(57)【要約】  試料から微生物細胞を単離し、試料から真核生物ＤＮＡを抽出し、かつ試料中の微生物種を同定するための方法およびデバイスが本明細書で開示される。
2017527301.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象からの試料中の１つまたは複数の特定の微生物種を同定するための方法であって、
試料から真核生物ＤＮＡを枯渇させること；
試料中の１つまたは複数の微生物細胞を溶解すること、ここで１つまたは複数の微生物細胞の溶解は、複数の微生物遺伝物質を放出させる；
複数の微生物遺伝物質を単離すること；
複数の微生物遺伝物質を増幅すること；
増幅された微生物遺伝物質を複数のＤＮＡ侵入人工核酸（ＤＩＡＮＡ）と接触させること、ここで複数のＤＩＡＮＡは、配列番号１〜３７からなる群から選択される配列を含む；および
微生物のそのそれぞれの単一種または群の微生物遺伝物質への１つまたは複数のＤＩＡＮＡの結合を検出すること、ここで結合の検出は、試料中の１つまたは複数の特定の微生物種または微生物の群の存在を示す
を含む方法。
【請求項２】
単離された複数のゲノム物質が精製される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
試料から真核生物ＤＮＡを枯渇させることが、真核細胞溶解用溶液を試料に添加することを含み、真核細胞溶解用溶液が、微生物細胞に対して真核細胞を選択的に標的としかつ優勢に溶解する、請求項１から２の１項に記載の方法。
【請求項４】
試料と組み合わせられた真核細胞溶解用溶液が約０．２５％〜１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ界面活性剤、約０．２％〜０．６５％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎまたはＩＧＥＰＡＬを含み、約６〜９のｐＨを有する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
遊離の真核生物ＤＮＡが、約０．１Ｍ〜０．８５Ｍの一価の塩濃度を有する約６〜９のｐＨの条件下で陰イオン性−交換微小粒子を使用して血液反応から除去される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
試料が血液または痰である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
対象が哺乳動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
哺乳動物がヒトである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
複数の微生物遺伝物質を単離することが、微生物遺伝物質を陰イオン性−交換微小粒子に結合させ、微生物遺伝物質を結合させた後、陰イオン−交換微小粒子を洗浄することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
単離された微生物遺伝物質がＲＮＡ、ＤＮＡ、またはその組合せである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ＤＮＡが一本鎖または二本鎖である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
試料中の１つまたは複数の微生物細胞を溶解することが、１つまたは複数の微生物細胞を、ＤＮＡインターカレーティング色素を含む溶解緩衝液と接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ＤＮＡインターカレーティング色素が、エチジウムモノアジド（ＥＭＡ）、プロピジウムモノアジド（ＰＭＡ）、またはその組合せから選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
微生物遺伝物質を結合させた後、陰イオン−交換微小粒子を洗浄することが、単離された複数の微生物遺伝物質を、約３〜７．５のｐＨ、少なくとも１つの一価の塩であって、一価の塩濃度が約０．７５Ｍ〜２．７５Ｍである一価の塩、少なくとも１つの非イオン性洗浄剤であって、非イオン性洗浄剤濃度が約０．０１％〜１．０％（ｖ／ｖ）である非イオン性洗浄剤、および少なくとも１つの両性イオン性洗浄剤であって、両性イオン性洗浄剤濃度が約０．１×〜４００×ＣＭＣである両性イオン性洗浄剤を含む洗浄緩衝液と接触させることを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
複数の微生物遺伝物質を増幅することが約４００〜２０００ｂｐのアンプリコンを得ることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ＤＩＡＮＡが１つまたは複数のリンカーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
リンカーが、長さが約４０〜２００原子である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＤＩＡＮＡが１つまたは複数の結合部分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
多方向の流れを可能にする複数の相互接続されたチャンバーを含むカートリッジであって：
第１のチャンバーが反応チャンバーであり、第１のチャンバーが約１０μｌ〜１０ｍｌの試料を受け取るように構成されており；
第２のチャンバーが溶解用溶液貯蔵チャンバーであり；
第３のチャンバーが溶解終結溶液貯蔵チャンバーであり；
第４のチャンバーが陰イオン交換樹脂貯蔵チャンバーであり；
第５のチャンバーがアウトプットチャンバーである、カートリッジ；および
複数の流れチャネルを含む流体デバイスであって、
第１の流れチャネルが第１のチャンバーを第２のチャンバーに連結し、
第２の流れチャネルが第１のチャンバーを第３のチャンバーに連結し、
第３の流れチャネルが第１のチャンバーを第４のチャンバーに連結し、
第４の流れチャネルが第１のチャンバーを第５のチャンバーに連結する、流体デバイス
を含むデバイス。
【請求項２０】
流体デバイスが流れゲートをさらに含み、流れゲートが２つ以上のチャンバーを連結する流れチャネル間に配置されている、請求項１９に記載のデバイス。
【請求項２１】
流体デバイスが１つまたは複数のニューマチックインターフェースをさらに含み、ニューマチックインターフェースが少なくとも１つのチャンバーに流体連結されている、請求項１９に記載のデバイス。
【請求項２２】
陰イオン交換樹脂貯蔵チャンバーが陰イオン交換樹脂を含む、請求項１９に記載のデバイス。
【請求項２３】
陰イオン交換樹脂貯蔵チャンバーが、支持基板にコンジュゲートしている陰イオン交換樹脂を含む、請求項１９に記載のデバイス。
【請求項２４】
溶解用溶液貯蔵チャンバーが真核生物溶解用溶液を含み、試料と組み合わせられた真核生物溶解用溶液が約０．２５％〜１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ界面活性剤および約０．２％〜０．６５％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎまたはＩＧＥＰＡＬを含む、請求項１９に記載のデバイス。
【請求項２５】
Ｔｗｅｅｎ界面活性剤が、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｔｗｅｅｎ−４０、およびＴｗｅｅｎ−８０からなる群から選択される、請求項２４に記載のデバイス。
【請求項２６】
ＴｒｉｔｏｎがＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００またはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４である、請求項２４に記載のデバイス。
【請求項２７】
ＩＧＥＰＡＬが、ＩＧＥＰＡＬ  ＣＯ−５２０、ＩＧＥＰＡＬ  ＣＯ−６３０、およびＩＧＥＰＡＬ  ＣＯ−７２０からなる群から選択される、請求項２４に記載のデバイス。
【請求項２８】
流体撹拌がチャンバーの１つまたは複数中への無菌気体の流れによって作製される、請求項１９に記載のデバイス。
【請求項２９】
独立型デバイスである、請求項１９に記載のデバイス。
【請求項３０】
デバイスが第２のデバイス中のモジュールであり、第２のデバイスがモジュールの上流および／または下流処理を行う、請求項１９に記載のデバイス。
【請求項３１】
１つまたは複数のＤＩＡＮＡを含む組成物であって、ＤＩＡＮＡが、配列番号１〜３７からなる群から選択される配列を有する、組成物。
【請求項３２】
１つまたは複数のＤＩＡＮＡが固体支持体に結合している、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
１つまたは複数のＤＩＡＮＡが検出可能なマーカーを含む、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３４】
試料から真核生物ＤＮＡを枯渇させるための方法であって、真核細胞溶解用溶液を試料に添加することを含み、真核細胞溶解用溶液が、請求項１９に記載のデバイスを使用して、微生物細胞に対して真核細胞を選択的に標的としかつ優勢に溶解する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１４年９月１７日に提出された米国仮出願第６２／０５１，４４７号の利益およびこれへの優先権を主張し、その内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれている。
政府支援
本発明は、国立保健研究所（ＮＩＨ）によって与えられた契約番号第Ｒ４３−ＯＤ０１６４６６号および第Ｒ４３ＡＩ１０９９１３号の下、政府の支援により行われた。政府は、本発明における一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
以下の説明は、読者の理解を助けるために提供される。提供された情報も引用された参考文献も本明細書で開示された組成物および方法への先行技術であると認められない。
血流感染（ＢＳＩ）は、米国における死亡の６番目に多い原因および最も費用が掛かる病院治療状態になるまで高まった。ＢＳＩは、全てのＩＣＵ利用の２５％および米国における全ての病院死のおよそ５０％を占める。ＢＳＩは、細菌または真菌によって典型的に引き起こされ、効果的な疾患管理には、それらの早期のかつ正確な同定が必要である。ＢＳＩは、典型的には、潜在的な病原体を同定するために最大数日かかる一連の血液培養を通して同定される。
分子診断法は、適切なタイミングで、非常に詳細な情報を介護者に提供する。感染症の場合、いくつかの病原体は、類似した病態生理学的症状をしばしば誘発するので、治療プロトコールを処方する際、感染病原体の同定が重要である。しかしながら、多くの病原体種は、決まって、治療の潜在的な諸ラインに対して大きく異なった応答を示す。
微生物病原体を同定するための分子診断法は、それらのそれぞれのゲノム物質中の保存された領域を探索することによって行われ得る。ゲノム同定のための方法は、病原性ＤＮＡの単離および検出を含む。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
一態様では、本テクノロジーは、対象からの試料中の１つまたは複数の特定の微生物種を同定するための方法であって、試料から真核生物ＤＮＡを枯渇させること；試料中の１つまたは複数の微生物細胞を溶解することであって、複数の微生物遺伝物質を放出させる、溶解すること；複数の微生物遺伝物質を単離すること；複数の微生物遺伝物質を増幅すること；増幅された微生物遺伝物質を複数のＤＮＡ侵入人工核酸（ＤＮＡ  Ｉｎｖａｄｉｎｇ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）（ＤＩＡＮＡ）と接触させることであって、複数のＤＩＡＮＡが、配列番号１〜３７からなる群から選択される配列を含む、接触させること；および微生物のそのそれぞれの単一種または群の微生物遺伝物質への１つまたは複数のＤＩＡＮＡの結合を検出することであって、結合の検出が試料中の１つまたは複数の特定の微生物種または微生物の群の存在を示す、検出することを含む方法を提供する。
【０００４】
一部の実施形態では、単離された複数のゲノム物質は、精製される。
一部の実施形態では、試料から真核生物ＤＮＡを枯渇させることは、真核細胞溶解用溶液を試料に添加することであって、真核細胞溶解用溶液が、微生物細胞に対して真核細胞を選択的に標的としかつ優勢に溶解する、添加することを含む。
一部の実施形態では、試料と組み合わせられた真核細胞溶解用溶液は、約０．２５％〜１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ界面活性剤、約０．２％〜０．６５％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎまたはＩＧＥＰＡＬを含み、約６〜９のｐＨを有する。
一部の実施形態では、遊離の真核生物ＤＮＡは、約０．１Ｍ〜０．８５Ｍの一価の塩濃度を有する約６〜９のｐＨの条件下で陰イオン性−交換（ａｎｉｏｎｉｃ−ｅｘｃｈａｎｇｅ）微小粒子を使用して血液反応から除去される。
【０００５】
一部の実施形態では、試料は、血液または痰である。
一部の実施形態では、対象は、哺乳動物である。一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。
一部の実施形態では、複数の微生物遺伝物質を単離することは、微生物遺伝物質を陰イオン性−交換微小粒子に結合させ、微生物遺伝物質を結合させた後、陰イオン−交換微小粒子を洗浄することを含む。
【０００６】
一部の実施形態では、単離された微生物遺伝物質は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはその組合せである。一部の実施形態では、ＤＮＡは、一本鎖または二本鎖である。
一部の実施形態では、試料中の１つまたは複数の微生物細胞を溶解することは、１つまたは複数の微生物細胞を、ＤＮＡインターカレーティング色素（ＤＮＡ  ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ  ｄｙｅ）を含む溶解緩衝液と接触させることを含む。
一部の実施形態では、ＤＮＡインターカレーティング色素は、エチジウムモノアジド（ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｍｏｎａｚｉｄｅ）（ＥＭＡ）、プロピジウムモノアジド（ＰＭＡ）、またはその組合せから選択される。
【０００７】
一部の実施形態では、微生物遺伝物質を結合させた後、陰イオン−交換微小粒子を洗浄することは、単離された複数の微生物遺伝物質を、約３〜７．５のｐＨ、少なくとも１つの一価の塩であって、一価の塩濃度が約０．７５Ｍ〜２．７５Ｍである一価の塩、少なくとも１つの非イオン性洗浄剤であって、非イオン性洗浄剤濃度が約０．０１％〜１．０％（ｖ／ｖ）である非イオン性洗浄剤、および少なくとも１つの両性イオン性洗浄剤であって、両性イオン性洗浄剤濃度が約０．１×〜４００×ＣＭＣである両性イオン性洗浄剤を含む洗浄緩衝液と接触させることを含む。
一部の実施形態では、複数の微生物遺伝物質を増幅することは、約４００〜２０００ｂｐのアンプリコンを生ずることを含む。
一部の実施形態では、ＤＩＡＮＡは、１つまたは複数のリンカーを含む。一部の実施形態では、リンカーは、長さが約４０〜２００原子である。
【０００８】
一部の実施形態では、ＤＩＡＮＡは、１つまたは複数の結合部分を含む。
別の態様では、本テクノロジーは、多方向の流れを可能にする複数の相互接続されたチャンバーを含むカートリッジであって、第１のチャンバーが反応チャンバーであり、第１のチャンバーが約１０μｌ〜１０ｍｌの試料を受け取るように構成されており；第２のチャンバーが溶解用溶液貯蔵チャンバーであり；第３のチャンバーが溶解終結溶液（ｌｙｓｉｓ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）貯蔵チャンバーであり；第４のチャンバーが陰イオン交換樹脂貯蔵チャンバーであり；第５のチャンバーがアウトプットチャンバーである、カートリッジ；および流体デバイス（ｆｌｕｉｄｉｃ  ｄｅｖｉｃｅ）であって、複数の流れチャネル（ｆｌｏｗ  ｃｈａｎｎｅｌ）を含む流体デバイスであって、第１の流れチャネルが第１のチャンバーを第２のチャンバーに連結し、第２の流れチャネルが第１のチャンバーを第３のチャンバーに連結し、第３の流れチャネルが第１のチャンバーを第４のチャンバーに連結し、かつ第４の流れチャネルが第１のチャンバーを第５のチャンバーに連結する、流体デバイスを含むデバイスを提供する。
一部の実施形態では、流体デバイスは、流れゲート（ｆｌｏｗ−ｇａｔｅ）であって、２つ以上のチャンバーを連結する流れチャネル間に配置されている流れゲートをさらに含む。
一部の実施形態では、流体デバイスは、１つまたは複数のニューマチックインターフェース（ｐｎｅｕｍａｔｉｃ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）であって、少なくとも１つのチャンバーに流体連結（ｆｌｕｉｄ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ）されているニューマチックインターフェースをさらに含む。
【０００９】
一部の実施形態では、陰イオン交換樹脂貯蔵チャンバーは、陰イオン交換樹脂を含む。
一部の実施形態では、陰イオン交換樹脂貯蔵チャンバーは、支持基板にコンジュゲートしている陰イオン交換樹脂を含む。
一部の実施形態では、溶解用溶液貯蔵チャンバーは、真核生物溶解用溶液を含み、試料と組み合わせられた真核生物溶解用溶液は、約０．２５％〜１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ界面活性剤および約０．２％〜０．６５％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎまたはＩＧＥＰＡＬを含む。
一部の実施形態では、Ｔｗｅｅｎ界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｔｗｅｅｎ−４０、およびＴｗｅｅｎ−８０からなる群から選択される。一部の実施形態では、Ｔｒｉｔｏｎは、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００またはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４である。
【００１０】
一部の実施形態では、ＩＧＥＰＡＬは、ＩＧＥＰＡＬ  ＣＯ−５２０、ＩＧＥＰＡＬ  ＣＯ−６３０、およびＩＧＥＰＡＬ  ＣＯ−７２０からなる群から選択される。
一部の実施形態では、流体撹拌は、チャンバーの１つまたは複数中への無菌気体（ｓｔｅｒｉｌｅ  ｇａｓ）の流れによって作製される。
一部の実施形態では、デバイスは、独立型デバイスである。一部の実施形態では、デバイスは、第２のデバイス中のモジュールであり、ここで、第２のデバイスは、モジュールの上流および／または下流処理を行う。
別の態様では、本テクノロジーは、１つまたは複数のＤＩＡＮＡを含む組成物であって、ＤＩＡＮＡが、配列番号１〜３７からなる群から選択される配列を有する組成物を提供する。
一部の実施形態では、１つまたは複数のＤＩＡＮＡは、固体支持体に結合している。
一部の実施形態では、１つまたは複数のＤＩＡＮＡは、検出可能なマーカーを含む。
【００１１】
別の態様では、本テクノロジーは、試料から真核生物ＤＮＡを枯渇させるための方法であって、真核細胞溶解用溶液を試料に添加することであって、真核細胞溶解用溶液が、デバイスを使用して、微生物細胞に対して真核細胞を選択的に標的としかつ優勢に溶解する、添加することを含む方法を提供し、このデバイスは、多方向の流れを可能にする複数の相互接続されたチャンバーを含むカートリッジであって、第１のチャンバーが反応チャンバーであり、第１のチャンバーが約１０μｌ〜１０ｍｌの試料を受け取るように構成されており；第２のチャンバーが溶解用溶液貯蔵チャンバーであり；第３のチャンバーが溶解終結溶液貯蔵チャンバーであり；第４のチャンバーが陰イオン交換樹脂貯蔵チャンバーであり；第５のチャンバーがアウトプットチャンバーである、カートリッジ；および複数の流れチャネルを含む流体デバイスであって、第１の流れチャネルが第１のチャンバーを第２のチャンバーに連結し、第２の流れチャネルが第１のチャンバーを第３のチャンバーに連結し、第３の流れチャネルが第１のチャンバーを第４のチャンバーに連結し、かつ第４の流れチャネルが第１のチャンバーを第５のチャンバーに連結する、流体デバイスを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】溶液から真核生物ＤＮＡを除去するための典型的な、非限定的なプロセスを示す概略図である。
【図２Ａ】溶液から真核生物ＤＮＡを除去するためのデバイスの典型的な、非限定的な実施形態の俯瞰図である。
【図２Ｂ】溶液から真核生物ＤＮＡを除去するためのデバイスの典型的な、非限定的な実施形態の開かれた俯瞰図である。
【図２Ｃ】溶液から真核生物ＤＮＡを除去するためのデバイスの典型的な、非限定的な実施形態の下面図である。
【図３】溶解緩衝液を使用した全血からのヒトＤＮＡ（ｈＤＮＡ）の抽出のための典型的な、非限定的な方法を示す概略図である。
【図４】溶解緩衝液が真核細胞を標的とすることを示す典型的な、非限定的な方法を示す概略図である。
【図５】試料から真核生物ＤＮＡを除去するための典型的な、非限定的な方法を示す概略図である。
【図６】残存物ヒトＤＮＡ（ｈＤＮＡ）がオンベンチとオンチップアッセイの両方に関するＰＣＲプロセスに著しく影響を及ぼさないことを示すゲルである。
【図７】ヒト血液試料中の黄色ブドウ球菌の検出を示すチャートである。ここで、黄色ブドウ球菌が高負荷および低負荷で血液試料に播種された。
【図８】ヒト血液試料中の表皮ブドウ球菌の検出を示すチャートである。ここで、表皮ブドウ球菌が高負荷および低負荷で血液試料に播種された。
【図９】ヒト血液試料中のスタフィロコッカス・ルグドゥネンシスの検出を示すチャートである。ここで、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシスが高負荷および低負荷で血液試料に播種された。
【図１０】ヒト血液試料中のストレプトコッカス・アガラクチアの検出を示すチャートである。ここで、ストレプトコッカス・アガラクチアが高負荷および低負荷で血液試料に播種された。
【図１１】ヒト血液試料中の肺炎球菌の検出を示すチャートである。ここで、肺炎球菌が高負荷および低負荷で血液試料に播種された。
【図１２】ヒト血液試料中の化膿性連鎖球菌の検出を示すチャートである。ここで、化膿性連鎖球菌が高負荷および低負荷で血液試料に播種された。
【図１３】ヒト血液試料中のフェカリス菌の検出を示すチャートである。ここで、フェカリス菌が高負荷および低負荷で血液試料に播種された。
【図１４】ヒト血液試料中のフェシウム菌の検出を示すチャートである。ここで、フェシウム菌が高負荷および低負荷で血液試料に播種された。
【図１５】ヒト血液試料中の大腸菌の検出を示すチャートである。ここで、大腸菌が高負荷および低負荷で血液試料に播種された。
【図１６】ヒト血液試料中のアシネトバクター・バウマンニの検出を示すチャートである。ここで、アシネトバクター・バウマンニが高負荷および低負荷で血液試料に播種された。
【図１７】ヒト血液試料中のエンテロバクター・エロゲネスの検出を示すチャートである。ここで、エンテロバクター・エロゲネスが高負荷および低負荷で血液試料に播種された。
【図１８】ヒト血液試料中のエンテロバクター・クロアカの検出を示すチャートである。ここで、エンテロバクター・クロアカが高負荷および低負荷で血液試料に播種された。
【図１９】ヒト血液試料中の肺炎桿菌の検出を示すチャートである。ここで、肺炎桿菌が高負荷および低負荷で血液試料に播種された。
【図２０】ヒト血液試料中のクレブシエラ・オキシトカの検出を示すチャートである。ここで、クレブシエラ・オキシトカが高負荷および低負荷で血液試料に播種された。
【図２１】ヒト血液試料中の緑膿菌の検出を示すチャートである。ここで、緑膿菌が高負荷および低負荷で血液試料に播種された。
【図２２】ヒト血液試料中の霊菌の検出を示すチャートである。ここで、霊菌が高負荷および低負荷で血液試料に播種された。
【図２３】ヒト血液試料中のカンジダ・アルビカンスの検出を示すチャートである。ここで、カンジダ・アルビカンスが高負荷および低負荷で血液試料に播種された。
【図２４】ヒト血液試料中のカンジダ・グラブラータの検出を示すチャートである。ここで、カンジダ・グラブラータが高負荷および低負荷で血液試料に播種された。
【図２５】ヒト血液試料中のカンジダ・トロピカリスの検出を示すチャートである。ここで、カンジダ・トロピカリスが高負荷および低負荷で血液試料に播種された。
【図２６】ヒト血液試料中のカンジダ・パラプシローシスの検出を示すチャートである。ここで、カンジダ・パラプシローシスが高負荷および低負荷で血液試料に播種された。
【図２７】ヒト血液試料中のカンジダ・クルセイの検出を示すチャートである。ここで、カンジダ・クルセイが高負荷および低負荷で血液試料に播種された。
【図２８】ヒト血液試料中の大腸菌およびカンジダ・アルビカンスの検出を示すチャートである。ここで、黄色ブドウ球菌が高負荷および低負荷で血液試料に播種された。
【図２９】ヒト血液試料中の大腸菌および黄色ブドウ球菌の検出を示すチャートである。ここで、大腸菌および黄色ブドウ球菌が高負荷および低負荷で血液試料に播種された。
【図３０】単一発光色／波長を使用した２３病原体群のそれぞれを分析し得る１８ウェル系の典型的な、非限定的なレイアウトである。
【図３１】３色蛍光系を使用した２１病原体群のそれぞれを分析し得る６ウェル系の典型的な、非限定的なレイアウトである。
【図３２】単一発光色／波長を使用した２１病原体群のそれぞれを分析し得る１１ウェル系の典型的な、非限定的なレイアウトである。
【図３３】単一発光色／波長を使用した２１病原体群のそれぞれを分析し得る１８ウェル系の典型的な、非限定的なレイアウトである。
【図３４】単一発光色／波長を使用した２１病原体群のそれぞれを分析し得る１２ウェル系の典型的な、非限定的なレイアウトである。
【図３５】単一発光色／波長を使用した５グラム陰性病原体群のそれぞれおよびそれらの耐性同定を分析し得る６ウェル系の典型的な、非限定的なレイアウトである。
【図３６】単一発光色／波長を使用した４グラム陰性病原体群のそれぞれおよびそれらの耐性同定を分析し得る６ウェル系の典型的な、非限定的なレイアウトである。
【図３７】試料中の微生物を単離する、検出する、かつ同定するための典型的な、非限定的なダイヤグラムである。ここで、ｈＤＮＡは、ヒトＤＮＡであり、ｇＤＮＡは、微生物ＤＮＡである。
【図３８】全長（約１．５ｋｂｐ）１６Ｓ／１８Ｓアンプリコン（リボソームＤＮＡ）の使用がランダムなＤＮＡ汚染によって産出されるバックグラウンドレベルを減少させるのに有利であることを示すグラフである。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏシミュレーション（各データポイントに関してｎ＝１０，０００シミュレーション）は、より短い断片がより長い断片よりも増幅可能である傾向が著しく強いことを強調している。汚染は、典型的に低品質（低分子量）のものであるので、より長いアンプリコン（例えば、１．５ｋｂｐアンプリコン）を標的とすることにより、汚染ＤＮＡを増幅する可能性を減少させることができる。チャートにおけるｇＤＮＡは、ランダムに剪断された微生物ＤＮＡを表す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
上で導入され、以下でより詳細に考察される本テクノロジーの様々な態様および実施形態は、任意の数の方法で実行され得、本明細書に記載されたように、実行のいかなる特定の様式にも限定されない。特定の実行および適用の例は、主に例示的目的で提供される。
【００１４】
本明細書では、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないと明確に指示しない限り、複数形の指示対象を含む。例えば、「細胞」への言及は、２つ以上の細胞の組合せなどを含む。
【００１５】
本明細書では、「約」は、当業者によって理解されることになり、それが使用される文脈に依存してある程度変動することになる。当業者に明白ではない用語の使用がある場合、それが使用される文脈を考慮すると、「約」は、その特定の用語の最大プラスまたはマイナス１０％を意味することになる。
【００１６】
本明細書では、「原子」は、炭素原子、窒素原子、酸素原子、または２つ以上の共有結合を作製する能力がある任意の原子を表す。代わりに、一部の実施形態では、「原子」は、２つの共有結合している原子間の距離を表す。例として、限定することなく、以下の構造：ＤＩＡＮＡ−（ＣＨ2）40−（結合部分）は、４０原子の長さを有するリンカー（−（ＣＨ2）40−）を有する。例として、限定することなく、以下の構造：ＤＩＡＮＡ−（ＣＨ2）40−Ｏ−（ＣＨ2）40−（結合部分）は、８１原子の長さを有するリンカー（−（ＣＨ2）40−Ｏ−（ＣＨ2）40−）を有する。例として、限定することなく、以下の構造：ＤＩＡＮＡ−（ＣＨ2）40−Ｏ−ＮＨ−（ＣＨ2）30−（結合部分）は、７２原子の長さを有するリンカー（−（ＣＨ2）40−Ｏ−ＮＨ−（ＣＨ2）30−）を有する。例として、限定することなく、以下の構造：ＤＩＡＮＡ−（ＣＨ2）40−Ｏ−Ｎ（ＣＨ2）3ＣＨ3−（ＣＨ2）30−（結合部分）は、７２原子の長さを有するリンカー（−（ＣＨ2）40−Ｏ−Ｎ（ＣＨ2）3ＣＨ3−（ＣＨ2）30−）を有する（−（ＣＨ2）3ＣＨ3構成成分は、窒素原子から枝分かれしており、リンカーの長さに寄与しない）。
【００１７】
本明細書では、「侵入」という用語は、ワトソン・クリック塩基対形成を通した（局所的または普遍的）二本鎖または二重鎖ゲノム物質（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）へのＤＮＡ侵入人工核酸（ＤＩＡＮＡ）の結合を表す。
本明細書では、「多方向の流れ」という用語は、１つを超える方向での流体または試料の流れを可能にすることを表す。例として、限定することなく、一部の実施形態では、流体または試料がチャンバー１からチャンバー２およびチャンバー２からチャンバー１に流れ得る場合、デバイスの２つのチャンバー、例えば、チャンバー１およびチャンバー２間の多方向の流れがある。一部の実施形態では、多方向の流れは、２つのチャンバーを連結している単一チューブまたは流れチャネル内にある。一部の実施形態では、多方向の流れは、２つのチャンバーを連結している１つを超えるチューブまたは流れチャネルによって達成される。
当業者に理解されることになるように、任意のおよび全ての目的に関して、特に、文書の説明を提供する観点から、本明細書で開示された全ての範囲は、任意のおよび全ての可能なサブ範囲およびそのサブ範囲の組合せも包含する。任意の列挙された範囲は、同じものを十分に説明かつ可能にすると容易に認識され得る。
【００１８】
一般
典型的に、感染症のための分子診断法は、病原体のゲノム物質、すなわち、そのＤＮＡまたはＲＮＡへのアクセスを必要とする。大部分の方法は、微生物生体を溶解し（例えば、機械的に、化学的に、または両方の組合せを通して）、それによって、それらのゲノム物質を抽出することを含む。方法または市販のキットが塩、緩衝液および追加の細胞残骸からゲノム物質を精製して、さらなる処理、例えば、増幅および検出の準備が整っている純粋なまたは不純物のないゲノム産物をもたらすために使用される。
【００１９】
一部の分子診断法では、全血が出発物質または試料として使用される。全血は、白血球、赤血球、および血小板などの複数の細胞型、ならびに自然発生の有機および無機構成成分を含有する複合溶液である。血液構成成分があると、例えば、酵素的ＰＣＲまたは等温増幅などのＤＮＡおよび／またはＲＮＡの追加のまたは下流処理が困難になる（かつ完全に阻止までもし得る）。その上、体液試料採取中に通例使用される抗凝固薬および保存剤がさらに酵素的処理の障害となり得る。
全血中のヒトＤＮＡ（ｈＤＮＡ）が酵素的増幅（例えば、ＰＣＲまたは等温増幅）に供されることになる場合、一部の市販のキットでは、単純な熱ショックで白血球を溶解することによってゲノム物質を血液／緩衝溶液に曝露することが可能でことにより、ｈＤＮＡ精製ステップが低減されている。これらのキットは、感受性が徹底的に損なわれる前に、典型的な反応における５〜２０％の全血の処理のみを典型的に可能にし；したがって、キットは、単一反応において試験される血液の体積を約２０μｌに通常限定する。ｈＤＮＡが検出前に増幅される場合、低試料体積は、十分なｈＤＮＡが酵素的増幅プロセスを成功的に行うために回復され得るので、限定事項ではない。
【００２０】
しかしながら、血液が血液中に存在する病原体を同定するための分子診断法のための試料として使用される場合、試験試料体積を数十マイクロリットルに限定することは、特に、病原体が血液試料中に非常に低い濃度で存在する場合、不利である。例として、限定することなく、ヒト血液に感染する微生物病原体の負荷レベル（血液の単位体積中に存在する微生物病原体の数として定義される）は、全血中で１０細胞／ｍｌまでも低くてもよい一方、ヒト全血の典型的なミリリットルは、約４×１０6〜１１×１０6白血球または白血球細胞（ＷＢＣ）を含有する。ヒトゲノムのサイズを考慮すると、１ｍｌのヒト全血中のｈＤＮＡ含有量は、典型的に２０〜６０μｇにわたる一方、１ｍｌの血液中の微生物ＤＮＡの質量は、典型的に５０ｆｇ〜５０ｐｇにわたる。
【００２１】
本テクノロジーは、一般に、試料中の微生物細胞を単離する、検出する、かつ／または同定するための方法およびデバイスに関する。一部の実施形態では、方法およびデバイスは、試料中の微生物細胞の１つまたは複数の種を同定し得る。一部の実施形態では、試料中の微生物細胞の検出および同定は、試料から真核生物ＤＮＡを除去することを含む。一部の実施形態では、本テクノロジーは、試料の流体体積、例えば、約１ｍｌ中の微生物の感受性の高い検出を提供する方法およびデバイスを提供する。一部の実施形態では、本テクノロジーは、微生物感染の感受性検出の前にヒト核酸を選択的に除去することによって体液に存在する微生物病原体の検出感受性を増加させるための方法およびデバイスを開示する。一部の実施形態では、本テクノロジーの方法は、完全に自動化されており、標準的な実験プロセス、例えば、ＤＮＡを抽出するための従来の遠心分離を必要としない。
別の態様では、本テクノロジーは、培養ステップを必要としない血流感染を診断するための方法およびデバイスを記載する。一部の実施形態では、方法およびデバイスは、血液試料から直接的にかつ血液試料を培養することなく、臨床的に関連する負荷レベルで微生物のパネルを検出し同定する。
【００２２】
試料中の微生物を単離する、検出する、かつ同定するための方法
一部の実施形態では、本テクノロジーは、試料中の微生物細胞を単離する、検出する、かつ／または同定するための方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、以下のステップの１つまたは複数を含む：試料から真核生物ＤＮＡを枯渇させること、試料中の１つまたは複数の微生物細胞を溶解することであって、複数の微生物遺伝物質を放出させる、溶解すること、複数の微生物遺伝物質を単離すること、複数の微生物遺伝物質を増幅すること、増幅された微生物遺伝物質を複数の二重鎖ＤＮＡ侵入人工核酸（ＤＩＡＮＡ）と接触させることであって、各ＤＩＡＮＡが特定の病原体または病原体の群の微生物遺伝物質を標的とする、接触させること、およびそれらの標的微生物遺伝物質への１つまたは複数のＤＩＡＮＡの結合を検出することであって、結合の検出が１つまたは複数の特定の微生物種の存在を示す、検出すること。
【００２３】
一部の実施形態では、方法は、５つのステッププロセスを含む（図３７を参照されたい）：（１）穏やかなまたは選択的真核細胞溶解；（２）病原体溶解；（３）微生物ゲノム物質の捕獲単離および精製；（４）酵素的増幅；および（５）ＤＮＡ侵入人工核酸（ＤＩＡＮＡ）ベース検出および同定。一部の実施形態では、上記の方法は、血液培養プロセスを行う必要なく、処理されていない血液からの直接的な臨床的に関連する微生物負荷レベルでの微生物病原体の同定も可能にする。一部の実施形態では、全プロセス（すなわち、ステップ１〜５）には、約８時間未満が必要である。一部の実施形態では、全プロセスには、約１〜５時間が必要である。一部の実施形態では、全プロセスには、約２〜４時間が必要である。
【００２４】
例として、限定することなく、かつ理論に束縛されることを望むものではないが、一部の実施形態では、上で開示された典型的な５つのステップ方法、および本明細書で記載された各典型的なステップの実施形態は、以下の利点を提供する：
ステップ１）本明細書で記載された選択的真核（ｅｕｒｋａｒｙｏｔｉｃ）細胞溶解を通して真核生物ＤＮＡを除去するための方法は、汚染がなく、ヒトの介入のないプロセスを可能にし、相互汚染またはＤＮＡｅｍｉａによる偽陽性を減少させる閉じられた流体のカートリッジ上において容易に自動化可能である。
ステップ２）本明細書で記載された微生物細胞溶解のための方法は、１つまたは複数の微生物（例えば、細菌および／または真菌細胞）から長い（例えば、２ｋｂｐ〜２９０ｋｂｐ）微生物ゲノム物質（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を迅速かつ高収率で作製する。一部の実施形態では、本明細書で記載された微生物細胞溶解方法は、強く相互作用し、かつ本明細書に記載の微生物ゲノム物質の下流単離および精製中に陰イオン交換樹脂から容易に放出される長い微生物ゲノム物質を作製する。
ステップ３）一部の実施形態では、本明細書で記載された長い微生物ゲノム物質の精製のための方法は、陰イオン交換樹脂を通した長い微生物ゲノム物質単離を好ましくは可能にし、同時に高度に純粋なゲノム物質をもたらす条件を提供する。高度に純粋かつ長い微生物ゲノム物質の精製は、本明細書で記載された下流増幅プロセスにおける長いアンプリコンの効率的な作製を可能にする。
ステップ４）一部の実施形態では、長いアンプリコンを増幅することにより、環境汚染物質を増幅する見込みが減少する（図３８を参照されたい）ので、長いアンプリコン（例えば、約４００ｂｐ〜４０００ｂｐ）の作製により、ＤＩＡＮＡへの感受性が増加する。長いアンプリコンの作製は、短いアンプリコンを増幅することと比較して効率性が低いので、ハイブリダイゼーションのための増幅ステップ中の長いアンプリコンの作製は、一般に当技術分野においてあまり教示されていない。
ステップ５）一部の実施形態では、ＤＩＡＮＡの使用により、高レベルの詳細において微生物の広範なパネルに関してゲノム間変動も種間変動もない高度に保存されたゲノム領域を標的とすることが可能になる。さらに、長いアンプリコンに侵入しこれを探索するためのＤＩＡＮＡの使用する上で、ＤＮＡプローブのハイブリダイゼーションにおいて障害となるであろう、ＤＮＡの内部二次構造の形成が問題となることもない。
【００２５】
一部の実施形態では、上記の方法は、固体基板への高い効率および選択性を有する長い二重鎖ＤＮＡの固定化の利点を提供する。
一部の実施形態では、試料中のまたは試料中にあることが疑われる微生物細胞は、細菌細胞、真菌細胞、ウイルス粒子、またはその組合せを含むが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、試料は、体液、体分泌物、または体排出物である。例として、限定することなく、一部の実施形態では、試料は、便、痰、尿、血液を含むが、これらに限定されない。
【００２６】
一部の実施形態では、試料は、約１μｌ、１０μｌ、２０μｌ、３０μｌ、４０μｌ、５０μｌ、６０μｌ、７０μｌ、８０μｌ、９０μｌ、１００μｌ、または前に列挙された量の任意の２つ間の任意の量である。一部の実施形態では、試料は、約１００μｌ〜２．５ｍｌ、約２００μｌ〜２ｍｌ、約３００μｌ〜１．５ｍｌ、約４００μｌ〜１ｍｌ、または約５００μｌ〜７５０μｌである。一部の実施形態では、試料は、約０．５ｍｌ〜１０ｍｌ、約１ｍｌ〜９ｍｌ、約２ｍｌ〜８ｍｌ、約３ｍｌ〜７ｍｌ、または約４ｍｌ〜６ｍｌである。
一部の実施形態では、試料は、対象からである。対象は、哺乳動物、鳥類、爬虫類、昆虫、両生類、および魚類を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、哺乳動物対象は、ヒトである。
【００２７】
一部の実施形態では、本テクノロジーは、試料中の微生物の存在を検出するための方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、穏やかなまたは選択的な細胞溶解剤を試料に添加することであって、細胞溶解剤が微生物細胞と比較して真核細胞を優勢に溶解し、微生物細胞の大部分を無傷のままにしておく、添加すること、試料から真核細胞の溶解によって放出された真核生物ＤＮＡを除去することであって、単離された微生物細胞が試料中に残る、除去すること、および単離された微生物細胞を分子診断法に供することを含む。例として、限定することなく、一部の実施形態では、分子診断法は、単離された微生物細胞を溶解すること、微生物ＤＮＡまたはＲＮＡを単離すること、および核酸プローブ、直接配列決定、またはゲノム物質を同定するための当技術分野で既知の任意の他の方法を使用してゲノム物質を同定することを含む。一部の実施形態では、単離された微生物ＤＮＡまたはＲＮＡは、標的または非標的増幅に供される。一部の実施形態では、微生物の存在を検出するための方法は、溶解反応を終結させることも含む。
【００２８】
一部の実施形態では、試料は、対象からである。対象は、哺乳動物、鳥類、爬虫類、昆虫、両生類、および魚類を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、対象は、ヒトである。
一部の実施形態では、試料中のまたは試料中にあることが疑われる微生物細胞は、細菌細胞、真菌細胞、ウイルス粒子、またはその組合せを含むが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、試料は、体液、体分泌物、または体排出物である。例として、限定することなく、一部の実施形態では、試料は、便、痰、尿、および血液を含むが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、試料は、約１μｌ〜５０μｌ、約１０μｌ〜３．０ｍｌ、約２０μｌ〜２．５ｍｌ、約３０μｌ〜２．０ｍｌ、約４０μｌ〜１．５ｍｌ、約５０μｌ〜１．０ｍｌ、約６０μｌ〜９０μｌ、約７０μｌ〜８０μｌ、または約０．５ｍｌ〜１０ｍｌである。
【００２９】
試料から真核細胞を枯渇させること
一部の実施形態では、試料から真核生物ＤＮＡを枯渇させることは、真核細胞溶解用溶液を試料に添加することであって、真核細胞溶解用溶液が、微生物細胞に対して真核細胞を優勢に溶解する、添加すること、および試料から真核細胞の溶解によって放出された真核生物ＤＮＡを除去することであって、１つまたは複数の無傷の微生物細胞が試料中に残る、除去することを含む。一部の実施形態では、方法は、真核細胞溶解反応を終結させることを含む。
【００３０】
真核細胞の溶解
一部の実施形態では、真核細胞溶解剤は、溶液（以下、「真核細胞溶解用溶液」）である。代わりに、一部の実施形態では、真核細胞溶解剤は、ペレット化され、使用前に水または水性緩衝液に再懸濁される。
一部の実施形態では、真核細胞溶解用溶液は、１つまたは複数の洗浄剤または界面活性剤を含む。一部の実施形態では、洗浄剤または界面活性剤は、非イオン性、陰イオン性、陽イオン性、両性イオン性、または非洗浄剤スルホベタインである。洗浄剤および界面活性剤は、ＢｉｇＣＨＡＰ、Ｄｅｏｘｙ  ＢｉｇＣＨＡＰ、Ｂｒｉｊ  ３５、Ｂｒｉｊ  ５８Ｐ、Ｃｙｍａｌ−１、Ｃｙｍａｌ−２、Ｃｙｍａｌ−５、Ｃｙｍａｌ−６、Ｄｅｃｙｌ−β−マルトピラノシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−ヘキサデシル−β−Ｄ−マルトシド、ウンデシル−β−Ｄ−マルトシド、デシル−β−Ｄ−１−チオマルトピラノシド、オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、デシル−β−Ｄ−１−チオグルコピラノシド、オクチル−β−Ｄチオグルコピラノシド、ジギトニン、ジメチルデシルホスフィンオキシド（ＡＰＯ−１０）、ドデシルジメチルホスフィンオキシド（ＡＰＯ−１２）、ＩＧＥＰＡＬ  ＣＯ−５２０、ＩＧＥＰＡＬ  ＣＯ−６３０、およびＩＧＥＰＡＬ  ＣＯ−７２０、Ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミン（ＭＥＧＡ−８）、Ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミン（ＭＥＧＡ−９）、Ｎ−デカノイル−Ｎ−メチルグルカミン（ＭＥＧＡ−１０）、ノニデット  Ｐ４０−代用品、プルロニック  Ｆ−６８、サポニン、ｔｈｅｓｉｔ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４、ＴＷＥＥＮ  ２０、ＴＷＥＥＮ  ４０、ＴＷＥＥＮ  ８０、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、Ｎ−ｌ−ラウロイルザルコシン、ドデシル硫酸リチウム、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、臭化トリメチル（テトラデシル）アンモニウム（ＴＴＡＢ）、ＡＳＢ−１４（アミドスルホベタイン−１４）、ＡＳＢ−１６（アミドスルホベタイン−１６）、Ｃ７ＢｚＯ、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ＥＭＰＩＧＥＮ  ＢＢ、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルオクチルアンモニオ）プロパンスルホネート分子内塩（ＳＢ３−８）、３−（デシルジメチルアンモニオ）−プロパンスルホネート分子内塩（ＳＢ３−１０）、３−（ドデシルジメチルアンモニオ）−プロパンスルホネート分子内塩（ＳＢ３−１２）、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルミリスチルアンモニオ）−プロパンスルホネート（ＳＢ３−１４）、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルパルミチルアンモニオ）−プロパンスルホネート（ＳＢ３−１６）、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルオクタデシルアンモニオ）−プロパンスルホネート（ＳＢ３−１８）、３−（１−ピリジニオ）−１−プロパンスルホネート（ＮＤＳＢ  ２０１）、および３−（ベンジルジメチルアンモニオ）プロパンスルホネート（ＮＤＳＢ  ２５６）を含むが、これらに限定されない。
【００３１】
例として、限定することなく、一部の実施形態では、真核細胞溶解用溶液は、約０．２７％〜１５％ｖ／ｖ、約０．３９％〜１３％ｖ／ｖ、約０．４５％〜１２％（ｖ／ｖ）、もしくは約０．６０％〜１０％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ界面活性剤および／または約０．２２％〜１０％（ｖ／ｖ）、約０．１６％〜８．２５％（ｖ／ｖ）、もしくは約０．４４％〜６．７５％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎまたはＩＧＥＰＡＬの界面活性剤の濃度を有する。一部の実施形態では、Ｔｗｅｅｎ界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｔｗｅｅｎ−４０、およびＴｗｅｅｎ−８０からなる群から選択される。一部の実施形態では、Ｔｒｉｔｏｎは、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００またはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４である。一部の実施形態では、ＩＧＥＰＡＬは、ＩＧＥＰＡＬ  ＣＯ−５２０、ＩＧＥＰＡＬ  ＣＯ−６３０、およびＩＧＥＰＡＬ  ＣＯ−７２０からなる群から選択される。
【００３２】
一部の実施形態では、界面活性剤は、乾燥形で個々に保管され、使用前に再懸濁される。
例として、限定することなく、一部の実施形態では、真核細胞溶解反応（例えば、試料と組み合わせられた真核細胞溶解用溶液（以下、「混合物」））は、約０．２５％〜１％（ｖ／ｖ）、約０．３５％〜０．８５％（ｖ／ｖ）、約０．４５％〜０．７５％（ｖ／ｖ）、もしくは約０．５５％〜０．６５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ界面活性剤および／または約０．１５％〜０．６５％（ｖ／ｖ）、約０．２５％〜０．５５％（ｖ／ｖ）、もしくは約０．３５％〜０．４５％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎまたはＩＧＥＰＡＬの界面活性剤の最終濃度を含む。一部の実施形態では、Ｔｗｅｅｎ界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｔｗｅｅｎ−４０、およびＴｗｅｅｎ−８０からなる群から選択される。一部の実施形態では、Ｔｒｉｔｏｎは、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００またはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４である。一部の実施形態では、ＩＧＥＰＡＬは、ＩＧＥＰＡＬ  ＣＯ−５２０、ＩＧＥＰＡＬ  ＣＯ−６３０、およびＩＧＥＰＡＬ  ＣＯ−７２０からなる群から選択される。
【００３３】
一部の実施形態では、洗浄剤は、真核細胞の構造的完全性を減少させる。
一部の実施形態では、少なくとも１つの泡止め剤が真核細胞溶解用溶液と組み合わせられる。泡止め剤は、Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ａ、Ａｎｔｉｆｏａｍ  ２０４、Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ｂ、Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ｃ、Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ｙ−３０、Ａｎｔｉｆｏａｍ  ＳＥ−１５、およびシメチコンベース消泡剤を含むが、これらに限定されない。
【００３４】
一部の実施形態では、混合物は、約０．１５Ｍ未満の一価の塩を含有する。理論に束縛されることを望むものではないが、一部の実施形態では、混合物が約０．１５Ｍ未満の一価の塩を含有する場合、浸透圧ストレスの誘発がある。一部の実施形態では、混合物は、約０．１５Ｍ〜０．７５Ｍ、約０．２Ｍ〜０．７Ｍ、約０．２５Ｍ〜０．６５Ｍ、約０．３Ｍ〜０．６Ｍ、約０．３５Ｍ〜０．５５Ｍ、または約０．４Ｍ〜０．５Ｍの一価の塩を含む。
一部の実施形態では、真核細胞溶解用溶液対試料の体積比は、約０．２５：１、０．５：１、０．７５：１、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、またはこれらの比の任意の２つ間の任意の比である。
一部の実施形態では、真核細胞溶解反応は、約室温で行われる。一部の実施形態では、真核細胞溶解反応は、約５℃〜２０℃、約９℃〜１６℃、または約１２℃〜１３℃で行われる。一部の実施形態では、真核細胞溶解反応は、約２５℃〜７５℃、約３０℃〜７０℃、約３５℃〜６５℃、約４０℃〜６０℃、または約４５℃〜５５℃の温度で行われる。
【００３５】
一部の実施形態では、真核細胞溶解反応は、約０．０１〜２０分、約０．１〜９．０分、約１．０〜８．０分、約２．０〜７．０分、約３．０〜６．０分、約４．０〜５．０分間行われる。一部の実施形態では、真核細胞溶解プロセスは、約５分後に停止される。
一部の実施形態では、真核細胞溶解用溶液は、緩衝剤を含有しない。他の実施形態では、真核細胞溶解用溶液は、緩衝剤を含有する。緩衝剤の例は、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール（ビス−トリス）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）（トリス）、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム／重炭酸（Ｂｉｃａｒｏｎａｔｅ）緩衝液、酢酸ナトリウム、Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（４−ブタンスルホン酸）（ＨＥＰＢＳ）、Ｎ−メチルピペラジン、ピペラジン、ジエタノールアミン、およびプロパン１，３−ジアミノを含むが、これらに限定されない。
【００３６】
一部の実施形態では、真核細胞溶解反応のｐＨは、約６〜９のｐＨである。一部の実施形態では、ｐＨは、中性または中性付近である。約６〜９または中性付近のｐＨでの真核細胞の選択的溶解は、真核細胞溶解反応に関してアルカリ条件（例えば、ｐＨ９．５〜１４での）を強調する現法と対照的である。一部の実施形態では、約６〜９または中性付近のｐＨで真核細胞溶解反応を行うことは、いくつかの界面活性剤の存在下での微生物細胞の生存能力および／または構造的完全性の増加により、当技術分野で既知の現法よりも有利である。
一部の実施形態では、本明細書で記載された真核細胞溶解反応のための方法は、当技術分野で既知の現法よりも有利であるが、なぜなら本明細書で記載された真核細胞溶解反応方法は、統合デバイスにおける自動化に適しているからである。
【００３７】
真核細胞の溶解の終結
一部の実施形態では、真核細胞溶解反応は、少なくとも１つの電解質を含む溶解終結溶液を混合物（すなわち、真核細胞溶解用溶液／試料組合せ）に添加することによって終結される。一部の実施形態では、反応における電解質の最終濃度は、約２５ｍＭ〜８５０ｍＭ、約１００ｍＭ〜７５０ｍＭ、約１５０ｍＭ〜６５０ｍＭ、約２００ｍＭ〜５５０ｍＭ、約２５０ｍＭ〜４５０ｍＭ、または約３００ｍＭ〜４００ｍＭである。溶解終結緩衝液に添加され得る電解質は、一価の塩および二価の塩を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、少なくとも１つの電解質を使用した真核細胞溶解反応の終結により、陰イオン−交換樹脂を使用する下流プロセス（例えば、真核生物ＤＮＡの除去、微生物細胞の単離、微生物細胞の溶解、または微生物ゲノム物質の単離）が改善される。
【００３８】
一部の実施形態では、溶解終結緩衝液に添加される電解質は、少なくとも１つの一価の塩を含む。一価の塩は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、ヨウ化カリウム、ヨウ化ナトリウム、塩化リチウム、ヨウ化リチウム、臭化カリウム、フッ化ナトリウム、およびフッ化カリウムを含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、一価の塩単独が溶解反応を終結させるために混合物に添加される。一部の実施形態では、溶解プロセスの終結は、必要ではない。
一部の実施形態では、溶解終結緩衝液は、約９未満のｐＨを有する。一部の実施形態では、溶解終結緩衝液のｐＨは、約６〜９である。一部の実施形態では、溶解終結緩衝液は、４．０未満のまたは１１．０を超えるｐＨを有さない。一部の実施形態では、溶解終結緩衝液は、約中性のｐＨを有する。
【００３９】
一部の実施形態では、溶解終結緩衝液および混合物組合せは、約９未満のｐＨを有する。一部の実施形態では、溶解終結緩衝液および混合物組合せは、約６〜９のｐＨを有する。一部の実施形態では、溶解終結緩衝液および混合物組合せは、約中性のｐＨを有する。一部の実施形態では、溶解終結緩衝液および混合物の組合せを約６〜９または約中性のｐＨで維持することにより、無傷の微生物細胞の下流処理（例えば、真核生物ＤＮＡの除去、微生物細胞の単離、微生物細胞の溶解、または微生物ＤＮＡの増幅）が改善される。
【００４０】
真核生物ＤＮＡ／ＲＮＡを除去する
一部の実施形態では、混合物または溶解終結緩衝液および混合物組合せ中の無傷の微生物細胞からの真核生物ゲノム物質の分離は、無傷の微生物細胞、真核細胞残骸、または他の非核酸物質の捕獲も固定化もなしに、真核生物ゲノム物質の「選択的捕獲」または真核生物ＤＮＡの固定化を通して行われる。一部の実施形態では、捕獲される真核生物ゲノム物質は、真核生物ＤＮＡおよび／またはＲＮＡである。
一部の実施形態では、陰イオン交換樹脂は、真核生物ゲノム物質を捕獲する／固定化するために使用される。一部の実施形態では、陰イオン交換樹脂は、１つまたは複数の弱陰イオン−交換樹脂（ＷＡＸ）である。ＷＡＸの例は、カルボキシメチル（ＣＭ）、ジエチルアミノプロピル（ＡＮＸ）、ジエチルエタノールアミン（ＤＥＡＥ）、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  Ｉｒａ６７、Ｐｕｒｏｌｉｔｅ  Ａ８４７、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  Ｉｒａ９６、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ９６ＳＢ、Ｄｏｗｅｘ  Ｍａｒａｔｈｏｎ  ＷＢＡ、Ｄｏｗｅｘ  Ｕｐｃｏｒｅ  Ｍｏｎｏ  ＷＢ−５００、Ｐｕｒｏｌｉｔｅ  Ａ８３５、Ｄｏｗｅｘ  Ｍｏｎｏｓｐｈｅｒｅ  ７７、およびＤｏｗｅｘ  Ｍｏｎｏｓｐｈｅｒｅ  ６６を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、ＷＡＸ樹脂は、少なくとも１つの三級アミン官能基を含有する。
【００４１】
一部の実施形態では、陰イオン交換樹脂は、１つまたは複数の強陰イオン−交換樹脂（ＳＡＸ）である。ＳＡＸの例は、−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨＯＨ−ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨＯＨ−ＣＨ2−Ｎ+（ＣＨ3）3、Ａｍｂｅｒｊｅｔ  Ｕｐ４０００、Ａｍｂｅｒｊｅｔ  ９０００  ＯＨ、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＦＰＡ４０  Ｃｌ、およびＤｏｗｅｘ  Ｕｐｃｏｒｅ  Ｍｏｎｏ  ＭＡ−６００を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、ＳＡＸベース樹脂は、少なくとも１つの四級アミン官能基を含有する。
一部の実施形態では、陰イオン交換樹脂は、少なくとも１つのＷＡＸおよび少なくとも１つのＳＡＸの組合せである。
一部の実施形態では、陰イオン交換樹脂の形は、ファイバー、膜、吸着剤、ゲル、およびろ紙から選択される。一部の実施形態では、溶解された真核細胞を有する試料は、陰イオン交換樹脂を通過させられるまたはこれと接触させられる。一部の実施形態では、陰イオン交換樹脂は、溶液の形である。
【００４２】
一部の実施形態では、陰イオン交換樹脂は、支持基板にコンジュゲートしている。支持基板の例は、粒子、ビーズ、表面、または球を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、支持基板は、磁性、例えば、磁性粒子またはビーズである。一部の実施形態では、陰イオン交換樹脂は、支持基板にコンジュゲートしており、溶液の形である。
一部の実施形態では、支持基板は、シリカ、ガラス、金属、ポリスチレンベース物質、セルロースベース物質、アガロースベース物質、デキストランベース物質、メタクリル酸ベース物質、セファロースベース物質、またはその組合せを含む。一部の実施形態では、支持基板は、多孔質である。
一部の実施形態では、支持基板は、ビーズまたは球であり、約１０〜１００μｍ、約２０〜９０μｍ、約３０〜８０μｍ、約４０〜７０μｍ、または約５０〜６０μｍの直径を有する。
別の実施形態では、支持基板は、ビーズまたは球であり、約０．０１〜１０μｍ、約０．１〜９．０μｍ、約１．０〜８．０μｍ、約２．０〜７．０μｍ、約３．０〜６．０μｍ、または約４．０〜５．０μｍの直径を有する。
【００４３】
一部の実施形態では、混合物は、約０．１〜１０分、約２〜９分、約３〜８分、約４〜７分、または約５〜６分、陰イオン交換樹脂とインキュベートされる。一部の実施形態では、混合物は、約１０〜３０分、約１２〜２８分、約１５〜２５分、約１８〜２３分、または約１９〜２２分、陰イオン交換樹脂とインキュベートされる。一部の実施形態では、混合物は、１分未満の間、陰イオン交換樹脂とインキュベートされる。
一部の実施形態では、陰イオン交換樹脂は、支持基板上で持続的に固定化されている。一部の実施形態では、固定化された陰イオン交換樹脂は、混合物と接触させられかつ／またはこれとインキュベートされ、次いで、混合物が除去される。
一部の実施形態では、支持基板、例えば、ビーズまたは粒子にコンジュゲートしている少なくとも１つの陰イオン交換樹脂は、混合物と接触させられるかつ／またはこれとインキュベートされる。一部の実施形態では、混合物との接触および／またはこれとのインキュベーション後、支持基板にコンジュゲートしている陰イオン交換樹脂は、混合物から除去される。別の実施形態では、混合物との接触および／またはこれとのインキュベーション後、支持基板にコンジュゲートしている陰イオン交換樹脂は、固定化され、混合物は、除去される。例として、限定することなく、一部の実施形態では、支持基板が磁化または金属ビーズであり、磁化または金属ビーズが磁石または磁界に曝露される場合、支持基板にコンジュゲートしている陰イオン交換樹脂は、選択的に固定化される。
【００４４】
一部の実施形態では、混合物を陰イオン交換樹脂と接触させるかつ／またはこれとインキュベートすることにより、混合物から真核生物ＤＮＡ、例えば、ヒトＤＮＡ（ｈＤＮＡ）、および／またはＲＮＡが抽出される。一部の実施形態では、真核生物ＤＮＡ（および／またはＲＮＡ）は、陰イオン交換樹脂に結合する。一部の実施形態では、陰イオン交換樹脂は、混合物から約５％〜１００％、約１０％〜９９％、約１５％〜８５％、約２０％〜８０％、約２５％〜７５％、約３０％〜７０％、約３５％〜６５％、約４０％〜６０％、または約４５％〜５５％の真核生物ＤＮＡ（および／またはＲＮＡ）、例えば、ｈＤＮＡを抽出する。一部の実施形態では、陰イオン交換樹脂は、混合物から９５％を超える真核生物ＤＮＡを抽出する。
【００４５】
微生物細胞の溶解
一部の実施形態では、真核生物ＤＮＡが除去された混合物（または溶解終結溶液および混合物組合せ）（以下、「単離された微生物細胞試料」）は、１つまたは複数の微生物細胞を含有する。一部の実施形態では、単離された微生物細胞試料は、さらなる処理に供される。一部の実施形態では、単離された微生物細胞試料は、微生物細胞溶解用溶液と接触させられる。
【００４６】
一部の実施形態では、微生物細胞は、１つまたは複数の化学的溶解剤を含む溶解用溶液を使用して溶解される。一部の実施形態では、化学的溶解剤は、陽イオン性洗浄剤、非イオン性洗浄剤、両性イオン性洗浄剤、および酵素を含むが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、微生物溶解反応は、約６〜９のｐＨまたは中性ｐＨで行われる。
一部の実施形態では、微生物溶解用溶液は、以下のものの１つまたは複数も含む：酵素、洗浄剤、ならびに塩、緩衝剤、および金属キレート剤などの他の構成成分。
一部の実施形態では、複数の溶解用溶液が使用される。一部の実施形態では、複数の溶解緩衝液が段階的に添加される。一部の実施形態では、単一微生物溶解用溶液のみが使用される。
【００４７】
一部の実施形態では、微生物溶解反応は、約１５℃〜５０℃、約２０℃〜４５℃、約２５℃〜４０℃、または約３０℃〜３５℃まで加熱される。一部の実施形態では、微生物溶解反応は、室温で行われる。
一部の実施形態では、微生物溶解用溶液は、以下の酵素の１つまたは複数を含む：リゾチーム、リティカーゼ（ｌｙｔｉｃａｓｅ）、ザイモリアーゼ、ムタノリシン、およびリゾスタフィン。一部の実施形態では、１つまたは複数の酵素が乾燥またはペレット化形で保管され、ここで、それぞれの酵素の再懸濁時に、酵素は、以下で同定された濃度に達する。
一部の実施形態では、微生物溶解用溶液中のリゾチーム濃度は、約５〜２００ｍｇ／ｍｌ、約１〜１５０ｍｇ／ｍｌ、５〜１７５ｍｇ／ｍｌ、約１５〜１４０ｍｇ／ｍｌ、約２０〜１００ｍｇ／ｍｌ、約３０〜９５ｍｇ／ｍｌ、約４５〜７５ｍｇ／ｍｌ、約５０〜６２ｍｇ／ｍｌ、または前に開示された濃度の任意の２つ間である。
【００４８】
一部の実施形態では、微生物溶解反応（例えば、微生物溶解用溶液および単離された微生物細胞試料を含む溶液）におけるリゾチーム濃度は、約０．０１〜１ｍｇ／ｍｌ、約０．１〜１０ｍｇ／ｍｌ、０．５〜１５ｍｇ／ｍｌ、約１〜２０ｍｇ／ｍｌ、約０．３〜８ｍｇ／ｍｌ、約０．７〜７ｍｇ／ｍｌ、約０．２〜０．９ｍｇ／ｍｌ、約０．０５〜０．３５ｍｇ／ｍｌ、または前に開示された濃度の任意の２つ間である。
一部の実施形態では、微生物溶解用溶液中のリティカーゼ濃度は、約５００〜５０，０００Ｕ／ｍｌ、約２５０〜１０，０００Ｕ／ｍｌ、４２５〜８，０００Ｕ／ｍｌ、約３００〜６，０００Ｕ／ｍｌ、約４００〜５，０００Ｕ／ｍｌ、約１，０００〜４，７５０Ｕ／ｍｌ、約１，５００〜４，５００Ｕ／ｍｌ、約２，０００〜６，５００Ｕ／ｍｌ、約２，５００〜５，５００Ｕ／ｍｌ、約３，０００〜１５，０００Ｕ／ｍｌ、または前に開示された濃度の任意の２つ間である。
【００４９】
一部の実施形態では、微生物溶解反応におけるリティカーゼ濃度は、約１〜１０００Ｕ／ｍｌ、約５〜２００Ｕ／ｍｌ、２０Ｕ〜８００Ｕ／ｍｌ、約３０〜７００Ｕ／ｍｌ、約４０〜６００Ｕ／ｍｌ、約５０〜５００Ｕ／ｍｌ、約６０〜４００Ｕ／ｍｌ、約７０〜３００Ｕ／ｍｌ、約８０〜２００Ｕ／ｍｌ、約９０〜１００Ｕ／ｍｌ、または前に開示された濃度の任意の２つ間である。
一部の実施形態では、微生物溶解用溶液中のザイモリアーゼ濃度は、約５００〜５０，０００Ｕ／ｍｌ、約２５０〜１０，０００Ｕ／ｍｌ、４２５Ｕ〜８，０００Ｕ／ｍｌ、約３００〜６，０００Ｕ／ｍｌ、約４００〜５，０００Ｕ／ｍｌ、約１，０００〜４，７５０Ｕ／ｍｌ、約１，５００〜４，５００Ｕ／ｍｌ、約２，０００〜６，５００Ｕ／ｍｌ、約２，５００〜５，５００Ｕ／ｍｌ、約３，０００〜１５，０００Ｕ／ｍｌ、または前に開示された濃度の任意の２つ間である。
一部の実施形態では、微生物溶解反応におけるザイモリアーゼ濃度は、約１〜１０００Ｕ／ｍｌ、約５〜２００Ｕ／ｍｌ、２０Ｕ〜８００Ｕ／ｍｌ、約３０〜７００Ｕ／ｍｌ、約４０〜６００Ｕ／ｍｌ、約５０〜５００Ｕ／ｍｌ、約６０〜４００Ｕ／ｍｌ、約７０〜３００Ｕ／ｍｌ、約８０〜２００Ｕ／ｍｌ、約９０〜１００Ｕ／ｍｌ、または前に開示された濃度の任意の２つ間である。
【００５０】
一部の実施形態では、微生物溶解用溶液中のムタノリシン濃度は、約５００〜５０，０００Ｕ／ｍｌ、約２５０〜１０，０００Ｕ／ｍｌ、４２５〜８，０００Ｕ／ｍｌ、約３００〜６，０００Ｕ／ｍｌ、約４００〜５，０００Ｕ／ｍｌ、約１，０００〜４，７５０Ｕ／ｍｌ、約１，５００〜４，５００Ｕ／ｍｌ、約２，０００〜６，５００Ｕ／ｍｌ、約２，５００〜５，５００Ｕ／ｍｌ、約３，０００〜１５，０００Ｕ／ｍｌ、または前に開示された濃度の任意の２つ間である。
一部の実施形態では、微生物溶解反応におけるムタノリシン濃度は、約１〜１０００Ｕ／ｍｌ、約５〜２００Ｕ／ｍｌ、２０〜８００Ｕ／ｍｌ、約３０〜７００Ｕ／ｍｌ、約４０〜６００Ｕ／ｍｌ、約５０〜５００Ｕ／ｍｌ、約６０〜４００Ｕ／ｍｌ、約７０〜３００Ｕ／ｍｌ、約８０〜２００Ｕ／ｍｌ、約９０〜１００Ｕ／ｍｌ、または前に開示された濃度の任意の２つ間である。
【００５１】
一部の実施形態では、微生物溶解用溶液中のリゾスタフィン濃度は、約５００〜５０，０００Ｕ／ｍｌ、約２５０〜１０，０００Ｕ／ｍｌ、４２５Ｕ〜８，０００Ｕ／ｍｌ、約３００〜６，０００Ｕ／ｍｌ、約４００〜５，０００Ｕ／ｍｌ、約１，０００〜４，７５０Ｕ／ｍｌ、約１，５００〜４，５００Ｕ／ｍｌ、約２，０００〜６，５００Ｕ／ｍｌ、約２，５００〜５，５００Ｕ／ｍｌ、約３，０００〜１５，０００Ｕ／ｍｌ、または前に開示された濃度の任意の２つ間である。
一部の実施形態では、微生物溶解反応におけるリゾスタフィン濃度は、約１〜１０００Ｕ／ｍｌ、約５〜２００Ｕ／ｍｌ、２０〜８００Ｕ／ｍｌ、約３０〜７００Ｕ／ｍｌ、約４０〜６００Ｕ／ｍｌ、約５０〜５００Ｕ／ｍｌ、約６０〜４００Ｕ／ｍｌ、約７０〜３００Ｕ／ｍｌ、約８０〜２００Ｕ／ｍｌ、約９０〜１００Ｕ／ｍｌ、または前に開示された濃度の任意の２つ間である。
【００５２】
一部の実施形態では、１つまたは複数の塩が微生物溶解用溶液に添加される。一部の実施形態では、一価の塩の濃度は、約５０ｍＭ〜６Ｍ、約１５０ｍＭ〜５Ｍ、約３５０ｍＭ〜４．５Ｍ、約５５０ｍＭ〜４Ｍ、約９００ｍＭ〜３．７５Ｍ、約１Ｍ〜３．５Ｍ、または前に開示された濃度の任意の２つ間である。一部の実施形態では、塩は、１つまたは複数の一価の塩を含む。例として、限定することなく、一部の実施形態では、一価の塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、および／またはＬｉＣｌの１つまたは複数である。
一部の実施形態では、微生物溶解反応における塩濃度は、約５０ｍＭ〜８００ｍＭ、約１００ｍＭ〜７００ｍＭ、約２００ｍＭ〜６００ｍＭ、約３００ｍＭ〜５００ｍＭ、および約３５０ｍＭ〜４５０ｍＭ、または前に開示された濃度の任意の２つ間である。
【００５３】
一部の実施形態では、１つまたは複数の一価の塩が乾燥またはペレット化形で保管され、ここで、それぞれの塩の再懸濁時に、塩は、上で同定された濃度に達する。
一部の実施形態では、酵素反応時間は、約１〜６０分、約５〜５５分、約１０〜４５分、約１５〜４０分、約２０〜３５分、または約２５〜３０分である。
一部の実施形態では、酵素反応におけるＤＮＡ汚染物質は、除去される。一部の実施形態では、ＤＮＡの除去は、イオン交換樹脂を使用して達成される。
一部の実施形態では、少なくとも１つのＤＮＡインターカレーティング色素が微生物溶解用溶液に添加される。一部の実施形態では、ＤＮＡインターカレーティング色素は、適切な波長および適用量の光源での活性化後に両方のＤＮＡ鎖への共有結合を生ずる色素である。理論に束縛されることを望むものではないが、一部の実施形態では、共有結合は、試料中に存在するＤＮＡの少なくとも一部を増幅不可能にする。例として、限定することなく、一部の実施形態では、ＤＮＡインターカレーティング色素は、エチジウムモノアジド（ＥＭＡ）およびプロピジウムモノアジド（ＰＭＡ）を含むが、これらに限定されない。
【００５４】
一部の実施形態では、微生物溶解用溶液中のＤＮＡインターカレーティング色素の濃度は、約０．０１μＭ〜１．０μＭ、約０．１μＭ〜０．９μＭ、０．２μＭ〜０．８μＭ、約０．３μＭ〜０．７μＭ、もしくは約０．４μＭ〜０．６μＭ、または前に開示された濃度の任意の２つ間である。
一部の実施形態では、微生物溶解用溶液は、１つまたは複数のヌクレアーゼも含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、微生物溶解用溶液の利用前に中和される。使用される正確なヌクレアーゼは、目的の下流配列に依存する。例として、限定することなく、一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｌＩ、ＨｈａＩ、ＤｄｅＩ、ＲｓａＩ、Ｓａｕ３ＡＩおよびＭｓｐＩから選択されるが、これらに限定されない。
【００５５】
一部の実施形態では、微生物溶解用溶液は、１つまたは複数の洗浄剤を含む。一部の実施形態では、洗浄剤は、両性イオン性洗浄剤である。一部の実施形態では、両性イオン性洗浄剤は、スルホベタインファミリーからである。例として、限定することなく、一部の実施形態では、スルホベタイン洗浄剤は、Ｎ−デシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、Ｎ−デシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、Ｎ−ヘキサデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、Ｎ−オクタデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、および３−［Ｎ，Ｎ−ジメチル（３−ミリストイルアミノプロピル）アンモニオ］プロパンスルホネートを含むが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、洗浄剤は、グルコピラノシドファミリーからの非イオン性洗浄剤である。例として、限定することなく、一部の実施形態では、非イオン性グルコピラノシド洗浄剤は、３−アセチルウンベリフェリルｂ−Ｄ−グルコピラノシド、Ｎ−アミルｂ−Ｄ−グルコピラノシドデシルｂ−Ｄ−チオグルコピラノシド、ｎ−ドデシルｂ−Ｄ−グルコピラノシド、ヘキサデシルｂ−Ｄ−グルコピラノシド、ヘキシルｂ−Ｄ−グルコピラノシド、メチルａ−Ｄ−グルコピラノシド、オクチルｂ−Ｄ−グルコピラノシド、およびフェニル−ａ−Ｄ−グルコピラノシドを含むが、これらに限定されない。
【００５６】
一部の実施形態では、洗浄剤は、陽イオン性洗浄剤である。例として、限定することなく、一部の実施形態では、陽イオン性洗浄剤は、臭化アルキルトリメチルアンモニウム、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、臭化ヘキサデシルピリジニウム、臭化ミリスチルトリメチルアンモニウム、臭化ベンジルドデシルジメチルアンモニウム、ヘキサデシル（２−ヒドロキシエチル）ジメチルアンモニウム、塩化ヘキサデシルピリジニウム、塩化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、または臭化テトラキス（デシル）アンモニウムを含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、陽イオン性洗浄剤の濃度は、約１〜１００×臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）である。
【００５７】
一部の実施形態では、スルホベタインおよびグルコピラノシドファミリーからの単一洗浄剤が微生物溶解用溶液に添加される。一部の実施形態では、スルホベタインファミリーおよびグルコピラノシドファミリーからの１つまたは複数の洗浄剤が微生物溶解用溶液に添加される。その上、または代わりに、一部の実施形態では、微生物溶解用溶液は、１つまたは複数の陽イオン性洗浄剤を含む。例として、限定することなく、一部の実施形態では、陽イオン性洗浄剤は、臭化アルキルトリメチルアンモニウム、アンプロリウム塩酸塩、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンジルジメチルドデシルアンモニウム、塩化ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウム、臭化ベンジルドデシルジメチルアンモニウム、塩化セチルピリジニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、臭化ドデシルエチルジメチルアンモニウム、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム、臭化エチルヘキサデシルジメチルアンモニウム、臭化ヘキサデシルピリジニウム、塩化ヘキサデシルピリジニウム、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、塩化メチルベンゼトニウム、臭化ミリスチルトリメチルアンモニウム、臭化オキシフェノニウム、臭化テトラヘプチルアンモニウム、臭化テトラキス（デシル）アンモニウム、臭化テトラキス（デシル）アンモニウム、および塩化トリカプリルイルメチルアンモニウムを含む。
【００５８】
一部の実施形態では、個々の洗浄剤の濃度は、微生物溶解反応における特定の洗浄剤の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）に依存する。一部の実施形態では、微生物溶解用溶液中の各洗浄剤濃度は、ＣＭＣの約１０〜１１，０００、約２５〜１２，５００、約５０〜８，０００、約７５〜７，０００、約９５〜８，５００、または約９８〜６，７５０倍である。一部の実施形態では、微生物溶解用溶液中の洗浄剤濃度は、ＣＭＣの約１００〜５，０００、約１２５〜９，０００、約２００〜８，０００、約４００〜７，０００、または約５００〜６，０００倍である。
【００５９】
一部の実施形態では、微生物溶解用溶液中の洗浄剤濃度は、ＣＭＣの約１００〜１０００、約２００〜９００、約３００〜８００、約４００〜７００、または約５００〜６００倍である。一部の実施形態では、微生物溶解反応における各洗浄剤濃度は、ＣＭＣの約０．１〜１００、約１．０〜９０、約１０〜８０、約２０〜７０、約３０〜６０、または約４０〜５０倍である。
一部の実施形態では、洗浄剤（群もしくは個々で、またはその任意の組合せとして）は、乾燥またはペレット化形で保管され、ここで、それぞれの洗浄剤の再懸濁時に、洗浄剤は、上で同定された濃度に達する。
【００６０】
一部の実施形態では、微生物溶解用溶液は、１つまたは複数の金属キレート剤を含む。例として、限定することなく、一部の実施形態では、金属キレート剤は、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、微生物溶解用溶液中の金属キレート剤の濃度は、約５０ｍＭ〜１．０Ｍ、約１００ｍＭ〜０．７５Ｍ、約１１０ｍＭ〜５００ｍＭ、約１２５ｍＭ〜５００ｍＭ、約１２５ｍＭ〜４５０ｍＭ、または前に開示された濃度の任意の２つ間である。一部の実施形態では、微生物溶解反応における金属キレート剤の濃度は、約５ｍＭ〜２５０ｍＭ、約１０ｍＭ〜１００ｍＭ、約１５ｍＭ〜９０ｍＭ、約２０ｍＭ〜８０ｍＭ、約１２５ｍＭ〜４５０ｍＭ、または前に開示された濃度の任意の２つ間である。
一部の実施形態では、金属キレート剤は、乾燥またはペレット化形で保管され、ここで、金属キレート剤の再懸濁時に、金属キレート剤は、上で同定された濃度に達する。
【００６１】
一部の実施形態では、微生物溶解用溶液は、１つまたは複数の還元剤を含む。例として、限定することなく、一部の実施形態では、還元剤は、２−メルカプトエタノールまたはジチオスレイトールである。一部の実施形態では、微生物溶解用溶液中の還元剤の濃度は、約１０ｍＭ〜２０Ｍ、約１５ｍＭ〜１５Ｍ、約５０ｍＭ〜１４Ｍ、約１００ｍＭ〜１４Ｍ、もしくは約１１０ｍＭ〜１５Ｍ、または前に開示された濃度の任意の２つ間である。
一部の実施形態では、微生物溶解反応における還元剤の濃度は、約１ｍＭ〜１００ｍＭ、約１０ｍＭ〜９０ｍＭ、約２０ｍＭ〜８０ｍＭ、約３０ｍＭ〜７０ｍＭ、約４０ｍＭ〜６０ｍＭ、もしくは約４５ｍＭ〜５５ｍＭ、または前に開示された濃度の任意の２つ間である。
一部の実施形態では、還元剤は、乾燥またはペレット化形で保管され、ここで、それぞれの還元剤の再懸濁時に、還元剤は、上で同定された濃度に達する。
一部の実施形態では、微生物細胞溶解反応は、約９未満のｐＨで行われる。一部の実施形態では、微生物細胞溶解反応は、約６〜９のｐＨで行われる。一部の実施形態では、微生物細胞溶解反応は、約中性のｐＨで行われる。
【００６２】
一部の実施形態では、本明細書で開示された微生物細胞溶解方法は、高分子量の微生物ＤＮＡの放出につながる。理論に束縛されることを望むものではないが、一部の実施形態では、本明細書で開示された微生物細胞溶解方法は、微生物細胞溶解中の微生物遺伝物質の剪断の減少につながり、溶解用溶液中の高分子量の微生物ＤＮＡの存在を促進する。一部の実施形態では、高分子量の微生物ＤＮＡは、約２ｋｂｐ〜２００ｋｂｐ、約１０ｋｂｐ〜１９０ｋｂｐ、約２０ｋｂｐ〜１８０ｋｂｐ、約３０ｋｂｐ〜１７０ｋｂｐ、約４０ｋｂｐ〜１６０ｋｂｐ、約５０ｋｂｐ〜１５０ｋｂｐ、約６０ｋｂｐ〜１４０ｋｂｐ、約７０ｋｂｐ〜１３０ｋｂｐ、約８０ｋｂｐ〜１２０ｋｂｐ、または約９０ｋｂｐ〜１１０ｋｂｐである。
【００６３】
微生物遺伝物質の単離
一部の実施形態では、微生物細胞溶解後、微生物遺伝物質は、単離されるかつ／または精製される。一部の実施形態では、単離されたかつ／または精製された遺伝物質は、ＲＮＡまたはＤＮＡである。一部の実施形態では、ＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）または二本鎖ＤＮＡ（ｄＤＮＡ）である。
一部の実施形態では、微生物遺伝物質は、微生物溶解反応溶液をカラム中に充填された陰イオン交換物質と接触させることによって単離され、ここで、陰イオン交換物質は、微生物遺伝物質の吸着およびその後の溶出に使用される。一部の実施形態では、既知のイオン強度およびｐＨの溶液は、陰イオン交換カラムへの核酸の結合を可能にし、結合がより低い汚染物質が洗い流されるのを可能にする。例として、限定することなく、一部の実施形態では、陰イオン交換物質で微生物遺伝物質を選択的に結合するための条件は、以下の条件の１つまたは複数で微生物溶解反応溶液を陰イオン交換と接触させることを含む：接触反応が約６〜９、約４．５〜７、または約８〜９．５のｐＨで行われる、および接触反応が約１００ｍＭ〜７５０ｍＭ、約４５０ｍＭ〜１．７５Ｍ、または約５０ｍＭ〜３５０ｍＭの一価の塩濃度を有する。汚染物質が除去された後、次いで、結合した遺伝物質が溶出され得る。
【００６４】
一部の実施形態では、陰イオン交換樹脂は、微生物ゲノム物質を捕獲する／固定化するために使用される。一部の実施形態では、陰イオン交換樹脂は、１つまたは複数の弱陰イオン−交換樹脂（ＷＡＸ）である。ＷＡＸの例は、カルボキシメチル（ＣＭ）、ジエチルアミノプロピル（ＡＮＸ）、ジエチルエタノールアミン（ＤＥＡＥ）、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  Ｉｒａ６７、Ｐｕｒｏｌｉｔｅ  Ａ８４７、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  Ｉｒａ９６、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ９６ＳＢ、Ｄｏｗｅｘ  Ｍａｒａｔｈｏｎ  ＷＢＡ、Ｄｏｗｅｘ  Ｕｐｃｏｒｅ  Ｍｏｎｏ  ＷＢ−５００、Ｐｕｒｏｌｉｔｅ  Ａ８３５、Ｄｏｗｅｘ  Ｍｏｎｏｓｐｈｅｒｅ  ７７、およびＤｏｗｅｘ  Ｍｏｎｏｓｐｈｅｒｅ  ６６を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、ＷＡＸ樹脂は、三級アミン官能基を含有する。
【００６５】
一部の実施形態では、陰イオン交換樹脂は、１つまたは複数の強陰イオン−交換樹脂（ＳＡＸ）である。ＳＡＸの例は、−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨＯＨ−ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨＯＨ−ＣＨ2−Ｎ+（ＣＨ3）3、Ａｍｂｅｒｊｅｔ  Ｕｐ４０００、Ａｍｂｅｒｊｅｔ  ９０００  ＯＨ、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＦＰＡ４０  Ｃｌ、およびＤｏｗｅｘ  Ｕｐｃｏｒｅ  Ｍｏｎｏ  ＭＡ−６００を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、ＳＡＸベース樹脂は、四級アミン官能基を含有する。
一部の実施形態では、陰イオン交換樹脂は、ＷＡＸおよびＳＡＸの組合せである。
一部の実施形態では、陰イオン交換樹脂の形は、ファイバー、膜、吸着剤、ゲル、およびろ紙から選択される。一部の実施形態では、溶解された真核細胞を有する試料は、陰イオン交換樹脂を通過させられるまたはこれと接触させられる。一部の実施形態では、陰イオン交換樹脂は、溶液の形である。
【００６６】
一部の実施形態では、陰イオン交換樹脂は、支持基板にコンジュゲートしている。支持基板の例は、粒子、ビーズ、表面、または球を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、支持基板は、磁性、例えば、磁性粒子またはビーズである。一部の実施形態では、陰イオン交換樹脂は、支持基板にコンジュゲートしており、溶液の形である。
一部の実施形態では、支持基板は、シリカ、ガラス、金属、ポリスチレンベース物質、セルロースベース物質、アガロースベース物質、デキストランベース物質、メタクリル酸ベース物質、セファロースベース物質、またはその組合せを含む。一部の実施形態では、支持基板は、多孔質である。
【００６７】
一部の実施形態では、支持基板は、ビーズまたは球であり、約１０〜１００μｍ、約２０〜９０μｍ、約３０〜８０μｍ、約４０〜７０μｍ、または約５０〜６０μｍの直径を有する。
別の実施形態では、支持基板は、ビーズまたは球であり、約０．１〜１０μｍ、約１．０〜９．０μｍ、約２．０〜８．０μｍ、約３．０〜７．０μｍ、または約４．０〜６．０μｍの直径を有する。
一部の実施形態では、微生物溶解反応は、約０．１〜１０分、約２〜９分、約３〜８分、約４〜７分、または約５〜６分、陰イオン交換樹脂とインキュベートされる。一部の実施形態では、微生物溶解反応は、約１０〜３０分、約１２〜２８分、約１５〜２５分、約１８〜２３分、または約１９〜２２分、陰イオン交換樹脂とインキュベートされる。一部の実施形態では、微生物溶解反応は、１分未満の間、陰イオン交換樹脂とインキュベートされる。
【００６８】
一部の実施形態では、微生物溶解反応は、微生物細胞を溶解するのに必要とされるよりも約０．０１〜１０分、約０．１〜９分、１〜８分、約２〜７分、３〜６分、または約４〜５分長く、陰イオン交換樹脂とインキュベートされる。
一部の実施形態では、陰イオン交換樹脂は、支持基板上で持続的に固定化されている。一部の実施形態では、固定化された陰イオン交換樹脂は、混合物と接触させられかつ／またはこれとインキュベートされ、次いで、混合物が除去される。
一部の実施形態では、支持基板、例えば、ビーズまたは粒子（例えば、微小粒子）にコンジュゲートしている少なくとも１つの陰イオン交換樹脂は、混合物と接触させられるかつ／またはこれとインキュベートされる。一部の実施形態では、微生物溶解反応との接触および／またはこれとのインキュベーション後、支持基板にコンジュゲートしている陰イオン交換樹脂は、微生物溶解反応から除去される。別の実施形態では、微生物溶解反応との接触および／またはこれとのインキュベーション後、支持基板にコンジュゲートしている陰イオン交換樹脂は、固定化され、微生物溶解反応は、除去される。例として、限定することなく、一部の実施形態では、支持基板が磁化または金属ビーズであり、磁化または金属ビーズが磁石または磁界に曝露される場合、支持基板にコンジュゲートしている陰イオン交換樹脂は、選択的に固定化される。
【００６９】
一部の実施形態では、ビーズまたは粒子は、カラム中に充填される。一部の実施形態では、ビーズまたは粒子は、浮遊形である。
一部の実施形態では、陰イオン−交換−微小粒子は、磁化可能なミクロスフェアに結合している弱陰イオン交換物質である。一部の実施形態では、陰イオン−交換−微小粒子は、磁化可能なミクロスフェアに結合している強陰イオン交換物質である。
一部の実施形態では、陰イオン−交換−微小粒子は、多孔質アガロースベース−ミクロスフェアに結合している弱陰イオン交換物質である。一部の実施形態では、陰イオン−交換−微小粒子は、多孔質アガロースベース−ミクロスフェアに結合している強陰イオン交換物質である。
【００７０】
一部の実施形態では、微生物遺伝物質を陰イオン−交換−微小粒子に結合させた後、陰イオン−交換−微小粒子は、洗浄緩衝液を使用して洗浄される。
一部の実施形態では、洗浄緩衝液の塩濃度は、微生物遺伝物質の結合中の塩濃度と比較して上昇される。一部の実施形態では、洗浄条件のｐＨは、よりストリンジェントな洗浄条件を達成するために改変される。一部の実施形態では、洗浄緩衝液のｐＨは、約３．０〜７．５、約３．５〜７．０、約４．０〜６．５、約４．５〜６．０、または約５．０〜５．５である。
一部の実施形態では、洗浄緩衝液は、約０．５Ｍ〜３．０Ｍ、約０．７５Ｍ〜２．７５Ｍ、約１．０Ｍ〜２．５Ｍ、約１．２５Ｍ〜２．２５Ｍ、または約１．５Ｍ〜２．０Ｍの塩濃度を有する。
【００７１】
一部の実施形態では、洗浄緩衝液は、１つまたは複数の界面活性剤を含む。例として、限定することなく、一部の実施形態では、界面活性剤は、ＴｗｅｅｎおよびＴｒｉｔｏｎ−Ｘを含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、Ｔｗｅｅｎおよび／またはＴｒｉｔｏｎ−Ｘ濃度は、約０．０１％〜１．０％（ｖ／ｖ）、約０．１％〜０．９％（ｖ／ｖ）、約０．２％〜０．８％（ｖ／ｖ）、約０．３％〜０．７％（ｖ／ｖ）、または約０．４％〜０．６％（ｖ／ｖ）である。
一部の実施形態では、洗浄緩衝液は、１つまたは複数の洗浄剤を含む。例として、限定することなく、一部の実施形態では、洗浄剤は、両性イオン性洗浄剤を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、両性イオン性洗浄剤濃度は、約０．１×〜３５０×ＣＭＣ、約１．０×〜３００×ＣＭＣ、約１０×〜２５０×ＣＭＣ、約５０×〜２００×ＣＭＣ、または約１００×〜１５０×ＣＭＣである。
【００７２】
一部の実施形態では、微生物ＤＮＡを単離するための方法は、溶出ステップを含む。一部の実施形態では、単離プロセスの競争は、陰イオン−交換−微小粒子のＤＮＡを溶出するまたは除去することによって促進される。
一部の実施形態では、溶出緩衝液のｐＨは、約１２〜１３．５である。約１２を超えるｐＨを有する溶出緩衝液の使用は、当技術分野で通例使用されない。
一部の実施形態では、溶出緩衝液は、リン酸ナトリウムまたはリン酸カリウムなどの緩衝剤を含む。一部の実施形態では、リン酸ナトリウムまたはリン酸カリウムの濃度は、約０．０１Ｍ〜１Ｍ、約０．１Ｍ〜１．８Ｍ、約０．４Ｍ〜１．６Ｍ、約０．８Ｍ〜１．４Ｍ、または約１．０Ｍ〜１．２Ｍである。一部の実施形態では、緩衝剤は、必要ではない。
【００７３】
その上、または代わりに、一部の実施形態では、溶出緩衝液は、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムを含む。一部の実施形態では、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムの濃度は、約１０〜５００ｍＭ、約３０〜４５０ｍＭ、約５０〜４００ｍＭ、約７０〜３５０ｍＭ、約９０〜３００ｍＭ、約１１０〜２５０ｍＭ、または約１３０〜２００ｍＭである。
一部の実施形態では、溶出緩衝液は、１つまたは複数の一価の塩も含む。例として、限定することなく、一部の実施形態では、一価の塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌおよびＬｉＣｌを含むが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、溶出緩衝液中の１つまたは複数の一価の塩の濃度は、約０ｍＭ〜２００ｍＭ、約２５ｍＭ〜１７５ｍＭ、約５０ｍＭ〜１５０ｍＭ、約７５ｍＭ〜１２５ｍＭ、または約９０ｍＭ〜１１０ｍＭである。約２００ｍＭ未満の一価の塩濃度を有する溶出緩衝液の使用は、当技術分野で通例使用されない。一部の実施形態では、溶出緩衝液は、いかなる一価の塩も含有しない。
一部の実施形態では、微生物遺伝物質の単離は、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）精製ステップも含む。一部の実施形態では、精製ステップは、カオトロピック塩を使用することを含む。
【００７４】
一部の実施形態では、核酸精製ステップは、約６Ｍ〜９Ｍの塩化グアニジウムまたはチオシアン酸グアニジウムの添加を含む。理論に束縛されることを望むものではないが、一部の実施形態では、精製は、フィルター／膜、重力もしくはスピンカラムに包埋されたフィルター／膜、またはビーズ／微粒子／磁性粒子などのシリカベース固相物質への核酸の効率的な結合を可能にする。一部の実施形態では、固相物質のその後の洗浄は、残りの塩および他の残存構成成分の大部分をさらに除去する。一部の実施形態では、洗浄は、塩に富んだアルコールベース緩衝液を使用して完了される。一部の実施形態では、２Ｍ未満の塩化グアニジウムまたはチオシアン酸グアニジウムが添加される。
【００７５】
一部の実施形態では、上記の単離された微生物遺伝物質は、約５．０を超えるｐＨを有する水−ベース溶液の添加を通して溶出される。一部の実施形態では、単離された微生物遺伝物質は、約６〜９のｐＨを有する水−ベース溶液の添加を通して溶出される。一部の実施形態では、単離された微生物遺伝物質は、約１０を超えるｐＨを有する水−ベース溶液の添加を通して溶出される。
一部の実施形態では、サイズ排除膜が残留非核酸汚染物質を除去するために使用される。サイズ排除ろ過のための膜は、それらの親水性の性質を考慮すると、再生セルロース（ＲＣ）、およびポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）を含む。膜のこれらの型を使用するための方法および技法は、当業者に既知であり、重力カラム、スピンカラム、真空カラム、および圧力駆動カラムを含むが、これらに限定されない。その上、これらの膜は、上で示されたものと同一または類似した物理的原理下で作動するプロセス特異的デバイス中に組み込まれ得る。
一部の実施形態では、この核酸精製プロセスは、単離された微生物ゲノム物質を脱塩するために使用される。一部の実施形態では、溶出緩衝液は、酸性溶液（ＨＣｌなど）でまたは中性緩衝液で中和される。一部の実施形態では、中和ステップは、必要ではない。
一部の実施形態では、陰イオン−交換樹脂からゲノム物質を溶出した後、追加の精製または脱塩は、必要ではない。
【００７６】
微生物遺伝物質の増幅
一部の実施形態では、単離された微生物遺伝物質は、増幅に供される。一部の実施形態では、増幅された遺伝物質は、ＲＮＡまたはＤＮＡである。一部の実施形態では、ＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）または二本鎖ＤＮＡ（ｄＤＮＡ）である。一部の実施形態では、ＤＮＡは、リボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）である。
一部の実施形態では、酵素的増幅は、等温増幅または熱サイクル増幅プロセスを通して達成され得る。
一部の実施形態では、ポリメラーゼ連鎖反応、またはＰＣＲは、熱サイクルベース酵素的増幅の既知の方法である酵素的増幅の好ましい方法である。
【００７７】
一部の実施形態では、アンプリコンは、約４００ｂｐを超える。一部の実施形態では、アンプリコンは、約４００〜４０００ｂｐ、約７００〜３７００ｂｐ、約１０００〜３４００ｂｐ、約１３００〜３１００ｂｐ、約１６００〜２７００ｂｐ、約１９００〜２４００ｂｐ、または約２１００〜２２００ｂｐである。一部の実施形態では、上で開示された長さのアンプリコンの使用は、本明細書で開示された方法における下流処理（例えば、微生物遺伝物質の検出および同定）に有利である。
一部の実施形態では、細菌ゲノム物質のみが増幅される。一部の実施形態では、真菌ゲノム物質のみが増幅される。一部の実施形態では、真菌と細菌標的の両方が増幅される。一部の実施形態では、合成標的が増幅される。一部の実施形態では、合成標的は、プラスミドおよび合成遺伝子を含むが、これらに限定されない。例として、限定することなく、一部の実施形態では、プラスミドは、例えば、Ｍ１３ｍｐ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＣＬＩＰｆ、ｐＣＬｕｓ、ｐＣＭＶ−Ｃｌｕｃ、ｐＫＬＡＣ２、ＰＭＡＬ−ｐ５ｘ、ｐＮＥＢ２０６Ａ、ｐＳＮＡＰｆ、ｐＳＶ４０−ＣＬｕｃ、ｐＴＫ−ＧＬｕｃ、ｐＴＸＢ１、ｐＴＹＢ２１、ｐＵＣ１９、およびθＸ１７４などのＤＮＡ断片を含む。
【００７８】
微生物遺伝物質の検出および微生物の同定
一部の実施形態では、微生物ＤＮＡが検出されかつ同定される。
一部の実施形態では、ＤＮＡ侵入人工核酸（ＤＩＡＮＡ）が微生物遺伝物質を検出し同定するために使用される。一部の実施形態では、侵入のプロセスは、ハイブリダイゼーションとは対照的に、二本鎖ＤＮＡを完全に変性させる必要性を否定する二本鎖ＤＮＡを特異的に標的とする（例えば、Egholm et al., Nucleic Acids Res. 23(2): 217-222 (Jan. 25, 1995)を参照されたい。
一部の実施形態では、ＤＩＡＮＡは、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（ＰＮＡ）の特定化された型またはクラスの形をとる。一部の実施形態では、ＤＩＡＮＡは、ＰＮＡの特定のクラスに限定されない。一部の実施形態では、ＤＩＡＮＡは、ＬｏｃｋｅｄまたはＢｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（ＬＮＡおよび／またはＢＮＡ）の特定化された型またはクラスの形をとる。一部の実施形態では、二重鎖ＤＮＡに局所的に侵入するＤＩＡＮＡは、本明細書で開示された方法において使用される必要な親和性および配列特異性を有する。
【００７９】
一部の実施形態では、ＰＮＡオリゴマーベースＤＩＡＮＡは、主鎖のガンマ−ポジションでのキラル立体−中心を有する（γＰＮＡとしても既知である）。右巻きらせん中に構造的に前もって向けられたＰＮＡオリゴマーは、二重鎖ＤＮＡ侵入を行うようにエネルギー的に恵まれている。一部の実施形態では、微生物ＤＮＡは、その内容が、その全体が参照によって組み込まれているＷＯ２０１３／１７６９９２において教示されているようにγＰＮＡを使用して検出される。一部の実施形態では、ＤＩＡＮＡの使用は、長いアンプリコン（例えば、約４００〜４０００ｂｐのアンプリコン）に有利である。
【００８０】
一部の実施形態では、増幅された遺伝物質中の目的の標的ゲノム領域は、細菌１６Ｓ、ＩＴＳ、２３Ｓ、ＲＰＬ遺伝子、またはＴＵＦ遺伝子を含むが、これらに限定されない。その上、または代わりに、一部の実施形態では、増幅された遺伝物質中の目的の標的ゲノム領域は、真菌１８Ｓ、ＩＴＳ、５．８Ｓ、および２５／２８Ｓを含むが、これらに限定されない。その上、または代わりに、一部の実施形態では、増幅された遺伝物質中の目的の標的ゲノム領域は、抗生物質耐性マーカーおよび／または遺伝子を含む。
一部の実施形態では、各ＤＩＡＮＡは、単一微生物種からの特定の微生物遺伝物質（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を標的とする。一部の実施形態では、各ＤＩＡＮＡは、微生物の群の特定の微生物遺伝物質（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を標的とする。一部の実施形態では、特定の微生物遺伝物質（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）は、増幅された微生物遺伝物質である。
【００８１】
一部の実施形態では、微生物同定において有用なＤＩＡＮＡのためのオリゴマー配列は、以下の通りである（表１）：
【表１】
2017527301.tif 000003
【００８２】
一部の実施形態では、ＤＩＡＮＡプローブは、微生物遺伝物質中の抗生物質耐性を与える遺伝子または抗生物質耐性を与えるマーカーを検出する。抗生物質耐性を与える遺伝子または抗生物質耐性を与えるマーカーは、特定の抗菌剤または抗菌剤のクラスへの感受性の減少を与えるゲノム物質を含む。例として、限定することなく、一部の実施形態では、抗生物質耐性を与える遺伝子または抗生物質耐性を与えるマーカーは、ＭｅｃＡ（いくつかのＢ−ラクタム−ベース抗生物質への感受性の減少を与える）、ＶａｎＡ／ＶａｎＢ（バンコマイシンなどのいくつかのグリコペプチド−ベース抗生物質への感受性の減少を与える）、ＯＸＡ−４８、Ｎｅｗ  Ｄｅｌｈｉ  Ｍｅｔａｌｌｏ−ベータ−ラクタマーゼ−１（ＮＤＭ−１）、およびｂｌａｋｐｃ（一般的なカルバペネムへの感受性の減少を与える）を含むが、これらに限定されない。
【００８３】
一部の実施形態では、ＤＩＡＮＡプローブは、抗生物質耐性微生物細胞を検出し同定するために使用される。これらの核酸バイオマーカーの同定のための配列は、表２に見出され得る：
【表２】
2017527301.tif 000004
【００８４】
一部の実施形態では、抗生物質耐性を与える遺伝子またはマーカーは、検出前に増幅される。一部の実施形態では、抗生物質耐性を与える遺伝子またはマーカーの増幅は、ｒＤＮＡ増幅での単一反応で行われる。一部の実施形態では、抗生物質耐性を与える遺伝子またはマーカーの増幅は、添加または外的反応として行われる。
一部の実施形態では、ＤＩＡＮＡプローブは、配列番号１〜３７の任意の１つの逆相補的配列を含む。一部の実施形態では、ＤＩＡＮＡプローブは、配列番号１〜３７の任意の１つまたはそれらの逆相補的対応物との８５％を超える同一性を有する配列を含む。
【００８５】
一部の実施形態では、増幅産物は、精製される。例として、限定することなく、一部の実施形態では、増幅産物を精製するための方法は、カオトロピック塩と組み合わせたガラスもしくはシリカファイバーまたは粒子上へのアンプリコンの可逆的結合または吸収、それに続くそれらの洗浄および溶出を含む。一部の実施形態では、精製方法は、アルコールベース溶液（例えば、エタノールまたはイソプロパノールなど）中での沈殿、陰イオン交換樹脂、またはサイズ排除フィルターと接触させることを含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、増幅産物のクリーニングアップは、下流プロセスの障害となり得る過剰なプライマー、ｄＮＴＰ、塩および他の構成成分を除去する。
【００８６】
一部の実施形態では、精製プロセスは、必要ではなく、増幅産物／溶液は、そのままで使用され得る。
一部の実施形態では、ＤＩＡＮＡは、結合部分を含有するように修飾される。一部の実施形態では、結合部分は、ＤＩＡＮＡを固体基板に結合する。一部の実施形態では、ＤＩＡＮＡを固体基板に結合することは、下流の分離または洗浄ステップに有用である。例として、限定することなく、一部の実施形態では、結合部分は、非共有結合部分（例えば、ビオチン、ジゴキシン、ジギトキシンなど）または共有結合部分（例えば、ＣＯＯＨ基、ＮＨＳ−エステル基、マレイミド（ｍａｌｅｍｉｄｅ）化学、およびクリックケミストリー）を含むが、これらに限定されない。
【００８７】
一部の実施形態では、結合部分は、１つまたは複数のリンカーによってＤＩＡＮＡプローブから間隔があけられている。一部の実施形態では、リンカーは、単一分子である。一部の実施形態では、リンカーは、単一リンカー分子となるように組み合わせられた直鎖状または分岐した複数の個々の分子の鎖からなる。
一部の実施形態では、リンカーは、（エチレン）グリコール、ジ（エチレン）グリコール、トリ（エチレン）グリコール、ポリ（エチレン）グリコール、炭素リンカー、アミノ酸、シランベースリンカー、またはその任意の組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、リンカーは、ＤＩＡＮＡタグをつけられたＤＮＡ断片をＤＩＡＮＡが結合している固相基板の表面から遠ざけるのに役立つ。
一部の実施形態では、リンカー長は、約２０〜２００、約４０〜１８０、約６０〜１６０、約８０〜１４０、または約１００〜１２０原子である。一部の実施形態では、リンカー長は、少なくとも４０原子である。開示されたリンカー長は、当技術分野で通例使用されない。
【００８８】
一部の実施形態では、１つまたは複数の結合部分は、単一リンカーに沿って使用される。一部の実施形態では、単一リンカーに沿った２つ以上の結合部分であって、ここで、各リンカーが１つまたは複数の結合部分を有し、各結合部分がオリゴマーに沿った異なる位置に付着している。一部の実施形態では、複数の結合部分は、表面結合動態および／もしくは収率および／もしくは効率、ならびに／または強度を増加させる。
一部の実施形態では、ＤＮＡアンプリコンは、１つまたは複数のＤＩＡＮＡで最初にタグをつけられ、次いで、ハイブリッド複合体を固相表面上へ捕獲する。
一部の実施形態では、ＤＩＡＮＡは、微生物遺伝物質ＤＮＡを捕獲する前に固体表面とインキュベートされる。
一部の実施形態では、固相表面は、ビーズ、ナノ粒子、微小粒子または平らな基板である。一部の実施形態では、固相表面は、それへのＤＩＡＮＡの結合を促進するためにさらに化学的に修飾される。
【００８９】
一部の実施形態では、標的アンプリコンを捕獲し、それを固相表面上へ固定化することは、系（例えば、プレートまたはチップ）上の個々のウェルにおいて起こる。系上のウェルの典型的な、非限定的なレイアウトは、図３０〜３６に示されている。
一部の実施形態では、ウェルは、単一ＤＩＡＮＡオリゴマーで活性化される。
一部の実施形態では、ウェルは、単一病原体に関する１つを超えるＤＩＡＮＡプローブで活性化される；例えば緑膿菌に関するウェル（表１を参照されたい）。
一部の実施形態では、１つまたは複数のプローブが複数の病原体に使用され得る；例えば、エンテロバクター・エロゲネス、エンテロバクター・クロアカ、クレブシエラ・オキシトカ、および肺炎桿菌に関する単一ウェル。
一部の実施形態では、位置（ウェルナンバー／ポジション）は、どの標的が捕獲されたかに関する情報をもたらすことになる（例えば、ＤＩＡＮＡプローブの存在により）。一部の実施形態では、検出された色（例えば、蛍光が光学的検出モダリティーとして使用される場合）および位置の組合せは、どの標的が捕獲されたかを解読するために使用され得る。
【００９０】
一部の実施形態では、ｄｓＤＮＡよりもｓｓＤＮＡが利用される。一部の実施形態では、ｓｓＤＮＡは、ＤＮＡ分子のＤＩＡＮＡタギング前に変性プロトコールを通してまたは不斉増幅プロセスを通してｄｓＤＮＡから生じる。
一部の実施形態では、ＤＮＡは、完全に二重鎖形である。一部の実施形態では、ＤＮＡは、局所的に二重鎖形である。
一部の実施形態では、侵入溶液は、緩衝剤を含む。例として、限定することなく、一部の実施形態では、緩衝剤は、トリス、リン酸ナトリウム、およびリン酸カリウムを含むが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、緩衝剤の濃度は、約１ｍＭ〜５００ｍＭ、約５０ｍＭ〜４５０ｍＭ、約１００ｍＭ〜４００ｍＭ、約１５０ｍＭ〜３５０ｍＭ、または約２００ｍＭ〜３００ｍＭである。
【００９１】
一部の実施形態では、侵入溶液は、１つまたは複数の一価の塩を含む。一部の実施形態では、一価の塩は、ＮａＣｌまたはＫＣｌである。一部の実施形態では、一価の塩の濃度は、約１ｍＭ〜１５０ｍＭ、約５ｍＭ〜１４５ｍＭ、約１５ｍＭ〜１３０ｍＭ、約２５ｍＭ〜１１５ｍＭ、約３５ｍＭ〜１００ｍＭ、約４５ｍＭ〜８５ｍＭ、または約５５ｍＭ〜７０ｍＭである。一部の実施形態では、侵入溶液は、一価の塩を含有しない。侵入アッセイの開示された塩濃度は、標準的なハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用される塩濃度未満である。
【００９２】
一部の実施形態では、侵入溶液は、１つまたは複数の界面活性剤を含んだ。一部の実施形態では、界面活性剤は、非特異的結合を減少させる。例として、限定することなく、界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ−２０、またはＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、侵入溶液中の界面活性剤の濃度は、約０．０１％〜１．０％（ｖ／ｖ）、約０．１％〜０．９％（ｖ／ｖ）、約０．２％〜０．８％（ｖ／ｖ）、約０．３％〜０．７％（ｖ／ｖ）、または約０．４％〜０．６％（ｖ／ｖ）である。
【００９３】
一部の実施形態では、侵入溶液は、排除体積を変動させる構成成分（例えば、クラウディング剤（ｃｒｏｗｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ））を含む。例として、限定することなく、クラウディング剤は、ポリ−エチレングリコール（ＥＧ）、ＥＧ−２００、ＥＧ−２５０、ＥＧ−３００、ＥＧ−４００、ＥＧ−５００、ＥＧ−７５０、ＥＧ−１，０００、ＥＧ−９，５００、ＥＧ−２，０００、ＥＧ−４，０００、ＥＧ−５，０００、ＥＧ−６，０００、ＥＧ−８，０００、ＥＧ−１０，０００、ＥＧ−１２，０００、ＥＧ−１３，０００、ＥＧ−２０，０００、デキストラン（ＤＸ）、ポリビニル−アルコール（ＰＶＡ）、Ｆｉｃｏｌｌｓ（ＦＣ）、ＤＸ−１，０００、ＤＸ−５，０００、ＤＸ−１２，０００、ＤＸ−５０，０００、ＤＸ−８０，０００、ＰＶＡ  ８９ｋ−９８ｋ、ＰＶＡ  ８５ｋ−１２４ｋ、ＰＶＡ  １３０ｋ、ＰＶＡ  ３１ｋ−５０ｋ、ＰＶＡ  ５０ｋ−８０ｋ、ＰＶＡ  ７０ｋ−１００ｋ、ＰＶＡ  ９０ｋ−１２０ｋ、ＰＶＡ  １７０ｋ−２５０ｋ、ＰＶＡ  ６１ｋ、ＰＶＡ  ３１ｋ、ＰＶＡ  １３０ｋ、ＰＶＡ  ６７ｋ、ＰＶＡ  ２７ｋ、ＰＶＡ  ２５ｋ、ＦＣ−４００、ＦＣ−７０、ＦＣ−４０、グリセロール、グルコース、およびスクロースを含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、侵入溶液中のクラウディング剤の濃度範囲は、侵入溶液の総体積の約１％〜２０％（ｖ／ｖ）、約３％〜１７％（ｖ／ｖ）、約６％〜１４％（ｖ／ｖ）、または約９％〜１１％（ｖ／ｖ）である。
【００９４】
一部の実施形態では、侵入溶液は、１つまたは複数のＤＮＡ変性剤を含んだ。例として、限定することなく、ＤＮＡ変性剤は、ＤＭＳＯ、ホルムアミド、およびベタインを含むが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、侵入溶液は、ＤＭＳＯ、ホルムアミド、ベタイン、またはその組合せも含む。一部の実施形態では、ＤＭＳＯおよび／またはホルムアミドは、侵入溶液の総体積の約１％〜３０％（ｖ／ｖ）、約５％〜２５％（ｖ／ｖ）、約１０％〜２０％（ｖ／ｖ）、または約１４％〜１６％（ｖ／ｖ）である。一部の実施形態では、侵入緩衝液中のベタインの濃度は、約０．１Ｍ〜２．５Ｍ、約０．５Ｍ〜２．０Ｍ、または約１．０Ｍ〜１．５Ｍである。
一部の実施形態では、侵入溶液は、約１０以上のｐＨを有する。一部の実施形態では、約１０を超えるｐＨを有する侵入溶液は、ＤＮＡ変性または不安定化に貢献する。
【００９５】
一部の実施形態では、侵入反応は、約０．１〜５分、約１〜１０分、約５〜３０分、または約１０〜６０分、持続する。
一部の実施形態では、ＤＩＡＮＡおよび微生物遺伝物質（例えば、増幅された微生物ＤＮＡ）のインキュベーションは、約６５℃〜９９℃、約７０℃〜９５℃、約７５℃〜９０℃、または約８０℃〜８５℃の温度である。
例として、限定することなく、一部の実施形態では、ＤＩＡＮＡ侵入プロセスは、約１４〜１８塩基を有するＤＩＡＮＡオリゴマーを含み、ここで、より低い侵入温度は、約：ＴM（ＤＮＡ）＋１５℃と定義され、より高い侵入温度は、９９℃である。ＴM（ＤＮＡ）は、ほぼ同一の溶液条件（電解質強度、緩衝液、ｐＨ、他の添加剤など）に置かれた場合の、ＤＩＡＮＡオリゴマーと同一の組成および配列を有するＤＮＡオリゴマーの融解温度と定義される。
例として、限定することなく、一部の実施形態では、ＤＩＡＮＡ侵入プロセスは、１８塩基よりも大きいＤＩＡＮＡオリゴマーを使用することを含み、ここで、より低い侵入温度は、約：ＴM（ＤＮＡ）＋０．７℃×（塩基の数）と定義され、より高い侵入温度は、９９℃である。
【００９６】
例として、限定することなく、一部の実施形態では、ＤＩＡＮＡ侵入プロセスは、１４塩基よりも小さい／短いＤＩＡＮＡオリゴマーを使用することを含み、ここで、より低い侵入温度は、約：ＴM（ＤＮＡ）＋１．１℃×（塩基の数）と定義され、より高い侵入温度は、９９℃である。
一部の実施形態では、洗浄ステップは、ＤＩＡＮＡ侵入後に行われる。一部の実施形態では、洗浄ステップは、非特異的結合を減少させる。一部の実施形態では、洗浄は、高温度洗浄溶液を使用する。一部の実施形態では、洗浄溶液の温度は、約６０℃〜９９℃、約６５℃〜９５℃、約７０℃〜９０℃、または約７５℃〜８５℃である。
一部の実施形態では、洗浄緩衝液は、以下のものの１つまたは複数を含む：１）例えば、約５０〜６５０ｍＭ、約１００〜６００ｍＭ、約１５０〜５５０ｍＭ、約２００〜５００ｍＭ、約２５０〜４５０ｍＭ、または約３００〜４００ｍＭでのＮａＣｌまたはＫＣｌなどの一価の塩；２）例えば約６〜９の中性付近ｐＨに緩衝された；および３）界面活性剤、例えば、約０．１％〜１．０％（ｖ／ｖ）、約０．２％〜０．９％（ｖ／ｖ）、約０．３％〜０．８％（ｖ／ｖ）、約０．４％〜０．７％（ｖ／ｖ）、または約０．５％〜０．６％（ｖ／ｖ）でのＴｗｅｅｎ−２０またはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００。一部の実施形態では、洗浄緩衝液は、加熱される。
【００９７】
一部の実施形態では、洗浄緩衝液は、１つまたは複数のＤＮＡ不安定化または変性剤、例えば、ＤＭＳＯ、ベタイン、およびホルムアミドを含む。一部の実施形態では、ＤＭＳＯおよび／またはホルムアミドは、侵入溶液の総体積の約１０％〜３０％（ｖ／ｖ）、約１５％〜２５％（ｖ／ｖ）、約１０％〜２０％（ｖ／ｖ）、または約１４％〜１６％（ｖ／ｖ）である。一部の実施形態では、侵入緩衝液中のベタインの濃度は、約０．１Ｍ〜２．５Ｍ、約０．５Ｍ〜２．０Ｍ、または約１．０Ｍ〜１．５Ｍである。
一部の実施形態では、洗浄緩衝液のｐＨは、９．０を超え、約０ｍＭ〜３００ｍＭ、約５０ｍＭ〜２５０ｍＭ、約１００ｍＭ〜２００ｍＭ、または約１２５ｍＭ〜１７５ｍＭの一価の塩および／または界面活性剤を含む。一部の実施形態では、洗浄緩衝液のｐＨは、６．０未満であり、約０ｍＭ〜８００ｍＭ、約５０ｍＭ〜７５０ｍＭ、約１００ｍＭ〜７００ｍＭ、約１５０ｍＭ〜６５０ｍＭ、または約２００ｍＭ〜６００ｍＭ、約２５０ｍＭ〜５５０ｍＭ、約３００ｍＭ〜５００ｍＭ、または約３５０ｍＭ〜４５０ｍＭの一価の塩および／または界面活性剤を含む。
【００９８】
例として、限定することなく、一部の実施形態では、洗浄ステップは、約１４〜１８塩基のサイズであるＤＩＡＮＡオリゴマーを洗浄することを含み、ここで、より低い洗浄温度は、約：ＴM（ＤＮＡ）＋２０℃と定義され、より高い洗浄温度は、９９℃である。
例として、限定することなく、一部の実施形態では、洗浄ステップは、１８塩基よりも大きいＤＩＡＮＡオリゴマーを洗浄することを含み、ここで、より低い洗浄温度は、約：ＴM（ＤＮＡ）＋０．９℃×（塩基の数）と定義され、より高い洗浄温度は、９９℃である。
例として、限定することなく、一部の実施形態では、洗浄ステップは、１４塩基よりも小さい／短いＤＩＡＮＡオリゴマーを洗浄することを含み、ここで、より低い洗浄温度は、約：ＴM（ＤＮＡ）＋１．２５℃×（塩基の数）と定義され、より高い洗浄温度は、９９℃である。
【００９９】
一部の実施形態では、それらのそれぞれの標的へのＤＩＡＮＡの結合の検出は、光学的、化学的、電気的、または機械的検出方法を通してである。
一部の実施形態では、光学的検出は、蛍光またはルミネセンスの使用を通してである。
一部の実施形態では、１つまたは複数の検出可能なマーカーは、侵入ＤＩＡＮＡ上に配置されている。一部の実施形態では、１つまたは複数の検出可能なマーカーは、固定化されたオリゴマーを通して捕獲されたＤＮＡアンプリコン上に配置されている。一部の実施形態では、１つまたは複数の検出可能なマーカーは、一部のまたは全ての潜在的な標的に普遍的である第２のオリゴマー上に配置されている。
【０１００】
例として、限定することなく、一部の実施形態では、検出可能なマーカーは、蛍光色素、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ルシフェラーゼ、メトキシクマリン、ダンシル、ピレン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、ＡＭＣＡ、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ色素、ダポキシル色素、ジアルキルアミノクマリン、ビマン、ヒドロキシクマリン、ｃａｓｃａｄｅ  ｂｌｕｅ色素、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｏｒａｎｇｅ色素、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｙｅｌｌｏｗ色素、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ色素、ＰｙＭＰＯ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０、フルオレセイン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８、ＢＯＤＩＰＹ  ４９３／５０３、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ５１４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５１４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、ＢＯＤＩＰＹ  ５５８／５６８、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｒｅｄ色素、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、ＢＯＤＩＰＹ  ５８１／５９１、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ色素、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６１０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０、およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７９０を含むが、これらに限定されない。
【０１０１】
例として、限定することなく、間接的検出を可能にする検出可能なマーカーは、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、ビオチン、またはジニトロフェニルを含むが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、微生物種の同定は、ＤＮＡアンプリコン標識を通してである。
一部の実施形態では、増幅において使用されるプライマーは、増幅プロセスを開始する前に検出可能なマーカーで標識される。
【０１０２】
一部の実施形態では、タグを含有するまたはタグの下流コンジュゲーションを可能にするように修飾されている修飾ヌクレオチドが増幅プロセスにおいて使用される。例として、限定することなく、タグ−修飾ヌクレオチドは、ジエチルアミノクマリン（ＤＥＡＣ）、シアニン３（Ｃｙ３）、シアニン５（Ｃｙ５）、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、リサミン、Ｒ１１０、Ｒ６Ｇ、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、またはＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ色素で修飾されたヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。その後のタギングを可能にする修飾ヌクレオチドに関する例は、アミノ−ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、ビオチン、またはジニトロフェニル（ＤＮＰ）で修飾されたヌクレオチドであるが、これらに限定されない。
【０１０３】
一部の実施形態では、ＤＮＡアンプリコンの標識は、続いてインターカレーティング色素とインキュベーションすることによって達成される。例として、限定することなく、インターカレーティング色素は、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、ＯｌｉＧｒｅｅｎ、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ、ＳＹＢＲ  Ｓａｆｅ、ＴＯＴＯ−１、ＹＯＹＯ−１、ＹＯＹＯ−３、ＰＯＰＯ−１、ＢＯＢＯ−１、ＪＯＪＯ−１、ＰＯＰＯ−３、ＬＯＬＯ−１、ＢＯＢＯ−３、ＹＯＹＯ−３、ＴＯＴＯ−３、ＳＹＴＯＸ−Ｂｌｕｅ、ＳＹＴＯＸ−Ｇｒｅｅｎ、ＳＹＴＯＸ−Ｏｒａｎｇｅ、ＳＹＴＯＸ−Ｒｅｄ、およびＥｔＢｒを含むが、これらに限定されない。
試料からの真核生物ゲノム物質の自動除去のためのデバイス
一部の態様では、本テクノロジーは、試料からの真核生物ゲノム物質の自動除去のためのデバイスに関する。一部の実施形態では、デバイスは、試料から１つまたは複数の無傷の微生物細胞を単離する。一部の実施形態では、デバイスは、上記の真核生物ＤＮＡを除去するかつ／または１つまたは複数の微生物細胞を単離するための方法を自動化する。
【０１０４】
一部の実施形態では、デバイスは、完全に自動化されており、ここで、さらなるヒトの介入は、必要ではない。一部の実施形態では、デバイスは、半自動化されており、ここで、ヒトの介入が、望ましいプロセスを完了するために必要である。
一部の実施形態では、デバイスは、独立型であり、専用の計測手段を必要としない。一部の実施形態では、デバイスは、１つまたは複数の機器によって作動されるまたは動力を供給される。
【０１０５】
図１は、上で記載された真核細胞の選択的溶解および真核生物ゲノム物質の除去の典型的な実施形態を行うデバイスにおける典型的なプロセス１００を示す。図１を参照して、一部の実施形態では、最初の試料１０１、例えば、対象からの試料が細胞溶解用溶液１０２、例えば、真核生物溶解用溶液と組み合わせられて、混合物を形成する。一部の実施形態では、第１の反応１０３、例えば、真核細胞の溶解がある。一部の実施形態では、溶解終結溶液１０４が混合物に添加されて、第２の反応１０５、例えば、細胞溶解を終結させることが開始される。一部の実施形態では、混合物が樹脂または樹脂溶液１０６、例えば、陰イオン交換樹脂と接触させられて、第３の反応１０７、例えば、ＤＮＡを捕獲することが開始される。一部の実施形態では、捕獲されたＤＮＡは、真核生物ＤＮＡ、例えば、ｈＤＮＡである。一部の実施形態では、第３の反応後のアウトプット１０８は、例えば、真核生物ＤＮＡが枯渇したＤＮＡ枯渇溶液である。一部の実施形態では、アウトプットは、１つまたは複数の微生物細胞を含有する溶液を含む。
【０１０６】
一部の実施形態では、デバイスは、１回だけ使用のデバイス、すなわち、使い捨てのデバイスである。一部の実施形態では、デバイスは、統合または機能的バイオチップの形である。
一部の実施形態では、デバイスは、流体デバイスに連結された、流体体積、例えば約０．５ｍｌ〜５ｍｌを処理するために必要な能力を有するカートリッジを含む。一部の実施形態では、カートリッジは、流体のカートリッジである。
一部の実施形態では、カートリッジは、複数のチャンバーを含む。例として、限定することなく、一部の実施形態では、チャンバーは、液体、例えば、溶解緩衝液または溶液、溶解終結試薬または溶液、樹脂溶液を保管するために使用され、反応、例えば、溶解反応を処理するために使用され、溶液、例えば、試料をデバイス、またはその組合せに添加するために使用される。一部の実施形態では、デバイスのチャンバーは、試料の処理におけるヒトの介入を最小化するのにも役立つ。
【０１０７】
例として、限定することなく、デバイスの典型的な実施形態は、以下のチャンバーを含む：（１）反応プロセスを可能にするのに十分な体積の試料を受け取るチャンバー；（２）溶解用溶液を含有するチャンバー；（３）溶解プロセスを終結させる溶液を含有するチャンバー；（４）粒子に結合した樹脂を含有するチャンバー；および（５）最終溶液、例えば、単離された微生物細胞試料が移され得るチャンバー。
一部の実施形態では、１つまたは複数のチャンバーが相互に連結されている。代わりに、またはその上、一部の実施形態では、１つまたは複数のチャンバーが直列で連結されている。例として、限定することなく、一部の実施形態では、チャンバー間の連結部は、流れ−チャネル、チューブ、パイプ、またはその組合せを含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、チャンバーを連結している流れ−チャネル、チューブ、およびパイプは、流体デバイス上に配置されている。一部の実施形態では、チャンバーを連結している流れ−チャネル、チューブ、およびパイプは、連結されたチャンバー間の多方向の流れを提供する。
【０１０８】
一部の実施形態では、１つまたは複数のチャンバーが、あるチャンバーから別のチャンバーへの流体の通過または移動を制御するための１つまたは複数の流れゲートと連結されている。一部の実施形態では、流れゲートは、空気または流体の流れ、それとの連結のための１つまたは複数のインプット流れ−チャネル、および空気の流れまたはそれとの流体連結のための１つまたは複数のアウトプット流れ−チャネルを有する。一部の実施形態では、流れゲート、インプット流れ−チャネル、およびアウトプット流れ−チャネルは、流体デバイス上に配置されている。
一部の実施形態では、流体デバイスは、チップ、バイオチップ、または統合チップである。一部の実施形態では、流体デバイスは、複数のインプットおよびアウトプットを含む。一部の実施形態では、流体デバイスは、複数のベンティングポートを含む。一部の実施形態では、流体デバイスは、１つまたは複数のニューマチックインターフェースを含む。一部の実施形態では、各ベントポートは、流体デバイス上に配置されているチューブ、パイプ、または流れチャネルによってカートリッジ中のその関連するチャンバーと連結されている。
【０１０９】
図２Ａ〜Ｃは、デバイス２００の典型的な、非限定的な実施形態を示す。図２Ａを参照して、一部の実施形態では、デバイスは、流体のカートリッジ２０１および流体のチップ２０２を含み、ここで、流体のカートリッジ２０１は、流体のチップ２０２に付着している。一部の実施形態では、試料挿入チャンバー２０３がある。一部の実施形態では、流体のチップ２０２および流体のカートリッジ２０１は、同じ材料から製造される。一部の実施形態では、流体のチップ２０２および流体のカートリッジ２０１は、異なる材料から製造される。一部の実施形態では、流体カートリッジ２０１は、結合を通して流体のチップ２０２に付着していてもよい。一部の実施形態では、結合は、熱的、化学的、または超音波的である。一部の実施形態では、チップ／カートリッジ組合せは、単一構成成分として製造され得る。
一部の実施形態では、デバイス２００は、独立型デバイスである。別の実施形態では、デバイス２００は、第２のデバイスまたは機械への付属物、モジュール、または消耗品である。一部の実施形態では、第２のデバイスまたは機械は、上流および／または下流処理ステップを提供する。
【０１１０】
一部の実施形態では、流体のカートリッジ２０１は、１つまたは複数のチャンバー３０１〜３０５を収容しており、図２Ｂを参照されたい。例として、限定することなく、一部の実施形態では、流体のカートリッジ中のチャンバーは、反応チャンバー３０１、溶解用溶液貯蔵チャンバー３０２、樹脂貯蔵チャンバー３０３、溶解終結溶液貯蔵チャンバー３０４、およびＤＮＡ枯渇溶液を採取するためのアウトプットチャンバー３０５を含むが、これらに限定されない。
図２Ｃを参照して、例として、限定することなく、一部の実施形態では、流体のチップ２０２は、流れチャネル４０１、流れゲート４０２、ニューマチックインターフェース４０３、およびベント４０４を含むが、これらに限定されない。図２Ｃは、流体のカートリッジ２０１（図２Ａ〜Ｂを参照されたい）のチャンバー３０１〜３０５を流体のチップに接触させるための典型的な、非限定的な実施形態も描写する。
【０１１１】
一部の実施形態では、流体圧力は、あるチャンバーから別のチャンバーへの流体の流れを駆動する。一部の実施形態では、流体圧力は、無菌液体および／または無菌気体によって誘発される。一部の実施形態では、流体圧力は、チャンバー間の流体の移動を駆動する。代わりに、またはその上、一部の実施形態では、流体圧力は、チャンバー間の流体の移動を妨げる。
一部の実施形態では、チャンバー中の１つまたは複数の溶液は、滅菌気体をチャンバー中に流すことによって混合されるまたは撹拌される。一部の実施形態では、１つまたは複数の溶液を含有するチャンバーは、１つまたは複数の溶液の混合または均質化を引き起こすために無菌空気または気体のストリームまたは複数のパルスに供される。代わりに、またはその上、一部の実施形態では、チャンバー中の１つまたは複数の溶液は、滅菌流体をチャンバー中に流すことによって混合されるまたは撹拌される。
【０１１２】
一部の実施形態では、デバイスは、試料を添加する、例えば、試料をチャンバー中に注入するための開口部を含む。一部の実施形態では、開口部は、封のし直しができるカバーを有する。一部の実施形態では、カバーを開けるには、機械的な力が必要であり、ここで、機械的な力がなければ、カバーは閉じたままである。一部の実施形態では、開口部は、そこを通して試料が注入される膜で覆われている。
一部の実施形態では、チャンバー中への試料注入は、約１μｌ〜５０μｌ、約１０μｌ〜３．０ｍｌ、約２０μｌ〜２．５ｍｌ、約３０μｌ〜２．０ｍｌ、約４０μｌ〜１．５ｍｌ、約５０μｌ〜１．０ｍｌ、約６０μｌ〜９０μｌ、約７０μｌ〜８０μｌ、または約０．５ｍｌ〜１０ｍｌである。
【０１１３】
一部の実施形態では、試料は、体液、体分泌物、または体排出物である。例として、限定することなく、一部の実施形態では、試料は、便、痰、尿、および血液を含むが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、デバイスは、１つまたは複数のニューマチックインターフェースを含有し、ここで、無菌空気または任意の無菌気体物質があるチャンバーから別のチャンバーへ流体を押すかつ駆動するために使用される。一部の実施形態では、チャンバー間の連結部、例えば、流れ−チャネルは、手動、半自動、または自動流体−流体制御系に結合されている。
一部の実施形態では、デバイスに入る気体または液体は、デバイス中に配置されている少なくとも１つの多孔質膜によって滅菌される。一部の実施形態では、多孔質膜は、天然に親水性または天然に疎水性である。一部の実施形態では、多孔質膜は、油分をはじく。
【０１１４】
一部の実施形態では、滅菌用多孔質膜は、約０．０２μｍ〜１０μｍ、約０．０５μｍ〜４μｍ、約０．１μｍ〜３μｍ、または約１．０μｍ〜２μｍのポアを有する。
一部の実施形態では、気体は、ＵＶベース汚染除去プロセスに供される。
一部の実施形態では、アウトプット溶液、すなわち、単離された微生物細胞試料は、試料中の微生物種を同定するために処理される。
【実施例】
【０１１５】
本明細書で記載された本テクノロジーは、以下の例によってさらに例証される。例は、例示的であることのみが意図され、決して限定的と解釈されない。
（例１）全血中のヒト細胞を溶解する
本例は、高百分率の真核生物ＤＮＡの抽出につながる典型的な溶解緩衝液を示す。
方法
０．７５ｍｌのヒト全血を市販の抽出キットによって処理し、これは、シリカスピンフィルターを有するカオトロピック塩およびアルコールベース試薬を使用して、ヒトＤＮＡ（ｈＤＮＡ）を抽出した。図３のシナリオ１を参照されたい。
０．７５ｍｌのヒト全血を、等体積の溶解緩衝液を全血と混合し、溶解緩衝液／全血混合物を１５分間インキュベートすることによって処理した。溶解緩衝液は、それぞれに関して約０．５％（ｖ／ｖ）の濃度で組合せＴｗｅｅｎ  ２０およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有した。インキュベーション後、溶液を遠心分離して、残存している無傷の細胞を捕獲した。遠心分離後、細胞残骸および遊離のｈＤＮＡを含有する上清を除去した。ペレットをＨ2Ｏに懸濁した。Ｈ2Ｏにおけるペレットの懸濁後、溶液を上で記載された市販の抽出キットによって処理した。図３のシナリオ２を参照されたい。
全ての処理ステップを三連で行い、ここで、結果を平均±標準偏差として示す（図３も参照されたい）。
【０１１６】
結果
市販のキットのみによるｈＤＮＡの抽出は、吸収ベースアッセイを通して測定されるように、２５．５３１±０．４１７μｇの質量でのｈＤＮＡ収率を有した。
最初にｈＤＮＡ枯渇、次いで、市販の抽出を経た全血は、吸収ベースアッセイを通して測定されるように、０．６７±０．０１３μｇの質量での低ｈＤＮＡ収率を有した。
結果は、約２４．８６μｇまたは９７．５％のｈＤＮＡがＴｗｅｅｎ  ２０およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶解緩衝液を使用して抽出されたことを示している。
これらの結果は、開示された溶解緩衝液が、真核細胞を標的とするのに非常に効率的であることを示している。したがって、本明細書で開示された溶解緩衝液は、試料中の微生物細胞を単離するかつ／または真核生物ＤＮＡを除去するための方法およびデバイスに有用である。
【０１１７】
（例２）：全血中のヒト細胞の標的溶解
本例は、例１において使用された溶解緩衝液が細菌細胞を標的としないことを示す。
方法
２つの細菌種：１）黄色ブドウ球菌、および２）大腸菌、ここで、例１からの溶解緩衝液で処置し、水を対照として使用した。黄色ブドウ球菌は、追加の「防壁」を有するので、「頑丈な」細菌である（グラム陽性）。一方、大腸菌は、追加の「防壁」を有さないので、幾分「弱い」（または影響されやすい）細菌である（グラム陰性）。
微生物検体を標準的な培地および方法を使用して終夜培養した。培養後、かつなお対数期の間、細菌培養物をＰＢＳに連続的に１０6×希釈した。全てのその後の処理ステップを三連で行い、ここで、図４に示された結果を平均±標準偏差として示す。
アッセイ１、すなわち、図４の左側では、等体積の無菌Ｈ2Ｏを細菌希釈物に添加し、組み合わせられた試料を混合し、次いで、１５分間インキュベートした。インキュベーション後、０．１ｍｌの試料を寒天ベース培地上に蒔き、３７℃で終夜インキュベートした。インキュベーション後、コロニーの数を各プレート上で計数した。
【０１１８】
アッセイ２、すなわち、図４の右側では、例１の等体積溶解緩衝液を細菌希釈物に添加し、組み合わせられた試料を混合し、次いで、１５分間インキュベートした。インキュベーション後、０．１ｍｌの試料を寒天ベース培地上に蒔き、３７℃で終夜インキュベートした。インキュベーション後、コロニーの数を各プレート上で計数した。
結果
Ｈ2Ｏ溶解細菌細胞からのコロニーの数は、黄色ブドウ球菌：８１±４および大腸菌：６５±５であった。
溶解緩衝液溶解細菌細胞からのコロニーの数は、黄色ブドウ球菌：８３±１２および大腸菌：５８±７であった。
結果は、本明細書で開示された溶解緩衝液が細菌細胞および細菌細胞生存に影響を及ぼさないことを示している。したがって、本明細書で開示された溶解緩衝液は、真核細胞を標的とするので、溶解緩衝液は、試料中の微生物細胞を単離するかつ／または真核生物ＤＮＡを除去するための方法およびデバイスに有用である。
【０１１９】
（例３）：全血からｈＤＮＡを除去する
本例は、ｈＤＮＡが例１からの溶解緩衝液および陰イオン交換樹脂を使用して全血から選択的に除去されたことを示す。
方法
処理されていないヒト−全血の０．１ｍｌ試料を第１のバイアル中の等体積の例１において記載された溶解緩衝液に添加した。組み合わせられた混合物を室温（約２１℃）で２分間インキュベートした。反応を同様に室温で、７．０に等しいｐＨを有する、２Ｍ  ＮａＣｌを含有する溶解終結溶液の添加で終結させた。
【０１２０】
溶解プロセスを終結させた後、約１μｍの直径の約５０μｇジエチルエタノールアミン結合磁性ビーズ、すなわち、ＷＡＸ磁性ビーズを混合物に添加した。ＷＡＸ磁性ビーズおよび溶液を室温で５分間、穏やかに撹拌しながらインキュベートした。
インキュベーション期間後、希土類磁石をバイアルの外に導入して、バイアルの壁にビーズを固定化した。上清を第１のバイアルから除去し、第２のバイアル中に置いた。
ビーズを有する第１のバイアルを水で洗浄し、捕獲されたｈＤＮＡを、電解質濃度を中性付近ｐＨで緩衝された４Ｍ  ＮａＣｌまで増加させることによって溶出した。ｈＤＮＡアウトプットを、吸収ベースアッセイを通して定量化した。
上清を有する第２のバイアルを市販のゲノムｈＤＮＡ抽出プロセスに供した。ｈＤＮＡアウトプットを、吸収ベースアッセイを通して定量化した。
【０１２１】
上で記載された全ての処理ステップを三連で行い、ここで、図５に示された結果を平均±標準偏差として示す。
結果
第１のバイアルからのｈＤＮＡアウトプットは、２，９３０±７３ｎｇであった。第２のバイアルからのｈＤＮＡアウトプットは、１４６．５±１８ｎｇであった。結果は、約９５％のｈＤＮＡがＷＡＸビーズによって除去されたことを示している。
結果は、陰イオン交換樹脂が溶液からｈＤＮＡを効果的に除去することを示している。したがって、真核細胞を標的とするために開示された溶解緩衝液を使用すること、および真核生物ＤＮＡを除去するために陰イオン交換樹脂を使用することは、試料中の微生物細胞を単離するかつ／または真核生物ＤＮＡを除去するための方法およびデバイスに有用である。
【０１２２】
（例４）：チップ上での自動プロセスによるｈＤＮＡ抽出と手動でのｈＤＮＡ抽出の比較
本例は、チップ上での自動プロセスを使用したｈＤＮＡ抽出が、手動で、手作業で、すなわち、ベンチトップで処理されたｈＤＮＡ抽出と同じくらい効果的であることを示す。
方法
「オンベンチ」アッセイ：１．５ｍｌのヒト全血が例３に記載されたものと同じ手動プロセスを経た。増加した血液体積を埋め合わせるために、陰イオン交換樹脂の量を３０×、総計１．５ｍｇに増加させた。溶解インキュベーション時間を１０分に増加させた。全ての他の反応ステップは、前に記載されたものと同一である（図５を参照されたい）。全ての処理ステップを三連で行い、ここで、表１および２に示された結果を平均±標準偏差として示す。
【０１２３】
「オンチップ」アッセイ：１．５ｍｌのヒト全血が例３に記載されたものと同じプロセスを経たが、しかしながら、処理を図２に記載された自動デバイスで完了した。一般に、全ての試薬、体積、処理時間、および温度は、例３に記載されたものと同一であった。１．５ｍｌのヒト全血を、手動プロセスを通して反応チャンバー（３０１、図２Ｃ）中に注入した。それぞれ約０．５％（ｖ／ｖ）の濃度を有するＴｗｅｅｎ−２０とＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の両方を含有する１．５ｍｌの溶解緩衝液を溶解用溶液貯蔵チャンバー３０２から反応チャンバー３０１に移し、室温で２分間インキュベートした。インキュベーション後、反応を、溶解終結溶液貯蔵チャンバー３０４に元々保管されていた、７．０のｐＨを有する２Ｍ  ＮａＣｌを含有する溶解終結溶液の添加で終結させた。溶解反応を終結させた後、樹脂貯蔵チャンバー３０３に保管された１．５ｍｇ  ＤＥＡＥ被覆磁性ビーズを反応チャンバー３０１に移した。反応チャンバー３０１を無菌空気の導入を通して穏やかに撹拌した。混合をおよそ５分間行い、その後、希土類磁石を使用して、ビーズを反応チャンバー３０１の壁に固定化した。次いで、ｈＤＮＡ枯渇試料をアウトプットチャンバー３０５に移した。全ての処理ステップを三連で行い、ここで、表１および２に示された結果を平均±標準偏差として示す。
【０１２４】
溶出されたｈＤＮＡでのＰＣＲ反応：両方の場合、すなわち、オンチップおよびオンベンチアッセイにおいて、ＷＡＸから溶出されたｈＤＮＡを単一ＤＮＡ鋳型の１，０００コピーを含有するＰＣＲマスターミックスに添加した。標準的な手順を使用して、かつＫａｐａ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＨｉＦｉ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて、ＰＣＲ反応を行った。
【０１２５】
結果
「オンベンチ」アッセイは、９６．９±０．３％のｈＤＮＡを抽出した（表１を参照されたい）。使い捨てのデバイスは、９７．２±０．４％のｈＤＮＡを抽出した（表２を参照されたい）。
【表３】
2017527301.tif 000005
【表４】
2017527301.tif 000006
【０１２６】
結果は、等しいレベルの有効性でオンベンチとオンチップの両方でのＤＮＡ抽出プロセスを完了する能力を示している。
図６を参照して、レーン１〜３（Ｓ1〜Ｓ3）は、ヒト全血から抽出されず、手動処理を経たｈＤＮＡを含んだＰＣＲ試料であり、レーン４〜６（Ｓ4〜Ｓ6）は、ヒト全血から抽出されず、自動処理を経たｈＤＮＡを含んだＰＣＲ試料である。ＮＣは、ニセの実験を描写し、ＰＣは、ｈＤＮＡの存在がない１０3コピー鋳型からのＰＣＲ産物アウトプット（１．５ｋｂｐ）を示す。
図６は、オンベンチとオンチップの両方でＰＣＲプロセスに問題がなかったので、残り物または残存物ｈＤＮＡが感受性観点から下流プロセスに著しく影響を及ぼさないことを示している。
【０１２７】
結果は、正の対照とも著しく異ならない、オンベンチとオンチップ処理の両方からの等しいレベルのＤＮＡ産物を示している。
（例５）：黄色ブドウ球菌の検出
本例は、２つの臨床的に関連する負荷レベル：１０〜１００ＣＦＵ／ｍｌ（「高負荷」）および１〜１０ＣＦＵ／ｍｌ（「低負荷」）で、本明細書で開示された方法を使用した、ヒト全血からの直接的な黄色ブドウ球菌の検出を示す。負荷は、特に、４１ＣＦＵ／ｍｌおよび４ＣＦＵ／ｍｌであった。
方法：ＥＤＴＡ  ｖａｃｕｅｔｔｅ中に引き出された新鮮なヒト全血に黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ＃４３３００）を「高負荷」または「低負荷」で播種した。１．５ｍｌの人為的なヒト血液を抽出し、新鮮なバイアル中に置いた。１．５ｍｌ血液試料に、２％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ−２０および１．３％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００からなる１．５ｍｌの溶解用溶液を添加した。約５分後、ＮａＣｌを１５０〜３００ｍＭの最終濃度まで組み合わせられた混合物に添加し、ＷＡＸコンジュゲート磁性粒子を添加した。約２分後、希土類磁石を使用して、磁性粒子をバイアルの表面に固定化し、約３ｍｌの溶液を除去し、新鮮なバイアル中に置いた。
【０１２８】
微生物溶解用溶液を新鮮なバイアルに添加した。微生物溶解用溶液は、以下のものを含有した：グルコピラノシド、陽イオン性洗浄剤、およびスルホベタイン（その全ては、それらの個々のＣＭＣを超える濃度であった（＞１０×））を含有する洗浄剤ベース試薬に加えて、架橋および親和性精製リゾチーム（２〜１３ｍｇ）、ムタノリシン（１０〜３５０Ｕ）、ザイモリアーゼ（１８〜２００Ｕ）、およびリゾスタフィン（６５〜２５０Ｕ）。微生物溶解反応は、ＥＤＴＡ（約１０ｍＭで）および２−メルカプトエタノール（約２５ｍＭで）も含んだ。組み合わせられた反応混合物を約１０〜１５分間インキュベートし、その後、ＷＡＸコンジュゲート磁性粒子を溶液に添加した。約２分後、希土類磁石を使用して、磁性粒子をバイアルの表面に固定化し、微生物溶解用溶液を除去し、廃棄した。
【０１２９】
ビーズを１Ｍ  ＮａＣｌを含有する緩衝された洗浄液で繰り返し洗浄した。微生物ＤＮＡをｐＨ１２．５に緩衝された溶出試薬でビーズから溶出した。溶出溶液を限外ろ過した。限外ろ過後、微生物ＤＮＡを以下のプライマー配列（５’〜３’）での全長ｒＤＮＡのＰＣＲに供した：
CCC CCC CCT CAG TTA TCG TTT ATT TGA TAG TAC C; CCC CCC CCT CAG TTA TCG TTT ATT TGA TAG TTC C; CCC TTC CCA GAG TTT GAT CAT GGC TCA G; CCC TTC CAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG; CCC CCC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T; CCC CCGG CTA CCT TGT TAC GACT T; CCC TTC CCT GAT GAC TCG TGC CTA CTA; CCC TCT CCC TGA TGA CTT GCG CTT ACT A
【０１３０】
各プライマーは、その後の標識化のためのハプテン部分を含有する。ＰＣＲ後、試料を、それぞれ表１で同定された配列を有するビオチン化ガンマ修飾ＰＮＡプローブならびにＴｗｅｅｎ−２０、ＮａＣｌ、およびポリ−ＥＧ−１２，０００を含有する侵入支持試薬を充填された１７のチャンバー中に等しく分けた。各ウェルを、５ｍｌのストックＭｙＯｎｅ  Ｃ１ストレプトアビジン被覆ビーズの添加で７０〜９５℃まで１〜５分間加熱した。ビーズ上へのγＰＮＡプローブの固定化後、ビーズを１５０〜５５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する溶液中で少なくとも７５〜９５℃の温度で洗浄した。洗浄後、各チャンバーに、捕獲されたアンプリコン上の遊離のハプテン（存在する場合）に結合するプライマー−ハプテンを標的とするＨＲＰ−コンジュゲートを含有する溶液を添加した。中性の低塩洗浄でのいくつかの洗浄ステップ後、ルミノールを添加して、微生物ＤＮＡが捕獲された場所のみで明瞭な光学的シグネチャーを得た。光学的シグネチャーを２．５秒／ウェルの積分時間でＰｒｏｍｅｇａ  ＧｌｏＭａｘプレートリーダーを使用して読んだ。各反応を三連で完了した。
【０１３１】
結果：明確に同定可能な光学的シグネチャーは、黄色ブドウ球菌チャネル（黄色ブドウ球菌に特異的なガンマ修飾ＰＮＡプローブで活性化されたチャンバーに由来した）においてのみ見られた。図７を参照されたい。
これらの結果は、本明細書で開示された組成物および方法が少なくとも１つの特異的な病原体を試料血液から同定し得ることを示している。したがって、本明細書で開示された組成物および方法は、試料中の微生物の検出および同定に有用である。
【０１３２】
（例６）：表皮ブドウ球菌の検出
本例は、２つの臨床的に関連する負荷レベル：１０〜１００ＣＦＵ／ｍｌ（「高負荷」）および１〜１０ＣＦＵ／ｍｌ（「低負荷」）で、本明細書で開示された方法を使用した、ヒト全血からの直接的な表皮ブドウ球菌の検出を示す。負荷は、特に、４７ＣＦＵ／ｍｌおよび５ＣＦＵ／ｍｌであった。
方法：ＥＤＴＡ  ｖａｃｕｅｔｔｅ中に引き出された新鮮なヒト全血に表皮ブドウ球菌（ＡＴＣＣ＃５１６２５）を「高負荷」または「低負荷」で播種した。微生物ＤＮＡを検出するための例５に開示された方法を使用した。
結果：強い光学的シグネチャーがＣｏＮＳチャネル（ＣｏＮＳに特異的なガンマ修飾ＰＮＡプローブで活性化されたチャンバーに由来した）において見られた。図８を参照されたい。
これらの結果は、本明細書で開示された組成物および方法が少なくとも１つの特異的な病原体を試料血液から同定し得ることを示している。したがって、本明細書で開示された組成物および方法は、試料中の微生物の検出および同定に有用である。
【０１３３】
（例７）：スタフィロコッカス・ルグドゥネンシスの検出
本例は、２つの臨床的に関連する負荷レベル：１０〜１００ＣＦＵ／ｍｌ（「高負荷」）および１〜１０ＣＦＵ／ｍｌ（「低負荷」）で、本明細書で開示された方法を使用した、ヒト全血からの直接的なスタフィロコッカス・ルグドゥネンシスの検出を示す。負荷は、特に、５１ＣＦＵ／ｍｌおよび５ＣＦＵ／ｍｌであった。
方法：ＥＤＴＡ  ｖａｃｕｅｔｔｅ中に引き出された新鮮なヒト全血にスタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（ＡＴＣＣ＃４９５７６）を「高負荷」または「低負荷」で播種した。微生物ＤＮＡを検出するための例５に開示された方法を使用した。
結果：明確に同定可能な光学的シグネチャーがＣｏＮＳチャネル（ＣｏＮＳに特異的なガンマ修飾ＰＮＡプローブで活性化されたチャンバーに由来した）においてのみ見られた。図９を参照されたい。
これらの結果は、本明細書で開示された組成物および方法が少なくとも１つの特異的な病原体を試料血液から同定し得ることを示している。したがって、本明細書で開示された組成物および方法は、試料中の微生物の検出および同定に有用である。
【０１３４】
（例８）：ストレプトコッカス・アガラクチアの検出
本例は、２つの臨床的に関連する負荷レベル：１０〜１００ＣＦＵ／ｍｌ（「高負荷」）および１〜１０ＣＦＵ／ｍｌ（「低負荷」）で、本明細書で開示された方法を使用した、ヒト全血からの直接的なストレプトコッカス・アガラクチアの検出を示す。負荷は、特に、２０ＣＦＵ／ｍｌおよび２ＣＦＵ／ｍｌであった。
方法：ＥＤＴＡ  ｖａｃｕｅｔｔｅ中に引き出された新鮮なヒト全血にストレプトコッカス・アガラクチア（ＡＴＣＣ＃１３８１３）を「高負荷」または「低負荷」で播種した。微生物ＤＮＡを検出するための例５に開示された方法を使用した。
結果：明確に同定可能な光学的シグネチャーがストレプトコッカス・アガラクチアチャネル（ストレプトコッカス・アガラクチアに特異的なガンマ修飾ＰＮＡプローブで活性化されたチャンバーに由来した）においてのみ見られた。図１０を参照されたい。
これらの結果は、本明細書で開示された組成物および方法が少なくとも１つの特異的な病原体を試料血液から同定し得ることを示している。したがって、本明細書で開示された組成物および方法は、試料中の微生物の検出および同定に有用である。
【０１３５】
（例９）：肺炎球菌の検出
本例は、２つの臨床的に関連する負荷レベル：１０〜１００ＣＦＵ／ｍｌ（「高負荷」）および１〜１０ＣＦＵ／ｍｌ（「低負荷」）で、本明細書で開示された方法を使用した、ヒト全血からの直接的なＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａの検出を示す。負荷は、特に、７５ＣＦＵ／ｍｌおよび７ＣＦＵ／ｍｌであった。
方法：ＥＤＴＡ  ｖａｃｕｅｔｔｅ中に引き出された新鮮なヒト全血に肺炎球菌（ＡＴＣＣ＃６３０３）を「高負荷」または「低負荷」で播種した。微生物ＤＮＡを検出するための例５に開示された方法を使用した。
【０１３６】
結果：強い光学的シグネチャーがＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａチャネル（肺炎球菌に特異的なガンマ修飾ＰＮＡプローブで活性化されたチャンバーに由来した）において見られた。図１１を参照されたい。
これらの結果は、本明細書で開示された組成物および方法が少なくとも１つの特異的な病原体を試料血液から同定し得ることを示している。したがって、本明細書で開示された組成物および方法は、試料中の微生物の検出および同定に有用である。
【０１３７】
（例１０）：化膿性連鎖球菌の検出
本例は、２つの臨床的に関連する負荷レベル：１０〜１００ＣＦＵ／ｍｌ（「高負荷」）および１〜１０ＣＦＵ／ｍｌ（「低負荷」）で、本明細書で開示された方法を使用した、ヒト全血からの直接的な化膿性連鎖球菌の検出を示す。負荷は、特に、１７ＣＦＵ／ｍｌおよび２ＣＦＵ／ｍｌであった。
方法：ＥＤＴＡ  ｖａｃｕｅｔｔｅ中に引き出された新鮮なヒト全血に化膿性連鎖球菌（ＡＴＣＣ＃１２３４４）を「高負荷」または「低負荷」で播種した。微生物ＤＮＡを検出するための例５に開示された方法を使用した。
結果：明確に同定可能な光学的シグネチャーが化膿性連鎖球菌チャネル（化膿性連鎖球菌に特異的なガンマ修飾ＰＮＡプローブで活性化されたチャンバーに由来した）においてのみ見られた。図１２を参照されたい。
これらの結果は、本明細書で開示された組成物および方法が少なくとも１つの特異的な病原体を試料血液から同定し得ることを示している。したがって、本明細書で開示された組成物および方法は、試料中の微生物の検出および同定に有用である。
【０１３８】
（例１１）：フェカリス菌の検出
本例は、２つの臨床的に関連する負荷レベル：１０〜１００ＣＦＵ／ｍｌ（「高負荷」）および１〜１０ＣＦＵ／ｍｌ（「低負荷」）で、本明細書で開示された方法を使用した、ヒト全血からの直接的なフェカリス菌の検出を示す。負荷は、特に、５４ＣＦＵ／ｍｌおよび５ＣＦＵ／ｍｌであった。
方法：ＥＤＴＡ  ｖａｃｕｅｔｔｅ中に引き出された新鮮なヒト全血にフェカリス菌（ＡＴＣＣ＃２９２１２）を「高負荷」または「低負荷」で播種した。微生物ＤＮＡを検出するための例５に開示された方法を使用した。
結果：明確に同定可能な光学的シグネチャーがフェカリス菌チャネル（フェカリス菌に特異的なガンマ修飾ＰＮＡプローブで活性化されたチャンバーに由来した）においてのみ見られた。図１３を参照されたい。
これらの結果は、本明細書で開示された組成物および方法が少なくとも１つの特異的な病原体を試料血液から同定し得ることを示している。したがって、本明細書で開示された組成物および方法は、試料中の微生物の検出および同定に有用である。
【０１３９】
（例１２）：フェシウム菌の検出
本例は、２つの臨床的に関連する負荷レベル：１０〜１００ＣＦＵ／ｍｌ（「高負荷」）および１〜１０ＣＦＵ／ｍｌ（「低負荷」）で、本明細書で開示された方法を使用した、ヒト全血からの直接的なフェシウム菌の検出を示す。負荷は、特に、２２ＣＦＵ／ｍｌおよび２ＣＦＵ／ｍｌであった。
方法：ＥＤＴＡ  ｖａｃｕｅｔｔｅ中に引き出された新鮮なヒト全血にフェシウム菌（ＡＴＣＣ＃７００２２１）を「高負荷」または「低負荷」で播種した。微生物ＤＮＡを検出するための例５に開示された方法を使用した。
結果：明確に同定可能な光学的シグネチャーがフェシウム菌チャネル（フェシウム菌に特異的なガンマ修飾ＰＮＡプローブで活性化されたチャンバーに由来した）においてのみ見られた。図１４を参照されたい。
これらの結果は、本明細書で開示された組成物および方法が少なくとも１つの特異的な病原体を試料血液から同定し得ることを示している。したがって、本明細書で開示された組成物および方法は、試料中の微生物の検出および同定に有用である。
【０１４０】
（例１３）：大腸菌の検出
本例は、２つの臨床的に関連する負荷レベル：１０〜１００ＣＦＵ／ｍｌ（「高負荷」）および１〜１０ＣＦＵ／ｍｌ（「低負荷」）で、本明細書で開示された方法を使用した、ヒト全血からの直接的な大腸菌の検出を示す。負荷は、特に、５０ＣＦＵ／ｍｌおよび５ＣＦＵ／ｍｌであった。
方法：ＥＤＴＡ  ｖａｃｕｅｔｔｅ中に引き出された新鮮なヒト全血に大腸菌（ＡＴＣＣ＃ＢＡＡ−２４６９）を「高負荷」または「低負荷」で播種した。微生物ＤＮＡを検出するための例５に開示された方法を使用した。
結果：強い光学的シグネチャーが大腸菌チャネル（大腸菌に特異的なガンマ修飾ＰＮＡプローブで活性化されたチャンバーに由来した）において見られた。図１５を参照されたい。
これらの結果は、本明細書で開示された組成物および方法が少なくとも１つの特異的な病原体を試料血液から同定し得ることを示している。したがって、本明細書で開示された組成物および方法は、試料中の微生物の検出および同定に有用である。
【０１４１】
（例１４）：アシネトバクター・バウマンニの検出
本例は、２つの臨床的に関連する負荷レベル：１０〜１００ＣＦＵ／ｍｌ（「高負荷」）および１〜１０ＣＦＵ／ｍｌ（「低負荷」）で、本明細書で開示された方法を使用した、ヒト全血からの直接的なアシネトバクター・バウマンニの検出を示す。負荷は、特に、２５ＣＦＵ／ｍｌおよび５ＣＦＵ／ｍｌであった。
方法：ＥＤＴＡ  ｖａｃｕｅｔｔｅ中に引き出された新鮮なヒト全血にアシネトバクター・バウマンニ（ＡＴＣＣ＃１９６０６）を「高負荷」または「低負荷」で播種した。微生物ＤＮＡを検出するための例５に開示された方法を使用した。
結果：明確に同定可能な光学的シグネチャーがアシネトバクター・バウマンニチャネル（アシネトバクター・バウマンニに特異的なガンマ修飾ＰＮＡプローブで活性化されたチャンバーに由来した）においてのみ見られた。図１６を参照されたい。
これらの結果は、本明細書で開示された組成物および方法が少なくとも１つの特異的な病原体を試料血液から同定し得ることを示している。したがって、本明細書で開示された組成物および方法は、試料中の微生物の検出および同定に有用である。
【０１４２】
（例１５）：エンテロバクター・エロゲネスの検出
本例は、２つの臨床的に関連する負荷レベル：１０〜１００ＣＦＵ／ｍｌ（「高負荷」）および１〜１０ＣＦＵ／ｍｌ（「低負荷」）で、本明細書で開示された方法を使用した、ヒト全血からの直接的なエンテロバクター・エロゲネスの検出を示す。負荷は、特に、２２ＣＦＵ／ｍｌおよび２ＣＦＵ／ｍｌであった。
方法：ＥＤＴＡ  ｖａｃｕｅｔｔｅ中に引き出された新鮮なヒト全血にエンテロバクター・エロゲネス（ＡＴＣＣ＃１３０４８）を「高負荷」または「低負荷」で播種した。微生物ＤＮＡを検出するための例５に開示された方法を使用した。
結果：明確に同定可能な光学的シグネチャーがエンテロバクター菌種／クレブシエラ菌種チャネル（エンテロバクター・エロゲネス／エンテロバクター・クロアカ／肺炎桿菌／クレブシエラ・オキシトカに特異的なガンマ修飾ＰＮＡプローブで活性化されたチャンバーに由来した）においてのみ見られた。図１７を参照されたい。
これらの結果は、本明細書で開示された組成物および方法が少なくとも１つの特異的な病原体を試料血液から同定し得ることを示している。したがって、本明細書で開示された組成物および方法は、試料中の微生物の検出および同定に有用である。
【０１４３】
（例１６）：エンテロバクター・クロアカの検出
本例は、２つの臨床的に関連する負荷レベル：１０〜１００ＣＦＵ／ｍｌ（「高負荷」）および１〜１０ＣＦＵ／ｍｌ（「低負荷」）で、本明細書で開示された方法を使用した、ヒト全血からの直接的なエンテロバクター・クロアカの検出を示す。負荷は、特に、３８ＣＦＵ／ｍｌおよび４ＣＦＵ／ｍｌであった。
方法：ＥＤＴＡ  ｖａｃｕｅｔｔｅ中に引き出された新鮮なヒト全血にエンテロバクター・クロアカ（ＡＴＣＣ＃１３０４７）を「高負荷」または「低負荷」で播種した。微生物ＤＮＡを検出するための例５に開示された方法を使用した。
結果：明確に同定可能な光学的シグネチャーがエンテロバクター菌種／クレブシエラ菌種チャネル（エンテロバクター・エロゲネス／エンテロバクター・クロアカ／肺炎桿菌／クレブシエラ・オキシトカに特異的なガンマ修飾ＰＮＡプローブで活性化されたチャンバーに由来した）においてのみ見られた。図１８を参照されたい。
これらの結果は、本明細書で開示された組成物および方法が少なくとも１つの特異的な病原体を試料血液から同定し得ることを示している。したがって、本明細書で開示された組成物および方法は、試料中の微生物の検出および同定に有用である。
【０１４４】
（例１７）：肺炎桿菌の検出
本例は、２つの臨床的に関連する負荷レベル：１０〜１００ＣＦＵ／ｍｌ（「高負荷」）および１〜１０ＣＦＵ／ｍｌ（「低負荷」）で、本明細書で開示された方法を使用した、ヒト全血からの直接的な肺炎桿菌の検出を示す。負荷は、特に、６０ＣＦＵ／ｍｌおよび６ＣＦＵ／ｍｌであった。
方法：ＥＤＴＡ  ｖａｃｕｅｔｔｅ中に引き出された新鮮なヒト全血に肺炎桿菌（ＡＴＣＣ＃２７７３６）を「高負荷」または「低負荷」で播種した。微生物ＤＮＡを検出するための例５に開示された方法を使用した。
結果：強い光学的シグネチャーがエンテロバクター菌種／クレブシエラ菌種チャネル（エンテロバクター・エロゲネス／エンテロバクター・クロアカ／肺炎桿菌／クレブシエラ・オキシトカに特異的なガンマ修飾ＰＮＡプローブで活性化されたチャンバーに由来した）において見られた。図１９を参照されたい。
これらの結果は、本明細書で開示された組成物および方法が少なくとも１つの特異的な病原体を試料血液から同定し得ることを示している。したがって、本明細書で開示された組成物および方法は、試料中の微生物の検出および同定に有用である。
【０１４５】
（例１８）：クレブシエラ・オキシトカの検出
本例は、２つの臨床的に関連する負荷レベル：１０〜１００ＣＦＵ／ｍｌ（「高負荷」）および１〜１０ＣＦＵ／ｍｌ（「低負荷」）で、本明細書で開示された方法を使用した、ヒト全血からの直接的なクレブシエラ・オキシトカの検出を示す。負荷は、特に、２４ＣＦＵ／ｍｌおよび２ＣＦＵ／ｍｌであった。
方法：ＥＤＴＡ  ｖａｃｕｅｔｔｅ中に引き出された新鮮なヒト全血にクレブシエラ・オキシトカ（ＡＴＣＣ＃４９１３１）を「高負荷」または「低負荷」で播種した。微生物ＤＮＡを検出するための例５に開示された方法を使用した。
結果：強い光学的シグネチャーがエンテロバクター菌種／クレブシエラ菌種チャネル（エンテロバクター・エロゲネス／エンテロバクター・クロアカ／Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ／クレブシエラ・オキシトカに特異的なガンマ修飾ＰＮＡプローブで活性化されたチャンバーに由来した）において見られた。図２０を参照されたい。
これらの結果は、本明細書で開示された組成物および方法が少なくとも１つの特異的な病原体を試料血液から同定し得ることを示している。したがって、本明細書で開示された組成物および方法は、試料中の微生物の検出および同定に有用である。
【０１４６】
（例１９）：緑膿菌の検出
本例は、２つの臨床的に関連する負荷レベル：１０〜１００ＣＦＵ／ｍｌ（「高負荷」）および１〜１０ＣＦＵ／ｍｌ（「低負荷」）で、本明細書で開示された方法を使用した、ヒト全血からの直接的な緑膿菌の検出を示す。負荷は、特に、６０ＣＦＵ／ｍｌおよび６ＣＦＵ／ｍｌであった。
方法：ＥＤＴＡ  ｖａｃｕｅｔｔｅ中に引き出された新鮮なヒト全血に緑膿菌（ＡＴＣＣ＃１０１４５）を「高負荷」または「低負荷」で播種した。微生物ＤＮＡを検出するための例５に開示された方法を使用した。
結果：明確に同定可能な光学的シグネチャーが緑膿菌チャネル（緑膿菌に特異的なガンマ修飾ＰＮＡプローブで活性化されたチャンバーに由来した）においてのみ見られた。図２１を参照されたい。
これらの結果は、本明細書で開示された組成物および方法が少なくとも１つの特異的な病原体を試料血液から同定し得ることを示している。したがって、本明細書で開示された組成物および方法は、試料中の微生物の検出および同定に有用である。
【０１４７】
（例２０）：霊菌の検出
本例は、２つの臨床的に関連する負荷レベル：１０〜１００ＣＦＵ／ｍｌ（「高負荷」）および１〜１０ＣＦＵ／ｍｌ（「低負荷」）で、本明細書で開示された方法を使用した、ヒト全血からの直接的な霊菌の検出を示す。負荷は、特に、５９ＣＦＵ／ｍｌおよび６ＣＦＵ／ｍｌであった。
方法：ＥＤＴＡ  ｖａｃｕｅｔｔｅ中に引き出された新鮮なヒト全血に霊菌（ＡＴＣＣ＃１３８８０）を「高負荷」または「低負荷」で播種した。微生物ＤＮＡを検出するための例５に開示された方法を使用した。
結果：強い光学的シグネチャーが霊菌チャネル（霊菌に特異的なガンマ修飾ＰＮＡプローブで活性化されたチャンバーに由来した）において見られた。図２２を参照されたい。
これらの結果は、本明細書で開示された組成物および方法が少なくとも１つの特異的な病原体を試料血液から同定し得ることを示している。したがって、本明細書で開示された組成物および方法は、試料中の微生物の検出および同定に有用である。
【０１４８】
（例２１）：カンジダ・アルビカンスの検出
本例は、２つの臨床的に関連する負荷レベル：１０〜１００ＣＦＵ／ｍｌ（「高負荷」）および１〜１０ＣＦＵ／ｍｌ（「低負荷」）で、本明細書で開示された方法を使用した、ヒト全血からの直接的なカンジダ・アルビカンスの検出を示す。負荷は、特に、２７ＣＦＵ／ｍｌおよび３ＣＦＵ／ｍｌであった。
方法：ＥＤＴＡ  ｖａｃｕｅｔｔｅ中に引き出された新鮮なヒト全血にカンジダ・アルビカンス（ＡＴＣＣ＃９００２８）を「高負荷」または「低負荷」で播種した。微生物ＤＮＡを検出するための例５に開示された方法を使用した。
結果：強い光学的シグネチャーがカンジダ・アルビカンスチャネル（カンジダ・アルビカンスに特異的なガンマ修飾ＰＮＡプローブで活性化されたチャンバーに由来した）において見られた。図２３を参照されたい。
これらの結果は、本明細書で開示された組成物および方法が少なくとも１つの特異的な病原体を試料血液から同定し得ることを示している。したがって、本明細書で開示された組成物および方法は、試料中の微生物の検出および同定に有用である。
【０１４９】
（例２２）：カンジダ・グラブラータの検出
本例は、２つの臨床的に関連する負荷レベル：１０〜１００ＣＦＵ／ｍｌ（「高負荷」）および１〜１０ＣＦＵ／ｍｌ（「低負荷」）で、本明細書で開示された方法を使用した、ヒト全血からの直接的なカンジダ・グラブラータの検出を示す。負荷は、特に、１７ＣＦＵ／ｍｌおよび２ＣＦＵ／ｍｌであった。
方法：ＥＤＴＡ  ｖａｃｕｅｔｔｅ中に引き出された新鮮なヒト全血にカンジダ・グラブラータ（ＡＴＣＣ＃ＭＹＡ−２９５０）を「高負荷」または「低負荷」で播種した。微生物ＤＮＡを検出するための例５に開示された方法を使用した。
結果：明確に同定可能な光学的シグネチャーがカンジダ・グラブラータチャネル（カンジダ・グラブラータに特異的なガンマ修飾ＰＮＡプローブで活性化されたチャンバーに由来した）においてのみ見られた。図２４を参照されたい。
これらの結果は、本明細書で開示された組成物および方法が少なくとも１つの特異的な病原体を試料血液から同定し得ることを示している。したがって、本明細書で開示された組成物および方法は、試料中の微生物の検出および同定に有用である。
【０１５０】
（例２３）：カンジダ・トロピカリスの検出
本例は、２つの臨床的に関連する負荷レベル：１０〜１００ＣＦＵ／ｍｌ（「高負荷」）および１〜１０ＣＦＵ／ｍｌ（「低負荷」）で、本明細書で開示された方法を使用した、ヒト全血からの直接的なカンジダ・ｔｒｏｐｉｃａｌｓの検出を示す。負荷は、特に、３１ＣＦＵ／ｍｌおよび６ＣＦＵ／ｍｌであった。
方法：ＥＤＴＡ  ｖａｃｕｅｔｔｅ中に引き出された新鮮なヒト全血にカンジダ・トロピカルス（ＡＴＣＣ＃１３８０３）を「高負荷」または「低負荷」で播種した。微生物ＤＮＡを検出するための例５に開示された方法を使用した。
結果：明確に同定可能な光学的シグネチャーがカンジダ・トロピカルスチャネル（カンジダ・トロピカルスに特異的なガンマ修飾ＰＮＡプローブで活性化されたチャンバーに由来した）においてのみ見られた。図２５を参照されたい。
これらの結果は、本明細書で開示された組成物および方法が少なくとも１つの特異的な病原体を試料血液から同定し得ることを示している。したがって、本明細書で開示された組成物および方法は、試料中の微生物の検出および同定に有用である。
【０１５１】
（例２４）：カンジダ・パラプシローシスの検出
本例は、２つの臨床的に関連する負荷レベル：１０〜１００ＣＦＵ／ｍｌ（「高負荷」）および１〜１０ＣＦＵ／ｍｌ（「低負荷」）で、本明細書で開示された方法を使用した、ヒト全血からの直接的なカンジダ・パラプシローシスの検出を示す。負荷は、特に、４５ＣＦＵ／ｍｌおよび５ＣＦＵ／ｍｌであった。
方法：ＥＤＴＡ  ｖａｃｕｅｔｔｅ中に引き出された新鮮なヒト全血にカンジダ・パラプシローシス（ＡＴＣＣ＃１４２４３）を「高負荷」または「低負荷」で播種した。微生物ＤＮＡを検出するための例５に開示された方法を使用した。
結果：強い光学的シグネチャーがカンジダ・パラプシローシスチャネル（カンジダ・パラプシローシスに特異的なガンマ修飾ＰＮＡプローブで活性化されたチャンバーに由来した）において見られた。図２６を参照されたい。
これらの結果は、本明細書で開示された組成物および方法が少なくとも１つの特異的な病原体を試料血液から同定し得ることを示している。したがって、本明細書で開示された組成物および方法は、試料中の微生物の検出および同定に有用である。
【０１５２】
（例２５）：カンジダ・クルセイの検出
本例は、２つの臨床的に関連する負荷レベル：１０〜１００ＣＦＵ／ｍｌ（「高負荷」）および１〜１０ＣＦＵ／ｍｌ（「低負荷」）で、本明細書で開示された方法を使用した、ヒト全血からの直接的なカンジダ・クルセイの検出を示す。負荷は、特に、４５ＣＦＵ／ｍｌおよび５ＣＦＵ／ｍｌであった。
方法：ＥＤＴＡ  ｖａｃｕｅｔｔｅ中に引き出された新鮮なヒト全血にカンジダ・クルセイ（ＡＴＣＣ＃１３８０３）を「高負荷」または「低負荷」で播種した。微生物ＤＮＡを検出するための例５に開示された方法を使用した。
結果：明確に同定可能な光学的シグネチャーがカンジダ・クルセイチャネル（カンジダ・クルセイに特異的なガンマ修飾ＰＮＡプローブで活性化されたチャンバーに由来した）においてのみ見られた。図２７を参照されたい。
これらの結果は、本明細書で開示された組成物および方法が少なくとも１つの特異的な病原体を試料血液から同定し得ることを示している。したがって、本明細書で開示された組成物および方法は、試料中の微生物の検出および同定に有用である。
【０１５３】
（例２６）：大腸菌およびカンジダ・アルビカンスでの同時感染の検出
本例は、臨床的に関連する負荷レベルで、本明細書で開示された方法を使用した、ヒト全血からの直接的な大腸菌とカンジダ・アルビカンスの両方の同時検出を示す：負荷は、特に、それぞれ、大腸菌およびカンジダ・アルビカンスに関して１７ＣＦＵ／ｍｌおよび３ＣＦＵ／ｍｌであった。
方法：ＥＤＴＡ  ｖａｃｕｅｔｔｅ中に引き出された新鮮なヒト全血に大腸菌（ＡＴＣＣ＃ＢＡＡ−２４６９）とカンジダ・アルビカンス（ＡＴＣＣ＃９００２８）の両方を播種した。微生物ＤＮＡを検出するための例５に開示された方法を使用した。
結果：明確に同定可能な光学的シグネチャーが大腸菌およびカンジダ・アルビカンスチャネル（大腸菌またはカンジダ・アルビカンスに特異的なガンマ修飾ＰＮＡプローブで活性化されたチャンバーに由来した）においてのみ見られた。図２８を参照されたい。
これらの結果は、本明細書で開示された組成物および方法が少なくとも１つの特異的な病原体を試料血液から同定し得ることを示している。したがって、本明細書で開示された組成物および方法は、試料中の微生物の検出および同定に有用である。
【０１５４】
（例２７）：大腸菌および黄色ブドウ球菌での同時感染の検出
本例は、臨床的に関連する負荷レベルで、本明細書で開示された方法を使用した、ヒト全血からの直接的な大腸菌と黄色ブドウ球菌の両方の同時検出を示す：負荷は、特に、それぞれ、大腸菌および黄色ブドウ球菌に関して１７ＣＦＵ／ｍｌおよび８ＣＦＵ／ｍｌであった。
方法：ＥＤＴＡ  ｖａｃｕｅｔｔｅ中に引き出された新鮮なヒト全血に大腸菌（ＡＴＣＣ＃ＢＡＡ−２４６９）と黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ＃４３３００）の両方を播種した。微生物ＤＮＡを検出するための例５に開示された方法を使用した。
結果：強い光学的シグネチャーが大腸菌および黄色ブドウ球菌チャネル（大腸菌または黄色ブドウ球菌に特異的なガンマ修飾ＰＮＡプローブで活性化されたチャンバーに由来した）において見られた。図２９を参照されたい。
これらの結果は、本明細書で開示された組成物および方法が少なくとも１つの特異的な病原体を試料血液から同定し得ることを示している。したがって、本明細書で開示された組成物および方法は、試料中の微生物の検出および同定に有用である。
【０１５５】
均等物
いくつかの実施形態が例証され、記載されたが、以下の特許請求の範囲において定義されたそのより広範な態様におけるテクノロジーから逸脱することなく、当業者によって実施形態に対し変更および修正が行いわれ得ることが理解されよう。
本明細書で例証的に記載された実施形態は、本明細書で明確に開示されていない任意のエレメント、限定の非存在下で適切に実行され得る。したがって、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する」などの用語は、拡張的にかつ限定なく解釈されるべきである。その上、本明細書で用いられた用語および表現は、説明の用語として使用され、限定するものではなく、示されかつ記載された特色のいかなる均等物もその部分もかかる用語および表現の使用において排除する意図はないが、様々な変更形態が特許請求されたテクノロジーの範囲内で可能であることが認識される。その上、「から本質的になる」というフレーズは、特に列挙されたエレメントおよび特許請求されたテクノロジーの基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を及ぼさない追加のエレメントを含むと理解されることになる。「からなる」というフレーズは、特定されていないあらゆるエレメントを排除する。
【０１５６】
本開示は、本出願において記載された特定の実施形態の観点から限定されない。当業者には明らかとなるように、多くの変更形態および変形形態がその精神および範囲から逸脱することなく行われ得る。本明細書で列挙されたものに加えて、本開示の範囲内の機能的に同等の方法および組成物は、前述の説明から当業者に明らかとなる。かかる変更形態および変形形態は、添付の特許請求の範囲内であることが意図されている。本開示は、かかる特許請求の範囲が与えられた均等物の完全な範囲とともに、添付の特許請求の範囲の用語によってのみ限定される。本開示は、当然変動し得る特定の方法、試薬、化合物、組成物または生物系に限定されないことが理解されるべきである。本明細書で使用された専門用語は、特定の実施形態を記載することのみを目的とし、限定することは意図されていないことも理解されるべきである。
【０１５７】
さらに、本開示の特色または態様がマーカッシュグループの観点から記載される場合、それによって、本開示がマーカッシュグループのメンバーの任意の個々のメンバーまたはサブグループの観点からも記載されることを当業者は認識することになる。
【０１５８】
本明細書において参照された全ての刊行物、特許出願、発行された特許、および他の文書は、まるで各個々の刊行物、特許出願、発行された特許、または他の文書が、その全体が参照によって組み込まれていると明確にかつ個々に示されているように、参照によって本明細書に組み込まれている。参照によって組み込まれたテキストに含有されている定義は、それらが本開示における定義と矛盾する程度まで除外される。
【０１５９】
他の実施形態が以下の特許請求の範囲において記載される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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