(57)【要約】本発明は、ＲｅｂＭ及びステビアの葉で微量に生成されるグリコシル化産物などのステビオール配糖体を作製する方法を提供し、かつ、これらの方法で使用するための酵素、コードするポリヌクレオチド、及び宿主細胞を提供する。本発明は、ＲｅｂＭのようなステビオールのグリコシル化産物を、高純度及び／または高収率で生成させるための、工学的に操作した酵素及び工学的に操作した宿主細胞を提供する。本発明はさらに、ＲｅｂＭのようなステビオール配糖体を含有する、食品、飲料、口腔ケア用品、甘味料、及び香味料などの製品を作製する方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
レバウジオシドＭ（ＲｅｂＭ）またはレバウジオシドＤ（ＲｅｂＤ）を作製する方法であって、
複数のウリジン二リン酸依存型グリコシルトランスフェラーゼ酵素（ＵＧＴ）を介してステビオールからＲｅｂＭまたはＲｅｂＤを生成する宿主細胞を提供すること、ただし、該ＵＧＴ酵素は、
（ａ）レバウジオシドＡ（ＲｅｂＡ）のＣ１９における１−２’グリコシル化活性がその親ＵＧＴ酵素より高く、ステビオールモノシドのＣ１３において１−２’グリコシル化活性の実質的損失がない、修飾されたＵＧＴ酵素、及び
（ｂ）レバウジオシドＤ（ＲｅｂＤ）のＣ１９における１−３’グリコシル化活性がその親ＵＧＴ酵素より高く、かつステビオシドのＣ１３において１−３’グリコシル化活性の実質的損失がない、修飾されたＵＧＴ酵素
のうち１つ以上を含んでおり、かつ
前記宿主細胞を前記ＲｅｂＭが生成される条件下で培養すること
を含む前記方法。
【請求項２】
（ａ）レバウジオシドＡ（ＲｅｂＡ）のＣ１９における１−２’グリコシル化活性が、ステビオールモノシドのＣ１３における１−２’グリコシル化活性と等しいかまたはそれより優れており、かつ／または
（ｂ）レバウジオシドＤ（ＲｅｂＤ）のＣ１９における１−３’グリコシル化活性が、ステビオシドのＣ１３における１−３’グリコシル化活性と等しいかまたはそれより優れている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞は、ステビオールモノシドのＣ１３における１−２’グリコシル化活性を有するＵＧＴ酵素を１つのみ発現し、かつ／またはステビオシドのＣ１３における１−３’グリコシル化活性を有するＵＧＴ酵素を１つのみ発現する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも１つのＵＧＴ酵素は、親ＵＧＴ酵素の円順列変異体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記円順列変異体は、切断部位を、野生型酵素の１５０位と３００位に対応する各アミノ酸の間、任意選択で１７０位と２８０位のアミノ酸の間、任意選択で１９０位と２１０位の残基の間に有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
１−２’グリコシル化活性を有する前記ＵＧＴ酵素は、ＯｓＵＧＴ１−２もしくはＳｒＵＧＴ９１Ｄ２、またはＳｒＵＧＴ９１Ｄ１、または、ＲｅｂＡのＣ１９における高いグリコシル化活性を有するその誘導体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
１−２’グリコシル化活性を有する前記ＵＧＴ酵素は、ＯｓＵＧＴ１−２またはその誘導体であり、かつ、任意選択で、ＲｅｂＡのＣ１９における１−２’グリコシル化活性を高めるアミノ酸置換、アミノ酸欠失、及び／またはアミノ酸挿入を１つ以上含む、ＯｓＵＧＴ１−２の円順列変異体である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
１−２’グリコシル化活性を有する前記ＵＧＴ酵素は、配列番号７の１９０〜２１０内のある位置に対応する切断部位を有し、任意選択で配列番号７のＮ末端残基及びＣ末端残基に対応するアミノ酸の間にリンカー配列を有するＯｓＵＧＴ１−２の円順列変異体であり、前記リンカーが任意選択で２〜２５アミノ酸長である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記リンカーは８〜２０アミノ酸長であり、任意選択で１７アミノ酸長である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記切断部位は、配列番号７の１９６位、１９７位、１９８位、または１９９位に対応する、請求項６または７に記載の方法。
【請求項１１】
１−２’グリコシル化活性を有する前記ＵＧＴ酵素は、ＳｒＵＧＴ９１Ｄ２またはその誘導体であり、任意選択で、ＲｅｂＡのＣ１９のグリコシル化活性を高めるアミノ酸置換、アミノ酸挿入、及び／またはアミノ酸欠失を１つ以上含む円順列変異体である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
１−２’グリコシル化活性を有する前記ＵＧＴ酵素は、ＭｂＵＧＴ１，２−２（配列番号４５）またはその誘導体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
１−３’グリコシル化活性を有する前記ＵＧＴ酵素は、ＳｒＵＧＴ７６Ｇ１、または、ＲｅｂＤのＣ１９において高いグリコシル化活性を有するその誘導体である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
１−３’グリコシル化活性を有する前記ＵＧＴ酵素は、ＳｒＵＧＴ７６Ｇ１の誘導体であり、任意選択で、ＲｅｂＤのＣ１９のグリコシル化活性を高めるアミノ酸置換、アミノ酸挿入、及び／またはアミノ酸欠失を１つ以上含む円順列変異体である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
１−３’グリコシル化活性を有する前記ＵＧＴ酵素は、２００位、２８４位及び／または３７９位のうち１つ以上の位置におけるアミノ酸置換を含むＳｒＵＧＴ７６Ｇ１の誘導体であり、それらは任意選択でＬ２００Ａ、Ｌ２００Ｇ、Ｔ２８４Ｇ及び／またはＬ３７９Ｇであり、ここで、アミノ酸の位置が配列番号３にしたがい番号付けされている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＳｒＵＧＴ７６Ｇ１は、配列番号３の１９０位〜２９０位内のある残基に対応する切断部位を有する円順列変異体である、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記円順列変異体は、配列番号３の２１３位、２３９位、２５５位、２６１位、または２６３位に対応する切断部位を有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記円順列変異体は、配列番号３の２６３位に対応する切断部位を有し、任意選択で、配列番号３のＮ末端残基及びＣ末端残基に対応するアミノ酸の間にリンカー配列を有し、該リンカーが任意選択で２〜２５アミノ酸長である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記リンカーは８〜２０アミノ酸長である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記宿主細胞は、ステビオールをステビオールモノシドに変換するＵＧＴ酵素をさらに含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ステビオールをステビオールモノシドに変換する前記ＵＧＴ酵素は、ＳｒＵＧＴ８５Ｃ２、またはその誘導体である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ステビオールをステビオールモノシドに変換する前記ＵＧＴ酵素は、野生型配列にしたがい番号付けされている変異Ｐ２１５Ｔ、Ｓ３０８Ｔ、Ｄ３１１Ｑ、Ｇ３１６Ａ、Ｈ３４９Ｅ、Ｅ４１４Ｇ、及びＧ４２０Ｄのうち１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または７つを含むＳｒＵＧＴ８５Ｃ２誘導体である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ステビオールをステビオールモノシドに変換する前記酵素は、ＳｒＵＧＴ８５Ｃ２の円順列変異体である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記宿主細胞は、ステビオールビオシドをステビオシドに変換するＵＧＴ酵素をさらに含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ステビオールビオシドをステビオシドに変換するＵＧＴ酵素は、ＳｒＵＧＴ７４Ｇ１、またはその誘導体である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記酵素はＳｒＵＧＴ７４Ｇ１の円順列変異体でステビオールビオシドをステビオシドに変換する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＳｒＵＧＴ７４Ｇ１の円順列変異体は、野生型酵素の２５８位、２５９位、２６０位、２６１位、または２６２位に対応する切断部位を有する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記宿主細胞は、カウレン合成酵素（ＫＳ）、カウレンオキシダーゼ（ＫＯ）、及びカウレン酸ヒドロキシラーゼ（ＫＡＨ）を含む酵素経路を介してステビオール基質を産生し、かつ、前記ＫＯ酵素及びＫＡＨ酵素の１つ以上を再生するシトクロムＰ４５０レダクターゼ酵素（ＣＰＲ）をさらに含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＫＡＨは、Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ、もしくはＭｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃｕｌａｔａのＫＡＨ、またはその誘導体である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＫＡＨは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａのＫＡＨ（ＡｔＫＡＨ）、またはその誘導体である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＡｔＫＡＨは、カウレン酸ヒドロキシラーゼ活性の速度を高めるアミノ酸置換、アミノ酸挿入、及び／またはアミノ酸欠失を１つ以上有し、かつ／または、Ｅ．ｃｏｌｉで機能発現するよう工学的に操作されたＮ末端を有する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＡｔＫＡＨは、配列番号２９の２５位、７９位、１１９位、１３７位、１４２位、１５５位、１８０位、１９３位、１９６位、１９７位、２２６位、３３１位、２３５位、２３８位、２４５位、２７２位、２８５位、２８７位、３２５位、３３０位、３３４位、３３９位、３５２位、３７３位、３９７位、４７０位、４９９位、５０６位、及び５０７位、に対応する位置のうち１つ以上の位置にアミノ酸置換を有し、それらは任意選択でＡ２５Ｌ、Ｓ７９Ｔ、Ｔ１１９Ｃ、Ｉ１３７Ｌ、Ｉ１４２Ｖ、Ｒ１５５Ｋ、Ｍ１８０Ｌ、Ｅ１９３Ｇ、Ｃ１９６Ａ、Ｄ１９７Ｅ、Ａ２２６Ｅ、Ｌ２３５Ｑ、Ｉ２３８Ｍ、Ｆ２４５Ｌ、Ｆ２４５Ｖ、Ｌ２７２Ｉ、Ｉ２８５Ｒ、Ｃ２８７Ｓ、Ｃ３２５Ｉ、Ｃ３２５Ｍ、Ｆ３３０Ｌ、Ｃ３３１Ｉ、Ｄ３３４Ｅ、Ｓ３３９Ｔ、Ｓ３５２Ｅ、Ｅ３７３Ｄ、Ｉ３９７Ｆ、Ｖ４７０Ｌ、Ｑ４９９Ｖ、Ｌ５０６Ｍ、Ｌ５０７Ｉ、Ｌ５０７Ｔ、及びＬ５０７Ｖのうちの１つ以上である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＡｔＫＡＨは、野生型配列の３３１位に対応する位置でのアミノ酸置換を含み、ここで、前記置換は任意選択でＣ３３１Ｉである、３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＫＳは、任意選択でＳｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ、Ｚｅａ  ｍａｙｓ、Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ、もしくはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、またはその誘導体に由来するＫＳである、請求項２８〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞は、Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ、Ｅｒｗｉｎａ  ｔｒａｃｈｅｉｐｈｉｌａ、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｆｒｅｄｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｚｅａ  ｍａｙｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａに由来するコパリル二リン酸合成酵素（ＣＰＰＳ）、またはその誘導体を発現する、請求項２８〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記宿主細胞は、任意選択でＰｈｏｍｏｐｓｉｓ  ａｍｙｇｄａｌｉ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ、  Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｓｐ．、またはその誘導体から選択されるＣＰＰＳとＫＳとの二機能性酵素を発現する、請求項２８〜３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記宿主細胞は、Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｆｕｊｉｋｏｒｏｉ、もしくはＴｒａｍｅｔｅｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ、または、その誘導体に由来するカウレン酸化酵素を発現し、該酵素は任意選択でＥ．ｃｏｌｉに機能発現させるためにＮ末端で修飾される、請求項２８〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＣＰＲは、Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、もしくはＧｉｂｅｒｅｌｌａ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉの酵素、または、その誘導体であり、かつ任意選択で、Ｅ．ｃｏｌｉに機能発現させるためにＮ末端で修飾される、請求項２８〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記宿主細胞は、ゲラニルゲラニルピロリン酸合成酵素（ＧＧＰＰＳ）を発現し、該酵素は任意選択でＴａｘｕｓ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ、Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ、海洋細菌４４３、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｈａｅｕｎｄａｅｎｓｉｓ、Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ  ｔｅｐｉｄｕｍ、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｅｌａｎｏｓｐｏｒｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ、Ｓｕｌｆｕｌｕｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇｏ  ｍａｒｉｔｉｍｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｌｕｓ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ｃａｌｉｄｉｆｏｎｔｉｓ、またはその誘導体である、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記宿主細胞は、イソペンチルピロリン酸（ｉｓｏ−ｐｅｎｔｙｌ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（ＩＰＰ）及びジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）を生成する経路を発現する、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記経路は、メチルエリスリトールリン酸（ＭＥＰ）経路及び／またはメバロネート（ＭＶＡ）経路である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記宿主細胞は、原核細胞または真核細胞である、請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｕｓ、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記宿主細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、及びＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａを含む、サッカロミセスの種、ピチアの種、またはヤロウィアの種である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記宿主細胞は、ｄｘｓ、ｉｄｉ、ＩｓｐＤ、及びＩｓｐＦの重複または過剰発現を有するＥ．ｃｏｌｉである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記Ｅ．ｃｏｌｉは、ＵＤＰ−グルコースの生成を高める遺伝子修飾を１つ以上有する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
１つ以上の前記遺伝子修飾に、ΔｇａｌＥ、ΔｇａｌＴ、ΔｇａｌＫ、ΔｇａｌＭ、ΔｕｓｈＡ、Δａｇｐ、Δｐｇｍ、Ｅ  ｃｏｌｉのＧＡＬＵの重複、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｕｓのＵＧＰＡの発現、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓのＳＰＬの発現が含まれる、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記宿主細胞は、異種発現させた遺伝子である、
Ｔａｘｕｓ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓのＧＧＰＳまたはその誘導体、
Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｓｐ．のＰｓＣＫ（またはその誘導体、
Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａのＫＯまたはその誘導体、
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａのＫＡＨまたはその誘導体、
Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａのＣＰＲまたはその誘導体、
Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａのＵＧＴ８５Ｃ２またはその誘導体、
Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａのＵＧＴ７４Ｇ１もしくはその誘導体、またはＭｂＵＧＴＣ１９もしくはその誘導体、
Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａのＵＧＴ７６Ｇ１もしくはその誘導体、またはＭｂＵＧＴ１−３もしくはその誘導体、及び
Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａのＵＧＴ９１Ｄ２、またはＯｓＵＧＴ１−２、またはＭｂＵＧＴ１−２またはその誘導体
を含む、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記宿主細胞は、異種発現させた遺伝子である、
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのＧＧＰＳまたはその誘導体、
Ｅｒｗｉｎａ  ｔｒａｃｈｅｉｐｈｉｌａのＣＰＰＳまたはその誘導体、
Ｅｒｗｉｎａ  ｔｒａｃｈｅｉｐｈｉｌａのＫＳまたはその誘導体、
Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａのＫＯまたはその誘導体、
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａのＫＡＨまたはその誘導体、
Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａのＣＰＲまたはその誘導体、
Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａのＵＧＴ８５Ｃ２またはその誘導体、
Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａのＵＧＴ７４Ｇ１もしくはその誘導体、またはＭｂＵＧＴＣ１９もしくはその誘導体、またはＭｂＵＧＴＣ１９−２もしくはその誘導体、
Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａのＵＧＴ７６Ｇ１もしくはその誘導体、またはＭｂＵＧＴ１−３もしくはその誘導体、及び
Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａのＵＧＴ９１Ｄ２、またはＯｓＵＧＴ１−２、またはＭｂＵＧＴ１，２−２またはその誘導体
を含む、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＫＡＨは、置換Ｃ３３１Ｉを有するＡｔＫＡＨ誘導体である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記ＵＧＴ８５Ｃ２は、置換Ｐ２１５Ｔを有する誘導体である、請求項５０または５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記宿主細胞は、２２℃〜３７℃、任意選択で２７℃〜３７℃で細胞培養されたＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞である、請求項５０〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
培地からＲｅｂＭを回収することをさらに含む、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
ＲｅｂＭを、濃度が少なくとも約１０ｍｇ／Ｌの培地で生成させる、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
ＲｅｂＭとＲｅｂＤとの比が１：１〜１：０である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
ＲｅｂＤを、ＲｅｂＭ収率の約２０％未満で生成させる、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
ＲｅｂＭが、前記ステビオールのグリコシル化産物の少なくとも約２５重量％を占める、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
請求項１〜５８のいずれか一項に記載の方法にしたがってＲｅｂＭを生成し、ＲｅｂＭを製品に組み込むことを含む、ＲｅｂＭを含む製品を製造する方法。
【請求項６０】
配列番号９と少なくとも６０％同一なアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項６１】
配列番号１０と少なくとも６０％同一なアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項６２】
配列番号８と少なくとも６０％同一なアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項６３】
配列番号４５と少なくとも６０％同一なアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項６４】
配列番号４６と少なくとも６０％同一なアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項６５】
３３１に対応する位置で置換を含み、任意選択でＣ３３１Ｉである、Ａｒａｂｏｄｏｐｉｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａのＫＡＨ。
【請求項６６】
２１５位、３０８位、３１１位、３１６位、３４９位、４１４位及び４２０位のうち１つ以上の位置における置換を含む、Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａのＵＧＴ８５Ｃ２。
【請求項６７】
前記置換に、Ｐ２１５Ｔ、Ｓ３０８Ｔ、Ｄ３１１Ｑ、Ｇ３１６Ａ、Ｈ３４９Ｅ、Ｅ４１４Ｇ、及びＧ４２０Ｄのうち１つ以上が含まれる、請求項６６に記載のＳｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａのＵＧＴ８５Ｃ２。
【請求項６８】
野生型ＵＧＴ酵素の円順列変異体であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、野生型の対応する位置に対するアミノ酸置換、アミノ酸欠失、及び／またはアミノ酸挿入を１〜５０含み得るアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項６９】
配列番号２９の２５位、７９位、１１９位、１３７位、１４２位、１５５位、１８０位、１９３位、１９６位、１９７位、２２６位、２３５位、２３８位、２４５位、２７２位、２８５位、２８７位、３２５位、３３０位、３３１位、３３４位、３３９位、３５２位、３７３位、３９７位、４７０位、４９９位、５０６位、及び５０７位に対応する位置のうち１つ以上の位置におけるアミノ酸置換を有し、それらは任意選択でＡ２５Ｌ、Ｓ７９Ｔ、Ｔ１１９Ｃ、Ｉ１３７Ｌ、Ｉ１４２Ｖ、Ｒ１５５Ｋ、Ｍ１８０Ｌ、Ｅ１９３Ｇ、Ｃ１９６Ａ、Ｄ１９７Ｅ、Ａ２２６Ｅ、Ｌ２３５Ｑ、Ｉ２３８Ｍ、Ｆ２４５Ｌ、Ｆ２４５Ｖ、Ｌ２７２Ｉ、Ｉ２８５Ｒ、Ｃ２８７Ｓ、Ｃ３２５Ｉ、Ｃ３２５Ｍ、Ｆ３３０Ｌ、Ｃ３３１Ｉ、Ｄ３３４Ｅ、Ｓ３３９Ｔ、Ｓ３５２Ｅ、Ｅ３７３Ｄ、Ｉ３９７Ｆ、Ｖ４７０Ｌ、Ｑ４９９Ｖ、Ｌ５０６Ｍ、Ｌ５０７Ｉ、Ｌ５０７Ｔ、及びＬ５０７Ｖのうち１つ以上である、カウレン酸ヒドロキシラーゼ（ＫＡＨ）ポリペプチド。
【請求項７０】
請求項６０〜６９のいずれか一項に記載の酵素をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項７１】
請求項７０に記載のポリヌクレオチドを発現している、宿主細胞。
【請求項７２】
カウレン酸を生成する宿主細胞に請求項６５または６９に記載のＫＡＨを発現させることを含む、ステビオールを作製する方法。
【請求項７３】
複数のグリコシル化を有するステビオール配糖体を作製する方法であって、
ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰからステビオールを生成するための組換え経路と、前記ステビオールから前記ステビオール配糖体を生成する少なくとも２つのＵＧＴ酵素とを発現しているＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞を２２〜３７℃で培養すること
を含む、前記方法。
【請求項７４】
前記ステビオール配糖体は、少なくとも５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも１００ｍｇ／Ｌの量で培養で生成され、かつ、任意選択でＲｅｂＤまたはＲｅｂＭである、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記Ｅ．ｃｏｌｉを、少なくとも約２４℃、または少なくとも約２７℃、または少なくとも約３０℃、または少なくとも約３４℃、または約３７℃の温度で培養する、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
少なくとも１つのＵＧＴ酵素は野生型酵素の円順列変異体である、請求項７３〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記Ｅ．ｃｏｌｉは、表１に掲載される酵素を１つ以上、またはその誘導体を発現する、請求項７５に記載の方法。
【請求項７８】
前記Ｅ．ｃｏｌｉは、
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのＧＧＰＳまたはその誘導体、
Ｅｒｗｉｎａ  ｔｒａｃｈｅｉｐｈｉｌａのＣＰＰＳまたはその誘導体、
Ｅｒｗｉｎａ  ｔｒａｃｈｅｉｐｈｉｌａのＫＳまたはその誘導体、
Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａのＫＯまたはその誘導体、
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａのＫＡＨまたはその誘導体、
Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａのＣＰＲまたはその誘導体、
Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａのＵＧＴ８５Ｃ２またはその誘導体、
Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａのＵＧＴ７４Ｇ１もしくはその誘導体、またはＭｂＵＧＴＣ１９もしくはその誘導体、またはＭｂＵＧＴＣ１９−２もしくはその誘導体、
Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａのＵＧＴ７６Ｇ１もしくはその誘導体、またはＭｂＵＧＴ１−３もしくはその誘導体、及び
Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａのＵＧＴ９１Ｄ２、またはＯｓＵＧＴ１−２、またはＭｂＵＧＴ１，２−２またはその誘導体
のうち１つ以上を発現する、請求項７５に記載の方法。
【請求項７９】
前記ＫＡＨは、置換Ｃ３３１Ｉを有するＡｔＫＡＨ誘導体である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記ＵＧＴ８５Ｃ２は、置換Ｐ２１５Ｔを有する誘導体である、請求項７８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１４年１１月５日に出願された米国仮出願第６２／０７５，６４４号に対する優先権及び利益を主張するものであり、その参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本願開示は、人工酵素を含めた酵素、コードするポリヌクレオチド、宿主細胞、及びステビオール配糖体を作製する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
高甘味度甘味料は、スクロースの甘味度よりも何倍も高い甘味度を有する。それらは本質的にカロリーゼロであり、一般に、食品及び飲料など、ダイエット用製品及び低カロリー製品に使用されている。高甘味度甘味料は血糖反応を誘発しないため、糖尿病患者及び炭水化物の摂取管理に関心のある人々をターゲットにした製品で使用するのに好適である。
【０００４】
ステビオール配糖体は、南アメリカの特定の地域に土着するＡｓｔｅｒａｃｅａｅ（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）科の多年生の低木Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  Ｂｅｒｔｏｎｉの葉に見られる、化合物群である。それらは、構造的に単一塩基ステビオールを特徴とし、Ｃ１３位及びＣ１９位において存在する炭水化物残基が異なる。ステビオール配糖体はステビアの葉に蓄積され、総乾燥重量の約１０％〜２０％を構成する。乾燥重量基準で見ると、ステビアの葉に見られる４つの主なグリコシドには典型的に、ステビオシド（９．１％）、レバウジオシドＡ（３．８％）、レバウジオシドＣ（０．６〜１．０％）及びズルコシドＡ（０．３％）が挙げられる。他の公知のステビオール配糖体には、レバウジオシドＢ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＭ、ステビオールビオシド及びルブソシドが挙げられる。
【０００５】
微量グリコシル化産物であるレバウジオシドＭは、スクロースよりも約２００〜３５０倍強力であると推定され、わずかな苦味または甘草の後味のあるきれいな甘味を持っていると表現されている。Ｐｒａｋａｓｈ  Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｔｅｖｉａ  Ｓｗｅｅｔｅｎｅｒ：Ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅ  Ｍ，Ｆｏｏｄｓ  ３（１），１６２−１７５（２０１４）。世界の食品産業はＲｅｂＭに大きな関心を寄せている。
【０００６】
Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａからステビオール配糖体を調製する方法は公知ではあるが、これらの方法の多くは商用には好適ではなく、かつ／または持続可能ではない。したがって、高度に精製されたステビオール配糖体組成物など、ステビオール配糖体を含む組成物を、簡便、効率的かつ経済的に調製する方法に対するニーズが依然としてある。さらに、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＥ、ＲｅｂＩ、ＲｅｂＭなどのようなグリコシル化を複数有する生成物を含む、微量グリコシル化生成物を実質的な量で製造する方法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００７】
さまざまな態様では、本発明は、ＲｅｂＤ及びＲｅｂＭならびにステビアの葉の微量生成物であるグリコシル化産物を含むステビオール配糖体を作製する方法を提供し、かつ、これらの方法で使用するための酵素、コードするポリヌクレオチド、及び宿主細胞を提供する。本発明は、ＲｅｂＤ及びＲｅｂＭのようなステビオールのグリコシル化産物を高純度及び／または高収率で製造するための、工学的に操作した酵素及び工学的に操作した宿主細胞を提供する。本発明はさらに、ステビオール配糖体を含有する製品、中でも、食品、飲料、口腔ケア用品、甘味料、香味料などの作製方法を提供する。
【０００８】
さまざまな態様及び実施形態では、本発明は、酵素、コードするポリヌクレオチド、宿主細胞、ならびにＣ１３及び／またはＣ１９に複数のグリコシル化を有するステビオール配糖体の作製方法を提供する。ステビオール配糖体は、２、３、４、５、６、７、８またはそれ以上のグリコシル化を有してよい。さまざまな実施形態では、グリコシル化を、Ｃ１３−Ｏ、Ｃ１９−Ｏ、１−２’（ステビオールのＣ−１３及び／またはＣ１９位）、及び１−３’（ステビオールのＣ−１３及び／またはＣ１９位）から選択する。これらのグリコシル化を実施するための例示的酵素は表８に掲載されており、ステビオールのＣ１３−Ｏグリコシル化（例えば、ＳｒＵＧＴ８５Ｃ２）、ステビオールのＣ１９−Ｏグリコシル化（例えば、ＳｒＵＧＴ７４Ｇ１）、ステビオール配糖体の１−２’グリコシル化（例えば、ＳｒＵＧＴ９１Ｄ１、ＳｒＵＧＴ９１Ｄ２、ＯｓＵＧＴ１−２）、及びステビオール配糖体の１−３’グリコシル化（例えば、ＳｒＵＧＴ７６Ｇ１）を触媒する酵素が含まれている。さまざまな実施形態で使用できる多数の誘導体を本明細書に開示しており、それらには、本明細書でＭｂＵＧＴｃ１３（配列番号５１）、ＭｂＵＧＴｃ１９（配列番号８）、ＭｂＵＧＴｃ１９−２（配列番号４６）、ＭｂＵＧＴ１−２（配列番号９）、ＭｂＵＧＴ１，２−２（配列番号４５）、及びＭｂＵＧＴ１−３（配列番号１０）として識別される酵素、及びその誘導体が含まれる。いくつかの実施形態では、本発明は、これらのグリコシル化をステビオール基質でインビボにて行うためのＵＧＴ酵素を少なくとも２つ、３つ、または４つ発現する宿主細胞を提供する。本発明の実施形態にしたがって製造され得るさまざまなステビオール配糖体生成物は、図２８〜３１及び表１０に示されており、それらには、ＲｅｂＭ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＥ、及びＲｅｂＩが含まれる。本発明実施形態に従って、これらのステビオール配糖体を、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌宿主細胞で高収率で生成させることができ、Ｅ．ｃｏｌｉの増殖及び代謝に好適な温度で生成させることができる。
【０００９】
いくつかの態様では、本発明は、修飾されたＵＧＴ酵素を提供し、これはレバウジオシドＡ（ＲｅｂＡ）のＣ１９における１−２’グリコシル化活性がその親ＵＧＴ酵素より高く、かつステビオールモノシドのＣ１３において１−２’グリコシル化活性の実質的損失がない。このような酵素により、ＲｅｂＤに対する高い炭素フラックスが提供され得る。さらに、本発明は、修飾されたＵＧＴ酵素を提供し、これはレバウジオシドＤ（ＲｅｂＤ）のＣ１９における１−３’グリコシル化活性がその親ＵＧＴ酵素より高く、かつステビオシドのＣ１３において１−３’グリコシル化活性の実質的損失がない。このような酵素により、ＲｅｂＭに対する高い炭素フラックスが提供され得る。
【００１０】
本願開示に従い、解糖からステビオール、さらにはステビオール配糖体へのさまざまな経路モジュールを作製して、宿主細胞内でステビオール配糖体の生成を工学的に操作するが、それを最適化し、バランスを調整して、主要グリコシル化産物としてのステビオール、それに次ぐＲｅｂＤまたはＲｅｂＭ（または他のグリコシル化産物）への炭素フラックスを促進させることができる。
【００１１】
別の態様では、本発明は、ＲｅｂＤを作製する方法を提供する。かかる方法は、複数のウリジン二リン酸依存型グリコシルトランスフェラーゼという酵素（ＵＧＴ）を介してステビオールからＲｅｂＤを生成する宿主細胞を提供すること、及びその宿主細胞を、ＲｅｂＤが生成される条件下で培養することを含む。ＵＧＴ酵素は、レバウジオシドＡ（ＲｅｂＡ）のＣ１９における１−２’グリコシル化活性が親ＵＧＴ酵素に比較して高く、ステビオールモノシドのＣ１３において１−２’グリコシル化活性の実質的損失がない、修飾されたＵＧＴ酵素を含む。ある実施形態では、レバウジオシドＡ（ＲｅｂＡ）のＣ１９における１−２’グリコシル化活性は、ステビオールモノシドのＣ１３における１−２’グリコシル化活性と等しいかまたはそれより優れている。
【００１２】
別の態様では、本発明は、ＲｅｂＭを作製する方法を提供する。かかる方法は、複数のウリジン二リン酸依存型グリコシルトランスフェラーゼ酵素（ＵＧＴ）を介してステビオールからＲｅｂＭを産生する宿主細胞を提供すること、及びその宿主細胞をＲｅｂＭが生成される条件下で培養することを含む。ＵＧＴ酵素は、（ａ）レバウジオシドＡ（ＲｅｂＡ）のＣ１９における１−２’グリコシル化活性がその親ＵＧＴ酵素より高く、ステビオールモノシドのＣ１３において１−２’グリコシル化活性の実質的損失がない、修飾されたＵＧＴ酵素；及び（ｂ）レバウジオシドＤ（ＲｅｂＤ）のＣ１９における１−３’グリコシル化活性がその親ＵＧＴ酵素より高く、かつステビオシドのＣ１３において１−３’グリコシル化活性の実質的損失がない、修飾されたＵＧＴ酵素のうち、１つ以上を含む。ある実施形態では、レバウジオシドＡ（ＲｅｂＡ）のＣ１９における１−２’グリコシル化活性は、ステビオールモノシドのＣ１３における１−２’グリコシル化活性と等しいかまたはそれより優れている。あるいは、またはさらに、レバウジオシドＤ（ＲｅｂＤ）のＣ１９における１−３’グリコシル化活性は、ステビオシドのＣ１３における１−３’グリコシル化活性と等しいかまたはそれより優れている。
【００１３】
いくつかの実施形態では、本発明は、野生型酵素（例えば、Ｌ２００ＡまたはＬ２００Ｇ）の２００位にアミノ酸置換を有する酵素を含め、ステビオシド及びＲｅｂＤの１−３’グリコシル化活性を提供し、実質的な活性改善を示す、修飾されたＳｒＵＧＴ７６Ｇ１酵素を提供する。
【００１４】
他の態様及び実施形態では、本発明は、野生型酵素に対し、新規な基質特異性、生成物プロファイル、及び反応速度を提供できる、ＵＧＴ酵素の円順列変異体（ならびに、コードするポリヌクレオチド）を提供する。円順列変異体は、本明細書に記載のように、ステビオール配糖体を生成させるために宿主細胞に発現させることができる。したがって、さまざまな実施形態では、微生物の細胞は、野生型ＵＧＴ酵素または親ＵＧＴ酵素の円順列変異体であるＵＧＴ酵素を少なくとも１つ発現させる。円順列変異体は、親酵素と同一の基本的折り畳み構造（ｆｏｌｄ）を保持しているが、Ｎ末端の位置（例えば、「切断部位」）が異なり、本来のＮ末端とＣ末端は連結されており、任意選択で連結配列により連結されている。例えば、円順列変異体では、Ｎ末端メチオニンは、天然のＮ末端ではなくタンパク質中の一部位に位置する。例えば、本発明は、ＯｓＵＧＴ１−２及びＳｒＵＧＴ７４Ｇ１の円順列変異体を提供し、それを、ステビオールのグリコシル化産物を生成させるために本明細書に記載のようにさらに修飾することができる。
【００１５】
別の態様では、本発明は、少なくとも４つのグリコシル化を有するステビオール配糖体をＥ．ｃｏｌｉ内に生成させる方法を提供する。本発明に従い、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞は、本明細書に記載の酵素を１つ以上含んでよい複数のＵＧＴ酵素を含み、これらは共に少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つのグリコシル化反応を連続して行う。本明細書に開示するように、グリコシル化の基質及び低グリコシル化産物は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞内に十分に蓄積して下流の反応を許容される速度で進行させ、グリコシル化産物のほとんど大部分が最終的に細胞外に蓄積する。ステビオール配糖体は、培地成分から精製され得る。したがって、Ｅ．ｃｏｌｉは、ステビオール足場のグリコシル化反応をいくつか必要とするステビオール配糖体の生成にとって望ましい宿主である。
【００１６】
さらに他の態様では、本発明は、ステビオール配糖体（ＲｅｂＭ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＥ、ＲｅｂＩ、及びその他を含む）をＥ．ｃｏｌｉ内に生成させる方法を提供する。宿主細胞内でステビオールを生成させることが既知の酵素の多くは植物酵素であり、それらは至適温度が２０〜２４℃の範囲であることが多いが、Ｅ．ｃｏｌｉの増殖率及び代謝は、それより高温で至適である。本願開示により、２４℃を上回る温度、例えば、２４℃〜３７℃、または２７℃〜３７℃、または３０℃〜３７℃での酵素による生成を可能にすることにより、Ｅ．ｃｏｌｉ内にステビオール配糖体を高収率で生成させることが可能になる。さまざまな実施形態では、本開示は、ステビオールまたはステビオール配糖体をＥ．ｃｏｌｉまたは他の微生物宿主内に生成させるための代替的または工学的に操作されたＧＧＰＰＳ酵素、ＫＳ酵素、ＣＰＰＳ酵素、ＫＯ酵素、及びＫＡＨ酵素を提供する。
【００１７】
本発明の他の態様及び実施形態は、以下の詳細な開示から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ステビオール配糖体ファミリーの微量成分であり、ジテルペノイドステビオール（枠内）の誘導体で６つのグルコシル修飾基を有するレバウジオシドＭ（ＲｅｂＭ）の化学構造を示す。
【図２】ＲｅｂＭへの経路モジュールを示す。解糖及びＭＥＰ経路を１つのモジュールとして扱い、その下流のカウレン生合成経路を第２モジュールとして示す。ステビオールの生合成を第３モジュールとして示す。第４モジュールはステビオールのグリコシル化とＲｅｂＭ生合成経路である。ＵＤＰ−グルコース生成増強を支持する第５モジュールも示されている。
【図３】ＲｅｂＭまでを含む、ステビオール配糖体生成の例示的な一経路を示す。ＰｓＣＫＳは二機能性コパリル二リン酸及びカウレン合成酵素（Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｓｐ．由来）であり、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰからＴａｘｕｓ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓのＧＧＰＰ合成酵素により合成。図示せず）に対して作用する。ＳｒＫＯはＳｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａカウレンオキシダーゼであり、ＡｔＫＡＨはステビオールモノオキシゲナーゼ活性を有するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  Ｐ４５０である。実線矢印は、既知のＵＧＴ活性である。点線枠の矢印は、インビトロで他の基質に対して実証されている活性に基づいて予測される反応である。ＭｂＵＧＴ１−２は本開示で設計した新規ＵＧＴ酵素である。
【図４】工学的に操作されたＥ．ｃｏｌｉ細胞から得たカウレン生成プロファイルを示す。
【図４Ａ】植物Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ（ＳｒＣＰＰＳ及びＳｒＫＳ）から選択されるＣＰＰＳ／ＫＳ酵素からのカウレン生成である。
【図４Ｂ】植物Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ（ＰｐＣＫ）から選択されるＣＰＰＳ／ＫＳ酵素からのカウレン生成である。
【図４Ｃ】真菌種Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ（ＧｆＣＫ）から選択される酵素を用いて構築した株である。
【図４Ｄ】真菌種Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｓｐ．（ＰｓＣＫ）から選択される酵素を用いて構築した株である。
【図５】異なるＫＳ酵素から構築された株により得られたＧＣプロファイルを示す。経路は図２に示されている。枠内の図（左部に挿入）は、副生成物の蓄積を示すクロマトグラフを拡大したものである。ＧＣプロファイル及び対応するＭＳスペクトルから、ＫＳ酵素は、生成物プロファイルに関して非特異的であり得ることが示されている。他のテルペノイド副生成物はカウレンと同様のＭＳ特性で生成された。３経路すべてにおいて主生成物はカウレンである。カウレンの真正性は、これまでに公開されている文献で報告されているＭＳスペクトル及びＮＭＲデータとの比較により確認される。すべての副生成物から得たＭＳスペクトルは、特徴的な２７２分子イオンを示す。
【図６】工学的に操作された株から得た生成物プロファイルを示す。上流経路の調節が異なる場合の各種の下流経路の発現レベルから得た生成プロファイルが示されている。副生成物は、図５に示されている副生成物と同一である。各株の遺伝子型の詳細表２に記載されている。
【図７】適切にバランスのとれたモジュールがカウレン生合成を可能にしている株（表２の株４７、Ｃｈ１ＴｒｃＭＥＰ−Ｃｈ１Ｔ７ＰｓＣＫＧ）は、２Ｌバイオリアクターにおいて１リットルあたり数グラム規模でのカウレン製造が可能であることを示す。
【図８】工学的に操作された株全体を通して、インドールの蓄積はカウレン生成と逆相関することを示す。
【図９】ＳｒＫＯ酵素の再設計及び特性記述を示す。
【図９Ａ】Ｎ末端膜貫通領域の分析及びＳｒＫＯに対する修飾を有する欠失である。
【図９Ｂ】設計したＳｒＫＯ／ＳｒＣＰＲ酵素構成体の概略図である。
【図９Ｃ】Ｅ．ｃｏｌｉ内の工学的に操作された各種構成体（１）ＷＴ、（２）ＷＴ＋（ＭＡ）ＫＯ−Ｏ−ＣＰＲ、（３）ＷＴ＋（ＭＡ）ＫＯ−Ｏ−ＣＰＲ、（４）ＷＴ＋（ＭＡ）ＫＯ−Ｌ−ＣＰＲ、（５）ＷＴ＋（ＭＡ）ＫＯ−Ｌ−ＣＰＲ、（６）ＷＴ＋（８ＲＰ）ＫＯ−Ｏ−ＣＰＲ、（７）ＷＴ＋（８ＲＰ）ＫＯ−Ｏ−ＣＰＲ、（８）ＷＴ＋（８ＲＰ）ＫＯ−Ｌ−ＣＰＲ、（９）ＷＴ＋（８ＲＰ）ＫＯ−Ｌ−ＣＰＲのタンパク質発現である。
【図１０】株４７のバックグラウンドでＳｒＣＰＲとのリンカーまたはオペロンとして立体配置されているＳｒＫＯのカウレン酸の生産性を示す。
【図１１】プラスミドのコピー数及びプロモーター強度をさまざまに変えた場合のＳｒＫＯ構成体のＭＭＭＥ全体像の探索を例示する。バランスの悪いモジュールは、カウレン酸の蓄積が少量であるかまたはまったくなく、その代わり、それと関連して上流のカウレン蓄積が増加を示している。
【図１２】ＫＯ、ＫＡＨ、またはＣＰＲ遺伝子の最適酵素多様体、Ｎ末端欠失、及び点変異についてスクリーニングするためのＣＹＰ４５０発現モジュール設計を示す。２つのＰ４５０とＣＰＲ酵素を、プラスミドのフォーマットまたは染色体に組み込んだフォーマットでプロモーター強度をさまざまに変えて、ポリシストロン性オペロンで発現させる。
【図１３】野生型ＡｔＫＡＨと比べたカウレン酸ヒドロキシラーゼ活性の倍率変化で表したＡｔＫＡＨ酵素の各種点変異体を示す。
【図１４】ステビオール生産性が改善され、最終的にカウレン酸からステビオールに完全変換されていることを実証する、工学的に操作された一連のＡｔＫＡＨを示す。
【図１５】適切にバランスのとれたモジュールにおいて、２つのＰ４５０（ＡｔＫＡＨ及びＳｒＫＯ）及び補因子ＣＹＰ４５０レダクターゼ（ＳｒＣＰＲ）は、カウレンからカウレン酸へ、さらにステビオールへと完全に変換できることを示す。
【図１６】ＵＤＰ−グルコース生成増加について操作されたテルペン生成Ｅ．ｃｏｌｉ株を用いて低分子カフェ酸をグリコシル化させ、ｐＥＴプラスミドから過剰発現させたＶｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａグリコシルトランスフェラーゼ２（ＶｖＧＴ２）を用いてカフェ酸３‐グルコシドを生成させるモデル系を使用した、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＵＤＰ−グルコース生成の増加を示す。グリコシル化されたカフェ酸の力価が非修飾バックグラウンド株よりも改善されていることから、グリコシル化を支持するＵＤＰ−グルコース基質プールが増加していることが示される。株１は、ガラクトース異化モジュール（ｇａｌＥＴＫＭ）、ＵＤＰ−糖ピロホスファターゼ（ｕｓｈＡ）、ホスホグルコムターゼ（ｐｇｍ）、グリコース−１ホスファターゼ（ａｇｐ）、β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）のノックアウトを有し、Ｔｒｃプロモーター下でスクロースホスホリラーゼ（ｓｐｌ）を過剰発現している株４７（表２）である（表７を参照されたい）。株２は、ガラクトース異化モジュール（ｇａｌＥＴＫＭ）、ＵＤＰ−糖ピロホスファターゼ（ｕｓｈＡ）、ホスホグルコムターゼ（ｐｇｍ）、グリコース−１ホスファターゼ（ａｇｐ）、β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）のノックアウトを有し、Ｔ７プロモーター下でスクロースホスホリラーゼ（ｓｐｌ）を過剰発現している株４７（表２）である（表７を参照されたい）。
【図１７】４つのＵＧＴ活性すべてを組み込んだ最適グリコシル化モジュールの識別過程示す。可能な全２４の組み合わせを、異なる３レベルでの発現を可能にする３種の異なるプラスミドに素早くアセンブリし合計７２の有力な構成体を得る。
【図１８】ＲｅｂＭのインビボでの生成を示す。
【図１８Ａ】Ｅ．ｃｏｌｉ培養から得たステビオール配糖体の生成物の力価である。
【図１８Ｂ】ＲｅｂＭの同定を示すＬＣ／ＭＳトレースである。陰性対照株は、ステビオール及びＵＤＰ−グルコースプール増量が得られるよう修飾されており、４ＵＧＴ株は陰性対照株に４種のＵＧＴを加えたものである。
【図１９】円順列変異体設計の開始点としての、ＯｓＵＧＴ１−２（米Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ由来１−２’グリコシル化酵素）相同モデルを示す。
【図２０】天然のＮ末端とＣ末端をつなぐＵＧＴ円順列変異体用リンカーを示す。３種の異なるリンカー、すなわち（Ａ）既存配列を結合しているＹＫＤＤＳＧＹＳＳＳＹＡＡＡＡＧＭ（配列番号４８）、（Ｂ）中間の長さのループを作るＹＫＤＡＡＧＭ（配列番号４９）、及び（Ｃ）最小ループを作るＹＧＳＧＭ（配列番号５０）が示されている。
【図２１】ＵＧＴ円順列変異体の新たなＮ末端及びＣ末端の選択基準を例示する。新たな末端の位置は、（１）溶媒に露出しており、障害を最小化するために活性部位から離れていること、（２）親配列との相違を最大にするため、配列の中間位置に近いこと、及び（３）既存の円順列変異体分岐点にしばしば見られるアミノ酸を有していることが必要である（Ｌｏ，ｅｔ  ａｌ．，２０１２，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ７（２）：ｅ３１７９１）。Ｇ１９８、Ｋ２４０、Ｇ２５０、及びＧ２５９における新たなＮ末端がこれらの基準に合致している。
【図２２】第１回目のＯｓＵＧＴ１−２の円順列変異体の１−２’グリコシル化活性を示す。数字は、Ｎ末端及びＣ末端の新規な位置を作製するために使用した親配列の切断部位の位置を指し、Ｌ／Ｍ／Ｓ表示は、長／中／短の各リンカー（図２０に記載）を表す。
【図２３】１−２’ＵＧＴ円順列変異体（ＭｂＵＧＴ１−２）の改良を示す。切断部位及びリンカー長の変更により、この酵素に可能な少なくとも１つの基質に対する活性が有意に増強されることが示されている。Ｌの手前の数字（例えば、ｘｘｘＬ）は、新しい切断部位の位置を指し、Ｌの後ろの数字（例えば、１Ｌｘｘ）は、切断部位が１９８のバックグラウンドにおける新しいリンカー長を指す［ＢＬ２１＝無ＵＧＴの陰性対照］。
【図２４】ＭｂＵＧＴ１−２酵素における点変異を示す。点変異では、基質ステビオールモノシドに対するより高い活性が示され、円順列変異法（ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｐｅｒｍｕｔｉｚａｔｉｏｎ）により作製されたＵＧＴ酵素改善についての可能性を示している［ＢＬ２１＝無ＵＧＴの陰性対照］。
【図２５】ＭｂＵＧＴ１−２酵素における点変異を示す。点変異では、基質レバウジオシドＡに対するより高い活性が示され、円順列変異法（ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｐｅｒｍｕｔｉｚａｔｉｏｎ）により作製されたＵＧＴ酵素改善についての可能性を示している。［ＢＬ２１＝無ＵＧＴの陰性対照］。
【図２６】ＭｂＵＧＴ１−２酵素に有益な点変異は、親ＵＧＴ酵素で適切なアミノ酸残基に翻訳されていれば、活性に対し中立的または有害な影響をもたらさないことを示す。このことは、円順列変異体には、これまで自然選択では選択されていない新規な配列への配列シャッフリングによりもたらされる、固有の改善と進化の可能性があることを実証している。［ＢＬ２１＝無ＵＧＴの陰性対照］。
【図２７】ＳｒＵＧＴ８５Ｃ２のＮ末端とＳｒＵＧＴ７６Ｇ１のＣ末端とを融合させて創作された、Ｃ１３−Ｏ−グリコシル化活性を持つキメラＵＧＴを示す。
【図２８】ＳｒＵＧＴ８５Ｃ２（すなわち、Ｃ１３−Ｏ−グリコシル化）により触媒される可能な反応（矢印で記載）の概要である。
【図２９】ＳｒＵＧＴ７４Ｇ１（すなわち、Ｃ１９−Ｏ−グリコシル化）により触媒される可能な反応（矢印で記載）の概要である。
【図３０】ＭｂＵＧＴ１−２（すなわち、１−２−グリコシル化）により触媒される可能な反応（矢印で記載）の概要である。
【図３１】ＳｒＵＧＴ７６Ｇ１（すなわち、１−３−グリコシル化）により触媒される可能な反応（矢印で記載）の概要である。
【図３２】ＳｒＵＧＴ８５Ｃ２酵素における点変異とステビオール基質に対する活性変化との対比を示す。［ＢＬ２１＝無ＵＧＴの陰性対照］。
【図３３】ＳｒＵＧＴ８５Ｃ２酵素における点変異とＣ１９−グルコピラノシルステビオール基質に対する活性変化との対比を示す。［ＢＬ２１＝無ＵＧＴの陰性対照］。
【図３４】第１回目のＳｒＵＧＴ７４Ｇ１の円順列変異体のＣ１９−Ｏ−グリコシル化活性を示す。数字は、新規なＮ末端及びＣ末端を作製するために使用した親配列の切断部位の位置を指し、ｗｔ／Ｌ／Ｓ表示は、野生型／長／短の各リンカーを表す（この場合、「ｗｔ」は、改変を含まない、既存のＮ末端配列とＣ末端配列との単純な融合を指す）。
【図３５】ＳｒＵＧＴ７６Ｇ１酵素における点変異とステビオシド基質に対する活性変化との対比を示す。［ＢＬ２１＝無ＵＧＴの陰性対照］。
【図３６】ＳｒＵＧＴ７６Ｇ１酵素における点変異とレバウジオシドＤ基質に対する活性変化との対比を示す。［ＢＬ２１＝無ＵＧＴの陰性対照］。
【図３７】第１回目のＳｒＵＧＴ７６Ｇ１の円順列変異体の１−３’グリコシル化活性を示す。数字は、新規なＮ末端及びＣ末端を作製するために使用した親配列の切断部位の位置を指し、Ｌ／Ｓ表示は長／短の各リンカーを表す。
【図３８】結晶構造が解明されているシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＵＧＴである２ＶＣＥに固定した、ＵＧＴアラインメント及び二次構造を示す。Ｑ０ＤＰＢ７−ＯＲＹＳＪはＯｓＵＧＴ１−２である。囲み枠は７６Ｇ１−Ｌ２００Ａ点変異の位置であり、有意に改善された活性を促進する。保存されたＰＳＰＧモチーフも複数の囲み枠に示されている。
【図３９】２２℃、３０℃、及び３７℃での性能についてインビボで試験した代替的ＧＧＰＰＳ酵素を示す。
【図４０】２２℃、３０℃、及び３７℃での性能についてインビボで試験した代替的ＣＰＰＳ／ＫＳ対を示す。
【図４１】２２℃で選択した株を使用してステビオール及び他のグリコシル化産物と比較した場合のＲｅｂＭの力価を示す。
【図４２】ＲｅｂＭの大部分が細胞外に蓄積することを示す。左パネル［訳者注：ＷＯ２０１６０７３７４０では上下に配されており、この図では上パネルに該当］は、細胞内及び細胞外のＲｅｂＭ及びステビオール配糖体の力価を示す。右パネル［訳者注：ＷＯ２０１６０７３７４０では上下に配されており、この図では下パネルに該当］は、同一のデータを、細胞外で観察された各化合物のパーセントとして示す。
【図４３】ステビオールモノシドの生成に基づく、２２℃、３０℃、及び３４℃でのＵＧＴ８５Ｃ２変異体のスクリーニングを示す。
【図４３Ａ】３４℃での変異体を示すパネルである。
【図４３Ｂ】３４℃での変異体を示すパネルである。
【図４３Ｃ】２２℃、３０℃、及び３４℃でのステビオールモノシドの生成についてスクリーニングした選択変異を示す。
【図４４】３０及び３４℃での活性についての７４Ｇ１円順列変異体のスクリーニングを示す。
【図４４Ａ】ステビオールに対する活性を示すパネルである。
【図４４Ｂ】ステビオールビオシドに対する活性を示すパネルである。
【図４５】２２℃、２６℃、及び３０℃での活性についてのＡｔＫＡＨ点変異体のスクリーニングを示す。
【図４６】３０℃及び３４℃でのＭｂＵＧＴ１−２組換え変異体のインビトロでのスクリーニングを示す。
【図４６Ａ】ＲｅｂＡからＲｅｂＤへの変換を示すパネルである。
【図４６Ｂ】ステビオールモノシドから１３Ｃステビオールビオシドへの変換を示すパネルである。
【図４７】各種モジュール構成体間の３０℃でのカウレン生成を示す。
【図４８】各種モジュール構成体間の３４℃でのカウレン生成を示す。
【図４９】ＡｔＫＡＨ点変異のライブラリー全体を通した３０℃でのステビオールの生成を示す。
【図５０】ＡｔＫＡＨ点変異のライブラリー全体を通した３４℃でのステビオールの生成を示す。
【図５１】３０℃、３４℃、及び３７℃でのＭｂＵＧＴ１−２円順列変異体の活性を示す。
【図５１Ａ】ＲｅｂＡからＲｅｂＤへの変換を示すパネルである。
【図５１Ｂ】ステビオールモノシドから１３Ｃステビオールビオシドへの変換を示すパネルである。
【図５２】３０℃、３４℃、及び３７℃においてステビオールを１３Ｃステビオールモノシドに変換するＵＧＴ８５Ｃ２変異体の活性を示す。
【図５３】３０℃、３４℃、及び３７℃においてＲｅｂＤを１３Ｃ  ＲｅｂＭに変換するＵＧＴ７６Ｇ１変異体の活性を示す。
【図５４】３０℃、３４℃、及び３７℃においてステビオールビオシドを１３Ｃステビオシドに変換するＵＧＴ７４Ｇ１円順列変異体の活性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
さまざまな態様では、本発明は、ＲｅｂＭ、ＲｅｂＤ、及びステビアの葉で微量に生成されるグリコシル化産物などのステビオール配糖体の作製方法を提供し、かつ、これらの方法で使用するための酵素、コードするポリヌクレオチド、及び宿主細胞を提供する。本発明は、ステビオールのグリコシル化産物を作製するための、工学的に操作した酵素及び工学的に操作した宿主細胞を高純度及び／または高収率で提供する。本発明はさらに、ＲｅｂＭまたはＲｅｂＤのようなステビオール配糖体を含有する製品、中でも、食品、飲料、口腔ケア用品、甘味料、香味料などを作製する方法を提供する。このようなステビオール配糖体含有製品を、本開示によって低コストで製造できる。
【００２０】
ＲｅｂＭは図１に例示されており、囲み枠で示されるステビオール足場（ジテルペノイド）を有している。ＲｅｂＭは、６つのグリコシル化、すなわち、（１）Ｃ１３  Ｏ−グリコシル化、（２）Ｃ１３  １−２’グリコシル化、（３）Ｃ１３  １−３’グリコシル化、（４）Ｃ１９  Ｏ−グリコシル化、（５）Ｃ１９  １−２’グリコシル化、及び（６）Ｃ１９  １−３’グリコシル化を含有している。ゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）からＲｅｂＭへの経路を図３に例示する。ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰ（ＭＥＰ経路またはＭＶＡ経路の生成物）から生成されるＧＧＰＰを、実施形態によっては二機能性酵素として提示され得るコパリル合成酵素及びカウレン合成酵素の作用によりカウレンに変換させる。ステビオールは、Ｐ４５０酵素であるカウレンオキシダーゼ及びカウレン酸ヒドロキシラーゼの２酵素の作用によってカウレンから生成され、これらの酵素は、１つ以上のＰ４５０レダクターゼ酵素により再生される。ステビオール生成後、Ｃ１３位及びＣ１９位での一連のグリコシル化反応により、６グリコシル化（ｈｅｘａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）ＲｅｂＭなど多様なステビオール配糖体生成物を生成させることができる。他のさまざまなグリコシル化産物が（図３に示すように）可能であり、図２８〜３１に例示されるように、既知のＵＧＴグリコシル化酵素はそれぞれ、多数の基質に対して作用することができる。したがって、グリコシル化産物の相対的収率は、その基質の忠実性、相対反応速度、発現レベル、及び利用性に影響されることになる。例えば、ＵＧＴ９１Ｄ２及びＯｓＵＧＴ１−２はどちらも、ステビオールモノシドから（Ｃ１３での作用により）ステビオールビオシド、ならびに、ＲｅｂＡから（Ｃ１９での作用により）ＲｅｂＤを生成させることができる１−２’グリコシル化酵素である。さらに、ＵＧＴ７６Ｇ１は、ステビオシドから（Ｃ１３での作用により）ＲｅｂＡ、ならびに、ＲｅｂＤから（Ｃ１９での作用により）ＲｅｂＭを生成させることができる１−３’グリコシル化酵素である。表８、９、及び１０は、６つのグリコシル化反応から生じ得る可能な各種ステビオール配糖体、ならびに、各反応の酵素を示す。表１は、ステビオール配糖体の生成に使用してよい各種酵素の一覧である。本明細書と共にアミノ酸配列も提供され、その各々は、任意選択で、細胞内の代謝回転を抑制するために２位にアラニンの挿入または置換を含むことができる。特定のＧＧＰＰＳ配列はさらに、２つのさらなる残基（ＶＤ）を配列末端に含有し、これらの残基は何らかの有害な影響があるとは考えられておらず、ある実施形態では省略され得る。
【００２１】
したがって、いくつかの態様では、本発明は、所望のステビオール配糖体（例えば、ＲｅｂＭ）の生成を最大限にするために工学的に操作した酵素、コードするポリヌクレオチド、及び宿主細胞を提供する。例えば、本開示は、レバウジオシドＡ（ＲｅｂＡ）のＣ１９における１−２’グリコシル化活性が親ＵＧＴ酵素より高く、ステビオールモノシドのＣ１３において１−２’グリコシル化活性の実質的損失がない、修飾されたＵＧＴ酵素を提供する。このような酵素は、ＲｅｂＤに対する高い炭素フラックスを提供し得る。さらに、本開示は、レバウジオシドＤ（ＲｅｂＤ）のＣ１９における１−３’グリコシル化活性が親ＵＧＴ酵素より高く、ステビオシドのＣ１３において１−３’グリコシル化活性の実質的損失がない、修飾されたＵＧＴ酵素を提供する。このような酵素は、ＲｅｂＭに対する高い炭素フラックスを提供し得る。理論に束縛されることは望まないが、いくつかの態様及び実施形態では、本発明は、基質（超基質を含む）をより良く収容することができ、それにより、ＲｅｂＡまたはＲｅｂＤのようにさらに高度にグリコシル化されたステビオール基質との作用速度（例えば、基質結合及び代謝回転の速度）を高めることができる基質結合ポケットを有する修飾ＵＧＴ酵素を提供する。
【００２２】
いくつかの態様では、本発明は、グリコシル化産物として主にＲｅｂＭが生成される制御されたグリコシル化経路を提供する。例えば、いくつかの実施形態では、本発明は、微生物の細胞でＲｅｂＭを作製する方法を提供し、ここで、ＲｅｂＭ：ＲｅｂＤ比は約１：１超、または約１：０．５超、または約１：０．２５超、または約１０：１超、または約２５：１超、または約５０：１超である。いくつかの実施形態では、ＲｅｂＤは、ＲｅｂＭ収率の約２０％未満、または約１０％未満、または約５％未満、または約１％未満で生成されるか、または単離されたステビオールのグリコシル化産物中で検出不可能である。ＲｅｂＤは、ＲｅｂＭからの分離が困難であり得ること、またはそのような分離が必要な場合に多大な精製コストが追加され得ることから、実施形態によってはＲｅｂＤ量の少ない生成物が望ましい。いくつかの実施形態では、ＲｅｂＭは、細胞により産生されたステビオールのグリコシル化産物の少なくとも約２５重量％、またはグリコシル化産物の少なくとも約５０重量％、またはグリコシル化産物の少なくとも約７５重量％、またはグリコシル化産物の少なくとも約８０重量％、またはグリコシル化産物の少なくとも約８５重量％、またはグリコシル化産物の少なくとも約９０重量％、またはステビオールのグリコシル化産物の少なくとも約９５重量％を示す。
【００２３】
グリコシル化経路には、１３−Ｏグリコシル化、１９−Ｏグリコシル化、ならびに、ステビオールのＣ１３及び／またはＣ１９における１つ以上の１−２’グリコシル化及び／または１つ以上の１−３’グリコシル化が関与する。用語「ステビオール配糖体（複数可）」とは、ステビオールの配糖体を指し、これには、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド、ルブソシド、ズルコシドＢ、ズルコシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＧ、ステビオシド、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＦ、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＨ、レバウジオシドＬ、レバウジオシドＫ、レバウジオシドＪ、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＮ、レバウジオシドＯが含まれるが、これらに限定されない。これらのステビオール配糖体の化学的特性は公知であり、例えば、表１０、ならびに、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／１２２２２７号に記載されている。
【００２４】
本願開示に従い、ステビオール配糖体の生成は、図２に例示されるようにさまざまな経路「モジュール」の作製を介して宿主細胞内で工学的に操作され、それを、最適化及びバランス調整してステビオール、それに次ぐ主要グリコシル化産物としての所望グリコシル化産物（ＲｅｂＭまたはＲｅｂＤなど）までの炭素フラックスを促進させることができる。代謝回転の類似する酵素を一つのサブセット、またはモジュールにグループ化し、かつ酵素の濃度／活性を調節して各種サブセットの代謝回転を一様にすることにより、経路の代謝回転と資源消費量との比を最適化することができる。
【００２５】
第１の経路モジュールは、ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰを生成する、ＭＥＰ経路またはＭＶＡ経路の酵素を含む。ＭＥＰ経路及びＭＶＡ経路は生物に内因性のものであってよく、これらの経路を、特定の律速酵素の重複コピーを提供することによって高め、かつ下流経路とのバランスを調整してよい。ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰは、（−）−カウレン生成用の基質として（例えば、コパリル合成酵素とカウレンシンターゼ酵素とを別々に、または二機能性酵素により）作用し、これが第２の経路モジュールとなる。第３の経路モジュールでは、２つのＰ４５０酵素（例えば、カウレンオキシダーゼ（ＫＯ）及びカウレン酸ヒドロキシラーゼ（ＫＡＨ））及び１つ以上のＰ４５０レダクターゼ酵素の作用により、（−）−カウレン酸をステビオールに変換する。ＧＧＰＰの生成とそのステビオールまでの変換を触媒する例示的な酵素は表１に掲載されている。その後、ステビオールはＵＤＰ酵素モジュールによりグリコシル化されて最終生成物となる。さらなるモジュールには、ＵＤＰ−グルコース基質の生成を増強する遺伝子が含まれる。本発明のさまざまな実施形態では、これらのモジュールはそれぞれモノシストロン性オペロンまたはポリシストロン性オペロンとして存在し、それぞれがプラスミド上に存在するかまたは染色体に組み込まれている。ある実施形態では、モジュールは、所望の最終生成物の生成が増加するよう構成されている。
【００２６】
一態様では、本発明は、任意選択でＲｅｂＭまたはＲｅｂＤである、ステビオール配糖体を作製する方法を提供する。かかる方法は、複数のウリジン二リン酸依存型グリコシルトランスフェラーゼ酵素（ＵＧＴ）を介してステビオールからステビオール配糖体を生成する宿主細胞を提供すること、及びその宿主細胞をステビオール配糖体が生成される条件下で培養することを含む。ＵＧＴ酵素は、（ａ）レバウジオシドＡ（ＲｅｂＡ）のＣ１９における１−２’グリコシル化活性がその親ＵＧＴ酵素より高く、ステビオールモノシドのＣ１３において１−２’グリコシル化活性の実質的損失がない、修飾されたＵＧＴ酵素（例えば、２２℃、２７℃、または３０℃で評価した場合）；及び（ｂ）レバウジオシドＤ（ＲｅｂＤ）のＣ１９における１−３’グリコシル化活性がその親ＵＧＴ酵素より高く、かつステビオシドのＣ１３において１−３’グリコシル化活性の実質的損失がない、修飾されたＵＧＴ酵素（例えば、２２℃、２７℃、または３０℃で評価した場合）のうち１つ以上を含む。
【００２７】
ある実施形態では、レバウジオシドＡ（ＲｅｂＡ）のＣ１９における１−２’グリコシル化活性は、ステビオールモノシドのＣ１３における１−２’グリコシル化活性と等しいかまたはそれより優れている。あるいは、またはさらに、レバウジオシドＤ（ＲｅｂＤ）のＣ１９における１−３’グリコシル化活性は、ステビオシドのＣ１３における１−３’グリコシル化活性と等しいかまたはそれより優れている。
【００２８】
いくつかの実施形態では、１−２’グリコシル化活性を有する修飾ＵＧＴ酵素及び／または１−３’グリコシル化活性を有するＵＧＴ酵素は、親酵素と比較した場合に、Ｃ１３における活性の実質的損失を示さない。例えば、修飾酵素は、親（例えば、野生型）酵素と比較して、Ｃ１３におけるその活性の少なくとも５０％、またはＣ１３におけるその活性の少なくとも約７５％、またはＣ１３におけるその活性の少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％を保持する（例えば、２２℃、２７℃、または３０℃で評価した場合）。いくつかの実施形態では、酵素は、Ｃ１３において改善された活性を有し、例えば、Ｃ１３における活性が少なくとも２倍または少なくとも３倍改善されている。グリコシル化活性の損失または改善は、インビトロ、例えば対象基質を添加した細胞抽出物において、または他のインビトロまたはインビボでのアッセイで決定できる。例えば、相対反応速度は、対象とするステビオールまたはステビオール配糖体の基質（複数可）が生成される株で決定され得る。グリコシル化活性を定量化する例示的な評価法は、本明細書ならびに参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／１２２２２７号に開示されている。
【００２９】
いくつかの実施形態では、Ｃ１３における１−２’グリコシル化活性及び１−３’グリコシル化活性は、これらの反応をＣ１９にて行う酵素で十分に（例えば、酵素によるこれらの段階のために何ら酵素を加えることなく）機能するが、他の実施形態では、細胞はさらに、Ｃ１３において１−２’グリコシル化及び／または１−３’グリコシル化を行うための酵素を発現する。いくつかの実施形態では、たとえＣ１９において活性損失があっても、１−２’反応及び／または１−３’反応をＣ１３において行うよう、第２の酵素を工学的に操作する。
【００３０】
いくつかの実施形態では、細胞は、ステビオールモノシドのＣ１３における１−２’グリコシル化活性を有するＵＧＴ酵素を１つのみ発現し、かつ／またはステビオシドのＣ１３における１−３’グリコシル化活性を有するＵＧＴ酵素を１つのみ発現する。そのような実施形態では、酵素を工学的に操作してＣ１９における反応を高め、これにより、ＲｅｂＭなどのＣ１９グリコシル化産物の方へ生成物を引き寄せることができ、細胞にさらに代謝負荷を掛けることになる追加酵素を発現させなくてもすむ。
【００３１】
複数の態様及び実施形態では、本発明は、親（例えば、野生型）酵素に対し、新規な基質特異性、生成物プロファイル、及び反応速度を提供できる、ＵＧＴ酵素の円順列変異体（ならびに、コードするポリヌクレオチド、及びＵＧＴ酵素の円順列変異体の作製方法）を提供する。理論に束縛されることは望まないが、円順列変異体は、１つ以上のグリコシル基を有するステビオール基質のような超基質に対し、より開かれているかまたは接近可能なＵＧＴ結合ポケット作製の機会を提供する。このようにすることで、本発明は、グリコシル化が多い形態のステビオールに対するグリコシル化反応を、グリコシル化が少ない（したがって、小さい）基質に対する反応と同様またはそれ以上の速度で進行させるようにできる。円順列変異体は、本明細書に記載のように、ステビオール配糖体を生成させるために宿主細胞に発現させることができる。したがって、さまざまな実施形態では、ステビオール配糖体（例えば、ＲｅｂＭまたはＲｅｂＤ）を生成する微生物細胞は、親（例えば、野生型）ＵＧＴ酵素の円順列変異体であるＵＧＴ酵素を少なくとも１つ発現する。
【００３２】
円順列変異体は、親酵素と同一の基本的折り畳み構造（ｆｏｌｄ）を保持しているが、天然のＮ末端の位置が異なり（例えば、「切断部位」）、本来のＮ末端とＣ末端は連結され、任意選択で連結配列により連結されている。ＵＧＴ酵素の例示的構造（例えば、ＯｓＵＧＴ１−２に基づく）は図２０に示されている。ＵＧＴアラインメント及び二次構造エレメントは、図３８に示されている。各円順列変異体について、切断部位は、変異体のＮ末端アミノ酸（例えば、Ｎ末端の５０または１００アミノ酸）と親または野生型の配列とのアラインメントにより、親配列（例えば、野生型配列）の対応する位置を基準にして記載され得る。本明細書で使用する場合、所与の円順列変異体の「切断部位」とは、円順列変異体の２位（例えば、開始Ｍｅｔの後）、またはタンパク質の代謝回転を抑制するために２位にアラニンを挿入した場合の円順列変異体の３位に位置するアミノ酸の元々の位置を指す。ＵＧＴ配列全体を比較するためのアラインメントは、図３８に示されている保存されたＰＳＰＧモチーフ周辺に固定する必要がある。ＰＳＰＧ（植物二次代謝産物グリコシルトランスフェラーゼ）モチーフは、ヌクレオチド二リン酸糖供与体分子を結合させる役割を果たす、植物ＵＧＴ内の保存されている領域である。Ｇａｃｈｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ：ｔｈｅ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．１０：５４２−５４９（２００５）。ＵＤＰＧＴファミリーのこのモチーフの最も保存された残基は、ＷＸＰＱＸＸＸＬＸＨＸＸＸＸＡＦＸＸ［Ｈ］ＸＧＸＸＸＸＸＥＸＸＸＸＧＸＰＸＸＸＸＰＸＦＸＸＱというパターンを示し、そこでは、角括弧で括ったヒスチジンは二リン酸領域との重要な接触を行う。Ｆｉｎｎ  ＲＤ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｆａｍ：ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆａｍｉｌｉｅｓ  ｄａｔａｂａｓｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４２：Ｄ２２２−２３０（２０１４）。さらに、このモチーフ周辺のアラインメントは、一クラスとしてのＵＧＴタンパク質にとって有益となる特性に翻訳する点変異の記載に有用である。例えば、モチーフの始めのトリプトファン、または中間位置にある重要ヒスチジンへのアラインメント固定を使用して、この配列に対する点変異を記載してよく、植物のＧＴ１  ＵＤＰ−グルコースグリコシルトランスフェラーゼにおいてはそれが普遍的となるであろう。
【００３３】
いくつかの実施形態では、円順列変異体は、Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ由来のＵＧＴ８５Ｃ２の円順列変異体である。ＳｒＵＧＴ８５Ｃ２は本明細書では配列番号１として提供される。いくつかの実施形態では、円順列変異体は、ＯｓＵＧＴ１−２（配列番号７）の円順列変異体である。いくつかの実施形態では、円順列変異体は、Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａのＵＧＴ９１Ｄ２の円順列変異体である（配列番号５）。いくつかの実施形態では、円順列変異体は、Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａのＵＧＴ７４Ｇ１の円順列変異体である（配列番号２）。いくつかの実施形態では、円順列変異体は、Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａのＵＧＴ７６Ｇ１の円順列変異体である（配列番号３）。このようにして、ＵＧＴ酵素のＮ末端の位置を変えることにより、新規な基質特異性と活性プロファイルを持つ酵素を創作することができる。例えば、切断部位は、円順列変異体のＮ末端（例えば、Ｎ末端の５０のアミノ酸）と親または野生型の酵素とのアラインメントを行った場合、いくつかの実施形態ではアミノ酸１５０から３００までの間、またはいくつかの実施形態ではアミノ酸１９０と２６０の間、またはいくつかの実施形態では残基１９０と２１０の間である。他の実施形態では、円順列変異体は、円順列変異体のＮ末端の５０のアミノ酸と親または野生型の酵素とのアラインメントを行った場合、切断部位を、アミノ酸２４５と２８０の間（例えば、２７２位）、またはアミノ酸２６０から２７５までの間に有する。いくつかの実施形態では、新たなＮ末端を、局所的な二次構造エレメント（α−ヘリックスまたはβ−シートなど）の間に配し、かつ／または野生型酵素のループ構造に配する。所望するＮ末端の位置を選択する場合、Ｍｅｔを開始アミノ酸として切断部位に付加し、任意選択で、細胞の代謝回転を抑制するためにＡｌａを第２位に配する。天然のＮ末端とＣ末端は連結され、任意選択で、連結配列で連結される。一般に、連結配列は、例えば、主にまたは本質的にＧｌｙ、Ｓｅｒ、及び／またはＡｌａからなる配列を用いて、柔軟性（例えば、可能性の高いループ構造以外の定義された二次構造がない）が得られるよう選択される。いくつかの実施形態では、連結アミノ酸配列は約２〜約２５アミノ酸長であり、それがループを形成してよい。円順列変異体はさらに、親または野生型の酵素の対応する位置に対し、（例えば、最もスコアの高い局所的アラインメントに基づき）アミノ酸の置換、欠失、または挿入を１〜約３０、または約１〜約２０、または１〜約１０、または１〜約５含んでよい。いくつかの実施形態では、天然のＮ末端Ｍｅｔは、その新しい位置で分子内に維持されているか、または他の実施形態では欠失している。
【００３４】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＵＧＴ酵素はキメラＵＧＴ酵素であり、それにおいて、１つのＵＧＴのＮ末端ドメインは別のＵＧＴ酵素のＣ末端ドメインと連結されている。例えば、Ｎ末端ドメイン及びＣ末端ドメインは、表９から選択される２つの異なる酵素のものであり、各ドメインはさらに、親ドメイン配列と比べてアミノ酸の置換、欠失、及び／または挿入を１〜１０含んでよい。ＵＧＴは、より可変なＮ末端の基質結合（糖受容体）ドメインと、より保存されたＣ末端のＵＤＰ−グルコース結合（糖供与体）ドメインの２ドメインを有する。Ｎ末端ドメインで酵素の基質特異性のほとんどが決定されるが、一部の特異性はＣ末端ドメインにより制御される。これらのドメイン各々が、そのタンパク質のおよそ半分ずつを作っている。
【００３５】
いくつかの実施形態では、１−２’グリコシル化活性を有するＵＧＴ酵素は、ＯｓＵＧＴ１−２（配列番号７）、ＳｒＵＧＴ９１Ｄ２（配列番号５）、ＳｒＵＧＴ９１Ｄ１（配列番号４）、ＳｒＵＧＴ９１Ｄ２ｅ（配列番号６）（表９を参照されたい）またはその誘導体である。いくつかの実施形態では、誘導体は、ＲｅｂＡのＣ１９における高いグリコシル化活性を有する。ＵＧＴ酵素は、一般に、ＯｓＵＧＴ１−２、ＳｒＵＧＴ９１Ｄ２、ＳｒＵＧＴ９１Ｄ１、及びＳｒＵＧＴ９１Ｄ２ｅの１つ以上に対し、約５０％超、約６０％超、約７０％超、約８０％超、約９０％超、もしくは約９５％超、または約９６、９７、９８、もしくは９９％超の同一性レベルを有してよい。
【００３６】
ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の類似性または同一性、すなわち配列同一性のパーセンテージは、配列アラインメントにより決定され得る。そのようなアラインメントは、当技術分野で公知のいくつかのアルゴリズム、例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌの数学アルゴリズム（Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７）、ｈｍｍａｌｉｇｎ（ＨＭＭＥＲパッケージ、ｈｔｔｐ：／／ｈｍｍｅｒ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／）またはＣＬＵＳＴＡＬアルゴリズム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．＆Ｇｉｂｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．（１９９４）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２，４６７３−８０）を用いて行うことができる。配列同一性（配列一致）のグレードは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＴまたはＢｌａｓｔＺ（またはＢｌａｓｔＸ）を使用して計算してよい。Ａｌｔｓｃｈｕｌら（（１９９０）  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）のＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰプログラムに同様のアルゴリズムが組み込まれている。ＢＬＡＳＴＮプログラムをスコア＝１００、ワード長＝１２で用いて、ＢＬＡＳＴポリヌクレオチド検索を実行することができる。
【００３７】
ＢＬＡＳＴＰプログラムをスコア＝５０、ワード長＝３で用いてＢＬＡＳＴタンパク質検索を実行してよい。比較を目的としてギャップありアラインメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に記載のＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを用いる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる際は、それぞれのプログラムのデフォルトのパラメータを使用する。配列一致解析には、Ｓｈｕｆｆｌｅ−ＬＡＧＡＮ（Ｂｒｕｄｎｏ  Ｍ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２００３ｂ，１９  Ｓｕｐｐｌ  １：１５４−１６２）またはマルコフ確率場のような確立された相同性マッピング技術を補完してよい。
【００３８】
いくつかの実施形態では、１−２’グリコシル化活性を有するＵＧＴ酵素はＯｓＵＧＴ１−２またはその誘導体であり、これは任意選択で、ＲｅｂＡのＣ１９における１−２’グリコシル化活性を高めるアミノ酸置換、アミノ酸欠失、及び／またはアミノ酸挿入を１つ以上含む、ＯｓＵＧＴ１−２の円順列変異体である。例えば、１−２’グリコシル化酵素は、ＯｓＵＧＴ１−２（配列番号７）のアミノ酸１９０〜２１０内の位置と整列するかまたはそれに対応する切断部位を有してよく、また、いくつかの実施形態では、配列番号７のアミノ酸１９４〜２００内の位置、例えば、１９５位、１９６位、１９７位、または１９９位であってよい。円順列変異体は、任意選択で、ＯｓＵＧＴ１−２のＮ末端残基及びＣ末端残基に対応するアミノ酸の間にリンカー配列を有してよい。リンカーは、２〜約２５アミノ酸の範囲というように長さが異なってよい。例えば、リンカーは約８〜約２０アミノ酸長であってよく、例えば、いくつかの実施形態では約１７アミノ酸であってよい。いくつかの実施形態では、円順列変異体は、いかなる連結配列も含有しない。円順列変異体はさらに、野生型配列に、アミノ酸の置換、付加、または欠失を１〜２０、または１〜１０、または１〜５含有してよい（ＯｓＵＧＴ１−２に対する変異配列の局所的アラインメントにより決定）。いくつかの実施形態では、２位にＡｌａの挿入または置換を行って細胞内の酵素の代謝回転を抑制する。いくつかの実施形態では、諸変異が集合的にＲｅｂＡのＣ１９における１−２’グリコシル化活性を高める（例えば、２２℃、２７℃、または３０℃で評価した場合）。
【００３９】
いくつかの実施形態では、１−２’グリコシル化活性を有するＵＧＴ酵素はＯｓＵＧＴ１−２の円順列変異体であり、切断部位がＯｓＵＧＴ１−２の１９５位、１９６位、１９７位、１９８位、または１９９位に対応している。ＭｂＵＧＴ１−２と命名した例示的な円順列変異体を本明細書に開示する。円順列変異体は、野生型酵素の１４位、１６位、８９位、１８５位、３６５位、３６６位、３９５位、３９６位、４１７位、４２０位、４２１位、４２２位、４２４位、４２７位、４２８位、４３０位、４３１位、４３２位、４３４位及び／または４６３位に対応する位置のうち１つ以上にアミノ酸置換を有してよい。いくつかの実施形態では、円順列変異体は、１４位にアミノ酸置換を有し、このような置換はＴｒｐまたはＴｙｒなどの芳香族アミノ酸であってよい。これらの実施形態または他の実施形態では、円順列変異体は３６６位にアミノ酸置換を有し、置換アミノ酸は任意選択でＰｒｏである。これらの実施形態または他の実施形態では、円順列変異体は４２０位にアミノ酸置換を有し、置換アミノ酸は任意選択でＧｌｕである。これらの実施形態または他の実施形態では、円順列変異体は４２１位にアミノ酸置換を有し、置換アミノ酸は任意選択でＰｈｅである。これらの実施形態または他の実施形態では、円順列変異体は４２４位にアミノ酸置換を有し、置換アミノ酸は任意選択でＡｓｐである。これらの実施形態または他の実施形態では、円順列変異体は４２７位にアミノ酸置換を有し、置換アミノ酸は任意選択でＧｌｕである。これらの実施形態または他の実施形態では、円順列変異体は４２８位にアミノ酸置換を有し、置換アミノ酸は任意選択でＧｌｕである。これらの実施形態または他の実施形態では、円順列変異体は４３２位にアミノ酸置換を有し、置換アミノ酸は任意選択でＴｙｒ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、Ａｓｐ、またはＧｌｕである。いくつかの実施形態では、酵素は、アミノ酸４２４と４２７の間に２〜５個のアミノ酸の挿入、例えば、配列Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒなどを含む。いくつかの実施形態では、１−２’グリコシル化活性を有するＵＧＴは、配列番号９（ＭｂＵＧＴ１−２）のアミノ酸配列を含むか、または、配列番号９に対して少なくとも約５０％の同一性、少なくとも約６０％の同一性、少なくとも約７０％の同一性、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約８５％の同一性、または少なくとも約９０％の同一性、または少なくとも約９５％の同一性、または少なくとも９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有し、かつ、ＲｅｂＡのＣ１９またはステビオールモノシドのＣ１３のうち１つ以上において１−２’グリコシル化活性を有する酵素を含む。
【００４０】
いくつかの実施形態では、１−２’グリコシル化活性を有するＵＧＴ酵素は、ＯｓＵＧＴ１−２の円順列変異体であり、切断部位がＯｓＵＧＴ１−２の１９６位に対応している。ＭｂＵＧＴ１，２−２と命名した例示的な円順列変異体（配列番号４５）を本明細書に開示する。円順列変異体は、野生型酵素の１６位、４２２位、４３０位、及び４３４位のうち１つ以上にアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、円順列変異体は１６位にアミノ酸置換を有し、このような置換は芳香族アミノ酸、例えばＴｒｐであってよい。これらの実施形態または他の実施形態では、円順列変異体は４２２位にアミノ酸置換を有し、置換アミノ酸は任意選択でＧｌｕである。これらの実施形態または他の実施形態では、円順列変異体は４３０位にアミノ酸置換を有し、置換アミノ酸は任意選択でＧｌｕである。これらの実施形態または他の実施形態では、円順列変異体は４３４位にアミノ酸置換を有し、置換アミノ酸は任意選択でＨｉｓである。いくつかの実施形態では、酵素は、天然のＮ末端アミノ酸とＣ末端アミノ酸の間にいかなる連結配列も含有せず、天然のＮ末端Ｍｅｔは任意選択で欠失させてよい。いくつかの実施形態では、１−２’グリコシル化活性を有するＵＧＴは、配列番号４５のアミノ酸配列を含むか、または、配列番号４５に対して少なくとも約５０％の同一性、少なくとも約６０％の同一性、少なくとも約７０％の同一性、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約８５％の同一性、または少なくとも約９０％の同一性、または少なくとも約９５％の同一性、または少なくとも９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有し、かつ、ＲｅｂＡのＣ１９またはステビオールモノシドのＣ１３のうち１つ以上において１−２’グリコシル化活性を有する酵素を含む。
【００４１】
いくつかの実施形態では、１−３’グリコシル化活性を有するＵＧＴ酵素はＳｒＵＧＴ７６Ｇ１であるか、または、ＲｅｂＤのＣ１９またはステビオシドのＣ１３におけるグリコシル化活性が同一もしくは高いＳｒＵＧＴ７６Ｇ１の誘導体である。いくつかの実施形態では、１−３’グリコシル化活性を有するＵＧＴ酵素は、配列番号３の７７位、７８位、８１位、８２位、９３位、９４位、１５５位、１９２位、２００位、２０２位、２０５位、２８３位、２８４位、３７９位、及び３９７位のうち１つ以上にアミノ酸置換を含むＳｒＵＧＴ７６Ｇ１誘導体である（表１３を参照されたい）。いくつかの実施形態では、誘導体はＬ２００位（野生型酵素にしたがった番号付け）にアミノ酸置換を有し、これは任意選択でＡｌａまたはＧｌｙである。これらの実施形態では、誘導体はさらに、アミノ酸置換を２８４位（例えば、Ａｌａ）及び／または３７９位（例えば、Ｇｌｙ）、及び／または１９２位（例えば、Ａｌａ）に有してよい。いくつかの実施形態では、２位にＡｌａの挿入または置換を行って細胞内の代謝回転を抑制する。いくつかの実施形態では、ＵＧＴ酵素は、配列番号３に対し少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約８５％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、または少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するが、配列番号３の２００位に対応するアミノ酸がＡｌａまたはＧｌｙということはない。表１３に示すように、Ｌ２００ＡまたはＬ２００Ｇの置換により、Ｃ１９及びＣ１３の両方の箇所における活性が大幅に改善される。
【００４２】
ＵＧＴ７６Ｇ１に対するさらなる修飾には、２２位、２５位、１４５位、１５４位、２５６位、及び２８２位の１つ以上における修飾、例えば、Ｑ２２Ｇ、Ｑ２２Ｈ、Ｉ２５Ｆ、Ｉ２５Ｗ、Ｔ１４５Ａ、Ｔ１４５Ｇ、Ｔ１４５Ｐ、Ｈ１５４Ｒ、Ｌ２５６Ｐ、Ｌ２５６Ｗ、Ｌ２５６Ｔ、Ｌ２５６Ｇ、Ｌ２５６Ａ、Ｌ２５６Ｒ、Ｌ２５６Ｅ、Ｓ２８１Ｇ及びＳ２８２Ｎのうちの１つ以上が含まれる。これらの修飾は、ＷＯ２０１４／１２２２２７に開示されており、参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＵＧＴ７６Ｇ１に対するこれらのさらなる修飾は、７７位、７８位、８１位、８２位、８３位、９３位、９４位、１５５位、１９２位、２００位、２０２位、２０５位、２８３位、２８４位、３７８位、３７９位、及び３９７位における修飾と組み合わせて、より優れた特性を示す。
【００４３】
いくつかの実施形態では、１−３’グリコシル化活性を有するＵＧＴ酵素は、ＳｒＵＧＴ７６Ｇ１の円順列変異体であり、切断部位がＳｒＵＧＴ７６Ｇ１のアミノ酸の１７０位〜２９０位（例えば、１９０位〜２１０位、１９６位〜２００位または２６０位〜２８０位）内の位置に対応している。いくつかの実施形態では、切断部位は、野生型酵素の１９６位または２６４位に対応する。円順列変異体（例えば、ＭｂＵＧＴ１−３）は、野生型酵素の対応する位置に対し、アミノ酸の置換、欠失、及び／または挿入を１〜３０、または１〜２０、または１〜１０、または１〜５有してよい。いくつかの実施形態では、１−３’グリコシル化活性を有するＵＧＴは、配列番号１０（ＭｂＵＧＴ１−３）のアミノ酸配列を含むか、または、配列番号１０に対し、少なくとも約５０％の同一性、少なくとも約６０％の同一性、少なくとも約７０％の同一性、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約８５％の同一性、または少なくとも約９０％の同一性、または少なくとも約９５％の同一性、または少なくとも９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有し、かつＲｅｂＤのＣ１９またはステビオシドのＣ１３における１−３’グリコシル化活性のうち１つ以上を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、２位にＡｌａの置換または挿入を行って細胞内の代謝回転を抑制する。
【００４４】
さまざまな実施形態では、本発明の宿主細胞または方法にはさらに、ステビオールをステビオールモノシドに変換するＵＧＴ酵素が使用される。いくつかの実施形態では、ステビオールをステビオールモノシドに変換するＵＧＴ酵素はＳｒＵＧＴ８５Ｃ２、またはその誘導体である。いくつかの実施形態では、酵素は、配列番号１に対し、アミノ酸の置換、欠失、及び／または挿入を１〜約５０、または１〜約２０、または１〜約１０含む。例えば、誘導体は、配列番号１に対する少なくとも約６５％の同一性、もしくは少なくとも約７０％の同一性、もしくは少なくとも約８０％の同一性、または配列番号１に対する少なくとも９０％の同一性、または配列番号１に対する少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有してよく、かつステビオールをステビオールモノシドに変換する、同一または類似の活性を（例えば、インビトロまたはインビボで）維持してよい。例示的なアミノ酸修飾を表１１に示す。いくつかの実施形態では、ステビオールをステビオールモノシドに変換する酵素は、野生型酵素の２１５位にアミノ酸置換を有するＳｒＵＧＴ８５Ｃ２誘導体である。いくつかの実施形態では、野生型酵素の２１５位に対応するアミノ酸は、スレオニン、セリン、グリシン、またはアラニンである（野生型でのアミノ酸はプロリンである）。いくつかの実施形態では、前記２１５位のアミノ酸はスレオニンである。これらの実施形態または他の実施形態では、ＳｒＵＧＴ８５Ｃ２誘導体は、３０８位、３１１位、３１６位、３４９位及び／または４１４位のうち１つ以上において変異を有する（野生型酵素に従った番号付け。いくつかの実施形態では、３０８位アミノ酸はスレオニンであり、かつ／または３１１位アミノ酸はグルタミンであり、かつ／または３１６位アミノ酸はアラニンであり、かつ／または３４９位アミノ酸はグルタミン酸であり、かつ／または４１４位アミノ酸にはグリシンである。いくつかの実施形態では、第２位にＡｌａの挿入または置換を行って細胞内の代謝回転を制限する。
【００４５】
さまざまな実施形態では、宿主細胞または方法にはさらに、ステビオールビオシドをステビオシドに変換するＵＧＴ酵素が使用され、この酵素は、いくつかの実施形態ではＳｒＵＧＴ７４Ｇ１、またはその誘導体である。いくつかの実施形態では、酵素は、配列番号２に対し、アミノ酸の置換、欠失、及び／または挿入を１〜約５０、または１〜約２０、または１〜１０含む。例えば、誘導体は、配列番号２に対する少なくとも８０％の同一性、配列番号２に対する少なくとも９０％の同一性、または配列番号２に対する少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有してよく、かつステビオールビオシドをステビオシドに（例えば、インビトロまたはインビボで）変換する、同一または類似の活性を維持してよい。
【００４６】
いくつかの実施形態では、ステビオールビオシドをステビオシドに変換するＵＧＴ酵素は、ＳｒＵＧＴ７４Ｇ１の円順列変異体（例えば、ＭｂＵＧＴＣ１９）である。いくつかの実施形態では、円順列変異体は、ＳｒＵＧＴ７４Ｇ１の１８０位〜２８０位（例えば、２５０位〜２７０位）内のアミノ酸に対応する切断部位を有する。円順列変異体は、本来のＮ末端とＣ末端の間に１〜１０個のアミノ酸でできた連結配列（例えば、ＧＳＧ）を有してよい。円順列変異体は、野生型配列の対応する位置に対し、アミノ酸の置換、欠失、及び／または挿入を１〜３０、または１〜２０、または１〜１０、または１〜５有してよい。いくつかの実施形態では、ＳｒＵＧＴ７４Ｇ１円順列変異体は、配列番号８（ＭｂＵＧＴＣ１９）または配列番号４６（ＭｂＵＧＴＣ１９−２）のアミノ酸配列を含むか、または、配列番号８または４６に対し、少なくとも約５０％の同一性、少なくとも約６０％の同一性、少なくとも約７０％の同一性、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約８５％の同一性、または少なくとも約９０％の同一性、または少なくとも約９５％の同一性、または少なくとも９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有し、かつステビオールビオシドをステビオシドに変換する活性を有するアミノ酸配列を含む。
【００４７】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、カウレン合成酵素（ＫＳ）、カウレンオキシダーゼ（ＫＯ）、及びカウレン酸ヒドロキシラーゼ（ＫＡＨ）を含む１つ以上の経路モジュールを介してステビオール基質を産生し、かかる宿主細胞はさらに、ＫＯ酵素及びＫＡＨ酵素の１つ以上を再生するシトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）を含む。いくつかの実施形態では、ＫＡＨはＳｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ、もしくはＭｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃｕｌａｔａのＫＡＨ、またはその誘導体（例えば、野生型配列に対し少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９７％の配列同一性を有するもの）である。いくつかの実施形態では、ＫＡＨは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａのＫＡＨ（ＡｔＫＡＨ）、またはその誘導体である。ＡｔＫＡＨは、カウレン酸ヒドロキシラーゼ活性率を高めるか、そうでなければ、酵素の生産性または発現を改善する、アミノ酸の置換、挿入、及び／または欠失を１つ以上有してよく、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉで機能発現するよう工学的に操作されたＮ末端が含まれる。いくつかの実施形態では、ＡｔＫＡＨは、表６に示す配列番号２９の親配列のうち１か所以上（例えば、２〜１０か所）において、ステビオールまたはカウレン酸の生成を高めるアミノ酸置換を有する。例示的な置換には、配列番号２９の以下の位置に対応する置換が挙げられる：２５位（例えば、Ａ２５Ｌ）、７９位（例えば、Ｓ７９Ｔ）、１１９位（例えば、Ｔ１１９Ｃ）、１３７位（例えば、Ｉ１３７Ｌ）、１４２位（例えば、Ｉ１４２Ｖ）、１５５位（例えば、Ｒ１５５Ｋ）、１８０位（例えば、Ｍ１８０Ｌ）、１９３位（例えば、Ｅ１９３Ｇ）、１９６位（例えば、Ｃ１９６Ａ）、１９７位（例えば、Ｄ１９７Ｅ）、２２６位（Ａ２２６Ｅ）、２３５位（例えば、Ｌ２３５Ｑ）、２３８位（例えば、Ｉ２３８Ｍ）、２４５位（Ｆ２４５Ｌ、Ｆ２４５Ｖ）、２７２位（例えば、Ｌ２７２Ｉ）、２８５位（例えば、Ｉ２８５Ｒ）、２８７位（例えば、Ｃ２８７Ｓ）、３２５位（例えば、Ｃ３２５Ｉ、Ｃ３２５Ｍ）、３３０位（例えば、Ｆ３３０Ｌ）、３３４位（例えば、Ｄ３３４Ｅ）、３３９位（例えば、Ｓ３３９Ｔ）、３５２位（例えば、Ｓ３５２Ｅ）、３７３位（例えば、Ｅ３７３Ｄ）、３９７位（例えば、Ｉ３９７Ｆ）、４７０位（例えば、Ｖ４７０Ｌ）、４９９位（例えば、Ｑ４９９Ｖ）、５０６位（例えば、Ｌ５０６Ｍ）、５０７位（例えば、Ｌ５０７Ｉ、Ｌ５０７Ｔ、Ｌ５０７Ｖ）。いくつかの実施形態では、ＡｔＫＡＨ酵素は、（野生型配列に対して）３３１位にアミノ酸置換を有する誘導体であり、この酵素は、いくつかの実施形態では、高温（例えば、２２℃超）における酵素の生産性を改善する。いくつかの実施形態では、３３１位アミノ酸はＩｌｅである。
【００４８】
Ｐ４５０酵素ＳｒＫＯの機能発現を達成するＮ末端修飾を図９に例示する。これらの修飾または同様の修飾を行ってＡｔＫＡＨなどのＫＡＨの機能発現を達成してよい。例えば、膜貫通領域の全部または複数の部分を、アミノ酸４個〜アミノ酸約３９個、またはいくつかの実施形態では、アミノ酸約６個〜アミノ酸約２５個、またはアミノ酸約４〜約２０個、またはアミノ酸約２９個、またはアミノ酸約３９個というように欠失させてよい。欠失は、膜貫通領域のＮ末端部分から取るのが好ましい。この欠失した部分を、約４〜約２０個のアミノ酸残基、例えば約４〜約１２個の残基（例えば、アミノ酸残基８個）の可溶化タグで置き換える。タグは、主に疎水性アミノ酸で構築され、それらは任意選択でＡｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、及びＰｈｅから選択される。機能発現の例示的配列はＮ末端タグ：ＭＡＬＬＬＡＶＦ（配列番号４７）である。いくつかの実施形態では、ＡｔＫＡＨは、アミノ酸１４個の欠失を有し、Ｎ末端タグ（例えば、配列番号２９）が付加され、任意選択で置換Ｃ３３１Ｉを有する（野生型酵素に基づく位置命名法）を有する。
【００４９】
Ｐ４５０酵素の代替的Ｎ末端タグ配列は、２０１５年８月２１日に出願された仮出願第６２／２０８，１６６号に記載されており、本発明の特定の実施形態において使用される。例えば、膜貫通ドメイン（または「Ｎ末端アンカー」）は、ｗａａＡ、ｙｐｆＮ、ｙｈｃＢ、ｙｈｂＭ、ｙｈｈｍ、ｚｉｐＡ、ｙｃｇＧ、ｄｊｌＡ、ｓｏｈＢ、ｌｐｘＫ、Ｆ１１Ｏ、ｍｏｔＡ、ｈｔｐｘ、ｐｇａＣ、ｙｇｄＤ、ｈｅｍｒ、及びｙｃｌｓから選択されるＥ．ｃｏｌｉ遺伝子由来であり得る。これらの遺伝子を、バイオインフォマティックス予測ならびに実験的検証により、Ｃ末端細胞質の内膜タンパク質として同定した。本発明では、Ｅ．ｃｏｌｉの野生型膜貫通ドメインの誘導体である、すなわち、野生型配列に対する１つ以上の変異を有する、Ｎ末端アンカー配列を使用する場合がある。例示的な実施形態では、膜アンカー配列は約８〜約７５アミノ酸長である。例えば、膜アンカーは長さが約１５〜約５０アミノ酸、または約１５〜約４０アミノ酸、または約１５〜約３０アミノ酸、または約２０〜約４０アミノ酸、または約２０〜約３０アミノ酸であってよい。
【００５０】
いくつかの実施形態では、カウレン合成酵素（ＫＳ）はＳｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ、Ｚｅａ  ｍａｙｓ、Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、Ｅｒｗｉｎａ  ｔｒａｃｈｅｉｐｈｉｌａ由来またはその誘導体（例えば、野生型配列に対し少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９７％の配列同一性を有するもの）である。さらに、細胞は、Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｚｅａ  ｍａｙｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、Ｅｒｗｉｎａ  ｔｒａｃｈｅｉｐｈｉｌａ由来のコパリル二リン酸合成酵素（ＣＰＰＳ）、またはその誘導体（例えば、野生型配列に対し少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９７％の配列同一性を有するもの）を発現してよい。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、任意選択でＰｈｏｍｏｐｓｉｓ  ａｍｙｇｄａｌｉ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ酵素から選択される、ＣＰＰＳとＫＳとの二機能性酵素、またはその誘導体を発現する。このような誘導体は、一般に、親配列（例えば、表１を参照されたい）に対し、少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有してよい。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｅｒｗｉｎａ  ｔｒａｃｈｅｉｐｈｉｌａのＣＰＰＳ酵素及びＫＳ酵素、またはその誘導体を発現する。
【００５１】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ（ＳｒＫＯ）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｆｕｊｉｋｏｒｏｉ、もしくはＴｒａｍｅｔｅｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ由来のカウレン酸化酵素、または、その誘導体を発現し、任意選択でＥ．ｃｏｌｉに機能発現させるためにＮ末端で（上記及び図９に示すように）修飾される。いくつかの実施形態では、ＣＰＲは、Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ（ＳｒＣＰＲ）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、もしくはＧｉｂｅｒｅｌｌａ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉの酵素、またはその誘導体であり、任意選択でＥ．ｃｏｌｉに機能発現させるためにＮ末端で修飾される。
【００５２】
ＳｒＫＯは、その活性を改善するアミノ酸修飾を１つ以上有してよい。例示的修飾は米国仮出願第６２／０４０，２８４号に開示されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。例えば、ＳｒＫＯは、複数の位置におけるアミノ酸修飾を１つ以上含んでよい（配列番号２２に対する、４７位（例えば、Ｌ４７Ｉ）、５９位（例えば、Ｙ５９Ｈ）、６０位（例えば、Ｍ６０Ｋ）、６３位（例えば、Ｔ６３Ａ）、６７位（例えば、Ａ６７Ｅ）、７６位（例えば、Ｋ７６Ｒ）、８０位（例えば、Ｔ８０Ｃ）、８２位（例えば、Ｍ８２Ｖ）、８５位（例えば、Ｖ８５Ｌ、Ｖ８５Ｉ）、８６位（例えば、Ｓ８６Ｎ）、１００位（例えば、Ｑ１００Ｓ）、１０６位（例えば、Ｎ１０６Ｋ）、１１２位（例えば、Ｋ１１２Ｔ）、１１６位（Ａ１１６Ｒ）、１１９位（例えば、Ｔ１１９Ｓ）、１２３位（例えば、Ｍ１２３Ｔ、Ｍ１２３Ｑ、Ｍ１２３Ｆ、Ｍ１２３Ｔ）、１２７位（例えば、Ｄ１２７Ｇ）、１２９位（例えば、Ｙ１２９Ｆ）、１４０位（例えば、Ａ１４０Ｒ）、１４９位（例えば、Ｋ１４９Ｒ）、１５０位（例えば、Ｈ１５０Ｆ）、１７１位（例えば、Ｎ１７１Ｄ）、１８０位（例えば、Ｌ１８０Ｆ）、１８３位（例えば、Ｉ１８３Ｖ）、２０８位（例えば、Ｄ２０８Ｅ）、２３２位（例えば、Ｄ２３２Ｅ）、２６７位（例えば、Ｓ２６７Ａ）、２７２位（例えば、Ｈ２７２Ｑ）、２８４位（例えば、Ｓ２８４Ｃ）、２８６位（例えば、Ｉ２８６Ｌ）、２９４位（例えば、Ｑ２９４Ｋ）、２９９位（例えば、Ｑ２９９Ｅ）、３１０位（例えば、Ｉ３１０Ｔ、Ｉ３１０Ｖ）、３７１位（例えば、Ｒ３７１Ｋ、Ｒ３７１Ｉ）、３７５位（例えば、Ｖ３７５Ｔ、Ｖ３７５Ｉ、Ｖ３７５Ｌ）、３７８位（例えば、Ｉ３７８Ｖ）、３８２位（例えば、Ｈ３８２Ｙ）、３８８位（例えば、Ｖ３８８Ｑ、Ｖ３８８Ｍ）、３９３位（例えば、Ｈ３９３Ｄ）、４００位（例えば、Ｌ４００Ｉ）、４１３位（例えば、Ｖ４１３Ｋ、Ｖ４１３Ｄ）、４３４位（例えば、Ｆ４３４Ｌ）、４４２位（例えば、Ｇ４４２Ａ）、４５０位（例えば、Ｓ４５０Ａ）、４５４位（例えば、Ｌ４５４Ｍ）、４６０位（例えば、Ｇ４６０Ａ）、４６４位（例えば、Ｍ４６４Ｌ）、４７５位（例えば、Ｍ４７５Ｇ）、４８７位（例えば、Ｔ４８７Ｎ）、４９２位（例えば、Ｐ４９２Ｋ）、及び４９７位（例えば、Ｉ４９７Ｌ）。いくつかの実施形態では、ＳｒＫＯは、Ｎ末端膜貫通ドメインのアミノ酸約２０個の欠失を含み、Ｎ末端タグ配列（上記）が付加されている。ＳｒＫＯは、２位にＡｌａを含有して細胞内の酵素の代謝回転を抑制してよい。
【００５３】
いくつかの実施形態では、Ｐ４５０レダクターゼパートナー（複数可）には、Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ（Ｓｒ）ＣＰＲ、Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ（Ｓｒ）ＣＰＲ１、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（Ａｔ）ＣＰＲ、Ｔａｘｕｓ  ｃｕｓｐｉｄａｔａ（Ｔｃ）ＣＰＲ、Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａ（Ａａ）ＣＰＲ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（Ａｔ）ＣＰＲ１、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（Ａｔ）ＣＰＲ２、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（Ａｔ）Ｒ２、Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ（Ｓｒ）ＣＰＲ２、Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ（Ｓｒ）ＣＰＲ３、またはＰｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ  ｇｒａｖｅｏｌｅｎｓ（Ｐｇ）ＣＰＲが含まれる。これらのＰ４５０のいずれも、実施形態によっては、誘導体化して、例えば、１〜約２０の変異、または約１〜約１０の変異を導入することができる。これらのＣＰＲタンパク質の詳細はＰＣＴ／ＵＳ１５／４６３６９号に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【００５４】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、単一ＣＰＲ酵素（例えば、ＳｒＣＰＲ）を含むＥ．ｃｏｌｉであり、酵素は染色体に組み込まれており、例えば、ＳｒＫＯ及びＡｔＫＡＨの両酵素を支持する。
【００５５】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ゲラニルゲラニルピロリン酸合成酵素（ＧＧＰＰＳ）を発現し、これは、任意選択でＴａｘｕｓ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ、Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｅｌａｎｏｓｐｏｒｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ、Ｓｕｌｆｕｌｕｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．（例えば、ＪＡ−３−３Ａｂ）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、海洋細菌４４３、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｈａｅｕｎｄａｅｎｓｉｓ、Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ  ｔｅｐｉｄｕｍ  ＴＬＳ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．（ＰＣＣ６８０３）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ  ＨＢ８、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｌｕｓ  ＨＢ２７、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ｃａｌｉｄｉｆｏｎｔｉｓ  ＪＣＭ１１５４８のゲラニルゲラニルピロリン酸合成酵素、またはその誘導体である。表１を参照されたい。このような誘導体は、一般に、親配列（例えば、表１を参照されたい）に対し、少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有してよい。いくつかの実施形態では、ＧＧＰＰＳはＴａｘｕｓ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、Ｔａｘｕｓ  ＧＧＰＰＳはＮ末端に欠失のある（例えば、Ｎ末端のアミノ酸７０〜１１０個、例えば約９８個が欠失している）配列である。欠失のある配列はさらに、対応する野生型配列において、アミノ酸の置換、欠失、及び／または挿入を約１〜約１０、例えば、約１〜約５含んでよい。欠失のある例示的配列を配列番号１２として本明細書に開示する。いくつかの実施形態では、ＧＧＰＰＳはＣｏｒｎｙｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来のＧＧＰＰＳまたはその誘導体であり、それにより２２℃より高温での生産性における利点が提供され得る。
【００５６】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、一経路で生成されるイソペンチルピロリン酸（ｉｓｏ−ｐｅｎｔｙｌ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（ＩＰＰ）及びジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）を発現する。いくつかの実施形態では、経路は、メチルエリスリトールリン酸（ＭＥＰ）経路及び／または、メバロン酸（ＭＶＡ）経路である。
【００５７】
ＭＥＰ（２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール  ４−リン酸）経路は、ＭＥＰ／ＤＯＸＰ（２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール  ４−リン酸／１−デオキシ−Ｄ−キシルロース  ５−リン酸）経路または非メバロン酸経路またはメバロン酸非依存的経路とも呼ばれ、グリセルアルデヒド−３−リン酸及びピルビン酸をＩＰＰ及びＤＭＡＰＰに変換する経路を指す。かかる経路には、典型的に、以下の酵素、すなわち１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸合成酵素（Ｄｘｓ）、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼ（ＩｓｐＣ）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール合成酵素（ＩｓｐＤ）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールキナーゼ（ＩｓｐＥ）、２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール−２，４−シクロ二リン酸合成酵素（ＩｓｐＦ）、１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル−４−二リン酸合成酵素（ＩｓｐＧ）、及びイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩｓｐＨ）の作用が関与する。ＭＥＰ経路、ならびにＭＥＰ経路を構成する遺伝子及び酵素はＵＳ８，５１２，９８８に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。例えば、ＭＥＰ経路を構成する遺伝子には、ｄｘｓ、ｉｓｐＣ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＧ、ｉｓｐＨ、ｉｄｉ、及びｉｓｐＡが挙げられる。いくつかの実施形態では、ステビオールは、少なくとも一部はＭＥＰ経路を介した代謝フラックスにより生成され、ここで、宿主細胞は、ｄｘｓ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＦ、及び／またはｉｄｉの遺伝子のさらなるコピーを少なくとも１つ有する。ＵＳ８，５１２，９８８に開示されているように、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＭＥＰ経路を介したテルペノイド生成物の効率的生成についての代用マーカーとして、代謝物であるインドール量を使用できる。
【００５８】
ＭＶＡ経路とは、アセチルＣｏＡをＩＰＰに変換する生合成経路を指す。メバロン酸経路は、典型的に、以下の段階を触媒する酵素を含む：（ａ）２分子のアセチルＣｏＡを縮合させてアセトアセチルＣｏＡにする（例えば、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼの作用による）；（ｂ）アセトアセチルＣｏＡとアセチルＣｏＡとを縮合させてヒドロキシメチルグルタリル−補酵素Ａ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）を形成させる（例えば、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素（ＨＭＧＳ）の作用による）；（ｃ）ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロネートに変換する（例えば、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧＲ）の作用による）；（ｄ）メバロネートをリン酸化させてメバロン酸−５−リン酸にする（例えば、メバロン酸キナーゼ（ＭＫ）の作用による）；（ｅ）メバロン酸−５−リン酸をメバロン酸−５−ピロリン酸（ｍｅｖａｌｏｎａｔｅ  ５−ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）に変換する（例えば、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）の作用による）；及び（ｆ）メバロン酸−５−ピロリン酸（ｍｅｖａｌｏｎａｔｅ  ５−ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）をイソペンテニルピロリン酸に変換する（例えば、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ（ＭＰＤ）の作用による）。ＭＶＡ経路、ならびにＭＥＰ経路を構成する遺伝子及び酵素は、ＵＳ７，６６７，０１７に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００５９】
宿主細胞は原核細胞または真核細胞であってよい。例えば、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｕｓ、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａから選択される細菌であってよい。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、及びＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａなど、サッカロミセスの一種、ピチアの一種、またはヤロウィアの一種である。宿主細胞は、ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰの生成を高めるｄｘｓ、ｉｄｉ、ＩｓｐＤ、及びＩｓｐＦの重複または過剰発現を有するＥ．ｃｏｌｉであってよい。
【００６０】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＵＤＰ−グルコースの生成を高める、例えば、ＵＤＰ−グルコース基質利用性を高める遺伝子修飾を１つ以上有するＥ．ｃｏｌｉである。ステビオールのグリコシル化についてＵＤＰ−グルコースの利用性を改善するため、一連の遺伝子ノックアウトと遺伝子挿入を導入して、ＵＤＰ−グルコースへの炭素フラックスを高め、かつＵＤＰ−グルコースから離れている経路のフラックス（例えば、グリコーゲン合成及び炭素貯蔵）を抑制することができる。例えば、遺伝子修飾により、細胞内へのスクロースの移入を増加させ、それをスクロースホスホリラーゼの作用によりフルクトースとグルコースに分けることができる。それに続く一連のノックアウトにより、一次代謝を改変して、炭素供給源としてフルクトースのみを使用して生物量を強制的に合成させ、グルコースを専らＵＤＰ−グルコース生合成に向かわせるようにできる。この戦略を実施するためのＥ．ｃｏｌｉ株に対する例示的修飾は表７に掲載されている。修飾についての詳細は、ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０６１８９１に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝子修飾には、ΔｇａｌＥ、ΔｇａｌＴ、ΔｇａｌＫ、ΔｇａｌＭ、ΔｕｓｈＡ、Δａｇｐ、Δｐｇｍ、Ｅ  ｃｏｌｉ  ＧＡＬＵの重複、及びＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｓｔｉｌｌｕｓ  ＵＧＰＡ、ＢａＳＰの発現が挙げられる。
【００６１】
例示的な一実施形態では、宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉであり、異種発現させた遺伝子、すなわち、Ｔａｘｕｓ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓのＧＧＰＰＳまたはその誘導体、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｓｐ．のＰｓＣＫまたはその誘導体、Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａのＫＯまたはその誘導体、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａのＫＡＨまたはその誘導体、Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａのＣＰＲまたはその誘導体（宿主細胞が発現するＣＰＲ酵素はこれのみ）、Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａのＵＧＴ８５Ｃ２またはその誘導体、Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａのＵＧＴ７４Ｇ１の誘導体のＳｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａのＵＧＴ７４Ｇ１、Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａのＵＧＴ７６Ｇ１またはその誘導体、及びＭｂＵＧＴ１−２またはその誘導体を含む。これらの酵素の各種誘導体を本明細書に開示する。いくつかの実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉは、ＫＡＨ−ＫＯのポリシストロン性発現モジュールを含有し、かつ、染色体に組み込まれているＳｒＣＰＲ（または誘導体）の単一コピーを含有する。いくつかの実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉを修飾して上述のようにＵＤＰ−グルコースの利用性を高める。いくつかの実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉは、ｄｘｓ、ｉｄｉ、ｉｓｐＤ、及びｉｓｐＦ遺伝子のさらなる１コピーを有する。いくつかの実施形態では、インビボでのさらなる安定性を提供するため、発現タンパク質の１つ以上が２位にアラニンを含有する。
【００６２】
他の実施形態では、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉであり、異種発現させた遺伝子、すなわち、Ｃｏｒｎｙｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのＧＧＰＰＳまたはその誘導体；Ｅｒｗｉｎａ  ｔｒａｃｈｅｉｐｈｉｌａのＣＰＰＳ及びＥｒｗｉｎａ  ｔｒａｃｈｅｉｐｈｉｌａのＫＳまたはその両方もしくはいずれかの誘導体；Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａのＫＯまたはその誘導体；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａのＫＡＨまたはその誘導体；Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａのＣＰＲまたはその誘導体；Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａのＵＧＴ８５Ｃ２もしくはＭｂＵＧＴｃ１３またはその誘導体；Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａのＵＧＴ７４Ｇ１またはその誘導体（またはＭｂＵＧＴＣ１９、ＭｂＵＧＴＣ１９−２、もしくはその誘導体）；Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａのＵＧＴ７６Ｇ１またはその誘導体（またはＭｂＵＧＴ１−３の誘導体のＭｂＵＧＴ１−３）；及びＯｓＵＧＴ１−２、ＳｒＵＧＴ９１Ｄ２、またはその誘導体、またはＭｂＵＧＴ１−２もしくはＭｂＵＧＴ１，１−２またはその誘導体を含む。これらの酵素の各種誘導体を本明細書に開示する。いくつかの実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉは、ＫＡＨ−ＫＯのポリシストロン性発現モジュールを含有し、かつ染色体に組み込まれているＳｒＣＰＲの単一コピーを含有する。いくつかの実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉを修飾して上述のようにＵＤＰ−グルコースの利用性を高める。いくつかの実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉは、ｄｘｓ、ｉｄｉ、ｉｓｐＤ、及びｉｓｐＦ遺伝子の１つ以上（または全部）のさらなる１コピーを有する。いくつかの実施形態では、インビボでのさらなる安定性を提供するため、発現タンパク質の１つ以上が２位にアラニンを含有する。いくつかの実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉは、約２４℃を上回る温度、例えば、約２７℃以上、または約３０℃以上、または約３２℃以上、または約３４℃以上、または約３７℃での高いＲｅｂＭまたはＲｅｂＤ生産性を提供する。
【００６３】
いくつかの実施形態では、方法はさらに、所望のステビオール配糖体（複数可）（例えば、ＲｅｂＭまたはＲｅｂＤ）を培地から回収することを含む。いくつかの実施形態では、所望のステビオール配糖体（例えば、ＲｅｂＭまたはＲｅｂＤ）を、濃度が少なくとも約１０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも約１００ｍｇ／Ｌ、または少なくとも約２００ｍｇ／Ｌ、または少なくとも約５００ｍｇ／Ｌ、または少なくとも約１ｇ／Ｌ、または少なくとも約１０ｇ／Ｌの培地で生成させる。
【００６４】
任意選択で、本発明の方法はさらに、標的ステビオール配糖体を開始組成物から分離することを含む。標的ステビオール配糖体は、例えば、晶出、膜による分離、遠心分離、抽出、クロマトグラフ分離法または、そのような方法の組合せなど任意の好適な方法により分離することができる。含有配糖体画分の異なる画分をブレンドして定義済み生成物を調製することができる。あるいは、ＲｅｂＭ及びＲｅｂＤを、例えば、別々の培養により調製して精製し、所定の比率でブレンドすることができる。
【００６５】
別の態様では、本発明は、少なくとも４つのグリコシル化を有するステビオール配糖体をＥ．ｃｏｌｉ内に生成させる方法を提供する。本発明に従い、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞は、本明細書に記載の酵素を１つ以上含み得る複数のＵＧＴ酵素を含み、それらは共同して少なくとも４、少なくとも５、または少なくとも６（７または８を含む）の連続的なグリコシル化反応を行う。本明細書に開示するように、グリコシル化の基質及び低グリコシル化産物は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞内に十分に蓄積して下流の反応を許容される速度で進行させ、可能性の高い膜輸送体の作用により、グリコシル化産物のほとんど大部分が最終的に細胞外に蓄積する。ステビオール配糖体は、培地成分から精製され得る。したがって、いくつかの実施形態では、方法は、増殖培地とＥ．ｃｏｌｉ細胞を、例えば、回分式、連続式、または半連続式バイオリアクター処理を使用して分離し、増殖培地から所望のグリコシル化産物（例えば、ＲｅｂＭ）を単離することを含む。
【００６６】
さらに他の態様では、本発明は、Ｅ．ｃｏｌｉ内にステビオール配糖体（ＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ、ＲｅｂＥ、ＲｅｂＩ及び他のグリコシル化産物）を生成させる方法を提供する。一般に、所望のステビオール配糖体は、少なくとも２つのグリコシル化、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つのグリコシル化を有する。いくつかの実施形態では、ステビオール配糖体はＲｅｂＭまたはＲｅｂＤである。宿主細胞内でステビオールを生成させることが既知の酵素の多くは植物酵素であり、それらは至適温度が２０〜２４℃の範囲であることが多いが、Ｅ．ｃｏｌｉの増殖率及び代謝は、より高温で至適である。本願開示により、２４℃を上回る温度、例えば、２４℃〜３７℃、または２７℃〜３７℃、または３０℃〜３７℃での酵素産生を可能にすることで、Ｅ．ｃｏｌｉ内にステビオール配糖体を高収率で生成させることが可能になる。
【００６７】
Ｅ．ｃｏｌｉでの商用生合成は、過剰発現酵素及び／または異物酵素が安定である温度の制約を受けることが多いが、いくつかの実施形態の本願開示では、培養を高温で維持することができるため、高収率及び全体的な高生産性をもたらす。いくつかの実施形態では、培養を約３０℃以上、または約３１℃以上、または約３２℃以上、または約３３℃以上、または約３４℃以上、または約３５℃以上、または約３６℃以上、または約３７℃で行う。
【００６８】
宿主細胞及び方法はさらに、ステビオール配糖体の商用生産に好適である、すなわち、かかる細胞及び方法は商用スケールでの生産性があり得る。いくつかの実施形態では、培養サイズは少なくとも約１００Ｌ、少なくとも約２００Ｌ、少なくとも約５００Ｌ、少なくとも約１，０００Ｌ、または少なくとも約１０，０００Ｌである。一実施形態において、培養を、回分式培養、連続式培養、または半連続式培養で行ってよい。
【００６９】
いくつかの態様では、本発明は、ステビオール配糖体成分を含む生成物を製造する方法を提供し、かかるステビオール配糖体成分は、いくつかの実施形態ではＲｅｂＭまたはＲｅｂＤである。方法は、ステビオール配糖体を生成させる本明細書に記載の株を培養し、ステビオール配糖体を回収して、かかるステビオール配糖体を、食品、飲料、口腔ケア製品、甘味料、香味剤、または他の製品などの製品に組み込むことを含む。
【００７０】
本発明に従い調製し、精製されたステビオール配糖体をさまざまな製品に使用してよく、それらには、食品、飲料、テクスチャラント（ｔｅｘｔｕｒａｎｔ）（例えば、デンプン、繊維、ゴム、脂肪及び脂肪模倣物、及び乳化剤）、医薬組成物、タバコ製品、栄養補助組成物、口腔衛生組成物、及び化粧料組成物が含まれるが、これらに限定されない。ＲｅｂＭと組み合わせて使用できる香味の非限定的な例には、ライム、レモン、オレンジ、果実、バナナ、ブドウ、ナシ、パイナップル、マンゴ、ビターアーモンド、コーラ、シナモン、砂糖、綿菓子及びバニラの各香味が挙げられる。他の食品成分の非限定的な例には、香味、酸味料、及びアミノ酸、着色料、増量剤、化工デンプン、ゴム、調質剤、保存料、抗酸化剤、乳化剤、安定化剤、粘稠剤及びゲル化剤が挙げられる。
【００７１】
本発明にしたがって得た高度に精製された目的ステビオール配糖体（複数可）は、食物、飲料、医薬組成物、化粧品、チューインガム、食卓用製品、穀類、乳製品、練り歯磨き及び他の口腔用組成物などに高甘味度天然甘味料として組み込まれ得る。
【００７２】
本発明にしたがって得た高度に精製された目的ステビオール配糖体（複数可）をさまざまな生理活性物質または機能性成分と併用することができる。機能性成分は、一般に、カロテノイド、食物繊維、脂肪酸誘導体、サポニン、抗酸化剤、栄養補助食品、フラボノイド、イソチオシアネート、フェノール、植物のステロール及びスタノール（フィトステロール及びフィトスタノール）；ポリオール；プレバイオティクス、プロバイオティクス；フィトエストロゲン；大豆タンパク質；硫化物／チオール；アミノ酸；タンパク質；ビタミン；及びミネラルなどのカテゴリーに分類される。機能性成分を、心血管、コレステロール減少、及び抗炎症など、それらの健康上の利益に基づいて分類してもよい。
【００７３】
本発明にしたがって得た高度に精製された目的ステビオール配糖体（複数可）を、味特性が改善されたゼロカロリー、低カロリーまたは糖尿病用の飲料及び食品を製造するために高甘味度甘味料として利用してよい。また、砂糖を使用できない飲み物、食物、医薬品、及び他製品に使用してよい。さらに、高度に精製された目的ステビオール配糖体（複数可）、特にＲｅｂＭは、人の食用に作られた飲み物、食物、及び他製品用だけではなく、動物用の食餌及び飼料にも、味特性が改善された甘味料として使用することができる。
【００７４】
高度に精製された目的ステビオール配糖体（複数可）が甘味化合物として使用され得る例には、ウォッカ、ワイン、ビール、蒸留酒、及び日本酒等のようなアルコール飲料、天然ジュース、清涼飲料水、炭酸入りソフトドリンク、ダイエット飲み物、ゼロカロリー飲み物、低カロリーの飲み物及び食品、ヨーグルト飲み物、インスタントジュース、インスタントコーヒー、粉末タイプのインスタント飲料、缶詰製品、シロップ、発酵大豆ペースト、醤油、酢、ドレッシング、マヨネーズ、ケチャップ、カレー、スープ、インスタントブイヨン、粉末醤油、粉末酢、ビスケット各種、米菓、クラッカー、パン、チョコレート、キャラメル、キャンディ、チューインガム、ゼリー、プリン、保存加工した果物及び野菜、新鮮なクリーム、ジャム、マーマレード、フラワーペースト、粉乳、牛乳、アイスクリーム、シャーベット、瓶詰めした野菜及び果物、豆の水煮缶詰、甘味ソースで煮た肉及び食物、農産物野菜食品、魚介類、ハム、ソーセージ、魚肉ハム、魚肉ソーセージ、魚のすり身、魚肉揚げ物製品、魚介類の乾物、冷凍食料品、保存加工海藻、保存加工肉、タバコ、医薬品、他多数が挙げられるが、これに限定されるものではない。原則として、その用途は無限であり得る。
【００７５】
食物、飲み物、医薬品、化粧品、食卓用製品、及びチューインガムなどの製品製造の際、混合、混練、溶解、酢漬（ｐｉｃｋｌｉｎｇ）、透過、浸出、散布、霧化、注入及び他の方法のような従来の方法を使用してよい。
【実施例】
【００７６】
ステビオール配糖体は、一般にステビアとして知られる、植物Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａの天然成分である。ステビオール配糖体であるレバウジオシドＭ（ＲｅｂＭ）（図１）は、その味プロファイルにより他のステビオール配糖体の味プロファイルに対して著しい改善をもたらし、現在使用されているレバウジオシドＡのようなステビオール配糖体に代わる理想的候補ではあるが、その期待に応えられていないのは、ステビア植物に少量しかないことにある（＜０．０１％）。ステビオールは、ＲｅｂＭのようなステビオール配糖体の化学的コア構造を形成するジテルペノイドである（１）。
【００７７】
テルペノイド生合成は、複合体テルペノイド分子を異種生成させるために、原核細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）及び真核細胞（例えば、酵母）の両方で工学的操作が行われている（２、３）。Ｅ．ｃｏｌｉのＭＥＰ経路は、酵母のＭＶＡ−経路より化学量論的に優れており、副生成物の蓄積が少ない（４、５）。新しい代謝工学的方法である多変量モジュラーメタボリックエンジニアリング（ＭＭＭＥ）、及びテルペノイドの前駆体を過剰生成できるプラットフォームＥ．ｃｏｌｉ株が記載されている（４、６）。ＭＭＭＥでは、代謝ネットワークを明確なモジュールの集合体として再定義することにより、規制及び経路による障害を評価し排除することが容易になる（７）。代謝回転の類似する酵素を一つのサブセット、またはモジュールにグループ化し、その後、濃度／活性を調節して各種サブセットの代謝回転を一様にすることにより、経路の代謝回転と資源消費量との比を最大にすることができる。
【００７８】
ステビオール及びステビオール配糖体用の足場となる官能基のないテルペン前駆体であるカウレンを生合成させるために、ＭＭＭＥ経路工学をＥ  ｃｏｌｉに応用した。次に、下流の、ＣＹＰ４５０介在性の酸化反応を工学的に操作して、ジテルペノイドを足場とするステビオールをＥ．ｃｏｌｉで生合成させることができることを実証した。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてステビオールをステビオール配糖体に変換する糖鎖付加化学を工学的に操作して、糖鎖を付加した天然由来物質を作製する技術基盤を開発した。またさらに、Ｅ．ｃｏｌｉを工学的に操作して、高いステビオール配糖体生成量を支持する、改善された量のＵＤＰ−グルコースを作製した。この研究により、再生可能な資源による微生物系においてＲｅｂＭ（及び本明細書に記載する他のステビオール配糖体）を得るための、経済的で、商業的に実行可能な供給源が提供される。
【００７９】
実施例１：ステビオール及びステビオール配糖体の生合成
ステビオール配糖体はジテルペノイド誘導体であり、その生合成初期経路では、共通の中間体をジベレリン酸生合成と共有している（８）。全体の直線経路は、４部分、すなわち（１）グルコース由来の中心炭素代謝物から開始前駆体であるＩＰＰとＤＭＡＰＰとを形成させる部分、（２）最初に貢献する中間体であるカウレンを生成させる部分、（３）主要中間体であるステビオールを生合成させる部分、（４）各種のステビオール配糖体を形成させる部分にモジュール化される。さらなるモジュール（５）を独立して工学的に操作し、ステビオールのグリコシル化に必要な第２の基質であるＵＤＰ−グルコースの増量生成を支持する。５つのモジュールを図２に示す。
【００８０】
植物では、共通のイソプレノイド前駆体であるＩＰＰ及びＤＭＡＰＰの形成は、２つの生合成経路、つまりメバロン酸（ＭＶＡ）経路またはメチルエリスリトールリン酸（ＭＥＰ）経路（９）から生じ得る。ステビオール・ジテルペノイド生合成の第１段階は、ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰのゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）への変換である。ＧＧＰＰはすべてのジテルペノイド分子に対する４サブユニット前駆体である。次に、プロトン化で開始されるＧＧＰＰからコパリル二リン酸（ＣＰＰ）への環化をＣＰＰ合成酵素（ＣＰＰＳ）により触媒させる。その後、カウレン合成酵素（ＫＳ）で触媒されるイオン化依存性の環化により、ＣＰＰからカウレンが生成される。これらの酵素は、ステビアの野生型生合成経路から同定され明らかにされている。このほかには、ＧＧＰＰをカウレンに変換することが基部植物（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）及び真菌種（例えば、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ及びＰｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｓｐ．）から明らかになっている、二機能性酵素がある（１０、１１）。その後、カウレンを、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼであるカウレンオキシダーゼ（ＫＯ）によって３段階反応でカウレン酸に酸化させる。完全長のＫＯ  ｃＤＮＡを酵母に発現させ、それによりカウレンがカウレン酸に変換され得ることが示された（１２）。経路の次の段階は、カウレン酸１３−ヒドロキシラーゼ（ＫＡＨ）によるカウレン酸の水酸化である。シトクロムＰ４５０であるＫＡＨを酵母に発現させ、それによりカウレン酸がステビオールに変換された（１３）。
【００８１】
コアのステビオール分子を組み立てると、一連の６つのグリコシル化で６つのグルコース部分がステビオールのコアに結合される。これらの活性に関与するグリコシルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．４．１．１７）は、ＵＤＰ−グルコースのグルコース成分の疎水性低分子（この場合はステビオール分子）への移動を触媒する（１４）。Ｏ−グリコシル化は、ステビオールのＣ１３位及びＣ１９位で生じ（図１）、その後、これらの両Ｏ−グリコシルにおける１−２’グリコシル化及び１−３’グリコシル化により合計６つのグリコシル化がもたらされる。グリコシル化の順序は、さまざまな中間生成物によってＣ１３またはＣ１９のグリコシル化、ならびに、１−２’または１−３’グリコシル化に与えられる順序に変化が生じ、極めて複雑になり得る（図３）。中間生成物のプールがＳｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａに蓄積すると仮定した場合、ＲｅｂＭ生成経路で可能性が高いのは、ステビオール＞ステビオールモノシド＞ステビオールビオシド＞ステビオシド＞レバウジオシドＡ＞レバウジオシドＤ＞レバウジオシドＭである。ただし、これは、微生物の生合成系における代替経路を除外するものではない（図３）。
【００８２】
ステビオール配糖体の生化学経路について詳細に理解して明らかにし、また、異種性の生合成経路の工学的操作を介してＩＰＰ及びＤＭＡＰＰの経路を変更するための、上流イソプレノイド経路の工学技術を進歩させることは、好都合な微生物系バイオプロセスで精製された高品質のステビオール配糖体を、持続可能に管理製造するための基盤となる。植物を用いる現在の製造及び精製のスキームにはコスト削減という重要な課題がある。植物経路を微生物宿主に再構築して使用する本明細書に記載の微生物経路は、現在の方法を改善し、天然では存在量が非常に少ないステビオール配糖体を優れた品質で生成させる優れた機会を提供する。
【００８３】
（Ａ）Ｅ．ｃｏｌｉにおけるカウレン生合成操作
【００８４】
カウレンは、ステビオール及び植物成長ホルモンであるジベレリン酸の環式ジテルペノイド前駆体である。カウレンの生合成は、テルペノイドの汎用的な前駆体ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰから３段階で構成される。ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰからの３段階反応は、酵素ＧＰＰＳ、ＣＰＳ及びＫＳまたは二機能性ＣＰＰＳ／ＫＳ酵素により触媒される。カウレンまでの全体的経路は２つのモジュールにグループ化される（図２）。異なる生物に由来するいくつかの酵素で、ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰからＧＧＰＰへの変換（１５〜１８）及びＧＧＰＰからカウレン（９〜１２、１８）への変換及びカウレンからステビオールへの変換（１２、１９〜２４）が明らかになっている（表１）。ステビアなどの高等植物では、ＧＧＰＰからカウレンへの生合成は、コパリルピロリン酸合成酵素（ＣＰＰＳ）及びカウレン合成酵素（ＫＳ）と呼ばれる酵素が仲介する２段階反応として行われる。基部植物（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）及び真菌（例えば、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ及びＰｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｓｐ．）種では、ＧＧＰＰからカウレンへの生合成は、これらの生物で明らかになっている二機能性酵素により行われる。同様に、複数の酵素がクローニングされ、ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰを変換してＧＧＰＰにすることが明らかになっている。したがって、カウレン生合成の工学的操作へ向けた第１段階は酵素の選択である。カウレンの生合成について試験するために異なる種に由来する酵素を選択した（表１）。タキサジエン生合成についてＭＭＭＥで最適化した研究から、ＴｃＧＰＰＳの動態は、タキサジエンの約１ｇ／Ｌでの製造を支持できるものであり、したがって他のジテルペンの製造も支持できることがわかった。最良のカウレン合成酵素オーソログを同定するため、上流の候補酵素としてＴｃＧＰＰＳを選択した。次いで、上流経路を工学的に操作した株で経路を試験するため、ＫＳ−ＣＰＳ−ＧＧＰＰＳ（ＫＣＧ）または二機能性ＰｓＣＫ−ＧＧＰＰＳ（ＣＫＧ）を含んでいるオペロンを選択した。下流カウレン経路の発現を調節するため、ＫＳ−ＣＰＰＳ−ＧＧＰＰＳ（ＫＣＧ）及びＣＫ−ＧＧＰＰＳ（ＣＫＧ）オペロンを、コピー数及びプロモーター強度をさまざまに変えてプラスミド系にクローニングした（ｐ５Ｔｒｃ、ｐ１０Ｔｒｃ、ｐ２０Ｔｒｃ及びｐ５Ｔ７）。さらに、カウレンの各オペロンの１コピーを、発現レベルがさまざまに異なる上流経路と共に、強度がさまざまに異なるプロモーター下でＥ．ｃｏｌｉ染色体に組み込んだ。
【００８５】
経路を調節し、各種の組み合わせの生産性を試験するため、上流及び下流の発現をさまざまに変えて株を選択した。これらの株を、小規模（２ｍＬ）Ｈｕｎｇａｔｅチューブ発酵に供し、表現型の特性及びカウレン生産性の特徴付けを行った。図４に示すように、複雑な非線形のカウレン蓄積が観察された。興味深いことに、植物種由来のＫＳ（ＳｒＣＰＰＳ、ＳｒＫＳ及びＰｐＣＫ）は同様のプロファイルを示したが（図４Ａ、Ｂ）、真菌酵素で構築した経路（ＧｆＣＫ及びＰｓＣＫ）では、非常に類似したパターンの生成物蓄積が示された（図４Ｃ、Ｄ）。興味深いことに、真菌酵素を組み込んでいる経路の低コピー発現は、植物酵素経路より比較的高い生産性を示した。生成物力価の最大値（約１４０ｍｇ／Ｌ）は、植物酵素のみを用いた構成体によるものである（図４Ａ、すなわち、Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ遺伝子を用いて上流をＴｒｃプロモーター下、下流をプラスミドｐ２０Ｔｒｃに構築した株）。しかし、完全に染色体に組み込んだ真菌経路の酵素（ＰｓＣＫ）（図４Ｄ、すなわち、上流にＴｒｃ、下流にＴ７−ＰｓＣＫＧを有する株）では約１００ｍｇ／Ｌのカウレンが生成された。これら２株の下流成分の発現を比較すると、同一強度の上流経路Ｃｈ１ＴｒｃＭＥＰ下で、Ｃｈ１Ｔ７ＰｓＣＫＧ経路はｐ２０ＴｒｃＳｒＫＣＧ（３５ａ．ｕ．）より２３倍低い（１．５ａ．ｕ．）（４）。多段階／マルチモジュール経路の性能の主要駆動力は、フラックスにおける至適バランスである。今回の下流発現を非常に低くした、Ｃｈ１ＴｒｃＭＥＰ及びＣｈ１Ｔ７ＰｓＣＫＧで構築した株において、我々は、最高１００ｍｇ／Ｌのカウレン生成を達成した。これにより、ＰｓＣＫ酵素はバランスのとれた経路発現下で高フラックスを支持できることが実証された。さらに、本研究から、異なる経路バランス下のジテルペン生成物プロファイルが複雑な非線形挙動であることについての洞察も与えられた（図５、６、及び表２）。このような、フラックス調節がさまざまに異なる場合の、経路による生成物選択性に関する複雑な挙動は、多変量モジュールによる経路最適化の力を明確に示している。至適バランス下では、株は、生成物プロファイルで高い選択性を示し得る（図６Ｄ、株４７）。さらに、多変量モジュールによる検索で、最良の変異型カウレン酵素（ＰｓＣＫ）を選択し、さらに高生産性の株を人工的に作り出すことができた。この至適株（すなわち、株４７）をバイオリアクターシステムで増殖させた際、我々は、培地または工程の改善を最小限に抑えつつ、カウレンを１．６ｇ／Ｌ生成できる株を作製することができた（図７）。ＭＭＭＥは、経路のさらなる最適化へ向けた洞察も与えるとともに、同様の手法を使用してＧＧＰＰＳ酵素の最良の変異型（表１）を同定する一助となる。その上、タキサジエン生成株に対する経路操作で観察されたように、カウレン生成もまた、抑制分子インドールの生成と逆相関を示した（図８）。
【００８６】
（Ｂ）Ｅ．ｃｏｌｉにおけるステビオール生合成操作
【００８７】
ステビオールの生合成には、シトクロムＰ４５０酵素が介在する主要酸化反応２つが関与している（図３）。Ｐ４５０は、数千の天然由来物質の代謝経路に関与する重要な酸化酵素である（２５）。最近まで、科学コミュニティーでは、野生型の真核生物宿主（例えば、植物または酵母）に比べると、Ｅ．ｃｏｌｉなど細菌宿主は、こうした重要な天然物化学反応の実施には理想的な系ではないと考えられていた。しかし、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてタキソールの生化学を最適化する間に、Ｐ４５０酵素の生化学、具体的にはＥ．ｃｏｌｉにおけるＰ４５０酵素の使用に関する生化学に関与する構造と機能との機構的関係について理解が深まった。Ｎ末端膜領域の操作と、ＣＹＰ４５０酵素及びその補因子のＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）の各酵素の至適組み合わせの構築とを至適に行うことは、機能発現にとって重要である。ＣＹＰ４５０酵素を機能発現させ、タキサジエン、バレンセン、リモネンまたはカウレンなどの複雑な天然テルペノイドの天然由来物質をインビボで酸化させるために、いくつかの酵素／経路最適化技術が開発された。
【００８８】
ステビオール生合成は、カウレンオキシダーゼ（ＫＯ）及びカウレン酸ヒドロキシラーゼ（ＫＡＨ）ならびにＣＹＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）の異なる２種のＣＹＰ４５０酵素に仲介される。候補となるいくつかの遺伝子／酵素を同定し、ステビオール生合成における酸化及び水酸化反応のためのＰ４５０酵素として注釈を付した（表１）。カルボキシル化及びヒドロキシル化のための酵素であるＫＯ及びＫＡＨを機能発現させるには、タンパク質の再設計及び工学操作が必要である。我々は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて改善された機能発現をさせるためのＳｒＫＯ酵素を再設計しクローニングすることから開始した。バイオインフォマティクス解析を徹底的に行った後、Ｎ末端に欠失及び修飾のあるＫＯ酵素をいくつか構築した（図９Ａ）。ＳｒＫＯと補因子シトロクロム（ｃｙｔｒｏｃｈｒｏｍｅ）Ｐ４５０レダクターゼ酵素（ＳｒＣＰＲ）とを、融合タンパク質（「リンカー」構成体）として、またはポリシストロン性モジュール（「オペロン」構成体）としてｐＥＴ４５ｄ発現ベクターに組み込んだ構成体（図９Ｂ）を創作した。Ｅ．ｃｏｌｉ内のこれらの構成体でのタンパク質生成及び相対的溶解度をＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して評価した（図９Ｃ）。
【００８９】
その後、これらの構成体を、我々が作製したベクターｐ５Ｔｒｃに移し、その経路のｉｎ  ｖｉｖｏ機能活性を試験した。これらの構成体を形質転換してカウレン生成株３、９及び１１とし（表２）、カウレンからカウレン酸への変換を試験した（表３）。設計したキメラ酵素は機能的に活性であったが、酵素の反応性が不完全であったためカウレノ−ル及びカウレナールが生成された。Ｎ末端に欠失のある各種ＫＯ構成体すべてのうち、ＫＯの３９ＡＡを欠失させた構成体が、４及び２０アミノ酸を欠失させた構成体より機能的に活性であった。さらに、オペロンとして発現させたＳｒＫＯ及びＳｒＣＰＲは、ＳｒＫＯ及びＳｒＣＰＲから構築した融合酵素と同様の活性を示した。この当初の研究に続いて、我々はＳｒＫＯ酵素を３遺伝子のＫＡＨ−ＫＯ−ＣＰＲモジュールの一部としてさらに最適化し（下記を参照されたい）、この構成体のうち、至適ＳｒＫＯ構成体はＮ末端からアミノ酸残基２０個を欠失させており、カウレンからカウレン酸に完全に変換された（下記を参照されたい）。
【００９０】
上記ＳｒＫＯ株の初回スクリーニングにおいて、基質プールの利用性は、その後のカウレン酸への変換に重要であることがわかった。高量の基質（カウレン）プールが利用可能な場合（株９）、カウレンは酸化経路で約６０ｍｇ／Ｌの酸素化カウレン化合物に変換された。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａのＫＯ酵素の酵素活性に関するこれまでのインビトロ研究から、この酵素で、カウレンのアルコール誘導体、ジオール誘導体、及びアルデヒド誘導体が生成されることが実証された（１２）。同様の生成物多様性はタキソールＰ４５０酵素でも見られるが、その場合、経路全体のバランスの再調整によって生成物プロファイルが変化し、水酸化されたタキサンのみが生成された。これを受け、ＫＯのＰ４５０モジュールと上流モジュールとのバランスを再調整するため、株操作研究を開始した。モジュールバランスを再調整するため、ＫＯ経路を、染色体に組み込んだカウレン高生成株（株４７）に導入し、活性及び生産性について試験した（図１０）。異なる生物由来のオーソロガスなＫＯ酵素の設計、合成及び試験も行い（表１）最良の変異型酵素を同定した。カウレン経路の場合と同様に、多変量での経路最適化を実施し、フラックスのバランスをさまざまに変えて最良の変異型酵素の同定、及びそれらの非線形生成物プロファイルと生成物分布の確認を行った（図１１）。その後、野生型バックグラウンドの点変異体コレクションの設計及び検証を行ってＳｒＫＯ活性を改善した（表４）。
【００９１】
カウレン酸が首尾よく生成されたら、生合成経路における酵素による最終段階を組み込み、酵素ＫＡＨによりカウレン酸のＣ１３位炭素で水酸化が起こりステビオールが得られることを検証した（図１及び２）。ＳｒＫＯ及びＳｒＣＰＲのポリシストロン性発現についての研究から、この酵素が独立成分として発現し、機能活性を維持し得ることがわかった。ＫＯ及びＫＡＨ両酵素が、ＳｒＣＰＲ酵素単一を用いた場合も機能的に活性であるかどうかを測定した。プラスミド数を制限し、ＫＯ及びＫＡＨの発現バランスを調整するために、ＳｒＣＰＲの単一コピーをカウレン操作株の染色体に組み込んだ。ＫＯ及びＫＡＨを、ｐ５Ｔｒｃプラスミド下のポリシストロン性発現として構築した。全株（表５）を４日間発酵させ酢酸エチルで抽出しＧＣ−ＭＳ分析を行ったところ、検出可能レベルのステビオールが検出された。
【００９２】
この有望な初回結果をもとに、Ｅ．ｃｏｌｉの生合成経路に組み立てるための至適酵素を同定し、その際、操作した各種バージョンのＫＯ及びＫＡＨの両候補をＣＰＲ補因子酵素を有するポリシストロン性オペロンでインビボ発現させることを手段とした（図１２）。ＡｔＫＡＨ酵素を点変異の活動（ｃａｍｐａｉｇｎ）でさらに増強させた。合理的な方法を使用してＡｔＫＡＨ配列の単一点変異コレクションを設計し、カウレン酸からステビオールへの変換を改善するために野生型酵素の安定性、溶解度、または活性を高めることを目標とした。野生型ＡｔＫＡＨに対する点変異及び対応する倍率変化の改善を表６にまとめ、図１３に表示している。その後、これらの点変異のいくつかをＡｔＫＡＨ酵素で組み換え、カウレン酸をステビオールに完全に変換することができる組換え酵素を同定した（図１４）。至適なＳｒＫＯ及びＳｒＣＰＲを有するオペロンで発現させると、カウレンからステビオールへの完全変換が示され（図１５）、このことは、経路成分を慎重にバランス調整することの重要性をさらに強調している。
【００９３】
（Ｃ）Ｅ．ｃｏｌｉにおける低分子グリコシル化操作
【００９４】
ステビオールからレバウジオシドＭ及びすべての中間ステビオール配糖体に至るまでの複数のグリコシル化を支持するため、利用可能なＵＤＰ−グルコース量を増加させようとするバックグラウンドＥ．ｃｏｌｉ株に一連の修飾を導入した。ＵＤＰ−グルコースへの炭素フラックスを増加させること、及び低分子グリコシル化（すなわち、グリコーゲン合成及び炭素貯蔵）に従っていない、ＵＤＰ−グルコースから離れている経路のフラックスを抑制することを目的として、一連の遺伝子ノックアウト及び遺伝子挿入を行った。かかる設計により、スクロースを細胞内へ移入させること、及び移入させたスクロースを、スクロースホスホリラーゼの作用によりフルクトースとグルコースに分けることが可能になる。炭素供給源としてスクロースを使用して細胞増殖が行われている場合、その後の一連のノックアウトにより一次代謝が改変され、炭素供給源としてフルクトースのみを使用して生物量が合成されるよう強制し、グルコースがＵＤＰ−グルコース生合成だけに向かって集められる。ただし、炭素供給源としてグリセロールまたはグルコースで増殖させたいずれの場合でも、細胞には依然として増殖能があり、かつＵＤＰ−グルコース利用性が改善されている。この戦略を実現する、Ｅ．ｃｏｌｉ株に施用される特定の修飾は表７に掲載されている。これらの修飾で低分子のグリコシル化が増強されたか否かを試験して測定したところ、カフェ酸（培地に添加）のインビボでのグリコシル化の増強が操作株により示され、実際に増強させることが実証された（図１６）。
【００９５】
ステビオールのコア分子を構築し、コアを、グリコシル化反応がそれぞれ異なる４種のＵＧＴの組立て体を使用してＵＤＰ−グルコースでグリコシル化させた（表８及び９）。これらの化学反応には、（１）ステビオールのＣ１３におけるＯ−グリコシル化、（２）ステビオールのＣ１９におけるＯ−グリコシル化、（３）Ｃ１３  Ｏ−グルコースまたはＣ１９  Ｏ−グルコースにおける１−２’−グリコシル化、及び（４）Ｃ１３  Ｏ−グルコースまたはＣ１９  Ｏ−グルコースにおける１−３’−グリコシル化（上記反応すべてを含む例については図１を参照されたい）が含まれる。Ｃ１３の酸素及び／またはＣ１９の酸素の一方または双方が一旦グリコシル化されたら、さらなるグリコシル化を１−２’または１−３’を加えてＯ−グルコースに付加できる。以下に記載するように、これらのＵＧＴは、基本的にはそれらのドメインのシャッフリングにより修飾されており、目的の点変異でさらに増強され、所望の最終生成物であるＲｅｂＭまでのフラックスを増強させる。ＭＭＭＥ法を用いて４種のＵＧＴを可能なあらゆる組み合わせに迅速に組み合わせ、ステビオール生成株をバックグラウンドにして得られた構成体をインビボでスクリーニングした（図１７）。最適なポリシストロン性配置に組み立てた改善ＵＧＴと他の４つのモジュールとを単一Ｅ．ｃｏｌｉ株に組み合わせた。我々は、その株を培養し、レバウジオシドＭをもたらすステビオール配糖体のインビボ生成を実証した（図１８）。かかる株は合計５．７ｍｇ／Ｌのステビオール配糖体を生成でき、それには１００μｇ／ＬのＲｅｂＭが含まれている。可能なあらゆる構成体を作製し、それらを、プロモーター強度をさまざまに変えてプラスミドで発現させるかまたは染色体に組み込んで発現させることにより、ＲｅｂＤ：ＲｅｂＭ比が１：１から０：１（残ったＲｅｂＤなし）に至るまでの範囲であるステビオール配糖体生成物プロファイルを得た。
【００９６】
我々の知る限り、ステビオールのような酸素化された二機能性テルペノイド分子を生成させるために、Ｅ．ｃｏｌｉに２つのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼを機能的に発現させたのは今回が初めてである。その上、カウレンをステビオールに変換するために、１個のＣＰＲ酵素が両Ｐ４５０酵素（ＫＯ及びＫＡＨ）の補因子として作用した。これは、Ｅ．ｃｏｌｉ系でのＰ４５０介在性酸化反応の工学操作における、もう１つの重要な躍進である。さらに、我々の知る限り、４つのＵＧＴを単一Ｅ．ｃｏｌｉ株に組み合わせ、それが、テルペノイドのコア分子を順次６回グリコシル化させてレバウジオシドＭを単独のステビオール配糖体中間生成物として生成する能力があることを実証したのは今回が初めてである。これは、ＵＧＴの工学的操作、及び希少なステビオール配糖体を持続可能に生成するための基盤確立における大きな前進である。
【００９７】
実施例２：グリコシルトランスフェラーゼ酵素の円順列変異体の構築
酵素に対して作用する自然選択では、十分な安定性及び生物学的機能の活性について選択しようとする。このプロセスで、酵素は特定の進化経路へ送られるが、これは産業用途に求められる安定性と活性の獲得に容易に適合しないことがある。一例として、特定の一基質に特化した酵素は、特化していなかった酵素よりも新しい基質の人工操作で問題が多くなりがちである。したがって、ドメインの接続を交換して酵素を「振り混ぜる」ことにより、タンパク質の折り畳みは同一であるが、折り返しの相互作用と折り込まれている相互作用とが新規である、新たに選択及び進化の対象となるであろう酵素が創作される可能性がある。言い換えれば、アミノ酸変異を何ら導入することなく、単純に配列をシャッフリングし、酵素をその本来の進化経路から移動させることによって、タンパク質の折り畳みから進化空間の別のポイントへと「飛ぶ」ことができる可能性がある。
【００９８】
ＵＧＴ（ＵＤＰ−グルコースグリコシルトランスフェラーゼ）には、より可変なＮ末端の基質結合（糖受容体）ドメインと、より保存されたＣ末端のＵＤＰ−グルコース結合（糖供与体）ドメインという２つのドメインがある。Ｎ末端ドメインで酵素の基質特異性のほとんどが決定されるが、一部の特異性はＣ末端ドメインにより制御される。これらのドメイン各々がそのタンパク質のおよそ半分ずつを作っている。この２ドメイン構造を考えたとき、我々は、タンパク質を半分に切断して新たなＮ末端とＣ末端を作り、本来のＮ末端とＣ末端とを共に結合させれば（例えば、円「順列変異法（ｐｅｒｍｕｔｉｚａｔｉｏｎ）」）、酵素が「シャッフル」され、また（得られる酵素は、選択という圧力から生じたものではないと考えらえることから）人工的に活性を改善する新たな機会が作られるであろうという仮説を立てた。
【００９９】
一般手順の説明として、シャッフル酵素の設計では以下の工程が含まれる：（ｉ）所望のグリコシル化活性を有する公知のＵＧＴとの相同モデルを作製する（図１９）；（ｉｉ）その相同モデルを使用して、Ｎ末端残基とＣ末端残基の間の距離を推定する；（ｉｉｉ）既存のＮ末端とＣ末端とを連結するさまざまな長さのリンカーを設計する；（ｉｖ）新たなＮ末端及びＣ末端となる酵素内の位置を選択する；（ｖ）得られる配列を合成する；（ｖｉ）インビボ及びインビトロで発現させ、親活性を保持するあらゆるシャッフル酵素を同定する；（ｖｉｉ）シャッフル酵素の新しい相同モデルから情報を得て、合理的操作法によって各設計を変更する；（ｖｉｉｉ）所望の活性改善が達成されるまで工程ｖｉｉを繰り返す。リンカーを作製する場合（工程ｉｉｉ）、Ｎ末端残基及びＣ末端残基の同定を行い、各末端に最も近いが、相同モデルの構造に基づきタンパク質の残りの部分と直接相互作用すると予測されるものを同定する（図２０）。新たなＮ末端とＣ末端用に切断部位を選ぶ場合（工程ｉｖ）（図２１）、二次構造エレメント間のループ領域を選ぶが、かかるループ領域は、ドメイン構造を維持しており、可能な限り配列の中間に近く、また、溶媒露出していて活性部位から離れているものを選ぶ。
【０１００】
円順列変異体を、Ｃ１３、Ｃ１９、１−２’及び１−３’の各グリコシル化活性について設計、合成し、かつ組み込みを行った（親酵素はそれぞれ、ＳｒＵＧＴ８５Ｃ２、ＳｒＵＧＴ７４Ｇ１、ＯｓＵＧＴ１−２（Ｑ０ＤＰＢ７＿ＯＲＹＳＪ）（２８）、及びＳｒＵＧＴ７６Ｇ１である）。４活性はいずれも円順列変異体で機能した。一例として、データは、第１回目の円順列変異体操作で得た新規な酵素ＭｂＵＧＴ１−２を示し、親酵素ＯｓＵＧＴ１−２と同等の活性を示している（図２２）。シャッフル酵素に対して行った次の改良では本来の親配列より活性が増強された酵素が生成され、このシャッフリング法が改善された酵素を生成することについての可能性を示している（図２３）。これらの改良は、シャッフル酵素の新規なＮ末端とＣ末端を形成している位置と特定残基に対する、より微細なスケールでの修飾、ならびに親のＮ末端とＣ末端を連結するリンカーの長さとアミノ酸配列を改良することに焦点を当てる。
【０１０１】
ＭｂＵＧＴ１−２酵素に対する一連の点変異により、この新規配列にさらなる改善がもたらされ（図２４及び２５）、酵素配列をシャッフリングすることによって有意に改善する機会がかかる方法により作られたことが確認された。しかしながら、ＭｂＵＧＴ１−２に改善された活性を付与したこれらの点変異を親ＯｓＵＧＴ１−２バックグラウンドで試験したところ、中性であるかまたは活性に悪影響があることがわかった（図２６）。新規酵素と親配列の間には点変異の移動可能性がないことから、円順列変異法（ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｐｅｒｍｕｔｉｚａｔｉｏｎ）は、ＵＧＴ酵素を改善する機会を得るための有益かつ普遍的な方法であることが確認された。
【０１０２】
実施例３：別個のグリコシルトランスフェラーゼのキメラ融合
円順列変異法（ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｐｅｒｍｕｔｉｚａｔｉｏｎ）によって生じた酵素のシャッフリングと同じように、Ｎ末端の低分子糖受容体である結合ドメインまたはＣ末端の糖供与体である結合ドメインを、既知のＵＧＴ同士で交換することによって、グリコシルトランスフェラーゼ酵素をシャッフルする代替的方法を創作した。例えば、ＳｒＵＧＴ８５Ｃ２のＮ末端ドメインとＳｒＵＧＴ７６Ｇ１のＣ末端ドメインとで構成されるキメラ酵素を創作した（図２７）。このアプローチの背後にある根拠は、ＵＧＴ酵素のドメインをシャッフリングするという概念にあるが、今回に限り特別に、各ＵＧＴ間でドメインをシャッフリングするというニュアンスを加えた。その意図するところは、エネルギー全体像において親酵素が占めているポイントから離れて、新たに最適な酵素立体配置へ向けたさらなる進化が可能な、新規な配列の非最適化酵素を生成株に作製することにある。ここでも、この酵素はそれ自体が自然選択を受けた結果生じたものではないため、このキメラ法で生じたシャッフル酵素は、高い進化可能性／点変異から良好な利益を受ける大きな可能性（すなわち、より高い活性）を有していなければならない。さらに、この方法を使用して、折り畳み及び／または安定性が増強されたキメラタンパク質を作製することができる。
【０１０３】
簡潔に述べると、この方法では、広範な４つの工程を使用し、すなわち、（１）２つの候補ＵＧＴを同定する、（２）２つのＵＧＴ同士でキメラを作製するための乗換え位置（ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ）を選択する（すなわち、２つの配列をつなぎ合わせるポイントを選択する）、（３）Ｃ末端ドメイン（ヌクレオチド−炭水化物の結合ドメイン、例えば、ＵＤＰ−グルコース結合ドメイン）を、構造上の考察に基づき、低分子基質またはＮ末端低分子結合ドメインとの相互作用が改善されるよう変異させる、（４）キメラ構成体を創作して活性について試験する、という各工程を使用する。この方法は、潜在的なあらゆるＵＧＴの機能的性能を改善するために一般化及び適用することができる。ＵＧＴのドメイン構造が保存されていれば、２つのＵＧＴのいずれに由来するドメインでも組み合わせ可能と考えられる。
【０１０４】
実施例４：活性を改善し希少配糖体を生合成させるためのグリコシルトランスフェラーゼ酵素修飾
ステビア植物から明らかになっている、十分量で生じるステビオール配糖体は約２０種のみであるが、生合成により生成され得る、グリコシル化パターンの異なった考えられるステビオール配糖体がさらにいくつかある。表１０及び図２９、３０、３１及び３２には、本項に記載するステビオール配糖体として可能性の高い、既知のステビオール配糖体がまとめられており、それらは符号ＳＧ＃で略称されている。これらのグリコシドには天然に存在するものもあれば、本明細書に記載の４つのグリコシル化反応（すなわち、Ｃ１３−Ｏ−グリコシル化、Ｃ１９−Ｏ−グリコシル化、１，２’−グリコシル化、及び１，３’−グリコシル化）を触媒するＵＧＴを使用して生合成が可能なものもある。
【０１０５】
合理的な設計法を使用して、ステビオールからステビオールモノシド（ＳＧ１）、及び／またはＣ１９−グルコピラノシルステビオール（ＳＧ２）からルブソシド（ＳＧ５）、及び／またはＳＧ４からＳＧ１０、及び／またはＳＧ７からＳＧ１１、及び／またはＳＧ１３からＳＧ１７、及び／またはＳＧ１９からＳＧ２９、及び／またはＳＧ２３からＳＧ３１への変換を改善するために、野生型酵素の安定性、溶解度、または活性を高めることを目的として、ＳｒＵＧＴ８５Ｃ２配列（Ｃ１３−Ｏ−グリコシル化活性を有する）における単一点変異、二重点変異、及び三重点変異のコレクションを設計した。野生型ＳｒＵＧＴ８５Ｃ２に対する点変異及び対応する倍率変化改善を表１１にまとめ、図３２及び３３に表示している。
【０１０６】
合理的な設計法を使用して、ステビオールからＣ１９−グルコピラノシルステビオール（ＳＧ２）、及び／またはステビオールモノシド（ＳＧ１）からルブソシド（ＳＧ５）、及び／またはステビオールビオシド（ＳＧ３）からステビオシド（ＳＧ８）、及び／またはＳＧ６からレバウジオシドＧ（ＳＧ９）、及び／またはレバウジオシドＢ（ＳＧ１２）からレバウジオシドＡ（ＳＧ１６）、及び／またはＳＧ１８からＳＧ２８、及び／またはＳＧ２２からＳＧ３０への変換を改善するために、野生型酵素の安定性、溶解度、または活性を高めることを目的とした、ＳｒＵＧＴ７４Ｇ１配列（Ｃ１９−Ｏ−グリコシル化活性を有する）における単一点変異、二重点変異、及び三重点変異のコレクションを設計した。
【０１０７】
合理的な設計法を使用して、ステビオールモノシド（ＳＧ１）からステビオールビオシド（ＳＧ３）、及び／またはＣ１９−グルコピラノシルステビオール（ＳＧ２）からＳＧ４、及び／またはルブソシド（ＳＧ５）からステビオシド（ＳＧ８）、及び／またはルブソシド（ＳＧ５）からＳＧ１０、及び／またはルブソシド（ＳＧ５）からレバウジオシドＥ（ＳＧ１４）、及び／またはＳＧ６からレバウジオシドＢ（ＳＧ１２）、及び／またはＳＧ７からＳＧ１３、及び／または及び／またはステビオシド（ＳＧ８）からレバウジオシドＥ（ＳＧ１４）、及び／またはＳＧ１０からレバウジオシドＥ（ＳＧ１４）、及び／またはレバウジオシドＧ（ＳＧ９）からレバウジオシドＡ（ＳＧ１６）、及び／またはレバウジオシドＧ（ＳＧ９）からＳＧ２１、及び／またはＳＧ１１からＳＧ１７、及び／またはＳＧ１１からＳＧ２０、及び／またはレバウジオシドＢ（ＳＧ１２）からＳＧ２２、及び／またはＳＧ１３からＳＧ２３、及び／またはＳＧ１５からレバウジオシドＩ（ＳＧ２６）、及び／またはＳＧ１５からＳＧ２７、及び／またはレバウジオシドＡ（ＳＧ１６）からレバウジオシドＤ（ＳＧ２４）、及び／またはレバウジオシドＡ（ＳＧ１６）からＳＧ３０、及び／またはＳＧ１７からＳＧ２５、及び／またはＳＧ１７からＳＧ３１、及び／またはＳＧ２０からＳＧ２５、及び／またはＳＧ２１からレバウジオシドＤ（ＳＧ２４）、及び／またはレバウジオシドＤ（ＳＧ２４）からＳＧ３７、及び／またはＳＧ２５からＳＧ３９、及び／またはレバウジオシドＩ（ＳＧ２６）からレバウジオシドＭ（ＳＧ３２）、及び／またはレバウジオシドＩ（ＳＧ２６）からＳＧ３８、及び／またはＳＧ２７からレバウジオシドＭ（ＳＧ３２）、及び／またはＳＧ２７からＳＧ４０、及び／またはＳＧ２８からＳＧ３３、及び／またはＳＧ２９からＳＧ３５、及び／またはＳＧ３０からＳＧ３７、及び／またはＳＧ３１からＳＧ３９、及び／またはレバウジオシドＭ（ＳＧ３２）からＳＧ４３、及び／またはレバウジオシドＭ（ＳＧ３２）からＳＧ４４、及び／またはＳＧ３４からＳＧ４１、及び／またはＳＧ３６からＳＧ４２、及び／またはＳＧ３８からＳＧ４３、及び／またはＳＧ４０からＳＧ４４、及び／またはＳＧ４１からＳＧ４７、及び／またはＳＧ４２からＳＧ４８、及び／またはＳＧ４３からＳＧ４６、及び／またはＳＧ４４からＳＧ４６への変換を改善するために、野生型酵素の安定性、溶解度、または活性を高めることを目的として、ＭｂＵＧＴ１−２配列（１−２’グリコシル化活性を有する）における単一点変異、二重点変異、及び三重点変異のコレクションを設計した。野生型ＭｂＵＧＴ１−２に対する点変異及び対応する倍率変化改善を表１２にまとめ、代表的反応を図２４及び２５に示す。
【０１０８】
合理的な設計法を使用して、ステビオールモノシド（ＳＧ１）からＳＧ６、及び／またはＣ１９−グルコピラノシルステビオール（ＳＧ２）からＳＧ７、及び／またはステビオールビオシド（ＳＧ３）からレバウジオシドＢ（ＳＧ１２）、及び／またはＳＧ４からＳＧ１３、及び／またはルブソシド（ＳＧ５）からレバウジオシドＧ（ＳＧ９）、及び／またはルブソシド（ＳＧ５）からＳＧ１１、及び／またはルブソシド（ＳＧ５）からＳＧ１５、及び／またはステビオシド（ＳＧ８）からレバウジオシドＡ（ＳＧ１６）、及び／またはステビオシド（ＳＧ８）からＳＧ２０、及び／またはレバウジオシドＧ（ＳＧ９）からＳＧ１５、及び／またはＳＧ１０からＳＧ１７、及び／またはＳＧ１０からＳＧ２１、及び／またはＳＧ１１からＳＧ１５、及び／またはレバウジオシドＢ（ＳＧ１２）からＳＧ１８、及び／またはＳＧ１３からＳＧ１９、及び／またはレバウジオシドＥ（ＳＧ１４）からレバウジオシドＤ（ＳＧ２４）、及び／またはレバウジオシドＥ（ＳＧ１４）からＳＧ２５、及び／またはレバウジオシドＥ（ＳＧ１４）からレバウジオシドＭ（ＳＧ３２）、及び／またはレバウジオシドＡ（ＳＧ１６）からレバウジオシドＩ（ＳＧ２６）、及び／またはレバウジオシドＡ（ＳＧ１６）からＳＧ２８、及び／またはＳＧ１７からＳＧ２７、及び／またはＳＧ１７からＳＧ２９、及び／またはＳＧ２０からレバウジオシドＩ（ＳＧ２６）、及び／またはＳＧ２１からＳＧ２７、及び／またはレバウジオシドＤ（ＳＧ２４）からレバウジオシドＭ（ＳＧ３２）、及び／またはレバウジオシドＤ（ＳＧ２４）からＳＧ３３、及び／またはＳＧ２５からレバウジオシドＭ（ＳＧ３２）、及び／またはＳＧ２５からＳＧ３５、及び／またはレバウジオシドＩ（ＳＧ２６）からＳＧ３４、及び／またはＳＧ２７からＳＧ３６、及び／またはＳＧ２８からＳＧ３４、及び／またはＳＧ２９からＳＧ３６、及び／またはＳＧ３０からＳＧ３８、及び／またはＳＧ３１からＳＧ４０、及び／またはレバウジオシドＭ（ＳＧ３２）からＳＧ４１、及び／またはレバウジオシドＭ（ＳＧ３２）からＳＧ４２、及び／またはＳＧ３３からＳＧ４１、及び／またはＳＧ３５からＳＧ４２、及び／またはＳＧ３７からＳＧ４３、及び／またはＳＧ３９からＳＧ４４、及び／またはＳＧ４１からＳＧ４５、及び／またはＳＧ４２からＳＧ４５、及び／またはＳＧ４３からＳＧ４８、及び／またはＳＧ４４からＳＧ４７への変換を改善するために、野生型酵素の安定性、溶解度、または活性を高めることを目的として、ＳｒＵＧＴ７６Ｇ１配列（１−３’グリコシル化活性を有する）における単一点変異、二重点変異、三重点変異、または四重点変異のコレクションを設計した。野生型ＳｒＵＧＴ７６Ｇ１に対する点変異及び対応する倍率変化改善を表１３にまとめ、代表的反応を図３５及び３６に示す。
【０１０９】
実施例５：２２℃を上回る場合の収率及び性能の改善
２２℃を上回る温度での最適下限を決定するためカウレンモジュールにおける酵素の性能を測定した。先の実施例に使用したＧＧＰＰＳ（ゲラニルゲラニル二リン酸）シンターゼ酵素及び二機能性コパリル二リン酸（ＣＰＰ）／カウレンシンターゼ酵素の代替的酵素のクラスターを同定した。特に、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて細菌酵素のほうが植物酵素及び真菌酵素より良好に機能する場合があることから、細菌供給源に由来する代替的酵素を検討した。可能な場合は好熱性細菌由来の酵素を検討した。ＣＰＰ合成酵素及びカウレン合成酵素の活性については、根圏細菌がその共生ライフスタイルからカウレン生成性であることが多いため、根圏細菌の遺伝子を同定した。
【０１１０】
図３９は、代替的ＧＧＰＰＳ酵素についての結果を示す。いくつかの酵素は、高温において改善された性能を示し、それらには海洋細菌４４３、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｃｏｒｎｙｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、及びＰｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ｃａｌｉｄｉｆｏｎｔｉｓが含まれる。
【０１１１】
図４０は、代替的ＣＰＰＳ及びＫＳ酵素についての結果を示す。Ｅｒｗｉｎａ  ｔｒａｃｈｅｉｐｈｉｌａ（Ｅｔ）のＣＰＰＳ及びＥｔＫＳが、高温における改善された活性を示した。
【０１１２】
さまざまなステビオール配糖体（ＲｅｂＭなど）の生成を選択株において２２℃で試験した。かかる株は、ＦＡＢ４６−ＭＥＰ、Ｔ７−ＰｓＣＫＳ−ＡｎＧＧＰＰＳ、Ｔ７−ＡｔＫＡＨ−ＳｒＫＯ−ＳｒＣＰＲ、Ｔ７−ＭｂＵＧＴ１，３−ＭｂＵＧＴ１，２−ＭｂＵＧＴｃ１３−ＭｂＵＧＴｃ１９を含んでいるｐＢＡＣ単一コピー染色体を有するＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２であった。図４１に示すように、ＲｅｂＭの力価は５５．５ｍｇ／Ｌ、ステビオール配糖体総力価は５８．３ｍｇ／Ｌであったが、これは、ＲｅｂＭ９４．４％に等しい。ＲｅｂＭ：ＲｅｂＤ比は６４．５：１（単位：グラム）であった。
【数１】
2017532976.tif 000003
【０１１３】
ステビオール配糖体の細胞内蓄積を調べた。図４２に示すように、ステビオール配糖体の大部分が細胞から排泄されている。図４２は、細胞内及び細胞外の物質を合わせて、細胞の内側と外側とで蓄積生成物のパーセンテージを比べている。これは、ほとんどが細胞内の蓄積を示し、ステビオール配糖体の収率が実質的に少なかった当初の研究と対照的であった。当初の研究では力価が低かったために、蓄積された生成物プールでは、細胞の外へ生成物をポンピングするのに必要な能動輸送機序に不十分だったことが考えられる。実際、力価の上昇に伴い、細胞の外側に蓄積した生成物の割合が大きくなり、これは、推定上のポンプ活性の閾濃度を一旦超えると、残りの生成物が運び出されることを示している。中間生成物プールが輸送体のＫｂ以下に維持されれば、炭素が外部に失われることなく、Ｃ−フラックスを最終生成物まで効果的に押し出させることができるため（例えば、ステビオール配糖体中間体が一旦ポンピングで出されると、そこからさらにグリコシル化されてＲｅｂＭなど所望の生成物になることができない）、これらのデータは、株の工学的操作の観点及びＥ．ｃｏｌｉにおける商用生産の点で非常に有望である。
【０１１４】
ＵＧＴ８５Ｃ２の点変異体を作製し、２２℃、３０℃、及び３４℃で試験した。図４３Ａ、Ｂは、３４℃でのステビオールモノシドの生成を示す。図４３Ｃは、選択した変異体の２２℃、３０℃、及び３４℃でのステビオールモノシド生成を示す。いくつかの変異は、３４℃で高いステビオールモノシド生成を示し、変異Ｐ２１５Ｔが生成量が最も多かった。
【０１１５】
７４Ｇ１の円順列変異体も３０℃及び３４℃での活性について試験した。図４４Ａ、Ｂは、ステビオールから１３Ｃ−ｃ１９−Ｇｌｕ−ステビオールへの変換（図４４Ａ）及びステビオールビオシドから１３Ｃステビオシドへの変換（図４４Ｂ）を示す。
【０１１６】
ＡｔＫＡＨにおける変異を２２℃、２６℃、及び３０℃での活性についてスクリーニングした。図４５に示すように、Ｃ３３１Ｉでは実質的な熱安定性が得られた。Ｃ３３１Ｉはｔ１４バックグラウンドで作製されたものである。
【０１１７】
ＭｂＵＧＴ１，２の合理的組換えを行い、ＲｅｂＡからＲｅｂＤへの変換（図４６Ａ）、ならびにステビオールモノシドから１３ｃステビオールビオシドへの変換（図４６Ｂ）について３０℃及び３４℃でスクリーニングを行った。これらの試験から、残基１９６において切断して新たなＮ末端を創出し、Ｓ１６Ｗ、Ｈ４２２Ｅ、Ｒ４３０Ｅ、Ｒ４３４Ｈに変異が導入された円順列変異体が得られた（ＭｂＵＧＴ１，２−２）。これらの試験では、これらの酵素を生成する細胞に列記した温度で４時間のタンパク質生成を誘導して抽出し、一晩インビトロでアッセイを行った。基質濃度は１ｍＭである。
【０１１８】
３０℃及び３４℃にて温度がカウレン基質生成に与える影響を試験した。図４７は、各種モジュール構成体間の３０℃でのカウレン生成を示し、図４８は、各種モジュール構成体間の３４℃でのカウレン生成を示す。３０℃では、バックグラウンドＴ７ＭＥＰのＣｈ１．Ｔ７−ＰｓＣＫ−ＡｎＧＧＰＰＳが最も高いカウレン力価（約１５ｍｇ／Ｌ）を与えた。３４℃では、バックグラウンドＴ７ＭＥＰのＣｈ１．Ｔ７−ＰｓＣＫ−ＡｎＧＧＰＰＳが最も高いカウレン力価（約２ｍｇ／Ｌ）を示した。
【０１１９】
ＡｔＫＡＨの熱耐性を調べるため、ＡｔＫＡＨ点変異体を３０℃及び３４℃で試験した。条件は、Ｒ培地＋グルコース、９６ディープウェルプレート、３０℃または３４℃にて３日間という条件であった。株のバックグラウンドはｐ５Ｔｒｃ−（８ＲＰ）ｔ１４ＡｔＫＡＨ−Ｏ−（８ＲＰ）ｔ２０ＳｒＫＯ−Ｏ−ＦＬＳｒＣＰＲであった。図４９は、ＡｔＫＡＨ点変異のライブラリー全体を通した３０℃でのステビオールの生成を示す。図５０は、ＡｔＫＡＨ点変異のライブラリー全体を通した３４℃でのステビオールの生成を示す。各種点変異は、３０または３４℃におけるステビオールの高力価に示されるように、野生型の熱耐性を改善している。
【０１２０】
ＭｂＵＧＴ１＿２の各円順列変異体（ｃｕｒｃｕｌａｒ  ｐｅｒｍｕｔａｎｔ）を３０℃、３３℃、及び３７℃で活性について試験した。図５１（Ａ）、（Ｂ）は、ＭｂＵＧＴ１＿２円順列変異体の３０℃、３４℃、及び３７℃での活性を示す。パネル（Ａ）は、ＲｅｂＡからＲｅｂＤへの変換を示し、パネル（Ｂ）は、ステビオールモノシドから１３Ｃステビオールビオシドへの変換を示す。いずれも、円順列変異体の発現を誘導し、その後、４時間のインキュベーションを行った。示されているように、ＥＵＧＴ１１は３０℃以上で誘導するとその活性を失った。対照的に、誘導円順列変異体は３０℃で最も活性が高いようである。ＭｂＵＧＴ１＿２  １９６Ｌは、両基質で最も高い活性を保持している。
【０１２１】
図５２は、３０℃、３４℃、及び３７℃においてステビオールを１３Ｃステビオールモノシドに変換するＵＧＴ８５Ｃ２変異体の活性を示す。発現を誘導し、その後、４時間のインキュベーションを行った。示されているように、８５Ｃ２−ＷＴ及び各誘導は、３４℃及び３７℃で同程度の活性を保持しており、３０℃での最も高い活性を維持している。
【０１２２】
図５３は、３０℃、３４℃、及び３７℃においてＲｅｂＤを１３Ｃ  ＲｅｂＭに変換するＵＧＴ７６Ｇ１変異体の活性を示す。発現を誘導し、その後、４時間のインキュベーションを行った。７６Ｇ１−Ｌ２００Ａは、高温で誘導してアッセイを行った場合に特に活性であり、タンパク質量の多さによる可能性がある。
【０１２３】
図５４は、３０℃、３４℃、及び３７℃においてステビオールビオシドを１３Ｃステビオシドに変換するＵＧＴ７４Ｇ１円順列変異体の活性を示す。７４Ｇ１−ＷＴは、３７Ｃで誘導してアッセイを行った場合でもステビオールビオシドに対する活性を保持している。円順列変異体７４Ｇ１−２５９Ｍ及び７４Ｇ１−２５９Ｌは、高温における有意な活性低下を示している。
【０１２４】
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１４．Ｒｉｃｈｍａｎ  Ａ，Ｓｗａｎｓｏｎ  Ａ，Ｈｕｍｐｈｒｅｙ  Ｔ，Ｃｈａｐｍａｎ  Ｒ，ＭｃＧａｒｖｅｙ  Ｂ，Ｐｏｃｓ  Ｒ＆Ｂｒａｎｄｌｅ  Ｊ．（２００５）  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｕｎｃｏｖｅｒｓ  ｔｈｒｅｅ  ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｓｗｅｅｔ  ｇｌｕｃｏｓｉｄｅｓ  ｏｆ  Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ．Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ４１（１）：５６−６７．
１５．Ｈｅｆｎｅｒ  Ｊ，Ｋｅｔｃｈｕｍ  ＲＥＢ，＆Ｃｒｏｔｅａｕ  Ｒ（１９９８）  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｃｏｄｉｎｇ  Ｇｅｒａｎｙｌｇｅｒａｎｙｌ  Ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｔａｘｕｓ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ  ａｎｄ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｉｓ  Ｐｒｅｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｓ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｆｏｒ  Ｔａｘｏｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ３６０（１）：６２−７４．
１６．Ｂｕｒｋｅ  Ｃ＆Ｃｒｏｔｅａｕ  Ｒ（２００２）  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｓｍａｌｌ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｇｅｒａｎｙｌ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｓ  ｔｈｅ  ｃｈａｉｎ  ｌｅｎｇｔｈ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｇｅｒａｎｙｌｇｅｒａｎｙｌ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｔｏ  ｐｒｏｄｕｃｅ  ｇｅｒａｎｙｌ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７７（５）：３１４１−３１４９．
１７．Ｇａｌａｇａｎ  ＪＥ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｗｉｔｈ  Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ  ａｎｄ  Ａ．ｏｒｙｚａｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ４３８（７０７１）：１１０５−１１１５．
１８．Ｋｉｍ  ＳＹ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｙｃｌｏｏｃｔａｔｉｎ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｇｅｎｅ  ｃｌｕｓｔｅｒ  ａｆｆｏｒｄ  ａ  ｄｉｔｅｒｐｅｎｅ  ｃｙｃｌａｓｅ  ａｎｄ  ｔｗｏ  Ｐ４５０  ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅｓ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆ｂｉｏｌｏｇｙ  １６（７）：７３６−７４３．
１９．Ｋａｗａｉｄｅ  Ｈ，Ｉｍａｉ  Ｒ，Ｓａｓｓａ  Ｔ，＆Ｋａｍｉｙａ  Ｙ（１９９７）  ｅｎｔ−Ｋａｕｒｅｎｅ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｆｕｎｇｕｓ  Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｓｐ．Ｌ４８７．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７２（３５）：２１７０６−２１７１２．
２０．Ｈｕｍｐｈｒｅｙ  ＴＶ，Ｒｉｃｈｍａｎ  ＡＳ，Ｍｅｎａｓｓａ  Ｒ，＆Ｂｒａｎｄｌｅ  ＪＥ（２００６）  Ｓｐａｔｉａｌ  ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｏｕｒ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  ｔｈａｔ  ａｒｅ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｓｔｅｖｉｏｌ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｐｌａｎｔ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ６１（１）：４７−６２．
２１．Ｍｉｙａｚａｋｉ  Ｓ，Ｋａｔｓｕｍａｔａ  Ｔ，Ｎａｔｓｕｍｅ  Ｍ，＆Ｋａｗａｉｄｅ  Ｈ（２０１１）  Ｔｈｅ  ＣＹＰ７０１Ｂ１  ｏｆ  Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ  ｉｓ  ａｎ  ｅｎｔ−ｋａｕｒｅｎｅ  ｏｘｉｄａｓｅ  ｔｈａｔ  ｒｅｓｉｓｔｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ｕｎｉｃｏｎａｚｏｌｅ−Ｐ．ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔｅｒｓ  ５８５（１２）：１８７９−１８８３．
２２．Ｍｉｚｕｔａｎｉ  Ｍ＆Ｏｈｔａ  Ｄ（１９９８）  Ｔｗｏ  Ｉｓｏｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ＮＡＤＰＨ：Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ：Ｇｅｎｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｅｌｌｓ，ａｎｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １１６（１）：３５７−３６７．
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２４．Ｋｉｍ  ＫＫ，Ｓａｗａ  Ｙ，＆Ｓｈｉｂａｔａ  Ｈ（１９９６）  Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｔ−Ｋａｕｒｅｎｏｉｃ  Ａｃｉｄ  ｔｏ  Ｓｔｅｖｉｏｌ  ｉｎ  Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  Ｂｅｒｔｏｎｉ−Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐａｒｔｉａｌ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅ．Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ３３２（２）：２２３−２３０．
２５．Ｓｃｈｕｌｅｒ  ＭＡ（１９９６）  Ｐｌａｎｔ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅｓ．Ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  ｐｌａｎｔ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １５（３）：２３５−２８４．
２６．Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ  Ｕ＆Ｈａｈｎ  Ｍ．（１９９５）  Ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｈａｉｎｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｐｒｏｇ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．  ６４（２−３）：１２１−１４３．
２７．Ｙｕ  Ｙ，Ｌｕｔｚ  Ｓ（２０１１）  Ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ：ａ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｗａｙ  ｔｏ  ｅｎｇｉｎｅｅｒ  ｅｎｚｙｍｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ    ２９（１）：１８−２５．
２８．Ｈｏｕｇｈｔｏｎ−Ｌａｒｓｅｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔｅｖｉｏｌ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ．ＰＣＴ公開番号第ＷＯ２０１３／０２２９８９号．
【０１２５】
【表１】
2017532976.tif 000004
【０１２６】
【表２−１】
2017532976.tif 000005
【０１２７】
【表２−２】
2017532976.tif 000006
【０１２８】
【表３】
2017532976.tif 000007
【０１２９】
【表４】
2017532976.tif 000008
【０１３０】
【表５】
2017532976.tif 000009
【０１３１】
【表６−１】
2017532976.tif 000010
【０１３２】
【表６−２】
2017532976.tif 000011
【０１３３】
【表６−３】
2017532976.tif 000012
【０１３４】
【表７】
2017532976.tif 000013
【０１３５】
【表８】
2017532976.tif 000014
【０１３６】
【表９】
2017532976.tif 000015
【０１３７】
【表１０−１】
2017532976.tif 000016
【０１３８】
【表１０−２】
2017532976.tif 000017
【０１３９】
【表１０−３】
2017532976.tif 000018
【０１４０】
【表１１−１】
2017532976.tif 000019
【０１４１】
【表１１−２】
2017532976.tif 000020
【０１４２】
【表１１−３】
2017532976.tif 000021
【０１４３】
【表１１−４】
2017532976.tif 000022
【０１４４】
【表１１−５】
2017532976.tif 000023
【０１４５】
【表１１−６】
2017532976.tif 000024
【０１４６】
【表１１−７】
2017532976.tif 000025
【０１４７】
【表１１−８】
2017532976.tif 000026
【０１４８】
【表１２】
2017532976.tif 000027
【０１４９】
【表１３−１】
2017532976.tif 000028
【０１５０】
【表１３−２】
2017532976.tif 000029
【０１５１】
【表１３−３】
2017532976.tif 000030
【０１５２】
【表１３−４】
2017532976.tif 000031
【０１５３】
配列表
ＵＧＴ配列
＞ＳｒＵＧＴ８５Ｃ２  ｇｉ｜３７９９３６６１｜ｇｂ｜ＡＡＲ０６９１６．１｜ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ８５Ｃ２［Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ］
（配列番号１）
ＭＤＡＭＡＴＴＥＫＫＰＨＶＩＦＩＰＦＰＡＱＳＨＩＫＡＭＬＫＬＡＱＬＬＨＨＫＧＬＱＩＴＦＶＮＴＤＦＩＨＮＱＦＬＥＳＳＧＰＨＣＬＤＧＡＰＧＦＲＦＥＴＩＰＤＧＶＳＨＳＰＥＡＳＩＰＩＲＥＳＬＬＲＳＩＥＴＮＦＬＤＲＦＩＤＬＶＴＫＬＰＤＰＰＴＣＩＩＳＤＧＦＬＳＶＦＴＩＤＡＡＫＫＬＧＩＰＶＭＭＹＷＴＬＡＡＣＧＦＭＧＦＹＨＩＨＳＬＩＥＫＧＦＡＰＬＫＤＡＳＹＬＴＮＧＹＬＤＴＶＩＤＷＶＰＧＭＥＧＩＲＬＫＤＦＰＬＤＷＳＴＤＬＮＤＫＶＬＭＦＴＴＥＡＰＱＲＳＨＫＶＳＨＨＩＦＨＴＦＤＥＬＥＰＳＩＩＫＴＬＳＬＲＹＮＨＩＹＴＩＧＰＬＱＬＬＬＤＱＩＰＥＥＫＫＱＴＧＩＴＳＬＨＧＹＳＬＶＫＥＥＰＥＣＦＱＷＬＱＳＫＥＰＮＳＶＶＹＶＮＦＧＳＴＴＶＭＳＬＥＤＭＴＥＦＧＷＧＬＡＮＳＮＨＹＦＬＷＩＩＲＳＮＬＶＩＧＥＮＡＶＬＰＰＥＬＥＥＨＩＫＫＲＧＦＩＡＳＷＣＳＱＥＫＶＬＫＨＰＳＶＧＧＦＬＴＨＣＧＷＧＳＴＩＥＳＬＳＡＧＶＰＭＩＣＷＰＹＳＷＤＱＬＴＮＣＲＹＩＣＫＥＷＥＶＧＬＥＭＧＴＫＶＫＲＤＥＶＫＲＬＶＱＥＬＭＧＥＧＧＨＫＭＲＮＫＡＫＤＷＫＥＫＡＲＩＡＩＡＰＮＧＳＳＳＬＮＩＤＫＭＶＫＥＩＴＶＬＡＲＮ
＞ＳｒＵＧＴ７４Ｇ１  ｇｉ｜３７９９３６６９｜ｇｂ｜ＡＡＲ０６９２０．１｜ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ７４Ｇ１［Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ］
（配列番号２）
ＭＡＥＱＱＫＩＫＫＳＰＨＶＬＬＩＰＦＰＬＱＧＨＩＮＰＦＩＱＦＧＫＲＬＩＳＫＧＶＫＴＴＬＶＴＴＩＨＴＬＮＳＴＬＮＨＳＮＴＴＴＴＳＩＥＩＱＡＩＳＤＧＣＤＥＧＧＦＭＳＡＧＥＳＹＬＥＴＦＫＱＶＧＳＫＳＬＡＤＬＩＫＫＬＱＳＥＧＴＴＩＤＡＩＩＹＤＳＭＴＥＷＶＬＤＶＡＩＥＦＧＩＤＧＧＳＦＦＴＱＡＣＶＶＮＳＬＹＹＨＶＨＫＧＬＩＳＬＰＬＧＥＴＶＳＶＰＧＦＰＶＬＱＲＷＥＴＰＬＩＬＱＮＨＥＱＩＱＳＰＷＳＱＭＬＦＧＱＦＡＮＩＤＱＡＲＷＶＦＴＮＳＦＹＫＬＥＥＥＶＩＥＷＴＲＫＩＷＮＬＫＶＩＧＰＴＬＰＳＭＹＬＤＫＲＬＤＤＤＫＤＮＧＦＮＬＹＫＡＮＨＨＥＣＭＮＷＬＤＤＫＰＫＥＳＶＶＹＶＡＦＧＳＬＶＫＨＧＰＥＱＶＥＥＩＴＲＡＬＩＤＳＤＶＮＦＬＷＶＩＫＨＫＥＥＧＫＬＰＥＮＬＳＥＶＩＫＴＧＫＧＬＩＶＡＷＣＫＱＬＤＶＬＡＨＥＳＶＧＣＦＶＴＨＣＧＦＮＳＴＬＥＡＩＳＬＧＶＰＶＶＡＭＰＱＦＳＤＱＴＴＮＡＫＬＬＤＥＩＬＧＶＧＶＲＶＫＡＤＥＮＧＩＶＲＲＧＮＬＡＳＣＩＫＭＩＭＥＥＥＲＧＶＩＩＲＫＮＡＶＫＷＫＤＬＡＫＶＡＶＨＥＧＧＳＳＤＮＤＩＶＥＦＶＳＥＬＩＫＡ
＞ＳｒＵＧＴ７６Ｇ１  ｇｉ｜３７９９３６５３｜ｇｂ｜ＡＡＲ０６９１２．１｜ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ７６Ｇ１［Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ］
（配列番号３）
ＭＥＮＫＴＥＴＴＶＲＲＲＲＲＩＩＬＦＰＶＰＦＱＧＨＩＮＰＩＬＱＬＡＮＶＬＹＳＫＧＦＳＩＴＩＦＨＴＮＦＮＫＰＫＴＳＮＹＰＨＦＴＦＲＦＩＬＤＮＤＰＱＤＥＲＩＳＮＬＰＴＨＧＰＬＡＧＭＲＩＰＩＩＮＥＨＧＡＤＥＬＲＲＥＬＥＬＬＭＬＡＳＥＥＤＥＥＶＳＣＬＩＴＤＡＬＷＹＦＡＱＳＶＡＤＳＬＮＬＲＲＬＶＬＭＴＳＳＬＦＮＦＨＡＨＶＳＬＰＱＦＤＥＬＧＹＬＤＰＤＤＫＴＲＬＥＥＱＡＳＧＦＰＭＬＫＶＫＤＩＫＳＡＹＳＮＷＱＩＬＫＥＩＬＧＫＭＩＫＱＴＫＡＳＳＧＶＩＷＮＳＦＫＥＬＥＥＳＥＬＥＴＶＩＲＥＩＰＡＰＳＦＬＩＰＬＰＫＨＬＴＡＳＳＳＳＬＬＤＨＤＲＴＶＦＱＷＬＤＱＱＰＰＳＳＶＬＹＶＳＦＧＳＴＳＥＶＤＥＫＤＦＬＥＩＡＲＧＬＶＤＳＫＱＳＦＬＷＶＶＲＰＧＦＶＫＧＳＴＷＶＥＰＬＰＤＧＦＬＧＥＲＧＲＩＶＫＷＶＰＱＱＥＶＬＡＨＧＡＩＧＡＦＷＴＨＳＧＷＮＳＴＬＥＳＶＣＥＧＶＰＭＩＦＳＤＦＧＬＤＱＰＬＮＡＲＹＭＳＤＶＬＫＶＧＶＹＬＥＮＧＷＥＲＧＥＩＡＮＡＩＲＲＶＭＶＤＥＥＧＥＹＩＲＱＮＡＲＶＬＫＱＫＡＤＶＳＬＭＫＧＧＳＳＹＥＳＬＥＳＬＶＳＹＩＳＳＬ
＞ＳｒＵＧＴ９１Ｄ１
（配列番号４）
ＭＹＮＶＴＹＨＱＮＳＫＡＭＡＴＳＤＳＩＶＤＤＲＫＱＬＨＶＡＴＦＰＷＬＡＦＧＨＩＬＰＦＬＱＬＳＫＬＩＡＥＫＧＨＫＶＳＦＬＳＴＴＲＮＩＱＲＬＳＳＨＩＳＰＬＩＮＶＶＱＬＴＬＰＲＶＱＥＬＰＥＤＡＥＡＴＴＤＶＨＰＥＤＩＱＹＬＫＫＡＶＤＧＬＱＰＥＶＴＲＦＬＥＱＨＳＰＤＷＩＩＹＤＦＴＨＹＷＬＰＳＩＡＡＳＬＧＩＳＲＡＹＦＣＶＩＴＰＷＴＩＡＹＬＡＰＳＳＤＡＭＩＮＤＳＤＧＲＴＴＶＥＤＬＴＴＰＰＫＷＦＰＦＰＴＫＶＣＷＲＫＨＤＬＡＲＭＥＰＹＥＡＰＧＩＳＤＧＹＲＭＧＭＶＦＫＧＳＤＣＬＬＦＫＣＹＨＥＦＧＴＱＷＬＰＬＬＥＴＬＨＱＶＰＶＶＰＶＧＬＬＰＰＥＩＰＧＤＥＫＤＥＴＷＶＳＩＫＫＷＬＤＧＫＱＫＧＳＶＶＹＶＡＬＧＳＥＡＬＶＳＱＴＥＶＶＥＬＡＬＧＬＥＬＳＧＬＰＦＶＷＡＹＲＫＰＫＧＰＡＫＳＤＳＶＥＬＰＤＧＦＶＥＲＴＲＤＲＧＬＶＷＴＳＷＡＰＱＬＲＩＬＳＨＥＳＶＣＧＦＬＴＨＣＧＳＧＳＩＶＥＧＬＭＦＧＨＰＬＩＭＬＰＩＦＣＤＱＰＬＮＡＲＬＬＥＤＫＱＶＧＩＥＩＰＲＮＥＥＤＧＣＬＴＫＥＳＶＡＲＳＬＲＳＶＶＶＥＮＥＧＥＩＹＫＡＮＡＲＡＬＳＫＩＹＮＤＴＫＶＥＫＥＹＶＳＱＦＶＤＹＬＥＫＮＡＲＡＶＡＩＤＨＥＳ
＞ＳｒＵＧＴ９１Ｄ２
（配列番号５）
ＭＡＴＳＤＳＩＶＤＤＲＫＱＬＨＶＡＴＦＰＷＬＡＦＧＨＩＬＰＹＬＱＬＳＫＬＩＡＥＫＧＨＫＶＳＦＬＳＴＴＲＮＩＱＲＬＳＳＨＩＳＰＬＩＮＶＶＱＬＴＬＰＲＶＱＥＬＰＥＤＡＥＡＴＴＤＶＨＰＥＤＩＰＹＬＫＫＡＳＤＧＬＱＰＥＶＴＲＦＬＥＱＨＳＰＤＷＩＩＹＤＹＴＨＹＷＬＰＳＩＡＡＳＬＧＩＳＲＡＨＦＳＶＴＴＰＷＡＩＡＹＭＧＰＳＡＤＡＭＩＮＧＳＤＧＲＴＴＶＥＤＬＴＴＰＰＫＷＦＰＦＰＴＫＶＣＷＲＫＨＤＬＡＲＬＶＰＹＫＡＰＧＩＳＤＧＹＲＭＧＬＶＬＫＧＳＤＣＬＬＳＫＣＹＨＥＦＧＴＱＷＬＰＬＬＥＴＬＨＱＶＰＶＶＰＶＧＬＬＰＰＥＶＰＧＤＥＫＤＥＴＷＶＳＩＫＫＷＬＤＧＫＱＫＧＳＶＶＹＶＡＬＧＳＥＶＬＶＳＱＴＥＶＶＥＬＡＬＧＬＥＬＳＧＬＰＦＶＷＡＹＲＫＰＫＧＰＡＫＳＤＳＶＥＬＰＤＧＦＶＥＲＴＲＤＲＧＬＶＷＴＳＷＡＰＱＬＲＩＬＳＨＥＳＶＣＧＦＬＴＨＣＧＳＧＳＩＶＥＧＬＭＦＧＨＰＬＩＭＬＰＩＦＧＤＱＰＬＮＡＲＬＬＥＤＫＱＶＧＩＥＩＰＲＮＥＥＤＧＣＬＴＫＥＳＶＡＲＳＬＲＳＶＶＶＥＫＥＧＥＩＹＫＡＮＡＲＥＬＳＫＩＹＮＤＴＫＶＥＫＥＹＶＳＱＦＶＤＹＬＥＫＮＴＲＡＶＡＩＤＨＥＳ
＞ＳｒＵＧＴ９１Ｄ２ｅ
（配列番号６）
ＭＡＴＳＤＳＩＶＤＤＲＫＱＬＨＶＡＴＦＰＷＬＡＦＧＨＩＬＰＹＬＱＬＳＫＬＩＡＥＫＧＨＫＶＳＦＬＳＴＴＲＮＩＱＲＬＳＳＨＩＳＰＬＩＮＶＶＱＬＴＬＰＲＶＱＥＬＰＥＤＡＥＡＴＴＤＶＨＰＥＤＩＰＹＬＫＫＡＳＤＧＬＱＰＥＶＴＲＦＬＥＱＨＳＰＤＷＩＩＹＤＹＴＨＹＷＬＰＳＩＡＡＳＬＧＩＳＲＡＨＦＳＶＴＴＰＷＡＩＡＹＭＧＰＳＡＤＡＭＩＮＧＳＤＧＲＴＴＶＥＤＬＴＴＰＰＫＷＦＰＦＰＴＫＶＣＷＲＫＨＤＬＡＲＬＶＰＹＫＡＰＧＩＳＤＧＹＲＭＧＬＶＬＫＧＳＤＣＬＬＳＫＣＹＨＥＦＧＴＱＷＬＰＬＬＥＴＬＨＱＶＰＶＶＰＶＧＬＬＰＰＥＩＰＧＤＥＫＤＥＴＷＶＳＩＫＫＷＬＤＧＫＱＫＧＳＶＶＹＶＡＬＧＳＥＶＬＶＳＱＴＥＶＶＥＬＡＬＧＬＥＬＳＧＬＰＦＶＷＡＹＲＫＰＫＧＰＡＫＳＤＳＶＥＬＰＤＧＦＶＥＲＴＲＤＲＧＬＶＷＴＳＷＡＰＱＬＲＩＬＳＨＥＳＶＣＧＦＬＴＨＣＧＳＧＳＩＶＥＧＬＭＦＧＨＰＬＩＭＬＰＩＦＧＤＱＰＬＮＡＲＬＬＥＤＫＱＶＧＩＥＩＰＲＮＥＥＤＧＣＬＴＫＥＳＶＡＲＳＬＲＳＶＶＶＥＫＥＧＥＩＹＫＡＮＡＲＥＬＳＫＩＹＮＤＴＫＶＥＫＥＹＶＳＱＦＶＤＹＬＥＫＮＡＲＡＶＡＩＤＨＥＳ
＞ＯｓＵＧＴ１−２（Ｑ０ＤＰＢ７＿ＯＲＹＳＪ）
配列番号７
ＭＤＳＧＹＳＳＳＹＡＡＡＡＧＭＨＶＶＩＣＰＷＬＡＦＧＨＬＬＰＣＬＤＬＡＱＲＬＡＳＲＧＨＲＶＳＦＶＳＴＰＲＮＩＳＲＬＰＰＶＲＰＡＬＡＰＬＶＡＦＶＡＬＰＬＰＲＶＥＧＬＰＤＧＡＥＳＴＮＤＶＰＨＤＲＰＤＭＶＥＬＨＲＲＡＦＤＧＬＡＡＰＦＳＥＦＬＧＴＡＣＡＤＷＶＩＶＤＶＦＨＨＷＡＡＡＡＡＬＥＨＫＶＰＣＡＭＭＬＬＧＳＡＨＭＩＡＳＩＡＤＲＲＬＥＲＡＥＴＥＳＰＡＡＡＧＱＧＲＰＡＡＡＰＴＦＥＶＡＲＭＫＬＩＲＴＫＧＳＳＧＭＳＬＡＥＲＦＳＬＴＬＳＲＳＳＬＶＶＧＲＳＣＶＥＦＥＰＥＴＶＰＬＬＳＴＬＲＧＫＰＩＴＦＬＧＬＭＰＰＬＨＥＧＲＲＥＤＧＥＤＡＴＶＲＷＬＤＡＱＰＡＫＳＶＶＹＶＡＬＧＳＥＶＰＬＧＶＥＫＶＨＥＬＡＬＧＬＥＬＡＧＴＲＦＬＷＡＬＲＫＰＴＧＶＳＤＡＤＬＬＰＡＧＦＥＥＲＴＲＧＲＧＶＶＡＴＲＷＶＰＱＭＳＩＬＡＨＡＡＶＧＡＦＬＴＨＣＧＷＮＳＴＩＥＧＬＭＦＧＨＰＬＩＭＬＰＩＦＧＤＱＧＰＮＡＲＬＩＥＡＫＮＡＧＬＱＶＡＲＮＤＧＤＧＳＦＤＲＥＧＶＡＡＡＩＲＡＶＡＶＥＥＥＳＳＫＶＦＱＡＫＡＫＫＬＱＥＩＶＡＤＭＡＣＨＥＲＹＩＤＧＦＩＱＱＬＲＳＹＫＤ
ＵＧＴの変異体及び円順列変異体
＞ＭｂＵＧＴＣ１９
（配列番号８）
ＭＡＥＣＭＮＷＬＤＤＫＰＫＥＳＶＶＹＶＡＦＧＳＬＶＫＨＧＰＥＱＶＥＥＩＴＲＡＬＩＤＳＤＶＮＦＬＷＶＩＫＨＫＥＥＧＫＬＰＥＮＬＳＥＶＩＫＴＧＫＧＬＩＶＡＷＣＫＱＬＤＶＬＡＨＥＳＶＧＣＦＶＴＨＣＧＦＮＳＴＬＥＡＩＳＬＧＶＰＶＶＡＭＰＱＦＳＤＱＴＴＮＡＫＬＬＤＥＩＬＧＶＧＶＲＶＫＡＤＥＮＧＩＶＲＲＧＮＬＡＳＣＩＫＭＩＭＥＥＥＲＧＶＩＩＲＫＮＡＶＫＷＫＤＬＡＫＶＡＶＨＥＧＧＳＳＤＮＤＩＶＥＦＶＳＥＬＩＫＡＧＳＧＥＱＱＫＩＫＫＳＰＨＶＬＬＩＰＦＰＬＱＧＨＩＮＰＦＩＱＦＧＫＲＬＩＳＫＧＶＫＴＴＬＶＴＴＩＨＴＬＮＳＴＬＮＨＳＮＴＴＴＴＳＩＥＩＱＡＩＳＤＧＣＤＥＧＧＦＭＳＡＧＥＳＹＬＥＴＦＫＱＶＧＳＫＳＬＡＤＬＩＫＫＬＱＳＥＧＴＴＩＤＡＩＩＹＤＳＭＴＥＷＶＬＤＶＡＩＥＦＧＩＤＧＧＳＦＦＴＱＡＣＶＶＮＳＬＹＹＨＶＨＫＧＬＩＳＬＰＬＧＥＴＶＳＶＰＧＦＰＶＬＱＲＷＥＴＰＬＩＬＱＮＨＥＱＩＱＳＰＷＳＱＭＬＦＧＱＦＡＮＩＤＱＡＲＷＶＦＴＮＳＦＹＫＬＥＥＥＶＩＥＷＴＲＫＩＷＮＬＫＶＩＧＰＴＬＰＳＭＹＬＤＫＲＬＤＤＤＫＤＮＧＦＮＬＹＫＡＮＨＨ
＞ＭｂＵＧＴ１−２
（配列番号９）
ＭＡＧＳＳＧＭＳＬＡＥＲＦＳＬＴＬＳＲＳＳＬＶＶＧＲＳＣＶＥＦＥＰＥＴＶＰＬＬＳＴＬＲＧＫＰＩＴＦＬＧＬＭＰＰＬＨＥＧＲＲＥＤＧＥＤＡＴＶＲＷＬＤＡＱＰＡＫＳＶＶＹＶＡＬＧＳＥＶＰＬＧＶＥＫＶＨＥＬＡＬＧＬＥＬＡＧＴＲＦＬＷＡＬＲＫＰＴＧＶＳＤＡＤＬＬＰＡＧＦＥＥＲＴＲＧＲＧＶＶＡＴＲＷＶＰＱＭＳＩＬＡＨＡＡＶＧＡＦＬＴＨＣＧＷＮＳＴＩＥＧＬＭＦＧＨＰＬＩＭＬＰＩＦＧＤＱＧＰＮＡＲＬＩＥＡＫＮＡＧＬＱＶＡＲＮＤＧＤＧＳＦＤＲＥＧＶＡＡＡＩＲＡＶＡＶＥＥＥＳＳＫＶＦＱＡＫＡＫＫＬＱＥＩＶＡＤＭＡＣＨＥＲＹＩＤＧＦＩＱＱＬＲＳＹＫＤＤＳＧＹＳＳＳＹＡＡＡＡＧＭＨＶＶＩＣＰＷＬＡＦＧＨＬＬＰＣＬＤＬＡＱＲＬＡＳＲＧＨＲＶＳＦＶＳＴＰＲＮＩＳＲＬＰＰＶＲＰＡＬＡＰＬＶＡＦＶＡＬＰＬＰＲＶＥＧＬＰＤＧＡＥＳＴＮＤＶＰＨＤＲＰＤＭＶＥＬＨＲＲＡＦＤＧＬＡＡＰＦＳＥＦＬＧＴＡＣＡＤＷＶＩＶＤＶＦＨＨＷＡＡＡＡＡＬＥＨＫＶＰＣＡＭＭＬＬＧＳＡＨＭＩＡＳＩＡＤＲＲＬＥＲＡＥＴＥＳＰＡＡＡＧＱＧＲＰＡＡＡＰＴＦＥＶＡＲＭＫＬＩＲＴＫ
＞ＭｂＵＧＴ１−３
（配列番号１０）
ＭＡＮＷＱＩＬＫＥＩＬＧＫＭＩＫＱＴＫＡＳＳＧＶＩＷＮＳＦＫＥＬＥＥＳＥＬＥＴＶＩＲＥＩＰＡＰＳＦＬＩＰＬＰＫＨＬＴＡＳＳＳＳＬＬＤＨＤＲＴＶＦＱＷＬＤＱＱＰＰＳＳＶＬＹＶＳＦＧＳＴＳＥＶＤＥＫＤＦＬＥＩＡＲＧＬＶＤＳＫＱＳＦＬＷＶＶＲＰＧＦＶＫＧＳＴＷＶＥＰＬＰＤＧＦＬＧＥＲＧＲＩＶＫＷＶＰＱＱＥＶＬＡＨＧＡＩＧＡＦＷＴＨＳＧＷＮＳＴＬＥＳＶＣＥＧＶＰＭＩＦＳＤＦＧＬＤＱＰＬＮＡＲＹＭＳＤＶＬＫＶＧＶＹＬＥＮＧＷＥＲＧＥＩＡＮＡＩＲＲＶＭＶＤＥＥＧＥＹＩＲＱＮＡＲＶＬＫＱＫＡＤＶＳＬＭＫＧＧＳＳＹＥＳＬＥＳＬＶＳＹＩＳＳＬＥＮＫＴＥＴＴＶＲＲＲＲＲＩＩＬＦＰＶＰＦＱＧＨＩＮＰＩＬＱＬＡＮＶＬＹＳＫＧＦＳＩＴＩＦＨＴＮＦＮＫＰＫＴＳＮＹＰＨＦＴＦＲＦＩＬＤＮＤＰＱＤＥＲＩＳＮＬＰＴＨＧＰＬＡＧＭＲＩＰＩＩＮＥＨＧＡＤＥＬＲＲＥＬＥＬＬＭＬＡＳＥＥＤＥＥＶＳＣＬＩＴＤＡＬＷＹＦＡＱＳＶＡＤＳＬＮＬＲＲＬＶＬＭＴＳＳＬＦＮＦＨＡＨＶＳＬＰＱＦＤＥＬＧＹＬＤＰＤＤＫＴＲＬＥＥＱＡＳＧＦＰＭＬＫＶＫＤＩＫＳＡＹＳ
＞ＭｂＵＧＴ１，２−２
（配列番号４５）
ＭＡＴＫＧＳＳＧＭＳＬＡＥＲＦＷＬＴＬＳＲＳＳＬＶＶＧＲＳＣＶＥＦＥＰＥＴＶＰＬＬＳＴＬＲＧＫＰＩＴＦＬＧＬＭＰＰＬＨＥＧＲＲＥＤＧＥＤＡＴＶＲＷＬＤＡＱＰＡＫＳＶＶＹＶＡＬＧＳＥＶＰＬＧＶＥＫＶＨＥＬＡＬＧＬＥＬＡＧＴＲＦＬＷＡＬＲＫＰＴＧＶＳＤＡＤＬＬＰＡＧＦＥＥＲＴＲＧＲＧＶＶＡＴＲＷＶＰＱＭＳＩＬＡＨＡＡＶＧＡＦＬＴＨＣＧＷＮＳＴＩＥＧＬＭＦＧＨＰＬＩＭＬＰＩＦＧＤＱＧＰＮＡＲＬＩＥＡＫＮＡＧＬＱＶＡＲＮＤＧＤＧＳＦＤＲＥＧＶＡＡＡＩＲＡＶＡＶＥＥＥＳＳＫＶＦＱＡＫＡＫＫＬＱＥＩＶＡＤＭＡＣＨＥＲＹＩＤＧＦＩＱＱＬＲＳＹＫＤＤＳＧＹＳＳＳＹＡＡＡＡＧＭＨＶＶＩＣＰＷＬＡＦＧＨＬＬＰＣＬＤＬＡＱＲＬＡＳＲＧＨＲＶＳＦＶＳＴＰＲＮＩＳＲＬＰＰＶＲＰＡＬＡＰＬＶＡＦＶＡＬＰＬＰＲＶＥＧＬＰＤＧＡＥＳＴＮＤＶＰＨＤＲＰＤＭＶＥＬＨＲＲＡＦＤＧＬＡＡＰＦＳＥＦＬＧＴＡＣＡＤＷＶＩＶＤＶＦＨＨＷＡＡＡＡＡＬＥＨＫＶＰＣＡＭＭＬＬＧＳＡＥＭＩＡＳＩＡＤＥＲＬＥＨＡＥＴＥＳＰＡＡＡＧＱＧＲＰＡＡＡＰＴＦＥＶＡＲＭＫＬＩＲ
＞ＭｂＵＧＴＣ１９−２
（配列番号４６）
ＭＡＮＨＨＥＣＭＮＷＬＤＤＫＰＫＥＳＶＶＹＶＡＦＧＳＬＶＫＨＧＰＥＱＶＥＥＩＴＲＡＬＩＤＳＤＶＮＦＬＷＶＩＫＨＫＥＥＧＫＬＰＥＮＬＳＥＶＩＫＴＧＫＧＬＩＶＡＷＣＫＱＬＤＶＬＡＨＥＳＶＧＣＦＶＴＨＣＧＦＮＳＴＬＥＡＩＳＬＧＶＰＶＶＡＭＰＱＦＳＤＱＴＴＮＡＫＬＬＤＥＩＬＧＶＧＶＲＶＫＡＤＥＮＧＩＶＲＲＧＮＬＡＳＣＩＫＭＩＭＥＥＥＲＧＶＩＩＲＫＮＡＶＫＷＫＤＬＡＫＶＡＶＨＥＧＧＳＳＤＮＤＩＶＥＦＶＳＥＬＩＫＡＧＳＧＥＱＱＫＩＫＫＳＰＨＶＬＬＩＰＦＰＬＱＧＨＩＮＰＦＩＱＦＧＫＲＬＩＳＫＧＶＫＴＴＬＶＴＴＩＨＴＬＮＳＴＬＮＨＳＮＴＴＴＴＳＩＥＩＱＡＩＳＤＧＣＤＥＧＧＦＭＳＡＧＥＳＹＬＥＴＦＫＱＶＧＳＫＳＬＡＤＬＩＫＫＬＱＳＥＧＴＴＩＤＡＩＩＹＤＳＭＴＥＷＶＬＤＶＡＩＥＦＧＩＤＧＧＳＦＦＴＱＡＣＶＶＮＳＬＹＹＨＶＨＫＧＬＩＳＬＰＬＧＥＴＶＳＶＰＧＦＰＶＬＱＲＷＥＴＰＬＩＬＱＮＨＥＱＩＱＳＰＷＳＱＭＬＦＧＱＦＡＮＩＤＱＡＲＷＶＦＴＮＳＦＹＫＬＥＥＥＶＩＥＷＴＲＫＩＷＮＬＫＶＩＧＰＴＬＰＳＭＹＬＤＫＲＬＤＤＤＫＤＮＧＦＮＬＹＫＡ
＞ＭｂＵＧＴＣ１３
（配列番号５１）
ＭＡＤＡＭＡＴＴＥＫＫＰＨＶＩＦＩＰＦＰＡＱＳＨＩＫＡＭＬＫＬＡＱＬＬＨＨＫＧＬＱＩＴＦＶＮＴＤＦＩＨＮＱＦＬＥＳＳＧＰＨＣＬＤＧＡＰＧＦＲＦＥＴＩＰＤＧＶＳＨＳＰＥＡＳＩＰＩＲＥＳＬＬＲＳＩＥＴＮＦＬＤＲＦＩＤＬＶＴＫＬＰＤＰＰＴＣＩＩＳＤＧＦＬＳＶＦＴＩＤＡＡＫＫＬＧＩＰＶＭＭＹＷＴＬＡＡＣＧＦＭＧＦＹＨＩＨＳＬＩＥＫＧＦＡＰＬＫＤＡＳＹＬＴＮＧＹＬＤＴＶＩＤＷＶＰＧＭＥＧＩＲＬＫＤＦＰＬＤＷＳＴＤＬＮＤＫＶＬＭＦＴＴＥＡＴＱＲＳＨＫＶＳＨＨＩＦＨＴＦＤＥＬＥＰＳＩＩＫＴＬＳＬＲＹＮＨＩＹＴＩＧＰＬＱＬＬＬＤＱＩＰＥＥＫＫＱＴＧＩＴＳＬＨＧＹＳＬＶＫＥＥＰＥＣＦＱＷＬＱＳＫＥＰＮＳＶＶＹＶＮＦＧＳＴＴＶＭＳＬＥＤＭＴＥＦＧＷＧＬＡＮＳＮＨＹＦＬＷＩＩＲＳＮＬＶＩＧＥＮＡＶＬＰＰＥＬＥＥＨＩＫＫＲＧＦＩＡＳＷＣＳＱＥＫＶＬＫＨＰＳＶＧＧＦＬＴＨＣＧＷＧＳＴＩＥＳＬＳＡＧＶＰＭＩＣＷＰＹＳＷＤＱＬＴＮＣＲＹＩＣＫＥＷＥＶＧＬＥＭＧＴＫＶＫＲＤＥＶＫＲＬＶＱＥＬＭＧＥＧＧＨＫＭＲＮＫＡＫＤＷＫＥＫＡＲＩＡＩＡＰＮＧＳＳＳＬＮＩＤＫＭＶＫＥＩＴＶＬＡＲＮ
ステビオール生合成の酵素
＞ＴｃＧＧＰＰＳ
（配列番号１１）
ＭＹＴＡＭＡＡＧＴＱＳＬＱＬＲＴＶＡＳＹＱＥＣＮＳＭＲＳＣＦＫＬＴＰＦＫＳＦＨＧＶＮＦＮＶＰＳＬＧＡＡＮＣＥＩＭＧＨＬＫＬＧＳＬＰＹＫＱＣＳＶＳＳＫＳＴＫＴＭＡＱＬＶＤＬＡＥＴＥＫＡＥＧＫＤＩＥＦＤＦＮＥＹＭＫＳＫＡＶＡＶＤＡＡＬＤＫＡＩＰＬＥＹＰＥＫＩＨＥＳＭＲＹＳＬＬＡＧＧＫＲＶＲＰＡＬＣＩＡＡＣＥＬＶＧＧＳＱＤＬＡＭＰＴＡＣＡＭＥＭＩＨＴＭＳＬＩＨＤＤＬＰＣＭＤＮＤＤＦＲＲＧＫＰＴＮＨＫＶＦＧＥＤＴＡＶＬＡＧＤＡＬＬＳＦＡＦＥＨＩＡＶＡＴＳＫＴＶＰＳＤＲＴＬＲＶＩＳＥＬＧＫＴＩＧＳＱＧＬＶＧＧＱＶＶＤＩＴＳＥＧＤＡＮＶＤＬＫＴＬＥＷＩＨＩＨＫＴＡＶＬＬＥＣＳＶＶＳＧＧＩＬＧＧＡＴＥＤＥＩＡＲＩＲＲＹＡＲＣＶＧＬＬＦＱＶＶＤＤＩＬＤＶＴＫＳＳＥＥＬＧＫＴＡＧＫＤＬＬＴＤＫＡＴＹＰＫＬＭＧＬＥＫＡＫＥＦＡＡＥＬＡＴＲＡＫＥＥＬＳＳＦＤＱＩＫＡＡＰＬＬＧＬＡＤＹＩＡＦＲＱＮ
＞ＴｃＧＧＰＰＳ  ９８位で切断し角括弧で括った変異を有する
（配列番号１２）
ＭＡＤＦＮＥＹＭＫＳＫＡＶＡＶＤＡＡＬＤＫＡＩＰＬＥＹＰＥＫＩＨＥＳＭＲＹＳＬＬＡＧＧＫＲＶＲＰＡＬＣＩＡＡＣＥＬＶＧＧＳＱＤＬＡＭＰＴＡＣＡＭＥＭＩＨＴＭＳＬＩＨＤＤＬＰＣＭＤＮＤＤＦＲＲＧＫＰＴＮＨＫＶＦＧＥＤＴＡＶＬＡＧＤＡＬＬＳＦＡＦＥＨＩＡＶＡＴＳＫＴＶＰＳＤＲＴＬＲＶＩ［Ｃ］ＥＬＧＫＴＩＧＳＱＧＬＶＧＧＱＶＶＤＩＴＳＥＧＤＡＮＶＤＬＫＴＬＥＷＩＨＩＨＫＴＡＶＬＬＥＣＳＶＶＳＧＧＩＬＧ［Ｄ］ＡＴＥＤＥＩＡＲＩＲＲＹＡＲＣＶＧＬＬＦＱＶＶＤＤＩＬＤＶＴＫＳＳＥＥＬＧＫＴＡＧＫＤＬＬＴＤＫＡＴＹＰＫＬＭＧＬＥＫＡＫＥＦＡＡＥＬＡＴＲＡＫＥＥＬＳＳＦＤＱＩＫ［Ｖ］ＡＰＬＬＧＬＡＤＹＩＡＦＲＱＮ
＞ＡｇＧＧＰＰＳ  ｇｉ｜１７３５２４５１｜ｇｂ｜ＡＡＬ１７６１４．２｜ＡＦ４２５２３５＿１  ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素［Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ］
（配列番号１３）
ＭＡＹＳＧＭＡＴＳＹＨＧＬＨＦＭＮＩＡＴＱＥＣＮＬＫＲＬＳＩＰＳＲＲＦＨＧＶＳＰＳＬＷＡＳＮＧＦＱＧＨＬＫＲＥＬＳＡＮＳＦＬＶＳＳＳＲＹＳＮＴＩＡＫＦＴＮＬＰＥＫＶＫＥＫＶＩＥＦＤＦＫＥＹＬＲＳＫＡＭＡＶＮＥＡＬＤＲＡＶＰＬＲＹＰＥＲＩＨＥＡＭＲＹＳＬＬＡＧＧＫＲＶＲＰＶＬＣＩＳＡＣＥＬＶＧＧＴＥＥＶＡＭＰＴＡＣＡＭＥＭＩＨＴＭＳＬＩＨＤＤＬＰＣＭＤＮＤＤＦＲＲＧＫＰＴＮＨＫＶＦＧＥＧＴＡＩＬＡＧＤＡＬＬＳＦＡＦＥＨＩＡＶＳＴＳＫＳＶＧＴＤＲＩＬＲＶＶＳＥＬＧＲＴＩＧＳＱＧＬＶＧＧＱＶＡＤＩＴＳＥＧＤＡＳＶＤＬＤＴＬＥＷＩＨＩＨＫＴＡＶＬＬＥＣＳＶＭＣＧＡＩＩＳＧＡＳＤＮＥＩＥＲＩＱＲＹＡＲＳＶＧＬＬＦＱＶＶＤＤＩＬＤＶＴＫＳＳＫＥＬＧＫＴＡＧＫＤＬＩＳＤＫＡＴＹＰＫＬＭＧＬＥＫＡＫＱＦＡＳＤＬＬＩＲＡＫＥＤＬＳＣＦＤＰＭＫＡＡＰＬＬＧＬＡＤＹＩＡＦＲＱＮ
＞ＡｎＧＧＰＰＳ  ｇｉ｜２５９４８６９２３｜ｔｐｅ｜ＣＢＦ８５１７７．１｜  ＴＰＡ：保存された仮定上のタンパク質［Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ  ＦＧＳＣ  Ａ４｝
（配列番号１４）
ＭＳＰＰＬＤＳＡＬＥＰＬＳＥＹＫＥＴＡＦＰＲＴＥＫＤＰＳＱＹＫＥＨＤＬＶＴＰＥＫＥＩＱＴＧＹＦＳＰＲＧＳＨＳＳＨＧＳＨＤＳＳＡＳＳＮＩＳＬＤＤＡＲＭＳＤＶＮＮＳＰＮＶＦＨＤＤＰＤＴＩＤＥＫＬＳＭＹＷＫＡＡＮＥＴＶＩＲＥＰＹＤＹＩＡＧＩＰＧＫＥＩＲＲＫＬＬＥＡＦＮＨＷＹＫＶＤＥＱＳＣＱＡＩＡＴＴＶＧＭＡＨＮＡＳＬＬＩＤＤＩＱＤＳＳＫＬＲＲＧＶＰＣＡＨＥＶＦＧＩＡＱＴＩＮＳＡＮＹＶＹＦＬＡＱＮＱＬＦＲＬＲＳＷＰＱＡＩＳＶＦＮＥＥＭＶＮＬＨＲＧＱＧＭＥＬＦＷＲＤＮＬＬＰＰＳＭＤＤＹＬＱＭＩＡＮＫＴＧＧＬＦＲＭＩＶＲＬＬＱＴＳＳＲＱＶＩＤＶＥＱＬＶＤＶＬＧＬＹＦＱＩＬＤＤＹＫＮＩＲＥＥＫＭＡＡＱＫＧＦＦＥＤＬＴＥＧＫＦＳＦＰＩＣＨＡＩＧＥＧＡＫＮＲＴＡＬＬＨＭＬＲＬＫＴＤＤＭＫＩＫＱＥＡＶＣＩＬＤＮＡＧＳＬＤＹＴＲＥＶＬＹＧＬＤＲＫＡＲＳＬＬＲＥＦＫＴＰＮＰＦＭＥＡＬＬＤＡＭＬＳＳＬＱＡＣＨ
＞ＳｍＧＧＰＰＳ  ｇｉ｜２６０６５３８６９｜ｄｂｊ｜ＢＡＩ４４３３７．１｜  ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素［Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｅｌａｎｏｓｐｏｒｏｆａｃｉｅｎｓ］
配列番号１５）
ＭＴＴＰＴＬＳＰＧＲＬＤＡＤＴＶＲＫＳＶＤＶＶＬＥＤＦＬＴＡＫＡＨＴＴＰＱＨＨＬＰＹＬＳＧＬＬＫＤＦＬＳＧＧＫＲＩＲＰＬＬＣＶＴＧＷＱＡＶＧＧＧＥＤＴＥＰＶＦＲＶＡＡＣＬＥＭＦＨＡＦＡＬＩＨＤＤＶＭＤＤＳＤＴＲＲＧＲＰＴＩＨＲＴＬＡＡＬＣＡＴＤＲＲＰＥＱＩＥＲＦＧＶＳＧＡＶＬＬＧＤＬＡＬＴＷＳＤＥＬＬＨＳＡＧＬＴＰＶＱＦＤＡＶＬＰＬＬＳＥＭＲＴＥＶＭＬＧＱＹＬＤＬＱＡＴＧＥＬＴＤＤＶＥＡＴＬＴＶＮＲＹＫＴＡＫＹＴＩＥＲＰＬＨＶＧＡＡＩＡＧＡＧＰＥＡＭＥＡＦＴＡＹＡＬＰＬＧＥＡＦＱＬＲＤＤＬＬＧＶＹＧＤＰＥＳＴＧＫＳＱＬＤＤＬＲＡＧＫＮＴＴＬＩＡＬＡＬＲＧＳＤＳＴＱＡＡＲＬＲＳＬＩＧＮＰＬＬＤＥＲＤＡＡＴＩＱＥＩＦＡＡＴＴＡＲＤＡＶＥＱＭＩＤＤＲＲＴＱＡＬＲＡＬＤＤＡＰＦＴＡＤＡＶＮＡＬＫＱＩＡＲＬＡＴＶＲＮＳ
＞ＭｂＧＧＰＰＳ［海洋細菌４４３］
（配列番号３６）
ＭＡＥＮＧＬＬＤＣＥＱＹＬＥＥＡＭＡＥＨＡＴＡＱＣＰＰＬＬＡＱＡＬＮＹＡＶＦＰＧＧＡＲＶＲＰＫＩＣＫＡＶＡＬＡＮＮＳＳＤＶＧＬＡＮＡＡＡＳＡＩＥＬＬＨＣＡＳＬＶＨＤＤＬＰＣＦＤＤＡＴＱＲＲＧＫＰＳＶＨＡＫＦＧＥＲＩＡＶＬＴＧＤＡＬＩＶＡＡＦＱＴＬＡＴＨＡＩＨＡＶＲＴＥＲＶＰＬＶＴＡＩＶＡＲＧＶＧＡＰＨＧＩＣＡＧＱＡＷＥＣＥＲＳＶＤＬＳＲＹＨＲＡＫＴＧＡＬＦＶＡＡＴＣＡＧＡＡＡＡＧＶＤＰＧＰＷＶＮＬＧＡＳＩＧＥＡＹＱＶＡＤＤＩＫＤＡＩＳＤＰＥＴＬＧＫＰＴＧＩＤＶＫＬＤＲＰＳＡＶＲＥＬＧＬＤＧＡＶＴＲＬＫＱＣＬＥＡＧＬＤＳＭＰＡＣＡＧＱＤＬＬＱＫＩＶＲＡＱＡＳＲＦＶＰＥＫＩＡＱＶＡＡＶＤ
＞ＰｈＧＧＰＰＳ［Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｈａｅｕｎｄａｅｎｓｉｓ］
（配列番号３７）
ＭＡＲＲＤＶＮＰＩＨＡＴＬＬＱＴＲＬＥＥＩＡＱＧＦＧＡＶＳＱＰＬＧＡＡＭＳＨＧＡＬＳＳＧＲＲＦＲＧＭＬＭＬＬＡＡＥＡＳＧＧＶＣＤＴＩＶＤＡＡＣＡＶＥＭＶＨＡＡＳＬＩＦＤＤＬＰＣＭＤＤＡＧＬＲＲＧＲＰＡＴＨＶＡＨＧＥＳＲＡＶＬＧＧＩＡＬＩＴＥＡＭＡＬＬＡＧＡＲＧＡＳＧＴＶＲＡＱＬＶＲＩＬＳＲＳＬＧＰＱＧＬＣＡＧＱＤＬＤＬＨＡＡＫＮＧＡＧＶＥＱＥＱＤＬＫＴＧＶＬＦＩＡＧＬＥＭＬＡＶＩＫＥＦＤＡＥＥＱＴＱＭＩＤＦＧＲＱＬＧＲＶＦＱＳＹＤＤＬＬＤＶＶＧＤＱＡＡＬＧＫＤＴＧＲＤＡＡＡＰＧＰＲＲＧＬＬＡＶＳＤＬＱＮＶＳＲＨＹＥＡＳＲＡＱＬＤＡＭＬＲＳＫＲＬＱＡＰＥＩＡＡＬＬＥＲＶＬＰＹＡＡＲＡＶＤ
＞ＣｔＧＧＰＰＳ［Ｃｌｏｒｏｂｉｕｍ  ｔｅｐｉｄｕｍ  ＴＬＳ］
（配列番号３８）
ＭＡＳＳＰＩＴＱＡＱＶＥＳＫＹＲＱＹＨＡＫＩＮＥＡＬＡＡＣＦＰＫＥＫＰＡＴＬＹＤＰＡＲＹＩＬＥＧＫＧＫＲＩＲＰＦＬＴＬＬＡＡＥＡＶＳＧＫＳＤＮＡＬＧＶＡＬＧＩＥＶＬＨＮＦＴＬＭＨＤＤＩＭＤＱＡＤＬＲＨＧＲＰＴＶＨＫＱＷＮＶＮＡＡＩＬＳＧＤＭＭＩＡＹＡＹＥＬＡＬＫＡＩＳＳＲＨＡＥＩＩＨＩＦＮＤＡＮＩＴＩＣＥＧＱＡＬＤＭＥＬＥＱＲＫＤＶＴＩＡＤＹＬＤＭＩＳＫＫＴＧＲＬＩＳＡＡＬＥＡＧＧＶＡＧＤＧＴＰＥＱＩＡＡＬＶＴＦＧＥＫＩＧＲＡＦＱＩＱＤＤＹＬＤＩＭＡＧＤＧＫＳＧＫＶＰＧＧＤＶＩＮＧＫＫＴＷＬＬＬＲＳＬＥＬＡＥＧＡＤＲＥＬＬＱＳＩＦＤＮＮＧＴＳＰＤＮＶＰＡＶＫＡＩＦＥＫＣＧＶＬＮＥＴＲＡＫＩＮＥＤＴＥＡＡＬＡＡＬＤＡＬＰＦＥＥＧＲＧＹＬＲＧＦＡＮＩＬＭＫＲＤＦＶＤ
＞ＳｓＧＧＰＰＳ［Ｓｙｎｅｃｈｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＪＡ−３−３Ａｂ］
（配列番号３９）
ＭＡＶＡＱＴＦＮＬＤＴＹＬＳＱＲＱＱＱＶＥＥＡＬＳＡＡＬＶＰＡＹＰＥＲＩＹＥＡＭＲＹＳＬＬＡＧＧＫＲＬＲＰＩＬＣＬＡＡＣＥＬＡＧＧＳＶＥＱＡＭＰＴＡＣＡＬＥＭＩＨＴＭＳＬＩＨＤＤＬＰＡＭＤＮＤＤＦＲＲＧＫＰＴＮＨＫＶＦＧＥＤＩＡＩＬＡＧＤＡＬＬＡＹＡＦＥＨＩＡＳＱＴＲＧＶＰＰＱＬＶＬＱＶＩＡＲＩＧＨＡＶＡＡＴＧＬＶＧＧＱＶＶＤＬＥＳＥＧＫＡＩＳＬＥＴＬＥＹＩＨＳＨＫＴＧＡＬＬＥＡＳＶＶＳＧＧＩＬＡＧＡＤＥＥＬＬＡＲＬＳＨＹＡＲＤＩＧＬＡＦＱＩＶＤＤＩＬＤＶＴＡＴＳＥＱＬＧＫＴＡＧＫＤＱＡＡＡＫＡＴＹＰＳＬＬＧＬＥＡＳＲＱＫＡＥＥＬＩＱＳＡＫＥＡＬＲＰＹＧＳＱＡＥＰＬＬＡＬＡＤＦＩＴＲＲＱＨＶＤ
＞ＳｓＧＧＰＰＳ２［Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ６８０３］
（配列番号４０）
ＭＡＶＡＱＱＴＲＴＤＦＤＬＡＱＹＬＱＶＫＫＧＶＶＥＡＡＬＤＳＳＬＡＩＡＲＰＥＫＩＹＥＡＭＲＹＳＬＬＡＧＧＫＲＬＲＰＩＬＣＩＴＡＣＥＬＣＧＧＤＥＡＬＡＬＰＴＡＣＡＬＥＭＩＨＴＭＳＬＩＨＤＤＬＰＳＭＤＮＤＤＦＲＲＧＫＰＴＮＨＫＶＹＧＥＤＩＡＩＬＡＧＤＧＬＬＡＹＡＦＥＹＶＶＴＨＴＰＱＡＤＰＱＡＬＬＱＶＩＡＲＬＧＲＴＶＧＡＡＧＬＶＧＧＱＶＬＤＬＥＳＥＧＲＴＤＩＴＰＥＴＬＴＦＩＨＴＨＫＴＧＡＬＬＥＡＳＶＬＴＧＡＩＬＡＧＡＴＧＥＱＱＱＲＬＡＲＹＡＱＮＩＧＬＡＦＱＶＶＤＤＩＬＤＩＴＡＴＱＥＥＬＧＫＴＡＧＫＤＶＫＡＱＫＡＴＹＰＳＬＬＧＬＥＡＳＲＡＱＡＱＳＬＩＤＱＡＩＶＡＬＥＰＦＧＰＳＡＥＰＬＱＡＩＡＥＹＩＶＡＲＫＹＶＤ
＞ＴｍＧＧＰＰＳ［Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ  ＨＢ８］
（配列番号４１）
ＭＡＫＫＥＫＶＥＥＲＩＲＥＩＬＲＰＧＷＤＬＬＴＥＥＡＭＬＹＳＡＴＶＧＧＫＲＩＲＰＬＬＶＬＴＬＧＥＤＬＧＶＥＥＥＫＬＬＤＶＡＶＡＶＥＬＦＨＴＡＳＬＩＨＤＤＬＰＰＩＤＮＡＤＦＲＲＧＫＰＳＣＨＲＴＹＧＥＤＩＡＬＬＡＧＤＧＬＦＦＬＡＦＳＱＩＳＫＩＧＮＳＫＩＦＥＥＦＳＥＴＡＹＫＬＬＬＧＥＡＭＤＶＥＦＥＲＲＫＭＥＶＳＱＥＭＶＥＲＭＹＡＦＫＴＧＡＬＦＡＦＣＦＳＡＰＦＩＬＫＧＫＤＨＴＫＭＫＬＬＧＥＫＦＧＶＡＦＱＩＹＤＤＬＫＤＩＬＧＳＦＥＫＶＧＫＤＬＧＫＤＴＥＫＶＴＬＶＫＫＶＧＩＱＫＡＲＥＭＡＤＫＹＹＥＥＶＬＫＧＩＥＳＥＧＬＦＲＴＬＦＬＬＫＥＬＫＱＭＶＥＥＲＶＤ
＞ＣｇＧＧＰＰＳ［Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ］
（配列番号４２）
ＭＡＫＤＶＳＬＳＳＦＤＡＨＤＬＤＬＤＫＦＰＥＶＶＲＤＲＬＴＱＦＬＤＡＱＥＬＴＩＡＤＩＧＡＰＶＴＤＡＶＡＨＬＲＳＦＶＬＮＧＧＫＲＩＲＰＬＹＡＷＡＧＦＬＡＡＱＧＨＫＮＳＳＥＫＬＥＳＶＬＤＡＡＡＳＬＥＦＩＱＡＣＡＬＩＨＤＤＩＩＤＳＳＤＴＲＲＧＡＰＴＶＨＲＡＶＥＡＤＨＲＡＮＮＦＥＧＤＰＥＨＦＧＶＳＶＳＩＬＡＧＤＭＡＬＶＷＡＥＤＭＬＱＤＳＧＬＳＡＥＡＬＡＲＴＲＤＡＷＲＧＭＲＴＥＶＩＧＧＱＬＬＤＩＹＬＥＳＨＡＮＥＳＶＥＬＡＤＳＶＮＲＦＫＴＡＡＹＴＩＡＲＰＬＨＬＧＡＳＩＡＧＧＳＰＱＬＩＤＡＬＬＨＹＧＨＤＩＧＩＡＦＱＬＲＤＤＬＬＧＶＦＧＤＰＡＩＴＧＫＰＡＧＤＤＩＲＥＧＫＲＴＶＬＬＡＬＡＬＱＲＡＤＫＱＳＰＥＡＡＴＡＩＲＡＧＶＧＫＶＴＳＰＥＤＩＡＶＩＴＥＨＩＲＡＴＧＡＥＥＥＶＥＱＲＩＳＱＬＴＥＳＧＬＡＨＬＤＤＶＤＩＰＤＥＶＲＡＱＬＲＡＬＡＩＲＳＴＥＲＲＭＶＤ
＞ＴｔＧＧＰＰＳ［Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｌｕｓ  ＨＢ２７］
（配列番号４３）
ＭＡＶＰＡＰＥＡＩＲＱＡＬＱＥＲＬＬＡＲＬＤＨＰＤＰＬＹＲＤＬＬＱＤＹＰＲＲＧＧＫＭＬＲＧＬＬＴＶＹＳＡＬＡＨＧＡＰＬＥＡＧＬＥＡＡＴＡＬＥＬＦＱＮＷＶＬＶＨＤＤＩＥＤＧＳＥＥＲＲＧＲＰＡＬＨＲＬＨＰＭＰＬＡＬＮＡＧＤＡＭＨＡＥＭＷＧＬＬＡＥＧＬＡＲＧＬＦＰＰＥＶＬＬＥＦＨＥＶＶＲＲＴＡＹＧＱＨＬＤＬＬＷＴＬＧＧＴＦＤＬＲＰＥＤＹＦＲＭＶＡＨＫＡＡＹＹＴＡＶＡＰＬＲＬＧＡＬＬＡＧＫＴＰＰＡＡＹＥＥＧＧＬＲＬＧＴＡＦＱＩＶＤＤＶＬＮＬＥＧＧＥＡＹＧＫＥＲＡＧＤＬＹＥＧＫＲＴＬＩＬＬＲＦＬＥＥＡＰＰＥＥＲＡＲＡＬＡＬＬＡＬＰＲＥＡＫＰＥＡＥＶＧＷＬＬＥＲＬＬＡＳＲＡＬＡＷＡＫＡＥＡＫＲＬＱＡＥＧＬＡＬＬＥＡＡＦＱＤＬＰＧＫＥＡＬＤＨＬＲＧＬＬＡＡＬＶＥＲＲＡＶＤ
＞ＰｃＧＧＰＰＳ［Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ｃａｌｉｄｉｆｏｎｔｉｓ  ＪＣＭ１１５４８］
（配列番号４４）
ＭＡＤＶＶＳＲＬＨＱＫＹＧＡＥＶＥＫＡＬＶＲＹＬＳＩＧＬＡＥＤＦＲＥＡＶＬＹＱＶＫＴＧＧＫＲＬＲＰＬＬＴＬＡＡＡＥＡＶＳＧＱＷＲＰＡＬＰＡＡＡＩＶＥＬＩＨＮＹＳＬＩＹＤＤＩＩＤＲＧＤＶＲＲＧＬＰＴＶＲＫＡＦＧＤＮＡＡＩＬＶＧＩＷＹＲＥＡＩＥＥＡＶＬＤＴＰＫＰＴＬＦＡＫＥＶＡＥＶＩＫＡＩＤＥＧＥＲＬＤＩＬＦＥＡＡＧＲＳＤＰＹＦＶＱＡＲＷＲＥＶＴＬＤＤＹＩＫＭＶＳＬＫＴＧＡＬＩＡＡＡＡＫＷＧＶＬＳＶＳＤＤＲＧＬＡＥＡＡＷＮＦＧＭＡＡＧＶＡＦＱＩＩＤＤＶＬＤＩＹＧＤＰＫＫＦＧＫＥＩＧＫＤＩＫＥＨＫＲＧＮＡＶＶＡＶＡＬＳＨＬＧＥＧＥＲＲＲＬＬＥＩＬＡＲＥＶＶＥＥＡＤＶＲＥＡＶＡＬＬＤＳＶＧＡＲＥＥＡＬＲＬＡＡＲＹＲＥＥＡＥＲＨＬＡＫＩＰＮＮＧＴＬＫＥＬＬＤＦＩＶＡＲＥＹ
＞ＳｒＣＰＰＳ［Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ］
（配列番号１６）
ＭＫＴＧＦＩＳＰＡＴＶＦＨＨＲＩＳＰＡＴＴＦＲＨＨＬＳＰＡＴＴＮＳＴＧＩＶＡＬＲＤＩＮＦＲＣＫＡＶＳＫＥＹＳＤＬＬＱＫＤＥＡＳＦＴＫＷＤＤＤＫＶＫＤＨＬＤＴＮＫＮＬＹＰＮＤＥＩＫＥＦＶＥＳＶＫＡＭＦＧＳＭＮＤＧＥＩＮＶＳＡＹＤＴＡＷＶＡＬＶＱＤＶＤＧＳＧＳＰＱＦＰＳＳＬＥＷＩＡＮＮＱＬＳＤＧＳＷＧＤＨＬＬＦＳＡＨＤＲＩＩＮＴＬＡＣＶＩＡＬＴＳＷＮＶＨＰＳＫＣＥＫＧＬＮＦＬＲＥＮＩＣＫＬＥＤＥＮＡＥＨＭＰＩＧＦＥＶＴＦＰＳＬＩＤＩＡＫＫＬＮＩＥＶＰＥＤＴＰＡＬＫＥＩＹＡＲＲＤＩＫＬＴＫＩＰＭＥＶＬＨＫＶＰＴＴＬＬＨＳＬＥＧＭＰＤＬＥＷＥＫＬＬＫＬＱＣＫＤＧＳＦＬＦＳＰＳＳＴＡＦＡＬＭＱＴＫＤＥＫＣＬＱＹＬＴＮＩＶＴＫＦＮＧＧＶＰＮＶＹＰＶＤＬＦＥＨＩＷＶＶＤＲＬＱＲＬＧＩＡＲＹＦＫＳＥＩＫＤＣＶＥＹＩＮＫＹＷＴＫＮＧＩＣＷＡＲＮＴＨＶＱＤＩＤＤＴＡＭＧＦＲＶＬＲＡＨＧＹＤＶＴＰＤＶＦＲＱＦＥＫＤＧＫＦＶＣＦＡＧＱＳＴＱＡＶＴＧＭＦＮＶＹＲＡＳＱＭＬＦＰＧＥＲＩＬＥＤＡＫＫＦＳＹＮＹＬＫＥＫＱＳＴＮＥＬＬＤＫＷＩＩＡＫＤＬＰＧＥＶＧＹＡＬＤＩＰＷＹＡＳＬＰＲＬＥＴＲＹＹＬＥＱＹＧＧＥＤＤＶＷＩＧＫＴＬＹＲＭＧＹＶＳＮＮＴＹＬＥＭＡＫＬＤＹＮＮＹＶＡＶＬＱＬＥＷＹＴＩＱＱＷＹＶＤＩＧＩＥＫＦＥＳＤＮＩＫＳＶＬＶＳＹＹＬＡＡＡＳＩＦＥＰＥＲＳＫＥＲＩＡＷＡＫＴＴＩＬＶＤＫＩＴＳＩＦＤＳＳＱＳＳＫＥＤＩＴＡＦＩＤＫＦＲＮＫＳＳＳＫＫＨＳＩＮＧＥＰＷＨＥＶＭＶＡＬＫＫＴＬＨＧＦＡＬＤＡＬＭＴＨＳＱＤＩＨＰＱＬＨＱＡＷＥＭＷＬＴＫＬＱＤＧＶＤＶＴＡＥＬＭＶＱＭＩＮＭＴＡＧＲＷＶＳＫＥＬＬＴＨＰＱＹＱＲＬＳＴＶＴＮＳＶＣＨＤＩＴＫＬＨＮＦＫＥＮＳＴＴＶＤＳＫＶＱＥＬＶＱＬＶＦＳＤＴＰＤＤＬＤＱＤＭＫＱＴＦＬＴＶＭＫＴＦＹＹＫＡＷＣＤＰＮＴＩＮＤＨＩＳＫＶＦＥＩＶＩ
＞ＳｒＫＳ［Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ］
（配列番号１７）
ＭＮＬＳＬＣＩＡＳＰＬＬＴＫＳＮＲＰＡＡＬＳＡＩＨＴＡＳＴＳＨＧＧＱＴＮＰＴＮＬＩＩＤＴＴＫＥＲＩＱＫＱＦＫＮＶＥＩＳＶＳＳＹＤＴＡＷＶＡＭＶＰＳＰＮＳＰＫＳＰＣＦＰＥＣＬＮＷＬＩＮＮＱＬＮＤＧＳＷＧＬＶＮＨＴＨＮＨＮＨＰＬＬＫＤＳＬＳＳＴＬＡＣＩＶＡＬＫＲＷＮＶＧＥＤＱＩＮＫＧＬＳＦＩＥＳＮＬＡＳＡＴＥＫＳＱＰＳＰＩＧＦＤＩＩＦＰＧＬＬＥＹＡＫＮＬＤＩＮＬＬＳＫＱＴＤＦＳＬＭＬＨＫＲＥＬＥＱＫＲＣＨＳＮＥＭＤＧＹＬＡＹＩＳＥＧＬＧＮＬＹＤＷＮＭＶＫＫＹＱＭＫＮＧＳＶＦＮＳＰＳＡＴＡＡＡＦＩＮＨＱＮＰＧＣＬＮＹＬＮＳＬＬＤＫＦＧＮＡＶＰＴＶＹＰＨＤＬＦＩＲＬＳＭＶＤＴＩＥＲＬＧＩＳＨＨＦＲＶＥＩＫＮＶＬＤＥＴＹＲＣＷＶＥＲＤＥＱＩＦＭＤＶＶＴＣＡＬＡＦＲＬＬＲＩＮＧＹＥＶＳＰＤＰＬＡＥＩＴＮＥＬＡＬＫＤＥＹＡＡＬＥＴＹＨＡＳＨＩＬＹＱＥＤＬＳＳＧＫＱＩＬＫＳＡＤＦＬＫＥＩＩＳＴＤＳＮＲＬＳＫＬＩＨＫＥＶＥＮＡＬＫＦＰＩＮＴＧＬＥＲＩＮＴＲＲＮＩＱＬＹＮＶＤＮＴＲＩＬＫＴＴＹＨＳＳＮＩＳＮＴＤＹＬＲＬＡＶＥＤＦＹＴＣＱＳＩＹＲＥＥＬＫＧＬＥＲＷＶＶＥＮＫＬＤＱＬＫＦＡＲＱＫＴＡＹＣＹＦＳＶＡＡＴＬＳＳＰＥＬＳＤＡＲＩＳＷＡＫＮＧＩＬＴＴＶＶＤＤＦＦＤＩＧＧＴＩＤＥＬＴＮＬＩＱＣＶＥＫＷＮＶＤＶＤＫＤＣＣＳＥＨＶＲＩＬＦＬＡＬＫＤＡＩＣＷＩＧＤＥＡＦＫＷＱＡＲＤＶＴＳＨＶＩＱＴＷＬＥＬＭＮＳＭＬＲＥＡＩＷＴＲＤＡＹＶＰＴＬＮＥＹＭＥＮＡＹＶＳＦＡＬＧＰＩＶＫＰＡＩＹＦＶＧＰＫＬＳＥＥＩＶＥＳＳＥＹＨＮＬＦＫＬＭＳＴＱＧＲＬＬＮＤＩＨＳＦＫＲＥＦＫＥＧＫＬＮＡＶＡＬＨＬＳＮＧＥＳＧＫＶＥＥＥＶＶＥＥＭＭＭＭＩＫＮＫＲＫＥＬＭＫＬＩＦＥＥＮＧＳＩＶＰＲＡＣＫＤＡＦＷＮＭＣＨＶＬＮＦＦＹＡＮＤＤＧＦＴＧＮＴＩＬＤＴＶＫＤＩＩＹＮＰＬＶＬＶＮＥＮＥＥＱＲ
＞ＧｆＣＰＰＳ／ＫＳ［Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ］
（配列番号１８）
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＞ＰｐＣＰＰＳ／ＫＳ［Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ］
（配列番号１９）
ＭＡＳＳＴＬＩＱＮＲＳＣＧＶＴＳＳＭＳＳＦＱＩＦＲＧＱＰＬＲＦＰＧＴＲＴＰＡＡＶＱＣＬＫＫＲＲＣＬＲＰＴＥＳＶＬＥＳＳＰＧＳＧＳＹＲＩＶＴＧＰＳＧＩＮＰＳＳＮＧＨＬＱＥＧＳＬＴＨＲＬＰＩＰＭＥＫＳＩＤＮＦＱＳＴＬＹＶＳＤＩＷＳＥＴＬＱＲＴＥＣＬＬＱＶＴＥＮＶＱＭＮＥＷＩＥＥＩＲＭＹＦＲＮＭＴＬＧＥＩＳＭＳＰＹＤＴＡＷＶＡＲＶＰＡＬＤＧＳＨＧＰＱＦＨＲＳＬＱＷＩＩＤＮＱＬＰＤＧＤＷＧＥＰＳＬＦＬＧＹＤＲＶＣＮＴＬＡＣＶＩＡＬＫＴＷＧＶＧＡＱＮＶＥＲＧＩＱＦＬＱＳＮＩＹＫＭＥＥＤＤＡＮＨＭＰＩＧＦＥＩＶＦＰＡＭＭＥＤＡＫＡＬＧＬＤＬＰＹＤＡＴＩＬＱＱＩＳＡＥＲＥＫＫＭＫＫＩＰＭＡＭＶＹＫＹＰＴＴＬＬＨＳＬＥＧＬＨＲＥＶＤＷＮＫＬＬＱＬＱＳＥＮＧＳＦＬＹＳＰＡＳＴＡＣＡＬＭＹＴＫＤＶＫＣＦＤＹＬＮＱＬＬＩＫＦＤＨＡＣＰＮＶＹＰＶＤＬＦＥＲＬＷＭＶＤＲＬＱＲＬＧＩＳＲＹＦＥＲＥＩＲＤＣＬＱＹＶＹＲＹＷＫＤＣＧＩＧＷＡＳＮＳＳＶＱＤＶＤＤＴＡＭＡＦＲＬＬＲＴＨＧＦＤＶＫＥＤＣＦＲＱＦＦＫＤＧＥＦＦＣＦＡＧＱＳＳＱＡＶＴＧＭＦＮＬＳＲＡＳＱＴＬＦＰＧＥＳＬＬＫＫＡＲＴＦＳＲＮＦＬＲＴＫＨＥＮＮＥＣＦＤＫＷＩＩＴＫＤＬＡＧＥＶＥＹＮＬＴＦＰＷＹＡＳＬＰＲＬＥＨＲＴＹＬＤＱＹＧＩＤＤＩＷＩＧＫＳＬＹＫＭＰＡＶＴＮＥＶＦＬＫＬＡＫＡＤＦＮＭＣＱＡＬＨＫＫＥＬＥＱＶＩＫＷＮＡＳＣＱＦＲＤＬＥＦＡＲＱＫＳＶＥＣＹＦＡＧＡＡＴＭＦＥＰＥＭＶＱＡＲＬＶＷＡＲＣＣＶＬＴＴＶＬＤＤＹＦＤＨＧＴＰＶＥＥＬＲＶＦＶＱＡＶＲＴＷＮＰＥＬＩＮＧＬＰＥＱＡＫＩＬＦＭＧＬＹＫＴＶＮＴＩＡＥＥＡＦＭＡＱＫＲＤＶＨＨＨＬＫＨＹＷＤＫＬＩＴＳＡＬＫＥＡＥＷＡＥＳＧＹＶＰＴＦＤＥＹＭＥＶＡＥＩＳＶＡＬＥＰＩＶＣＳＴＬＦＦＡＧＨＲＬＤＥＤＶＬＤＳＹＤＹＨＬＶＭＨＬＶＮＲＶＧＲＩＬＮＤＩＱＧＭＫＲＥＡＳＱＧＫＩＳＳＶＱＩＹＭＥＥＨＰＳＶＰＳＥＡＭＡＩＡＨＬＱＥＬＶＤＮＳＭＱＱＬＴＹＥＶＬＲＦＴＡＶＰＫＳＣＫＲＩＨＬＮＭＡＫＩＭＨＡＦＹＫＤＴＤＧＦＳＳＬＴＡＭＴＧＦＶＫＫＶＬＦＥＰＶＰＥ
＞ＰｓＣＰＰＳ／ＫＳ［Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｓｐ．］
（配列番号２０）
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＞ＥｔＣＰＰＳ［Ｅｒｗｉｎａ  ｔｒａｃｈｅｉｐｈｉｌａ］
（配列番号３２）
ＭＡＨＡＬＡＥＮＩＬＴＥＬＮＴＬＬＳＤＭＤＤＧＧＹＶＧＰＳＶＹＤＴＡＱＬＬＲＦＨＰＮＰＰＤＲＡＧＩＹＲＷＬＩＫＱＱＨＥＤＧＧＷＧＳＰＤＦＰＬＨＲＱＶＰＴＶＡＡＩＬＡＬＨＥＡＱＰＱＰＥＧＡＡＡＡＬＡＡＡＡＶＹＬＡＱＥＲＤＬＹＡＤＴＩＰＤＤＡＰＩＧＡＥＬＩＬＰＱＬＣＲＱＡＡＡＬＦＰＨＬＡＹＰＲＹＧＡＬＹＥＡＥＡＡＲＬＧＫＶＥＳＬＴＡＶＰＳＧＨＰＬＬＨＳＷＥＳＷＧＲＳＳＴＥＶＴＰＤＶＦＧＳＩＧＩＳＰＳＡＴＡＶＷＬＧＲＡＣＡＥＮＰＡＣＬＰＥＨＡＴＲＹＬＨＮＡＳＲＡＴＧＶＧＩＤＧＶＶＰＮＶＷＰＩＤＶＦＥＰＣＷＳＬＹＳＬＨＬＡＧＬＦＳＨＰＧＬＳＴＶＶＱＮＩＡＴＮＩＱＡＩＬＴＰＬＧＬＧＰＡＬＳＦＡＳＤＡＤＤＴＡＩＡＡＡＶＶＱＬＳＧＨＳＬＴＣＹＰＬＨＱＦＥＫＧＤＬＦＶＴＦＰＧＥＲＮＰＳＬＳＴＴＩＨＡＶＨＡＬＳＬＬＧＴＴＡＰＤＡＲＡＹＩＥＮＳＫＳＡＤＧＶＷＫＮＥＫＷＨＡＳＷＬＹＰＴＳＨＡＶＡＡＬＡＨＧＭＰＳＷＲＤＮＤＶＬＹＫＩＬＥＡＱＨＬＳＧＧＷＧＡＧＡＡＰＴＱＥＥＴＡＹＡＬＦＡＬＨＶＭＮＤＲＶＮＡＰＬＲＥＫＬＶＳＡＶＡＲＡＲＥＷＬＬＶＲＹＱＳＮＱＬＰＩＴＰＬＷＩＧＫＥＬＹＣＰＱＲＶＶＲＶＴＥＬＴＧＬＷＬＡＬＮＷＮＰＳＨＳＤＶＳＤＴＲＴＥＴＰＧＥＲＩ
＞ＥｔＫＳ［Ｅｒｗｉｎａ  ｔｒａｃｈｅｉｐｈｉｌａ］
（配列番号３３）
ＭＡＴＳＨＤＤＡＣＱＱＶＫＶＷＧＥＴＬＦＧＦＬＤＥＨＡＶＥＡＶＲＧＧＱＦＩＬＲＨＩＲＰＥＬＡＡＩＳＡＲＴＧＲＤＰＤＤＥＡＲＥＬＡＦＹＱＥＭＡＬＬＦＷＩＤＤＣＨＤＲＧＶＭＳＰＤＤＹＡＶＶＥＧＩＬＶＧＲＭＰＤＡＰＴＰＳＶＧＣＳＦＬＲＨＲＬＡＱＬＡＳＨＫＨＤＹＳＱＬＬＡＤＴＱＡＹＳＴＡＬＲＮＧＫＲＬＡＳＤＰＤＲＷＳＹＳＥＨＬＲＮＧＶＤＳＩＧＹＱＮＶＦＧＣＬＳＬＬＷＧＬＤＭＰＲＷＲＴＥＰＡＦＱＮＡＬＳＦＬＣＡＩＧＲＬＱＮＤＬＨＧＬＡＮＤＲＴＬＧＥＡＤＮＬＡＶＱＬＥＲＲＹＰＴＬＤＡＶＥＦＬＱＴＥＩＴＧＹＥＲＭＬＲＰＬＬＥＴＡＮＦＤＰＶＷＶＲＬＭＥＴＭＬＴＶＳＤＱＹＹＡＴＳＴＬＲＹＲＩＤＤＴＡＴＴＡＰＳＣＤＴＲＨＡＳＧＡＶＴＧＳＧＮＥＴＥ
＞ＳｆＣＰＰＳ［Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｆｒｅｄｉｉ］
（配列番号３４）
ＭＡＮＡＬＳＥＱＩＬＦＥＬＲＨＬＬＳＥＭＳＤＧＧＳＶＧＰＳＶＹＤＴＡＲＡＬＱＦＧＧＮＶＴＧＲＱＤＡＹＡＷＬＬＡＱＱＱＡＤＧＧＷＧＳＡＤＦＰＬＦＲＨＡＰＴＷＡＡＬＬＡＬＱＲＡＤＰＬＰＧＡＡＤＡＶＱＡＡＴＲＦＬＥＲＱＡＤＰＹＡＨＡＶＰＥＤＡＰＩＧＡＥＬＩＬＰＱＬＣＧＥＡＡＳＬＬＧＧＶＡＦＰＲＨＰＡＬＬＰＬＲＱＡＣＬＶＫＬＧＡＶＡＴＬＰＳＧＨＰＬＬＨＳＷＥＡＷＧＴＷＰＴＡＡＣＰＤＤＤＧＳＩＧＩＳＰＡＡＴＡＡＷＲＡＨＡＶＴＱＧＳＴＰＱＶＧＲＡＤＡＹＬＱＡＡＳＲＡＴＲＳＧＩＥＧＶＶＰＮＶＷＰＩＮＶＦＥＰＣＷＳＬＹＴＬＨＬＡＧＬＦＡＨＰＡＬＤＥＡＶＲＶＩＶＡＱＬＤＡＲＬＧＶＲＧＬＧＰＡＬＨＦＡＡＤＡＤＤＴＡＶＡＬＣＶＬＲＬＡＧＲＤＰＡＶＤＡＬＲＨＦＥＩＧＥＬＦＶＴＦＰＧＥＲＮＡＳＶＳＴＮＩＨＡＬＨＡＬＲＬＬＧＫＰＡＡＧＴＳＡＹＶＥＡＮＲＮＰＨＧＬＷＤＮＥＫＷＨＶＳＷＬＹＰＴＡＨＡＶＡＡＬＡＱＧＫＰＱＷＲＤＥＲＡＬＡＡＬＬＱＡＱＲＤＤＧＧＷＧＡＧＲＡＳＴＦＥＥＴＡＹＡＬＦＡＬＨＶＭＤＧＳＥＥＰＴＧＲＲＲＩＡＱＡＶＡＲＡＬＥＷＭＬＡＲＨＡＡＰＡＬＰＱＭＰＬＷＩＧＫＥＬＹＣＰＩＲＶＶＲＶＡＥＬＡＧＬＷＬＡＬＲＷＧＰＲＶＰＡＥＧＡＧＡＡＰ
＞ＳｆＫＳ［Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｆｒｅｄｉｉ］
（配列番号３５）
ＭＡＩＰＴＥＲＧＬＱＱＶＬＥＷＧＲＳＬＴＧＦＡＤＥＨＡＡＥＡＶＲＧＧＱＹＩＬＱＲＩＨＰＳＬＲＤＴＳＡＲＴＧＲＤＰＱＤＥＴＬＩＶＡＦＹＲＥＬＡＬＬＦＷＬＤＤＣＮＤＬＤＬＩＡＰＥＱＬＡＡＶＥＱＡＬＧＱＧＶＰＣＡＬＰＧＦＥＧＣＡＶＬＲＡＳＬＡＡＬＡＹＤＲＲＤＹＡＱＬＬＤＤＴＲＣＹＣＡＡＬＲＡＧＨＡＱＡＡＧＡＡＥＲＷＳＹＡＥＹＬＨＮＧＩＤＳＩＡＹＡＮＶＦＣＣＬＳＬＬＷＧＬＤＭＡＴＬＲＡＲＰＡＦＲＱＶＬＲＬＩＳＡＩＧＲＬＱＮＤＬＨＧＲＤＫＤＲＳＡＧＥＡＤＮＡＡＩＬＬＬＥＲＹＰＡＭＰＶＶＥＦＬＮＤＥＬＡＧＨＴＲＭＬＨＲＶＭＡＥＥＲＦＰＡＰＷＧＰＬＩＥＡＭＡＡＩＲＡＨＹＹＱＴＳＴＳＲＹＲＳＤＡＡＧＧＧＱＨＡＰＡ
＞ＳｒＫＯ  ＡＡＱ６３４６４．１｜ｅｎｔ−カウレンオキシダーゼＣＹＰ７０１Ａ５［Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ］
（配列番号２１）
ＭＤＡＶＴＧＬＬＴＶＰＡＴＡＩＴＩＧＧＴＡＶＡＬＡＶＡＬＩＦＷＹＬＫＳＹＴＳＡＲＲＳＱＳＮＨＬＰＲＶＰＥＶＰＧＶＰＬＬＧＮＬＬＱＬＫＥＫＫＰＹＭＴＦＴＲＷＡＡＴＹＧＰＩＹＳＩＫＴＧＡＴＳＭＶＶＶＳＳＮＥＩＡＫＥＡＬＶＴＲＦＱＳＩＳＴＲＮＬＳＫＡＬＫＶＬＴＡＤＫＴＭＶＡＭＳＤＹＤＤＹＨＫＴＶＫＲＨＩＬＴＡＶＬＧＰＮＡＱＫＫＨＲＩＨＲＤＩＭＭＤＮＩＳＴＱＬＨＥＦＶＫＮＮＰＥＱＥＥＶＤＬＲＫＩＦＱＳＥＬＦＧＬＡＭＲＱＡＬＧＫＤＶＥＳＬＹＶＥＤＬＫＩＴＭＮＲＤＥＩＦＱＶＬＶＶＤＰＭＭＧＡＩＤＶＤＷＲＤＦＦＰＹＬＫＷＶＰＮＫＫＦＥＮＴＩＱＱＭＹＩＲＲＥＡＶＭＫＳＬＩＫＥＨＫＫＲＩＡＳＧＥＫＬＮＳＹＩＤＹＬＬＳＥＡＱＴＬＴＤＱＱＬＬＭＳＬＷＥＰＩＩＥＳＳＤＴＴＭＶＴＴＥＷＡＭＹＥＬＡＫＮＰＫＬＱＤＲＬＹＲＤＩＫＳＶＣＧＳＥＫＩＴＥＥＨＬＳＱＬＰＹＩＴＡＩＦＨＥＴＬＲＲＨＳＰＶＰＩＩＰＬＲＨＶＨＥＤＴＶＬＧＧＹＨＶＰＡＧＴＥＬＡＶＮＩＹＧＣＮＭＤＫＮＶＷＥＮＰＥＥＷＮＰＥＲＦＭＫＥＮＥＴＩＤＦＱＫＴＭＡＦＧＧＧＫＲＶＣＡＧＳＬＱＡＬＬＴＡＳＩＧＩＧＲＭＶＱＥＦＥＷＫＬＫＤＭＴＱＥＥＶＮＴＩＧＬＴＴＱＭＬＲＰＬＲＡＩＩＫＰＲＩ
＞ｔ２０−８ＲＰＳｒＫＯ
（配列番号２２）
ＭＡＬＬＬＡＶＦＡＶＡＬＡＶＡＬＩＦＷＹＬＫＳＹＴＳＡＲＲＳＱＳＮＨＬＰＲＶＰＥＶＰＧＶＰＬＬＧＮＬＬＱＬＫＥＫＫＰＹＭＴＦＴＲＷＡＡＴＹＧＰＩＹＳＩＫＴＧＡＴＳＭＶＶＶＳＳＮＥＩＡＫＥＡＬＶＴＲＦＱＳＩＳＴＲＮＬＳＫＡＬＫＶＬＴＡＤＫＴＭＶＡＭＳＤＹＤＤＹＨＫＴＶＫＲＨＩＬＴＡＶＬＧＰＮＡＱＫＫＨＲＩＨＲＤＩＭＭＤＮＩＳＴＱＬＨＥＦＶＫＮＮＰＥＱＥＥＶＤＬＲＫＩＦＱＳＥＬＦＧＬＡＭＲＱＡＬＧＫＤＶＥＳＬＹＶＥＤＬＫＩＴＭＮＲＤＥＩＦＱＶＬＶＶＤＰＭＭＧＡＩＤＶＤＷＲＤＦＦＰＹＬＫＷＶＰＮＫＫＦＥＮＴＩＱＱＭＹＩＲＲＥＡＶＭＫＳＬＩＫＥＨＫＫＲＩＡＳＧＥＫＬＮＳＹＩＤＹＬＬＳＥＡＱＴＬＴＤＱＱＬＬＭＳＬＷＥＰＩＩＥＳＳＤＴＴＭＶＴＴＥＷＡＭＹＥＬＡＫＮＰＫＬＱＤＲＬＹＲＤＩＫＳＶＣＧＳＥＫＩＴＥＥＨＬＳＱＬＰＹＩＴＡＩＦＨＥＴＬＲＲＨＳＰＶＰＩＩＰＬＲＨＶＨＥＤＴＶＬＧＧＹＨＶＰＡＧＴＥＬＡＶＮＩＹＧＣＮＭＤＫＮＶＷＥＮＰＥＥＷＮＰＥＲＦＭＫＥＮＥＴＩＤＦＱＫＴＭＡＦＧＧＧＫＲＶＣＡＧＳＬＱＡＬＬＴＡＳＩＧＩＧＲＭＶＱＥＦＥＷＫＬＫＤＭＴＱＥＥＶＮＴＩＧＬＴＴＱＭＬＲＰＬＲＡＩＩＫＰＲＩ
＞ＡｔＫＯ［Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ］
（配列番号２３）
ＭＡＦＦＳＭＩＳＩＬＬＧＦＶＩＳＳＦＩＦＩＦＦＦＫＫＬＬＳＦＳＲＫＮＭＳＥＶＳＴＬＰＳＶＰＶＶＰＧＦＰＶＩＧＮＬＬＱＬＫＥＫＫＰＨＫＴＦＴＲＷＳＥＩＹＧＰＩＹＳＩＫＭＧＳＳＳＬＩＶＬＮＳＴＥＴＡＫＥＡＭＶＴＲＦＳＳＩＳＴＲＫＬＳＮＡＬＴＶＬＴＣＤＫＳＭＶＡＴＳＤＹＤＤＦＨＫＬＶＫＲＣＬＬＮＧＬＬＧＡＮＡＱＫＲＫＲＨＹＲＤＡＬＩＥＮＶＳＳＫＬＨＡＨＡＲＤＨＰＱＥＰＶＮＦＲＡＩＦＥＨＥＬＦＧＶＡＬＫＱＡＦＧＫＤＶＥＳＩＹＶＫＥＬＧＶＴＬＳＫＤＥＩＦＫＶＬＶＨＤＭＭＥＧＡＩＤＶＤＷＲＤＦＦＰＹＬＫＷＩＰＮＫＳＦＥＡＲＩＱＱＫＨＫＲＲＬＡＶＭＮＡＬＩＱＤＲＬＫＱＮＧＳＥＳＤＤＤＣＹＬＮＦＬＭＳＥＡＫＴＬＴＫＥＱＩＡＩＬＶＷＥＴＩＩＥＴＡＤＴＴＬＶＴＴＥＷＡＩＹＥＬＡＫＨＰＳＶＱＤＲＬＣＫＥＩＱＮＶＣＧＧＥＫＦＫＥＥＱＬＳＱＶＰＹＬＮＧＶＦＨＥＴＬＲＫＹＳＰＡＰＬＶＰＩＲＹＡＨＥＤＴＱＩＧＧＹＨＶＰＡＧＳＥＩＡＩＮＩＹＧＣＮＭＤＫＫＲＷＥＲＰＥＤＷＷＰＥＲＦＬＤＤＧＫＹＥＴＳＤＬＨＫＴＭＡＦＧＡＧＫＲＶＣＡＧＡＬＱＡＳＬＭＡＧＩＡＩＧＲＬＶＱＥＦＥＷＫＬＲＤＧＥＥＥＮＶＤＴＹＧＬＴＳＱＫＬＹＰＬＭＡＩＩＮＰＲＲＳ
＞ＰｐＫＯ［Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ］
（配列番号２４）
ＭＡＫＨＬＡＴＱＬＬＱＱＷＮＥＡＬＫＴＭＰＰＧＦＲＴＡＧＫＩＬＶＷＥＥＬＡＳＮＫＶＬＩＴＩＡＬＡＷＶＬＬＦＶＡＲＴＣＬＲＮＫＫＲＬＰＰＡＩＰＧＧＬＰＶＬＧＮＬＬＱＬＴＥＫＫＰＨＲＴＦＴＡＷＳＫＥＨＧＰＩＦＴＩＫＶＧＳＶＰＱＡＶＶＮＮＳＥＩＡＫＥＶＬＶＴＫＦＡＳＩＳＫＲＱＭＰＭＡＬＲＶＬＴＲＤＫＴＭＶＡＭＳＤＹＧＥＥＨＲＭＬＫＫＬＶＭＴＮＬＬＧＰＴＴＱＮＫＮＲＳＬＲＤＤＡＬＩＧＭＩＥＧＶＬＡＥＬＫＡＳＰＴＳＰＫＶＶＮＶＲＤＹＶＱＲＳＬＦＰＦＡＬＱＱＶＦＧＹＩＰＤＱＶＥＶＬＥＬＧＴＣＶＳＴＷＤＭＦＤＡＬＶＶＡＰＬＳＡＶＩＮＶＤＷＲＤＦＦＰＡＬＲＷＩＰＮＲＳＶＥＤＬＶＲＴＶＤＦＫＲＮＳＩＭＫＡＬＩＲＡＱＲＭＲＬＡＮＬＫＥＰＰＲＣＹＡＤＩＡＬＴＥＡＴＨＬＴＥＫＱＬＥＭＳＬＷＥＰＩＩＥＳＡＤＴＴＬＶＴＳＥＷＡＭＹＥＩＡＫＮＰＤＣＱＤＲＬＹＲＥＩＶＳＶＡＧＴＥＲＭＶＴＥＤＤＬＰＮＭＰＹＬＧＡＩＩＫＥＴＬＲＫＹＴＰＶＰＬＩＰＳＲＦＶＥＥＤＩＴＬＧＧＹＤＩＰＫＧＹＱＩＬＶＮＬＦＡＩＡＮＤＰＡＶＷＳＮＰＥＫＷＤＰＥＲＭＬＡＮＫＫＶＤＭＧＦＲＤＦＳＬＭＰＦＧＡＧＫＲＭＣＡＧＩＴＱＡＭＦＩＩＰＭＮＶＡＡＬＶＱＨＣＥＷＲＬＳＰＱＥＩＳＮＩＮＮＫＩＥＤＶＶＹＬＴＴＨＫＬＳＰＬＳＣＥＡＴＰＲＩＳＨＲＬＰ
＞ＳｒＫＡＨ１  ｇｉ｜１８９４１８９６２｜ｇｂ｜ＡＣＤ９３７２２．１｜ｅｎｔ−カウレン酸１３−ヒドロキシラーゼ［Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ］
（配列番号２５）
ＭＩＱＶＬＴＰＩＬＬＦＬＩＦＦＶＦＷＫＶＹＫＨＱＫＴＫＩＮＬＰＰＧＳＦＧＷＰＦＬＧＥＴＬＡＬＬＲＡＧＷＤＳＥＰＥＲＦＶＲＥＲＩＫＫＨＧＳＰＬＶＦＫＴＳＬＦＧＤＲＦＡＶＬＣＧＰＡＧＮＫＦＬＦＣＮＥＮＫＬＶＡＳＷＷＰＶＰＶＲＫＬＦＧＫＳＬＬＴＩＲＧＤＥＡＫＷＭＲＫＭＬＬＳＹＬＧＰＤＡＦＡＴＨＹＡＶＴＭＤＶＶＴＲＲＨＩＤＶＨＷＲＧＫＥＥＶＮＶＦＱＴＶＫＬＹＡＦＥＬＡＣＲＬＦＭＮＬＤＤＰＮＨＩＡＫＬＧＳＬＦＮＩＦＬＫＧＩＩＥＬＰＩＤＶＰＧＴＲＦＹＳＳＫＫＡＡＡＡＩＲＩＥＬＫＫＬＩＫＡＲＫＬＥＬＫＥＧＫＡＳＳＳＱＤＬＬＳＨＬＬＴＳＰＤＥＮＧＭＦＬＴＥＥＥＩＶＤＮＩＬＬＬＬＦＡＧＨＤＴＳＡＬＳＩＴＬＬＭＫＴＬＧＥＨＳＤＶＹＤＫＶＬＫＥＱＬＥＩＳＫＴＫＥＡＷＥＳＬＫＷＥＤＩＱＫＭＫＹＳＷＳＶＩＣＥＶＭＲＬＮＰＰＶＩＧＴＹＲＥＡＬＶＤＩＤＹＡＧＹＴＩＰＫＧＷＫＬＨＷＳＡＶＳＴＱＲＤＥＡＮＦＥＤＶＴＲＦＤＰＳＲＦＥＧＡＧＰＴＰＦＴＦＶＰＦＧＧＧＰＲＭＣＬＧＫＥＦＡＲＬＥＶＬＡＦＬＨＮＩＶＴＮＦＫＷＤＬＬＩＰＤＥＫＩＥＹＤＰＭＡＴＰＡＫＧＬＰＩＲＬＨＰＨＱＶ
＞ＳｒＫＡＨ２  特許ＵＳ２００８００６４０６３によるｅｎｔ−カウレン酸１３−ヒドロキシラーゼ［Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ］
（配列番号２６）
ＭＧＬＦＰＬＥＤＳＹＡＬＶＦＥＧＬＡＩＴＬＡＬＹＹＬＬＳＦＩＹＫＴＳＫＫＴＣＴＰＰＫＡＳＧＥＨＰＩＴＧＨＬＮＬＬＳＧＳＳＧＬＰＨＬＡＬＡＳＬＡＤＲＣＧＰＩＦＴＩＲＬＧＩＲＲＶＬＶＶＳＮＷＥＩＡＫＥＩＦＴＴＨＤＬＩＶＳＮＲＰＫＹＬＡＡＫＩＬＧＦＮＹＶＳＦＳＦＡＰＹＧＰＹＷＶＧＩＲＫＩＩＡＴＫＬＭＳＳＳＲＬＱＫＬＱＦＶＲＶＦＥＬＥＮＳＭＫＳＩＲＥＳＷＫＥＫＫＤＥＥＧＫＶＬＶＥＭＫＫＷＦＷＥＬＮＭＮＩＶＬＲＴＶＡＧＫＱＹＴＧＴＶＤＤＡＤＡＫＲＩＳＥＬＦＲＥＷＦＨＹＴＧＲＦＶＶＧＤＡＦＰＦＬＧＷＬＤＬＧＧＹＫＫＴＭＥＬＶＡＳＲＬＤＳＭＶＳＫＷＬＤＥＨＲＫＫＱＡＮＤＤＫＫＥＤＭＤＦＭＤＩＭＩＳＭＴＥＡＮＳＰＬＥＧＹＧＴＤＴＩＩＫＴＴＣＭＴＬＩＶＳＧＶＤＴＴＳＩＶＬＴＷＡＬＳＬＬＬＮＮＲＤＴＬＫＫＡＱＥＥＬＤＭＣＶＧＫＧＲＱＶＮＥＳＤＬＶＮＬＩＹＬＥＡＶＬＫＥＡＬＲＬＹＰＡＡＦＬＧＧＰＲＡＦＬＥＤＣＴＶＡＧＹＲＩＰＫＧＴＣＬＬＩＮＭＷＫＬＨＲＤＰＮＩＷＳＤＰＣＥＦＫＰＥＲＦＬＴＰＮＱＫＤＶＤＶＩＧＭＤＦＥＬＩＰＦＧＡＧＲＲＹＣＰＧＴＲＬＡＬＱＭＬＨＩＶＬＡＴＬＬＱＮＦＥＭＳＴＰＮＤＡＰＶＤＭＴＡＳＶＧＭＴＮＡＫＡＳＰＬＥＶＬＬＳＰＲＶＫＷＳ
＞ＡｔＫＡＨ  ｇｉ｜３３２００５９９３｜ｇｂ｜ＡＥＤ９３３７６．１｜シトクロムＰ４５０、ファミリー７１４、サブファミリーＡ、ポリペプチド２［Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ］
（配列番号２７）
ＭＥＳＬＶＶＨＴＶＮＡＩＷＣＩＶＩＶＧＩＦＳＶＧＹＨＶＹＧＲＡＶＶＥＱＷＲＭＲＲＳＬＫＬＱＧＶＫＧＰＰＰＳＩＦＮＧＮＶＳＥＭＱＲＩＱＳＥＡＫＨＣＳＧＤＮＩＩＳＨＤＹＳＳＳＬＦＰＨＦＤＨＷＲＫＱＹＧＲＩＹＴＹＳＴＧＬＫＱＨＬＹＩＮＨＰＥＭＶＫＥＬＳＱＴＮＴＬＮＬＧＲＩＴＨＩＴＫＲＬＮＰＩＬＧＮＧＩＩＴＳＮＧＰＨＷＡＨＱＲＲＩＩＡＹＥＦＴＨＤＫＩＫＧＭＶＧＬＭＶＥＳＡＭＰＭＬＮＫＷＥＥＭＶＫＲＧＧＥＭＧＣＤＩＲＶＤＥＤＬＫＤＶＳＡＤＶＩＡＫＡＣＦＧＳＳＦＳＫＧＫＡＩＦＳＭＩＲＤＬＬＴＡＩＴＫＲＳＶＬＦＲＦＮＧＦＴＤＭＶＦＧＳＫＫＨＧＤＶＤＩＤＡＬＥＭＥＬＥＳＳＩＷＥＴＶＫＥＲＥＩＥＣＫＤＴＨＫＫＤＬＭＱＬＩＬＥＧＡＭＲＳＣＤＧＮＬＷＤＫＳＡＹＲＲＦＶＶＤＮＣＫＳＩＹＦＡＧＨＤＳＴＡＶＳＶＳＷＣＬＭＬＬＡＬＮＰＳＷＱＶＫＩＲＤＥＩＬＳＳＣＫＮＧＩＰＤＡＥＳＩＰＮＬＫＴＶＴＭＶＩＱＥＴＭＲＬＹＰＰＡＰＩＶＧＲＥＡＳＫＤＩＲＬＧＤＬＶＶＰＫＧＶＣＩＷＴＬＩＰＡＬＨＲＤＰＥＩＷＧＰＤＡＮＤＦＫＰＥＲＦＳＥＧＩＳＫＡＣＫＹＰＱＳＹＩＰＦＧＬＧＰＲＴＣＶＧＫＮＦＧＭＭＥＶＫＶＬＶＳＬＩＶＳＫＦＳＦＴＬＳＰＴＹＱＨＳＰＳＨＫＬＬＶＥＰＱＨＧＶＶＩＲＶＶ
＞ｔ２６−８ＲＰＡｔＫＡＨ
（配列番号２８）
ＭＡＬＬＬＡＶＦＶＹＧＲＡＶＶＥＱＷＲＭＲＲＳＬＫＬＱＧＶＫＧＰＰＰＳＩＦＮＧＮＶＳＥＭＱＲＩＱＳＥＡＫＨＣＳＧＤＮＩＩＳＨＤＹＳＳＳＬＦＰＨＦＤＨＷＲＫＱＹＧＲＩＹＴＹＳＴＧＬＫＱＨＬＹＩＮＨＰＥＭＶＫＥＬＳＱＴＮＴＬＮＬＧＲＩＴＨＩＴＫＲＬＮＰＩＬＧＮＧＩＩＴＳＮＧＰＨＷＡＨＱＲＲＩＩＡＹＥＦＴＨＤＫＩＫＧＭＶＧＬＭＶＥＳＡＭＰＭＬＮＫＷＥＥＭＶＫＲＧＧＥＭＧＣＤＩＲＶＤＥＤＬＫＤＶＳＡＤＶＩＡＫＡＣＦＧＳＳＦＳＫＧＫＡＩＦＳＭＩＲＤＬＬＴＡＩＴＫＲＳＶＬＦＲＦＮＧＦＴＤＭＶＦＧＳＫＫＨＧＤＶＤＩＤＡＬＥＭＥＬＥＳＳＩＷＥＴＶＫＥＲＥＩＥＣＫＤＴＨＫＫＤＬＭＱＬＩＬＥＧＡＭＲＳＣＤＧＮＬＷＤＫＳＡＹＲＲＦＶＶＤＮＣＫＳＩＹＦＡＧＨＤＳＴＡＶＳＶＳＷＣＬＭＬＬＡＬＮＰＳＷＱＶＫＩＲＤＥＩＬＳＳＣＫＮＧＩＰＤＡＥＳＩＰＮＬＫＴＶＴＭＶＩＱＥＴＭＲＬＹＰＰＡＰＩＶＧＲＥＡＳＫＤＩＲＬＧＤＬＶＶＰＫＧＶＣＩＷＴＬＩＰＡＬＨＲＤＰＥＩＷＧＰＤＡＮＤＦＫＰＥＲＦＳＥＧＩＳＫＡＣＫＹＰＱＳＹＩＰＦＧＬＧＰＲＴＣＶＧＫＮＦＧＭＭＥＶＫＶＬＶＳＬＩＶＳＫＦＳＦＴＬＳＰＴＹＱＨＳＰＳＨＫＬＬＶＥＰＱＨＧＶＶＩＲＶＶ
＞ｔ１４−８ＲＰＡｔＫＡＨ
（配列番号２９）
ＭＡＬＬＬＡＶＦＩＶＩＶＧＩＦＳＶＧＹＨＶＹＧＲＡＶＶＥＱＷＲＭＲＲＳＬＫＬＱＧＶＫＧＰＰＰＳＩＦＮＧＮＶＳＥＭＱＲＩＱＳＥＡＫＨＣＳＧＤＮＩＩＳＨＤＹＳＳＳＬＦＰＨＦＤＨＷＲＫＱＹＧＲＩＹＴＹＳＴＧＬＫＱＨＬＹＩＮＨＰＥＭＶＫＥＬＳＱＴＮＴＬＮＬＧＲＩＴＨＩＴＫＲＬＮＰＩＬＧＮＧＩＩＴＳＮＧＰＨＷＡＨＱＲＲＩＩＡＹＥＦＴＨＤＫＩＫＧＭＶＧＬＭＶＥＳＡＭＰＭＬＮＫＷＥＥＭＶＫＲＧＧＥＭＧＣＤＩＲＶＤＥＤＬＫＤＶＳＡＤＶＩＡＫＡＣＦＧＳＳＦＳＫＧＫＡＩＦＳＭＩＲＤＬＬＴＡＩＴＫＲＳＶＬＦＲＦＮＧＦＴＤＭＶＦＧＳＫＫＨＧＤＶＤＩＤＡＬＥＭＥＬＥＳＳＩＷＥＴＶＫＥＲＥＩＥＣＫＤＴＨＫＫＤＬＭＱＬＩＬＥＧＡＭＲＳＣＤＧＮＬＷＤＫＳＡＹＲＲＦＶＶＤＮＣＫＳＩＹＦＡＧＨＤＳＴＡＶＳＶＳＷＣＬＭＬＬＡＬＮＰＳＷＱＶＫＩＲＤＥＩＬＳＳＣＫＮＧＩＰＤＡＥＳＩＰＮＬＫＴＶＴＭＶＩＱＥＴＭＲＬＹＰＰＡＰＩＶＧＲＥＡＳＫＤＩＲＬＧＤＬＶＶＰＫＧＶＣＩＷＴＬＩＰＡＬＨＲＤＰＥＩＷＧＰＤＡＮＤＦＫＰＥＲＦＳＥＧＩＳＫＡＣＫＹＰＱＳＹＩＰＦＧＬＧＰＲＴＣＶＧＫＮＦＧＭＭＥＶＫＶＬＶＳＬＩＶＳＫＦＳＦＴＬＳＰＴＹＱＨＳＰＳＨＫＬＬＶＥＰＱＨＧＶＶＩＲＶＶ
＞ＳｒＣＰＲ  ＡＢＢ８８８３９．２｜ＮＡＤＰＨシトクロムＰ４５０レダクターゼ［Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ］
（配列番号３０）
ＭＱＳＤＳＶＫＶＳＰＦＤＬＶＳＡＡＭＮＧＫＡＭＥＫＬＮＡＳＥＳＥＤＰＴＴＬＰＡＬＫＭＬＶＥＮＲＥＬＬＴＬＦＴＴＳＦＡＶＬＩＧＣＬＶＦＬＭＷＲＲＳＳＳＫＫＬＶＱＤＰＶＰＱＶＩＶＶＫＫＫＥＫＥＳＥＶＤＤＧＫＫＫＶＳＩＦＹＧＴＱＴＧＴＡＥＧＦＡＫＡＬＶＥＥＡＫＶＲＹＥＫＴＳＦＫＶＩＤＬＤＤＹＡＡＤＤＤＥＹＥＥＫＬＫＫＥＳＬＡＦＦＦＬＡＴＹＧＤＧＥＰＴＤＮＡＡＮＦＹＫＷＦＴＥＧＤＤＫＧＥＷＬＫＫＬＱＹＧＶＦＧＬＧＮＲＱＹＥＨＦＮＫＩＡＩＶＶＤＤＫＬＴＥＭＧＡＫＲＬＶＰＶＧＬＧＤＤＤＱＣＩＥＤＤＦＴＡＷＫＥＬＶＷＰＥＬＤＱＬＬＲＤＥＤＤＴＳＶＴＴＰＹＴＡＡＶＬＥＹＲＶＶＹＨＤＫＰＡＤＳＹＡＥＤＱＴＨＴＮＧＨＶＶＨＤＡＱＨＰＳＲＳＮＶＡＦＫＫＥＬＨＴＳＱＳＤＲＳＣＴＨＬＥＦＤＩＳＨＴＧＬＳＹＥＴＧＤＨＶＧＶＹＳＥＮＬＳＥＶＶＤＥＡＬＫＬＬＧＬＳＰＤＴＹＦＳＶＨＡＤＫＥＤＧＴＰＩＧＧＡＳＬＰＰＰＦＰＰＣＴＬＲＤＡＬＴＲＹＡＤＶＬＳＳＰＫＫＶＡＬＬＡＬＡＡＨＡＳＤＰＳＥＡＤＲＬＫＦＬＡＳＰＡＧＫＤＥＹＡＱＷＩＶＡＮＱＲＳＬＬＥＶＭＱＳＦＰＳＡＫＰＰＬＧＶＦＦＡＡＶＡＰＲＬＱＰＲＹＹＳＩＳＳＳＰＫＭＳＰＮＲＩＨＶＴＣＡＬＶＹＥＴＴＰＡＧＲＩＨＲＧＬＣＳＴＷＭＫＮＡＶＰＬＴＥＳＰＤＣＳＱＡＳＩＦＶＲＴＳＮＦＲＬＰＶＤＰＫＶＰＶＩＭＩＧＰＧＴＧＬＡＰＦＲＧＦＬＱＥＲＬＡＬＫＥＳＧＴＥＬＧＳＳＩＦＦＦＧＣＲＮＲＫＶＤＦＩＹＥＤＥＬＮＮＦＶＥＴＧＡＬＳＥＬＩＶＡＦＳＲＥＧＴＡＫＥＹＶＱＨＫＭＳＱＫＡＳＤＩＷＫＬＬＳＥＧＡＹＬＹＶＣＧＤＡＫＧＭＡＫＤＶＨＲＴＬＨＴＩＶＱＥＱＧＳＬＤＳＳＫＡＥＬＹＶＫＮＬＱＭＳＧＲＹＬＲＤＶＷ
＞ＡｔＣＰＲ［Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ］
（配列番号３１）
ＭＴＳＡＬＹＡＳＤＬＦＫＱＬＫＳＩＭＧＴＤＳＬＳＤＤＶＶＬＶＩＡＴＴＳＬＡＬＶＡＧＦＶＶＬＬＷＫＫＴＴＡＤＲＳＧＥＬＫＰＬＭＩＰＫＳＬＭＡＫＤＥＤＤＤＬＤＬＧＳＧＫＴＲＶＳＩＦＦＧＴＱＴＧＴＡＥＧＦＡＫＡＬＳＥＥＩＫＡＲＹＥＫＡＡＶＫＶＩＤＬＤＤＹＡＡＤＤＤＱＹＥＥＫＬＫＫＥＴＬＡＦＦＣＶＡＴＹＧＤＧＥＰＴＤＮＡＡＲＦＳＫＷＦＴＥＥＮＥＲＤＩＫＬＱＱＬＡＹＧＶＦＡＬＧＮＲＱＹＥＨＦＮＫＩＧＩＶＬＤＥＥＬＣＫＫＧＡＫＲＬＩＥＶＧＬＧＤＤＤＱＳＩＥＤＤＦＮＡＷＫＥＳＬＷＳＥＬＤＫＬＬＫＤＥＤＤＫＳＶＡＴＰＹＴＡＶＩＰＥＹＲＶＶＴＨＤＰＲＦＴＴＱＫＳＭＥＳＮＶＡＮＧＮＴＴＩＤＩＨＨＰＣＲＶＤＶＡＶＱＫＥＬＨＴＨＥＳＤＲＳＣＩＨＬＥＦＤＩＳＲＴＧＩＴＹＥＴＧＤＨＶＧＶＹＡＥＮＨＶＥＩＶＥＥＡＧＫＬＬＧＨＳＬＤＬＶＦＳＩＨＡＤＫＥＤＧＳＰＬＥＳＡＶＰＰＰＦＰＧＰＣＴＬＧＴＧＬＡＲＹＡＤＬＬＮＰＰＲＫＳＡＬＶＡＬＡＡＹＡＴＥＰＳＥＡＥＫＬＫＨＬＴＳＰＤＧＫＤＥＹＳＱＷＩＶＡＳＱＲＳＬＬＥＶＭＡＡＦＰＳＡＫＰＰＬＧＶＦＦＡＡＩＡＰＲＬＱＰＲＹＹＳＩＳＳＣＱＤＷＡＰＳＲＶＨＶＴＳＡＬＶＹＧＰＴＰＴＧＲＩＨＫＧＶＣＳＴＷＭＫＮＡＶＰＡＥＫＳＨＥＣＳＧＡＰＩＦＩＲＡＳＮＦＫＬＰＳＮＰＳＴＰＩＶＭＶＧＰＧＴＧＬＡＰＦＲＧＦＬＱＥＲＭＡＬＫＥＤＧＥＥＬＧＳＳＬＬＦＦＧＣＲＮＲＱＭＤＦＩＹＥＤＥＬＮＮＦＶＤＱＧＶＩＳＥＬＩＭＡＦＳＲＥＧＡＱＫＥＹＶＱＨＫＭＭＥＫＡＡＱＶＷＤＬＩＫＥＥＧＹＬＹＶＣＧＤＡＫＧＭＡＲＤＶＨＲＴＬＨＴＩＶＱＥＱＥＧＶＳＳＳＥＡＥＡＩＶＫＫＬＱＴＥＧＲＹＬＲＤＶＷ
【図１】
2017532976.tif 000032
【図２】
2017532976.tif 000033
【図３】
2017532976.tif 000034
【図４】
2017532976.tif 000035
【図５】
2017532976.tif 000036
【図６】
2017532976.tif 000037
【図７】
2017532976.tif 000038
【図８】
2017532976.tif 000039
【図９】
2017532976.tif 000040
【図９−１】
2017532976.tif 000041
【図１０】
2017532976.tif 000042
【図１１】
2017532976.tif 000043
【図１２】
2017532976.tif 000044
【図１３−１】
2017532976.tif 000045
【図１３−２】
2017532976.tif 000046
【図１４】
2017532976.tif 000047
【図１５】
2017532976.tif 000048
【図１６】
2017532976.tif 000049
【図１７】
2017532976.tif 000050
【図１８−１】
2017532976.tif 000051
【図１８−２】
2017532976.tif 000052
【図１９】
2017532976.tif 000053
【図２０Ａ】
2017532976.tif 000054
【図２０Ｂ】
2017532976.tif 000055
【図２０Ｃ】
2017532976.tif 000056
【図２１】
2017532976.tif 000057
【図２２】
2017532976.tif 000058
【図２３】
2017532976.tif 000059
【図２４】
2017532976.tif 000060
【図２５】
2017532976.tif 000061
【図２６】
2017532976.tif 000062
【図２７】
2017532976.tif 000063
【図２８】
2017532976.tif 000064
【図２９】
2017532976.tif 000065
【図３０】
2017532976.tif 000066
【図３１】
2017532976.tif 000067
【図３２−１】
2017532976.tif 000068
【図３２−２】
2017532976.tif 000069
【図３２−３】
2017532976.tif 000070
【図３３−１】
2017532976.tif 000071
【図３３−２】
2017532976.tif 000072
【図３３−３】
2017532976.tif 000073
【図３４】
2017532976.tif 000074
【図３５】
2017532976.tif 000075
【図３６】
2017532976.tif 000076
【図３７】
2017532976.tif 000077
【図３８−１】
2017532976.tif 000078
【図３８−２】
2017532976.tif 000079
【図３９】
2017532976.tif 000080
【図４０】
2017532976.tif 000081
【図４１】
2017532976.tif 000082
【図４２】
2017532976.tif 000083
【図４３Ａ】
2017532976.tif 000084
【図４３Ｂ】
2017532976.tif 000085
【図４３Ｃ】
2017532976.tif 000086
【図４４Ａ】
2017532976.tif 000087
【図４４Ｂ】
2017532976.tif 000088
【図４５】
2017532976.tif 000089
【図４６Ａ】
2017532976.tif 000090
【図４６Ｂ】
2017532976.tif 000091
【図４７】
2017532976.tif 000092
【図４８】
2017532976.tif 000093
【図４９】
2017532976.tif 000094
【図５０】
2017532976.tif 000095
【図５１Ａ】
2017532976.tif 000096
【図５１Ｂ】
2017532976.tif 000097
【図５２】
2017532976.tif 000098
【図５３】
2017532976.tif 000099
【図５４】
2017532976.tif 000100
【配列表】
2017532976000001.app
【国際調査報告】
2017532976.tif 000101
2017532976.tif 000102
2017532976.tif 000103