(57)【要約】  本発明は、概して、個々の細胞から核酸をハイスループット方式で単離し、溶解させ、バーコード化し、および調製するための分子バーコード化およびエマルジョンベースマイクロ流体工学の組合せに関する。
2017532024.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド装飾ビーズであって、
（ａ）リンカー；
（ｂ）シーケンシングプライミング部位として使用される同一配列；
（ｃ）均一または準均一ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列；
（ｄ）それぞれのプライミング部位について異なるユニーク分子識別子；
（ｅ）場合により、ポリアデニル化ｍＲＮＡを捕捉し、かつ逆転写をプライミングするためのオリゴヌクレオチド冗長配列；および
（ｆ）場合により、同定のための追加の基質を提供する少なくとも１つの他のオリゴヌクレオチドバーコード
を含む、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド装飾ビーズ。
【請求項２】
前記ビーズの表面上の前記ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列が分子バーコードである、請求項１に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド装飾ビーズ。
【請求項３】
前記バーコードが４〜１０００ヌクレオチド長の範囲である、請求項２に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド装飾ビーズ。
【請求項４】
前記ポリアデニル化ｍＲＮＡを捕捉し、かつ逆転写をプライミングするためのオリゴヌクレオチド配列がオリゴｄＴ配列である、請求項１に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド装飾ビーズ。
【請求項５】
前記リンカーが非開裂性直鎖ポリマーである、請求項１に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド装飾ビーズ。
【請求項６】
前記リンカーが化学開裂性直鎖ポリマーである、請求項１に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド装飾ビーズ。
【請求項７】
前記リンカーが、非開裂性の場合により置換されている炭化水素ポリマーである、請求項１に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド装飾ビーズ。
【請求項８】
前記リンカーが、感光性の場合により置換されている炭化水素ポリマーである、請求項１に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド装飾ビーズ。
【請求項９】
前記リンカーがポリエチレングリコールである、請求項１に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド装飾ビーズ。
【請求項１０】
前記リンカーがＰＥＧ−Ｃ３〜ＰＥＧ−２４である、請求項１に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド装飾ビーズ。
【請求項１１】
複数のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド装飾ビーズを含む混合物であって、前記ビーズが、
（ａ）リンカー；
（ｂ）シーケンシングプライミング部位として使用される同一配列；
（ｃ）均一または準均一ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列；
（ｄ）それぞれのプライミング部位について異なるユニーク分子識別子；
（ｅ）ポリアデニル化ｍＲＮＡを捕捉し、かつ逆転写をプライミングするためのオリゴヌクレオチド冗長配列；および
（ｆ）場合により、下流分子−生物学的反応のための基質を提供する少なくとも１つの追加のオリゴヌクレオチド配列
を含み、
前記均一または準均一ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列が、任意の１つのビーズ上の全ての前記プライミング部位にわたり同一であるが、個々のビーズ上のオリゴヌクレオチド間で変動する、混合物。
【請求項１２】
前記ビーズの表面上の前記ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列が分子バーコードである、請求項１１に記載の混合物。
【請求項１３】
前記バーコードが４〜１０００ヌクレオチド長の範囲である、請求項１２に記載の混合物。
【請求項１４】
前記ポリアデニル化ｍＲＮＡを捕捉し、かつ逆転写をプライミングするためのオリゴヌクレオチド配列がオリゴｄＴ配列である、請求項１１に記載の混合物。
【請求項１５】
下流分子−生物学的反応のための基質を提供する少なくとも１つのオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項１１に記載の混合物。
【請求項１６】
前記下流分子生物学的反応が、成熟ｍＲＮＡの逆転写のため、トランスクリプトームの特異的部分を捕捉するため、ＤＮＡポリメラーゼおよび／もしくは類似の酵素をプライミングするため、または前記トランスクリプトームもしくはゲノム全体を通してプライミングするためのものである、請求項１１に記載の混合物。
【請求項１７】
前記追加のオリゴヌクレオチド配列がオリジオ−ｄＴ配列を含む、請求項１１に記載の混合物。
【請求項１８】
前記追加のオリゴヌクレオチド配列がプライマー配列を含む、請求項１１に記載の混合物。
【請求項１９】
前記追加のオリゴヌクレオチド配列がオリジオ−ｄＴ配列およびプライマー配列を含む、請求項１１に記載の混合物。
【請求項２０】
エラー訂正バーコードビーズであって、
（ａ）リンカー；
（ｂ）シーケンシングプライミング部位として使用される同一配列；
（ｃ）少なくともヌクレオチド塩基のデュプリケートを含む均一または準均一ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列；
（ｄ）それぞれのプライミング部位について異なるユニーク分子識別子；および
（ｅ）ポリアデニル化ｍＲＮＡを捕捉し、かつ逆転写をプライミングするための冗長オリゴヌクレオチド
を含む、エラー訂正バーコードビーズ。
【請求項２１】
請求項２０に記載のバーコードビーズが前記ｍＲＮＡにハイブリダイズし得ず、それにより逆転写を受け得ない方法。
【請求項２２】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチド結合ビーズおよび請求項２０に記載の自己訂正バーコードビーズの混合物を含むキット。
【請求項２３】
コンポジット単一細胞シーケンシングライブラリーを作出する方法であって、
（ａ）１つのユニークにバーコード化されたＲＮＡ捕捉マイクロビーズを、５０μｍ〜２１０μｍの直径を有するエマルジョン液滴中で単一細胞と合流させること；
（ｂ）前記細胞を溶解させ、それにより前記ＲＮＡ捕捉マイクロビーズ上でＲＮＡを捕捉すること；
（ｃ）逆転写反応を実施して前記細胞のＲＮＡを、前記ＲＮＡ捕捉マイクロビーズに共有結合している第１のｃＤＮＡ鎖に変換するか、または逆に液滴内で逆転写させ、およびその後に液滴を破壊し、かつｃＤＮＡ付着ビーズを回収すること；
（ｄ）それぞれのＲＮＡ起源細胞を記録する細胞バーコード、および同一細胞からのＲＮＡ間を区別する分子バーコードを含有する単一コンポジットＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリーを調製およびシーケンシングすること
を含む、方法。
【請求項２４】
コンポジット単一細胞シーケンシングライブラリーを作出する方法であって、
（ａ）１つのユニークにバーコード化されたＲＮＡ捕捉マイクロビーズを、５０μｍ〜２１０μｍの直径を有するエマルジョン液滴中で単一細胞と合流させること；
（ｂ）前記細胞を溶解させ、それにより前記ＲＮＡ捕捉マイクロビーズ上でＲＮＡを捕捉すること；
（ｃ）液滴を破壊し、かつビーズを溶液中でプールすること；
（ｄ）逆転写反応を実施して前記細胞のＲＮＡを、前記ＲＮＡ捕捉マイクロビーズに共有結合している第１のｃＤＮＡ鎖に変換するか、または逆に液滴内で逆転写させ、およびその後に液滴を破壊し、かつｃＤＮＡ付着ビーズを回収すること；
（ｅ）それぞれのＲＮＡ起源細胞を記録する細胞バーコード、および同一細胞からのＲＮＡ間を区別する分子バーコードを含有する単一コンポジットＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリーを調製およびシーケンシングすること
を含む、方法。
【請求項２５】
前記ｃＤＮＡ付着ビーズを増幅させる方法がテンプレートスイッチ増幅である、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ｃＤＮＡ付着ビーズを増幅させる方法がＴ７リニア適用である、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記ｃＤＮＡ付着ビーズを増幅させる方法が指数関数的等温増幅である、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２８】
ＲＮＡ捕捉マイクロビーズおよびコンポジット単一細胞を含む同時封入を介して前記エマルジョン液滴が形成される、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記エマルジョン液滴が前記ＲＮＡ捕捉マイクロビーズの容量よりも少なくとも１．２５倍大きい、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記エマルジョン液滴が前記ＲＮＡ捕捉マイクロビーズの容量の少なくとも１．５倍である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＲＮＡがｍＲＮＡである、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項３２】
前記エマルジョン液滴の前記直径が１２５μｍである、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＲＮＡ捕捉マイクロビーズの直径が１０μｍ〜９５μｍである、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項３４】
ユニーク核酸配列を有する複数のビーズを調製する方法であって、
（ａ）合成のそれぞれのサイクルにおいて前記ビーズが複数のサブセットにスプリットされるように、プールアンドスプリット法で前記複数のビーズの表面上でポリヌクレオチド合成を実施することであって、それぞれのサブセットが異なる化学反応に供される、実施すること；
（ｂ）前記プールアンドスプリット法を２サイクル〜２００サイクルのいずれかで繰り返すこと
を含む、方法。
【請求項３５】
前記ポリヌクレオチド合成がホスホラミダイト合成である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ポリヌクレオチド合成が逆方向ホスホラミダイト化学反応である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
それぞれのサブセットが異なるヌクレオチドに供される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
それぞれのサブセットが異なるカノニカルヌクレオチドに供される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
３回繰り返される、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
４回繰り返される、請求項３４に記載の方法。
【請求項４１】
１２回繰り返される、請求項３４に記載の方法。
【請求項４２】
前記マイクロビーズを前記オリゴヌクレオチドに共有結合するリンカーがポリエチレングリコールである、請求項３４に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＲＮＡ捕捉マイクロビーズの直径が１０μｍ〜９５μｍである、請求項３４〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
複数のステップが１２回のステップである、請求項３４〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
均一、準均一、またはパターニングヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列が任意の個々のビーズ上で合成される一方、多数の異なるヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列が異なるビーズ上で同時に合成される、複数のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド装飾ビーズを同時に調製する方法であって、
（ａ）複数のビーズを含む混合物を形成すること；
（ｂ）前記ビーズをサブセットに分離すること；
（ｃ）化学合成を介して個々のヌクレオチドを添加することにより、前記ビーズの表面上の前記ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列を伸長させること；
（ｄ）（ｃ）における前記ビーズのサブセットを単一の共通プール中でプールすること；
（ｅ）ステップ（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）を複数回繰り返して１０００個以上のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列をコンビナトリアルに産生すること；および
（ｆ）前記ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド装飾ビーズを回収すること
を含む、方法。
【請求項４６】
前記ビーズの前記表面上の前記ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列が分子バーコードである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
プールアンドスプリット合成ステップが、サイクル毎ではなく、２〜１０サイクル毎に行われる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
バーコードがビルトインエラー訂正を含有する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
バーコードが４〜１０００ヌクレオチド長の範囲である、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
ポリヌクレオチド合成がホスホラミダイト合成である、請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
ポリヌクレオチド合成が逆方向ホスホラミダイト化学反応である、請求項４５に記載の方法。
【請求項５２】
それぞれのサブセットが異なるヌクレオチドに供される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５３】
１つ以上のサブセットが２つのヌクレオチドのカクテルを受けることをさらに含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項５４】
それぞれのサブセットが異なるカノニカルヌクレオチドに供される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５５】
前記ビーズがマイクロビーズである、請求項４５に記載の方法。
【請求項５６】
前記ビーズがナノ粒子である、請求項４５に記載の方法。
【請求項５７】
前記ビーズがマクロビーズである、請求項４５に記載の方法。
【請求項５８】
前記オリゴヌクレオチド配列がジヌクレオチドである、請求項４５に記載の方法。
【請求項５９】
前記オリゴヌクレオチド配列がトリヌクレオチドである、請求項４５に記載の方法。
【請求項６０】
均一または準均一ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列が任意の個々のビーズ上で合成される一方、複数の異なるヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列が異なるビーズ上で同時に合成される、１０００個以上のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド装飾ビーズを同時に調製する方法であって、
（ａ）複数のビーズを含む混合物を形成すること；
（ｂ）前記ビーズをサブセットに分離すること；
（ｃ）化学合成を介して個々のヌクレオチドを添加することにより、前記ビーズの表面上の前記ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列を伸長させること；
（ｄ）（ｃ）における前記ビーズのサブセットを単一の共通プール中でプールすること；
（ｅ）ステップ（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）を複数回繰り返して多数のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列をコンビナトリアルに産生すること；および
（ｆ）前記ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド装飾ビーズを回収すること；
（ｇ）合成のそれぞれのサイクルにおいて前記ビーズが複数のサブセットにスプリットされるように、プールアンドスプリット合成で前記複数のビーズの前記表面上でポリヌクレオチド合成を実施することであって、それぞれのサブセットが異なる化学反応に供される、実施すること；
（ｈ）前記プールアンドスプリット合成を複数回繰り返すこと
を含む、方法。
【請求項６１】
前記ビーズの前記表面上の前記ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列が分子バーコードである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記プールアンドスプリット合成ステップが、サイクル毎ではなく、２〜１０サイクル毎に行われる、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
生成されたバーコードがビルトインエラー訂正を含有する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
バーコードが４〜１０００ヌクレオチド長の範囲である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６５】
前記ポリヌクレオチド合成がホスホラミダイト合成である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６６】
前記ポリヌクレオチド合成が逆方向ホスホラミダイト化学反応である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６７】
それぞれのサブセットをが異なるヌクレオチドに供される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６８】
１つ以上のサブセットが２つのヌクレオチドのカクテルを受けることをさらに含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６９】
それぞれのサブセットが異なるカノニカルヌクレオチドに供される、請求項６０に記載の方法。
【請求項７０】
前記ビーズがマイクロビーズである、請求項６０に記載の方法。
【請求項７１】
前記ビーズがナノ粒子である、請求項６０に記載の方法。
【請求項７２】
前記ビーズがマクロビーズである、請求項６０に記載の方法。
【請求項７３】
前記オリゴヌクレオチドバーコード化ビーズがジヌクレオチドである、請求項６０に記載の方法。
【請求項７４】
前記オリゴヌクレオチドバーコード化ビーズがトリヌクレオチドである、請求項６０に記載の方法。
【請求項７５】
前記プールアンドスプリット合成が１２回繰り返される、請求項４５または６０に記載の方法。
【請求項７６】
前記複合ビーズの直径が１０μｍ〜９５μｍである、請求項４５または６０に記載の方法。
【請求項７７】
マイクロ流体系を介してコンポジット単一細胞シーケンシングライブラリーを作出するための機器であって、
フィルターと、レジスターをさらに含む担体流体チャネルとを含む油−界面活性剤インレット；
フィルターと、レジスターをさらに含む担体流体チャネルとを含む、分析物のためのインレット；
フィルターと、レジスターをさらに含む担体流体チャネルとを含む、ｍＲＮＡ捕捉マイクロビーズおよび溶解試薬のためのインレット
を含み、
前記担体流体チャネルが、調整可能または所定の流速においてその中を流動する担体流体を有し、
それぞれの前記担体流体チャネルがジャンクションにおいて合流し、および
前記ジャンクションが、ドロップのためのアウトレットを含有する混合器に接続されている、機器。
【請求項７８】
前記分析物が、化学試薬、タンパク質、薬物、抗体、酵素、核酸、オルガネラ、細胞またはそれらの任意の組合せを含む、請求項７７に記載の機器。
【請求項７９】
前記ジャンクションが、液滴ピンチオフ用構造物を有する流体担体チャネルにより前記混合器に接続されている、請求項７７に記載の機器。
【請求項８０】
前記分析物が細胞である、請求項７７に記載の機器。
【請求項８１】
前記分析物が哺乳動物細胞である、請求項７７に記載の機器。
【請求項８２】
前記分析物が複合組織である、請求項７７に記載の機器。
【請求項８３】
前記細胞が脳細胞である、請求項８１に記載の機器。
【請求項８４】
前記細胞が網膜細胞である、請求項８１に記載の機器。
【請求項８５】
前記細胞がヒト骨髄細胞である、請求項８１に記載の機器。
【請求項８６】
前記細胞が宿主−病原体細胞である、請求項８１に記載の機器。
【請求項８７】
前記溶解試薬が、アニオン性界面活性剤、例えば、ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、またはカオトロピック塩、例えば、チオシアン酸グアニジニウムを含む、請求項７７に記載の機器。
【請求項８８】
前記フィルターが正方ＰＤＭＳを含む、請求項７７に記載の機器。
【請求項８９】
前記レジスターが、７０００〜９０００の長さと、５０〜７５μｍの幅と、１００〜１５０ｍｍの深さとを有するサーペンタインである、請求項７７に記載の機器。
【請求項９０】
５０μｍの直径を有する、請求項８９に記載のレジスター。
【請求項９１】
前記チャネルが８０００〜１２，０００μｍの長さの長さと、１２５〜２５０ｍｍの幅と、１００〜１５０ｍｍの深さとを有する、請求項７７に記載の機器。
【請求項９２】
直径が１２５μｍである、請求項８９に記載のチャネル。
【請求項９３】
前記混合器が７０００〜９０００μｍの長さと１１０〜１４０μｍの幅とを有する、請求項７７に記載の機器。
【請求項９４】
前記幅が１２５μｍである、請求項９３に記載の混合器。
【請求項９５】
前記油−界面活性剤がＰＥＧブロックポリマーである、請求項７７に記載の機器。
【請求項９６】
前記ＰＥＧブロックポリマーがＢＩＯＲＡＤ（商標）ＱＸ２００  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｏｉｌである、請求項９５に記載の機器。
【請求項９７】
前記担体流体が水−グリセロール混合物である、請求項７７に記載の機器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願および参照による組み込み
本出願は、２０１４年９月９日に出願された米国仮特許出願第６２／０４８，２２７号明細書、２０１５年４月１３日に出願された同第６２／１４６，６４２号明細書の利益および優先権を主張する。
【０００２】
上記の出願、ならびにそれらの出願においてまたはそれらの審査中に引用される全ての文献（「出願引用文献」）およびその出願引用文献において引用または参照される全ての文献、ならびに本明細書において引用または参照される全ての文献（「本明細書引用文献」）、および本明細書引用文献において引用または参照される全ての文献は、本明細書においてまたは本明細書に参照により組み込まれる任意の文献において挙げられる任意の製品に関する任意の製造業者の指示書、説明書、製品仕様書、および製品シートと一緒に、参照により本明細書に組み込まれ、本発明の実施において用いることができる。より具体的には、全ての参照文献は、それぞれの個々の文献が、引用または参照される場合および箇所において具体的かつ個別に参照により組み込まれることが示されるような程度で参照により組み込まれる。
【０００３】
本発明は、概して、個々の細胞から核酸をハイスループット方式で単離し、溶解させ、バーコード化し、および調製するための分子バーコード化およびエマルジョンベースマイクロ流体工学の組合せに関する。
【０００４】
連邦政府による資金提供
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈにより授与されたＧｒａｎｔ  Ｎｏ．ＨＧ００６１９３のもとで政府支援により行われた。政府は本発明の一定の権利を有し得る。
【背景技術】
【０００５】
細胞は、様々なタイプ、サブタイプおよび活性状態のものがあり、それらを本出願人らはその形状、局在、機能、または分子プロファイル、例えば、それらが発現するＲＮＡのセットに基づき分類する。ＲＮＡプロファイリングは、細胞が数千個の異なるＲＮＡを発現するため、原理上、特に情報を示す。例えば、全てのタイプのＲＮＡのレベルを計測するアプローチが、近年まで、全ての細胞の含有物が一緒に混合された「ホモジナイズ化」試料に適用されてきた。これは、そのような技術を使用して、例えば、脳におけるヒト組織機能および病理を理解する能力を大幅に制限した。過去２年間において、そのような計測を単一細胞中で実施するための新たな技術が出現し始めたが、それらは依然として多数の細胞に対してスケーラブルでなく、極めてコストを要する。ここで、本出願人らは、数万および数十万個の個々のヒト細胞、例として、脳組織からの細胞のＲＮＡ含有物を迅速かつ安価にプロファイリングする方法を開発する。これを行うため、本出願人らは特殊なマイクロ流体装置を使用してそれぞれの細胞を個々のドロップ中に封入し、それぞれの細胞のＲＮＡを、その細胞／ドロップにユニークな「細胞バーコード」と会合させ、それぞれのＲＮＡの発現レベルをシーケンシングにより計測し、次いで細胞バーコードを使用してそれぞれのＲＮＡ分子が由来する細胞を決定する。本出願人らは、このアプローチを使用してほぼ全ての生物学的試料をより良好に理解することができ、それは、任意の複合組織、例えば、網膜からの試料を理解するために特に重要である。
【０００６】
単一細胞（または単一分子）レベルにおけるデータ分解能を要求する研究の実施は困難であり、または最良の状況下で莫大な費用を要し得る。単一分子または単一細胞分析のための技術または計器は存在するが（例えば、それぞれデジタルポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはＦｌｕｉｄｉｇｍ  Ｃ１）、現在、試薬を動的に送達し、および／または分子「情報」を個々の反応に付随させ、その結果、大集団の反応／アッセイを処理し、集団で分析することができる一方、依然として個々の反応／アッセイごとに結果を区画する能力を維持するスケーラブルな方法を可能とするものはない。
【０００７】
マイクロ流体工学は、小容量の流体を取り扱うマイクロスケール装置を含む。マイクロ流体工学は小流体容量、特に１μｌ未満の容量を正確かつ再現可能に制御および分注し得るため、マイクロ流体工学の適用は顕著なコスト節約を提供する。マイクロ流体工学技術の使用は、サイクル時間を低減させ、結果が出るまでの時間を短縮し、スループットを増加させる。さらに、マイクロ流体工学技術の取り込みは、系の統合および自動化を向上させる。マイクロ流体工学反応は、一般に、マイクロ液滴中で実施される。マイクロ液滴中で反応を実施する能力は、様々な試料流体および様々なマイクロ液滴を合流させ得ることに依存する。例えば、米国特許出願公開第２０１２０２１９９４７号明細書を参照されたい。
【０００８】
液滴マイクロ流体工学は、ハイスループットスクリーンおよび高感度アッセイを実施するための顕著な利点を提供する。液滴は、試料容量の顕著な低減を可能とし、コストを要する汚染物質低減をもたらす。キロヘルツ速度における操作および計測により、最大１０８個の区別される生物学的実体（例として、限定されるものではないが、個々の細胞またはオルガネラ）を１日でスクリーニングすることが可能となる。液滴中のコンパートメント化は、希少種の有効濃度を増加させ、検出閾値に到達するために要求される時間を減少させることによりアッセイ感度を増加させる。液滴マイクロ流体工学は、それらの強力な特性を組み合わせて現在実現困難なハイスループットスクリーニング用途、例として、単一細胞および単一分子アッセイを可能とする。例えば、Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ，２０１２，１２，２１４６−２１５５を参照されたい。
【０００９】
本明細書における任意の文献の引用および識別は、そのような文献が本発明に対する先行技術として利用可能であることを容認するものではない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、特に、個々の細胞から核酸をハイスループット方式で単離し、溶解させ、バーコード化し、および調製するための分子バーコード化およびエマルジョンベースマイクロ流体工学の組合せに関する。
【００１１】
本発明は、様々な細胞からのＲＮＡを個々にタグ付けし、単一ライブラリーの作出を可能とする一方、それぞれのリードの細胞アイデンティティーを保持する、ハイスループット単一細胞ＲＮＡ−Ｓｅｑおよび／または標的化核酸プロファイリング（例えば、シーケンシング、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応など）を提供する。ハイスループットにおいて個々の細胞から核酸を単離し、溶解させ、バーコード化し、および調製するための分子バーコード化およびエマルジョンベースマイクロ流体工学の組合せが使用される。マイクロ流体装置（例えば、ポリジメチルシロキサン製）、ナノリットル未満逆エマルジョン液滴。これらの液滴は、核酸をバーコード化捕捉ビーズと同時封入するために使用される。例えば、それぞれのビーズは、それぞれのドロップおよびその内容物が区別可能になるようにユニークにバーコード化される。核酸は、当技術分野において公知の任意の資源、例えば、単一細胞、細胞のペア、細胞溶解物、または溶液に由来するものなどに由来し得る。細胞は、それが液滴中に封入されるため溶解される。単一細胞およびバーコード化ビーズをそれらの液滴中にポアソン統計でロードするため、１００，０００〜１０００万個のそのようなビーズが、約１０，０００〜１００，０００個の細胞をバーコード化するために必要とされる。
【００１２】
本発明は、単一細胞シーケンシングライブラリーを作出する方法であって、１つのユニークにバーコード化されたｍＲＮＡ捕捉マイクロビーズを、７５〜１２５μｍの直径を有するエマルジョン液滴中で単一細胞と合流させること；細胞を溶解させてそのＲＮＡをＲＮＡ捕捉マイクロビーズ上へのハイブリダイゼーションによる捕捉に利用可能とすること；エマルジョン液滴の内側または外側のいずれかで逆転写を実施して細胞のｍＲＮＡを、ｍＲＮＡ捕捉マイクロビーズに共有結合している第１のｃＤＮＡ鎖に変換すること；全ての細胞からｃＤＮＡ付着マイクロビーズをプールすること；および単一コンポジットＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリーを調製およびシーケンシングすることを含む方法を提供する。
【００１３】
本発明は、ユニークバーコードおよびマイクロ流体装置に好適な直径を有するユニークにバーコード化されたｍＲＮＡ捕捉ビーズを調製する方法であって、１）合成のそれぞれのサイクルにおいてビーズが、４つのカノニカルヌクレオチド（Ｔ、Ｃ、Ｇ、またはＡ）の１つまたは２つ以上の塩基長のユニークオリゴヌクレオチドとの４つの反応中にスプリットされるように、プールアンドスプリット法でビーズの表面上で逆ホスホラミダイト合成を実施すること；２）後にプール中のそれぞれのビーズの表面上に１６００万個超のユニークバーコードが存在するように、このプロセスを多数回にわたり、少なくとも２回、最適には１２回超繰り返すことを含む方法を提供する。（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｍｃ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ＰＭＣ２０６４４７参照）。
【００１４】
一般に、本発明は、ユニーク核酸バーコードを有する多数のビーズ、粒子、マイクロビーズ、ナノ粒子などを調製する方法であって、合成のそれぞれのサイクルにおいてビーズがサブセットにスプリットされるように、プールアンドスプリット方式でビーズの表面上でポリヌクレオチド合成を実施することであって、それらが異なる化学反応に供される、実施すること；および次いでこのスプリットプール法を２回以上のサイクルで繰り返してコンビナトリアルに多数の区別される核酸バーコードを産生することを含む方法を提供する。本発明は、段階法のポリヌクレオチド配列の「構築」の当業者に公知の任意のタイプの合成であり得るポリヌクレオチド合成を実施することをさらに提供する。例としては、限定されるものではないが、ホスホラミダイト化学反応による逆方向合成またはホスホラミダイト化学による順方向合成が挙げられる。従来および周知の方法は、オリゴヌクレオチドを別個に合成し、次いで所望の配列全体をビーズ上に酵素的に「接着」する。本出願人らは、複合ビーズおよびヌクレオチドをビーズ材料上にハイスループット方式で化学的に構築するそれらのビーズを産生する新規方法を提示する。さらに、本出願人らは、一般に、数百万個の配列を別個のコンパートメント中に送達し、次いで全て一度にスクリーニングすることを可能とするビーズの「パケット」の送達を記載する。
【００１５】
本発明は、マイクロ流体系を介して単一細胞シーケンシングライブラリーを作出するための機器であって、フィルターと、レジスターをさらに含む担体流体チャネルとを含む油−界面活性剤インレット；フィルターと、レジスターをさらに含む担体流体チャネルを含む、分析物のためのインレット；フィルターと、レジスターをさらに含む担体流体チャネルとを含む、ｍＲＮＡ捕捉マイクロビーズおよび溶解試薬のためのインレットを含み、前記担体流体チャネルは、調整可能または所定の流速においてその中を流動する担体流体を有し、それぞれの前記担体流体チャネルはジャンクションにおいて合流し、および前記ジャンクションは、ドロップ用アウトレットを含有する混合器に接続されている、機器をさらに提供する。
【００１６】
したがって、本出願人らが権利を留保し、本明細書により任意のこれまでに公知の産物、プロセス、または方法の放棄を開示するようなこれまでに公知のいかなる産物、その産物の作製プロセス、またはその産物の使用方法も本発明の範囲内に包含しないことが、本発明の目的である。さらに、本発明は、本出願人らが権利を留保し、本明細書により任意のこれまでに記載された産物、その産物の作製プロセス、またはその産物の使用方法の放棄を開示するような、米国特許商標庁（ＵＳＰＴＯ）（米国特許法第１１２条第１段落）または欧州特許庁（ＥＰＯ）（ＥＰＣ第８３条）の明細書の記載および実施可能要件を満たさないいかなる産物、その産物の作製プロセス、またはその産物の使用方法も本発明の範囲内に包含しないものと意図されることが留意される。
【００１７】
本開示ならびに特に特許請求の範囲および／または段落において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んだ（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの用語は、米国特許法におけるそれに属する意味を有し得、例えば、それらは、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んだ（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味し得、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」などの用語は、米国特許法におけるそれらに属する意味を有し、例えば、それらは明示されていない要素を許容するが、先行技術に見出され、または本発明の基本もしくは新規特徴に影響を与える要素を排除することに留意される。
【００１８】
これらのおよび他の実施形態は開示され、または以下の詳細な説明から明らかであり、それにより包含される。
【００１９】
以下の詳細な説明は、例として挙げられるが、本発明を記載される具体的な実施形態のみに限定するものではなく、添付の図面とともに最良に理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、例示的に開示される実施形態によるマイクロ流体液滴を説明する。
【図２】図２Ａ−Ｂは、ｍＲＮＡ捕捉のための単一塩基および最終オリゴ−ｄＴテールを使用してビーズ上でスプリットアンドプール合成によりバーコードを構築する本発明の実施形態を説明する。
【図３】図３Ａ−Ｄは、理論レベルの複雑性にアプローチする細胞バーコード配列を説明する。
【図４】注入（１回）されるＰＢＳ中の細胞の同時封入を説明するマイクロ流体装置である。
【図５】マイクロ流体装置の概略的な説明である。
【図６】マイクロ流体装置から生成されたｄｒｏｐ−ｓｅｑ法を使用してソートされる目的ドロップを説明する。
【図７】図７Ａ−Ｄは、液滴中の細胞トランスクリプトームの分子バーコード化を説明する。
【図８】図８Ａ−Ｄは、Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑによる単一細胞トランスクリプトームの抽出および処理を説明する。
【図９】図９Ａ−Ｇは、種混合実験を使用するＤｒｏｐ−Ｓｅｑの重要な評価を説明する。
【図１０】図１０Ａ−Ｃは、Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑにより分析されたＨＥＫおよび３Ｔ３細胞の細胞周期分析を説明する。
【図１１】図１１Ａ−Ｆは、Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑにより調製された４４，８０８個の単一細胞転写プロファイルからの網膜細胞タイプのアブイニシオ再構築を説明する。
【図１２】図１２Ａ−Ｉは、アマクリン細胞、錐体細胞および網膜神経節細胞間のより微細なスケールの発現区別を示す。
【図１３】図１３Ａ−Ｃは、Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑにより調製された４７１個の単一細胞転写プロファイルからのヒト骨髄細胞タイプのアブイニシオ再構築を説明する。
【図１４】図１４Ａ−Ｃは、マイクロ粒子（ビーズ）の表面上のバーコード化プライマーの特性の評価を説明する。
【図１５】図１５Ａ−Ｅは、装置設計およびＤｒｏｐ−Ｓｅｑライブラリー調製における単一細胞不純物への技術的寄与の詳細を説明する。
【図１６】図１６Ａ−Ｆは、５０個の細胞／μｌの濃度において調製された低深度および高深度種混合（ＨＥＫ／２９３Ｔ）Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑライブラリーをダウンサンプリングすることにより評価されたシーケンシングカバレッジの関数としての特異性および感度を説明する。（Ａ、Ｂ）特異性の分析。
【図１７】図１７Ａ−Ｆは、Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑ発現バイアスおよび捕捉効率の推定を説明する。
【図１８】分析において使用された４４，８０８個の網膜細胞ＳＴＡＭＰの主成分１〜３２のプロットを説明する。
【図１９】単一細胞遺伝子発現の教師なし分析により生成された３９個の網膜細胞クラスタ中の選択マーカー遺伝子の発現を示すバイオリンプロットを説明する。
【図２０】完全な４４，８０８個の細胞のデータセットを構成した７つのレプリケートの１つに由来する細胞から構成されるそれぞれのクラスタの割合を示す。
【図２１】Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑ設定の概略的な表示を説明する。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下の詳細な説明は、添付の図面を参照してここで特許請求される本発明の例示的な実施形態のものである。このような説明は、説明であることが意図され、本発明の範囲に関して限定するものではない。このような実施形態は、当業者が主題発明を実施することが可能となるように十分詳細に記載され、主題発明の趣旨からも範囲からも逸脱せずに一部を変形して他の実施形態を実施し得ることが理解される。
【００２２】
本発明は、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド装飾ビーズであって、リンカー；シーケンシングプライミング部位として使用される同一配列；均一または準均一ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列；それぞれのプライミング部位について異なるユニーク分子識別子；場合により、ポリアデニル化ｍＲＮＡを捕捉し、かつ逆転写をプライミングするためのオリゴヌクレオチド冗長配列；および場合により、同定のための追加の基質を提供する少なくとも１つの他のオリゴヌクレオチドバーコードを含む、ビーズを提供する。
【００２３】
本発明の一実施形態において、ビーズの表面上のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列は、分子バーコードである。さらなる実施形態において、バーコードは、４〜１０００ヌクレオチド長の範囲である。別の実施形態において、ポリアデニル化ｍＲＮＡを捕捉し、かつ逆転写をプライミングするためのオリゴヌクレオチド配列は、オリゴｄＴ配列である。
【００２４】
本発明の一実施形態において、リンカーは、非開裂性直鎖ポリマーである。別の実施形態において、リンカーは、化学開裂性直鎖ポリマーである。さらなる実施形態において、リンカーは、非開裂性の場合により置換されている炭化水素ポリマーである。別の実施形態において、リンカーは、感光性の場合により置換されている炭化水素ポリマーである。別の実施形態において、リンカーは、ポリエチレングリコールである。一実施形態において、リンカーは、ＰＥＧ−Ｃ３〜ＰＥＧ−２４である。
【００２５】
本発明は、複数のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド装飾ビーズを含む混合物であって、前記ビーズは、リンカー；シーケンシングプライミング部位として使用される同一配列；均一または準均一ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列；それぞれのプライミング部位について異なるユニーク分子識別子；場合により、ポリアデニル化ｍＲＮＡを捕捉し、かつ逆転写をプライミングするためのオリゴヌクレオチド冗長配列；および場合により、下流分子−生物学的反応のための基質を提供する少なくとも１つの追加のオリゴヌクレオチド配列を含み、均一または準均一ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列は、任意の１つのビーズ上の全てのプライミング部位にわたり同一であるが、個々のビーズ上のオリゴヌクレオチド間で変動する、混合物を提供する。
【００２６】
本発明の一実施形態において、ビーズの表面上のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列は、分子バーコードである。さらなる実施形態において、バーコードは、４〜１０００ヌクレオチド長の範囲である。別の実施形態において、ポリアデニル化ｍＲＮＡを捕捉し、かつ逆転写をプライミングするためのオリゴヌクレオチド配列は、オリゴｄＴ配列である。
【００２７】
本発明の一実施形態において、混合物は、下流分子−生物学的反応のための基質を提供する少なくとも１つのオリゴヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、下流分子生物学的反応は、成熟ｍＲＮＡの逆転写のため、トランスクリプトームの特異的部分を捕捉するため、ＤＮＡポリメラーゼおよび／もしくは類似の酵素をプライミングするため、またはトランスクリプトームもしくはゲノム全体を通してプライミングするためのものである。本発明の一実施形態において、追加のオリゴヌクレオチド配列は、オリゴ−ｄＴ配列を含む。本発明の別の実施形態において、追加のオリジオ（ｏｌｉｇｉｏ）ヌクレオチド配列は、プライマー配列を含む。本発明の一実施形態において、追加のオリゴヌクレオチド配列は、オリジオ−ｄＴ配列およびプライマー配列を含む。
【００２８】
本発明は、エラー訂正バーコードビーズであって、リンカー；シーケンシングプライミング部位として使用される同一配列；少なくともヌクレオチド塩基のデュプリケートを含む均一または準均一ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列；それぞれのプライミング部位について異なるユニーク分子識別子；およびポリアデニル化ｍＲＮＡを捕捉し、かつ逆転写をプライミングするための冗長オリゴヌクレオチドを含む、ビーズを提供する。
【００２９】
本発明の一実施形態において、エラー訂正バーコードビーズは、ｍＲＮＡにハイブリダイズし得ず、それにより逆転写を受け得ない。
【００３０】
本発明はまた、オリゴヌクレオチド結合ビーズおよび自己訂正バーコードビーズの混合物を含むキットを提供する。
【００３１】
本発明は、単一細胞シーケンシングライブラリーを作出する方法であって、１つのユニークにバーコード化されたＲＮＡ捕捉マイクロビーズを、５０μｍ〜２１０μｍの直径を有するエマルジョン液滴中で単一細胞と合流させること；細胞を溶解させ、それによりＲＮＡ捕捉マイクロビーズ上でＲＮＡを捕捉すること；液滴を破壊し、かつビーズを溶液中でプールすること；逆転写反応を実施して細胞のＲＮＡを、ＲＮＡ捕捉マイクロビーズに共有結合している第１のｃＤＮＡ鎖に変換するか、または逆に液滴内で逆転写させ、およびその後に液滴を破壊し、かつｃＤＮＡ付着ビーズを回収すること；それぞれのＲＮＡ起源細胞を記録する細胞バーコード、および同一細胞からのＲＮＡ間を区別する分子バーコードを含有する単一コンポジットＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリーを調製およびシーケンシングすることを含む、方法を提供する。
【００３２】
一実施形態において、エマルジョン液滴の直径は、５０〜２１０μｍである。さらなる実施形態において、ｍＲＮＡ捕捉ビーズの直径が、１０μｍ〜９５μｍである方法である。さらなる実施形態において、エマルジョン液滴の直径は、１２５μｍである。
【００３３】
本発明は、ユニーク核酸配列を有する複数のビーズを調製する方法であって、合成のそれぞれのサイクルにおいてビーズが複数のサブセットにスプリットされるように、プールアンドスプリット法で複数のビーズの表面上でポリヌクレオチド合成を実施することであって、それぞれのサブセットが異なる化学反応に供される、実施すすること；プールアンドスプリット法を２サイクル〜２００サイクルのいずれかで繰り返すことを含む、方法を提供する。
【００３４】
本発明の一実施形態において、ポリヌクレオチド合成は、ホスホラミダイト合成である。本発明の別の実施形態において、ポリヌクレオチド合成は、逆方向ホスホラミダイト化学反応である。本発明の一実施形態において、それぞれのサブセットが異なるヌクレオチドに供される。別の実施形態において、それぞれのサブセットが異なるカノニカルヌクレオチドに供される。本発明の一実施形態において、本方法が３、４、または１２回繰り返される。
【００３５】
一実施形態において、共有結合は、ポリエチレングリコールである。別の実施形態において、ｍＲＮＡ捕捉マイクロビーズの直径は、１０μｍ〜９５μｍである。一実施形態において、複数のステップは、１２回のステップである。
【００３６】
さらなる実施形態において、本方法は、ユニークバーコードおよびマイクロ流体装置に好適な直径を有するユニークにバーコード化されたｍＲＮＡ捕捉マイクロビーズを調製する方法であって、１）合成のそれぞれのサイクルにおいてビーズが、４つのカノニカルヌクレオチド（Ｔ、Ｃ、Ｇ、またはＡ）の１つとの４つの反応中にスプリットされるように、プールアンドスプリット法でビーズの表面上で逆ホスホラミダイト合成を実施すること；２）後にプール中のそれぞれのビーズの表面上に１６００万個超のユニークバーコードが存在するように、このプロセスを多数回にわたり、少なくとも６回、最適には１２回超繰り返すことを含む方法をさらに含む。
【００３７】
一実施形態において、ｍＲＮＡ捕捉マイクロビーズの直径は、１０μｍ〜９５μｍである。
【００３８】
本発明は、均一、準均一、またはパターニングヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列が任意の個々のビーズ上で合成される一方、多数の異なるヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列が異なるビーズ上で同時に合成される、複数のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド装飾ビーズを同時に調製する方法であって、複数のビーズを含む混合物を形成すること；ビーズをサブセットに分離すること；化学合成を介して個々のヌクレオチドを添加することにより、ビーズの表面上のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列を伸長させること；（ｃ）におけるビーズのサブセットを単一の共通プール中でプールすること；ステップ（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）を複数回繰り返して１０００個以上のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列をコンビナトリアルに産生すること；およびヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド装飾ビーズを回収することを含む、方法を提供する。
【００３９】
本発明の一実施形態において、ビーズの表面上のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列は、分子バーコードである。さらなる実施形態において、プールアンドスプリット合成ステップが、サイクル毎ではなく、２〜１０サイクル毎に行われる。
【００４０】
本発明の一実施形態において、バーコードは、ビルトインエラー訂正を含有する。別の実施形態において、バーコードは、４〜１０００ヌクレオチド長の範囲である。本発明の実施形態において、ポリヌクレオチド合成は、ホスホラミダイト合成である。さらなる実施形態において、ポリヌクレオチド合成は、逆方向ホスホラミダイト化学反応である。本発明の一実施形態において、それぞれのサブセットが異なるヌクレオチドに供される。さらなる実施形態において、１つ以上のサブセットは、２つのヌクレオチドのカクテルを受ける。一実施形態において、それぞれのサブセットが異なるカノニカルヌクレオチドに供される。
【００４１】
本発明により提供される方法は、ビーズがマイクロビーズ、ナノ粒子、またはマクロビーズである種々の実施形態を企図する。同様に、本発明は、オリゴヌクレオチド配列がジヌクレオチドまたはトリヌクレオチドであることを企図する。
【００４２】
本発明は、均一または準均一ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列が任意の個々のビーズ上で合成される一方、複数の異なるヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列が異なるビーズ上で同時に合成される、１０００個以上のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド装飾ビーズを同時に調製する方法であって、複数のビーズを含む混合物を形成すること；ビーズをサブセットに分離すること；化学合成を介して個々のヌクレオチドを添加することにより、ビーズの表面上のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列を伸長させること；（ｃ）におけるビーズのサブセットを単一の共通プール中でプールすること；ステップ（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）を複数回繰り返して多数のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列をコンビナトリアルに産生すること；およびヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド装飾ビーズを回収すること；合成のそれぞれのサイクルにおいてビーズが複数のサブセットにスプリットされるように、プールアンドスプリット合成で複数のビーズの表面上でポリヌクレオチド合成を実施することであって、それぞれのスプリットが異なる化学反応に供される、実施すること；プールアンドスプリット合成を複数回繰り返すことを含む、方法を提供する。
【００４３】
本発明の一実施形態において、ビーズの表面上のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列は、分子バーコードである。一実施形態において、プールアンドスプリット合成ステップが、サイクル毎ではなく、２〜１０サイクル毎に行われる。一実施形態において、生成されたバーコードは、ビルトインエラー訂正を含有する。別の実施形態において、バーコードは、４〜１０００ヌクレオチド長の範囲である。本発明の実施形態において、ポリヌクレオチド合成は、ホスホラミダイト合成である。さらなる実施形態において、ポリヌクレオチド合成は、逆方向ホスホラミダイト化学反応である。本発明の一実施形態において、それぞれのサブセットが異なるヌクレオチドに供される。さらなる実施形態において、１つ以上のサブセットは、２つのヌクレオチドのカクテルを受ける。一実施形態において、それぞれのサブセットが異なるカノニカルヌクレオチドに供される。
【００４４】
本発明により提供される方法は、ビーズがマイクロビーズ、ナノ粒子、またはマクロビーズである種々の実施形態を企図する。同様に、本発明は、オリゴヌクレオチド配列がジヌクレオチドまたはトリヌクレオチドであることを企図する。
【００４５】
本発明は、マイクロ流体系を介してコンポジット単一細胞シーケンシングライブラリーを作出するための機器であって、フィルターと、レジスターをさらに含む２つの担体流体チャネルとを含む油−界面活性剤インレット；フィルターと、レジスターをさらに含む２つの担体流体チャネルとを含む、分析物のためのインレット；担体流体チャネルを含む、ｍＲＮＡ捕捉マイクロビーズおよび溶解試薬のためのインレットを含み、前記担体流体チャネルは、調整可能または所定の流速においてその中を流動する担体流体を有し、それぞれの前記担体流体チャネルはジャンクションにおいて合流し、および前記ジャンクションは、液滴ピンチオフ用構造物とそれに続くドロップ用アウトレットに接続されている混合器とに接続されている、機器をさらに提供する。
【００４６】
機器の一実施形態において、分析物は、化学試薬、遺伝子摂動細胞、タンパク質、薬物、抗体、酵素、核酸、オルガネラ、例えば、ミトコンドリアまたは核、細胞またはそれらの任意の組合せを含む。機器の一実施形態において、分析物は細胞である。さらなる実施形態において、分析物は哺乳動物細胞である。別の実施形態において、機器の分析物は、複合組織である。さらなる実施形態において、細胞は、脳細胞である。本発明の一実施形態において、細胞は、網膜細胞である。別の実施形態において、細胞は、ヒト骨髄細胞である。一実施形態において、細胞は、宿主−病原体細胞である。
【００４７】
機器の一実施形態において、溶解試薬は、アニオン性界面活性剤、例えば、ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、またはカオトロピック塩、例えば、チオシアン酸グアニジニウムを含む。機器の一実施形態において、フィルターは、正方ＰＤＭＳポストからなり、細胞チャネル上のフィルターはそのようなポストからなり、辺は１２５〜１３５μｍの範囲であり、ポスト間は７０〜１００ｎｍ離隔している。油−界面活性剤インレット上のフィルターは、２つのサイズの正方ポストを含み、一方は、７５〜１００μｍの範囲の辺を有し、それらの間は２５〜３０μｍ離隔しており、他方は、４０〜５０μｍの範囲の辺を有し、１０〜１５μｍ離隔している。機器の一実施形態において、レジスターは、７０００〜９０００μｍの長さと、５０〜７５μｍの幅と、１００〜１５０ｍｍの深さとを有するサーペンタインである。機器の一実施形態において、チャネルは、油−界面活性剤インレットについては８０００〜１２，０００μｍ、分析物（細胞）インレットについては５０００〜７０００、ならびにマイクロビーズおよび溶解薬剤用インレットについては９００〜１２００μｍの長さを有する。全てのチャネルは、１２５〜２５０ｍｍの幅と１００〜１５０ｍｍの深さとを有する。別の実施形態において、細胞チャネルの幅は１２５〜２５０μｍであり、深さは１００〜１５０μｍである。機器の一実施形態において、混合器は、７０００〜９０００μｍの長さと１１０〜１４０μｍの幅とを有し、１５０μｍごとに３５〜４５°のジグザグを有する。一実施形態において、混合器の幅は１２５μｍである。機器の一実施形態において、油−界面活性剤は、ＰＥＧブロックポリマー、例えば、ＢＩＯＲＡＤ（商標）ＱＸ２００  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｏｉｌである。機器の一実施形態において、担体流体は水−グリセロール混合物である。
【００４８】
以下の要素の組合せ：提供される方法により作出されたビーズ特異的オリゴヌクレオチドバーコード；個々のビーズ上のオリゴヌクレオチド間で変動し、したがってそれらの個々のオリゴヌクレオチド分子を区別または識別するために使用することができる追加のオリゴヌクレオチドバーコード配列；下流分子−生物学的反応のための基質を作出する追加のオリゴヌクレオチド配列、例えば、オリゴ−ｄＴ（成熟ｍＲＮＡの逆転写のため）、特異的配列（トランスクリプトームの特異的部分を捕捉するか、またはＤＮＡポリメラーゼおよび類似の酵素をプライミングするため）、またはランダム配列（トランスクリプトームまたはゲノム全体を通してプライミングするため）により装飾されている複数のマイクロビーズを含む混合物である。一実施形態において、任意の個々のマイクロビーズの表面上の個々のオリゴヌクレオチド分子は、それらの要素の３つ全てを含有し、第３の要素は、オリゴ−ｄＴおよびプライマー配列の両方を含む。
【００４９】
別の実施形態において、混合物は、以下の要素：概略される方法により得られる少なくとも１つのビーズ特異的オリゴヌクレオチドバーコード；個々のビーズ上のオリゴヌクレオチド間で変動し、それによりビーズ特異的オリゴヌクレオチド分子の識別を支援する少なくとも１つの追加の識別子オリゴヌクレオチドバーコード配列；場合により、下流分子−生物学的反応のための基質を提供する少なくとも１つの追加のオリゴヌクレオチド配列を含み得る複数のマイクロビーズを含む。別の実施形態において、混合物は、下流分子−生物学的反応のための基質を提供する少なくとも１つのオリゴヌクレオチド配列を含む。さらなる実施形態において、下流分子生物学的反応は、成熟ｍＲＮＡの逆転写のため、トランスクリプトームの特異的部分を捕捉するため、ＤＮＡポリメラーゼおよび／もしくは類似の酵素をプライミングするため、またはトランスクリプトームもしくはゲノム全体を通してプライミングするためのものである。さらなる実施形態において、混合物は、オリジオ−ｄＴ配列を含む追加のオリゴヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、混合物は、プライマー配列を含む追加のオリゴヌクレオチド配列をさらに含む。別の実施形態において、混合物は、オリジオ−ｄＴ配列およびプライマー配列を含む追加のオリゴヌクレオチド配列をさらに含む。
【００５０】
用いることができる標識物質の例としては、当業者に公知の標識物質、例えば、蛍光色素、酵素、補酵素、化学発光物質、および放射性物質が挙げられる。具体例としては、放射性同位体（例えば、３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、および１３１Ｉ）、フルオレセイン、ローダミン、ダンシルクロリド、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ビオチン、およびルテニウムが挙げられる。標識物質としてビオチンが用いられる場合、好ましくは、ビオチン標識抗体の添加後、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ）に結合しているストレプトアビジンがさらに添加される。
【００５１】
有利には、標識は、蛍光標識である。蛍光標識の例としては、限定されるものではないが、Ａｔｔｏ色素、４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’ジスルホン酸；アクリジンおよび誘導体：アクリジン、アクリジンイソチオシアネート；５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）；４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５ジスルホネート；Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド；アントラニルアミド；ＢＯＤＩＰＹ；ブリリアントイエロー；クマリンおよび誘導体；クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクルアリン（ｃｏｕｌｕａｒｉｎ）（クマラン（Ｃｏｕｍａｒａｎ）１５１）；シアニン色素；シアノシン；４’，６−ジアミニジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）；５’５’’−ジブロモピロガロール−スルホナフタレイン（ブロモピロガロールレッド）；７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン；ジエチレントリアミンペンタアセテート；４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸；４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸；５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−スルホニルクロリド（ＤＮＳ、ダンシルクロリド）；４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシンおよび誘導体；エオシン、エオシンイソチオシアネート、エリスロシンおよび誘導体；エリスロシンＢ、エリスロシン、イソチオシアネート；エチジウム；フルオレセインおよび誘導体；５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’，７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ＱＦＩＴＣ、（ＸＲＩＴＣ）；フルオレスカミン；ＩＲ１４４；ＩＲ１４４６；マラカイトグリーンイソチオシアネート；４−メチルウンベリフェロンオルトクレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラロザニリン；フェノールレッド；Ｂ−フィコエリスリン；ｏ−フタルジアルデヒド；ピレンおよび誘導体：ピレン、ピレンブチレート、スクシンイミジル１−ピレン；ブチレート量子ドット；リアクティブレッド４（Ｃｉｂａｃｒｏｎ（商標）ブリリアントレッド３Ｂ−Ａ）ローダミンおよび誘導体：６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミンローダミンＢスルホニルクロリドローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１の塩化スルホニル誘導体（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）；テトラメチルローダミン；テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）；リボフラビン；ロゾール酸；テルビウムキレート誘導体；Ｃｙ３；Ｃｙ５；Ｃｙ５．５；Ｃｙ７；ＩＲＤ７００；���ＲＤ８００；Ｌａ  Ｊｏｌｔａ  Ｂｌｕｅ；フタロシアニン；およびナフタロシアニンが挙げられる。
【００５２】
蛍光標識は、蛍光タンパク質、例えば、青色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質または任意の光変換タンパク質であり得る。比色標識、生物発光標識および／または化学発光標識は、標識をさらに達成させ得る。標識としては、摂動分析によるハイブリダイゼーション複合体中の分子間のエネルギー移動、クエンチング、またはドナーおよびアクセプター分子間の電子輸送をさらに挙げることができ、その後者は二本鎖マッチハイブリダイゼーション複合体により容易にすることができる。蛍光標識は、ペリレンまたはテリレンであり得る。代替例において、蛍光標識は、蛍光バーコードであり得る。
【００５３】
有利な実施形態において、標識は、光感受性であり得、標識は、光活性化され、および／または光が１つ以上のリンカーを開裂させて分子積み荷を放出させる。光活性化分子積み荷は、主要集光性複合体（ＬＨＣＩＩ）であり得る。別の実施形態において、蛍光標識は、フリーラジカル形成を誘導し得る。
【００５４】
有利な実施形態において、薬剤は、動的な方法でユニークに標識することができる（例えば、２０１２年９月２１日に出願された米国仮特許出願第６１／７０３，８８４号明細書参照）。ユニーク標識は、少なくとも部分的に、天然核酸であり得、２つ以上の検出可能オリゴヌクレオチドタグの互いへの逐次付着により生成することができ、それぞれのユニーク標識は、別個の薬剤と会合させることができる。検出可能オリゴヌクレオチドタグは、そのヌクレオチド配列のシーケンシングにより、および／またはそれを付着させることができる非核酸検出可能部分の検出により検出することができるオリゴヌクレオチドであり得る。
【００５５】
オリゴヌクレオチドタグは、それらのヌクレオチド配列により、またはオリゴヌクレオチドに付着している非核酸検出可能部分、例えば、限定されるものではないが、フルオロフォアにより、またはそれらのヌクレオチド配列および非核酸検出可能部分の組合せにより検出可能であり得る。
【００５６】
一部の実施形態において、検出可能オリゴヌクレオチドタグは、１つ以上の非オリゴヌクレオチド検出可能部分を含み得る。検出可能部分の例としては、限定されるものではないが、フルオロフォア、微粒子、例として、量子ドット（Ｅｍｐｏｄｏｃｌｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３９９：１２６−１３０，１９９９）、金ナノ粒子（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７２：６０２５−６０２９，２０００）、マイクロビーズ（Ｌａｃｏｓｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７（１７）：９４６１−９４６６，２０００）、ビオチン、ＤＮＰ（ジニトロフェニル）、フコース、ジゴキシゲニン、ハプテン、および当業者に公知の他の検出可能部分を挙げることができる。一部の実施形態において、検出可能部分は、量子ドットであり得る。このような部分を検出する方法は本明細書に記載され、および／または当技術分野において公知である。
【００５７】
したがって、検出可能オリゴヌクレオチドタグは、限定されるものではないが、ユニークヌクレオチド配列を含み得るオリゴヌクレオチド、検出可能部分を含み得るオリゴヌクレオチド、ならびにユニークヌクレオチド配列および検出可能部分の両方を含み得るオリゴヌクレオチドであり得る。
【００５８】
ユニーク標識は、２つ以上の検出可能オリゴヌクレオチドタグの互いへの逐次付着により産生することができる。検出可能タグは、複数の検出可能タグ中に存在し得、またはその中で提供することができる。同一または異なる複数のタグを使用することができる。なぜなら、それぞれの検出可能タグの資源がユニーク標識の一部であり得るためである。換言すると、複数のタグは、下位セットに下位分類することができ、単一の下位セットをそれぞれのタグのための資源として使用することができる。
【００５９】
一部の実施形態において、１つ以上の他の種をタグと会合させることができる。特に、溶解細胞により放出される核酸を１つ以上のタグにライゲートすることができる。これらとしては、例えば、染色体ＤＮＡ、ＲＮＡ転写物、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡなどを挙げることができる。このような核酸は、タグそれ自体のシーケンシングに加え、シーケンシングすることができ、それはタグ、または対応する液滴もしくは細胞が曝露される条件と関連し得る細胞の核酸プロファイルについての情報を生じ得る。
【００６０】
本明細書に記載の本発明により、油中水型エマルジョンとしてマイクロ流体装置により生成される単分散水性液滴の使用を通して細胞、オルガネラ、核酸、タンパク質などを含有し得る個々のエマルジョン液滴への試薬のハイスループットおよび高分解能送達が可能となる。液滴は、流動油相中で運搬され、界面活性剤により安定化される。一態様において、単一細胞または単一オルガネラまたは単一分子（タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ）は、水溶液／分散液から均一な液滴中に封入される。関連態様において、複数の細胞または複数の分子が単一細胞または単一分子に代用し得る。１ｐＬ〜１０ｎＬの範囲の容量の水性液滴は、個々の反応器として機能する。開示の実施形態は、単一のランで処理および分析することができる液滴中の数千個の単一細胞を提供する。
【００６１】
迅速なラージスケール化学スクリーニングまたは複合生物学的ライブラリー同定のためにマイクロ液滴を利用するため、規定の化合物または生物学的プローブ細胞または目的分子バーコードをそれぞれ含有する異なる種のマイクロ液滴を、好ましい条件、例えば、混合比、濃度、および組合せの順序において、生成および組み合わせなければならない。
【００６２】
それぞれの種の液滴は、別個のインレットマイクロ流体チャネルからメインのマイクロ流体チャネル中のコンフルエンス点において導入される。好ましくは、液滴容量は、それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００７／０１９５１２７号明細書および国際公開第２００７／０８９５４１号パンフレットに開示のとおり、ある種が他の種よりも大きく、担体流体中で異なる速度において、通常、他の種よりも緩慢に移動するような設計により選択される。チャネル幅および長さは、より早い種の液滴が最も緩慢な種を捕捉するように選択される。チャネルのサイズ制約は、より早く移動する液滴がより緩慢に移動する液滴を追い越し、合流帯域に流入する一連の液滴をもたらすのを防止する。多段階化学反応、生化学反応、またはアッセイ検出化学反応は、異なるタイプの種を反応に添加する前に固定反応時間を要求することが多い。多段階反応は、プロセスを複数回繰り返すことにより達成され、第２、第３またはそれより多いコンフルエンス点はそれぞれ別個の合流点を有する。高度に効率的で正確な反応および反応の分析は、インレットチャネルからの液滴の頻度が最適化された比にマッチし、種の容量がマッチして組合せ液滴中で最適化された反応条件を提供する場合に達成される。
【００６３】
流体液滴は、液滴を含有する液体の流動を変更することにより本発明の流体系内でスクリーニングまたはソートすることができる。例えば、実施形態の１セットにおいて、流体液滴は、流体液滴を包囲する液体を第１のチャネル、第２のチャネルなどに方向付けることにより進行させ、またはソートすることができる。実施形態の別のセットにおいて、流体系内、例えば、異なるチャネル内またはチャネルの異なる部分内の圧力は、流体液滴の流動を方向付けるように制御することができる。例えば、液滴は、流動のさらなる方向付けのための複数のオプションを含むチャネルジャンクションに向けて方向付ける（例えば、任意選択の下流流動チャネルを定義するチャネル中のブランチ部、またはフォーク部に向けて方向付ける）ことができる。任意選択の下流流動チャネルの１つ以上の中の圧力は、液滴をチャネルの１つの中に選択的に方向付けるように制御することができ、それぞれの連続的な液滴の下流流動経路を独立して制御することができるように連続的な液滴のジャンクションへの到達に要求される時間の順序で圧力変化をもたらすことができる。１つの配置において、液体リザーバーの膨張および／または収縮を使用し、例えば、流動液滴を含有する液体の移動を方向付けることにより流動液滴をチャネル中に進行させ、またはソートすることができる。別の実施形態において、液体リザーバーの膨張および／または収縮は、例えば、本明細書に記載の他の流動制御装置および方法と組み合わせることができる。液体リザーバーの膨張および／または収縮を引き起こし得る装置の非限定的な例としては、ピストンが挙げられる。
【００６４】
液滴を処理するためのマイクロ流体チャネルを使用するためのキー要素としては、（１）正確な容量の液滴を産生すること、（２）正確な頻度において液滴を産生することおよび（３）第１の試料液滴流の頻度が第２の試料液滴流の頻度にマッチするように第１の試料液滴流を第２の試料液滴流と一緒にすることが挙げられる。好ましくは、ライブラリー液滴の頻度が試料液滴の頻度にマッチするように試料液滴流を事前作製されたライブラリー液滴流と一緒にすること。
【００６５】
規則的な頻度において均一な容量の液滴を産生する方法は、当技術分野において周知である。１つの方法は、例えば、米国特許出願公開第２００５／０１７２４７６号明細書および国際公開第２００４／００２６２７号パンフレットに開示される分散相流体および非混和性担体流体の流体力学的収束を使用して液滴を生成することである。事前作製された液滴のライブラリーであることがコンフルエンスにおいて導入される種の１つに望ましく、そのライブラリーは、複数の反応条件を含有し、例えば、ライブラリーは、細胞または酵素に対するそれらの効果のスクリーニングのために別個のライブラリー要素として封入される一連の濃度における複数の異なる化合物を含有し得、あるいはライブラリーは、遺伝子座のコレクションの標的化増幅のために異なるライブラリー要素として封入される複数の異なるプライマーペアから構成され得、あるいはライブラリーは、複数の結合アッセイを実施するために異なるライブラリー要素として封入される複数の異なる抗体種を含有し得る。基質上への反応条件のライブラリーの導入は、事前作製されたライブラリー液滴のコレクションを、推進流体によりバイアルからプッシュすることにより達成される。推進流体は、連続流体である。推進流体は、担体流体（例えば、フルオロカーボン油）と同一の物質を含み得る。例えば、１０ピコリットルの液滴からなるライブラリーをマイクロ流体サブストレート上のインレットチャネル中に、毎秒１０，０００ピコリットルの流速の推進流体により推進させる場合、公称上、液滴がコンフルエンス点に流入すると予測される頻度は、毎秒１０００個である。しかしながら、実際、液滴は、緩慢に流出するそれらの間の油と一緒になる。経時的には、担体流体はライブラリー液滴から流出し、液滴の数密度（数／ｍＬ）は増加する。したがって、推進流体のための注入の単一固定速度は、サブストレート中のマイクロ流体チャネル中への液滴の均一な導入速度を提供しない。さらに、平均ライブラリー液滴容量のライブラリーごとの変動は、コンフルエンス点における液滴導入の頻度のシフトをもたらす。したがって、試料変動および油流出から生じる液滴の均一性の欠如は、解決すべき別の問題を提供する。例えば、ライブラリー中で公称上の液滴容量が１０ピコリットルと予測されるが、ライブラリーごとに９〜１１ピコリットルで変動する場合、１０，０００ピコリットル／秒の注入速度は毎秒９００〜１，１００個の液滴の頻度範囲を名目上もたらす。要約すると、チップ上で作製された液滴についての分散相の組成の試料ごとの変動、ライブラリー液滴の数密度が経時的に増加する傾向および平均液滴容量のライブラリーごとの変動は、単に固定注入速度を使用することにより液滴の頻度がコンフルエンスにおいて容易にマッチし得る程度を厳しく限定する。さらに、これらの限定は、容量を再現可能に組み合わせることができる程度に対しても影響する。ポンプ流速正確性の典型的な変動およびチャネル寸法の変動との組合せにより、系は、ランツーランに基づき補償する手段なしで厳しく限定される。上記事実は、解決すべき問題を説明するだけでなく、マイクロ流体チャネル内のマイクロ液滴に対するマイクロ流体制御の即時調節の方法の必要性を実証する。
【００６６】
界面活性剤および油の組合せは、液滴の生成、貯蔵、および操作を容易にして多様なライブラリーのそれぞれの液滴内のユニークな化学／生化学／生物学的環境を維持するために開発しなければならない。したがって、界面活性剤および油の組合せは、（１）ドロップ形成プロセスならびに後続の回収および貯蔵の間の制御不能な癒合に対して液滴を安定化し、（２）油相および／または液滴間へのいかなる液滴含有物の輸送も最小化し、（３）それぞれの液滴の含有物との化学および生物学的不活性を維持しなければならない（例えば、油−水界面における封入含有物の吸着も反応もなし、および液滴中の生物学的または化学成分に対する悪影響もなし）。液滴ライブラリー機能および安定性に対する要求に加え、油中界面活性剤溶液は、プラットフォームと関連する流体物理学および材料と結び付けなければならない。具体的には、油溶液は、マイクロ流体チップを構築するために使用される材料を膨潤も、溶解も、分解もさせてはならず、油の物理的特性（例えば、粘度、沸点など）はプラットフォームの流動および操作条件に適してなければならない。
【００６７】
界面活性剤なしで油中で形成される液滴は安定でなく癒合を許容し、したがって、界面活性剤はエマルジョンライブラリーのための連続相として使用される油中で溶解させなければならない。界面活性剤分子は、両親媒性であり、分子の一部は油溶性であり、分子の一部は水溶性である。水−油界面が、例えば、本明細書に記載のインレットモジュール中のマイクロ流体チップのノズルにおいて形成される場合、油相中で溶解される界面活性剤分子は界面に吸着する。分子の親水性部分は、液滴内側に残留し、分子の親フルオロ部分は液滴の外部をデコレートする。界面に界面活性剤が集中する場合、液滴の表面張力は低減し、したがってエマルジョンの安定性が改善される。癒合に対する液滴の安定化の他、界面活性剤は、それぞれの液滴の含有物に対して不活性であるべきであり、界面活性剤は、油または他の液滴への封入成分の輸送を促進すべきでない。
【００６８】
液滴ライブラリーは、単一のコレクションにおいて一緒にプールされる多数のライブラリー要素から構成することができる（例えば、米国特許出願公開第２０１０００２２４１号明細書参照）。ライブラリーは、単一のライブラリー要素から１０１５個のライブラリー要素以上まで複雑性が変動し得る。それぞれのライブラリー要素は、固定濃度における１つ以上の所与の成分であり得る。要素は、限定されるものではないが、細胞、オルガネラ、ウイルス、細菌、酵母、ビーズ、アミノ酸、タンパク質、ポリペプチド、核酸、ポリヌクレオチドまたは小分子化合物であり得る。要素は、識別子、例えば、標識を含有し得る。用語「液滴ライブラリー」は、本明細書において、「エマルジョンライブラリー」とも称される。これらの用語は本明細書全体を通して交換可能に使用される。
【００６９】
細胞ライブラリー要素としては、限定されるものではないが、ハイブリドーマ、Ｂ細胞、初代細胞、培養細胞系、癌細胞、幹細胞、組織から得られた細胞（例えば、網膜またはヒト骨髄）、末梢血単核細胞、または任意の他の細胞タイプを挙げることができる。細胞ライブラリー要素は、１つから何十万個の多数の細胞を個々の液滴中で封入することにより調製される。封入される細胞の数は、通常、ポアソン統計により、細胞の数密度および液滴の容量から与えられる。しかしながら、一部の場合、この数は、Ｅｄｄ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  ｍｏｎｏｄｉｓｐｅｒｓｅ  ｐｉｃｏｌｉｔｒｅ  ｄｒｏｐｓ．”Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ，８（８）：１２６２−１２６４，２００８に記載のとおりポアソン統計から逸れる。細胞の離散的性質は、単一出発媒体中に全て存在する複数の細胞バリアントを用いるライブラリーの大量調製を可能とし、次いでその媒体は多くとも１つの細胞を含有する個々の液滴カプセルに破壊される。次いで、これらの個々の液滴カプセルを合わせ、またはプールしてユニークライブラリー要素からなるライブラリーを形成する。封入後の細胞分裂、または一部の実施形態において細胞分裂に続く封入が、クローンライブラリー要素を産生する。
【００７０】
上記のドロップシーケンシング（Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）法についての使用に種々の分析物を企図することができる。企図される細胞の例は、哺乳動物細胞であるが、本発明は、宿主−病原体細胞をプロファイルする方法を企図する。宿主−病原体相互作用の発現を特徴決定するため、宿主および病原体を、病原体感染の複数の機会なしで同一の細胞中で増殖させることが重要である。
【００７１】
ビーズベースライブラリー要素は、所与のタイプの１つ以上のビーズを含有し得、他の試薬、例えば、抗体、酵素または他のタンパク質も含有し得る。全てのライブラリー要素が異なるタイプのビーズを含有するが、同一の包囲媒体を含有する場合、ライブラリー要素は、単一出発流体から全て調製することができ、または種々の出発流体を有し得る。バリアント、例えば、ゲノム改変された酵母または細菌細胞のコレクションから大量調製された細胞ライブラリーの場合、ライブラリー要素は、種々の出発流体から調製される。
【００７２】
タンパク質に対するバリアントを産生するように遺伝子操作された複数の細胞または酵母または細菌を用いて出発する場合、液滴当たり正確に１つの細胞を有し、わずかな液滴が２つ以上の細胞を含有することが望ましいことが多い。一部の場合、ポアソン統計からの変動は、液滴当たり正確に１つの細胞を有するより多くの液滴が存在し、例外的にわずかな空の液滴または２つ以上の細胞を含有する液滴が存在するように液滴のロードの向上を提供するように達成することができる。
【００７３】
液滴ライブラリーの例は、ビーズ、細胞、小分子、ＤＮＡ、プライマー、抗体の範囲の異なる含有物を有する液滴のコレクションである。より小さい液滴は、フェムトリットル（ｆＬ）容量ドロップのオーダーであり得、それは特に液滴分注器について企図される。容量は、約５〜約６００ｆＬの範囲であり得る。より大きい液滴は、サイズが約０．５ミクロン〜５００ミクロン直径の範囲であり、それは約１ピコリットル〜１ナノリットルに相当する。しかしながら、液滴は、５ミクロンほど小さく、５００ミクロンほど大きくてよい。好ましくは、液滴は、１００ミクロン未満、約１ミクロン〜約１００ミクロン直径である。最も好ましいサイズは、約２０〜４０ミクロン直径（１０〜１００ピコリットル）である。液滴ライブラリーの試験される好ましい特性としては、浸透圧バランス、均一サイズ、およびサイズ範囲が挙げられる。
【００７４】
本発明のエマルジョンライブラリー内に含まれる液滴は、少なくとも１つのフルオロ界面活性剤を含み得る非混和性油内に含有され得る。一部の実施形態において、非混和性フルオロカーボン油内に含まれるフルオロ界面活性剤は、１つ以上の過フッ素化ポリエーテル（ＰＦＰＥ）ブロックおよび１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ブロックからなるブロックコポリマーである。他の実施形態において、フルオロ界面活性剤は、２つのＰＦＰＥブロックにアミド結合基により共有結合しているＰＥＧセンターブロックからなるトリブロックコポリマーである。フルオロ界面活性剤（ライブラリー中の液滴の均一サイズと類似）の存在は、液滴の安定性および統一性を維持するために重要であり、本明細書に記載の種々の生物学的および化学アッセイのためのライブラリー内の液滴の後続の使用にも不可欠である。本発明の液滴ライブラリー中で利用することができる流体（例えば、水性流体、非混和性油など）および他の界面活性剤は、本明細書により詳細に記載される。
【００７５】
本発明は、少なくとも１つのフルオロ界面活性剤を含み得る非混和性油（例えば、フルオロカーボン油）内の複数の水性液滴を含み得るエマルジョンライブラリーであって、それぞれの液滴はサイズが均一であり、同一の水性流体を含み得、異なるライブラリー要素を含み得るエマルジョンライブラリーを提供する。本発明はまた、エマルジョンライブラリーを形成する方法であって、異なるライブラリー要素を含み得る単一水性流体を提供すること、それぞれのライブラリー要素を、少なくとも１つのフルオロ界面活性剤を含み得る非混和性フルオロカーボン油内の水性液滴中に封入すること（それぞれの液滴は、サイズが均一であり、同一の水性流体を含み得、異なるライブラリー要素を含み得る）、ならびに少なくとも１つのフルオロ界面活性剤を含み得る非混和性フルオロカーボン油内で水性液滴をプールし、それによりエマルジョンライブラリーを形成することを含み得る方法を提供する。
【００７６】
例えば、エマルジョンライブラリーの１つのタイプにおいて、全ての異なるタイプの要素（例えば、細胞またはビーズ）を、同一媒体中で含有される単一資源中でプールすることができる。初回プール後、細胞またはビーズを液滴中で封入し、異なるタイプのビーズまたは細胞を有するそれぞれの液滴が異なるライブラリー要素である液滴のライブラリーを生成する。初回溶液の希釈は、封入プロセスを可能とする。一部の実施形態において、形成される液滴は、単一細胞もしくはビーズを含有し、または何も含有せず、すなわち、空である。他の実施形態において、形成される液滴は、ライブラリー要素の複数のコピーを含有する。封入されている細胞またはビーズは、一般に、同一タイプの細胞またはビーズに対するバリアントである。一例において、細胞は、組織生検の癌細胞を含み得、それぞれの細胞タイプは、ゲノムデータについてまたは様々な薬物療法に対してスクリーニングするために封入される。別の例は、その１０１１または１０１５個の異なるタイプの細菌（それぞれがその中でスプライシングされる異なるプラスミドを有する）を封入することである。一例は、それぞれのライブラリー要素が酵素のバリアントを分泌するクローン集団に増殖する細菌ライブラリーである。
【００７７】
別の例において、エマルジョンライブラリーは、非混和性フルオロカーボン油内の複数の水性液滴を含み得、単一分子を封入することができ、その結果、産生される２０〜６０個の液滴（例えば、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０個の液滴、またはその間の任意の整数）当たり１つの液滴内で含有される単一分子が存在する。単一分子は、分子を含有する溶液を、単一分子の封入が可能となるような低濃度に希釈することにより封入することができる。１つの具体例において、ＬａｃＺプラスミドＤＮＡを２０ｆＭの濃度においてインキュベーションの２時間後に封入し、その結果、４０個の液滴中に約１つの遺伝子が存在し、１０μｍの液滴が毎秒１０ｋＨｚにおいて作製された。これらのライブラリーの形成は、限定希釈に依存する。
【００７８】
本発明はまた、少なくとも１つのフルオロ界面活性剤を含み得るフルオロカーボン油内の少なくとも第１の水性液滴および少なくとも第２の水性液滴を含み得るエマルジョンライブラリーであって、少なくとも第１および少なくとも第２の液滴は、サイズが均一であり、異なる水性流体および異なるライブラリー要素を含むエマルジョンライブラリーを提供する。本発明はまた、エマルジョンライブラリーを形成する方法であって、少なくとも第１の要素のライブラリーを含み得る少なくとも第１の水性流体を提供すること、少なくとも第２の要素のライブラリーを含み得る少なくとも第２の水性流体を提供すること、前記少なくとも第１のライブラリーのそれぞれの要素を、少なくとも１つのフルオロ界面活性剤を含み得る非混和性フルオロカーボン油内の少なくとも第１の水性液滴中に封入すること、前記少なくとも第２のライブラリーのそれぞれの要素を、少なくとも１つのフルオロ界面活性剤を含み得る非混和性フルオロカーボン油内の少なくとも第２の水性液滴中に封入すること（少なくとも第１および少なくとも第２の液滴は、サイズが均一であり、異なる水性流体および異なるライブラリー要素を含む）、ならびに少なくとも１つのフルオロ界面活性剤を含み得る非混和性フルオロカーボン油内の少なくとも第１の水性液滴および少なくとも第２の水性液滴をプールし、それによりエマルジョンライブラリーを形成することを含み得る方法を提供する。
【００７９】
当業者は、本発明の方法および系が、いかなる特定のタイプの試料にも限定されず、本発明の方法および系を任意のタイプの有機、無機、または生物学的分子（例えば、米国特許出願公開第２０１２０１２２７１４号明細書参照）と使用し得ることを認識する。特定の実施形態において、試料としては、核酸標的分子を挙げることができる。核酸分子は、合成であり、または天然存在資源に由来し得る。一実施形態において、核酸分子は、種々の他の成分、例えば、タンパク質、脂質および非テンプレート核酸を含有する生物学的試料から単離することができる。核酸標的分子は、動物、植物、細菌、真菌、または任意の他の細胞生物から得られた任意の細胞材料から得ることができる。ある実施形態において、核酸標的分子は、単一細胞から得ることができる。本発明において使用される生物学的試料としては、ウイルス粒子または調製物を挙げることができる。核酸標的分子は、生物から直接、または生物から得られた生物学的試料から、例えば、血液、尿、脳脊髄液、精液、唾液、痰、糞便および組織から得ることができる。任意の組織または体液標本を本発明において使用される核酸のための資源として使用することができる。核酸標的分子は、培養細胞、例えば、初代細胞培養物または細胞系から単離することもできる。標的核酸が得られる細胞または組織は、ウイルスまたは他の細胞内病原体により感染されていてよい。試料は、生物学的標本から抽出された全ＲＮＡ、ｃＤＮＡライブラリー、ウイルスまたはゲノムＤＮＡでもあり得る。
【００８０】
一般に、核酸は、種々の技術、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．２８０−２８１（１９８２）により記載されるものにより生物学的試料から抽出することができる。核酸分子は、一本鎖、二本鎖、または一本鎖領域を有する二本鎖（例えば、ステムおよびループ構造）であり得る。
【００８１】
生物学的試料から得られた核酸は、典型的には、断片化して分析に好適な断片を産生することができる。標的核酸は、種々の機械的、化学的および／または酵素的方法を使用して所望の長さに断片化または剪断することができる。ＤＮＡは、音波処理、例えば、Ｃｏｖａｒｉｓ法、ＤＮアーゼへの短時間曝露を介して、または１つ以上の制限酵素の混合物、もしくはトランスポーゼースもしくはニック形成酵素を使用してランダムに剪断することができる。ＲＮＡは、ＲＮアーゼへの短時間曝露、加熱およびマグネシウム、または剪断により断片化することができる。ＲＮＡは、ｃＤＮＡに変換することができる。断片化を用いる場合、断片化前または後にＲＮＡをｃＤＮＡに変換することができる。一実施形態において、生物学的試料からの核酸は、音波処理により断片化される。別の実施形態において、核酸は、ハイドロシェア装置により断片化される。一般に、個々の核酸標的分子は、約４０塩基〜約４０ｋｂであり得る。核酸分子は、一本鎖、二本鎖、または一本鎖領域を有する二本鎖（例えば、ステムおよびループ構造）であり得る。
【００８２】
本明細書に記載の生物学的試料は、洗浄剤または界面活性剤の存在下でホモジナイズまたは分別することができる。緩衝液中の洗浄剤の濃度は、約０．０５％〜約１０．０％であり得る。洗浄剤の濃度は、最大で、洗浄剤が溶液中で可溶性のままである量であり得る。一実施形態において、洗浄剤の濃度は０．１％〜約２％である。洗浄剤、特に非変性性である軽度のものは、試料を溶解させるように作用し得る。洗浄剤は、イオン性または非イオン性であり得る。非イオン性洗浄剤の例としては、ｔｒｉｔｏｎ、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘシリーズ（Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００  ｔ−Ｏｃｔ−Ｃ６Ｈ４−−（ＯＣＨ２−−ＣＨ２）ｘＯＨ、ｘ＝９〜１０、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００Ｒ、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１１４  ｘ＝７〜８）、オクチルグルコシド、ポリオキシエチレン（９）ドデシルエーテル、ジギトニン、ＩＧＥＰＡＬ（商標）ＣＡ６３０オクチルフェニルポリエチレングリコール、ｎ−オクチル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド（ベータＯＧ）、ｎ−ドデシル−ベータ、Ｔｗｅｅｎ（商標）２０ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート、Ｔｗｅｅｎ（商標）８０ポリエチレングリコールソルビタンモノオレエート、ポリドカノール、ｎ−ドデシルベータ−Ｄ−マルトシド（ＤＤＭ）、ＮＰ−４０ノニルフェニルポリエチレングリコール、Ｃ１２Ｅ８（オクタエチレングリコールｎ−ドデシルモノエーテル）、ヘキサエチレングリコールモノ−ｎ−テトラデシルエーテル（Ｃ１４Ｅ０６）、オクチル−ベータ−チオグルコピラノシド（オクチルチオグルコシド、ＯＴＧ）、Ｅｍｕｌｇｅｎ、およびポリオキシエチレン１０ラウリルエーテル（Ｃ１２Ｅ１０）が挙げられる。イオン性洗浄剤（アニオン性またはカチオン性）の例としては、デオキシコレート、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、Ｎ−ラウロイルサルコシン、およびセチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）が挙げられる。双性イオン試薬、例えば、Ｃｈａｐｓ、ｚｗｉｔｔｅｒｉｏｎ  ３−１４、および３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネートを、本発明の精製スキームにおいて使用することもできる。別の洗浄剤または界面活性剤を用いてまたは用いずに尿素を添加し得ることも企図される。
【００８３】
溶解またはホモジナイゼーション溶液は、他の薬剤、例えば、還元剤をさらに含有し得る。このような還元剤の例としては、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、β−メルカプトエタノール、ＤＴＥ、ＧＳＨ、システイン、システアミン、トリカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）、または亜硫酸の塩が挙げられる。
【００８４】
核酸のサイズ選択は、極めて短い断片または極めて長い断片を除去するように実施することができる。核酸断片は、当技術分野において公知の任意の好適な方法を使用して所望数の断片を含み得る分画に分けることができる。それぞれの断片の断片サイズを限定する好適な方法は、当技術分野において公知である。本発明の種々の実施形態において、断片サイズは、約１０〜約１００Ｋｂ以上の長さの間に限定される。
【００８５】
別の実施形態において、試料は、個々の標的タンパク質、タンパク質複合体、翻訳修飾を有するタンパク質、およびタンパク質／核酸複合体を含む。タンパク質標的としては、ペプチドが挙げられ、酵素、ホルモン、構造成分、例えば、ウイルスカプシドタンパク質、および抗体も挙げられる。タンパク質標的は、合成であり、または天然存在資源に由来し得る。本発明の一実施形態において、タンパク質標的は、種々の他の成分、例として、脂質、非テンプレート核酸、および核酸を含有する生物学的試料から単離される。ある実施形態において、タンパク質標的は、動物、細菌、真菌、細胞生物、および単一細胞から得ることができる。タンパク質標的は、合成であり、または天然存在資源に由来し得る。本発明のタンパク質標的は、種々の他の成分、例として、脂質、非テンプレート核酸、および核酸を含有する生物学的試料から単離することができる。タンパク質標的は、動物、細菌、真菌、細胞生物、および単一細胞から得ることができる。タンパク質標的は、生物から直接、または生物から得られた生物学的試料、例として、体液、例えば、血液、尿、脳脊髄液、精液、唾液、痰、糞便および組織から得ることができる。タンパク質標的は、細胞および組織溶解物ならびに生化学的分画から得ることもできる。個々のタンパク質は、単離ポリペプチド鎖である。タンパク質複合体としては、２つまたはポリペプチド鎖が挙げられる。試料としては、翻訳後修飾、例として、限定されるものではないが、リン酸化、メチオニン酸化、脱アミノ化、グリコシル化、ユビキチン化、カルバミル化、Ｓ−カルボキシルメチル化、アセチル化、およびメチル化を有するタンパク質を挙げることができる。タンパク質／核酸複合体としては、架橋または安定タンパク質−核酸複合体が挙げられる。
【００８６】
個々のタンパク質、タンパク質複合体、翻訳後修飾を有するタンパク質、およびタンパク質／核酸複合体の抽出または単離は、当技術分野において公知の方法を使用して実施される。
【００８７】
本発明の方法は、試料液滴の形成を含む。液滴は、非混和性担体流体により包囲される水性液滴である。このような液滴を形成する方法は、例えば、Ｌｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許出願第２００８／００１４５８９号明細書、同第２００８／０００３１４２号明細書、および同第２０１０／０１３７１６３号明細書）、Ｓｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第７，７０８，９４９号明細書および米国特許出願第２０１０／０１７２８０３号明細書）、Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第７，０４１，４８１号明細書およびＲＥ４１，７８０号明細書として再発行）およびＲａｉｎｄａｎｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．の欧州特許出願公開第２０４７９１０号明細書に示されている。これらのそれぞれの内容は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【００８８】
本発明は、液滴をハイスループットマイクロ流体系内で操作するための系および方法に関する。図１を参照すると、マイクロ流体液滴（１０）は、分化細胞（図中に示さず）を封入する。細胞は溶解され、そのｍＲＮＡ（２０）は、表面上のバーコード化オリゴｄＴプライマーを含有する捕捉ビーズ上にハイブリダイズされ（３０）（４０）、これらは全て液滴内側にある。バーコードは、フレキシブル多原子リンカー、例えば、ＰＥＧ（５０）を介して捕捉ビーズに共有結合している。好ましい実施形態において、液滴は、フルオロ界面活性剤（例えば、ペルフルオロオクタノール）の添加により破壊し、洗浄し、回収する。次いで、逆転写（ＲＴ）反応を実施してそれぞれの細胞のｍＲＮＡを、ユニークにバーコード化され、ｍＲＮＡ捕捉ビーズに共有結合している第１のｃＤＮＡ鎖に変換する。続いて、慣用のライブラリー調製プロトコルを使用して、テンプレートスイッチング反応を介するユニバーサルプライマーを訂正してＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリーを調製する。任意の所与の細胞からのｍＲＮＡの全てをユニークにバーコード化するため、単一ライブラリーをシーケンシングし、次いでコンピュータにより分解して、いずれのｍＲＮＡがいずれの細胞に由来したかを決定する。このように、単一シーケンシングランを通して、何万（以上）という区別可能なトランスクリプトームを同時に得ることができる。
【００８９】
図２Ａおよび２Ｂを参照すると、ビーズ表面上で生成されたオリゴヌクレオチド配列を図２Ａに示す。これらのサイクルの間、ビーズを合成カラムから取り出し、プールし、４つの質量が等しい部分にアリコート化し；次いで、それらのビーズアリコートを別個の合成カラム中で配置し、ｄＧ、ｄＣ、ｄＴ、またはｄＡホスホラミダイトのいずれかと反応させた。他の例において、長さがより大きいジヌクレオチド、トリヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドを使用し、他の例において、オリゴ−ｄＴテールを遺伝子特異的オリゴヌクレオチドにより置き換えて特異的標的（単数または複数）、全てまたは特異的ＲＮＡの捕捉のための任意の長さのランダム配列をプライミングする。このプロセスを、合計で４１２＝１６，７７７，２１６個のユニークバーコード配列について１２回繰り返した（図２Ｂ）。これらのサイクルの完了時、８サイクルの縮重オリゴヌクレオチド合成を全てのビーズに対して実施し（図２Ａの分子バーコード「ＭＢＣ」）、次いで３０サイクルのｄＴ添加を実施した。他の実施形態において、縮重合成を省略し、短縮し（８サイクル未満）、または延長し（８サイクル超）；他の実施形態において、３０サイクルのｄＴ添加を遺伝子特異的プライマー（単一標的または多くの標的）または縮重配列により置き換える。
【００９０】
図３Ａ〜３Ｄにおいて、１０００個の細胞バーコード配列を分析して細胞バーコード複雑性を決定した（図３Ａ）。
【００９１】
上記のマイクロ流体系は、本発明の試薬送達系マイクロ流体ライブラリープリンタまたは液滴ライブラリープリンティング系（図４）とみなす。溶解試薬およびバーコードを含有する液滴生成器（５１）から、油を（５３）含有するマイクロ流体アウトレットチャネル（５２）を通り、ジャンクション（５４）に向かって試料流体が流動するにつれて液滴（５５）が形成される。規定数の液滴に対応するロードされる試薬エマルジョンの規定容量を、担体流体の流動流中にオンデマンドで分注させる。
【００９２】
試料流体は、典型的には、水性緩衝溶液、例えば、超純水（例えば、１８メガオーム抵抗率、例えば、カラムクロマトグラフィーにより得られたもの）、１０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌおよび１ｍＭのＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）または酢酸塩緩衝液を含み得る。核酸分子と生理学的に適合性である任意の液体または緩衝液を使用することができる。担体流体は、試料流体と非混和性であるものを含み得る。担体流体は、非極性溶媒、デカン（例えば、テトラデカンまたはヘキサデカン）、フルオロカーボン油、シリコーン油、不活性油、例えば、炭化水素または別の油（例えば、鉱油）であり得る。
【００９３】
ある実施形態において、担体流体は、１つ以上の添加剤、例えば、表面張力を低減させる薬剤（界面活性剤）を含有し得る。界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎ、Ｓｐａｎ、フルオロ界面活性剤、および水に対して油中で可溶性である他の薬剤を挙げることができる。一部の用途において、実施は、第２の界面活性剤を試料流体に添加することにより改善される。界面活性剤は、例えば、液滴を交差チャネル中に押し出し、または注入するために必要とされる剪断力を低減させることにより液滴サイズ、流動および均一性の制御または最適化を支援し得る。これは、液滴容量および周期性、または液滴が交差チャネル中に割ける速度もしくは頻度に影響を与え得る。さらに、界面活性剤は、フッ素化油中で水性エマルジョンを癒合から安定化するように機能し得る。
【００９４】
ある実施形態において、液滴は、液滴を安定化する界面活性剤により水性油界面における表面張力を低減させることにより包囲させることができる。担体流体に添加することができる好ましい界面活性剤としては、限定されるものではないが、ソルビタン系カルボン酸エステル（例えば、「Ｓｐａｎ」界面活性剤、Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｋａ）、例として、ソルビタンモノラウレート（Ｓｐａｎ  ２０）、ソルビタンモノパルミテート（Ｓｐａｎ  ４０）、ソルビタンモノステアレート（Ｓｐａｎ  ６０）およびソルビタンモノオレエート（Ｓｐａｎ  ８０）、ならびに過フッ素化ポリエーテル（例えば、ＤｕＰｏｎｔ  Ｋｒｙｔｏｘ  １５７  ＦＳＬ、ＦＳＭ、および／またはＦＳＨ）などの界面活性剤が挙げられる。使用することができる非イオン性界面活性剤の他の非限定的な例としては、ポリオキシエチレン化アルキルフェノール（例えば、ノニル−、ｐ−ドデシル−、およびジノニルフェノール）、ポリオキシエチレン化直鎖アルコール、ポリオキシエチレン化ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレン化メルカプタン、長鎖カルボン酸エステル（例えば、天然脂肪酸のグリセリルおよびポリグリセリルエステル、プロピレングリコール、ソルビトール、ポリオキシエチレン化ソルビトールエステル、ポリオキシエチレングリコールエステルなど）およびアルカノールアミン（例えば、ジエタノールアミン−脂肪酸縮合物およびイソプロパノールアミン−脂肪酸縮合物）が挙げられる。
【００９５】
図５は、マイクロ流体系を介して単一細胞シーケンシングライブラリーを作出するための機器の概略図を説明する。一部の例において、装置は容量推進流動を提供し、一定容量を経時的に注入する。流体チャネル中の圧力は、注入速度およびチャネル寸法の関数である。図５によるスキームの一実施形態において、装置は、油／界面活性剤インレット（６０）；分析物用インレット（７０）；フィルター（８０）、ｍＲＮＡ捕捉マイクロビーズおよび溶解試薬用インレット（９０）；図５に説明されるインレットを接続する担体流体チャネル；レジスター（１００）；液滴ピンチオフ用構造物（１０１）；混合器（１１０）；およびドロップ用アウトレット（１２０）を提供する。一実施形態において、本発明は、マイクロ流体系を介して単一細胞シーケンシングライブラリーを作出するための機器であって、フィルターと、レジスターをさらに含む担体流体チャネルとを含む油−界面活性剤インレット；フィルターと、レジスターをさらに含む担体流体チャネルとを含む、分析物のためのインレット；フィルターと、レジスターをさらに含む担体流体チャネルとを含む、ｍＲＮＡ捕捉マイクロビーズおよび溶解試薬のためのインレットを含み、前記担体流体チャネルは、調整可能または所定の流速においてその中を流動する担体流体を有し、それぞれの前記担体流体チャネルはジャンクションにおいて合流し、および前記ジャンクションは、ドロップ用アウトレットを含有する混合器に接続されている、機器を提供する。
【００９６】
図６は、（ａ）単一細胞ＲＮＡ−ｓｅｑのためのマイクロ流体流動スキームを説明する。２つのチャネル（一方は細胞懸濁液を担持し、他方はユニークにバーコード化されたｍＲＮＡ捕捉ビーズ、溶解緩衝液およびライブラリー調製試薬を担持する）は、ジャンクションにおいて合わさり、液滴当たり１つの細胞および１つのビーズの率において不活性担体油中に直ちに同時封入される。それぞれのドロップにおいて、ビーズバーコードタグ付きオリゴヌクレオチドをｃＤＮＡテンプレートとして使用して、それぞれのｍＲＮＡをユニーク細胞特異的識別子によりタグ付けする。（ｂ）マウスおよびヒト細胞の混合物のＤｒｏｐ−Ｓｅｑライブラリーである。それぞれのドットは、ユニークバーコードを表し、ヒト（ｘ軸）およびマウス（ｙ軸）ゲノムに対してアラインすることができた遺伝子の数を示す。
【００９７】
図７は、液滴中の細胞トランスクリプトームの分子バーコード化を説明する。（Ａ）Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑバーコード化概略図である。複合組織を個々の細胞に解離させ、次いでそれらを液滴中で、バーコード化プライマーを送達するマイクロ粒子（灰色丸）と一緒に封入する。それぞれの細胞は液滴内で溶解され；そのｍＲＮＡは、その付随マイクロ粒子上のプライマーに結合する。ｍＲＮＡはｃＤＮＡに逆転写され、「マイクロ粒子に付着している単一細胞トランスクリプトーム（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｓ  ａｔｔａｃｈｅｄ  ｔｏ  ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）」（ＳＴＡＭＰ）と呼ばれるビーズのセットを生成する。次いで、バーコード化ＳＴＡＭＰを、ハイスループットｍＲＮＡ−ｓｅｑのためのプール中で増幅させて任意の所望数の個々の細胞を分析することができる。（Ｂ）マイクロ粒子上のプライマーの配列である。全てのビーズ上のプライマーは、ＳＴＡＭＰ形成後のＰＣＲ増幅を可能とするための共通配列（「ＰＣＲハンドル」）を含有する。それぞれのマイクロ粒子は、同一の「細胞バーコード」（パネルＣ）を共有するが、異なるユニーク分子識別子（ＵＭＩ）を有する１０８超の個々のプライマーを含有し、ｍＲＮＡ転写物のデジタルカウントを可能とする（パネルＤ）。３０ｂｐのオリゴｄＴ配列が、ポリアデニル化３’末端を介するｍＲＮＡの捕捉のための全てのプライマー配列の末端において存在する。（Ｃ）細胞バーコードのスプリットアンドプール合成である。細胞バーコードを生成するため、マイクロ粒子のプールを４つのサイズが等しいオリゴヌクレオチド合成反応中に繰り返しスプリットし、それに４つのＤＮＡ塩基の１つを添加し、次いでそれぞれのサイクル後に、合計１２回のスプリット−プールサイクルで一緒にプールする。任意の個々のビーズ上で合成されたバーコードは、一連の合成反応を通したそのビーズのユニーク経路を反映する。結果は、マイクロ粒子のプールであり、それぞれは、プライマーのその全相補鎖に対して４１２（１６，７７７，２１６）個の考えられる配列の１つを有する。（Ｄ）ユニーク分子識別子（ＵＭＩ）の合成である。「スプリットアンドプール」合成サイクルの完了後、全てのマイクロ粒子を、それぞれのサイクルの間に利用可能な４つ全てのＤＮＡ塩基を用いる８回のラウンドの縮重合成に一緒に供して、その結果、それぞれの個々のプライマーは、４８（６５，５３６）個の考えられる配列（ＵＭＩ）の１つを受ける。
【００９８】
図８は、Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑによる単一細胞トランスクリプトームの抽出および処理を説明する。（Ａ）Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑを用いる単一細胞ｍＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリー調製の概略図である。カスタム設計されたマイクロ流体装置は、２つの水性流動をそれらのコンパートメント化前に区別される液滴中に入れる。一方の流動は細胞を含有し、他方の流動は溶解緩衝液中で懸濁しているバーコード化プライマービーズを含有する。液滴形成直後、細胞を溶解薬剤に曝露し、そのｍＲＮＡを放出させ、次いでそれがマイクロ粒子表面上のプライマーにハイブリダイズする。油−水界面を脱安定化するための試薬を添加することにより、液滴を破壊し（拡張実験手順）、マイクロ粒子を回収および洗浄する。次いで、ｍＲＮＡをバルクで逆転写させ、ＳＴＡＭＰを形成し、テンプレートスイッチングを使用してＰＣＲハンドルを合成ｃＤＮＡの下流に導入する（Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。（Ｂ）Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑにおいて使用されるマイクロ流体装置である。溶解剤中で懸濁しているビーズ（画像中の褐色）は、中央チャネルから装置に流入し；細胞は上部および下部から流入する。層流は、液滴形成前の２つの水性インプットの混合を防止し；これは、画像中で２つの流動の界面に沿った光の反射から明らかである（動画Ｓ１も参照）。（Ｃ）Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑシーケンシングライブラリーの分子要素である。第１のリードは、細胞バーコードおよびＵＭＩを生じさせる。第２に、ペアードリードは、ｃＤＮＡからの配列を調査し（典型的には、５０ｂｐをシーケンシングするが、より長いまたは短いリードも考えられる）；次いで、この配列をゲノムに対してアラインして転写物の起源遺伝子を決定する。細胞バーコードを使用して転写物の起源細胞を決定する。（Ｄ）数千個の単一細胞トランスクリプトームのインシリコ再構築である。数百万個のペアードエンドリードをＤｒｏｐ−Ｓｅｑライブラリーからハイスループットシーケンサー（例えば、ＭｉＳｅｑ、ＮｅｘｔＳｅｑ、またはＨｉＳｅｑ）により生成する。リードを最初に参照ゲノムに対してアラインしてｃＤＮＡの起源遺伝子を同定する。次に、リードをそれらの細胞バーコードにより組織化し、個々のＵＭＩをそれぞれ細胞中のそれぞれの遺伝子についてカウントする（拡張実験手順）。最も右側に示される結果は、「デジタル発現行列」であり、それにおいてそれぞれの列は細胞に対応し、それぞれの行は遺伝子に対応し、それぞれの成分はその細胞中のその遺伝子から検出された転写物の整数に対応する。
【００９９】
図９は、種混合実験を使用するＤｒｏｐ−Ｓｅｑの重要な評価を説明する。（Ａ、Ｂ）マウスおよびヒト細胞の混合物のＤｒｏｐ−Ｓｅｑ分析である。ヒト（ＨＥＫ）およびマウス（３Ｔ３）細胞の混合物を、示される濃度においてＤｒｏｐ−Ｓｅｑにより分析した。散布図は、それぞれのＳＴＡＭＰに会合するヒトおよびマウスの転写物の数を示す。青色ドットは、それらのデータからヒト特異的な転写物（平均９９％のヒト転写物）のセットを含有することが指定されたＳＴＡＭＰを示し；赤色ドットは、マウス特異的（平均９９％）と推定されるＳＴＡＭＰを示す。低い細胞濃度において、（５７０個の）１つのＳＴＡＭＰバーコードがヒトおよびマウス転写物の混合物と会合した（パネルＡ、紫色）。高い細胞濃度において、ＳＴＡＭＰバーコードの約１．９％がマウス−ヒト混合物と会合した（パネルＢ）。他の細胞濃度および異なる単一細胞分析プラットフォームについてのデータを図Ｓ２ＣおよびＳ２Ｄに示す。（Ｃ、Ｄ）高いリード深度におけるＤｒｏｐ−Ｓｅｑの感度分析である。バイオリンプロットは、細胞当たり７３７，２４０個の高品質アラインリードの平均リード深度にシーケンシングされた５４個のＨＥＫ（ヒト）ＳＴＡＭＰ（青色）および２８個の３Ｔ３（マウス）ＳＴＡＭＰ（緑色）について細胞ごとに検出された転写物（Ｂ、ＵＭＩによりスコアリング）および遺伝子（Ｃ）の数の分布を示す。（Ｅ、Ｆ）Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑにおける遺伝子発現計測および非単一細胞ＲＮＡ−ｓｅｑ法間の相関である。Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑ遺伝子発現計測（５５０個のＳＴＡＭＰにわたり平均化）と、（Ｅ）Ｓｍａｒｔ−Ｓｅｑ２（Ｐｉｃｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）（拡張実験手順）と類似する溶液中テンプレートスイッチ増幅（ＴＳＡ）手順により調製されたｍＲＮＡ−ｓｅｑライブラリーであり；および（Ｆ）Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｔｒｕ−Ｓｅｑ  ｍＲＮＡ−Ｓｅｑにおいて分析されたバルクＲＮＡからの計測との比較である。全ての比較は、同一の細胞培養フラスコに由来するＲＮＡを含む（３Ｔ３細胞）。全ての発現カウントを百万当たりの平均転写物（ＡＴＰＭ）に変換し、ｌｏｇ（１＋ＡＴＰＭ）としてプロットした。（Ｇ）ＥＲＣＣスパイクインによるＤｒｏｐ−Ｓｅｑ捕捉効率の定量である。液滴当たり１００，０００個のＥＲＣＣ  ＲＮＡ分子の推定濃度においてスパイクインされたＥＲＣＣ対照合成ＲＮＡを用いてＤｒｏｐ−Ｓｅｑを実施した。８４個のＳＴＡＭＰを２４０万リードの平均深度においてシーケンシングし、ＥＲＣＣ参照配列に対してアラインし、潜在的なシーケンシングエラーについて厳しい下方訂正を適用した後、ＵＭＩをそれぞれのＥＲＣＣ種についてカウントした（拡張実験手順）。液滴当たり少なくとも１つの分子において存在するそれぞれのＥＲＣＣ  ＲＮＡ種について、液滴当たりの分子の予測数を対数空間でプロットし（ｘ軸）、それに対してＤｒｏｐ−Ｓｅｑにより液滴当たり検出された液滴当たりの分子の実測数も対数空間でプロットした（ｙ軸）。１の傾きを有するように制約され、７つの最高点にフィットされた回帰直線の切片を使用して変換係数（０．１２８）を推定した。検出された転写物の平均数を使用されたＥＲＣＣ分子の数（１００，０００個）により割って使用する第２の推定は、０．１２５の変換係数を生じさせた。
【０１００】
図１０は、Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑにより分析されたＨＥＫおよび３Ｔ３細胞の細胞周期分析を説明する。（Ａ）Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑにより計測された５８９個のＨＥＫ細胞（左側）および４１２個の３Ｔ３細胞（右側）細胞周期状態である。それぞれの細胞の遺伝子発現の網羅的パターンと、周期（横の行）の５つの時期の１つでエンリッチされることが公知の遺伝子セットとの比較により細胞周期を通して細胞をそれらの進行について評価した。時期特異的スコアを、それぞれの細胞についてそれらの５つの時期のそれぞれにわたり計算し（拡張実験手順）、細胞をそれらの時期スコアにより順序付けた。（Ｂ）細胞周期調節遺伝子の発見である。Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑシーケンシングされた細胞中で細胞周期により調節されることが見出された５４４個のヒトおよび６６８個のマウス遺伝子の平均正規化発現を示すヒートマップである。細胞周期調節された遺伝子を見出すため、最大および最小発現を、順序付けされた細胞のスライディングウィンドウにわたりそれぞれ遺伝子について計算し、シャッフルされた細胞と比較して偽発見率（ＦＤＲ）を得た（拡張実験手順）。次いで、プロットされた遺伝子（５％のＦＤＲ閾値）をｋ平均分析によりクラスタリングして類似の発現パターンを有する遺伝子のセットを同定した。クラスタ境界を点線灰色線により表す。（Ｃ）Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑにより発見された代表的な細胞周期調節遺伝子である。ＨＥＫおよび３Ｔ３細胞セットの両方で細胞周期調節されることが見出された選択された遺伝子である。左側は、細胞周期調節されることが周知の選択された遺伝子である。右側に、細胞周期に関連することがこれまで公知でなかった、この分析において同定された一部の遺伝子を示す（実験手順）。細胞周期調節遺伝子の完全なリストは、表４に見出すことができる。
【０１０１】
図１１は、Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑにより調製された４４，８０８個の単一細胞転写プロファイルからの網膜細胞タイプのアブイニシオ再構築を説明する。（Ａ）網膜中の主要な細胞クラスの概略的な表示である。光受容体（桿体または錐体）は光を検出し、情報を双極細胞に伝達し、次いでそれが軸索を他のＣＮＳ組織中に延ばす網膜神経節細胞にコンタクトする。アマクリンおよび水平細胞は、網膜介在ニューロンであり；ミュラーグリアはニューロンを包囲するための支持細胞として作用する。（Ｂ）４４，８０８個のＤｒｏｐ−Ｓｅｑ単一細胞発現プロファイルの、３９個の網膜細胞集団へのクラスタリングである。プロットは、４４，８０８個の細胞間の網羅的遺伝子発現関係の二次元表示を示し；クラスタは細胞クラスにより着色されている（図１１Ａに従う着色）。（Ｃ）３９個の網膜細胞集団にわたり示差的に発現される遺伝子である。このヒートマップにおいて、行は、個々のクラスタにおいて選択的に上方調節されることが見出された個々の遺伝子に対応し（ｐ＜０．０１、ボンフェローニ補正）；列は、クラスタ（１〜３９）により順序付けされた個々の細胞である。＞１，０００個の細胞のクラスタは、１，０００個の細胞にダウンサンプリングしてそれらがプロットに影響することを防止した。（Ｄ）３９個の推定細胞集団間の遺伝子発現類似度関係である。全ての検出遺伝子にわたる平均遺伝子発現を、３９個の細胞クラスタのそれぞれの細胞について計算し、３９個のクラスタについての遺伝子発現パターン間の相対（ユークリッド）距離を系統樹により表した。（系統樹は、網羅的遺伝子発現類似度関係を表し；それは発生系譜を表さない）。系統樹の枝は、網膜細胞クラスおよびタイプについての公知のマーカーの示差的発現を試験することによりアノテートした。１２個の例を右側に示し、バイオリンプロットを使用してクラスタ内の発現の分布を表す。追加の遺伝子についてのバイオリンプロットを図Ｓ６に示す。（Ｅ）それぞれの細胞集団における実験レプリケートの表示である。それぞれ細胞を用いる図８ＢからのｔＳＮＥプロットを、この図で実験レプリケートごとに着色した。７つのレプリケートのそれぞれは、３９個全ての細胞集団に寄与する。クラスタ３６（矢印）は、それらのレプリケートが不規則に表示され、網膜由来でない、解剖アーティファクトと推定される線維芽細胞のマーカーを発現した。（Ｆ）分析された細胞の数の関数としてのアマクリンクラスタリングの軌道である。３つの異なるダウンサンプリングデータセットを生成した：（１）５００、（２）２，０００、または（３）９，４５１個の細胞（拡張実験手順）。完全な分析においてアマクリンとして同定された細胞（クラスタ３〜２３）は、ここでその分析におけるそれらのクラスタアイデンティティーごとに着色される。より少数の細胞の分析は、それらの下位集団を互いに不完全に区別した。
【０１０２】
図１２は、アマクリン細胞、錐体および網膜神経節細胞間のより微細なスケールの発現区別である。（Ａ）汎アマクリンマーカーである。同定された６つの遺伝子（Ｎｒｘｎ２、Ａｔｐ１ｂ１、Ｐａｘ６、Ｓｌｃ３２ａ１、Ｓｌｃ６ａ１、Ｅｌａｖｌ３）の発現レベルを、３９個全てのクラスタにわたるドットプロットとして表し；大きいドットはクラスタ内のより広い発現を示し；濃い赤色は、より高い発現レベルを示す。（Ｂ）クラスタ間の公知のアマクリンタイプの同定である。２１個のアマクリンクラスタは、１２個のＧＡＢＡ作動性、５つのグリシン作動性、１つのグルタミン酸作動性および３つの非ＧＡＢＡ作動性非グリシン作動性クラスタからなった。スターバーストアマクリンをクラスタ３において、それらのＣｈａｔの発現により同定し；興奮性アマクリンをＳｌｃ１７ａ８の発現により同定し；Ａ−ＩＩアマクリンをクラスタ１６中でそれらのＧｊｄ２の発現により同定し；ＳＥＧアマクリンニューロンをクラスタ１７および２０中でそれらのＥｂｆ３発現により同定した。（Ｃ）アマクリン下位集団の新規候補マーカーのノミネートである。それぞれのクラスタを、全ての他のアマクリンクラスタに対してそのクラスタ中で示差的に発現される遺伝子についてスクリーニングし（ｐ＜０．０１、ボンフェローニ補正）（ＭｃＤａｖｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）、最大相対エンリッチメントを有するものについてフィルタリングした。それぞれのクラスタについての単一候補マーカーの発現は、全ての網膜細胞クラスタにわたり示される（クラスタ中の示差的に発現される全ての遺伝子は、表６に見出すことができ；全てのクラスタペア間で示差的に発現される遺伝子は、表７に見出すことができる）。（Ｄ）ＧＡＢＡ作動性アマクリン集団についてのマーカーとしてのＭＡＦの検証である。ＭＡＦのＧＡＤ１との同時局在化を実証するが、ＳＬＣ６Ａ９との同時局在化を実証しないＭＡＦ（パネルｉ、ｉｉ、ｖ、ならびにｉｖおよびｖｉｉにおける緑色染色）、ＧＡＤ１（パネルｉｉｉおよびｉｖ、赤色染色）、およびＳＬＣ６Ａ９（パネルｖｉおよびｖｉｉ、赤色染色；ＭＡＦ染色を緑色で示す）についての野生型マウスからの固定成体網膜の染色である。（Ｅ）最近傍アマクリンクラスタ（＃６）についてのクラスタ７（ＭＡＦ＋）の示差的発現である。平均遺伝子発現を、クラスタ６および７の細胞間で比較し；１６個の遺伝子（赤色ドット）を、クラスタ７における＞２．８のエンリッチメント倍率で同定した（ｐ＜１０−９）。（Ｆ）アマクリン下位集団についてのマーカーとしてのＰＰＰ１Ｒ１７の検証である。ｎＧｎＧアマクリンおよび１型双極細胞の両方でＣＦＰを発現するＭｉｔｏ−Ｐマウス（Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）からの固定成体網膜の染色である。アスタリスク（＊）は、Ｍｉｔｏ−Ｐ系統中で標識された双極細胞を示す一方、矢印は、Ｍｉｔｏ−Ｐトランスジェニック系統（赤色）およびＰＰＰ１Ｒ１７抗体（緑色）の両方により標識されるｎＧｎＧアマクリンニューロンを示す。ＣＦＰ＋細胞の８５％がＰＰＰ１Ｒ１７＋であり；ＰＰＰ１Ｒ１７＋細胞の５０％がＣＦＰ−であり、このマーカーを発現する第２のアマクリンタイプを示唆した。（Ｇ）最近傍アマクリ���クラスタ（＃２１）についてのクラスタ２０（ＰＰＰ１Ｒ１７＋）の示差的発現である。平均遺伝子発現をクラスタ２０および２１の細胞間で比較し；１２個の遺伝子（赤色ドット）をクラスタ７における＞２．８のエンリッチメント倍率で同定した（ｐ＜１０−９）。（Ｈ）Ｍ−オプシンおよびＳ−オプシン錐体の示差的発現である。クラスタ２５の細胞を、Ｍ−オプシン（緑色光を検出するため）および／またはＳ−オプシン（青色光を検出するため）を発現する錐体光受容体として同定した。平均遺伝子発現を、Ｍ−オプシンのみのみを発現する細胞（ｘ軸）およびＳ−オプシンのみを発現する細胞（ｙ軸）間で比較した。２倍超の発現差（ｐ＜１０−９）を示す８つの遺伝子を、２つのオプシン遺伝子Ｏｐｎ１ｓｗおよびＯｐｎ１ｍｗとともにプロット上で標識する。緑色の点はＭ錐体中でエンリッチされた遺伝子である一方、赤色の点はＳ錐体中でエンリッチされた遺伝子である。（Ｉ）メラノプシン陽性および陰性ＲＧＣの示差的発現である。メラノプシンをコードする遺伝子Ｏｐｎ４を発現する２４個の網膜神経節細胞を、クラスタ２中で同定し、平均発現をそれらの細胞およびクラスタ２の残りのものの間で比較した。７つの遺伝子を示差的に発現されるものとして同定した（赤色ドット、＞２の倍率、ｐ＜１０−９）。
【０１０３】
図１３Ａ〜Ｃは、Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑにより調製された４７１個の単一細胞転写プロファイルからのヒト骨髄細胞タイプのアブイニシオ再構築を説明する。（Ａ）単一細胞発現プロファイルの８つの細胞クラスへのクラスタリングである。プロットは、細胞間の網羅的遺伝子発現関係の二次元表示（ｔＳＮＥ）を示し；クラスタは、細胞クラスごとに着色および標識する。（Ｂ）８つの細胞クラスにわたり示差的に発現された遺伝子のヒートマップである。行は、個々のマーカー遺伝子に対応し；列は、クラスタ（１〜８）ごとに順序付けされた個々の細胞である。（Ｃ）マーカー遺伝子発現の例（赤色が高い）をｔＳＮＥマップ上に示す。
【０１０４】
図１４Ａ〜Ｃは、マイクロ粒子（ビーズ）の表面上のバーコード化プライマーの特性の評価を説明する。（Ａ）多重化実験における個々のビーズバーコードの同定である。合成ポリアデニル化ＲＮＡを、バーコード化プライマービーズの表面上に逆転写させた。次いで、これらのビーズの１１個を手作業により選択し、シーケンシングライブラリーの構築のためのテンプレートとして使用した（拡張実験手順）。ライブラリーをＭｉＳｅｑ上でシーケンシングし、細胞バーコード配列を収集およびカウントした。シーケンシングリード中のバーコード位置における１１番目および１２番目に最もアバンダントな１２ｍｅｒを担持するリードの数の間で著しい区別が観察され、それぞれのビーズからの細胞バーコードをシーケンシング実験の結果におけるそれらの高い表示から認識し得ることを実証した。（Ｂ）１２ｂｐ細胞バーコードの塩基組成分析である。別のシーケンシング実験において確認された１，０００個の細胞バーコードの配列を、全ヌクレオチドおよびジヌクレオチド組成について評価した。赤色点線は、任意の配列バイアスを欠く完全にランダムなバーコードセットについての値を表す。（Ｃ）１２ｂｐ細胞バーコードのコンピュータトランケーションである。（Ｂ）における１，０００個の細胞バーコード配列を３’末端からトリミングし、残留ユニークバーコードの数をトリミングされた塩基のそれぞれの数において計算した（青色線）。トリミングのそれぞれの数におけるユニークバーコードの数を、ランダムに生成された１０００個の１２ｍｅｒのセット（緑色線）と比較した。
【０１０５】
図１５Ａ〜Ｅは、装置設計およびＤｒｏｐ−Ｓｅｑライブラリー調製における単一細胞不純物への技術寄与の詳細を説明する。（Ａ）マイクロ流体同時流動装置設計である。油、細胞懸濁液、およびマイクロ粒子用の３つのインレットは、細胞懸濁液およびマイクロ粒子チャネルからの等しい容量の寄与から構成される水性液滴を収束および生成する。屈曲凹凸アウトレットは、液滴の混合を改善して放出されるＲＮＡのビーズ上へのハイブリダイゼーションを促進する。装置のＣＡＤファイルは、データファイル１に見出すことができる。（Ｂ）増幅されたビーズのプールにおけるＳＴＡＭＰの同定である。Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑは、細胞を液滴中のポアソン限界濃度に希釈することによる単一細胞プロファイルの生成を含み；したがって、増幅されたビーズの大多数（９０〜９９％）は、細胞のＲＮＡに曝露されず、環境ＲＮＡのみに曝露された。ＳＴＡＭＰに対応する細胞バーコードを同定するため、図３Ａに示される実験からの細胞バーコードを降順サイズ（リードの数）で配列させ、リードの累積割合をプロットする。カウントおよびアリコート化されたビーズの数（約５００）についてポアソン統計により予測される細胞の数の極めて近くで変曲点（５７０における縦の点線）が観察される。この変曲点の確認は、個々のＳＴＡＭＰの種特異性をプロットし、変曲点における特異性の大幅な降下を観察することにより観察され、細胞ＲＮＡをサンプリングしたビーズから、環境ＲＮＡをサンプリングしたビーズへの推移を示した。（Ｃ）Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  Ｃ１上でのヒト−マウス実験である。ヒト（ＨＥＫ）およびマウス（３Ｔ３）細胞を等しい濃度において混合し、２つのＦｌｕｉｄｉｇｍ  Ｃ１チップ上で製造業者の説明書に従ってランさせた。リードを、Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑと完全に同一の分析パイプラインで結合ヒト−マウス参照配列に対してアラインした。細胞−細胞ダブレットに対する３１％の下界を設定して、５６個の混合生物ライブラリーを１８２個から同定した。１２個のＣ１ポートを、顕微鏡観察により＞１つの細胞を有するとして同定し、その５つはシーケンシングによる混合種であった。（Ｄ）Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑライブラリー純度の濃度依存性である。ＳＴＡＭＰは、ヒト（ＨＥＫ）およびマウス（３Ｔ３）細胞の混合物を４つの異なる濃度において使用して調製した（１００個の細胞／μｌ、５０個の細胞／μｌ、２５個の細胞／μｌ、および１２．５個の細胞／μｌについてそれぞれＮ＝１１５０、６９０、５９５、および５６０個のＳＴＡＭＰ）。細胞ダブレットの率は、混合種ＳＴＡＭＰの数に２を乗じることにより計算し；単一細胞純度は、平均ヒト細胞および平均マウス細胞純度を合計することにより計算した。（Ｅ）単一細胞不純物分析である。Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑライブラリーを、Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑライブラリー調製の３つの異なる段階においてプールされたヒトおよびマウス細胞の組合せから調製した。第１の条件において、ヒトおよびマウス細胞を一緒に混合してから液滴形成した（赤色バイオリンプロット、「細胞ミックス」）。第２の条件において、ヒトおよびマウス細胞を液滴中で別個に封入し、次いでそれらを混合してから液滴を破壊し、その混合物に対して後続の分析を実施した（青色、「液滴ミックス」）。第３の条件において、ヒトおよびマウス細胞を液滴中で別個に封入し、それらを別個の反応において破壊し、次いで逆転写させて共有結合ＳＴＡＭＰの別個のプールを形成し、それらを混合してからＰＣＲ増幅させた（緑色、「ＰＣＲミックス」）。それぞれの生物からの２０個の最大ＳＴＡＭＰを、３つの条件のそれぞれについて選択し、同一リード深度にダウンサンプリングし、生物純度をバイオリンプロットとして表した。黒色ドットは、それぞれの分布における４０個のＳＴＡＭＰの平均生物純度である。使用された細胞ミックスを液滴中の５０個の細胞／μｌの最終濃度に希釈した。これらのデータから、本出願人らは、（この細胞濃度において）細胞懸濁液が不純物の４８％に寄与し、液滴破壊後のＲＮＡ転写が４０％に寄与し、ＰＣＲアーティファクトが１２％に寄与することを推定する。
【０１０６】
図１６Ａ〜Ｆは、５０個の細胞／μｌの濃度において調製された低深度および高深度種混合（ＨＥＫ／２９３Ｔ）Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑライブラリーをダウンサンプリングすることにより評価されたシーケンシングカバレッジの関数としての特異性および感度を説明する。（Ａ、Ｂ）特異性の分析である。低いリード深度（パネルＡ、５８９個のヒト特異的および４１２個のマウス特異的ＳＴＡＭＰ）または高いリード深度（パネルＢ、５４個のヒトおよび２８個のマウス）においてシーケンシングされたヒト特異的ＳＴＡＭＰおよびマウス特異的ＳＴＡＭＰについての種特異性のダウンサンプリング分析である。（Ｃ〜Ｆ）感度の分析である。低いリード深度Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑラン（ＣおよびＥ）および高いリード深度シーケンシング（ＤおよびＦ）について検出された遺伝子の平均数（ＣおよびＤ）および検出された転写物の平均数（ＥおよびＦ）による単一細胞ライブラリー感度のダウンサンプリング分析である。
【０１０７】
図１７Ａ〜Ｆは、Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑ発現バイアスおよび捕捉効率の推定を説明する。（Ａ）Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑおよび溶液中テンプレートスイッチ増幅（ＴＳＡ）における平均遺伝子発現間の間のＧＣ含有率バイアスである。５５０個の３Ｔ３のＳＴＡＭＰのライブラリー、およびＤｒｏｐ−Ｓｅｑにおいて使用された同一の細胞培養フラスコに由来するＲＮＡを使用してＳｍａｒｔ−Ｓｅｑ２（Ｐｉｃｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）（拡張実験手順）と類似する溶液中テンプレートスイッチ増幅（ＴＳＡ）手順により調製されたｍＲＮＡ−ｓｅｑライブラリーからの低ＧＣ含有率遺伝子（＜０．４の平均含有率、赤色ドット）における平均遺伝子発現の比較である。（Ｂ）Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑおよび標準ｍＲＮＡ−ｓｅｑにおける平均遺伝子発現間のＧＣ含有率バイアスである。５５０個の３Ｔ３のＳＴＡＭＰのライブラリー、およびＤｒｏｐ−Ｓｅｑにおいて使用された同一の細胞培養フラスコに由来するＲＮＡを使用して標準的方法（拡張実験手順）により調製されたｍＲＮＡ−ｓｅｑライブラリーからの低ＧＣ含有率遺伝子（＜０．４の平均含有率、赤色ドット）における平均遺伝子発現の比較である。（Ｃ）Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑおよび標準ｍＲＮＡ−ｓｅｑにおける平均遺伝子発現間の長さバイアスである。５５０個の３Ｔ３のＳＴＡＭＰのライブラリー、およびＤｒｏｐ−Ｓｅｑにおいて使用された同一の細胞培養フラスコに由来するＲＮＡを使用して標準的方法（拡張実験手順）により調製されたｍＲＮＡ−ｓｅｑライブラリーからの長い転写物（＞５０００の平均転写物長さ、赤色ドット）における平均遺伝子発現の比較である。ここで観察されたバイアスは、Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑおよび溶液中ＴＳＡの比較において見出されず（データ示さず）、このバイアスが、より長い断片を優先的に増幅するテンプレート抑制ＰＣＲの結果である可能性が高いことを示した（Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。（Ｄ）ｄｄＰＣＲによる感度推定である。ＲＮＡを５０，０００個のＨＥＫ細胞の培養物から単離し、ＲＴ−ｄｄＰＣＲを使用して１０個の遺伝子（ＡＣＴＢ、Ｂ２Ｍ、ＣＣＮＢ１、ＧＡＰＤＨ、ＥＥＦ２、ＥＮＯ１、ＰＳＭＢ４、ＴＯＰ２Ａ、ＹＢＸ３、およびＹＷＨＡＨ）のレベルをこのバルク溶液中でデジタル定量した。次いで、これらの転写物カウントを、Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑにより細胞当たりでカウントされたユニーク転写物の平均数と比較した。エラーバーは、個々のｄｄＰＣＲ計測値（横のバー、Ｎ＝３つのレプリケート）について、またはＳＴＡＭＰ（縦のバー、Ｎ＝５４）にわたる標準誤差を示す。これらの１０個の遺伝子発現計測値の平均に基づき、本出願人らは、Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑが細胞ｍＲＮＡの約１０．７％を捕捉することを推定する。（Ｅ）バーコード化プライマービーズの捕捉効率である。Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑにおいて使用された同一のバーコード化プライマービーズを、２０ｎｇ／μｌの濃度における精製ヒト脳ＲＮＡに溶液中でハイブリダイズさせた（拡張実験手順）。次いで、ビーズをスピンダウンし、３回洗浄し、水の存在下でビーズを加熱することにより結合ＲＮＡを溶出させた。２つのｍＲＮＡ転写物ＧＡＰＤＨおよびＡＣＴＢの濃度を、５つのステップのそれぞれにおいて計��した。エラーバーは、平均の標準誤差である。（Ｆ）バーコード化ビーズプライマー結合飽和の評価である。３つの異なるインプットＲＮＡ濃度：２０ｎｇ／μｌ、５０ｎｇ／μｌおよび１００ｎｇ／μｌを使用して（Ｅ）に記載のものと同一の手順を実施した。ビーズの外に溶出されたインプットＲＮＡの割合はインプットＲＮＡ濃度に伴って線形的にスケールし、ビーズへのハイブリダイゼーションがｍＲＮＡ結合部位の飽和により制限されないことを示した。
【０１０８】
図１８は、分析において使用された４４，８０８個の網膜細胞ＳＴＡＭＰの主成分１〜３２のプロットを説明する。（Ａ）４４，８０８個のＳＴＡＭＰの無着色ＰＣＡプロットであり；（Ｂ）（Ａ）と同一のＰＣＡプロットであるが、図１１Ｂの色を使用してそれぞれ細胞がそれらの最終クラスタアイデンティティーにより着色されている。
【０１０９】
図１９は、単一細胞遺伝子発現の教師なし分析により生成された３９個の網膜細胞クラスタにおける選択マーカー遺伝子の発現を示すバイオリンプロットを説明する。
【０１１０】
図２０は、完全な４４，８０８個の細胞データセットを構成した７つのレプリケート（４つの異なる日にわたり調製、（拡張実験手順）の１つに由来する細胞から構成されるそれぞれのクラスタの割合を示す。それぞれのレプリケートの割合を、積み上げバープロットとして表す。レプリケート１〜６は、Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑの「アグレッシブモード」（約９０％の単一細胞、約９０％の純度）において調製し；レプリケート７は、「ピュアモード」（＞９９％の単一細胞、９８．６％の純度）において調製した。星印は、不完全な網膜解剖から生じる汚染線維芽細胞に対応する２つの不均衡なクラスタ＃３６を指定する。
【０１１１】
図２１は、Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑ設定の概略的な表示を説明する。油、細胞、およびビーズが充填された３つのシリンジポンプが、フレキシブルチューブを介して図Ｓ２ＡのＰＤＭＳ装置にそれぞれ接続されている。装置は、液滴生成をリアルタイムでモニタリングすることができるように倒立顕微鏡のステージ上に存在する。チューブは、アウトレットチャネルを、液滴回収用の５０ｍＬのコニカルチューブに接続する。
【０１１２】
ある実施形態において、担体流体は、担体流体中の界面活性剤がチャネル壁部をコートするようにアウトレットチャネルを通して流動させることができる。一実施形態において、フルオロ界面活性剤は、過フッ素化ポリエーテルＤｕＰｏｎｔ  Ｋｒｙｔｏｘ  １５７  ＦＳＬ、ＦＳＭ、またはＦＳＨを、揮発性フッ素化溶媒中で水性水酸化アンモニアと反応させることにより調製することができる。溶媒および残留水およびアンモニアは、ロータリーエバポレーターにより除去することができる。次いで、界面活性剤は、フッ素化油（例えば、Ｆｌｏｕｒｉｎｅｒｔ（３Ｍ））中で溶解させることができ（例えば、２．５重量％）、次いでそれが担体流体として機能する。
【０１１３】
試薬液滴１００６を産生するための試料流体リザーバー１０１２の作動をここに記載する。開示される発明は、オンデマンドキャパビリティーを介する動的試薬送達（例えば、コンビナトリアルバーコード化）の概念を基礎とする。オンデマンド特性は、送達液滴を本明細書に記載のとおり一次液滴に放出するための種々の技術キャパビリティーの１つにより提供することができる。
【０１１４】
この装置の開発の一態様は、流速、チャネル長さ、およびチャネル形状をを決定することである。これらの設計規格が確立されたら、ランダムまたは規定の試薬組合せを含有する液滴をオンデマンドで生成し、目的の試料／細胞／基質を含有する「反応チャンバ」液滴と合流させることができる。
【０１１５】
複数のユニークタグを追加の液滴中に取り込み、そのタグを、一次液滴に特異的であるように設計された固体担体に結合することにより、一次液滴が曝露される条件をコードおよび記録することができる。例えば、核酸タグを連続的にライゲートして条件およびその順序を反映する配列を作出することができる。あるいは、タグを独立して固体担体に付加し、付属させることができる。バイオインフォマティクスにより情報を記録するために使用することができる動的標識系の非限定的な例は、２０１２年９月２１日および２０１２年１１月２９日に出願された米国仮特許出願である名称「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｕｎｉｑｕｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  Ａｇｅｎｔｓ」に見出すことができる。このように、２つ以上の液滴を、種々の異なる条件に曝露することができ、液滴を条件に曝露するたびに、条件をコードする核酸を、一緒に、または液滴と会合しているユニーク固体担体にそれぞれライゲートされた液滴に添加し、その結果、異なる履歴を有する液滴を後に合わせる場合であっても、液滴のそれぞれの条件は、異なる核酸を通して利用可能のままである。複数の条件への曝露に対する応答を評価する方法の非限定的な例は、２０１２年９月２１日に出願された米国仮特許出願である名称「Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｔａｇｇｉｎｇ」に見出すことができる。
【０１１６】
開示される装置の適用は、種々の目的化合物（薬物、小分子、ｓｉＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ、試薬など）の制御送達から独立して、またはそれに関連して分子バーコード（例えば、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、フルオロフォアなど）の動的生成のための使用を含み得る。例えば、ユニーク分子バーコードをノズルの１つのアレイ中で作出することができる一方、個々の化合物または化合物の組合せを別のノズルアレイにより生成することができる。次いで、バーコード／目的化合物を細胞含有液滴と合流させることができる。コンピュータログファイルの形式の電子記録を、送達されるバーコードを送達される下流試薬に関連付けることを保持させる。この方法により、例えば、単一細胞薬物スクリーニング、調節経路の制御摂動などの用途のために細胞の大集団を効率的にスクリーニングすることが可能となる。開示される発明の装置および技術は、単一細胞（または単一分子）レベルにおいて、およびコスト効率的にデータ分解能を要求する研究を実施する労力を容易にする。開示される実施形態は、油中水型エマルジョンとしてマイクロ流体チップ中で１つずつ生成される単分散水性液滴の使用を通して細胞、核酸、タンパク質などを含有し得る個々のエマルジョン液滴への試薬のハイスループットおよび高分解能送達を提供する。したがって、本発明は、寿命実験の間に個々の細胞および液滴処理／組合せを動的に追跡し得ることにより先行技術の系に対して利点を提供する。開示される本発明の追加の利点は、開示プロセスを通して液滴を操作するさらなるキャパビリティーでエマルジョン液滴のライブラリーをオンデマンドで作出する能力を提供する。開示される実施形態は、それにより、液滴の動的追跡を提供し、液滴配置の履歴および単一細胞ベース環境における用途を作出する。
【０１１７】
液滴生成および配置は、動的インデックス化方針を介して、および本発明の開示実施形態による制御方法で生成する。本明細書に記載のマイクロ流体装置の開示される実施形態は、毎秒数千個の液滴の高度に効率的な速度において処理し、分析し、ソートすることができるマイクロ液滴のキャパビリティーを提供し、疾患の生物学的機序の細胞モデル、または生化学、もしくは薬理学的アッセイのいずれかにおいて数百万個の区別される化合物、生物学的プローブ、タンパク質または細胞の迅速なスクリーニングを可能とする強力なプラットフォームを提供する。
【０１１８】
複数の生物学的アッセイおよび生物学的合成が本発明について企図される。
【０１１９】
有利な実施形態において、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が企図される（例えば、米国特許出願公開第２０１２０２１９９４７号明細書参照）。本発明の方法は、任意のタイプの化学反応または任意のタイプの生物学的アッセイを実施するために試料流体を合流させるために使用することができる。ある実施形態において、本発明の方法は、液滴における増幅反応を実施するための試料流体の合流に使用される。増幅は、核酸配列の追加のコピーの産生を指し、一般に、ポリメラーゼ連鎖反応または当技術分野において周知の他の技術（例えば、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．［１９９５］）を使用して実施される。増幅反応は、核酸分子を増幅させる当技術分野において公知の任意の増幅反応、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、ネステッドポリメラーゼ連鎖反応、ポリメラーゼ連鎖反応−一本鎖立体構造多型、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ  Ｆ．（１９９１）ＰＮＡＳ  ８８：１８９−１９３；Ｂａｒａｎｙ  Ｆ．（１９９１）ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  １：５−１６）、リガーゼ検出反応（Ｂａｒａｎｙ  Ｆ．（１９９１）ＰＮＡＳ  ８８：１８９−１９３）、鎖置換増幅および制限断片長多型、転写ベース増幅系、核酸配列ベース増幅、ローリングサイクル増幅、および超分岐ローリングサイクル増幅であり得る。
【０１２０】
ある実施形態において、増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応である。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、クローニングも精製もなしでゲノムＤＮＡの混合物中の標的配列のセグメントの濃度を増加させる、Ｋ．Ｂ．Ｍｕｌｌｉｓ（米国特許第４，６８３，１９５号明細書および同第４，６８３，２０２号明細書、参照により本明細書に組み込まれる）による方法を指す。標的配列を増幅させる方法は、過剰のオリゴヌクレオチドプライマーを、所望の標的配列とそれに続く熱サイクリングの正確な配列を含有するＤＮＡ混合物にＤＮＡポリメラーゼの存在下で導入することを含む。プライマーは、二本鎖標的配列のそのそれぞれの鎖に相補的である。
【０１２１】
増幅を行うため、プライマーを標的分子内のその相補的配列にアニールさせる。アニール後、プライマーをポリメラーゼにより伸長させて相補鎖の新たなペアを形成する。変性、プライマーアニールおよびポリメラーゼ伸長のステップは、複数回にわたり（すなわち、変性、アニールおよび伸長が１つのサイクルを構成し；多数のサイクルが存在し得る）繰り返して高濃度の所望標的配列の増幅セグメントを得ることができる。所望標的配列の増幅セグメントの長さは、互いに関してプライマーの相対的位置により決定され、したがって、この長さは制御可能なパラメータである。
【０１２２】
液滴中でＰＣＲを実施する方法は、例えば、Ｌｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許出願公開第２００８／００１４５８９号明細書、同第２００８／０００３１４２号明細書、および同第２０１０／０１３７１６３号明細書）、Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第７，０４１，４８１号明細書、ＲＥ４１，７８０号明細書として再発行）およびＲａｉｎｄａｎｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．の欧州特許出願公開第２０４７９１０号明細書に示されている。そのそれぞれの内容は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【０１２３】
第１の試料流体は、核酸テンプレートを含有する。第１の試料流体の液滴は、上記のとおり形成する。それらの液滴は、核酸テンプレートを含む。ある実施形態において、液滴は、単一の核酸テンプレートのみを含み、したがって、デジタルＰＣＲを実施することができる。第２の試料流体は、ＰＣＲ反応のための試薬を含有する。このような試薬としては、一般に、Ｔａｑポリメラーゼ、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ型のデオキシヌクレオチド、塩化マグネシウム、ならびにフォワードおよびリバースプライマー（全て水性緩衝液内で懸濁）が挙げられる。第２の流体は、詳細が以下に考察される増幅標的核酸の検出のための検出可能標識プローブも含む。２つの試料流体間の試薬のこのタイプの分別が唯一の可能性ではない。ある実施形態において、第１の試料流体は、ＰＣＲに必要な試薬の一部または全部を含む一方、第２の試料流体は、ＰＣＲに必要な試薬の残部を検出プローブと一緒に含有する。
【０１２４】
プライマーは、種々の方法、例として、限定されるものではないが、当技術分野において周知の方法（Ｎａｒａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，６８：９０（１９７９）；Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，６８：１０９（１９７９））を使用する適切な配列のクローニングおよび直接化学的合成により調製することができる。プライマーは、市販源、例えば、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｓｉｇｍａ、およびＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手することもできる。プライマーは、同一の融解温度を有し得る。プライマーの長さは、５’末端または３’末端において伸長または短縮して所望の融解温度を有するプライマーを産生することができる。さらに、それぞれのプライマーペアのアニール位置は、プライマーペアの配列および長さが所望の融解温度を生じさせるように設計することができる。２５塩基対よりも小さいプライマーの融解温度を決定するための最も単純な式は、Ｗａｌｌａｃｅルール（Ｔｄ＝２（Ａ＋Ｔ）＋４（Ｇ＋Ｃ））である。コンピュータプログラム、例として、限定されるものではないが、Ａｒｒａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｒｒａｙｉｔ  Ｉｎｃ．）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｏｂｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｃｏ．）、ＮｅｔＰｒｉｍｅｒ、およびＨｉｔａｃｈｉ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ製のＤＮＡｓｉｓを使用してプライマーを設計することもできる。それぞれのプライマーのＴＭ（融解またはアニール温度）は、ソフトウェアプログラム、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．から入手可能なＯｌｉｇｏ  Ｄｅｓｉｇｎを使用して計算する。
【０１２５】
次いで、核酸を含有する液滴をＰＣＲ試薬と、上記の本発明の方法により第２の流体中で合併し、Ｔａｑポリメラーゼ、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ型のデオキシヌクレオチド、塩化マグネシウム、フォワードおよびリバースプライマー、検出可能標識プローブ、ならびに標的核酸を含む液滴を産生する。
【０１２６】
混合液滴を産生したら、液滴を熱サイクリングし、それぞれの液滴中の標的核酸の増幅をもたらす。ある実施形態において、液滴は、加熱および冷却ラインの間のサーペンタイン経路中のチャネルに通して流動させて液滴中の核酸を増幅させることができる。チャネルの幅および深さは、それぞれの温度において滞留時間を設定するように調整することができ、それは１秒未満および数分の間のいずれでも制御することができる。
【０１２７】
ある実施形態において、３つの温度帯域を増幅反応に使用される。３つの温度帯域は、二本鎖核酸の変性（高温帯域）、プライマーのアニール（低温帯域）、および二本鎖核酸を産生するための一本鎖核酸の増幅（中間温度帯域）をもたらすように制御する。これらの帯域内の温度は、ＰＣＲ反応を実施するための当技術分野において周知の範囲内に収まる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２００１）を参照されたい。
【０１２８】
ある実施形態において、３つの温度帯域は、以下のとおり温度を有するように制御される：９５℃（ＴＨ）、５５℃（ＴＬ）、７２℃（ＴＭ）。調製された試料液滴は、制御速度においてチャネルを通り流動する。試料液滴は、熱サイクリング前に最初に初回変性帯域（ＴＨ）を通過する。初回予熱は、試料液滴内の核酸が熱サイクリング前に良好に変性したことを確保するための拡張帯域である。予熱帯域についての要求および要求される変性時間の長さは、反応において使用される化学物質に依存的である。試料は、約９５℃の高温帯域中を通過し、そこで変性と呼ばれるプロセスにおいて試料を最初に一本鎖ＤＮＡに分離する。次いで、試料は約５５℃の低温に流動し、そこでハイブリダイゼーションプロセスが生じ、その間にプライマーは試料の相補的配列にアニールする。最終的に、試料が約７２℃の第３の中間温度を通り流動するとき、ポリメラーゼプロセスが生じ、熱安定酵素を用いてプライマーをＤＮＡの一本鎖に沿って伸長させる。
【０１２９】
核酸は、液滴がチャネルを通り流動するとき、液滴がそれぞれの熱サイクルを通過するのと同一の熱サイクリングおよび化学反応を受ける。装置中のサイクルの総数は、加熱帯域の拡張により容易に変更される。試料は、それが完全な加熱装置のＮ回の増幅サイクルを通過するのと同一の熱サイクリングおよび化学反応を受ける。
【０１３０】
他の実施形態において、温度帯域は、ＰＣＲ反応のための２つの個々の温度帯域を達成するように制御される。ある実施形態において、２つの温度帯域は、以下の温度を有するように制御される：９５℃（ＴＨ）および６０℃（ＴＬ）。試料液滴は、場合により、熱サイクリングに流入する前に初回予熱帯域を通り流動する。予熱帯域は、活性化のための一部の化学物質に、およびさらに熱サイクリング反応が開始する前に液滴中の二本鎖核酸が完全に変性されることを確保するために重要であり得る。例示的な実施形態において、予熱滞留長さは、より高温における液滴の約１０分の予熱をもたらす。
【０１３１】
試料液滴は、約９５℃の高温帯域へと続き、そこで変性と呼ばれるプロセスにおいて試料を最初に一本鎖ＤＮＡに分離する。次いで、試料は装置を通り約６０℃の低温帯域に流動し、そこでハイブリダイゼーションプロセスが生じ、その間、プライマーは試料の相補的配列にアニールする。最終的に、ポリメラーゼプロセスが生じ、熱安定酵素を用いてプライマーをＤＮＡの一本鎖に沿って伸長させる。試料は、それが完全装置のそれぞれの熱サイクルを通過するのと同一の熱サイクリングおよび化学反応を受ける。装置中のサイクルの総数は、ブロック長および管の拡張により容易に変更される。
【０１３２】
増幅後、液滴を増幅産物の検出のための検出モジュールに流動させることができる。液滴は、当技術分野において公知の任意の方法、例えば、レポーターの存在または量の検出を使用して個々に分析および検出することができる。一般に、検出モジュールは、１つ以上の検出機器と連動している。検出機器は、光学もしくは電気的検出器またはそれらの組合せであり得る。好適な検出機器の例としては、特徴の代表的なシグナル、マーカー、またはレポーターを検出するため、ならびにソーティングモジュールにおける計測またはソート作用を測定および方向付けるために協働する光導波路、顕微鏡、ダイオード、光刺激装置（例えば、レーザ）、光電子倍増管、およびプロセッサ（例えば、コンピュータおよびソフトウェア）、ならびにそれらの組合せが挙げられる。検出モジュールおよび液滴中の増幅産物を検出する方法のさらなる記載は、Ｌｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許出願公開第２００８／００１４５８９号明細書、同第２００８／０００３１４２号明細書、および２０１０／０１３７１６３号明細書）およびＲａｉｎｄａｎｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．の欧州特許出願公開第２０４７９１０号明細書に示されている。
【０１３３】
別の実施形態において、アッセイの例は、ＥＬＩＳＡアッセイ（例えば、米国特許出願公開第２０１０００２２４１４号明細書参照）である。本発明は、少なくとも１つのフルオロ界面活性剤を含み得る非混和性フルオロカーボン油内の複数の水性液滴を含み得る別のエマルジョンライブラリーであって、それぞれの液滴は、サイズが均一であり、少なくとも第１の抗体、および少なくとも第２の抗体に結合している単一要素を含み得、前記第１および第２の抗体は異なるエマルジョンライブラリーを提供する。一例において、それぞれのライブラリー要素は、異なるビーズを含み得、それぞれのビーズは多数の抗体に付着しており、ビーズは、溶液中の異なる抗体を含有する液滴内に封入されている。次いで、これらの抗体は、「ＥＬＩＳＡサンドイッチ」を形成させることができ、それをＥＬＩＳＡアッセイのために洗浄および調製することができる。さらに、これらの液滴の含有物は、それに含有される抗体に特異的であるように変更してアッセイの結果を最大化することができる。
【０１３４】
別の実施形態において、単一細胞アッセイも、本発明の一部として企図される（例えば、個々の細胞をアッセイするためのマイクロ流体工学の適用の概要についてＲｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  ５，０２１５０１（２０１１）参照）。その細胞とその環境との相互作用を正確に制御することができ、または実験下の機能もしくは特性から単離することができる場合、単一細胞アッセイを個々の細胞の機能または特性を定量する実験として企図することができる。単一細胞アッセイの研究開発は、遺伝子変動が疾患を引き起こし、細胞の小さい下位集団が疾患起源を表すという概念を大きく前提とする。細胞から分泌される化合物、細胞内成分、細胞−細胞または細胞−薬物相互作用をアッセイする方法および個々の細胞をパターニングする方法も、本発明内に企図される。
【０１３５】
他の実施形態において、化学的プロトタイピングおよび合成化学反応も本発明の方法の範囲内で企図される。
【０１３６】
本発明およびその利点を詳細に記載してきたが、種々の変化形態、置換形態および変更形態が、本明細書において添付の特許請求の範囲に定義される本発明の趣旨および範囲から逸脱せずになされ得ることを理解すべきである。
【０１３７】
本発明を以下の実施例においてさらに説明し、それらは説明目的のためにのみ挙げられ、決して本発明を限定するものではない。
【実施例】
【０１３８】
実施例１
このプロトコルにおいて、ユニークにバーコード化されたビーズを、逆転写のためのプライマーとして使用するために合成する。ビーズは、下流ＰＣＲのためのプライミング部位として使用される表面上で合成された固定配列（図２ＡのＳＭＴ  Ａ）を有するものから最初に開始する。次に、ビーズを４つの等しい反応容器中に合計１２回スプリットおよびプールしてそれぞれのビーズにユニークである４＾１２個のユニークバーコード配列を生成する（図２Ｂ）。この１２ｂｐ領域は、それがそれぞれビーズに特異的であるため、細胞バーコードとして機能する。次に、ビーズを、４つ全ての塩基との８ラウンドの縮重合成にわたり全て一緒にプールし；この８ｂｐ領域は「分子バーコード」であり、それぞれのｍＲＮＡをユニークにタグ付けし、その結果、細胞中のそれぞれのｍＲＮＡ分子をデジタルカウントすることができる。最後に、ｍＲＮＡのポリアデニル化テールのための捕捉領域として機能する３０ｄＴ塩基を合成する（文献中では「オリゴｄＴ」と称されることが多い）。
【０１３９】
ユニークにバーコード化されたビーズの合成
Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−６５Ｓ樹脂を、Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｉｎｃ．から購入した。表面ヒドロキシルをＰＥＧ誘導体と反応させて１８炭素長のフレキシブル鎖リンカーを生成した。次いで、１０μｍｏｌサイクルスケールおよび３分間のカップリング時間のＤＮＡ合成を使用するＥｘｐｅｄｉｔｅ  ８９０９  ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置上での逆５’−＞３’ホスホラミダイト合成のための固体担体として誘導体化ビーズを使用した。使用されるアミダイトは、以下のものであった：Ｎ６−ベンゾイル−３’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−デオキシアデノシン−５’−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−ホスホラミダイト（ｄＡ−Ｎ−Ｂｚ）；Ｎ４−アセチル−３’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−デオキシ−シチジン−５’−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−ホスホラミダイト（ｄＣ−Ｎ−Ａｃ）；Ｎ２−ＤＭＦ−３’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−デオキシグアノシン−５’−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホラミダイト（ｄＧ−Ｎ−ＤＭＦ）；３’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−デオキシチミジン−５’−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホラミダイト；および３’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−デオキシウリジン−５’−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホラミダイト。無水酢酸およびＮ−メチルイミダゾールをキャッピングステップにおいて使用し；エチルチオテトラゾールを活性化ステップにおいて使用し；ヨウ素を酸化ステップにおいて使用し、ジクロロ酢酸を脱ブロッキングステップにおいて使用した。ビーズ表面上で生成されたオリゴヌクレオチド配列を図２Ａに示す。ＰＣＲハンドルとして使用される一定配列（図の「ＳＭＴ  Ａ）を合成する。次いで、１２サイクルのプールアンドスプリットホスホラミダイト合成を実施する（図２Ａの細胞バーコードまたは「ＣＢＣ」）。これらのサイクルの間、ビーズを合成カラムから取り出し、プールし、４つの質量が等しい部分にアリコート化し；次いで、それらのビーズアリコートを別個の合成カラム中に配置し、ｄＧ、ｄＣ、ｄＴ、またはｄＡホスホラミダイトのいずれかと反応させた。このプロセスを、合計で４＾１２＝１６，７７７，２１６個のユニークバーコード配列について１２回繰り返した（図２Ｂ）。これらのサイクルの完了時、８サイクルの縮重オリゴヌクレオチド合成を全てのビーズに対して実施し（図２Ａの分子バーコード「ＭＢＣ」）、次いで３０サイクルのｄＴ添加を実施した。
【０１４０】
ビーズの特徴決定
１）ポリアデニル化ＲＮＡについてのビーズ結合キャパシティーの決定。飽和量（２０，０００個のビーズ当たり１００ｐｍｏｌ）のポリアデニル化合成ＲＮＡをバーコードビーズに２×ＳＳＣ中で５分間アニールした。次いで、ビーズを２００ｕｌの１×ＴＥ＋０．０１％のＴｗｅｅｎにより３回洗浄し、１０ｕｌのＴＥ中で再懸濁させた。次いで、ビーズを６５℃において５分間加熱し、１ｕｌの上清をＮａｎｏｄｒｏｐ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ上で２６０ｎｍにおいて定量した。
【０１４１】
２）細胞バーコード配列の品質および均一性の決定。合成ＲＮＡを１２５μｌのマイクロ流体同時流動液滴生成装置中に０．２ｕＭの濃度において流動させた。他の流動は、２×逆転写ミックスを含有した。液滴を４２℃において３０分間インキュベートし、次いで破壊した。１１個のビーズをＰＣＲチューブにピックし、１７サイクルのＰＣＲにより増幅させた。アンプリコン産物を精製し、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００上で定量し、次いでＭｉＳｅｑ上でシーケンシングした。細胞バーコード配列を抽出し、編集距離１において崩壊させて図３Ｂを得た。
【０１４２】
３）細胞バーコード複雑性の決定。１０００個の細胞バーコード配列を、塩基組成（図２Ｃ）、ジヌクレオチド組成（図２Ｄ）について分析し、３’末端から連続的にトリミングし、デュプリケート配列について確認した（図２Ｅ）。これら全ての分析において、実験細胞バーコードは、それらの長さ（４＾１２個のユニーク配列）を考慮してそれらの複雑性の理論限界をわずかに下回るにすぎない複雑性を示した。
【０１４３】
【表１】
2017532024.tif 000003
【０１４４】
【表２】
2017532024.tif 000004
【０１４５】
油および装置を調製する：油を１０ｍＬのシリンジ中にロードする。ニードル（２７Ｇ１／２）およびチューブ（ＰＥ−２）を取り付け、油をチューブに通して端部まで押圧し、ポンプ中にロードする。チューブ端部を無菌装置の最も左側のチャネル中に配置する（図６参照、装置上の全てのフィーチャーは、１２５μｍの深さである）。
【０１４６】
細胞培養
ヒト２９３Ｔ細胞およびネズミＮＩＨ／３Ｔ３細胞を購入した。２９３Ｔおよび３Ｔ３細胞を、１０％のＦＢＳおよび１％のペニシリン−ストレプトマイシンが補給されたＤＭＥＭ中で増殖させた。
【０１４７】
細胞を３０〜６０％のコンフルエンスに増殖させ、ＴｒｙｐＬＥにより５分間処理し、等容量の増殖培地によりクエンチし、３００×ｇにおいて５分間スピンダウンした。上清を除去し、細胞を１ｍＬの１×ＰＢＳ＋０．２％のＢＳＡ中で再懸濁させ、３００×ｇにおいて３分間再スピンした。上清を再度除去し、細胞を１ｍＬの１×ＰＢＳ中で再懸濁させ、４０ミクロンのセルストレーナーに通し、カウントした。Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑのため、細胞を１×ＰＢＳ＋２００μｇ／ｍＬのＢＳＡ中で最終濃度に希釈した。
【０１４８】
全網膜懸濁液の生成
ラット網膜から網膜神経節細胞を精製する既に記載の方法（Ｂａｒｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）を適合させることにより、単一細胞懸濁液をＰ１４マウス網膜から調製した。手短に述べると、マウス網膜をパパイン溶液（４０Ｕのパパイン／１０ｍＬのＤＰＢＳ）中で４５分間消化した。次いで、パパインをトリプシン阻害剤溶液（ＤＰＢＳ中０．１５％のオボムコイド）中で中和し、組織を粉砕して単一細胞懸濁液を生成した。粉砕後、細胞をペレット化し、再懸濁させ、細胞懸濁液を２０μｍのＮｉｔｅｘメッシュフィルターに通して濾過していかなる塊状細胞も排除し、次いでこの懸濁液をＤｒｏｐ−Ｓｅｑに使用した。次いで、細胞をＤＰＢＳ＋０．２％のＢＳＡ中で２００個の細胞／μｌ（レプリケート１〜６）または３０個の細胞／μｌ（レプリケート７）のいずれかに希釈した。
【０１４９】
Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑを通して網膜懸濁液を４日に分けて処理した。１つのライブラリーを１日目に調製し（レプリケート１）；２つのライブラリーを２日目に調製し（レプリケート２および３）；３つのライブラリーを３日目に調製し（レプリケート４〜６）；１つのライブラリーを４日目に調製した（レプリケート７、高純度）。レプリケート４〜６に、ヒトＨＥＫ細胞を１個の細胞／μｌ（０．５％）の濃度においてスパイクインしたが、網膜データの広範な細胞サイズにより、交差種比較法を使用して単一細胞純度もダブレットも較正することができなかった。７つのレプリケートのそれぞれを別個にシーケンシングした。
【０１５０】
ビーズの調製
ビーズ（Ｂａｒｃｏｄｅｄ  Ｂｅａｄ  ＳｅｑＡまたはＢａｒｃｏｄｅｄ  Ｂｅａｄ  ＳｅｑＢのいずれか）を、３０ｍＬの１００％のＥｔＯＨにより２回洗浄し、３０ｍＬのＴＥ／ＴＷ（１０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１％のＴｗｅｅｎ）により２回洗浄した。ビーズペレットを１０ｍＬのＴＥ／ＴＷ中で再懸濁させ、１００μｍフィルターに通して４℃における長期保存のために５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブ中に入れた。フックスローゼンタール細胞カウンターを使用してビーズの原液濃度（ビーズ／μＬ）を評価した。Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑのため、ビーズのアリコートを原液チューブから取り出し、５００μＬのＤｒｏｐ−Ｓｅｑ溶解緩衝液（ＤＬＢ、２００ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．５、６％のＦｉｃｏｌｌ  ＰＭ−４００、０．２％のサルコシル、２０ｍＭのＥＤＴＡ）中で洗浄し、次いで１００個のビーズ／μＬのビーズ濃度に適切な容量のＤＬＢ＋５０ｍＭのＤＴＴ中で再懸濁させた。
【０１５１】
マイクロ流体装置上での細胞溶解およびビーズへのｍＲＮＡハイブリダイゼーション。１）界面活性剤含有油；２）水溶液（例えば、ＰＢＳ）中で懸濁している細胞；および３）溶解薬剤（すなわち、洗浄剤）中で懸濁しているバーコード化ビーズ。細胞およびビーズを装置中に同時に流動させ、そこでそれらは合流し、液滴を形成する。液滴の内側で細胞が溶解すると、ＲＮＡが放出され、ハイブリダイゼーションによりバーコード化ビーズの表面上に捕捉される。
【０１５２】
シリンジポンプ：油について１４，０００μｌ／時間；ビーズおよび細胞についてそれぞれ４，１００μｌ／時間；液滴を５０ｍＬのｆａｌｃｏｎチューブ中で回収し；１５００μｌの水溶液（７５０μｌのそれぞれの流動）当たり１つのｆａｌｃｏｎチューブを使用する。
【０１５３】
【表３】
2017532024.tif 000005
【０１５４】
マイクロ流体装置は、ＳＵ８フォトレジスト１製のマスターからのポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を使用して組み立てる。次いで、ＰＤＭＳ装置をプラズマ処理してガラス顕微鏡スライド（７５ｍｍ×５０ｍｍ×１ｍｍ）と固着させる。本出願人らは連続油相を用いて作業するため、油インレットに通してＡｑｕａｐｅｌ（Ｒｉｄｅｒ，ＭＡ，ＵＳＡ）中で流動させ、加圧空気を使用して過剰の流体を残りのインレット／アウトレットに通してフラッシュアウトすることによりチャネルを疎水性とする。ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｉｎ  ｐｏｌｙ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２１，２７（２０００）を参照されたい。
【０１５５】
実施例２
ナノリットル液滴を使用する数千個の個々の細胞のゲノムワイド発現プロファイリング
疾患は、異なるタイプの細胞から構成される複合組織内で生じ、それ自体で作用する単一細胞を（ほとんど）含まず；細胞は、常に互いに相互作用し、集団的決定をなし、動的変化を連係し、一緒に機能する。正常組織において、この結果はホメオスタシスであり；疾患において、１つ以上の相互作用の機能不全が病変をもたらし、またはそれを悪化させ得る。
【０１５６】
細胞は、生物学的構造および機能の基礎単位であり、タイプおよび状態が広く変動する。単一細胞ゲノミクスは、細胞アイデンティティーおよび機能を特徴決定し得るが、容易性およびスケールの限界によりその広い用途が妨げられている。ここで、本出願人らは、数千個の個々の細胞を、ナノリットルサイズの水性液滴中にそれらを分離し、異なるバーコードをそれぞれの細胞のＲＮＡに適用し、それらを全て一緒にシーケンシングすることにより迅速にプロファイリングするための方針のＤｒｏｐ−Ｓｅｑを記載する。Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑは、数千個の個々の細胞のｍＲＮＡ転写物を分析する一方、転写物の起源細胞を記憶する。本出願人らは、４４，８０８個のマウス網膜細胞からのトランスクリプトームを分析し、主要な網膜細胞クラスを反復し、サブタイプの候補マーカーを同定し、それぞれにおける遺伝子発現をプロファイリングして３９個の区別される細胞集団を定義した。本出願人らは、４７１個のヒト骨髄細胞も分析し、８つの区別される細胞集団を定義した。Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑは、単一細胞分解能における定型的な転写プロファイリングを可能とすることにより生物学的発見を加速させる。
【０１５７】
個々の細胞は、組織、器官、および生物のビルディングブロックである。それぞれの組織は、多くのタイプの細胞を含有し、それぞれのタイプの細胞は、生物学的状態間で切り替わり得る。組織中の細胞タイプの数は１００超であり得、細胞当たりの状態の数は不明である。それぞれタイプおよび状態がユニークな機能キャパビリティー、応答および分子組成を有するため、組織生理学、発生プロセス、および疾患を理解するためには細胞タイプおよび状態を確認することが必要である。
【０１５８】
ほとんどの生物学的系において、本出願人らの細胞多様性の知識は不完全である。例えば、脳の細胞タイプの複雑性は不明であり、広く議論されている（Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｐｅｔｉｌｌａ  Ｉｎｔｅｒｎｅｕｒｏｎ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。多くの重要であるが希少な細胞集団が、未発見である可能性が高い。このような希少タイプは、重要な役割を担い得る。例えば、プルキンエニューロンは、脳機能に不可欠であるが、それらは小脳中のニューロンの０．０５％未満をなす（Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。希少細胞集団の発見は、多数の細胞の分析を、理想的にはバイアスなしで要求し得る。
【０１５９】
それぞれの細胞の機能の主要な決定因子は、その転写プログラムである。近年の進歩により、現在では個々の細胞のｍＲＮＡ−ｓｅｑ分析が可能となる（Ｋｕｒｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。プロファイリングのための細胞を調製する現在の方法のＨｏＦＩＧＳバージョンが、典型的には、ソート（Ｓｈａｌｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）、ピック（Ｈａｓｈｉｍｓｈｏｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）、またはマイクロ流体工学（Ｓｈａｌｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）により細胞を最初に分離し、次いでそれぞれの細胞のトランスクリプトームをそれ自体のウェルまたはマイクロ流体工学チャンバ中で増幅させた後、数百個の細胞（Ｈａｓｈｉｍｓｈｏｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｉｓｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｐｉｃｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｐｏｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｓｈａｌｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）または（自動化で）数千個の細胞（Ｊａｉｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）に適用される。スケーラブルアプローチは、多様な条件および摂動下で多くの細胞タイプおよび状態を有する複合組織を特徴決定するために必要とされる。多数の細胞のプロファイリングは、多くの細胞中で反復する生物学的に意味のあるパターン（少数の遺伝子を含むこともある）からノイズを区別するためにも重要であり得る（Ｇｒｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｋｈａｒｃｈｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。
【０１６０】
ラージスケール単一細胞研究の主要な障害は、シーケンシングのための多数の個々の細胞の調製に関与するコストおよび時間であった。ここで、本出願人らは、数千個の個々の細胞を小型の「液滴」（水および油が混合するときに形成されるナノリットルスケール水性コンパートメント）中に封入し、次いでそれぞれの液滴中のＲＮＡをバーコード化して数千個のバーコード化単一細胞トランスクリプトームを１つのシーケンシング用試料中にプールすることによりこの障害を回避する手法を記載する。単一ｍＲＮＡ配列分析をここに記載する一方、他のタイプのヌクレオチド、例えば、細胞からのＤＮＡおよびウイルスまたはホスホラミダイト化学反応を活用し得る任意の分子化合物を捕捉することができる。マイクロ流体装置は、毎分数万個の正確なサイズの（「単分散」）ピコリットルまたはナノリットルスケールの液滴を作出し得る（Ｔｈｏｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｕｍｂａｎｈｏｗａｒ，２０００）。これらの液滴は、小型の反応チャンバとして機能し、ＰＣＲ（Ｈｉｎｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｋｉｎｚｌｅｒ，１９９９）、逆転写（Ｂｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）、細胞生存性スクリーン（Ｂｒｏｕｚｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）、および蛍光顕微鏡観察（Ｊａｒｏｓｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）に使用されてきた。しかしながら、トランスクリプトミクスのための液滴を使用する根本的な課題は、それぞれのｍＲＮＡ転写物が単離された細胞のアイデンティティーの分子記憶を保持することである。有効な分子バーコード化の欠落は、遺伝学およびゲノミクスの多くの分野における液滴の適用を妨げてきた（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【０１６１】
ここで、本出願人らは、それぞれの転写物に液滴特異的分子タグを付与するバーコード化系を導入することによりこの課題に対処する。本出願人らの方法は、Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑと呼ばれ、液滴マイクロ流体工学を大規模分子バーコード化と組み合わせて数千個の細胞からのｍＲＮＡ転写物を１つのシーケンシング用反応において同時に標識および処理し、個々の細胞の機械的なソートもピックも要求しない。
【０１６２】
複合組織中の細胞をカテゴリー化するＤｒｏｐ−Ｓｅｑの検出力を実証するため、本出願人らはそれをマウス網膜に適用した。網膜は、ニューロンの構造、機能および発生の分析のための強力なモデルである。なぜなら、それは、脳の任意の他の部分とほぼ同程度に複雑であるが、それはコンパクト容量の完全かつ利用可能な回路を提供するためである（Ｈｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｍａｓｌａｎｄ，２０１２；Ｍａｓｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｓａｎｅｓ，２０１５；Ｓａｎｅｓ  ａｎｄ  Ｚｉｐｕｒｓｋｙ，２０１０）。網膜は、約１００タイプに分類される５つのニューロンクラスを含有し、そのうちの少数が分子的に特徴決定されているにすぎない。本出願人らは、Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑを使用してマウス網膜からの４４，８０８個の単一細胞を分析し、それから本出願人らは、多くの個々の細胞の転写プロファイル間のパターンのみに基づき３９個の細胞タイプのアブイニシオ細胞分類をコンピュータによりアセンブルした。この分類は、単一実験において、数十年の網膜の分子、生理学的、および解剖学的調査からの発見を再現する一方、多くの新規推定サブタイプおよび特異的マーカーをノミネートする。結果は、いかにラージスケール単一細胞分析が、複合組織および細胞集団の生物学の本出願人らの理解を深めるかを示唆する。
【０１６３】
複合組織中の細胞をカテゴリー化するＤｒｏｐ−Ｓｅｑのキャパビリティーおよびキャパシティーをさらに実証するため、本出願人らは、Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑをヒト骨髄細胞において適用した。本出願人らは、制限数の細胞に対してヒト骨髄細胞の複雑性を探索し、それらのプロファイルのみに基づき公知のキー分類を確認した。
【０１６４】
結果
多数の個々の細胞を効率的にプロファイリングするため、本出願人らはＤｒｏｐ−Ｓｅｑを開発し、それにおいて、本出願人らは細胞を小型の液滴中で封入し、それぞれの個々の液滴（封入された細胞）からの転写物をバーコード化してそれらの起源細胞を記憶させる。Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑは、以下のステップからなる（図７Ａ）：（１）組織から単一細胞懸濁液を調製する；（２）それぞれの個々の細胞を、１つの区別されてバーコード化されたマイクロ粒子、ビーズまたは粒子（例えば、マイクロビーズ、マクロビーズ、ナノ粒子など）とナノリットルスケール液滴中で同時封入する；（３）細胞を、それらが液滴中で単離された後にのみ溶解させる；（４）細胞のｍＲＮＡをその付随マイクロ粒子上で捕捉し、ＳＴＡＭＰ（マイクロ粒子に付着している単一細胞トランスクリプトーム）を形成する；（５）数千個のＳＴＡＭＰを単一反応において逆転写させ、増幅させ、シーケンシングする；および（６）ＳＴＡＭＰバーコードを使用してそれぞれの転写物の起源細胞を推定する。本出願人らは、このアプローチのキー構成要素およびそれらの検証を記載する。
【０１６５】
多数の区別されてバーコード化されたビーズの生成へのスプリットプール合成アプローチ。スプリットアンドプールは、それぞれのサイクル後に、または任意の規定数のサイクル後に行うことができる。したがって、情報のそれぞれのバーコードは、単一ヌクレオチドからジヌクレオチドまたはトリヌクレオチドなどまでの範囲であり得る。
【０１６６】
多数のバーコード化プライマー分子を個々の液滴中に送達するため、本出願人らは、オリゴヌクレオチドをビーズ上で直接合成した。ビーズ材料として、本出願人らは、相当の表面積を有する多孔性マイクロ粒子から構成される、最初にクロマトグラフィー用に開発されたメタクリレート樹脂（拡張実験手順）を使用した。種々のビーズ材料が有用なビーズ基材として想定される。用いることができるビーズ材料の例としては、ホスホラミダイト化学反応を活用し得る任意のビーズ、例えば、当業者に公知のオリゴヌクレオチド合成において使用されるものが挙げられる。具体例としては、限定されるものではないが、官能化ポリマー（例えば、メタクリレート、ポリステレン、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール）、常磁性ビーズ、および磁性ビーズが挙げられる。
【０１６７】
次いで、本出願人らは、逆方向ホスホラミダイト合成を使用してマイクロ粒子の外側に５’から３’にオリゴヌクレオチドを構築し、酵素プライミング（Ｃｈｅｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｋａｄｏｎａｇａ，１９９１；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）に利用可能なフリー３’末端を生じさせた。バーコードを生成するために使用されるホスホラミダイト合成により、このタイプの化学反応を活用し得るオリゴヌクレオチドに沿う任意の塩基の化学修飾が可能となる。具体例としては、限定されるものではないが、ＤＮＡ塩基、ＲＮＡ塩基、ＬＮＡ塩基、ビオチン修飾塩基、フルオロフォアコンジュゲート塩基、および非カノニカル塩基（すなわち、イソ−Ｇ、イソ−Ｃ、イソ−Ａなど）によるバーコード化が挙げられる。さらに、これらのバーコード化ビーズは、他の形態のバーコード化、例えば、ビーズをパターニングし、または種々のフルオロフォアもしくはフルオロフォアの組合せにより蛍光標識することによる任意選択のバーコード化と組み合わせることができる。
【０１６８】
それぞれのマイクロ粒子結合オリゴヌクレオチドは、５つの部分から構成される（図７Ｂ）：（１）ＰＣＲおよびシーケンシングのためのプライミング部位として使用される一定配列（全てのプライマー上で同一）；（２）任意の１つのビーズの表面上の全てのプライマーにわたり同一であるが、全ての他のビーズ上の細胞バーコードと異なる「細胞バーコード」；（３）それぞれのプライマー上で異なり、同一起源のｍＲＮＡ分子（増幅およびＰＣＲデュプリケート）に由来する配列リードのコンピュータによる同定を可能とし、その結果、それらは二重カウントされないユニーク分子識別子（ＵＭＩ）（Ｋｉｖｉｏｊａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）；（４）ポリアデニル化ｍＲＮＡを捕捉し、かつ逆転写をプライミングするためのオリゴｄＴ配列（３０塩基）、ならびに（５）ビーズ材料（標識されない）の表面およびプライミング配列に付着している非開裂性リンカー。
【０１６９】
それぞれが他のビーズ上のバーコードと区別される細胞バーコードの数百万個のコピーを有する大規模数のビーズを効率的に生成するため、本出願人らは、「スプリットアンドプール」合成方針を開発した（図７Ｃ）。数百万個のマイクロ粒子のプールを４つのサイズが等しい群に分類し；異なるＤＮＡ塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴ）を４つの群のそれぞれに添加した。次いで、マイクロ粒子の４つの群を再度プールし、混合し、別の４つの群にランダムに再度スプリットし、別のＤＮＡ塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴ）を４つの新たな群のそれぞれに添加した。このスプリットプールプロセスを１２回繰り返した後、それぞれビーズのバーコードは、１２回の合成反応を通したそのビーズのユニーク経路を反映し（図７Ｃ）、その結果、単一マイクロ粒子上の全てのプライマーは、４１２＝１６，７７７，２１６個の考えられる１２ｂｐバーコードの同一のものを有する。次いで、マイクロ粒子プール全体は８ラウンドの縮重オリゴヌクレオチド合成を受けてＵＭＩをそれぞれオリゴ上で生成し（図７Ｄ）；最後にオリゴｄＴ配列（Ｔ３０）を全てのビーズ上の全てのオリゴの３’末端上で合成する。
【０１７０】
オリゴヌクレオチド結合ビーズ合成の種々の実施形態において、任意選択「フロッピー塩基」、例えば、ここに記載されるオリゴｄＴを使用することができる。しかしながら、これらの「フロッピー塩基」は、Ｔ塩基に限定されず、任意の好適な塩基を０〜２０塩基のいずれかで使用することができる。
【０１７１】
マイクロビーズがここに記載される一方、本方法は、「マイクロ」サイズのビーズに限定されず、プライマー、ＰＣＲテンプレート、トランスポゾン、ｓｉＲＮＡ、または捕捉プローブを標的コンパートメントに送達する適用において任意の適切なサイズのビーズが有用である。ビーズは、オリゴヌクレオチドおよび他の化合物、生物学的粒子、またはさらには試薬の両方を同時に送達することができる。例としては、限定されるものではないが、小分子ライブラリー、ｓｉＲＮＡ、抗体、ウイルス、細菌などが挙げられる。したがって、ビーズサイズは、ビーズの適用に関連する。例えば、直径１ｃｍのビーズは、数百万個のプライマーを収容し、次いでそのプライマーを９６ウェルタイタープレートに送達し得、次いでリンカーを開裂させてプライマーを放出させ、それらの細胞に送達する。開裂性リンカーとしては、水性酸性または塩基性条件下で加水分解し、光分解を受け、水素化下で開裂する種々のポリマー（または他のタイプの「フレキシブル」変形鎖化合物）、またはｍＲＮＡまたはヌクレオチド配列からビーズを放出させる当業者に公知の任意の方法を挙げることができる。
【０１７２】
本出願人らは、本出願人らのバーコード化ビーズの品質および複雑性をいくつかの手法で評価した。第１に、マイクロ粒子当たりのプライマーの数を推定するため、本出願人らは、合成ポリアデニル化ＲＮＡをマイクロ粒子にハイブリダイズさせ、合成ＲＮＡを溶出させ、その濃度を計測し；それらの実験から、本出願人らは、それぞれビーズが１０８超のプライマー部位を含有することを推定する（拡張実験手順）。第２に、付着バーコードに基づきＲＮＡ間を区別する能力を決定するため、本出願人らは、１１個のマイクロ粒子にハイブリダイズしている合成ＲＮＡを逆転写させ、それらのバーコード化ｃＤＮＡを単一溶液中で増幅させ、シーケンシングライブラリーを作出した（拡張実験手順）。得られた配列データにおいて、１１個の細胞バーコードはそれぞれ、シーケンシングリードの３．５％〜１４％を構成した一方、バーコード位置における次に最もアバンダントな１２ｍｅｒは、リードの０．０６％を構成したにすぎなかった（図１３Ａ）。これらの結果は、ほとんどのｃＤＮＡについての起源マイクロ粒子をシーケンシングにより認識し得ることを示唆した。最後に、バーコード複雑性を評価するため、本出願人らは、１，０００個のマイクロ粒子からの細胞バーコードをシーケンシングし、塩基およびジヌクレオチド組成（図１３Ｂ）、それとともに配列がコンピュータによりトランケートされるにつれて残留するユニーク細胞バーコードの数（図１３Ｃ）を計測した。３つ全ての分析は、細胞バーコードの配列多様性は理論限界にアプローチすること、およびしたがって、細胞バーコードを数千個のＳＴＡＭＰ間で容易に区別し得ることを示唆した。
【０１７３】
細胞をビーズと同時封入するためのマイクロ流体工学装置。本出願人らは、細胞をバーコード化マイクロ粒子と同時封入するようにマイクロ流体「同時流動」装置（Ｕｔａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）を設計した（図８Ａ、１４Ａ）。この装置は、２つの水溶液を油チャネルにわたり迅速に同時流動させて毎分５０，０００個超のナノリットルサイズの液滴を形成し得る。一方の流動は、溶解緩衝液中で懸濁しているバーコード化マイクロ粒子を含有し；他方の流動は、細胞懸濁液を含有する（図８Ａ、左側）。流動は封入前に層流であり、その結果、２つの溶液は液滴形成後にのみ混合する。細胞溶解およびビーズ表面上へのｍＲＮＡの拡散を最大化するため、本出願人らの装置は、カオス的移流による迅速な混合が凹凸屈曲マイクロ流体チャネル中で生じる「混合器」（Ｂｒｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）を含有する。
【０１７４】
液滴、細胞、およびマイクロ粒子の相対数は、Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑの効力のキーである。作出される液滴の数は、注入されるビーズまたは細胞の数を大きく超過し、その結果、液滴は、一般に、細胞を含有せず、または１つの細胞を含有し、ビーズを含有せず、または１つのビーズを含有する。本出願人らが以下に考察するとおり、細胞の濃度を慎重に選択することも、細胞−細胞ダブレットおよび潜在的単一細胞不純物の調節に重要である。１時間当たり数百万個のナノリットルサイズの液滴が生成され、そのうちの数千個はビーズおよび細胞の両方を含有する。ＳＴＡＭＰは、ビーズおよび細胞の両方を含有する液滴のサブセット中でのみ産生される。
【０１７５】
単一反応における多くのＳＴＡＭＰのシーケンシングおよび分析。数千個のＳＴＡＭＰを１回で効率的に分析するため、本出願人らは、任意の所望数のマイクロ粒子に結合している核酸を１つの反応において処理する手法を開発した。本出願人らは、最初に多容量の高濃度塩溶液中で液滴を破壊してＲＮＡのビーズ間の移動を最小化した（実験手順）。次いで、マイクロ粒子と会合しているｍＲＮＡを１つの反応において一緒に逆転写させ、共有結合ＳＴＡＭＰを形成した（図８Ａ、ステップ７）。（逆転写は、原理上、液滴内で実施することができるが、本出願人らは、反応を阻害する細胞溶解物由来因子（Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）に潜在的に起因して液滴外側がより効率的であることを見出した）。重要なことに、この段階において、科学者は、細胞懸濁液から所望数の細胞を選択するのと同じだけ、分析のための任意の所望数のＳＴＡＭＰを選択することができる。ＳＴＡＭＰは、複数の実験にわたり「バンクする（ｂａｎｋ）」ことができ；本出願人らは、有意なｃＤＮＡ分解の観察なしでＳＴＡＭＰを２ヵ月超貯蔵した（データ示さず）。本出願人らは、ＳＴＡＭＰに付着しているバーコード化ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅させ、次いでトランスポーゼースを使用してシーケンシングアダプターをｃＤＮＡ中に挿入することにより３’末端ライブラリーを調製する（実験手順）。本出願人らは、大容量並列シーケンシング（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ、ＮｅｘｔＳｅｑ、またはＨｉＳｅｑ）を使用してそれぞれの末端から得られる分子をシーケンシングし（図８Ｃ）、それらのリードを使用してさらなる分析のためにデジタル遺伝子発現計測値（それぞれの細胞中のそれぞれの遺伝子のカウント）の行列をアセンブルする（図８Ｄ、実験手順）。
【０１７６】
Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑは、種混合実験において評価されるとおり高い単一細胞特異性を有する。Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑが個々の転写物が単離された細胞を正確に記憶するか否かを決定するため、本出願人らは、培養ヒト（ＨＥＫ）およびマウス（３Ｔ３）細胞を含有する懸濁液を本出願人らが作製した種混合実験を設計した。ほぼ全てのヒトまたはマウスｍＲＮＡ配列断片を、正確な起源ゲノムに明確に割り当てることができ；したがって、細胞ライブラリーの「生物純度」を使用してその単一細胞純度を推定することができる。
【０１７７】
本出願人らは、ヒトおよびマウス細胞の混合物からＤｒｏｐ−Ｓｅｑライブラリーを調製し、シーケンシングデータにおけるそれぞれの細胞バーコードと会合したヒトおよびマウス転写物の数をスコアリングした（図９Ａ、９Ｂ、１４Ｂ）。この分析は、ＳＴＡＭＰが高度に生物特異的な転写物のセットに会合することを明らかにし（図９Ａおよび９Ｂ）、それは高い単一細胞特異性なしでは考えられない結果である。８２個のＳＴＡＭＰのシーケンシングを大幅に飽和したシーケンシングの深度レベルにおいて（細胞当たり７３７，２４０個のリード、図１５）、本出願人らは、ＨＥＫ細胞中の６，７２２個の遺伝子から平均４４，２９５個の転写物、および３Ｔ３細胞中の５，６６３個の遺伝子から２６，０４４個の転写物を検出した（図９Ｃおよび９Ｄ）。
【０１７８】
Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑライブラリーの単一細胞純度。新たな技術の限界および強度を理解することが重要である。したがって、本出願人らは、単一細胞ライブラリーにおける２つの不純物源を特徴決定した。
【０１７９】
細胞ダブレット。任意の単一細胞法における不成功の１つの形式は、一緒に固着し、またはそうでなければ期せずしてライブラリー調製について同時単離される細胞を含む。一部の早期の方法において、ウェルの顕微鏡イメージングを使用して「可視的ダブレット」を同定し、ダブレット率の下界を確立してきた。ＦＡＣＳを使用して単一細胞をソートする従来の研究は、ウェルの２．３％が可視的細胞ダブレットを含有することを報告した（Ｊａｉｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。主な市販の単一細胞分析プラットフォーム（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  Ｃ１）は、９６個のマイクロ流体単離された細胞のセットをイメージングし、部分的には、その結果、使用者がそれらのイメージからダブレットを同定することができ；１つの近年の研究は、細胞を含有する捕捉チャンバの１１％±９％において可視的ダブレットを同定した（Ｓｈａｌｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。
【０１８０】
種混合による分子分析は、ダブレットから調製されたライブラリーを同定するための強力かつ高感度な新たな手法を提供し、顕微鏡観察により検出されない多くのダブレットを同定し得る。例えば、本出願人らが種混合細胞集団をＤｒｏｐ−Ｓｅｑの分析と全く同様に調製し（図９Ａ、９Ｂ）、それらをＦｌｕｉｄｉｇｍ  Ｃ１上で分析した場合、本出願人らは、調製されたライブラリーの３０％が種混合であることを見出し（図１４Ｃ）、その約３分の１は顕微鏡観察イメージにおいて可視的ダブレットであった。本出願人らが、１２．５個の細胞／μｌの細胞濃度（１時間当たり約１，２００個の細胞の処理を可能とする）における細胞懸濁液からＤｒｏｐ−Ｓｅｑライブラリーを調製した場合、ほぼ全てのライブラリーが種特異的であった（図９Ａ）。本出願人らが、より早い細胞の処理（４，８００個の細胞／時間）を提供するより高い細胞濃度（５０個の細胞／μｌ）における細胞懸濁液からＤｒｏｐ−Ｓｅｑライブラリーを調製した場合、シーケンシングされたＳＴＡＭＰの１．９％が種混合であった（図９Ｂ）。１２．５個の細胞／μｌ〜１００個の細胞／μｌに及ぶ４つの条件にわたり、使用された細胞濃度および種混合ＳＴＡＭＰの割合間の強力な線形関係が存在し（図１５Ｄ；実験手順）、液滴がマウスおよびヒト細胞の両方をより高い細胞濃度において封入するより大きい機会を反映した。ヒト−マウスダブレットが全ての細胞−細胞ダブレットの半数を占めるため、本出願人らは、最大純度から最大スループットの範囲であるＤｒｏｐ−Ｓｅｑ条件について０．３６％〜１１．３％の全ダブレット率を計算した。
【０１８１】
単一細胞不純物。単一細胞分析において大部分が探索されていない問題は、単一細胞ライブラリーが他の細胞からの転写物により汚染される程度を含む。Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑのハイスループットおよび本出願人らの種混合実験の使用により、異なる細胞濃度において調製された数千個の単一細胞ライブラリーにわたる単一細胞純度を慎重に計測することが可能となった。本出願人らは、細胞懸濁液がロードされる濃度に不純物が強力に関連することを見出し；生物純度は、１２．５個の細胞／μｌにおける９８．８％〜１００個の細胞／μｌにおける９０．４％の範囲であった（図１５Ｄ）。ヒトおよびマウス細胞からライブラリーへのパイプラインを異なる段階（細胞懸濁液；ビーズおよび溶解細胞を含有する液滴；液滴後ＳＴＡＭＰ）において混合することにより、本出願人らは、細胞懸濁液が不純物の４８％に寄与し、液滴破壊後のＲＮＡ転写が４０％に寄与し、ＰＣＲアーティファクトが１２％に寄与することを見出した（図１５Ｅ）。したがって、最大の汚染源は、実験の開始時に細胞懸濁液中に存在し、調製の間に損傷する細胞から生じると推定される環境ＲＮＡであると考えられる。この結果は、単一細胞トランスクリプトミクス研究に重要である。なぜなら、細胞懸濁液の作出は、ほとんど全てのそのような方法の必須の最初のステップであるためである。実際、本出願人らが同一の種混合細胞集団を市販の単一細胞シーケンシングプラットフォーム（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  Ｃ１）上で分析した場合、本出願人らは、９５．８％の平均細胞純度を計測し（図１５Ｃ）、５０個の細胞／μｌにおけるＤｒｏｐ−Ｓｅｑと類似した。ここで実施された種混合実験の種類を使用して全ての単一細胞法を慎重に評価することが重要である。
【０１８２】
Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑの高純度モード（図９Ａ）がそれらの理由で最大スループットモード（図９Ｂ）よりも好ましいと考えられる一方、本出願人らは、多くの実験状況において、生存細胞を可能な限り迅速に処理することが望ましいことがあることを留意する。なぜなら、生存細胞の超高速処理は、再現性を強化し、それにより、より緩慢なスループットの既存の方法に対するＤｒｏｐ−Ｓｅｑの潜在的な強度に実現に役立ち得るためである。本出願人らは、これらの疑問を以下の網膜実験においてさらに探索する。
【０１８３】
細胞中の転写物の１２％についてのＤｒｏｐ−Ｓｅｑ試料。次に、本出願人らは、いかにＤｒｏｐ−Ｓｅｑにより確認されたデジタル単一細胞トランスクリプトームが細胞の内在ｍＲＮＡ含有率に関連するかを理解することを求めた。
【０１８４】
Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑは、ＲＮＡのビーズへのハイブリダイゼーションを含み、それは遺伝子の絶対的発現レベルの計測に影響し得るため、本出願人らは、Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑ発現計測値を一般に使用される溶液中ｃＤＮＡ増幅プロセスのテンプレートスイッチ増幅からのものと比較した（拡張実験手順）。テンプレートスイッチ増幅はここに記載される一方、Ｔ７リニア増幅または指数関数的等温増幅を使用して産物を増幅させることもできる。２つのライブラリーにおける遺伝子レベル対数発現計測値は高度に相関したが（ｒ＝０．９４、図９Ｅ）、Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑは、ＧＣリッチ転写物のより低い確認を定量的に示した（図１７Ａ）。本出願人らは、Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑ単一細胞対数発現計測値をバルクｍＲＮＡ−ｓｅｑからの計測値とも比較し、ｒ＝０．９０の相関を観察した（図９Ｆ）。
【０１８５】
単一細胞トランスクリプトミクスにおける重要かつ長期にわたる課題は、いかに実験において確認されたＲＮＡが細胞の元のＲＮＡ含有率に関連するかを理解することである。公知の濃度におけるＥｘｔｅｒｎａｌ  ＲＮＡ  Ｃｏｎｔｒｏｌｓ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ＥＲＣＣ）「スパイクイン」対照の、二重カウントの回避のためのＵＭＩと一緒の使用の増加により、現在ではデジタル単一細胞発現技術についての捕捉率の推定が可能となる（Ｂｒｅｎｎｅｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。３つの近年の研究は、３％（ＭＡＲＳ−Ｓｅｑ）（Ｊａｉｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）、３．４％（ＣＥＬ−Ｓｅｑ）（Ｇｒｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）、および４８％（５’−末端ＳＭＡＲＴ−ｓｅｑ）（Ｉｓｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）における現在の単一細胞デジタル発現技術の捕捉率を推定した。Ｉｓｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．（ＰＣＲまたはシーケンシングエラーに起因するＵＭＩの二重カウントを回避する試み）の相関法を使用するＤｒｏｐ−Ｓｅｑ捕捉率の推定は、Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑについて４７％の捕捉率推定値を生成し；しかしながら、本出願人らは、相関法を使用する場合であっても、シーケンシングエラーが依然としてＵＭＩカウントをつり上げ得る証拠を同定したため（拡張実験手順）、本出願人らは、Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑにおいて８ｂｐのＵＭＩを利用して、類似のＵＭＩ配列を単一カウントに崩壊させる新規アプローチに基づきより保存的な推定値（１２．８％、図９Ｇ）を導出した。捕捉率をさらに評価するため、本出願人らは、液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）（Ｈｉｎｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）を使用して１０個の遺伝子に対して独立したデジタル発現計測値（５０，０００個のＨＥＫ細胞からのバルクＲＮＡに対して）を作製した。Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑは、デジタルＰＣＲにより予測されたＲＮＡの数の平均１０．７％を捕捉した（図１７Ｄ、１７Ｅ、および１７Ｆ）。これらのデータは、Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑの感度が、本出願人らの新規かつかなり保存的なＵＭＩカウント法を使用してＤｒｏｐ−Ｓｅｑを評価する場合であっても、近年開発されたデジタル発現法により確立された範囲内であることを示す。
【０１８６】
細胞周期の単一細胞分析は、連続的に変動する細胞状態を明らかにする。Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑによる細胞状態の可視性を評価するため、本出願人らは、最初に、本出願人らが上記実験においてＳＴＡＭＰを調製した５８９個のＨＥＫおよび４１２個の３Ｔ３細胞間の細胞−細胞変動を試験した（細胞当たり６１，６９７個のリード）。両方の培養物は、非同調的に分裂する細胞からなり；単一細胞発現プロファイルの主成分分析（ＰＣＡ）は、タンパク質合成、増殖、ＤＮＡ複製、および細胞周期の他の局面における役割を有する遺伝子が上位主成分に偏ることを示した（表５）。本出願人らは、化学的同調細胞において既に特徴決定された細胞周期の５つの時期（Ｇ１／Ｓ、Ｓ、Ｇ２／Ｍ、Ｍ、およびＭ／Ｇ１）（表６）（Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）を反映する遺伝子セット（シグネチャー）をスコアリングすることにより１，００１個の細胞のそれぞれの細胞周期時期を推定した。それぞれのシグネチャーにおける遺伝子は、個々の細胞にわたり同時変動し、それにより細胞を細胞周期に沿って時間的に順序付けすることができた（図１０Ａ）。この順序付けを使用して、本出願人らは、細胞周期に沿って変動する発現パターンを有する遺伝子を同定し（５％の偽発見率における；実験手順）、ヒト（ＨＥＫ）およびマウス（３Ｔ３）細胞においてそれぞれ５４４および６６８個の遺伝子を生じさせた（図１０Ｂ）。遺伝子のほとんどは、Ｇ１＋ＳまたはＧ２＋Ｍ期のいずれかにおいてピーク発現を有し（図１０Ｂ）、少数が他のパターン、例えば、Ｍ／Ｇ１推移におけるピーク発現を示した（例えば、マウス細胞におけるクラスタ８、図１０Ｂ）。これらの遺伝子のうち、２つの種間のオルソロガス遺伝子の有意な重複が存在し（２００個の共有オルソログ、超幾何検定によるＰ＜１０−６５）、保存される細胞周期プログラムと一致する。この「保存される」サイクリング遺伝子（両方の種において細胞周期調節されるものとして同定された遺伝子）のほとんど（８２．５％）は、少なくとも一方の種において細胞周期に関するものとして既にアノテートされている。細胞周期調節されるものとしてこれまでアノテートされなかった保存される周期遺伝子の１７．５％のうち、本出願人らは、細胞周期変動を示すことが予測されるいくつか（例えば、Ｅ２Ｆ７、ＮＣＡＰＧ、ＣＤＣＡ４、ＤＮＭＴ１およびＰＡＲＰＢＰ）、および本出願人らの知識によれば、細胞周期にこれまで関連しなかったいくつか、例として、転写因子（ＴＣＦ１９、ＡＴＦ４、ＺＦＨＸ４）および他の遺伝子を見出した（図１０Ｃ）。
【０１８７】
最後に、本出願人らは、それぞれの種において、５つの上位ＰＣの４つが、細胞周期時期特異的スコアの少なくとも１つと高度に相関することを見出し（Ｐ＜１０−１０）、このことはそれらの細胞における細胞−細胞変動の細胞周期の優位な役割を示し、分裂細胞における他の報告（Ｂｕｅｔｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）と一致した。したがって、Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑ単一細胞プロファイルは、下位集団表現型に従って変動する遺伝子のセットを明らかにし得る。特に、これは、細胞周期に影響することがこれまで公知でない保存されるヒト−マウス遺伝子ペアの同定を支援し得る、化学的同調を用いない、多数の細胞にわたる高い時間分解能における細胞周期の研究を可能とする。
【０１８８】
網膜のＤｒｏｐ−Ｓｅｑ分析は、細胞クラスを明らかにする。本出願人らは、Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑを用いて試験するため網膜を選択した。なぜなら、数十年にわたる研究は、多くの網膜細胞タイプに関する情報を生成しており（Ｍａｓｌａｎｄ，２０１２；Ｓａｎｅｓ  ａｎｄ  Ｚｉｐｕｒｓｋｙ，２０１０）、本出願人らの単一細胞ＲＮＡ−ｓｅｑデータを既存の細胞分類スキームに関連付ける機会を提供するためである。網膜は、それぞれが形態学的、生理学的、および分子基準の組合せにより定義される５つのクラスの神経細胞を含有する（図１１Ａ）。３つの細胞層の最外層は、光を電気シグナルに変換する光受容体を含有する。中間層は、３つのクラスの介在ニューロン、水平、双極およびアマクリン細胞ならびにミュラーグリア細胞を含有する。最内層は、網膜神経節細胞および一部のアマクリン細胞を含有する。光受容体は介在ニューロン上にシナプス結合し、それは視覚シグナルを処理し、それらを網膜神経節細胞に伝達し、次いでその細胞がそれらを脳の残部に送出する。このクラスのほとんどは、区別されるタイプ（合計で約１００において現在推定される）に分類可能であるが、明確に半数未満がそれらを他の関連タイプから特異的に区別する分子マーカーを有する。Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑは、もっぱら形態学的または生理学的基準により既に定義された細胞タイプの分子シグネチャーを同定する機会を提供する。
【０１８９】
網膜は、ラージスケール単一細胞プロファイリングについて非常に困難な技術的課題を提示する。第１に、網膜中の細胞の約７０％が桿体光受容体であり；他の網膜細胞クラスは、それぞれ、網膜細胞の０．５〜８％をなし、さらにタイプに分類される。したがって、網膜の問題は、多数の個々に希少な細胞タイプを同定することである。第２に、直径１．２ミクロン（桿体）〜２０ミクロン（網膜神経節細胞）の範囲であり、したがって容積の３桁の幅に及ぶ網膜細胞間のサイズ変動が、細胞のバイアスのない単離についての技術的課題を提供するだけでなく、ｍＲＮＡ含有率の膨大な細胞−細胞差のために分析を複雑にし得る。
【０１９０】
本出願人らは、１４日齢マウスの全網膜から作製された細胞懸濁液に対してＤｒｏｐ−Ｓｅｑを実施し、４９，３００個のＳＴＡＭＰを１４，０８４個のリードの平均深度にシーケンシングした（ＳＴＡＭＰは、４日間にわたり７つの実験バッチ中で回収した）。アブイニシオ単一細胞発現プロファイルから細胞タイプを発見するため、本出願人らは、最初に、転写物のランダム統計サンプリングにより説明することができるもの（細胞内）よりも発現分散のより大きい程度を示した遺伝子（細胞全体）を使用して主成分分析を実施し、最初に、最大数の転写物を有する１３，１５５個の細胞にフォーカスして分析に対する小型光受容体細胞の他の点で不均衡な寄与を低減させた（実験手順）。本出願人らは、古典的な並べ替え検定（Ｐｅｒｅｓ−Ｎｅｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）および近年開発されたリサンプリング手順（Ｃｈｕｎｇ  ａｎｄ  Ｓｔｏｒｅｙ，２０１４）を利用して統計的に有意な主成分（ＰＣ）を同定し、それらのデータにおいて３２個の有意なＰＣを見出した（図１８）。有意なＰＣのほとんど全てが、網膜細胞タイプの周知のマーカーである遺伝子により強力に方向付けられた。本出願人らは、それらの主成分に関連する細胞ローディングを、ｔ分布型確率的近傍埋め込み（ｔ−Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ  Ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ  Ｎｅｉｇｈｂｏｒ  Ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ）（ｔＳＮＥ）（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍａａｔｅｎ  ａｎｄ  Ｈｉｎｔｏｎ，２００８）用インプットとして使用してそれらの３２個のＰＣを２つの次元に低減させた。本出願人らは、このデータの残りの３６，１４５個の細胞をｔＳＮＥ上に射影し、密度クラスタリングアプローチを示差的発現分析と組み合わせてこのｔＳＮＥ分析から細胞の区別されるクラスタを同定した（拡張実験手順）。これらのステップにより、３９個の転写的に区別される細胞集団が残り、最大のものは２９，４００個の細胞を含有し、最小のものは５０個の細胞を含有し、全体で４４，８０８個の細胞から構成された（図１１Ｂ）。最後に、本出願人らは、３９個の細胞集団間の類似度関係の系統樹を遺伝子発現空間のそれらのユークリッド距離に基づき構築することにより３９個の細胞集団を転写的に類似するクラスタのより大きいカテゴリー（クラス）に組織化した（図１１Ｄ、左側）。
【０１９１】
本出願人らは、それらの教師なしクラスタリング結果（全体的に、公知のマーカーにより「教育された」ものではなく単一細胞トランスクリプトームデータ自体のクラスタリングから導出した）が、多くの網膜細胞タイプについて存在する公知の分子マーカーの発現と著しく相関することを見出した（図１１Ｄ、右側）。網膜細胞タイプの周知のマーカーとしては、網膜神経節細胞についてＳｌｃ１７ａ６（Ｖｇｌｕｔ２）およびＴｈｙ１、双極細胞についてＶｓｘ２、水平細胞についてＬｈｘ１、光受容体についてオプシン、アマクリン細胞についてＴｆａｐ２ｂおよびＰａｘ６、ならびにミュラーグリアについてＲｌｂｐ１が挙げられる。これらのマーカーのそれぞれは、本出願人らの教師なし分析に由来する系統樹の枝または葉に対応する遺伝子発現の単一細胞パターンを示した（図１１Ｄ）。光受容体は、それらの桿体および錐体オプシンの発現に基づき桿体および錐体として容易に同定可能な２つの群にクラスタリングされた。追加のクラスタは、網膜に関連する非神経細胞、例として、星状細胞（網膜から出る網膜神経節細胞軸索に関連）、常在性ミクログリア（Ｐｒｏｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）、内皮細胞（網膜内血管系からのもの）、周皮細胞（内皮を包囲する細胞）、および線維芽細胞に対応した（図１１Ｄ）。さらに、本出願人らは、本出願人らのデータにおける主要な細胞クラスの相対比率が、顕微鏡観察からの早期の推定値（Ｊｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）と大きく一致することを見出した。予測比におけるこれらの生物学的に公知の細胞クラスの全てを同定する教師なし分析の能力は、そのような分析が、常在性細胞集団の特徴決定が乏しい多くの他の組織に適用可能であり得る示唆する。
【０１９２】
Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑデータの複製および累積検出力。実験セッションにわたる複製により、微量の生物学的シグナルの検出のための累積的により強力なデータセットの構築が可能となる。４匹の異なるマウス同腹仔を利用して網膜ＳＴＡＭＰを４つの異なる日において（週を空けて）生成し、いくつかのセッションは、合計７つのレプリケートについて複数のレプリケートＤｒｏｐ−Ｓｅｑランを生成した。本出願人らは、特に低い細胞濃度（１５個の細胞／μｌ）および高純度におけるそれらのレプリケートの１つを調製して任意の分析結果が細胞−細胞ダブレットのアーティファクトであるか単一細胞不純物のアーティファクトであるか（すなわち、それらがそれらの「高純度」細胞を排除したか否か）を評価した。なぜなら、Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑの最速スループットモードにより生存細胞のかなり速い処理が可能となるが（インビボ系への対応の維持に有価である）が、その最大純度モードに対して単一細胞純度のいくらかの代償を伴い（図９Ａ、９Ｂ）、それらのモードにおいて同定された転写パターン間の対応を理解することが重要であったためである。次いで、キーとなる疑問は、全て実験セッションが細胞を、本出願人らが上記分析において観察した３９個の集団のそれぞれに提供するか否かということであった（図１１Ｂ）。本出願人らは、３９個全てのクラスタが全ての実験セッションおよび条件からの細胞を含有することを見出した。しかしながら、クラスタ３６（図１１Ｅにおける矢印；図２０における星印）は、レプリケート２および３から不均衡に抜き出された。このクラスタは、網膜由来でないが、代わりに網膜を包囲する組織中に存在する細胞タイプの線維芽細胞のマーカーを発現し；２つのレプリケートにおけるより多数の線維芽細胞の包含は、網膜境界周囲解剖の課題を表す可能性が最も高い。最も重要なことに、高純度条件下で調製された３，２２６個の細胞（レプリケート７）は、全てのクラスタに寄与し、それはクラスタがダブレットのアーティファクトでも他の不純物のアーティファクトでもないことを示した（図１１Ｅ）。本出願人らは、実験変動がＤｒｏｐ−Ｓｅｑにおける遺伝子発現計測値に影響を与える可能性を除外することができない一方、それらの実験において、そのような効果は、より高度に類似する細胞サブタイプ（例えば、下記の２１個のアマクリン細胞の集団）間の差に対しても小さいと考えられる。
【０１９３】
次に本出願人らは、いかに細胞の分類（それらの遺伝子発現のパターンに基づく）が、分析における細胞の数に応じて進化するかを試験してクラスタリング分析のロバストネスおよび多数の細胞の分析への科学的利益の両方を評価した。本出願人らは、本出願人らのデータセットからの５００、２，０００、または９，４３１個の細胞を使用し、いかに（例えば）完全なもの（４４，８０８個の細胞分析）において同定されたアマクリン細胞がより少数の細胞の分析においてクラスタリングしたかを追求した（図１１Ｆ）。本出願人らは、データの細胞数が増加するにつれ、関連クラスタ間の区別は、より明確な、より強力な、およびより微細な分解能になることを見出し、より多数の希少アマクリン細胞集団（それぞれ、実験における細胞の０．１〜０．９％の表す）を互いに最終的に区別することができる結果を得た（図１１Ｆ）。より少数の細胞の分析において、それらの細胞は、ゲノムワイド実験において単一細胞生物学的、技術的、および統計的ノイズから反復パターン（少数の遺伝子を含むことが多い）を区別する課題を反映する「スーパータイプ」に同時クラスタリングされることが多かった。
【０１９４】
２１個の候補アマクリン細胞タイプのプロファイル。密接に関連する細胞タイプを区別する単一細胞分析の能力をより良好に理解するため、本出願人らは、最も形態学的に多様であるとみなされるニューロンクラスのアマクリンニューロン（Ｍａｓｌａｎｄ，２０１２）として同定された２１個のクラスタにフォーカスした。ほとんどのアマクリン細胞は抑制性であり、約半数は神経伝達物質としてグリシンを使用し、他の半数はＧＡＢＡを使用する。Ｓｌｃ１７ａ８（ＶＧｌｕｔ３）を発現し、グルタミン酸を放出する興奮性アマクリン細胞も同定されている（Ｈａｖｅｒｋａｍｐ  ａｎｄ  Ｗａｓｓｌｅ，２００４）。別の近年発見されたアマクリン細胞集団は、公知の古典的神経伝達物質を放出しない（ｎＧｎＧアマクリン）（Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。
【０１９５】
本出願人らは、最初に、他の細胞クラスに対してアマクリンクラスタにより最も普遍的に発現される潜在的なアマクリンマーカーを同定した（図１２Ａ）。次いで、本出願人らは、公知のグリシン作動性およびＧＡＢＡ作動性マーカーの発現を評価し；それらの相互に排他的な発現が形態学的な相関による根本的な区別として見られ：ほとんどのＧＡＢＡ作動性アマクリンは、単一の下位層に制限される広い系統樹分枝（ワイドフィールド）を有する一方、グリシン作動性アマクリンは、複数の下位層に及ぶ狭い系統樹分枝（ナローフィールド）を有する。２１個のアマクリン細胞のクラスタのうち、１２個の群（合計で２，５１６個の細胞になる）がＧＡＢＡ作動性として同定可能であり、区別される５つのクラスタ（合計で１，１２１個の細胞になる）がグリシン作動性として同定可能であり、これらはそれぞれそれぞれＧＡＢＡ合成酵素、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（Ｇａｄ１およびＧａｄ２によりコードされる２つのアイソフォーム）およびグリシントランスポーター（Ｓｌｃ６ａ９）の発現に基づく（図１２Ｂ）。追加の細胞集団（７３個の細胞を含む）は、他のアマクリン集団中で発現されないＳｌｃ１７ａ８のその発現により興奮性として同定された（図１２Ｂ）。残り３つのアマクリン細胞集団（クラスタ４、２０、および２１）は、Ｇａｄ１、Ｇａｄ２、Ｓｌｃ６ａ９、およびＳｌｃ１７ａ８を有さず、または低レベルのそれらを有し；それらは下記のとおりｎＧｎＧアマクリンを含む可能性が高い。
【０１９６】
公知の分子マーカーを有するアマクリンタイプは、分析から特異的細胞集団（クラスタ）に容易に割り当てられた。グリシン作動性Ａ−ＩＩアマクリンニューロンは、最も多様なグリシン作動性クラスタ（図１２Ｂ、クラスタ１６）に対応すると考えられた。なぜなら、これはギャップジャンクションタンパク質コネキシン３６をコードするＧｊｄ２遺伝子を強力に発現する唯一のクラスタであったためである（Ｆｅｉｇｅｎｓｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｍｉｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。ＳＥＧグリシン作動性およびｎＧｎＧアマクリンにおいて見出された転写因子Ｅｂｆ３は、クラスタ１７および２０に特異的であった。アセチルコリンを共存伝達物質として使用する唯一の網膜細胞のスターバーストアマクリンニューロン（ＳＡＣ）は、それらの細胞のコリンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子Ｃｈａｔの発現によりクラスタ３として同定可能であり（図１２Ｂ）；Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑデータも、ＳＡＣが、他のＧＡＢＡ作動性細胞とは異なり、ウサギにおいて既に観察されているとおり（Ｆａｍｉｇｌｉｅｔｔｉ  ａｎｄ  Ｓｕｎｄｑｕｉｓｔ，２０１０）、Ｇａｄ１を発現するがＧａｄ２を発現しないことを示唆した。
【０１９７】
上記区別に加え、生理学的および形態学的に多様なアマクリンタイプ間の分子区別についてはほとんど知られてない。これらのタイプの分子マーカーは、アマクリンの回路、発生、および機能をより包括的に研究するための強力なツールである。２１個のアマクリン細胞集団（クラスタ）のそれぞれについて、本出願人らは、他のアマクリンに対してそれぞれのクラスタにおいて高度にエンリッチされる複数の遺伝子を同定した（図１２Ｃ）。それぞれのクラスタ（図１２Ｃ）の多くのマーカーは、神経伝達または神経調節に関与する遺伝子であり；そのような遺伝子は、他の脳領域中の個々の神経細胞タイプの歴史的に良好なマーカーであった。
【０１９８】
Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑは細胞タイプの新規マーカーを同定し得るであろうか。本出願人らは、アマクリンクラスタの２つ：ＧＡＢＡ作動性クラスタのクラスタ７、ならびにグリシン作動性およびｎＧｎＧ細胞の混合物を有するクラスタ２０において発現される遺伝子を分析した。第１に、本出願人らは、網膜切片を、クラスタ７の上位マーカーの転写因子ＭＡＦに対する抗体と、それぞれＧＡＢＡ作動性およびグリシン作動性伝達のマーカーＧＡＤ１またはＳＬＣ６Ａ９のいずれかに対する抗体により同時染色した。Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑデータにより予測されるとおり、ＭＡＦは、ＧＡＢＡ作動性でありグリシン作動性でないアマクリン細胞の小サブセットにおいて特異的に見出された（図１２Ｄ）。クラスタ７は、最近傍クラスタ６に対してエンリッチされる多数の遺伝子（図１２Ｅ、＞２．８のエンリッチメント倍率の１６個の遺伝子、ｐ＜１０−９）、例として、眼球レンズ発生の間にＭａｆにより直接上方調節されることが公知のタンパク質のクリスタリンファミリーに属するＣｒｙｂｂ３（Ｙａｎｇ  ａｎｄ  Ｃｖｅｋｌ，２００５）、およびクリスタリンを基質として受容することが示されている別のマトリックスメタロプロテイナーゼＭｍｐ９（Ｄｅｓｃａｍｐｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｓｔａｒｃｋｘ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）を有した。第２に、本出願人らは、クラスタ２０において選択的に発現されるＰＰＰ１Ｒ１７に対する抗体により切片を染色した。クラスタ２０は、弱い低頻度のグリシントランスポーター発現を示し、グリシン作動性でもＧＡＢＡ作動性でもないｎＧｎＧニューロンのマーカーＮｅｕｒｏｄ６（Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）を発現する２つのみのクラスタ（クラスタ２１とともに）の一方である。本出願人らは、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）をｎＧｎＧアマクリン中で特異的に発現することが示されているトランスジェニック株（ＭｉｔｏＰ）を使用した（Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。ＰＰＰ１Ｒ１７は、ＭｉｔｏＰ系統の全てのＣＦＰ陽性アマクリンの８５％において染色し、これをｎＧｎＧ細胞のマーカーとして検証した。クラスタ２１における推定ｎＧｎＧアマクリンからのＰＰＰ１Ｒ１７の不存在は、これまでに考えられないレベルのｎＧｎＧアマクリン間の不均一性を示唆する。クラスタ７と同様、クラスタ２０は、それをその最近傍と区別する多数のマーカーを発現した（図１２Ｇ；＞２．８のエンリッチメント倍率の１２個の遺伝子、ｐ＜１０−９）。
【０１９９】
個々のクラスタ内の追加の細胞多様性の同定。本出願人らの教師なしクラスタリング分析は、細胞を３９個の区別される集団にグルーピングし；形態学または生理学に基づき１００個もの多くの網膜細胞タイプが存在することが提案される。したがって、本出願人らは、追加の不均一性および集団構造がクラスタ内に存在し得るか否か、および教師あり分析において可視的であるか否かを追求し；これは、より多数の細胞を用いて、または教師なしおよび既知マーカードライブ分析の組合せを用いていっそう深層の分類が可能になることを示唆する。ここで、本出願人らは、錐体光受容体および網膜神経節細胞にフォーカスした。
【０２００】
錐体。マウスは二色型色覚であり、遺伝子Ｏｐｎ１ｓｗおよびＯｐｎ１ｍｗによりそれぞれコードされる短波長（青色またはＳ−）および中波長（緑色またはＭ−）オプシンのみを有する。Ｓ−およびＭ−オプシンは背腹軸に沿って逆の勾配で発現され、特に、中心網膜中の多くの錐体はそれらのオプシンの両方を発現する（Ｓｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。ＳまたはＭ錐体を選択的にマークする他の遺伝子は同定されていない。
【０２０１】
本出願人らは、クラスタ２５をそれらのＯｐｎ１ｍｗ、Ｏｐｎ１ｓｗ、Ａｒｒ３、および他の錐体特異的遺伝子の発現により錐体として同定した。本出願人らは、Ｏｐｎ１ｓｗ（青色光感受性オプシン）のみを発現する３３６個の細胞（クラスタ２５のもの）ゲノムワイド遺伝子発現を、Ｏｐｎ１ｍｗ（緑色光感受性オプシン）のみを発現する５５１個の細胞（同一クラスタのもの）中の発現と比較した（図１２Ｈ）。８つの遺伝子が、２つの細胞集団間で少なくとも２倍だけ（およびｐ＜１０−９において）発現において異なった。１つのそのような遺伝子Ｔｈｒｂは、示差的なオプシン発現を方向付ける背腹パターン形成のキー発生調節因子の甲状腺ホルモンの受容体をコードする（Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。２つの他の遺伝子Ｓｍｕｇ１およびＣｃｄｃ１３６は、背および腹錐体中でそれぞれ濃縮されることが示されており（Ｃｏｒｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）、本出願人らのそれらのＭおよびＳ錐体への割り当てと一致する。
【０２０２】
網膜神経節細胞。網膜からの唯一の出力ニューロンクラスの網膜神経節細胞（ＲＧＣ）は、約２０個のタイプからなると考えられ、そのうちのいくつかは公知の分子マーカーを有する（Ｍａｓｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｓａｎｅｓ，２０１５）。ＲＧＣは、全体で網膜中の細胞の１％未満をなす（Ｊｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。本出願人らの４４，８０８個の細胞の分析において、本出願人らは、分析された全ての細胞の１％未満からなる単一ＲＧＣクラスタを同定した。メラノプシンをコードする遺伝子Ｏｐｎ４は、区別されるＲＧＣタイプの公知のマーカーであり（Ｈａｔｔａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）；４３２個のＲＧＣのうち、本出願人らは、Ｏｐｎ４を発現する２６個の細胞を同定した。これらの２６個の細胞は、７つの遺伝子を４０６個のＯｐｎ４−ＲＧＣが発現したよりも少なくとも２倍強力に発現し（ｐ＜１０９、図１２Ｉ）；それらの７つの遺伝子の１つのＥｏｍｅｓは、メラノプシン含有ＲＧＣの発生および維持に要求されることが近年示された（Ｍａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。
【０２０３】
ヒト骨髄細胞。ヒト骨髄細胞は、２つの前駆細胞のタイプ：リンパ幹細胞および骨髄幹細胞に分化する多能性造血幹細胞を含有する。リンパ幹細胞は前リンパ球に分化し、それがＴ、ＢおよびＮＫ細胞（すなわち、末梢血単核細胞）に発達する一方、骨髄幹細胞は３つの細胞系のタイプ：顆粒球−単球前駆細胞、赤血球前駆細胞、および巨核球に分化する。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、疾患、例えば、白血病、癌、および感染症の撲滅に関与する丸型の核を有する血液細胞からなる。Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑにより調製された４７１個の単一細胞転写プロファイルの本出願人らの分析は、造血幹細胞の公知の細胞タイプと相関する遺伝子マーカーの８つのクラスタを同定した。
【０２０４】
考察
ここで、本出願人らは、無制約数の個々の細胞のゲノムワイド発現を同時に分析するための新たな技術のＤｒｏｐ−Ｓｅｑを記載してきた。本出願人らは、最初に、インタクトヒトおよびマウス細胞の混合物をプロファイリングすることによりＤｒｏｐ−Ｓｅｑを検証した。次いで、本出願人らは、Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑを使用して名目上均一な細胞集団における細胞状態および複合組織中の細胞タイプを確認した。細胞状態を分析するため、本出願人らは、２つの種からの１，００１個の非同調的に分裂する細胞にわたり準連続時間分解能において細胞周期をプロファイリングし、進化的に保存される発現振動を有する新規細胞周期調節遺伝子を明らかにした。細胞タイプを分析するため、本出願人らは、中枢神経系の利用可能な部分のマウス網膜からの４４，８０８個の個々の細胞をプロファイリングした。本出願人らは、網膜において３９個の転写的に区別される細胞集団を同定し、それらの細胞間の新規関係を明らかにし、新たな細胞タイプ特異的マーカーをノミネートし、そのうちの２つを本出願人らが免疫組織化学により検証した。
【０２０５】
本技術の他の実施形態において、技術の適用を使用して健常状態に対して疾患状態に特異的に存在する細胞集団、細胞マーカー、または細胞集団の組合せを同定することにより疾患、例えば、癌または自己免疫疾患の新規バイオマーカーを同定することができる。
【０２０６】
さらなる適用において、Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑ技術は、疾患モデリングまたは疾患の予後診断に適用することができる。単一細胞技術を利用して病因または起源が不明な疾患を診断することができる。例えば、原発組織不明の癌は、特定の組織の細胞タイプのマーカーを発現する組織中の希少細胞を同定することにより起源組織を追跡することができる。
【０２０７】
上記のとおり、Ｄｒｏｐｑ−Ｓｅｑプロセスは、ＳＴＡＭＰ（マイクロ粒子に付着している単一細胞トランスクリプトーム）を生成する。したがって、マイクロ粒子は、細胞中に存在するｍＲＮＡの安定な記録を有し、したがって、様々な遺伝子の発現を探ることができる。例えば、Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑ技術を利用して遺伝子を迅速に並列的にシーケンシングすることができるため、ヒト身体に関連する微生物叢における表現型の差に関連するそれらの遺伝子を探ることが可能である。したがって、この技術を拡張して分子、オルガネラ、細胞断片（例えば、シナプス）、全細胞、または細胞のコレクション（すなわち、オルガノイド）を分析することができる。
【０２０８】
生物学を広く適合させ、進歩させるため、新たな技術はこれらの特徴を有すべきである。
【０２０９】
１．この新たな技術は、満たされていない科学的必要性を満たすべきである。生物学者は、細胞レベルにおける転写バリエーションを確認することにより可能とされる科学的機会を迅速に認識している。しかしながら、現在の方法は、細胞当たり＄３〜＄５０のコストにおいて１日当たり最大数百個の細胞をプロファイリングし得るにすぎない。対照的に、Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑを用いる単独科学者は、細胞当たり約６セントにつき１０，０００個のシーケンシング用単一細胞ライブラリーを完全に調製することができる。本出願人らは、容易性、速度、および低コストにより豊富な実験、慎重な複製、および多くのサイクルの実験、分析、着想、およびより多くの実験が容易になることを所望する。
【０２１０】
２．この新たな技術は、採用が容易であるべきである。技術がより簡潔であればあるほど、それをいかに良好な使用に当てはめるかを知る科学者により採用され得る見込みが大きくなる。Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑは、任意の生物学実験室が利用可能な設備、小型倒立顕微鏡およびシリンジポンプ、例えば、マイクロインジェクションに定型的に使用されるものを利用する。Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑ設定は、迅速かつ安価に構築することができる（図２１および拡張実験手順）。Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑは、２つの新規試薬：液滴調製用のマイクロ流体装置、および個々にバーコード化されるそれぞれの細胞のＲＮＡに対するビーズも使用する。本出願人らは、任意の学術的または市販のマイクロ流体工学施設において容易に構築することができる簡易でパッシブな装置になるようにマイクロ流体装置を（３０回の設計反復を通して）設計し、本出願人らは、これを可能とするためのＣＡＤファイルを提供する。本明細書に記載のバーコード化ビーズは、本論文公開時に利用可能である（拡張実験手順）。本出願人らの補足的材料は、関心を有する読者用の詳細なプロトコルを含む。
【０２１１】
３．この新たな技術は、綿密に試験して技術の利点および限界の明確な理解を提供すべきである。ここで、本出願人らは、マウスおよびヒト細胞を混合物を使用して単一細胞純度および細胞ダブレットの頻度の両方を慎重に計測した（本出願人らがこの手法で任意の単一細胞分析方針を試験することを留意する最初の作業）。本出願人らは、インプット細胞濃度を調整することにより本出願人らが２つのキー品質パラメータ（細胞−細胞ダブレットおよび汚染ＲＮＡ）をチューニングし得ること、ならびにより低い細胞濃度（依然として１時間当たり１，２００個の細胞のスループットを提供する）において、Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑがダブレットおよび純度の両方について既存の技術と好ましく同等であることを見出した。本出願人らの結果は、細胞懸濁液から単一細胞を単離する他の方法、例えば、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）またはマイクロ流体工学もダブレットおよび単一細胞不純物に脆弱であることを示唆する。本出願人らの網膜データセットの分析は、「超ハイスループット」モード（１μｌ当たり１００個の細胞、約１０％のダブレットおよび不純物割合において１時間当たり１０，０００個の細胞の処理を可能とする）において生成された相対的に不純なライブラリーであっても、リッチ、ロバストおよび生物学的に検証された細胞分類を生じさせ得るが、他の組織または適用は、より純粋なＤｒｏｐ−Ｓｅｑのモードの使用を要求し得ることを示唆する。本出願人らは、パイロット分析がＤｒｏｐ−Ｓｅｑのより高純度モードの１つから開始することを常に示唆する。
【０２１２】
単一細胞プロファイリング技術の他の主要な品質計量値は、捕捉効率である。本出願人らは、Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑの捕捉効率が、合成ＲＮＡ「スパイクイン」の分析に基づき約１２％であると推定し、本出願人らは次いで１０個の遺伝子のより高感度のデジタルＰＣＲ計測によりそれを裏付けた。過去１年間の単一細胞デジタル発現プロファイリング法の研究は、３％、３．４％、および４８％の捕捉率を報告しているが、それらの率は統一的手法で推定も訂正もされたものではなく；本出願人らは、特に保存的な推定法を選択してＤｒｏｐ−Ｓｅｑについてのその１２％の推定値を得、単一細胞ゲノミクスにおける大きい必要性が、統一的比較方針および計量値のためのものであることを示唆する。本出願人らの網膜の分析は、それぞれ細胞のトランスクリプトームの約１２％のみの捕捉（およびそれ未満のシーケンシング）が、わずかな細胞タイプの差（例えば、２１個のアマクリン細胞集団間）の認識も可能とし得ることを示し；これは、近年の３０１個の皮質細胞の研究（Ｐｏｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）において提案される着想に広がる。非常に多くの細胞を分析する能力は、他の点で理解困難な生物学的パターンを解明するために役立ち得る。なぜなら、それらのパターンは、次いで、単一細胞レベルにおいて存在する生物学的、技術的および統計的サンプリングノイズを克服する手法で多数の分析細胞にわたり共有されるためである。
【０２１３】
Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑデータの教師なしコンピュータ分析は、３９個の転写的に区別される網膜細胞集団を同定し；既に検証されたマーカーの発現に基づき、全ての集団は、公知の細胞クラスに属することが判明し、ほとんどが公知または仮定網膜細胞タイプおよびサブタイプに対応すると考えられた（図１１および１２）。クラスタおよびタイプ間の対応の確立が多くの場合において直接的であるのは、網膜の特定の強度であり；分類は、そのような検証を可能とするほど脳のほとんどの他の部分において十分に先に進行しておらず、したがって、網膜のような組織における初期検証が極めて重要であった。これらの細胞集団の多く（特にアマクリンクラス内のもの）は、形態学および生理学によってのみ既に同定された細胞についての新たな区別マーカーをノミネートした。
【０２１４】
多くの興味深い疑問が、トランスクリプトミクスデータからの細胞タイプの定義に存在する。例えば、２つの細胞群を区別されるタイプとする明確な発現閾値が常に存在するか、または区別は段階的および連続的であるか。より重要なことには、いかに細胞集団間の転写差が解剖学的および生理学的な差を生じさせるか。Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑにより実行されるスループットは、十分数のプロファイルを提供して希少細胞タイプにおける発現のパターンも認識することにより全組織においてそのような疑問の包括的な対処を可能とし得る。
【０２１５】
本出願人らは、細胞タイプおよび細胞状態の同定に加え、生物学におけるＤｒｏｐ−Ｓｅｑの多くの他の重要な適用を把握する。ゲノムスケール遺伝学研究は、遺伝子変異が疾患リスクに寄与する多数の遺伝子を同定しており；しかし、生物学は、遺伝子を特異的細胞集団およびそれらのユニーク機能応答に結びつける同様にハイスループットの手法を欠落している。非常に多くの遺伝子の細胞部位および生物学的活性を見出すことは、遺伝学の進歩が生物学的洞察をもたらすために重要である。ハイスループット単一細胞トランスクリプトミクスは、リスク遺伝子の発現を特異的細胞タイプに局在化し得、遺伝子摂動とともに、それぞれの遺伝子を（ｉ）ほとんどがそれらの遺伝子の損失または摂動により影響を受ける細胞タイプ；および（ｉｉ）そのような摂動により誘発される細胞状態の変更に体系的に関連づけるのにも役立ち得る。このようなアプローチは、ハイスループット遺伝子発見から（獲得困難な）ヒト疾患の病因に関する現実の洞察までの困難なギャップを交差させるのに役立ち得る（ＭｃＣａｒｒｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。
【０２１６】
Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑを追加の摂動（例えば、小分子、突然変異（天然または遺伝子操作）、病原体、または他の刺激）に連結させることを使用して多くの種類の細胞に関する摂動の影響の情報豊富な多次元リードアウトを生成することができる。突然変異の効果を研究する場合、例えば、Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑは、同一の突然変異が細胞自律および細胞非自律方式の両方で多くの細胞タイプに影響する方式を同時に明らかにし得る。
【０２１７】
遺伝子発現の機能的意味は、単に遺伝子またはコードされるタンパク質の固有の特性の産物であるだけでなく、遺伝子が発現される細胞レベルコンテクスト全体の産物でもある。本出願人らは、Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑが多くの生物学の分野においてそのような関係の大量かつ定型的な発見を可能とすることを所望する。
【０２１８】
実験手順
装置組立。マイクロ流体装置はＡｕｔｏＣＡＤソフトウェア（Ａｕｔｏｄｅｓｋ，Ｉｎｃ．）を使用して設計し、コンポーネントはＣＯＭＳＯＬ  Ｍｕｌｔｉｐｈｙｓｉｃｓ（ＣＯＭＳＯＬ  Ｉｎｃ．）を使用して試験した。ＣＡＤファイルも補足として利用可能である。
【０２１９】
装置は、既に記載（Ｍａｚｕｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；ＭｃＤｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）のとおりエポキシベースフォトレジストＳＵ８をマスターとして使用するレプリカ成形を介して生体適合性ケイ素ベースポリマーのポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を使用して組み立てた。次いで、チャネルに通してＡｑｕａｐｅｌ（Ｒｉｄｅｒ，ＭＡ，ＵＳＡ）中で流動させ、加圧空気中で流動させることにより過剰の流体を乾燥除去し、装置を６５℃において１０分間ベーキングすることによりＰＤＭＳ装置を疎水性とした。
【０２２０】
バーコード化マイクロ粒子合成。ビーズ官能化および逆方向ホスホラミダイト合成は、Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ  Ｃｏｒｐ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）により実施した。「スプリットアンドプール」サイクルは、カラムから乾燥樹脂を取り出し、手作業で混合し、４つの等しい部分を秤量してから、追加の合成サイクル用の樹脂に戻すことにより達成した。十分な詳細（ビーズの利用可能性を含む）は、拡張実験手順に記載される。
【０２２１】
Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑ手順。プロトコルの完全な綿密な記載、例として、全ての試薬についての組成およびカタログ番号は、拡張実験手順に見出すことができる。手短に述べると、上記の同時流動マイクロ流体装置を使用して約１ｎＬサイズの液滴を生成し、その中で溶解緩衝液中で懸濁しているバーコード化マイクロ粒子を単一細胞懸濁液の速度と等しい速度において流動させ、その結果、液滴を等量のそれぞれの成分から構成させた。液滴生成の完了直後、液滴を３０ｍＬの６×ＳＳＣ中でペルフルオロオクタノールにより破壊した。大量水性物の液滴への添加は、液滴破壊後のハイブリダイゼーションイベントを低減させる。なぜなら、ＤＮＡ塩基対合は二次速度論に従うためである（Ｂｒｉｔｔｅｎ  ａｎｄ  Ｋｏｈｎｅ，１９６８；Ｗｅｔｍｕｒ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄｓｏｎ，１９６８）。次いで、ビーズを洗浄し、逆転写酵素ミックス中で再懸濁させた。２５℃における３０分間および４２℃における９０分間のインキュベーション後、ビーズを洗浄し、エキソヌクレアーゼＩミックス中で再懸濁させ、３７℃において４５分間インキュベートした。ビーズを洗浄し、カウントし、ＰＣＲチューブ中にアリコート化し、ＰＣＲ増幅させた（詳細については、拡張実験手順参照）。ＰＣＲ反応物を精製し、プールし、増幅されたｃＤＮＡをＢｉｏＡｎａｌｙｓｉｓ  Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｃｈｉｐ（Ａｇｉｌｅｎｔ）上で定量した。３’末端のみの特異的増幅を可能とするカスタムプライマーを使用するＮｅｘｔｅｒａ  ＸＴ  ＤＮＡ試料調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用するシーケンシングのために、３’末端を断片化し、増幅させた（表９）。ライブラリーを精製し、Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｃｈｉｐ上で定量し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＮｅｘｔＳｅｑ  ５００上でシーケンシングした。反応条件、使用プライマー、およびシーケンシング仕様に関する全ての詳細は、拡張実験手順に見出すことができる。
【０２２２】
デジタル発現レベルのアラインメントおよび推定。未加工シーケンシングデータをフィルタリングし、アダプターおよびポリＡトリミングし、網膜実験のためにマウス（ｍｍ１０）ゲノムまたは組合せマウス（ｍｍ１０）−ヒト（ｈｇ１９）大規模参照配列のいずれかに対してＳＴＡＲ  ｖ２．４．０（Ｄｏｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）を使用してアラインした。同一の細胞バーコードを有する全てのリードを一緒にグルーピングし、ＥＤ＝１以内のＵＭＩを用いて同一遺伝子に対してアラインする同一細胞からのリードをマージした。それぞれの細胞に対して、それぞれ遺伝子について、ユニークＵＭＩをカウントし；次いでこのカウントをデジタル発現行列中に配置した。行列を細胞当たりの全てのＵＭＩの合計ごとに順序付け、累積合計プロットを作成した。本出願人らは、第１の変曲点を推定することによりＳＴＡＭＰの数を決定し（図１４Ｂ）、本出願人らはそれが推定数の増幅ＳＴＡＭＰに常に近いことを実験的に見出した。追加の詳細は、拡張実験手順に見出すことができる。
【０２２３】
ＨＥＫおよび３Ｔ３細胞の細胞周期分析。ＨｅＬａ細胞周期の５つの時期（Ｇ１／Ｓ、Ｓ、Ｇ２／Ｍ、ＭおよびＭ／Ｇ１）を反映する遺伝子セットを、Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）から入手し、一部修正した（拡張実験手順）。５つ全ての時期にわたり、それぞれの遺伝子セットにおける遺伝子の平均化正規化発現レベル（ｌｏｇ２（ＴＰＭ＋１））を使用して時期特異的スコアをそれぞれの細胞について生成した。次いで、細胞当たりのそれらの５つの時期スコアのパターンを比較することにより細胞を細胞周期に沿って順序付けた。細胞周期調節遺伝子を同定するため、本出願人らは、スライディングウィンドウアプローチを使用し、順序付けした細胞およびシャッフルした細胞の両方について最大および最小平均発現のウィンドウを同定して偽発見率を評価した。十分な詳細は、拡張実験手順に見出すことができる。
【０２２４】
全網膜懸濁液の生成。懸濁液は、既に記載の方法（Ｂａｒｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）を適合させることにより１４日齢（Ｐ１４）Ｃ５７ＢＬ／６マウスの網膜から調製した。追加の詳細については、拡張実験手順を参照されたい。
【０２２５】
網膜データの主成分およびクラスタリング分析。最初に、４９，３００個の細胞データセットの１３，１５５個の細胞「トレーニングセット」に対して＞９００個の遺伝子を有する単一細胞ライブラリーを使用して主成分分析（ＰＣＡ）を実施した。本出願人らは、それらのアプローチが、希少細胞タイプに対応する構造の発見において、多数の小型桿体光受容体に偏る完全データセットに対するＰＣＡの実施よりも有効であること見出した（拡張実験手順）。このトレーニングセット内の有意な変動性または構造のいずれかを示した３８４個の遺伝子を使用して主成分（ＰＣ）を学習させた。並べ替え検定を使用して３２個の統計的に有意なＰＣを同定し、修正リサンプリング手順（Ｃｈｕｎｇ  ａｎｄ  Ｓｔｏｒｅｙ，２０１４）を使用して独立して確認した。網膜中の細胞タイプの組織化を可視化するため、本出願人らは、トレーニングセット内の個々の細胞をそれらのスコアに基づき、ｔ分布型確率的近傍埋め込み（ｔ−ＳＮＥ）（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍａａｔｅｎ  ａｎｄ  Ｈｉｎｔｏｎ，２００８）を使用して単一二次元マップ上に有意なＰＣに沿って射影した。次に、残りの３６，１４５個の単一細胞ライブラリー（＜９００個の検出遺伝子）を、トレーニングセットのＰＣ部分空間内のそれらの表示に基づきこのｔＳＮＥマップ上に射影した（Ｂｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｓｈｅｋｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。このアプローチは、遺伝子ドロップアウトに起因する低い複雑性のライブラリーのノイジーな変動の影響を軽減し、本出願人らが所与のクラスタからの全ての細胞をｔＳＮＥから保留し、次いでそれらの射影を試みる場合にそれらの保留された細胞は射影により別のクラスタに誤って割り当てられなかったという意味においても信頼性がある（表１０）。さらに、細胞は、１０個未満の細胞の類似度に基づき射影させなかった（拡張実験手順参照）。ｔ−ＳＮＥマップ上の点群は細胞タイプを表し、密度クラスタリング（Ｅｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）は、大小のクラスタの両方を定義するための２つのパラメータセットを使用してそれらの領域を同定した。次いで、示差的発現試験（ＭｃＤａｖｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）を使用してクラスタが互いに区別されることを確認した。ユークリッド距離および完全連鎖に基づく階層クラスタリングを使用してクラスタに関連するツリーを構築した。本出願人らは、別の網膜細胞遺伝子発現研究（Ｓｉｅｇｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）においてなされた観察の、全ての細胞クラスタ中のいくつかの桿体特異的遺伝子、例えば、ＲｈｏおよびＮｒｌの発現に留意した。これは、細胞懸濁液調製の間のそれらの高存在量転写物の可溶化から生じる可能性が高い。網膜細胞データ分析に関する追加の情報は、拡張実験手順に見出すことができる。
【０２２６】
実施例３
実施例２についての拡張実験手順
ビーズ合成。ビーズ官能化および逆方向ホスホラミダイト合成（５’から３’）は、Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ  Ｃｏｒｐにより実施した。Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−６５Ｓ樹脂（３０ミクロン平均粒子直径）をＴｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｉｎｃ．から購入し、表面アルコールをＰＥＧ誘導体により官能化して１８炭素長のフレキシブル鎖リンカーを生成した。次いで、１０マイクロモルサイクルスケールおよび３分間のカップリング時間におけるＤＮＡ合成を使用するＥｘｐｅｄｉｔｅ  ８９０９ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置上での逆方向ホスホラミダイト合成（５’→３’）のための固体担体として官能化ビーズを使用した。使用されるアミダイトは、以下のものであった：Ｎ６−ベンゾイル−３’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−デオキシアデノシン−５’−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−ホスホラミダイト（ｄＡ−Ｎ６−Ｂｚ−ＣＥＰ）；Ｎ４−アセチル−３’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−デオキシ−シチジン−５’−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−ホスホラミダイト（ｄＣ−Ｎ４−Ａｃ−ＣＥＰ）；Ｎ２−ＤＭＦ−３’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−デオキシグアノシン−５’−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−ホスホラミダイト（ｄＧ−Ｎ２−ＤＭＦ−ＣＥＰ）；および３’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−デオキシチミジン−５’−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−ホスホラミダイト（Ｔ−ＣＥＰ）。無水酢酸およびＮ−メチルイミダゾールをキャッピングステップにおいて使用し；エチルチオ−テトラゾールを活性化ステップにおいて使用し；ヨウ素を酸化ステップにおいて使用し、ジクロロ酢酸を脱ブロッキングステップにおいて使用した。１２回のスプリットアンドプールホスホラミダイト合成サイクルのそれぞれの後、ビーズを合成カラムから取り出し、プールし、手作業で混合し、４つの質量が等しい部分に分配し；次いでそれらのビーズアリコートを別個の合成カラム中で配置し、ｄＧ、ｄＣ、ｄＴ、またはｄＡホスホラミダイトのいずれかと反応させた。このプロセスを、合計で４＾１２＝１６，７７７，２１６個のユニークバーコード配列について１２回繰り返した。使用されるバーコード化ビーズ配列に関する完全な詳細についてである。
【０２２７】
細胞培養。ヒト２９３Ｔ細胞およびネズミＮＩＨ／３Ｔ３細胞を購入した。２９３Ｔおよび３Ｔ３細胞を、１０％のＦＢＳおよび１％のペニシリン−ストレプトマイシンが補給されたＤＭＥＭ中で増殖させた。
【０２２８】
細胞を３０〜６０％のコンフルエンスに増殖させ、ＴｒｙｐＬＥにより５分間処理し、等容量の増殖培地によりクエンチし、３００×ｇにおいて５分間スピンダウンした。上清を除去し、細胞を１ｍＬの１×ＰＢＳ＋０．２％のＢＳＡ中で再懸濁させ、３００×ｇにおいて３分間再スピンした。上清を再度除去し、細胞を１ｍＬの１×ＰＢＳ中で再懸濁させ、４０ミクロンのセルストレーナーに通し、カウントした。Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑのため、細胞を１×ＰＢＳ＋２００μｇ／ｍＬのＢＳＡ中で最終濃度に希釈した。
【０２２９】
全網膜懸濁液の生成。ラット網膜から網膜神経節細胞を精製する既に記載の方法（Ｂａｒｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）を適合させることにより、Ｐ１４マウス網膜から単一細胞懸濁液を調製した。手短に述べると、マウス網膜をパパイン溶液（４０Ｕのパパイン／１０ｍＬのＤＰＢＳ）中で４５分間消化した。次いで、パパインをトリプシン阻害剤溶液（ＤＰＢＳ中０．１５％のオボムコイド）中で中和し、組織を粉砕して単一細胞懸濁液を生成した。粉砕後、細胞をペレット化し、再懸濁させ、細胞懸濁液を２０μｍのＮｉｔｅｘメッシュフィルターに通して濾過していかなる塊状細胞も排除し、次いでこの懸濁液をＤｒｏｐ−Ｓｅｑに使用した。次いで、細胞をＤＰＢＳ＋０．２％のＢＳＡ中で２００個の細胞／μｌ（レプリケート１〜６）または３０個の細胞／μｌ（レプリケート７）のいずれかに希釈した。
【０２３０】
Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑを通して網膜懸濁液を４日に分けて処理した。１つのライブラリーを１日目に調製し（レプリケート１）；２つのライブラリーを２日目に調製し（レプリケート２および３）；３つのライブラリーを３日目に調製し（レプリケート４〜６）；１つのライブラリーを４日目に調製した（レプリケート７、高純度）。レプリケート４〜６に、ヒトＨＥＫ細胞を１個の細胞／μｌ（０．５％）の濃度においてスパイクインしたが、網膜データの広範な細胞サイズにより、交差種比較法を使用して単一細胞純度もダブレットも較正することができなかった。７つのレプリケートのそれぞれを別個にシーケンシングした。
【０２３１】
Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑ
ビーズの調製。ビーズ（Ｂａｒｃｏｄｅｄ  Ｂｅａｄ  ＳｅｑＡまたはＢａｒｃｏｄｅｄ  Ｂｅａｄ  ＳｅｑＢのいずれか；表９および拡張実験手順最後の注釈参照）を、３０ｍＬの１００％のＥｔＯＨにより２回洗浄し、３０ｍＬのＴＥ／ＴＷ（１０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１％のＴｗｅｅｎ）により２回洗浄した。ビーズペレットを１０ｍＬのＴＥ／ＴＷ中で再懸濁させ、１００μｍフィルターに通して４℃における長期保存のために５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブ中に入れた。ＩＮＣＹＴＯから購入したフックスローゼンタール細胞カウンターを使用してビーズの原液濃度（ビーズ／μＬ）を評価した。Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑのため、ビーズのアリコートを原液チューブから取り出し、５００μＬのＤｒｏｐ−Ｓｅｑ溶解緩衝液（ＤＬＢ、２００ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．５、６％のＦｉｃｏｌｌ  ＰＭ−４００、０．２％のサルコシル、２０ｍＭのＥＤＴＡ）により洗浄し、次いで１００個のビーズ／μＬのビーズ濃度に適切な容量のＤＬＢ＋５０ｍＭのＤＴＴ中で再懸濁させた。
【０２３２】
液滴生成。６．４ｍｍ磁性撹拌板を含有する３ｍＬのプラスチックシリンジ中に２つの水性懸濁液（単一細胞懸濁液およびビーズ懸濁液）をロードした。液滴生成油を１０ｍＬのプラスチックシリンジ中にロードした。３つのシリンジを０．３８ｍｍ内径のポリエチレンチューブにより１２５μｍの同時流動装置に接続し（図１５Ａ）、シリンジポンプを使用してそれぞれの水性懸濁液について４．１ｍＬ／時間、および油について１４ｍＬ／時間の流速において注入し、それぞれ約１ナノリットルの容量を有する約１２５μｍのエマルジョンドロップをもたらした。動画作成のため、流動を光学顕微鏡下で１０倍の倍率において可視化し、ＦＡＳＴＣＡＭ  ＳＡ５カラーカメラを使用して毎秒約１０００〜２０００フレームにおいてイメージングした。液滴を５０ｍＬのｆａｌｃｏｎチューブ中で回収し；コレクションチューブを１ｍＬの合わせた水性流動容量ごとに交換して液滴破壊時の溶液中の可溶性ＲＮＡの量を低減させた。
【０２３３】
液滴生成の間、連続的で穏やかな磁性撹拌によりビーズを懸濁液中で保持した。明視野照明を用いて光学顕微鏡下で液滴のアリコートを観察することにより、液滴サイズの均一性およびビーズの占有率を評価し；それぞれの実験において、ビーズ占有液滴の９５％超が単一ビーズのみを含有した。
【０２３４】
液滴破壊。それぞれの液滴のアリコートの底部からの油をＰ１０００ピペットにより除去し、その後に３０ｍＬの室温における６×ＳＳＣを添加した。液滴を破壊するため、本出願人らは、６００μＬのペルフルオロ−１−オクタノールを添加し、チューブを手で約２０秒間激しく振動させた。次いで、チューブを１０００×ｇにおいて１分間遠心分離した。アニールしたｍＲＮＡがビーズから解離する見込みを低減させるため、試料を残りの破壊プロトコルの間氷上で保持した。上清を油−水性界面のほぼ５ｍＬ上まで除去し、ビーズを追加の３０ｍＬの室温６×ＳＳＣにより洗浄し、水層を新たなチューブに移し、再度遠心分離した。上清を除去し、ビーズペレットを非付着性１．５ｍＬの微小遠心チューブに移した。次いで、ペレットを１ｍＬの室温６×ＳＳＣにより２回洗浄し、３００μＬの５×Ｍａｘｉｍａ  Ｈ−ＲＴ緩衝液（ＥＰ０７５１）により１回洗浄した。
【０２３５】
逆転写およびエキソヌクレアーゼＩ処理。９０，０００個のビーズのペレットに２００μＬのＲＴミックスを添加し、室温ミックスは１×Ｍａｘｉｍａ  ＲＴ緩衝液、４％のＦｉｃｏｌｌ  ＰＭ−４００、１ｍＭのｄＮＴＰ、１Ｕ／μＬのＲｎアーゼインヒビター、２．５μＭのＴｅｍｐｌａｔｅ＿Ｓｗｉｔｃｈ＿Ｏｌｉｇｏ（表９）、および１０Ｕ／μＬのＭａｘｉｍａ  Ｈ−ＲＴを含有した。Ｆｉｃｏｌｌを含めて沈降を低減させ、それはＲＴ効率を改善するその能力のためでもあった（Ｌａｒｅｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。ビーズを室温において３０分間インキュベートし、次いで４２℃において９０分間インキュベートした。次いで、ビーズを１ｍＬの１×ＴＥ＋０．５％のドデシル硫酸ナトリウムにより１回洗浄し、１ｍＬのＴＥ／ＴＷにより２回洗浄し、１０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．５により１回洗浄した。次いで、ビーズペレットを、１×エキソヌクレアーゼＩ緩衝液および１Ｕ／μＬのエキソヌクレアーゼＩを含有する２００μＬのエキソヌクレアーゼＩミックス中で再懸濁させ、３７℃において４５分間インキュベートした。
【０２３６】
次いで、ビーズを１ｍＬのＴＥ／ＳＤＳにより１回、１ｍＬのＴＥ／ＴＷにより２回、１ｍＬのｄｄＨ２Ｏにより１回洗浄し、ｄｄＨ２Ｏ中で再懸濁させた。ビーズ濃度は、フックスローゼンタール細胞カウンターを使用して決定した。１×Ｈｉｆｉ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  Ｒｅａｄｙｍｉｘおよび０．８μＭのＴｅｍｐｌａｔｅ＿Ｓｗｉｔｃｈ＿ＰＣＲプライマーを使用して５０μＬの容量においてＰＣＲにより１０００個のビーズのアリコートを増幅させた（表９）。
【０２３７】
アリコートを以下のとおりサーモサイクリング処理した：９５℃において３分間；次いで以下の４サイクル：９８℃において２０秒間、６５℃において４５秒間、７２℃において３分間；次いで以下のＸサイクル：９８℃において２０秒間、６７℃において２０秒間、７２℃において３分間；次いで、５分間の最終伸長ステップ。培養細胞を使用するヒト−マウス実験についてＸは８サイクルであり；解離網膜時間についてＸは９サイクルであった。アリコートのペアをＰＣＲ後に一緒にプールし、０．６ｘ  Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズにより製造業者の説明書に従って精製し、１０μＬのＨ２Ｏ中で溶出させた。アリコートを、シーケンシングすべきＳＴＡＭＰの数に従ってプールし、プールの濃度をＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ  Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｃｈｉｐ上で定量した。
【０２３８】
シーケンシング用Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑ  ｃＤＮＡライブラリーの調製。シーケンシング用３’末端ｃＤＮＡ断片を調製するため、それぞれの試料の６００ｐｇのｃＤＮＡの４つのアリコートをインプットとして標準的なＮｅｘｔｅｒａ  ＸＴタグメンテーション反応において使用し、製造業者の説明書に従って実施し、但し、２００ｎＭのカスタムプライマーＰ５＿ＴＳＯ＿ＨｙｂｒｉｄおよびＮｅｘｔｅｒａ＿Ｎ７０１（表９）を、キット提供オリゴヌクレオチドに代えて使用した。次いで、試料を以下のとおり増幅させた：９５℃において３０秒間；９５℃において１０秒間、５５℃において３０秒間、７２℃において３０秒間の１１サイクル；次いで、７２℃において５分間の最終伸長ステップ。
【０２３９】
４つのアリコートのペアを一緒にプールし、次いで０．６×Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ  Ｂｅａｄｓを製造業者の説明書に従って使用して精製し、１０μＬの水中で溶出させた。２つの１０μＬのアリコートを一緒に合わせ、ＢｉｏＡｎａｙｚｅｒ  Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｃｈｉｐを使用して濃度を決定した。シーケンシングされるライブラリーの平均サイズは、４５０および６５０ｂｐであった。
【０２４０】
ライブラリーをＩｌｌｕｍｉｎａ  ＮｅｘｔＳｅｑ上で、リード１のプライミングのために３ｍＬの容量の４．６７ｐＭのＨＴ１、および３ｍＬの０．３μＭのＲｅａｄ１ＣｕｓｔＳｅｑＡまたはＲｅａｄ１ＣｕｓｔＳｅｑＢ（表９および拡張実験手順の最後の注釈参照）を使用してシーケンシングした。リード１は２０ｂｐ（塩基１〜１２が細胞バーコード、塩基１３〜２０がＵＭＩ）であり；リード２（ペアードエンド）は、ヒト−マウス実験について５０ｂｐ、網膜実験について６０ｂｐであった。
【０２４１】
種汚染実験。ＳＴＡＭＰライブラリーの種外汚染（図１５Ｅ）の起源を決定するため、本出願人らは、（１）１００個の細胞／μＬの濃度のＨＥＫ／３Ｔ３細胞懸濁液混合物を用いて完全に上記のとおりＤｒｏｐ−Ｓｅｑを実施し（対照実験）；（２）ＨＥＫおよび３Ｔ３細胞を別個にそれぞれ１００個の細胞／μＬの濃度において用いてマイクロ流体同時流動ステップを実施し、次いで液滴を混合してから破壊し；（３）ＨＥＫおよび３Ｔ３細胞を別個に用いてエキソヌクレアーゼ消化を通してＳＴＡＭＰ生成を実施し、次いで等数のＳＴＡＭＰを混合してからＰＣＲ増幅させた。単一の１０００個のマイクロ粒子アリコートを３つの条件のそれぞれについて増幅させ、次いで精製し、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ  Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ＤＮＡチップ上で上で定量した。６００ｐｇのそれぞれのライブラリーを、上記の単一のＮｅｘｔｅｒａタグメンテーション反応において使用し、但し、３つのライブラリーのそれぞれをプライマーＮｅｘｔｅｒａ＿Ｎ７０１（条件１）、Ｎｅｘｔｅｒａ＿Ｎ７０２（条件２）、またはＮｅｘｔｅｒａ＿Ｎ７０３（条件３）により個々にバーコード化し、合計で１２回のＰＣＲサイクルを１１回に代えてＮｅｘｔｅｒａ  ＰＣＲにおいて使用した。得られたライブラリーをＨｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ＤＮＡチップ上で定量し、０．５μＭのＲｅａｄ１ＣｕｓｔＳｅｑＡをリード１用カスタムプライマーとして使用してＭｉＳｅｑ上で２５ｐＭの濃度においてランさせた。
【０２４２】
可溶性ＲＮＡ実験。プライマーアニーリング部位の数を定量するため、２０，０００個のビーズを１０μＭのポリアデニル化合成ＲＮＡ（ｓｙｎＲＮＡ、表９）と２×ＳＳＣ中で室温において５分間インキュベートし、２００μＬのＴＥ−ＴＷにより３回洗浄し、次いで１０μＬのＴＥ−ＴＷ中で再懸濁させた。次いで、ビーズを６５℃において５分間インキュベートし、１μＬの上清をＮａｎｏｄｒｏｐ  ２０００上での分光光度分析用に取り出した。濃度を、同一の手法で処理されたが、ｓｙｎＲＮＡを添加しなかったビーズと比較した。
【０２４３】
ビーズ結合プライマーが逆転写し得るか否かを決定するため、およびビーズ表面上の細胞バーコード配列の均一性を計測するため、ビーズをＴＥ−ＴＷにより洗浄し、１００個／μＬの濃度において上記の逆転写酵素ミックスに添加した。次いで、このミックスを標準Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑ１２０ミクロン同時流動装置中に、１×ＰＢＳ＋０．０２％のＢＳＡ中２００ｎＭのＳｙｎＲＮＡと同時流動させた。液滴を回収し、４２℃において３０分間インキュベートした。１５０μＬの５０ｍＭのＥＤＴＡをエマルジョンに添加し、次いで１２μＬのペルフルオロオクタン酸を添加してエマルジョンを破壊した。ビーズを１ｍＬのＴＥ−ＴＷ中で２回洗浄し、次いでＨ２Ｏ中で１回洗浄し、次いでＴＥ中で再懸濁させた。１×Ｋａｐａ  ＨｉＦｉ  Ｈｏｔｓｔａｒｔ  ＰＣＲマスターミックス、４００ｎＭのＰ７−ＴＳＯ＿Ｈｙｂｒｉｄ、および４００ｎＭのＴｒｕＳｅｑ＿Ｆ（表９）を含有する５０μＬのＰＣＲミックス中に１１個のビーズを、顕微鏡下で手摘みした。ＰＣＲ反応を以下のとおりサイクル処理した：９８℃において３分間；以下の１２サイクル；９８℃において２０秒間、７０℃において１５秒間、７２℃において１分間；次いで、５分間の最終７２℃インキュベーション。得られたアンプリコンをＺｙｍｏ  ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ  ５カラム上で精製し、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ  Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｃｈｉｐ上でランさせて濃度を推定した。次いで、アンプリコンを２ｎＭに希釈し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ上でシーケンシングした。標準Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕＳｅｑプライマーを使用してプライミングされるリード１は、ＳｙｎＲＮＡ上の２０ｂｐの分子バーコードであった一方、ＣｕｓｔＳｙｎＲＮＡＳｅｑを用いてプライミングされるリード２は、１２ｂｐの細胞バーコードおよび８ｂｐのＵＭＩを含有した。
【０２４４】
Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑの効力を推定するため、本出願人らは、外部ＲＮＡのセットを使用した。本出願人らは、ＥＲＣＣスパイクインを１×ＰＢＳ＋１Ｕ／μＬのＲＮアーゼインヒビター＋２００μｇ／ｍＬのＢＳＡ（ＮＥＢ）中０．３２％の原液に希釈し、これをＤｒｏｐ−Ｓｅｑプロトコルにおける細胞流動に代えて使用し、そうしてそれぞれのビーズをナノリットル液滴当たり約１００，０００個のＥＲＣＣｍＲＮＡ分子とインキュベートした。ＥＲＣＣ単独参照配列に対するアラインメントと比較してＳＴＡＲにより報告されるＥＲＣＣ転写物に対する低品質アラインメントの数を大幅に低減させる「おとり」としてヒト配列を使用して配列リードを二重ＥＲＣＣ−ヒト（ｈｇ１９）参照配列に対してアラインした。
【０２４５】
標準ｍＲＮＡ−ｓｅｑ。Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑ平均発現データを標準ｍＲＮＡｓｅｑデータと比較するため、本出願人らは、本出願人らが５５０個のＳＴＡＭＰを調製およびシーケンシングもした３Ｔ３細胞からの１．８１５ｕｇの精製ＲＮＡを使用した。このＲＮＡをＴｒｕＳｅｑ  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｍＲＮＡ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎキットにおいて製造業者の説明書に従って使用した。ＮｅｘｔＳｅｑ  ５００シーケンシングのため、０．７２ｐＭのＤｒｏｐ−Ｓｅｑライブラリーを、０．４８ｐＭのｍＲＮＡｓｅｑライブラリーと合わせた。
【０２４６】
溶液中テンプレートスイッチ増幅。Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑ平均発現データを、標準的な溶液中テンプレートスイッチ増幅アプローチにより調製されたｍＲＮＡｓｅｑライブラリーと比較するため、本出願人らが５５０個のＳＴＡＭＰを調製およびシーケンシングもした３Ｔ３細胞からの５ｎｇの精製ＲＮＡを２．７５μｌのＨ２Ｏ中で希釈した。このＲＮＡに、１μｌの１０μＭのＵＭＩ＿ＳＭＡＲＴｄＴプライマーを添加し（表９）、７２℃に加熱し、次いで４℃において１分間インキュベートし、その後に本出願人らは、２μｌの２０％のＦｉｃｏｌｌ  ＰＭ−４００、２μｌの５×ＲＴ緩衝液（Ｍａｘｉｍａ  Ｈ−キット）、１μｌの１０ｍＭのｄＮＴＰ、０．５μｌの５０μＭのＴｅｍｐｌａｔｅ＿Ｓｗｉｔｃｈ＿Ｏｌｉｇｏ（表９）、および０．５μｌのＭａｘｉｍａ  Ｈ−ＲＴを添加した。ＲＴを４２℃において９０分間インキュベートし、次いで８５℃において５分間熱不活化させた。ＲＮアーゼカクテル（０．５μｌのＲＮアーゼＩ、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｎ６９０１Ｋ、および０．５μｌのＲＮアーゼＨ）を添加してテンプレートスイッチオリゴから末端リボＧを除去し、試料を３７℃において３０分間インキュベートした。次いで、０．４μｌのＭ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ＿Ｓｗｉｔｃｈ＿ＰＣＲプライマーを、２５μｌの２×Ｋａｐａ  Ｈｉｆｉスーパーミックス、および１３．６μｌのＨ２Ｏとともに添加した。試料を以下のとおりサイクル処理した：９５℃において３分間；以下の１４サイクル：９８℃において２０秒間、６７℃において２０秒間、および７２℃において３分間；次いで、７２℃において５分間。試料を０．６  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズにより製造業者の説明書に従って精製し、１０μｌで溶出させた。６００ｐｇの増幅ｃＤＮＡをＮｅｘｔｅｒａ  ＸＴ反応においてインプットとして使用した。０．６ｐＭのライブラリーをＮｅｘｔＳｅｑ  ５００上でシーケンシングし、３つの他の試料と多重化し；Ｒｅａｄ１ＣｕｓｔＳｅｑＢを使用してリード１をプライミングした。
【０２４７】
液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）実験。Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑの効率を定量するため、Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑと同一方式で調製された５０，０００個のＨＥＫ細胞をペレット化し、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｋｉｔを製造業者のプロトコルに従って使用してＲＮＡを精製した。ＲＴ−ｄｄＰＣＲスーパーミックス、および遺伝子プライマー−プローブセットを含有するＲＴ−ｄｄＰＣＲ反応物中の１マイクロリットル当たり１細胞当量の最終濃度に、溶出させたＲＮＡを希釈した。ＢｉｏＲａｄ  ｄｄＰＣＲ液滴生成系を使用して液滴を産生し、製造業者の推奨プロトコルを用いてサーモサイクリング処理し、液滴蛍光をＢｉｏＲａｄ  ＱＸ１００液滴リーダー上で分析した。ＲＮＡの濃度および信頼区間を、ＢｉｏＲａｄ  ＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェアによりコンピュータ計算した。５０，０００個のＨＥＫ細胞の３つのレプリケートを並列的に精製し、それぞれのレプリケートにおけるそれぞれの遺伝子の濃度を２つの独立した時点において計測した。使用プローブは、以下のものであった：ＡＣＴＢ（ｈｓ０１０６０６６５＿ｇ１）、Ｂ２Ｍ（ｈｓ００９８４２３０＿ｍ１）、ＣＣＮＢ１（ｍｍ０３０５３８９３）、ＥＥＦ２（ｈｓ００１５７３３０＿ｍ１）、ＥＮＯ１（ｈｓ００３６１４１５＿ｍ１）、ＧＡＰＤＨ（ｈｓ０２７５８９９１＿ｇ１）、ＰＳＭＢ４（ｈｓ０１１２３８４３＿ｇ１）、ＴＯＰ２Ａ（ｈｓ０１０３２１３７＿ｍ１）、ＹＢＸ３（ｈｓ０１１２４９６４＿ｍ１）、およびＹＷＨＡＨ（ｈｓ００６０７０４６＿ｍ１）。
【０２４８】
Ｄｒｏｐ−ＳｅｑのＲＮＡハイブリダイゼーション効率を推定するため、ヒト脳全ＲＮＡを２０μｌの容量中で４０ｎｇ／μｌに希釈し、２，０００個のビーズ／μｌの濃度においてＤｒｏｐ−Ｓｅｑ溶解緩衝液（ＤＬＢ、下記の組成）中で再懸濁させた２０μｌのバーコード化プライマービーズと合わせた。溶液を回転させながら１５分間インキュベートし、次いでスピンダウンし、上清を新たなチューブに移した。ビーズを１００μｌの６×ＳＳＣにより３回洗浄し、５０μｌのＨ２Ｏ中で再懸濁させ、７２℃に５分間加熱してＲＮＡをビーズの外に溶出させた。溶出ステップを１回繰り返し、溶出物をプールした。ハイブリダイゼーションの全てのステップのもの（ＲＮＡインプット、ハイブリダイゼーション上清、３回の洗浄物、および合わせた溶出物）は、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを製造業者の説明書に従って使用して別個に精製した。溶出物の種々の希釈物を、ＡＣＴＢまたはＧＡＰＤＨのいずれかのためのプライマーおよびプローブとＲＴ−ｄｄＰＣＲ反応において使用した。
【０２４９】
Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  Ｃ１実験。Ｃ１実験を既に記載のとおり実施した（Ｓｈａｌｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。手短に述べると、３Ｔ３およびＨＥＫ細胞の懸濁液をカルセインバイオレットおよびカルセインオレンジ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により製造業者の推奨に従って染色し、１ｍＬ当たり２５０，０００個の細胞の濃度に至るまで希釈し、１：１で混合した。次いで、この細胞混合物をＦｌｕｉｄｉｇｍからの２つの中間Ｃ１細胞捕捉チップ中にロードし、ロード後、ＤＡＰＩおよびＴＲＩＴＣ蛍光を使用して捕捉された細胞を可視化および同定した。明視野画像を使用して＞１つの細胞を有するポートを同定した（合計１９２個のうち、使用された２つのＣ１チップから合計で１２個が同定された）。Ｃ１媒介ホールトランスクリプトーム増幅後、Ｎｅｘｔｅｒａ  ＸＴ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してライブラリーを作製し、ＮｅｘｔＳｅｑ  ５００上に２．２ｐＭにおいてロードした。単一リードシーケンシング（６０ｂｐ）を実施してＤｒｏｐ−Ｓｅｑにおけるリード構造を模倣し、リードを下記のとおりアラインした。
【０２５０】
リードアラインメントおよびデジタル発現データの生成。最初に、未加工配列データをフィルタリングして１０未満のバーコード塩基品質を有する全てのリードペアを除去した。次いで、第２のリード（５０または６０ｂｐ）を５’末端においてトリミングしていかなるＴＳＯアダプター配列も除去し、３’末端においてトリミングして長さ６以上のポリＡテールを除去し、次いでＳＴＡＲ  ｖ２．４．０ａをデフォルト設定で使用してマウス（ｍｍ１０）ゲノム（網膜実験）または組合せマウス（ｍｍ１０）−ヒト（ｈｇ１９）大規模参照配列のいずれかに対してアラインした。
【０２５１】
ユニークにマッピングされたリードを、細胞バーコードごとにグルーピングした。遺伝子転写物をデジタルカウントするため、それぞれの細胞内のそれぞれの遺伝子中のＵＭＩのリストをアセンブルし、ＤＥ＝１以内のＵＭＩを一緒にマージした。ユニークＵＭＩ配列の総数をカウントし、この数を所与の細胞についてのその遺伝子の転写物の数として報告した。
【０２５２】
ＳＴＡＭＰから生じる細胞バーコードを、細胞溶解物に曝露されなかったビーズに対応するものと区別するため、本出願人らは、細胞バーコード当たりの転写物の総数によりデジタル発現行列を順序付け、それぞれの連続的により小さい細胞バーコードについての行列における全ての転写物の累積割合をプロットした。実験的に、本出願人らのデータは、増幅されたＳＴＡＭＰの推定数に近い細胞バーコード数において「ニー（ｋｎｅｅ）」を常に示す（図１４Ｂ）。このカットオフよりも大きい全ての細胞バーコードを下流の分析において使用した一方、残りの細胞バーコードを廃棄した。
【０２５３】
ＨＥＫおよび３Ｔ３細胞の細胞周期分析。ＨｅＬａ細胞周期の５つの時期（Ｇ１／Ｓ、Ｓ、Ｇ２／Ｍ、ＭおよびＭ／Ｇ１）を反映する遺伝子セットを、Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）から入手し（表３）、それぞれの遺伝子の発現パターンおよびそれぞれの遺伝子セットにおける全ての遺伝子の平均発現パターン間の相関を試験し、低い相関（Ｒ＜０．３）を有する遺伝子を除外することによりリファインした。このステップは、Ｈｅｌａ細胞において時期特異的として同定されたが、本出願人らの単一細胞データにおけるその時期と相関しない遺伝子を除去した。それぞれのリファインされた遺伝子セットにおける残りの遺伝子は、高度に相関した（示さず）。次いで、本出願人らは、それぞれの遺伝子セットにおける遺伝子の正規化発現レベル（ｌｏｇ２（ＴＰＭ＋１））を平均化してそれぞれの細胞の時期特異的スコアを定義した。次いで、これらのスコアを２つの正規化ステップに供した。第１に、それぞれの時期についてスコアをセンタリングし、それらの標準偏差により割った。第２に、それぞれの細胞の正規化スコアをセンタリングおよび正規化した。
【０２５４】
細胞を細胞周期に沿ってそれらの進行に従って順序付けるため、最初に、本出願人らは、それぞれの細胞の時期特異的スコアのパターンを細胞周期に沿う８つの潜在的パターン：Ｇ１／Ｓのみ、Ｇ１／ＳおよびＳの両方、Ｓのみ、Ｇ２／Ｍのみ、Ｇ２／ＭおよびＭ、Ｍのみ、Ｍ／Ｇ１のみ、Ｍ／Ｇ１およびＧ１と比較した。本出願人らは、全ての時期の等しいスコアについての第９のパターンも追加した（全て活性または全て不活性のいずれか）。それぞれのパターンは、活性プログラムについて１および不活性プログラムについて０のベクトルとして簡潔に定義した。次いで、本出願人らは、細胞をそれらの潜在的パターンに対する時期特異的スコアの最大相関に基づき定義パターンに分類した。重要なことに、等しい活性の第９のパターンに分類された細胞はなかった一方、複数の細胞が他のパターンのそれぞれに分類された。それぞれのクラス内の細胞をさらに順序付けるため、本出願人らは、細胞を先行および後続パターンとのそれらの相対相関に基づきソートし、それによりクラス間の推移を平滑化した（図１０Ａ）。
【０２５５】
細胞周期調節遺伝子を同定するため、本出願人らは、上記の細胞周期順序付けおよび１００個の細胞のウィンドウサイズを用いるスライディングウィンドウアプローチを使用した。本出願人らは、それぞれの遺伝子についての最大平均発現および最小平均発現を有するウィンドウを同定し、２試料ｔ検定を使用して最大および最小ウィンドウ間の差について初期ｐ値を割り当てた。細胞の順序をシャッフルした後に類似の分析を実施して偽発見率（ＦＤＲ）を評価するために使用することができる対照ｐ値を生成した。具体的には、本出願人らは、それぞれの潜在的なｐ値閾値について、いくつの遺伝子が細胞周期順序付けおよびランダムに順序付けされた分析におけるその閾値をパスするかを試験してＦＤＲを割り当てた。遺伝子が細胞周期ＧＯ／ＫＥＧＧ／ＲＥＡＣＴＯＭＥ遺伝子セットに含まれ、または近年の同調複製細胞中の遺伝子発現のゲノムワイド研究（Ｂａｒ−Ｊｏｓｅｐｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）において報告された場合、遺伝子を細胞周期調節されることが既に公知であると定義した。
【０２５６】
網膜データの教師なし次元削減およびクラスタリング分析。Ｐ１４マウス網膜懸濁液を７つの異なるレプリケートでＤｒｏｐ−Ｓｅｑを通して４日に分けて処理し、それぞれ別個にシーケンシングした。未加工デジタル発現行列を７つのシーケンシングランについて生成した。それぞれの試料レプリケートについての変曲点（細胞の数）は、以下のとおりであった：６，６００、９，０００、６，１２０、７，６５０、７，６５０、８２８０、および４０００。全４９，３００個の細胞を単一行列中で一緒にマージし、最初にＵＭＩの数を細胞当たりのＵＭＩの総数により割ることにより正規化し、次いで１０，０００を乗じた。次いで、全ての計算およびデータを対数空間で実施した（すなわち、ｌｎ（１０，０００個当たりの転写物＋１））。
【０２５７】
初期ダウンサンプリングおよび高変動性遺伝子の同定。桿体光受容体は、網膜細胞集団の６０〜７０％を構成する。さらに、それらは他の網膜細胞タイプよりも顕著に小さく（Ｃａｒｔｅｒ−Ｄａｗｓｏｎ  ａｎｄ  ＬａＶａｉｌ，１９７９）、結果として本出願人らの単一細胞データにおいて顕著に少数の遺伝子（およびより高レベルのノイズ）を生じさせた。本出願人らの予備コンピュータ実験において、完全データセットに対する教師なし次元削減の実施は、多数の桿体サブセット内のノイジーな変動に偏る表示をもたらし；これは頻度が比較的小さい他の細胞タイプ（例えば、アマクリン、ミクログリア）内の不均一性を分解する本出願人らの能力を減衰させた。したがって、それらのタイプを発見するための教師なし次元削減技術の検出力を増加させるため、最初に本出願人らは、４９，３００個の細胞データセットをダウンサンプリングして９００個以上の遺伝子が検出される単一細胞ライブラリーを抽出し、１３，１５５個の細胞の「トレーニングセット」をもたらした。本出願人らは、この「トレーニングセット」が、「ノイジー」桿体細胞を代償としてサイズがより大きい希少細胞タイプについてエンリッチされることを推定した。次いで、残りの３６，１４５個の細胞（以後、「射影セット」）をトレーニングセットから学習させた低次元表示上に直接埋め込んだ（下記参照）。これにより、本出願人らのデータの完全な統計的検出力を活用して細胞タイプを定義およびアノテートすることが可能となった。
【０２５８】
最初に、本出願人らは、平均発現および変動性間の関係について制御した後、トレーニングセットにわたり最も変動性である遺伝子のセットを同定した。本出願人らは、全１３，１５５個の単一細胞にわたりそれぞれの遺伝子についての平均および散布度（分散／平均）を計算し、遺伝子をそれらの平均発現に基づき２０個のビン中に配置した。次いで、本出願人らは、それぞれのビン内で、ビン内の全ての遺伝子の散布度をｚ正規化して、類似の平均発現を有する遺伝子と比較した場合であっても発現値が高度に変動性である外れ値遺伝子を同定した。本出願人らは、１．７のＺスコアカットオフを使用して３８４個の有意に変動性の遺伝子を同定し、予測されるとおり、それらは区別される網膜細胞タイプについてのマーカーからなった。
【０２５９】
主成分分析。本出願人らは、それぞれの遺伝子に沿ってデータをスケーリングおよびセンタリングした後、Ｒのｐｒｃｏｍｐ関数を使用して既に記載（Ｓｈａｌｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）のとおり本出願人らのトレーニングセットに対して主成分分析（ＰＣＡ）を行った。本出願人らは、既に同定された「高変動性」遺伝子のみをＰＣＡへのインプットとして使用してデータ中の一次構造のロバストな同定を確保した。
【０２６０】
返される主成分の数がプロファイリングされた細胞の数と等しい一方、ほんのわずかのそれらの成分のみが、ヌルモデルと比較して変量の統計的に有意な比率を説明する。本出願人らは、２つのアプローチを使用してさらなる分析のために統計的に有意なＰＣを同定した：（１）本出願人らは、データの１００００回の独立ランダム化を実施して、その結果、それぞれの実現において、スケーリングされた発現行列の全ての行（遺伝子）に沿った値をランダムに並べ替えた。この操作は、遺伝子間のペアワイズ相関をランダム化する一方、全ての不変遺伝子の発現分布を残す。ＰＣＡは、それらの１００００回「ランダム化された」データセットのそれぞれに対して実施した。並べ替えされていないデータ中の有意なＰＣは、１００００回ランダム化されたデータセットにわたる最大固有値と比較して大きい固有値を有するものとして同定した（ｐ＜０．０１、ボンフェローニ補正）。（２）本出願人らは、ＣｈｕｎｇおよびＳｔｏｒｅｙ（Ｃｈｕｎｇ  ａｎｄ  Ｓｔｏｒｅｙ，２０１４）により提案され、本出願人らが単一細胞ＲＮＡ−ｓｅｑデータ（Ｓｈａｌｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）に既に適用したランダム化アプローチ（「ジャックストロー（ｊａｃｋ  ｓｔｒａｗ）」）を修正した。手短に述べると、本出願人らは、インプットデータに対して１，０００回のＰＣＡを実施したが、それぞれの分析において、本出願人らは、遺伝子の１％をランダムに「スクランブル」して全ての遺伝子についてのスコアのヌル分布を実験的に推定した。本出願人らは、結合ヌル（ｊｏｉｎｔ−ｎｕｌｌ）基準（Ｌｅｅｋ  ａｎｄ  Ｓｔｏｒｅｙ，２０１１）を使用してそれぞれのヌル分布とは有意に異なる遺伝子スコアを有するＰＣを同定した（ｐ＜０．０１、ボンフェローニ補正）。（１）および（２）の両方は、３２個の「有意な」ＰＣを生じさせた。可視的調査は、それらのＰＣが主としてミトコンドリア遺伝子によっても、ハウスキーピング遺伝子によっても、ヘモグロビン遺伝子によってもドライブされないことを裏付けた。予測されるとおり、区別される網膜細胞タイプについてのマーカーは、それらのＰＣに沿って最大スコア（＋ｖｅおよび−ｖｅ）を有する遺伝子間で高度に表示された（表５）。
【０２６１】
残りの細胞のｔ−ＳＮＥ表示およびポストホック射影。様々な網膜細胞タイプについてのカノニカルマーカーが有意なＰＣに沿って強力に表示されたため（図１７）、本出願人らは、主固有ベクトルに沿ったトレーニングセットにおける個々の細胞についてのローディング（「ＰＣ部分空間表示」とも）を使用してデータにおける区別される細胞タイプを取り出し得ることを推定した。本出願人らは、それらのローディングがＰＣＡにおける３８４個の遺伝子からの情報を活用し、したがって、個々の遺伝子の単一細胞計測よりも技術的ノイズに対してロバストであることに留意する。本出願人らは、それらのＰＣローディングを、Ｒのｔｓｎｅパッケージに「パープレキシティ」パラメータ設定３０で実装されたｔ分布型確率的近傍埋め込み（ｔＳＮＥ）（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍａａｔｅｎ  ａｎｄ  Ｈｉｎｔｏｎ，２００８）用のインプットとして使用した。ｔ−ＳＮＥ手順は、単一細胞の二次元埋め込みを返す。本出願人らの変動性セット内の遺伝子の類似の発現シグネチャーを有する細胞、およびしたがって、類似のＰＣローディングは、埋め込みにおいて互いの近くに局在化する可能性が高く、したがって、区別される細胞タイプは、ｔＳＮＥマップにわたり二次元点群を形成するはずである。
【０２６２】
クラスタを同定およびアノテートする前、本出願人らは、残りの３６，１４５個の細胞（射影セット）をトレーニングセットのｔＳＮＥマップ上に以下の手順により射影した：
（１）本出願人らは、それらの細胞を、トレーニングセットから同定された有意なＰＣにより定義された部分空間上に射影した。手短に述べると、本出願人らは、高変動性遺伝子のみを考慮して射影セットに対応する３８４×３６，１４５個の発現行列をセンタリングおよびスケーリングし；トレーニングセットのスケーリングパラメータを使用してそれぞれの行をセンタリングおよびスケーリングした。次いで、本出願人らは、このスケーリングされた発現行列の転置行列に、トレーニングセットＰＣＡから学習された３８４×３２個の遺伝子スコア行列を乗じた。これは、トレーニングセット上で学習された３２個の有意なＰＣに沿う射影セットにおける細胞についてのＰＣ「ローディング」を生じさせた。
（２）このＰＣローディングに基づき、射影セットにおけるそれぞれの細胞を、元のｔＳＮＥアルゴリズム（Ｓｈｅｋｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）と一致する数学的フレームワークを使用してより早期に導入されたトレーニングセットのｔＳＮＥマップ上に独立して埋め込んだ。本出願人らは、このアプローチがトレーニングセットから同定されたものの外側で新規クラスタを発見しない一方、完全データセットの統計的検出力を活用することにより異なるクラスタ間の区別を鮮明にすることに留意する。さらに、細胞を、未加工遺伝子発現値ではなくそれらのＰＣシグネチャーに基づき射影し、それにより本出願人らのアプローチは個々の遺伝子計測値における技術的ノイズに対してよりロバストになる。
【０２６３】
十分な詳細については、以下のセクション「ｔＳＮＥマップ上への射影セットの埋め込み」を参照されたい。
【０２６４】
この「ポストホック射影アプローチ」についての１つの潜在的懸念は、トレーニングセットに全く存在しない細胞タイプが、定義されたクラスタ中の１つに誤って射影され得るという可能性であった。本出願人らは、対照データセットに対して射影アルゴリズムを試験してこの可能性を探索し、厳しい条件を配置してトレーニングセット内で適切に表示された細胞タイプのみを射影して誤った割り当てを回避することを確保した（「「サンプル外」射影試験」参照）。このアプローチを使用して、射影セットにおける細胞の９７％が良好に埋め込まれ、４９３００個のシーケンシングされた細胞の４８２９６個からなるｔＳＮＥマップをもたらした（表１０）。
【０２６５】
本出願人らのアプローチの追加の検証として、完全データのクラスタリング後に同定された様々な細胞タイプの相対頻度（下記参照）が、文献中の推定値に密接にマッチすることが留意された（表１）。桿体を除き、他の全ての細胞タイプは完全データのそれらの頻度と比較してトレーニングセットにおいて２．３倍の中央値においてエンリッチされた。これは、本出願人らのダウンサンプリングアプローチが桿体細胞を代償として他の細胞タイプの表示を実際に増加させ、それによりそれらの細胞を定義するＰＣを発見し得ることを強力に示唆する。
【０２６６】
細胞タイプを同定するための密度クラスタリング。ｔＳＮＥマップ上の推定細胞タイプを自動的に同定するため、本出願人らは、ＤＢＳＣＡＮ  Ｒパッケージ（Ｅｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）において実装される密度クラスタリングアプローチを使用し、到達可能距離パラメータ（ｅｐｓ）を１．９に設定し、５０個未満の細胞のクラスタを除去した。除去された細胞の大多数は、より大きいクラスタ接点間に局在するシングルトン細胞を含んだ。これらのステップの結果として、本出願人らは、４４８０８個の細胞（データの９１％）を４９個のクラスタに割り当てることができた。
【０２６７】
次に、本出願人らは、合計４９個のクラスタを試験して同定されたクラスタが過剰分割化（ｏｖｅｒ−ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ）とは対照的に区別される細胞分類を真に表示することを確保した。本出願人らは、本出願人らが示差的に発現される遺伝子を探索したポストホック検定（ＭｃＤａｖｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）をクラスタ（少なくとも１０個の遺伝子を要求し、それぞれは、ｐ＜０．０１でボンフェローニ補正して１よりも大きい自然対数値のクラスタ間の平均発現差を有する）の全てのペア間で実施した。本出願人らは、２つの最も関連するペア（最低数の示差的発現遺伝子）から出発してこの基準を満たさなかったクラスタペアを反復的にマージした。このプロセスは、１０個のマージクラスタをもたらし、３９個を残した。
【０２６８】
次いで、本出願人らは、３９個の残りのクラスタのそれぞれについての平均遺伝子発現をコンピュータ計算し、完全結合階層クラスタリングおよび系統樹アセンブリ用インプットとしてこのデータを使用して全てのペア間のユークリッド距離を計算した。次いで、本出願人らは、尤度比検定（ＭｃＤａｖｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）を使用して３９個のクラスタのそれぞれを残りの細胞と比較してクラスタにおいて示差的に発現されるマーカー遺伝子を同定した。
【０２６９】
ｔＳＮＥマップ上への射影セットの埋め込み。本出願人らは、Ｓｈｅｋｈａｒ  ｅｔ  ａｌ（Ｓｈｅｋｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）およびＢｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）におけるコンピュータ計算アプローチを使用して新たな細胞を既存のｔＳＮＥマップ上に射影した。最初に、高変動性遺伝子のセットのみを含むように細胞の発現ベクトルを低減させ、続いてトレーニングセットにおける遺伝子発現の平均および標準偏差を使用してそれぞれの遺伝子に沿ってセンタリングおよびスケーリングした。このスケーリングされた発現ベクトルｚ（次元１×３８４）に、遺伝子Ｓのスコア行列（次元３８４×３２）を乗じて有意なＰＣのｕ（次元１×３２）に沿うその「ローディング」を得た。したがって、ｕ‘＝ｚ’．Ｓ
である。
【０２７０】
ｕ（次元１×３２）は、トレーニングセットから同定されたＰＣ部分空間における新たな細胞の表示を示す。本出願人らは、ここで、トレーニングセットから採用されたスケーリングされた細胞の発現ベクトルｚに対する上記のドット積の実施が、その正確な部分空間表示ｕをそのケースであるはずのとおりに戻すという点で一致性の点に留意する。
【０２７１】
トレーニングセットにおける細胞のＰＣローディング｛ｕｉ｝（ｉ＝１、２、…Ｎｔｒａｉｎ）およびそれらのｔＳＮＥ座標｛ｙｉ｝（ｉ＝１、２、…Ｎｔｒａｉｎ）を考慮すると、現在のタスクは、新たな細胞のｔＳＮＥ座標ｙ’を、そのローディングベクトルｕ’に基づき見出すことである。元のｔＳＮＥフレームワーク（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍａａｔｅｎ  ａｎｄ  Ｈｉｎｔｏｎ，２００８）におけるとおり、本出願人らは、推移確率
【数１】
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のセットをコンピュータ計算することにより新たな細胞をトレーニングセットにおける細胞に対して部分空間中で「局在」させた。
【０２７２】
ここで、ｄ（．，．）はユークリッド距離を表し、バンド幅σｕは、ｐ（ｕ’｜ｕｉ）に関連するシャノンエントロピーをｌｏｇ２（３０）に制約するように単純二分探索により選択され、３０は、トレーニングセットのｔＳＮＥ埋め込みにおいて使用されるパープレキシティパラメータの値に対応する。σｕ’は、それぞれの細胞について独立して選択されることに留意されたい。
【０２７３】
低次元埋め込みにおける対応する推移確率のセットは、スチューデントのｔ分布に基づき、
【数２】
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として定義され、ｙ’は、未知の新たな細胞の座標である。本出願人らは、ｐ（ｕ’｜ｕｉ）およびｑ（ｙ’｜ｙｉ）間のカルバック・ライブラーダイバージェンスを最小化することによりそれらを計算した。
【数３】
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【０２７４】
これは、独立変数に関する非凸目的関数であり、Ｍａｔｌａｂ関数ｆｍｉｎｓｅａｒｃｈに実装されるネルダー・ミードシンプレックスアルゴリズムを使用して最小化される。この手順は、射影セットにおける全ての細胞にわたり並列化することができる。
【０２７５】
実行に対する新たな留意、
１．これはポストホック射影であり、ｐ（ｕ’｜ｕｉ）は、それが常に合計１に制約されるという点でペアワイズ類似度の相対尺度にすぎないため、本出願人らは、新たな細胞が１または２つのトレーニング細胞とのそれらの高い相対類似性に関してｔＳＮＥマップ上に埋め込まれる可能性（「ショート回路形成」）を回避することを所望した。換言すると、本出願人らは、少なくとも数個の細胞によりトレーニングセットにおいて十分に表示されたＰＣ部分空間の領域から抜き出されたそれらの細胞のみを射影することを選択した。したがって、本出願人らは、ｐ（ｕ’｜ｕｉ）＞Ｐｔｈｒｅｓがトレーニングセットにおける少なくともＮｍｉｎ個の細胞について真である場合（ｐｔｈｒｅｓ＝５×１０−３、Ｎｍｉｎ＝１０）にのみ、射影のための細胞ｕ’を保持した。本出願人らは、射影セットがトレーニングセットと完全に異なることが既知であるケースに対して射影アルゴリズムを試験することによりｐｔｈｒｅｓおよびＮｍｉｎについての値を較正してそのような細胞がこの制約により大部分射影されることを確保した。（セクション「「サンプル外」射影試験」参照）
２．ポイント１における制約をパスする細胞について、ｔＳＮＥ座標ｙ’０の初期値は、
【数４】
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すなわち、ＰＣ部分空間表示におけるペアワイズ類似度に設定された重みを有するトレーニングセットのｔＳＮＥ座標の加重平均に設定する。
３．１における条件を充足する細胞は、ＫＬダイバージェンスの最小値を最大数の反復内で見出すことができる場合、位置ｙ’＊に「良好に射影された」と言われる。しかしながら、プログラムは非凸であり、極小値のみを見出すことが保証されるため、本出願人らは、より良好な最小値を見出すことができるか否か探索することを所望した。手短に述べると、本出願人らは、ｙ’＊に対してセンタリングされた２５×２５格子からのポイントを均一にサンプリングしてＫＬ−ダイバージェンスの値がｙ’＊以下におけるその値の５％内である点を確認した。この条件がそのときの（＜２％）で充足された場合は常に、本出願人らは、初期値として新たな点を設定することにより最適化を再実行した。
【０２７６】
「サンプル外」射影試験。ポストホック射影法を試験するため、本出願人らは、ｔＳＮＥマップ上の３９個の区別されるクラスタのそれぞれをｔＳＮＥマップから合成的に「取り出し」、次いで上記に概略される手順を使用して残りのクラスタのｔＳＮＥ上で細胞ごとに再射影する以下のコンピュータ計算実験を実施した。トレーニングセットからの細胞のみをそれらの計算において使用した。
【０２７７】
本出願人らのクラスタ区別が正確であると想定すると、それらの３９個の実験のそれぞれにおいて、再射影されているクラスタは「サンプル外」細胞タイプを表示する。したがって、それらの細胞の、残りの３８個のクラスタの１つへの良好な割り当ては誤りである。取り出しおよび再射影された３９個のクラスタのそれぞれについて、本出願人らは、射影法の結果に基づき細胞を３つの群に分類した。
（１）上記セクションの条件１を充足せず（すなわち、少なくともＮｍｉｎ個のトレーニング細胞との高い相対類似度を有さなかった）、したがって、射影に「不成功」であった細胞。
（２）ｔＳＮＥ座標ｙ’に良好に割り当てられたが、以下の条件に従って既存のクラスタのいずれにも割り当てることができなかった細胞。
（３）ｔＳＮＥ座標ｙ’に良好に割り当てられ、既存のクラスタの１つに「間違って割り当てられた」細胞。細胞を、ｙ’およびセントロイド間の距離がクラスタ半径（セントロイドから最も遠い点の距離）よりも小さい場合およびその場合に限りセントロイドがｙ’に最も近いクラスタに割り当てた。
【０２７８】
明るい兆候として、３９個の「サンプル外」射影実験の全てについて、わずかな細胞がクラスタの１つに誤って割り当てられたにすぎず、すなわち、上記（３）を充足し、パラメータｐｔｈｒｅｓ＝５×１０−３であり、Ｎｍｉｎ＝１０であった（表１０）。これは、本出願人らの射影セットのポストホック埋め込みが、区別される細胞タイプを既存のクラスタの１つに誤って割り当てないという信頼性を提供した。
【０２７９】
網膜データのダウンサンプリング分析。図１１Ｆに示される５００個の細胞および２０００個の細胞にダウンサンプリングされたｔＳＮＥプロットを作成するため、細胞を高純度レプリケート（レプリケート７）からランダムにサンプリングし、ＰＣＡおよびｔＳＮＥ用インプットとして使用した。５００個の細胞のｔＳＮＥは、５．５の到達可能距離パラメータ（ｅｐｓ）を使用してクラスタリングした一方、２０００個の細胞のｔＳＮＥは、３．０のｅｐｓ値を使用してクラスタリングした。未クラスタリング細胞は除去した。９，４３１個の細胞にダウンサンプリングされたｔＳＮＥプロットを作成するため、１０，０００個の細胞を完全データセットからランダムにサンプリングし、９００個超の遺伝子から転写物を発現する細胞を主成分分析およびｔＳＮＥにおいて使用し；残りの（より少数の）細胞をｔＳＮＥ埋め込み上に射影し、２．０のｅｐｓ値を使用してクラスタリングし、９，４３１個の細胞についてのプロットをもたらした。
【０２８０】
免疫組織化学。野生型Ｃ５７マウスまたはｎＧｎＧアマクリンおよび１型双極細胞中でＣＦＰを発現するＭｉｔｏ−Ｐマウス（Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）を、ペントバルビタールの腹腔内注射により安楽死させた。眼をＰＢＳ中４％のＰＦＡ中で氷上で１時間固定し、次いで網膜を解剖し、さらに３０分間、後固定し、次いでＰＢＳによりリンスした。網膜を冷凍し、クライオスタット中で２０μｍに切片化した。切片を一次抗体（ニワトリ抗ＧＦＰ［Ａｂｃａｍ］またはウサギ抗ＰＰＰ１Ｒ１７［Ａｔｌａｓ］）と４℃において一晩インキュベートし、二次抗体（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎおよびＪａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）と室温において２時間インキュベートした。次いで、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ  Ｇ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して切片をマウントし、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＦＶＢ共焦点顕微鏡を用いて観察した。
【０２８１】
ビーズ表面プライマーおよびカスタムシーケンシングプライマーに関する注釈。本論文についての実験過程の間、本出願人らは、わずかに異なる２つの配列を有するビーズの２つのバッチを使用した（Ｂａｒｃｏｄｅｄ  Ｂｅａｄ  ＳｅｑＡおよびＢａｒｃｏｄｅｄ  Ｂｅａｄ  ＳｅｑＢ、表９）。Ｂａｒｃｏｄｅｄ  Ｂｅａｄ  ＳｅｑＡは、ヒト−マウス実験において、および網膜実験のレプリケート１〜３において使用した。レプリケート４〜７は、Ｂａｒｃｏｄｅｄ  Ｂｅａｄ  ＳｅｑＢを用いて実施した。Ｂａｒｃｏｄｅｄ  Ｂｅａｄ  ＳｅｑＡビーズを使用して産生されたＤｒｏｐ−Ｓｅｑライブラリーについてのリード１をプライミングするため、Ｒｅａｄ１ＣｕｓｔＳｅｑＡを使用し；Ｂａｒｃｏｄｅｄ  Ｂｅａｄ  ＳｅｑＢビーズを使用して産生されたＤｒｏｐ−Ｓｅｑライブラリーについてのリード２をプライミングするため、Ｒｅａｄ１ＣｕｓｔＳｅｑＢを使用した。ＣｈｅｍＧｅｎｅｓは、Ｂａｒｃｏｄｅｄ  Ｂｅａｄ  ＳｅｑＢ配列を保有する大規模数のビーズを製造することを計画した。これらのビーズは、Ｒｅａｄ１ＣｕｓｔＳｅｑＢと使用すべきである。
【０２８２】
Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑ実行に関する追加の注釈
細胞およびビーズ濃度。本出願人らの実験は、Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑにおいて使用される細胞濃度が、得られるライブラリーの純度およびダブレット割合に対して強力な線形関係を有することを示した（図９Ａ、９Ｂ、および１４Ｄ）。細胞濃度は、スループットにも線形的に影響する：細胞を１００個の細胞／ｕｌの最終濃度において使用する場合、１時間当たり約１０，０００個の単一細胞ライブラリーを処理することができ、細胞を１２．５個の細胞／ｕｌの最終濃度において使用する場合、約１，２００個を処理することができる。スループットおよび純度間のトレードオフは、追求される具体的な科学的疑問に応じて使用者に異なって影響する可能性が高い。現在、標準的実験のため、本出願人らは、小さい割合の二重および細胞汚染物質を許容する５０個の細胞／ｕｌの最終濃度を使用して容易にかつ信頼性をもって１０，０００個の細胞を数時間の過程にわたり処理することができる。上記推奨のとおり、本出願人らは、現在、１２０個／ｕｌの濃度（液滴中の最終濃度＝６０個／ｕｌ）におけるビーズのローディングを推薦し、それは実験的に＜５％のビーズダブレット割合を生じさせる。
【０２８３】
Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑ準備コスト。Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑを実行するために要求される設備の主な部品は、３つのシリンジポンプ（ＫＤ  Ｌｅｇａｔｏ  １００ポンプ、それぞれリスト価格約＄２，０００）、標準的な倒立顕微鏡（Ｍｏｔｉｃ  ＡＥ３１、リスト価格約＄１，９００）、およびマグネティックスターラー（Ｖ＆Ｐ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，＃７１０Ｄ２、リスト価格約＄１，２００）である。高速カメラ（液滴生成をリアルタイムでモニタリングするために使用される）は、大多数の使用者に不要である（液滴品質は、フックスローゼンタールヘモサイトメーター中に３ｕｌの液滴を１７ｕｌの液滴生成油と簡易に配置して液滴を単一焦点面中に希釈することにより容易にモニタリングすることができる）。
【０２８４】
実施例４
実施例２および３についての表
【０２８５】
【表４】
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【０２８６】
【表５】
2017532024.tif 000011
【０２８７】
【表６】
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【０２８８】
【表７】
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【０２８９】
【表８】
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【０２９０】
【表９】
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【０２９１】
【表１０】
2017532024.tif 000016
【０２９２】
【表１１】
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【０２９３】
【表１２】
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【０２９４】
【表１３】
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【０２９５】
【表１４】
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【０２９６】
【表１５】
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【０２９７】
【表１６】
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【０２９８】
【表１７】
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【０２９９】
【表１８】
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【０３００】
【表１９】
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【０３０１】
【表２０】
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【０３０２】
【表２１】
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【０３０３】
【表２２】
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【０３０４】
【表２３】
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【０３０５】
【表２４】
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【０３０６】
【表２５】
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【０３０７】
【表２６】
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【０３０８】
【表２７】
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【０３０９】
【表２８】
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【０３１０】
【表２９】
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【０３１１】
【表３０】
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【０３１２】
【表３１】
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【０３１３】
【表３２】
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【０３１４】
【表３３】
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【０３１５】
【表３４】
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【０３１６】
【表３５】
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【０３１７】
【表３６】
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【０３１８】
【表３７】
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【０３１９】
【表３８】
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【０３２０】
【表３９】
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【０３２１】
【表４０】
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【０３２２】
【表４１】
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【０３２３】
【表４２】
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【０３２４】
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【０４３２】
【表１５１】
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【０４３３】
【表１５２】
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【０４３４】
【表１５３】
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【０４３５】
【表１５４】
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【０４３６】
【表１５５】
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【０４３７】
【表１５６】
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【０４３８】
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【０４３９】
【表１５８】
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【０４４０】
表７．３９個の網膜細胞クラスタのそれぞれのペアワイズ組合せ間の示差的遺伝子発現。
【０４４１】
【表１５９】
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【０４４２】
【表１６０】
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【０４４３】
【表１６１】
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【０４４４】
参照文献
Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｂ．Ｂ．，Ｋｏｒｂｏ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｐａｋｋｅｎｂｅｒｇ，Ｂ．（１９９２）．Ａ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ  ｗｉｔｈ  ｕｎｂｉａｓｅｄ  ｓｔｅｒｅｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ３２６，５４９−５６０．
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Ｂｅｒｍａｎ，Ｇ．Ｊ．，Ｃｈｏｉ，Ｄ．Ｍ．，Ｂｉａｌｅｋ，Ｗ．，ａｎｄ  Ｓｈａｅｖｉｔｚ，Ｊ．Ｗ．（２０１４）．Ｍａｐｐｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｔｅｒｅｏｔｙｐｅｄ  ｂｅｈａｖｉｏｕｒ  ｏｆ  ｆｒｅｅｌｙ  ｍｏｖｉｎｇ  ｆｒｕｉｔ  ｆｌｉｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ／ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １１．
Ｂｒｅｎｎｅｃｋｅ，Ｐ．，Ａｎｄｅｒｓ，Ｓ．，Ｋｉｍ，Ｊ．Ｋ．，Ｋｏｌｏｄｚｉｅｊｃｚｙｋ，Ａ．Ａ．，Ｚｈａｎｇ，Ｘ．，Ｐｒｏｓｅｒｐｉｏ，Ｖ．，Ｂａｙｉｎｇ，Ｂ．，Ｂｅｎｅｓ，Ｖ．，Ｔｅｉｃｈｍａｎｎ，Ｓ．Ａ．，Ｍａｒｉｏｎｉ，Ｊ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．Ａｃｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｎｏｉｓｅ  ｉｎ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ＲＮＡ−ｓｅｑ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  １０，１０９３−１０９５．
Ｂｒｉｎｇｅｒ，Ｍ．Ｒ．，Ｇｅｒｄｔｓ，Ｃ．Ｊ．，Ｓｏｎｇ，Ｈ．，Ｔｉｃｅ，Ｊ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｉｓｍａｇｉｌｏｖ，Ｒ．Ｆ．（２００４）．Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｔｈａｔ  ｒｅｌｙ  ｏｎ  ｃｈａｏｔｉｃ  ｍｉｘｉｎｇ  ｉｎ  ｄｒｏｐｌｅｔｓ．Ｐｈｉｌｏｓｏｐｈｉｃａｌ  ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ａ，Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ，ｐｈｙｓｉｃａｌ，ａｎｄ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ３６２，１０８７−１１０４．
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Ｂｒｏｕｚｅｓ，Ｅ．，Ｍｅｄｋｏｖａ，Ｍ．，Ｓａｖｅｎｅｌｌｉ，Ｎ．，Ｍａｒｒａｎ，Ｄ．，Ｔｗａｒｄｏｗｓｋｉ，Ｍ．，Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ，Ｊ．Ｂ．，Ｒｏｔｈｂｅｒｇ，Ｊ．Ｍ．，Ｌｉｎｋ，Ｄ．Ｒ．，Ｐｅｒｒｉｍｏｎ，Ｎ．，ａｎｄ  Ｓａｍｕｅｌｓ，Ｍ．Ｌ．（２００９）．Ｄｒｏｐｌｅｔ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０６，１４１９５−１４２００．
Ｂｕｅｔｔｎｅｒ，Ｆ．，Ｎａｔａｒａｊａｎ，Ｋ．Ｎ．，Ｃａｓａｌｅ，Ｆ．Ｐ．，Ｐｒｏｓｅｒｐｉｏ，Ｖ．，Ｓｃｉａｌｄｏｎｅ，Ａ．，Ｔｈｅｉｓ，Ｆ．Ｊ．，Ｔｅｉｃｈｍａｎｎ，Ｓ．Ａ．，Ｍａｒｉｏｎｉ，Ｊ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｓｔｅｇｌｅ，Ｏ．（２０１５）．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌ−ｔｏ−ｃｅｌｌ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｉｎ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ＲＮＡ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｄａｔａ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｈｉｄｄｅｎ  ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３３，１５５−１６０．
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Ｃｈｕｎｇ，Ｎ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｓｔｏｒｅｙ，Ｊ．Ｄ．（２０１４）．Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  Ｖａｒｉａｂｌｅｓ  Ｄｒｉｖｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｉｇｈ−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｄａｔａ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．
Ｃｏｒｂｏ，Ｊ．Ｃ．，Ｍｙｅｒｓ，Ｃ．Ａ．，Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｋ．Ａ．，Ｊａｄｈａｖ，Ａ．Ｐ．，ａｎｄ  Ｃｅｐｋｏ，Ｃ．Ｌ．（２００７）．Ａ  ｔｙｐｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０４，１２０６９−１２０７４．
Ｄｅｓｃａｍｐｓ，Ｆ．Ｊ．，Ｍａｒｔｅｎｓ，Ｅ．，Ｐｒｏｏｓｔ，Ｐ．，Ｓｔａｒｃｋｘ，Ｓ．，Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｓｔｅｅｎ，Ｐ．Ｅ．，Ｖａｎ  Ｄａｍｍｅ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｏｐｄｅｎａｋｋｅｒ，Ｇ．（２００５）．Ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ  Ｂ／ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−９  ｐｒｏｖｏｋｅｓ  ｃａｔａｒａｃｔ  ｂｙ  ｃｌｅａｖｉｎｇ  ｌｅｎｓ  ｂｅｔａＢ１  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎ．ＦＡＳＥＢ  ｊｏｕｒｎａｌ：ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９，２９−３５．
Ｄｏｂｉｎ，Ａ．，Ｄａｖｉｓ，Ｃ．Ａ．，Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ，Ｆ．，Ｄｒｅｎｋｏｗ，Ｊ．，Ｚａｌｅｓｋｉ，Ｃ．，Ｊｈａ，Ｓ．，Ｂａｔｕｔ，Ｐ．，Ｃｈａｉｓｓｏｎ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｉｎｇｅｒａｓ，Ｔ．Ｒ．（２０１３）．ＳＴＡＲ：ｕｌｔｒａｆａｓｔ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＲＮＡ−ｓｅｑ  ａｌｉｇｎｅｒ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２９，１５−２１．
Ｅｓｔｅｒ，Ｍ．，Ｋｒｉｅｇｅｌ，Ｈ．Ｐ．，Ｓａｎｄｅｒ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｘｕ，Ｘ．（１９９６）．Ａ  ｄｅｎｓｉｔｙ−ｂａｓｅｄ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｉｎｇ  ｃｌｕｓｔｅｒｓ  ｉｎ  ｌａｒｇｅ  ｓｐａｔｉａｌ  ｄａｔａｂａｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ｎｏｉｓｅ．（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆ．：ＡＡＡＩ  Ｐｒｅｓｓ）．
Ｆａｍｉｇｌｉｅｔｔｉ，Ｅ．Ｖ．，ａｎｄ  Ｓｕｎｄｑｕｉｓｔ，Ｓ．Ｊ．（２０１０）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｉｔｏｒｙ  ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ  ｎｅｕｒｏｎｓ，ｓｔａｒｂｕｒｓｔ  ａｍａｃｒｉｎｅ  ｃｅｌｌｓ，ａｎｄ  ＧＡＢＡｅｒｇｉｃ  ａｍａｃｒｉｎｅ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｒａｂｂｉｔ  ｒｅｔｉｎａ，ｗｉｔｈ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｐｒｅｖｉｓｕａｌ  ａｎｄ  ｖｉｓｕａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｇａｎｇｌｉｏｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｖｉｓｕａｌ  ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２７，１９−４２．
Ｆｅｉｇｅｎｓｐａｎ，Ａ．，Ｔｅｕｂｎｅｒ，Ｂ．，Ｗｉｌｌｅｃｋｅ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｗｅｉｌｅｒ，Ｒ．（２００１）．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｃｏｎｎｅｘｉｎ３６  ｉｎ  ＡＩＩ  ａｍａｃｒｉｎｅ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｒｅｔｉｎａ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ：ｔｈｅ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２１，２３０−２３９．
Ｇｒｕｎ，Ｄ．，Ｋｅｓｔｅｒ，Ｌ．，ａｎｄ  ｖａｎ  Ｏｕｄｅｎａａｒｄｅｎ，Ａ．（２０１４）．Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｉｓｅ  ｍｏｄｅｌｓ  ｆｏｒ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  １１，６３７−６４０．
Ｇｕｏ，Ｍ．Ｔ．，Ｒｏｔｅｍ，Ａ．，Ｈｅｙｍａｎ，Ｊ．Ａ．，ａｎｄ  Ｗｅｉｔｚ，Ｄ．Ａ．（２０１２）．Ｄｒｏｐｌｅｔ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｓｓａｙｓ．Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  ｃｈｉｐ  １２，２１４６−２１５５．
Ｈａｓｈｉｍｓｈｏｎｙ，Ｔ．，Ｗａｇｎｅｒ，Ｆ．，Ｓｈｅｒ，Ｎ．，ａｎｄ  Ｙａｎａｉ，Ｉ．（２０１２）．ＣＥＬ−Ｓｅｑ：ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ  ｂｙ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ｌｉｎｅａｒ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ  ｒｅｐｏｒｔｓ  ２，６６６−６７３．
Ｈａｔｔａｒ，Ｓ．，Ｌｉａｏ，Ｈ．Ｗ．，Ｔａｋａｏ，Ｍ．，Ｂｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｙａｕ，Ｋ．Ｗ．（２００２）．Ｍｅｌａｎｏｐｓｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｇａｎｇｌｉｏｎ  ｃｅｌｌｓ：ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ，ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎｓ，ａｎｄ  ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９５，１０６５−１０７０．
Ｈａｖｅｒｋａｍｐ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｗａｓｓｌｅ，Ｈ．（２００４）．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｍａｃｒｉｎｅ  ｃｅｌｌ  ｔｙｐｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｒｅｔｉｎａ  ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｅ  ｆｏｒ  ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ３．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ４６８，２５１−２６３．
Ｈｉｎｄｓｏｎ，Ｂ．Ｊ．，Ｎｅｓｓ，Ｋ．Ｄ．，Ｍａｓｑｕｅｌｉｅｒ，Ｄ．Ａ．，Ｂｅｌｇｒａｄｅｒ，Ｐ．，Ｈｅｒｅｄｉａ，Ｎ．Ｊ．，Ｍａｋａｒｅｗｉｃｚ，Ａ．Ｊ．，Ｂｒｉｇｈｔ，Ｉ．Ｊ．，Ｌｕｃｅｒｏ，Ｍ．Ｙ．，Ｈｉｄｄｅｓｓｅｎ，Ａ．Ｌ．，Ｌｅｇｌｅｒ，Ｔ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｄｒｏｐｌｅｔ  ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ８３，８６０４−８６１０．
Ｈｏｏｎ，Ｍ．，Ｏｋａｗａ，Ｈ．，Ｄｅｌｌａ  Ｓａｎｔｉｎａ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｗｏｎｇ，Ｒ．Ｏ．（２０１４）．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｔｉｎａ：ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  ｒｅｔｉｎａｌ  ａｎｄ  ｅｙｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４２，４４−８４．
Ｉｓｌａｍ，Ｓ．，Ｋｊａｌｌｑｕｉｓｔ，Ｕ．，Ｍｏｌｉｎｅｒ，Ａ．，Ｚａｊａｃ，Ｐ．，Ｆａｎ，Ｊ．Ｂ．，Ｌｏｎｎｅｒｂｅｒｇ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｌｉｎｎａｒｓｓｏｎ，Ｓ．（２０１２）．Ｈｉｇｈｌｙ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ａｎｄ  ｓｔｒａｎｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ＲＮＡ  ５’ｅｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ７，８１３−８２８．
Ｉｓｌａｍ，Ｓ．，Ｚｅｉｓｅｌ，Ａ．，Ｊｏｏｓｔ，Ｓ．，Ｌａ  Ｍａｎｎｏ，Ｇ．，Ｚａｊａｃ，Ｐ．，Ｋａｓｐｅｒ，Ｍ．，Ｌｏｎｎｅｒｂｅｒｇ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｌｉｎｎａｒｓｓｏｎ，Ｓ．（２０１４）．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ＲＮＡ−ｓｅｑ  ｗｉｔｈ  ｕｎｉｑｕｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  １１，１６３−１６６．
Ｊａｉｔｉｎ，Ｄ．Ａ．，Ｋｅｎｉｇｓｂｅｒｇ，Ｅ．，Ｋｅｒｅｎ−Ｓｈａｕｌ，Ｈ．，Ｅｌｅｆａｎｔ，Ｎ．，Ｐａｕｌ，Ｆ．，Ｚａｒｅｔｓｋｙ，Ｉ．，Ｍｉｌｄｎｅｒ，Ａ．，Ｃｏｈｅｎ，Ｎ．，Ｊｕｎｇ，Ｓ．，Ｔａｎａｙ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ＲＮＡ−ｓｅｑ  ｆｏｒ  ｍａｒｋｅｒ−ｆｒｅｅ  ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｉｎｔｏ  ｃｅｌｌ  ｔｙｐｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４３，７７６−７７９．
Ｊａｒｏｓｚ，Ｄ．Ｆ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｊ．Ｃ．，Ｗａｌｋｅｒ，Ｇ．Ａ．，Ｄａｔｔａ，Ｍ．Ｓ．，Ｕｎｇ，Ｗ．Ｌ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，Ａ．Ｋ．，Ｒｏｔｅｍ，Ａ．，Ｃｈａｎｇ，Ａ．，Ｎｅｗｂｙ，Ｇ．Ａ．，Ｗｅｉｔｚ，Ｄ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．Ｃｒｏｓｓ−ｋｉｎｇｄｏｍ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  ｄｒｉｖｅｓ  ａ  ｈｅｒｉｔａｂｌｅ，ｍｕｔｕａｌｌｙ  ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ  ｐｒｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｃｅｌｌ  １５８，１０８３−１０９３．
Ｊｅｏｎ，Ｃ．Ｊ．，Ｓｔｒｅｔｔｏｉ，Ｅ．，ａｎｄ  Ｍａｓｌａｎｄ，Ｒ．Ｈ．（１９９８）．Ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｃｅｌｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｒｅｔｉｎａ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ：ｔｈｅ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １８，８９３６−８９４６．
Ｋａｄｏｎａｇａ，Ｊ．Ｔ．（１９９１）．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ＤＮＡ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２０８，１０−２３．
Ｋａｙ，Ｊ．Ｎ．，Ｖｏｉｎｅｓｃｕ，Ｐ．Ｅ．，Ｃｈｕ，Ｍ．Ｗ．，ａｎｄ  Ｓａｎｅｓ，Ｊ．Ｒ．（２０１１）．Ｎｅｕｒｏｄ６  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄｅｆｉｎｅｓ  ｎｅｗ  ｒｅｔｉｎａｌ  ａｍａｃｒｉｎｅ  ｃｅｌｌ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅｉｒ  ｆａｔｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １４，９６５−９７２．
Ｋｈａｒｃｈｅｎｋｏ，Ｐ．Ｖ．，Ｓｉｌｂｅｒｓｔｅｉｎ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｓｃａｄｄｅｎ，Ｄ．Ｔ．（２０１４）．Ｂａｙｅｓｉａｎ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  １１，７４０−７４２．
Ｋｉｖｉｏｊａ，Ｔ．，Ｖａｈａｒａｕｔｉｏ，Ａ．，Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｋ．，Ｂｏｎｋｅ，Ｍ．，Ｅｎｇｅ，Ｍ．，Ｌｉｎｎａｒｓｓｏｎ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｔａｉｐａｌｅ，Ｊ．（２０１２）．Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｎｕｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｕｎｉｑｕｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｅｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ９，７２−７４．
Ｋｕｒｉｍｏｔｏ，Ｋ．，Ｙａｂｕｔａ，Ｙ．，Ｏｈｉｎａｔａ，Ｙ．，Ｏｎｏ，Ｙ．，Ｕｎｏ，Ｋ．Ｄ．，Ｙａｍａｄａ，Ｒ．Ｇ．，Ｕｅｄａ，Ｈ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｓａｉｔｏｕ，Ｍ．（２００６）．Ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｃＤＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３４，ｅ４２．
Ｌａｒｅｕ，Ｒ．Ｒ．，Ｈａｒｖｅ，Ｋ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｒａｇｈｕｎａｔｈ，Ｍ．（２００７）．Ｅｍｕｌａｔｉｎｇ  ａ  ｃｒｏｗｄｅｄ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｄｒａｍａｔｉｃａｌｌｙ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ３６３，１７１−１７７．
Ｌｅｅｋ，Ｊ．Ｔ．，ａｎｄ  Ｓｔｏｒｅｙ，Ｊ．Ｄ．（２０１１）．Ｔｈｅ  ｊｏｉｎｔ  ｎｕｌｌ  ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ  ｔｅｓｔｓ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０，１−２２．
Ｌｕｏ，Ｌ．，Ｃａｌｌａｗａｙ，Ｅ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｓｖｏｂｏｄａ，Ｋ  （２００８）．Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｒａｌ  ｃｉｒｃｕｉｔｓ．Ｎｅｕｒｏｎ  ５７，６３４−６６０．
Ｍａｏ，Ｃ．Ａ．，Ｌｉ，Ｈ．，Ｚｈａｎｇ，Ｚ．，Ｋｉｙａｍａ，Ｔ．，Ｐａｎｄａ，Ｓ．，Ｈａｔｔａｒ，Ｓ．，Ｒｉｂｅｌａｙｇａ，Ｃ．Ｐ．，Ｍｉｌｌｓ，Ｓ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｗａｎｇ，Ｓ．Ｗ．（２０１４）．Ｔ−ｂｏｘ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  Ｔｂｒ２  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  Ｏｐｎ４／ｍｅｌａｎｏｐｓｉｎ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｉｎｔｒｉｎｓｉｃａｌｌｙ  ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｇａｎｇｌｉｏｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ：ｔｈｅ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ３４，１３０８３−１３０９５．
Ｍａｓｌａｎｄ，Ｒ．Ｈ．（２０１２）．Ｔｈｅ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｔｉｎａ．Ｎｅｕｒｏｎ  ７６，２６６−２８０．
Ｍａｓｌａｎｄ，Ｒ．Ｈ．，ａｎｄ  Ｓａｎｅｓ，Ｊ．Ｒ．（２０１５）．Ｒｅｔｉｎａｌ  ｇａｎｇｌｉｏｎ  ｃｅｌｌ  ｔｙｐｅｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｔａｔｅｓ  ａｎｄ  ｌｅｓｓｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎ．Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ．
Ｍａｚｕｔｉｓ，Ｌ．，Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｊ．，Ｕｎｇ，Ｗ．Ｌ．，Ｗｅｉｔｚ，Ｄ．Ａ．，Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ａ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｈｅｙｍａｎ，Ｊ．Ａ．（２０１３）．Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｏｒｔｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｄｒｏｐｌｅｔ−ｂａｓｅｄ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ８，８７０−８９１．
ＭｃＣａｒｒｏｌｌ，Ｓ．Ａ．，Ｆｅｎｇ，Ｇ．，ｎｄ  Ｈｙｍａｎ，Ｓ．Ｅ．（２０１４）．Ｇｅｎｏｍｅ−ｓｃａｌｅ  ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｔｉｃｓ：ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｅａｎｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ  ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １７，７５６−７６３．
ＭｃＤａｖｉｄ，Ａ．，Ｆｉｎａｋ，Ｇ．，Ｃｈａｔｔｏｐａｄｙａｙ，Ｐ．Ｋ．，Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，Ｍ．，Ｌａｍｏｒｅａｕｘ，Ｌ．，Ｍａ，Ｓ．Ｓ．，Ｒｏｅｄｅｒｅｒ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｏｔｔａｒｄｏ，Ｒ．（２０１３）．Ｄａｔａ  ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ，ｑｕａｌｉｔｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｉｎ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｑＰＣＲ−ｂａｓｅｄ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２９，４６１−４６７．
ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｊ．Ｃ．，Ｄｕｆｆｙ，Ｄ．Ｃ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．，Ｃｈｉｕ，Ｄ．Ｔ．，Ｗｕ，Ｈ．，Ｓｃｈｕｅｌｌｅｒ，Ｏ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ｇ．Ｍ．（２０００）．Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｉｎ  ｐｏｌｙ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２１，２７−４０．
Ｍｉｌｌｓ，Ｓ．Ｌ．，Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｊ．Ｊ．，Ｌｉ，Ｗ．，Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｍａｓｓｅｙ，Ｓ．Ｃ．（２００１）．Ｒｏｄ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｒｅｔｉｎａ  ｕｓｅ  ｃｏｎｎｅｘｉｎ  ３６．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ４３６，３３６−３５０．
Ｐｅｒｅｓ−Ｎｅｔｏ，Ｐ．Ｒ．，Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｄ．Ａ．，ａｎｄ  Ｓｏｍｅｒｓ，Ｋ．Ｍ．（２００５）．Ｈｏｗ  ｍａｎｙ  ｐｒｉｎｃｉｐａｌ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ？  ｓｔｏｐｐｉｎｇ  ｒｕｌｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｔｒｉｖｉａｌ  ａｘｅｓ  ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ４９，９７４−９９７．
Ｐｅｔｉｌｌａ  Ｉｎｔｅｒｎｅｕｒｏｎ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ，Ｇ．，Ａｓｃｏｌｉ，Ｇ．Ａ．，Ａｌｏｎｓｏ−Ｎａｎｃｌａｒｅｓ，Ｌ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓ．Ａ．，Ｂａｒｒｉｏｎｕｅｖｏ，Ｇ．，Ｂｅｎａｖｉｄｅｓ−Ｐｉｃｃｉｏｎｅ，Ｒ．，Ｂｕｒｋｈａｌｔｅｒ，Ａ．，Ｂｕｚｓａｋｉ，Ｇ．，Ｃａｕｌｉ，Ｂ．，Ｄｅｆｅｌｉｐｅ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（２００８）．Ｐｅｔｉｌｌａ  ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ：ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ＧＡＢＡｅｒｇｉｃ  ｉｎｔｅｒｎｅｕｒｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｃｏｒｔｅｘ．Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ９，５５７−５６８．
Ｐｉｃｅｌｌｉ，Ｓ．，Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄ，Ａ．Ｋ．，Ｆａｒｉｄａｎｉ，Ｏ．Ｒ．，Ｓａｇａｓｓｅｒ，Ｓ．，Ｗｉｎｂｅｒｇ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｓａｎｄｂｅｒｇ，Ｒ．（２０１３）．Ｓｍａｒｔ−ｓｅｑ２  ｆｏｒ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｉｎ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  １０，１０９６−１０９８．
Ｐｏｌｌｅｎ，Ａ．Ａ．，Ｎｏｗａｋｏｗｓｋｉ，Ｔ．Ｊ．，Ｓｈｕｇａ，Ｊ．，Ｗａｎｇ，Ｘ．，Ｌｅｙｒａｔ，Ａ．Ａ．，Ｌｕｉ，Ｊ．Ｈ．，Ｌｉ，Ｎ．，Ｓｚｐａｎｋｏｗｓｋｉ，Ｌ．，Ｆｏｗｌｅｒ，Ｂ．，Ｃｈｅｎ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．Ｌｏｗ−ｃｏｖｅｒａｇｅ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｍＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｃｏｒｔｅｘ．Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．
Ｐｒｏｖｉｓ，Ｊ．Ｍ．，Ｄｉａｚ，Ｃ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｐｅｎｆｏｌｄ，Ｐ．Ｌ．（１９９６）．Ｍｉｃｒｏｇｌｉａ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｔｉｎａ：ａ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｏｎｔｏｇｅｎｉｅｓ．Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｏｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３，２１３−２２２．
Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｍ．Ｒ．，Ｓｒｉｎｉｖａｓ，Ｍ．，Ｆｏｒｒｅｓｔ，Ｄ．，Ｍｏｒｒｅａｌｅ  ｄｅ  Ｅｓｃｏｂａｒ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｒｅｈ，Ｔ．Ａ．（２００６）．Ｍａｋｉｎｇ  ｔｈｅ  ｇｒａｄｉｅｎｔ：ｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｃｏｎｅ  ｏｐｓｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｍｏｕｓｅ  ｒｅｔｉｎａ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０３，６２１８−６２２３．
Ｓａｎｅｓ，Ｊ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｚｉｐｕｒｓｋｙ，Ｓ．Ｌ．（２０１０）．Ｄｅｓｉｇｎ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｉｎｓｅｃｔ  ａｎｄ  ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  ｖｉｓｕａｌ  ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｎｅｕｒｏｎ  ６６，１５−３６．
Ｓｈａｌｅｋ，Ａ．Ｋ．，Ｓａｔｉｊａ，Ｒ．，Ａｄｉｃｏｎｉｓ，Ｘ．，Ｇｅｒｔｎｅｒ，Ｒ．Ｓ．，Ｇａｕｂｌｏｍｍｅ，Ｊ．Ｔ．，Ｒａｙｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｒ．，Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｓ．，Ｙｏｓｅｆ，Ｎ．，Ｍａｌｂｏｅｕｆ，Ｃ．，Ｌｕ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｂｉｍｏｄａｌｉｔｙ  ｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４９８，２３６−２４０．
Ｓｈａｌｅｋ，Ａ．Ｋ．，Ｓａｔｉｊａ，Ｒ．，Ｓｈｕｇａ，Ｊ．，Ｔｒｏｍｂｅｔｔａ，Ｊ．Ｊ．，Ｇｅｎｎｅｒｔ，Ｄ．，Ｌｕ，Ｄ．，Ｃｈｅｎ，Ｐ．，Ｇｅｒｔｎｅｒ，Ｒ．Ｓ．，Ｇａｕｂｌｏｍｍｅ，Ｊ．Ｔ．，Ｙｏｓｅｆ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ＲＮＡ−ｓｅｑ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｐａｒａｃｒｉｎｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ５１０，３６３−３６９．
Ｓｈｅｋｈａｒ，Ｋ．，Ｂｒｏｄｉｎ，Ｐ．，Ｄａｖｉｓ，Ｍ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ，Ａ．Ｋ．（２０１４）．Ａｕｔｏｍａｔｉｃ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  Ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ  Ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ（ＡＣＣＥＮＳＥ）．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １１１，２０２−２０７．
Ｓｉｅｇｅｒｔ，Ｓ．，Ｃａｂｕｙ，Ｅ．，Ｓｃｈｅｒｆ，Ｂ．Ｇ．，Ｋｏｈｌｅｒ，Ｈ．，Ｐａｎｄａ，Ｓ．，Ｌｅ，Ｙ．Ｚ．，Ｆｅｈｌｉｎｇ，Ｈ．Ｊ．，Ｇａｉｄａｔｚｉｓ，Ｄ．，Ｓｔａｄｌｅｒ，Ｍ．Ｂ．，ａｎｄ  Ｒｏｓｋａ，Ｂ．（２０１２）．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｃｏｄｅ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｍａｐ  ｆｏｒ  ａｄｕｌｔ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｔｙｐｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １５，４８７−４９５，Ｓ４８１−４８２．
Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｓ．Ｃ．，Ｐａｎｄｅｙ，Ｄ．，Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｎ．Ｐ．，ａｎｄ  Ｂａｊｐａｉ，Ｓ．Ｐ．（２００８）．ＲＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ  ｆｏｒ  ＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ．Ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ，ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅｓ  ａｎｄ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ＲＮＡ  ａｔ  ｔｈｅ  ３’−ｅｎｄ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｓｅｒｉｅｓ，１０３−１０４．
Ｓｔａｒｃｋｘ，Ｓ．，Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｓｔｅｅｎ，Ｐ．Ｅ．，Ｖｅｒｂｅｅｋ，Ｒ．，ｖａｎ  Ｎｏｏｒｔ，Ｊ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｏｐｄｅｎａｋｋｅｒ，Ｇ．（２００３）．Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｒａｔｉｏｎａｌｅ  ｆｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ  Ｂ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ＭＭＰ−９  ｄｅｓｔｒｏｙｓ  ａｌｐｈａ  Ｂ−ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｒａｔｅｓ  ａ  ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４１，４７−５７．
Ｓｚｅｌ，Ａ．，Ｌｕｋａｔｓ，Ａ．，Ｆｅｋｅｔｅ，Ｔ．，Ｓｚｅｐｅｓｓｙ，Ｚ．，ａｎｄ  Ｒｏｈｌｉｃｈ，Ｐ．（２０００）．Ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｔｉｎａｓ  ｏｆ  ｓｕｂｐｒｉｍａｔｅ  ｍａｍｍａｌｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ａ，Ｏｐｔｉｃｓ，ｉｍａｇｅ  ｓｃｉｅｎｃｅ，ａｎｄ  ｖｉｓｉｏｎ  １７，５６８−５７９．
Ｔａｎｇ，Ｆ．，Ｂａｒｂａｃｉｏｒｕ，Ｃ．，Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｎｏｒｄｍａｎ，Ｅ．，Ｌｅｅ，Ｃ．，Ｘｕ，Ｎ．，Ｗａｎｇ，Ｘ．，Ｂｏｄｅａｕ，Ｊ．，Ｔｕｃｈ，Ｂ．Ｂ．，Ｓｉｄｄｉｑｕｉ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２００９）．ｍＲＮＡ−Ｓｅｑ  ｗｈｏｌｅ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ６，３７７−３８２．
Ｔｈｏｒｓｅｎ，Ｔ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｒ．Ｗ．，Ａｒｎｏｌｄ，Ｆ．Ｈ．，ａｎｄ  Ｑｕａｋｅ，Ｓ．Ｒ．（２００１）．Ｄｙｎａｍｉｃ  ｐａｔｔｅｒｎ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｖｅｓｉｃｌｅ−ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｄｅｖｉｃｅ．Ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｌｅｔｔｅｒｓ  ８６，４１６３−４１６６．
Ｕｍｂａｎｈｏｗａｒ，Ｐ．Ｂ．Ｐ．，Ｖ．；Ｗｅｉｔｚ，Ｄ．Ａ．（２０００）．Ｍｏｎｏｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｅｍｕｌｓｉｏｎ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｖｉａ  Ｄｒｏｐ  Ｂｒｅａｋ  Ｏｆｆ  ｉｎ  ａ  Ｃｏｆｌｏｗｉｎｇ  Ｓｔｒｅａｍ．Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １６，３４７−３５１．
Ｕｔａｄａ，Ａ．Ｓ．，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｎｉｅｖｅｓ，Ａ．，Ｓｔｏｎｅ，Ｈ．Ａ．，ａｎｄ  Ｗｅｉｔｚ，Ｄ．Ａ．（２００７）．Ｄｒｉｐｐｉｎｇ  ｔｏ  ｊｅｔｔｉｎｇ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｃｏｆｌｏｗｉｎｇ  ｌｉｑｕｉｄ  ｓｔｒｅａｍｓ．Ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｌｅｔｔｅｒｓ  ９９，０９４５０２．
ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍａａｔｅｎ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｈｉｎｔｏｎ，Ｇ．（２００８）．Ｖｉｓｕａｌｉｚｉｎｇ  Ｄａｔａ  ｕｓｉｎｇ  ｔ−ＳＮＥ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ９，２５７９−２６０５．
Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．，ａｎｄ  Ｋｉｎｚｌｅｒ，Ｋ．Ｗ．（１９９９）．Ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９６，９２３６−９２４１．
Ｗｅｔｍｕｒ，Ｊ．Ｇ．，ａｎｄ  Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｎ．（１９６８）．Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｒｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ３１，３４９−３７０．
Ｗｈｉｔｅ，Ａ．Ｋ．，ＶａｎＩｎｓｂｅｒｇｈｅ，Ｍ．，Ｐｅｔｒｉｖ，Ｏ．Ｉ．，Ｈａｍｉｄｉ，Ｍ．，Ｓｉｋｏｒｓｋｉ，Ｄ．，Ｍａｒｒａ，Ｍ．Ａ．，Ｐｉｒｅｔ，Ｊ．，Ａｐａｒｉｃｉｏ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｈａｎｓｅｎ，Ｃ．Ｌ．（２０１１）．Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ＲＴ−ｑＰＣＲ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０８，１３９９９−１４００４．
Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ，Ｍ．Ｌ．，Ｓｈｅｒｌｏｃｋ，Ｇ．，Ｓａｌｄａｎｈａ，Ａ．Ｊ．，Ｍｕｒｒａｙ，Ｊ．Ｉ．，Ｂａｌｌ，Ｃ．Ａ．，Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｋ．Ｅ．，Ｍａｔｅｓｅ，Ｊ．Ｃ．，Ｐｅｒｏｕ，Ｃ．Ｍ．，Ｈｕｒｔ，Ｍ．Ｍ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｐ．Ｏ．，ｅｔ  ａｌ．（２００２）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｐｅｒｉｏｄｉｃａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  １３，１９７７−２０００．
Ｙａｎｇ，Ｙ．，ａｎｄ  Ｃｖｅｋｌ，Ａ．（２００５）．Ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ａｌｐｈａＡ−ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｌｅｎｓ  ｖｉａ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐａｘ６  ａｎｄ  ｃ−Ｍａｆ  ｔｏ  ｉｔｓ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ３５１，４５３−４６９．
Ｚｈｕ，Ｙ．Ｙ．，Ｍａｃｈｌｅｄｅｒ，Ｅ．Ｍ．，Ｃｈｅｎｃｈｉｋ，Ａ．，Ｌｉ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｓｉｅｂｅｒｔ，Ｐ．Ｄ．（２００１）．Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ：ａ  ＳＭＡＲＴ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３０，８９２−８９７．
【０４４５】
このように本発明の好ましい実施形態を詳述してきたが、上記段落により定義される本発明は、本発明の趣旨からも範囲からも逸脱せずに多くの明らかなその変法が考えられるため、上記詳細な説明に記載の特定の詳細に限定されないことを理解すべきである。
【図１】
2017532024.tif 000168
【図２】
2017532024.tif 000169
【図３】
2017532024.tif 000170
【図４】
2017532024.tif 000171
【図５】
2017532024.tif 000172
【図６】
2017532024.tif 000173
【図７】
2017532024.tif 000174
【図８】
2017532024.tif 000175
【図９】
2017532024.tif 000176
【図１０】
2017532024.tif 000177
【図１１】
2017532024.tif 000178
【図１２】
2017532024.tif 000179
【図１３】
2017532024.tif 000180
【図１４】
2017532024.tif 000181
【図１５】
2017532024.tif 000182
【図１６】
2017532024.tif 000183
【図１７】
2017532024.tif 000184
【図１８】
2017532024.tif 000185
【図１９】
2017532024.tif 000186
【図２０】
2017532024.tif 000187
【図２１】
2017532024.tif 000188
【配列表】
2017532024000001.app
【国際調査報告】
2017532024.tif 000189
2017532024.tif 000190
2017532024.tif 000191
2017532024.tif 000192
2017532024.tif 000193