(57)【要約】    グルタメート興奮毒性に関連する病態の治療における使用のための、グルタメートのシナプス前放出をブロックするペプチド少なくとも一つを含むペプチド系であって、該ペプチドが配列番号５：ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＩＥＱＳＩＥＱＥＥＧＬＮＲＳの配列および／または配列番号８：ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＭＳＥＹＮＡＴＱＳＤＹＲＥＲ の配列を有する。【選択図】  図１
2017516493.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルタメートのシナプス前放出をブロッキングするペプチド少なくとも一つ、および細胞透過性ペプチド少なくとも一つを含むペプチド系であって、
グルタメートのシナプス前放出をブロッキングする該ペプチドがシンタキシン１ａのＮ末端部分の配列と類似の配列を有し、該配列が下記：
配列番号１：
ＭＫＤＲＴＱＥＬＲＴＡＫＤＳＤＤＤＤＤＶＴＶＴＶＤＲＤＲＦＭＤＥＦＦＥＱＶＥＥＩＲＧＦＩＤＫＩＡＥＮＶＥＥＶＫＲＫＨＳＡＩＬＡＳＰＮＰＤＥＫＴＫＥＥＬＥＥＬＭＳＤＩＫＫＴＡＮＫＶＲＳＫＬＫＳＩＥＱＳＩＥＱＥＥＧＬＮＲＳＳＡＤＬＲＩＲＫＴＱＨＳＴＬＳＲＫＦＶＥＶＭＳＥＹＮＡＴＱＳＤＹＲＥＲＣＫＧＲＩＱＲＱＬＥＩＴＧＲＴＴＴＳＥＥＬＥＤＭＬＥＳＧＮＰＡＩＦＡＳＧＩＩＭＤＳＳＩＳＫＱＡＬＳＥＩＥＴＲＨＳＥＩＩＫＬＥＴＳＩＲＥＬＨＤＭＦＭＤＭＡＭＬＶＥＳＱＧＥＭＩＤＲＩＥＹＮＶＥＨＡＶＤＹＶＥＲＡＶＳＤＴＫＫＡＶＫＹＱＳＫＡＲＲＫＫＩＭＩＩＩＣＣＶＩＬＧＩＩＩＡＳＴＩＧＧＩＦＧ
であり、そして該細胞透過性ペプチドがＨＩＶウィルスのＴａｔ蛋白（４８―５９）の下記配列：
配列番号４：
ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰ
を含み、該ペプチド系は下記配列：
配列番号１２：
ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＭＫＤＲＴＱＥＬＲＴＡＫＤＳＤＤＤＤＤＶＴＶＴＶＤＲＤＲＦＭＤＥＦＦＥＱＶＥＥＩＲＧＦＩＤＫＩＡＥＮＶＥＥＶＫＲＫＨＳＡＩＬＡＳＰＮＰＤＥＫＴＫＥＥＬＥＥＬＭＳＤＩＫＫＴＡＮＫＶＲＳＫＬＫＳＩＥＱＳＩＥＱＥＥＧＬＮＲＳＳＡＤＬＲＩＲＫＴＱＨＳＴＬＳＲＫＦＶＥＶＭＳＥＹＮＡＴＱＳＤＹＲＥＲＣＫＧＲＩＱＲＱＬＥＩＴＧＲＴＴＴＳＥＥＬＥＤＭＬＥＳＧＮＰＡＩＦＡＳＧＩＩＭＤＳＳＩＳＫＱＡＬＳＥＩＥＴＲＨＳＥＩＩＫＬＥＴＳＩＲＥＬＨＤＭＦＭＤＭＡＭＬＶＥＳＱＧＥＭＩＤＲＩＥＹＮＶＥＨＡＶＤＹＶＥＲＡＶＳＤＴＫＫＡＶＫＹＱＳＫＡＲＲＫＫＩＭＩＩＩＣＣＶＩＬＧＩＩＩＡＳＴＩＧＧＩＦＧ
を有し、該細胞透過性ペプチドはグルタメートのシナプス前放出をブロッキングするペプチドのＮ末端部分又はＣ末端部分に結合されること、を意図している上記ペプチド系。
【請求項２】
グルタメートのシナプス前放出をブロッキングするペプチドがシンタキシン１ａのＮ末端部分から選択される下記配列：
配列番号２：
ＩＥＱＥＥＧＬＮＲＳ
を少なくとも含み、該細胞透過性ペプチド系が下記配列：
配列番号１３：
ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＩＥＱＥＥＧＬＮＲＳ
を有する、請求項１記載のペプチド系。
【請求項３】
グルタメートのシナプス前放出をブロッキングするペプチドがシンタキシン１ａのＮ末端部分から選択される下記配列：
配列番号３：
ＭＳＥＹＮＡＴＱＳＤＹＲＥＲ
を少なくとも含み、該細胞透過性ペプチド系が下記配列：
配列番号８：
ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＭＳＥＹＮＡＴＱＳＤＹＲＥＲ
を有する、請求項１記載のペプチド系。
【請求項４】
下記選択された配列：
配列番号７：
ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＩＥＱＥＥＧＬＮＲＳ
を有する細胞透過性ペプチド、および、
下記選択された配列：
配列番号８：
ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＭＳＥＹＮＡＴＱＳＤＹＲＥＲ
を有する細胞透過性ペプチドを含む、請求項１記載のペプチド系。
【請求項５】
グルタメートのシナプス前放出をブロッキングするペプチドがシンタキシン１ａのＮ末端部分から選択される下記配列：
配列番号１１：
ＩＥＱＳＩＥＱＥＥＧＬＮＲＳ
を少なくとも含み、該ペプチド系が下記配列：
配列番号５：
ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＩＥＱＳＩＥＱＥＥＧＬＮＲＳ
を有する、請求項１記載のペプチド系。
【請求項６】
下記選択された配列：
配列番号５：
ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＩＥＱＳＩＥＱＥＥＧＬＮＲＳ
を有するペプチド、および下記選択された配列：
配列番号８：ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＭＳＥＹＮＡＴＱＳＤＹＲＥＲ
を有するペプチドを含む、請求項１記載のペプチド系。
【請求項７】
Ｌシリーズの立体化学またはＤシリーズの立体化学に属するアミノ酸を含む、請求項１から６の何れか一つに記載のペプチド系。
【請求項８】
医薬として使用するための、請求項１から７の何れか一つに記載のペプチド系。
【請求項９】
グルタメート興奮毒性により起こる疾患を治療するための方法における使用のための、請求項１から７の何れか一つに記載のペプチド系であって、該疾患がアルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、脳虚血、多発性硬化症、大うつ病性障害、分裂病、不安障害、片側頭痛および神経障害性疼痛である、上記ペプチド系。
【請求項１０】
下記工程：
−  固相上に第一のアミノ酸をアンカリングできるようにする固相中の共通の化学合成機を用いることによるペプチド鎖の合成、ここで該固相は樹脂であり、そしてその後のイソペプチド反応、ここで該反応は反復サイクルで起こる、
−  ＨＰＬＣ手法によるペプチドの精製、
−  以前に合成され精製されたペプチド系の質量スペクトル法による構造分析、
を含む、請求項１から７の何れか一つに記載のペプチド系を製造するためのプロセス。
【請求項１１】
発現ベクターであって、該ベクターがウィルスを生産するための細胞系統、細菌又はベクター中の発現ベクターであり、それが請求項１から７の何れか一つに記載のペプチド系を含むこと、を特徴とする上記発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１から７の何れか一つに記載のペプチド系を含有するプラスミドｐ−ＥＧＦＰ−Ｃ１又はプラスミドｐｃ−ＤＮＡであることを特徴とする、請求項１１記載の発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１から７の何れか一つに記載のペプチド系を含有するプラスミドｐＧＥＸ−４又はｐＴＡＴであることを特徴とする、請求項１１記載の発現ベクター。
【請求項１４】
請求項１２記載の発現ベクターを含むことを特徴とする、ＤＨ５アルファ型のＥ・コリ細菌株。
【請求項１５】
請求項１３記載の発現ベクターを含むことを特徴とする、ＢＬ２１型又は誘導体のＥ・コリ細菌株。
【請求項１６】
下記工程：
−０．５ＭのＫＣｌ；０．１５ＭのＣａＣｌ2；０．２５ＭのＭｇＣｌ2を含有する溶液２０μＬをプラスミドＤＮＡ５μｇに添加すること、その後、ＭｎＣｌ2の５μＬ溶液およびＨ2Ｏを溶液少なくとも１００μＬが得られるまで添加すること、
−化学的にコンピテントなＤＨ５アルファＥ・コリ細菌細胞１００μＬを添加すること、
−上記工程から得られる溶液を４℃の温度で保持すること、
−上記溶液を熱ショックに付すこと、ここで該溶液は少なくとも十分間室温に置くこと、
−少なくとも１０ｇ／ｌのトリプトン、少なくとも５ｇ／ｌの酵母エキス、少なくとも１０ｇ／ｌのＮａＣｌ、少なくとも１５ｇ／ｌの寒天を含む溶液６００μＬを添加すること、ここで該溶液は予め３７℃に加熱され、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有すること、
−寒天上に溶液をプレーティングすること、
−文献記載の古典的方法によりプラスミドＤＮＡを精製すること、
を含む、請求項１４記載のＤＨ５アルファ型のＥ・コリ細菌株を調製するためのプロセス。
【請求項１７】
請求項１６記載のプロセスにより得ることができる、請求項１４記載のＤＨ５アルファ型のＥ・コリ細菌株。
【請求項１８】
下記工程：
−プラスミド少なくとも５μｇをＢＬ２１型のＥ・コリ細菌を含有する溶液約１００μｌに添加すること、
−得られた溶液を４℃の温度で少なくとも三十分間インキュベートすること、
−溶液を熱ショックに付すこと、ここで該熱ショックは溶液を約４２℃に約四十五秒間置くことにより起こすこと、
−溶液を氷中に少なくとも五分間の時間の間置くこと、
−１０ｇ／ｌのトリプトン、５ｇ／ｌの酵母エキス、１０ｇ／ｌのＮａＣｌ、１５ｇ／ｌの寒天を含有する溶液４００μＬを添加すること、
−このようにして得られた溶液をアンピシリン含有寒天上にプレーティングすること、
−細菌コロニーを寒天上で少なくとも十二時間３７℃で維持すること、
を含む、請求項１５記載のＢＬ２１型のＥ・コリ細菌株又は誘導体を調製するためのプロセス。
【請求項１９】
請求項１８記載のプロセスにより得ることができる、請求項１５記載のＢＬ２１型のＥ・コリ細菌株又は誘導体。
【請求項２０】
コーディングＤＮＡ配列を含むことを特徴とする、請求項１から７の何れか一つに記載のペプチド系であって、該配列が配列ＨＡ、又は配列ＧＳＴ、又は配列Ｍｙｃ、又は配列ＥＧＦＰである、上記ペプチド系。
【請求項２１】
請求項１から７の何れか一つに記載のペプチド系を含むことを特徴とする、医薬組成物。
【請求項２２】
請求項１から７の何れか一つに記載のペプチド系を含む医薬組成物であり、ここで該製剤は懸濁液又は軟膏、又はパッチ、又は錠剤、又はカプセルである、上記医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医学分野に関する。より詳細には、本発明はグルタメートのＮＭＤＡ誘導シナプス前放出をブロッキングすることができる新しいペプチド系を指す。本発明のペプチド系はグルタメート興奮毒性に関連する病態を治療するために使用されることに適合される。
【背景技術】
【０００２】
脳に最も豊富に存在するアミノ酸の一つはＬ−グルタメートである。そのニューロンレベルにおける最も重要な機能は興奮性神経伝達の制御であり、これは１９５０年代から報告されており、その生理学的拮抗剤はガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）である。
【０００３】
Ｌ−グルタメートは中枢神経系において、興奮性シグナルおよび迅速なシナプス伝達の主要なメディエーターであると考えられている。Ｌ−グルタメートは中枢神経系（ＣＮＳ）の発達において、シナプスの形成および消失において、そして、細胞の遊走、分化および死滅において基本的な役割を果たしている。更にまた、Ｌ−グルタメートは末梢臓器および組織において、並びに、内分泌細胞においてもシグナル伝達のための重要な分子である。
【０００４】
生理学的レベルで遊離した場合、Ｌ−グルタメートは脳機能において基本的役割を有し、認知、記憶および学習を包含する正常な脳機能の多くの側面に関与していると考えられる。逆説的に、Ｌ−グルタメートがシナプス空間で高レベルに達したとき、それは高度に毒性となる。従って、神経伝達物質としての遊離のＬ−グルタメートとシナプス空間から脱離して分解されているＬ−グルタメートとの平衡を有することが必要である。この平衡が良好に制御されると、それはシナプス伝達の正常な生理を維持する。この平衡が何らかの原因によりシナプス空間にＬ−グルタメートが残存し続ける方向に偏った場合、そのイベントは細胞の生存にとって極めて危険である毒性状態をもたらす。この病理学的状態は「グルタメート興奮毒性」と定義され、このアミノ酸が遍在性であるにも関わらず中枢神経系（ＣＮＳ）にのみ伴っている。
【０００５】
グルタミン酸作動性のシナプス伝達はＣＮＳ細胞上のＬ−グルタメート受容体（ＧｌｕＲ）の存在により生じる。これらの受容体は二種類の主要な範疇：イオンチャネル型（ｉＧｌｕＲ）及び代謝型（ｍＧｌｕＲ）のグルタミン酸作動性受容体に分割される。
【０００６】
これらの二種の受容体クラスはそれらの機能に関して異なっている。実際、イオンチャネル受容体は蛋白のセット（サブユニット）であり、これは細胞膜上にイオンチャネルを形成し、開口してイオンを内外に流動させることによりシグナルを伝導している。逆に、代謝型受容体は細胞膜を横断し、分子を膜通過させることはないが、外部のシグナルを移動させ、一連の細胞内イベントを開始させる蛋白である（第二メッセンジャー）。
【０００７】
サブタイプＮＭＤＡ、ＡＭＰＡおよびカイネート（ＫＡ）はイオンチャネル型受容体のグループの一部を構成する。
【０００８】
代謝型受容体のグループはｍＧｌｕＲと標記され、その八種の異なる蛋白が知られている。
【０００９】
多くの研究は、グルタメートに起因する神経毒性の急性の型はグルタメートのイオンチャネル型受容体（ｉＧｌｕＲ）により主に媒介されることを示している。この型の神経毒性はシナプス前およびシナプス後のｉＧｌｕＲの過剰な活性化を特徴としており、これには、受動的にＣｌ-イオンを後続させる大量のＮａ+のニューロン内進入と、Ｋ+イオンの流出が関与している。このイオンの移動は水の進入を担っており、これが神経の「膨潤」、浸透圧溶解および壊死をもたらす。更に又、Ｃａ2+の大量流動がイオンの移動を完了させる。
【００１０】
グルタメートのシナプス前放出を担うグルタミン酸作動性の受容体のうち、ＮＭＤＡとして知られているものがある。この受容体は発見され特性化された最初のグルタミン酸作動性受容体であった。
【００１１】
ＮＭＤＡの名前はそれを特異的な態様において薬理学的に活性化する化学物質、即ちＮ−メチルＤ−アスパルテートに基づく。これは一緒になって細胞膜中に細孔を形成する四サブユニットにより形成されるリガンドにより活性化されるチャネル受容体である。そのニューロン内の所在はシナプス後とシナプス前の両方である。
【００１２】
ＮＭＤＡチャネルはマグネシウムイオンで通常ブロックされることを特徴とする。この「マグネシウムブロック」はニューロンの脱分極がある場合、例えば他のグルタメート受容体（ＡＭＰＡ、代謝型）が活性化された場合には起こらない。
【００１３】
ＮＭＤＡ受容体は複数のサブユニットＧＬＵＮ１およびＧＬＵＮ２の組み立てにより構成される。次に後者は他のアイソフォームに分割される（２Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ）。サブユニットの組成は脳の種々の部分において、そして細胞未満の所在において変動するが、ＧＬＵＮ１の存在は正常な受容体機能のために必要である。
【００１４】
グルタメートを伴って共アゴニストとなるが故、チャネルの開口、さらにはこのイベントへの細胞応答の強度をモジュレートできる種々の分子に対して、ＮＭＤＡ受容体複合体は多くの異なる結合部位を有する。これらのモジュレーター部位はグルタメートのもの（ＮＭＤＡの部位でもある）、グリシンのもの、およびポリアミン（スペルミンおよびスペルミジン）のものである。
【００１５】
シナプス前ＮＭＤＡチャネルがいったん開口すると、Ｎａ+、Ｃａ2+イオンの進入、およびＫ+イオンの退出が起こる。このイオンの運動が膜の脱分極、さらにはグルタメートの放出をもたらす。ＮＭＤＡによる脱分極は、神経伝達物質の放出をもたらす全ての系を活性化する細胞内Ｃａ2+の増大および移動を誘導する。
【００１６】
ＮＭＤＡ受容体が外部のシグナルを細胞の内部に移動させる様式について今では多くの研究が報告しているとしても、ＮＭＤＡ受容体とグルタメートの放出を結びつけるこの機序に関与する蛋白がどれであるかを理解するためにはさらに多くの検討が必要である。
【００１７】
この議論の重要性は多くの病理が興奮毒性に関連しているという事実にあり、そしてそれに対抗することを試みるための薬品が存在するとしても、革新的な医薬の標的に、より特定的になりえる新しい薬理学的標的を発見する必要性は大きい。
【００１８】
しかしながらグルタメートはニューロンの生存に必須であることに加えて、高度に毒性ともなりえる。虚血、頭蓋外傷および癲癇発作のような急性のストレスのイベントの間にＧｌｕＲが過剰に活性化されると脳ニューロン死がもたらされる。さらに、グルタメートの神経毒性はまた神経変性および神経炎症の範囲に分類される種々の慢性疾患の病因にも関与している場合がある。グルタメートの神経毒性はＮＭＤＡ、ＡＭＰＡ、ＫＡ受容体又はグルタメートの代謝型受容体のグループＩの異常刺激を通して起こる場合がある。これらの種々のクラスの受容体の相対的寄与度は関与するニューロンおよび種々の他の状況に応じて変動する。
【００１９】
グルタメートはその受容体の過剰な活性化により、癲癇状態、脳虚血、周産期の窒息および頭蓋外傷のような種々の攻撃に続く細胞死において重要な役割を果たしていると考えられる。さらに詳細には、ＮＭＤＡ受容体はこれらの病態にさらに大きく関与するものであると考えられ、実際、実験的には、ＮＭＤＡ拮抗剤を使用することにより、これらの病態に関連する脳損傷の大きさを低減できた。
【００２０】
ストレスが重度である場合、細胞死は壊死を介して起こるが、重症度がより低ければアポトーシス型の過程がトリガーされる場合がある。関与する主要な機序は、リガンド依存性および電圧依存性のチャネルを通過するＮａ+およびＣａ2+の過剰な進入に関連したイオン不均衡である。細胞内Ｃａ2+濃度の増大は細胞死に寄与する種々の酵素をカスケード態様において活性化する。イオンホメオスタシス、変化したエネルギー細胞代謝、ミトコンドリアの毒性およびフリーラジカルによる酸化ストレスの間には複雑な相互作用が存在する。
【００２１】
ＧｌｕＲ受容体の慢性的活性化はまた、種々の遅発性神経学的攪乱における神経変性の過程を誘導することができるため、基礎的な役割を果たすとも考えられている。少なくとも部分的には、ＮＭＤＡ又はＡＭＰＡのような受容体を過剰に、そして慢性的に活性化する内因性のグルタメートは筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症、ハンチントン病、アルツハイマー病およびパーキンソン病のような疾患の病因の原因であると考えられる。臨床使用の薬品は急性および慢性の病態の両方に対して現在販売されている。それらの活性はＮＭＤＡ受容体拮抗剤である場合が多い。この受容体ブロックは一方ではこれらの病態の一部では有効であり初期の利点をもたらすと考えられる場合、他方では更に重度である可能性のある副作用をもたらす。従って医学的研究は、考えられる薬剤の作用をますます特異的にし、そしてさらに低毒性とするような態様で、受容体の細胞内パートナー、この特定の場合はＮＭＤＡを発見し続けることに尽力すべきである。
【００２２】
高齢者の慢性痴呆の原因である最も一般的な病態はアルツハイマー病（ＡＤ）である。
この病態において、発症は進行性であり、認知機能がわずかに低下する若年から発生する。
【００２３】
次に、散発性の記憶低下のエピソードの後、言語と現実知覚および正常な日常活動を行う能力の両方において認知不全が亢進する。
【００２４】
病態は記憶に割り付けられる領域における神経炎プラークの沈着および神経原線維のもつれによるものであることが、現在まで確認されている。これらの沈着は経時的には進行性のニューロン死をもたらし、これにより皮質および海馬の全ての上部において脳萎縮を誘発する。
【００２５】
アミロイド前駆体蛋白（ＡβＰＰ）のアミロイド形性のプロセシングにより過剰に生産されるベータアミロイド（Ａβ）ペプチドのフラグメントがＡＤ原因の第一の因子であると認識されている。
【００２６】
実際、Ａβペプチドの細胞外蓄積は神経炎プラークの形成をもたらす。ニューロンに対して毒性の物質種が循環している細胞外ペプチドであるか、または不溶性プラークか、については現在考察中である。
【００２７】
神経原線維のもつれは病態のもう一つの組織病理学的特徴である。これらのもつれに最も多く存在する蛋白はその過剰ホスホリル化型の微小管（Ｔａｕ）に関連する蛋白である。これらの細胞内凝集体はタウオパシーと称される種々の神経変性病態に存在する。この蛋白の過剰ホスホリル化はこれらの病態におけるニューロン変性の原因とされていた。
【００２８】
パーキンソン病（ＰＤ）は中枢神経系の特定の領域が主に運動系を攻撃することにより損傷する神経変性病態であり、重度の遊歩障害を伴う。この型の不全は線条体に突出する黒質のドパミン作動性ニューロンの進行性の変性に起因する。脳組織における分子レベルにおいては、ＰＤはアルファシヌクレインおよびユビキチンが他の要素よりもとりわけ認識されることのできる蛋白凝集体であるレビー小体の蓄積を特徴とする。病態に寄与する種々の突然遺伝子変異および蛋白が存在し、現時点で知られているもののうち、突然変異が家族性ＰＤ型の大部分の原因であるＰａｒｋｉｎおよび種々の遺伝子の転写に関与する多機能蛋白ＤＪ−１が存在する。ＤＪ−１の機能消失はＰＤの早期発症の原因の一つである。
【００２９】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は脳の運動ニューロンおよび脊髄に影響する高度障害を伴う変性的な神経学的病態である。
【００３０】
病態は高度な疲労から始まり、その後筋肉の萎縮が起こり、進行性の筋肉麻痺が発生する。
【００３１】
ＳＬＡは通常では散発性の発症源を有するが遺伝的なものも一部知られている。遺伝型の場合、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）の突然変異が病態の原因である。ＳＯＤ１は解毒の役割を果たすことにより「酸化」からニューロン細胞を保護することに関与している。
【００３２】
突然変異したヒトＳＯＤ１は対象となるニューロン細胞にとって毒性である凝集体の形成をもたらす。
【００３３】
ハンチントン病（ＨＤ）は遺伝的な性質を有する神経変性病態であり、ポリグルタミンに由来する病態の範疇に属する。線条体ニューロンが徐々に萎縮することがこの病態の主な特徴であり、極めてよく知られた遊歩不全に至る。
【００３４】
ＨＤはハンチントン蛋白（ＨＴＴ）のＮ末端鎖のｐｏｌｙＱの伸長の結果として起こり、これはそのままでは分解されず、ニューロン内に蓄積する。
【００３５】
脳虚血は変性的特徴を有する病態ではないが、死に至る神経細胞攻撃は他の神経変性病態との病理学的同時罹患率においても重要な作用を有する場合があり、癲癇並びに周産期の窒息および頭蓋外傷に存在する。これは死亡又は重度の障害の原因となる高度障害疾患である。虚血は心臓発作、動脈瘤、精管閉塞、出血、外傷などにより脳領域が正常な血流の供給をもはや受けられなくなった場合に、見かけ上は突然な態様において生じる。虚血中の酸素およびグルコースの枯渇、および患部における血液再灌流による損傷もまた、ニューロン細胞が高度な代謝ストレスを起こす原因となる。
【００３６】
細胞レベルにおいては、虚血はＡＴＰの低下をもたらし、それに伴い細胞内カルシウム増大、酸化的損傷およびミトコンドリア機能不全が起こる。これらのイベントは全て、高度なグルタメート作動性の伝達をもたらし、その結果、興奮毒性、さらには死に至るニューロン細胞の損傷が起こる。
【００３７】
多発性硬化症（ＭＳ）は中枢神経系を攻撃し多様な兆候および症状をもたらす脱髄性慢性自己免疫疾患である。多発性硬化症は神経細胞を攻撃し、脳と脊髄との間の連絡を困難にする。神経細胞は隔離物質であるミエリン鞘により被覆された軸索を通じて電気信号を伝達する。疾患においては患者の免疫防御がこの鞘を攻撃して損傷を与える。これが起こると、軸索はもはや効果的にシグナルを伝達することができなくなる。発症機序は複雑であり、興奮毒性に基づいた炎症と変性の過程により持続するが、厳密な因果関係はいまだ不明である。異なる理論は遺伝子的原因と感染性の原因の両方を提案しており、さらに環境危険因子との相関も指摘されている。疾患は多くの種類の神経学的症状において顕在化し、身体的および認知的な障害にまで進行する場合がある。多発性硬化症は回帰的および進行性の形態を包含する種々の形態を取りえる。
【００３８】
大うつ病性障害は低い自尊心および通常は楽しい活動に興味又は喜びを感じない抑鬱的気分のエピソードを特徴とする気分障害又は病態である。うつ病は神経系の複雑なネットワークが関与する遺伝子的および環境上の因子による複雑な疾患である。最も確実な仮説は「抑鬱のモノアミン作動性理論」であり、これによれば、臨床的抑鬱はセロトニン、ドパミン又はノルアドレナリンのようなモノアミンを使用する脳シナプスの一又は複数の型の効率性が低下することに起因している。新しい研究は抑鬱とグルタメートシグナルの伝達に関与する遺伝子グループの一部の変異体の間の関係を指摘している。即ち、ＮＭＤＡ受容体をブロッキングすることで知られている物質であるケタミンは結果を示すまでに何週間もかかる従来の抗鬱剤よりもはるかに迅速な抗鬱作用を有することがわかっており、ケタミンは抗鬱剤で現在得られているよりもはるかに有効に抑鬱に対抗できる（従来の抗鬱剤は現時点で実際には問題に効果的に対応していない）。
【００３９】
分裂病は複雑で障害を伴うことが多い重度の精神攪乱である。分裂病の最初の兆候は一般的には青年期および早期の成人時代に顕在化する。分裂病に罹患した患者は自身の考えを明確に表現することが困難であり、この状態は幻覚、譫妄、支離滅裂な考え並びに異常な挙動および話をすることにつながる。これらの症状のため、この疾患に罹患した者は他者との相互関係が重篤に困難となり外界から隔離されようとする傾向がある。変化した脳の機能と分裂病の間の関連性を説明するために種々の試みがなされている。最も古典的な仮説の一つはドパミンの役割に関するものであり、ドパミン作動性のニューロンの誤機能が精神病をもたらす症状の原因である可能性がある。最近の結果は、身体的対象におけるドパミンの系とグルタメート神経伝達物質との間の変則的な関係の仮説を裏付けており、グルタメート伝達経路に影響することができる薬品の開発が精神病の治療に有用であることを示唆している。
【００４０】
不安障害は顕著な苦悶と問題を起こす場合が多く、生活の質を低下させる精神疾患の一般的形態である。不安障害には種々の型、例えば全般性不安障害、社会不安障害、パニック障害及び強迫性障害が存在する。不安障害の原因は知られていない。しかしながら、脳機能の何らかの変化が種々の不安障害に関与すると考えられる。更に又、社会的およびストレスの状態が不安障害の発症に寄与する可能性がある。恐怖、不安および関連する障害の関与する生物学的根拠の理解は完全とは言えないがかなり進歩しており、その理由は遺伝学、神経化学、精神薬理学および神経画像化手法が開発されたためである。特に、不安の神経生物学的根拠の知見に関する大きな増大は、関与する神経解剖学的な経路（扁桃、前頭前皮質［ＰＦＣ］、視床および海馬）に関する概念に特に関連する恐怖応答の挙動成分並びに不安障害に対する個人の種々の無防備性を少なくとも部分的に説明できる受容体と遺伝子的な側面の研究によるものである。関与する神経伝達物質のうち、重要な役割はＧＡＢＡ、グルタメート、セロトニン、神経ペプチドおよび内在性カンナビノイドにより果たされている。
【００４１】
片頭痛は中枢神経系に限定される高度障害性の神経学的病態であり、最も重度の症例では自律神経系の症状を伴う。典型的には、病態は頭部に局在化する疼痛により顕在化するが、吐き気、嘔吐、羞明および音声恐怖症を伴う場合もある。片頭痛に罹患した者の多くは苦悩性頭痛が後続する一過性の視覚、運動および感覚の障害として顕在化する雰囲気を経験する。現時点で最も確認された分子の原因は変則的な興奮性の動揺であり、これはニューロン、特に皮質で起こり、そしてそれに後続して皮質領域全体に拡張するニューロン活性の抑制が起こる。現在使用されている薬品は最も重度の症例において抗嘔吐薬と組み合わせた古典的な鎮痛剤である。従って、この病態においても、グルタメートの過剰放出が臓器障害の根源である。
【００４２】
グルタメートの放出が疼痛症状の原因の一つとなる別の病態は慢性神経障害性疼痛である。これは末梢線維と中枢線維の間の神経シグナルの連結が変則的な態様において機能するために開始する中枢神経系の病態である。一般的に、症状は連続的な熱傷感又は電気ショックにより顕在化し、知覚異常もまた原発疼痛位置の領域周辺に存在する。痛覚過敏および異痛はこの病態の主要な特徴である。
【００４３】
神経障害性疼痛は不幸にも治癒困難であり、現在使用されている唯一の薬品は鎮痛剤であり、それは効果のないことが多い。
【００４４】
本発明は神経伝達のシナプス前コンパートメントに局在するＮＭＤＡ受容体の活性化により誘導されるグルタメート放出の極めて特異的な機序の発見に基づいており、特に、以下に詳述する本発明は、ＮＭＤＡ受容体の活性化によりトリガーされる細胞イベントのカスケードにおける蛋白ｃ−ＪｕｎＮ−末端キナーゼ（ＪＮＫ）の関与の発見を達成している。これはシナプス前のレベルにおいてＪＮＫ蛋白が存在することを初めて文書化する間に想到した。より詳細な説明を行う前に、ＪＮＫが多くの細胞機能に関与する種々異なるシグナリング経路に関連する酵素活性を有する遍在性の細胞内キナーゼであることを指摘することが適切である。ＪＮＫは種々の病理学的状態において確認されているニューロン死をもたらすシグナルにおいて中枢的役割を担う蛋白である。ＪＮＫはチロシンキナーゼ受容体、サイトカイン受容体、Ｇ蛋白と結合した受容体およびリガンド依存性のイオンチャネル、例えばＮＭＤＡ受容体の刺激の後に活性化される場合があり、そしてそれらはシグナリング細胞死の真の指標となる。ＪＮＫは一般的にはシナプス後ＮＭＤＡ受容体に伴っているが、そのシナプス前の役割は大部分が発見されないままとなっている。
【発明の概要】
【００４５】
本発明はグルタメートのＮＭＤＡ誘導シナプス前放出を特異的にブロッキングすることのできるペプチド系に関する。より詳細には本発明は、グルタメート放出の制御に関与する蛋白の相互作用を阻害するために適宜調製された二種の細胞透過性ペプチドに関する。本発明のペプチド系の定義の上流においては、生化学的および電気生理学的方法により、グルタメートのＮＭＤＡ誘導放出の制御に関与するシナプス前のレベルにおけるＪＮＫの存在を示した。更に又、分子モデル研究と組み合わせてＩＮＫの単一アイソフォームに関するノックアウトマウスを用いることにより、本発明に関する研究の過程において、ＪＮＫのアイソフォーム２がこのシナプス前イベントを媒介する必須蛋白であることが明らかになった。より詳細には、ＪＮＫ２はニューロンのシナプス前部分に存在し、おそらくはシンタキシン１ａ（ＳＴＸ１ａ）と称される排他的シナプス蛋白との相互作用によりＮＭＤＡ媒介放出の制御というその作用を示していると考えられる。ＳＴＸ１ａは神経伝達物質放出機序にとって必須の蛋白であるため、本発明は二種の蛋白が相互作用する部分を定義するためのＪＮＫ２とＳＴＸ１ａとの間の相互作用の研究に基づいている。従ってこのＪＮＫ２−ＳＴＸ１ａ相互作用をブロックすることができる二種の細胞透過性ペプチドを設計した。ペプチドはそれらが細胞障壁を通過してシナプス前のレベルにある相互作用を阻害することができるような態様において設計されている。即ちこれらの二種のペプチドはグルタメートのＮＭＤＡ誘導シナプス前放出を特異的にブロックできる。以後、二種のペプチドをＪＧＲｉ１およびＪＧＲｉ２と称する。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１はグルタメートのシナプス前放出に対してＪＮＫ蛋白阻害が有する作用を示し、さらに異なる刺激の作用の下でのＪＮＫ蛋白のシナプス活性化を示す。Ａ）は放射性神経伝達物質を予め負荷させ、その後、記載の異なる刺激とともにインキュベートした野生型マウスの皮質から調製したシナプトソームに関する結果を示す。結果は誘導された放出のパーセンテージとして表示する。データは三連で反復した三実験（各実験条件に対して三灌流チャンバー）から得られた平均±ＳＥＭ（平均の標準誤差）として表示する。＊＊基礎放出に対してｐ＜０．０１。Ｂ）野生型マウスの皮質から調製したシナプトソームに放射性神経伝達物質を予め負荷し、記載の刺激の前の三十分間Ｌ−ＪＮＫｉ１（２μＭ）とともにインキュベートした。結果は誘導された放出のパーセンテージとして表示する。データは三連で反復した三実験（各実験条件に対して三灌流チャンバー）から得られた平均±ＳＥＭ（平均の標準誤差）として表示する。Ｌ−ＪＮＫｉｌはＮＭＤＡ刺激により誘発される放出を防止した。＊＊ＮＭＤＡにより誘発された放出１００％に対してｐ＜０．０１。Ｃ−Ｄ−Ｅ）はＫＣｌ刺激九十秒（Ｂ）、ＮＭＤＡ十分（Ｃ）、ＡＭＰＡ十分（Ｄ）及びＬ−ＪＮＫｉｌによるシナプトソームの処理の後に達成されたｐ−ＪＮＫのレベルを示す相対的定量を行った代表的ウエスタンブロットである。結果は対照（１００％とする）に基づいたｐ−ＪＮＫ／ＪＮＫの比の増加のパーセントとして表示する。データは各条件に関する四実験の平均±ＳＥＭを示す。ＮＭＤＡ処理はＪＮＫのホスホリル化の増大をもたらした（＊＊対照１００％に対してｐ＜０．０１）に対し、ＪＮＫｉｌはＮＭＤＡの作用を低減していない（＊対照１００％に対してｐ＜０．０５）。
【図２】図２はＮＭＤＡに依存するグルタメートの放出におけるＪＮＫの機能的役割を示す。Ａ）はＣ５７ＢＬ６／Ｊ系統のマウスのスライス由来の７ニューロンにより、そして、Ｌ−ＪＮＫｉｌ（２μΜ）とともに予備インキュベートしたマウスＣ５７ＢＬ６／Ｊのスライスの１０ニューロンにより登録された誘発ＥＰＳＣの対パルス比（ＰＰＲ）のヒストグラム（平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ）を示す。左側は代表的な痕跡をＤ−ＡＰ５（５０μＭ）の投与中、およびＤ−ＡＰ５の洗浄後の対照条件下の同じニューロンから得たものである。Ｂ）はＤ−ＡＰ５に応答してＣ５７ＢＬ６／Ｊの単一のニューロンまたはＬ−ＪＮＫｉｌとともに予備インキュベートしたＣ５７ＢＬ６／Ｊのニューロンを用いて記録したｍＥＰＳＣの振幅（左）及びイベント間の時間間隔（右）の累積分布を示す。最も上の痕跡はＤ−ＡＰ５投与とその後の洗浄の間、対照条件下で同じニューロンから得た。Ｃ）はＤ−ＡＰ５に応答してＣ５７ＢＬ６／Ｊ系統のマウスのスライス由来の１１ニューロンにより、そして、Ｌ−ＪＮＫｉｌ（２μΜ）とともに予備インキュベートしたマウスＣ５７ＢＬ６／Ｊのスライスの１０ニューロンにより記録された誘発ＥＰＳＣの一対パルス比（ＰＰＲ）のヒストグラム（平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ）を示す。＊＊ｐ＜０．０１（ｔ−検定）。
【図３】図３はＪＮＫがシンタキシン１ａのホスホリル化を制御すること、およびＪＮＫ２／３がシンタキシン１ａとともに共免疫沈降することを示す。Ａ）は示された投与の間のＳＴＸ１ａのホスホリル化の相対的定量を行った代表的ウエスタンブロットである。結果はパーセントとして表示し、対照に基づいて規格化されている。データは五実験の平均±ＳＥＭであり、ここではＮＭＤＡ＋Ｌ−ＪＮＫｉｌの十分間はＬ−ＪＮＫｉｌ単独の場合と同様、相対的ｐＳＴＸｌａ／ＳＴＸｌａを低減している（＊＊対照１００％に対してｐ＜０．０１）。Ｂ）はＤ−ＡＰ５投与の間のＪＮＫのホスホリル化のレベルを示す相対的定量を行った代表的ウエスタンブロットである。結果は対照（１００％）に対するパーセントとして表示する。データは三実験の平均±ＳＥＭである。Ｃ）はＤ−ＡＰ５投与の間のＳＴＸ１ａのホスホリル化のレベルを示す相対的定量を行った代表的ウエスタンブロットである。結果はパーセントとして表示し、対照に基づいて規格化されている。データは三実験の平均±ＳＥＭを示す。Ｄ）は相対的定量を行った共免疫沈降（Ｃｏ−ＩＰ）の実験の結果を示す。野生型マウスの皮質シナプトソームを図面に示す通り刺激し、免疫沈降をＳＴＸ１ａ抗体を用いて実施した。代表的ウエスタンブロットはストリッピング操作の後のｐ−ＪＮＫとＪＮＫのＣｏ−ＩＰを示す。ＳＴＸ１ａ（免疫沈降の対照として）及びＳＹＴ１（特異性の対照として）に対してメンブレンをブロットした。結果は対照条件に対する相対的ｐ−ＪＮＫ／ＳＴＸｌａ又はＪＮＫ／ＳＴＸｌａの増大のパーセントとして表示する。データは各投与に関する四実験の平均±ＳＥＭである（対照１００％に対して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。
【図４】図４はグルタメートのＮＭＤＡ誘発放出およびＪＮＫのＮＭＤＡ誘導ホスホリル化がＪＮＫ２ＫＯマウスにおいてどのように阻害されたかを示す。Ａ）は放射性トレーサーを予め負荷した野生型およびＪＮＫ−ＫＯマウスの皮質から得たシナプトソームのＮＭＤＡ刺激により誘導されたグルタメートの放出の結果を示す。結果は誘発された放出のパーセントとして表示する。データは三連で実施した四実験（各実験条件につき三灌流チャンバー）の平均±ＳＥＭである。＊＊ＷＴに対してｐ＜０．０１；ＪＮＫ１−ＫＯ又はＪＮＫ３−ＫＯに対してｐ＜０．０５。Ｂ）は投与の間のＪＮＫ２−ＫＯ又はＪＮＫ３−ＫＯマウスにおける比ｐＪＮＫ／ＪＮＫを示す定量を行った代表的ウエスタンブロットの結果を示す。結果は対照（１００％）に対するパーセントとして表示する。データは三実験の平均±ＳＥＭを表す（＊＊対照１００％に対してｐ＜０．０１）。
【図５】図５はグルタメートのＮＭＤＡ媒介放出にアイソフォームＪＮＫ２がどのように関与しているかを示しており、Ａ）は Ｄ−ＡＰ５（５０μＭ）に応答してＪＮＫＫＯマウスの単一のニューロンを用いて記録したｍＥＰＳＣの振幅（左）及びイベント間の時間間隔（右）の累積分布を示す。最も上の線はＤ−ＡＰ５投与とその後の洗浄の間、対照条件下で同じニューロンから得た。Ｂ）はＤ−ＡＰ５に応答してｎ＝８のＪＮＫ１ＫＯ、ｎ＝７のＪＮＫ２ＫＯおよびｎ＝６のＪＮＫ３ＫＯのニューロンを用いた場合のｍＥＰＳＣの振幅値（左）及びイベント間の時間間隔（右）の平均のヒストグラム（平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ）を示す。＊＊ｐ＜０．０１、ｔ−検定。
【図６】図６は蛋白相互作用ＪＮＫ−ＳＴＸｌａの分子ドッキングのモデルを示す。Ａ、Ｂ、Ｃ）はモデル１、２および３としてそれぞれ認識されるＳＴＸｌａとＪＮＫ２の間の相互作用の試験から得られた三つの最良ドッキング可能性を示す。ＪＮＫ２蛋白はグループ１００により表し、ＳＴＸｌａのＮ末端部分はグループ２００により表す。Ｄ）はＳＴＸｌａのＮ末端部分の構造を示し、ＪＮＫ２と最も高い確率で相互作用する部分を示すセクション３００、４００および５００を示す。全画像の表示はＶＭＤソフトウエアを用いることにより実施した。
【図７】図７はＮＭＤＡ刺激条件下および単独適用の場合の何れにおいても、Ｌ−ＪＮＫｉｌ投与がＮＭＤＡおよびＡＭＰＡ受容体サブユニットの変化を誘導しないこと（Ａ）、および放出機序の蛋白の変化も誘導しないこと（Ｂ）を示している。
【図８】図８は電気生理学的パッチクランプ実験における野生型マウスの皮質スライスにおけるグルタメートの放出に対する二種のペプチドＪＧＲｉ１およびＪＧＲｉ２の作用を示す。より詳細には、該当する図は、ｎ＝９のニューロンのイベント間の時間間隔の振幅値の平均のヒストグラム（平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ）を示しており、ここでＪＧＲｉ１およびＪＧＲｉ２はともに適用するかＪＧＲｉ１の場合はｎ＝４のニューロン、ＪＧＲｉ２の場合はｎ＝６のニューロンとした。＊＊ｐ＜０．０１、ｔ−検定。
【図９】図９はペプチドの固相化学合成プロセスの例を示す。符号は、小丸はアミノ酸鎖の保護のための基、Ｒはアミノ基の保護、Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｌは官能基を示す。プロセスはペプチドが得られるまでサイクル反復した。
【図１０】図１０は配列番号５：ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＩＥＱＳＩＥＱＥＥＧＬＮＲＳの配列を有するペプチドＪＧＲｉ１のＨＰＬＣ分析から得られたクロマトグラムを示す。
【図１１】図１１は配列番号８：ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＭＳＥＹＮＡＴＱＳＤＹＲＥＲの配列を有するペプチドＪＧＲｉ２のＨＰＬＣ分析から得られたクロマトグラムを示す。
【図１２】図１２は配列番号５：ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＩＥＱＳＩＥＱＥＥＧＬＮＲＳの配列を有するペプチドＪＧＲｉ１の質量スペクトル示す。
【図１３】図１３は配列番号８：ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＭＳＥＹＮＡＴＱＳＤＹＲＥＲの配列を有するペプチドＪＧＲｉ２の質量スペクトル示す。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
本発明はＳＴＸｌａのシナプス前レベルにおけるＪＮＫアイソフォーム（ＪＮＫ１、ＪＮＫ２、ＪＮＫ３）の存在を示したことに基づく。この蛋白相互作用を出発点としながら、二種のペプチド、即ち細胞透過性のＪＧＲｉ１およびＪＧＲｉ２を設計し、これらはＪＮＫ２−ＳＴＸ１ａ相互作用をブロックし、ＮＭＤＡ受容体の刺激により誘導されたグルタメートの放出を低減することができる。
【００４８】
＜実験データ＞
ｃ−ＪｕｎＮ−末端キナーゼ（ＪＮＫ）はグルタメートのシナプス前放出を調節する。
シナプス前レベルにおけるＪＮＫの生理学的存在をグルタメート放出実験を実施することにより明らかにした。この実験タイプにより、シナプス前コンパートメントにおけるＪＮＫキナーゼの役割の研究が可能になった。マウス系統Ｃ５７／ＢＬ６の単離皮質末端（シナプトソーム）を使用した。トリチル化されたＤ−アスパルテート（［3Ｈ］Ｄ−Ａｓｐ）を予め負荷したこれらのシナプトソームを種々異なる刺激により誘導されたグルタメート放出に付した。シナプトソームを連続流溶液で連続洗浄し、特定の時点で刺激するといういわゆる超融合という名称の長年使用されている方法でシナプトソームを刺激した。この操作法で放出されたトリチル化されたグルタメートはシナプス前細胞内イベントにより排他的に放出され、一旦収集されるとベータ放出放射線カウンター内に分布する。僅かな脱分極刺激（８ｍＭのＫＣｌ）へのシナプトソームの一過性の曝露（９０ｓ）により［3Ｈ］Ｄ−Ａｓｐの有意な細胞外放出が誘導され（対照に対して１５８±３７％。＊＊Ｐ＜０．０１）、これは１００μＭのＮＭＤＡへの曝露十分で得られるもの（対照に対して２０２±２１％。＊＊Ｐ＜０．０１）に匹敵していた。ＮＭＤＡ刺激はＭｇ2+欠失培地中で適用し、これによりシナプス前ＮＭＤＡ受容体の有効性を確保した。同様の態様において、５０μＭの（Ｓ）−ＡＭＰＡ十分刺激は［3Ｈ］Ｄ−Ａｓｐの放出の有意な増大をもたらすことができた（対照に対して９８±１１％。＊＊Ｐ＜０．０１）（図１Ａ）。全ての適用刺激はＣａ2+依存性の態様で神経伝達物質の放出をトリガーすることが知られている。次に、考えられるＪＮＫのシナプス前の役割を検討するために、ＪＮＫシグナリングカスケードをブロックする特異的阻害剤（Ｌ−ＪＮＫｉ１）を使用し、ＪＮＫ結合ドメイン（ＪＢＤ）に結合する標的蛋白とのＪＮＫの相互作用を防止した。Ｌ-ＪＮＫｉ１は市販の細胞透過性ペプチドであり、次にこれを２μＭの濃度で三十分間皮質シナプトソームに投与した。ＮＭＤＡ刺激グルタメートの放出のみがＬ−ＪＮＫｉ１により強力に阻害された（対象１００％に対して−６０±１０％。＊＊Ｐ＜０．０１）（図１Ｂ） ことが観察されたことは興味深いものであり、グルタメートのＮＭＤＡ誘発放出のみのモジュレーションにおいてＪＮＫシグナリングカスケードの特異性が有ったことを示している。
【００４９】
シナプス前ボタンレベルにおけるＪＮＫの活性化
上記報告した結果は、シナプス前ボタンにおけるＪＮＫの存在およびそれによる機能を最初に示すものである。さらにＪＮＫはＮＭＤＡ受容体の活性化により誘導されたグルタメートの放出を調節することができる。ＪＮＫのシナプス前の位置とその考えられる活性化を確認するために、マウスの皮質シナプトソーム上で生化学的実験を実施し、上記列挙した刺激により誘導されたホスホリル化を計測した（図１Ｃ−Ｅ）。Ｍｇ2+非含有培地中１００μＭのＮＭＤＡへの曝露十分間の後にＪＮＫのホスホリル化が増大した（対照１００％に対して＋６３±１８％。＊＊Ｐ＜０．０１）。Ｌ−ＪＮＫｉ１はそれを予備インキュベートした場合であってもＪＮＫのホスホリル化には影響しないため、ＮＭＤＡの適用刺激はホスホリル化ＪＮＫの増大をもたらし続ける（対照１００％に対し＋４９±１０％。＊Ｐ＜０．０５）。逆に、ＪＮＫ基礎ホスホリル化はＬ−ＪＮＫｉ１を単独で適用した場合は不変のままであり、物質が基礎的な系においては作用を有さないことを示している（図１Ｄ）。他の二種の脱分極刺激、ＡＭＰＡおよびＫＣｌは逆にＪＮＫのホスホリル化を増大させることが不可能であり、ＪＮＫの活性を特異的にモジュレートするのはＮＭＤＡ刺激であることを示している（図１Ｃ−Ｅ）。
【００５０】
ＪＮＫはＮＭＤＡ依存性グルタメートのシナプス前放出を媒介する。
グルタミン酸作動性末端におけるシナプス前ＮＭＤＡ受容体は自発的に放出されたグルタメートにより活性化され、正のフィードバック機序によりグルタメートの緊張性解放を決定する。グルタメートの放出におけるＪＮＫの機能的役割を検討するために電気生理学的記録を行った。この理由のため、対パルス促通（ＰＰＦ）という名称のパラメーターを、ＪＮＫの阻害剤、Ｌ−ＪＮＫｉ１の存在下又は非存在下（２μＭ、三十分間）でインキュベートした成体マウスＣ５７ＢＬ６／Ｊから得た嗅内皮質（ＥＣ）の脳スライスの錐体ニューロンから計測した。このような対パルス促通（ＰＰＦ）はパッチクランプ構成における電気生理学的記録方法を用いて研究されている例である。
【００５１】
この場合、ＮＭＤＡ受容体の拮抗剤、Ｄ−ＡＰ５（５０μＭ）を用いた灌流は、５０ｍｓの時間間隔で得られた対パルス（ＰＰＲ）関連を不可逆的に減少させた（＊＊ｐ＜０．０１、スチューデントｔ検定、対照ｖｓＤ−ＡＰ５、ｎ＝７；＊＊ｐ＜０．０１スチューデントｔ検定、Ｄ−ＡＰ５ｖｓ洗浄、ｎ＝７；図２Ａ）。スライスをＬ−ＪＮＫｉ１とともに予備インキュベートした場合、Ｄ−ＡＰ５を用いた灌流はＰＰＲを変化させなかった （ｐ＞０．０５、スチューデントｔ検定、対照ｖｓＤ−ＡＰ５、ｎ＝１０；図２Ａ）。このデータはＬ−ＪＮＫｉ１がＮＭＤＡ依存性シナプス前放出の可能性を消失させることを示しており、脳スライスのようなより統合的な系においてもシナプトソームによる放出のデータと整合している。
【００５２】
次にすでに一般的に使用されているプロトコルに従ってミニアチュールタイプの興奮性電流（ｍＥＰＳＣ）を計測することによりＮＭＤＡ依存性シナプス前グルタメート放出に対するＬ−ＪＮＫｉ１の作用を検討した。パッチピペット中でＮＭＤＡの阻害剤であるＭＫ−８０１（１０ｍＭ）とともに（記録すべき細胞中のシナプス後ＮＭＤＡチャネルをブロックするため）細胞外テトロドトキシン（１ｍＭ）及びピクロトキシン（１００μＭ）の存在下でＤ−ＡＰ５を適用した場合、累積イベントの間の時間間隔（ＩＥＩ）の分布（＊＊＊ｐ＜０．００１、ＫＳ検定、Ｃ５７ＢＬ６／ＪｖｓＤ−ＡＰ５、ｎ＝１１；図２Ｂ）およびその平均値（＊＊ｐ＜０．０１、スチューデントｔ検定、対照ｖｓＤ−ＡＰ５、ｎ＝１１；図２Ｃ）の可逆的増大が観察され；更に又、累積振幅と同イベントの平均の何れも影響されなかった（ｐ＞０．０５、ＫＳ検定、Ｃ５７ＢＬ６／ＪｖｓＤ−ＡＰ５、ｎ＝１１；図２Ｂ、ｐ＞０．０５、スチューデントｔ検定、対照ｖｓＤ−ＡＰ５、ｎ＝１１；図２Ｃ）。Ｄ−ＡＰ５の周波数の低下はシナプス前ＮＭＤＡ受容体のブロックによるものであり、これは緊張性グルタメート放出を促進している。Ｌ−ＪＮＫｉ１とともに予備インキュベートしたスライスにおいてはＤ−ＡＰ５の作用は消失している。実際、Ｄ−ＡＰ５による灌流はイベント間の時間間隔（ｐ＞０．０５、ＫＳ検定、Ｃ５７ＢＬ６／Ｊ＋Ｌ−ＪＮＫｉｌｖｓＤ−ＡＰ５、ｎ＝１０；図２Ｂ；ｐ＞０．０５、スチューデントｔ検定、対照ｖｓＤ−ＡＰ５、ｎ＝１０；図２Ｃ）とその振幅（ｐ＞０．０５、ＫＳ検定、Ｃ５７ＢＬ６／Ｊ＋Ｌ−ＪＮＫｉｌｖｓＤ−ＡＰ５、ｎ＝１０；図２Ｂ；ｐ＞０．０５、スチューデントｔ検定、対照ｖｓＤ−ＡＰ５、ｎ＝１０；図２Ｃ）の何れにおいても有意な変化をもたらさなかった。これらの結果はＪＮＫの阻害によりシナプス前ＮＭＤＡ受容体により媒介されるグルタメート放出が低減されることを示唆している。
【００５３】
全体として、本発明者等の電気生理学的データは、ＮＭＤＡにより急性に処理された脳スライスにおけるグルタメートのＮＭＤＡ依存性放出においてＪＮＫが機能的役割を果たしていることを示している。
【００５４】
ＪＮＫはＳＴＸ１ａのホスホリル化を調節する。
シンタキシン１ａは神経伝達物質の放出のための必須な工程であるＳＮＡＲＥ複合体（可溶性ＮＳＦ結合蛋白受容体）の組み立てのために必須の蛋白である。神経伝達物質放出機序におけるｓｅｒ１４中のＳＴＸ１ａ（ｐＳＴＸ１ａ）のホスホリル化の役割はいまだに論争の対象となっている。一部の報告ではｐＳＴＸ１ａの減少は神経伝達物質放出の縮小の直接の結果であるが、他の報告ではｐＳＴＸ１ａの縮小は神経伝達物質の放出の促進をもたらすとされている。
【００５５】
十分間のＮＭＤＡ曝露の後、ＪＮＫホスホリル化は増大し（図１Ｄ）、これはＳＴＸｌａのホスホリル化（ＳＴＸｌａ（Ｓ１４）） の僅かであるが有意ではない減少をもたらしている（図３Ａ）。三十分間Ｌ−ＪＮＫｉ１とともに予備インキュベートし、その後ＮＭＤＡ刺激するとｐＳＴＸ１ａの有意な減少が起こることが観察されたことは興味深い （対照１００％に対して−４０±６．４％。＊＊Ｐ＜０．０１）。Ｌ−ＪＮＫｉ１単独の投与は、ＪＮＫのホスホリル化には影響しなかった場合（図１Ｄ）においても、意外にもＳＴＸ１ａのホスホリル化の高度な低下をもたらした（対照１００％に対し−４５±６．４％。＊＊Ｐ＜０．０１）。この現象を説明するために、Ｍｇ2+欠失培地を有するバッチ中にシナプトソームを維持するため、グルタメートを包含する神経伝達物質は細胞外コンパートメントに蓄積し、そしてこれによりＬ−ＪＮＫｉ１を単独で適用した場合にも受容体を活性化することができると本発明者等は推定することができる。次に、対照条件（１００％）に対するｐＪＮＫ（対照に対して＋１０±８．９％）（図３Ｂ）又はｐＳＴＸｌａ（対照に対して−１０±７．２％）（図３Ｃ）の考えられる変化を推定するために、従ってそのような変化が起こる可能性を排除するために、ＮＭＤＡ拮抗剤Ｄ−ＡＰ５を適用した。他の蛋白は神経伝達物質放出系の一部であることが知られているため、シナプシンのホスホリル化とのＪＮＫの考えられる相互作用を分析した。シナプシンのホスホリル化（ＳＹＮ（Ｓ９））はすべての実験条件において生じた刺激により影響されなかった（図３Ａ）。全体としてこれらの結果によれば本発明者等はＪＮＫ活性の阻害がＳＴＸ１ａのホスホリル化を特異的に低減すると推測することができる。
【００５６】
ＪＮＫはＳＴＸｌａと相互作用する。
グルタメートのＮＭＤＡ誘導放出におけるＪＮＫとＳＴＸ１ａの間の相乗作用的な相互作用を更に理解するために、共免疫沈降（Ｃｏ−ＩＰ）実験を実施した（図３Ｄ）。シナプトソームから抽出した蛋白をＳＴＸ１ａに特異的な抗体とともに免疫沈降させ、次にウエスタンブロットによりｐＪＮＫとＪＮＫを特異的抗体を用いて検出した。対照（非免疫沈降試料）はより下のバンド（ＪＮＫ１、４６ｋＤａ）及びより上のバンド（ＪＮＫ２／３、５４ｋＤａ）を有する典型的なＪＮＫシグナルを示した。意外にも、ＳＴＸ１ａはＪＮＫおよびホスホリル化ｐＪＮＫ型の両方としてＪＮＫ２および３のアイソフォームのみを免疫沈降させ、実際、抗体はより上のバンドを検出した。この結果は蛋白ＳＴＸ１ａがＪＮＫ１と結合することを明確に防止しており、ＳＴＸ１ａとＪＮＫ２／３の相互作用の形成が基礎状態（対照）において既に確認されることを示唆している。更に又、ＪＮＫおよびｐＪＮＫの両方の免疫沈降がＬ−ＪＮＫｉ１をＮＭＤＡとともに適用した場合に対照条件に対して大きく減少し（図、比３ＤＪＮＫ／ＳＴＸｌａ：対照１００％に対し−４２±２％；＊＊ｐ＜０．０１および比ｐＪＮＫ／ＳＴＸｌａ：対照１００％に対し−３９±３％；＊ｐ＜０．０５）、蛋白−蛋白相互作用がＬ−ＪＮＫｉ１により攪乱されることを示唆している。ＳＴＸ１ａ−ＪＮＫ２／３の相互作用がＬ−ＪＮＫｉ１を適用することにより非刺激条件下で減少した（図３ＤＪＮＫ／ＳＴＸｌａ：対照１００％に対し−４４±４％；＊＊ｐ＜０．０１および比ｐＪＮＫ／ＳＴＸｌａ：対照１００％に対し−４６±８％；＊＊ｐ＜０．０１）ことを観察したことは興味深く、相互作用が構成的に存在することを示している。免疫沈降の特異性を評価するために、抗シナプトタグミン１抗体（Ｓｙｔ１）も使用したが、これは免疫沈降せず、ＳＴＸ１ａ−ＪＮＫ２／３の相互作用が特異的であることを示していた。
【００５７】
ＪＮＫ２ノックアウトマウスにおいてグルタメート放出とＪＮＫホスホリル化はＮＭＤＡによりもはや誘導されない。
シナプス前コンパートメントにおけるＮＭＤＡ刺激により活性化されるＪＮＫの特異的アイソフォームを発見するために、ＪＮＫノックアウト（ＫＯ）マウスから得た皮質シナプトソーム上でグルタメート放出実験を実施した。［3Ｈ］Ｄ−Ａｓｐの流出として計測するグルタメート放出を十分間適用したＮＭＤＡにより誘導した。ＪＮＫ１、ＪＮＫ３−ＫＯマウスおよび野生型マウス（ＷＴ）に対して、ＪＮＫ２−ＫＯマウスにおいてのみ、基底に関して有意に低値である放出（オバーフロー基底に対して２８±１９％）をＮＭＤＡが誘導したことを観察したことは興味深い（図４Ａ）。この結果はシナプス前ＪＮＫ２アイソフォームが特にＮＭＤＡ誘発放出を制御することを示唆している。
【００５８】
放出実験を確認するために、ＪＮＫ２の非存在がＪＮＫのホスホリル化を低減するかどうか、ＮＭＤＡで刺激したシナプトソーム上で試験した。予測した通り、ＪＮＫ２−ＫＯマウスにおいて、ＪＮＫのホスホリル化は対照と比較した場合に完全に消失していた。逆に、ＪＮＫ３−ＫＯマウスではいまだに維持されており、この場合ＮＭＤＡはｐＪＮＫの増大を誘導し（対照１００％に対し＋７６±１０％；＊＊ｐ＜０．０１）（図４Ｂ）、ＷＴマウスで得られたもの（図１Ｄ）と完全に同等であった。両方の場合において、Ｌ−ＪＮＫｉ１は単独ではＪＮＫのホスホリル化に影響することは不可能である。
【００５９】
ＪＮＫ２はパッチクランプ実験においてグルタメートのＮＭＤＡ依存性放出をモジュレートする。
ＪＮＫ１ＫＯ、ＪＮＫ２−ＫＯおよびＪＮＫ３−ＫＯマウスから上記プロトコルと同様にしてｍＥＰＳＣを記録することにより電気生理学的記録を実施した。Ｄ−ＡＰ５の灌流によりＪＮＫｌ−ＫＯ（＊＊＊ｐ＜０．００１、ＫＳ検定、ＪＮＫ１ＫＯｖｓＤ−ＡＰ５、図５Ａ）およびＪＮＫ３ＫＯ（＊＊＊ｐ＜０．００１、ＫＳ検定、ＪＮＫ３−ＫＯｖｓＤ−ＡＰ５、図５Ａ）においてイベント間の時間間隔の累積分布の増大、および平均値の増大（＊＊ｐ＜０．０１、スチューデントｔ検定、対照ｖｓＪＮＫ１又はＪＮＫ３ＫＯ；図５Ｂ）が誘発された。両方の遺伝子型において、ｍＥＰＳＣの振幅はＤ−ＡＰ５による影響を受けなかった（ｐ＞０．０５、ＫＳ検定、ＪＮＫｌ又はＪＮＫ３−ＫＯｖｓＤ−ＡＰ５、図５Ａ；Ｐ＞０．０５、スチューデントｔ検定、対照ｖｓＪＮＫｌ又はＪＮＫ３ＫＯ；図５Ｂ）、がＤ−ＡＰ５の適用によるグルタメート放出の縮小はＪＮＫ２−ＫＯマウスにおいて有意に低下した。実際Ｄ−ＡＰ５はｍＥＰＳＣ（ｐ＞０．０５、ＫＳ検定、ＪＮＫ２−ＫＯｖｓＤ−Ｐ５；図５Ａ；ｐ＞０．０５、スチューデントｔ検定、対照ｖｓＪＮＫ２ＫＯ、図５Ｂ）においても、そして振幅（ｐ＞０．０５、ＫＳ検定、ＪＮＫ２−ＫＯｖｓＤ−Ｐ５、図５Ａ；ｐ＞０．０５、スチューデントｔ検定、対照ｖｓＪＮＫ２ＫＯ、図５Ｂ）においても有意な変化をもたらさなかった。全体として、このデータはＪＮＫ２アイソフォームのみが本発明者等の実験条件においてはグルタメートのシナプス前放出を媒介することを示している。
【００６０】
ＪＮＫ変異体に関するドッキング結果
三種のＪＮＫの異なる配列を比較することにより、ＪＮＫ１が十八個の特徴的残基を与え、ＪＮＫ２は四十五個だったのに対し、ＪＮＫ３はわずか十一個であることがわかった。特徴的残基は一つのアイソフォームのみの特定の変異体であり、他の二つのＪＮＫに対して区別できる残基として定義する。
【００６１】
特徴的残基は蛋白−蛋白相互作用において重要であり、特にＪＮＫの一つの変異体のみに対してシンタキシン１ａが特異的に相互作用する場合、そのような変異体の特徴的残基は他のＪＮＫに対して異なっていなければならない。ＪＮＫ２がＪＮＫ１およびＪＮＫ３とは顕著に異なるという事実はシンタキシンとのその特異的相互作用を最初に示したものである。
【００６２】
次に、Ｒｏｓｅｔｔａソフトウエアを用いながらシンタキシン１ａとＪＮＫ２との間の複合体をモデリングするために蛋白−蛋白ドッキングの刺激を実施した。
【００６３】
分析から得られた三種の主要な構造はインターフェイススコアに基づけば三つの最良に分類された構造であったことがわかった。これらの各々のレンダリング画像を図６に示し、図中ＪＮＫ２は白、シンタキシン１ａのＮ末端は赤で示す。
【００６４】
これらの構造をより良好に評価するために、遮蔽された表面積を計算した。モデル１（図６ａ）及び２（図６ｂ）においては約１７００Ａ２の遮蔽表面積があったが、モデル３（図６ｃ）は２６８０Ａ２の表面積を示している。次にインターフェイス残基を分析し、ＪＮＫ２の特徴的残基と比較した。この試験は、モデル３においてはシンタキシン１ａのＮ末端が八個の特徴的残基と相互作用しており、モデル２では五個のそのような残基、そしてモデル１では僅か二つのそのような残基と相互作用していることを示した。これらの観察により、本発明者等はモデル３が最良の相互作用確認結果であると解釈した。次にシンタキシン１ａのＮ末端部分の考えられる接触部位を示すレンダリング画像を得た（セクション３００および４００）。
【００６５】
ＪＮＫの阻害は小胞蛋白およびＮＭＤＡ又はＡＭＰＡ受容体のサブユニットレベルの機構の変化をもたらさない。
次にシンタキシン１ａ（ＳＴＸ１ａ）、シナプシン（ＳＹＮ）、Ｍｕｎｃ１８−１およびシナプトタグミン１（Ｓｙｔ１）のような数種のシナプス前蛋白につき、それらの改変が神経伝達物質放出機序を弱化することから、それらの発現レベルをモニタリングした。本発明者等の実験条件においては、Ｌ−ＪＮＫｉ１を単独又はＮＭＤＡと組み合わせて適用した場合、シナプトソーム中のＳＴＸｌａ、ＳＹＮ、Ｍｕｎｃ１８−１およびＳｙｔ１の存在を変調させなかった（図７Ａ）。同様の態様において、ＮＭＤＡおよびＡＭＰＡの受容体のサブユニットの発現（図７Ｂ）は不変のままであり、シナプス前ＪＮＫに対するＮＭＤＡ媒介作用がそれらの発現レベルの特定の変調に依存しないことが確認された。
【００６６】
グルタメートの放出を阻害するペプチドの分析および構築
シンタキシン１ａのＮ末端部分のアミノ酸配列を分析しながら、特徴的な三つのアルファヘリックスを形成する三種の異なる残基を発見することができ、それらをＨａ、ＨｂおよびＨｃとした。以下にアミノ酸配列を示す（合計２８８アミノ酸）。
配列番号１：
ＭＫＤＲＴＱＥＬＲＴＡＫＤＳＤＤＤＤＤＶＴＶＴＶＤＲＤＲ（２８）ＦＭＤＥＦＦＥＱＶＥＥＩＲＧＦＩＤＫＩＡＥＮＶＥＥＶＫＲＫＨＳＡＩＬ（６２）ＡＳＰＮＰＤＥＫＴ（７１）ＫＥＥＬＥＥＬＭＳＤＩＫＫＴＡＮＫＶＲＳＫＬＫＳＩＥＱＳＩＥＱＥＥ（１０４）ＧＬＮＲＳＳＡ（１１１）ＤＬＲＩＲＫＴＱＨＳＴＬＳＲＫＦＶＥＶＭＳＥＹＮＡＴＱＳＤＹＲＥＲ（１４４）ＣＫＧＲＩＱＲＱＬＥＩＴＧＲＴＴＴＳＥＥＬＥＤＭＬＥＳＧＮＰＡＩＦＡＳＧＩＩＭＤＳＳＩＳＫＱＡＬＳＥＩＥＴＲＨＳＥＩＩＫＬＥＴＳＩＲＥＬＨＤＭＦＭＤＭＡＭＬＶＥＳＱＧＥＭＩＤＲＩＥＹＮＶＥＨＡＶＤＹＶＥＲＡＶＳＤＴＫＫＡＶＫＹＱＳＫＡＲＲＫＫＩＭＩＩＩＣＣＶＩＬＧＩＩＩＡＳＴＩＧＧＩＦＧ
Ｈａはアミノ酸２８から６２までである。
Ｈｂはアミノ酸７１から１０４までである。
Ｈｃはアミノ酸１１１から１４４までである。
【００６７】
シンタキシン１ａ上のＪＮＫ２の相互作用点として発見された二つの配列を以下に示す。
１）配列番号２：ＩＥＱＥＥＧＬＮＲＳ
２）配列番号３：ＭＳＥＹＮＡＴＱＳＤＹＲＥＲ
【００６８】
次にこれらの二つの配列を二つの細胞透過性ペプチドＪＧＲｉ１およびＪＧＲｉ２の構築のために考慮することとした。
【００６９】
ペプチドの機能はシンタキシン１ａのＮ末端部分とのＪＮＫ２蛋白の相互作用の妨害の原則に基づいている。従って、シンタキシン１ａのＮ末端の二つの蛋白の間の最小相互作用部位又はその全体にまで変動する異なる長さのシンタキシン１ａのアミノ酸配列を細胞に付与した場合、これらのペプチドはＪＮＫ２との相互作用に競合的に参加することになり、これにより内因性シンタキシン１ａとの結合を阻害する。このイベントはグルタメートの放出を低減することができる。有効であると考えることができるペプチドはその長さにおいてシンタキシン１ａの全Ｎ末端部分、２２８個のアミノ酸から始まり、配列番号２：ＩＥＱＥＥＧＬＮＲＳの配列に相当する最小１０個のアミノ酸、又は配列番号３：ＭＳＥＹＮＡＴＱＳＤＹＲＥＲの配列に相当する１４個のアミノ酸まで変動する。
【００７０】
ペプチドに細胞透過性を付与するために、ＨＩＶウィルスのＴａｔ蛋白（４８−５９）の配列を本配列のＮ末端部分の前に挿入することにより、さらに１２個のアミノ酸を付加した。
【００７１】
Ｔａｔ（４８−５９）は１２個のアミノ酸の以下の配列：ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰを有する。
【００７２】
この配列は考えられる合成ペプチドの各々のＮ又はＣ末端の何れの位置に付加させても極めて有効である。ペプチドの一例は全長２６アミノ酸となるような態様で合成したものである。
【００７３】
二つのペプチドの配列は以下の通りである。
ＪＧＲｉｌ（配列番号５）：ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＩＥＱＳＩＥＱＥＥＧＬＮＲＳ又は（配列番号６）ＩＥＱＳＩＥＱＥＥＧＬＮＲＳＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰ又はｔａｔ配列に関してそれぞれの鏡像である配列、例えば（配列番号７）ＰＰＲＲＲＱＲＲＫＫＲＧＩＥＱＳＩＥＱＥＥＧＬＮＲＳ。
ＪＧＲｉ２（配列番号８）：ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＭＳＥＹＮＡＴＱＳＤＹＲＥＲ又は（配列番号９）ＭＳＥＹＮＡＴＱＳＤＹＲＥＲＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰ又はｔａｔ配列に関してそれぞれの鏡像である配列、例えば（配列番号１０）ＰＰＲＲＲＱＲＲＫＫＲＧＭＳＥＹＮＡＴＱＳＤＹＲＥＲ。
【００７４】
二つのペプチドはＬエナンチオマー構造を有するアミノ酸を用いて合成したが、Ｄエナンチオマーとしても合成し、これにより生存している生物におけるそれらの安定性を向上させた。細胞系統、細菌中における発現のための種々異なるベクター中、およびウィルス製造用のベクター中に、相当するＤＮＡ配列として同じ配列を挿入できる。
【００７５】
発現ベクター中の挿入は全配列のものとすることができ、このため、ＪＧＲｉｌ（配列番号５）：ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＩＥＱＳＩＥＱＥＥＧＬＮＲＳ又は（配列番号６）ＩＥＱＳＩＥＱＥＥＧＬＮＲＳＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰとして、又さらにはｔａｔ配列に関するそれぞれの鏡像配列として行うこともできる。
【００７６】
例えば、（配列番号７）ＰＰＲＲＲＱＲＲＫＫＲＧＩＥＱＳＩＥＱＥＥＧＬＮＲＳ、ＪＧＲｉ２（配列番号８）：ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＭＳＥＹＮＡＴＱＳＤＹＲＥＲ又は（配列番号９）ＭＳＥＹＮＡＴＱＳＤＹＲＥＲＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰ又はｔａｔ配列に関するそれぞれの鏡像配列、例えば（配列番号５）ＰＰＲＲＲＱＲＲＫＫＲＧＭＳＥＹＮＡＴＱＳＤＹＲＥＲを使用するか、又は異なるドメインを付加、即ち最初にＴＡＴの配列、次にその（配列番号２）ＩＥＱＥＥＧＬＮＲＳ又は（配列番号３）ＭＳＥＹＮＡＴＱＳＤＹＲＥＲを付加、あるいはその逆を行う。更に又、最終蛋白を細胞系で認識可能とするために、ＨＡ、ＧＳＴ、Ｍｙｃ、ＥＧＦＰ等のような小型（タグ）ペプチドをコードするＳＮＡの小片を付加させてよい。
【００７７】
例えばｐＧＥＸ−４、ｐＴＡＴ、ｐ−ＥＧＦＰ−Ｃｌ、ｐｃ−ＤＮＡ、第三世代レンチウィルスベクター、市販又は遺伝子療法に使用されていないもの、シンドビスウィルス、ニューロンの感染（トランスダクション）のためのアデノウィルスに関するベクターである。
【００７８】
二つのペプチドをグルタメート放出実験（上記）及び電気生理学的実験（パッチクランプ、上記）において試験することにより神経伝達物質のＮＭＤ誘発放出を低減する場合のそれらの有効性を試験した。
【００７９】
両方のペプチドとも、パッチクランプ試験においてグルタメートのＮＭＤＡ依存性放出を低減する場合に活性であった。マウス皮質スライスを三十分間処理したのちに、種々の条件でペプチドを用いながらｍＥＰＳＣのイベント間の累積分布の記録を行った。二つのペプチド（ＪＧＲｉ１およびＪＧＲｉ２）は、５μＭの濃度で一緒に、或いは１０μＭの濃度で別個に添加した場合の何れにおいても、ＮＭＤＡシナプス前受容体のブロッキングにおいて阻害剤Ｄ−ＡＰ５の機能を低下させた（図８）。このデータはＮＭＤＡ受容体が細胞内経路において二つのペプチドにより既に効果的にブロックされており、そのためＮＭＤＡの細胞外部分に対して作用する受容体阻害剤はもはや作用を有していない。
【００８０】
二つのペプチドはシナプトソームおよび脳スライスの両方に対して有効性を示し、それらが細胞外環境で投与されたとすれば、それらは細胞内に浸透し、さらには統合された組織中へも拡散することができることを示している。ペプチドは生物中でも完全に拡散できることも期待される。それらの分解を低減するために、即ちそれらの半減期を延長するために、Ｄ立体化学のシリーズに属するアミノ酸を用いることにより本ペプチド系を合成した。
Ｄ−ＪＧＲｉ１：ｄＧ−ｄＲ−ｄＫ−ｄＫ−ｄＲ−ｄＲ−ｄＱ−ｄＲ−ｄＲ−ｄＲ−ｄＰ−ｄＰ−ｄＩ−ｄＥ−ｄＱ−ｄＳ−ｄＩ−ｄＥ−ｄＱ−ｄＥ−ｄＥ−ｄＧ−ｄＬ−ｄＮ――ｄＲ−ｄＳ
Ｄ−ＪＧＲｉ２：ｄ−Ｇ−ｄＲ−ｄＫ−ｄＫ−ｄＲ−ｄＲ−ｄＱ−ｄＲ−ｄＲ−ｄＲ−ｄＰ−ｄＰ−ｄＭ−ｄＳ−ｄＥ−ｄＹ−ｄＮ−ｄＡ−ｄＴ−ｄＱ−ｄＳ−ｄＤ−ｄＹ−ｄＲ−ｄＥ−ｄＲ。
【００８１】
これらの細胞透過性ペプチドの可能な投与経路は、即時の生体利用性を有するものから経時的に変化する放出のものまで、全ての知られた組み合わせを含む。
【００８２】
本発明者等は腹腔内、筋肉内、皮下および静脈内注射（ペプチド系の生理学的溶液）を介したもの、経皮吸収経路（プラスター、軟膏、クリーム、オイル等）、舌下（ペースト状又は固溶液）、鼻内（種々の生理学的溶液）及び経口（懸濁液、錠剤、カプセル等のような経口用製剤）の経路を投与様式に包含する。
【００８３】
更に又、注射又は経口投与による経皮又は全身投与の何れにおいても、変調された放出をもたらす全てのナノテクノロジー製剤も挙げられる。
【００８４】
更に又、新しい投与経路も考慮され、細胞透過型（配列Ｔａｔを発現）又は非細胞透過型のペプチド系を与えるように操作されたニューロン幹細胞の製造も挙げられる。これらの細胞は注射された後、そして変性病態に罹患した脳領域に達した後、インサイチュで増殖してペプチド系を解放することができる。
【００８５】
本発明のペプチド系を調製するプロセス
これらのペプチドの合成は７０残基までものアミノ酸鎖を得ることができる最近頻繁に使用されている化学的慣行を用いることにより実施した。第一のアミノ酸を固相（樹脂）にアンカリングする固相化学合成機を使用し、次にアミノ酸間のイソペプチド反応を用いることにより反復サイクルを介してペプチドの鎖を伸長する（図９；Current Protocols in Molecular Biology(2002)11.15.1-11.15.9からの変法）。
【００８６】
合成の後、反応副産物である夾雑物からペプチドを精製するためにＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）分析を用いた。さらに、質量スペクトル法の循環を実施することによりペプチドの同定を確認した。得られた収率（２６アミノ酸のペプチドに関して）が９５％を超えた場合にペプチドは良好であるとみなした。
【００８７】
ペプチド鎖は最終ペプチドがＬ型である場合はＬ立体化学の型のアミノ酸を用いて、最終ペプチドがＤ型の場合はＤ型のものを用いて形成した。
【００８８】
プラスミドベクター合成
プラスミド系に関し、ペプチドのヌクレオチド配列は、それらが全てシンタキシン１ａのＮ末端部分か、配列（配列番号２）ＩＥＱＥＥＧＬＮＲＳに相当する１０アミノ酸又は配列（配列番号３）ＭＳＥＹＮＡＴＱＳＤＹＲＥＲに相当する１４アミノ酸の長さまでのより小型のペプチド及び全ての可能な長さを含むか、さらには配列Ｔａｔ＝（配列番号４）ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰの前（Ｎ末端）又は後（Ｃ末端）において負荷を有していても、プラスミド発現ベクターに挿入される。
【００８９】
例えばアミノ酸配列（配列番号２）ＩＥＱＥＥＧＬＮＲＳ又は（配列番号１１）ＩＥＱＳＩＥＱＥＥＧＬＮＲＳおよび（配列番号３）ＭＳＥＹＮＡＴＱＳＤＹＲＥＲに相当するヌクレオチド配列を挿入し、更に又シンタキシン１ａのＮ末端部分の全てを細菌発現ベクターｐＴＡＴに挿入する。このベクターの特定の性質は細菌が合成する融合蛋白が、Ｎ末端部分から始まる６ｘＨｉｓ、配列Ｔａｔ＝（配列番号４）ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰおよびタグヒトインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）である種々のタグを含有するという事実に基づいている。合成された蛋白に細胞透過性を付与する働きを有する配列Ｔａｔを除き、他のタグは特異的抗体を用いることによる外因性蛋白の認識のために有用である。
【００９０】
細胞発現のためのプラスミドの調製およびプラスミド中の細菌の合成からの蛋白の精製
以下に、本記載の目的であるペプチド系を含むプラスミドベクターを含有する細菌系統の調製に関して幾つかの例を記載する。以下に記載する物質の量は非限定的な例として報告するのみである。従って本記載の過程において、当業者であれば、以下の例において試薬の間の比を尊重する限り異なる量を使用する可能性を理解する。
【００９１】
上記配列を含有するレンチウィルスプラスミドｐＧＥＸ−４又はｐＴＡＴ又はｐ−ＥＧＦＰ−Ｃｌ又はｐｃ−ＤＮＡをＥ・コリ細菌、例えば菌株ＤＨ５アルファ又はＢＬ２１および化学的にコンピテントな誘導体（ｒｏｓｅｔｔａ）中に挿入する。次に、５μｇのプラスミドＤＮＡ（ｐ−ＥＧＦＰ−Ｃｌ又はｐｃ−ＤＮＡ）を２０μｌのＫＣＭ５Ｘ（０．５ＭＫＣ１；０．１５ＭＣａＣ１２；０．２５ＭＭｇＣ１２を含む）、５μｌのＭｎＣ１２および溶液を１００μｌとするために必要な量のＨ2Ｏに添加する。この時点で等しい容量の化学的にコンピテントなＤＨ５アルファ細菌細胞を添加する。これを数分間氷中（４℃）に放置する。溶液全体を数分間室温に置くことにより熱ショックを起こす。
【００９２】
次に、プラスミドはアンピシリンに対する耐性を有することからこの抗生物質を１００μｇ／ｍｌ含有する３７℃に加熱したルリアブロス培地（ＬＢ）（１０ｇ／１トリプトン、５ｇ／ｌ酵母エキス、１０ｇ／１ＮａＣｌ、１５ｇ／ｌ寒天）６００μｌに等しい容量を添加する。次に同じ濃度のアンピシリンを有する寒天上に溶液をプレーティングする。次にＭＡＸＩ−ｐｒｅｐ市販キットを用いることによりプラスミドＤＮＡの精製を行い、文献記載の古典的方法により細胞のトランスフェクション又はレンチウィルス粒子の合成のために使用する。
【００９３】
細菌ＢＬ２１および誘導体のトランスフォームは異なるプロトコルを用いて実施する。
【００９４】
５μｇのベクター（ｐＧＥＸ−４又はｐＴＡＴ）を１００μｌの細菌に添加し、次にこれを４℃で三十分間インキュベートする。次に溶液を四十五秒間４２℃に置くことにより熱ショックを誘導する。この態様において、細菌はプラスミドを取り込む。次に溶液を五分間氷中に放置し、次に四倍容量（４００μｌ）のＬＢを添加する。全溶液をアンピシリン含有寒天上にプレーティングし、約３７℃において十二時間コロニーを生育させる。
【００９５】
ＭＩＮＩ−ＰＲＥＰ、制限酵素による切断
目的の配列は制限酵素の間に挿入されたため、細菌内部へのプラスミドの実際の取り込みを制御するために細菌の生育を試験する。
【００９６】
次に生育したコロニーを、滅菌ポイントを用いて採取し、アンピシリンを含有する５ｍｌのＬＢ中に入れる。五から六時間３７℃で細菌を生育させたのち、市販キットを用いてミニプレップ（ｍｉｎｉｐｒｅｐ）を調製する。次に各コロニーから得たＤＮＡ溶液の一部をサブクローニングに使用した制限酵素を用いて酵素切断に付す（３７℃六十分間）。
【００９７】
その後、アガロースゲル上にＤＮＡを流し、切断配列を光度計を用いて制御する。
【００９８】
より多いプラスミドを発現しているコロニー数μｌを生育させることにより、その後グリセロール保存溶液を調製し、これを−８０℃で凍結する。
【００９９】
生育および誘導：
グリセロール保存溶液から、単コロニー由来の細菌を、ＬＢ＋アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）中の予備接種物として撹拌下（２５０ｒｐｍ）３７℃で生育させる。
【０１００】
予備接種物の５０分の１を、０．８から１のＯＤ６００が得られるまで、３７℃（２５０ｒｐｍ）で新鮮なＬＢ＋Ａｍｐ（量は生成物の意図する大きさによる）中に生育させる。
【０１０１】
次に０．５ｍＭのＩＰＴＧを添加することにより外因性の蛋白の生産を誘導する。
【０１０２】
予備接種物１ｍｌを採取し、五分間５０００ｒｐｍで遠心分離する。次にペレットを−２０℃で保存し、これにより、その後ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析する。
【０１０３】
誘導は２５０ｒｐｍの速度で３７℃で四から五時間継続する。
【０１０４】
次に４℃で二十分間８０００ｒｐｍで細菌を遠心分離する。
【０１０５】
上澄みを傾瀉し、ペレットを計量し、−２０℃で保存する。
【０１０６】
細菌ペレットの溶解
以下の組成（０．１ＭＴＲＩＳ−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡｐＨ７．５）を有する溶解緩衝液をペレットグラム当たり溶解緩衝液２ｍｌの比率でペレットに添加する。
【０１０７】
次にペレットを再懸濁し、１．５ｍｇ／ｇのリソザイムを添加（１０ｍｇ／ｍｌの保存溶液から）し、これにより細菌を溶解する。溶液は室温で二時間インキュベートし２００ｒｐｍで攪拌する。
【０１０８】
溶解物を十分間氷上においてインキュベートし、次に各々五十秒の持続時間で四パルスを用いながら超音波処理する。一回のパルスと次との間、溶液は氷中に一分間放置する。次に４℃で二十分間１２０００ｒｐｍで遠心分離する。
【０１０９】
上澄みを保存し、ペレットフレークを除去し、このようなフレークは崩壊して軟化する。
【０１１０】
封入体の単離
溶解物（超音波処理後）に二分の一に等しい容量のトリトン緩衝液を添加する。次に、これを２００ｒｐｍで攪拌しながら室温で三十分間インキュベートする。次に１２０００ｒｐｍの速度で４℃で二十分間遠心分離する。ペレットを溶解緩衝液中に再度懸濁する。次に、試験管内の容量の半量のトリトン緩衝液を添加する。つぎにこれを２００ｒｐｍで室温でインキュベートする。４℃で二十分間１２０００ｒｐｍで遠心分離する。
【０１１１】
ペレットを洗浄緩衝液中に再懸濁し、４℃で二十分間１２０００ｒｐｍで遠心分離する。ペレットを再度、さらに三又は四回、常に洗浄緩衝液を用いながら洗浄する。次にペレットを−２０℃で保存する。
【０１１２】
可溶化および透析  
ペレットを６Ｍグアニジニウムおよび１ｍＭＤＴＴを含有する可溶化緩衝液５ｍｌ／ｇを用いて可溶化する。
【０１１３】
二から三時間の後、ＨＣｌを用いてｐＨを３から４に調節する。次に１２０００ｒｐｍで４℃において二十分間遠心分離する。
【０１１４】
次に上澄みをｐＨ３から４において６Ｍグアニジニウムを用いて透析する。
【０１１５】
透析溶液を三回交換し、三時間後に各々洗浄を実施し、三回目の洗浄は４℃で一夜継続する。
【０１１６】
次に透析溶液を、グアニジニウムを用いた透析の場合に使用した様式によりｐＨ７で＊＊５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液と交換する。
【０１１７】
その後最終的に、透析した物質の一部をアクリルアミドゲル上で使用し、クーマシー染色を行うことにより合成された蛋白に相当するバンドが観察できるはずである。
【０１１８】
透析物質の残余はイオン交換カラム上で精製する。
【０１１９】
＊＊リン酸塩緩衝液の調製
１ＭのＮａＨ２ＰＯ４溶液および１ＭのＮａ２ＨＰＯ４溶液を調製する。二つの溶液をともに添加し、ｐＨ７を確認する。
【０１２０】
イオン交換カラム上の精製
三種の溶液、即ち５０ｍＭｐＨ７リン酸塩緩衝液；５０ｍＭｐＨ７リン酸塩緩衝液＋１ＭＮａＣｌ；Ｈ2Ｏ中２０％エタノール＋２０％酢酸ナトリウムを使用する。
【０１２１】
溶液を濾過し、脱気し、＋４℃で保存することにより使用時に低温であるようにする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
2017516493000001.app
【国際調査報告】
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2017516493.tif 000017
2017516493.tif 000018