(57)【要約】基質に付着した接着細胞の凍結保存方法および、基質上の凍結保存細胞の生存率および保持率を改善させる、１種類または複数種の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分および／またはマトリックス細胞タンパク質を特定する方法。この凍結保存方法は、少なくとも１種類のＥＣＭ成分で基質を処理する工程および／または少なくとも１種類のマトリックス細胞タンパク質を基質または細胞培養培地に添加する工程と、処理された基質上に細胞を播種する工程と、細胞を凍結保存する工程とを備える。細胞生存率および保持率を改善させる１種類または複数種のＥＣＭ成分および／またはマトリックス細胞タンパク質は、凍結保存温度から解凍された細胞を評価して、細胞生存率及び保持率を測定することにより特定することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
凍結保存状態から細胞を解凍した後の、基質上の細胞の生存率および保持率を改善させる、１種類または複数種の細胞外マトリックス成分および／またはマトリックス細胞タンパク質を特定する方法であって、
特定の細胞型の細胞を選択する工程と、
１種類または複数種の異なる細胞外マトリックス成分で基質を処理する工程および／または１種類または複数種のマトリックス細胞タンパク質を前記基質または細胞培養培地に添加する工程と、
前記処理された基質上に細胞を播種する工程と、
前記細胞を凍結保存温度まで冷却することにより、前記処理された基質上の前記細胞を凍結保存する工程と、
まず、前記細胞を含む前記処理された基質を、前記凍結保存温度よりも高い第１の加温温度の第１の環境に曝露することにより、前記凍結保存温度から前記細胞を加温し、その後
前記細胞を、前記第１の加温温度よりも高い第２の加温温度の第２の環境に曝露することにより、前記第１の加温温度から前記細胞をさらに加温することによって前記細胞を解凍する工程と、
前記細胞を評価して前記処理された基質上の前記細胞の生存率および保持率を測定することによって、前記細胞を凍結保存状態から解凍した後の細胞の生存率および保持率を改善する少なくとも１種類の細胞外マトリックス成分および／または少なくとも１種類のマトリックス細胞成分を特定する工程と、を備える方法。
【請求項２】
前記凍結保存温度が−３０℃以下であり、
前記第１の加温温度が−３０℃より高く３０℃未満であり、
前記第２の加温温度が３２℃以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１種類または複数種の細胞外マトリックス成分が、フィブロネクチン、ラミニン、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、およびＶ型コラーゲンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記１種類または複数種のマトリックス細胞タンパク質が、テネイシンＣ、テネイシンＸ、ＳＰＡＲＣ、ペリオスチン、ＣＣＮ１、オステオポンチン、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記特定の細胞型の細胞に対応するかあるいは前記特定の細胞型の細胞によって生成されることが知られる、細胞外マトリックス成分を特定する工程をさらに備える、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
接着細胞の凍結保存方法であって、
少なくとも１種類の細胞外マトリックス成分で基質を処理する工程および／または１種類または複数のマトリックス細胞タンパク質を前記基質または細胞培養培地に添加する工程と、
前記処理された基質上に細胞を播種する工程と、
前記細胞を凍結保存温度まで冷却することにより、前記処理された基質上の前記細胞を凍結保存する工程とを備える方法。
【請求項７】
まず、前記細胞を含む前記処理された基質を、前記凍結保存温度よりも高い第１の加温温度の第１の環境に曝露することにより、前記凍結保存温度から前記細胞を加温し、その後
前記細胞を、前記第１の加温温度よりも高い第２の加温温度の第２の環境に曝露することにより、前記第１の加温温度から前記細胞をさらに加温することによって、
前記細胞を解凍する工程をさらに後に備える、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記凍結保存温度が−３０℃以下であり、
前記第１の加温温度が−３０℃より高く３０℃未満であり、
前記第２の加温温度が３２℃以上である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記１種類または複数種の細胞外マトリックス成分が、フィブロネクチン、ラミニン、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、およびＶ型コラーゲンからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記１種類または複数種のマトリックス細胞タンパク質が、テネイシンＣ、テネイシンＸ、ＳＰＡＲＣ、ペリオスチン、ＣＣＮ１、オステオポンチン、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞がウシ角膜内皮細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記１種類または複数種の細胞外マトリックス成分が、フィブロネクチン、ラミニン、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、およびＶ型コラーゲンからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記１種類または複数種の細胞外マトリックス成分が、少なくともフィブロネクチン、Ｉ型コラーゲン、およびＶ型コラーゲンを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記１種類または複数種の細胞外マトリックス成分が、フィブロネクチン、ラミニン、Ｉ型コラーゲン、およびＩＶ型コラーゲンである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞外マトリックス成分が、フィブロネクチン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、およびＶ型コラーゲンである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞外マトリックス成分が、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、およびＶ型コラーゲンである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞がヒト間葉系幹細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項１８】
前記１種類または複数種の細胞外マトリックス成分が、フィブロネクチン、ラミニン、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン、およびビトロネクチンからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記１種類または複数種のマトリックス細胞タンパク質が、アクチン結合タンパク質、トロンボスポンジン１、テネイシンＣ、テネイシンＸ、ＳＰＡＲＣ、ペリオスチン、ＣＣＮ１、およびオステオポンチンからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞外マトリックス成分が、少なくともフィブロネクチン、ＩＶ型コラーゲン、およびＶ型コラーゲンを含む、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本開示の主題は、基質に付着した接着細胞の凍結保存およびその後の解凍の方法に関する。さらに、凍結保存状態からの解凍中および解凍後の細胞の生存率および保持率を改善させる、１種類または複数種の細胞外マトリックス（ＥＣＭ：ＥｘｔｒａＣｅｌｌｕｌａｒ  Ｍａｔｒｉｘ）成分および／またはマトリックス細胞タンパク質を特定する方法を開示する。
【０００２】
研究に使用する動物の数を低減させる要求の高まりにより、様々な化学物質、化合物、および薬剤についての正確な毒性データを提供する、細胞および組織の両方を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験の開発が進められている。２００９年、欧州連合は、化粧品原料の試験に動物を使用することを禁止した。医薬品および家庭用化学品を含む他種の化合物の毒性試験への動物の使用も、追って禁止になる可能性が高い。
【０００３】
この要求に応じて、細胞および組織を水の凝固点を下回る温度まで冷却させることによって生体系を保護および保存するために、細胞および組織の凍結保存が用いられている。凍結保存は一般的に浮遊状態の細胞で行われ、固定された基質上の細胞の凍結保存を調査した研究は非常に少ない。したがって、一般に用いられる、細胞懸濁液用に開発された凍結保存法が、固定された基質上の接着細胞にも一般的に適用されるが、多くの場合、凍結保存後に細胞の剥離および膜の損傷が生じてしまう。凍結保存工程における過酷な凍結および解凍を経た細胞の生存は、適切な凍結保護剤を使用することのみによって達成される。このため、低温生物学の多くの研究は、新たな凍結保護物質を発見し、試験することに焦点を当ててきた。
【０００４】
しかし、過酷な凍結および解凍の後に自然由来または合成のＥＣＭへの細胞の付着の保持は、自然由来および人工の組織の保存およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒性試験などの他の用途において非常に重要である。接着機構の崩壊は、必然的に深刻な結果をもたらす。基礎をなすＥＣＭからの空間的隔離が大きいため再付着が妨げられ、接着機構に対する可逆的作用も大きな損害をもたらす可能性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、接着細胞の凍結保存法の改善が必要とされている。特に、基質に付着した細胞に凍結保存状態から加温した後の細胞付着率および生存率の改善が望まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書では、凍結保存細胞の細胞生存率および保持率を改善させる、基質に付着した接着細胞の凍結保存方法を開示する。この方法は、少なくとも１種類のＥＣＭ成分で基質を処理する工程および／または少なくとも１種類のマトリックス細胞タンパク質を基質または細胞培養培地に添加する工程と、処理された基質上に細胞を播種する工程と、細胞を凍結保存温度まで冷却することにより、処理された基質上の細胞を凍結保存する工程とを備える。
【０００７】
さらに、凍結保存状態から細胞を解凍した後の、基質上の細胞の生存率および保持率を改善させる、１種類または複数種のＥＣＭ成分および／またはマトリックス細胞タンパク質を特定する方法を開示する。この方法は、１種類または複数種の異なるＥＣＭ成分で基質を処理する工程および／または１種類または複数種のマトリックス細胞タンパク質を基質または細胞培養培地に添加する工程と、処理された基質上に特定の細胞型の細胞を播種する工程と、細胞を凍結保存温度まで冷却することにより、様々に処理された基質上の細胞を凍結保存する工程と、まず、細胞を含む処理された基質を、凍結保存温度よりも高い第１の加温温度の第１の環境に曝露することにより、凍結保存温度から細胞を加温し、その後、細胞を、第１の加温温度よりも高い第２の加温温度の第２の環境に曝露することにより、第１の加温温度から細胞をさらに加温することによって細胞を解凍する工程と、解凍した細胞を評価して細胞の生存率および保持率を測定することによって、細胞を凍結保存状態から解凍した後の特定の細胞型の細胞の生存率および保持率を改善する１種類または複数種のＥＣＭ成分および／または少なくとも１種類のマトリックス細胞成分を特定する工程とを備える。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１Ａおよび図１Ｂは、ＥＣＭまたは組織培養処理プラスチック（ＴＣＰ：Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｔｒｅａｔｅｄ  Ｐｌａｓｔｉｃ）上における接着性ウシ角膜内皮（ＢＣＥ：Ｂｏｖｉｎｅ  Ｃｏｒｎｅａｌ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ）細胞の、様々な冷却速度での凍結保存後の（Ａ）細胞生存率および（Ｂ）ＤＮＡ含有率（％）（すなわち細胞保持率）を示す棒グラフである。
【図２】図２Ａ〜２Ｄは、（Ａ）１種類および２種類のＥＣＭ成分、（Ｂ）３種類のＥＣＭ成分、（Ｃ）４種類のＥＣＭ成分、および（Ｄ）５種類のＥＣＭ成分を用いた、接着性ＢＣＥ細胞の凍結保存後の細胞生存率を示す棒グラフである。
【図３】図３Ａ〜３Ｄは、（Ａ）１種類および２種類のＥＣＭ成分、（Ｂ）３種類のＥＣＭ成分、（Ｃ）４種類のＥＣＭ成分、および（Ｄ）５種類のＥＣＭ成分を用いた、接着性ＢＣＥ細胞の凍結保存後のＤＮＡ含有率（％）（すなわち、細胞保持率）を示す棒グラフである。
【図４】図４Ａ〜４Ｄは、（Ａ）１種類および２種類のＥＣＭ成分、（Ｂ）３種類のＥＣＭ成分、（Ｃ）４種類のＥＣＭ成分、および（Ｄ）５種類のＥＣＭ成分を用いた、接着性ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の凍結保存後の細胞生存率を示す棒グラフである。
【図５】図５Ａおよび図５Ｂは、様々な基質上における接着性ｈＭＳＣの凍結保存および単一工程の急速解凍または２段階の解凍手順による解凍後の、（Ａ）細胞生存率および（Ｂ）ＤＮＡ含有率（％）（すなわち細胞保持率）を示す棒グラフである。
【図６】マトリックス細胞タンパク質であるテネイシンＸが存在する場合と存在しない場合の、ラミニン、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、およびＶ型コラーゲンを組み合わせたＥＣＭ、またはゼラチン上における凍結保存後の接着性ｈＭＳＣの細胞生存率を示す棒グラフ。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本明細書で使用するとき、量に関係して用いられる修飾語「約」は、指定されるかまたは文脈により規定された値を非限定的に含む。例えば、少なくとも特定の量の測定に関連する誤差の程度を含むものとする。範囲の文脈で使用されるとき、修飾語「約」はまた、２つの端点の絶対値により定められる範囲を表すと考えるべきである。例えば、範囲「約２〜約４」は、範囲「約２〜４」も表す。
【００１０】
特に指定しない限り、温度（℃）に関する修飾語「約」は、指定された値または値の範囲とともに、指定された値または値の範囲±１％〜４％を指す。
【００１１】
特に指定しない限り、細胞生存率および細胞保持率または付着率（％）に関する修飾語「約」は、指定された値または値の範囲とともに、指定された値または値の範囲±１％〜３％を指す。
【００１２】
特に指定しない限り、濃度（μｇ／ｍＬ）に関する修飾語「約」は、指定された値または値の範囲とともに、指定された値または値の範囲±１％〜４％を指す。
【００１３】
特に指定しない限り、モル濃度（Ｍ）に関する修飾語「約」は、指定された値または値の範囲とともに、指定された値または値の範囲±１％〜２％を指す。
【００１４】
特に指定しない限り、冷却速度（℃／分）に関する修飾語「約」は、指定された値または値の範囲とともに、指定された値または値の範囲±１％〜３％を指す。
【００１５】
本明細書で使用するとき、用語「室温」は、標準圧力において約１８℃〜約２５℃の温度を指す。様々な例において、室温は、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、または約２５℃である場合がある。
【００１６】
本発明の方法は、毒性試験などの様々な用途のための、基質に固定された接着細胞の凍結保存、すなわち凍結による保存、およびその後の解凍、すなわち細胞の凍結保存温度からの加温に関する。用語「凝固点」は、例えば、水の凝固点、すなわち０℃未満の温度を指す。凍結保存では、一般的に、細胞を凝固点よりもかなり低い温度まで、例えば−８０℃以下まで、より一般的には−１３０℃以下まで凍結させる。当該技術分野の実務者に知られるあらゆる凍結保存の方法を制限なく用い得る。凍結保存温度は−２０℃未満、例えば−８０℃以下または−１３０℃以下であってもよい。凍結保存温度は、約−２０℃〜約−２００℃、約−３０〜約−１７５℃、約−５０℃〜約−１６０℃、約−６５℃〜約−１５０℃、約−７５℃〜約−１３５℃、約−８０℃〜約−１３０℃、約−９０℃〜約−１２５℃、または約−１００℃〜約−１１５℃であってもよい。例えば、Armitage et al., "The Influence of Cooling Rate on Survival of Frozen Cells Differs in Monolayers and Suspensions", Cryo-Letters 17: 213-218 (1996)を参照されたい。
【００１７】
本発明の方法は、細胞の播種、増殖、および再播種の必要なく、再解凍後にただちに細胞が使用可能であるように設計される。この目的のために、凍結保存された接着細胞を凍結保存温度から加温するための２段階加温法が開発されている。例えば、接着細胞をマルチウェルプレート内の接着性分化細胞単層として凍結保存できることを示すＣａｍｐｂｅｌｌらによる米国特許第６，５９６，５３１号（「Ｃａｍｐｂｅｌｌ’５３１特許」）を参考されたい。この特許の全体は参照により本明細書に取り込まれるものとする。
【００１８】
本発明の方法は、基質に付着した接着細胞、例えばＢＣＥ細胞およびｈＭＳＣを凍結保存することを目的とする。例えば、Ji et al., "Cryopreservation of Adherent Human Embryonic Stem Cells", Biotechnology and Bioengineering 88(3): 299-312 (2004)、Katkov et al., "DMSO-Free Programmed Cryopreservation of Fully Dissociated and Adherent Human Induced Pluripotent Stem Cells", Stem Cells International 2011, 2011:981606. doi: 10.4061/2011/981606. Epub 2011 Jun 1、および Xu et al., "Effects of Osmotic and Cold Shock on Adherent Human Mesenchymal Stem Cells During Cryopreservation", J. Biotech. 162(2-3): 224-231 (2012)を参照されたい。
【００１９】
特に限定なく、任意の適切な基質を用いることができる。例えば、複数のウェルを有するマイクロタイタープレート（すなわちマルチウェルプレート）の表面を構成する組織培養プラスチック（ＴＣＰ）、コラーゲンゲル、天然由来マトリックス、または合成材料に細胞を付着させてもよい。細胞を基質に付着させることは当該技術分野で公知である。例えば、生存率および接着性細胞のＴＣＰへの細胞付着率が良好であったことを示す、Campbell et al., "Serum free solutions for the cryopreservation of cells", In Vitro Cell Dev. Biol., 43:269-275 (2007)、 Campbell et al., "Cryopreservation of porcine aortic heart valve leaflet-derived myofibroblasts", Biopreservation and Biobanking, 8(4):211-217 (2010)、Campbell et al., "Culturing with Trehalose Produces Viable Endothelial Cells after Cryopreservation", Cryobiology, 64(3):240-244 (2012)、Hornung et al., "Cryopreservation of Anchorage-Dependent Mammalian Cells Fixed to Structured Glass and Silicon Substrates. Cryobiology", 33: 260-70 (1996)、McGann et al., "Cell-to-Cell and Cell-to-Surface Interactions Affect Responses During Cryopreservation", Transfusion 33(7): 611 (1993)、Ohno, "A Simple Method for In Situ Freezing of Anchorage-Dependent Cells", in: A Doyle, JB Griffiths, DG Newell (eds.), Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures, Chichester: John Wiley and Sons (1994)、Pasch et al., "Variation of the HES concentration for the Cryopreservation of Keratinocytes in Suspensions and in Monolayers", Cryobiology 41(2): 89-96 (2000)、およびPasch et al., "Cryopreservation of Keratinocytes in a Monolayer", Cryobiology, 39(2): 158-168 (1999)を参照されたい。これらの文献の全体は参照により本明細書に取り込まれるものとする。
【００２０】
本発明の方法は、基質をＥＣＭまたは１種類または複数種のＥＣＭ成分で処理することにより凍結保存中の細胞の生存率および付着率を高め、改善することを目的とする。ＥＣＭは、組織の構造的な骨組みを提供し、また、シグナル伝達、分化、増殖、接着、極性、および生存などの細胞プロセスに密接に関与する、動的構造ニッチである。例えば、ＥＣＭが細胞の根本的な健全性に重要な役割を果たすことを明らかにする、Frantz et al., "The extracellular matrix at a glance", J. Cell Sci. 123:4196-4200 (2010)を参照されたい。
【００２１】
「改善された細胞生存率」または「改善された生存率」という表現は、例えば、８０％以上など、最低で６０％の細胞生存率（％）を指す。改善された細胞生存率（％）は、６５％以上、６７％以上、７０％以上、７３％以上、７５％以上、７７％以上、８０％以上、８３％以上、８５％以上、８７％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上であってもよい。同様に、用語「細胞保持率」、「保持率」、「細胞付着率」、または「付着率」は、例えば、細胞数の指標として用い得るＤＮＡ含有率の測定値を指す。「細胞保持率」、「改善された保持率」、「改善された細胞付着率」、または「改善された付着率」という表現は、例えば、最低８０％、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８７％以上、８９％以上、９０％以上、９２％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上のＤＮＡ含有率（％）を指す。例えば、Malpique et al., "Cryopreservation of Adherent Cells: Strategies to Improve Cell viability and Function after Thawing", Tissue Engineering Part C Methods 15(3):373-386 (2009)を参照されたい。
【００２２】
図１に示されるように、ＴＣＰよりもＥＣＭへ細胞を付着させることにより、凍結保存中およびその後の細胞生存率および保持率が改善される。十分に形成され組織化されたＥＣＭが存在することにより、細胞の本来の（ｎａｔｉｖｅ）環境により近似する表面がもたらされる。そのため、細胞付着率が、凍結保存プロセスによる影響を受けにくい可能性がある。さらに、ＥＣＭの組成は、凍結保存中に付着を維持する細胞の機能に影響を与え得る。またさらに、細胞をＥＣＭとともに凍結保存することにより、細胞は、その全体的な健全性により貢献し得、また凝固点に対するその耐久性および回復力を改善し得る構成となる。
【００２３】
ある実施形態は、十分に形成されたＥＣＭ上での接着細胞の凍結保存に関する。別の実施形態は、凍結保存中の細胞の付着を促進させ、使用前に凍結保存状態からの再解凍を経た細胞にとってより自然な環境をもたらすため、特定のＥＣＭ成分とともに接着細胞を凍結保存することに関する。ＥＣＭ成分による基質の処理では、細胞基質にＥＣＭをコーティングしてもよい。
【００２４】
ＥＣＭ成分は、当該技術分野で既知の任意のＥＣＭ成分を含み得る。例えば、当該技術分野において、ＥＣＭ基材への細胞の付着は、結合複合体（焦点接着）を介してなされることが知られている。この結合複合体として、特異的接着受容体が挙げられ、その多くは、結合する細胞外タンパク質内のＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）トリペプチド配列を主として識別するインテグリンとよばれる相同マトリックス受容体の大きなスーパーファミリーに属する。コラーゲンに結合する際、他の一見無関係の膜貫通型糖タンパク質を用いる細胞もあるが、多くの細胞は、直接細胞をＥＣＭに結合する内在性膜プロテオグリカンを有する。例えば、Rixen et al., "Adhesion and Spreading of Corneal Endothelial Cells on Collagen Type I and IV In Vitro: A Model to Study Mechanisms of Endothelial Repair", Res. Exp. Med., 190:203-211 (1990)を参照されたい。
【００２５】
培養条件下で、ウシ角膜内皮細胞などの様々な細胞型の組織培養ポリスチレンへの初期付着は、フィブロネクチンおよび／またはビトロネクチンなどの細胞接着糖タンパク質の培養表面への吸着に依存し得る。例えば、Underwood et al., "A Comparison of the Biological Activities of the Cell-Adhesive Proteins Vitronectin and Fibronectin", J. Cell. Sci. 93(Pt. 4): 641-649 (1989)を参照されたい。このような細胞接着タンパク質は、細胞播種に先立ち、精製された状態のポリマーにあらかじめコーティングしておいてもよく、培養培地を補助するために使用される血清から培養表面に吸着する場合もあり、または細胞から合成し、プラスチック表面に付着させてもよい。
【００２６】
内因性タンパク質は、フィブロネクチンまたはビトロネクチンなどの血清由来のタンパク質が存在しない状態での、細胞の合成基質への付着に少なくとも部分的に寄与することが報告されている。任意の新たに同定されるかまたは公知の内因性タンパク質および細胞接着タンパク質を用いることができる。例えば、Gordon et al., "Role of the Cytoskeleton During Injury - Induced Cell Migration in Corneal Endothelium", Cell Motil. & Cytoskeleton, 16:47-57 (1990)を参照されたい。プロテオグリカンを介した相互作用により、付着する細胞のアクチンフィラメントの組織化が促進され得る。アクチンの動的作用は、アクチンフィラメントの長さおよび会合を調節するアクチン結合タンパク質の作用を含み、球状のアクチンとフィラメント状アクチンの間の平衡に依存し得る。これは、すべて凍結保存の要素である、温度、ｐＨ、イオン強度、および有機溶媒の存在の影響を受ける。そのため、アクチン結合タンパク質を本発明の方法のＥＣＭタンパク質として用いてもよい。
【００２７】
ＢＣＥ細胞は、フィブロネクチン、ラミニン、ならびにＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、およびＶ型のコラーゲンをはじめとした多数のＥＣＭタンパク質を生成して成熟したマトリックスを樹立させる。フィブロネクチンとラミニンは、単離細胞および単層内の細胞によって、異なって発現する。同様に、異なるコラーゲン型でも発現量が同等とならず、ＩＩＩ型コラーゲンが優位である。例えば、Gospodarowicz et al., "The Identification and Localization of Fibronectin in Cultured Corneal Endothelial Cells: Cell Surface Polarity and Physiological Implications", Exp. Eye Res. 29:485-509 (1979)、 Gospodarowicz et al., "The Production and Localization of Laminin in Cultured Vascular and Corneal Endothelial Cells", J. Cell Physiol. 107:171-183 (1981)、およびScheffer et al., "Characterization of Collagens Synthesized by Cultured Bovine Corneal Endothelial Cells", J. Biol. Chem. 256(7):3361-3365 (1981)を参照されたい。例えば、大部分が単層形成の前に生成されるラミニンでは、タンパク質の生成量が減少し、細胞密度によって生成量が変化しないフィブロネクチンのように凍結保存中の接着を促進しない場合がある。さらに、成分の組み合わせが、付着率および生存率を維持するためのより良いマトリックスとなることが判明するかもしれない。例えば、フィブロネクチンは、マトリックス内のコラーゲンへのウシ角膜内皮細胞の付着を促進することが明らかになっている。例えば、Scott et al., "Investigation of the Attachment of Bovine Corneal Endothelial Cells to Collagens and Other Components of the Subendothelium", Exp. Cell Res. 144:472-478 (1983)を参照されたい。
【００２８】
ｈＭＳＣはまた、フィブロネクチン、ラミニン、ならびにＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、およびＶ型のコラーゲンなどのＥＣＭタンパク質を生成し、それらが中に存在するＥＣＭニッチの影響を大きく受ける。ＥＣＭ組成は、プレート上で凍結保存される幹細胞用のＥＣＭコーティングを開発する際に考慮する必要がある、間葉系幹細胞がどのように、またどの系統方向に分化するかに影響を与える。例えば、Singh et al., "Fibronectin and stem cell differentiation-lessons from chondrogenesis", J. Cell Sci. 125:3703-3712 (2012)を参照されたい。
【００２９】
基質は、フィブロネクチン、ラミニン、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、およびＶ型コラーゲンのうち１つまたは複数を含むＥＣＭ成分で処理してもよい。基質は、約０．５μｇ／ｍＬ〜約２５μｇ／ｍＬ、例えば約１μｇ／ｍＬ〜約１５μｇ／ｍＬ、または約１μｇ／ｍＬ〜約１０μｇ／ｍＬの濃度のＥＣＭ成分で処理することができる。基質は、約０．７５μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ〜約１５μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ〜約１０μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ〜約１２μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ〜約１５μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ〜約１８μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ〜約２２μｇ／ｍＬ、約７μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬ、約７μｇ／ｍＬ〜約１５μｇ／ｍＬ、約７μｇ／ｍＬ〜約１０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ〜約２５μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ〜約１５μｇ／ｍＬ、約１５μｇ／ｍＬ〜約２５μｇ／ｍＬ、または約１５μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬの濃度のＥＣＭ成分により処理することができる。
【００３０】
凍結保存する細胞がウシ角膜内皮細胞である場合、基質は、フィブロネクチン（Ｆ）、ラミニン（Ｌ）、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、およびＶ型コラーゲンのうち、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つを含み得るＥＣＭ細胞で処理してもよい。ＥＣＭ成分の組み合わせの例として、フィブロネクチン、Ｉ型コラーゲン、およびＶ型コラーゲンと、フィブロネクチン、ラミニン、Ｉ型コラーゲン、およびＩＶ型コラーゲンと、フィブロネクチン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、およびＶ型コラーゲンと、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、およびＶ型コラーゲンとが挙げられる。
【００３１】
凍結保存する細胞がヒト間葉系幹細胞である場合、ＥＣＭ成分は、フィブロネクチン、ラミニン、Ｉ型コラーゲン（ＣＩ）、ＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）、ＩＶ型コラーゲン（ＣＩＶ）、およびＶ型（ＣＶ）コラーゲンなどの１つまたは複数のタンパク質であればよい。ＥＣＭ成分の組み合わせの例として、フィブロネクチン、ＩＶ型コラーゲン、および／またはＶ型コラーゲンと、フィブロネクチン、ラミニン、Ｉ型コラーゲン、およびＶ型コラーゲンと、ＩＶ型コラーゲンおよびＶ型コラーゲンと、フィブロネクチン、ラミニン、およびＶ型コラーゲンと、ラミニン、ＩＶ型コラーゲン、およびＶ型コラーゲンと、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、およびＶ型コラーゲンと、ラミニン、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、およびＶ型コラーゲンとを挙げることができる。
【００３２】
ＥＣＭ成分に加え、マトリックス細胞タンパク質を基質に添加してもよく、あるいは細胞培養培地に添加してもよい。近年、マトリックス細胞タンパク質の機能および重要性が明らかになってきた。このタンパク質はＥＣＭ内に見られるが、マトリックスの構造維持には大きな役割を果たしていない。一方で、このタンパク質は細胞機能の調節に関与している。マトリックス細胞タンパク質は、細胞表面受容体、ホルモン、およびＥＣＭを含む他のエフェクター分子と相互に作用することにより細胞機能を調節する。そのタンパク質は分泌され、細胞外環境に存在するが、従来のＥＣＭタンパク質のように構造的な役割を果たさない。このタンパク質は発達中により顕著ではあるが、成体、特に損傷部位にも存在する。マトリックス細胞タンパク質は、置かれた状況で要求される広範な機能を果たす。将来発見される任意の公知のマトリックス細胞タンパク質またはマトリックス細胞タンパク質を本発明の方法に用いることもできる。例えば、Bornstein et al., "Matricellular proteins: extracellular modulators of cell function", Curr. Opin. Cell Biol. 14:608-616 (2002)、Bornstein et al., "Matricellular proteins: an overview", J. Cell Commun. Signal. 3:163-165 (2009)、Frangogiannis, "Matricellular proteins in cardiac adaptation and disease", Physiol. Rev. 92:635-688 (2012) 、Morris et al., "Matricellular proteins and biomaterials", Matrix Biol. Mar. pii:S0945-053X(14)00051-1. Doi: 10.1016/j.matbio.2014.03.002 (2014) 、Roberts, "Emerging functions of matricellular proteins", Cell Mol. Life Sci. 68(19):3133-3136 (2011) 、およびWong et al., "Matricellular proteins: priming the tumour microenvironment for cancer development and metastasis", Brit. J. Cancer, 108:755-761 (2013)を参照されたい。現在までの多くの研究は、ノックアウトマウスを用いてマトリックス細胞タンパク質の様々な機能を調査しており、これらのタンパク質をｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価した研究はほとどない。
【００３３】
細胞挙動に影響を与えるマトリックス細胞タンパク質の機能を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系における生存率および細胞付着率を高めることができる。したがって、１種類または複数種のマトリックス細胞タンパク質のみによって、またはＥＣＭ成分と組合せて基質を処理してもよい。すなわち、この方法は、マトリックス細胞タンパク質を細胞基質または培養培地に添加する工程を含む。適切なマトリックス細胞タンパク質として、トロンボスポンジン１、テネイシンＣ、テネイシンＸ、ＳＰＡＲＣ（Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ，Ａｃｉｄｉｃ  ａｎｄ  Ｒｉｃｈ  ｉｎ  Ｃｙｓｔｅｉｎｅ）、ペリオスチン、ＣＣＮ１、およびオステオポンチンが挙げられる。
【００３４】
マトリックス細胞タンパク質は、約０μｇ／ｍＬ〜約５μｇ／ｍＬの濃度で使用することができる。マトリックス細胞タンパク質は、約０．２５μｇ／ｍＬ〜約５μｇ／ｍＬ、約０．５μｇ／ｍＬ〜約５μｇ／ｍＬ、約０．７５μｇ／ｍＬ〜約５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ〜約５μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ〜約５μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ〜約５μｇ／ｍＬ、約４μｇ／ｍＬ〜約５μｇ／ｍＬ、約０μｇ／ｍＬ〜約４μｇ／ｍＬ、約０μｇ／ｍＬ〜約３μｇ／ｍＬ、約０μｇ／ｍＬ〜約２μｇ／ｍＬ、約０μｇ／ｍＬ〜約１μｇ／ｍＬ、約０．５μｇ／ｍＬ〜約４μｇ／ｍＬ、約０．５μｇ／ｍＬ〜約３μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ〜約４μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ〜約３μｇ／ｍＬ、または約１μｇ／ｍＬ〜約２μｇ／ｍＬの濃度で使用することができる。
【００３５】
この細胞はさらに、凍結保存の前にトレハロースなどの二糖類とともに培養することにより保護してもよい（２００７年９月１８日に発行された、Ｃａｍｐｂｅｌｌらによる米国特許第７，２７０，９４６号「Method for treatment of cellular materials with sugars prior to preservation」）。
【００３６】
この細胞はさらに、凍結保存温度までの凍結に先立ち、凍結保存組成物と接触させることにより凍結保存中に保護することができる。「凍結保存組成物と接触させる」とは、細胞を何らかの方法で凍結保存組成物と接触させることにより、凍結保存温度まで温度を低下させる間、細胞を凍結保存組成物により保護することを意味する。例えば、保護する細胞が付着したプレートの適当なウェルを凍結保存組成物で満たすことによって、細胞を凍結保存組成物と接触させることができる。
【００３７】
また、凍結保存する細胞は、凍結適合性の高いｐＨ緩衝液、すなわち最も典型的には、少なくとも塩基性塩溶液、エネルギー源（例えばグルコース）および冷却温度において中性ｐＨを維持することができる緩衝液で構成される、ｐＨ緩衝液と接触させてもよい。公知のこのような物質として、例えば、ダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）が挙げられる。この物質は凍結保存組成物の一部として含まれてもよい。例えば、Campbell et al., "Cryopreservation of Adherent Smooth Muscle and Endothelial Cells with Disaccharides", In: Katkov I. (ed.) Current Frontiers in Cryopreservation. Croatia: In Tech (2012)およびCampbell et al., "Development of Pancreas Storage Solutions: Initial Screening of Cytoprotective Supplements for β-cell Survival and Metabolic Status after Hypothermic Storage", Biopreservation and Biobanking 11(1): 12-18 (2013)を参照されたい。
【００３８】
凍結保存組成物は、当該技術で既知のいずれかの凍結保護物質を含んでもよい。既知の凍結保護剤として、アセトアミド、アガロース、アルギン酸塩、Ｌ?アナリン（ｌ?ａｎａｌｉｎｅ）、アルブミン、酢酸アンモニウム、ブタンジオール、コンドロイチン硫酸、クロロホルム、コリン、デキストラン、ジエチレングリコール、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エリトリトール、エタノール、エチレングリコール、ホルムアミド、グルコース、グリセロール、α‐グリセロリン酸塩、グリセロールモノアセテート、グリシン、ヒドロキシエチルスターチ、イノシトール、ラクトース、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、マルトース、マンニトール、マンノース、メタノール、メチルアセトアミド、メチルホルムアミド、メチル尿素類、フェノール、プルロニックポリオール（ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ｐｏｌｙｏｌｓ）、ポリエチレングリコール、ポリビニールピロリドン、プロリン、プロピレングリコール、ピリジンＮ‐オキシド、リブロース、セリン、臭化ナトリウム、塩化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、硝酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、ソルビトール、スクロース、トレハロース、トリエチレングリコール、トリメチルアミンアセテート、尿素、バリン、キシロースなどが挙げられる。
【００３９】
凍結保護剤は、凍結保存組成物中、例えば、約０．０５Ｍ〜約６．０Ｍ、約０．１Ｍ〜約３Ｍ、約０．２５Ｍ〜約６Ｍ、約１Ｍ〜約６Ｍ、約２Ｍ〜約６Ｍ、約３Ｍ〜約６Ｍ、約４Ｍ〜約６Ｍ、約５Ｍ〜約６Ｍ、約０．２５Ｍ〜約１Ｍ、約０．２５Ｍ〜約２Ｍ、約０．２５Ｍ〜約３Ｍ、約０．２５Ｍ〜約４Ｍ、約０．２５Ｍ〜約５Ｍ、約１Ｍ〜約４Ｍ、約１Ｍ〜約３Ｍ、約１Ｍ〜約２Ｍ、約３Ｍ〜約５Ｍ、約２Ｍ〜約４Ｍ、約０．５Ｍ〜約６Ｍ、約０．５Ｍ〜約５Ｍ、約０．５Ｍ〜約４Ｍ、約０．５Ｍ〜約３Ｍ、約０．５Ｍ〜約２Ｍ、または約０．５Ｍ〜約１Ｍの量で存在してもよい。
【００４０】
凍結保護組成物は、凍結保護剤として少なくとも１種のシクロヘキサンジオール（ＣＨＤ）化合物、例えばシス型またはトランス型の１，３‐シクロヘキサンジオール（１，３‐ＣＨＤ）または１，４‐シクロヘキサンジオール（１，４‐ＣＨＤ）またはそれらのラセミ混合物を含んでもよい。
【００４１】
ＣＨＤ化合物は、凍結保存組成物中、例えば、約０．０５Ｍ〜約２Ｍ、約０．１Ｍ〜約１Ｍ、約０．１Ｍ〜約２Ｍ、約０．１Ｍ〜約１Ｍ、約０．１Ｍ〜約１．５Ｍ、約０．１Ｍ〜約０．５Ｍ、約０．１Ｍ〜約０．２５Ｍ、約１Ｍ〜約２Ｍ、約１．５Ｍ〜約２Ｍ、約０．７５Ｍ〜約２Ｍ、約０．７５Ｍ〜約１．５Ｍ、約０．７５Ｍ〜約１Ｍ、約０．０５Ｍ〜約１Ｍ、約０．０５Ｍ〜約０．７５Ｍ、約０．０５Ｍ〜約０．５Ｍ、または約０．０５Ｍ〜約０．１Ｍの量で存在してもよい。また、凍結保存組成物は、細胞、組織および臓器の保存に適した溶液を含んでもよい。溶液は、上記の緩衝液を含んでもよい。溶液は、例えば、デキストロース、第一及び第二リン酸カリウム、重炭酸ナトリウム並びに塩化カリウムからなるユーロコリンズ液であってもよい。例えば、Taylor et al., "Comparison of Unisol with Euro-Collins Solution as a Vehicle Solution for Cryoprotectants", Transplantation Proceedings 33: 677-679 (2001)を参照されたい。
【００４２】
凍結保存組成物は、少なくとも一種のＣＨＤ化合物と、少なくとも一種の追加の凍結保護化合物の両方を含んでもよい。
【００４３】
さらに、凍結保存組成物は、不凍タンパク質／ペプチド（ＡＦＰ）または不凍糖脂質（ＡＦＧＬ）を含んでもよい。ＡＦＰには、不凍糖タンパク質（ＡＦＧＰ）、および昆虫不凍タンパク質または「熱ヒステリシス（Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｈｙｓｔｅｒｅｓｉｓ）」タンパク質（ＴＨＰ）が含まれる。最近発見されたＡＦＧＬは、昆虫および植物中で観察される。天然に生じるＡＦＰは形成中の氷晶のプリズム面に結合し、それにより形成形態を変化させることが可能であると考えられている。これらのタンパク質が生じる魚および昆虫では、このことは凝固点が低下することを意味するため、通常であれば体液が凍るような条件下でも生存可能となる。そのため、本発明の方法では、新たに発見されるかまたは公知のあらゆるＡＦＰを使用することができる。例えば、８つのこのようなタンパク質を記載するSicheri and Yang, Nature, 375:427-431, (1995)、DeVries, "Antifreeze glycopeptides and peptides: interactions with ice and water", Meth. Enzymol. 127:293-303 (1986)、Duman, "Antifreeze and ice nucleator proteins in terrestrial arthropods", Annual Rev. Physiol. 63:327-3257 (2001)、Holmstrup et al. "Dehydration and cold hardiness in the Arctic collembolan Onychiurus arcticus", J. Comp. Physiol. B 168: 197-203 (1998) 、Kuiper et al., "Purification of antifreeze proteins by adsorption to ice", Biochem. Biophys. Res. Commun. 300(3): 64-68 (2003) 、Miller, "Cold-hardiness strategies of some adult and immature insects overwintering in interior Alaska", Comp. Biochem. Physiol. 73A: 595-604 (1982) 、Neven et al., "Purification and characterization of an insect hemolymph lipoprotein ice nucleator: evidence for the importance of phosphatidylinositol and apolipoprotein in the ice nucleator activity", J. Comp. Physiol. B 159: 71-82 (1989) 、Sformo et al., "Deep supercooling, vitrification and limited survival to -100℃ in the Alaskan beetle Cucujus clavipes puniceus larvae", J. Exp. Biol. 213(3): 502-509 (2010) 、Storey et al., "Freeze tolerance in animals", Physiol. Rev. 68: 27-84 (1988) 、Storey et al., "Biochemical adaptation for cold hardiness in insects", Phil. Trans. R. Soc. Lond. B326: 635-54 (1990) 、Walters et al., "Freeze tolerance in the Arctic Alaska Stonefly, Nemoura arctica", J. Exp. Biol. 212: 305-12 (2009a) 、Walters et al., "Cryoprotectant biosynthesis and the selective accumulation of threitol in the freeze tolerant Alaskan beetle, Upis ceramboides", J. Biol. Chem. 284: 16822-16831 (2009b) 、Walters et al., "A Non-protein thermal hysteresis-producing xylomannan antifreeze in the freeze-tolerant Alaskan beetle, Upis ceramboides", Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 20210-20215 (2009c) 、Walters et al., "A thermal hysteresis-producing xylomannan glycolipid antifreeze associated with cold tolerance is found in diverse taxa", J. Comp. Physiol. B. 181(5): 631-40 (2011) 、Wang et al., "Antifreeze proteins of the beetle Dendroides canadensis enhance one another's activities", Biochemistry 44: 10305-10312 (2005) 、Worland et al., "Desiccation stress at subzero temperatures in polar terrestrial arthropods", J. Insect. Physiol. 49: 193-203 (2003) 、Zachariassen et al., "Nucleating agents in the haemolymph of insects tolerant to freezing", Nature 262: 285-87 (1976) 、およびZachariassen, "Physiology of cold tolerance in insects", Physiol. Rev. 65: 799-832 (1985)を参照されたい。
【００４４】
ＡＦＰの例として、ＡＦＰＩ（Ｉ型ＡＦＰ）、ＡＦＰＩＩＩ（ＩＩＩ型ＡＦＰ）および／またはＡＦＧＰが挙げられる。ＡＦＰは、存在する各ＡＦＰについて、例えば、約０．００１ｍｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬ、約０．０５ｍｇ／ｍＬ〜約０．５ｍｇ／ｍＬ、または約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約０．７５ｍｇ／ｍＬの量で凍結保存組成物中に存在してもよい。
【００４５】
細胞を凍結保存組成物に接触させた後、凍結保存のために細胞を凍結させることができる。凍結保存のための冷却は、いずれの方法で行ってもよく、さらに上記物質に加えて何らかの追加の物質を使用してもよい。
【００４６】
例えば、凍結保存のための冷却（凍結）手順は、任意の適切な手順であってもよい。多種の冷却手順が、当業者によく知られている。冷却手順は氷核形成点から?８０℃または上に記載したいずれかの冷却温度までの連続的な速度での冷却を含み得、冷却速度は、凍結する細胞／組織の特性により決定される。冷却速度は例えば、毎分約−０．１℃〜約−１０℃または毎分約−１℃〜約−２℃であってもよい。冷却速度は、約−０．１℃／分〜約−９℃／分、約−０．１℃／分〜約−８℃／分、約−０．１℃／分〜約−７℃／分、約−０．１℃／分〜約−６℃／分、約−０．１℃／分〜約−５℃／分、約−０．１℃／分〜約−４℃／分、約−０．１℃／分〜約−３℃／分、約−０．１℃／分〜約−２℃／分、約０．１℃／分〜約−１℃／分、約０．１℃／分〜約−０．５℃／分、約−１℃／分〜約−２℃／分、約−１℃／分〜約−３℃／分、約−１℃／分〜約−４℃／分、約−１℃／分〜約−５℃／分、約−１℃／分〜約−６℃／分、約−１℃／分〜約−７℃／分、約−１℃／分〜約−８℃／分、約−１℃／分〜約−９℃／分、約−１℃／分〜約−１０℃／分、約−２℃／分〜約−３℃／分、約−２℃／分〜約−５℃／分、約−２℃／分〜約−７℃／分、約−２℃／分〜約−８℃／分、約−２℃／分〜約−２０℃／分、約−４℃／分〜約−１０℃／分、約−４℃／分〜約−８℃／分、約−４℃／分〜約−６℃／分、約−６℃／分〜約−１０℃／分、約−６℃／分〜約−９℃／分、約−６℃／分〜約−８℃／分、約−６℃／分〜約−７℃／分、約−７℃／分〜約−１０℃／分、約−７℃／分〜約−９℃／分、約−７℃／分〜約−８℃／分、約−８℃／分〜約−９℃／分、または約−９℃／分〜約−１０℃／分であってもよい。細胞をこの連続的な速度での冷却により約‐４０℃〜‐８０℃まで冷却した後、細胞を液体窒素または液体窒素の気相に移動して、さらに、凍結溶液のガラス転移温度よりも一般的に低い凍結保存温度まで冷却してもよい。凍結保存温度までさらに冷却する前に、細胞を約−４０℃〜約−７５℃、約−４５℃〜約−７０℃、約−５０℃〜約−６０℃、約−５５℃〜約−６０℃約−７０℃〜約−８０℃、約−７５℃〜約−８０℃、約−４０℃〜約−４５℃、約−４０℃〜約−５０℃、約−４０℃〜約−６０℃、約−５０℃〜約−７０℃、または約−５０℃〜約−８０℃まで冷却してもよい。
【００４７】
加温手順は、２段階の加温工程を含み得る。この２段階の加温手順では、凍結保存細胞（凍結保存温度で凍結保存済み）を、凍結保存用冷凍庫から取り出してもよい。２段階の加温手順の第１段階において、第１の環境でまずゆるやかに加温される。この第１の環境は、いかなる特別な処理を行うことも、いかなる特別な性質を有することも必要とされず、あらゆる環境を用いることができる。環境は、例えば空気のような気体雰囲気であってもよい。第１段階における緩やかな加温を行うために、環境は凍結保存温度よりも高い第１の加温温度としてもよい。第１の加温温度は室温に近い温度であってもよい。例えば、約１５℃〜約３０℃、約２０℃〜約２５℃、または約２０℃〜約３０℃など、３０℃以下の温度を用いることができる。
【００４８】
２段階加温工程の第２段階では、第２の環境において、第１加温段階で用いた加温温度よりも高い第２の加温温度で、細胞を急速に解凍する。第２の加温温度は、３２℃以上、約３２℃〜約５０℃、約３５℃〜約４５℃、約４０℃〜約５０℃、約４５℃〜約５０℃、約３２℃〜約４０℃、約３５℃〜約４０℃、または約３７℃であってもよい。ここでも、第２の環境として、気体（空気）、液体または流動床などの任意の適切な環境を使用することができる。例えば、加温温度の水槽を用いて、急速な加温を行うことができる。
【００４９】
図５は、２段階の加温方法が細胞の生存率および付着率を改善させることを示している。ＥＣＭタンパク質の添加により、細胞の生存率および付着率が高くなり、ＥＣＭの有効な組み合わせは、細胞型によって決まる。２段階加温方法は、基質に固定された接着細胞として凍結保存されるあらゆる細胞型に適用することができる。
【００５０】
特定のＥＣＭ成分および／または特定のＥＣＭ成分の組み合わせは、１つの細胞型のみの生存率および保持率を高めることができ、他の細胞型には機能しない。したがって、本発明の主題は、凍結保存状態から細胞を解凍した後の、基質上の細胞の生存率および保持率を改善させる、１種類または複数種のＥＣＭ成分を特定する方法にも関する。この方法では、まず、ＢＣＥ細胞またはヒト間葉系幹細胞などの特定の細胞型の細胞を選択する。この方法ではさらに、特定の細胞型の細胞に対応するかあるいは特定の細胞型の細胞によって生成されることが知られる、ＥＣＭ成分を特定する。あるいは、既知のＥＣＭ成分を、選択された細胞型に対応する特定のＥＣＭ成分の事前知識なしに選別してもよい。次に、上述のとおり、基質をＥＣＭ成分およびＥＣＭ成分の様々な組み合わせで処理し、選択された細胞型の細胞を様々に処理された基質上に播種することができ、その後、基質上の細胞の凍結保存およびそれに続いて解凍が行われる。細胞を解凍した後、細胞を生存率および保持率について評価して、選択された細胞型についてどのＥＣＭ成分またはＥＣＭ成分の組み合わせが６０％以上、例えば８０％以上の細胞生存率（％）および少なくとも８０％のＤＮＡ含有率（％）をもたらすのかを特定する。細胞生存率および保持率は任意の既知の方法にしたがって評価することができる。細胞生存率（％）を測定するための既知の方法として、蛍光を用いた測定法などの生存率測定法が挙げられる。ＤＮＡ含有率（％）を測定するための既知の方法として、細胞数の正確な計測を可能にするために用い得る細胞増殖測定法が挙げられる。
【００５１】
凍結保護剤の選択が、凍結保存後の細胞の生存率および保持率に影響を及ぼし得るため、特定の細胞型に対し、ＥＣＭ成分と用いて最もよく機能する凍結保護剤を特定することもできる。例えば、グリセロールおよびＤＭＳＯは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの微小管の会合を促進し、ＤＭＳＯを除いたプロパンジオールなどの他の凍結保護剤は、卵母細胞内のアクチンを脱重合化する。例えば、Vincent et al., "Effects of Cryoprotectants on Actin Filaments During the Cryopreservation of One-Cell Rabbit Embryos", Cryobiology, 27:9-23 (1990)を参照されたい。いくつかの細胞において、ＤＭＳＯは、ストレスファイバーの解体および、細胞内アクチン束の生成を生じる。したがって、基質に付着した凍結保存細胞の重要な性質は、過酷な凍結および解凍後に細胞を基質に保持する能力である。
【００５２】
以下に実施例が記載され、それらは特定の実施形態を実施する際に用い得る異なる方法および条件を説明する。多くの変形、修正、および変更が当業者にとっては明らかであろう。したがって、実施例は説明のみを意図するものであって、限定を意図しない。
【実施例】
【００５３】
（実施例１）
＜ＥＣＭおよびＴＣＰ上で凍結保存された細胞の細胞生存率および保持率＞
【００５４】
分化細胞株、ＢＣＥ細胞（ＢＣＥ細胞株、ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−２０４８）を、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）１０％、ピルビン酸ナトリウム１．０ｍＭ、およびグルタミン４ｍＭ、ならびにペニシリン（１００Ｕ）／ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）と用いたダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に、二酸化炭素５％、３７℃で維持した。ＢＣＥ細胞は、組織培養プラスチックまたは天然ＢＣＥ細胞由来のＥＣＭに播種した。ＥＣＭを生成するために、ＢＣＥ細胞を９６ウェルプレート内にコンフルエントに近い密度（５０，０００細胞／ウェル）で播種し、ＤＭＥＭ中でＦＣＳ１０％およびリン酸アスコルビルマグネシウム（和光純薬工業株式会社製）８２μｇ／ｍＬとともに６日間放置した。細胞培養培地中のアスコルビン酸は、ＥＣＭの付着および形成を促進した。６日後、水中で２５ｍＭのＮＨ４ＯＨを添加することにより細胞を除去した後、水で３回洗浄した。例えば、Roemer et al., "In Vitro Assay Systems for Inflammatory Cell-Mediated Damage to Interstitial Extracellular Matrix", In Vitro Toxicol., 7(2):75-81 (1994)を参照されたい。
【００５５】
その後、播種したＢＣＥ細胞を２ＭのＤＭＳＯに曝露して、氷上に上記のプレートを配置し、細胞を０．５Ｍのマンニトールで前処理することにより凍結保存して、凍結保護物質、例えば２ＭのＤＭＳＯなどを添加する際に想定される高浸透圧環境に曝露するための細胞を用意する。最終濃度の凍結保護物質を添加した後、プレートを、制御された速度で−８０℃まで冷却し、−１３０℃で静置した。次の制御された冷却速度を用いた。−０．２℃／分、−１．０℃／分、−１０．０℃／分、および修正された−１．０℃／分  核形成工程を含むプロファイル（ＭＰ）。保存の少なくとも２４時間後、Ｃａｍｐｂｅｌｌ’５３１特許の２段階加温手順にしたがってプレートを加温した。まず、プレートを−２０℃で３０分間静置し、その後急速解凍のためにプレートを３７℃で静置した。プレートが解凍された（氷が視認されない）直後、プレートを氷上に配置し、１０％ＦＣＳを加えたＤＭＥＭ中で０．５Ｍのマンニトールで繰り返しウェルを洗浄した。１０％ＦＣＳを加えたＤＭＥＭをさらに洗浄した後、細胞生存率および保持率を評価する前に回復させるために、細胞をＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ）内に１時間３７℃で放置した。解凍後、アラマーブルー（商標）試薬およびＣＹＱＵＡＮＴ（商標）アッセイをそれぞれ用いて、生存率および細胞保持率について細胞を評価した。
【００５６】
細胞生存率は、アラマーブルー非侵襲代謝試薬（Ｔｒｅｋ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いて測定した。アラマーブルー試薬は細胞内における酸化／還元反応を測定する蛍光色素であるため、凍結保護剤への曝露後の細胞の全体的な生存率を示す。アラマーブルー試薬は、蛍光または吸光によって読み取ることができる。凍結保存後に２００μｌのＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ）中に放置した細胞に２０μｌの量のアラマーブルー試薬を添加し、プレートを３７℃で３時間培養した。アラマーブルー試薬からの蛍光を、蛍光マイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス社製）を用いて励起波長５４４ｎｍ、発光波長５９０ｎｍで読み取った。データは、無処理コントロールに対し標準化した。その値は、９回〜１２回の反復実験の平均値（＋／−ＳＥＭ）として示される。
【００５７】
各ウェル内の細胞のＤＮＡ含有率をＣＹＱＵＡＮＴアッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社による）によって測定することにより、凍結保存後にマイクロタイタープレートのウェル内に残存する細胞の比率（すなわち、細胞保持率）を評価した。ＤＮＡ含有率を細胞数の指標として用いた。ＣＹＱＵＡＮＴアッセイは、核酸を標識するために蛍光色素を用い、核酸はその後、蛍光マイクロプレートリーダーを用いて励起波長４８５ｎｍ、発光波長５３８ｎｍで測定される。ＲＮＡｓｅ  Ａ（シグマ社製）も用いて個々の細胞内の可変量のＲＮＡを除去することにより、ＤＮＡ含有率を直接測定することが可能となった。データは、無処理コントロールに対し標準化し、９回〜１２回の反復実験の平均値（＋／−ＳＥＭ）を示す。
【００５８】
図１に示すように、細胞生存率は、細胞をＴＣＰではなく細胞自体由来のＥＣＭ上に播種した場合、用いられる冷却速度に関わらず、大幅に改善した（ｐ＜０．００１）。−１０．０℃／分を除くすべての冷却速度について、細胞がＴＣＰに播種された場合に対し、ＥＣＭに播種された場合、細胞保持率が同等またはより良好となった。しかし、−１０．０℃／分では、細胞をＴＣＰではなく細胞のＥＣＭに播種した場合、細胞保持率に顕著な改善が見られた（ｐ＜０．０００１）。図１はさらに、高い冷却温度に対し、冷却温度が低いほど、概して良い生存率および付着率が得られることを示している（ｐ＜０．００１）。凍結保存中、すべての冷却温度にわたってＥＣＭの存在により細胞生存率が改善されるが、高い冷却温度での凍結保存中、ＥＣＭの存在により細胞保持率が向上する。低い冷却温度では、ＥＣＭおよびＴＣＰに播種された細胞の細胞保持率は同等であった。細胞培養培地に使用される血清中に存在するビトロネクチンなどのＥＣＭタンパク質が、未熟なマトリックスを生成することにより、凍結保存中の細胞の足場の枠組みがもたらされるということが、可能性のある１つの説明として考えられる。この可能性により、次の実施例（２〜４）を、血清が存在しない状態で行った。
【００５９】
完全に形成され組織化されたＥＣＭが存在することにより、細胞の本来（ｎａｔｉｖｅ）環境により近似する表面がもたらされる。そのため、細胞付着率は凍結保存プロセスによる影響を受けにくい。さらに、ＥＣＭの組成は、凍結保存中に付着を維持する細胞の機能に影響を与える。またさらに、細胞をＥＣＭとともに凍結保存することにより、細胞は、その全体的な健全性により貢献し、また凝固点に対するその耐久性および快復力を改善する構成となる。
（実施例２）
＜ＥＣＭ成分の様々な組み合わせを用いて凍結保存されたＢＣＥ細胞の細胞生存率および保持率＞
【００６０】
ＢＣＥ細胞（ＢＣＥ細胞株、ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−２０４８）を、ダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）１０％、ピルビン酸ナトリウム１．０ｍＭ、およびグルタミン４ｍＭ、ならびにペニシリン（１００Ｕ）／ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）とともに、二酸化炭素５％、３７℃で維持した。
【００６１】
５つのＥＣＭ成分である、フィブロネクチン、ラミニン、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、およびＶ型コラーゲンの最適な濃度を求めた後、１種の成分または１種または複数種の他の成分との組み合わせで評価した。ＥＣＭタンパク質を商業的供給源から入手し、細胞の播種に先立って、およそ１μｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬの濃度を用いてマイクロタイタープレートを処理した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で、様々な濃度のＥＣＭタンパク質で個々のウェルを処理し、２時間、３７℃で放置した後、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で１時間３７℃で培養することにより、当該技術分野で既知の方法にしたがって、未結合部位をブロックした。例えば、Underwood, "The Effect of Extracellular Matrix Molecules on the In Vitro Behavior of Bovine Endothelial Cells", Exp. Cell. Res. 205:311-319 (1993)を参照されたい。ウェルは、血清の存在しない培養培地で浄化し、その後細胞が播種されるまで培地内に放置した。
【００６２】
実施例１に記載したように、細胞を凍結保存し、その後解凍した。実施例１のように、アラマーブルー試薬およびＣＹＱＵＡＮＴアッセイを用いて、生存率および保持率を評価した。凍結保存の細胞生存率および細胞持続付着率の評価を、２つの凍結保護物質、ＤＭＳＯ、および１，２−プロパンジオール（ＰＤ）を用いて行った。細胞をプレートに播種し、細胞密度８０，０００cells/wellで、様々なＥＣＭを組み合わせて処理した。図２および図３に示される結果は、媒介溶液であるＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳＩ）（ＮａＣｌ２７５ｍＭ、ＨＥＰＥＳ２５ｍＭ）中で、２．０ＭのＤＭＳＯとともに単層として凍結保存された細胞のものである。ＰＤを凍結保護剤として用いて、異なるＥＣＭの組み合わせを用いたほぼ同様の結果が観察された。
【００６３】
図２および図３に示すように、ＥＣＭ成分のいくつかの組み合わせが優れた生存率および付着率を示した。処理済み細胞と同時に播種された個別の無処理コントロール細胞に基づいて、細胞生存率百分率および細胞数の指標となるＤＮＡ含有率を計算した。データの統計的分析は、いずれのＥＣＭ成分組合せも最も有意とは識別しなかった。ただし、ＥＣＭの組み合わせのいくつかが他の組み合わせよりも有意に良好であると考えられ、それらは使用する凍結保護剤に依存していた（ｐ＜０．０１）。目立った傾向としては、ＥＣＭ成分混合物が複雑（４種以上）であるほどより良好な生存率および付着率が生じたということがある。図２は、２種類のＥＣＭタンパク質が凍結保存およびその後の解凍後の細胞生存率を大幅に改善したことを示している。最良の組み合わせとして、生存率についてはフィブロネクチンおよびＩ型コラーゲン、または付着率についてはフィブロネクチンおよびＶ型コラーゲンが挙げられ、ラミニンはＢＣＥ細胞の生存率および付着率の改善に最も寄与しなかった。４種のＥＣＭ成分の組み合わせのいくつか（Ｆ＋Ｌ＋ＣＩ＋ＣＩＶ、Ｆ＋ＣＩＩＩ＋ＣＩＶ＋ＣＶ、およびＣＩ＋ＣＩＩＩ＋ＣＩＶ＋ＣＶ）では、凍結保存後、ほぼ１００％の細胞が生存し付着していた。
【００６４】
図３は、ＴＣＰ単独に対して、１種のＥＣＭタンパク質が存在する場合でさえ細胞付着率を改善させることを示している。細胞付着率は、ＢＣＥ細胞により供されたマトリックスを含む、試験したすべてのＥＣＭの組み合わせで８０％を超えた。細胞を少なくとも１種類のＥＣＭ成分とともに凍結保存することにより、細胞付着率の全体的な改善が見られた。
（実施例３）
＜ＥＣＭ成分の様々な組み合わせを用いて凍結保存されたｈＭＳＣの細胞生存率および保持率＞
【００６５】
ヒト骨髄由来の間葉系幹細胞を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中に、１０％ＦＣＳ、非必須アミノ酸、２ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ、およびペニシリン（５０Ｕ）／ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍＬ）とともに３７℃、二酸化炭素５％で維持した。
【００６６】
最初の実験は、フィブロネクチン、ラミニン、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、およびＶ型コラーゲンのＥＣＭ成分を評価して、個別に最適な濃度を求めた。その後、個別のタンパク質により規定される濃度を用いて２種類のタンパク質について調べた。３種または４種タンパク質のさらなる組み合わせを選び、個別のタンパク質および様々な２種類のタンパク質の組み合わせで得られた結果に基づいて調べた。ＥＣＭタンパク質を商業的供給源から入手し、細胞の播種に先立って、およそ１μｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬの濃度を用いてマイクロタイタープレートを処理した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で、様々な濃度のＥＣＭタンパク質で個々のウェルを処理し、２時間、３７℃で放置した後、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で１時間３７℃で培養することにより、未結合部位をブロックした。ウェルは、血清の存在しない培養培地で浄化し、その後細胞が播種されるまで培地内に放置した。
【００６７】
実施例１に記載したように、細胞を凍結保存し、その後解凍した。解凍後、生存率を測定し、ＴＣＰまたはｈＭＳＣの通常の培養および維持に慣例的に用いられるゼラチンに付着させた細胞と比較して、どのＥＣＭ成分が凍結保存中の細胞の生存持続率および付着率に最も寄与するかを確認した。これらの実験において、凍結する前の、各ウェル内の細胞の生存率に基づいて、百分率による細胞生存率を計算した。実施例１のように、アラマーブルー試薬およびＣＹＱＵＡＮＴアッセイを用いて、生存率および保持率を評価した。
【００６８】
複数のＢＣＥ細胞では、ＥＣＭタンパク質の組み合わせにより細胞生存率が改善されたことが明白であるが、これは必ずしもｈＭＳＣには当てはまらない。１種のＥＣＭ成分によって、２種類以上のＥＣＭ成分の組み合わせとほぼ同じ程度、ｈＭＳＣの生存率が改善された。４種以上のＥＣＭタンパク質の組み合わせが、ＢＣＥ細胞には最も有効であったが、ｈＭＳＣでは、最良の生存率をもたらした組み合わせが明確に優位である。ＥＣＭ成分の２つの組み合わせは７０％を超える生存率を生じ、Ｆ＋Ｌ＋ＣＩ＋ＣＶおよびＣＩＶ＋ＣＶであった。別のいくつかの組み合わせは、６０％を超える生存率をもたらし、Ｆ＋Ｌ＋ＣＶ、Ｌ＋ＣＩＶ＋ＣＶ、ＣＩＩＩ＋ＣＩＶ＋ＣＶ、Ｆ＋Ｌ＋ＣＩＶ＋ＣＶ、Ｆ＋ＣＩ＋ＣＩＶ＋ＣＶ、Ｆ＋ＣＩＩＩ＋ＣＩＶ＋ＣＶ、およびＬ＋ＣＩ＋ＣＩＩＩ＋ＣＶであった。興味深いことに、ｈＭＳＣ細胞培養に通常用いられるゼラチンは、凍結保存および解凍後の細胞生存率を上昇させなかった。これは、特定の細胞型を培養するための基質処理の確立された方法が、凍結保存に必ずしも有効であるとは限らないことを示している。これは、マトリックス細胞タンパク質が含まれる場合にも観察された（実施例４参照）。概して、少なくとも１種類のＥＣＭタンパク質が存在することにより、凍結保存後のｈＭＳＣ生存率が改善された。最良の生存率を示した組み合わせは、その混合物中にフィブロネクチン、ＩＶ型コラーゲンおよび／またはＶ型コラーゲンを含む傾向があった。
（実施例４）
＜マトリックス細胞プロテインであるテネイシンＸとともに凍結保存した後のｈＭＳＣの生存率＞
【００６９】
ヒト骨髄由来の間葉系幹細胞を、ゼラチンまたはラミニン、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、およびＶ型コラーゲンを組み合わせたＥＣＭに播種した。細胞の播種と同時に、マトリックス細胞タンパク質である、濃度５００ｎｇ／ｍＬのテネイシンＸを図６に示されるサンプルに導入した。実施例１に記載したように、細胞を１ＭのＤＭＳＯ中で２．５％コンドロイチン硫酸とともに凍結保存し、その後解凍した。解凍後に細胞生存率を測定し、無処理コントロールに対し標準化した。テネイシンＸの添加によりＥＣＭ単独が存在する場合（５７％）に対し、細胞生存率の改善が助長され（１００％）、ＥＣＭ±テネイシンＸ上のｈＭＳＣの全体的な生存率は、細胞がゼラチンに播種された場合よりも良好であった（ｐ＜０．０５、図１）。興味深いことに、テネイシンＸはＥＣＭの組合せと比較して、ゼラチンとともに用いた際にはまったく改善を示さなかったが、これは恐らく、ゼラチンがコラーゲンを処理した形態であり、組合せて用いるＥＣＭ成分がすべて天然由来のタンパク質として生成されるためである。これは、特定細胞型培養のための基質処理の確立された方法が、接着細胞の凍結保存中に必ずしも有効であるとは限らない可能性があることをさらに強調している。
【００７０】
分化細胞株および間葉系幹細胞についてここに示される結果は、ＥＣＭ成分を添加することにより、凍結保存後の生存率が改善され、マルチウェルプレートに付着した細胞の凍結保存後の付着率が維持されることを示した。２つの細胞型間には相違が見られ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞の健全性および維持にＥＣＭが果たすことができる重要な役割を強調している。これは、幹細胞にとって特に重要であるが、それはＥＣＭが、幹細胞が分化する機能およびどの細胞系統に進むかに影響を与え得るためである。これらの結果はまた、ＥＣＭの組成が、細胞および凍結保存後に接着性集団として生き残る細胞の能力に影響を与えることを示した。
【００７１】
様々な上述または他の特徴および機能またはそれらの代替物を随意に組み合わせて、多くの他の様々なシステムまたは用途を実現できることが理解されるだろう。また、様々な現在予想されていないかまたは先行開示されていない代替、修正、変形またはその改善が、後に当業者によってなされる可能性があり、また、それらは以下の請求項に包含されることが意図される。
【図１】
2017535259.tif 000002
【図２−１】
2017535259.tif 000003
【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年6月29日(2017.6.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
凍結保存状態から細胞を解凍した後の、基質上の細胞の生存率および保持率を改善させる、１種類または複数種の細胞外マトリックス成分および／またはマトリックス細胞タンパク質を特定する方法であって、
特定の細胞型の前記細胞を選択する工程と、
１種類または複数種の異なる細胞外マトリックス成分で基質を処理する工程および／または１種類または複数種のマトリックス細胞タンパク質を前記基質または細胞培養培地中の前記細胞に添加する工程と、
前記基質上に細胞を播種する工程と、
前記細胞を凍結保存温度まで冷却することにより、前記基質上の前記細胞を凍結保存する工程と、
まず、前記細胞を含む前記基質を、前記凍結保存温度よりも高い第１の加温温度の第１の環境に曝露することにより、前記凍結保存温度から前記細胞を加温し、その後
前記細胞を、前記第１の加温温度よりも高い第２の加温温度の第２の環境に曝露することにより、前記第１の加温温度から前記細胞をさらに加温することによって前記細胞を解凍する工程と、
前記細胞を評価して前記基質上の前記細胞の生存率および保持率を測定することによって、前記細胞を凍結保存状態から解凍した後の細胞の生存率および保持率を改善する少なくとも１種類の細胞外マトリックス成分および／または少なくとも１種類のマトリックス細胞成分を特定する工程と、を備える方法。
【請求項２】
前記凍結保存温度が−３０℃以下であり、
前記第１の加温温度が−３０℃より高く３０℃未満であり、
前記第２の加温温度が３２℃以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１種類または複数種の細胞外マトリックス成分が、フィブロネクチン、ラミニン、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、およびＶ型コラーゲンからなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記１種類または複数種のマトリックス細胞タンパク質が、テネイシンＣ、テネイシンＸ、ＳＰＡＲＣ、ペリオスチン、ＣＣＮ１、オステオポンチン、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１〜３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
前記特定の細胞型の前記細胞に対応するかあるいは前記特定の細胞型の前記細胞によって生成されることが知られる、細胞外マトリックス成分を特定する工程をさらに備える、請求項１〜４の何れかに記載の方法。
【請求項６】
接着細胞の凍結保存方法であって、
少なくとも１種類の細胞外マトリックス成分で基質を処理する工程および／または１種類または複数種のマトリックス細胞タンパク質を前記基質または細胞培養培地中の前記細胞に添加する工程と、
前記基質上に細胞を播種する工程と、
前記細胞を凍結保存温度まで冷却することにより、前記基質上の前記細胞を凍結保存する工程とを備える方法。
【請求項７】
まず、前記細胞を含む前記基質を、前記凍結保存温度よりも高い第１の加温温度の第１の環境に曝露することにより、前記凍結保存温度から前記細胞を加温し、その後
前記細胞を、前記第１の加温温度よりも高い第２の加温温度の第２の環境に曝露することにより、前記第１の加温温度から前記細胞をさらに加温することによって、
前記細胞を解凍する工程をさらに後に備える、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記凍結保存温度が−３０℃以下であり、
前記第１の加温温度が−３０℃より高く３０℃未満であり、
前記第２の加温温度が３２℃以上である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記１種類または複数種の細胞外マトリックス成分が、フィブロネクチン、ラミニン、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン、およびビトロネクチンからなる群から選択される、請求項６〜８の何れかに記載の方法。
【請求項１０】
前記１種類または複数種のマトリックス細胞タンパク質が、テネイシンＣ、テネイシンＸ、ＳＰＡＲＣ、ペリオスチン、ＣＣＮ１、オステオポンチン、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項６〜９の何れかに記載の方法。
【請求項１１】
前記１種類または複数種のマトリックス細胞タンパク質が、アクチン結合タンパク質、トロンボスポンジン１、テネイシンＣ、テネイシンＸ、ＳＰＡＲＣ、ペリオスチン、ＣＣＮ１、およびオステオポンチンからなる群から選択される、請求項６〜９の何れかに記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞外マトリックス成分が、少なくともフィブロネクチン、ＩＶ型コラーゲン、およびＶ型コラーゲンを含む、請求項６〜１１の何れかに記載の方法。
【請求項１３】
前記１種類または複数種の細胞外マトリックス成分が、少なくともフィブロネクチン、Ｉ型コラーゲン、およびＶ型コラーゲンを含む、請求項６〜１１の何れかに記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞がウシ角膜内皮細胞である、請求項６〜１３の何れかに記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞がヒト間葉系幹細胞である、請求項６〜１３の何れかに記載の方法。
【国際調査報告】
2017535259.tif 000011
2017535259.tif 000012
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