(57)【要約】  ミリスチン酸及びレプチン関連ペプチドのコンジュゲートである肥満関連障害の治療のための医薬化合物。好ましくは、レプチン関連ペプチドは、Leu-4でD置換されているOB3である。得られたコンジュゲートは、送達経路に応じて半減期を1時間未満から28時間もの長さまで延長し、取り込みを増加させ、血漿クリアランスの速度を低下させ、最小有効用量を数倍低下させることを可能にすることによってレプチン関連ペプチドの薬物動態プロファイルを著しく改善した。
2017532292.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レプチン関連ペプチドにコンジュゲートしたミリスチン酸を含む医薬化合物。
【請求項２】
ミリスチン酸がレプチン関連ペプチドのN末端に結合している、請求項1に記載の医薬化合物。
【請求項３】
レプチン関連ペプチドがOB3である、請求項2に記載の医薬化合物。
【請求項４】
レプチン関連ペプチドが配列番号16である、請求項3に記載の医薬化合物。
【請求項５】
レプチン関連ペプチドが少なくとも1個のDアイソフォームアミノ酸を含有する、請求項4に記載の医薬化合物。
【請求項６】
レプチン関連ペプチドがLeu-4でD置換されている、請求項5に記載の医薬化合物。
【請求項７】
レプチン関連ペプチドが配列番号1である、請求項3に記載の医薬化合物。
【請求項８】
レプチン関連ペプチドにコンジュゲートしたミリスチン酸の分子の薬学的に有効な量を投与する工程を含む、対象の体重の恒常性に関連する状態を治療するための方法。
【請求項９】
ミリスチン酸がレプチン関連ペプチドのN末端に結合している、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
レプチン関連ペプチドがOB3である、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
レプチン関連ペプチドが配列番号1である、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
レプチン関連ペプチドが少なくとも1個のDアイソフォームアミノ酸を含有する、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
レプチン関連ペプチドがLeu-4でD置換されている、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
レプチン関連ペプチドが配列番号16である、請求項10に記載の方法。
【請求項１５】
状態が、肥満、高血糖、高インスリン血症、過食症、甲状腺機能障害、不妊症又は糖尿病である、請求項8に記載の方法。
【請求項１６】
状態が、栄養不良、飢餓、神経性食欲不振、骨粗鬆症、がん、糖尿病、結核、慢性下痢症、AIDS及び上腸間膜動脈症候群である、請求項15に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2014年8月11日に出願された米国特許仮出願第62/035916号の優先権を主張する。
【０００２】
1.技術分野
本発明は、レプチン関連ペプチド、より詳細にはミリストイル化レプチン関連ペプチドに関する。
【背景技術】
【０００３】
2.関連技術の説明
除脂肪体重に対する体脂肪の過剰として定義される肥満は、高血圧、血液脂質増加、II型又はインスリン非依存性糖尿病(NIDDM)等の数多くの重要な臨床及び心理的病的状態並びに平均余命の減少を伴う。合衆国ではNIDDMの人は約600〜1000万人存在し、65歳を超える人口全体の18%が含まれる。更に、NIDDMの男性の約45%及び女性の70%が肥満で、糖尿病は減量によって実質的に改善されるか、又は解消されることもある。
【０００４】
レプチン関連ペプチド及び類似体は、ヒトの肥満及びそれに関連した機能障害の治療に大きな可能性を有することが示された。レプチン関連合成ペプチドアゴニスト及びアンタゴニストの設計、開発及び前臨床応用の努力を続けることによって、臨床においてレプチンでは肥満のヒトの大多数の治療上の必要性を満たすことが明らかにうまくいかないことが、世界的に蔓延したこの疾患及び付随する代謝機能障害の割合を低下させることを目標とした新規ペプチド治療薬を開発する努力の起爆剤となった。このことに関して、低分子ペプチド治療薬は、中枢神経系(CNS)への取り込みが血液脳関門(BBB)を通る飽和輸送に依存しないので、組換えレプチンの限界を克服する可能性を有する。ヒト肥満症例の大多数においてCNSへの輸送不全がレプチン耐性の原因として同定されている。
【０００５】
例えば、マウス[D-Leu-4]-OB3及びその類似体等のレプチン様活性を備えた合成ペプチドは、レプチン欠損ob/ob及びレプチン耐性db/dbマウスモデルにおいて、体重増加、食物及び水分摂取、血糖、インスリン感受性並びに骨代謝の敏感な特異的マーカーである血清オステオカルシンに著しい影響を及ぼす。しかし、ヒトにおける薬物候補としての[D-Leu-4]-OB3及びその類似体の薬物動態は、治療上使用できるほど最適ではない。特に、[D-Leu-4]-OB3及びその類似体の血清半減期は短く血漿クリアランスの速度は高く、その結果[D-Leu-4]-OB3及びその類似体の生物学的利用率が低下し、したがってより高い用量が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、ヒト肥満及びそれに関連した機能障害の治療のために効果的な治療薬を提供するために、薬物動態が改善された修飾レプチン関連ペプチド及び類似体を開発することが必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ミリスチン酸がコンジュゲートしていないレプチン関連ペプチドよりも薬理学的効果が改善したミリスチン酸及びレプチン関連ペプチドのポリペプチドコンジュゲートを含む。好ましくは、ミリスチン酸はレプチン関連ペプチドのN末端にコンジュゲートする。本明細書では、ポリペプチドコンジュゲートは、投与後の体重増加、食物摂取、水分消費及び/又は血糖値の低下によって体重を調節することができる。本明細書では、ポリペプチドコンジュゲートはまた、骨形成を増加させることができる。
【０００８】
本発明の一実施形態では、レプチン関連ペプチドは配列SCSLPQT(配列番号1)を有するレプチン様活性を備えた合成ペプチドアミド、[D-Leu-4]-OB3を含み、ミリスチン酸にコンジュゲートして化合物MA-[D-Leu-4]-OB3を形成する。
【０００９】
本明細書で記載した医薬組成物は、非ミリストイル化レプチン関連ペプチドの投薬量より少なくとも4倍、更には10倍低い投薬量で投与することができる。ミリスチン酸をコンジュゲートしたレプチン関連ペプチドを使用して、対象に治療有効量を投与することによってそれを必要とする対象における体重の恒常性に関連する状態を治療することができる。例えば、治療する状態は、肥満、高血糖、高インスリン血症、過食症、甲状腺機能障害、不妊症又は糖尿病であってもよい。ミリスチン酸をコンジュゲートしたレプチン関連ペプチドはまた、骨形成を増加させるために使用することができる。例えば、ミリスチン酸をコンジュゲートしたレプチン関連ペプチドを使用して、栄養不良、飢餓、神経性食欲不振、骨粗鬆症、がん、糖尿病、結核、慢性下痢症、AIDS及び上腸間膜動脈症候群からなる群から選択される障害に罹患している対象を治療することができる。ミリスチン酸をコンジュゲートしたレプチン関連ペプチドは、皮下、腹腔内、筋肉内、経口又は鼻腔内投与によって投与することができる。
【００１０】
本発明は、添付の図面と併せて以下の詳細な説明を読むことによってより完全に理解され、認識されるだろう:
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明によるミリスチン酸をコンジュゲートしたレプチン関連ペプチドの概略を示した図である。
【図２】MA-[D-Leu-4]OB3 0.1mgを雄Swiss Websterマウス(時点当たりマウスn=3)に皮下送達する前(時間0)並びに処置後1、2、4、6、18及び24時間のMA-[D-Leu-4]OB3の血清濃度を示した図である。各値は、平均±SEMを表す。エラーバーは点内に含有され、0.01と0.12ng/mlの間の範囲である。
【図３】MA-[D-Leu-4]OB3 0.1mgを雄Swiss Websterマウス(時点当たりマウスn=3)に腹腔内送達する前(時間0)並びに処置後1、2、4、6、18及び24時間のMA-[D-Leu-4]OB3の血清濃度を示した図である。各値は、平均±SEMを表す。エラーバーは点内に含有され、0.01と0.12ng/mlの間の範囲である。
【図４】MA-[D-Leu-4]OB3 0.1mgを雄Swiss Websterマウス(時点当たりマウスn=3)に筋肉内送達する前(時間0)並びに処置後1、2、4、6、18及び24時間のMA-[D-Leu-4]OB3の血清濃度を示した図である。各値は、平均±SEMを表す。エラーバーは点内に含有され、0.01と0.12ng/mlの間の範囲である。
【図５】MA-[D-Leu-4]OB3 0.1mgを雄Swiss Websterマウス(時点当たりマウスn=3)に経口送達する(胃管栄養法)前(時間0)並びに処置後1、2、4、6、18及び24時間のMA-[D-Leu-4]OB3の血清濃度を示した図である。各値は、平均±SEMを表す。エラーバーは点内に含有され、0.01と0.12ng/mlの間の範囲である。
【図６】MA-[D-Leu-4]OB3 0.1mgを雄Swiss Websterマウス(時点当たりマウスn=3)に鼻腔内投与する前(時間0)並びに処置後1、2、4、6、18及び24時間のMA-[D-Leu-4]OB3の血清濃度を示した図である。各値は、平均±SEMを表す。エラーバーは点内に含有され、0.01と0.12ng/mlの間の範囲である。
【図７】db/dbマウスにおいてミリスチン酸をコンジュゲートした[D-Leu-4]-OB3を0.3%ドデシルマルトシドに溶かして経口送達した後の空腹時血糖に対する効果を示した図である。
【図８】db/dbマウスにおいてミリスチン酸をコンジュゲートした[D-Leu-4]-OB3をPBSに溶かして経口送達した後の空腹時血糖に対する効果を示した図である。
【図９】STZ誘発高血糖性雄Swiss Websterマウスにおいて、MA-[D-Leu-4]-OB3又はメトホルミンの非存在下又は存在下で、デテミルインスリンの体重増加に対する効果を示した図である。各点は、開始時のパーセントとして表した体重の平均±SEM(群当たりマウスn=6)を表す。
【図１０】STZ誘発高血糖性雄Swiss Websterマウスにおいて、MA-[D-Leu-4]-OB3又はメトホルミンの非存在下又は存在下で、デテミルインスリンの空腹時血糖値に対する効果を示した図である。各棒及び垂直線は、空腹時血糖の平均±SEMを表す(群当たりマウスn=6)。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
ここで図面を参照すると、全体を通じて同じ参照番号は同じ部分を表しており、図1に見られるのは、レプチン関連タンパク質のみよりも著しく改善された薬物動態プロファイルを引き起こすミリスチン酸及びレプチン関連ペプチドのコンジュゲートである。好ましくは、レプチン関連ペプチドは、レプチンの残基116〜122に対応するOB3として知られる合成ペプチドであり、マウスOB3は配列SCSLPQT(配列番号1)を有し、ヒトOB3は配列SCHLPWA(配列番号16)を有する。
【００１３】
レプチン関連ペプチドはまた、SCSLPQT(配列番号1)及びSCHLPWA(配列番号16)に対応する領域の近隣にあるか、又は重複しているその他の領域レプチンを含んでいてもよい。例えば、AVPIQKVQDDTKTLI(配列番号2);TKTLIKTIVTRINDI(配列番号3);RINDISHTQSVSAKQ(配列番号4);VSAKQRVTGLDFIPG(配列番号5);DFIPGLHPILSLSKM(配列番号6);SLSKMDQTLAVYQQV(配列番号7);VYQQVLTSLPSQNVL(配列番号8);SQNVLQIANDLENLR(配列番号9);DLLHLLAFSKSCSLP(配列番号10);SCSLPQTSGLQKPES(配列番号11);QKPESLDGVLEASLY(配列番号12);EASLYSTEVVALSRL(配列番号13);ALSRLQGSLQDILQQ(配列番号14);又はDILQQLDVSPEC(配列番号15)は下記のプロトコールを使用して評価することができた。
【００１４】
好ましくは、レプチン関連ペプチドは少なくとも1個のD置換アミノ酸を含む。例えば、Dアイソフォームアミノ酸は、配列番号1に関して[D-Ser-1];[D-Cys-2];[D-Ser-3];[D-Leu-4];[D-Pro-5];[D-Gln-6]及び[D-Thr-7]からなる群から選択することができ、配列番号16に関して[D-Ser-1];[D-Cys-2];[D-His-3];[D-Leu-4];[D-Pro-5];[D-Trp-6]及び[D-Ala-7]からなる群から選択することができる。
【００１５】
図1に示したように、ミリスチン酸はレプチン関連ペプチドの残基の遊離アミノ基に共有結合する。或いは、ミリスチン酸はペプチドの残基のいかなる遊離アミノ基にコンジュゲートしてもよい。例えば、ヒトOB3ペプチド(配列番号16)の3位のヒスチジン(H)残基は、アルファアミノ基に加えて更に遊離アミノ基を提供する。以下の脂質はまた、ミリスチン酸の代わりに使用することができ、下記のプロトコールに従って試験する:シクロヘキシルバレロイル、アシル-グルタミル、ラウロイル、2-スクシニルアミドミリスチン酸、2-スクシニルアミドエチルオキシパルミチン酸、ミリストイル-α-グルタミル、ミリストイル-α-グルタミル-グリシル、コロイル、7-デオキシコロイル、リトコロイル、リトコロイル-グルタミル、4-ベンゾイル-フェニルアラニン、L-チロキシル、スベロイル-D-チロキシン、3,3',5,5'-テトラヨードチロアセチル、シクロヘキシルバレロイル。
【００１６】
特許請求に係る本発明の合成は、脂肪酸がタンパク質に共有結合する公知のアシル化法に基づいている。ε-アミノ基を選択的にアシル化(例えば、ミリストイル化)するために、様々な保護基を使用してカップリング中にα-アミノ基をブロックしてもよい。適切な保護基の選択は当業者には公知で、p-メトキシベンゾキシ-カルボニル(pmZ)が含まれる。好ましくは、ε-アミノ基は、アミノ保護基を使用しない1工程合成法でアシル化(例えば、ミリストイル化)する。アシル化(例えば、ミリストイル化)は、極性溶媒中の塩基性条件下で、活性化した脂肪酸エステルをタンパク質のε-アミノ基と反応させることによって実施する。反応の塩基性は、レプチン類似体の遊離アミノ基全てを脱プロトン化するために十分でなければならない。弱塩基性条件下では、遊離アミノ基が全て脱プロトン化する訳ではなく、N末端又はα-アミノ基の優先的アシル化(例えば、ミリストイル化)が生じる。アシル化(例えば、ミリストイル化)後、生成物は逆相疎水性クロマトグラフィー等の標準的方法によって精製する。その後、生成物は凍結乾燥又は結晶化等の標準的方法によって回収する。
【００１７】
例えば、ペプチドの試料は、Rainin Symphony合成機でRink Amide樹脂でFmoc/tertブチル戦略を用いて合成した。アミノ酸は、HCTU/DIPEA溶液でカップリングさせ、Fmocは20%ピペリジン/DMFの溶液で除去した。自動合成が完了した後、ミリスチン酸無水物を手作業でペプチドのN末端に付加した。ペプチドはTFA切断カクテルを使用して樹脂から切断した。Maldi-Tof質量分析を使用して目標質量が存在することを調べた。ペプチドは逆相HPLC及びWaters社製C-18 Sunfireカラムを使用して精製した。
【００１８】
ミリストイル化ペプチドの薬物動態は、当業界で公知の任意の方法に従って決定することができる。例えば、ミリストイル化レプチン関連ペプチドの薬物動態は、全取り込み、血清半減期及び血漿クリアランス速度を分析することによって決定することができる。全取り込み、血清半減期及び血漿クリアランス速度を決定するためのアッセイは当業界では周知で、以下の実施例で使用した。ミリスチン酸の[D-Leu-4]-OB3へのコンジュゲーションは、送達経路に応じて半減期を1時間未満から28時間もの長さまで延長し、取り込みを増加させ、血漿クリアランスの速度を低下させ、最小有効用量を4倍以上低下させることを可能にすることによって薬物動態プロファイルを著しく改善した。したがって、本発明のミリストイル化ペプチドは、ミリストイル化されていないレプチンペプチドよりも著しく有利で、例えば、より低い投薬量、より少ない投与頻度で投与することができる。本発明は配列番号1を使用して試験しているが、本発明のアプローチは、その他のレプチン関連ペプチドに適用することができ、以下に記載したような有効性を試験することができる。
【実施例１】
【００１９】
生物学的に活性のあるレプチン関連合成ペプチドアミド、[D-Leu-4]-OB3へのミリスチン酸のコンジュゲーションは、その薬物動態プロファイルを著しく改善する
材料及び方法
動物の収容
体重12から15gの3から4週齢の雄Swiss WebsterマウスはCharles River Laboratories社(Troy、NY、USA)から入手した。動物は、Albany Medical Collegeの動物資源施設において、ステンレススチールワイヤの覆い及びエアフィルターを備えたポリカーボネートケージにケージ当たり3匹ずつ収容し、換気された棚(Thoren Caging Systems社、Hazelton、PA、USA)で保持した。マウスは一定温度(24℃)で、07:00時から19:00時まで点灯して維持し、取り込み研究に使用するまでは食物及び水分を自由に摂取させた。
【００２０】
ペプチド投与
MA-[D-Leu-4]OB3は、NeoBioLab社(Cambridge、MA、USA)によってC末端アミドとして市販された。SC、IP及びIM送達については、ペプチドを滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH7.2)に、2種類の遺伝的に肥満のマウスモデルにおいて、エネルギー消費、グルコース値及びインスリン感受性の調節に最適であることが以前に示された[D-Leu-4]-OB3の濃度よりも10倍低い濃度である0.1mg/200μlの濃度で溶解した。経口及び鼻腔内投与については、MA-[D-Leu-4]-OB3を滅菌脱イオン水で再構成した0.3% Intravail(登録商標)(Aegis Therapeutics社、San Diego、CA、USA)に、それぞれ0.1mg/100μL及び0.1mg/10μLの濃度で溶解した。ゼロ(0)時に、時点当たり3匹のマウスそれぞれに、MA-[D-Leu-4]-OB3 200μlを1回SC、IM又はIP注射した。鼻腔内送達は、マウスをイソフルラン(1〜4%)で軽く麻酔し、MA-[D-Leu-4]OB3 10μlを鼻孔にGilson(登録商標)P-20ピペッターを使用して送達することによって達成した。ペプチド投与後、マウスを指定した期間別々のケージに移した。
【００２１】
血液採取及び調製
ペプチド送達の1、2、4、6、18及び24時間後に、マウスをイソフルラン(5%)で麻酔し、心臓穿刺によって失血させた。血液を滅菌非ヘパリン化プラスチック遠心管に採取し、室温で1時間静置した。凝固した血液を滅菌した木製塗布棒で管の壁の縁から掻き取った。個々の血清試料は、エッペンドルフ5702Rに入れてA-4-38ローター(Eppendorf North America社、Westbury、NY、USA)で2600×gで30分間遠心分離することによって調製し、時点によって収集し、MA-[D-Leu-4]OB3含量をアッセイするまで凍結保存した。これらの動物処置は、Albany Medical College動物実験委員会によって承認されており、関連する指針及び規則に従って実施された。
【００２２】
血清MA-[D-Leu-4]-OB3の測定
収集した血清試料中のMA-[D-Leu-4]-OB3濃度は、以下の改変を加えて本発明者等が開発し、検証した競合ELISAによって測定した:MA-[D-Leu-4]-OB3を使用して標準曲線を作成した。ELISAで使用した[D-Leu-4]-OB3に対するポリクローナル抗体とのMA-[D-Leu-4]-OB3の交差反応性は100%であった。各血清を2連でアッセイした。変動係数はアッセイ内では0.03%、アッセイ間では0.2%であった。
【００２３】
薬物動態分析:全取り込み(AUC)
MA-[D-Leu-4]OB3の血清濃度対SC、IP、IM、経口又は鼻腔内送達後の時間は、画像プログラムSigmaPlot 8.0(SPSS Science社、Chicago、IL、USA)を使用してプロットした。各曲線下面積(AUC)は、このプログラムに応じて計算し、ng/ml/分として表した。
【００２４】
薬物動態分析:血清半減期(t1/2)
IP、SC、IM、経口及び鼻腔内投与後に達成される最大濃度の正確に2分の1までMA-[D-Leu-4]OB3の血清濃度を低下させるために必要な時間は、以下の式を使用して計算した:
t1/2=0.693/kelim
式中、kelimは消失定数を表し、時間に対して取り込みプロファイルのベータ相における濃度点それぞれの自然対数をプロットすることによって決定される。これらのプロットそれぞれの線形回帰分析によって直線が生じ、その傾きは各送達法のkelimを表す。
【００２５】
薬物動態分析:血漿クリアランス(CL)
IP、SC、IM、経口及び鼻腔内投与後の血漿からのMA-[D-Leu-4]-OB3のクリアランスは、以下の式を使用してAUCから計算した:
CL=用量/AUC
【００２６】
薬物動態分析:見かけ上の分布容積(Vd)
薬物の半減期は血漿からのクリアランスに反比例し、その分布容積に正比例するので、ip、sc、im及び鼻腔内送達後のMA-[D-Leu-4]-OB3の見かけ上の分布容積は、以下の式を使用して半減期及びクリアランスから計算する:
t1/2=0.693×Vd/CL
【００２７】
結果
[D-Leu-4]-OB3の半減期は、通常1時間未満で、生理学的に有効な用量はミリグラムの範囲である。ヒト肥満及び/又は糖尿病の治療に対する[D-Leu-4]-OB3の適用を考えると、[D-Leu-4]-OB3の薬物動態プロファイルを改善して、主に血清半減期を延長し、且つ/又は最適有効用量を低下させることが非常に重要である。本明細書で提示した結果から、ミリスチン酸の[D-Leu-4]-OB3へのコンジュゲーションは、(a)送達経路に応じて半減期を1時間未満から28時間もの長さまで延長し、(b)取り込みを増加させ、(c)血漿から除去される速度を低下させ、(d)最小有効用量を4倍低下させることを可能にすることによって薬物動態プロファイルを著しく改善したことが示された。
【００２８】
取り込みプロファイル
SC、IP、IM、経口及び鼻腔内送達後のMA-[D-Leu-4]OB3の取り込みプロファイルをそれぞれ図2〜図6に示す。ペプチド0.1mgのSC、IP及びIM投与後のMA-[D-Leu-4]-OB3の最大取り込み(Cmax)は2時間(tmax)で生じ、時間と共に迅速に減少した。18時間後、血清中のMA-[D-Leu-4]-OB3の濃度は、基準レベル近くまで低下した(図2〜図4)。経口及び鼻腔内投与後の取り込みプロファイル(図5及び図6)は、SC、IP又はIM送達で認められたものとは明らかに異なっていた。MA-[D-Leu-4]-OB3の経口及び鼻腔内投与後のCmaxはそれぞれ4時間及び7時間後に達成された。しかし、経口及び鼻腔内投与して24時間後、Cmaxはそれぞれ31%及び80%低下した。
【００２９】
全取り込み
MA-[D-Leu-4]-OB3の全取り込みは、各送達法について取り込み曲線下面積(AUC)を測定することによって決定した。この値は、全取り込み又は体循環へのペプチド吸収の程度、或いは投与後の全取り込みを表す。SC、IP、IM、経口及び鼻腔内送達後のAUC値はそれぞれ1,829,225ng/ml/分、1,212,330ng/ml/分、842,374ng/ml/分、278,460ng/ml及び158,426ng/mlであった。これらの値から、鼻腔内、経口、IM、IP及びSC送達後の相対的生物学的利用率は、それぞれ1.0、1.8、5.3、7.7及び11.7と計算された。
【００３０】
消失定数(kelim)及び血清半減期(t1/2)
SC、IP、IM、経口及び鼻腔内送達後のMA-[D-Leu-4]-OB3の消失定数は、材料及び方法において記載したように計算すると、それぞれ-0.350、-0.155、-0.117、-0.024及び-0.085であることが決定された。SC、IP、IM、経口及び鼻腔内投与後のMA-[D-Leu-4]OB3の血清半減期は、それぞれ2.0、4.1、5.5、28.9及び8.2時間であった。
【００３１】
血漿クリアランス(CL)及び見かけ上の分布容積(Vd)
SC、IP、IM、経口及び鼻腔内投与後の血漿からのMA-[D-Leu-4]OB3のクリアランスは、それぞれで0.05、0.08、0.12、0.36及び0.63ml/分あった。SC、IP、IM、経口及び鼻腔内送達後のMA-[D-Leu-4]OB3の見かけ上の分布容積は、それぞれ8.6、30.9、61.3、900.8及び447.0mlであった。これらの薬物動態パラメータ及び[D-Leu-4]-OB3について以前に記載されたパラメータを以下のTable1(表1)にまとめて示す。
【００３２】
【表１】
2017532292.tif 000003
【００３３】
[D-Leu-4]-OB3による以前の研究では、エネルギー平衡及びグルコース恒常性に対するレプチン様効果が繰り返し示されたが、送達経路に関わらず、持続性の応答には高濃度(ミリモル範囲)及び毎日の反復投与が必要であった。したがって、本発明では、ヒトへの適用のために[D-Leu-4]-OB3の薬物動態を改善することが必須であった。具体的には、[D-Leu-4]-OB3の生物学的利用率を増加させ、半減期を延長し、体循環から除去される速度を低下させることが求められた。このような改善によって、その有効性を持続するか、又は改善しながら、送達する[D-Leu-4]-OB3の用量の大きさ及び頻度を低下させることが可能となる。
【００３４】
本発明によるミリスチン酸の[D-Leu-4]-OB3へのコンジュゲーションによって、[D-Leu-4]-OB3の薬物動態プロファイルを改善するための妥当なアプローチは必要なくなる。IP、SC若しくはIM注射によって、又は胃管栄養法によって経口的に送達したとき、MA-[D-Leu-4]-OB3の最大取り込み(Cmax)は、10倍少ない用量であっても[D-Leu-4]-OB3の最大取り込みよりも飛躍的に高かった。しかし、鼻腔内滴下後に認められた[D-Leu-4]-OB3の2相性の取り込みは、MA-[D-Leu-4]-OB3の鼻腔内送達後には認められず、この現象は投与が低用量であることに関連するのであろう。鼻腔内滴下後のMA-[D-Leu-4]-OB3の取り込みプロファイルにおけるこの変化によって、最高濃度のペプチドの1カ所からの吸収は、[D-Leu-4]-OB3の取り込みプロファイルで認められた2つのピークと比較してずっと後で達成されることが示唆され、Tmaxはそれぞれ6時間対10分及び60分である。
【００３５】
データによって示されるように、MA-[D-Leu-4]-OB3の吸収は投与経路に応じて2時間から6時間の期間に亘り、[D-Leu-4]-OB3の5分から60分と比較してゆっくりである。これらの発見は、ミリスチン酸コンジュゲーションは[D-Leu-4]-OB3と比較してMA-[D-Leu-4]-OB3の高濃度であるがゆっくりした速度の取り込みを促進することを示す。このようなパターンの吸収は、使用した送達方法全てにおいてMA-[D-Leu-4]-OB3の全取り込み(AUC)を増加させないようであるが、高レベルのペプチドが体循環に存在する時間を延長させた。
【００３６】
MA-[D-Leu-4]-OB3の生物学的活性の延長に直接関係して特に注意すべきことは、[D-Leu-4]-OB3と比較して長い半減期及び血漿からのゆっくりとしたクリアランスが本研究で使用した各送達方法の後で認められたことである。このパターンは、血清中で迅速に増加し迅速に除去される[D-Leu-4]-OB3と比較したとき、MA-[D-Leu-4]-OB3の生物学的活性を長期間持続することができる。[D-Leu-4]-OB3で以前に使用したよりも低い用量のMA-[D-Leu-4]-OB3を送達したdb/dbマウスにおける経口有効性の研究結果から、これが事実であることが示された。
【００３７】
したがって、本発明による[D-Leu-4]-OB3のミリスチン酸コンジュゲーションは、その薬物動態プロファイルを著しく改善する。データはまた、MA-[D-Leu-4]-OB3がヒトにおける肥満及び/又は糖尿病の管理のための経口による非侵襲的で安全な治療的アプローチとして使用できることを示している。
【実施例２】
【００３８】
6週齢から7週齢の雄BKS.Cg-Dock7m+/+Leprdb/J糖尿病性db/dbマウスにおけるPBS又は0.3%ドデシルマルトシド(DDM、Intravail(登録商標))に溶かしたミリスチン酸コンジュゲート[D-Leu-4]-OB3の経口送達の空腹時血糖に対する効果を比較する研究
雄db/dbマウスに、PBS又はDDMのいずれかに濃度を増加させて溶かしたMA-[D-Leu-4]-OB3を胃管栄養法によって経口的に1日1回夕方に14日間連続して投与した。空腹時(8時間)血糖値は、Accu-Chek Nanoグルコースメーター(Roche社、Indianapolis、IN)を使用して1日おきに測定した。処置して14日後に、PBSに溶かしたMA-[D-Leu-4]-OB3(250又は500mcg/日)を投与したマウスの血糖値は、PBSのみを投与された対照マウスのものと変化がなかった。しかし、0.3%DDMに溶かして100又は250mcg/日投与したdb/dbマウスの血糖値は、250mcg/日で処置したマウスにおける14日間の治療期間の最後に非糖尿病性BKSマウスで認められたレベルよりも著しく低下した。
【００３９】
これらの結果は、[D-Leu-4]-OB3についての以前の研究で使用した濃度よりも4倍低い濃度のMA-[D-Leu-4]-OB3が、DDMに溶かして経口的に送達したとき血糖値の低下に有効であることを示している。これらの結果は、DDMに溶かした[D-Leu-4]-OB3と比較してDDMに溶かしたMA-[D-Leu-4]-OB3の取り込み増加、ゆっくりとしたクリアランス及び長い半減期を示した薬物動態データと一致した。
【実施例３】
【００４０】
ミリスチン酸コンジュゲート[D-Leu-4]-OB3(MA-[D-Leu-4]-OB3)のインスリン欠乏性糖尿病のマウスモデルにおける体重増加及び血糖コントロールへの有効性を示した研究
目的
MA-[D-Leu-4]-OB3の糖尿病のインスリン欠乏性マウスモデルにおける体重増加及びインスリン感受性に対する効果を調べるために、これらの研究ではストレプトゾトシン(STZ)誘発雄Swiss Websterマウスを使用した。このモデルを使用して、MA-[D-Leu-4]-OB3のインスリン抵抗性改善効果を別のよく特徴付けられたインスリン抵抗性改善剤、メトホルミンと比較した。
【００４１】
材料及び方法
7週齢の雄Swiss WebsterマウスをSTZ150mg/kgの1回の腹腔内(ip)投与で高血糖にさせた。空腹時血糖値は、正常(非糖尿病性)血糖値を確立するためにSTZ処置前に、及び高血糖を評価するためにその後毎日測定した。空腹時血糖値は、STZ処置後4〜5日で正常よりも常に3倍から4倍高かった。
【００４２】
デテミルインスリン(Levemir(登録商標)、Novo Nordisk社、Malov、Denmark)送達ペンを使用してリン酸緩衝生理食塩水(PBS)0.025U/100μLを分注し、1日2回8:00a.m.と9:00a.m.の間及び4:00p.m.と5:00p.m.の間に皮下(sc)注射によって14日間送達した。MA-[D-Leu-4]-OB3(NeoBiolab社、Cambridge、MA)及びメトホルミン(Sigma Aldrich社、St. Louis、MO)を滅菌脱イオン水で再構成した0.3%ドデシルマルトシド(DDM、Intravail(登録商標)、Aegis Therapeutics社、San Diego、CA)に溶解し、経口胃管栄養法によって1日2回8:00hと9:00hの間及び16:00hと17:00hの間にそれぞれ5mg/kg/100μL又は100mg/kg/100μLの濃度で14日間送達した。
【００４３】
ゼロ日目及びその後毎日、食物及び水分摂取を測定し、朝8:00hと9:00hの間にマウスの体重を測定した。血糖を測定した日の空腹時(8時間)血糖値を保証するために、食物は8:00hと9:00hの間ケージから取り出し、測定後すぐに戻した。
【００４４】
結果
インスリン単独又はMA-[D-Leu-4]-OB3若しくはメトホルミンとの組み合わせのSTZ誘発高血糖性雄SWマウスの体重増加に対する効果を以下の図9及びTable2(表2)に示す。
【００４５】
【表２】
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【００４６】
DDMのみを投与されたマウスは14日間の試験期間の終了時に11.9%重くなっていたが、毎日インスリン0.05Uを投与されたマウスは16.1%重くなった。MA-[D-Leu-4]-OB3のみを投与されたマウスは8.1%だけ重くなった。MA-[D-Leu-4]-OB3をインスリンと組み合わせて投与したとき、インスリンによって誘発される体重増加は未処置のマウスで認められたよりも低下した(11.9%)。メトホルミンをインスリンと組み合わせて投与したとき、体重増加は10.0%だけであった。
【００４７】
MA-[D-Leu-4]-OB3又はメトホルミンの非存在下又は存在下でのインスリンのSTZ誘発高血糖性マウスの空腹時血糖に対する効果を図10及びTable2(表2)に示した。正常SWマウスにおける空腹時血糖値は14日間の研究中安定して維持されたが(150〜170mg/dl)、DDMのみを投与されたSTZ処置マウスの空腹時血糖値は500と600mg/dLとの間の範囲であった。デテミルインスリン0.05Uは、血糖値を64.0%低下させたが、正常範囲ではなかった。MA-[D-Leu-4]-OB3のみの空腹時血糖値に対する効果は非常にわずかであった。MA-[D-Leu-4]-OB3又はメトホルミンと組み合わせて投与したとき、デテミルインスリン0.05Uの抗高血糖効果は増幅された。2日以内に、インスリンと組み合わせてMA-[D-Leu-4]-OB3を投与されたマウスの空腹時血糖値はほぼ正常化し、研究期間を通じてそのまま維持された。低血糖事象は示されなかった。同様の結果が、メトホルミンをインスリンと組み合わせて投与したとき認められた。しかし、処置6日後にメトホルミンを投与されたマウスはますます低血糖になった。
【００４８】
結論
この研究の結果は、MA-[D-Leu-4]-OB3は、皮下投与したインスリンと組み合わせて経口的に投与すると、インスリン薬物療法に伴う体重増加を防ぐことを示す。結果は更に、MA-[D-Leu-4]-OB3は、糖尿病のこのインスリン欠乏性マウスモデルにおいて、外来性インスリンによって誘発される体重増加の予防及びインスリンに対する組織感受性の増強においてメトホルミンと同じくらい良好であるか、又はメトホルミンよりも優れていることを示唆している。
【００４９】
MA-[D-Leu-4]-OB3のインスリン抵抗性改善効果は更に、高インスリン性ob/ob及びdb/dbマウスにおいて[D-Leu-4]-OB3で、db/dbマウスにおいてMA-[D-Leu-4]-OB3で、以前に認められたこととは対照的に、このインスリン欠乏性マウスモデルにおいてMA-[D-Leu-4]-OB3のみでは空腹時血糖値をあまり低下させることはできなかったという観察によって支持される。試験開始時よりも14日間の試験期間の終了時に1.2%だけ低かったこれらのレベルは、内在性インスリン産生がSTZ処置によって著しく損なわれたことを裏付ける。
【００５０】
このデータは、MA-[D-Leu-4]-OB3が血糖値に対して影響力を発揮するためには、インスリンの存在が絶対的に必要であることを反映している。この結論は更に、MA-[D-Leu-4]-OB3(0.25mg/kg/日)は外来性インスリンと組み合わせて投与すると試験の最初の2日以内に血糖値を正常化することができたという所見によって支持される。
【００５１】
このマウスモデルにおけるMA-[D-Leu-4]-OB3のグルコース恒常性に対する有効性に関して特に注意すべきことは、MA-[D-Leu-4]-OB3及びメトホルミンは外来性インスリンと組み合わせて投与すると、いずれも血糖を正常レベル内に低下させることができるが、MA-[D-Leu-4]-OB3の用量はメトホルミンよりも20倍低かったという事実である(それぞれ10mg/kg/日対200mg/kg/日)。このデータは、このインスリン欠乏性マウスモデルにおけるインスリン感受性の改善において、MA-[D-Leu-4]-OB3がメトホルミンよりも質量ベースで20倍有効であり、モルベースで6.1倍有効であることを示している。
【００５２】
その他の実施形態では、本発明はレプチン関連ペプチドにコンジュゲートしたシクロヘキシルバレロイル、アシル-グルタミル、ラウロイル、2-スクシニルアミドミリスチン酸、2-スクシニルアミドエチルオキシパルミチン酸、ミリストイル-α-グルタミル、ミリストイル-α-グルタミル-グリシル、コロイル、7-デオキシコロイル、リトコロイル、リトコロイル-グルタミル、4-ベンゾイル-フェニルアラニン、L-チロキシル、スベロイル-D-チロキシン、3,3',5,5'-テトラヨードチロアセチル、シクロヘキシルバレロイルのいずれか1つを含む医薬化合物であってもよい。レプチン関連ペプチドは、AVPIQKVQDDTKTLI(配列番号2);TKTLIKTIVTRINDI(配列番号3);RINDISHTQSVSAKQ(配列番号4);VSAKQRVTGLDFIPG(配列番号5);DFIPGLHPILSLSKM(配列番号6);SLSKMDQTLAVYQQV(配列番号7);VYQQVLTSLPSQNVL(配列番号8);SQNVLQIANDLENLR(配列番号9);DLLHLLAFSKSCSLP(配列番号10);SCSLPQTSGLQKPES(配列番号11);QKPESLDGVLEASLY(配列番号12);EASLYSTEVVALSRL(配列番号13);ALSRLQGSLQDILQQ(配列番号14);又はDILQQLDVSPEC(配列番号15)の1つであってもよい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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