(57)【要約】  トウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子調節要素を用いて、植物細胞および／または植物組織において導入遺伝子を発現させるための構築物および方法が提供される。
2017503513.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含む遺伝子発現カセットであって、前記プロモーターは、配列番号２の相補体に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドプローブにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、遺伝子発現カセット。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１に記載の遺伝子発現カセット。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドがイントロンを含む、請求項１に記載の遺伝子発現カセット。
【請求項４】
前記イントロンが、配列番号５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項３に記載の遺伝子発現カセット。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１に記載の遺伝子発現カセット。
【請求項６】
前記作動可能に連結された導入遺伝子が、ポリペプチドまたは小型ＲＮＡ遺伝子をコードする、請求項１に記載の遺伝子発現カセット。
【請求項７】
前記導入遺伝子が、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合タンパク質導入遺伝子および選択マーカー導入遺伝子からなる群から選択される、請求項１に記載の遺伝子発現カセット。
【請求項８】
３’非翻訳領域をさらに含む、請求項１に記載の遺伝子発現カセット。
【請求項９】
前記３’非翻訳領域が、配列番号７または配列番号８に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項８に記載の遺伝子発現カセット。
【請求項１０】
３’非翻訳領域をさらに含み、ここで５’−ＵＴＲは、配列番号１９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１に記載の遺伝子発現カセット。
【請求項１１】
請求項１に記載の遺伝子発現カセットを含む組換えベクターであって、プラスミド、コスミド、細菌人工染色体、ウイルスおよびバクテリオファージからなる群から選択される、ベクター。
【請求項１２】
請求項１に記載の遺伝子発現カセットを含むトランスジェニック細胞。
【請求項１３】
トランスジェニック植物細胞である、請求項１２に記載のトランスジェニック細胞。
【請求項１４】
請求項１３に記載のトランスジェニック植物細胞を含むトランスジェニック植物。
【請求項１５】
単子葉植物または双子葉植物である、請求項１４に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１６】
前記単子葉植物が、トウモロコシ植物、イネ植物およびコムギ植物からなる群から選択される、請求項１５に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１７】
請求項１４に記載のトランスジェニック植物由来のトランスジェニック種子。
【請求項１８】
前記プロモーターが、組織優先プロモーターである、請求項１に記載の遺伝子発現カセット。
【請求項１９】
前記組織優先プロモーターが、葉、殻、茎またはシルク組織優先プロモーターである、請求項１に記載の遺伝子発現カセット。
【請求項２０】
前記プロモーターが、配列番号２のヌクレオチド１〜１，８８７のポリヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の遺伝子発現カセット。
【請求項２１】
トランスジェニック植物において異種コード配列を発現させるための方法であって、
ａ）３’非翻訳領域に作動可能に連結された異種コード配列に作動可能に連結された、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列を含む遺伝子発現カセットで植物細胞を形質転換すること；
ｂ）前記遺伝子発現カセットを含む形質転換された植物細胞を単離すること；
ｃ）前記形質転換された植物細胞を再生してトランスジェニック植物にすること；および
ｄ）配列番号２を含む前記ポリヌクレオチド配列を含む前記遺伝子発現カセットを含むトランスジェニック植物を得ること
を含む、方法。
【請求項２２】
配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む合成ポリヌクレオチド配列を製造するための方法であって、
ａ）配列番号２を含むポリヌクレオチド配列を同定すること；
ｂ）配列番号２を含むポリヌクレオチド配列を単離すること；
ｃ）配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む複数のポリヌクレオチド配列を画定すること；
ｄ）配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列を合成すること；および
ｅ）配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む合成ポリヌクレオチド配列を製造すること
を含む、方法。
【請求項２３】
前記合成することが、
ａ）配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列を同定すること；
ｂ）配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列に結合する、複数のオリゴヌクレオチドプライマー配列を生成すること；
ｃ）前記複数のオリゴヌクレオチドプライマー配列をライゲートして、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列を合成すること
を含む請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本出願は、２０１４年１月２３日に出願された米国仮特許出願第６１／９３０，７３８号「トウモロコシ調節要素およびその使用（ZEA MAYS REGULATORY ELEMENTS AND USES THEREOF）」の出願日の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、概して、植物分子生物学の分野に関し、より具体的には植物における導入遺伝子の発現の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
多くの植物種は、農学的に望ましい形質または特徴を導入するために、導入遺伝子で形質転換することができる。植物種は、特定の所望の形質を有するように開発および／または改変される。一般的に、所望の形質としては、例えば、栄養価の品質を改善すること、収量を増加させること、害虫または病害抵抗性を付与すること、干ばつおよびストレス耐性を増加させること、園芸品質（例えば、色素形成および成長）を向上させること、除草剤耐性を付与すること、植物由来の工業的に有用な化合物および／または材料の生産を可能にすること、および／または医薬品の生産を可能にすることが挙げられる。
【０００４】
単一のゲノム遺伝子座に積み重ねられた複数の導入遺伝子を含むトランスジェニック植物種は、植物形質転換技術を介して製造される。植物形質転換技術は、植物細胞への導入遺伝子の導入、植物ゲノムにおいて安定に組み込まれた導入遺伝子のコピーを含有する稔性トランスジェニック植物の回収をもたらし、ならびに植物ゲノムの転写および翻訳を介したその後の導入遺伝子発現は、所望の形質および表現型を有するトランスジェニック植物をもたらす。しかしながら、形質の積み重ねとして遺伝子操作された複数の導入遺伝子を高度に発現するようにトランスジェニック植物種の生産を可能にする機構が望まれる。
【０００５】
同様に、植物の特定の組織または器官内で導入遺伝子の発現を可能にする機構が望まれる。例えば、土壌媒介性病原体による感染に対する植物の抵抗性の増大は、病原体抵抗性タンパク質が植物の根内で着実に発現されるように、病原体抵抗性遺伝子で植物ゲノムを形質転換することにより達成されてもよい。あるいは、例えば、細胞分裂または伸長などの特定の成長または発達段階にある植物組織において導入遺伝子を発現することが望ましい場合がある。さらに、植物の葉および茎組織において導入遺伝子を発現することが望ましい場合がある。
【０００６】
トウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター調節要素が本明細書に記載される。さらに、トウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター調節要素を利用する構築物および方法が本明細書に記載される。
【発明の概要】
【０００７】
植物細胞および／または植物組織において導入遺伝子を発現させるための配列、構築物および方法が本明細書に開示される。一実施形態において、本開示は、導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含む遺伝子発現カセットに関し、ここで、該プロモーターは、配列番号２の相補体に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドプローブにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。さらなる実施形態において、プロモーターは、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。追加の実施形態において、プロモーターは、イントロンを含むポリヌクレオチドを含む。他の実施形態において、イントロンは、配列番号５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。一実施形態において、プロモーターは、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。他の実施形態において、作動可能に連結された導入遺伝子は、ポリペプチドまたは小型ＲＮＡをコードする。続く実施形態において、導入遺伝子は、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子および選択マーカー導入遺伝子からなる群から選択される。さらに別の実施形態において、遺伝子発現カセットは、３’非翻訳領域をさらに含む。一実施形態において、３’非翻訳領域は、配列番号７または配列番号８に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。さらに別の実施形態において、遺伝子発現カセットは、５’非翻訳領域をさらに含む。別の実施形態において、５’非翻訳領域は、配列番号１９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。一実施形態において、組換えベクターは遺伝子発現カセットを含む。実施形態のさらなる態様において、組換えベクターは、プラスミド、コスミド、細菌人工染色体、ウイルスおよびバクテリオファージからなる群から選択される。一実施形態において、トランスジェニック細胞は遺伝子発現カセットを含む。実施形態の続く局面において、細胞はトランスジェニック植物細胞である。一実施形態において、トランスジェニック植物はトランスジェニック植物細胞を含む。実施形態のさらなる態様において、トランスジェニック植物は単子葉植物または双子葉植物である。実施態様の他の側面において、単子葉植物は、トウモロコシ植物、イネ植物およびコムギ植物からなる群から選択される。一実施形態では、トランスジェニック種子はトランスジェニック植物から得られる。続く実施形態において、プロモーターは組織優先プロモーター（tissue-preferred promoter）である。さらなる実施形態において、組織優先プロモーターは、葉、殻、茎またはシルク組織優先プロモーターである。さらに別の実施形態において、プロモーターは、配列番号２のヌクレオチド１〜１，８８７のポリヌクレオチド配列を含む。
【０００８】
一実施形態において、本開示は、ストリンジェントな条件下で、配列番号２の相補体に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドプローブにハイブリダイズする合成ポリヌクレオチドを含むトランスジェニック細胞に関する。さらなる実施形態において、合成ポリヌクレオチドは、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。さらなる実施形態において、合成ポリヌクレオチドは、イントロンを含むポリヌクレオチドを含む。他の実施形態において、イントロンは、配列番号５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。一実施形態において、合成ポリヌクレオチドは、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。さらなる実施形態において、トランスジェニック細胞はトランスジェニック植物細胞である。続く実施形態において、トランスジェニック植物細胞は、植物形質転換法により生産される。追加の実施形態において、植物形質転換法は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換法、微粒子銃形質転換法、炭化ケイ素形質転換法、プロトプラスト形質転換法およびリポソーム形質転換法からなる群から選択される。一実施形態において、トランスジェニック植物はトランスジェニック植物細胞を含む。さらなる実施形態において、トランスジェニック植物は単子葉植物または双子葉植物である。他の実施形態において、単子葉植物は、トウモロコシ植物、イネ植物およびコムギ植物からなる群から選択される。一実施形態において、トランスジェニック種子はトランスジェニック植物から得られる。さらなる実施形態において、プロモーターは組織優先プロモーターである。続く実施形態において、組織優先プロモーターは、葉、殻、茎またはシルク組織優先プロモーターである。別の実施形態において、合成ポリヌクレオチドは、配列番号２のヌクレオチド１〜１，８８７のポリヌクレオチド配列を含む。
【０００９】
一実施形態において、本開示は、精製されたポリヌクレオチドプロモーターに関し、ここで、該プロモーターは、ストリンジェントな条件下で、配列番号２の相補体に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドプローブにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。さらなる実施形態において、精製されたポリヌクレオチドプロモーターは、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。さらなる実施形態において、精製されたポリヌクレオチドプロモーターは、イントロンを含むポリヌクレオチドを含む。他の実施形態において、イントロンは、配列番号５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。一実施形態において、精製されたポリヌクレオチドプロモーターは、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。別の実施形態において、精製されたポリヌクレオチドは、導入遺伝子に作動可能に連結されている。続く実施形態において、作動可能に連結された導入遺伝子は、ポリペプチドをコードするまたは小型ＲＮＡである。一実施形態において、遺伝子発現カセットは、３’非翻訳領域に作動可能に連結された導入遺伝子に作動可能に連結された、精製されたポリヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、３’非翻訳領域は、配列番号７または配列番号８に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。一実施形態において、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結された、精製されたポリヌクレオチド配列を含み、ここで、該精製されたポリヌクレオチドは、配列番号１９の５’非翻訳領域である。別の実施形態において、５’非翻訳領域は、配列番号１９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。別の実施形態において、導入遺伝子は、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子および選択マーカー導入遺伝子からなる群から選択される。一実施形態において、組換えベクターは、遺伝子発現カセットを含む。さらなる実施形態において、組換えベクターは、プラスミドベクター、コスミドベクターおよびＢＡＣベクターからなる群から選択される。一実施形態において、トランスジェニック細胞は遺伝子発現カセットを含む。続く実施形態において、トランスジェニック細胞はトランスジェニック植物細胞である。一実施形態において、トランスジェニック植物はトランスジェニック植物細胞を含む。さらなる実施形態において、トランスジェニック植物は単子葉植物である。なおさらなる実施形態において、単子葉植物は、トウモロコシ植物、小麦植物およびイネ植物からなる群から選択される。一実施形態において、トランスジェニック種子はトランスジェニック植物から得られる。続く実施形態において、精製されたポリヌクレオチド配列は導入遺伝子の組織優先発現を促進する。追加の実施形態において、精製されたポリヌクレオチド配列は、葉、殻、茎またはシルクの導入遺伝子の組織優先発現を促進する。他の実施形態において、精製されたポリヌクレオチドは、配列番号２のヌクレオチド１〜１，８８７のポリヌクレオチド配列を含む。
【００１０】
一実施形態において、本開示は、トランスジェニック植物において異種コード配列を発現させるための方法であって、
ａ）３’非翻訳領域に作動可能に連結された異種コード配列に作動可能に連結された、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列を含む遺伝子発現カセットで植物細胞を形質転換すること；
ｂ）遺伝子発現カセットを含む形質転換された植物細胞を単離すること；
ｃ）形質転換された植物細胞を再生してトランスジェニック植物にすること；および
ｄ）配列番号２を含むポリヌクレオチド配列を含む遺伝子発現カセットを含むトランスジェニック植物を得ること
を含む、方法に関する。
【００１１】
追加の実施形態において、ポリヌクレオチド配列はイントロンを含む。他の実施形態において、イントロンは、配列番号５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。一実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。さらなる実施形態において、異種コード配列は、殺虫剤抵抗性コード配列、除草剤耐性コード配列、窒素利用効率コード配列、水利用効率コード配列、栄養価コード配列、ＤＮＡ結合コード配列および選択マーカーコード配列からなる群から選択される。追加の実施形態において、植物細胞の形質転換は、植物形質転換法を利用する。なお別の実施形態において、植物形質転換法は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換法、微粒子銃形質転換法、炭化ケイ素形質転換法、プロトプラスト形質転換法およびリポソーム形質転換法からなる群から選択される。他の実施形態において、トランスジェニック植物は、単子葉トランスジェニック植物または双子葉トランスジェニック植物である。他の実施形態において、単子葉トランスジェニック植物は、トウモロコシ植物、コムギ植物およびイネ植物からなる群から選択される。一実施形態において、トランスジェニック種子はトランスジェニック植物から得られる。さらなる実施形態において、異種コード配列は組織において優先的に発現される。なお別の実施形態において、異種コード配列は、葉、殻、茎またはシルク組織において発現される。他の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号２のヌクレオチド１〜１，８８７の配列を含む。
【００１２】
一実施形態において、本開示は、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列を単離するための方法であって、
ａ）配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列を同定すること；
ｂ）配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列に結合する、複数のオリゴヌクレオチドプライマー配列を生成すること；
ｃ）複数のオリゴヌクレオチドプライマー配列から選択されるオリゴヌクレオチドプライマー配列を用いて、ＤＮＡ試料から配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列を増幅すること；および
ｄ）配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列を同定すること
を含む、方法に関する。
【００１３】
追加の実施形態において、ポリヌクレオチド配列はイントロンを含む。他の実施形態において、イントロンは、配列番号５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。一実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。追加の実施形態において、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む単離されたポリヌクレオチド配列は、導入遺伝子に作動可能に連結されている。さらなる実施形態において、作動可能に連結された導入遺伝子はポリペプチドをコードする。一実施形態において、遺伝子発現カセットは、３’非翻訳領域に作動可能に連結された導入遺伝子に作動可能に連結された、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、３’非翻訳領域は、配列番号７または配列番号８に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。さらなる実施形態において、導入遺伝子は、殺虫剤抵抗性コード配列、除草剤耐性コード配列、窒素利用効率コード配列、水利用効率コード配列、栄養価コード配列、ＤＮＡ結合コード配列および選択マーカーコード配列からなる群から選択される。一実施形態において、組換えベクターは遺伝子発現カセットを含む。さらなる実施形態において、ベクターは、プラスミドベクター、コスミドベクターおよびＢＡＣベクターからなる群から選択される。一実施形態において、トランスジェニック細胞は遺伝子発現カセットを含む。さらなる実施形態において、トランスジェニック細胞はトランスジェニック植物細胞である。一実施形態において、トランスジェニック植物はトランスジェニック植物細胞を含む。さらなる実施形態において、トランスジェニック植物は単子葉植物または双子葉植物である。さらなる実施形態において、単子葉植物は、トウモロコシ植物、コムギ植物およびイネ植物からなる群から選択される。一実施形態において、トランスジェニック種子はトランスジェニック植物から得られる。他の実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号２のヌクレオチド１〜１，８８７のポリヌクレオチド配列を含む。
【００１４】
一実施形態において、本開示は、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む合成ポリヌクレオチド配列を製造するための方法であって、
ａ）配列番号２を含むポリヌクレオチド配列を同定すること；
ｂ）配列番号２を含むポリヌクレオチド配列を単離すること；
ｃ）配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む複数のポリヌクレオチド配列を画定すること；
ｄ）配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列を合成すること；および
ｅ）配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む合成ポリヌクレオチド配列を製造すること
を含む。さらなる実施形態において、合成することは、
ａ）配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列を同定すること；
ｂ）オリゴヌクレオチドプライマー配列が、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列に結合する、複数のオリゴヌクレオチドプライマー配列を生成すること；
ｃ）複数のオリゴヌクレオチドプライマー配列をライゲートして、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列を合成すること
を含む、方法に関する。
【００１５】
追加の実施形態において、合成されたポリヌクレオチド配列はイントロンを含む。他の実施形態において、イントロンは、配列番号５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。一実施形態において、合成されたポリヌクレオチド配列は、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。追加の実施形態において、合成されたポリヌクレオチド配列は、導入遺伝子に作動可能に連結された配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む。なお別の実施形態において、作動可能に連結された導入遺伝子はポリヌクレオチドをコードする。一実施形態において、遺伝子発現カセットは、３’非翻訳領域に作動可能に連結された導入遺伝子に作動可能に連結された、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む合成されたポリヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、３’非翻訳領域は、配列番号７または配列番号８に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。なお別の実施形態において、導入遺伝子は、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子および選択マーカー導入遺伝子からなる群から選択される。一実施形態において、組換えベクターは遺伝子発現カセットを含む。追加の実施形態において、組換えベクターは、プラスミドベクター、コスミドベクターおよびＢＡＣベクターからなる群から選択される。一実施形態において、トランスジェニック細胞は遺伝子発現カセットを含む。さらなる実施形態において、トランスジェニック細胞はトランスジェニック植物細胞である。一実施形態において、トランスジェニック植物はトランスジェニック植物細胞を含む。さらなる実施形態において、トランスジェニック植物は単子葉植物である。他の実施形態において、単子葉植物は、トウモロコシ植物、コムギ植物およびイネ植物からなる群から選択される。一実施形態において、トランスジェニック種子はトランスジェニック植物から得られる。他の実施形態において、合成ポリヌクレオチドは、配列番号２のヌクレオチド１〜１，８８７のポリヌクレオチド配列を含む。
【００１６】
一実施形態において、構築物は、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４のトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーターを含む遺伝子発現カセットを含む。一実施形態において、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子または異種コード配列に作動可能に連結された、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４のトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーターを含む。一実施形態において、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結された、配列番号７または配列番号８のトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子の３’−ＵＴＲを含む。一実施形態において、遺伝子発現カセットは、プロモーターに作動可能に連結された、配列番号７または配列番号８のトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子の３’−ＵＴＲを含む。さらなる実施形態において、遺伝子発現カセットは、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４のトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーターに作動可能に連結された、配列番号７または配列番号８のトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子の３’−ＵＴＲを含む。一実施形態において、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結された、配列番号１９のトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子５’−ＵＲＴを含む。一実施形態において、遺伝子発現カセットは、プロモーターに作動可能に連結された、配列番号１９のトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子５’−ＵＴＲを含む。さらなる実施形態において、遺伝子発現カセットは、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４のトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーターに作動可能に連結された、配列番号１９のトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子を含む。一実施形態において、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結された、配列番号５または配列番号６のトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子イントロンを含む。一実施形態において、遺伝子発現カセットは、プロモーターに作動可能に連結された、配列番号５または配列番号６のトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子イントロンを含む。一実施形態において、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子または異種コード配列に作動可能に連結された、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４のトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーターを含む。一実施形態において、遺伝子発現カセットは、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれを超える導入遺伝子を含む。
【００１７】
一実施形態において、遺伝子発現カセットは、独立して、ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４のトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター、ｂ）配列番号５または配列番号６のトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子イントロン、ｃ）配列番号７または配列番号８のトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子３’−ＵＴＲ、およびｄ）配列番号１９のトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子５’−ＵＴＲを含む。
【００１８】
配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４のトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター；配列番号５または配列番号６のイントロン；配列番号７または配列番号８の３’−ＵＴＲ；および配列番号１９の５’−ＵＴＲを用いて、導入遺伝子を発現する植物を成長させる方法が、本明細書に開示される。また、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４のトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター；配列番号５または配列番号６のイントロン；配列番号７または配列番号８の３’−ＵＴＲ；および配列番号１９の５’−ＵＴＲを用いて、導入遺伝子を発現する植物組織および細胞を培養する方法が、本明細書に開示される。一実施形態において、本明細書に開示される方法は、植物の葉および茎における組織特異的遺伝子発現を含む。
【００１９】
一実施形態において、遺伝子発現カセットは、トウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子から得られた、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】次世代シーケンシング（ＮＧＳ）による転写プロファイリングアプローチを用いた、トウモロコシにおける高発現遺伝子を同定するプロセスを示す図式フローチャートを示す図である。
【図２−１】修飾されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター（配列番号３）と比較した全長のトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター（配列番号１）のアラインメントを示す図である。このアラインメントは、修飾されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター配列を生成するために除かれた反復ポリヌクレオチド配列を示す。
【図２−２】修飾されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター（配列番号３）と比較した全長のトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター（配列番号１）のアラインメントを示す図である。このアラインメントは、修飾されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター配列を生成するために除かれた反復ポリヌクレオチド配列を示す。
【図２−３】修飾されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター（配列番号３）と比較した全長のトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター（配列番号１）のアラインメントを示す図である。このアラインメントは、修飾されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター配列を生成するために除かれた反復ポリヌクレオチド配列を示す。
【図２−４】修飾されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター（配列番号３）と比較した全長のトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター（配列番号１）のアラインメントを示す図である。このアラインメントは、修飾されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター配列を生成するために除かれた反復ポリヌクレオチド配列を示す。
【図３】ｃｒｙ３４Ａｂ１レポーター遺伝子の発現を制御する、全長のトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター調節要素（「ＺｍＣＡＢプロモーター」と表記される）を含む遺伝子発現カセットを示すｐＤＡＢ１１４４３８のベクタープラスミドマップを示す図である。
【図４】目的の遺伝子として試験プロモーター構築物であるｐＤＡＢ１１４４３８に存在するｃｒｙ３４Ａｂｌレポーター遺伝子の代わりに、ｙｆｐレポーター遺伝子を含有するｐＤＡＢ１０１５５６対照ベクターのマップを示す図である。ｙｆｐ遺伝子発現は、トウモロコシ（Zea mays）のユビキチン−１（ＺｍＵｂｉ１）プロモーターによって駆動し、トウモロコシ（Zea mays）Ｐｅｒ５（ＺｍＰｅｒ５）３’−ＵＴＲによって終了する。
【図５】ＺｍｕＵｂｉ１プロモーターによって駆動され、ソラヌム・ツベロスム（Solanum tuberosum）ＰｉｎＩＩ（ＳｔＰｉｎＩＩ）３’−ＵＴＲによって終了するｃｒｙ３４Ａｂ１レポーター遺伝子を含有する陽性対照ベクターであるｐＤＡＢ１０８７４６のマップを示す図である。
【図６】ｃｒｙ３４Ａｂ１レポーター遺伝子の発現を制御する、修飾されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター調節要素を含む遺伝子発現カセットを示すｐＤＡＢ１２０１６５のベクタープラスミドマップを示す図である。
【図７】全長のトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター（「ＺｍＣＡＢプロモーター」と表記される）、およびｃｒｙ３４Ａｂ１レポーター遺伝子の発現を制御する、修飾されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子３’ＵＴＲ（配列番号８）調節要素を含む遺伝子発現カセットを示すｐＤＡＢ１２０１６６のベクタープラスミドマップを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
定義
本明細書で使用するとき、冠詞の「１つの（ａ）」「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈において明確かつ一義的な他の指示がない限り、複数への言及も含む。
【００２２】
本明細書で使用するとき、用語「戻し交配」とは、ブリーダーが雑種子孫をその親の片方と再び交配する方法を指し、例えば、第一世代のＦｌ雑種が、Ｆｌ雑種の親の片方の遺伝子型を有することである。
【００２３】
本明細書で使用するとき、用語「イントロン」とは、転写されるが、翻訳はされない遺伝子に含まれる任意の核酸配列（または対象とする発現されたヌクレオチド配列）を指す。イントロンは、ＤＮＡの発現された配列内の非翻訳核酸配列、ならびにそれから転写されたＲＮＡ分子の対応する配列を含む。
【００２４】
本明細書に記載される構築物はまた、イントロンなどの、翻訳および／またはｍＲＮＡの安定性を高める配列を含むことができる。このようなイントロンの１つの例は、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のヒストン変異体の遺伝子ＩＩの第１イントロン、または任意の他の一般的に知られているイントロン配列である。イントロンは、翻訳および／またはｍＲＮＡの安定性を高めるために、プロモーター配列と組み合わせて使用することができる。
【００２５】
本明細書で使用するとき、用語「５’非翻訳領域」または「５’−ＵＴＲ」とは、プレｍＲＮＡまたは成熟ｍＲＮＡの５’末端における非翻訳セグメントを指す。例えば、成熟したｍＲＮＡに関して、５’−ＵＴＲは、典型的には、その５’上に７−メチルグアノシンキャップを有し、スプライシング、ポリアデニル化、細胞質へのｍＲＮＡの排出、翻訳機構によるｍＲＮＡの５’端の識別、および分解に対するｍＲＮＡの保護などの多数のプロセスに関与する。
【００２６】
本明細書で使用するとき、用語「３’非翻訳領域」または「３’−ＵＴＲ」とは、プレｍＲＮＡまたは成熟ｍＲＮＡの３’末端における非翻訳セグメントを指す。例えば、成熟したｍＲＮＡに関して、この領域は、ポリ（Ａ）テールを有し、ｍＲＮＡ安定性、翻訳開始およびｍＲＮＡ排出における多数の役割を有することが公知である。
【００２７】
本明細書で使用するとき、用語「ポリアデニル化シグナル」とは、ポリ（Ａ）ポリメラーゼの存在下である場合、例えば、ポリ（Ａ）シグナルの下流の１０〜３０塩基に位置した、ポリアデニル化部位上でポリアデニル化されるように転写を可能にするｍＲＮＡ転写物に存在する核酸配列を指す。多数のポリアデニル化シグナルは当該技術分野において公知であり、本発明に有用である。典型的な配列には、ＡＡＵＡＡＡおよびその改変体が含まれ、Loke J., et al, (2005) Plant Physiology 138(3); 1457-1468に記載されている。
【００２８】
本明細書で使用するとき、用途「単離された」とは、生物学的成分（例えば、核酸またはタンパク質）が天然に存在する生物の細胞中の他の生物学的成分（すなわち、他の染色体および染色体外のＤＮＡ）から区別された上記生物学的成分を指す。
【００２９】
本明細書で使用するとき、核酸分子に関して「精製された」という用語は、絶対的な純度（例えば、均質な調製）を要求しない；代わりに、それは、配列が、その天然の細胞環境におけるものよりも相対的に純粋であるという指示を表す（天然レベルと比較して、このレベルは、例えば、濃度または遺伝子発現レベルの点で少なくとも２〜５倍大きいことが必要である）。ＤＮＡ分子は、総ＤＮＡからまたは総ＲＮＡから直接得ることができる。さらに、ｃＤＮＡクローンは、天然に存在しないが、むしろ、好ましくは、部分的に精製された、天然に存在する物質（メッセンジャーＲＮＡ）の操作を介して得られる。ｍＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリーの構築は、合成物質（ｃＤＮＡ）を作製することを伴う。個々のｃＤＮＡクローンは、ｃＤＮＡライブラリーを有する細胞のクローン選択により合成ライブラリーから精製することができる。したがって、ｍＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリーの構築、および異なるｃＤＮＡクローンの精製を伴うプロセスは、天然のメッセージのおよそ１０６倍の精製をもたらす。同様に、プロモーターＤＮＡ配列をプラスミドにクローニングすることができる。このようなクローンは、天然に存在しないが、むしろ、好ましくは、ゲノムＤＮＡライブラリーなどの部分的に精製された、天然に存在する物質の操作を介して得られる。したがって、少なくとも一桁の大きさの精製、およびいくつかの実施形態において２桁または３桁、および他の実施形態において４桁または５桁以上の大きさは、これらの技術において好まれる。
【００３０】
同様に、精製は、成分のＤＮＡ配列における化学的または機能的な変化が生じたという指示を表す。「精製」された核酸分子およびタンパク質は、標準的な精製方法により精製された核酸分子およびタンパク質を含む。用語「精製された」はまた、宿主細胞（例えば、植物細胞）において組換えＤＮＡ法により調製された核酸およびタンパク質、ならびに化学的に合成された核酸分子、タンパク質およびペプチドを包含する。
【００３１】
用語「組換え体」は、遺伝子組換えが起こった細胞または生物を意味する。また、ヒトの介入により、人工的にまたは合成的に（すなわち、非天然に）改変された分子（例えば、ベクター、プラスミド、核酸、ポリペプチドまたは小型ＲＮＡ）を含む。改変は、その天然の環境もしくは状況内の分子またはそこから取り出された分子について行うことができる。
【００３２】
本明細書で使用するとき、用語「発現」とは、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡ（小型ＲＮＡ分子を含む）に転写されるプロセス、および／または転写されたｍＲＮＡ（「転写物」とも呼ばれる）が、続いて、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。遺伝子発現は、外部シグナル、例えば、遺伝子発現を増加または減少させる薬剤への細胞、組織または生物の曝露により影響を与える場合がある。また、遺伝子の発現は、ＤＮＡからＲＮＡからタンパク質への経路におけるいずれかの場所で調節され得る。遺伝子発現の調節は、例えば、転写、翻訳、ＲＮＡ輸送およびプロセッシングに作用する制御を介して、ｍＲＮＡなどの中間分子の分解、または作製された後の特定のタンパク質の活性化、不活性化、コンパートメンント化もしくは分解を介して、あるいはこれらの組合せによって起こる。遺伝子発現は、限定されないが、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、ウェスタンブロット、またはインビトロの、インサイチュのもしくはインビボのタンパク質活性アッセイ（単数または複数）などの当該技術分野において公知の任意の方法により、ＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルで測定することができる。
【００３３】
本明細書で使用するとき、用語「相同性ベースの遺伝子サイレンシング」または「ＨＢＧＳ」は、転写遺伝子サイレンシングと転写後遺伝子サイレンシングの両方を含む総称である。非連結サイレンシング遺伝子座による標的遺伝子座のサイレンシングは、プロモーターまたは転写された配列に対応する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の生成に起因して、それぞれ転写阻害（転写遺伝子サイレンシング；ＴＧＳ）またはｍＲＮＡ分解（転写後遺伝子サイレンシング；ＰＴＧＳ）に起因し得る。それぞれのプロセスへの異なる細胞コンポーネントの関与は、ｄｓＲＮＡ誘導ＴＧＳおよびＰＴＧＳが、おそらく古代の共通な機構の多様化に起因することを示唆している。しかしながら、ＴＧＳとＰＴＧＳを厳密に比較することは、その比較が一般的に異なるサイレンシング遺伝子座の分析に依拠しているために達成が困難であった。単一トランス遺伝子座は、異なる標的遺伝子のプロモーターおよび転写された配列に対応するｄｓＲＮＡの生成に起因して、ＴＧＳとＰＴＧＳの両方を始動させると説明することができる。
【００３４】
本明細書で使用するとき、用語「核酸分子」、「核酸」または「ポリヌクレオチド」（３つ全ての用語は互いに同義である）とは、ヌクレオチドのポリマー形態を指し、これには、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成形態のセンス鎖とアンチセンス鎖の両方、ならびに上記の混合ポリマーを含み得る。「ヌクレオチド」とは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはいずれかの種類のヌクレオチドの改変された形態を指してもよい。核酸分子は、通常、他に指定されなければ、少なくとも１０塩基長である。これらの用語は、未定長のＲＮＡまたはＤＮＡの分子を指してもよい。これらの用語には、一本鎖形態および二本鎖形態のＤＮＡが含まれる。核酸分子は、天然に存在するおよび／または天然には存在しないヌクレオチド連鎖により互いに連結された天然に存在するおよび改変されたヌクレオチドのいずれかまたは両方を含んでもよい。
【００３５】
核酸分子は、当業者により容易に認識されるように、化学的にもしくは生化学的に改変されてもよく、または非天然もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含有していてもよい。このような改変には、例えば、標識、メチル化、天然に存在するヌクレオチドのうちの１つ以上の類似体との置換、ヌクレオチド間改変（例えば、無電荷連鎖：例えば、メチルホスホン酸、リン酸トリエステル、ホスホロアミド酸、カルバミン酸など；電荷連鎖：例えば、ホスホロチオエート、ジチオリン酸など；ペンダント部分、例えば、ペプチド；介入物、例えば、アクリジン、ソラレンなど；キレート剤；アルキル化剤；および改変連鎖、例えば、アルファアノマー核酸、等）が含まれる。また、用語「核酸分子」には、一本鎖、二本鎖、部分的二重鎖、三重鎖、ヘアピン、環状および錠かけ型の立体構造を含む、任意のトポロジー立体構造も含まれる。
【００３６】
転写は、ＤＮＡ鎖に沿って５’から３’への様式で進行する。これは、ＲＮＡが、成長している鎖の３’末端へのリボヌクレオチド−５’−三リン酸の連続付加（ピロリン酸の不可欠な除去とともに）により作製されることを意味する。線形または環状の核酸分子のいずれかにおいて、別々の要素（例えば、特定のヌクレオチド配列）は、その要素から５’方向の同じ核酸に結合しているまたは結合することになるのであれば、さらなる要素に対して「上流」にあると呼んでもよい。同様に、別々のエレメントは、そのエレメントから３’方向の同じ核酸に結合しているまたは結合することになるのであれば、さらなる要素に対して「下流」にあることになり得る。
【００３７】
本明細書で使用するとき、用語「塩基位置」とは、指定された核酸内の所与の塩基またはヌクレオチド残基の位置を指す。指定された核酸は、参照核酸とのアライメントにより定義されてもよい。
【００３８】
本明細書で使用するとき、用語「ハイブリダイゼーション」とは、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドとそれらの類似体が水素結合によりハイブリダイズするプロセスを指し、水素結合としては、相補的塩基間のワトソン−クリック、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン水素結合が含まれる。一般的に、核酸分子は、ピリミジン（シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）およびチミン（Ｔ））またはプリン（アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ））のいずれかである窒素含有塩基からなる。これらの窒素含有塩基は、ピリミジンとプリン間で水素結合を形成し、プリンへのピリミジンの結合は「塩基対合」と呼ばれる。さらに具体的には、ＡはＴまたはＵと水素結合し、ＧはＣと結合する。「相補的」とは、２つの異なる核酸配列間または同じ核酸配列の２つの異なる領域間で起こる塩基対合を指す。
【００３９】
本明細書で使用するとき、用語「特異的にハイブリダイズ可能な」および「特異的に相補的な」とは、ポリヌクレオチド／オリゴヌクレオチドとＤＮＡまたはＲＮＡ標的の間で、安定であり特異的な結合が生じるのに十分な程度の相補性を指す。特異的にハイブリダイズするために、オリゴヌクレオチド／ポリヌクレオチドは、その標的配列に１００％相補的である必要はない。標的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子へのオリゴヌクレオチド／ポリヌクレオチドの結合が標的ＤＮＡまたはＲＮＡの正常な機能と干渉し、特異的結合が望ましい条件下で、例えば、インビボのアッセイまたは系の場合の生理的条件下で非標的配列へのオリゴヌクレオチド／ポリヌクレオチドの非特異的結合を避けるのに十分な程度の相補性が存在するとき、オリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオチドは特異的にハイブリダイズ可能である。このような結合は、特異的ハイブリダイゼーションと呼ばれる。特定の程度のストリンジェンシーを生じるハイブリダイゼーション条件は、選択されたハイブリダイゼーション法の性質、ならびにハイブリダイズする核酸配列の組成および長さに応じて変化する。一般的に、ハイブリダイゼーションの温度およびハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度（特に、Ｎａ＋および／またはＭｇ２＋濃度）は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに寄与するが、洗浄時間もまたストリンジェンシーに影響を与える。特定の程度のストリンジェンシーを達成するのに必要なハイブリダイゼーション条件に関する計算は、Sambrook et al. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989で考察されている。
【００４０】
本明細書で使用するとき、用語「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーション分子とＤＮＡ標的の間のミスマッチが５０％未満である場合にのみハイブリダイゼーションが起こる条件を包含する。「ストリンジェントな条件」には、さらに特定レベルのストリンジェンシーが含まれる。したがって、本明細書で使用するとき、「中程度のストリンジェンシー」条件とは、５０％を超える配列ミスマッチを有する分子ではハイブリダイズしない条件であり；「高ストリンジェンシー」の条件とは、２０％を超えるミスマッチを有する配列ではハイブリダイズしない条件であり；「超高ストリンジェンシー」の条件とは、１０％を超えるミスマッチを有する配列ではハイブリダイズしない条件である。
【００４１】
特定の実施形態において、ストリンジェントな条件は、６５℃でのハイブリダイゼーション、続く、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳを用いた６５℃での４０分間の洗浄を含むことができる。以下は、代表的な非限定的ハイブリダイゼーション条件である：
●超高ストリンジェンシー：５×ＳＳＣ緩衝液中、６５℃で１６時間のハイブリダイゼーション；２×ＳＳＣ緩衝液中、室温でそれぞれ１５分間の洗浄２回；および０．５×ＳＳＣ緩衝液中、６５℃でそれぞれ２０分間の洗浄２回。
●高ストリンジェンシー：５〜６×ＳＳＣ緩衝液中、６５〜７０℃で１６〜２０時間のハイブリダイゼーション；２×ＳＳＣ緩衝液中、室温でそれぞれ５〜２０分間の洗浄２回；および１×ＳＳＣ緩衝液中、５５〜７０℃でそれぞれ３０分間の洗浄を２回。
●中程度ストリンジェンシー：６×ＳＳＣ緩衝液中、室温から５５℃で１６〜２０時間のハイブリダイゼーション；２×〜３×ＳＳＣ緩衝液中、室温から５５℃でそれぞれ２０〜３０分間の洗浄を少なくとも２回。
【００４２】
一実施形態において、特異的にハイブリダイズ可能な核酸分子は、超高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で結合したままでいることができる。一実施形態において、特異的にハイブリダイズ可能な核酸分子は、高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で結合したままでいることができる。一実施形態において、特異的にハイブリダイズ可能な核酸分子は、中程度ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で結合したままでいることができる。
【００４３】
本明細書で使用するとき、用語「オリゴヌクレオチド」とは、短い核酸ポリマーを指す。オリゴヌクレオチドは、さらに長い核酸セグメントを切断することにより、または個々のヌクレオチド前駆体を重合することにより形成し得る。自動合成装置により、最大数百塩基対長のオリゴヌクレオチドの合成が可能になる。オリゴヌクレオチドは相補的ヌクレオチド配列に結合することができるため、ＤＮＡまたはＲＮＡを検出するためのプローブとして使用し得る。ＤＮＡで構成されているオリゴヌクレオチド（オリゴデオキシリボヌクレオチド）は、小型ＤＮＡ配列の増幅のための技術であるポリメラーゼ連鎖反応において使用し得る。ポリメラーゼ連鎖反応において、オリゴヌクレオチドは、典型的には、「プライマー」と呼ばれ、これによりＤＮＡポリメラーゼはオリゴヌクレオチドを伸長し、相補鎖を複製することができる。
【００４４】
本明細書で使用するとき、「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」とは、微量の核酸、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡが、米国特許第４，６８３，１９５号に記載されたように増幅される手順または技術を一般に指す。一般的に、オリゴヌクレオチドプライマーが設計できるように、目的とする領域の末端からのまたはそれを超えた配列情報を入手できる必要がある；これらのプライマーは、増幅されるべき鋳型の対向する鎖と配列が同一または類似している。２つのプライマーの５’末端ヌクレオチドは、増幅された材料の末端と一致してもよい。ＰＣＲを用いて、特異的ＲＮＡ配列、全ゲノムＤＮＡからの特異的ＤＮＡ配列、および全細胞性ＲＮＡ、バクテリオファージ配列またはプラスミド配列から転写されたｃＤＮＡなどを増幅することができる。一般に、Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51 :263 (1987); Erlich, ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989)を参照されたい。
【００４５】
本明細書で使用するとき、用語「プライマー」とは、条件がプライマー伸長産物の合成に適している場合、相補鎖に沿った合成の開始点として作用し得るオリゴヌクレオチドを指す。合成条件には、４つの異なるデオキシリボヌクレオチド三リン酸と、逆転写酵素またはＤＮＡポリメラーゼなどの少なくとも１つの重合誘導剤の存在が含まれる。これらは、適切な緩衝液中に存在し、該緩衝液は、補因子である、または様々な適切な温度でｐＨなどの条件に影響を与える構成物質を含んでもよい。プライマーは、好ましくは一本鎖配列であり、それにより、増幅効率が最適化されるが、二本鎖配列を利用することができる。
【００４６】
本明細書で使用するとき、用語「プローブ」とは、標的配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列を指す。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）またはＴＡＱＭＡＮ（登録商標）形式のアッセイ手法において、プローブは、２つのプライマーのアニーリング部位間に位置する標的の部分にハイブリダイズする。プローブは、約８ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチドまたは約５０ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、プローブは、約８ヌクレオチドから約１５ヌクレオチドを含む。
【００４７】
サザンブロットアッセイ手法において、プローブは、メンブレンに結合されたＤＮＡ断片にハイブリダイズする。このようなアッセイにおいて、プローブは、約１０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約２５０ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド、約２，５００ヌクレオチドまたは約５，０００ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、プローブは、約５００ヌクレオチドから約２，５００ヌクレオチドを含む。
【００４８】
プローブは、検出可能な標識、例えば、放射性標識、ビオチン化標識、フルオロフォア（ＴＥＸＡＳ  ＲＥＤ（著作権）、フルオレセインイソチオシアネートなど）をさらに含むことができる。検出可能な標識は、例えば、プローブの５’端またはプローブの３’端に位置したプローブオリゴヌクレオチドに直接、共有結合され得る。また、フルオロフォアを含むプローブは、クエンチャー、例えば、ＢＬＡＣＫ  ＨＯＬＥ  ＱＵＥＮＣＨＥＲ（登録商標）、ＩＯＷＡ  ＢＬＡＣＫ（商標）などを含むことができる。
【００４９】
本明細書で使用するとき、用語「配列同一性」または「同一性」は、交換可能に使用され得、特定の比較ウィンドウにわたって、最大一致となるように整列させた場合に同一である２つの配列中の核酸残基を指す。
【００５０】
本明細書で使用するとき、用語「配列同一性の割合」とは、比較ウィンドウにわたって、２つの最適に整列された配列（例えば、核酸配列またはアミノ酸配列）を比較することにより決定される値を指し、ここで、比較ウィンドウにおける配列の一部は、この２つの配列の最適アライメントの（付加または欠失を含まない）参照配列と比較した場合に、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。割合は、同一の核酸またはアミノ酸の残基が両方の配列に生じる位置の数を決定して、マッチした位置の数を算出し、マッチした位置の数を、比較ウィンドウにおける位置の総数で割り、その結果に１００を掛けて、配列同一性の割合を算出することにより計算される。比較のために配列を整列させる方法は周知である。様々なプログラムおよびアライメントアルゴリズムが、例えば、Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444; Higgins and Sharp ( 1988) Gene 73:237-44; Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5: 151-3; Corpet et al., (1988) Nucleic Acids Res. 16: 10881-90; Huang el ai, (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-65; Pearson et ai, (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-31 ; Tatiana et al., (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50に記載されている。
【００５１】
国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）ベーシックローカルアライメント検索ツール（ＢＬＡＳＴ（商標）；Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10）は、複数の配列分析プログラムと連結して使用するために、複数の供給元、例えば、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）から、および、インターネット上で入手可能である。このプログラムを使用する配列同一性の決定方法の説明は、インターネット上で、ＢＬＡＳＴ（商標）の「ｈｅｌｐ」欄で利用可能である。核酸配列の比較について、ＢＬＡＳＴ（商標）（Ｂｌａｓｔｎ）プログラムの「Ｂｌａｓｔ２配列」機能を、デフォルトパラメーターを用いて採用することができる。参照配列に対してより一層大きな類似性を有する核酸配列は、この方法により評価した場合、同一性の割合が高くなることを示す。
【００５２】
本明細書で使用するとき、用語「作動可能に連結された」とは、別の核酸と機能的な関係に置かれた核酸を指す。一般的に、「作動可能に連結された」とは、連結された核酸が連続していることを意味し得る。連結は、都合の良い制限部位でのライゲーションにより達成することができる。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが核酸にライゲートまたはアニーリングされ、連続したポリヌクレオチド断片を連結させるために使用される。しかしながら、作動可能に連結しようとする要素は、必ずしも連続していなくてもよい。
【００５３】
本明細書で使用するとき、用語「プロモーター」とは、遺伝子の上流（遺伝子の５’領域方向）に一般的に配置されているＤＮＡの領域を指し、該遺伝子の転写を開始および駆動するため必要とされる。プロモーターは、それが調節する遺伝子を適切に活性化または抑制することができる。プロモーターは、転写因子によって認識される特定配列を含有し得る。これらの因子は、プロモーターＤＮＡ配列に結合してもよく、遺伝子のコード領域からＲＮＡを合成する酵素である、ＲＮＡポリメラーゼの漸増をもたらす。プロモーターは、一般的に、上流プロモーター、５’−ＵＴＲ、イントロンおよびリーダー配列を含む、遺伝子の上流に配置された全ての遺伝子調節要素を指す。
【００５４】
本明細書で使用するとき、用語「上流プロモーター」とは、転写の開始を指向するのに十分である連続したポリヌクレオチド配列を指す。本明細書で使用するとき、上流プロモーターは、ＴＡＴＡボックス、イニシエーター配列、ＴＦＩＩＢ認識要素および他のプロモーターモチーフを含む、いくつかの配列モチーフを有する転写の開始部位を包含する（Jennifer, E.F. et al., (2002) Genes & Dev., 16: 2583-2592）。上流プロモーターは、ＴＦＩＩＡ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＨのような基本のまたは一般的な転写因子を含むマルチサブユニット酵素であるＲＮＡポリメラーゼＩＩに対する作用部位を提供する。これらの因子は、ＤＮＡ鋳型からＲＮＡの合成を触媒する転写開始前の複合体に集合する。
【００５５】
上流プロモーターの活性化は、様々なタンパク質が結合し、続いて、遺伝子発現を活性化するために、転写開始複合体と相互作用する調節ＤＮＡ配列要素の追加配列によって行われる。これらの遺伝子調節要素配列は、特異的ＤＮＡ結合因子と相互作用する。これらの配列モチーフは、しばしば、シス要素と呼ばれることがある。このようなシス要素は、それに組織特異的または発生特異的な転写因子が結合するが、個々にまたは組み合わせて、転写レベルでプロモーターの時空間的発現パターンを決定することができる。これらのシス要素は、それらが作動可能に連結された遺伝子に影響を与える制御の種類の点で大きく異なる。いくつかの要素は、環境応答（例えば、温度、湿度および創傷）に応答して、作動可能に連結された遺伝子の転写を増大させるように作用する。他のシス要素は、発生の合図（例えば、発芽、種子成熟および開花）または空間情報（例えば、組織特異性）に応答することができる。例えば、Langridge et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3219-23を参照されたい。これらのシス要素は転写開始点から様々な距離に配置され、いくつかのシス要素（近位要素と呼ばれる）は最小コアプロモーター領域に隣接し、一方、他の要素は、プロモーター（エンハンサー）の数キロベース上流または下流に位置する場合もある。
【００５６】
「ＤＮＡ結合導入遺伝子」は、ＤＮＡ結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドコード配列である。ＤＮＡ結合タンパク質は、続いて、別の分子に結合することができる。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合することができる。タンパク質結合タンパク質の場合において、それは自分自身に結合する（ホモ二量体、ホモ三量体などを形成する）ことができる、および／またはそれは異なるタンパク質もしくは複数のタンパク質の１つ以上の分子に結合することができる。結合タンパク質は、１より多い種類の結合活性を有してもよい。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合、ＲＮＡ結合およびタンパク質結合活性を有する。
【００５７】
ＤＮＡ結合タンパク質の例としては、所定のヌクレオチド配列に結合するように「遺伝性操作され」得るメガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー、ＣＲＩＳＰＲおよびＴＡＬＥ結合ドメインが含まれる。典型的には、遺伝子操作されたＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ジンクフィンガー、ＣＲＩＳＰＲまたはＴＡＬＥ）は、天然に存在しないタンパク質である。ＤＮＡ結合タンパク質を遺伝子操作するための方法の非限定的な例は、設計および選択である。設計されたＤＮＡ結合タンパク質は、その設計／組成が主として合理的基準によってもたらされる、天然には生じないタンパク質である。設計のための合理的基準は、置換規則の適用、ならびに既存のＺＦＰ、ＣＲＩＳＰＲおよび／またはＴＡＬＥ設計および結合データの情報を格納するデータベース内の情報を処理するためのコンピュータアルゴリズムの適用を含む。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号、第６，４５３，２４２号および第６，５３４，２６１号を参照されたい。さらに、国際公開ＷＯ９８／５３０５８、ＷＯ９８／５３０５９、ＷＯ９８／５３０６０、ＷＯ０２／０１６５３６およびＷＯ０３／０１６４９６、ならびに米国特許出願公開第２０１１０３０１０７３号、第２０１１０２３９３１５号および第２０１１９１４５９４０号も参照されたい。
【００５８】
「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、構造が亜鉛イオンの配位により安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である、１つ以上のジンクフィンガーにより配列特異的様式でＤＮＡに結合する、タンパク質、またはより大きいタンパク質内のドメインである。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質なる用語は、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと省略されることが多い。ジンクフィンガー結合ドメインを「遺伝子操作」して、所定のヌクレオチド配列に結合させることができる。ジンクフィンガータンパク質を遺伝子操作するための方法の非限定な例は、設計および選択である。設計されたジンクフィンガータンパク質は、設計／組成が主に合理的基準に基づく自然には存在しないタンパク質である。設計のための合理的基準は、置換規則の適用、ならびに既存のＺＦＰ設計および結合データの情報を格納するデータベース内の情報を処理するためのコンピュータアルゴリズムの適用を含む。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号、第６，４５３，２４２号、第６，５３４，２６１号および第６，７９４，１３６号を参照されたい。さらに、国際公開ＷＯ９８／５３０５８、ＷＯ９８／５３０５９、ＷＯ９８／５３０６０、ＷＯ０２／０１６５３６およびＷＯ０３／０１６４９６も参照されたい。
【００５９】
他の例において、１つ以上のヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、天然に存在するまたは遺伝子操作された（天然に存在しない）ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインを含む。例えば、米国特許出願公開第２０１１０３０１０７３号を参照されたい。キサントモナス（Xanthomonas）属の植物病原性細菌は、重要な作物に多くの病害を引き起こすことが知られている。キサントモナス（Xanthomonas）の病原性は、植物細胞内により多くの異なるエフェクタータンパク質を注入する保存されたＩＩＩ型分泌（Ｔ３Ｓ）系に依存する。これらの注入されるタンパク質の中には、植物の転写活性化因子を模倣し、植物のトランスクリプトームを操作する転写活性化因子様（ＴＡＬＥＮ）エフェクターがある（Kay et al., (2007) Science 318:648-651を参照されたい）。これらのタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含有する。最もよく特徴付けされたＴＡＬエフェクターの１つは、キサントモナス・カンペストリス病原型ベシカトリア（Xanthomonas campestgris pv. Vesicatoria）に由来するＡｖｒＢｓ３である（Bonas et al., (1989) Mol Gen Genet 218: 127- 136および国際公開ＷＯ２０１００７９４３０を参照されたい）。ＴＡＬエフェクターは、タンデム反復の集中ドメインを含有し、各反復が、これらのタンパク質のＤＮＡ結合特異性の要である約３４個のアミノ酸を含有する。さらに、それらは、核局在化配列および酸性転写活性化ドメインを含有する（概説については、Schornack S, et al., (2006) J Plant Physiol 163(3): 256-272を参照されたい）。加えて、植物病原性細菌である青枯病菌（Ralstonia solanacearum）において、ｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７と表記される２つの遺伝子が、青枯病菌（R. solanacearum）の次亜種１系統ＧＭＩ１０００および次亜種４系統ＲＳ１０００において、キサントモナス（Xanthomonas）のＡｖｒＢｓ３ファミリーと相同であることが見出されている（Heuer et al., (2007) Appl and Enviro Micro 73(13): 4379-4384を参照されたい）。これらの遺伝子は、ヌクレオチド配列において互いに９８．９％同一であるが、ｈｐｘ１７の反復ドメインにおいて１，５７５ｂｐの欠失分だけ異なる。しかしながら、両方の遺伝子産物が、キサントモナス（Xanthomonas）のＡｖｒＢｓ３ファミリータンパク質と４０％未満の配列同一性を有する。例えば、米国特許公開第２０１１０３０１０７３号を参照されたい。
【００６０】
これらのＴＡＬエフェクターの特異性は、タンデム反復に見出される配列に依存する。反復した配列は、およそ１０２ｂｐを含み、反復は、典型的には、互いに９１〜１００％相同である（Bonas et al.、同書）。反復の多型性は、通常、１２および１３位に位置し、１２および１３位の超可変ジ残基の正体と、ＴＡＬエフェクターの標的配列における連続したヌクレオチドの正体との間に１対１の対応関係が存在するようである（Moscou and Bogdanove, (2009) Science 326:1501およびBoch et al., (2009) Science 326: 1509-1512を参照されたい）。１２および１３位のＨＤ配列がシトシン（Ｃ）への結合をもたらし、ＮＧがＴに、ＮＩがＡ、Ｃ、ＧまたはＴに結合し、ＮＮがＡまたはＧに結合し、およびＩＮＧがＴに結合するように、これらのＴＡＬエフェクターのＤＮＡ認識のための天然コードが実験的に決定されている。これらのＤＮＡ結合反復を、新たな反復の組合せおよび数を用いてタンパク質へと組み立てて、新たな配列と相互作用し、植物細胞内の非内因性レポーター遺伝子の発現を活性化することが可能である人工転写因子を作製した（Boch et al.、同書）。遺伝子操作されたＴＡＬタンパク質をＦｏｋＩ切断ハーフドメインに連結して、酵母レポーターアッセイ（プラスミドベースの標的）において活性を示すＴＡＬエフェクタードメインヌクレアーゼ融合（ＴＡＬＥＮ）を得た。
【００６１】
ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された等間隔短鎖回文反復（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats））／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）ヌクレアーゼ系は、ゲノム遺伝子操作に使用され得る細菌系に基づいて、最近遺伝子操作されたヌクレアーゼ系である。それは、多くの細菌および古細菌の適応的免疫応答の一部に基づく。ウイルスまたはプラスミドが細菌に侵入するとき、侵入体のＤＮＡのセグメントは、「免疫」応答によってＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）に変換される。次に、このｃｒＲＮＡは、部分的に相補的な領域を通じて、ｔｒａｃｒＲＮＡと呼ばれる別の種類のＲＮＡと会合して、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを「プロトスペーサー」と呼ばれる標的ＤＮＡにおけるｃｒＲＮＡと相同な領域に導く。Ｃａｓ９は、ＤＮＡを切断して、ｃｒＲＮＡ転写物内に含有される２０ヌクレオチドガイド配列によって特定される部位で二本鎖切断（ＤＳＢ）の平滑末端を生成する。Ｃａｓ９は、部位特異的ＤＮＡ認識および切断のために、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの両方を必要とする。この系は、今では、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが１つの分子に組み合わされ得るように遺伝子操作されており（「単一ガイドＲＮＡ」）、単一ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡに匹敵する部分は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが任意の所望の配列を標的とするように導くように遺伝子操作され得る（Jinek et al., (2012) Science 337, pp. 816-821, Jinek et al., (2013), eLife 2:e00471, およびDavid Segal, (2013) eLife 2:e00563を参照されたい）。したがって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ゲノム内の所望の標的においてＤＳＢを作製するように遺伝子操作することができ、ＤＳＢの修復は、修復阻害因子を使用して、誤りがちな修復の増加を引き起こすことによって影響を受け得る。
【００６２】
他の例において、ＤＮＡ結合導入遺伝子は、遺伝子操作された（天然に存在しない）メガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼとも記載される）を含む部位特異的ヌクレアーゼである。ホーミングエンドヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼの認識配列、例えば、Ｉ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩｌ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩおよびＩ−ＴｅｖＩＩＩが公知である。さらに、米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Belfort et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-30 3388；Dujon et al., ( 1989) Gene 82: 115-118；Perler et al., (1994) Nucleic Acids Res. 22, 11127；Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228；Gimble et al., (1996) J. Mo Biol 263: 163-180；Argast et al., (1998) J Mol. Biol. 280:345-353およびNew England Biolabsカタログを参照されたい。加えて、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性は、非天然の標的部位に結合するように遺伝子操作することができる。例えば、Chevalier et al., (2002) Molec. Cell 10:895-905；Epinat et al., (2003) Nucleic Acids Res. 5 31 :2952-2962；Ashworth et al., (2006) Nature 441: 656-659；Paques et al., (2007) Current Gene Therapy 7:49-66；米国特許出願公開第２００７０１１７１２８号を参照されたい。ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、全体としてのヌクレアーゼという文脈において改変され得る（すなわち、ヌクレアーゼが同族の切断ドメインを含むように）または異種の切断ドメインに融合され得る。
【００６３】
本明細書で使用するとき、用語「形質転換」は、核酸分子をこのような細胞内に導入することができる全ての技術を包含する。例としては、限定されないが、ウイルスベクターによるトランスフェクション；プラスミドベクターによる形質転換；エレクトロポレーション、リポフェクション；マイクロインジェクション（Mueller et al., (1978) Cell 15:579-85）；アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介による移入；ＤＮＡ直接取り込み；ＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）媒介による形質転換；および微粒子銃が挙げられる。これらの技術は、植物細胞の安定した形質転換と一過性の形質転換の両方に使用することができる。「安定した形質転換」とは、遺伝的に安定した遺伝的形質をもたらす宿主生物のゲノムへの核酸断片の導入を指す。安定に形質転換されると、核酸断片は、宿主生物およびいずれかの後続世代のゲノムに安定に組み込まれる。形質転換された核酸断片を含有する宿主生物は、「トランスジェニック」生物と呼ばれる。「一過性の形質転換」とは、遺伝的に安定した遺伝的形質なしに遺伝子発現をもたらす、宿主生物の核またはＤＮＡ含有細胞小器官への核酸断片の導入を指す。
【００６４】
本明細書で使用するとき、用語「形質導入する」とは、ウイルスが細胞内に核酸を移入するプロセスを指す。
【００６５】
本明細書で使用するとき、用語「導入遺伝子」とは外因性核酸配列を指す。一例において、導入遺伝子は、遺伝子配列（例えば、除草剤耐性遺伝子）、工業的もしくは薬学的に有用な化合物をコードする遺伝子、または望ましい農業形質をコードする遺伝子である。さらに別の例において、導入遺伝子は、小型ＲＮＡ配列、例えば、アンチセンス核酸配列であり、ここで、小型ＲＮＡの発現は、標的核酸配列の発現を阻害する。導入遺伝子は、導入遺伝子に作動可能に連結された調節配列（例えば、プロモーター、イントロンまたは３’−ＵＴＲ）を含有し得る。いくつかの実施形態において、目的とする核酸は導入遺伝子である。しかしながら、他の実施形態において、目的とする核酸は、内因性核酸の付加的なゲノムコピーが所望される内因性核酸、または宿主生物における標的核酸の配列に対してアンチセンス方向である核酸である。
【００６６】
本明細書で使用するとき、用語「小型ＲＮＡ」とは、いくつかの種類の非コードリボ核酸（ｎｃＲＮＡ）を指す。小型ＲＮＡなる用語は、細菌細胞、動物、植物および菌類において生成されるｎｃＲＮＡの短鎖を記述する。ｎｃＲＮＡのこれらの短鎖は、細胞内で天然に生成され得て、または短鎖もしくはｎｃＲＮＡを発現する外因性配列を導入することにより生成され得る。小型ＲＮＡ配列は、タンパク質を直接コードせず、小型ＲＮＡ配列が転写されるのみであり、翻訳されない点で他のＲＮＡと機能において相違する。小型ＲＮＡ配列は、遺伝子発現および修飾を含む、他の細胞機能に関与する。小型ＲＮＡ分子は、通常、約２０〜３０ヌクレオチドから構成される。小型ＲＮＡ配列は、より長い前駆体から誘導することができる。前駆体は、自己相補性領域において、互いに折り畳む構造を形成する；次に、それらは、動物のヌクレアーゼであるダイサーまたは植物のＤＣＬ１により処理される。
【００６７】
多種類の小型ＲＮＡは、天然に存在しまたは人工的に生成され、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）および短鎖核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）が含まれる。マイクロＲＮＡおよびｓｉＲＮＡなどのある種の小型ＲＮＡは、遺伝子サイレンシングおよびＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）において重要である。遺伝子サイレンシングは、正常に発現される遺伝子が、細胞内の要素、この場合は小型ＲＮＡによって「止め」られる遺伝子調節のプロセスである。通常、この遺伝情報によって形成されるタンパク質は、干渉により形成されず、該遺伝子においてコードされる情報は発現からブロックされる。
【００６８】
本明細書で使用するとき、用語「小型ＲＮＡ」には、文献に記載されているＲＮＡ分子が包含され、例えば、「小さなＲＮＡ」（Storz, (2002) Science 296: 1260-3; Illangasekare et al., (1999) RNA 5 : 1482-1489）；原核生物の「小型ＲＮＡ」（ｓＲＮＡ）（Wassarman et al., (1999) Trends Microbiol. 7:37-45）；真核生物の「非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）」：「マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）」；「小型非ｍＲＮＡ（ｓｍｍＲＮＡ）」、「機能的ＲＮＡ（ｆＲＮＡ）」、「転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）」、「触媒ＲＮＡ」［例えば、リボザイム、例えば自己アシル化リボザイム（Illangaskare et al., (1999) RNA 5 : 1482-1489）］；「小型核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）」、「ｔｍＲＮＡ」（別名「１０Ｓ  ＲＮＡ」、Muto et al., (1998) Trends Biochem Set. 23 :25-29;およびGillet et al., (2001) Mol Microbiol. 42:879-885）；限定されないが、「小型干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）」を含むＲＮＡｉ分子、「エンドヌクレアーゼ調製ｓｉＲＮＡ（ｅ−ｓｉＲＮＡ）」、「短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）」、および「小型一時的調節ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）」、「角切りｓｉＲＮＡ（ｄ−ｓｉＲＮＡ）」、ならびにアプタマー、オリゴヌクレオチド、および少なくとも１つのウラシル塩基を含む他の合成核酸が挙げられる。
【００６９】
本明細書で使用するとき、用語「ベクター」とは、細胞内に導入されると形質転換細胞を生成する核酸分子を指す。ベクターは、複製起点などの宿主細胞中での複製を可能にする核酸配列を含むことができる。例としては、限定されないが、細胞内に外来ＤＮＡを運ぶプラスミド、コスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体（ＢＡＣ）またはウイルスが含まれる。また、ベクターは、１つ以上の遺伝子、アンチセンス分子および／または選択マーカー遺伝子、ならびに当該技術分野において公知の他の遺伝的要素を含むことができる。ベクターは、細胞を形質導入すること、形質転換すること、または細胞に感染することが可能であり、それによって、細胞が、ベクターによってコードされた核酸分子および／またはタンパク質を発現するようにさせる。ベクターは、場合により、細胞への核酸分子の侵入を達成するのを助けるための材料（例えば、リポソーム）を含んでもよい。
【００７０】
本明細書で使用するとき、用語「カセット」、「発現カセット」および「遺伝子発現カセット」は、特定の制限部位で、または相同組換えによって、核酸またはポリヌクレオチドに挿入することができるＤＮＡのセグメントを指す。ＤＮＡのセグメントは、目的とする小型ＲＮＡまたはポリペプチドをコードする目的とする遺伝子を含有するポリヌクレオチドを含み、カセットおよび制限部位は、転写および翻訳に適切なリーディングフレームにカセットの挿入を確実にするために設計される。一実施形態において、発現カセットは、目的とする小型ＲＮＡまたはポリペプチドをコードし、ポリヌクレオチドに加えて、特定の宿主細胞の形質転換を容易にする要素を含むことができる。一実施形態において、遺伝子発現カセットはまた、宿主細胞において目的とするポリペプチドをコードする小型ＲＮＡまたはポリヌクレオチドの発現を増強され得る要素を含んでもよい。これらの要素は、限定されないが、プロモーター、最小プロモーター、エンハンサー、応答要素、イントロン、５’非翻訳領域配列、３’非翻訳領域配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列などを含んでもよい。
【００７１】
本明細書で使用するとき、用語「異種コード配列」は、宿主生物に通常は存在しないが、適切な条件下で宿主細胞において発現されることができる、ペプチドまたはタンパク質またはその等価なアミノ酸配列、例えば酵素をコードするまたは最終的にコードする、任意のポリヌクレオチドを示すために使用される。したがって、「異種コード配列」は、宿主細胞に通常存在しないコード配列の１つまたは追加のコピーを含んでもよく、よって該細胞は、該細胞に通常存在しないコード配列の追加のコピーを発現している。異種コード配列は、ＲＮＡもしくはその任意の種類、例えば、ｍＲＮＡ、ＤＮＡもしくはその任意の種類、例えば、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡ／ＤＮＡのハイブリッドであり得る。コード配列の例としては、限定されないが、コード配列、イントロン、プロモーター領域、５’−ＵＴＲ、３’−ＵＴＲおよびエンハンサー領域などのような特徴を含む完全長の転写単位が挙げられる。
【００７２】
「異種コード配列」はまた、ペプチドまたは酵素のコード部分、すなわち、ペプチドまたは酵素のｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ配列、ならびに、完全長の転写単位のコード部分、すなわち、イントロンおよびエクソンを含む遺伝子、ならびに、酵素をコードするもしくはその等価なアミノ酸配列をコードする「コドン最適化された」配列、切断された配列、または他の形態の改変された配列を含み、ただし、等価なアミノ酸配列は、機能的タンパク質を生成する。このような等価なアミノ酸配列は、１つ以上のアミノ酸の欠失を有することができ、この欠失はＮ末端、Ｃ末端またはその中間である。切断された形態は、それらが本明細書に示された触媒能を有する限り想定される。
【００７３】
本明細書で使用するとき、用語「対照」は、比較目的で分析手法において使用される試料を指す。対照は、「陽性」または「陰性」であり得る。例えば、分析手法の目的が、細胞または組織中で示差的に発現された転写物またはポリペプチドを検出することである場合、一般的に、所望の発現を示す公知の植物からの試料などの陽性対照を含み、所望の発現を欠いている公知の植物由来の試料などの陰性対照を含むことが好ましい。
【００７４】
本明細書で使用するとき、用語「植物」には、植物および植物の部分が含まれ、限定されないが、植物細胞および植物組織、例えば、葉、茎、根、花、花粉および種子が挙げられる。本発明において使用することができる植物の種類は、一般的に、被子植物、裸子植物、シダおよび多細胞藻類を含む突然変異誘発に適した、高等植物および下等植物の種類と同程度に広い。したがって、「植物」とは、双子葉植物および単子葉植物を含む。双子葉植物の例としては、タバコ、シロイヌナズナ（Arabidopsis）、ダイズ、トマト、パパイヤ、キャノーラ、ヒマワリ、綿、アルファルファ、ジャガイモ、ブドウの木、キマメ、エンドウ、アブラナ属（Brassica）、ヒヨコマメ、テンサイ、ナタネ、スイカ、メロン、ペッパー、ピーナッツ、カボチャ、ダイコン、ホウレンソウ、スクワッシュ、ブロッコリー、キャベツ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、白菜、キュウリ、ナスおよびレタスが挙げられる。単子葉植物の例としては、トウモロコシ、イネ、キムギ、サトウキビ、オオムギ、ライムギ、ソルガム、ラン、竹、バナナ、ガマ、ユリ、オートムギ、タマネギ、キビおよびライコムギが挙げられる。
【００７５】
本明細書で使用するとき、用語「植物材料」とは、葉、茎、根、花もしくは花部、果実、花粉、卵細胞、接合子、種子、挿し木、細胞もしくは組織培養物、または植物の任意の他の部分または生成物を指す。一実施形態において、植物材料には子葉および葉を含む。一実施形態において、植物材料は、根組織、地下に位置する他の植物組織を含む。
【００７６】
本明細書で使用するとき、用語「選択マーカー遺伝子」とは、例えば、選択剤から植物細胞を保護し、または選択剤に対して抵抗性／耐性を提供するために、場合により植物形質転換に使用される遺伝子を指す。さらに、「選択マーカー遺伝子」は、レポーター遺伝子を包含することを意味する。機能的選択マーカーを受け入れるそれらの細胞または植物だけが、選択剤を有する条件下で分裂または成長することができる。選択剤の例としては、例えば、スペクチノマイシン、ネオマイシン、カナマイシン、パロモマイシン、ゲンタマイシンおよびハイグロマイシンなどの抗生物質を挙げることができる。これらの選択マーカーには、抗生物質カナマイシンに対する抵抗性を付与する酵素を発現するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔ  ＩＩ）、ならびにハイグロマイシンに抵抗性を付与する酵素を発現する、関連抗生物質ネオマイシン、パロモマイシン、ゲンタマイシンおよびＧ４１８またはハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ）の遺伝子が含まれる。他の選択マーカー遺伝子は、ｂａｒまたはｐａｔ（グルホシネートアンモニウムまたはホスフィノトリシンに対する耐性）、アセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ、分岐鎖アミノ酸の合成における第一段階を妨げる、スルホニルウレア（ＳＵ）、イミダゾリノン（ＩＭｌ）、トリアゾロピリミジン（ＴＰ）、ピリミジニルオキシベンゾエート（ＰＯＢ）およびスルホニルアミノカルボニルトリアゾリノンなどの阻害剤に対する耐性）、グリホサート、２，４−Ｄ、および金属抵抗性または感受性を含む除草剤耐性をコードする遺伝子を含むことができる。選択マーカー遺伝子として使用することができる「レポーター遺伝子」の例としては、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、ＤｓＲｅｄ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アルカリホスファターゼなどをコードするタンパク質などの発現されたレポーター遺伝子タンパク質の目視観察を含む。句「マーカー陽性」とは、選択マーカー遺伝子を含むように形質転換された植物を指す。
【００７７】
本明細書で使用するとき、用語「検出可能なマーカー」とは、例えば、放射性同位元素、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤または酵素などの検出を可能にする標識を指す。検出可能なマーカーの例としては、限定されないが、以下：蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体のための結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）が挙げられる。一実施形態において、検出可能なマーカーは、潜在的な立体障害を減少させるために様々な長さのスペーサーアームによって結合させることができる。
【００７８】
本明細書で使用するとき、用語「検出」は、特定の分子の定性的測定と定量的測定の両方、例えば、特定のポリペプチドの測定を含むために、最も広い意味で使用される。
【００７９】
他に特に説明がない限り、本明細書で使用される全ての科学技術的用語は、本開示が属する当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。分子生物学における一般的な用語の定義は、例えば、Lewin, Genes V, Oxford University Press, 1994; Kendrew et al., (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994;およびMeyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995において見出すことができる。
【００８０】
調節要素
基礎研究またはバイオテクノロジー用途に使用される植物プロモーターは、代謝工学および形質の積み重ねに関して、植物内で導入遺伝子を確実に発現させるために、その３’端（下流）で融合されている導入遺伝子の発現を指向する。結果として、トランスジェニック作物において複数の遺伝子の発現を駆動することができる新規なプロモーターが必要である。本明細書には、３’末端（下流）で融合されている第１遺伝子の発現を指向することができるプロモーターが開示される。
【００８１】
トランスジェニック産物の開発は、ますます複雑になり、確実に導入遺伝子を発現させ、単一の遺伝子座に複数の導入遺伝子を積み重ねる必要がある。伝統的に、それぞれの導入遺伝子は、発現のために固有のプロモーターを必要とし、複数のプロモーターが、１つの遺伝子の積み重ね内に異なる導入遺伝子を発現させるために必要とされる。サイズが増加した遺伝子の積み重ねを用いることは、多くの場合、単一の多遺伝子形質の発現のための異なる導入遺伝子の発現パターンの類似のレベルを得るために、同一のプロモーターの反復使用をもたらす。同じプロモーターによって駆動される多重遺伝子構築物は、この分野において、有効性が低いトランスジェニック産物を生じさせる遺伝子サイレンシングを引き起こすことは公知である。プロモーターの反復に起因した過剰の転写因子（ＴＦ）結合部位は、転写不活性化をもたらす内因性ＴＦの枯渇を引き起こす可能性がある。導入遺伝子のサイレンシングは、おそらくは、導入遺伝子を発現するように生成されたトランスジェニック植物の性能に不必要に影響を及ぼす。導入遺伝子内の反復配列は、ポリヌクレオチドの再配列をもたらす遺伝子内の遺伝子座相同組換えをもたらす可能性がある。
【００８２】
組織特異的（すなわち、組織優先）または器官特異的プロモーターは、植物の仁、根、葉またはタペータムなどの特定の組織における遺伝子発現を駆動する。組織および発育段階の特異的プロモーターは、特定の組織においてまたは植物の発育中の特定の期間に発現される遺伝子の発現を導く。組織特異的プロモーターは、トランスジェニック植物産業における特定の用途に必要とされ、組織および／または発育段階の選択的方法で異種遺伝子の特異的発現を可能にするために望ましく、様々な器官、組織および／または時間で示差的に異種遺伝子の発現を示し、その他は示さない。例えば、土壌媒介性病原体による感染に対する植物の抵抗性の増加は、病原体抵抗性遺伝子で植物ゲノムを形質転換することによって達成され得、それにより、病原体抵抗性タンパク質は植物の根内で確実に発現される。あるいは、例えば、細胞の分裂または伸長などの特定の成長または発達時期にある植物組織において導入遺伝子を発現することが望ましい場合がある。別の用途は、例えば、木部の発育において農業形質をコードする導入遺伝子の発現を付与するように、望ましくは組織特異的プロモーターを用いることである。組織特異的プロモーターの同定において残された１つの特定の課題は、潜在的に最も重要な遺伝子およびそれらの対応するプロモーターをどのように同定し、細胞の特定の発生特性にこれらがどのように関連するのかということである。別の課題は、クローニングされたＤＮＡ断片が望まれる特定の発現パターンにおいて転写を駆動するように、全ての関連するシス作用の転写調節要素をクローニングすることである。このような調節要素が、翻訳導入部位または翻訳開始部位から遠位に位置することを考慮すると、プロモーターを含むように選択されるポリヌクレオチドの大きさは、プロモーターポリヌクレオチド配列の発現レベルおよび発現パターンを付与するのに重要なものである。具体的な課題は、他の植物組織において発現されない、植物における特定の細胞型、発育段階および／または機能に関連付けられる、組織特異的プロモーターを同定することである。
【００８３】
植物において導入遺伝子を発現させるために、トウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター調節要素を用いる方法および構築物が提供される。一実施形態において、プロモーターは、下記の全長のトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーターであり得る。
【００８４】
【化１】
2017503513.tif 000003
【００８５】
一実施形態において、プロモーターは、下記の全長のトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子上流プロモーターであり得る。
【００８６】
【化２】
2017503513.tif 000004
2017503513.tif 000005
【００８７】
一実施形態において、プロモーターは、下記の修飾されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーターであり得る。
【００８８】
【化３】
2017503513.tif 000006
【００８９】
一実施形態において、プロモーターは、下記の修飾されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子上流プロモーターであり得る。
【００９０】
【化４】
2017503513.tif 000007
【００９１】
一実施形態において、遺伝子発現カセットはプロモーターを含む。一実施形態において、プロモーターは、本開示のトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーターであり得る。一実施形態において、遺伝子発現カセットはプロモーターを含み、該プロモーターは、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一である。一実施形態において、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結されているトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーターを含む。一実施形態において、トウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーターを含む遺伝子発現カセットは、２つ以上の導入遺伝子の発現を駆動し得る。例示的な実施形態において、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結されているトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーターを含み、ここで、該導入遺伝子は、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組合せであり得る。
【００９２】
導入遺伝子発現はまた、プロモーター配列の下流に位置したイントロン領域によって制御され得る。プロモーターとイントロンの両方は、導入遺伝子発現を制御することができる。プロモーターは転写を駆動するために必要であるが、イントロンの存在は、翻訳およびタンパク質合成のためにｍＲＮＡ転写物をもたらす発現レベルを増加させることができる。イントロン遺伝子領域は、導入遺伝子の安定な発現を助ける。
【００９３】
一実施形態において、遺伝子発現カセットはイントロンを含む。一実施形態において、遺伝子発現カセットは、トウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子由来のイントロンを含む。一実施形態において、イントロンは、下記のトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子イントロン（１）であり得る。
【００９４】
【化５】
2017503513.tif 000008
【００９５】
一実施形態において、イントロンは、下記のトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子イントロン（２）であり得る。
【００９６】
【化６】
2017503513.tif 000009
【００９７】
一実施形態において、遺伝子発現カセットはイントロンを含み、該イントロンは、配列番号５または配列番号６に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一である。一実施形態において、遺伝子発現カセットは、プロモーターに作動可能に連結されているトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子由来のイントロンを含み、ここで、該プロモーターは、トウモロコシ（Zea mays）遺伝子プロモーター、植物が起源であるプロモーター（例えば、トウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーターもしくはトウモロコシ（Zea mays）のユビキチン１プロモーター）、ウイルスが起源であるプロモーター（例えば、キャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター）または細菌が起源であるプロモーター（例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）デルタマス）である。例示的な実施形態において、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結されているトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子由来のイントロンを含み、ここで、導入遺伝子は、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組合せであり得る。
【００９８】
また、導入遺伝子発現は、遺伝子コード配列の下流に位置した３’非翻訳遺伝子領域（すなわち、３’−ＵＴＲ）によって調節されてもよい。プロモーターと３’−ＵＴＲはともに、導入遺伝子発現を調節することができる。プロモーターは転写を駆動するために必要であるが、３’−ＵＴＲ遺伝子領域は、転写を終了し、翻訳およびタンパク質合成のために、得られたｍＲＮＡ転写物のポリアデニル化を開始することができる。３’−ＵＴＲ遺伝子領域は、導入遺伝子の安定な発現を助ける。一実施形態において、３’−ＵＴＲは、下記の全長のトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子３’−ＵＴＲであり得る。
【００９９】
【化７】
2017503513.tif 000010
【０１００】
一実施形態において、３’−ＵＴＲは、下記の修飾されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子３’−ＵＴＲであり得る。
【０１０１】
【化８】
2017503513.tif 000011
【０１０２】
一実施形態において、遺伝子発現カセットは３’−ＵＴＲを含む。一実施形態において、３’−ＵＴＲは、トウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子３’−ＵＴＲであり得る。一実施形態において、遺伝子発現カセットは３’−ＵＴＲを含み、ここで、該３’−ＵＴＲは、配列番号７または配列番号８に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一である。一実施形態において、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結されているトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子３’−ＵＴＲを含む。例示的な実施形態において、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結されている３’−ＵＴＲを含み、ここで、該導入遺伝子は、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組合せであり得る。
【０１０３】
一実施形態において、遺伝子発現カセットは、トウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子から精製されたプロモーター、イントロンおよび３’−ＵＴＲを含む。一実施形態において、遺伝子発現カセットは、ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３もしくは配列番号４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一であるプロモーター；ｂ）配列番号５もしくは配列番号６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一であるイントロン；および／またはｃ）配列番号７もしくは配列番号８に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一である３’−ＵＴＲを含む。
【０１０４】
例えば、遺伝子発現カセットは、プロモーターと３’−ＵＴＲの両方を含んでもよく、ここで、プロモーターは配列番号１のポリヌクレオチドであり、３’−ＵＴＲは配列番号７のポリヌクレオチドである。別の実施形態において、遺伝子発現カセットは、プロモーターと３’−ＵＴＲの両方を含んでもよく、ここで、プロモーターは、配列番号１のポリヌクレオチドであり、３’−ＵＴＲは、配列番号８のポリヌクレオチドである。続く実施形態において、遺伝子発現カセットは、プロモーターと３’−ＵＴＲの両方を含んでもよく、ここで、プロモーターは、配列番号２のポリヌクレオチドであり、３’−ＵＴＲは、配列番号７のポリヌクレオチドである。さらに別の実施形態において、遺伝子発現カセットは、プロモーターと３’−ＵＴＲの両方を含んでもよく、ここで、プロモーターは、配列番号２のポリヌクレオチドであり、３’−ＵＴＲは、配列番号８のポリヌクレオチドである。
【０１０５】
さらなる実施形態において、遺伝子発現カセットは、プロモーターと３’−ＵＴＲの両方を含んでもよく、ここで、プロモーターは、配列番号３のポリヌクレオチドであり、３’−ＵＴＲは、配列番号７のポリヌクレオチドである。さらに別の実施形態において、遺伝子発現カセットは、プロモーターと３’−ＵＴＲの両方を含んでもよく、ここで、プロモーターは、配列番号３のポリヌクレオチドであり、３’−ＵＴＲは、配列番号８のポリヌクレオチドである。一実施形態において、遺伝子発現カセットは、プロモーターと３’−ＵＴＲの両方を含んでもよく、ここで、プロモーターは、配列番号４のポリヌクレオチドであり、３’−ＵＴＲは、配列番号７のポリヌクレオチドである。なお別の実施形態において、遺伝子発現カセットは、プロモーターと３’−ＵＴＲの両方を含んでもよく、ここで、プロモーターは、配列番号４のポリヌクレオチドであり、３’−ＵＴＲは、配列番号８のポリヌクレオチドである。
【０１０６】
別の実施形態において、遺伝子発現カセットは、プロモーター、イントロンおよび３’−ＵＴＲを含んでもよく、ここで、プロモーターは、配列番号１のポリヌクレオチドであり、イントロンは、配列番号５のポリヌクレオチドであり、３’−ＵＴＲは、配列番号７のポリヌクレオチドである。さらなる実施形態において、遺伝子発現カセットは、プロモーター、イントロンおよび３’−ＵＴＲを含んでもよく、ここで、プロモーターは、配列番号１のポリヌクレオチドであり、イントロンは、配列番号５のポリヌクレオチドであり、３’−ＵＴＲは、配列番号８のポリヌクレオチドである。さらなる実施形態において、遺伝子発現カセットは、プロモーター、イントロンおよび３’−ＵＴＲを含んでもよく、ここで、プロモーターは、配列番号３のポリヌクレオチドであり、イントロンは、配列番号５のポリヌクレオチドであり、３’−ＵＴＲは、配列番号７のポリヌクレオチドである。さらなる実施形態において、遺伝子発現カセットは、プロモーター、イントロンおよび３’−ＵＴＲを含んでもよく、ここで、プロモーターは、配列番号３のポリヌクレオチドであり、イントロンは、配列番号５のポリヌクレオチドであり、３’−ＵＴＲは、配列番号７のポリヌクレオチドである。
【０１０７】
別の実施形態において、遺伝子発現カセットは、プロモーター、イントロンおよび３’−ＵＴＲを含んでもよく、ここで、プロモーターは、配列番号２のポリヌクレオチドであり、イントロンは、配列番号５のポリヌクレオチドであり、３’−ＵＴＲは、配列番号７のポリヌクレオチドである。さらなる実施形態において、遺伝子発現カセットは、プロモーター、イントロンおよび３’−ＵＴＲを含んでもよく、ここで、プロモーターは、配列番号２のポリヌクレオチドであり、イントロンは、配列番号５のポリヌクレオチドであり、３’−ＵＴＲは、配列番号８のポリヌクレオチドである。さらなる実施形態において、遺伝子発現カセットは、プロモーター、イントロンおよび３’−ＵＴＲを含んでもよく、ここで、プロモーターは、配列番号４のポリヌクレオチドであり、イントロンは、配列番号５のポリヌクレオチドであり、３’−ＵＴＲは、配列番号７のポリヌクレオチドである。さらなる実施形態において、遺伝子発現カセットは、プロモーター、イントロンおよび３’−ＵＴＲを含んでもよく、ここで、プロモーターは、配列番号４のポリヌクレオチドであり、イントロンは、配列番号５のポリヌクレオチドであり、３’−ＵＴＲは、配列番号８のポリヌクレオチドである。
【０１０８】
一実施形態において、５’−ＵＴＲは、修飾されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子３’−ＵＴＲであり得る。
【０１０９】
【化９】
2017503513.tif 000012
【０１１０】
一実施形態において、５’−ＵＴＲを含む核酸構築物が提供され、ここで、５’−ＵＴＲは、配列番号１９に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一である。一実施形態において、遺伝子発現カセットは５’−ＵＴＲを含む。一実施形態において、５’−ＵＴＲは、トウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子５’−ＵＴＲであり得る。一実施形態において、遺伝子発現カセットは５’−ＵＴＲを含み、ここで、５’−ＵＴＲは、配列番号１９に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一である。一実施形態において、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結されているトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子５’−ＵＴＲを含む。例示的な実施形態において、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結されている５’−ＵＴＲを含み、ここで、導入遺伝子は、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組合せであり得る。
【０１１１】
一実施形態において、遺伝子発現カセットは、トウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子から精製されたプロモーター、イントロンおよび５’−ＵＴＲを含む。一実施形態において、遺伝子発現カセットは、ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３もしくは配列番号４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一であるプロモーター；ｂ）配列番号５もしくは配列番号６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一であるイントロン；および／またはｃ）配列番号１９に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一である５’−ＵＴＲを含む。
【０１１２】
例えば、遺伝子発現カセットは、プロモーターと５’−ＵＴＲの両方を含んでもよく、ここで、プロモーターは配列番号１のポリヌクレオチドであり、５’−ＵＴＲは配列番号１９のポリヌクレオチドである。続く実施形態において、遺伝子発現カセットは、プロモーターと５’−ＵＴＲの両方を含んでもよく、ここで、プロモーターは、配列番号２のポリヌクレオチドであり、５’−ＵＴＲは、配列番号１９のポリヌクレオチドである。
【０１１３】
さらなる実施形態において、遺伝子発現カセットは、プロモーターと５’−ＵＴＲの両方を含んでもよく、ここで、プロモーターは、配列番号３のポリヌクレオチドであり、５’−ＵＴＲは、配列番号１９のポリヌクレオチドである。さらに別の実施形態において、遺伝子発現カセットは、プロモーターと５’−ＵＴＲの両方を含んでもよく、ここで、プロモーターは、配列番号４のポリヌクレオチドであり、５’−ＵＴＲは、配列番号１９のポリヌクレオチドである。
【０１１４】
別の実施形態において、遺伝子発現カセットは、プロモーター、イントロンおよび５’−ＵＴＲを含んでもよく、ここで、プロモーターは、配列番号２のポリヌクレオチドであり、イントロンは、配列番号５のポリヌクレオチドであり、５’−ＵＴＲは、配列番号１９のポリヌクレオチドである。さらなる実施形態において、遺伝子発現カセットは、プロモーター、イントロンおよび５’−ＵＴＲを含んでもよく、ここで、プロモーターは、配列番号４のポリヌクレオチドであり、イントロンは、配列番号５のポリヌクレオチドであり、５’−ＵＴＲは、配列番号１９のポリヌクレオチドである。
【０１１５】
遺伝子発現カセットが１つ以上の導入遺伝子を含む場合、プロモーター、イントロン、３’−ＵＴＲおよび／または５’−ＵＴＲは、遺伝子発現カセット内の異なる導入遺伝子に作動可能に連結することができる。例示的な実施形態において、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結しているトウモロコシ遺伝子プロモーター（配列番号１、配列番号２、配列番号または配列番号４）を含み、ここで、該導入遺伝子は、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組合せであり得る。例示的な実施形態において、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）遺伝子プロモーター（配列番号１、配列番号２、配列番号または配列番号４）、イントロン（配列番号５または配列番号６）および５’−ＵＴＲ（配列番号１９）を含み、ここで、該導入遺伝子は、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組合せであり得る。例示的な実施形態において、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結されているトウモロコシ（Zea mays）遺伝子３’−ＵＴＲ（配列番号７または配列番号８）を含み、ここで、該導入遺伝子は、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組合せであり得る。別の例示的な実施形態において、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結されているトウモロコシ（Zea mays）遺伝子５’−ＵＴＲ（配列番号１９）を含み、ここで、該導入遺伝子は、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組合せであり得る。
【０１１６】
一実施形態において、ベクターは、本明細書に開示される遺伝子発現カセットを含む。一実施形態において、ベクターは、プラスミド、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、バクテリオファージ、ウイルス、またはドナーＤＮＡなどの形質転換もしくは遺伝子標的において使用するための切り出されたポリヌクレオチド断片であり得る。
【０１１７】
一実施形態において、細胞または植物は、本明細書に開示される遺伝子発現カセットを含む。一実施形態において、細胞または植物は、本明細書に開示される遺伝子発現カセットを含むベクターを含む。一実施形態において、ベクターは、プラスミド、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、バクテリオファージまたはウイルスであり得る。それにより、本明細書に開示される遺伝子発現カセットを含む細胞または植物は、それぞれトランスジェニック細胞またはトランスジェニック植物である。一実施形態において、トランスジェニック植物は単子葉植物であり得る。一実施形態において、トランスジェニック単子葉植物は、限定されないが、トウモロコシ、コムギ、イネ、ソルガム、オートムギ、ライムギ、バナナ、サトウキビおよびキビであり得る。一実施形態において、トランスジェニック植物は双子葉植物であり得る。一実施形態において、トランスジェニック双子葉植物は、限定されないが、ダイズ、綿、ヒマワリおよびカノーラであり得る。また、実施形態は、本明細書に開示されるトランスジェニック植物からのトランスジェニック種子を含む。
【０１１８】
一実施形態において、遺伝子発現カセットは、２つ以上の導入遺伝子を含む。２つ以上の導入遺伝子は、本明細書に開示されるトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター、イントロンまたは３’−ＵＴＲに作動可能に連結されていてもよい。一実施形態において、遺伝子発現カセットは１つ以上の導入遺伝子を含む。１つ以上の導入遺伝子を有する実施形態において、少なくとも１つの導入遺伝子は、トウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター、イントロンもしくは３’−ＵＴＲまたは本開示に作動可能に連結されている。
【０１１９】
選択マーカー
レポーター遺伝子としても記載される様々な選択マーカーは、形質転換植物（「形質転換体」）の同定および選択を可能にする選ばれた発現ベクターに組み込むことができる。形質転換植物における選択マーカーの発現を確認するために多数の方法を利用することができ、例えば、ＤＮＡ配列決定およびＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、サザンブロット、ＲＮＡブロット、ベクターから発現されたタンパク質、例えば、ホスフィノトリシン抵抗性を媒介する沈殿タンパク質を検出するための免疫学的方法、または他のタンパク質、例えば、レポーター遺伝子コードβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、ＤｓＲｅｄ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アルカリホスファターゼおよびこれらに類するものの目視観察が挙げられる（Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Press, N.Y., 2001を参照されたい）。
【０１２０】
選択マーカー遺伝子は、形質転換細胞または組織の選択に利用される。選択マーカー遺伝子としては、抗生物質抵抗性をコードする遺伝子、例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）およびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）をコードするもの、ならびに除草剤化合物に対する耐性を付与する遺伝子が挙げられる。除草剤耐性遺伝子は、一般的に、除草剤に対して非感受性の修飾された標的タンパク質をコードしている、または植物中の除草剤をそれが作用し得る前に分解もしくは解毒する酵素をコードしている。例えば、グリホサートに対する耐性は、突然変異型標的酵素、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）をコードする遺伝子を使用することによって得られた。ＥＰＳＰＳについての遺伝子および突然変異体は周知であり、下記でさらに説明される。グルホシネートアンモニウム、ブロモキシニルおよび２，４−ジクロロフェノキシアセテート（２，４−Ｄ）に対する耐性は、それぞれの除草剤を解毒する、ｐａｔもしくはＤＳＭ−２をコードする細菌遺伝子、ニトリラーゼ、ａａｄ−１またはａａｄ−１２遺伝子を使用することによって得られた。
【０１２１】
一実施形態において、イミダゾリノンまたはスルホニル尿素を含む除草剤は、生長点または分裂組織を阻害することができ、これらの除草剤に対するアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）およびアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）の抵抗性／耐性のための遺伝子は周知である。グリホサート耐性遺伝子としては、突然変異５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰｓ）およびｄｇｔ−２８遺伝子（組換え核酸の導入および／もしくは天然ＥＰＳＰｓ遺伝子の様々な形態のインビボ突然変異誘発による）、ａｒｏＡ遺伝子ならびにグルホサートアセチルトランスフェラーゼ（ＧＡＴ）遺伝子がそれぞれ挙げられる）。他のホスホノ化合物に対する抵抗性遺伝子としては、ストレプトマイセス・ヒグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus）およびストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridichromogenes）を含むストレプトマイセス属（Streptomyces）種からのｂａｒ遺伝子、ならびにピリジノキシまたはフェノキシプロピオン酸およびシクロヘキソン（ＡＡＣアーゼ阻害剤コード遺伝子）が挙げられる。シクロヘキサンジオンおよび／またはアリールオキシフェノキシプロパン酸（ハロキシフォップ、ジクロホップ、フェノキシプロプ、フルアジホップ、キザロホップを含む）に対する抵抗性を付与する例示的遺伝子としては、アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ（ＡＣＣアーゼ）の遺伝子−−Ａｃｃ１−Ｓ１、Ａｃｃ１−Ｓ２およびＡｃｃ１−Ｓ３が挙げられる。一実施形態において、トリアジン（ｐｓｂＡおよび１ｓ＋遺伝子）またはベントニトリル（ニトリラーゼ遺伝子）を含む除草剤は、光合成を阻害することができる。
【０１２２】
一実施形態において、選択マーカー遺伝子としては、限定されないが、以下をコードする遺伝子が挙げられる：ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ；シアナミドヒドラターゼ；アスパラギン酸キナーゼ；ジヒドロジピコリン酸シンターゼ；トリプトファンデカルボキシラーゼ；ジヒドロジピコリン酸シンターゼおよび脱感作型アスパラギン酸キナーゼ；ｂａｒ遺伝子；トリプトファンデカルボキシラーゼ；ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＥＯ）；ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴまたはＨＹＧ）；ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）；ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ；２，２−ジクロロプロピオン酸デハロゲナーゼ；アセトヒドロキシ酸シンターゼ；５−エノールピルビルシキミ酸−リン酸シンターゼ（ａｒｏＡ）；ハロアリールニトリラーゼ；アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ；ジヒドロプテロイン酸シンターゼ（ｓｕｌ  Ｉ）；および３２ｋＤ光化学系ＩＩポリペプチド（ｐｓｂＡ）。
【０１２３】
一実施形態はまた、下記に対する抵抗性をコードする遺伝子を含む：クロラムフェニコール；メトトレキサート；ヒグロマイシン；スペクチノマイシン；ブロモキシニル；グリホサート；およびホスフィノトリシン。
【０１２４】
選択マーカー遺伝子の上記リストは、限定を意図したものではない。任意のレポーターまたは選択可能マーカー遺伝子が本発明によって包含される。
【０１２５】
選択マーカー遺伝子は、植物における最適な発現のために合成される。例えば、一実施形態において、遺伝子のコード配列は、植物における発現を高めるためにコドン最適化によって修飾されている。選択マーカー遺伝子は、特定の植物種における発現のために最適化され得、または代替的に双子葉植物もしくは単子葉植物における最適な発現のために修飾され得る。植物の好ましいコドンは、目的とする特定の植物種において最大量で発現されるタンパク質における最高の頻度のコドンから決定されてもよい。一実施形態において、選択マーカー遺伝子は、より高い形質転換効率をもたらす、より高いレベルで植物中に発現されるように設計される。遺伝子の植物最適化のための方法は周知である。合成ポリヌクレオチド配列の最適化および製造に関する指針は、例えば、国際公開ＷＯ２０１３０１６５４６、ＷＯ２０１１１４６５２４、ＷＯ１９９７０１３４０２、米国特許第６，１６６，３０２号および米国特許第５，３８０，８３１号に見出すことができる。
【０１２６】
導入遺伝子
開示されている方法および組成物は、植物ゲノム内でポリヌクレオチド遺伝子配列を発現させるために使用することができる。したがって、除草剤耐性、害虫抵抗性、栄養分、抗生物質または治療用分子をコードする遺伝子の発現を植物プロモーターによって駆動することができる。
【０１２７】
一実施形態において、本開示のトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子調節要素は、グリホサートまたは別の除草剤に対する抵抗性または耐性を付与するポリヌクレオチド配列をコードする遺伝子と組み合わせられまたはそれに作動可能に連結され、ならびに／あるいは害虫もしくは病害に対する抵抗性および／または栄養強化、および／または改善された農業特性、および／または食事、食物、産業上、医薬的もしくは他の使用に有用なタンパク質もしくは他の生産物を与える。導入遺伝子は、植物ゲノム内の目的とする２つ以上の核酸配列と「積み重ね」ることができる。積み重ねは、２つ以上の事象を用いた従来の植物育種、目的とする配列を含有する構築物を用いた植物の形質転換、トランスジェニック植物の再形質転換、または相同組換えによる標的組み込みを介した新しい形質の付与によって達成され得る。
【０１２８】
目的とするこのようなポリヌクレオチド配列としては、限定されないが、以下に示す例が含まれる：
１．有害生物または病害に対して抵抗性を付与する遺伝子またはコード配列（例えば、ｉＲＮＡ）
（Ａ）植物病害抵抗性遺伝子。植物防御は、多くの場合、植物中の病害抵抗性遺伝子（Ｒ）の生成物と、病原体中の対応する非病原性（Ａｖｒ）遺伝子の生成物間の特定の相互作用によって活性化される。ある植物種を、クローニングされた抵抗性遺伝子で形質転換し、特定の病原体株に対して抵抗性である植物に遺伝子操作することができる。このような遺伝子の例として、クラドスポリウム・フルブム（Cladosporium fulvum）に対する抵抗性のためのトマトＣｆ−９遺伝子（Jones et al., 1994 Science 266:789）、トマト斑葉細菌病（Pseudomonas syringae pv. tomato）に対する抵抗性のためのプロテインキナーゼをコードするトマトＰｔｏ遺伝子（Martin et al., 1993 Science 262: 1432）およびシュードモナス・シリンゲ（Pseudomonas syringae）に対する抵抗性のための、アラビドプシス属ＲＳＳＰ２遺伝子（Mindrinos et al., 1994 Cell 78: 1089）が挙げられる。
（Ｂ）Ｂｔδ−エンドトキシン遺伝子のヌクレオチド配列などの、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）タンパク質、その誘導体またはそれをモデルにした合成ポリペプチド（Geiser et al., 1986 Gene 48:109）および栄養型殺虫性（ＶＩＰ）遺伝子（例えば、Estruch et al., (1996)、Proc. Natl. Acad. Sci. 93:5389-94を参照されたい）。さらに、δ−エンドトキシン遺伝子をコードするＤＮＡ分子は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．）からＡＴＣＣ受託番号４００９８、６７１３６、３１９９５および３１９９８の下で購入可能である。
（Ｃ）いくつかのクンシラン（Clivia miniata）マンノース結合レクチン遺伝子のヌクレオチド配列などのレクチン（Van Damme et al., 1994 Plant Molec. Biol. 24:825）。
（Ｄ）昆虫有害生物に対する幼虫駆除剤として有用であるアビジンおよびアビジン相同体などのビタミン結合タンパク質。米国特許第５，６５９，０２６号を参照されたい。
（Ｅ）酵素阻害剤、例えば、プロテアーゼ阻害剤またはアミラーゼ阻害剤。このような遺伝子の例として、イネシステインプロテイナーゼ阻害剤（Abe et al., 1987 J. Biol. Chem. 262:16793）、タバコプロテイナーゼ阻害剤Ｉ（Huub et al., 1993 Plant Molec. Biol. 21:985）およびα−アミラーゼ阻害剤（Sumitani et al., 1993 Biosci. Biotech. Biochem. 57:1243）が挙げられる。
（Ｆ）昆虫特異的ホルモンまたはフェロモン、例えば、エクジステロイドおよび幼若ホルモンその改変体、それをベースとした模倣体またはそのアンタゴニストもしくはアゴニスト、例えば、クローニングされた幼若ホルモンエステラーゼのバキュロウイルス発現、幼若ホルモンの不活化（Hammock et al., 1990 Nature 344:458）。
（Ｇ）発現すると、影響を受ける有害生物の生理学を撹乱する、昆虫特異的ペプチドまたはニューロペプチド（J. Biol. Chem. 269:9）。このような遺伝子の例として、昆虫利尿ホルモン受容体（Regan, 1994）、ディプロプテラ・プンクタータ（Diploptera punctata）において同定されたアロスタチン（Pratt, 1989）および昆虫特異的、麻痺性神経毒（米国特許第５，２６６，３６１号）が挙げられる。
（Ｈ）ヘビ、スズメバチなどによって天然に産生される昆虫特異的毒液、例えば、サソリ昆虫毒ペプチド（Pang, 1992 Gene 116:165）。
（Ｉ）モノテルペン、セスキテルペン、ステロイド、ヒドロキサム酸、フェニルプロパノイド誘導体または殺虫活性を有する別の非タンパク質分子の高度集積に関与している酵素。
（Ｊ）生物学的に活性な分子の翻訳後修飾を含めた、修飾に関与している酵素、例えば、天然または合成にかかわらず、解糖酵素、タンパク質分解酵素、脂肪分解酵素、ヌクレアーゼ、シクラーゼ、トランスアミナーゼおよびエステラーゼ、ヒドロラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、ホスホリラーゼ、ポリメラーゼ、エラスターゼ、キチナーゼおよびグルカナーゼ。このような遺伝子の例として、ｃａｌｌａｓ遺伝子（ＰＣＴ公開出願ＷＯ９３／０２１９７）、キチナーゼをコードする配列（例えば、ＡＴＣＣから受託番号３９９９６３７および６７１５２の下で入手できる）、タバコ鉤虫キチナーゼ（Kramer et al., 1993 Insect Molec. Biol. 23:691）およびパセリｕｂｉ４−２ポリユビキチン遺伝子（Kawalleck et al., 1993 Plant Molec. Biol. 21:673）が挙げられる。
（Ｋ）シグナル変換をシミュレートする分子。このような分子の例として、リョクトウカルモジュリンｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列（Botella et al., 1994 Plant Molec. Biol. 24:757）およびトウモロコシカルモジュリンｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列（Griess et al., 1994 Plant Physiol. 104:1467）が挙げられる。
（Ｌ）疎水性モーメントペプチド。米国特許第５，６５９，０２６号および第５，６０７，９１４号を参照されたい；後者は、病害抵抗性を付与する合成抗菌ペプチドを教示している。
（Ｍ）膜透過酵素、チャネル形成剤またはチャネル遮断剤、例えば、トランスジェニックタバコ植物をシュードモナス・ソラナセアラム（Pseudomonas solanacearum）に対して抵抗性にする、セクロピン−ベータ溶菌性ペプチド類似体（Jaynes et al., 1993 Plant Sci. 89:43）。
（Ｎ）ウイルス侵襲性タンパク質またはそれに由来する複合毒素。例えば、形質転換植物細胞におけるウイルスコートタンパク質の蓄積は、ウイルス感染および／またはコートタンパク質遺伝子が由来するウイルスによって、ならびに関連ウイルスによって達成される病害発生に対する抵抗性を与える。アルファルファモザイクウイルス、キュウリモザイクウイルス、タバコ条斑ウイルス、ジャガイモウイルスＸ、ジャガイモウイルスＹ、タバコエッチウイルス、タバコ茎えそウイルスおよびタバコモザイクウイルスに対して、コートタンパク質媒介性抵抗性が形質転換植物に付与されている。例えば、Beachy et al., (1990) Ann. Rev. Phytopathol. 28:451を参照されたい。
（Ｏ）昆虫特異的抗体またはそれに由来する免疫毒素。したがって、昆虫腸において重大な代謝機能にターゲッティングされる抗体は、影響を受ける酵素を不活化し、昆虫を死滅させる。例えば、Taylor et al., (1994), Abstract #497, Seventh Int'l. Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactionsは、一本鎖抗体断片の製造によるトランスジェニックタバコにおける酵素性不活性化を示す。
（Ｐ）ウイルス特異的抗体。例えば、組換え抗体遺伝子を発現するトランスジェニック植物は、ウイルス攻撃から保護されるということを示すTavladoraki et al., (1993)、Nature 266:469を参照されたい。
（Ｑ）病原体または寄生生物によって天然に生成される発達遅延性タンパク質。したがって、真菌エンドα−１，４−Ｄポリガラクツロナーゼは、植物細胞壁ホモ−α−１，４−Ｄ−ガラクツロナーゼを可溶化することによって、真菌コロニー形成および植物栄養放出を促進する（Lamb et al., (1992), Biotechnology 10:1436）。マメエンドポリガラクツロナーゼ阻害性タンパク質をコードする遺伝子のクローニングおよび特性決定が、Toubart et al., (1992 Plant J. 2:367)に記載されている。
（Ｒ）植物によって天然に生成される発達遅延性タンパク質、例えば、真菌病害に対する増大した抵抗性を提供するオオムギリボソーム不活化遺伝子（Longemann et al., (1992), Bio/Technology 10:3305）。
（Ｓ）ＲＮＡ分子が、標的遺伝子の発現を阻害するために使用される、ＲＮＡ干渉。一例では、ＲＮＡ分子は、部分的または完全に二本鎖であり、サイレンシング反応を引き起こし、ｄｓＲＮＡの低分子干渉ＲＮＡへの切断をもたらし、次いで、これが、相同ｍＲＮＡを破壊するターゲッティング複合体中に組み込まれる。例えば、Fire et al., 米国特許第６，５０６，５５９号；Graham et al., 米国特許第６，５７３，０９９号を参照されたい。
【０１２９】
２．除草剤に対する耐性を付与する遺伝子
（Ａ）成長点または分裂組織を阻害する除草剤、例えば、イミダゾリノン（imidazalinone）、スルホンアニリドまたはスルホニル尿素除草剤に対する抵抗性または耐性をコードする遺伝子。このカテゴリー中の例示的遺伝子は、突然変異体アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）をコードし（Lee et al., 1988 EMBOJ. 7:1241）、これは、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）酵素としても知られている（Miki et al., 1990 Theor. Appl. Genet. 80:449）。
（Ｂ）突然変異体ＥＰＳＰシンターゼおよびａｒｏＡ遺伝子によって、またはＤＧＴ−２８、２ｍＥＰＳＰＳ、ＧＡＴ（グリホサートアセチルトランスフェラーゼ）もしくはＧＯＸ（グリホサートオキシダーゼ）などの遺伝子およびグルホシネート（ｐａｔ、ｂａｒ、およびｄｓｍ−２遺伝子）などのその他のホスホノ化合物ならびにアリールオキシフェノキシプロピオン酸およびシクロヘキサンジオン（ＡＣＣアーゼ阻害剤をコードする遺伝子）による代謝不活性化によって与えられる、グリホサートに対する抵抗性または耐性をコードする１つ以上のさらなる遺伝子。例えば、グリホサート抵抗性を付与できるＥＰＳＰの形態のヌクレオチド配列を開示する米国特許第４，９４０，８３５号を参照のこと。突然変異体ａｒｏＡ遺伝子をコードするＤＮＡ分子は、ＡＴＣＣ受託番号３９２５６の下で得ることができ、突然変異体遺伝子のヌクレオチド配列は、米国特許第４，７６９，０６１号に開示されている。欧州特許出願番号０３３３０３３および米国特許第４，９７５，３７４号には、Ｌ−ホスフィノトリシンなどの除草剤に対する抵抗性を付与するグルタミンシンセターゼ遺伝子のヌクレオチド配列が開示されている。ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、欧州特許出願０２４２２４６に提供されている。De Greef et al., (1989), Bio/Technology 7:61には、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ活性のためにキメラｂａｒ遺伝子コーディングを発現するトランスジェニック植物の製造が記載されている。アリールオキシフェノキシプロピオン酸およびセトキシジムおよびハロキシフォップなどのシクロヘキサンジオンに対する抵抗性を付与する遺伝子の例示的なものとして、Marshall et al., (1992, Theor. Appl. Genet. 83:435)に記載される、Ａｃｃｌ−Ｓ１、Ａｃｃｌ−Ｓ２およびＡｃｃｌ−Ｓ３遺伝子がある。
（Ｃ）光合成を阻害する除草剤、例えば、トリアジンに対する抵抗性または耐性をコードする遺伝子（ｐｓｂＡおよびｇｓ＋遺伝子）およびベンゾニトリル（ニトリラーゼ遺伝子）。Przibilla et al., (1991, Plant Cell 3:169)には、クラミドモナス（Chlamydomonas）を形質転換するための突然変異体ｐｓｂＡ遺伝子をコードするプラスミドの使用が記載されている。ニトリラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、米国特許第４，８１０，６４８号に開示されており、これらの遺伝子を含有するＤＮＡ分子は、ＡＴＣＣ受託番号５３４３５、６７４４１および６７４４２の下で入手可能である。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼのＤＮＡコーディングのクローニングおよび発現は、Hayes et al., (1992, Biochem. J. 285:173)に記載されている。
（Ｄ）ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）、パラ−ヒドロキシフェニルピルビン酸（ＨＰＰ）がホモゲンチジン酸に形質転換される反応を触媒する酵素と結合する除草剤に対する抵抗性または耐性をコードする遺伝子。これは、イソキサゾール（ＥＰ４１８１７５、ＥＰ４７０８５６、ＥＰ４８７３５２、ＥＰ５２７０３６、ＥＰ５６０４８２、ＥＰ６８２６５９、米国特許第５，４２４，２７６号）、特に、トウモロコシの選択的除草剤であるイソキサフルトール、ジケトニトリル（ＥＰ４９６６３０、ＥＰ４９６６３１）、特に、２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−ＳＯ２ＣＨ３−４−ＣＦ３フェニル）プロパン−１，３−ジオンおよび２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−ＳＯ２ＣＨ３−４−２，３Ｃｌ２フェニル）プロパン−１，３−ジオン、トリケトン（ＥＰ６２５５０５、ＥＰ６２５５０８、米国特許第５，５０６，１９５号）、特に、スルコトリオンおよびピラゾリネートなどの除草剤を含む。例えば、米国特許第６，２６８，５４９号および同６，２４５，９６８号および米国特許出願公開第２００３００６６１０２号に記載される遺伝子を含めた、植物において過剰量のＨＰＰＤを生成する遺伝子は、このような除草剤に対する耐性または抵抗性を提供し得る。
（Ｅ）フェノキシオーキシン除草剤、例えば、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）に対する抵抗性または耐性をコードし、アリールオキシフェノキシプロピオネート（ＡＯＰＰ）除草剤に対する抵抗性または耐性も付与し得る遺伝子。このような遺伝子の例として、米国特許第７，８３８，７３３号に記載される、α−ケトグルタレート依存性ジオキシゲナーゼ酵素（ａａｄ−１）遺伝子が挙げられる。
（Ｆ）２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）などのフェノキシオーキシン除草剤に対する抵抗性または耐性をコードし、フルロキシピルまたはトリクロピルなどのピリジルオキシオーキシン除草剤に対する抵抗性または耐性も付与し得る遺伝子。このような遺伝子の例として、ＷＯ２００７／０５３４８２Ａ２に記載されるα−ケトグルタレート依存性ジオキシゲナーゼ酵素遺伝子（ａａｄ−１２）が挙げられる。
（Ｇ）ジカンバに対する抵抗性または耐性をコードする遺伝子（例えば、米国特許公開第２００３０１３５８７９号を参照されたい）。
（Ｈ）プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＰＰＯ）を阻害する除草剤に対する抵抗性または耐性を提供する遺伝子（米国特許第５，７６７，３７３号を参照されたい）。
（Ｉ）光化学系ＩＩ反応中心（ＰＳ  ＩＩ）のコアタンパク質と結合する、トリアジン除草剤（アトラジンなど）および尿素誘導体（ジウロンなど）除草剤に対する抵抗性または耐性を提供する遺伝子（Brussian et al., (1989), EMBO J. 1989, 8(4): 1237-1245を参照されたい）。
【０１３０】
３．価値が付加された形質を付与するまたはそれに貢献する遺伝子
（Ａ）植物のステアリン酸含量を増大させるために、例えば、アンチセンス遺伝子またはステアロイル−ＡＣＰ不飽和化酵素で、トウモロコシまたはアブラナ属（Brassica）を形質転換することによって修飾された脂肪酸代謝（Knultzon et al., 1992, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 89:2624）。
（Ｂ）減少したフィチン酸含量
（１）クロコウジカビ（Aspergillus niger）フィターゼ遺伝子などのフィターゼをコードする遺伝子の導入（Van Hartingsveldt et al., 1993 Gene 127:87）は、フィチン酸の分解を増強し、より多くの遊離リン酸を形質転換植物に付加する。
（２）フィチン酸含量を低下させる遺伝子は導入され得る。トウモロコシにおいて、これは、例えば、クローニングすることおよび次いで、低レベルのフィチン酸を特徴とするトウモロコシ突然変異体に関与する単一の対立遺伝子と関連しているＤＮＡを再導入することによって達成され得る（Raboy et al., 1990 Maydica 35:383）。
（Ｃ）例えば、植物を、デンプンの分岐パターンを変更する酵素をコードする遺伝子で形質転換することによって達成される修飾された炭水化物組成物。このような酵素の例として、ストレプトコッカス・ミューカス（Streptococcus mucus）のフルクトース転移酵素遺伝子（Shiroza et al., 1988 J. Bacteriol. 170:810）、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）のレバンスクラーゼ遺伝子（Steinmetz et al., 1985 Mol. Gen. Genel. 200:220）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）のα−アミラーゼ（Pen et al., 1992 Bio/Technology 10:292）、トマトインベルターゼ遺伝子（Elliot et al., 1993 Plant Mol. Biol. 21 :515-524）、オオムギアミラーゼ遺伝子（Sogaard et al., 1993 J. Biol. Chem. 268:22480）およびトウモロコシ胚乳デンプン分岐酵素ＩＩ（Fisher et al., 1993 Plant Physiol. 102:10450）が挙げられる。
【０１３１】
形質転換
植物の形質転換に適した方法は、ＤＮＡが細胞内に導入され得る任意の方法を含み、例えば、限定されないが、エレクトロポレーション（米国特許第５，３８４，２５３号参照）、微粒子銃（例えば、米国特許第５，０１５，５８０号；第５，５５０，３１８号；第５，５３８，８８０号；第６，１６０，２０８号；第６，３９９，８６１号；および第６，４０３，８６５号参照）；アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性形質転換（例えば、米国特許第５，６３５，０５５号；第５，８２４，８７７号；第５，５９１，６１６号；第５，９８１，８４０号；および第６，３８４，３０１号参照）；およびプロトプラスト形質転換（例えば、米国特許５，５０８，１８４号参照）が挙げられる。これらの方法は、植物を安定的に形質転換しまたは一過性に形質転換するために使用されてもよい。
【０１３２】
ＤＮＡ構築物は、炭化ケイ素繊維を用いた撹拌などの技術を用いて植物細胞のゲノムＤＮＡ内に直接導入されてもよく（例えば、米国特許第５，３０２，５２３号および第５，４６４，７６５号参照）、またはＤＮＡパーティクル銃などのバイオリスティック法を用いて、植物組織に直接導入することができる（例えば、Klein et al., (1987) Nature 327:70-73参照）。あるいは、ＤＮＡ構築物は、ナノ粒子形質転換を介して植物細胞に導入することができる（例えば、米国特許出願公開第２００９／０１０４７００号参照）。
【０１３３】
さらに、遺伝子導入は、リゾビウム属（Rhizobium）種のＮＧＲ２３４、アルファルファ根粒菌（Sinorhizoboium meliloti）、ミヤコグサ根粒菌（Mesorhizobium loti）、ジャガイモウイルスＸ、カリフラワーモザイクウイルスおよびキャッサバ葉脈モザイクウイルスおよび／またはタバコモザイクウイルスなどの非アグロバクテリウム属（Agrobacterium）細菌またはウイルスを用いて達成されてもよい。
【０１３４】
形質転換技術の適用により、実質的に任意の植物種の細胞を安定に形質転換してもよいし、これらの細胞を周知技術によってトランスジェニック植物に発育させてもよい。例えば、綿の形質転換との関連で特に有用であり得る技術は米国特許第５，８４６，７９７号、第５，１５９，１３５号、第５，００４，８６３号、および第６，６２４，３４４号に記載されている；アブラナ属（Brassica）植物を形質転換するための技術は、例えば、米国特許第５，７５０，８７１号に詳細に記載されている；ダイズを形質転換するための技術は、例えば、米国特許第６，３８４，３０１号に記載されている；トウモロコシを形質転換するための技術は、例えば、米国特許第７，０６０，８７６号および第５，５９１，６１６号、ならびに国際ＰＣＴ出願公開ＷＯ９５／０６７２２に記載されている。
【０１３５】
レシピエント細胞への外因性核酸の送達を行った後、形質転換された細胞は、一般的に、さらに培養および植物再生のために識別される。形質転換体を同定する能力を改善するために、形質転換体を生成するために使用される形質転換ベクターとともに選択マーカー遺伝子を使用することが望まれる場合がある。例示的な実施形態において、形質転換された細胞集団は、選択剤（単数または複数）に細胞を暴露することによってアッセイすることができ、または細胞は、所望のマーカー遺伝子形質についてスクリーニングすることができる。
【０１３６】
選択剤への暴露に対して生き残った細胞、またはスクリーニングアッセイにおいて陽性のスコアが示された細胞は、植物の再生を支持する培地で培養することができる。一実施形態において、任意の適切な植物組織培地は、成長調節因子などのさらなる物質を含むことによって修飾されてもよい。組織は、十分な組織が植物の再生取り組みを開始するために利用可能になるまで、または反復ラウンドの手動選択後、組織の形態学が再生に適切であり（例えば、少なくとも２週間）、続いてシュート形成を促す培地に移されるまで、成長調節剤を含む基礎培地に維持することができる。十分シュート形成が起こるまで、培養物を定期的に移す。シュートが形成されると、それらは根形成を促す培地に移される。十分な根が形成されると、植物はさらなる成長と成熟のために土壌に移され得る。
【０１３７】
再生中の植物に付与される構築物を含む所望の核酸の存在を確認するために、様々なアッセイを行ってもよい。このようなアッセイには、分子生物学的アッセイ、例えば、サザンブロットおよびノーザンブロットならびにＰＣＲ；生化学的アッセイ、例えば、タンパク質産物の存在を、例えば、免疫学的手法（ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットおよび／またはＬＣ−ＭＳ  ＭＳ分光光度法）により、または酵素機能により検出するアッセイ；植物部分アッセイ、例えば、葉または根アッセイ；および／または再生した植物全体の表現型の分析などが挙げられる。
【０１３８】
トランスジェニック事象は、例えば、目的とする核酸分子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ増幅によってスクリーニングすることができる。ＰＣＲ遺伝子型決定には、限定されないが、ゲノムに組み込まれた目的とする核酸分子を含むことが予期された、単離された宿主植物カルス組織由来のゲノムＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、続く、ＰＣＲ増幅産物の標準的なクローニングおよび配列分析が含まれることは理解される。ＰＣＲ遺伝子型決定の方法は、十分に報告され（例えば、Rios et al., (2002) Plant J. 32:243-53）、任意の植物種または組織タイプ由来のゲノムＤＮＡに適用されてもよく、細胞培養が含まれる。標的配列と導入された配列の両方に結合するオリゴヌクレオチドプライマーの組合せを順次使用しまたはＰＣＲ増幅反応において多重化されてもよい。標的部位にアニーリングするように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーは、核酸配列を導入し、および／またはこれらの２つの組合せが生成され得る。したがって、ＰＣＲ遺伝子型決定の戦略は、例えば、限定されないが、植物ゲノム中の特定の配列の増幅；植物ゲノム中の複数の特定の配列の増幅；植物ゲノム中の非特異的配列の増幅；および上記の任意の組合せを含んでもよい。当業者は、ゲノムを調べるために、プライマーおよび増幅反応の追加の組合せを考案することができる。例えば、フォワードおよびリバースのオリゴヌクレオチドプライマーのセットは、導入された核酸配列の境界外で標的に特異的である核酸配列（単数または複数）にアニーリングするように設計されてもよい。
【０１３９】
フォワードおよびリバースのオリゴヌクレオチドプライマーは、例えば、そこに含まれる目的とするヌクレオチド配列内のコード領域に対応する配列、または核酸分子の他の部分で、導入された核酸分子に特異的にアニーリングするように設計されてもよい。プライマーは、本明細書に記載されるプライマーと組み合わせて使用することができる。オリゴヌクレオチドプライマーは、所望の配列に従って合成されてもよく、（例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡから）市販されている。増幅は、クローニングおよび配列決定、または増幅産物の直接的な配列分析に続いてもよい。一実施形態において、遺伝子標的に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーをＰＣＲ増幅において採用する。
【０１４０】
導入遺伝子を発現させる方法
一実施形態において、植物において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーターを含む植物を成長させることを含む。一実施形態において、植物において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子イントロンを含む植物を成長させることを含む。一実施形態において、植物において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーターおよびイントロンを含む植物を成長させることを含む。一実施形態において、植物において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子３’−ＵＴＲを含む植物を成長させることを含む。一実施形態において、植物において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター、イントロンおよび３’−ＵＴＲを含む植物を成長させることを含む。一実施形態において、植物において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子５’−ＵＴＲを含む植物を成長させることを含む。一実施形態において、植物において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター、イントロンおよび５’−ＵＴＲを含む植物を成長させることを含む。一実施形態において、植物において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーターを含む植物を成長させることを含む。一実施形態において、植物において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子イントロンを含む植物を成長させることを含む。一実施形態において、植物において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーターおよびイントロンを含む植物を成長させることを含む。一実施形態において、植物において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子３’−ＵＴＲを含む植物を成長させることを含む。一実施形態において、植物において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、トウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター、および少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子３’−ＵＴＲを含む植物を成長させることを含む。一実施形態において、植物において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子５’−ＵＴＲを含む植物を成長させることを含む。一実施形態において、植物において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーターおよびトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子５’−ＵＴＲを含む植物を成長させることを含む。
【０１４１】
一実施形態において、植物組織または植物細胞において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーターを含む植物組織または植物細胞を培養することを含む。一実施形態において、植物組織または植物細胞において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子イントロンを含む植物組織または植物細胞を培養することを含む。一実施形態において、植物組織または植物細胞において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーターおよびイントロンを含む植物組織または植物細胞を培養することを含む。一実施形態において、植物組織または植物細胞において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子３’−ＵＴＲを含む植物組織または植物細胞を培養することを含む。一実施形態において、植物組織または植物細胞において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーターおよびトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子３’−ＵＴＲを含む植物組織または植物細胞を培養することを含む。一実施形態において、植物組織または植物細胞において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター、イントロンおよび３’−ＵＴＲを含む植物組織または植物細胞を培養することを含む。一実施形態において、植物組織または植物細胞において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子５’−ＵＴＲを含む植物組織または植物細胞を培養することを含む。一実施形態において、植物組織または植物細胞において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーターおよびトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子５’−ＵＴＲを含む植物組織または植物細胞を培養することを含む。一実施形態において、植物組織または植物細胞において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター、イントロンおよび５’−ＵＴＲを含む植物組織または植物細胞を培養することを含む。
【０１４２】
一実施形態において、植物において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーターを含む遺伝子発現カセットを含む植物を成長させることを含む。一実施形態において、植物において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子イントロンを含む遺伝子発現カセットを含む植物を成長させることを含む。一実施形態において、植物において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーターおよびイントロンを含む遺伝子発現カセットを含む植物を成長させることを含む。一実施形態において、植物において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子３’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む植物を成長させることを含む。一実施形態において、植物において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーターおよびトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子３’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む植物を成長させることを含む。一実施形態において、植物において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター、イントロンおよび３’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む植物を成長させることを含む。一実施形態において、植物において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子５’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む植物を成長させることを含む。一実施形態において、植物において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーターおよびトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子５’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む植物を成長させることを含む。一実施形態において、植物において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター、イントロンおよび５’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む植物を成長させることを含む。
【０１４３】
一実施形態において、植物組織または植物細胞において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーターを含む遺伝子発現カセットを含む植物組織または植物細胞を培養することを含む。一実施形態において、植物組織または植物細胞において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子イントロンを含む遺伝子発現カセットを含む植物組織または植物細胞を培養することを含む。一実施形態において、植物組織または植物細胞において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーターおよびイントロンを含む遺伝子発現カセットを含む植物組織または植物細胞を培養することを含む。一実施形態において、植物組織または植物細胞において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子３’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む植物組織または植物細胞を培養することを含む。一実施形態において、植物組織または植物細胞において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーターおよびトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子３’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む植物組織または植物細胞を培養することを含む。一実施形態において、植物組織または植物細胞において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター、イントロンおよび３’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む植物組織または植物細胞を培養することを含む。一実施形態において、植物組織または植物細胞において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子５’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む植物組織または植物細胞を培養することを含む。一実施形態において、植物組織または植物細胞において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子５’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む植物組織または植物細胞を培養することを含む。一実施形態において、植物組織または植物細胞において少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも１つの導入遺伝子に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター、イントロンおよび５’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む植物組織または植物細胞を培養することを含む。
【０１４４】
一実施形態において、植物、植物組織または植物細胞は、トウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター（上流プロモーターも含む）を含む。一実施形態において、トウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーターは、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４であり得る。一実施形態において、植物、植物組織または植物細胞は、トウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーターを含む遺伝子発現カセットを含み、ここで、該プロモーターは、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１  ％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一である。一実施形態において、植物、植物組織または植物細胞は、導入遺伝子に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーターを含む遺伝子発現カセットを含む。例示的な実施形態において、植物、植物組織または植物細胞は、導入遺伝子に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーターを含む遺伝子発現カセットを含み、ここで、導入遺伝子は、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組合せであり得る。
【０１４５】
一実施形態において、植物、植物組織または植物細胞は、イントロンを含む遺伝子発現カセットを含む。一実施形態において、植物、植物組織または植物細胞は、トウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子イントロンを含む遺伝子発現カセットを含む。一実施形態において、トウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子イントロンは、配列番号５または配列番号６のポリヌクレオチドである。一実施形態において、植物、植物組織または植物細胞は、イントロンを含む遺伝子発現カセットを含み、ここで、該イントロンは、配列番号５または配列番号６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一である。一実施形態において、遺伝子発現カセットは、プロモーターに作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子イントロンを含み、ここで、該プロモーターは、トウモロコシプロモーター、または植物が起源であるプロモーター（例えば、トウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーターもしくはトウモロコシ（Zea mays）のユビキチン１プロモーター）、ウイルスが起源であるプロモーター（例えば、キャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター）もしくは細菌が起源であるプロモーター（例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）デルタマス）である。一実施形態において、植物、植物組織または植物細胞は、導入遺伝子に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子イントロンを含む遺伝子発現カセットを含む。例示的な実施形態において、植物、植物組織または植物細胞は、導入遺伝子に作動可能に連結されているトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子イントロンを含む遺伝子発現カセットを含み、ここで、導入遺伝子は、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組合せであり得る。
【０１４６】
一実施形態において、植物、植物組織または植物細胞は、トウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子３’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む。一実施形態において、トウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子３’−ＵＴＲは、配列番号７または配列番号８のポリヌクレオチドである。一実施形態において、植物、植物組織または植物細胞は、トウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子３’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含み、ここで、トウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子３’−ＵＴＲは、配列番号７または配列番号８に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一である。一実施形態において、遺伝子発現カセットは、プロモーターに作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子３’−ＵＴＲを含み、ここで、該プロモーターは、トウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター、または植物が起源であるプロモーター（例えば、トウモロコシ（Zea mays）のユビキチン１プロモーター）、ウイルスが起源であるプロモーター（例えば、キャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター）もしくは細菌が起源であるプロモーター（例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）デルタマス）である。一実施形態において、植物、植物組織または植物細胞は、導入遺伝子に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子３’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む。例示的な実施形態において、植物、植物組織または植物細胞は、導入遺伝子に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子３’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含み、ここで、導入遺伝子は、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組合せであり得る。
【０１４７】
一実施形態において、植物、植物組織または植物細胞は、トウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子５’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む。一実施形態において、トウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子５’−ＵＴＲは、配列番号１９のポリヌクレオチドである。一実施形態において、植物、植物組織または植物細胞は、トウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子５’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含み、ここで、トウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子５’−ＵＴＲは、配列番号１９に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一である。一実施形態において、遺伝子発現カセットは、プロモーターに作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子５’−ＵＴＲを含み、ここで、該プロモーターは、トウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター、または植物が起源であるプロモーター（例えば、トウモロコシ（Zea mays）のユビキチン１プロモーター）、ウイルスが起源であるプロモーター（例えば、キャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター）もしくは細菌が起源であるプロモーター（例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）デルタマス）である。一実施形態において、植物、植物組織または植物細胞は、導入遺伝子に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子５’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む。例示的な実施形態において、植物、植物組織または植物細胞は、導入遺伝子に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子５’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含み、ここで、導入遺伝子は、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組合せであり得る。
【０１４８】
一実施形態において、植物、植物組織または植物細胞は、導入遺伝子に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーターおよびトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子イントロンを含む遺伝子発現カセットを含む。プロモーター、イントロン、３’−ＵＴＲおよび５’−ＵＴＲは、遺伝子発現カセットが２つ以上の導入遺伝子を含む場合、遺伝子発現カセット内で異なる導入遺伝子に作動可能に連結され得る。例示的な実施形態において、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーターを含み、ここで、導入遺伝子は、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組合せであり得る。例示的な実施形態において、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子イントロンを含み、ここで、導入遺伝子は、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組合せであり得る。
【０１４９】
一実施形態において、植物、植物組織または植物細胞は、導入遺伝子に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター、トウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子イントロンおよびトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子３’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む。プロモーター、イントロンおよび３’−ＵＴＲは、遺伝子発現カセットが２つ以上の導入遺伝子を含む場合、遺伝子発現カセット内で異なる導入遺伝子に作動可能に連結され得る。例示的な実施形態において、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーターを含み、ここで、導入遺伝子は、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組合せであり得る。例示的な実施形態において、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子イントロンを含み、ここで、導入遺伝子は、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組合せであり得る。例示的な実施形態において、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子３’−ＵＴＲを含み、ここで、導入遺伝子は、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組合せであり得る。
【０１５０】
一実施形態において、植物、植物組織または植物細胞は、導入遺伝子に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター、トウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子イントロン、トウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子３’−ＵＴＲおよびウモロコシのクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子５’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む。プロモーター、イントロン、３’−ＵＴＲおよび５’−ＵＴＲは、遺伝子発現カセットが２つ以上の導入遺伝子を含む場合、遺伝子発現カセット内で異なる導入遺伝子に作動可能に連結され得る。例示的な実施形態において、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーターを含み、ここで、導入遺伝子は、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組合せであり得る。例示的な実施形態において、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子イントロンを含み、ここで、導入遺伝子は、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組合せであり得る。例示的な実施形態において、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子５’−ＵＴＲを含み、ここで、導入遺伝子は、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組合せであり得る。
【０１５１】
一実施形態において、本明細書に記載される方法を用いた導入遺伝子発現は、植物の葉および茎の組織内で発現される。一実施形態において、導入遺伝子発現は、植物の葉や茎の組織において発現される１を超える導入遺伝子を含む。一実施形態において、本明細書に記載されるトランスジェニック植物を成長させる方法は、葉および茎の優先的な導入遺伝子の発現を含む。一実施形態において、植物組織または植物細胞中で導入遺伝子を発現させる方法は、葉および茎の優先組織ならびに葉および茎の優先細胞を含む。一実施形態において、葉および茎の優先発現は、トウモロコシの葉および茎の優先発現を含む。
【０１５２】
さらなる実施形態において、本明細書に記載される方法を用いた導入遺伝子発現は、地上の植物組織内で発現される（例えば、地上の植物組織は、葉、殻、茎およびシルクを含む）。一実施形態において、導入遺伝子発現は、地上の植物組織において発現される１を超える導入遺伝子を含む。一実施形態において、本明細書に記載されるトランスジェニック植物を成長させる方法は、地上の植物組織の導入遺伝子発現を含む。一実施形態において、植物組織または植物細胞において導入遺伝子を発現させる方法は、地上の植物組織および地上の植物細胞を含む。一実施形態において、地上の植物組織発現は、トウモロコシの地上の植物組織発現を含む。
【０１５３】
一実施形態において、植物、植物組織または植物細胞は、本明細書に開示されるトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター、イントロン、３’−ＵＴＲまたは５’−ＵＴＲ調節要素を含むベクターを含む。一実施形態において、植物、植物組織または植物細胞は、導入遺伝子に作動可能に連結されている、本明細書に開示されるトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター、イントロン、３’−ＵＴＲまたは５’−ＵＴＲ調節要素を含むベクターを含む。一実施形態において、植物、植物組織または植物細胞は、本明細書に開示される遺伝子発現カセットを含むベクターを含む。一実施形態において、ベクターは、プラスミド、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、バクテリオファージまたはウイルス断片であり得る。
【０１５４】
一実施形態において、本明細書に開示される方法に係る植物、植物組織または植物細胞は単子葉植物であり得る。単子葉植物、植物組織または植物細胞は、限定されないが、トウモロコシ、イネ、コムギ、サトウキビ、オオムギ、ライムギ、ソルガム、ラン、竹、バナナ、ガマ、ユリ、オートムギ、タマネギ、キビおよびライコムギであり得る。
【０１５５】
一実施形態において、本明細書に開示される方法に係る植物、植物組織または植物細胞は双子葉植物であり得る。双子葉植物、植物組織または植物細胞は、限定されないが、ナタネ、カノーラ、カラシナ、エチオピアカラシ、ダイズ、ヒマワリおよび綿であり得る。
【０１５６】
遺伝的に修飾された植物の作製に関して、植物を遺伝子操作するための方法は、当該技術分野において周知である。例えば、植物形質転換のための多数の方法が開発されており、双子葉植物および単子葉植物についての生物学的および物理学的な形質転換プロトコルが挙げられる（例えば、Goto-Fumiyuki et al., Nature Biotech 77:282-286 (1999); Miki et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. and Thompson, J. E. Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 67-88 (1993)）。さらに、植物細胞または組織の形質転換および植物の再生のためのベクターおよびインビトロ培養法は、例えば、Gruber et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. and Thompson, J. E. Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 89-119 (1993)において利用可能である。
【０１５７】
当業者は、外因性配列がトランスジェニック植物に安定に導入され、作動可能であることが確認された後、それを有性交配によって他の植物に導入することができることを認識する。多数の標準的な育種技術のうちのいずれかは、交配される種に応じて使用することができる。
【０１５８】
形質転換された植物細胞、カルス、組織または植物を同定し、ＤＮＡの形質転換時に存在するマーカー遺伝子によってコードされる形質について遺伝子操作された植物材料を選択またはスクリーニングすることによって単離し得る。例えば、選択は、形質転換遺伝子構築物が抵抗性を付与する抗生物質または除草剤の阻害量を含む培地上で、遺伝子操作された植物材料を成長させることによって行うことができる。さらに、形質転換された細胞はまた、組換え核酸構築物に存在し得る任意の可視マーカー遺伝子（例えば、ｙｆｐ、ｇｆｐ、β−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、ＢまたはＣＩ遺伝子）の活性についてスクリーニングすることにより同定することができる。このような選択およびスクリーニング法は、当業者に周知である。
【０１５９】
物理的および生化学的方法もまた、挿入された遺伝子構築物を含む植物または植物細胞の形質転換体を同定するために使用することができる。これらの方法としては、限定されないが、１）組換えＤＮＡインサートの構造を検出および決定するためのサザン分析またはＰＣＲ増幅；２）遺伝子構築物のＲＮＡ転写物を検出および検査するためのノーザンブロット、Ｓ１  ＲＮａｓｅ保護、プライマー伸長または逆転写ＰＣＲ増幅；３）酵素またはリボザイム活性を検出するための酵素的アッセイ、この場合、このような遺伝子産物は遺伝子構築物によってコードされる；４）次世代シーケンシング（ＮＧＳ）分析；５）タンパク質ゲル電気泳動、ウェスタンブロット技術、免疫沈降または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、この場合、遺伝子構築産物はタンパク質である、が挙げられる。インサイチュハイブリダイゼーション、酵素染色および免疫染色などの更なる技術もまた、特定の植物器官および組織における組換え構築物の存在または発現を検出するために使用され得る。これらのアッセイの全てを実施するための方法は、当業者に周知である。
【０１６０】
本明細書に開示される方法を用いた遺伝子操作の効果は、例えば、目的とする組織から単離されたＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）のノーザンブロットにより観察することができる。典型的には、ｍＲＮＡが存在するまたはｍＲＮＡの量が増加した場合、対応する導入遺伝子が発現していると想定することができる。遺伝子および／またはコードされたポリペプチドの活性を測定する他の方法を用いることができる。様々なタイプの酵素アッセイは、使用される基質および反応生成物もしくは副産物の増加または減少を検出する方法に応じて使用することができる。さらに、発現されるポリペプチドのレベルは、免疫化学的に、すなわち、電気泳動検出アッセイ（染色またはウェスタンブロッティングのいずれか）によるものなどの当業者に周知であるＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＩＡおよび他の抗体ベースのアッセイにより測定することができる。１つの非限定的な例として、ＥＬＩＳＡアッセイを用いたＡＡＤ−１（アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ；国際公開第ＷＯ２００５／１０７４３７を参照されたい）およびＰＡＴ（ホスフィノトリシン−Ｎ−アセチル−トランスフェラーゼ）タンパク質の検出は、米国特許出願公開第２００９００９３３６６号に記載されている。導入遺伝子は、植物のいくらかの細胞型もしくは組織において、またはいくつかの発育段階で選択的に発現され得、あるいは導入遺伝子は、実質的にその全体のライフサイクルに沿って発現され得る。しかしながら、任意のコンビナトリアル発現様式も適用可能である。
【０１６１】
本開示はまた、種子が導入遺伝子または遺伝子発現カセットを含む、上述のトランスジェニック植物の種子を包含する。本開示は、さらに、子孫、クローン、細胞株または細胞が導入遺伝子または遺伝子構築体を含む、上述のトランスジェニック植物の子孫、クローン、細胞株または細胞を包含する。
【０１６２】
本発明は、特定の方法および実施形態を参照して記載されているが、様々な修正および変更が、本発明から逸脱することなしに行うことができることは理解されよう。
［実施例］
【実施例１】
【０１６３】
高発現の調節要素の同定
新規なトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子調節要素は、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を、転写プロファイリングアプローチを介して同定した。次に、これらの調節要素を単離し、同定し、クローニングして、トランスジェニック植物で使用するために調節要素の発現プロファイルを特徴付けた。バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）から単離されたｃｒｙ３４Ａｂ１遺伝子とａａｄ−１選択マーカー遺伝子で安定に形質転換されたトランスジェニックトウモロコシ系統を作製し、導入遺伝子発現レベルおよび組織特異性を評価した。このようにして、新規なトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子調節要素を同定し、特徴付けた。遺伝子発現構築物において使用するためのプロモーター、イントロン、５’−ＵＴＲおよび３’−ＵＴＲ調節要素が初めて開示される。
【０１６４】
転写プロファイリングアプローチ：
遺伝子発現カセットに使用するための所望の発現プロファイルを有する天然のトウモロコシ遺伝子の調節要素を同定し、選択するために、転写プロファイリングについて植物の成長と発育の異なる段階に成長した植物からトウモロコシ組織を得た。例えば、葉の４段階（Ｖ４（二連）、Ｖ１２とＲ３）、根の４段階（Ｖ４とＶ１２の結節および線維組織）発育からの組織試料、花粉、シルク、穂軸、未熟カーネル（受粉２０日後）、殻および茎（Ｖ４とＲ１）を採取した。総ｍＲＮＡを上記の所望の組織の全てから単離し、所望量の高品質ｍＲＮＡを得た。
【０１６５】
次に、ｃＤＮＡライブラリーをｍＲＮＡ試料のそれぞれから調製し、ハイスループットシークエンシングは、ＩＬＬＵＭＩＮＡ  Ｈ１ＳＥＱ（登録商標）２０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して完了した。さらに、ＩＬＬＵＭＩＮＡ  ＴＲＵＳＥＱ（登録商標）ＲＮＡサンプル調製キットをＲＮＡｓｅｑ試料調製のための製造業者の推奨プロトコルに従って使用した。簡単に述べると、総ＲＮＡの５ｇをポリ−Ｔオリゴ結合磁気ビーズを用いて精製し、続いて、高温で二価陽イオンを用いて、より小さな小片（約２００ｂｐの平均長）に断片化した。次に、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ（登録商標）ＩＩ逆転写酵素およびランダムプライマーを用いて、第一鎖ｃＤＮＡに断片化ｍＲＮＡをコピーした。ｃＤＮＡは、さらにＤＮＡポリメラーゼＩおよびＲＮａｓｅ  Ｈを用いて二本鎖ｃＤＮＡ（ｄｓ  ｃＤＮＡ）に変換された。次に、二本鎖ｃＤＮＡ断片を、エンド修復、Ａ−テーリング化、続いてインデックス付きのＩｌｌｕｍｉｎａ対合エンド（ＰＥ）アダプターへのライゲーションを行った。最後に、ライブラリー製品をクリーンアップし、１５サイクルのＰＣＲで濃縮し、精製した。濃縮したライブラリーを２ｎＭの濃度に標準化し、水酸化ナトリウムで変性し、ＨｉＳＥＱ（登録商標）フローセルの単一レーンに充填するために、ハイブリダイゼーション緩衝液で１２ｐＭに希釈した。クラスター生成、プライマーハイブリダイゼーションおよび配列決定反応をＩｌｌｕｍｉｎａの製造業者が推奨する配列決定プロトコルに従って行った。
【０１６６】
次に、配列決定の読み取り物は、低品質の読み取り物を除くためにフィルターにかけられた。配列決定の読み取り物の約９９．９％がフィルタリング後に保持された。配列決定の読み取り物は、トウモロコシＧＤＢにおいて利用可能な注釈付きのトウモロコシ（Zea mays）ｃ．ｖ．Ｂ７３ゲノムに対して整列された。１を超える遺伝子座でトウモロコシゲノムにマッピングされた配列決定の読み取り物は、高発現遺伝子の同定とそれらの更なる特徴付けにおいて混乱を避けるために廃棄された。このステップは、トウモロコシゲノムに対して、それぞれの試料からの７０％を超える配列決定の読み取り物の整列をもたらした。マッピングされた１００万個の断片あたりのエクソンのキロベースあたりの断片の定量的遺伝子発現単位（またはＦＰＫＭ値）を用いて、遺伝子発現構築物において使用するための所望の発現パターンにマッチした安定な形質転換試験についての遺伝子をランク付けした。トウモロコシにおいて最高に発現した遺伝子の約０．１％を占める約１５〜２０個の高発現遺伝子を、安定なトランスジェニック系統における試験について優先させた（図１）。
【実施例２】
【０１６７】
遺伝子調節要素の同定
プロモーター、イントロン、５’−ＵＴＲおよび３’−ＵＴＲ配列は、以前に報告されているバイオインフォマティクスと転写プロファイリングから同定されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子配列から抽出された。トウモロコシ（Zea mays）ｃ．ｖ．Ｂ７３ゲノムからトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子の単離および精製された配列を配列番号９として提供する。全長２，００６ｂｐのプロモーター配列（配列番号１）は、配列番号９の塩基対１〜２００６を含む。１，８８７ｂｐの上流プロモーター配列（配列番号２）は、配列番号９の塩基対１〜１，８８７を含む。５９ｂｐのイントロン配列（配列番号５）は、配列番号９の塩基対１，８８８〜１，９４６を含む。６０ｂｐの５’−ＵＴＲ配列（配列番号１９）は、配列番号９の塩基対１，９４７〜２，００６を含む。コード配列に隣接するＡＴＧおよびＴＧＡ転写開始および終止コドンは、それぞれ、配列番号９の塩基対２，００７〜２，００９および２，８０２〜２，８０４を含む。１，０００ｂｐの３’−ＵＴＲ配列（配列番号７）は、配列番号９の塩基対２，８０５〜３，８０４を含む。第２の４３ｂｐのイントロン（配列番号６）は、３’−ＵＴＲ内で特定され、配列番号９の塩基対２，８０９〜２，８５１を含む。
【０１６８】
ＤＮＡ要素を増幅または合成し、エントリーベクターにクローニングした。全長のプロモーターおよび全長の３’−ＵＴＲサイズは、それぞれ２，００６ｂｐおよび１，０００ｂｐであった。
【実施例３】
【０１６９】
トウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーターおよび３’−ＵＴＲ配列の修飾
トウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター配列を修飾した。反復配列を特定および除去し、それにより、下記の修飾されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター配列を得た。
【０１７０】
【化１０】
2017503513.tif 000013
【０１７１】
図２は、修飾されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター（配列番号３）と比較した全長のトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター（配列番号１）のアラインメントを与える。このアラインメントは、修飾されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター配列を生じさせるために除かれた反復ポリヌクレオチド配列を示す。
【０１７２】
次に、トウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子３’−ＵＴＲ配列（配列番号７）を修飾した。３’−ＵＴＲを４００ｂｐのポリヌクレオチド配列に切断し、それにより、以下の修飾されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子３’−ＵＴＲ配列（配列番号８）を得た。
【０１７３】
【化１１】
2017503513.tif 000014
【０１７４】
ＤＮＡ要素を増幅または合成し、エントリーベクターにクローニングした。修飾されたプロモーターと修飾された３’−ＵＴＲの長さは、それぞれ１，４４２ｂｐと４００ｂｐであった。
【実施例４】
【０１７５】
トウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター構築物
配列番号５のトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子イントロンおよび５’−ＵＴＲ配列（配列番号１９）と連結された、配列番号２の全長のトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子上流プロモーターは、配列番号１の全長のトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーターをもたらした。ｃｒｙ３４Ａｂ１（Ｂ．チューリンゲンシス（B. thurengiensis）由来のレポーター遺伝子）の発現は、全長のトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター（配列番号１）によって駆動され、ソラヌム・ツベロスム（Solanum tuberosum）ＰｉｎＩＩ３’−ＵＴＲ（ＳｔＰｉｎＩＩ３’−ＵＴＲ  ｖ２；An et ah, (1989) Plant Cell 1 ; 115-22）によって終了された。遺伝子要素のそれぞれは、それらの隣接ＤＮＡ要素に最小１５ｂｐの重複相同性を含有するプライマーを用いて増幅された。全ての断片をゲル精製した。次に、エントリーベクターバックボーン、ｐＥＮＴＲｌ１とともに３つの断片は、ＧＥＮＥＡＲＴ（登録商標）Ｓｅａｍｌｅｓｓクローニング反応（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を介して、方向性の順で組み立てられた。次に、ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）ＬＲＣＬＯＮＡＳＥ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）反応は、得られたエントリープラスミドと、最終発現ベクター、ｐＤＡＢ１１４４３８をもたらすデスティネーションベクターを用いて行われた。デスティネーションベクターは、全長のトウモロコシ（Zea mays）のユビキチン１プロモーター（Christensen et al., (1992) Plant Molecular Biology 18; 675-689）によって駆動され、トウモロコシリパーゼ３’−ＵＴＲ（米国特許第７，１７９，９０２号）によって終了されるａａｄ−１遺伝子で構成される選択マーカーカセットを含有した。得られた構築物、ｐＤＡＢ１１４４３８は、ａａｄ−１遺伝子発現カセットとｃｒｙ３４Ａｂ１遺伝子発現カセットを含有する異種発現構築物である（図３）。
【０１７６】
第２の構築物において、ｃｒｙ３４Ａｂ１（Ｂ．チューリンゲンシス（B. thurengiensis）由来のレポーター遺伝子）の発現は、全長のトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター（配列番号１）によって駆動され、修飾されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子３’−ＵＴＲ（配列番号８）によって終了された。遺伝子要素のそれぞれは、それらの隣接ＤＮＡ要素に最小１５ｂｐの重複相同性を含有するプライマーを用いて増幅された。全ての断片をゲル精製した。次に、エントリーベクターバックボーン、ｐＥＮＴＲｌ１とともに３つの断片は、ＧＥＮＥＡＲＴ（登録商標）Ｓｅａｍｌｅｓｓクローニング反応（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を介して、方向性の順で組み立てられた。次に、ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）ＬＲＣＬＯＮＡＳＥ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）反応は、得られたエントリープラスミドと、最終発現ベクター、ｐＤＡＢ１２０１６６をもたらすデスティネーションベクターを用いて行われた。デスティネーションベクターは、トウモロコシ（Zea mays）のユビキチン１プロモーター（Christensen et al., (1992) Plant Molecular Biology 18; 675-689）によって駆動され、トウモロコシリパーゼ３’−ＵＴＲ（米国特許第７，１７９，９０２号）によって終了されるａａｄ−１遺伝子で構成される選択マーカーカセットを含有した。得られた構築物、ｐＤＡＢ１２０１６６は、ａａｄ−１遺伝子発現カセットとｃｒｙ３４Ａｂ１遺伝子発現カセットを含有する異種発現構築物である（図７）。
【０１７７】
第３の構築物において、ｃｒｙ３４Ａｂ１（Ｂ．チューリンゲンシス（B. thurengiensis）由来のレポーター遺伝子）の発現は、修飾されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーターによって駆動された。配列番号５のトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子イントロンおよび５’−ＵＴＲ配列（配列番号１９）と連結された、配列番号４の修飾されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子上流プロモーターは、配列番号３の修飾されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーターをもたらした。ｃｒｙ３４Ａｂ１（Ｂ．チューリンゲンシス（B. thurengiensis）由来のレポーター遺伝子）の発現は、修飾されたウモロコシのクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター（配列番号３）によって駆動され、ソラヌム・ツベロスム（Solanum tuberosum）ＰｉｎＩＩ３’−ＵＴＲ（ＳｔＰｉｎＩＩ３’−ＵＴＲ  ｖ２；An et ah, (1989) Plant Cell 1 ; 115-22）によって終了された。遺伝子要素のそれぞれは、それらの隣接ＤＮＡ要素に最小１５ｂｐの重複相同性を含有するプライマーを用いて増幅された。全ての断片をゲル精製した。次に、エントリーベクターバックボーン、ｐＥＮＴＲｌ１とともに３つの断片は、ＧＥＮＥＡＲＴ（登録商標）Ｓｅａｍｌｅｓｓクローニング反応（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を介して、方向性の順で組み立てられた。次に、ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）ＬＲＣＬＯＮＡＳＥ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）反応は、得られたエントリープラスミドと、最終発現ベクター、ｐＤＡＢ１２０１６５をもたらすデスティネーションベクターを用いて行われた。デスティネーションベクターは、修飾されたトウモロコシ（Zea mays）のユビキチン１プロモーター（Christensen et al., (1992) Plant Molecular Biology 18; 675-689）によって駆動され、トウモロコシリパーゼ３’−ＵＴＲ（米国特許第７，１７９，９０２号）によって終了されるａａｄ−１遺伝子で構成される選択マーカーカセットを含有した。得られた構築物、ｐＤＡＢ１２０１６５は、ａａｄ−１遺伝子発現カセットとｃｒｙ３４Ａｂ１遺伝子発現カセットを含有する異種発現構築物である（図６）。
【０１７８】
ｃｒｙ３４Ａｂ１遺伝子の代わりに黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ；Shagin et al., (2004) Mol Biol Evol 21 ; 841 -50）レポーター遺伝子（図４）と、ｐＤＡＢ１１４４３８と同じａａｄ−１発現カセットを含有する陰性対照構築物ｐＤＡＢ１０１５５６を組み立てた。トウモロコシ（Zea mays）のユビキチン−１プロモーターと、ｃｒｙ３４Ａｂ１遺伝子の発現を制御するソラヌム・ツベロスム（Solanum tuberosum）プロテアーゼ阻害剤遺伝子ＩＩ３’−ＵＴＲ（ＳｔＰｉｎＩＩ３’−ＵＴＲ  ｖ２；An et al., (1989) Plant Cell 1 ; 115-22）で構成される陽性対照構築物ｐＤＡＢ１０８７４６を構築した（図５）。ａａｄ−１カセットは、ｐＤＡＢ１１４４３８に存在するものと同じであった。
【実施例５】
【０１７９】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の植物形質転換および分子立体配座形質転換
二成分発現ベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株ＤＡｔ１３１９２（ＲｅｃＡ欠損三重株）（国際特許出願公開第ＷＯ２０１２０１６２２２号）に形質転換した。細菌コロニーを選択し、二成分プラスミドＤＮＡを単離し、制限酵素消化によって確認した。
【０１８０】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）培養開始：
アグロバクテリウム（Agrobacterium）培養は、ＡＢ最小培地上にグリセロールストックを面線接種し（Gelvin, S., 2006, Agrobacterium Virulence Gene Induction, in Wang, K., ed., Agrobacterium Protocols Second Edition Vol. 1, Humana Press, p. 79；スクロース非含有、５ｇ／Ｌグルコースと１５ｇ／Ｌ  ＢＡＣＴＯ（商標）アガー含有で作製）、３日間、暗所にて２０℃でインキュベートすることによってなされた。次に、アグロバクテリウム（Agrobacterium）培養物はＹＥＰ培地のプレート上に面線接種し（Gelvin, S., 2006, Agrobacterium Virulence Gene Induction, in Wang, K., ed., Agrobacterium Protocols Second Edition Vol. 1, Humana Press, p. 79）、１日間、暗所にて２０℃でインキュベートした。
【０１８１】
実験当日、接種培地の混合物（２．２ｇ／Ｌ  ＭＳ塩、６８．４ｇ／Ｌスクロース、３６ｇ／Ｌグルコース、１１５ｍｇ／Ｌ  Ｌ−プロリン、２ｍｇ／Ｌグリシン、１００ｍｇ／Ｌミオ−イノシトール、０．０５ｍｇ／Ｌニコチン酸、０．５ｍｇ／ＬピリドキシンＨＣｌ、０．５ｍｇ／ＬチアミンＨＣｌ）およびアセトシリンゴンを実験のサイズに適した体積に調製した。１００％ジメチルスルホキシド中のアセトシリンゴンの１Ｍストック溶液を接種培地に添加し、アセトシリンゴンの最終濃度を２００μＭとした。
【０１８２】
各構築物について、ＹＥＰプレートからのアグロバクテリウム（Agrobacterium）の１〜２ループを、滅菌した使い捨ての５０ｍｌ遠心分離管内で１５ｍｌの接種培地／アセトシリンゴン混合物中に懸濁し、６００ｎｍでの溶液の光学密度（Ｏ．Ｄ．６００）を分光光度計で測定した。次に、懸濁液は、追加の接種培地／アセトシリンゴン混合物を用いて、０．２５〜０．３５のＯ．Ｄ．６００まで希釈された。続いて、アグロバクテリウム（Agrobacterium）懸濁液のチューブは、使用前の１〜４時間、室温で約７５ｒｐｍに設定されたプラットフォームシェーカー上で水平に配置された。
【０１８３】
トウモロコシ形質転換：
実験的構築物は、近交系統トウモロコシ（Zea mays）ｃ．ｖ．Ｂ１０４から単離された未熟胚のアグロバクテリウム（Agrobacterium）を媒介した形質転換を介してトウモロコシに形質転換された。使用した方法は、Ishida et al., (1996) Nature Biotechnol 14 :745-750およびFrame et al., (2006) Plant Cell Rep 25: 1024-1034によって公開された方法に類似しているが、いくつかの変更と改善を行い、ハイスループット形質転換に適した方法とした。トウモロコシにおける多数のトランスジェニック事象を生成させるために使用される方法の例は、米国特許出願公開第ＵＳ２０１３／０１５７３６９Ａ１号に与えられ、胚の感染および共培養ステップから開始する箇所である。
【０１８４】
分子立体配座：
ｃｒｙ３４Ａｂ１とａａｄ−１定量的ＰＣＲアッセイを用いて、導入遺伝子の存在についてＶ２−３葉段階で、推定トランスジェニックトウモロコシ植物をサンプリングした。総ＤＮＡは、製造業者の指示に従って、ＭＡＧＡＴＴＲＡＣＴ（登録商標）ＤＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、４つの葉のパンチから抽出された。
【０１８５】
目的とする遺伝子を検出するために、遺伝子特異的ＤＮＡ断片は、ｃｒｙ３４Ａｂｌ遺伝子についてのＦＡＭ標識蛍光プローブと、内因性インベルターゼ参照遺伝子対照についてのＨＥＸ標識蛍光プローブを含有するＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プライマー／プローブセットを用いて増幅された。以下のプライマーをｃｒｙ３４Ａｂ１とインベルターゼ内因性参照遺伝子の増幅のために使用した。プライマー配列は以下の通りである。
Ｃｒｙ３４Ａｂ１プライマー／プローブ：
フォワードプライマー：ＴＱ．８ｖ６．１．Ｆ：ＧＣＣＡＴＡＣＣＣＴＣＣＡＧＴＴＧ（配列番号１０）
リバースプライマー：ＴＱ．８ｖ６．１．Ｒ：ＧＣＣＧＴＴＧＡＴＧＧＡＧＴＡＧＴＡＧＡＴＧＧ（配列番号１１）
プローブ：ＴＱ．８ｖ６．１．ＭＧＢ．Ｐ：５’−／５６−ＦＡＭ／ＣＣＧＡＡＴＣＣＡＡＣＧＧＣＴＴＣＡ／ＭＧＢ（配列番号１２）
インベルターゼプライマー：
フォワードプライマー：インベルターゼＦ：ＴＧＧＣＧＧＡＣＧＡＣＧＡＣＴＴＧＴ（配列番号１３）
リバースプライマー：インベルターゼＲ：ＡＡＡＧＴＴＴＧＧＡＧＧＣＴＧＣＣＧＴ（配列番号１４）
インベルターゼプローブ：５’−／５ＨＥＸ／ＣＧＡＧＣＡＧＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＴ／３ＢＨＱ_１／−３’（配列番号１５）。
【０１８６】
次に、ＰＣＲ反応は、５μｌのＲｏｃｈｅ  ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０Ｐｒｏｂｅｓ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）；最終濃度を４００ｎＭにした、１０μＭストックからの各０．４μｌのＴＱ．８ｖ６．１．Ｆ、ＴＱ．８ｖ６．１．Ｒ、インベルターゼＦ、およびインベルターゼＲプライマー；最終濃度を２００ｎＭにした、５μＭストックからの各０．４μｌのＴＱ．８ｖ６．１．ＭＧＢ．Ｐおよびインベルターゼプローブ；最終濃度を０．１％にした、０．１μｌの１０％ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）；２μｌの１０ｎｇ／μｌのゲノムＤＮＡおよび０．５μｌの水を含有する最終体積１０μｌ反応物中で行われた。ＤＮＡは、Ｒｏｃｈｅ  ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０システムにおいて、以下の条件：９５℃で１０分間の１サイクル；以下の３ステップ：９５℃で１０秒間、５８℃で３５秒間および７２℃で１秒の４０サイクル；４℃で１０秒間の最終サイクルで増幅された。ｃｒｙ３４Ａｂ１コピー数は、ｃｒｙ３４Ａｂ１コピー数対照の標的／参照値に対する、未知試料（ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０によるアウトプット）についての標的（目的とする遺伝子）／参照（インベルターゼ遺伝子）の比較によって決定された。
【０１８７】
ａａｄ−１遺伝子の検出は、インベルターゼ内因性参照遺伝子を用いたｃｒｙ３４Ａｂ１遺伝子について上記されるように行われた。ａａｄ−１プライマー配列は以下の通りであった。
ＡＡＤ１フォワードプライマー：ＴＧＴＴＣＧＧＴＴＣＣＣＴＣＴＡＣＣＡＡ（配列番号１６）
ＡＡＤ１リバースプライマー：ＣＡＡＣＡＴＣＣＡＴＣＡＣＣＴＴＧＡＣＴＧＡ（配列番号１７）
ＡＡＤ１プローブ：５’−ＦＡＭ／ＣＡＣＡＧＡＡＣＣＧＴＣＧＣＴＴＣＡＧＣＡＡＣＡ−ＭＧＢ／ＢＨＱ−３’（配列番号１８）
【０１８８】
最後に、目的とする遺伝子を含むＴ０植物は、ｃｒｙ３４ＡｂｌとＡＡＤ−１葉のＥＬＩＳＡアッセイのためにＶ４−５でサンプリングされた。４つ葉のパンチをサンプリングした。別のセットの植物は、両方のタンパク質ＥＬＩＳＡアッセイのために、根の塊全体についてＶ４−５でサンプリングされた。葉および根のｃｒｙ３４Ａｂ１（Ａｇｄｉａ，Ｉｎｃ．，Ｅｌｋａｒｔ，ＩＮ）とＡＡＤ−１（Ａｃａｄｉａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）ＥＬＩＳＡアッセイは、製造業者の指示に従って行われた。ｃｒｙ３４Ａｂ１葉のＥＬＩＳＡアッセイをｎｇ／ｃｍ２または１００万分の１（ｐｐｍもしくはｎｇタンパク質／ｍｇ全植物タンパク質）として表され、根のＥＬＩＳＡ結果をｐｐｍとして表した。全体の根タンパク質アッセイは、製造業者の指示に従って、ブラッドフォード検出法を用いて行われた。
【０１８９】
Ｔ０植物をトウモロコシ（Zea mays）ｃ．ｖ．Ｂ１０４の非トランスジェニック形質転換系統と交雑して、Ｔ１種子を得た。試験調節要素構築物のそれぞれについての３つのトランスジェニック系統または事象は、Ｔ１タンパク質およびＲＮＡ遺伝子発現研究について先行し、次に、Ｔ２種子生成を行った。したがって、各事象の３０〜４０Ｔ１種子を播種した；苗は、非トランスジェニック分離個体を死滅させるために、発育のＶ２−Ｖ３段階でＡＳＳＵＲＥＩＩ（登録商標）を用いて噴霧された。トランスジェニック植物は、ｃｒｙ３４Ａｂ１およびＡＡＤ−１  ＥＬＩＳＡについて、以下のように植物の発育の複数の段階でサンプリングされた：葉（Ｖ４、Ｖ１２およびＲ３）；根（Ｖ４およびＲ１）；茎（Ｒ１）；花粉（Ｒ１）；シルク（Ｒ１）；殻（Ｒ３）；カーネル（Ｒ３）；ならびに穂軸（Ｒ３）。全ての組織を単離し、ドライアイス中に埋め込まれたチューブに入れられ、次に−８０℃に移された。凍結組織は、ＥＬＩＳＡについてのタンパク質抽出前に凍結乾燥された。
【０１９０】
ｃｒｙ３４Ａｂ１、ｙｆｐとａａｄ−１導入遺伝子を含有する推定トランスジェニックＴ１植物は、葉のＥＬＩＳＡアッセイについてＶ４−５でサンプリングされた。４つの葉のパンチをサンプリングした。葉のパンチをチューブに配置し、単一の１／８”ステンレススチール製ビーズ（Ｈｏｏｖｅｒ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｃｕｍｍｉｎｇ，ＧＡ，ＵＳＡ）を、３００μｌの抽出緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０と０．５％ＢＳＡが補足された１×ＰＢＳＴ）を含有する各１．２ｍｌのチューブに添加した。試料をＧＥＮＯＧＲＩＮＤＥＲ（商標）（ＳＰＥＸ  ＳａｍｐｌｅＰｒｅｐ，Ｍｅｔｕｃｈｅｎ，ＮＪ）において１，５００ｒｐｍで４分間処理した。試料をＳｏｒｖａｌｌ  Ｌｅｇｅｎｄ  ＸＦＲ（商標）遠心分離機で４，０００ｒｐｍにて２分間遠心分離した。次に、さらに３００μｌの抽出緩衝液を添加し、試料をさらに１回、ＧＥＮＯＧＲＩＮＤＥＲ（商標）で１，５００ｒｐｍにて２分間処理した。試料をさらに１回、４，０００ｒｐｍにて７分間遠心分離した。最後に、上清を回収し、ＥＬＩＳＡアッセイは、製造業者の指示に従って、市販のｃｒｙ３４Ａｂ１（Ａｇｄｉａ，  Ｉｎｃ）とＡＡＤ−１（Ａｃａｄｉａ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ，  ＬＬＣ）ＥＬＩＳＡアッセイキットを用いて、タンパク質標準とともに様々な希釈で完了した。様々な組織タイプのＥＬＩＳＡについてのタンパク質抽出は、ペイントシェーカー中で３０秒間、凍結乾燥させた組織を粉砕することによって行われた。さらに粉砕を必要とする組織については、粉砕ステップをさらに３０秒間繰り返した。ガーネット粉末を、チューブの底部に湾曲した部分を覆うために添加した。粗粉砕組織を２ｍｌチューブに移し、０．５ｍｌのマークまで満たした。０．６ｍｌの部分抽出緩衝液（２００μｌのプロテアーゼインヒビターカクテル、２００μｌの５００ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５．５ｍｇのＤＴＴ粉末、および２０ｍｌまでＰＢＳＴ）とした各チューブに１つのセラミックボールを添加した。全チューブを氷上で１０分間保持した。冷却したチューブをＧＥＮＯＧＲＴＮＤＥＲ（商標）の２ｍｌホルダーに移した。試料を３０秒間、２回粉砕し、その間、氷上で５分間冷却した。次に、４０μｌの１０％ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０と３００μｌの抽出緩衝液を試料に添加した。試料をさらに３０秒間粉砕し、その間、氷上で５分間冷却した。最後に、各試料を１３，０００ｒｐｍで７分間遠心分離し、上清を新しいチューブに慎重に移して、抽出物を回収した。抽出物を抽出緩衝液に再懸濁させ、ＥＬＩＳＡアッセイの葉組織に必要とされるように希釈した。
【実施例６】
【０１９１】
Ｔ０トランスジェニック植物発現
Ｃｒｙ３４Ａｂ１  ＥＬＩＳＡ結果は、全長のトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター調節要素（配列番号１と配列番号２）が、構築物ｐＤＡＢ１１４４３８で形質転換されたＴ０事象において、Ｃｒｙ３４Ａｂ１の葉の好ましい発現を駆動したことを示した。全長のトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター調節要素によるＣｒｙ３４Ａｂ１の無視できる程度の発現は、これらの事象の根組織において観察された（表１および２）。陽性対照構築物ｐＤＡＢ１０８７４６から産生された事象は、葉と根の組織の両方においてＣｒｙ３４Ａｂ１を発現した。Ｃｒｙ３４Ａｂ１遺伝子を含有しない、陰性対照構築物ｐＤＡＢ１０１５５６で形質転換された植物事象において観察または検出されたＣｒｙ３４Ａｂ１の葉発現はなかった。全ての構築物は、根と葉の組織の両方においてａａｄ−１遺伝子を発現した。
【０１９２】
さらに、修飾されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター調節要素（配列番号３と配列番号４）は、Ｔ０トランスジェニック植物においてＥＬＩＳＡによって測定した場合、葉（Ｖ４）におけるＣｒｙ３４Ａｂ１とＡＡＤ−１タンパク質発現を駆動した（表３）。ｐＤＡＢ１２０１６５で形質転換されたＴ０トランスジェニック植物は、Ｓｔ．ＰｉｎＩＩ３’−ＵＴＲと組み合わせて、修飾されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター（配列番号３と４）の発現を示し、一方、ｐＤＡＢ１２０１６６で形質転換されたＴ０トランスジェニック植物は、修飾されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子３’−ＵＴＲ（配列番号８）と組み合わせて、全長のトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター（配列番号１と２）の発現を示す。これらの結果は、この開示のプロモーター（配列番号１〜４）と３’−ＵＴＲ（配列番号７と８）配列が、ランスジェニックＴ０トウモロコシ植物事象内で遺伝子発現カセットにおいて導入遺伝子の発現の駆動に機能的であることを示す。
【０１９３】
【表１】
2017503513.tif 000015
【０１９４】
【表２】
2017503513.tif 000016
【０１９５】
【表３】
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【実施例７】
【０１９６】
Ｔ１トランスジェニック植物発現
Ｔ１トランスジェニック植物事象のＣｒｙ３４  ＥＬＩＳＡの結果は、トウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター調節要素（配列番号１）が、具体的にはＣｒｙ３４Ａｂ１の葉、茎および殻の組織において、地上の好ましい発現を駆動したことを示した。このデータは、構築物ｐＤＡＢ１１４４３８で形質転換されたＴ１事象から生じた。さらに、トウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター調節要素（配列番号１および配列番号２）によるＣｒｙ３４Ａｂ１の無視できる程度の発現は、これらの事象の根、カーネルおよび花粉の組織において観察された（表４）。興味深いことに、穂軸組織におけるＣｒｙ３４Ａｂ１の発現は、分析された事象のシルク組織におけるＣｒｙ３４Ａｂ１の発現よりも１０倍低い発現を示した。陰性対照構築物ｐＤＡＢ１０１５５６で形質転換された植物事象において観察または検出されたＣｒｙ３４Ａｂ１の葉発現はなかった。この構築物ｐＤＡＢ１０１５５６は、ｃｒｙ３４Ａｂｌ導入遺伝子を含まない。全ての構築物は、根と葉の組織の両方においてａａｄ−１遺伝子を発現した。
【０１９７】
【表４】
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【０１９８】
葉（Ｖ４）のＴ１  Ｃｒｙ３４Ａｂ１のＥＬＩＳＡ結果は、Ｃｒｙ３４ａｂ１遺伝子について調節要素として異なる３’−ＵＴＲを有する全長のトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター（配列番号１および２）を含有するｐＤＡＢ１２０１６６とｐＤＡＢ１１４４３８トランスジェニック事象と類似した発現範囲を示した。前者の構築物ｐＤＡＢ１２０１６６は、修飾されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子３’−ＵＴＲ（配列番号８）を含有し、該プロモーターと同じ遺伝子から誘導され、一方、後者の構築物ｐＤＡＢ１１４４３８は、Ｓｔ  ＰｉｎＩＩ３’−ＵＴＲを含有した。Ｔ１葉（Ｖ４）Ｃｒｙ３４Ａｂ１（表５）。さらに葉（Ｖ４）組織のＴ１  Ｃｒｙ３４Ａｂ１  ＥＬＩＳＡ結果には、ｃｒｙ３４ａｂ１遺伝子のための調節要素としてＳｔ  ＰｉｎＩＩ３’−ＵＴＲとともに、修飾された長さのトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター（配列番号３と４）を含有するｐＤＡＢ１２０１６５トランスジェニック事象も含まれた。ｐＤＡＢ１２０１６５トランスジェニック事象のＥＬＩＳＡ結果は、全長のトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター（配列番号１と２）を含有するｐＤＡＢ１２０１６６またはｐＤＡＢ１１４４３８のいずれかと比較して、約５０％〜６０％未満の発現を示した。構築物ｐＤＡＢ１２０１６５は、修飾されたプロモーター（配列番号３と４）およびＰｉｎＩＩ３’−ＵＴＲを含有した。これらの結果は、本開示のプロモーター（配列番号１〜４）と３’−ＵＴＲ（配列番号７と８）配列が、トランスジェニックＴ１トウモロコシ植物事象内の遺伝子発現カセットにおいて導入遺伝子の発現の駆動に機能的であることを示す。
【０１９９】
【表５】
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【０２００】
このようにして、新規なトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子調節要素が同定および特徴付けられ、以下を含む：配列番号１と配列番号２の全長のトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター；配列番号３と配列番号４の修飾されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子プロモーター；配列番号５のトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子イントロン；配列番号１９のトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子５’−ＵＴＲ；配列番号１９のトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子５’−ＵＴＲ；配列番号７の全長のトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子３’−ＵＴＲ；および配列番号８の修飾されたトウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ結合遺伝子３’−ＵＴＲ。遺伝子発現構築物において使用するための新規なプロモーター調節要素が初めて開示される。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３】
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【図４】
2017503513.tif 000026
【図５】
2017503513.tif 000027
【図６】
2017503513.tif 000028
【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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