(57)【要約】本発明は、医学、薬理学、バイオテクノロジー、分子生物学、遺伝子工学に関係し、鎮痛のために利用することができる。原核生物の要素と真核生物の要素を含む骨組、ならびにヒトのαディフェンシンＨＮＰ−１又はＨＮＰ−２又はＨＮＰ−３をコード化するポリヌクレオチドによって構成される、哺乳類の細胞における一過性発現を行うプラスミドＤＮＡが提案されている。また、細菌の細胞をベースとする、このようなプラスミドＤＮＡの産生株及びそのような産生株をベースとした、哺乳類、特にヒトに用いられる鎮痛剤（諸形態）が提案されている。このような発明諸形態の利用による技術的効果は、鎮痛剤の範囲拡大、鎮痛継続時間の延長、鎮痛処置の安全性向上、鎮痛剤生産の簡素化及び生産費の削減として現れている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
原核生物の要素、複写開始点、レポーター遺伝子、真核生物の要素、強力なプロモーター、ｍＲＮＡのリーダー配列及び上記諸要素のための制御配列、目的遺伝子のクローン化のための一つのサイト、望ましくはそのための複数のサイト、分析用のプライマー植付け用の一つのサイト、望ましくはそのための複数のサイトを含む骨組によって構成された、ならびに分泌配列及び、哺乳類用にコドンが最適化されたαディフェンシンＨＮＰ−１又はＨＮＰ−２又はＨＮＰ−３をコード化する断片より成るポリヌクレオチド及びターミネーター配列によって構成された、哺乳類の細胞において一過性発現を行うプラスミドＤＮＡ（諸形態）。
【請求項２】
プレプロタンパク質が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８により構成されていることを特徴とする、請求項１に記載されているプラスミドＤＮＡ。
【請求項３】
ポリヌクレオチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２によって構成されていることを特徴とする、請求項１又は請求項２に記載されているプラスミドＤＮＡ。
【請求項４】
細菌の細胞をベースとする、請求項１又は請求項２又は請求項３に記載されたプラスミドＤＮＡの産生株。
【請求項５】
製薬上許容できる添加剤を含む、請求項１又は請求項２又は請求項３に記載された、有効量のプラスミドＤＮＡをベースとした、哺乳類、特にヒトに用いられる鎮痛剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療、薬理学、バイオテクノロジー、分子生物学、遺伝子工学に関係し、鎮痛用として用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
痛みとは、たんに主要な病気の又は損傷過程の指示器であるばかりでなく、個々人及び社会全体に大きな損失を及ぼす、それ自体として取り上げなければならない独立した問題であるということを認めることが重要である。ＱＯＬの改善にとって、痛みの軽減は、それ自体として、治療の目的でなければならない。現代医療は痛みの治療へと移行しつつあるが、これに対する有望なアプローチとなるのが、痛みのメカニズムの解明及び薬理学的ターゲット治療（具体的な分子を攻撃目標とした治療）である［ＷＨＯ  ｎｏｒｍａｔｉｖｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ  ｏｎ  Ｐａｉｎ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，  Ｇｅｎｅｖａ  Ｊｕｎｅ  ２００７］ 。
【０００３】
消炎剤及び鎮痛剤（特許文献１）として、ペプチドアミド（特許文献２）、フェニルヒドラジン誘導体、痛みの予防及び治療用としての合成ペプチドアミド（特許文献３）の利用が知られている。鎮痛活性を有し、一般式をＡ−Ｂ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ  （ＤＰｒｏ，  ｄＨＰｒｏ，  ＤｄＨＰｒｏ，  ＤＬｄｈＰｒｏ，  Ｈｙｐ）−Ｃ−Ｘとするペプチド系、皮下注射又は経口投与され、鎮痛活性もしくは抗障害受容活性を有する誘導ペプチドの利用が知られている（特許文献４）。
【０００４】
化学合成されたペプチド及びペプチド誘導体の欠点は、求むべき物質に鏡像異性体が混入する可能性があり、このことによって想定外の結果がもたらされる点にある。一般に、薬剤の様々な鏡像異性体が異なる生物的活性を有する限り、鏡像異性体についての理解が、製薬学において重要な役割を果たす。ペプチド分子を産生するために生体系を利用することによって、天然の構造、均一混合物を産生することができる。
【０００５】
細菌を表示するための、同種レギュロン又は異種ＤＮＡを含む組換えプラスミドが知られているが、この異種ＤＮＡは、鎮痛効果を有するポリペプチドをコード化することができる（特許文献５）。漸深海性マクロゲノム遺伝子クラスターを含み、大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの細胞中で合成される、新しい構造を有するインドールモノ化合物が知られている（特許文献６）。顕著な鎮痛作用をもつイソギンチャクＨｅｔｅｒａｃｔｉｓ  ｃｒｉｓｐａからのポリペプチド及びその産生法が知られている（特許文献７）。多数の架橋をもち、微生物アクチノマデュラ・ナミビエンシスＡｃｔｉｎｏｍａｎｄｕｒａ  Ｎａｍｉｂｉｅｎｓｉｓによって分泌される、炎症によって生ずる神経因性疼痛の治療のために有効なペプチドが知られている（特許文献８）。しかしながら、このような分子が、ヒトから遠い生物に由来しているため、その作用については、ヒトに用いる以前に、とりわけ入念に研究されなければならない。
【０００６】
癌及びＡＩＤＳの最終段階、手術後の痛み、火傷等のための鎮痛剤の調合に用いることができる、コノトキシン（カタツムリ毒）をベースにした組換えタンパク質ＭＶｏ  Ａ及びＴｒｘが知られている（特許文献９）。バキュロウイルス及び昆虫の細胞もしくは昆虫を利用してコノトキシンを産生する方法が知られている（特許文献１０）。オメガ・コノペプチドＴＶＩＡ（ＳＮＸ−１８５）またはＭＶＩＩＡ（ＳＮＸ−１１１）を投与することによる無痛法及びアヘン無痛法の改善を行う方法（特許文献１１）、αコノトキシンを用いた無痛法（特許文献１２，１３，１４）、コノトキシンＬｔ７ｂを用いた方法（特許文献１５）が知られている。神経因性疼痛進行抑制剤の生産用としてのオメガ・コノペプチドの利用が知られている（特許文献１６）。鎮痛作用及び抗腫瘍性作用を有する、サソリのポリペプチドが知られており（特許文献１７、１８）及びそれを適用する方法（特許文献１９）及びその産生法（特許文献２０）が知られており、また鎮痛作用をもつムカデＳｃｏｌｏｐｐｅｎｄｒａ  ｓｕｂｓｐｉｎｉｐｅｓ  ｍｕｔｉｌａｎｓ  −  ｍｕ−ＳＬＰＴＸ−Ｓｓｍ６ａが知られている（特許文献２１）。鎮痛作用を有するクモＧｒａｍｍｏｓｔｏｌａ  ｓｐａｔｕｌａｔａの毒のペプチド（特許文献２２）、中国のトリクイグモのペプチドＨＷＡＰ−１（特許文献２３）が知られている。単独で又は他の鎮痛分子と組み合わされた形で痛みを抑制又は軽減することのできる、ヘビの毒から得られるペプチド分子及びその誘導体、同型、類似型及び模倣型（特許文献２４，２５）ならびに鎮痛用の、ウミヘビＬａｐｅｍｉｓ  ｈａｒｄｗｉｃｋｉｉの短縮型の神経毒も知られている（特許文献２６）。
【０００７】
このグループの発明の欠点は、製薬上純粋であった場合でも、これらの毒物の使用がリスクを伴い、過剰投与の場合には死に至る場合もありうる点にある。
【０００８】
新しいポリペプチドの利用、すなわち、鎮痛用の、ヒトＧタンパク質のサブユニット９．０１（特許文献２７）、サブユニット１２．６５（特許文献２８）、サブユニット９．４６（特許文献２９）、サブユニット１１．４４（特許文献３０）の利用が知られている。Ｇタンパク質受容体ＨＦＩＡ０４１（特許文献３１）、ＨＬＹＡＺ６１（特許文献３２）、ＨＵＶＣＴ３６（特許文献３３）、Ｈ７ＴＢＡ６２（特許文献３４）、ｏｒｇＩＯ（特許文献３５）、ｏｒｇＩＩ（特許文献３６）、及びＩＧＳ４系に属するもの（特許文献３７、３８をベースとしたポリペプチドが知られている。エプスタイン・バール・ウィルスＥＢＩ  ３に誘導されたＧタンパク質の接合受容体の利用例が知られている（特許文献３９）。
【０００９】
骨の癌、骨関節炎、手術後の痛みを、神経成長因子アンタゴニストを投与することによって治療する方法（特許文献４０，４１，４２）が知られており、この分子と特別な結合を行う諸パートナー（特許文献４３）が知られている。ＮＧＦと受容体ＴｒｋＡとの結合を抑制する能力のある分子を、薬効の長い鎮痛剤として用いることができることが示されている（特許文献４４）。生体内で安定性に優れた、神経成長因子に対する諸抗体（特許文献４５）も知られており、ＮＧＦにきわめて類似した神経成長因子抗体（特許文献４６）及び神経組織成長因子に対するヒト化抗体薬剤の剤型（特許文献４７）も知られている。
【００１０】
以下の治療方法が知られている：
＊  ペプチドを用いた、痛み及び炎症の治療法（特許文献４８）、ＣＲＭＰ−２及びＣａＶ２．２の相互作用を分離し、その結果Ｎタイプのカルシウムチャンネルの活性化が起こらないにする痛み及び炎症の治療法（特許文献４９）、及びＬＩ−ＣＡＭ、アンキリン及び電位依存性カルシウムチャンネルの相互作用の分離により、軸索の損傷を治療し、神経伝達物質の放出及び痛みの伝達を抑制し、ニューロン内におけるカルシウムポンプをブロックする治療法（特許文献５０）、ならびに、鎮痛用の、ナトリウムチャンネルＮａｖｌ．７のペプチド毒素の類似型（特許文献５１）が知られている。
＊  アンタゴニストＩＬ−３１、ヒト化単クローン抗体又はキメラ抗体を使用した、神経組織内の痛み及び炎症の治療法（特許文献５２）、前立腺酸性フォスファターゼ（ＰＡＰ）、その活性型、断片型または誘導体を使用した痛み及び炎症の治療法（特許文献５３）。
＊  ＣＣＲ２に対する抗体を用いた神経因性疼痛の治療法（特許文献５４）、プロサポニンの誘導体であるペプチドを用いた神経障害性疼痛の治療法（特許文献５５）、アミノ酸配列Ｔｈｒ−Ｒｌ−Ｌｕｅ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ただし、Ｒｌは、神経変性疾患又は髄鞘形成障害に作用を及ぼすＤ−アラニン）を含むペプチドを用いた治療法（特許文献５６）、調整領域と結合した、神経障害性疼痛（ＶＲ１,  ＮａＶ１．８及びＴｒｋＡ）に関連する標的遺伝子の発現を活性化もしくは抑制１５  ０００７５６する能力を有する、亜鉛フィンガータンパク質領域をもつタンパク質を用いた治療法（特許文献５７）。
＊  分離された遺伝子の配列を利用した、神経因性疼痛又は鋭敏化した中枢性疼痛の治療法。この場合、この遺伝子が、力学的にそれぞれ異なる１番目及び２番目の神経因性疼痛又は鋭敏化した中枢性疼痛に応じて、哺乳類の脊髄中で制御される（特許文献５８，５９，６０，６１）。
＊  慢性疼痛の、ポリペプチドＴＯＲＣを利用した治療法（特許文献６２）、ヒストグラニン及び化学的に安定なその類似型を利用した治療法（特許文献６３）、線形及び環形ヒストグラニンペプチド及びそれらをベースとした擬ペプチドを利用した治療法（特許文献６４）、ＩＬ−１０及びＩＬ−４を含む組換えタンパク質を利用した治療法（特許文献６５）、ＩＬ−１０をベースとするポリペプチドを利用した治療法（特許文献６６）。
＊  急性及び慢性疼痛（様々な形態の疼痛）の、ＩＬ−１３結合タンパク質を利用した治療法（特許文献６７）、ｌｂ−１２／ｐ４０結合タンパク質を利用した治療法（特許文献６８）、ＩＬ−１２／ｐ４１結合タンパク質を利用した治療法（特許文献６９）、ＩＬ−１７−結合タンパク質を利用した治療法（特許文献７０）、プロスタグランジンＥ２結合タンパク質を利用した治療法（特許文献７１）、二重可変領域をもつ免疫グロブリンを利用した治療法（特許文献７２）、プロスタグランジンＥ２に対して二重可変理領域をもつ免疫グロブリンを利用した治療法（特許文献７３）、ＥＥ３系タンパク質を利用した、慢性又は急性の疼痛発作との戦い（特許文献７４）。
＊  受容体のグニアル酸シクラーゼ活性を高めるポリペプチドを利用した内臓性疼痛の治療（特許文献７５）。
＊  ＩＬ−１結合タンパク質を用いた神経因性疼痛、骨関節炎痛、炎症性疼痛の治療法（特許文献７６）、安定した、可溶性のＴＮＦ−αの抗体・抑制剤を用いた、関節炎の炎症過程及びその他の腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）媒介疾病又は病態生理学的メカニズム、とくに様々な形態の痛みの治療法（特許文献７７）、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）のヒト化アンタゴニスト抗体を用いた関節炎疼痛の治療（特許文献７８）、少なくとも一つのボツリヌス毒素又はそれをベースとしたペプチドを用いた、少なくとも一つの抗癌剤によって誘導された痛みの治療（特許文献７９）及びそれにアヘン誘導体を併用した治療法（特許文献８０）、Ｍｕｓタンパク質と関連したＰＡＭを用いた疼痛治療（特許文献８１）、ガラニン受容体に似た、ポリペプチドＧＰＣＲ（Ｇタンパク質共役受容体）を用いた治療法（特許文献８２，８３，８４）、コントゥラキンＧ（ｃｏｎｔｕｌａｋｉｎ−Ｇ）及びその脱グリコキシル形態を用いた治療法（特許文献８５，８６）、タンパク質キナーゼＣのペプチド抑制剤を使用する治療法（特許文献８７）、カリシトニン遺伝子と結びついたペプチドに対して向けられるアンタゴニスト抗体の投与による内臓性疼痛の治療法（特許文献８８）。
＊  主としてラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）を用いた腹痛の治療法（特許文献８９）。
【００１１】
ＴＲＰＡ１のアンタゴニスト抗体、主として単クローン抗体を利用して、生理学的及び病態生理学的条件（例えば、異痛症及び痛覚過敏症）における痛覚感受性、とくにＴＲＰＡ１を介した機械的な感受性と結びつくか、もしくは媒介された痛覚を低減させる方法が知られている（特許文献９０）。以下のクラスの、受容体アンタゴニスト及び酵素抑制剤から選ばれた鎮痛・抗炎症剤が知られており、それぞれのクラスが、痛みに対して作用し、炎症を抑えための様々な分子的作用メカニズムに従って作用している：  （４）ブラジキニン受容体のアンタゴニスト（ペプチド）、媒介されたペプチド（ＣＧＲＰ）受容体のアンタゴニスト、カルシトニン遺伝子（アルファ−ＳＯＫＲ−（８−３７）、（８）インターロイキン受容体のアンタゴニスト（Ｌｙｓ−Ｄ−ｐｒｏ−Ｔｈｒ）（特許文献９１）、ベータセルリンタンパク質（ＢＴＣ）（特許文献９２）。障害がＣＲＦ２Ｒによって調整された際に、副腎皮質刺激ホルモン放出因子受容体（ＣＲＦ  ２Ｒ）のアゴニストを利用して痛みを低減させる方法（特許文献９３）、アミリンの特性を有するペプチドを用いて疼痛を治療する方法（特許文献９４）、ノシセプチン受容体（NOP）のペプチドアゴニストを用いた治療法（特許文献９５）、血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）の断片１  １−２８の、中枢神経系統へもたらされる二つ以上のアミノ酸残基を含むペプチドを用いた治療法（特許文献９６）、カルシトニンをベースとした誘導体ペプチドを用いた治療法（特許文献９７）、ヒトのＣＧＲＰ−ＲＣＦポリペプチドを用いた治療法（特許文献９８，９９）、ＣＧＲＰのヒト化受容体ポリペプチドを用いた、頭痛、ストレス性慢性頭痛、群発性頭痛、偏頭痛の治療・予防方法（特許文献１００）、ヒトの、新たな接合型ポリペプチド１１ｃｂを用いた治療法（特許文献１０１）、最後のタンパク質のアゴニスト及びアンタゴニストを用いた治療法（特許文献１０２）、七つの膜透過領域をもつ受容体を用いた治療法（特許文献１０３，１０４，１０５，１０６，１０７，１０８，１０９，１１０，１１１，１１２）、ホスホジエステラーゼ活性をもつペプチドを用いた治療法（特許文献１１３）、ポリペプチド・ヒトプロテインキナーゼ ｈＹＡＫ３及びＨＯＡＣＦ７２を用いた治療法（特許文献１１４，１１５）が知られている。
【００１２】
可溶性タンパク質発現の原核生物のシステムを利用して得られる、脳髄の神経栄養因子をベースにした組換えタンパク質が知られている（特許文献１１６，１１７）。痛みを治療するための、タイプ２のニューロテンシン受容体をベースにしたポリペプチドが知られている（特許文献１１８）。体温低下又は鎮痛を誘導するために使用することができる、治療用ペプチドを含む複合ニューロテンシン又はその類似型が知られている（特許文献１１９）。中枢神経系統に特異的に作用する、配座が最適化されたアルファ−メラノトロピンの類似型が知られている（特許文献１２０）。神経伝達物質の放出を調節する、ＳＮＡＲＥに類似する合成ペプチドが知られている（特許文献１２１）。
【００１３】
アクチノマデュラ・ナミビエンシスから分泌される、多くの架橋をもつペプチドのように、鎮痛などの多くの機能を有するペプチド（特許文献１２２）、ＤＧＳＶＶＶＮＫＶＳＥＬＰＡＧＨＧＬＮＶＮＴＬＳＹＧＤＬＡＡＤ（特許文献１２３）、Ｎ末端アミノ酸残基において、バソペプチダーゼの抑制剤としての２−チオアシル基を含むジペプチド（特許文献１２４）、胸腺特異性タンパク質（特許文献１２５）、及びペプチド及びペプチドと同系の化合物をベースとした、高度の浸透性をもつプロドラッグ組成（特許文献１２６）が知られている。
【００１４】
ノルアドレナリンのニューロン輸送体の選択的抑制剤とヒトを含む脊椎動物の内科治療において鎮痛、痛みの予防又は軽減のために用いられる鎮痛剤とを相乗的に組み合わせた、組合せ式鎮痛法（特許文献１２７）が知られている。麻薬剤又は鎮痛剤と併用すると、鎮痛作用を増強させる、エンケファリン及びβエンドルフィンなどの、ダイノルフィンのペプチド類似型（特許文献１２８）も知られている。
【００１５】
痛みの治療もしくは軽減などに用いられる医薬品の前躯体を形成する媒介基と結合したペプチドＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔを利用して、薬剤の経口的又は非経口的投与の際に物質の薬理活性を増強させる方法（特許文献１２９）が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】欧州特許第０９５２１５９号明細書
【特許文献２】米国特許第４４５９２２５号明細書
【特許文献３】露国特許第号明細書  ２５００６８５  Ｃ２
【特許文献４】米国特許出願公開第２００８／００９４４８号明細書
【特許文献５】スロバキア特許第２７８１７０号明細書
【特許文献６】中国特許出願公開第１０２４７７４３６号明細書
【特許文献７】露国特許第２４１５８６６号明細書
【特許文献８】露国特許第２４９８９９５号明細書
【特許文献９】中国特許出願公開第１４８７０８５号明細書
【特許文献１０】中国特許出願公開第１０２８７６６８３号明細書
【特許文献１１】欧州特許第０６２５１６２号明細書
【特許文献１２】国際公開第２０１４／０２３１２９号
【特許文献１３】中国特許出願公告第１０２２８６０７９号明細書
【特許文献１４】中国特許出願公開第１０３３７４０６６号明明細書
【特許文献１５】中国特許出願公開第１０２６２８０４８号明細書
【特許文献１６】欧州特許第１３３６４０９号明細書
【特許文献１７】米国特許第７５９２３０９号明細書
【特許文献１８】中国特許出願公開第１０１５９１６６８号明細書
【特許文献１９】米国特許第７５９２３０９号明細書
【特許文献２０】中国特許出願公開第１０１５９１６６８号明細書
【特許文献２１】中国特許出願公開第０２９７７２０１号明細書
【特許文献２２】米国特許第５７７６８９６号明細書
【特許文献２３】米国特許第６６７０３２９号明細書
【特許文献２４】米国特許第６６１３７４５号明細書
【特許文献２５】米国特許第７９０２１５２号明細書
【特許文献２６】米国特許第７２９４６９７号明細書
【特許文献２７】中国特許出願公開第１３４５７５１号明細書
【特許文献２８】国際公開第００／２１２３１０号
【特許文献２９】国際公開第００／２０４５０４号
【特許文献３０】中国特許出願公開第１３５２１９５号明細書
【特許文献３１】米国特許出願公開第２００１／０１０６３３６号明細書
【特許文献３２】欧州特許出願公開第号０８３７１２８号明細書
【特許文献３３】米国特許第５９１２３３５号明細書
【特許文献３４】米国特許第５９５５３０９号明細書
【特許文献３５】米国特許出願公開第２００３／１６２９４５号明細書
【特許文献３６】国際公開第００／２００７２５号
【特許文献３７】豪国特許第７７９９９３号明細書
【特許文献３８】米国特許第６９９８２５５号明細書
【特許文献３９】米国特許第５８７４２５２号明細書
【特許文献４０】露国特許第２３８９５０９号明細書
【特許文献４１】露国特許第２４２９０１３号明細書
【特許文献４２】露国特許第２３３８５５５号明細書
【特許文献４３】露国特許第２４０６７２８号明細書
【特許文献４４】露国特許第２４２７３８７号明細書
【特許文献４５】露国特許出願公開第２０１１／１４９２６３号明細書
【特許文献４６】露国特許第２４７３５６４号明細書
【特許文献４７】露国特許第２４２７３８７号明細書
【特許文献４８】露国特許出願公開第２０１１／１０５２８０号明細書
【特許文献４９】国際公開第２０１２／００９０７５号
【特許文献５０】米国特許第７７３７２５０号明細書
【特許文献５１】米国特許出願公開第２０１３／２９６２４７号明細書
【特許文献５２】露国特許第２４４０１３０号明細書
【特許文献５３】国際公開第２００９／０６４４９７号
【特許文献５４】露国特許出願公開第２０１１／１１０１６９号明細書
【特許文献５５】露国特許出願公開第２００７／１１９３１３号明細書
【特許文献５６】露国特許第２２６６１２９号明細書
【特許文献５７】米国特許第８４６６２６７号明細書
【特許文献５８】米国特許出願公開第２００３／１０８９０６号明細書
【特許文献５９】米国特許出願公開第２００３／１３４３０１号明細書
【特許文献６０】米国特許出願公開第２００３／１３８８０３号明細書
【特許文献６１】米国特許出願公開第２００４／０５８３２６号明細書
【特許文献６２】露国特許出願公開第９８１／１８０９１号明細書
【特許文献６３】加国特許第２２１９４３７号明細書
【特許文献６４】米国特許第６５６６３２７号明細書
【特許文献６５】国際公開第２０１３／０７００７６号
【特許文献６６】米国特許第７２６１８８２号明細書
【特許文献６７】露国特許第２４７２８０７号明細書
【特許文献６８】露国特許出願公開第２０１２／１２４４３８号明細書
【特許文献６９】露国特許出願公開第２００８／１０３３１２号明細書
【特許文献７０】露国特許出願公開第２０１１／１４０３３５号明細書
【特許文献７１】露国特許出願公開第２０１１／１０４２２８号明細書
【特許文献７２】露国特許第２５１５１０８号明細書
【特許文献７３】露国特許出願公開第２０１１／１０４３４８号明細書
【特許文献７４】露国特許出願公開第２００４／１１４９８９号明細書
【特許文献７５】露国特許第２４３３１３３号明細書
【特許文献７６】露国特許出願公開第２０１２／１５４２１０号明細書
【特許文献７７】露国特許第２４１５１５１号明細書
【特許文献７８】露国特許第２４６７７６５号明細書
【特許文献７９】露国特許第２４８３７４７号明細書
【特許文献８０】露国特許第２４３４６３７号明細書
【特許文献８１】露国特許第２３４５７８５号明細書
【特許文献８２】米国特許出願公開２００４／０５３２４４第号明細書
【特許文献８３】米国特許出願公開第２００３／０７３１１５号明細書
【特許文献８４】国際公開第００／１６８８４３号
【特許文献８５】米国特許第６６９６４０８号明細書
【特許文献８６】米国特許第６５２５０２１号明細書
【特許文献８７】米国特許第７９３９４９３号明細書
【特許文献８８】露国特許出願公開第２０１２／１０６４６８号明細書
【特許文献８９】露国特許出願公開第２０１１／１３６４５４号明細書
【特許文献９０】露国特許第２４３０７５０号明細書
【特許文献９１】露国特許第２１８０８５２号明細書
【特許文献９２】特開２０００−１９８７４４号公報
【特許文献９３】露国特許第２３８５８７８号明細書
【特許文献９４】露国特許第２３８５８７８号明細書
【特許文献９５】露国特許出願公開第２０１２／１０６８２０号明細書
【特許文献９６】国際公開第０９／１０４０４１号
【特許文献９７】米国特許第５４４６０２６号明細書
【特許文献９８】米国特許第５７１００２４号明細書
【特許文献９９】国際公開第０９／８０３５３４号
【特許文献１００】米国特許第７１９３０７０号明細書
【特許文献１０１】米国特許第６０３３８７２号明細書
【特許文献１０２】国際公開第０９／９２８４９２号
【特許文献１０３】米国特許第５８２４５０４号明細書
【特許文献１０４】米国特許第６２７７９６０号明細書
【特許文献１０５】米国特許第６２７７９７７号明細書
【特許文献１０６】米国特許第５９５５３０号明細書
【特許文献１０７】米国特許第６２２１６２７号明細書
【特許文献１０８】米国特許出願公開第２００２／１０６７６６号明細書
【特許文献１０９】米国特許第５９９４０９８号明細書
【特許文献１１０】米国特許第６１７４９９４号明細書
【特許文献１１１】米国特許第６０３７１４６号明細書
【特許文献１１２】米国特許第５８７４２４３号明細書
【特許文献１１３】国際公開第００／１６６７１６号
【特許文献１１４】欧州特許第０８７０８２５号明細書
【特許文献１１５】米国特許第５９７２６０６号明細書
【特許文献１１６】中国特許出願公告第１９７８４６６号明細書
【特許文献１１７】国際公開第９９／４２４８０号
【特許文献１１８】米国特許第６００８０５０号明細書
【特許文献１１９】国際公開第２０１０／０６３１２２号
【特許文献１２０】米国特許第４６４９１９１号明細書
【特許文献１２１】韓国公開特許第２００９−００４１０６６号公報
【特許文献１２２】露国特許出願公開第２０１０／１４４７７８号明細書
【特許文献１２３】露国特許第２４２２４５９号明細書
【特許文献１２４】露国特許第２２９８５５９号明細書
【特許文献１２５】露国特許第２３９８７７６号明細書
【特許文献１２６】露国特許出願公開第２０１１／１４９７９６号明細書
【特許文献１２７】米国特許第８１８８０４８号明細書
【特許文献１２８】欧州特許第００９６５９２号明細書
【特許文献１２９】豪国特許第２００２２２８２６号明細書
【特許文献１３０】国際公開第２００９／０４３４６１号
【特許文献１３１】米国特許第８３７２８１７号明細書
【特許文献１３２】米国特許第８５７５３３０号明細書
【特許文献１３３】米国特許第８３６１９８５号明細書
【特許文献１３４】国際公開第２０１３／１２６９６３号
【特許文献１３５】米国特許第７１６６２７９号明細書
【特許文献１３６】国際公開第２０１３／１７７４８４号
【特許文献１３７】欧州特許第１４２５４０３号明細書
【特許文献１３８】中国特許出願公開第１０１５１８６５５号明細書
【特許文献１３９】特許第４８０３７８９号公報
【特許文献１４０】国際公開第２０１３／０３４１５７号
【特許文献１４１】中国特許出願公開第１０１６４８０１１号明細書
【特許文献１４２】米国特許出願公開第２００６／１５４８８６号明細書
【特許文献１４３】中国特許出願公開第１０１６４８０１１号明細書
【特許文献１４４】米国特許出願公開第２００６／１５４８６号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
生産の面でより簡単で、低価格の、高効率鎮痛剤を用いる方が得策である。
【００１８】
麻痺、全身痛、カウザルギー（灼熱痛）を含む、末梢神経血管疾患などの予防及び／又は治療薬として、ヒト好中球タンパク質１（ＨＮＰ−１）を単独又は神経ペプチドＭと組み合わせて利用する方法（特許文献１３０）が知られている。
【００１９】
抗体応答を含む免疫応答の誘導原としてみなされていなかった、タンパク質の特性を持った分子の利用は、まさにそれらの結果によって複雑化され、そのことが、例えば、自己抗体の形成に関連する副作用を引き起こすこともあり得る。
【００２０】
炎症痛又は耐え難い慢性痛、とくに臨床慢性疼痛及び火傷痛を緩和するための、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸皮下受容体のサブユニットＮＲ１の遺伝子ノックダウンのために小さな干渉ＲＮＡ及び短鎖ヘアピンＲＮＡを利用する方法（特許文献１３１，特許文献１３２，特許文献１３３）が知られている。慢性的疼痛の治療のために、干渉剤としてのＲＮＡ（特許文献１３４）が知られている。しかしながら、ＲＮＡ薬剤は、生体外においては、かなり急速に破壊され、特殊な保存条件を要するため、ＲＮＡをベースとした薬剤の工業的使用には疑問の余地がある。
【００２１】
長期鎮痛法が知られており、この場合には、患者に筋原細胞が投与され、その筋原細胞中で、オピオイド受容体を活性化又はＰ物質と受容体との結合を媒介するペプチドが当該ＤＮＡから合成される（特許文献１３５）。しかしながら、この方法の実施はかなり複雑であり、多くのリスクを伴う。
【００２２】
タンパク質、ＲＮＡ又はＤＮＡを用いる抑鬱症及び痛みの治療法が知られている（特許文献１３６）。狂犬病ウイルスのＧタンパク質を含む、疼痛治療用のレンチウイルス・ベクター（特許文献１３７）、及びＩＬ−２４をコード化するアデノウイルス（特許文献１３８）が知られており、その中には癌の痛みを治療する物質も含まれている。レンチウイルス、レトロウイルス、仙台ウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスの遺伝子伝播のためのベクターから合成されるオンコスタチンＭ又はその同型が知られ、その中には痛みの治療に使用されるものもある（特許文献１３９）。アロジニア、痛覚過敏症、自発性疼痛及び幻肢痛を、ポリペプチドとして提供されるか、あるいはコメチン発現用の発現ベクターの投与によって得られるコメチン・ポリペプチド（ｃｏｍｅｔｉｎ  ｐｏｌｙｐｅｔｉｄｅ）（当該タンパク質によって形成もしくは形質移入された細胞株及び上記の細胞を含むカプセル）を用いて治療する方法が知られている（特許文献１４０）。ウイルスベクターには、それらが高価であり、炎症反応を起こす可能性があるために、ベクターの再挿入ができなくなるなどの、多くの欠点がある。また、ウイルスベクターには自己複製する能力があり、そのためターゲットタンパク質の発現制御度を低下させ、そのことによって、とくに鎮痛の面では、必ずしも望ましいとは言えず、いつも適用可能とはみなせない。
【００２３】
腫瘍の痛みの治療も含め、腫瘍をターゲットとし、シクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）をコード化する遺伝子、マウス・ユビキチン（Ｍｕｂｉ）及びＤＮＡの免疫刺激配列（ＩＳＳ）（ｐＶＡＸ１−ｍＵｂｉ−ＩＳＳ−ＣＯＸ−２−ＩＳＳ）を含む、ｐＶＡＸ１ベクターをベースとした組換えＤＮＡワクチンが知られている（特許文献１４１）。しかしながら、この構造は、免疫応答を起こさせることを狙いとしており、細胞毒性作用を有するものであり、それゆえ、免疫反応活性を条件付け、強化する要素が導入されている。その中には、プラスミドＤＮＡなどのベクター及び痛みの軽減、予防又は治療のための、製薬上許容される添加剤もしくはアジュバントを含む製剤組成物も知られており、その際このベクターには、受容体ＶＲ１の発現を調整する、少なくとも一つの領域を含む核酸配列が含まれている（特許文献１４２）。この場合、鎮痛は、イオンチャネル−非特異的カチオン導体と結合した受容体をブロックすることによって行われる。哺乳類の細胞中でディフェンシンが合成される遺伝子を担うプラスミドＤＮＡを、鎮痛作用誘導剤として利用することによっても、生体中で病原体が発展する可能性を最小限に抑えることができる。しかし一般に、病因がいかなるものであれ、痛みがあれば、気分は悪くなり、生体の感染に対する対抗力は減少し、その結果、例えば手術後に、抗生物質が処方されることになるかもしれないが、天然の抗菌性ペプチドを使用すれば、鎮痛効果と防護効果を統一することができ、その結果、抗生物質の服用を避けることができる。
【００２４】
本発明に近い類似型は、（特許文献１４３，１４４）に記載されている発明であり、そこにはプラスミドＤＮＡの形における鎮痛剤が開示されている。
【００２５】
発現ＤＮＡベクターを筋肉内に注射した場合、それは、筋肉細胞によって吸収され、挿入されるベクターにおいてコード化されたタンパク質の発現が起こることが示された［Ｊ．Ａ．  Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７，１４６５（１９９０）；Ｇ．Ａｓｃａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２，８１５（１９９１）］。プラスミドがエピソームの形で維持され、自己複製されないことが示された。また、ラット、魚類及び霊長類の骨格筋ならびにラットの心筋においても、筋肉内注射後、絶えず発現が生ずることが示された［Ｈ．Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８２，２２１７（１９９０）；Ｒ．Ｎ．Ｋｉｔｓｉｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，（ＵＳＡ）８８，４１３８（１９９１）；Ｅ．Ｈａｎｓｅｎ  ｅｔ．  ａｌ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ２９０，７３（１９９１）；Ｓ．Ｊｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３，２１（１９９２）；Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ，Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１，３６３（１９９２）］。プラスミドＤＮＡを様々な組織の細胞に運ぶ別のテクノロジー、例えば、生きた動物の様々な組織の細胞への運搬を行うことができる噴射式注射器を利用することも可能である［Ｆｕｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０５，３６５−３６８，（１９９２）］。
【００２６】
通常、筋線維は主要組織適合遺伝複合体（ＭＨＣ）の抗原を発現しないが、感染に関連した炎症が見られる場合は、あるいはインターフェロン−γがある場合は、筋線維は、クラス１ＭＨＣとの複合体の形、もしくはクラス２ＭＨＣさえとの複合体の形における抗原を産生する能力をもつことが示されている［ＭＥＣＫＥＲＴ，Ｐ．Ｃ，ＨＯＮＴＥＢＥＹＲＩＥ−ＪＯＳＫＯＷＩＣＺ，Ｍ．，ＣＨＡＭＢＯ，Ｊ．，ＬＥＶＩＮ，Ｍ．，ａｎｄ  ＬＡＧＵＥＮＳ，Ｒ．Ｐ．（１９９１）．Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ：Ａｂｅｒｒａｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｉｎ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ａｎｄ  ｈｅａｒｔ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃａｌｌｙ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｍｉｃｅ．  Ｅｘｐ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．７２，８−１４；Ｈｏｈｌｆｅｌｄ  ａｎｄ  ＥＮＧＥＬ，Ａ．Ｇ．（１９８４）Ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｍｕｓｃｌｅ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １５，２６９−２７４．；ＭＡＮＴＥＧＡＺＺＡ，Ｒ．，ａｎｄ  ＢＥＲＮＡＳＣＯＮＩ，Ｐ．（１９９４）．Ｃｅｌｌｕｌａ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ｍｙｏｓｉｔｉｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．６，５６８−５７４，Ｈａｒｉｋｋａ  Ｊ，Ｓａｗｄｅｙ  Ｍ，Ｃｏｒｎｅｆｅｒｔ−Ｊｅｎｓｅｎ  Ｆ，Ｍａｒｇａｌｉｔｈ  Ｍ，Ｂａｒｎｈａｒｔ  Ｋ，Ｎｏｌａｓｃｏ  Ｍ，Ｖａｈｌｓｉｎｇ  ＨＬ，Ｍｅｅｋ  Ｊ，Ｍａｒｑｕｅｔ  Ｍ，Ｈｏｂａｒｔ  Ｐ，Ｎｏｒｍａｎ  Ｊ，Ｍａｎｔｈｏｒｐｅ  Ｍ．Ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｄｉｒｅｃｔ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１９９６  Ｊｕｎ  ２０；７（１０）：１２０５−１７］。それゆえ、筋組織の損傷が最小限に抑えられた形におけるプラスミドＤＮＡの挿入が望ましい。
【００２７】
動物実験において免疫原性が見られた場合でさえも、ヒトにおいては、プラスミドＤＮＡをベースにした薬剤に免疫原性が見られないことが示された［Ｓａａｄｅ  Ｆ，Ｐｅｔｒｏｖｓｋｙ  Ｎ．Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ．２０１２  Ｆｅｂ；１１（２）：１８９−２０９．ｄｏｉ：１０．１５８６／ｅｒｖ．ｌ  １．１８８］。研究者たちはまた、マウス又はウサギにＤＮＡの再注射を行ったのちに、病変の証拠を見出すことができなかった［Ｐａｒｋｅｒ  ＳＥ，Ｂｏｒｅｌｌｉｎｉ  Ｆ，Ｗｅｎｋ  ＭＬ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ｍａｌａｒｉａ  ｖａｃｃｉｎｅ：ｔｉｓｓｕｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓａｆｅｔｙ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ａｎｄ  ｒａｂｂｉｔｓ．Ｈｕｍ．ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１９９９；１０（５）：７４１−７５８．］。２００７年、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、ＤＮＡワクチンに関して、自己免疫疾患に対する効果の評価には、前臨床試験は必要とされないとの結論に達した。
【００２８】
プラスミドＤＮＡには、しかるべき制御配列とともに、生体がそれを維持し、利用するために必須の要素が含まれていなければならない。制御配列とは、転写及び／又は翻訳のレベルにおける遺伝子発現及びプラスミドＤＮＡの機能の存在及び維持を可能にするメカニズムに影響を与えることができるヌクレオチド配列である。
【００２９】
原核生物系にとって本質的であるのは、複製開始点及びレポーター遺伝子である。プラスミドＤＮＡの細菌要素は、哺乳類の細胞における発現に悪影響を及ぼしてはならず、プラスミドＤＮＡの使用による副作用の条件を生み出してはならない。文献には、レポーター遺伝子として、アンピシリン耐性遺伝子を利用することは、患者にアンピシリンに対する反応が進行するので、望ましくないかもしれないというデータが見られるが、本発明の考案者たちは、このような結果はプラスミドＤＮＡの精製の質が低いことによるものであり、要素そのものによるものではないと考える。
【００３０】
哺乳類にプラスミドを利用する場合の本質的な要素は、プロモーター、ｍＲＮＡリーダー配列、転写終結配列である。
【００３１】
プロモーターは、ターゲット遺伝子の発現を開始させる、重要なプラスミドの成分である。薬剤成分としてのプラスミドＤＮＡにとっての古典的なプロモーターは、最初期のヒト巨細胞ウイルス（ＣＭＶ）又はＣＭＶチキンβアクチンプロモーター（ＣＡＧＧプロモーター）である。ＣＭＶのプロモーターは、それらが、哺乳類の広範囲の組織において高水準の構成的発現を媒介するので、大半のＤＮＡワクチンに利用されており［Ｍａｎｔｈｏｒｐｅ  Ｍ，Ｃｏｒｎｅｆｅｒｔ−Ｊｅｎｓｅｎ  Ｆ，  Ｈａｒｉｋｋａ  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｂｙ  ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ：ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｆｉｒｅｆｌｙ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１９９３；４（４）：４１９−４３１］、下流の読み取りを抑圧しない。ＣＭＶプロモーターが変化する際、例えば、巨細胞ウイルス（ＣＭＶ）のプロモーターの下流ＨＴＬＶ−１Ｒ−Ｕ５が取込まれた際、またはキメラプロモーターＳＶ４０−ＣＭＶが用いられた際に、発現レベルの増強が認められる［Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＪＡ，Ｃａｒｎｅｓ  ＡＥ，Ｈｏｄｇｓｏｎ  ＣＰ．Ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｖｅｃｔｏｒ  ｄｅｓｉｇｎ：ｉｍｐａｃｔ  ｏｎ  ｅｆｆｉｃａｃｙ，  ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｕｐｓｔｒｅａｍ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．２００９；２７（４）：３５３−３７０］。ＣＭＶプロモーターの代案となるのが、ホストの組織特異的プロモーターであり、それらは不適当な組織における抗原の構成的発現を避けることができ、そのことによって、全体として免疫原性が低減する［Ｃａｚｅａｕｘ  Ｎ，Ｂｅｎｎａｓｓｅｒ  Ｙ，Ｖｉｄａｌ  ＰＬ，Ｌｉ  Ｚ，Ｐａｕｌｉｎ  Ｄ，Ｂａｈｒａｏｕｉ  Ｅ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｎｓｅｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｆｔｅｒ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ＨＩＶ−１  Ｎｅｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＭＶ−ＩＥ  ｏｒ  ｔｈｅ  ｍｕｓｃｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｄｅｓｍｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ．Ｖａｃｃｉｎｅ．２００２；２０（２７−２８）：３３２２−３３３１］。
【００３２】
ｍＲＮＡのリーダー配列も大きな役割を果たす。ＡＴＧ開始コドン直前のコザック配列によって発現を強化することができる［Ｋｏｚａｋ  Ｍ．Ｒｉｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＡＵＧ  ａｎｄ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｉｎｉｔｉａｔｏｒ  ｃｏｎｄｏｎｓ  ｉｓ  ａｕｇｍｅｎｔｅｄ  ｂｙ  Ｇ  ｉｎ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ＋４  ｂｕｔ  ｉｓ  ｎｏｔ  ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  ａｆｆｅｃｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｍｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｉｎ  ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ＋５  ａｎｄ  ＋６．ＥＭＢＯ  Ｊ．１９９７；１６（９）：２４８２−２４９２］。プロモーターのプラスミド下流にイントロンが存在することによって、ｍＲＮＡの安定性を高まり、遺伝子発現が増大する。
【００３３】
種特異的コドンを用いることによって、遺伝子発現を増大させることができる［Ｆｒｅｌｉｎ  Ｌ，Ａｈｌｅｎ  Ｇ，Ａｌｈｅｉｍ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｄｏｎ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍＲＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｉｅｌｙ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ３／４Ａ  ｇｅｎｅ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００４；１  １（６）：５２２−５３３］。
【００３４】
ｍＲＮＡの安定性を維持し、ｍＲＮＡの転写をしかるべく中止し、核からｍＲＮＡを送り出すために不可欠な転写終結配列に対して、短縮などの変更を加えることによって、諸遺伝子の発現に影響を及ぼすことができる。多くの現代的ＤＮＡワクチンにおいて、ウシ成長ホルモンの転写ターミネーター配列が利用されている［Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ  ＤＬ，Ｓｈｉｖｅｒ  ＪＷ，Ｌｅａｎｄｅｒ  ＫＲ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ａｎｄ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ：ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｖｅｃｔｏｒｓ．ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９３；１２（９）：７７７−７８３］。ポルアルデニル化（ｐｏｌｙＡ）は、遺伝子転写物の安定化に不可欠である。ｐｏｌｙＡの配列変更によって、遺伝子発現レベルが向上する［Ｎｏｒｍａｎ  ＪＡ，Ｈｏｂａｒｔ  Ｐ，Ｍａｎｔｈｏｒｐｅ  Ｍ，Ｆｅｉｇｎｅｒ  Ｐ，Ｗｈｅｅｌｅｒ  Ｃ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ−ｂａｓｅｄ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｖａｃｃｉｎｅ．１９９７；１５（８）：８０１−８０３］。プラスミドｐＶＡＸ１（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）において、ウシ成長ホルモンのターミネーターの領域には、ヌクレアーゼに対して高感度なホモプリンの領域が含まれている。代替えｐｏｌｙＡによって、ヌクレアーゼに対するプラスミドの安定性を著しく向上させることができることが示されている［Ａｚｚｏｎｉ  ＡＲ，Ｒｉｂｅｉｒｏ  ＳＣ，Ｍｏｔｅｉｒｏ  ＧＡ，Ｐｒａｚｅｒｅｓ  ＤＭＦ．Ｔｈｅ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｎｇｎａｌｓ  ｏｎ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｎｕｃｌｅａｓｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．２００７；９：３９２−１０２］。二つの終止コドンを導入することによって転写ターミネーターの効率を高めることができる。
【００３５】
目的を達成するための、プラスミドの最適構造は、哺乳類において、生産過程における高コピー数及び高発現レベルを保障するために、「細菌要素」と「真核細胞要素」とを統一し、しかるべき制御配列を備えたものでなければならない［Ｓａａｄｅ  Ｆ，Ｐｅｔｒｏｖｓｋｙ  Ｎ．Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ．２０１２  Ｆｅｂ；１  １（２）：１８９−２０９．ｄｏｉ：１０．１５８６／ｅｒｖ．１  １．１８８］。
【００３６】
本発明に従って鎮痛剤を作るために、プラスミドＤＮＡを用いることができるが、このプラスミドＤＮＡは、少なくとも、ヒトを含む哺乳類の生体内へ送り、発現させるために標準的に用いられおり、２００９年のウィリアムズ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）その他の論考に詳述されている［Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＪＡ，  Ｃａｒｎｅｓ  ＡＥ，Ｈｏｄｇｓｏｎ  ＣＰ．Ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｖｅｃｔｏｒ  ｄｅｓｉｇｎ：ｉｍｐａｃｔ  ｏｎ  ｅｆｆｉｃａｓｙ，  ｓａｆｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｕｐｓｔｒｅａｍ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．２００９；２７（４）：３５３−３７０］ものも含め、上記仕様に従って最適化されたものでなければならない。米国食品医薬品局のガイドライン（２００７年）においては、生体内に導入された後の物質の体内分布の研究が、新たな遺伝子のクローン化によってプラスミドベクターの中へ生産されるＤＮＡワクチンに対しては取り消されることもあり得ることが表明された。この際、プラスミドベクターに関しては、以前に、許容可能な生体内分布及び統合プロファイルが文書で確定されている。ＷＨＯのガイドライン（２００７年）では、ほぼ同一又は類似の生産物の取り扱いの経験があまり蓄積されていない場合には、生物の分布及び保存の研究が必要とされることが表明された。欧州薬品審査庁（ＥＭＥＡ）のガイドライン（２００６年）では、ベクター系の取り扱いの経験を積むことによって、前臨床試験を最適化し、焦点のあったものにすることができることが表明された。クローン化された様々な遺伝子を用いたＤＮＡベクター利用の安全性に関する研究によって、類似の生体内分布［Ｓｈｅｅｔｓ  ＲＬ，Ｓｔｅｉｎ  Ｊ，Ｍａｎｅｔｚ  ＴＳ，Ｄｕｆｆｙ  Ｃ，Ｎａｓｏｎ  Ｍ，Ａｎｄｒｅｗｓ  Ｃ，Ｋｏｎｇ  ＷＰ，Ｎａｂｅｌ  ＧＪ，Ｇｏｍｅｚ  ＰＬ，Ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ＨＩＶ−１，Ｅｂｏｌａ，Ｓｅｖｅｒｅ  Ａｃｕｔｅ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ，  ｏｒ  Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ  ｖｉｒｕｓ  ｉｓ  ｓｉｍｉｌａｒ，  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ，  ｄｅｓｐｉｔｅ  ｄｉｆｆｅｒｉｎｇ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｂａｃｋｂｏｎｅｓ  ｏｒ  ｇｅｎｅ  ｉｎｓｅｒｔｓ．Ｓｈｅｅｔｓ  ＲＬ，Ｓｔｅｉｎ  Ｊ，Ｍａｎｅｔｚ  ＴＳ，Ｄｕｆｆｙ  Ｃ，Ｎａｓｏｎ  Ｍ，Ａｎｄｒｅｗｓ  Ｃ，Ｋｏｎｇ  ＷＰ，  Ｎａｂｅｌ  ＧＪ，  Ｇｏｍｅｚ  ＰＬ．Ｔｏｘｉｃｏ  Ｓｃｉ．２００６  Ｊｕｎ；９１（２）：６１０−９．Ｅｐｕｂ  ２００６  Ｍａｒ  ２８．］及び毒物管理［Ｓｈｅｅｔｓ  ＲＬ，Ｓｈｅｅｔｓ  ＲＪ，Ｓｔｅｉｎ  Ｊ，Ｍａｎｅｔｚ  ＴＳ，Ａｎｄｒｅｗｓ  Ｃ，Ｂａｉｌｅｒ  Ｒ，Ｒａｔｈｍａｎｎ  Ｊ，Ｇｏｍｅｚ  ＰＬ，Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓａｆｅｔｙ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ＨＩＶ−１，Ｅｂｏｌａ，  Ｓｅｖｅｒｅ  Ａｃｕｔｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ，  ｏｒ  Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ  ｖｉｒｕｓ  ｉｓ  ｓｉｍｉｌａｒ  ｄｅｓｐｉｔｅ  ｄｉｆｆｅｒｉｎｇ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｂａｃｋｂｏｎｅｓ  ｏｒ  ｇｅｎｅ−ｉｎｓ��ｒｔｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｓｃｉ．２００６  Ｊｕｎ；９１（２）：６１０−３０．Ｅｐｕｂ  ２００６  Ｍａｒ  ２８］が示された。ヒトを除く哺乳類に用いるためのプラスミドＤＮＡに対しては、要件はそれほど厳しくなく、それゆえ、より広範囲のプラスミドを利用することができる。
【００３７】
ヒト用に用いることを目的としたＤＮＡにとっては、製薬上許容できる担体もしくは緩衝液においてＤＮＡの最終産生物を生産することが有益であるかもしれない。製薬上許容できる担体もしくは緩衝液は、先行技術において知られており、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載されているような様々な文献に記述されているものを含む。
【００３８】
発明諸形態の原型は、世界特許協力条約国際出願ＷＯ  ２００９／０４３４６１  Ａ１「痛み等の治療用としてのディフェンシンＨＮＰ−１の適用」において開示されている発明である。
【００３９】
ディフェンシンは、いくつかの（通常三つの）ジスルフィド結合によって安定化された、低分子（３〜５ｋＤａ）のシステインに富むカチオン性ペプチドの大きな科を構成し［Ｇａｎｚ，Ｔ．２００２．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９８：９７７−９７９，Ｌｅｈｒｅｒ，Ｒ．Ｉ．ａｎｄ  Ｇａｎｚ，Ｔ．２００２．Ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ  ｏｆ  ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  ａｎｉｍａｌｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：９６−１０２．］、このペプチドが、様々な細菌、真菌及びエンベロープウイルスを含む広範囲の病原体に対する殺菌能力を有する。ヒトでは、この科は、ディフェンシンのα亜科（ＨＮＰ）及びβ亜科（ｈＢＤ）の形をとる。αディフェンシンは、好中球及びパネート細胞の形をとることが最も多い。ＨＮＰ−１及びＨＮＰ−３は、その成分に合計３０のアミノ酸残基を含み、これらのペプチドは、位置１におけるアラニンのアスパラギンへの置換を除けば、相互に同一である。ＨＮＰ−２はＨＮＰ−１及びＨＮＰ−３のタンパク質分解産物であり、２９のアミノ酸残基を含む（Ｎ−末端基をもつ第１番目のアミノ酸が欠けている）。ジスリフィド結合の存在によって、ディフェンシン分子の、白血球及び微生物のタンパク質分解酵素に対する安定性の維持ならびに炎症及び組織破壊の病巣における抗生物質特性の維持が保障される［Ｌｅｖｙ  Ｏ．Ａｎｔｉｍｉｃｏｂｉａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ａｎｔｉ−ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ．Ｊ．ｏｆ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．２００４；７６：９０９−９２６］。正しい空間構造の当該分子の生成は、かなり困難な課題である。
【００４０】
ディフェンシンをコード化する遺伝子は、８番染色体の遺伝子座ｐ２２〜２３においてクラスターを形成する。ＨＮＰ１〜３は、二つの遺伝子ＨＤＥＦＡ１及びＨＤＥＦＡ３によってコード化される。ディフェンシンのそれぞれの遺伝子は、プレプロペプチドをコード化するいくつかのエクソンを含んでいる。
【００４１】
最初にディフェンシンは、長さが９４アミノ酸残基であるプレプロペプチドとして前駆体の形で合成される。プレプロペプチドは、信号部位（平均で１９アミノ酸残基）、アニオン部位（平均４５アミノ酸残基）及び「成熟した」ペプチドそのものを含んでいる。プレプロペプチドの小胞体におけるタンパク質分解切断の結果、信号部位が除去され、プロディフェンシン（平均７５アミノ酸残基）が形成される。それに続く残基の成熟（４５アミノ酸残基の切断）が、成熟好中球顆粒で起きる。αディフェンシンもＮＫ細胞、Ｂリンパ球、γδＴリンパ球、単球（マクロファージ）及び上皮細胞の中で発見された［Ａ．Ｓ．ブジーヒナ、Ｂ．Ｖ．ピネーギン。ヒト多機能カチオン性ペプチドとしてのディフェンシン。免疫病理学、アレルギー学、感染症学。２００８年Ｎｏ．２：３１−４０］。本発明の考案者たちによって、ＨＮＰ−１／ＨＮＰ−２／ＨＮＰ−３をコード化する遺伝子を担うプラスミドＤＮＡの投与によって、鎮痛作用がもたらされることが初めて示され、その際、血清中のβエンドルフィンのレベルの上昇が観察された。
【００４２】
類似型と原型の欠点は、これらについての記述のすぐ後に記載されている。特許申請済みの発明（発明の諸形態）には、これらの欠点はない。
【課題を解決するための手段】
【００４３】
本発明の諸形態を利用して得られる技術的効果は、第一に、鎮痛剤の範囲の拡大という形で現れる。類似型が耐久性に欠けるか、全く耐久性がないのに対して、本発明による鎮痛法の一つを用いれば、鎮痛を行うことができ、そのことによって患者は、行うことができなかった、もしくは鎮痛法なくしては行うことを望まなかった行動を行うことができるようになり、必要な治療を受ける決心をすることができるほか、鎮痛剤を用いなかったときに比べ不快感を減らし、急性又は慢性の疼痛を緩和するなど、ＱＯＬを改善することができるだろう。上記の技術的効果は、本発明（諸発明形態）による鎮痛剤を用いることによって達成される。
【００４４】
このほか、技術的効果として、鎮痛期間の長期化を上げることができるが、これは、以下のことによって達成される：  生体に投与された後、ヒトのαディフェンシンＨＮＰ−１、ＨＮＰ−２、ＨＮＰ−３の合成に寄与する、プラスミドＤＮＡが使用されること；  ヒトのディフェンシンをコード化する核酸配列が、ｍＲＮＡを安定化させるとともに、それに応じて、ｍＲＮＡの半減期を延長させる要素を含み、その結果ｍＲＮＡの一分子からのタンパク質合成回数が増え、その結果、タンパク質の合成量が増えること；  ヒトのαディフェンシンの核酸配列のコドンが、哺乳類における発現を促すように最適化されており、その結果タンパク質の合成がより集中的に行われること。上記の方法の実施により、プラスミドＤＮＡの投与量が、現在、ロシア国内及び世界の遺伝子治療で実際に使用されている量に比べ、著しく（１/１０〜１/５０）削減することができる。
【００４５】
このほか、技術的効果は、鎮痛処置の安全性が高まる点にある。この技術的効果は、以下のことによって達成される：  抗体が形成され、分子をそれが由来する生体で使用する場合、副作用を起こしかねないタンパク質ではなく、エピソームの形で存在し、ゲノムに統合せず、のちにそこからヒトタンパク質が合成され、細胞から分泌するプラスミドＤＮＡが、反応物質として使用され、その結果、鎮痛用として、ヒトのディフェンシンが非免疫原性的に、安全に使用されることによって、この技術的効果は達成される。上記技術的効果は、プラスミドＤＮＡから生体内で合成されるタンパク質が、自然な翻訳後プロセシングを受け、細胞のシャペロンによって正しいフォールディングが行われることによっても達成される。タンパク質を生成する際、この修飾は、たやすい作業ではないため、これらのタンパク質の一連の機能に著しい影響を及ぼす。上記技術的効果は、毒性生成物なしに、反応物質の代謝及び異化の自然なメカニズムが用いられていることによっても達成され、プラスミド構造及びそれによってコード化されるタンパク質の天然の性質のおかげであり、また形成されるタンパク質と本来備わっている類似型タンパク質との同一性のおかげでもある。上記技術的効果は、また、プラスミドＤＮＡが哺乳類の生体に投与された後、自己複製しないので、合成されるタンパク質の量を管理することができ、したがって鎮痛処理の管理を行うことができることによっても達成される。プラスミドＤＮＡには、例えば、サイレンサー及び／又はインシュレーターのような制御配列があり、このことによっても、タンパク質合成量の管理が行われ、従って、おおむねタンパク質の合成そのものによって、鎮痛処理管理（必要に応じて、短期間で、遺伝子発現を停止もしくは減少させることが可能）が行われ、このこともまた、上記技術的効果の達成に寄与する。この発明形態の場合、必要に応じて、組織特異的発現を行うことも可能である。
【発明の効果】
【００４６】
技術的効果は、生体外タンパク質薬剤の生産及び精製の過程を避け、生体内でタンパク質の合成を行うことによって、鎮痛剤の生産を単純化し、コストを削減する点にもある。ＤＮＡ薬剤の生産、精製及び保存は、タンパク質に比べ、経済的に有利である。というのも、前者がより安定しているため、より少ない経費で、大量に産生できるからである。
【００４７】
血漿中のβエンドルフィンの濃度変化は、疼痛症候群の種類及びその強さならびに鎮痛剤の効率に直接依存しており、鎮痛効果の評価基準となることが示されている［癌患者の急性疼痛及び慢性疼痛症候群に対する鎮痛効果のマーカーとしてのβエンドルフィン／Ｚ．Ｖ．パーヴロワ、その他／／臨床医学の諸問題。−２００７年．−Ｎ１．−Ｃ．３６−４０．−ＩＳＳＮ  １８１７−８３５９］。本発明に従った鎮痛剤を投与した場合、血清中のβエンドルフィンのレベルの向上が観察された（図３）。
【００４８】
時間特性に従って、痛みを二つのタイプに分けることができる：
＊  急性疼痛、すなわち、損傷と不可分に結びついた、一般に何らかの症候としての、新たな、つい最近痛み出した疼痛は、損傷を取り除くことによって消える［Ｅｄｄｙ  Ｎ．Ｂ．，Ｌｅｉｍｂａｃｈ  Ｄ．Ｊ．／／Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ．−Ｍａｒ；１０７（３）３８５−９３．−１９５３］。そこには、手術前後の痛み、外傷後の疼痛、火傷の痛み、分娩時の激痛、脊髄外傷による疼痛、激しい頭痛、ＨＩＶ／ＡＩＤＳの痛み、鎌状赤血球クリーゼ、三叉神経症、膵臓炎及びその他の胃腸管の疾患による痛み、心筋梗塞及びその他の心臓疾患に伴う痛み、（診断時及び治療時における）侵襲性介入による痛み、２〜３か月間つづき、痛みが放散する慢性疼痛の激化も含まれる［ＷＨＯ  Ｎｏｒｍａｔｉｖｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｏｎ  Ｐａｉｎ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，  Ｇｅｎｅｖａ  Ｊｕｎｅ  ２００７］。
＊  慢性疼痛、すなわち、長期間（２〜３か月超）継続する痛み及び痛みの原因を除去したのちも一つの個別疾患とみなされる、例えば炎症痛のような痛み［Ｅｄｄｙ  Ｎ．Ｂ．，Ｌｅｉｍｂａｃｈ  Ｄ．Ｊ．／／Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ．−Ｍａｒ；１０７（３）：３８５−９３．−１９５３］で、その際、鎮痛効力の減衰が認められる痛み。（癌患者、ＨＩＭ／ＡＩＤＳ患者の痛み、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症による痛み、器官障害の最終段階の痛み、広範囲の慢性閉鎖性肺疾患、広範囲の鬱血性心不全、パーキンソン病の痛みを含む）悪性疾患に伴う慢性的痛みが、慢性的疼痛とみなされるほか、悪性疾患と結びつかない以下のような慢性的痛みも慢性疼痛とみなされる：背中の痛み又は腰痛のような慢性筋骨格系疼痛、慢性的変性性関節炎、骨関節炎、リューマチ性関節炎の痛み、筋筋膜疼痛及びリューマチ痛、慢性頭痛、偏頭痛、骨の痛み、神経因性疼痛（神経性圧迫、外傷、神経に障害を受けたのち及び切断後の痛みを含む）、糖尿病性の神経障害に伴う痛み、複合性局所疼痛症候群（タイプＩ及びタイプII）、骨格筋の痙攣、帯状疱疹後神経痛に伴う痛み、外科手術後の慢性疼痛、内臓痛（体腔拡張に伴う痛み及びさしこみ）、及び鎌状赤血球症に伴う慢性疼痛［ＷＨＯ  Ｎｏｒｍａｔｉｖｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｏｎ  Ｐａｉｎ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，  Ｇｅｎｅｖａ  Ｊｕｎｅ  ２００７］。
【００４９】
本発明による鎮痛剤を用いることによって、上記両タイプの痛みを軽減し、均一化することができる。周知の通り、哺乳類の細胞中で、自らを原料としてヒトαディフェンシンを合成するプラスミド鎮痛剤が知られている。プラスミドＤＮＡの要素が多数にのぼり、それらの性格も多様であるので、より詳しい仕様明細が必要となる。「発明の本質」及び「発明の詳細な記述」の部に記載されている発明の仕様は、「特許請求の範囲」を明確化し、プラスミドＤＮＡの主要要素についての詳述を含んでいるので、提案されている全ての実施例において発明を実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】ホットプレートテストの結果を示すグラフである（横軸は足舐め行動までの潜時、縦軸は被験物質投与後の時間である。凡例  １：ネガティブコントロール（生理食塩水を投与）、２：ｐＶＡＸ１ｓｅｑ３、３：ｐＶＲ１０１２ｓｅｑ４、４：ｐＶＲ１０１２ｓｅｑ５、５：ｐＶＡＸｌｓｅｑ６、６：ｐＶＲ１０１２ｓｅｑ９、７：ｐＶＡＸ１ｓｅｑ１０、８：ｐＶＡＸ１ｓｅｑ１１、９：ｐＶＲ１０１２ｓｅｑ１２、１０：ｐｃＤＮＡ３．１＋ｓｅｑ１１、１１：ｐｃＤＮＡ３．１＋（ｖａｒ）ｓｅｑ１２、１２：アナルギン（５０ｍｇ／ｋｇ）、１３：モルヒネ塩酸塩（１０ｍｇ／ｋｇ）、１４：ｐＶＡＸ１、１５：ｐＶＲ１０１２、１６：ｐｃＤＮＡ３．１＋、１７：ｐｃＤＮＡ３．１＋（ｖａｒ）。プラスミドＤＮＡは、５ｍｇ／ｋｇの量にて投与）。
【図２】ホットプレートテストにおける、様々な投与量のプラスミドＤＮＡ（ｐＶＡＸ１ｓｅｑ３）の検査結果を示すグラフである（横軸は足舐め行動までの潜時、縦軸は被験物質投与後の時間である。凡例  １：ネガティブコントロール（生理食塩水を投与）、２：ｐＶＡＸ１ｓｅｑ３  １ｍｇ／ｋｇ、３：ｐＶＡＸ１ｓｅｑ３  ５ｍｇ／ｋｇ、４：ｐＶＡ１ｓｅｑ３  １０ｍｇ／ｋｇ、５：アナルギン（５０ｍｇ／ｋｇ）、６：モルヒネ塩酸塩（１０ｍｇ／ｋｇ））。
【図３】マウス血清中におけるβエンドルフィンの濃度変化についての試験結果を示すグラフである（横軸は被験物質投与後の時間、縦軸は血清中におけるβエンドルフィンの濃度である。凡例  １：ネガティブコントロール（生理食塩水を投与）、２：ｐＶＲ１０１２、３：ｐＶＲ１０１２ｓｅｑ４。プラスミドＤＮＡは、５ｍｇ／ｋｇの量にて投与）
【発明を実施するための形態】
【００５１】
本発明では、哺乳類の細胞において一過性発現を行うプラスミドＤＮＡが提案されており、このプラスミドＤＮＡは、原核生物の要素、複写開始点、レポーター遺伝子、真核生物の要素、強力なプロモーター、ｍＲＮＡのリーダー配列及び上記諸要素のための制御配列、目的遺伝子のクローン化のための一つのサイト、望ましくはそのための複数のサイト、分析用のプライマー植付け用の一つのサイト、望ましくはそのための複数のサイトを含む骨組によって構成されるとともに、分泌配列及び哺乳類用にコドンが最適化されたαディフェンシンＨＮＰ−１又はＨＮＰ−２又はＨＮＰ−３をコード化する断片より成るポリヌクレオチド及びターミネーター配列によって構成されている。発明の一形態においては、プレプロタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８によって構成されている。発明の一形態においては、ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：6又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２によって構成されている。
【００５２】
細菌の細胞をベースとした、このようなプラスミドＤＮＡの産生株（諸実施形態）、及び有効量の、このようなプラスミドＤＮＡをベースとし、製薬上許容できる添加剤を含んだ、哺乳類用の、とくにヒト用の鎮痛剤（諸実施例）も提案されている。
【００５３】
原核生物の細胞、主として細菌の細胞でプラスミドＤＮＡを産生することが最も有利である。これに関連して、本発明に従うプラスミドＤＮＡは、細菌の細胞において、主として大量に、維持、増殖されるための要素を含んでいる。このような重要な要素となるのが、中程度のコピー数、望ましくは高コピー数を有する細胞中にて維持されるための細菌複製開始点及び産生株の選択可能性のためのレポーター遺伝子である。適正な複製開始点は、ｐＭｌ（ｄｅｒ．）、ＣｏｌＥｏ（ｄｅｒ．）及びＦｌ、ｐＵＣ及びＦｌによって構成されるが、これに限られるわけではない。適正なレポーター遺伝子は、抗体耐久性遺伝子、例えば、アンピシリン、望ましくはカナマイシンによって構成されるが、しかし、これだけに限られるわけではない。
【００５４】
本発明に従うプラスミドＤＮＡは、哺乳類の細胞中で効率的に機能するための諸要素を含んでいる。
【００５５】
このような要素であるのが、自分自身の制御要素（ＣａＭキナーゼII、ＣＭＶ、ネスチン、Ｌ７、ＢＤＮＦ、ＮＦ、ＭＢＰ、ＮＳＥ、ｐ−ｇｌｏｂｉｎ、ＧＦＡＰ、ＧＡＰ４３、チロシンヒドロキシラーゼ、カイニン酸受容体のサブユニット１、グルタミン酸受容体サブユニットＢ）を有する天然プロモーターの、又は制御配列を有する合成プロモーターの、しかるべき制御配列を有する、転写レベルにおける標的遺伝子にとって必要な発現特性（時間と発現レベルとの相互関係）を獲得するためのプロモーターである。
【００５６】
プロモーターに対して、可能な制御配列：
＊  ＲＮＡポリメラーゼとＤＮＡとの相互作用を改善することを通じて、発現レベルを増強するためのエンハンサー
＊  エンハンサーの機能を調整するためのインシュレーター
＊  転写レベルを低下させるための、例えば組織特異的発現のための、サイレンサーもしくはその断片
＊  イントロンを含む、プロモーターまでの５’非翻訳領域
【００５７】
本発明に従うプラスミドＤＮＡは、プロモーターの選択及び標的遺伝子に対する希望パラメーターにもとづくプラスミドＤＮＡの種類に従って、上記制御配列の一つを含む。現時点の技術水準、すなわち、これらの要素の既知の種類及び用法に依拠しつつ、本発明に従うプラスミドＤＮＡには、上記条件を満たす任意の組合せを含めることができ、その組合せによって、αディフェンシンＨＮＰ−１又はＨＮＰ−２又はＨＮＰ−３を、哺乳類の細胞において、プラスミドＤＮＡから合成することができる。構造の一部としてサイレンサーもしくはインシュレーターを使用する場合には、標的遺伝子、すなわち、既述のヒトαディフェンシンＨＮＰ−１又はＨＮＰ−２又はＨＮＰ−３の遺伝子の発現を制御することができる（諸形態）。
【００５８】
その他の制御配列：
＊  ｍＲＮＡの安定性を高め、標的遺伝子の発現を増強するための、イントロンを含む、プロモーター下流の非翻訳領域
【００５９】
実施例の一つにおいて、本発明に従うプラスミドＤＮＡは、このような制御配列を補足的に含む。
【００６０】
本発明に従うプラスミドＤＮＡは、ＡＴＧ開始コドン直前のコザック配列を含む、ｍＲＮＡのリーダー配列のような重要な要素も含む。
【００６１】
プラスミドＤＮＡは、また、標的遺伝子のクローン化のための、及びプラスミドＤＮＡにおいて標的遺伝子の適正な配向を行うためのサイト、主としてそのための複数の様々なサイトを含み、標的遺伝子の配列決定のためのプライマーの植付け用サイト、主として、それ用の複数のサイトを含む。
【００６２】
プラスミドＤＮＡは、このほかに、終止コドン、ポリアデニル化信号及びサイトを有する３’非翻訳領域、それによってｍＲＮＡの安定が保たれている終止コドンを順に含むターミネーター配列を含んでおり、転写の中止が適正に行われ、核からのｍＲＮＡの送り出しが行われる。ターミネーター配列は、ネイティブ、すなわち、標的遺伝子本来のものであるか、あるいはもっと強力な別物である場合もあり、例えばウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）のターミネーター配列が用いられることもあるが、これに限られるわけではない。また、第二案として、３’非翻訳領域の前に終止コドンを付加的に含むこともある。現時点の技術水準、すなわち、この要素の既知の種類に依拠しつつ、本発明に従うプラスミドＤＮＡには、上記条件を満たす任意のターミネーター配列を含めることができ、その配列によって、αディフェンシンＨＮＰ−１又はＨＮＰ−２又はＨＮＰ−３を、哺乳類の細胞において、プラスミドＤＮＡから合成することができる。
【００６３】
プラスミドＤＮＡは、また、哺乳類用にコドンが最適化された、ネイティブな、又は異種の分泌配列を含む。一つの発明形態では、例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）の分泌配列が含まれる（ｔｉｓｓｕｅ−ｔｙｐｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｉｓｏｆｏｒｍ  １  ｐｒｅｐｒｏｐｒｐｔｅｉｎ［Ｈｏｍｅ  ｓａｐｉｅｎｓ］，ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ  ０００９２１．１）が、これに限られるわけではない。ＴＰＡ分泌配列を使用する場合の長所は、すでに広く臨床試験が行われているだけでなく、様々な標的遺伝子から分泌されるタンパク質に関して高い生産性が示されている点にもある。
【００６４】
プラスミドＤＮＡは、ヒトαディフェンシンＨＮＰ−１又はＨＮＰ−２又はＨＮＰ−３をコード化する、哺乳類用にコドンが最適化されている断片も含んでいる。
【００６５】
リボソームにおける当該ｍＲＮＡの情報の読み出し効率を向上させることによって標的遺伝子の発現を強化するために、コドンの最適化が行われた。
【００６６】
プラスミドＤＮＡは、さらに、ターミネーター配列（ポリアデニル化信号及びサイトを含む３’非翻訳領域及び終結シグナル・終結コドン）のような、上記遺伝子の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）のための初期要素を補足的に含むことができ、これらの初期要素が当該ｍＲＮＡの安定性を条件づける。従って、この場合には、プラスミドＤＮＡの骨組に類似の要素は存在しないか、又は機能しない。
【００６７】
鎮痛作用の条件を整える遺伝子を送り届けるためのプラスミドＤＮＡは、哺乳類の細胞中で目的遺伝子の発現レベルが高いという、プラスミドＤＮＡをベースにしたＤＮＡワクチンの特性と、免疫原性がなく、例えば、ｍＲＮＡの安定性の向上により遺伝子発現期間が長いという、遺伝子治療のためのベクター特性とを兼ね備えている。このようなＤＮＡは、ゲノムに組み込まれず、哺乳類の細胞中で自己複製しない。
【００６８】
哺乳類の細胞中における発現にとってふさわしいベクターは、この分野の当業者にとって既知であり、文献にも記載されており［Ｈａｒｔｉｋｋａ  Ｊ，  Ｓａｗｄｅｙ  Ｍ，Ｃｏｒｎｅｆｅｒｔ−Ｊｅｎｓｅｎ  Ｆ，Ｍａｒｇａｌｉｔｈ  Ｍ，Ｂａｍｈａｒｔ  Ｋ，Ｎｏｌａｓｃｏ  Ｍ，Ｖａｈｌｓｉｎｇ  ＨＬ，  Ｍｅｅｋ  Ｊ，Ｍａｒｑｕｅｔ  Ｍ，Ｈｏｂａｒｔ  Ｐ，Ｎｏｒｍａｎ  Ｊ，Ｍａｎｔｈｏｒｐｅ  Ｍ．Ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｄｉｒｅｃｔ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ．  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１９９６  Ｊｕｎ  ２０；７（１０）：１２０５−１７  ｅｔｃ．］、この分野の当業者が、ベクター諸要素についての勧告に従うことによって作り出せるプラスミドである［“Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ”，  ｅｄ．  Ｐｏｕｗｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ−Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ−Ｏｘｆｏｒｄ，  １９８５，  ＩＳＢＮ  ０  ４４４  ９０４０１８，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＪＡ，  Ｃａｒｎｅｓ  ＡＥ，  Ｈｏｄｇｓｏｎ  ＣＰ．  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｖｅｃｔｏｒ  ｄｅｓｉｇｎ：  ｉｍｐａｃｔ  ｏｎ  ｅｆｆｉｃａｃｙ，  ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｕｐｓｔｒｅａｍ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｄｖ．  ２００９  Ｊｕｌ−Ａｕｇ；  ２７（４）：３５３−７０．  ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｉｏｔｅｃｈａｄｖ．２００９．０２．００３．  Ｅｐｕｂ  ２００９  Ｆｅｂ  ２０．  Ｒｅｖｉｅｗ  ｅｔｃ．］。ヒト用としての望ましいプラスミドＤＮＡとは、人間において治験済みであり、適当な制御配列を有する上記要素を含むベクターであって、できれば、提示された基準に合致させ、薬剤登録のために必要な試験の数を減らすように調整されたベクターであることが望ましい。しかしながら、上記の要求された諸要素を含む、ほかのプラスミドＤＮＡを使用することもできる。
【００６９】
プラスミドＤＮＡにおける、上記諸要素の配置順序は、この分野の当業者にとって、明らかである。
【００７０】
本発明では、細菌の細胞（主として、大腸菌、ストレプトミセス、桿菌、シュードモナス、しかしこれに限られるわけではない）をベースとしたプラスミドＤＮＡの産生株が提案されている。この分野の当業者にとっては、本発明に従うプラスミドＤＮＡ及び細菌の細胞、例えば市販の細菌の細胞、しかしこれに限られるわけではないが、を用いて、プラスミドＤＮＡの産生株を、例えば、トランスフェクション、電気穿孔法又はパーティクル・ガンなどにより産生することができることは明らかである。プラスミドＤＮＡのメチル化によって突然変異が起こる確率を低減するためには、ゲノム中にメチル化酵素を含まない微生物菌株を使用することが望ましい。
【００７１】
また、有効量の、製薬上許容される添加剤を含む、既述の特徴を有するプラスミドＤＮＡをベースとした、哺乳類、特にヒトに対して用いるための鎮痛剤も提案されている。この製薬組成は、疼痛、特に急性又は慢性の疼痛、感受性障害の治療、緩和及び又は予防のためのものである。
【００７２】
本発明の考案者たちによって、既述の特徴を有する発明群の実施が可能であることを裏付けるための試験が、試験所において実施された。試験の結果は、実施例１〜３及び図１〜３にて例解されている。
【実施例１】
【００７３】
１．１．  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２として特徴づけられ、認識部位によってフランキングされ、コザック配列を付け加えられたＤＮＡの化学的合成が行われた。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のためには、認識部位Ｎｈｅｌ（５’）、ＢａｍＨＩ（３’）が使われ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９のためには、認識部位Ｓａｉｌ（５’）、Ｋｐｎｌ（３’）が使われ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２のためには、認識部位Ｓａｉｌ（５’）、ＢａｍＨＩ（３’）が使われ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のためには、認識部位Ｎｈｅｌ（５’）、Ａｐａｌ（３’）が使われた。
【００７４】
１．２．  プラスミドｐＶＡＸ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びｐＶＲ１０１２（Ｖｉｃａｌ）へ、合成された遺伝子のクローン化が実施された。また、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１の、認識部位がＮｈｅｌ（５’）、Ａｐａｌ（３’）であるベクターｐｃＤＮＡ３．１＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へのクローン化が実施された。また、ＳＶ４０プロモーター（７１ｂｐ）の部位で、制限酵素の当該ベクターの制限によって、ネオマイシンの発現能力がないベクターｐｃＤＮＡ３．１＋も得られた。得られたベクターへ、認識部位がＮｈｅｌ（５’）、Ａｐａｌ（３’）であるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２がクローン化された。
【００７５】
１．３．  ライゲーション反応用として、合成されたＤＮＡ溶液３μＬ、出来上がっているベクター溶液１μＬ、２回分のライゲーション用の緩衝液５μＬ及びＴ４リガーゼ１μＬが用意された。反応は２０℃で、２時間行われた。こののち、混合物は、９５℃で１０分間加熱され、孔径０．０２５μのニトロセルロースフィルター（米国、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いた透析によって塩類からの浄化が行われた。透析は、１０％グリセリン中のエチレンジアミン四酢酸０．５ｍＭを含む溶液に対して１０分間行われた。以下のプラスミドＤＮＡが得られた：ｐＶＡＸ１ｓｅｑ３、ｐＶＲ１０１２ｓｅｑ４、ｐＶＲ１０１２ｓｅｑ５、ｐＶＡＸｌｓｅｑ６、ｐＶＲ１０１２ｓｅｑ９、ｐＶＡＸ１ｓｅｑ１０、ｐＶＡＸ１ｓｅｑ１１、ｐＶＲ１０１２ｓｅｑ１２、ｐｃＤＮＡ３．１＋ｓｅｑ１１、ｐｃＤＮＡ３．１＋（ｖａｒ）ｓｅｑ１２。
【００７６】
１．４．  こののち、ＤＨ１０Ｂ／Ｒ菌株（Ｆ−ｍｃｒＡ，  Δ（ｍｒｒ−ｈｓｄＲＭＳ−ｍｃｒＢＣ），  （ψ８０ｄｌａｃＺＡＭ  １５，  ΔｌａｃＸ７４，ｄｅｏＲ，  ｒｅｃＡＬ，  ｅｎｄＡｌ，  ａｒａＤ１３９，  Δ（ａｒａ，ｌｅｕ）７６９，  ｇａｌＵ，  ｇａｌλ，  ｒｐｓＬ，  ｎｕｐＧ）の大腸菌の細胞の形質転換が、電気穿孔機ＭｉｃｒＰｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）を用いた電気穿孔法により、産生されたプラスミドＤＮＡによって行われた。この菌株は、メチル化酵素を含まないため、この菌株中で維持されるプラスミド中でクローン化された遺伝子を含め、ＤＮＡにおいて突然変異が起こる可能性を最小限に抑えることができる。適格細胞１２μＬは、透析済みの合成酵素混合物１μＬが添加され、穿孔される細胞の電極の間に置かれ、電気パルスで処理された。形質転換の後、細胞は、ＳＯＣ培地１ｍＬ（２％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、１０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭｎのＭｇＳＯ４，２０ｍＭのグルコース）に入れられ、３７℃で４０分間培養された。
【００７７】
１．５．  産生されたプラスミドＤＮＡを含む大腸菌細胞のクローン検出が、ＬＢ  ａｇａｒ、カナマイシン又はアンピシリン（ｐｃＤＮＡ３．１＋をベースとしたプラスミドＤＮＡ用）５０ｍｃｇ／ｍＬを含んだ選択培地にて行われた。成長したクローンから、プラスミドＤＮＡが分離された。プラスミドＤＮＡの分離は、ＤＮＡ精製システムＷｉｚａｒｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（米国、Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて行われた。精製された組換えプラスミドＤＮＡは、配列解析によって検査された。
【００７８】
１．６．  サイクルシークエンスキットＡｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＢｉｇＤｙｅＲ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（ＢＤＴ）ｖ３．１  Cｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ  （米国、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、サンガー法により、付属の取り扱説明書に従って、クローン化された断片の配列解析が行われた。反応生成物の標識付のために、標識を付けられたジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）の蛍光色素が用いられた。その際、それぞれのｄｄＮＴＰにそれ自身の色素が対応した。配列解析のために、プラスミドに対しては標識の付けられていない特殊なプライマーが使用された。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が行われ、そののち、ＢｉｇＤｙｅ  Ｘ  −Ｔｅｒｍｉａｔｏｒ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（米国、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）付属の取扱説明書に従い、遊離した、標識付きのｄｄＮＴＰの除去が行われ、キャピラリー・シークエンサーＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３５０００／３５００ｘＬ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  “ＰＯＰ−６ＴＭ”（米国、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いて配列解析の反応生成物が分離された。配列解析反応生成物の分離結果は、全てのタイプのｄｄＮＴＰに含まれている４つの蛍光色素のレーザーによるスキャンニング及び検出により記録された。
【００７９】
１．７．  ＤＮＡ配列のコンピューター解析が、Ｃｈｒｏｍａｓ及びＢｉｏＥｄｉｔというソフトを用いてパーソナルコンピューターにて行われた。検査対象のＤＮＡ断片のヌクレオチド配列が、想定された配列と比較対照され、合成断片の想定断片に対する同一性が示された。その結果、αディフェンシンＨＮＰ−１又はＨＮＰ−２又はＨＮＰ−３をコード化するＤＮＡ配列のプラスミドに含まれる、標的遺伝子の実物大配列を含む大腸菌細胞のクローンが選び出された。
【実施例２】
【００８０】
試験所にて動物実験を実施するための、αディフェンシンＨＮＰ−１又はＨＮＰ−２又はＨＮＰ−３をコード化するプラスミドＤＮＡの産生。
【００８１】
ペトリ皿中のＬＢ培地で培養された大腸菌の個別コロニーに、カナマイシン（又はアンピシリン）が添加され、１０ｍＬ分だけ選別培地に移された。細胞は、一夜の間、３７℃にて、絶えず攪拌（２５０ｒｐｍ）される条件下で培養された。得られた細胞は、４，０００ｇの遠心力を用いて採取された。さらに、プラスミドＤＮＡの分離及び精製が、パイロジェンＤＮＡ分離・精製用のＥｎｄｏＦｒｅｅ  Ｐｌａｍｉｄ  Ｍｅｇ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて行われた。分離されたプラスミドＤＮＡは、０．８％アガロースゲルにて、電気泳動法により分析され、蛍光定量法により濃度の測定が行われた。
【００８２】
標準液として、被験物質無添加の水が用いられた。光学的密度測定用の容積２ｍＬの小胞へ、１．９５０ｍＬの水及び０．０５ｍＬの被験溶液（濃度１ｍｇ／ｍＬ）が注入され、攪拌され、波長２６０ｎｍで光学的密度が測定された。ＤＮＡの濃度測定は、以下の式に従って行われた：
Ｃ（ｍｉｃｇ／ｍＬ）＝４０Ａ２６０Ｋ
ただし、Ａ２６０は波長２６０ｎｍで測定された薬剤の光学的密度；Ｋ（ｍｉｃｇ／ｍＬ）は、５０ｍｉｃｇ／ｍＬのＤＮＡ（水中の、５０ｍｉｃｇ／ｍＬの二本鎖ＤＮＡ）に対するもの；４０は被験薬剤の希釈。
【００８３】
結局、以下のプラスミドＤＮＡが産生されたと決定された：ｐＶＡＸ１ｓｅｑ３（濃度３．４ｍｇ／ｍＬ）、ｐＶＲ１０１２ｓｅｑ４（濃度３．７ｍｇ／ｍＬ）、ｐＶＲ１０１２ｓｅｑ５（濃度４ｍｇ／ｍＬ）、ｐＶＡＸｌｓｅｑ６（濃度３．８ｍｇ／ｍＬ）、ｐＶＲ１０１２ｓｅｑ９（濃度４．１ｍｇ／ｍＬ）、ｐＶＡＸ１ｓｅｑ１０（濃度４ｍｇ／ｍＬ）、ｐＶＡＸ１ｓｅｑ１１（濃度４．３ｍｇ／ｍＬ）、ｐＶＲ１０１２ｓｅｑ１２（濃度４．５ｍｇ／ｍＬ）、ｐｃＤＮＡ３．１＋ｓｅｑ１１（濃度４．４ｍｇ／ｍＬ）、ｐｃＤＮＡ３．１＋（ｖａｒ）ｓｅｑ１２（濃度４．３ｍｇ／ｍＬ）。プラスミドＤＮＡの歩留まりは、培養液１Ｌから３．４ｍｇ〜４．５ｍｇであった。
【００８４】
産生されたプラスミドＤＮＡ薬剤の純度は、波長２６０ｎｍで測定された薬剤の光学的密度の、波長２８０ｎｍで測定された薬剤の光学的密度に対する割合（Ａ２６０／Ａ２８０）及び波長２６０ｎｍで測定された薬剤の光学的密度の、波長２３０ｎｍで測定された薬剤の光学的密度に対する割合（Ａ２６０／Ａ２３０）に従って評価された。測定は、水溶液中で行われ、標準液として、被験薬剤が添加されていない水が用いられた。
【００８５】
純粋ＤＮＡ薬剤の特徴となるのは、Ａ２６０／Ａ２８０＞１．８０及びＡ２６０／Ａ２３０＞１．８０となることである。試験における測定値は、純粋薬剤にとっての、産生された全てのプラスミドＤＮＡの薬剤にとってのＡ２６０／Ａ２８０及びＡ２６０／Ａ２３０の割合の値に合致した。
【００８６】
産生されたプラスミドＤＮＡ、ｐＶＡＸ１ｓｅｑ３、ｐＶＲ１０１２ｓｅｑ４、ｐＶＲ１０１２ｓｅｑ５、ｐＶＡＸｌｓｅｑ６、ｐＶＲ１０１２ｓｅｑ９、ｐＶＡＸ１ｓｅｑ１０、ｐＶＡＸ１ｓｅｑ１１、ｐＶＲ１０１２ｓｅｑ１２、ｐｃＤＮＡ３．１＋ｓｅｑ１１、ｐｃＤＮＡ３．１＋（ｖａｒ）ｓｅｑ１２の薬剤中のタンパク質不純物の定量測定も、タンパク質定量法ソフトｍｉｃｒｏＢＣＡ  ａｓｓａｙ[Ｓｍｉｔｈ，  Ｐ．Ｋ．，  ｅｔ  ａｌｌ，  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｕｓｉｎｇ  ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ  ａｃｉｄ．  Ａｎａｌｙｔ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １５０，  ７６−８５（１９８５）]を用いて、形成される着色銅・タンパク質複合体及びビシンコニン酸の、波長５６２ｎｍにおける光学的密度を測定しつつ行われた。ｍｉｃｒｏＢＣＡ  ａｓｓａｙの感度は、タンパク質０．５〜２０ｍｉｃｇ／ｍＬである。総タンパク質の濃度は、いずれのプラスミドＤＮＡ薬剤においても基準（０．５〜１２ｍｉｃｇ／ｍｇプラスミドＤＮＡ）を越えることはなかった。
【００８７】
ＬＡＬ検査用のゲル・クロットを用いて、感度＞０．２５ＥＵ／ｍＬで、プラスミドＤＮＡ薬剤中の細菌由来リポ多糖類の含有量の測定も行われた（米国、ＴｏｘｉｎＳｅｎｓｏｒ，  ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）。ＬＡＬ試薬としては、アメリカカブトガニ（Ｌｉｍｕｌｕｓ  ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ）の血球抽出成分が用いられた。ＬＡＬ試薬は、細菌由来のエンドトキシンに対して特異的に反応し、酵素反応の結果、エンドドキシンの濃度に比例して、反応混合物が変化する。測定結果は、試験管を転倒させて、試験管の底に密度の高いクロットが残るか否かによって評価された。プラスミドＤＮＡ、ｐＶＡＸ１ｓｅｑ３、ｐＶＲ１０１２ｓｅｑ４、ｐＶＲ１０１２ｓｅｑ５、ｐｃＤＮＡ３．１＋（ｖａｒ）ｓｅｑ１２の薬剤用に１０倍に希釈された(感度２．５ＥＵ／ｍＬ)サンプル及びプラスミドＤＮＡ、ｐＶＡＸｌｓｅｑ６、ｐＶＲ１０１２ｓｅｑ９、ｐＶＡＸ１ｓｅｑ１０、ｐＶＡＸ１ｓｅｑ１１、ｐＶＲ１０１２ｓｅｑ１２、ｐｃＤＮＡ３．１＋ｓｅｑ１１の薬剤用に５倍に希釈された（感度１．２５ＥＵ／ｍＬ）サンプルを検査した際に、このようなゲル・クロットの形成は見られなかった。このことは、サンプル中のプラスミドＤＮＡの濃度を考慮すると、エンドトキシンの浄化指数が許容範囲にあることを裏付けている。
【実施例３】
【００８８】
αディフェンシンＨＮＰ−１又はＨＮＰ−２又はＨＮＰ−３をコード化するプラスミドＤＮＡの鎮痛効果の測定。
３．１．  ホットプレートテスト
ホットプレートテストにより、αディフェンシンＨＮＰ−１又はＨＮＰ−２又はＨＮＰ−３をコード化するプラスミドＤＮＡの鎮痛活性の検査が行われた。
【００８９】
ホットプレートテストは、痛覚の閾値及び研究対象のプラスミドＤＮＡ薬剤の潜在的鎮痛効果を計測することを目的に実施された[Ａ．Ｖ．ヴァルドマン、Ｙｕ．Ｄ．イグナートフ。  痛みの中枢機構−レニングラード：ナウカ−１９７６年]。このテストは、鎮痛活性の研究の基礎をなすものであり、この研究は鎮痛活性化合物の解明に利用される。
【００９０】
熱いプレートの表面に置かれ、痛覚の閾に達すると、動物には足を上げる、足の底を舐める、飛び上がるなどの、不安による運動反応が認められる。このテストでは、動物が熱いプレート表面に置かれた時から最初に足を舐めるまでの潜時が考慮された。この方法により、被験動物の鎮痛活性、鎮痛のピーク時間、鎮痛継続時間などの指標の計測を行うことができる。
【００９１】
この研究には、ＢＡＬＢ／Ｃ系統のマウス（オス、体重１５〜２２ｇ、生後１８週）が用いられた。実験では、対照群を含め、１７のマウス群が編成され、それぞれの群のマウス数は３匹とした。
１群：ネガティブコントロール（生理食塩水を投与）
２群：ｐＶＡＸ１ｓｅｑ３
３群：ｐＶＲ１０１２ｓｅｑ４
４群：ｐＶＲ１０１２ｓｅｑ５
５群：ｐＶＡＸｌｓｅｑ６
６群：ｐＶＲ１０１２ｓｅｑ９
７群：ｐＶＡＸ１ｓｅｑ１０
８群：ｐＶＡＸ１ｓｅｑ１１
９群：ｐＶＲ１０１２ｓｅｑ１２
１０群：ｐｃＤＮＡ３．１＋ｓｅｑ１１
１１群：ｐｃＤＮＡ３．１＋（ｖａｒ）ｓｅｑ１２
１２群：アナルギン（５０ｍｇ／ｋｇ）
１３群：モルヒネ塩酸塩（１０ｍｇ／ｋｇ）
１４群：ｐＶＡＸ１
１５群：ｐＶＲ１０１２
１６群：ｐｃＤＮＡ３．１＋
１７群：ｐｃＤＮＡ３．１＋（ｖａｒ）
プラスミドＤＮＡが５ｍｇ／ｋｇずつ投与された。
ホットプレートメーター一式(Ｈｏｔｐｌａｔｅ  Ａｎａｌｇｅｓｉａ  Ｍｅｔｅｒ，  ＣｏｌｕｍｂｕｓＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＵＳＡ)が用いられた。
【００９２】
試験開始前の１０分間、試験を行う部屋におけるテストシステムの環境順化が行われた。実験動物の使用は一回に限られた。実験動物は、恒温に保たれたプレートに再度置かれると、表面に触れたとたんに即時反応を起こすからである。サーモスタットは５５℃にセットされた。被験物質が注射されたのち、実験動物は、ホットプレートに注意深く置かれ、それと同時に、機器パネルの「スタート」ボタンが押された。四肢を舐めるまでの（実験動物がプレート表面に置かれた瞬間から、最初に四肢を舐めるまでの）潜時が記録された。こののち、「ストップ」ボタンが押され、実験動物が熱いプレー表面から取り除かれた。そのほかの行動反応は無視された。足裏の熱障害を少なくするため、最大実験時間は６０秒以内とされた。薬剤の鎮痛作用のピーク時間を測定するために、ゼロ点及び、被験群に薬剤が投与されてから２時間、１２時間、２４時間後の対照群（生理食塩水）のマウスが四肢を舐め始めるまでの潜時が測定された。次の実験動物がプレートに置かれる前に、プレートの表面は、消毒剤（７０％エタノールに対する０．５％クロルヘキシジングルコン酸塩）をしみ込ませたティッシュペーパーで拭われた［学生のための方法論的アドバス。連邦保健・社会発展局高等職業教育国家教育機関Ｉ．Ｍ．セーチェノフ記念モスクワ医学アカデミー薬理学科−モスクワ、２００６年］。
【００９３】
薬剤の鎮痛活性の測定データの分析が行われた。最良の結果を示したプラスミドＤＮＡに対して、ＥＤ５０、すなわち、薬剤鎮痛活性の５０％が現れるために必要な投与量が決定された。
【００９４】
試験結果は図１に示されている。ディフェンシンＨＮＰ−１又はＨＮＰ−２又はＨＮＰ−３をコード化する、全ての被験プラスミドＤＮＡの薬剤が、効果の点でモルヒネに引けを取らず、アナルギンの鎮痛活性を上回る、顕著な鎮痛作用を発揮した。プラスミド投与の２時間後には、鎮痛度はそれほど高くはなかったが、その後、鎮痛作用は強まり、１２時間後及び２４時間後にも、同じような高度の鎮痛作用が認められ、効果の維持が示された。
【００９５】
先行する実験（ｐＶＡＸ１ｓｅｑ３）において最良の結果を示したプラスミドＤＮＡの様々な投与量を用いた試験において、１から１０ｍｇ／ｋｇまでの間隔における、鎮痛作用の投与量依存性が示された（図２）。この際、１２時間経過後には、最低濃度１ｍｇ／ｋｇのプラスミドＤＮＡ、ｐＶＡＸ１ｓｅｑ３を用いた際の指標は、モルヒネ塩酸塩１０ｍｇ／ｋｇを使用した群の指標と事実上同一であった。２４時間後には、最低濃度のプラスミドＤＮＡの群における指標は、事実上、モルヒネ塩酸塩１０ｍｇ／ｋｇを使用した群の指標の２倍であることが示された。アナルギンの作用は、この鎮痛剤投与２時間後に初めて現れ、１２時間後及び２４時間後の反応は、対照群の反応に類似していた。濃度５ｍｇ／ｋｇのプラスミドＤＮＡ、ｐＶＡＸ１ｓｅｑ３を用いた際には、最低濃度のプラスミドＤＮＡの群と比較すると、潜時期間の著しい（１５％までの）延長が観察されたが、この際、これら二つの群の間の差は大きくはなかった。
【００９６】
３．２．  マウス血清中のβエンドルフィン濃度の研究
血漿中のβエンドルフィン濃度の変化が、鎮痛効果を評価するための基準であるので［癌患者の急性疼痛及び慢性疼痛症候群における鎮痛効果のマーカーとしてのβエンドルフィン／Ｚ．Ｖ．パ−ヴロワ（及びその他）／／臨床医学の諸問題−２００７年−ＮＩ−ＩＳＳＮ  １８１７−８３５９］、プラスミドＤＮＡ投与後の被験マウス（複数）の血清中におけるβエンドルフィン濃度検査が、ＨＮＰ−２又はＨＮＰ−３をコード化するプラスミドＤＮＡ（ｐＶＲ１０１２ｓｅｑ４）を投与した場合の実例において、ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｂｅｔａ−Ｅｎｄｏｒｐｉｎ  （ｂＥＰ）Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  （Ｍｏｕｓｅ）  ＣＥＡ８０６Ｍｕ（Ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．）を用いて実施された。
【００９７】
試験結果は、図３に示されている。βエンドルフィンのレベルは、プラスミドＤＮＡ、ｐＶＲ１０１２ｓｅｑ４を投与した際に著しく上昇したことは明らかであり、この際、標的遺伝子の挿入なしにプラスミドＤＮＡを投与した場合、及び対照群においては、実験の全経過時間を通して、βエンドルフィンのレベルの顕著な向上は見られなかった。
【００９８】
このようにして、ＨＮＰ−１又はＨＮＰ−２又はＨＮＰ−３をコード化するプラスミドＤＮＡの様々な代替え案を創出し、細菌性産出株を用いてそれらを産生することが可能であり、上記基準に合致するどの代替え案においても、最低濃度１ｍｇ／ｋｇ（モルヒネ塩酸塩の１／１０の濃度）においてさえ、このようなプラスミドには鎮痛作用があることが示されるとともに、このようなプラスミドＤＮＡを使用する際の安全性（実験動物が死んだり、副作用を受けたりすることはなかった）が示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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