(57)【要約】  本発明は、標的遺伝子配列及び関連した遺伝子産物の発現を変更するための系、方法、及び組成物を提供する。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のＣａｓタンパク質についての構造情報、ＣＲＩＳＰＲ複合体の改変された構成成分の作製におけるこの情報の使用、ＣＲＩＳＰＲ複合体の１つ以上の構成成分又は改変された構成成分をコードするベクター及びベクター系、並びにこのようなベクター及び構成成分の設計及び使用のための方法が提供される。また、真核細胞におけるＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を誘導する方法及びＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を利用する方法も提供される。特に、本発明は、最適化されたモジュラーＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ酵素系のエンジニアリングを包含する。
2017503485.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然に存在しない又はエンジニアリングされた誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系であって：
誘導性二量体の第１の半分に付着した第１のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物及び
前記誘導性二量体の第２の半分に付着した第２のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物を含み、
前記第１のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物が、１つ以上の核局在化シグナルに機能的に連結され、
前記第２のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物が、１つ以上の核外移行シグナルに機能的に連結され、
誘導物質エネルギー源に接触すると、前記誘導性二量体の第１の半分と第２の半分が１つになり、
前記誘導性二量体の第１の半分と第２の半分が１つになることにより、前記第１及び前記第２のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物が機能的ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を構成することが可能となり、
前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系が、細胞内の目的のゲノム遺伝子座における標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列を含むガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含み、
前記機能的ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系が前記標的配列に結合し、かつ任意に、前記ゲノム遺伝子座を編集して遺伝子発現を変更する、誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系。
【請求項２】
前記誘導性二量体が誘導性ヘテロ二量体である、請求項１に記載の誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系。
【請求項３】
前記誘導性ヘテロ二量体の第１の半分がＦＫＢＰであり、任意にＦＫＢＰ１２である、請求項２に記載の誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系。
【請求項４】
前記誘導性ヘテロ二量体の第２の半分がＦＲＢである、請求項２に記載の誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系。
【請求項５】
前記第１のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物の配列が、Ｎ’末端Ｃａｓ９部分−ＦＲＢ−ＮＥＳである、請求項４に記載の誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系。
【請求項６】
前記第１のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物の配列が、ＮＥＳ−Ｎ’末端Ｃａｓ９部分−ＦＲＢ−ＮＥＳである、請求項５に記載の誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系。
【請求項７】
前記第２のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物の配列が、Ｃ’末端Ｃａｓ９部分−ＦＫＢＰ−ＮＬＳである、請求項３に記載の誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系。
【請求項８】
前記第２のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物の配列が、ＮＬＳ−Ｃ’末端Ｃａｓ９部分−ＦＫＢＰ−ＮＬＳである、請求項７に記載の誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系。
【請求項９】
リンカーが、前記Ｃａｓ９と前記誘導性二量体の半分を分離している、請求項５〜８のいずれか１項に記載の誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系。
【請求項１０】
前記誘導物質エネルギー源がラパマイシンである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系。
【請求項１１】
前記誘導性二量体が誘導性ホモ二量体である、請求項１に記載の誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系。
【請求項１２】
前記ＣＲＩＳＰＲ酵素がＣａｓ９である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系。
【請求項１３】
前記ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳｐＣａｓ９である、請求項１〜１２のいずれか１項記載の誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系。
【請求項１４】
前記Ｃａｓ９が、ＳｐＣａｓ９における次のスプリット点：２０２Ａ／２０３Ｓ間のスプリット位置；２５５Ｆ／２５６Ｄ間のスプリット位置；３１０Ｅ／３１１Ｉ間のスプリット位置；５３４Ｒ／５３５Ｋ間のスプリット位置；５７２Ｅ／５７３Ｃ間のスプリット位置；７１３Ｓ／７１４Ｇ間のスプリット位置；１００３Ｌ／１０４Ｅ間のスプリット位置；１０５４Ｇ／１０５５Ｅ間のスプリット位置；１１１４Ｎ／１１１５Ｓ間のスプリット位置；１１５２Ｋ／１１５３Ｓ間のスプリット位置；１２４５Ｋ／１２４６Ｇ間のスプリット位置；又は１０９８と１０９９との間のスプリット位置のいずれか１つのスプリット位置で２つの部分に分割される、請求項１〜１３のいずれか１項記載の誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系。
【請求項１５】
１つ以上の機能的ドメインが、前記Ｃａｓ９酵素の一方又は両方の部分に関連し、前記機能的ドメインが任意に、転写アクチベーター、転写、又はヌクレアーゼ、例えば、Ｆｏｋ１ヌクレアーゼを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系。
【請求項１６】
前記機能的ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系が、前記標的配列に結合し、前記酵素が、ｄｅａｄＣａｓ９であり、任意に、少なくとも１つの突然変異も有していないＣＲＩＳＰＲ酵素と比較して少なくとも９７％又は１００％のヌクレアーゼ活性の低下を有する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系。
【請求項１７】
前記ｄｅａｄＣａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ酵素）が、２つ以上の突然変異を含み、ＳｐＣａｓ９タンパク質又は任意の対応するオーソログにおけるＤ１０、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、又はＤ９８６、又はＳａＣａｓ９タンパク質におけるＮ５８０の２つ以上が突然変異している、又は前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が、少なくとも１つの突然変異を含み、少なくともＨ８４０が突然変異している、請求項１６に記載の誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載の、誘導性二量体の第１の半分に付着し、かつ１つ以上の核局在化シグナルに機能的に連結された、第１のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物の送達ベクター。
【請求項２０】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載の、誘導性二量体の第２の半分に付着し、かつ１つ以上の核外移行シグナルに機能的に連結された、第２のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物の送達ベクター。
【請求項２１】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載の、誘導性二量体の第１の半分に付着し、かつ１つ以上の核局在化シグナルに機能的に連結された、第１のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物；及び請求項１〜１８のいずれか１項に記載の、誘導性二量体の第２の半分に付着し、かつ１つ以上の核外移行シグナルに機能的に連結された、第２のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物の両方の送達ベクター。
【請求項２２】
単一プラスミド又は発現カセットである、請求項２１に記載のベクター。
【請求項２３】
請求項１９〜２２のいずれか１項に記載のベクターで形質転換された、又は請求項１〜１７のいずれか１項に記載の誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を発現する真核宿主細胞又は細胞株。
【請求項２４】
請求項１９〜２２のいずれか１項に記載のベクターで形質転換された、又は請求項１〜１７のいずれか１項に記載の誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を発現するトランスジェニック生物又はその子孫。
【請求項２５】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を構成的に発現するモデル生物。
【請求項２６】
天然に存在しない又はエンジニアリングされた誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系であって：
誘導性ヘテロ二量体の第１の半分に付着した第１のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物及び
前記誘導性ヘテロ二量体の第２の半分に付着した第２のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物を含み、
前記第１のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物が、１つ以上の核局在化シグナルに機能的に連結され、
前記第２のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物が、核外移行シグナルに機能的に連結され、
誘導物質エネルギー源に接触すると、前記誘導性ヘテロ二量体の第１の半分と第２の半分が１つになり、
前記誘導性ヘテロ二量体の第１の半分と第２の半分が１つになることにより、前記第１及び前記第２のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物が機能的ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を構成することが可能となり、
前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系が、細胞内の目的のゲノム遺伝子座の標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列を含むガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含み、
前記機能的ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系が、前記ゲノム遺伝子座を編集して遺伝子発現を変更する、誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系。
【請求項２７】
処置を必要とする対象を処置する方法であって、請求項１８に記載のポリヌクレオチド又は請求項１９〜２２のいずれか１項に記載のベクターを用いて前記対象を形質転換し、そして前記対象に誘導物質エネルギー源を投与することによって遺伝子編集を誘導するステップを含む、方法。
【請求項２８】
修復鋳型も提供され、前記修復鋳型が、例えば、前記修復鋳型を含むベクターによって送達される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
処置を必要とする対象を処置する方法であって、請求項１８に記載のポリヌクレオチド又は請求項１９〜２２のいずれか１項に記載のベクターを用いて前記対象を形質転換することによって転写の活性化又は抑制を誘導するステップを含み、前記ポリヌクレオチド又は前記ベクターが、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ酵素及び請求項１５に記載の１つ以上の関連した機能的ドメインをコードする又は含み；前記対象に誘導物質エネルギー源を投与するステップをさらに含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願及び／又は参照による組み入れ
本出願は、２０１３年１２月１２日出願の米国仮特許出願第６１／９１５，２６７号明細書、２０１４年２月１２日出願の米国仮特許出願第６１／９３９，２２８号明細書の優先権を主張するものである。
【０００２】
上記の出願、及びこれらの出願で引用される又はこれらの出願の審査中に引用される全ての文献（「出願引用文献」）、及びこの出願引用文献において引用又は参照される全ての文献、及び本明細書において引用又は参照される全ての文献（「本明細書引用文献」）、及び本明細書の引用文献において引用又は参照される全ての文献は、本明細書において又は本明細書での参照により組み入れられる任意の文献において述べられる任意の製品についての任意の製造者の指示書、説明書、製品仕様書、及び製品シートと共に、参照により本明細書に組み入れられ、かつ本発明の実施に利用することができる。より具体的には、全ての参照文献は、それぞれ個々の文献が具体的かつ個別に参照により組み入れられることが示されるのと同程度に参照により組み入れられる。
【０００３】
本発明は、一般に、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）及びその構成成分に関連するベクター系を使用することができる配列標的化、例えば、ゲノム摂動（ｇｅｎｏｍｅ  ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）又は遺伝子編集を含む遺伝子発現の制御に使用される系、方法、及び組成物に関する。特に、本発明は、最適化モジュラーＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ酵素系のエンジニアリングを包含する。
【０００４】
連邦政府により資金提供された研究の記載
本発明は、米国立衛生研究所によって助成されたＮＩＨパイオニア賞ＤＰ１ＭＨ１００７０６の下、政府支援によってなされた。米国政府は本発明の一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００５】
ゲノムシーケンシング技術及び分析法の近年の進歩により、多様な範囲の生物学的機能及び疾患に関連する遺伝因子を分類及びマッピングする技能が顕著に加速されている。正確なゲノム標的化技術は、個々の遺伝子エレメントの選択的摂動を可能とすることにより原因遺伝子変異体の体系的なリバースエンジニアリングを可能とするため、並びに合成生物学、バイオテクノロジー用途、及び医薬用途を進歩させるために必要とされる。ゲノム編集技術、例えば、デザイナー亜鉛フィンガー、転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）、又はホーミングメガヌクレアーゼが、標的化されるゲノム摂動の産生に利用可能であるが、安価で、設定が容易で、スケーラブルで、真核ゲノム内の複数の位置を標的化しやすい新たなゲノム工学技術が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
多様な用途の配列標的化のための代替的でロバストな系及び技術が強く要望されている。本発明は、この要望に対処し、関連する利点を提供する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ又はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系（両方の語は、本出願全体に亘って互換的に使用される）は、特定の配列を標的化するためにカスタム化タンパク質の生成を必要としないが、単一Ｃａｓ酵素を、短鎖ＲＮＡ分子によってプログラムして特定のＤＮＡ標的を認識することができ、言い換えると、Ｃａｓ酵素は、前記短鎖ＲＮＡ分子を用いて特定のＤＮＡ標的にリクルートすることができる。ゲノムシーケンシング技術及び分析法のレパートリーへのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の追加により、方法論を著しく容易にし、多様な範囲の生物学的機能及び疾患に関連する遺伝因子を分類及びマッピングする技能が加速することができる。有害な影響なしでゲノム編集にＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を有効に利用するため、特許請求される本発明の態様であるこれらのゲノム工学ツールのエンジニアリング及び最適化の態様を理解することが重要である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一態様では、本発明は、天然に存在しない又はエンジニアリングされた誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を提供し、この誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は：
誘導性二量体の第１の半分に付着した第１のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物及び
誘導性二量体の第２の半分に付着した第２のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物を含み、
第１のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物が、１つ以上の核局在化シグナルに機能的に連結され、
第２のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物が、１つ以上の核外移行シグナルに機能的に連結され、
誘導物質エネルギー源に接触すると、誘導性二量体の第１の半分と第２の半分が１つになり、
誘導性二量体の第１の半分と第２の半分が１つになることにより、第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物が機能的ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を構成することが可能となり、
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系が、細胞内の目的のゲノム遺伝子座の標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列を含むガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含み、
機能的ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系が標的配列に結合し、かつ任意に、ゲノム遺伝子座を編集して遺伝子発現を変更する。
【０００８】
本発明の一態様では、誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系において、誘導性二量体は、誘導性ヘテロ二量体である、又は誘導性ヘテロ二量体を含む、又は誘導性ヘテロ二量体から本質的になる、又は誘導性ヘテロ二量体からなる。一態様では、誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系において、誘導性ヘテロ二量体の第１の半分、又は第１の部分、又は第１の断片は、ＦＫＢＰ、任意にＦＫＢＰ１２である、又はＦＫＢＰ、任意にＦＫＢＰ１２を含む、又はＦＫＢＰ、任意にＦＫＢＰ１２からなる、又はＦＫＢＰ、任意にＦＫＢＰ１２から本質的になる。本発明の一態様では、誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系において、誘導性ヘテロ二量体の第２の半分、又は第２の部分、又は第２の断片は、ＦＲＢである、又はＦＲＢを含む、又はＦＲＢからなる、又はＦＲＢから本質的になる。本発明の一態様では、誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系において、第１のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物の配列は、Ｎ’末端Ｃａｓ９部分−ＦＲＢ−ＮＥＳである、又はＮ’末端Ｃａｓ９部分−ＦＲＢ−ＮＥＳを含む、又はＮ’末端Ｃａｓ９部分−ＦＲＢ−ＮＥＳからなる、又はＮ’末端Ｃａｓ９部分−ＦＲＢ−ＮＥＳから本質的になる。本発明の一態様では、誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系において、第１のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物の配列は、ＮＥＳ−Ｎ’末端Ｃａｓ９部分−ＦＲＢ−ＮＥＳである、又はＮＥＳ−Ｎ’末端Ｃａｓ９部分−ＦＲＢ−ＮＥＳを含む、又はＮＥＳ−Ｎ’末端Ｃａｓ９部分−ＦＲＢ−ＮＥＳからなる、又はＮＥＳ−Ｎ’末端Ｃａｓ９部分−ＦＲＢ−ＮＥＳから本質的になる。本発明の一態様では、誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系において、第２のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物の配列は、Ｃ’末端Ｃａｓ９部分−ＦＫＢＰ−ＮＬＳである、又はＣ’末端Ｃａｓ９部分−ＦＫＢＰ−ＮＬＳを含む、又はＣ’末端Ｃａｓ９部分−ＦＫＢＰ−ＮＬＳから本質的になる、又はＣ’末端Ｃａｓ９部分−ＦＫＢＰ−ＮＬＳからなる。一態様では、本発明は、誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系における第２のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物の配列を提供し、この第２のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物の配列は、ＮＬＳ−Ｃ’末端Ｃａｓ９部分−ＦＫＢＰ−ＮＬＳである、又はＮＬＳ−Ｃ’末端Ｃａｓ９部分−ＦＫＢＰ−ＮＬＳを含む、又はＮＬＳ−Ｃ’末端Ｃａｓ９部分−ＦＫＢＰ−ＮＬＳからなる、又はＮＬＳ−Ｃ’末端Ｃａｓ９部分−ＦＫＢＰ−ＮＬＳから本質的になる。一態様では、誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系において、Ｃａｓ９部分を誘導性二量体の半分、又は部分、又は断片から分離するリンカーが存在し得る。一態様では、誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系において、誘導物質エネルギー源は、ラパマイシンである、又はラパマイシンを含む、又はラパマイシンから本質的になる、又はラパマイシンからなる。一態様では、誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系において、誘導性二量体は誘導性ホモ二量体である。一態様では、誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９、例えば、ＳｐＣａｓ９又はＳａＣａｓ９である。一態様では、誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系において、Ｃａｓ９は、ＳｐＣａｓ９における又は関連する次のスプリット点：２０２Ａ／２０３Ｓ間のスプリット位置；２５５Ｆ／２５６Ｄ間のスプリット位置；３１０Ｅ／３１１Ｉ間のスプリット位置；５３４Ｒ／５３５Ｋ間のスプリット位置；５７２Ｅ／５７３Ｃ間のスプリット位置；７１３Ｓ／７１４Ｇ間のスプリット位置；１００３Ｌ／１０４Ｅ間のスプリット位置；１０５４Ｇ／１０５５Ｅ間のスプリット位置；１１１４Ｎ／１１１５Ｓ間のスプリット位置；１１５２Ｋ／１１５３Ｓ間のスプリット位置；１２４５Ｋ／１２４６Ｇ間のスプリット位置；又は１０９８と１０９９との間のスプリット位置のいずれか１つのスプリット位置で２つの部分に分割される。一態様では、誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系において、１つ以上の機能的ドメインは、Ｃａｓ９酵素の一方又は両方の部分に関連し、例えば、機能的ドメインは任意に、転写アクチベーター、転写、又はヌクレアーゼ、例えば、Ｆｏｋ１ヌクレアーゼを含む。一態様では、誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系において、機能的ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、標的配列に結合し、酵素は、ｄｅａｄＣａｓ９であり、任意に、少なくとも１つの突然変異も有していないＣＲＩＳＰＲ酵素と比較して少なくとも９７％又は１００％のヌクレアーゼ活性の低下（又は３％以下及び有利には０％のヌクレアーゼ活性）を有する。一態様では、誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系において、ｄｅａｄＣａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ酵素）は、２つ以上の突然変異を含み、ＳｐＣａｓ９タンパク質又は任意の対応するオーソログにおけるＤ１０、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、又はＤ９８６、又はＳａＣａｓ９タンパク質におけるＮ５８０の２つ以上が突然変異している、又はＣＲＩＳＰＲ酵素が、少なくとも１つの突然変異を含み、例えば、少なくともＨ８４０が突然変異している。本発明は、本明細書に記載の誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系をコードするポリヌクレオチドをさらに包含し、かつ本発明の一態様は、このポリヌクレオチドを提供する。
【０００９】
ＣＲＩＳＰＲ酵素の突然変異に関連して、酵素がＳｐＣａｓ９でない場合は、突然変異は、ＳｐＣａｓ９の１０位、７６２位、８４０位、８５４位、８６３位、及び／又は９８６位に対応する任意の又は全ての残基で起こり得る（例えば、標準的な配列比較ツールによって確認することができる）。特に、ＳｐＣａｓ９では、任意の又は全ての以下の突然変異が好ましい：Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、及び／又はＤ９８６Ａ；さらに、任意の置換アミノ酸が保存的置換であることも想定される。一態様では、本発明は、本明細書に記載の任意の、又はそれぞれの、又は全ての実施形態を提供し、この実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素が、少なくとも１つ以上、又は少なくとも２つ以上の突然変異を含み、少なくとも１つ以上の突然変異又は少なくとも２つ以上の突然変異が、ＳｐＣａｓ９タンパク質におけるＤ１０、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、若しくはＤ９８６、例えば、ＳｐＣａｓ９におけるＤ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、及び／若しくはＤ９８６Ａ、例えば、ＳａＣａｓ９におけるＮ５８０Ａ、又はＳｐ若しくはＳａのオーソログのＣａｓ９における任意の対応する突然変異である、或いはＣＲＩＳＰＲ酵素が、少なくとも１つの突然変異を含み、少なくともＳｐＣａｓ９におけるＨ８４０若しくはＮ８６３Ａ又はＳａＣａｓ９におけるＮ５８０Ａが突然変異し；例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＳｐＣａｓ９タンパク質におけるＨ８４０Ａ、若しくはＤ１０Ａ及びＨ８４０Ａ、若しくはＤ１０Ａ及びＮ８６３Ａ、又はＳｐタンパク質若しくはＳａタンパク質のオーソログのＣａｓ９における任意の対応する突然変異を含む。
【００１０】
一態様では、本発明は、本明細書に記載の、誘導性二量体の第１の半分、又は第１の部分、又は第１の断片に付着し、かつ１つ以上の核局在化シグナルに機能的に連結された、第１のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物の送達ベクターを提供する。一態様では、本発明は、誘導性二量体の第２の半分、又は第２の部分、又は第２の断片に付着し、かつ１つ以上の核外移行シグナルに機能的に連結された、第２のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物の送達ベクターを提供する。
【００１１】
一態様では、本発明は、本明細書に記載の、誘導性二量体の第１の半分、又は第１の部分、又は第１の断片に付着し、かつ１つ以上の核局在化シグナルに機能的に連結された、第１のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物；及び本明細書に記載の、誘導性二量体の第２の半分、又は第２の部分、又は第２の断片に付着し、かつ１つ以上の核外移行シグナルに機能的に連結された、第２のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物の両方の送達ベクターを提供する。
【００１２】
一態様では、ベクターは、単一プラスミド又は発現カセットであり得る。
【００１３】
本発明は、一態様では、本明細書に記載の任意のベクターで形質転換された、又は本明細書に記載の誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を発現する真核宿主細胞又は細胞株を提供する。
【００１４】
本発明は、一態様では、本明細書に記載の任意のベクターで形質転換された、又は本明細書に記載の誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を発現するトランスジェニック生物又はその子孫を提供する。一態様では、本発明は、本明細書に記載の誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を構成的に発現するモデル生物を提供する。
【００１５】
一態様では、本発明は、天然に存在しない又はエンジニアリングされた誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を提供し、この誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は：
誘導性ヘテロ二量体の第１の半分に付着した第１のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物及び
誘導性ヘテロ二量体の第２の半分に付着した第２のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物を含み、
第１のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物が、１つ以上の核局在化シグナルに機能的に連結され、
第２のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物が、核外移行シグナルに機能的に連結され、
誘導物質エネルギー源に接触すると、誘導性ヘテロ二量体の第１の半分と第２の半分が１つになり、
誘導性ヘテロ二量体の第１の半分と第２の半分が１つになることにより、第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物が機能的ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を構成することが可能となり、
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系が、細胞内の目的のゲノム遺伝子座の標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列を含むガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含み、
機能的ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系が、ゲノム遺伝子座を編集して遺伝子発現を変更する。
【００１６】
一態様では、本発明は、処置を必要とする対象を処置する方法を提供し、この方法は、本明細書に記載のポリヌクレオチド又は本明細書に記載の任意のベクターを用いて対象を形質転換し、そして対象に誘導物質エネルギー源を投与することによって遺伝子編集を誘導するステップを含む。本発明は、薬剤の製造におけるこのようなポリヌクレオチド又はベクターの使用を包含し、例えば、このような薬剤は、対象を処置するため、又は対象を処置するためのこのような方法に使用される。一態様では、この方法において、修復鋳型も提供され、この修復鋳型は、例えば、前記修復鋳型を含むベクターによって送達される。
【００１７】
本発明は、処置を必要とする対象を処置する方法も提供し、この方法は、本明細書に記載のポリヌクレオチド又は本明細書に記載の任意のベクターを用いて対象を形質転換することによって転写の活性化又は抑制を誘導するステップを含み、このポリヌクレオチド又はベクターは、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ酵素及び本明細書に記載の１つ以上の関連した機能的ドメインをコードする又は含み；対象に誘導物質エネルギー源を投与するステップをさらに含む。
【００１８】
従って、本発明は、特に、例えば、突然変異によって本質的にヌクレアーゼ活性を有していないホモ二量体及びヘテロ二量体、ｄｅａｄＣａｓ９又はＣａｓ９、１つ以上のＮＬＳ及び／又は１つ以上のＮＥＳが存在する系又は複合体；ｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９に連結された機能的ドメイン；処置の方法を含む方法、及び使用を包含する。
【００１９】
本明細書でＣＲＩＳＰＲ酵素、Ｃａｓ、又はＣａｓタンパク質について言及する場合；これは本ｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９を含むことを理解されたい。一態様では、本発明は、遺伝子産物の発現を変更又は修正する方法を提供する。前記方法は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含み、かつ発現する細胞に、Ｃａｓタンパク質及びＤＮＡ分子を標的とするガイドＲＮＡを含むエンジニアリングされた天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を導入するステップを含み得、このガイドＲＮＡは、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を標的とし、このＣａｓタンパク質は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を切断し、これにより遺伝子産物の発現が変更され；かつ、このＣａｓタンパク質とガイドＲＮＡは、一緒には天然に存在しない。本発明は、ｔｒａｃｒ配列に融合したガイド配列を含むガイドＲＮＡを包含する。本発明は、真核細胞での発現のためにコドンが最適化されたＣａｓタンパク質をさらに包含する。好ましい一実施形態では、真核細胞は哺乳動物細胞であり、より好ましい一実施形態では、哺乳動物細胞はヒト細胞である。本発明のさらなる一実施形態では、遺伝子産物の発現が減少する。
【００２０】
一態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質及び細胞内の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を標的とするガイドＲＮＡを含む、エンジニアリングされた天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を提供し、このガイドＲＮＡは、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を標的とし、このＣａｓタンパク質は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を切断し、これにより遺伝子産物の発現が変更され；かつ、このＣａｓタンパク質とガイドＲＮＡは、一緒には天然に存在せず；これは本ｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９を含む。本発明は、ｔｒａｃｒ配列に融合したガイド配列を含むガイドＲＮＡを包含する。本発明の一実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質であり、好ましい一実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質であり；これは本ｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９を含む。本発明は、真核細胞での発現のためにコドンが最適化されたＣａｓタンパク質をさらに包含する。好ましい一実施形態では、真核細胞は哺乳動物細胞であり、より好ましい一実施形態では、哺乳動物細胞はヒト細胞である。本発明のさらなる一実施形態では、遺伝子産物の発現が減少する。
【００２１】
別の態様では、本発明は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を標的とするＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ガイドＲＮＡに機能的に連結された第１の調節エレメント、及びＣａｓタンパク質に機能的に連結された第２の調節エレメントを含む１つ以上のベクターを含む、エンジニアリングされた天然に存在しないベクター系を提供し；これは本ｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９を含む。構成成分（ａ）及び（ｂ）が、この系の同じ又は異なるベクターに位置しても良い。ガイドＲＮＡは、細胞内の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を標的とし、このＣａｓタンパク質は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を切断し、これにより遺伝子産物の発現が変更され；かつ、このＣａｓタンパク質とガイドＲＮＡは、一緒には天然に存在しない。本発明は、ｔｒａｃｒ配列に融合したガイド配列を含むガイドＲＮＡを包含する。本発明の一実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質であり、好ましい一実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質であり；これは本ｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９を含む。本発明は、真核細胞での発現のためにコドンが最適化されたＣａｓタンパク質をさらに包含する。好ましい一実施形態では、真核細胞は哺乳動物細胞であり、より好ましい一実施形態では、哺乳動物細胞はヒト細胞である。本発明のさらなる一実施形態では、遺伝子産物の発現が減少する。
【００２２】
一態様では、本発明は、１つ以上のベクターを含むベクター系を提供する。一部の実施形態では、この系は：（ａ）ｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ配列に機能的に連結された第１の調節エレメント、及びこのｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ配列の上流の１つ以上のガイド配列を挿入するための１つ以上の挿入部位であって、発現されると、このガイド配列が、ＣＲＩＳＰＲ複合体の真核細胞内の標的配列への配列特異的結合を誘導し、このＣＲＩＳＰＲ複合体が、（１）標的配列にハイブリダイズするガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含む、第１の調節エレメント及び１つ以上の挿入部位；並びに（ｂ）核局在化配列を含む前記ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に機能的に連結された第２の調節エレメントを含み；構成成分（ａ）及び（ｂ）が、この系の同じ又は異なるベクターに位置し；これは本ｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９を含む。一部の実施形態では、構成成分（ａ）は、第１の調節エレメントの制御下のｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ配列の下流のｔｒａｃｒ配列をさらに含む。一部の実施形態では、構成成分（ａ）は、第１の調節エレメントに機能的に連結された２つ以上のガイド配列をさらに含み、発現されると、２つ以上のガイド配列のそれぞれが、ＣＲＩＳＰＲ複合体の真核細胞内の異なる標的配列への配列特異的結合を誘導する。一部の実施形態では、この系は、第３の調節エレメント、例えば、ポリメラーゼＩＩＩプロモーターの制御下のｔｒａｃｒ配列を含む。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒ配列は、最適に整列されると、ｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ配列の長さに沿って少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％の配列相補性を示す。最適なアラインメントの決定は、当業者の知識の範囲内である。例えば、公表され市販されているアラインメントアルゴリズム及びプログラム、例えば、限定されるものではないが、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ  ｉｎ  ｍａｔｌａｂ、Ｂｏｗｔｉｅ、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ、Ｂｉｏｐｙｔｈｏｎ、及びＳｅｑＭａｎが存在する。
【００２３】
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記ＣＲＩＳＰＲ複合体の真核細胞内の核への検出可能な量の蓄積を促進するのに十分な強度の１つ以上の核局在化配列を含む。理論に拘束されることを望むものではないが、核局在化配列は、真核細胞ではＣＲＩＳＰＲ複合体の活性に必ずしも必要ではないが、このような配列を含めることにより、系の活性、特に核内での核酸分子の標的化を促進すると考えられる。
【００２４】
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素はＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系酵素である。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素はＣａｓ９酵素である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９酵素は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｃａｓ９、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９、又はサーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９であり、かつこれらの生物由来の突然変異Ｃａｓ９を含み得る。この酵素は、Ｃａｓ９ホモログ又はオーソログであり得る。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、真核細胞での発現のためにコドンが最適化されている。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の位置にある１つ又は２つの鎖の切断を誘導する。一部の実施形態では、第１の調節エレメントはポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。一部の実施形態では、第２の調節エレメントはポリメラーゼＩＩプロモーターである。一部の実施形態では、ガイド配列は、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５ヌクレオチド長、又は１０〜３０、又は１５〜２５、又は１５〜２０ヌクレオチド長である。
【００２５】
一般に、そして本明細書全体において、「ベクター」という語は、連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターとしては、限定されるものではないが、一本鎖、二本鎖、又は部分的に二本鎖の核酸分子；１つ以上の遊離末端を含む核酸分子、遊離末端を含まない（例えば、環状）核酸分子；ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は両方を含む核酸分子；並びに当該技術分野で公知の他の様々なポリヌクレオチドが挙げられる。１つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、プラスミドは、例えば、標準的な分子クローニング技術によって追加のＤＮＡセグメントを挿入することができる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別のタイプのベクターは、ウイルス由来ＤＮＡ又はＲＮＡ配列が、ウイルスへのパッケージングのためのベクター中に存在するウイルスベクターである（例えば、レトロウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス、及びアデノ関連ウイルス）。ウイルスベクターは、宿主細胞へのトランスフェクションのためにウイルスによって運ばれるポリヌクレオチドも含む。特定のベクターは、このベクターが導入された宿主細胞での自己複製が可能である（例えば、細菌複製起源を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）が、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、これにより宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、ベクターが機能的に連結された遺伝子の発現を誘導することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。組換えＤＮＡ技術に有用な一般的な発現ベクターは、多くの場合、プラスミドの形態である。
【００２６】
組換え発現ベクターは、宿主細胞での核酸の発現に適した形態の本発明の核酸を含み得る、つまり組換え発現ベクターは、１つ以上の調節エレメントを含むことを意味し、かつ発現に使用される宿主細胞に基づいて選択することができ、この調節エレメントは、発現される核酸配列に機能的に連結される。組換え発現ベクター内で「機能的に連結された」とは、目的のヌクレオチド配列が、（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系で、又はベクターが宿主細胞に導入される場合は宿主細胞で）このヌクレオチド配列の発現が可能となるように調節エレメントに連結されたことを意味するものとする。
【００２７】
「調節エレメント」という語は、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、及び他の発現制御エレメント（例えば、転写終結シグナル、例えば、ポリアデニル化シグナル及びポリ−Ｕ配列）を含むものとする。このような調節エレメントは、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）で説明されている。調節エレメントは、多数の種類の宿主細胞におけるヌクレオチド配列の構成的な発現を誘導する調節エレメント、及び特定の宿主細胞のみでのヌクレオチド配列の発現を誘導する調節エレメント（例えば、組織特異的調節配列）を含む。組織特異的プロモーターは、主として所望の目的の組織、例えば、筋肉、ニューロン、骨、皮膚、血液、特定の臓器（例えば、肝臓、膵臓）、又は特定の細胞型（例えば、リンパ球）での発現を誘導し得る。調節エレメントはまた、時間依存的に、例えば、細胞周期依存的に、又は発生段階依存的に発現を誘導することができ、この誘導は、組織特異的又は細胞型特異的であっても良いし、又はこのように特異的でなくても良い。一部の実施形態では、ベクターは、１つ以上のｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれ以上のｐｏｌ  Ｉプロモーター）、１つ以上のｐｏｌ  ＩＩプロモーター（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれ以上のｐｏｌ  ＩＩプロモーター）、１つ以上のｐｏｌ  Ｉプロモーター（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれ以上のｐｏｌ  Ｉプロモーター）、又はこれらの組み合わせを含む。ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの例として、限定されるものではないが、Ｕ６プロモーター及びＨ１プロモーターが挙げられる。ｐｏｌ  ＩＩプロモーターの例として、限定されるものではないが、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意にＲＳＶエンハンサーを含む）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意にＣＭＶエンハンサーを含む）［例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ，４１：５２１−５３０（１９８５）を参照されたい］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、及びＥＦ１αプロモーターが挙げられる。また、「調節エレメント」という語には、エンハンサーエレメント、例えば、ＷＰＲＥ；ＣＭＶエンハンサー；ＨＴＬＶ−ＩのＬＴＲにおけるＲ−Ｕ５’セグメント（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．８（１），ｐ．４６６−４７２，１９８８）；ＳＶ４０エンハンサー；及びウサギβ−グロビンのエキソン２と３との間のイントロン配列（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，Ｖｏｌ．７８（３），ｐ．１５２７−３１，１９８１）も包含される。当業者であれば、発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細の選択などの因子、望ましい発現レベルなどによって異なり得ることを理解されよう。ベクターを宿主細胞に導入し、これにより、本明細書に記載の核酸によってコードされる、融合タンパ��質又は融合ペプチドを含む転写物、タンパク質、又はペプチド（例えば、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）転写物、タンパク質、酵素、これらの突然変異型、これらの融合タンパク質など）を産生することができる。
【００２８】
有利なベクターは、レンチウイルス及びアデノ関連ウイルスを含み、このようなタイプのベクターは、特定の細胞型の標的化のために選択することもできる。
【００２９】
一態様では、本発明は、真核宿主細胞を提供し、この真核宿主細胞は：（ａ）ｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ配列に機能的に連結された第１の調節エレメント、及びこのｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ配列の上流の１つ以上のガイド配列を挿入するための１つ以上の挿入部位であって、発現されると、ガイド配列が、ＣＲＩＳＰＲ複合体の真核細胞内の標的配列への配列特異的結合を誘導し、このＣＲＩＳＰＲ複合体が、（１）標的配列にハイブリダイズするガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含む、第１の調節エレメント及び１つ以上の挿入部位；並びに／又は（ｂ）核局在化配列を含む前記ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に機能的に連結された第２の調節エレメントを含む。一部の実施形態では、この宿主細胞は、構成成分（ａ）及び（ｂ）を含む；これは本ｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９を含む。一部の実施形態では、構成成分（ａ）、構成成分（ｂ）、又は構成成分（ａ）及び（ｂ）は、宿主真核細胞のゲノムに安定に組み込まれる。一部の実施形態では、構成成分（ａ）は、第１の調節エレメントの制御下のｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ配列の下流のｔｒａｃｒ配列をさらに含む。一部の実施形態では、構成成分（ａ）は、第１の調節エレメントに機能的に連結された２つ以上のガイド配列をさらに含み、発現されると、２つ以上のガイド配列のそれぞれが、ＣＲＩＳＰＲ複合体の真核細胞内の異なる標的配列への配列特異的結合を誘導する。一部の実施形態では、この真核宿主細胞は、前記ｔｒａｃｒ配列に機能的に連結された第３の調節エレメント、例えば、ポリメラーゼＩＩＩプロモーターをさらに含む。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒ配列は、最適に整列されると、ｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ配列の長さに沿って少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％の配列相補性を示す。この酵素は、Ｃａｓ９ホモログ又はオーソログであり得る。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、真核細胞での発現のためにコドンが最適化されている。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の位置にある１つ又は２つの鎖の切断を誘導する。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡ鎖切断活性が欠損している。一部の実施形態では、第１の調節エレメントはポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。一部の実施形態では、第２の調節エレメントはポリメラーゼＩＩプロモーターである。一部の実施形態では、ガイド配列は、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５ヌクレオチド長、又は１０〜３０、又は１５〜２５、又は１５〜２０ヌクレオチド長である。一態様では、本発明は、非ヒト真核生物：好ましくは、説明された任意の実施形態による真核宿主細胞を含む多細胞真核生物を提供する。別の態様では、本発明は、真核生物：好ましくは、説明された任意の実施形態による真核宿主細胞を含む多細胞真核生物を提供する。これらの態様の一部の実施形態における生物は、動物：例えば、哺乳動物であり得る。また、生物は、節足動物、例えば、昆虫であり得る。生物はまた、植物であり得る。さらに、生物は真菌であり得る。
【００３０】
一態様では、本発明は、本明細書に記載の１つ以上の構成成分を含むキットを提供する。一部の実施形態では、このキットは、ベクター系、及びこのキットを使用するための取扱説明書を含む。一部の実施形態では、ベクター系は、（ａ）ｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ配列に機能的に連結された第１の調節エレメント、及びこのｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ配列の上流の１つ以上のガイド配列を挿入するための１つ以上の挿入部位であって、発現されると、ガイド配列が、ＣＲＩＳＰＲ複合体の真核細胞内の標的配列への配列特異的結合を誘導し、このＣＲＩＳＰＲ複合体が、（１）標的配列にハイブリダイゼーションダイスしたガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含む、第１の調節エレメント及び１つ以上の挿入部位；並びに／又は（ｂ）核局在化配列を含む前記ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に機能的に連結された第２の調節エレメントを含み、有利なことに、これは本ｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９を含む。一部の実施形態では、このキットは、系の同じ又は異なるベクターに位置する構成成分（ａ）及び（ｂ）を含む。一部の実施形態では、構成成分（ａ）は、第１の調節エレメントの制御下のｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ配列の下流のｔｒａｃｒ配列をさらに含む。一部の実施形態では、構成成分（ａ）は、第１の調節エレメントに機能的に連結された２つ以上のガイド配列をさらに含み、発現されると、２つ以上のガイド配列のそれぞれが、ＣＲＩＳＰＲ複合体の真核細胞内の異なる標的配列への配列特異的結合を誘導する。一部の実施形態では、この系は、前記ｔｒａｃｒ配列に機能的に連結された第３の調節エレメント、例えば、ポリメラーゼＩＩＩプロモーターをさらに含む。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒ配列は、最適に整列されると、ｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ配列の長さに沿って少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％の配列相補性を示す。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素の真核細胞の核への検出可能な量の蓄積を促進するのに十分な強度の１つ以上の核局在化配列を含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系酵素である。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素はＣａｓ９酵素である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９酵素は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｃａｓ９、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９、又はサーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９であり、かつこれらの生物由来の突然変異Ｃａｓ９を含み得る。この酵素は、Ｃａｓ９ホモログ又はオーソログであり得る。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、真核細胞での発現のためにコドンが最適化されている。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の位置にある１つ又は２つの鎖の切断を誘導する。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡ鎖切断活性が欠損している。一部の実施形態では、第１の調節エレメントはポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。一部の実施形態では、第２の調節エレメントはポリメラーゼＩＩプロモーターである。一部の実施形態では、ガイド配列は、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５ヌクレオチド長、又は１０〜３０、又は１５〜２５、又は１５〜２０ヌクレオチド長である。
【００３１】
一態様では、本発明は、真核細胞内で標的ポリヌクレオチドを改変する方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドへの結合を可能にして前記標的ポリヌクレオチドを切断し、これにより標的ポリヌクレオチドを改変するステップを含み、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズするガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ガイド配列は、ｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ配列に連結され、このｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ配列はｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズする。一部の実施形態では、前記切断は、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素によって標的配列の位置にある１つ又は２つの鎖を切断するステップを含み；これは本ｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９を含む。一部の実施形態では、前記切断により、標的遺伝子の転写が減少する。一部の実施形態では、この方法は、外因性鋳型ポリヌクレオチドでの相同組換えによって前記切断標的ポリヌクレオチドを修復するステップをさらに含み、前記修復は、前記標的ポリヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、又は置換を含む突然変異を引き起こす。一部の実施形態では、前記突然変異は、標的配列を含む遺伝子から発現されるタンパク質中の１つ以上のアミノ酸の変化をもたらす。一部の実施形態では、この方法は、１つ以上のベクターを前記真核細胞に送達するステップをさらに含み、１つ以上のベクターが：ＣＲＩＳＰＲ酵素、ｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ配列に連結されたガイド配列、及びｔｒａｃｒ配列の１つ以上の発現を駆動する。一部の実施形態では、前記ベクターは、対象の真核細胞に送達される。一部の実施形態では、前記改変するステップは、細胞培養中の前記真核細胞で行われる。一部の実施形態では、この方法は、前記改変するステップの前に、前記真核細胞を対象から分離するステップをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、前記真核細胞及び／又はこの真核細胞由来の細胞を前記対象に戻すステップをさらに含む。
【００３２】
一態様では、本発明は、真核細胞でのポリヌクレオチドの発現を変更する方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体のポリヌクレオチドへの結合を可能にして、前記結合により、前記ポリヌクレオチドの発現が増減するようにするステップを含む；前記ＣＲＩＳＰＲ複合体が、前記ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズするガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ガイド配列が、ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ配列に連結され；これは本ｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９を含む。一部の実施形態では、この方法は、１つ以上のベクターを前記真核細胞に送達するステップをさらに含み、この１つ以上のベクターが：ＣＲＩＳＰＲ酵素、ｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ配列に連結されたガイド配列、及びｔｒａｃｒ配列の１つ以上の発現を駆動する。
【００３３】
一態様では、本発明は、突然変異疾患遺伝子を含むモデル真核細胞を作製する方法を提供する。一部の実施形態では、疾患遺伝子は、疾患を有する又は発症するリスクの増加に関連した任意の遺伝子である。一部の実施形態では、この方法は、（ａ）１つ以上のベクターを真核細胞に導入するステップであって、この１つ以上のベクターが：ＣＲＩＳＰＲ酵素、ｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ配列に連結されたガイド配列、及びｔｒａｃｒ配列の１つ以上の発現を駆動する、ステップ；及び（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドへの結合を可能にして前記疾患遺伝子内の標的ポリヌクレオチドを切断するステップであって、ＣＲＩＳＰＲ複合体が、（１）標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズするガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、これにより、突然変異疾患遺伝子を含むモデル真核細胞を作製する、ステップを含み；これは本ｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９を含む。一部の実施形態では、前記切断は、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素によって標的配列の位置にある１つ又は２つの鎖を切断するステップを含む。一部の実施形態では、前記切断により、標的遺伝子の転写が減少する。一部の実施形態では、この方法は、外因性鋳型ポリヌクレオチドでの相同組換えによって前記切断標的ポリヌクレオチドを修復するステップをさらに含み、前記修復は、前記標的ポリヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、又は置換を含む突然変異を引き起こす。一部の実施形態では、前記突然変異は、標的配列を含む遺伝子からのタンパク質発現における１つ以上のアミノ酸の変化をもたらす。
【００３４】
一態様では、本発明は、疾患遺伝子に関連した細胞シグナル伝達事象を調節する生物活性剤を開発するための方法を提供する。一部の実施形態では、疾患遺伝子は、疾患を有する又は発症するリスクの増加に関連した任意の遺伝子である。一部の実施形態では、この方法は、（ａ）試験化合物を、説明したいずれか１つの実施形態のモデル細胞に接触させるステップ；及び（ｂ）前記疾患遺伝子の前記突然変異に関連した細胞シグナル伝達事象の減少又は増加を示唆する測定値の変化を検出し、これにより、前記疾患遺伝子に関連した前記細胞シグナル伝達事象を調節する前記生物活性剤を開発するステップを含む。
【００３５】
一態様では、本発明は、ｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ配列の上流のガイド配列を含む組換えポリヌクレオチドを提供し、このガイド配列は、発現されると、ＣＲＩＳＰＲ複合体の、真核細胞内に存在する対応する標的配列への配列特異的結合を誘導する。一部の実施形態では、標的配列は、真核細胞内に存在するウイルス配列である。一部の実施形態では、標的配列は、癌原遺伝子又は癌遺伝子である。
【００３６】
一態様では、本発明は、１つ以上の細胞の遺伝子に１つ以上の突然変異を導入することによって１つ以上の細胞を選択する方法を提供し、この方法は：１つ以上のベクターを細胞に導入するステップであって、１つ以上のベクターが：ＣＲＩＳＰＲ酵素、ｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ配列に連結されたガイド配列、ｔｒａｃｒ配列、及び編集鋳型の１つ以上の発現を駆動し；この編集鋳型が、ＣＲＩＳＰＲ酵素の切断を停止する１つ以上の突然変異を含む、ステップ；選択されるべき細胞内の標的ポリヌクレオチドでの編集鋳型の相同組換えを可能にするステップ；ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドへの結合を可能にして前記遺伝子内の標的ポリヌクレオチドを切断するステップであって、ＣＲＩＳＰＲ複合体が、（１）標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズするガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドへの結合が細胞死を誘導し、これにより、１つ以上の突然変異が導入された１つ以上の細胞を選択することが可能となる、ステップを含み；これは本ｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９を含む。好ましい一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素はＣａｓ９である。本発明の別の好ましい実施形態では、選択されるべき細胞は、真核細胞であり得る。本発明の態様により、対抗選択系を含み得る選択マーカー又は２段階プロセスを必要とすることなく、特定の細胞の選択が可能となる。
【００３７】
本明細書には、「これは本ｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９を含む」という句又は類似の文章が存在し；そして、これは、本明細書の実施形態のある又はそのＣＲＩＳＰＲ酵素又はＣａｓ９が、論じられる本明細書のｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９であり得ることを示している。
【００３８】
「結合部位」又は「活性部位」は、結合ポケット又は結合領域における部位（例えば、原子、アミノ酸残基の官能基、又は複数のこのような原子及び／若しくは基）を含む、又はこの部位から本質的になり、この結合ポケット又は結合領域は、化合物、例えば、核酸分子に結合することができ、結合に関与する。
【００３９】
本明細書で言及する物質におけるＣＲＩＳＰＲ酵素の結晶の構造情報は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のモジュラー又は複数部分型の構成成分のエンジニアリング又は変更又は作製を可能にして全ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の新たな機能を達成する又はその機能を最適化することを可能にする、ＣＲＩＳＰＲ酵素（例えば、Ｃａｓ９）のｓｇＲＮＡ（又はキメラＲＮＡ）及び標的ＤＮＡとの相互作用の問い合わせを可能にする。モジュラー又は複数部分型ＣＲＩＳＰＲ酵素はまた、さらに最適化することができる誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の作製を可能にする。誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の特徴については、参照によりその全開示内容が本明細書に組み入れられる、２０１３年７月２１日に出願され、２０１４年１月３０日にＰＣＴ公開の国際公開第２０１４０１８４２３Ａ２号パンフレットとして公開された「ＩＮＤＵＣＩＢＬＥ  ＤＮＡ  ＢＩＮＤＩＮＧ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ  ＡＮＤ  ＧＥＮＯＭＥ  ＰＥＲＴＵＲＢＡＴＩＯＮ  ＴＯＯＬＳ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ  ＴＨＥＲＥＯＦ」という名称の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０５１４１８号明細書に記載されている。
【００４０】
一態様では、本発明は、天然に存在しない又はエンジニアリングされた誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を含み、このＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、誘導性ヘテロ二量体の第１の半分に付着した第１のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物及びこの誘導性ヘテロ二量体の第２の半分に付着した第２のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物を含み、第１のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物は、１つ以上の核局在化シグナルに機能的に連結され、第２のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物は、核外移行シグナルに機能的に連結され、誘導物質エネルギー源に接触すると、誘導性ヘテロ二量体の第１の半分と第２の半分が１つになり、誘導性ヘテロ二量体の第１の半分と第２の半分が１つになることにより、第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物が機能的ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を構成することが可能となり、このＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、細胞内の目的のゲノム遺伝子座における標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列を含むガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含み、機能的ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、ゲノム遺伝子座を編集して遺伝子発現を変更する。本発明の一実施形態では、誘導性ヘテロ二量体の第１の半分はＦＫＢＰ１２であり、誘導性ヘテロ二量体の第２の半分はＦＲＢである。本発明の別の実施形態では、誘導物質エネルギー源はラパマイシンである。本発明の好ましい一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９、例えば、ＳｐＣａｓ９である。
【００４１】
従って、本発明の目的は、本発明の範囲内に、既に記載されたあらゆる製品、製品の製造プロセス、又は製品の使用方法を含めないことであり、本出願人らは、あらゆる既知の製品、プロセス、又は方法の権利を留保するが、その放棄をここに明示する。本発明は、ＵＳＰＴＯ（米国特許法第１１２条の第１段落）又はＥＰＯ（ＥＰＣの第８３項）の記述及び実施可能要件を満たさない、あらゆる製品、プロセス、又はこのような製品の製造、又はこのような製品を使用する方法が本発明の範囲内に含まれないものとし、本出願人らは、既に記載されたあらゆる製品、製品の製造プロセス、又は製品の使用方法の権利を留保するが、その放棄をここに明示することにさらに留意されたい。
【００４２】
本開示、特に特許請求の範囲及び／又は段落では、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んだ（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、及び「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの語は、米国特許法による意味を有し得；例えば、これらの語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んだ（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」、及び「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味し；そして「〜本質的になっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」及び「〜本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」などの語が、米国特許法による意味を有し、例えば、明確に述べられていない要素は許容されるが、従来技術に見られる要素又は本発明の基本的又は新規な特徴に影響を与える要素は排除されることに留意されたい。本発明の実施において、条項５３（ｃ）ＥＰＣ及び規則２８（ｂ）及び（ｃ）ＥＰＣを順守することが有利であろう。本明細書では、誓約と解釈されるべきものは存在しない。
【００４３】
これら及び他の実施形態が、開示される、又は以下の詳細な説明から明らかになり、かつこの説明に包含される。
【００４４】
本発明の新規な特徴は、特に添付の特許請求の範囲で説明される。本発明の原理が利用された例示的な実施形態を説明する以下の詳細な説明及び添付の図面から、本発明の特徴及び利点をより良く理解できるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１Ａ−Ｄ】図１Ａ〜図１Ｄは、ＳｐＣａｓ９−ＦＲＢＰ１２及びＳｐＣａｓ９−ＦＲＢ融合タンパク質の作製を示している。（Ａ）ＳｐＣａｓ９が分割されてＦＫＢＰ１２（Ｃ末端断片）又はＦＲＢ（Ｎ末端）に融合されている１１の位置（青色の三角形）を示す略図。（Ｂ）ＦＫＢＰ１２及びＦＲＰの構造。融合部位が、黄色の丸で示されている。（Ｃ）位置番号１２から作製されたＳｐＣａｓ９融合タンパク質の表現図。（Ｄ）１１のＦＫＢＰ１２／ＦＲＢ融合の正確な位置を要約した表。融合側の列における最初の数字は、ＦＫＢＰ１２が対応するＳｐＣａｓ９断片に融合する位置のアミノ酸を指している。２番目の数字は、ＦＲＢが対応するＳｐＣａｓ９断片に融合する位置のアミノ酸を指している。
【図２Ａ−Ｂ】図２Ａ〜図２Ｂは、（Ａ）ＰＸ３３０プラスミド及びｐＴＢ００５プラスミドの略図を示している。ＳｐＣａｓ９−ＦＫＢＰ  ｆｕ１５及びＳｐＣａｓ９−ＦＲＢ  ｆｕ１５の作製用の代表的なプライマー結合部位が示されている。（Ｂ）最終型のＳｐＣａｓ９−ＦＫＰＢ  ｆｕ１５プラスミド及び中間型のＳｐＣａｓ９−ＦＲＰ  ｆｕ１５プラスミドの略図。最終型のＳｐＣａｓ９−ＦＲＢ構築物はＮ末端にＮＥＳを有する。
【図３Ａ−Ｃ】図３Ａ〜図３Ｃは、ＮＬＳの配列、１５アミノ酸のリンカー、及び２０ｂｐのギブソン相同（Ｇｉｂｓｏｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）側が組み込まれたＰＣＲプライマーの表を示している。
【図４Ａ−Ｃ】図４Ａ〜図４Ｃは、作製されたＮＬＳフリーＦＲＢ−Ｃａｓ９融合断片が組み込まれたプライマーの表を示している。
【図５Ａ−Ｃ】図５Ａ〜図５Ｃは、ラパマイシン処置がＳｐＣａｓ９−ＦＲＢ／ＦＫＢＰ１２融合タンパク質の構築を誘導し、ＥＭＸ１遺伝子座で挿入欠失が発生することを示している。（Ａ）ＳｐＣａｓ９融合断片の略図。ＦＰＢ断片は、Ｎ末端に核外移行配列（ＮＥＳ）を含む。ＦＫＢＰ断片は、核局在化配列（ＮＬＳ）に隣接している。（Ｂ）ラパマイシン誘導ｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９（上側）及び非誘導ｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９（下側）によって媒介された挿入欠失の発生を示す代表的なＳＵＲＶＥＹＯＲゲル。（Ｃ）誘導ｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９（青色）対非誘導ｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９（オレンジ色）によって媒介された挿入欠失の発生の定量化。
【図６Ａ−Ｇ】図６Ａ〜図６Ｇは、誘導性ｓｐｌｉｔ−Ｃａｓ９の作製及び最適化を示している。（ａ）Ｃａｓ９のリボン表現。三角形は、ｓｐｌｉｔ−４（緑色）及びスプリット−５（赤色）の分割部位を示している。（ｂ）誘導性ｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９融合体の線図。ヒトコドン最適化化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９のＮ末端断片及びＣ末端断片がそれぞれ、ＦＲＢ二量体化ドメイン及びＦＫＢＰ二量体化ドメインに融合している。（ｃ及びｄ）ｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９系を最適化する方法。ラパマイシンの非存在下（ｃ）では、Ｃａｓ９（Ｎ）−ＦＲＢ−ＮＥＳ断片が、ヒトＰＴＫ２からのＮＥＳの付加により細胞質内に隔離されている。Ｃａｓ９（Ｃ）−ＦＫＢＰ断片は、２つのＮＬＳを含み、核内に能動的に移行する。ラパマイシンの存在下（ｄ）では、Ｃａｓ９（Ｎ）−ＦＲＢ−ＮＥＳはＣａｓ９（Ｃ）−ＦＫＢＰに結合する。結果として生じる再構成Ｃａｓ９のＮＬＳは、核内移行及びこれに続く標的遺伝子座への結合を媒介する。（ｅ）ラパマイシンを用いた（左側）及び用いない（右側）ヒトＥＭＸ１遺伝子座におけるｓｐｌｉｔ−４及び５媒介挿入欠失についての代表的なＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイ。矢印は、予想ＳＵＲＶＥＹＯＲ断片を示している。Ｎｄ＝非検出。（ｆ）Ｕ６プロモーター駆動ｓｇＲＮＡ、ＥＦＳプロモーター駆動ｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９断片、及びピューロマイシン耐性遺伝子（ｐｕｒｏ）を含むレンチウイルスｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９プラスミドの略図。２Ａ自己切断ペプチド（Ｐ２Ａ）は、ｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９断片及びｐｕｒｏの両方を分離している。（ｇ）ＥＭＸ１遺伝子座及び４つの注釈付きＯＴにおけるディープシークエンシングによって測定された挿入欠失頻度。挿入欠失は、形質導入の４週間後（ｗｔ−Ｃａｓ９；ｎ＝２の生物学的複製）又は６週間後（ｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９；ｎ＝３の生物学的複製）に測定した（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。ラパマイシン処置は１２日間続けた。全てのパネルにおいて、平均±標準誤差。
【図７Ａ−Ｃ】図７Ａ〜図７Ｃは、ｓｐｌｉｔ  ｄＣａｓ９−ＶＰ６４融合体を用いた誘導性転写活性化を示している。（ａ）転写活性化に使用されるｓ  ｄＣａｓ９（Ｎ）−ＦＲＢ−２ｘＮＥＳ及びｄＣａｓ９（Ｃ）−ＦＫＢＰ−２ｘＮＬＳ−ＶＰ６４融合体の略図。各断片は、注釈付き点突然変異（Ｄ１０Ａ又はＮ８６３Ａ）を有し、この点突然変異は、ラパマイシン誘導構築時にｄｅａｄ  Ｃａｓ９を再構成する。ＶＰ６４転写アクチベータードメインは、ｄＣａｓ９（Ｃ）−ＦＫＢＰ−２ｘＮＬＳ−ＶＰ６４断片のＣ末端に融合している。（ｂ）ｓｐｌｉｔ−４（Ｓｐｌｉｔ）及び１遺伝子当たり４つのｓｇＲＮＡでトラスフェクトされたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞においてｑＰＣＲによって測定されたＡＳＣＬ１、ＭＹＯＤ１、及びＩＬ１ＲＮの遺伝子発現。発現を、ラパマイシンを用いた及び用いない細胞で測定し（ｎ＝４の生物学的複製）、完全長ｄｅａｄ  Ｃａｓ９−ＶＰ６４（完全長）（ｎ＝３の技術的複製）と比較した。非トランスフェクト細胞をベースラインとして使用した。（ｃ）ラパマイシン処置の２時間後、６時間後、１２時間後、２４時間後、及び７２時間後にｑＰＣＲによって測定したＨＥＫ２９３ＦＴ細胞におけるＡＳＣＬ１の発現及びＮ２Ａ細胞におけるＮｅｕｒｏｇ２の発現（各時点でｎ＝３の生物学的複製）。細胞を、ラパマイシンで継続的に処置した（濃青色の丸）、２時間だけ処置した（薄青色の四角形）、又は処置しなかった（オレンジ色の三角形）。非トランスフェクト細胞をベースラインとて使用した。全てのパネルにおいて、平均±標準誤差。
【図８Ａ−Ｇ】図８Ａ〜図８Ｇは、Ｃａｓ９を分割することができ、かつＣａｓ９−ＦＲＢ／ＦＫＢＰ融合タンパク質が、ラパマイシン誘導性再構築を示すことを示している。（ａ）１１のスプリット位置が赤色の矢印及び緑色の矢印で示されているＣａｓ９一次構造の略図。赤色の矢印は、ループ領域におけるスプリットを示し；緑色の矢印は、非構造領域におけるスプリットを示している。Ｎ末端における末端アミノ酸（ａａ）の位置。Ｃａｓ９のスプリットは、スプリット番号で示されている。ＢＨ＝ブリッジへリックス、ＰＩ＝ＰＡＭ相互作用ドメイン。（ｂ）誘導性ｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９の方法の略図。ヒトコドン最適化化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９のＮ末端断片及びＣ末端断片がそれぞれ、ＦＲＢ二量体化ドメイン及びＦＫＢＰ二量体化ドメインに融合している。Ｃａｓ９−ＦＲＢ／ＦＫＢＰ断片は、ＦＲＢ及びＦＫＢＰのラパマイシン誘導性二量体化により機能的な完全長Ｃａｓ９ヌクレアーゼが再構築されるまで分離されたままで不活性である。（ｃ）ラパマイシン誘導を用いた（上側）及び用いない（下側）、１１全てのＣａｓ９のスプリットのヒトＥＭＸ１遺伝子座におけるｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９媒介挿入欠失についての代表的なＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイ。矢印は、予想ＳＵＲＶＥＹＯＲ断片を示している。（ｄ）（ｃ）の定量化。エラーバーは、２つの別個の生物学的複製の５つの技術的複製からのＳＥＭを反映している。（ｅ）二量体化ドメインが欠損したＮ末端Ｃａｓ９断片及びＣ末端Ｃａｓ９断片の自己構築を試験する方法の線図。（ｆ）ヒトＥＭＸ１遺伝子座における自己構築スプリット−４〜６及びスプリット−１１媒介挿入欠失についての代表的なＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイ。（ｇ）（ｆ）の定量化。エラーバーは、行われた２つの生物学的複製の３つの技術的複製からのＳＥＭを反映している。
【図９Ａ−Ｂ】図９Ａ〜図９Ｂは、Ｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９を含む単一ベクター構築物を示している（Ａ）。ｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９は、ラパマイシンの存在下では野生型に類似した挿入欠失の発生を示したが、ラパマイシンの非存在下では野生型よりも著しく少ない挿入欠失の発生を示した（Ｂ）。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本明細書の図面は、単に例示目的であり、必ずしも正確な縮尺で描かれているものではない。
【００４７】
全て本発明の実施に有用であるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系、その構成成分、及びこのような構成成分の送達だけではなく、これらの方法、材料、送達ビヒクル、ベクター、粒子、ＡＡＶ、並びに作製及び使用、さらにはこの量及び製剤についての一般情報についは、以下を参照されたい。米国特許第８，６９７，３５９号明細書、同第８，７７１，９４５号明細書、同第８，７９５，９６５号明細書、同第８，８６５，４０６号明細書、同第８，８７１，４４５号明細書、同第８，８８９，３５６号明細書、同第８，８８９，４１８号明細書、及び同第８，８９５，３０８；米国特許出願公開第２０１４−０３１０８３０号明細書（米国特許出願第１４／１０５，０３１号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２８７９３８  Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２１３，９９１号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２７３２３４  Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２９３，６７４号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２７３２３２  Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２９０，５７５号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２７３２３１号明細書（米国特許出願第１４／２５９，４２０号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２５６０４６  Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２２６，２７４号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２４８７０２  Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２５８，４５８号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２４２７００  Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２２２，９３０号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２４２６９９  Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１８３，５１２号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２４２６６４  Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１０４，９９０号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２３４９７２  Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１８３，４７１号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２２７７８７  Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２５６，９１２号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０１８９８９６  Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１０５，０３５号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０１８６９５８号明細書（米国特許出願第１４／１０５，０１７号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０１８６９１９  Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１０４，９７７号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０１８６８４３  Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１０４，９００号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０１７９７７０  Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１０４，８３７号明細書）、及び米国特許出願公開第２０１４−０１７９００６  Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１８３，４８６号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０１７０７５３号明細書（米国特許出願第１４／１８３，４２９号明細書）；欧州特許出願第２７７１４６８号明細書（欧州特許第１３８１８５７０．７号明細書）、同第２７６４１０３号明細書（欧州特許第１３８２４２３２．６号明細書）、及び同第２７８４１６２号明細書（欧州特許第１４１７０３８３．５号明細書）；並びに国際公開第２０１４／０９３６６１号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４７４３号明細書）、同第２０１４／０９３６９４号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４７９０号明細書）、同第２０１４／０９３５９５号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６１１号明細書）、同第２０１４／０９３７１８号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８２５号明細書）、同第２０１４／０９３７０９号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８１２号明細書）、同第２０１４／０９３６２２号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７号明細書）、同第２０１４／０９３６３５号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６９１号明細書）、同第２０１４／０９３６５５号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４７３６号明細書）、同第２０１４／０９３７１２号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８１９号明細書）、同第２０１４／０９３７０１号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８００号明細書）、及び同第２０１４／０１８４２３号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０５１４１８号明細書）。また、２０１３年１月３０日出願の米国仮特許出願第６１／７５８，４６８号明細書；２０１３年３月１５日出願の同第６１／８０２，１７４号明細書；２０１３年３月２８日出願の同第６１／８０６，３７５号明細書；２０１３年４月２０日出願の同第６１／８１４，２６３号明細書；２０１３年５月６日出願の同第６１／８１９，８０３号明細書；及び２０１３年５月２８日出願の同第６１／８２８，１３０号明細書も参照されたい。また、２０１３年６月１７日出願の米国仮特許出願第６１／８３６，１２３号明細書も参照されたい。また、それぞれ２０１３年６月１７日出願の米国仮特許出願第６１／８３５，９３１号明細書、同第６１／８３５，９３６号明細書、同第６１／８３６，１２７号明細書、同第６１／８３６，１０１号明細書、同第６１／８３６，０８０号明細書、及び同第６１／８３５，９７３号明細書も参照されたい。さらに、２０１３年８月５日出願の米国仮特許出願第６１／８６２，４６８号明細書及び同第６１／８６２，３５５号明細書；２０１３年８月２８日出願の同第６１／８７１，３０１号明細書；２０１３年９月２５日出願の同第６１／９６０，７７７号明細書、及び２０１３年１０月２８日出願の同第６１／９６１，９８０号明細書も参照されたい。なおさらに、それぞれ２０１４年６月１０日出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０３号明細書、同ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８００号明細書、同ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０９号明細書、同ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０４号明細書、及び同ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０６号明細書；２０１４年６月１１日出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０８号明細書；２０１４年１０月２８日出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／６２５５８号明細書、及びそれぞれ２０１３年１２月１２日出願の米国仮特許出願第６１／９１５，１５０号明細書、同第６１／９１５，３０１号明細書、同第６１／９１５，２６７号明細書、及び同第６１／９１５，２６０号明細書；２０１３年１月２９日出願の同第６１／７５７，９７２号明細書及び２０１３年２月２５日出願の同第６１／７６８，９５９号明細書；２０１３年６月１７日出願の同第６１／８３５，９３６号明細書、同第６１／８３６，１２７号明細書、同第６１／８３６，１０１号明細書、同第６１／８３６，０８０号明細書、同第６１／８３５，９７３号明細書、及び同第６１／８３５，９３１号明細書；共に２０１４年６月１１日出願の同第６２／０１０，８８８号明細書及び同第６２／０１０，８７９号明細書；それぞれ２０１４年６月１０日出願の同第６２／０１０，３２９号明細書及び同第６２／０１０，４４１号明細書；並びにそれぞれ２０１４年２月１２日出願の同第６２／９３９，２５６号明細書同第６１／９３９，２４２号明細書；２０１４年４月１５日出願の同第６１／９８０，０１２号明細書；２０１４年８月１７日出願の同第６２／０３８，３５８号明細書；それぞれ２０１４年９月２５日出願の同第６２／０５４，４９０号明細書、同第６２／０５５，４８４号明細書、同第６２／０５５，４６０号明細書、及び同第６２／０５５，４８７号明細書；並びに２０１４年１０月２７日出願の同第６２／０６９，２４３号明細書を参照されたい。また、２０１４年９月２５日出願の米国仮特許出願第６２／０５５，４８４号明細書、同第６２／０５５，４６０号明細書、及び同第６２／０５５，４８７号明細書；２０１４年４月１５日出願の米国仮特許出願第６１／９８０，０１２号明細書；並びに２０１４年２月１２日出願の米国仮特許出願第６１／９３９，２４２号明細書を参照されたい。特に米国を指定国とする２０１４年６月１０日出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１４／４１８０６号明細書を参照されたい。２０１４年１月２２日出願の米国仮特許出願第６１／９３０，２１４号明細書を参照されたい。それぞれ２０１３年１２月１２日出願の米国仮特許出願第６１／９１５，２５１号明細書；同第６１／９１５，２６０号明細書、及び同第６１／９１５，２６７号明細書を参照されたい。２０１４年４月１５日出願の米国仮特許出願第６１／９８０，０１２号明細書を参照されたい。特に米国を指定国とする２０１４年６月１０日出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１４／４１８０６号明細書を参照されたい。２０１４年１月２２日出願の米国仮特許出願第６１／９３０，２１４号明細書を参照されたい。それぞれ２０１３年１２月１２日出願の米国仮特許出願第６１／９１５，２５１号明細書；同第６１／９１５，２６０号明細書、及び同第６１／９１５，２６７号明細書を参照されたい。２０１４年１月２２日出願の米国仮特許出願第６１／９３０，２１４号明細書を参照されたい。それぞれ２０１３年１２月１２日出願の米国仮特許出願第６１／９１５，２５１号明細書；同第６１／９１５，２６０号明細書、及び同第６１／９１５，２６７号明細書を参照されたい。２０１４年１月２２日出願の米国仮特許出願第６１／９３０，２１４号明細書を参照されたい。それぞれ２０１３年１２月１２日出願の米国仮特許出願第６１／９１５，２５１号明細書；同第６１／９１５，２６０号明細書、及び同第６１／９１５，２６７号明細書を参照されたい。全て「ＳＹＳＴＥＭＳ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ」という名称の２０１２年１２月１２日、２０１３年１月２日、２０１３年３月１５日、及び２０１３年１月１７にそれぞれ出願の米国仮特許出願第６１／７３６，５２７号明細書、同第６１／７４８，４２７号明細書、同第６１／７９１，４０９号明細書、及び同第６１／８３５，９３１号明細書を参照されたい。また、「ＳＹＳＴＥＭＳ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ」という名称の２０１３年１月２９日出願及び２０１３年２月２５日にそれぞれ出願の米国仮特許出願第６１／７５７，９７２号明細書及び同第６１／７６８，９５９号明細書を参照されたい。また、それぞれ２０１３年６月１７日出願の米国仮特許出願第６１／８３５，９３６号明細書、同第６１／８３６，１２７号明細書、同第６１／８３６，１０１号明細書、同第６１／８３６，０８０号明細書、及び同第６１／８３５，９７３号明細書を参照されたい。これらの特許、特許公報、及び特許出願のそれぞれ、並びにこれらの特許において又はこれらの審査中に引用される全ての文献（「出願引用文献」）、並びにその出願引用文献において引用又は参照される全ての文献は、これらの特許において又は本明細書での参照により組み入れられるこれらの特許の任意の文献において述べられる任意の製品に関する任意の製造業者の指示書、説明書、製品仕様書、及び製品シートと共に、参照によりこれらの特許に組み入れられ、かつ本発明の実施に利用することができる。全ての文献（例えば、これらの特許、特許公報、及び出願、並びに出願引用文献）は、それぞれの個々の文献が具体的かつ個別に参照により組み入れられることが示されるのと同程度に参照により組み入れられる。
【００４８】
また、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系に関する一般情報については、以下を参照されたい（同様に、参照により本明細書に組み入れられる）：
それぞれ参照により本明細書に組み入れられ、以下に簡単に説明される：
Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｃｏｎｇ，Ｌ．，Ｒａｎ，Ｆ．Ａ．，Ｃｏｘ，Ｄ．，Ｌｉｎ，Ｓ．，Ｂａｒｒｅｔｔｏ，Ｒ．，Ｈａｂｉｂ，Ｎ．，Ｈｓｕ，Ｐ．Ｄ．，Ｗｕ，Ｘ．，Ｊｉａｎｇ，Ｗ．，Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ，Ｌ．Ａ．，＆  Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｆｅｂ  １５；３３９（６１２１）：８１９−２３（２０１３）；
ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｊｉａｎｇ  Ｗ．，Ｂｉｋａｒｄ  Ｄ．，Ｃｏｘ  Ｄ．，Ｚｈａｎｇ  Ｆ，Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ  ＬＡ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｍａｒ；３１（３）：２３３−９（２０１３）；
Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｅ  Ｃａｒｒｙｉｎｇ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｇｅｎｅｓ  ｂｙ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｗａｎｇ  Ｈ．，Ｙａｎｇ  Ｈ．，Ｓｈｉｖａｌｉｌａ  ＣＳ．，Ｄａｗｌａｔｙ  ＭＭ．，Ｃｈｅｎｇ  ＡＷ．，Ｚｈａｎｇ  Ｆ．，Ｊａｅｎｉｓｃｈ  Ｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍａｙ  ９；１５３（４）：９１０−８（２０１３）；
Ｏｐｔｉｃａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｔａｔｅｓ．Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ  Ｓ，Ｂｒｉｇｈａｍ  ＭＤ，Ｔｒｅｖｉｎｏ  ＡＥ，Ｈｓｕ  ＰＤ，Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ  Ｍ，Ｃｏｎｇ  Ｌ，Ｐｌａｔｔ  ＲＪ，Ｓｃｏｔｔ  ＤＡ，Ｃｈｕｒｃｈ  ＧＭ，Ｚｈａｎｇ  Ｆ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１３  Ａｕｇ  ２２；５００（７４６３）：４７２−６．ｄｏｉ：１０．１０３８／Ｎａｔｕｒｅ１２４６６．Ｅｐｕｂ  ２０１３  Ａｕｇ  ２３；
Ｄｏｕｂｌｅ  Ｎｉｃｋｉｎｇ  ｂｙ  ＲＮＡ−Ｇｕｉｄｅｄ  ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９  ｆｏｒ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｄｉｔｉｎｇ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｒａｎ，ＦＡ．，Ｈｓｕ，ＰＤ．，Ｌｉｎ，ＣＹ．，Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ，ＪＳ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．，Ｔｒｅｖｉｎｏ，ＡＥ．，Ｓｃｏｔｔ，ＤＡ．，Ｉｎｏｕｅ，Ａ．，Ｍａｔｏｂａ，Ｓ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，＆  Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｃｅｌｌ  Ａｕｇ  ２８．ｐｉｉ：Ｓ００９２−８６７４（１３）０１０１５−５．（２０１３）；
ＤＮＡ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  Ｃａｓ９  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｈｓｕ，Ｐ．，Ｓｃｏｔｔ，Ｄ．，Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｊ．，Ｒａｎ，ＦＡ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．，Ａｇａｒｗａｌａ，Ｖ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ｆｉｎｅ，Ｅ．，Ｗｕ，Ｘ．，Ｓｈａｌｅｍ，Ｏ．，Ｃｒａｄｉｃｋ，ＴＪ．，Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ，ＬＡ．，Ｂａｏ，Ｇ．，＆  Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２６４７（２０１３）；
Ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｓｙｓｔｅｍ．Ｒａｎ，ＦＡ．，Ｈｓｕ，ＰＤ．，Ｗｒｉｇｈｔ，Ｊ．，Ａｇａｒｗａｌａ，Ｖ．，Ｓｃｏｔｔ，ＤＡ．，Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｎｏｖ；８（１１）：２２８１−３０８．（２０１３）；
Ｇｅｎｏｍｅ−Ｓｃａｌｅ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌｓ．Ｓｈａｌｅｍ，Ｏ．，Ｓａｎｊａｎａ，ＮＥ．，Ｈａｒｔｅｎｉａｎ，Ｅ．，Ｓｈｉ，Ｘ．，Ｓｃｏｔｔ，ＤＡ．，Ｍｉｋｋｅｌｓｏｎ，Ｔ．，Ｈｅｃｋｌ，Ｄ．，Ｅｂｅｒｔ，ＢＬ．，Ｒｏｏｔ，ＤＥ．，Ｄｏｅｎｃｈ，ＪＧ．，Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｅｃ  １２．（２０１３）．［Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］；
Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｃａｓ９  ｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ｔａｒｇｅｔ  ＤＮＡ．Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ，Ｈ．，Ｒａｎ，ＦＡ．，Ｈｓｕ，ＰＤ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．，Ｓｈｅｈａｔａ，ＳＩ．，Ｄｏｈｍａｅ，Ｎ．，Ｉｓｈｉｔａｎｉ，Ｒ．，Ｚｈａｎｇ，Ｆ．，Ｎｕｒｅｋｉ，Ｏ．Ｃｅｌｌ  Ｆｅｂ  ２７．（２０１４）．１５６（５）：９３５−４９；
Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｃａｓ９  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｗｕ  Ｘ．，Ｓｃｏｔｔ  ＤＡ．，Ｋｒｉｚ  ＡＪ．，Ｃｈｉｕ  ＡＣ．，Ｈｓｕ  ＰＤ．，Ｄａｄｏｎ  ＤＢ．，Ｃｈｅｎｇ  ＡＷ．，Ｔｒｅｖｉｎｏ  ＡＥ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ  Ｓ．，Ｃｈｅｎ  Ｓ．，Ｊａｅｎｉｓｃｈ  Ｒ．，Ｚｈａｎｇ  Ｆ．，Ｓｈａｒｐ  ＰＡ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１４）Ａｐｒ  ２０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２８８９，
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  Ｋｎｏｃｋｉｎ  Ｍｉｃｅ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｄｉｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ，Ｐｌａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １５９（２）：４４０−４５５（２０１４）ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１４．０９．０１４，
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  １５７，１２６２−１２７８（Ｊｕｎｅ  ５，２０１４）（Ｈｓｕ  ２０１４），
Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｃｒｅｅｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ｓｙｓｔｅｍ，Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１４  Ｊａｎｕａｒｙ  ３；３４３（６１６６）：８０−８４．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２４６９８１，
Ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｇＲＮＡｓ  ｆｏｒ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｄｏｅｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  オンラインで公表  ３  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２０１４；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３０２６，及び
Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｂｒａｉｎ  ｕｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９，Ｓｗｉｅｃｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；オンラインで公表  １９  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２０１４；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３０５５．
Ｃｏｎｇらは、サーモフィラス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９及び化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の両方をベースとした真核細胞で使用されるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をエンジニアリングして、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、短鎖ＲＮＡによって誘導されて、ヒト細胞及びマウス細胞におけるＤＮＡの正確な切断を誘導できることを実証した。彼らの研究は、切断酵素に変換されるＣａｓ９を使用して、変異原作用が最小限の真核細胞における相同組換え修復を容易にできることをさらに示した。加えて、彼らの研究は、複数のガイド配列を単一ＣＲＩＳＰＲアレイにコードすることができ、これにより哺乳動物ゲノム内の内因性ゲノム遺伝子座部位におけるいくつかの同時編集を可能にすることを実証し、ＲＮＡガイドヌクレアーゼ技術が容易にプログラム可能であること及びその広範な適用性を実証している。細胞においてＲＮＡを用いて配列特異的ＤＮＡ切断をプログラムするこの能力は、ゲノム工学ツールの新たなクラスを定義した。これらの研究は、他のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座が、哺乳動物細胞に移植可能である可能性が高く、哺乳動物ゲノム切断も媒介し得ることをさらに示した。重要なことに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のいくつかの態様をさらに改善して、その効率及び多用途性を高めることができることが企図され得る。
Ｊｉａｎｇらは、二重ＲＮＡと複合体を形成した、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）−関連Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを使用して、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）のゲノムに正確な突然変異を導入した。このアプローチは、標的ゲノム部位における二重ＲＮＡ：Ｃａｓ９依存性切断に依存して、突然変異しなかった細胞を殺し、選択マーカー又はカウンター選択系の必要性を回避した。この研究は、編集鋳型が単一ヌクレオチド変化及び複数ヌクレオチド変化を有するように短鎖ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）の配列を変更することによる二重ＲＮＡ：Ｃａｓ９特異性の再プログラミングを報告した。この研究は、２つのｃｒＲＮＡの同時の使用により多重突然変異誘発を可能にすることを示した。さらに、このアプローチが、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）においてリコンビニアリングと組み合わせて使用される場合、説明されるアプローチを用いて回収された細胞のほぼ１００％が所望の突然変異を含み、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）では、回収した６５％が突然変異を含んでいた。
Ｋｏｎｅｒｍａｎｎらは、ＤＮＡ結合ドメインをベースとするＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９酵素及び転写アクチベーター様エフェクターの光学的及び化学的調節を可能にする用途の広いロバストな技術についての当該技術分野の要求に対処した。
微生物ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系からのＣａｓ９ヌクレアーゼは、２０ｎｔのガイド配列により特定のゲノム遺伝子座を標的とし、このガイド配列は、ＤＮＡ標的に対する特定のミスマッチを許容することができ、これにより不所望の標的外の突然変異を促進する。これに対処するために、Ｒａｎらは、Ｃａｓ９ニッカーゼ突然変異を対ガイドＲＮＡと組み合わせて標的二本鎖切断を導入するアプローチを説明した。ゲノム中の個々の切れ目は、高い忠実性で修復されるため、適切にオフセットされたガイドＲＮＡによる同時ニッキングが、二本鎖切断に必要であり、標的切断のために特異的に認識される塩基の数を増加させる。著者らは、対ニッキング（ｐａｉｒｅｄ  ｎｉｃｋｉｎｇ）を用いて、細胞株において標的外活性を１／５０〜１／１，５００に低下させて、標的上の切断有効性を犠牲にすることなく、マウス接合体における遺伝子ノックアウトを容易にできることを実証した。この多用途戦略は、高い特異性を必要とする多様なゲノム編集用途を可能にする。
Ｈｓｕらは、標的部位の選択を知らせて標的外の影響を回避するためにヒト細胞におけるＳｐＣａｓ９標的化特異性を特徴付けた。この研究は、２９３Ｔ細胞及び２９３ＦＴ細胞の１００を超える推定ゲノム標的外遺伝子座における７００を超えるガイドＲＮＡ変異体及びＳｐＣＡｓ９誘導性挿入欠失変異レベルを評価した。著者らは、ＳｐＣａｓ９が、配列依存的に異なる位置でのガイドＲＮＡと標的ＤＮＡとの間のミスマッチを許容し、ミスマッチの数、位置、及び分布の影響を受けることを報告した。著者らは、ＳｐＣａｓ９媒介切断がＤＮＡメチル化による影響を受けないこと、並びにＳｐＣａｓ９及びｓｇＲＮＡの量を、標的外の変更を最小限にするために増減できることをさらに示した。加えて、哺乳動物ゲノムエンジニアリングの用途を拡大するために、著者らは、標的配列の選択及び評価及び標的外分析をガイドするウェブベースのソフトウェアツールを提供することを報告した。
Ｒａｎらは、哺乳動物細胞における非相同末端結合（ＮＨＥＪ）又は相同依存性修復（ＨＤＲ）によるＣａｓ９媒介ゲノム編集のための一連のツール、及び下流機能の研究のための改変細胞株の作製について説明した。標的外切断を最小限にするために、著者らは、対ガイドＲＮＡを用いるＣａｓ９ニッカーゼ突然変異を使用するダブルニッキング法についてさらに説明した。著者らによって提供されるプロトコルは、標的部位の選択、切断効率の評価、及び標的外の活性の分析についてのガイドラインを経験的に導き出した。この研究は、標的の設計から開始して、遺伝子改変を僅か１〜２週間で達成することができ、改変クローナル細胞系を２〜３週間以内に得ることができることを示した。
Ｓｈａｌｅｍらは、ゲノム規模で遺伝子機能を問い合わせる新たな方法について説明した。著者らの研究は、１８，０８０の遺伝子を標的とするゲノム規模ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ノックアウト（ＧｅＣＫＯ）ライブラリーの６４，７５１のユニークなガイド配列を用いた送達により、ヒト細胞におけるネガティブ選択スクリーニング及びポジティブ選択スクリーニングの両方が可能になることを示した。第１に、著者らは、ＧｅＣＫＯライブラリーを使用した、癌細胞及び多能性幹細胞において細胞の生存に必須の遺伝子の同定を示した。次に、黒色腫モデルにおいて、著者らは、その減少が、変異プロテインキナーゼＢＲＡＦを阻害する治療薬であるベムラフェニブに対する耐性に影響を与える遺伝子をスクリーニングした。著者らの研究は、最高位の候補が、既に評価された遺伝子ＮＦ１及びＭＥＤ１２、並びに新規にヒットしたＮＦ２、ＣＵＬ３、ＴＡＤＡ２Ｂ、及びＴＡＤＡ１を含むことを示した。著者らは、同じ遺伝子を標的とする独立のガイドＲＮＡと高いヒット確認率との間の高いレベルの一貫性を観察し、従ってＣａｓ９を用いたゲノム規模のスクリーニングが有望であることを実証した。
Ｎｉｓｈｉｍａｓｕらは、ｓｇＲＮＡ及びその標的ＤＮＡと複合体を形成した化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の結晶構造を２．５Åの解像度で報告した。この構造により、その界面で正に帯電した溝にｓｇＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二重鎖を収容する、標的認識ローブとヌクレアーゼローブからなる２ローブ構造が明らかになった。認識ローブは、ｓｇＲＮＡとＤＮＡの結合に必須であるが、ヌクレアーゼローブは、ＨＮＨヌクレアーゼドメイン及びＲｕｖＣヌクレアーゼドメインを含み、ＨＮＨヌクレアーゼドメインは、標的ＤＮＡの相補鎖の切断に適切な位置にあり、ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインは、非相補鎖の切断に適切な位置にある。ヌクレアーゼローブは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）との相互作用に関与するカルボキシ末端ドメインも含む。この高解像度構造及び付随する機能分析は、Ｃａｓ９によるＲＮＡガイドＤＮＡ標的化の分子機構を明らかにし、従って新規な多用途ゲノム編集技術の合理的設計の道が開かれた。
Ｗｕらは、マウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）において単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）が付加された化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）から触媒不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）のゲノムワイド結合部位をマッピングした。著者らは、試験された４種類のｓｇＲＮＡのそれぞれが、ｓｇＲＮＡの５−ヌクレオチドシード領域によって頻繁に特徴付けられる数十〜数千のゲノム部位とＮＧＧプロトスペーサー近接モチーフ（ＰＡＭ）との間のｄＣａｓ９を標的とすることを示した。クロマチン非アクセシビリティ（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｉｎａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）により、マッチングシード配列を有するｄＣａｓ９の他の部位への結合が減少し；従って、標的外部位の７０％が遺伝子に関連する。著者らは、触媒活性Ｃａｓ９でトランスフェクトされたｍＥＳＣにおける２９５のｄＣａｓ９結合部位のターゲットシークエンシングにより、バックグラウンドレベルよりも高い突然変異部を１つしか同定されなかったことを示した。著者らは、シードマッチ（ｓｅｅｄ  ｍａｔｃｈ）が結合をトリガーするが切断のために標的ＤＮＡとの広範な対合を必要とする、Ｃａｓ９の結合及び切断のための２状態モデルを提案した。
Ｈｓｕ  ２０１４は、ヨーグルトからゲノム編集までのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の歴史を一般的に論じる総説であり、このゲノム編集には、２０１４年６月５日以前に出願された本出願の系統の出願の情報、データ、及び知見中にある細胞の遺伝子スクリーニングが含まれる。Ｈｓｕ  ２０１４の一般的な教示は、特定のモデル、本明細書の動物に無関係である。
本発明又は出願の従来技術とは考えられないが、本発明の実施で考慮され得るＴｓａｉ  ｅｔ  ａｌ，“Ｄｉｍｅｒｉｃ  ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ＦｏｋＩ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈｌｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３２（６）：５６９−７７（２０１４）についても言及する。
そして、特に、Ｃａｓ９結晶に関する「本明細書で言及する物質」である、全て参照により本明細書に組み入れられる２０１３年１２月１２日出願の米国仮特許出願第６１／９１５，２５１号明細書、２０１４年１月２２日出願の同第６１／９３０，２１４号明細書、２０１４年４月１５日出願の同第６１／９８０，０１２号明細書：及びＮｉｓｈｉｍａｓｕ  ｅｔ  ａｌ，“Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｃａｓ９  ｉｎ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  Ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ  ａｎｄ  Ｔａｒｇｅｔ  ＤＮＡ，”Ｃｅｌｌ  １５６（５）：９３５−９４９，ＤＯＩ：ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１４．０２．００１（２０１４）についても言及する。
【００４９】
誘導物質エネルギー源は、単純に誘導物質又は二量体化剤であると見なすことができる。「誘導物質エネルギー源」という語は、一貫性のために本明細書を通じて使用される。誘導物質エネルギー源（又は誘導物質」は、Ｃａｓ９を再構築するように機能する。一部の実施形態では、誘導物質エネルギー源は、誘導性二量体の２つの半部分の作用により、Ｃａｓ９の２つの部分を１つにする。従って、誘導性二量体の２つの半部分は、誘導物質エネルギー源の存在下でより頑丈になる。この二量体の２つの半部分は、誘導物質エネルギー源がないと二量体を形成しない（二量体化しない）。
【００５０】
従って、誘導性二量体の２つの半部分は、誘導物質エネルギー源と協働して二量体を形成する。これにより、Ｃａｓ９の第１の部分と第２の部分が１つになってＣａｓ９を再構築する。
【００５１】
ＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物はそれぞれ、ｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９の一方の部分を含む。これらは、好ましくは、リンカー、例えば、本明細書に記載のＧｌｙＳｅｒリンカーによって二量体の２つの半部分の一方に融合される。二量体の２つの半部分は、共にホモ二量体を形成する実質的に同じ２つの単量体であっても良いし、又は共にヘテロ二量体を形成する異なる単量体であっても良い。従って、２つの単量体は、完全二量体の半分と考えることができる。
【００５２】
Ｃａｓ９は、Ｃａｓ９酵素の２つの部分が機能的Ｃａｓ９を実質的に構成するという意味で分割されている。このＣａｓ９は、ゲノム編集酵素（標的ＤＮＡ及びガイドと複合体を形成する場合）、例えば、ニッカーゼ又はヌクレアーゼ（ＤＮＡの両方の鎖を切断する）として機能し得る、又は本質的にＤＮＡ結合タンパク質であるｄｅａｄＣａｓ９であり得、このＤＮＡ結合タンパク質は、典型的にはその触媒メインにおける２つ以上の突然変異により触媒活性を殆ど若しくは全く有していない（Ｈ８４０又はＮ８６３と組み合わせられたＤ１０、特にＨ８４０Ａ又はＮ８６３Ａと組み合わせられたＤ１０Ａは、Ｓｐ  Ｃａｓ９で最も好ましく、対応する突然変異は、オーソログにとって適切となる）。
【００５３】
ｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９の２つの部分は、このｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９のＮ’末端部分及びＣ’末端部分と考えることができる。融合は、典型的にはＣａｓ９の分割点でなされる。言い換えれば、ｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９のＮ’末端部分のＣ’末端部分が、二量体の一方の半部分に融合し、Ｃ’末端部分のＮ’末端が二量体の他方の半部分に融合する。
【００５４】
Ｃａｓ９は、切断が新たに形成されるという意味で必ずしも分割されていなくても良い。分割点は、典型的には、コンピューター内で設計され、構築物にクローニングされる。ｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９の２つの部分、即ち、Ｎ’末端部分とＣ’末端部分とが１つになって、好ましくは少なくとも７０％以上の野生型アミノ酸（又はこれらをコードするヌクレオチド）、好ましくは少なくとも８０％以上、好ましくは少なくとも９０％以上、好ましくは少なくとも９５％以上、最も好ましくは少なくとも９９％以上の野生型アミノ酸（又はこれらをコードするヌクレオチド）を含む完全Ｃａｓ９を形成する。ある程度のトリミングが可能であり得、突然変異が企図される。非機能的ドメイン、例えば、Ｒｅｃ２ドメインを完全に除去することができる。重要なことは、２つの部分を１つにできること、及び所望のＣａｓ９機能が元に戻る又は再構築されることである。
【００５５】
二量体は、ホモ二量体でも良いし、又はヘテロ二量体でも良い。例は、本明細書に記載される。
【００５６】
１つ以上、好ましくは、２つのＮＬＳを、第１のＣＲＩＳＰＲ酵素構築物に対する機能的な連結に使用することができる。１つ以上、好ましくは、２つのＮＥＳを、第１のＣＲＩＳＰＲ酵素構築物に対する機能的な連結に使用することができる。ＮＬＳ及び／又はＮＥＳは、好ましくは、ｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９二量体（即ち、半二量体）融合体に隣接する、即ち、１つのＮＬＳが第１のＣＲＩＳＰＲ酵素構築物のＮ’末端に位置することができ、１つのＮＬＳが第１のＣＲＩＳＰＲ酵素構築物のＮ’末端に位置することができる。同様に、１つのＮＥＳが、第２のＣＲＩＳＰＲ酵素構築物のＮ’末端に位置することができ、１つのＮＥＳが第２のＣＲＩＳＰＲ酵素構築物のＮ’末端に位置することができる。Ｎ’末端又はＣ’末端について述べる場合、これらは、対応するヌクレオチド配列における５’末端及び３’末端に一致することを理解されたい。
【００５７】
好ましい配置では、第１のＣＲＩＳＰＲ酵素構築物は、５’−ＮＬＳ−（Ｎ’末端Ｃａｓ９部分）−リンカー−（二量体の第１の半部分）−ＮＬＳ−３’の配置である。好ましい配置では、第２のＣＲＩＳＰＲ酵素構築物は、５’−ＮＥＳ−（二量体の第２の半部分）−リンカー−（Ｃ’末端Ｃａｓ９部分）−ＮＥＳ−３’の配置である。適切なプロモーターは、好ましくは、構築物のそれぞれの上流である。２つの構築物は、別個に又は一緒に送達され得る。
【００５８】
一部の実施形態では、第２のＣＲＩＳＰＲ酵素構築物に対する機能的な連結における１つ又は全てのＮＥＳは、ＮＬＳで置換することができる。しかしながら、これは、典型的には好ましくなく、他の実施形態では、第２のＣＲＩＳＰＲ酵素構築物に対する機能的な連結における局在化シグナルは、１つ以上のＮＥＳである。
【００５９】
また、ＮＥＳを、ｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９のＮ’末端断片に機能的に連結することができ、ＮＬＳを、ｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９のＣ’末端断片に機能的に連結することができることを理解されたい。しかしながら、ＮＬＳがｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９のＮ’末端断片に機能的に連結され、ＮＬＳがｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９のＣ’末端断片に機能的に連結される配置が好ましい。
【００６０】
ＮＥＳは、少なくとも誘導物質エネルギー源が供給されるまで（例えば、少なくともエネルギー源が誘導物質に供給されてその機能が果たされるまで）、第２のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物を核外に局在化させるように機能する。誘導物質の存在は、細胞質内での２つのＣＲＩＳＰＲ酵素融合体の二量体化を刺激し、二量体化した第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ酵素融合体の核への局在化を熱力学的に価値あるものにする。理論に拘束されることなく、本出願人らは、ＮＥＳは、第２のＣＲＩＳＰＲ酵素を細胞質（即ち、核の外部）に隔離すると考えている。第１のＣＲＩＳＰＲ酵素上のＮＬＳは、この第１のＣＲＩＳＰＲ酵素を核に局在化させる。いずれの場合も、本出願人らは、ＮＥＳ又はＮＬＳを使用して平衡（核輸送の平衡）を所望の方向にシフトさせる。二量体化は、典型的には、核外で起こり（核内でもほんの僅か起こり得る）、二量体化複合体上のＮＬＳは、核輸送の平衡を核局在化にシフトさせ、これにより二量体化して再構築Ｃａｓ９が核に進入する。これを示す簡易図が図６Ｃ及び図６Ｄに示されている。
【００６１】
有利なことに、本出願人らは、ｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９の機能を再構築することができた。一過性トランスフェクションを使用して、その概念、及び誘導物質エネルギー源の存在下で、バックグラウンドで起こる二量体化を立証した。ＣＲＩＳＰＲ酵素の分離断片では活性が見られなかった。次いで、レンチウイルス送達による安定な発現を使用してこれを進展させ、ｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９アプローチを使用できることを示した。
【００６２】
この本ｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９のアプローチは、Ｃａｓ９活性を誘導性とすることができ、従って一時的な制御を可能とするために有用である。さらに、異なる局在化配列を使用して（即ち、ＮＥＳ及びＮＬＳが好ましい）、自己構築複合体からバックグラウンド活性を低減することができる。組織特異的プロモーター、例えば、第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物のそれぞれのプロモーターも、組織特異的標的化に使用することができ、従って空間的制御を行うことができる。必要に応じて、２つの異なる組織特異的プロモーターを使用して、より高精度の制御を行うことができる。同じアプローチを、発生段階特異的プロモーターに対して使用しても良いし、又は発生段階特異的プロモーターと組織特異的プロモーターの混合でも良く、この場合、第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物の一方が、組織特異的プロモーターの制御下であり（即ち、組織特異的プロモーターに機能的に連結されるか又はこれを含む）、第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物の他方が、発生段階特異的プロモーターの制御下である（即ち、発生段階特異的プロモーターに機能的に連結されるか又はこれを含む）。
【００６３】
誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、例えば、第１のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物に機能的に連結された、本明細書に記載される１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）を含む。これらの核局在化配列は、真核細胞の核において検出可能な量の前記第１のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物の蓄積を誘導するのに十分な理想的な強度である。理論に拘束されることを望むものではないが、核局在化配列は、真核細胞におけるＣＲＩＳＰＲ複合体の活性に必ずしも必要ではないが、このような配列を含めることにより、この系の活性、特に核内での核酸分子の標的化を高め、かつ本２部分系の働きを助けると考えられる。
【００６４】
同様に、第２のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物は、核外移行配列（ＮＥＳ）に機能的に連結される。実際、第２のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物は、１つ以上の核外移行配列に結合することができる。言い換えれば、第２のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物と共に使用される移行配列の数は、好ましくは１つ、２つ、又は３つである。典型的には２つが好ましいが、１つで十分であり、従って一部の実施形態では、１つが好ましい。ＮＬＳ及びＮＥＳの適切な例は、当該技術分野で公知である。好ましい例は、本明細書の実施例で使用される例である。例えば、好ましい核外移行シグナル配列（ＮＥＳ）は、ヒトプロテインチロシンキナーゼ２；及び（ＮＬＳ）である。好ましいシグナルは、種特異的であろう。
【００６５】
ＦＲＢ系及びＦＫＢＰ系が使用される場合、ＦＫＢＰは、好ましくは核局在化配列（ＮＬＳ）によって隣接される。ＦＲＢ系及びＦＫＢＰ系が使用される場合、好ましい配置は、Ｎ’末端Ｃａｓ９−ＦＲＢ−ＮＥＳ：Ｃ’末端Ｃａｓ９−ＦＫＢＰ−ＮＬＳである。従って、第１のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物は、Ｃ’末端Ｃａｓ９部分を含むことになり、第２のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物は、Ｎ’末端Ｃａｓ９部分を含むことなる。
【００６６】
本発明の別の有利な側面は、系が、迅速に切り替わり得ること、即ち、迅速な応答を有することである。理論に拘束されるものではないが、Ｃａｓ９活性は、新たな融合構築物の発現（特に翻訳）によるよりも迅速に、既存の（既に存在する）融合構築物の（誘導物質エネルギー源との接触による）二量体化によって誘導することができると考えられる。従って、第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物は、早めに、即ち、Ｃａｓ９活性が必要になる前に標的細胞で発現させることができる。次いで、Ｃａｓ９活性は、一時的に制御することができ、次いで誘導物質エネルギー源の追加によって迅速に構成することができ、これにより、例えば、ベクターによって送達されるＣａｓ９の発現（転写の誘導を含む）よりも迅速に、理想的に役割を果たす（ヘテロ二量体を二量体化し、これによりＣａｓ９活性を提供する）。
【００６７】
Ｃａｓ９及びＣＲＩＳＰＲ酵素という語は、明確な記載がなければ、本明細書で互換的に使用される。しかしながら、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、好ましくはＣａｓ９であり、最も好ましくはＳｐ（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））Ｃａｓ９又はその変異体若しくは誘導体である。
【００６８】
実施例２において、本出願人らは、Ｃａｓ９を、１つに戻されると機能的ヌクレアーゼに戻る２つの構成成分に分割できることを実証する。ラパマイシン感受性二量体化ドメインを利用することにより、本出願人らは、Ｃａｓ９媒介ゲノム編集の一時的な制御及び転写調節のための化学的誘導性Ｃａｓ９を作製した。言い換えると、本発明者らは、２つの断片に分割することによってＣａｓ９に化学的誘導性を付与することができること、及びラパマイシン感受性二量体化ドメインをＣａｓ９の制御された再構築に使用できることを実証した。本出願人らは、再構築Ｃａｓ９を使用して（ヌクレアーゼ／ニッカーゼ活性により）ゲノム編集及び転写調節を（ＤＮＡ結合ドメイン、いわゆる「ｄｅａｄＣａｓ９」として）媒介することができることを示している。
【００６９】
従って、ラパマイシン感受性二量体化ドメインの使用が好ましい。Ｃａｓ９の再構築が好ましい。再構築は、結合活性の回復によって決定することができる。Ｃａｓ９が、ニッカーゼである又は二本鎖の切断を誘導する場合、野生型と比較した適切な比較パーセンテージが本明細書に記載される。
【００７０】
ラパマイシン処置は１２日間持続した。ラパマイシンは、２００ｎＭで投与した。この一時的用量及び／又はモル用量は、ヒト胚性腎２９３ＦＴ（ＨＥＫ２９３ＦＴ）細胞株に適切な用量の一例であり、これは、他の細胞株でも使用することができる。この数字を、ｉｎ  ｖｉｖｏでの治療的使用のために外挿して、例えば、ｍｇ／ｋｇにすることができる。しかしながら、ラパマイシンを対象に投与するための標準用量をここで使用することも企図される。「標準用量」とは、ラパマイシンの通常の治療的使用での用量又は最初の指標（即ち、ラパマイシンが臓器拒絶反応を防止するための使用で投与される場合に使用される用量）を意味する。
【００７１】
図８は、赤色の矢印及び緑色の矢印で示された１１のスプリット位置の好ましい例を用いたＣａｓ９一次構造の略図を示している。赤色の矢印（番号１〜４と１０）は、ループ領域への分割を示し、緑色の矢印（番号５〜９と１１）は、非構造領域への分割を示す。示されている分割を以下に説明する。
【００７２】
Ｃａｓ９−ＦＲＢ／ＦＫＢＰ断片の好ましい配置が、ＦＲＢ及びＦＫＢＰのラパマイシン誘導性二量体化により機能的完全長Ｃａｓ９ヌクレアーゼが再構築されるまで、分離されて不活性であることが注目に値する。従って、誘導性ヘテロ二量体の第１の半分に付着した第１のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物は、別個に送達され、かつ／又は誘導性ヘテロ二量体の第１の半分に付着した第２のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物とは別に局在化することが好ましい。
【００７３】
Ｃａｓ９（Ｎ）−ＦＲＢ断片を、核局在化Ｃａｓ９（Ｃ）−ＦＫＢＰ断片と二量体化する可能性が低い細胞質内に隔離するために、ヒトプロテインチロシンキナーゼ２からの単一核外移行配列（ＮＥＳ）をＣａｓ９（Ｎ）−ＦＲＢに使用することが好ましい（Ｃａｓ９（Ｎ）−ＦＲＢ−ＮＥＳ）。ラパマイシンの存在下では、Ｃａｓ９（Ｎ）−ＦＲＢ−ＮＥＳがＣａｓ９（Ｃ）−ＦＫＢＰ−２ｘＮＬＳと二量体化して、完全Ｃａｓ９タンパク質を再構築し、これにより、核輸送のバランスが、核内移行に向かってシフトし、ＤＮＡ標的化が可能となる（図６Ｃ及び図６Ｄ）。
【００７４】
高用量のＣａｓ９は、ガイド鎖に対して殆どミスマッチのない標的外（ＯＴ）配列における挿入欠失頻度を悪化させ得る。このような配列は、ミスマッチが不連続的であり、かつ／又はガイド鎖のシード領域の外部であると、特に影響受けやすい。従って、Ｃａｓ９活性の一時的な制御を使用して、長期発現実験における用量を減少させることができ、従って、構成的に活性なＣａｓ９と比較して標的外挿入欠失が減少する。
【００７５】
ウイルス送達が好ましい。特に、レンチウイルス又はＡＡＶ送達ベクターが企図される。本出願人らは、ｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲプラスミドに類似したｓｐｌｉｔ−Ｃａｓ９レンチウイルス構築物を作製した。スプリット断片は、ＡＡＶの約４．７ｋｂサイズ制限に適合するように十分に小さくするべきである。
【００７６】
本出願人らのデータは、ｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９の安定した低いコピー発現を使用して、標的外部位における著しい突然変異なしに、標的遺伝子座での相当な挿入欠失を誘導することができる。本出願人らは、Ｃａｓ９断片（本明細書に記載のスプリット−５に基づいた２部分）をクローニングした。
【００７７】
ｄｅａｄＣａｓ９も使用することができる。このｄｅａｄＣａｓ９は、ＦＲＢ融合体（ｄＣａｓ９（Ｎ）−ＦＲＢ−２ｘＮＥＳ）におけるＤ１０Ａ点突然変異及びＦＫＢＰ融合体におけるＮ８６３Ａ点突然変異を含み、かつＶＰ６４トランス活性化ドメインをＣａｓ９（Ｃ）−ＦＫＢＰ−２ｘＮＬＳに追加した（ｄＣａｓ９（Ｃ）−ＦＫＢＰ−２ｘＮＬＳ−ＶＰ６４）（図７Ａ）。これらの断片は、触媒不活性Ｃａｓ９−ＶＰ６４融合体（ｄＣａｓ９−ＶＰ６４）を再構築した。転写活性を、ラパマイシンの存在下でＶＰ６４によって誘導して、Ｃａｓ９（Ｃ）−ＦＫＢＰ融合体及びＣａｓ９（Ｎ）−ＦＲＢ融合体の二量体化を誘導した。言い換えれば、本出願人らは、ｓｐｌｉｔ  ｄＣａｓ９−ＶＰ６４の誘導性を試験し、転写活性がラパマイシンの存在下でｓｐｌｉｔ  ｄＣａｓ９−ＶＰ６４によって誘導されることを示した。従って、本誘導性Ｃａｓ９は、１つ以上の機能的ドメイン、例えば、転写アクチベーター若しくはリプレッサー、又はヌクレアーゼ（例えば、Ｆｏｋ１）に関連し得る。機能的ドメインは、ｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９の一部分に結合又は融合し得る。
【００７８】
好ましい配置では、第１のＣＲＩＳＰＲ酵素構築物は、５’−第１の局在化シグナル（Ｎ’末端Ｃａｓ９部分）−リンカー−（二量体の第１の半分）−第１の局在化シグナル３’の配置であり、第２のＣＲＩＳＰＲ酵素構築物は、５’−第２の局在化シグナル（二量体の第２の半分）−リンカー−（Ｃ’末端Ｃａｓ９部分）−第２の局在化シグナル機能的ドメイン３’の配置である。ここでは、機能的ドメインは、第２のＣＲＩＳＰＲ酵素構築物の３’末端に配置される。あるいは、機能的ドメインは、第１のＣＲＩＳＰＲ酵素構築物の５’末端に配置することができる。１つ以上の機能的ドメインを、３’末端又は５’末端又は両末端に使用することができる。適切なプロモーターは、好ましくは、これらの各構築物の上流である。これらの２つの構築物は、別々に送達しても良いし、又は一緒に送達しても良い。局在化シグナルは、ＮＬＳ及びＮＥＳが各構築物で混合されていなければ、ＮＬＳ又はＮＥＳであり得る。
【００７９】
一概要では、本発明は、Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ酵素）が、１つの突然変異も有していないＣＲＩＳＰＲ酵素と比較してヌクレアーゼ活性が少なくとも９７％又は１００％低下した誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を提供する。一態様では、本発明は、任意の上記の系を提供し、この系では、ＣＲＩＳＰＲ酵素が２つ以上の突然変異を含み、ＳｐＣａｓ９タンパク質又は任意の対応するオーソログにおけるＤ１０、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、又はＤ９８６、又はＳａＣａｓ９タンパク質におけるＮ５８０の２つ以上が突然変異している、あるいはＣＲＩＳＰＲ酵素が、少なくとも１つの突然変異を含み、少なくともＨ８４０が突然変異している。一態様では、本発明は、本明細書で言及する系を提供し、この系では、ＣＲＩＳＰＲ酵素が、ＳｐＣａｓ９タンパク質におけるＤ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、又はＤ９８６Ａ、又は任意の対応するオーソログ、又はＳａＣａｓ９タンパク質におけるＮ５８０Ａを含む２つ以上の突然変異を含む、あるいはＨ８４０Ａを含む少なくとも１つの突然変異を含む。一態様では、本発明は、本明細書で言及する任意の系を提供し、この系では、ＣＲＩＳＰＲ酵素が、ＳｐＣａｓ９タンパク質又は任意の対応するオーソログにおけるＨ８４０Ａ、又はＤ１０Ａ及びＨ８４０Ａ、又はＤ１０Ａ及びＮ８６３Ａを含む。一態様では、本発明は、本明細書で言及する任意の系を提供し、この系では、ＣＲＩＳＰＲ酵素が：ＳａＣａｓ９タンパク質若しくは任意の対応するオーソログにおけるＮ５８０Ａ；又はＳｐＣａｓ９タンパク質若しくは任意の対応するオーソログにおけるＤ１０Ａ、及びＳａＣａｓ９タンパク質におけるＮ５８０Ａを含む。
【００８０】
従って、Ｃａｓ９がｄｅａｄＣａｓ９であることも好ましい。理想的には、分割は常に、触媒ドメインが影響を受けないようにするべきである。ｄｅａｄＣａｓ９の場合、その意図は、ＤＮＡ結合は起こるが、切断又はニッカーゼ活性が示されないことである。
【００８１】
一態様では、本発明は、１つ以上の機能的ドメインがＣａｓ９に関連している、本明細書に記載の誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を提供する。この機能的ドメインは、ｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９の一部分又は両方に関連（即ち、結合又は融合）し得る。ｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９の２つの部分のそれぞれに関連した機能的ドメインが存在し得る。従って、これらは、典型的には、第１及び／又は第２のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物の一部として、この構築物内の融合体として提供することができる。機能的ドメインは、典型的には、本明細書に記載されるようにリンカー、例えば、ＧｌｙＳｅｒリンカーによって融合される。この１つ以上の機能的ドメインは、転写活性ドメイン又はリプレッサードメインであり得る。この１つ以上の機能的ドメインは、異なるドメインでも良いが、この全ての機能的ドメインがアクチベーター又はリプレッサーであること、及びこの２つの混合物が使用されないことが好ましい。
【００８２】
転写活性化ドメインは、ＶＰ６４、ｐ６５、ＭｙｏＤ１、ＨＳＦ１、ＲＴＡ、又はＳＥＴ７／９を含み得る。
【００８３】
一態様では、本発明は、Ｃａｓ９に関連した１つ以上の機能的ドメインが転写リプレッサードメインである、本明細書に記載の誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を提供する。
【００８４】
一態様では、本発明は、転写リプレッサードメインがＫＲＡＢドメインである、本明細書に記載の誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を提供する。
【００８５】
一態様では、本発明は、転写リプレッサードメインが、ＮｕＥドメイン、ＮｃｏＲドメイン、ＳＩＤドメイン、又はＳＩＤ４Ｘドメインである、本明細書に記載の誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を提供する。
【００８６】
一態様では、本発明は、明細書に記載の誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を提供し、この誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、アダプタータンパク質に関連した１つ以上の機能的ドメインが、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性、ＤＮＡ切断活性、ＤＮＡ組込み活性、又は核酸結合活性を含む１つ以上の活性を有する。
【００８７】
ヒストン修飾ドメインも、一部の実施形態では好ましい。例示的なヒストン修飾ドメインを以下に説明する。トランスポザーゼドメイン、ＨＲ（相同組換え）機構ドメイン、リコンビナーゼドメイン、及び／又はインテグラーゼドメインも、本機能的ドメインとして好ましい。一部の実施形態では、ＤＮＡ組込み活性は、ＨＲ機構ドメイン、インテグラーゼドメイン、リコンビナーゼドメイン、及び／又はトランスポザーゼドメインを含む。
【００８８】
一態様では、本発明は、ＤＮＡ切断活性がヌクレアーゼによるものである、本明細書に記載の誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を提供する。
【００８９】
一態様では、本発明は、ヌクレアーゼがＦｏｋ１ヌクレアーゼを含む、本明細書に記載の誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を提供する。
【００９０】
本ｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９系と共に使用するのが好ましいこのような機能的ドメインの使用は、Ｋｏｎｅｒｍａｎｎら（“Ｇｅｎｏｍｅ−ｓｃａｌｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｃｏｍｐｌｅｘ”Ｎａｔｕｒｅ  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  １１  Ｄｅｃ  ２０１４）にも詳細に説明されている。本系は、任意のガイドと共に使用することができるが、一部の実施形態では、最適化されたガイドが好ましい。特に好ましいのは、上述のＫｏｎｅｒｍａｎｎ  Ｎａｔｕｒｅ  １１  Ｄｅｃ  ２０１４  ｐａｐｅｒに従ったガイドである。これらのガイドは、タンパク質結合ＲＮＡ部分（例えば、アプタマー）が、テトラループ及び／又はステムループ２に追加される、又はこれらを置換するように変更される。次いで、対応するＲＮＡ結合タンパク質ドメインを使用して、ＲＮＡを認識し、機能的ドメイン、例えば、本明細書に記載の機能的ドメインをガイドにリクルートすることができる。これは、主にｄｅａｄＣａｓ９と共に使用され、転写の活性化若しくは抑制、又はヌクレアーゼ、例えば、Ｆｏｋ１によるＤＮＡ切断がもたらされる。このようなガイドとｄｅａｄＣａｓ９との併用は強力であり、本明細書で説明されるように、Ｃａｓ９自体も、それ自体の機能的ドメインに関連していると特に強力である。ｄｅａｄＣａｓ９（それ自体に関連した機能的ドメインを含む又は含まない）が、本発明に従って誘導されて再構成される、即ち、ｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９になると、ツールが特に有用である。
【００９１】
ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、同様に本発明に使用するのに好ましく、細胞内の目的のゲノム遺伝子座の標的配列にハイブリダイズすることができるガイド配列を含むことができ、ｓｇＲＮＡの少なくとも１つのループが、１つ以上のアダプタータンパク質に結合する異なるＲＮＡ配列の挿入によって変更され、このアダプタータンパク質は、１つ以上の機能的ドメインに関連する。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、好ましくはｄｅａｄＣａｓ９である。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、このＣＲＩＳＰＲ酵素が少なくとも１つの突然変異を有していないＣＲＩＳＰＲ酵素の５％以下のヌクレアーゼ活性を有するように少なくとも１つの突然変異；及び／又は少なくとも１つ以上の核局在化配列を含み得る。また、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物も提供され、この組成物は：細胞内の目的のゲノム遺伝子座の標的配列にハイブリダイズすることができるガイド配列を含む１つ以上のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、少なくとも１つ以上の核局在化配列を含むＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、このＣＲＩＳＰＲ酵素は、このＣＲＩＳＰＲ酵素が少なくとも１つの突然変異を有していないＣＲＩＳＰＲ酵素の５％以下のヌクレアーゼ活性を有するように少なくとも１つの突然変異を含み、少なくとも１つのｓｇＲＮＡの少なくとも１つのループが、１つ以上のアダプタータンパク質に結合する異なるＲＮＡ配列の挿入によって変更され、アダプタータンパク質が、１つ以上の機能的ドメインに関連する。
【００９２】
１つ以上のアダプタータンパク質に結合する異なるＲＮＡ配列の挿入によって変更されるのが好ましいｓｇＲＮＡの少なくとも１つのループは、テトラループ又はステムループ２の一方又は両方である。１つ以上のアダプタータンパク質に結合する異なるＲＮＡ配列の挿入は、好ましくは、同じ又は異なるアダプタータンパク質に特異的な１つのアプタマー配列又は２つ以上のアプタマー配列である。アダプタータンパク質は、好ましくは、ＭＳ２、ＰＰ７、Ｑβ、Ｆ２、ＧＡ、ｆｒ、ＪＰ５０１、Ｍ１２、Ｒ１７、ＢＺ１３、ＪＰ３４、ＪＰ５００、ＫＵ１、Ｍ１１、ＭＸ１、ＴＷ１８、ＶＫ、ＳＰ、ＦＩ、ＩＤ２、ＮＬ９５、ＴＷ１９、ＡＰ２０５、φＣｂ５、φＣｂ８ｒ、φＣｂ１２ｒ、φＣｂ２３ｒ、７ｓ、ＰＲＲ１を含む。特にｓｐｌｉｔ  ｄＣａｓ９を安定的に発現する細胞株は有用であり得る。
【００９３】
本出願人らは、Ｃａｓ９を、化学的誘導を用いて１つに戻されると機能的完全長Ｃａｓ９ヌクレアーゼに戻る２つの異なる断片に分割できることを実証した。ｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９の構造は、様々な適用例に有用であろう。例えば、ｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９は、各断片を異なる組織特異的プロモーター下に置くことによりＣａｓ９活性を交差細胞集団に制限するための遺伝子法を可能にすることができる。加えて、化学的に誘導される異なる二量体化ドメイン、例えば、ＡＰＡ及びジベレリンも利用することができる。
【００９４】
誘導物質エネルギー源は、好ましくは化学的誘導である。
【００９５】
スプリット位置又は場所は、Ｃａｓ９酵素の第１の部分が第２の部分から分離される点である。一部の実施形態では、第１の部分は、アミノ酸１〜Ｘを含む又はコードし、第２の部分は、アミノ酸Ｘ＋１〜最後を含む又はコードする。この例では、付番は連続しているが、アミノ酸（又はアミノ酸をコードするヌクレオチド）は分割端部のいずれかの端部から切り取ることができるため、必ずしも連続にしなくても良い。ただし、この切り取りは、十分なＤＮＡ結合活性及びＤＮＡニッカーゼ活性又はＤＮＡ切断活性（必要な場合）が、野生型Ｃａｓ９と比較して、例えば、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％の活性を保持する場合に限られる。
【００９６】
本明細書で提供される例示的な付番は、野生型タンパク質、好ましくは野生型ＳｐＣａｓ９タンパク質に関連し得る。しかしながら、野生型ＳｐＣａｓ９タンパク質の突然変異を使用できることが企図される。例えば、結晶のデータ論文自体では、ｄｅａｄＣａｓ９を使用し、これらは、一部の実施形態では好ましく、本明細書の他の部分を参照されたい。この付番も同様に、例えば、ある程度のＮ’  末端又はＣ’末端の切断又は欠失を使用できるため、ＳｐＣａｓ９の付番に正確に従わなくても良いが、これは、標準的な配列アラインメントツールを用いて対処することができる。オーソログも、配列アラインメントツールとして好ましい。
【００９７】
従って、スプリット位置を、例えば、本明細書で言及する物質に示される結晶データに基づいて、当該技術分野の一般的な技術を用いて選択することができる。
【００９８】
実施例１及び２では、本出願人らは、ＳｐＣａｓ９の多数のスプリット位置を調べ、本出願人らが行った全てのスプリット位置は、誘導性二量体化ドメインでＣａｓ９を再構成することができた。実施例１では、図１、特に図１Ｄに示されているように以下が試され、以下にコピーする：
【００９９】
【表１】
2017503485.tif 000003
【０１００】
潜在的な分割側の特定は、結晶構造を利用して極めて単純に行われる。Ｓｐ突然変異の場合、例えば、配列アラインメントの対応する位置がどこであるかは容易に分かるはずである。非Ｓｐ酵素の場合は、オーソログと対象のＣａｓ９との間に比較的高い相同性が存在する場合は、オーソログの結晶構造を使用することができる。
【０１０１】
理想的には、スプリット位置は、領域又はループ内に位置するべきである。好ましくは、スプリット位置は、アミノ酸配列の中断が構造的特徴（例えば、αへリックス又はβシート）の部分的又は完全な破壊をもたらさない場所である。非構造領域（これらの領域が結晶で「凍結」するには十分に構造化されていないため、結晶構造で現れない領域）は、しばしば好ましい選択肢である。本実施例では、本出願人らは、ＳｐＣａｓ９の表面に露出した全ての非構造領域で分割した。非構造領域又は外部ループ内の位置は、正確に上記の番号にしなくても良いが、スプリット位置がなお外部ループの非構造領域の範囲内であれば、ループのサイズによって、上記の位置のいずれかの側で、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、又は１０ものアミノ酸が異なり得る。
【０１０２】
Ｒｅｃ２ドメインの外部ループにおける分割が、一部の実施形態では好ましい。他の実施形態では、Ｒｅｃ１の外部ループにおける分割が好ましい。他の実施形態では、ＰＩの外部ループにおける分割が好ましい。他の実施形態では、Ｒｅｃ１の非構造領域における分割が好ましい。他の実施形態では、ＲｕｖＣ３の非構造領域における分割が好ましい。他の実施形態では、ＰＩの非構造領域における分割が好ましい。
【０１０３】
本出願人らは、好ましい実施例及びガイドラインとして示される以下の手順に従った。非構造領域は結晶構造で現れないため、本出願人らは、ＳｐＣａｓ９の一次アミノ酸配列とこの結晶の周囲のアミノ酸配列とを相互参照した。各非構造領域を３〜１０のアミノ酸で作製し、これらの非構造領域は結晶で現れなかった。従って、本出願人らは、これらのアミノ酸間で分割を行った。ＳｐＣａｓ９では、非構造領域において僅か６つの分割が可能であった。より多くの分割を試験することにより、本出願人らが、機能する分割を見つける可能性が高くなるであろうと仮定した（当初は、大きいタンパク質での分割が機能するかは懐疑的であった）。より可能性の高い分割側を含めるために、本出願人らは、非構造領域と同じ基準を用いてＣａｓ９の外部にあるループに位置する分割を含めた。驚くべきことに、上記の分割の全てが機能した。
【０１０４】
一部の実施形態では、スプリット位置は、Ｃａｓ９の外部ループ内である。他の好ましい実施形態では、スプリット位置は、Ｃａｓ９の非構造領域内である。非構造領域は、典型的には、結晶パターンからは構造を容易に決定することができない非常に柔軟な外部ループである。
【０１０５】
分割は、好ましくは、上述の２つアミノ酸間、例えば、第１の列の２０２ＡのＣ’末端で行われる。上記の分割のいずれも、ＳｐＣａｓ９において好ましい、又は突然変異ＳｐＣａｓ９若しくはオーソログにおける対応する位置である。一部の実施形態では、スプリット位置は２０２Ａ／２０３Ｓ間であり得る。一部の実施形態では、スプリット位置は２５５Ｆ／２５６Ｄ間であり得る。一部の実施形態では、スプリット位置は３１０Ｅ／３１１Ｉ間であり得る。一部の実施形態では、スプリット位置は５３４Ｒ／５３５Ｋ間であり得る。一部の実施形態では、スプリット位置は５７２Ｅ／５７３Ｃ間であり得る。一部の実施形態では、スプリット位置は７１３Ｓ／７１４Ｇ間であり得る。一部の実施形態では、スプリット位置は１００３Ｌ／１０４Ｅ間であり得る。一部の実施形態では、スプリット位置は１０５４Ｇ／１０５５Ｅ間であり得る。一部の実施形態では、スプリット位置は１１１４Ｎ／１１１５Ｓ間であり得る。一部の実施形態では、スプリット位置は１１５２Ｋ／１１５３Ｓ間であり得る。一部の実施形態では、スプリット位置は１２４５Ｋ／１２４６Ｇ間であり得る。別の好ましい位置は、実施例１で述べられるように１０９８と１０９９との間の分割である。
【０１０６】
スプリット位置が特定されると、適切な構築物を設計することができる。例えば、２０２Ａ／２０３Ｓ間の分割における１つのこのような構築物が図１Ｃに示されている。
【０１０７】
典型的には、ＮＥＳは、分割アミノ酸の第１の部分のＮ’末端（又はこのアミノ酸をコードするヌクレオチドの５’末端）に位置する。この場合、ＮＬＳは、分割アミノ酸の第２の部分のＣ’末端（又はこのアミノ酸をコードするヌクレオチドの３’末端）に位置する。このようにして、第１のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物を、１つ以上の核外移行シグナルに機能的に連結することができ、かつ第２のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物を、核局在化シグナルに機能的に連結することができる。
【０１０８】
もちろん、ＮＬＳが分割アミノ酸の第１の部分のＮ’末端（又はこのアミノ酸をコードするヌクレオチドの５’末端）に位置する逆の配置も提供することができる。この場合は、ＮＥＳは、分割アミノ酸の第２の部分のＣ’末端（又はこのアミノ酸をコードするヌクレオチドの３’末端）に位置する。従って、第１のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物を、１つ以上の核局在化シグナルに機能的に連結することができ、かつ第２のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物を、核外移行シグナルに機能的に連結することができる。
【０１０９】
実施例２は、上記に立脚し、同様の位置を使用する。これらは、以下に示され、上記で使用された位置に近い。また、図２、特に図２Ａ及び実施例２を参照されたい。
【０１１０】
【表２】
2017503485.tif 000004
【０１１１】
上記のスプリット−４、スプリット−５、及びスプリット−６は、一態様では、２つの部分（分割の両側）をパッケージングのためにほぼ同じ長さに維持するある利点が存在するため有利である。例えば、転写物がほぼ同じサイズであるときに両方の断片間の化学量論を容易に維持すると考えられる。
【０１１２】
実施例２では、ヒトコドン最適化化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９のＮ末端断片及びＣ末端断片がそれぞれ、ＦＲＢ及びＦＫＢＰ二量体化ドメインに融合される。この配置が好ましい。この配置は、切り替えることができ（即ち、Ｎ’末端とＦＫＢＰ及びＣ’末端とＦＲＢ）、この切り替えられた配置も機能するが、この切り替えられた配置はＣａｓ９の２つの部分をさらに分離するという考えが存在する。
【０１１３】
リンカー、例えば、（ＧＧＧＧＳ）３は、好ましくは、Ｃａｓ９断片を二量体化ドメインから分離するために本明細書で使用される。（ＧＧＧＧＳ）３は、比較的長いリンカー（１５のアミノ酸）であるため好ましい。グリシン残基は、最も柔軟性が高く、セリン残基は、リンカーがタンパク質の外部にくる確率を高める。（ＧＧＧＧＳ）６、（ＧＧＧＧＳ）９、又は（ＧＧＧＧＳ）１２は、好ましくは、代替として使用することができる。他の好ましい代替は、（ＧＧＧＧＳ）１、（ＧＧＧＧＳ）２、（ＧＧＧＧＳ）４、（ＧＧＧＧＳ）５、（ＧＧＧＧＳ）７、（ＧＧＧＧＳ）８、（ＧＧＧＧＳ）１０、又は（ＧＧＧＧＳ）１１である。
【０１１４】
例えば、図８は、Ｎ’末端Ｃａｓ９断片とＦＲＢとの間の（ＧＧＧＧＳ）３を示す。図８はまた、ＦＫＢとＣ’末端Ｃａｓ９断片との間の（ＧＧＧＧＳ）３も示す。
【０１１５】
代替のリンカーを利用可能であるが、非常に柔軟性の高いリンカーは、最も良く機能して、Ｃａｓ９の２つの部分が１つになる最大の機会を与え、従ってＣａｓ９活性を元に戻すと考えられる。１つの代替では、核質のＮＬＳをリンカーとして使用することができる。
【０１１６】
リンカーは、Ｃａｓ９と任意の機能的ドメインとの間に使用することもできる。同様に、（ＧＧＧＧＳ）３リンカーをここに使用しても良いし（又は結果として６、９、又は１２の反復型）、又は核質のＮＬＳを、Ｃａｓ９と機能的ドメインとの間のリンカーとして使用することができる。
【０１１７】
ＦＲＢ／ＦＫＢＰ系の代替も企図される。例えば、ＡＢＡ系及びジベレリン系。
【０１１８】
従って、ＦＫＢＰファミリーの好ましい例は、以下の誘導系のいずれか１つである。ＦＫ５０６の存在下でカルシニューリンＡ（ＣＮＡ）と二量体化するＦＫＢＰ；ＦＫＣｓＡの存在下でＣｙＰ−Ｆａｓと二量体化するＦＫＢＰ；ラパマイシンの存在下でＦＲＢと二量体化するＦＫＢＰ；クーママイシンの存在下でＧｒｙＢと二量体化するＧｙｒＢ；ジベレリンの存在下でＧＩＤ１と二量体化するＧＡＩ；ＨａＸＳの存在下でＨａｌｏＴａｇと二量体化するＳｎａｐタグ。
【０１１９】
ＦＫＢＰファミリー自体の中での代替も好ましい。例えば、ＦＫ１０１２の存在下でホモ二量体化する（即ち、あるＦＫＢＰが別のＦＫＢＰと二量体化する）ＦＫＢＰ。従って、天然に存在しない又はエンジニアリングされた誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系も提供され、この誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は：
誘導性ホモ二量体の第１の半分に付着した第１のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物及び
誘導性ホモ二量体の第２の半分に付着した第２のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物を含み、
第１のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物が、１つ以上の核局在化シグナルに機能的に連結され、
第２のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物が、（任意に１つ以上の）核外移行シグナルに機能的に連結され、
誘導物質エネルギー源との接触により、誘導性ホモ二量体の第１の半分と第２の半分が１つになり、
誘導性ホモ二量体の第１の半分と第２の半分が１つになることにより、第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物が、機能的ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を再構成することができ、
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系が、細胞内の目的のゲノム遺伝子座における標的配列にハイブリダイズすることができるガイド配列を含むガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含み、かつ
機能的ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系が標的配列に結合し、任意にゲノム遺伝子座を編集して遺伝子発現を変更する。
【０１２０】
一実施形態では、ホモ二量体は、好ましくはＦＫＢＰであり、誘導物質エネルギー源は、好ましくはＦＫ１０１２である。別の実施形態では、ホモ二量体は、好ましくはＧｒｙＢであり、誘導物質エネルギー源は、好ましくはクーママイシンである。別の実施形態では、ホモ二量体は、好ましくはＡＢＡであり、誘導物質エネルギー源は、好ましくはジベレリンである。
【０１２１】
他の実施形態では、二量体はヘテロ二量体である。ヘテロ二量体の好ましい例は、以下の誘導系のいずれか１つである：ＦＫ５０６の存在下でカルシニューリンＡ（ＣＮＡ）と二量体化するＦＫＢＰ；ＦＫＣｓＡの存在下でＣｙＰ−Ｆａｓと二量体化するＦＫＢＰ；ラパマイシンの存在下、クーママイシンの存在下でＦＲＢと二量体化するＦＫＢＰ；ジベレリンの存在下でＧＩＤ１と二量体化するＧＡＩ；ＨａＸＳの存在下でＨａｌｏＴａｇと二量体化するＳｎａｐタグ。
【０１２２】
ＦＫＢＰ／ＦＲＢは、十分に特徴付けられ、両方のドメインが十分に小さくて（１００未満のアミノ酸）パッケージングを容易にするため、本出願人らはＦＫＢＰ／ＦＲＢを使用した。さらに、ラパマイシンは、長期間使用されており、副作用が十分に分かっている。大きい二量体化ドメイン（３００を超えるアミノ酸）も機能するはずであるが、Ｃａｓ９の再構成を可能にするためにはより長いリンカーを必要とし得る。
【０１２３】
Ｐａｕｌｍｕｒｕｇａｎ及びＧａｍｂｈｉｒ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，Ａｕｇｕｓｔ  １５，２００５  ６５；７４１３）は、ＦＲＢ／ＦＫＢＰ／ラパマイシン系のバックグラウンドについて説明している。別の有用な論文は、Ｃｒａｂｔｒｅｅら（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １３，９９−１０７，Ｊａｎ  ２００６）による論文である。この図６Ｂはまた、本発明によって企図されるラパマイシンの存在下での構築物並びに得られる発現及び二量体化の有用な略図を示している。
【０１２４】
実施例３では、図９Ａに示されているように、単一ベクター、発現カセット（プラスミド）を構築した。ｓｇＲＮＡは、Ｕ６プロモーターの制御下にあった。２つの異なるＣａｓのスプリット：実施例２からのスプリット−４及び５を使用した。ｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９構築物は、ＦＫＢＰがＧｌｙＳｅｒリンカーによってｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９のＣ末端部分に融合した、ＮＬＳに隣接した第１のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物；及びＦＲＢがＧｌｙＳｅｒリンカーによってｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９のＮ末端部分に融合した、ＮＥＳに隣接した第２のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物に基づいていた。第１のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物と第２のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物とを分離するために、Ｐ２Ａを使用して転写時に分割した。ｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９は、ラパマイシンの存在下で野生型に類似した挿入欠失の発生を示したが、ラパマイシンの非存在下では野生型より著しく低い挿入欠失の発生を示した。
【０１２５】
従って、単一ベクターが提供される。このベクターは：
誘導性二量体の第１の半分に付着した第１のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物及び
誘導性二量体の第２の半分に付着した第２のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物を含み、
第１のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物が、１つ以上の核局在化シグナルに機能的に連結され、
第２のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物が、１つ以上の核外移行シグナルに機能的に連結され、
誘導物質エネルギー源との接触により、誘導性ヘテロ二量体の第１の半分と第２の半分が１つになり、
誘導性ヘテロ二量体の第１の半分と第２の半分が１つになることにより、第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物が、機能的ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を構成することができ、
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系が、細胞内の目的のゲノム遺伝子座における標的配列にハイブリダイズすることができるガイド配列を含むガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含み、かつ
機能的ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系が標的配列に結合し、任意にゲノム遺伝子座を編集して遺伝子発現を変更する。これらのエレメントは、好ましくは、単一構築物、例えば、発現カセット上に位置する。
【０１２６】
第１のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物は、好ましくは、各末端で少なくとも１つの核局在化シグナルに隣接する。第２のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物は、好ましくは、各末端で少なくとも１つの核外移行シグナルに隣接する。
【０１２７】
処置を必要とする対象を処置する方法も提供され、この方法は、系をコードするポリヌクレオチド又は任意の本ベクターを用いて対象を形質転換することによって遺伝子編集を誘導するステップ、及び誘導物質エネルギー源を対象に投与するステップを含む。適切な修復鋳型も提供することができ、この修復鋳型は、例えば、前記修復鋳型を含むベクターによって送達される。
【０１２８】
また、処置を必要とする対象を処置する方法も提供され、この方法は、本系をコードするポリヌクレオチド又は任意の本ベクターを用いて対象を形質転換することによって転写の活性化又は抑制を誘導するステップを含み、前記ポリヌクレオチド又はベクターが、触媒不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素及び１つ以上の関連する機能的ドメインをコードする又は含み；この方法は、誘導物質エネルギー源を対象に投与するステップをさらに含む。
【０１２９】
前記方法の処置に使用される本系を含む組成物も提供される。このような方法の処置のための薬剤の製造における本系の使用も提供される。
【０１３０】
本系によって処置可能な状態の例は、本明細書に、又は本明細書で言及される文献に記載されている。
【０１３１】
単一ベクターは、転写分割剤、例えば、Ｐ２Ａを含み得る。Ｐ２Ａは、転写物を２つに分割して、第１のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物と第２のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物を分離する。この分割は、「リボソームスキップ」によるものである。本質的に、リボソームは、翻訳中にアミノ酸をスキップし、これがタンパク質鎖を切断して、２つの分離したポリペプチド／タンパク質が生じる。単一ベクターはまた、低いバックグラウンド活性は重要ではないが高い誘導活性が望ましい適用例で有用である。
【０１３２】
一例は、クローン胚性幹細胞株の作製であろう。通常の手順は、ｗｔ  Ｃａｓ９又はＣａｓ９ニッカーゼをコードするプラスミドでの一過性のトランスフェクションである。これらのプラスミドは、Ｃａｓ９分子を産生し、このＣａｓ９分子は、数日間活性を維持し、標的外活性の高い確率を有する。ｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９に単一発現ベクターを使用することにより、「高い」Ｃａｓ９活性をより短期間に制限することが可能となる（例えば、誘導物質、例えば、ラパマイシンの単回投与）。連続的な（毎日の）誘導（例えば、ラパマイシン）処置を行わないと、単一発現ｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９ベクターの活性が低く、不所望の標的外の影響を引き起こす確率の低下を示す。
【０１３３】
誘導Ｃａｓ９活性のピークは、一部の実施形態では有利であり、単一送達ベクターを用いて極めて容易に引き起こすことができるが、二重ベクター系（各ベクターがｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９の半分を送達する）によっても可能である。このピークは、高い活性であり、短期間、典型的には誘導物質の存続期間であり得る。
【０１３４】
従って、クローン胚性幹細胞株の作製方法が提供され、この方法は、１つ以上の胚性幹細胞を、本系をコードするポリヌクレオチド又は本ｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９を発現する本ベクターの１つでトランスフェクトするステップ、１つ以上の幹細胞を投与する又は本誘導物質エネルギー源に接触させてＣａｓ９の再構成を誘導するステップを含む。修復鋳型を提供することができる。
【０１３５】
本明細書に記載の全ての方法と同様に、適切なｓｇＲＮＡ又はガイドが必要となることを理解されたい。
【０１３６】
機能的ドメインなどが、酵素の一部分又は他の部分に「関連」している場合、これらは、典型的には融合している。「〜に関連している」という語は、本明細書では、例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素の部分と機能的ドメインとの間で１つの分子が別の分子にどのように「関連する」かについて使用される。このようなタンパク質−タンパク質の相互作用の場合には、この関連は、抗体がエピトープを認識する方法における認識の点から考えることができる。あるいは、１つのタンパク質は、２つの融合、例えば、１つのサブユニットが別のサブユニットに融合されることによって別のタンパク質に関連し得る。融合は、典型的には、一方のアミノ酸配列の他方のアミノ酸配列への追加、例えば、各タンパク質又はサブユニットをコードするヌクレオチド配列を一緒にスプライシングすることによって起こり得る。あるいは、これは、本質的に、２つの分子間の結合又は直接連結、例えば、融合タンパク質と見なすことができる。いずれの場合も、融合タンパク質は、目的のサブユニット間（即ち、酵素と機能的ドメインとの間、又はアダプタータンパク質と機能的ドメインとの間）にリンカーを含み得る。従って、一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素の一部は、機能的ドメインに結合することによってこの機能的ドメインに関連している。他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、任意に中間リンカーを介して、このＣＲＩＳＰＲ酵素と機能的ドメインの２つが１つに融合しているため、この機能的ドメインに関連している。リンカーの例として、本明細書に記載のＧｌｙＳｅｒリンカーが挙げられる。
【０１３７】
誘導物質の他の例として、光及びホルモンが挙げられる。光の場合、誘導性二量体は、ヘテロ二量体であり得、二量体の第１の光誘導性半部分及び二量体の第２の（及び相補的な）光誘導性半部分を含み得る。第１及び第２の光誘導性二量体の半部分の好ましい例は、ＣＩＢ１系及びＣＲＹ２系である。ＣＩＢ１ドメインは、光感受性クリプトクロム２（ＣＲＹ２）のヘテロ二量体結合パートナーである。
【０１３８】
本発明は、誘導物質エネルギー源が、熱、超音波、電磁エネルギー、又は化学種であり得ることを包含する。本発明の好ましい一実施形態では、誘導物質エネルギー源は、抗生物質、小分子、ホルモン、ホルモン誘導体、ステロイド、又はステロイド誘導体であり得る。より好ましい実施形態では、誘導物質エネルギー源は、アブシジン酸（ＡＢＡ）、ドキシサイクリン（ＤＯＸ）、クミン酸、ラパマイシン、４−ヒドロキシタモキシフェン（４ＯＨＴ）、エストロゲン、又はエクジソンであり得る。本発明は、抗生物質ベース誘導系、電磁エネルギーベース誘導系、小分子ベース誘導系、核受容体ベース誘導系、及びホルモンベース誘導系からなる群から選択され得る少なくとも１つのスイッチを提供する。より好ましい実施形態では、この少なくとも１つのスイッチは、テトラサイクリン（Ｔｅｔ）／ＤＯＸ誘導系、光誘導系、ＡＢＡ誘導系、クミン酸受容体／オペレーター系、４ＯＨＴ／エストロゲン誘導系、エクジソンベース誘導系、及びＦＫＢＰ１２／ＦＲＡＰ（ＦＫＢＰ１２−ラパマイシン複合体）誘導系からなる群から選択され得る。このような誘導物質はまた、本明細書、及び参照により本明細書に組み入れられる国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０５１４１８号明細書に記載されている。
【０１３９】
一般に、ｗｔ、ニッカーゼ、又はｄｅａｄＣａｓ９（関連した機能的ドメインを含む又は含まない）にかわらず、Ｃａｓ９を利用できるあらゆる使用は、本ｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９アプローチを用いて追跡することができる。有効な利点は、Ｃａｓ９活性の誘導性が残存することである。
【０１４０】
さらなる例として、蛍光タンパク質様ＧＦＰと融合したｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９を作製することができる。これは、ゲノム遺伝子座の画像化を可能にし得るが（“Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｌｏｃｉ  ｉｎ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ａｎ  Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  Ｓｙｓｔｅｍ”Ｃｈｅｎ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ２０１３を参照）、この画像化は誘導可能な方式で行われる。従って、一部の実施形態では、１つ以上のＣａｓ９部分を、蛍光タンパク質、例えば、ＧＦＰに関連（特に融合）させることができる。
【０１４１】
さらなる実験は、標的上の切断が同じレベルのときに、野生型（ｗｔ）とｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９との間に標的外の切断における差が存在するか否かに取り組む。これをするために、本出願人らは、ｗｔ及びｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９プラスミドの一過性トランスフェクションを使用し、異なる時点で回収する。本出願人らは、標的上の切断が±５％以内であるサンプルのセットを見出した後に標的外の活性化を調べる。本出願人らは、ガイドを用いずに（レンチウイルスを使用して）ｗｔ又はｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９の安定な発現で細胞株を作製する。抗体選択後に、ガイドを別のレンチウイルスを用いて送達し、標的上／標的外の切断を測定するために異なる時点で回収する。
【０１４２】
誘導性転写の系を考慮して、本出願人らは、スプリット−１１を用いてｓｐｌｉｔ  ｄＣａｓ９の異なる構造をクローニングした。スプリット−１１は、ラパマイシンの投与中止後に複合体がより不安定で、従ってより解離しやすくなることが期待されるため、２つのＣａｓ９断片間に最小の結合面を有する。このアプローチは、誘導を有していたが、誘導が少なく、バックグラウンドが多く、可逆的でもなかった。
【０１４３】
本出願人らは、不安定化配列（ＰＥＳＴ、“Ｕｓｅ  ｏｆ  ｍＲＮＡ−  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｔｏ  ｄｅｖｅｌｏｐ  ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ”Ｖｏｏｎ  ＤＣ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００５を参照されたい）をＦＲＢ（Ｎ）Ｃａｓ９−ＮＥＳ断片に導入して迅速な分解を促進し、従ってｓｐｌｉｔ  ｄＣａｓ９−ＶＰ６４複合体の安定性を低下させた。このような不安定化配列（ＰＥＳＴを含む）は、本系に有利であり得る。
【０１４４】
ｓｐｌｉｔ  ｄＣａｓ９−ＶＰ６４及びＭＳ２−ｐ６５−ＨＳＦ１＋ガイドを安定に発現する細胞株を作製した。ＰＬＸ抵抗性スクリーンにより、非可逆的な時限転写活性が薬物スクリーニングに有用であり得ることを実証することができる。このアプローチは、ｓｐｌｉｔ  ｄＣａｓ９−ＶＰ６４が非可逆的であるときに有利であり得る。
【０１４５】
一般に、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系又はＣＲＩＳＰＲ系は、前述の文献、例えば、国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７号明細書）で使用され、これらの系はまとめて、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ］）遺伝子の発現又はその活性の誘導に関与する転写物及び他のエレメントを指し、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス−活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ又は活性な部分的ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒ−ｍａｔｅ配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈において「直接反復」及びｔｒａｃｒＲＮＡ処理された部分的直接反復を包含する）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈において「スペーサー」とも呼ばれる）、又は本明細書で使用される語である「ＲＮＡ」（例えば、Ｃａｓ９をガイドするＲＮＡ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ、及びトランス活性化（ｔｒａｃｒ）ＲＮＡ、又は単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）（キメラＲＮＡ））、又はＣＲＩＳＰＲ遺伝子座由来の他の配列及び転写物を含む。一般に、ＣＲＩＳＰＲ系は、標的配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈においてプロトスペーサーとも呼ばれる）の部位におけるＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するエレメントによって特徴付けられる。ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成の文脈において、「標的配列」は、ガイド配列が相補性を有するように設計される配列を指し、標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションが、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。標的配列は、任意のポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡポリヌクレオチド又はＲＮＡポリヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、標的配列は、細胞の核内又は細胞質内に位置する。一部の実施形態では、直接反復は、次の基準：１．ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に隣接したゲノム配列の２Ｋｂの枠内に見られる；２．２０〜５０ｂｐに及ぶ；３．２０〜５０ｂｐの間隔が空いている、のいずれか又は全てを満たす反復モチーフを検索することによってコンピューター内で特定することができる。一部の実施形態では、これらの基準の２つ、例えば、１と２、２と３、又は１と３を使用することができる。
【０１４６】
一部の実施形態では、３つ全ての基準を使用することができる。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ複合体において、ｔｒａｃｒ配列が、１つ以上のヘアピンを有し、かつ３０以上のヌクレオチド長、４０以上のヌクレオチド長、又は５０以上のヌクレオチド長であり：ガイド配列が、１０〜３０ヌクレオチド長であり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素がＩＩ型Ｃａｓ９酵素であることが好ましいであろう。
【０１４７】
本発明の実施形態では、ガイド配列及びガイドＲＮＡという語は、上記の文献、例えば、国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７号明細書）と互換的に使用される。一般に、ガイド配列は、標的配列とハイブリダイズしてＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列への配列特異的結合を誘導するように、標的ポリヌクレオチド配列と十分な相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、適切なアラインメントアルゴリズムを用いて最適に整列されたときの、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、約５０％、約６０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７．５％、約９９％、若しくはそれよりも高い、又は約５０％を超える、約６０％を超える、約７５％を超える、約８０％を超える、約８５％を超える、約９０％を超える、約９５％を超える、約９７．５％を超える、約９９％を超える、若しくはそれよりも高い。最適なアラインメントは、配列を整列させるための任意の適切なアルゴリズムを用いて決定することができ、このような適切なアルゴリズムの非限定的な例として、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ  Ｗｈｅｅｌｅｒ  Ａｌｉｇｎｅｒ）に基づいたアルゴリズム、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ｗｗｗ．ｎｏｖｏｃｒａｆｔ．ｃｏｍで入手可能）、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎで入手可能）、及びＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔで入手可能）が挙げられる。一部の実施形態では、ガイド配列は、約５、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約７５、若しくはそれ以上、又は約５を超える、約１０を超える、約１１を超える、約１２を超える、約１３を超える、約１４を超える、約１５を超える、約１６を超える、約１７を超える、約１８を超える、約１９を超える、約２０を超える、約２１を超える、約２２を超える、約２３を超える、約２４を超える、約２５を超える、約２６を超える、約２７を超える、約２８を超える、約２９を超える、約３０を超える、約３５を超える、約４０を超える、約４５を超える、約５０を超える、約７５を超える、若しくはそれ以上のヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ガイド配列は、約７５未満、約５０未満、約４５未満、約４０未満、約３５未満、約３０未満、約２５未満、約２０未満、約１５未満、約１２未満、又はそれ未満のヌクレオチド長である。好ましくは、ガイド配列は、１０〜３０ヌクレオチド長である。ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列に対する配列特異的結合を誘導するガイド配列の能力は、任意の適切なアッセイによって評価することができる。例えば、試験するべきガイド配列を含む、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するのに十分なＣＲＩＳＰＲ系の構成成分を、例えば、ＣＲＩＳＰＲ配列の構成成分をコードするベクターでのトランスフェクションによって、対応する標的配列を有する宿主細胞に導入し、続いて、標的配列内の優先的切断の評価を、例えば、本明細書に記載のＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイによって行うことができる。同様に、標的ポリヌクレオチド配列の切断は、標的配列、試験するべきガイド配列及びこの試験ガイド配列とは異なる対照ガイド配列を含むＣＲＩＳＰＲ複合体の構成成分を用意し、そして標的配列における結合又は切断率を試験配列反応と対照ガイド配列反応との間で比較することによって試験管で評価することができる。他のアッセイも可能であり、当業者であれば想到するであろう。ガイド配列は、任意の標的配列を標的とするように選択することができる。一部の実施形態では、標的配列は、細胞のゲノム内の配列である。例示的な標的配列として、標的ゲノム中のユニークな配列が挙げられる。例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の場合は、ゲノム中のユニークな標的配列は、ＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧの形態のＣａｓ９標的部位を含むことができ、このＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧ（ＮはＡ、Ｇ、Ｔ、又はＣであり；かつＸはいずれであっても良く；ＷはＡ又はＴである）は、ゲノム中の単一発生を有する。ゲノム中のユニークな標的配列は、ＭＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧの形態の化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９標的部位を含むことができ、このＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧ（ＮはＡ、Ｇ、Ｔ、又はＣであり；Ｘはいずれであっても良い）は、ゲノム中の単一発生を有する。サーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ１  Ｃａｓ９の場合は、ゲノム中のユニークな標的配列は、ＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷの形態のＣａｓ９標的部位を含むことができ、このＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷ（ＮはＡ、Ｇ、Ｔ、又はＣであり；Ｘはいずれであっても良く；ＷはＡ又はＴである）は、ゲノム中の単一発生を有する。ゲノム中のユニークな標的配列は、ＭＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷの形態のサーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ１  Ｃａｓ９標的部位を含むことができ、このＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷ（ＮはＡ、Ｇ、Ｔ、又はＣであり；Ｘはいずれであっても良く；ＷはＡ又はＴである）は、ゲノム中の単一発生を有する。化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の場合は、ゲノム中のユニークな標的配列は、ＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧの形態のＣａｓ９標的部位を含むことができ、このＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧ（ＮはＡ、Ｇ、Ｔ、又はＣであり；かつＸはいずれであっても良い）は、ゲノム中の単一発生を有する。ゲノム中のユニークな標的配列は、ＭＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧの形態の化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を含むことができ、このＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧ（ＮはＡ、Ｇ、Ｔ、又はＣであり；かつＸはいずれであっても良い）は、ゲ��ム中の単一発生を有する。これらの配列のそれぞれにおいて、「Ｍ」は、Ａ、Ｇ、Ｔ、又はＣであり得、配列をユニークと見なす際に考慮する必要がない。一部の実施形態では、ガイド配列は、このガイド配列内の二次構造の程度を低下させるように選択される。一部の実施形態では、ガイド配列のヌクレオチドの約７５％、約５０％、約４０％、約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、約５％、約１％、若しくはそれより未満、又は約７５％未満、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約１％未満、若しくはそれ未満が、最適に折り畳まれるときの自己相補的塩基対形成に関与する。最適な折り畳みは、任意の適切なポリヌクレオチド折り畳みアルゴリズムによって決定することができる。一部のプログラムは、最小ギブス自由エネルギーの算出に基づいている。１つのこのようなアルゴリズムの例は、ｍＦｏｌｄであり、Ｚｕｋｅｒ及びＳｔｉｅｇｌｅｒ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．９（１９８１），１３３−１４８）によって説明されている。折り畳みアルゴリズムの別の例は、重心構造予測アルゴリズム（例えば、Ａ．Ｒ．Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｃｅｌｌ  １０６（１）：２３−２４；及びＰＡ  Ｃａｒｒ  ａｎｄ  ＧＭ  Ｃｈｕｒｃｈ，２００９，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２７（１２）：１１５１−６２を参照）を用いて、ウィーン大学の理論化学研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）で開発されたオンラインウェブサーバーＲＮＡｆｏｌｄである。
【０１４８】
一般に、ｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ配列は：（１）対応するｔｒａｃｒ配列を含む細胞内のｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ配列に隣接したガイド配列の切除；及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ配列を含むＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列での形成、の１つ以上を促進する、ｔｒａｃｒ配列との十分な相補性を有する任意の配列を含む。一般に、相補性の程度は、ｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ配列とｔｒａｃｒ配列の短い方の長さに沿った、これらの配列の最適なアラインメントについてである。最適なアラインメントは、任意の適切なアラインメントアルゴリズムによって決定することができ、かつ二次構造、例えば、ｔｒａｃｒ配列又はｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ配列のいずれかの中の自己相補性をさらに考慮することができる。一部の実施形態では、最適に整列されたときのｔｒａｃｒ配列とｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ配列の短い方の長さに沿ったこれらの配列間の相補性の程度は、約２５％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９７．５％、約９９％、若しくはそれよりも高い、又は約２５％を超える、約３０％を超える、約４０％を超える、約５０％を超える、約６０％を超える、約７０％を超える、約８０％を超える、約９０％を超える、約９５％を超える、約９７．５％を超える、約９９％を超える、若しくはそれよりも高い。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒ配列は、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２５、約３０、約４０、約５０、若しくはそれを超える、又は約５を超える、約６を超える、約７を超える、約８を超える、約９を超える、約１０を超える、約１１を超える、約１２を超える、約１３を超える、約１４を超える、約１５を超える、約１６を超える、約１７を超える、約１８を超える、約１９を超える、約２０を超える、約２５を超える、約３０を超える、約４０を超える、約５０を超える、若しくはそれを超えるヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒ配列及びｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ配列は、これらの配列間のハイブリダイゼーションが、二次構造、例えば、ヘアピンを有する転写物を形成するように、単一転写物内に含まれる。本発明の一実施形態では、転写物又は転写されたポリヌクレオチド配列は、少なくとも２つ以上のヘアピンを有する。好ましい実施形態では、転写物は、２つ、３つ、４つ、又は５つのヘアピンを有する。本発明のさらなる実施形態では、転写物は、最多で５つのヘアピンを有する。ヘアピン構造において、ループの上流の最後の「Ｎ」の５’側の配列の部分がｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ配列に対応し、ループの３’側の配列の部分がｔｒａｃｒ配列に対応する。ガイド配列、ｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ配列、及びｔｒａｃｒ配列を含む単一ポリヌクレオチドのさらなる非限定的な例は、以下の通りであり（５’から３’に記載）、配列中の「Ｎ」は、ガイド配列の塩基を表し、小文字の第１のブロックはｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ配列を表し、小文字の第２のブロックはｔｒａｃｒ配列を表し、かつ最終ポリＴ配列は転写ターミネーターを表す：
（１）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔｔｇｔａｃｔｃｔｃａａｇａｔｔｔａＧＡＡＡｔａａａｔｃｔｔｇｃａｇａａｇｃｔａｃａａａｇａｔａａｇｇｃｔｔｃａｔｇｃｃｇａａａｔｃａａｃａｃｃｃｔｇｔｃａｔｔｔｔａｔｇｇｃａｇｇｇｔｇｔｔｔｔｃｇｔｔａｔｔｔａａＴＴＴＴＴＴ；（２）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔｔｇｔａｃｔｃｔｃａＧＡＡＡｔｇｃａｇａａｇｃｔａｃａａａｇａｔａａｇｇｃｔｔｃａｔｇｃｃｇａａａｔｃａａｃａｃｃｃｔｇｔｃａｔｔｔｔａｔｇｇｃａｇｇｇｔｇｔｔｔｔｃｇｔｔａｔｔｔａａＴＴＴＴＴＴ；（３）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔｔｇｔａｃｔｃｔｃａＧＡＡＡｔｇｃａｇａａｇｃｔａｃａａａｇａｔａａｇｇｃｔｔｃａｔｇｃｃｇａａａｔｃａａｃａｃｃｃｔｇｔｃａｔｔｔｔａｔｇｇｃａｇｇｇｔｇｔＴＴＴＴＴＴ；（４）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａＧＡＡＡｔａｇｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａａａａｇｔｇｇｃａｃｃｇａｇｔｃｇｇｔｇｃＴＴＴＴＴＴ；（５）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａＧＡＡＡＴＡＧｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａａａａｇｔｇＴＴＴＴＴＴＴ；及び（６）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａｇＡＡＡＴＡＧｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａＴＴＴＴＴＴＴＴ．
一部の実施形態では、配列（１）〜（３）は、サーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ１からのＣａｓ９と組み合わせて使用される。一部の実施形態では、配列（４）〜（６）は、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９と組み合わせて使用される。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒ配列は、ｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ配列を含む転写物とは別個の転写物である。
【０１４９】
一部の実施形態では、候補ｔｒａｃｒＲＮＡは、以下の基準のいずれか又は全てを満たす配列によって後に予測することができる：１．反復を誘導する配列相同性（最大１８ｂｐのミスマッチでのＧｅｎｅｉｏｕｓにおけるモチーフの検索）；２．転写方向における推定Ｒｈｏ依存性転写ターミネーターの存在；及び３．ｔｒａｃｒＲＮＡと直接反復との間の安定なヘアピン二次構造。一部の実施形態では、これらの基準の２つ、例えば、１と２、２と３、又は１と３を使用することができる。一部の実施形態では、３つ全ての基準を使用することができる。
【０１５０】
一部の実施形態では、キメラ合成ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の設計は、直接反復とｔｒａｃｒＲＮＡと間に少なくとも１２ｂｐの二重鎖構造を含み得る。
【０１５１】
毒性及び標的外の影響を最小限にするために、送達されるＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡの濃度を制御することが重要である。ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡの最適な濃度は、細胞又は非ヒト真核動物モデルにおいて異なる濃度を試験し、そしてディープシークエンシングを用いて潜在的な標的外ゲノム遺伝子座における変更の程度を分析することによって決定することができる。例えば、ヒトゲノムのＥＭＸ１遺伝子における５’−ＧＡＧＴＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡ−３’を標的とするガイド配列の場合は、ディープシークエンシングを使用して、次の２つの標的外遺伝子座、１：５’−ＧＡＧＴＣＣＴＡＧＣＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡ−３’及び２：５’−ＧＡＧＴＣＴＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡ−３’における変更のレベルを評価することができる。標的外の変更のレベルを最低にすると共に標的上の変更を最高レベルにする濃度を、ｉｎ  ｖｉｖｏ送達のために選択するべきである。別法では、毒性及び標的外の影響のレベルを最小限にするために、ＣＲＩＳＰＲ酵素ニッカーゼｍＲＮＡ（例えば、Ｄ１０Ａ突然変異を有する化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）を、目的の部位を標的とするガイドＲＮＡの対で送達することができる。２つのガイドＲＮＡは、以下のように離間させる必要がある。毒性及び標的外の影響を最小限にするガイド配列及び戦略は、国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７号明細書）と同様とすることができる。
【０１５２】
ＣＲＩＳＰＲ系は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系から有利に送達される。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントは、内因性ＣＲＩＳＰＲ系を含む特定の生物、例えば、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来する。本発明の好ましい実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系であり、Ｃａｓ酵素は、ＤＮＡの切断を触媒するＣａｓ９である。Ｃａｓタンパク質の非限定的な例として、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても知られている）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、これらのホモログ、又はこれらの修飾型が挙げられる。
【０１５３】
一部の実施形態では、非修飾ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えば、Ｃａｓ９は、ＤＮＡ切断活性を有する。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の位置、例えば、標的配列内及び／又は標的配列の相補体内の一方又は両方の鎖の切断を誘導する。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の最初又は最後のヌクレオチドから、約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つ、約６つ、約７つ、約８つ、約９つ、約１０、約１５、約２０、約２５、約５０、約１００、約２００、約５００、又はそれよりも多い塩基対以内の一方又は両方の鎖の切断を誘導する。一部の実施形態では、ベクターは、突然変異ＣＲＩＳＰＲ酵素が、標的配列を含む標的ポリヌクレオチドの一方又は両方の鎖を切断する能力を喪失するように対応する野生型酵素に対して突然変異したＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする。例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９のＲｕｖＣ  Ｉ触媒ドメインにおけるアスパラギン酸のアラニンへの置換（Ｄ１０Ａ）は、Ｃａｓ９を両方の鎖を切断するヌクレアーゼからニッカーゼ（一本鎖を切断する）に変換する。Ｃａｓ９をニッカーゼにする突然変異の他の例として、限定されるものではないが、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、及びＮ８６３Ａが挙げられる。さらなる例として、Ｃａｓ９の２つ以上の触媒ドメイン（ＲｕｖＣ  Ｉ、ＲｕｖＣ  ＩＩ、及びＲｕｖＣ  ＩＩＩ、又はＨＮＨドメイン）は、全てのＤＮＡ切断活性を実質的に失った突然変異Ｃａｓ９を作製するために突然変異させることができる。一部の実施形態では、Ｄ１０Ａ突然変異を、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、又はＮ８６３Ａ突然変異の１つ以上と組み合わせて、全てのＤＮＡ切断活性を実質的に失ったＣａｓ９酵素を作製する。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、突然変異酵素のＤＮＡ切断活性が、非突然変異型の酵素のＤＮＡ切断活性の約２５％以下、約１０％以下、約５％以下、約１％以下、約０．１％以下、約０．０１％以下、又はそれ未満である場合に、全てのＤＮＡ切断活性を実質的に喪失していると見なされる；一例は、突然変異型のＤＮＡ切断活性が、ゼロ、又は非突然変異型と比較してごく僅かであるときであり得る。酵素がＳｐＣａｓ９でない場合は、突然変異は、ＳｐＣａｓ９の１０位、７６２位、８４０位、８５４位、８６３位、及び／又は９８６位に対応する一部又は全ての残基において生じさせることができる（例えば、標準的な配列比較ツールによって確認することができる）。特に、以下の突然変異の一部又は全ては、ＳｐＣａｓ９において好ましい：ＳｐＣａｓ９に対しては、Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、及び／又はＤ９８６Ａ；また他のオーソログにおける同様又は同一の突然変異、例えば、ＳａＣａｓ９におけるＮ５８０Ａ；及び置換アミノ酸のいずれかの保存的な置換も企図される。他のＣａｓ９における対応する位置でのこれらの突然変異の同じ（又は保存的な）置換も好ましい。ＳｐＣａｓ９におけるＤ１０及びＨ８４０が特に好ましい。しかしながら、他のＣａｓ９では、ＳｐＣａｓ９  Ｄ１０及びＨ８４０に対応する残基も好ましい。ＳｐＣａｓ９のオーソログを、本発明の実施に使用することができる。Ｃａｓ酵素は、ＩＩ型Ｃ��ＩＳＰＲ系からの複数のヌクレアーゼドメインを有する最大のヌクレアーゼと相同性を共有する一般的なクラスの酵素を指し得るため、同定されたＣａｓ９であり得る。最も好ましくは、Ｃａｓ９酵素は、ｓｐＣａｓ９（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）又はｓａＣａｓ９（黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９）からであるか、又はこれらに由来する。ＳｔＣａｓ９”は、サーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）からの野生型Ｃａｓ９を指し、このタンパク質配列は、アクセッション番号Ｇ３ＥＣＲ１としてＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースに存在する。同様に、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９又はｓｐＣａｓ９も、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースにアクセッション番号Ｑ９９ＺＷ２として収蔵されている。由来とは、本発明者らにおいては、由来酵素は、野生型酵素と高度の配列相同性を有するという点で大いに野生型酵素に基づいているが、本明細書に記載される任意の方法で突然変異している（修飾されている）ことを意味する。Ｃａｓ及びＣＲＩＳＰＲ酵素という語は、明確な記載がなければ、一般に本明細書では互換的に使用されることを理解されたい。上述のように、本明細書で使用される残基の付番の多くは、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）におけるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からのＣａｓ９酵素を指す。しかしながら、本発明は、他の種の微生物からのより多くのＣａｓ９、例えば、ＳｐＣａｓ９、ＳａＣａ９、及びＳｔ１Ｃａｓ９などを含むことを理解されたい。化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９又は任意の近縁のＣａｓ９による酵素作用は、ガイド配列の２０のヌクレオチドにハイブリダイズする標的部位の配列において二本鎖の切断を果たし、この標的配列は、その２０のヌクレオチドに続くプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列（例として、本明細書に記載されるように決定することができるＮＧＧ／ＮＲＧ又はＰＡＭが挙げられる）を有する。部位特異的ＤＮＡ認識及び切断についてのＣａｓ９によるＣＲＩＳＰＲ活性は、ガイド配列、このガイド配列に部分的にハイブリダイズするｔｒａｃｒ配列、及びＰＡＭ配列によって決定される。ＣＲＩＳＰＲ系のさらなる態様は、Ｋａｒｇｉｎｏｖ及びＨａｎｎｏｎ，Ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ  ｓｙｓｔｅｍ：ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｄｅｆｅｎｃｅ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  ａｒｃｈａｅａ，Ｍｏｌｅ  Ｃｅｌｌ  ２０１０，Ｊａｎｕａｒｙ  １５；３７（１）：７に記載されている。化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０からのＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、及びＣｓｎ１の４つの遺伝子のクラスター、並びに２つの非コードＲＮＡエレメント、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及び短い長さの非反復配列（スペーサー、それぞれ約３０ｂｐ）が間に挿入された反復配列（直接反復）の特徴的なアレイを含む。この系では、標的ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）が、４つの連続ステップで行われる。第１に、２つの非コードＲＮＡ、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイ、及びｔｒａｃｒＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。���２に、ｔｒａｃｒＲＮＡが、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡの直接反復にハイブリダイズし、次いでこのハイブリダイズしたｐｒｅ−ｃｒＲＮＡが、個々のスペーサー配列を含む成熟ｃｒＲＮＡにプロセシングされる。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体が、Ｃａｓ９を、ｃｒＲＮＡのスペーサー領域とプロトスペーサーＤＮＡとの間のヘテロ二本鎖形成によってプロトスペーサー及び対応するＰＡＭからなるＤＮＡ標的に誘導する。最後に、Ｃａｓ９は、ＰＡＭの上流の標的ＤＮＡの切断を媒介してプロトスペーサー内にＤＳＢを生じさせる。２つの直接反復（ＤＲ）に隣接した単一スペーサーからなるｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイもまた、「ｔｒａｃｒ−ｍａｔｅ配列」という語に包含される。特定の実施形態では、Ｃａｓ９は、構成的に存在し得る、又は誘導的に存在し得る、又は条件付きで存在し得る、又は投与され得る、又は送達され得る。Ｃａｓ９最適化を使用して、機能を促進する、又はキメラＣａｓ９タンパク質を作製できる新たな機能を開発することができる。そしてＣａｓ９は、一般的なＤＮＡ結合タンパク質として使用することができる。
【０１５４】
一態様では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＳｐＣａｓ９タンパク質又は任意の対応するオーソログにおける、Ｈ８４０Ａ、又はＤ１０Ａ及びＨ８４０Ａ、又はＤ１０Ａ及びＮ８６３Ａを含む。Ｓａ中のＮ５８０は、Ｓｐ  Ｃａｓ９中のＮ８６３に対応する。従って、一態様では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は：ＳａＣａｓ９タンパク質又は任意の対応するオーソログにおけるＮ５８０Ａ；又はＳｐＣａｓ９タンパク質若しくは任意の対応するオーソログにおけるＤ１０Ａ、及びＳａＣａｓ９タンパク質におけるＮ５８０Ａを含む。
【０１５５】
典型的には、内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈では、ＣＲＩＳＰＲ複合体（標的配列にハイブリダイズして１つ以上のＣａｓタンパク質と複合体を形成するガイド配列を含む）の形成により、標的配列中又はその近傍（例えば、標的配列からの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、２０、５０、又はそれよりも多い塩基対の範囲内）の一方又は両方の鎖が切断される。理論に拘束さることを望むものではないが、ｔｒａｃｒ配列は、野生型ｔｒａｃｒ配列の全て若しくは一部を含む又はこの全て若しくは一部（例えば、野生型ｔｒａｃｒ配列の約２０、約２６、約３２、約４５、約４８、約５４、約６３、約６７、約８５、若しくはそれよりも多い、又は約２０を超える、約２６を超える、約３２を超える、約４５を超える、約４８を超える、約５４を超える、約６３を超える、約６７を超える、約８５を超える、若しくはそれよりも多いヌクレオチド）からなり得、かつ、例えば、ｔｒａｃｒ配列の少なくとも一部に沿った、ガイド配列に機能的に連結されたｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ配列の全て又は一部へのハイブリダイゼーションによってＣＲＩＳＰＲ複合体の一部も形成し得る。
【０１５６】
コドン最適化配列の一例は、この場合には、真核生物、例えば、ヒトでの発現が最適化された配列（即ち、ヒトでの発現が最適化されている）、又は本明細書に記載の別の真核生物、動物、又は哺乳動物での発現が最適化された配列である；例えば、国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７号明細書）のＳａＣａｓ９ヒトコドン最適化配列を参照されたい。これが好ましいが、他の例も可能であり、かつヒト以外の他の宿主種のコドン最適化、又は特定の生物のコドン最適化も知られていることを理解されたい。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列は、特定の細胞、例えば、真核細胞での発現が最適化されたコドンである。真核細胞は、特定の生物、例えば、限定されるものではないがヒトを含む哺乳動物、又は非ヒト真核生物、動物、又は本明細書に記載の哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、家畜、又は非ヒト哺乳動物若しくは霊長類であっても良いし、これらに由来するものでも良い。一部の実施形態では、ヒト又は動物に実質的な医学的利点が全くない、ヒト又は動物を苦しめる可能性の高い、ヒトの生殖細胞系の遺伝的同一性を変更するプロセス及び／又は動物の遺伝的同一性を変更するプロセス、並びにこのようなプロセスから生じる動物も排除することができる。一般に、コドン最適化は、天然配列の少なくとも１つのコドン（例えば、約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つ、約１０、約１５、約２０、約２５、約５０、若しくはそれよりも多い、又は約１つを超える、約２つを超える、約３つを超える、約４つを超える、約５つを超える、約１０を超える、約１５を超える、約２０を超える、約２５を超える、約５０を超える、それよりも多いコドン）を、その宿主細胞の遺伝子中で使用されるより高頻度に又は最も高頻度に使用されるコドンで置き換える一方で、天然アミノ酸配列を維持することにより目的の宿主細胞での発現の促進のために核酸配列を改変するプロセスを指す。様々な種は、特定のアミノ酸のあるコドンに対する特定のバイアスを示す。コドンバイアス（生物間のコドン使用頻度の差）は、しばしば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳の効率に相関し、これは、とりわけ、翻訳されるコドンの特性及び特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられる。細胞における選択されるｔＲＮＡの優位性は、一般に、ペプチド合成において最も高頻度で使用されるコドンの反映である。従って、遺伝子は、コドン最適化に基づいて所与の生物での最適な遺伝子発現のために調整することができる。コドン使用頻度表は、例えば、ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒｊｐ／ｃｏｄｏｎ／で入手できる「コドン使用頻度データベース」において容易に入手可能であり、これらの表は、多数の方法で適応させることができる。Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．“Ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  ｔａｂｕｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａｂａｓｅｓ：ｓｔａｔｕｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｙｅａｒ  ２０００”Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００）を参照されたい。特定の宿主細胞��の発現のために特定の配列をコドン最適化するためのコンピュータアルゴリズムも入手可能であり、例えば、Ｇｅｎｅ  Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ；Ｊａｃｏｂｕｓ，ＰＡ）も入手可能である。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列の１つ以上のコドン（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、１０、１５、２０、２５、５０、若しくはそれよりも多い、又は全てのコドン）は、特定のアミノ酸に対して最も高頻度で使用されるコドンに対応する。
【０１５７】
一部の実施形態では、ベクターは、１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）、例えば、約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つ、約６つ、約７つ、約８つ、約９つ、約１０、若しくはそれよりも多い、又は約１つを超える、約２つを超える、約３つを超える、約４つを超える、約５つを超える、約６つを超える、約７つを超える、約８つを超える、約９つを超える、約１０を超える、若しくはそれよりも多いＮＬＳを含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、アミノ末端又はその近傍に約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つ、約６つ、約７つ、約８つ、約９つ、約１０、若しくはそれよりも多い、又は約１つを超える、約２つを超える、約３つを超える、約４つを超える、約５つを超える、約６つを超える、約７つを超える、約８つを超える、約９つを超える、約１０を超える、若しくはそれよりも多いＮＬＳ、カルボキシ末端又はその近傍に約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つ、約６つ、約７つ、約８つ、約９つ、約１０、若しくはそれよりも多い、又は約１つを超える、約２つを超える、約３つを超える、約４つを超える、約５つを超える、約６つを超える、約７つを超える、約８つを超える、約９つを超える、約１０を超える、若しくはそれよりも多いＮＬＳ、又はこれらの組合せ（例えば、アミノ末端における０又は少なくとも１つ以上のＮＬＳ、及びカルボキシ末端における０又は１つ以上のＮＬＳ）を含む。２つ以上のＮＬＳが存在する場合、それぞれは、単一ＮＬＳが２つ以上のコピー中に存在し得るように他から独立して、及び／又は１つ以上のコピー中に存在する１つ以上の他のＮＬＳとの組合せで選択することができる。本発明の好ましい一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、最大で６つのＮＬＳを含む。一部の実施形態では、ＮＬＳは、このＮＬＳの最も近いアミノ酸が、Ｎ末端又はＣ末端からポリペプチド鎖に沿って約１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、又はそれよりも多いアミノ酸の中にある場合は、Ｎ末端又はＣ末端の近傍であると見なされる。ＮＬＳの非限定的な例としては、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶを有するＳＶ４０ウイルスラージＴ抗原のＮＬＳ；ヌクレオプラスミンからのＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫを有するヌクレオプラスミン二部（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）ＮＬＳ）；アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ又はＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰを有するｃ−ｍｙｃ  ＮＬＳ；配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹを有するｈＲＮＰＡ１  Ｍ９  ＮＬＳ；インポーチンαからのＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ；筋腫Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰ及びＰＰＫＫＡＲＥＤ；ヒトｐ５３の配列ＰＯＰＫＫＫＰＬ；マウスｃ−ａｂｌ  ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ；インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲ及びＰＫＱＫＫＲＫ；肝炎ウイルスδ抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ；マウスＭｘ１タンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ；ヒトポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ；並びにステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドの配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫに由来するＮＬＳ配列が挙げられる。一般に、１つ以上のＮＬＳは、真核細胞の核内に検出可能な量のＣＲＩＳＰＲ酵素を蓄積させるのに十分な強度である。一般に、核局在化活性の強度は、ＣＲＩＳＰＲ酵素中のＮＬＳの数、使用される特定のＮＬＳ、又はそれらの因子の組合せから生じ得る。核内での蓄積の検出は、任意の好適な技術によって実施することができる。例えば、検出可能なマーカーをＣＲＩＳＰＲ酵素に融合させることができ、これにより、細胞内の位置を、例えば、核の位置を検出する手段（例えば、核に特異的な染色、例えば、ＤＡＰＩ）との組合せで可視化することができる。細胞核を細胞から単離することもでき、次いでその含有物を、タンパク質を検出する任意の好適なプロセス、例えば、免疫組織化学的分析、ウエスタンブロット、又は酵素活性アッセイによって分析することができる。核内での蓄積は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体形成の効果についてのアッセイ（例えば、標的配列におけるＤＮＡの切断若しくは突然変異についてのアッセイ、又はＣＲＩＳＰＲ複合体形成及び／若しくはＣＲＩＳＰＲ酵素活性の影響を受ける、変更された遺伝子発現活性についてのアッセイ）により、ＣＲＩＳＰＲ酵素にも複合体にも曝露されていない、又は１つ以上のＮＬＳが欠失したＣＲＩＳＰＲ酵素に曝露された対照と比較して、間接的に決定することもできる。
【０１５８】
本発明の態様は、遺伝子産物の発現の減少、又は遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子にさらに導入される鋳型ポリヌクレオチド、又は２つの５’オーバーハングのリアニール及び結合を可能にすることによって正確に切断される介在配列、又は変更される遺伝子産物の活性若しくは機能、又は遺伝子産物の発現の増加に関する。本発明の一実施形態では、遺伝子産物はタンパク質である。ガイド配列間の重複が８ｂｐ未満の５’オーバーハング（−８ｂｐを超えるオフセット）を形成するｓｇＲＮＡ対のみが、検出可能な挿入欠失の発生を媒介することができた。重要なことに、これらのアッセイに使用される各ガイドは、野生型Ｃａｓ９と対を形成したときに挿入欠失を効率的に誘導することができ、ガイド対の相対位置が、二重ニッキング活性の予測において最も重要なパラメーターであることを示唆する。Ｃａｓ９ｎ及びＣａｓ９Ｈ８４０ＡがＤＮＡの逆鎖に切れ目を入れるため、所与のｓｇＲＮＡ対を用いたＣａｓ９ｎのＣａｓ９Ｈ８４０Ａでの置換は、オーバーハング型の逆のはずであるが；Ｃａｓ９Ｈ８４０Ａと同様に挿入欠失の発生が観察されず、Ｃａｓ９Ｈ８４０Ａが、全ＤＮＡ切断活性が実質的に欠損しているＣＲＩＳＰＲ酵素であることを示唆する（これは、突然変異酵素のＤＮＡ切断活性が、非突然変異型の酵素のＤＮＡ切断活性の約２５％未満、約１０％未満、約５％未満、約１％未満、約０．１％未満、約０．０１％未満、又はそれ未満であるときであり；これにより、一例は、非突然変異型と比較して、突然変異型のＤＮＡ切断活性がゼロ又はごく僅かである場合、例えば、生化学系又は原核生物系とは対照的に真核生物系におけるＣａｓ９Ｈ８４０Ａと同様に挿入欠失の発生が観察されない場合であり得る）。とはいえ、Ｃａｓ９ｎで５’オーバーハングを形成するｓｇＲＮＡの対は、原則として、代わりに対応する３’オーバーハング及び二重ニッキングを形成するはずである。従って、Ｃａｓ９ｎでの３’オーバーハングの形成をもたらすｓｇＲＮＡ対を別の突然変異Ｃａｓ９と共に使用して、５’オーバーハング及び二重ニッキングを形成することができる。従って、一部の実施形態では、組換え鋳型も提供される。組換え鋳型は、本明細書に記載される、別個のベクターに含まれる又は別個のポリヌクレオチドとして提供される別のベクターの構成成分であり得る。一部の実施形態では、組換え鋳型は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体の一部としてＣＲＩＳＰＲ酵素によって切れ目が入れられる又は切断される標的配列内又はその近傍の相同組換えにおける鋳型として役立つように設計される。鋳型ポリヌクレオチドは、任意の適切な長さ、例えば、約１０、約１５、約２０、約２５、約５０、約７５、約１００、約１５０、約２００、約５００、約１０００、若しくはそれを超える、又は約１０を超える、約１５を超える、約２０を超える、約２５を超える、約５０を超える、約７５を超える、約１００を超える、約１５０を超える、約２００を超える、約５００を超える、約１０００を超える、若しくはそれを超えるヌクレオチド長であり得る。一部の実施形態では、鋳型ポリヌクレオチドは、標的配列を含むポリヌクレオチドの一部に相補的である。最適に整列されると、鋳型ポリヌクレオチドは、標的配列の１つ以上のヌクレオチド（例えば、約１、約５、約１０、約１５、約２０、若しくはそれよりも多い、又は約１を超える、約５を超える、約１０を超える、約１５を超える、約２０を超える、若しくはそれよりも多いヌクレオチド）と重複する可能性がある。一部の実施形態では、鋳型配列、及び標的配列を含むポリヌクレオチドが最適に整列されると、鋳型ポリヌクレオチドの最も近いヌクレオチドは、標的配列から約１つ以内、約５つ以内、約１０以内、約１５以内、約２０以内、約２５以内、約５０以内、約７５以内、約１００以内、約２００以内、約３００以内、約４００以内、約５００以内、約１０００以内、約５０００以内、約１００００以内、若しくはそれを超えるヌクレオチドの範囲内である。
【０１５９】
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントの発現を駆動する１つ以上のベクターを、ＣＲＩＳＰＲ系のエレメントの発現が１つ以上の標的部位でのＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を誘導するように宿主細胞に導入する。例えば、Ｃａｓ酵素、ｔｒａｃｒ−ｍａｔｅ配列に連結されたガイド配列、及びｔｒａｃｒ配列はそれぞれ、別個のベクターにおける調節エレメントを分離するために機能的に連結することができる。あるいは、ＣＲＩＳＰＲ系のＲＮＡを、トランスジェニックＣａｓ９動物又は哺乳動物、例えば、Ｃａｓ９を構成的に、若しくは誘導的に、若しくは条件付きで発現する動物又は哺乳動物；あるいは、他の方法、例えば、Ｃａｓ９をコードし、かつｉｎ  ｖｉｖｏでＣａｓ９を発現する１つ又は複数のベクターの事前投与によりＣａｓ９を発現する、又はＣａｓ９を含む細胞を有する動物若しくは哺乳動物に送達することができる。別法では、同じ又は異なる調節エレメントから発現される２つ以上のエレメントを、単一ベクター中で、この第１のベクターに含まれていないＣＲＩＳＰＲ系のあらゆる構成成分を提供する１つ以上の追加のベクターを用いて組み合わせることができる。単一ベクター中で組み合わせられるＣＲＩＳＰＲ系のエレメントは、任意の適切な向き、例えば、１つのエレメントが、第２のエレメントに対して５’側（第２のエレメントの上流）に配置する、又は３’側（第２のエレメントの下流）に配置することができる。１つのエレメントのコード配列を、第２のエレメントのコード配列の同じ鎖又は反対の鎖上に配置し、かつ同じ方向又は反対の方向に向けることができる。一部の実施形態では、単一プロモーターが、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする転写物、並びに１つ以上のイントロン配列内に組み込まれた（例えば、それぞれが異なるイントロン内にある、２つ以上が少なくとも１つのイントロン内にある、又は全てが単一イントロン内にある）ガイド配列、ｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ配列（任意にガイド配列に機能的に連結される）、及びｔｒａｃｒ配列の１つ以上の発現を駆動する。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ガイド配列、ｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ配列、及びｔｒａｃｒ配列は、同じプロモーターに機能的に連結され、この同じプロモーターから発現される。ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントの発現のための送達ビヒクル、ベクター、粒子、ナノ粒子、製剤、及びこれらの構成成分が、上述の文献、例えば、国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７号明細書）に記載されているように使用される。一部の実施形態では、ベクターは、１つ以上の挿入部位、例えば、制限エンドヌクレオチドアーゼ認識配列（「クローニング」部位とも呼ばれる）を含む。一部の実施形態では、１つ以上の挿入部位（例えば、約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つ、約６つ、約７つ、約８つ、約９つ、約１０、若しくはそれよりも多い、又は約１つを超える、約２つを超える、約３つを超える、約４つを超える、約５つを超える、約６つを超える、約７つを超える、約８つを超える、約９つを超える、約１０を超える、若しくはそれよりも多い挿入部位）が、１つ以上のベクターの１つ以上の配列エレメントの上流及び／又は下流に位置している。一部の実施形態では、ベクターは、ｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ配列の上流の挿入部位、及び任意に、ｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ配列に機能的に連結された調節エレメントの下流の挿入部位を含み、これにより、ガイド配列の挿入部位への挿入後の発現時に、ガイド配列が、ＣＲＩＳＰＲ複合体の真核細胞内の標的配列への配列特異的結合を誘導する。一部の実施形態では、ベクターは、２つ以上の挿入部位を含む、各挿入部位は、各部位でのガイド配列の挿入が可能となるように２つのｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ配列間に位置する。このような配置では、２つ以上のガイド配列は、単一ガイド配列の２つ以上のコピー、２つ以上の異なるガイド配列、又はこれらの組み合わせを含み得る。複数の異なるガイド配列が使用される場合、単一発現構築物を使用して、細胞内の複数の異なる、対応する標的配列に対してＣＲＩＳＰＲ活性を標的とするようにすることができる。例えば、単一ベクターは、約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つ、約６つ、約７つ、約８つ、約９つ、約１０、約１５、約２０、若しくはそれよりも多い、又は約１つを超える、約２つを超える、約３つを超える、約４つを超える、約５つを超える、約６つを超える、約７つを超える、約８つを超える、約９つを超える、約１０を超える、約１５を超える、約２０を超える、若しくはそれよりも多いガイド配列を含み得る。一部の実施形態では、約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つ、約６つ、約７つ、約８つ、約９つ、約１０、若しくはそれよりも多い、又は約１つを超える、約２つを超える、約３つを超える、約４つを超える、約５つを超える、約６つを超える、約７つを超える、約８つを超える、約９つを超える、約１０を超える、若しくはそれよりも多いこのようなガイド配列を含むベクターを提供し、任意に細胞に送達することができる。一部の実施形態では、ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする酵素コード配列に機能的に連結された調節エレメントを含む。ＣＲＩＳＰＲ酵素、又はＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ、又はＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ若しくはＲＮＡを別個に送達することができ；そして有利なことに、これらの少なくとも１つが、ナノ粒子複合体によって送達される。ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ酵素が発現する時間を与えるために、ガイドＲＮＡの前に送達することができる。ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡは、ガイドＲＮＡの投与の１〜１２時間（好ましくは約２〜６時間）前に投与しても良い。別法では、ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡを一緒に投与することができる。有利なことに、ガイドＲＮＡの第２のブースター用量を、ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ＋ガイドＲＮＡの最初の投与から１〜１２時間（好ましくは、約２〜６時間）後に投与することができる。ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ及び／又はガイドＲＮＡの追加の投与は、最も効率の高いレベルのゲノム改変を達成するのに有用であろう。
【０１６０】
一態様では、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントを使用するための方法を提供する。本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的ポリヌクレオチドを改変するための有効な手段を提供する。本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、複数の細胞型内で標的ポリヌクレオチドを改変（例えば、欠失、挿入、転座、不活性化、活性化）するステップを含む多種多様な有用性を有する。従って、本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、例えば、遺伝子療法、薬物スクリーニング、疾患診断、及び予後診断における広範囲の用途を有する。例示的なＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズしたガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含む。ガイド配列は、ｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ配列に連結され、このｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ配列は、ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズする。一実施形態では、本発明は、標的ポリヌクレオチドを切断する方法を提供する。この方法は、標的ポリヌクレオチドに結合して前記標的ポリヌクレオチドを切断するＣＲＩＳＰＲ複合体を用いて標的ポリヌクレオチドを改変するステップを含む。典型的には、本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、細胞内に導入されると、ゲノム配列に切断部（例えば、一本鎖又は二本鎖の切断部）を形成する。例えば、この方法を使用して細胞内の疾患遺伝子を切断することができる。ＣＲＩＳＰＲ複合体によって形成された切断部は、修復プロセス、例えば、修復ミスの多い非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路又は高忠実性相同組換え修復（ＨＤＲ）によって修復することができる。これらの修復プロセス中に、外因性ポリヌクレオチド鋳型をゲノム配列に導入することができる。一部の方法では、ＨＤＲプロセスを使用してゲノム配列が改変される。例えば、上流の配列及び下流の配列に隣接した組み込まれる配列を含む外因性ポリヌクレオチド鋳型が細胞内に導入される。上流配列及び下流配列は、染色体内の組み込み部位の両側と配列類似性を共有する。望ましい場合は、ドナーヌクレオチドは、ＤＮＡ、例えば、ＤＮＡプラスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、ウイルスベクター、ＤＮＡの線状断片、ＰＣＲ断片、裸の核酸、又は送達ビヒクル、例えば、リポソーム若しくはポロキサマーと複合体を形成した核酸であり得る。外因性ポリヌクレオチド鋳型は、組み込まれるべき配列（例えば、突然変異遺伝子）を含む。組み込みのための配列は、細胞に対して内因性の配列であっても良いし、又は外因性の配列であっても良い。組み込まれる配列の例として、タンパク質又は非コードＲＮＡ（例えば、ｍｉｃｒｏＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。従って、組み込みのための配列を、１つ又は複数の適切な制御配列に機能的に連結することができる。別法では、組み込まれるべき配列は、制御機能を提供することができる。外因性ポリヌクレオチド鋳型における上流配列及び下流配列は、目的の染色体配列とドナーポリヌクレオチドとの間の組換えを促進するように選択される。上流配列は、組み込みのための標的部位の上流のゲノム配列と配列類似性を共有する核酸配列である。同様に、下流配列は、組み込みの標的部位の下流の染色体配列と配列類似性を共有する核酸配列である。外因性ポ��ヌクレオチド鋳型における上流配列及び下流配列は、標的ゲノム配列と７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％の配列同一性を有し得る。好ましくは、外因性ポリヌクレオチド鋳型における上流配列及び下流配列は、標的ゲノム配列と約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％の配列同一性を有する。一部の方法では、外因性ポリヌクレオチド鋳型における上流配列及び下流配列は、標的ゲノム配列と約９９％又は約１００％の配列同一性を有する。上流配列又は下流配列は、約２０ｂｐ〜約２５００ｂｐ、例えば、約５０ｂｐ、約１００ｂｐ、約２００ｂｐ、約３００ｂｐ、約４００ｂｐ、約５００ｂｐ、約６００ｂｐ、約７００ｂｐ、約８００ｂｐ、約９００ｂｐ、約１０００ｂｐ、約１１００ｂｐ、約１２００ｂｐ、約１３００ｂｐ、約１４００ｂｐ、約１５００ｂｐ、約１６００ｂｐ、約１７００ｂｐ、約１８００ｂｐ、約１９００ｂｐ、約２０００ｂｐ、約２１００ｂｐ、約２２００ｂｐ、約２３００ｂｐ、約２４００ｂｐ、又は約２５００ｂｐを含み得る。一部の方法では、例示的な上流配列又は下流配列は、約２００ｂｐ〜約２０００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約１０００ｂｐ、又は特に７００ｂｐ〜約１０００ｂｐを有する。一部の方法では、外因性ポリヌクレオチド鋳型は、マーカーをさらに含み得る。このようなマーカーは、標的の組み込みについてのスクリーニングを容易にすることができる。適切なマーカーの例として、制限部位、蛍光タンパク質、又は選択マーカーが挙げられる。本発明の外因性ポリヌクレオチド鋳型は、組換え技術を用いて作製することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１、及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６を参照されたい）。外因性ポリヌクレオチド鋳型を組み込むことによって標的ポリヌクレオチドを改変する方法では、二本鎖の切断部をＣＲＩＳＰＲ複合体によってゲノム配列に導入し、この切断部は、外因性ポリヌクレオチド鋳型がゲノムに組み込まれるようにこの鋳型の相同組換えによって修復される。二本鎖切断部の存在は、鋳型の組み込みを促進する。他の実施形態では、本発明は、真核細胞でのポリヌクレオチドの発現を変更する方法を提供する。この方法は、標的ポリヌクレオチドに結合するＣＲＩＳＰＲ酵素の使用によってこの標的ポリヌクレオチドの発現を増加させる又は低下させるステップを含む。一部の方法では、標的ポリヌクレオチドを不活性化して、細胞内での発現を変更することができる。例えば、細胞内でＣＲＩＳＰＲ複合体が標的配列に結合すると、標的ポリヌクレオチドが不活性化され、これにより配列が転写されなくなる、コードタンパク質が産生されなくなる、又は配列が野生型配列のようには機能しなくなる。例えば、タンパク質又はｍｉｃｒｏＲＮＡコード配列を不活性化させて、このタンパク質又はｍｉｃｒｏＲＮ又はｐｒｅ−ｍｉｃｒｏＲＮＡの転写が行われないようにすることができる。一部の方法では、制御配列を不活性化させて、この制御配列が制御配列として機能しなくなるようにすることができる。本明細書で使用される「制御配列」という語は、核酸配列の転写、翻訳、又は接触性を実現する任意の核酸配列を指す。制御配列の例として、プロモーター、転写ターミネーター、及びエンハンサーが挙げられる。ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドは、真核細胞の内因性又は外因性のあらゆるポリヌクレオチドであり得る。例えば、標的ポリヌクレオチドは、真核細胞の核内に存在するポリヌクレオチドであり得る。標的ポリヌクレオチドは、遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする配列、又は非コード配列（例えば、調節ポリヌクレオチド又はジャンクＤＮＡ）であり得る。標的ポリヌクレオチドの例として、シグナル伝達生化学経路に関連した配列、例えば、シグナル伝達生化学経路関連遺伝子又はポリヌクレオチドが挙げられる。標的ポリヌクレオチドの例として、疾患関連遺伝子又はポリヌクレオチドが挙げられる。「疾患関連」遺伝子又はポリヌクレオチドは、非疾患対照の組織又は細胞と比較して、疾患の影響を受けた組織に由来する細胞において異常なレベル又は異常な形態で転写産物又は翻訳産物を生じさせるあらゆる遺伝子又はポリヌクレオチドを指す。疾患関連遺伝子は、異常に高いレベルで発現されるようになる遺伝子であり得；疾患関連遺伝子は、異常に低いレベルで発現されるようになる遺伝子であり得、この発現の変更は、疾患の発症及び／又は進行に相関する。疾患関連遺伝子はまた、疾患の病因に直接関与する、又は疾患の病因に関与する遺伝子と連鎖不平衡である、突然変異又は遺伝的変異を有する遺伝子も指す。転写産物又は翻訳産物は、既知又は未知であり得、かつ正常レベル又は異常レベルであり得る。ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドは、真核細胞に対して内因性又は外因性のあらゆるポリヌクレオチドであり得る。例えば、標的ポリヌクレオチドは、真核細胞の核内に存在するポリヌクレオチドであり得る。標的ポリヌクレオチドは、遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする配列、又は非コード配列（例えば、調節ポリヌクレオチド又はジャンクＤＮＡ）であり得る。理論に拘束されることを望むものではないが、標的配列がＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）に関連するはずであると考えられる；即ち、ＣＲＩＳＰＲ複合体によって認識される短い配列である。ＰＡＭにとっての正確な配列及び長さの要件は、使用されるＣＲＩＳＰＲ酵素によって異なるが、ＰＡＭは、典型的には、プロトスペーサーに近接した２〜５塩基対の配列（即ち、標的配列）である。ＰＡＭ配列の例として、以下の実施例のセクションに示され、当業者であれば、所与のＣＲＩＳＰＲ酵素に使用されるさらなるＰＡＭ配列を同定できるであろう。一部の実施形態では、この方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドへの結合を可能にして前記標的ポリヌクレオチドの切断をもたらし、これにより標的ポリヌクレオチドを改変するステップを含み、このＣＲＩＳＰＲ複合体が、前記標的ポリヌクレオチド中の標的配列にハイブリダイズしたガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ガイド配列が、ｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ配列に連結され、このｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズする。一態様では、本発明は、真核細胞内でのポリヌクレオチドの発現を変更する方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体のポリヌ��レオチドへの結合を可能にし、前記結合により前記ポリヌクレオチドの発現が増加又は低下するステップを含み；このＣＲＩＳＰＲ複合体が、前記標的ポリヌクレオチド中の標的配列にハイブリダイズしたガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ガイド配列が、ｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ配列に連結され、このｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズする。標的ポリヌクレオチドを変更する方法に、同様の考慮及び条件が上記のように当てはまる。実際、これらのサンプリング、培養、及び再導入の選択肢は、本発明の態様の全てに当てはまる。一態様では、本発明は、真核細胞で標的ポリヌクレオチドを改変する方法を提供し、この方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで行うことができる。一部の実施形態では、この方法は、ヒト又は非ヒト動物から細胞又は細胞集団をサンプリングするステップ、及びこの１つ又は複数の細胞を改変するステップを含む。培養は、ｅｘ  ｖｉｖｏで全ての段階を行うことができる。１つ又は複数の細胞を、非ヒト動物又は植物に再導入することさえできる。再導入された細胞では、細胞が幹細胞であることが特に好ましい。
【０１６１】
実際、本発明のいずれの態様でも、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的配列にハイブリダイズしたガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含むことができ、前記ガイド配列が、ｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ配列に連結され得、このｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし得る。
【０１６２】
本発明は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系及びその構成成分に関連した、配列標的化、例えば、ゲノム摂動又はゲノム編集に関与する遺伝子発現の制御に使用される系、方法、及び組成物のエンジニアリング及び最適化に関連する。有利な実施形態では、Ｃａｓ酵素はＣａｓ９である。本発明の方法の利点は、ＣＲＩＳＰＲ系が、標的外の結合及びその副作用を最小限にする又は回避することである。これは、標的ＤＮＡに対する高度の配列特異性を有するように配置された系を用いて達成される。
【０１６３】
一般的な送達
ベクター送達、例えば、プラスミド、ウイルス送達：ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えば、Ｃａｓ９、及び／又は任意の本ＲＮＡ、例えば、ガイドＲＮＡを、任意の適切なベクター、例えば、プラスミド又はウイルスベクター、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、アデノウイルス、又は他の種ルのウイルスベクター、又はこれらの組み合わせを用いて送達することができる。Ｃａｓ９及び１つ以上のガイドＲＮＡを、１つ以上のベクター、例えば、プラスミド又はウイルスベクターにパッケージングすることができる。一部の実施形態では、ベクター、例えば、プラスミド又はウイルスベクターは、例えば、筋肉注射によって目的の組織に送達され、そうでないときは、送達は、静脈内、経皮、鼻腔内、口腔、粘膜、又は他の送達方法による。このような送達は、単回投与又は複数回投与であり得る。当業者であれば、本明細書で送達される実際の用量は、様々な因子、例えば、ベクターの選択、標的細胞、生物、又は組織、処置するべき対象の全身の健康、求められる形質転換／改変の程度、投与経路、投与方式、求められる形質転換／改変の種類などによって大幅に異なり得ることを理解されよう。
【０１６４】
このような用量は、例えば、担体（水、生理食塩水、エタノール、グリセロール、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ゴマ油など）、希釈剤、薬学的に許容され得る担体（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、薬学的に許容され得る賦形剤、及び／又は当該技術分野で公知の他の化合物をさらに含み得る。用量は、１つ以上の薬学的に許容され得る塩、例えば、鉱酸塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩など；及び有機酸塩、例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などをさらに含み得る。加えて、補助物質、例えば、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝物質、ゲル又はゲル化物質、香料、着色剤、ミクロスフェア、ポリマー、懸濁剤なども、この中に存在しても良い。加えて、１つ以上の他の従来の医薬成分は、例えば、防腐剤、湿潤剤、懸濁剤、界面活性剤、酸化防止剤、固化防止剤、充填剤、キレート化剤、コーティング剤、化学安定剤なども、特に剤形が再構成可能な形態である場合は、存在しても良い。適切な例示的な成分として、微結晶性セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリソルベート８０、フェニルエチルアルコール、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、パラクロロフェノール、ゼラチン、アルブミン、及びこれらの組み合わせが挙げられる。薬学的に許容され得る賦形剤の徹底的な議論は、参照により本明細書に組み入れられるＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎ．Ｊ．１９９１）で入手可能である。
【０１６５】
本明細書の一実施形態では、送達はアデノウイルスにより、この送達は、少なくとも１×１０５の粒子（粒子単位、ｐｕとも呼ばれる）のアデノウイルスベクターを含む単回ブースター投与であり得る。本明細書の一実施形態では、この用量は、好ましくは、少なくとも約１×１０６の粒子（例えば、約１×１０６〜１×１０１２の粒子）、より好ましくは少なくとも約１×１０７の粒子、より好ましくは少なくとも約１×１０８の粒子（例えば、約１×１０８〜１×１０１１の粒子又は約１×１０８〜１×１０１２の粒子）、そして最も好ましくは少なくとも約１×１００の粒子（例えば、約１×１０９〜１×１０１０の粒子又は約１×１０９〜１×１０１２の粒子）、又はさらに少なくとも約１×１０１０の粒子（例えば、約１×１０１０〜１×１０１２の粒子）のアデノウイルスベクターである。別法として、用量は、約１×１０１４以下の粒子、好ましくは約１×１０１３以下の粒子、さらにより好ましくは約１×１０１２以下の粒子、さらにより好ましくは約１×１０１１以下の粒子、そして最も好ましくは約１×１０１０以下の粒子（例えば、約１×１０９以下の粒子）を含む。従って、用量は、例えば、約１×１０６の粒子単位（ｐｕ）、約２×１０６ｐｕ、約４×１０６ｐｕ、約１×１０７ｐｕ、約２×１０７ｐｕ、約４×１０７ｐｕ、約１×１０８ｐｕ、約２×１０８ｐｕ、約４×１０８ｐｕ、約１×１０９ｐｕ、約２×１０９ｐｕ、約４×１０９ｐｕ、約１×１０１０ｐｕ、約２×１０１０ｐｕ、約４×１０１０ｐｕ、約１×１０１１のｐｕ、約２×１０１１ｐｕ、約４×１０１１ｐｕ、約１×１０１２ｐｕ、約２×１０１２ｐｕ、又は約４×１０１２ｐｕのアデノウイルスベクターを含むアデノウイルスベクターの単回用量を含み得る。例えば、参照により本明細書に組み入れられる２０１３年６月４日にＮａｂｅｌらに付与された米国特許第８，４５４，９７２  Ｂ２号明細書のアデノウイルスベクターを参照されたい；投与量は、その段落２９の３６〜５８行目を参照されたい。本明細書の一実施形態では、アデノウイルスは、複数回投与によって送達される。
【０１６６】
本明細書の一実施形態では、送達はＡＡＶによる。ＡＡＶのヒトへのｉｎ  ｖｉｖｏ送達での治療有効量は、約１×１０１０〜約１×１０１０の機能的ＡＡＶ／ｍｌ溶液を含む約２０〜約５０ｍｌの範囲の生理食塩水であると考えられる。投与量は、治療効果をあらゆる副作用に対してバランスさせるために調整することができる。本明細書の一実施形態では、ＡＡＶの用量は、一般に約１×１０５〜１×１０５０のゲノムＡＡＶ、約１×１０８〜１×１０２０のゲノムＡＡＶ、約１×１０１０〜約１×１０１６のゲノム、又は約１×１０１１〜約１×１０１６のゲノムＡＡＶの濃度範囲である。ヒト投与量は、約１×１０１３のゲノムＡＡＶであり得る。このような濃度は、約０．００１ｍｌ〜約１００ｍｌ、約０．０５〜約５０ｍｌ、又は約１０〜約２５ｍｌの担体溶液で送達することができる。他の有効な投与量は、用量反応曲線を確立するルーチンの試験によって当業者により容易に確立することができる。例えば、２０１３年３月２６日にＨａｊｊａｒらに付与された米国特許第８，４０４，６５８  Ｂ２号明細書の段落２７の４５〜６０行目を参照されたい。
【０１６７】
本明細書の一実施形態では、送達はプラスミドによる。このようなプラスミド組成物では、投与量は、プラスミドが応答を引き出すのに十分な量にするべきである。例えば、プラスミド組成物中のプラスミドＤＮＡの適切な量は、７０ｋｇの人で約０．１〜約２ｍｇ、又は約１μｇ〜約１０μｇであり得る。本発明のプラスミドは、一般に、（ｉ）プロモーター；（ｉｉ）前記プロモーターに機能的に連結された、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列；（ｉｉｉ）選択マーカー；（ｉｖ）複製起点；及び（ｖ）（ｉｉ）の下流の、（ｉｉ）に機能的に連結された転写ターミネーターを含む。プラスミドは、ＣＲＩＳＰＲ複合体のＲＮＡ構成成分もコードし得るが、これらの１つ以上は、代わりに異なるベクターにコードされても良い。
【０１６８】
本明細書の用量は、平均７０ｋｇの人に基づいている。投与の頻度は、医学実施者又は獣医学実施者（例えば、医師、獣医師）、又は当業者の範囲内である。また、実験に使用されるマウスは、典型的には、約２０ｇであり、マウスの実験から、７０ｋｇの人にスケールアップすることができることに留意されたい。
【０１６９】
一部の実施形態では本発明のＲＮＡ分子は、リポソーム又はリポフェクション製剤などで送達され、かつ当業者に周知の方法で調製することができる。このような方法は、例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，５９３，９７２号明細書、同第５，５８９，４６６号明細書、及び同第５，５８０，８５９号明細書に記載されている。特に改良されて改善されたｓｉＲＮＡの哺乳動物細胞への送達を目的とした送達系が開発され（例えば、Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔ．２００３，５３９：１１１−１１４；Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２００２，２０：１００６−１０１０；Ｒｅｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｖｉｓｉｏｎ．２００３，９：２１０−２１６；Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００３，３２７：７６１−７６６；Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎ．２００２，３２：１０７−１０８、及びＳｉｍｅｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ  ２００３，３１，１１：２７１７−２７２４を参照されたい）、本発明に適用することができる。ｓｉＲＮＡは近年、霊長類での遺伝子発現の抑制での使用に成功している（例えば、本発明にも適用され得るＴｏｌｅｎｔｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｔｉｎａ  ２４（４）：６６０を参照されたい）。
【０１７０】
実際、ＲＮＡの送達は、ｉｎ  ｖｉｖｏ送達の有用な方法である。リポソーム又はナノ粒子を用いてＣａｓ９及びｇＲＮＡ（及び、例えば、ＨＲ修復鋳型）を細胞内に送達することが可能である。従って、ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えば、Ｃａｓ９の送達及び／又は本発明のＲＮＡの送達は、ＲＮＡ形態で、微小胞、リポソーム、又はナノ粒子によって行うことができる。例えば、Ｃａｓ９ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの送達のためにリポソーム粒子内にパッケージングすることができる。リポソームトランスフェクション試薬、例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのリポフェクタミン及び市販の他の試薬は、ＲＮＡ分子を肝臓に効果的に送達することができる。
【０１７１】
ＲＮＡの送達手段はまた、好ましくは、ＲＮＡのナノ粒子による送達（Ｃｈｏ，Ｓ．，Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｍ．，Ｓｏｎ，Ｓ．，Ｘｕ，Ｑ．，Ｙａｎｇ，Ｆ．，Ｍｅｉ，Ｙ．，Ｂｏｇａｔｙｒｅｖ，Ｓ．，Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．，Ｌｉｐｉｄ−ｌｉｋｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，１９：  ３１１２−３１１８，２０１０）又はエキソソームによる送達（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，Ａ．，Ｌｅｖｉｎｓ，Ｃ．，Ｃｏｒｔｅｚ，Ｃ．，Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．，ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．，Ｌｉｐｉｄ−ｂａｓｅｄ  ｎａｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｆｏｒ  ｓｉＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２６７：９−２１，２０１０，ＰＭＩＤ：２００５９６４１）を含む。実際、エキソソームは、ｓｉＲＮａ、ＣＲＩＳＰＲ系とある程度の類似性を有する系の送達に特に有用なはずである。例えば、Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．（“Ｅｘｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．”Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．２０１２  Ｄｅｃ；７（１２）：２１１２−２６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１２．１３１．Ｅｐｕｂ  ２０１２  Ｎｏｖ  １５．）に、エキソソームがいかに、様々な生物学的障壁を越える薬物送達にとっての有望なツールであるか、かつｉｎ  ｖｔｉｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでのｓｉＲＮＡの送達に利用できるかが記載されている。このアプローチでは、ペプチドリガンドに融合したエキソソームタンパク質を含む発現ベクターのトランスフェクションにより標的エキソソームを作製する。次いで、エキソソームが精製され、トランスフェクトされた細胞上清から特徴付けられ、次いで、ＲＮＡがエキソソーム内に導入される。限定されるものではないが特に脳への本発明による送達又は投与は、エキソソームを用いて行うことができる。ビタミンＥ（α−トコフェロール）をＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓにコンジュゲートさせて、例えばＵｎｏら（ＨＵＭＡＮ  ＧＥＮＥ  ＴＨＥＲＡＰＹ  ２２：７１１−７１９（Ｊｕｎｅ  ２０１１））によって行われた、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を脳に送達する方式と同様の方式で、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）と共に脳に送達することができる。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又はフリーＴｏｃｓｉＢＡＣＥ又はＴｏｃ−ｓｉＢＡＣＥ／ＨＤＬで満たされ、Ｂｒａｉｎ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  Ｋｉｔ  ３（Ａｌｚｅｔ）に接続された浸透圧ミニポンプ（モデル１００７Ｄ；Ａｌｚｅｔ，Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，ＣＡ）によりマウスに注入した。脳注入カニューレを、背側第３脳室内への注入のために正中線におけるブレグマの後約０．５ｍｍに配置した。Ｕｎｏらは、ＨＤＬを含む僅か３ｎｍｏｌのＴｏｃ−ｓｉＲＮＡが、同じＩＣＶ注入法により同程度の標的の減少をもたらすことができることを見出した。脳を標的としてＨＤＬと共投与される、α−トコフェロールにコンジュゲートされた同様の用量のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓが、本発明においてヒトで企図され得、例えば、脳を標的とする約３ｎｍｏｌ〜約３μｍｏｌのＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓが企図され得る。Ｚｏｕら（（ＨＵＭＡＮ  ＧＥＮＥ  ＴＨＥＲＡＰＹ  ２２：４６５−４７５（Ａｐｒｉｌ  ２０１１））は、ラットの脊髄におけるｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子サイレンシングのためのＰＫＣγを標的とする短鎖ヘアピンＲＮＡのレンチウイルス媒介送達の方法を記載している。Ｚｏｕらは、１×１０９の形質導入単位（ＴＵ）／ｍｌの力価を有する約１０μｌの組換えレンチウイルスをくも膜下カテーテルによって投与した。脳を標的とするレンチウイルスベクターで発現される同様の量のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓが、本発明においてヒトで企図され得、例えば、１×１０９の形質導入単位（ＴＵ）／ｍｌの力価を有するレンチウイルスでの、脳を標的とする約１０〜５０ｍｌのＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓが企図され得る。
【０１７２】
脳への局所送達に関して、これを様々な方法で達成することができる。例えば、物質を、例えば、注入により線条体内に送達することができる。注入は、開頭により定位的に行うことができる。
【０１７３】
ＮＨＥＪ効率又はＨＲ効率を高めることも送達に役立つ。ＮＨＥＪ効率は、末端プロセシング酵素、例えば、Ｔｒｅｘ２（Ｄｕｍｉｔｒａｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２０１１  Ａｕｇｕｓｔ；１８８（４）：７８７−７９７）の共発現によって高められることが好ましい。ＨＲ効率は、ＮＨＥＪ装置、例えば、Ｋｕ７０及びＫｕ８６の一過性の阻害によって増大されるのが好ましい。ＨＲ効率はまた、原核生物又は真核生物相同組換え酵素、例えば、ＲｅｃＢＣＤ、ＲｅｃＡの共発現によっても増大させることができる。
【０１７４】
一般的なパッケージング及びプロモーター
ｉｎ  ｖｉｖｏでのゲノム改変を媒介するためにＣａｓ９コード核酸分子、例えば、ＤＮＡをベクター、例えば、ウイルスベクター内にパッケージングする方法は：
・ＮＨＥＪ媒介遺伝子ノックアウトを達成する：
・単一ウイルスベクター：
・２つ以上の発現カセットを含むベクター：
・プロモーター−Ｃａｓ９コード核酸分子−ターミネーター：
・プロモーター−ｇＲＮＡ１−ターミネーター：
・プロモーター−ｇＲＮＡ２−ターミネーター：
・プロモーター−ｇＲＮＡ（Ｎ）−ターミネーター：（最大でベクターのサイズ制限まで）：
・二重ウイルスベクター：
・Ｃａｓ９の発現を駆動する１つの発現カセットを含むベクター１：
・プロモーター−Ｃａｓ９コード核酸分子−ターミネーター：
・１つ以上のガイドＲＮＡの発現を駆動する１つ以上の発現カセットを含むベクター２：
・プロモーター−ｇＲＮＡ１−ターミネーター：
・プロモーター−ｇＲＮＡ（Ｎ）−ターミネーター：（最大でベクターのサイズ制限まで）：
・相同性依存性修復を媒介する：
・上記の単一及び二重ウイルスベクターアプローチに加えて、追加のベクターを使用して相同性依存性修復鋳型を送達することができる。
【０１７５】
Ｃａｓ９コード核酸分子の発現を駆動するために使用されるプロモーターは以下を含み得る：ＡＡＶ  ＩＴＲはプロモーターとして役立ち得る：これは、追加のプロモーターエレメント（ベクター内で場所をとり得る）が必要ないという点で有利である。自由になった追加の空間を使用して、追加のエレメント（ｇＲＮＡなど）の発現を駆動することができる。また、ＩＴＲ活性は比較的弱いため、Ｃａｓ９の過剰発現による潜在的な毒性を軽減するために使用することができる。偏在発現の場合は、以下のいずれかのプロモーターを使用することができる：ＣＭＶ、ＣＡＧ、ＣＢｈ、ＰＧＫ、ＳＶ４０、及びＦｅｒｒｉｔｉｎ重鎖又は軽鎖など。脳又は他のＣＮＳでの発現の場合は、以下のプロモーターを使用することができる：全てのニューロン用のＳｙｎａｐｓｉｎＩ、興奮性ニューロン用のＣａＭＫＩＩα、ＧＡＢＡ作動性ニューロン用のＧＡＤ６７又はＧＡＤ６５又はＶＧＡＴなど。肝臓での発現の場合は、アルブミンプロモーターを使用することができる。肺での発現の場合は、ＳＰ−Ｂを使用することができる。内皮細胞の場合は、ＩＣＡＭを使用することができる。造血細胞の場合は、ＩＦＮβ又はＣＤ４５を使用することができる。骨芽細胞の場合は、ＯＧ−２を使用することができる。
【０１７６】
ガイドＲＮＡを駆動するために使用されるプロモーターは以下を含み得る：Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター、例えば、Ｕ６又はＨ１、Ｐｏｌ  ＩＩプロモーター、及びｇＲＮＡを発現させるイントロンカセット。
【０１７７】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）
Ｃａｓ９及び１つ以上のガイドＲＮＡは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、アデノウイルス、又は他のタイプのプラスミド若しくはウイルスベクターを用いて、特に、例えば、米国特許第８，４５４，９７２号明細書（アデノウイルス用の製剤、用量）、同第８，４０４，６５８号明細書（ＡＡＶ用の製剤、用量）、及び同第５，８４６，９４６号明細書（ＤＮＡプラスミドの製剤、用量）からの、並びに臨床試験やレンチウイルス、ＡＡＶ、及びアデノウイルスに関する臨床試験に関する出版物からの製剤及び用量を用いて送達することができる。例えば、ＡＡＶの場合は、投与経路、製剤、及び用量は、米国特許第８，４５４，９７２号明細書及びＡＡＶに関する臨床試験と同様にすることができる。アデノウイルスの場合は、投与経路、製剤、及び用量は、米国特許第８，４０４，６５８号明細書及びアデノウイルスに関する臨床試験と同様にすることができる。プラスミド送達の場合は、投与経路、製剤、及び用量は、米国特許第５，８４６，９４６号明細書及びプラスミドに関する臨床研究と同様にすることができる。用量は、平均７０ｋｇの人（例えば、ヒト成人男性）に基づく又は外挿することができ、かつ患者、対象、哺乳動物の様々な体重及び種に合わせて調整することができる。投与の頻度は、医学実施者又は獣医学実施者（例えば、医師、獣医師）の領域内であり、年齢、性別、全身の健康、患者又は対象の他の状態、及び対処される特定の状態又は症状を含む通常の因子によって決まる。ウイルスベクターは、目的の組織に注入することができる。細胞型特異的ゲノム改変の場合は、Ｃａｓ９の発現は、細胞型特異的プロモーターによって駆動され得る。例えば、肝臓特異的発現はアルブミンプロモーターを使用することができ、ニューロン特異的発現（例えば、ＣＮＳ障害を標的とする場合）はＳｙｎａｐｓｉｎ  Ｉプロモーターを使用することができる。ｉｎ  ｖｉｖｏ送達に関しては、ＡＡＶは、２、３の理由：低毒性（これは、免疫応答を活性化させ得る細胞粒子の超遠心分離を必要としない精製法により得る）から他のウイルスベクターよりも有利である。
【０１７８】
ＡＡＶは宿主ゲノムにに組み込まれないため、挿入突然変異を引き起こす可能性が低い。
【０１７９】
ＡＡＶは、４．５Ｋｂ又は４．７５Ｋｂのパッケージング制限を有する。これは、Ｃａｓ９並びにプロモーター及び転写ターミネーターが全て、同じウイルスベクター内に適合しなければならないことを意味する。４．５Ｋｂ又は４．７５Ｋｂよりも大きい構築物は、ウイルスの産生を大幅に減少させる。ＳｐＣａｓ９は、かなり大きく、遺伝子自体が４．１Ｋｂを超え、ＡＡＶ内にパッキングすることが困難である。従って、本発明の実施形態は、比較的短いＣａｓ９のホモログを利用することを含む。例えば：
【０１８０】
【表３】
2017503485.tif 000005
【０１８１】
従って、これらの種は、一般に好ましいＣａｓ９種である。
【０１８２】
ＡＡＶについては、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、又はこれらの任意の組合せであり得る。標的とされるべき細胞に関するＡＡＶについてＡＡＶを選択することができ；例えば、脳又は神経細胞を標的とする場合は、ＡＡＶ血清型１、２、５、又はハイブリッドカプシドＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、又はこれらの任意の組合せを選択することができ；心臓組織を標的とする場合はＡＡＶ４を選択することができる。ＡＡＶ８は、肝臓に送達するのに有用である。本明細書のプロモーター及びベクターは個々に好ましい。これらの細胞についての特定のＡＡＶ血清型の表（Ｇｒｉｍｍ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２：５８８７−５９１１（２００８）を参照されたい）は次の通りである：
【０１８３】
【表４】
2017503485.tif 000006
【０１８４】
レンチウイルス
レンチウイルスは、有糸核分裂細胞及び分裂終了細胞の両方に感染してその遺伝子を発現させる能力を有する複合レトロウイルスである。最も良く知られているレンチウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）であり、他のウイルスのエンベロープ糖タンパク質を使用して広範囲の細胞型を標的とする。
【０１８５】
レンチウイルスは、以下のように好ましいであろう。ｐＣａｓＥＳ１０（レンチウイルストランスファープラスミド主鎖を含む）のクローニング後、低継代（ｐ＝５）のＨＥＫ２９３ＦＴを、１０％ウシ胎仔血清が添加された、抗生物質を含まないＤＭＥＭ中でのトランスフェクションの前日にＴ−７５フラスコに播種して５０％コンフルエンスにした。２０時間後、培地をＯｐｔｉＭＥＭ（無血清）培地に交換し、４時間後にトランスフェクションを行った。細胞を１０μｇのレンチウイルストランスファープラスミド（ｐＣａｓＥＳ１０）及び次のパッケージングプラスミド：５μｇのｐＭＤ２．Ｇ（ＶＳＶ−ｇ偽型）、及び７．５μｇのｐｓＰＡＸ２（ｇａｇ／ｐｏｌ／ｒｅｖ／ｔａｔ）でトランスフェクトした。陽イオン性脂質送達剤（５０ｕＬのリポフェクタミン２０００及び１００ｕｌのＰｌｕｓ試薬）を含む４ｍＬのＯｐｔｉＭＥＭ中でトランスフェクションを行った。６時間後に、培地を、１０％ウシ胎仔血清を含む抗生物質を含まないＤＭＥＤに交換した。これらの方法は、細胞培養中に血清を使用するが、無血清法が好ましい。
【０１８６】
レンチウイルスを以下のように精製することができる。４８時間後にウイルス上清を回収した。まずこの上清からデブリを除去し、これを、０．４５μｍの低タンパク質結合（ＰＶＤＦ）フィルターに通してろ過した。次いで、上清を、２４，０００ｒｐｍで２時間、超遠心機にかけた。ウイルスペレットを、５０μｌのＤＭＥＭ中、４℃で一晩再懸濁した。次いで、これを等分して−８０℃で急速冷凍した。
【０１８７】
別の実施形態では、特に眼の遺伝子療法（例えば、Ｂａｌａｇａａｎ，Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ  ２００６；  ８：２７５  −  ２８５を参照されたい）のための、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）をベースとした最小非霊長類レンチウイルスベクターも企図される。別の実施形態では、網型（ｗｅｂ  ｆｏｒｍ）の加齢黄斑変性症の治療用の網膜下注入により送達されるＲｅｔｉｎｏＳｔａｔ（登録商標）、即ち、血管新生抑制タンパク質であるエンドスタチン及びアンジオスタチンを発現するウマ感染性貧血ウイルスをベースとしたレンチウイルス遺伝子療法ベクターも企図され（例えば、Ｂｉｎｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＨＵＭＡＮ  ＧＥＮＥ  ＴＨＥＲＡＰＹ  ２３：９８０−９９１（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２０１２））、このベクターは、本発明のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のために改変することができる。
【０１８８】
別の実施形態では、ＨＩＶ  ｔａｔ／ｒｅｖ、核局在化ＴＡＲデコイ、及び抗ＣＣＲ５特異的ハンマーヘッド型リボザイムによって共有される共通のエキソンを標的とするｓｉＲＮＡを含む自己不活性化レンチウイルスベクター（例えば、ＤｉＧｉｕｓｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ２：３６ｒａ４３）を、本発明のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系に使用することができ、かつ／又は適合させることができる。患者の体重１ｋｇ当たり最低でも２．５×１０６のＣＤ３４＋細胞を収集して、２μｍｏｌ／Ｌ−グルタミン、幹細胞因子（１００ｎｇ／ｍｌ）、Ｆｌｔ−３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）（１００ｎｇ／ｍｌ）、及びトロンボポエチン（１０ｎｇ／ｍｌ）（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）を含むＸ−ＶＩＶＯ１５培地（Ｌｏｎｚａ）中、２×１０６細胞／ｍｌの濃度で１６〜２０時間、前刺激することができる。前刺激した細胞を、フィブロネクチンがコーティングされた７５ｃｍ２の組織培養フラスコ（２５ｍｇ／ｃｍ２）（ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ，Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．）で１６〜２４時間、５重感染でレンチウイルスを用いて形質導入することができる。
【０１８９】
レンチウイルスベクターは、パーキンソン病の治療で開示され、例えば、米国特許出願公開第２０１２０２９５９６０号明細書並び米国特許第７，３０３，９１０号明細書及び同第７，３５１，５８５号明細書を参照されたい。レンチウイルスベクターはまた、眼の疾患の治療でも開示され、例えば、米国特許出願公開第２００６０２８１１８０号明細書、同第２００９０００７２８４号明細書、同第２０１１０１１７１８９号明細書；同第米国２００９００１７５４３号明細書；同第２００７００５４９６１号明細書、同第２０１００３１７１０９号明細書を参照されたい。レンチウイルスベクターはまた、脳への送達でも開示され、例えば、米国特許出願公開第２０１１０２９３５７１号明細書；同第２０１１０２９３５７１号明細書、同第２００４００１３６４８号明細書、同第２００７００２５９７０号明細書、同第２００９０１１１１０６号明細書、及び米国特許第７，２５９，０１５号明細書を参照されたい。
【０１９０】
ＲＮＡの送達
ＲＮＡの送達：ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えば、Ｃａｓ９及び／又は任意の本ＲＮＡ、例えば、ガイドＲＮＡは、ＲＮＡの形態で送達することもできる。Ｃａｓ９ｍＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を用いて作製することができる。例えば、Ｃａｓ９ｍＲＮＡは、次のエレメント：βグロビン−ポリＡ尾部（１２０以上の一連のアデニン）からのＴ７＿プロモーター−ｋｏｚａｋ配列（ＧＣＣＡＣＣ）−Ｃａｓ９−３’  ＵＴＲを含むＰＣＲカセットを用いて合成することができる。このカセットは、Ｔ７ポリメラーゼによる転写に使用することができる。ガイドＲＮＡはまた、Ｔ７＿プロモーター−ＧＧ−ガイドＲＮＡ配列を含むカセットからのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を用いて転写することができる。
【０１９１】
発現を促進し、かつ生じ得る毒性を低減するために、ＣＲＩＳＰＲ酵素コード配列及び／又はガイドＲＮＡを、例えば、偽Ｕ又は５−メチル−Ｃを用いて、１つ以上の改変ヌクレオチドを含めるように改変することができる。
【０１９２】
ｍＲＮＡ送達法は、現在、肝臓への送達に特に有望である。
【０１９３】
ＲＮＡ送達についての多くの臨床研究は、ＲＮＡｉ又はアンチセンスに集中しているが、これらの系は、本発明の実施のためにＲＮＡの送達に適用することができる。ＲＮＡｉなどについての以下の参照文献を宜読むべきである。
【０１９４】
ナノ粒子
ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡは、ナノ粒子又は脂質エンベロープを用いて同時に送達することができる。
【０１９５】
例えば、Ｓｕ  Ｘ，Ｆｒｉｃｋｅ  Ｊ，Ｋａｖａｎａｇｈ  ＤＧ，Ｉｒｖｉｎｅ  ＤＪ（“Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｍＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｕｓｉｎｇ  ｌｉｐｉｄ−ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ  ｐＨ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ”Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ．２０１１  Ｊｕｎ  ６；８（３）：７７４−８７．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｍｐ１００３９０ｗ．Ｅｐｕｂ  ２０１１  Ａｐｒ  １）は、リン脂質二重層シェルによって覆われたポリ（β−アミノエステル）（ＰＢＡＥ）コアを有する生分解性コアシェル構造ナノ粒子について記載している。これらは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのｍＲＮＡの送達のために開発された。ｐＨ応答性ＰＢＡＥ構成成分は、エンドソームの破壊を促進するために選択されたが、脂質表面層は、ポリカチオンコアの毒性を最小限にするために選択された。従って、これらは、本発明のＲＮＡの送達に好ましい。
【０１９６】
一実施形態では、自己構築生体接着ポリマーに基づいたナノ粒子が企図され、このナノ粒子は、全て脳への送達であるペプチドの経口送達、ペプチドの静脈内送達、及びペプチドの経鼻送達に適用することができる。他の実施形態、例えば、疎水性薬物の経口吸収及び眼送達も企図される。分子エンベロープ技術は、保護された疾患部位に送達される改変ポリマーエンベロープを含む（例えば、Ｍａｚｚａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．ＡＣＳＮａｎｏ，２０１３．７（２）：１０１６−１０２６；Ｓｉｅｗ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ，２０１２．９（１）：１４−２８；Ｌａｌａｔｓａ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｏｎｔｒ  Ｒｅｌ，２０１２．１６１（２）：５２３−３６；Ｌａｌａｔｓａ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ，２０１２．９（６）：１６６５−８０；Ｌａｌａｔｓａ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ，２０１２．９（６）：１７６４−７４；Ｇａｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃｓ，２０１２．５（５−６）：４５８−６８；Ｇａｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｒａｍａｎ  Ｓｐｅｃｔ，２０１２．４３（５）：６８１−６８８；Ａｈｍａｄ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ２０１０．７：Ｓ４２３−３３；Ｕｃｈｅｇｂｕ，Ｉ．Ｆ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ，２００６．３（５）：６２９−４０；Ｑｕ，Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２００６．７（１２）：３４５２−９、及びＵｃｈｅｇｂｕ，Ｉ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ，２００１．２２４：１８５−１９９を参照されたい）。約５ｍｇ／ｋｇの用量が企図され、標的組織によって単回投与又は複数回投与である。
【０１９７】
一実施形態では、ＭＩＴのＤａｎ  Ａｎｄｅｒｓｏｎの研究室で開発された、ＲＮＡを癌細胞に送達して腫瘍の成長を停止させることができるナノ粒子を、本発明のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系に使用することができ、かつ／又は適合させることができる。特に、Ａｎｄｅｒｓｏｎの研究室は、新たな生体材料及びナノ製剤の合成、精製、特徴付け、及び製剤を完全に自動化した組み合わせシステムを開発した。例えば、Ａｌａｂｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０１３  Ａｕｇ  ６；１１０（３２）：１２８８１−６；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ  Ｍａｔｅｒ．２０１３  Ｓｅｐ  ６；２５（３３）：４６４１−５；Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．２０１３  Ｍａｒ  １３；１３（３）：１０５９−６４；Ｋａｒａｇｉａｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｎａｎｏ．２０１２  Ｏｃｔ  ２３；６（１０）：８４８４−７；Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｎａｎｏ．２０１２  Ａｕｇ  ２８；６（８）：６９２２−９、及びＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２  Ｊｕｎ  ３；７（６）：３８９−９３を参照されたい。
【０１９８】
米国特許出願公開第２０１１０２９３７０３号明細書は、ポリヌクレオチドの投与にも特に有用な脂質化合物に関し、この脂質化合物は、本発明のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系の送達に適用することができる。一態様では、アミノアルコール脂質化合物は、微粒子、ナノ粒子、リポソーム、又はミセルを形成するために細胞又は対象に送達するべき作用物質と組み合わせられる。粒子、リポソーム、又はミセルによって送達するべき作用物質は、気体、液体、又は固体の形態であり得、この作用物質は、ポリヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、又は小分子であり得る。このアミノアルコール脂質化合物は、他のアミノアルコール脂質化合物、ポリマー（合成又は天然）、界面活性剤、コレステロール、炭水化物、タンパク質、脂質などと組み合わせて粒子を形成することができる。次いで、これらの粒子を、任意に医薬賦形剤と組み合わせて医薬組成物を形成することができる。
【０１９９】
米国特許出願公開第２０１１０２９３７０３号明細書はまた、アミノアルコール脂質化合物を調製する方法を提供する。アミンの１つ以上の等価物を、本発明のアミノアルコール脂質化合物を形成するのに適切な条件下でエポキシド末端化合物の１つ以上の等価物と反応させる。特定の実施形態では、アミンの全てのアミノ基は、エポキシド末端化合物と十分に反応して第３級アミンを形成する。他の実施形態では、アミンの全てのアミノ基が、エポキシド末端化合物と十分に反応して第３級アミンを形成するわけではなく、従ってアミノアルコール脂質化合物中に第１級アミン又は第２級アミンが形成される。これらの第１級アミン又は第２級アミンは、そのまま残る、又は別の求電子体、例えば、異なるエポキシド末端化合物と反応することができる。当業者には分かるように、アミンを過剰未満のエポキシド末端化合物と反応させると、様々な数の尾部を有する複数の異なるアミノアルコール脂質化合物が生じる。特定のアミンは、２つのエポキシド由来化合物尾部で十分に官能性を持たせることができるが、他の分子は、エポキシド由来化合物尾部では十分に官能性を持たない。例えば、ジアミン又はポリアミンは、分子の様々なアミノ部分から離れた１つ、２つ、３つ、又は４つのエポキシド由来化合物尾部を含み得、第１級アミン、第２級アミン、及び第３級アミンが形成される。特定の実施形態では、全てのアミノ基が、完全には官能性を持たない。特定の実施形態では、２つの同じタイプのエポキシド末端化合物が使用される。他の実施形態では、２つ以上の異なるエポキシド末端化合物が使用される。アミノアルコール脂質化合物の合成は、溶媒を用いて又は用いずに行われ、この合成は、３０〜１００℃の高温、好ましくは約５０〜９０℃で行うことができる。調製したアミノアルコール脂質化合物は、任意に精製することができる。例えば、アミノアルコール脂質化合物の混合物を精製して、特定の数のエポキシド由来化合物尾部を有するアミノアルコール脂質化合物を得ることができる。又は、この混合物を精製して特定の立体異性体又は位置異性体を得ることができる。アミノアルコール脂質化合物はまた、ハロゲン化アルキル（例えば、ヨウ化メチル）又は他のアルキル化剤を用いてアルキル化することもでき、かつ／又はアシル化することもできる。
【０２００】
米国特許出願公開第２０１１０２９３７０３号明細書はまた、本発明の方法によって調製されたアミノアルコール脂質化合物のライブラリーも提供する。これらのアミノアルコール脂質化合物は、液体ハンドラー、ロボット、マイクロタイタープレート、コンピューターなどを含む高スループット技術を用いて調製及び／又はスクリーニングすることができる。特定の実施形態では、アミノアルコール脂質化合物は、ポリヌクレオチド又は他の作用物質（例えば、タンパク質、ペプチド、小分子）を細胞内にトランスフェクトするその能力についてスクリーニングされる。
【０２０１】
米国特許出願公開第２０１３０３０２４０１号明細書は、組み合わせ重合を用いて調製されたポリ（β−アミノアルコール）（ＰＢＡＡ）のクラスに関する。本発明のＰＢＡＡは、コーティング（例えば、医療器具又はインプラント用の薄膜又は多層薄膜のコーティング）、添加剤、材料、賦形剤、非生物付着剤、微細パターン化剤、及び細胞封入剤としてバイオテクノロジー及び医用用途に使用することができる。表面コーティングとして使用される場合、これらのＰＢＡＡは、その化学構造により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの両方で異なるレベルの炎症を引き起こした。このクラスの材料の幅広い化学的多様性により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのマクロファージの活性を阻害するポリマーコーティングを特定することができた。さらに、これらのコーティングは、炎症細胞のリクルートを低減し、かつカルボキシル化ポリスチレン微粒子の皮下注入後の線維症を軽減する。これらのポリマーを使用して、細胞封入のための高分子電解質複合カプセルを形成することができる。本発明はまた、例えば、抗菌コーティング、ＤＮＡ又はｓｉＲＮＡの送達、及び幹細胞組織のエンジニアリングなどの多くの他の生物学的用途も有し得る。米国特許出願公開第２０１３０３０２４０１号明細書の教示は、本発明のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系に適用することができる。
【０２０２】
別の実施形態では、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）も企図される。抗トランスサイレチン短鎖干渉ＲＮＡが、脂質ナノ粒子内に封入されてヒトに送達され（例えば、Ｃｏｅｌｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０１３；３６９：８１９−２９を参照）、かつこのような系を、本発明のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系に適合させて適用することができる。静脈投与される体重１ｋｇ当たり約０．０１〜約１ｍｇの用量が企図される。注入に関連した反応のリスクを軽減する薬剤が企図され、例えば、デキサメタゾン、アセトアンピノフェン（ａｃｅｔａｍｐｉｎｏｐｈｅｎ）、ジフェンヒドラミン又はセチリジン、及びラニチジンが企図される。合計５回の４週間ごとの約０．３ｍｇ／ｋｇの複数回投与も企図される。
【０２０３】
ＬＮＰは、ｓｉＲＮＡの肝臓への送達に極めて有効であることが示され（例えば、Ｔａｂｅｒｎｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ａｐｒｉｌ  ２０１３，Ｖｏｌ．３，Ｎｏ．４，ｐａｇｅｓ  ３６３−４７０を参照されたい）、従ってＣＲＩＳＰＲ  ＣａｓをコードするＲＮＡの肝臓への送達が企図される。２週間毎のＬＮＰの６ｍｇ／ｋｇの約４回の投与が企図され得る。Ｔａｂｅｒｎｅｒｏらは、最初の２サイクルの０．７ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ投与後に腫瘍退縮が観察され、６サイクルの終了までに、患者が、リンパ節転移の完全な退縮及び肝腫瘍の実質的な縮小を含む部分反応を達成したことを実証した。完全反応が、この患者での４０回の投与後に得られ、この患者は、寛解期を維持し、２６か月に亘る投与後に処置を終了した。ＶＥＧＦ経路阻害剤での前治療の後に進行した、腎臓、肺、及びリンパ節を含む疾患の肝外部位及びＲＣＣを有する２人の患者は、約８〜１２か月間全ての部位で疾患が安定しており、ＰＮＥＴ及び肝転位を有する患者は、疾患が安定した状態で１８か月間（３６回の投与）の延長研究を続けた。
【０２０４】
しかしながら、ＬＮＰの変化を考慮しなければならない。カチオン性脂質を、細胞内送達を促進する単層構造を誘導するために負に帯電した脂質と組み合わせる。帯電ＬＮＰは、静脈注射の後に循環から迅速に除去されるため、ｐＫａ値が７未満のイオン性カチオン性脂質を開発された（例えば、Ｒｏｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９，ｎｏ．１２，ｐａｇｅｓ  １２８６−２２００，Ｄｅｃ．２０１１を参照されたい）。負に帯電したポリマー、例えば、ＲＮＡを低ｐＨ値（例えば、ｐＨ４）でＬＮＰに導入し、このイオン性脂質は正電荷を示すことができる。しかしながら、生理学的ｐＨ値では、ＬＮＰは、長い循環時間に適合する低い表面電荷を示す。４種類のイオン性カチオン性脂質、即ち、１，２−ジリネオイル（ｄｉｌｉｎｅｏｙｌ）−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイオキシ（ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌｏｘｙ）−３−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡで）、１，２−ジリノレイオキシケト（ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌｏｘｙｋｅｔｏ）−Ｎ、Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｉｎＫＤＭＡ）、及び１，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ）に集中した。これらの脂質を含むＬＮＰ  ｓｉＲＮＡ系は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの肝細胞において著しく異なる遺伝子サイレンシング特性を示し、第ＶＩＩ因子遺伝子サイレンシングモデルを利用するシリーズＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ＞ＤＬｉｎＫＤＭＡ＞ＤＬｉｎＤＭＡ＞＞ＤＬｉｎＤＡＰに従って異なる効力を有することが示された（例えば、Ｒｏｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９，ｎｏ．１２，ｐａｇｅｓ  １２８６−２２００，Ｄｅｃ．２０１１を参照されたい）。特に、ＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡを含む製剤の場合は、１μｇ／ｍｌの用量のＬＮＰ又はこのＬＮＰ内の、又はこのＬＮＰに関連したＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ  ＲＮＡが企図され得る。
【０２０５】
ＬＮＰ及びＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ封入の調製では、Ｒｏｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９，ｎｏ．１２，ｐａｇｅｓ  １２８６−２２００，Ｄｅｃ．２０１１を使用することができ、かつ／又はこの文献に合わせることができる。カチオン性脂質、１，２−ジリネオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイオキシ−３−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレイオキシケト−Ｎ、Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｉｎＫ−ＤＭＡ）、１，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ）、（３−Ｏ−［２’’−（メトキシポリエチレングリコール２０００）スクシノイル］−１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリコール（ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ）、及びＲ−３−［（ω−メトキシ−ポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］−１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−アミン（ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ）は、Ｔｅｋｍｉｒａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）から与えられても良いし、又は合成しても良い。コレステロールは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入することができる。特定のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ  ＲＮＡは、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎＫ−ＤＭＡ、及びＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ（４０：１０：４０：１０のモル比）のカチオン性脂質：ＤＳＰＣ：ＣＨＯＬ：ＰＥＧＳ−ＤＭＧ又はＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ）を含むＬＮＰに封入することができる。必要に応じて、０．２％  ＳＰ−ＤｉＯＣ１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｃａｎａｄａ）を封入して、細胞の取り込み、細胞内送達、及び生体内分布を評価することができる。封入は、カチオン性脂質：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ（４０：１０：４０：１０のモル比）からなる脂質混合物をエタノール中で溶解して、１０ｍｍｏｌ／ｌの最終脂質濃度にすることによって行うことができる。この脂質のエタノール溶液を、５０ｍｍｏｌ／ｌ  クエン酸塩、ｐＨ４．０に滴下して多重小胞を形成し、３０％エタノール（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の最終濃度にすることができる。押し出し機（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）を用いて二重の８０ｎｍ  Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅポリカーボネートフィルターに多層小胞を通した後に、大きい単層小胞を形成することができる。この押し出されて事前に形成された大きい単層小胞に、３０％エタノール（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を含む５０ｍｍｏｌ／ｌ  クエン酸塩、ｐＨ４．０に２ｍｇ／ｍｌに溶解したＲＮＡを滴下し、そして０．０６／１  ｗｔ／ｗｔの最終ＲＮＡ／脂質重量比となるように常に混合しながら３１℃で３０分間インキュベートすることによって封入を達成することができる。エタノールの除去及び製剤緩衝液の中和を、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ  ２再生セルロース透析膜を用いたリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４に対する１６時間の透析によって行った。ナノ粒子のサイズ分布を、ＮＩＣＯＭＰ  ３７０粒子選別機（Ｎｉｃｏｍｐ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉ��ｇ，Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）を小胞／強度モードで用いた動的光散乱、及びガウシアンフィッティングによって決定することができる。３つ全てのＬＮＰ系の粒子サイズは、直径が約７０ｎｍであり得る。ＲＮＡの封入効率は、ＶｉｖａＰｕｒｅＤ  ＭｉｎｉＨカラム（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いた、透析の前及び後に収集されたサンプルからの遊離ＲＮＡの除去によって決定することができる。封入ＲＮＡは、溶出ナノ粒子から抽出することができ、２６０ｎｍで定量することができる。ＲＮＡの脂質に対する比は、Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＵＳＡ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ）のコレステロール酵素アッセイを用いた小嚢中のコレステロール含有量の測定によって決定した。ＬＮＰ及びＰＥＧ脂質の本明細書の考察に関連して、ペグ化リポソーム又はＬＮＰは同様に、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系又はその構成成分の送達に適している。
【０２０６】
大きいＬＮＰの調製では、Ｒｏｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９，ｎｏ．１２，ｐａｇｅｓ  １２８６−２２００，Ｄｅｃ．２０１１を使用することができ、かつ／又はこの文献に合わせることができる。脂質プレミックス溶液（２０．４ｍｇ／ｍｌの全脂質濃度）を、５０：１０：３８．５のモル比でＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＳＰＣ、及びコレステロールを含むエタノール中で調製することができる。酢酸ナトリウムを、０．７５：１（酢酸ナトリウム：ＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ）のモル比で脂質プレミックスに添加することができる。続いて、この混合物を強く撹拌しながら１．８５倍量のクエン酸塩緩衝液（（１０ｍｍｏｌ／ｌ、ｐＨ３．０）と化合させることによって脂質を水和させることができ、これにより、３５％エタノールを含む水性緩衝液中に自然にリポソームが形成される。このリポソーム溶液を３７℃でインキュベートして、粒子サイズを時間依存性に増加させることができる。インキュベーション中の様々な時間にアリコートを取り出して、動的光散乱（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ））によってリポソームのサイズの変化を評価することができる。所望の粒子サイズが達成されたら、水性ＰＥＧ脂質溶液（ストック＝３５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）エタノール中、１０ｍｇ／ｍｌ  ＰＥＧ−ＤＭＧ）をリポソーム混合物に添加して、全脂質の３．５％の最終ＰＥＧモル濃度にすることができる。ＰＥＧ−脂質の添加時に、リポソームは、そのサイズがさらに成長するのを効果的に停止するべきである。次いで、ＲＮＡを、ＲＮＡと全脂質との比が約１：１０（ｗｔ：ｗｔ）で空のリポソームに加え、次いで、３７℃で３０分間インキュベートして充填ＬＮＰを形成することができる。続いて、この混合物を、ＰＢＳ中で一晩透析し、０．４５−μｍシリンジフィルターでろ過することができる。
【０２０７】
Ｓｐｈｅｒｉｃａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（ＳＮＡ（商標））構築物及び他のナノ粒子（特に金ナノ粒子）もまた、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を意図する標的に送達する手段として企図される。有意なデータが、核酸−機能化金ナノ粒子に基づいたＡｕｒａＳｅｎｓｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ’  Ｓｐｈｅｒｉｃａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（ＳＮＡ（商標））構築物が有用であることを示している。
【０２０８】
本明細書の教示に関連して利用することができる文献として：Ｃｕｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１１  １３３：９２５４−９２５７，Ｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｍａｌｌ．２０１１  ７：３１５８−３１６２，Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｎａｎｏ．２０１１  ５：６９６２−６９７０，Ｃｕｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２  １３４：１３７６−１３９１，Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．２０１２  １２：３８６７−７１，Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２０１２  １０９：１１９７５−８０，Ｍｉｒｋｉｎ，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１２  ７：６３５−６３８  Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２  １３４：１６４８８−１６９１，Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｎａｔｕｒｅ  ２０１３  ４９５：Ｓ１４−Ｓ１６，Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２０１３  １１０（１９）：７６２５−７６３０，Ｊｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．５，２０９ｒａ１５２（２０１３）、及びＭｉｒｋｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｍａｌｌ，１０：１８６−１９２が挙げられる。
【０２０９】
ＲＮＡを含む自己構築ナノ粒子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の遠位端部に付着したＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチドリガンドでＰＥＧ化されたポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いて形成することができる。この系は、例えば、インテグリンを発現する腫瘍新生血管を標的とし、血管内皮成長因子受容体−２（ＶＥＧＦ  Ｒ２）の発現を抑制するｓｉＲＮＡを送達し、これにより腫瘍の血管新生を達成する手段として使用した（例えば、Ｓｃｈｉｆｆｅｌｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４，Ｖｏｌ．３２，Ｎｏ．１９を参照されたい）。ナノプレックスは、等量のカチオン性ポリマーの水溶液と核酸を混合して、２〜６の範囲で正味モル過剰のイオン化窒素（ポリマー）をリン酸塩（核酸）に付与して調製することができる。カチオン性ポリマーと核酸との間の静電相互作用により、平均粒子サイズ分布が約１００ｎｍのポリプレックスが形成され、従って、本明細書ではナノプレックスと呼ばれる。約１００〜２００ｍｇの用量のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓが、Ｓｃｈｉｆｆｅｌｅｒｓらの自己構築ナノ粒子での送達のために考えられる。
【０２１０】
Ｂａｒｔｌｅｔｔら（ＰＮＡＳ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２５，２００７，ｖｏｌ．１０４，ｎｏ．３９）のナノプレックスも本発明に適用することができる。Ｂａｒｔｌｅｔｔらのナノプレックスは、等量のカチオン性ポリマーの水溶液と核酸を混合して、２〜６の範囲で正味モル過剰のイオン化窒素（ポリマー）をリン酸塩（核酸）に加えて調製される。カチオン性ポリマーと核酸との間の静電相互作用により、平均粒子サイズ分布が約１００ｎｍのポリプレックスが形成され、従って、本明細書ではナノプレックスと呼ばれる。ＢａｒｔｌｅｔｔらのＤＯＴＡ−ｓｉＲＮＡを次のように合成した：１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸モノ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）（ＤＯＴＡ−ＮＨＳｅｓｔｅｒ）をＭａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ（Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）で注文した。炭酸塩緩衝液（ｐＨ９）中のアミン修飾ＲＮＡセンス鎖及び１００倍モル過剰のＤＯＴＡ−ＮＨＳｅｓｔｅｒと共に微小遠心管に加えた。室温で４時間撹拌して内容物を反応させた。ＤＯＴＡ−ＲＮＡセンス鎖コンジュゲートをエタノール沈殿させ、水に再懸濁し、そして未修飾アンチセンス鎖にアニーリングさせてＤＯＴＡ−ｓｉＲＮＡを得た。微量の金属汚染物を除去するために全ての液体をＣｈｅｌｅｘ−１００（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で処理した。Ｔｆ標的ｓｉＲＮＡナノ粒子及びＴｆ非標的ｓｉＲＮＡナノ粒子を、シクロデキストリン含有ポリカチオンを使用して形成することができる。典型的には、ナノ粒子は、３（±）の電荷比及び０．５ｇ／リットルのｓｉＲＮＡ濃度で、水中で形成された。標的ナノ粒子の表面上の１％のアダマンタン−ＰＥＧ分子をＴｆで修飾した（アダマンタン−ＰＥＧ−Ｔｆ）。このナノ粒子を、注入のために５％（ｗｔ／ｖｏｌ）グルコース担体溶液に懸濁した。
【０２１１】
Ｄａｖｉｓら（Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ  ４６４，１５  Ａｐｒｉｌ  ２０１０）は、標的ナノ粒子送達系を用いるＲＮＡ臨床試験を行う（臨床試験登録番号ＮＣＴ００６８９０６５）。標準癌療法では効果がない固形癌の患者に、３０分間の静脈注射により２１日サイクルの１日目、３日目、８日目、及び１０日目に標的ナノ粒子が投与される。ナノ粒子は：（１）線状のシクロデキストリン系ポリマー（ＣＤＰ）、（２）癌細胞の表面のＴＦ受容体（ＴＦＲ）に結合するためにナノ粒子の外面に提示されるリガンドを標的とするヒトトランスフェリンタンパク質（ＴＦ）、（３）親水性ポリマー（生体液中でのナノ粒子の安定性を向上させるために使用されるポリエチレングリコール（ＰＥＧ））、及び（４）ＲＲＭ２の発現を抑制するように設計されたｓｉＲＮＡ（クリニックで使用される配列は、既にｓｉＲ２Ｂ＋５として示された）を含む合成送達系からなる。ＴＦＲは、悪性細胞で上方制御されることが以前から知られており、ＲＲＭ２は、確立された抗癌標的である。これらのナノ粒子（ＣＡＬＡＡ−０１として示される臨床型）は、非ヒト霊長類での複数回投与試験で十分に耐容性であることが示されている。一人の慢性骨髄性白血病患者に、リポソーム送達によってｓｉＲＮＡが投与されたが、Ｄａｖｉｓらの臨床試験は、標的送達系を用いてｓｉＲＮＡを全身に送達して、固形癌患者を治療する最初のヒト試験である。標的送達系が、機能的ｓｉＲＮＡをヒト腫瘍に有効に送達できるかを確認するために、Ｄａｖｉｓらは、３つの異なる投薬コホートを構成する３人の患者：それぞれが転移性黒色腫を有し、それぞれ１８、２４、及び３０ｍｇ／ｍ２の用量のＣＡＬＡＡ−０１が投与された患者Ａ、Ｂ、及びＣからの生検を調べた。本発明のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系でも同様の用量が企図され得る。本発明の送達は、線状のシクロデキストリン系ポリマー（ＣＤＰ）、癌細胞の表面のＴＦ受容体（ＴＦＲ）に結合するためにナノ粒子の外面に提示されるリガンドを標的とするヒトトランスフェリンタンパク質（ＴＦ）、及び／又は親水性ポリマー（例えば、生体液中でのナノ粒子の安定性を向上させるために使用されるポリエチレングリコール（ＰＥＧ））を含むナノ粒子で達成することができる。
【０２１２】
粒子送達系及び／又は製剤：
多様な範囲の生物医学の適用例に有用ないくつかの種類の粒子送達系及び／又は製剤が知られている。一般に、粒子は、その輸送及び特性に関して全単体として挙動する小さい物体として定義されている。粒子は、直径に従ってさらに分類される。粗粒子は、２，５００〜１０，０００ナノメートルの範囲に及ぶ。微粒子は、１００〜２，５００ナノメートルのサイズである。超微粒子又はナノ粒子は、一般に１〜１００ナノメートルのサイズである。１００−ｎｍを限度とする根拠は、粒子をバルク材料と区別する新たな特性が、典型的には、１００ｎｍ未満の臨界長スケールで生じるという事実による。
【０２１３】
本明細書で使用される粒子送達系／製剤は、本発明による粒子を含む任意の生物学的送達系／製剤として定義される。本発明による粒子は、１００マイクロメートル（μｍ）未満の最大寸法を有する任意の実在物である。一部の実施形態では、本発明の粒子は、１０μｍ未満の最大寸法（例えば、直径）を有する。一部の実施形態では、本発明の粒子は、２０００ナノメートル（ｎｍ）未満の最大寸法を有する。一部の実施形態では、本発明の粒子は、１０００ナノメートル（ｎｍ）未満の最大寸法を有する。一部の実施形態では、本発明の粒子は、９００ｎｍ未満、８００ｎｍ未満、７００ｎｍ未満、６００ｎｍ未満、５００ｎｍ未満、４００ｎｍ未満、３００ｎｍ未満、２００ｎｍ未満、又は１００ｎｍ未満の最大寸法を有する。典型的には、本発明の粒子は、５００ｎｍ未満の最大寸法（例えば、直径）を有する。一部の実施形態では、本発明の粒子は、２５０ｎｍ未満の最大寸法（例えば、直径）を有する。一部の実施形態では、本発明の粒子は、２００ｎｍ未満の最大寸法（例えば、直径）を有する。一部の実施形態では、本発明の粒子は、１５０ｎｍ未満の最大寸法（例えば、直径）を有する。一部の実施形態では、本発明の粒子は、１００ｎｍ未満の最大寸法（例えば、直径）を有する。例えば、５０ｎｍ未満の最大寸法を有する小さい粒子は、本発明の一部の実施形態で使用される。一部の実施形態では、本発明の粒子は、２５ｎｍ〜２００ｎｍの範囲の最大寸法を有する。
【０２１４】
粒子の特徴付け（例えば、形態、寸法などを特徴付けることを含む）は、様々な異なる技術を用いて行われる。一般的な技術は、電子顕微鏡法（ＴＥＭ、ＳＥＭ）、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）、動的光散乱法（ＤＬＳ）、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）、粉末Ｘ線回折法（ＸＲＤ）、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、紫外−可視分光法、二偏波干渉法、及び核磁気共鳴法（ＮＭＲ）である。特徴付け（寸法測定）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかでの本発明の適用で送達に最適なサイズの粒子を提供するために、天然の粒子（即ち、カーゴに入れる前の粒子）又はカーゴに入れた後の粒子について行うことができる（本明細書では、カーゴは、例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の１つ以上の構成成分、例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素又はｍＲＮＡ又はガイドＲＮＡ、又は任意のこれらの組み合わせを指し、追加の担体及び／又は賦形剤を含み得る）。特定の好ましい実施形態では、粒子寸法（例えば、直径）の特徴付けは、動的レーザー散乱（ＤＬＳ）を用いた測定に基づいている。米国特許第８，７０９，８４３号明細書；同第６，００７，８４５号明細書；同第５，８５５，９１３号明細書；同第５，９８５，３０９号明細書；同第５，５４３，１５８号明細書；並びにＪａｍｅｓ  Ｅ．Ｄａｈｌｍａｎ及びＣａｒｍｅｎ  Ｂａｒｎｅｓらによる出版物、２０１４年５月１１日にオンラインで公表された、Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１４）、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｎａｎｏ．２０１４．８４に、粒子、これらの作製及び使用方法並びにその測定が記載されている。
【０２１５】
本発明の範囲内の粒子送達系は、限定されるものではないが、固体、半固体、エマルション、又はコロイド粒子を含む任意の形態で提供することができる。従って、限定されるものではないが、例えば、脂質ベースの系、リポソーム、ミセル、微小粒子、エキソソーム、又は遺伝子銃を含む本明細書に記載の任意の送達系を、本発明の範囲内の粒子送達系として提供することができる。
【０２１６】
ナノ粒子
本発明に関して、ＣＲＩＳＰＲ複合体の１つ以上の構成成分、例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素又はｍＲＮＡ又はガイドＲＮＡを、ナノ粒子又は脂質エンベロープを用いて送達することが好ましい。他の送達系又はベクターを、本発明のナノ粒子の態様に関連して使用することができる。
【０２１７】
一般に、「ナノ粒子」とは、１０００ｎｍ未満の直径を有する任意の粒子のことである。ある好ましい実施形態では、本発明のナノ粒子は、５００ｎｍ未満の最大寸法（例えば、直径）を有する。他の好ましい実施形態では、本発明のナノ粒子は、２５ｎｍ〜２００ｎｍの範囲の最大寸法を有する。他の好ましい実施形態では、本発明のナノ粒子は、１００ｎｍ未満の最大寸法を有する。他の好ましい実施形態では、本発明のナノ粒子は、３５ｎｍ〜６０ｎｍの範囲の最大寸法を有する。
【０２１８】
本発明に包含されるナノ粒子は、様々な形態、例えば、固体ナノ粒子（例えば、金属、例えば、銀、金、鉄、チタン）、非金属、脂質ベースの固体、ポリマー、ナノ粒子の懸濁液、又はこれらの組み合わせとして提供することができる。金属、誘電体、及び半導体ナノ粒子、さらにはハイブリッド構造（例えば、コア−シェルナノ粒子）を調製することができる。半導体材料から形成されたナノ粒子はまた、電子エネルギーレベルの量子化が起こるほど十分に小さい（典型的には、１０ｎｍ未満）場合は標識量子ドットであり得る。このようなナノスケールの粒子は、薬物担体又は造影剤として生物医学的応用に使用され、かつ本発明の同様の目的のために適合させることができる。
【０２１９】
半固体ナノ粒子及び柔軟なナノ粒子が製造されるが、これらは本発明の範囲内である。半固体性のプロトタイプナノ粒子はリポソームである。様々な種類のリポソームナノ粒子が、現在、抗癌剤及びワクチンの送達系として臨床で使用されている。半分が親水性で残りの半分が疎水性のナノ粒子は、Ｊａｎｕｓ粒子と呼ばれ、エマルションの安定化に特に有効である。このナノ粒子は、水／油の界面で自己構築して、固体界面活性剤として機能し得る。
【０２２０】
参照により本明細書に組み入れられる米国特許第８，７０９，８４３号明細書は、治療剤を含む粒子の組織、細胞、及び細胞内区画への標的送達用の薬物送達系を提供する。本発明は、界面活性剤、親水性ポリマー、又は脂質にコンジュゲートしたポリマーを含む標的粒子を提供する。
【０２２１】
参照により本明細書に組み入れられる米国特許第６，００７，８４５号明細書は、多官能化合物と１つ以上の疎水性ポリマー及び１つ以上の親水性ポリマーとの共有結合によって形成されたマルチブロックコポリマーのコアを有し、かつ生物学的に活性な材料を含む粒子を提供する。
【０２２２】
参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，８５５，９１３号明細書は、０．４ｇ／ｃｍ３未満のタップ密度及び５μｍ〜３０μｍの平均直径を有する空気力学的に軽い粒子を有し、かつその表面に肺系統への薬物送達用の界面活性剤を含む微粒子組成物を提供する。
【０２２３】
参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，９８５，３０９号明細書は、肺系統への送達用の界面活性剤及び／又は正若しくは負に帯電した治療薬若しくは診断薬と反対の電荷の荷電分子との親水性若しくは疎水性複合体を含む粒子を提供する。
【０２２４】
参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，５４３，１５８号明細書は、表面に生物学的に活性な材料及びポリ（アルキレングリコール）部分を含む生分解性固体コアを有する生分解性の注射用ナノ粒子を提供する。
【０２２５】
参照により本明細書に組み入れられる国際公開第２０１２１３５０２５号パンフレット（米国特許出願公開第２０１２０２５１５６０号明細書としても公開されている）は、コンジュゲートポリエチレンイミン（ＰＥＩ）ポリマー及びコンジュゲートアザ大員環（まとめて「コンジュゲートリポマー（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｌｉｐｏｍｅｒ）」又は「リポマー」と呼ばれる）を説明している。特定の実施形態では、このようなコンジュゲートリポマーを、タンパク質の発現の調節を含む、遺伝子発現を調節するためにｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏでゲノム摂動を達成するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系との関連で使用できることが想定され得る。
【０２２６】
一実施形態では、ナノ粒子は、エポキシド修飾脂質ポリマー、有利に７Ｃ１であり得る（例えば、Ｊａｍｅｓ  Ｅ．Ｄａｈｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｃａｒｍｅｎ  Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１４）オンラインで公表  １１  Ｍａｙ  ２０１４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｎａｎｏ．２０１４．８４を参照されたい）。Ｃ７１は、１４：１のモル比でＣ１５エポキシド終端脂質とＰＥＩ６００とを反応させて合成し、Ｃ１４ＰＥＧ２０００を用いて、少なくとも４０日間ＰＢＳ溶液中で安定なナノ粒子（３５〜６０ｎｍの直径）を製剤化した。
【０２２７】
エポキシド修飾脂質−ポリマーを利用して本発明のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を肺細胞、心血管細胞、又は腎細胞に送達することができるが、当業者であれば、他の標的器官に送達するためにこの系を適合させることができるであろう。約０．０５〜約０．６ｍｇ／ｋｇの用量が考えられる。総用量が約２ｍｇ／ｋｇである数日又は数週間に亘る投与も考えられる。
【０２２８】
エキソソーム
エキソソームは、ＲＮＡ及びタンパク質を輸送する内因性ナノ−小胞であり、ＲＮＡを脳及び他の標的器官に送達することができる。免疫原性を低減するために、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉら（２０１１，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２９：３４１）は、エキソソームの作製に自己由来樹状細胞を使用した。脳を標的とすることは、ニューロン特異的ＲＶＧペプチドに融合したＬａｍｐ２ｂ、エキソソーム膜タンパク質を発現させるために樹状細胞をエンジニアリングすることによって達成した。精製エキソソームを、エレクトロポレーションによって外因性ＲＮＡに付加した。静脈注射されたＲＶＧ−標的エキソソームは、特に脳内のニューロン、小膠細胞、乏突起膠細胞にＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡを送達し、結果として特定の遺伝子ノックダウンが起きた。ＲＶＧエキソソームへの事前曝露は、ノックダウンを弱めず、他の組織への非特異的な取り込みは観察されなかった。エキソソーム媒介ｓｉＲＮＡ送達の治療可能性が、アルツハイマー病の治療標的であるＢＡＣＥ１の強力なｍＲＮＡ（６０％）及びタンパク質（６２％）のノックダウンによって実証された。
【０２２９】
免疫学的に不活性なエキソソームのプールを得るために、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉらは、同種主要組織適合複合体（ＭＨＣ）ハプロタイプの近交系Ｃ５７ＢＬ／６マウスから骨髄を採取した。未成熟樹状細胞は、Ｔ細胞活性化物質、例えば、ＭＨＣ−ＩＩ及びＣＤ８６を含まない大量のエキソソームを産生するため、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉらは、７日間、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を用いて樹状細胞を選択した。翌日、十分に確立された超遠心分離プロトコルを用いて培養上清からエキソソームを精製した。得られたエキソソームは、物理的に均質であり、サイズ分布は、ナノ粒子トラッキング分析（ＮＴＡ）及び電子顕微鏡法によって決定される８０ｎｍの直径でピークであった。Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉらは、１０６細胞当たり６〜１２μｇ（タンパク質濃度に基づいて測定）のエキソソームを得た。
【０２３０】
次に、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉらは、ナノスケールの適用例に適合されたエレクトロポレーションプロトコルを用いて、外因性カーゴが改変エキソソームに導入される可能性を調べた。ナノメートルスケールでの膜粒子のエレクトロポレーションが十分には特徴付けられていないため、非特異的Ｃｙ５標識ＲＮＡを、エレクトロポレーションのプロトコルの経験的な最適化に使用した。封入されるＲＮＡの量を、エキソソームの超遠心分離及び溶解の後に分析した。４００Ｖ及び１２５μＦでのエレクトロポレーションにより、ＲＮＡが最大に保持されたため、後の全ての実験にこれを使用した。
【０２３１】
Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉらは、１５０μｇのＲＶＧエキソソーム中に封入された１５０μｇの各ＢＡＣＥ１  ｓｉＲＮＡを正常なＣ５７ＢＬ／６マウスに投与し、ノックダウン効率を４つの対照：未処置マウス、ＲＶＧエキソソームのみが注射されたマウス、ｉｎ  ｖｉｖｏカチオン性リポソーム試薬と複合体を形成したＢＡＣＥ１  ｓｉＲＮＡが注射されたマウス、及びＲＶＧ−９Ｒ、即ち、ｓｉＲＮＡに静電結合する９Ｄ−アルギニンにコンジュゲートしたＲＶＧペプチドと複合体を形成したＢＡＣＥ１  ｓｉＲＮＡが注射されたマウスと比較した。皮質組織サンプルを、投与の３日後に分析し、ｓｉＲＮＡ−ＲＶＧ−９Ｒ処置マウス及びｓｉＲＮＡＲＶＧエキソソーム処置マウスの両方で有意なタンパク質ノックダウン（４５％、Ｐ＜０．０５、対６２％、Ｐ＜０．０１）が観察され、これは、ＢＡＣＥ１  ｍＲＮＡレベルの有意な低下（それぞれ６６％［＋又は−］１５％、Ｐ＜０．００１及び６１％［＋又は−］１３％、Ｐ＜０．０１）から生じた。さらに、本出願人らは、ＲＶＧ−エキソソーム処置動物において、アルツハイマー病の病理におけるアミロイドプラークの主成分である全［β］−アミロイド１〜４２のレベルの有意な低下（５５％、Ｐ＜０．０５）を実証した。観察された低下は、ＢＣＡＥ１阻害剤の脳室内注射後の正常なマウスで実証されたβ−アミロイド１〜４０の低下よりも大きかった。Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉらは、ＢＣＡＥ１切断産物におけるｃＤＮＡ末端（ＲＡＣＥ）の５’迅速増幅を行い、ｓｉＲＮＡによるＲＮＡｉ媒介ノックダウンのエビデンスを得た。
【０２３２】
最後に、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉらは、ＩＬ−６、ＩＰ−１０、ＴＮＦα、及びＩＦＮ−αの血清濃度を評価することによってＲＮＡ−ＲＶＧエキソソームがｉｎ  ｖｉｖｏで免疫応答を誘導したか否かを調べた。エキソソーム処置の後、全てのサイトカインにおける有意でない変化が、ＩＬ−６の分泌を強力に刺激するｓｉＲＮＡ−ＲＶＧ−９Ｒとは対照的なｓｉＲＮＡトランスフェクション試薬処置と同様に記録され、エキソソーム処置の免疫学的に不活性なプロフィールが確認された。エキソソームがｓｉＲＮＡの２０％しか封入しないとすると、ＲＶＧエキソソームでの送達は、同等のｍＲＮＡのノックダウン及びより大きなタンパク質のノックダウンが、対応するレベルの免疫刺激無しで１／５のｓｉＲＮＡで達成されたため、ＲＶＧ−９Ｒ送達よりも効率的であると思われる。この実験は、ＲＶＧエキソソーム技術の治療の可能性を実証し、この治療は、神経変性疾患に関連した遺伝子の長期間のサイレンシングに適している可能性がある。Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉらのエキソソーム送達系は、本発明のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の治療標的、特に神経変性疾患への送達に適用することができる。本発明では、約１００〜１０００ｍｇのＲＶＧエキソソームに封入される約１００〜１０００ｍｇのＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓの用量が企図され得る。
【０２３３】
Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ７，２１１２−２１２６（２０１２））は、どのようにすれば培養細胞由来のエキソソームをｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでのＲＮＡの送達に利用できるかを開示している。このプロトコルはまず、ペプチドリガンドに融合したエキソソームタンパク質を含む発現ベクターのトランスフェクションによる標的エキソソームの作製を説明する。次に、Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉらは、トランスフェクト細胞の上清からのエキソソームの精製及び特徴付けの方法を説明する。次に、Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉらは、ＲＮＡをエキソソームに導入する重要なステップを詳述する。最後に、Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉらは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでマウスの脳にＲＮＡを効率的に送達するためにエキソソームをどのように使用するかを概説する。エキソソーム媒介ＲＮＡ送達が機能アッセイ及びイメージングによって評価される予想結果の例も示される。全プロトコルには、約３週間かかる。本発明による送達又は投与は、自己由来樹状細胞から産生されるエキソソームを用いて行うことができる。本明細書の教示から、これを本発明の実施に利用することができる。
【０２３４】
別の実施形態では、Ｗａｈｌｇｒｅｎら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１２，Ｖｏｌ．４０，Ｎｏ．１７  ｅ１３０）の血漿エキソソームが企図される。エキソソームは、樹状細胞（ＤＣ）、Ｂ細胞、Ｔ細胞、肥満細胞、上皮細胞、及び腫瘍細胞を含む多くの細胞型で産生されるナノサイズの小胞（３０〜９０ｎｍのサイズ）である。これらの小胞は、後期エンドソームの内向き出芽によって形成され、次いで、血漿膜との融合時に細胞外環境に放出される。エキソソームは、自然に細胞間でＲＮＡを輸送するため、この特性は、遺伝子療法に有用であり得、そしてこの開示を、本発明の実施に利用することができる。
【０２３５】
血漿からのエキソソームは、９００ｇでの２０分間の軟膜の遠心分離によって血漿を分離し、そして細胞上清を回収し、３００ｇでの１０分間の遠心分離によって細胞を除去し、そして１６５００ｇで３０分間遠心分離し、次いで０．２２ｍｍフィルターに通して濾過することによって調製することができる。１２００００ｇでの７０分間の超遠心分離によってエキソソームをペレット化する。ｓｉＲＮＡのエキソソームへの化学的トランスフェクションを、ＲＮＡｉ  Ｈｕｍａｎ／Ｍｏｕｓｅ  Ｓｔａｒｔｅｒ  Ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の製造者の取扱説明書に従って行う。ｓｉＲＮＡを１００ｍｌのＰＢＳに加えて、２ｍｍｏｌ／ｍｌの最終濃度にする。ＨｉＰｅｒＦｅｃｔトランスフェクション試薬の添加後、混合物をＲＴで１０分間インキュベートする。過剰なミセルを除去するために、アルデヒド／流酸塩ラテックスビーズを用いてエキソソームを再分離する。ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓのエキソソームへの化学的なトランスフェクションを、ｓｉＲＮＡと同様に行うことができる。エキソソームは、健康なドナーの末梢血から単離された単球及びリンパ球と共に培養することができる。従って、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓを含むエキソソームを単球及びリンパ球に導入して、ヒトに自己再導入できることが企図され得る。従って、本発明による送達又は投与は、血漿エキソソームを用いて行うことができる。
【０２３６】
リポソーム
本発明による送達又は投与は、リポソームで行うことができる。リポソームは、内部の水性区画を取り囲んでいる単膜又は多重膜の脂質二重層及び比較的不浸透性の外側親油性リン脂質二重層から構成された球形小胞構造である。リポソームは、生体適合性かつ非毒性であり、親水性薬物分子及び親油性薬物分子の両方を送達することができ、そのカーゴを血漿酵素による分解から保護し、その充填物を生体膜を通過させて血液脳関門（ＢＢＢ）に輸送するため、薬物送達担体としてかなりの注目を集めた（例えば、Ｓｐｕｃｈ  ａｎｄ  Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ４６９６７９，１２  ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７（参照用）を参照されたい）。
【０２３７】
リポソームは、いくつかの異なる種類の脂質から形成することができるが；リン脂質が、薬物担体としてリポソームを形成するために最もよく使用される。リポソーム形成は、脂質膜が水溶液と混合されるときに自然に起こるが、ホモジナイザー、超音波処理器、又は押し出し機を用いることによって振蘯の形態で力を加えることによって促進することもできる（例えば、Ｓｐｕｃｈ  ａｎｄ  Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ４６９６７９，１２  ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９（参照用）を参照されたい）。
【０２３８】
リポソームの構造及び特性を変更するために、いくつかの他の添加剤をリポソームに添加することができる。リポソーム構造を安定させて、リポソーム内部のカーゴの漏れを防止するために、例えば、コレステロール又はスフィンゴミエリンのいずれかをリポソーム混合物に添加することができる。さらに、リポソームは、水素化卵ホスファチジルコリン又は卵ホスファチジルコリン、コレステロール、及びジセチルリン酸から調製され、その平均小胞サイズが、約５０〜１００ｎｍに調整された（例えば、Ｓｐｕｃｈ  ａｎｄ  Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ４６９６７９，１２  ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９（参照用）を参照されたい）。
【０２３９】
リポソーム製剤は、主に天然リン脂質及び脂質、例えば、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、スフィンゴミエリン、卵ホスファチジルコリン、及びモノシアロガングリオシドから構成され得る。この製剤は、リン脂質のみから調製されるため、リポソーム製剤は、多数の課題に直面し、その１つが血漿中での不安定性である。これらの課題を克服するためにいくつかの試み、特に脂質膜の処置が行われた。これらの試みの１つは、コレステロールの処置に重点を置いた。従来の製剤へのコレステロールの添加は、封入された生物活性化合物の血漿への急速な放出を低減する、又は１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファエタノールアミン（ＤＯＰＥ）が安定性を高める（例えば、Ｓｐｕｃｈ  ａｎｄ  Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ４６９６７９，１２  ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９（参照用）を参照されたい）。
【０２４０】
特定の有利な実施形態では、トロイの木馬リポソーム（Ｔｒｏｊａｎ  Ｈｏｒｓｅ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ）（分子トロイの木馬としても知られる）が望ましく、プロトコルをｈｔｔｐ：／／ｃｓｈｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．ｃｓｈｌｐ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／２０１０／４／ｐｄｂ．ｐｒｏｔ５４０７．ｌｏｎｇで確認することができる。これらの粒子は、血管注入後に脳全体に導入遺伝子を送達することができる。限定されるものではないが、特定の抗体が表面にコンジュゲートした中性脂質粒子は、エンドサイトーシスにより血液脳関門を通過できると考えられる。本出願人らは、トロイの木馬リポソームを利用して血管注入によってヌクレアーゼのＣＲＩＳＰＲファミリーを脳に送達すると仮定し、これにより、胎児を操作しなくても全脳トランスジェニック動物が可能となる。リポソームでの約１〜５ｇのＤＮＡ又はＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏでの投与が企図され得る。
【０２４１】
別の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系を、リポソーム、例えば、安定核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）で投与することができる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．８，Ａｕｇｕｓｔ  ２００５を参照されたい）。ＳＮＡＬＰ中の標的とされる特定のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓの約１ｍｇ／ｋｇ／日、３ｍｇ／ｋｇ／日、又は５ｍｇ／ｋｇ／日の毎日の静脈注射が企図される。毎日の処置を約３日間行い、次いで週１回の投与を５週間行うことができる。別の実施形態では、約１ｍｇ／ｋｇ又は２．５ｍｇ／ｋｇの用量で静脈注射によって投与されるＳＮＡＬＰに封入された特定のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓも企図される（例えば、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．４４１，４  Ｍａｙ  ２００６を参照されたい）。ＳＮＡＬＰ製剤は、脂質３−Ｎ−［（ｗメトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］−１，２−ジミリスチルオキシ−プロピルアミン（ＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ、Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、及びコレステロールを２：４０：１０：４８のモルパーセント比で含み得る（例えば、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．４４１，４  Ｍａｙ  ２００６を参照されたい）。
【０２４２】
別の実施形態では、安定核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）は、高度に血管新生されたＨｅｐＧ２由来肝腫瘍では効果的な分子の送達が証明されたが、血管新生が不十分なＨＣＴ−１１６由来肝腫瘍では証明されなかった（例えば、Ｌｉ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１２）１９，７７５−７８０を参照されたい）。ＳＮＡＬＰリポソームは、２５：１の脂質／ｓｉＲＮＡ比及びコレステロール／Ｄ−Ｌｉｎ−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／ＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡを４８／４０／１０／２モル比で、Ｄ−Ｌｉｎ−ＤＭＡ及びＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡをジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、及びｓｉＲＮＡと調合することによって調製することができる。得られたＳＮＡＬＰリポソームは、約８０〜１００ｎｍの大きさである。
【０２４３】
なお別の実施形態では、ＳＮＡＬＰは、合成コレステロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ，ＵＳＡ）、３−Ｎ−［（ｗ−メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］−１，２−ジミレスチルオキシプロピルアミン、及びカチオン性１，２−ジリノレオイルオキシ−３−Ｎ，Ｎジメチルアミノプロパンを含み得る（例えば、Ｇｅｉｓｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ２０１０；３７５：１８９６−９０５を参照されたい）。例えば、ボーラス静脈注入として、１投与当たり約２ｍｇ／ｋｇの用量の全ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓが企図され得る。
【０２４４】
なお別の実施形態では、ＳＮＡＬＰは、合成コレステロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ；Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ  Ｉｎｃ．）、ＰＥＧ−ｃＤＭＡ、及び１，２−ジリノレイルオキシ−３−（Ｎ；Ｎ−ジメチル）アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）を含み得る（例えば、Ｊｕｄｇｅ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１９：６６１−６７３（２００９）を参照されたい）。ｉｎ  ｖｉｖｏでの研究に使用される製剤は、約９：１の最終脂質／ＲＮＡ質量比を有し得る。
【０２４５】
ＲＮＡｉナノ薬剤の安全性プロフィールが、Ａｌｎｙｌａｍ  ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのＢａｒｒｏｓ及びＧｏｌｌｏｂによって再検討された（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ６４（２０１２）１７３０−１７３７を参照されたい）。安定核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）は、４つの異なる脂質−ｐＨの低いカチオン性のイオン性脂質（ＤＬｉｎＤＭＡ）、中性ヘルパー脂質、コレステロール、及び拡散性ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質から構成されている。この粒子は、直径が約８０ｎｍであり、生理学的ｐＨで中立電荷である。製剤中、イオン性脂質は、粒子形成中にアニオン性ＲＮＡで脂質を凝縮する役割を果たす。酸性が強まるエンドソーム条件下で正に帯電すると、イオン性脂質はまた、ＳＮＡＬＰとエンドソーム膜との融合を媒介し、ＲＮＡの細胞質への放出が可能となる。ＰＥＧ−脂質は、粒子を安定させ、かつ製剤中の凝集を軽減し、かつ薬物動態学的特性を改善する中性で親水性の外部を後に提供する。
【０２４６】
今日まで、ＲＮＡを含むＳＮＡＬＰ製剤を用いた２つの臨床プログラムが開始されている。Ｔｅｋｍｉｒａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓが、近年、ＬＤＬコレステロールの高い成人ボランティアでＳＮＡＬＰ−ＡｐｏＢの第１相単回投与試験を完了した。ＡｐｏＢは、主に肝臓及び空腸で発現され、ＶＬＤＬ及びＬＤＬの構築及び分泌に必須である。１７人の対象が、ＳＮＡＬＰ−ＡｐｏＢの単回投与を受けた（７つの用量レベルで用量を増加）。（前臨床試験に基づいて潜在的な用量制限毒性と予想された）肝臓毒性は見られなかった。最も高い用量の（２人のうちの）１人の対象が、免疫系の刺激に一致するインフルエンザに似た症状を示し、この試験を結論付ける決定がなされた。
【０２４７】
Ａｌｎｙｌａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓは、同様にＡＬＮ−ＴＴＲ０１を進めた。ＡＬＮ−ＴＴＲ０１は、上記のＳＮＡＬＰ技術を利用し、突然変異型及び野生型ＴＴＲの両方の肝細胞産生を標的としてＴＴＲアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）を処置する。３つのＡＴＴＲ症状が説明されている：家族性アミロイド多発性ニューロパシー（ＦＡＰ）及び家族性アミロイド心筋症（ＦＡＣ）−共にＴＴＲにおける常染色体優性突然変異によって引き起こされる；及び野生型ＴＴＲによって引き起こされる老人性全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）。近年、ＡＬＮ−ＴＴＲ０１のプラセボ対照単回投与用量増加第１相試験がＡＴＲの患者で完了した。ＡＬＮ−ＴＴＲ０１は、０．０１〜１．０ｍｇ／ｋｇ（ｓｉＲＮＡを基準）の用量範囲で、３１人の患者（試験薬物の２３人とプラセボの８人）に１５分の静脈注入として投与された。処置は、肝機能試験で有意な増加が見られず、良好な耐容性を示した。注射関連反応は、０．４ｍｇ／ｋｇ以上で、２３人の患者のうち３人で見られ；全てが、注入速度の低下に応答し、全てで試験を継続した。血清サイトカインＩＬ−６、ＩＰ−１０、及びＩＬ−１ｒａの最小限及び一過性の上昇が、１ｍｇ／ｋｇの最高用量で２人の患者に見られた（これは前臨床及びＮＨＰ試験から予測された）。血清ＴＴＲの低下により、ＡＬＮ−ＴＴＲ０１の予想された薬力学的効果が、１ｍｇ／ｋｇで観察された。
【０２４８】
なお別の実施形態では、ＳＮＡＬＰは、カチオン性脂質、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ−脂質をそれぞれ、例えば、４０：１０：４０：１０のモル比で、例えば、エタノールで可溶化することによって行うことができる（Ｓｅｍｐｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２８  Ｎｕｍｂｅｒ  ２  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２０１０，ｐｐ．１７２−１７７を参照されたい）。この脂質混合物を水性緩衝液（５０ｍＭ  クエン酸塩、ｐＨ４）に添加し、混合して最終エタノール濃度及び脂質濃度をそれぞれ３０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）及び６．１ｍｇ／ｍｌにし、押し出しの前に２２℃で２分間平衡化した。この水和脂質を、動的光散乱分析によって決定される７０〜９０ｎｍの小胞直径が得られるまでＬｉｐｅｘ  Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｌｉｐｉｄｓ）を用いて２２℃で、孔径が８０ｎｍの二層フィルター（Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ）に通して押し出した。これには、一般に、１〜３回の通過が必要である。（３０％エタノールを含む５０ｍＭ  クエン酸塩、ｐＨ４の水溶液に可溶化された）ｓｉＲＮＡを、混合しながら約５ｍｌ／分の速度で、前平衡化した（３５℃）小胞に添加した。０．０６（ｗｔ／ｗｔ）の最終的な目標ｓｉＲＮＡ／脂質比に達したら、混合物を３５℃でさらに３０分間インキュベートして、小胞の再構築及びｓｉＲＮＡの封入を行った。次いで、エタノールを除去し、透析又は接線流透析濾過によって外部緩衝液をＰＢＳ（１５５ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．５）で置換した。ｓｉＲＮＡを、制御された段階希釈法のプロセスを用いてＳＮＡＬＰ中に封入した。ＫＣ２−ＳＮＡＬＰの脂質成分は、５７．１：７．１：３４．３：１．４のモル比で使用されるＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ（カチオン性脂質）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ；Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）、合成コレステロール（Ｓｉｇｍａ）、及びＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡであった。封入粒子が形成されたら、使用の前にＳＮＡＬＰをＰＢＳで透析し、０．２μｍフィルターに通して滅菌した。平均粒子サイズは、７５〜８５ｎｍであり、ｓｉＲＮＡの９０〜９５％が、脂質粒子内に封入された。ｉｎ  ｖｉｖｏ試験に使用される製剤中の最終的なｓｉＲＮＡ／脂質比は、約０．１５（ｗｔ／ｗｔ）であった。第ＶＩＩ因子ｓｉＲＮＡを含むＬＮＰ−ｓｉＲＮＡ系を、使用の直前に滅菌ＰＢＳで適切な濃度に希釈し、この製剤を、１０ｍｌ／ｋｇの総量で外側尾静脈に静脈内投与した。この方法及びこれらの送達系を、本発明のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系に対して外挿することができる。
【０２４９】
他の脂質
他のカチオン性脂質、例えば、アミノ脂質２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）は、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ又はその構成成分又は、例えば、ｓｉＲＮＡに類似したこれをコードする核酸分子（例えば、Ｊａｙａｒａｍａｎ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１２，５１，８５２９  −８５３３を参照されたい）を封入するために利用することができ、従って、本発明の実施に利用することができる。次の脂質組成物を含む予備成形小胞が企図され得る：それぞれ４０／１０／４０／１０のモル比のアミノ脂質、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、及び（Ｒ）−２，３ビス（オクタデシルオキシ）プロピル−１−（メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）プロピルカルバメート（ＰＥＧ−脂質）、並びに約０．０５（ｗ／ｗ）のＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡ／全脂質比。７０〜９０ｎｍの狭い範囲の粒子サイズ分布及び０．１１±０．０４（ｎ＝５６）の低い多分散指数にするために、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ  ＲＮＡを添加する前に８０ｎｍの膜で粒子を最大３回押し出すことができる。極めて強力なアミノ脂質１６を含む粒子を、４つの脂質成分１６、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ−脂質を（５０／１０／３８．５／１．５）のモル比で使用することができ、このモル比は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの活性を促進するためにさらに最適化することができる。
【０２５０】
Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｓ  Ｄ  Ｋｏｒｍａｎｎら（“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｆｔｅｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｍＲＮＡ  ｉｎ  ｍｉｃｅ：Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ：２９，Ｐａｇｅｓ：１５４−１５７（２０１１））は、脂質エンベロープを使用したＲＮＡの送達を説明している。脂質エンベロープの使用は、本発明でも好ましい。
【０２５１】
別の実施形態では、脂質を本発明のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系で製剤化して脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を形成することができる。脂質は、限定されるものではないが、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ４、Ｃ１２−２００、及び共脂質ジステロイルホスファチジルコリン、コレステロールを含み、ＰＥＧ−ＤＭＧを、自然小胞形成手順を用いてｓｉＲＮＡの代わりにＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系で製剤化することができる（例えば、Ｎｏｖｏｂｒａｎｔｓｅｖａ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ（２０１２）１，ｅ４；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１１．３を参照されたい）。成分モル比は、約５０／１０／３８．５／１．５（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ又はＣ１２−２００／ジステロイルホスファチジルコリン／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ）であり得る。最終的な脂質：ｓｉＲＮＡの重量比は、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ及びＣ１２−２００脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の場合にそれぞれ、約１２：１及び９：１とすることができる。製剤は、９０％を超える封入効率で、約８０ｎｍの平均粒子直径を有し得る。３ｍｇ／ｋｇの用量が企図され得る。
【０２５２】
Ｔｅｋｍｉｒａは、全てが本発明に使用することができ、かつ／又は適合させることができる、ＬＮＰ及びＬＮＰ製剤の様々な態様に関連する、米国及び海外の約９５の対応特許のポートフォリオ（例えば、米国特許第７，９８２，０２７号明細書、同第７，７９９，５６５号明細書、同第８，０５８，０６９号明細書、同第８，２８３，３３３号明細書、同第７，９０１，７０８号明細書、同第７，７４５，６５１号明細書、同第７，８０３，３９７号明細書、同第８，１０１，７４１号明細書、同第８，１８８，２６３号明細書、同第７，９１５，３９９号明細書、同第８，２３６，９４３号明細書、及び同第７，８３８，６５８号明細書、並びに欧州特許第１７６６０３５号明細書、同第１５１９７１４号明細書、同第１７８１５９３号明細書、及び同第１６６４３１６号明細書を参照されたい）を有する。
【０２５３】
ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系又はその構成成分、又はこれらをコードする核酸分子を、ＰＬＧＡマイクロスフェア中に封入して送達することができ、このＰＬＧＡマイクロスフェアは、例えば、タンパク質、タンパク質前駆体、又は部分的若しくは完全にプロセシングされた形態のタンパク質若しくはタンパク質前駆体をコードし得る改変核酸分子を含む組成物の製剤の態様に関する米国特許出願公開第２０１３０２５２２８１号明細書、同第２０１３０２４５１０７号明細書、及び同第２０１３０２４４２７９号明細書（Ｍｏｄｅｒｎａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓに譲渡）で詳述されているＰＬＧＡマイクロスフェアである。この製剤は、５０：１０：３８．５：１．５〜３．０（カチオン性脂質：融合脂質：コレステロール：ＰＥＧ脂質）のモル比を有し得る。ＰＥＧ脂質は、限定されるものではないが、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ、ＰＥＧ−ＤＭＧから選択され得る。融合脂質は、ＤＳＰＣであり得る。また、Ｓｃｈｒｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ、米国特許出願公開第２０１２０２５１６１８号明細書を参照されたい。
【０２５４】
Ｎａｎｏｍｅｒｉｃｓの技術は、低分子量の疎水性薬物、ペプチド、及び核酸ベースの治療（プラスミド、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）を含む広範囲の治療におけるバイオアベイラビリティの課題に取り組んでいる。この技術が明確な利点を実証した特定の投与経路として、経口経路、血液脳関門を通る輸送、固形腫瘍への送達、及び眼が挙げられる。例えば、Ｍａｚｚａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，ＡＣＳ  Ｎａｎｏ．２０１３  Ｆｅｂ  ２６；７（２）：１０１６−２６；Ｕｃｈｅｇｂｕ  ａｎｄ  Ｓｉｅｗ，２０１３，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．１０２（２）：３０５−１０、及びＬａｌａｔｓａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ．２０１２  Ｊｕｌ  ２０；１６１（２）：５２３−３６を参照されたい。
【０２５５】
米国特許出願公開第２００５００１９９２３号明細書に、生物活性分子、例えば、ポリヌクレオチド分子、ペプチド及びポリペプチド、及び／又は医薬品を哺乳動物の体に送達するためのカチオン性デンドリマーが記載されている。デンドリマーは、例えば、肝臓、脾臓、肺、腎臓、又は心臓（さらには脳）への生物活性分子の送達を目的とするのに適している。デンドリマーは、単一の分岐単量体単位から段階的に合成された合成３次元巨大分子であり、その性質及び機能性は、容易に制御でき、かつ変更することができる。デンドリマーは、多機能コアに対して（合成への発散型アプローチ）、又は多機能コアに向けて（合成への収束型アプローチ）ビルディングブロックを反復付加することにより合成され、ビルディングブロックが３次元シェルに付加される度に、高位世代のデンドリマーが形成される。ポリプロピレンイミンデンドリマーは、ジアミノブタンコアから出発し、１級アミンへのアクリロニトリルのダブルマイケル付加により、このジアミノブタンに２倍量のアミノ基が付加され、次に、ニトリルの水素化が行われる。この結果、アミノ基が２倍になる。ポリプロピレンイミンデンドリマーは、１００％プロトン化可能な窒素及び最大６４の末端アミノ基（世代５、ＤＡＢ６４）を含む。プロトン化可能な基は、通常、中性ｐＨでプロトンを受容できるアミノ基である。デンドリマーの遺伝子送達剤としての使用は、接合単位としてアミン／アミドの混合物又はＮ−Ｐ（Ｏ２）Ｓと共にそれぞれ、ポリアミドアミン及びリン含有化合物を使用することに概ね集中しているが、低位世代のポリプロピレンイミンデンドリマーの遺伝子送達としての使用は報告されていない。ポリプロピレンイミンデンドリマーはまた、薬剤送達用のｐＨ感受性制御放出システムとして、及び抹消アミノ酸基によって化学的に修飾されたゲスト分子の封入用のｐＨ感受性制御放出システムとして研究されている。細胞毒性及びＤＮＡとポリプロピレンイミンデンドリマーとの相互作用、並びにＤＡＢ６４のトランスフェクション効力も研究されている。
【０２５６】
米国特許出願公開第２００５００１９９２３号明細書は、以前の報告に反して、カチオン性デンドリマー、例えば、ポリプロピレンイミンデンドリマーは、生物活性分子、例えば、遺伝物質の標的への送達に使用されると、適切な特性、例えば、特定の標的化及び低い毒性を示すという知見に基づいている。加えて、カチオン性デンドリマーの誘導体も、生物活性分子の標的への送達にとって適切な特性を示す。また、カチオン性ポリアミンポリマー及びデンドリマーポリマーを含む様々なポリマーを開示する米国特許出願公開第２００８０２６７９０３号明細書の生物活性ポリマーを参照されたい。この生物活性ポリマーは、抗増殖活性を有することが示され、従って、不所望の細胞増殖によって特徴付けられる障害、例えば、新生物及び腫瘍、炎症障害（自己免疫障害を含む）、乾癬、及びアテローム性動脈硬化の処置に有用であり得る。これらのポリマーは、活性剤として単独で、又は他の治療薬、例えば、遺伝子療法用の薬物分子又は核酸の送達ビヒクルとして使用することができる。このような場合、ポリマー自体の固有の抗腫瘍活性は、送達されるべき作用物質の活性を補完し得る。これらの特許公報の開示は、本明細書の教示と共に、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系又はその構成成分、又はこれらをコードする核酸分子の送達に利用することができる。
【０２５７】
超荷電タンパク質（ｓｕｐｅｒｃｈａｒｇｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）
超荷電タンパク質は、異常に高い正又は負の正味理論電荷を有するエンジニアリングされた又は天然のタンパク質のクラスであり、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系又はその構成成分、又はこれらをコードする核酸分子の送達に利用することができる。正又は負に過剰に荷電されたタンパク質はいずれも、熱的又は化学的に誘導された凝集に耐える優れた能力を示す。正に過剰に荷電されたタンパク質はまた、哺乳動物細胞に進入することができる。これらのタンパク質に結合するカーゴ、例えば、プラスミド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は他のタンパク質は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの両方でのこれらの巨大分子の哺乳動物細胞への機能的な送達を可能にし得る。Ｄａｖｉｄ  Ｌｉｕの研究室が、超荷電タンパク質の作製及び特徴付けを２００７年に報告した（Ｌａｗｒｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １２９，１０１１０−１０１１２）。
【０２５８】
ＲＮＡ及びプラスミドＤＮＡの哺乳動物細胞への非ウイルス送達は、研究への応用及び治療への応用の双方に価値がある（Ａｋｉｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２６，５６１−５６９）。精製＋３６ＧＦＰタンパク質（又は他の正に過剰に荷電されたタンパク質）を適切な無血清培地でＲＮＡと混合し、細胞の添加の前に複合体が形成されるようにする。この段階で血清を含むと、超荷電タンパク質−ＲＮＡ複合体の形成が阻害され、処置の有効性が低下する。以下のプロトコルは、様々な細胞株に有効であることが分かった（ＭｃＮａｕｇｈｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０６，６１１１−６１１６）。しかしながら、タンパク質及びＲＮＡの用量を変更するパイロット実験を行って特定の細胞株の手順を最適化するべきである。
（１）処置の前日に、４８ウェルプレートの各ウェルに１×１０５の細胞をプレーティングする。
（２）処置の当日に、精製＋３６ＧＦＰタンパク質を無血清培地で希釈して、２００ｎＭの最終濃度にする。ＲＮＡを５０ｎＭの最終濃度まで添加する。ボルテックスして混合し、室温で１０分間インキュベートする。
（３）インキュベーション中に、細胞から培地を吸引し、ＰＢＳで１回洗浄する。
（４）＋３６ＧＦＰ及びＲＮＡのインキュベーション後、タンパク質−ＲＮＡ複合体を細胞に添加する。
（５）細胞を複合体と共に３７℃で４時間インキュベートする。
（６）インキュベーション後、培地を吸引し、２０Ｕ／ｍＬ  ヘパリンＰＢＳで３回洗浄する。細胞を血清含有培地でさらに４８時間、活性のアッセイによってはそれ以上の時間インキュベートする。
（７）免疫ブロット法、ｑＰＣＲ、表現型アッセイ、又は他の適切な方法によって細胞を分析する。
【０２５９】
Ｄａｖｉｄ  Ｌｉｕの研究室は、＋３６ＧＦＰが、様々な細胞における有効なプラスミド送達試薬であることをさらに見出した。プラスミドＤＮＡは、ｓｉＲＮＡよりも大きいカーゴであるため、効果的にプラスミドを複合体化するためには比例して多い＋３６ＧＦＰタンパク質が必要である。効果的なプラスミド送達のために、本出願人らは、インフルエンザウイルス赤血球凝集素タンパク質に由来の既知のエンドソーム破壊ペプチドであるＣ末端ＨＡ２ペプチドタグを有する＋３６ＧＦＰタンパク質の変異体を開発した。以下のプロトコルは、様々な細胞に有効であるが、上記のようにプラスミドＤＮＡ及び超荷電タンパク質の用量を、特定の細胞株及び送達の適用例に最適化することが推奨される。
（１）処置の前日に、４８ウェルプレートの各ウェルに１×１０５の細胞をプレーティングする。
（２）処置の当日に、精製ｐ３６ＧＦＰタンパク質を無血清培地で希釈して、２ｍＭの最終濃度にする。１ｍｇのプラスミドＤＮＡを添加する。ボルテックスして混合し、室温で１０分間インキュベートする。
（３）インキュベーション中に、細胞から培地を吸引し、ＰＢＳで１回洗浄する。
（４）ｐ３６ＧＦＰタンパク質及びプラスミドＤＮＡのインキュベーション後、タンパク質−ＤＮＡ複合体を細胞に静かに添加する。
（５）細胞を複合体と共に３７℃で４時間インキュベートする。
（６）インキュベーション後、培地を吸引し、ＰＢＳで洗浄する。細胞を血清含有培地でインキュベートし、さらに２４〜４８時間インキュベートする。
（７）適宜、プラスミド送達を（例えば、プラスミド駆動遺伝子発現によって）分析する。
【０２６０】
また、例えば、ＭｃＮａｕｇｈｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０６，６１１１−６１１６（２００９）；Ｃｒｏｎｉｃａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５，７４７−７５２（２０１０）；Ｃｒｏｎｉｃａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １８，８３３−８３８（２０１１）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ５０３，２９３−３１９（２０１２）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｄ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９（７），８３１−８４３（２０１２）を参照されたい。超荷電タンパク質の方法は、本発明のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系の送達に使用することができ、かつ／又は適合させることができる。Ｄｒ．Ｌｕｉのこれらの系及び本明細書の文献は、本明細書の教示と共に、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系又はその構成成分、又はこれらをコードする核酸分子の送達に利用することができる。
【０２６１】
植え込み型装置
別の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系又はその構成成分、又はこれらをコードする核酸分子の送達用の植え込み型装置も企図される。例えば、米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書に、薬物を局所的に長期間に亘って溶出する植え込み型医療装置が開示され、この開示には、いくつかのタイプのこのような装置、実施の処置モード、及び植え込みの方法が含まれる。この装置は、その本体として使用される、例えば、マトリックスなどのポリマー物質、及び薬物、場合によっては追加の足場材料、例えば、金属又は追加のポリマー、及び視認性及びイメージングを促進する材料から構成される。植え込み型送達装置は、局所的に長期間に亘って放出させるのに有利であり得、薬物が、罹患部、例えば、腫瘍、炎症、変性の細胞外基質（ＥＣＭ）に、又は症状の緩和のために、又は障害した平滑筋細胞に、又は予防のために直接放出される。１種類の薬物は、上で開示されたＲＮＡであり、この系は、本発明のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系に使用することができ、かつ／又は適合させることができる。一部の実施形態における植え込みのモードは、最近開発されて使用されている、近接照射療法及び針生検を含む他の処置用の既存の植え込み手順である。このような場合、本発明で説明される新たなインプラントの寸法は、元のインプラントと同様である。典型的には、数個の装置が、同じ処置手順中に植え込まれる。
【０２６２】
米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書で説明されているように、空洞部、例えば、腹腔に適用可能なシステムを含む薬物送達植え込み型又は挿入型のシステム、及び／又は、例えば、任意にマトリックスであり得る生体安定性かつ／又は分解性かつ／又は生体吸収性ポリマー基質を含む、薬物送達系が固定又は付着されないその他のタイプの投与が提供される。「挿入」という語は、植え込みも含むことに留意されたい。薬物送達系は、好ましくは、米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書で説明されている「Ｌｏｄｅｒ」として実施される。
【０２６３】
１つのポリマー又は複数のポリマーは、生体適合性であり、１つの作用物質及び／又は複数の作用物質を含み、制御された速度での作用物質の放出を可能にし、一部の実施形態では、例えば、マトリックスなどのポリマー基質の総量は、任意に、かつ好ましくは、作用物質の治療レベルに達するのを可能にする最大量以下である。非限定的な一例として、このような量は、好ましくは、導入される作用物質の量に応じて０．１ｍ３〜１０００ｍｍ３の範囲内である。Ｌｏｄｅｒは、例えば、機能性、例えば、限定されるものではないが膝関節及び子宮内又は子宮頸リングなどによってサイズが決まる装置に組み込まれる場合は、任意に大きめにすることができる。
【０２６４】
（組成物送達用の）薬物送達系は、一部の実施形態では、好ましくは分解性ポリマーを利用するように設計され、主な放出機構はバルク浸食である；又は一部の実施形態では、非分解性又は徐々に分解されるポリマーが使用され、主な放出機構は、バルク浸食ではなく拡散であり、このため外部が膜として機能し、その内部は、長期間（例えば、約１週間〜約数か月）に亘って周囲による影響を実際に受けない薬物貯蔵部として機能する。異なる放出機構の異なるポリマーの組み合わせも、任意に使用することができる。表面における濃度勾配は、好ましくは、全薬物放出期間のかなりの期間の間、事実上一定に維持され、従って、拡散速度は事実上一定である（「０モード」拡散と呼ばれる）。「一定」という語は、好ましくは、治療効果の下側閾値よりも上に維持される拡散速度を意味するが、なお任意に初期バーストの特徴を有し得、かつ／又は、例えば、一定程度の増減で変動し得る。拡散速度は、好ましくは、長期間に亘ってこのように維持され、治療有効期間、例えば、有効サイレンシング期間を最適化するためにあるレベルまで一定であると見なすことができる。
【０２６５】
薬物送達系は、任意に、かつ好ましくは、化学的性質又は対象の体内の酵素及び他の因子からの攻撃によるものであっても、ヌクレオチドベースの治療薬を分解から保護するように設計される。
【０２６６】
米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書で説明されている薬物送達系は、任意に検出器具及び／又は活性化器具に関連し、このような器具は、例えば、任意に、限定されるものではないが、熱による加熱及び冷却、レーザービーム、並びに集束超音波及び／又はＲＦ（無線周波数）法又は装置を含む超音波を含め、活性化及び／又は加速／減速の非侵襲的及び／又は低侵襲性の方法によって、装置の植え込み時及び／又は植え込み後に作動される。
【０２６７】
米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書の一部の実施形態によると、局所送達の部位は、腫瘍を含む細胞の異常に高い増殖及びアポトーシスの抑制、自己免疫疾患状態を含む活動性及び／又は慢性炎症及び感染症、筋肉組織及び神経組織を含む組織の変性、慢性痛、変性部位、及び組織の再生が促進される骨折部位及び他の創傷部位、及び傷害した心筋、平滑筋、及び横紋筋によって特徴付けられる標的部位を任意に含み得る。
【０２６８】
組成物の植え込み部位、又は標的部位は、好ましくは、標的局所送達にとって十分に小さい半径、面積、及び／又は体積を有することを特徴とする。例えば、標的部位は、任意に、約０．１ｍｍ〜約５ｃｍの範囲の直径を有する。
【０２６９】
標的部位の位置は、好ましくは、最大治療効果が得られるように選択される。例えば、薬物送達系の組成物は（任意に、上記の植え込み用の装置と共に）、任意に、かつ好ましくは、腫瘍環境又はこの腫瘍環境に関連した血液供給部の内部又はその近傍に植え込まれる。
【０２７０】
例えば、組成物は（任意に、装置と共に）、任意に、血管系などの中でニップルを介して膵臓、前立腺、乳房、肝臓の中又はその近傍に植え込まれる。
【０２７１】
標的位置は：１．大脳基底核、白質、及び灰白質におけるパーキンソン病又はアルツハイマー病のような変性部位の脳；２．筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の場合の脊椎；３．ＨＰＶ感染を防ぐための子宮頸部；４．活動性及び慢性炎症関節；５．乾癬の場合の真皮；６．鎮痛効果用の交感神経及び感覚神経部位；７．骨移植内；８．急性及び慢性感染部位；９．膣内；１０．内耳−聴覚系、内耳迷路、前庭系；１１．気管内；１２．心臓内；冠状動脈、心外膜；１３．膀胱；１４．胆管系；１５．限定されるものではないが腎臓、肝臓、脾臓を含む実質組織；１６．リンパ節；１７．唾液腺；１８．歯肉；１９．関節内（関節の中）；２０．眼内；２１．脳組織；２２．脳室；２３．腹腔を含む空洞部（例えば、限定されるものではないが、卵巣癌の場合）；２４．食道内、及び２５．直腸内（単に非限定的な例として、任意に、体内のあらゆる部位がＬｏｄｅｒの植え込みに適し得る）からなる群から任意に選択される。
【０２７２】
任意に、システム（例えば、組成物を含む装置）の挿入は、標的部のＥＣＭ及びその部位の近傍に材料を注入して、標的部位及びこのような部位の近傍の局所ｐＨ及び／又は温度及び／又はＥＣＭ中での薬物の拡散及び／又は薬物動態に作用する他の生物学的因子に影響を与えることに関連する。
【０２７３】
任意に、一部の実施形態によると、前記作用物質の放出は、検出器具及び／又は活性化器具に関連し得、このような器具は、レーザービーム、照射、熱による加熱及び冷却、並びに集束超音波及び／又はＲＦ（無線周波数）法又は装置を含む超音波、及び化学活性剤を含む、活性化及び／又は加速／減速の非侵襲的及び／又は低侵襲性及び／又は他の方法によって、挿入前及び／又は挿入時及び／又は挿入後に作動される。
【０２７４】
米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書の他の実施形態によると、薬物は、好ましくは、例えば、後述するように、乳房、膵臓、脳、腎臓、膀胱、肺、及び前立腺における限局性癌の場合にはＲＮＡを含む。ＲＮＡｉで例示されるが、多くの薬物が、Ｌｏｄｅｒへの封入に適用可能であり、かつこのような薬物がＬｏｄｅｒ基質、例えば、マトリックスなどで封入できるのであれば、本発明に関連して使用することができ、この系を、本発明のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系の送達に使用することができ、かつ／又は適合させることができる。
【０２７５】
特定の適用例の別の例として、神経及び筋肉の変性疾患が、異常な遺伝子発現によって発症する。ＲＮＡの局所送達は、このような異常な遺伝子発現を妨げる治療特性を有し得る。小さい薬物及び巨大分子を含む抗アポトーシス薬、抗炎症薬、及び抗変性薬の局所送達もまた、任意に、治療用とすることができる。このような場合、Ｌｏｄｅｒは、一定速度での、かつ／又は別個に植え込まれる専用装置による長期間の放出に適用される。この全てを、本発明のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系に使用することができ、かつ／又は適合させることができる。
【０２７６】
特定の適用例のなお別の例として、精神疾患及び認知障害が、遺伝子改変剤（ｇｅｎｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ）で処置される。遺伝子ノックダウンが、処置の選択肢である。作用物質を中枢神経部位に局所的に送達するＬｏｄｅｒは、限定されるものではないが、精神病、双極性疾患、神経症性障害、及び行動疾患を含む精神疾患及び認知障害の治療の選択肢である。Ｌｏｄｅｒはまた、特定の脳の部位に植え込まれると、小さい薬物及び巨大分子を含む薬物を局所的に送達することができる。この全てを、本発明のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系に使用することができ、かつ／又は適合させることができる。
【０２７７】
特定の適用例の別の例として、局所部位における先天性及び／又は適応免疫メディエーターのサイレンシングにより、臓器移植拒絶反応を防止することができる。移植された臓器及び／又は植え込まれた部位に植え込まれたＬｏｄｅｒでのＲＮＡ及び免疫調節剤の局所送達により、移植された臓器に対して活性化される免疫細胞、例えば、ＣＤ８の撃退による局所免疫抑制が可能となる。この全てを、本発明のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系に使用することができ、かつ／又は適合させることができる。
【０２７８】
特定の適用例の別の例として、ＶＥＧＦ及びアンジオジェニンを含む血管成長因子などが、新血管形成に必須である。因子、ペプチド、ペプチド模倣薬の局所送達、又はこれらのリプレッサーの抑制は、重要な治療様式であり；リプレッサーのサイレンシング、及びＬｏｄｅｒでの血管形成を刺激する因子、ペプチド、巨大分子、及び小さい薬物の局所送達は、末梢血管疾患、全身血管疾患、及び心血管疾患に治療効果がある。
【０２７９】
挿入、例えば、植え込みの方法は、このような方法において任意の変更なしで、又は別法として任意の僅かな変更のみで、任意に、他のタイプの組織の植え込み及び／又は挿入及び／又は組織のサンプリングに既に使用しても良い。このような方法は、任意に、限定されるものではないが、小線源療法、生検、超音波を用いる及び／又は用いない内視鏡検査、例えば、ＥＲＣＰ、脳組織に入れる定位法、腹腔鏡を関節、腹部臓器、膀胱壁、及び体腔に入れる植え込みを含む腹腔鏡検査を含む。
【０２８０】
患者特異的スクリーニング法
ヌクレオチド、例えば、トリヌクレオチド反復を標的とするＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ系を使用して、このような反復の存在について患者又は患者のサンプルをスクリーニングすることができる。この反復は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のＲＮＡの標的であり得、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系によるこの反復への結合が存在すると、この結合を検出することができ、これによりこのような反復が存在することが示される。従って、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を使用して、反復の存在について患者又は患者のサンプルをスクリーニングすることができる。次いで、患者に、症状に対処するために適切な化合物を投与することができる；又は、結合して挿入、欠失、又は突然変異を引き起こして症状を緩和するためにＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を投与することができる。
【０２８１】
核酸、アミノ酸、及びタンパク質、調節配列、ベクターなど
核酸、アミノ酸、及びタンパク質：本発明は、標的ＤＮＡ配列に結合する核酸を使用する。これは、核酸がタンパク質よりも作製するのが遥かに容易で安価であるため有利であり、特異性は、相同性が求められる伸長の長さによって異なり得る。例えば、複数のフィンガーの複雑な３Ｄ位置決めを行う必要がない。「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、及び「オリゴヌクレオチド」という語は、互換的に使用される。これらの語は、任意の長さのデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、又はその類似体のポリマー形態のヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドは、任意の３次元構造を有し得、かつ既知又は未知の任意の機能を果たし得る。次に示すのは、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子又は遺伝子断片のコード領域又は非コード領域、連鎖解析によって決定される複数の遺伝子座（１つの遺伝子座）、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマー。この語はまた、合成主鎖を有する核酸様構造も包含する。例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，１９９１；Ｂａｓｅｒｇａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｍｉｌｌｉｇａｎ，１９９３；国際公開第９７／０３２１１号パンフレット；同第９６／３９１５４号パンフレット；Ｍａｔａ，１９９７；Ｓｔｒａｕｓｓ−Ｓｏｕｋｕｐ，１９９７；及びＳａｍｓｔａｇ，１９９６を参照されたい。ポリヌクレオチドは、１つ以上の修飾ヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体を含み得る。存在する場合は、ヌクレオチド構造の修飾は、ポリマーの構築の前又は後で行うことができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成成分で中断することができる。ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドの重合の後に、例えば、標識構成成分との接合によりさらに修飾することができる。本明細書で使用される「野生型」という語は、当業者によって理解される語であり、突然変異型又は変異型とは区別される、天然に存在する典型的な形態の生物、菌株、遺伝子、又は特徴を意味する。「野生型」はベースラインであり得る。本明細書で使用される「変異体」という語は、天然に存在するものから逸脱したパターンを有する質の提示を意味すると解釈するべきである。「天然に存在しない」又は「エンジニアリングされた」という語は、互換的に使用され、人間の手が加えられていることを示す。この語は、核酸分子又はポリペプチドについてである場合、核酸分子又はポリペプチドが、自然では自然に結合し、かつ自然で見られる少なくとも１つの他の構成成分から少なくとも実質的に解放されていることを意味する。「相補性」とは、従来のワトソン−クリック塩基対形成又は他の非従来型によって核酸が別の核酸配列と水素結合を形成する能力のことである。パーセント相補性は、第２の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン−クリック塩基対形成）を��成することができる核酸分子中の残基のパーセンテージを示す（例えば、１０のうちの５、６、７、８、９、１０がそれぞれ、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％の相補性）。「完全に相補的」とは、核酸配列の全ての連続する残基が、第２の核酸配列の同じ数の連続する残基と水素結合することを意味する。本明細書で使用される「実質的に相補的」という語は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、またはそれ以上のヌクレオチドの領域に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である相補性の程度を指す、又はストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２つの核酸を指す。本明細書で使用される、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェントな条件」とは、標的配列に対して相補性を有する核酸が標的配列に優先的にハイブリダイズし、かつ非標的配列とは実質的にハイブリダイズしない条件のことである。ストリンジェントな条件は、一般に、配列依存性であり、因子の数によって異なる。一般に、配列が長ければ長いほど、配列がその標的配列に特異的にハイブリダイズする温度が高くなる。ストリンジェントな条件の非限定的な例が、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３），Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｃｈａｐｔｅｒ“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．に詳述されている。ポリヌクレオチド配列について述べられる場合、相補的な配列又は部分的に相補的な配列も想定される。これらは、好ましくは、高ストリンジェントな条件下で基準配列とハイブリダイズすることができる。一般に、ハイブリダイゼーション率を最大化するために、比較的低いストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が選択される：熱融点（Ｔｍ）よりも低い約２０〜２５℃。このＴｍは、特定の標的配列の５０％が、規定イオン強度及びｐＨで、溶液中で完全に相補的なプローブにハイブリダイズする温度である。一般に、ハイブリダイズした配列の少なくとも約８５％のヌクレオチド相補性を必要とするため、高ストリンジェントな洗浄条件が、Ｔｍよりも低い約５〜１５℃であるように選択される。ハイブリダイズした配列の少なくとも約７０％のヌクレオチド相補性を必要とするため、中ストリンジェントな洗浄条件が、Ｔｍよりも低い約１５〜３０℃であるように選択される。高い許容の（非常に低いストリンジェントな）洗浄条件は、Ｔｍよりも低い５０℃であり得、ハイブリダイズした配列間の高レベルのミスマッチが許容される。当業者であれば、ハイブリダイゼーション段階及び洗浄段階における他の物理的及び化学的なパラメーターも、標的配列とプローブ配列との間の特定のレベルの相同性からの検出可能なハイブリダイゼーションシグナルの結果に影響を与えるように変更できることが分かるであろう。好ましい高ストリンジェントな条件は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、及び１％  ＳＤＳ中、４２℃でのインキュベーション、又は５×ＳＳＣ及び１％  ＳＤＳ中、６５℃でのインキュベーションと、０．２×ＳＳＣ及び０．１％  ＳＤＳでの６５℃の洗浄を含む。「ハイブリダイゼーション」とは、１つ以上のポリヌクレオチドが、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合により安定した複合体を形成する反応のことである。水素結合は、ワトソン−クリック塩基対形成、Ｈｏｏｇｓｔｅｉｎ結合、又はその他の配列特異的な方法によって起こり得る。この複合体は、二重鎖構造を形成する２つの鎖、多数鎖複合体を形成する３つ以上の鎖、単一の自己ハイブリダイズ鎖、又はこれらの任意の組合せを含み得る。ハイブリダイゼーション反応は、より広範囲のプロセス、例えば、ＰＣＲの開始、又は酵素によるポリヌクレオチドの切断における１つのステップを構成し得る。所与の配列にハイブリダイズし得る配列は、所与の配列の「相補体」と呼ばれる。本明細書で使用される「ゲノム遺伝子座」又は「遺伝子座」（複数形も含む）という語は、染色体上の遺伝子又はＤＮＡ配列の特定の位置である。「遺伝子」は、ポリペプチドをコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡの伸長、又は生物において機能的役割を果たし、従って生体における分子単位の遺伝であるＲＮＡ鎖のことである。本発明の目的のために、遺伝子は、遺伝子産物の産生を調節する領域がコード配列及び／又は転写配列に隣接しているか否かにかかわらず、このような調節配列を含むと見なすことができる。従って、遺伝子は、必ずしも限定されるものではないが、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列、例えば、リボソーム結合部位及び内部リボソーム進入部位、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス付着部位、及び遺伝子座調節領域を含む。本明細書で使用される「ゲノム遺伝子座の発現」又は「遺伝子発現」は、遺伝子からの情報が機能的遺伝子産物の合成に使用されるプロセスである。遺伝子発現の産物は、多くの場合タンパク質であるが、非タンパク質コード遺伝子、例えば、ｒＲＮＡ遺伝子又はｔＲＮＡ遺伝子の場合は、産物は機能的ＲＮＡである。遺伝子発現のプロセスは、全ての既知の生命−真核生物（多細胞生物を含む）、原核生物（細菌及び古細菌）、及び生存する機能的産物を産生するウイルスによって使用される。本明細書で使用される遺伝子又は核酸の「発現」は、細胞での遺伝子発現だけではなく、クローニング系及びその他の関連における核酸の転写及び翻訳も包含する。本明細書で使用される「発現」はまた、ポリヌクレオチドがＤＮＡ鋳型から（例えば、ｍＲＮＡ又は他のＲＮＡ転写物に）転写されるプロセス、及び／又は転写されたｍＲＮＡが続いてペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質に翻訳されるプロセスである。転写物及びコードされたポリペプチドは、まとめて「遺伝子産物」と呼ぶことができる。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞でのｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために本明細書では互換的に使用される。ポリマーは、線状又は分岐であり得、修飾アミノ酸を含み得、かつ非アミノ酸によって中断され得る。この語はまた、修飾；例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又はその他の処置、例えば、標識成分との接合がなされたアミノ酸ポリマーも包含する。本明細書で使用される「アミノ酸」という語は、グリシン及びＤ又はＬ光学異性体の両方、アミノ酸類似体、及びペプチド模倣体を含む、天然及び／又は天然に存在しない若しくは合成アミノ酸を含む。本明細書で使用される「ドメイン」又は「タンパク質ドメイン」という語は、タンパク質鎖の残りの部分とは独立に存在して機能し得るタンパク質配列の部分を指す。本発明の態様で説明されるように、配列同一性は、配列相同性に関連する。相同性の比較は、肉眼で、より一般的には容易に入手できる配列比較プログラムの支援で行うことができる。これらの市販のコンピュータープログラムは、２つ以上の配列間のパーセント（％）相同性を計算することができ、かつ２つ以上のアミノ酸配列又は核酸配列によって共有される配列同一性を計算することもできる。一部の好ましい実施形態では、本明細書に記載されるｄＴＡＬＥのキャッピング領域は、本明細書で提供されるキャッピング領域アミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性又は共有同一性である配列を有する。配列相同性は、当該技術分野で公知の多数のコンピュータープログラムのいずれか、例えば、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどによって作成することができる。このようなアラインメントを実施するのに適したコンピュータープログラムは、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ；Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２：３８７）である。配列の比較を行うことができる他のソフトウェアの例として、限定されるものではないが、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９  ｉｂｉｄ−Ｃｈａｐｔｅｒ  １８を参照されたい）、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４０３
−４１０）、及び比較ツールのＧＥＮＥＷＯＲＫＳ一式が挙げられる。ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡは共に、オフライン及びオンライン検索で利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９  ｉｂｉｄ，ｐａｇｅｓ  ７−５８  ｔｏ  ７−６０を参照されたい）。しかしながら、ＧＣＧ  Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。パーセンテージ（％）配列相同性は、連続する配列に対して計算することができる、即ち、一方の配列を他方の配列と整列させて、一方の配列における各アミノ酸又はヌクレオチドが、他方の配列における対応するアミノ酸又はヌクレオチドと、一度に１つの残基が直接比較される。これは、「無ギャップ（ｕｎｇａｐｐｅｄ）」アラインメントと呼ばれる。典型的には、このような無ギャップアラインメントは、比較的少数の残基に対してのみ行われる。これは、非常に単純で一貫した方法であるが、例えば、その他が同一の配列の対でも、１つの挿入又は欠失によって続くアミノ酸残基がアラインメントから外れ、従って全アラインメントが行われたときに相同性（％）が大幅に低下する可能性があることを考慮できない。結果として、殆どの配列比較法は、起こり得る挿入及び欠失を、全体の相同性又は同一性スコアに著しいペナルティーを課すことなく考慮する最適なアラインメントとなるように設計されている。これは、局所相同性又は同一性を最大にするように配列アラインメントに「ギャップ」を挿入することによって達成される。しかしながら、これらのより複雑な方法は、アラインメントで生じる各ギャップに「ギャップペナルティー」を割り当てて、同数の同一アミノ酸の場合、ギャップが最少の配列アラインメントは、２つの比較される配列間の高い関連性を反映し、ギャップが多い配列よりも高いスコアを獲得することができる。典型的には、ギャップの存在に対して比較的高いコストを付与し、ギャップにおける各連続する残基に小さいペナルティーを付与する「親和性ギャップコスト」が使用される。これは、最も一般的に使用されているギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティーは、もちろん、ギャップの少ない最適化アラインメントを作成することができる。殆どのアラインメントプログラムは、ギャップペナルティーを変更することが可能である。しかしながら、配列の比較にこのようなソフトウェアを使用する場合は、デフォルト値を使用することが好ましい。例えば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージを使用する場合、アミノ酸配列のデフォルトのギャップペナルティーは、１つのギャップが−１２、各伸長が−４である。従って、最大％相同性の計算はまず、ギャップペナルティーを考慮した最適なアラインメントの作成を必要とする。このようなアラインメントを行うのに適したコンピュータープログラムは、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４  Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２  ｐ３８７）である。配列の比較を行うことができる他のソフトウェアの例として、限定されるものではないが、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕ��ａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  Ｅｄ．−Ｃｈａｐｔｅｒ  １８を参照されたい）、ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０３−４１０）、及び比較ツールのＧＥＮＥＷＯＲＫＳ一式が挙げられる。ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡは共に、オフライン及びオンライン検索で利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐａｇｅｓ  ７−５８  ｔｏ  ７−６０を参照されたい）。しかしながら、一部の適用例では、ＧＣＧ  Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。ＢＬＡＳＴ  ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓと呼ばれる新しいツールも、タンパク質配列及びヌクレオチド配列の比較に利用可能である（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．１９９９  １７４（２）：２４７−５０；ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．１９９９  １７７（１）：１８７−８、及び米国の国立衛生研究所のウェブサイトに記載のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトを参照されたい）。最終％相同性は、同一性に関して測定することができるが、アラインメントプロセス自体が、典型的には、オール・オア・ナッシングの対比較に基づくものではない。むしろ、一般に、化学的類似性又は進化距離に基づいて各対比較にスコアを割り当てるスケールド類似性スコアマトリックス（ｓｃａｌｅｄ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｓｃｏｒｅ  ｍａｔｒｉｘ）が使用される。一般的に使用されるこのようなマトリックスの一例は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス−プログラムのＢＬＡＳＴ一式のデフォルトマトリックスである。ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは、一般に、パブリックデフォルト値、又はカスタム記号比較表が提供される場合はこれを使用する（さらなる詳細についてはユーザーマニュアルを参照されたい）。一部の適用例では、ＧＣＧパッケージにはパブリックデフォルト値、又は他のソフトウェアでは、デフォルトマトリックス、例えば、ＢＬＯＳＵＭ６２を使用することが好ましい。別法として、パーセンテージ相同性は、ＣＬＵＳＴＡＬ（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＤＧ  ＆  Ｓｈａｒｐ  ＰＭ（１９８８），Ｇｅｎｅ  ７３（１），２３７−２４４）に類似のアルゴリズムに基づいて、ＤＮＡＳＩＳ（商標）（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）における複数のアラインメントの特徴を用いて計算することができる。このソフトウェアが、最適なアラインメントを作成したら、％相同性、好ましくは、％配列同一性を計算することが可能である。このソフトウェアは、典型的には、これを配列比較の一部として、数値結果を出す。配列は、サイレント変化を生じさせて機能的に同等の物質にする、アミノ酸残基の欠失、挿入、又は置換も有し得る。計画的なアミノ酸置換を、アミノ酸特性の類似性（例えば、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性）に基づいて行うことができ、従って、この計画的なアミノ酸置換は、アミノ酸を官能基に分類するのに有用である。アミノ酸は、その側鎖のみの特性に基づいて分類することができる。しかしながら、突然変異のデータも含めるとより有用であ���。従って、このように得られたアミノ酸のセットは、構造的理由から保存される可能性が高い。これらのセットは、ベン図の形式で示すことができる（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ  Ｃ．Ｄ．ａｎｄ  Ｂａｒｔｏｎ  Ｇ．Ｊ．（１９９３）“Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ：ａ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ”Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．９：７４５−７５６）（Ｔａｙｌｏｒ  Ｗ．Ｒ．（１９８６）“Ｔｈｅ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ”Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．１１９；２０５−２１８）。保存的な置換は、例えば、一般に許容されるアミノ酸分類のベン図を示す下表に従って行うことができる。
【０２８２】
【表５】
2017503485.tif 000007
【０２８３】
本発明の実施形態は、相同置換（本明細書では、置換及び交換は共に、既存のアミノ酸残基又はヌクレオチドの別のアミノ酸残基又はヌクレオチドでの置き換えを指すために用いられる）を含み得る配列（ポリヌクレオチド又はポリペプチドの両方）を含み、この相同置換は、即ち、アミノ酸の場合は同種置換、例えば、塩基性の塩基性での置換、酸性の酸性での置換、極性の極性での置換などが起こり得る。非相同置換、即ち、あるクラスの残基から別のクラスの残基への置換、あるいは天然に存在しないアミノ酸、例えば、オルニチン（以降、Ｚと呼ぶ）、ジアミノ酪酸オルニチン（以降、Ｂと呼ぶ）、ノルロイシンオルニチン（以降、Ｏと呼ぶ）、ピリイルアラニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニン、及びフェニルグリシンの取り込みを伴う置換も起こり得る。変異アミノ酸配列は、配列のいずれか２つのアミノ酸残基間に適切なスペーサー基を含み得、このスペーサー基には、アミノ酸スペーサー、例えば、グリシン又はβ−アラニン残基に加えて、アルキル基、例えば、メチル基、エチル基、又はプロピル基が含まれる。ペプトイド形態の１つ以上のアミノ酸残基の存在を伴う変異のさらなる形態は、当業者には十分に理解されよう。誤解を避けるために、「ペプトイド形態」は、α−炭素置換基がα−炭素上ではなくその残基の窒素原子上にある変異アミノ酸残基を指すために用いられる。ペプトイド形態のペプチドの調製プロセスは、当技術分野で公知であり、例えば、Ｓｉｍｏｎ  ＲＪ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ（１９９２）８９（２０），９３６７−９３７１、及びＨｏｒｗｅｌｌ  ＤＣ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９５）１３（４），１３２−１３４を参照されたい。
【０２８４】
本発明の目的では、増幅は、十分な忠実性で標的配列を複製することができるプライマー及びポリメラーゼを利用する任意の方法を意味する。増幅は、天然又は組換えＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＴａｑＧｏｌｄ（商標）、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗ断片、及び逆転写酵素によって行うことができる。好ましい増幅法はＰＣＲである。
【０２８５】
ある態様では、本発明はベクターに関係する。本明細書で使用される「ベクター」は、ある環境から別の環境への実体の移送を可能にする又は促進するツールである。レプリコン、例えば、プラスミド、ファージ、又はコスミドは、別のＤＮＡセグメントが挿入されて、この挿入されたセグメントを複製することができる。一般に、ベクターは、適切な制御エレメントに結合されると複製を行うことができる。一般に、「ベクター」という語は、結合した別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターは、限定されるものではないが、一本鎖、二本鎖、又は部分的に二本鎖の核酸分子；１つ以上の遊離末端を含む核酸分子、遊離末端のない（例えば、環状の）核酸分子；ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は両方を含む核酸分子；及び当該技術分野で公知の他の様々なポリヌクレオチドを含む。１つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、プラスミドとは、例えば、標準的な分子クローニング技術によって追加のＤＮＡセグメントを挿入することができる環状の二本鎖ＤＮＡループのことである。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、ウイルスベクターでは、ウイルス（例えば、レトロウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス、及びアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ））へのパッケージングのためにウイルス由来ＤＮＡ又はＲＮＡ配列がベクター中に存在する。ウイルスベクターは、宿主細胞へのトランスフェクションのためにウイルスによって運ばれるポリヌクレオチドも含む。あるベクターは、導入された宿主細胞で自己複製することができる（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入されるとこの宿主細胞のゲノムに組み込まれ、これにより宿主ゲノムと共に複製される。さらに、あるベクターは、機能的に連結された遺伝子の発現を誘導することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。組換えＤＮＡ技術に有用な一般的な発現ベクターは、プラスミドの形態である場合が多い。
【０２８６】
組換え発現ベクターは、宿主細胞での核酸の発現に適した形態で本発明の核酸を含むことができる、即ち、組換え発現ベクターは、発現される核酸配列に機能的に連結された、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択できる、１つ以上の調節エレメントを含む。組換え発現ベクターにおいて、「機能的に連結された」とは、目的のヌクレオチド配列が、（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系において、又はベクターが導入された宿主細胞において）ヌクレオチド配列の発現を可能にするように調節エレメントに連結されたことを意味するものとする。組換え法及びクローニング法については、参照により全開示内容が本明細書に組み入れられる、２００４年９月２日に米国特許出願公開第２００４−０１７１１５６  Ａ１号として公開された米国特許出願第１０／８１５，７３０号明細書に記載されている。
【０２８７】
本発明の態様は、キメラＲＮＡ及びＣａｓ９用のバイシストロン性ベクターに関する。キメラＲＮＡ及びＣａｓ９用のバイシストロン性発現ベクターが好ましい。一般に、そして特にこの実施形態では、Ｃａｓ９が、好ましくは、ＣＢｈプロモーターによって駆動される。キメラＲＮＡは、好ましくは、Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター、例えば、Ｕ６プロモーターによって駆動され得る。理想的には、この２つのプロモーターが組み合わせられる。キメラガイドＲＮＡは、典型的には、２０ｂｐのガイド配列（Ｎｓ）からなり、これは、ｔｒａｃｒ配列（下鎖の最初の「Ｕ」から転写物の末端まで延びている）に接続することができる。ｔｒａｃｒ配列は、示されているように様々な位置で切断することができる。ガイド配列及びｔｒａｃｒ配列は、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡであり得るｔｒａｃｒ−ｍａｔｅ配列によって分離されている。このｔｒａｃｒ配列には、図示されているループ配列ＧＡＡＡが続き得る。これらは共に、好ましい例である。本出願人らは、ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイによってヒトＥＭＸ１及びＰＶＡＬＢ遺伝子座におけるＣａｓ９媒介挿入欠失を実証している。ＣｈｉＲＮＡは、その「＋ｎ」指定によって示され、ｃｒＲＮＡは、ガイド配列及びｔｒａｃｒ配列が別個の転写物として発現されるハイブリッドＲＮＡを指す。本出願全体において、キメラＲＮＡは、単一ガイド、又は合成ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）とも呼ばれることがある。ループは、好ましくはＧＡＡＡであるが、この配列、又は僅か４ｂｐの長さに限定されるものではない。実際、ヘアピン構造に使用される好ましいループ形成配列は、４ヌクレオチド長であり、最も好ましくは、配列ＧＡＡＡを有する。しかしながら、これよりも長い又は短いループ配列を使用することができ、これらは代替の配列とすることができる。この配列は、好ましくは、ヌクレオチドトリプレット（例えば、ＡＡＡ）及び追加のヌクレオチド（例えば、Ｃ又はＧ）を含む。ループ形成配列の例として、ＣＡＡＡ及びＡＡＡＧが挙げられる。本明細書に開示の任意の方法の実施において、適切なベクターを、当該技術分野で公知の１つ以上の方法によって細胞又は胚に導入することができ、このような方法には、限定されるものではないが、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ソノポレーション、微粒子銃、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、カチオン性トランスフェクション、リポソームトランスフェクション、デンドリマートランスフェクション、熱ショックトランスフェクション、ヌクレオフェクショントランスフェクション、マグネトフェクション、リポフェクション、インペールフェクション（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）、光トランスフェクション、専売薬剤で促進される核酸の取り込み、及びリポソーム、イムノリポソーム、ビロソーム、または人工ビリオンによる送達が含まれる。一部の方法では、ベクターは、マイクロインジェクションによって胚に導入され得る。１つ又は複数のベクターは、胚の核又は細胞質に導入され得る。一部の方法では、１つ又は複数のベクターは、ヌクレオフェクションによって細胞に導入され得る。
【０２８８】
「調節エレメント」という語は、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、及び他の発現制御エレメント（例えば、転写終結シグナル、例えば、ポリアデニル化シグナル及びポリ−Ｕ配列）を含むものとする。このような調節エレメントは、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）で説明されている。調節エレメントは、多数の種類の宿主細胞におけるヌクレオチド配列の構成的な発現を誘導する調節エレメント、及び特定の宿主細胞のみでのヌクレオチド配列の発現を誘導する調節エレメント（例えば、組織特異的調節配列）を含む。組織特異的プロモーターは、主として所望の目的の組織、例えば、筋肉、ニューロン、骨、皮膚、血液、特定の臓器（例えば、肝臓、膵臓）、又は特定の細胞型（例えば、リンパ球）での発現を誘導し得る。調節エレメントはまた、時間依存的に、例えば、細胞周期依存的に、又は発生段階依存的に発現を誘導することができ、この誘導は、組織特異的又は細胞型特異的であっても良いし、又はこのように特異的でなくても良い。一部の実施形態では、ベクターは、１つ以上のｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれ以上のｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター）、１つ以上のｐｏｌ  ＩＩプロモーター（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれ以上のｐｏｌ  ＩＩプロモーター）、１つ以上のｐｏｌ  Ｉプロモーター（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれ以上のｐｏｌ  Ｉプロモーター）、又はこれらの組み合わせを含む。ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの例として、限定されるものではないが、Ｕ６プロモーター及びＨ１プロモーターが挙げられる。ｐｏｌ  ＩＩプロモーターの例として、限定されるものではないが、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意にＲＳＶエンハンサーを含む）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意にＣＭＶエンハンサーを含む）［例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ，４１：５２１−５３０（１９８５）を参照されたい］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、及びＥＦ１αプロモーターが挙げられる。また、「調節エレメント」という語には、エンハンサーエレメント、例えば、ＷＰＲＥ；ＣＭＶエンハンサー；ＨＴＬＶ−ＩのＬＴＲにおけるＲ−Ｕ５’セグメント（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．８（１），ｐ．４６６−４７２，１９８８）；ＳＶ４０エンハンサー；及びウサギβ−グロビンのエキソン２と３との間のイントロン配列（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，Ｖｏｌ．７８（３），ｐ．１５２７−３１，１９８１）も包含される。当業者であれば、発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細の選択などの因子、望ましい発現レベルなどによって異なり得ることを理解されよう。ベクターを宿主細胞に導入し、これにより、本明細書に記載の核酸によってコードされる、融合タ��パク質又は融合ペプチドを含む転写物、タンパク質、又はペプチド（例えば、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）転写物、タンパク質、酵素、これらの突然変異型、これらの融合タンパク質など）を産生することができる。調節配列に関して、参照によりその全開示内容が本明細書に組み入れられる米国特許出願第１０／４９１，０２６号明細書に記載されている。プロモーターに関しては、それぞれ参照により全開示内容が本明細書に組み入れられるＰＣＴ公開の国際公開第２０１１／０２８９２９号パンフレット及び米国特許出願第１２／５１１，９４０号明細書に記載されている。
【０２８９】
ベクターは、原核細胞又は真核細胞でのＣＲＩＳＰＲ転写物（例えば、核酸転写物、タンパク質、又は酵素）の発現用に設計することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ転写物は、細菌細胞、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用）、酵母細胞、又は哺乳動物細胞で発現させることができる。適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に詳述されている。別法として、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列及びＴ７ポリメラーゼを用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写して翻訳することができる。
【０２９０】
ベクターは、原核生物又は原核細胞に導入して増殖させることができる。一部の実施形態では、原核生物は、真核細胞に導入されるベクターのコピーを増幅するため、又は真核細胞に導入されるベクターの産生における中間ベクター（例えば、ウイルスベクターパッケージングシステムの一部としてプラスミドを増幅する）として使用される。一部の実施形態では、原核生物は、ベクターのコピーを増幅して１つ以上の核酸を発現させるため、例えば、宿主細胞又は宿主生物に送達するための１つ以上のタンパク質の供給源を提供するために使用される。原核生物でのタンパク質の発現は、融合タンパク質又は非融合タンパク質の発現を誘導する構成的プロモーター又は誘導プロモーターを含むベクターを用いて大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）で行われる場合が殆どである。融合ベクターは、多数のアミノ酸を、その中でコードされたタンパク質、例えば、組換えタンパク質のアミノ末端に付加する。このような融合ベクターは、１つ以上の目的、例えば：（ｉ）組換えタンパク質の発現を増加させること；（ｉｉ）組換えタンパク質の溶解度を高めること；及び（ｉｉｉ）親和性精製におけるリガンドとして作用することによって組換えタンパク質の精製を助けることに役立ち得る。しばしば、融合発現ベクターでは、タンパク質分解切断部位は、融合タンパク質の精製の後に組換えタンパク質と融合部分との分離を可能にするために、融合部分と組換えタンパク質との接合部に導入される。このような酵素及びその同族認識配列は、因子Ｘａ、トロンビン、及びエンテロキナーゼを含む。融合発現ベクターの例として、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，１９８８．Ｇｅｎｅ  ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）、及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げられ、これらはそれぞれ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、又はプロテインＡを標的組換えタンパク質に融合させる。適切な誘導性非融合大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターの例として、ｐＴｒｃ（Ａｍｒａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６９：３０１−３１５）及びｐＥＴ  １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）６０−８９）が挙げられる。一部の実施形態では、ベクターは酵母発現ベクターである。酵母サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｉｖｉｓａｅ）での発現用のベクターの例として、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ，ｅｔ  ａｌ．，１９８７．ＥＭＢＯ  Ｊ．６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｉｊａｎ  ａｎｄ  Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，１９８２．Ｃｅｌｌ  ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７．Ｇｅｎｅ  ５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａ��ｉｆ．）、及びｐｉｃＺ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。一部の実施形態では、ベクターは、バキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞でのタンパク質の発現を駆動する。培養昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）でのタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターとして、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ  ａｌ．，１９８３．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）及びｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ  ａｎｄ  Ｓｕｍｍｅｒｓ，１９８９．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：３１−３９）が挙げられる。
【０２９１】
一部の実施形態では、ベクターは、哺乳動物発現ベクターを用いて哺乳動物細胞での１つ以上の配列の発現を駆動することができる。哺乳動物発現ベクターの例として、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，１９８７．Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：８４０）及びｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９８７．ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１８７−１９５）が挙げられる。哺乳動物細胞で使用される場合、発現ベクターの制御機能は、典型的には、１つ以上の調節エレメントによって提供される。例えば、一般的に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、シミアン・ウイルス４０、及び本明細書に開示され当該技術分野で公知の他のウイルスに由来する。原核細胞及び真核細胞の両方の他の適切な発現系については、例えば、Ｃｈａｐｔｅｒｓ  １６  ａｎｄ  １７  ｏｆ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ．２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９を参照されたい。
【０２９２】
一部の実施形態では、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型で優先的に核酸の発現を誘導することができる（例えば、組織特異的調節エレメントが、核酸の発現に使用される）。組織特異的調節エレメントは当該技術分野で公知である。適切な組織特異的プロモーターの非限定的な例として、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔ，ｅｔ  ａｌ．，１９８７．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１：２６８−２７７）、リンパ特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅ  ａｎｄ  Ｅａｔｏｎ，１９８８．Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５−２７５）、特に、Ｔ細胞受容体のプロモーター（Ｗｉｎｏｔｏ  ａｎｄ  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８９．ＥＭＢＯ  Ｊ．８：７２９−７３３）及び免疫グロブリンのプロモーター（Ｂａｎｅｉｊｉ，ｅｔ  ａｌ．，１９８３．Ｃｅｌｌ  ３３：７２９−７４０；Ｑｕｅｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８３．Ｃｅｌｌ  ３３：７４１−７４８）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、ｔｈｅ  ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ；Ｂｙｒｎｅ  ａｎｄ  Ｒｕｄｄｌｅ，１９８９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：５４７３−５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄ，ｅｔ  ａｌ．，１９８５．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：９１２−９１６）、及び哺乳動物腺特異的プロモーター（例えば、ｍｉｌｋ  ｗｈｅｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ；米国特許第４，８７３，３１６号明細書、及び欧州特許出願第２６４，１６６号明細書）が挙げられる。発生的に調節されるプロモーターは、例えば、ネズミｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ  ａｎｄ  Ｇｒｕｓｓ，１９９０．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３７４−３７９）及びαフェトプロテインプロモーター（Ｃａｍｐｅｓ  ａｎｄ  Ｔｉｌｇｈｍａｎ，１９８９．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．３：５３７−５４６）も包含する。これらの原核生物ベクター及び真核生物ベクターに関しては、参照によりその全開示内容が本明細書に組み入れられる米国特許第６，７５０，０５９号明細書に記載されている。本発明の他の実施形態は、ウイルスベクターの使用に関連することがあり、このようなウイルスベクターについては、参照によりその全開示内容が本明細書に組み入れられる米国特許出願第１３／０９２，０８５号明細書に記載されている。組織特異的調節エレメントは、当該技術分野で公知であり、これに関しては、参照によりその全開示内容が本明細書に組み入れられる米国特許第７，７７６，３２１号明細書に記載されている。一部の実施形態では、調節エレメントは、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントの発現を駆動するためにＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントに機能的に連結される。一般に、ＳＰＩＤＲ（ＳＰａｃｅｒ  Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｒｅｐｅａｔｓ）としても知られるＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ）は、通常は特定の細菌種に特異的であるＤＮＡ遺伝子座のファミリーを構成する。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に見られる短鎖散在配列反復（ＳＳＲ：ｓｈｏｒｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｐｅａｔ）の異なるクラス（Ｉｓ��ｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９：５４２９−５４３３［１９８７］；及びＮａｋａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７１：３５５３−３５５６［１９８９］）及び関連する遺伝子を含む。類似の散在ＳＳＲが、ハロフェラックス・メディテラネイ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、及び結核菌でも同定された（Ｇｒｏｅｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１０：１０５７−１０６５［１９９３］；Ｈｏｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，５：２５４−２６３［１９９９］；Ｍａｓｅｐｏｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １３０７：２６−３０［１９９６］；及びＭｏｊｉｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１７：８５−９３［１９９５］を参照されたい）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、典型的には、反復の構造が他のＳＳＲとは異なり、短鎖規則的間隔反復（ＳＲＳＲ：ｓｈｏｒｔ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｓｐａｃｅｄ  ｒｅｐｅａｔｓ）と呼ばれる（Ｊａｎｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＯＭＩＣＳ  Ｊ．Ｉｎｔｅｇ．Ｂｉｏｌ．，６：２３−３３［２００２］；及びＭｏｊｉｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３６：２４４−２４６［２０００］）。一般に、この反復は、実質的に一定の長さのユニークな介在配列によって規則的に間隔が空いたクラスターで生じる短鎖エレメントである（Ｍｏｊｉｃａ  ｅｔ  ａｌ．，［２０００］、上記）。反復配列は、株間で高度に保存されているが、散在反復の数及びスペーサー領域の配列は、典型的には、株毎に異なる（ｖａｎ  Ｅｍｂｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８２：２３９３−２４０１［２０００］）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、限定されるものではないが、アエロピュルム属（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ）、ピュロバクルム属（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ）、スルフォロブス属（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）、アルカエオグロブス属（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）、ハロアオーキュラ属（Ｈａｌｏｃａｒｃｕｌａ）、メタノバクテリウム属（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、メタノコックス属（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）、メタノサルキナ属（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）、メタノピュルス属（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ）、ピュロコックス属（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ピクロフィルス属（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ）、テルモプラズマ属（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、アクウィフェクス門（Ａｑｕｉｆｅｘ）、ポルフィロモナス属（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、クロロビウム属（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）、テルムス属（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、サーモアナエロバクター属（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アゾアルカス属（Ａｚａｒｃｕｓ）、クロモバクテリウム属（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）、デスルフォビブリオ属（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）、ジオバクター属（Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ）、ミキソコッカス属（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ウォリネラ属（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、メチロコッカス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、フォトバクテリウム属（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、及びテルモトガ門（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）を含む４０を超える原核生物で同定された（例えば、Ｊａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４３：１５６５−１５７５［２００２］；及びＭｏｊｉｃａ  ｅｔ  ａｌ．，［２００５］を参照されたい）。
【０２９３】
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つ以上のヘテロタンパク質ドメイン（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素に加えて、約１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、若しくはそれ以上の、又は約１つを超える、２つを超える、３つを超える、４つを超える、５つを超える、６つを超える、７つを超える、８つを超える、９つを超える、１０を超える、ドメイン）を含む融合タンパク質の一部である。ＣＲＩＳＰＲ酵素融合タンパク質は、任意の追加のタンパク質配列、及び任意の２つのドメイン間のリンカー配列を含み得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素に融合し得るタンパク質ドメインの例として、限定されるものではないが、エピトープタグ、受容体遺伝子配列、並びに次の活性：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ開裂活性、及び核酸結合活性の１つ以上を有するタンパク質ドメインが挙げられる。エピトープタグの非限定的な例としては、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、及びチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグが挙げられる。レポーター遺伝子の例としては、限定されるものではないが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、及び青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む自己蛍光タンパク質が挙げられる。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ−タグ、Ｌｅｘ  Ａ  ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合体、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン融合体、及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合体を含む、ＤＮＡ分子又は他の細胞分子に結合するタンパク質又はタンパク質の断片をコードする遺伝子配列に融合させることができる。ＣＲＩＳＰＲ酵素を含む融合タンパク質の一部を形成し得る追加のドメインは、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２０１１００５９５０２号明細書に記載されている。一部の実施形態では、タグ化ＣＲＩＳＰＲ酵素を使用して標的配列の局在を同定する。
【０２９４】
一部の態様では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、誘導系の構成成分を形成し得る。この系の誘導性は、あるエネルギー形態を用いて遺伝子編集又は遺伝子発現の時空制御を可能にするであろう。このエネルギー形態には、限定されるものではないが、電磁放射線、音波エネルギー、化学エネルギー、及び熱エネルギーが含まれ得る。誘導系の例として、テトラサイクリン誘導プロモーター（Ｔｅｔ−Ｏｎ又はＴｅｔ−Ｏｆｆ）、小分子２ハイブリッド転写活性化系（ＦＫＢＰ、ＡＢＡなど）、又は光誘導系（ファイトクロム、ＬＯＶドメイン、又はクリプトクロム）が挙げられる。一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、配列特異的に転写活性に変化を誘導する光誘導性転写エフェクター（ＬＩＴＥ）の一部であり得る。光の構成成分は、ＣＲＩＳＰＲ酵素、光応答性シトクロムヘテロ二量体（例えば、シロイヌナズナからの）、及び転写活性化／抑制ドメインを含み得る。誘導性ＤＮＡ結合タンパク質及びその使用方法のさらなる例は、それぞれ参照により全開示内容が本明細書に組み入れられる米国仮特許出願第６１／７３６４６５号明細書及び同第６１／７２１，２８３号明細書に記載されている。
【０２９５】
本発明の実施では、特段の記載がない限り、当該技術分野の技術の範囲内である免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクス、及び組換えＤＮＡの従来の技術を利用する。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）；ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，（１９８７））；ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ  ２：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ  ｅｄｓ．（１９９５）），Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．（１９８８）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、及びＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８７））を参照されたい。
【０２９６】
標的の改変
一態様では、本発明は、真核細胞における標的ポリヌクレオチドを改変する方法を提供し、この方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで行うことができる。一部の実施形態では、この方法は、ヒト又は非ヒト動物からの細胞又は細胞集団をサンプリングするステップ、及び１つ又は複数の細胞を改変するステップを含む。ｅｘ  ｖｉｖｏで任意の段階で培養を行うことができる。この１つ又は複数の細胞は、非ヒト動物又は植物に再導入することさえできる。再導入される細胞の場合、細胞が幹細胞であることが特に好ましい。
【０２９７】
一部の実施形態では、この方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を標的ポリヌクレオチドに結合させて前記標的ポリヌクレオチドを切断し、これによりこの標的ポリヌクレオチドを改変するステップを含み、このＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズした又はハイブリダイズ可能なガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ガイド配列は、ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ配列に連結される。
【０２９８】
一態様では、本発明は、真核細胞におけるポリヌクレオチドの発現を改変する方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体をポリヌクレオチドに結合させて、前記結合により、前記ポリヌクレオチドの発現を増加又は減少させるステップを含み；ＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズした又はハイブリダイズ可能なガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ガイド配列は、ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ配列に連結される。同様の考慮及び条件が、標的ポリヌクレオチドを改変する方法に上記のように当てはまる。実際、これらのサンプリング、培養、及び再導入の選択肢は、本発明の全ての態様に当てはまる。
【０２９９】
実際、本発明の何れの態様でも、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的配列にハイブリダイズした又はハイブリダイズ可能なガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み得、前記ガイド配列は、ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし得るｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ配列に連結され得る。同様の考慮及び条件が、標的ポリヌクレオチドを改変する方法に上記のように当てはまる。
【０３００】
キット
一態様では、本発明は、上記の方法で開示されるいずれか１つ以上の要素、及び組成物を含むキットを提供する。要素は、個別に又は組み合わせて提供することができ、かつ任意の適切な容器、例えば、バイアル、瓶、又は管に入れて提供することができる。一部の実施形態では、キットは、１つ以上の言語、例えば、２つ以上の言語の取扱説明書を含む。
【０３０１】
一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載の１つ以上の要素を利用するプロセスに使用される１つ以上の試薬を含む。試薬は、任意の適切な容器に入れて提供することができる。例えば、キットは、１つ以上の反応緩衝液又は保存緩衝液を提供することができる。試薬は、特定のアッセイにおいて使用可能形態で、又は使用の前に１つ以上の他の成分の添加を必要とする形態（例えば、濃縮形態又は凍結乾燥形態）で提供することができる。緩衝液は、限定されるものではないが、炭酸ナトリウム緩衝液、重炭酸ナトリウム緩衝液、ホウ酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、及びこれらの組み合わせを含む任意の緩衝液とすることができる。一部の実施形態では、緩衝液はアルカリ性である。一部の実施形態では、緩衝液は、約７〜約１０のｐＨを有する。一部の実施形態では、キットは、ガイド配列及び調節エレメントを機能的に連結するようにベクターに挿入されるガイド配列に一致する１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、キットは、相同組換え鋳型ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載の１つ以上のベクター及び／又は１つ以上のポリヌクレオチドを含む。キットは、本発明の系の全ての要素を提供できると有利であろう。
【０３０２】
ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡ
ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡは、別個に送達しても良い。ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ酵素が発現する時間を与えるためにガイドＲＮＡの前に送達することができる。ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡは、ガイドＲＮＡの投与の１〜１２時間前（好ましくは、約２〜６時間前）に投与することができる。別法では、ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡとガイドＲＮＡは一緒に投与することができる。有利なことに、ガイドＲＮＡの第２のブースター投与量を、ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ＋ガイドＲＮＡの最初の投与から１〜１２時間後（好ましくは、約２〜６時間後）に投与することができる。ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ及び／又はガイドＲＮＡの追加の投与は、最も効率的なレベルのゲノム改変を達成するに有用であろう。毒性及び標的外の影響を最小限にするために、送達されるＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡの濃度を制御することが重要であろう。ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡの最適な濃度は、細胞モデル又は動物モデルでの異なる濃度の試験及び潜在的な標的外のゲノム遺伝子座における改変の程度を分析するディープシークエンシングの使用によって決定することができる。例えば、ヒトゲノムのＥＭＸＩ遺伝子における５’−ＧＡＧＴＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡ−３’を標的とするガイド配列では、ディープシークエンシングを使用して、次の２つの標的外遺伝子座、１：５’−ＧＡＧＴＣＣＴＡＧＣＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡ−３’及び２：５’−ＧＡＧＴＣＴＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡ−３’における改変のレベルを評価することができる。標的上の改変のレベルを最高にすると共に標的外の改変のレベルを最小にする濃度を、ｉｎ  ｖｉｖｏ送達用に選択するべきである。
【０３０３】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の結晶化及び結晶構造の特徴付け：本発明の結晶は、バッチ、液体架橋、透析、蒸気拡散、及び水滴法を含むタンパク質結晶学の技術によって得ることができる。一般に、本発明の結晶は、実質的に純粋なＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９及びこのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９が結合する核酸分子を、沈殿に必要な濃度よりも僅かに低い濃度の沈殿剤を含む水性緩衝液中で溶解することによって成長させる。沈殿条件を作るために制御された蒸発によって水を除去し、結晶の成長が止まるまでこれを続ける。
【０３０４】
結晶、結晶構造、及び原子構造の座標の使用：ＣＲＩＳＰＲ酵素の結晶、及び特にこの結晶から得られる原子構造の座標は、広範な用途を有する。結晶及び構造の座標は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９に結合する化合物（核酸分子）、及び特定の化合物（核酸分子）に結合し得るＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を同定するのに特に有用である。従って、本明細書に記載の構造の座標は、追加の合成又は突然変異ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９、Ｃａｓ９、ニッカーゼ、結合ドメインの結晶構造を決定する際にフェージングモデルとして使用することができる。本明細書で言及する物質でのように核酸分子と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の結晶構造の提供は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の作用機序についての詳細な知見を当業者に与える。この知見は、例えば、改変ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９に官能基、例えば、リプレッサー又はアクチベーターを付着させることによって改変ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を設計する手段を提供する。官能基、例えば、リプレッサー又はアクチベーターをＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９のＮ末端又はＣ末端に付着させることができ、結晶構造が、Ｎ末端が覆われる又は隠れるように見えるが、Ｃ末端は、官能基、例えば、リプレッサー又はアクチベーターがより利用可能であることを実証する。さらに、結晶構造は、官能基、例えば、アクチベーター又はリプレッサーの付着に適した、概ねＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））残基５３４〜６７６の間に可動性ループが存在することを実証する。付着は、リンカー、例えば、可動性グリシン−セリン（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）又は（ＧＧＧＳ）３又は剛性αへリックスリンカー、例えば、（Ａｌａ（ＧｌｕＡｌａＡｌａＡｌａＬｙｓ）Ａｌａ）を介してとすることができる。可動性ループに加えて、ヌクレアーゼ又はＨ３領域、Ｈ２領域、及び螺旋領域も存在する。「へリックス」又は「螺旋」は、限定されるものではないが、αへリックスを含め、当該技術分野で公知のへリックスを意味する。加えて、へリックス又は螺旋という語は、Ｎ末端ターンを有するｃ末端螺旋エレメントを示すために使用することもできる。
【０３０５】
核酸分子と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の結晶構造の提供は、薬物又は化合物の発見、同定、及びＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９に結合し得る化合物の設計のための新規なアプローチを可能にし、従って、本発明は、多細胞生物、例えば、藻類、植物、無脊椎動物、魚、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳類；例えば、栽培植物、家畜（例えば、生産動物、例えば、ブタ、ウシ、ニワトリ；ペット動物、例えば、ネコ、イヌ、齧歯類（ウサギ、スナネズミ、ハムスター）；実験動物、例えば、マウス、ラット）、及びヒトの症状又は疾患の診断、処置、又は予防に有用なツールを提供する。従って、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体を合理的に設計するコンピューターベースの方法を含む。この合理的な設計は：本明細書で言及する物質の一部又は全て（例えば、構造の少なくとも２つ以上、例えば、少なくとも５つ、有利には少なくとも１０、より有利には少なくとも５０、さらに有利には少なくとも１００の原子）の座標によって定義されるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体の構造を提供するステップ；どのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体が望ましいかについて所望の核酸分子の構造を提供するステップ；及び本明細書で言及する物質の一部又は全ての座標によって定義されるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体の構造を、所望の核酸分子にフィッティングするステップであって、前記フィッティングにおいて、前記所望の核酸分子に関与するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体に結合するこの所望の核酸分子について、本明細書で言及する物質の一部又は全ての座標によって定義されるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体の推定上の改変を得る、ステップを含み得る。この方法又はこの方法のフィッティングは、活性部位又は結合領域（例えば、構造の少なくとも２つ以上、例えば、少なくとも５つ、有利には少なくとも１０、より有利には少なくとも５０、さらに有利には少なくとも１００の原子）の近傍をモデル化するために、活性部位又は結合領域の近傍にある本明細書で言及する物質の一部又は全ての座標によって定義されるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体の目的の原子の座標を使用することができる。これらの座標は、所望又は候補の核酸分子に対して「コンピューターで」後にスクリーニングされる空間を画定するために使用することができる。従って、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体を合理的に設計するコンピューターベースの方法を提供する。この方法は：本明細書で言及する物質の少なくとも２つの原子の座標（「選択された座標」）を提供するステップ；候補又は所望の核酸分子の構造を提供するステップ；及び候補構造を選択された座標に対してフィッティングするステップを含み得る。このように、当業者は、官能基及び候補又は所望の核酸分子をフィッティングすることもできる。例えば、本明細書で言及する物質の一部又は全て（例えば、構造の少なくとも２つ以上、例えば、少なくとも５つ、有利には少なくとも１０、より有利には少なくとも５０、さらに有利には少なくとも１００の原子）の座標によって定義されるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体の構造を提供するステップ；どのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体が望ましいかについて所望の核酸分子の構造を提供するステップ；本明細書で言及する物質の一部又は全ての座標によって定義されるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体の構造を、所望の核酸分子にフィッティングするステップであって、前記フィッティングにおいて、前記所望の核酸分子に関与するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体に結合するこの所望の核酸分子について、本明細書で言及する物質の一部又は全ての座標によって定義されるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体の推定上の改変を得る、ステップ；推定上の適合ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９−所望の核酸分子複合体を選択するステップ、このような推定上の適合ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９−所望の核酸分子複合体を、例えば、官能基（例えば、アクチベーター、リプレッサー）を配置する位置（例えば、可動ループ内の位置）及び／又は官能基を配置する位置を得るための推定上の適合ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９−所望の核酸分子複合体の推定上の改変について、官能基にフィッティングするステップ。示唆したように、本発明は、活性部位又は結合領域の近傍にある本明細書で言及する物質の座標を用いて実施することができ；従って、本発明の方法は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体の目的のサブドメインを利用することができる。本発明の方法は、ドメイン又はサブドメインの座標を用いて実施することができる。この方法は、任意に、「コンピューターでの」出力から候補又は所望の核酸分子及び／又はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系を合成するステップ、及び「ウェット（ｗｅｔ）」又は実際の候補又は所望の核酸分子に結合された「ウェット」又は実際のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系に連結された「ウェット」又は実際の官能基の結合及び／又は活性を試験するステップを含み得る。この方法は、「コンピューターでの」出力からＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系（官能基を含む）を合成するステップ、及び、例えば、「コンピューターでの」出力からの、官能基を含む「ウェット」又は実際のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系を、所望又は候補の核酸分子を含む細胞と接触させるステップを含む。ｉｎ  ｖｉｖｏで「ウェット」又は実際の候補又は所望の核酸分子に結合された「ウェット」又は実際のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系に連結された「ウェット」又は実際の官能基の結合及び／又は活性を試験するステップを含み得る。これらの方法は、所望の反応、例えば、症状又は状態又は疾患の軽減について、細胞又は細胞を含む生物を観察するステップを含み得る。候補の核酸分子の構造を提供するステップは、核酸分子データ、例えば、状態又は疾患についてのこのようなデータを含むデータベースをコンピューターで検索することによって化合物を選択するステップを含み得る。候補核酸分子の結合についての３Ｄディスクリプタを、本明細書で言及する物質からのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体又はそのドメイン又は領域の構造及び化学的性質から生じる幾何学的及び機能的制約から得ることができる。事実上、このディスクリプタは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を候補又は所望の核酸分子に結合するための本明細書のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体結晶構造の仮想改変の一種とすることができる。次いで、このディスクリプタを使用して核酸分子データベースに問い合わせて、ディスクリプタに対して良好な結合性を有すると推定されるデータベースの核酸分子���確認することができる。次いで、本明細書の「ウェット」ステップを、ディスクリプタ及び良好な結合性を有すると推定される核酸分子を用いて行うことができる。
【０３０６】
「フィッティング」は、候補の少なくとも１つの原子とＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体の少なくとも１つの原子との間の相互作用を、自動手段又は半自動手段によって決定すること、及びこのような相互作用が安定である範囲を計算することを意味し得る。相互作用は、電荷及び立体的な要因などによって生じる引力、反発力を含み得る。「サブドメイン」は、二次構造の少なくとも１つ、例えば、１つ、２つ、２つ、３つ、又は４つの完全な要素を意味し得る。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の特定の領域又はドメインは、本明細書で言及する物質で同定されるものを含む。
【０３０７】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）複合体の３次元構造の決定により、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９（例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）に結合する新規かつ特定の核酸分子の設計及び新規なＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系の設計の基礎が、例えば、様々な核酸分子に結合するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系の改変によって、互いに相互作用し得る、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９（例えば、機能の自己活性化及び／又は自己終結を提供する誘導系）と相互作用し得る、核酸分子（例えば、官能基は、規則的又は機能的なドメインであり得、このドメインは、転写リプレッサー、転写アクチベーター、ヌクレアーゼドメイン、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、タンパク質トランスフェラーゼ、タンパク質デアセチラーゼ、タンパク質メチルトランスフェラーゼ、タンパク質デアミナーゼ、タンパク質キナーゼ、及びタンパク質ホスファターゼからなる群から選択され得；そして一部の態様では、機能的ドメインは後成的制御因子であり；例えば、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第８，５０７，２７２号明細書を参照されたい、そしてこの文献及び本明細書で言及する全ての文献並びに本明細書で言及する全ての出願書類は参照により本明細書に組み入れられることを再び述べておく）と相互作用し得る様々な官能基のいずれか１つ以上に連結されたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系の改変によって、Ｃａｓ９の改変によって、新規なニッカーゼの改変によって提供される。実際、これにより、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）の結晶構造は複数の用途を有する。例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）結晶構造の３次元構造を知ることにより、コンピューターモデリングプログラムを使用して、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系（例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）の可能な部位又は確認された部位、例えば、結合部位又は他の構造的若しくは機能的特徴と相互作用すると予想される様々な分子を設計又は同定することができる。潜在的に結合する化合物（「バインダー」）を、ドッキングプログラムを用いてコンピューターモデリングの使用によって調べることができる。ドッキングプログラムは既知である；例えば、ＧＲＡＭ，ＤＯＣＫ又はＡＵＴＯＤＯＣＫ（Ｗａｌｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ，ｖｏｌ．３，ｎｏ．４（１９９８），１６０−１７８、及びＤｕｎｂｒａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｏｌｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｓｉｇｎ  ２（１９９７），２７−４２を参照されたい）。この手順は、潜在的なバインダーの形状及び化学構造がどの程度良好にＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系（例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）に結合するかを確認する潜在的なバインダーのコンピューターフィッティングを含み得る。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系（例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）の活性部位又は結合部位のコンピューター支援の手動試験を行うことができる。プログラム、例えば、ＧＲＩＤ（Ｐ．Ｇｏｏｄｆｏｒｄ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ，１９８５，２８，８４９−５７）−様々な官能基を有��る分子間の推定相互作用部位を決定するプログラムを使用して、活性部位又は結合部位を分析して結合化合物の部分的な構造を推定することもできる。コンピュータープログラムを利用して、２つの結合パートナー、例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系（例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）と候補核酸分子との間、又は核酸分子と候補ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系（例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）との間の引力、反発力、又は立体障害を推定することができ；かつＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９結晶構造（例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）と共に、この方法を可能にする。一般に、適合がタイトであればあるほど、立体障害が少なく、引力が大きければ大きいほど、潜在的なバインダーがより強力になる。これは、これらの特性が、よりタイトな結合定数に一致しているためである。さらに、候補ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系（例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）の設計の特異性が高ければ高いほど、標的外分子と相互作用しない可能性も高くなる。また、「ウェット」法は、本発明によって可能となる。例えば、一態様では、本発明は、候補ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系（例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）に結合する候補ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系（例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）のバインダー（例えば、標的核酸分子）の構造を決定する方法を含み、前記方法が、（ａ）本発明による候補ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）の第１の結晶又は候補ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系（例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）の第２の結晶を提供するステップ、（ｂ）複合体が形成され得る条件下で、第１の結晶又は第２の結晶を前記バインダーを用いて接触させるステップ；及び（ｃ）前記候補（例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系（例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）又はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）複合体）の構造を決定するステップを含む。第２の結晶は、本質的に、本明細書で論じた座標と同じ座標を有し得るが、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系における僅かな変化により（例えば、このような系のＣａｓ９が、例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９であることと化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９であることとの比較、「例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９」は、このＣａｓ９が、あるＣａｓ９であり、かつ化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）又はそのオーソログであり得る又はこれらに由来し得ることを示すことから）、この結晶は、異なる空間群で形成され得る。
【０３０８】
本発明は、「コンピューター内での」方法の代わり、又はこれに加えて、他の「ウェット」法をさらに含み、この方法は、結合活性を用いて化合物を選択するための、バインダー（例えば、標的核酸分子）及び候補ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系（例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）、又は候補バインダー（例えば、標的核酸分子）及びＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系（例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）、又は候補バインダー（例えば、標的核酸分子）及び候補ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系（例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）（１つ以上の官能基を含む又は含まない上述のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系）の高スループットスクリーニングを含む。結合活性を示すバインダーとＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系のこれらの対を選択し、Ｘ線分析のために、例えば、共結晶化によって、又は浸漬によって本明細書の構造を有するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９結晶でさらに結晶化することができる。得られるＸ線構造を、様々な目的のため、例えば、重複領域について、本明細書で言及する物質のＸ線構造と比較することができる。好ましいフィッティング特性、例えば、本明細書のバインダーとＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の結晶構造のデータの対に基づいて推定される強い引力を有するバインダーとＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系の対を決定することによって、バインダーとＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系の可能な対を設計、同定、又は選択することにより、これらの可能な対を、活性について「ウェット」法によってスクリーニングすることができる。結果として、一態様では、本発明は：可能な対を得る又は合成するステップ；及びバインダー（例えば、標的核酸分子）と候補ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系（例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）とを、又は候補バインダー（例えば、標的核酸分子）とＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系（例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）とを、又は候補バインダー（例えば、標的核酸分子）と候補ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系（例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）（１つ以上の官能基を含む又は含まない上述のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系）とを接触させて結合能力を決定するステップを含み得る。後者のステップでは、この接触は、機能を決定する条件下であると有利である。このようなアッセイを行う代わり、又はこれに加えて、本発明は：前記接触から複合体を得る又は合成するステップ、及びこの複合体を、例えば、Ｘ線回折又はＮＭＲ又は他の手段によって分析して結合又は相互作用する能力を決定するステップを含み得る。次いで、詳細な構造の情報を結合について得ることができ、この情報から、候補ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系又はその構成成分の構造又は機能性を調整することができる。これらのステップは、繰り返すことができ、必要に応じてさらに繰り返すことができる。別法として、又はこれに加えて、上述の方法からの又はこの方法における潜在的なＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系を、限定されるものではないが、投与により所望の結果（例えば、症状の軽減、処置）となるか否かを含め、機能を解明又は確認するために生物（非ヒト動物及びヒトを含む）への投与によって、ｉｎ  ｖｉｖｏで核酸分子と一緒にすることができる。
【０３０９】
本発明は、本明細書で言及する物質の構造の座標を用いることによって、未知の構造のＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ系又は複合体の３次元構造を決定する方法をさらに含む。例えば、未知の結晶構造のＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ系又は複合体についてのＸ線結晶学的データ又はＮＭＲ分光分析データが提供されると、本明細書で言及する物質で定義されるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体の構造を使用して、そのデータが、Ｘ線結晶学の場合のフェーズモデリングによる技術と同じ技術によって未知の系又は複合体の可能性の高い構造を提供すると解釈することができる。従って、本発明は：未知の結晶構造を有するＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ系又は複合体の表現と、本明細書の結晶構造のＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ（９）系及び複合体の類似の表現とを整列させて、相同領域又は類似領域（例えば、相同配列又は類似配列）を一致させるステップ；未知の結晶構造のＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ系又は複合体の一致した相同領域又は類似領域（例えば、配列）の構造を、対応する領域（例えば、配列）の本明細書で言及する物質で定義される構造に基づいてモデリングするステップ；及び、（例えば、低いエネルギーのコンフォメーションが形成されるように好ましい相互作用が生じるべきであることを考慮して）前記一致した相同領域の構造を実質的に保存する未知の結晶構造のコンフォメーションを決定するステップを含み得る。「相同領域」は、例えば、アミノ酸の場合は、例えば、脂肪族、芳香族、極性、負に帯電、又は正に帯電、側鎖の化学基が同一又は同様である２つの配列中のアミノ酸残基を表す。核酸分子の相同領域は、少なくとも８５％、又は８６％、又は８７％、又は８８％、又は８９％、又は９０％、又は９１％、又は９２％、又は９３％、又は９４％、又は９５％、又は９６％、又は９７％、又は９８％、又は９９％の相同性又は同一性を有し得る。同一領域及び類似領域はそれぞれ、時には、当業者によって「不変の」及び「保存された」と呼ばれる。有利なことに、第１のステップと第３のステップは、コンピューターモデリングによって行われる。相同性モデリングは、当業者に周知の技術である（例えば、Ｇｒｅｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｖｏｌ．２２８（１９８５）１０５５、及びＢｌｕｎｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ｖｏｌ  １７２（１９８８），５１３を参照されたい）。本明細書で言及する物質のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９結晶構造の保存された領域のコンピューター表現及び未知の結晶構造のＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ系の保存された領域のコンピューター表現は、未知の結晶構造のＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ系の結晶構造の推定及び決定に役立つ。なおさらに、コンピューター内でＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９結晶構造を利用する本発明の態様は、本明細書のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９結晶構造を用いることによって推測された新たなＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ結晶構造に等しく当てはまり得る。このように、ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ結晶構造のライブラリーを得ることができる。従って、合理的なＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ系の設計が本発明によって提供される。例えば、本明細書に記載の方法によって、ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ系又は複合体のコンフォメーション又は結晶構造を決定することにより、このようなコンフ���メーションを、結晶構造がなお未知である他のＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ系又は複合体のコンフォメーション又は結晶構造を決定するために本明細書のコンピューターベースの方法に使用することができる。これらの結晶構造の全てからのデータを、データベースに入れることができ、そして本明細書の方法は、本明細書の結晶構造又はその一部をライブラリー中の１つ以上の結晶構造と本明細書で比較することによってよりロバストにすることができる。本発明は、ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ系又は複合体の構造を作成し、かつ／又はこの合理的な設計を行うためのシステム、例えば、コンピューターシステムをさらに含む。このシステムは：本明細書で言及する物質に従った原子座標データ又は、例えば、モデリングによって本明細書で言及する物質から得られる原子座標データを含み、前記データは、ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ系若しくは複合体又はその少なくとも１つのドメイン若しくはサブドメインの３次元構造、又はその構造因子データを定義し、前記構造因子データは、本明細書で言及する物質の原子座標データから得ることができる。本発明はまた、コンピューター可読媒体も含み、この可読媒体は：本明細書で言及する物質に従った原子座標データ又は、例えば、相同性モデリングによって本明細書で言及する物質から得られる原子座標データを含み、前記データは、ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ系若しくは複合体又はその少なくとも１つのドメイン若しくはサブドメインの３次元構造、又はその構造因子データを定義し、前記構造因子データは、本明細書で言及する物質の原子座標データから得ることができる。「コンピューター可読媒体」は、コンピューターが読むことができ、かつコンピューターが直接アクセス可能な任意の媒体を指し、限定されるものではないが：磁気媒体；光学媒体；蓄電媒体；クラウド記憶措置、及びこれらのカテゴリーのハイブリッドを含む。このようなコンピューター可読媒体を提供することにより、原子座標データに、モデリング又は他の「コンピューター内での」方法のためにごく普通にアクセスすることができる。本発明は、例えば、購読料を払えば、インターネット又はグローバル通信／コンピューターネットワークを介した、このようなコンピューター可読媒体へのアクセスを可能にすることによってビジネスを行う方法をさらに包含する；又はコンピューターシステムは、購読料を払えばユーザーが利用することができる。「コンピューターシステム」は、本発明の原子座標データを分析するために使用されるハードウェア手段、ソフトウェア手段、及びデータ記憶手段を指す。本発明のコンピューターベースのシステムの最小のハードウェア手段は、中央処理装置（ＣＰＵ）、入力手段、出力手段、及びデータ記憶手段を含み得る。望ましくは、構造データを可視化するためにディスプレイ又はモニターが提供される。本発明は、本明細書に記載の任意の方法又はそのステップで得られる情報又は本明細書に記載の任意の情報を、例えば、電気通信、電話、マスコミ、マスメディア、発表、インターネット、電子メールなどによって送信する方法をさらに包含する。本発明の結晶構造を分析して、ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ系又は複合体のフーリエ電子密度図を作成することができ；有���なことに、３次元構造が、本明細書で言及する物質に従った原子座標データによって定義される。フーリエ電子密度図は、Ｘ線回折パターンに基づいて計算することができる。次いで、これらの図を使用して、結合又は他の相互作用の特徴を決定することができる。電子密度図は、既知のプログラム、例えば、ＣＣＰ４コンピューターパッケージ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｐｒｏｊｅｃｔ，Ｎｏ．４．Ｔｈｅ  ＣＣＰ４  Ｓｕｉｔｅ：Ｐｒｏｇｒａｍｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ，Ｄ５０，１９９４，７６０−７６３）からのプログラムを用いて計算することができる。図の可視化及びモデル構築のために、プログラム、例えば、「ＱＵＡＮＴＡ」（１９９４，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  Ａ４７（１９９１），１１０−１１９）を使用することができる。
【０３１０】
本明細書で言及する物質は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））の原子座標データを提供し、かつ各原子を次の固有の数字で列記する；各アミノ酸残基の化学元素及びその位置（電子密度図及び抗体配列比較によって決定される）、エレメントが位置するアミノ酸残基、鎖ＩＤ、残基の数、それぞれの原子の原子位置（オングストローム単位）を結晶軸に対して定義する座標（例えば、Ｘ、Ｙ、Ｚ）、それぞれの位置における原子の占有率、「Ｂ」、原子の中心の周りの原子の動きを説明する等方性変位パラメーター（平方オングストローム単位）、及び原子番号。
【０３１１】
本発明の特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系又はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の構成成分の結晶構造におけるコンフォメーションの変動は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の機能に重要であり得るヌクレオチド（ＲＮＡ又はＤＮＡ）構造領域に対するタンパク質構造領域の柔軟性又は移動についての重要かつ重大な情報を提供する。本発明におけるＣＲＩＳＰＲ酵素であるＣａｓ９（例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）について提供される構造情報を使用してＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系をさらにエンジニアリングして最適化することができ、そしてこれを外挿して、さらに他のＣＲＩＳＰＲ酵素系における構造と機能の関係、特に他のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素又はＣａｓ９オーソログにおける構造と機能の関係を調べることができる。本発明の一態様は、２．４Åの解像度の、ｓｇＲＮＡ及びその標的ＤＮＡと複合体を形成した化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の結晶構造に関する。この構造は、標的認識ローブ及びヌクレアーゼローブからなる２ローブ構造を明らかにし、その境界面にある正に帯電した溝にｓｇＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖を受容している。認識ローブは、ｓｇＲＮＡとＤＮＡの結合に必須であり、ヌクレアーゼローブは、ＨＮＨヌクレアーゼドメイン及びＲｕｖＣヌクレアーゼドメインを含み、これらのドメインはそれぞれ、標的ＤＮＡの相補鎖及び非相補鎖の切断のために適切に配置される。本明細書で提供されるこの高解像度構造及び機能分析は、Ｃａｓ９によるＲＮＡガイドによるＤＮＡ標的化の分子機序を解明し、最適化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系及びその構成成分を作成するための十分な情報を提供する。
【０３１２】
結晶構造は、Ｃａｓ９によってＲＮＡガイドによるＤＮＡ標的化の分子機序の理解に向けたステップを提供することができる。本明細書の構造及び機能分析は、Ｃａｓ９ベースのゲノム調節技術の合理的なエンジニアリングのための有用な足掛かりを提供し、かつ標的ＤＮＡ上のＰＡＭ配列のＣａｓ９媒介認識又はｓｇＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖間のミスマッチ耐容性についての案内を提供し得る。本発明の態様はまた、切断突然変異にも関連し、例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９切断突然変異は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＣａｓ９のサイズ制約ウイルスベクターへのパッケージング及び治療への適用を容易にし得る。同様に、ＰＡＭ相互作用（ＰＩ）ドメインの未来のエンジニアリングは、ＰＡＭ特異性のプログラミングを可能にし、標的部位認識忠実性を改善し、かつＣａｓ９ゲノムエンジニアリングプラットフォームの汎用性を高めることができる。
【０３１３】
本明細書で提供される構造情報は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のモジュラー又は複数部分型の構成成分のエンジニアリング又は変更又は作製を可能にして全ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の新たな機能を達成する又はその機能を最適化することを可能にする、ＣＲＩＳＰＲ酵素（例えば、Ｃａｓ９）のｓｇＲＮＡ（又はキメラＲＮＡ）及び標的ＤＮＡとの相互作用の問い合わせを可能にする。モジュラー又は複数部分型ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えば、ＳｐＣａｓ９融合構築物は、さらに最適化することができる誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の作製を可能にする。誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の特徴については、参照によりその全開示内容が本明細書に組み入れられる、２０１３年７月２１日に出願され、２０１４年１月３０日にＰＣＴ公開の国際公開第２０１４０１８４２３Ａ２号パンフレットとして公開された「ＩＮＤＵＣＩＢＬＥ  ＤＮＡ  ＢＩＮＤＩＮＧ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ  ＡＮＤ  ＧＥＮＯＭＥ  ＰＥＲＴＵＲＢＡＴＩＯＮ  ＴＯＯＬＳ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ  ＴＨＥＲＥＯＦ」という名称の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０５１４１８号明細書に記載されている。
【０３１４】
一態様では、本発明は、少なくとも１つのスイッチを含み得る天然に存在しない又はエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を提供し、前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の活性は、スイッチについての少なくとも１つの誘導物質エネルギー源との接触によって制御される。本発明の一実施形態では、前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の少なくとも１つのスイッチ又は活性についての制御を活性化する、向上させる、終了する、又は抑制することができる。少なくとも１つの誘導物質エネルギー源との接触は、第１の効果及び第２の効果をもたらし得る。第１の効果は、核内移行、核外移行、二次構成成分（例えば、エフェクター分子）のリクルート、（タンパク質、ＤＮＡ、又はＲＮＡの）コンフォメーション変化、切断、カーゴ（例えば、ケージド分子又は補助因子）の放出、会合、又は解離の１つ以上であり得る。第２の効果は、前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の少なくとも１つのスイッチ又は活性についての制御の活性化、向上、終了、又は抑制の１つ以上であり得る。一実施形態では、第１の効果と第２の効果は続いて起こり得る。
【０３１５】
本発明の別の態様では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、核外移行シグナル（ＮＥＳ）、機能的ドメイン、柔軟性リンカー、突然変異、欠失、変更、又は切断の少なくとも１つ以上をさらに含み得る。ＮＬＳ、ＮＥＳ、又は機能的ドメインの１つ以上は、任意に活性化又は不活性化することができる。別の実施形態では、突然変異は、転写因子相同領域における突然変異、ＤＮＡ結合ドメインにおける突然変異（例えば、ベーシック・へリックス・ループ・へリックスの塩基性残基の突然変異）、内因性ＮＬＳにおける突然変異、又は内因性ＮＥＳにおける突然変異の１つ以上であり得る。本発明は、誘導物質エネルギー源が、熱、超音波、電磁エネルギー、又は化学物質であり得ることを包含する。本発明の好ましい一実施形態では、誘導物質エネルギー源は、抗生物質、小分子、ホルモン、ホルモン誘導体、ステロイド、又はステロイド誘導体であり得る。より好ましい一実施形態では、誘導物質エネルギー源は、アブシジン酸（ＡＢＡ）、ドキシサイクリン（ＤＯＸ）、クミン酸、ラパマイシン、４−ヒドロキシタモキシフェン（４ＯＨＴ）、エストロゲン、又はエクジシンであり得る。本発明は、少なくとも１つのスイッチが、抗生物質ベースの誘導系、電磁エネルギーベースの誘導系、小分子ベースの誘導系、核受容体ベースの誘導系、及びホルモンベースの誘導系からなる群から選択され得ることを提供する。より好ましい一実施形態では、少なくとも１つのスイッチは、テトラサイクリン（Ｔｅｔ）／ＤＯＸ誘導系、光誘導系、ＡＢＡ誘導系、クミン酸受容体／オペレーター系、４ＯＨＴ／エストロゲン誘導系、エクジソンベースの誘導系、及びＦＫＢＰ１２／ＦＲＡＰ（ＦＫＢＰ１２−ラパマイシン複合体）誘導系からなる群から選択され得る。
【０３１６】
本出願で詳述される制御の特徴は、少なくとも１つ以上のスイッチに関連する。本明細書で使用される「スイッチ」という語は、生物学的機能の全ての特徴、例えば、その機能の活性化、抑制、向上、又は終了を含む変化を起こすために協調的に作用する系又は一連の構成成分を指す。一態様では、スイッチという語は、遺伝子調節タンパク質の基本的な構成成分、及びこれらのタンパク質が認識する特定のＤＮＡ配列を含む遺伝的スイッチを包含する。一態様では、スイッチは、遺伝子調節で使用される誘導系及び抑制系に関連する。一般に、誘導系は、遺伝子発現を可能にする一部の分子（誘導物質と呼ばれる）が存在しない限りオフであり得る。この分子は、「発現を誘導する」と言われている。この発現の誘導が起こる方式は、制御機序及び細胞型における差異によって決まる。抑制系は、遺伝子発現を抑制する一部の分子（コリプレッサーと呼ばれる）が存在する場合を除きオンである。この分子は、「発現を抑制する」と言われている。この発現の抑制が起こる方式は、制御機序及び細胞型における差異によって決まる。本明細書で使用される「誘導性」という語は、関与する分子機序にかかわらず、スイッチの全ての特徴を包含し得る。従って、本発明によって包含されるスイッチは、限定されるものではないが、抗生物質ベースの誘導系、電磁エネルギーベースの誘導系、小分子ベースの誘導系、核受容体ベースの誘導系、及びホルモンベースの誘導系を含み得る。好ましい実施形態では、スイッチは、テトラサイクリン（Ｔｅｔ）／ＤＯＸ誘導系、光誘導系、アブシジン酸（ＡＢＡ）誘導系、クミン酸受容体／オペレーター系、４ＯＨＴ／エストロゲン誘導系、エクジソンベースの誘導系、又はＦＫＢＰ１２／ＦＲＡＰ（ＦＫＢＰ１２−ラパマイシン複合体）誘導系であり得る。
【０３１７】
ＣａｓＬＩＴＥは、時間的かつ空間的に正確に個々の内因性遺伝子の発現を調節又は変更するように設計されている。ＣａｓＬＩＴＥで利用されるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、遺伝子発現を変化させるために目的の遺伝子のプロモーター配列に結合するように設計することができる。ＣＲＩＳＰＲ酵素は２つに分割することができ、一方の半分は、クリプトクロムヘテロ二量体（クリプトクロム−２又はＣＩＢ１）の半分に融合し、残りのクリプトクロムパートナーは、ＣＲＩＳＰＲ酵素の他方の半分に融合する。一部の態様では、転写エフェクタードメインも、ＣａｓＬＩＴＥ系に含まれ得る。エフェクタードメインは、アクチベーター、例えば、ＶＰ１６、ＶＰ６４、若しくはｐ６５、又はリプレッサー、例えば、ＫＲＡＢ、ＥｎＲ、若しくはＳＩＤであり得る。ＬＩＴＥの非刺激状態では、半分のＣＲＩＳＰＲ酵素−クリプトクロム２タンパク質は、目的の遺伝子のプロモーターに局在するが、ＣＩＢ１−エフェクタータンパク質に結合しない。ＬＩＴＥの青色スペクトル光の刺激を受けると、クリプトクロム−２は、活性化し、コンフォメーション変化を受け、その結合ドメインが明らかになる。次に、ＣＩＢ１がクリプトクロム−２に結合し、ＣＲＩＳＰＲ酵素の第２の半分が目的の遺伝子のプロモーター領域に局在化し、遺伝子の過剰発現又はサイレンシングを引き起こし得るゲノム編集を開始する。ＬＩＴＥの特徴は、参照によりその全開示内容が本明細書に組み入れられるＬｉｕ，Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００８、及びＫｅｎｎｅｄｙ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１０にさらに記載されている。
【０３１８】
機能をさらに調節し得るアクチベータードメイン及びリプレッサードメインは、種、強度、機序、継続時間、サイズ、又は任意の数の他のパラメーターに基づいて選択することができる。好ましいエフェクタードメインの例としては、限定されるものではないが、トランスポザーゼドメイン、インテグラーゼドメイン、リコンビナーゼドメイン、リゾルバーゼドメイン、インベルターゼドメイン、プロテアーゼドメイン、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメイン、ＤＮＡデメチラーゼドメイン、ヒストンアセチラーゼドメイン、ヒストンデアセチラーゼドメイン、ヌクレアーゼドメイン、リプレッサードメイン、アクチベータードメイン、核局在化シグナルドメイン、転写−タンパク質リクルートドメイン、細胞取り込み活性関連ドメイン、核酸結合ドメイン、又は抗体提示ドメインが挙げられる。
【０３１９】
さらに、化学誘導系を作製するいくつかの方法が存在する：１．アブシジン酸（ＡＢＡ）によって誘導可能なＡＢＩ−ＰＹＬベースの系（例えば、ウェブサイトｓｔｋｅ．ｓｃｉｅｎｃｅｍａｇ．ｏｒｇ／ｃｇｉ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ａｂｓｔｒａｃｔ／ｓｉｇｔｒａｎｓ；４／１６４／ｒｓ２を参照されたい）、２．ラパマイシン（又はラパマイシン系の関連化学物質）によって誘導可能なＦＫＢＰ−ＦＲＢベースの系（例えば、ウェブサイトｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ｎｍｅｔｈ／ｊｏｕｒｎａｌ／ｖ２／ｎ６／ｆｕｌｌ／ｎｍｅｔｈ７６３．ｈｔｍｌを参照されたい）、３．ジベレリン（ＧＡ）によって誘導可能なＧＩＤ１−ＧＡＩベースの系（例えば、ウェブサイトｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ｎｃｈｅｍｂｉｏ／ｊｏｕｒｎａｌ／ｖ８／ｎ５／ｆｕｌｌ／ｎｃｈｅｍｂｉｏ．９２２．ｈｔｍｌを参照されたい）。
【０３２０】
本発明によって企図される別の系は、細胞内局在化における変化に基づいた化学誘導系である。本出願人らは、目的のゲノム遺伝子座を標的とするようにエンジニアリングされた誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系も理解し、この遺伝子座では、Ｃａｓ酵素が２つの誘導構築物に分割され、これらの融合構築物は、化学又はエネルギー感受性タンパク質の異なる部分にさらに連結される。この化学又はエネルギー感受性タンパク質は、化学又はエネルギー移動が化学又はエネルギー感受性タンパク質に結合されると、Ｃａｓ酵素のいずれか半分の細胞内局在化（即ち、Ｃａｓ酵素のいずれか半分の細胞質から細胞の核への移行）における変化をもたらす。再構成されたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の基質の不足により融合構築物の活性が抑制される融合構築物の１つの細胞内区画又は細胞小器官から、基質が存在する別の細胞内区画又は細胞小器官へのこの移行により、構成成分が一緒になって機能活性を取り戻し、そしてその所望の基質（即ち、哺乳動物の核のゲノムＤＮＡ）に接触して、標的遺伝子発現を活性化又は抑制するであろう。
【０３２１】
他の誘導系は、例えば、限定されるものではないが、重金属による調節［Ｍａｙｏ  ＫＥ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １９８２，２９：９９−１０８；Ｓｅａｒｌｅ  ＰＦ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １９８５，５：１４８０−１４８９、及びＢｒｉｎｓｔｅｒ  ＲＬ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）１９８２，２９６：３９−４２］、ステロイドホルモン［Ｈｙｎｅｓ  ＮＥ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９８１，７８：２０３８−２０４２；Ｋｌｏｃｋ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）１９８７，３２９：７３４−７３６、及びＬｅｅ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）１９８１，２９４：２２８−２３２．］、熱ショック［Ｎｏｕｅｒ  Ｌ：Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ：ＣＲＣ；１９９１］が企図され、及び他の試薬も開発された［Ｍｕｌｌｉｃｋ  Ａ，Ｍａｓｓｉｅ  Ｂ：Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ，ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｉｎ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ：Ｓｐｅｉｒ  ＲＥ．Ｗｉｌｅｙ；２０００：１１４０−１１６４、及びＦｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒ  Ｍ，．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ  ２００１，１７：１−５１］。しかしながら、これらの誘導性哺乳動物プロモーターの制限、例えば、「オフ」状態の「漏出（ｌｅａｋｉｎｅｓｓ）」及び誘導物質（熱ショック、重金属、グルココルチコイドなど）の多面発現効果が存在する。哺乳動物細胞での細胞プロセスの妨害を軽減しようとして、昆虫ホルモン（エクジソン）の使用が提案された［Ｎｏ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９６，９３：３３４６−３３５１］。別の洗練された系は、誘導物質［Ｒｉｖｅｒａ  ＶＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １９９６，２：１０２８−１０３２］としてラパマイシンを使用するが、免疫抑制剤としてのラパマイシンの役割は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのその使用の大きな制限であり、従って、遺伝子発現の制御のために生物学的に不活性な化合物［Ｓａｅｚ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２０００，９７：１４５１２−１４５１７］を探すために必要であった。
【０３２２】
ここで、以下の非限定的な実施例によって本発明をさらに説明する。
【実施例】
【０３２３】
以下の実施例は、本発明の様々な実施形態を例示するために記載するものであり、本発明を限定することを一切意図するものではない。本実施例は、本明細書に記載の方法と共に、現在好ましい実施形態の代表であり、例示であり、そして本発明の範囲を限定することを意図するものではない。当業者であれば、特許請求の範囲によって規定される本発明の精神の範囲内に包含される本発明における変化及び他の使用に想到するであろう。
【０３２４】
実施例１：化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９結晶構造に基づいたモジュラー又は複数部分型の誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のエンジニアリング
結晶構造情報（参照によりそれぞれの全開示内容が本明細書に組み入れられる、２０１３年１２月１２日出願の米国仮特許出願第６１／９１５，２５１号明細書、２０１４年１月２２日出願の同第６１／９３０，２１４号明細書、２０１４年４月１５日出願の同第６１／９８０，０１２号明細書；及びＮｉｓｈｉｍａｓｕ  ｅｔ  ａｌ，“Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｃａｓ９  ｉｎ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  Ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ  ａｎｄ  Ｔａｒｇｅｔ  ＤＮＡ，”Ｃｅｌｌ  １５６（５）：９３５−９４９，ＤＯＩ：ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１４．０２．００１（２０１４）に記載されている）は、切断して誘導性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系に組み込むことができるモジュラー又は複数部分型のＣＲＩＳＰＲ酵素を作製するために構造情報を提供する。特に、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）の構造情報が提供され、そしてこれを、他のＣａｓ９オーソログ又は他のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素について外挿することができる。一連の化学誘導性Ｃａｓ９を、２つの構成成分系として構築し、Ｃａｓ９タンパク質の一方の部分はＦＫＢＰに融合され、残りの部分はＦＲＢに融合される（例えば、ＦＫＢＰ−Ｃａｓ９（アミノ酸１〜１０９８）、ＦＲＢ−Ｃａｓ（１０９９−１３６８））（一連の潜在的な融合構築物は図１から決定することができる）。化学誘導の非存在下では、２つの誘導性Ｃａｓ９構成成分の同時トランスフェクションは、触媒活性を示さないが、構成成分の機能的集合をラパマイシン［５ｎＭ〜１０μＭ］を用いて誘導することができる。
【０３２５】
ＳｐＣａｓ９融合構築物を、ギブソンアセンブリーによって作製した。簡単に述べると、ＳｐＣａｓ９、ＦＫＢＰ、及びＦＲＢ断片をＰＣＲ増幅によって作製した。図２に示されているように、ＰＸ３３０からのコドン最適化ＳｐＣａｓ９をＳｐＣａｓ９の鋳型として使用し、ｐＴＢ００５をＦＫＢＰ及びＦＲＢの鋳型として使用した。ＮＬＳの配列、１５のアミノ酸のリンカー、及び２０ｂｐのギブソン相同側をＰＣＲプライマーに組み込んだ（図３）。ＳｐＣａｓ９  ＰＣＲ断片及びＦＫＢＰ又はＦＲＢ  ＰＣＲ断片をベクター主鎖と共に、ギブソンアセンブリー試薬中で１時間インキュベートした。ベクター主鎖は、Ａｇｅ１及びＥｃｏＲ１で切断したＰＸ３３０から調製し、Ｆａｓｔ−ＡＰで処置した（全ての酵素はＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから）（図２）。
【０３２６】
ＮＬＳフリーＦＲＢ−Ｃａｓ９融合断片を、ＮＬＳ配列がプライマーに組み込まれない点を除き、上記のように作製した（図４）。ＮＥＳ−ＦＲＢ−Ｃａｓ９融合断片を、ギブソンアセンブリーによって作製した。簡単に述べると、ＮＥＳ  ｕｌｔｒａｍｅｒ（図４）をアニーリングして、Ａｇｅ１切断ＮＬＳフリーＦＲＢ−Ｃａｓ９融合プラスミドと共にギブソンアセンブリー試薬中で１時間インキュベートした。
【０３２７】
配列検証済み（ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ  ｖｅｒｉｆｉｅｄ）クローンを、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞へのトランスフェクションのために使用した：ＨＥＫ細胞を、それぞれ１００ｎｇのＳｐＣａｓ９−ＦＫＢＰ及びＳＰＣａｓ９−ＦＲＢ並びに１００ｎｇのｓｇＲＮＡガイド標的化ＥＭＸ１でトランスフェクトした。ＳｐＣａｓ９の導入のために、作製細胞を、トランスフェクションの直後に１μｍ  ラパマイシンで処置し、新しいラパマイシンを２４時間ごとに添加した。未処置トランスフェクト細胞を対照として使用した。トランスフェクションの７２時間後に細胞を回収し、標的ＥＭＸ１遺伝子座での挿入欠失情報をＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイによって評価した（図５）。
【０３２８】
実施例２：条件付きゲノム編集及び転写調節のためのＳｐｌｉｔ  Ｃａｓ９構造
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓは、外来ＤＮＡから保護する微生物適応免疫系である１。ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼＣａｓ９は、哺乳動物細胞及び動物モデルのゲノム編集ツールとして適合されている２。キメラ単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を使用すると３、Ｃａｓ９を、哺乳動物細胞の効率的なゲノム編集を容易にするために使用することができる４、５。加えて、触媒不活性Ｃａｓを利用する戦略は、エフェクタータンパク質をゲノム標的に誘導して６〜９、転写調節を達成することができる。ここで、本出願人らは、Ｃａｓ９を２つの断片に分割し、制御された再構築用のラパマイシン感受性二量体化ドメインを用いてゲノム編集及び転写調節を媒介することによってＣａｓ９に化学誘導性を付与できることを実証する。
【０３２９】
ｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９系を開発するために、本出願人らは、ｓｇＲＮＡ及び相補的標的ＤＮＡと複合体を形成したＣａｓ９の結晶構造に基づいて１１の潜在的なスプリット部位を同定した１０。５つの部位が非構造領域に位置し、６つが、タンパク質表面のループに位置する（図６Ａ及び図８Ａ）。得られるＣ末端Ｃａｓ９断片及びＮ末端Ｃａｓ９断片をそれぞれ、ラパマイシンの哺乳動物標的ｍＴＯＲ）のＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ）及びＦＫＢＰラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメイン１１に融合させた（図８Ｂ及び図６Ｂ）。本出願人らは、既に検証されたｓｇＲＮＡを用いてヒト胎児腎２９３ＦＴ（ＨＥＫ２９３ＦＴ）細胞のＥＭＸ１遺伝子座を標的にすることによって１１全てのｓｐｌｉｔ−Ｃａｓ９セットを試験した４。ＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼアッセイを用いることにより、本出願人らは、ラパマイシンで処置された細胞の全てのｓｐｌｉｔ−Ｃａｓ９セットによって媒介される挿入／欠失（挿入欠失）突然変異を検出することができた。加えて、適度なレベルの挿入欠失を、ラパマイシンの非存在下でも検出することができる（図８Ｃ〜図８Ｄ）。観察されたバックグラウンド活性は、カウンターパートのないスプリット断片が、ＳＵＲＶＥＹＯＲでは検出可能なレベルの挿入欠失を示さなかったため（データは不図示）、個々のスプリット断片の残存ヌクレアーゼ活性によるものではなかった。二量体化ドメインが欠損したｓｐｌｉｔ−Ｃａｓ９の小さいセットを使用することにより、本出願人らは、Ｃａｓのスプリット断片が、細胞内で自己構築することができることを見出し（図８Ｅ〜図８Ｇ）、これは、観察されたバックグラウンド活性の説明となる。
【０３３０】
ｓｐｌｉｔ−Ｃａｓ９系のバックグラウンド活性がＣａｓ９の自然の自己構築によるものであることを立証した後、本出願人らは、各Ｃａｓ９断片を空間的に別個に維持することで、バックグラウンド活性を低減できると仮定した１２。Ｃａｓ９（Ｎ）−ＦＲＢ断片を、核局在化Ｃａｓ９（Ｃ）−ＦＫＢＰ断片と二量体を形成する可能性が低い細胞質内に隔離するために、本出願人らは、Ｃａｓ９（Ｎ）−ＦＲＢの２つの核局在化配列（ＮＬＳ）を、ヒトタンパク質チロシンキナーゼ２１３（Ｃａｓ９（Ｎ）−ＦＲＢ−ＮＥＳ）からの単一核外移行配列（ＮＥＳ）で置換した。ラパマイシンの存在下で、Ｃａｓ９（Ｎ）−ＦＲＢ−ＮＥＳがＣａｓ９（Ｃ）−ＦＫＢＰ−２ｘＮＬＳと二量体を形成して完全なＣａｓ９タンパク質を再構築し、核輸送のバランスが核内移行に向かい、ＤＮＡ標的が可能となる（図６Ｃ〜図６Ｄ）。本出願人らは、この戦略をスプリット−４及びスプリット−５で試験し（図６Ａ）、高レベルの活性が示され（図８Ｄ）、単一ＮＥＳが、バックグラウンド活性をＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイの検出限界よりも低くするのに十分であることが分かった（図６Ｅ）。本出願人らのデータは、細胞内のＣａｓ９−ＦＲＢ／ＦＫＢＰスプリット断片の空間的隔離が、ラパマイシン活性化二量体化と組み合わせられると、Ｃａｓ９ヌクレアーゼの誘導活性が可能となることを示している。
【０３３１】
高用量のＣａｓ９は、ガイド鎖に対するミスマッチを殆ど示さない標的外（ＯＴ）配列の挿入欠失頻度を悪化させることができる１４。このような配列は、ミスマッチが非連続的であり、かつ／又はガイド４、１４、１５のシード領域の外側である場合は、特に影響を受けやすい。時間が経つと、ＯＴ部位の挿入欠失の蓄積が、構成的に発現されるＣａｓ９で観察される１６。本出願人らは、Ｃａｓ９活性の一時的な制御を使用して、長期の発現実験の用量を低下させることができ、従って構成的に活性なＣａｓ９と比較して標的外の挿入欠失が低減する。このために、本出願人らは、スプリット−５用のｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲプラスミド１６（ｌｅｎｔｉ  ｓｐｌｉｔ−Ｃａｓ９  スプリット−５用のＬＳＣ−５）に類似したｓｐｌｉｔ−Ｃａｓ９レンチウイルス構築物を作製した（図６Ｆ）。スプリット断片及びピューロマイシン耐性遺伝子（ｐｕｒｏ）の両方が、伸長因子１α短鎖（ＥＦＳ）プロモーターの制御下である。ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞は、０．３以下のＭＯＩで形質導入し、ピューロマイシンで５日間選択した。
【０３３２】
１２日間の２００ｎＭ  ラパマイシンでの連続処置を考慮して、Ｗｔ−Ｃａｓ９形質導入ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を、形質導入の４週間後にディープシークエンシングによって分析する一方、ＬＳＣ−５形質導入細胞は６週間後に分析した（図６Ｇ）。ｗｔ−Ｃａｓ９及び既に検証されたＥＭＸ１標的ｓｇＲＮＡ４の両方を有するレンチウイルスで形質導入された細胞において、本出願人らは、標的上の部位での約９５％の挿入欠失及び４つの検証された標的外の部位（ＯＴ−１〜４）での突然変異を検出した１７。これに対して、ＬＳＣ−５で形質導入された細胞における標的上の挿入欠失頻度は、ラパマイシン処置の１２日後に約４３％であった。未処置細胞では、ＬＳＣ−５と対照サンプルとの間では、ＥＭＸ１標的上の挿入欠失における有意差を検出できなかった。さらに、ラパマイシン処置にかかわらず、ＬＳＣ−５で形質導入された細胞では、ＯＴ挿入欠失の有意な増加が検出できなかった（一方向ＡＮＯＶＡ、ｐ＞０．９９９９）。これらのデータは、ｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９の安定した低いコピー発現を使用して、標的外の部位での有意な突然変異を伴うことなく、標的遺伝子座で相当な挿入欠失を誘導できることを実証している。
【０３３３】
加えて、Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性は、ＤＮＡ結合能力を阻害することなく不活性化することができる。得られる触媒活性のないＣａｓ９（ｄＣａｓ９）を使用して、トランス活性化ドメインを標的遺伝子座に輸送することができる７。本出願人らは、ｓｐｌｉｔ−Ｃａｓ９構造をｄＣａｓ９に適用して誘導性転写活性化を媒介できることを示そうとした。このために、本出願人らは、ＦＲＢ融合体（ｄＣａｓ９（Ｎ）−ＦＲＢ−２ｘＮＥＳ）におけるＤ１０Ａ点突然変異及びＦＫＢＰ融合体におけるＮ８６３Ａ点突然変異を有するスプリット−４断片をクローニングし、ＶＰ６４トランス活性化ドメインをＣａｓ９（Ｃ）−ＦＫＢＰ−２ｘＮＬＳ（ｄＣａｓ９（Ｃ）−ＦＫＢＰ−２ｘＮＬＳ−ＶＰ６４）に追加した（図７Ａ）。これらの断片が、触媒活性のないＣａｓ９−ＶＰ６４融合体（ｄＣａｓ９−ＶＰ６４）を再構成する。
【０３３４】
本出願人らは、１つの遺伝子に対して既に検証した４つのｓｇＲＮＡ７を用いて、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞でＡＳＣＬ１、ＭＹＯＤ１、又はＩＬ１ＲＮ転写を活性化させることによってｓｐｌｉｔ  ｄＣａｓ９−ＰＶ６４の誘導性を試験した。トランスフェクションの２４時間後に細胞をラパマイシンで処置し、トランスフェクションの４８時間後のＲＮＡの回収まで２００ｎＭ  ラパマイシンで維持した。非トランスフェクトＨＥＫ２９３ＦＴと比較したｍＲＮＡレベルの有意な上昇を、定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により３つ全ての遺伝子について検出することができるであろう（一方向ＡＮＯＶＡ、ＡＳＣＬ１  ｐ＜０．０００１、ＭＹＯＤ１  ｐ＜０．０００１、ＩＬ１ＲＮ  ｐ＜０．０００１）（図７Ｂ）。バックグラウンド活性は、ラパマイシン誘導細胞と比較して低く（＋ラパマイシン／−ラパマイシン比、ＡＳＣＬ１＝７７、ＭＹＯＤ１＝２９、ＩＬ１ＲＮ＝６４９）、非トランスフェクト細胞と比較して有意でなかった（一方向ＡＮＯＶＡ、ｐ＞０．９９）。従って、転写活性化を、ラパマイシンの存在下でｓｐｌｉｔ  ｄＣａｓ９−ＶＰ６４によって誘導した。
【０３３５】
ラパマイシンの使用を中止すると、転写活性化が元に戻るかを試験するために、本出願人らは、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞でのＡＳＣＬ１の発現、及びＮ２Ａ細胞でのＮｅｕｒｏｇ２の発現を活性化した（図７Ｃ）。トランスフェクションの２４時間後に細胞をラパマイシンで処置した。ラパマイシンは、２時間後に使用停止するか、又は継続的な誘導のために２４時間ごとに交換した。ラパマイシン処置の２時間後、６時間後、１２時間後、２４時間後、及び７２時間後に細胞を回収し、ｍＲＮＡレベルをｑＰＣＲによって分析した。ＡＳＣＬ１及びＮｅｕｒｏｇ２のレベルが、試験全体を通じて上昇し、継続的なラパマイシン処置と２時間の処置との間に有意差はなかった（相関係数、ＡＳＣＬ１＝１、Ｎｅｕｒｏｇ２＝１）。
【０３３６】
本出願人らは、Ｃａｓ９を２つの異なる断片に分割することができ、化学誘導を用いて１つに戻されると、機能的な完全長Ｃａｓ９ヌクレアーゼに戻ることを実証した。ｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９構造は、様々な適用例に有用である。例えば、ｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９は、各断片を異なる組織特異的プロモーターの下に置くことによってＣａｓ９活性を共通部分の細胞集団に制限する遺伝子戦略を可能にする。加えて、異なる化学誘導二量体化ドメイン、例えば、ＡＰＡ１８及びジベレリン１９を利用して、異なる調節ドメインに融合した誘導性Ｃａｓ９のアレイを作製して合成転写ネットワークを構築することもできる。
【０３３７】
材料及び方法
ｓｐｌｉｔ−Ｃａｓ９の設計及び構築
個々のｓｐｌｉｔ−Ｃａｓ９プラスミドを、ギブソンアセンブリー・クローニング２０（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏｌａｂｓのＧｉｂｓｏｎ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ）によって作製した。簡単に述べると、個々のｓｐｌｉｔ−Ｃａｓ９断片を、ＰＸ３３０からＰＣＲで増幅して、ＦＫＢＰ／ＦＲＢ断片を、ｇＢｌｏｃｋｓ  Ｇｅｎｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により増幅した。ギブソン相同性、グリシン−セリンリンカー、Ｐ２Ａ、ＮＬＳ、及び／又はＮＥＳ配列を、以下のプライマーを用いてＰＣＲによって導入した：
【化１】
2017503485.tif 000008
【化２】
2017503485.tif 000009
【化３】
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【０３３８】
ＬＣＳ−５を、ＰＣＲ鋳型として既に作製したｓｐｌｉｔ−Ｃａｓ９断片を用いてギブソンアセンブリーによって作製した。トランス活性化ｓｐｌｉｔ  ｄＣａｓ９−ＶＰ６４を、ＰＣＲ鋳型としてＤ１０Ａ、Ｎ８６３Ａ突然変異Ｃａｓ９を用いて作製し、ギブソン相同性のＶＰ６４をｇＢｌｏｃｋｓ  Ｇｅｎｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）として購入した。
【０３３９】
細胞培養、トランスフェクション、及びラパマイシン処置
ヒト胎児腎２９３ＦＴ（ＨＥＫ２９３ＦＴ）細胞株（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びマウスＮｅｕｒｏ  ２ａ（Ｎ２ａ）細胞株（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を、１０％  ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）、２ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンが添加されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で、３７℃、５％  ＣＯ２インキュベーションで維持した。ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を、トランスフェクションの２４時間前に２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種した。製造者の推奨するプロトコルに従って、細胞を、８０〜９０％の細胞密集度でＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてトランスフェクトした。２４ウェルプレートの各ウェルに対して、合計５００ｎｇのＤＮＡを使用した。ｓｐｌｉｔ−Ｃａｓ９トランスフェクションでは、２００ｎｇのＦＫＢＰ−Ｃａｓ９及び２００ｎｇのＦＲＢ−Ｃａｓ９＋１００ｎｇのＵ６−ｓｇＲＮＡ  ＰＣＲ製品を使用した。ｗｔ−Ｃａｓ９では、２００ｎｇのＰＸ３３０及び２００ｎｇのｐＵＣ１９＋１００ｎｇのＵ６−ｓｇＲＮＡ  ＰＣＲ製品を使用した。転写活性化のために、２００ｎｇのＦＫＢＰ−Ｃａｓ９及び２００ｎｇのＦＲＢ−Ｃａｓ９＋それぞれ２５ｎｇの４つのガイドを運ぶプラスミドでトランスフェクトした。
【０３４０】
Ｓｐｌｉｔ−Ｃａｓ９二量体化を、２００ｎＭ  ラパマイシン（Ａｂｃａｍ）で誘導した。特段の記載がない限り、ラパマイシン含有培地を２４時間ごとに、２００ｎＭ  ラパマイシンを含む新鮮な培地に交換した。
【０３４１】
ゲノム改変についてのＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼアッセイ
ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を、上記のようにＤＮＡでトランスフェクトした。細胞を、ゲノムＤＮＡ抽出の前のトランスフェクションの７２時間後に３７℃でインキュベートした。ゲノムＤＮＡを、製造者のプロトコルに従ってＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ  ＤＮＡ抽出溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を用いて抽出した。簡単に述べると、ペレット化細胞をＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ溶液で再懸濁し、６５℃で１５分間、６８℃で１５分間、そして９８℃で１０分間インキュベートした。各遺伝子のＣＲＩＳＰＲ標的部位に隣接したゲノム領域を、以下の標的部位及びプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。
【０３４２】
ＳＵＲＶＥＹＯＲ−アッセイ及びＮｅｘｔ−Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇのアンプリコンを作製するために使用したプライマー。
【０３４３】
【表６】
2017503485.tif 000011
【０３４４】
製造者のプロトコルに従って、産物を、ＱｉａＱｕｉｃｋスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。合計２００ｎｇの精製ＰＣＲ産物を、１μｌの１０×Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼＰＣＲ緩衝液（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）及び超純水と混合して１０μｌの最終容量にし、再アニーリング処理を行ってヘテロ二重鎖の形成を可能にした：９５℃で１０分間保持し、１秒に２℃下げて９５℃〜８５℃にし、１秒に０．２５℃下げて８５℃〜２５℃にし、そして２５℃で１分間保持した。再アニーリング後、製造者の推奨するプロトコルに従って、産物を、ＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼ及びＳＵＲＶＥＹＯＲエンハンサーＳ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃｓ）で処置し、４〜２０％  Ｎｏｖｅｘ  ＴＢＥポリアクリルアミドゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で分析した。ゲルをＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡ染色（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で３０分間染色し、Ｇｅｌ  Ｄｏｃゲルイメージングシステム（Ｂｉｏ−ｒａｄ）で画像化した。定量は、相対バンド強度を基にした。挿入欠失率を、式、１００×（１−（１−（ｂ＋ｃ）／（ａ＋ｂ＋ｃ））１／２）によって決定した。式中、ａは、未消化ＰＣＲ産物の積分強度であり、ｂ及びｃは、各切断産物の積分強度である。
【０３４５】
標的特異性を評価するためのディープシークエンシング
２４ウェルプレートにプレーティングしたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を、ゲノムＤＮＡ抽出の７２時間前にＣａｓ９プラスミドＤＮＡ及びｓｇＲＮＡ  ＰＣＲカセットでトランスフェクトした。ＥＭＸ１又は標的外のＣＲＩＳＰＲ標的部位に隣接したゲノム領域を、融合ＰＣＲ法によって増幅し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｐ５アダプター及びユニークなサンプル特異的バーコードを、以下のプライマーで標的アンプリコン１４に付着させた。
【０３４６】
Ｃａｓ９結合を誘導するために使用したガイド。
【０３４７】
【表７】
2017503485.tif 000012
【０３４８】
ＰＣＲ産物を、製造者の推奨するプロトコルに従って、ＱｉａＱｕｉｃｋスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いるゲル抽出によって精製した。バーコード化されて精製されたＤＮＡサンプルを、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ  ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡアッセイキット又はＱｕｂｉｔ  ２．０蛍光光度計（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって定量し、等モル比でプールした。次いで、シークエンシングライブラリーを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑパーソナルシーケンサー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてシークエンシングした。
【０３４９】
シークエンシングデータ分析及び挿入欠失の検出
ＭｉＳｅｑ測定値を、少なくとも３０の平均Ｐｈｒｅｄ品質（Ｑスコア）、及びバーコード及びアンプリコンフォワードプライマーに対する完全な配列一致を要求することでフィルタリングした。標的上及び標的外の遺伝子座からの測定値を、標的部位の３０ｎｔ上流及び下流（合計８０ｂｐ）を含む遺伝子座配列に対して、Ｐｙｔｈｏｎ  ｄｉｆｆｌｉｂモジュールで実施されるＲａｔｃｌｉｆｆ−Ｏｂｅｒｓｈｅｌｐ文字列比較を行うことによって分析した。生じた編集操作を解析し、測定値を、挿入又は欠失の操作が見つかったときは挿入欠失としてカウントした。分析した標的領域は、そのアラインメントの一部がＭｉＳｅｑ測定値自体の範囲外である又は６以上の塩基が不必要であった場合は廃棄した。
【０３５０】
相対遺伝子発現のｐＰＣＲ分析
ＲＮＡを、製造者の取扱説明書に従ってＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出し、サンプルに付き１μｇのＲＮＡを、ｑＳｃｒｉｐｔ（Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて逆転写した。相対ｍＲＮＡレベルを、標的遺伝子に特異的なＴａｑＭａｎプローブ及び内因性対照（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）としてのＧＡＰＤＨを用いて、逆転写及び定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって測定した。ＴａｑＭａｎプローブのＩＤは次の通りである。
【０３５１】
【表８】
2017503485.tif 000013
【０３５２】
ΔΔＣｔ分析を使用して、２００ｎＭ  ラパマイシンで処置された非トランスフェクト細胞に対する倍数変化を得た。この結果は、本明細書で述べた図６、図７、及び図８に示されている。
【０３５３】
実施例２の参照文献
１．Ｂａｒｒａｎｇｏｕ，Ｒ．＆  Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ，Ｌ．Ａ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ：Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ  ｕｐｇｒａｄｅ  ｔｏ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌ  ５４，２３４−２４４（２０１４）．
２．Ｈｓｕ，Ｐ．Ｄ．，Ｌａｎｄｅｒ，Ｅ．Ｓ．＆  Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｆｏｒ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｃｅｌｌ  １５７，１２６２−１２７８（２０１４）．
３．Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ｄｕａｌ−ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ＤＮＡ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）３３７，８１６−８２１（２０１２）．
４．Ｃｏｎｇ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）３３９，８１９−８２３（２０１３）．
５．Ｍａｌｉ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｖｉａ  Ｃａｓ９．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９，８２３−８２６（２０１３）．
６．Ｍａｅｄｅｒ，Ｍ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  １０，９７７−９７９（２０１３）．
７．Ｐｅｒｅｚ−Ｐｉｎｅｒａ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｇｅｎｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９−ｂａｓｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  １０，９７３−９７６（２０１３）．
８．Ｑｉ，Ｌ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ  ａｓ  ａｎ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｃｅｌｌ  １５２，１１７３−１１８３（２０１３）．
９．Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｌ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．ＣＲＩＳＰＲ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｍｏｄｕｌａｒ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ．Ｃｅｌｌ  １５４，４４２−４５１（２０１３）．
１０．Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｃａｓ９  ｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ｔａｒｇｅｔ  ＤＮＡ．Ｃｅｌｌ  １５６，９３５−９４９（２０１４）．
１１．Ｂａｎａｓｚｙｎｓｋｉ，Ｌ．Ａ．，Ｌｉｕ，Ｃ．Ｗ．＆  Ｗａｎｄｌｅｓｓ，Ｔ．Ｊ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＦＫＢＰ・Ｒａｐａｍｙｃｉｎ・ＦＲＢ  Ｔｅｒｎａｒｙ  Ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １２７，４７１５４７２１（２００５）．
１２．Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｏｐｔｉｃａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｔａｔｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ５００，４７２−４７６（２０１３）．
１３．Ｏｓｓｏｖｓｋａｙａ，Ｖ．，Ｌｉｍ，Ｓ．Ｔ．，Ｏｔａ，Ｎ．，Ｓｃｈｌａｅｐｆｅｒ，Ｄ．Ｄ．＆  Ｉｌｉｃ，Ｄ．ＦＡＫ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｅｘｐｏｒｔ  ｓｉｇｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５８２，２４０２−２４０６（２００８）．
１４．Ｈｓｕ，Ｐ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．ＤＮＡ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  Ｃａｓ９  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３１，８２７−８３２（２０１３）．
１５．Ｆｕ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｉｇｈ−ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３１，８２２−８２６（２０１３）．
１６．Ｓｈａｌｅｍ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ−ｓｃａｌｅ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）３４３，８４−８７（２０１４）．
１７．Ｒａｎ，Ｆ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｏｕｂｌｅ  ｎｉｃｋｉｎｇ  ｂｙ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９  ｆｏｒ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｃｅｌｌ  １５４，１３８０−１３８９（２０１３）．
１８．Ｌｉａｎｇ，Ｆ．Ｓ．，Ｈｏ，Ｗ．Ｑ．＆  Ｃｒａｂｔｒｅｅ，Ｇ．Ｒ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ＡＢＡ  ｐｌａｎｔ  ｓｔｒｅｓｓ  ｐａｔｈｗａｙ  ｆｏｒ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ４，ｒｓ２（２０１１）．
１９．Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｌｏｇｉｃ  ｇａｔｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ａ  ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｎａｔｕｒｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ８，４６５−４７０（２０１２）．
２０．Ｇｉｂｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｕｐ  ｔｏ  ｓｅｖｅｒａｌ  ｈｕｎｄｒｅｄ  ｋｉｌｏｂａｓｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６，３４３−３４５（２００９）．
【０３５４】
実施例３  ｓｇＲＮＡ及びＳｐｌｉｔ  Ｃａｓ９の送達用の単一発現ベクター
方法：ベクターを、図９Ａに示されているように作製した。ｓｇＲＮＡは、Ｕ６プロモーターの制御下であった。２つの異なるＣａｓ９のスプリットを使用した：実施例２のスプリット４及び５。ｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９構築物は：ＧｌｙＳｅｒリンカーによってｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９のＣ末端部分にＦＫＢＰが融合した、ＮＬＳに隣接した、第１のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物；及びＧｌｙＳｅｒリンカーによってｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９のＮ末端部分である、ＮＥＳに隣接した、第２のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物を基にした。第１と第２のＣＲＩＳＰＲ酵素融合構築物を分離するために、Ｐ２Ａを使用して転写時に分割した。この分割は、「リボソームスキップ」によるものである。本質的には、リボソームは、翻訳中にアミノ酸をスキップし、これによりタンパク質鎖が切断され、２つの別個のタンパク質となる。他の特徴には、ポリＡ尾部及び環状プラスミド（発現カセット）が含まれる。ベクターを、ガイド標的ＥＭＸ１（実施例２で使用されたガイドと同じ）を用いてＨＥＫ２９３ＦＴ細胞で試験した。５００ｎｇの単一発現ベクターで、２４ウェルでトランスフェクトした。約７２時間のラパマイシン処置を行った（２４時間ごとに新鮮なラパマイシンに取り換えた）。挿入欠失をディープシークエンシングによって検出した。
【０３５５】
結果：かなり高いバックグラウンドが見られたが、このアプローチにはメリットがあることは明らかである。図９Ｂにおける左側の３つのカラムはラパマイシンを含み、右側の３つのカラムはラパマイシンを含んでいない。ラパマイシンの存在対非存在で予想されるように野生型酵素間には殆ど差異がなかったが、ラパマイシンの存在又は非存在における２つのｓｐｌｉｔ  Ｃａｓ９（スプリット−４とスプリット−５）での結果の間には大きな差異が存在した。これらのＳｐｌｉｔ  Ｃａｓ９は、ラパマイシンの存在下では野生型に類似した挿入欠失の発生を示したが、ラパマイシンの非存在下では野生型よりも著しく少ない挿入欠失の発生を示した。
【０３５６】
全体の参照文献：
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１８．Ｇａｓｉｕｎａｓ，Ｇ．，Ｂａｒｒａｎｇｏｕ，Ｒ．，Ｈｏｒｖａｔｈ，Ｐ．＆  Ｓｉｋｓｎｙｓ，Ｖ．Ｃａｓ９−ｃｒＲＮＡ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＤＮＡ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｆｏｒ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（２０１２）．
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３３．Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ，Ｌ．Ａ．＆  Ｓｏｎｔｈｅｉｍｅｒ，Ｅ．Ｊ．Ｓｅｌｆ  ｖｅｒｓｕｓ  ｎｏｎ−ｓｅｌｆ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ  ４６３，５６８−５７１（２０１０）．
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３７．Ｃｏｎｇ  Ｌ，Ｒａｎ  ＦＡ，Ｃｏｘ  Ｄ，Ｌｉｎ  Ｓ，Ｂａｒｒｅｔｔｏ  Ｒ，Ｈａｂｉｂ  Ｎ，Ｈｓｕ  ＰＤ，Ｗｕ  Ｘ，Ｊｉａｎｇ  Ｗ，Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ  ＬＡ，Ｚｈａｎｇ  Ｆ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｕｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１３  Ｆｅｂ  １５；３３９（６１２１）：８１９−２３．
３８．Ｍａｌｉ，Ｐ．，Ｙａｎｇ，Ｌ．，Ｅｓｖｅｌｔ，Ｋ．Ｍ．，Ａａｃｈ，Ｊ．，Ｇｕｅｌｌ，Ｍ．，ＤｉＣａｒｌｏ，Ｊ．Ｅ．，Ｎｏｒｖｉｌｌｅ，Ｊ．Ｅ．，ａｎｄ  Ｃｈｕｒｃｈ，Ｇ．Ｍ．（２０１３ｂ）．ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｖｉａ  Ｃａｓ９．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９，８２３−８２６．
３９．Ｈｏｓｋｉｎｓ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ｓｔｒａｉｎ  Ｒ６．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８３，５７０９−５７１７（２００１）．
４０．Ｈａｖａｒｓｔｅｉｎ，Ｌ．Ｓ．，Ｃｏｏｍａｒａｓｗａｍｙ，Ｇ．＆  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｄ．Ａ．Ａｎ  ｕｎｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｈｅｐｔａｄｅｃａｐｅｐｔｉｄｅ  ｐｈｅｒｏｍｏｎｅ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２，１１１４０−１１１４４（１９９５）．
４１．Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉ，Ｓ．＆  Ｗｅｉｓｂｌｕｍ，Ｂ．Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｍａｐ  ｏｆ  ｐＣ１９４，ａ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｔｈａｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｅｓ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５０，８１５−８２５（１９８２）．
４２．Ｈｏｒｔｏｎ，Ｒ．Ｍ．Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ：ＳＯＥｉｎｇ  Ｔｏｇｅｔｈｅｒ  Ｔａｉｌｏｒ−Ｍａｄｅ  Ｇｅｎｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５，２５１−２６１（１９９３）．
４３．Ｐｏｄｂｉｅｌｓｋｉ，Ａ．，Ｓｐｅｌｌｅｒｂｅｒｇ，Ｂ．，Ｗｏｉｓｃｈｎｉｋ，Ｍ．，Ｐｏｈｌ，Ｂ．＆  Ｌｕｔｔｉｃｋｅｎ，Ｒ．Ｎｏｖｅｌ  ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｇｒｏｕｐ  Ａ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ（ＧＡＳ）．Ｇｅｎｅ  １７７，１３７−１４７（１９９６）．
４４．Ｈｕｓｍａｎｎ，Ｌ．Ｋ．，Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｒ．，Ｌｉｎｄａｈｌ，Ｇ．＆  Ｓｔｅｎｂｅｒｇ，Ｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｒｐ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ａ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆａｍｉｌｙ，ｉｓ  ｎｏｔ  ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｏ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６３，３４５−３４８（１９９５）．
４５．Ｇｉｂｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｕｐ  ｔｏ  ｓｅｖｅｒａｌ  ｈｕｎｄｒｅｄ  ｋｉｌｏｂａｓｅｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６，３４３−３４５（２００９）．
４６．Ｇａｒｎｅａｕ  Ｊ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｃｌｅａｖｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ａｎｄ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ．Ｎａｔｕｒｅ  ４６８，６７−７１（０４  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２０１０）
４７．Ｂａｒｒａｎｇｏｕ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．ＣＲＩＳＰＲ  ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｉｎ  ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００７  Ｍａｒ  ２３；３１５（５８１９）：１７０９−１２．
４８．Ｉｓｈｉｎｏ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉａｐ  ｇｅｎｅ，ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  ｆｏｒ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｉｓｏｚｙｍｅ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８７  Ｄｅｃ；１６９（１２）：５４２９−３３．
４９．Ｍｏｊｉｃａ  Ｆ．Ｊ．Ｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ａ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｓｐａｃｅｄ  ｒｅｐｅａｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ｏｆ  Ａｒｃｈａｅａ，Ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２０００）３６（１），２４４−２４６．
５０．Ｊａｎｓｅｎ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｔｈａｔ  ａｒｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ＤＮＡ  ｒｅｐｅａｔｓ  ｉｎ  ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００２）４３（６），１５６５−１５７５．
５１．Ｇｏｕｅｔ，Ｐ．，Ｃｏｕｒｃｅｌｌｅ，Ｅ．，Ｓｔｕａｒｔ，Ｄ．Ｉ．，ａｎｄ  Ｍｅｔｏｚ，Ｆ．（１９９９）．ＥＳＰｒｉｐｔ：ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ＰｏｓｔＳｃｒｉｐｔ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １５，３０５−３０８．
５２．Ｎｏｔｒｅｄａｍｅ，Ｃ．，Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．，ａｎｄ  Ｈｅｒｉｎｇａ，Ｊ．（２０００）．Ｔ−Ｃｏｆｆｅｅ：Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｆａｓｔ  ａｎｄ  ａｃｃｕｒａｔｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３０２，２０５−２１７．
５３．Ａｄａｍｓ，Ｐ．Ｄ．，Ｇｒｏｓｓｅ−Ｋｕｎｓｔｌｅｖｅ，Ｒ．Ｗ．，Ｈｕｎｇ，Ｌ．Ｗ．，Ｉｏｅｒｇｅｒ，Ｔ．Ｒ．，ＭｃＣｏｙ，Ａ．Ｊ．，Ｍｏｒｉａｒｔｙ，Ｎ．Ｗ．，Ｒｅａｄ，Ｒ．Ｊ．，Ｓａｃｃｈｅｔｔｉｎｉ，Ｊ．Ｃ．，Ｓａｕｔｅｒ，Ｎ．Ｋ．，ａｎｄ  Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ，Ｔ．Ｃ．（２００２）．ＰＨＥＮＩＸ：ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｎｅｗ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｆｏｒ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ５８，１９４８−１９５４．
５４．Ａｒｉｙｏｓｈｉ，Ｍ．，Ｖａｓｓｙｌｙｅｖ，Ｄ．Ｇ．，Ｉｗａｓａｋｉ，Ｈ．，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｈ．，Ｓｈｉｎａｇａｗａ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｍｏｒｉｋａｗａ，Ｋ．（１９９４）．Ａｔｏｍｉｃ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＲｕｖＣ  ｒｅｓｏｌｖａｓｅ：ａ  ｈｏｌｌｉｄａｙ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｅ．ｃｏｌｉ．Ｃｅｌｌ  ７８，１０６３−１０７２．
５５．Ｂｉｅｒｔｕｍｐｆｅｌ，Ｃ．，Ｙａｎｇ，Ｗ．，ａｎｄ  Ｓｕｃｋ，Ｄ．（２００７）．Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｔ４  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＶＩＩ  ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ  ａ  Ｈｏｌｌｉｄａｙ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ４４９，６１６−６２０．
５６．Ｃｈｅｎ，Ｌ．，Ｓｈｉ，Ｋ．，Ｙｉｎ，Ｚ．，ａｎｄ  Ａｉｈａｒａ，Ｈ．（２０１３）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｓｙｍｍｅｔｒｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＲｕｖＣ  ｄｉｍｅｒ  ｓｕｇｇｅｓｔｓ  ａ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｓｔｒａｎｄ  ｃｌｅａｖａｇｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  Ｈｏｌｌｉｄａｙ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４１，６４８−６５６．
５７．ｄｅｌａＦｏｒｔｅｌｌｅ，Ｅ．，ａｎｄ  Ｂｒｉｃｏｇｎｅ，Ｇ．（１９９７）．Ｍａｘｉｍｕｍ−ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  ｈｅａｖｙ−ａｔｏｍ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ  ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｉｓｏｍｏｒｐｈｏｕｓ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｍｕｌｔｉｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ  ａｎｏｍａｌｏｕｓ  ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２７６，４７２−４９４．
５８．Ｅｍｓｌｅｙ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｃｏｗｔａｎ，Ｋ．（２００４）．Ｃｏｏｔ：ｍｏｄｅｌ−ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｒａｐｈｉｃｓ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ６０，２１２６−２１３２．
５９．Ｆｏｎｆａｒａ，Ｉ．，Ｌｅ  Ｒｈｕｎ，Ａ．，Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ，Ｋ．，Ｍａｋａｒｏｖａ，Ｋ．Ｓ．，Ｌｅｃｒｉｖａｉｎ，Ａ．Ｌ．，Ｂｚｄｒｅｎｇａ，Ｊ．，Ｋｏｏｎｉｎ，Ｅ．Ｖ．，ａｎｄ  Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ，Ｅ．（２０１３）．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ  ｏｆ  Ｃａｓ９  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｘｃｈａｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｄｕａｌ−ＲＮＡ  ａｎｄ  Ｃａｓ９  ａｍｏｎｇ  ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．
６０．Ｆｕ，Ｙ．，Ｆｏｄｅｎ，Ｊ．Ａ．，Ｋｈａｙｔｅｒ，Ｃ．，Ｍａｅｄｅｒ，Ｍ．Ｌ．，Ｒｅｙｏｎ，Ｄ．，Ｊｏｕｎｇ，Ｊ．Ｋ．，ａｎｄ  Ｓａｎｄｅｒ，Ｊ．Ｄ．（２０１３）．Ｈｉｇｈ−ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３１，８２２−８２６．
６１．Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｌ．Ａ．，Ｌａｒｓｏｎ，Ｍ．Ｈ．，Ｍｏｒｓｕｔ，Ｌ．，Ｌｉｕ，Ｚ．，Ｂｒａｒ，Ｇ．Ａ．，Ｔｏｒｒｅｓ，Ｓ．Ｅ．，Ｓｔｅｒｎ−Ｇｉｎｏｓｓａｒ，Ｎ．，Ｂｒａｎｄｍａｎ，Ｏ．，Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ，Ｅ．Ｈ．，Ｄｏｕｄｎａ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．ＣＲＩＳＰＲ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｍｏｄｕｌａｒ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ．Ｃｅｌｌ  １５４，４４２−４５１．
６２．Ｇｏｒｅｃｋａ，Ｋ．Ｍ．，Ｋｏｍｏｒｏｗｓｋａ，Ｗ．，ａｎｄ  Ｎｏｗｏｔｎｙ，Ｍ．（２０１３）．Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ＲｕｖＣ  ｒｅｓｏｌｖａｓｅ  ｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  Ｈｏｌｌｉｄａｙ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ４１，９９４５−９９５５．
６３．Ｇｒａｔｚ，Ｓ．Ｊ．，Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ａ．Ｍ．，Ｎｇｕｙｅｎ，Ｊ．Ｎ．，Ｈａｍｍ，Ｄ．Ｃ．，Ｄｏｎｏｈｕｅ，Ｌ．Ｋ．，Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｍ．Ｍ．，Ｗｉｌｄｏｎｇｅｒ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ−Ｇｉｌｅｓ，Ｋ．Ｍ．（２０１３）．Ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  Ｃａｓ９  ｎｕｃｌｅａｓｅ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９４，１０２９−１０３５．
６４．Ｈｏｌｍ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎｓｔｒｏｍ，Ｐ．（２０１０）．Ｄａｌｉ  ｓｅｒｖｅｒ：ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｉｎ  ３Ｄ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３８，Ｗ５４５−５４９．
６５．Ｈｓｕ，Ｐ．Ｄ．，Ｓｃｏｔｔ，Ｄ．Ａ．，Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ａ．，Ｒａｎ，Ｆ．Ａ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．，Ａｇａｒｗａｌａ，Ｖ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ｆｉｎｅ，Ｅ．Ｊ．，Ｗｕ，Ｘ．，Ｓｈａｌｅｍ，Ｏ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．ＤＮＡ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  Ｃａｓ９  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３１，８２７−８３２．
６６．Ｈｗａｎｇ，Ｗ．Ｙ．，Ｆｕ，Ｙ．，Ｒｅｙｏｎ，Ｄ．，Ｍａｅｄｅｒ，Ｍ．Ｌ．，Ｔｓａｉ，Ｓ．Ｑ．，Ｓａｎｄｅｒ，Ｊ．Ｄ．，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ｔ．，Ｙｅｈ，Ｊ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｊｏｕｎｇ，Ｊ．Ｋ．（２０１３）．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３１，２２７−２２９．
６７．Ｋａｂｓｃｈ，Ｗ．（２０１０）．Ｘｄｓ．Ａｃｔａ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｄ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  ６６，１２５−１３２．
６８．Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．，Ｂｒｉｇｈａｍ，Ｍ．Ｄ．，Ｔｒｅｖｉｎｏ，Ａ．Ｅ．，Ｈｓｕ，Ｐ．Ｄ．，Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ，Ｍ．，Ｃｏｎｇ，Ｌ．，Ｐｌａｔｔ，Ｒ．Ｊ．，Ｓｃｏｔｔ，Ｄ．Ａ．，Ｃｈｕｒｃｈ，Ｇ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｚｈａｎｇ，Ｆ．（２０１３）．Ｏｐｔｉｃａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｔａｔｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ５００，４７２−４７６．
６９．Ｌｉ，Ｃ．Ｌ．，Ｈｏｒ，Ｌ．Ｉ．，Ｃｈａｎｇ，Ｚ．Ｆ．，Ｔｓａｉ，Ｌ．Ｃ．，Ｙａｎｇ，Ｗ．Ｚ．，ａｎｄ  Ｙｕａｎ，Ｈ．Ｓ．（２００３）．ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ  ｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｖｖｎ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｗｉｔｈ  ａ  ｋｎｏｗｎ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ．Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  ｊｏｕｒｎａｌ  ２２，４０１４−４０２５．
７０．Ｍａｅｄｅｒ，Ｍ．Ｌ．，Ｌｉｎｄｅｒ，Ｓ．Ｊ．，Ｃａｓｃｉｏ，Ｖ．Ｍ．，Ｆｕ，Ｙ．，Ｈｏ，Ｑ．Ｈ．，ａｎｄ  Ｊｏｕｎｇ，Ｊ．Ｋ．（２０１３）．ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  １０，９７７−９７９．
７１．Ｍａｌｉ，Ｐ．，Ａａｃｈ，Ｊ．，Ｓｔｒａｎｇｅｓ，Ｐ．Ｂ．，Ｅｓｖｅｌｔ，Ｋ．Ｍ．，Ｍｏｏｓｂｕｒｎｅｒ，Ｍ．，Ｋｏｓｕｒｉ，Ｓ．，Ｙａｎｇ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｃｈｕｒｃｈ，Ｇ．Ｍ．（２０１３ａ）．ＣＡＳ９  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｐａｉｒｅｄ  ｎｉｃｋａｓｅｓ  ｆｏｒ  ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３１，８３３−８３８．
７２．Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ，Ｌ．Ａ．，ａｎｄ  Ｓｏｎｔｈｅｉｍｅｒ，Ｅ．Ｊ．（２００８）．ＣＲＩＳＰＲ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｌｉｍｉｔｓ  ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ  ｂｙ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＤＮＡ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２２，１８４３−１８４５．
７３．Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ，Ｌ．Ａ．，ａｎｄ  Ｓｏｎｔｈｅｉｍｅｒ，Ｅ．Ｊ．（２０１０）．ＣＲＩＳＰＲ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：ＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  ａｒｃｈａｅａ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  １１，１８１−１９０．
７４．Ｍｏｊｉｃａ，Ｆ．Ｊ．，Ｄｉｅｚ−Ｖｉｌｌａｓｅｎｏｒ，Ｃ．，Ｇａｒｃｉａ−Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｊ．，ａｎｄ  Ａｌｍｅｎｄｒｏｓ，Ｃ．（２００９）．Ｓｈｏｒｔ  ｍｏｔｉｆ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  ｔｈｅ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  ＣＲＩＳＰＲ  ｄｅｆｅｎｃｅ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５５，７３３−７４０．
７５．Ｐａｔｔａｎａｙａｋ，Ｖ．，Ｌｉｎ，Ｓ．，Ｇｕｉｌｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｐ．，Ｍａ，Ｅ．，Ｄｏｕｄｎａ，Ｊ．Ａ．，ａｎｄ  Ｌｉｕ，Ｄ．Ｒ．（２０１３）．Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ＤＮＡ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｒｅｖｅａｌｓ  ＲＮＡ−ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｃａｓ９  ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３１，８３９−８４３．
７６．Ｐｅｒｅｚ−Ｐｉｎｅｒａ，Ｐ．，Ｋｏｃａｋ，Ｄ．Ｄ．，Ｖｏｃｋｌｅｙ，Ｃ．Ｍ．，Ａｄｌｅｒ，Ａ．Ｆ．，Ｋａｂａｄｉ，Ａ．Ｍ．，Ｐｏｌｓｔｅｉｎ，Ｌ．Ｒ．，Ｔｈａｋｏｒｅ，Ｐ．Ｉ．，Ｇｌａｓｓ，Ｋ．Ａ．，Ｏｕｓｔｅｒｏｕｔ，Ｄ．Ｇ．，Ｌｅｏｎｇ，Ｋ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｇｅｎｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９−ｂａｓｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  １０，９７３−９７６．
７７．Ｑｉ，Ｌ．Ｓ．，Ｌａｒｓｏｎ，Ｍ．Ｈ．，Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｌ．Ａ．，Ｄｏｕｄｎａ，Ｊ．Ａ．，Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｊ．Ｓ．，Ａｒｋｉｎ，Ａ．Ｐ．，ａｎｄ  Ｌｉｍ，Ｗ．Ａ．（２０１３）．Ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ  ａｓ  ａｎ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｃｅｌｌ  １５２，１１７３−１１８３．
７８．Ｒａｎ，Ｆ．Ａ．，Ｈｓｕ，Ｐ．Ｄ．，Ｌｉｎ，Ｃ．Ｙ．，Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｓ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．，Ｔｒｅｖｉｎｏ，Ａ．Ｅ．，Ｓｃｏｔｔ，Ｄ．Ａ．，Ｉｎｏｕｅ，Ａ．，Ｍａｔｏｂａ，Ｓ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．Ｄｏｕｂｌｅ  ｎｉｃｋｉｎｇ  ｂｙ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９  ｆｏｒ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｃｅｌｌ  １５４，１３８０−１３８９．
７９．Ｓａｍｐｓｏｎ，Ｔ．Ｒ．，Ｓａｒｏｊ，Ｓ．Ｄ．，Ｌｌｅｗｅｌｌｙｎ，Ａ．Ｃ．，Ｔｚｅｎｇ，Ｙ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓ，Ｄ．Ｓ．（２０１３）．Ａ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｅｖａｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ４９７，２５４−２５７．
８０．Ｓｈａｌｅｍ，Ｏ．，Ｓａｎｊａｎａ，Ｎ．Ｅ．，Ｈａｒｔｅｎｉａｎ，Ｅ．，Ｓｈｉ，Ｘ．，Ｓｃｏｔｔ，Ｄ．Ａ．，Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ，Ｔ．Ｓ．，Ｈｅｃｋｌ，Ｄ．，Ｅｂｅｒｔ，Ｂ．Ｌ．，Ｒｏｏｔ，Ｄ．Ｅ．，Ｄｏｅｎｃｈ，Ｊ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．Ｇｅｎｏｍｅ−ｓｃａｌｅ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４３，８４−８７．
８１．Ｓｈｅｌｄｒｉｃｋ，Ｇ．Ｍ．（２００８）．Ａ  ｓｈｏｒｔ  ｈｉｓｔｏｒｙ  ｏｆ  ＳＨＥＬＸ．Ａｃｔａ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ａ，Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  ６４，１１２−１２２．
８２．Ｓｐｉｌｍａｎ，Ｍ．，Ｃｏｃｏｚａｋｉ，Ａ．，Ｈａｌｅ，Ｃ．，Ｓｈａｏ，Ｙ．，Ｒａｍｉａ，Ｎ．，Ｔｅｒｎｓ，Ｒ．，Ｔｅｒｎｓ，Ｍ．，Ｌｉ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｓｔａｇｇ，Ｓ．（２０１３）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎ  ＲＮＡ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌ  ５２，１４６−１５２．
８３．Ｗａｎｇ，Ｈ．，Ｙａｎｇ，Ｈ．，Ｓｈｉｖａｌｉｌａ，Ｃ．Ｓ．，Ｄａｗｌａｔｙ，Ｍ．Ｍ．，Ｃｈｅｎｇ，Ａ．Ｗ．，Ｚｈａｎｇ，Ｆ．，ａｎｄ  Ｊａｅｎｉｓｃｈ，Ｒ．（２０１３）．Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｅ  ｃａｒｒｙｉｎｇ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｇｅｎｅｓ  ｂｙ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｃｅｌｌ  １５３，９１０−９１８．
８４．Ｗａｎｇ，Ｔ．，Ｗｅｉ，Ｊ．Ｊ．，Ｓａｂａｔｉｎｉ，Ｄ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｌａｎｄｅｒ，Ｅ．Ｓ．（２０１４）．Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｃｒｅｅｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｓｙｓｔｅｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４３，８０−８４．
８５．Ｗｉｅｄｅｎｈｅｆｔ，Ｂ．，Ｌａｎｄｅｒ，Ｇ．Ｃ．，Ｚｈｏｕ，Ｋ．，Ｊｏｒｅ，Ｍ．Ｍ．，Ｂｒｏｕｎｓ，Ｓ．Ｊ．，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｏｏｓｔ，Ｊ．，Ｄｏｕｄｎａ，Ｊ．Ａ．，ａｎｄ  Ｎｏｇａｌｅｓ，Ｅ．（２０１１）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｆｒｏｍ  ａ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｎａｔｕｒｅ  ４７７，４８６−４８９．
８６．Ｗｉｎｎ，Ｍ．Ｄ．，Ｂａｌｌａｒｄ，Ｃ．Ｃ．，Ｃｏｗｔａｎ，Ｋ．Ｄ．，Ｄｏｄｓｏｎ，Ｅ．Ｊ．，Ｅｍｓｌｅｙ，Ｐ．，Ｅｖａｎｓ，Ｐ．Ｒ．，Ｋｅｅｇａｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｋｒｉｓｓｉｎｅｌ，Ｅ．Ｂ．，Ｌｅｓｌｉｅ，Ａ．Ｇ．，ＭｃＣｏｙ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＣＰ４  ｓｕｉｔｅ  ａｎｄ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ．Ａｃｔａ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｄ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  ６７，２３５−２４２．
８７．Ｙａｎｇ，Ｈ．，Ｗａｎｇ，Ｈ．，Ｓｈｉｖａｌｉｌａ，Ｃ．Ｓ．，Ｃｈｅｎｇ，Ａ．Ｗ．，Ｓｈｉ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｊａｅｎｉｓｃｈ，Ｒ．（２０１３）．Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｅ  ｃａｒｒｙｉｎｇ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ａｎｄ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ａｌｌｅｌｅｓ  ｂｙ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｃｅｌｌ  １５４，１３７０−１３７９．
８８．Ｐａｕｌｍｕｒｕｇａｎ  ａｎｄ  Ｇａｍｂｈｉｒ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，Ａｕｇｕｓｔ  １５，２００５  ６５；７４１３）．
８９．Ｃｒａｂｔｒｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １３，９９−１０７，Ｊａｎ  ２００６）．
【０３５７】
本発明の好ましい実施形態を本明細書に示して説明してきたが、当業者には、このような実施形態が単なる例として示されることは明白であろう。当業者であれば、本発明から逸脱することなく様々なバリエーション、変形形態、及び置換形態にすぐに想到するであろう。本明細書に記載の本発明の実施形態の様々な変更形態を本発明の実施に利用できることを理解されたい。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を規定し、これらの特許請求の範囲内の方法及び構造並びにその等価物が本発明に包含されるものとする。
【図１Ａ−Ｄ】
2017503485.tif 000014
【図２Ａ−Ｂ】
2017503485.tif 000015
【図３Ａ】
2017503485.tif 000016
【図３Ｂ】
2017503485.tif 000017
【図３Ｃ】
2017503485.tif 000018
【図４Ａ】
2017503485.tif 000019
【図４Ｂ】
2017503485.tif 000020
【図４Ｃ】
2017503485.tif 000021
【図５Ａ−Ｃ】
2017503485.tif 000022
【図６Ａ−Ｄ】
2017503485.tif 000023
【図６Ｅ−Ｇ】
2017503485.tif 000024
【図７Ａ−Ｃ】
2017503485.tif 000025
【図８Ａ−Ｇ】
2017503485.tif 000026
【図９Ａ−Ｂ】
2017503485.tif 000027
【国際調査報告】
2017503485.tif 000028
2017503485.tif 000029
2017503485.tif 000030