(57)【要約】  本発明は、ＰＤＧＦアンタゴニストに連結したＶＥＧＦアンタゴニストを含むデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニストを提供する。ＶＥＧＦアンタゴニストは、ＶＥＧＦ若しくはＶＥＧＦＲに対する抗体であるか、又はＶＥＧＦＲ細胞外トラップセグメント（即ち、少なくとも１つのＶＥＧＦに対する少なくとも１つのＶＥＧＦＲの結合を阻害する１つ以上のＶＥＧＦＲ受容体の細胞外領域由来のセグメント）である。ＰＤＧＦアンタゴニストは、ＰＤＧＦ若しくはＰＤＧＦＲに対する抗体であるか、又はＰＤＧＦＲ細胞外トラップセグメント（即ち、少なくとも１つのＰＤＧＦＲと少なくとも１つのＰＤＧＦとの結合を阻害する、１つ以上のＰＤＧＦＲの細胞外領域由来のセグメント）である。このデュアルアンタゴニストは、好ましくはＨＥＭＡ−ＰＣポリマーなどの半減期延長部分にコンジュゲートされる。このデュアルアンタゴニストは湿潤型加齢黄斑変性症の治療に特に有用である。
2017526635.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＤＧＦアンタゴニストに連結したＶＥＧＦアンタゴニストを含むデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニストであって、前記ＶＥＧＦアンタゴニストが（ａ）ＶＥＧＦ若しくはＶＥＧＦＲに対する抗体であるか、又は（ｂ）ＶＥＧＦＲ細胞外トラップセグメントであり、且つ前記ＰＤＧＦアンタゴニストが（ａ）ＰＤＧＦ若しくはＰＤＧＦＲに対する抗体であるか、又は（ｂ）ＰＤＧＦＲ細胞外トラップセグメントであり、但し、前記ＶＥＧＦ及びＰＤＧＦアンタゴニストが両方とも抗体であることはない、デュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項２】
前記ＶＥＧＦアンタゴニストが重鎖と軽鎖とを含む抗体であり、且つ前記ＰＤＧＦアンタゴニストが前記ＰＤＧＦＲ細胞外トラップセグメントであり、及び前記抗体の前記重鎖が前記ＰＤＧＦＲ細胞外トラップセグメントのＣ末端にリンカーを介して融合し、且つ前記軽鎖が前記重鎖と複合体を形成する、請求項１に記載のデュアルアンタゴニスト。
【請求項３】
前記抗体がＦａｂ断片である、請求項１又は２に記載のデュアルアンタゴニスト。
【請求項４】
前記抗体がインタクトな抗体である、請求項１に記載のデュアルアンタゴニスト。
【請求項５】
前記ＰＤＧＦアンタゴニストがＰＤＧＦＲ−α又はＰＤＧＦＲ−β受容体の細胞外トラップセグメントであり、且つ前記ＶＥＧＦアンタゴニストがＶＥＧＦに対する抗体としてである、請求項１に記載のデュアルアンタゴニスト。
【請求項６】
前記ＰＤＧＦＲ細胞外トラップセグメントがＰＤＧＦＲ−βのドメインＤ１〜Ｄ５の１つ以上を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項７】
前記ＰＤＧＦＲ細胞外トラップセグメントがＰＤＧＦＲ−βのドメインＤ１〜Ｄ３を含む、請求項６に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項８】
前記ＰＤＧＦＲ細胞外トラップセグメントが配列番号１１のアミノ酸３３〜３１４を含む、請求項７に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項９】
前記ＶＥＧＦアンタゴニストが抗ＶＥＧＦ抗体を含む、請求項５〜８のいずれか一項に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項１０】
前記抗ＶＥＧＦ抗体が抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体である、請求項９に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項１１】
前記ＰＤＧＦＲ細胞外トラップセグメントが前記重鎖又は軽鎖のＣ末端に位置する、請求項６〜１０のいずれか一項に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項１２】
前記ＰＤＧＦＲ細胞外トラップセグメントが前記重鎖又は軽鎖のＮ末端に位置する、請求項６〜１０のいずれか一項に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項１３】
前記ＰＤＧＦＲトラップと前記抗ＶＥＧＦ抗体重鎖との間に位置するリンカーを更に含む、請求項１２に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項１４】
前記リンカーが、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＧＧ、又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧである、請求項１３に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項１５】
前記リンカーがＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳである、請求項１４に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項１６】
前記抗ＶＥＧＦ抗体重鎖が、ＣＤＲH１：ＧＹＤＦＴＨＹＧＭＮ、ＣＤＲH２：ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＫＲ、及びＣＤＲH３：ＹＰＹＹＹＧＴＳＨＷＹＦＤＶを含む、請求項１５に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項１７】
前記抗ＶＥＧＦ軽鎖が、ＣＤＲL１：ＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ、ＣＤＲL２：ＦＴＳＳＬＨＳ及びＣＤＲL３：ＱＱＹＳＴＶＰＷＴを含む、請求項１６に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項１８】
抗ＶＥＧＦ重鎖アイソタイプが、ＣＨ1、ヒンジ、ＣＨ2及びＣＨ3ドメインを含むＩｇＧ１であり、且つ軽鎖アイソタイプがκである、請求項１７に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項１９】
ＩｇＧ１定常ドメインが配列番号１７に示す配列を有し、且つ軽鎖定常領域が配列番号１８に示す配列を有する、請求項１８に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項２０】
前記ＩｇＧ１定常ドメインが、エフェクター機能を低減する１つ以上の突然変異を有する、請求項１９に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項２１】
前記突然変異が、以下のアミノ酸位置（ＥＵ付番）：Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３６、Ｇ２３７、Ａ３２７、Ａ３３０、及びＰ３３１の１つ以上に対するものである、請求項２０に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項２２】
前記突然変異が、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓ（ＥＵ付番）からなる群から選択される、請求項２０に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項２３】
以下の突然変異：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＧ２３７Ａを有する、請求項２２に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項２４】
前記重鎖が、組換えＤＮＡ技術によって付加されたシステイン残基を更に含む、請求項２３に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項２５】
前記システイン残基が、（ＥＵ付番）Ｑ３４７Ｃ及びＬ４４３Ｃからなる群から選択される、請求項２４に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項２６】
前記システイン残基がＬ４４３Ｃである、請求項２５に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項２７】
前記細胞外トラップセグメントとの重鎖トラップ融合物が配列番号９のアミノ酸配列を有し、且つ前記軽鎖が配列番号１０のアミノ酸配列を有する、請求項２６に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項２８】
前記ＰＤＧＦＲトラップがＰＤＧＦＲ−βのドメインＤ１〜Ｄ５の１つ以上を含む、請求項３に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項２９】
前記ＰＤＧＦＲトラップがＰＤＧＦＲ−βのドメインＤ１〜Ｄ３を含む、請求項２８に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項３０】
前記ＰＤＧＦＲトラップが配列番号１１のアミノ酸３３〜３１４を含む、請求項２９に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項３１】
前記ＶＥＧＦアンタゴニストが抗ＶＥＧＦ抗体を含む、請求項３０に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項３２】
前記抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ断片が抗ＶＥＧＦ−Ａ  Ｆａｂ断片を含む、請求項３１に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項３３】
前記ＰＤＧＦＲトラップが前記Ｆａｂ重鎖又は軽鎖のＣ末端に位置する、請求項３２に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項３４】
前記ＰＤＧＦＲトラップが前記Ｆａｂ重鎖又は軽鎖のＮ末端に位置する、請求項３３に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項３５】
前記トラップ細胞外セグメントとの重鎖融合物が抗ＶＥＧＦ−Ａ  Ｆａｂ断片重鎖を含み、且つ前記軽鎖が抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖を含む、請求項３４に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項３６】
前記ＰＤＧＦＲトラップと前記抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ断片重鎖との間に位置するリンカーを更に含む、請求項３５に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項３７】
前記リンカーが、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＧＧ、及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧからなる群から選択される、請求項３６に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項３８】
前記リンカーがＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳである、請求項３７に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項３９】
前記抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ断片重鎖が、ＣＤＲH１：ＧＹＤＦＴＨＹＧＭＮ、ＣＤＲH２：ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＫＲ、及びＣＤＲH３：ＹＰＹＹＹＧＴＳＨＷＹＦＤＶを含む、請求項３８に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項４０】
前記抗ＶＥＧＦ軽鎖が、ＣＤＲL１：ＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ、ＣＤＲL２：ＦＴＳＳＬＨＳ及びＣＤＲL３：ＱＱＹＳＴＶＰＷＴを含む、請求項３９に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項４１】
抗ＶＥＧＦ重鎖アイソタイプが、ＣＨ1ドメインを含むＩｇＧ１であり、且つ軽鎖アイソタイプがκである、請求項４０に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項４２】
半減期延長部分を更に含む、請求項１〜４１のいずれか一項に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項４３】
前記半減期延長部分がポリマーである、請求項４２に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項４４】
前記ポリマーが、ＰＥＧ及び双性イオンポリマーからなる群から選択される、請求項４３に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項４５】
前記ポリマーが双性イオンポリマーを含む、請求項４４に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項４６】
前記双性イオンポリマーが、ホスホリルコリンを含む単量体を含む、請求項４５に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項４７】
前記単量体が２−（アクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェートを含む、請求項４６に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項４８】
前記単量体が２−（メタクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェート（ＨＥＭＡ−ＰＣ）を含む、請求項４６に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項４９】
前記ポリマーが３本以上のアームを有する、請求項４８に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項５０】
前記ポリマーが、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２本のアームを有する、請求項４９に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項５１】
前記ポリマーが、３、６又は９本のアームを有する、請求項５０に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項５２】
前記ポリマーが９本のアームを有する、請求項５１に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項５３】
コンジュゲートのポリマー部分が３００，０００〜１，７５０，０００Ｄａのピーク分子量を有する、請求項４９に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項５４】
前記コンジュゲートの前記ポリマー部分が５００，０００〜１，０００，０００Ｄａのピーク分子量を有する、請求項５３に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項５５】
前記コンジュゲートの前記ポリマー部分が６００，０００〜８００，０００Ｄａのピーク分子量を有する、請求項５４に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項５６】
前記ポリマーが９本のアームを有する、請求項５５に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項５７】
前記ポリマーに共有結合的に結合している、請求項４３〜５６のいずれか一項に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項５８】
前記ポリマーが、アミノ基、ヒドロキシル基、スルフヒドリル基及びカルボキシル基からなる群から選択される部分に共有結合的に結合している、請求項５７に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項５９】
前記ポリマーがスルフヒドリル基に共有結合的に結合している、請求項５８に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項６０】
前記スルフヒドリル基が、天然に存在するシステイン残基のものである、請求項５９に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項６１】
前記スルフヒドリル基が、組換えＤＮＡ技術によって付加されたシステイン残基のものである、請求項５９に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項６２】
前記ポリマーが配列番号９の７３１位で前記システイン残基に共有結合的に結合している、請求項６１に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項６３】
前記ＶＥＧＦアンタゴニストが、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２及びＶＥＧＦＲ−３の１つ以上の細胞外セグメントを含むＶＥＧＦＲ細胞外トラップセグメントを含み、且つ前記ＰＤＧＦアンタゴニストが抗ＰＤＧＦ抗体である、請求項１に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項６４】
ＶＥＧＦＲの前記細胞外セグメントがドメインＤ１〜Ｄ７の１つ以上を含む、請求項６３に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項６５】
前記細胞外セグメントがＶＥＧＦＲ−１由来のＤ２及びＶＥＧＦＲ−２由来のＤ３を含む、請求項６３に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項６６】
前記Ｄ２が前記Ｄ３のＮ末端側にあり、且つ前記ドメイン間にリンカーを更に含む、請求項６５に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項６７】
前記ＰＤＧＦアンタゴニストがインタクトな抗体である、請求項６３に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項６８】
前記ＰＤＧＦアンタゴニストがＦａｂ断片である、請求項６３に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項６９】
前記抗ＰＤＧＦＲ抗体が、ヒト化２Ａ１Ｅ２、ＨｕＭ４Ｔｓ．２２、ヒト化１Ｂ３、ヒト化２Ｃ５、抗ＰＤＧＦ−ＢＢ、抗ＰＤＧＦ−ＤＤ、抗ＰＤＧＦ−ＢＢ又は抗ＰＤＧＦ−ＡＢである、請求項６７に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項７０】
重鎖がＩｇＧ１であり、且つ軽鎖がκである、請求項６９に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニストタンパク質。
【請求項７１】
前記重鎖が、Ｑ３４７Ｃ又はＬ４４３Ｃからなる群から選択されるシステインを有する、請求項７０に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項７２】
前記システインにコンジュゲートした半減期延長部分を更に含む、請求項７１に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項７３】
前記半減期延長部分が双性イオンポリマーを含み、前記ポリマーが１つ以上の単量体単位を含み、少なくとも１つの単量体単位が双性イオン基を含む、請求項７２に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニストタンパク質。
【請求項７４】
前記双性イオン基がホスホリルコリンを含む、請求項７３に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項７５】
前記単量体が２−（アクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェートを含む、請求項７４に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項７６】
前記単量体が２−（メタクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェート（ＨＥＭＡ−ＰＣ）を含む、請求項７４に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項７７】
前記ポリマーが３本以上のアームを有する、請求項７６に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項７８】
前記ポリマーが、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２本のアームを有する、請求項７７に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項７９】
前記ポリマーが、３、６又は９本のアームを有する、請求項７８に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項８０】
前記ポリマーが９本のアームを有する、請求項７９に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項８１】
コンジュゲートのポリマー部分が３００，０００〜１，７５０，０００Ｄａのピーク分子量を有する、請求項８０に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項８２】
前記コンジュゲートの前記ポリマー部分が５００，０００〜１，０００，０００Ｄａのピーク分子量を有する、請求項８１に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項８３】
前記コンジュゲートの前記ポリマー部分が６００，０００〜８００，０００Ｄａのピーク分子量を有する、請求項８２に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項８４】
前記ＰＤＧＦアンタゴニストが、ＰＤＧＦＲ−α及びＰＤＧＦＲ−βからなる群から選択されるＰＤＧＦＲの１つ以上の細胞外セグメントを含むＰＤＧＦ細胞外トラップセグメントであり、且つ前記ＶＥＧＦアンタゴニストが、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２及びＶＥＧＦＲ−３からなる群から選択されるＶＥＧＦＲの１つ以上の細胞外セグメントを含むＶＥＧＦ細胞外トラップセグメントである、請求項１に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項８５】
ＶＥＧＦＲの前記細胞外トラップセグメントがドメインＤ１〜Ｄ７の１つ以上を含む、請求項８４に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項８６】
前記細胞外トラップセグメントがＶＥＧＦＲ−１由来のＤ２及びＶＥＧＦＲ−２由来のＤ３を含む、請求項８５に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項８７】
前記Ｄ２が前記Ｄ３のＮ末端側にあり、且つ前記ドメイン間にリンカーを更に含む、請求項８６に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項８８】
前記ＰＤＧＦＲトラップがＰＤＧＦＲ−βのドメインＤ１〜Ｄ５の１つ以上を含む、請求項８４に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項８９】
前記ＰＤＧＦＲトラップがＰＤＧＦＲ−βのドメインＤ１〜Ｄ３を含む、請求項８８に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項９０】
前記ＰＤＧＦＲトラップが配列番号１１のアミノ酸３３〜３１４を含む、請求項８９に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項９１】
前記ＶＥＧＦアンタゴニストと前記ＰＤＧＦアンタゴニストとの間にリンカー配列を更に含む、請求項９０に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項９２】
半減期延長部分を更に含む、請求項８４〜９１のいずれか一項に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項９３】
前記半減期延長部分が、ＰＥＧ及び双性イオンポリマーからなる群から選択されるポリマーを含む、請求項９２に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項９４】
前記半減期延長部分が双性イオンポリマーを含む、請求項９３に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項９５】
前記双性イオンポリマーが、ホスホリルコリンを含む単量体を含む、請求項９４に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項９６】
前記単量体が２−（アクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェートを含む、請求項９５に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項９７】
前記単量体が２−（メタクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェート（ＨＥＭＡ−ＰＣ）を含む、請求項９５に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項９８】
前記ポリマーが３本以上のアームを有する、請求項９７に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項９９】
前記ポリマーが、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２本のアームを有する、請求項９８に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項１００】
前記ポリマーが、３、６又は９本のアームを有する、請求項９９に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項１０１】
前記ポリマーが９本のアームを有する、請求項１００に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項１０２】
コンジュゲートのポリマー部分が３００，０００〜１，７５０，０００Ｄａのピーク分子量を有する、請求項９９に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項１０３】
前記コンジュゲートの前記ポリマー部分が５００，０００〜１，０００，０００Ｄａのピーク分子量を有する、請求項１０２に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項１０４】
前記コンジュゲートの前記ポリマー部分が６００，０００〜８００，０００Ｄａのピーク分子量を有する、請求項１０３に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項１０５】
前記ポリマーが９本のアームを有する、請求項１０４に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項１０６】
前記細胞外トラップセグメントが、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣ及びＰＤＧＦ−ＤＤの１つ以上に結合する、請求項５に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項１０７】
前記細胞外トラップが、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ及びＰＤＧＦ−ＤＤに結合する、請求項１０７に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項１０８】
前記細胞外トラップが、ＰＤＧＦＲ−αα、ＰＤＧＦＲ−αβ、及びＰＤＧＦＲ−ββ受容体のいずれか１つに対するＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ及びＰＤＧＦ−ＤＤの結合を阻害する、請求項１０８に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項１０９】
デュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニストを精製する方法であって、
前記デュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニストを、前記デュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニストに結合するアフィニティークロマトグラフィー残基と接触させるステップと、
アフィニティークロマトグラフィー樹脂から前記デュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニストを溶出させて、前記デュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニストを含むアフィニティークロマトグラフィー溶出液を形成するステップと、
前記アフィニティークロマトグラフィー溶出液を、前記デュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニストと結合するイオン交換樹脂と接触させるステップと、
前記イオン交換樹脂から前記デュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニストを溶出させるステップと
を含む方法。
【請求項１１０】
前記イオン交換樹脂が陰イオン交換樹脂である、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１１】
前記イオン交換樹脂が陽イオン交換樹脂である、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
前記アフィニティークロマトグラフィー樹脂がプロテインＡカラムである、請求項１１０、１１１又は１１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
薬学的に許容可能な賦形剤と、少なくとも１つのデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニストとを含む液体医薬組成物であって、０．２ＥＵ／ｍｌ未満を有する液体医薬組成物。
【請求項１１４】
０．１ＥＵ／ｍｌ未満を有する、請求項１１４に記載の液体医薬組成物。
【請求項１１５】
０．０５ＥＵ／ｍｌ未満を有する、請求項１１５に記載の液体医薬組成物。
【請求項１１６】
前記ポリマーが、約１００ｋＤａ〜１５００ｋＤａのＭｗによって計測される分子量を有する、請求項４８に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項１１７】
前記ポリマーが、１個以上のポリマー開始部位を有するＡＴＲＰに好適な開始剤から作られる、請求項１１６に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項１１８】
前記開始剤が３個以上のポリマー開始部位を有する、請求項１１７に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項１１９】
前記開始剤が、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２個のポリマー開始部位を有する、請求項１１８に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項１２０】
前記開始剤が、３、６又は９個のポリマー開始部位を有する、請求項１１９に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項１２１】
前記開始剤が９個のポリマー開始部位を有する、請求項１２０に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項１２２】
前記開始剤がＯＧ１７８６である、請求項１２１に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項１２３】
前記ポリマーが、約５００ｋＤａ〜１０００ｋＤａのＭｗによって計測される分子量を有する、請求項１１６に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項１２４】
前記ポリマーが、１個以上のポリマー開始部位を有するＡＴＲＰに好適な開始剤から作られる、請求項１２３に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項１２５】
前記開始剤が３個以上のポリマー開始部位を有する、請求項１２４に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項１２６】
前記開始剤が、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２個のポリマー開始部位を有する、請求項１２５に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項１２７】
前記開始剤が、３、６又は９個のポリマー開始部位を有する、請求項１２６に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項１２８】
前記開始剤が９個のポリマー開始部位を有する、請求項１２７に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項１２９】
前記開始剤がＯＧ１７８６である、請求項１２８に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項１３０】
前記ポリマーが、約６００ｋＤａ〜約９００ｋＤａのＭｗによって計測される分子量を有する、請求項１２５に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項１３１】
前記ポリマーが、１個以上のポリマー開始部位を有するＡＴＲＰに好適な開始剤から作られる、請求項１３０に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項１３２】
前記開始剤が３個以上のポリマー開始部位を有する、請求項１３１に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項１３３】
前記開始剤が、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２個のポリマー開始部位を有する、請求項１３２に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項１３４】
前記開始剤が、３、６又は９個のポリマー開始部位を有する、請求項１３３に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項１３５】
前記開始剤が９個のポリマー開始部位を有する、請求項１３４に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項１３６】
前記開始剤がＯＧ１７８６である、請求項１３５に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項１３７】
前記ポリマーが、７５０ｋＤａ±１５％のＭｗによって計測される分子量を有する、請求項１１６に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項１３８】
前記ポリマーが、１個以上のポリマー開始部位を有するＡＴＲＰに好適な開始剤から作られる、請求項１３７に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項１３９】
前記開始剤が３個以上のポリマー開始部位を有する、請求項１４０に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項１４０】
前記開始剤が、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２個のポリマー開始部位を有する、請求項１３９に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項１４１】
前記開始剤が、３、６又は９個のポリマー開始部位を有する、請求項１４０に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項１４２】
前記開始剤が９個のポリマー開始部位を有する、請求項１４１に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項１４３】
前記開始剤がＯＧ１７８６である、請求項１４２に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項１４４】
疾患の治療又は予防のための、請求項１〜１０８又は１１６〜１４３のいずれか一項に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【請求項１４５】
新生血管障害、任意選択で湿潤型加齢黄斑変性症などの眼新生血管障害の治療又は予防のための、請求項１〜１０８又は１１６〜１４４のいずれか一項に記載のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１４年６月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／０１８，５７９号明細書（あらゆる目的において全体として参照により援用される）の非仮出願である。
【背景技術】
【０００２】
血管新生（血管の形成）は、生物の発生全体を通じて起こる。実際、胚における最初の器官は血管である。血管新生はまた、創傷治癒、損傷組織への血流の回復にも極めて重要である。しかしながら、血管新生が適切になされない又は調節不全に陥ると、癌、乾癬、関節炎及び失明を含めた多くの疾患の一因となり、又はそれらが引き起こされる。Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ  Ｐ．２００３．Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  ９（６）：６５３−６６０。
【０００３】
加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）は、高齢者の視力低下及び失明の主な原因である。約１０００万人のアメリカ人がＡＭＤに罹患している。集団におけるＡＭＤの有病率は年齢と共に着実に増加する。４０歳では、ＡＭＤに罹患しているのは集団の約２％に過ぎないが、８０歳になるとこれが約２５％になる。Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｄ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．２００４．Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１２２：５６４−５７２。概して２種類のＡＭＤ、即ち乾燥型と湿潤型とがある。
【０００４】
乾燥型ＡＭＤは、この疾患の最も一般的な形態である。乾燥型ＡＭＤでは、黄斑の網膜色素上皮細胞層が消耗する。乾燥型ＡＭＤは慢性的であり、概して幾らかの視力低下を引き起こす。乾燥型ＡＭＤの重症例では、患者は略完全な失明を生じ得る。湿潤型ＡＭＤは乾燥型ＡＭＤ患者の一部の１０〜１５％に発症する。湿潤型ＡＭＤは、血管新生、特に脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）によって特徴付けられる。ＣＮＶは、脈絡膜から網膜の外側に向かって成長する未成熟な新血管の存在によって特徴付けられる。これらの未成熟な血管から網膜下及び網膜内に液体が漏れ、視力低下及び失明を引き起こす。湿潤型ＡＭＤによる失明は、典型的には急性である。
【０００５】
血管新生はまた、癌及び腫瘍の形成及び維持においても重要な役割を果たす。新血管の動員は、転移経路の不可欠な要素である。多くの腫瘍で血管密度が転移可能性の予測的指標を提供し得る。高度に血管が発達した腫瘍は、血管の少ない腫瘍と比べて転移発生率が高い。
【０００６】
血管新生は、増殖因子、血管内皮細胞、細胞外マトリックス分子、ケモカイン及び細胞シグナル伝達分子の間の複雑な相互作用の結果である。血管新生のメディエーターとして同定される因子としては、塩基性及び酸性線維芽細胞増殖因子、形質転換増殖因子α及びβ、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、アンジオゲニン、血小板由来内皮細胞増殖因子、ＩＬ８、及び血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）が挙げられる。血管新生におけるＶＥＧＦの役割については、広範囲に報告されている。
【０００７】
ＶＥＧＦシグナル伝達は生理的血管新生において極めて重要な律速段階となることが示されている。ＶＥＧＦはまた、病理的血管新生（例えば腫瘍成長）においても中心的な役割を果たす。Ｆｅｒｒａｒａ  Ｎ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ−Ｓｍｙｔｈ  Ｔ．１９９７．Ｔｈｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ．Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．１８：４−２５。ＶＥＧＦはまた、血管漏出を誘導することも知られている。Ｂａｔｅｓ  ＤＯ  ａｎｄ  Ｃｕｒｒｙ  ＦＥ．１９９７．Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｖｉａ  ａ  Ｃａ（２＋）−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐａｔｈｗａｙ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７３：Ｈ６８７−Ｈ６９４；Ｒｏｂｅｒｔｓ  ＷＧ  ａｎｄ  Ｐａｌａｄｅ  ＧＥ．１９９５．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｆｅｎｅｓｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１０８：２３６９−２３７９。
【０００８】
湿潤型ＡＭＤ及び癌の治療に抗ＶＥＧＦ療法薬の使用が成功している。２００４年、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈの抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））が、癌の治療に対してＦＤＡの承認を受けた。抗ＶＥＧＦ剤は湿潤型ＡＭＤの治療に対して承認されている。２００４年、ＦＤＡはＥｙｅｔｅｃｈ／ＰｆｉｚｅｒのＭａｃｕｇｅｎ（登録商標）を承認した。ＧｅｎｅｎｔｅｃｈのＬｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）が、２００６年に湿潤型ＡＭＤに対して承認された。ベバシズマブはまた、湿潤型ＡＭＤの治療にも適応外使用されている。２０１１年、湿潤型ＡＭＤの治療に対してＲｅｇｅｎｅｒｏｎのＥｙｌｅａ（登録商標）が承認された。
【０００９】
抗ＶＥＧＦ療法薬は成功しているとはいえ、これらのいずれも病理的新生血管（ＮＶ）組織の退縮を生じさせるものではない。従って、継続的な抗ＶＥＧＦ治療にも関わらずＮＶ組織は残り続け、治療患者の大幅な視力増加を阻み得る。ＮＶ組織は、内皮細胞、周皮細胞及び炎症細胞（即ち、偶発的なマクロファージ）からなる。毛細血管上に周皮細胞が存在することにより、ＮＶの支持及び安定化につながるのみならず、ＶＥＧＦの周皮細胞産生を含めた化学的シグナル伝達及び物理的相互作用を介して内皮細胞生存が促進される。一体化した周皮細胞によるこの内皮生存シグナル伝達は極めて重要であり、ＶＥＧＦの消退に対するＮＶ組織の抵抗性、即ち、単剤療法抗ＶＥＧＦ治療に対するＮＶ退縮の欠如を説明し得る。加えて、病理的ＮＶ組織は時間と共に線維化及び瘢痕につながり得る。
【００１０】
治療を受けた眼の略半分において、抗ＶＥＧＦ療法から２年以内に網膜下瘢痕が生じる。Ｄａｎｉｅｌ  Ｅ，Ｔｏｔｈ  ＣＡ，Ｇｒｕｎｗａｌｄ  ＪＥ．２０１４．Ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｓｃａｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｅｔｔｉｎｇｓ．Ｒｅｔｉｎａ  ３２：１４８０−１４８５。網膜下線維化形成は、黄斑系の永久的な機能不全を引き起こし得る。それは、光受容体、網膜色素上皮及び脈絡膜血管の破壊を引き起こす。Ｉｓｈｉｋａｗａ  Ｋ，Ｒａｍ  Ｋ，Ｈｉｎｔｏｎ  ＤＲ．２０１５．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｓｕｂｒｅｔｉｎａｌ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．ｘｘｘ：１−７。抗ＶＥＧＦ療法は概して視力を安定化させ、又は改善するが、瘢痕形成は治療後の視力低下の原因の１つとして特定されている。Ｃｏｈｅｎ  ＳＹ，Ｏｕｂｒａｈａｍ  Ｈ，Ｕｚｚａｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．２０１２．Ｃａｕｓｅｓ  ｏｆ  ｕｎｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ  ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｉｎ  ｅｘｕｄａｔｉｖｅ  ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｅｔｔｉｎｇｓ．Ｒｅｔｉｎａ  ３２：１４８０−１４８５。
【００１１】
ＰＤＧＦは、周皮細胞の動員、成熟及び抗ＶＥＧＦ媒介性退縮に対する抵抗性において役割を果たすことが報告されている。角膜及び脈絡膜血管新生の動物モデルにより、ＰＤＧＦ−Ｂ／ＰＤＧＦＲ−β相互作用を遮断する薬剤の投与が病理的新生血管系からの周皮細胞の剥離につながることが実証されたとの報告がなされている。Ｊｏ  Ｎ，Ｍａｉｌｈｏｓ  Ｃ，Ｊｕ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．２００６．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｔｅｌｅｔ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｂ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅ  Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  Ａｎｔｉ−Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  Ｏｃｕｌａｒ  Ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊ  Ｐａｔｈ．１６８（６）：２０３６−２０５３。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
両方の経路をターゲティングするため、現在、臨床試験が進行中であり、ここで患者は２つの薬物、即ち、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）（抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ）、及びＯｐｈｔｈｏｔｅｃｈによるＰＤＧＦを標的とするＰＥＧ化アプタマーであるＦｏｖｉｓｔａ（商標）の投与を受けている。Ｆｏｖｉｓｔａは、単一のＰＤＧＦリガンド、ＰＤＧＦ−ＢＢのみを標的とする。しかしながら、ＰＤＧＦリガンドは他に多くある：ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＣＣ及びＰＤＧＦ−ＤＤ。例えばＰＤＧＦ−ＤＤは、眼血管新生において重要な役割を果たすことが示されている。Ｋｕｍａｒ  Ａ，Ｈｏｕ  Ｘ，Ｃｈｕｎｓｉｋ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．２０１０．Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−ＤＤ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ａｒｒｅｓｔｓ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  Ｇｌｙｃｏｇｅｎ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ  Ｋｉｎａｓｅ−３β  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８５（２０）：１５５００−１５５１０。しかし、ＦｏｖｉｓｔａはＰＤＧＦ−ＤＤと相互作用しない。当該技術分野においては、より広域の抗ＰＤＧＦ療法薬が必要とされている。
【００１３】
加えて、アプタマーベースの療法薬は、一般に、アプタマーが腎臓ろ過及び血清消化を受ける点で薬物動態特性が良くない。これらの問題はペグ化によって多少解消することができるが、ペグ化は標的との結合性を低下させる傾向を有する。アプタマーは典型的には、その抗体対応物と比べてはるかに低い親和性で標的に結合する。ペグ化は結合を更に一層低下させる傾向を有する。従って、当該技術分野においては、非アプタマーベースの抗ＰＤＧＦ療法薬が必要とされている。
【００１４】
Ｆｏｖｉｓｔａの現在の臨床計画では、患者が治療のために受けなければならない注射の回数が、現在承認されている抗ＶＥＧＦ療法薬と比べて２倍となる。Ｆｏｖｉｓｔａは抗ＶＥＧＦ剤と別個に製剤化され、そのため、患者に１回でなく、２回の注射を投与しなければならない。更に、一回の注射で眼圧の上昇が引き起こされるため、これらの注射は同時にはできない。
【００１５】
患者及び治療を行う医師の両方の観点から、硝子体内注射には問題がある。多くの患者はこの注射によって痛み及び不快感を覚え、患者コンプライアンスが重要な課題である。硝子体内注射の一般的な副作用には、結膜出血、眼痛、飛蚊症、眼圧上昇、及び眼内の炎症が含まれる。硝子体内注射は、眼内炎、網膜剥離及び外傷性白内障を含めた比較的まれな重篤有害事象を伴う。
【００１６】
従って、当該技術分野においては、患者が耐えなければならない硝子体内注射の回数が増すことのない療法薬が必要とされている。加えて、現在の抗ＶＥＧＦ療法薬は多くの場合に月１回の注射を必要とする。月１回より少ない頻度で済む療法薬も必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、ＰＤＧＦアンタゴニストに連結したＶＥＧＦアンタゴニストを含むデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニストを提供し、ここでＶＥＧＦアンタゴニストは（ａ）ＶＥＧＦ若しくはＶＥＧＦＲに対する抗体であるか、又は（ｂ）ＶＥＧＦＲ細胞外トラップセグメントであり、且つＰＤＧＦアンタゴニストは（ａ）ＰＤＧＦ若しくはＰＤＧＦＲに対する抗体であるか、又は（ｂ）ＰＤＧＦＲ細胞外トラップセグメントであり、但し、ＶＥＧＦ及びＰＤＧＦアンタゴニストが両方とも抗体であることはない。任意選択で、ＶＥＧＦアンタゴニストは重鎖と軽鎖とを含む抗体であり、且つＰＤＧＦアンタゴニストはＰＤＧＦＲ細胞外トラップセグメントであり、及び抗体の重鎖はリンカーを介してＰＤＧＦＲ細胞外トラップセグメントのＣ末端に融合し、且つ軽鎖は重鎖と複合体を形成する。任意選択で、抗体はＦａｂ断片である。任意選択で、抗体はインタクトな抗体である。任意選択で、ＰＤＧＦアンタゴニストはＰＤＧＦＲ−α又はＰＤＧＦＲ−β受容体の細胞外トラップセグメントであり、且つＶＥＧＦアンタゴニストはＶＥＧＦに対する抗体である。任意選択で、ＰＤＧＦＲ細胞外トラップセグメントはＰＤＧＦＲ−βのドメインＤ１〜Ｄ５の１つ以上を含む。任意選択で、ＰＤＧＦＲ細胞外トラップセグメントはＰＤＧＦＲ−βのドメインＤ１〜Ｄ３を含む。任意選択で、ＰＤＧＦＲ細胞外トラップセグメントは配列番号１１のアミノ酸３３〜３１４を含む。任意選択で、ＶＥＧＦアンタゴニストは抗ＶＥＧＦ抗体を含む。任意選択で、抗ＶＥＧＦ抗体は抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体である。任意選択で、ＰＤＧＦＲ細胞外トラップセグメントは重鎖又は軽鎖のＣ末端に位置する。任意選択で、ＰＤＧＦＲ細胞外トラップセグメントは重鎖又は軽鎖のＮ末端に位置する。
【００１８】
任意選択で、ＰＤＧＦＲトラップと抗ＶＥＧＦ抗体重鎖との間に位置するリンカーを更に含むデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト。任意選択でリンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＧＧ、又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧである。
【００１９】
任意選択で、抗ＶＥＧＦ抗体重鎖は、ＣＤＲH１：ＧＹＤＦＴＨＹＧＭＮ、ＣＤＲH２：ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＫＲ、及びＣＤＲH３：ＹＰＹＹＹＧＴＳＨＷＹＦＤＶを含む。任意選択で、抗ＶＥＧＦ軽鎖は、ＣＤＲL１：ＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ、ＣＤＲL２：ＦＴＳＳＬＨＳ及びＣＤＲL３：ＱＱＹＳＴＶＰＷＴを含む。
【００２０】
任意選択で、抗ＶＥＧＦ重鎖アイソタイプは、ＣＨ1、ヒンジ、ＣＨ2及びＣＨ3ドメインを含むＩｇＧ１であり、且つ軽鎖アイソタイプはκである。任意選択で、ＩｇＧ１定常ドメインは配列番号１７に示す配列を有し、且つ軽鎖定常領域は配列番号１８に示す配列を有する。
【００２１】
任意選択で、ＩｇＧ１定常ドメインは、エフェクター機能を低減する１つ以上の突然変異を有する。任意選択で突然変異は、以下のアミノ酸位置（ＥＵ付番）：Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３６、Ｇ２３７、Ａ３２７、Ａ３３０、及びＰ３３１の１つ以上に対するものである。任意選択で、突然変異は、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓからなる群から選択される。任意選択で、突然変異は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＧ２３７Ａである。
【００２２】
任意選択で、デュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニストは、組換えＤＮＡ技術によって付加されたシステイン残基を更に含む重鎖を含む。任意選択で、システイン残基は、（ＥＵ付番）Ｑ３４７Ｃ及びＬ４４３Ｃからなる群から選択される。
【００２３】
任意選択で、デュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニストは配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖を有し、且つ軽鎖は配列番号１０のアミノ酸配列を有する。
【００２４】
任意選択で、デュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニストは、ＰＤＧＦＲ−βのドメインＤ１〜Ｄ５の１つ以上を含むＰＤＧＦＲトラップ細胞外セグメントを含む。任意選択で、ＰＤＧＦＲトラップ細胞外セグメントはＰＤＧＦＲ−βのドメインＤ１〜Ｄ３を含む。任意選択で、ＰＤＧＦＲトラップ細胞外セグメントは配列番号１１のアミノ酸３３〜３１４を含む。
【００２５】
任意選択で、デュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニストは、抗ＶＥＧＦ抗体であるＶＥＧＦアンタゴニストを含む。任意選択で、抗体は抗ＶＥＧＦ−Ａ  Ｆａｂ断片である。任意選択で、ＰＤＧＦＲ細胞外トラップセグメントはＦａｂ重鎖又は軽鎖のＣ末端に位置する。任意選択で、ＰＤＧＦＲ細胞外トラップセグメントはＦａｂ重鎖又は軽鎖のＮ末端に位置する。
【００２６】
任意選択で、デュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦは、抗ＶＥＧＦ−Ａ  Ｆａｂ断片重鎖を含む重鎖と抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖を含む軽鎖とを含む。任意選択で、デュアルアンタゴニストは、ＰＤＧＦＲトラップと抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ断片重鎖との間に位置するリンカーを更に含む。任意選択で、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＧＧ、及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧからなる群から選択される。任意選択で、抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ断片重鎖は、ＣＤＲH１：ＧＹＤＦＴＨＹＧＭＮ、ＣＤＲH２：ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＫＲ、及びＣＤＲH３：ＹＰＹＹＹＧＴＳＨＷＹＦＤＶを含む。任意選択で、抗ＶＥＧＦ軽鎖は、ＣＤＲL１：ＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ、ＣＤＲL２：ＦＴＳＳＬＨＳ及びＣＤＲL３：ＱＱＹＳＴＶＰＷＴを含む。任意選択で、抗ＶＥＧＦ重鎖アイソタイプは、ＣＨ1ドメインを含むＩｇＧ１であり、且つ軽鎖アイソタイプはκである。
【００２７】
任意のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニストが、半減期延長部分を更に含み得る。任意選択で、半減期延長部分はポリマーを含み、ポリマーはＰＥＧ又は双性イオンポリマーである。任意選択で、双性イオンポリマーは、ホスホリルコリンを含む単量体を含む。任意選択で、単量体は２−（アクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェートを含む。任意選択で、単量体は２−（メタクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェート（ＨＥＭＡ−ＰＣ）を含む。任意選択で、ポリマーは３本以上のアームを有する。任意選択で、ポリマーは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２本のアームを有する。任意選択で、ポリマーは、３、６又は９本のアームを有する。任意選択で、ポリマーは９本のアームを有する。任意選択で、コンジュゲートのポリマー部分は３００，０００〜１，７５０，０００Ｄａのピーク分子量を有する。任意選択で、コンジュゲートのポリマー部分は５００，０００〜１，０００，０００Ｄａのピーク分子量を有する。任意選択で、コンジュゲートのポリマー部分は６００，０００〜８００，０００Ｄａのピーク分子量を有する。任意選択で、デュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニストはポリマーに共有結合的に結合している。任意選択で、ポリマーは、アミノ基、ヒドロキシル基、スルフヒドリル基及びカルボキシル基の少なくとも１つに共有結合的に結合している。任意選択で、スルフヒドリル基は、天然に存在するシステイン残基のものである。任意選択で、スルフヒドリル基は、組換えＤＮＡ技術によって付加されたシステイン残基のものである。任意選択で、ポリマーは配列番号９の７３１位でシステイン残基に共有結合的に結合している。
【００２８】
任意選択で、ＶＥＧＦアンタゴニストは、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２及びＶＥＧＦＲ−３の１つ以上の細胞外セグメントを含むＶＥＧＦＲ細胞外トラップセグメントを含み、且つＰＤＧＦアンタゴニストは抗ＰＤＧＦ抗体である。任意選択で、ＶＥＧＦＲの細胞外セグメントはドメインＤ１〜Ｄ７の１つ以上を含む。任意選択で、細胞外セグメントはＶＥＧＦＲ−１由来のＤ２及びＶＥＧＦＲ−２由来のＤ３を含む。任意選択で、Ｄ２はＤ３のＮ末端側にあり、且つこれらのドメイン間にリンカーを更に含む。任意選択で、ＰＤＧＦアンタゴニストはインタクトな抗体である。任意選択で、ＰＤＧＦアンタゴニストはＦａｂ断片である。任意選択で、抗ＰＤＧＦＲ抗体は、ヒト化２Ａ１Ｅ２、ＨｕＭ４Ｔｓ．２２、ヒト化１Ｂ３、ヒト化２Ｃ５、抗ＰＤＧＦ−ＢＢ、抗ＰＤＧＦ−ＤＤ、抗ＰＤＧＦ−ＢＢ又は抗ＰＤＧＦ−ＡＢである。任意選択で、重鎖はＩｇＧ１であり、且つ軽鎖はκである。任意選択で、重鎖配列は、組換えＤＮＡ技術を用いて付加されたシステインを有し、このシステインは、Ｑ３４７Ｃ又はＬ４４３Ｃからなる群から選択される。任意選択で、デュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニストは、システインにコンジュゲートした半減期延長部分を更に含む。任意選択で、デュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニストタンパク質は、双性イオンポリマーであって、１つ以上の単量体単位を含む双性ポリマーを含む半減期延長部分を有し、この少なくとも１つの単量体単位は、ホスホリルコリンなどの双性イオン基を含む。任意選択で、単量体は２−（アクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェートを含む。任意選択で、単量体は２−（メタクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェート（ＨＥＭＡ−ＰＣ）を含む。任意選択で、ポリマーは３本以上のアームを有する。任意選択で、ポリマーは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２本のアームを有する。任意選択で、ポリマーは、３、６又は９本のアームを有する。任意選択で、ポリマーは９本のアームを有する。任意選択で、コンジュゲートのポリマー部分は３００，０００〜１，７５０，０００Ｄａのピーク分子量を有する。任意選択で、コンジュゲートのポリマー部分は５００，０００〜１，０００，０００Ｄａのピーク分子量を有する。任意選択で、コンジュゲートのポリマー部分は６００，０００〜８００，０００Ｄａのピーク分子量を有する。
【００２９】
一部のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニストにおいて、ＰＤＧＦアンタゴニストは、ＰＤＧＦＲ−α及びＰＤＧＦＲ−βからなる群から選択されるＰＤＧＦＲの１つ以上の細胞外セグメントを含むＰＤＧＦ細胞外トラップセグメントを含み、且つＶＥＧＦアンタゴニストは、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２及びＶＥＧＦＲ−３からなる群から選択されるＶＥＧＦＲの１つ以上の細胞外セグメントを含むＶＥＧＦ細胞外トラップセグメントである。任意選択で、ＶＥＧＦＲの細胞外トラップセグメントはドメインＤ１〜Ｄ７の１つ以上を含む。任意選択で、細胞外トラップセグメントはＶＥＧＦＲ−１由来のＤ２及びＶＥＧＦＲ−２由来のＤ３を含む。任意選択で、Ｄ２はＤ３のＮ末端側にあり、且つこれらのドメイン間にリンカーを更に含む。任意選択で、ＰＤＧＦＲトラップはＰＤＧＦＲ−βのドメインＤ１〜Ｄ５の１つ以上を含む。任意選択で、ＰＤＧＦＲトラップはＰＤＧＦＲ−βのドメインＤ１〜Ｄ３を含む。任意選択で、ＰＤＧＦＲトラップは配列番号１１のアミノ酸３３〜３１４を含む。任意選択で、デュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニストは、ＶＥＧＦアンタゴニストとＰＤＧＦアンタゴニストとの間にリンカー配列を更に含む。任意選択で、デュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニストは半減期延長部分を更に含む。任意選択で、半減期延長部分は、ＰＥＧ及び双性イオンポリマーからなる群から選択されるポリマーを含む。任意選択で、半減期延長部分は双性イオンポリマーを含む。任意選択で、双性イオンポリマーは、ホスホリルコリンを含む単量体を含む。任意選択で、単量体は２−（アクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェートを含む。任意選択で、単量体は２−（メタクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェート（ＨＥＭＡ−ＰＣ）を含む。任意選択で、ポリマーは３本以上のアームを有する。任意選択で、ポリマーは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２本のアームを有する。任意選択で、ポリマーは、３、６又は９本のアームを有する。任意選択で、コンジュゲートのポリマー部分は３００，０００〜１，７５０，０００Ｄａのピーク分子量を有する。任意選択で、コンジュゲートのポリマー部分は５００，０００〜１，０００，０００Ｄａのピーク分子量を有する。任意選択で、コンジュゲートのポリマー部分は６００，０００〜８００，０００Ｄａのピーク分子量を有する。任意選択で、ポリマーは９本のアームを有する。任意選択で、デュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニストはポリマーに共有結合的に結合している。任意選択で、ポリマーは、アミノ基、ヒドロキシル基、スルフヒドリル基及びカルボキシル基の少なくとも１つに共有結合的に結合している。任意選択で、スルフヒドリル基は、天然に存在するシステイン残基のものである。任意選択で、スルフヒドリル基は、組換えＤＮＡ技術によって付加されたシステイン残基のものである。
【００３０】
上記に記載したとおりの任意のデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニストは、疾患、特に新生血管障害、任意選択で湿潤型加齢黄斑変性症などの眼新生血管障害の治療又は予防において使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ヒトＰＤＧＦＲ−βのタンパク質配列である。
【図２】ＶＥＧＦＲ−１のタンパク質配列である。
【図３】ＶＥＧＦＲ−２のタンパク質配列である。
【図４】ＶＥＧＦＲ−３のタンパク質配列である。
【図５】ベバシズマブ配列（ＤｒｕｇＢａｎｋ  ＤＢ００１１２）である。
【図６】ラニビズマブ（Ｎｏｖａｒｔｉｓが公開したもの）である。
【図７Ａ】ＰＤＧＦＲβ−ＧＳ１０−抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖のタンパク質配列である。
【図７Ｂ】抗ＶＥＧＦ−Ａ重鎖のタンパク質配列である。
【図８Ａ】ＰＤＧＦＲβ−ＧＧ−抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖のタンパク質配列である。
【図８Ｂ】抗ＶＥＧＦ−Ａ重鎖のタンパク質配列である。
【図９Ａ】ＰＤＧＦＲβ−ＧＳ１０−抗ＶＥＧＦ−Ａ重鎖（野生型Ｆｃ）のタンパク質配列である。
【図９Ｂ】抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖のタンパク質配列である。
【図１０Ａ】ＰＤＧＦＲβ−ＧＧ−抗ＶＥＧＦ−Ａ重鎖（野生型Ｆｃ）のタンパク質配列である。
【図１０Ｂ】抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖のタンパク質配列である。
【図１１Ａ】抗ＶＥＧＦ−Ａ重鎖（野生型Ｆｃ）−ＧＳ２１−ＰＤＧＦＲβのタンパク質配列である。
【図１１Ｂ】抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖のタンパク質配列である。
【図１２Ａ】ＰＤＧＦＲ−β−ＧＳ２１−抗ＶＥＧＦ−Ａ重鎖（Ｑ３４７Ｃ）のタンパク質配列である。
【図１２Ｂ】抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖（ＴＡＦ３４７）のタンパク質配列である。
【図１３Ａ】ＰＤＧＦＲ−β−ＧＳ２１−抗ＶＥＧＦ−Ａ重鎖（Ｌ４４３Ｃ）のタンパク質配列である。
【図１３Ｂ】抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖（ＴＡＦ４４３）のタンパク質配列である。
【図１４Ａ】ＰＤＧＦＲβ−ＧＳ１０−抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖のタンパク質配列である。
【図１４Ｂ】抗ＶＥＧＦ−Ａ  Ｆａｂのタンパク質配列である。
【図１５Ａ】ＰＤＧＦＲβ−ＧＧ−抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖のタンパク質配列である。
【図１５Ｂ】抗ＶＥＧＦ−Ａ  Ｆａｂのタンパク質配列である。
【図１６Ａ】ＰＤＧＦＲβ−ＧＳ１０−抗ＶＥＧＦ−Ａ  Ｆａｂのタンパク質配列である。
【図１６Ｂ】抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖のタンパク質配列である。
【図１７Ａ】ＰＤＧＦＲβ−ＧＧ−抗ＶＥＧＦ−Ａ  Ｆａｂのタンパク質配列である。
【図１７Ｂ】抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖のタンパク質配列である。
【図１８Ａ】抗ＶＥＧＦ−Ａ  Ｆａｂ−ＧＳ２１−ＰＤＧＦＲβのタンパク質配列である。
【図１８Ｂ】抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖のタンパク質配列である。
【図１９Ａ】特定の突然変異を含むＰＤＧＦＲβ−ＧＳ１０−抗ＶＥＧＦ−Ａ  Ｆａｂのタンパク質配列である。
【図１９Ｂ】抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖のタンパク質配列である。
【図２０Ａ】ＰＤＧＦＲβ−抗ＶＥＧＦ−Ａ重鎖のタンパク質配列である。
【図２０Ｂ】抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖（１ａ）のタンパク質配列である。
【図２１Ａ】ＰＤＧＦＲ−β（Ｄ２−Ｄ３）−抗ＶＥＧＦ−Ａ重鎖のタンパク質配列である。
【図２１Ｂ】抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖（１ｂ）のタンパク質配列である。
【図２２Ａ】ＰＤＧＦＲ−β（Ｄ１−Ｄ３）−抗ＶＥＧＦ−Ａ  Ｆａｂのタンパク質配列である。
【図２２Ｂ】抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖（２ｂ）のタンパク質配列である。
【図２３Ａ】ＰＤＧＦＲ−β（Ｄ２−Ｄ３）−６ｘＧＳ−抗ＶＥＧＦ−Ａ  Ｆａｂのタンパク質配列である。
【図２３Ｂ】抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖（２ｂ’）のタンパク質配列である。
【図２４Ａ】ＰＤＧＦＲ−β−６ｘＧＳ−抗ＶＥＧＦ−Ａ  Ｆａｂのタンパク質配列である。
【図２４Ｂ】抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖のタンパク質配列である。
【図２５Ａ】抗ＶＥＧＦ−Ａ  Ｆａｂ−６ｘＧＳ−ＰＤＧＦＲ−β（Ｄ２−Ｄ３）のタンパク質配列である。
【図２５Ｂ】抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖（３）のタンパク質配列である。
【図２６】ＯＧ１４４８の化学構造を示す。
【図２７】化合物Ｌを示す。
【図２８】化合物Ｋを示す。
【図２９】Ｒ３７０７からのＯＧ１８０２の合成を示す。
【図３０】ＯＧ１７８６を示す。
【図３１】ＯＧ１５５０からのＯＧ１５４６の合成を示す。
【図３２】ＯＧ１５４６及びＯＧ１５６３からのＯＧ１７８４の合成を示す。
【図３３】ＯＧ１７８４からのＯＧ１４０５の合成を示す。
【図３４】ＯＧ１４０５からのＯＧ１７８５の合成を示す。
【図３５】ＯＧ１７８５からのＯＧ１７８６の合成を示す。
【図３６】ＯＧ１８０２を示す。
【図３７】パーセントグレードＩＶレーザー病変率のグラフを示す。
【図３８】化合物Ｅを示す。
【図３９】ＯＧ１４４８を示す。
【図４０】ＯＧ１４４８、Ａｖａｓｔｉｎ、及び抗ＰＤＧＦ−ＢＢ抗体並びにそれらの様々な組み合わせを使用した相対血管新生を示す。
【図４１】指示化合物についてのＣＮＶサルモデルにおける日数に対する％グレードＩＶ病変率を示す。
【図４２】ウサギ硝子体におけるアフリベルセプト及びラニビズマブと比較したＯＧ１４４８眼薬物動態を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
配列番号の簡単な説明
配列番号１は、ＰＤＧＦＲｂ−ＧＳ１０−軽鎖抗ＶＥＧＦ−Ａ（ベバシズマブ）のタンパク質配列である。
配列番号２は、抗ＶＥＧＦ−Ａベバシズマブ重鎖である。
配列番号３は、ＰＤＧＦＲｂ−ＧＧ−軽鎖抗ＶＥＧＦ−Ａ（ベバシズマブ）のタンパク質配列である。
配列番号４は、ＰＤＧＦＲβ−ＧＳ１０−重鎖抗ＶＥＧＦ−Ａ（ベバシズマブ）である。
配列番号５は、抗ＶＥＧＦ−Ａベバシズマブ軽鎖である。
配列番号６は、ＰＤＧＦＲβ−ＧＧ−重鎖抗ＶＥＧＦ−Ａ（ベバシズマブ）である。
配列番号７は、抗ＶＥＧＦ−Ａ重鎖（ベバシズマブ）−ＧＳ２１−ＰＤＧＦＲβである。
配列番号８は、ＴＡＦ３４７の重鎖トラップ細胞外セグメント：ＰＤＧＦＲ−βトラップ−抗ＶＥＧＦ−Ａ重鎖（Ｑ３４７Ｃ）のアミノ酸配列である。
配列番号９は、ＴＡＦ４４３の重鎖トラップ細胞外セグメント：ＰＤＧＦＲ−βトラップ−抗ＶＥＧＦ−Ａ重鎖（Ｌ４４３Ｃ）のアミノ酸配列であり、配列番号１０は、抗ＶＥＧＦ−Ａの軽鎖のアミノ酸配列である。
配列番号１１は、ヒトＰＤＧＦＲ−βである。
配列番号１２は、ラニビズマブ軽鎖である。
配列番号１３は、ラニビズマブ重鎖である。
配列番号１４は、ヒトＶＥＧＦＲ−１である。
配列番号１５は、ヒトＶＥＧＦＲ−２である。
配列番号１６は、ヒトＶＥＧＦＲ−３である。
配列番号１７は、ヒトＩｇＧ１定常領域である。
配列番号１８は、ヒトκ軽鎖定常領域である。
配列番号１９は、図７のＰＤＧＦＲ−ＧＳ１０−抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖である。
配列番号２０は、図８のＰＤＧＦＲ−ＧＧ−抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖である。
配列番号２１は、ベバシズマブＦａｂである。
配列番号２２は、ＰＤＧＦＲ−β−ＧＳ１０−抗ＶＥＧＦ−Ａ  Ｆａｂである。
配列番号２３は、ＰＤＧＦＲ−β−ＧＧ−抗ＶＥＧＦ−Ａ  Ｆａｂである。
配列番号２４は、抗ＶＥＧＦ−Ａ  Ｆａｂ−ＧＳ２１−ＰＤＧＦＲ−βである。
配列番号２５は、特定の突然変異を含むＰＤＧＦＲ−β−ＧＳ１０−抗ＶＥＧＦ−Ａ  Ｆａｂである。
配列番号２６は、ＰＤＧＦＲβ−抗ＶＥＧＦ−Ａ重鎖（１ａ）のタンパク質配列である。
配列番号２７は、ＰＤＧＦＲ−β（Ｄ２−Ｄ３）−抗ＶＥＧＦ−Ａ重鎖（１ｂ）のタンパク質配列である。
配列番号２８は、ＰＤＧＦＲ−β（Ｄ２−Ｄ３）−抗ＶＥＧＦ−Ａ  Ｆａｂ（２ｂ）のタンパク質配列である。
配列番号２９は、ＰＤＧＦＲ−β（Ｄ２−Ｄ３）−６ｘＧＳ−抗ＶＥＧＦ−Ａ  Ｆａｂのタンパク質配列である。
配列番号３０は、抗ＶＥＧＦ−Ａ  Ｆａｂ−６ｘＧＳ−ＰＤＧＦＲ−β（Ｄ２−Ｄ３）のタンパク質配列である。
配列番号３１は、重鎖抗ＶＥＧＦ−ＰＤＧＦＲ融合物をコードする核酸である。
配列番号３２は、軽鎖抗ＶＥＧＦをコードする核酸である。
ＧＧＧＧＳ（配列番号３７）、ＧＧＧＳ（配列番号３８）、ＧＧＧＥＳ（配列番号３９）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４０）及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ）（配列番号４１）。
ラニビズマブＣＤＲは、ＣＤＲH１：ＧＹＤＦＴＨＹＧＭＮ、ＣＤＲH２：ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＫＲ、及びＣＤＲH３：ＹＰＹＹＹＧＴＳＨＷＹＦＤＶ（配列番号４２〜４４）、ＣＤＲL１：ＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ、ＣＤＲL２：ＦＴＳＳＬＨＳ及びＣＤＲL３：ＱＱＹＳＴＶＰＷＴ（配列番号４５〜４７）である。ベバシズマブＣＤＲH１はＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮ（配列番号４８）であり、ＣＤＲH３はＹＰＨＹＹＧＳＳＨＷＹＦＤＶ（配列番号４９）である。
【００３３】
定義
「新生血管障害」は、変化した調節不全の又は調節されていない血管新生によって特徴付けられる障害又は病態である。新生血管障害の例としては、新生物形質転換（例えば癌）並びに糖尿病性網膜症及び加齢黄斑変性症を含めた眼新生血管障害が挙げられる。
【００３４】
「眼新生血管」障害は、患者の眼における変化した調節不全の又は調節されていない血管新生によって特徴付けられる障害である。かかる障害としては、視神経乳頭血管新生、虹彩血管新生、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、角膜血管新生、硝子体血管新生、緑内障、パンヌス、翼状片、黄斑浮腫、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、血管性網膜症、網膜変性症、ブドウ膜炎、炎症性網膜疾患、及び増殖性硝子体網膜症が挙げられる。
【００３５】
「ポリペプチドリンカー」は、２つのポリペプチド（例えば、ＶＨドメイン及びＶＬドメイン、又はＶＨドメイン及び細胞外トラップセグメント）を連結するために用いられるペプチド結合によってつながった２つ以上のアミノ酸残基を含むポリペプチドである。かかるリンカーポリペプチドの例は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  Ｐ，Ｐｒｏｓｐｅｒｏ  Ｔ，Ｗｉｎｔｅｒ  Ｇ．１９９３．ＰＮＡＳ  ＵＳＡ．９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ  ＲＪ．１９９４．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｄｉａｂｏｄｉｅｓ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３を参照されたい）。例示的リンカーとしては、Ｇ、ＧＧ、ＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＳ、及びＧＧＧＥＳ、並びにかかるリンカーのオリゴマー（例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ）が挙げられる。
【００３６】
本明細書に記載されるデュアルアンタゴニスト又は他の生物学的製剤は、典型的には単離形態で提供される。これは、アンタゴニストが典型的には少なくとも５０％ｗ／ｗ純度でその作製又は精製によって生じる妨害タンパク質及び他の夾雑物を含まないことを意味し、しかし、アンタゴニストがその使用の促進を意図した過剰量の薬学的に許容可能な賦形剤と組み合わされる可能性を除外するものではない。場合により、アンタゴニストは、少なくとも６０、７０、８０、９０、９５又は９９％ｗ／ｗ純度で作製又は精製による妨害タンパク質及び夾雑物を含まない。多くの場合、アンタゴニストはその精製後に残る優勢な巨大分子種である。
【００３７】
抗体という用語には、インタクトな抗体及びその結合断片が含まれる。結合断片は、インタクトな抗体のうち、そのインタクトな抗体が結合する抗原と結合する一部分を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。結合断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；線状抗体；一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。ｓｃＦｖ抗体については、Ｈｏｕｓｔｏｎ  ＪＳ．１９９１．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３：４６−９６に記載されている。加えて、抗体断片には、ＶＨドメインの特性を有する、即ちＶＬドメインと一体に集合することが可能であるか、又はＶＬドメインの特性を有する、即ちＶＨドメインと一体に集合することが可能であり、それにより機能性の抗原結合部位となり、従って完全長抗体の抗原結合特性を提供する単鎖ポリペプチドが含まれる。
【００３８】
抗体、細胞外トラップセグメント又はデュアルアンタゴニストとその１つ又は複数の標的抗原との特異的結合とは、少なくとも１０6、１０7、１０8、１０9、又は１０10Ｍ-1の親和性を意味する。特異的結合は規模が検出可能な程度に大きく、且つ少なくとも１つの無関係の標的に対して起こる非特異的結合と区別可能である。特異的結合は、特定の官能基間の結合又は特定の空間的嵌め合い（例えば、鍵及び鍵穴型）が形成される結果であり得る一方、非特異的結合は、通常はファンデルワールス力の結果である。しかしながら、特異的結合とは、必ずしも抗体又は融合タンパク質が１つのみの標的と結合することを含意するわけではない。
【００３９】
基本的な抗体構造単位は、サブユニットの四量体である。各四量体が２つの同一のポリペプチド鎖対を含み、各対が１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）と１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）とを有する。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識に主として関与する約１００〜１１０個以上のアミノ酸の可変領域を含む。この可変領域は、初めは開裂性シグナルペプチドに連結されて発現する。シグナルペプチドを含まない可変領域は、場合により成熟可変領域と称されることもある。従って、例えば、軽鎖成熟可変領域とは、軽鎖シグナルペプチドを含まない軽鎖可変領域を意味する。しかしながら、可変領域と言うとき、シグナル配列が必ず存在することを意味するわけではなく、実際、本発明の抗体又は融合タンパク質が発現して分泌されると、シグナル配列は切断される。重鎖及び軽鎖可変領域の対が抗体の結合領域を定義する。軽鎖及び重鎖のカルボキシ末端部分はそれぞれ軽鎖及び重鎖定常領域を定義する。重鎖定常領域はエフェクター機能に主として関与する。ＩｇＧ抗体では、重鎖定常領域は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３領域に分けられる。ＣＨ１領域はジスルフィド結合及び非共有結合によって軽鎖定常領域に結合する。ヒンジ領域は、抗体の結合領域とエフェクター領域との間に柔軟性を提供し、また、四量体サブユニットにおける２つの重鎖定常領域間の分子間ジスルフィド結合部位も提供する。ＣＨ２及びＣＨ３領域は、エフェクター機能及びＦｃＲ結合の主要な部位である。
【００４０】
軽鎖はκ又はλのいずれかに分類される。重鎖はγ、μ、α、δ、又はεに分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥとして定義する。軽鎖及び重鎖内において、可変領域と定常領域とは約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」セグメントによってつながり、重鎖はまた約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」セグメントも含む（概略的に、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ  ｅｄ．Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９８９），Ｃｈ．７を参照されたい）（あらゆる目的において全体として参照により援用される）。
【００４１】
各軽鎖／重鎖対の成熟可変領域が抗体結合部位を形成する。従って、インタクトな抗体は２つの結合部位を有し、即ち二価である。天然抗体では、これらの結合部位は同じである。しかしながら、２つの結合部位が異なる二重特異性抗体を作ることができる（例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ  Ｓ，Ｌａｃｈｍａｎｎ  ＰＣ．１９９０．Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ：ａ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ＳＡ，Ｃｏｌｅ  ＭＳ，Ｔｓｏ  ＪＹ．１９９２．Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｌｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３を参照されたい）。可変領域は全て、比較的保存されているフレームワーク領域（ＦＲ）が、相補性決定領域又はＣＤＲとも称される３つの超可変領域によってつながった同じ一般構造を呈する。各対の２つの鎖のＣＤＲはフレームワーク領域によって整列し、特異的なエピトープとの結合が可能になっている。Ｎ末端からＣ末端に、軽鎖及び重鎖の両方が、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４を含む。便宜上、可変重鎖ＣＤＲは、ＣＤＲH１、ＣＤＲH２及びＣＤＲH３と称することができ、可変軽鎖ＣＤＲは、ＣＤＲL１、ＣＤＲL２及びＣＤＲL３と称することができる。各ドメインへのアミノ酸の割当ては、Ｋａｂａｔ  ＥＡ，ｅｔ  ａｌ．１９８７  ａｎｄ  １９９１．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）又はＣｈｏｔｈｉａ  Ｃ，Ｌｅｓｋ  ＡＭ．１９８７．Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  Ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９６：９０１−９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．１９８９．Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  Ｒｅｇｉｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７−８８３の定義に従う。Ｋａｂａｔはまた、広く用いられている付番規則（Ｋａｂａｔ付番）も提供しており、ここでは異なる重鎖可変領域間又は異なる軽鎖可変領域間の対応する残基に同じ番号が割り当てられる。抗体定常領域には、Ｋａｂａｔ付番を使用してもよいが、本願においてそうであるように、ＥＵ付番がより広く用いられている。例示的デュアルアンタゴニストについて特定の配列が提供されるが、タンパク質鎖の発現後に分子の一部又は全てにおいて軽鎖及び／又は重鎖のアミノ末端又はカルボキシ末端の１個〜数個のアミノ酸、特に重鎖Ｃ末端リジン残基が欠損し又は誘導体化し得ることは理解されるであろう。
【００４２】
用語「エピトープ」は、抗体又は細胞外トラップセグメントが結合する抗原上の部位を指す。タンパク質上のエピトープは、連続アミノ酸によるか、又は１つ以上のタンパク質の三次の折り畳みによって隣接した非連続アミノ酸によって形成され得る。連続アミノ酸で形成されたエピトープ（線状エピトープとしても知られる）は、典型的には変性溶媒への曝露時に保持され、一方、三次の折り畳みで形成されたエピトープ（立体エピトープとしても知られる）は、典型的には変性溶媒で処理すると失われる。エピトープは典型的には、少なくとも３個、より通例では少なくとも５個又は８〜１０個のアミノ酸をユニークな空間的コンホメーションで含む。エピトープの空間的コンホメーションの決定方法としては、例えば、Ｘ線結晶構造解析及び二次元核磁気共鳴法が挙げられる。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６，Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ．（１９９６）を参照されたい。
【００４３】
同じ又は重複エピトープを認識する抗体は、ある抗体が標的抗原に対する別の抗体の結合と競合する能力を明らかにする単純なイムノアッセイで同定し得る。抗体のエピトープは同様に、その抗原に結合した抗体（又はＦａｂ断片）のＸ線結晶構造解析で接触残基を同定することによっても定義し得る。
【００４４】
或いは、一方の抗体の結合を低下又は消失させるその抗原中の全てのアミノ酸突然変異が他方の抗体の結合を低下又は消失させる場合、２つの抗体は同じエピトープを有する。一方の抗体の結合を低下又は消失させる一部のアミノ酸突然変異が他方の抗体の結合を低下又は消失させる場合、２つの抗体は重複エピトープを有する。
【００４５】
抗体間の競合は、供試抗体が共通抗原に対する基準抗体の特異的結合を阻害するアッセイによって決定される（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０：１４９５，１９９０を参照されたい）。過剰量の試験抗体（例えば、少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍又は１００倍）が、競合的結合アッセイで計測するときに基準抗体の結合を少なくとも５０％、しかし、好ましくは７５％、９０％又は９９％阻害する場合、試験抗体は基準抗体と競合する。競合アッセイによって同定された抗体（競合抗体）には、基準抗体と同じエピトープに結合する抗体及び基準抗体が結合するエピトープに対して立体障害が起こるのに十分に近接した隣接エピトープに結合する抗体が含まれる。
【００４６】
用語「患者」には、予防的処置又は治療的処置のいずれかを受けるヒト及び他の哺乳類対象が含まれる。
【００４７】
アミノ酸置換を保存的又は非保存的に分類するため、アミノ酸を以下のように分ける：グループＩ（疎水性側鎖）：ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；グループＩＩ（中性親水性側鎖）：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；グループＩＩＩ（酸性側鎖）：ａｓｐ、ｇｌｕ；グループＩＶ（塩基性側鎖）：ａｓｎ、ｇｉｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；グループＶ（鎖配向に影響を及ぼす残基）：ｇｌｙ、ｐｒｏ；及びグループＶＩ（芳香族側鎖）：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。保存的置換には、同じクラス内のアミノ酸間の置換が関わる。非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーと別のクラスのメンバーとの交換を成す。
【００４８】
パーセンテージ配列同一性は、可変領域についてはＫａｂａｔ付番規則によるか、又は定常領域についてはＥＵ付番によって最大限アラインメントした抗体配列で決定される。アラインメント後、対象抗体領域（例えば、重鎖又は軽鎖の成熟可変領域全体）が基準抗体の同じ領域と比較されるものである場合、その対象抗体領域と基準抗体領域との間のパーセンテージ配列同一性は、対象抗体領域及び基準抗体領域の両方で同じアミノ酸によって占有される位置の数を、２つの領域のアラインメントした位置の総数で除し（ギャップはカウントしない）、１００を乗じてパーセンテージに変換したものである。他の配列の配列同一性は、デフォルトのギャップパラメータを使用した、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓソフトウェアパッケージリリース７．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩのＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡなどのアルゴリズムを使用して配列をアラインメントすることによるか、又は検査と最良のアラインメント（即ち、比較ウィンドウで最も高い配列類似性パーセンテージが得られるもの）とによって決定し得る。配列同一性パーセンテージは、比較ウィンドウにわたって２つの最適にアラインメントされた配列を比較して、両方の配列に同一の残基が現れる位置の数を決定することによりマッチ位置の数を求め、そのマッチ位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数（即ち、ウィンドウサイズ）で除して、その結果に１００を乗じて配列同一性パーセンテージを求めることによって計算される。
【００４９】
１つ以上の記載される要素「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物又は方法には、具体的に記載されていない他の要素が含まれ得る。例えば、抗体を含む組成物は、抗体を単独で、又は他の成分と組み合わせて含有し得る。
【００５０】
用語「抗体依存性細胞傷害性」、又はＡＤＣＣは、抗体被覆標的細胞（即ち、抗体が結合している細胞）と溶解活性を有する免疫細胞（エフェクター細胞とも称される）との相互作用に依存する細胞死誘導機構である。かかるエフェクター細胞には、ナチュラルキラー細胞、単球／マクロファージ及び好中球が含まれる。ＡＤＣＣは、細胞に結合した抗体のＦｃ領域と、好中球、マクロファージ及びナチュラルキラー細胞などの免疫エフェクター細胞上のＦｃｙ受容体、特にＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＩとの間の相互作用によって惹起される。標的細胞は、介在するエフェクター細胞の種類に応じて食作用又は溶解によって排除される。エフェクター細胞活性の結果として抗体被覆標的細胞の死滅が起こる。
【００５１】
「抗体依存性細胞食作用」、又はＡＤＣＰとしても知られるオプソニン化という用語は、抗体被覆細胞の全体或いは一部が、免疫グロブリンＦｃ領域に結合する食作用免疫細胞（例えば、マクロファージ、好中球及び樹状細胞）によってインターナライズされる過程を指す。
【００５２】
用語「補体依存性細胞傷害」又はＣＤＣは、標的に結合した抗体の１つ又は複数のＦｃエフェクタードメインが一連の酵素反応を活性化し、ついには標的細胞膜に穴をあける細胞死誘導機構を指す。典型的には、抗体被覆標的細胞上にあるような抗原抗体複合体が補体成分Ｃ１ｑに結合してそれを活性化させ、次にはＣ１ｑが補体カスケードを活性化させることにより、標的細胞死につながる。補体の活性化はまた、標的細胞表面上への補体成分の付着ももたらし、それが白血球上の補体受容体（例えば、ＣＲ３）と結合することによってＡＤＣＣを促進し得る。
【００５３】
ヒト化抗体は、非ヒト「ドナー」抗体由来のＣＤＲがヒト「アクセプター」抗体配列にグラフトされた遺伝子改変抗体である（例えば、Ｑｕｅｅｎ、米国特許第５，５３０，１０１号明細書及び同第５，５８５，０８９号明細書；Ｗｉｎｔｅｒ、米国特許第５，２２５，５３９号明細書、Ｃａｒｔｅｒ、米国特許第６，４０７，２１３号明細書、Ａｄａｉｒ、米国特許第５，８５９，２０５号明細書、同第６，８８１，５５７号明細書、Ｆｏｏｔｅ、米国特許第６，８８１，５５７号明細書を参照されたい）。アクセプター抗体配列は、例えば、成熟ヒト抗体配列、かかる配列の複合体、ヒト抗体配列のコンセンサス配列、又は生殖細胞系列領域配列であってもよい。従って、ヒト化抗体は、完全に又は実質的にドナー抗体由来の一部又は全てのＣＤＲと、存在する場合に、完全に又は実質的にヒト抗体配列由来の可変領域フレームワーク配列及び定常領域とを有する抗体である。同様に、ヒト化重鎖は、完全に又は実質的にドナー抗体重鎖由来の少なくとも１つ、２つ及び通常３つの全てのＣＤＲと、存在する場合に、実質的にヒト重鎖可変領域フレームワーク及び定常領域配列由来の重鎖可変領域フレームワーク配列及び重鎖定常領域とを有する。同様に、ヒト化軽鎖は、完全に又は実質的にドナー抗体軽鎖由来の少なくとも１つ、２つ及び通常３つの全てのＣＤＲと、存在する場合に、実質的にヒト軽鎖可変領域フレームワーク及び定常領域配列由来の軽鎖可変領域フレームワーク配列及び軽鎖定常領域とを有する。ナノボディ及びｄＡｂを除き、ヒト化抗体はヒト化重鎖とヒト化軽鎖とを含む。ヒト化抗体のＣＤＲは、それぞれのＣＤＲ間で（Ｋａｂａｔにより定義されるとおりの）対応する残基の少なくとも８５％、９０％、９５％又は１００％が同一であるとき、実質的に非ヒト抗体の対応するＣＤＲ由来である。抗体鎖の可変領域フレームワーク配列又は抗体鎖の定常領域は、Ｋａｂａｔによって定義される対応する残基の少なくとも８５、９０、９５又は１００％が同一であるとき、それぞれ実質的にヒト可変領域フレームワーク配列又はヒト定常領域由来である。
【００５４】
ヒト化抗体は、多くの場合にマウス抗体の６つ全てのＣＤＲ（好ましくはＫａｂａｔにより定義されるとおり）を組み込むが、ヒト化抗体はまた、全てに満たないＣＤＲ（例えば、マウス抗体の少なくとも３つ、４つ、又は５つのＣＤＲ）で作られてもよい（例えば、Ｄｅ  Ｐａｓｃａｌｉｓ  Ｒ，Ｉｗａｈａｓｈｉ  Ｍ，Ｔａｍｕｒａ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．２００２．Ｇｒａｆｔｉｎｇ  “Ａｂｂｒｅｖｉａｔｅｄ”  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ−Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ−Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｒｅｓｉｄｕｅｓ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｃｏｎｔａｃｔ  ｔｏ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒ  ａ  Ｌｅｓｓ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：３０７６−３０８４；Ｖａｊｄｏｓ  ＦＦ，Ａｄａｍｓ  ＣＷ，Ｂｒｅｅｃｅ  ＴＮ，Ｐｒｅｓｔａ  ＬＧ，ｄｅ  Ｖｏｓ  ＡＭ，Ｓｉｄｈｕ，ＳＳ．２００２．Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｍａｐｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉ−ＥｒｂＢ２  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｏｂｔａｉｎｅｄ  ｗｉｔｈ  ｓｈｏｔｇｕｎ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．３２０：４１５−４２８；Ｉｗａｈａｓｈｉ  Ｍ，Ｍｉｌｅｎｉｃ  ＤＥ，Ｐａｄｌａｎ  ＥＡ，ｅｔ  ａｌ．１９９９．ＣＤＲ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＣＣ４９）：Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ＣＤＲｓ  ｔｏ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ．Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：１０７９−１０９１；Ｔａｍｕｒａ  Ｍ，Ｍｉｌｅｎｉｃ  ＤＥ，Ｉｗａｈａｓｈｉ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．２０００．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｎｔｉｂｏｄｙ：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ（ＳＤＲｓ）ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｍｉｎｉｍａｌｌｙ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｖａｒｉａｎｔ  ｂｙ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＤＲｓ  ｏｎｌｙ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：１４３２−１４４１）。
【００５５】
キメラ抗体は、非ヒト抗体（例えばマウス）の軽鎖及び重鎖の成熟可変領域をヒト軽鎖及び重鎖定常領域と組み合わせた抗体である。かかる抗体はマウス抗体の結合特異性を実質的に又は完全に保持しており、約３分の２がヒト配列である。
【００５６】
ベニヤ抗体は、ＣＤＲの一部及び通常は全てと、非ヒト抗体の非ヒト可変領域フレームワーク残基の一部とを保持しているが、Ｂ細胞又はＴ細胞エピトープに寄与し得る他の可変領域フレームワーク残基、例えば露出している残基（Ｐａｄｌａｎ  ＥＡ．１９９１．Ａ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｗｈｉｌｅ  ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ  ｔｈｅｉｒ  ｌｉｇａｎｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９−９８）はヒト抗体配列の対応する位置の残基で置き換えられているヒト化抗体の一種である。その結果、ＣＤＲが完全に又は実質的に非ヒト抗体由来であり、且つ非ヒト抗体の可変領域フレームワークが置換によってよりヒト様となるように作られた抗体となる。ヒト抗体はヒトから単離することができ、又はその他にヒト免疫グロブリン遺伝子の（例えば、トランスジェニックマウスにおける、インビトロでの、又はファージディスプレイによる）発現から得ることができる。ヒト抗体の作製方法としては、Ｏｅｓｔｂｅｒｇ  Ｌ，Ｐｕｒｓｃｈ  Ｅ．１９８３．Ｈｕｍａｎ  ｘ（ｍｏｕｓｅ  ｘ  ｈｕｍａｎ）ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ｓｔａｂｌｙ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ２：３６１−３６７；Ｏｅｓｔｂｅｒｇ、米国特許第４，６３４，６６４号明細書；及びＥｎｇｌｅｍａｎら、米国特許第４，６３４，６６６号明細書のトリオーマ法、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含むトランスジェニックマウスの使用（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇら、国際公開第９３／１２２２７号パンフレット（１９９３）；米国特許第５，８７７，３９７号明細書、米国特許第５，８７４，２９９号明細書、米国特許第５，８１４，３１８号明細書、米国特許第５，７８９，６５０号明細書、米国特許第５，７７０，４２９号明細書、米国特許第５，６６１，０１６号明細書、米国特許第５，６３３，４２５号明細書、米国特許第５，６２５，１２６号明細書、米国特許第５，５６９，８２５号明細書、米国特許第５，５４５，８０６号明細書、Ｎａｔｕｒｅ  １４８，１５４７−１５５３（１９９４）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，８２６（１９９６）、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ、国際公開第９１／１０７４１号パンフレット（１９９１）を参照されたい）、及びファージディスプレイ法（例えば、Ｄｏｗｅｒら、国際公開第９１／１７２７１号パンフレット及びＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、国際公開第９２／０１０４７号パンフレット、米国特許第５，８７７，２１８号明細書、米国特許第５，８７１，９０７号明細書、米国特許第５，８５８，６５７号明細書、米国特許第５，８３７，２４２号明細書、米国特許第５，７３３，７４３号明細書及び米国特許第５，５６５，３３２号明細書を参照されたい）が挙げられる。
【００５７】
「ポリマー」は、互いに連結された一連の単量体群を指す。ポリマーは、複数単位の単一の単量体（ホモポリマー）又は種々の単量体（ヘテロポリマー）で構成される。高分子量ポリマーは、限定はされないが、アクリレート類、メタクリレート類、アクリルアミド類、メタクリルアミド類、スチレン類、ビニル−ピリジン、ビニル−ピロリドン及びビニルエステル類、例えば酢酸ビニルを含む単量体から調製される。本発明の高分子量ポリマーにおいては、追加的な単量体が有用である。２つの異なる単量体が使用される場合、それらの２つの単量体は「コモノマー」と呼ばれ、これは、それらの異なる単量体が共重合して単一のポリマーを形成することを意味する。ポリマーは線状又は分枝状であってもよい。ポリマーが分枝状である場合、各ポリマー鎖は「ポリマーアーム」と称される。開始剤部分に連結したポリマーアームの末端が近位端であり、ポリマーアームの成長鎖末端が遠位端である。ポリマーアームの成長鎖末端において、ポリマーアーム末端基は遊離基捕捉剤、又は別の基であり得る。
【００５８】
「開始剤」は、本発明の単量体又はコモノマーを使用して重合を開始させる能力を有する化合物を指す。重合は、従来の遊離基重合又は好ましくは、制御／「リビング」ラジカル重合、例えば、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、可逆的付加−開裂−停止（ＲＡＦＴ）重合又はニトロキシド媒介重合（ＮＭＰ）であってもよい。重合は、「擬似」制御重合、例えばデジェネレイティブ移動（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）であってもよい。開始剤がＡＴＲＰに好適である場合、開始剤は不安定結合を含有し、それがホモリシス開裂することにより、ラジカル重合を開始させる能力を有する基である開始剤断片Ｉと、成長ポリマー鎖の基と反応して重合を可逆的に停止させる遊離基捕捉剤Ｉ’とを形成し得る。遊離基捕捉剤Ｉ’は、典型的にはハロゲンであるが、またニトリルなどの有機部分であってもよい。本発明の一部の実施形態において、開始剤は、ＡＴＲＰによる重合部位として１つ以上の２−ブロモイソ酪酸基を含有する。
【００５９】
「化学的リンカー」は、半減期延長部分及びタンパク質など、２つの基を共に連結する化学的部分を指す。リンカーは開裂性又は非開裂性であり得る。開裂性リンカーは、特に、加水分解性、酵素開裂性、ｐＨ感受性、光解離性、又はジスルフィドリンカーであり得る。他のリンカーとしては、ホモ二官能性及びヘテロ二官能性リンカーが挙げられる。「連結基」は、生物活性剤との１つ以上の結合からなる共有結合的連結を形成する能力を有する官能基である。非限定的な例としては、国際公開第２０１３０５９１３７号パンフレット（参照により援用される）の表１に示されるものが挙げられる。
【００６０】
用語「反応基」は、別の化学基と反応して共有結合を形成する能力を有する基を指し、即ち好適な反応条件下で共有結合的に反応するものであり、概して別の物質に対する結合点に相当する。反応基は、マレイミド又はスクシンイミジルエステルなどの部分であり、別の部分にある官能基と化学的に反応して共有結合的連結を形成する能力を有する。反応基には、概して、求核剤、求電子剤及び光活性化可能な基が含まれる。
【００６１】
「ホスホリルコリン」は、「ＰＣ」とも表され、以下を指す：
【化１】
2017526635.tif 000003
（式中、*は結合点を示す）。ホスホリルコリンは双性イオン基であり、その塩（内塩など）、並びにプロトン化及び脱プロトン化形態を含む。
【００６２】
「ホスホリルコリン含有ポリマー」は、ホスホリルコリンを含有するポリマーである。「双性イオン含有ポリマー」は、双性イオンを含有するポリマーを指す。
【００６３】
ポリ（アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）含有ポリマーは、２−（アクリロイルオキシ）エチル−２−（トリメチルアンモニウム）エチルホスフェート（以下の実施例５１に示すＨＥＡ−ＰＣ）を単量体として含有するポリマーを指す。
【００６４】
ポリ（メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）含有ポリマーは、２−（メタクリロイルオキシ）エチル−２−（トリメチルアンモニウム）エチルホスフェート（ＨＥＭＡ−ＰＣ）を単量体として含有するポリマーを指す。
【００６５】
「分子量」は、ポリマーに関連して、数平均分子量、又は重量平均分子量又はピーク分子量のいずれとしても表すことができる。特に指示されない限り、本明細書における分子量への言及は全て、ピーク分子量を指す。これらの分子量決定、数平均（Ｍｎ）、重量平均（Ｍｗ）及びピーク（Ｍｐ）は、サイズ排除クロマトグラフィー法又は他の液体クロマトグラフィー法を用いて計測することができる。末端基解析又は束一的特性（例えば、凝固点降下、沸点上昇、又は浸透圧）の計測を用いた数平均分子量の決定、又は光散乱法、超遠心法又は粘度測定法を用いた重量平均分子量の決定など、分子量値を計測する他の方法も用いることができる。本発明の好ましい実施形態において、分子量はＳＥＣ−ＭＡＬＳ（サイズ排除クロマトグラフィー−多角度光散乱）によって計測される。本発明のポリマー試薬は、典型的には多分散性であり（即ち、ポリマーの数平均分子量と重量平均分子量とが等しくない）、好ましくは、例えばＳＥＣ−ＭＡＬＳ計測から導き出されるＰＤＩ値によって判断するとき、例えば約１．５未満といった低い多分散性値を有する。他の実施形態において、多分散性（ＰＤＩ）は、より好ましくは約１．４〜約１．２の範囲、更により好ましくは約１．１５未満、及び更により好ましくは約１．１０未満、なおも更により好ましくは約１．０５未満、及び最も好ましくは約１．０３未満である。
【００６６】
「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」実体という語句は、その実体の１つ以上を指す。例えば、化合物は、１つ以上の化合物又は少なくとも１つの化合物を指す。従って、用語「１つの（ａ）」（又は「１つの（ａｎ）」）、「１つ以上」及び「少なくとも１つ」は、本明細書では同義的に使用することができる。
【００６７】
「約」は、異なる計器、試料、及び試料調製の間で行った計測に見られ得るばらつきを意味する。
【００６８】
「保護された」、「保護形態」、「保護基（ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）」及び「保護基（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｇｒｏｕｐ）」は、ある種の反応条件下における分子内の特定の化学反応性官能基の反応を防ぎ又は阻止する基（即ち、保護基）の存在を指す。保護基は、保護される化学反応基のタイプ及び用いられる反応条件と、存在する場合に、分子内の更なる反応性基又は保護基の存在とに応じて異なる。好適な保護基としては、Ｇｒｅｅｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  Ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，”３rd  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９による論文に見られるものなどが挙げられる。
【００６９】
「アルキル」は、指示される炭素原子数を有する直鎖状又は分枝状の飽和した脂肪族基を指す。例えば、Ｃ1〜Ｃ6アルキルとしては、限定はされないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ヘキシル等が挙げられる。他のアルキル基としては、限定はされないが、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル等が挙げられる。アルキルは、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、２〜３、２〜４、２〜５、２〜６、３〜４、３〜５、３〜６、４〜５、４〜６及び５〜６個など、任意の数の炭素を含むことができる。アルキル基は、典型的には一価であり、しかし、アルキル基が２つの部分を共に連結している場合など、二価であってもよい。
【００７０】
上記及び以下において有機基又は化合物との関係で言及する用語「低級」は、それぞれ、７個以下、好ましくは４個以下及び（非分枝状として）１個又は２個の炭素原子を有する分枝状又は非分枝状であり得る化合物又は基を定義する。
【００７１】
「アルキレン」は、少なくとも２つの他の基を連結する、上記に定義するとおりのアルキル基、即ち二価の炭化水素基を指す。アルキレンに連結した２つの部分は、アルキレンの同じ原子に連結することも、又は異なる原子に連結することもできる。例えば、直鎖アルキレンは、−（ＣＨ2）n（式中、ｎは１、２、３、４、５又は６である）の二価基であり得る。アルキレン基としては、限定はされないが、メチレン、エチレン、プロピレン、イソプロピレン、ブチレン、イソブチレン、ｓｅｃ−ブチレン、ペンチレン及びヘキシレンが挙げられる。
【００７２】
アルキル基及びヘテロアルキル基（多くの場合にアルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、及びヘテロシクロアルケニルと称されるものを含む）の置換基は、０〜（２ｍ’＋１）（式中、ｍ’は、かかる基の炭素原子総数である）の範囲の数の、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ2Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）2Ｒ’、−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ2）＝ＮＨ、−ＮＲ’Ｃ（ＮＨ2）＝ＮＨ、−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ2）＝ＮＲ’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）2Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ’Ｒ’’、−ＣＮ及び−ＮＯ2から選択される種々の基であり得る。Ｒ’、Ｒ’’及びＲ’’’は各々独立して、水素、非置換（Ｃ1〜Ｃ8）アルキル及びヘテロアルキル、非置換アリール、１〜３個のハロゲンで置換されたアリール、非置換アルキル、アルコキシ又はチオアルコキシ基、又はアリール−（Ｃ1〜Ｃ4）アルキル基を指す。Ｒ’及びＲ’’が同じ窒素原子に結合しているとき、それらは窒素原子と一緒になって５、６、又は７員環を形成し得る。例えば、−ＮＲ’Ｒ’’は、１−ピロリジニル及び４−モルホリニルを含むことが意図される。用語「アルキル」は、ハロアルキル（例えば、−ＣＦ3及び−ＣＨ2ＣＦ3）及びアシル（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ3、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ3、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ2ＯＣＨ3等）などの基であり、それらを含む。好ましくは、置換アルキル及びヘテロアルキル基は、１〜４個の置換基、より好ましくは１、２又は３個の置換基を有する。例外はパーハロアルキル基（例えば、ペンタフルオロエチルなど）であり、これらも好ましく、本発明によって企図される。
【００７３】
アルキル基及びヘテロアルキル基（多くの場合にアルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、及びヘテロシクロアルケニルと称されるものを含む）の置換基は、０〜（２ｍ’＋１）（式中、ｍ’は、かかる基の炭素原子総数である）の範囲の数の、限定はされないが、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ2Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）2Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）2Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ2Ｒ’、−ＣＮ及び−ＮＯ2から選択される種々の基の１つ以上であり得る。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’及びＲ’’’’は各々好ましくは独立に、水素、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換アリール、例えば１〜３個のハロゲンで置換されたアリール、置換又は非置換アルキル、アルコキシ又はチオアルコキシ基、又はアリールアルキル基を指す。例えば、本発明の化合物が２つ以上のＲ基を含むとき、Ｒ基の各々は独立に選択され、各Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’及びＲ’’’’基も、これらの基の２つ以上が存在するときと同様である。Ｒ’及びＲ’’が同じ窒素原子に結合しているとき、それらは窒素原子と一緒になって５、６、又は７員環を形成し得る。例えば、−ＮＲ’Ｒ’’は、限定はされないが、１−ピロリジニル及び４−モルホリニルを含むことが意図される。上記の置換基に関する考察から、当業者は、用語「アルキル」が、ハロアルキル（例えば、−ＣＦ3及び−ＣＨ2ＣＦ3）及びアシル（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ3、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ3、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ2ＯＣＨ3等）など、水素基以外の基に結合した炭素原子を含む基を含むように意図されることを理解するであろう。
【００７４】
「アルコキシ」は、アルコキシ基を結合点に結び付けるか、又はアルコキシ基の２つの炭素に連結されるかのいずれかである酸素原子を有するアルキル基を指す。アルコキシ基としては、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソ−プロポキシ、ブトキシ、２−ブトキシ、イソ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペントキシ、ヘキソキシ等が挙げられる。アルコキシ基は、範囲内に記載される種々の置換基で更に置換されていてもよい。例えば、アルコキシ基はハロゲンで置換され、「ハロ−アルコキシ」基を形成してもよい。
【００７５】
「カルボキシアルキル」は、カルボキシ基で置換された（本明細書に定義するとおりの）アルキル基を意味する。用語「カルボキシシクロアルキル」は、カルボキシ基で置換された（本明細書に定義するとおりの）シクロアルキル基を意味する。アルコキシアルキルという用語は、アルコキシ基で置換された（本明細書に定義するとおりの）アルキル基を意味する。本明細書で用いられる用語「カルボキシ」は、カルボン酸類及びそれらのエステルを指す。
【００７６】
「ハロアルキル」は、水素原子の一部又は全てがハロゲン原子で置換された、上記に定義するとおりのアルキルを指す。ハロゲン（ハロ）は好ましくはクロロ又はフルオロを表し、しかし、ブロモ又はヨードであってもよい。例えば、ハロアルキルとしては、トリフルオロメチル、フルオロメチル、１，２，３，４，５−ペンタフルオロ−フェニル等が挙げられる。用語「ペルフルオロ」は、全ての利用可能な水素がフッ素に置き換えられた化合物又は基を定義する。例えば、ペルフルオロフェニルは、１，２，３，４，５−ペンタフルオロフェニルを指し、ペルフルオロメチルは、１，１，１−トリフルオロメチルを指し、及びペルフルオロメトキシは、１，１，１−トリフルオロメトキシを指す。
【００７７】
「フルオロ置換アルキル」は、１つ、一部、又は全ての水素原子がフッ素に置き換えられているアルキル基を指す。
【００７８】
「サイトカイン」は、本発明に関連して、免疫及び炎症反応における細胞間コミュニケーションに関与し得るタンパク質シグナル伝達分子群のメンバーである。サイトカインは、典型的には、約８〜３５ｋＤａの質量を有する小型の水溶性糖タンパク質である。
【００７９】
「シクロアルキル」は、約３〜１２、３〜１０、又は３〜７個の環内炭素原子を含有する環状炭化水素基を指す。シクロアルキル基は、縮合、架橋及びスピロ環構造を含む。
【００８０】
「環内」は、環式環構造の一部を成す原子又は原子団を指す。
【００８１】
「環外」は、環式環構造に結合しているが、それを定義しない原子又は原子団を指す。
【００８２】
「環状アルキルエーテル」は、３又は４個の環内炭素原子と１個の環内酸素又は硫黄原子とを有する４員又は５員環アルキル基（例えば、オキセタン、チエタン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロチオフェン）；又は１又は２個の環内酸素又は硫黄原子を有する６〜７員環アルキル基（例えば、テトラヒドロピラン、１，３−ジオキサン、１，４−ジオキサン、テトラヒドロチオピラン、１，３−ジチアン、１，４−ジチアン、１，４−オキサチアン）を指す。
【００８３】
「アルケニル」は、少なくとも１つの二重結合を有する、２〜６個の炭素原子の直鎖又は分枝状のいずれかの炭化水素を指す。アルケニル基の例としては、限定はされないが、ビニル、プロペニル、イソプロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、イソブテニル、ブタジエニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、イソペンテニル、１，３−ペンタジエニル、１，４−ペンタジエニル、１−ヘキセニル、２−ヘキセニル、３−ヘキセニル、１，３−ヘキサジエニル、１，４−ヘキサジエニル、１，５−ヘキサジエニル、２，４−ヘキサジエニル、又は１，３，５−ヘキサトリエニルが挙げられる。アルケニル基はまた、２〜３、２〜４、２〜５、３〜４、３〜５、３〜６、４〜５、４〜６及び５〜６個の炭素も有し得る。アルケニル基は、典型的には一価であり、しかし、アルケニル基が２つの部分を共に連結している場合など、二価であってもよい。
【００８４】
「アルケニレン」は、少なくとも２つの他の基を連結する、上記に定義するとおりのアルケニル基、即ち二価の炭化水素基を指す。アルケニレンに連結した２つの部分は、アルケニレンの同じ原子に連結することも、又は異なる原子に連結することもできる。アルケニレン基としては、限定はされないが、エテニレン、プロペニレン、イソプロペニレン、ブテニレン、イソブテニレン、ｓｅｃ−ブテニレン、ペンテニレン及びヘキセニレンが挙げられる。
【００８５】
「アルキニル」は、少なくとも１つの三重結合を有する、２〜６個の炭素原子の直鎖又は分枝状のいずれかの炭化水素を指す。アルキニル基の例としては、限定はされないが、アセチレニル、プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、イソブチニル、ｓｅｃ−ブチニル、ブタジイニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、イソペンチニル、１，３−ペンタジイニル、１，４−ペンタジイニル、１−ヘキシニル、２−ヘキシニル、３−ヘキシニル、１，３−ヘキサジイニル、１，４−ヘキサジイニル、１，５−ヘキサジイニル、２，４−ヘキサジイニル、又は１，３，５−ヘキサトリイニルが挙げられる。アルキニル基はまた、２〜３、２〜４、２〜５、３〜４、３〜５、３〜６、４〜５、４〜６及び５〜６個の炭素も有し得る。アルキニル基は、典型的には一価であり、しかし、アルキニル基が２つの部分を共に連結している場合など、二価であってもよい。
【００８６】
「アルキニレン」は、少なくとも２つの他の基を連結する、上記に定義するとおりのアルキニル基、即ち二価の炭化水素基を指す。アルキニレンに連結した２つの部分は、アルキニレンの同じ原子に連結することも、又は異なる原子に連結することもできる。アルキニレン基としては、限定はされないが、エチニレン、プロピニレン、ブチニレン、ｓｅｃ−ブチニレン、ペンチニレン及びヘキシニレンが挙げられる。
【００８７】
「シクロアルキル」は、３〜１２個の環原子、又は指示される原子数を含有する飽和又は部分不飽和、単環式、縮合二環式又は架橋多環式の環集合体を指す。単環式の環としては、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、及びシクロオクチルが挙げられる。二環式及び多環式の環としては、例えば、ノルボルナン、デカヒドロナフタレン及びアダマンタンが挙げられる。例えば、Ｃ3〜8シクロアルキルには、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロオクチル、及びノルボルナンが含まれる。
【００８８】
「シクロアルキレン」は、少なくとも２つの他の基を連結する、上記に定義するとおりのシクロアルキル基、即ち二価の炭化水素基を指す。シクロアルキレンに連結した２つの部分は、シクロアルキレンの同じ原子に連結することも、又は異なる原子に連結することもできる。シクロアルキレン基としては、限定はされないが、シクロプロピレン、シクロブチレン、シクロペンチレン、シクロへキシレン、及びシクロオクチレンが挙げられる。
【００８９】
「ヘテロシクロアルキル」は、３環員〜約２０環員と１〜約５個のヘテロ原子、例えばＮ、Ｏ及びＳとを有する環系を指す。限定はされないが、Ｂ、Ａｌ、Ｓｉ及びＰを含めた更なるヘテロ原子も有用であり得る。ヘテロ原子はまた、限定はされないが、−Ｓ（Ｏ）−及び−Ｓ（Ｏ）2−など、酸化されていてもよい。例えば、ヘテロ環としては、限定はされないが、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフェニル、モルホリノ、ピロリジニル、ピロリニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピペラジニル、ピペリジニル、インドリニル、キヌクリジニル及び１，４−ジオキサ−８−アザ−スピロ［４．５］デカ−８−イルが挙げられる。
【００９０】
「ヘテロシクロアルキレン」は、少なくとも２つの他の基を連結する、上記に定義するとおりのヘテロシクロアルキル基を指す。ヘテロシクロアルキレンに連結した２つの部分は、ヘテロシクロアルキレンの同じ原子に連結することも、又は異なる原子に連結することもできる。
【００９１】
「アリール」は、６〜１６個の環炭素原子を含有する単環式又は縮合二環式、三環式又はそれ以上の芳香環集合体を指す。例えば、アリールは、フェニル、ベンジル又はナフチル、好ましくはフェニルであってもよい。「アリーレン」は、アリール基から誘導される二価の基を意味する。アリール基は、アルキル、アルコキシ、アリール、ヒドロキシ、ハロゲン、シアノ、アミノ、アミノ−アルキル、トリフルオロメチル、アルキレンジオキシ及びオキシ−Ｃ2−Ｃ3−アルキレン（これらは全て、任意選択で、例えば以上に定義したとおり更に置換されている）、又は１−又は２−ナフチル、又は１−又は２−フェナントレニルから選択される１、２又は３個の基によって一置換、二置換又は三置換されていてもよい。アルキレンジオキシは、フェニルの２つの隣接する炭素原子に結合した二価の置換基、例えばメチレンジオキシ又はエチレンジオキシである。オキシ−Ｃ2−Ｃ3−アルキレンもまた、フェニルの２つの隣接する炭素原子に結合した二価の置換基、例えばオキシエチレン又はオキシプロピレンである。オキシ−Ｃ2−Ｃ3−アルキレン−フェニルの例は、２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イルである。
【００９２】
アリールとしては、ナフチル、フェニル、又はアルコキシ、フェニル、ハロゲン、アルキル若しくはトリフルオロメチルによって一置換若しくは二置換されたフェニル、特にフェニル、又はアルコキシ、ハロゲン若しくはトリフルオロメチルによって一置換若しくは二置換されたフェニル、詳細にはフェニルが好ましい。
【００９３】
Ｒとしての置換フェニル基の例は、例えば、任意選択でヘテロ環で置換されている、４−クロロフェン−１−イル、３，４−ジクロロフェン−１−イル、４−メトキシフェン−１−イル、４−メチルフェン−１−イル、４−アミノメチルフェン−１−イル、４−メトキシエチルアミノメチルフェン−１−イル、４−ヒドロキシエチルアミノメチルフェン−１−イル、４−ヒドロキシエチル−（メチル）−アミノメチルフェン−１−イル、３−アミノメチルフェン−１−イル、４−Ｎ−アセチルアミノメチルフェン−１−イル、４−アミノフェン−１−イル、３−アミノフェン−１−イル、２−アミノフェン−１−イル、４−フェニル−フェン−１−イル、４−（イミダゾール−１−イル）−フェニル、４−（イミダゾール−１−イルメチル）−フェン−１−イル、４−（モルホリン−１−イル）−フェン−１−イル、４−（モルホリン−１−イルメチル）−フェン−１−イル、４−（２−メトキシエチルアミノメチル）−フェン−１−イル及び４−（ピロリジン−１−イルメチル）−フェン−１−イル、４−（チオフェニル）−フェン−１−イル、４−（３−チオフェニル）−フェン−１−イル、４−（４−メチルピペラジン−１−イル）−フェン−１−イル、及び４−（ピペリジニル）−フェニル及び４−（ピリジニル）−フェニルである。
【００９４】
「アリーレン」は、少なくとも２つの他の基を連結する、上記に定義するとおりのアリール基を指す。アリーレンに連結した２つの部分は、アリーレンの異なる原子に連結する。アリーレン基としては、限定はされないが、フェニレンが挙げられる。
【００９５】
「アリーレン−オキシ」は、アリーレンに連結した部分の１つが酸素原子を介して連結している、上記に定義するとおりのアリーレン基を指す。アリーレン−オキシ基としては、限定はされないが、フェニレン−オキシが挙げられる。
【００９６】
同様に、アリール基及びヘテロアリール基の置換基は様々であり、以下から選択される：−ハロゲン、−ＯＲ’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−Ｒ’、−ＣＮ、−ＮＯ2、−ＣＯ2Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）2Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ2）＝ＮＨ、−ＮＲ’Ｃ（ＮＨ2）＝ＮＨ、−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ2）＝ＮＲ’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）2Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ’Ｒ’’、−Ｎ3、−ＣＨ（Ｐｈ）2、ペルフルオロ（Ｃ1〜Ｃ4）アルコキシ、及びペルフルオロ（Ｃ1〜Ｃ4）アルキル（０から芳香環系の空いている価の総数までの範囲の数；且つ式中、Ｒ’、Ｒ’’及びＲ’’’は、水素、（Ｃ1〜Ｃ8）アルキル及びヘテロアルキル、非置換アリール及びヘテロアリール、（非置換アリール）−（Ｃ1〜Ｃ4）アルキル、及び（非置換アリール）オキシ−（Ｃ1〜Ｃ4）アルキルから独立して選択される）。
【００９７】
アリール環又はヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基の２つは、任意選択で、式−Ｔ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ2）q−Ｕ−（式中、Ｔ及びＵは独立に−ＮＨ−、−Ｏ−、−ＣＨ2−又は単結合であり、及びｑは０〜２の整数である）の置換基に置換されていてもよい。或いは、アリール環又はヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基の２つは、任意選択で、式−Ａ−（ＣＨ2）r−Ｂ−（式中、Ａ及びＢは独立に−ＣＨ2−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）2−、−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ’−又は単結合であり、及びｒは１〜３の整数である）の置換基に置換されていてもよい。このように形成された新しい環の単結合の１つは、任意選択で、二重結合に置換されていてもよい。或いは、アリール環又はヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基の２つは、任意選択で、式−（ＣＨ2）s−Ｘ−（ＣＨ2）t−（式中、ｓ及びｔは独立に０〜３の整数であり、及びＸは−Ｏ−、−ＮＲ’−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）2−、又は−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ’−である）の置換基に置換されていてもよい。−ＮＲ’−及び−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ’−の置換基Ｒ’は、水素又は非置換（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルから選択される。
【００９８】
「ヘテロアリール」は、５〜１６個の環原子であって、そのうちの１〜４個は、各々Ｎ、Ｏ又はＳのヘテロ原子である環原子を含有する単環式又は縮合二環式又は三環式芳香環集合体を指す。例えば、ヘテロアリールには、ピリジル、インドリル、インダゾリル、キノキサリニル、キノリニル、イソキノリニル、ベンゾチエニル、ベンゾフラニル、フラニル、ピロリル、チアゾリル、ベンゾチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピラゾリル、イミダゾリル、チエニル、又は例えばアルキル、ニトロ若しくはハロゲンによって置換されている、特に一置換若しくは二置換されている任意の他の基が含まれる。ピリジルは、２−、３−又は４−ピリジル、有利には２−又は３−ピリジルを表す。チエニルは、２−又は３−チエニルを表す。キノリニルは、好ましくは２−、３−又は４−キノリニルを表す。イソキノリニルは、好ましくは１−、３−又は４−イソキノリニルを表す。ベンゾピラニル、ベンゾチオピラニルは、好ましくはそれぞれ３−ベンゾピラニル又は３−ベンゾチオピラニルを表す。チアゾリルは、好ましくは２−又は４−チアゾリル、最も好ましくは４−チアゾリルを表す。トリアゾリルは、好ましくは１−、２−又は５−（１，２，４−トリアゾリル）である。テトラゾリルは、好ましくは５−テトラゾリルである。
【００９９】
好ましくは、ヘテロアリールは、ピリジル、インドリル、キノリニル、ピロリル、チアゾリル、イソオキサゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピラゾリル、イミダゾリル、チエニル、フラニル、ベンゾチアゾリル、ベンゾフラニル、イソキノリニル、ベンゾチエニル、オキサゾリル、インダゾリル、又は置換されている、特に一置換若しくは二置換されている基のいずれかである。
【０１００】
用語「ヘテロアルキル」は、Ｎ、Ｏ及びＳなどの１〜３個のヘテロ原子を有するアルキル基を指す。限定はされないが、Ｂ、Ａｌ、Ｓｉ及びＰを含めた、更なるヘテロ原子も有用であり得る。ヘテロ原子はまた、限定はされないが−Ｓ（Ｏ）−及び−Ｓ（Ｏ）2−など、酸化されていてもよい。例えば、ヘテロアルキルには、エーテル類、チオエーテル類、アルキル−アミン類及びアルキル−チオール類が含まれ得る。
【０１０１】
用語「ヘテロアルキレン」は、少なくとも２つの他の基を連結する、上記に定義するとおりのヘテロアルキル基を指す。ヘテロアルキレンに連結した２つの部分は、ヘテロアルキレンの同じ原子に連結することも、又は異なる原子に連結することもできる。
【０１０２】
「求電子剤」は、求電子中心、即ち電子求引性であり、求核剤と反応可能な中心を有するイオン又は原子若しくは原子団（イオン性であってもよい）を指す。求電子剤（又は求電子試薬）は、その反応パートナーからの両方の結合電子を受容することによって、その反応パートナー（求核剤）との結合を形成する試薬である。
【０１０３】
「求核剤」は、求核中心、即ち求電子中心を求引し又は求電子剤と反応可能な中心を有するイオン又は原子若しくは原子団（イオン性であってもよい）を指す。求核剤（又は求核試薬）は、両方の結合電子を供与することによってその反応パートナー（求電子剤）との結合を形成する試薬である。「求核基」は、それが反応基と反応した後の求核剤を指す。非限定的な例としては、アミノ、ヒドロキシル、アルコキシ、ハロアルコキシなどが挙げられる。
【０１０４】
「マレイミド」は、以下の構造を有するピロール２，５−ジオン−１−イル基をいう
【化２】
2017526635.tif 000004
上記は、スルフヒドリル（例えば、チオアルキル）との反応時に、以下の構造を有する−Ｓ−マレイミド基を形成する：
【化３】
2017526635.tif 000005
ここで「・」は、マレイミド基に対する結合点を示す。なお、式中、
【化４】
2017526635.tif 000006
で示す符号は、チオールの硫黄原子と元のスルフヒドリル担持基の残りの部分との結合点を示す。
【０１０５】
本開示の目的上、タンパク質及びポリペプチドに見られる「天然に存在するアミノ酸」は、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、及び／又はＬ−バリンである。タンパク質に見られる「天然に存在しないアミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸として記載されるもの以外の任意のアミノ酸である。天然に存在しないアミノ酸には、限定なしに、天然に存在するアミノ酸のＤ異性体、並びに天然に存在するアミノ酸のＤ及びＬ異性体の混合物が含まれる。他のアミノ酸、例えば、Ｎ−α−メチルアミノ酸（例えばサルコシン）、４−ヒドロキシプロリン、デスモシン、イソデスモシン、５−ヒドロキシリジン、ε−Ｎ−メチルリジン、３−メチルヒスチジンは、天然に存在するタンパク質に見られるものの、概してｍＲＮＡのリボソーム翻訳以外の手段によって導入されるため、本開示の目的上、タンパク質に見られる天然に存在しないアミノ酸と見なす。
【０１０６】
ポリマーの幾何学的形状、構成又は全体的な構造に関連した「線状」とは、単一のポリマーアームを有するポリマーを指す。
【０１０７】
ポリマーの幾何学的形状、構成又は全体的な構造に関連した「分枝状」とは、開始剤内に含まれるコア構造から延在する２つ以上のポリマー「アーム」を有するポリマーを指す。開始剤は原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）反応で用いられ得る。分枝状ポリマーは、２本のポリマー鎖（アーム）、３本のポリマーアーム、４本のポリマーアーム、５本のポリマーアーム、６本のポリマーアーム、７本のポリマーアーム、８本のポリマーアーム、９本のポリマーアーム又はそれ以上を有し得る。各ポリマーアームはポリマー開始部位から延在する。各ポリマー開始部位は、単量体の付加によってポリマー鎖が成長する部位となることができる。例えば、限定としてではなく、ＡＴＲＰを使用して、開始剤上のポリマー開始部位は、典型的には、ハロゲン化銅などの遷移金属化合物によって触媒される可逆的酸化還元プロセスを受ける有機ハロゲン化物である。好ましくは、ハロゲン化物は臭素である。
【０１０８】
「薬学的に許容可能な賦形剤」は、本発明の組成物に含めることのできる賦形剤であって、患者に重要な有害毒性効果をもたらすことのない、且つ特にヒトでの治療的使用がＦＤＡによって承認済み又は承認見込みである賦形剤を指す。薬学的に許容可能な賦形剤の非限定的な例としては、水、ＮａＣｌ、ノーマル生理食塩水、乳酸加リンゲル液、ノーマルショ糖、ノーマルグルコースなどが挙げられる。
【０１０９】
デュアルアンタゴニストは、有効なレジーム、即ち、発症を遅延させ、重症度を低減し、更なる悪化を阻止し、及び／又は障害の少なくとも１つの徴候又は症状を改善する投薬量、投与経路及び投与頻度で投与される。患者が既に障害に罹患している場合、そのレジームは、治療上有効なレジームと称され得る。患者の障害リスクが一般集団と比べて高いが、未だ症状が現れていない場合、そのレジームは、予防上有効なレジームと称され得る。場合によっては、治療上又は予防上の有効性は、個々の患者において、同じ患者の病歴対照又は過去の経験と比べて観察されてもよい。他の場合には、治療上又は予防上の有効性は、前臨床試験又は臨床試験で対照未治療患者集団と比べた治療患者集団において実証されてもよい。
【０１１０】
物質の「生物学的半減期」は、その物質の導入後に組織又は生物から物質の２分の１が除去されるのに必要な時間を特定する薬物動態パラメータである。
【０１１１】
「ＨＥＭＡ−ＰＣ」は、２−（メタクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェートである。
【０１１２】
「ＴＡＦ」は、可変領域に以下の突然変異、即ち、Ｔ２８Ｄ、Ｎ３１Ｈ、Ｈ９７Ｙ、Ｓ１００ａＴ（Ｆｅｒｒａｒａ  Ｎ，Ｄａｍｉｃｏ  Ｌ，Ｓｈａｍｓ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．２００６．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ，ａｎ  ａｎｔｉ−ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆｒａｇｍｅｎｔ，ａｓ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒ  ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｒｅｔｉｎａ  ２６（８）：８５９−８７０）を有し；且つＦｃ領域に以下の突然変異、即ちＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＧ２３７Ａ（ＥＵ付番）（Ｓｔｒｏｈｌ  ＷＲ．２００９．Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｃ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：６８５−６９１）を有するベバシズマブ重鎖配列のＮ末端に連結したグリシン−セリンリンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）を介して単一のオープンリーディングフレームとして融合した、重鎖のアミノ酸１〜２８２がヒトＰＤＧＦＲ−β（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ０９６１９．１）のアミノ酸３３〜３１４に対応するＰＤＧＦＲβ−ＧＳ１０−抗ＶＥＧＦ−Ａ重鎖／抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖を意味する。軽鎖は、Ｍ４Ｌ突然変異を有するベバシズマブ軽鎖である。ＴＡＦは、通常、２つの重鎖と２つの軽鎖とを有する二量体として存在する。ＴＡＦは、細胞から発現した後に炭水化物又は他の翻訳後修飾を有することも、又は有しないこともある。ＴＡＦはまた、場合によりＴＡＦｗｔ又はＴＡＦＷＴと呼ばれることもあり、これは、対象の分子が、以下に定義するＴＡＦ３４７又はＴＡＦ４４３のように重鎖（Ｆｃ領域）におけるＱ３４７Ｃ又はＬ４４３Ｃのいずれの突然変異も有しないことを示している。
【０１１３】
「ＴＡＦ３４７」は、それがＱ３４７Ｃ突然変異を有することを除いてＴＡＦと同じである。
【０１１４】
「ＴＡＦ４４３」は、それがＬ４４３Ｃ突然変異を有することを除いてＴＡＦと同じである。ＴＡＦ４４３は、場合により本明細書においてＯＧ１３２１と称されることもある。
【０１１５】
「ＯＧ１７８６」は、図３５（トリフルオロ酢酸との塩形態のＯＧ１７８６を表す）に示す構造を有するポリマー合成に使用される９アーム開始剤である。ＯＧ１７８６は、本発明において他の塩として、又は遊離塩基として用いられ得る。
【０１１６】
「ＯＧ１８０１」は、単量体ＨＥＭＡ−ＰＣを使用したＡＴＲＰ合成の開始剤としてＯＧ１７８６を使用して作られる約（±１５％）７５０ｋＤａのポリマー（Ｍｎ又はＭｐのいずれかによる）である。
【０１１７】
「ＯＧ１８０２」は、マレイミド官能基が付加されたＯＧ１８０１であり、図３６（式中、ｎ1、ｎ2、ｎ3、ｎ4、ｎ5、ｎ6、ｎ7、ｎ8及びｎ9の各々は、ポリマーの総分子量が（Ｍｗ）７５０，０００±１５％ダルトンとなるような（正の）整数（０〜最大約３０００）である）に示される。
【０１１８】
「ＯＧ１４４８」は、ＯＧ１８０２バイオポリマーにコンジュゲートしたＴＡＦ４４３である。
【０１１９】
Ｉ．概論
本発明は、ＰＤＧＦアンタゴニストに連結したＶＥＧＦアンタゴニストを含むデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニストを提供する。ＶＥＧＦアンタゴニストはＶＥＧＦ若しくはＶＥＧＦＲに対する抗体であるか、又はＶＥＧＦＲ細胞外トラップセグメント（即ち、少なくとも１つのＶＥＧＦＲと少なくとも１つのＶＥＧＦとの結合を阻害する１つ以上のＶＥＧＦＲ受容体の細胞外領域由来のセグメント）である。ＰＤＧＦアンタゴニストはＰＤＧＦ若しくはＰＤＧＦＲに対する抗体であるか、又はＰＤＧＦＲ細胞外トラップセグメント（即ち、少なくとも１つのＰＤＧＦＲと少なくとも１つのＰＤＧＦとの結合を阻害する、１つ以上のＰＤＧＦＲの細胞外領域由来のセグメント）である。アンタゴニストの少なくとも一方は抗体でなく、又は換言すれば、アンタゴニストの少なくとも一方は細胞外トラップセグメントである。好ましくは、デュアルアンタゴニストは抗体アンタゴニストと１つの細胞外トラップセグメントアンタゴニストとを含む。かかるデュアルアンタゴニストにおいて、細胞外トラップセグメントは、好ましくは、任意選択でリンカーを介して抗体重鎖のＮ末端に融合される。抗体軽鎖は天然抗体と同じように抗体重鎖と複合体を形成する。かかるデュアルアンタゴニストは、好ましくは、デュアルアンタゴニストにコンジュゲートした半減期延長部分を含むコンジュゲートの形態で提供される。好ましくは、コンジュゲーションには、アンタゴニストに導入されているシステイン残基が使用される。より好ましくは、システイン残基はＩｇＧ１重鎖の３４７位又は４４３位である。半減期延長部分は双性イオンポリマーであることが好ましい。最も好ましくは双性イオンポリマーはホスホリルコリン含有ポリマーである。
【０１２０】
血管新生は、新生血管が作り出される過程であり、発生（胚から成体に至らせる）及び創傷治癒（損傷又は傷害組織への血流の回復）において重要な役割を果たす。しかしながら、血管新生が調節不全に陥ると、それは癌、乾癬、関節炎及び失明を含めた多くの障害の病理の一因となる。Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ  Ｐ．２００３．Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  ９（６）：６５３−６６０。
【０１２１】
異常な血管新生は、湿潤型加齢黄斑変性症（高齢者における主要な失明原因）及び癌に関連する。血管新生は、増殖性内皮及び間質細胞の増加並びに形態が変化した血管系によって特徴付けられる。一般に、Ｆｏｌｋｍａｎ  Ｊ．２００７．Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ  ｏｒｇａｎｉｚｉｎｇ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ？．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  ６：２７３−２８６及びＢａｌｕｋ  Ｐ，Ｈａｓｈｉｚｕｍｅ  Ｈ，ＭｃＤｏｎａｌｄ  ＤＭ．２００５．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｂｌｏｏｄ  ｖｅｓｓｅｌｓ  ａｓ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  Ｄｅｖ．１５：１０２−１１１を参照されたい。
【０１２２】
上述のとおり、血管新生（ＮＶ）は、発生及び創傷治癒の両方で起こる正常な過程であるが、血管新生が調節不全に陥り、腫瘍（癌）に関連する組織、無血管角膜又は網膜下腔（湿潤型ＡＭＤ）に起こると病的となり得る。ＮＶ血管の増殖、浸潤及び移動は、増殖因子、血管内皮細胞、細胞外マトリックス分子、ケモカイン及び細胞シグナル伝達分子の間の複雑な相互作用によって制御される。
【０１２３】
ＮＶ組織は、内皮細胞（ＥＣ）、周皮細胞及び炎症細胞（例えばマクロファージ）で構成される。周皮細胞は肥満細胞からの分化を経て生じる。血管新生の過程は、初めに、既存の毛細血管から無血管腔に入るＥＣで構成された血管新生芽の形成が関わる。ＶＥＧＦシグナル伝達は、このＮＶ過程のマスタースイッチであるものと理解される。この点で、ＶＥＧＦは、血管新生芽をもたらす先端細胞フィロポディアに局在している。
【０１２４】
出芽形成後、新しく形成された血管が周皮細胞によって覆われ、ＮＶの成熟につながる。ＮＶの周皮細胞被覆は、物理的にも、及びＶＥＧＦの周皮細胞産生を含めたシグナル伝達を通じても、ＮＶの安定化及び支持につながる。Ａｒｍｕｌｉｋ  Ａ，Ａｂｒａｍｓｓｏｎ  Ａ，Ｂｅｔｓｈｏｌｔｚ  Ｃ．２００５．Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ／Ｐｅｒｉｃｙｔｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．９７：５１２−５２３。
【０１２５】
承認済みの湿潤型ＡＭＤ療法薬は、全てがＶＥＧＦシグナル伝達の抑制を標的にしている。これらの療法薬には、２００４年に承認されたペガプタニブ（Ｍａｃｕｇｅｎ（登録商標））、２００４年に癌に対して承認された、ＡＭＤに適応外使用されるＧｅｎｅｎｔｅｃｈのベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））、２００６年に承認されたＧｅｎｅｎｔｅｃｈのラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標））、及び２０１１年に承認されたＲｅｇｅｎｅｒｏｎのアフリベルセプト（Ｅｙｌｅａ（登録商標））が含まれる。ペガプタニブはアプタマーベースの療法薬であるが、恐らくは患者にとって視力増加が限られていることに起因して、タンパク質ベースの療法薬と比較すると市場が限られている。ベバシズマブは、癌の治療用に承認された抗ＶＥＧＦＡ  ＩｇＧ１抗体であるが、ＡＭＤの治療に広く適応外使用されている。ラニビズマブは、ベバシズマブから親和性成熟させたＦａｂであり、ＡＭＤに対して承認されている。しかしながら、ラニビズマブの市場は、はるかに安価なベバシズマブの使用によって実質的に切り崩されている。最後に、アフリベルセプトは、可溶性受容体断片デコイを用いたＶＥＧＦトラップである。
【０１２６】
抗ＶＥＧＦ単剤療法は、病理的ＮＶの疾患修飾的な退縮にはつながっていない。Ｂｒｏｗｎ  ＤＭ，Ｋａｉｓｅｒ  ＰＫ，Ｍｉｃｈｅｌｓ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．２００６．ＡＮＣＨＯＲ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ．Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ  ｖｅｒｓｕｓ  ｖｅｒｔｅｐｏｒｆｉｎ  ｆｏｒ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒ  ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５５（１４）：１４３２−１４４４；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ＰＪ，Ｂｒｏｗｎ  ＤＭ，Ｈｅｉｅｒ  ＪＳ，ｅｔ  ａｌ．２００６．ＭＡＲＩＮＡ  ｓｔｕｄｙ  ｇｒｏｕｐ．Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ  ｆｏｒ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒ  ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５５（１４）：１４１９−１４３１；Ｒｅｇｉｌｌｏ  ＣＤ，Ｂｒｏｗｎ  ＤＭ，Ａｂｒａｈａｍ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．２００８．Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，ｄｏｕｂｌｅ−ｍａｓｋｅｄ，ｓｈａｍ０ｃｏｎｔｒｏｌｌｏｅｄ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ  ｆｏｒ  ｎｅｏｖａｃｕｌａｒ  ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：ＰＩＥＲ  ｓｔｕｄｙ  ｙｅａｒ  １．Ａｍ  Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１４５：２３９−２４８。代わりに、抗ＶＥＧＦ療法薬の有効性又は治療利益の大半は、その抗透過特性に起因する。Ｚｅｂｒｏｗｓｋｉ  ＢＫ，Ｙａｎｏ  Ｓ，Ｌｉｕ  Ｗ，ｅｔ  ａｌ．１９９９．Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｌｅｖｅｌｓ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｐｌｅｕｒａｌ  ｅｆｆｕｓｉｏｎｓ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５：３３６４−３３６８。
【０１２７】
従来の抗ＶＥＧＦ療法薬は病理的ＮＶの退縮をもたらさないため、多くの患者について視力増加は極めて限られていた。更に、新生血管系はまた、湿潤型ＡＭＤ患者の失明原因である網膜下線維化も引き起こし得る。
【０１２８】
治療を受けた眼の略半分において、抗ＶＥＧＦ療法から２年以内に網膜下瘢痕が発症する。Ｄａｎｉｅｌ  Ｅ，Ｔｏｔｈ  ＣＡ，Ｇｒｕｎｗａｌｄ  ＪＥ．２０１４．Ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｓｃａｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｅｔｔｉｎｇｓ．Ｒｅｔｉｎａ  ３２：１４８０−１４８５。網膜下線維化形成は、黄斑系の永久的な機能不全を引き起こし得る。それは、光受容体、網膜色素上皮及び脈絡膜血管の破壊を引き起こす。Ｉｓｈｉｋａｗａ  Ｋ，Ｒａｍ  Ｋ，Ｈｉｎｔｏｎ  ＤＲ．２０１５．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｓｕｂｒｅｔｉｎａｌ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．Ｍａｒ  １３、２０１５  Ｅｐｕｂ  １−７。抗ＶＥＧＦ療法は概して視力を安定化させ、又は改善するが、治療後の視力低下の原因の１つとして瘢痕形成が特定されている。Ｃｏｈｅｎ  ＳＹ，Ｏｕｂｒａｈａｍ  Ｈ，Ｕｚｚａｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．２０１２．Ｃａｕｓｅｓ  ｏｆ  ｕｎｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ  ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｉｎ  ｅｘｕｄａｔｉｖｅ  ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｅｔｔｉｎｇｓ．Ｒｅｔｉｎａ  ３２：１４８０−１４８５。
【０１２９】
病理的血管新生では、概して、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）ファミリーの２つのメンバー、即ちＶＥＧＦ−Ａ及び胎盤増殖因子（ＰＧＦ）を含めた血管新生促進因子が上方制御される。ＶＥＧＦ−Ａ及びＰＧＦは静止内皮細胞を活性化させ、細胞増殖及び血管透過性を促進する。ＶＥＧＦ−Ａは、湿潤型ＡＭＤにおける血管漏出の主因として特定されている。Ｄｖｏｒａｋ  ＨＦ，Ｎａｇｙ  ＪＡ，Ｆｅｎｇ  Ｄ，Ｂｒｏｗｎ  ＬＦ，Ｄｖｏｒａｋ  ＡＭ．１９９９．Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｆａｃｔｏｒ／ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｈｙｐｅｒｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３７：９７−１３２。
【０１３０】
血小板由来増殖因子「ＰＤＧＦ」シグナル伝達は、ＮＶ成熟において、詳細には周皮細胞によるＮＶの被覆に対して重要な役割を果たす。周皮細胞によるＮＶ内皮細胞の被覆はパラクリン血小板由来増殖因子ＢのＥＣ発現から始まり、それがホモ二量体ＰＤＧＦ−ＢＢを形成する。ＰＤＧＦ−ＢＢは硫酸ヘパリンプロテオグリカンによって血管新生芽の先端細胞に高度に保持されている。このＰＤＧＦ−ＢＢが、次には周皮細胞結合受容体ＰＤＧＦＲ−βによって認識され、それにより成長血管新生に沿った周皮細胞の増殖及び移動が惹起される。
【０１３１】
ＰＤＧＦ−ＤＤも病理的血管新生において重要な役割を果たすことが発見されていた。Ｋｕｍａｒ  Ａ，Ｈｏｕ  Ｘ，Ｃｈｕｎｓｉｋ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．２０１０．Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−ＤＤ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ａｒｒｅｓｔｓ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  Ｇｌｙｃｏｇｅｎ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ  Ｋｉｎａｓｅ−３β  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８５（２０）：１５５００−１５５１０。血管新生においては、ＰＤＧＦ−ＤＤの過剰発現が血管成熟を誘導する。Ｋｏｎｇ  Ｄ，Ｗａｎｇ  Ｚ，Ｓａｒｋａｒ  ＦＨ，ｅｔ  ａｌ．２００８．Ｐｌａｔｅｌｅｔ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−Ｄ  Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＣ３  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２６：１４２５−１４３５。ＰＤＧＦ−ＤＤは眼で高発現する。Ｒａｙ  Ｓ，Ｇａｏ  Ｃ，Ｗｙａｔｔ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．２００５．Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｆｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｄ，Ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅｙｅ，ａｎｄ  ａ  Ｋｅｙ  Ｒｏｌｅ  ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｌｅｎｓ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８０：８４９４−８５０２。Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）は、病理的血管新生の間にＰＤＧＦ−ＤＤ発現が上方制御されたこと、及びＰＤＧＦ−ＤＤシグナル伝達の阻害が脈絡膜及び網膜血管新生を低下させたことを見出した。
【０１３２】
用語「ＰＤＧＦ」は、本明細書で使用されるとき、（ｉ）ＰＤＧＦＲ−β、又はＰＤＧＦＲ−αなどのＰＤＧＦ受容体に結合し；（ｉｉ）ＰＤＧＦ受容体に関連するチロシンキナーゼ活性を活性化し；及び（ｉｉｉ）それによって血管新生又は血管新生過程に影響を及ぼす増殖因子クラスの任意のメンバーを意味する。用語「ＰＤＧＦ」は、概して、反応性細胞型上の血小板由来増殖因子細胞表面受容体（即ち、ＰＤＧＦＲ）の結合及び活性化を介してＤＮＡ合成及び有糸分裂誘発を誘導する増殖因子クラスのメンバーを指す。ＰＤＧＦは、例えば：指向性の細胞遊走（走化性）及び細胞活性化；ホスホリパーゼ活性化；ホスファチジルイノシトール代謝回転及びプロスタグランジン代謝の増加；反応性細胞によるコラーゲン及びコラゲナーゼ合成の両方の刺激；マトリックス合成、サイトカイン産生、及びリポタンパク質取り込みを含めた細胞の代謝活性の改変；間接的に、ＰＤＧＦ受容体を欠く細胞における増殖反応の誘導；線維化及び強力な血管収縮活性を含めた、特定の生物学的効果を生じさせる。用語「ＰＤＧＦ」は、「ＰＤＧＦ」ポリペプチド及びその対応する「ＰＤＧＦ」コード遺伝子又は核酸の両方を含むことが意図される。
【０１３３】
ＰＤＧＦファミリーは、ジスルフィド結合したＰＤＧＦ−Ａ（Ｓｗｉｓｓタンパク質Ｐ０４０８５）、−Ｂ（Ｐ０１１２７）、−Ｃ（Ｑ９ＮＲＡ１）及び−Ｄ（Ｑ９ＧＺＰ０）のホモ二量体並びにヘテロ二量体ＰＤＧＦ−ＡＢからなる。様々なＰＤＧＦアイソフォームが、α及びβ−チロシンキナーゼ受容体（それぞれＰＤＧＦＲ−α（Ｐ１６２３４）及びＰＤＧＦＲ−β（Ｐ０９６１９））に結合することによってその効果を及ぼす。一般に、米国特許第５，８７２，２１８号明細書（あらゆる目的において参照により本明細書に援用される）を参照されたい。α及びβ受容体は構造的に類似しており、両方とも５つの免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインを含む細胞外ドメインとキナーゼ機能を含む細胞内ドメインとを有する。ＰＤＧＦ結合は、主として受容体のドメイン２及び３を介して起こり、受容体の二量化を生じさせる。Ｉｇ様ドメイン４は受容体二量化に関与する。受容体二量化は、ＰＤＧＦシグナル伝達の主要な構成要素である。受容体二量体化は受容体の自己リン酸化につながる。一方で自己リン酸化は受容体の立体構造変化を引き起こし、受容体キナーゼを活性化させる。ＰＤＧＦ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ及び−Ｄは、異なる親和性及び効果を有する２つの異なる受容体に結合する。ＰＤＧＦ−ＡＡ、−ＡＢ、−ＢＢ及び−ＣＣはαα受容体ホモ二量体を誘導し、ＰＤＧＦ−ＢＢ及び−ＤＤはββホモ二量体を誘導し、ＰＤＧＦ−ＡＢ、−ＢＢ、−ＣＣ及び−ＤＤはαβ受容体ヘテロ二量体を生成する。
【０１３４】
機能の点では、ＰＤＧＦＲ−αとＰＤＧＦＲ−βとは実質的に異なる役割を有するように見える。ＰＤＧＦＲ−αシグナル伝達は、原腸形成並びに頭蓋及び心臓の神経堤、生殖腺、肺、腸、皮膚、ＣＮＳ及び骨格の発生に関与する。ＰＤＧＦＲ−βシグナル伝達は、血管形成及び初期造血に関与する。Ａｎｄｒａｅ  Ｊ，Ｒａｄｉｏｓａ  Ｇ，Ｂｅｔｓｈｏｌｔｚ  Ｃ．２００８．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ  ２２：１２７６−１３１２。様々なＰＤＧＦリガンドと受容体との相互作用の点では、ＰＤＧＦ−ＡＡ及びＰＤＧＦ−ＣＣはＰＤＧＦＲ−αのみと結合し、相互作用する。ＰＤＧＦ−ＢＢ及びＰＤＧＦ−ＡＢはα及びβ受容体と結合する。ＰＤＧＦ−ＤＤはＰＤＧＦＲ−βのみと相互作用する。Ｒａｉｃａ  Ｍ，Ｃｉｍｐｅａｎ  ＡＭ．２０１０．Ｐｌａｔｅｌｅｔ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ（ＰＤＧＦ）／ＰＤＧＦ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ（ＰＤＧＦＲ）Ａｘｉｓ  ａｓ  Ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｎｄ  Ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．３：５７２−５９９。
【０１３５】
文脈から特に明らかでない限り、ＰＤＧＦへの言及は、天然アイソフォーム若しくは天然変異体又は天然型と少なくとも９０、９５、９８若しくは９９％の配列同一性を有する誘導変異体のいずれかにおけるＰＤＧＦ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ及び−Ｄの任意のものを意味する。好ましくは、かかるＰＤＧＦはヒトＰＤＧＦである。同様にＰＤＧＦＲへの言及は、任意の天然アイソフォーム若しくは天然変異体、又は天然配列と少なくとも９０、９５、９８又は９９％又は１００％の配列同一性を有する誘導変異体を含むＰＤＧＦＲ−Ａ（Ｐ１６２３４）又はＰＤＧＦＲ−Ｂを意味する。
【０１３６】
ヒトＰＤＧＦＲ−β（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ０９６１９．１）のアミノ酸配列を図１に示し、図１は、１１０６アミノ酸タンパク質である完全長ヒトＰＤＧＦＲ−β（リーダー配列を含む）を示す。アミノ酸１〜３２は、成熟タンパク質では切り取られるリーダーペプチドの一部である。ＰＤＧＦＲ−βは５個の細胞外Ｉｇ様ドメインＤ１〜Ｄ５を有する。Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＡＦ，Ｂａｒｃｌａｙ  ＡＮ．１９８８．Ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ−ｄｏｍａｉｎｓ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：３８１−４０５。完全長細胞外領域はおよそアミノ酸３３〜５３２にわたり、膜貫通ドメインはおよそ残基５３３〜５５３にわたり、及び細胞質ドメインはおよそ残基５５４〜１１０６にわたる。細胞外領域は５つの免疫グロブリン様ドメインＤ１〜Ｄ５を含む。Ｄ１ドメインは、典型的にはおよそアミノ酸３３（Ｌｅｕ）〜約１２３（Ｐｒｏ）であると考えられる。本発明において、Ｄ１はまた３３〜１２２（Ｖａｌ）であってもよい。Ｄ２は、典型的にはおよそ１２４（Ｔｈｒ）〜およそ２１３（Ｓｅｒ）であると考えられる。本発明において、Ｄ２は１２９（Ｐｒｏ）〜２１０（Ｇｌｎ）であってもよい。Ｄ３は、典型的にはおよそアミノ酸２１４（Ｉｌｅ）〜３１４（Ｇｌｙ）であると考えられる。本発明において、Ｄ３は２１４（Ｉｌｅ）〜３０９（Ｔｈｒ）であってもよい。Ｄ４は、典型的にはおよそアミノ酸３１５（Ｔｙｒ）〜４１６（Ｐｒｏ）と考えられる。Ｄ５は、典型的にはおよそアミノ酸４１７（Ｖａｌ）〜５３１（Ｌｙｓ）と考えられる。
【０１３７】
Ｄ１〜Ｄ５ドメインの正確な境界は、分析がどのように行われるかによって異なり得る。好ましくは、境界は９アミノ酸以下だけ異なる。典型的には境界は７アミノ酸以下、より典型的には５アミノ酸以下だけ異なる。通常、境界のばらつきは３アミノ酸以下である。最も典型的には、境界はアミノ酸のみだけ異なる。各ドメインの本質的特徴は、そのコグネイトリガンドに結合するその能力である。
【０１３８】
「ＰＤＧＦアンタゴニスト」又は「ＰＤＧＦをアンタゴナイズする」分子は、ＰＤＧＦＲに特異的に結合するその能力、及び結果として起こる細胞応答、例えば増殖を含めたＰＤＧＦの少なくとも１つの活性を部分的に又は完全に低減又は阻害する薬剤である。ＰＤＧＦアンタゴニストには、ＰＤＧＦ又はＰＤＧＦＲ及びＰＤＧＦＲ由来の細胞外トラップセグメントに特異的に結合する抗体が含まれる。
【０１３９】
ＰＤＧＦＲ−β細胞外受容体配列の１つ以上の部分は、ＰＤＧＦ−ＰＤＧＦＲ−βシグナル伝達のアンタゴニストとして使用することができる。細胞外トラップセグメントという用語は、ＰＤＧＦ−ＰＤＧＦＲ−βシグナル伝達をアンタゴナイズすることのできる完全長細胞外領域又はその任意の一部、又は異なるＰＤＧＦ受容体からの部分の組み合わせを指す。かかる部分は、典型的には、ＰＤＧＦＲの膜貫通配列及び細胞内配列を含まずに使用され、結果的に可溶性であると称される。これらの部分は、コグネイトＰＤＧＦに対するトラップ又はデコイとしての役割を果たすことによってアンタゴナイズする。ＰＤＧＦは可溶性ＰＤＧＦＲ−βセグメントトラップに結合し、対応する膜結合型受容体に結合することができない。好ましくは、かかるトラップはＰＤＧＦＲ−βドメインＤ１〜Ｄ５の１つ以上を含む。好ましくは、トラップはＤ２及びＤ３の少なくとも一方を含有する。より好ましくは、トラップはＤ１、Ｄ２及びＤ３を含有する。より好ましくは、トラップは、Ｄ１〜Ｄ３を含有する図８のアミノ酸３３〜３１４に対応する連続セグメントである。ＰＤＧＦＲ−αも同様にドメインＤ１〜Ｄ５を含み、ＰＤＧＦＲ−βの代わりに、ＰＤＧＦＲ−αの対応するドメインを組み込む細胞外トラップセグメントも同様に使用することができる。
【０１４０】
受容体に結合する抗体（例えば、２Ａ１Ｅ２［米国特許第７，０６０，２７１号明細書］；ＨｕＭ４Ｔｓ．２２［米国特許第５，８８２，６４４号明細書］；又は１Ｂ３若しくは２Ｃ５［米国特許第７，７４０，８５０号明細書］）、並びに抗ＰＤＧＦ  ＢＢ、抗ＰＤＧＦ−ＤＤ、抗ＰＤＧＦ−ＢＢ及び抗ＰＤＧＦ−ＡＢなどの抗ＰＤＧＦ抗体を含め、抗体もＰＤＧＦＲ−βのアンタゴニストとして使用することができる。
【０１４１】
「ＶＥＧＦ」又は「血管内皮増殖因子」は、血管新生又は血管新生過程に影響を及ぼすヒト血管内皮増殖因子である。詳細には、ＶＥＧＦという用語は、（ｉ）ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）、ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）、又はＶＥＧＦＲ−３（ＦＬＴ−４）などのＶＥＧＦ受容体に結合し；（ｉｉ）ＶＥＧＦ受容体に関連するチロシンキナーゼ活性を活性化し；及び（ｉｉｉ）それによって血管新生又は血管新生過程に影響を及ぼす増殖因子クラスの任意のメンバーを意味する。
【０１４２】
ＶＥＧＦ因子ファミリーは、５つの関連する糖タンパク質、即ち、ＶＥＧＦ−Ａ（ＶＰＥとしても知られる）、−Ｂ、−Ｃ、−Ｄ及びＰＧＦ（胎盤増殖因子）で構成される。これらのうち、ＶＥＧＦ−Ａは最も十分な研究がなされており、抗血管新生療法の標的である。Ｆｅｒｒａｒａ  ｅｔ  ａｌ，（２００３）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：６６９−６７６。ＶＥＧＦ−Ａは、選択的スプライシング及びタンパク質分解の両方によって産生される幾つもの異なるアイソタイプ、即ち、ＶＥＧＦ−Ａ206、ＶＥＧＦ−Ａ189、ＶＥＧＦ−Ａ165、及びＶＥＧＦ−Ａ121として存在する。アイソフォームは、ヘパリン及びニューロピリンと呼ばれる非シグナル伝達結合タンパク質に対するその結合能が異なる。これらのアイソフォームは全て、二量体として生物学的に活性である。
【０１４３】
ＶＥＧＦの様々な効果は、ＶＥＧＦ、例えば、ＶＥＧＦ−Ａ（Ｐ１５６９２）、−Ｂ（Ｐ４９７６６）、−Ｃ（Ｐ４９７６７）及び−Ｄ（Ｑ４３９１５）が受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）に結合することによって媒介される。ＶＥＧＦファミリー受容体はクラスＶ  ＲＴＫに属し、各々が細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に７個のＩｇ様ドメインを有する。ヒトでは、ＶＥＧＦは３種類のＲＴＫ、即ち、ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）（Ｐ１７９４８）、ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ、Ｆｌｋ−１）（Ｐ９３５９６８）及びＶＥＧＦＲ−３（Ｆｌｔ−４）（Ｐ３５９１６）に結合する。ＶＥＧＦＲ−１の配列は、図２に示す。文脈から特に明らかでない限り、ＶＥＧＦへの言及は、天然アイソフォーム若しくは天然変異体又は天然型と少なくとも９０、９５、９８又は９９％若しくは１００％の配列同一性を有する誘導変異体のいずれかにおけるＶＥＧＦ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ、−Ｄ、及びＰＧＦの任意のものを意味する。好ましくは、かかるＶＥＧＦはヒトＶＥＧＦである。同様に、ＶＥＧＦＲへの言及は、任意の天然アイソフォーム若しくは天然変異体、又は天然配列と少なくとも９０、９５、９８又は９９％又は１００％の配列同一性を有する誘導変異体を含めた、ＶＥＧＲ−１、Ｒ−２又はＲ−３の任意のものを意味する。
【０１４４】
細胞外領域はおよそアミノ酸２７〜７５８にわたり、膜貫通ドメインはおよそアミノ酸７５９〜７８０にわたり、及び細胞内領域はおよそ７８１〜１３３８にわたる。細胞外領域は７つの免疫グロブリン様ドメインＤ１〜Ｄ７を含む。ＶＥＧＦＲ−１のドメイン１は３２（Ｐ）〜１２８（Ｉ）、ドメイン２は１３４（Ｐ）〜１２５（Ｑ）、ドメイン３は２３２（Ｖ）〜３３１（Ｋ）、ドメイン４は３３３（Ｆ）〜４２８（Ｐ）、ドメイン５は４３１（Ｙ）〜５５３（Ｔ）、ドメイン６は５５８（Ｇ）〜６５６（Ｒ）及びドメイン７は６６２（Ｙ）〜７５１（Ｔ）である。一般に、米国特許第８，２７３，３５３号明細書（あらゆる目的において参照により本明細書に援用される）を参照されたい。ＶＥＧＦＲ−１のドメインＤ１〜Ｄ７の正確な境界は、分析がどのように行われるかによって異なり得る。好ましくは、境界は９アミノ酸以下だけ異なる。典型的には境界は７アミノ酸以下、より典型的には５アミノ酸以下だけ異なる。通常、境界のばらつきは３アミノ酸以下である。最も典型的には境界はアミノ酸のみだけ異なる。
【０１４５】
ＶＥＧＦＲ−２のタンパク質配列を以下の図３に示す。
【０１４６】
細胞外領域はおよそ残基２０〜７６４にわたり、膜貫通ドメインはおよそ残基７６５〜７８５にわたり、及び細胞内ドメインはおよそ残基７８６〜１３５６にわたる。細胞外領域は７つの免疫グロブリン様ドメインＤ１〜Ｄ７を含む。ＶＥＧＦＲ−２のドメイン１は３２（Ｐ）〜１１８（Ｖ）であり、ドメイン２は１２４（Ｐ）〜２２０（Ｇ）であり、ドメイン３は２２６（Ｖ）〜３２７（Ｋ）であり、ドメイン４は３２９（Ｆ）〜４２１（Ｐ）であり、ドメイン５は４２４（Ｇ）〜５４８（Ｔ）であり、ドメイン６は５５３（Ｉ）〜６６２（Ｌ）であり、及びドメイン７は６６８（Ｔ）〜７５７（Ａ）である。一般に、米国特許第８，２７３，３５３号明細書（あらゆる目的において参照により本明細書に援用される）を参照されたい。ＶＥＧＦＲ−２のドメインＤ１〜Ｄ７の正確な境界は、分析がどのように行われるかによって異なり得る。好ましくは、境界は９アミノ酸以下だけ異なる。典型的には境界は７アミノ酸以下、より典型的には５アミノ酸以下だけ異なる。通常、境界のばらつきは３アミノ酸以下である。最も典型的には境界ｌはアミノ酸のみだけ異なる。
【０１４７】
ＶＥＧＦＲ−３のタンパク質配列を以下の図４に示す。細胞外領域はおよそ残基２５〜７７５にわたり、膜貫通ドメインはおよそ残基７７６〜７９６にわたり、及び細胞内ドメインはおよそ残基７９７〜１３６３にわたる。細胞外ドメインは７つの免疫グロブリン様ドメインＤ１〜Ｄ７を含む。ＶＥＧＦＲ−３のドメイン１は３０（Ｐ）〜１３２（Ｖ）であり、ドメイン２は１３８（Ｐ）〜２２６（Ｇ）であり、ドメイン３は２３２（Ｉ）〜３３０（Ｎ）であり、ドメイン４は３３２（Ｆ）〜４２２（Ｐ）であり、ドメイン５は４２５（Ｈ）〜５５２（Ｔ）であり、ドメイン６は５５７（Ｇ）〜６７３（Ｑ）であり、及びドメイン７は６７９（Ｒ）〜７６８（Ｓ）である。一般に、米国特許第８，２７３，３５３号明細書（あらゆる目的において参照により本明細書に援用される）を参照されたい。ＶＥＧＦＲ−３のドメインＤ１〜Ｄ７の正確な境界は、分析がどのように行われるかによって異なり得る。好ましくは、境界は９アミノ酸以下だけ異なる。典型的には境界は７アミノ酸以下、より典型的には５アミノ酸以下だけ異なる。通常、境界のばらつきは３アミノ酸以下だけのものである。最も典型的には境界はアミノ酸のみだけ異なる。
【０１４８】
ＶＥＧＦＲ−２は主に血管内皮細胞上に発現する。ＶＥＧＦＲ−１も血管内皮上に発現するが、それに加え、幾つもの他の細胞型、即ち、好中球、単球、マクロファージ、壁細胞及び内皮前駆細胞によっても発現される。ＶＥＧＦＲ−１はＶＥＧＦＲ−２と比べてＶＥＧＦ−Ａに対する親和性が高い。しかしながら、ＶＥＧＦＲ−１が内皮細胞においてＶＥＧＦ−Ａに結合するとき、ＶＥＧＦＲ−１は極めて弱いチロシンリン酸化を呈するに過ぎない。従って、血管内皮に対するＶＥＧＦ−Ａ（その様々なアイソフォームを含む）の効果は、ＶＥＧＦ−ＡとＶＥＧＦＲ−２の結合によって媒介されると考えられる。
【０１４９】
ＰＧＦ及びＶＥＧＦ−ＢはＶＥＧＦＲ−１にのみ結合する。ＰＧＦ及びＶＥＧＦ−Ｂは病原性の血管リモデリングに関与するとされている。Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ  Ｐ，Ｍｏｏｎｓ  Ｌ，Ｌｕｔｔｅｎ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．２００１．Ｓｙｎｅｒｇｉｓｍ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｌａｓｍａ  ｅｘｔｒａｖａｓａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ．７（５）；５７５−５８３。ＶＥＧＦ−Ｃ及び−Ｄは、主として成人のリンパ管内皮細胞上に見られるＶＥＧＦＲ−３に高親和性で結合する。ＶＥＧＦ−Ｃ及び−Ｄは、リンパ管新生に関して役割を果たすと考えられている。
【０１５０】
「ＶＥＧＦアンタゴニスト」又は「ＶＥＧＦをアンタゴナイズする」分子は、その受容体ＶＥＧＦＲに結合するその能力、及び結果として起こる細胞応答、例えば血管新生及び細胞増殖を含めたＶＥＧＦの活性を部分的に又は完全に低減又は阻害する薬剤である。ＶＥＧＦアンタゴニストには、ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦＲ又はＶＥＧＦＲ細胞外トラップセグメントに特異的に結合する抗体が含まれる。
【０１５１】
細胞外トラップセグメントという用語は、少なくとも１つのＶＥＧＦとＶＥＧＦＲとの間のシグナル伝達をアンタゴナイズすることのできる完全長細胞外領域又はその任意の一部、又は異なるＶＥＧＦＲ受容体からの部分の組み合わせを指す。好ましくは、細胞外トラップセグメントは、上記に定義したＶＥＧＦＲ−１、−２又は−３の１つからの少なくとも１つのドメイン、より好ましくは少なくとも２つの連続ドメイン、例えばＤ２及びＤ３を含む。任意選択で、細胞外ドメインは、少なくとも２つの異なるＶＥＧＦＲ由来の上記に定義したとおりの少なくとも１つのドメインを含む。好ましい細胞外ドメインは、ＶＥＧＦＲ−１のＤ２及びＶＥＧＦＲ−２のＤ３を含むか、又はそれらから本質的になる。
【０１５２】
ＶＥＧＦアンタゴニスト療法薬は、特定の癌及び湿潤型ＡＭＤの治療用に承認されている。ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）は、ヒトＶＥＧＦ、詳細にはＶＥＧＦ−Ａの全てのアイソフォーム及びＶＥＧＦ−Ａの生理活性タンパク質分解性断片に結合してそれを中和するヒト化マウスモノクローナル抗体である。例えば、Ｆｅｒｒａｒａ  Ｎ，Ｈｉｌｌａｎ  ＫＪ，Ｇｅｒｂｅｒ  ＨＰ，Ｎｏｖｏｔｎｙ  Ｗ．２００４．Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ，ａｎ  ａｎｔｉ−ＶＥＧＦ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｉｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．３（５）：３９１−４００を参照されたい。ベバシズマブは、特定の癌の治療用に承認されている。ベバシズマブ（ＤｒｕｇＢａｎｋ  ＤＢ００１１２）の重鎖及び軽鎖のタンパク質配列を以下の図５に示し、ＣＤＲには下線を引く（配列番号２及び５も参照されたい）。
【０１５３】
ベバシズマブ可変軽鎖ＣＤＲは、ＣＤＲL１：ＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ、ＣＤＲL２：ＦＴＳＳＬＨＳ及びＣＤＲL３：ＱＱＹＳＴＶＰＷＴである。ベバシズマブ可変重鎖ＣＤＲは、ＣＤＲH１：ＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮ、ＣＤＲH２：ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＫＲ、及びＣＤＲH３：ＹＰＨＹＹＧＳＳＨＷＹＦＤＶである。ＣＤＲはＫａｂａｔによって定義され、但しＣＤＲＨ１については複合Ｋａｂａｔ／Ｃｈｏｔｈｉａ定義である。
【０１５４】
ベバシズマブと同じマウスモノクローナル抗体に由来する別の抗ＶＥＧＦ分子、ラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）が、湿潤型ＡＭＤの治療として承認されている。ラニビズマブは抗体断片又はＦａｂである。ラニビズマブは、ベバシズマブの可変重鎖及び軽鎖の親和性成熟によって作製されたものである。ラニビズマブの重鎖及び軽鎖の配列（Ｎｏｖａｒｔｉｓによって公開されているとおりの）を以下の図６に示す（配列番号１２及び１３も参照されたい）。
【０１５５】
ラニビズマブ可変軽鎖ＣＤＲは、ＣＤＲL１：ＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ、ＣＤＲL２：ＦＴＳＳＬＨＳ及びＣＤＲL３：ＱＱＹＳＴＶＰＷＴである。ラニビズマブ可変重鎖ＣＤＲは、ＣＤＲH１：ＧＹＤＦＴＨＹＧＭＮ、ＣＤＲH２：ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＫＲ、及びＣＤＲH３：ＹＰＹＹＹＧＴＳＨＷＹＦＤＶである。
【０１５６】
ＶＥＧＦ−Ａとの結合又はＶＥＧＦ−Ａ上のベバシズマブと同じエピトープとの結合に関してベバシズマブと競合する抗体も使用することができる。
【０１５７】
別の抗ＶＥＧＦ療法薬は、ＶＥＧＦトラップである。例えば、アフリベルセプト（Ｅｙｌｅａ（登録商標）、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）は、ヒトＩｇＧ１の定常領域（Ｆｃ）とのインライン融合物として発現するＶＥＧＦＲ−１の第２Ｉｇ様ドメインとＶＥＧＦＲ−２の第３Ｉｇ様ドメインとからなる。Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．２０１２．Ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ，ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ  ａｎｄ  ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ．Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  １５：１７１−１８５。理論的には、アフリベルセプトはＶＥＧＦ−Ａのみならず、ＶＥＧＦ−Ｂ及びＰＧＦにも結合し、それによってＶＥＧＦＲ−１とのそれらの相互作用をアンタゴナイズする。
【０１５８】
本発明において、ＰＤＧＦアンタゴニストに連結したＶＥＧＦアンタゴニストを含むデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニストが提供される。連結は好ましくは、タンパク質鎖の融合を含んで、両方のアンタゴニストの成分で形成されるハイブリッド鎖を形成する。或いは、これらの成分は化学的架橋によってつなぎ合わされる。例として、融合による連結のうち、デュアルアンタゴニストが抗体と細胞外トラップセグメントとで形成される場合、抗体の重鎖又は軽鎖が細胞外トラップセグメントに融合し得る。好ましくは、細胞外トラップセグメントは抗体重鎖又は軽鎖のＮ末端に直接、又はリンカーを介して間接的に融合する。細胞外トラップセグメントに融合しない方の鎖が、天然抗体における重軽鎖会合と同じ方法でその鎖と会合し得る。例えば、例示的フォーマットは、リンカーを介して抗体重鎖のＮ末端に融合した細胞外トラップセグメントと、抗体重鎖と複合体を形成した抗体軽鎖とを有する。かかるデュアルアンタゴニストの抗体は、インタクトな抗体か、又はＦａｂ断片などの上記に記載する結合断片のいずれかであってもよい。好ましくは、かかるデュアルアンタゴニストにおいて、ＶＥＧＦアンタゴニストはベバシズマブ又はラニビズマブなどのＶＥＧＦ−Ａに対する抗体であり、ＰＤＧＦアンタゴニストはＰＤＧＲ−１由来の細胞外トラップセグメントである。
【０１５９】
代替的なフォーマットでは、ＶＥＧＦアンタゴニスト及びＰＤＧＦアンタゴニストが両方とも細胞外トラップセグメントである。これらの２つのセグメントは、互いに対していずれの向きにも、直接、又はリンカーを介して融合し得る。即ち、ＶＥＧＦＲ細胞外トラップ領域は、ＰＤＧＦＲ細胞外トラップ領域のＮ末端又はＣ末端につなぎ合わせることができる。かかる融合タンパク質のＣ末端を抗体のＦｃ領域に連結すると、Ｆｃ融合タンパク質を形成し得る。
【０１６０】
好ましい実施形態において、ＰＤＧＦＲはＰＤＧＦＲ−βであり、細胞外トラップセグメントはＰＤＧＦＲ−βのドメインＤ１〜Ｄ５の１つ以上を含む。より好ましくは、細胞外トラップセグメントはＰＤＧＦＲ−βのドメインＤ１〜Ｄ３を含む。更により好ましくは、細胞外トラップセグメントは配列番号１１のアミノ酸３３〜３１４を含むか、又はそれからなる。好ましい実施形態において、ＶＥＧＦアンタゴニストは抗ＶＥＧＦ抗体、好ましくは抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体である。
【０１６１】
互いに融合した抗体及び細胞外トラップ成分を有するデュアルアンタゴニストにおいて、それぞれの成分、典型的には抗体重鎖と細胞外トラップセグメントとは、リンカー配列によって隔てられる。リンカーは、好ましくは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＧＧ、又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ又はこれらのいずれかのオリゴマーである。より好ましくは、リンカーはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳである。
【０１６２】
本発明のある態様において、抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体重鎖は、少なくとも以下のＣＤＲ配列を有する：ＣＤＲH１：ＧＹＤＦＴＨＹＧＭＮ、ＣＤＲH２：ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＫＲ、及びＣＤＲH３：ＹＰＹＹＹＧＴＳＨＷＹＦＤＶ。好ましくは、抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖は、少なくとも以下のＣＤＲを有する：ＣＤＲL１：ＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ、ＣＤＲL２：ＦＴＳＳＬＨＳ及びＣＤＲL３：ＱＱＹＳＴＶＰＷＴ。抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体重鎖の場合、そのアイソタイプがＩｇＧ１であり、且つＣＨ1、ヒンジ、ＣＨ2及びＣＨ3ドメインを有することが好ましい。また、軽鎖アイソタイプがκであることも好ましい。好ましいＩｇＧ１配列の定常領域を配列番号１７に示す。軽鎖定常領域の配列は、好ましくは配列番号１８に示される。
【０１６３】
抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体のＩｇＧ１ドメインは好ましくは、エフェクター機能を低減し又は低下させる１つ以上の突然変異を有する。エフェクター機能を低減する突然変異に使用するのに好ましいアミノ酸としては、（ＥＵ付番）Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５、Ｇ２３６、Ｇ２３７、ｄｅｌＧ２３６、Ｄ２７０Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ａ３２７Ｇ、Ｐ３２９Ａ、Ａ３３０、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、及びＰ３３１Ａが挙げられる（ここでは２番目に挙げたアミノ酸が突然変異である）。好ましくは、突然変異は以下の１つ以上を含む：Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓ（ＥＵ付番）。より好ましくは、抗ＶＥＧＦ−Ａ重鎖は以下の突然変異を有する：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＧ２３７Ａ。天然ヒトＩｇＧ１配列と比べたかかる突然変異の数は、１０個以下、好ましくは５、４、３、２又は１個以下である。
【０１６４】
或いは、ＩｇＧドメインは、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４、好ましくは、ヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４、又は定常領域がこれらのアイソタイプの２つ以上で形成される複合体（例えば、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４のＣＨ１領域、ヒンジ、ＩｇＧ１のＣＨ２及びＣＨ３領域）であってもよい。かかるドメインは、ＩｇＧ１について挙げられるＥＵ位置の１つ以上にエフェクター機能を低減する突然変異を含有し得る。ヒトＩｇＧ２及びＩｇＧ４はヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ３と比べて低いエフェクター機能を有する。
【０１６５】
抗ＶＥＧＦ−Ａ重鎖はまた、組換えＤＮＡ技術によって突然変異として付加された、半減期延長部分のコンジュゲーションに使用することのできるシステイン残基も含有し得る。好ましくは、この突然変異は（ＥＵ付番）Ｑ３４７Ｃ及び／又はＬ４４３Ｃである。より好ましくは、この突然変異はＬ４４３Ｃである。好ましくは、デュアルアンタゴニストとポリマーの化学量論は１：１であり、換言すれば、コンジュゲートは、各々が１つのポリマー分子にコンジュゲートした１つのデュアルアンタゴニスト分子を含む分子から本質的になる。
【０１６６】
ＶＥＧＦ−Ａに対する抗体とＰＤＧＦＲ細胞外トラップセグメントとを含む好ましいデュアルアンタゴニストは、配列番号９のアミノ酸配列を有する抗体重鎖及びＰＤＧＦＲ細胞外トラップセグメントと配列番号１０のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖との融合タンパク質、又は各々配列番号９及び１０と１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１アミノ酸以下だけ異なる配列を含むその変異体を含む。
【０１６７】
本発明の別の態様において、上記に記載したとおりのＰＤＧＦＲの１つ以上のセグメントを成すＰＤＧＦアンタゴニストと抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ断片を成すＶＥＧＦアンタゴニストとを有するデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニストが提供される。本発明のこの態様について、ＰＤＧＦＲ細胞外トラップはＰＤＧＦＲ−βのドメインＤ１〜Ｄ５の１つ以上を含む。より好ましくは、ＰＤＧＦＲトラップはＰＤＧＦＲ−βのドメインＤ１〜Ｄ３を成す。より好ましくは、ＰＤＧＦＲトラップは配列番号１１のアミノ酸３３〜３１４である。
【０１６８】
ＰＤＧＦＲトラップは、好ましくはＦａｂ重鎖又は軽鎖のＣ末端に位置する。ＰＤＧＦＲトラップはまた、Ｆａｂ重鎖又は軽鎖のＮ末端にも優先的に位置する。好ましくは、デュアルアンタゴニストは、リンカーを介してＰＤＧＦＲ細胞外トラップセグメント及び抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖に融合した抗ＶＥＧＦ−Ａ  Ｆａｂ断片重鎖を含む。
【０１６９】
本発明の別の態様において、細胞外トラップセグメントがＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣ及びＰＤＧＦ−ＤＤの１つ以上に結合しているデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニストが提供される。好ましくは、細胞外トラップはＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ及びＰＤＧＦ−ＤＤと結合する。更により好ましくは、細胞外トラップは、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ及びＰＤＧＦ−ＤＤが、ＰＤＧＦＲ−αα、ＰＤＧＦＲ−αβ、及びＰＤＧＦＲ−ββ受容体のいずれか１つに結合するのを阻害する。
【０１７０】
好ましくはＰＤＧＦＲトラップと抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ断片重鎖との間にリンカーが位置する。好ましくは、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＧＧ、及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ、及びこれらのいずれかのオリゴマーからなる群から選択される。より好ましくは、リンカーはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳである。
【０１７１】
抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ断片重鎖は好ましくは、少なくとも以下のＣＤＲを有する：ＣＤＲH１：ＧＹＤＦＴＨＹＧＭＮ、ＣＤＲH２：ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＫＲ、及びＣＤＲH３：ＹＰＹＹＹＧＴＳＨＷＹＦＤＶ。抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖は好ましくは、少なくとも以下のＣＤＲを有する：ＣＤＲL１：ＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ、ＣＤＲL２：ＦＴＳＳＬＨＳ及びＣＤＲL３：ＱＱＹＳＴＶＰＷＴ。
【０１７２】
好ましい抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ断片重鎖アイソタイプはＩｇＧ１であり、且つＣＨ1ドメインを含み、軽鎖アイソタイプはκである。
【０１７３】
デュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニストは、結合した半減期延長部分を有し得る。好ましくは半減期延長部分は双性イオンポリマーであるが、或いは以下で考察するＰＥＧ又は他の半減期延長剤が用いられてもよい。より好ましくは、双性イオンポリマーは、ホスホリルコリン基を有する単量体で形成される。好ましくは単量体は２−（アクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェートである。より好ましくは、単量体は２−（メタクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェート（ＨＥＭＡ−ＰＣ）である。
【０１７４】
デュアルアンタゴニストにコンジュゲートしたポリマーは好ましくは、少なくとも２本、より好ましくは３本以上のアームを有する。一部のポリマーは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２本のアームを有する。更により好ましくはポリマーは、３、６又は９本のアームを有する。最も好ましくは、ポリマーは９本のアームを有する。好ましくは、ポリマーピーク分子量は３００，０００〜１，７５０，０００Ｄａである。より好ましくは、ポリマーは５００，０００〜１，０００，０００Ｄａのピーク分子量を有する。更により好ましくは、ポリマーは６００，０００〜８００，０００Ｄａのピーク分子量を有する。
【０１７５】
ポリマーは、コンジュゲーションによってデュアルアンタゴニストに共有結合的に結合し得る。好ましくは、ポリマーは、アミノ基、ヒドロキシル基、スルフヒドリル基又はカルボキシル基などの基を介してデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニストにコンジュゲートする。スルフヒドリル基は、天然に存在するシステイン残基のものであってもよい。スルフヒドリル基はまた、組換えＤＮＡ技術によって付加されたシステイン残基のものであってもよい。
【０１７６】
本発明の好ましい態様において、ポリマーは、配列番号９の７３１位、又は本明細書に開示される配列番号９の任意の変異体の整列する位置にあるシステイン残基にコンジュゲートする。
【０１７７】
本発明の別の態様において、抗ＰＤＧＦ抗体又はＦａｂ断片重鎖若しくは軽鎖に融合した、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２又はＶＥＧＦＲ−３などの、ＶＥＧＦＲの１つ以上の細胞外セグメントを含有するＶＥＧＦＲトラップと、融合に含まれない抗ＰＤＧＦ抗体又はＦａｂ断片重鎖若しくは軽鎖とを有するデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニストである。
【０１７８】
本発明のある態様において、ＶＥＧＦＲの細胞外セグメントは好ましくはドメインＤ１〜Ｄ７の１つ以上である。より好ましくは、細胞外セグメントはＶＥＧＦＲ−１由来のＤ２及びＶＥＧＦＲ−２由来のＤ３を含む。更により好ましくは、Ｄ２はＤ３のＮ末端側にあり、これらのドメイン間にリンカーを更に含む。
【０１７９】
本発明のこの態様の好ましい実施形態において、ＰＤＧＦアンタゴニストは抗体である。より好ましくは、抗体は、ヒト化２Ａ１Ｅ２、ＨｕＭ４Ｔｓ．２２、ヒト化１Ｂ３、ヒト化２Ｃ５、抗ＰＤＧＦ−ＢＢ、抗ＰＤＧＦ−ＤＤ、抗ＰＤＧＦ−ＢＢ及び抗ＰＤＧＦ−ＡＢからなる群から選択される。ＰＤＧＦアンタゴニストはまた、好ましくはＦａｂ断片でもある。
【０１８０】
本発明のこの態様において、抗体重鎖は好ましくはＩｇＧ１、より好ましくはヒトＩｇＧ１であり、軽鎖は好ましくはκ、ヒトκである。重鎖は、組換えＤＮＡ技術を用いて付加されたシステインを有し得る。好ましくは、システインは、Ｑ３４７Ｃ及びＬ４４３Ｃからなる群から選択される。好ましくは、システインにコンジュゲートした半減期延長部分がある。
【０１８１】
好ましくは、半減期延長部分は、１つ以上の単量体単位を有する双性イオンポリマーであり、ここで少なくとも１つの単量体単位が双性イオン基を有する。好ましくは、双性イオン基はホスホリルコリンである。単量体は、好ましくは２−（アクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェートである。より好ましくは、単量体は２−（メタクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェート（ＨＥＭＡ−ＰＣ）である。
【０１８２】
本発明のこの態様において、ポリマーは好ましくは、少なくとも２本、より好ましくは３本以上のアームを有する。一部のポリマーは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２本のアームを有する。更により好ましくは、ポリマーは、３、６又は９本のアームを有する。最も好ましくは、ポリマーは９本のアームを有する。本発明のある態様において、３００，０００〜１，７５０，０００Ｄａのポリマーピーク分子量である。より好ましくは、ポリマーは、５００，０００〜１，０００，０００Ｄａのピーク分子量を有する。更により好ましくは、ポリマーは、６００，０００〜８００，０００Ｄａのピーク分子量を有する。
【０１８３】
本発明のある態様において、ポリマーは、コンジュゲーションによってポリマーに共有結合的に結合する。好ましくは、ポリマーは、アミノ基、ヒドロキシル基、スルフヒドリル基及びカルボキシル基からなる群から選択される基を介してデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニストにコンジュゲートする。好ましくは、スルフヒドリル基は、天然に存在するシステイン残基のものである。他の好ましい実施形態において、スルフヒドリル基は、組換えＤＮＡ技術によって付加されたシステイン残基のものである。
【０１８４】
本発明の好ましい態様において、ＰＤＧＦトラップ−ＶＥＧＦトラップは、他のデュアルアンタゴニストで考察するとおりの半減期延長部分にコンジュゲートする。
【０１８５】
好ましくは、半減期延長部分は、１つ以上の単量体単位を有する双性イオンポリマーであり、ここで少なくとも１つの単量体単位が双性イオン基を有する。好ましくは、双性イオン基はホスホリルコリンである。単量体は、好ましくは２−（アクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェートである。より好ましくは、単量体は２−（メタクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェート（ＨＥＭＡ−ＰＣ）である。
【０１８６】
本発明のこの態様において、ポリマーは好ましくは、少なくとも２本、より好ましくは３本以上のアームを有する。一部のポリマーは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２本のアームを有する。更により好ましくはポリマーは、３、６又は９本のアームを有する。最も好ましくは、ポリマーは９本のアームを有する。本発明のある態様において、３００，０００〜１，７５０，０００Ｄａのポリマーピーク分子量である。より好ましくは、ポリマーは、５００，０００〜１，０００，０００Ｄａのピーク分子量を有する。更により好ましくは、ポリマーは、６００，０００〜８００，０００Ｄａのピーク分子量を有する。
【０１８７】
本発明のある態様において、ポリマーは、コンジュゲーションによってポリマーに共有結合的に結合する。好ましくは、ポリマーは、アミノ基、ヒドロキシル基、スルフヒドリル基又はカルボキシル基などの基を介してデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニストにコンジュゲートする。一部のコンジュゲートにおいて、スルフヒドリル基は、天然に存在するシステイン残基のものである。一部のコンジュゲートにおいて、スルフヒドリル基は、組換えＤＮＡ技術によって付加されたシステイン残基のものである。
【０１８８】
デュアルＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアンタゴニストは、（ｉ）遺伝子工学による組換えＤＮＡの産生、（ｉｉ）例えば、限定なしに、トランスフェクション、電気穿孔又はマイクロインジェクションによる原核細胞又は真核細胞への組換えＤＮＡの導入、（ｉｉｉ）形質転換細胞の培養、（ｉｖ）例えば構成的な又は誘導時のデュアルアンタゴニストの発現、及び（ｖ）例えば培養培地からの、又は形質転換細胞の回収によるデュアルアンタゴニストの単離、それによる（ｖｉ）精製デュアルアンタゴニストの入手を含む組換え発現によって作製することができる。
【０１８９】
デュアルアンタゴニストは、薬理学的に許容可能なデュアルアンタゴニスト分子の産生によって特徴付けられる好適な原核生物又は真核生物宿主系における発現によって作製することができる。真核細胞の例は、哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ  ２９３、ＢＨＫ、ＳＫ−Ｈｉｐ、及びＨｅｐＧ２である。他の好適な発現系は、原核細胞（例えば、ｐＥＴ／ＢＬ２１発現系を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、酵母（サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及び／又はピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）系）、及び昆虫細胞である。
【０１９０】
デュアルアンタゴニストの調製には幅広い種類のベクターを使用することができ、それらは真核生物及び原核生物発現ベクターから選択される。原核生物発現用ベクターの例としては、プラスミド、例えば、限定なしに、ｐｒｅｓｅｔ、ｐｅｔ、及びｐａｄが挙げられ、ここで原核生物発現ベクターに使用されるプロモーターとしては、限定なしに、ｌａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ｒｅｃＡ、又はａｒａＢＡＤの１つ以上が挙げられる。真核生物発現用ベクターの例としては、以下が挙げられる：（ｉ）酵母での発現には、限定なしに、ｐＡＯ、ｐＰＩＣ、ｐＹＥＳ、又はｐＭＥＴなどのベクター、限定なしに、ＡＯＸ１、ＧＡＰ、ＧＡＬ１、又はＡＵＧ１などのプロモーターを使用し；（ｉｉ）昆虫細胞での発現には、限定なしに、ｐＭＴ、ｐＡｃ５、ｐＩＢ、ｐＭＩＢ、又はｐＢＡＣなどのベクター、限定なしに、ＰＨ、ｐ１０、ＭＴ、Ａｃ５、ＯｐＩＥ２、ｇｐ６４、又はｐｏｌｈなどのプロモーターを使用し、及び（ｉｉｉ）哺乳類細胞での発現には、限定なしに、ｐＳＶＬ、ｐＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡ３、又はｐＢＰＶなどのベクター、及び一態様では、限定なしに、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、又はレトロウイルスなどのウイルス系に由来するベクター、限定なしに、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＥＦ−１、ＵｂＣ、ＲＳＶ、ＡＤＶ、ＢＰＶ、及びβ−アクチンなどのプロモーターを使用する。
【０１９１】
デュアルアンタゴニストの半減期は、「半減期延長部分」又は「半減期延長基」（本明細書では、これらの用語は、−ＳＨ、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ２、−ＮＨ２、又は１つ以上のＮ−及び／又はＯ−グリカン構造などの１つ以上のアミノ酸側鎖官能基に結合した、且つタンパク質／ペプチドにコンジュゲートしたとき、それらのタンパク質／ペプチドのインビボ循環半減期を増加させることのできる１つ以上の化学基を指して同義的に使用される）を結合することによって延長させることができる。半減期延長部分の例としては、本明細書に記載されるポリマー、特に双性イオン単量体のもの、例えば、ＨＥＭＡ−ホスホリルコリン、ＰＥＧ、生体適合性脂肪酸及びその誘導体、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）例えばヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（Ｇｌｙｘ−Ｓｅｒｙ）（ＨＡＰ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ヘパロサンポリマー（ＨＥＰ）、Ｆｌｅｘｉｍｅｒ、デキストラン、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、Ｆｃドメイン、トランスフェリン、２５アルブミン、エラスチン様（ＥＬＰ）ペプチド、ＸＴＥＮポリマー、ＰＡＳポリマー、ＰＡポリマー、アルブミン結合ペプチド、ＣＴＰペプチド、ＦｃＲｎ結合ペプチド及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【０１９２】
一実施形態において、半減期延長部分は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル類を使用してタンパク質の遊離アミノ基を介してデュアルアンタゴニストにコンジュゲートすることができる。アミン基とのコンジュゲーションを標的化する試薬は、リジンのε−アミン基、Ｎ末端アミノ酸のα−アミン基、及びヒスチジンのδ−アミン基とランダムに反応し得る。
【０１９３】
しかしながら、このデュアルアンタゴニストは、ポリマーコンジュゲーションに利用可能なアミン基を多く有する。従って、ポリマーと遊離アミノ基のコンジュゲーションが、デュアルアンタゴニストタンパク質がＶＥＧＦ及び／又はＰＤＧＦと結合する能力に悪影響を及ぼし得る。
【０１９４】
別の実施形態において、半減期延長部分は、限定なしにマレイミド化学を含めた、任意の適切なチオール反応化学を用いて１つ以上の遊離ＳＨ基にカップリングされ、又は前酸化後のポリマーヒドラジド類若しくはポリマーアミン類とデュアルアンタゴニストの炭水化物部分とのカップリングである。マレイミドカップリングの使用が、本発明の特に好ましい実施形態である。カップリングは好ましくは、天然に存在する、又は遺伝子工学によって導入されたシステインで行う。
【０１９５】
ポリマーは、好ましくは、部位特異的突然変異誘発によってデュアルアンタゴニストに導入されたシステイン残基に共有結合的に結合する。特に、デュアルアンタゴニストのＦｃ部分のシステイン残基を用いることが好ましい。システイン残基をＦｃ領域に導入するのに好ましい部位については、国際公開第２０１３／０９３８０９号パンフレット、米国特許第７，５２１，５４１号明細書、国際公開第２００８／０２０８２７号パンフレット、米国特許第８，００８，４５３号明細書、米国特許第８，４５５，６２２号明細書及び米国特許出願公開第２０１２／０２１３７０５号明細書（あらゆる目的において参照により本明細書に援用される）を参照されたい。特に好ましいシステイン突然変異は、ＥＵ付番によるヒトＩｇＧ重鎖に基づきＱ３４７Ｃ及びＬ４４３Ｃである。
【０１９６】
本発明は、デュアルアンタゴニストと、半減期延長剤としての役割を果たす高分子量ポリマーとのコンジュゲートを提供する。好ましいコンジュゲートは、双性イオンポリマーにカップリングしたデュアルアンタゴニストを含み、このポリマーは１つ以上の単量体単位で形成され、ここで少なくとも１つの単量体単位が双性イオン基を有する。好ましくは、双性イオン基はホスホリルコリンである。
【０１９７】
好ましくは、単量体単位のうちの１つは２−（アクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェート又は２−（メタクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェート（ＨＥＭＡ−ＰＣ）である。他の好ましい実施形態において、ポリマーは、好ましくは２−（アクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェート又は２−（メタクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェートである単一の単量体から合成される。
【０１９８】
一部のデュアルアンタゴニストコンジュゲートは、２本以上、又はより好ましくは３本以上のポリマーアームを有し、ここで単量体はＨＥＭＡ−ＰＣである。好ましくは、コンジュゲートは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２本のポリマーアームを有し、ここで単量体はＨＥＭＡ−ＰＣである。より好ましくは、コンジュゲートは、３、６又は９本のアームを有する。最も好ましくは、コンジュゲートは９本のアームを有する。
【０１９９】
ポリマー−デュアルアンタゴニストコンジュゲートは好ましくは、１００，０００〜１，５００，０００Ｄａの分子量のポリマー部分を有する。より好ましくは、コンジュゲートは分子量５００，０００〜１，０００，０００Ｄａのポリマー部分を有する。更により好ましくは、コンジュゲートは分子量６００，０００〜８００，０００Ｄａのポリマー部分を有する。最も好ましくは、コンジュゲートは分子量６００，０００〜８５０，０００Ｄａのポリマー部分を有し、且つ９本のアームを有する。ポリマーにコンジュゲートしたデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニストについて分子量が与えられるとき、その分子量は、タンパク質（それと会合した任意の炭水化物部分を含む）の分子量とポリマーの分子量とを加えたものとする。
【０２００】
本発明のある態様によると、約１００ｋＤａ〜１５００ｋＤａのＭｗによって計測した分子量を有するＨＥＭＡ−ＰＣポリマーを有するデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニストである。より好ましくは、Ｍｗによって計測するときのポリマーの分子量は約５００ｋＤａ〜１０００ｋＤａである。更により好ましくは、Ｍｗによって計測するときのポリマーの分子量は約６００ｋＤａ〜約９００ｋＤａである。最も好ましくは、Ｍｗによって計測するときのポリマー分子量は７５０ｋＤａ±１５％である。
【０２０１】
本発明のこの態様において、ポリマーは、好ましくは、１個以上のポリマー開始部位を有するＡＴＲＰに好適な開始剤から作られる。好ましくは、ポリマー開始部位は２−ブロモイソ酪酸部位を有する。好ましくは、開始剤は３個以上のポリマー開始部位を有する。より好ましくは、開始剤は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２個のポリマー開始部位を有する。より好ましくは、開始剤は、３、６又は９個のポリマー開始部位を有する。更により好ましくは、開始剤は９個のポリマー開始部位を有する。最も好ましくは、開始剤はＯＧ１７８６である。
【０２０２】
本発明は、双性イオンポリマー−デュアルアンタゴニストコンジュゲートの合成方法を提供し、このコンジュゲートは１つ以上の機能性薬剤と１つ以上のポリマーアームとを有し、ここでポリマーアームの各々は１つ以上の単量体単位を有し、それらの単位のうちの少なくとも１つは双性イオンを有する。この方法は、
ａ．１つ以上の単量体重合部位を有する開始剤と、アミン基を有する第１のリンカーとを提供するステップであって、開始剤がトリフルオロ酢酸塩である、ステップと、
ｂ．重合に好適な１つ以上の単量体を提供するステップであって、単量体の少なくとも１つが双性イオンである、ステップと、
ｃ．単量体を開始剤と反応させて、各々が単量体重合部位に対応する１本以上のポリマーアームを形成し、アミン基を含む第１のリンカーを有する開始剤−ポリマーコンジュゲートを提供するステップと、
ｄ．少なくとも第２及び第３の反応基を有する第２のリンカーを提供するステップと、
ｅ．第２のリンカーの第２及び第３の反応基の一方を開始剤−ポリマーコンジュゲートの第１のリンカーのアミン基にカップリングして、カップリングステップで使用されなかった１つ以上の反応基を有するリンカー−開始剤−ポリマーコンジュゲートを提供するステップと、
ｆ．１つ以上の機能性薬剤をリンカー−開始剤−ポリマー部分の未反応反応基の１つ以上にカップリングして、ポリマー−機能性薬剤コンジュゲートを提供するステップと
を有し得る。
【０２０３】
本発明に先立ち、開始剤分子又は物質は、機能性薬剤のカップリングを可能にし得る脱保護可能な官能基を含有しなければならなかった。保護されたマレイミドを有する開始剤の例を以下に示す。
【化５】
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【０２０４】
ポリマー合成後、保護されたマレイミドを熱で脱保護して、機能性薬剤のカップリングに使用し得るマレイミドの生成を可能にする。マレイミド及びポリマー開始部位の間にある化学物質の性質を変えようとする場合、完全に新規の開始剤を合成することが必要になる。
【０２０５】
開始剤を変更し、又は何らかの方法で変えるたびに、新規のスケールアップした合成手順を開発しなければならない。開始剤分子の性質の変更毎に、ポリマー合成に多様な影響がもたらされ得る。しかしながら、本発明においては、ポリマー合成後にコンジュゲーション基（例えばマレイミド）が付加される方法が提供される。これは、場合により「スナップオン戦略」又は「ユニバーサルポリマー戦略」と称されることもある。大規模なポリマー及びバイオコンジュゲートの創薬及び開発に、単一の開始剤部分を使用することができる。従って、スケールアップした最適なポリマー合成のための条件を開発することができる。次に、各種リンカー及び機能性コンジュゲーション化学物質を「スナップオン」することにより、かかるポリマーを各種の機能性薬剤に適合させることができる。
【０２０６】
例えば、より大型の機能性薬剤を抗体又は更にはＦａｂ断片などの本発明のポリマーとコンジュゲートすることが所望される場合、このポリマーに、より長いリンカー配列をスナップオンすることができる。対照的に、より小型の機能性薬剤は比較的短いリンカー配列を必要とし得る。
【０２０７】
これらの方法の好ましい実施形態において、開始剤は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２個のポリマー開始部位を有する。好ましくは、開始剤は、３、６又は９個のポリマー開始部位を有する。
【０２０８】
本発明のある態様において、第２のリンカーは、第２、第３、第４、第５、及び第６の反応基を有する。より好ましくは、第２のリンカーは第２及び第３の反応基のみを有する。
【０２０９】
本発明のある態様において、各ポリマーアームは約２０〜約２０００単量体単位を有する。好ましくは、各アームは約１００〜５００単量体単位又は約５００〜１０００単量体単位又は約１０００〜１５００単量体単位又は約１５００〜２０００単量体単位を有する。
【０２１０】
本発明のある態様において、ポリマー−機能性薬剤コンジュゲートのピーク分子量は約１００，０００〜１，５００，０００Ｄａである。好ましくは、ポリマー−機能性薬剤コンジュゲートのピーク分子量は、約２００，０００〜約３００，０００Ｄａ、約４００，０００〜約６００，０００Ｄａ又は約６５０，０００〜約８５０，０００Ｄａである。
【０２１１】
本発明の別の態様において、第１のリンカーは、好ましくは、アルキル、置換アルキル、アルキレン、アルコキシ、カルボキシアルキル、ハロアルキル、シクロアルキル、環状アルキルエーテル、アルケニル、アルケニレン、アルキニル、アルキニレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキレン、アリール、アリーレン、アリーレンオキシ、ヘテロアリール、アミノ、アミド又はそれらの任意の組み合わせである。より好ましくは、第１のリンカーは、式：
【化６】
2017526635.tif 000008
（式中、ｍは１〜１０である）を有する。より好ましくは、第１のリンカーは上記の式を有し、ｍは４である。
【０２１２】
本発明の更に他の態様において、開始剤は好ましくは、
【化７】
2017526635.tif 000009
【化８】
2017526635.tif 000010
及び
【化９】
2017526635.tif 000011
（式中、Ｘは、ＮＣＳ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩからなる群から選択される）からなる群から選択される構造を含む。より好ましくは、ＸはＢｒである。
【０２１３】
本発明の好ましい実施形態において、単量体は、
【化１０】
2017526635.tif 000012
（式中、Ｒ７はＨ又はＣ1〜6アルキルであり、及びｔは１〜６である）からなる群から選択される。
【０２１４】
より好ましくは、単量体は、２−（メタクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェート（ＨＥＭＡ−ＰＣ）及び２−（アクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェートからなる群から選択される。
【０２１５】
最も好ましくは、単量体は２−（メタクリロイルオキシエチル）−２’−（トリメチルアンモニウムエチル）ホスフェートである。
【０２１６】
第２のリンカー部分は好ましくは、構造
【化１１】
2017526635.tif 000013
（式中、Ｒ８は、
【化１２】
2017526635.tif 000014
及び
【化１３】
2017526635.tif 000015
からなる群から選択され、
且つＲ９は、
【化１４】
2017526635.tif 000016
（式中、ｐは１〜１２である）である）
を有する活性化エステルを含む。
【０２１７】
本発明のより好ましい実施形態において、ポリマーは９本のアームを有し、Ｒ２のｍは２〜４であり、Ｒ９は
【化１５】
2017526635.tif 000017
であり、及びｐは４〜１５である。更により好ましくは、ｍは４であり、及びｐは１２である。
【０２１８】
ポリマーがシステイン（又は他の指定された残基）を介してコンジュゲートされる場合、ポリマーは残基に直接連結されても、又は間接的に（例えば、介在する開始剤、及び／又はスペーサーなどを伴い）連結されてもよい。
【０２１９】
デュアルアンタゴニストは、薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物中に配合することができる。経口投与に適合した医薬組成物は、カプセルなどの個別の単位として、溶液、シロップ又は懸濁液として（水性又は非水性液体中；又は食用フォーム又はホイップとして；又はエマルションとして）提供され得る。錠剤又は硬ゼラチンカプセルに好適な賦形剤としては、ラクトース、トウモロコシデンプン又はその誘導体、ステアリン酸又はその塩が挙げられる。軟ゼラチンカプセルでの使用に好適な賦形剤としては、例えば、植物油、ワックス、脂肪、半固体、又は液体ポリオール類等が挙げられる。溶液及びシロップの調製については、使用し得る賦形剤として、例えば、水、ポリオール類及び糖類が挙げられる。懸濁液の調製については、油（例えば植物油）を使用して水中油型又は油中水型懸濁液が提供され得る。
【０２２０】
医薬組成物は経鼻投与に適合させることができ、その場合に賦形剤は固体であり、例えば２０〜５００ミクロンの範囲の粒径を有する粗末を含み、これは、嗅ぐようにして、即ち鼻の近くに保持した粉末容器から鼻道を介して急速吸入することによって投与される。賦形剤が液体の、鼻腔内スプレー又は点鼻液としての投与に好適な組成物としては、活性成分の水性又は油性溶液が挙げられる。吸入による投与に適合した医薬組成物としては、各種の定量加圧エアロゾル、ネブライザー又はインサフレーターを用いて生成し得る微粒子ダスト又はミストが挙げられる。
【０２２１】
非経口投与に適合した医薬組成物としては、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤及び製剤を意図するレシピエントの血液と略等張性にする溶質を含有し得る水性及び非水性滅菌注射溶液；並びに懸濁剤及び増粘剤を含み得る水性及び非水性滅菌懸濁液が挙げられる。注射用溶液に用いられ得る賦形剤としては、例えば、水、アルコール類、ポリオール類、グリセリン及び植物油が挙げられる。組成物は単位用量又は複数回用量容器、例えば密封したアンプル及びバイアルに提供することができ、使用直前に滅菌液体担体、例えば注射用水を添加するのみでよいフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存し得る。即時調合注射溶液及び懸濁液は、滅菌粉末、顆粒及び錠剤から調製し得る。医薬組成物は略等張性であってもよく、これは約２５０〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇ水の重量オスモル濃度を含意する。
【０２２２】
医薬組成物は、保存剤、可溶化剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、甘味料、着色料、臭気剤、塩（本発明の物質それ自体が薬学的に許容可能な塩の形態で提供されてもよい）、緩衝液、コーティング剤又は抗酸化剤を含有し得る。医薬組成物はまた、本発明の物質に加えて治療上活性な薬剤も含有し得る。本発明の医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤と併せて用いられ得る。かかる賦形剤としては、限定はされないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水（リン酸緩衝生理食塩水など）、デキストロース、リポソーム、水、グリセロール、エタノール及びそれらの組み合わせを挙げることができる。
【０２２３】
デュアルアンタゴニスト及びそれを含有する医薬組成物は、例えば、経口、硝子体内、静脈内、皮下、筋肉内、骨内、鼻腔内、局所、腹腔内、及び病変内投与による投与を含め、患者の疾患の治療又は予防に有効なレジームで投与され得る。非経口注入には、特に、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与又は経路が含まれる。療法において又は予防として、活性薬剤は、好ましくは等張性又は略等張性の、注射用組成物、例えば滅菌水性分散液として個体に投与され得る。
【０２２４】
哺乳動物、特にヒトへの投与については、活性薬剤の投薬量は０．０１ｍｇ／ｋｇ体重、典型的には約１ｍｇ／ｋｇからであることが予想される。医師は、個体の年齢、体重、性別及び反応、治療下の疾患又は障害並びに治療下の個体の年齢及び状態を含む諸要因に応じた個体に最も好適な実際の投薬量を決定することができる。上記の投薬量は平均的なケースの例である。当然ながら、より高い又はより低い投薬量が有利となる場合もあり得る。
【０２２５】
この投薬量は、必要に応じた頻度で（例えば、毎週、隔週、毎月、３ヵ月毎に）繰り返され得る。副作用が生じた場合、通常の臨床診療に従い投薬の量及び／又は頻度を減らすことができる。一実施形態において、医薬組成物は１〜３０日に１回投与され得る。
【０２２６】
本発明のデュアルアンタゴニスト及び医薬組成物は、単独で、又は他の化合物、例えば治療化合物又は分子、例えば抗炎症薬、鎮痛薬又は抗生物質と併せて用いることができる。他の化合物と合わせたかかる投与は、同時、別々又は逐次的であり得る。成分は、必要に応じて説明書を含み得るキットの形態で調製されてもよい。
【０２２７】
本明細書に開示されるデュアルアンタゴニスト及び医薬組成物は、疾患の治療又は予防、特に本明細書に記載される眼疾患又は眼病態に使用することができる。上記で考察し、及び実施例４０に示すとおり、デュアルアンタゴニスト内の両方のアンタゴニストモダリティが有効性に寄与すると考えられるが、本発明を実施するために機構を理解する必要はない。好ましくは、デュアルアンタゴニストは、単独で投与される等モル濃度の各アンタゴニスト、又は別個の分子として投与されるこれらのアンタゴニストの１：１の組み合わせと比べて有効性が高い。
【０２２８】
このように使用されるとき、コンジュゲートは、典型的には、眼、眼内、及び／又は硝子体内注射、及び／又は強膜近傍注射、及び／又は網膜下注射及び／又はテノン嚢下注射、及び／又は脈絡膜上注射及び／又は点眼薬及び／又は軟膏の形態の局所投与用に製剤化され、且つそれによって投与される。かかるデュアルアンタゴニスト及び組成物は、Ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｊａｆｆｅ，Ａｓｈｔｏｎ，ａｎｄ  Ｐｅａｒｓｏｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ（Ｍａｒｃｈ  ２００６）などの文献に記載されるものを含め、種々の方法によって、例えば硝子体内への化合物の徐放を可能にする器具及び／又はデポーとして硝子体内に送達することができる。一例において、器具は、化合物を長時間放出するミニポンプ及び／又はマトリックス及び／又は受動拡散システム及び／又はカプセル化細胞の形態であってもよい（Ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｊａｆｆｅ，Ａｓｈｔｏｎ，ａｎｄ  Ｐｅａｒｓｏｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ（Ｍａｒｃｈ  ２００６）。
【０２２９】
眼、眼内又は硝子体内投与用の製剤は、当該技術分野において公知の方法及び成分の使用によって調製することができる。効率的な治療のための主な要件は、眼からの適切な浸透である。薬物を局所送達し得る眼の前部の疾患と異なり、網膜疾患では、より部位特異的な手法が必要である。点眼薬及び軟膏はほとんど眼の裏側に浸透せず、血液眼関門が全身投与された薬物の眼組織への浸透を妨げる。従って、通常、ＡＭＤ及びＣＮＶなどの網膜疾患の治療に選択される薬物送達方法は、直接的な硝子体内注射である。硝子体内注射は、通常、患者の状態、並びに送達される薬物の特性及び半減期に応じた間隔を置いて繰り返される。
【０２３０】
本発明に係る治療的デュアルアゴニスト及び関連するコンジュゲートは、概して、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針によって穿刺可能な栓を有する静脈内注射液バッグ又はバイアルに入れられる。かかる組成物はまた、プレフィルドシリンジの形態で供給されてもよい。
【０２３１】
「安定」製剤は、その中のタンパク質又は他の半減期延長部分のポリマーにコンジュゲートしたタンパク質が保存時にその物理的安定性及び／又は化学的安定性及び／又は生物学的活性を本質的に保持しているものである。「安定」とは、凝集及び／又はアミド分解を含めた不安定性の徴候をほとんど又は全く呈しない製剤も意味する。例えば、本発明のある態様において、本発明によって提供される製剤は、指示されるとおり５〜８℃の温度で保存したとき、少なくとも２年間安定したままであり得る。
【０２３２】
タンパク質の安定性を計測するための様々な分析技法が当該技術分野で利用可能であり、例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２４７−３０１（Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｌｅｅ  ｅｄ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９９１）及びＪｏｎｅｓ，１９９３  Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．１０：２９−９０にレビューされている。安定性は、選択した温度で選択した時間にわたって計測することができる。安定製剤の保存は、好ましくは少なくとも６ヵ月間、より好ましくは１２ヵ月間、より好ましくは１２〜１８ヵ月間、より好ましくは２年以上である。
【０２３３】
抗体又はその断片などのタンパク質は、色及び／又は澄明性の目視検査時、又は紫外光散乱又はサイズ排除クロマトグラフィーによって計測するとき、それが凝集、沈殿、アミド分解及び／又は変性の徴候を示さない場合、医薬製剤中において「その物理的安定性を保持している」。
【０２３４】
タンパク質は、所与の時点において、タンパク質がその生物学的活性をなおも保持していると考えられるような化学的安定性である場合、医薬製剤中において「その化学的安定性を保持している」。化学的安定性は、化学的に変化した形態のタンパク質を検出し及び定量化することによって評価し得る。化学的変化には、サイズの改変（例えば、クリッピング）が含まれてもよく、これは、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び／又はマトリックス支援レーザー脱離イオン化／飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ  ＭＳ）を用いて判定することができる。他のタイプの化学的変化としては荷電変化（例えば、アミド分解の結果として起こる）が挙げられ、これは、例えば、イオン交換クロマトグラフィーによって判定することができる。抗体は、所与の時点における抗体の生物学的活性が、例えば、抗原結合アッセイで決定するときに、医薬製剤が調製された時点で呈した生物学的活性の約１０％以内（アッセイ誤差の範囲内）である場合、医薬製剤中において「その生物学的活性を保持している」。
【０２３５】
タンパク質−ポリマーコンジュゲートは、「その化学的安定性を保持している」、タンパク質とポリマーとの間の化学結合がインタクトに維持されている、例えば、それが加水分解されたり、又は他の形で破壊されたりしていない。コンジュゲートのタンパク質部分は、上記に記載したとおりその化学的安定性を保持している。
【０２３６】
「等張性」とは、目的の製剤が本質的にヒト血液又は硝子体内注射される硝子体と同じ浸透圧を有することを意味する。等張性製剤は、概して、約２５０〜４００ｍＯｓｍの浸透圧を有することになる。等張性は、例えば、蒸気圧型又は氷冷型浸透圧計を使用して計測することができる。
【０２３７】
本明細書で使用されるとき、「緩衝液」は、その酸塩基コンジュゲート成分の作用によってｐＨの変化に抵抗する緩衝液を指す。この発明の緩衝液は、好ましくは約３．０〜約８．０；例えば約４．５〜８；又は約ｐＨ６〜約７．５；又は約６．０〜約７．０、又は約６．５〜７．０、又は約ｐＨ７．０〜約７．５；又は約７．１〜約７．４の範囲のｐＨを有する。上記の範囲の間にある任意の点のｐＨも企図される。
【０２３８】
「ＰＢＳ」リン酸緩衝生理食塩水、トリス系緩衝液及びヒスチジン系緩衝液が、本発明のデュアルアンタゴニストに特に好ましい緩衝液である。ＯＧ１４４８の場合、ＰＢＳが特に好ましい。より好ましくは、ＯＧ１４４８の場合、ＰＢＳ緩衝液が７〜８のｐＨを有し、且つＯＧ１４４８の濃度が約１０ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌである。更により好ましくは、ＯＧ１４４８は約２５〜約６５ｍｇ／ｍｌであり、且つｐＨは約７．４である。本発明の最も好ましい実施形態では、ＯＧ１４４８の濃度は５０ｍｇ／ｍｌ〜６０ｍｇ／ｍｌである。
【０２３９】
本発明の好ましい実施形態において、ＰＢＳ緩衝液は、適切なｐＨをもたらすように調整された、少なくともＮａ2ＨＰＯ4、ＫＨ2ＰＯ4及びＮａＣｌで構成される。本発明の特に好ましい実施形態において、緩衝液は、安定保存溶液を提供するため、ＫＣｌ及び他の塩、界面活性剤及び／又は保存剤などの他の医薬賦形剤を含有し得る。
【０２４０】
「保存剤」は、本質的にその中の細菌作用を低減し、従って例えばマルチユース製剤の生産を促進するため製剤中に含めることのできる化合物である。可能性のある保存剤の例としては、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム（アルキル基が長鎖化合物であるアルキルベンジルジメチルアンモニウムクロリド混合物）、及び塩化ベンゼトニウムが挙げられる。他のタイプの保存剤としては、芳香族アルコール類、例えば、フェノール、ブチル及びベンジルアルコール、アルキルパラベン類、例えば、メチル又はプロピルパラベン、カテコール、レソルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、及びｍ−クレゾールが挙げられる。
【０２４１】
本発明のある態様において、ヒトへの使用又は動物試験向けに安全である本発明に係るデュアルＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアンタゴニストの製剤は、エンドトキシンレベルが十分に低くなければならない。「エンドトキシン」は、グラム陰性菌の細胞膜に由来するリポ多糖（ＬＰＳ）である。エンドトキシンは、疎水性脂質部分（リピドＡ）に共有結合的に連結した親水性多糖部分で構成される。Ｒａｅｔｚ  ＣＲ，Ｕｌｅｖｉｔｃｈ  ＲＪ，Ｗｒｉｇｈｔ  ＳＤ，Ｓｉｂｌｅｙ  ＣＨ，Ｄｉｎｇ  Ａ，Ｎａｔｈａｎ  ＣＦ．１９９１．Ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ：ａｎ  ｅｘｔｒａｏｒｄｉｎａｒｙ  ｌｉｐｉｄ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｆｏｕｎｄ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ．ＦＡＳＥＢ  Ｊ．５（１２）：２６５２−２６６０。リピドＡは、エンドトキシンの生物学的活性、即ちその毒性のほとんどに関与する。エンドトキシンは細菌細胞の死滅時並びに成長及び分裂中に大量にシェディングされる。エンドトキシンは高度な熱安定性を有し、通常の滅菌条件下では破壊されない。極端な熱又はｐＨによる処理、例えば１８０〜２５０℃及び０．１Ｍの酸又は塩基などを用いる必要がある（Ｐｅｔｓｃｈ  Ｄ，Ａｎｓｐａｃｈ  Ｆ．２０００．Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  ｒｅｍｏｖａｌ  ｆｒｏｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７６：９７−１１９）。当然ながら、かかる条件は生物学的薬物に極めて有害であり得る。
【０２４２】
バイオテクノロジー及び製薬産業では、生産工程及び最終産物の両方でエンドトキシンが見出される可能性がある。細菌は、水、生理食塩水及び緩衝液を含めた低栄養培地で成長することができるため、予防措置を講じなければエンドトキシンが蔓延する。動物又はヒトへのエンドトキシン注射は、内毒素性ショック、組織傷害及び更には死亡を含めた、広範囲にわたる病態生理学的効果を引き起こす。Ｏｇｉｋｕｂｏ  Ｙ，Ｏｇｉｋｕｂｏ  Ｙ，Ｎｏｒｉｍａｔｓｕ  Ｍ，Ｎｏｄａ  Ｋ，Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｊ，Ｉｎｏｔｓｕｍｅ  Ｍ，Ｔｓｕｃｈｉｙａ  Ｍ，Ｔａｍｕｒａ  Ｙ．２００４．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  ｔｅｓｔ  ｆｏｒ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ３２：８８−９３。
【０２４３】
哺乳動物においては、低濃度（１ｎｇ／ｍＬ）のエンドトキシンの静脈内注射時に発熱反応及びショックが誘発される（Ｆｉｓｋｅ  ＪＭ，Ｒｏｓｓ  Ａ，ＶａｎＤｅｒＭｅｉｄ  ＲＫ，ＭｃＭｉｃｈａｅｌ  ＪＣ，Ａｒｕｍｕｇｈａｍ．２００１．Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  ｉｎ  Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ  ＵｓｐＡ２  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ．Ｊ  Ｃｈｒｏｍ  Ｂ．７５３：２６９−２７８）。医薬製剤及び生物学的製剤の静脈内適用に対する最大エンドトキシンレベルは、全ての薬局方によって体重１ｋｇ当たり毎時５エンドトキシン単位（ＥＵ）に設定されている（Ｄａｎｅｓｈｉａｍ  Ｍ，Ｇｕｅｎｔｈｅｒ  Ａ，Ｗｅｎｄｅｌ  Ａ，Ｈａｒｔｕｎｇ  Ｔ，Ｖｏｎ  Ａｕｌｏｃｋ  Ｓ．２００６．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｐｙｒｏｇｅｎ  ｔｅｓｔ  ｆｏｒ  ｔｏｘｉｃ  ｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  ｄｒｕｇｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  ３１３：１６９−１７５）。ＥＵは、エンドトキシンの生物学的活性の尺度である。例えば、１００ｐｇの標準エンドトキシンＥＣ−５及び１２０ｐｇの大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｏ１１１：Ｂ４由来エンドトキシンは１ＥＵの活性を有する（Ｈｉｒａｙａｍａ  Ｃ，Ｓａｋａｔａ  Ｍ．２００２．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  ｒｅｍｏｖａｌ  ｏｆ  ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  ｆｒｏｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ｂｙ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｊ  Ｃｈｒｏｍ  Ｂ  ７８１：４１９−４３２）。生物学研究及び製薬産業では、この閾値レベルを満たすことが常に課題となっている（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｗ，Ｗａｌｔｅｒ  Ｊ．１９９４．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ２２：１３５−１５０；Ｐｅｔｓｃｈ  Ｄ，Ａｎｓｐａｃｈ  ＦＢ．２０００．Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  ｒｅｍｏｖａｌ  ｆｒｏｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ７６：９７−１１９）。
【０２４４】
硝子体内注射によって送達される薬物中のエンドトキシンの存在は、特に懸念される。薬物（ペニシリン）の硝子体内注射は、１９４５年にＲｙｃｒｏｆｔによって初めて実施された。Ｒｙｃｒｏｆｔ  ＢＷ．１９４５．Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｄｅｅｐ  ｉｎｔｒａ−ｏｃｕｌａｒ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  ２９（２）：５７−８７。硝子体は、高いレベルの薬物を導入して比較的長時間にわたり維持することのできる腔である。硝子体内注射によって達成し得る薬物の濃度は、局所投与又は全身投与（例えば静脈内）によって生じさせることのできる濃度をはるかに超えている。
【０２４５】
硝子体内注射によって起こる可能性のある最も危険な合併症の１つは、眼内炎である。眼内炎は２つのクラス、即ち感染性と無菌性とに分類される。感染性眼内炎は、概して、細菌、真菌又は寄生虫によって引き起こされる。感染性眼内炎の症状には、激痛、視力低下、並びに結膜及び下層の上強膜の発赤が含まれる。感染性眼内炎は緊急の診断及び治療が必要である。可能な治療としては、抗生物質の硝子体内注射及び場合によっては経毛様体扁平部硝子体切除術が挙げられる。痛みを伴う失明した眼を取り除くため、眼球摘出が要求されることもある。例えば、Ｃｈｒｉｓｔｙ  ＮＥ，Ｓｏｍｍｅｒ  Ａ．１９７９．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ  ｏｆ  ｐｏｓｔｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｅｎｄｏｐｈｔｈａｌｍｉｔｉｓ．Ａｎｎ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  １１（８）：１２６１−１２６５を参照されたい。
【０２４６】
対照的に無菌性眼内炎は感染病原体が関与せず、硝子体内抗生物質及び／又は硝子体網膜手術の必要なしに解消する硝子体腔の急性眼内炎として定義することができる。硝子体の微生物学的試験が行われている場合、無菌性眼内炎の診断を支持するためには、陰性が培養で証明されなくてはならない。Ｍａｒｔｉｃｏｒｅｎａ  Ｊ，Ｒｏｍａｎｏ  Ｖ，Ｇｏｍｅｚ−Ｕｌｌａ  Ｆ．２０１２  Ｓｔｅｒｉｌｅ  Ｅｎｄｏｐｈｔｈａｌｍｉｔｉｓ  ａｆｔｅｒ  Ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ  Ｍｅｄ  Ｉｎｆｌａｍ．９２８１２３。
【０２４７】
エンドトキシンで汚染された生物学的薬物の硝子体内注射は無菌性眼内炎をもたらし得ることが観察されている。Ｍａｒｔｉｃｏｒｅｎａ，ｅｔ  ａｌ．。ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）は、食品医薬品局（Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）によって膠芽腫並びに転移性結腸直腸癌、進行非扁平上皮非小細胞肺癌及び転移性腎癌の治療用に承認されている。ベバシズマブはまた、湿潤型ＡＭＤの治療としても広く適応外使用されている。ベバシズマブは製造者によって１００ｍｇ／４ｍｌとして供給される。この溶液を硝子体内注射に直接使用することはできず、薬剤師が調合しなければならない。無菌性眼内炎のクラスターが観察されており、調合薬剤師によるベバシズマブの不注意なエンドトキシン汚染によって引き起こされることが理論付けられている。
【０２４８】
エンドトキシンの硝子体内注射の危険な臨床結果を考えると、硝子体内投与によって患者が受けることのできるエンドトキシンの総量は極めて限られている。本発明のある態様において、エンドトキシンレベルが５．０ＥＵ／ｍｌを超えない本発明に係るデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニストを有する溶液が提供される。より好ましくは、エンドトキシンレベルは１．０ＥＵ／ｍｌを超えない。更により好ましくは、エンドトキシンレベルは０．５ＥＵ／ｍｌを超えない。更により好ましくは、エンドトキシンレベルは０．２ＥＵ／ｍｌを超えない。更により好ましい実施形態において、エンドトキシンレベルは、０．１、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２又は０．０１ＥＵ／ｍｌを超えない。
【０２４９】
エンドトキシンの存在に関して一般的に用いられているＦＤＡ承認済みの２つの試験は、ウサギ発熱物質試験及びリムルス変形細胞溶解物（ＬＡＬ）アッセイである（Ｈｏｆｆｍａｎ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．２００５．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｐｙｒｏｇｅｎ  ｔｅｓｔｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２９８：１６１−１７３；Ｄｉｎｇ  ＪＬ，Ｈｏ  ＢＡ．２００１．Ｎｅｗ  ｅｒａ  ｉｎ  ｐｙｒｏｇｅｎ  ｔｅｓｔｉｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：２７７−２８１）。ウサギ発熱物質試験は１９２０年代に開発されたもので、試液を注射したウサギの体温上昇をモニタすることを含む。しかしながら、ウサギ発熱物質試験の使用は、費用及び長いターンアラウンド時間に起因して、ここ何年も大幅に減少している。ＬＡＬ試験の方がはるかに一般的である。ＬＡＬはカブトガニの血液に由来し、エンドトキシンへの曝露時に凝固する。
【０２５０】
最も単純なＬＡＬアッセイの１つは、ＬＡＬゲル凝固アッセイである。本質的に、ＬＡＬ凝固アッセイは対象試料の段階希釈物と組み合わせる。ゲルの形成は試料中のエンドトキシン量に比例する。試料から段階希釈物を調製し、ＬＡＬゲルを形成するその能力について各希釈物をアッセイする。ある時点で陰性反応が含まれる。この希釈アッセイから、元の試料中のエンドトキシン量を推定することができる。
【０２５１】
比濁ＬＡＬアッセイ（Ｏｎｇ  ＫＧ，Ｌｅｌａｎ  ＪＭ，Ｚｅｎｇ  ＫＦ，Ｂａｒｒｅｔｔ  Ｇ，Ａｏｕｒｏｂ  Ｍ，Ｇｒｉｍｅｓ  ＣＡ．２００６．Ａ  ｒａｐｉｄ  ｈｉｇｈｌｙ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  ２１：２２７０−２２７４）及び発色ＬＡＬアッセイ（Ｈａｉｓｈｉｍａ  Ｙ，Ｈａｓｅｇａｗａ  Ｃ，Ｙａｇａｍｉ  Ｔ，Ｔｓｕｃｈｉｙａ  Ｔ，Ｍａｔｓｕｄａ  Ｒ，Ｈａｙａｓｈｉ  Ｙ．２００３．Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｃｅｒｔａｉｎｔｙ  ｉｎ  ｋｉｎｅｔｉｃ−ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓ．Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ．３２：４９５−５０３）を含め、他のＬＡＬ試験も開発されている。比濁及び発色アッセイは、単純ゲル凝固希釈アッセイと比べてはるかに高感度且つ定量的である。
【０２５２】
本発明は、デュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニストを有する組成物中のエンドトキシン量を低減する方法を提供し、この方法は、デュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニストに結合するアフィニティークロマトグラフィー樹脂に組成物を接触させるステップと；アフィニティークロマトグラフィー樹脂からデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニストを溶出させて、アンタゴニストを有するアフィニティークロマトグラフィー溶出液を形成するステップと；デュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニストと結合するイオン交換樹脂にアフィニティークロマトグラフィー溶出液を接触させるステップと；イオン交換樹脂からデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニストを溶出させるステップとを有し、ここでイオン交換樹脂から溶出したデュアルＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニストは、実質的にエンドトキシンを含まない。
【０２５３】
エンドトキシン量を低減するための上記の方法、又は本明細書に記載される他の方法又はプロセスは、上記のステップに記載される順序で実施してもよく、又は任意選択で、ステップの順序を変えて、又は更にはステップの１つ以上を繰り返すことにより実施してもよい。一実施形態において、組成物中のエンドトキシン量を低減する方法は、記載されるステップの順序で実施される。一部の実施形態において、アフィニティークロマトグラフィー樹脂の接触、洗浄及び溶出ステップは、アフィニティークロマトグラフィー溶出液をイオン交換樹脂に接触させる前に、同じ順序で２回以上繰り返される。この方法はまた、例えば、０．１ミクロン、０．２２ミクロン、又は０．４４ミクロンフィルタを使用したろ過ステップを含んでもよく、これは、各樹脂結合ステップの後に取り出される溶出液のいずれか１つ以上で実施することができる。
【０２５４】
場合によっては、組成物をアフィニティークロマトグラフィー樹脂に接触させるステップ、洗浄するステップ及びアフィニティークロマトグラフィー樹脂から抗体を溶出させるステップは、第１の溶出液をイオン交換樹脂に接触させる前に、２回以上繰り返すことができる。一実施形態において、アフィニティークロマトグラフィー樹脂は組換えプロテインＡ（「ｒＰｒｏｔｅｉｎＡ」）樹脂を含む。好適な組換えプロテインＡ樹脂の一例は、ｒＰｒｏｔｅｉｎＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（登録商標）樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）である。別の実施形態において、好適なアフィニティークロマトグラフィー樹脂はプロテインＧクロマトグラフィー樹脂を含み得る。他の実施形態において、好適なアフィニティークロマトグラフィー樹脂は混合プロテインＡ／プロテインＧ樹脂を含む。他の実施形態において、好適なアフィニティークロマトグラフィー樹脂は、ＭＥＰ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ（登録商標）樹脂（ＢｉｏＳｅｐｒａ、Ｃｅｒｇｙ、Ｓａｉｎｔ  Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅ、フランス）などの４−メルカプトエチルピリジンリガンドを含む疎水性電荷誘導樹脂を含む。
【０２５５】
一部の実施形態において、イオン交換樹脂は陰イオン交換樹脂を含むことが好ましい。当業者に公知であろうとおり、イオン交換体は、マトリックス並びに結合した荷電基に関して様々な材料に基づき得る。例えば、以下のマトリックスを使用してもよく、ここで挙げる材料は、多かれ少なかれ架橋していてもよい：ＭａｃｒｏＣａｐ  Ｑ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、アガロース系（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−６Ｂ（登録商標）、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（登録商標）及びＳｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（登録商標）など）、セルロース系（ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｃｅｌ（登録商標）など）、デキストラン系（Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）など）、シリカ系及び合成高分子系。陰イオン交換樹脂については、マトリックスに共有結合的に結合している荷電基は、例えば、ジエチルアミノエチル、第四級アミノエチル、及び／又は第四級アンモニウムであってもよい。陰イオン交換樹脂は第四級アミン基を含むことが好ましい。抗Ｍ−ＣＳＦ抗体との結合用の第四級アミン基を有する例示的な陰イオン交換樹脂は、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）である。
【０２５６】
他の態様において、組成物を前述の陰イオン交換クロマトグラフィーステップに供した後にエンドトキシンレベルが目標値より高い場合、代わりに組成物を陽イオン交換樹脂に供し得る。本発明のこの態様によると、組成物中の任意のエンドトキシンが対象のタンパク質と比べてイオン交換樹脂に対して結合の差を有しなければならず、それによりエンドトキシンからのタンパク質の精製が可能となる。この点で、エンドトキシンは負電荷であり、概して陰イオン交換樹脂に結合することになる。タンパク質及びエンドトキシンの両方が陰イオン交換樹脂に結合する場合、一方からの他方の精製は、塩勾配を用いてこれら２つを異なる画分中に溶出させることにより達成し得る。特定の樹脂に対するタンパク質の相対的結合はまた、タンパク質のｐＩに対する緩衝液のｐＨを変化させることによっても達成し得る。本発明の好ましい態様では、陽イオン交換クロマトグラフィーが、用いられる唯一のイオン交換クロマトグラフィーである。
【０２５７】
本発明の別の態様において、陰イオン交換樹脂後にエンドトキシンレベルが高過ぎる場合、組成物を更に、例えば組成物を陽イオン交換樹脂に接触させることによる第２のイオン交換ステップに供し、続いて洗浄ステップ、次にイオン交換樹脂からの溶出に供し得る。好ましい実施形態において、陽イオン交換樹脂は結合用にスルホン酸基を含む。例示的な陽イオン交換樹脂は、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）樹脂ＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）、Ｐｏｒｏｓ  ＸＳ（ＣＥＸ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）である。
【０２５８】
本発明の態様によると、指定されたレベルのエンドトキシンを有するデュアルＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアンタゴニストタンパク質の溶液が生じた後、タンパク質を最終的に製剤化する前に幾つものステップがある。本発明の一部の実施形態では、タンパク質に半減期延長部分がコンジュゲートされる。次にこのコンジュゲートが、患者に注射される最終的な薬物製剤に製剤化される。一部の実施形態において、コンジュゲートは再びイオン交換樹脂（好ましくは陽イオン交換樹脂であり得る）で精製される。他の実施形態では、タンパク質が製剤化される。いずれの場合にも、タンパク質試料又はタンパク質−ポリマーコンジュゲートへのエンドトキシン汚染の混入を防止するため、通常の実験手順を用いなければならない。
【実施例】
【０２５９】
実施例１．ＰＤＧＦＲβ−ＧＳ１０−抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖／抗ＶＥＧＦ−Ａ重鎖（野生型Ｆｃ）のタンパク質配列
以下の図７Ａ、図７Ｂに示す配列を有するＰＤＧＦＲ−βトラップ−抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖／抗ＶＥＧＦ−Ａ重鎖を構築した。ＰＤＧＦＲ−ＧＳ１０−抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖アミノ酸１〜２８２はヒトＰＤＧＦＲ−β（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ０９６１９．１）の３３〜３１４に対応し、その後にリンカー配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ及びベバシズマブ軽鎖配列が続く。任意選択で、ＰＤＧＦＲ−βセグメントと抗ＶＥＧＦセグメントとの間にリンカーは使用しなくてもよい。或いはリンカーは、これらの２つのタンパク質の活性が最適となるような、ＧＧＧＧＳモチーフ×１、×２（上述のとおり）、×３、×４等であってもよい。Ｇ、ＧＧ、ＧＧＧＳ及びＧＧＧＥＳ×１、×２、×３、×４等を含め、当業者に公知の他のリンカーモチーフも本発明において使用し得る。リンカーは上記の組み合わせであってもよい。図７Ａの配列は配列番号１９に示す。図７Ｂはベバシズマブ重鎖配列（配列番号２）を示す。ベバシズマブ軽鎖は、任意選択で、Ｍ４Ｌ突然変異（Ｋａｂａｔ付番）を有する。ベバシズマブ重鎖は、任意選択で、以下の突然変異：Ｔ２８Ｄ、Ｎ３１Ｈ、Ｈ９７Ｙ、Ｓ１００ａＴ（Ｋａｂａｔ付番）、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｑ３４７Ｃ及びＬ４４３Ｃ  ＥＵ付番）の１つ以上を有する。
【０２６０】
実施例２．ＰＤＧＦＲβ−ＧＧ−抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖／抗ＶＥＧＦ−Ａ重鎖（野生型Ｆｃ）のタンパク質配列
以下の図８Ａ、図８Ｂに示す配列を有する別のＰＤＧＦＲ−βトラップ−抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖／抗ＶＥＧＦ−Ａ重鎖を構築した。図８Ａのアミノ酸１〜２８２はヒトＰＤＧＦＲ−β（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ０９６１９．１）の３３〜３１４に対応し、その後にリンカー配列ＧＧ及びベバシズマブ軽鎖配列が続く。或いはリンカーは、これらの２つのタンパク質の活性が最適となるような、ＧＧＧＧＳモチーフ×１、×２、×３、×４等であってもよい。Ｇ、ＧＧ（上述のとおり）、ＧＧＧＳ及びＧＧＧＥＳ×１、×２、×３、×４等を含め、他のリンカーモチーフも本発明において使用し得る。リンカーは上記の組み合わせであってもよい。図８Ａのタンパク質配列は配列番号３に示す。図８Ｂはベバシズマブ重鎖配列（配列番号２）を示す。図８Ａのベバシズマブ軽鎖は、任意選択で、Ｍ４Ｌ突然変異を有する。ベバシズマブ重鎖は、任意選択で、以下の突然変異：Ｔ２８Ｄ、Ｎ３１Ｈ、Ｈ９７Ｙ、Ｓ１００ａＴ（Ｋａｂａｔ付番）、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｑ３４７Ｃ及びＬ４４３Ｃ（ＥＵ付番）の１つ以上を有する。
【０２６１】
実施例３．ＰＤＧＦＲβ−ＧＳ１０−抗ＶＥＧＦ−Ａ重鎖（野生型Ｆｃ）／抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖のタンパク質配列
図９Ａ、図９Ｂに示す配列を有する別のＰＤＧＦＲ−βトラップ−抗ＶＥＧＦ−Ａ重鎖（野生型Ｆｃ）／抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖を構築した。図９Ａのアミノ酸１〜２８２はヒトＰＤＧＦＲ−β（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ０９６１９．１）の３３〜３１４に対応し、その後にリンカー配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、及び任意選択でＱ３４７Ｃ又はＬ４４３Ｃ（ＥＵ付番）を有するベバシズマブ重鎖配列が続く。或いはリンカーは、これらの２つのタンパク質の活性が最適となるような、ＧＧＧＧＳモチーフ×１、×２（上述のとおり）、×３、×４等であってもよい。Ｇ、ＧＧ、ＧＧＧＳ及びＧＧＧＥＳ×１、×２、×３、×４等を含め、他のリンカーモチーフも本発明において使用し得る。リンカーは上記の組み合わせであってもよい。図９Ａのタンパク質配列は配列番号４に示す。図９Ｂのタンパク質はベバシズマブ軽鎖配列（配列番号５）である。ベバシズマブ軽鎖は、任意選択で、Ｍ４Ｌ突然変異を有する。ベバシズマブ重鎖は、任意選択で、以下の突然変異：Ｔ２８Ｄ、Ｎ３１Ｈ、Ｈ９７Ｙ、Ｓ１００ａＴ（Ｋａｂａｔ付番）、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｑ３４７Ｃ及びＬ４４３Ｃ（ＥＵ付番）の１つ以上を有する。
【０２６２】
実施例４．ＰＤＧＦＲβ−ＧＧ−抗ＶＥＧＦ−Ａ重鎖（野生型Ｆｃ）／抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖のタンパク質配列
以下の図１０Ａ、図１０Ｂに示す配列を有する別のＰＤＧＦＲ−βトラップ−抗ＶＥＧＦ−Ａ重鎖（野生型Ｆｃ）／抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖を構築した。図１０Ａのアミノ酸１〜２８２はヒトＰＤＧＦＲ−β（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ０９６１９．１）の３３〜３１４に対応し、その後にリンカー配列ＧＧ、及び任意選択でＱ３４７Ｃ又はＬ４４３Ｃを有するベバシズマブ重鎖配列が続く。或いはリンカーは、これらの２つのタンパク質の活性が最適となるような、ＧＧＧＧＳモチーフ×１、×２、×３、×４等であってもよい。Ｇ、ＧＧ（上述のとおり）、ＧＧＧＳ及びＧＧＧＥＳ×１、×２、×３、×４等を含め、他のリンカーモチーフも本発明において使用し得る。リンカーは上記の組み合わせであってもよい。図１０Ａのタンパク質配列は配列番号６に示す。図１０Ｂのタンパク質はベバシズマブ軽鎖配列（配列番号５）である。ベバシズマブ軽鎖は、任意選択で、Ｍ４Ｌ突然変異を有する。ベバシズマブ重鎖は、任意選択で、以下の突然変異：Ｔ２８Ｄ、Ｎ３１Ｈ、Ｈ９７Ｙ、Ｓ１００ａＴ（Ｋａｂａｔ付番）、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｑ３４７Ｃ及びＬ４４３Ｃ（ＥＵ付番）の１つ以上を有する。
【０２６３】
実施例５．抗ＶＥＧＦ−Ａ重鎖（野生型Ｆｃ）−ＧＳ２１−ＰＤＧＦＲβ／抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖のタンパク質配列
以下の図１１Ａ、図１１Ｂに示す配列を有する、抗ＶＥＧＦ−Ａ重鎖がＰＤＧＦＲ−βトラップの上流又はＮ末端側にあるＰＤＧＦＲ−βトラップ−抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体コンストラクトを構築した。図１１Ａのアミノ酸１〜４５１は、任意選択でＱ３４７Ｃ又はＬ４４３Ｃを有するベバシズマブ重鎖配列に対応し、その後にリンカー配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧが続く。或いはリンカーは、これらの２つのタンパク質の活性が最適となるような、ＧＧＧＧＳモチーフ×１、×２（上述のとおり）、×３、×４等であってもよい。Ｇ、ＧＧ、ＧＧＧＳ及びＧＧＧＥＳ×１、×２、×３、×４等を含め、他のリンカーモチーフも本発明において使用される。リンカーは上記の組み合わせであってもよい。リンカーの後ろには、ヒトＰＤＧＦＲ−β（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ０９６１９．１）のアミノ酸配列３３〜３１４が続く。図１１Ａのタンパク質配列は配列番号７に示す。図１１Ｂはベバシズマブ軽鎖配列（配列番号５）を示す。ベバシズマブ軽鎖は、任意選択で、Ｍ４Ｌ突然変異を有する。ベバシズマブ重鎖は、任意選択で、以下の突然変異：Ｔ２８Ｄ、Ｎ３１Ｈ、Ｈ９７Ｙ、Ｓ１００ａＴ（Ｋａｂａｔ付番）、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｑ３４７Ｃ及びＬ４４３Ｃ（ＥＵ付番）の１つ以上を有する。
【０２６４】
実施例６．ＰＤＧＦＲβ−ＧＳ１０−抗ＶＥＧＦ−Ａ重鎖（Ｑ３４７Ｃ）／抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖（ＴＡＦ３４７）のタンパク質配列
以下の図１２Ａ、図１２Ｂに示す配列を有する別のＰＤＧＦＲ−βトラップ−抗ＶＥＧＦ−Ａ重鎖（Ｑ３４７Ｃ）／抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖を構築した。図１２Ａのアミノ酸１〜２８２はヒトＰＤＧＦＲ−β（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ０９６１９．１）の３３〜３１４に対応する。ＰＤＧＦＲ配列の後には、１０アミノ酸リンカーＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳが直ちに続く。任意選択で、ＰＤＧＦＲ−βセグメントと抗ＶＥＧＦセグメントとの間にリンカーは使用しなくてもよい。リンカーは上記の組み合わせであってもよい。リンカーのセリン残基のカルボキシル末端には、以下のアミノ酸：Ｔ２８Ｄ、Ｎ３１Ｈ、Ｈ９７Ｙ、Ｓ１００ａＴ（Ｋａｂａｔ付番）、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ及びＱ３４７Ｃ（ＥＵ付番）を含むベバシズマブ重鎖が結合している。図１２Ａのタンパク質配列は配列番号８に示す。図１２Ｂのタンパク質はラニビズマブ軽鎖（Ｍ４Ｌを含むベバシズマブ）（配列番号１２）である。
【０２６５】
実施例７．ＰＤＧＦＲβ−ＧＳ１０−抗ＶＥＧＦ−Ａ重鎖（Ｌ４４３Ｃ）／抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖のタンパク質配列
以下の図１３Ａ、図１３Ｂに示す配列を有する別のＰＤＧＦＲ−βトラップ−抗ＶＥＧＦ−Ａ重鎖（Ｌ４４３Ｃ））／抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖を構築した。図１３Ａのアミノ酸１〜２８２はヒトＰＤＧＦＲ−β（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ０９６１９．１）の３３〜３１４に対応する。ＰＤＧＦＲ配列の後には、１０アミノ酸リンカーＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳが直ちに続く。リンカーのセリン残基のカルボキシル末端には、以下のアミノ酸：Ｔ２８Ｄ、Ｎ３１Ｈ、Ｈ９７Ｙ、Ｓ１００ａＴ（Ｋａｂａｔ付番）、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ及びＬ４４３Ｃ（ＥＵ付番）を含むベバシズマブ重鎖が結合している。ＴＡＦ４４３軽鎖は、Ｍ４Ｌ変化（Ｋａｂａｔ付番）を除いてベバシズマブと同じである。図１３Ａのタンパク質配列は配列番号９に示す。図１３Ｂはラニビズマブ軽鎖（Ｍ４Ｌを含むベバシズマブ）（配列番号１２）を示す。
【０２６６】
実施例８．ＰＤＧＦＲβ−ＧＳ１０−抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖／抗ＶＥＧＦ−Ａ  Ｆａｂのタンパク質配列
以下の図１４Ａ、図１４Ｂに示す配列を有するＰＤＧＦＲ−βトラップ−抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖／抗ＶＥＧＦ−Ａ  Ｆａｂを構築した。図１４Ａのアミノ酸１〜２８２はヒトＰＤＧＦＲ−β（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ０９６１９．１）の３３〜３１４に対応し、その後にリンカー配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ及びベバシズマブ軽鎖配列が続く。任意選択で、ＰＤＧＦＲ−βセグメントと抗ＶＥＧＦセグメントとの間にリンカーは使用しなくてもよい。或いはリンカーは、これらの２つのタンパク質の活性が最適となるような、ＧＧＧＧＳモチーフ×１、×２（上述のとおり）、×３、×４等であってもよい。Ｇ、ＧＧ、ＧＧＧＳ及びＧＧＧＥＳ×１、×２、×３、×４等を含め、他のリンカーモチーフも本発明において使用し得る。リンカーは上記の組み合わせであってもよい。図１４Ａのタンパク質配列は配列番号１に示す。図１４Ｂのタンパク質はベバシズマブＦａｂ（配列番号２１）である。図１４Ａのベバシズマブ軽鎖は、任意選択で、Ｍ４Ｌ突然変異を有する。第２のタンパク質のベバシズマブＦａｂは、任意選択で、以下の突然変異：Ｔ２８Ｄ、Ｎ３１Ｈ、Ｈ９７Ｙ、及びＳ１００ａＴの１つ以上を有する。第２の鎖のベバシズマブＦａｂは、任意選択で、半減期延長部分をコンジュゲートするためＣ末端に付加されたシステイン部分を有する。好ましくは、システイン部分はＳＧＧＧＣ又はＣＡＡを介して付加される。或いは、ＳＧＧＧＣ又はＣＡＡは軽鎖のＣ末端に付加されてもよい。
【０２６７】
実施例９．ＰＤＧＦＲβ−ＧＧ−抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖／抗ＶＥＧＦ−Ａ  Ｆａｂのタンパク質配列
以下の図１５Ａ、図１５Ｂに示す配列を有するＰＤＧＦＲ−βトラップ−抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖／抗ＶＥＧＦ−Ａ  Ｆａｂを構築した。図１５Ａのアミノ酸１〜２８２はヒトＰＤＧＦＲ−β（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ０９６１９．１）の３３〜３１４に対応し、その後にリンカー配列ＧＧ及びベバシズマブ軽鎖配列が続く。任意選択で、ＰＤＧＦＲ−βセグメントと抗ＶＥＧＦセグメントとの間にリンカーは使用しなくてもよい。或いはリンカーは、これらの２つのタンパク質の活性が最適となるような、ＧＧＧＧＳモチーフ×１、×２、×３、×４等であってもよい。Ｇ、ＧＧ（上記のとおり）、ＧＧＧＳ及びＧＧＧＥＳ×１、×２、×３、×４等を含め、他のリンカーモチーフも本発明において使用し得る。リンカーは上記の組み合わせであってもよい。図１５Ａのタンパク質配列は配列番号３に示す。図１５ＢはベバシズマブＦａｂ（配列番号２１）の重鎖を示す。図１５Ａのベバシズマブ軽鎖は、任意選択で、Ｍ４Ｌ突然変異（Ｋａｂａｔ付番）を有する。図１５ＢのベバシズマブＦａｂは、任意選択で、以下の突然変異：Ｔ２８Ｄ、Ｎ３１Ｈ、Ｈ９７Ｙ、及びＳ１００ａＴ（Ｋａｂａｔ付番）の１つ以上を有する。図１５ＢのベバシズマブＦａｂは、任意選択で、半減期延長部分をコンジュゲートするためＣ末端に付加されたシステイン部分を有する。好ましくは、システイン部分はＳＧＧＧＣ又はＣＡＡを介して付加される。或いは、ＳＧＧＧＣ又はＣＡＡは軽鎖のＣ末端に付加されてもよい。
【０２６８】
実施例１０．ＰＤＧＦＲβ−ＧＳ１０−抗ＶＥＧＦ−Ａ  Ｆａｂ／抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖のタンパク質配列
以下の図１６Ａ、図１６Ｂに示す配列を有する別のＰＤＧＦＲ−βトラップ−抗ＶＥＧＦ−Ａ  Ｆａｂ／抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖を構築した。図１６Ａのアミノ酸１〜２８２はヒトＰＤＧＦＲ−β（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ０９６１９．１）の３３〜３１４に対応し、その後にリンカー配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ及びベバシズマブＦａｂ配列が続く。任意選択で、ＰＤＧＦＲ−βセグメントと抗ＶＥＧＦセグメントとの間にリンカーは使用しなくてもよい。或いはリンカーは、これらの２つのタンパク質の活性が最適となるような、ＧＧＧＧＳモチーフ×１、×２（上記のとおり）、×３、×４等であってもよい。Ｇ、ＧＧ、ＧＧＧＳ及びＧＧＧＥＳ×１、×２、×３、×４等を含め、他のリンカーモチーフも本発明において使用し得る。リンカーは上記の組み合わせであってもよい。図１６Ａのタンパク質配列は配列番号２２に示す。図１６Ｂはベバシズマブ軽鎖配列（配列番号５）を示す。ベバシズマブ軽鎖は、任意選択で、Ｍ４Ｌ突然変異を有する。ベバシズマブ重鎖は、任意選択で、以下の突然変異：Ｔ２８Ｄ、Ｎ３１Ｈ、Ｈ９７Ｙ、及びＳ１００ａＴ（Ｋａｂａｔ付番）の１つ以上を有する。重鎖は、任意選択で、半減期延長部分をコンジュゲートするためＣ末端に付加されたシステイン部分を有する。好ましくは、システイン部分はＳＧＧＧＣ又はＣＡＡを介して付加される。或いは、ＳＧＧＧＣ又はＣＡＡは軽鎖のＣ末端に付加されてもよい。
【０２６９】
実施例１１．ＰＤＧＦＲβ−ＧＧ−抗ＶＥＧＦ−Ａ  Ｆａｂ／抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖のタンパク質配列
以下の図１７Ａ、図１７Ｂに示す配列を有する別のＰＤＧＦＲ−βトラップ−抗ＶＥＧＦ−Ａ  Ｆａｂ／抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖を構築した。図１７Ａのアミノ酸１〜２８２はヒトＰＤＧＦＲ−β（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ０９６１９．１）の３３〜３１４に対応し、その後にリンカー配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ及びベバシズマブＦａｂ配列が続く。任意選択で、ＰＤＧＦＲ−βセグメントと抗ＶＥＧＦセグメントとの間にリンカーは使用しなくてもよい。或いはリンカーは、これらの２つのタンパク質の活性が最適となるような、ＧＧＧＧＳモチーフ×１、×２（上記のとおり）、×３、×４等であってもよい。Ｇ、ＧＧ、ＧＧＧＳ及びＧＧＧＥＳ×１、×２、×３、×４等を含め、他のリンカーモチーフも本発明において使用し得る。リンカーは上記の組み合わせであってもよい。図１７Ａのタンパク質配列は配列番号２３に示す。図１７Ｂはベバシズマブ軽鎖配列（配列番号５）を示す。ベバシズマブ軽鎖は、任意選択で、Ｍ４Ｌ突然変異を有する。ベバシズマブ重鎖は、任意選択で、以下の突然変異：Ｔ２８Ｄ、Ｎ３１Ｈ、Ｈ９７Ｙ、及びＳ１００ａＴ（Ｋａｂａｔ付番）の１つ以上を有する。ベバシズマブＦａｂ重鎖は、任意選択で、半減期延長部分をコンジュゲートするためＣ末端に付加されたシステイン部分を有する。好ましくは、システイン部分はＳＧＧＧＣ又はＣＡＡを介して付加される。或いは、ＳＧＧＧＣ又はＣＡＡは軽鎖のＣ末端に付加されてもよい。
【０２７０】
実施例１２．抗ＶＥＧＦ−Ａ  Ｆａｂ−ＧＳ２１−ＰＤＧＦＲβ／抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖のタンパク質配列
以下の図１８Ａ、図１８Ｂに示す配列を有する、抗ＶＥＧＦ−Ａ重鎖がＰＤＧＦＲ−βトラップの上流又はＮ末端側にあるＰＤＧＦＲ−βトラップ−抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体コンストラクトを構築した。図１８Ａのアミノ酸１〜２３１はベバシズマブＦａｂに対応し、その後にリンカー配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧが続く。任意選択で、ＰＤＧＦＲ−βセグメントと抗ＶＥＧＦセグメントとの間にリンカーは使用しなくてもよい。或いはリンカーは、これらの２つのタンパク質の活性が最適となるような、ＧＧＧＧＳモチーフ×１、×２、×３、×４等であってもよい。Ｇ、ＧＧ、ＧＧＧＳ及びＧＧＧＥＳ×１、×２、×３、×４等を含め、他のリンカーモチーフも本発明において使用し得る。リンカーは上記の組み合わせであってもよい。リンカーの後には、ヒトＰＤＧＦＲ−β（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ０９６１９．１）のアミノ酸配列３３〜３１４が続く。図１８Ａのタンパク質配列は配列番号２４に示す。図１８Ｂはベバシズマブ軽鎖配列（配列番号５）を示す。ベバシズマブ軽鎖は、任意選択で、Ｍ４Ｌ突然変異を有する。ベバシズマブ重鎖は、任意選択で、以下の突然変異：Ｔ２８Ｄ、Ｎ３１Ｈ、Ｈ９７Ｙ、及びＳ１００ａＴの１つ以上を有する。図１８Ａのタンパク質は、任意選択で、半減期延長部分をコンジュゲートするためＣ末端に付加されたシステイン部分を有する。好ましくは、システイン部分はＳＧＧＧＣ又はＣＡＡを介して付加される。或いは、ＳＧＧＧＣ又はＣＡＡは図１８Ｂの軽鎖のＣ末端に付加されてもよい。
【０２７１】
実施例１３．ＰＤＧＦＲβ−ＧＳ１０−抗ＶＥＧＦ−Ａ  Ｆａｂ／抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖のタンパク質配列
以下の図１９Ａ、図１９Ｂに示す配列を有する別のＰＤＧＦＲ−βトラップ−抗ＶＥＧＦ−Ａ  Ｆａｂ／抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖を構築した。図１９Ａのアミノ酸１〜２８２はヒトＰＤＧＦＲ−β（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ０９６１９．１）の３３〜３１４に対応する。ＰＤＧＦＲ配列の後には、１０アミノ酸リンカーＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳが直ちに続く。任意選択で、ＰＤＧＦＲ−βセグメントと抗ＶＥＧＦセグメントとの間にリンカーは使用しなくてもよい。或いはリンカーは、これらの２つのタンパク質の活性が最適となるような、ＧＧＧＧＳモチーフ×１、×２（上記のとおり）、×３、×４等であってもよい。Ｇ、ＧＧ、ＧＧＧＳ及びＧＧＧＥＳ×１、×２、×３、×４等を含め、他のリンカーモチーフも本発明において使用し得る。リンカーは上記の組み合わせであってもよい。リンカーのセリン残基のカルボキシル末端には、突然変異Ｔ２８Ｄ、Ｎ３１Ｈ、Ｈ９７Ｙ、及びＳ１００ａＴ（Ｋａｂａｔ付番）を有するベバシズマブＦａｂが結合している。図１９Ａのタンパク質配列は配列番号２５に示す。図１９Ｂのタンパク質はラニビズマブ軽鎖（Ｍ４Ｌを含むベバシズマブ）（配列番号１２）である。図１９Ａのタンパク質は、任意選択で、半減期延長部分をコンジュゲートするためＣ末端に付加されたシステイン部分を有する。好ましくは、システイン部分はＳＧＧＧＣ又はＣＡＡを介して付加される。或いは、ＳＧＧＧＣ又はＣＡＡは図１９Ｂの軽鎖のＣ末端に付加されてもよい。
【０２７２】
実施例１４．ＰＤＧＦＲβ−抗ＶＥＧＦ−Ａ  Ｆａｂ／抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖（１ａ）のタンパク質配列
図２０Ａ、図２０Ｂに示す配列を有する別のＰＤＧＦＲ−βトラップ−抗ＶＥＧＦ−Ａ  Ｆａｂ／抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖を構築した。図２０Ａのアミノ酸１〜２８３はヒトＰＤＧＦＲ−β（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ０９６１９．１）の３２〜３１４に対応し、その後にベバシズマブ重鎖が続く。図２０Ａのタンパク質配列は配列番号２６に示す。図２０Ｂのタンパク質はベバシズマブ軽鎖配列（配列番号５）である。この例に示すとおり、ＰＤＧＦＲ−βセグメントと抗ＶＥＧＦセグメントとの間にリンカーは使用しなくてもよい。或いはリンカーは、これらの２つのタンパク質の活性が最適となるような、ＧＧＧＧＳモチーフ×１、×２、×３、×４等であってもよい。Ｇ、ＧＧ、ＧＧＧＳ及びＧＧＧＥＳ×１、×２、×３、×４等を含め、他のリンカーモチーフも本発明において使用し得る。リンカーは上記の組み合わせであってもよい。ベバシズマブ軽鎖は、任意選択で、Ｍ４Ｌ突然変異を有する。ベバシズマブ重鎖は、任意選択で、以下の突然変異：Ｔ２８Ｄ、Ｎ３１Ｈ、Ｈ９７Ｙ、Ｓ１００ａＴ（Ｋａｂａｔ付番）、Ｑ３４７Ｃ及びＬ４４３Ｃ（ＥＵ付番）の１つ以上を有する。
【０２７３】
実施例１５．ＰＤＧＦＲ−β（Ｄ２−Ｄ３）−抗ＶＥＧＦ−Ａ重鎖／抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖（１ｂ）のタンパク質配列
以下の図２１Ａ、図２１Ｂに示す配列を有する別のＰＤＧＦＲ−βトラップ（Ｄ２−Ｄ３）−抗ＶＥＧＦ−Ａ重鎖／抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖を構築した。図２１Ａのアミノ酸１〜１９０はヒトＰＤＧＦＲ−β（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ０９６１９．１）の１２５〜３１４に対応し、その後にベバシズマブ重鎖が続く。図２１Ａのタンパク質配列は配列番号２７に示す。この例に示すとおり、ＰＤＧＦＲ−βセグメントと抗ＶＥＧＦセグメントとの間にリンカーは使用しなくてもよい。或いはリンカーは、これらの２つのタンパク質の活性が最適となるような、ＧＧＧＧＳモチーフ×１、×２、×３、×４等であってもよい。Ｇ、ＧＧ、ＧＧＧＳ及びＧＧＧＥＳ×１、×２、×３、×４等を含め、他のリンカーモチーフも本発明において使用し得る。リンカーは上記の組み合わせであってもよい。図２１Ｂはベバシズマブ軽鎖配列（配列番号５）を示す。ベバシズマブ軽鎖は、任意選択で、Ｍ４Ｌ突然変異を有する。ベバシズマブ重鎖は、任意選択で、以下の突然変異：Ｔ２８Ｄ、Ｎ３１Ｈ、Ｈ９７Ｙ、Ｓ１００ａＴ（Ｋａｂａｔ付番）、Ｑ３４７Ｃ及びＬ４４３Ｃ（Ｅｕ付番）の１つ以上を有する。
【０２７４】
実施例１６．ＰＤＧＦＲ−β（Ｄ２−Ｄ３）−抗ＶＥＧＦ−Ａ  Ｆａｂ／抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖（２ｂ）のタンパク質配列
図２２Ａ、図２２Ｂに示す配列を有する別のＰＤＧＦＲ−βトラップ（Ｄ２−Ｄ３）−抗ＶＥＧＦ−Ａ  Ｆａｂ／抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖を構築した。図２２Ａのアミノ酸１〜１９０はヒトＰＤＧＦＲ−β（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ０９６１９．１）の１２５〜３１４に対応し、その後にベバシズマブＦａｂが続く。この例に示すとおり、ＰＤＧＦＲ−βセグメントと抗ＶＥＧＦセグメントとの間にリンカーは使用しなくてもよい。或いはリンカーは、これらの２つのタンパク質の活性が最適となるような、ＧＧＧＧＳモチーフ×１、×２、×３、×４等であってもよい。ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳリンカーが特に好ましい。Ｇ、ＧＧ、ＧＧＧＳ及びＧＧＧＥＳ×１、×２、×３、×４等を含め、他のリンカーモチーフも本発明において使用し得る。リンカーは上記の組み合わせであってもよい。図２２Ａの配列は配列番号２８に示す。図２２Ｂはベバシズマブ軽鎖配列（配列番号５）を示す。ベバシズマブ軽鎖は、任意選択で、Ｍ４Ｌ突然変異を有する。ベバシズマブ重鎖は、任意選択で、以下の突然変異：Ｔ２８Ｄ、Ｎ３１Ｈ、Ｈ９７Ｙ、及びＳ１００ａＴ（Ｋａｂａｔ付番）の１つ以上を有する。図２２ＡのベバシズマブＦａｂは、任意選択で、半減期延長部分をコンジュゲートするためＣ末端に付加されたシステイン部分を有する。好ましくは、システイン部分はＳＧＧＧＣ又はＣＡＡを介して付加される。或いは、ＳＧＧＧＣ又はＣＡＡは図２２Ｂの軽鎖のＣ末端に付加されてもよい。
【０２７５】
実施例１７．ＰＤＧＦＲ−β（Ｄ２−Ｄ３）−抗ＶＥＧＦ−Ａ  Ｆａｂ／抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖（２ｂ’）のタンパク質配列
以下の図２３Ａ、図２３Ｂに示す配列を有する別のＰＤＧＦＲ−βトラップ（Ｄ２−Ｄ３）−６ｘＧＳ−抗ＶＥＧＦ−Ａ  Ｆａｂ／抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖を構築した。図２３Ａのアミノ酸１〜１９０はヒトＰＤＧＦＲ−β（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ０９６１９．１）の１２５〜３１４に対応し、その後にリンカーＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ及び次にベバシズマブＦａｂが続く。任意選択で、ＰＤＧＦＲ−βセグメントと抗ＶＥＧＦセグメントとの間にリンカーは使用しなくてもよい。或いはリンカーは、これらの２つのタンパク質の活性が最適となるような、ＧＧＧＧＳモチーフ×１、×２、×３、×４等であってもよい。Ｇ、ＧＧ、ＧＧＧＳ及びＧＧＧＥＳ×１、×２、×３、×４等を含め、当業者に公知の他のリンカーモチーフも本発明において使用し得る。リンカーは上記の組み合わせであってもよい。図２３Ａのタンパク質配列は配列番号２９に示す。図２３Ｂはベバシズマブ軽鎖配列（配列番号５）を示す。ベバシズマブ軽鎖は、任意選択で、Ｍ４Ｌ突然変異を有する。ベバシズマブ重鎖は、任意選択で、以下の突然変異：Ｔ２８Ｄ、Ｎ３１Ｈ、Ｈ９７Ｙ、及びＳ１００ａＴ（Ｋａｂａｔ付番）の１つ以上を有する。ベバシズマブＦａｂ重鎖は、任意選択で、半減期延長部分をコンジュゲートするためＣ末端に付加されたシステイン部分を有する。好ましくは、システイン部分はＳＧＧＧＣ又はＣＡＡを介して付加される。或いは、ＳＧＧＧＣ又はＣＡＡは軽鎖のＣ末端に付加されてもよい。
【０２７６】
実施例１８．ＰＤＧＦＲ−β（Ｄ２−Ｄ３）−抗ＶＥＧＦ−Ａ  Ｆａｂ／抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖（２ｂ’）のタンパク質配列
以下の図２４Ａ、図２４Ｂに示す配列を有する別の抗ＶＥＧＦ−Ａ  Ｆａｂ−６ｘＧＳ−ＰＤＧＦＲ−βトラップ（Ｄ２−Ｄ３）／抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖を構築した。図２４Ａのアミノ酸１〜１９０はヒトＰＤＧＦＲ−β（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ０９６１９．１）の１２５〜３１４に対応し、その後にリンカーＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ及び次にベバシズマブＦａｂが続く。任意選択で、ＰＤＧＦＲ−βセグメントと抗ＶＥＧＦセグメントとの間にリンカーは使用しなくてもよい。或いはリンカーは、これらの２つのタンパク質の活性が最適となるような、ＧＧＧＧＳモチーフ×１、×２、×３、×４等であってもよい。Ｇ、ＧＧ、ＧＧＧＳ及びＧＧＧＥＳ×１、×２、×３、×４等を含め、他のリンカーモチーフも本発明において使用し得る。リンカーは上記の組み合わせであってもよい。図２４Ａの配列は配列番号２９に示す。図２４Ｂはベバシズマブ軽鎖配列（配列番号５）を示す。図２４Ｂのベバシズマブ軽鎖は、任意選択で、Ｍ４Ｌ突然変異を有する。第１のタンパク質のベバシズマブ重鎖は、任意選択で、以下の突然変異：Ｔ２８Ｄ、Ｎ３１Ｈ、Ｈ９７Ｙ、及びＳ１００ａＴ（Ｋａｂａｔ付番）の１つ以上を有する。図２４ＡのベバシズマブＦａｂは、任意選択で、半減期延長部分をコンジュゲートするためＣ末端に付加されたシステイン部分を有する。好ましくは、システイン部分はＳＧＧＧＣ又はＣＡＡを介して付加される。或いは、ＳＧＧＧＣ又はＣＡＡは軽鎖のＣ末端に付加されてもよい。
【０２７７】
実施例１９．抗ＶＥＧＦ−Ａ  Ｆａｂ−６ｘＧＳ−ＰＤＧＦＲ−β（Ｄ２−Ｄ３）／抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖（３）のタンパク質配列
以下の図２５Ａ、図２５Ｂに示す配列を有する別の抗ＶＥＧＦ−Ａ  Ｆａｂ−６ｘＧＳ−ＰＤＧＦＲ−β（Ｄ２−Ｄ３）／抗ＶＥＧＦ−Ａ軽鎖を構築した。図２５Ａのアミノ酸１〜２３１はベバシズマブＦａｂに対応し、その後にリンカーＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ及び次にヒトＰＤＧＦＲ−β（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ０９６１９．１）の１２５〜３１４が続く。任意選択で、ＰＤＧＦＲ−βセグメントと抗ＶＥＧＦセグメントとの間にリンカーは使用しなくてもよい。或いはリンカーは、これらの２つのタンパク質の活性が最適となるような、ＧＧＧＧＳモチーフ×１、×２、×３、×４等であってもよい。Ｇ、ＧＧ、ＧＧＧＳ及びＧＧＧＥＳ×１、×２、×３、×４等を含め、他のリンカーモチーフも本発明において使用し得る。リンカーは上記の組み合わせであってもよい。図２５Ａの配列は配列番号３０に示す。図２５Ｂはベバシズマブ軽鎖配列（配列番号５）を示す。ベバシズマブ軽鎖は、任意選択で、Ｍ４Ｌ突然変異を有する。ベバシズマブ重鎖は、任意選択で、以下の突然変異：Ｔ２８Ｄ、Ｎ３１Ｈ、Ｈ９７Ｙ、及びＳ１００ａＴ（Ｋａｂａｔ付番）の１つ以上を有する。図２５ＡのＰＤＧＦＲ−βは、任意選択で、半減期延長部分をコンジュゲートするためＣ末端に付加されたシステイン部分を有する。好ましくは、システイン部分はＳＧＧＧＣ又はＣＡＡを介して付加される。或いは、ＳＧＧＧＣ又はＣＡＡは軽鎖のＣ末端に付加されてもよい。
【０２７８】
実施例２０．デュアルＰＤＧＦＲ／ＶＥＧＦアンタゴニストタンパク質の作製
ＴＡＦ４４３重鎖及び軽鎖を発現プラスミドにクローニングし、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。細胞を適切な培地で成長させて回収した。ＴＡＦ４４３は以下のとおり精製した。配列番号３１及び３２を発現するＣＨＯ細胞からの１０Ｌ培養培地を５％（ｖ／ｖ）１．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、０．２２Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ６．７又は１０％０．５５Ｍ  Ｈｅｐｅｓ、０．１１Ｍ  ＥＤＴＡ、５．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ６．７で調整し、５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（５ＣＶ）で平衡化したＭａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ樹脂が充填された１６７／４００ｍｌプロテインＡカラム（２ラン）にロードした。カラムを５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（２ＣＶ）、５０ｍＭトリス、０．５Ｍ  ＣａＣｌ2、ｐＨ７．５（５ＣＶ）、次に１０ｍＭトリス、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（３ＣＶ）で洗浄してから、１５０ｍＭグリシン、４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ３．５（４ＣＶ）を使用してタンパク質を溶出させた。画分をプールし、２Ｍグリシン、ｐＨ２．７を使用してｐＨ３．５に調整し、次に２Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０を使用してｐＨ７に中和した。プロテインＡプールを、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、６５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０（５ＣＶ）で平衡化した２７４ｍｌ  ＴＭＡＥカラムにロードした。このカラムを５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、６５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０（３ＣＶ）で洗浄し、次に５０ｍＭトリス、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（５ＣＶ）で溶出させた。溶出画分をプールし、ＰＢＳ−ＣＭＦ、ｐＨ７．２で平衡化した１１５０ｍＬ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５  Ｃｏａｒｓｅカラムで緩衝液交換した。このプールをろ過し、３０ｋ  ＭＷＣＯ  ＶｉｖａＦｌｏｗ２００で＞５ｍｇ／ｍｌに濃縮した。濃縮したタンパク質を０．２２ｕｍフィルタでろ過し、次にＳＤＳ−ＰＡＧＥ、分析的ＳＥＣ、Ｏ．Ｄ．２８０／３２０、エンドトキシンＬＡＬアッセイ、プロテインＡ  ＥＬＩＳＡ、ＩＥＦ、及び凍結融解分析によって特徴付けた。
【０２７９】
以下の表に、精製ＴＡＦ４４３の例示的なバッチの特性をまとめる。
【０２８０】
【表１】
2017526635.tif 000018
【０２８１】
実施例２１．代表的な製剤における高濃度でのＴＡＦ二機能性分子の安定性
ショ糖などの賦形剤の存在下で、ＴＡＦ二機能性分子をｐＨ４．５〜７．５の範囲の標準製剤化緩衝液系列中５０〜８５ｍｇ／ｍｌに濃縮した。これらの試料のアリコートを室温（ＲＴ）及び４℃で６週間にわたって保存し、時間０及びその後は後続の各週に試料を採取して、凝集した材料のパーセンテージを分析的ＳＥＣによって計測した。以下の表に、ＴＡＦ４４３の凝集に対するｐＨの効果を見ることができる。
【０２８２】
【表２】
2017526635.tif 000019
【０２８３】
実施例２２．ＣＨＯ細胞へのコンストラクトのトランスフェクション
ＴＡＦｗｔ、ＴＡＦ４４３及びＴＡＦ３４７のＤＮＡコンストラクトをＣＨＯ−Ｋ１  ＳＶ  ＳＳＩにトランスフェクトした：３プール／コンストラクト。細胞株のほとんどで、正常な３週間の回復が認められた。しかしながら、ＴＡＦｗｔ及びＴＡＦ３４７細胞株は他の細胞株に約１週間の遅れを取った。プールの樹立後、ほとんどについては４日目及びＴＡＦｗｔ及びＴＡＦ３４７については３日目に、馴化培地試料をＯｃｔｅｔにかけた。ＴＡＦｗｔ及びＴＡＦ３４７の３日馴化培地はＯｃｔｅｔによって約７ｍｇ／ｍｌを示した。４日馴化培地は、ＴＡＦ４４３について約２１ｍｇ／ｍｌを示した。プール間に僅かな差異が観察され、それらのプールを使用してプールのプールを作製し、それをタンパク質産生に進めた。
【０２８４】
実施例２３．タンパク質のＳＥＣ−ＭＡＬＳ
ＴＡＦのＰＤＧＦＲセグメントは７個の推定グリコシル化部位を有する。このタンパク質は、ＳＥＣ−ＭＡＬＳ計測から、高度にグリコシル化しているものと思われる。
【０２８５】
【表３】
2017526635.tif 000020
【０２８６】
ＳＥＣ−ＭＡＬＳにかけた試料は、全て９８％より高い純度であった。分子量計測値は妥当であった。恐らくは三量体〜五量体の幾らかの高分子量材料が観察された（データは示さず）。
【０２８７】
実施例２４．ＴＡＦタンパク質の熱安定性
ＰＢＳ、ｐＨ７．２中ＴＡＦｗｔ、ＴＡＦ４４３及びＴＡＦ３４７を熱安定性プロファイルにかけた。各タンパク質が３つのピークを有した（データは示さず）。ピークの相対位置を以下の表に示す。
【０２８８】
【表４】
2017526635.tif 000021
【０２８９】
この温度範囲に関するタンパク質の安定性は極めて類似している。しかしながら、Ｔm３について幾らか僅かな違いがあることが注記される。Ｔm３はこれらの３つのＴＡＦタンパク質の抗体ドメインのＣＨ３ドメインに対応している可能性が高く、この違いはＣｙｓ突然変異を反映している。ＴＡＦタンパク質の全体的安定性の低さは、タンパク質のＰＤＧＦＲセグメントのアンフォールディングに起因する可能性が高い。
【０２９０】
実施例２５．ＴＡＦ強制凝集
熱に応じたこれらの３つのＴＡＦタンパク質の溶液中の凝集物の割合を調べた（データは示さず）。タンパク質の各々（ＴＡＦｗｔ、ＴＡＦ３４７及びＴＡＦ４４３）の溶液は、約５４℃を始点として凝集を示し始めた。タンパク質の各々についての凝集物の割合は、温度の増加に伴い急激に増加した。６４℃で、ＴＡＦタンパク質の各々の略４０％が凝集物を成した。凝集は最も低いＴｍで現れ始め、一見したところタンパク質のＰＤＧＦＲ部分のアンフォールディングに対応していることが注記される。
【０２９１】
実施例２６．ｐＨに応じたＴＡＦ４４３熱安定性
ＴＡＦ４４３の熱安定性を、以下の表に示すとおりの様々なｐＨで調べた。非ＰＢＳ緩衝液中では、４つの熱変性ピークが見られる。
【０２９２】
【表５】
2017526635.tif 000022
【０２９３】
見て分かるとおり、弱いｐＨ依存性がある。特に、Ｔm２及びＴm３ドメイン（推定ＣＨ2、Ｆab）はＰＢＳ中では重複するが、他の緩衝液中では重複しない。
【０２９４】
実施例２７．標的に対するデュアルＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアンタゴニストタンパク質及びコンジュゲートの親和性
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて、ＴＡＦ−ＷＴ、ＴＡＦ−３４７、ＴＡＦ−４４３、ＴＡＦ４４３−６Ａ２５０Ｋ、及びＴＡＦ４４３−３Ａ２５０ＫデュアルＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアンタゴニスト変異体に対する組換えヒトＰＤＧＦ−ＢＢ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、１００−１４Ｂ）の結合動態を特徴付けた。初めに、製造者のプロトコルに従い、ＣＭ５カルボキシメチル化デキストランで被覆されたセンサーチップの４つ全てのフローセルに、約１０，０００共鳴単位（ＲＵ）の密度となるよう抗ヒトＩｇＧ抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＢＲ−１００８−３９）を共有結合的にアミンカップリングした。各ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦ変異体を約１５０ＲＵのレベルまで捕捉した。ＰＤＧＦ分析のランニング及び試料緩衝液は、ＨＢＳ−ＥＰ＋３００ｍＭ  ＮａＣｌ（１０ｍＭ  ４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）ｐＨ７．４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０）であった。１ｎＭ〜０．１２５ｎＭの濃度範囲のＰＤＧＦ−ＢＢの２倍段階希釈系列を１１０秒の会合について１００μＬ／分の流量で注入し、解離は３００から２７００秒まで異なった。次に表面を３Ｍ  ＭｇＣｌ2の３０秒パルス、イオン再生緩衝液（０．４６Ｍ  ＫＳＣＮ、１．８３Ｍ  ＭｇＣｌ２、０．９２Ｍ尿素、及び１．８３Ｍグアニジン−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９９）の３０秒パルスで再生し、次にＨＢＳ−ＥＰ＋３００ｍＭ  ＮａＣｌランニング緩衝液の３０秒パルスで平衡化した。
【０２９５】
同様に、ＳＰＲを使用して、ＴＡＦ−ＷＴ、ＴＡＦ−３４７、及びＴＡＦ−４４３デュアルＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアンタゴニスト変異体に対する組換えヒトＶＥＧＦ１２１（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、１００−２０Ａ）の結合親和性を決定した。ＶＥＧＦ分析用のランニング及び試料緩衝液は、ＨＢＳ−ＥＰ＋終濃度１５０ｍＭ  ＮａＣｌであった。１００ｎＭ〜１２．５ｎＭの濃度範囲のＶＥＧＦ１２１の２倍希釈系列を約５０秒の会合について５０ｕＬ／分の流量で注入し、解離は３００から３６００秒まで異なった。次に表面を３Ｍ  ＭｇＣｌ2の３０秒パルス、イオン再生緩衝液（０．４６Ｍ  ＫＳＣＮ、１．８３Ｍ  ＭｇＣｌ２、０．９２Ｍ尿素、及び１．８３Ｍグアニジン−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９９）の３０秒パルスで再生し、次にＨＢＳ−ＥＰ＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌランニング緩衝液の３０秒パルスで平衡化した。
【０２９６】
全てのＳＰＲアッセイは、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、データ収集速度を１Ｈｚとして２５℃で実施した。得られたＰＤＧＦ及びＶＥＧＦセンサーグラムは、対照表面及び緩衝液注入の両方を用いて二重参照した。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００評価ソフトウェアｖ２．０及び式ＫD＝ｋd／ｋaを用いてデータを１：１ラングミュアモデルにフィットさせることにより、速度定数を決定した。
【０２９７】
【表６】
2017526635.tif 000023
【０２９８】
【表７】
2017526635.tif 000024
【０２９９】
実施例２８．マレイミドコンジュゲーション前のＴＡＦ４４３のデキャッピング
ＴＡＦ４４３システイン残基は、典型的には細胞培養培地中の化学物質によって「キャッピングされている」か、又は酸化されており、コンジュゲーションに利用することができない。これに関して、精製ＴＡＦ４４３（ＯＧ１３２１）をデキャッピング（即ち還元）手順に供してキャップを除去し、遊離した（即ちＣｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合に関与しないもの）システイン残基によるポリマーのマレイミド官能基とのコンジュゲーションを可能にする。デキャッピングはＴＡＦタンパク質を３０倍モル過剰の還元剤ＴＣＥＰ（３，３’，３’’−ホスファントリイルトリプロパン酸）と２５℃で１時間混合することによって行われる。ＴＣＥＰとの還元反応はＳＤＳ−ＰＡＧＥによってモニタする。非変性ＴＡＦは約２５０ｋＤａ（この重量の約４０ｋＤａは炭水化物である）にシングルバンドとして泳動する。完全に変性したところで、このシングル２５０ｋＤａバンドを軽鎖及び重鎖に対応するバンドに変換する。変性後、Ｐｅｌｌｉｏｎ  ＸＬ限外ろ過カセットを使用して、２０ｍＭトリス  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＴＣＥＰ緩衝液でＵＦｄＦによりＴＡＦタンパク質を洗浄して、キャップを除去した。次に同じＵＦｄＦセットアップで、２０ｍＭトリス  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌによってＴＣＥＰ試薬を除去した。還元したＴＡＦは空気（周囲酸素）を使用してリフォールディングさせ、これもアッセイとしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって追跡した。
【０３００】
詳細なデキャッピング手順は以下のとおりである。５００ｍｇのＯＧ１３２１を−８０℃から４℃で一晩解凍し、２５℃の水浴中で加温した後、３０倍モル過剰のＴＣＥＰと混合した。この反応物を２５℃の水浴中で１時間インキュベートした。１５、３０、及び６０分の時点で試料を取り出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけることにより還元の完了を判定した。１０ｋＤ  ＭＷＣＯのＵＦｄＦカセットを使用して緩衝液交換を実施した。最初の緩衝液交換ステップは、約１００倍に関して２０ｍＭトリス  ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＴＣＥＰで行い、キャップを完全に除去した。２回目の緩衝液交換ステップは、約１０００倍に関して２０ｍＭトリス  ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌで行い、ＴＣＥＰを除去した後、空気中リフォールディングを行った。試料中の最終的なＴＣＥＰ濃度は約０．５μＭであった。両方の緩衝液交換ステップからＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＳＥＣの両方の分析用の試料を取り出して、タンパク質再酸化状態及びタンパク質凝集を判定した。２回目の緩衝液交換ステップの後、ＯＧ１３２１を約２ｍｇ／ｍｌに濃縮し、０．２２μｍろ過し、４℃の空気で再酸化させた。種々の時点でＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＳＥＣ分析用の試料を取り出し、再酸化状態を判定した。再酸化したＯＧ１３２１は０．２２μｍろ過し、更に濃縮した。試料をＶＩＶＡＣＥＬＬ  １００  ３０ｋ  ＭＷＣＯスピンコンセントレーターで４〜６ｍｇ／ｍｌまで濃縮し続け、試料を滅菌ろ過した。ＯＤ２８０によって定量化した。
【０３０１】
実施例２９．ＴＡＦ４４３とバイオポリマーとのコンジュゲーション
ｐＨ７．５トリス緩衝液中の１５倍過剰のポリマーを使用してデキャッピングした後、ＯＧ１３２１とも称されるＴＡＦ４４３をポリマーＯＧ１８０２（下記参照）にコンジュゲートして、図２６に示すＯＧ１４４８を作製した（図２６は、バイオポリマーＯＧ１８０２にコンジュゲートしたＴＡＦ４４３であるＯＧ１４４８の化学構造を示す）。ＴＡＦ４４３は、この図に示される分子の右端にあり、システイン４４３残基を介して５員環にコンジュゲートしている。コンジュゲーションはＳＤＳ−ＰＡＧＥによってモニタし、略完了まで至らせた。コンジュゲートは陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製し、ＵＦ／ＤＦによって製剤化緩衝液中に緩衝液交換した。
【０３０２】
一般に、成分ＯＧ１８０２及びＯＧ１３２１からのＯＧ１４４８の合成には３つのステップが関わる。ステップＡ：システイン４４３位のスルフヒドリル基を使えるようにするためＯＧ１３２１を大幅に還元又はデキャッピングする。ＴＡＦの重鎖のシステイン４４３位はシステイン−システインジスルフィド対形成に関与しないと考えられるが、このシステインは、典型的には培地の成分によりキャッピングされており、還元しないと、マレイミドとの反応に利用できない。ステップＢ：次に還元したＴＡＦをＯＧ１８０２にコンジュゲートする。ステップＣ：次にコンジュゲートしたＴＡＦ（ＯＧ１４４８）をクロマトグラフィーによって非コンジュゲートＴＡＦ及びポリマーと分離する。これらの３つの概略ステップは、以下の表にある７つの細かいステップに分けられる。
【０３０３】
【表８】
2017526635.tif 000025
【０３０４】
実施例３０．陰イオン交換（Ｍａｃｒｏｃａｐ  Ｑ）によるＯＧ１４４８の精製
上記に記載したとおりＴＡＦ４４３をＯＧ１８０２とコンジュゲートした後、ＯＧ１４４８を以下のとおり精製した。上記に記載したとおりＴＡＦ４４３をＯＧ１８０２とコンジュゲートした後、ＯＧ１４４８を以下のとおり精製した。約３：１の樹脂：コンジュゲート比に従い２×４００ｍｌのＭａｃｒｏｃａｐ  Ｑカラムを充填した。このカラムを５ＭのＮａＣｌでフラッシュし、２０ｍＭトリス  ｐＨ７．５、２０ｍＭ  ＮａＣｌ（平衡化緩衝液）でサイホン処理によって平衡化した。コンジュゲーション反応混合物を２０ｍＭトリス  ｐＨ７．５で希釈し、カラムにロードした。次にカラムを平衡化緩衝液でチェースし、２０ｍＭトリス  ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌ（Ｗａｓｈ  １）、次に２０ｍＭトリス  ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ（Ｗａｓｈ  ２）で洗浄した。１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２２０ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、及び５００ｍＭ  ＮａＣｌの段階勾配として、２０ｍＭトリス  ｐＨ７．５で溶出を行った。カラムのフロースルー、洗浄液、及び溶出液を全て、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＡＥＸ分析用に清浄なボトルに回収した。コンジュゲートを含有する溶出画分をプールし、３０ｋＤ  ＭＷＣＯ及びＰＥＳ膜を備えたＰｅｌｌｉｃｏｎ  ＸＬ  ＴＦＦカセットを使用して濃縮した。次に同じＴＦＦカセットを使用して、濃縮したプールを１×ＰＢＳ  ｐＨ７．４緩衝液で約１００倍の緩衝液交換を行い、ＶＩＶＡＣＥＬＬ  １００スピンコンセントレーターに移して、目標濃度（約３０ｍｇ／ｍｌ）に達するまで更に濃縮した。ロットリリースのため、最終的なコンジュゲートを０．２μｍ  ＰＥＳシリンジフィルタでろ過した。
【０３０５】
実施例３１．細菌性エンドトキシンの低減
最終タンパク質（ＯＧ１３２１）又はコンジュゲート（ＯＧ１４４８）のエンドトキシンレベルを低減するため、タンパク質又はコンジュゲートのいずれについても、陰イオン交換の代わりに陽イオン交換を利用する精製手順を用い得る。例えば、ＯＧ１３２１の精製に関する上記の手順では、陰イオン交換ＴＭＡＥ樹脂が用いられる。ＴＭＡＥ樹脂の代わりに、陽イオン交換樹脂ＣＥＸを使用し得る。しかしながら、ＣＥＸ残基を使用するためには、対象のタンパク質を含有する溶液のｐＨをタンパク質のｐＩ未満に下げなければならない。ＯＧ１３２１について、プロテインＡカラム後のタンパク質溶液のｐＨはｐＨ３．５にまで下がる。ＯＧ１３２１はｐＨ５でＰｏｒｏｓ  ＸＳカラムに結合する。次に、Ｐｏｒｏｘ  ＸＳ（ＣＥＸ）を使用してＯＧ１３２１を結合し、溶出させることができる。
【０３０６】
実施例３２．ＯＧ１８０２の経路１合成
ＯＧ１８０２の第１の合成経路は以下のとおりである。初めに、図２７に示す構造を有するＴＦＡ／アミン塩開始剤（化合物Ｌ）を以下のとおり合成した。
【０３０７】
初めに、図２８に示す構造を有する化合物Ｋを以下のとおり合成した。窒素下の２００ｍＬ丸底フラスコに、化合物Ｊ（ＯＧ１５６３）（１．９ｇ、２．６７ｍｍｏｌ、３．３当量）
【化１６】
2017526635.tif 000026
及び化合物Ｅ（０．５２５ｇ、０．８１ｍｍｏｌ、１．０当量）（図３８を参照）と、続いてジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）、次にジイソプロピルエチルアミン（２．５ｍＬ、１４．６ｍｍｏｌ、１８当量）を入れた。このフラスコを氷浴を使用して０℃に冷却した。これに、プロピルホスホン酸無水物溶液（酢酸エチル中５０ｗｔ．％、２．５ｍＬ、４．０４ｍｍｏｌ、５当量）を約６分かけて添加した。
【０３０８】
この反応物を室温に加温し、１５分間撹拌した。水（２０ｍＬ）、飽和重炭酸ナトリウム水溶液（２０ｍＬ）及び酢酸エチル（１００ｍＬ）を添加することによって反応をクエンチした。有機層を分離し、水層を酢酸エチル（７５ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を飽和重炭酸ナトリウム水溶液（３０ｍＬ）、０．５Ｍクエン酸水溶液（４０ｍＬ）、水（２５ｍＬ）、及び飽和塩化ナトリウム水溶液（４０ｍＬ）で洗浄し、次に乾燥させて（硫酸ナトリウム）、ろ過し、真空下で濃縮した。残渣（更なる精製なしに使用した）は２．０ｇ（０．８０ｍｍｏｌ、９９％）の化合物Ｋとなった。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ  ＤＭＳＯ−ｄ６）：＝１．３６（ｓ，９Ｈ，ＯＣＣＨ３），１．９０（ｓ，５４Ｈ，ＣＣ（ＣＨ３）２Ｂｒ），２．３１（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，６Ｈ，ＣＣＨ２ＣＨ２ＮＨ），２．９８（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，６Ｈ，ＣＣＨ２ＮＨ），３．０４（ｑ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ，ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨ），３．１８（ｓ，２Ｈ，ＯＣＨ２Ｃ），３．３−３．３７（ｍ，８Ｈ，ＣＨ２），３．４７−３．５５（ｍ，１２Ｈ，ＣＨ２），３．５８（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ２Ｃ），３．８７（ｓ，６Ｈ，Ｏ＝ＣＣＨ２Ｏ），４．２７（ｓ，１８Ｈ，ＣＣＨ２ＯＣ＝Ｏ），６．７４（ｂｒ  ｔ，１Ｈ，ＣＨ２ＮＨＣ＝Ｏ），７．６９（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ２ＮＨＣ＝Ｏ），７．８４（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ２ＮＨＣ＝Ｏ）．
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳ，ｍ／ｚ）：［（Ｍ＋２Ｈ−ｂｏｃ）／２］＋（Ｃ８４Ｈ１３６Ｂｒ９Ｎ７Ｏ３３＋２Ｈ−Ｂｏｃ）／２の計算値＝１１９６．６；実測値１１９６．６
【０３０９】
次の化合物Ｌ（図２７）は以下のとおり合成した。窒素下の１００ｍＬ丸底に、化合物Ｋ（２．０ｇ、０．８ｍｍｏｌ）と、ジクロロメタン（１０ｍＬ）と、続いてトリフルオロ酢酸（５ｍＬ）とを添加した。この反応物を室温で３０分間撹拌した。反応物を真空下で濃縮した。反応物をジクロロメタン（１０ｍＬ）を使用して希釈し、真空下で濃縮した。アセトニトリル（１０ｍＬ）を使用して残渣を溶解し、シリンジフィルタ（Ａｃｒｏｄｉｓｃ  ＣＲ２５、ＰＮ  ４２２５Ｔ）でろ過して、調製用ＨＰＬＣカラムにロードし、水中６０％アセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸含有）〜最大９８％アセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸含有）で溶出させた。産物を含有するチューブをプールし、真空下で濃縮し、凍結して凍結乾燥器に置いた。これにより、９９０ｍｇ（０．４ｍｍｏｌ、２ステップで５０％）の化合物Ｌが白色粉末として得られた。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ  ＤＭＳＯ−ｄ６）：  ＝１．９０（ｓ，５４Ｈ，ＣＣ（ＣＨ３）２Ｂｒ），２．３１（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，６Ｈ，ＣＣＨ２ＣＨ２ＮＨ），２．９７−３．０（ｍ，８Ｈ，ＣＣＨ２ＮＨ及びＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨ），３．１７（ｓ，２Ｈ，ＯＣＨ２Ｃ），３．３（ｑ，６Ｈ，ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ＝Ｏ），３．４−３．５９（ｍ，２０Ｈ，ＣＨ２），３．８７（ｓ，６Ｈ，Ｏ＝ＣＣＨ２Ｏ），４．２７（ｓ，１８Ｈ，ＣＣＨ２ＯＣ＝Ｏ），７．６９−７．８４（ｍ，９Ｈ，両方ともＣＨ２ＮＨＣ＝Ｏ及びＮＨ３＋）．
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳ，ｍ／ｚ）：［（Ｍ＋２Ｈ）／２］＋（Ｃ８４Ｈ１３６Ｂｒ９Ｎ７Ｏ３３＋２Ｈ）／２の計算値＝１１９６．６；実測値１１９７．４
【０３１０】
次に、化合物Ｌを開始剤として使用してＭＰＣポリマーを合成した。開始剤は、典型的には約１００ｍｇ／ｍＬのＤＭＦ中のストック溶液として調製される。開始剤及びリガンド（２，２’−ビピリジル）をシュレンク管に入れた。得られた溶液をドライアイス／アセトン混合物を使用して−７８℃に冷却し、真空下で１０分間脱気した。この管をアルゴン下で補充し、このシュレンク管に、アルゴン下に置いた触媒（特に指示されない限りＣｕＢｒ）を入れた（開始剤／触媒（ＣｕＢｒ）／リガンドの臭素原子のモル比を１／１／２に保った）。直ちに溶液が暗褐色になった。シュレンク管を密封し、短いサイクルの真空／アルゴンを適用することによって直ちにパージした。窒素下に保ったグローブボックス内で調製した定義付けられた分量の単量体と２００プルーフの脱気エタノールとを混合することにより、ＨＥＭＡ−ＰＣの溶液を調製した。この単量体溶液をシュレンク管に（カニューレを用いて）滴下して添加した（及び軽く撹拌することによってホモジナイズした）。温度は−７８℃に維持した。この反応混合物に、溶液の泡立ちが止むまで少なくとも１０〜１５分間にわたって完全真空を加えた。次にこの管にアルゴンを補充し、室温に加温した。溶液を撹拌すると、重合が進むに従い溶液が粘性になった。３〜８時間後又は一晩ただ放置した後、空気に直接曝露してＣｕ（Ｉ）をＣｕ（ＩＩ）に酸化させることにより反応をクエンチし、混合物が青緑色になり、シリカカラムに通して銅触媒を除去した。収集した溶液を回転蒸発によって濃縮し、得られた混合物をテトラヒドロフランで沈殿させるか、或いは水で透析し、続いて凍結乾燥すると、易流動性の白色粉末が得られた。以下の表は、化合物Ｌを開始剤として用いるポリマーに関するポリマーデータを示す。
【０３１１】
【表９】
2017526635.tif 000027
【０３１２】
次に、マレイミドＭａｌ−ＰＥＧ４−ＰＦＰエステルを上述の７５０ｋＤａポリマーにスナップオンすると（図２９に示すとおり）、ＯＧ１８０２が得られた。２０ｍＬバイアルにポリマーＲ３７０７（Ｌを開始剤として使用して作られる７５０ｋＤａポリマー、５１５ｍｇ）を入れ、エタノール（４．０ｍＬ）を使用して４０分間の撹拌後に溶解させた。これに、アセトニトリル（２２ｕＬ）中４−メチルモルホリンの１％溶液を添加した。別個のバイアルにおいて、アセトニトリル（１．０ｍＬ）中にＭａｌ−ＰＥＧ４−ＰＦＰ（１．９７ｍｇ）を溶解させて、この溶液を室温で約２分間かけてポリマー溶液に添加し、得られた溶液を一晩撹拌した。この反応物を０．１％トリフルオロ酢酸水溶液（２ｍＬ）（ｐＨ約５）、続いて水（約１２ｍＬ）で希釈し、シリンジフィルタ（Ａｃｒｏｄｉｓｃ  Ｓｕｐｏｒ、ＰＮ  ４６１２）でろ過し、３つのＡｍｉｃｏｎ遠心膜透析管（３０，０００ｍｗｃｏ）に均等に入れた。この管を希釈し、水（各約５ｍＬ）と混合し、遠心機（ｒｐｍ  ３２００）に２５分間置いた。分析のためろ液を取り出す一方で、保持液を希釈し、水（約１０ｍＬ／管）と混合する。この遠心手順を更に５回繰り返した後、保持液を取り出してバイアルに入れる。Ａｍｉｃｏｎ膜管を水（各管２×約２ｍＬ）でリンスし、これを保持液と合わせた。保持溶液をシリンジフィルタ（Ａｃｒｏｄｉｓｃ  Ｓｕｐｏｒ、ＰＮ  ４６１２）でろ過し、凍結して凍結乾燥器に置いた。これにより４８５ｍｇが白色粉末として得られた。
【０３１３】
実施例３３．ＴＡＦ（ＯＧ１４４８及びＯＧ１３２１）のＢｉａｃｏｒｅ結合試験
ＯＧ１４４８（及びＯＧ１３２１）のその意図される標的に対する結合親和性をＢｉａｃｏｒｅアッセイで判定した。結合試験は、ＧＬＭ（Ｐｒｏｔｅｏｎ）及びＣＭ４（Ｂｉａｃｏｒｅ）センサーチップを備えた、且つランニング緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ−２０、０．２ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）で平衡化したＢｉｏＲａｄ  Ｐｒｏｔｅｏｎ  ＸＰＲ３６及びＢｉａｃｏｒｅ  ２０００光学バイオセンサーを使用して、２５℃及び３７℃で実施した。ＯＧ１４４８、ＯＧ１３２１、ベバシズマブ、アフリベルセプト及び抗ＰＤＧＦはアミンカップリングによってセンサー表面に固定化した。
【０３１４】
カップリングしたタンパク質とリガンドとの結合を標準方法によって決定した。例えば、５２ｎＭで始まる３倍希釈系列における結合に関してｒｈＶＥＧＦＡ−１６５を試験した。表面全体にｒｈＶＥＧＦＡ−１６５を５分間注入し、次に表面を緩衝液で洗浄したときの解離相を＞１０００秒間モニタした。洗浄相（＞３００秒）の間の見かけ上平坦な反応によって示されるとおり（データは示さず）、ｒｈＶＥＧＦＡ−１６５／ＯＧ１４４８複合体は極めて安定しているように見えた。５２ｎＭ  ｒｈＶＥＧＦＡ−１６５の解離相は２時間超モニタした。時間の経過に伴う結合反応の低下は観察されなかった。
【０３１５】
同様に、１１．４ｎＭで始まる３倍系列における結合に関してｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを試験した。ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ／ＯＧ１４４８相互作用については、質量輸送効果のため、速度定数が速過ぎて信頼性のある報告がなかった。以下のＫD定数が観察された。
【０３１６】
【表１０】
2017526635.tif 000028
【０３１７】
実施例３４．ＴＡＦ−ｒｈＶＥＧＦＲに対するｒｈＶＥＧＦＡ−１６５結合の競合阻害剤
抗ＶＥＧＦ活性に関するその潜在的効力の尺度として、ＶＥＧＦＡ−１６５に対するＴＡＦ（ＯＧ１４４８及びＯＧ１３２１）の結合活性を競合的結合アッセイで判定し、ここでは種々の濃度のＴＡＦを、ｒｈＶＥＧＦとの結合に関して固定化したｒｈＶＥＧＦＲと競合させた。固定化したＶＥＧＦＲが結合したｒｈＶＥＧＦＡ−１６５をＥＬＩＳＡによって決定した（データは示さず）。
【０３１８】
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートの底面をヒトＶＥＧＦＲ１／Ｆｃで１．０μｇ／ｍＬで被覆した。０．３９〜２００ｎＭの範囲の様々な濃度のＴＡＦ（ＯＧ１４４８及びＯＧ１３２１）を０．１ｎＭのビオチン化ＶＥＧＦＡ−１６５と共に３０分間インキュベートした後、ＥＬＩＳＡプレートに加えた。ＶＥＧＦＲ１に結合したビオチン化ｒｈＶＥＧＦＡ−１６５をストレプトアビジン−ＨＲＰによって検出し、続いてＨＲＰ基質で発色させた。ラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ）及びベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）も同様に、ＶＥＧＦＲ１に対するＶＥＧＦＡ−１６５の競合的結合阻害に関して試験した。
【０３１９】
ＯＧ１３２１、ＯＧ１４４８、ラニビズマブ及びベバシズマブは、ｒｈＶＥＧＦＲに対するＶＥＧＦ−１６５の結合の阻害において同程度のＩＣ50を示したことから、抗ＶＥＧＦ活性における同程度の潜在的効力が示唆される。これらの結果は、ＴＡＦ（ＯＧ１４４８及びＯＧ１３２１の両方）が承認されている薬剤ラニビズマブ及びベバシズマブと同程度に強力であり、従って新生血管（即ち湿潤型）ＡＭＤの治療に好適であり得ることを示唆している。
【０３２０】
【表１１】
2017526635.tif 000029
【０３２１】
実施例３５．ＯＧ１４４８−ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの存在下におけるｒｈＶＥＧＦＲに対するｒｈＶＥＧＦＡ−１６５結合の競合阻害剤
ＯＧ１４４８がｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの存在下でｒｈＶＥＧＦＡ−１６５に結合することができるかどうか、即ち、ＴＡＦの受容体デコイに結合するｒｈＰＤＧＦ−ＢＢが、ｒｈＶＥＧＦＡ−１６５に結合するＴＡＦの能力を阻害するかどうかを判定するため、実施例２７と同様の結合試験を、但し様々な濃度のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの存在下で実施した。
【０３２２】
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートの底面をヒトＶＥＧＦＲ１／Ｆｃで１．０μｇ／ｍＬで被覆した。様々な濃度のＯＧ１４４８を０．１ｎＭのｒｈＶＥＧＦＡ−１６５及びそれぞれ０．４、１．２及び２．０ｎＭのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢと共に３０分間インキュベートした後、ＥＬＩＳＡプレートに加えた。ｒｈＶＥＧＦＲ１に結合しているｒｈＶＥＧＦＡ−１６５を、ビオチン化抗ＶＥＧＦＡ抗体、０．４μｇ／ｍＬ、続いてストレプトアビジンＨＲＰ及びＨＲＰ基質によって検出した。ＯＧ１４４８は１０．１のＩＣ５０（ｎＭ）を有することが分かった。これは、実施例２８のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢがない場合に観察されたＩＣ５０に十分に匹敵するものである。ＯＧ１３２１の値はこのアッセイでは決定していないが、ＯＧ１４４８と同程度であることが予想される。
【０３２３】
実施例３６．ＴＡＦ−ｒｈＰＤＧＦＲに対するｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ結合の競合阻害剤
抗ＰＤＧＦ活性のその潜在的効力の尺度として、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢに対するＴＡＦ（ＯＧ１４４８及びＯＧ１３２１）の結合活性を競合的結合アッセイで判定し、ここでは種々の濃度のＴＡＦをｒｈＰＤＧＦＢＢとの結合に関して固定化したＰＤＧＦＲと競合させた。固定化したＰＤＧＦＲに結合したｒｈＰＤＧＦ−ＢＢをＥＬＩＳＡアッセイによって決定した。
【０３２４】
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートの底面をヒトＰＤＧＦＲ／Ｆｃで０．４μｇ／ｍＬで被覆した。１ｐＭ〜２０ｎＭの範囲の様々な濃度のＯＧ１４４８及びＯＧ１３２１を０．２ｎＭのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢと共に３０分間インキュベートした後、ＥＬＩＳＡプレートに加えた。ｒｈＰＤＧＦＲに結合したｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを、ビオチン化抗ＰＤＧＦＢＢ抗体、０．４μｇ／ｍＬ、続いてストレプトアビジン−ＨＲＰ及びＨＲＰ基質によって検出した。
【０３２５】
ＯＧ１４４８、ＯＧ１３２１及び基準抗ＰＤＧＦ抗体は、以下の表に示すとおり、ＰＤＧＦＲに対するｒｈＰＤＧＦＢＢ結合の阻害において同程度のＩＣ５０を示したことから、極めて強力な抗ＰＤＧＦ活性が示唆される。
【０３２６】
【表１２】
2017526635.tif 000030
【０３２７】
実施例３７．ＯＧ１４４８−ｒｈＶＥＧＦＡ−１６５の存在下におけるｒｈＰＤＧＦＲに対するｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ結合の競合阻害剤
ＯＧ１４４８がｒｈＶＥＧＦＡ−１６５の存在下でｒｈＰＤＧＦ−ＢＢに結合することができるかどうかを判定するため、ＰＤＧＦに関する結合試験（実施例２９のとおり）の同様の競合阻害を、ｒｈＶＥＧＦＡ−１６５の存在下及び非存在下で実施した。
【０３２８】
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートの底面をヒトＰＤＧＦＲｂ／Ｆｃで０．４μｇ／ｍＬで被覆した。様々な濃度のＯＧ１４４８を０．２ｎＭのＰＤＧＦＢＢ及び０．２ｎＭのＰＤＧＦＲｂ及びそれぞれ０．２ｎＭ、０．６ｎＭ及び１．０ｎＭのｒｈＶＥＧＦＡ−１６５と共に３０分間インキュベートした後、ＥＬＩＳＡプレートに加えた。ＰＤＧＦＲｂとのＰＤＧＦ−ＢＢの結合を、ビオチン化抗ＰＥＧＦＢＢ抗体、０．４μｇ／ｍＬ、続いてストレプトアビジンＨＲＰ及びＨＲＰ基質によって検出した。ｒｈＶＥＧＦＡ−１６５の存在下におけるＩＣ５０（ｐＭ）（２５）を、実施例２９で得られた数値と比較した。ｒｈＶＥＧＦＡ−１６５の存在下におけるＯＧ１３２１の数値は決定していないが、同程度であることが予想される。
【０３２９】
実施例３８．初代ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＶＥＣ）のＶＥＧＦ誘発性増殖の阻害
内皮細胞増殖は、血管新生、従って新生血管ＡＭＤの発病において極めて重要な段階である。ＯＧ１４４８が初代ヒト網膜微小血管内皮細胞に対するＶＥＧＦの増殖作用をアンタゴナイズする能力は、新生血管ＡＭＤの治療におけるその生物活性の尺度であり得る。
【０３３０】
様々な濃度のＴＡＦ（ＯＧ１４４８及びＯＧ１３２１）及び参照薬物の存在下でＨＲＭＶＥＣを１．３ｎＭのｒｈＶＥＧＦ１６５−Ａによって３日間刺激した。細胞増殖はＷＳＴ−１細胞増殖検出試薬によって計測した。結果を以下の表に示す。
【０３３１】
【表１３】
2017526635.tif 000031
【０３３２】
ＯＧ１４４８及びＯＧ１３２１は、このアッセイにおいて、他の承認されている抗ＶＥＧＦ療法薬と同等のＩＣ５０を実証した。これらのデータは、ＶＥＧＦ媒介性の網膜微小血管内皮細胞増殖活性を阻害する効力について、ＴＡＦ（ＯＧ１４４８及びＯＧ１３２１の両方）がラニビズマブ、ベバシズマブ及びアフリベルセプトと少なくとも同等であることを示している。
【０３３３】
実施例３９．初代ヒト脳血管周皮細胞（ＨＢＶＰ）のＰＤＧＦ誘発性増殖の阻害
周皮細胞遊走及び増殖は血管新生において決定的に重要なイベントであり、従って新生血管ＡＭＤの発病において重要な役割を果たす。ＴＡＦ（ＯＧ１４４８及びＯＧ１３２１）がヒト脳周皮細胞に対するＰＤＧＦの増殖作用をアンタゴナイズする能力は、新生血管ＡＭＤの治療におけるその有効性の尺度であり得る。
【０３３４】
ＨＢＶＰを様々な濃度のＴＡＦ（ＯＧ１４４９及びＯＧ１３２１）及び参照抗ＰＤＧＦ−ＢＢ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＡＢ−２２０−ＮＡ）の存在下で２．０ｎＭのＰＤＧＦＢＢによって３日間刺激した。細胞増殖はＷＳＴ−１細胞増殖検出試薬によって計測した。
【０３３５】
【表１４】
2017526635.tif 000032
【０３３６】
ＯＧ１３２１（ＴＡＦ４４３）をＯＧ１４４８（ＴＡＦ４４３ポリマーコンジュゲート）と比較する上記の様々な実験から、ＨＥＭＡ−ＰＣバイオポリマーとのコンジュゲーションはタンパク質活性に悪影響を与えないことが分かる。
【０３３７】
ＯＧ１４４８及びＯＧ１３２１は抗ＰＤＧＦ抗体と同等のＩＣ５０を示す。
【０３３８】
実施例４０．ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＶＥＣ）とヒト間葉系周皮細胞（ＨＭＰ）との共培養における発芽の阻害
内皮細胞及び周皮細胞が血管に共存し、新生血管ＡＭＤにおいて決定的に重要なイベントである血管新生の間に共に増殖及び遊走するインビボ条件を模倣するため、この複雑なモデルにおいてＯＧ１４４８が血管新生を阻害する能力を判定する目的で、ＨＲＭＶＥＣとＨＭＰとの三次元共培養を樹立した。
【０３３９】
媒体、Ａｖａｓｔｉｎ、抗ＰＤＧＦ−ＢＢ抗体（上記と同じ）、Ａｖａｓｔｉｎと抗ＰＤＧＦ−ＢＢ抗体との併用及びＯＧ１４４８を、７日目に共培養物に加えた。１４日目、ＣＤ３１（内皮細胞）及びａＳＭＡ（周皮細胞）の免疫組織化学染色を使用して、実験群間で比較したときの、樹立した内皮細胞スフェロイドから出て来る芽の長さを定量化した。
【０３４０】
ＯＧ１４４８は、２つの異なる濃度のＡｖａｓｔｉｎ単独又は抗ＰＤＧＦ単独と比べて、ＨＲＭＶＥＣ−ＨＭＰ共培養における内皮／周皮細胞発芽の阻害の有効性がより高かった。更に、ＯＧ１４４８はまた、Ａｖａｓｔｉｎと抗ＰＤＧＦ−ＢＢ抗体との併用と比べても、発芽の阻害の有効性がより高かった。これは、Ａｖａｓｔｉｎ及び抗ＰＤＧＦ−ＢＢ抗体と比べてＯＧ１４４８に相乗作用があることを実証している。この結果は、以下の表及び図４０に示す。
【０３４１】
【表１５】
2017526635.tif 000033
【０３４２】
実施例４１．カニクイザルにおけるレーザー誘発性脈絡膜血管新生の阻害に対するＯＧ１４４８の有効性
十分に認められている霊長類ＣＮＶモデルであるカニクイザルにおけるレーザー誘発性脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）モデルを使用して、ＯＧ１４４８のインビボ有効性を判定した。例えば、Ｎｏｒｋ  ＴＭ，Ｄｕｂｉｅｌｚｉｇ  ＲＲ，Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  ＢＪ，ｅｔ  ａｌ．２０１１．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｃｈｏｒｏｉｄａｌ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｔｉｖｅ  ｌｅｓｉｏｎｓ  ｂｙ  ＶＥＧＦ  ｔｒａｐ  ｉｎ  ｎｏｎｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ．Ａｒｃｈ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１２９：１０４２−１０５２；Ｌｌｏｙｄ  ＲＬ，Ｈａｒｒｉｓ  Ｊ，Ｗａｄｈｗａ  Ｓ，Ｃｈａｍｂｅｒｓ  Ｗ．２００８．Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ａｐｐｒｏｖａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  ｄｒｕｇｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕ．Ｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１９：１９０−１９４（これらは両方とも本明細書によって参照により援用される）を参照されたい。このモデルでは、ブルッフ膜破損所見のあるサル眼の黄斑部における脈絡網膜複合体にレーザー病変が設けられる。２〜３週間で脈絡膜血管新生が生じる。様々な時点で、フルオレセイン血管造影を用いて、原発病変を越えるフルオレセイン漏出を示す臨床的に関連性のある病変（グレードＩＶ）を判定する。このＣＮＶモデルはＣＮＶ病変の研究に広く用いられており、現在承認されているあらゆる新生血管ＡＭＤ治療のベンチマークとして使用されている。このモデルでは、新生血管ＡＭＤに対する承認済みの抗ＶＥＧＦ剤は全て、臨床的に関連性のあるグレードＩＶ病変からの漏出の阻害に有効である。この試験はＣｏｖａｎｃｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩで行われた。
【０３４３】
要約すれば、ＣＮＶ病変を治療前の１４日間にわたって生じさせ、且つ後続の時点で、網膜／脈絡膜上の臨床的に関連性のあるグレードＩＶ病変に焦点を合わせたフルオレセイン血管造影を用いて判定した動物において、０．５又は２．４ｍｇ／眼（タンパク質含有量に基づき計算した）のＯＧ１４４８の単回硝子体内注射に対する用量依存的反応が観察された。０．５ｍｇ／眼では、グレードＩＶ病変に対する有益な効果が顕著であった（ｐ＝０．０１９；一般化推定方程式［ＧＥＥ］モデル；０．５ｍｇ治療群７対ＰＢＳ注射プラセボ群５）。ベバシズマブ又はアフリベルセプトの治療用量内の用量（モル当量）である２．４ｍｇ／眼のＯＧ１４４８は、グレードＩＶ−ＣＮＶ病変の漏出の改善に極めて高い有効性を有した（１５日目から４３日目のグレードＩＶ−ＣＮＶ様病変の７５％の低下と、対するＰＢＳ治療群の２７％の低下）（ｐ＝０．０００７；ＧＥＥモデル；２．４ｍｇ治療群９対ＰＢＳ注射プラセボ群５）。
【０３４４】
ＯＧ１４４８は、このベンチマークＣＮＶモデルにおいて臨床的に関連性のあるグレードＩＶ病変からの漏出の阻害に有効性を示す。
【０３４５】
以下の表に群及び試験設計を示す。この試験には、忍容性に関する群（群１〜４）が含まれたが、しかしながら、本特許出願の目的上、薬理活性に関する群及びリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）注射で処置した対照群のみを示す。
【０３４６】
【表１６】
2017526635.tif 000034
【０３４７】
２つの治療レジメンを判定した。予防レジメンでは、１、１５及び２９日目に０．２４ｍｇ／眼／投与（用量含有量はタンパク質含有量に基づく；群６）のＯＧ１４４８又はＰＢＳ（群５）を両側性に３回硝子体内投与し、投与期間の８日目にレーザー処置を行った。レーザー処置の１５、２１、３０、３７及び４３日目（投与期間の２２、２８、３７、４４及び５０日目）におけるフルオレセイン血管造影図を使用して、臨床的に関連性のあるグレードＩＶ病変を判定した。
【０３４８】
治療レジメン（群７［０．５ｍｇ］、群８［０．５ｍｇ］及び群９［２．４ｍｇ］では、レーザー誘発１５日後にＣＮＶ病変が確立されたとき、６匹の動物の両眼にＯＧ１４４８を０．５ｍｇ（群７及び群９）又は２．４ｍｇ／眼（群９）の用量で硝子体内投与した。レーザー処置の１５、２１、３０、３７及び４３日目に得られたフルオレセイン血管造影図を使用して、臨床的に関連性のあるグレードＩＶ病変を判定した。
【０３４９】
一般化推定方程式（Ｇｅｅ）モデルを使用することにより（Ｈａｌｅｋｏｈ，Ｕ＆Ｙａｎ  Ｊ（２００６）Ｔｈｅ  Ｒ  Ｐａｃｋａｇｅ  ｇｅｅｐａｃｋ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ  Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ  Ｅｑｕａｔｉｏｎｓ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  １５，２，ｐｐ１−１１）、介入レジメンにおいてＯＧ１４４８に対する用量依存的反応が観察された。０．５ｍｇ／眼では、媒体対照と比較したグレードＩＶ病変のパーセント変化率の差が示すとおり、効果は顕著であった（０．５ｍｇ治療群７対ＰＢＳ注射プラセボ群５；ｐ＝０．０１９、ＧＥＥ）。２．４ｍｇ／眼のＯＧ１４４８（ベバシズマブ又はアフリベルセプトの治療用量内のモル当量の用量）では、４３日目に、ＰＢＳ対照群のＣＮＶの２７％の低下と比較して、グレードＩＶ病変のパーセント変化率の７５％の低下（２．４ｍｇ治療群９対ＰＢＳ注射プラセボ群５；ｐ＝０．０００７、ＧＥＥ）が観察された。サルＣＮＶモデルにおける様々な実験からのデータを図４１に示す。
【０３５０】
ＯＧ１４４８は、このＣＮＶモデルにおいて、臨床的に関連性のあるグレードＩＶ病変からの漏出の阻害における用量依存的有効性を示す。これらの結果は、ＶＥＧＦ媒介性血管新生活性に対するＯＧ１４４８の活性を示す上記に記載した試験と一致する。
【０３５１】
実施例４２．組織分布及び薬物動態
雄性ニュージーランド赤白Ｆ１交雑有色ウサギを使用して、125Ｉ−ＯＧ１４４８を用いた組織分布及び薬物動態試験を実施した。要約すれば、この試験は、ウサギにおいてＯＧ１４４８の１６．１日の硝子体半減期を示し、これはアフリベルセプトについて報告されている半減期（４．５日）の約３倍及びラニビズマブの半減期（２．９日）の５倍（Ｂａｋｒｉ  ＳＪ，Ｓｎｙｄｅｒ  ＭＲ，Ｒｅｉｄ  ＪＭ  ｅｔ  ａｌ．２００７．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌ  Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ  ［Ｌｕｃｅｎｔｉｓ］．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  １１４：２１７９−２１８２）であり、血漿曝露は僅か（硝子体曝露の約０．２％）で、血漿中半減期は６．５日であった（アフリベルセプトは６．５日と報告されている）（Ｓｔｒｕｂｌｅ  Ｃ，Ｋｏｅｈｌｅｒ−Ｓｔｅｃ  Ｅ，Ｚｉｍｍｅｒ  Ｅ，ａｎｄ  Ｔｕ  Ｗ．２００８．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｏｃｕｌａｒ  ｔｉｓｓｕｅ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ  ａｆｔｅｒ  ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｒａｂｂｉｔｓ．ＥＶＥＲ；Ｐｏｒｔｏｒｚ，Ｓｌｏｖｅｎｉａ）。
【０３５２】
この試験の目的は、雄ニュージーランド赤白Ｆ１ウサギに対する硝子体内又は静脈内用量投与後の非放射性標識被験物質及び放射性標識被験物質の眼分布及び薬物動態を評価することであった。治療群及び試験設計を以下の表に示す。
【０３５３】
【表１７】
2017526635.tif 000035
【０３５４】
放射分析に基づきＰＫパラメータを得た。硝子体、網膜及び脈絡膜からのクリアランスプロファイルは互いに同様であった。このパターンは、ラニビズマブ又はアフリベルセプトなどの他の確立されたＣＮＶ治療と一致する。以下の表には、０．２５ｍｇの125Ｉ−ＯＧ１４４８の単回両側性硝子体内注射後の種々の眼組織における薬物動態パラメータを示す。
【０３５５】
【表１８】
2017526635.tif 000036
【０３５６】
以下の表及び図４２において、様々なＶＥＧＦ阻害薬の眼組織半減期をＯＧ１４４８と比較し、これは、Ｌｕｃｅｎｔｉｓの３０日及びＥｙｌｅａの５０日とは対照的に、ＯＧ１４４８が９０日より長く０．１μｇ／ｍｌの薬学的に活性な最小阻害濃度を上回ったままであり続け得ることを示唆している。
【０３５７】
【表１９】
2017526635.tif 000037
【０３５８】
この試験は、ウサギにおいてＯＧ１４４８について１６．１日の硝子体半減期を示し、これはアフリベルセプトについて報告されている４．５日の硝子体半減期の約３倍及びラニビズマブの硝子体半減期（２．９日）の５倍（Ｂａｋｒｉ  ２００７、前掲）であり、血漿曝露は低かった（硝子体曝露の約０．２％）。この血漿曝露はアフリベルセプトのものと一致する（Ｓｉｎａｐｉｓ  ＣＩ，Ｒｏｕｔｓｉａｓ  ＪＧ，Ｓｉｎａｐｉｓ  ＡＩ，ｅｔ  ａｌ．２０１１．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌ  ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ  ［Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）］  ｉｎ  ｒａｂｂｉｔｓ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ５：６９７−７０４）。ラニビズマブ及びアフリベルセプトについての既報告のデータと同様に、硝子体網膜及び脈絡膜クリアランスプロファイルは互いに同様である。
【０３５９】
実施例４３．毒性学
ＯＧ１４４８に関する２つのパイロット非ＧＬＰ単回投与眼及び全身忍容性試験をＣｏｖａｎｃｅで実施した：（ｉ）有色ウサギにおける単回投与５７日間硝子体内又は静脈内忍容性試験及び（ｉｉ）カニクイザルにおける硝子体内（５８日間試験）又は静脈内（２８日間試験）投与後の単回投与忍容性試験。
【０３６０】
端的には、ウサギにおける０．２５ｍｇのＯＧ１４４８／投与／眼の単回投与硝子体内注射は、当初は良好に忍容されたが、投与後約２週間で（又はそれ以降に）発生した持続性の前部炎症（軽度〜中等度の結膜充血、軽度〜中等度の房水フレア及びセル）及び後部炎症（軽度〜重度の白色硝子体細胞、軽度〜中等度の硝子体の濁り及び飛蚊症の存在、及び多巣性灰色−白色網膜下炎症性病巣）を伴った。この炎症反応は免疫抑制及び抗炎症療法薬で改善した。投与後の発症のタイミング及び治療反応性は、動物において眼内投与されるヒト化バイオ医薬品に典型的な免疫介在性の反応と一致している。
【０３６１】
対照的に、カニクイザルにおいては０．２４又は１．４ｍｇ  ＯＧ１４４８／投与／眼の単回硝子体内用量が良好に忍容され、眼科学的、臨床的、及び組織病理学的に免疫反応の有害な所見又はエビデンスはなかった。
【０３６２】
有効性試験（上記で考察される）では、１４日間隔で３回の０．２４ｍｇ／眼／投与の硝子体内注射又は０．５ｍｇ／眼／投与の単回注射が、眼検査で示されるとおり、少なくともフォローアップの４０日間良好に忍容された。治療動物の眼に免疫に関連した反応は認められなかった。
【０３６３】
これらの試験は、判定した用量での硝子体内投与又は静脈内投与時にＯＧ１４４８が良好に忍容されることを実証している。
【０３６４】
実施例４４．カニクイザルにおける単回投与忍容性
本試験のこの部分の目的は、カニクイザルにおける硝子体内投与又は静脈内投与後のＯＧ１４４８の忍容性を判定することであった。
【０３６５】
眼及び全身忍容性の群及び試験設計を以下の表に示す。
【０３６６】
【表２０】
2017526635.tif 000038
【０３６７】
投与前及び（ｉ）硝子体内群については：３、８、１５、２９、４３及び５７日目、及び（ｉｉ）静脈内群については：３、８、１５、及び２９日目に、４群全てにわたって認定獣医眼科専門医による眼検査を実施した。該当する場合には、３、８、１５、２９、４３及び５７日目に臨床所見及び臨床病理学で動物をフォローした。解剖学的病理学−全ての動物について剖検時の肉眼的観察、並びに群１及び群２（５７日目）については眼組織及び群３及び群４（２９日目）については標準的な全身器官項目の顕微鏡的評価も実施した。
【０３６８】
いずれの群においても有害な又は毒性学的に意味のある所見はなかった。いずれの群においても臨床観察及び体重の所見はなかった。いずれの群においても解剖学的病理学（硝子体内注射群については眼組織及び静脈内注射群については標準的な器官／組織項目）からのＯＧ１４４８に関連する肉眼的又は顕微鏡的所見はなかった。
【０３６９】
硝子体内投与群の眼科学的所見は、眼房水試料採取部位における軽度から中等度の一過性の房水及び／又は硝子体セル及び瘢痕の存在など、注射に関連する事象に限られた。
【０３７０】
実施例４５．ポリマーＯＧ１７８６の合成
ＯＧ１７８６は、ＯＧ１８０２の合成において前駆体として使用されるポリマー合成用の９アーム開始剤である。各アームの末端は、ＡＴＲＰ下で重合を開始させることが可能な２−ブロモイソ酪酸塩である。ＯＧ１７８６は、図３０に示されるとおり、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の塩である。ＯＧ１７８６は以下のとおり調製される。初めに、ＯＧ１５５０をＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）と反応させて、図３１に示すとおりのＯＧ１５４６を生成する。
【０３７１】
磁石撹拌子及び添加用漏斗を備えた１Ｌ丸底フラスコに、ＯＧ１５５０（１４．８ｇ）、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）（３５０ｍｌ）及び水（３０ｍｌ）を加えた。混合物を撹拌してＯＧ１５５０を溶解させて、次に氷浴中で冷却した。この混合物に、水中（９０ｍｌ）のトリフルオロ酢酸（４．９ｍｌ）の溶液を９０分かけて滴下して添加した。添加完了後、混合物を更に１５分間撹拌し、次に氷浴から取り出し、室温に温まるまで放置した。ｔｌｃが約５％の出発物質の残留を示し、且つ水溶液のｐＨが３〜４（ｐＨ試験紙）になるまで、この混合物を（氷浴から取り出した後）更に４〜５時間撹拌した。
【０３７２】
この混合物を分配した。ＭＴＢＥ層を水（３０ｍｌ）で洗浄した。水層を合わせ、次にその水層をＭＴＢＥ（１５０ｍｌ）で抽出した。第２のＭＴＢＥ相を水（３０ｍｌ）で洗浄した。合わせた水層を第３の部分量のＭＴＢＥ（１００ｍｌ）で洗浄した。第３のＭＢＴＥ相を水（２５ｍｌ）で洗浄した。これらの水層を再び合わせた（約２５０ｍｌ、ｐＨ約４（ｐＨ試験紙による））。
【０３７３】
凍結乾燥によって生成物を収集した。１１．５ｇの白色固体が得られた。この材料は極めて吸湿性が高く、従って窒素下で取り扱うことが最良である。生成物はＬＣＭＳによって確認した。
【０３７４】
次に調製したＯＧ１５４６をＯＧ１５６３と反応させてＯＧ１７８４を得た（図３２に示すとおり）。
【０３７５】
撹拌子を備えた窒素下の２５０ｍｌフラスコに、ＯＧ１５４６（吸湿性、９．０ｇ）、続いてＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１１０ｍｌ）を添加した。この混合物を、全てのＯＧ１５４６が溶解するまで室温で撹拌し（約１５分間）、次にＯＧ１５６３（２９．９ｇ）を添加し、この混合物を更に３分間、ＯＧ１５６３も溶解し終えるまで撹拌した。得られた溶液を氷浴中で冷却し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３７．６ｍｌ）を３分かけて添加し、続いてプロピルホスホン酸無水物（Ｔ３Ｐ）、酢酸エチル中５０％（３４．５ｍｌ）を５分かけて滴下して添加した（Ｔ３Ｐの添加は発熱性である）。Ｔ３Ｐの添加が完了した後、フラスコを冷却浴から取り出し、室温に達するまで放置した。次にＬＣＭＳ分析のため５分間隔で試料を採取した。反応物はごく薄い黄色／黄褐色を示した。
【０３７６】
２０分後、反応物を再び氷浴中で冷却し、５ｍｌの水を添加した。次にこの混合物を冷却浴から取り出し、更に５０ｍｌの分量の水を添加し、続いて５０ｍｌの０．５Ｍ  クエン酸、次に酢酸イソプロピル（３００ｍｌ）を添加した。この混合物を分配した。水相（約３００ｍｌ）を更なる酢酸イソプロピル（１５０ｍｌ）で抽出した。水相はＨＰＬＣ試験についてＡＱ１であった。合わせた有機物をクエン酸水溶液（１１５ｍｌ、６５ｍＭ、これは１５ｍｌの０．５Ｍ  クエン酸及び１００ｍｌ水の混合物であった）で洗浄し、水相はＡＱ２（ｐＨ約３）であった。有機相を水／飽和塩化ナトリウム（１００ｍｌ／２５ｍｌ）で洗浄し、水相はＡＱ３（ｐＨ約３）であった。最後に有機相を飽和塩化ナトリウム（１００ｍｌ）で洗浄し、水相はＡＱ４であった。いずれのＡＱ画分も、有意な生成物を含有しなかった（データは提供せず）。有機相により、ＬＣＭＳで生成物が確認された。生成物を硫酸ナトリウム（８０ｇ）で乾燥させて、ろ過し、酢酸イソプロピル（７５ｍｌ）でリンスし、ロータリーエバポレータで濃縮すると、黄褐色の油（３３．２ｇ）となった。この粗生成物を窒素下で一晩保存した。
【０３７７】
翌日、粗生成物を室温にし、次にアセトニトリル／水（４６ｍｌ／１２ｍｌ）中に溶解し、ＨＰＬＣフィルタディスク（Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ  ＰＴＦＥ０．２μｍ、製品番号０２９１５−２０）を使用してろ過した。ろ液を３つの部分量に等分し、３回のランで精製した。
【０３７８】
５０％アセトニトリル／水で平衡化したＲｅｄｉＳｅｐ  Ｒｆ  Ｇｏｌｄ  Ｃ１８カラム（２７５ｇ、ＳＮ６９−２２０３−３３９、ロット番号２４１２６−６１１Ｙ）にロードした。以下の勾配を使用して材料を１００ｍｌ／分で溶出させた（溶媒Ａ：水、溶媒Ｂ：アセトニトリル）。関連性のある画分は全て、ＨＰＬＣによって確認した。十分な純度に調整した画分を（３回のラン全てから）プールし、ロータリーエバポレータで（浴温を約２０℃に保って）濃縮し、次にジクロロメタン（１００ｍｌ）と水（５ｍｌ）／飽和塩化ナトリウム（２５ｍｌ）とで分配した。水相をジクロロメタン（２×３０ｍｌ）で更に２回抽出した。合わせた有機相を硫酸ナトリウム（３５ｇ）で乾燥させて、ろ過し、ＤＣＭ（３０ｍｌ）でリンスし、濃縮した。生成物及び純度はＬＣＭＳ方法によって確認した。
【０３７９】
【表２１】
2017526635.tif 000039
【０３８０】
次に、図３３に示すとおり、ＯＧ１７８４からＯＧ１４０５を調製した。磁石撹拌子を備えた５００ｍｌ丸底フラスコにＯＧ１７８４（２０．９ｇ）、続いてジクロロメタン（５０ｍｌ）、次にトリフルオロ酢酸（２０ｍｌ）を添加した。この混合物を室温で撹拌し、２３分でＨＰＬＣ分析によって完全な脱保護が示された。この混合物をロータリーエバポレータで濃縮し、ジクロロメタン（２５ｍｌ）中に再溶解して再濃縮し、次にアセトニトリル（２５ｍｌ）中に再溶解して再濃縮した。生成物はＬＣＭＳによって確認した。上記からの材料（ＯＧ１４０５、３４．５ｇ、２１．０ｇを定量的収量と見なす）を、次のステップで粗油として使用した。精製は不要である。
【０３８１】
次に、図３４に示すとおり、ＯＧ１４０５をＯＧ１４０２と反応させてＯＧ１７８５を調製した。撹拌子を備えた窒素下の５００ｍｌフラスコにＯＧ１４０２（５．５ｇ）、続いてアセトニトリル（７０ｍｌ）、次にＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２６．３ｍｌ）及びＴ３Ｐ溶液（上記参照）（７．９ｍｌ）を入れた。この溶液を室温で３０分間撹拌し、次に氷水浴中で冷却し、アセトニトリル（７０ｍｌ）中ＯＧ１４０５（上記からの粗油、３４．５ｇ）の溶液を添加した。この混合物を室温に加温した。２０分後、反応物を氷水浴中で冷却し、水（５ｍｌ）でクエンチした。次にこの混合物を、容積が半分になるまでロータリーエバポレータを使用して真空下で濃縮した。ＬＣＭＳ用に試料を採取した。
【０３８２】
更なる水（５０ｍｌ）、続いて０．５Ｍクエン酸（７５ｍｌ）及び酢酸イソプロピル（１７５ｍｌ）を添加した。この混合物を５分で分配した。水相を更なる酢酸イソプロピル（５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相をクエン酸水溶液（０．１３Ｍ、３０ｍｌ、１０ｍｌの０．５Ｍクエン酸と２０ｍｌ水とからなる）で洗浄した。次に有機相を飽和塩化ナトリウム（２５ｍｌ）と水（２５ｍｌ）との混合物で洗浄し、次に最後に飽和塩化ナトリウム（２５ｍｌ）で洗浄した。次にこれらを硫酸ナトリウム（１２４ｇ）で乾燥させて、ろ過し、酢酸イソプロピル（３０ｍｌ）でリンスし、ロータリーエバポレータ下で濃縮すると、黄褐色の油（２７．３ｇ）になった。ＬＣＭＳ分析用に試料を採取した。
【０３８３】
この油をアセトニトリル／水（３：１、１５ｍｌ／５ｍｌ）中に溶解し、ＨＰＬＣフィルタディスク（Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ  ＰＴＦＥ膜０．２μｍ、製品番号０２９１５−２０）でろ過し、３つの部分量に等分し、その各々を以下のとおり個別に精製した。
【０３８４】
部分量を５０％溶媒Ｂ（アセトニトリル）／５０％溶媒Ａ（水）で平衡化したＲｅｄｉ−Ｓｅｐ  Ｇｏｌｄ  Ｃ１８カラム（２７５ｇ、ＳＮ−６９−２２０３−３３９、ロット２４１２３４−６１１Ｗ）にロードした。次にこの材料を逆相ＨＰＬＣによって溶媒Ａ：水／溶媒Ｂ：アセトニトリル勾配で精製した。適切な画分をプールし、ジクロロメタン（１５０ｍｌ）と水（５ｍｌ）／飽和塩化ナトリウム（２５ｍｌ）とで分配した。水相をジクロロメタン（２×５０ｍｌ）で２回抽出した。合わせた有機相を硫酸ナトリウム（６０ｇ）で乾燥させて、ろ過し、ジクロロメタン（４０ｍｌ）でリンスして濃縮した。ＬＣＭＳを含めた様々な分析によって構造及び純度を確認した。ＯＧ１７８５は泡状の固体（Ｒ５３２９、１９．０ｇ、８３％収率、９５．１％純度（ａ／ａ２１０ｎｍ）として単離され、窒素下４℃で保存した。
【０３８５】
次に、図３５に示すとおり、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を使用してＯＧ１７８５のｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル保護基を取り除き、ＯＧ１７８６を作製した。
【０３８６】
実施例４６．ポリマー１８０１の合成
化合物ＯＧ１８０２をＴＡＦ４４３のスルフヒドリル基にコンジュゲートしてＯＧ１４４８を作製する。ポリマーＯＧ１８０１は、初めに開始剤ＯＧ１７８６から作られる。ＯＧ１８０１はアミン官能基を有し、これはポリマー合成中の安定性が（マレイミドと比べて）高い。ポリマーＯＧ１８０１の合成には改良型のＡＴＲＰを使用し、ここではＣｕ（ＩＩ）に金属銅を加えることによってインサイチュで銅種（Ｃｕ（Ｉ））を生成させる。この反応に必要な出発物質及び試薬は、単量体（ＨＥＭＡ−ＰＣ）ＯＧ４７のバッチ入力、並びに目標分子量（ＭＷ）に基づき計算する。
【０３８７】
グローブボックスにおいて５０ｇの単量体ＯＧ４７を秤量し、２００ｍＬの脱気ＥｔＯＨを添加して単量体を室温で溶解させ、単量体濃度検査用に試料を採取した。５００ｍＬフラスコにＣｕ（ＩＩ）、Ｂｐｙ、Ｃｕ（０）を秤量し、アルゴンでパージしながらフラスコに単量体溶液を添加し、フラスコを栓で密封し、気泡がなくなるまで２５分間減圧した。反応物の色が淡緑色から濃緑色、次に淡褐色に徐々に変化した。グローブボックスにおいて約２００ｍｇの開始剤ＯＧ１７８６を秤量し、室温下で約２０００ｕＬのＤＭＦ中に溶解させて１００ｍｇ／ｍＬのストック溶液を作り、開始剤濃度及び純度の検査用の試料を採取し、アルゴン下でフラスコに開始剤溶液を添加した。時間と共に反応液が暗褐色になり、濃厚になり始めた。この系を密封し、２日間反応を生じさせておいた。
【０３８８】
次に、マレイミドを付加するためＯＧ１８０１を調製し、以下のとおり触媒（銅）を除去した。プレパックのＲｅｄｉＳｅｐ（登録商標）Ｒｆ順相シリカカラムを使用して触媒を除去する。カラムのサイズは、反応混合物中の銅の量に基づき選択する。例えば、ＯＧ１８０１の５０ｇバッチには、３３０ｇカラム（カタログ番号６９−２２０３−３３０、カラムサイズ３３０ｇ、ＣＶ＝４４３ｍＬ）を使用した。ＥｔＯＨが溶出溶媒であることに伴い、全ての接続部にテフロン（登録商標）製チューブを使用する。
【０３８９】
銅の除去後、全ての画分をバッチ単位で丸底フラスコに移し、ロータリーエバポレータによって減圧下４５〜５０℃でＥｔＯＨを蒸発乾固させた。このステップでは、凝結から回収されるＥｔＯＨ容積をモニタして、＞９０％のＥｔＯＨの除去を確認した。２５０ｍＬのＷＦＩ中にポリマーを溶解し、０．２ｕｍフィルタを使用してろ過した。それにより約１５０ｍｇ／ｍＬの透明〜淡黄色のポリマー溶液が得られた。この溶液は、使用まで２〜８℃で最長３ヵ月間保存することができた。
【０３９０】
実施例４７．ポリマーＯＧ１８０２の合成
反応に必要な出発物質及び試薬は、ＯＧ１８０１のバッチ入力に基づき計算する。リンカーは３−マレイミドプロピオン酸、ＮＨＳエステルである。３０ｍｌの０．５Ｍリン酸ナトリウム（ＷＦＩ中、ｐＨ８）を５０ｇのポリマー溶液（約１５０ｍｇ／ｍＬ）に添加した。１分間撹拌させておいた。ｐＨはｐＨ試験紙によるときに８．０であった。２０４．８ｍｇのリンカーを秤量し、ＤＭＦ  ４．１ｍＬ中に溶解して５０ｍｇ／ｍＬのストック溶液とした。激しく撹拌しながらポリマー溶液にリンカー溶液を毎分８１５ｕＬで滴下して添加した。５分間かけて４０９５ｕＬのリンカー溶液を添加した。室温で３０分間反応させた。最終ｐＨが５に達するように２０ｍＬの５％酢酸で反応をクエンチした。１Ｌ真空フィルタ（０．２ｕｍ）を使用してこの溶液をろ過した。
【０３９１】
次にＯＧ１８０２を以下のとおり精製する。水溶液系のポリマー精製に、Ｍｉｌｉｐｏｒｅクロスフローカセットを使用した。ポリマー溶液を２５０ｍＬ（約２００ｍｇ／ｍＬ）に濃縮することから開始した。リザーバから新鮮ＷＦＩを添加し、新鮮ＷＦＩフィードの流量が透過液（約２ｍＬ／分）と同じになるように調整した。ＵＦ／ＤＦを２〜８℃で一晩セットアップした。典型的には２．５ＬのＷＦＩを使用した（１０倍の対ポリマー溶液容積比）。純度検査のため保持液の試料を採取した。目標純度は＞９８％であった。０．２μＭ  １Ｌフィルタボトルによってポリマー溶液をろ過した。このポリマー溶液は、コンジュゲーションまで２〜８℃で最長３ヵ月間保存することができた。
【０３９２】
実施例４８．ＯＧ１４４８の製剤；易注入性
１．７ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4；５ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4；１５０ｍＭ  ＮａＣｌを使用して滅菌注射用水中にＯＧ１４４８の２７．２ｍｇ／ｍｌ及び４４．５ｍｇ／ｍｌ溶液を調製した。容積に応じてＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ＸＬ  ＴＦＦカートリッジ（カタログ番号ＰＸＢ０３０Ａ５０、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、３０ｋＤ  ＭＷＣＯ又はＶＩＶＡＣＥＬＬ  １００スピンコンセントレーター（カタログ番号ＶＣ１０２２、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）、３０ｋＤ  ＭＷＣＯにより、ＯＧ１４４８コンジュゲートを濃縮した。上記に記載する有効性実験用のサルにおいて３０ゲージ（Ｇ）の１／２インチ針で２７．２ｍｇ／ｍｌのＴＡＦ溶液を硝子体内注射した。ＯＧ１４４８を針に押し通すのに、過度の圧力は不要であった。実験室で易注入性について４４．５ｍｇ／ｍｌ溶液を試験し、これも過度の圧力なしに女性の操作者が針に押し通すことが可能であった。
【０３９３】
実施例４９．安定性
ＰＢＳ中４４．５ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．４のＯＧ１４４８基準ロットＲ５６０６（上記に記載したとおり）を使用して、進行中の安定性試験を実施した。この試験には３つの温度を選択した：室温（ＲＴ）、４℃及び−２０℃。試料抜き取り頻度は、０、１４、２８、９１、１８１及び３６２日である。試料は、未反応の及び捕捉されたタンパク質、並びに可能性のある凝集について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び分析的ＡＥ−ＨＰＬＣによって判定した。ＡＥ−ＨＰＬＣによるとき、ＯＧ１４４８は３つ全ての温度で最長６ヵ月まで、時点０のレベルと同程度である５％未満のタンパク質不純物を示すことが観察された（データは示さず）。この試験は進行中である。
【０３９４】
実施例５０．代替的ホスホリルコリンポリマー
ＨＥＡ−ＰＣポリマーを以下に記載するとおり合成した。ＨＥＡ−ＰＣ（２−（アクリロイルオキシ）エチル−２−（トリメチルアンモニウム）エチルホスフェート）（これは、上記に記載したメタクリレートＨＥＭＡ−ＰＣとは対照的に、アクリレートである）は、以下の構造を有する。
【化１７】
2017526635.tif 000040
ＨＥＡ−ＰＣを、実施例２３に化合物Ｌとして示す開始剤に重合した。
【０３９５】
【表２２】
2017526635.tif 000041
【０３９６】
２．２ｍｇの開始剤を１１μｌの乾燥ＤＭＦに溶解することにより２００ｍｇ／ｍＬの開始剤のストック溶液を調製し、及び４．６ｍｇのＭｅ６ＴＲＥＮを２３μＬの乾燥ＤＭＦに溶解することにより２００ｍｇ／ｍｌのリガンド溶液を調製した。８．２５μｌの開始剤ストック溶液及び１３．６μｌのリガンドをチューブに分注する。−７８℃で５分間脱気し、次にアルゴンを補充して、１．２ｍｇのＣｕＢｒを添加する。脱気し、アルゴンを補充する。−７８℃の反応器内にあるこの溶液にメタノール中ＨＥＡ−ＰＣのストック溶液（０．４６１ｇのＨＥＡ−ＰＣを秤量し、それを０．５ｍＬのメタノールに溶解させる）を添加する。バイアルを２００μｌのメタノールでリンスし、それを−７８℃の反応器内に加え、次に、０．５ｍＬの蒸留水、次に更なる２００μｌの水を添加する。気泡が見えなくなり、一切の不均一性が消える（固体粒子が溶解又は消失する）まで、完全に脱気する。４ｐｓｉのアルゴンを補充し、反応を室温で１時間進行させる。反応物は既に粘稠性であった。この反応を約１時間進行させた。メタノール中ビピリンジン（ｂｉｐｙｒｉｎｄｉｎｅ）溶液（０．５ｕＬ中５ｍｇ）を添加した。更に２〜３ｍｌのメタノールを添加し、触媒を４℃で一晩酸化させた。１Ｈ  ＮＭＲによって決定した変換率は９４％と推定された。
【０３９７】
翌日、ポリマーを透析し、Ｓｈｏｄｅｘ  ＳＢ８０６Ｍ＿ＨＱカラム（７．８×３００ｍｍ）を使用して１×ＰＢＳ  ｐＨ７．４中１ｍｌ／分でＳＥＣ／ＭＡＬＳ分析に供すると、１．１５７のＰＤＩ、７２３．５ｋＤａのＭｎ、８２０．４ｋＤａのＭｐ及び８３７．２ｋＤａのＭｗが得られた（透析前、ＰＤＩは１．１２、Ｍｎ＝６９５ｋＤａ、Ｍｐ＝７７８ｋＤａである）。次にポリマーにマレイミド官能基を付加して、ポリマーがＴＡＦ４４３を含めたタンパク質とコンジュゲートできるようにした。
【０３９８】
次に、マレイミドＭａｌ−ＰＥＧ４−ＰＦＰ（上記の実施例２３参照）エステルを実施例２３に示されるとおりＨＥＡ−ＰＣポリマーにスナップオンした。得られたマレイミド官能化ＨＥＡ−ＰＣポリマーは、次に、ＨＥＭＡ−ＰＣポリマーについて本明細書で考察するとおりスルフヒドリル基にコンジュゲートすることができる。
【０３９９】
以下の構造を有する単量体２−（アクリルアミル）エチル−２−（トリメチルアンモニウム）エチルホスフェート（Ａｍ−ＰＣ）を使用して、アクリルアミドＰＣポリマーも作製した。
【化１８】
2017526635.tif 000042
【０４００】
Ａｍ−ＰＣは、構造：
【化１９】
2017526635.tif 000043
を有する３アーム開始剤（ＴＦＡ塩）を用いた重合に使用した。
【０４０１】
Ａｍ−ＰＣポリマーの合成は以下のとおり行った。
【０４０２】
【表２３】
2017526635.tif 000044
【０４０３】
９ｍｇのＭｅ６ＴＲＥＮを４５ｕＬの乾燥ＤＭＦに溶解することにより、２００ｍｇ／ｍＬのリガンドのストック溶液を調製した。１９．７ｕＬのストック溶液を反応槽に加える。６．５ｍｇの材料を３２．５ｕＬのＤＭＦに溶解することにより、２００ｍｇ／ｍＬの開始剤のストック溶液を調製する。１１ｕＬの開始剤ストック溶液を上記のリガンドに添加する。５分間脱気する。１ｍｇのＣｕＢｒを添加する。４ｍｇ  ＣｕＢｒ2を２０μＬのＤＭＦに溶解することにより、２００ｍｇ／ｍＬのＣｕＢｒ2のストック溶液を調製する。０．５ｇの単量体（ＡｍＰＣ）を１ｍＬのメタノール（低速溶解／粘性溶液）に添加し、続いて１ｕＬのＣｕＢｒ2ストック溶液に添加する。上記の反応混合物に単量体溶液を滴下して添加する。１ｍＬの水でリンスする。反応混合物を完全に脱気する（凍結融解）。反応を２４時間進行させる。
【０４０４】
その後、Ａｍ−ＰＣポリマーを透析し得る。上記のポリマーの分子量をＳＥＣ／ＭＡＬＳによって決定した。Ｍｎは２１５ｋＤａであり、Ｍｐ：２５０ｋＤａ、ＰＤＩは１．１７である。変換率は１Ｈ  ＮＭＲによって９４％と推定された。上記でＨＥＭＡ−ＰＣ及びＨＥＡ−ＰＣについて考察したとおり、Ａｍ−ＰＣポリマーにマレイミド官能基を付加することができる。上記に記載したとおり、マレイミド官能化Ａｍ−ＰＣポリマーはＴＡＦ４４３などのタンパク質にコンジュゲートすることができる。
【０４０５】
実施例５１．化合物中の遊離マレイミドを計算するための逆エルマンアッセイ
ポリマーＯＧ１８０１にマレイミド官能基を付加してＯＧ１８０２を形成した後（上記参照）、エルマンアッセイを用いて試料中の官能性マレイミド（即ちコンジュゲート可能）の量を決定する。チオールは、中性及びアルカリｐＨの水中でエルマン試薬（ＤＴＮＢ）をＴＮＢ−、次にＴＮＢ２−に変換し、これにより黄色が発色する（４１２ｎｍで計測）。システインで標準曲線を作成する。マレイミドはチオールと反応するため、このアッセイは実際には残ったチオール（システイン）を計測する。（元のチオール−マレイミドポリマーを加えた後に残ったチオール）／（元のチオール）として阻害を計算し、パーセンテージで表す。
【０４０６】
アッセイに用いる試薬：６２．５μＭ〜２μＭのシステインを使用して標準曲線を作成した。１×ＰＢＳ  ｐＨ７．４（反応緩衝液）中に粉末を溶解し、完全に混合することにより、ポリマーストック溶液を調製した。等モルのポリマー及びシステイン溶液を混合し、２７℃で３０分間反応させた。システイン標準及びポリマー／システイン反応物に１５０μＭのＤＴＮＢ溶液を添加し、２７℃で５分間発色させた。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘプレートリーダーで４１２ｎｍのＯＤを読み取り、Ｓｏｆｔｍａｘ  Ｐｒｏソフトウェア及びシステイン標準曲線でパーセント阻害率を計算した。
【０４０７】
上記又は以下に引用する全ての特許出願、ウェブサイト、他の刊行物、受託番号などは、個々のアイテムそれぞれがそのように参照により援用されることを具体的且つ個別に示されたものとみなすのと同程度にあらゆる目的において全体として参照により援用される。別の時点で別のバージョンの配列が受託番号に関連付けられる場合、本願の有効出願日時点でその受託番号に関連付けられたバージョンが意図される。有効出願日とは、実際の出願日又は該当する場合にはその受託番号を参照する優先出願の出願日のうちの早い方を意味する。同様に、別の時点で別のバージョンの刊行物、ウェブサイトなどが発表される場合、特に指示されない限り、本願の有効出願日時点で最新の発表であるバージョンが意図される。本発明の任意の特徴、ステップ、要素、実施形態、又は態様は、特に具体的に指示されない限り、任意の他のものと組み合わせて用いることができる。本発明は明確さ及び理解のため例証及び実施例として幾らか詳細に記載されているが、添付の特許請求の範囲内で特定の変更形態及び改良形態がなされ得ることは明らかであろう。
【０４０８】
配列
配列番号１
1 LVVTPPGPEL VLNVSSTFVL TCSGSAPVVW ERMSQEPPQE MAKAQDGTFS SVLTLTNLTG LDTGEYFCTH NDSRGLETDE
81 RKRLYIFVPD PTVGFLPNDA EELFIFLTEI TEITIPCRVT DPQLVVTLHE KKGDVALPVP YDHQRGFSGI FEDRSYICKT
161 TIGDREVDSD AYYVYRLQVS SINVSVNAVQ TVVRQGENIT LMCIVIGNEV VNFEWTYPRK ESGRLVEPVT DFLLDMPYHI
241 RSILHIPSAE LEDSGTYTCN VTESVNDHQD EKAINITVVE SGGGGGSGGG GSDIQMTQSP SSLSASVGDR VTITCSASQD
321 ISNYLNWYQQ KPGKAPKVLI YFTSSLHSGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL QPEDFATYYC QQYSTVPWTF GQGTKVEIKR
401 TVAAPSVFIF PPSDEQLKSG TASVVCLLNN FYPREAKVQW KVDNALQSGN SQESVTEQDS KDSTYSLSST LTLSKADYEK
481 HKVYACEVTH QGLSSPVTKS FNRGEC
配列番号２
1 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYTFT NYGMNWVRQA PGKGLEWVGW INTYTGEPTY AADFKRRFTF SLDTSKSTAY
81 LQMNSLRAED TAVYYCAKYP HYYGSSHWYF DVWGQGTLVT VSSASTKGPS VFPLAPSSKS TSGGTAALGC LVKDYFPEPV
161 TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG TQTYICNVNH KPSNTKVDKK VEPKSCDKTH TCPPCPAPEL
241 LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL
321 NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT
401 PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK
配列番号３
1 LVVTPPGPEL VLNVSSTFVL TCSGSAPVVW ERMSQEPPQE MAKAQDGTFS SVLTLTNLTG LDTGEYFCTH NDSRGLETDE
81 RKRLYIFVPD PTVGFLPNDA EELFIFLTEI TEITIPCRVT DPQLVVTLHE KKGDVALPVP YDHQRGFSGI FEDRSYICKT
161 TIGDREVDSD AYYVYRLQVS SINVSVNAVQ TVVRQGENIT LMCIVIGNEV VNFEWTYPRK ESGRLVEPVT DFLLDMPYHI
241 RSILHIPSAE LEDSGTYTCN VTESVNDHQD EKAINITVVE SGGGDIQMTQ SPSSLSASVG DRVTITCSAS QDISNYLNWY
321 QQKPGKAPKV LIYFTSSLHS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLQPEDFATY YCQQYSTVPW TFGQGTKVEI KRTVAAPSVF
401 IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV
481 THQGLSSPVT KSFNRGEC
配列番号４
1 LVVTPPGPEL VLNVSSTFVL TCSGSAPVVW ERMSQEPPQE MAKAQDGTFS SVLTLTNLTG LDTGEYFCTH NDSRGLETDE
81 RKRLYIFVPD PTVGFLPNDA EELFIFLTEI TEITIPCRVT DPQLVVTLHE KKGDVALPVP YDHQRGFSGI FEDRSYICKT
161 TIGDREVDSD AYYVYRLQVS SINVSVNAVQ TVVRQGENIT LMCIVIGNEV VNFEWTYPRK ESGRLVEPVT DFLLDMPYHI
241 RSILHIPSAE LEDSGTYTCN VTESVNDHQD EKAINITVVE SGGGGGSGGG GSEVQLVESG GGLVQPGGSL RLSCAASGYT
321 FTNYGMNWVR QAPGKGLEWV GWINTYTGEP TYAADFKRRF TFSLDTSKST AYLQMNSLRA EDTAVYYCAK YPHYYGSSHW
401 YFDVWGQGTL VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KSTSGGTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA VLQSSGLYSL
481 SSVVTVPSSS LGTQTYICNV NHKPSNTKVD KKVEPKSCDK THTCPPCPAP ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV
561 VVDVSHEDPE VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKALPAPI EKTISKAKGQ
641 PREPQVYTLP PSREEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV
721 FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK
配列番号５
1 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCSASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKVLIYF TSSLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP
81 EDFATYYCQQ YSTVPWTFGQ GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ
161 ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC
配列番号６
1 LVVTPPGPEL VLNVSSTFVL TCSGSAPVVW ERMSQEPPQE MAKAQDGTFS SVLTLTNLTG LDTGEYFCTH NDSRGLETDE
81 RKRLYIFVPD PTVGFLPNDA EELFIFLTEI TEITIPCRVT DPQLVVTLHE KKGDVALPVP YDHQRGFSGI FEDRSYICKT
161 TIGDREVDSD AYYVYRLQVS SINVSVNAVQ TVVRQGENIT LMCIVIGNEV VNFEWTYPRK ESGRLVEPVT DFLLDMPYHI
241 RSILHIPSAE LEDSGTYTCN VTESVNDHQD EKAINITVVE SGGGEVQLVE SGGGLVQPGG SLRLSCAASG YTFTNYGMNW
321 VRQAPGKGLE WVGWINTYTG EPTYAADFKR RFTFSLDTSK STAYLQMNSL RAEDTAVYYC AKYPHYYGSS HWYFDVWGQG
401 TLVTVSSAST KGPSVFPLAP SSKSTSGGTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSVVTVPS
481 SSLGTQTYIC NVNHKPSNTK VDKKVEPKSC DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED
561 PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT
641 LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
721 ALHNHYTQKS LSLSPGK
配列番号７
1 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYTFT NYGMNWVRQA PGKGLEWVGW INTYTGEPTY AADFKRRFTF SLDTSKSTAY
81 LQMNSLRAED TAVYYCAKYP HYYGSSHWYF DVWGQGTLVT VSSASTKGPS VFPLAPSSKS TSGGTAALGC LVKDYFPEPV
161 TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG TQTYICNVNH KPSNTKVDKK VEPKSCDKTH TCPPCPAPEL
241 LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL
321 NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT
401 PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGGGGGSGGG GSGGGGSGGG GSGLVVTPPG
481 PELVLNVSST FVLTCSGSAP VVWERMSQEP PQEMAKAQDG TFSSVLTLTN LTGLDTGEYF CTHNDSRGLE TDERKRLYIF
561 VPDPTVGFLP NDAEELFIFL TEITEITIPC RVTDPQLVVT LHEKKGDVAL PVPYDHQRGF SGIFEDRSYI CKTTIGDREV
641 DSDAYYVYRL QVSSINVSVN AVQTVVRQGE NITLMCIVIG NEVVNFEWTY PRKESGRLVE PVTDFLLDMP YHIRSILHIP
721 SAELEDSGTY TCNVTESVND HQDEKAINIT VVESG
配列番号８
1 LVVTPPGPEL VLNVSSTFVL TCSGSAPVVW ERMSQEPPQE MAKAQDGTFS SVLTLTNLTG LDTGEYFCTH NDSRGLETDE
81 RKRLYIFVPD PTVGFLPNDA EELFIFLTEI TEITIPCRVT DPQLVVTLHE KKGDVALPVP YDHQRGFSGI FEDRSYICKT
161 TIGDREVDSD AYYVYRLQVS SINVSVNAVQ TVVRQGENIT LMCIVIGNEV VNFEWTYPRK ESGRLVEPVT DFLLDMPYHI
241 RSILHIPSAE LEDSGTYTCN VTESVNDHQD EKAINITVVE SGGGGGSGGG GSEVQLVESG GGLVQPGGSL RLSCAASGYD
321 FTHYGMNWVR QAPGKGLEWV GWINTYTGEP TYAADFKRRF TFSLDTSKST AYLQMNSLRA EDTAVYYCAK YPYYYGTSHW
401 YFDVWGQGTL VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KSTSGGTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA VLQSSGLYSL
481 SSVVTVPSSS LGTQTYICNV NHKPSNTKVD KKVEPKSCDK THTCPPCPAP EAAGAPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV
561 VVDVSHEDPE VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKALPAPI EKTISKAKGQ
641 PREPCVYTLP PSREEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV
721 FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK
配列番号９
1 LVVTPPGPEL VLNVSSTFVL TCSGSAPVVW ERMSQEPPQE MAKAQDGTFS SVLTLTNLTG LDTGEYFCTH NDSRGLETDE
81 RKRLYIFVPD PTVGFLPNDA EELFIFLTEI TEITIPCRVT DPQLVVTLHE KKGDVALPVP YDHQRGFSGI FEDRSYICKT
161 TIGDREVDSD AYYVYRLQVS SINVSVNAVQ TVVRQGENIT LMCIVIGNEV VNFEWTYPRK ESGRLVEPVT DFLLDMPYHI
241 RSILHIPSAE LEDSGTYTCN VTESVNDHQD EKAINITVVE SGGGGGSGGG GSEVQLVESG GGLVQPGGSL RLSCAASGYD
321 FTHYGMNWVR QAPGKGLEWV GWINTYTGEP TYAADFKRRF TFSLDTSKST AYLQMNSLRA EDTAVYYCAK YPYYYGTSHW
401 YFDVWGQGTL VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KSTSGGTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA VLQSSGLYSL
481 SSVVTVPSSS LGTQTYICNV NHKPSNTKVD KKVEPKSCDK THTCPPCPAP EAAGAPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV
561 VVDVSHEDPE VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKALPAPI EKTISKAKGQ
641 PREPQVYTLP PSREEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV
721 FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS CSPGK
配列番号１０
1 DIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCSASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKVLIYF TSSLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP
81 EDFATYYCQQ YSTVPWTFGQ GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ 
161 ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC
配列番号１１
1 MRLPGAMPAL ALKGELLLLS LLLLLEPQIS QGLVVTPPGP ELVLNVSSTF VLTCSGSAPV VWERMSQEPP QEMAKAQDGT 
81 FSSVLTLTNL TGLDTGEYFC THNDSRGLET DERKRLYIFV PDPTVGFLPN DAEELFIFLT EITEITIPCR VTDPQLVVTL
161 HEKKGDVALP VPYDHQRGFS GIFEDRSYIC KTTIGDREVD SDAYYVYRLQ VSSINVSVNA VQTVVRQGEN ITLMCIVIGN
241 EVVNFEWTYP RKESGRLVEP VTDFLLDMPY HIRSILHIPS AELEDSGTYT CNVTESVNDH QDEKAINITV VESGYVRLLG
321 EVGTLQFAEL HRSRTLQVVF EAYPPPTVLW FKDNRTLGDS SAGEIALSTR NVSETRYVSE LTLVRVKVAE AGHYTMRAFH
401 EDAEVQLSFQ LQINVPVRVL ELSESHPDSG EQTVRCRGRG MPQPNIIWSA CRDLKRCPRE LPPTLLGNSS EEESQLETNV
481 TYWEEEQEFE VVSTLRLQHV DRPLSVRCTL RNAVGQDTQE VIVVPHSLPF KVVVISAILA LVVLTIISLI ILIMLWQKKP
561 RYEIRWKVIE SVSSDGHEYI YVDPMQLPYD STWELPRDQL VLGRTLGSGA FGQVVEATAH GLSHSQATMK VAVKMLKSTA
641 RSSEKQALMS ELKIMSHLGP HLNVVNLLGA CTKGGPIYII TEYCRYGDLV DYLHRNKHTF LQHHSDKRRP PSAELYSNAL
721 PVGLPLPSHV SLTGESDGGY MDMSKDESVD YVPMLDMKGD VKYADIESSN YMAPYDNYVP SAPERTCRAT LINESPVLSY
801 MDLVGFSYQV ANGMEFLASK NCVHRDLAAR NVLICEGKLV KICDFGLARD IMRDSNYISK GSTFLPLKWM APESIFNSLY
881 TTLSDVWSFG ILLWEIFTLG GTPYPELPMN EQFYNAIKRG YRMAQPAHAS DEIYEIMQKC WEEKFEIRPP FSQLVLLLER
961 LLGEGYKKKY QQVDEEFLRS DHPAILRSQA RLPGFHGLRS PLDTSSVLYT AVQPNEGDND YIIPLPDPKP EVADEGPLEG
1041 SPSLASSTLN EVNTSSTISC DSPLEPQDEP EPEPQLELQV EPEPELEQLP DSGCPAPRAE AEDSFL
配列番号１２
1 DIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCSASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKVLIYF TSSLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP
81 EDFATYYCQQ YSTVPWTFGQ GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ
161 ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC
配列番号１３
1 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYDFT HYGMNWVRQA PGKGLEWVGW INTYTGEPTY AADFKRRFTF SLDTSKSTAY
81 LQMNSLRAED TAVYYCAKYP YYYGTSHWYF DVWGQGTLVT VSSASTKGPS VFPLAPSSKS TSGGTAALGC LVKDYFPEPV
161 TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG TQTYICNVNH KPSNTKVDKK VEPKSCDKTH L
配列番号１４
1 MVSYWDTGVL LCALLSCLLL TGSSSGSKLK DPELSLKGTQ HIMQAGQTLH LQCRGEAAHK WSLPEMVSKE SERLSITKSA
81 CGRNGKQFCS TLTLNTAQAN HTGFYSCKYL AVPTSKKKET ESAIYIFISD TGRPFVEMYS EIPEIIHMTE GRELVIPCRV
161 TSPNITVTLK KFPLDTLIPD GKRIIWDSRK GFIISNATYK EIGLLTCEAT VNGHLYKTNY LTHRQTNTII DVQISTPRPV
241 KLLRGHTLVL NCTATTPLNT RVQMTWSYPD EKNKRASVRR RIDQSNSHAN IFYSVLTIDK MQNKDKGLYT CRVRSGPSFK
321 SVNTSVHIYD KAFITVKHRK QQVLETVAGK RSYRLSMKVK AFPSPEVVWL KDGLPATEKS ARYLTRGYSL IIKDVTEEDA
401 GNYTILLSIK QSNVFKNLTA TLIVNVKPQI YEKAVSSFPD PALYPLGSRQ ILTCTAYGIP QPTIKWFWHP CNHNHSEARC
481 DFCSNNEESF ILDADSNMGN RIESITQRMA IIEGKNKMAS TLVVADSRIS GIYICIASNK VGTVGRNISF YITDVPNGFH
561 VNLEKMPTEG EDLKLSCTVN KFLYRDVTWI LLRTVNNRTM HYSISKQKMA ITKEHSITLN LTIMNVSLQD SGTYACRARN
641 VYTGEEILQK KEITIRDQEA PYLLRNLSDH TVAISSSTTL DCHANGVPEP QITWFKNNHK IQQEPGIILG PGSSTLFIER
721 VTEEDEGVYH CKATNQKGSV ESSAYLTVQG TSDKSNLELI TLTCTCVAAT LFWLLLTLFI RKMKRSSSEI KTDYLSIIMD
801 PDEVPLDEQC ERLPYDASKW EFARERLKLG KSLGRGAFGK VVQASAFGIK KSPTCRTVAV KMLKEGATAS EYKALMTELK
881 ILTHIGHHLN VVNLLGACTK QGGPLMVIVE YCKYGNLSNY LKSKRDLFFL NKDAALHMEP KKEKMEPGLE QGKKPRLDSV
961 TSSESFASSG FQEDKSLSDV EEEEDSDGFY KEPITMEDLI SYSFQVARGM EFLSSRKCIH RDLAARNILL SENNVVKICD
1041 FGLARDIYKN PDYVRKGDTR LPLKWMAPES IFDKIYSTKS DVWSYGVLLW EIFSLGGSPY PGVQMDEDFC SRLREGMRMR
1121 APEYSTPEIY QIMLDCWHRD PKERPRFAEL VEKLGDLLQA NVQQDGKDYI PINAILTGNS GFTYSTPAFS EDFFKESISA
1201 PKFNSGSSDD VRYVNAFKFM SLERIKTFEE LLPNATSMFD DYQGDSSTLL ASPMLKRFTW TDSKPKASLK IDLRVTSKSK
1281 ESGLSDVSRP SFCHSSCGHV SEGKRRFTYD HAELERKIAC CSPPPDYNSV VLYSTPPI
配列番号１５
1 MQSKVLLAVA LWLCVETRAA SVGLPSVSLD LPRLSIQKDI LTIKANTTLQ ITCRGQRDLD WLWPNNQSGS EQRVEVTECS 
81 DGLFCKTLTI PKVIGNDTGA YKCFYRETDL ASVIYVYVQD YRSPFIASVS DQHGVVYITE NKNKTVVIPC LGSISNLNVS
161 LCARYPEKRF VPDGNRISWD SKKGFTIPSY MISYAGMVFC EAKINDESYQ SIMYIVVVVG YRIYDVVLSP SHGIELSVGE
241 KLVLNCTART ELNVGIDFNW EYPSSKHQHK KLVNRDLKTQ SGSEMKKFLS TLTIDGVTRS DQGLYTCAAS SGLMTKKNST
321 FVRVHEKPFV AFGSGMESLV EATVGERVRI PAKYLGYPPP EIKWYKNGIP LESNHTIKAG HVLTIMEVSE RDTGNYTVIL
401 TNPISKEKQS HVVSLVVYVP PQIGEKSLIS PVDSYQYGTT QTLTCTVYAI PPPHHIHWYW QLEEECANEP SQAVSVTNPY
481 PCEEWRSVED FQGGNKIEVN KNQFALIEGK NKTVSTLVIQ AANVSALYKC EAVNKVGRGE RVISFHVTRG PEITLQPDMQ
561 PTEQESVSLW CTADRSTFEN LTWYKLGPQP LPIHVGELPT PVCKNLDTLW KLNATMFSNS TNDILIMELK NASLQDQGDY
641 VCLAQDRKTK KRHCVVRQLT VLERVAPTIT GNLENQTTSI GESIEVSCTA SGNPPPQIMW FKDNETLVED SGIVLKDGNR
721 NLTIRRVRKE DEGLYTCQAC SVLGCAKVEA FFIIEGAQEK TNLEIIILVG TAVIAMFFWL LLVIILRTVK RANGGELKTG
801 YLSIVMDPDE LPLDEHCERL PYDASKWEFP RDRLKLGKPL GRGAFGQVIE ADAFGIDKTA TCRTVAVKML KEGATHSEHR
881 ALMSELKILI HIGHHLNVVN LLGACTKPGG PLMVIVEFCK FGNLSTYLRS KRNEFVPYKT KGARFRQGKD YVGAIPVDLK
961 RRLDSITSSQ SSASSGFVEE KSLSDVEEEE APEDLYKDFL TLEHLICYSF QVAKGMEFLA SRKCIHRDLA ARNILLSEKN
1041 VVKICDFGLA RDIYKDPDYV RKGDARLPLK WMAPETIFDR VYTIQSDVWS FGVLLWEIFS LGASPYPGVK IDEEFCRRLK
1121 EGTRMRAPDY TTPEMYQTML DCWHGEPSQR PTFSELVEHL GNLLQANAQQ DGKDYIVLPI SETLSMEEDS GLSLPTSPVS
1201 CMEEEEVCDP KFHYDNTAGI SQYLQNSKRK SRPVSVKTFE DIPLEEPEVK VIPDDNQTDS GMVLASEELK TLEDRTKLSP
1281 SFGGMVPSKS RESVASEGSN QTSGYQSGYH SDDTDTTVYS SEEAELLKLI EIGVQTGSTA QILQPDSGTT LSSPPV
配列番号１６
1 MQRGAALCLR LWLCLGLLDG LVSGYSMTPP TLNITEESHV IDTGDSLSIS CRGQHPLEWA WPGAQEAPAT GDKDSEDTGV
81 VRDCEGTDAR PYCKVLLLHE VHANDTGSYV CYYKYIKARI EGTTAASSYV FVRDFEQPFI NKPDTLLVNR KDAMWVPCLV
161 SIPGLNVTLR SQSSVLWPDG QEVVWDDRRG MLVSTPLLHD ALYLQCETTW GDQDFLSNPF LVHITGNELY DIQLLPRKSL
241 ELLVGEKLVL NCTVWAEFNS GVTFDWDYPG KQAERGKWVP ERRSQQTHTE LSSILTIHNV SQHDLGSYVC KANNGIQRFR
321 ESTEVIVHEN PFISVEWLKG PILEATAGDE LVKLPVKLAA YPPPEFQWYK DGKALSGRHS PHALVLKEVT EASTGTYTLA
401 LWNSAAGLRR NISLELVVNV PPQIHEKEAS SPSIYSRHSR QALTCTAYGV PLPLSIQWHW RPWTPCKMFA QRSLRRRQQQ
481 DLMPQCRDWR AVTTQDAVNP IESLDTWTEF VEGKNKTVSK LVIQNANVSA MYKCVVSNKV GQDERLIYFY VTTIPDGFTI
561 ESKPSEELLE GQPVLLSCQA DSYKYEHLRW YRLNLSTLHD AHGNPLLLDC KNVHLFATPL AASLEEVAPG ARHATLSLSI
641 PRVAPEHEGH YVCEVQDRRS HDKHCHKKYL SVQALEAPRL TQNLTDLLVN VSDSLEMQCL VAGAHAPSIV WYKDERLLEE
721 KSGVDLADSN QKLSIQRVRE EDAGRYLCSV CNAKGCVNSS ASVAVEGSED KGSMEIVILV GTGVIAVFFW VLLLLIFCNM
801 RRPAHADIKT GYLSIIMDPG EVPLEEQCEY LSYDASQWEF PRERLHLGRV LGYGAFGKVV EASAFGIHKG SSCDTVAVKM
881 LKEGATASEH RALMSELKIL IHIGNHLNVV NLLGACTKPQ GPLMVIVEFC KYGNLSNFLR AKRDAFSPCA EKSPEQRGRF
961 RAMVELARLD RRRPGSSDRV LFARFSKTEG GARRASPDQE AEDLWLSPLT MEDLVCYSFQ VARGMEFLAS RKCIHRDLAA
1041 RNILLSESDV VKICDFGLAR DIYKDPDYVR KGSARLPLKW MAPESIFDKV YTTQSDVWSF GVLLWEIFSL GASPYPGVQI
1121 NEEFCQRLRD GTRMRAPELA TPAIRRIMLN CWSGDPKARP AFSELVEILG DLLQGRGLQE EEEVCMAPRS SQSSEEGSFS
1201 QVSTMALHIA QADAEDSPPS LQRHSLAARY YNWVSFPGCL ARGAETRGSS RMKTFEEFPM TPTTYKGSVD NQTDSGMVLA
1281 SEEFEQIESR HRQESGFSCK GPGQNVAVTR AHPDSQGRRR RPERGARGGQ VFYNSEYGEL SEPSEEDHCS PSARVTFFTD
1361 NSY
配列番号１７
1 ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT
81 YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW
161 YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE
241 LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT
321 QKSLSLSPGK
配列番号１８
1 TVAAPSVFIF PPSDEQLKSG TASVVCLLNN FYPREAKVQW KVDNALQSGN SQESVTEQDS KDSTYSLSST LTLSKADYEK
81 HKVYACEVTH QGLSSPVTKS FNRGEC
配列番号１９
1 LVVTPPGPEL VLNVSSTFVL TCSGSAPVVW ERMSQEPPQE MAKAQDGTFS SVLTLTNLTG LDTGEYFCTH NDSRGLETDE
81 RKRLYIFVPD PTVGFLPNDA EELFIFLTEI TEITIPCRVT DPQLVVTLHE KKGDVALPVP YDHQRGFSGI FEDRSYICKT
161 TIGDREVDSD AYYVYRLQVS SINVSVNAVQ TVVRQGENIT LMCIVIGNEV VNFEWTYPRK ESGRLVEPVT DFLLDMPYHI
241 RSILHIPSAE LEDSGTYTCN VTESVNDHQD EKAINITVVE SGGGGGSGGG GSDIQMTQSP SSLSASVGDR VTITCSASQD
321 ISNYLNWYQQ KPGKAPKVLI YFTSSLHSGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL QPEDFATYYC QQYSTVPWTF GQGTKVEIKR
401 TVAAPSVFIF PPSDEQLKSG TASVVCLLNN FYPREAKVQW KVDNALQSGN SQESVTEQDS KDSTYSLSST LTLSKADYEK
481 HKVYACEVTH QGLSSPVTKS FNRGEC
配列番号２１
1 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYTFT NYGMNWVRQA PGKGLEWVGW INTYTGEPTY AADFKRRFTF SLDTSKSTAY
81 LQMNSLRAED TAVYYCAKYP HYYGSSHWYF DVWGQGTLVT VSSASTKGPS VFPLAPSSKS TSGGTAALGC LVKDYFPEPV
161 TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG TQTYICNVNH KPSNTKVDKK VEPKSCDKTH T
配列番号２２
1 LVVTPPGPEL VLNVSSTFVL TCSGSAPVVW ERMSQEPPQE MAKAQDGTFS SVLTLTNLTG LDTGEYFCTH NDSRGLETDE
81 RKRLYIFVPD PTVGFLPNDA EELFIFLTEI TEITIPCRVT DPQLVVTLHE KKGDVALPVP YDHQRGFSGI FEDRSYICKT
161 TIGDREVDSD AYYVYRLQVS SINVSVNAVQ TVVRQGENIT LMCIVIGNEV VNFEWTYPRK ESGRLVEPVT DFLLDMPYHI
241 RSILHIPSAE LEDSGTYTCN VTESVNDHQD EKAINITVVE SGGGGGSGGG GSEVQLVESG GGLVQPGGSL RLSCAASGYT
321 FTNYGMNWVR QAPGKGLEWV GWINTYTGEP TYAADFKRRF TFSLDTSKST AYLQMNSLRA EDTAVYYCAK YPHYYGSSHW
401 YFDVWGQGTL VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KSTSGGTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA VLQSSGLYSL
481 SSVVTVPSSS LGTQTYICNV NHKPSNTKVD KKVEPKSCDK THT
配列番号２３
1 LVVTPPGPEL VLNVSSTFVL TCSGSAPVVW ERMSQEPPQE MAKAQDGTFS SVLTLTNLTG LDTGEYFCTH NDSRGLETDE
81 RKRLYIFVPD PTVGFLPNDA EELFIFLTEI TEITIPCRVT DPQLVVTLHE KKGDVALPVP YDHQRGFSGI FEDRSYICKT
161 TIGDREVDSD AYYVYRLQVS SINVSVNAVQ TVVRQGENIT LMCIVIGNEV VNFEWTYPRK ESGRLVEPVT DFLLDMPYHI
241 RSILHIPSAE LEDSGTYTCN VTESVNDHQD EKAINITVVE SGGGEVQLVE SGGGLVQPGG SLRLSCAASG YTFTNYGMNW
321 VRQAPGKGLE WVGWINTYTG EPTYAADFKR RFTFSLDTSK STAYLQMNSL RAEDTAVYYC AKYPHYYGSS HWYFDVWGQG
401 TLVTVSSAST KGPSVFPLAP SSKSTSGGTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSVVTVPS
481 SSLGTQTYIC NVNHKPSNTK VDKKVEPKSC DKTHT
配列番号２４
1 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYTFT NYGMNWVRQA PGKGLEWVGW INTYTGEPTY AADFKRRFTF SLDTSKSTAY
81 LQMNSLRAED TAVYYCAKYP HYYGSSHWYF DVWGQGTLVT VSSASTKGPS VFPLAPSSKS TSGGTAALGC LVKDYFPEPV
161 TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG TQTYICNVNH KPSNTKVDKK VEPKSCDKTH TGGGGGSGGG
241 GSGGGGSGGG GSGLVVTPPG PELVLNVSST FVLTCSGSAP VVWERMSQEP PQEMAKAQDG TFSSVLTLTN LTGLDTGEYF
321 CTHNDSRGLE TDERKRLYIF VPDPTVGFLP NDAEELFIFL TEITEITIPC RVTDPQLVVT LHEKKGDVAL PVPYDHQRGF
401 SGIFEDRSYI CKTTIGDREV DSDAYYVYRL QVSSINVSVN AVQTVVRQGE NITLMCIVIG NEVVNFEWTY PRKESGRLVE
481 PVTDFLLDMP YHIRSILHIP SAELEDSGTY TCNVTESVND HQDEKAINIT VVESG
配列番号２５
1 LVVTPPGPEL VLNVSSTFVL TCSGSAPVVW ERMSQEPPQE MAKAQDGTFS SVLTLTNLTG LDTGEYFCTH NDSRGLETDE
81 RKRLYIFVPD PTVGFLPNDA EELFIFLTEI TEITIPCRVT DPQLVVTLHE KKGDVALPVP YDHQRGFSGI FEDRSYICKT
161 TIGDREVDSD AYYVYRLQVS SINVSVNAVQ TVVRQGENIT LMCIVIGNEV VNFEWTYPRK ESGRLVEPVT DFLLDMPYHI
241 RSILHIPSAE LEDSGTYTCN VTESVNDHQD EKAINITVVE SGGGGGSGGG GSEVQLVESG GGLVQPGGSL RLSCAASGYD
321 FTHYGMNWVR QAPGKGLEWV GWINTYTGEP TYAADFKRRF TFSLDTSKST AYLQMNSLRA EDTAVYYCAK YPYYYGTSHW
401 YFDVWGQGTL VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KSTSGGTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA VLQSSGLYSL
481 SSVVTVPSSS LGTQTYICNV NHKPSNTKVD KKVEPKSCDK THL
配列番号２６
1 LVVTPPGPE LVLNVSSTFV LTCSGSAPVV WERMSQEPPQ EMAKAQDGTF SSVLTLTNLT GLDTGEYFCT HNDSRGLETD 
80 ERKRLYIFVP DPTVGFLPND AEELFIFLTE ITEITIPCRV TDPQLVVTLH EKKGDVALPV PYDHQRGFSG IFEDRSYICK
160 TTIGDREVDS DAYYVYRLQV SSINVSVNAV QTVVRQGENI TLMCIVIGNE VVNFEWTYPR KESGRLVEPV TDFLLDMPYH
240 IRSILHIPSA ELEDSGTYTC NVTESVNDHQ DEKAINITVV ESGEVQLVES GGGLVQPGGS LRLSCAASGY TFTNYGMNWV
320 RQAPGKGLEW VGWINTYTGE PTYAADFKRR FTFSLDTSKS TAYLQMNSLR AEDTAVYYCA KYPHYYGSSH WYFDVWGQGT
400 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKSTSGGTAA LGCLVKDYFP EPVTVSWNSG ALTSGVHTFP AVLQSSGLYS LSSVVTVPSS
480 SLGTQTYICN VNHKPSNTKV DKKVEPKSCD KTHTCPPCPA PELLGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP
560 EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP IEKTISKAKG QPREPQVYTL
640 PPSREEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA
720 LHNHYTQKSL SLSPGK
配列番号２７
1 VGFLPNDAEE LFIFLTEITE ITIPCRVTDP QLVVTLHEKK GDVALPVPYD HQRGFSGIFE DRSYICKTTI GDREVDSDAY
81 YVYRLQVSSI NVSVNAVQTV VRQGENITLM CIVIGNEVVN FEWTYPRKES GRLVEPVTDF LLDMPYHIRS ILHIPSAELE
161 DSGTYTCNVT ESVNDHQDEK AINITVVESG EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYTFT NYGMNWVRQA PGKGLEWVGW
241 INTYTGEPTY AADFKRRFTF SLDTSKSTAY LQMNSLRAED TAVYYCAKYP HYYGSSHWYF DVWGQGTLVT VSSASTKGPS
321 VFPLAPSSKS TSGGTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG TQTYICNVNH
401 KPSNTKVDKK VEPKSCDKTH TCPPCPAPEL LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV
481 HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS
561 LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS
641 PGK
配列番号２８
1 VGFLPNDAEE LFIFLTEITE ITIPCRVTDP QLVVTLHEKK GDVALPVPYD HQRGFSGIFE DRSYICKTTI GDREVDSDAY
81 YVYRLQVSSI NVSVNAVQTV VRQGENITLM CIVIGNEVVN FEWTYPRKES GRLVEPVTDF LLDMPYHIRS ILHIPSAELE
161 DSGTYTCNVT ESVNDHQDEK AINITVVESG EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYTFT NYGMNWVRQA PGKGLEWVGW
241 INTYTGEPTY AADFKRRFTF SLDTSKSTAY LQMNSLRAED TAVYYCAKYP HYYGSSHWYF DVWGQGTLVT VSSASTKGPS
321 VFPLAPSSKS TSGGTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG TQTYICNVNH
401 KPSNTKVDKK VEPKSCDKTH T
配列番号２９
1 VGFLPNDAEE LFIFLTEITE ITIPCRVTDP QLVVTLHEKK GDVALPVPYD HQRGFSGIFE DRSYICKTTI GDREVDSDAY
81 YVYRLQVSSI NVSVNAVQTV VRQGENITLM CIVIGNEVVN FEWTYPRKES GRLVEPVTDF LLDMPYHIRS ILHIPSAELE
161 DSGTYTCNVT ESVNDHQDEK AINITVVESG GGGSGGGGSG GGGSGGGGSG GGGSGGGGSE VQLVESGGGL VQPGGSLRLS
241 CAASGYTFTN YGMNWVRQAP GKGLEWVGWI NTYTGEPTYA ADFKRRFTFS LDTSKSTAYL QMNSLRAEDT AVYYCAKYPH
321 YYGSSHWYFD VWGQGTLVTV SSASTKGPSV FPLAPSSKST SGGTAALGCL VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ
401 SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT QTYICNVNHK PSNTKVDKKV EPKSCDKTHT
配列番号３０
1 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYTFT NYGMNWVRQA PGKGLEWVGW INTYTGEPTY AADFKRRFTF SLDTSKSTAY
81 LQMNSLRAED TAVYYCAKYP HYYGSSHWYF DVWGQGTLVT VSSASTKGPS VFPLAPSSKS TSGGTAALGC LVKDYFPEPV
161 TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG TQTYICNVNH KPSNTKVDKK VEPKSCDKTH TGGGSGGGGS
241 GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS VGFLPNDAEE LFIFLTEITE ITIPCRVTDP QLVVTLHEKK GDVALPVPYD HQRGFSGIFE
321 DRSYICKTTI GDREVDSDAY YVYRLQVSSI NVSVNAVQTV VRQGENITLM CIVIGNEVVN FEWTYPRKES GRLVEPVTDF
401 LLDMPYHIRS ILHIPSAELE DSGTYTCNVT ESVNDHQDEK AINITVVESG
配列番号３１  重鎖抗ＶＥＧＦ−ＰＤＧＦＲ融合物をコードする核酸
GACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCTGCAGATATCCAGCACAGTGGCGGCCGCCatgaaagctgtggtgctggccgtggctctggtcttcctgacagggagccaggctctggtcgtcacacccccggggccagagcttgtcctcaatgtctccagcaccttcgttctgacctgctcgggttcagctccggtggtgtgggaacggatgtcccaggagcccccacaggaaatggccaaggcccaggatggcaccttctccagcgtgctcacactgaccaacctcactgggctagacacgggagaatacttttgcacccacaatgactcccgtggactggagaccgatgagcggaaacggctctacatctttgtgccagatcccaccgtgggcttcctccctaatgatgccgaggaactattcatctttctcacggaaataactgagatcaccattccatgccgagtaacagacccacagctggtggtgacactgcacgagaagaaaggggacgttgcactgcctgtcccctatgatcaccaacgtggcttttctggtatctttgaggacagaagctacatctgcaaaaccaccattggggacagggaggtggattctgatgcctactatgtctacagactccaggtgtcatccatcaacgtctctgtgaacgcagtgcagactgtggtccgccagggtgagaacatcaccctcatgtgcattgtgatcgggaatgaggtggtcaacttcgagtggacatacccccgcaaagaaagtgggcggctggtggagccggtgactgacttcctcttggatatgccttaccacatccgctccatcctgcacatccccagtgccgagttagaagactcggggacctacacctgcaatgtgacggagagtgtgaatgaccatcaggatgaaaaggccatcaacatcaccgtggttgagagcggcggtggtggcggctccggtggaggcggaagcgaggtgcagctggtggaatccggcggaggcctggtccagcctggcggatccctgagactgtcctgtgccgcctccggctacgacttcacccattacggcatgaactgggtccgacaggcccctggcaagggcctggaatgggtcggatggatcaacacctacaccggcgagcccacctacgccgccgacttcaagcggcggttcaccttctccctggacacctccaagtccaccgcctacctgcagatgaactccctgcgggccgaggacaccgccgtgtactactgcgccaagtacccctactactacggcacctcccactggtacttcgacgtgtggggccagggcaccctggtcaccgtgtcctccgcctctaccaagggcccctccgtgttccctctggccccctccagcaagtccacctctggcggcaccgccgctctgggctgcctggtcaaggactacttccccgagcccgtgaccgtgtcctggaactctggcgccctgacctccggcgtgcacacctttccagccgtgctgcagtcctccggcctgtactccctgtcctccgtcgtgaccgtgccctccagctctctgggcacccagacctacatctgcaacgtgaaccacaagccctccaacaccaaggtggacaagaaggtggaacccaagtcctgcgacaagacccacacctgtcccccctgccctgcccctgaagcagccggtgcacccagcgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatctcccggacccccgaagtgacctgcgtggtggtggacgtgtcccacgaggaccctgaagtgaagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaatgccaagaccaagcccagagaggaacagtacaactccacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcatcaggactggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtctccaacaaggccctgcctgcccccatcgaaaagaccatctccaaggccaagggccagccccgcgagcctcaggtgtacacactgccacccagccgggaagagatgaccaagaaccaggtctccctgacctgtctggtcaagggcttctacccctccgatatcgccgtcgaatgggagtccaacggccagcccgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggactccgacggctcattcttcctgtactccaagctgaccgtggacaagtcccggtggcagcagggcaacgtgttctcctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtcctgcagccccggcaagtgataaTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTC
配列番号３２：抗ＶＥＧＦ軽鎖をコードする軽鎖
GACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCTGCAGATATCCAGCACAGTGGCGGCCGCCatgggatggagctgtatcatcctcttcttggtggcaacagctacaggcgtgcactccgacatccagctgacccagtccccctccagcctgtccgcctctgtgggcgacagagtgaccatcacctgttccgccagccaggacatctccaactacctgaactggtatcagcagaagcccggcaaggcccccaaggtgctgatctacttcacctcctccctgcactccggcgtgccctccagattctccggctctggctccggcaccgactttaccctgaccatctccagcctgcagcccgaggacttcgccacctactactgccagcagtactccaccgtgccctggaccttcggccagggcaccaaggtggaaatcaagcggaccgtggccgctccctccgtgttcatcttcccaccctccgacgagcagctgaagtccggaaccgcctccgtcgtgtgcctgctgaacaacttctacccccgcgaggccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagagcggcaactcccaggaatccgtcaccgagcaggactccaaggacagcacctactccctgtccagcaccctgaccctgtccaaggccgactacgagaagcacaaggtgtacgcctgcgaagtgacccaccagggcctcagctccccagtgaccaagtccttcaaccggggcgagtgctagtaaTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTC
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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