(57)【要約】担体と、より少ないアイソフォームおよび増強された生物安定性を有する組換え血小板由来増殖因子との新規組合せを含む組成物を含む、創傷を処置し、その治癒を促進するための新規組成物が記載される。最小数の処置適用で有効な結果をもたらす投薬手順を使用して新規治療組成物で創傷を処置する方法もまた、記載される。一部の実施形態では、この創傷は、皮下組織中にもしくはそれを超えて拡張し得、またはこの創傷は、糖尿病性足部潰瘍であり得る。
2017532346.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
無菌ｒｈＰＤＧＦと無菌多孔性マトリックスとを含む治療組成物であって、
（ａ）前記ｒｈＰＤＧＦの少なくとも８０％が非切断型ｒｈＰＤＧＦであり、
（ｂ）前記マトリックスと合わせる前に、前記ｒｈＰＤＧＦが、少なくとも約６カ月間にわたって１６〜３２℃で貯蔵されたときにその生物活性の少なくとも８０％を保持することが可能であるように、前記ｒｈＰＤＧＦが生体安定性であり、
（ｃ）前記マトリックスが、細胞付着および孔中への内殖を可能にする孔を含む、
治療組成物。
【請求項２】
前記無菌ｒｈＰＤＧＦが、約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの間のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを有するｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液を含む、請求項１に記載の治療組成物。
【請求項３】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液対前記マトリックスの比が、約４μｌ／ｃｍ３〜約４，０００μｌ／ｃｍ３の間である、またはｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ対前記マトリックスの比が、１ｃｍ３のマトリックス当たり約１．２μｇのＰＤＧＦと１ｃｍ３のマトリックス当たり約１２ｍｇのＰＤＧＦとの間である、請求項２に記載の治療組成物。
【請求項４】
凍結乾燥ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含有する無菌ｒｈＰＤＧＦ粉末から形成され、重量基準で前記凍結乾燥ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの少なくとも約８０％が非切断型凍結乾燥ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢである、請求項１に記載の治療組成物。
【請求項５】
前記ｒｈＰＤＧＦ粉末を無菌の水、生理食塩水、緩衝液または生理的溶液と合わせることによって、前記凍結乾燥ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを再構成することによって形成される、請求項３に記載の治療組成物。
【請求項６】
（１）約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの間のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含むｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液であって、
ａ）凍結乾燥ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含有する無菌粉末であって、重量基準で前記凍結乾燥ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの少なくとも約８０％が非切断型凍結乾燥ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢであり、前記粉末が、約１６℃と約３２℃との間で貯蔵されることが可能であり、少なくとも約１年間にわたって前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの少なくとも８０％の生物活性をなおも維持する、無菌粉末、および
ｂ）無菌の水、生理食塩水、緩衝液または生理的溶液
を合わせ、それにより前記非切断型凍結乾燥ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを溶液へと再構成することによって形成されるｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液；ならびに
（２）生体適合性の吸収性担体
を含み、前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液対前記担体の比が、約４μｌ／ｃｍ３〜約４，０００μｌ／ｃｍ３の間である、またはｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ対前記担体の比が、１ｃｍ３の担体当たり約１．２μｇのＰＤＧＦと１ｃｍ３の担体当たり約１２ｍｇのＰＤＧＦとの間である、治療組成物。
【請求項７】
前記担体が、細胞付着および孔中への内殖を可能にする孔を有するマトリックスを含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記マトリックスが、天然ポリマー、合成ポリマーまたはそれらの組合せである、請求項１または７に記載の組成物。
【請求項９】
前記マトリックスが、コラーゲン、ゼラチン、フィブリン、アルギネート、セルロース、キトサンおよびフィブロネクチンからなる群から選択される天然ポリマーである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記マトリックスが、ポリ（ＤＬ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（ＤＬ−ラクチド）（ＰＤＬＡ）、ポリ（Ｌ−ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（ｅ−カプロラクトン）（ＰＣＬ）およびポリウレタンからなる群から選択される合成ポリマーである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
前記マトリックスが、コラーゲンスポンジまたはコラーゲン創傷包帯である、請求項１または７に記載の組成物。
【請求項１２】
前記マトリックスが、約５０μｍ〜約１ｍｍの間の範囲の孔径を有する多孔性細胞足場を提供する、請求項１または７に記載の組成物。
【請求項１３】
前記マトリックスが、約５０ミクロン〜約５００ミクロンの間の平均孔径を有する多孔性細胞足場を提供する、請求項１または７に記載の組成物。
【請求項１４】
前記マトリックスが、約１００ミクロン〜約３００ミクロンの間の平均孔径を有する多孔性細胞足場を提供する、請求項１または７に記載の組成物。
【請求項１５】
前記マトリックスの孔の大部分が相互接続されている、請求項１２、１３または１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液が、予め製剤化された無菌性ＰＤＧＦ溶液である、請求項２または６に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液が、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌの間のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含む、請求項２または６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液が、約０．２ｍｇ／ｍｌ〜約０．４ｍｇ／ｍｌの間のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含む、請求項２または６に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液が、約０．３ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含む、請求項２または６に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液が、約０．５ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含む、請求項２または６に記載の組成物。
【請求項２１】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液が、約１．０ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含む、請求項２または６に記載の組成物。
【請求項２２】
重量基準で前記凍結乾燥ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの少なくとも約８５％が、非切断型凍結乾燥ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢである、請求項４または６に記載の組成物。
【請求項２３】
重量基準で前記凍結乾燥ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの少なくとも約９０％が、非切断型凍結乾燥ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢである、請求項４または６に記載の組成物。
【請求項２４】
重量基準で前記凍結乾燥ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの少なくとも約９５％が、非切断型凍結乾燥ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢである、請求項４または６に記載の組成物。
【請求項２５】
重量基準で前記凍結乾燥ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの少なくとも約９７％が非切断型凍結乾燥ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢである、請求項４または６に記載の組成物。
【請求項２６】
前記治療組成物中に含まれる前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢが、配列番号１に対して少なくとも約９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、少なくとも約９０％のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含む、請求項１または６に記載の組成物。
【請求項２７】
前記治療組成物中に含まれる前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢが、配列番号１に対して少なくとも約９０％の相同性を有するアミノ酸配列から本質的になる、少なくとも約８０％のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢから本質的になる、請求項１または６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液対前記マトリックスまたは担体の比が、約０．１ｍｌ／ｃｍ３〜約３０ｍｌ／ｃｍ３の間である、請求項３または６に記載の組成物。
【請求項２９】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液対前記マトリックスまたは担体の比が、約０．２ｍｌ／ｃｍ３〜約２０ｍｌ／ｃｍ３の間である、請求項３または６に記載の組成物。
【請求項３０】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液対前記マトリックスまたは担体の比が、約０．１ｍｌ／ｃｍ３〜約１０ｍｌ／ｃｍ３の間である、請求項３または６に記載の組成物。
【請求項３１】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液対前記マトリックスまたは担体の比が、約０．２５ｍｌ／ｃｍ３〜約１０ｍｌ／ｃｍ３の間である、請求項３または６に記載の組成物。
【請求項３２】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液対前記マトリックスまたは担体の比が、約０．２５ｍｌ／ｃｍ３〜約５ｍｌ／ｃｍ３の間である、請求項３または６に記載の組成物。
【請求項３３】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液対前記マトリックスまたは担体の比が、約０．２５ｍｌ／ｃｍ３〜約２．５ｍｌ／ｃｍ３の間である、請求項３または６に記載の組成物。
【請求項３４】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液対前記マトリックスまたは担体の比が、約０．１ｍｌ／ｃｍ３〜約１ｍｌ／ｃｍ３の間である、請求項３または６に記載の組成物。
【請求項３５】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液対前記マトリックス担体の比が、約０．５ｍｌ／ｃｍ３〜約１．５ｍｌ／ｃｍ３の間である、請求項３または６に記載の組成物。
【請求項３６】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ対前記マトリックスまたは担体の比が、約３０μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ３〜約９ｍｇのＰＤＧＦ／ｃｍ３の間である、請求項３または６に記載の組成物。
【請求項３７】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ対前記マトリックスまたは担体の比が、約６０μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ３〜約６ｍｇのＰＤＧＦ／ｃｍ３の間である、請求項３または６に記載の組成物。
【請求項３８】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ対前記マトリックスまたは担体の比が、約７５μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ３〜約３ｍｇのＰＤＧＦ／ｃｍ３の間である、請求項３または６に記載の組成物。
【請求項３９】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ対前記マトリックスまたは担体の比が、約７５μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ３〜約１．５ｍｇのＰＤＧＦ／ｃｍ３の間である、請求項３または６に記載の組成物。
【請求項４０】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ対前記マトリックスまたは担体の比が、約７５μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ３〜約７５０μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ３の間である、請求項３または６に記載の組成物。
【請求項４１】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ対前記マトリックスまたは担体の比が、約１２０μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ３〜約６００μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ３の間である、請求項３または６に記載の組成物。
【請求項４２】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ対前記マトリックスまたは担体の比が、約１５０μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ３〜約４５０μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ３の間である、請求項３または６に記載の組成物。
【請求項４３】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ対前記マトリックスまたは担体の比が、１ｃｍ３の担体当たり約７５μｇのＰＤＧＦと１ｃｍ３の担体当たり約２２５μｇのＰＤＧＦとの間である、請求項３または６に記載の組成物。
【請求項４４】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液および前記マトリックスが合わされる場合、前記マトリックスが、前記マトリックスの孔内に前記再構成された非切断型ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの少なくとも約２０％を捕捉することが可能であり、その結果、前記組成物が患者の創傷に適用される場合に、前記患者の身体によって前記マトリックスが吸収されるにつれて前記再構成された非切断型ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢが経時的に放出され、それによって、前記創傷部位におけるｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの遅延または延長された送達を提供し、同時に、新たな細胞および組織内殖のための多孔性マトリックスを提供する、請求項５または７に記載の組成物。
【請求項４５】
Ｅ．ｃｏｌｉ発現系を介して産生されたｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含む、請求項１または６に記載の組成物。
【請求項４６】
ｒｈＰＤＧＦとマトリックスとを含有する凍結乾燥組成物を含む乾燥デバイスを含む治療組成物であって、前記マトリックスは、細胞付着および孔中への内殖を可能にする孔を含み、前記ｒｈＰＤＧＦの少なくとも８０％が非切断型ｒｈＰＤＧＦであり、前記乾燥デバイス中に含有される前記ｒｈＰＤＧＦが、少なくとも約６カ月間にわたって１６〜３２℃で貯蔵されたときにその生物活性の少なくとも８０％を保持することが可能であるように、前記乾燥デバイスが生体安定性である、治療組成物。
【請求項４７】
創傷を処置する方法であって、
（１）前記創傷を清拭するステップ；
（２）請求項１、６または４６に記載の組成物を、前記創傷を清拭するステップの４８時間以内に、前記創傷に適用するステップ；および
（３）任意選択で、前記創傷の重症度に応じて３〜４２日毎に１回前記組成物を再適用するステップ
を含み、
各適用によって、前記組成物が、１ｃｍ２の創傷表面積当たり、約１０μｇと１０００μｇとの間のｒｈＰＤＧＦを前記創傷に送達する、方法。
【請求項４８】
創傷を処置する方法であって、
（１）前記創傷を清拭して、壊死組織または感染組織を除去するステップ；
（２）無菌ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢと無菌多孔性生体適合性担体とを含む治療組成物を形成するステップ；
（３）前記治療組成物を前記創傷表面に適用するステップであって、前記担体が、前記創傷が治癒する際の細胞付着および脈管内殖のための基材を提供する、ステップ；
（４）前記創傷を包帯で覆うステップ；ならびに
（５）処置期間の間、前記創傷の前記治癒をモニタリングし、３日間またはそれ超の処置間隔でステップ（１）〜（４）を反復して、前記創傷を再処置するステップ
を含む方法。
【請求項４９】
前記処置間隔が、３〜４２日毎に１回であり、前記処置期間が、約２〜約２０週間である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
最初の処置間隔で適用される前記治療組成物が、１ｃｍ２の創傷表面積当たり少なくとも約１０μｇのｒｈＰＤＧＦを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
創傷を処置する方法であって、
（１）前記創傷を清拭するステップ；
（２）ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含有する治療組成物を、３〜４２日毎に約１回の処置間隔で、約２〜約２０週間の処置期間にわたって前記創傷に適用するステップであって、最初の処置間隔で適用される前記治療組成物が、１ｃｍ２の創傷表面積当たり少なくとも約１０μｇのｒｈＰＤＧＦを含む、ステップ；
（３）前記治療組成物の各適用後に、前記創傷を包帯で覆うステップ；および
（４）前記創傷に圧力を適用することを回避するように患者にアドバイスするステップ
を含む方法。
【請求項５２】
前記治療組成物が、無菌生体適合性担体をさらに含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含有する溶液を前記担体と合わせることによって前記治療組成物を形成するステップをさらに含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記担体が多孔性生体吸収性創傷包帯であり、前記治療組成物を形成する前記ステップおよび前記治療組成物を前記創傷に適用する前記ステップが、前記創傷上で直接前記治療組成物を形成することによって同時に実施される、請求項４８または５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記治療組成物が、
（１）前記多孔性生体吸収性創傷包帯を前記創傷に適用し、次いで、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液を前記包帯に適用すること；または
（２）ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液を前記創傷に適用し、次いで、包帯を前記創傷に適用すること
のいずれかによって形成される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢが、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含有する凍結乾燥無菌粉末を、無菌の水、生理食塩水、緩衝液または生理的溶液で再構成することによって形成される無菌ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液を含む、請求項４８または５２に記載の方法。
【請求項５７】
前記治療組成物が、前記担体が前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液で湿らされる形で、前記無菌ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液を前記担体に無菌的に添加することによって形成される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記処置期間の間に前記創傷に適用されるｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの累積総量が、０ｍｇ超であるが約５０ｍｇ未満のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢである、請求項４８または５１に記載の方法。
【請求項５９】
前記処置期間の間に前記創傷に適用されるｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの累積総量が、０ｍｇ超であるが約２５ｍｇ未満のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢである、請求項４８または５１に記載の方法。
【請求項６０】
前記処置期間の間に前記創傷に適用されるｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの累積総量が、０ｍｇ超であるが約１０ｍｇ未満のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢである、請求項４８または５１に記載の方法。
【請求項６１】
前記処置期間の間に前記創傷に適用されるｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの累積総量が、０ｍｇ超であるが約５ｍｇ未満のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢである、請求項４８または５１に記載の方法。
【請求項６２】
各処置間隔のための時間の長さが、実質的に同じである、請求項４８または５１に記載の方法。
【請求項６３】
一部の処置間隔のための時間の長さが変動する、請求項４８または５１に記載の方法。
【請求項６４】
前記処置間隔が、３〜２８日毎に１回である、請求項４８または５１に記載の方法。
【請求項６５】
前記処置間隔が、４〜２１日毎に１回である、請求項４８または５１に記載の方法。
【請求項６６】
前記処置間隔が、７〜２１日毎に１回である、請求項４８または５１に記載の方法。
【請求項６７】
前記処置間隔が、７〜１４日毎に１回である、請求項４８または５１に記載の方法。
【請求項６８】
前記創傷が、０回と４６回との間の回数、再処置される、請求項４８または５１に記載の方法。
【請求項６９】
前記創傷が、１回と４６回との間の回数、再処置される、請求項４８または５１に記載の方法。
【請求項７０】
前記創傷が、０回と２０回との間の回数、再処置される、請求項４８または５１に記載の方法。
【請求項７１】
前記創傷が、１回と２０回との間の回数、再処置される、請求項４８または５１に記載の方法。
【請求項７２】
各処置間隔で適用される前記治療組成物が、１ｃｍ２の創傷表面積当たり少なくとも約１０μｇのｒｈＰＤＧＦを含む、請求項４８または５１に記載の方法。
【請求項７３】
各処置間隔で適用される前記治療組成物が、１ｃｍ２の創傷表面積当たり少なくとも約２５μｇのｒｈＰＤＧＦを含む、請求項４８または５１に記載の方法。
【請求項７４】
各処置間隔で適用される前記治療組成物が、１ｃｍ２の創傷表面積当たり少なくとも約５０μｇのｒｈＰＤＧＦを含む、請求項４８または５１に記載の方法。
【請求項７５】
各処置間隔で適用される前記治療組成物が、１ｃｍ２の創傷表面積当たり少なくとも約１００μｇのｒｈＰＤＧＦを含む、請求項４８または５１に記載の方法。
【請求項７６】
各処置間隔で適用される前記治療組成物が、１ｃｍ２の創傷表面積当たり少なくとも約２５０μｇのｒｈＰＤＧＦを含む、請求項４８または５１に記載の方法。
【請求項７７】
各処置間隔で適用される前記治療組成物が、１ｃｍ２の創傷表面積当たり少なくとも約５００μｇのｒｈＰＤＧＦを含む、請求項４８または５１に記載の方法。
【請求項７８】
各処置間隔で適用される前記治療組成物が、１ｃｍ２の創傷表面積当たり約１０μｇのｒｈＰＤＧＦと１ｃｍ２の創傷表面積当たり約５００μｇのｒｈＰＤＧＦとの間のｒｈＰＤＧＦを含む、請求項４８または５１に記載の方法。
【請求項７９】
各処置間隔で適用される前記治療組成物が、１ｃｍ２の創傷表面積当たり約１０μｇのｒｈＰＤＧＦと１ｃｍ２の創傷表面積当たり約１００μｇのｒｈＰＤＧＦとの間のｒｈＰＤＧＦを含む、請求項４８または５１に記載の方法。
【請求項８０】
各処置間隔で適用される前記治療組成物が、１ｃｍ２の創傷表面積当たり約１５μｇのｒｈＰＤＧＦと１ｃｍ２の創傷表面積当たり約３７５μｇのｒｈＰＤＧＦとの間のｒｈＰＤＧＦを含む、請求項４８または５１に記載の方法。
【請求項８１】
各処置間隔で適用される前記治療組成物が、１ｃｍ２の創傷表面積当たり約３０μｇのｒｈＰＤＧＦと１ｃｍ２の創傷表面積当たり約１９０μｇのｒｈＰＤＧＦとの間のｒｈＰＤＧＦを含む、請求項４８または５１に記載の方法。
【請求項８２】
各処置間隔で適用される前記治療組成物が、１ｃｍ２の創傷表面積当たり約３０μｇのｒｈＰＤＧＦと１ｃｍ２の創傷表面積当たり約３００μｇのｒｈＰＤＧＦとの間のｒｈＰＤＧＦを含む、請求項４８または５１に記載の方法。
【請求項８３】
前記包帯が、半密封包帯または密封包帯である、請求項４８または５１に記載の方法。
【請求項８４】
各処置間隔の間に、前記包帯が交換され、前記創傷を包帯で覆うステップの前に、前記創傷が生理食塩水または適切な消毒性創傷浄化剤および／もしくは清拭化化学薬剤で浄化される、請求項４８または５１に記載の方法。
【請求項８５】
前記治療組成物が、
（１）約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの間のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含むｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液であって、
ａ）凍結乾燥ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含有する無菌粉末であって、重量基準で前記凍結乾燥ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの少なくとも約８０％が非切断型凍結乾燥ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢであり、前記粉末が、約１６℃と約３２℃との間で貯蔵されることが可能であり、少なくとも約１年間にわたって前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの少なくとも８０％の生物活性をなおも維持する、無菌粉末、および
ｂ）無菌の水、生理食塩水、緩衝液または生理的溶液
を合わせ、それにより前記非切断型凍結乾燥ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを溶液へと再構成することによって形成されるｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液；ならびに
（２）生体適合性の吸収性担体
を含み、前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液対前記担体の比が、１ｃｍ３の担体当たり約４μｌと１ｃｍ３の担体当たり約４，０００μｌとの間である、またはｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ対前記担体の比が、１ｃｍ３の担体当たり約１．２μｇのＰＤＧＦと１ｃｍ３の担体当たり約１２ｍｇのＰＤＧＦとの間である、請求項４８または５１に記載の方法。
【請求項８６】
前記担体が、天然ポリマー、合成ポリマーまたはそれらの組合せである、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記担体が、コラーゲン、ゼラチン、フィブリン、アルギネート、セルロース、キトサンおよびフィブロネクチンからなる群から選択される天然ポリマーである、請求項８５に記載の方法。
【請求項８８】
前記担体が、ポリ（ＤＬ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（ＤＬ−ラクチド）（ＰＤＬＡ）、ポリ（Ｌ−ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（ｅ−カプロラクトン）（ＰＣＬ）およびポリウレタンからなる群から選択される合成ポリマーである、請求項８５に記載の方法。
【請求項８９】
前記担体が、コラーゲンスポンジまたはコラーゲン創傷包帯である、請求項８５に記載の方法。
【請求項９０】
前記担体が、約５０μｍ〜約１ｍｍの間の範囲の孔径を有する多孔性細胞足場を提供する、請求項８５に記載の方法。
【請求項９１】
前記担体が、約５０ミクロン〜約５００ミクロンの間の平均孔径を有する多孔性細胞足場を提供する、請求項８５に記載の方法。
【請求項９２】
前記担体が、約１００ミクロン〜約３００ミクロンの間の平均孔径を有する多孔性細胞足場を提供する、請求項８５に記載の方法。
【請求項９３】
前記担体の孔の大部分が相互接続されている、請求項９０、９１または９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液が、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌの間のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項９５】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液が、約０．２ｍｇ／ｍｌ〜約０．４ｍｇ／ｍｌの間のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項９６】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液が、約０．３ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項９７】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液が、約０．５ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項９８】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液が、約１．０ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項９９】
重量基準で前記凍結乾燥ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの少なくとも約８５％が、非切断型凍結乾燥ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢである、請求項８５に記載の方法。
【請求項１００】
重量基準で前記凍結乾燥ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの少なくとも約９０％が、非切断型凍結乾燥ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢである、請求項８５に記載の方法。
【請求項１０１】
重量基準で前記凍結乾燥ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの少なくとも約９５％が、非切断型凍結乾燥ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢである、請求項８５に記載の方法。
【請求項１０２】
重量基準で前記凍結乾燥ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの少なくとも約９７％が非切断型凍結乾燥ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢである、請求項８５に記載の方法。
【請求項１０３】
前記治療組成物中に含まれる前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢが、配列番号１に対して少なくとも約９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、少なくとも約９０％のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項１０４】
前記治療組成物中に含まれる前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢが、配列番号１に対して少なくとも約９０％の相同性を有するアミノ酸配列から本質的になる、少なくとも約８０％のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢから本質的になる、請求項８５に記載の方法。
【請求項１０５】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液対前記担体の比が、約０．１ｍｌ／ｃｍ３〜約３０ｍｌ／ｃｍ３の間である、請求項８５に記載の方法。
【請求項１０６】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液対前記担体の比が、約０．２ｍｌ／ｃｍ３〜約２０ｍｌ／ｃｍ３の間である、請求項８５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液対前記担体の比が、約０．１ｍｌ／ｃｍ３〜約１０ｍｌ／ｃｍ３の間である、請求項８５に記載の方法。
【請求項１０８】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液対前記担体の比が、約０．２５ｍｌ／ｃｍ３〜約５ｍｌ／ｃｍ３の間である、請求項８５に記載の方法。
【請求項１０９】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液対前記担体の比が、約０．２５ｍｌ／ｃｍ３〜約２．５ｍｌ／ｃｍ３の間である、請求項８５に記載の方法。
【請求項１１０】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液対前記担体の比が、約０．１ｍｌ／ｃｍ３〜約１ｍｌ／ｃｍ３の間である、請求項８５に記載の方法。
【請求項１１１】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液対前記担体の比が、約０．５ｍｌ／ｃｍ３〜約１．５ｍｌ／ｃｍ３の間である、請求項８５に記載の方法。
【請求項１１２】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ対前記担体の比が、約３０μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ３〜約９ｍｇのＰＤＧＦ／ｃｍ３の間である、請求項８５に記載の方法。
【請求項１１３】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ対前記担体の比が、約６０μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ３〜約６ｍｇのＰＤＧＦ／ｃｍ３の間である、請求項８５に記載の方法。
【請求項１１４】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ対前記担体の比が、約７５μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ３〜約３ｍｇのＰＤＧＦ／ｃｍ３の間である、請求項８５に記載の方法。
【請求項１１５】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ対前記担体の比が、約７５μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ３〜約１．５ｍｇのＰＤＧＦ／ｃｍ３の間である、請求項８５に記載の方法。
【請求項１１６】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ対前記担体の比が、約７５μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ３〜約７５０μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ３の間である、請求項８５に記載の方法。
【請求項１１７】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ対前記担体の比が、約１２０μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ３〜約６００μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ３の間である、請求項８５に記載の方法。
【請求項１１８】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ対前記担体の比が、約１５０μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ３〜約４５０μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ３の間である、請求項８５に記載の方法。
【請求項１１９】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ対前記担体の比が、１ｃｍ３の担体当たり約７５μｇのＰＤＧＦと１ｃｍ３の担体当たり約２２５μｇのＰＤＧＦとの間である、請求項８５に記載の方法。
【請求項１２０】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液および前記担体が合わされる場合、前記担体が、前記担体の孔内に前記再構成された非切断型ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの少なくとも約２０％を捕捉することが可能であり、その結果、前記組成物が患者の創傷に適用される場合に、前記患者の身体によって前記担体が吸収されるにつれて前記再構成された非切断型ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢが経時的に放出され、それによって、前記創傷部位におけるｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの遅延または延長された送達を提供し、同時に、新たな細胞および組織内殖のための多孔性担体を提供する、請求項８５に記載の方法。
【請求項１２１】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢが、Ｅ．ｃｏｌｉ発現系を介して産生されたｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項１２２】
前記創傷が、慢性または急性創傷である、任意の請求項に記載の方法。
【請求項１２３】
前記創傷が糖尿病性足部潰瘍である、任意の請求項に記載の方法。
【請求項１２４】
前記創傷が、静脈うっ血性潰瘍、褥瘡、熱傷または大きい外科的創傷、例えば、腹壁形成術もしくは外科的組織フラップである、任意の請求項に記載の方法。
【請求項１２５】
前記患者を感染制御の形態で処置するステップをさらに含む、任意の請求項に記載の方法。
【請求項１２６】
前記患者を陰圧創傷治療の形態で処置するステップをさらに含む、任意の請求項に記載の方法。
【請求項１２７】
壊死組織または感染組織が除去された創傷を処置するために、創傷包帯と組み合わせた、３日間またはそれ超の処置間隔での処置期間にわたる複数回の適用において使用するための、無菌ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢと無菌多孔性生体適合性担体とを含む治療組成物であって、前記創傷が治癒する際の細胞付着および脈管内殖のための基材を提供することにおける使用のためのものである治療組成物。
【請求項１２８】
３〜４２日毎に１回の処置間隔での約２〜約２０週間の処置期間にわたる複数回の適用における使用のための、請求項４８に記載の組成物。
【請求項１２９】
初期処置における、１ｃｍ２の創傷表面積当たり少なくとも約１０μｇのｒｈＰＤＧＦの投薬量での使用のための、請求項４８に記載の組成物。
【請求項１３０】
清拭された創傷を処置するために、創傷包帯と組み合わせて使用するための、無菌ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含む治療組成物であって、３〜４２日毎に約１回、約２〜約２０週間の処置期間にわたる複数回の適用における使用のためのものであり、初期処置における、１ｃｍ２の創傷表面積当たり少なくとも約１０μｇのｒｈＰＤＧＦの投薬量での使用のためのものである治療組成物。
【請求項１３１】
前記治療組成物が、無菌生体適合性担体をさらに含む、請求項５１に記載の組成物。
【請求項１３２】
前記治療組成物が、前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含有する溶液を前記担体と合わせることによって形成される、請求項５２に記載の組成物。
【請求項１３３】
前記担体が、多孔性生体吸収性創傷マトリックスである、請求項４８または５３に記載の組成物。
【請求項１３４】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢが、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含有する凍結乾燥無菌粉末を、無菌の水、生理食塩水、緩衝液または生理的溶液で再構成することによって形成される無菌ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液を含む、請求項４８または５２に記載の組成物。
【請求項１３５】
前記治療組成物が、前記担体が前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液で湿らされる形で、前記無菌ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液を前記担体に無菌的に添加することによって形成される、請求項５６に記載の組成物。
【請求項１３６】
０ｍｇ超であるが約５０ｍｇ未満のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの累積総量を、前記処置期間の間に前記創傷に適用することにおける使用のための、請求項４８または５１に記載の組成物。
【請求項１３７】
０ｍｇ超であるが約２５ｍｇ未満のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの累積総量を、前記処置期間の間に前記創傷に適用することにおける使用のための、請求項４８または５１に記載の組成物。
【請求項１３８】
０ｍｇ超であるが約１０ｍｇ未満のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの累積総量を、前記処置期間の間に前記創傷に適用することにおける使用のための、請求項４８または５１に記載の組成物。
【請求項１３９】
０ｍｇ超であるが約５ｍｇ未満のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの累積総量を、前記処置期間の間に前記創傷に適用することにおける使用のための、請求項４８または５１に記載の組成物。
【請求項１４０】
各処置間隔のための時間の長さが、実質的に同じである、請求項４８または５１に記載の組成物。
【請求項１４１】
一部の処置間隔のための時間の長さが変動する、請求項４８または５１に記載の組成物。
【請求項１４２】
前記処置間隔が、３〜２８日毎に１回である、請求項４８または５１に記載の組成物。
【請求項１４３】
前記処置間隔が、４〜２１日毎に１回である、請求項４８または５１に記載の組成物。
【請求項１４４】
前記処置間隔が、７〜２１日毎に１回である、請求項４８または５１に記載の組成物。
【請求項１４５】
前記処置間隔が、７〜１４日毎に１回である、請求項４８または５１に記載の組成物。
【請求項１４６】
各処置における、１ｃｍ２の創傷表面積当たり少なくとも約１０μｇのｒｈＰＤＧＦの投薬量での使用のための、請求項４８または５１に記載の組成物。
【請求項１４７】
各処置における、１ｃｍ２の創傷表面積当たり少なくとも約２５μｇのｒｈＰＤＧＦの投薬量での使用のための、請求項４８または５１に記載の組成物。
【請求項１４８】
各処置における、１ｃｍ２の創傷表面積当たり少なくとも約５０μｇのｒｈＰＤＧＦの投薬量での使用のための、請求項４８または５１に記載の組成物。
【請求項１４９】
各処置における、１ｃｍ２の創傷表面積当たり少なくとも約１００μｇのｒｈＰＤＧＦの投薬量での使用のための、請求項４８または５１に記載の組成物。
【請求項１５０】
各処置における、１ｃｍ２の創傷表面積当たり少なくとも約２５０μｇのｒｈＰＤＧＦの投薬量での使用のための、請求項４８または５１に記載の組成物。
【請求項１５１】
各処置における、１ｃｍ２の創傷表面積当たり少なくとも約５００μｇのｒｈＰＤＧＦの投薬量での使用のための、請求項４８または５１に記載の組成物。
【請求項１５２】
各処置における、１ｃｍ２の創傷表面積当たり約１０μｇのｒｈＰＤＧＦと１ｃｍ２の創傷表面積当たり約５００μｇのｒｈＰＤＧＦとの間の投薬量での使用のための、請求項４８または５１に記載の組成物。
【請求項１５３】
各処置における、１ｃｍ２の創傷表面積当たり約１０μｇのｒｈＰＤＧＦと１ｃｍ２の創傷表面積当たり約１００μｇのｒｈＰＤＧＦとの間の投薬量での使用のための、請求項４８または５１に記載の組成物。
【請求項１５４】
各処置における、１ｃｍ２の創傷表面積当たり約１５μｇのｒｈＰＤＧＦと１ｃｍ２の創傷表面積当たり約３７５μｇのｒｈＰＤＧＦとの間の投薬量での使用のための、請求項４８または５１に記載の組成物。
【請求項１５５】
各処置における、１ｃｍ２の創傷表面積当たり約３０μｇのｒｈＰＤＧＦと１ｃｍ２の創傷表面積当たり約１９０μｇのｒｈＰＤＧＦとの間の投薬量での使用のための、請求項４８または５１に記載の組成物。
【請求項１５６】
各処置における、１ｃｍ２の創傷表面積当たり約３０μｇのｒｈＰＤＧＦと１ｃｍ２の創傷表面積当たり約３００μｇのｒｈＰＤＧＦとの間の投薬量での使用のための、請求項４８または５１に記載の組成物。
【請求項１５７】
前記包帯が、半密封包帯または密封包帯である、請求項４８または５１に記載の組成物。
【請求項１５８】
（３）約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの間のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含むｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液であって、
ａ）凍結乾燥ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含有する無菌粉末であって、重量基準で前記凍結乾燥ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの少なくとも約８０％が非切断型凍結乾燥ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢであり、前記粉末が、約１６℃と約３２℃との間で貯蔵されることが可能であり、少なくとも約１年間にわたって前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの少なくとも８０％の生物活性をなおも維持する、無菌粉末、および
ｂ）無菌の水、生理食塩水、緩衝液または生理的溶液
を合わせ、それにより前記非切断型凍結乾燥ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを溶液へと再構成することによって形成されるｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液；ならびに
（４）生体適合性の吸収性担体
をさらに含み、前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液対前記担体の比が、１ｃｍ３の担体当たり約４μｌと１ｃｍ３の担体当たり約４０ｍｌとの間である、またはｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ対前記担体の比が、１ｃｍ３の担体当たり約１．２μｇのＰＤＧＦと１ｃｍ３の担体当たり約１２ｍｇのＰＤＧＦとの間である、またはｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ対前記担体の比が、１ｃｍ３の担体当たり約１．２μｇのＰＤＧＦと１ｃｍ３の担体当たり約１２ｍｇのＰＤＧＦとの間である、請求項４８または５１に記載の組成物。
【請求項１５９】
前記担体が、天然ポリマー、合成ポリマーまたはそれらの組合せである、請求項８５に記載の組成物。
【請求項１６０】
前記担体が、コラーゲン、ゼラチン、フィブリン、アルギネート、セルロース、キトサンおよびフィブロネクチンからなる群から選択される天然ポリマーである、請求項８５に記載の組成物。
【請求項１６１】
前記担体が、ポリ（ＤＬ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（ＤＬ−ラクチド）（ＰＤＬＡ）、ポリ（Ｌ−ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（ｅ−カプロラクトン）（ＰＣＬ）およびポリウレタンからなる群から選択される合成ポリマーである、請求項８５に記載の組成物。
【請求項１６２】
前記担体がコラーゲンスポンジである、請求項８５に記載の組成物。
【請求項１６３】
前記担体が、約５０μｍ〜約１ｍｍの間の範囲の孔径を有する多孔性細胞足場を提供する、請求項８５に記載の組成物。
【請求項１６４】
前記担体が、約５０ミクロン〜約５００ミクロンの間の平均孔径を有する多孔性細胞足場を提供する、請求項８５に記載の組成物。
【請求項１６５】
前記担体が、約１００ミクロン〜約３００ミクロンの間の平均孔径を有する多孔性細胞足場を提供する、請求項８５に記載の組成物。
【請求項１６６】
前記担体の孔の大部分が相互接続されている、請求項９０、９１または９２に記載の組成物。
【請求項１６７】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液が、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌの間のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含む、請求項８５に記載の組成物。
【請求項１６８】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液が、約０．２ｍｇ／ｍｌ〜約０．４ｍｇ／ｍｌの間のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含む、請求項８５に記載の組成物。
【請求項１６９】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液が、約０．３ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含む、請求項８５に記載の組成物。
【請求項１７０】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液が、約０．５ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含む、請求項８５に記載の組成物。
【請求項１７１】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液が、約１．０ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含む、請求項８５に記載の組成物。
【請求項１７２】
重量基準で前記凍結乾燥ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの少なくとも約８５％が、非切断型凍結乾燥ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢである、請求項８５に記載の組成物。
【請求項１７３】
重量基準で前記凍結乾燥ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの少なくとも約９０％が、非切断型凍結乾燥ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢである、請求項８５に記載の組成物。
【請求項１７４】
重量基準で前記凍結乾燥ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの少なくとも約９５％が、非切断型凍結乾燥ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢである、請求項８５に記載の組成物。
【請求項１７５】
重量基準で前記凍結乾燥ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの少なくとも約９７％が、非切断型凍結乾燥ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢである、請求項８５に記載の組成物。
【請求項１７６】
前記治療組成物中に含まれる前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢが、配列番号１に対して少なくとも約９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、少なくとも約９０％のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含む、請求項８５に記載の組成物。
【請求項１７７】
前記治療組成物中に含まれる前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢが、配列番号１に対して少なくとも約９０％の相同性を有するアミノ酸配列から本質的になる、少なくとも約８０％のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢから本質的になる、請求項８５に記載の組成物。
【請求項１７８】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液対前記担体の比が、約０．１ｍｌ／ｃｍ３〜約３０ｍｌ／ｃｍ３の間である、請求項８５に記載の組成物。
【請求項１７９】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液対前記担体の比が、約０．２ｍｌ／ｃｍ３〜約２０ｍｌ／ｃｍ３の間である、請求項８５に記載の組成物。
【請求項１８０】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液対前記担体の比が、約０．１ｍｌ／ｃｍ３〜約１０ｍｌ／ｃｍ３の間である、請求項８５に記載の組成物。
【請求項１８１】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液対前記担体の比が、約０．２５ｍｌ／ｃｍ３〜約５ｍｌ／ｃｍ３の間である、請求項８５に記載の組成物。
【請求項１８２】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液対前記担体の比が、約０．２５ｍｌ／ｃｍ３〜約２．５ｍｌ／ｃｍ３の間である、請求項８５に記載の組成物。
【請求項１８３】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液対前記担体の比が、約０．１ｍｌ／ｃｍ３〜約１ｍｌ／ｃｍ３の間である、請求項８５に記載の組成物。
【請求項１８４】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液対前記担体の比が、約０．５ｍｌ／ｃｍ３〜約１．５ｍｌ／ｃｍ３の間である、請求項８５に記載の組成物。
【請求項１８５】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ対前記担体の比が、約３０μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ３〜約９ｍｇのＰＤＧＦ／ｃｍ３の間である、請求項８５に記載の組成物。
【請求項１８６】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ対前記担体の比が、約６０μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ３〜約６ｍｇのＰＤＧＦ／ｃｍ３の間である、請求項８５に記載の組成物。
【請求項１８７】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ対前記担体の比が、約７５μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ３〜約３ｍｇのＰＤＧＦ／ｃｍ３の間である、請求項８５に記載の組成物。
【請求項１８８】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ対前記担体の比が、約７５μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ３〜約１．５ｍｇのＰＤＧＦ／ｃｍ３の間である、請求項８５に記載の組成物。
【請求項１８９】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ対前記担体の比が、約７５μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ３〜約７５０μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ３の間である、請求項８５に記載の組成物。
【請求項１９０】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ対前記担体の比が、約１２０μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ３〜約６００μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ３の間である、請求項８５に記載の組成物。
【請求項１９１】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ対前記担体の比が、約１５０μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ３〜約４５０μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ３の間である、請求項８５に記載の組成物。
【請求項１９２】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ対前記担体の比が、１ｃｍ３の担体当たり約７５μｇのＰＤＧＦと１ｃｍ３の担体当たり約２２５μｇのＰＤＧＦとの間である、請求項８５に記載の組成物。
【請求項１９３】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液および前記担体が合わされる場合、前記担体が、前記担体の孔内に前記再構成された非切断型ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの少なくとも約２０％を捕捉することが可能であり、その結果、前記組成物が患者の創傷に適用される場合に、前記患者の身体によって前記担体が吸収されるにつれて前記再構成された非切断型ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢが経時的に放出され、それによって、前記創傷部位におけるｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの遅延された送達を提供し、同時に、新たな細胞および組織内殖のための多孔性担体を提供する、請求項８５に記載の組成物。
【請求項１９４】
前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢが、Ｅ．ｃｏｌｉ発現系を介して産生されたｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含む、請求項８５に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年１０月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／０６３，７９３号の利益を請求し、その全体の内容が、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、創傷を処置するため、特に、治癒が困難な創傷、例えば、糖尿病患者の下肢潰瘍、静脈うっ血性潰瘍、褥瘡、重症熱傷ならびに大きい外科的創傷、例えば、腹壁形成術および他の型の外科的組織フラップを処置するために有用な、組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
糖尿病は、世界中で大流行している。報告によれば、およそ３億７０００万人が糖尿病を有しており、この数は、全ての国で増加している。糖尿病から生じる最も一般的かつ重篤な合併症のうちの１つは、母趾（第一趾）の下、中足指節関節、足指の先端および末端、足の中央および側面ならびに踵などの足の表面上の高い圧力の領域上で最も一般的に発症する治癒不良の創傷である。足潰瘍は、足上のかかる圧点にわたる感覚の喪失を生じる神経損傷の結果として形成され、それにより、微小外傷が拡がり、覆っている組織が破綻し、最終的に潰瘍が形成される。さらに、感覚におけるこの喪失は、適切な処置なしで済むような軽微な擦れまたは切れを許容し得、潰瘍の形成を最終的にもたらす。かなりの割合の糖尿病患者が、その生涯の間に足潰瘍を発症する。糖尿病性足部潰瘍（ＤＦＵ）が一旦形成された場合、特に、その全てが糖尿病にしばしば付随するニューロパチー、脈管疾患、変更された好中球機能、低下した組織灌流および／または欠陥があるタンパク質合成の存在に起因して損なわれた治癒環境を考慮すると、処置は困難であり得る。
【０００４】
これらの慢性潰瘍形成に対するより良い処置モダリティーが大いに必要とされている。ＤＦＵは、肢切断の主要原因である。これらの創傷が長く残存するほど、創傷のサイズおよび深さが増加し、創傷が感染する機会は大きくなる。結果として、これらの合併症は、米国だけで年に８０，０００の肢切断を生じている。この慢性病理はまた、患者の全体的健康をひどく損ない、これらの患者のさらなる健康上の下方スパイラルをもたらし、ヘルスケアシステムのコストをさらに増大させる；それらの処置は、罹患した糖尿病患者のためのケアのコストを２倍にする。
【０００５】
ＤＦＵ管理の原則的目的は、創傷閉鎖である。現在の標準治療の下では、ＤＦＵ創傷ケアは、根治的な反復清拭、頻繁な検査および細菌制御、創傷に対する任意の圧力からの解放、ならびに浸軟を防止するための注意深い水分バランスに焦点を当てている。しかし、有効なＤＦＵ治癒は、このアプローチを通じては一貫して達成されておらず、結果は、患者コンプライアンスに大きく依存し得る。結果として、ＤＦＵに対処するための補助的処置が開発されてきた。糖尿病性足部潰瘍の管理についての一致した報告は、良好な標準的創傷ケアの４週間後に５０％未満の治癒を示す潰瘍について、創傷治癒を加速させ、合併症を減少させるために、一歩進んだ治療剤を考慮すべきことを推奨した。かかる一歩進んだ処置は、陰圧創傷治療、生物学的包帯、生物工学処理された皮膚等価物、高圧酸素療法、血小板リッチ血漿および増殖因子を含む。
【０００６】
しかし、少数のこれらの一歩進んだ創傷ケア製品だけが、前向き無作為化登録試験においてＤＦＵ治癒を加速させることが示されており、その結果でさえも、他の研究によって疑問視されてきた。前向き無作為化登録試験において研究された製品には、組換えヒト血小板由来増殖因子Ｂ鎖ホモダイマー（ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ）を含有する外用ゲルであるベカプレルミン（Ｒｅｇｒａｎｅｘ（登録商標）；Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｎｅｐｈｅｗ）、ＰＤＧＦと複合体化する分子を含む外用スプレーであるＢｉｏＣｈａｐｅｒｏｎｅ  ＰＤＧＦ−ＢＢ（Ａｄｏｃｉａ、Ｌｙｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）、２種の生きた皮膚等価物：二重層皮膚代用品（Ａｐｌｉｇｒａｆ（登録商標）；Ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ｉｎｃ．、Ｃａｎｔｏｎ、ＭＡ）およびヒト線維芽細胞由来真皮代用品（Ｄｅｒｍａｇｒａｆｔ（登録商標）；Ｓｈｉｒｅ，Ｐｌｃ．、Ｄｕｂｌｉｎ、Ｉｒｅｌａｎｄ）、ならびに減圧補助創傷閉鎖（Ｖ．Ａ．Ｃ．（登録商標）；ＫＣＩ、Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ、ＴＸ）が含まれる。あまり厳密でない試験データを有する他の処置モダリティーには、コラーゲン、血小板リッチ血漿、銀製品、高圧酸素および電気刺激が含まれる。
【０００７】
特定の一歩進んだ創傷ケア製品についての前向き無作為化登録試験からの一部の有利な結果にもかかわらず、それらの全体的利益は、継続的な高い肢切断率によって明らかなように、期待外れであった。以下の結果が、糖尿病性足部潰瘍の一歩進んだ治療を評価する３５の無作為化対照試験の公開されたメタ分析で報告された：
・血小板リッチ血漿は、良好な標準的創傷ケアと比較して、糖尿病性潰瘍の治癒を改善しなかった。
・３つの研究からのプールされた結果におけるＤｅｒｍａｇｒａｆｔ（登録商標）生物学的皮膚等価物は、標準的ケアと比較して有意でない改善を示すが、潰瘍治癒はＤｅｒｍａｇｒａｆｔの方が良い（３５％対２４％）。
・Ａｐｌｉｇｒａｆ（登録商標）生物学的皮膚等価物二重層は、良好な標準的創傷ケアを超えて治癒を改善することが報告されている（５５％対３４％、ｐ＝．００１；２研究）
・５、Ｒｅｇｒａｎｅｘ（登録商標）ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢは、プラセボまたは良好な標準的創傷ケアと比較して、治癒された潰瘍の百分率の改善を示した（５８％対３７％、ｐ＝０．０４；７研究）。
・Ｖ．Ａ．Ｃ．（登録商標）陰圧創傷治療は、良好な標準的創傷ケアよりも治癒を改善した（４３％対２９％、ｐ＜０．０５；１研究）。
・全ての研究について、潰瘍治癒までの向上した時間に関連する低いまたは不十分な証拠が存在した。
さらに、４つの研究において、Ｒｅｇｒａｎｅｘについての完全な創傷閉鎖の発生率は、５０％またはそれ未満（４８％、５０％、４４％および３６％）と報告された。
【０００８】
かかる一歩進んだ治療は、ＤＦＵを処置するための一貫して有効な解法を生じさせてこなかった。標準的治療と比較したそれらのより高い製品コストと共に、それらのまちまちの臨床結果を考慮すると、これらの一歩進んだ治療には、ＤＦＵを処置するための新たな標準治療として広く採用されたものは存在しない。
【０００９】
上記のように、１つのかかる一歩進んだ治療は、カルボキシメチルセルロースナトリウムゲル中１００μｇ／ｇの濃度のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢからなる、Ｒｅｇｒａｎｅｘゲル（ベカプレルミン（becaplerman））である。具体的には、Ｒｅｇｒａｎｅｘは、多用途の非無菌で低バイオバーデンの保存加工されたカルボキシメチルセルロースナトリウムベースの（ＣＭＣ）外用ゲルとして製剤化され、数カ月間にわたって慢性ＤＦＵの治癒を改善するために、毎日の適用に適応される。Ｒｅｇｒａｎｅｘ添付文書（ラベル）は、それが、２０週間の期間にわたる最大１４０回の毎日の適用に向けて毎日、そして医師が適切と考える場合には、１ｃｍ２の創傷表面積当たり約０．００６ｍｇ（６．２５μｇ）に等しい用量でさらに長く適用されるべきであることを述べている。
【００１０】
１５年以上前にＦＤＡ承認されたにもかかわらず、慢性創傷の処置のためのＦＤＡ承認を受けた唯一の組換え増殖因子製品であるという事実によって明らかなように、Ｒｅｇｒａｎｅｘは、依然として創傷の治癒のための最先端の増殖因子治療である。さらに、そのＦＤＡ承認以来、Ｒｅｇｒａｎｅｘ（すなわち、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ）の首尾よく開発された別の製剤は存在しない。臨床および非臨床データはその臨床的使用を支持しているが、本発明者らは、Ｒｅｇｒａｎｅｘが以下を含むいくつかの制限を有していると考えている：１）患者による毎日の創傷包帯交換を必要とする、患者によるＤＦＵへの毎日の適用の必要性；２）１ｃｍ２の創傷表面積当たり約０．００６ｍｇ（６μｇ）の、ＦＤＡ承認された使用のための指示書において処方される低い投薬；３）足底に位置する場合が多い創傷の可視化およびかかる創傷上へのチューブ（練り歯磨きのチューブと類似）からのゲルの適用において患者が経験する困難に起因した、しばしば不正確な投薬；４）製品を冷蔵（約２〜８℃）しておく必要性；５）Ｒｅｇｒａｎｅｘゲルの無菌性の欠如；６）延長された患者使用−最大１４０回の、潜在的には１４０回を超える、約５カ月の期間にわたる毎日の適用の必要性；ならびに７）細胞内殖のための生物学的マトリックスを提供する能力を欠くカルボキシメチルセルロースベースの（ＣＭＣ）外用ゲルの使用。
【００１１】
さらに、Ｒｅｇｒａｎｅｘは、ＤＦＵに対する有効な処置としては、医学界にあまり受容されていない。４つのＲｅｇｒａｎｅｘ効力臨床試験からのデータの欧州医薬品庁（ＥＭＡ）のレビューによれば、ＥＭＡは、３０μｇのＰＤＧＦ／ｇ製剤が、１００μｇのＰＤＧＦ／ｇよりも有効性が低く、１００μｇのＰＤＧＦ／ｇ製剤と３００μｇのＰＤＧＦ／ｇ製剤との間に差異がほとんどなかったと結論付けている。ＥＭＡはさらに、１００μｇのＰＤＧＦ／製品製剤ｇが、「中程度の」効力のみを有したと結論付けている。
【００１２】
おそらくはＲｅｇｒａｎｅｘの「中程度の」効力の結果として、創傷を処置する際のＲｅｇｒａｎｅｘ中の活性成分（すなわち、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ）の有効性は疑問視されてきた。Park  SA、Raghunathan  VK、Shah  NM、Teixeira  L、Motta  MJら（２０１４年）PDGF-  BB  Does  Not  Accelerate  Healing  in  Diabetic  Mice  with  Splinted  Skin  Wounds、PLoS  ONE  ９巻（８号）：ｅ１０４４４７頁．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１０４４４７は、ｄｂ／ｄｂマウスにおける制御全厚スプリント切除創傷モデル（controlled  full  thickness  splinted  excisional  wound  model）（２型糖尿病マウスモデル）を使用した研究からの結果を報告した。２つのスプリントされた８ｍｍ背側全厚創傷を、ｄｂ／ｄｂマウスにおいて作成し、３０μｌの５％ＰＥＧ−ＰＢＳビヒクル中３μｇのＰＤＧＦ−ＢＢまたは等容積のビヒクルのいずれかで１０日間にわたって１日１回外用処置した。この研究は、ＰＤＧＦ−ＢＢが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは生物活性ではあるものの、スプリント創傷モデルを使用したｄｂ／ｄｂマウスではｉｎ  ｖｉｖｏで創傷治癒を加速させることができなかったと結論付けた。
【００１３】
当業者は、Ｒｅｇｒａｎｅｘの活性成分ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの有効性に疑問を持っているが、本出願人らは、Ｒｅｇｒａｎｅｘの疑わしい効力にはいくつかの理由が存在すると考えている。第１に、Ｒｅｇｒａｎｅｘは、ゲル担体によって創傷部位に送達される。この製剤を用いると、数分〜数時間以内に創傷部位からｒｈＰＤＧＦがなくなってしまう。第２に、ゲル担体は生体適合性であるが、本発明者らは、このゲル担体が細胞および脈管内殖のための基材を提供せず、実際には創傷における細胞の成長および遊走にとって阻害的であり得、それによって、治癒プロセスを潜在的に減速させ、準最適な治癒を生じると考えている。第３に、Ｒｅｇｒａｎｅｘは、非無菌であり、２〜８℃で貯蔵（冷蔵）される場合にのみ安定であり、毎日適用されなければならず、解剖学的部位に達するのが困難である場合が多く、全てが低い患者コンプライアンスをもたらす；第４に、診療所データは、１００μｇ／ｇ製剤と３００μｇ／ｇ製剤との間の差異を示さなかったが、本出願人らは、Ｒｅｇｒａｎｅｘ中の増殖因子が、最適な細胞動員および増殖のための濃度には低すぎると考えている。創傷表面積の平方センチメートル当たりのＲｅｇｒａｎｅｘ用量は、僅か６μｇであり、本出願人らは、最適な細胞動員および増殖には低すぎると考えている。第５にかつ最後に、過去１５年間にわたる患者に対するその商業的使用にもかかわらず、本出願人らは、Ｒｅｇｒａｎｅｘ中に含まれる増殖因子の能力が完全ではないと考えている。Ｒｅｇｒａｎｅｘ中で使用されるｒｈＰＤＧＦは、酵母発現系中で組換え産生される。酵母中で発現される場合、このタンパク質は、２つの鎖間ジスルフィド結合によって一緒にされた２つのアンチパラレルＢ鎖からなる完全にフォールディングされたホモダイマータンパク質として排出される。しかし、発酵の間、内部タンパク質分解（残基Ａｒｇ３２と残基Ｔｈｒ３３との間での切断）およびＣ末端トランケーション（Ａｒｇ３２およびＴｈｒ１０９）が生じ得る。内部タンパク質分解は、３つの潜在的形態のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを生じる：インタクト（両方のＢ鎖がインタクトである）、単一切断型（一方のＢ鎖が切断型である）および二重切断型（両方のＢ鎖が切断型である）。切断は、さらなるＣ末端トランケーションのための新たなＣ末端部位もまた創出し、アイソフォームの非常に複雑な混合物をもたらす。本出願人らは、Ｒｅｇｒａｎｅｘ中に含まれるｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの非インタクトなアイソフォームは、完全にインタクトなアイソフォームよりも、ＤＦＵを処置するにあたってかなり有効性が低いと考えている。
ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢは、整形外科的および歯周適応症においても使用されており、ここでは、治癒環境および治癒プロセスは、真皮創傷とは非常に異なっている。２つのかかる製品には、共に活性成分としてｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含む、Ａｕｇｍｅｎｔ  Ｂｏｎｅ  ＧｒａｆｔおよびＧＥＭ２１Ｓが含まれる。ＧＥＭ２１Ｓは、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液および粒状合成骨代用品からなり、２００５年にＦＤＡ承認され、慢性歯周欠陥において骨治癒を改善することが示されている。Ａｕｇｍｅｎｔ  Ｂｏｎｅ  Ｇｒａｆｔもまた、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液および粒状合成骨代用品からなる。Ａｕｇｍｅｎｔは、米国およびカナダにおける４３４人の患者の中心的臨床試験に基づいて、手術の間の骨欠陥中への単回の移植後の足および足首の癒合において骨癒合を改善するとしてＦＤＡ承認されている。しかし、これらの製品のいずれも、ＤＦＵなどの真皮創傷を処置することに適応されておらず、両方とも、単回の手術内適用を介して、皮膚創傷治癒とは非常に異なる細胞性および生理学的プロセスである骨の成長および癒合を促進するために製品を使用することに焦点を当てている。Ｒｅｇｒａｎｅｘと同様、ＧＥＭ２１ＳおよびＡｕｇｍｅｎｔ  Ｂｏｎｅ  Ｇｒａｆｔ製品は、冷蔵（約２〜８℃）貯蔵されなければならず、このことは、使用者の利便性およびコンプライアンスを損なう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Park  SA、Raghunathan  VK、Shah  NM、Teixeira  L、Motta  MJら（２０１４年）PDGF-  BB  Does  Not  Accelerate  Healing  in  Diabetic  Mice  with  Splinted  Skin  Wounds、PLoS  ONE  ９巻（８号）：ｅ１０４４４７頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
要約すると、高い肢切断率をもたらす不良な患者転帰および矛盾する科学的分析から、ＤＦＵおよび他の型の治癒が困難な創傷を処置することを含む、真皮創傷治癒を促進するための、より予測可能な、患者／使用者フレンドリーであり一貫して有効な方法および治療組成物が未だに必要とされていることは明らかである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
発明の開示中に提供される本発明の実施形態は、例示に過ぎず、本明細書で開示される選択された実施形態の概要を提供することを意図する。発明の開示は、例示的かつ選択的であり、いずれの請求項の範囲も限定せず、本明細書で開示または企図される本発明の実施形態の全範囲を提供するものではなく、本開示または任意の特許請求された本発明の実施形態の範囲を限定も制限もしないと解釈すべきである。
【００１７】
本発明は、創傷、例えば、糖尿病患者の下肢潰瘍、静脈うっ血性潰瘍、褥瘡、重症熱傷、外傷性傷害ならびに大きい外科的創傷、例えば、腹壁形成術および他の型の外科的組織フラップを処置するためまたはそれらの治癒を促進するための、方法および組成物を提供する。一部の実施形態では、この創傷は、皮下組織中にもしくはそれを超えて拡張し得、またはこの創傷は、糖尿病性足部潰瘍であり得る。
【００１８】
以下の改善および利益の組合せを同時に含むｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの改善された製剤が、本明細書で提供される：１）創傷部位において延びた期間にわたって有効なＰＤＧＦ投薬量を維持することを促進する担体；２）細胞付着および脈管内殖のための基材を提供する担体；３）無菌であり、したがってより安全である；４）冷蔵される必要がなく、したがって、患者にとって取り扱いがより安全かつ容易である；５）好ましくは１週間おきに約１回、現行の治療よりも少ない頻度で適用され、より良い患者コンプライアンスおよび使用の容易さを促進する；６）先行技術の製剤よりも高い濃度で存在するｒｈＰＤＧＦを有する；ならびに７）特定の先行技術の製剤よりも少ないアイソフォームを有する、より純粋かつ強力なｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ製剤を含有する。本発明のある特定の実施形態では、上記改善および利益の全てが、同時に実現される。
【００１９】
治療組成物を創傷表面に適用するステップ、創傷の治癒をモニタリングするステップ、および治癒を達成するために必要と思われる場合、この治療組成物を創傷表面に定期的に再適用するステップを含む、創傷を処置する方法が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、この方法は、治療組成物を適用するステップの前に、創傷を清拭して、壊死組織または感染組織を除去するステップ、および治療組成物の適用後に、創傷を包帯で覆うステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、半密封包帯または密封包帯、および包帯は、例えば、治療組成物の各再適用と共に包帯を交換するなど、定期的に交換され得る。本発明の方法は、包帯交換時に、創傷を生理食塩水または適切な消毒性創傷浄化剤および／もしくは清拭化化学薬剤で清潔にするステップもまた含み得る。本明細書で提供される方法は、患者を感染制御または陰圧創傷治療の形態で処置するステップもまた含み得る。
【００２０】
一部の実施形態では、この方法は、無菌ＰＤＧＦと無菌生体適合性マトリックスとを合わせることによって治療組成物を形成するステップをさらに含む。この無菌ＰＤＧＦは、予め製剤化された無菌ＰＤＧＦ溶液であり得るか、またはＰＤＧＦを含有する凍結乾燥無菌粉末を無菌の水もしくは緩衝溶液で再構成することによって、処置手順の一部として形成され得る。一部の実施形態では、この生体適合性マトリックスは、無菌多孔性マトリックスであり、コラーゲン、ゼラチン、フィブリン、アルギネート（alginate）、セルロースまたはフィブロネクチンなどの天然ポリマーからなる群から選択され得る。あるいは、この生体適合性マトリックスは、例えば、ポリ（ＤＬ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（ＤＬ−ラクチド）（ＰＤＬＡ）、ポリ（Ｌ−ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（ｅ−カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリウレタンなどの合成ポリマーの群から選択される無菌多孔性マトリックスである。一部の実施形態では、この生体適合性マトリックスは、コラーゲンスポンジ、または天然ポリマーと合成ポリマーとの混合物である。
【００２１】
一部の実施形態では、この治療組成物は、コラーゲンスポンジなどのマトリックスを創傷表面に最初に適用し、次いで、ＰＤＧＦ溶液をコラーゲンスポンジに適用すること、またはあるいは、ＰＤＧＦ溶液を創傷表面に最初に適用し、次いで、コラーゲンスポンジなどのマトリックスを創傷表面に適用することのいずれかによって、創傷表面上で直接形成される。一部の実施形態では、この治療組成物は、ＰＤＧＦを含有する凍結乾燥無菌粉末を無菌の水または緩衝溶液で再構成することによって無菌ＰＤＧＦ溶液を最初に形成し、次いで、マトリックスがＰＤＧＦ溶液で湿らされる形で、無菌ＰＤＧＦ溶液をコラーゲンスポンジなどの無菌多孔性生体適合性マトリックスに無菌的に添加することによって、形成される。
【００２２】
本発明の別の態様によれば、以下を含む、真皮創傷を処置する方法が、本明細書で提供される：創傷を清拭するステップ；組換え血小板由来増殖因子ＢＢ（ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ）を含有する治療組成物を、３〜４２日毎に約１回、約２〜約２０週間の処置期間にわたって創傷に適用するステップであって、前記最初の用量は、１ｃｍ２の創傷表面積当たり少なくとも約１０μｇのｒｈＰＤＧＦを含む、ステップ；および治療組成物の各適用後に、創傷を包帯で覆うステップ。一部の実施形態では、この方法は、創傷が治癒する際に創傷に圧力を適用することを回避するように前記患者にアドバイスするステップをさらに含み得る。一部の実施形態では、処置期間の間に創傷に適用されるｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの累積総量は、約２５ｍｇまたは約１０ｍｇまたは約５ｍｇまたは約４ｍｇまたは約３ｍｇまたは約２ｍｇまたは約１ｍｇ未満のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢである。一部の実施形態では、この方法は、７〜２８日毎に１回または７〜２１日毎に１回または１０〜１５日毎に１回または１２〜１４日毎に１回、治療組成物を創傷に適用するステップを含む。一部の実施形態では、各処置は、１ｃｍ２の創傷表面積当たり少なくとも約１０μｇのｒｈＰＤＧＦの、または１ｃｍ２の創傷表面積当たり約１０μｇのｒｈＰＤＧＦと、１ｃｍ２の創傷表面積当たり約５，０００μｇのｒｈＰＤＧＦとの間の適用を含む。
【００２３】
本発明は、無菌ＰＤＧＦと、無菌および／または多孔性であり得る生体適合性マトリックスとを含む治療組成物もまた提供する。一部の実施形態では、この無菌ＰＤＧＦは、予め製剤化された無菌ＰＤＧＦ溶液を含み、他の実施形態では、この無菌ＰＤＧＦは、無菌の水または緩衝溶液で再構成される、ＰＤＧＦを含有する凍結乾燥無菌粉末を含む。
【００２４】
ある特定の実施形態では、本発明の治療組成物中に含まれる無菌ＰＤＧＦは、約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの間のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含有するｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液を含む。このｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液は、凍結乾燥ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含有する無菌粉末と無菌の水または生理食塩水とを合わせ、それによりこの凍結乾燥ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを溶液へと再構成することによって形成され得る。ある特定の実施形態では、このｒｈＰＤＧＦ−ＢＢは、Ｅ．ｃｏｌｉ発現系を介して産生され得、ここで、重量基準で前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの少なくとも約８０％は、非切断型ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢであり、これは引き続いて凍結乾燥され得る。ある特定の実施形態では、この凍結乾燥ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢは、約２０℃と約２６℃との間で貯蔵されることが可能であり、少なくとも約６カ月間もしくは少なくとも約１年間にわたって前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの少なくとも８０％の生物活性をなおも維持する、または約１６℃と約３２℃との間で貯蔵されることが可能であり、少なくとも約６カ月間もしくは少なくとも約１年間にわたって前記ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの少なくとも８０％の生物活性をなおも維持する。
【００２５】
ある特定の実施形態では、本発明の治療組成物中に含まれるマトリックスは、コラーゲン、ゼラチン、フィブリン、アルギネート、セルロース、キトサン（Chitan）またはフィブロネクチンからなる群から選択され得る。このマトリックスは、吸収性の細胞足場を提供し得、コラーゲンスポンジを含み得る。ある特定の実施形態では、このマトリックスは、約１０ミクロン〜約２，０００ミクロンの間の孔径分布、および／または約５０ミクロン〜約５００ミクロンの間の平均孔径を有する。ある特定の実施形態では、孔の一部が相互接続され、または孔の大部分が相互接続される。
【００２６】
ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液とマトリックスなどの担体とを含む治療組成物もまた本明細書で提供され、ここで、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液対マトリックスの比は、約４μｌ／ｃｍ３〜約４０μｌ／ｃｍ３の間である、またはｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ対マトリックスの比は、１ｃｍ３の担体当たり約１．２μｇのＰＤＧＦと１ｃｍ３の担体当たり約１２ｍｇのＰＤＧＦとの間である。本明細書で開示されるｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液は、約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの間または約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌの間または約０．２ｍｇ／ｍｌ〜約０．４ｍｇ／ｍｌの間のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含み得る。本明細書で開示されるｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液は、約０．３ｍｇ／ｍｌまたは約０．５ｍｇ／ｍｌまたは約１．０ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含み得る。ある特定の実施形態では、重量基準でＰＤＧＦ溶液または治療組成物中に含まれるｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの少なくとも約８０％または約８５％または約９０％または約９５％または約９７％は、非切断型ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢである。
【００２７】
ある特定の態様では、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液とマトリックスとを含む治療組成物が提供され、そのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの少なくとも約２０％はマトリックスの孔内に捕捉され、その結果、前記組成物が患者の創傷に適用される場合に、患者の身体によってマトリックスが吸収されるにつれてｒｈＰＤＧＦ−ＢＢが経時的に放出される。ある特定の実施形態では、この治療組成物は、マトリックスが吸収される際に創傷部位におけるｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの持続性の送達を提供し、同時に、新たな細胞および組織内殖のためのマトリックスを提供する。
【００２８】
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。方法および材料が、本開示での使用について本明細書に記載されているが、当該分野で公知の他の適切な方法および材料もまた使用され得る。これらの材料、方法および例は、例示に過ぎず、限定を意図しない。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリーおよび他の参考文献は、それらの全体が参照によって組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先される。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、デジタルノギス測定値によって計算した、研究に含まれる３つの群の動物における経時的な平均創傷面積の変化をグラフとして示す図である。
【００３０】
【図２】図２は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して計算した、研究に含まれる３つの群の動物における経時的な平均創傷面積の変化をグラフとして示す図である。
【００３１】
【図３】図３は、研究の０日目の各試験動物についてＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して計算した創傷面積をグラフとして示す図である。
【００３２】
【図４】図４は、研究の７日目の各試験動物についてＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して計算した創傷面積をグラフとして示す図である。
【００３３】
【図５】図５は、研究の１４日目の各試験動物についてＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して計算した創傷面積をグラフとして示す図である。
【００３４】
【図６】図６は、研究の２１日目の各試験動物についてＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して計算した創傷面積をグラフとして示す図である。
【００３５】
【図７Ａ】図７Ａは、Ｒｅｇｒａｎｅｘ群１およびｒｈＰＤＧＦ／コラーゲン群３についての、各時点について累積投薬量の数当たりの、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用した創傷治癒の量（ｍｍ２）をグラフとして示す図である。
【００３６】
【図７Ｂ】図７Ｂは、処置期間にわたる各群についての平均パーセント創傷閉鎖をグラフとして示す図である。
【００３７】
【図８−１】図８は、本発明に従う組成物を試験する研究に含まれる動物についての経時的な治癒の程度を示す一連の創傷画像を示す図である。
【図８−２】図８は、本発明に従う組成物を試験する研究に含まれる動物についての経時的な治癒の程度を示す一連の創傷画像を示す図である。
【図８−３】図８は、本発明に従う組成物を試験する研究に含まれる動物についての経時的な治癒の程度を示す一連の創傷画像を示す図である。
【００３８】
【図９】図９は、３匹の研究動物からの２１日目の創傷部位の断面の一連の顕微鏡写真を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本発明は、真皮創傷、例えば、糖尿病性足部潰瘍（ＤＦＵ）、静脈うっ血性潰瘍、褥瘡、熱傷、外傷性傷害および大きい外科的創傷を処置する新規方法を提供する。本発明はさらに、かかる創傷を処置することにおける使用のための新規生物活性治療組成物、創傷の処置に有用な生物活性包帯を調製する新規方法、および患者コンプライアンスおよび創傷治癒を改善するための新規処置レジメンを提供する。
【００４０】
本発明に従う新規方法および治療組成物は、真皮創傷を処置するにあたり先行技術の製品と比較して等価なまたは優れた効果を可能にし、より良い安全性プロファイルならびに改善された患者コンプライアンスおよび利便性を提供する。本明細書で提供される新規治療組成物は、以下を提供する：１）各適用からの創傷上へのＰＤＧＦの延長された送達、したがって、患者によるはるかに頻繁な適用（例えば、先行分野の製品による毎日または１日おきの適用）の必要性を除去する；２）数日毎に１回創傷上に適用され得る物理的材料、例えば、Ｂａｎｄ−Ａｉｄなどのコラーゲンスポンジ、したがって、患者コンプライアンスを改善する；３）製品を冷蔵しておく必要性を排除する、室温での安定性；４）先行技術の製品を超えて安全性を改善する無菌製品；５）治癒プロセスをより良く開始する、先行技術の製品と比較してより高い初期用量のＰＤＧＦ、したがって、延長された患者使用の必要性を低減させる；６）ＰＤＧＦの送達を持続させるだけでなく、同時に、細胞、血管および新たな組織の内殖を促進し、細胞内殖のための生物学的マトリックスを提供する能力を欠く先行技術の製品と比較して改善された治癒をもたらす生物学的足場および／または開放多孔性マトリックスを提供する、改善された担体の使用；ならびに７）先行技術の製剤よりも少ないアイソフォームを有する、より純粋かつ強力なｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ製剤を含有する。本明細書で開示される新規方法は、以下を提供する：１）治癒プロセスをより良く開始する、先行技術の製品と比較してより高い初期用量のＰＤＧＦ、したがって、延長された患者使用の必要性を低減させる；ならびに２）治療組成物のより少ない定期的適用、おそらく、先行技術の製品によって必要とされる１４０回の適用に対して、１〜６回の少ない適用を要求することによって、改善された患者コンプライアンスおよび利便性を促進する処置プロトコール。
Ｉ．定義／命名法
【００４１】
本明細書で使用する場合、特記しない限り、オープンの用語、例えば、「含有する（contain）」、「含有する（containing）」、「含む（include）」、「含む（including）」などは、含む（comprising）を意味する。
【００４２】
本明細書の一部の実施形態は、数値範囲を企図する。数値範囲が提供される場合、この範囲は、特記しない限り、範囲の終点を含む。特記しない限り、数値範囲は、明示的に全て書き出したかのように、その中の全ての値および下位範囲を含む。
【００４３】
本明細書の一部の値は、用語「約」によって修飾される。一部の場合には、参照数値に関連する用語「約」は、その値からプラスまたはマイナス１０％の値の範囲を含み得る。例えば、量「約１０」は、９から１１までの量を含み得る。他の実施形態では、参照数値に関連する用語「約」は、その値からプラスまたはマイナス１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％の値の範囲を含み得る。
【００４４】
本明細書で使用する場合、冠詞「１つの（ａ）」とは、明示的に述べない限り、１または複数を意味する。
【００４５】
本明細書に記載される方法およびステップが特定の順序で生じる特定の事象を示す場合、当業者は、特定のステップの順序付けが改変され得ること、およびかかる改変が本発明のバリエーションに従うことを認識する。さらに、特定のステップは、可能な場合には並行プロセスで同時発生的に実施され得る、ならびに逐次的に実施され得る。
【００４６】
略称の意味は以下のとおりである：「Ｃ」は、その用法から明らかなように、セルシウスまたは℃を意味する、「μＬ」または「ｕＬ」または「ｕｌ」は、マイクロリットル（複数可）を意味する、「ｍＬ」は、ミリリットル（複数可）を意味する、「Ｌ」は、リットル（複数可）を意味する、「ｍｍ」は、ミリメートル（複数可）を意味する、「ｎｍ」は、ナノメートルを意味する、「ｍＭ」は、ミリモル濃度を意味する、「μＭ」または「ｕＭ」は、マイクロモル濃度を意味する、「Ｍ」は、モル濃度を意味する、「ｍｍｏｌ」は、ミリモル（複数可）を意味する、「μｍｏｌ」または「ｕＭｏｌ」は、マイクロモル（複数可）を意味する、「ｇ」は、グラム（複数可）を意味する、「μｇ」または「ｕｇ」は、マイクログラム（複数可）を意味する、「ｎｇ」は、ナノグラム（複数可）を意味する、「％ｗ／ｖ」は、重量／容積パーセントを意味する、「％ｖ／ｖ」は、容積／容積パーセントを意味する、「ＨＰＬＣ」は、高速液体クロマトグラフィーを意味する、「ＵＰＬＣ」は、超高性能液体クロマトグラフィーを意味する、「ＧＣ」は、ガスクロマトグラフィーを意味する。
【００４７】
用語「相同性」とは、アルゴリズムのコンピュータ化実行によって実施され得る、配列（ヌクレオチドまたはアミノ酸のいずれか）の最適なアラインメントを指す。「相同性」は、ポリヌクレオチドに関して、例えば、デフォルトパラメーターを使用してＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いた分析によって決定され得る。「相同性」は、ポリペプチド（すなわち、アミノ酸）に関して、比較されるポリペプチドまたは断片をアラインさせ（および、ヌクレオチド断片もまたアラインさせ得る）、それらの間でのアミノ酸の同一性または類似性の程度を決定する、ＢＬＡＳＴＰバージョン２．２．２などのプログラムをデフォルトパラメーターと共に使用して決定され得る。
【００４８】
配列相同性についての上の説明および方法は、例示的であることが意図され、この概念は、当該分野で十分に理解されていると認識される。さらに、核酸配列は変動し得るが、機能的酵素をなおも提供し得、かかるバリエーションは、本発明の範囲内であることが理解される。用語「酵素ホモログ」もまた、機能的バリアントを意味し得る。
【００４９】
本明細書で使用する場合、用語「担体」は、ＰＤＧＦのための送達ビヒクルとして機能し得る任意の生物学的に適合性の物質を広く指すことを意図し、用語「マトリックス」および「足場」は、創傷が治癒する際の細胞付着および／もしくは脈管内殖のための基材として作用する、ならびに／あるいは（例えば、相互接続された孔などを介して）その構造内にＰＤＧＦを捕捉し、それによって、創傷が治癒する際のＰＤＧＦの進行する送達のまたは遅延もしくは延長された送達を可能にするための手段を提供する担体を指すために、互換的に使用される。
ＩＩ．創傷を処置する新規方法
【００５０】
本発明は、創傷を処置する新規方法を提供する。一実施形態では、創傷を処置する方法は、生体適合性足場、マトリックスまたは担体中に取り込まれたＰＤＧＦ溶液を含む治療組成物を提供するステップ、および治療組成物を創傷に適用するステップを含む。生体適合性足場、マトリックスまたは担体中に取り込まれたＰＤＧＦ溶液を含む治療組成物は、例えば、創傷に外用適用され得る。一部の実施形態では、創傷を処置する方法は、数週間の期間にわたる、創傷への治療組成物の複数回の定期的適用を含む。
【００５１】
本発明の一態様によれば、創傷を処置するための新規処置方法は、以下のステップを含む：
（１）必要に応じて創傷を清拭して、壊死組織または感染組織を除去するステップ；
（２）無菌ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢと無菌多孔性生体適合性担体とを含む治療組成物を形成するステップ；
（３）ＰＤＧＦを含有する治療組成物を創傷表面に適用するステップであって、この担体は、創傷が治癒する際の細胞付着および脈管内殖のための基材を提供する、ステップ；
（４）創傷を包帯で覆うステップ；ならびに
（５）処置期間の間、創傷の治癒をモニタリングし、３日間またはそれ超の処置間隔でステップ（１）〜（４）を反復するステップ。
この新規処置方法は、新規治療組成物を創傷表面に適用する前にそれを調製するステップをさらに含み得、この組成物は、ＰＤＧＦと生物学的マトリックスとを含む。この組成物を調製する方法は、以下を含み得る：
（２ａ）凍結乾燥（フリーズドライ）無菌ＰＤＧＦ粉末を無菌の水、生理食塩水、緩衝液または生理的溶液で再構成して、特定の安全な治療濃度のＰＤＧＦを提供するステップ；および
（１ｂ）無菌ＰＤＧＦ溶液をバイアル（コンテナ）から引き出し、マトリックスまたはパッチがＰＤＧＦ溶液で湿らされる形で、それを乾燥親水性無菌マトリックスまたはパッチに無菌的に添加するステップ。
【００５２】
一部の実施形態では、この包帯は、密封包帯または半密封包帯である。一部の実施形態では、ステップ（１）〜（３）の反復は、以下のステップもまた含み得る：（Ａ）包帯を除去し、治療組成物包帯を適用するステップの前に、創傷を生理食塩水または適切な消毒性創傷浄化剤で清潔にするステップ、および（Ｂ）治療組成物の適用後に、創傷を新たな包帯で覆うステップ。一部の実施形態では、本明細書に記載される新規生物活性治療組成物は、例えば、感染制御、陰圧創傷治療を含む、創傷を処置する他の態様、および／または創傷部位に圧力をかけることを回避するように患者に指導することと組み合わせて使用され得る。
【００５３】
本発明の一態様によれば、創傷を定期的に再処置するため、すなわち、ステップ（２）〜（４）を反復するためまたは治療組成物を創傷に定期的に再適用するためのタイミングスケジュールが提供される。再処置の実際の数および再処置頻度（すなわち、処置間隔）は、創傷の重症度（例えば、そのグレード、サイズおよび深さ）、天然の創傷治癒環境が損なわれた程度（例えば、その部位における脈管供給、患者の代謝状態、部位に対する圧力を解放する能力、感染の存在、ＤＦＵについての糖尿病ステージ、ある熱傷についての熱傷の程度）、患者の年齢、創傷の持続時間、および他の併存症、例えば、喫煙、肥満、制御されないグルコースレベル、患者コンプライアンスなどを含むいくつかの因子に基づいて決定すべきである。再処置の数および再処置頻度は、より重症の創傷のためまたはより損なわれた治癒環境を有する創傷のためには、増加させるべきである。さらに、処置の処方される数および／または再処置頻度は、創傷の治癒速度に基づいて処置期間の間に調整され得る、すなわち、より遅く治癒する創傷のために再処置の数および／もしくは再処置頻度を増加させ得る、またはより速く治癒する創傷のために再処置の数および／もしくは再処置頻度を減少させ得る。
【００５４】
本発明の一態様によれば、再処置頻度は、少なくとも約２日間、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１１日間、少なくとも約１２日間、少なくとも約１３日間、少なくとも約１４日間、もしくは少なくとも約１５日間などから、最大６週間毎に少なくとも約１回、またはそれらの組合せである。本発明の別の一態様によれば、再処置頻度は、２〜４２日毎に１回、または３〜４２日毎に１回、または２〜２８日毎に１回、または３〜２８日毎に１回、または２〜７日毎に１回、または３〜７日毎に１回、または４〜２１日毎に１回、７〜２８日毎に１回、または７〜２１日毎に１回、または７〜１４日毎に１回、または１０〜１５日毎に１回、または１２〜１４日間日毎に１回である。本発明の別の一態様によれば、再処置頻度は、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎、７日毎、８日毎、９日毎、１０日毎、１２日毎、１４日毎、１５日毎、２１日毎、２８日毎、３０日毎、３５日毎、４２日毎に１回、またはそれらの組合せである。
【００５５】
本発明の別の一態様によれば、再処置頻度は、処置期間にわたって実質的に同じであり、この再処置頻度は、少なくとも約２日毎、少なくとも約３日毎、少なくとも約４日毎、少なくとも約５日毎、少なくとも約６日毎、少なくとも約７日毎、少なくとも約８日毎、少なくとも約９日毎、少なくとも約１０日毎、少なくとも約１１日毎、少なくとも約１２日毎、少なくとも約１３日毎、少なくとも約１４日毎、または少なくとも約１５日毎に１回などから、最大６週間毎に少なくとも約１回である。
【００５６】
本発明の一態様によれば、創傷は、処置期間にわたって、少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回または少なくとも５回、再処置される。本発明の別の一態様によれば、創傷は、処置期間にわたって、０回と６回との間、０回と７回との間、または０回と８回との間の回数、再処置される。本発明の別の一態様によれば、創傷は、処置期間にわたって、１〜８回の間、または２〜７回の間、または３〜６回の間、処置される。本発明の別の一態様によれば、創傷は、処置期間にわたって、１、２、３、４、５、６、７、８、１０または２０回、再処置される。本発明の別の一態様によれば、創傷は、０回と４６回との間、または１回と４６回との間、または０回と２０回との間、または１回と２０回との間、または０回と２７回との間、または１回と２７回との間の回数、再処置される。
【００５７】
本発明の一態様によれば、この処置期間の間に創傷に適用されるｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの累積総量は、好ましくは０ｍｇ超であるが、約５０ｍｇ未満、または約２５ｍｇ未満、または約２０ｍｇ未満、または約１５ｍｇ未満、または約１０ｍｇ未満、または約５ｍｇ未満、または約４ｍｇ未満、または約３ｍｇ未満、または約２ｍｇ未満、または約１ｍｇ未満のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢである。ある特定の実施形態では、処置期間の間に創傷に適用されるｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの累積総量は、好ましくは約０．１ｍｇ〜約５０ｍｇの間、または約０．５ｍｇ〜約２５ｍｇの間、または約１ｍｇ〜約１０ｍｇの間、または約２．５ｍｇ〜約８ｍｇの間、または約３ｍｇ〜約７ｍｇの間、約４ｍｇ〜約６ｍｇの間である。
【００５８】
種々の再処置は、創傷に適用されるｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの正確な量（すなわち、「絶対的投薬量」）に関して、または創傷面積の平方センチメートル（ｃｍ２）当たり適用されるｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの量（すなわち、「面積投薬量」）に関して、同じまたは異なる投薬量のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含み得る。本発明の一態様によれば、各処置は、約１０μｇと約５０ｍｇとの間、もしくは約１０μｇと約２５ｍｇとの間、もしくは約１０μｇと約２０ｍｇとの間、もしくは約１０μｇと約１５ｍｇとの間、もしくは約１０μｇと約１０ｍｇとの間、もしくは約１０μｇと約５ｍｇとの間のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ、または約１０μｇと約１ｍｇとの間のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの、絶対的投薬量を適用する。本発明の別の一態様によれば、各処置は、約１０μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ２と約１．０ｍｇのＰＤＧＦ／ｃｍ２との間、または約１０μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ２と約０．５ｍｇのＰＤＧＦ／ｃｍ２との間、または約１０μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ２と約０．２５ｍｇのＰＤＧＦ／ｃｍ２との間、または約１０μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ２と０．１ｍｇのＰＤＧＦ／ｃｍ２との間、または約１０μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ２と約０．０５ｍｇのＰＤＧＦ／ｃｍ２との間の面積投薬量を適用する。ある特定の実施形態では、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢによる各処置は、好ましくは、約１０μｇ〜１０００μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ２の間、または約０．０１ｍｇ〜約５０ｍｇのＰＤＧＦ／ｃｍ２の間、または約０．０５ｍｇ〜約２５ｍｇのＰＤＧＦ／ｃｍ２の間、または約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇのＰＤＧＦ／ｃｍ２の間、または約０．２ｍｇ〜約２ｍｇのＰＤＧＦ／ｃｍ２の間である。ある特定の実施形態では、各処置は、１ｃｍ２の創傷表面積当たり少なくとも約１０μｇのｒｈＰＤＧＦ、または１ｃｍ２の創傷表面積当たり少なくとも約２５μｇのｒｈＰＤＧＦ、または１ｃｍ２の創傷表面積当たり少なくとも約５０μｇのｒｈＰＤＧＦ、または１ｃｍ２の創傷表面積当たり少なくとも約１００μｇのｒｈＰＤＧＦ、または１ｃｍ２の創傷表面積当たり少なくとも約２５０μｇのｒｈＰＤＧＦ、または１ｃｍ２の創傷表面積当たり少なくとも約５００μｇのｒｈＰＤＧＦである面積投薬量を適用する。ある特定の実施形態では、各処置は、１ｃｍ２の創傷表面積当たり約１０μｇのｒｈＰＤＧＦと１ｃｍ２の創傷表面積当たり約５００μｇのｒｈＰＤＧＦとの間、または１ｃｍ２の創傷表面積当たり約１０μｇのｒｈＰＤＧＦと１ｃｍ２の創傷表面積当たり約１００μｇのｒｈＰＤＧＦとの間、または１ｃｍ２の創傷表面積当たり約１５μｇのｒｈＰＤＧＦと１ｃｍ２の創傷表面積当たり約３７５μｇのｒｈＰＤＧＦとの間、または１ｃｍ２の創傷表面積当たり約３０μｇのｒｈＰＤＧＦと１ｃｍ２の創傷表面積当たり約１９０μｇのｒｈＰＤＧＦとの間、または１ｃｍ２の創傷表面積当たり約３０μｇのｒｈＰＤＧＦと１ｃｍ２の創傷表面積当たり約３００μｇのｒｈＰＤＧＦとの間である面積投薬量を適用する。
【００５９】
本発明の一態様によれば、本発明に従う組成物による初期処置は、最も重要な処置であり得る。ＰＤＧＦは、細胞増殖（有糸分裂誘発）および指向された細胞移動（走化性）ならびに再血管新生（新たな血管の生成）に対するその効果を介して、創傷治癒プロセスを促進する。結合組織細胞（皮膚、骨、軟骨、腱および靱帯）、血管細胞および神経系の細胞を含む多くの細胞が、ＰＤＧＦに対する受容体（結合部位）を有することが示されている。ＰＤＧＦに対する受容体を有する細胞は、創傷の部位（ここで、ＰＤＧＦは、本発明に従う治療組成物を適用した結果として、上昇したレベルで存在する）に向かって遊走し、ＰＤＧＦを結合した後に引き続いて増殖することによって、応答する。ＰＤＧＦ受容体は、活性化後に迅速に分解されるので、細胞増殖は、局所的に利用可能なＰＤＧＦの存在によって、ならびに創傷治癒の増殖期から完全な治癒を最終的に生じるマトリックス沈着へと細胞を進行させる細胞−細胞相互作用によって、制御および制限される。結果として、患者の天然の創傷治癒プロセスが適切に活性化されることを確実にするために、決定的なボーラスのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを初期処置の間に適用しなければならない。したがって、本発明によれば、この初期処置は、少なくとも１０μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ２創傷表面積から最大５０００μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ２創傷表面積、または少なくとも２０μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ２創傷表面積から最大１０００μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ２創傷表面積、または少なくとも３０μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ２創傷表面積から最大６００μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ２創傷表面積、または少なくとも４０μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ２創傷表面積から最大４００μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ２創傷表面積、または少なくとも５０μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ２創傷表面積から最大３５０μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ２創傷表面積、または少なくとも６０μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ２創傷表面積から最大３００μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ２創傷表面積、または少なくとも２００μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ２創傷表面積から最大２０００μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ２創傷表面積である面積投薬量を含有する治療組成物を適用することを含む。本発明の別の一態様によれば、この初期処置は、少なくとも１０μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ２創傷表面積、または少なくとも２０μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ２創傷表面積、または少なくとも２５μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ２創傷表面積、または少なくとも３０μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ２創傷表面積、または少なくとも４０μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ２創傷表面積、または少なくとも５０μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ２創傷表面積、または少なくとも６０μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ２創傷表面積、または少なくとも７０μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ２創傷表面積、または少なくとも８０μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ２創傷表面積、または少なくとも９０μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ２創傷表面積、または少なくとも１００μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ２創傷表面積、または少なくとも２５０μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ２創傷表面積、または少なくとも５００μｇのＰＤＧＦ／ｃｍ２創傷表面積である面積投薬量を含有する治療組成物を適用することを含む。
【００６０】
本発明の別の一態様によれば、各処置は、１ｃｍ３の担体（コラーゲンスポンジなどのマトリックスであり得る）当たり約４μｌのＰＤＧＦ溶液と１ｃｍ３の担体当たり約４０ｍｌのＰＤＧＦ溶液との間、または１ｃｍ３の担体当たり約０．１ｍｌのＰＤＧＦ溶液と１ｃｍ３の担体当たり約３０ｍｌのＰＤＧＦ溶液との間、または１ｃｍ３の担体当たり約０．２ｍｌのＰＤＧＦ溶液と１ｃｍ３の担体当たり約２０ｍｌのＰＤＧＦ溶液との間、または１ｃｍ３の担体当たり約０．１ｍｌのＰＤＧＦ溶液と１ｃｍ３の担体当たり約１０ｍｌのＰＤＧＦ溶液との間、または１ｃｍ３の担体当たり約０．２５ｍｌのＰＤＧＦ溶液と１ｃｍ３の担体当たり約５ｍｌのＰＤＧＦ溶液との間、または１ｃｍ３の担体当たり約０．２５ｍｌのＰＤＧＦ溶液と１ｃｍ３の担体当たり約２．５ｍｌのＰＤＧＦ溶液との間、または１ｃｍ３の担体当たり約０．１ｍｌのＰＤＧＦ溶液と１ｃｍ３の担体当たり約１ｍｌのＰＤＧＦ溶液との間、または１ｃｍ３の担体当たり約０．５ｍｌのＰＤＧＦ溶液と１ｃｍ３の担体当たり約１．５ｍｌのＰＤＧＦ溶液との間を適用する。ある特定の実施形態では、このＰＤＧＦ溶液は、約０．３ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含有する。
【００６１】
本発明の別の一態様によれば、各処置は、１ｃｍ３の担体当たり約１．２μｇのＰＤＧＦと１ｃｍ３の担体当たり約１２ｍｇのＰＤＧＦとの間、または１ｃｍ３の担体当たり約３０μｇのＰＤＧＦと１ｃｍ３の担体当たり約９ｍｇのＰＤＧＦとの間、または１ｃｍ３の担体当たり約６０μｇのＰＤＧＦと１ｃｍ３の担体当たり約６ｍｇのＰＤＧＦとの間、または１ｃｍ３の担体当たり約７５μｇのＰＤＧＦと１ｃｍ３の担体当たり約３ｍｇのＰＤＧＦとの間、または１ｃｍ３の担体当たり約７５μｇのＰＤＧＦと１ｃｍ３の担体当たり約１．５ｍｇのＰＤＧＦとの間、または１ｃｍ３の担体当たり約７５μｇのＰＤＧＦと１ｃｍ３の担体当たり約７５０μｇのＰＤＧＦとの間、または１ｃｍ３の担体当たり約１２０μｇのＰＤＧＦと１ｃｍ３の担体当たり約６００μｇのＰＤＧＦとの間、または１ｃｍ３の担体当たり約１５０μｇのＰＤＧＦと１ｃｍ３の担体当たり約４５０μｇのＰＤＧＦとの間、または１ｃｍ３の担体当たり約７５μｇのＰＤＧＦと１ｃｍ３の担体当たり約２２５μｇのＰＤＧＦとの間を適用する。
【００６２】
本発明の一態様によれば、初期ＰＤＧＦ処置の絶対的投薬量は、引き続く再処置投薬量より多くてもよい。初期ＰＤＧＦ処置の絶対的投薬量は、引き続く再処置ＰＤＧＦ投薬量の各々よりも、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％もしくは約５０％高くてもよく、または最大約３００％高くてもよい。
【００６３】
本発明の一態様によれば、この方法は、室温、一般的には１６℃と３２℃との間で、ＰＤＧＦを貯蔵するステップを含む。使用前に、これは、所望のＰＤＧＦ濃度を有する溶液を形成するために、無菌の水、生理食塩水、緩衝液または他の生理的溶液で再構成され得る。次いで、この溶液は、マトリックスを湿らせるための所望の容積で、担体、好ましくは所望の多孔度を有する細胞マトリックス（例えば、コラーゲンスポンジ）に添加される。次いで、ｒｈＰＤＧＦ浸漬されたマトリックスは、創傷表面に適用される。創傷が外部創傷である場合、これは次いで、創傷包帯で覆われる。次いで、このプロセスは、創傷が実質的に治癒するまで、上記頻度および持続時間パラメーターに従って反復され得る。
ＩＩＩ．創傷を処置するための新規治療組成物
【００６４】
本発明は、生体適合性の無菌の担体、マトリックスまたは足場中に取り込まれた無菌ＰＤＧＦを含む、創傷を処置するための新規治療組成物もまた提供する。例えば、この治療組成物は、創傷の治癒を促進するために、創傷に外用適用され得る。
【００６５】
本発明の一態様によれば、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液と、好ましくは生体適合性細胞足場である担体とを含む治療組成物が提供され、このｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液は、細胞足場中に置かれる、または細胞足場中に取り込まれる。一部の実施形態では、このｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液は、約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの間のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ、または約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌの間のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ、または約０．２ｍｇ／ｍｌ〜約０．４ｍｇ／ｍｌの間のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含む。本発明の一態様によれば、このｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液は、約０．０５ｍｇ／ｍｌ、または約０．１ｍｇ／ｍｌ、または約０．２ｍｇ／ｍｌ、または約０．２５ｍｇ／ｍｌ、または約０．３ｍｇ／ｍｌ、または約０．３５ｍｇ／ｍｌ、または約０．４ｍｇ／ｍｌ、または約０．５ｍｇ／ｍｌ、または約０．６ｍｇ／ｍｌ、または約０．７ｍｇ／ｍｌ、または約０．８ｍｇ／ｍｌ、または約０．９ｍｇ／ｍｌ、または約１ｍｇ／ｍｌ、または約２ｍｇ／ｍｌ、または約３ｍｇ／ｍｌ、または約４ｍｇ／ｍｌ、または約５ｍｇ／ｍｌの濃度のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含有する。
【００６６】
一部の実施形態では、このｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液は、本明細書に記載される要素（例えば、ＰＤＧＦ濃度、無菌溶液組成物など）を含む、予め製剤化された無菌性ＰＤＧＦ溶液である。他の実施形態では、このｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液は、好ましくは、無菌溶液（例えば、無菌の水、生理食塩水、緩衝溶液または生理的溶液）を、凍結乾燥ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含むまたは凍結乾燥ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢから本質的になる無菌粉末と合わせることによって、使用時に形成される。この無菌溶液は、凍結乾燥ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを再構成するために使用される。凍結乾燥ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢは、無菌的条件下で、本明細書の以下にさらに記載される組換え発現系を使用することによって産生された液体ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを凍結乾燥することによって形成される。
【００６７】
本発明の別の一態様では、ｒｈＰＤＧＦは、担体、好ましくは、無菌の生体適合性の吸収性細胞足場中に取り込まれ得、次いで、ＰＤＧＦ飽和した担体は、ｒｈＰＤＧＦを取り込む無菌の乾燥デバイスを形成するために凍結乾燥される。組換えタンパク質を凍結乾燥するための任意の公知の技術が、それが無菌粉末を生じる限り、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを凍結乾燥するために使用され得る。得られた凍結乾燥ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ粉末は、室温で貯蔵されることが可能であり、少なくとも約６カ月間、または少なくとも約１年間、または少なくとも約２年間、または少なくとも約３年間にわたってその生物活性の少なくとも約８０％をなおも維持する。次いで、この無菌凍結乾燥デバイスは、創傷部位に直接適用され得るか、または創傷上への配置の前に、血液もしくは他の無菌溶液のいずれかによって湿らされ得る。
【００６８】
ＰＤＧＦは、（特により高いｐＨでは）バイアルなどのコンテナの表面に接着する傾向を有するので、バイアル中で凍結乾燥ＰＤＧＦの１００％の再構成を達成することは、困難であり得る。したがって、ある特定の実施形態では、添加剤が、そのｐＨを約７未満、または約６未満、または約５未満または約４未満または約３未満まで低下させるために、ＰＤＧＦ溶液中に含められ得る。凍結乾燥ＰＤＧＦを再構成することを促進し得る添加剤には、塩、担体タンパク質、例えばアルブミン、または低ｐＨ溶液、例えば、希酢酸もしくは塩酸が含まれる。しかし、ＰＤＧＦ溶液が酸性すぎる場合、これは、生体適合性足場に負に影響し得る。したがって、ある特定の実施形態では、凍結乾燥ＰＤＧＦは、約５未満のｐＨを有する溶液中で再構成され、一旦ＰＤＧＦが実質的に完全に再構成されると、塩基溶液が、ＰＤＧＦ溶液のｐＨを、それを生体適合性足場と合わせる前に、約６〜約８の間に増加させるため、または約７に増加させるために、添加される。かかるｐＨ調整ステップは、生体適合性足場がコラーゲンスポンジである場合に、特に有用である。
【００６９】
凍結乾燥ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを再構成するために使用される緩衝溶液は、水、生理食塩水、炭酸塩、リン酸塩（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、ヒスチジン、酢酸塩（例えば、酢酸ナトリウム）、酸性緩衝液、例えば、酢酸およびＨＣｌ、ならびに有機緩衝液、例えば、リシン、Ｔｒｉｓ緩衝液（例えば、ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）アミノエタン）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ならびに３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）を含み得るが、これらに限定されない。好ましくは、この緩衝溶液は無菌である。緩衝液は、ＰＤＧＦとの生体適合性および望ましくないタンパク質改変を妨害する緩衝液の能力に基づいて選択され得る。緩衝液は、創傷組織との適合性に基づいてさらに選択され得る。一実施形態では、酢酸ナトリウム緩衝液が使用される。これらの緩衝液は、異なる容積モル濃度、例えば、約０．１ｍＭ〜約１００ｍＭ、約１ｍＭ〜約５０ｍＭ、約５ｍＭ〜約４０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約３０ｍＭ、もしくは約１５ｍＭ〜約２５ｍＭ、またはこれらの範囲内の任意の容積モル濃度で使用され得る。一部の実施形態では、酢酸塩緩衝液は、約２０ｍＭの容積モル濃度で使用される。
【００７０】
上記のように、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液は、治療組成物を形成するために担体と合わされる。この担体は、創傷が治癒する際の細胞付着および／もしくは脈管内殖のための基材として作用する、ならびに／あるいは（例えば、相互接続された孔などを介して）その構造内にＰＤＧＦを捕捉し、それによって、創傷が治癒する際のＰＤＧＦの進行する送達のまたは遅延もしくは延長された送達を可能にするための手段を提供する、マトリックスまたは足場であり得、このマトリックスまたは足場は、身体によって吸収される。一部の実施形態では、この担体またはマトリックスは、生体適合性の吸収性の細胞足場である。この担体またはマトリックスは、天然ポリマー、例えば、コラーゲン、ゼラチン、フィブリン、アルギネート、セルロース、キトサンまたはフィブロネクチンを含み得る。この担体またはマトリックスは、合成ポリマー、例えば、ポリ（ＤＬ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（ＤＬ−ラクチド）（ＰＤＬＡ）、ポリ（Ｌ−ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（ｅ−カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリウレタンなどの群から選択される合成生体適合性ポリマーもまた含み得る。この担体またはマトリックスはまた、かかる天然ポリマーと合成ポリマーとの混合物であり得る。一部の実施形態では、このマトリックスは、１型コラーゲンスポンジであり得る、コラーゲンまたはゼラチンスポンジを含む。コラーゲンスポンジは、ｒｈＰＤＧＦを創傷部位に保持し、同時発生的に、細胞成長のための足場を提供し、改善された使用者フレンドリーさおよびより迅速かつ完全な治癒を生じる。本発明の一態様では、コラーゲンスポンジであり得る担体またはマトリックスは、約１０ミクロン〜約２ｍｍの間、または約５０ミクロン〜約１０００ミクロンの間、または約１００ミクロン〜約５００ミクロンの間の多孔度を有する。平均孔径は、約５０ミクロン〜約５００ミクロンの間であり得、孔の大部分は相互接続されている。
【００７１】
一部の実施形態では、担体またはマトリックス材料は、生体吸収可能である。担体またはマトリックス材料は、一実施形態では、創傷へのその適用後１カ月以内に少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、９０％または１００％吸収され得る。生体吸収性は以下に依存する：（１）材料の性質（すなわち、その化学的構成、物理的構造およびサイズ）；（２）材料が配置される身体内の位置；（３）使用される材料の量；（４）患者の代謝状態（糖尿病／非糖尿病、喫煙者、年齢など）；ならびに（５）処置される創傷の程度および／または型。
【００７２】
本発明の一態様では、このｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液および担体は、創傷を治癒する際に最適な有効性を有する治療組成物を形成するために、適切な比で合わせるべきである。一部の実施形態では、このｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液および担体は、１ｃｍ３の担体（コラーゲンスポンジなどのマトリックスであり得る）当たり約４μｌのＰＤＧＦ溶液と１ｃｍ３の担体当たり約４０ｍｌのＰＤＧＦ溶液との間、または１ｃｍ３の担体当たり約０．１ｍｌのＰＤＧＦ溶液と１ｃｍ３の担体当たり約３０ｍｌのＰＤＧＦ溶液との間、または１ｃｍ３の担体当たり約０．２ｍｌのＰＤＧＦ溶液と１ｃｍ３の担体当たり約２０ｍｌのＰＤＧＦ溶液との間、または１ｃｍ３の担体当たり約０．１ｍｌのＰＤＧＦ溶液と１ｃｍ３の担体当たり約１０ｍｌのＰＤＧＦ溶液との間、または１ｃｍ３の担体当たり約０．２５ｍｌのＰＤＧＦ溶液と１ｃｍ３の担体当たり約５ｍｌのＰＤＧＦ溶液との間、または１ｃｍ３の担体当たり約０．２５ｍｌのＰＤＧＦ溶液と１ｃｍ３の担体当たり約２．５ｍｌのＰＤＧＦ溶液との間、または１ｃｍ３の担体当たり約０．１ｍｌのＰＤＧＦ溶液と１ｃｍ３の担体当たり約１ｍｌのＰＤＧＦ溶液との間、または１ｃｍ３の担体当たり約０．５ｍｌのＰＤＧＦ溶液と１ｃｍ３の担体当たり約１．５ｍｌのＰＤＧＦ溶液との間である比で合わされる。
【００７３】
一部の実施形態では、このｒｈＰＤＧＦ−ＢＢおよび担体は、１ｃｍ３の担体当たり約１．２μｇのＰＤＧＦと１ｃｍ３の担体当たり約１２ｍｇのＰＤＧＦとの間、または１ｃｍ３の担体当たり約３０μｇのＰＤＧＦと１ｃｍ３の担体当たり約９ｍｇのＰＤＧＦとの間、または１ｃｍ３の担体当たり約６０μｇのＰＤＧＦと１ｃｍ３の担体当たり約６ｍｇのＰＤＧＦとの間、または１ｃｍ３の担体当たり約７５μｇのＰＤＧＦと１ｃｍ３の担体当たり約３ｍｇのＰＤＧＦとの間、または１ｃｍ３の担体当たり約７５μｇのＰＤＧＦと１ｃｍ３の担体当たり約１．５ｍｇのＰＤＧＦとの間、または１ｃｍ３の担体当たり約７５μｇのＰＤＧＦと１ｃｍ３の担体当たり約７５０μｇのＰＤＧＦとの間、または１ｃｍ３の担体当たり約１２０μｇのＰＤＧＦと１ｃｍ３の担体当たり約６００μｇのＰＤＧＦとの間、または１ｃｍ３の担体当たり約１５０μｇのＰＤＧＦと１ｃｍ３の担体当たり約４５０μｇのＰＤＧＦとの間、または１ｃｍ３の担体当たり約７５μｇのＰＤＧＦと１ｃｍ３の担体当たり約２２５μｇのＰＤＧＦとの間である比で合わされる。
【００７４】
本発明の一態様では、この担体は足場であり、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ／足場比は、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ溶液および足場が合わされる場合、足場が、足場の孔内にｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの少なくとも約２０％、３０％、４０％または５０％から最大少なくとも約１００％を捕捉することが可能であり、その結果、患者の身体によって足場が吸収されるにつれてｒｈＰＤＧＦ−ＢＢが経時的に放出され、それによって、延びた期間にわたる創傷部位におけるｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの制御された送達を提供し、同時に、新たな細胞および組織内殖のためのマトリックスを提供するような比である。一部の実施形態では、この足場は、足場の孔内に、約２０％〜約１００％の間、または約２５％〜約９５％の間、または３０％〜約９０％の間のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを捕捉することが可能である。上記ＰＤＧＦ捕捉の百分率は、再構成された凍結乾燥ＰＤＧＦ−ＢＢの捕捉にも適用可能である。
【００７５】
種々の量のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢが、本発明の治療組成物中で使用され得る。本発明の一態様によれば、治療組成物中に含まれるｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの総量は、５０ｍｇ未満、または２５ｍｇ未満、または１０ｍｇ未満、または５ｍｇ未満、または２．５ｍｇ未満または１ｍｇ未満である。本発明の別の一態様によれば、治療組成物中に含まれるｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの総量は、約５０ｍｇ、または約２５ｍｇ、または約１０ｍｇ、または約１．０ｍｇ、または約０．５ｍｇ、または約０．１ｍｇである。
【００７６】
本発明の実施形態におけるＰＤＧＦの濃度は、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，２２１，６２５号、米国特許第５，７４７，２７３号および米国特許第５，２９０，７０８号に記載される酵素結合イムノアッセイ、またはＰＤＧＦ濃度を決定するための当該分野で公知の任意の他のアッセイを使用することによって、決定され得る。本発明の実施形態におけるＰＤＧＦの濃度は、約１０ｍｇ／ｇ未満、または約５ｍｇ／ｇ未満または約１ｍｇ／ｇ未満または約０．５ｍｇ／ｇ未満または約０．１ｍｇ／ｇ未満または約０．０５ｍｇ／ｍｌ未満である。本発明の別の一態様では、本発明の実施形態におけるＰＤＧＦの濃度は、約０．０５ｍｇ／ｇ〜約５ｍｇ／ｇの間、または約０．１ｍｇ／ｇ〜約１ｍｇ／ｇの間、または約０．２５ｍｇ／ｇと約０．５ｍｇ／ｇとの間である。
【００７７】
本発明の治療組成物中で使用されるＰＤＧＦ−ＢＢは、任意の供給源、例えば、天然供給源、合成供給源または組換え供給源に由来し得る。本発明の一態様によれば、ＰＤＧＦは、組換えＤＮＡ技術によって産生される。ＰＤＧＦが組換えＤＮＡ技術によって産生される場合、単一モノマー（例えば、ＰＤＧＦ  Ｂ鎖）をコードするＤＮＡ配列は、Ｂ鎖モノマーの発現のために培養細胞中に挿入される。次いで、このモノマーは細胞培養物から抽出および単離され、さらなる精製のためにさらに加工され得る生物学的に活性なホモダイマー（例えば、ＰＤＧＦ−ＢＢ）を形成するように再フォールディングされる。本発明の一態様によれば、この培養細胞は、原核生物細胞であり、またはＥ．ｃｏｌｉ細胞である。これらの組換え技術を介して産生されたｒｈＰＤＧＦ−ＢＢは、本明細書に組み込まれるＰＣＴ番号ＷＯ２００５／０７７９７３に概略された技術に従って精製され得る。
【００７８】
上記のように、先行技術の組換えＤＮＡ産生方法は、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ断片の混合物を生じてきた。本発明の一態様によれば、本明細書に記載される治療組成物中に含まれるｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの実質的に全ては、インタクトな非切断型鎖である。本発明の一態様によれば、細菌発現系は、Ｅ．ｃｏｌｉ発現系であり、得られたタンパク質は、逆相高速液体クロマトグラフィー、ゲル濾過もしくはイオン交換クロマトグラフィー、またはそれらの一部の組合せを使用して精製され、精製されたタンパク質組成物中に含有される得られたｒｈＰＤＧＦ−ＢＢは、重量基準で少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％の非切断型ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢである。
【００７９】
一部の実施形態では、本発明の治療組成物中に含まれるｒｈＰＤＧＦ−ＢＢは、以下に提供される配列番号１に対して少なくとも約９０％、約９２％、約９４％、約９６％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含むまたはかかるアミノ酸配列から本質的になるｒｈＰＤＧＦ−ＢＢである：
配列番号１：
【化１】
2017532346.tif 000003
【００８０】
本発明の別の一態様によれば、本発明の治療組成物中に含まれるｒｈＰＤＧＦ−ＢＢは、重量基準で少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約８５％、もしくは少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％の非切断型ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含むまたはかかるｒｈＰＤＧＦ−ＢＢから本質的になる。本発明の別の一態様によれば、本発明の治療組成物中に含まれるｒｈＰＤＧＦ−ＢＢは、少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約８５％、もしくは少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％の、配列番号１に対して少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含むまたはかかるアミノ酸配列から本質的になるｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含むあるいはかかるｒｈＰＤＧＦ−ＢＢから本質的になる。
【００８１】
一部の実施形態では、本発明の新規組成物を構成する成分は、キット中に提供される。キットは、３つの成分を含み得る：
ａ）無菌ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ凍結乾燥粉末のバイアル、
ｂ）無菌の水、緩衝液、生理食塩水または生理的溶液のバイアル、および
ｃ）担体。
このキットは、最大３年間にわたって室温で貯蔵され得る。一部の実施形態では、この貯蔵は、１６℃と３２℃との間である。一部の実施形態では、キット中に含まれる粉末は、所定の量のＰＤＧＦを含む。一部の実施形態では、ＰＤＧＦの量は、本明細書で提供される値と一致する。一部の実施形態では、担体は、所定の量の担体を含むブリスターパック中に含まれる。一部の実施形態では、担体の量は、本明細書で提供される値と一致し、担体の型は、本明細書に記載される材料と一致する。
【００８２】
使用時に、キット中のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢは、無菌の水、生理食塩水、緩衝液または生理的溶液で再構成され、担体は、創傷のサイズに成形される。創傷にフィットするように担体をトリミングした後、この担体は、その溶液が担体の内部孔を完全に飽和させるように、ｒｈＰＤＧＦ溶液で浸漬される。次いで、ｒｈＰＤＧＦ飽和した担体は、清拭された創傷に適用され、創傷包帯で覆われる。このプロセスは、本明細書で上記したタイミングスケジュールに従って反復される。
ＩＶ．種々の型の創傷を処置する方法
【００８３】
本発明の方法および組成物は、糖尿病性潰瘍、褥瘡、神経障害性潰瘍、脈管潰瘍、熱傷、偶発的急性創傷および外科的創傷を含む種々の創傷を処置する際に有用である。種々の創傷分類システムが存在し、本発明の方法および組成物が処置において特に有用である創傷を同定するために使用され得る。２つのかかる潰瘍分類システムには、Ｗａｇｎｅｒ分類システム（Wagner（１９８７年）Orthopedics  １０巻：１６３〜７２頁を参照のこと）およびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ分類システム（Lavery（１９９６年）J  Foot  Ankle  Surg  ３５巻：５２８〜３１頁を参照のこと）が含まれる。Ｗａｇｎｅｒシステムは、創傷の深さおよび感染の存在によって創傷をグレード分けする。これは、５つの数字グレードを有する：
グレード１：表在性糖尿病性潰瘍
グレード２：潰瘍の拡張
靱帯、腱、関節包または筋膜が関与する
膿瘍も骨髄炎もなし
グレード３：膿瘍または骨髄炎を有する深い潰瘍
グレード４：足先の一部分への壊疽
グレード５：足の広範な壊疽
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ分類は、創傷の深さに基づく４つの数字グレードを有する。さらに、感染および虚血に関連して、４つの文字グレードＡ〜Ｄが存在する。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ分類システムは以下を含む：
ステージ
ステージＡ：感染も虚血もなし
ステージＢ：感染が存在する
ステージＣ：虚血が存在する
ステージＤ：感染および虚血が存在する
グレード分け
グレード０：上皮化した創傷
グレード１：表在性創傷
グレード２：創傷は、腱または包まで到達する
グレード３：創傷は、骨または関節まで到達する
３の数字グレードおよびＤの文字グレードを有する創傷は、例えば、骨または関節まで到達する創傷であり、感染し虚血性である。本発明の一態様によれば、本発明の方法および組成物は、Ｗａｇｎｅｒ分類システムの下でグレード２、グレード３もしくはグレード４の創傷、またはＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ分類システムの下でグレード１、２もしくは３の創傷（ステージＡ、Ｂ、ＣもしくはＤ）のいずれかである創傷を処置するために使用される。
【００８４】
一部の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物は、創傷、例えば、糖尿病患者の下肢潰瘍、特に足潰瘍を処置するために使用され得る。本発明の方法および組成物は、背景技術において上記される現行の標準治療の下での約４週間の従来の治療の後で約５０％が治癒に失敗した非治癒性の下肢糖尿病性潰瘍を処置する際に特に有用である。
【００８５】
一部の実施形態では、本発明の組成物は、１：１．５または１：１．３メッシュにした分層皮膚移植（メッシュ化により、移植片がより広い領域を覆うことが可能になるが、治癒が必要な小さい開口部が残る）、腹壁形成術（いわゆる「タミータック（tummy  tuck）」）、他の型の形成手術および再建手術後の治癒、または肢切断後創傷と組み合わせて、熱傷を処置するために使用される。
Ｖ．さらなる治療要素
【００８６】
本発明の治療組成物は、創傷の治癒をさらに促進するために、さらなる治療要素を含み得る。一部の実施形態では、ＰＤＧＦを含む溶液は、さらなる成分、例えば、他の生物学的に活性な薬剤をさらに含み得る。他の実施形態では、ＰＤＧＦを含む溶液は、細胞培養培地、他の安定化タンパク質、例えばアルブミン、抗菌剤、プロテアーゼ阻害剤［例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール−ビス（ベータ−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、アプロチニン、ε−アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）など］ならびに／あるいは他の増殖因子、例えば、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、またはＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣおよび／もしくはＰＤＧＦ−ＤＤの組成を含む他のＰＤＧＦをさらに含み得る。さらに、ＰＤＧＦに加えて本発明の組成物中に取り込まれ得る生物学的に活性な薬剤は、有機分子、無機材料、タンパク質、ペプチド、核酸（例えば、遺伝子、遺伝子断片、小分子挿入（small  insert）リボ核酸［ｓｉ−ＲＮＡ］、遺伝子調節配列、核転写因子およびアンチセンス分子）、核タンパク質、多糖（例えば、ヘパリン）、糖タンパク質およびリポタンパク質を含み得る。例えば、抗がん剤、抗生物質、鎮痛剤、抗炎症剤、免疫抑制薬、酵素阻害剤、抗ヒスタミン剤、ホルモン、筋弛緩剤、プロスタグランジン、栄養因子、増殖因子およびワクチンが含まれる、本発明の組成物中に取り込まれ得る生物学的に活性な化合物のさらなる非限定的な例は、米国特許出願第１１／１５９，５３３号（特許出願公開第２００６００８４６０２号）に開示されている。
【００８７】
さらなる生物学的に活性な薬剤の送達のための標準的なプロトコールおよびレジメンは、当該分野で公知である。さらなる生物学的に活性な薬剤は、適切な投薬量の薬剤の創傷部位への送達を可能にする量で、本発明の組成物中に導入され得る。ほとんどの場合、投薬量は、実務者に公知のガイドラインを使用して決定され、問題になっている特定の薬剤に適用可能である。本発明の組成物中に含まれるさらなる生物学的に活性な薬剤の量は、状態の型および程度、特定の患者の全体的健康状態、生物学的に活性な薬剤の製剤、放出速度論、ならびに生体適合性足場の生体吸収性などの変数に依存し得る。標準的臨床試験は、任意の特定のさらなる生物学的に活性な薬剤のための用量および投薬頻度を最適化するために使用され得る。
【実施例】
【００８８】
（実施例１）
０．３ｍｇ／ｍｌの組換えヒト血小板由来増殖因子−ＢＢ（ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ）を含有するコラーゲン創傷包帯の効力を、レプチン受容体中の変異によって糖尿病にされたマウス（ｄｂ／ｄｂ）において外科的に誘導した全厚創傷の処置において評価した。
Ａ．研究設計
【００８９】
４１．４６ｇの平均出発体重を有する１５匹の雄性Ｃ５７／Ｂ６（Ｌｅｐｒｄｂ）ｄｂ／ｄｂマウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）系統コード０００６４２から取得した。動物を、研究開始前に順化した。３日間のこの期間の間、状態が不良な動物を不合格にするために、これらの動物を毎日観察した。
【００９０】
研究の間、全ての動物を、使い捨てケージ中に同一の条件下で１匹ずつ収容した。研究を、ＨＥＰＡ濾過空気を提供した動物飼育室中で、華氏７０度＋／−華氏５度の温度および５０％＋／−２０％の相対湿度で実施した。動物飼育室を、１時間当たり最低でも１２〜１５回の空気交換を維持するように設定した。飼育室を、薄暮なしに、１２時間のオンおよび１２時間のオフの明／暗サイクルの自動タイマーにかけた。ＡｌｐｈａＤｒｙ（登録商標）寝床を使用した。寝床を、最低でも１週間に１回交換した。ケージ、蓋、ビンなどは、市販の洗剤で洗浄し、風乾させた。市販の消毒剤を使用して、フード中に導入した表面および材料を殺菌した。床を毎日掃き掃除し、市販の洗剤を用いて最低でも１週間に２回モップがけした。壁およびケージラックを、希釈漂白剤溶液を用いて最低でも１カ月に１回スポンジで拭いた。研究、用量、動物番号および処置群を特定するために必要な適切な情報を有するケージカードまたはラベルで、全てのケージにマークした。温度および相対湿度を、研究の間記録し、記録を残した。動物に、無菌Ｐｕｒｉｎａ  Ｌａｂｄｉｅｔ（登録商標）５０５３げっ歯類食餌を給餌し、無菌化水を適宜に提供した。
【００９１】
研究の開始時に、１５匹の動物を、各々５匹の動物の３つの群へと、無作為かつ前向きに分割した：
群１−Ｒｅｇｒａｎｅｘゲル０．０１％ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを、添付文書によって処方されたように、２１日間毎日適用した；
群２−緩衝液と合わせたコラーゲン創傷包帯を、０日目、７日目および１４日目に適用した；ならびに
群３−０．３ｍｇ／ｍｌの組換えヒト血小板由来増殖因子−ＢＢ（ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ）を含有するコラーゲン創傷包帯を、０日目、７日目および１４日目に適用した。
各動物は、個体番号に対応する耳パンチによって同定した。０日目に、平均出発重量を記録して、平均出発重量が群間で同等であることを確実にした。ケージカードを使用して、研究番号（ＬＹＮ−０１）、処置群番号および動物番号でマークした各ケージまたはラベルを同定した。
【００９２】
試験および対照コラーゲン＋／−ＰＤＧＦ物品を、創傷の誘導直後に、（以下に記載するように）外科的包帯として外用投与し、７日毎（Ｑ７）に交換した。Ｒｅｇｒａｎｅｘ処置部位を、以下に概略した毎日の投薬を含む、製品添付文書中に含まれる使用のための指示書（ＩＦＵ）に処方されるように処置した。全ての包帯を、Ｔｅｇａｄｅｒｍ（商標）を使用して適所に適用および保持し、ベンゾインを用いて創傷領域の外側の適所で固定した。包帯交換時に、創傷領域を生理食塩水でリンスし、リンス液を収集し、プロテアーゼ活性のさらなる分析のために−８０℃で貯蔵した。コラーゲン創傷包帯で処置した部位について、全ての非接着性コラーゲンを、治癒している創傷から穏やかに除去し、記載したように、部位を生理食塩水でリンスし、リンス液を収集した。包帯の除去およびリンス液の収集後、創傷を、包帯／試験物品の再適用前に、ノギスを使用して測定し、写真撮影した。全ての創傷面積はｍｍ２で報告した。
【００９３】
創傷治癒の写真記録のために、全ての写真が一貫することを確実にするために最適な距離で、カメラを三脚上に取り付けた。病変サイズの正確な推定を可能にするために画像中に捕らえられるように、定規を配置した。創傷面積の生前測定に加えて、創傷の全ての写真を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して分析し、創傷領域をトレースし、研究の結論において定量した。
【００９４】
血中グルコースレベルを、研究の開始前に決定し、２１日目の屠殺の直前に再度決定して、糖尿病の疾患状態を確認した。研究終結時に、創傷部位を１０％ＮＢＦ中に収集し、病理組織診断のために調製した。研究設計を以下の表１中にまとめる。
【００９５】
【表１】
2017532346.tif 000004
Ｂ．試験物品およびビヒクル調製
【００９６】
研究で使用した外用製剤は、Ｒｅｇｒａｎｅｘゲル（カルボキシメチルセルロースゲル中０．０１％のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ）（群１）；ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢで湿らせたコラーゲン創傷包帯（群３）；および生理食塩水で湿らせたコラーゲン創傷包帯（群２）であった。全ての包帯をＴｅｇａｄｅｒｍ（商標）で覆い、ベンゾインで固定した。
１．包帯組成物
ａ．群１  ｒｈＰＤＧＦ投薬量
【００９７】
Ｒｅｇｒａｎｅｘ添付文書に記載されるように、「各平方センチメートルの潰瘍表面積は、１５グラムチューブから絞り出されたおよそ０．２５ｃｍの長さのゲルを必要とする」。式：（ｌ×ｗ）÷４＝ｃｍ長さのＲｅｇｒａｎｅｘ。１．５ｃｍ×１．５ｃｍ平方の創傷について：（１．５×１．５）÷４＝０．５６ｃｍ長さのＲｅｇｒａｎｅｘ。Ｒｅｇｒａｎｅｘ添付文書に記載されるように、「１５ｇチューブからのＲｅｇｒａｎｅｘゲルの重量は、０．２５ｇ／ｃｍ長さである」。Ｒｅｇｒａｎｅｘは、０．０１％のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢまたは１００μｇ／ｇのＲｅｇｒａｎｅｘである。製品の長さ０．５６ｃｍについて、製品の重量は、１４μｇのＰＤＧＦ−ＢＢの総用量のために０．１４ｇである。Ｒｅｇｒａｎｅｘで２１日間処置した部位について、研究期間にわたる最大総用量（０日目から開放創傷サイズには変化がないものとする）は、１４μｇ／日×２１日間または２９４μｇのＰＤＧＦ−ＢＢである。しかし、７日目および１４日目に、開放創傷サイズを、全てのＲｅｇｒａｎｅｘ処置部位について決定し、適用するＲｅｇｒａｎｅｘの量を、上記式（［ｌ×ｗ］÷４＝ｃｍ長さのＲｅｇｒａｎｅｘ）を使用して再計算した。
ｂ．群３  ｒｈＰＤＧＦおよび群２  生理食塩水投薬量
【００９８】
研究において使用したｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの濃度は、０．３ｍｇ／ｍｌまたは３００μｇ／ｍｌであった。研究期間にわたる２９４μｇのＰＤＧＦ−ＢＢの総用量（Ｒｅｇｒａｎｅｘと同じ総最大研究用量）を超えないように、０．３ｍｇ／ｍｌのＰＤＧＦ−ＢＢの合計０．９８ｍｌを、２１日の研究期間にわたって創傷部位に適用する。合計３回の投与（０日目、７日目および１４日目）を仮定すると、各投与は、およそ９８μｇのＰＤＧＦＢＢ／投与（Ｒｅｇｒａｎｅｘ処置部位について、７×初期の個々の用量よりも僅かに多い）の用量を示す、コラーゲンスポンジ上への約３２７μｌのＰＤＧＦ−ＢＢからなる。これは、開放創傷表面積の平方センチメートル当たり合計１４５μｌ（３２７μｌ／２．２５ｃｍ２創傷表面積）を示す。
【００９９】
７日目および１４日目に新たなコラーゲンスポンジに適用する０．３ｍｇ／ｍｌのＰＤＧＦ−ＢＢ（群３）または緩衝液／無菌生理食塩水（群２）の容積を、以下の式を使用して決定した：
１４５×ｃｍ２開放創傷表面積（開放創傷の長さ［ｃｍ］×幅［ｃｍ］）。
ｃ．コラーゲンスポンジ
【０１００】
群１で処置した部位について上記したように、全ての創傷を、７日目および１４日目に評価および測定して、各個々の部位について開放創傷測定値を記録した。コラーゲンスポンジ（群２および群３）で処置した部位について、包帯の除去、部位の穏やかなリンス、ならびに測定値および写真記録を含む知見の文書化後に、スポンジを測定し、元の創傷の開放創傷部分にフィットするようにトリミングした。
Ｃ．外科的手順
【０１０１】
０日目に、動物を、イソフルランで麻酔した。背中の毛を刈り込み、皮膚を無菌性溶液で拭き取った。鋳型を使用して、動物の背中中央の１．５×１．５ｃｍ平方をマークし、鋳型に対応する全厚創傷を、皮膚および肉様層（panniculus  carnosus）を切除することによって作成した。熱水循環パッドまたは等価物を動物の下に配置して、手順の間に正常体温を維持し、類似の熱水循環パッド上で動物を回復させた。ブプレノルフィン（０．０６ｍｇ／ｋｇ）を、麻酔からの回復の直後およびその後７２時間にわたって１２時間毎に、皮下注射によって与えた。温リンゲル溶液（０．５ｍＬ）を、マウスが意識を回復した後に、皮下注射によって与えた。動物の創傷形成を、無菌的条件下で実施した。創傷部位を、写真撮影し、切除の直後におよびその後毎日、デジタルノギスを使用して長さおよび幅を測定した。０日目から２１日目まで、マウスに、表１に列挙したように試験物品を投与した。
Ｄ．研究結果
１．動物生存
【０１０２】
３匹の動物が死亡し、またはこの研究の間に早めに安楽死させた（全ての動物が群１−Ｒｅｇｒａｎｅｘ由来）。第１の動物は、手術の１日後に死亡していることが見出された（動物番号３）。第２の動物（動物番号１）は、創傷部位に対して後側の後部側腹部の自己切断に起因して、５日目に屠殺しなければならなかった。群１中の動物番号５は、その出発体重の２０％超を喪失した結果として、１６日目に屠殺しなければならなかった。以下の表２は、動物の死亡／屠殺をまとめる：
【０１０３】
【表２】
2017532346.tif 000005
２．創傷測定
【０１０４】
創傷領域を、デジタルノギスを使用して測定し、各創傷の長さ（Ｌ）および幅（Ｗ）を記録した。創傷面積を、式Ａ＝Ｌ×Ｗを使用して計算して、方形の面積を計算した。図１は、０日目、７日目、１４日目および２１日目の、各群についての創傷の面積を示す。ピーク創傷面積が、３つ全ての群について０日目に記録され、引き続いて、７日目、１４日目および２１日目に平均創傷面積は減少した。全ての処置群は、研究の過程の間に、創傷面積におけるかなりの減少を示した。
【０１０５】
方形の形状中の、治癒されない可能性がある（したがって、上で使用した式では捕捉されない）創傷についてのさらなる測定および説明を提供するために、創傷の内側もまた、ＩｍａｇｅＪ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（商標）を使用して内側創傷端をトレースすることによって測定した。図２は、各処置群についての、このアプローチを使用した各動物からの創傷面積を示す。図３〜６は、評価日に記録した個々の測定値のより詳細な評価を提供するための、散布図としての、評価日（０日目、７日目、１４日目および２１日目）による全ての処置群についての平均創傷面積を示す。研究の間に死亡した動物について、最後のデータポイントが図３〜６において繰り越される。図７Ａは、本発明の重要な態様、すなわち、治療組成物のより少ない適用を用いて肯定的な結果が達成されることを強調している。図７Ａは、群１および３についての、４つの時点（０日目、７日目、１４日目および２１日目）の各々における処置の累積数当たりの創傷面積低減の量（ｍｍ２）を示す。図７Ｂは、研究の過程にわたる各群についての創傷閉鎖の平均パーセントを示す。死亡した動物について、最後のデータポイントを繰り越した。
３．臨床評価
【０１０６】
創傷画像を、再上皮化および肉芽組織の形成に関して、治癒の程度における起こりうる差異についても臨床的に評価した。各時点における各動物からの創傷の代表的画像が、０日目（図８Ａ）、７日目（図８Ｂ）、１４日目（図８Ｃ）および２１日目（図８Ｄ）から、図８に示される。各処置からの生画像は、群３（ｒｈＰＤＧＦ／コラーゲンスポンジ群）が、群２（緩衝液で処置したコラーゲンスポンジ対照群）と比較して、肉芽組織の形成および再上皮化において実証可能な加速を生じたことを示している。さらに、Ｒｅｇｒａｎｅｘで毎日処置した創傷（群１）もまた、群２（緩衝液対照＋コラーゲン）と比較して、より良い創傷閉鎖速度を示した。創傷領域のホルマリン固定試料に対する病理組織学もまた実施し、緩衝液対照処置スポンジと比較して、ｒｈＰＤＧＦ／コラーゲンによる処置およびＲｅｇｒａｎｅｘ処置創傷から生じる加速された創傷治癒をさらに実証した。病理学もまた、Ｒｅｇｒａｎｅｘ処置を超えた、ｒｈＰＤＧＦ／コラーゲンで処置した創傷における再上皮化におけるなおさらなる改善を示唆している。
【０１０７】
病理組織学的試料の代表的試料は、図９に提供され、この図は、群１−動物２（図９Ｅおよび９Ｆ）、群２−動物２（図９Ａおよび９Ｂ）および群３−動物１（図９Ｃおよび９Ｄ）を含む、３匹の研究動物からの２１日目の創傷部位の断面の一連の顕微鏡写真を含む。顕微鏡写真の各セットについて、２×の倍率（図９Ａ、９Ｃおよび９Ｅ）および１０×の倍率（図９Ｂ、９Ｄおよび９Ｆ）が示される。
【０１０８】
群１に関して、図９Ｅおよび９Ｆは、創傷が２１日目に１００％表面再生されたが、いくらかの剪断が、真皮−上皮構造の脆弱性に起因して明らかであったことを示している。図９Ｅ中の矢印６０は、左側の隣接表皮および右側の創傷床のおよその位置を示す。図９Ｆは、創傷の中央部からのより高い倍率の画像を提供する。１００％の上皮による表面再生が明らかであり、表皮における分化した層形成の存在は、その成熟度を示す。新生真皮（neodermis）は、高密度の毛細血管をなおも含有し、新たなコラーゲン形成が進行中である。
【０１０９】
群２に関して、顕微鏡写真は、コラーゲンスポンジの一部分が、２１日間にわたって創傷床中に残ったことを示している。この創傷端において、スポンジは、上による表面再生を妨害するようであった。図９Ａ中の矢印１０は、創傷端を示す。図９Ａで見られるように、いくらかの肉芽組織が、コラーゲンスポンジの下に発生した。図９Ｂを参照すると、コラーゲンスポンジおよび肉芽組織がそれぞれ矢印２０および３０によって示される。示されるように、コラーゲンスポンジは、この領域において接着性に見えたが、細胞による浸潤は最小である。スポンジの下に形成された古典的肉芽組織が示される。
【０１１０】
群３に関して、図９Ｃおよび９Ｄは、創傷が表皮で１００％表面再生されることを示している。図９Ｃ中の矢印４０は、創傷床のおよその端を示し、領域５０は皮下脂肪である。図９Ｄは、創傷の中央部内で撮影され、元のコラーゲンスポンジの全ての証拠がなくなったことを示している。創傷は、１００％表面再生され、成熟度を示す角質層で十分に層形成されている。新生真皮は、新たなコラーゲン産生の証拠を示し、細胞充実性は減少しており、これは、真皮組織が成熟しつつあり、肉芽組織の未成熟な特徴を喪失しつつあることを示している。
Ｅ．研究結論
【０１１１】
以下の結論がこの研究から下された：
（１）Ｒｅｇｒａｎｅｘの２１回の適用を群１において施したが、緩衝液／コラーゲンまたはｒｈＰＤＧＦ／コラーゲン創傷包帯の適用３回だけを、それぞれ群２および３において適用した。
（２）群１（Ｒｅｇｒａｎｅｘ）の３匹の動物は、死亡していることが見出されたか、または研究の生前部分の間に安楽死させなければならなかった。
（３）全ての処置群は、ノギス測定値およびＩｍａｇｅＪソフトウェア分析を使用した創傷トレースの両方によって決定される、０日目から２１日目までの創傷面積における減少を示した。屠殺時（２１日目）に、５つのＲｅｇｒａｎｅｘ処置創傷のうち２つ、５つのｒｈＰＤＧＦ／コラーゲン処置創傷のうち３つ、および５つのコラーゲン包帯処置創傷のうち０個が治癒した。
（４）各処置からの生画像は、群３（ｒｈＰＤＧＦ／コラーゲン）が、緩衝液で処置したコラーゲン創傷包帯対照群（群２）と比較して、肉芽組織の形成および再上皮化において実証可能な加速を生じることを示している。さらに、Ｒｅｇｒａｎｅｘで毎日処置した創傷（群１）もまた、対照コラーゲンスポンジ処置動物と比較して、より良い閉鎖速度を示した。
（５）創傷再上皮化によって評価される治癒は、Ｒｅｇｒａｎｅｘの２１回の適用（群１）または生理食塩水で湿らせたコラーゲン創傷包帯の３回の適用と比較して、ｒｈＰＤＧＦ／コラーゲンの３回の適用（群３）で処置した創傷において最大であった。
（６）ｒｈＰＤＧＦ／コラーゲンの３回の毎週適用（群３）は、コラーゲン創傷包帯（群２）と比較して、肉芽組織形成および再上皮化を含む創傷閉鎖を加速させ、２１回の毎日用量のＲｅｇｒａｎｅｘゲル（群１）と少なくとも同等に有効なようである。
（７）ｒｈＰＤＧＦ／コラーゲンは、安全かつ有効であり、市販のコラーゲン創傷包帯と比較して、糖尿病性創傷のより良好な治癒を促進する。５つのｒｈＰＤＧＦ／コラーゲン処置創傷のうち３つは、５匹のコラーゲン創傷包帯処置動物のうち０匹と比較して、完全な再上皮化によって明らかなように、完全に治癒した。
（８）ｒｈＰＤＧＦ／コラーゲンは、安全かつ有効であり、市販のコラーゲン創傷包帯と比較して、組織学的に実証されたように、血管形成、肉芽組織形成および再上皮化を促進する。
（９）ｒｈＰＤＧＦ／コラーゲン無菌製品は、組織学的に実証されたように、高度に生体適合性である。
（１０）ｒｈＰＤＧＦ／コラーゲンは、Ｒｅｇｒａｎｅｘゲルよりも適用がかなり容易であり、患者コンプライアンスを改善するはずである。
（１１）Ｒｅｇｒａｎｅｘを受けた動物は高い死亡率を有したが、かかる死亡率はｒｈＰＤＧＦ／コラーゲンまたはコラーゲン創傷包帯では観察されなかったということを考慮すると、ｒｈＰＤＧＦ／コラーゲンはＲｅｇｒａｎｅｘよりも安全であり得る。
（実施例２）
仮想例
【０１１２】
本明細書に記載される新規治療組成物および創傷処置方法の効力を実証するための研究を実施する。実施例１について概略した同じ研究設計を、５つの試験群−標準治療群（生理食塩水で湿潤させたガーゼ）、Ｒｅｇｒａｎｅｘ群、コラーゲンスポンジ群、およびＰＤＧＦ−ＢＢとコラーゲンスポンジとを含む本発明に従う処置組成物を利用する２つの群で、ｄｂ／ｄｂマウスモデルを含むこの研究にも使用する。しかし、以下に詳述するように、投薬の頻度は、この研究において変化させる。この研究はまた、Ｒｅｇｒａｎｅｘ群およびコラーゲンスポンジ／ＰＤＧＦ−ＢＢ群の両方において研究の過程にわたって送達されるＰＤＧＦの総用量が同じになるように、設計する。
Ａ．実験設計
【０１１３】
実験設計を、実施例１に記載される研究の結果によって精密化するが、１群当たりの動物の数はより多く（すなわち、８匹）、研究持続時間はより長く、すなわち、２８日間であることが理解される。さらに、試験および対照コラーゲン＋／−ＰＤＧＦ物品を、本明細書に記載される新規組成物および処置方法に従って、創傷の誘導直後および合計２回の適用について約１４日目に（群５）、または手術の直後ならびに試験物品の合計４回の適用について７日目、１４日目および２１日目に、創傷包帯として外用投与する（表Ｘを参照のこと）。陰性対照（生理食塩水で湿潤させたガーゼ）およびＲｅｇｒａｎｅｘ処置部位は、処方された使用のための指示書に従って、創傷包帯として２８回の毎日の外用投与を受ける。
【０１１４】
この実施例では、血中グルコースレベルを、研究の開始前に決定し、２８日目の屠殺の直前に再度決定して、糖尿病の疾患状態を確認する。全ての他の態様では、この研究の設計は、実施例１に記載されるものと同じである。研究の詳細を、以下の表３中に概略する。
【０１１５】
【表３】
2017532346.tif 000006
【０１１６】
研究の期間にわたって毎日、処置群間での動物応答における起こりうる視覚的差異を評価するために、各動物を検査し、その生存を記録する。創傷閉鎖の速度を決定し、任意の所与の時点で完全に治癒した創傷の百分率もまた決定する。
Ｂ．ＰＤＧＦ−ＢＢ用量計算
【０１１７】
この研究で使用したＰＤＧＦ投薬量は、本発明（群４および５）またはＲｅｇｒａｎｅｘラベルに従って処方された実際の治療用量（群２）のいずれかに従う実際の治療用量を模倣するように設計する。群２についての投薬量を、実施例１のＲｅｇｒａｎｅｘ群と同じ様式で決定する。２８日間にわたってＲｅｇｒａｎｅｘで処置した部位について、研究期間にわたって投与されるＰＤＧＦの総用量は、１４μｇ／日×２８日間または３９２μｇのＰＤＧＦ−ＢＢである。この用量は、６．２２μｇ／ｃｍ２／日または１７４．２μｇ／ｃｍ２のＰＤＧＦ−ＢＢの、元の創傷サイズの面積当たりのＰＤＧＦの量（「面積用量」）としても表され得る。
【０１１８】
群４および５について、０．３ｍｇ／ｍｌまたは３００μｇ／ｍｌのＰＤＧＦ濃度を有するＰＤＧＦ溶液を使用する。３９２μｇのＰＤＧＦ−ＢＢの、研究期間にわたる総用量（Ｒｅｇｒａｎｅｘ群と同じ総研究用量）を達成するために、合計で１．３０７ｍｌのＰＤＧＦ溶液を、２８日の研究期間にわたって創傷部位に適用する。７日毎に１回包帯交換を受ける部位について、合計４回（０日目、７日目、１４日目および２１日目）投与する。各投与は、コラーゲンスポンジ上への３２７μｌのＰＤＧＦ−ＢＢ（または緩衝液単独）からなる。ＰＤＧＦの用量に関して、各投与は、０．３μｇ／μｌ×３２６μｌまたは９８ｕｇのＰＤＧＦ−ＢＢ（およそ７×のＲｅｇｒａｎｅｘの個々の用量）からなる。０日目および１４日目に２回の用量のみを受ける部位について、合計２回投与する。各投与は、コラーゲンスポンジ上への６５４μｌのＰＤＧＦ−ＢＢからなる。各投与は、０．３μｇ／μｌ×６５４μｌまたは１９６ｕｇのＰＤＧＦ−ＢＢ（およそ１４×のＲｅｇｒａｎｅｘの個々の用量）からなる。これらの用量は、元の創傷サイズの面積当たりのＰＤＧＦの量（「面積用量」）としても表され得る。群４に関して、ＰＤＧＦ用量は、４３．５μｇ／ｃｍ２／用量または１７４μｇ／ｃｍ２のＰＤＧＦ−ＢＢである。群５に関して、ＰＤＧＦ用量は、約８７μｇ／ｃｍ２／用量または１７４μｇ／ｃｍ２のＰＤＧＦ、すなわち、全ての群において同じ累積用量であるが、群４および５は、はるかに少ない用量を有する。
（実施例３）
仮想例
【０１１９】
無作為化臨床試験を実施して、慢性糖尿病性足部潰瘍の処置における、標準治療（過剰な創傷滲出物の除去を伴う湿潤創傷治癒、壊死組織の清拭、圧力の解放、生理食塩水で湿潤させたガーゼ、必要に応じた抗生物質、および創傷包帯からなる）およびＲｅｇｒａｎｅｘと比較した、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢとコラーゲンとの種々の組成物の有効性を評価する。以下の表４は、研究設計をまとめる。研究の各アーム（１〜３７）について、製品を、最大２０週間にわたってまたは完全な創傷閉鎖まで、表４に示される投薬量および頻度で適用する。Ｒｅｇｒａｎｅｘは、その承認されたＵＳラベリングに従って適用する。ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ／コラーゲン組成物は、第５０段落中に上記した手順（ステップ１〜５）に従って適用する。
【０１２０】
この研究のための転帰尺度は以下である：
・完全な創傷閉鎖の発生率。
・完全な創傷閉鎖を達成するまでの時間。
・各来診時の総潰瘍表面積における百分率低減。
・創傷治癒の１２週間後に観察された潰瘍再発の数。
・処置により発生する有害事象（最大５２週間）。
【０１２１】
研究のための組入れ基準は以下を含む：
・１型または２型糖尿病を有する、１８歳またはそれ超の男性または女性
・処置した足上に単一の潰瘍を有する患者
・インフォームドコンセントを提供することができ提供する意志がある患者
・プロトコールの来診および手順に従うことができ従う意志がある患者
・研究の全持続時間の間に解放方法を使用する意志がある患者
・趾間部潰瘍（趾間）を除き、骨、腱、靱帯または筋肉は関与しないが表皮および真皮を通じて拡張する、四肢（踝の下）の全厚足底、外側または背側潰瘍（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ糖尿病性創傷分類によって規定されるグレードＩＡまたはＷａｇｎｅｒ分類に従うグレード１）
・適切な創傷ケアにもかかわらず少なくとも６週間の慢性潰瘍
・共に包括的な１〜１０ｃｍ２の、鋭い清拭（sharp  debridement）後の式：長さ×幅×０．８で測定した潰瘍面積
・ベースライン来診前の十分に制御された感染または蜂巣炎（全身抗生治療（antibiotherapy））
・Ｓｅｍｍｅｓ−Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎモノフィラメント試験または生体知覚計（bio  esthesimeter）（振動覚閾値）によって評価される末梢性ニューロパチー
・足関節・上腕血圧指数＞０．６０かつ＜１．３
・手術により生殖不能の、閉経後の、または適切な避妊を実施することに同意し、スクリーニングの時点において妊娠試験陰性の女性
・看護なし
【０１２２】
研究のための除外基準は以下を含む：
・趾間部潰瘍
・他の原因または起源の潰瘍：電気的、化学的もしくは放射線傷害、床ずれ、脈管潰瘍またはシャルコー変形（Charcot  deformity）潰瘍
・シャルコー足（Charcot  foot）
・肢切断ベッド（amputation  bed）に起源する創傷
・必要に応じて臨床試験およびＸ線検査によって評価される活動性潰瘍感染。清拭によって除去できず、標準的創傷ケアによって制御できない壊死、化膿または洞管の存在。
・標的潰瘍の領域に影響を与える活動性骨髄炎
・制御不良の糖尿病（制御されない糖血症：ＨｂＡ１ｃ％＞＝１０％）、腎不全（血清クレアチニン＞３．０ｍｇ／ｄＬ）、栄養状態不良（アルブミン＜３．０ｇ／ｄＬまたは総タンパク質＜６．５ｇ／ｄＬ）
・既知の結合組織疾患または悪性疾患
・コルチコステロイド、免疫抑制剤、放射線療法または抗がん化学療法との併用処置
・３０日以内の調査薬物／デバイスまたは増殖因子の使用
・７日以内のこの創傷に対する任意の事前の創傷ケア（消毒薬、抗生物質、デブリダー（debrider）、酵素）の外用適用
・８週間以内の脈管再構築
・プロトコールに従わないと予測される患者（試験、処置または創傷ケアのコンプライアンスの持続時間の間対応できない）、または任意の他の理由のために調査者によって不適切と感じられる患者
・重症脳血管事象の病歴
【０１２３】
【表４】
2017532346.tif 000007
【０１２４】
ｒｈＰＤＧＦ／コラーゲンスポンジ組成物の各々は、これらの転帰尺度のうち少なくとも１つにおいてＲｅｇｒａｎｅｘもしくは標準治療よりも良好に機能し、および／または処置期間にわたって適用されるより少ない累積ｒｈＰＤＧＦの適用もしくはより少ない処置の適用と実質的に等価な結果を達成し、より良い患者コンプライアンスをもたらす。
【０１２５】
本明細書に記載される実施形態、バリエーションおよび配列は、本発明の有用性および多用途性の指標を提供するはずである。本明細書に示される特徴および利点の全てを提供するわけではない他の実施形態もまた、本発明の精神および範囲から逸脱することなしに利用され得る。かかる改変およびバリエーションは、本発明の範囲内とみなされる。
【図１】
2017532346.tif 000008
【図２】
2017532346.tif 000009
【図３】
2017532346.tif 000010
【図４】
2017532346.tif 000011
【図５】
2017532346.tif 000012
【図６】
2017532346.tif 000013
【図７Ａ】
2017532346.tif 000014
【図７Ｂ】
2017532346.tif 000015
【図８−１】
2017532346.tif 000016
【図８−２】
2017532346.tif 000017
【図８−３】
2017532346.tif 000018
【図９Ａ】
2017532346.tif 000019
【図９Ｂ】
2017532346.tif 000020
【図９Ｃ】
2017532346.tif 000021
【図９Ｄ】
2017532346.tif 000022
【図９Ｅ】
2017532346.tif 000023
【図９Ｆ】
2017532346.tif 000024
【手続補正書】
【提出日】平成29年6月13日(2017.6.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2017532346000001.app
【国際調査報告】
2017532346.tif 000025
2017532346.tif 000026
2017532346.tif 000027