(57)【要約】  本発明は、メバロン酸またはメバロン酸を含む溶液を、所望により、固体触媒の存在下でかつ／または高温および／もしくは高圧で反応させて、第１の生成物または第１の生成混合物を生じさせることを含む方法に関する。本発明は、（ａ）生合成メバロン酸経路を発現する微生物を提供することと、（ｂ）好適な炭素基質を含む発酵培地で微生物を増殖させ、バイオベースメバロン酸が産生されることと、（ｃ）当該バイオベースメバロン酸を反応させて第１の生成物または第１の生成混合物を生じさせることとを含む方法にさらに関する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＭＶＬまたはＭＶＬを含む溶液を固体触媒の存在下で反応させて第１の生成物または第１の生成混合物を生じさせることを含む方法。
【請求項２】
前記ＭＶＬを含む溶液は、アンヒドロメバロノラクトンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＭＶＬを含む溶液は、共反応物質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記共反応物質は、水、アルキルアルコール、エーテル、芳香族化合物、酸、アルデヒド、エステル、およびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ａ）は、約１００℃〜約５００℃の範囲の温度で起こる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ａ）は、約１０ｂａｒ〜約１００ｂａｒの範囲の圧力で起こる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ａ）は、約１００℃〜約５００℃の範囲の温度および約１０ｂａｒ〜約１００ｂａｒの範囲の圧力で起こる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記固体触媒は固体酸触媒である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記固体酸触媒は、官能化スチレン−ジビニルベンゼンコポリマー、官能化テトラフルオロエチレン−フルオロポリマーコポリマー、カルシウムアパタイト、シリカ−アルミナ、シリカ、チタニア、アルミナ、樹脂、金属酸化物、ゼオライト、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記固体触媒は、金属酸化物触媒および炭素触媒からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記固体触媒は約２０ｍ２／ｇ〜約６００ｍ２／ｇの表面積を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記固体触媒は、酸化ケイ素、酸化アルミニウム、酸化チタン、酸化マグネシウム、酸化ジルコニウム、酸化コバルト、酸化鉄、酸化ニッケル、酸化マンガン、酸化亜鉛、酸化モリブデン、酸化タングステン、酸化カルシウム、酸化セリウム、酸化スズ、および酸化クロム、およびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記固体触媒は混合金属酸化物触媒を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記固体触媒は、担持遷移金属または貴金属を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記担持遷移金属または貴金属は、マグネシウム、バナジウム、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、ジルコニウム、モリブデン、ルテニウム、ロジウム、銀、スズ、タングステン、タンタル、イリジウム、プラチナ、および金、およびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１の生成物または第１の生成混合物は、イソプレン、３−メチル−２−ブタノン、メチルビニルケトン、アンヒドロメバロノラクトン、２−ペンテン、２−メチル−１−ブテン、２−メチル−１−ペンテン、メタン、水素、またはアルキルアルコールの１つ以上を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１の生成物または第１の生成混合物を第１の試薬および第２の触媒と反応させて、第２の生成物または第２の生成混合物を生じさせ、前記第１の試薬は水またはオレフィンまたはアルコールである、ステップ（ｂ）をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１の試薬はオレフィンであり、前記第２の触媒は、ルテニウム、モリブデン、タングステン、レニウム、スズ、およびロジウムオレフィンメタセシス触媒、およびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１の試薬はアルコールであり、前記第２の触媒は、均一系および不均一系酸および塩基、糖、リパーゼ、イオン交換樹脂、金属酸化物、およびゼオライト、およびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ｂ）は、約１００℃〜約５００℃の範囲の温度で起こる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記第２の生成物または第２の生成混合物を第２の試薬および第３の触媒と反応させて、第３の生成物または第３の生成混合物を生じさせること（ｃ）をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
（ａ）ＭＶＬまたはＭＶＬを含む溶液を、約１００℃〜約５００℃の範囲の温度で反応させて第１の生成物または第１の生成混合物を生じさせることを含む方法。
【請求項２３】
（ａ）生合成ＭＶＬ経路を発現する微生物を提供することと、（ｂ）少なくとも１つの炭素基質を含む発酵培地で前記微生物を増殖させ、バイオベースＭＶＬが産生されることと、（ｃ）前記バイオベースＭＶＬを反応させて第１の生成物または第１の生成混合物を生じさせることとを含む方法。
【請求項２４】
前記ステップ（ｃ）は、固体触媒の存在下で起こる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ステップ（ｃ）は、約１００℃〜約５００℃の範囲の温度で起こる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記微生物は、バイオベースＭＶＬ産生を可能にする代謝修飾を含む非天然微生物である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記代謝修飾は、
ｉ．ｍｖａＥ、ｍｖａＳ、
ｉｉ．ｍｖａＥ、ｍｖａＳ、ａｔｏＢ、
ｉｉｉ．ａｔｏＢ、ｈｍｇＲ、ｈｍｇＳ、および
ｉｖ．ｉ〜ｉｉｉの機能的相同体
からなる群から選択された少なくとも１組の遺伝子の発現を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記代謝修飾は、少なくとも１つの遺伝子の修飾を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記遺伝子は、ａｃｋＡ−ｐｔａ、ａｄｈＥ、およびｌｄｈＡからなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記発酵培地は再生可能原料を含む、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照することにより本明細書に組み込まれる２０１４年１１月２６日出願の「生物学的に誘導されたメバロン酸の転換方法」と題する米国仮特許出願第６２／０８４，６８９号の優先権利益を主張するものである。
【０００２】
配列表
以下の出願は、２５ＫＢの２０１５年１１月２３日に作成された「４６５６７配列表」と題するＡＳＣＩＩ形式のテキストファイルとして提出されたコンピュータ可読形式（ＣＲＦ）の配列表を含む。ＣＲＦの内容は参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０００３】
技術分野
本発明は、一般に、生化学的経路を介して誘導された有機酸から炭化水素バイオ燃料およびその他の製品のための中間生成物を製造する方法に関する。特に、メバロン酸（またはメバロノラクトン）はバイオマス発酵に由来でき、さまざまな中間生成物を生成する。本発明の１つ以上の実施形態は、イソプレン、メチルビニルケトン、３−メチル−２−ブタノン、およびアンヒドロメバロノラクトンに関する。
【背景技術】
【０００４】
有機酸は、生化学的経路によりバイオマスに由来できる化合物の重要な種類であり、炭化水素バイオ燃料およびその他の製品の持続可能な製造の中間生成物としての役割を果たすことができる。特に興味深いのは、アルキレートとして知られている、種々の合成ポリマー（すなわち、合成ゴム）、特殊化学製品、およびガソリン添加剤の重要な出発物質であるイソプレンを生成するための脱水／脱炭酸である。イソプレンは石油の分留によって得ることができるが、この材料の精製は高価で時間がかかる。加えて、化石燃料の枯渇によって、この重要な出発物質の別の供給源を見つけることが非常に重要となっている。イソプレンは種々の微生物、植物、および動物種によって自然に作られる。しかしながら、天然生物からのイソプレンの収率は商業的に魅力に欠けている。したがって、バイオマス由来のメバロノラクトンからの大規模なイソプレンおよびその他の合成に有用な中間生成物の合成は、かなりの商業的可能性を持つであろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一態様において、本発明は、（ａ）ＭＶＬまたはＭＶＬを含む溶液を固体触媒の存在下で反応させて第１の生成物または第１の生成混合物を生じさせる方法であって、ＭＶＬを含む溶液は所望によりアンヒドロメバロノラクトンおよび／または共反応物質を含むことを含む方法に関する。
【０００６】
いくつかの実施形態では、共反応物質は、水、アルキルアルコール、エーテル、芳香族化合物、酸、アルデヒド、エステル、およびこれらの混合物からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）は、約１００℃〜約５００℃の範囲の温度で起こる。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）は、およそ準大気圧から約２００ｂａｒの範囲の圧力で起こる。
【０００７】
いくつかの実施形態では、固体触媒は固体酸触媒である。潜在的に好適な固体触媒の非限定的な例示的リストは、官能化スチレン−ジビニルベンゼンコポリマー、官能化テトラフルオロエチレン−フルオロポリマーコポリマー、カルシウムアパタイト、シリカ−アルミナ、シリカ、チタニア、アルミナ、樹脂、金属酸化物、および／またはゼオライトを含む。
【０００８】
いくつかの実施形態では、固体触媒は、金属酸化物触媒および炭素触媒からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、固体触媒は約２０ｍ２／ｇ〜約６００ｍ２／ｇの表面積を有する。いくつかの実施形態では、固体触媒は、酸化ケイ素、酸化アルミニウム、酸化チタン、酸化マグネシウム、酸化ジルコニウム、酸化コバルト、酸化鉄、酸化ニッケル、酸化マンガン、酸化亜鉛、酸化モリブデン、酸化タングステン、酸化カルシウム、酸化セリウム、酸化スズ、および酸化クロム、およびこれらの混合物からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、固体触媒は混合金属酸化物触媒を含む。
【０００９】
本発明のいくつかの実施形態では、固体触媒は、担持遷移金属または貴金属、例えば、パラジウム、マグネシウム、バナジウム、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、ジルコニウム、モリブデン、ルテニウム、ロジウム、銀、スズ、タングステン、タンタル、イリジウム、プラチナ、および金、およびこれらの混合物を含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、第１の生成物または第１の生成混合物は、イソプレン、３−メチル−２−ブタノン、メチルビニルケトン、アンヒドロメバロノラクトン、２−ペンテン、２−メチル−１−ブテン、２−メチル−１−ペンテン、メタン、水素、またはアルキルアルコールの１つ以上を含む。
【００１１】
本発明のいくつかの実施形態では、前述の方法は、当該第１の生成物または第１の生成混合物を第１の試薬および第２の触媒と反応させて、第２の生成物または第２の生成混合物を生じさせ、当該第１の試薬は水またはオレフィンまたはアルコールである、さらなるステップ（ｂ）を含む。いくつかの実施形態では、第１の試薬はオレフィンであり、当該第２の触媒は、パラジウム、プラチナ、ルテニウム、モリブデン、タングステン、レニウム、スズ、およびロジウムオレフィンメタセシス触媒、およびこれらの混合物からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１の試薬はアルコールであり、当該第２の触媒は、均一系および不均一系酸および塩基、糖、リパーゼ、イオン交換樹脂、金属酸化物、およびゼオライト、およびこれらの混合物からなる群から選択される。
【００１２】
いくつかの実施形態では、前述のステップ（ｂ）は、約１００℃〜約５００℃の範囲の温度で行われる。いくつかの実施形態では、この方法は、当該第２の生成物または第２の生成混合物を第２の試薬および第３の触媒と反応させて、第３の生成物または第３の生成混合物を生じさせるステップ（ｃ）をさらに含む。
【００１３】
別の態様では、本発明は、（ａ）ＭＶＬまたはＭＶＬを含む溶液を、約１００℃〜約５００℃の範囲の温度で反応させて第１の生成物または第１の生成混合物を生じさせることを含む方法を提供する。
【００１４】
さらに別の態様では、本発明は、（ａ）生合成ＭＶＬ経路を発現する微生物を提供することと、（ｂ）好適な炭素基質を含む発酵培地で微生物を増殖させ、バイオベースＭＶＬが産生されることと、（ｃ）当該バイオベースＭＶＬを反応させて第１の生成物または第１の生成混合物を生じさせることとを含む方法を提供する。ステップ（ｃ）は、所望により、固体触媒の存在下で、かつ／または約１００℃〜約５００℃の範囲の温度で行われる。
【００１５】
いくつかの実施形態では、上記方法に使用される微生物は、バイオベースＭＶＬ産生を可能にする代謝修飾を含む非天然微生物である。
【００１６】
いくつかの実施形態では、代謝修飾は、ｉ．ｍｖａＥ、ｍｖａＳ；ｉｉ．ｍｖａＥ、ｍｖａＳ、ａｔｏＢ；ｉｉｉ．ａｔｏＢ、ｈｍｇＲ、ｈｍｇＳ；およびｉｖ．ｉ、ｉｉ、またはｉｉｉの機能的相同体からなる群から選択された少なくとも１組の遺伝子の発現を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、代謝修飾は、少なくとも１つの遺伝子、例えば、ａｃｋＡ−ｐｔａ、ａｄｈＥ、および／またはｌｄｈＡの修飾を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態では、使用される発酵培地は再生可能原料を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、実施例１１に使用される高圧小規模ユニットの概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
メバロン酸、メバロネート、およびメバロノラクトンはｐＨに依存する平衡状態で存在する。したがって、「メバロネート」を含有する溶液は、実際にはメバロン酸、メバロネート、および／またはメバロノラクトンを含有していてもよい。加えて、ｐＨに応じて、成分は塩形態であってもよい。選択した試薬に応じて、対イオンは、アンモニウム、ナトリウム、リチウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アルミニウム、またはセシウムのカチオンであり得る。便宜上、メバロノラクトン、すなわち「ＭＶＬ」は本明細書において、総括して使用される。
【００２１】
メバロノラクトン（ＭＶＬ）およびその関連誘導体、例えば、２，３−デヒドロメバロノラクトン（４−メチル−５，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オン、アンヒドロメバロノラクトン、ＡＭＬとも呼ばれる）は、工業規模で調製できる潜在的に豊富な供給原料を代表する。発酵を介したバイオベース製造によって、低揮発性を有する再生可能原料、例えば、糖、グリセリン、合成気体、またはメタンからの高収率かつコスト競争力のあるＭＶＬの製造が可能になる。バイオベースＭＶＬおよびその関連誘導体から製造される化学製品は、石油またはその他の再生不可能な資源を主成分としない安価で再生可能な消費者製品および工業製品への要求を満たすことができるであろう。バイオベースメバロノラクトンはその後、種々の有用な化合物に転換することができる。例示化合物は本明細書に、また参照することにより本明細書中にその全体が組み込まれる２０１５年１１月１２日出願の同時係属の米国仮特許出願第１４／９３９，４３７号に記載される。
【００２２】
本明細書で使用する用語「バイオベース」とは、化合物が生物学的前駆体、特に再生可能な生物学的炭素源、例えば、バイオマスから（再生不可能な石油ベース炭素源とは対照的に）合成されたことを意味する。ＡＳＴＭは、組成物中に含まれるバイオベース材料の濃度を算出するための標準的な方法を設定している。ＡＳＴＭ  Ｄ６８６６−放射性炭素分析を用いた固体、液体、および気体試料のバイオベース含有量を測定する標準試験法。組成物のバイオベース含有量は、材料中の全有機炭素の重量分率（質量）または重量割合（質量）としての材料中のバイオベース炭素の量である。ＡＳＴＭ  Ｄ６８６６は、年齢方程式を用いない放射性炭素年代測定に類似している。これは、材料中の放射性炭素（１４Ｃ）の量対現代標準試料の放射性炭素（１４Ｃ）の量の比を測定することにより行われる。この比は、現代炭素の割合（単位「ｐＭＣ」）と呼ばれる割合として報告される。分析される材料が現代放射性炭素と化石炭素（すなわち、放射性炭素を含有していない）と混合物である場合、得られるｐＭＣ値は、試料中に存在するバイオベース材料の量と直接相関関係を持つ。
【００２３】
ＡＳＴＭ  Ｄ６８６６は、現代のバイオマスベースの投入材料から生じる炭素と化石ベース材料由来の炭素とを区別する。バイオマスは、よく特徴付けられた量の炭素１４を含有し、これは炭素１４をまったく含有しない化石燃料等のその他材料と容易に区別できる。「バイオマス」は、燃料またはエネルギー源として使用される植物性材料、植物、または農業廃棄物として一般に定義される。バイオマス炭素の炭素１４同位体対炭素１２同位体の比は、大気試料からとった炭素１４対炭素１２の現在の天然存在度に基づき約２×１０−１２対１であることが当業者に公知である。バイオマス中の炭素１４の量は公知であるため、再生可能な資源の炭素割合は、試料中の全有機炭素から容易に計算できる。０％の炭素１４は、材料中に炭素１４原子が完全にないことを示し、したがって、化石または石油ベースの炭素源であることを示す。同様に、１００％の炭素１４（大気補正後）は、現代のバイオベース炭素源であることを示す。
【００２４】
放射性炭素年代測定に使用される現代の標準試料は、西暦１９５０年におよそ等しい公知の放射性炭素含有量を用いたＮＩＳＴ（米国国立標準技術研究所）規格である。西暦１９５０年は、爆発の度に大気中に過剰な放射性炭素（「爆発炭素」と呼ぶ）が大量に取り込まれた熱核兵器実験よりも前の時点を表すため選択された。これは、考古学者および地質学者にとって基準として使用するのにもっともな時点であった。参考までに、放射性炭素年代を使用する考古学者または地質学者にとって、西暦１９５０年は「０年」に等しい。また、これは１００ｐＭＣを表す。大気中の「爆発炭素」は、実験ピークであり核実験禁止条約前における１９６３年に通常レベルのほぼ２倍に達した。その出現以来、大気中におけるその分布が概算されているが、西暦１９５０年以来生存している植物および動物については１００ｐＭＣより大きい値を示している。これは、時間と共に徐々に減少し、現代の値は１０５ｐＭＣ付近である。これは、新鮮なバイオマス材料、例えば、トウモロコシ、サトウキビ、またはダイズ等が、１０５ｐＭＣ付近の放射性炭素の痕跡を与えるであろうことを意味する。約１０５ｐＭＣが、現代のバイオマス材料を表し、０ｐＭＣが、石油誘導体を表すと推定すると、その材料について測定したｐＭＣ値は、２つの成分のタイプの比率を反映するであろう。例えば、現代のダイズに１００％由来する材料は、１０５ｐＭＣ付近の放射性炭素の痕跡を与えるであろう。しかし、これを５０％石油誘導体で希釈した場合、５３ｐＭＣ付近の放射性炭素の痕跡が得られるであろう。
【００２５】
材料の「バイオベース含有量」は、全有機炭素に対する全再生可能有機炭素に関する百分率の値として報告される。最終結果は、材料について測定したｐＭＣ値に０．９５を乗じて（爆発炭素効果を調整するため）算出する。最終％値は、平均バイオベース結果として引用され、分析される材料中の全成分が現代生物（過去数十年内）起源であるかまたは化石起源であるかを仮定する。一態様において、本発明に使用する材料（例えば、前駆体化合物または得られるポリマー）は、０％超、より好ましくは１０％超、より好ましくは２５％超、より好ましくは５０％超、さらに好ましくは７５％超のバイオベース含有量を有する。好ましくは、本発明に使用する材料は、ＡＳＴＭ  Ｄ６８６６に従って実質的に全体がバイオベースであり、これは、９５％以上が生物由来であることを意味する。したがって、バイオベース製品は石油ベース製品とは炭素フィンガープリントにより区別できることが認識されるだろう。したがって、本発明によるバイオベースポリマーおよびポリマー前駆体は、石油（再生不可能）起源の同種のポリマーよりも多い放射性炭素１４（１４Ｃ）含有量または高い１４Ｃ／１２Ｃ比を有する。一態様において、バイオベースポリマー前駆体および／または得られるポリマーは、０超、好ましくは１超の１４Ｃ／１２Ｃ比を有する。
【００２６】
バイオベースＭＶＬは、同時係属の米国仮特許出願第１４／９３９，４３７号に記載されるように、いくつかの種類のポリマーの製造の一般的な出発物質として機能することができる 。
【００２７】
例えば、ＭＶＬおよびＡＭＬ自体は重合反応のためのモノマーである。ＭＶＬおよびＡＭＬのラクトン構造により、開環共重合が可能となる。ＭＶＬ誘導β−メチル−δ−バレロラクトンの開環共重合が既に報告されている。開環重合に加えて、ＡＭＬは、フリーラジカル重合反応のためのコモノマーであってよい。ＭＶＬの脱水反応の間、不飽和の位置が異なるさまざまなＡＭＬ異性体、すなわち、３，４−デヒドロメバロノラクトン（４−メチル−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オン）、４，５−デヒドロメバロノラクトン（４−メチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オン）、およびエキソデヒドロメバロノラクトン（４−メチレンテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オン）を得ることができる。これらの異性体は、ＡＭＬと同様に開環およびフリーラジカル重合のためのモノマーとして利用できる。
【００２８】
ＭＶＬおよび上述の関連化合物の直接重合に加えて、これらは逐次ポリマーの構築ブロック、例えば、とりわけジオールおよび二酸に転換できる。これらの転換は、化学反応の種類により大まかに分類できる：ｉ）酸化、ｉｉ）還元、ｉｉｉ）ラクトン開環、ｉｖ）オレフィン修飾、およびｖ）アルコール修飾。
【００２９】
α，ω−ジカルボン酸を得るためのＭＶＬおよび関連ラクトンの完全な酸化は、高原子価金属酸化物、例えば、とりわけＣｒＯ６またはＫＭｎＯ４を用いた処理により実現できる。当該高原子価金属酸化物は化学量論的強酸化剤の存在下で触媒量で利用されてもよい。一級アルコールのカルボン酸への酸化は、硝酸または酸化剤としての酸素分子を用いても可能である。上記の試薬の例は、カルボン酸およびラクトンの酸化に見出すことができる。ＭＶＬ誘導ジカルボン酸は、いくつか例を挙げるとポリエステル、アルキド樹脂、不飽和ポリエステル樹脂、ポリエステルポリオール、またはポリアミドの構築ブロックとしての用途を見出すことができる。
【００３０】
ＭＶＬおよび関連ラクトンの完全な還元は置換α，ω−ジオールをもたらす。金属触媒の存在下で金属水素化物、例えば、リチウムテトラヒドリドアルミネート、元素状ナトリウム、または水素を利用して、ラクトン官能基を２つの一級アルコールに還元できる。これらのＭＶＬ誘導ジオールおよびポリオールは、とりわけ、ポリエステル、アルキド樹脂、不飽和ポリエステル樹脂、ポリエステルポリオール、ポリカーボネート、またはビニルウレタン樹脂の構築ブロックとして使用されてもよい。
【００３１】
求核試薬、例えば、アルコール、チオール、またはアミンはラクトンを開環できる。二官能性または多官能性求核試薬を用いたＭＶＬおよび関連ラクトンの反応は、置換開環ＭＶＬ系ジオールまたはポリオールの形成をもたらす。求核試薬は、ホモ官能性、例えば、とりわけグリセロールもしくはエチレンジアミン、またはヘテロ官能性、例えば、とりわけエタノールアミンもしくはメルカプトエタノールのいずれかであることができる。これらの開環誘導体の使用は、上述のＭＶＬ還元生成物に相当する。
【００３２】
ＡＭＬおよびその異性体におけるアルケン基の修飾としては、とりわけ、エポキシ化、ジヒドロキシル化、マイケル付加、ディールス−アルダー反応、または［２＋２］付加環化が挙げられる。反応生成物は、官能基が多様であり、かつおそらくは種々のポリマーのための構築ブロックとして機能する。ラクトン官能基は上述のすべての反応において保存されている。これら化合物の開環重合は、とりわけ熱可塑性エラストマー、不飽和ポリエステル樹脂、またはポリウレタンとしての用途を持つ変性脂肪族ポリエステルを形成することができる。
【００３３】
ＭＶＬの三級アルコールは修飾されてエーテル誘導体およびエステル誘導体を形成できる。重合を促進する官能基または可溶性および接着性等の特性を取り込むことができる。ペンダントＭＶＬエステル基を有するメタクリレートがＭＶＬから得ることができるとの報告がある。この二官能性付加化合物は、フリーラジカルおよび開環重合に関与してアクリル樹脂およびビニルポリエステルを生成することが想定され得る。
【００３４】
ＭＶＬ誘導ジオールもしくはポリオールおよび二酸もしくはポリ酸もまたエポキシ樹脂、ポリ（ビニルエーテル）、または多官能性環状カーボネートの前駆体として機能することができる。
【００３５】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＭＶＬまたはＭＶＬを含む溶液を、第１の生成物または第１の生成混合物を生じる条件下で反応させる第１のステップを含む方法を提供する。次いで、任意の第２のステップでは、第１の生成物または第１の生成混合物は、所望により触媒存在下にて、試薬とさらに反応させることができる。本発明のいくつかの実施形態では、試薬はオレフィンまたはアルコールである。任意の第３のステップでは、この反応から得られる第２の生成物または第２の生成混合物は、再び任意により触媒の存在下で同じまたは別の試薬と反応させ、第３の生成物または第３の生成混合物を生じさせることができる。本明細書において使用される場合、用語「生成混合物」は、構造が異なる化合物の混合物を意味する。
【００３６】
本発明の特定の態様では、生成物または生成混合物は、例えば、同時係属の米国仮特許出願第１４／９３９，４３７号に記載されるように、バイオベースＭＶＬまたはＭＶＬ誘導体のポリマー前駆体化合物（別名ポリマー構築ブロック）を含む。１つ以上の実施形態において、本発明のポリマー前駆体化合物は、開環バイオベースＭＶＬまたはその誘導体を含む。本発明のポリマー前駆体化合物の例としては、バイオベースＭＶＬジオール、バイオベースＭＶＬ二酸、およびバイオベースＭＶＬグリシジルエーテル／エステルが挙げられる。本発明は、前述のバイオベースＭＶＬ前駆体化合物の１つ以上から調製されたポリマーを含む開環バイオベースＭＶＬ化合物の１つ以上を含む組成物の合成を容易にする。本発明はさらに、本明細書に記載されるバイオベースＭＶＬまたは誘導体から調製されるさまざまなその他のバイオベースポリマーおよびオリゴマーを提供する。
【００３７】
より詳細には、バイオベース化合物、特にバイオベースＭＶＬおよびその関連誘導体から誘導された化合物（例えば、モノマー、オリゴマー、および／またはポリマー）、ならびにこれらの化合物を合成する方法が本明細書に記載されている。例えば、酸化を通じて、これらのバイオベース前駆体が反応して、（不飽和）ポリエステル、ポリエステルポリオール、およびポリアミドのための構築ブロック、ならびにグリシジルエステルおよびω−アルケニルエステル（例えば、アリルエーテル、ホモアリルエーテル、ビニルエーテル等）の前駆体を生じることができる。
【００３８】
本発明の方法ステップは好ましくは、溶液中、例えば、溶媒の存在下において実施される。いくつかの実施形態では、溶媒は、ＭＶＬ、ＭＶＬの誘導体、またはＭＶＬから誘導された何らかの他の化合物と反応させることで共反応物質として機能する。本発明のいくつかの実施形態では、水は、溶媒として使用される。その他の溶媒、例えば、直鎖、分枝鎖、または環状アルコールまたはジオール（すなわち、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ｓｅｃ−ブタノール、シクロブタノール、グリセロール、２−エチルヘキサノール、プロパンジオール、ブタンジオール、ラウリルアルコール等）を使用してもよい。その他の好適な溶媒としては、極性非プロトン性溶媒、例えば、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、その他の直鎖または環状エーテル、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジオキサン等が挙げられる。一般的に、当業者に容易に認識されるように、アルキルアルコール、エーテル、芳香族化合物、酸、アルデヒド、エステルは、すべて本発明の種々の実施形態において有効な溶媒および共反応物質として機能することができる。水およびこれらの溶媒（およびその他の好適な溶媒）の混合物も使用してよい。
【００３９】
本発明のいくつかの実施形態では、方法ステップの１つ以上は触媒存在下にて起こる。触媒は現在公知の触媒または将来的に開発される触媒であってよい。いくつかの実施形態では、限定されないが特に第１のステップに関して特に好ましい触媒は固体触媒である。本発明の好ましい触媒としては、固体酸触媒、金属酸化物触媒、および炭素触媒が挙げられる。固体酸触媒は、現在公知のものであれ将来的に開発されるものであれ制限なく１種以上の固体酸材料を含んでよい。利用可能な例示的な固体酸触媒としては、熱安定性担体におけるヘテロポリ酸、酸性樹脂タイプの触媒、メソポーラスシリカ、酸性白土、硫酸化ジルコニア、分子ふるい材料、ゼオライト、および酸性物質が挙げられるが、これらに限定されない。酸性物質が熱安定性担体に付与される場合、熱安定性担体としては、例えば、シリカ、酸化スズ、ニオビア、ジルコニア、チタニア、炭素、α−アルミナ等のうちの１つ以上を挙げることができる。任意で追加の酸性基、例えば、サルフェート、ホスフェート等がドープされていてもよい酸化物それ自体（例えば、ＺｒＯ２、ＳｎＯ２、ＴｉＯ２等）はさらに、固体酸触媒としても使用することができる。好適な固体酸触媒のさらなる例としては、強酸性イオン交換体、例えば、スルホン酸基を含む架橋ポリスチレンが挙げられる。例えば、Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ樹脂（登録商標）は、異なる表面特性および多孔性を有する官能化スチレン−ジビニルベンゼンコポリマーである。官能基は一般に硫酸タイプのものである。Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ樹脂（登録商標）は、ゲル状またはマクロ孔質球状ビーズとして供給される（Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ（登録商標）はミシガン州ミッドランドのＤｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．の登録商標である）。同様に、Ｎａｆｉｏｎ樹脂（登録商標）は、固体酸触媒であるスルホン化テトラフルオロエチレン系フルオロポリマーコポリマーである（Ｎａｆｉｏｎ（登録商標）はデラウェア州ウィルミントンのＥ．Ｉ．  ｄｕ  Ｐｏｎｔ  ｄｅ  Ｎｅｍｏｕｒｓ＆Ｃｏ．の登録商標である）。ゼオライトも固体酸触媒として使用してよい。これらのうち、一般的にＨ型ゼオライト、例えば、モルデナイトグループのゼオライトまたは細孔ゼオライト、例えば、ゼオライトＸ、Ｙ、およびＬ（すなわち、モルデナイト、エリオナイト、菱沸石、またはフォージャサイト）が好ましい。さらなるゼオライトは、脱アルミン酸されたフォージャサイトグループの超安定性ゼオライトである。固体酸触媒は、好ましくは、官能化スチレン−ジビニルベンゼンコポリマー、官能化テトラフルオロエチレン−フルオロポリマーコポリマー、カルシウムアパタイト、シリカ−アルミナ、シリカ、チタニア、アルミナ、樹脂、金属酸化物、およびゼオライトからなる群から選択される。
【００４０】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、使用される触媒は、酸化ケイ素、酸化アルミニウム、酸化チタン、酸化マグネシウム、酸化ジルコニウム、酸化コバルト、酸化鉄、酸化ニッケル、酸化マンガン、酸化亜鉛、酸化モリブデン、酸化タングステン、酸化カルシウム、酸化セリウム、酸化スズ、および酸化クロム、およびこれらの混合物からなる群から選択される。本発明のいくつかの好ましい実施形態は、混合金属酸化物触媒を含む固体触媒、すなわち、２種以上の異なる金属または金属酸化物を含む触媒を利用する。いくつかの好ましい実施形態では、本発明の方法は不均一系触媒を利用する。いくつかの実施形態では、硫酸水素カリウムは、第１の触媒のための固体酸触媒のリストから除外される。
【００４１】
いくつかの実施形態では、本発明に使用される固体触媒は、担持遷移金属または貴金属を含む。本発明により包含される遷移金属または貴金属の例示的な非限定的なリストは、パラジウム、マグネシウム、バナジウム、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、ジルコニウム、モリブデン、ルテニウム、ロジウム、銀、スズ、タングステン、タンタル、イリジウム、プラチナ、および金、およびこれらの混合物を含む。
【００４２】
本発明のいくつかの実施形態では、第２のステップがオレフィンを用いた反応を含む場合、ルテニウム、モリブデン、タングステン、レニウム、スズ、およびロジウムオレフィンメタセシス触媒、およびこれらの混合物からなる群から選択される触媒が利用される。その他の実施形態では、第２のステップがアルコールを用いた反応を含む場合、均一系および不均一系酸および塩基、糖、リパーゼ、イオン交換樹脂、金属酸化物、およびゼオライト、およびこれらの混合物からなる群から選択される触媒が利用される。
【００４３】
本発明の触媒は広範囲の表面領域によって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、１ｍ２／ｇ、５ｍ２／ｇ、１０ｍ２／ｇ、２０ｍ２／ｇ、５０ｍ２／ｇ、１００ｍ２／ｇ、または２００ｍ２／ｇ以上の表面積を有する固体触媒が使用される。いくつかの実施形態では、５０ｍ２／ｇ、１００ｍ２／ｇ、２００ｍ２／ｇ、６００ｍ２／ｇ、１０００ｍ２／ｇ、または２０００ｍ２／ｇ以下の表面積を有する固体触媒が使用される。例示的だが非限定的な実施例としては、いくつかの好ましい実施形態では、固体触媒は２０ｍ２／ｇ〜６００ｍ２／ｇの表面積を有する。
【００４４】
いくつかの実施形態では、第１の生成物または第１の生成混合物は、イソプレン、３−メチル−２−ブタノン、メチルビニルケトン、アンヒドロメバロノラクトン、２−ペンテン、２−メチル−１−ブテン、２−メチル−１−ペンテン、メタン、水素、またはアルキルアルコールの１つ以上を含む。
【００４５】
いくつかの実施形態では、第１の生成物または第１の生成混合物は、独立して、
【００４６】
【化１】
2017538403.tif 000003
からなる群から選択される化合物を含む。
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、Ｈ、分岐鎖および非分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３アルキル、ならびに分枝鎖および非分岐鎖Ｃ２〜Ｃ４アルケニルからなる群から独立して選択される。
【００４７】
好ましい実施形態では、第１の生成物または第１の生成混合物は、独立して、
【００４８】
【化２】
2017538403.tif 000004
からなる群から選択される化合物を含む。
【００４９】
一実施形態において、任意の第２のステップのオレフィンは、好ましくは、分岐鎖および非分岐鎖Ｃ２〜Ｃ２０アルケン、分岐鎖および非分岐鎖Ｃ３〜Ｃ２０アルケン酸（ａｌｋｅｎｉｃ  ａｃｉｄ）、分岐鎖および非分岐鎖Ｃ３〜Ｃ２０アルケン酸エステルなる群から選択され、オレフィンは場合により置換されている。オレフィンは、より好ましくは、エテン、プロペン、１−ブテン、２−ブテン、２−メチル−２−プロペン、アクリル酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、およびアラキドン酸、およびこれらのエステルからなる群から選択される。
【００５０】
第２のステップは第２の触媒をさらに含んでよい。一実施形態において、第２の触媒は、好ましくは、パラジウム、プラチナ、ルテニウム、モリブデン、タングステン、レニウム、スズ、およびロジウムオレフィンメタセシス触媒、およびこれらの混合物からなる群から選択されるオレフィンメタセシス触媒である。特定の触媒の例は、主な文献、特許文献、および雑誌、例えば、Ｇｒｕｂｂｓ，Ｒ．Ｈ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１１年、１３３巻、７４９０〜７４９６ページ；Ｋａｄｙｒｏｖ，Ｒ．ら、Ｔｏｐ．Ｃａｔａｌ．２０１２年、５５巻、５３８〜５４２ページ；Ｈｏｖｅｙｄａ，Ａ．Ｈ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００９年、１３１（３１）巻、１０８４０〜１０８４１ページ；Ｇｒｕｂｂｓ，Ｒ．Ｈ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２年、１３４（１）巻、６９３〜６９９ページ；Ｓｃｈｒｏｄｉ，Ｙ．ら、Ｃｌｅａｎ  ２００８年、３６（９）巻、６６９〜６７３ページ；Ｅｌｅｖａｎｃｅ  Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．の米国特許出願公開第２０１３／０２８９３２７号；およびＢｕｒｋ，Ｍ．Ｊ．らの米国特許出願公開第２００９／０１５５８６６号に見出すことができる。好ましい触媒は以下に示される（Ｇｒｕｂｂｓ，Ｒ．Ｈ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１１年、１３３巻、７４９０〜７４９６ページ）。
【００５１】
【化３】
2017538403.tif 000005
【化４】
2017538403.tif 000006
【００５２】
一実施形態において、第２のステップのアルコールは、好ましくは、分岐鎖および非分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３４アルキルアルコール、分岐鎖および非分岐鎖Ｃ２〜Ｃ２０アルキルジオール、ならびに分岐鎖および非分岐鎖Ｃ２〜Ｃ３４アルケノールなる群から選択される。アルコールは、より好ましくは、メタノール、エタノール、グリセロール、２−エチルヘキサノール、プロパンジオール、ブタンジオール、およびラウリルアルコールからなる群から選択される。
【００５３】
第２のステップは第２の触媒をさらに含んでよい。一実施形態では、第２の触媒は、好ましくは、均一系および不均一系酸および塩基、糖、リパーゼ、イオン交換樹脂、金属酸化物、およびゼオライトからなる群から選択される。第２の触媒はより好ましくは、ＫＯＨ、ＫＯＣＨ３、ＮａＯＣＨ３、ＮａＯＨ、Ｈ２ＳＯ４、およびこれらの混合物からなる群から選択される。
【００５４】
国際純正および応用化学連合（ＩＵＰＡＣ）は、本明細書に記載されている化合物のいくつかを以下のように名付けている：メバロン酸：３，５−ジヒドロキシ−３−メチルペンタン酸；メバロノラクトン：４−ヒドロキシ−４−メチルテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オン；脱水メバロノラクトン：４−メチル−５，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オン（異性体１）および４−メチル−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オン（異性体２）；脱水メバロン酸：（Ｅ）−５−ヒドロキシ−３−メチルペンタ−２−エン酸（異性体１）および（Ｅ）−５−ヒドロキシ−３−メチルペンタ−３−エン酸（異性体２）。
【００５５】
第１の反応後かつ第２の反応前に、当該化合物または化合物の混合物を含有する溶液中に存在する水の少なくとも一部が除去されることが好ましい。水分離ステップは、特に水中触媒が第２のステップに使用される場合、または水による希釈が望ましい場合、任意である。
【００５６】
本発明の反応は好ましくは、約２５０Ｋ〜約１０００Ｋの範囲で行われる。本発明のいくつかの実施形態では、反応ステップは、約２５℃、５０℃、１００℃、１５０℃、２００℃、３００℃、４００℃、または５００℃以上の温度で実施される。本発明のいくつかの実施形態では、反応ステップは、約１００℃、１５０℃、２００℃、３００℃、４００℃、５００℃、６００℃、または７５０℃以下の温度で実施される。本発明の特定の好ましい実施形態に利用される温度範囲の非限定的だが例示的な例としては、約１００℃〜５００℃、約１５０℃〜５００℃、約２００℃〜５００℃、約２５０℃〜５００℃、約１００℃〜４００℃、約１５０℃〜４００℃、約２００℃〜４００℃、および約２５０℃〜５００℃が挙げられる。本発明の反応は、触媒の存在下または不存在下のいずれかで実施され、適切な触媒の存在下で良好な効果のためにより低い温度を利用できることが一般的であり、これは当業者により容易に決定できる。
【００５７】
本発明の反応は準大気圧から極めて高い圧力までのさまざまな圧力範囲で実施されてもよい。本発明のいくつかの実施形態では、反応ステップは、およそ大気圧、２ｂａｒ、５ｂａｒ、１０ｂａｒ、２０ｂａｒ、３５ｂａｒ、５０ｂａｒ、１００ｂａｒ、２００ｂａｒ、５００ｂａｒ、またはこれ以上の圧力で実施される。本発明のいくつかの実施形態では、反応ステップは、大気圧、２ｂａｒ、５ｂａｒ、１０ｂａｒ、２０ｂａｒ、３５ｂａｒ、５０ｂａｒ、１００ｂａｒ、２００ｂａｒ、５００ｂａｒ、または１０００ｂａｒ以下の圧力で実施される。本発明の特定の好ましい実施形態で利用される圧力範囲の非限定的だが例示的な例としては、０〜１５ｂａｒ、２ｂａｒ〜１００ｂａｒ、５ｂａｒ〜１００ｂａｒ、１０ｂａｒ〜１００ｂａｒ、２０ｂａｒ〜１００ｂａｒ、３５ｂａｒ〜１００ｂａｒ、および５０ｂａｒ〜１００ｂａｒが挙げられる。場合によっては、本発明の所望の出力は、触媒の存在下または不存在下にて比較的高い温度および圧力の組み合わせを使用することにより向上させることができる。例えば、本発明のいくつかの実施形態では、反応の１つ以上は、１００℃〜５００℃の範囲の温度および２０ｂａｒ〜１００ｂａｒの範囲の圧力、または２００℃〜５００℃の範囲の温度および２０ｂａｒ〜１００ｂａｒの範囲の圧力で起こる。
【００５８】
一実施形態では、第２のステップから生じる生成物または生成混合物は、独立して、
【００５９】
【化５】
2017538403.tif 000007
からなる群から選択され、
式中、Ｒ６は、分岐鎖および非分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３４アルカン、分岐鎖および非分岐鎖Ｃ２〜Ｃ２０アルキルアルコール、ならびに分岐鎖および非分岐鎖Ｃ２〜Ｃ３４アルケンなる群から選択され、より好ましくは、メチル、エチル、グリセリル、２−エチルヘキシル、２−プロパノリル、ブタノリル、およびラウリルからなる群から選択される。
【００６０】
別の実施形態では、第２のステップの生成物または生成混合物は、第３の温度および第３の圧力で試薬および触媒と組み合わせられてもよい。好ましい実施形態では、試薬はオレフィンであり、触媒は、好ましくは、パラジウム、プラチナ、ルテニウム、モリブデン、タングステン、レニウム、スズ、およびロジウムオレフィンメタセシス触媒、およびこれらの混合物からなる群から選択されるオレフィンメタセシス触媒である。特定の触媒の例は、主な文献、特許文献、および雑誌、例えば、Ｇｒｕｂｂｓ，Ｒ．Ｈ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１１年、１３３巻、７４９０〜７４９６ページ；Ｋａｄｙｒｏｖ，Ｒ．ら、Ｔｏｐ．Ｃａｔａｌ．２０１２年、５５巻、５３８〜５４２ページ；Ｈｏｖｅｙｄａ，Ａ．Ｈ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００９年、７５７（３１）巻、１０８４０〜１０８４１ページ；Ｇｒｕｂｂｓ，Ｒ．Ｈ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２年、１３４（１）巻、６９３〜６９９ページ；Ｓｃｈｒｏｄｉ，Ｙ．ら、Ｃｌｅａｎ  ２００８年、３６（９）巻、６６９〜６７３ページ；Ｅｌｅｖａｎｃｅ  Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．の米国特許出願公開第２０１３／０２８９３２７号；およびＢｕｒｋ，Ｍ．Ｊ．らの米国特許出願公開第２００９／０１５５８６６号に見出すことができる。好ましい触媒はスキーム１に示される（Ｇｒｕｂｂｓ，Ｒ．Ｈ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１１年、１３３巻、７４９０〜７４９６ページ）。第３のステップのオレフィンは、好ましくは、分岐鎖および非分岐鎖Ｃ２〜Ｃ２０アルケン、分岐鎖および非分岐鎖Ｃ３〜Ｃ２０アルケン酸、分岐鎖および非分岐鎖Ｃ３〜Ｃ２０アルケン酸エステルなる群から選択され、オレフィンは場合により置換されている。オレフィンは、より好ましくは、エテン、プロペン、１−ブテン、２−ブテン、２−メチル−２−プロペン、アクリル酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、およびアラキドン酸、およびこれらのエステルからなる群から選択される。
【００６１】
別の好ましい実施形態では、試薬はアルコールであり、触媒は、均一系および不均一系酸および塩基、糖、リパーゼ、イオン交換樹脂、金属酸化物、およびゼオライトからなる群から選択される。触媒はより好ましくは、ＫＯＨ、ＫＯＣＨ３、ＮａＯＣＨ３、ＮａＯＨ、Ｈ２ＳＯ４、ＨＣｌ、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ樹脂（登録商標）、Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ樹脂（登録商標）、ＣａＯ−ＣｅＯ２、ＺＳＭ−５ゼオライト、およびこれらの混合物からなる群から選択される。第３のステップのアルコールは、好ましくは、分岐鎖および非分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３４アルキルアルコール、分岐鎖および非分岐鎖Ｃ２〜Ｃ２０アルキルジオール、ならびに／または分岐鎖および非分岐鎖Ｃ２〜Ｃ３４アルケノールなる群から選択される。アルコールは、より好ましくは、メタノール、エタノール、グリセロール、２−エチルヘキサノール、プロパンジオール、ブタンジオール、および／またはラウリルアルコールからなる群から選択される。
【００６２】
別の実施形態では、第１のステップから得られる生成物または生成混合物は、Ｃ８以下を有する分子を含む。ｐＨに応じて、成分は塩形態であってもよい。いくつかの実施形態では、選択した試薬に応じて、対イオンは、アンモニウム、ナトリウム、リチウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アルミニウム、および／またはセシウムのカチオンから独立して選択される。
【００６３】
いくつかの実施形態では、生成物または第１の生成混合物は、独立して、
【００６４】
【化６】
2017538403.tif 000008
からなる群から選択される化合物を含む。
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、Ｈ、分岐鎖および非分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３アルキル、ならびに分岐鎖および非分岐鎖Ｃ２〜Ｃ４アルケニルからなる群から独立して選択される。
【００６５】
化学製品、例えば、バイオベースＭＶＬをバイオ産生するための１つの有用な方法は発酵である。発酵手順は当業者に周知されている。メバロネート等の標的化合物の生合成製造のための一組の相補的代謝生物の発酵は、例えば、バッチ発酵、流加発酵、または連続発酵に利用できる。加えて、これらの発酵方法のいずれかはさらに、バッチ分離または連続分離等の発酵手順に適用できる周知の分離方法と併用できる。メバロネート等の標的化合物の生物学的製造に適用可能な発酵方法および分離方法の例示的な組み合わせとしては、例えば、バッチ発酵およびバッチ分離、バッチ発酵および連続分離、流加発酵およびバッチ分離、流加発酵および連続分離、連続発酵およびバッチ分離、または連続発酵および連続分離が挙げられる。バッチ発酵手順および連続発酵手順の例は当該技術分野において周知である。
【００６６】
メバロネートは天然微生物および非天然微生物の両方から産生され得る。いくつかの実施形態では、本発明は、生合成ＭＶＬ経路によりＭＶＬおよび／またはＭＶＬ誘導体を発現できる遺伝子組換えされた非天然微生物を提供する。本発明は、バイオベースＭＶＬおよびＭＶＬ誘導体の産生における生合成ＭＶＬ経路を発現でき、好ましくは実際に発現する天然および非天然微生物の両方を用いる方法をさらに提供する。例えば、いくつかの実施形態では、本発明は、（ａ）生合成ＭＶＬ経路を発現する微生物を提供するステップと、（ｂ）好適な炭素基質を含む発酵培地で微生物を増殖させ、バイオベースＭＶＬが産生されるステップとを含む方法を提供する。
【００６７】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、本発明は、（ａ）生合成ＭＶＬ経路を発現する微生物を提供するステップと、（ｂ）好適な炭素基質を含む発酵培地で微生物を増殖させ、バイオベースＭＶＬが産生されるステップと、（ｃ）当該バイオベースＭＶＬを反応させて生成物または生成混合物を生じさせるステップとを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、反応は触媒、好ましくは、固体触媒の存在下にて起こる。いくつかの実施形態では、反応は高温および／または高圧で起こる。いくつかの実施形態では、第１の生成物または生成混合物は、その後、１つ以上の後の反応でさらに反応する。例えば、第１の生成物または生成混合物は、上述のように、任意で触媒存在下にて、かつ任意で高温および／または高圧で、アルコールまたはオレフィンと反応できる。
【００６８】
いくつかの実施形態では、本発明は、代謝修飾、例えば、バイオベースＭＶＬ産生を可能にする代謝修飾を導入することによって非天然微生物を形成する方法を提供する。いくつかの好ましい実施形態では、代謝修飾は、ｉ．ｍｖａＥ、ｍｖａＳ；ｉｉ．ｍｖａＥ、ｍｖａＳ、ａｔｏＢ；および／またはｉｉｉ．ａｔｏＢ、ｈｍｇＲ、ｈｍｇＳ、またはこれらの機能的相同体（またはオルソロガス遺伝子）の遺伝子セットのうち少なくとも１つを含む。語句「機能的相同体」とは、共通の祖先および配列保存のため類似しており、触媒、細胞、または生物レベルで同一または類似の機能を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を意味する。このような代謝修飾は、メバロネートの安定した産生を可能にできる。本発明は、得られる非天然微生物および本発明のさまざまな態様を具現するさまざまな方法でこれを使用する方法をさらに提供する。上述の方法のいずれかで産生されるメバロネートは、上述したように、メバロネートが次のステップの前に単離されないように、または次のステップの前に分離されないように、統合方法で使用されてもよい。
【００６９】
いくつかの実施形態では、代謝修飾はさらに、少なくとも１つの遺伝子の修飾または阻害を含む。好ましい実施形態では、遺伝子は、独立して、ａｄｈ１〜ａｄｈ７、ｇｐｄ１、ｇｐｄ２、ａｃｋＡ−ｐｔａ、ａｄｈＥ、およびｌｄｈＡからなる群から選択される。一実施形態において、非天然微生物は、バクテリア、酵母菌、藻類、および真菌からなる群から選択される。例示的なバクテリアとしては、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ａ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ、Ａ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｍ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ、Ｒ．ｅｔｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ  Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｓｐ．、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａからなる群から選択される種が挙げられる。例示的な酵母菌としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ａｒｒｈｉｚｕｓ、およびＰｉｃｈｉａ  ｓｐ．からなる群から選択される種が挙げられる。いくつかの実施形態では、微生物は、メタン資化性または光合成微生物、例えば、メタン資化性または光合成バクテリアである。
【００７０】
一実施形態において、メバロネートは、天然のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ  ｆｉｂｕｌｉｇｅｒａ  ＩＦＯ  ０１０７を利用して産生できる（Ｋｏｉｋｅら、Ｊ．Ｆｅｒｍ．Ｂｉｏｅｎｇ．１９８９年、６８（１）巻、５８〜５９ページ）。別の実施形態では、メバロネート（ＭＶＡ）はＭＶＡ生合成のために遺伝子を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉで産生された。ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ（ｍｖａＳ）および二官能性ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素／アセチルＣｏａＡアセチルトランスフェラーゼ（ｍｖａＥ）およびアセチルＣｏａＡアセチルトランスフェラーゼ（ａｔｏＢ）はクローニングされて、内因性アセチルＣｏＡプールを利用したＥ．ｃｏｌｉにおけるメバロネートの産生経路を提供する。類似の方法は文献で実証される（Ｚｈａｎｇ，Ｋ．ら、ＰＮＡＳ  ２０１４年、１１１（２３）巻、８３５７〜８３６２ページ；Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｓ．−Ｉ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌｅｔ．２００４年、２６巻、１４８７〜１４９１ページ；Ｅｎｄｏ，Ａ．ら、Ｊ．Ｆｅｒｍ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎ．１９８９年、６８（１）巻、５８〜５９ページ）。
【００７１】
別の実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３）は、Ｔ７プロモータによって推進されるコドン最適化Ｅ．ｆｅａｃａｌｉｓ  ｍｖａＥおよびｍｖａＳ遺伝子を過剰発現し、クローニングされてメバロネート産生経路を提供した。
【００７２】
別の実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＣＥＮ．ＰＫは、コドン最適化Ｅ．ｆｅａｃａｌｉｓ  ｍｖａＥおよびｍｖａＳ遺伝子を過剰発現し、クローニングされてメバロネート産生経路を提供した。
【００７３】
別の実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３）は、すべてＴ７プロモータによって推進される、Ｅ．ｃｏｌｉ  ａｔｏＢ遺伝子と一緒にコドン最適化Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｈｍｇＳおよびｈｍｇＲ遺伝子を過剰発現し、組換えられてメバロネート産生経路を提供した。
【００７４】
別の実施形態では、メバロネートは、文献で実証されるように、合成ガスまたはＣＯ２／Ｈ２ブレンドを利用してＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．ＭＴ１２４３を使用して産生され得る（Ｋｉｒｉｕｋｈｉｎ，Ｍ．ら、Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｂｉｏｓｙｓｔ．Ｅｎｇ．２０１４年、３７巻、２４５〜２６０ページ）。合成ガスまたは合成気体は、さまざまな炭素材料、例えば、石炭、酸加水分解リグノセルロースバイオマス、製鋼所の排気物からのガス回収、または天然ガスから入手可能である。
【００７５】
別の実施形態では、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓは、すべてＣａＭＶ３５Ｓプロモータによって推進される、Ｅ．ｃｏｌｉ  ａｔｏＢ遺伝子と一緒にコドン最適化Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｖａＥおよびｍｖａＳ遺伝子を過剰発現し、組換えられて、光合成的独立栄養条件、混合栄養条件、または従属栄養条件のいずれかでＣＯ２からメバロネート産生経路を提供する。
【００７６】
別の実施形態では、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓは、すべてＴｒｃプロモータによって推進される、Ｅ．ｃｏｌｉ  ａｔｏＢ遺伝子と一緒にコドン最適化Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ  ｍｖａＥおよびｍｖａＳ遺伝子を過剰発現し、組換えられて、メタンまたはメタノールからメバロネート産生経路を提供する。
【００７７】
メバロネートを産生する微生物の発酵は、炭素およびエネルギー、例えば、グルコース、スクロース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、ＣＯ、Ｈ２、またはＣＯ２、および光、またはこれらの組み合わせを必要とする。これらのエネルギー源を供給する例示的な材料および／または基質としては、バイオマス、再生可能原料、天然ガス、バイオガス、石炭、および原油が挙げられる。バイオマスは任意の植物由来の有機材料として定義される。最適には、エネルギーのためのバイオマスは、持続可能な基材、例えば、草質エネルギー作物および木質エネルギー作物、農産食品および飼料作物、農作物廃棄物および残渣、木質廃棄物および残渣、水生植物、ならびにその他の廃棄物（すなわち、何らかの一般廃棄物）から得られる。供給原料として使用可能なバイオマスの供給源は、セルロース系バイオマス、ヘミセルロース系バイオマス、またはリグノセルロース系バイオマス、例えば、農業残渣（すなわち、小麦ストラス（ｓｔｒａｓｓ）トウモロコシ茎葉、バガス、小麦または綿の木くず）、クサヨシ、トウモロコシ、小麦、綿、木くず、またはエネルギー作物（すなわち、ススキ）である。再生可能原料は、再生可能なエネルギー供給源、例えば、バイオマス由来の材料を含む生命体またはその代謝副産物に由来する材料として定義される。農業残渣の利用に加えて、再生可能原料として使用するために栽培される作物としては、トウモロコシ、ダイズ、アメリカクサキビ、小麦、アマニ、サトウキビ、パーム油、および樹木（すなわち、ポプラ）が挙げられる。
【００７８】
バイオマスおよび再生可能原料は、さまざまな炭化水素の特に有用な供給源である。より詳細には、グルコースは、文献（Ｋｗｉａｋｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ｒ．ら、Ｉｎｄ．Ｃｒｏｐｓ  Ｐｒｏｄ．２００６年、２３巻、２８８〜２９６ページ）で実証されるようにトウモロコシ乾式粉砕方法から入手可能である。トウモロコシ茎葉のグルコースへの変換例については、 Ｄｕｄｇｅｏｎ，Ｄ．ら、Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ  Ｂｉｏｍａｓｓ  ｔｏ  Ｅｔｈａｎｏｌ：Ｄｉｌｕｔｅ−Ａｃｉｄ  Ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｏｒｎ  Ｓｔｏｖｅｒ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＮＲＥＬ）、Ｇｏｌｄｅｎ，ＣＯ．、２０１１年）参照。
【００７９】
前述のバイオマスおよび再生可能原料は、生合成生成物の相補的代謝生物の増殖培地に使用可能な種々の炭化水素の有用な供給源である。特に有用な炭素源としては、細胞増殖に有用なさまざまな単純炭化水素または複合炭水化物を含有する培地または原料が挙げられる。一実施形態において、栄養素および培地は、グルコース、スクロース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、ＣＯ、およびＣＯ２からなる群から選択される少なくとも１つの炭素基質を含む。好ましい実施形態では、栄養素および培地は再生可能原料である。一実施形態において、再生可能原料はバイオマスから誘導される。好ましい実施形態では、再生可能原料は、セルロース系バイオマスまたはヘミセルロース系バイオマスからなる群から選択される。別の実施形態では、再生可能原料は、炭化水素、芳香族化合物、およびリグニンからなる群から選択される炭素源を含む。
【００８０】
本発明のさまざまな実施形態のさらなる利点は、本開示ならびに以下に示される実施例および／または仮想例を考慮することにより、当業者には明白となるであろう。本明細書に記載されるさまざまな実施形態は、本明細書において別途明記されない限り、必ずしも相互に排他的ではないことが認識されるだろう。例えば、一実施形態に記載または記述された特徴は、他の実施形態に含まれてもよいが、必ずしも含まれない。したがって、本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態のさまざまな組み合わせおよび／または統合を包含する。
【００８１】
本明細書で使用する場合、２つ以上の項目のリストで使用されたときの語句「および／または」は、列挙された項目のいずれか１つが単独で利用できること、または列挙された項目の２つ以上の任意の組み合わせが利用できることを意味する。例えば、組成物が成分Ａ、Ｂ、および／またはＣを含有または排除するものとして記述される場合、この組成物は、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡおよびＢの組み合わせ、ＡおよびＣの組み合わせ、ＢおよびＣの組み合わせ、またはＡ、Ｂ、およびＣの組み合わせを含有または排除できる。
【００８２】
本発明の記載はさらに、本発明のさまざまな実施形態に関連する特定のパラメータを定量化するために数値範囲を使用する。数値範囲が与えられた場合、このような範囲は、範囲の下限値のみを述べたクレームの限定および範囲の上限値のみを述べたクレームの限定に対する文字通りの支持を与えるものとして考慮されるものであると理解すべきである。例えば、約１０〜約１００の開示された数値範囲は、「約１０を超える」（上界値なし）と述べるクレームおよび「約１００未満」（下界値なし）と述べるクレームの文字通りの支持を与える。さらに、上限値または下限値を構成する数値または数値範囲、例えば、「１００以上」、「１００以下」、または「１０〜１００」が与えられた場合はどんなときでも、このような限界値または数値範囲が、数値の前の語「約」を組み込むクレームの限定の文字通りの支持を与えるものとして解釈されることを理解すべきである。例えば、「１０〜１００」は、「約１０〜約１００」を引用するクレームの限定の文字通りの支持を与えると理解すべきである。
【実施例】
【００８３】
以下の実施例は、本発明による好ましい方法を記載する。しかしながら、これらの実施例は例示のために与えられ、実施例中の何も本発明の範囲全体に対する限定としてとられるべきではないことが理解されるべきである。加えて、精製されたメバロネートを用いて行われたすべての実施例は未精製材料を用いて行ってもよい。
【００８４】
実施例１
プラスミドおよびＥ．ｃｏｌｉ株の構築
Ｅｎｔｅｒｐｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ  Ｖ５８３のｍｖａＥ（アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ／ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＡＧ０２４３８）およびｍｖａＳ（ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＡＧ０２４３９）をコードする遺伝子セグメントをそのゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣから入手）から増幅した。これらのセグメントは、ＩＰＴＧ誘導Ｔｒｃプロモータ−−ｌａｃオペレータの制御下でベクター（ｐＢＲ３２２由来の骨格、アンピシリンマーカー、ｌａｃＩｑ、ｒｒｎＢ転写終了配列を持つ）に挿入されプラスミドｐＳＥ１を得た（配列番号１）。
【００８５】
ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ株の化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ細胞（ｅｎｄＡ１  ｇｙｒＡ９６（ｎａｌＲ）ｔｈｉ−１  ｒｅｃＡ１  ｒｅｌＡ１  ｌａｃ  ｇｌｎＶ４４  Ｆ’［：：Ｔｎ１０  ｐｒｏＡＢ＋  ｌａｃＩｑ  Δ（ｌａｃＺ）Ｍ１５］ｈｓｄＲ１７（ｒΚ−  ｍΚ＋））は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ−Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．Ｒ．；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．Ｅｄ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第４版、２００２年）に概説された手順を使用してプラスミドｐＳＥ１を用いて形質転換した。
【００８６】
実施例２
メバロノラクトン製造
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＥ１株を、２２０ｒｐｍのオービタルシェーカーに置かれた３７℃でインキュベートされた１Ｌコニカルフラスコ内の培地２５０ｍＬ中にアンピシリン１００μｇ／リットルを補足したＬＢ培地で１０時間増殖させ、３のＯＤ６００に達した。これは、Ｉｎｆｏｒｓ社の５リットルバイオリアクタにおける生成での接種材料として使用された。１．７５リットルの産生培地（１５ｇ／ｌのグルコース、７ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ｌのＮＨ４Ｃｌ、５ｇ／ｌの酵母菌抽出物、１ｇ／ｌのクエン酸、１０ｍｇのＭｎＳＯ４、２ｇ／ｌのＭｇＳＯ４、２００ｍｇ／ｌのＦｅＳＯ４、および１０ｍｇ／ｌのチアミン−ＨＣｌを含有）をバイオリアクタ内で２５０ｍＬの接種材料と混ぜ合わせた。ｐＨは２０％ＮＨ４ＯＨを用いて７で維持された。温度を３２℃で維持した。２リットル／分（ＬＰＭ）で空気をスパージし、撹拌は７００ｒｐｍで維持した。接種してから１０時間後、１ｍｌの１Ｍ  ＩＰＴＧをバイオリアクタに添加した。消泡剤を必要に応じて添加した。グルコース濃度は、２時間間隔でバイオリアクタに６００ｇ／ｌのグルコース溶液を添加することで約１０ｇ／ｌに維持した。バイオリアクタの動作は４８時間で停止された。細胞は０．４５マイクロフィルタを使用して培養液から分離し、透明な培養液を得た。メバロノラクトン濃度は発酵終了時点で４０ｇ／ｌであることが判明した。
【００８７】
実施例３
メバロノラクトン精製
実施例２の透明な培養液を、ロータリーエバポレータにおける蒸発により４００ｍＬの体積になるまで濃縮し、２０％Ｈ２ＳＯ４の添加によりｐＨ２まで酸性化した。溶液がＮａＣｌで飽和するまでＮａＣｌを添加した。８００ｍＬの酢酸エチルを得るために２００ｍＬを４回使用して酢酸エチルにメバロノラクトンを抽出した。これをロータリーエバポレータで２００ｍＬまで濃縮した。メバロノラクトンを酢酸エチルから１５０ｍＬの１０Ｍ  ＮａＯＨ溶液に逆抽出した。酸性化およびエチル抽出ステップを繰り返し、酢酸エチルをすべて蒸発させて、９５％超の純度のメバロノラクトンを得た。
【００８８】
実施例４
プラスミドおよび藍色細菌株の構築
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ  Ｖ５８３のｍｖａＥ（アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ／ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＡＧ０２４３８）およびｍｖａＳ（ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＡＧ０２４３９）をコードする遺伝子セグメントをそのゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣから入手）から増幅する。これらのセグメントは、構築プロモータ（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）ｐｓｂＡ１の制御下でベクターＭＣＳに挿入され、プラスミドｐＭＳＥ１を得る。
【００８９】
構築物は、製造業者の手順（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）  Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ、文献番号ＭＡＮ０００９７９２、１６〜１７ページ）に従って、プラスミドｐＭＳＥ１を使用してＣｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ株ＰＣＣ７９４２ゲノムに挿入され、株Ｓ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＭＳＥ１を得る。
【００９０】
実施例５
メバロノラクトンの光合成産生
Ｓ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＭＳＥ１株を、５０ｍＭのＮａＨＣＯ３および１０ｍｇ／ｌのチアミンを補足したＢＧ−１１培地で増殖させる。細胞は、細胞培地から１５ｃｍ離して置かれた８つの８６ｃｍの２０Ｗ蛍光灯により提供され蛍光（５５μＥｓ−１ｍ−２）下で３０℃でインキュベートした１リットルＲｏｕｘボトルの培地６００ｍＬ中で増殖させ、５％ＣＯ２を含む空気により通気した。毎日細胞培地の全体積の１０分の１を細胞培地から除去する。その後、同体積の０．５Ｍ  ＮａＨＣＯ３を含有する新鮮培地を細胞培地に添加する。ＮａＨＣＯ３を含む細胞培地のｐＨは、毎日１０  ＮＨＣｌにより７．５に調節される。これを１０日間行う。
【００９１】
実施例６
アセテートからのメバロノラクトンの製造
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＥ１株を、２２０ｒｐｍのオービタルシェーカーに置かれた３７℃でインキュベートされた１５ｍｌチューブ内の培地５ｍＬ中にアンピシリン１００μｇ／リットルを補足したＬＢ培地で１０時間増殖させ、３のＯＤ６００に達した。これは、２５０ｍｌ振とうフラスコにおける生成での接種材料として使用された。５０ｍｌの産生培地（５ｇ／ｌの酢酸ナトリウム、７ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ｌのＮＨ４Ｃｌ、５ｇ／ｌの酵母菌抽出物、１ｇ／ｌのクエン酸、１０ｍｇのＭｎＳＯ４、２ｇ／ｌのＭｇＳＯ４、２００ｍｇ／ｌのＦｅＳＯ４、および１０ｍｇ／ｌのチアミン−ＨＣｌを含有）を振とうフラスコ内で５ｍＬの接種材料と混ぜ合わせた。ｐＨは２０％ＮＨ４ＯＨを用いて７で維持された。温度を３２℃で維持した。接種してから１０時間後、２５μｌの１Ｍ  ＩＰＴＧをフラスコに添加した。アセテート濃度は、６時間間隔で振とうフラスコに３００ｇ／ｌの酢酸ナトリウム溶液を添加することで約２ｇ／ｌに維持した。動作は７２時間で停止された。細胞は０．４５マイクロフィルタを使用して培養液から分離し、透明な培養液を得た。メバロノラクトン濃度は発酵終了時点で８ｇ／ｌであることが判明した。
【００９２】
実施例７
グリセロールからのメバロノラクトンの製造
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＥ１株を、２２０ｒｐｍのオービタルシェーカーに置かれた３７℃でインキュベートされた１５ｍｌチューブ内の培地５ｍＬ中にアンピシリン１００μｇ／リットルを補足したＬＢ培地で１０時間増殖させ、３のＯＤ６００に達した。これは、２５０ｍｌ振とうフラスコにおける生成での接種材料として使用された。５０ｍｌの産生培地（１０ｇ／ｌのグリセロール、７ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ｌのＮＨ４Ｃｌ、５ｇ／ｌの酵母菌抽出物、１ｇ／ｌのクエン酸、１０ｍｇのＭｎＳＯ４、２ｇ／ｌのＭｇＳＯ４、２００ｍｇ／ｌのＦｅＳＯ４、および１０ｍｇ／ｌのチアミン−ＨＣｌを含有）を振とうフラスコ内で５ｍＬの接種材料と混ぜ合わせた。ｐＨは２０％ＮＨ４ＯＨを用いて７で維持された。温度を３２℃で維持した。接種してから１０時間後、２５μｌの１Ｍ  ＩＰＴＧをフラスコに添加した。グリセロール濃度は、６時間間隔で振とうフラスコに４００ｇ／ｌのグリセロール水溶液を添加することで約５ｇ／ｌに維持した。動作は７２時間で停止された。細胞は０．４５マイクロフィルタを使用して培養液から分離し、透明な培養液を得た。メバロノラクトン濃度は発酵終了時点で１５ｇ／ｌであることが判明した。
【００９３】
実施例８
合成気体からのメバロノラクトンの製造
合成気体（さまざまな比率でのＣＯ２、ＣＯ、およびＨ２の混合物）からのメバロノラクトンの製造は、Ｋｉｒｉｕｋｈｉｎらにより記載され（「Ｍｅｖａｌｏｎａｔｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ａｃｅｔｏｇｅｎ  ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔ  ｄｕｒｉｎｇ  ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｙｎｇａｓ  ｏｒ  ＣＯ２／Ｈ２  ｂｌｅｎｄ」、Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｂｉｏｓｙｓｔ．Ｅｎｇ．２０１４年、３７巻、２４５〜２６０ページ）、本明細書にその全体が組み込まれている。
【００９４】
実施例９
プラスミドおよび酵母菌株の構築
プロモータおよびターミネータＤＮＡ配列は、カナダのＢｉｏｂａｓｉｃ，Ｉｎｃ．により合成された。Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓの酵素ｍｖａＥおよびｍｖａＳ（Ａ１１０Ｇ）のコドン最適化遺伝子配列はＢｉｏｂａｓｉｃｎｉｙｏｒｉにより合成された。ＴＤＨ３プロモータおよびＡＤＨ１ターミネータの制御下でｍｖａＥを、ならびにＴＥＦ１プロモータおよびＡＣＴ１ターミネータの制御下のｍｖａＳ（Ａ１１０Ｇ）をコードする配列はベクター（２ミクロンの起点、ＵＲＡ３マーカー、およびアンピシリンマーカーを含有）にクローニングされ、プラスミドｐＶＳ１９（配列番号２）を得た。
【００９５】
酵母菌Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｃ（ＭＡＴａ；ｕｒａ３−５２；ｔｒｐｌ−２８９；ｌｅｕ２−３，１１２；ｈｉｓ３Δ１；ＭＡＬ２−８Ｃ；ＳＵＣ２）は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ−Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．Ｒ．；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．Ｅｄ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第４版、２００２年）に概説される手順を使用してプラスミドｐＶＳ１９を用いて形質転換され、株Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＶＳ１９を得た。
【００９６】
実施例１０
スクロースからのメバロノラクトンの製造
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＶＳ１９株を、２２０ｒｐｍのオービタルシェーカーに置かれた３０℃でインキュベートされた１５ｍｌチューブ内の５ｍＬのＣＭグルコース培養液マイナスウラシル（Ｔｅｋｎｏｖａカタログ番号Ｃ８１４０）培地で７２時間増殖させた。細胞は０．４５マイクロフィルタを使用して培養液から分離し、透明な培養液を得た。メバロノラクトン濃度は発酵終了時点で１．２ｇ／ｌであることが判明した。
【００９７】
実施例１１
初期リアクター条件
固定床リアクターの設定
反応は、高精度マスフローコントローラにより制御された３つのガスラインと、液体原料を高精度ポンプを介して運搬する１つの液体供給ラインとを備えた高圧小規模試験ユニット（図１）で行われる。ユニットは、３ゾーン炉により外部から加熱されたステンレススチール固定床リアクターと共に動作するが、リアクターの出口流は、熱交換器を介して冷却され、液体およびガス状生成物の分離および収集のために容器のシステムに向けられる。反応温度は触媒床に挿入された熱電対でモニタされた。液体生成物およびガス流の両方がガスクロマトグラフィーで分析された。
【００９８】
触媒および供給原料
試験は、Ｇｒａｃｅ（ＤＡＶＩＣＡＴ  ＳＩＡＬ３１１３）により供給された市販の非晶質ＳｉＯ２／Ａｌ２Ｏ３触媒およびＺｅｏｌｙｓｔ  Ｉｎｃ．により供給された市販のＺＳＭ−５（ＳｉＯ２／Ａｌ２Ｏ３比２３−ＣＢＶ２３１４）を用いて行われた。両方の場合において、触媒は粉末形態で供給された。非晶質ＳｉＯ２／Ａｌ２Ｏ３は提供されたままで使用した。ＺＳＭ−５触媒は、アンモニウムをＨ＋形態に転換するために、５００℃で３時間、空気中で焼成した。次いで試料を、使用前に粉砕して１００〜１８０μｍの粒径になるように篩過した。試験は、メバロノラクトンの１０ｗｔ％水溶液および２０ｗｔ％水溶液ならびに１０ｗｔ％デヒドロメバロノラクトン（アンヒドロメバロノラクトンとも呼ばれる）を用いて行われた。
【００９９】
触媒充填
まず、グラスウールのプラグをリアクターに挿入して詰めた後、リアクターに必要な触媒量を充填した。その上に別のグラスウールのプラグを挿入し、その後リアクターをユニットに接続した。
【０１００】
実験手順および条件
メバロノラクトン転換試験は、適切な量（１４．３ｇ）の触媒が充填されたダウンフローステンレススチール固定床リアクターで行われた。触媒は３０分間空気中３００℃でその場で前処理した。供給材料導入の前に、不活性ガス（Ｎ２）流下で所望の反応温度および圧力に達した。所望の反応条件に達するとすぐに、メバロノラクトン水溶液（１０ｗｔ％メバロノラクトン）を高精度ポンプを用いて充填された管状リアクターに供給した。圧力を維持するために、少量のＮ２流（５０ｃｍ３／分）を液体供給材料と一緒に供給した。反応は１時間−１または２時間−１の毎時重量空間速度（ＷＨＳＶ）を用いて３６ｂａｒの圧力で行われた。ＷＨＳＶは全液体供給材料（溶液）に基づいて計算された。定常状態活動測定を、各条件について約２時間のオンストリーム後に行った。液体は、トラップ（約１０℃）で収集されたが、ガス状試料はガスサンプリングバッグに収集された。
【０１０１】
生成物分析
ガス状生成物の分析は、直列バイパス構成で２つの検出器（ＦＩＤおよびＴＣＤ）および３つのカラム（ＭＳ、Ｐｏｒａｐａｋ  Ｎ、およびＡｌ２Ｏ３／ＫＣｌ）を備えたＧＣで行った。液体はＧＣ−ＭＳで分析した。
【０１０２】
表１−実施例１１の反応条件
【表１】
2017538403.tif 000009
【０１０３】
非晶質ＳｉＯ２／Ａｌ２Ｏ３を利用した反応の液体生成物のＧＣ−ＭＳによる分析によると、調査した温度のいずれでも生成物中に供給材料（すなわち、メバロノラクトン）の存在は示されず、研究した条件においてメバロノラクトンの完全な転換が達成されたことが示唆される。ＧＣ−ＭＳによる液体生成物および温度の関数としてのガス状生成物の組成は、それぞれ表２および表３に提示される。
【０１０４】
表２−非晶質ＳｉＯ２／Ａｌ２Ｏ３で得られたＧＣ−ＭＳによる液体生成物の分析
【表２】
2017538403.tif 000010
【０１０５】
液体層で得られた主な生成物はアンヒドロメバロノラクトンであった。したがって、低温では脱水反応のみが生じる。限られた量のＣＯ２はいくらかのＣ６炭化水素と一緒にガス状生成物中で検出された。
【０１０６】
温度が３００℃まで上昇すると、液体生成物は２つの別個の層、すなわち、上層を成す油相と、エマルションに似ており下部にたまっている水相とに分離した。２つの相は分離され、別個に分析された。水相は、主に３−メチル−２−ブタノン、３−メチル−３−ブテン−１−オール、およびアンヒドロメバロノラクトンからなり、脱水および開環反応の両方が起こったことが示された。油相は非常に複雑で、低濃度の１５０種類以上の化合物からなっていた。表２に示す分析は１．５％超の濃度で検出された成分を表す。この相中の最も豊富にある化合物はベンゼン環を有する芳香族炭化水素であった。少量のイソプレンが、３００℃で油相および水相の両方で検出された。ガス状生成物（表３）は、ＣＯ２生成物の増加（高い程度の激しいクラッキング反応）および少量の軽質炭化水素を示した。
【０１０７】
温度を４００℃まで上げた場合、液体生成物は、エマルション状テクスチャの均質な一相生成物へと戻る。この場合、アンヒドロメバロノラクトンは検出されず、主要生成物は３−メチル−２−ブタノンであった。Ｃ１〜Ｃ５の範囲の相当量の軽質アルカンおよび軽質オレフィンも生成され、このような高温（４００℃）では、ラクトン供給材料の広範囲の脱炭酸およびクラッキングが起こることが示された。
【０１０８】
表３−非晶質ＳｉＯ２／Ａｌ２Ｏ３で得られたガス状生成物の分析
【表３】
2017538403.tif 000011
【０１０９】
ＺＳＭ−５を用いた触媒の結果
非晶質ＳｉＯ２／Ａｌ２Ｏ３について言えば、未転換メバロノラクトンはＺＳＭ−５触媒を用いた、調査した温度のいずれの液体生成物においても検出されなかった。これは、メバロノラクトンの完全な転換はＺＳＭ−５を用いて研究された条件下でも達成されたことを示す。ＧＣ−ＭＳによる液体生成物および温度の関数としてのガス状生成物の組成は、それぞれ表４および表５に提示される。
【０１１０】
２００℃において、反応の液体生成物はエマルション状均質溶液であった。得られる主な生成物は無水形態のメバロノラクトンおよび３−メチル−２−ブタノンである。限られた量のＣＯ２がガス生成物で検出された。非晶質シリカ−アルミナと比較して、脱水メバロノラクトンのみが２００℃で観察された場合、いっそう多くの酸性ＺＳＭ−５触媒は脱水だけでなく脱炭酸も触媒した。
【０１１１】
４００℃においては、液体生成物は２つの別個の層、すなわち、上層を成す油相と、水性エマルション状相とに分離した。２つの相は再び分離され、別個に分析された。水相は主に酢酸／プロパン酸、アセトン、およびトルエンからなっていた。２００℃および非晶質シリカアルミナでの結果とは対照的に、３−メチル−２−ブタノンは観察されなかった。これは、広範囲の脱炭酸／クラッキング反応の発生を示す。油相は、芳香族化合物、例えば、ｐ−キシレン、トルエン、１，２，３−トリメチルベンゼン、および１−エチル−２−メチルベンゼンから構成されていた。これらの芳香族化合物は、おそらくは、ＺＳＭ−５での中間生成物として生じるオレフィンのオリゴマー化反応の結果である。ＣＯ２および少量の軽質炭化水素（アルカン／アルケン）は表５に示されるように気相で検出された。
【０１１２】
表４−ＺＳＭ−５で得られたＧＣ−ＭＳによる液体生成物の分析
【表４】
2017538403.tif 000012
【０１１３】
表５−ＺＳＭ−５で得られたガス状生成物の分析
【表５】
2017538403.tif 000013
【０１１４】
実施例１２
非晶質ＳｉＯ２／Ａｌ２Ｏ３での温度の効果
実施例１２の反応は、実施例１１に記載されたものと類似の手順で行われた。
【０１１５】
表６−実施例１２および実施例１３の反応条件
【表６】
2017538403.tif 000014
【０１１６】
ＧＣ−ＭＳによる液体生成物ならびに２７５℃および３２５℃（表６の条件１および条件２）におけるガス状生成物の組成は、それぞれ表７および表８に提示される。先に調査した温度（２００℃、３００℃、および４００℃）についての結果も比較のために提示される。ＧＣ−ＭＳによる反応の液体生成物の分析によると、調査した温度のいずれでも生成物中に供給材料（すなわち、メバロノラクトン）の存在は示されず、研究した条件においてメバロノラクトンの完全な転換が達成されたことが示唆される。
【０１１７】
表７−一定のＷＨＳＶおよび圧力ならびに多様な温度での実験における非晶質ＳｉＯ２／Ａｌ２Ｏ３で得られたＧＣ−ＭＳによる液体生成物の分析
【表７】
2017538403.tif 000015
【０１１８】
表８−一定のＷＨＳＶおよび圧力ならびに多様な温度での実験における非晶質ＳｉＯ２／Ａｌ２Ｏ３で得られたガス状生成物の分析
【表８】
2017538403.tif 000016
【０１１９】
２７５℃で得られる主な生成物は、３−メチル−２−ブタノンであったがイソプレンは形成されなかった。３２５℃では、３−メチル−２−ブタノン、２−メチル−２−プロパノール、およびデヒドロメバロノラクトンと一緒に、イソプレンが測定可能な量で形成された。無水形態の存在は３２５℃では予期されなかったが、これは脱水が２７５℃でも完了していると思われたためである。しかし、この矛盾は、２７５℃の実験の供給材料がデヒドロメバロノラクトン（２００℃でＡＳＡを用いた先の実験で得られる）であったのに対し、３２５℃での実験はデヒドロメバロノラクトンおよび新鮮な供給材料（すなわち、メバロノラクトン）の混合物を用いて行われたことにより説明できる。
【０１２０】
ガス状生成物（表８）は、温度に伴う一定のＣＯ２排出量の傾向は示さないが、これは再び、調査した条件で使用されるさまざまな供給材料に起因し得る。しかしながら、軽質炭化水素の濃度は温度と共に増加し、より高い程度のクラッキング反応を示すことが明らかである。
【０１２１】
イソプレン形成に関する最適な結果が３２５℃で得られたため、この温度が、非晶質ＳｉＯ２／Ａｌ２Ｏ３でのメバロノラクトンの脱炭酸における、ＷＨＳＶおよび供給材料希釈の効果のさらなる調査のために選択された。
【０１２２】
実施例１３
非晶質ＳｉＯ２／Ａｌ２Ｏ３における供給材料濃度およびＷＨＳＶの効果
実施例１１に類似の手順が使用された。反応条件は表６に記載されている。表９および表１０は、高いＷＨＳＶで得た、供給材料中のメバロノラクトン濃度が高い、液体生成物およびガス状生成物の組成をそれぞれ表す。参照条件（ＷＨＳＶ＝１時間−１、１０％水溶液）もまた比較のために１番目の縦列に示される。
【０１２３】
しかしながら、イソプレンの産生の明らかな増加が見てとれ、これは中間生成物であるため、より短い滞留時間が好まれることが示される。２−メチル−２−プロパノール濃度でも増加が観察されたが、３−メチル−２−ブタノンの形成は影響を受けていないようである。
【０１２４】
主な変化は、メバロノラクトンの供給材料濃度が１０ｗｔ％から２０ｗｔ％に増加されたときに検出された。イソプレン形成の１桁の増加がより高い供給材料濃度で記録された。２０ｗｔ％メバロノラクトン供給材料における唯一のその他主要生成物は３−メチル−２−ブタノンであった。これらの結果は、イソプレンの量を増加するためには、より高い空間速度およびより高濃度の供給材料が利用されるべきであることを示唆する。
【０１２５】
表９−３２５℃でのさまざまな供給材料組成およびＷＨＳＶでの実験における非晶質ＳｉＯ２／Ａｌ２Ｏ３で得られたＧＣ−ＭＳによる液体生成物の分析
【表９】
2017538403.tif 000017
【０１２６】
表１０−３２５℃でのさまざまな供給材料組成およびＷＨＳＶでの実験における非晶質ＳｉＯ２／Ａｌ２Ｏ３で得られたガス状生成物の分析
【表１０】
2017538403.tif 000018
【０１２７】
２０％メバロノラクトン水溶液を用いた実験のさらなる分析
上述のように、２０％メバロノラクトン水溶液を用いて３２５℃で非晶質ＳｉＯ２／Ａｌ２Ｏ３において行われた実験は、ＧＣ−ＭＳ分析における全生成物面積ピークに対するイソプレンの面積％としての液体生成物中のイソプレンが高い割合であることを示した。この条件はイソプレン形成に関しては最も期待できる結果を示したため、イソプレンの量を定量化するために液体生成物試料のさらなる分析を行った。第１のステップは、カール−フィッシャー法（ＡＳＴＭ  Ｄ６３０４）を用いて液体生成物中の水の量を測定することから構成される。水は液体生成物中約９４ｗｔ％であると分かった。これは、反応の主要生成物が水であり、液体生成物中の有機物質の濃度が＜６ｗｔ％であることを示した。さらに、ＧＣ−ＭＳのイソプレン標準物質を使用した半定量分析を行って、所望の生成物の実際の濃度を測定しようと試みた。これらの結果は、イソプレンの実際の濃度がおそらく＜３ｗｔ％であり、残りは３−メチル−２−ブタノンおよびその他の特定できない成分であることを指摘した。
【０１２８】
実施例１４
イソプレンの合成
イソプレンへのメバロノラクトン転換は、実施例１１に従って、非晶質ＳｉＯ２／Ａｌ２Ｏ３触媒が充填されたダウンフローステンレススチール固定床リアクターで行われる。触媒は３０分間空気中３００℃でその場で前処理した。供給材料導入の前に、不活性ガス（Ｎ２）流下で所望の反応温度３２５℃および圧力３６ｂａｒに達した。所望の反応条件に達するとすぐに、メバロノラクトン水溶液（６００ｇメバロノラクトン／Ｌ）水溶液を高精度ポンプを用いて充填された管状リアクターに供給した。圧力を維持するために、少量のＮ２流（５０ｃｍ３／分）を液体供給材料と一緒に供給する。反応は２時間−１の毎時重量空間速度（ＷＨＳＶ）を用いて３６ｂａｒの圧力で行われた。ＷＨＳＶは全液体供給材料（溶液）に基づいて計算された。定常状態活動測定を、約２時間のオンストリーム後に行う。液体は、トラップ（約１０℃）で収集するが、ガス状試料はガスサンプリングバッグに収集する。
【０１２９】
供給材料濃度および空間速度を変化させた追加の実験
上記の設定を使用して、１４．３ｍｇの触媒ＳｉＯ２／Ａｌ２Ｏ３（粉末形態でそのまま使用される、Ｇｒａｃｅより入手したＤＡＶＩＣＡＴ  ＳＩＡＬ３１３３）を固定床リアクターに充填し、３０分間空気中３００℃]でその場で前処理する。実施例１１から得た純粋メバロノラクトン水溶液を表１１にまとめられているようなさまざまな条件でリアクターを通るように送り出される。各実験の主要生成物はイソプレンであり、副生成物は３−メチル−２−ブタノンである。
【０１３０】
表１１−供給材料濃度および空間速度を変化させた追加の実験
【表１１】
2017538403.tif 000019
【０１３１】
実施例１５
置換芳香族化合物の合成
置換芳香族化合物へのメバロノラクトン転換は、実施例１１に記載されるように、非晶質ＺＳＭ−５触媒が充填されたダウンフローステンレススチール固定床リアクターで行われる。触媒は３０分間空気中３００℃でその場で前処理する。充填前に、ＺＳＭ−５触媒は、触媒をアンモニウムからＨ＋形態に転換するために、５００℃で３時間、空気中で焼成した。試料を、使用前に粉砕して１００〜１８０μｍの粒径になるように篩過した。供給材料導入の前に、不活性ガス（Ｎ２）流下で所望の反応温度（２５０℃、３００℃、３５０℃）および圧力（３６ｂａｒ）に達する。所望の反応条件に達するとすぐに、メバロノラクトン水溶液（１０％メバロノラクトン水溶液）を高精度ポンプを用いて充填された管状リアクターに供給する。圧力を維持するために、少量のＮ２流（５０ｃｍ３／分）を液体供給材料と一緒に供給する。反応は１時間−１の毎時重量空間速度（ＷＨＳＶ）を用いて３６ｂａｒの圧力で行われる。ＷＨＳＶは全液体供給材料（溶液）に基づいて計算される。定常状態活動測定を、約２時間のオンストリーム後に行う。液体は、トラップ（約１０℃）で収集するが、ガス状試料はガスサンプリングバッグに収集する。生成物は、液体クロマトグラフィーおよびガスクロマトグラフィーにより分析されたように、芳香族化合物および３−メチル−２−ブタノンの混合物である。
【０１３２】
実施例１６
アンヒドロメバロノラクトンの合成
アンヒドロメバロノラクトンへのメバロノラクトン転換は、実施例１１に記載されるように、非晶質ＺＳＭ−５触媒が充填されたダウンフローステンレススチール固定床リアクターで行われる。触媒は３０分間空気中３００℃でその場で前処理した。充填前に、ＺＳＭ−５触媒は、触媒をアンモニウムからＨ＋形態に転換するために、５００℃で３時間、空気中で焼成した。試料を、使用前に粉砕して１００〜１８０μｍの粒径になるように篩過した。供給材料導入の前に、不活性ガス（Ｎ２）流下で所望の反応温度（７０℃、１００℃、１２１℃、１５０℃）および圧力（３６ｂａｒ）に達する。所望の反応条件に達するとすぐに、メバロノラクトン水溶液（１０％メバロノラクトン水溶液）を高精度ポンプを用いて充填された管状リアクターに供給した。圧力を維持するために、少量のＮ２流（５０ｃｍ３／分）を液体供給材料と一緒に供給する。反応は１時間−１の毎時重量空間速度（ＷＨＳＶ）を用いて３６ｂａｒの圧力で行われる。ＷＨＳＶは全液体供給材料（溶液）に基づいて計算される。定常状態活動測定を、約２時間のオンストリーム後に行う。液体は、トラップ（約１０℃）で収集するが、ガス状試料はガスサンプリングバッグに収集する。主要生成物は、液体クロマトグラフィーおよびガスクロマトグラフィーにより分析されたように、アンヒドロメバロノラクトンである。
【０１３３】
実施例１７
アンヒドロメバロノラクトンの合成
アセトアセチルＣｏＡプールは、酵素アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼａｔｏＢにより内因的にＥ．ｃｏｌｉによって生成される。第１に、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ（ｍｖａＳまたはｈｍｇＳ）およびＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素（ｍｖａＥまたはｈｍｇＲ）は、クローニングされて、このプールからメバロネート産生経路を提供する。最大メバロネートフラックスに加えて、ＢｌａｓｔＰ（Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）を使用して、さまざまな生物、例えば、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、およびＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｏｌｔａｅからのｍｖａＳおよびｍｖａＥを特定する。組み合わせ検定を使用して、メバロネート産生に対する最適なセットのｍｖａＳおよびｍｖａＥを特定する。メバロネート産生規模を拡大するために、Ｌ．ｃａｓｅｉからの遺伝子をもつＥ．ｃｏｌｉ株は１．３Ｌバイオリアクターで発酵される。アンヒドロメバロノラクトンを調製するために、固体酸触媒を直接、発酵培養液に添加し、加熱還流させてメバロネートの脱水を触媒する。得られるアンヒドロメバロノラクトンは、クロロホルムを使用した溶媒抽出により単離される。混ぜ合わせられた有機相を減圧下で濃縮し、粗生成物を生成する。
【０１３４】
実施例１８
ｐ−トルエンスルホン酸を用いたアンヒドロメバロノラクトンの合成
１０ｇｍのメバロノラクトン（実施例２で得られる）を、１０時間、１ｇｍのｐ−トルエンスルホン酸／トルエンの存在下で還流させた。８５％のアンヒドロメバロノラクトンの収率が観察された。生成物は飽和ＮａＨＣＯ３で洗浄し、シリカゲルプラグを通して、＞９５％純度のアンヒドロメバロノラクトン（１Ｈ  ＮＭＲ）を得た。
【０１３５】
実施例１９
酢酸サマリウムを用いたアンヒドロメバロノラクトンの合成 
２００ｍｇのメバロノラクトン（実施例２で得られた）を、１ｍＬバイアル瓶中でアルゴンガスで３０分間バブリングし、５ｍｇの酢酸サマリウムをアルゴンガス流下で添加した。バイアル瓶を密封し、振とう器内に１５０℃で４８時間入れた。ＮＭＲで確認されるように、アンヒドロメバロノラクトンが得られた。
【０１３６】
実施例２０
塩化第２鉄を用いたアンヒドロメバロノラクトンの合成
２００ｍｇのメバロノラクトン（実施例２で得られた）を、１ｍＬバイアル瓶中でアルゴンガスで３０分間バブリングし、４ｍｇのＦｅＣｌ３をアルゴンガス流下で添加した。バイアル瓶を密封し、振とう器内に１５０℃で４８時間入れた。ＮＭＲで確認されるように、アンヒドロメバロノラクトンが得られた。
【０１３７】
実施例２１
Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ（登録商標）３５を用いたアンヒドロメバロノラクトンの合成
５００ｍｇのメバロノラクトン（実施例２で得られた）を１０ｍＬの水に溶解させ、１０個のバイアル瓶に均等に分配した。各バイアル瓶には６３ｍｇのＡｍｂｅｒｌｙｓｔ（登録商標）３５ｗｅｔ（Ｄｏｗより入手）を添加した。バイアル瓶を密封し、６５ｐｓｉまで加圧した後、５つのバイアル瓶を９０℃まで加熱し、５つのバイアル瓶を１５０℃まで加熱した。１００μｌの試料をさまざまな時間間隔で取り除き、クエンチして、水で希釈し、ＬＣ−ＭＳにより分析した。アンヒドロメバロノラクトンは、表１２に強調されているように、形成された唯一の主要生成物であった。
【０１３８】
表１２  Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ（登録商標）３５を用いたアンヒドロメバロノラクトン形成の分析
【表１２】
2017538403.tif 000020
【０１３９】
実施例２２
アンヒドロメバロノラクトンのエテノリシス
厚いガラス壁で構成された１Ｌのガラスリアクターに窒素またはアルゴン下で適切な溶媒、例えば、ジクロロメタンまたはジクロロエタン（５００ｍＬ）、デヒドロメバロノラクトン（０．８６ｍｏｌ）、およびＧｒｕｂｂｓルテニウムメタセシス触媒（０．０１〜１．０ｍｏｌ％）を充填した。窒素下にて１０〜６０分間撹拌後、容器を１５０ｐｓｉのエチレンガスで加圧し、反応液を最長２４時間かけて、または方法モニタリングが反応が完了したことを示すまで４０℃で撹拌する。次に、未使用エチレンを除去して回収し、反応容器を大気中に開放する。溶媒の除去に次いで、粗生成物を精製する。
【０１４０】
実施例２３
５−ヒドロキシ−３−メチル−２−（Ｅ）−ペンテン酸のエテノリシス
厚いガラス壁で構成された１Ｌのガラスリアクターに窒素またはアルゴン下で適切な溶媒、例えば、ジクロロメタンまたはジクロロエタン（５００ｍＬ）、５−ヒドロキシ−３−メチル−２−（Ｅ）−ペンテン酸（０．８６ｍｏｌ）、およびＧｒｕｂｂｓルテニウムメタセシス触媒（０．０１〜１．０ｍｏｌ％）を充填した。窒素下にて１０〜６０分間撹拌後、容器を１５０ｐｓｉのエチレンガスで加圧し、反応液を最長２４時間かけて、または方法モニタリングが反応が完了したことを示すまで４０℃で撹拌する。次に、未使用エチレンを除去して回収し、反応容器を大気中に開放する。溶液は水酸化ナトリウム水溶液（３００〜５００ｍＬ、１〜５Ｍ溶液）で処理し、水相は反応溶媒で２度抽出する。次いで、水相をｐＨ０〜２まで酸性化し、ジクロロメタンまたはジエチルエーテル（５×１００ｍＬ）で抽出する。溶媒の除去に次いで、粗生成物を精製する。
【０１４１】
実施例２４
アンヒドロメバロノラクトンのメチルエステル
Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ（登録商標）樹脂をアンヒドロメバロノラクトンのメタノール溶液に添加し、スラリーを加熱還流させる。２４時間後、反応液を室温まで冷却し、フィルタにかけ、減圧下で濃縮して粗生成物を得、これは精製することなくさらなる反応で使用する。
【０１４２】
実施例２５
５−ヒドロキシ−３−メチル−２−（Ｚ）−ペンテン酸のメチルエステルのエテノリシス
厚いガラス壁で構成された１Ｌのガラスリアクターに窒素またはアルゴン下で適切な溶媒、例えば、ジクロロメタンまたはジクロロエタン、実施例２４の５−ヒドロキシ−３−メチル−２−（Ｚ）−ペンテン酸のメチルエステル、およびＧｒｕｂｂｓルテニウムメタセシス触媒（０．０１〜１．０ｍｏｌ％）を充填した。窒素下にて１０〜６０分間撹拌後、容器を１５０ｐｓｉのエチレンガスで加圧し、反応液を最長２４時間かけて、または方法モニタリングが反応が完了したことを示すまで４０℃で撹拌する。次に、未使用エチレンを除去して回収し、反応容器を大気中に開放する。溶媒の除去に次いで、粗生成物を精製する。
【０１４３】
実施例２６
アンヒドロメバロノラクトンのエチルエステル
Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ（登録商標）樹脂をアンヒドロメバロノラクトンのエタノール溶液に添加し、スラリーを加熱還流させる。２４時間後、反応液を室温まで冷却し、フィルタにかけ、減圧下で濃縮して粗生成物を得、これは精製することなくさらなる反応で使用する。
【０１４４】
実施例２７
５−ヒドロキシ−３−メチル−２−（Ｚ）−ペンテン酸のエチルエステルのエテノリシス
厚いガラス壁で構成された１Ｌのガラスリアクターに窒素またはアルゴン下で適切な溶媒、例えば、ジクロロメタンまたはジクロロエタン（５００ｍＬ）、実施例２６の５−ヒドロキシ−３−メチル−２−（Ｚ）−ペンテン酸のエチルエステル、およびＧｒｕｂｂｓルテニウムメタセシス触媒（０．０１〜１．０ｍｏｌ％）を充填した。窒素下にて１０〜６０分間撹拌後、容器を１５０ｐｓｉのエチレンガスで加圧し、反応液を最長２４時間かけて、または方法モニタリングが反応が完了したことを示すまで４０℃で撹拌する。次に、未使用エチレンを除去して回収し、反応容器を大気中に開放する。溶媒の除去に次いで、粗生成物を精製する。
【０１４５】
実施例２８
アンヒドロメバロノラクトンのグリセロールエステル
Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ（登録商標）樹脂をアンヒドロメバロノラクトンのグリセロール溶液に添加し、スラリーを加熱還流させる。２４時間後、反応液を室温まで冷却し、フィルタにかけ、減圧下で濃縮して粗生成物を得、これは精製することなくさらなる反応で使用する。
【０１４６】
実施例２９
５−ヒドロキシ−３−メチル−２−（Ｚ）−ペンテン酸のグリセロールエステルのエテノリシス
厚いガラス壁で構成された１Ｌのガラスリアクターに窒素またはアルゴン下で適切な溶媒、例えば、ジクロロメタンまたはジクロロエタン、実施例２８の５−ヒドロキシ−３−メチル−２−（Ｚ）−ペンテン酸のグリセロールエステル、およびＧｒｕｂｂｓルテニウムメタセシス触媒（０．０１〜１．０ｍｏｌ％）を充填した。窒素下にて１０〜６０分間撹拌後、容器を１５０ｐｓｉのエチレンガスで加圧し、反応液を最長２４時間かけて、または方法モニタリングが反応が完了したことを示すまで４０℃で撹拌する。次に、未使用エチレンを除去して回収し、反応容器を大気中に開放する。溶媒の除去に次いで、粗生成物を精製する。
【０１４７】
実施例３０
５−ヒドロキシ−３−メチル−２−（Ｅ）−ペンテン酸のメチルエステル
Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ（登録商標）樹脂を５−ヒドロキシ−３−メチル−２−（Ｅ）−ペンテン酸のメタノール溶液に添加し、スラリーを加熱還流させる。２４時間後、反応液を室温まで冷却し、フィルタにかけ、減圧下で濃縮して粗生成物を得、これは精製することなくさらなる反応で使用する。
【０１４８】
実施例３１
５−ヒドロキシ−３−メチル−２−（Ｅ）−ペンテン酸のメチルエステルのエテノリシス
厚いガラス壁で構成された１Ｌのガラスリアクターに窒素またはアルゴン下で適切な溶媒、例えば、ジクロロメタンまたはジクロロエタン、実施例３０の５−ヒドロキシ−３−メチル−２−（Ｅ）−ペンテン酸のメチルエステル、およびＧｒｕｂｂｓルテニウムメタセシス触媒（０．０１〜１．０ｍｏｌ％）を充填した。窒素下にて１０〜６０分間撹拌後、容器を１５０ｐｓｉのエチレンガスで加圧し、反応液を最長２４時間かけて、または方法モニタリングが反応が完了したことを示すまで４０℃で撹拌する。次に、未使用エチレンを除去して回収し、反応容器を大気中に開放する。溶媒の除去に次いで、粗生成物を精製する。
【０１４９】
実施例３２
５−ヒドロキシ−３−メチル−２−（Ｅ）−ペンテン酸のエチルエステル
Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ（登録商標）樹脂を５−ヒドロキシ−３−メチル−２−（Ｅ）−ペンテン酸のエタノール溶液に添加し、スラリーを加熱還流させる。２４時間後、反応液を室温まで冷却し、フィルタにかけ、減圧下で濃縮して粗生成物を得、これは精製することなくさらなる反応で使用する。
【０１５０】
実施例３３
５−ヒドロキシ−３−メチル−２−（Ｅ）−ペンテン酸のエチルエステルのエテノリシス
厚いガラス壁で構成された１Ｌのガラスリアクターに窒素またはアルゴン下で適切な溶媒、例えば、ジクロロメタンまたはジクロロエタン、実施例３２の５−ヒドロキシ−３−メチル−２−（Ｅ）−ペンテン酸のエチルエステル、およびＧｒｕｂｂｓルテニウムメタセシス触媒（０．０１〜１．０ｍｏｌ％）を充填した。窒素下にて１０〜６０分間撹拌後、容器を１５０ｐｓｉのエチレンガスで加圧し、反応液を最長２４時間かけて、または方法モニタリングが反応が完了したことを示すまで４０℃で撹拌する。次に、未使用エチレンを除去して回収し、反応容器を大気中に開放する。溶媒の除去に次いで、粗生成物を精製する。
【０１５１】
実施例３４
５−ヒドロキシ−３−メチル−２−（Ｅ）−ペンテン酸のグリセロールエステル
Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ（登録商標）樹脂を５−ヒドロキシ−３−メチル−２−（Ｅ）−ペンテン酸のグリセロール溶液に添加し、スラリーを加熱還流させる。２４時間後、反応液を室温まで冷却し、フィルタにかけ、減圧下で濃縮して粗生成物を得、これは精製することなくさらなる反応で使用する。
【０１５２】
実施例３５
５−ヒドロキシ−３−メチル−２−（Ｅ）−ペンテン酸のグリセロールエステルのエテノリシス
厚いガラス壁で構成された１Ｌのガラスリアクターに窒素またはアルゴン下で適切な溶媒、例えば、ジクロロメタンまたはジクロロエタン、実施例３４の５−ヒドロキシ−３−メチル−２−（Ｅ）−ペンテン酸のグリセロールエステル、およびＧｒｕｂｂｓルテニウムメタセシス触媒（０．０１〜１．０ｍｏｌ％）を充填した。窒素下にて１０〜６０分間撹拌後、容器を１５０ｐｓｉのエチレンガスで加圧し、反応液を最長２４時間かけて、または方法モニタリングが反応が完了したことを示すまで４０℃で撹拌する。次に、未使用エチレンを除去して回収し、反応容器を大気中に開放する。溶媒の除去に次いで、粗生成物を精製する。
【０１５３】
実施例３６
シリカ触媒を用いたイソプレンおよびメチルビニルケトンの高選択的生成
小さな体積の固定床リアクターに、１グラムのＤａｖｉｓｉｌグレード６２のシリカゲルを充填し、１．４ｓｃｃｍの窒素キャリアガスおよび２．５μＬ／分流量の２０ｗｔ％メバロノラクトン水溶液は同軸注入により注入しながら２５０℃の温度まで加熱した。加えて、６０〜７０℃で保持されたリアクター後蒸気トラップを使用して水および脱水メバロノラクトンを捕集し、使用されるインラインＧＣ−ＦＩＤまたは分析の汚染を防止する。これらの条件下で、インラインＧＣ−ＦＩＤを使用して分析されるイソプレンの面積割合は９１％であり、ピーク面積の７％はメチルビニルケトンとして特定された。
【０１５４】
モル当量のモデル流と比較したピーク面積分析に基づいて、イソプレン流の転化率は６９％超であり、６１％の最小の全収率（すなわち、メバロノラクトン１モル当たりイソプレン０．６１モル）、イソプレンに対して９１％の選択性を示す。各場合において、「全転換」が意味するのは、４５℃のカラム温度で４分以内にＧＣ−ＦＩＤにより検出可能なメバロノラクトンの生成物への転換量を意味し、脱水メバロノラクトンへの転換を明示的に含まない。メバロノラクトンのほぼ１００％が消費され、完全に他の分子に転換されていなければ、脱水メバロノラクトンへと転換されることが予測される。
【０１５５】
さらなる実験はリアクターにおける滞留時間を変化させたが、低流量での選択性および転化率の増加を示した。２５０℃で２．５μＬ／分流量の２０ｗｔ％メバロノラクトン水溶液および１４．０５ｓｃｃｍのキャリアガス流量は、８４％のイソプレンピーク面積を示し、ピーク面積の１４％はメチルビニルケトンであった。モデル流と比較した収率は、５６％の最小転化率に対して４８％を超えるイソプレン全収率を意味する。他のパラメータは変えないままで、７．０の中程度の滞留時間、１．４ｓｃｃｍのキャリアガスにおいて、イソプレン選択性は８６％で、ピーク面積の１１％がメチルビニルケトンであり、同じ推定法により、少なくとも５９％の全収率に対して６７％の最小全転化率であった。
【０１５６】
さらなる実験はリアクターにおける温度を変化させたが、より低温でのイソプレン選択性の増加を示した。３００℃、１０μＬ／分の２０％メバロノラクトン水溶液および２８．１３ｓｃｃｍの窒素を用いて、イソプレンピーク面積は７２％であり、４７％の全収率に対して推定転化率は少なくとも６６％である。
【０１５７】
さらなる実験では、約２００ｍｇのＡｅｒｏｓｉｌ３８０シリカ触媒を使用して水中のメバロノラクトン濃度を変化させた。３００℃、５μＬ／分の７０％メバロノラクトン水溶液および１４．０５ｓｃｃｍの窒素を用いて、生成物分布は６４％のイソプレン、２４％のメチルビニルケトン、２％の２−メチル−１−ブテン、および２％の２−メチル−１−プロペンを示す。温度が上昇するにつれ、メチルビニルケトンの割合は増加するが、イソプレンは減少する。３５０℃では、イソプレンはピーク面積の３６％、メチルビニルケトンはピーク面積の３３％、２−メチル−１−ブテンはピーク面積の１４％、２−メチル−１−プロペンはピーク面積の６％である。４００℃では、イソプレンはピーク面積の２１％、メチルビニルケトンはピーク面積の３９％、２−メチル−１−ブテンはピーク面積の３３％、２−メチル−１−プロペンはピーク面積の６％である。
【０１５８】
さらなる実験は、キャリアガスを除去し、リアクターに２．５μＬ／分で２０％メバロノラクトンを流した。２５０℃では、イソプレンピーク面積は９１％、メチルビニルケトンは３％、２−メチル−１−プロペンは４％であった。さらに低い温度では、イソプレンへの選択性の増加が見られた。２００℃では、イソプレンピーク面積は９６％、メチルビニルケトン２．５％であった。１５０℃では、イソプレンピーク面積は９８．４％に達し、メチルビニルケトン１％であった。
【０１５９】
したがって、リアクター温度および滞留時間を変化させることにより、格別な選択性をもってイソプレンを製造するか、またはイソプレン、メチルビニルケトン、１−メチル−２−ブテン、および１−メチル−２−プロペンの望ましい生成物分布を作り出すための中間状態に切り替えることができる。これは、本出願人の分析ツールが定量的に低沸点化合物をモニタしただけであるため、生成物分布についての制限とみなすべきではない。リアクターの生成物を分析したときにみられるその他の生成物としては、２−ブテン、１，３−ペンタジエン、２−メチル−１，３−ブタジエン、２−ブタノン、１，４−ペンタジエン−３−オン、１−ペンテン−３−オン、１−メチル−１，３−シクロヘキサジエン、１−メチル−１，４−シクロヘキサジエン、トルエン、１−メチルシクロヘキサ−２，４−ジエン、フェノール、クロロベンゼン、キシレン、４−ペンテン−１−イルアセテート、１−（１，２−ジメチルシクロペンタ−２−エニル）エタノン、４−アセチル−１−メチルシクロヘキセン、および脱水メバロノラクトンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６０】
実施例３７
シリカに担持されたパラジウムでのメバロノラクトンの反応
実施例３６と同じ試験リアクターを使用して、シリカに担持されたパラジウムであるＳｉｌｉｃａＣａｔ  Ｐｄ０触媒およそ５００ｍｇを試験した。３２５℃、１０μＬ／分の２０ｗｔ％ＭＶＬ水溶液および２８．１３ｓｃｃｍの窒素キャリアガスを用いて、イソプレンピーク面積はおおよそ６８％、メチルビニルケトンは５％、２−メチル−１−ブテンは４％、２−メチル−１−ペンテンは６％、２−ペンテンは１５％である。
【０１６１】
さらなる実験では、さまざまな温度範囲および条件方法試験した。触媒がまず１０μＬ／分の２０ｗｔ％ＭＶＬ水溶液および２８．１３ｓｃｃｍの窒素下で２７５℃で保持される場合、温度の上昇により、イソプレンに対する選択性が高くなり、ほぼゼロの選択性が高収率となる３７５℃では７５％の選択性へと増加した。しかしながら、触媒がまず４００℃で保持される場合、イソプレンに対する選択性は、温度が３２５℃に低下するにつれ高まり、３７５℃ではピーク面積の４０％、３５０℃では５５％、３２５℃では６８％である。これは、パラジウムがゆっくりと失活しながら、より優先的に他の異性体を生成することを示す。
【０１６２】
さらなる実験では、さまざまな時間のオンストリームを試験した。上記の温度勾配方向試験を示されるように、オンストリーム時間を長くすることにより、一般によりパラジウムが失活し、他の生成物よりも高いイソプレン選択性がもたらされる。その他の生成物は、２−ペンテン、２−メチル−１−プロペン、２−メチル−１−ブテン、メチルビニルケトン、１，３，５−トリブチルベンゼン、およびその他のベンゼン誘導体を含む。
【０１６３】
さらなる実験では、さまざまな滞留時間を試験した。３２５℃において、５μＬ／分の２０ｗｔ％ＭＶＬ水溶液および１４．０５ｓｃｃｍの窒素を用いて、イソプレンの面積割合はおおよそ７８％、メチルビニルケトンは１１％、２−メチル−１−ブテンは５％、および２−メチル−１−プロペンは６％である。流量を１０μＬ／分の液体ＭＶＬ溶液および２８．１３ｓｃｃｍの窒素まで増加させることで滞留時間を半分にした場合、イソプレンのピーク面積は８２％までわずかに増加し、メチルビニルケトンは９％、２−メチル−１−ブテンは３％、および２−メチル−１−プロペンは６％である。１５μＬ／分のＭＶＬ溶液および４１．７２ｓｃｃｍの窒素の流量を使用して滞留時間が３分の１まで低減された場合、イソプレンピーク面積割合は８１％までわずかに減少し、メチルビニルケトンは１０％、２−メチル−１−ブテンは３％、および２−メチル−１−プロペンは７％である。この結果に基づいて、中程度の滞留時間がシリカに担持されたパラジウムに好ましいことが推定される。おおよそ１ｇｍ／ｍＬの粉末タップ密度では、５００ｍｇの触媒は、おおよそ５００μＬの体積を有する。３２５℃では、１ｓｃｃｍの窒素は、約２ｍＬ／分の実流量である。３２５℃では、１μＬ／分の水の流量は、おおよそ１ｍＬ／分の実流量である。したがって、１０μＬ／分のＭＶＬ水溶液および２８．１３ｓｃｃｍの窒素を用いると、推定滞留時間の０．４５秒に対して実流量は６６．２６ｍＬ／分の実流量であると推定できる。
【０１６４】
さらなる実験では、水中のＭＶＬ濃度を変化させて試験した。すべての試験は３２５℃、４０ｓｃｃｍの窒素で行われた。まず、１０μＬ／分の１００％ＭＶＬの試験により、イソプレンをピーク面積８０％で生成したが、平均約７０％に対して８６分後は５８％まで低下した。メチルビニルケトンは、ピーク面積約１６％、２−メチル−１−ブテンは４％、２−メチル−１−プロペンは６％で存在した。１００％ＭＶＬ流量を５μＬ／分に減少させることにより、約６４％の初期イソプレンピーク面積をもたらし、これは２９４分かけて６０％まで低下した。メチルビニルケトンは、ピーク面積約２１％、２−メチル−１−ブテンは７％、２−メチル−１−プロペンは７％で存在した。５μＬ／分の流量での７０ｗｔ％ＭＶＬ水溶液を使用すると、イソプレンピーク面積は、ピーク面積が約７０％となりわずかに改善された。
【０１６５】
実施例３８
アルミナシリカでのメバロノラクトンの反応
アルミナシリカ触媒Ｄａｖｉｃａｔ  ＳＩＡＬ３１１３での試験は、実施例１１に記載したリアクターを使用して行った試験に加え、実施例３６に記載されている器具で行った。この追跡試験において、実施例３７と類似のオンストリーム時間挙動が見られ、イソプレンに対する初期選択性はほぼゼロであったが、何時間にもわたるオンストリーム後選択性は改善された。
【０１６６】
Ｄａｖｉｃａｔの最終性能は、７３％のピーク面積をイソプレンとして８％をメチルイソプロピルケトンとして示す。これは、メチルイソプロピルケトンがかなりの量で存在するが、その他の触媒もいかなる触媒試験もメチルイソプロピルケトンをほぼまったく生成せず、代わりにメチルビニルケトン形成に有利に働くという点で他の試験とは最も区別される。実施例１１〜１４に示される生成物のリストに加えて、１−エチル−ｎ−メチルベンゼン、１，３，５−トリメチルベンゼン、１−メチル−３−（１−メチルエチル）ベンゼン、１，４−ジエチルベンゼン、４−エチル−１，２−ジメチルベンゼン、１，２，４，５−テトラメチルベンゼン、１，２，３，４−テトラメチルベンゼン、１，２，４，５−テトラメチルベンゼン、およびジエチルフタレートのいくつかの異性体を特定できた。Ｄａｖｉｃａｔ  ＳＩＡＬ３１１３触媒についてはオンストリーム時間に強く依存するため、示されている数字は大体の推定値としてのみみなすべきである。
【０１６７】
リアクター温度を変化させたさらなる実験は、３００℃、２８．１３ｓｃｃｍの窒素で３０μＬ／分の２０ｗｔ％ＭＶＬ水溶液では、イソプレンピーク面積は５０％で始まり、３００分間のオンストリームにわたって８３％まで増加し、メチルイソプロピルケトンは同じ期間で２０％から４％まで低下することが見て取れる。３５０℃、２８．１３ｓｃｃｍの窒素で３０μＬ／分の２０ｗｔ％ＭＶＬ水溶液では、約７３％のイソプレンピーク面積に対して、メチルイソプロピルケトンは約８％のピーク面積であった。
【０１６８】
圧力を変化させたさらなる実験は、高圧（５００ＰＳＩ）ではベンゼン誘導体が好まれ、イソプレン選択性の低下がもたらされることを示した。
【０１６９】
実施例３９
チタニアでのメバロノラクトンの反応
ＡｅｒｏｘｉｄｅチタニアＰ２５は、実施例３６に記載されるリアクターを使用して１０μＬ／分の２０ｗｔ％ＭＶＬおよび２８．１３ｓｃｃｍの窒素、５００ｍｇの触媒を用いて２５０℃〜３５０℃の範囲の温度で試験した。３５０℃では、イソプレンは、６３％のピーク面積を表し、メチルビニルケトンは１３％、２−メチル−１−ブテンは１３％、２−メチル−１−プロペンは８％であった。３００℃では、イソプレンは、６８％のピーク面積を表し、メチルビニルケトンは１２％、２−メチル−１−ブテンは８％、２−メチル−１−プロペンは１１％であった。２５０℃では、イソプレンは、４２％のピーク面積を表し、メチルビニルケトンは４９％、２−メチル−１−ブテンは６％であった。モデルイソプレン流を使用し、ａＭＶＬへの転化率を無視した実施例３６に記載のものと同じ転化率推定法を使用して、２５０℃での転化率は少なくとも１５％であり、イソプレンへの収率は６％であった。３００℃での転化率は、イソプレンへの最小収率３０％で４４％であった。３５０℃での転化率は、イソプレンへの最小収率３５％で５５％であった。
【０１７０】
実施例４０
触媒なしでのメバロノラクトンの反応
ＭＶＬ溶液は、実施例３６に記載のリアクターを通じて一切の触媒と反応させられず、おおよそ３ｍＬのリアクター内容積が３００℃〜４５０℃の範囲の温度で加熱されたが、触媒は充填されなかった。すべての温度において、２０ｗｔ％ＭＶＬ水溶液は、１０μＬ／分で流れ、窒素キャリアガスは２８．１３ｓｃｃｍであった。３００℃では、イソプレンは、ピーク総面積の８％を表し、メチルビニルケトンは８４％、２−メチル−１−ブテンは８％であった。実施例３６に記載のモデルイソプレン溶液に基づいて、１１％の全体転化率および１％のイソプレン収率が推定される。３５０℃では、イソプレンは、ピーク総面積の１２％を表し、メチルビニルケトンは７１％、２−メチル−１−ブテンは１４％、２−メチル−１−プロペンは３％であった。推定転化率は３０％で、イソプレン収率は３％であった。４００℃では、イソプレンは、ピーク総面積の１４％を表し、メチルビニルケトンは５４％、２−メチル−１−ブテンは２５％、２−メチル−１−プロペンは５％であった。推定転化率は４４％で、イソプレン収率は６％であった。４５０℃では、イソプレンは、ピーク総面積の１２％を表し、メチルビニルケトンは４６％、２−メチル−１−ブテンは３２％、２−メチル−１−プロペンは５％であった。推定転化率は４８％で、イソプレン収率は６％であった。この結果は、触媒なしでは、特にメチルビニルケトンと比較するとイソプレンは実質的にあまり好ましくないことをはっきりと示す。
【０１７１】
実施例４１
アルミナに担持されたニッケル金属でのメバロノラクトンの反応
ＭＶＬは、実施例３６に記載されたリアクターを使用して、Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒのカタログ番号３１２７６のシリカアルミナにおける６６±５％Ｎｉ触媒で反応させた。３００℃では、１０μＬ／分の２０ｗｔ％ＭＶＬおよび２８．１３ｓｃｃｍの窒素により蒸気トラップ後にインラインＦＩＤにおいて、メタン、一酸化炭素、または水素であると推定される１つのみの目に見えるピークが生じる。イソプレン、メチルビニルケトン、メチルイソプロピルケトン、またはその他の公知の生成物は生成物流において確認されなかった。リアクター温度を２５０℃まで下げることにより、目に見える生成物に対する大きな変化はもたらされなかった。
【０１７２】
実施例４２
シリカにおけるエタノールを用いたメバロノラクトンの反応
実施例３６と同じ試験リアクターを使用して、１．１７２ｇｍのＤａｖｉｓｉｌグレード６２のシリカゲルを充填し、３００℃で保持した。本実施例では、３．６３８ｇｍの２０ｗｔ％ＭＶＬ水溶液とさらなる０．４０２ｇｍの無水エタノールをシリンジポンプ中で混合することにより、エタノールを共反応物質として添加し、これは２ｓｃｃｍの窒素と一緒にリアクター内に１０μＬ／分で注入された。系を３０分間平衡させた後、完全な生成物の分布がジクロロメタンまたは１−オクタノールのいずれかで収集され、溶媒との重なりにより生成物ピークが欠けることを回避した。本実施例では、蒸気トラップおよびインラインＧＣ−ＦＩＤが迂回されることによって、重い高沸点分子を含む完全な生成物の収集を可能にする。ジクロロメタンおよび１−オクタノール中の生成物についての質量スペクトルは別途捕捉され、分析された。いくらかの溶媒汚染が予想され、すべての質量スペクトルと同様に、同定は常にいくらか曖昧であるため、これは、エタノールまたは任意の他の共反応物質を使用して生成される潜在的生成物を限定するものとしてみなすべきではない。
同定された化学物質を組み合わせたリストは、以下である。
・シクロブタノール
・４−ペンテン−２−オール、３−メチル−
・エタノール
・４−ペンテン−１−イルアセテート
・１，３−ジオキソラン、２−ヘプチルー４−フェニル−
・メチルビニルケトン
・エチルアセテート
・１，４−ペンタジエン−３−オン
・４−ペンテン酸エチルエステル
・ベンゼン、［（シクロヘキシルオキシ）メチル］
・ビシクロ［２．２．２］オクタ−７−エン−２−オン、５−メチレン−
・２，６−オクタジエン−１−オール、２，７−ジメチル−
・ｐ−メンタ−１（７）−エン−９−オール
・３−シクロヘキセン−１−オール、４−メチル−１−（１−メチルエチル）−、アセテート
・２，３−エポキシカラン、（Ｅ）−
・シクロヘキサノール、１−メチル−４−（１−メチルエテニル）−、アセテート
・エタノール、２−（３，３−ジメチルシクロヘキシリデン）−、（Ｚ）−
・５−カラノール、トランス，トランス−（＋）−
・２−フラノン、２，５−ジヒドロ−３，５−ジメチル
・３−メチレンビシクロ［３．２．１］オクタ−６−エン−８−オール
・ベンゼンエタノール、α，α−ジメチル−、アセテート
・２−シクロヘキセン−１−オン、４，５−ジメチル−
・（３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｒ）−４，５−ビス（ヒドロキシメチル）−３，６−ジメチルシクロヘキセン
・４−アセチル−１−メチルシクロヘキセン
・シクロペンタン、１−アセチル−１，２−エポキシ−
・ケトン、１，５−ジメチルビシクロ［２．１．０］ペンタ−５−イルメチル
・デヒドロメバロン酸ラクトン
・スピロ［３．４］オクタン−５−オン
・１−フタラノール、１，３，３−トリメチル−
・９−オクタデセン−１２−イン酸、メチルエステル
・２Ｈ−ピラン−２−オン、５，６−ジヒドロ−４−（２，３−ジメチル−２−ブテン−２−イル）−
・６−（ｐ−トリル）−２−メチル−２−ヘプテノール
・４，４−ジメチルシクロヘキサジエノン
・フェナントロ［３，２−ｂ］フラン−７，１１−ジオン、１，２，３，４，８，９−ヘキサヒドロ−４，８，８−トリメチル−、（＋）−
・１−ノナノール
・デカナール
・１−デカノール
・シュウ酸、イソブチルノニルエステル
・デカン酸、メチルエステル
・テトラヒドロピラン１２−テトラデシン−１−オールエーテル
・炭酸、オクタデシルフェニルエステル
【図１】
2017538403.tif 000021
【配列表】
2017538403000001.app
【国際調査報告】
2017538403.tif 000022