(57)【要約】  免疫チェックポイントの調節因子を評価するための組成物、システム、及び方法を本明細書において提供する。特に、免疫チェックポイントを阻害する試験因子の効能を評価するための人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）及び免疫エフェクター細胞を提供する。いくつかの実施形態において、表面において（１）抗原応答要素活性化因子及び（２）免疫チェックポイントリガンド（ＩＣＬ）を提示する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）またはリン脂質液滴を含む組成物を本明細書において提供する。いくつかの実施形態において、抗原応答要素活性化因子は、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）複合体活性化因子である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面においてＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）活性化因子及び免疫チェックポイントリガンド（ＩＣＬ）を提示する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）またはリン脂質液滴を含む組成物。
【請求項２】
前記ａＡＰＣとＴＣＲ及び免疫チェックポイントレセプター（ＩＣＲ）を含むエフェクター細胞との相互作用の際、前記ＴＣＲ活性化因子が、前記エフェクター細胞のＴＣＲを活性化し、前記ＩＣＬが前記ＩＣＲと相互作用して、ＩＣＲ／ＩＣＬ複合体を形成する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＩＣＲ／ＩＣＬ複合体の形成が、ＴＣＲ活性化の下流の効果を調節する、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＴＣＲ活性化因子が、抗分化抗原群列３（ＣＤ３）抗体、もしくはその抗体フラグメント、または主要組織適合複合体（ＭＨＣ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＩＣＬが、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ１５５、ガレクチン−９、及びＨＶＥＭからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記ａＡＰＣが、リン脂質、ＴＣＲ活性化因子、ＩＣＬ、または免疫刺激レセプターリガンドをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
（ａ）表面において免疫チェックポイントレセプター（ＩＣＲ）を提示し、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）を含むエフェクター細胞と；
（ｂ）表面においてＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）活性化因子及び免疫チェックポイントリガンド（ＩＣＬ）を提示する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）またはリン脂質液滴と；
を含むシステムであって、前記ＩＣＲ及びＩＣＬが、相互作用の際にＩＣＲ／ＩＣＬ複合体を形成する、前記システム。
【請求項８】
前記ＩＣＲ／ＩＣＬ複合体の形成が、前記ＴＣＲ活性化因子によるＴＣＲ活性化の調節及び／または１以上のＴＣＲ依存性経路の調節を結果として生じさせる、請求項７に記載のシステム。
【請求項９】
調節が：
（ａ）前記ＴＣＲ活性化因子及び／もしくは１以上のＴＣＲ依存性経路によるＴＣＲ活性化の阻害；または
（ｂ）前記ＴＣＲ活性化因子及び／もしくは１以上のＴＣＲ依存性経路によるＴＣＲ活性化の向上
を含む、請求項８に記載のシステム。
【請求項１０】
前記ＴＣＲ活性化因子が、抗分化抗原群列３（ＣＤ３）抗体、もしくはその抗体フラグメント、または主要組織適合複合体（ＭＨＣ）である、請求項７に記載のシステム。
【請求項１１】
前記ＩＣＬが、ＣＤ８０／８６ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ１５５、ガレクチン−９、及びＨＶＥＭからなる群から選択される、請求項７に記載のシステム。
【請求項１２】
前記ＩＣＲが、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＩＬ−１０レセプター、及びＢＴＬＡからなる群から選択される、請求項７に記載のシステム。
【請求項１３】
前記エフェクター細胞が、Ｊｕｒｋａｔ、ＨｕＴ−７８、ＣＥＭ、Ｍｏｌｔ−４及び一次Ｔ細胞を含むＴ細胞から選択される、請求項７に記載のシステム。
【請求項１４】
前記エフェクター細胞が、ＴＣＲ活性化、ＴＣＲ経路活性化、及び／またはＴＣＲ活性化もしくはＴＣＲ経路活性化のＩＣＲ／ＩＣＬ複合体調節のレポーターをさらに含む、請求項７に記載のシステム。
【請求項１５】
前記レポーターの特徴が、細胞濃度、発現、活性、局在、タンパク質修飾、またはタンパク質−タンパク質相互作用を含む、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１６】
前記ＩＣＲ／ＩＣＬ複合体の形成が、前記特徴を調節する、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１７】
前記レポーターが、前記エフェクター細胞型に内在性であって、ＴＣＲ活性化、ＴＣＲ経路活性化、及び／またはＴＣＲ活性化もしくはＴＣＲ経路活性化のＩＣＲ／ＩＣＬ複合体調節を検出可能でありかつこれと相関する特徴を有する天然レポーターである、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１８】
前記レポーターが、前記エフェクター細胞型に外因性であって、ＴＣＲ活性化、ＴＣＲ経路活性化、及び／またはＴＣＲ活性化もしくはＴＣＲ経路活性化のＩＣＲ／ＩＣＬ複合体調節を検出可能でありかつこれと相関する特徴を有する人工レポーターである、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１９】
前記レポーターが遺伝子であり、その発現が、ＴＣＲ経路依存性レポーターの制御下にある、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２０】
前記ＴＣＲ経路依存性レポーターが、活性化Ｔ細胞（ＮＦＡＴ）プロモーターの核因子である、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２１】
前記レポーターが、ルシフェラーゼ、ベータラクタマーゼ、ＣＡＴ、ＳＥＡＰ、蛍光タンパク質、及び定量化可能な遺伝子産物からなる群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２２】
遮断因子または試験遮断因子をさらに含む、請求項７に記載のシステム。
【請求項２３】
前記遮断因子が、前記ＩＣＲ／ＩＣＬ複合体の形成を阻害して、ＴＣＲ活性化またはＴＣＲ経路活性化の調節を結果として生じさせる、請求項２２に記載のシステム。
【請求項２４】
前記遮断因子または試験遮断因子が、小分子、ペプチド、タンパク質、または抗体である、請求項２２に記載のシステム。
【請求項２５】
（ａ）表面におけるＴＣＲ及びＰＤ−１と、ＮＦＡＴ−プロモーター依存性ルシフェラーゼをと含むエフェクター細胞と；
（ｂ）表面において抗ＣＤ３抗体または抗体フラグメント及びＰＤ−Ｌ１を提示する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）と
を含むシステム。
【請求項２６】
ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１複合体の形成が、前記ＮＦＡＴ−プロモーター依存性ルシフェラーゼの抑制された発現を結果として生じさせる、請求項２５に記載のシステム。
【請求項２７】
遮断因子または試験遮断因子をさらに含む、請求項２６に記載のシステム。
【請求項２８】
前記遮断因子または試験遮断因子が、前記ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１複合体の形成を阻害して、前記ＮＦＡＴ−プロモーター依存性ルシフェラーゼの増加された発現を結果として生じさせる、請求項２７に記載のシステム。
【請求項２９】
（ａ）
（ｉ）表面において免疫チェックポイントレセプター（ＩＣＲ）を提示し、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）及びＴＣＲ経路依存性レポーターを含むエフェクター細胞と、
（ｉｉ）表面においてＴＣＲ活性化因子及び免疫チェックポイントリガンド（ＩＣＬ）を提示する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）と
を含むシステムを形成することにおいて、前記ＩＣＲ及びＩＣＬが、相互作用の際にＩＣＲ／ＩＣＬ複合体を形成し、前記ＩＣＲ／ＩＣＬ複合体の形成が、前記ＴＣＲ活性化因子によるＴＣＲ活性化の調節及び／または１以上のＴＣＲ依存性経路の調節を結果として生じさせることと；
（ｂ）前記ＴＣＲ経路依存性レポーターまたは前記レポーターからのシグナルを検出することと
を含む方法。
【請求項３０】
前記システムを遮断因子に添加することをさらに含み、前記遮断因子が、前記ＩＣＲ／ＩＣＬ複合体の形成を阻害し、または前記ＴＣＲ活性化因子によるＴＣＲ活性化のＩＣＲ／ＩＣＬ依存性調節及び／もしくは１以上のＴＣＲ依存性経路の調節を阻害する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＴＣＲ経路依存性レポーターまたは前記レポーターからのシグナルが、前記遮断因子の添加の（１）前、（２）同時、及び／または（３）後に検出される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記遮断因子の添加の（１）前、（２）同時、及び／または（３）後にシグナルを比較して、前記遮断因子の効果を決定するステップをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
（ａ）
（ｉ）表面においてＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）及び免疫チェックポイントレセプター（ＩＣＲ）と、ＴＣＲ活性化経路依存性レポーターとを提示するエフェクター細胞と、
（ｉｉ）ＴＣＲ活性化因子及び免疫チェックポイントリガンド（ＩＣＬ）を提示する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）において、前記ＩＣＲ及びＩＣＬが、相互作用の際にＩＣＲ／ＩＣＬ複合体を形成する、前記人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）と
を共培養することと；
（ｂ）前記試験遮断因子を添加することと；
（ｃ）前記レポーターからの前記シグナルを検出することと；
（ｄ）前記レポーターからの前記シグナルを対照と比較することにおいて、前記対照についてのシグナルのゲインが、前記試験遮断因子による前記ＩＣＲ／ＩＣＬ複合体の阻害を示すことと
を含む前記方法。
【請求項３４】
ＩＣＲ／ＩＣＬ遮断因子を同定する方法であって：
（ａ）
（ｉ）表面においてＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）及び免疫チェックポイントレセプター（ＩＣＲ）と、ＴＣＲ経路依存性レポーターとを提示するエフェクター細胞と、
（ｉｉ）抗分化抗原群列３（ＣＤ３）抗体及び免疫チェックポイントリガンドを提示する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）において、前記ＩＣＲ及びＩＣＬが、相互作用の際にＩＣＲ／ＩＣＬ複合体を形成する、前記人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）と
を共培養することと；
（ｂ）前記レポーターからのシグナルを検出することと；
（ｃ）前記試験遮断因子を添加することと；
（ｄ）前記レポーターからの前記シグナルの検出を繰り返すことと；
（ｅ）ステップ（ｂ）からの前記シグナルをステップ（ｄ）からの前記シグナルと比較することにおいて、ステップ（ｂ）からステップ（ｄ）のシグナルのゲインが、前記試験遮断因子による前記ＩＣＲ／ＩＣＬ複合体の阻害を示すことと
を含む、前記方法。
【請求項３５】
ＩＣＲ／ＩＣＬ遮断因子を同定する方法であって：
（ａ）
（ｉ）表面においてＰＤ−１を表示し、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）及び活性化Ｔ細胞（ＮＦＡＴ）プロモーター依存性ルシフェラーゼレポーターの核因子を含むエフェクター細胞を、
（ｉｉ）抗分化抗原群列３（ＣＤ３）抗体及びＰＤ−Ｌ１を提示する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）と
接触させることと；
（ｂ）前記ＮＦＡＴ−プロモーター依存性ルシフェラーゼレポーターからのシグナルを検出することと
を含む、前記方法。
【請求項３６】
（ｃ）前記試験遮断因子を添加することと；
（ｄ）前記レポーターからの前記シグナルの検出を繰り返すことと
をさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
（ｅ）ステップ（ｂ）からの前記シグナルをステップ（ｄ）からの前記シグナルと比較することをさらに含み、ステップ（ｂ）からステップ（ｄ）のシグナルのゲインが、前記試験遮断因子による前記ＩＣＲ／ＩＣＬ複合体の阻害を示している、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
表面においてＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）活性化因子及び免疫チェックポイントリガンド（ＩＣＬ）を提示する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を、天然エフェクター細胞を含むシステムに投与することを含む方法。
【請求項３９】
表面においてＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）活性化因子及び免疫チェックポイントリガンド（ＩＣＬ）を提示する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を、人工エフェクター細胞を含むシステムに投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対するクロスリファレンス
本発明は、２０１４年１１月２０日に提出された米国仮特許出願第６２／０８２，４５８号の優先権の利益を主張し、その全体が参照により組み込まれる。
【０００２】
免疫チェックポイントの調節因子を評価するための組成物、システム、及び方法を本明細書において提供する。特に、免疫チェックポイントを阻害する試験因子の効能を評価するための人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）及び免疫エフェクター細胞を提供する。
【背景技術】
【０００３】
治療的抗腫瘍免疫を活性化することに対する最も有望なアプローチの中に、免疫チェックポイントの遮断がある。免疫チェックポイントとは、自己寛容を維持しかつ生理的免疫応答の持続及び振幅を調節するのに重要である、免疫系に元来備わっている大量の阻害経路を称する。腫瘍は、特に、腫瘍抗原に特異的であるＴ細胞に対して、主な免疫耐性機構としてある特定の免疫チェックポイント経路を選出することが現在のところ明らかである。免疫チェックポイントの多くは、リガンド−レセプター相互作用によって開始されるため、これらの相互作用を阻害する因子によって、例えば、リガンドまたはレセプターに特異的な抗体によって遮断され得る。
【０００４】
がん処置のターゲットとして調査されてきたリガンド−レセプター相互作用は、膜透過プログラム細胞死１タンパク質（ＰＤ−１；ＣＤ２７９としても知られている）と、そのリガンド、ＰＤ−１リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）及びＰＤ−１リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）との間の相互作用である。通常の生理学では、細胞の表面上のＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２が、免疫細胞の活性を阻害する、免疫細胞の表面上のＰＤ−１に結合する。いくつかのがん細胞の表面上のＰＤ−Ｌ１を上方調節することにより、さもなければ腫瘍を攻撃するＴ細胞を阻害することによって該がん細胞が宿主免疫系を回避することを可能にする場合がある。ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１のいずれかに結合し、これにより相互作用を遮断する抗体は、阻害メカニズムを無効にして、免疫細胞ががん細胞または腫瘍を攻撃することを可能にする。ＮＩＶＯＬＵＭＡＢと呼ばれるＩｇＧ４ＰＤ−１抗体による最初の臨床試験結果が公開されている（Ｐａｒｄｏｌｌ，ＤＭ（２０１２年３月２２日）．「Ｔｈｅ  ｂｌｏｃｋａｇｅ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．」Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ｃａｎｃｅｒ．１２（４）：２５２−６４．；全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０００５】
免疫遮断レセプターに対する抗体を測定する常套的な方法は、多数の欠点を有している。例えば、動物モデルは、担がんマウスにおける腫瘍塊の表現型分析、平均生存時間、マウスの全生存率などによってｍＡｂ遮断の抗腫瘍効果を評価するのに使用され得る。かかる分析は、桁違いのコスト及び時間という主な欠点を有する。代替として、新たに単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が、サイトカイン産生の阻害遮断における免疫治療薬を研究するのに使用され得る。例えば、凍結保存ＰＢＭＣが臨床研究において使用されており、成人対照被検体から得られたＰＢＭＣ誘導ＣＤ３＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４５＋／ＣＤ１４＋単球においてＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１の両方の発現が有意に低減されたことが報告されている。しかし、ＰＢＭＣの単離は退屈なものであり、また、かかる実験は、結果において大きな変動を生じる。最終的に、免疫チェックポイントレセプターを過剰発現するＪｕｒｋａｔ細胞においてＩＬ−２産生を測定するための細胞ベースのアッセイ（ＥＬＩＳＡベースのアッセイ）が開発されたが、かかるアッセイは、実施するのに抗体刺激後最低２日を必要とする。免疫チェックポイントレセプターに対する抗体の有効性を測定するための便利な方法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
免疫チェックポイントの調節因子を評価するための組成物、システム、及び方法を本明細書において提供する。特に、免疫チェックポイントを阻害する試験因子（例えば、抗体）の効能を評価するする人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）及び免疫エフェクター細胞を提供する。
【０００７】
いくつかの実施形態において、表面において（１）抗原応答要素活性化因子及び（２）免疫チェックポイントリガンド（ＩＣＬ）を提示する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）またはリン脂質液滴を含む組成物を本明細書において提供する。いくつかの実施形態において、抗原応答要素活性化因子は、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）複合体活性化因子である。いくつかの実施形態において、表面においてＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）活性化因子及び免疫チェックポイントリガンド（ＩＣＬ）を提示する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）またはリン脂質液滴を含む組成物を提供する。本明細書に記載されている実施形態は、ＴＣＲ複合体及びＴＣＲ活性化因子を参照して典型的には記載されているが、本明細書に記載されている組成物、システム、及び方法はまた、他の抗原応答要素及びその活性化因子に適用されてもよい。いくつかの実施形態において、ａＡＰＣは、その表面において、第２（または第３、第４など）の異なる免疫チェックポイントリガンドをさらに提示する。
【０００８】
いくつかの実施形態において、ＴＣＲ活性化因子は、ＴＣＲ複合体の構成要素に結合またはさもなければ相互作用してＴＣＲ複合体及びＴＣＲ依存性経路を活性化する表面提示分子実体（例えば、タンパク質、ペプチド、ポリペプチドなど）である。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ活性化因子は、抗分化抗原群列３抗体（抗ＣＤ３）、抗ＣＤ３の抗体フラグメントを含有する膜融合タンパク質、またはその抗体フラグメント、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）などである。
【０００９】
いくつかの実施形態において、ＩＣＬは、エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｊｕｒｋａｔなど）において免疫チェックポイントレセプター（ＩＣＲ）と相互作用してエフェクター細胞の免疫応答を調節（例えば、阻害、向上など）する分子実体（例えば、タンパク質、ペプチド、ポリペプチドなど）である。いくつかの実施形態において、ＩＣＬは、限定されないが、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ１５５、ガレクチン−９、ＨＶＥＭなどを含めたいずれかの好適な免疫チェックポイントリガンドである。
【００１０】
いくつかの実施形態において、表面において（１）ＴＣＲ活性化因子（例えば、抗ＣＤ３）及び（２）免疫チェックポイントリガンド（例えば、ＰＤ−Ｌ１）を提示する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を含む組成物を本明細書において提供する。
【００１１】
いくつかの実施形態において、ＡＰＣの人工、外因性、及び／または改変要素として、限定されないが、ＴＣＲ活性化因子（例えば、抗ＣＤ３抗体、ＭＨＣなど）、免疫チェックポイントリガンド（例えば、ＰＤ−Ｌ１）などが挙げられる。
【００１２】
いくつかの実施形態において、表面においてＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）活性化因子及び免疫チェックポイントリガンド（ＩＣＬ）を提示する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）またはリン脂質液滴を含む組成物を本明細書において提供する。いくつかの実施形態において、ａＡＰＣまたはリン脂質液滴とＴＣＲ及び免疫チェックポイントレセプター（ＩＣＲ）を含むエフェクター細胞との相互作用の際、ＴＣＲ活性化因子が、エフェクター細胞のＴＣＲを活性化し、ＩＣＬが、ＩＣＲ／ＩＣＬ複合体を形成するＩＣＲと相互作用する。いくつかの実施形態において、ＩＣＲ／ＩＣＬ複合体の形成は、ＴＣＲ活性化の下流の効果を調節する。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ活性化因子は、抗分化抗原群列３（ＣＤ３）抗体、もしくはその抗体フラグメント、または主要組織適合複合体（ＭＨＣ）である。いくつかの実施形態において、ＩＣＬは、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ１５５、ガレクチン−９、及びＨＶＥＭからなる群から選択される。
【００１３】
いくつかの実施形態において、（ａ）表面において（ｉ）Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）活性化因子及び（ｉｉ）免疫チェックポイントリガンド（ＩＣＬ）を提示する人工抗原提示細胞またはリン脂質液滴と、（ｂ）表面において免疫チェックポイントレセプター（ＩＣＲ）を提示し、（ｉ）ＴＣＲ複合体ならびに（ｉｉ）（Ａ）ＩＣＲ／ＩＣＬ複合体形成、（Ｂ）ＴＣＲ活性化、及び／または（Ｃ）ＴＣＲ活性化経路依存性レポーターの１以上のレポーター（例えば、ＴＣＲ経路依存性レポーター）を含む人工エフェクター細胞とを含むシステムを本明細書において提供する。いくつかの実施形態において、ＩＣＲ／ＩＣＬ複合体の形成は、（例えば、ＩＣＲ／ＩＣＬ相互作用の非存在下に対する）ＴＣＲ活性化経路依存性レポーターからのシグナルの検出可能な変更（例えば、活性の変化、表現の変化など）を結果として生じさせる。いくつかの実施形態において、システムは、遮断因子または試験遮断因子をさらに含む。いくつかの実施形態において、遮断因子または試験遮断因子は、ＩＣＲ／ＩＣＬ複合体の形成を阻害し、ＴＣＲ活性化経路依存性レポーターからのシグナルの阻害を結果として生じさせる。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ活性化経路依存性レポーターからのシグナルの変更は、少なくとも２倍（例えば、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、２０００倍、５０００倍、及びこれらの中のいずれかの範囲）である。
【００１４】
いくつかの実施形態において、ＴＣＲ活性化因子は、ＴＣＲ複合体の構成要素に結合またはさもなければ相互作用してＴＣＲ複合体及びＴＣＲ依存性経路を活性にする表面提示分子実体（例えば、タンパク質、ペプチド、ポリペプチドなど）である。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ活性化因子は、抗分化抗原群列３抗体（抗ＣＤ３）またはその抗体フラグメント、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）などである。
【００１５】
いくつかの実施形態において、ＩＣＬは、エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｊｕｒｋａｔなど）において免疫チェックポイントレセプター（ＩＣＲ）と相互作用してエフェクター細胞の免疫応答を調節（例えば、阻害、向上など）する分子実体（例えば、タンパク質、ペプチド、ポリペプチドなど）である。いくつかの実施形態において、ＩＣＬは、限定されないが、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ１５５、ガレクチン−９、ＨＶＥＭなどを含めたいずれかの好適な免疫チェックポイントリガンドである。
【００１６】
いくつかの実施形態において、人工エフェクター細胞は、親（例えば、非人工）細胞にネイティブでない１以上の要素（例えば、レポーター構築物、外因性遺伝子など）を含有、発現等するように改変されている、限定されないが、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＨｕＴ−７８、ＣＥＭ、Ｍｏｌｔ−４などを含む群から選択されるＴ細胞である。
【００１７】
いくつかの実施形態において、ＩＣＲは、限定されないが、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１６０、ＢＴＬＡ、ＩＬ−１０レセプターなどを含めたいずれかの好適な免疫阻害レセプターである。
【００１８】
いくつかの実施形態において、ＴＣＲ複合体は、可変ＴＣＲレセプターα及びβ鎖と、３種の二量体シグナリングモジュールＣＤ３δ／ε、ＣＤ３γ／ε、及びＣＤ２４７ζ／ζまたはζ／ηとの八量体複合体である。
【００１９】
いくつかの実施形態において、レポーター（例えば、ＴＣＲ活性化経路依存性レポーター）は、（ｉ）ＩＣＲ／ＩＣＬ複合体形成、（ｉｉ）ＴＣＲ活性化、及び／または（ｉｉｉ）ＴＣＲシグナリング経路の活性化の１以上に依存するまたはこれと相関する特徴（例えば、活性、発現、濃度、局在、相互作用、修飾など）を有するエフェクター細胞におけるまたは該細胞内の要素である。いくつかの実施形態において、レポーターは、ＩＣＲ／ＩＣＬ複合体形成及び／またはＴＣＲ活性化の下流にある（例えば、改変レポーター構築物、上記エフェクター細胞内に自然発生する、検出可能な要素／シグナル／相互作用）。いくつかの実施形態において、レポーターは、（ｉ）ＩＣＲ／ＩＣＬ複合体形成、（ｉｉ）ＴＣＲ活性化、及び／または（ｉｉｉ）ＴＣＲシグナリング経路の１以上によって変更される特徴（例えば、活性、発現、濃度、局在、相互作用、修飾など）を有するエフェクター細胞におけるまたは該細胞内の要素である。いくつかの実施形態において、レポーターは、エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞などの内在性要素）に内在性である。かかる実施形態において、内在性レポーターの特徴の変更は、ｉ）ＩＣＲ／ＩＣＬ複合体形成、（ｉｉ）ＴＣＲ活性化、及び／または（ｉｉｉ）ＴＣＲシグナリング経路活性化の１以上の存在、非存在及び／またはレベルのシグナルとして検出可能である。例示的な内在性レポーター及び／またはシグナルとして、限定されないが、遺伝子発現（例えば、ＴＣＲ経路依存性遺伝子の）、タンパク質濃度（例えば、ＴＣＲ経路依存性遺伝子によって発現されるタンパク質）、タンパク質−タンパク質相互作用（例えば、ＩＣＲ／ＩＣＬ複合体形成及び／またはＴＣＲ活性化によって媒介される）、ＴＣＲ依存性タンパク質（例えば、酵素、プロテイナーゼ、キナーゼ）の活性、内在性エフェクター細胞要素の局在及び移動などが挙げられる。いくつかの実施形態において、レポーターは、エフェクター細胞（例えば、エフェクター細胞に導入または改変されたレポーター要素または構築物）に対して外在性である。かかる実施形態において、外在性及び／または改変レポーターの特徴の変更は、（ｉ）ＩＣＲ／ＩＣＬ複合体形成、（ｉｉ）ＴＣＲ活性化、及び／または（ｉｉｉ）ＴＣＲシグナリング経路活性化の１以上の存在、非存在及び／またはレベルのシグナルとして検出可能である。例示的な外在性レポーター及び／またはシグナルとして、限定されないが、ＴＣＲ依存性及び／またはＴＣＲ経路依存性レポーター構築物の発現（例えば、ＮＦＡＴ−応答要素、ＮＦ−κＢ−応答要素、ＡＰ１−応答要素、上記言及の応答要素のうち１または複数を含有するプロモーター、ＩＬ−２プロモーターの制御下）、活性化及び／または発現がＴＣＲ−またはＴＣＲ−経路依存性であるレポーター（例えば、ルシフェラーゼ、ベータラクタマーゼ、ＣＡＴ、ＳＥＡＰ、蛍光タンパク質など）の活性、タンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質移動、ｑＰＣＲを介した内因性遺伝子上方調節などが挙げられる。
【００２０】
いくつかの実施形態において、（ａ）表面において（ｉ）Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）活性化因子、（ｉｉ）第１免疫チェックポイントリガンド（ＩＣＬ）、及び（ｉｉｉ）第２ＩＣＬを提示する人工抗原提示細胞またはリン脂質液滴と、（ｂ）表面において（ｉ）第１免疫チェックポイントレセプター（ＩＣＲ）、（ｉｉ）第２ＩＣＲ、及び（ｉｉｉ）ＴＣＲ複合体を提示する人工エフェクター細胞とを含み、（Ａ）第１ＩＣＲ及び第１ＩＣＬ間の複合体形成、（Ｂ）第２ＩＣＲ及び第２ＩＣＬ間の複合体形成、（Ｃ）ＴＣＲ活性化、ならびに／または（Ｄ）ＴＣＲ活性化経路依存性レポーターの１以上のレポーター（例えば、ＴＣＲ経路依存性レポーター）を含むシステムを本明細書において提供する。いくつかの実施形態において、第１ＩＣＲ及び第１ＩＣＬならびに／または第２ＩＣＲ及び第２ＩＣＬ間の複合体の形成は、（例えば、ＩＣＲ／ＩＣＬ相互作用の非存在下に対する）ＴＣＲ活性化経路依存性レポーターからのシグナルの検出可能な変更（例えば、活性の変化、表現の変化など）を結果として生じさせる。いくつかの実施形態において、システムは、遮断因子または試験遮断因子をさらに含む。いくつかの実施形態において、遮断因子または試験遮断因子は、第１ＩＣＲ及び第１ＩＣＬならびに／または第２ＩＣＲ及び第２ＩＣＬ間の複合体の形成を阻害し、ＴＣＲ活性化経路依存性レポーターからのシグナルの阻害を結果として生じさせる。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ活性化経路依存性レポーターからのシグナルの変更は、少なくとも２倍（例えば、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、２０００倍、５０００倍、及びこれらの中のいずれかの範囲）である。
【００２１】
いくつかの実施形態において、（ａ）表面においてＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）及び免疫チェックポイントレセプター（ＩＣＲ）、ならびにＴＣＲ活性化経路依存性レポーター（例えば、活性化Ｔ細胞（ＮＦＡＴ）プロモーターの核因子依存性レポーター）を提示するエフェクター細胞と、（ｂ）ＴＣＲ活性化因子（例えば、表面発現された抗分化抗原群列３抗体または抗体フラグメント、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）など）及び免疫チェックポイントリガンド（ＩＣＬ）を提示する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）とを含むシステムであって、ＩＣＲ及びＩＣＬが、相互作用の際にＩＣＲ／ＩＣＬ複合体を形成する、上記システムを本明細書において提供する。いくつかの実施形態において、ＩＣＲ／ＩＣＬ複合体の形成は、ＮＦＡＴ−プロモーター依存性レポーターの抑制された発現を結果として生じさせる。いくつかの実施形態において、システムは、遮断因子または試験遮断因子をさらに含む。いくつかの実施形態において、遮断因子または試験遮断因子は、ＩＣＲ／ＩＣＬ複合体の形成を阻害して、ＮＦＡＴ−プロモーター依存性レポーターの増加された発現を結果として生じさせる。いくつかの実施形態において、増加された発現は、少なくとも２倍（例えば、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、２０００倍、５０００倍、及びこれらの中のいずれかの範囲）である。いくつかの実施形態において、増加された発現は、抑制された発現に対して６〜１２倍増加する。いくつかの実施形態において、エフェクター細胞は、限定されないが、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＨｕＴ−７８、ＣＥＭ、Ｍｏｌｔ−４などを含めたＴ細胞である。いくつかの実施形態において、レポーターは、ルシフェラーゼ、ベータラクタマーゼ、ＣＡＴ、ＳＥＡＰ、蛍光タンパク質、遺伝子産物（例えば、ｑＰＣＲ、質量分析などによって検出される）などである。いくつかの実施形態において、ＩＣＲは、限定されないが、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１６０、ＢＴＬＡ、ＩＬ−１０レセプターなどを含めたいずれかの免疫阻害レセプターであり、ＩＣＬは、限定されないが、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ１５５、ガレクチン−９、ＨＶＥＭなどを含めたいずれかの対応する免疫阻害リガンドである。いくつかの実施形態において、遮断因子または試験遮断因子は、抗体（もしくは抗体フラグメント）、タンパク質、ペプチド、もしくは小分子、ワクチン、またはこれらの組み合わせである。
【００２２】
いくつかの実施形態において、（ａ）表面におけるＴＣＲ及びＰＤ−１、ならびにＴＣＲ活性化経路依存性（例えば、ＮＦＡＴ−プロモーター依存性）レポーターを含むエフェクター細胞と、（ｂ）表面においてＴＣＲ活性化因子（例えば、抗分化抗原群列３抗体または抗体フラグメント、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）などの表面発現）及びＰＤ−Ｌ１を提示する人工抗原提示細胞とを含むシステムを本明細書において提供する。いくつかの実施形態において、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１複合体の形成は、ＴＣＲ活性化経路依存性（例えば、ＮＦＡＴ−プロモーター依存性）レポーターの抑制された発現を結果として生じさせる。いくつかの実施形態において、システムは、遮断因子または試験遮断因子をさらに含む。いくつかの実施形態において、遮断因子または試験遮断因子は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１複合体の形成を阻害して、ＴＣＲ活性化経路依存性レポーターの増加された発現を結果として生じさせる。いくつかの実施形態において、増加された発現は、少なくとも２倍（例えば、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、２０００倍、５０００倍、及びこれらの中のいずれかの範囲）である。
【００２３】
いくつかの実施形態において、レポーターは、ルシフェラーゼ、ベータラクタマーゼ、ＣＡＴ、ＳＥＡＰ、蛍光タンパク質、タンパク質−タンパク質相互作用などである。いくつかの実施形態において、発現は、（例えば、ｑＰＣＲによって、質量分析によって等）遺伝子発現の量を直接測定することによって検出される。
【００２４】
いくつかの実施形態において、ＴＣＲ、及び、限定されないが、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１６０、ＢＴＬＡ、ＩＬ−１０レセプターなどを含めたいずれかの免疫阻害レセプターを表面において提示し、ＴＣＲ活性化経路依存性レポーター（例えば、ＮＦＡＴ−プロモーター依存性レポーター）、例えばルシフェラーゼ、ベータラクタマーゼ、ＣＡＴ、ＳＥＡＰ、蛍光タンパク質などを含む人工エフェクター細胞を含む組成物を本明細書において提供する。
【００２５】
いくつかの実施形態において、（ａ）表面において免疫チェックポイントレセプター（ＩＣＲ）を提示し、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）を含むエフェクター細胞と、（ｂ）表面においてＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）活性化因子及び免疫チェックポイントリガンド（ＩＣＬ）を提示する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）とを含むシステムであって、ＩＣＲ及びＩＣＬが、相互作用の際にＩＣＲ／ＩＣＬ複合体を形成する、上記システムを本明細書において提供する。いくつかの実施形態において、ＩＣＲ／ＩＣＬ複合体の形成は、ＴＣＲ活性化因子によるＴＣＲ活性化の調節及び／または１以上のＴＣＲ依存性経路の調節を結果として生じさせる。いくつかの実施形態において、調節は、（ａ）ＴＣＲ活性化因子によるＴＣＲ活性化及び／もしくは１以上のＴＣＲ依存性経路の阻害、または（ｂ）ＴＣＲ活性化因子によるＴＣＲ活性化及び／もしくは１以上のＴＣＲ依存性経路の向上を含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ活性化因子は、抗分化抗原群列３（ＣＤ３）抗体、もしくはその抗体フラグメント、または主要組織適合複合体（ＭＨＣ）である。いくつかの実施形態において、ＩＣＬは、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ１５５、ガレクチン−９、及びＨＶＥＭからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＩＣＲは、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＩＬ−１０レセプター、及びＢＴＬＡからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、エフェクター細胞は、Ｊｕｒｋａｔ、ＨｕＴ−７８、ＣＥＭ、及びＭｏｌｔ−４からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、エフェクター細胞は、ＴＣＲ活性化、ＴＣＲ経路活性化、及び／またはＴＣＲ活性化もしくはＴＣＲ経路活性化のＩＣＲ／ＩＣＬ複合体調節のレポーターをさらに含む。いくつかの実施形態において、レポーターの特徴は、細胞濃度、発現、活性、局在、またはタンパク質−タンパク質相互作用を含む。いくつかの実施形態において、ＩＣＲ／ＩＣＬ複合体の形成は、上記特徴を調節する。いくつかの実施形態において、レポーターは、例えば、エフェクター細胞型に内在性であって、ＴＣＲ活性化、ＴＣＲ経路活性化、及び／またはＴＣＲ活性化もしくはＴＣＲ経路活性化のＩＣＲ／ＩＣＬ複合体調節を検出可能でありかつこれと相関する特徴を有する天然レポーターである。いくつかの実施形態において、レポーターは、例えば、エフェクター細胞型に外因性であって、ＴＣＲ活性化、ＴＣＲ経路活性化、及び／またはＴＣＲ活性化もしくはＴＣＲ経路活性化のＩＣＲ／ＩＣＬ複合体調節を検出可能でありかつこれと相関する特徴を有する人工レポーターである。いくつかの実施形態において、レポーターは、遺伝子であり、その発現は、ＴＣＲ経路依存性レポーターの制御下にある。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ経路依存性レポーターは、活性化Ｔ細胞（ＮＦＡＴ）プロモーターの核因子である。いくつかの実施形態において、レポーターは、ルシフェラーゼ、ベータラクタマーゼ、ＣＡＴ、ＳＥＡＰ、蛍光タンパク質、または定量化可能な遺伝子産物からなる群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、システムは、遮断因子または試験遮断因子をさらに含む。いくつかの実施形態において、遮断因子は、ＩＣＲ／ＩＣＬ複合体の形成を阻害して、ＴＣＲ活性化またはＴＣＲ経路活性化の調節を結果として生じさせる。いくつかの実施形態において、遮断因子または試験遮断因子は、小分子、ペプチド、タンパク質、または抗体である。
【００２６】
いくつかの実施形態において、（ａ）表面におけるＴＣＲ及びＰＤ−１と、ＮＦＡＴ−プロモーター依存性ルシフェラーゼをと含むエフェクター細胞と、（ｂ）表面において抗ＣＤ３抗体またはその抗体フラグメント及びＰＤ−Ｌ１を提示する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）とを含むシステムを本明細書において提供する。いくつかの実施形態において、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１複合体の形成は、ＮＦＡＴ−プロモーター依存性ルシフェラーゼの抑制された発現を結果として生じさせる。いくつかの実施形態において、システムは、遮断因子または試験遮断因子をさらに含む。いくつかの実施形態において、遮断因子または試験遮断因子は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１複合体の形成を阻害して、ＮＦＡＴ−プロモーター依存性ルシフェラーゼの増加された発現を結果として生じさせる。
【００２７】
いくつかの実施形態において、（ａ）（ｉ）表面において（Ａ）Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）活性化因子及び（Ｂ）免疫チェックポイントリガンド（ＩＣＬ）を提示する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を、（ｉｉ）ＴＣＲ複合体を含み、表面において免疫チェックポイントレセプター（ＩＣＲ）を提示するエフェクター細胞と接触させることにおいて、ＴＣＲ活性化因子とＴＣＲ複合体との相互作用が、ＴＣＲシグナリング経路を活性化し、上記ＩＣＲ及び上記ＩＣＬが、相互作用の際にＩＣＲ／ＩＣＬ複合体を形成し、ＩＣＲ／ＩＣＬ複合体の形成が、ＴＣＲ活性化及び／またはＴＣＲシグナリング経路を向上または阻害することと、（ｂ）上記エフェクター細胞におけるＴＣＲ活性化の存在、非存在及び／またはレベルを検出することとを含む方法を本明細書において提供する。いくつかの実施形態において、上記方法は、（ｃ）上記エフェクター細胞及び／または上記ａＡＰＣを遮断因子または試験遮断因子と接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態において、上記方法は、（ｄ）上記遮断因子または試験遮断因子の、（ｉ）ＩＣＲ／ＩＣＬ複合体形成、（ｉｉ）ＴＣＲ活性化、及び／または（ｉｉｉ）ＴＣＲシグナリング経路に対する効果を検出することをさらに含む。いくつかの実施形態において、（ｉ）ＩＣＲ／ＩＣＬ複合体形成、（ｉｉ）ＴＣＲ活性化、及び／または（ｉｉｉ）ＴＣＲシグナリング経路の１以上が、上記遮断因子または試験遮断因子の存在及び非存在下で検出されて、効果を決定する。
【００２８】
いくつかの実施形態において、（ｉ）ＩＣＲ／ＩＣＬ複合体形成、（ｉｉ）ＴＣＲ活性化、及び／または（ｉｉｉ）ＴＣＲシグナリング経路は、ＩＣＲ／ＩＣＬ複合体形成及び／またはＴＣＲ活性化の下流のレポーター（例えば、改変レポーター構築物、上記エフェクター細胞内に自然発生する、検出可能な要素／シグナル／相互作用）に基づいて検出される。いくつかの実施形態において、レポーターは、（ｉ）ＩＣＲ／ＩＣＬ複合体形成、（ｉｉ）ＴＣＲ活性化、及び／または（ｉｉｉ）ＴＣＲシグナリング経路の１以上によって変更される特徴（例えば、活性、発現、濃度、局在、相互作用、修飾など）を有するエフェクター細胞におけるまたは該細胞内の要素である。いくつかの実施形態において、レポーターは、エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞などの内在性要素）に内在性である。かかる実施形態において、内在性レポーターの特徴の変更は、ｉ）ＩＣＲ／ＩＣＬ複合体形成、（ｉｉ）ＴＣＲ活性化、及び／または（ｉｉｉ）ＴＣＲシグナリング経路活性化の１以上の存在、非存在及び／またはレベルのシグナルとして検出可能である。例示的な内在性レポーター及び／またはシグナルとして、限定されないが、遺伝子発現（例えば、ＴＣＲ経路依存性遺伝子の）、タンパク質濃度（例えば、ＴＣＲ経路依存性遺伝子によって発現されるタンパク質）、タンパク質−タンパク質相互作用（例えば、ＩＣＲ／ＩＣＬ複合体形成及び／またはＴＣＲ活性化によって媒介される）、ＴＣＲ経路依存性タンパク質修飾、ＴＣＲ依存性タンパク質の活性、内在性エフェクター細胞要素の局在など挙げられる。いくつかの実施形態において、レポーターは、エフェクター細胞に対して外在性である（例えば、エフェクター細胞に導入または改変されたレポーター要素または構築物）。かかる実施形態において、外在性及び／または改変レポーターの特徴の変更は、（ｉ）ＩＣＲ／ＩＣＬ複合体形成、（ｉｉ）ＴＣＲ活性化、及び／または（ｉｉｉ）ＴＣＲシグナリング経路活性化の１以上の存在、非存在及び／またはレベルのシグナルとして検出可能である。例示的な外在性レポーター及び／またはシグナルとして、限定されないが、ＴＣＲ依存性及び／またはＴＣＲ経路依存性レポーター構築物の発現（例えば、ＮＦＡＴプロモーターの制御下）、活性化及び／または発現がＴＣＲ−またはＴＣＲ−経路依存性であるレポーター（例えば、ルシフェラーゼ、ベータラクタマーゼ、ＣＡＴ、ＳＥＡＰ、蛍光タンパク質など）の活性、タンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質移動、タンパク質修飾の検出、ｑＰＣＲを介した内因性遺伝子上方調節などが挙げられる。
【００２９】
いくつかの実施形態において、ＴＣＲ活性化因子は、ＴＣＲ複合体の構成要素に結合またはさもなければ相互作用してＴＣＲ複合体及びＴＣＲ依存性経路を活性化する表面提示分子実体（例えば、タンパク質、ペプチド、ポリペプチドなど）である。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ活性化因子は、抗分化抗原群列３抗体（抗ＣＤ３）またはその抗体フラグメント、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）などである。
【００３０】
いくつかの実施形態において、ＩＣＬは、エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｊｕｒｋａｔなど）において免疫チェックポイントレセプター（ＩＣＲ）と相互作用してエフェクター細胞の免疫応答を調節（例えば、阻害、向上など）する分子実体（例えば、タンパク質、ペプチド、ポリペプチドなど）である。いくつかの実施形態において、ＩＣＬは、限定されないがＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ１５５、ガレクチン−９、ＨＶＥＭなどを含めたいずれかの好適な免疫チェックポイントリガンドである。
【００３１】
いくつかの実施形態において、エフェクター細胞は、限定されないが、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＨｕＴ−７８、ＣＥＭ、Ｍｏｌｔ−４などを含む群から選択されるＴ細胞である。いくつかの実施形態において、エフェクター細胞は、人工的である（例えば、親（例えば、非人工）細胞にネイティブでない１以上の要素（例えば、レポーター構築物、外因性遺伝子など）を含有、発現等するように改変されている）。いくつかの実施形態において、エフェクター細胞は、非改変ヒトまたは動物Ｔ細胞である。
【００３２】
いくつかの実施形態において、ＩＣＲは、限定されないが、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１６０、ＢＴＬＡ、ＩＬ−１０レセプターなどを含むいずれかの好適な免疫阻害レセプターである。
【００３３】
いくつかの実施形態において、ＴＣＲ複合体は、可変ＴＣＲレセプターα及びβ鎖と３種の二量体シグナリングモジュールＣＤ３δ／ε、ＣＤ３γ／ε、及びＣＤ２４７ζ／ζまたはζ／ηとの八量体複合体である。
【００３４】
いくつかの実施形態において、試験遮断因子の効能を測定して、免疫チェックポイントレセプター及び免疫チェックポイントリガンドの相互作用を阻害する方法であって、（ａ）（ｉ）表面においてＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）及び免疫チェックポイントレセプター（ＩＣＲ）と、ＴＣＲ活性化経路依存性レポーターとを提示するエフェクター細胞と、（ｉｉ）抗分化抗原群列３（ＣＤ３）抗体、もしくはその抗体フラグメント、及び免疫チェックポイントリガンドを提示する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）において、ＩＣＲ及びＩＣＬが、相互作用の際にＩＣＲ／ＩＣＬ複合体を形成する、上記人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）と、（ｉｉｉ）試験遮断因子とを共培養することと、（ｂ）（ａ）における混合物をインキュベートしてシグナル誘発を可能にすることと、（ｃ）上記レポーターから上記シグナルを検出することと、（ｄ）試験遮断因子との細胞共培養システム及び試験遮断因子を用いない細胞共培養システムからの上記シグナルを比較することにおいて、シグナルのゲインが、上記試験遮断因子による上記ＩＣＲ／ＩＣＬ複合体の阻害を示すこととを含む、上記方法を本明細書において提供する。いくつかの実施形態において、エフェクター細胞は、限定されないが、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＨｕＴ−７８、ＣＥＭ、Ｍｏｌｔ−４などを含めたＴ細胞である。いくつかの実施形態において、レポーターは、ルシフェラーゼ、ベータラクタマーゼ、ＣＡＴ、ＳＥＡＰ、蛍光タンパク質などである。いくつかの実施形態において、ＩＣＲは、限定されないが、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１６０、ＢＴＬＡ、ＩＬ−１０レセプターなどを含めたいずれかの免疫阻害レセプターであり得、ＩＣＬは、限定されないが、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ１５５、ガレクチン−９、ＨＶＥＭなどを含めたいずれかの免疫阻害リガンドであり得る。いくつかの実施形態において、遮断因子または試験遮断因子は、抗体（もしくは抗体フラグメント）、タンパク質、ペプチド、もしくは小分子、またはこれらの組み合わせである。
【００３５】
いくつかの実施形態において、試験遮断因子の効能を測定して、免疫チェックポイントレセプター及び免疫チェックポイントリガンドの相互作用を阻害する方法であって、（ａ）（ｉ）表面においてＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）及び免疫チェックポイントレセプター（ＩＣＲ）と、ＴＣＲ活性化経路依存性レポーター（例えば、ＮＦＡＴ−プロモーター依存性レポーター）とを提示するエフェクター細胞と、（ｉｉ）ＴＣＲ活性化因子（例えば、抗分化抗原群列３（ＣＤ３）抗体またはその抗体フラグメント）及び免疫チェックポイントリガンド（ＩＣＬ）を提示する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）において、ＩＣＲ及びＩＣＬが、相互作用の際にＩＣＲ／ＩＣＬ複合体を形成する、上記人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）とを共培養することと、（ｂ）上記レポーターからのシグナルを検出することと、（ｃ）上記試験遮断因子を添加することと、（ｄ）上記レポーターからの上記シグナルの検出を繰り返すことと、（ｅ）ステップ（ｂ）からの上記シグナルをステップ（ｄ）からの上記シグナルと比較することにおいて、ステップ（ｂ）からステップ（ｄ）のシグナルのゲインが、上記試験遮断因子による上記ＩＣＲ／ＩＣＬ複合体の阻害を示すこととを含む、上記方法を本明細書において提供する。いくつかの実施形態において、エフェクター細胞は、限定されないが、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＨｕＴ−７８、ＣＥＭ、Ｍｏｌｔ−４などを含めたＴ細胞である。いくつかの実施形態において、レポーターは、ルシフェラーゼ、ベータラクタマーゼ、ＣＡＴ、ＳＥＡＰ、蛍光タンパク質、遺伝子発現（例えば、ｑＰＣＲによって定量化される）などである。いくつかの実施形態において、ＩＣＲは、限定されないが、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１６０、ＢＴＬＡ、ＩＬ−１０レセプターなどを含めたいずれかの免疫阻害レセプターであり得、ＩＣＬは、限定されないが、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ１５５、ガレクチン−９、ＨＶＥＭなどを含めたいずれかの対応する免疫阻害リガンドであり得る。いくつかの実施形態において、遮断因子または試験遮断因子は、抗体（もしくは抗体フラグメント）、タンパク質、ペプチド、もしくは小分子、またはこれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、ＩＣＲは、ＰＤ−１であり、ＩＣＬは、ＰＤ−Ｌ１である。いくつかの実施形態において、試験遮断因子は、抗体または小分子である。
【００３６】
いくつかの実施形態において、試験遮断因子の効能を測定して、免疫チェックポイントレセプター及び免疫チェックポイントリガンドの相互作用を阻害する方法であって、（ａ）（ｉ）表面においてＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）及び免疫チェックポイントレセプター（ＩＣＲ）と、ＴＣＲ活性化経路依存性レポーター（例えば、ＮＦＡＴ−プロモーター依存性レポーター）とを提示するエフェクター細胞と、（ｉｉ）ＴＣＲ活性化因子（例えば、抗分化抗原群列３（ＣＤ３）抗体またはその抗体フラグメント）及び免疫チェックポイントリガンド（ＩＣＬ）を提示する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）において、ＩＣＲ及びＩＣＬが、相互作用の際にＩＣＲ／ＩＣＬ複合体を形成する、上記人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）とを共培養することと、（ｂ）上記レポーターからのシグナルを試験遮断因子の存在下で検出することと、（ｃ）ステップ（ｂ）からの上記シグナルを対照（例えば、上記試験遮断因子の非存在下でのシグナル、対照シグナル、バックグラウンド、ゼロ対照、ネガティブ対照など）と比較することにおいて、対照に対するシグナルのゲインが、上記試験遮断因子による上記ＩＣＲ／ＩＣＬ複合体の阻害を示すこととを含む、上記方法を本明細書において提供する。いくつかの実施形態において、上記方法は、試験遮断因子を添加するステップをさらに含む。
【００３７】
いくつかの実施形態において、（ａ）（ｉ）表面において免疫チェックポイントレセプター（ＩＣＲ）を提示し、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）及びＴＣＲ経路依存性レポーターを含むエフェクター細胞と、（ｉｉ）表面においてＴＣＲ活性化因子及び免疫チェックポイントリガンド（ＩＣＬ）を提示する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）とを含むシステムを形成することにおいて、ＩＣＲ及びＩＣＬが、相互作用の際にＩＣＲ／ＩＣＬ複合体を形成し、ＩＣＲ／ＩＣＬ複合体の形成が、ＴＣＲ活性化因子によるＴＣＲ活性化の調節及び／または１以上のＴＣＲ依存性経路の調節を結果として生じさせることと、（ｂ）上記ＴＣＲ経路依存性レポーターまたは上記レポーターからのシグナルを検出することとを含む方法を本明細書において提供する。いくつかの実施形態において、方法は、システムに遮断因子を添加することをさらに含み、遮断因子が、ＩＣＲ／ＩＣＬ複合体の形成を阻害し、またはＴＣＲ活性化因子によるＴＣＲ活性化のＩＣＲ／ＩＣＬ依存性調節及び／もしくは１以上のＴＣＲ依存性経路の調節を阻害する。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ経路依存性レポーターまたは上記レポーターからのシグナルは、上記遮断因子の添加の（１）前、（２）同時、及び／または（３）後に検出される。いくつかの実施形態において、システムは、上記遮断因子の添加の（１）前、（２）同時、及び／または（３）後にシグナルを比較して、遮断因子の効果を決定するステップをさらに含む。
【００３８】
いくつかの実施形態において、（ａ）（ｉ）表面においてＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）及び免疫チェックポイントレセプター（ＩＣＲ）と、ＴＣＲ活性化経路依存性レポーターとを提示するエフェクター細胞と、（ｉｉ）ＴＣＲ活性化因子及び免疫チェックポイントリガンド（ＩＣＬ）を提示する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）において、ＩＣＲ及びＩＣＬが、相互作用の際にＩＣＲ／ＩＣＬ複合体を形成する、上記人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）とを共培養することと、（ｂ）上記試験遮断因子を添加することと、（ｃ）上記レポーターからの上記シグナルを検出することと、（ｄ）上記レポーターからの上記シグナルを対照と比較することにおいて、対照に対するシグナルのゲインが、上記試験遮断因子による上記ＩＣＲ／ＩＣＬ複合体の阻害を示すこととを含む方法を本明細書において提供する。
【００３９】
いくつかの実施形態において、ＩＣＲ／ＩＣＬ遮断因子を同定する方法であって、（ａ）（ｉ）表面においてＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）及び免疫チェックポイントレセプター（ＩＣＲ）と、ＴＣＲ活性化経路依存性レポーターとを提示するエフェクター細胞と、（ｉｉ）抗分化抗原群列３（ＣＤ３）抗体、もしくはその抗体フラグメント、及び免疫チェックポイントリガンドを提示する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）において、ＩＣＲ及びＩＣＬが、相互作用の際にＩＣＲ／ＩＣＬ複合体を形成する、上記人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）とを共培養することと、（ｂ）上記レポーターからのシグナルを検出することと、（ｃ）上記試験遮断因子を添加することと、（ｄ）上記レポーターからの上記シグナルの検出を繰り返すことと、（ｅ）ステップ（ｂ）からの上記シグナルをステップ（ｄ）からの上記シグナルと比較することにおいて、ステップ（ｂ）からステップ（ｄ）のシグナルのゲインが、上記試験遮断因子による上記ＩＣＲ／ＩＣＬ複合体の阻害を示すこととを含む、上記方法を本明細書において提供する。
【００４０】
いくつかの実施形態において、ＩＣＲ／ＩＣＬ遮断因子を同定する方法であって、（ａ）（ｉ）表面においてＰＤ−１を提示し、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）及び活性化Ｔ細胞（ＮＦＡＴ）プロモーター依存性ルシフェラーゼレポーターの核因子を含むエフェクター細胞を、（ｉｉ）抗分化抗原群列３（ＣＤ３）抗体、もしくはその抗体フラグメント、及びＰＤ−Ｌ１を提示する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）と接触させることと、（ｂ）上記ＮＦＡＴ−プロモーター依存性ルシフェラーゼレポーターからのシグナルを検出することとを含む、上記方法を本明細書において提供する。いくつかの実施形態において、方法は、（ｃ）上記試験遮断因子を添加することと、（ｄ）上記レポーターからの上記シグナルの検出を繰り返すこととをさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、（ｅ）ステップ（ｂ）からの上記シグナルをステップ（ｄ）からの上記シグナルと比較することにおいて、ステップ（ｂ）からステップ（ｄ）のシグナルのゲインが、上記試験遮断因子による上記ＩＣＲ／ＩＣＬ複合体の阻害を示すことをさらに含む。
【００４１】
いくつかの実施形態において、表面においてＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）活性化因子及び免疫チェックポイントリガンド（ＩＣＬ）を提示する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を、天然エフェクター細胞を含むシステムに投与することを含む方法を本明細書において提供する。
【００４２】
いくつかの実施形態において、表面においてＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）活性化因子及び免疫チェックポイントリガンド（ＩＣＬ）を提示する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を、人工エフェクター細胞を含むシステムに投与することを含む方法を本明細書において提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】免疫チェックポイントの阻害因子を評価するための一般的なシステムの概略を示す。細胞膜においてＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）活性化因子及び免疫チェックポイントリガンド（ＩＣＬ）を提示するａＡＰＣは、免疫チェックポイントレセプター（ＩＣＲ）、ＣＤ２８及びＴＣＲ複合体を提示し、ＴＣＲ経路プロモーター依存性レポーター構築物を含む改変エフェクター細胞と相互作用すると示されている。ａＡＰＣ及び改変エフェクター細胞の共培養の際、ＴＣＲ活性化因子は、ＴＣＲ複合体を活性化する；しかし、ＩＣＲ及びＩＣＬの相互作用は、ＴＣＲ経路からの発現の活性化を阻害し、レポーターのわずかな発現が生じる。ＩＣＲ／ＩＣＬ相互作用を阻害する遮断因子の存在下で、ＴＣＲ経路は活性化され、ＴＣＲ経路プロモーターからのレポーターの発現が向上され、レポーターシグナルが上昇する。
【図２】免疫チェックポイントの阻害因子を評価するための例示的なシステムの概略を示す。細胞膜においてＰＤ−Ｌ１及び抗ＣＤ３抗体Ｆａｂドメインを提示するａＡＰＣは、ＰＤ−１、ＴＣＲ複合体を提示し、ＮＦＡＴ−プロモーター依存性ルシフェラーゼレポーター構築物を含むＪｕｒｋａｔＴ細胞と相互作用すると示されている。ａＡＰＣ及びＪｕｒｋａｔエフェクター細胞の共発現の際、抗ＣＤ３は、ＴＣＲ複合体を活性化する；しかし、ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１の相互作用は、ＮＦＡＴプロモーターからの発現の活性化を阻害し、ルシフェラーゼのわずかな発現が生じる。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用の阻害因子の存在下で、活性化されたＴＣＲ複合体は、ＮＦＡＴプロモーターからのルシフェラーゼレポーターの発現を活性化し、ルシフェラーゼシグナルが上昇する。
【図３】例示的なＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断アッセイの特異性を表示するグラフを示す。
【図４】例示的なＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断アッセイにおける抗ＰＤ−Ｌ１抗体によるレポーター発現の濃度依存性活性化を表示するグラフを示す。
【図５】例示的なＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断アッセイにおける抗ＰＤ−１抗体によるレポーター発現の濃度依存性活性化を表示するグラフを示す。
【図６】図２に示されているものに類似するが、ＡＰＣがＴＣＲ活性化因子を発現しないシステムの概略を示す。
【図７】ａＡＰＣが改変膜結合抗ＣＤ３を欠失している、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断アッセイにおける抗ＰＤ−Ｌ１抗体によるレポーター発現の濃度依存性活性化を表示するグラフを示す。
【図８】抗ＣＤ３／ＰＤ−Ｌ１−ＦｃビーズによるＴ細胞活性化のＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１依存性阻害の非存在を表示するグラフを示す。
【図９Ａ】ビーズへのＰＤ−Ｌ１の付着を確認するフローサイトメトリー結果を示す。
【図９Ｂ】ビーズへのＰＤ−Ｌ１の付着を確認するフローサイトメトリー結果を示す。
【図１０】抗ＣＤ３：ＰＤ−Ｌ１ビーズ（１：９の比）がＴ細胞活性化の阻害を誘発せず、そのため抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１抗体がＴ細胞活性化を誘発しないことを実証しているグラフを示す。
【図１１】抗ＣＤ３：ＰＤ−Ｌ１ビーズに対して延長された長さの抗ＰＤ−Ｌ１−ＦｃがＴ細胞活性化の阻害を誘発せず、そのため抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１抗体がＴ細胞活性化を誘発しないことを実証しているグラフを示す。
【図１２】抗ＣＤ３：ＰＤ−Ｌ１ビーズが例示的な遮断アッセイにおいて抗ＣＤ３：ＰＤ−Ｌ１ａＡＰＣのように挙動しないことに関しての予期される機構的説明を示す。
【図１３】免疫チェックポイントレセプターＰＤ−１及びそのリガンド、ＰＤ−Ｌ２の阻害因子を評価するための例示的なシステムの概略を示す。
【図１４Ａ】例示的なＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ２遮断アッセイにおける抗ＰＤ−Ｌ２抗体によるレポーター発現の濃度依存性活性化を表示するグラフを示す。
【図１４Ｂ】例示的なＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ２遮断アッセイにおける抗ＰＤ−１抗体によるレポーター発現の濃度依存性活性化を表示するグラフを示す。
【図１５】免疫チェックポイントレセプターＣＴＬＡ−４及びそのリガンド、ＣＤ８０／ＣＤ８６の阻害因子を評価するための例示的なシステムの概略を示す。
【図１６】例示的なＣＴＬＡ−４遮断アッセイにおける抗ＣＴＬＡ−４抗体によるレポーター発現の濃度依存性活性化を表示するグラフを示す。
【図１７】免疫チェックポイントレセプターＴＩＧＩＴ及びそのリガンド、ＣＤ１５５の阻害因子を評価するための例示的なシステムの概略を示す。
【図１８】Ｊｕｒｋａｔ−Ｔ細胞におけるＴＩＧＩＴエフェクター細胞を使用した例示的なＴＩＧＩＴ／ＣＤ１５５遮断アッセイにおける抗ＴＩＧＩＴ抗体によるレポーター発現の濃度依存性活性化を表示するグラフを示す。
【図１９】免疫チェックポイントレセプターＴＩＧＩＴ及びそのリガンド、ＣＤ１５５の阻害因子を評価するための例示的なシステムの概略を示す。
【図２０】ＣＥＭ  Ｔ細胞におけるＴＩＧＩＴエフェクター細胞を使用した例示的なＴＩＧＩＴ／ＣＤ１５５遮断アッセイにおける抗ＴＩＧＩＴ抗体によるレポーター発現の濃度依存性活性化を表示するグラフを示す。
【図２１】免疫チェックポイントレセプターＰＤ−１及びそのリガンドＰＤ−Ｌ１の阻害因子を評価するための例示的なシステムの概略を示す。
【図２２】例示的なＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断アッセイにおける抗ＰＤ−１抗体による濃度依存性ＩＬ−２産生を表示するグラフを示す。
【図２３】免疫チェックポイントレセプターＬＡＧ−３及びそのリガンド、ＭＨＣＩＩの阻害因子を評価するための例示的なシステムの概略を示す。
【図２４】例示的なＬＡＧ−３遮断アッセイにおける抗ＬＡＧ−３抗体によるレポーター発現の濃度依存性活性化を表示するグラフを示す。
【図２５】免疫チェックポイントレセプターＴＩＧＩＴ及びＰＤ−１ならびにそれらのリガンド、ＣＤ１５５及びＰＤ−Ｌ１の阻害因子をそれぞれ評価するための例示的なシステムの概略を示す。細胞膜においてＰＤ−Ｌ１、ＣＤ１５５及び抗ＣＤ３抗体Ｆａｂドメインを提示するａＡＰＣは、ＰＤ−１、共刺激レセプターＣＤ２２６、ＴＩＧＩＴ、ＴＣＲ複合体を提示し、ＩＬ２−プロモーター依存性ルシフェラーゼレポーター構築物を含むＪｕｒｋａｔＴ細胞と相互作用すると示されている。ａＡＰＣ及びＪｕｒｋａｔエフェクター細胞の相互作用の際、抗ＣＤ３Ａｂは、ＴＣＲ複合体を活性化し、ＣＤ１５５は、ＣＤ２２６を共刺激する。これらが、ＩＬ−２プロモーター駆動ルシフェラーゼ発現の活性化をもたらす；しかし、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用は、低減されたＴＣＲ経路活性化及び低減されたＩＬ−２プロモーター依存性レポーター発現をもたらす。また、ＣＤ１５５は、ＣＤ２２６よりも高い、ＴＩＧＩＴとの結合親和性を有する。そのため、ＴＩＧＩＴは、ＣＤ１５５とＣＤ２２６との相互作用を阻害し、低減されたレポーター発現をもたらす。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１及び／またはＴＩＧＩＴ／ＣＤ１５５相互作用の阻害因子の存在下で、ＩＬ−２プロモーターからのルシフェラーゼレポーターの発現が向上され、ルシフェラーゼシグナルが上昇する。
【図２６ａ】Ｊｕｒｋａｔ−Ｔ細胞及びＰＤ−Ｌ１／ＣＤ１５５ａＡＰＣ／ＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるＰＤ−１／ＴＩＧＩＴエフェクター細胞を使用した例示的なＰＤ−１／ＴＩＧＩＴ遮断アッセイにおける抗ＰＤ−１抗体によるレポーター発現の濃度依存性活性化を表示するグラフを示す。
【図２６ｂ】Ｊｕｒｋａｔ−Ｔ細胞及びＰＤ−Ｌ１／ＣＤ１５５ａＡＰＣ／ＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるＰＤ−１／ＴＩＧＩＴエフェクター細胞を使用する例示的なＰＤ−１／ＴＩＧＩＴ遮断アッセイにおける抗ＴＩＧＩＴ抗体によるレポーター発現の濃度依存性活性化を表示するグラフを示す。
【図２６ｃ】いずれかの抗体のみと比較した抗ＰＤ−１及び抗ＴＩＧＩＴ抗体の組み合わせの効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
定義
本明細書において使用されているとき、用語「免疫チェックポイントレセプター」（「ＩＣＲ」）は、リガンドに結合しているときに細胞の免疫活性を調節する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞など）における表面レセプタータンパク質を称する。本明細書において特に興味深いのは、リガンドがレセプターに結合する際に細胞免疫活性を阻害する「阻害免疫チェックポイントレセプター」である。「阻害免疫チェックポイントレセプター」の例として、限定されないが、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＩＬ−１０レセプター、及びＢＴＬＡが挙げられる。
【００４５】
本明細書において使用されているとき、用語「免疫チェックポイントリガンド」（「ＩＣＬ」）は、免疫チェックポイントレセプターのリガンドを称する。「免疫チェックポイントリガンド」は、一般的に、抗原提示細胞（ＡＰＣ）における表面提示タンパク質である。免疫細胞提示免疫チェックポイントレセプターとの相互作用を通して、「免疫チェックポイントリガンド」は、抗原提示細胞に対する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の免疫応答を調節する。阻害免疫チェックポイントレセプターに結合する「免疫チェックポイントリガンド」の例として、限定されないが、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ１５５、ガレクチン−９、ＨＶＥＭなどが挙げられる。
【００４６】
本明細書において使用されているとき、用語「免疫チェックポイント」「チェックポイント経路」及び「免疫チェックポイント経路」は、免疫チェックポイントレセプターへの免疫チェックポイントリガンドの結合が免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＨｕＴ−７８、ＣＥＭ、Ｍｏｌｔ−４など）の活性化の振幅及び質を調節する経路を称する。
【００４７】
本明細書において使用されているとき、用語「免疫チェックポイント遮断」は、「遮断因子」の投与または発現による免疫チェックポイント経路の阻害を称する。典型的には、「遮断因子」は、免疫チェックポイントレセプター及びリガンドの相互作用を防止し、これにより、チェックポイント経路を阻害する。遮断因子は、免疫チェックポイントリガンドまたは免疫チェックポイントレセプターに結合してＩＣＲ／ＩＣＬ複合体の形成を阻害する小分子、ペプチド、抗体またはそのフラグメントなどであってよい。遮断因子はまた、ＩＣＲ／ＩＣＬ複合体によるシグナリングを防止することによって機能してもよい。
【００４８】
本明細書において使用されているとき、「人工抗原提示細胞」または「人工エフェクター細胞」におけるような用語「人工」は、自然に生じない実体（例えば、細胞、構築物など）を称する。例えば、親（例えば、非改変細胞）に内在性でない外因性遺伝子（例えば、レポーター構築物）を表現するように改変された細胞は、「人工」である。
【００４９】
本明細書において使用されているとき、用語「抗体」は、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子のフラグメントによって実質的にコードされた１以上のポリペプチドを有するタンパク質を称する。認識されている免疫グロブリン遺伝子として、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン及びミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかとして分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンとして分類され、これにより、免疫グロブリンクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥをそれぞれ定義している。基本の免疫グロブリン（抗体）構造単位は、四量体を含むことが知られている。各四量体は、各対が１つの「軽」（約２５ｋＤ）及び１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有する、２つの同一のポリペプチド鎖対から構成される。各鎖のＮ末端は、抗原認識に主に関与する約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変領域を定義する。用語「可変軽鎖（ＶL）」及び「可変重鎖（ＶH）」は、これらの軽及び重鎖をそれぞれ称する。
【００５０】
用語「抗体」は、本明細書において広義で使用され、具体的には、ヒト、非ヒト（例えば、マウス）、ならびにヒト化モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば、二特異性抗体）、単鎖抗体、及び抗体フラグメントを、これらが所望の生物活性を示す限りカバーする。抗体は、無傷免疫グロブリンとして、または、例えば、ＦａｂＦｃ2、Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆｄ、（ＦａｂＮ）2、軽及び重鎖可変領域のみを含有するＦｖフラグメント、可変領域と定常領域の部分とを含有するＦａｂもしくは（Ｆａｂ）Ｎ2フラグメント、単鎖抗体、例えば、ｓｃＦｖ、ＣＤＲグラフト化抗体などを含めた種々の形態の修飾体として存在していてよい。Ｆｖの重及び軽鎖は、同じ抗体から誘導されても、異なる抗体から誘導されることによりキメラＦｖ領域を生成してもよい。抗体は、動物（特にマウスもしくはラット）またはヒト起源のものであってよく、またはキメラであってもヒト化されていてもよい。本明細書において使用されているとき、用語「抗体」は、これらの種々の形態を含む。
【００５１】
用語「レポーター」は、分子実体を記載するのに本明細書において広義で使用され、該実体の特徴及び／または特性（例えば、濃度、量、発現、活性、局在、相互作用（例えば、タンパク質−タンパク質相互作用）など）は、レポーターを含有するシステム（例えば、細胞、細胞溶解物、インビトロシステム、生物、インビボシステムなど）の特徴及び／または特性と共に検出され相関され得る。「レポーター」は、１以上の検出可能かつ相関可能な特性を示す、システムの内在性（例えば、内因性）要素であっても、システムにおいて改変されまたはこれに導入され、プロセス（例えば、遺伝子発現）またはシステム内の構成要素に関連する検出可能な特徴を示す人工（例えば、外因性）要素であってもよい。好適なレポーターとして、限定されないが、内在性遺伝子またはタンパク質（例えば、その発現、濃度、活性、もしくはタンパク質−タンパク質相互作用が、システム（例えば、細胞プロセス）と相関されていてよい）、外因性遺伝子またはタンパク質（例えば、その発現、濃度、活性、もしくはタンパク質−タンパク質相互作用、システム（例えば、細胞プロセス）と相関されていてよい）、ルシフェラーゼ、ベータラクタマーゼ、ＣＡＴ、ＳＥＡＰ、蛍光タンパク質などが挙げられる。
【００５２】
詳細な説明
免疫チェックポイントの調節因子を評価するための組成物、システム、及び方法を本明細書において提供する。特に、試験因子（例えば、抗体）の効能を評価して免疫チェックポイントを阻害する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）及び免疫エフェクター細胞を提供する。
【００５３】
いくつかの実施形態において、（１）ＴＣＲ活性化因子及び（２）免疫チェックポイントリガンド（ＩＣＬ）を含む（例えば、表面において提示する）人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を含む組成物を本明細書において提供する。
【００５４】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）、または補助細胞は、抗原提示として知られているプロセスにおいて、表面において主要組織適合複合体（ＭＨＣ）と複合体化される外来抗原を処理及び提示する細胞である。Ｔ細胞は、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）及び／またはＴ細胞レセプター複合体を使用してこれらの複合体を認識し得る。人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、（例えば、レトロウイルスまたはレンチウイルス導入を使用して）改変されて免疫シナプス形成に必要とされる共刺激及び接着特性を付与する分子を導入する初代または形質転換ヒトまたは異種細胞から典型的には誘導される。このストラテジーは、ａＡＰＣとの相互作用の際のＴ細胞への多くの正及び負シグナルの送達の厳しい制御を可能にする（例えば、免疫療法におけるａＡＰＣのレビューに関するＴｕｒｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．２０１０年７〜８月；１６（４）：３７４−８１）を参照されたい；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【００５５】
いくつかの実施形態において、表面においてＴＣＲの活性化因子を表現及び／または提示するａＡＰＣを提供する。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ活性化因子とＴＣＲとの相互作用は、ＴＣＲ依存性経路の活性化と、ＴＣＲの下流のプロモーターからの向上した遺伝子発現（例えば、ＮＦＡＴ依存性発現）とを結果として生じさせる。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３抗体（例えば、全抗体、Ｆａｂドメインなど）を発現するａＡＰＣを提供する。いくつかの実施形態において、表面において抗ＣＤ３抗体（例えば、全抗体、Ｆａｂドメインなど）を提示するａＡＰＣを提供する。静止Ｔ−リンパ球は、抗ＣＤ３抗体によって活性化されることが実証されている（Ｔｓｏｕｋａｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８５年９月；１３５（３）：１７１９−２３．；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３発現ａＡＰＣは、Ｔ細胞（例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞）のＴＣＲ複合体内で表面提示ＣＤ３への抗ＣＤ３の結合を通してＴ細胞（例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞）を活性化する。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ複合体に結合している抗ＣＤ３は、関連する酵素、コレセプター、特異的なアダプター分子、及び活性化または放出された転写因子によって媒介される一連の下流の生化学的事象を結果として生じさせる。例えば、ＴＣＲに結合している抗ＣＤ３は、ＮＦＡＴタンパク質（例えば、ＮＦＡＴｃ１、ＮＦＡＴｃ２、ＮＦＡＴｃ３、ＮＦＡＴｃ４、ＮＦＡＴ５）の活性化と、ＮＦＡＴプロモーター（例えば、ＮＦＡＴに結合して向上した転写を結果として生じさせるプロモーター）からの増加した遺伝子発現とを結果として生じさせる。いくつかの実施形態において、ＮＦＡＴ−プロモーター連結レポーター（例えば、ルシフェラーゼ）の発現は、Ｔ細胞活性化及び免疫チェックポイント遮断の定量的尺度を付与する。いくつかの実施形態において、ＴＣＲへの抗ＣＤ３の結合によってトリガーされる他の下流の事象は、Ｔ細胞活性化の好適なマーカーを付与する（または同等のマーカーを付与するように操作され得る）。Ｔ細胞活性化因子（例えば、ＴＣＲ活性化因子）の他の例として、超抗原、抗ＴＣＲ抗体、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ４抗体、ＰＨＡ、ＭＨＣ及び同種ペプチド、ならびにＣｏｎＡが挙げられ、これらはいずれも、ａＡＰＣにおいて発現され及び／または表面提示されてエフェクター細胞を活性化し得る。
【００５６】
いくつかの実施形態において、（例えば、ＩＣＲを提示するエフェクター細胞を含むシステムにおける使用のための）ＩＣＬを発現するａＡＰＣを提供する。いくつかの実施形態において、限定されないが、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ１５５、ガレクチン−９、ＨＶＥＭなどを含む、表面においてＩＣＬを提示するａＡＰＣを提供する。いくつかの実施形態において、ａＡＰＣは、ＩＣＬの全体または一部と少なくとも５０％の配列同一性（例えば、＞５０％、＞６０％、＞７０％、＞８０％、＞９０％、＞９５％、またはそれを超える）でペプチド／ポリペプチドを発現及び／または提示し、ＩＣＲに関するＩＣＬの親和性の少なくとも５０％（例えば、＞５０％、＞６０％、＞７０％、＞８０％、＞９０％、＞９５％、またはそれを超える）を保持する。いくつかの実施形態において、ＩＣＲに関するＩＣＬの親和性の少なくとも５０％（例えば、＞５０％、＞６０％、＞７０％、＞８０％、＞９０％、＞９５％、またはそれを超える）を有するペプチド／ポリペプチドを提示または発現するａＡＰＣを提供する。
【００５７】
いくつかの実施形態において、（例えば、ＰＤ−１を提示するエフェクター細胞を含むシステムにおける使用のための）ＰＤ−Ｌ１を発現するａＡＰＣを提供する。いくつかの実施形態において、表面においてＰＤ−Ｌ１を提示するａＡＰＣを提供する。いくつかの実施形態において、ａＡＰＣは、ＩＣＬの全体または一部と少なくとも５０％の配列同一性（例えば、＞５０％、＞６０％、＞７０％、＞８０％、＞９０％、＞９５％、またはそれを超える）でペプチド／ポリペプチドを発現及び／または提示し、ＰＤ−Ｌ１の親和性の少なくとも５０％（例えば、＞５０％、＞６０％、＞７０％、＞８０％、＞９０％、＞９５％、またはそれを超える）を保持する。いくつかの実施形態において、ＰＤ−１に関するＰＤ−Ｌ１の親和性の少なくとも５０％（例えば、＞５０％、＞６０％、＞７０％、＞８０％、＞９０％、＞９５％、またはそれを超える）を有するペプチド／ポリペプチドを提示または発現するａＡＰＣを提供する。
【００５８】
いくつかの実施形態において、（ａ）（ｉ）Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）活性化因子及び（ｉｉ）免疫チェックポイントリガンド（ＩＣＬ）（例えば、上記ａＡＰＣのいずれか）を含む（例えば、表面において提示する）人工抗原提示細胞と、（ｂ）免疫チェックポイントレセプター（ＩＣＲ）（例えば、表面において提示する）を含み、（ｉ）ＴＣＲ複合体及び（ｉｉ）レポーター（例えば（Ａ）ＩＣＲ／ＩＣＬ複合体形成、（Ｂ）ＴＣＲ活性化、及び／または（Ｃ）ＴＣＲシグナリング経路ＴＣＲ活性化経路依存性レポーターのうち１以上のレポーター）を含む人工エフェクター細胞とを含むシステムを本明細書において提供する。
【００５９】
ある特定の実施形態において、ａＡＰＣ（例えば、上記セクションＩまたは本明細書におけるいずれかの箇所に記載されている）と、エフェクター細胞（例えば、人工エフェクター細胞）とを含むシステムを提供する。エフェクター細胞は、免疫応答をマウントすることが可能である形態に分化するように誘発されたリンパ球（例えば、Ｔ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞など）である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている遮断アッセイに有用な表面タンパク質及び／または表面タンパク質の複合体（例えば、抗原応答要素（例えば、ＴＣＲ）、ＩＣＲ（例えば、ＰＤ−１）など）を発現及び／または提示するエフェクター細胞を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている実施形態において有用なエフェクター細胞は、エフェクター細胞活性化のレポーターを発現するように改変されている。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞の活性化に関与する１以上の経路は、レポーター及び／またはレポーターの発現を活性化することにより、免疫チェックポイントの遮断及びＴ細胞活性化を検出可能にシグナリングする。
【００６０】
いくつかの実施形態において、エフェクター細胞は、Ｔ細胞（例えば、ヒトＴ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞など）を示す多数のマーカーを提示する。例えば、エフェクター細胞は、Ｔ細胞レセプター複合体及び／またはその構成要素（例えば、ＣＤ３、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδなど）、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２、ＬＦＡ−１などのうち１以上を提示し得る。
【００６１】
Ｔ細胞の活性化は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）における主要組織適合複合体（ＭＨＣＩＩ）ペプチド及び共刺激分子によるＴ細胞でのＴ細胞レセプター及び共刺激分子の同時係合を通して生じる。一旦、ＡＰＣによって適切に係合されたら、下流のシグナリング経路が開始されてＴ細胞を活性化する。例えば、共刺激分子は、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）経路に係合し、細胞膜でホスファチジルイノシトール（３，４，５）−トリスリン酸（ＰＩＰ３）を生じさせ、ＰＫＣθの活性化、及び最終的なＩＬ−２産生に必須であるＰＨドメイン含有シグナリング分子（例えば、ピルビン酸デヒドロゲナーゼリポアミドキナーゼアイソザイム１（ＰＤＫ１））を補充する。非限定的な、一連の、活性化の下流の効果として：ＣＤ２８、ＬＡＴ及びＳＬＰ−７６のリン酸化であって、これらのタンパク質の周囲でのシグナリング複合体の凝集を可能にする上記リン酸化；膜へのＳＬＰ−７６の補充であって、次いでＰＬＣ−γ、ＶＡＶ１、Ｉｔｋ及び潜在的なＰＩ３Ｋをもたらし得る上記補充；転写因子、例えばＮＦ−κＢ及びＡＰ−１の活性化；小胞体（ＥＲ）におけるカルシウムレセプターの活性化；ＥＲ膜においてＳＴＩＭ１のクラスター化を引き起こして、さらなるカルシウムが細胞外空間から細胞質ゾルに流入することを可能にする細胞膜ＣＲＡＣチャネルの活性化をもたらす細胞質ゾル内へのＥＲからのカルシウムの放出；次いでカルシニューリンを活性化する、凝集した細胞質カルシウムによるカルモジュリンの結合；活性化Ｔ細胞（ＮＦＡＴ）の核因子のカルシニューリン活性化、核へのＮＦＡＴの転座；多様な一連の遺伝子、中でも、ＩＬ−２、インターフェロン、腫瘍壊死因子、ＩＬ−１７、ＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−２３、ＩＬ−１、形質転換成長因子ベータ、ＩＬ−８及び他のケモカインの転写のＮＦＡＴ活性化、ならびに多数の他の経路；が挙げられる。いくつかの実施形態において、これらの下流の効果のいずれが、（例えば、検出可能レポーターに対する下流の効果に合うことによる）免疫チェックポイントの遮断のマーカーとしての用途を見出してもよい。
【００６２】
いくつかの実施形態において、免疫チェックポイント経路を阻害するときの遮断因子（例えば、抗体）の効能を評価するためのシステム及び方法を提供する。例示的なシステムは、（１）抗原応答要素（例えば、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）複合体）及び免疫チェックポイントレセプター（ＩＣＲ）を表面（例えば、ＰＤ−１）において提示し、レポーターを含む人工エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞（例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞など）など）と、（２）表面においてエフェクター細胞の抗原応答要素の活性化因子（例えば、抗ＣＤ３抗体またはそのフラグメント）、及びエフェクター細胞のＩＣＲに対応する免疫チェックポイントリガンド（ＩＣＬ）（例えば、ＰＤ−Ｌ１）を提示する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）と、（３）試験遮断因子（例えば、ＩＣＬまたはＩＣＲに対する抗体）とを含む。いくつかの実施形態において、遮断因子の非存在下で（または試験遮断因子が有効でない事象において）、ＩＣＲ及びＩＣＬは相互作用して、レポーター構築物からのシグナルを調節（例えば、阻害または向上）する。しかし、強力な遮断因子の存在下では、ＩＣＲ及びＩＣＬの相互作用が阻害され、ＩＣＲ／ＩＣＬによるレポーターシグナルの調節が阻害される。
【００６３】
いくつかの実施形態において、阻害免疫チェックポイント経路を遮断するときの遮断因子（例えば、抗体）の効能を評価するためのシステム及び方法を提供する。例示的なシステムは、（１）抗原応答要素（例えば、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）複合体）及び免疫チェックポイントレセプター（ＩＣＲ）を表面において提示し、発現が抗原応答要素の活性化に依存するレポーター構築物を含む人工エフェクター細胞（例えば、改変Ｔ細胞（例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞など）など）と、（２）表面においてエフェクター細胞の抗原応答要素の活性化因子、及びエフェクター細胞のＩＣＲに相当する免疫チェックポイントリガンド（ＩＣＬ）を提示する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）と、（３）試験遮断因子（例えば、ＩＣＬまたはＩＣＲに対する抗体）とを含む。いくつかの実施形態において、抗原応答要素の活性化因子との相互作用による抗原応答要素の活性化は、レポーターからのシグナル（またはシグナルの非存在）を結果として生じさせる。いくつかの実施形態において、遮断因子の非存在下で（または試験遮断因子が有効でない事象において）、ＩＣＲ及びＩＣＬは、相互作用して、レポーターからのシグナルを調節する。強力な遮断因子の存在下では、ＩＣＲ及びＩＣＬの相互作用が阻害され、ＩＣＲ／ＩＣＬによるレポーターシグナルの調節が遮断され、レポーターシグナルが、ＩＣＲ／ＩＣＬの非存在下でのシグナルとなる傾向がある。いくつかの実施形態において、エフェクター細胞及びａＡＰＣが共培養されるとき、第１シグナルレベルがレポーターから生成される（例えば、ＩＣＲ／ＩＣＬ複合体がレポーターシグナルを調節するからである）；しかし、強力な遮断因子の添加は、レポーターから第２シグナルレベルを結果として生じさせる（例えば、ＩＣＲ／ＩＣＬの形成が阻害され、これにより、ＩＣＲ／ＩＣＬ複合体によるレポーターシグナルの調節が低減されるからである）。
【００６４】
いくつかの実施形態において、免疫チェックポイント経路を阻害するときの遮断因子（例えば、抗体）の効能を評価するためのシステム及び方法を提供する。例示的なシステムは、（１）Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）複合体及び免疫チェックポイントレセプター（ＩＣＲ）を表面において提示し、ＮＦＡＴ−プロモーター依存性レポーター（例えば、ルシフェラーゼ）を発現するエフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞（例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞など）など）と、（２）抗ＣＤ３抗体（またはそのフラグメント）、及びエフェクター細胞のＩＣＲに相当する免疫チェックポイントリガンド（ＩＣＬ）を提示する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）と、（３）試験遮断因子（例えば、ＩＣＬまたはＩＣＲに対する抗体）とを含む。いくつかの実施形態において、遮断因子の非存在下で（または試験遮断因子が有効でない事象において）、ＩＣＲ及びＩＣＬは、相互作用して、ＣＤ３−抗体−結合ＴＣＲ複合体によるＮＦＡＴプロモーターの活性化を阻害することにより、レポーターの発現を阻害する。しかし、強力な遮断因子の存在下では、ＩＣＲ及びＩＣＬの相互作用が阻害され、ＮＦＡＴプロモーターが活性化され、レポーターが発現される。いくつかの実施形態において、エフェクター細胞及びａＡＰＣが共培養されるとき、シグナルが殆どまたは全く発生されない（例えば、ＩＣＲ／ＩＣＬ複合体がレポーター発現を阻害するからである）；しかし、強力な遮断因子の添加は、ＮＦＡＴプロモーターからの増加された発現及びレポーターからのシグナルのゲインを結果として生じさせる。
【００６５】
いくつかの実施形態において、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫チェックポイント経路を阻害するときの遮断因子（例えば、抗体）の効能を評価するためのシステム及び方法を提供する。例示的なシステムは、（１）Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）複合体及びＰＤ−１を表面において提示し、ＮＦＡＴ−プロモーター誘発ルシフェラーゼレポーター（例えば、ｌｕｃ２）を発現するＪｕｒｋａｔ細胞と、（２）抗ＣＤ３抗体及びＰＤ−Ｌ１を表面において提示する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）と、（３）試験遮断因子（例えば、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１に対する抗体）とを含む。いくつかの実施形態において、遮断因子の非存在下で（または試験遮断因子が有効でない事象において）、ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１は、相互作用して、抗ＣＤ３−抗体−結合ＴＣＲ複合体によるＮＦＡＴプロモーターの活性化を阻害する；そのため、ルシフェラーゼ発現が阻害され、レポーターシグナルが減少する。強力な遮断因子の存在下では、ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１の相互作用が阻害され、ＮＦＡＴプロモーターが活性化され、ルシフェラーゼ発現が向上され、レポーターシグナルが増加する。いくつかの実施形態において、Ｊｕｒｋａｔエフェクター細胞及びａＡＰＣが共培養されるとき、ルシフェラーゼが殆どまたは全く発現されず、シグナルが殆どまたは全く発生されない（例えば、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１複合体がレポーター発現を阻害するからである）；しかし、強力な遮断因子の添加は、ルシフェラーゼの増加された発現及びシステムからのシグナルのゲインを結果として生じさせる。
【００６６】
いくつかの実施形態において、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ２免疫チェックポイント経路を阻害するときの遮断因子（例えば、抗体）の効能を評価するためのシステム及び方法を提供する。例示的なシステムは、（１）Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）複合体及びＰＤ−１を表面において提示し、ＮＦＡＴ−プロモーター誘発ルシフェラーゼレポーター（例えば、ｌｕｃ２）を発現するＪｕｒｋａｔ細胞と、（２）抗ＣＤ３抗体及びＰＤ−Ｌ２を表面において提示する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）と、（３）試験遮断因子（例えば、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ２に対する抗体）とを含む。いくつかの実施形態において、遮断因子の非存在下で（または試験遮断因子が有効でない事象において）、ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ２は、相互作用して、抗ＣＤ３−抗体−結合ＴＣＲ複合体によるＮＦＡＴプロモーターの活性化を阻害する；そのため、ルシフェラーゼ発現が阻害され、レポーターシグナルが減少する。強力な遮断因子の存在下では、ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ２の相互作用が阻害され、ＮＦＡＴプロモーターが活性化され、ルシフェラーゼ発現が向上され、レポーターシグナルが増加する。いくつかの実施形態において、Ｊｕｒｋａｔエフェクター細胞及びａＡＰＣが共培養されるとき、ルシフェラーゼが殆どまたは全く発現されず、シグナルが殆どまたは全く発生されない（例えば、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ２複合体がレポーター発現を阻害するからである）；しかし、強力な遮断因子の添加は、ルシフェラーゼの増加された発現及びシステムからのシグナルのゲインを結果として生じさせる。
【００６７】
いくつかの実施形態において、ＣＤ８０／ＣＤ８６及びＣＴＬＡ−４の相互作用に依存する免疫チェックポイント経路を阻害するときの遮断因子（例えば、抗体）の効能を評価するためのシステム及び方法を提供する。例示的なシステムは、（１）共刺激レセプターＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＴＣＲ複合体を提示し、ＩＬ−２−プロモーター依存性ルシフェラーゼレポーター構築物を含むＪｕｒｋａｔ細胞と、（２）ＣＤ８０／ＣＤ８６及び抗ＣＤ３抗体Ｆａｂドメインを細胞膜において提示する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）と、（３）試験遮断因子（例えば、ＣＴＬＡ−４またはＣＤ８０／ＣＤ８６に対する抗体）とを含む。ａＡＰＣ及びＪｕｒｋａｔエフェクター細胞の相互作用の際、抗ＣＤ３Ａｂは、ＴＣＲ複合体を活性化し、ＣＤ８０／ＣＤ８６はＣＤ２８を共刺激する。これにより、ＩＬ−２プロモーターの活性化をもたらし、ルシフェラーゼ発現を駆動する；しかし、ＣＴＬＡ−４は、ＣＤ２８との結合親和性よりも高い、ＣＤ８０／ＣＤ８６との結合親和性を有する。これは、ＣＤ８０／ＣＤ８６とＣＤ２８との相互作用、及びＩＬ−２プロモーターからのルシフェラーゼ発現を阻害する。ＣＤ８０／ＣＤ８６相互作用によるＣＴＬＡ−４の阻害因子の存在下では、活性化されたＣＤ２８が、ＩＬ−２プロモーターからのルシフェラーゼレポーターの発現を活性化し、ルシフェラーゼシグナルが上昇する。
【００６８】
いくつかの実施形態において、ＴＩＧＩＴ／ＣＤ１５５免疫チェックポイント経路を阻害するときの遮断因子（例えば、抗体）の効能を評価するためのシステム及び方法を提供する。例示的なシステムは、（１）共刺激レセプターＣＤ２２６、ＴＩＧＩＴ、ＴＣＲ複合体を提示し、ＩＬ−２−プロモーター依存性ルシフェラーゼレポーター構築物を含むＪｕｒｋａｔＴ細胞と、（２）ＣＤ１５５及び抗ＣＤ３抗体Ｆａｂドメインを細胞膜において提示する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）と、（３）試験遮断因子（例えば、ＴＩＧＩＴまたはＣＤ１５５に対する抗体）とを含む。ａＡＰＣ及びＪｕｒｋａｔエフェクター細胞の相互作用の際、抗ＣＤ３Ａｂは、ＴＣＲ複合体を活性化し、ＣＤ１５５は、ＣＤ２２６を共刺激する。これにより、ＩＬ−２プロモーター駆動ルシフェラーゼ発現の活性化がもたらされる；しかし、ＣＤ１５５は、ＣＤ２２６よりも高い、ＴＩＧＩＴとの結合親和性を有する。そのため、ＴＩＧＩＴは、ＣＤ１５５とＣＤ２２６との相互作用、及びＩＬ−２プロモーターからのルシフェラーゼ発現の活性化を阻害する。ＴＩＧＩＴ／ＣＤ１５５相互作用の阻害因子の存在下では、活性化されたＣＤ２２６が、ＩＬ−２プロモーターからのルシフェラーゼレポーターの発現を活性化し、ルシフェラーゼシグナルが上昇する。
【００６９】
いくつかの実施形態において、ＴＩＧＩＴ／ＣＤ１５５免疫チェックポイント経路を阻害するときの遮断因子（例えば、抗体）の効能を評価するためのシステム及び方法を提供する。例示的なシステムは、（１）共刺激レセプターＣＤ２２６、ＴＩＧＩＴ、ＴＣＲ複合体を提示し、ＩＬ−２−プロモーター依存性ルシフェラーゼレポーター構築物（例えば、人工ＣＥＭエフェクター細胞）を含むＣＥＭ  Ｔ細胞と、（２）ＣＤ１５５及び抗ＣＤ３抗体Ｆａｂドメインを細胞膜において提示する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）と、（３）試験遮断因子（例えば、ＴＩＧＩＴまたはＣＤ１５５に対する抗体）とを含む。ａＡＰＣ及びＣＥＭエフェクター細胞の相互作用の際、抗ＣＤ３Ａｂは、ＴＣＲ複合体を活性化し、ＣＤ１５５は、ＣＤ２２６を共刺激する。両者は、ＩＬ−２プロモーター駆動ルシフェラーゼ発現の活性化をもたらす；しかし、ＣＤ１５５は、ＣＤ２２６よりも高い、ＴＩＧＩＴとの結合親和性を有する。そのため、ＴＩＧＩＴは、ＣＤ１５５とＣＤ２２６との相互作用、及びＩＬ−２プロモーターからのルシフェラーゼ発現の活性化を阻害する。ＴＩＧＩＴ／ＣＤ１５５相互作用の阻害因子の存在下では、活性化されたＣＤ２２６が、ＩＬ−２プロモーターからのルシフェラーゼレポーターの発現を活性化し、ルシフェラーゼシグナルが上昇する。
【００７０】
いくつかの実施形態において、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫チェックポイント経路を阻害するときの遮断因子（例えば、抗体）の効能を評価するためのシステム及び方法を提供する。例示的なシステムは、（１）ＰＤ−１、ＴＣＲ複合体、及びネイティブＩＬ−２プロモーターによって駆動される内因性ＩＬ−２遺伝子を提示するＪｕｒｋａｔＴ細胞と、（２）ＰＤ−Ｌ１及び抗ＣＤ３抗体Ｆａｂドメインを細胞膜において提示する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）と、（３）試験遮断因子（例えば、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１に対する抗体）とを含む。ａＡＰＣ及びＪｕｒｋａｔエフェクター細胞の相互作用の際、抗ＣＤ３Ａｂは、ＴＣＲ複合体を活性化し、ＩＬ−２プロモーターを活性化し、ＩＬ−２産生を増加させる；しかし、ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１の相互作用は、ＩＬ−２プロモーターからのＩＬ−２発現の活性化を阻害し、ＩＬ−２タンパク質の産生が殆ど生じない。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用の阻害因子の存在下では、活性化されたＴＣＲ複合体が、ＩＬ−２プロモーターからのＩＬ−２発現を活性化し、媒体におけるＩＬ−２産生が上昇する。
【００７１】
いくつかの実施形態において、ＬＡＧ−３／ＭＨＣＩＩ免疫チェックポイント経路を阻害するときの遮断因子（例えば、抗体）の効能を評価するためのシステム及び方法を提供する。例示的なシステムは、（１）ＬＡＧ−３、ＴＣＲ複合体を提示し、ＮＦＡＴ−プロモーター依存性ルシフェラーゼレポーター構築物を含むＪｕｒｋａｔＴ細胞と、（２）ＭＨＣＩＩを細胞膜において提示するＲａｊｉＢ細胞における人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）と、（３）試験遮断因子（例えば、ＬＡＧ−３またはＭＨＣＩＩに対する抗体）とを含む。ＡＰＣ及びＪｕｒｋａｔエフェクター細胞の相互作用の際、ＭＨＣＩＩによって提示される超抗原は、ＴＣＲ複合体を活性化し、ＮＦＡＴプロモーター駆動ルシフェラーゼ発現を活性化する；しかし、ＭＨＣＩＩと結合するＬＡＧ−３はＴＣＲ活性化を阻害する。これにより、ＮＦＡＴプロモーターからのルシフェラーゼ発現の不活化がもたらされる。ＬＡＧ−３／ＭＨＣＩＩ相互作用の阻害因子の存在下では、活性化されたＴＣＲが、ＮＦＡＴプロモーターからのルシフェラーゼレポーターの発現を活性化し、ルシフェラーゼシグナルが上昇する。
【００７２】
いくつかの実施形態において、システムは、本明細書に記載されているａＡＰＣ、エフェクター細胞、ＩＣＬ、ＩＣＲ、プロモーター、レポーター、細胞型などのいずれの好適な組み合わせも含む。
【００７３】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されているシステム及び方法は、ＡＰＣ（例えば、ＴＣＲ複合体に結合する抗ＣＤ３抗体）によるＴＣＲの適切な係合から下流のＴＣＲ活性化経路からの転写の活性化を利用する。いくつかの実施形態において、エフェクター細胞は、細胞の活性化をシグナリングするレポーター構築物によって付与される（例えば改変される）。いくつかの実施形態において、構築物は、ＴＣＲ活性化経路の制御下でレポーター（例えば、ルシフェラーゼ）遺伝子によって付与される。Ｔ細胞活性化経路の活性化の際、レポーター（例えば、ルシフェラーゼ）の増加された発現が生じ、細胞活性化は、レポーターからのシグナルに基づいて検出及び／または定量化され得る。上記のように、静止Ｔ−リンパ球が抗ＣＤ３抗体によって活性化され得ることが実験的に実証されている（Ｔｓｏｕｋａｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８５年９月；１３５（３）：１７１９−２３．；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。本明細書に記載されている実施形態は、抗ＣＤ３による活性化に限定されない。いくつかの実施形態において、他のＴ細胞刺激シグナル（例えば、ａＡＰＣにおいて提示される）は、Ｔ細胞を活性化するのに使用され、ＴＣＲ活性化経路依存性レポーターによって検出される。ＴＣＲ活性化経路依存性レポーターを含むエフェクター細胞が、抗ＣＤ３抗体（またはそのフラグメント）を提示するａＡＰＣによって接触されるとき、Ｔ細胞活性化経路が活性化されて、レポーターシグナルが増加する。しかし、（例えば、エフェクター細胞におけるＩＣＲとａＡＰＣにおけるＩＣＬとの間での）阻害ＩＣＲ／ＩＣＬ複合体の形成の際、適切に係合されたＴＣＲによるＴ細胞活性化が阻害され、ＴＣＲ活性化経路からのレポーターの転写が低減される。遮断因子によるＩＣＲ／ＩＣＬ複合体の遮断が、Ｔ細胞のＴＣＲ活性化を回復させ、ＴＣＲ活性化経路からのレポーターの転写が増加される。
【００７４】
いくつかの実施形態において、ＴＣＲ活性化経路依存性レポーター構築物は、（１）ＴＣＲ活性化経路応答要素またはプロモーターと、（２）検出可能なレポーターペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸とを含む。いくつかの実施形態において、エフェクター細胞（例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞）は、ＴＣＲ活性化経路依存性レポーター構築物によって安定にトランスフェクトされる。トランスフェクションは、当該分野においてよく理解されている方法によって実施され；好適な方法として、化学ベースのトランスフェクション、非化学トランスフェクション、粒子ベースのトランスフェクション、ウイルスベースのトランスフェクション、エレクトロポレーション、及び内因性プロモーター活性をモニタリングする遺伝子編集技術、または他の公知のトランスフェクション方法が挙げられる。
【００７５】
ＮＦＡＴプロモーターは、１以上のＮＦＡＴ応答要素を含有する核酸配列である。ＮＦＡＴ転写因子（例えば、ＮＦＡＴｃ１、ＮＦＡＴｃ２、ＮＦＡＴｃ３、ＮＦＡＴｃ４、またはＮＦＡＴ５）によって結合されるとき、関連する核酸配列（例えば、下流の遺伝子）の転写が向上される。１つの好適なＮＦＡＴ応答要素は：
ＧＧＡＧＧＡＡＡＡＡＣＴＧＴＴＴＣＡＴＡＣＡＧＡＡＧＧＣＧＴ（配列番号１）
である。
【００７６】
いくつかの実施形態において、ＮＦＡＴプロモーターは、配列番号１の繰り返しを含む。いくつかの実施形態において、ＮＦＡＴプロモーターは、配列番号１に対して少なくとも５０％（例えば、＞５０％、＞６０％、＞７０％、＞８０％、＞９０％、＞９５％及びこれらの中の範囲）の配列同一性を有する１以上のＮＦＡＴ応答要素を含み、ここで、ＮＦＡＴ応答要素は、ＮＦＡＴファミリー転写因子に結合して、関連（例えば、下流の）遺伝子の転写を向上させる。
【００７７】
いくつかの実施形態において、ＴＣＲ活性化経路応答要素またはプロモーターは、ＩＬ−２プロモーター配列、ＮＦカッパＢファミリー転写因子に結合して関連（例えば、下流の）遺伝子の転写を向上させるＮＦカッパＢ応答要素、ＡＰ１ファミリー転写因子に結合して関連（例えば、下流の）遺伝子の転写を向上させるＡＰ１応答要素、または上記応答要素のいずれかの組み合わせである。
【００７８】
いくつかの実施形態において、ＴＣＲ活性化経路依存性レポーター構築物のレポーターは、限定されないが、ルシフェラーゼ、ベータラクタマーゼ、ＣＡＴ、ＳＥＡＰ、蛍光タンパク質などを含めた検出可能シグナルを生成するいずれかのペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である。いくつかの実施形態において、レポーターは、蛍光または生物発光レポーターである。ある特定の実施形態において、生物発光レポーターは、ルシフェラーゼである。いくつかの実施形態において、ルシフェラーゼは、Ｏｍｐｈａｌｏｔｕｓ  ｏｌｅａｒｉｕｓ、ホタル（例えば、Ｐｈｏｔｉｎｉｎｉ）、Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、その変異体、その部分、その変形体、ならびに本明細書に記載されているシステム及び方法に好適ないずれか他のルシフェラーゼ酵素において見出されるものから選択される。本明細書に記載されている実施形態は、レポーターの起こり得る同一性によって限定されない。
【００７９】
いくつかの実施形態において、（例えば、ＰＤ−Ｌ１を提示するａＡＰＣを含むシステムにおける使用のための）ＰＤ−１を発現するエフェクター細胞を提供する。いくつかの実施形態において、表面においてＰＤ−１を提示するエフェクター細胞を提供する。いくつかの実施形態において、エフェクター細胞は、ＰＤ−１の全体または一部と少なくとも５０％の配列同一性（例えば、＞５０％、＞６０％、＞７０％、＞８０％、＞９０％、＞９５％、またはそれを超える）でペプチド／ポリペプチドを発現及び／または提示し、ＰＤ−Ｌ１に関するＰＤ−１の親和性の少なくとも５０％（例えば、＞５０％、＞６０％、＞７０％、＞８０％、＞９０％、＞９５％、またはそれを超える）を保持する。いくつかの実施形態において、ＰＤ−Ｌ１に関するＰＤ−１の親和性の少なくとも５０％（例えば、＞５０％、＞６０％、＞７０％、＞８０％、＞９０％、＞９５％、またはそれを超える）を有し、少なくとも５０％、例えば、＞５０％、＞６０％、＞７０％、＞８０％、＞９０％、＞９５％、またはそれを超える）の、ＰＤ−１がＰＤ−Ｌ１への結合の際にＴ細胞の活性化を阻害する可能性を有するペプチド／ポリペプチドを提示または発現するエフェクター細胞を提供する。
【００８０】
いくつかの実施形態において、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２２６、ＴＩＧＩＴなどを発現するエフェクター細胞を提供する。いくつかの実施形態において、エフェクター細胞は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２２６、ＴＩＧＩＴなどの全体または一部と少なくとも５０％の配列同一性（例えば、＞５０％、＞６０％、＞７０％、＞８０％、＞９０％、＞９５％、またはそれを超える）でペプチド／ポリペプチドを発現及び／または提示し、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２２６、ＴＩＧＩＴなどのそれらのリガンド（例えば、ＣＤ８０／ＣＤ８６、ＣＤ１５５など）に対する親和性の少なくとも５０％（例えば、＞５０％、＞６０％、＞７０％、＞８０％、＞９０％、＞９５％、またはそれを超える）を保持する。いくつかの実施形態において、レセプター（例えば、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２２６、ＴＩＧＩＴなど）の、それらのリガンド（例えば、ＣＤ８０／ＣＤ８６、ＣＤ１５５など）に対する親和性の少なくとも５０％（例えば、＞５０％、＞６０％、＞７０％、＞８０％、＞９０％、＞９５％、またはそれを超える）を有し、少なくとも５０％（例えば、＞５０％、＞６０％、＞７０％、＞８０％、＞９０％、＞９５％、またはそれを超える）の、レセプターが適切なリガンドに結合する際のＴ細胞の活性化に影響する可能性を有するペプチド／ポリペプチドを提示または発現するエフェクター細胞を提供する。
【００８１】
いくつかの実施形態において、（例えば、ＰＤ−Ｌ１以外のＩＣＬを提示するａＡＰＣを含むシステムにおける使用のための）ＰＤ−１以外の１以上のＩＣＲを発現及び／または提示するエフェクター細胞を提供する。例えば、いくつかの実施形態において、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡなどのうち１以上を発現及び／または提示するエフェクター細胞を提供する。本明細書に記載されている実施形態は、列挙されているＩＣＲに限定されない。ＩＣＬと相互作用してエフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）の活性を阻害することが可能であるいずれのＩＣＲも、本明細書に記載されている実施形態における用途を見出し得る。
【００８２】
いくつかの実施形態において、ａＡＰＣ及びエフェクター細胞を含むシステムであって、ａＡＰＣがエフェクター細胞を（例えば、エフェクター細胞のＴＣＲ複合体に結合するａＡＰＣの抗ＣＤ３を介して）活性化する可能性を有することにより、検出可能レポーター（例えば、ＮＦＡＴ−プロモーター依存性レポーター）の発現を誘発する、上記システムを本明細書において提供する；しかし、ａＡＰＣに対するＩＣＬ（ＰＤ−Ｌ１）の、及びエフェクター細胞に対するＩＣＲ（ＰＤ−１）の相互作用は、エフェクター細胞活性化及びレポーター発現を阻害する。いくつかの実施形態において、システムを遮断因子に曝すことで、ＩＣＲ／ＩＣＬ相互作用を阻害し、エフェクター細胞活性化を向上させ、レポーター発現を増加させる。いくつかの実施形態において、遮断因子の効能は、レポーター発現に正比例する。
【００８３】
ある特定の実施形態において、エフェクター細胞の活性及びレポーター発現を制限するのはＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１の相互作用である。そのため、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用の遮断が、エフェクター細胞を活性化し、レポーター発現及びレポーターシグナルを増加させる。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断は、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１に結合する抗体を含めた種々の機構によって達成され得る。ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１遮断体の例は、米国特許第７，４８８，８０２号；同第７，９４３，７４３号；同第８，００８，４４９号；同第８，１６８，７５７号；同第８，２１７，１４９号、ならびにＰＣＴ公開特許出願第ＷＯ０３０４２４０２号、同第ＷＯ２００８１５６７１２号、同第ＷＯ２０１００８９４１１号、同第ＷＯ２０１００３６９５９号、同第ＷＯ２０１１０６６３４２号、同第ＷＯ２０１１１５９８７７号、同第ＷＯ２０１１０８２４００号、及び同第ＷＯ２０１１１６１６９９号に記載されており；それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ある特定の実施形態において、遮断因子は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体及び／または類似の結合タンパク質、例えば、ＮＩＶＯＬＵＭＡＢ（ＭＤＸ１１０６、ＢＭＳ９３６５５８、ＯＮＯ４５３８）、ＰＤ−１に結合してＰＤ−１の活性化をそのリガンドＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２によって遮断する完全ヒト型ＩｇＧ４抗体；ＬＡＭＢＲＯＬＩＺＵＭＡＢ（ＭＫ−３４７５またはＳＣＨ９００４７５）、ＰＤ−１に対するヒト化モノクローナルＩｇＧ４抗体；ＰＤ−１に結合するヒト化抗体ＣＴ−０１１；抗体Ｆｃ部分によるＰＤ−Ｌ２の融合タンパク質であるＡＭＰ−２２４；ＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１）遮断のためのＢＭＳ−９３６５５９（ＭＤＸ−１１０５−０１）から選択される。
【００８４】
いくつかの実施形態において、試験遮断因子（例えば、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１複合体形成を阻害するまたはＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１複合体形成に対して知られていない効果を及ぼすとされている因子（例えば、抗体））は、本明細書に記載されているシステムに投与されて、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用を中断することに対する試験因子の効能について試験する。より一般には、本明細書における実施形態は、ＩＣＲ／ＩＣＬ相互作用を中断することに対する試験因子の効能について試験するのに本明細書に記載されているシステムに投与される試験遮断因子（例えば、ＩＣＲ／ＩＣＬ複合体形成を阻害するまたはＩＣＲ／ＩＣＬ複合体形成に対して知られていない効果を及ぼすとされている因子（例えば、抗体））を含む。
【００８５】
いくつかの実施形態において、試験遮断因子が（１）ＩＣＲ／ＩＣＬ相互作用を阻害し、（２）エフェクター細胞を活性化し、及び／または（３）ＮＦＡＴプロモーターからの転写を促進する能力についてスクリーニングするためのシステム及び方法を本明細書において提供する。いくつかの実施形態において、試験遮断因子は、特定のＩＣＲ／ＩＣＬ相互作用（例えば、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ２との、ＣＴＬＡ−４とＣＤ８０／ＣＤ８６との、ＴＩＧＩＴとＣＤ１５５との相互作用など）を阻害するとされていて、別のアッセイにおいてかかる阻害を実証している化合物、ペプチド、タンパク質、抗体などである。他の実施形態において、試験遮断因子は、ＩＣＲ／ＩＣＬ相互作用（例えば、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ２との、ＣＴＬＡ−４とＣＤ８０／ＣＤ８６との、ＴＩＧＩＴとＣＤ１５５との相互作用など）に対して知られていない効果を及ぼす。ＩＣＲ／ＩＣＬ相互作用に対する効果及び／またはエフェクター細胞活性化を誘発する能力について特徴付けされていない試験遮断因子は、本明細書に記載されているシステム及び方法を使用して、単独で、または複数の試験遮断因子のスクリーニング（例えば、高スループットスクリーニング）において試験され得る。
【００８６】
いくつかの実施形態において、ＩＣＲ／ＩＣＬ相互作用（例えば、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ２との、ＣＴＬＡ−４とＣＤ８０／ＣＤ８６との、ＴＩＧＩＴとＣＤ１５５との相互作用など）に対する知られていないまたは未確認の効果の複数の試験遮断因子をスクリーニングするためのシステム及び方法を提供する。いくつかの実施形態において、複数の試験遮断因子（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、もしくはそれを超える、またはこれらの中の範囲）は、本明細書に記載されている単一の遮断アッセイシステムに導入される。かかる実施形態において、ＩＣＲ／ＩＣＬ相互作用（例えば、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ２との、ＣＴＬＡ−４とＣＤ８０／ＣＤ８６との、ＴＩＧＩＴとＣＤ１５５との相互作用など）に対する阻害効果の検出の際に、レポーターシグナルの増加によって示されるように、個々の試験遮断因子または該因子のより小さい群が、別個の遮断アッセイシステムにおいて（例えば、別個の反応容器において）後に試験される。他の実施形態において、複数の試験遮断因子（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、５００、１０００、２０００、５０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、もしくはそれを超える、またはこれらの中の範囲）は、本明細書に記載されている平行遮断アッセイシステムに導入される。かかる平行アッセイは、大規模及び／または高スループットのスクリーニングを容易にするシステム、方法、デバイス、ロボット、及び当該分野において公知の他の機器を使用して実行されてよい。例えば、ａＡＰＣ及びエフェクター細胞は、９６−または３８４−ウエルプレートにおいて共培養され、ロボットは、試験遮断因子のライブラリーを効率的に導入してレポーターシグナルを検出するのに使用される。
【００８７】
いくつかの実施形態において、遮断アッセイを実施するための（例えば、本明細書に記載されているアッセイ構成要素（例えば、エフェクター細胞及びａＡＰＣ）と併せての試薬、組成物、デバイス、機器などを提供する。いくつかの実施形態において、試薬は、培地、血清、栄養素補給剤（例えば、ａＡＰＣ及びエフェクター細胞の共培養に十分な）、緩衝剤、レポーター基材（例えば、ルシフェリン、セレンテラジン（またはその誘導体）など）、対照遮断因子（例えば、ＩＣＲ／ＩＣＬ相互作用（例えば、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ２との、ＣＴＬＡ−４とＣＤ８０／ＣＤ８６との、ＴＩＧＩＴとＣＤ１５５との相互作用など）を阻害することが知られているポジティブ対照）などを含んでいてよい。いくつかの実施形態において、培養フラスコ及びビヒクル、微小遠心管、９６−及び３８４−ウエルプレートを含むマイクロプレート、リーダー、ウォーターバス、ＣＯ2インキュベーター、単一チャネル及び複数チャネルピペットなどが提供される。いくつかの実施形態において、（例えば、試薬分注、サンプルの組織化、レポーター検出などの）高スループットアッセイ用ロボット、レポーター検出用機器（例えば、蛍光光度計、照度計、分光計、Ｔａｑｍａｎ、ＥＬＩＳＡプレートなど）などが提供される。
【００８８】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている遮断アッセイを実施するための構成要素の全部または一部をキットとして提供する。構成要素は、便宜上または他の考えで一緒にまたは別個でパッケージングされている別個の容器にあってよい。いくつかの実施形態において、試薬（例えば、ＡＰＣ、エフェクター細胞など）は、ユーザーが実施する予定である遮断アッセイのサイズ及び／または数に従って所定の量で提供される。いくつかの実施形態において、付属品（例えば、容器、プレートなど）、説明書、他の試薬（例えば、緩衝剤、対照、媒体、レポーター基材など）なども提供する。いくつかの実施形態において、ユーザーは、本明細書に記載されている遮断アッセイを実施するキットの構成要素（例えば、媒体、遮断因子（複数可）、レポーター基材など）を使用するのに必要な１以上の構成要素を提供する。
【００８９】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている組成物及びシステムを利用する方法を提供する。人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を利用して、例えば、遮断因子をスクリーニングし、遮断因子を開発してさらに修飾及び最適化し、遮断因子の効能を試験し、エフェクター細胞の免疫を調節し、ＩＣＲ及びＩＣＬを同定し、インビトロまたはインビボで免疫機能を試験するなどの方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、ａＡＰＣを、人工エフェクター細胞（例えば、改変レセプターを含み、改変抗原応答要素を含み、改変レポーター構築物を含む、など）または天然のエフェクター細胞（例えば、内在性構成要素のみを含むヒトもしくは動物源由来のエフェクター細胞）と組み合わせて利用する。いくつかの実施形態において、方法を、インビトロにおいて、インビボにおいて、インサイチュにおいて、全生物（例えば、ヒトまたは動物モデル）において、細胞培養においてなどで実施する。いくつかの実施形態において、ａＡＰＣ、エフェクター細胞、遮断因子、または本明細書における組成物及びシステムと併せて記載されている他の構成要素のいずれかを利用する方法を本明細書において提供する。
【００９０】
いくつかの実施形態において、方法は、（ａ）ＩＣＲを含むエフェクター細胞（例えば、天然または改変）、抗原応答要素（例えば、ＴＣＲ複合体）、及びレポーター（例えば、外因性または内在性）を、（ｂ）本明細書に記載されているａＡＰＣ（例えば、ＩＣＬ、及び抗原応答要素の活性化因子（例えば、ＴＣＲ活性化因子）を提示する）と接触させる（例えば共培養する）ことを含む。いくつかの実施形態において、方法は、上記レポーターからのシグナルを検出して、ａＡＰＣによるエフェクター細胞免疫の活性化、ＩＣＲ／ＩＣＬ複合体の形成によるエフェクター細胞活性化の調節などを定量化することをさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、ａＡＰＣ及び／またはエフェクター細胞を遮断因子または試験遮断因子と接触させることと、上記レポーターからのシグナルを検出して、エフェクター細胞免疫の活性化、ＩＣＲ／ＩＣＬ複合体の形成、ＩＣＲ／ＩＣＬ複合体によるエフェクター細胞活性化の調節、抗原応答要素依存性経路、ＩＣＲ／ＩＣＬ依存性経路などのうちの１以上に対する遮断因子の効果を定量化することとをさらに含む。
【００９１】
いくつかの実施形態において、（ａ）（ｉ）表面において（Ａ）Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）活性化因子及び（Ｂ）免疫チェックポイントリガンド（ＩＣＬ）を提示する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を、（ｉｉ）ＴＣＲ複合体を含み、表面において免疫チェックポイントレセプター（ＩＣＲ）を提示するエフェクター細胞と接触させることにおいて、ＴＣＲ活性化因子とＴＣＲ複合体との相互作用が、ＴＣＲシグナリング経路を活性化し、上記ＩＣＲ及び上記ＩＣＬが、相互作用の際にＩＣＲ／ＩＣＬ複合体を形成し、ＩＣＲ／ＩＣＬ複合体の形成が、ＴＣＲ活性化及び／またはＴＣＲシグナリング経路を向上または阻害することと、（ｂ）上記エフェクター細胞におけるＴＣＲ活性化の存在、非存在及び／またはレベルを検出することとを含む方法を本明細書において提供する。いくつかの実施形態において、方法は、（ｃ）上記エフェクター細胞及び／または上記ａＡＰＣを遮断因子または試験遮断因子と接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、（ｄ）上記遮断因子または試験遮断因子の、（ｉ）ＩＣＲ／ＩＣＬ複合体形成、（ｉｉ）ＴＣＲ活性化、及び／または（ｉｉｉ）ＴＣＲシグナリング経路に対する効果を検出することをさらに含む。いくつかの実施形態において、（ｉ）ＩＣＲ／ＩＣＬ複合体形成、（ｉｉ）ＴＣＲ活性化、及び／または（ｉｉｉ）ＴＣＲシグナリング経路の１以上が、上記遮断因子または試験遮断因子の存在及び非存在下で検出されて、効果を決定する。
【００９２】
いくつかの実施形態において、（ａ）（ｉ）表面において（Ａ）Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）活性化因子及び（Ｂ）免疫チェックポイントリガンド（ＩＣＬ）を提示する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を、（ｉｉ）表面において免疫チェックポイントレセプター（ＩＣＲ）を提示し、ＴＣＲ複合体及びレポーター（例えば、内在性または外因性）を含むエフェクター細胞と接触させることにおいて、ＴＣＲ活性化因子とＴＣＲ複合体との相互作用が、ＴＣＲシグナリング経路を活性化し、上記ＩＣＲ及び上記ＩＣＬが、相互作用の際にＩＣＲ／ＩＣＬ複合体を形成し、ＩＣＲ／ＩＣＬ複合体の形成が、ＴＣＲ活性化及び／またはＴＣＲシグナリング経路を向上または阻害し、上記レポーターからの検出可能なシグナル（例えば、活性、発光、蛍光、発現レベル、濃度、局在、タンパク質−タンパク質相互作用など）が、ＴＣＲ活性化のレベルと相関することと、（ｂ）上記エフェクター細胞におけるＴＣＲ活性化の存在、非存在及び／またはレベルを検出することとを含む方法を本明細書において提供する。いくつかの実施形態において、方法は、（ｃ）上記エフェクター細胞及び／または上記ａＡＰＣを遮断因子または試験遮断因子と接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、（ｄ）上記遮断因子または試験遮断因子の、（ｉ）ＩＣＲ／ＩＣＬ複合体形成、（ｉｉ）ＴＣＲ活性化、及び／または（ｉｉｉ）ＴＣＲシグナリング経路に対する効果を検出することをさらに含む。いくつかの実施形態において、（ｉ）ＩＣＲ／ＩＣＬ複合体形成、（ｉｉ）ＴＣＲ活性化、及び／または（ｉｉｉ）ＴＣＲシグナリング経路の１以上が、上記遮断因子または試験遮断因子の存在及び非存在下で検出されて、効果を決定する。
【００９３】
いくつかの実施形態において、ａＡＰＣが、システム（例えば、細胞培養システム、全生物、組織サンプル、血液サンプルなど）に導入され、システム（もしくは下流の経路）内でのａＡＰＣ及び／または遮断因子とエフェクター細胞との相互作用がアッセイされる（例えば、ＴＣＲ／ＴＣＲ−活性化因子相互作用、ＩＣＬ／ＩＣＲ相互作用、遮断因子によるＩＣＲ／ＩＣＬ相互作用の崩壊など）。いくつかの実施形態において、エフェクター細胞は、一次細胞（（例えば、生物または細胞培養系から単離されたまたは誘導された）例えば、内在性構成要素のみを有するヒトまたは動物細胞）であり、相互作用は、例えば、エフェクター細胞内での内在性レポーターの特徴（例えば、ＴＣＲ経路依存性プロモーターからの発現、ＴＣＲ経路タンパク質の活性、ＴＣＲ活性化依存性細胞変化、ＴＣＲ依存性タンパク質−タンパク質相互作用及びタンパク質移動、または一時的もしくは安定な一体化におけるいずれかの遺伝子送達方法によるレポーター遺伝子制御の検出など）に基づいてアッセイされる。他の実施形態において、エフェクター細胞は、人工エフェクター細胞であり、ａＡＰＣの効果／効果の相互作用を検出するためのレポーター構築物を含む。
【００９４】
ある特定の実施形態において、遮断因子（または試験遮断因子）の効能をアッセイして、ＩＣＲ及びＩＣＬの相互作用またはＩＣＲ／ＩＣＬ複合体からのシグナリングを阻害する方法を本明細書において提供する。かかる実施形態において、レポーター、またはエフェクター細胞内のレポーター（例えば、天然もしくは改変）からのシグナルが、（例えば、遮断因子の存在下、非存在下、及び／または変動濃度で）モニタリングされて、遮断因子の効能を決定及び／または定量化する。
【００９５】
いくつかの実施形態において、試験遮断因子をスクリーニングする（例えば、化合物、ペプチド、抗体などのライブラリー）方法を提供する。かかる実施形態において、本明細書に記載されている多くの実質的に同一なシステムは、多数の試験遮断因子に対するシステムの応答を同定するのと平行にアッセイされる。かかるアッセイは、低または高スループット形式で実施されてよく、手動で実施されても自動化されていてもよい。
【００９６】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されているａＡＰＣが生物システム（例えば、生物サンプル（例えば、組織サンプル、血液サンプルなど）、全生物、細胞培養システムなど）内に導入される方法を提供する。いくつかの実施形態において、生物システムは、本明細書に記載されている実施形態に従って改変されている天然のエフェクター細胞及び／またはエフェクター細胞を含む。
【００９７】
いくつかの実施形態において、アッセイは、サービスとして実施される。かかる実施形態において、ユーザーは、試験される１以上の試験遮断因子を提出する。１以上の遮断アッセイが、本明細書に記載されている実施形態に従って実施されて、結果（例えば、試験遮断因子の阻害効能）がユーザーに報告される。試験結果は、いずれの好適な形式で報告されてもよく、ユーザーに容易に解釈できる結果を付与するように分析された形態で原データ（例えば、遮断因子濃度の関数としてレポーターシグナル）を含んでいてよい。
【００９８】
ａＡＰＣを含むまたは利用する組成物、システム、及び方法が本明細書に記載されている。いくつかの実施形態において、かかる組成物、システム、及び方法は、ａＡＰＣの代わりに、リン脂質液滴を代わりに含んでいてよい。かかるリン脂質液滴は本明細書に記載されているａＡＰＣ（例えば、ＴＣＲ活性化因子、免疫チェックポイントリガンドなど）と同じ要素を提示して含み、同じ方法（例えば、エフェクター細胞との相互作用）での用途を見出す。
【実施例】
【００９９】
実験
実施例１
ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断アッセイの特異性
本明細書に記載されている実施形態の開発の際に実験を行って、種々の条件に対する図１に示されている遮断アッセイの検出可能な応答を試験した。ＰＤ−１及びＮＦＡＴ−ＲＥ−ルシフェラーゼレポーターを発現するＪｕｒｋａｔエフェクター細胞を、いずれも抗ＣＤ３抗体（図２及び図３）を提示するＰＤ−Ｌ１-またはＰＤ−Ｌ１+ａＡＰＣと共培養した。ルシフェラーゼ活性は、Ｊｕｒｋａｔエフェクター細胞及びＰＤ−Ｌ１-ａＡＰＣを含む共培養システムと比較して、Ｊｕｒｋａｔエフェクター細胞及びＰＤ−Ｌ１+ａＡＰＣを含む共培養システムにおいて有意に減少した。異なる遮断因子をインキュベートし、Ｊｕｒｋａｔエフェクター細胞及びＰＤ−Ｌ１+ａＡＰＣを含むシステムと比較した（図３）。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用、抗ＰＤ−Ｌ１抗体または抗ＰＤ−１抗体を特異的に遮断することが知られている特異的な遮断因子の存在下のみで、しかし、抗ＣＴＬＡ−４抗体の非存在下で、抗ＣＤ３抗体は、ＴＣＲ複合体を活性化し、ＮＦＡＴ応答要素によって駆動されるルシフェラーゼレポーターの発現を増加させた。実験は、試験された種々の条件に対するシステムの特異性を実証した。
【０１００】
実験によって、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（図４）及び抗ＰＤ−１抗体（図５）活性がレポーターシステムによって測定され得ることを実証した。ＰＤ−１及びＮＦＡＴ−ＲＥ−ルシフェラーゼレポーターを発現するＪｕｒｋａｔエフェクター細胞を、連続希釈の抗ＰＤ−Ｌ１抗体（図４）または抗ＰＤ−１抗体（図５）の存在下で抗ＣＤ３／ＰＤ−Ｌ１+ａＡＰＣと共培養した。いずれの遮断因子もＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１複合体形成の濃度依存性阻害を付与し、発光シグナルの濃度依存性増加、及びレポーターシステムから４〜６倍増加されたルシフェラーゼ活性を結果として生じさせた。
【０１０１】
実施例２
抗ＣＤ３を発現しないａＡＰＣを使用したＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断アッセイ
本明細書に記載されている実施形態の開発の際に行った実験は、可溶性抗ＣＤ３抗体の存在下でＰＤ−Ｌ１を発現するが抗ＣＤ３を発現しないａＡＰＣを使用した遮断アッセイシステムを実証した（図６）。ＰＤ−１及びＮＦＡＴ−ＲＥ−ルシフェラーゼレポーターを発現するＪｕｒｋａｔエフェクター細胞を、可溶性抗ＣＤ３抗体と、連続希釈の遮断因子、抗ＰＤ−Ｌ１抗体との存在下で、抗ＣＤ３-／ＰＤ−Ｌ１+ａＡＰＣと共培養した（図６）。遮断因子は、図４における同じ遮断因子からのルシフェラーゼ発現の６倍の増加と比較して、ルシフェラーゼ（図７）のＮＦＡＴ−ＲＥ依存性発現の有意に低減された誘発（＜１．３倍）を付与した。
【０１０２】
実施例３
遮断アッセイにおける抗ＣＤ３／ＰＤ−Ｌ１ａＡＰＣの代わりの抗ＣＤ３／ＰＤ−Ｌ１ビーズ
本明細書に記載されている実施形態の開発の際に行った実験は、抗ＣＤ３／ＰＤ−Ｌ１ａＡＰＣビーズが、Ｊｕｒｋａｔエフェクター細胞によるルシフェラーゼのＮＦＡＴ−プロモーター依存性発現の活性化を阻害しないことを実証している（図８）。ビーズを定量の抗ＣＤ３（１０％のタンパク質）でコーティングした。ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃキメラを１：０（ＰＤ−Ｌ１なし）、１：３、及び１：９の抗ＣＤ３：ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃモル比で同時にコーティングした。無関係のＩｇＧを使用してモル比のバランスを取った。ＰＤ−１及びＮＦＡＴ−ＲＥ−ルシフェラーゼを発現するＪｕｒｋａｔエフェクター細胞を連続ビーズ希釈でインキュベートした。ＮＦＡＴ−ＲＥ依存性ルシフェラーゼ発現は、１：０、１：３、または１：９のいずれの抗ＣＤ３：ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃビーズを使用していても同様であった。ＦＡＣＳ分析は、ビーズにおけるＰＤ−Ｌ１の存在を確認する（図９）。図８に記載のビーズを抗ＰＤ−Ｌ１−ＦＩＴＣで標識化し、フローサイトメトリーによって分析した。
【０１０３】
抗ＣＤ３／ＰＤ−Ｌ１ビーズ（１：９のモル比）は、Ｔ細胞活性化のＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１係合誘発阻害を示さず、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、Ｔ細胞活性化を誘発しなかった（図１０）。ＰＤ−１及びＮＦＡＴ−ＲＥ−ルシフェラーゼを発現するＪｕｒｋａｔエフェクター細胞を、ＰＤ−Ｌ１遮断抗体の存在または非存在下で抗ＣＤ３：ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃビーズによって処理した。ＮＦＡＴ−ＲＥ依存性ルシフェラーゼ発現はＰＤ−Ｌ１遮断抗体の存在下で変化しなかった。ビーズにおけるＰＤ−Ｌ１の延長された長さは、ビーズによる活性化の欠失を是正しなかった（図１１）。ＰＤ−Ｌ１をビーズから離れて延長するストラテジーの説明を示す。ビーズを、抗ＣＤ３：抗ヒトＩｇＧによって１：９のモル比でコーティングした。次いでビーズをＰＤ−Ｌ１−Ｆｃキメラ（ＰＤ−Ｌ１に融合されたヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域を含有する）によってインキュベートし、ＰＤ−Ｌ１をビーズに充填した。ＰＤ−１及びＮＦＡＴ−ＲＥ依存性ルシフェラーゼを発現するＪｕｒｋａｔエフェクター細胞を、ＰＤ−Ｌ１遮断抗体の存在または非存在下でこれらのビーズによって処理した。ＮＦＡＴ−ＲＥ依存性ルシフェラーゼ発現は、ＰＤ−Ｌ１遮断抗体の存在によって影響されなかった。
【０１０４】
ビーズにおける抗ＣＤ３及びＰＤ−Ｌ１の配置の固定は、有効なＴ細胞阻害を防ぐ場合があることが予期されている（図１２）。具体的には、Ｔ細胞及びａＡＰＣ間の免疫シナプスの形成は、膜結合レセプター及びリガンドの動的な横方向の局在を必要とする。ＰＤ−Ｌ１を結合する際、ＰＤ−１は、免疫シナプスにおいてＴＣＲと共局在されることが知られており、ここで、ＰＤ−１は、ＴＣＲ複合体シグナリングを直接阻害することができる。ＰＤ−Ｌ１がａＡＰＣの細胞膜に局在するとき、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１のかかる横方向の局在が達成され得る（左側に図示）。ＰＤ−Ｌ１がビーズ表面において結合しているとき、ＰＤ−Ｌ１の位置は静止し、横方向の動きは制限される（右側に図示））。このように、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１は、ＴＣＲと共局在されず、ＰＤ−１は、ＴＣＲ複合体シグナリングを阻害することができない。このことは、ＰＤ−１が、近位のＴＣＲシグナリングを阻害する必要がない、ＴＣＲ複合体とのネガティブ共刺激マイクロクラスターを形成することを示す公開された研究と一致している（Ｙｏｋｏｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２０１２年６月４日；２０９（６）：１２０１−１７．；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。本明細書に記載されている実施形態は、いずれの特定の作用機構にも限定されず、該作用機構の理解は、かかる実施形態を実践するのに必要でない。
【０１０５】
実施例４
ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ２遮断アッセイの特異性
本明細書に記載されている実施形態の開発の際に実験を行って、種々の条件に対する図１３に示されている遮断アッセイの検出可能な応答を試験した。細胞膜においてＰＤ−Ｌ２及び抗ＣＤ３抗体Ｆａｂドメインを提示するａＡＰＣは、ＰＤ−１、ＴＣＲ複合体を提示し、ＮＦＡＴ−プロモーター依存性ルシフェラーゼレポーター構築物（Ｊｕｒｋａｔエフェクター細胞）を含むＪｕｒｋａｔＴ細胞と相互作用すると示されている。ａＡＰＣ及びＪｕｒｋａｔエフェクター細胞の相互作用の際、抗ＣＤ３Ａｂは、ＴＣＲ複合体、及びＮＦＡＴ−プロモーターを活性化する；しかし、ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ２の相互作用は、ＴＣＲ活性化、及びＮＦＡＴプロモーターからのルシフェラーゼ発現を阻害し、ルシフェラーゼの発現が殆ど生じない。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ２相互作用の阻害因子の存在下では、活性化されたＴＣＲ複合体が、ＮＦＡＴプロモーターからのルシフェラーゼレポーターの発現を活性化し、ルシフェラーゼシグナルが上昇する。
【０１０６】
実験によって、抗ＰＤ−１抗体（図１４ｂ）及び抗ＰＤ−Ｌ２抗体（図１４ａ）活性をレポーターシステムによって測定したことを実証した。ＰＤ−１及びＮＦＡＴ−ＲＥ−ルシフェラーゼレポーターを発現するＪｕｒｋａｔエフェクター細胞を、連続希釈の抗ＰＤ−Ｌ２抗体（図１４ａ）または抗ＰＤ−１抗体（図１４ｂ）の存在下で抗ＣＤ３／ＰＤ−Ｌ２+ａＡＰＣと共培養した。いずれの遮断因子もレポーター発現の濃度依存性活性化を付与し、発光シグナルの濃度依存性増加、及び増加したルシフェラーゼ活性を結果として生じさせた。
【０１０７】
実施例５
本明細書に記載されている実施形態の開発の際に実験を行って、図１５に示されているように、免疫チェックポイントレセプターＣＴＬＡ−４及びそのリガンド、ＣＤ８０／ＣＤ８６の阻害因子を評価した。ＣＤ８０／ＣＤ８６及び抗ＣＤ３抗体Ｆａｂドメインを細胞膜において提示するＲａｊｉＢ細胞におけるａＡＰＣは、共刺激レセプターＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＴＣＲ複合体を提示し、ＩＬ−２−プロモーター依存性ルシフェラーゼレポーター構築物を含むＪｕｒｋａｔＴ細胞（Ｊｕｒｋａｔエフェクター細胞）と相互作用すると示されている。ａＡＰＣ及びＪｕｒｋａｔエフェクター細胞の相互作用の際、抗ＣＤ３Ａｂは、ＴＣＲ複合体を活性化し、ＣＤ８０／ＣＤ８６はＣＤ２８を共刺激する。これにより、ＩＬ−２プロモーターの活性化をもたらし、ルシフェラーゼ発現を駆動する；しかし、ＣＴＬＡ−４は、ＣＤ２８との結合親和性よりもＣＤ８０／ＣＤ８６との結合親和性が高い。これは、ＣＤ８０／ＣＤ８６とＣＤ２８との相互作用、及びＩＬ−２プロモーターからのルシフェラーゼ発現を阻害する。ＣＴＬＡ−４とＣＤ８０／ＣＤ８６との相互作用の阻害因子の存在下では、活性化されたＣＤ２８が、ＩＬ−２プロモーターからのルシフェラーゼレポーターの発現を活性化し、ルシフェラーゼシグナルが上昇する。
【０１０８】
実験によって、レポーターシステムによる抗ＣＴＬＡ−４抗体、イピリムマブの活性を実証した（図１６）。ＣＴＬＡ−４及びＩＬ−２−ルシフェラーゼレポーターを発現するＪｕｒｋａｔエフェクター細胞を、連続希釈のイピリムマブの存在下で抗ＣＤ３／ＣＤ８０／ＣＤ８６+ａＡＰＣと共培養した。遮断因子は、レポーター発現の濃度依存性活性化を付与し、発光シグナルの濃度依存性増加、及び増加したルシフェラーゼ活性を結果として生じさせた。
【０１０９】
実施例６
本明細書に記載されている実施形態の開発の際に実験を行って、図１７に示されているように、免疫チェックポイントレセプターＴＩＧＩＴ及びそのリガンド、ＣＤ１５５の阻害因子を評価した。ＣＤ１５５及び抗ＣＤ３抗体Ｆａｂドメインを細胞膜において提示するａＡＰＣは、共刺激レセプターＣＤ２２６、ＴＩＧＩＴ、ＴＣＲ複合体を提示し、ＩＬ−２−プロモーター依存性ルシフェラーゼレポーター構築物を含むＪｕｒｋａｔＴ細胞と相互作用すると示されている。ａＡＰＣ及びＪｕｒｋａｔエフェクター細胞の相互作用の際、抗ＣＤ３Ａｂは、ＴＣＲ複合体を活性化し、ＣＤ１５５は、ＣＤ２２６を共刺激する。これにより、ＩＬ−２プロモーター駆動ルシフェラーゼ発現の活性化がもたらされる；しかし、ＣＤ１５５は、ＣＤ２２６よりも高い、ＴＩＧＩＴとの結合親和性を有する。そのため、ＴＩＧＩＴは、ＣＤ１５５とＣＤ２２６との相互作用、及びＩＬ−２プロモーターからのルシフェラーゼ発現の活性化を阻害する。ＴＩＧＩＴ／ＣＤ１５５相互作用の阻害因子の存在下では、活性化されたＣＤ２２６が、ＩＬ−２プロモーターからのルシフェラーゼレポーターの発現を活性化し、ルシフェラーゼシグナルが上昇する。
【０１１０】
実験によって、抗ＴＩＧＩＴ抗体（図１８）活性をレポーターシステムによって測定したことを実証した。ＴＩＧＩＴ及びＩＬ−２プロモーター依存性ルシフェラーゼレポーターを発現するＪｕｒｋａｔエフェクター細胞を、連続希釈の抗ＴＩＧＩＴ抗体の存在下で、抗ＣＤ３／ＣＤ１５５+ａＡＰＣと共培養した。遮断因子は、抗ＴＩＧＩＴ抗体によるレポーター発現の濃度依存性活性化を付与し、発光シグナルの増加及び増加したルシフェラーゼ活性を結果として生じさせた。
【０１１１】
実施例７
本明細書に記載されている実施形態の開発の際に実験を行って、図１９に示されているように、免疫チェックポイントレセプターＴＩＧＩＴ及びそのリガンド、ＣＤ１５５の阻害因子を評価した。細胞膜においてＣＤ１５５及び抗ＣＤ３抗体Ｆａｂドメインを提示するａＡＰＣは、共刺激レセプターＣＤ２２６、ＴＩＧＩＴ、ＴＣＲ複合体を提示し、ＩＬ−２−プロモーター依存性ルシフェラーゼレポーター構築物を含むＣＥＭ  Ｔ細胞（ＣＥＭエフェクター細胞）と相互作用すると示されている。ａＡＰＣ及びＣＥＭエフェクター細胞の相互作用の際、抗ＣＤ３Ａｂは、ＴＣＲ複合体を活性化し、ＣＤ１５５は、ＣＤ２２６を共刺激する。両者は、ＩＬ−２プロモーター駆動ルシフェラーゼ発現の活性化をもたらす；しかし、ＣＤ１５５は、ＣＤ２２６よりも高い、ＴＩＧＩＴとの結合親和性を有する。そのため、ＴＩＧＩＴは、ＣＤ１５５とＣＤ２２６との相互作用、及びＩＬ−２プロモーターからのルシフェラーゼ発現の活性化を阻害する。ＴＩＧＩＴ／ＣＤ１５５相互作用の阻害因子の存在下では、活性化されたＣＤ２２６が、ＩＬ−２プロモーターからのルシフェラーゼレポーターの発現を活性化し、ルシフェラーゼシグナルが上昇する。
【０１１２】
実験によって、抗ＴＩＧＩＴ抗体（図２０）活性をレポーターシステムによって測定したことを実証した。ＴＩＧＩＴ及びＩＬ−２プロモーター依存性ルシフェラーゼレポーターを発現するＣＥＭ  Ｔエフェクター細胞を、連続希釈の抗ＴＩＧＩＴ抗体の存在下で抗ＣＤ３／ＣＤ１５５+ａＡＰＣと共培養した。遮断因子は、抗ＴＩＧＩＴ抗体によるレポーター発現の濃度依存性活性化を付与し、発光シグナルの増加及び増加したルシフェラーゼ活性を結果として生じさせた。
【０１１３】
実施例８
本明細書に記載されている実施形態の開発の際に実験を行って、図２１に示されているように、免疫チェックポイントレセプターＰＤ−１及びそのリガンドＰＤ−Ｌ１の阻害因子を評価した。細胞膜においてＰＤ−Ｌ１及び抗ＣＤ３抗体Ｆａｂドメインを提示するａＡＰＣは、ＰＤ−１、ＴＣＲ複合体、及びネイティブＩＬ−２プロモーターによって駆動される内因性ＩＬ−２遺伝子を提示するＪｕｒｋａｔＴ細胞と相互作用すると示されている。ａＡＰＣ及びＪｕｒｋａｔエフェクター細胞の相互作用の際、抗ＣＤ３Ａｂは、ＴＣＲ複合体を活性化し、ＩＬ−２プロモーターを活性化し、ＩＬ−２産生を増加する；しかし、ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１の相互作用は、ＩＬ−２プロモーターからのＩＬ−２発現の活性化を阻害し、ＩＬ−２タンパク質の産生が殆ど生じない。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用の阻害因子の存在下では、活性化されたＴＣＲ複合体が、ＩＬ−２プロモーターからのＩＬ−２発現を活性化し、媒体におけるＩＬ−２産生が上昇する。
【０１１４】
実験によって、抗ＰＤ−１抗体（図２２）活性をＥＬＩＳＡによって測定したことを実証した。ＰＤ−１及びネイティブＩＬ−２プロモーターによって駆動される内因性ＩＬ−２遺伝子を発現するＪｕｒｋａｔＴエフェクター細胞を、連続希釈の抗ＰＤ−１抗体の存在下で抗ＣＤ３／ＰＤ−Ｌ１+ａＡＰＣと共培養した。遮断因子は、抗ＰＤ−１抗体による濃度依存性のＩＬ−２産生を付与した。
【０１１５】
実施例９
本明細書に記載されている実施形態の開発の際に実験を行って、図２３に示されているように、免疫チェックポイントレセプターＬＡＧ−３及びそのリガンド、ＭＨＣＩＩの阻害因子を評価した。細胞膜においてＭＨＣＩＩを提示するＲａｊｉＢ細胞におけるＡＰＣは、ＬＡＧ−３、ＴＣＲ複合体を提示し、ＮＦＡＴ−プロモーター依存性ルシフェラーゼレポーター構築物を含むＪｕｒｋａｔＴ細胞（Ｊｕｒｋａｔエフェクター細胞）と相互作用すると示されている。ＡＰＣ及びＪｕｒｋａｔエフェクター細胞の相互作用の際、ＭＨＣＩＩによって提示される超抗原は、ＴＣＲ複合体を活性化し、ＮＦＡＴプロモーター駆動ルシフェラーゼ発現を活性化する；しかし、ＭＨＣＩＩと結合しているＬＡＧ−３は、ＴＣＲ活性化を阻害する。これにより、ＮＦＡＴプロモーターからのルシフェラーゼ発現の不活化がもたらされる。ＬＡＧ−３／ＭＨＣＩＩ相互作用の阻害因子の存在下では、活性化されたＴＣＲが、ＮＦＡＴプロモーターからのルシフェラーゼレポーターの発現を活性化し、ルシフェラーゼシグナルが上昇する。
【０１１６】
実験によって、抗ＬＡＧ−３抗体（図２４）活性をレポーターシステムによって測定したことを実証した。ＬＡＧ−３及びＮＦＡＴ  ＲＥ−ルシフェラーゼレポーターを発現するＪｕｒｋａｔエフェクター細胞を、連続希釈の抗ＬＡＧ−３抗体の存在下で抗ＭＨＣＩＩ+ａＡＰＣと共培養した。遮断因子は、抗ＬＡＧ−３抗体によるレポーター発現の濃度依存性活性化を付与し、発光シグナルの増加及び増加したルシフェラーゼ活性を結果として生じさせた。
【０１１７】
実施例１０
図２５に示すように、本明細書に記載されている実施形態の開発の際に実験を行って、免疫チェックポイントレセプターＴＩＧＩＴ及びＰＤ−１ならびにそれらのリガンド、ＣＤ１５５及びＰＤ−Ｌ１の阻害因子をそれぞれ評価した。細胞膜においてＰＤ−Ｌ１、ＣＤ１５５及び抗ＣＤ３抗体Ｆａｂドメインを提示するａＡＰＣは、ＰＤ−１、共刺激レセプターＣＤ２２６、ＴＩＧＩＴ、ＴＣＲ複合体を提示し、ＩＬ２−プロモーター依存性ルシフェラーゼレポーター構築物を含むＪｕｒｋａｔＴ細胞と相互作用すると示されている。ａＡＰＣ及びＪｕｒｋａｔエフェクター細胞の相互作用の際、抗ＣＤ３Ａｂは、ＴＣＲ複合体を活性化し、ＣＤ１５５は、ＣＤ２２６を共刺激する。これにより、ＩＬ−２プロモーター駆動ルシフェラーゼ発現の活性化をもたらす；しかし、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用は、低減されたＴＣＲ経路活性化及び低減されたＩＬ−２プロモーター依存性レポーター発現をもたらす。また、ＣＤ１５５は、ＣＤ２２６よりも高い、ＴＩＧＩＴとの結合親和性を有する。そのため、ＴＩＧＩＴは、ＣＤ１５５とＣＤ２２６との相互作用を阻害し、低減されたレポーター発現をもたらす。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１及び／またはＴＩＧＩＴ／ＣＤ１５５相互作用の阻害因子の存在下で、ＩＬ−２プロモーターからのルシフェラーゼレポーターの発現が向上され、ルシフェラーゼシグナルが上昇する。
【０１１８】
図２６ａ〜ｂは、Ｊｕｒｋａｔ−Ｔ細胞及びＰＤ−Ｌ１／ＣＤ１５５ａＡＰＣ／ＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるＰＤ−１／ＴＩＧＩＴエフェクター細胞を使用する例示的なＰＤ−１／ＴＩＧＩＴ遮断アッセイにおける（ａ）抗ＰＤ−１抗体及び（ｂ）抗ＴＩＧＩＴ抗体によるレポーター発現の濃度依存性活性化を表示するグラフを示す。図２６ｃは、いずれかの抗体単独と比較した抗ＰＤ−１及び抗ＴＩＧＩＴ抗体の組み合わせの効果を示す。
【０１１９】
本明細書において提供されている全ての公開公報及び特許は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。本発明の記載されている組成物及び方法の種々の変更及び変形が、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく当業者に明らかである。本発明を具体的な好ましい実施形態と併せて記載しているが、特許請求の範囲に記載されている本発明は、かかる具体的な実施形態に不当に限定されるべきでないことが理解されるべきである。実際、当業者に明らかとなる、本発明を実施するための記載されている形態の種々の変更が、本発明の範囲内にあることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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