）を記載している。
【０００６】
特許文献３は、キノコ（mushroom）由来チロシナーゼ酵素を使用したチロソールのヒドロキシチロソールへの生物変換を記載している。そのプロセスは、高収率をもたらすが、反応時間は、非常に遅く、１リットル反応において１５ｍｇのキノコチロシナーゼを使用した１ｇのチロソール変換には、反応を完了するために５ｈを必要とする。さらに、市販のキノコチロシナーゼの調製物は、１０ｇ／ｌを超えるチロソールで阻害され、反応を完了することができない。科学文献は、５ｍＭでのアスコルビン酸によるキノコチロシナーゼの阻害を報告している（非特許文献４；非特許文献５）。青枯病菌チロシナーゼは、全細胞、粗製細胞溶解物または精製酵素として生物学的触媒として働き得る。生物学的触媒調製の最初の２つの方法は、容易であり、精製調製物において使用されるキノコチロシナーゼに対する利点を提供する。チロソール（５ｇ／ｌ）のヒドロキシチロソールへの変換のための反復バッチシステムが可能であることが示唆された（非特許文献６）が、収率は、１回の操業で８５％であり、生物学的触媒は、３回の操業後にその活性の６０％を失い、貧弱な収率、低い全体的な濃度をもたらし、最終生成物中に高濃度の基質を残す。したがって、高度に純粋なヒドロキシチロソールを達成するための複雑な下流での加工が必要となる。さらに、反復サイクルは、煩雑である。フェッドバッチ方法での別の変形法は、ビーズを用いた繰り返しの生成物除去を要求する（非特許文献７）が、これは、低い生成物濃度および５０％未満の収率をもたらした。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＥＰ１６２３９６０
【特許文献２】ＥＳ２３２０５０５
【特許文献３】米国特許出願公開第２００３／１８０８３３（Ｄ１）明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Allouche et al., Appl. Environ. Microbiol., 2004, 70, pp 2105-2109
【非特許文献２】Boullagui and Sayadi, J. Agric. Food Chem., 2006, 54, pp 9906-9911
【非特許文献３】Molloy et al., Biotechnol. Bioeng. 2013, 110, pp 1849-1857
【非特許文献４】Golan-Goldhirsh and Whitaker, J. Agric. Food Chem., 1984, 32, p 1003-1009
【非特許文献５】Marin-Zamora et al, J. Biotechnol., 2009, 139, pp 163-168
【非特許文献６】Bouallagui and Sayedi J. Agric. Food Chem., 2006, 54 (26), pp 9906-9911
【非特許文献７】Brouk and Fishman, J Mol Catal B: Enzym 84: 121-127
【非特許文献８】Smith et al. 1985
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、上記の問題の少なくとも１つを克服することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本出願人は、任意の他の生物学的触媒（２５ｍＭおよび０．４ｇ／ｌ／ｈで最善）と比較して、非常に高い濃度（最大１５０ｍＭ）および速度（最大９．３ｇ／ｌ／ｈ）でチロソールをヒドロキシチロソールに変換する能力がある青枯病菌からのチロシナーゼ酵素を同定した（図２〜４）。青枯病菌チロシナーゼ酵素を使用したチロソールの対応するカテコールへの変換速度は、天然の基質であるＬ−チロシンに関する変換速度よりもはるかに高い。本出願人は、青枯病菌チロシナーゼがチロシナーゼまたは任意の他の酵素を使用して以前に報告されているものよりも高い変換速度４ｇ／ｌ／ｈおよび生成物収率（＞９２％）で４−ハロフェノールを対応する４−ハロカテコールに変換する能力があることも実証した（図５）。本発明の方法は、２０分での１リットル反応において１ｇのチロソールの生物学的変換を完了するために青枯病菌からの１２．９ｍｇのチロシナーゼを必要とする（市販のキノコチロシナーゼよりも１５倍速い）。さらに、本発明の方法は、今まで達成されていない高濃度の基質での反応を実証する。青枯病菌チロシナーゼは、基質（２７．６ｇ／Ｌのチロソール）および生成物（３０．８ｇ／Ｌのヒドロキシチロソール）への高い耐性を実証する。アスコルビン酸ナトリウム塩（最大４００ｍＭ）による青枯病菌チロシナーゼ活性の阻害は観察されなかった。青枯病菌チロシナーゼは、全細胞、粗製細胞溶解物または精製酵素として生物学的触媒として働き得る。生物学的触媒調製の最初の２つの方法は、容易であり、精製調製物において使用されるキノコチロシナーゼを越える利点を提供する。
【００１１】
したがって、本発明は、フェノール基質の対応するカテコール生成物への酵素的変換のための方法であって、反応混合物中でフェノール基質を青枯病菌チロシナーゼ酵素またはその機能的誘導体と、前記酵素がフェノール基質の少なくとも一部をカテコール生成物に変換することを可能にするのに十分な期間インキュベートするステップを含む方法を提供する。
【００１２】
好ましくは、フェノール基質は、３−置換または４−置換フェノールであり、カテコール生成物は、対応する３−置換または４−置換カテコールである。
【００１３】
好ましくは、フェノールは、ヒドロキシアルキル−置換フェノールである。好ましくは、フェノールは、ヒドロキシエチル−置換フェノールである。好ましくは、フェノールは、３−または４−ヒドロキシアルキル−置換フェノールである。好ましくは、フェノールは、３−または４−ヒドロキシエチル−置換フェノールである。
【００１４】
典型的には、４−ヒドロキシエチル−置換フェノールは、チロソールであり、４−置換カテコールは、３，４−ジヒドロキシエチルフェノールである。
【００１５】
好適には、３−置換または４−置換フェノール基質は、３−ハロフェノールまたは４−ハロフェノールであり、カテコール生成物は、３−ハロカテコールまたは４−ハロカテコールである。
【００１６】
好ましくは、反応混合物は、アスコルビン酸を含む。好ましくは、反応混合物は、１００ｍＭから３００ｍＭのアスコルビン酸を含む。一実施形態では、反応混合物は、最大４００ｍＭのアスコルビン酸を含む。一実施形態では、アスコルビン酸は、塩、好ましくは、アスコルビン酸ナトリウムとして提供される。
【００１７】
好適には、青枯病菌チロシナーゼ酵素の機能的誘導体は、ＲＶＣ１０、ＲＶ１４５およびＣ１０＿Ｎ３２２Ｓからなる群から選択される改変型酵素（engineered enzyme）を含み、その詳細は、Ｍｏｌｌｏｙらの非特許文献３に記載されている。一実施形態では、機能的誘導体は、改変型酵素ＲＶ１４５である。
【００１８】
一実施形態では、青枯病菌チロシナーゼ酵素またはその機能的誘導体は、全細胞、粗製細胞溶解物または精製酵素として提供される。一実施形態では、酵素は、支持体に固定化されている。
【００１９】
典型的には、基質濃度は、少なくとも１０ｍＭである。一実施形態では、基質濃度は、少なくとも１００ｍＭである。一実施形態では、基質濃度は、少なくとも１５０ｍＭである。一実施形態では、基質濃度は、少なくとも１７５ｍＭである。
【００２０】
好適には、方法は、酵素からカテコール生成物を分離するステップを含む。一実施形態では、分離ステップは、膜ろ過ステップを含む。一実施形態では、分離ステップは、溶媒抽出ステップを含む。一実施形態では、分離は、水性の生物学的変換培地からカテコール生成物を結合しかつ抽出するための固相を使用して行われる。
【００２１】
一実施形態では、酵素は、９０％のフェノール基質をカテコール生成物に変換する。一実施形態では、酵素は、１００％のフェノール基質をカテコール生成物に変換する。
【００２２】
本発明は、本発明の方法に従って作られたカテコール生成物にも関する。一実施形態では、カテコール生成物は、ヒドロキシチロソールおよびハロカテコールから選択される。一実施形態では、ハロカテコールは、３−ハロカテコールおよび４−ハロカテコールから選択される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】モノフェノラーゼ活性によるハロフェノールのヒドロキシル化およびチロシナーゼのジフェノラーゼ活性によるハロカテコールの酸化を示す図である。
【図２】４０ｍＭアスコルビン酸ナトリウム塩の存在下でＷＴおよびＲＶ１４５酵素（２０μｇ／ｍＬ）を使用した振とうフラスコ中の２０ｍＭのチロソールの生物学的変換（ＴＹ：チロソール、ＨＴ：ヒドロキシチロソール）を示す図である。
【図３】改変型ＲＶ１４５酵素によるチロソールのヒドロキシチロソールへの生物学的変換を示す図である。ａ：１５０ｍＭアスコルビン酸ナトリウム塩の存在下で精製された改変型ＲＶ１４５酵素を使用したチロソールの７５ｍＭ生物学的変換。Ｂ：２００ｍＭアスコルビン酸ナトリウム塩の存在下で、改変型ＲＶ１４５酵素を宿す大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の、細胞を含まない溶解物を使用したチロソールの１００ｍＭ生物学的変換。
【図４】３００ｍＭアスコルビン酸ナトリウム塩の存在下で、改変型ＲＶ１４５酵素を宿す大腸菌の、細胞を含まない粗製溶解物を使用したチロソールの１５０ｍＭ生物学的変換を示す図である。
【図５】ａ  ２０ｍＭアスコルビン酸ナトリウム塩の存在下でＷＴおよびＲＶ１４５酵素（２０μｇ／ｍＬ）を使用した振とうフラスコ中の１０ｍＭの４−フルオロフェノールの生物学的変換を示す図である。ｂ  ２０ｍＭアスコルビン酸ナトリウム塩の存在下でＷＴおよびＲＶ１４５酵素（１０μｇ／ｍＬ）を使用した振とうフラスコ中の１０ｍＭの４−ヨードフェノールの生物学的変換を示す図である（４−ＩＰ：４−ヨードフェノール、４−ＩＣ：４−ヨードカテコール、４−ＦＰ：４−フルオロフェノール、４−ＦＣ：４−フルオロカテコール）。
【図６】２００ｍＭアスコルビン酸の存在下で市販のキノコチロシナーゼを使用したチロソールの１００ｍＭ生物学的変換を示す図である。反応は、３０％のみの生成物をもたらし、３０ｍＭ生成物がいったん形成されると停止し、これは、青枯病菌チロシナーゼと比較してそのはるかに貧弱な性能を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
定義：
「フェノール基質」は、非置換または置換フェノール、特に、３−置換または４−置換フェノールを意味する。置換基の例は、ハロゲンまたはヒドロキシアルキル置換基を含む。ヒドロキシアルキル置換基の例は、ヒドロキシメチルおよびヒドロキシエチル置換基、特に、４−ヒドロキシメチルおよび４−ヒドロキシエチル置換基を含む。典型的には、３−置換または４−置換フェノールは、３−ハロフェノールまたは４−ハロフェノールである。ハロフェノールの例は、ヨードフェノール、ブロモフェノール、クロロフェノール、およびフルオロフェノールを含む。好ましくは、フェノールは、チロソールである。好ましくは、フェノール基質は、水性環境におけるそれらの最大溶解度までの濃度で提供される。一実施形態では、フェノール基質は、チロソール、３−ハロフェノール、および４−ハロフェノールから選択される。一実施形態では、フェノール基質は、チロソールおよび４−ハロフェノールから選択される。
【００２５】
「対応するカテコール生成物」は、フェノール基質を青枯病菌チロシナーゼ酵素と反応させることによって製造されるカテコールを意味する。フェノール基質が４−ハロフェノール（例えば、４−フルオロフェノール）である場合、対応するカテコール生成物は、対応する４−フルオロカテコール（４−フルオロカテコール）である。同様に、フェノール基質が４−置換ヒドロキシアルキルフェノール（例えば、チロソール）である場合、対応するカテコール生成物は、対応する４−置換ヒドロキシアルキルカテコール（ヒドロキシチロソール）である。
【００２６】
「チロソール」は、４−（２−ヒドロキシエチル）フェノールをいう。
【００２７】
「ヒドロキシチロソール」は、４−（２−ヒドロキシエチル）−１，２−ベンゼンジオールを意味する。
【００２８】
「青枯病菌（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）チロシナーゼ酵素」は、青枯病菌（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）から単離されたチロシナーゼ酵素を意味する。そのような酵素の例は、Ｍｏｌｌｏｙらの非特許文献３に記載されている。野生型酵素に関するアミノ酸および核酸配列が以下に提供されている：
青枯病菌（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）チロシナーゼ酵素アミノ酸配列（配列番号１）
（ＮＰ＿５１８４５８）
【００２９】
【表１】
2017538432.tif 000003
【００３０】
青枯病菌（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）チロシナーゼ酵素核酸配列（配列番号２）
（ｇｉ  ３０４０７１２７）
【００３１】
【表２】
2017538432.tif 000004
【００３２】
青枯病菌チロシナーゼ酵素に適用される場合の「その機能的誘導体」は、特許文献３に記載されているキノコチロシナーゼよりも著しく優れた濃度および速度でフェノール（すなわちチロソール）を対応するカテコール（すなわちヒドロキシチロソール）に変換する能力が典型的にある青枯病菌チロシナーゼ酵素の改変型変異体（engineered variant）を意味する。野生型青枯病菌チロシナーゼ酵素の少なくとも同等値である濃度および速度でチロソールをヒドロキシチロソールに変換する能力がある変異体を含めた、青枯病菌チロシナーゼ酵素のそのような改変型変異体の例は、非特許文献３に記載されている。一実施形態では、青枯病菌チロシナーゼ酵素の改変型変異体は、以下に記載されたチロソール生物学的変換アッセイにおける１５０ｍＭチロソールのヒドロキシチロソールへの１００％変換の能力がある。一実施形態では、青枯病菌チロシナーゼ酵素の改変型変異体は、以下に記載されたチロソール生物学的変換における１７５ｍＭチロソールのヒドロキシチロソールへの１００％変換の能力がある。青枯病菌チロシナーゼ酵素の改変型変異体を生成し、かつ試験するための方法は、当業者に明らかであり、Ｍｏｌｌｏｙらの非特許文献３に記載されている。
【００３３】
青枯病菌チロシナーゼ酵素タンパク質の「改変型変異体（engineered variant）」は、野生型青枯病菌チロシナーゼ酵素と実質的に同一であるアミノ酸配列を有する酵素を意味すると解釈されるべきである。したがって、例えば、この用語は、１または複数のアミノ酸残基に関して変化された酵素を含むと解釈されるべきである。好ましくは、そのような変化は、５以下のアミノ酸、より好ましくは、４以下の、さらにより好ましくは、３以下の、最も好ましくは、１または２アミノ酸のみの挿入、付加、欠失および／または置換を含む。天然および修飾アミノ酸での挿入、付加および置換が想定される。改変型変異体は、保存的アミノ酸の変化を有し得、ここで、導入されるアミノ酸は、置換されるものと構造的、化学的、または機能的に類似している。一般に、変異体は、野生型青枯病菌チロシナーゼ酵素との少なくとも７０％アミノ酸配列相同性、好ましくは少なくとも８０％配列相同性、より好ましくは少なくとも９０％配列相同性、理想的には、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列相同性を有することになる。この文脈では、配列相同性は、配列同一性と類似性の両方を含む。すなわち、野生型青枯病菌チロシナーゼ酵素との７０％アミノ酸相同性を共有するポリペプチド配列は、整列された残基の任意の７０％が野生型青枯病菌チロシナーゼ酵素における対応する残基と同一であるものか、またはこれの保存的置換であるものである。本発明の範囲内に含まれる特定の変異体は、Ｍｏｌｌｏｙら、２０１３（非特許文献３）に記載された改変型変異体、特に（ＲＶＣ１０、ＲＶ１４５およびＣ１０＿Ｎ３２２Ｓ）である。一実施形態では、青枯病菌チロシナーゼ酵素の改変型変異体は、任意のチロシナーゼまたは他の生物学的触媒によって以前に報告されたよりも高い桁の濃度でのチロソール基質のヒドロキシチロソールへの完全な変換の能力がある（例えば１７５ｍＭチロソール）。
【００３４】
「改変型変異体（engineered variant）」という用語は、野生型青枯病菌チロシナーゼ酵素の化学的誘導体、すなわち、野生型酵素の１または複数の残基が官能性側基の反応によって化学的に誘導体化されているものを含むことも意図されている。天然に存在するアミノ酸残基がアミノ酸類似体で置き換えられている野生型青枯病菌チロシナーゼ酵素も変異体という用語内に含まれる。側鎖修飾の例は、アルデヒドとの反応、その後のＮａＢＨ4での還元による還元的アルキル化；メチルアセトイミデートでのアミド化；無水酢酸でのアセチル化；シアネートでのアミノ基のカルバミル化；２，４，６，トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）でのアミノ基のトリニトロベンジル化；無水コハク酸および無水テトラヒドロフタル酸でのアミノ基のアルキル化；およびピリドキサ−５’−ホスフェートでのリシンのピリドキシル化、その後のＮａＢＨ4での還元などによるアミノ基の修飾を含む。アルギニン残基のグアニジノ基は、２，３−ブタンジオン、フェニルグリオキサールおよびグリオキサールなどの試薬でのヘテロ環縮合生成物の形成によって修飾され得る。カルボキシル基は、ｏ−アシルイソ尿素形成を通したカルボジイミド活性化、その後のそれに続く例えば、対応するアミドへの誘導体化によって修飾され得る。スルフヒドリル基は、ヨード酢酸またはヨードアセトアミドでのカルボキシメチル化；システイン酸への過ギ酸酸化；他のチオール化合物との混合ジスルフィドの形成；マレイミド；無水マレイン酸または他の置換マレイミドとの反応；４−クロロマーキュリベンゾエート、４−クロロマーキュリフェニルスルホン酸、塩化フェニル水銀、２−クロロマーキュリック−４−ニトロフェノールおよび他の水銀剤を使用した水銀誘導体の形成；アルカリｐＨでのシアネートによるカルバミル化などの方法によって修飾され得る。トリプトファン残基は、例えば、Ｎ−ブロモスクシンイミドでの酸化または２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジルブロマイドもしくはスルフォニルハライドでのインドール環のアルキル化によって修飾され得る。チロシン残基は、テトラニトロメタンでのニトロ化によって変化されて、３−ニトロチロシン誘導体を形成し得る。ヒスチジン残基のイミダゾール環の修飾は、ヨード酢酸誘導体でのアルキル化またはピロ炭酸ジエチルでのＮ−カルベトキシル化によって達成され得る。酵素合成中に非天然アミノ酸および誘導体を組み込む例は、ノルロイシン、４−アミノ酪酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸、６−アミノヘキサン酸、ｔ−ブチルグリシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸、２−チエニルアラニンおよび／またはアミノ酸のＤ−異性体の使用を含むが、これらに限定されない。
【００３５】
（実施例）
材料および方法
チロシナーゼの株、増殖条件および精製
【００３６】
組換え大腸菌ＢＬ２１を使用して、青枯病菌からの野生型（ＷＴ）チロシナーゼ遺伝子およびＭｏｌｌｏｙら（２０１３）（非特許文献３）によって以前に生成された同じ遺伝子の３つの改変型変異体（ＲＶ１４５、ＲＶＣ１０、Ｃ１０＿Ｎ３２２Ｓ）を発現させた。全ての株を−８０℃で５０％グリセロールを有する溶原培地（ＬＢ）中で維持した。誘導およびチロシナーゼ精製のための調製において、−８０℃で保管された大腸菌株をＬＢ寒天上でストリークし、３７℃で２４ｈインキュベートした。第一次接種物を５ｍＬのＬＢ中で回転振とう機（２００ｒｐｍ、３７℃）において終夜培養した。カルベニシリン（５０μｇ／ｍＬ）を、研究を通してプラスミドの維持のための抗生物質として使用した。チロシナーゼ産生を誘導し、酵素を以前に記載されたように精製した（Ｍｏｌｌｏｙら、２０１３、非特許文献３）。精製チロシナーゼの異なる画分を純度および分子量の確認のために１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。タンパク質濃度を、標準としてウシ血清アルブミンを使用してビシンコニン酸方法（Ｓｍｉｔｈら、１９８５、非特許文献８）によって決定した。
【００３７】
基質および他の化学物質の調製
４−フルオロフェノール、４−ブロモフェノール、４−クロロフェノール、および４−ヨードフェノールなどの様々なモノフェノール基質をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｄｕｂｌｉｎ，Ｉｒｅｌａｎｄ）から購入した。４−ブロモフェノール、および４−ヨードフェノールのストック溶液（１Ｍ）を１００％エタノール中で調製し、その後の作業液（working solution）を５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７）中でさらに希釈した。同様に、４−フルオロフェノールおよび４−クロロフェノールのストック溶液（５００ｍＭ）を脱イオン水中で調製し、作業ストック（working stock）を５０ｍＭホスフェートバッファー中で調製した。チロソールをＴＣＩ  Ｅｕｒｏｐｅ（Ｂｅｌｇｉｕｍ）から購入し、ストックを５０ｍＭホスフェートバッファー中で調製した。アスコルビン酸およびアスコルビン酸ナトリウム塩（ＡＡ）（ｏ−キノンをｏ−ジフェノールに還元するために使用される）を生物学的変換アッセイ直前に脱イオン水中で調製した。
【００３８】
４−ハロゲン化フェノールおよびチロソールの生物学的変換
ハロフェノールの対応するハロカテコールへの生物学的変換を、精製酵素（ＷＴおよび改変型変異体）を使用して行った。様々な濃度（５、１０、および２０ｍＭ）のハロフェノール生物学的変換をシェーカーインキュベーター中で３０℃および２００ｒｐｍで２０ｍＬの作業体積を有する１００ｍＬ三角フラスコ中で行った。チロソールのヒドロキシチロソールへの生物学的変換を精製酵素、細胞を含まない溶解物または全細胞を使用して行った。様々な濃度（７５、１００、１５０および１７５ｍＭ）のチロソール生物学的変換をシェーカーインキュベーター中で３０℃および２００〜２５０ｒｐｍで１００ｍＬの作業体積を有する５００ｍＬバッフル付き三角フラスコ中で行った。１ｍＭの基質あたり２μｇ／ｍＬの酵素濃度を、１：２の基質対アスコルビン酸ナトリウム比で試験した。ヒドロキシチロソールへの１００ｍＭチロソールの生物学的変換を、上で特定した条件を使用して市販のキノコチロシナーゼ（Ｓｉｇｍａ，Ｉｒｅｌａｎｄ）を使用しても行った。試料（４５０μＬ）を様々な時点で取り出し、５０μＬの氷冷１Ｎ  ＨＣｌに直ちに加えた。試料を遠心分離し（１２，０００ｇ）、Ｗｈａｔｍａｎ  Ｍｉｎｉ−ＵｎｉＰｒｅｐ（商標）ｓｙｒｉｎｇｅｌｅｓｓ  ｆｉｌｔｅｒｓ（０．４５μ  Ｗｈａｔｍａｎ  Ｉｎｃ．ＮＪ，ＵＳＡ）を使用してろ過し、２０μＬの試料体積を全てのＨＰＬＣ注入に使用した。
【００３９】
ＨＰＬＣ分析
ろ過された試料を５μｍ  ＡＣＥ５  Ｃ１８カラム（２５ｃｍ×４．６ｍｍ  ＩＤ；Ａｐｅｘ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｒｅｌａｎｄ）およびＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｄｉｏｄｅ  Ａｒｒａｙ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒを備えたＨＰ  １１００器械を使用してＨＰＬＣによって分析した。試料を１．０ｍＬ／分の流速でリン酸（０．１％、ｖ／ｖ）およびメタノール混合物を使用して２２℃で、均一濃度で溶出した。リン酸とメタノールとの比は、４−フルオロフェノールに関して７０：３０であり、４−クロロ−、４−ブロモ−、および４−ヨードフェノールに関して５０：５０であった。
【図１】
2017538432.tif 000005
【図２】
2017538432.tif 000006
【図３】
2017538432.tif 000007
【図４】
2017538432.tif 000008
【図５】
2017538432.tif 000009
【図６】
2017538432.tif 000010
【配列表】
2017538432000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成28年10月17日(2016.10.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フェノール基質の対応するカテコール生成物への酵素的変換のための方法であって、前記フェノール基質は、チロソールおよび４−ハロフェノールから選択され、前記方法は、反応混合物中でフェノール基質を青枯病菌（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）チロシナーゼ酵素またはその機能的誘導体と、前記酵素が前記フェノール基質の少なくとも一部を前記カテコール生成物に変換することを可能にするのに十分な期間インキュベートするステップを含み、前記混合物がアスコルビン酸を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記フェノール基質は、チロソールであり、前記カテコール生成物は、ヒドロキシチロソールであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記フェノール基質は、ハロフェノールであり、前記カテコール生成物は、ハロカテコールであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記アスコルビン酸は塩として提供されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記青枯病菌チロシナーゼ酵素の前記機能的誘導体は、１７５ｍＭチロソールのヒドロキシチロソールへの１００％変換の能力がある青枯病菌チロシナーゼ酵素の改変型変異体であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
青枯病菌チロシナーゼ酵素の前記機能的誘導体は、ＲＶＣ１０、ＲＶ１４５およびＣ１０＿Ｎ３２２Ｓからなる群から選択される改変型酵素であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記青枯病菌チロシナーゼ酵素またはその機能的誘導体は、前記青枯病菌チロシナーゼ酵素またはその機能的誘導体を発現する細菌からの抽出物として提供されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記青枯病菌チロシナーゼ酵素またはその機能的誘導体は、前記青枯病菌チロシナーゼ酵素またはその機能的誘導体を発現する細菌として提供されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記青枯病菌チロシナーゼ酵素またはその機能的誘導体は、精製された酵素として提供されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記青枯病菌チロシナーゼ酵素またはその機能的誘導体は、細胞抽出物の形態での粗製混合物として提供されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
基質濃度は、少なくとも７５ｍＭであることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記カテコール生成物は、酵素的変換ステップ後に前記反応混合物を冷却することによって前記反応混合物中に存在する不純物から分離されることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記カテコール生成物は、酵素的変換ステップ後に前記反応混合物を冷蔵するまたは凍結させることによって前記反応混合物中に存在する不純物から分離されることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【国際調査報告】
2017538432.tif 000011
2017538432.tif 000012
2017538432.tif 000013
2017538432.tif 000014
2017538432.tif 000015