(57)【要約】  本発明は、表面多孔性粒子（ＳＰＰ）に関し、表面多孔性粒子（ＳＰＰ）はコアシェル、多孔性シェル、またはフューズドコア粒子とも呼ばれ、ＨＰＬＣカラムの製造に用いられる最新の支持体である。全多孔性粒子（ＦＰＰ）上の同様の固定相に比べて、より高い効率およびより短い保持時間を有する、加水分解に安定な、高選択性表面多孔性粒子（ＳＰＰ）親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）固定相が提供される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＩＬＩＣ選択剤に結合した表面多孔性粒子（ＳＰＰ）を含む、共有結合した、超安定な親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）相。
【請求項２】
ＳＰＰが、約０．５μｍ〜約２０μｍの粒子径を有する、請求項１に記載の、共有結合した、超安定な親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）相。
【請求項３】
ＳＰＰが、約１．３μｍ〜約１０μｍの粒子径を有する、請求項１に記載の、共有結合した、超安定な親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）相。
【請求項４】
ＳＰＰが、約１．７μｍ〜約５．０μｍの粒子径を有する、請求項１に記載の、共有結合した、超安定な親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）相。
【請求項５】
ＳＰＰが、約１．７、約２．７、および約４．０μｍからなる群から選択される粒子径を有する、請求項１に記載の、共有結合した、超安定な親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）相。
【請求項６】
ＳＰＰが、約１．７μｍの粒子径を有する、請求項１に記載の、共有結合した、超安定な親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）相。
【請求項７】
ＳＰＰが、約２．７μｍの粒子径を有する、請求項１に記載の、共有結合した、超安定な親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）相。
【請求項８】
ＳＰＰが、約４．０μｍの粒子径を有する、請求項１に記載の、共有結合した、超安定な親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）相。
【請求項９】
ＳＰＰが、約１００Å〜約３００Åのポアサイズを有する、請求項１に記載の、共有結合した、超安定な親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）相。
【請求項１０】
ＳＰＰが、約１００Å〜約１５０Åのポアサイズを有する、請求項１に記載の、共有結合した、超安定な親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）相。
【請求項１１】
ＳＰＰが、約１１０Å〜約１３０Åのポアサイズを有する、請求項１に記載の、共有結合した、超安定な親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）相。
【請求項１２】
ＳＰＰが、約１２０Åのポアサイズを有する、請求項１に記載の、共有結合した、超安定な親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）相。
【請求項１３】
ＳＰＰが、約１５０ｍ２／ｇ〜約５００ｍ２／ｇの表面積を有する、請求項１に記載の、共有結合した、超安定な親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）相。
【請求項１４】
ＳＰＰが、約１２０ｍ２／ｇの表面積を有する、請求項１に記載の、共有結合した、超安定な親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）相。
【請求項１５】
ＨＩＬＩＣ選択剤が、炭水化物および誘導体、オリゴ糖および誘導体、環状オリゴ糖および誘導体、ペプチドおよび誘導体、糖ペプチドおよび誘導体、大環状糖ペプチドおよび誘導体、荷電型またはイオン型、ならびに両性イオン型からなる群から選択される、請求項１に記載の、共有結合した、超安定な親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）相。
【請求項１６】
ＨＩＬＩＣ選択剤が、シクロデキストリン、誘導体化シクロデキストリン、シクロフルクタン、誘導体化シクロフルクタン、テイコプラニン、バンコマイシン、テイコプラニンアグリコン、リストセチンＡ、ダルババシン、ボロマイシン、スルホン化シクロフルクタン（ｃｙｃｌｏｆｒｕｔａｎ）、スルホン化シクロデキストリン、および３−Ｐ，Ｐ−ジフェニルホスホニウムプロピルスルホネートからなる群から選択される、請求項１５に記載の、共有結合した、超安定な親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）相。
【請求項１７】
ＨＩＬＩＣ選択剤が、ネイティブまたは誘導体化シクロフルクタン（ｃｙｃｌｏｆｒｕｔａｎ）、およびネイティブまたは誘導体化シクロデキストリンからなる群から選択される、請求項１に記載の、共有結合した、超安定な親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）相。
【請求項１８】
誘導体化シクロフルクタン（ｃｙｃｌｏｆｒｕｔａｎ）および誘導体化シクロデキストリンの誘導体化基が、Ｃ１〜Ｃ３０直鎖アルカン、Ｃ１〜Ｃ３０分岐アルカン、Ｃ１〜Ｃ３０不飽和アルカン、Ｃ１〜Ｃ３０環状アルカン、ならびにヘテロ原子（例えば、Ｎ、Ｓ、Ｏ）を含むＣ１〜Ｃ３０の直鎖および／または環状アルカンからなる群から選択される、請求項１７に記載の、共有結合した、超安定な親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）相）。
【請求項１９】
表面多孔性粒子（ＳＰＰ）が、エーテル結合、カルバメート結合、チオエーテル結合、チオカルバメート結合、エステル結合、トリアゾール結合、または尿素結合によってＨＩＬＩＣ選択剤に結合する、請求項１に記載の、共有結合した、超安定な親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）相。
【請求項２０】
保持時間ドリフトが、３．０％未満の変化である、請求項１に記載の、共有結合した、超安定な親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）相。
【請求項２１】
保持時間ドリフトが、１．０％未満の変化である、請求項１に記載の、共有結合した、超安定な親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）相。
【請求項２２】
表面多孔性粒子（ＳＰＰ）に共有結合した、高効率で、超安定な親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）基材を含む、表面多孔性粒子（ＳＰＰ）。
【請求項２３】
基材が、ＨＩＬＩＣ選択剤を含む、請求項２２に記載の表面多孔性粒子（ＳＰＰ）。
【請求項２４】
全多孔性粒子（ＦＰＰ）上の同様の固定相に比べて、より高い効率およびより短い保持時間を有する、加水分解に安定な、高選択性表面多孔性粒子（ＳＰＰ）親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）固定相。
【請求項２５】
ＨＩＬＩＣ充填剤が、非修飾シリカではなく、それによって、ＳＰＰ表面を溶解から保護し、かつ、むき出しの支持体およびシリカを含む全多孔性支持体に比べて、より広いＨＩＬＩＣ選択性およびより高い効率を有する、請求項３に記載の、加水分解に安定な、高選択性ＳＰＰ  ＨＩＬＩＣ相。
【請求項２６】
ＨＩＬＩＣ選択剤に結合した表面多孔性粒子（ＳＰＰ）を含む、共有結合した、超安定な親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）相に、分子を接触させることを含む、極性分子の分離方法。
【請求項２７】
シクロデキストリン、誘導体化シクロデキストリン、シクロフルクタン、誘導体化シクロフルクタン、テイコプラニン、バンコマイシン、テイコプラニンアグリコン、リストセチンＡ、ダルババシン、ボロマイシン、スルホン化シクロフルクタン（ｃｙｃｌｏｆｒｕｔａｎ）、スルホン化シクロデキストリン、および３−Ｐ，Ｐ−ジフェニルホスホニウムプロピルスルホネートからなる群から選択されるＨＩＬＩＣ選択剤を選択すること、キラル選択剤を表面多孔性粒子に共有結合させること、およびそれによって超安定なＨＩＬＩＣ  ＳＰＰ固定相を得ること、を含む、ＨＩＬＩＣ選択剤に結合した表面多孔性粒子（ＳＰＰ）を含む、超安定な親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）相の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１４年７月１７日に出願された、米国仮特許出願第６２／０２５，９９０号に対する優先権の利益を主張し、その内容が参照により本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【０００２】
本発明は、表面多孔性粒子（ＳＰＰ）に関し、表面多孔性粒子（ＳＰＰ）はコアシェル、多孔性シェル、またはフューズドコア粒子とも呼ばれ、ＨＰＬＣカラムの製造に用いられる最新の支持体である。
【０００３】
歴史的に見て、シェル粒子の概念は、１９６０年代の間に、Ｈｏｒｖａｔｈらによって最初に提案され、シェル粒子は、巨大な生体分子を分析するためのイオン交換材料として開発された。例えば、Ｊ．Ｊ．Ｄｅｓｔｅｆａｎｏ、Ｔ．Ｊ．ＬａｎｇｌｏｉｓおよびＪ．Ｊ．Ｋｉｒｋｌａｎｄ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｓｃｉ．４６（２００８）２５４、Ｘ．Ｌ．Ｗａｎｇ、Ｗ．Ｅ．ＢａｒｂｅｒおよびＷ．Ｊ．Ｌｏｎｇ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ．１２２８（２０１２）７２、Ｆ．ＧｒｉｔｔｉおよびＧ．Ｇｕｉｏｃｈｏｎ、ＬＣＧＣ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ．７（２０１２）５８６、ならびにＣ．Ｇ．Ｈｏｒｖａｔｈ、Ｂ．Ａ．ＰｒｅｉｓｓおよびＳ．Ｒ．Ｌｉｐｓｋｙ、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．３９（１９６７）１４２２（これらの各内容は、参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
【０００４】
ＳＰＰ技術は、Ｋｉｒｋｌａｎｄによって発展し、Ｋｉｒｋｌａｎｄは、１９７０年代に５０μｍの粒子を、１９９０年代に５μｍの粒子を調製した。例えば、Ｊ．Ｊ．Ｋｉｒｋｌａｎｄ、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．４１（１９６９）２１８、Ｊ．Ｊ．Ｋｉｒｋｌａｎｄ、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．４３（１９７１）Ａ３６、およびＪ．Ｊ．Ｋｉｒｋｌａｎｄ、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．６４（１９９２）１２３９（これらの各内容は、参照により組み込まれる）を参照のこと。
【０００５】
高品質な全多孔性粒子（ＦＰＰ）の製造が同時に進展したことによって、ＳＰＰの製造、適用、および使用は抑制された。例えば、Ｂ．Ｃｈａｕｖｅ、Ｄ．Ｇｕｉｌｌａｒｍｅ、Ｐ．Ｃｌｅｏｎ、およびＪ．Ｌ．Ｖｅｕｔｈｅｙ、Ｊ  Ｓｅｐ  Ｓｃｉ．３３（２０１０）７５２（その内容は、参照により組み込まれる）を参照のこと。直径３μｍ（１９９０年代）、および２μｍ未満（２００４年代）のＦＰＰが、高圧（例えば、１０００ｂａｒ）運転が可能な液体クロマトグラフと共に主流となった。しかしながら、近時の進展により、ＳＰＰ技術はＨＰＬＣ充填剤の最先端となった。例えば、ＳＰＰサイズが、１．７、２．６または２．７μｍ、多孔性シェル厚が、それぞれ０．２３、０．３５および０．５μｍであるカラムが、今日では入手可能である。例えば、Ｓ．Ｆｅｋｅｔｅ、Ｅ．ＯｌａｈおよびＪ．Ｆｅｋｅｔｅ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ．１２２８（２０１２）５７（その内容は、参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
【０００６】
この時代のＳＰＰは、多孔層に包まれた固形内部コアから構成される形態によって、クロマトグラフ性能を著しく改善した。例えば、図１を参照のこと。ＳＰＰは、バンド拡散に対する全ての寄与を減少させることができ、このような寄与には縦方向拡散、渦分散、および固定相物質移動の寄与に基づくものが含まれる。固形コアが存在することにより、分析物の移動行路が短くなり、物質移動が乏しいことによりバンド拡散が減少し、それによって著しく効率を損なうことなく高流速で分析を行うことが可能となる。さらに、ＳＰＰは一般に非常に狭い粒度分布で生産され、渦拡散によるバンド拡散が低減される。表面多孔性粒子が充填されたカラムは、方法の頑健性を保ちつつ、効率を改善することによって、ハイスループットな分離に使用されてきた。例えば、Ａ．Ｐｅｒｉａｔ、Ｉ．Ｋｏｈｌｅｒ、Ｊ．Ｌ．ＶｅｕｔｈｅｙおよびＤ．Ｇｕｉｌｌａｒｍｅ、ＬＣＧＣ  Ｅｕｒｏｐｅ．５（２０１３）１７（その内容は、参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
【０００７】
近年、ＳＰＰによるＨＰＬＣカラムに関する論文数は増加している。例えば、Ｊ．Ｒｕｔａ、Ｄ．Ｚｕｒｌｉｎｏ、Ｃ．Ｇｒｉｖｅｌ、Ｓ．Ｈｅｉｎｉｓｃｈ、Ｊ．Ｌ．ＶｅｕｔｈｅｙおよびＤ．Ｇｕｉｌｌａｒｍｅ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ．１２２８（２０１２）２２１、Ｊ．Ｊ．Ｋｉｒｋｌａｎｄ、Ｓ．Ａ．Ｓｃｈｕｓｔｅｒ、Ｗ．Ｌ．ＪｏｈｎｓｏｎおよびＢ．Ｅ．Ｂｏｙｅｓ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ．３（２０１３）３０３、Ｄ．Ｖ．ＭｃＣａｌｌｅｙ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ．１１９３（２００８）８５、Ｅ．Ｏｌａｈ、Ｓ．Ｆｅｋｅｔｅ、Ｊ．ＦｅｋｅｔｅおよびＫ．Ｇａｎｚｌｅｒ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ．１２１７（２０１０）３６４２、Ｆ．Ｇｒｉｔｔｉ、Ａ．Ｄ．Ｐｅｒｅｉｒａ、Ｐ．ＳａｎｄｒａおよびＧ．Ｇｕｉｏｃｈｏｎ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ．１２１７（２０１０）６８３、ならびにＦ．Ｇｒｉｔｔｉ、Ｉ．Ｌｅｏｎａｒｄｉｓ、Ｄ．Ｓｈｏｃｋ、Ｐ．Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ、Ａ．ＳｈａｌｌｉｋｅｒおよびＧ．Ｇｕｉｏｃｈｏｎ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ．１２１７（２０１０）１５８９（これらの各内容は、参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
【０００８】
多くの、ないし比較的少数のＳＰＰ  ＨＩＬＩＣカラムが種々の会社から購入可能であるが、上市されたＨＩＬＩＣ充填材の大多数は単なる非修飾シリカである。例えば、Ｆｅｋｅｔｅ、Ｅ．ＯｌａｈおよびＪ．Ｆｅｋｅｔｅ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ．１２２８（２０１２）５７を参照のこと。シリカゲルは、いつでも許容できるＨＩＬＩＣ分離をもたらすわけではない。例えば、Ｈ．Ｘ．Ｑｉｕ、Ｌ．Ｌｏｕｋｏｔｋｏｖａ、Ｐ．Ｓｕｎ、Ｅ．Ｔｅｓａｒｏｖａ、Ｚ．ＢｏｓａｋｏｖａおよびＤ．Ｗ．Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ．１２１８（２０１１）２７０、ならびにＨ．Ｑｉｕら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ．１２１８（２０１１）８０７５−８０８２（これらの各内容は、参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
【０００９】
さらに、シリカゲルは、ＨＩＬＩＣ分離に必要な、水を含有する移動相と共に用いた場合、安定ではない。この不安定性は、基礎となるシリカが緩やかに溶解すること、および分離した分析物の保持が絶えず変化することによって示される（実施例の表１を参照のこと）。これは、市販用のＨＩＬＩＣ固定相としては全く容認できるものではない。さらに、この傾向は、ＳＰＰについてはより重大である。よって、より新しく、より有望な、ＳＰＰ支持体上のＨＩＬＩＣ分離作用物質を製造し、評価することは、適時かつ重要なことである（例えば、図１〜３を参照のこと）。これは、示すように、表面を溶解から保護し、かつ、シリカのようなむき出しの支持体、または他の保護されていないもしくは保護の少ない支持体に比べて、より広いＨＩＬＩＣ選択性およびより高い効率を有する、超安定な、共有結合したＨＩＬＩＣ相を使用することによって実現される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】表面多孔性粒子（ＳＰＰ）、別名コアシェル粒子（多孔性シェルに包まれた非多孔性コア）、を示す概略図である。
【図２】表面多孔性粒子の透過型電子顕微鏡写真である。全粒子径に対する非多孔性コアの直径の割合をρと定義する。
【図３】異なる直径を有する３種類の表面多孔性粒子の例の走査型電子顕微鏡写真である。
【図４】シクロフルクタンおよびシクロフルクタン誘導体の例である。
【図５】シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の例である。
【図６】大環状糖ペプチドの例である。
【図７】イオン性ＨＩＬＩＣ選択剤の例である。
【図８】両性イオン性ＨＩＬＩＣ選択剤の例である。
【図９】非従来型シランを用いた、加水分解に安定な、高効率の、結合した両性イオン性ＳＰＰ  ＨＩＬＩＣ相の形成の例である。
【図１０】多点結合を用いた、加水分解に安定な、高効率の、結合したイオン性誘導体化シクロフルクタンＳＰＰ  ＨＩＬＩＣ相の形成の例である。
【図１１】むき出しのＳＰＰシリカの保持時間ドリフトである。
【図１２】非従来型シランを用いて、加水分解に安定な、高効率の、結合した両性イオン性ＳＰＰ  ＨＩＬＩＣ相を形成した場合の、保持時間ドリフトである。
【図１３】多点結合を用いて、加水分解に安定な、高効率の、結合したイオン性誘導体化シクロフルクタンＳＰＰ  ＨＩＬＩＣ相を形成した場合の、保持時間ドリフトである。
【図１４】ＨＩＬＩＣにおける、極性分析物である５−フェニル吉草酸およびフェルラ酸の分離である。
【図１５】安定化し、結合した、シクロフルクタン６に基づくＨＩＬＩＣ選択剤を用いたＨＩＬＩＣにおける、極性ヌクレオベース（ウラシルおよびシトシン）およびヌクレオシド（アデノシン）の分離である。
【図１６】ＨＩＬＩＣにおける、極性環状ヌクレオチドの分離である。
【図１７】ＨＩＬＩＣにおける、極性分析物であるピリドキシンおよびアスコルビン酸の分離である。
【図１８】安定化し、結合した、シクロデキストリンに基づくＨＩＬＩＣ選択剤を用いたＨＩＬＩＣにおける、極性ヌクレオベース（ウラシルおよびシトシン）およびヌクレオシド（アデノシン）の分離である。
【図１９】ＨＩＬＩＣにおける、極性キサンチンの分離である。
【図２０】安定化し、結合した、安息香酸官能化シクロフルクタンに基づくイオン性ＨＩＬＩＣ選択剤を用いたＨＩＬＩＣにおける、極性ヌクレオシドおよびヌクレオベースの分離である。
【図２１】安定化し、結合した、テイコプラニンに基づく大環状糖ペプチド（ｇｙｌｃｏｐｅｐｔｉｄｅ）ＨＩＬＩＣ選択剤を用いたＨＩＬＩＣにおける、一アミノ酸多型を有する極性ペプチド（エンケファリン）の分離である。
【図２２】順相モードにおける、効率の、フェルラ酸用の移動相の流速への依存性である。
【図２３】ＨＩＬＩＣにおける、効率の、フェルラ酸用の移動相の流速への依存性である。
【図２４】ＨＩＬＩＣにおける、１分間あたりの段数の、フェルラ酸用の移動相の流速への依存性である。
【図２５】ＨＩＬＩＣにおける、図１４〜１７で分離された全ての分析物に関する隣接するピークの選択性である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本出願において、ネイティブの、および誘導体化した、シクロフルクタン、シクロデキストリン、大環状抗生物質、および両性イオンに基づくＨＩＬＩＣ固定相を、支持体としてのＳＰＰに結合した場合の選択性および安定性について評価した（図１〜３を参照のこと）。カラムを順相（ＮＰ）モードにおいても試験し、水系移動相および非水系移動相の性能に対する影響も評価した。安定性、効率、分析時間、および分離度に関する結果を評価し、ＳＰＰに基づく新たなＨＩＬＩＣカラムの明らかな優位性を実証した。
【００１２】
さらに、このようなＨＩＬＩＣ結合ＳＰＰは、全粒子径の大きさが、約０．５〜約２０μｍ、好ましくは約１．３〜約１０μｍ、より好ましくは約１．７〜約５．０μｍの範囲のＳＰＰで製造することができる。本発明によるＳＰＰ−ＣＳＰは、全粒子径が、例えば、約０．５μｍ、約０．６μｍ、約０．７μｍ、約０．８μｍ、約０．９μｍ、約１．０μｍ、約１．１μｍ、約１．２μｍ、約１．３μｍ、約１．４μｍなどのＳＰＰで製造することができる。いくつかの粒子、例えば約１．７、約２．７、および約４．０μｍの粒子の走査型電子顕微鏡写真を図３に示す。
【００１３】
ネイティブシクロフルクタン−６（ＣＦ６）は、ＨＩＬＩＣモードでの極性化合物の分離における強力な選択剤であると報告されている。ＦＰＰに化学結合したＣＦ６に基づくカラムは、市販（ＦＲＵＬＩＣ−Ｎ）されており、市販の一般的なカラムよりも、いくつかの化合物、例えば、核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、キサンチン、βブロッカー、および炭水化物などの分離に関して優れていることが実証されている。
【００１４】
同様に、シクロデキストリンおよび誘導体化シクロデキストリン（ＣＤ）によって、優秀なＨＩＬＩＣ相が作製されることが示されている。挙げられたＨＩＬＩＣ選択剤のその他２種は、両性イオン型（例えば、カチオン部分とアニオン部分の両方を含むもの）、およびバンコマイシンのような大環状抗生物質型である。例えば、Ｒ．Ｊ．Ｓｏｕｋｕｐ−Ｈｅｉｎら、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ６６（２００７）４６１、および米国特許第４，５３９，３９９号（これらの各内容は、参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。表１に、本出願で示されるＨＩＬＩＣ選択剤のクラスの一覧を示す。
ＨＩＬＩＣ選択剤の各クラスに関する代表的／例示的な構造を図４〜８に示す。
【００１５】
【表１】
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【００１６】
本発明は、第１に、加水分解に安定な、共有結合した、高選択性ＳＰＰ  ＨＩＬＩＣ固定相の調製を提供する。さらに、これらのＳＰＰ  ＨＩＬＩＣ固定相は、全多孔性粒子（ＦＦＰ）上の同様の固定相に比べて、より高い効率およびより短い保持時間を有する。
【実施例】
【００１７】
無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、無水トルエン、無水ピリジン、３−（トリエトキシシリル）プロピルイソシアネート、酢酸アンモニウム（ＮＨ４ＯＡｃ）、トリフルオロ酢酸（ｔｒｉｆｌｕｏｒａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）（ＴＦＡ）、ならびに本研究で使用した全ての分析物（５−フェニル吉草酸、フェルラ酸、ピリドキシン、Ｌ−アスコルビン酸、ウラシル、アデノシン、シトシン、チミジン３’：５’環状モノホスフェート（ｃＴＭＰ）、アデノシン２’：３’環状モノホスフェート（ｃＡＭＰ）、グアノシン２’：３’環状モノホスフェート（ｃＧＭＰ）、およびシチジン２’：３’環状モノホスフェート（ｃＣＭＰ）は、シグマアルドリッチ社（ミルウォーキー、ＷＩ）から購入した。１，２−ビス（トリクロロシリル）エタンは、Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。１，３−ビス（クロロジメチルシリル））プロパンおよびビス（３−トリメトキシシリルプロピル）アミンは、Ｇｅｌｅｓｔ社（モリスビル、ＰＡ）から入手した。ＣＦ６、シクロデキストリン、および大環状糖ペプチドは、ＡＺＹＰ，ＬＬＣ（アーリントン、ＴＸ）から供給された。クロマトグラフ分離に使用した、アセトニトリル（ＡＣＮ）、ヘプタン（Ｈｅｐ）、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）、およびエタノール（ＥｔＯＨ）は、ＥＭＤ（ギブスタウン、ＮＪ）から入手した。水は、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水精製システム（ミリポア社、ビルリカ、ＭＡ）によって精製した。
【００１８】
全てのクロマトグラフ分離は、クォータナリポンプ、オートサンプラー、および多波長紫外可視検出器を備えたアジレントＨＰＬＣシリーズ１２６０システム（アジレント・テクノロジー社、サンタクララ、ＣＡ）で実施した。データの取得および解析には、Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトウェア・バージョンＲｅｖ．Ｂ．０３．０２［３４１］を用いた。注入量は、全ての分析で０．５であった。温度は、３０℃に維持した。ＨＩＬＩＣモードで用いた移動相（ＭＰ）の組成は、環状ヌクレオチドの場合を除き、ＡＣＮ  ７５〜９５％および２５ｍＭ  ＮＨ４ＯＡｃ  ５〜２５％であり、環状ヌクレオチドのための移動相（ＭＰ）の組成は、ＡＣＮ／１００ｍＭ  ＮＨ４ＯＡｃ（７０／３０、ｖ／ｖ）であった。順相で行う分離には、種々の比率のＨｅｐ／ＩＰＡおよびＨｅｐ／ＥｔＯＨを用い、フェルラ酸の分析については、ＴＦＡ  ０．１％をＥｔＯＨ相に加えた。
【００１９】
ネイティブＣＦ６を、Ｈ．Ｘ．Ｑｉｕ、Ｌ．Ｌｏｕｋｏｔｋｏｖａ、Ｐ．Ｓｕｎ、Ｅ．Ｔｅｓａｒｏｖａ、Ｚ．Ｂｏｓａｋｏｖａ、およびＤ．Ｗ．Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ．１２１８（２０１１）２７０の開示に従い、シリカゲルに化学結合した。シクロデキストリンに基づくＣＳＰは、米国特許第４，５３９，３９９号に開示されているように、Ｄ．Ｗ．Ａｒｍｓｔｒｏｎｇに従って合成した。大環状抗生物質ＣＳＰは、米国特許第５，６２６，７５７号（その内容は、参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているように、Ｄ．Ｗ．  Ａｒｍｓｔｒｏｎｇに従って合成した。両性イオン性固定相は、Ｑｉｕら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ  １２１８（２０１１）８０７５〜８０８２の開示に従って合成した。
【００２０】
以下の実施例は、種々の安定な、結合した表面多孔性粒子（ＳＰＰ）に基づくＨＩＬＩＣ固定相を調製するための合成である。
【実施例１】
【００２１】
シクロフルクタンに基づく、安定な、結合したＳＰＰ  ＨＩＬＩＣ固定相の調製
シクロフルクタンは、１８〜２４個のヒドロキシル基を有する環状オリゴ糖である。これらのヒドロキシル基は、シクロフルクタン（またはシクロフルクタン誘導体）をＳＰＰシリカに共有結合させるための、反応性官能基として使用することができる。シクロフルクタンは、ネイティブ形態で、または誘導体化形態で、ＨＩＬＩＣ選択剤として使用することができる。シクロフルクタン分子の誘導体化は、ＳＰＰシリカ上へのシクロフルクタン分子の固定化の前に行ってもよく、または後に行ってもよい。誘導体化基は、典型的には、Ｃ１〜Ｃ３０直鎖アルカン、Ｃ１〜Ｃ３０分岐アルカン、Ｃ１〜Ｃ３０不飽和アルカン、Ｃ１〜Ｃ３０環状アルカン、またはヘテロ原子（例えば、Ｎ、Ｓ、Ｏ）を含むＣ１〜Ｃ３０の直鎖および／もしくは環状アルカンであるが、これらに限定されず、前記誘導体化基は、数々の化学結合（例えば、エーテル結合、カルバメート結合、チオエーテル結合、チオカルバメート結合、エステル結合、トリアゾール結合、および尿素結合）によってシクロフルクタンに結合させる。
【００２２】
ネイティブおよび誘導体化シクロフルクタンは、同様にして、ＳＰＰシリカに結合させる。まず、２５０ｍＬ丸底フラスコ中で、シクロフルクタン（３ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（６０ｍＬ）にアルゴンブランケット下で溶解した。次いで、３−トリエトキシシリルプロピルイソシアネート（１２ｍｍｏｌ）および無水ピリジン（５ｍＬ）を加え、反応容器を９０℃に５時間加熱した。一方、ＳＰＰシリカ（４ｇ）をまずオーブン（１２０℃）で４時間乾燥し、その後ディーン・スターク・トラップおよび２５０ｍＬ丸底２口フラスコを用いて共沸蒸留（トルエン、１２５ｍＬ）した。反応容器を、両方とも一旦室温まで放冷させ、シクロフルクタン／ＤＭＦ溶液をＳＰＰシリカ−トルエンスラリーに加え、得られた懸濁液を１６時間還流した。その後、反応物をろ過し、洗浄した（トルエン、ジクロロメタン、イソプロパノール、メタノール、水、アセトン）。この方法によって、カルバメート結合したシクロフルクタンＨＩＬＩＣ相が生じる。得られたＳＰＰ  ＨＩＬＩＣ相を乾燥し、次いでステンレス鋼管中にスラリー充填した。あるいは、同様にカルバメート結合を形成する第２の結合化学反応を用いてもよい。ここで、ＳＰＰシリカ（３ｇ）を１２０℃で４時間乾燥した。次いで、トルエンを加え、残存する水を、ディーン・スターク・トラップを用いて除去し、トルエン−ＳＰＰシリカスラリーを共沸蒸留した。懸濁液を放冷（＜４０℃）させ、１ｍＬの（３−アミノプロピル）トリエトキシシランをシリカ（３．３ｇ）−トルエン（１２５ｍＬ）スラリーに加え、反応混合物を４時間還流した。その後、懸濁液をろ過し、洗浄（トルエン、ジクロロメタン、イソプロパノール、メタノール、水、アセトン）し、乾燥してアミノ官能化ＳＰＰシリカを得た。次いで、１，６−ジイソシアネートヘキサン（２ｍＬ）を乾燥アミノ−シリカトルエンスラリーに加え（アルゴン下）、それを氷浴で冷却した。全てのジイソシアネートを加えた後、反応混合物を７０℃に５時間加熱した。その後、懸濁液をろ過し、洗浄（トルエン）し、最後にトルエン（無水、１２５ｍＬ）およびＴＥＡ（１０ｍＬ）中に再懸濁した。最後に、シクロフルクタン（１ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（２５ｍＬ）中に溶解し、溶液をＳＰＰシリカ懸濁液に加え、得られたスラリーを１６時間還流した。その後、反応物をろ過し、洗浄した（トルエン、ジクロロメタン、イソプロパノール、メタノール、水、アセトン）。この方法により、カルバメート結合および尿素結合したシクロフルクタンＨＩＬＩＣ相が生じる。得られたＳＰＰ  ＨＩＬＩＣ相を乾燥し、次いでステンレス鋼管中にスラリー充填した。
【００２３】
第３の結合戦略により、シクロフルクタンおよびその誘導体が、どのようにしてエーテル結合で固定化され得るかの例が示されることになる。まず、５００ｍＬ丸底フラスコ中で、シクロフルクタン（１０ｍｍｏｌ）を３００ｍＬの無水ＤＭＦ中にアルゴンブランケット下で溶解した。次いで、１ｇのＮａＨをこの溶液に加え、得られた懸濁液を、不活性環境中、室温で、３０分間撹拌した。次に、未反応のＮａＨをすべてろ過して除き、ろ液を清浄な、乾燥した５００ｍＬ丸底フラスコに移し、そこに８ｍＬの３−グリシドキシプロピルトリメトキシシランを加えた。この溶液を９０℃に５時間加熱し、室温まで放冷させた。次に、この溶液を、乾燥ＳＰＰシリカ（２１ｇ）が入った５００ｍＬ丸底２口フラスコに移し、得られた懸濁液を１１０℃に１６時間加熱した。その後、反応物をろ過し、洗浄した（トルエン、ジクロロメタン、イソプロパノール、メタノール、水、アセトン）。得られたＳＰＰ  ＨＩＬＩＣ相を乾燥し、次いでステンレス鋼管中にスラリー充填した。
【実施例２】
【００２４】
シクロデキストリンに基づく、安定な、結合したＳＰＰ  ＨＩＬＩＣ固定相の調製
シクロデキストリンは、１８〜２４個のヒドロキシル基を有する環状オリゴ糖である。これらのヒドロキシル基は、シクロデキストリン（またはシクロデキストリン誘導体）をＳＰＰシリカに共有結合させるための、反応性官能基として使用することができる。シクロデキストリンは、ネイティブ形態で、または誘導体化形態で、ＨＩＬＩＣ選択剤として使用することができる。シクロデキストリン分子の誘導体化は、ＳＰＰシリカ上へのシクロデキストリン分子の固定化の前に行ってもよく、または後に行ってもよい。上述のように、誘導体化基は、典型的には、Ｃ１〜Ｃ３０直鎖アルカン、Ｃ１〜Ｃ３０分岐アルカン、Ｃ１〜Ｃ３０不飽和アルカン、Ｃ１〜Ｃ３０環状アルカン、またはヘテロ原子（例えば、Ｎ、Ｓ、Ｏ）を含むＣ１〜Ｃ３０の直鎖および／もしくは環状アルカンであるが、これらに限定されず、上述のように、前記誘導体化基は、数々の化学結合（例えば、エーテル結合、カルバメート結合、チオエーテル結合、チオカルバメート結合、エステル結合、トリアゾール結合、および尿素結合）によってシクロデキストリンに結合させる。
【００２５】
ネイティブおよび誘導体化シクロデキストリンは、同様にして、ＳＰＰシリカに結合させる。まず、２５０ｍＬ丸底フラスコ中で、シクロデキストリン（３ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（６０ｍＬ）にアルゴンブランケット下で溶解した。次いで、３−トリエトキシシリルプロピルイソシアネート（１２ｍｍｏｌ）および無水ピリジン（５ｍＬ）を加え、反応容器を９０℃に５時間加熱した。一方、ＳＰＰシリカ（４ｇ）をまずオーブン（１２０℃）で４時間乾燥し、その後ディーン・スターク・トラップおよび２５０ｍＬ丸底２口フラスコを用いて共沸蒸留（トルエン、１２５ｍＬ）した。反応容器を、両方とも一旦室温まで放冷させ、シクロデキストリン／ＤＭＦ溶液をＳＰＰシリカ−トルエンスラリーに加え、得られた懸濁液を１６時間還流した。その後、反応物をろ過し、洗浄した（トルエン、ジクロロメタン、イソプロパノール、メタノール、水、アセトン）。この方法によって、カルバメート結合したシクロデキストリンＨＩＬＩＣ相が生じる。得られたＳＰＰ  ＨＩＬＩＣ相を乾燥し、次いでステンレス鋼管中にスラリー充填した。あるいは、同様にカルバメート結合を形成する第２の結合化学反応を用いてもよい。ここで、ＳＰＰシリカ（３ｇ）を１２０℃で４時間乾燥した。次いで、トルエンを加え、残存する水を、ディーン・スターク・トラップを用いて除去し、トルエン−ＳＰＰシリカスラリーを共沸蒸留した。懸濁液を放冷（＜４０℃）させ、１ｍＬの（３−アミノプロピル）トリエトキシシランをシリカ（３．３ｇ）−トルエン（１２５ｍＬ）スラリーに加え、反応混合物を４時間還流した。その後、懸濁液をろ過し、洗浄（トルエン、ジクロロメタン、イソプロパノール、メタノール、水、アセトン）し、乾燥してアミノ官能化ＳＰＰシリカを得た。次いで、１，６−ジイソシアネートヘキサン（２ｍＬ）を乾燥アミノ−シリカトルエンスラリーに加え（アルゴン下）、それを氷浴で冷却した。全てのジイソシアネートを加えた後、反応混合物を７０℃に５時間加熱した。その後、懸濁液をろ過し、洗浄（トルエン）し、最後にトルエン（無水、１２５ｍＬ）およびＴＥＡ（１０ｍＬ）中に再懸濁した。最後に、シクロデキストリン（１ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（２５ｍＬ）中に溶解し、溶液をＳＰＰシリカ懸濁液に加え、得られたスラリーを１６時間還流した。その後、反応物をろ過し、洗浄した（トルエン、ジクロロメタン、イソプロパノール、メタノール、水、アセトン）。この方法により、カルバメート結合および尿素結合したシクロデキストリンＨＩＬＩＣ相が生じる。得られたＳＰＰ  ＨＩＬＩＣ相を乾燥し、次いでステンレス鋼管中にスラリー充填した。
【００２６】
第３の結合戦略により、シクロデキストリンおよびその誘導体が、どのようにしてエーテル結合で固定化され得るかの例が示されることになる。まず、５００ｍＬ丸底フラスコ中で、シクロデキストリン（１０ｍｍｏｌ）を３００ｍＬの無水ＤＭＦ中にアルゴンブランケット下で溶解した。次いで、１ｇのＮａＨをこの溶液に加え、得られた懸濁液を、不活性環境中、室温で、３０分間撹拌した。次に、未反応のＮａＨをすべてろ過して除き、ろ液を清浄な、乾燥した５００ｍＬ丸底フラスコに移し、そこに８ｍＬの３−グリシドキシプロピルトリメトキシシランを加えた。この溶液を９０℃に５時間加熱し、室温まで放冷させた。次に、この溶液を、乾燥ＳＰＰシリカ（２１ｇ）が入った５００ｍＬ丸底２口フラスコに移し、得られた懸濁液を１１０℃に１６時間加熱した。その後、反応物をろ過し、洗浄した（トルエン、ジクロロメタン、イソプロパノール、メタノール、水、アセトン）。得られたＳＰＰ  ＨＩＬＩＣ相を乾燥し、次いでステンレス鋼管中にスラリー充填した。
【実施例３】
【００２７】
糖ペプチドに基づく、安定な、結合したＳＰＰ  ＨＩＬＩＣ固定相の調製
大環状糖ペプチド（例えば、テイコプラニン、ボロマイシン、リストセチンＡ、ダルババシン、およびバンコマイシン）は、糖ペプチド（または糖ペプチドアナログ、例えばテイコプラニンアグリコン）をＳＰＰシリカに共有結合させるために使用することができる、アミン官能基およびヒドロキシル官能基を有している。大環状糖ペプチドをＳＰＰシリカ上に化学的に固定化するために使用することができる、数々の結合化学反応が存在する（例えば、エーテル、カルバメート、チオエーテル、チオカルバメート、エステル、トリアゾール、および尿素）。下記に、ＨＩＬＩＣ選択剤のモデルとしてテイコプラニンを用いた、結合戦略の例を示す。
【００２８】
まず、２５０ｍＬ丸底フラスコ中で、テイコプラニン（３ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（６０ｍＬ）にアルゴンブランケット下で溶解し、ＴＥＡ（３ｍＬ）を加えた。次いで、３−トリエトキシシリルプロピルイソシアネート（１２ｍｍｏｌ）を加え、反応容器を９０℃に５時間加熱した。一方、ＳＰＰシリカ（４ｇ）をまずオーブン（１２０℃）で４時間乾燥し、その後ディーン・スターク・トラップおよび２５０ｍＬ丸底２口フラスコを用いて共沸蒸留（トルエン、１２５ｍＬ）した。反応容器を、両方とも一旦室温まで放冷させ、テイコプラニン／ＤＭＦ溶液をＳＰＰシリカ−トルエンスラリーに加え、得られた懸濁液を１６時間還流した。その後、反応物をろ過し、洗浄した（トルエン、ジクロロメタン、イソプロパノール、メタノール、水、アセトン）。この方法によって、カルバメート結合したテイコプラニンＨＩＬＩＣ相が生じる。得られたＳＰＰ  ＨＩＬＩＣ相を乾燥し、次いでステンレス鋼管中にスラリー充填した。
【００２９】
あるいは、同様にカルバメート結合を形成する第２の結合化学反応を用いてもよい。ここで、ＳＰＰシリカ（３ｇ）を１２０℃で４時間乾燥した。次いで、トルエンを加え、残存する水を、ディーン・スターク・トラップを用いて除去し、トルエン−ＳＰＰシリカスラリーを共沸蒸留した。懸濁液を放冷（＜４０℃）させ、１ｍＬの（３−アミノプロピル）トリエトキシシランをシリカ（３．３ｇ）−トルエン（１２５ｍＬ）スラリーに加え、反応混合物を４時間還流した。その後、懸濁液をろ過し、洗浄（トルエン、ジクロロメタン、イソプロパノール、メタノール、水、アセトン）し、乾燥してアミノ官能化ＳＰＰシリカを得た。次いで、１，６−ジイソシアネートヘキサン（２ｍＬ）を乾燥アミノ−シリカトルエンスラリーに加え（アルゴン下）、それを氷浴で冷却した。全てのジイソシアネートを加えた後、反応混合物を７０℃に５時間加熱した。その後、懸濁液をろ過し、洗浄（トルエン）し、最後にトルエン（無水、１２５ｍＬ）中に再懸濁し、ＴＥＡ（１０ｍＬ）を加えた。最後に、テイコプラニン（１ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（２５ｍＬ）中に溶解し、溶液をＳＰＰシリカ懸濁液に加え、得られたスラリーを１６時間還流した。その後、反応物をろ過し、洗浄した（トルエン、ジクロロメタン、イソプロパノール、メタノール、水、アセトン）。この方法により、カルバメート結合および尿素結合したテイコプラニンＨＩＬＩＣ相が生じる。得られたＳＰＰ  ＨＩＬＩＣ相を乾燥し、次いでステンレス鋼管中にスラリー充填した。
【００３０】
第３の結合戦略により、テイコプラニンおよびその誘導体が、どのようにしてエーテル結合で固定化され得るかの例が示されることになる。まず、５００ｍＬ丸底フラスコ中で、テイコプラニン（１０ｍｍｏｌ）を３００ｍＬの無水ＤＭＦ中にアルゴンブランケット下で溶解した。次いで、１ｇのＮａＨをこの溶液に加え、得られた懸濁液を、不活性環境中、室温で、３０分間撹拌した。次に、未反応のＮａＨをすべてろ過して除き、ろ液を清浄な、乾燥した５００ｍＬ丸底フラスコに移し、そこに８ｍＬの３−グリシドキシプロピルトリメトキシシランを加えた。この溶液を９０℃に５時間加熱し、室温まで放冷させた。次に、この溶液を、乾燥ＳＰＰシリカ（２１ｇ）が入った５００ｍＬ丸底２口フラスコに移し、得られた懸濁液を１１０℃に１６時間加熱した。その後、反応物をろ過し、洗浄した（トルエン、ジクロロメタン、イソプロパノール、メタノール、水、アセトン）。得られたＳＰＰ  ＨＩＬＩＣ相を乾燥し、次いでステンレス鋼管中にスラリー充填した。
【実施例４】
【００３１】
イオン型の、安定な、結合したＳＰＰ  ＨＩＬＩＣ固定相の調製
荷電型またはイオン型の、安定な、結合したＨＩＬＩＣ固定相は、数々の合成技術および結合技術によって作製することができる。ここで、多点結合によってＳＰＰシリカに結合した、アニオン性シクロフルクタンに基づくＨＩＬＩＣ固定相を製造するための、誘導体化および結合戦略の例を示す。示されるＨＩＬＩＣ選択剤の第１のモデルは、安息香酸官能化シクロフルクタン６である。実施例は、数々のイオン性ＳＰＰ  ＨＩＬＩＣ相を製造するために使用することができる技術を示す。
【００３２】
安息香酸誘導体化シクロフルクタン６を製造し、その後、以下の結合方法のいずれかによってＳＰＰシリカに結合させた。まず、７５℃で２００ｍＬの無水ＤＭＦに溶解しているシクロフルクタン６（４．２ｇ）に、ＮａＨ（２．１２ｇ）を加えた。懸濁液を、７５℃で４５分間撹拌した。次いで、メチル４−（ブロモメチル）ベンゾエート（２０ｇ）を無水ＤＭＦ（５０ｍＬ）に溶解し、溶液をシクロフルクタン−ＮａＨ懸濁液に注意深く加え、反応液を７５℃に２０時間加熱し、その後、反応液を冷却し、あらゆる固形物をろ過した。溶媒をろ液から除去し、黄色がかった粗製物を得た。次いで、粗製エステル化産物を、水、メタノール、および水酸化ナトリウムを用いて、カルボン酸形態に加水分解した。その後、誘導体化シクロフルクタンを、ＳＰＰシリカに結合させた。まず、２５０ｍＬ丸底フラスコ中で、シクロフルクタン（３ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（６０ｍＬ）にアルゴンブランケット下で溶解した。次いで、３−トリエトキシシリルプロピルイソシアネート（１２ｍｍｏｌ）および無水ピリジン（５ｍＬ）を加え、反応容器を９０℃に５時間加熱した。一方、ＳＰＰシリカ（４ｇ）をまずオーブン（１２０℃）で４時間乾燥し、その後ディーン・スターク・トラップおよび２５０ｍＬ丸底２口フラスコを用いて共沸蒸留（トルエン、１２５ｍＬ）した。反応容器を、両方とも一旦室温まで放冷させ、シクロフルクタン／ＤＭＦ溶液をＳＰＰシリカ−トルエンスラリーに加え、得られた懸濁液を１６時間還流した。その後、反応物をろ過し、洗浄した（トルエン、ジクロロメタン、イソプロパノール、メタノール、水、アセトン）。この方法によって、カルバメート結合したシクロフルクタンＨＩＬＩＣ相が生じる。得られたＳＰＰ  ＨＩＬＩＣ相を乾燥し、次いでステンレス鋼管中にスラリー充填した。
【００３３】
あるいは、同様にカルバメート結合を形成する第２の結合化学反応を用いてもよい。ここで、ＳＰＰシリカ（３ｇ）を１２０℃で４時間乾燥した。次いで、トルエンを加え、残存する水を、ディーン・スターク・トラップを用いて除去し、トルエン−ＳＰＰシリカスラリーを共沸蒸留した。懸濁液を放冷（＜４０℃）させ、１ｍＬの（３−アミノプロピル）トリエトキシシランをシリカ（３．３ｇ）−トルエン（１２５ｍＬ）スラリーに加え、反応混合物を４時間還流した。その後、懸濁液をろ過し、洗浄（トルエン、ジクロロメタン、イソプロパノール、メタノール、水、アセトン）し、乾燥してアミノ官能化ＳＰＰシリカを得た。次いで、１，６−ジイソシアネートヘキサン（２ｍＬ）を乾燥アミノ−シリカトルエンスラリーに加え（アルゴン下）、それを氷浴で冷却した。全てのジイソシアネートを加えた後、反応混合物を７０℃に５時間加熱した。その後、懸濁液をろ過し、洗浄（トルエン）し、最後にトルエン（無水、１２５ｍＬ）およびＴＥＡ（１０ｍＬ）中に再懸濁した。最後に、シクロフルクタン（１ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（２５ｍＬ）中に溶解し、溶液をＳＰＰシリカ懸濁液に加え、得られたスラリーを１６時間還流した。その後、反応物をろ過し、洗浄した（トルエン、ジクロロメタン、イソプロパノール、メタノール、水、アセトン）。この方法により、カルバメート結合および尿素結合したシクロフルクタンＨＩＬＩＣ相が生じる。得られたＳＰＰ  ＨＩＬＩＣ相を乾燥し、次いでステンレス鋼管中にスラリー充填した。
【００３４】
第３の結合戦略により、シクロフルクタンおよびその誘導体が、どのようにしてエーテル結合で固定化され得るかの例が示されることになる。まず、５００ｍＬ丸底フラスコ中で、シクロフルクタン（１０ｍｍｏｌ）を３００ｍＬの無水ＤＭＦ中にアルゴンブランケット下で溶解した。次いで、１ｇのＮａＨをこの溶液に加え、得られた懸濁液を、不活性環境中、室温で、３０分間撹拌した。次に、未反応のＮａＨをすべてろ過して除き、ろ液を清浄な、乾燥した５００ｍＬ丸底フラスコに移し、そこに８ｍＬの３−グリシドキシプロピルトリメトキシシランを加えた。この溶液を９０℃に５時間加熱し、室温まで放冷させた。次に、この溶液を、乾燥ＳＰＰシリカ（２１ｇ）が入った５００ｍＬ丸底２口フラスコに移し、得られた懸濁液を１１０℃に１６時間加熱した。その後、反応物をろ過し、洗浄した（トルエン、ジクロロメタン、イソプロパノール、メタノール、水、アセトン）。得られたＳＰＰ  ＨＩＬＩＣ相を乾燥し、次いでステンレス鋼管中にスラリー充填した。
【実施例５】
【００３５】
両性イオン型の、安定な、結合したＳＰＰ  ＨＩＬＩＣ固定相の調製
両性イオン性ＨＩＬＩＣ相は、ＨＩＬＩＣリガンドを浸出から保護する何らかの措置を講じない限り、加水分解に対して不安定である。そのためのいくつかの手法が、（前述したように）存在する。本実施例において、硫酸ホスホニウム両性イオン（３−Ｐ，Ｐ−ジフェニルホスホニウムプロピルスルホネート）は、バイポーダルシランを使って、ＳＰＰシリカに、安定的な形態で化学結合させる。具体的には、空気の入らない条件下で、２５．８ｍＬの０．５Ｍカリウムジフェニルホスフィドを５００ｍＬ丸底フラスコ中に移した。次に、アルゴン下で、前記ホスフィドの撹拌を行いながら、１２０ｍＬの無水ＴＨＦを加えた。１０ｍＬの無水ＴＨＦに溶解した２．３５ｇのプロパンスルトンをゆっくり加えることによって、前記ホスフィドを両性イオンに変換した。前記スルトンは、３．３分間、一滴ずつ加えた。得られた白色の懸濁液を、（両性イオンをさらに沈殿させるために）冷凍庫中で保管した。白色の懸濁液を、アルゴン下で、ガラスフリット漏斗でろ過し、ジエチルエーテルで洗浄した。
【００３６】
得られた両性イオン（５．３ｇ）を、５００ｍＬフラスコに移し、６０ｍＬの無水ＤＭＦに溶解した。固形物が完全に溶解してから、２．３ｇの３−ブロモプロピオン酸（１０ｍＬ  ＤＭＦ中）を加え、この混合物を１００℃で終夜加熱した。反応後、ＫＢｒをろ過し、得られた粘性液体を、８０℃で回転蒸発させた。褐色の液体を熱ＴＨＦ、ＡＣＮ、およびヘプタンで洗浄した。真空下で終夜乾燥させた後、３−Ｐ，Ｐ−ジフェニルホスフィノプロピルスルホネートの白色結晶を得た。次工程において、無水ジクロロメタン中で、５．２４ｇの粗３−Ｐ，Ｐ−ジフェニルホスフィノプロピルスルホネートを、１．５５ｇの塩化オキサリルと、砕氷上で４時間反応させた。溶媒を、室温で、真空除去した。アシル化産物を、無水ＤＭＦ中で、４．１ｇのビス（３−トリメトキシシリルプロピル）アミンと直ちに混合した。ヒューニッヒ塩基を加えてＨＣｌを吸収した。得られた修飾シランを、ディーン・スターク・トラップを用いて共沸蒸留によってあらかじめ乾燥してあるトルエン中で、７ｇのＳＰＰシリカと共に還流した。得られたＳＰＰ  ＨＩＬＩＣ相を乾燥し、次いでステンレス鋼管中にスラリー充填した。
【００３７】
ＨＩＬＩＣ相を安定化させるための典型的な結合戦略を示す２つの概略図を、図９および図１０に示す。これらは、シリカ表面を保護するために十分な立体容積を有するＨＩＬＩＣ選択剤の使用と合わせて、安定性が向上したＨＩＬＩＣ固定相を提供するために極めて重要である。
【００３８】
提示した安定化技術による安定性特性を表２に示す。
【００３９】
【表２】
2017527824.tif 000004
【００４０】
図１１〜１３は、出願人らの「安定性戦略」が成功していることを表す、追加の代表的なデータを示す。図１１は、むき出しのＳＰＰシリカの保持時間ドリフトを示す。図１２は、非従来型シランを用いた、加水分解に安定な、高効率の、結合した両性イオン性ＳＰＰ  ＨＩＬＩＣ相の形成の例を示す。図１３は、多点結合を用いた、加水分解に安定な、高効率の、結合したイオン性誘導体化シクロフルクタンＳＰＰ  ＨＩＬＩＣ相の形成の例を示す。
【００４１】
表３に、このような、安定な、結合したＨＩＬＩＣ選択剤のモデル例となる、ＦＰＰおよびＳＰＰに結合したネイティブＣＦ６に関する、いくつかの粒子特性および表面被覆度データを示す。ＳＰＰは、ＦＰＰと比較して、はるかに表面積が小さいことに注目されたい。しかしながら、ＳＰＰに関して、ＨＩＬＩＣ選択剤の相対的被覆度（すなわちμｍｏｌ／ｍ２）は同等である。
【００４２】
【表３】
2017527824.tif 000005
【００４３】
本発明によれば、ＳＰＰのポアサイズは、約１００Å〜約３００Å、好ましくは約１００Å〜約１５０Å、より好ましくは約１１０Å〜約１３０Åの範囲である。本発明によるＳＰＰは、約１２０Åのポアサイズを有する。また、本発明によれば、ＳＰＰの表面積は、約１００ｍ２／ｇ〜約５００ｍ２／ｇ、好ましくは約１００ｍ２／ｇ〜約４００ｍ２／ｇ、約１００ｍ２／ｇ〜約３００ｍ２／ｇ、または約１００ｍ２／ｇ〜約２００ｍ２／ｇ、より好ましくは約１１０ｍ２／ｇ〜約１５０ｍ２／ｇの範囲である。本発明によるＳＰＰの表面積は、約１２０ｍ２／ｇである。
【００４４】
以下の段落およびその各図面によって、ＳＰＰ−ＨＩＬＩＣに基づく、安定な、結合した材料の、より高い効率（より高い理論段数（Ｎ）およびより短い保持時間（分析時間）での分離をもたらすという点における、優位性の例を説明する。
【００４５】
図１４は、極性分析物である５−フェニル吉草酸およびフェルラ酸の、シクロフルクタン６に基づく、安定化し、結合したＨＩＬＩＣ選択剤を用いたＨＩＬＩＣにおける分離を示す。この例は、安定化した相がＦＰＰおよびＳＰＰに結合した場合に得られる、分離の比較を示す。ピークの頂点の値は、カラムの段数（Ｎ）に関する効率に相当する。移動相は、ＡＣＮ／２５ｍＭ  ＮＨ４ＯＡｃ（８５／１５）からなり、流速＝７５０μＬ／分、Ｔ＝３０℃であった。同等の分離度が、３つ全てのクロマトグラムで観察されたが、ＳＰＰ−ＨＩＬＩＣ相を用いた分離は、はるかに短時間で完了したことに注目されたい。この優位性は、ＳＰＰによって、選択性の低下を伴わずに効率が向上した結果である。
【００４６】
図１５は、極性ヌクレオベース（ウラシルおよびシトシン）およびヌクレオシド（アデノシン）の、シクロフルクタン６に基づく、安定化し、結合したＨＩＬＩＣ選択剤を用いたＨＩＬＩＣにおける分離を示す。この例は、安定化した相がＦＰＰおよびＳＰＰに結合した場合に得られる、分離の比較を示す。ピークの頂点の値は、カラムの段数（Ｎ）に関する効率に相当する。移動相は、ＡＣＮ／２５ｍＭ  ＮＨ４ＯＡｃ（７５／２５）からなり、流速＝７５０μＬ／分、Ｔ＝３０℃であった。同等の分離度が、３つ全てのクロマトグラムで観察されたが、ＳＰＰ−ＨＩＬＩＣ相を用いた分離は、はるかに短時間で完了したことに注目されたい。この優位性は、ＳＰＰによって、選択性の低下を伴わずに効率が向上した結果である。
【００４７】
図１６は、極性環状ヌクレオチドの、シクロフルクタン６に基づく、安定化し、結合したＨＩＬＩＣ選択剤を用いたＨＩＬＩＣにおける分離を示す。この例は、安定化した相がＦＰＰおよびＳＰＰに結合した場合に得られる、分離の比較を示す。ピークの頂点の値は、カラムの段数（Ｎ）に関する効率に相当する。移動相は、ＡＣＮ／２５ｍＭ  ＮＨ４ＯＡｃ（７０／３０）からなり、流速＝７５０μＬ／分、Ｔ＝３０℃であった。ＳＰＰ−ＨＩＬＩＣ相を使用した場合、同等の／改善された分離度が観察されたことに注目されたい。また、ＳＰＰ−ＨＩＬＩＣ相を用いた分離は、はるかに短時間で完了した。この優位性は、ＳＰＰによって、選択性の低下を伴わずに効率が向上した結果である。
【００４８】
図１７は、極性分析物であるピリドキシンおよびアスコルビン酸の、シクロフルクタン６に基づく、安定化し、結合したＨＩＬＩＣ選択剤を用いたＨＩＬＩＣにおける分離を示す。この例は、安定化した相がＦＰＰおよびＳＰＰに結合した場合に得られる、分離の比較を示す。ピークの頂点の値は、カラムの段数（Ｎ）に関する効率に相当する。移動相は、ＡＣＮ／２５ｍＭ  ＮＨ４ＯＡｃ（７５／２５）からなり、流速＝７５０μＬ／分、Ｔ＝３０℃であった。同等の分離度が、３つ全てのクロマトグラムで観察されたが、ＳＰＰ−ＨＩＬＩＣ相を用いた分離は、はるかに短時間で完了したことに注目されたい。この優位性は、ＳＰＰによって、選択性の低下を伴わずに効率が向上した結果である。
【００４９】
図１８は、極性ヌクレオベース（ウラシルおよびシトシン）およびヌクレオシド（アデノシン）の、シクロデキストリンに基づく、安定化し、結合したＨＩＬＩＣ選択剤を用いたＨＩＬＩＣにおける分離を示す。この例は、安定化した相がＦＰＰおよびＳＰＰに結合した場合に得られる、分離の比較を示す。各ピークのそばの値は、カラムの段数（Ｎ）に関する効率に相当する。移動相は、ＡＣＮ／２５ｍＭ  ＮＨ４ＯＡｃ（９０／１０）からなり、流速＝７５０μＬ／分、Ｔ＝２５℃であった。同等の分離度が、３つ全てのクロマトグラムで観察されたが、ＳＰＰ−ＨＩＬＩＣ相を用いた分離は、はるかに短時間で完了したことに注目されたい。この優位性は、ＳＰＰによって、選択性の低下を伴わずに効率が向上した結果である。
【００５０】
図１９は、極性キサンチン（キサンチンおよびヒポキサンチン）の、シクロデキストリンに基づく、安定化し、結合したＨＩＬＩＣ選択剤を用いたＨＩＬＩＣにおける分離を示す。この例は、安定化した相がＦＰＰおよびＳＰＰに結合した場合に得られる、分離の比較を示す。各ピークのそばの値は、カラムの段数（Ｎ）に関する効率に相当する。移動相は、ＡＣＮ／２５ｍＭ  ＮＨ４ＯＡｃ（９０／１０）からなり、流速＝７５０μＬ／分、Ｔ＝２５℃であった。同等の分離度が、３つ全てのクロマトグラムで観察されたが、ＳＰＰ−ＨＩＬＩＣ相を用いた分離は、はるかに短時間で完了したことに注目されたい。この優位性は、ＳＰＰによって、選択性の低下を伴わずに効率が向上した結果である。
【００５１】
図２０は、極性ヌクレオシドおよびヌクレオベースの、安息香酸官能化シクロフルクタンに基づく、安定化し、結合したイオン性ＨＩＬＩＣ選択剤を用いたＨＩＬＩＣにおける分離を示す。この例は、安定化した相がＳＰＰに結合した場合に得られる、著しい高効率を示す。移動相は、ＣＡＮ／１０ｎＭ  ＮＨ４ＯＡｃ（８５／１５）からなり、流速＝１．５ｍＬ／分、Ｔ＝２５℃であった。また、１．７という換算理論段高さは、ＨＩＬＩＣ分離についてこれまでに得られた最高値であることに注目されたい。
【００５２】
図２１は、一アミノ酸多型を有する極性ペプチド（エンケファリン）の、テイコプラニンに基づく、安定化し、結合した大環状糖ペプチド両性イオン性ＨＩＬＩＣ選択剤を用いたＨＩＬＩＣにおける分離を示す。この例は、安定化した相がＳＰＰに結合した場合に得られる、著しい高効率を示す。移動相は、ＡＣＮ／水（８０／２０）からなり、流速＝１．０ｍＬ／分、Ｔ＝２５℃であった。
【００５３】
安定なＨＩＬＩＣ  ＳＰＰカラムの優位性を実証するための別の方法は、カイネティックプロット（ｖａｎ  Ｄｅｅｍｔｅｒプロットおよび関連するプロット）によるものである。図２２および２３は、それぞれＨＩＬＩＣモードと標準的な順相モードの双方における、２種の類似する全多孔性粒子固定相と比較した、（シクロフルクタン６に基づく）超安定なＨＩＬＩＣ  ＳＰＰ固定相に関するｖａｎ  Ｄｅｅｍｔｅｒプロットを示す。ＳＰＰ固定相は、全ての流速において最も低いＨＥＴＰ（またはＨ）カーブをもたらし、より高い流速において最も小さい傾きを有することに注目されたい。結果として、これらのＳＰＰ相は、最大の理論段数（Ｎ）（１分あたり）をもたらす（図２４）。よって、これらの相では、分析はより少ない時間で完了する。
【００５４】
より具体的には、図２２は、シクロフルクタン６に基づく、安定化し、結合した選択剤を用いた順相モードにおける、（ＨＥＴＰに関する）効率の、フェルラ酸用の移動相の流速への依存性を示す。この例は、ＦＰＰとＳＰＰとの比較を示す。ここから分かるように、ＳＰＰ材料の場合、より高い流速においてＨＥＴＰは最小となる。試験した全ての流速において、ＳＰＰカラムの効率は、試験したカラム中で最大であり、ＳＰＰカラムは、高流速において、物質移動バンド拡散効果の点で注目すべき改善を示した。
【００５５】
図２３は、シクロフルクタン６に基づく、安定化し、結合したＨＩＬＩＣ選択剤を用いたＨＩＬＩＣにおける、（ＨＥＴＰに関する）効率の、フェルラ酸用の移動相の流速への依存性を示す。この例は、ＦＰＰとＳＰＰとの比較を示す。ここから分かるように、ＳＰＰ材料の場合、より高い流速においてＨＥＴＰは最小となる。試験した全ての流速において、ＳＰＰカラムの効率は、試験したカラム中で最大であり、ＳＰＰカラムは、高流速において、物質移動バンド拡散効果の点で改善を示した。
【００５６】
図２４は、シクロフルクタン６に基づく、安定化し、結合したＨＩＬＩＣ選択剤を用いたＨＩＬＩＣにおける、段数（１分間あたり）の、フェルラ酸用の移動相の流速への依存性を示す。この例は、ＦＰＰとＳＰＰとの比較を示す。ＳＰＰカラムが、総分析時間の短縮をもたらすことに注目すべきである。この例は、各化合物に関して、移動相の流速に対する単位時間当たりの段数を示すことによって、このことを明確に示す。ここから分かるように、分析に費やした時間あたりの、得られる段数は、ＦＰＰカラムよりも、ＳＰＰカラムのほうがはるかに高い。
【００５７】
最後に、図２５は、安定化し、結合した、シクロフルクタン６に基づくＨＩＬＩＣ選択剤を用いたＨＩＬＩＣにおける、図１４〜１７で分離された全ての分析物に関する隣接するピークの選択性を示す。この例は、ＦＰＰとＳＰＰとの比較を示し、選択性は、以下の分離された分析物のペアに基づいて算出した：１）ウラシル−アデノシン、２）アデノシン−シトシン、３）５−フェニル吉草酸−フェルラ酸、４）ピリドキシン  アスコルビン酸、５）ｃＴＭＰ−ｃＡＭＰ、６）ｃＡＭＰ−ｃＧＭＰ、７）ｃＧＭＰ−ｃＣＭＰ。ここから分かるように、選択性は、ＦＰＰカラムとＳＰＰカラムとの間で実質的に等しい。選択性が、カラムへのＣＦ６の絶対的な充填量（質量％）に従わないことは明らかである（表２）。本発明は、安定化され、ＳＰＰ上に結合したＨＩＬＩＣ相に関し、同等の相対的被覆度（μｍｏｌ／ｍ２）を有し、同等の選択性をもたらすであろうことを初めて示すものである。
【００５８】
以下は、本発明によるいくつかの実施形態である。
【００５９】
実施形態１。ＨＩＬＩＣ選択剤に結合した表面多孔性粒子（ＳＰＰ）を含む、共有結合した、超安定な親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）相。
【００６０】
実施形態２。ＳＰＰが、約０．５μｍ〜約２０μｍの粒子径を有する、実施形態１の、共有結合した、超安定な親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）相。
【００６１】
実施形態３。ＳＰＰが、約１．３μｍ〜約１０μｍの粒子径を有する、実施形態１の、共有結合した、超安定な親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）相。
【００６２】
実施形態４。ＳＰＰが、約１．７μｍ〜約５．０μｍの粒子径を有する、実施形態１の、共有結合した、超安定な親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）相。
【００６３】
実施形態５。ＳＰＰが、約１．７、約２．７、および約４．０μｍからなる群から選択される粒子径を有する、実施形態１の、共有結合した、超安定な親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）相。
【００６４】
実施形態６。ＳＰＰが、約１．７μｍの粒子径を有する、実施形態１の、共有結合した、超安定な親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）相。
【００６５】
実施形態７。ＳＰＰが、約２．７μｍの粒子径を有する、実施形態１の、共有結合した、超安定な親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）相。
【００６６】
実施形態８。ＳＰＰが、約４．０μｍの粒子径を有する、実施形態１の、共有結合した、超安定な親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）相。
【００６７】
実施形態９。ＳＰＰが、約１００Å〜約３００Åのポアサイズを有する、実施形態１の、共有結合した、超安定な親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）相。
【００６８】
実施形態１０。ＳＰＰが、約１００Å〜約１５０Åのポアサイズを有する、実施形態１の、共有結合した、超安定な親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）相。
【００６９】
実施形態１１。ＳＰＰが、約１１０Å〜約１３０Åのポアサイズを有する、実施形態１の、共有結合した、超安定な親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）相。
【００７０】
実施形態１２。ＳＰＰが、約１２０Åのポアサイズを有する、実施形態１の、共有結合した、超安定な親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）相。
【００７１】
実施形態１３。ＳＰＰが、約１５０ｍ２／ｇ〜約５００ｍ２／ｇの表面積を有する、実施形態１の、共有結合した、超安定な親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）相。
【００７２】
実施形態１４。ＳＰＰが、約１２０ｍ２／ｇの表面積を有する、実施形態１の、共有結合した、超安定な親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）相。
【００７３】
実施形態１５。ＨＩＬＩＣ選択剤が、炭水化物および誘導体、オリゴ糖および誘導体、環状オリゴ糖および誘導体、ペプチドおよび誘導体、糖ペプチドおよび誘導体、大環状糖ペプチドおよび誘導体、荷電型またはイオン型、ならびに両性イオン型からなる群から選択される、実施形態１の、共有結合した、超安定な親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）相。
【００７４】
実施形態１６。ＨＩＬＩＣ選択剤が、シクロデキストリン、誘導体化シクロデキストリン、シクロフルクタン、誘導体化シクロフルクタン、テイコプラニン、バンコマイシン、テイコプラニンアグリコン、リストセチンＡ、ダルババシン、ボロマイシン、スルホン化シクロフルクタン（ｃｙｃｌｏｆｒｕｔａｎ）、スルホン化シクロデキストリン、および３−Ｐ，Ｐ−ジフェニルホスホニウムプロピルスルホネートからなる群から選択される、実施形態１５の、共有結合した、超安定な親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）相。
【００７５】
実施形態１７。ＨＩＬＩＣ選択剤が、ネイティブまたは誘導体化シクロフルクタン（ｃｙｃｌｏｆｒｕｔａｎ）、およびネイティブまたは誘導体化シクロデキストリンからなる群から選択される、実施形態１の、共有結合した、超安定な親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）相。
【００７６】
実施形態１８。誘導体化シクロフルクタン（ｃｙｃｌｏｆｒｕｔａｎ）および誘導体化シクロデキストリンの誘導体化基が、Ｃ１〜Ｃ３０直鎖アルカン、Ｃ１〜Ｃ３０分岐アルカン、Ｃ１〜Ｃ３０不飽和アルカン、Ｃ１〜Ｃ３０環状アルカン、ならびにヘテロ原子（例えば、Ｎ、Ｓ、Ｏ）を含むＣ１〜Ｃ３０の直鎖および／または環状アルカンからなる群から選択される、実施形態１７の、共有結合した、超安定な親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）相）
【００７７】
実施形態１９。表面多孔性粒子（ＳＰＰ）が、エーテル結合、カルバメート結合、チオエーテル結合、チオカルバメート結合、エステル結合、トリアゾール結合、または尿素結合によってＨＩＬＩＣ選択剤に結合する、実施形態１の、共有結合した、超安定な親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）相。
【００７８】
実施形態２０。保持時間ドリフトが、３．０％未満の変化である、実施形態１の、共有結合した、超安定な親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）相。
【００７９】
実施形態２１。保持時間ドリフトが、１．０％未満の変化である、請求項１の、共有結合した、超安定な親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）相。
【００８０】
実施形態２２。表面多孔性粒子（ＳＰＰ）に共有結合した、高効率で、超安定な親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）基材を含む、表面多孔性粒子（ＳＰＰ）。
【００８１】
実施形態２３。基材が、ＨＩＬＩＣ選択剤を含む、実施形態２２の表面多孔性粒子（ＳＰＰ）。
【００８２】
実施形態２４。全多孔性粒子（ＦＰＰ）上の同様の固定相に比べて、より高い効率およびより短い保持時間を有する、加水分解に安定な、高選択性表面多孔性粒子（ＳＰＰ）親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）固定相。
【００８３】
実施形態２５。ＨＩＬＩＣ充填剤が、非修飾シリカではなく、それによって、ＳＰＰ表面を溶解から保護し、かつ、むき出しの支持体およびシリカを含む全多孔性支持体に比べて、より広いＨＩＬＩＣ選択性およびより高い効率を有する、実施形態３の、加水分解に安定な、高選択性ＳＰＰ  ＨＩＬＩＣ相。
【００８４】
実施形態２６。ＨＩＬＩＣ選択剤に結合した表面多孔性粒子（ＳＰＰ）を含む、共有結合した、超安定な親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）相に、分子を接触させることを含む、極性分子の分離方法。
【００８５】
実施形態２７。シクロデキストリン、誘導体化シクロデキストリン、シクロフルクタン、誘導体化シクロフルクタン、テイコプラニン、バンコマイシン、テイコプラニンアグリコン、リストセチンＡ、ダルババシン、ボロマイシン、スルホン化シクロフルクタン（ｃｙｃｌｏｆｒｕｔａｎ）、スルホン化シクロデキストリン、および３−Ｐ，Ｐ−ジフェニルホスホニウムプロピルスルホネートからなる群から選択されるＨＩＬＩＣ選択剤を選択すること、キラル選択剤を表面多孔性粒子に共有結合させること、およびそれによって超安定なＨＩＬＩＣ  ＳＰＰ固定相を得ること、を含む、ＨＩＬＩＣ選択剤に結合した表面多孔性粒子（ＳＰＰ）を含む、超安定な親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）相の製造方法。
【００８６】
本発明の好ましい実施形態を本明細書に記載したが、この記載は例示にすぎない。本明細書に記載した本発明のさらなる改変に当業者は気づくであろうし、そのような全ての改変は、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲内であるとみなされる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【国際調査報告】
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