(57)【要約】  本発明は、癌を診断する及び／又は観察するのに有用である希少な細胞及び／又は種の改良された検出のために無細胞ＲＮＡを使用するための組成物、方法、及びシステムを提供する。本発明はまた、癌療法に対して抵抗性である細胞、及び／又は抵抗性が発現している細胞の早期検出のための組成物、方法、及びシステムも提供する。
2017538404.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌に罹患しているか又は罹患していることが疑われる個体由来の生物学的サンプル中の癌に関連する１若しくは複数のバイオマーカーを確認するための方法であって、以下の：
ａ．固体支持体を使用して、生物学的サンプルからＲＮＡを単離し、ここで、該生物学的サンプルをＲＮＡ安定化剤と相互作用させ；
ｂ．ＲＮＡが固体支持体上に存在している間に、生物学的サンプルから既存のＤＮＡを消化し；
ｃ．固体支持体から少なくとも一度、ＲＮＡを溶出し；
ｄ．ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し；
ｅ．ｃＤＮＡを、癌に関連する１若しくは複数のバイオマーカーを検出するために特異的な少なくとも１つのプライマーと反応させ；そして
ｆ．１若しくは複数のバイオマーカーが生物学的サンプル中に存在するか否か決定すること、ここで、該バイオマーカーの存在により、該個体が癌に関連するバイオマーカーを有するか否か確認する、を含む方法。
【請求項２】
前記ステップ（ｃ）の溶出液が、二重溶出のために同じカラムに通される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生物学的サンプルが、癌に罹患しているか又は罹患していることが疑われる個体由来の血漿である、請求項１又は２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
前記血漿が、ＲＮＡ安定化剤と相互作用させた後７日以内に加工される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ランダム六量体が、ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写するためにステップ（ｄ）で使用される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記バイオマーカーが、ＰＤ−Ｌ１、ＥＲＣＣ１、ＥＧＦＲ、ＴＳ、ＡＲＥＧ、ＥＲＥＧ、ＶＥＧＦＲ２、ＥＭＬ４ＡＬＫ、ＲＯＳ１、ＲＥＴ、ｃ−Ｍｅｔ、ＦＧＦＲ１、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＮＲＡＳ、Ｈｅｒ−２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＫＩＴ、ＧＮＡＱ、及びＧＮＡ１１から成る群から選択される遺伝子又は融合転写物の突然変異、或いは遺伝子発現である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記癌が、癌、肺癌、黒色腫、胃癌、食道癌、乳癌、卵巣癌、肉腫、腎臓細胞癌、前立腺癌、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、及び膵臓癌から成る群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
癌に罹患しているか又は罹患していることが疑われる個体由来の生物学的サンプル中の無細胞ＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）における、化学療法に対する抵抗性に関連する１若しくは複数の体細胞突然変異の検出感度を増強する方法であって、以下の：
ａ．固体支持体を使用して、生物学的サンプルからＲＮＡを単離し、ここで、該生物学的サンプルをＲＮＡ安定化剤と相互作用させ；
ｂ．ＲＮＡが固体支持体上に存在している間に、生物学的サンプルからの既存のＤＮＡを消化し；
ｃ．固体支持体から少なくとも一度、ＲＮＡを溶出し；
ｄ．ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し；
ｅ．ｃＤＮＡを、抵抗性に関連する体細胞突然変異の少なくとも１つを検出するために特異的な少なくとも１つのプライマーと反応させ；そして、
ｆ．１若しくは複数の体細胞突然変異が生物学的サンプル中に存在するか否かを決定すること、ここで、（単数若しくは複数の）体細胞突然変異の存在により、個体が化学療法に対する抵抗性に関連する１若しくは複数の体細胞突然変異を有するか否か確認する、を含む方法。
【請求項９】
他の態様において、本発明は、癌に罹患しているか又は罹患していることが疑われる個体の可能性を特定する方法であって、以下の：
ａ．個体由来の生物学的サンプルからＲＮＡを単離し、ここで、該生物学的サンプルをＲＮＡ安定化剤と相互作用させ；
ｂ．ＲＮＡが固体支持体上に存在している間に、生物学的サンプルから既存のＤＮＡを消化し；
ｃ．固体支持体から少なくとも一度、ＲＮＡを溶出し；
ｄ．ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し；
ｅ．ｃＤＮＡを、癌に関連する１若しくは複数のバイオマーカーを検出するために特異的な少なくとも１つのプライマーと反応させ；そして、
ｆ．癌に関連する１若しくは複数のバイオマーカーが生物学的サンプル中に存在するか否かを決定すること、ここで、該バイオマーカーの存在が、該個体が癌に罹患している可能性を特定する、を含む方法。
【請求項１０】
他の態様において、本発明は、癌に罹患しているか又は罹患していることが疑われる個体の可能性の診断を支援する方法であって、以下の：
ａ．個体由来の生物学的サンプルからＲＮＡを単離し、ここで、該生物学的サンプルをＲＮＡ安定化剤と相互作用させ；
ｂ．ＲＮＡが固体支持体上に存在している間に、生物学的サンプルから既存のＤＮＡを消化し；
ｃ．固体支持体から少なくとも一度、ＲＮＡを溶出し；
ｄ．ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し；
ｅ．ｃＤＮＡを、癌に関連する１若しくは複数のバイオマーカーを検出するために特異的な少なくとも１つのプライマーと反応させ；そして、
ｆ．癌に関連する１若しくは複数のバイオマーカーが生物学的サンプル中に存在するか否かを決定すること、ここで、該バイオマーカーの存在が、該個体が癌に罹患している可能性の診断を支援する、を含む方法。
【請求項１１】
前記ステップ（ｃ）の溶出液が、二重溶出のために同じカラムに通される、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記生物学的サンプルが、癌に罹患しているか又は罹患していることが疑われる個体由来の血漿である、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記血漿が、ＲＮＡ安定化剤と相互作用させた後７日以内に加工される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ランダム六量体が、ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写するためにステップ（ｄ）で使用される、請求項８〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記体細胞突然変異が、ＰＤ−Ｌ１、ＥＲＣＣ１、ＥＧＦＲ、ＴＳ、ＡＲＥＧ、ＥＲＥＧ、ＶＥＧＦＲ２、ＥＭＬ４ＡＬＫ、ＲＯＳ１、ＲＥＴ、ｃ−Ｍｅｔ、ＦＧＦＲ１、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＮＲＡＳ、Ｈｅｒ−２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＫＩＴ、ＧＮＡＱ、及びＧＮＡ１１から成る群から選択される遺伝子又は融合転写物、或いは遺伝子発現である、請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
前記バイオマーカーが、ＰＤ−Ｌ１、ＥＲＣＣ１、ＥＧＦＲ、ＴＳ、ＡＲＥＧ、ＥＲＥＧ、ＶＥＧＦＲ２、ＥＭＬ４ＡＬＫ、ＲＯＳ１、ＲＥＴ、ｃ−Ｍｅｔ、ＦＧＦＲ１、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＮＲＡＳ、Ｈｅｒ−２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＫＩＴ、ＧＮＡＱ、及びＧＮＡ１１から成る群から選択される遺伝子又は融合転写物の突然変異、或いは遺伝子発現である、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記癌が、癌、肺癌、黒色腫、胃癌、食道癌、乳癌、卵巣癌、肉腫、腎臓細胞癌、前立腺癌、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、及び膵臓癌から成る群から選択される、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年１１月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／０８０，０２２号、２０１５年９月４日に出願された同第６２／２１４，７５６号、及び２０１５年９月２８日に出願された同第６２／２３３，９３５号の利益を主張するものであり、その内容をその全体について参照により本明細書に援用する。
【０００２】
本発明の分野
本発明は、様々な型の癌を診断する及び／又は観察するための無細胞核酸、特に無細胞ＲＮＡの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
本発明の背景
ヒト血中の無細胞（ｃｆ）核酸、ＤＮＡとＲＮＡの両方、の存在は、１９４０年後半には知られていて、試験されていた。これらの分子が血流中に放出される機構は、まだそこまで明らかになっていなかった。それは、様々な組織由来の細胞のアポトーシスやネクローシスの結果であり得るか、或いは、ＲＮＡの場合には、核酸は、血中に分泌される小胞内に含まれるか、又はその中のＲＮアーゼから保護され得る。無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の有用性は最近、癌を診断すること及び癌治療の応答を観察することの両方の能力で強く実証された。次世代配列決定法などのＰＣＲベースの配列決定技術における最近の進展が、ｃｆＤＮＡの変異を検出すること、そしてそれにより、癌の素因突然変異、並びに癌のドライバー突然変異を認識することを可能にした。従来の腫瘍組織生検では、記号論理的又は医学的根拠が得られないことも多い。転移癌患者からの腫瘍組織サンプルが入手できないときには、液体生検検体（例えば、血液）が、転移性病巣のうちの１つの生検検体に伴う疼痛、危険、及び費用なしに迅速に実行できる代替手段を提供する（Bettegowda C et al. Detection of Circulating Tumor DNA in Early- and Late-Stage Human Malignancies.  Sci Transl Med 2014; 6, (224)）。腫瘍組織生検と比較して、血液検体を採取する相対的な容易さが、現在、腫瘍ＤＮＡの連続分析を容易に行うこと、そしてそれにより、腫瘍が初期治療に順応して、再発し始めた場合に、薬剤抵抗性クローンの出現を追跡することを可能にした。そして、患者のｃｆＤＮＡの再分析が、出現した新しい癌ドライバー突然変異の確認に役立ち、そして、新しく指図される治療法が設計されるのを可能にするだろう。
【０００４】
１つの難題は、ｃｆＤＮＡ分析の感度である−多くの場合、ｃｆＤＮＡは検出できないので、腫瘍組織内に存在する突然変異が血中で見つけることができない。よって、解決すべき課題の１つは、特に試験される生物学的サンプル中の細胞集団全体のごく一部である希少な細胞集団について、低レベルの無細胞核酸、例えば、無細胞ＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）を検出できる改良された検出法である。希少な細胞型について増強された感度を実現する溶液は、抵抗性細胞、例えば、１若しくは複数の制癌剤に対する抵抗性を発症している癌に罹患した個体に見られるそれらの細胞を診断する及び／又は観察するのに特に有用である。
【０００５】
別の難題は、患者から一般的に採取される標準量の血漿で達成され得る、希少種の高感度検出である。検出可能なｃｆＤＮＡを含んでいる患者の画分は、採取された血漿量から現在入手可能な最大量を表す。わずかな分泌の場合では、当業者は、検出可能なｃｆＤＮＡを単離するためにますます多くの血漿を使用しようとするが、しかしながら、このアプローチは実用的でない。このように、突然変異検出に使用される方法論の改善は、より高いパーセンテージの腫瘍が分析されることを可能にするだろう。
【０００６】
更に、現在、腫瘍は腫瘍生検を用いてサンプル抽出され、そしてそれが、１か所の腫瘍部位に関する静態的情報を生じる。１か所の腫瘍部位が癌療法に対する個体の抵抗性の状況を示していないかもしれない。同様に、時間内の１つの静態的なスナップショットは、癌療法に対する抵抗性の現状又は斯かる抵抗性を発症するその可能性を示していないかもしれない。必要とされるものは、希少種の検出のための増強された感度を有するような、腫瘍からサンプル抽出する非侵襲性の方法である。更に、この方法はまた、腫瘍が癌療法に対する潜在的抵抗性病期に発展するとき、腫瘍に関する動態的情報も提供できなければならない。この明細書に記載の発明は、上記のすべてを提供し、更に、付加的利点も提供する。
【０００７】
明細書を通して、様々な公開広報、特許、特許出願及び他の参照文献が引用される。これらの公開広報、特許、特許出願及び他の参照文献のすべてを、すべての目的のために参照によってその全体として援用する。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、とりわけ、様々な型の癌を診断する及び／又は観察するのに有用となり得る希少種を確認する、無細胞核酸、特に無細胞ＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）の改良された検出のための組成物、方法、及びシステムを提供する。
【０００９】
従って、一態様において、本発明は、癌に罹患しているか又は罹患していることが疑われる個体由来の生物学的サンプル中の癌に関連する１若しくは複数のバイオマーカーを確認するための方法であって、以下の：（ａ）固体支持体を使用して、生物学的サンプルからＲＮＡを単離し、ここで、該生物学的サンプルをＲＮＡ安定化剤と相互作用させ；（ｂ）ＲＮＡが固体支持体上に存在している間に、生物学的サンプルから既存のＤＮＡを消化し；（ｃ）固体支持体から少なくとも一度、ＲＮＡを溶出し；（ｄ）ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し；（ｅ）ｃＤＮＡを、癌に関連する１若しくは複数のバイオマーカーを検出するために特異的な少なくとも１つのプライマーと反応させ；そして（ｆ）１若しくは複数のバイオマーカーが生物学的サンプル中に存在するか否か決定すること、ここで、バイオマーカーの存在により、個体が癌に関連するバイオマーカーを有するか否か確認する、を含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、ステップ（ｃ）の溶出液が、二重溶出のために同じカラムに通される。他の実施形態において、生物学的サンプルは、癌に罹患しているか又は罹患していることが疑われる個体由来の血漿である。他の実施形態において、血漿は、ＲＮＡ安定化剤と相互作用させた後７日以内に加工される。他の実施形態において、ランダム六量体が、ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写するためにステップ（ｄ）で使用される。他の実施形態において、バイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ１、ＥＲＣＣ１、ＥＧＦＲ、ＴＳ、ＡＲＥＧ、ＥＲＥＧ、ＶＥＧＦＲ２、ＥＭＬ４ＡＬＫ、ＲＯＳ１、ＲＥＴ、ｃ−Ｍｅｔ、ＦＧＦＲ１、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＮＲＡＳ、Ｈｅｒ−２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＫＩＴ、ＧＮＡＱ、及びＧＮＡ１１から成る群から選択される遺伝子又は融合転写物の突然変異、或いは遺伝子発現である。他の実施形態において、癌は、癌、肺癌、黒色腫、胃癌、食道癌、乳癌、卵巣癌、肉腫、腎臓細胞癌、前立腺癌、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、及び膵臓癌から成る群から選択される。
【００１０】
他の態様において、本発明は、癌に罹患しているか又は罹患していることが疑われる個体由来の生物学的サンプル中の無細胞ＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）における、化学療法に対する抵抗性に関連する１若しくは複数の体細胞突然変異の検出感度を増強する方法を提供し、前記方法は、以下の：（ａ）固体支持体を使用して、生物学的サンプルからＲＮＡを単離し、ここで、該生物学的サンプルをＲＮＡ安定化剤と相互作用させ；（ｂ）ＲＮＡが固体支持体上に存在している間に、生物学的サンプルからの既存のＤＮＡを消化し；（ｃ）固体支持体から少なくとも一度、ＲＮＡを溶出し；（ｄ）ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し；（ｅ）ｃＤＮＡを、抵抗性に関連する体細胞突然変異の少なくとも１つを検出するために特異的な少なくとも１つのプライマーと反応させ；そして、（ｆ）１若しくは複数の体細胞突然変異が生物学的サンプル中に存在するか否かを決定すること、ここで、（単数若しくは複数の）体細胞突然変異の存在により、個体が化学療法に対する抵抗性に関連する１若しくは複数の体細胞突然変異を有するか否か確認する、を含む。
【００１１】
他の態様において、本発明は、癌に罹患しているか又は罹患していることが疑われる個体の可能性を特定する方法を提供し、前記方法は、以下の：（ａ）個体由来の生物学的サンプルからＲＮＡを単離し、ここで、該生物学的サンプルをＲＮＡ安定化剤と相互作用させ；（ｂ）ＲＮＡが固体支持体上に存在している間に、生物学的サンプルから既存のＤＮＡを消化し；（ｃ）固体支持体から少なくとも一度、ＲＮＡを溶出し；（ｄ）ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し；（ｅ）ｃＤＮＡを、癌に関連する１若しくは複数のバイオマーカーを検出するために特異的な少なくとも１つのプライマーと反応させ；そして、（ｆ）癌に関連する１若しくは複数のバイオマーカーが生物学的サンプル中に存在するか否かを決定すること、ここで、バイオマーカーの存在が、個体が癌に罹患している可能性を特定する、を含む。
【００１２】
他の態様において、本発明は、癌に罹患しているか又は罹患していることが疑われる個体の可能性の診断を支援する方法を提供し、前記方法は、以下の：（ａ）個体由来の生物学的サンプルからＲＮＡを単離し、ここで、該生物学的サンプルをＲＮＡ安定化剤と相互作用させ；（ｂ）ＲＮＡが固体支持体上に存在している間に、生物学的サンプルから既存のＤＮＡを消化し；（ｃ）固体支持体から少なくとも一度、ＲＮＡを溶出し；（ｄ）ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し；（ｅ）ｃＤＮＡを、癌に関連する１若しくは複数のバイオマーカーを検出するために特異的な少なくとも１つのプライマーと反応させ；そして、（ｆ）癌に関連する１若しくは複数のバイオマーカーが生物学的サンプル中に存在するか否かを決定すること、ここで、バイオマーカーの存在が、個体が癌に罹患している可能性の診断を支援する、を含む。
【００１３】
いずれかの実施形態において、ステップ（ｃ）の溶出液が、二重溶出のために同じカラムに通される。いずれかの実施形態において、生物学的サンプルは、癌に罹患しているか又は罹患していることが疑われる個体由来の血漿である。他の実施形態において、血漿は、ＲＮＡ安定化剤と相互作用させた後７日以内に加工される。いずれかの実施形態において、ランダム六量体が、ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写するためにステップ（ｄ）で使用される。いずれかの実施形態において、体細胞突然変異は、ＰＤ−Ｌ１、ＥＲＣＣ１、ＥＧＦＲ、ＴＳ、ＡＲＥＧ、ＥＲＥＧ、ＶＥＧＦＲ２、ＥＭＬ４ＡＬＫ、ＲＯＳ１、ＲＥＴ、Ｍｅｔ、ＦＧＦＲ１、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＮＲＡＳ、Ｈｅｒ−２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＫＩＴ、ＧＮＡＱ、及びＧＮＡ１１から成る群から選択される遺伝子又は融合転写物、或いは遺伝子発現である。いずれかの実施形態において、バイオマーカーは、ＰＤＬＡＲ−Ｖ７、−１、ＰＤ−Ｌ１、ＥＲＣＣ１、ＥＧＦＲ、ＴＳ、ＡＲＥＧ、ＥＲＥＧ、ＶＥＧＦＲ２、ＥＭＬ４ＡＬＫ、ＲＯＳ１、ＲＥＴ、ｃ−Ｍｅｔ、ＦＧＦＲ１、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＮＲＡＳ、Ｈｅｒ−２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＫＩＴ、ＧＮＡＱ、及びＧＮＡ１１から成る群から選択される遺伝子又は融合転写物の突然変異、或いは遺伝子発現である。いずれかの実施形態において、癌は、癌、肺癌、黒色腫、胃癌、食道癌、乳癌、卵巣癌、肉腫、腎臓細胞癌、前立腺癌、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、及び膵臓癌から成る群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、結腸癌患者の血漿から抽出された無細胞ＲＮＡ由来のＥＲＣＣ１及びＫＲＡＳ対βアクチンの相対発現を示す。
【００１５】
【図２】図２は、結腸癌患者の血漿からのＥＲＣＣ１発現を示す。
【００１６】
【図３】図３は、ＫＲＡＳに関する期待度数及びコピー数アッセイにおける、Ｇ１２Ｄ及びＧ１２Ｖ ＫＲＡＳ突然変異の様々な対立遺伝子画分に関するＤＮＡ分析に示す。
【００１７】
【図４】図４は、患者のＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ突然変異の分析を示す。無細胞ＤＮＡから決定される特異的なＫＲＡＳ突然変異は、同じ患者由来のＲＮＡに反映される。
【００１８】
【図５−Ａ】図５は、デジタルＰＣＲを使用した患者のＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ突然変異の分析を示す。Ｇ１２Ｄ ＫＲＡＳ突然変異を、異なったプラットフォームを使用して再び確認した。図中、いくつかの集団−（１）ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ変異体ＰＣＲ増幅、（２）ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ変異体及び野性型ＰＣＲ増幅、（３）ＫＲＡＳ野性型ＰＣＲ増幅、及び（４）ＰＣＲ増幅なし、を左上から時計回りの順で図示する。
【図５−Ｂ】図５は、デジタルＰＣＲを使用した患者のＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ突然変異の分析を示す。Ｇ１２Ｄ ＫＲＡＳ突然変異を、異なったプラットフォームを使用して再び確認した。図中、いくつかの集団−（１）ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ変異体ＰＣＲ増幅、（２）ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ変異体及び野性型ＰＣＲ増幅、（３）ＫＲＡＳ野性型ＰＣＲ増幅、及び（４）ＰＣＲ増幅なし、を左上から時計回りの順で図示する。
【００１９】
【図６】図６は、ＲＮＡとＤＮＡとの間のシグナルの相関を示す。結腸癌患者の血漿から抽出された逆転写ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）由来のＰＣＲシグナル中央値は、対応するＤＮＡより約７倍高いことがわかった。
【００２０】
【図７】図７は、カラムｃＤＮＡ浄化法を使用した結果を示す。ＤＮＡを超えるＲＮＡのシグナルが更に高められている。ＲＮＡの収量は、ＤＮＡより約６０倍高い。
【００２１】
【図８】図８は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者及び健常対照群を通じた相対ＰＤ−Ｌ１発現の結果を示す。
【００２２】
【図９】図９は、ＮＳＣＬＣ患者及び健常対照群を通じた相対ＥＲＣＣ１発現の結果を示す。
【００２３】
【図１０】図１０は、ＮＳＣＬＣ患者及び健常対照群由来の総核酸（中央値によって正規化されたβアクチンＣＴｓ由来のｃｔＲＮＡ）の結果を示す。
【００２４】
【図１１】図１１は、ＤＮＡとｍＲＮＡとの間のシグナルの相関を示す。ＤＮＡシグナルの中央値は、５９．６３ｎｇ／５ｍＬ（５．８８〜２０１６．０ｎｇ／５ｍＬの範囲）である。ｍＲＮＡシグナルの中央値は、６０８．４９ｎｇ／５ｍＬ（１１１．１〜６３１２．０２ｎｇ／ｍＬの範囲）である。
【００２５】
【図１２】図１２は、特定の患者の相対ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ発現の結果を示す。発現は、基準としてβアクチンを使用して、ＫＲＡＳ Ｇ１２ＤのＰＣＲ分析によって計測された。
【００２６】
【図１３】図１３Ａは、処置前の高応答患者及び無応答患者の無細胞ＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）に関する前処理ＰＤ−Ｌ１発現を示す。図１３Ｂは、応答患者の一連の処置を通じたｃｆＲＮＡのＰＤ−Ｌ１発現における予想された減少を示す。
【００２７】
【図１４】図１４Ａは、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、非小細胞肺癌患者（ＮＳＣＬＣ）及び健常人におけるＰＤ−Ｌ１遺伝子発現の相対頻度に示し、ＣＲＣ患者の１７．４％、ＮＳＣＬＣ患者の５０％、及び健常人の０％でＰＤ−Ｌ１発現が相対的に増加する。図１４Ｂは、相対ＰＤ−Ｌ１遺伝子発現レベルがＰＤ−Ｌ１陽性ＣＲＣ患者とＮＳＣＬＣ患者との間で類似していることを示す。
【００２８】
【図１５】図１５Ａは、レゴラフェニブ／セツキシマブを用いた結腸直腸癌の処置を通してＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖに関するｃｆＤＮＡの対立遺伝子画分観察における増大を示す。図１５Ｂは、処置の経過と共に、レゴラフェニブ／セツキシマブを用いた結腸直腸癌の処置中のｃｆＲＮＡにおけるＰＤ−Ｌ１の相対発現の減少があることを示す。図１５Ｃは、レゴラフェニブ／セツキシマブを用いた結腸直腸癌の処置中の経時的なＥＲＣＣ１の相対発現を示す。
【００２９】
【図１６】図１６は、ＰＤ−Ｌ１、ＥＲＣＣ１、及びＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄに関する、クリゾチニブ及びＦＯＬＦＯＸを用いた処置中の大腸癌患者のｃｆＲＮＡからの相対遺伝子発現を示す。
【００３０】
【図１７】図１７は、ＥＲＣＣ１、及びＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄに関する、ＦＯＬＦＩＲＩ／ベバシズマブ及びレゴラフェニブ／セツキシマブを用いた処置中の大腸癌患者のｃｆＲＮＡからの相対遺伝子発現を示す。
【００３１】
【図１８】図１８は、ＫＲＡＳ（赤色）、ＮＲＡＳ（緑色）、ＢＲＡＦ（黄色）突然変異を有するか又は突然変異を有していない（青色）患者におけるＥＲＣＣ１の相対発現を示す。
【００３２】
【図１９】図１９は、胃癌に罹患している患者におけるＰＤ−Ｌ１及びＨＥＲ２の無細胞ＲＮＡで観察された相対発現を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
発明の詳細な説明
本発明は、とりわけ、様々な型の癌を診断する及び／又は観察するのに有用となり得る希少種を確認する、無細胞核酸、特に無細胞ＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）の改良された検出のための組成物、方法、及びシステムを提供する。本明細書中で更に詳しく述べられた理由のために、様々な実施形態において、ＲＮＡ種は、様々な型の癌を診断及び／又は観察するために、ＤＮＡ種よりも使用しやすい可能性がある。一般的に、ＲＮＡの突出した種を検出する能力は周知である。しかしながら、増強された感度を用いて少数（希少）種のＲＮＡを検出する能力は、これまで事実上解決されていない問題である。
【００３４】
一般的に、臨床及び実験環境において、ＲＮＡを用いた作業が難しいことは認識されている。多数の参照文献が、ＲＮＡ分解の問題を取扱い、そして、ＲＮＡの加工にうまく対処することに挑戦している。ここで開示した発明は、これらの既存の難題を克服し、そして、高感度で、迅速で、正確な様式で希少なＲＮＡ種を検出する方法を提供し、更に、（静態的な診断及び／又は観察の代わりに）動態的な診断及び／又は観察に役立つ情報を提供する。
【００３５】
一般的な技術
本発明の実施は、別の方法で示されない限り、当業者に周知の分子生物学、微生物学、細胞生理学、生化学、核酸化学、及び免疫学の従来技術を利用する。斯かる技術は、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual, fourth edition (Sambrook et al., 2012) and Molecular Cloning: A Laboratory Manual, third edition (Sambrook and Russel, 2001), (jointly referred to herein as "Sambrook"); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987, including supplements through 2014); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Antibodies: A Laboratory Manual, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (Greenfield, ed., 2014), Beaucage et al. eds., Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, John Wiley & Sons, Inc., New York, 2000, (including supplements through 2014) and Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells (Makrides, ed., Elsevier Sciences B.V., Amsterdam, 2003)などの文献において完全に説明されている。
【００３６】
定義
別の方法で規定されない限り、本明細書中に使用されるすべて技術用語及び学術用語は、本願発明が関係する当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。
【００３７】
本明細書中に使用される場合、「生物学的サンプル」という用語は、個体（例えば、患者）から採取されるあらゆるサンプルを網羅する。生物学的サンプルの例としては、これだけに限定されるものではないが、血液、血漿、組織サンプル、血清、及び体液が挙げられる。
【００３８】
本明細書中に使用される場合、「タンパク質」という用語は、ポリペプチド、ペプチド、ポリペプチドの断片、及び融合ポリペプチドを含む。
【００３９】
本明細書中に使用される場合、単数形の用語「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈から明確に別の意味を示さない限り、複数の指示対象を含む。
【００４０】
この明細書全体にわたって与えられるあらゆる最大数値限定は、それより小さいあらゆる数値限定を、斯かる小さい数値限定が本明細書中に明示的に記載されているかのように包含することを意図する。この明細書全体にわたって与えられるあらゆる最小数値限定は、それより大きいあらゆる数値限定を、斯かる大きい数値限定が本明細書中に明示的に記載されているかのように包含する。この明細書全体にわたって与えられるあらゆる数値範囲は、斯かるより広い数値範囲内に入るそれよりも狭いあらゆる数値範囲を、斯かるより狭い数値範囲がすべて本明細書中に明示的に記載されているかのように包含する。数値範囲を引用するとき、該範囲内にある数値を、それぞれの個々の数値がすべて本明細書中に明示的に記載されているかのように包含することを意図する。
【００４１】
増強されたＲＮＡ検出のための組成物及び方法
ＲＮＡは元々、非常に不安定で、易崩壊性であり、そのため保護的な細胞環境外では安定である又は検出できる可能性が低いと考えられた。ＤＮＡがある遺伝子の１つのコピー（又は増幅事象において、複数のコピー）を含んでいるとき、遺伝子の転写が、ｍＲＮＡ形態でその遺伝子の多数のコピーを生じる可能性がある。ｍＲＮＡは、ＤＮＡの転写領域内と同じ遺伝情報を含んでおり、そのため、同じ突然変異が両分子内に存在するはずである。そして、理論的に、ある遺伝子が１００回転写されるなら、その突然変異遺伝子の検出感度もまた１００倍増強されるはずである。ｃｆＲＮＡ分析の成功の決定要素の１つは、診断解析に十分な腫瘍起源のｃｆＲＮＡが血中に存在するかどうか、そして、それが容易かつ首尾よく単離できるかどうかである。従って、本明細書中に記載した方法論によると、循環核酸からＤＮＡに比べて３０〜６０倍を超えるほど多くのＲＮＡが検出される結果を得ることが可能である。これは多くの有用性に役立ち、その１つが、腫瘍特異性突然変異を得られたｃＤＮＡで検出できることである。
【００４２】
実施例１で例示されているように、当業者は、以下の方法論に従って特に少数の又は希少なＲＮＡ種の無細胞ＲＮＡを検出できる。当業者は、本発明の範囲内に依然として存在している様々な置き換え及びわずかなずれが、使用されうることを理解できるはずである。癌に罹患しているか又は癌に罹患していることが疑われる個体から生物学的サンプル（例えば、血液）を入手する。いくつかの実施形態において、癌に罹患しているか又は罹患していることが疑われる個体は、１若しくは複数の医師の看護の下にいる患者である。生物学的サンプルは、ＲＮＡ安定化剤と混合される、接触させられる、相互作用させられる、及び／又は加工される。様々な代表的なＲＮＡ安定化剤が使用できる。様々なＲＮＡ安定化剤が、本発明の組成物及び方法で使用できる。使用できる無細胞血漿ＲＮＡのサンプル採取、安定化、及び輸送のための代表的な標準方法の１つが、Streck製のCell-Free RNA BCT（登録商標）である。使用できる他のＲＮＡ安定化剤としては、これだけに限定されるものではないが、Biomatrica RNA Guard (Biomatrica) <http://www.biomatrica.com/rnagardblood_tube.php>、Paxgene blood RNA tube (Becton Dickinson) <http://www.preanalytix.com/products/blood/RNA/paxgene-blood-rna-tube>、Tempus Blood RNA Tube (Life Tech) <http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4342792>、及びRNA/DNA Stabilization Reagent for Blood/Bone/Marrow (Roche) <http://lifescience.roche.com/shop/products/rna-dna-stabilization-reagent-for-blood-bone-marrow>が挙げられる。
【００４３】
血漿は、当業者に既知の様々な方法（例えば、遠心分離、スピニングなど）によって他の血液層から分離できる。一実施形態において、血漿層は、白血球層からを取り出される。分離のタイミングは、個体から採血してから短期間のうちであってもよい。いくつかの実施形態において、その期間は、約１分、２分、３、４、５、６、７、８、９、又は１０分間以内である。他の実施形態において、その期間は、約１０〜１５分、１５〜３０分、３０〜４５分、４５分〜１時間、１〜２４時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日及び７日以内である。追加の血漿が、冷凍され、必要に応じて別の時期に使用されてもよい。
【００４４】
いくつかの実施形態において、血漿は、約１分、２分、３、４、５、６、７、８、９、又は１０分以内にＲＮＡ安定化剤との相互作用の加工がなされる。他の実施形態において、その期間は、約１０〜１５分、１５〜３０分、３０〜４５分、４５分〜１時間、１〜２４時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日及び７日以内である。
【００４５】
次に、核酸（例えば、ＲＮＡ）が、生物学的サンプル、例えば、血漿から抽出される。ＲＮＡを抽出するのに、様々な方法が使用され得る。実施例１では代表的なプロトコールが使用され得る。他の市販キットが、ＲＮＡを抽出するのに使用されてもよい。一実施形態において、抽出には、カラムなどの固体支持体を使用する。一実施形態において、ＤＮＡは、デオキシリボヌクレアーゼ消化を使用することによってカラム上で消化され得る。溶出は、当業者に既知の標準的な技術によって達成され得る。代表的なプロトコールは、実施例１において見ることができる。一実施形態において、カラムからの同じ溶出液が、二重溶出ステップのために再び同じカラムに通される。別の実施形態において、方法論には、血液をＲＮＡ安定化剤と接触させること、血液から分離から３日以内に血漿を加工すること、カラム上でのデオキシリボヌクレアーゼ消化を使用すること、二度（以上）カラムからＲＮＡを溶出すること、を組み合わせる。
【００４６】
得られたＲＮＡは、当業者に既知の標準的な方法によってｃＤＮＡに逆転写され得る。代表的なプロトコールは、実施例１において見ることができる。ランダム六量体が使用され得る。ＲＮＡの更なる増幅は、特にＺＩＰ核酸などのクランプ配列の任意の使用により、それがｃＤＮＡに変換されるときに起こり得るものであり、そして、該クランプ配列は、核酸のポリアニオン性の性質に起因して静電反発力が減少することによって、それらの標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性が更に増大するように逆転写酵素プライマーに追加され得る。
【００４７】
得られたｃＤＮＡは、浄化され、分析に使用され得る。ＰＣＲ及び他の増幅法が、腫瘍及び癌に特異的なバイオマーカー、腫瘍及び癌に関連する遺伝子、及び／又は癌及び腫瘍に見られる融合転写物を検出するのに使用され得る。癌に関連する特定の遺伝子の遺伝子発現は、同じように検出及び定量され得、そして、癌及び腫瘍を予測するか、特定するか、診断するか、又は診断を支援するのに使用され得る。
【００４８】
特定の化学療法薬によって標的とされる多くの重要な融合転写物が存在する。これらには、ＥＭＬ４−ＡＬＫ、ＲＥＴ及びＲＯＳ１の融合パートナーが挙げられる。ＰＣＲによってＤＮＡを計測する血液ベースの分析では、転写産物の融合を検出できない。血中のｍＲＮＡの検出は、それが薬剤感受性に対応する場合には、融合検出に関して、並びに本来の化学療法レジメンに対する抵抗性及び別のレジメンに対する感受性を生じ得るこれらの融合における特定の突然変異の出現に関して、患者を観察する能力を増強する。
【００４９】
様々なアルゴリズムが、内部対照（例えば、βアクチン、ハウスキーピング遺伝子）との比較によってＲＮＡの収量を定量するのに使用され得る。一実施形態において、着目の遺伝子の相対発現は、（その遺伝子に特異的なプライマーを使用した）着目の遺伝子のＰＣＲサイクル閾値（Ｃｔｓ）からβアクチンなど安定して発現するハウスキーピング遺伝子のＰＣＲサイクル閾値を差し引くことによって決定され得る。定量化のこの方法は、相対定量のデルタデルタＣｔ法とも呼ばれる。内因基準に対して正規化され、かつ、キャリブレーターと相関する標的の量は、２-デルタ、デルタCtによって与えられる。ABI User Bulletin #2:ABI 7700 Sequence Detection System December 11, 1997 (updated 10/2001) <http://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/mcb_support/documents/generaldocuments/cms_040980.pdf.>。例えば、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ｍＲＮＡの相対発現は、定数（Ｋ）×２-(Ct(EML40ALK)-Ct(βアクチン))として表され得る。
【００５０】
多発の肺癌サンプルを通じたそれぞれのＥＭＬ４−ＡＬＫ融合相対発現レベル（２-(Ct(EML40ALK)-Ct(βアクチン))）の中央値に関する整数を作り出す乗数定数Ｋが設定される。未知サンプルにおけるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合物の相対発現は、発現に関する設定値を用いて既知の対照サンプルと未知サンプルの結果を比較することによって決定され得る。既知のサンプル値が１０に設定されて、且つ、Ｋが１００に任意に設定された場合、未知サンプルの相対発現（Ｘ）が、以下の式に従って計算される：
１０＝Ｋ×２-(Ct(EML40ALK)-Ct(βアクチン)(デルタCt既知))
Ｘ＝Ｋ×２-(Ct(EML40ALK)-Ct(βアクチン)(デルタCt未知))
未知の相対発現＝Ｘ＝１０×２-デルタCt未知／２-デルタCt既知
【００５１】
それぞれのＰＣＲプレートの実施に関して、既知のサンプルの値がちょうど設定点、１０であるように、既知のサンプルの相対発現におけるプレート変動に対してＰＣＲプレートを補正するように、乗数Ｋの値が調整され得る。
【００５２】
別の実施形態において、融合なしで一定量のＤＮＡ中に加えた既知量のＥＭＬ４−ＡＬＫ融合ＤＮＡ断片を用いるＰＣＲ産物の検量線は、ＥＭＬ４−ＡＬＫの既知の発現を有する対照に対する未知サンプルの相対発現を比較するための対照として機能するように用いられ得る。Ｙ軸上の既知のサンプルのＣｔｓのプロット対Ｘ軸上の既知のＥＭＬ４−ＡＬＫ対照のｌｏｇ１０相対発現は、以下の方程式によって説明される線形曲線を生じる：
ＣｔEML4-ALK＝傾き×Ｘ(Eml4-ALKの相対発現)＋Ｙ切片
Ｘの解答（未知サンプルの相対発現）
Ｘ＝相対発現未知サンプル＝（Ｃｔ未知サンプル−ｓｔｄ曲線のＹ切片）／ｓｔｄ曲線の傾き
【００５３】
少数種又は希少種の定量化
本発明のいくつかの態様において、本明細書中に記載した組成物及び方法論は、無細胞核酸、特に無細胞ＲＮＡを定量するのに使用され得る。定量化は、ＲＮＡの主要な種、並びに少数種について達成され得る。正確な診断が直面する難題は、癌療法に対する抵抗性を予測、診断、及び／又は診断の助けとなり得る、並びに／或いは、変異体又は（単数若しくは複数の）抵抗性細胞の出現を示すわずかな（希少な）ＲＮＡ種の検出である。本発明のいくつかの態様において、検出され得るＲＮＡの少数種は、野性型ＲＮＡの約０．０１％〜６０％に存在している。いくつかの実施形態において、検出され得るＲＮＡの少数種は、野性型ＲＮＡの少なくとも約０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、又は１％に存在している。他の実施形態において、検出され得るＲＮＡの少数種は、野性型ＲＮＡの少なくとも約２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、又は２０％に存在し得る。他の実施形態において、検出され得るＲＮＡの少数種は、野性型ＲＮＡの少なくとも約２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、又は３０％に存在し得る。他の実施形態において、検出され得るＲＮＡの少数種は、野性型ＲＮＡの少なくとも約３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、又は４０％に存在し得る。他の実施形態において、検出され得るＲＮＡの少数種は、野性型ＲＮＡの少なくとも約４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、又は５０％に存在し得る。他の実施形態において、検出され得るＲＮＡの少数種は、野性型ＲＮＡの少なくとも約５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、又は６０％に存在し得る。上記実施形態のいずれにおいても、検出され得るＲＮＡの少数種は、多くても先に示したパーセンテージのいずれか、及び先に示したパーセンテージのいずれかからの下限と上限の組み合わせを含む範囲内でも存在する。
【００５４】
腫瘍学に関する診断及び／又は観察のための無細胞ＲＮＡの使用
無細胞核酸、特に無細胞ＲＮＡを使用して様々な型の癌を診断及び／又は観察するための組成物、システム及び方法を本明細書中に記載する。ｃｆＲＮＡは、癌に罹患しているか又は癌に罹患していることが疑われる個体（例えば、医師の看護下にある患者）を、彼らがどんな型の癌に罹患しているか決定するための、及び／又は彼らが癌に関連する突然変異（すなわち、癌のバイオマーカー）を有するかどうか決定するために、及び／又は彼らが癌治療に対して抵抗性表現型若しくは抵抗性遺伝子型を有する（又は発現する）か否か決定するために、診断するのに有用である。加えて、本明細書中に開示された組成物、システム、及び方法は、抵抗性表現型又は抵抗性遺伝子型が発現されたときに迅速に検出するために個体を経時的に（例えば、比較的長期間にわたり経時的に）観察するのに使用され得る。ｃｆＤＮＡを使用しても容易に達成できない、診断及び／又は観察の確度と特異性は、ｃｆＲＮＡを使用することによって達成可能である。本明細書中に更に記載したように、発現の範囲が重なることのない癌に罹患している個体と健常人との間のｃｆＲＮＡ計測で見られる統計学的有意差は、癌の検出（早期検出を含む）及び癌の再発の観察に関して利点を提供する。必要に応じて、医師は、癌治療薬又は化合物に対する抵抗性の出現に対処するために適切なステップを採り得る。
【００５５】
血液ＤＮＡにおける突然変異検出の特異性は、ほぼ１００％であり得る、すなわち、血液ＤＮＡで見つけられた突然変異は、実際の腫瘍組織から得られたＤＮＡの突然変異をほとんど必ず反映する。しかしながら、１つの問題は、現在のｃｆＤＮＡ分析の感度が通例１００％未満であるということである；すなわち、多くの場合、ｃｆＤＮＡが検出されないので、腫瘍組織における突然変異の存在は血中で発見できない。例えば、ある研究において、ｃｆＤＮＡは、進行した膵臓癌、卵巣癌、結腸直腸癌、膀胱癌、胃食道癌、乳癌、黒色腫、肝細胞癌、及び頭頚部癌に罹患している患者の＞７５％で検出可能であったが、原発性脳腫瘍、腎臓癌、前立腺癌、又は甲状腺癌の５０％未満で検出可能であり、それに対して、限局した腫瘍に罹患している患者では、ｃｆＤＮＡは、結腸直腸癌、胃食道癌、膵臓癌、及び乳腺腺癌に罹患している患者それぞれの７３％、５７％、４８％、及び５０％で検出された（Bettagowda, 2012）。
【００５６】
理論に縛られることなしに、ｃｆＤＮＡ検出の不足は、次の限定されない理由：１）一部の癌が血流中にＤＮＡをまったく分泌しないか、又は２）すべての腫瘍がいくらかのｃｆＤＮＡを分泌するが、一部の腫瘍から生じるＤＮＡの量が現状技術で検出できないくらい少ないこと、に起因する可能性がある。理論に縛られることなしに、腫瘍の特徴が、細胞が急激に入れ替わり、それらが形成されるのと同じくらい急激に死滅し、それによって、癌患者の血中に見られる概して高いレベルの核酸の主な原因となるので、後者の可能性はあり得る。更に、腫瘍によるｃｆＤＮＡ分泌が非常に広範囲にわたって変動することが知られている。特別に設計された高感度検出法を使用したある研究では、１サンプルあたり１．３〜２３，０００個の変異体鋳型の範囲（１サンプルあたり９９個の変異体鋳型の中央値；１０〜９０パーセンタイル、３〜２，８３７のは範囲）におよんで、１８人の大腸癌患者のすべてでｃｆＤＮＡが見られた。この研究は、「従来の研究のほとんどが、この研究で評価した対象の多くで見られた低レベルのｃｆＤＮＡを検出するのに十分に高感度な技術を使用していなかった」との結論に至った（Diehl F et al. Circulating mutant DNA to assess tumor dynamics. Nat Med. 2008; 14:985-990）。
【００５７】
本明細書中に記載したように、ｃｆＲＮＡの使用は、ＤＮＡ分析から得られない潜在的に貴重、且つ、有用な情報に接する機会を提供する。ｍＲＮＡ発現が正常細胞において高度に調整されている一方で、癌に向かって進行する中で、それはますます調整されなくなる。よって、理論に縛られることなしに、正常組織では高度に発現されずに腫瘍で高度に発現される多くの遺伝子が存在するはずである。以前の研究では、チロシナーゼｍＲＮＡが癌患者の血清中に高レベルで検出される場合があるが、非癌性個体ではそうではないことが示された（Kopreski MS et al. Detection of tumor messenger RNA in the serum of patients with malignant melanoma. Clin Cancer Res. 1999;8:1961-5）。チロシナーゼｍＲＮＡと同様に、他の腫瘍ｍＲＮＡも、他の悪性腫瘍において血清及び血漿において実証できるはずである。別の研究では、チミジル酸シンターゼ（ＴＳ）発現が、定量的ＰＣＲによって８８人の患者と２６の対照由来の血漿で計測された。ＴＳ ｍＲＮＡは、４７％の患者の血漿において検出され、健常対照との有意差を示した。注目すべきは、血漿中にＴＳ ｍＲＮＡを含んでいる患者は、含んでいない患者に比べて腫瘍組織内のより高いＴＳレベルを有していた。
【００５８】
従って、一態様において、ｃｆＲＮＡを使用したｍＲＮＡ（遺伝子発現）計測値は、１若しくは複数の癌関連遺伝子、対立遺伝子、及び／又は突然変異の異常発現を検出するために有用であり得る。斯かる検出は、疾患の存在（又は不存在）を診断するか、又は癌の状況を評価するのに使用され得る。一実施形態において、無細胞ｍＲＮＡ値は、ＤＮＡと比較してより高い。
【００５９】
「液体生検検体」−固形悪性腫瘍における遺伝情報に関する適時の情報を得るために末梢血を使用すること−は、すべての腫瘍部位から動態的なＤＮＡ及びＲＮＡ情報を含んでいて、生検検体の領域に限定されない。
【００６０】
別の実施形態において、遺伝子発現もまた、化学療法の経過を観察するのに有用である場合がある。ＤＮＡは変更に関して概ね静態的な分子である（すなわち、ＤＮＡにおける新たな変異は、現れるのに長時間かかる傾向がある）のに対して、遺伝子発現における変化は、数日又はそれどころか数時間以内に、急激に起こることもあり、よって、薬剤の効果によって引き起こされたものなどの、腫瘍における変化を評価する迅速且つ高感度の手段を提供し得る。正常又は野生型の転写産物に関して希少であるか又は異常な転写産物の画分の（増加するか、減少するか又は不変のレベルの）相対発現に関する値の連続は、個体（例えば、患者）由来の血漿で経時的に計測され得る。発現の上昇又は下降傾向は、特定の化学療法レジメンに対する患者の転帰に関連し得る。
【００６１】
化学療法レジメンは、癌型、病期、及び患者の遺伝子によって異なる可能性がある。化学処置法は、特定の腫瘍表現型に対して適合させることができる。本発明の方法は、処置に先立ち、処置の最中に、及び処置後に、特定の化学療法レジメンに対する応答を観察するために使用され得る。化学療法の例としては、これだけに限定されるものではないが、ニボルマブを用いたＰＤ−Ｌ１陽性癌の処置；レゴラフェニブ／セツキシマブを用いたＣＲＣの処置；クリゾチニブ；ＦＯＬＦＯＸ；ＦＯＬＦＯＲＩ／ベバシズマブ；及びレゴラフェニブ（Regorafinib）／セツキシマブが挙げられる。
【００６２】
更に別の実施形態において、本発明は、薬剤の有効性を予測し、よって、処置法を決定するのに使用される場合がある薬物反応決定遺伝子の発現を量的に測定するために提供される。例えば、最近の研究は、進行したＨＥＲ２陽性乳房腫瘍が可変量のＨＥＲ−２を発現し、そして、最も高い発現レベル有する患者が、より低い発現を有する患者に比べて、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）から劇的に良好な生存利益を得たことを示した（Baselga J, et al. Relationship between tumor biomarkers and efficacy in EMILIA, a phase III study of trastuzumab emtansine (T-DM1) in HER2-positive metastatic breast cancer.  AACR 2013; Abstract LB-63）。そのうえ、ラパタニブなどの抗ＨＥＲ−２薬剤の効果を鈍らせるＰＩＫ３ＣＡにおける突然変異の活性化は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）を用いた処置に対して効果がなかった。これらの乳癌患者のＨＥＲ−２の組織発現レベルがそれらのｃｆＲＮＡに反映されるのであれば、組織生検よりむしろ採血が、ＨＥＲ−２の発現、並びにＰＩＫ３の突然変異状態に関する情報を得るのに使用され得る。（４）一部の癌関連バイオマーカー及び／又は遺伝子（例えば、Ｈｅｒ−２）に関しては、コピー数も変動し得る。この変動はＲＮＡでのみ検出され得る；そして（５）ＤＮＡ分析に関する追加された問題は、一部の化学療法薬が、ＲＮＡからだけ分析可能であって、ＤＮＡで計測できない遺伝子融合の場合を標的としていることである。これらの標的の限定されることのない例は、遺伝子融合（例えば、ＥＭＬ４−ＡＬＫ、ＲＯＳ１、ＲＥＴ）である。別の例として、ＥＧＦＲ阻害剤に対してＴ７９０Ｍ媒介性抵抗性のような二次的変化を伴うそれらの患者に関し、非可逆性チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）は有望な代替手段であるように思える。
【００６３】
治療を受ける患者血漿からのこれらの遺伝子における各異型の発現の計測、又は現れている抵抗性突然変異の計測は、最適な患者の看護にとって重要である。これらの遺伝子における特定の融合又は突然変異のみにおいて活性である特定の薬剤は、これらの遺伝子融合の迅速且つ正確な診断が存在すれば、患者を助けるために留置され得る。治療を受けている患者の再生検は、これらの患者にとって実用的でない。これは、本明細書中に記載したｃｆＲＮＡ方法論を使用して達成され得る。
【００６４】
従って、本明細書中に記載した方法論に従って計測される化学治療に対する応答に関連する遺伝子の限定されることのない例としては：ＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＮＲＡＳ、ＪＡＫ２、ＡＬＫ、ＰＤＧＦＲＡ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、及びＫＩＴが挙げられる。本発明のいくつかの態様において、バイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ１、ＥＲＣＣ１、ＥＧＦＲ、ＴＳ、ＡＲＥＧ、ＥＲＥＧ、ＶＥＧＦＲ２、ＥＭＬ４ＡＬＫ、ＲＯＳ１、ＲＥＴ、ｃ−Ｍｅｔ、ＦＧＦＲ１、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＮＲＡＳ、Ｈｅｒ−２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＫＩＴ、ＧＮＡＱ、及びＧＮＡ１１から成る群から選択される遺伝子又は融合転写物の突然変異である。
【００６５】
本発明のいくつかの実施形態において、個体は、結腸直腸癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、黒色腫、胃癌、食道癌、乳癌、卵巣癌、肉腫、腎臓細胞癌、前立腺癌、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、及び膵臓癌に罹患しているか又は罹患していることが疑われる。他の実施形態において、検出される及び／又は定量される遺伝子が、以下の表１に列挙される。
【表１】
2017538404.tif 000003
【００６６】
他の実施形態において、検出される及び／又は定量される遺伝子及び／又は突然変異が、以下の表２に列挙される。
【表２】
2017538404.tif 000004
【００６７】
腫瘍によって血流中に放出された無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）は、初期の腫瘍特異性突然変異の非侵襲性識別を可能にする。しかしながら、腫瘍におけるすべての分子変化がＤＮＡ突然変異を伴うというわけではなく；多くの場合、それはまた、重要な特定の遺伝子（例えば、遺伝子発現）の量でもある。一実施形態において、癌患者の遺伝子発現を観察するために血液中に放出された無細胞ＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）を使用する。特定の実施形態において、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路が有望な処置標的であり、抗ＰＤ−Ｌ１剤がさまざまな腫瘍型で活性を助長することが示された。
【００６８】
特定の遺伝子（例えば、ＰＤ−Ｌ１）に関して細胞ＲＮＡ量を算定するために、血漿が患者の採血血液から分画され得る。血液を分画する方法は、当該技術分野で知られていて、そして、限定されることのない例としては、コーン方法（例えば、低温エタノール分画法）、クロマトグラフィー、又はその組み合わせによる分留が挙げられる。定量的ＲＴ−ＰＣＲは、特定の遺伝子を定量するための遺伝子特異的プライマーが使用され得る。着目の遺伝子の遺伝子量は、健常ボランティアと比較され得る。本明細書中で先に記載の、例えばβアクチンなどのハウスキーピング遺伝子が、全ＲＮＡを表す分母の遺伝子として使用され得る。
【００６９】
当業者は、癌の検出及び／又は診断のための特定の遺伝子の発現を計測するために、本明細書中に記載した開示を使用する。本明細書中に更に詳述するように、一部の癌バイオマーカーでは、癌に罹患している個体と健常人との間のｃｆＲＮＡ計測に関する統計学的有意差を示す。癌に罹患している個体と健常人との間の発現範囲の重複の不足は、例えば、癌の検出（早期検出を含む）のため、及び癌の再発に関する観察するための複数の使用を許容する。
【００７０】
組成物、キット及びシステム
本発明はまた、出現する抵抗性突然変異が検出できるような高感度検出を達成するための組成物も提供する。一態様において、システムは、生物学的サンプル（血漿など）を単離するための試薬、（単数若しくは複数の）ＲＮＡ安定化剤、（単数若しくは複数の）抽出カラム、（単数若しくは複数の）溶出溶液だけでなく、逆転写に必要とされる試薬、並びに腫瘍／癌バイオマーカーに特異的なプライマー／プローブを含むことを条件とする。いくつかの実施形態において、システムは、方法論に関する取扱説明書を含むキットである。任意選択で、システムは、正常又は野生型の転写産物について突然変異、融合転写物、及び他の希少な転写産物のＲＮＡ収量の計算に関する取扱説明書を含む。
【００７１】
以下の実施例は、説明に役立てる目的のためだけに提供され、いかなる形であっても本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【００７２】
実施例１
いくつかの実施形態において利用された無細胞ＲＮＡ抽出、逆転写及びＰＣＲ増幅手順の代表的なプロトコールを以下に記載する。以下で記載したプロトコールは、市販のキット及び／又は試薬に付いてきた製造業者の取扱説明書に記載されていなかった発明者によってなされた改変を含む。
１）（ＲＮＡ安定化剤の入った）Streck（登録商標）RNA BCTチューブ内に患者から採血する。
２）患者から採血後７日以内に、遠心分離にかけて、他の血液層と無細胞ＲＮＡ血漿とを分離する。
３）最上層を慎重にピペット操作で取り除くことによって、白血球層から血漿層を取り除く。
４）血漿のスピンダウンによって約１〜３ｍｌの血漿を抽出する。
・ＲＮＡ安定化血液全体から血漿を分離した直後に抽出することによって、ＲＮＡの最大量が回収される。
５）余分な血漿を１ｍｌのアリコートで−８０℃にて冷凍する。
６）核酸の抽出を次のようにしておこなった：
ａ．QIAamp（登録商標）Circulating Nucleic Acid Kitの使用
ｉ．単離すべきサンプル数に対して必要とされる分量で、キットに含まれたバッファー：ＡＣＢ、ACW1、及びBuffer ACW2を調製し、
ｉｉ．キットに記載された反応あたりの分量でバッファーACLに担体ＲＮＡ（１μｇ）を加え、
ｉｉｉ．プロテイナーゼＫと血漿を６０℃にて１時間インキュベートし、
ｉｖ．バッファーＡＣＢを溶解物に加え、
ｖ．氷上で５分間インキュベートし、
ｖｉ．QIAampミニカラムに混合物を加え、真空を用いて通過した液体を吸い出し、
ｖｉｉ．６００μｌのBuffer ACW1をQIAamp Mini Columnに加える。真空ポンプを用いてカラムを通過した液体を吸い出し、
ｖｉｉｉ．７５０μｌのBuffer ACW2をQiaAmp Miniカラムに加える。真空を使用して通過した液体を吸い出し、
ｉｘ．カラムの中心に６０μｌのリボヌクレアーゼ不含デオキシリボヌクレアーゼを直接加え、そして、カラム上で室温にて１５分間インキュベートすることによって、カラム上でＤＮＡのデオキシリボヌクレアーゼ消化を実施する。
ｂ．２．５μｌのデオキシリボヌクレアーゼストック、１０μｌのＲＤＤバッファー、８７．７μｌの水（リボヌクレアーゼ不含）を使用したリボヌクレアーゼ不含デオキシリボヌクレアーゼ（Qiagen Cat No.79254）の調製
ｉ．先の（６）（ａ）のステップｖｉｉ及びｖｉｉｉを繰り返し、
ａ．６００μｌのBuffer ACW1をQIAamp Mini Columnに加える。真空ポンプを用いてカラムを通過した液体を吸い出し、
ｂ．７５０μｌのBuffer ACW2をQiaAmp Miniカラムに加える。真空を使用して通過した液体を吸い出し、
ｉｉ．追加ステップ：
１．７５０μｌのエタノール（９６〜１００％）をQIAampミニカラムに加える。真空を用いて通過したエタノールを吸い出し、
２．遠心分離によって水気がなくなるまで２ｍｌの清潔なチューブ内でミニカラムを遠心分離にかけ、
３．５６℃にて１０分間加熱することによってカラムを更に乾燥させる
ｉｉｉ．溶出ステップ
１．製造業者は、QIAamp Mini膜の中心に３０〜１５０μｌのバッファーAVEを配置し、室温にて３分間インキュベートし、そして２，０００×ｇにて１分間遠心分離して、核酸を溶出することによって、溶出が実施されると提案した。
２．製造業者はまた、RNeasy Clean upカラムにを使用した更なる浄化を用いれば、ＤＮＡが、デオキシリボヌクレアーゼ不含リボヌクレアーゼを使用して溶出溶液中で消化されることも提案した。結果：この手順は、失敗するか、或いは非常にわずかしか若しくはまったくＲＮＡ又は結果として生じるｃＤＮＡが得られないことがわかった。
３．製造業者は、カラム上でのデオキシリボヌクレアーゼ処置が機能しないであろうと強く示唆した。発明者らは、溶液中でＤＮＡを逆転写し、そして消化する別の市販品：Quantitect Reverse Transcriptionキットの製造業者の提案に従って試してみた。結果：このQuantitect Reverse Transcriptionキットは、βアクチンプライマー／プローブを用いてＰＣＲ増幅したとき、非常にわずかしか若しくはまったく、結果として生じるｃＤＮＡシグナルを生じなかった。
４．発明者らは、同じバッファーを用いて２回溶出し、次に、
ａ．６０μｌのバッファーAVEをQIAamp Mini膜の中心に配置し、室温にて３分間インキュベートし、２０，０００×ｇにて１分間遠心分離し、回収チューブから溶出液を取り出し、それをQIAmp Mini膜上に再び戻し、更に３分間インキュベートし、そして遠心分離して、溶出した。
ｂ．ＤＮＡがカラム上で消化されたので、浄化は必要なかった。
５．次に、ＲＮＡを、ＶＩＬＯ逆転写酵素キット（Life Technologies）及びランダム六量体プライマーを使用してｃＤＮＡに逆転写し、続いて、室温にて１０分間ランダム六量体を結合させ、４２℃にて６０分間伸長させ、８５℃にて１５分間酵素を熱不活化した。
ａ．結果として生じるｃＤＮＡを、製造業者の取扱説明書に従ってＺＹＭＯ ｓｓＤＮＡ及びＲＮＡ浄化カラムを使用して精製した。これは、いくつかの実施形態においておこなうことができる。
ｂ．βアクチンプライマー／プローブを使用したｃＤＮＡのＰＣＲを、ＲＮＡの相対量を決定するために使用した。ＲＮＡ濃度のＱＵＢＩＴ測定値は、ＲＮＡが存在しないような様相を呈した。
６．可能であればイントロンを埋めることによって、ＤＮＡよりむしろＲＮＡ配列を増幅するように開発されたプライマー／プローブを使用して、結果として生じるｃＤＮＡをＰＣＲ増幅した。
７．ＲＴなし対照（非逆転写ＲＮＡ）を、サンプル中の増幅可能ＤＮＡの存在を除外するために実施した。
８．  別の実施形態において、ロボット抽出技術を、患者血漿からＲＮＡを単離するのに使用した。
【００７３】
ＲＮＡの安定性及びＲＮＡをどのように処理するかに関して製造業者によって教えられたこと及び当該技術分野の現状とは逆に、ＲＮＡ抽出手順は、ＲＮＡ安定化採血チューブ、カラム上でのデオキシリボヌクレアーゼ消化、ＲＮＡの二重溶出（最初の溶出液をカラムに戻して通過させて、収量を高めること）、及びBCT安定化血液から分離した血漿の迅速な処理の組み合わせを利用する。ＲＮＡは、冷凍条件下でさえ血漿中で不安定である。Streck製のBCT ＲＮＡ安定化チューブは、冷凍後の分解からＲＮＡを保護するわけではない。
【００７４】
Agilent製のUniversal Human Reference（ＵＨＲ）ＲＮＡなどの既知濃度の対照からのｃＤＮＡを用いて、βアクチンプライマー／プローブ及びランダム六量体を使用して血漿からのｃＤＮＡのＰＣＲから生じたＣＴｓを比較することによって、ＲＮＡ（逆転写されたｃＤＮＡ）の収量を決定するためのアルゴリズムを開発した。一般的に、値は、未知サンプルのそれぞれのＰＣＲ実行に含まれる既知の対照ｃＤＮＡについて設定されて、未知サンプルの相対発現を決定する。節０００３３に記載のデルタデルタＣｔ法が、相対発現の計算に使用される。対照は、着目の各遺伝子に関する野性型又は正常対照ｃＤＮＡ中に添加し得る、細胞株ＲＮＡ（ＵＨＲなど）又はｃＤＮＡの合成断片が購入され得る。
【００７５】
プライマー及びプローブが、ランダム六量体を使用した逆転写から生じるｃＤＮＡ鎖を増幅するのに利用された。
【００７６】
実施例２
大腸癌患者からの血液を、ＲＮＡ安定剤の入ったチューブ（Streck製のRNA BCTチューブ）の中に採血し、そして、室温にて一晩保存した。血漿を遠心分離によって分離し、そして、ＲＮＡを、Qiagen Circulating Nucleic Acids核酸キットを使用して抽出した。相対遺伝子発現を、ＥＲＣＣ１、ＫＲＡＳ ＷＴ、及びβアクチンに特異的なプライマーを用いたリアルタイムTaqmanプラットフォーム（ABI7900）を使用して決定した。標準的なハウスキーピング遺伝子であるβアクチンのＰＣＲ産物と、それぞれＥＲＣＣ１及びＫＲＡＳ ＷＴ特異的プライマーからのＰＣＲ産物のレベルとの間でデルタＣＴ法を使用して計算をした。結果を、結腸癌患者の血漿から抽出された無細胞ＲＮＡ由来のＥＲＣＣ１及びＫＲＡＳ対βアクチンの相対発現を示す図１に示す。図１８は、ＫＲＡＳ（赤色）、ＮＲＡＳ（緑色）、ＢＲＡＦ（黄色）突然変異を有するか、又は突然変異を有していない（青色）患者におけるＥＲＣＣ１発現を示す。
【００７７】
実施例３
この実施例に記載の実験は、デオキシリボヌクレアーゼ消化後に血漿中に残された残留ＤＮＡからＥＲＣＣ１シグナルが得られる可能性があるか評価した。図２の上部は、ｃＤＮＡに逆転写されたＲＮＡを使用したＰＣＲ発現パネルを示す。下のパネルは、逆転写したＲＮＡを使用しないサンプル増幅の負の結果を示す。上部パネルの発現アッセイに貢献するであろう残留ＤＮＡのあらゆる増幅が、逆転写していないＲＮＡを使用したシグナルを生じさせたであろう。ＰＣＲシグナルは、ＲＮＡ特異的であり、逆転写していないＲＮＡ（ＲＴなし）はバックグラウンドＰＣＲシグナルを作り出さないことを更に示す。
【００７８】
実施例４
この実施例に記載の実験は、遺伝子発現を計測するのに使用されるサンプルのＤＮＡ内のＫＲＡＳ突然変異状態を評価した。図３に示されているように、このデータは、研究におけるサンプルが、結腸癌におけるＫＲＡＳの遺伝子突然変異頻度を一般的に反映することを示すために作成された。ＫＲＡＳ突然変異異型の期待度数は、このサンプルセット、並びにＫＲＡＳ基準である野生型遺伝子レベルの状況において見出される。結腸癌で最も頻繁なＫＲＡＳ突然変異異型は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄであり、続いてＧ１２Ｖであり、そして、頻繁が低いのがＧ１３Ｄであった。統計的に、Ｇ１２Ｄ及びＧ１２Ｖ突然変異は、この少数の患者の中で確認されるはずであるが、一方で、より多数の患者が、Ｇ１３Ｄ突然変異の確認を必要としているであろう。ＫＲＡＳ基準ＤＮＡを、突然変異のない遺伝子領域を使用してＰＣＲ増幅した。すべての患者サンプルが、ＫＲＡＳ基準ＤＮＡ配列を含んでいなければならない。
【００７９】
実施例５
この実施例において、図４で示されるように、無細胞ＤＮＡから決定される特異的なＫＲＡＳ突然変異は、同じ患者のＲＮＡに反映された。無細胞ＤＮＡは、腫瘍から血流中に滲出した。この実施例では、無細胞ＲＮＡが腫瘍からの無細胞ＤＮＡを反映する場合、そのとき、遺伝子の突然変異状態は、これらの２つの核酸が一致しているはずであるという仮説を確認した。これは、大腸癌患者１０３７人の分析に関する場合であった。
【００８０】
患者１０３７人におけるＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ突然変異の存在に関する更なる分析を、第二のプラットフォームとしてのデジタルＰＣＲ技術を使用して実施した。
【００８１】
実施例６
この実施例において、そして、図５で示されているように、我々は、野性型対立遺伝子に対してＫＲＡＳ突然変異対立遺伝子のパーセンテージを算定できた。この研究の目的のために、我々は、この患者サンプル中のＧ１２Ｄ ＫＲＡＳ突然変異の存在をバリデートするための第二のプラットフォーム及び第二のアッセイを使用した。
【００８２】
図１２は、ＤＮＡ及びｃＤＮＡ／ＲＮＡにおける血漿１ｍＬあたりのＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄの相対量を示す。
【００８３】
野生型ブロッカープライマーを伴った又は伴っていない対立遺伝子特異的ＰＣＲプライマープローブを、結腸直腸癌患者の血漿サンプル由来のＫＲＡＳの突然変異状態を評価するのに使用した。同じ結果を得た。ＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡ内の突然変異を計測する際に、対立遺伝子特異的ＰＣＲプライマープローブを使用した。更に、ＲＮＡ／ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅からのシグナルの感度を更に高めるための野生型ブロッカープライマーを設計し、そして、使用する。
【００８４】
増強された感度及び特異性を、ＲＮＡ対ＤＮＡの増強されたシグナルから得ることができる。ＤＮＡから転写された複数のＲＮＡ断片が存在するので、我々は、ＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡ対ゲノムＤＮＡのＰＣＲ分析から、より高いはずのシグナルを予想するであろう。図６において、我々は、ＲＮＡとＤＮＡとの間のシグナルの相関を示す。結腸癌患者の血漿から抽出した逆転写ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）由来のＰＣＲシグナル中央値は、対応するＤＮＡより約７倍高かった。非逆転写ｍＲＮＡバックグラウンドはごくわずかであった。
【００８５】
実施例７
カラムｃＤＮＡ浄化法を使用して、ＤＮＡを越えるＲＮＡのシグナルを更に増強した。理論に縛られることなく、浄化法は、逆転写反応における阻害物質を減少させることによってＲＮＡのシグナルを高め、そして、ｃＤＮＡを濃縮した。図７に示したように、ＲＮＡの収量はＤＮＡより最大６０倍高かった。ｃＤＮＡ（ＲＮＡ）対ＤＮＡの比例体積あたりの相対βアクチンＣＴｓによって計測した収量を、同じ患者血漿から抽出した。サイクリングパラメーター及び逆転写酵素浄化反応を、ＲＮＡシグナルを増強するように調整した。
【００８６】
実施例８
腫瘍によって血流中に放出された無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）は、初期の腫瘍特異性突然変異の非侵襲性識別を可能にする。しかしながら、腫瘍におけるすべての分子変化がＤＮＡ突然変異を伴うというわけではなく；多くの場合、それはまた、重要な特定の遺伝子（すなわち、遺伝子発現）の量でもある。ＮＳＣＬＣ患者のＰＤ−Ｌ１遺伝子発現を観察するために、血液中に放出された無細胞ＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）を計測した。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路が有望な処置標的であり、抗ＰＤ−Ｌ１剤がさまざまな腫瘍型で活性を助長することが示された。
【００８７】
血液サンプルを、治療中の様々な時点にてＮＳＣＬＣ患者から採取した。更に、癌を有していない血液サンプルを、健常ボランティア（「対照群」）から得た。血漿を血液サンプルから分画し、そして、核酸を抽出した。ランダムプライマーを使用して、ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、次に、適当な遺伝子特異的プライマーを使用した定量的ＲＴ−ＰＣＲによって分析した。ＰＤ−Ｌ１のｃＤＮＡを、癌患者及び対照群の両方で定量した。ＥＲＣＣ１発現もまた、非腫瘍特異性遺伝子の例として定量した。βアクチン発現を、全ＲＮＡを表す分母の遺伝子として使用した。
【００８８】
ＰＤ−Ｌ１発現は、ＮＳＣＬＣ患者の７０％（７／１０個の血漿サンプル）のｃｔＲＮＡにおいて検出されたが、対照群由来のいずれのサンプルからも検出されなかった（０／９）、（ｐ＝０．００３１、フィッシャーの正確確率検定）（図８）。ＥＲＣＣ１発現は、ＮＳＣＬＣ患者の１００％（１０／１０）及び対照群の６７％（６／９）で検出され、検出されたものの相対発現において有意差は観察されなかった（ｐ＝０．２３２８、ウィルコクソンの順位和）（図９）。癌患者及び対照群における相対βアクチン発現の中央値は、それぞれ１５．５２（０．５４〜９４．９１）及び０．５３（０〜１．０３）（ｐ＝０．０００８、ウィルコクソンの順位和）（図１０）であった。
【００８９】
これらのデータは、癌及びその再発の検出のために、並びに治療を選択する及び観察する際に、遺伝子発現を計測するために血液由来のｃｆＲＮＡを使用することの潜在的価値を実証する。血中のＰＤ−Ｌ１ ｃｆＲＮＡの存在は、癌の特異的な指標となり得るが、それがすべての癌患者で発現されるわけではないので、腫瘍検出の感度は決して１００％ではない。ＥＲＣＣ１発現は、癌患者及び健常人を通じて発現レベルに有意差がない遺伝子を例示する。癌患者と健常人との間の総ｃｆＲＮＡの中央値の驚くべき大きな違い（約３０倍）は、総ｃｆＲＮＡが癌の存在の高感度な予備的指標として、及び再発観察のために有用であり得ることを示唆している。図１４Ａは、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、非小細胞肺癌患者（ＮＳＣＬＣ）及び健常人におけるＰＤ−Ｌ１遺伝子発現の相対頻度に示し、ＣＲＣ患者の１７．４％、ＮＳＣＬＣ患者の５０％、及び健常人の０％でＰＤ−Ｌ１発現が相対的に増加する。図１４Ｂは、相対ＰＤ−Ｌ１遺伝子発現レベルがＰＤ−Ｌ１陽性ＣＲＣ患者とＮＳＣＬＣ患者との間で類似していることを示す。
【００９０】
実施例９
非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）において、標的化処置アプローチに関して臨床的結果を有するいくつかの遺伝的変化が確認されてきた。ＥＧＦＲ突然変異に関する場合、２以上の処置方針のための選択肢が既に存在している。ＥＧＦＲ阻害剤に対するＴ７９０Ｍ媒介性抵抗性のような二次的変化を伴う患者に関して、非可逆性チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）が有望な代替手段であることがわかった。しかしながら、これらの選択肢は、患者が侵襲的手技を必要とする高い死亡率の影響を受けやすい全身腫瘍組織量の増大ような変化がなくなった証明に限定され得る。いわゆる「液体生検検体」−固形悪性腫瘍における遺伝情報に関する適時の情報を得るために末梢血を使用すること−が、この問題に対する緊急に必要な解決法であると思われる。素早いターンアラウンド（turn around）の見込み及び幅広い利用可能性を確保する方法が必要である。
【００９１】
血清からの突然変異検出結果の相関関係は、入手可能な腫瘍標本の計測と有意に相関した。更に、期待度数は、公表されている遺伝的変化の出現と一致した。しかしながら、Ｔ７９０Ｍ突然変異が、癌センターの特有の患者選択に起因し得る予想より高かったので、潜在的な偏りが存在した。これらの結果は、試験した新鮮な血液サンプルと一致した。新鮮なサンプルのターンアラウンドは３日であった。
【００９２】
突然変異検出は、素早いターンアラウンド、並びに高い感度及び特異性で末梢血から実現可能である。加えて、サンプルは、新鮮な又は貯蔵した血清プローブのいずれでも使用できる。これは、より速い処置の決定と、治療開始までのより短い間隔によるより高い患者満足度を可能にする。液体（例えば、血清又は血液）からの突然変異の検出に関して本明細書中に記載した方法は、組織サンプルを分析するための明確且つ医学的に必要な代替手段である。特に、全身療法中の腫瘍の二次的変化の場合では、この方法が重要になる。
【００９３】
実施例１０
この実施例では、本発明の方法を、疾病の進行と処置を通じた動態的試験に利用する。図１３Ｂは、応答患者の一連の処置を通じたｃｆＲＮＡのＰＤ−Ｌ１発現における予想された減少を示す。
【００９４】
図１５Ａは、レゴラフェニブ／セツキシマブを用いた結腸直腸癌の処置を通してＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖに関するｃｆＤＮＡの対立遺伝子画分観察における増大を示す。図１５Ｂは、処置の経過と共に、レゴラフェニブ／セツキシマブを用いた結腸直腸癌の処置中のｃｆＲＮＡにおけるＰＤ−Ｌ１の相対発現の減少があることを示す。図１５Ｃは、レゴラフェニブ／セツキシマブを用いた結腸直腸癌の処置中の経時的なＥＲＣＣ１の相対発現を示す。
【００９５】
図１６は、ＰＤ−Ｌ１、ＥＲＣＣ１、及びＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄに関する、クリゾチニブ及びＦＯＬＦＯＸを用いた処置中の大腸癌患者のｃｆＲＮＡからの相対遺伝子発現を示す。
【００９６】
図１７は、ＥＲＣＣ１、及びＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄに関する、ＦＯＬＦＩＲＩ／ベバシズマブ及びレゴラフェニブ／セツキシマブを用いた処置中の大腸癌患者のｃｆＲＮＡからの相対遺伝子発現を示す。
【００９７】
本発明の方法は、処置前、処置中、及び処置後の時点で疾患の進行又は処置反応を観察するための非侵襲性又は低い侵襲性の方法を提供する。
【００９８】
更に、前記方法は、治療のための追加標的を求めて相対遺伝子発現を評価するために使用できる。例えば、図１９は、胃癌に罹患している患者におけるＰＤ−Ｌ１及びＨＥＲ２の無細胞ＲＮＡで観察された相対発現を示す。データは、最初の観察後のＰＤ−Ｌ１及びＨＥＲ２発現の増大を示し、治療のための２種類の追加標的を提示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−Ａ】
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【図５−Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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